(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターを染色体ＤＮＡ中に組み込み又はプラスミドで保持した放線菌を作製し，次いで，作製した前記放線菌とミコール酸含有微生物とを共培養し，前記放線菌に新たな二次代謝産物を生産させる又は前記二次代謝産物の生産量を増大させる異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスター，放線菌とミコール酸含有微生物の組み合わせ及び二次代謝産物のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記放線菌がストレプトマイセス属（Streptomyces）であることを特徴とする請求項１に記載の異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスター，放線菌とミコール酸含有微生物の組み合わせ及び二次代謝産物のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記ストレプトマイセス属の放線菌がストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans）であることを特徴とする請求項２に記載の異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスター，放線菌とミコール酸含有微生物の組み合わせ及び二次代謝産物のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記ミコール酸含有微生物は，ツカムレラ（Tsukamurella) ，コリネバクテリウム
(Corynebacterium) 属，ロドコッカス(Rhodococcus) 属，ゴルドニア(Gordonia)属，ダイエットジア(Dietzia) 属，ノカルジア(Nocardia)属，及びマイコバクテリウム
(Mycobacterium) 属のいずれかに属する微生物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスター，放線菌とミコール酸含有微生物の組み合わせ及び二次代謝産物のスクリーニング方法。
【請求項５】
異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターを染色体ＤＮＡ中に組み込み又はプラスミドで保持した放線菌を作製し，次いで，作製した前記放線菌とミコール酸含有微生物とを共培養することにより，前記放線菌に培養液中に新たな二次代謝産物を生産させる又は前記二次代謝産物の生産量を増大させることを特徴とする二次代謝産物の製造方法。  
【請求項６】
前記放線菌がストレプトマイセス属（Streptomyces）であることを特徴とする請求項５に記載の二次代謝産物の製造方法。
【請求項７】
前記ストレプトマイセス属の放線菌がストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans）であることを特徴とする請求項６に記載の二次代謝産物の製造方法。
【請求項８】
前記ミコール酸含有微生物は，ツカムレラ（Tsukamurella) ，コリネバクテリウム
(Corynebacterium) 属，ロドコッカス(Rhodococcus) 属，ゴルドニア(Gordonia)属，ダイエットジア(Dietzia) 属，ノカルジア(Nocardia)属，及びマイコバクテリウム
(Mycobacterium) 属のいずれかに属する微生物であることを特徴とする請求項５〜７のいずれか１項に記載の二次代謝産物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は，放線菌とミコール酸含有微生物との共培養を用いた異種微生物由来の天然物である二次代謝産物のスクリーニング方法，及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物培養において，純粋培養は基本的技術とされている。抗生物質スクリーニングにおいても，純粋培養された菌株からこれまでに多くの有用物質が発見されている。医薬品をはじめ，天然物からの抗生物質スクリーニングには，純粋分離された菌株を使用するのが一般的である。
【０００３】
従来，放線菌は，多様な天然物即ち二次代謝産物を生産する微生物として知られており，これらの二次代謝産物の一部は，抗生物質をはじめとする医薬品，農薬，或いは生理活性物質として利用されている。放線菌をはじめとして原核微生物の二次代謝生合成遺伝子は，染色体上でクラスターをなしており，数百から数十キロ塩基にわたって染色体にコードされている。放線菌は，一菌株あたり，約３０の二次代謝生合成遺伝子クラスターを有していることが最近のゲノム解析により明らかになっている。これまでにゲノム解析が終了したものにおいては，例えば，ストレプトマイセス・エバーミチリス(Streptomyces 
avermitilis)MA-4680 は３２種類，ストレプトマイセス・セリカラー(Streptomyces 
coelicolor A3(2)) は２５種類，ストレプトマイセス・グリセウス (Streptomyces
