(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原および／または生理活性分子を抗原提示細胞に送達する系において使用するための組成物であって、
−  集合するＡＳＣ蛋白質により形成される、少なくとも１つのＡＳＣスペック担体を含み;
−  抗原および／または生理活性分子である、少なくとも１つのペプチド／蛋白質が該ＡＳＣスペック担体により輸送されることを特徴とする、
組成物。
【請求項２】
該抗原が、生体内に入る際に抗体産生を刺激し得る、ペプチド、蛋白質およびペプチド模倣性の糖からなる群の少なくとも１つであるかまたは、前述の群の少なくとも２つ以上の混合物であることを特徴とする、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
該生理活性分子が薬物、酵素、増殖因子、ホルモン、受容体、受容体リガンド、アジュバントおよび抗体からなる群の少なくとも１つであるかまたは前述の群の少なくとも２つの混合物であることを特徴とする、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
該ＡＳＣスペック担体が、少なくとも１種類の抗原および／または少なくとも１種類の生理活性分子を輸送することにより特徴づけられる、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
該ＡＳＣスペック担体が、抗原および／または生理活性分子であるペプチド／蛋白質を、酸性条件下にて放出することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
該ＡＳＣスペック担体が、加水分解または酵素により生体分解性であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。 
【請求項７】
該抗原および／または生理活性分子が、ＡＳＣスペック担体を形成する少なくとも１つのＡＳＣ蛋白質との融合蛋白質として存在し、該ＡＳＣスペック担体により融合蛋白質として輸送されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
該抗原および／または生理活性分子がＡＳＣ蛋白質との融合蛋白質として存在し、ＡＳＣ蛋白質のＮ末端、Ｃ末端に融合しているかまたはＡＳＣ蛋白質の内部にある状態で融合していることを特徴とする、請求項７記載の組成物。
【請求項９】
該抗原および／または生理活性分子がＡＳＣスペック担体中で輸送されることを特徴とする、請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
該抗原および／または生理活性分子が、ＡＳＣスペック担体を形成するＡＳＣ蛋白質と疎水性の相互作用を形成することにより、ＡＳＣスペック担体に輸送されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
該抗原および／または生理活性分子が、少なくとも１３アミノ酸の長さである、少なくとも１種類のペプチド／蛋白質を含むことを特徴とする、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
該抗原および／または生理活性分子が、疎水性である少なくとも１種のペプチド／蛋白質を含むことを特徴とする、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
該抗原および／または生理活性分子が、ＡＳＣスペック担体の外殻をコートすることにより輸送されることを特徴とする、請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
該抗原および／または生理活性分子が少なくとも１種のペプチド／蛋白質を含むことを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
以下の工程:
−  集合するＡＳＣ蛋白質により少なくとも１つのＡＳＣスペック担体を形成すること;
−  抗原および／または生理活性分子である少なくとも１つのペプチド／蛋白質をＡＳＣスペック担体に負荷すること; 
−  ＡＳＣスペック担体とＡＳＣスペック担体に負荷された抗原および／または生理活性分子である、少なくとも１つのペプチド／蛋白質を含む組成物を得ること
を特徴とする、請求項１〜１４のいずれかに記載の組成物の製造方法。
【請求項１６】
抗原および／または生理活性分子である少なくとも１つのペプチド／蛋白質をＡＳＣスペック担体に負荷する工程において、抗原および／または生理活性分子であるペプチド／蛋白質が融合蛋白質として、ＡＳＣスペック担体を形成するＡＳＣ蛋白質に負荷されることを特徴とする、請求項１５記載の、組成物の製造方法。
【請求項１７】
組成物を得る工程において、ＡＳＣスペック担体と、抗原および／または生理活性分子である、少なくとも１つのペプチド／蛋白質を含む組成物を細胞培養中で合成し、細胞培養から精製することを特徴とする、請求項１５または１６記載の、組成物の製造方法。
【請求項１８】
炎症誘発性の刺激で細胞を刺激することにより、細胞培養中で該組成物を合成することを特徴とする、請求項１７記載の、組成物の製造方法。
【請求項１９】
ＡＳＣ蛋白質をコードするＤＮＡ配列を少なくとも１つ含むプラスミドを細胞培養中で過剰発現させることによる、刺激を与えずに該組成物を細胞培養中で合成することを特徴とする、請求項１７記載の、組成物の製造方法。
【請求項２０】
組成物を得る工程において、ＡＳＣスペック担体を形成するＡＳＣ蛋白質と、抗原および／または生理活性分子である、ペプチド／蛋白質とを含む、精製した融合蛋白質を用いて組成物を合成することを特徴とする、請求項１５または１６記載の、組成物の製造方法。
【請求項２１】
組成物を得る工程において、ＡＳＣスペック担体を形成するＡＳＣ蛋白質と、抗原および／または生理活性分子であるペプチド／蛋白質とを含む融合蛋白質を、低張溶液中で３７℃にてインキュベーションすることにより、試験管内で組成物を合成することを特徴とする、請求項２０記載の、組成物の製造方法。
【請求項２２】
抗原および／または生理活性分子であるペプチド／蛋白質を少なくとも１つＡＳＣスペック担体に負荷する工程において、抗原および／または生理活性分子であるペプチド／蛋白質が、疎水性の相互作用によりＡＳＣスペック担体に負荷されることを特徴とする、請求項１５記載の、組成物の製造方法。
【請求項２３】