griseus) IFO13350は３４種類, 及びストレプトマイセス・ビンチャンエンシス
(Streptomyces bingchengensis) BCW-1 は２３種類の二次代謝生合成遺伝子クラスターが存在していることが報告されている。また，これらの二次代謝産物の内訳は, エス・エバーミチリスを例に取ると，ポリケチド化合物が１２種類，ペプチド化合物が８種類，テルペン化合物が６種類，及び色素，シデロフォア等が６種類となっている。
【０００４】
また，宿主ベクター系の確立した放線菌宿主を用いて，異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子発現系を構築することにより，生合成遺伝子の遺伝子組換えが容易になる利点もあるため，このような二次代謝生合成遺伝子全長の異種放線菌への移植による抗生物質の生産例がストレプトマイセス属（Streptomyces）を中心に多数報告されている（例えば，非特許文献１参照））。
【０００５】
また，本発明者は，純粋培養時にはほとんど生産しない，このような二次代謝産物を効率的に生産する培養法として，複合培養法を開発し，先に特許出願した（例えば，特許文献１及び特許文献２参照）。
【０００６】
また，複合培養法は，放線菌とミコール酸含有微生物とを混合して培養することにより二次代謝産物を放線菌に新たに生産させる又はその生産量を増大させるという天然物即ち二次代謝産物製造方法である。ミコール酸を含有する微生物と放線菌とを共培養すると，放線菌純粋培養時には確認できなかった二次代謝産物の生産が確認される。これは，ミコール酸を細胞表層に含有する微生物が放線菌の二次代謝生合成遺伝子クラスターの転写調節スイッチをオンにし，遺伝子発現を誘導させるためであり，このため二次代謝産物の新規生産や生産量の増大がおこる。これまでに調べられた９割以上の放線菌が複合培養することにより，二次代謝産物のパターンに変化が生じることが明らかになっている（例えば，特許文献１及び特許文献２及び非特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００９−２０７３８５
【特許文献２】特許第４３６５８４３号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】H. Onaka, S. Taniguchi, H.Ikeda, Y. Igarashi and T. Furumai,pTOYAM  Acos, pTYM18, and pTYM19, actinomycete-Escherichia coli integrating vectors for heterologous gene expression. The Journal of Antibiotics, 56: 950-956 (2003).
【非特許文献２】H. Onaka, Y. Mori, Y. Igarashi, T. Furumai, Mycolic acid- containing bacteria induce natural-product biosynthesis in Streptomyces species.Appl. Environ. Microbiol. 77(2): 406 (2011).
【非特許文献３】日本放線菌学会編，放線菌の分類と同定，P179-191日本学会事務センター。
【非特許文献４】H. Onaka, M. Nakaho, K. Hayashi, Y. Igarashi, T. Furumai, Cloning and characterization of the goadsporin biosynthetic gene cluster from Streptomyces sp. TP-A0584. Microbiology, 151: 3923-3933 (2005).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら，従来の純粋培養法では，１種あたり３０種類以上存在する二次代謝生合成遺伝子クラスターのうち生産が確認されている抗生物質は数種類であり，例えば，エス・グリセウスについては生産物が確認できているのは，４種類であり，8 割以上の二次代謝産物は生産が確認できていない。そこで，天然物即ち二次代謝産物の探索においては，残りの８割以上の二次代謝産物を効率的に生産させる手法が求められている。また、二次代謝生合成遺伝子全長の異種放線菌への移植による抗生物質の生産においては，しばしば異種放線菌内で移植した二次代謝生合成遺伝子が発現しなかったり，発現したとしても，その生産量が少ないことが多々ある。そのため，異種宿主内で効率的に二次代謝生合成遺伝子を発現させる工夫が求められている。
【００１０】
この発明の目的は，予め異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターを，放線菌の染色体ＤＮＡ中に組み込み又はプラスミドで保持させることにより，その放線菌を用いてミコール酸を含有する微生物と共培養して，放線菌の二次代謝能を活性化することにより，放線菌に予め組み込んでおいた異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子を発現誘導させ，新たな二次代謝産物を生産させる又はその生産量を増大させる異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスター，放線菌とミコール酸含有微生物の組み合わせ及び二次代謝産物のスクリーニング方法，及びその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この発明は，異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターを染色体ＤＮＡ中に組み込み又はプラスミドで保持した放線菌を作製し，次いで，作製した前記放線菌とミコール酸含有微生物とを共培養し，前記放線菌に新たな二次代謝産物を生産させる又は前記二次代謝産物の生産量を増大させる異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスター，放線菌とミコール酸含有微生物の組み合わせ及び二次代謝産物のスクリーニング方法に関する。
【００１２】
また，この発明は，異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターを染色体ＤＮＡ中に組み込み又はプラスミドで保持した放線菌を作製し，次いで，作製した前記放線菌とミコール酸含有微生物とを共培養することにより，前記放線菌に培養液中に新たな二次代謝産物を生産させる又は前記二次代謝産物の生産量を増大させることを特徴とする二次代謝産物の製造方法に関する。
【００１３】
この発明において，前記放線菌はストレプトマイセス属（Streptomyces）であることが好ましい。更に，前記ストレプトマイセス属の放線菌がストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans ）であることが好ましい。また，前記ミコール酸含有微生物は，ツカムレラ（Tsukamurella) ，コリネバクテリウム(Corynebacterium) 属，ロドコッカス(Rhodococcus) 属，ゴルドニア(Gordonia)属，ダイエットジア(Dietzia) 属，ノカルジア(Nocardia)属，及びマイコバクテリウム(Mycobacterium) 属のいずれかに属する微生物であることが好ましい。
【００１４】
この発明は，上記のように，純粋培養では発現しない遺伝子を発現させることが可能である複合培養法を異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターを染色体上に組み込んだ又はプラスミドで保持した放線菌に適用することにより，ゲノム解析により明らかにされた異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターを効率的に生産させることができるようにしたものである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ｐＴＯＹＡＭＡｃｏｓのプラスミドマップを示す図である。
【図２】レベッカマイシン生合成遺伝子クラスターをｐＴＯＹＡＭＡｃｏｓにクローニングして作製したｐＴＹＭｃｏｓ−ｒｅｂのプラスミドマップを示す図である。
【図３】スタウロスポリン生合成遺伝子クラスターをｐＴＯＹＡＭＡｃｏｓにクローニングして作製したｐＴＹＭｃｏｓ−ｓｔａ１０のプラスミドマップを示す図である。
【図４】ゴードスポリン生合成遺伝子クラスターをｐＴＯＹＡＭＡｃｏｓにクローニングして作製したｐＧＳＢｃ１のプラスミドマップを示す図である。
【図５】ｐＴＹＭｃｏｓ−ｒｅｂを染色体ＤＮＡ中に組み込んだエス・リビダンス(S.lividans)の純粋培養及び複合培養時のレベッカマイシン生産量を示すグラフである。
【図６】ｐＴＹＭｃｏｓ−ｓｔａ１０を染色体ＤＮＡ中に組み込んだエス・リビダンス(S.lividans)の純粋培養及び複合培養時のスタウロスポリン生産量を示すグラフである。
【図７】ｐＧＳＢｃ１を染色体ＤＮＡ中に組み込んだエス・リビダンス(S.lividans)の純粋培養及び複合培養時のゴードスポリン生産量を示すグラフである。
【図８】ｐＴＹＭｃｏｓ−ｓｔａ７を染色体ＤＮＡ中に組み込んだエス・リビダンス(S.lividans)の純粋培養及びツカムレラ・プルモニスとの複合培養時のそれぞれの培養液のブタノール抽出液を高速液体クロマトグラフィーによって分析したプロファイルである。
【図９】図８において複合培養時特異的に検出されたピークのＵＶスペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
この発明は，特許第４３６５８４３号及び特開２００９ー２０７３８５号公報に記載されている方法，即ち少なくとも１種のミコール酸を含有する微生物及び少なくとも１種の放線菌を同一の培養容器内にて共培養する方法において，予め異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターを放線菌の染色体上に組み込んだ又はプラスミドで保持させたものを作製し，次いで，その作製した放線菌とミコール酸含有微生物とを共培養して，その放線菌に新たな天然物即ち二次代謝産物を効率的に生産させる或いはその生産量を増大させる異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスター，放線菌とミコール酸含有微生物の組み合わせ及び二次代謝産物のスクリーニング方法，及びその製造方法に関するものである。