抗原および／または生理活性分子である少なくとも１つのペプチド／蛋白質をＡＳＣスペック担体に負荷する工程において、疎水性の相互作用によりＡＳＣスペック担体に負荷された抗原および／または生理活性分子であるペプチド／蛋白質の配列が、少なくとも１３アミノ酸の長さであり、疎水性である少なくとも１種のペプチド／蛋白質を含むことを特徴とする、請求項２２記載の、組成物の製造方法。
【請求項２４】
該組成物を得る工程において、ＡＳＣスペック担体と、疎水性の相互作用によりＡＳＣスペック担体に負荷された、抗原および／または生理活性分子である少なくとも１つのペプチド／蛋白質とを含む組成物を、細胞培養中で合成し、細胞培養から精製することを特徴とする、請求項２３記載の、組成物の製造方法。
【請求項２５】
炎症誘発性刺激による細胞の刺激により、細胞培養中で該組成物を合成することを特徴とする、請求項２４記載の、組成物の製造方法。
【請求項２６】
ＡＳＣ蛋白質をコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列を含むプラスミドの細胞培養中での過剰発現により、刺激を与えずに、該組成物を細胞培養中で合成することを特徴とする、請求項２４記載の、組成物の製造方法。
【請求項２７】
該組成物を得る工程において、ＡＳＣスペック担体を形成する、精製したＡＳＣ蛋白質と、抗原および／または生理活性分子である精製したペプチド／蛋白質を用いて組成物を合成することを特徴とする、請求項２３記載の、組成物の製造方法。
【請求項２８】
組成物を得る工程において、試験管内で、ＡＳＣスペック担体を形成するＡＳＣ蛋白質と、抗原および／または生理活性分子であるペプチド／蛋白質を、低張性の溶液中で、３７℃にてインキュベーションして混合することにより該組成物を合成することを特徴とする、請求項２７記載の、組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原および／または生理活性分子を送達するための、新規の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
伝統的には、ワクチンは、不活化したまたは弱毒性の病原に対して生体が抗体を産生する原理に基づく。近年、バイオセイフティーを高めるために、病原体全体そのものを注射するよりも、特に病原体の構成要素を注射することに基づくサブユニットワクチンの開発についての研究がなされている。サブユニットワクチンは、病原体が天然でコードするペプチドまたは蛋白質中の抗原を含む。これらのペプチドおよび蛋白質の、抗原提示細胞（ＡＰＣ：antigen presenting cell）による貪食を促進するために、ナノメートルまたはマイクロメートルサイズの粒子に抗原を負荷(load)する。これらの種類のワクチンは、粒子ワクチンとよばれる (De Temmerman et al., 2011)。
【０００３】
現在、粒子ワクチンとして用いられる、多数の抗原送達方法についての研究が行われている。この目的のために、懸濁剤、リポソーム、免疫刺激性複合体、ウイルス様粒子、金、シリカ粒子およびポリマーベースの粒子が用いられている。ポリマーベースの粒子は、生分解性の化合物、例えばポリ(Ｄ,Ｌ−乳酸) (ＰＬＡ)およびポリ(Ｄ,Ｌ,乳酸−グリコール酸) (ＰＬＧＡ) または非生分解性の化合物、例えばポリスチレンのいずれかに基づいていてよい。他のポリマーベースの抗原送達方法としては、逐次積層カプセル(Layer-by-layer capsules)、キトサン粒子、マイクロゲルおよびナノゲルが挙げられる。
【０００４】
上述の方法全てに共通することは、ＡＰＣによる貪食を促進するために、抗原のサイズを大きくすることである(Xiang et al., 2006)。粒子ワクチンの別の性質は、貪食後に、抗原がその環境にある時間を長くし、それによりＡＰＣのこれらの抗原のＴ細胞への提示能を強化するために、酵素による、細胞外もしくは細胞内の抗原の分解を遅延化することである。
【０００５】
抗原送達に用いられている方法と類似の方法が、薬剤の徐放システムにおいても用いられている。経口または経鼻経路を介した微粒子性の薬剤放出系が適用されている。ポリマーベースの微粒子からの増殖因子の徐放について、数多くの研究が行われている(Balmayor et al., 2011)。
【０００６】
ＡＰＣによる抗原の効率的な貪食は、抗体産生のプロセスにおいて最も重要なものである。これを達成するために、短いペプチド抗原(ハプテン) が、大きい担体蛋白質に架橋されている。この目的に最も頻繁に用いられている担体蛋白質は、カサガイのヘモシアニン (ＫＬＨ) およびウシ血清アルブミン(ＢＳＡ) 蛋白質である。最も好ましい担体蛋白質であるＫＬＨは、ダイオウテンガイガイ(Megathura crenulata)より単離される、分子量350 kDaの蛋白質である。この蛋白質は、凝集する傾向がある。ＫＬＨの可溶型および凝集型はいずれも、抗原性の性質を示す。サイズが大きいため、ＫＬＨ蛋白質の細菌における発現およびハプテンとＫＬＨコード配列の、分子クローニング法による融合は、実際的ではない。
【０００７】
上述の抗原および／または薬剤送達系のうち、リポソームおよびハイドロゲルは比較的速く分解する。さらに、リポソームは、お互いに融合する傾向も見られる。したがって、リポソームおよびハイドロゲルはともに、保存期間が短い。
【０００８】
ポリマーベースの微粒子の合成に用いる方法(有機溶媒、高温および凍結融解サイクル) は、負荷量の抗原または生理活性分子の構造または活性に損傷を与える可能性がある。
【０００９】
一般的に、サブユニットワクチンは、病原体全体のワクチンに比べて、抗体産生量が低い。この課題を克服するために、様々な方法が開発されている。第一の方法は、ＡＰＣ膜と融合する傾向のある分子（抗体、受容体リガンド）で微粒子をコートすることである。この方法により、ＡＰＣによる微粒子の貪食頻度が上昇する。別の方法は、微粒子を、ＡＰＣの抗原提示能を強化する特定のＡＰＣ受容体を標的とする分子（アジュバント）でコートすることである。Toll様受容体(ＴＬＲ) ファミリー膜は、リガンドが結合すると刺激され、細胞の抗原提示能を促進する経路が活性化される。ＴＬＲファミリー膜を刺激するために、微粒子をＣｐＧ、ポリ(Ｉ:Ｃ)、ＭＰＬ、３Ｍ-０１９およびフラジェリンリガンドでコートする。
【００１０】
ＡＳＣ (Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD) (ＡＳＣ、ＰＹＣＡＲＤ、ＴＭＳ１)は、Ｎ末端にＰＹＤドメイン、およびＣ末端にＣＡＲＤドメインを持つ、ＮＬＲＰ３、ＮＬＲＣ４およびＡＩＭ２インフラマソーム複合体で機能する、22kDaのアダプター蛋白質である。ＡＳＣ蛋白質は、炎症およびピロトーシスシグナル伝達経路におけるカスパーゼ１の活性に機能する(Franchi et al., 2009)。該蛋白質は、インフラマソーム複合体の活性化において、核周囲の空間にてスペック構造 (ＡＳＣスペック) を形成する、細胞質蛋白質である(Miao et al., 2011)。
【００１１】
ピロトーシスによる細胞死の間、炎症性の刺激が到達すると、ＡＳＣ蛋白質は、ピロトソームと呼ばれる、直径数マイクロメートルの球状の超分子構造を形成する。ピロトソームは、多量体化したＡＳＣ二量体により形成されると考えられる (Fernandes-Alnemri et al., 2007)。
【００１２】
ＮＬＲＰ３インフラマソームは、また、ＡＳＣ蛋白質を含み、細胞外ＡＴＰ、膜損傷毒（ナイジェリシン）、リソソーム損傷、尿素一ナトリウム (monosodium urea (MSU))および紫外線のような刺激により引き起こされ得る。ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化は、マイクロメートルサイズのスペックまたはピロトソーム構造の合成を伴う。該スペック構造はまた、ＡＳＣ蛋白質の過剰発現時に、他の刺激を必要とせずに細胞内で合成し得る。ＡＳＣスペックは、精製組み換えＡＳＣ蛋白質を低浸透圧溶液中で３７℃にてインキュベーションすることにより、試験管内で合成し得る(Fernandes-Alnemri et al., 2007)。
【００１３】
国際特許文献である、国際公開第2009／014863号には、ＡＳＣ蛋白質およびピロトソームが、自己免疫疾患の診断および処置に用いられていることが記載されている。同発明によれば、ＡＳＣ二量体およびプロカスパーゼ−１を含むアポトーシスおよびピロトソーム構造は、マクロファージ細胞における早期の炎症応答の間に見られる。カスパーゼ−１の活性化は、ピロトソームの形成に依存する。炎症状態は、マクロファージ細胞からピロトソームを単離することにより診断する。
【００１４】
ＡＳＣ ＫＯマウスおよび野生型マウスの比較データから、MF59-アジュバント化インフルエンザワクチン接種の後、ＡＳＣ蛋白質は、抗原特異的なホルモン応答を引き起こすのに機能することが推測されている。しかし、抗原ペプチドをＡＳＣ蛋白質もしくはＡＳＣスペックに結合させることにより抗原送達を達成することについては何の示唆もされていない(Ellebedy et al., 2011)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開第2009014863号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】De Temmerman ML, Rejman J, Demeester J, Irvine DJ, Gander B, De Smedt SC. (2011) Particulate vaccines on the quest for optimal delivery and immune response. Drug Discov Today. 16(13-14):569-82.
【非特許文献２】Xiang SD, Scholzen A, Minigo G, David C, Apostolopoulos V, Mottram PL, Plebanski M. (2006) Pathogen recognition and development of particulate vaccines: Does size matter? Methods. 40(1):1-9.
【非特許文献３】Balmayor ER, Azevedo HS, Reis RL. (2011) Controlled delivery systems from pharmaceuticals to cells and genes. Pharm Res.  28(6):1241-58.
【非特許文献４】Franchi L, Eigenbrod T, Munoz-Planillo R, Nunez G. (2009) The inflammasome: a caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis. Nat Immunol. 10(3):241-7.
【非特許文献５】Miao EA, Rajan JV, Aderem A. (2011) Caspase-1-induced pyroptotic cell death. Immunol Rev. 243(1):206-14.
【非特許文献６】Fernandes-Alnemri T, Wu J, Yu JW, Datta P, Miller B, Jankowski W, Rosenberg S, Zhang J, Alnemri ES. (2007) The pyroptosome: a supramolecular assembly of ASC dimers mediating inflammatory cell death via caspase-1 activation. Cell Death Differ. 14(9):1590-604.
【非特許文献７】Ellebedy AH, Lupfer C, Ghoneim HE, DeBeauchamp J, Kanneganti TD, Webby RJ. (2011) Inflammasome-independent role of the apoptosis-associated speck-like protein containing CARD (ASC) in the adjuvant effect of MF59. Proc Natl Acad Sci U S A. 108(7):2927-32.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の目的は、ＡＳＣスペック担体に抗原および／または生理活性分子を負荷することを提供することである。
【００１８】
他の本発明の目的は、抗原および／または生理活性分子の抗原提示細胞 (ＡＰＣ)への送達において、ＡＳＣスペック担体を用いることを提供することである。
【００１９】
さらなる本発明の目的は、ＡＳＣスペック担体とともにエンドサイトーシスされたもしくは貪食された抗原が、細胞内の酵素により分解されるのを遅延化し、抗原が該環境に留まる時間を延長し、それによりＡＰＣのＴ細胞への抗原提示能を強化することである。