【００１７】
ところで，二次代謝生合成遺伝子は，ゲノム上でクラスターを構成しているので，生産が確認できない二次代謝産物の生合成遺伝子全長をクローニングすることが可能である。クローニングした遺伝子を別の放線菌へ形質転換することにより，異種微生物由来の生産が確認できない二次代謝生合成遺伝子クラスターを染色体上に組み込んだ，又はプラスミドで保持した放線菌を作製することができ，この結果，形質転換した放線菌を宿主として異種微生物由来の二次代謝生産を行わせることが可能である。
しかしながら，宿主を替えてもクローニングした遺伝子が宿主内で発現しなかったり，生産量が少ないことが多々ある。そのため，異種宿主内で効率的に二次代謝生合成遺伝子を発現させる工夫が求められている。
【００１８】
複合培養は，放線菌に属する微生物とミコール酸を細胞表層に含有する微生物とを共培養する培養法であり，複合培養を行うと放線菌の二次代謝パターンが純粋培養時に比べて変化し，新たな二次代謝産物の生産もしくは二次代謝産物の生産量が増大する。この現象，即ち，複合培養現象は，ミコール酸を細胞表層に含有する微生物が放線菌を外部より刺激し，放線菌がそれに応答して二次代謝生合成遺伝子クラスターの遺伝子発現を活性化することにより生じたものと考えられる。本願発明は，異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターを染色体上に組み込んだ又はプラスミドで保持した放線菌を用いて複合培養を行うことにより，外来二次代謝産物の新規生産や生産量を増大させる異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスター，放線菌とミコール酸含有微生物の組み合わせ及び二次代謝産物のスクリーニング方法，及びその製造方法である。
【００１９】
まず，本発明者は，それぞれ異なる放線菌由来のスタウロスポリン，レベッカマイシン，又はゴードスポリン生合成遺伝子クラスターをストレプトマイセス・リビダンスの染色体ＤＮＡ中にそれぞれ組み込み，異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターを染色体上に組み込んだ放線菌を参考例に示すとおりに作製した。
次いで，作製した放線菌をミコール酸を細胞表層に含有する微生物であるツカムレラ・プルモニス，ロドコッカス・エリスロポリス，又はコリネバクテリウム・グルタミカムと共にそれぞれ複合培養を行い，それぞれの培養液からスタウロスポリン，レベッカマイシン，ゴードスポリンを抽出し，その生産量を実施例１に示すように測定した。
その結果を，図５，図６，及び図７に示す。これらの図において，図５，図６，及び図７において，＋Ｔｐ，＋Ｃｇ，＋Ｒｅは，それぞれツカムレラ・プルモニス（Ｔｐ），コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｇ），及びロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｅ）と複合培養した際の生産量を示す。なお，培養条件は本文中実施例に示す。
【００２０】
その結果，図５に示すように，レベッカマイシン生合成遺伝子クラスターを染色体上に組み込んだエス・リビダンスは，純粋培養時には，１ｍｇ／Ｌの生産量であったのに対して，３種の微生物，ツカムレラ・プルモニス，ロドコッカス・エリスロポリス，又はコリネバクテリウム・グルタミカムと複合培養した時には，それぞれ，１４ｍｇ／Ｌ，１２ｍｇ／Ｌ，及び２８ｍｇ／Ｌと最大２８倍程度まで生産量を増大させることができた。
【００２１】
同様に，図６に示すように，スタウロスポリン生合成遺伝子クラスターを染色体上に組み込んだエス・リビダンスは，純粋培養時には，１９ｍｇ／Ｌの生産量であったのに対して，３種の微生物と複合培養した時には，それぞれ，７８ｍｇ／Ｌ，７０ｍｇ／Ｌ，及び１０３ｍｇ／Ｌと最大５倍程度まで生産量を増大させることができた。
【００２２】
また，図７に示すように，ゴードスポリン生合成遺伝子クラスターを染色体上に組み込んだエス・リビダンスは，純粋培養時には，３９ｍｇ／Ｌの生産量であったのに対して，２種の微生物と複合培養した時には，それぞれ，１４３ｍｇ／Ｌ，及び８２ｍｇ／Ｌと最大３．５倍程度まで生産量を増大させることができた。
以上の結果から，異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターを染色体上に組み込んだ放線菌において，複合培養によって，その生産量が増大することが示されるに至った。  
【００２３】
この発明による新たな二次代謝産物についての説明を記載すると，次のとおりである。新たな二次代謝産物は，ストレプトマイセス・エスピーＴＰ−Ａ０２７４（Streptomyces sp.TP-A0274）由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターをｐＴＹＭｃｏｓ−Ｓｔａ７を用いて染色体上に組み込んだ放線菌とミコール酸含有微生物であるツカムレラ・プルモニスとを複合培養することによって，実施例２に示すような高速液体クロマトグラフィーによる溶出位置と紫外線吸収波形により同定される新たな二次代謝産物の生産を確認した。その結果を，図８に示す。図８及び図９に示すように，ストレプトマイセス・エスピー
ＴＰ−Ａ０２７４（Streptomyces sp. TP-A0274 ）由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターをｐＴＹＭｃｏｓ−Ｓｔａ７を染色体上に組み込んだエス・リビダンスは，純粋培養時には検出できなかった１０分，１０．５分，１３分に溶出されるピークが高速液体クロマトグラフィーにより検出できた。
以上の結果から，異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターを染色体上に組み込んだ放線菌において，複合培養によって，放線菌に新たな二次代謝産物を生産させる又はその二次代謝産物の生産量を増大させることが示されるに至った。  
【００２４】
−天然物即ち二次代謝産物のスクリーニング方法−
この発明による異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスター，放線菌とミコール酸含有微生物の組み合わせ及び二次代謝産物のスクリーニング方法は，まず，異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターを染色体上に組み込んだ又はプラスミドで保持した放線菌を作製し，次いで，その作製した放線菌を用いて複合培養を行い，培養液中に二次代謝産物が含まれているかを確認することに特徴を有するものである。
二次代謝産物は，例えば，抗菌性抗生物質，制ガン性抗生物質，抗寄生虫物質，酵素阻害剤等になることができる。
異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターにおける，由来となる異種微生物は，組換え宿主内で発現可能な遺伝子を有する微生物であることが好ましい。特に，宿主が放線菌であるため，宿主内での遺伝子発現を考慮すると，放線菌であることが好ましい。  具体的には，二次代謝産物を生産する主な放線菌としては，アクチノマイセス
（Actinomyces ），ノカルディア（Nocardia），ロドコッカス（Rhodococcus ），ミクロモノスポラ（Micromonospora），アクチノプラネス（Actinoplanes），ダクチロスポランギウム（Dactylosporangium ），ノカルディオイデス（Nocardioides），シュードノカルディア（Pseudonocardia），アクチノビスポラ（Actinobispora ），アミコラトプシス
（Amycolatopsis ），サッカロモノスポラ（Saccharomonospora ），アクチノシネマ
（Actinosynnema ），アクチノキネオスポラ（Actinokineospora），ストレプトマイセス（Streptomyces），キタサトスポラ（Kitasatospora ），ストレプトスポランギウム
（Streptosporangium ），ミクロビスポラ（Microbispora），ミクロテトラスポラ
（Microtetraspora ），ノノムラエ（Nonomuraea），ノカルディオプシス（Nocardiopsis），アクチノマデュラ（Actinomadura），キネオコッカス（Kineococcus ），キネオスポリア（Kineosporia ），ルシバリエリア（Lechevarieria ），及びサーモビスポラ
（Thermobispora ）由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターであることが好ましい（非特許文献３参照）。
また，対象となる二次代謝生合成遺伝子クラスターは，宿主放線菌で発現可能であれば，ゲノム解析により新たに推定される未知の二次代謝生合成遺伝子クラスター，及び既知の二次代謝生合成遺伝子クラスター等のような二次代謝生合成遺伝子クラスターを用いることができる。その中で，好ましくは，ポリケチド化合物，ペプチド化合物，テルペン化合物，シキミ酸経路由来化合物，アルカロイド化合物，フラボノイド化合物等の生合成遺伝子クラスターを挙げることができる。
【００２５】
また，異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターを染色体上に組み込んだ又はプラスミドで保持した放線菌における宿主となる放線菌は，複合培養により二次代謝に変化が生じる放線菌であり，特に，特許第４３６５８４３号，及び特開２００９ー２０７３８５号公報に記載の天然物スクリーニング方法に使用されたストレプトマイセス属放線菌が好ましい。特に，ストレプトマイセス属放線菌の中では遺伝子操作系の確立している種である，例えば，エス・リビダンス，エス・セリカラー，又はエス・エバーミチリスなどが特に好ましい。