【００２０】
本発明の他の目的は、ＡＰＣによる貪食を促進するために、ＡＳＣスペック担体を介して抗原および／または生理活性分子のサイズを増大させることである。
【００２１】
本発明のさらなる他の目的は、ＡＳＣスペック担体により輸送される、抗原および／または生理活性分子の保存期間を延長させることである。
【００２２】
上記の本発明の目的を満たすために開発した、抗原送達方法を、以下に示す添付の図により例示する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】HEK 293 FT細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックの合成およびその精製。HEK 293 FT細胞に、ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣ 融合蛋白質をコードするプラスミドで遺伝子導入を行った。Ａ、Ｂ、Ｃ: ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックを合成するHEK 293 FT細胞。Ｓ: ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣ スペック(共焦点顕微鏡) Ｂ: 明視野顕微鏡による細胞像。Ｃ: 図１Ａと１Ｂを重ね合わせた像。その後、合成した ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックをHEK 293 FT細胞より精製した。Ｄ: 精製ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペック (共焦点顕微鏡)。Ｅ: 明視野顕微鏡によるスペック像。Ｆ: 図１Ｄと１Ｅを重ね合わせた像。
【図２】ｍＣｈｅｒｒｙ-ＦＧＦ２融合蛋白質のＥＧＦＰ-ＡＳＣスペックへの負荷。ｍＣｈｅｒｒｙ-ＦＧＦ２融合蛋白質およびＥＧＦＰ-ＡＳＣ融合蛋白質をコードするプラスミドを、HEK 293 FT細胞に遺伝子導入し、ｍＣｈｅｒｒｙ-ＦＧＦ２融合蛋白質のＥＧＦＰ-ＡＳＣスペックへの負荷を観察した。Ａ: ＥＧＦＰ-ＡＳＣ、Ｂ: ｍＣｈｅｒｒｙ-ＦＧＦ２、Ｃ: 明視野顕微鏡像。Ｄ: 図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃを重ね合わせた像。
【図３】ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックの外殻の、ＥＧＦＰ蛋白質に融合したペプチドによる、疎水性相互作用を介したコーティング。HEK 293 FT細胞を、ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣおよびＥＧＦＰ-Ｘをコードするプラスミドで共遺伝子導入した。Ｘは３Ａ、３Ｂ、３Ｃについては: 「ストップ」 (ＥＧＦＰ-ストップ、配列番号:２); ３Ｄ、３Ｅ、３Ｆについては: ペプチド１ (配列番号: ４); ３Ｇ、３Ｈ、３Ｉについては: ペプチド２ (配列番号: ８); ３Ｊ、３Ｋ、３Ｌについては: ペプチド３ (配列番号:９)である。３Ａ、３Ｄ、３Ｇ、３Ｊ: ＥＧＦＰ-Ｘ (Ｘはそれぞれ: 「ストップ」、ペプチド１、ペプチド２、ペプチド３)。３Ｂ、３Ｅ、３Ｈ、３Ｋ: ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣ。３Ｃ、３Ｆ、３Ｉ、３Ｌ: ＥＧＦＰ-Ｘ (Ｘはそれぞれ: 「ストップ」、ペプチド1、ペプチド２、ペプチド３)とｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣ蛋白質を重ね合わせた像。
【図４】ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックの外殻をコートするためには、疎水性ペプチドは、少なくとも１３アミノ酸の長さでなければならない。ＥＧＦＰ-Ｘをコードするプラスミドを、 HEK 293 FT細胞に共遺伝子導入した。Ｘは、４Ａ、４Ｂ、４Ｃについては: ペプチド1_19aa (配列番号:５); ４Ｄ、４Ｅ、４Ｆについては: ペプチド1_12aa (配列番号: ６); ４Ｇ、４Ｈ、４Ｉについては: ペプチド1_8aa (配列番号: ７)である。４Ａ、４Ｄ、４Ｇ: ＥＧＦＰ-Ｘ。４Ｂ、４Ｅ、４Ｈ: ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣ。４Ｃ、４Ｆ、４Ｉ: ＥＧＦＰ-Ｘ (Ｘはそれぞれ: ペプチド1_19aa、ペプチド1_12aa、ペプチド1_8aa)とｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣ蛋白質を重ね合わせた像。
【図５】ＥＧＦＰに融合したペプチドの疎水性親水性指標グラフ。横軸より下のカラムは、疎水性のアミノ酸を表し、横軸より上のカラムは親水性のアミノ酸を表す。５Ａ: ペプチド１ (配列番号: ４)、５Ｂ: ペプチド２ (配列番号:８)、５Ｃ: ペプチド３ (配列番号: ９)、５Ｄ: ペプチド1_19aa (配列番号: ５)、５Ｅ: ペプチド1_12aa (配列番号: ６)、５Ｆ: ペプチド1_8aa (配列番号: 7)。
【図６】THP-1細胞に貪食されたｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックの膜封入された状態および細胞内でのそのゆっくりとした分解。ＰＭＡ分化させた、マクロファージの特徴を示す、ＥＧＦＰ-ＡＳＣ安定発現THP-1細胞株を、精製したｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックとともに２時間インキュベーションした。非生理的環境における、大規模なタイムラプスイメージングの過程において、細胞は膜の統合性を失い、アポトーシスの特徴を示した。ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペック担体を含むファゴリソソーム小器官の膜構造はアポトーシスにより構造がほどけ、はっきりと観察できるようになった。さらに、ファゴリソソームの内部であり、ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックの外部である空間は、ｍＣｈｅｒｒｙシグナルに満たされていた (６Ｇ〜Ｌ: t=600秒〜t=1100秒)。これにより、ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックは細胞内で、ゆっくりとしたペースで分解されていることが示された。100秒間隔で、共焦点顕微鏡により細胞のイメージングを行った(６Ａ〜６Ｌ)。左: ＥＧＦＰ-ＡＳＣ。中央: ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣ。右: 明視野。