異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターを染色体上に組み込んだ又はプラスミドで保持した放線菌において，染色体上に組み込む又はプラスミドで保持する方法は，異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスター全長を組換え宿主で複製可能なコスミドベクター（例えば，非特許文献４に記載されているｐＴＯＹＡＭＡｃｏｓ）を用いて，定法に従ってクローニングし，定法（例えば，プロトプラスト法やプラスミド接合伝達法）に従って宿主放線菌に形質転換したものを用いることができる。
【００２６】
組換え宿主放線菌と共培養をする微生物は，特許第４３６５８４３号，特開２００９ー２０７３８５号公報，又は非特許文献２に記載されているミコール酸を含有する微生物ならば，どのような微生物を用いてもよい。ミコール酸を含有する細菌のうち，複合培養現象が確認されているものは，コリネバクテリウム(Corynebacterium) 属，ロドコッカス
(Rhodococcus) 属，ゴルドニア(Gordonia)属，ダイエットジア(Dietzia) 属，ノカルジア(Nocardia)属，ウィラムジア(Williamsia)属，マイコバクテリウム(Mycobacterium) 属，及びツカムレラ(Tsukamurella)属であるため，特に，これらのミコール酸を含有する微生物と複合培養することが好ましい。また，培養液中に二次代謝産物が含まれているかの確認は，二次代謝産物の種類に応じて，公知の方法を用いて行うことができる。例えば，公知の方法の一つとしては，培養液を有機溶媒抽出し，その抽出物をＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）によって測定することにより確認する方法が考えられる。
【００２７】
−天然物即ち二次代謝産物の製造方法−
この発明による二次代謝産物の製造方法は，異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターを染色体上に組み込んだ，又はプラスミドで保持した放線菌を作製し，次いで，その作製した放線菌とミコール酸含有微生物とを複合培養を行い，培養液中に産生される二次代謝産物を採取することを特徴とするものである。
ここで使用される異種微生物由来の二次代謝生合成遺伝子クラスターを染色体上に組み込んだ，又はプラスミドで保持した放線菌は，上記スクリーニング方法で二次代謝産物を生産することが確認された菌であることが適当である。
対象となる二次代謝生合成遺伝子クラスターも上記スクリーニング方法で宿主放線菌において遺伝子発現することが確認されたクラスターであることが適当である。
二次代謝産物の培養方法，及びその条件も，上記スクリーニング方法で説明したものと同様であるが，所望するターゲットの二次代謝産物の生産量が多くなるように最適化して行われることが好ましい。二次代謝産物の培養方法では，所定量の二次代謝産物が生産され，培養液に蓄積された時点で終了し，培養液から二次代謝産物を採取する。二次代謝産物の採取方法は，二次代謝産物の種類に応じて，公知の方法から適宜選択して行うことができる。
【００２８】
−培養物−
この培養物は，異種微生物由来二次代謝生合成遺伝子クラスターを染色体上に組み込んだ，又はプラスミドで保持した放線菌を作製した放線菌を用いて複合培養を行い，培養液中に産生される二次代謝産物も含有するものである。この培養物は，この発明の製造方法において，所定量の二次代謝産物が産生され，培養液に蓄積された時点で，培養を終了して得られる培養液であることができる。又は，この培養液を更に加工や処理を施して，二次代謝産物含有物として利用することができる。
【００２９】
次に，この発明を，実施例により更に詳細に説明をすると，次に記載する事項を参考にすることができる。
( 参考例) 
ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans) への異種放線菌由来の抗生物質生合成遺伝子クラスターの導入
１．レベッカマイシン生合成遺伝子クラスターを含むシャトルベクターの作製
１−１：材料・試薬
ｐＴＯＹＡＭＡｃｏｓ (大腸菌・放線菌シャトルコスミドベクター）
レチェバリエリア・アエロコロニジェン(Lechevalieria aerocolonigenes ATCC39243) の染色体ＤＮＡ
１−２：プラスミドの作製
レベッカマイシン生産菌であるレチェバリエリア・アエロコロニジェン(Lechevalieriaaerocolonigenes ATCC39243)の染色体をＳａｕ３ＡＩにて部分消化し，
ｐＴＯＹＡＭＡｃｏｓのマルチクローニングサイト内のＢａｍＨＩへ挿入し，染色体コスミドライブラリーを作製した（図１) 。Ｎｇｔ (N-glycosyltransferase)遺伝子をプローブとし定法に従ってコロニーハイブリダイゼーションを行い，レベッカマイシン生合成遺伝子クラスターを取得し，ｐＴＹＭｃｏｓ−ｒｅｂをクローニングした（図２，ＤＤＢＪＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０７１４０５）。
２．スタウロスポリン生合成遺伝子クラスターを含むシャトルベクターの作製
２−１：材料・試薬
ｐＴＯＹＡＭＡｃｏｓ
ストレプトマイセス・エスピーＴＰ−Ａ０２７４(Streptomyces sp. TP-A0274) の染色体ＤＮＡ