【図７】ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックを含むファゴリソソームからの管状小胞のくびれ切れ。PMA分化した、マクロファージの特徴を示すＥＧＦＰ-ＡＳＣ安定発現THP-1細胞株を、精製したｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックとともに２時間インキュベーションした。THP-1細胞に捕食された、ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックを含むファゴリソソームから管状の小胞がくびれ切れる瞬間を観察した。細胞を観察している間には、スペックは完全には分解されなかった。１０秒間隔で、共焦点顕微鏡にて細胞のイメージングを行った (７Ａ〜７Ｕ)。
【図８】ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックの長期間の３７℃でのインキュベーションに対する耐性。ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックをHEK 293 FT細胞中で合成して精製した。一定量のｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックを取り、精製の直後(８Ａ、８Ｂ) および３７℃で３０日間インキュベーションした後(８Ｃ、８Ｄ)に、共焦点顕微鏡にて試験した。ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣおよびＥＧＦＰ-ペプチド１ (ペプチド１、配列番号: ４)をコードするプラスミドをHEK 293 FT細胞に共遺伝子導入した。共遺伝子導入した細胞から精製した一定量のｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックを、精製の直後(８Ｅ〜８Ｇ)および３７℃で３０日間インキュベーションした後(８Ｈ〜８Ｊ)に、共焦点顕微鏡にて試験した。ＥＧＦＰ-ペプチド１がｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックの外殻をコートしており、長期間のインキュべーション後でもｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックに結合したままである様子が観察された。
【図９】ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックの、連続的な凍結融解サイクルに対する耐性。ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックをHEK 293 FT細胞中で合成して精製し、-８０℃〜+３７℃の凍結融解サイクルに繰り返し曝した。凍結融解した調製物から一定量を取り、共焦点顕微鏡によりカウントした。凍結融解サイクルを８回繰り返した後でも、ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックのカウント数に有意な変化は見られなかった。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
抗原および／または生理活性分子送達において、最も単純な形態で機能する組成物は;
−集合するＡＳＣ蛋白質により形成される、少なくとも１つのＡＳＣスペック担体、
−ＡＳＣスペック担体により輸送される、抗原および／または生理活性分子である、少なくとも１つのペプチド／蛋白質
を含む。
【００２５】
「ＰＹＣＡＲＤ （Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD）」および「ＡＳＣ」は、様々な種における、ＡＳＣ遺伝子のホモログの発現産物およびそのアイソフォームを意味する。この定義は、ヒト(配列番号: １)およびゼブラフィッシュ種(配列番号: １１)および他の生物におけるＡＳＣ蛋白質のホモログにも有効である。
【００２６】
ＡＳＣスペックを、上述するＡＳＣ蛋白質により形成されるマイクロサイズの核周囲の凝集体として定義する。これらの構造は、ＮＬＲＰ３、ＡＩＭ２およびＮＬＲＣ４蛋白質の刺激および／またはピロトーシスが引き起こされることによって合成し得る (Miao et al., 2011, Leemans et al., 2011, Gross et al., 2011)。しかし、ＡＳＣスペック構造は、ＡＳＣ蛋白質 (配列番号: １)の過剰発現により、他の刺激を必要とせずに合成し得る。本発明において、「ＡＳＣスペック担体」、「ＡＳＣスペック」および「スペック」という表現は、細胞培養中でＡＳＣ蛋白質(配列番号: １) から合成した、任意の種類の凝集体(内在性、安定もしくは一過性の遺伝子発現)または、細菌、真菌、バキュロウイルスなどの遺伝子発現系で産生された精製ＡＳＣ蛋白質 (配列番号: １)から試験管内で合成した凝集体を意味する。
【００２７】
本発明の組成物において、ＡＳＣスペック担体により輸送される少なくとも１つのペプチド／蛋白質である抗原、手短にいえば抗原は、生体内に入ると抗体産生を刺激する、ペプチド、蛋白質およびペプチド模倣性の糖からなる群の少なくとも１つであるか、またはこれらの群の少なくとも２つからなる混合物である。
【００２８】
生理活性分子は、生物体、組織もしくは細胞に治療効果を示す分子である。本発明の組成物において、ＡＳＣスペック担体により輸送される少なくとも１つのペプチド／蛋白質である生理活性分子、手短にいえば生理活性分子は、薬物、酵素、増殖因子、ホルモン、受容体、受容体リガンド、アジュバントおよび抗体からなる群の少なくとも１つ、またはこれらの群の少なくとも２つの混合物である。
【００２９】
本発明の好ましい態様において、組成物は少なくとも１つの種類の抗原および／または少なくとも１つの種類の生理活性分子を含む。
【００３０】
ＡＳＣスペック担体は、様々な方法で抗原および／または生理活性分子を輸送し得る。言い換えれば、抗原および／または生理活性分子は、様々な方法でＡＳＣスペック担体に負荷され得る。
【００３１】
本発明の好ましい態様において、抗原およびＡＳＣ蛋白質の両方をコードする融合ＤＮＡ配列を作製し、この融合ＤＮＡ配列が抗原およびＡＳＣ蛋白質の両方を含むＡＳＣ−抗原融合蛋白質をコードするように、抗原をコードするＤＮＡ配列とＡＳＣ蛋白質をコードするＤＮＡ配列を組み合わせる。
【００３２】
ＡＳＣ蛋白質は、２２kDaと比較的小さいサイズであるため、分子クローニングおよびそれに続く培養細胞または細菌中でのＡＳＣ−抗原融合蛋白質の発現はきわめて効率的である。
【００３３】
本発明の好ましい態様において、ＡＳＣスペック担体を形成する少なくとも１つのＡＳＣ蛋白質と抗原が、融合蛋白質として存在し、この方法で、本発明の組成物中で、該抗原は、ＡＳＣスペック担体とともに融合蛋白質として輸送される。
【００３４】
培養細胞からのＡＳＣスペックの精製およびその試験管内合成は、以前に記載されている (Fernandes-Alnemri et al., 2007)。本発明の組成物の精製および試験管内合成は、該文献に記載の方法にしたがって行った。
【００３５】
ＡＳＣスペック担体とＡＳＣスペック担体を形成するＡＳＣ蛋白質に融合する抗原を含む、本発明の組成物は、細胞培養中で合成し、細胞培養から精製する。
【００３６】
本発明の別の態様において、細菌（または他の遺伝子発現系）で産生したＡＳＣ-抗原融合蛋白質を精製し、ＡＳＣスペック担体とＡＳＣスペック担体を形成するＡＳＣ蛋白質に融合する抗原とを含む、本発明の組成物を試験管内で合成する。
【００３７】
ＡＳＣ蛋白質との融合蛋白質として存在する抗原は、ＡＳＣ蛋白質のＮ末端、Ｃ末端または内部に挿入してよい。本発明のこの態様において、抗原は、ＡＳＣスペック担体の中にある状態で輸送される。
【００３８】
本発明の他の好ましい態様において、抗原および／または生理活性分子は、ＡＳＣスペック担体またはＡＳＣスペック担体を形成するＡＳＣ蛋白質と疎水性の相互作用を形成することにより、ＡＳＣスペック担体に負荷され得る。
【００３９】
本発明の好ましい態様において、疎水性の相互作用によりＡＳＣスペック担体に負荷される抗原または生理活性分子である、ペプチドまたは蛋白質配列は、少なくとも１３アミノ酸の長さであり、疎水性である。該抗原または生理活性分子であるペプチドまたは蛋白質配列は、その疎水性の平均値が０を超えている場合は疎水性、疎水性の平均値が０より小さい場合は親水性と称される。
【００４０】
親水性の抗原または生理活性分子は、疎水性の相互作用のみでは、ＡＳＣスペック担体で輸送され得ない。親水性の抗原および／または生理活性分子は、少なくとも１３アミノ酸の長さであり、疎水性配列を有するペプチドとの融合蛋白質を作製することによって、疎水性の相互作用によりＡＳＣスペック担体に負荷され得る。
【００４１】
本発明の好ましい態様において、抗原および／または生理活性分子は、ＡＳＣスペック担体の表面または、換言すれば、外殻をコートする。
【００４２】
ＡＳＣスペック担体とＡＳＣスペック担体に疎水性の相互作用により負荷された少なくとも１つの抗原および／または生理活性分子を含む本発明の組成物は、細胞培養により合成し、細胞培養物から精製される。
【００４３】
本発明の他の態様において、細菌により産生した（または他の遺伝子発現系により産生した）、ＡＳＣスペック担体を形成するＡＳＣ蛋白質および抗原および／または生理活性分子を精製し;ＡＳＣスペック担体と疎水性の相互作用によりＡＳＣスペック担体に負荷された少なくとも１つの抗原および／または生理活性分子を含む本発明の組成物を、試験管内で合成する。
【００４４】
本発明の好ましい態様において、本組成物は、少なくとも１つの抗原および／または生理活性分子を、疎水性の相互作用によりＡＳＣスペック担体に負荷することにより形成し、これを疎水性相互作用介在組成物と称する。
【００４５】
本発明の他の好ましい態様において、本組成物は、少なくとも１つの抗原および／または生理活性分子と、ＡＳＣスペック担体を形成するＡＳＣ蛋白質との融合蛋白質を形成することにより形成し、これを融合組成物と称する。
【００４６】
本発明の他の好ましい態様において、本組成物は、融合組成物と疎水性の相互作用介在組成物の製造方法の両方により形成する。この組成物を、疎水性相互作用介在性融合組成物と称する。
【００４７】
本発明の組成物は、刺激を与えてまたは与えずに、細胞培養により合成し得る。該刺激は、炎症誘発性刺激(proinflammatory stimuli)により達成される。
【００４８】
本発明の組成物において、ＡＳＣ蛋白質(配列番号: １)をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドを、細胞培養中で如何なる刺激も加えずに過剰発現させることによってＡＳＣスペック担体を合成する。この方法により、ＡＳＣスペック担体およびＡＳＣスペック担体により輸送される抗原および／または生理活性分子は、刺激を与えなくても、細胞培養中に本発明の組成物を形成する。
【００４９】
本発明の他の好ましい態様において、本発明の組成物におけるＡＳＣスペック担体は、炎症誘発性の刺激により細胞を刺激することにより合成し得る。この方法により、ＡＳＣスペック担体およびＡＳＣスペック担体により輸送される抗原および／または生理活性分子は、刺激を伴う細胞培養により、本発明の組成物を形成する。該炎症誘発性刺激は、ＮＬＲＰ３、ＮＬＲＣ４またはＡＩＭ２インフラマソーム誘発刺激のいずれであってもよい。該ＮＬＲＰ３インフラマソームは、尿素一ナトリウム (monosodium urea (MSU))、尿酸、アスベスト、シリカ、水酸化アルミニウム、ＡＴＰ、細胞膜損傷物質、例えばナイジェリシン、ＵＶＢ、ヒアルロナン、アミロイド-β線維、ピロリン酸カルシウム脱水結晶により引き起こされ; ＮＬＲＣ４インフラマソームは、フラジェリンにより引き起こされ、ＡＩＭ２インフラマソームは、サイトゾルＤＮＡまたはＤＮＡ類似体 (ポリＡ:Ｔ)により引き起こされ得る (Franchi et al., 2009, Jin et al., 2010)。
【００５０】
本発明の他の態様において、本組成物は、試験管内で、低浸透圧中で合成される。ＡＳＣスペック担体を形成するＡＳＣ蛋白質 (配列番号:１)、抗原および／または生理活性分子を細菌、酵母、バキュロウイルス等の遺伝子発現系で発現させた後、精製する。該精製ＡＳＣ蛋白質と抗原および／または生理活性分子を、低浸透圧溶液(＜50mM KClの溶液) 中で、37℃にて共インキュベーションすることにより、本発明の組成物を形成する。
【００５１】