２−２：プラスミドの作製
スタウロスポリン生産菌である  ストレプトマイセス・エスピーＴＰ−Ａ０２７４
(Streptomyces sp. TP-A0274) を前述のとおり部分消化し，コスミドライブラリーを作製した。ｒｅｂＤ遺伝子をプローブとし，定法に従ってコロニーハイブリダイゼーションを行い，スタウロスポリン生合成遺伝子クラスター全長（図３）を含むｐＴＹＭｃｏｓ−
Ｓｔａ１０及び未知の二次代謝生合成遺伝子クラスターを含むｐＴＹＭｃｏｓ−Ｓｔａ７をクローニングした（図３，ＤＤＢＪ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ
ＡＢ０７１４０６）。
３．ゴードスポリン生合成遺伝子を含むシャトルベクターの作製
３−１：材料・試薬
ｐＴＯＹＡＭＡｃｏｓ
ストレプトマイセス・エスピーＴＰ−Ａ０５８４(Streptomyces sp. TP-A0584) の染色体ＤＮＡ
３−２：プラスミドの作製
ゴードスポリン生産菌であるストレプトマイセス・エスピーＴＰ−Ａ０５８４
(Streptomyces sp. TP-A0584) の染色体をＳａｕ３ＡＩにて部分消化し，図１に示す
ｐＴＯＹＡＭＡｃｏｓのマルチクローニングサイト内のＢａｍＨＩへ挿入し，染色体コスミドライブラリーを作製した。ｇｏｄＡ遺伝子をプローブとして，定法に従ってコロニーハイブリダイゼーションを行い，ゴードスポリン生合成遺伝子クラスターをを含む
ｐＧＳＢｃ１を構築した（図４，ＤＤＢＪ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  
ＡＢ０２５０１２，非特許文献４参照）。
４. 遺伝子導入
構築したプラスミドｐＴＹＭｃｏｓ−ｒｅｂ，ｐＴＹＭｃｏｓ−Ｓｔａ１０，
ｐＴＹＭｃｏｓ−Ｓｔａ７，ｐＧＳＢｃｌを，プラスミド接合伝達性大腸菌エッシェリキアコリＳ１７−１を用いてストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans) の染色体上に組み込ませ，形質転換体を取得した（大腸菌の形質転換，放線菌への接合伝達法については従来公知の方法でよい）。
【実施例１】
【００３０】
５. 異種放線菌由来の抗生物質生合成クラスター遺伝子による形質転換体を用いた複合誘導による抗生物質生産の増大
異種放線菌由来の抗生物質生合成クラスター遺伝子を形質転換したストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans) をＶ−２２液体培地で３０℃２日間振とう培養した。  ツカムレラ・プルモニス（Tsukamurella pulmonis ），ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）を培養した場合は，Ｖ−２２液体培地（０．１％澱粉，０．５％グルコース，０．３％ＮＺ−ｃａｓｅ，０．２％酵母抽出物，０．５％トリペプトン，０．３％Ｋ2 ＨＰＯ4 ，０．５％ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ，０．３％ＣａＣＯ3 ，ｐＨ７．０）で３０℃，それぞれ２日間，一方，コリネバクテリウム・グルタミカム
（Corynebacterium glutamicum）を培養した場合は，Ｖ−２２液体培地で３０℃，1 日間振とう培養した。
Ａ−３Ｍ培地（０．５％グルコース，２．０％グリセロール，２．０％澱粉，１．５％ファーマメディア，０．３％酵母抽出物，１．０％ＨＰ−２０，ｐＨ７．０）に形質転換ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans) を３％，ツカムレラ・プルモニス（Tsukamurella pulmonis ），ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus 
erythropolis），又はコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）はそれぞれ１％植菌し，７日間３０℃で振とう培養した。
培養液を等量のブタノールで抽出し，ブタノール層をロータリーエバポレータにて濃縮後，ジメチルスルホキシドにて溶解し，高速液体クロマトグラフィーにて解析を行った。その際，クロマトグラムのそれぞれの生産物ピーク面積を標品と比較して定量を行った。用いた評品はスタウロスポリン，レベッカマイシン，及び／又はゴードスポリンである。スタウロスポリン，レベッカマイシンは，ジメチルスルホキシドで１０ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解し，ＨＰＬＣにインジェクトした。スタウロスポリン，レベッカマイシンは市販品を使用した。
ゴードスポリンは，非特許文献４に示す方法で精製した評品を，２５ｍｇ／ｍｌの濃度にジメチルスルホキシドで溶解し，ＨＰＬＣにインジェクトした。
【００３１】
ＨＰＬＣ（ＨＰ１１００，Agilent ）は，Ｃ１８Reininカラム（Φ４．６×１００ｍｍ）を使用し，カラム温度３０℃，移動相には０．１％Ｈ3 ＰＯ4 バッファー（ｐＨ３. ５) およびアセトニトリルを用い，流速１．２ｍｌ／ｍｉｎで溶出した。溶出は0 から３分まで１５％，３分から６分まで４０％までの勾配，６分から１２分まで４０％，１２分から１９分まで５５％までの勾配，１９分から２２分まで８５％の勾配になるようにアセトニトリル濃度を調整して行った。スタウロスポリン及びレベッカマイシンの存在は２９０ｎｍのＵＶ吸収で検出し，ゴードスポリンの存在は２３０ｎｍのＵＶ吸収で検出した。
【００３２】
高速液体クロマトグラフィー解析の結果，レベッカマイシン生合成遺伝子クラスターを組み込んだエスリビダンスは純粋培養時には１ｍｇ／Ｌの生産量であったのに対して，ツカムレラ・プルモニス（Tsukamurella pulmonis ），ロドコッカス・エリスロポリス
（Rhodococcus erythropolis）もしくはコリネバクテリウム・グルタミカム
（Corynebacterium glutamicum）と複合培養した時はそれぞれ，１４ｍｇ／Ｌ，
１２ｍｇ／Ｌ，２８ｍｇ／Ｌと最大２８倍程度まで生産量が増大した。
【００３３】
スタウロスポリン生産においてはスタウロスポリン生合成遺伝子クラスター
ｐＴＹＭｃｏｓ−Ｓｔａ１０を組み込んだエスリビダンスは純粋培養時には１９ｍｇ／Ｌの生産量であったのに対して，ツカムレラ・プルモニス（Tsukamurella pulmonis ），ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis），又はコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）と複合培養した時はそれぞれ，７８ｍｇ／Ｌ，７０ｍｇ／Ｌ，１０３ｍｇ／Ｌと最大５倍程度まで生産量が増大した。
【００３４】
ゴードスポリン生産においてはゴードスポリン生合成遺伝子クラスターを組み込んだエスリビダンスは純粋培養時には３９ｍｇ／Ｌの生産量であったのに対して，ツカムレラ・プルモニス（Tsukamurella pulmonis ）もしくはロドコッカス・エリスロポリス
（Rhodococcus erythropolis）と複合培養した時はそれぞれ，１４３ｍｇ／Ｌ，８２ｍｇ／Ｌと最大３．５倍程度まで生産量が増大した。
【実施例２】
【００３５】
１. 異種放線菌由来の抗生物質生合成クラスター遺伝子による形質転換体を用いた複合誘導による新たな二次代謝産物の生産
異種放線菌由来の抗生物質生合成クラスター遺伝子ｐＴＹＭｃｏｓ−Ｓｔａ７を形質転換したストレプトマイセス・リビダンスをＶ−２２液体培地で３０℃で２日間振とう培養した。
ツカムレラ・プルモニスは，Ｖ−２２液体培地で３０℃で，それぞれ２日間振とう培養した。
Ａ−３Ｍ培地に形質転換ストレプトマイセス・リビダンスを３％，ツカムレラ・プルモニスを１％植菌し，７日間にわたって３０℃で振とう培養した。
培養液を等量のブタノールで抽出し，ブタノール層をロータリーエバポレータにて濃縮後，ジメチルスルホキシドにて溶解し，高速液体クロマトグラフィーにて解析を行った。その際，クロマトグラムのそれぞれの生産物ピークを形質転換ストレプトマイセス・リビダンスの純粋培養時のピークと比較して定量を行った。
【００３６】
ＨＰＬＣ（ＨＰ１１００，Agilent ）は，Ｃ１８Reininカラム（Φ４．６×１００ｍｍ）を使用し，カラム温度３０℃，移動相には０．１％Ｈ3 ＰＯ4 バッファー（ｐＨ３. ５) およびアセトニトリルを用い，流速１．２ｍｌ／ｍｉｎで溶出した。溶出は，０分から３分まで１５％，３分から６分まで４０％までの勾配，６分から１２分まで４０％，１２分から１９分まで５５％までの勾配，及び１９分から２２分まで８５％の勾配になるように，アセトニトリル濃度を調整して行った。二次代謝産物の存在は２９０ｎｍのＵＶ吸収で検出した。
【００３７】
高速液体クロマトグラフィー解析の結果，図８に示すように，ｐＴＹＭｃｏｓ−
Ｓｔａ７を組み込んだエス・リビダンスとツカムレラ・プルモニスと複合培養した時には１０分，１０．５分，１３分にｐＴＹＭｃｏｓ−Ｓｔａ７を組み込んだエス・リビダンスのみの純粋培養時には検出できなかったピークが検出できた。また，１０分，１０．５分，１３分のピークに該当するＵＶスペクトルは図９に示してある。以上の３つのピークはＵＶ吸収スペクトルよりｐＴＹＭｃｏｓ−Ｓｔａ７を組み込んだエス・リビダンスとツカムレラ・プルモニスとを共培養した時にのみ新たに生産が確認できる二次代謝産物である。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
この発明は，抗生物質等の生理活性物質のスクリーニング，及びその製造方法に用いて有用であり，また，それらで得られる培養物を有効に利用することができる。
【図１】
0005893275.tif 000002
【図２】
0005893275.tif 000003
【図３】
0005893275.tif 000004
【図４】
0005893275.tif 000005
【図５】
0005893275.tif 000006
【図６】
0005893275.tif 000007
【図７】
0005893275.tif 000008
【図８】
0005893275.tif 000009
【図９】
0005893275.tif 000010