上述の抗原負荷の方法は、ヒトＡＳＣ蛋白質 (配列番号: １) および進化的に近縁の種におけるホモログならびに、ゼブラフィッシュのような進化的に離れている種におけるホモログ(ｚＡＳＣ、配列番号: １１)の負荷にも有効である。ｚＡＳＣ蛋白質により形成されるスペック構造が、以前報告されている(Masumoto et al., 2003)。
【００５２】
本発明の好ましい態様において、本組成物を、ヒトまたはヒトに進化的に近縁の生物に属する抗原に対するポリクローナル抗体の開発に用いることを意図する場合、進化的に遠い種のＡＳＣ蛋白質、例えばゼブラフィッシュのＡＳＣ蛋白質ホモログ(配列番号: １１)を用いるのが有利である。この方法により、抗体産生に用いるホスト生物がゼブラフィッシュのＡＳＣ蛋白質ホモログ(配列番号: １１)に対する抗体を産生しても、ヒトとゼブラフィッシュのＡＳＣ蛋白質は配列が大きく異なるので、これらの抗体がヒトＡＳＣ蛋白質(配列番号:１) を認識する可能性は低い。同様に、本組成物が、ゼブラフィッシュまたはその近縁に属する抗原に対するポリクローナル抗体の産生に用いることを意図する場合、遺伝的に遠いホモログ、例えばＡＳＣ蛋白質のヒトホモログ(配列番号: １)を用いるのが有利である。ヒト(配列番号: １) およびゼブラフィッシュ (配列番号: １１)の ＡＳＣ 蛋白質は、34.2 %の配列同一性のみを共有しており、連続して同一なのは５アミノ酸のみである。これらの類似性は、少なくとも１つまたは僅かの変異を配列に入れることによって低下させ得る。
【００５３】
本発明の組成物は、抗原および／または生理活性分子を、ＡＳＣスペック担体とともに抗原提示細胞 (ＡＰＣ)へ送達することを提供する。抗原提示細胞 (ＡＰＣ) はマクロファージ、樹状細胞およびＢ細胞である。
【００５４】
ＡＰＣは、本発明の組成物を、エンドサイトーシス／ファゴサイトーシスにより貪食する。貪食した組成物は、pH値が6〜6.5の、細胞膜由来のエンドソーム／ファゴソーム小胞（初期エンドソーム）に封入され、それによりエンドサイトーシス／ファゴサイトーシス経路に入る。該エンドサイトーシス／ファゴサイトーシス経路は、順番に、初期エンドソーム(pH=6〜6.5)、エンドリソソーム/ファゴリソソーム (pH=5〜6) およびリソソーム (pH=4.5〜5) ステージからなる。本組成物は、エンドリソソーム/ファゴリソソームおよびリソソームステージにおいて、加水分解酵素および酸性ｐＨ値により分解される。結果として、本組成物に含まれる任意の抗原は、１３〜１８アミノ酸の長さのオリゴペプチドに分解され、これらのペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に負荷され、複合体中で細胞膜へ送達される。ＴＨ細胞は、これらの抗原の一部とＭＨＣクラスＩＩの構造を認識し、相互作用する。
【００５５】
本発明の組成物とともに貪食された抗原は、エンドサイトーシス／ファゴサイトーシス経路によって、制御された方法で分解される。この方法において、本組成物は、比較的遅い抗原放出および分解を提供する。
【００５６】
エンドサイトーシス／ファゴサイトーシスを受けたＡＳＣスペックがファゴリソソーム小器官中にある間、該小器官から、管状の小胞がくびれ切れるのが明確に観察された。ファゴリソソーム中の、蛋白質の分解産物であるオリゴペプチドが、この種類の小胞中でＭＨＣクラスＩＩ分子に負荷されることは知られている。
【００５７】
理想のワクチンは、保存期間が長く、輸送の間または偶然により起こり得る凍結融解サイクルに耐性を示し、体温においてその統合性を長期間保持すると同時に、生分解性であるようにデザインされたものである。
【００５８】
本発明の組成物により、該組成物中の抗原および／または生理活性分子の、３７℃における安定性が上昇し、該抗原/生理活性分子は、組成物中で、この温度にて、少なくとも３０日間分解せずに耐性である。これにより、本発明の組成物は、生理的条件下における抗原の安定性を強化し、その保存期間を長くしている。
【００５９】
本発明の組成物を用いることによって、抗原は、少なくとも８回の凍結融解サイクルに分解せずに耐えることができる。それにより、本組成物は、輸送の間または偶然起こり得る凍結融解により抗原／生理活性分子が被る損傷を最小化することができる。
【００６０】
本発明の組成物では、抗原に有害なプロセス、例えば高温、有機溶媒の使用または凍結融解は除かれている。
【００６１】
ＡＳＣスペック担体と抗原を含む組成物に関する上述の記載は全て、ＡＳＣスペック担体と生理活性分子を含む組成物についても有効である。
【００６２】
本発明の抗原送達方法を用いた基本的な概念について、様々な適用を発展させてよく、本発明は、本明細書中に記載の実施例に限定されるものではなく、本発明は実質的に特許請求の範囲にて規定される。
【実施例】
【００６３】
特定の態様
実施例１
ＡＳＣスペック担体とＡＳＣスペック担体を形成するＡＳＣ蛋白質に融合したｍＣｈｅｒｒｙ蛋白質を含む組成物の、HEK 293 FT細胞における合成と、HEK 293 FT細胞培養からのその精製
ペプチドまたは蛋白質である抗原または生理活性分子をコードするＤＮＡ配列をクローニングして、ＡＳＣ蛋白質 (配列番号:１) コード配列を含むプラスミドに、融合蛋白質が形成されるように挿入した。該プラスミドは、ＳＶ４０複製起点を含むのが好ましい (例えばpcDNA3またはpEGFP-C3ベクター骨格)。ＡＳＣ−抗原（または生理活性分子）融合蛋白質を過剰発現させるために、このように作製したプラスミドを、選択した細胞株に遺伝子導入する。HEK 293 FT細胞株は、細胞中で、ＳＶ４０複製起点を含むプラスミドを高いコピー数で増幅させるため、本発明では、HEK 293 FT細胞株を用いた。
【００６４】
ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣ融合蛋白質をコードするpmCherry-C3.1-ASCプラスミドを、リン酸カルシウム法により、HEK 293 FT細胞に遺伝し導入した。1,000,000個の細胞を、遺伝子導入の前日に35mm細胞培養ディッシュに播いた。プラスミド1μgに、蒸留水を加えて219μlとし、2M CaCl2 31μlと混合した。2X HBS (280 mM NaCl、50 mM HEPES、1.5 mM Na2HPO4、pH= 7.05) 250μlを添加し、混合して、該混合物を室温にて１５分間インキュベーションした。該混合物を前日に播いたHEK 293 FT細胞に滴加した。あるいは、該遺伝子導入混合物を、細胞を播いた直後の、細胞が培養ディッシュに接着する前に添加してもよい。 
【００６５】
ＡＳＣ蛋白質をHEK 293 FT細胞に発現させた場合、ＡＳＣスペックは、刺激を与える必要がなく合成された。ＡＳＣスペック担体を形成するＡＳＣ蛋白質に融合した、ペプチドまたは蛋白質 (例えばｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣ) をHEK 293 FT細胞に過剰発現させた場合、それらは、刺激を与えなくても、ＡＳＣスペック担体とともに融合蛋白質として本発明の組成物を形成した(図１Ａ〜Ｃ)。
【００６６】
HEK 293 FT細胞中の、ＡＳＣスペック担体およびＡＳＣスペック担体を形成するＡＳＣ蛋白質に融合したｍＣｈｅｒｒｙ蛋白質からなる組成物を、共焦点顕微鏡像 (図１Ａ)、明視野顕微鏡像(図1Ｂ) および共焦点顕微鏡像および明視野顕微鏡像の重ね合わせ像 (図１Ｃ)により示す。
【００６７】
ＡＳＣスペックの細胞培養からの精製についての詳細な手法は、以前に記載されている(Fernandes-Alnemri et al., 2007)。本発明では、本発明の組成物の精製は、このプロトコルに基づいて行った。本組成物を含むHEK 293 FT細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むTriton X-100緩衝溶液(1% Triton X-100、150 mM NaCl, 2 mM EDTA、20 mM Tris-HCl、pH=7.5) に回収し、G22注射針に20回通した。得られた可溶化液を5000 rpmにて1分間遠心分離し、上清中の可溶化蛋白質を処分した。その後、該沈殿を1X PBS (137 mM NaCl、2.7 mM KCl、4.3 mM Na2HPO4、1.47 mM KH2PO4) 溶液に再懸濁した。該再懸濁沈殿を5 μmフィルターに通してもよい。
【００６８】
この工程の後に得られた、試験管内のＡＳＣスペック担体とＡＳＣスペック担体を形成するＡＳＣ蛋白質に融合したｍＣｈｅｒｒｙ蛋白質からなる組成物を、共焦点顕微鏡 (図１Ｄ)、明視野顕微鏡 (図１Ｅ) および共焦点顕微鏡像および明視野顕微鏡像の重ね合わせ(図１Ｆ)により示す。
【００６９】
細胞内および試験管内の両方で、ｍＣｈｅｒｒｙ蛋白質は、融合蛋白質として、ＡＳＣスペック担体中に存在していた (図１Ａ、１Ｄ)。
【００７０】
実施例2
ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣ融合蛋白質をコードする融合ＤＮＡ配列の合成
ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣ融合蛋白質をコードする、pmCherry-C3.1-ASCプラスミドをクローニングするために、ヒトＡＳＣ蛋白質をコードするＤＮＡ配列を、pcDNA3-ASCプラスミドをHindIII-EcoRI酵素で消化することにより得、同じ酵素で消化したpmCherry-C3.1ベクターのマルチクローニングサイトにライゲーションし、ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣ融合蛋白質コード配列を作製した。pcDNA3-ASCプラスミドは、Gabriel Nunez氏 (University of Michigan, Ann Arbor, USA)よりご供与頂いた。
【００７１】
pmCherry-C3.1プラスミドをクローニングするために、ｍＣｈｅｒｒｙ蛋白質のコード配列を、NheI_mCherry_F(gctagcaccatggtgtctaagggcgaaga) およびXhoI_mCherry_R(ctcgagtttcttgtacagctcgtccat)プライマーを用いて、pcDNA3 IFP 1.4プラスミドからＰＣＲにより増幅した。ＥＧＦＰ蛋白質のコード配列をNheI-XhoI酵素によって消化してpEGFP-C3プラスミドより除き、同じ酵素で消化したPCR産物をその部位にライゲーションした。pcDNA3 IFP 1.4はTsien Lab (University of California San Diego, San Diego, USA)よりご供与頂いた。
【００７２】
融合蛋白質は、実施例のｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣ融合蛋白質と同じように、好ましい抗原/生理活性分子のコード配列を、ＡＳＣ蛋白質 (配列番号: 1)のコード配列のＮ末端にクローニングするか、または該蛋白質コード配列のＣ末端または内部にクローニングすることにより作製し得る。
【００７３】
実施例3
抗原および／または生理活性分子のＡＳＣスペック担体への他の負荷方法
ＡＳＣスペック担体に負荷し得る生理活性分子の例として、ＡＳＣスペック担体に負荷したＦＧＦ２ (fibroblast growth factor 2、配列番号: 10)が挙げられる。該ＦＧＦ２蛋白質は、血管新生、胚発生および創傷治癒において機能することが知られている増殖因子である。
【００７４】
抗原または生理活性分子を、ＡＳＣ蛋白質 (配列番号: 1)との融合蛋白質を作製せずに、ＡＳＣスペックに負荷することが望ましい場合、抗原および／または生理活性分子をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドと、ＡＳＣ蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドを、好ましい細胞株に共遺伝子導入する。
【００７５】
例として、ｍＣｈｅｒｒｙ-ＦＧＦ２融合蛋白質をコードするプラスミドを、ＥＧＦＰ-ＡＳＣ融合蛋白質をコードするプラスミドと共遺伝子導入した。ｍＣｈｅｒｒｙ-ＦＧＦ２とＥＧＦＰ-ＡＳＣをコードするプラスミドそれぞれ1μgの混合物を、総体積219μlになるように蒸留水中に混合した。遺伝子導入手法の残りと、ＡＳＣスペック担体と抗原および／または生理活性分子とを含む本発明の組成物の精製は、実施例１と同様に行った。
【００７６】
HEK 293 FT細胞中の、ＡＳＣスペック担体、ＡＳＣスペック担体を形成するＡＳＣ蛋白質に融合したＥＧＦＰ蛋白質 (抗原) とＡＳＣスペック担体の外殻をコートする、ｍＣｈｅｒｒｙ-ＦＧＦ２蛋白質(生理活性分子) からなる本発明の組成物を、共焦点顕微鏡像 (図２Ａ〜Ｂ)、明視野顕微鏡像 (図２Ｃ)および共焦点顕微鏡像と明視野顕微鏡像の重ね合わせ像(図２Ｄ)より示す。
【００７７】
細胞中で、ｍＣｈｅｒｒｙ-ＦＧＦ２融合蛋白質からなる球形の殻が、ＥＧＦＰ-ＡＳＣ融合蛋白質からなるＡＳＣスペック担体の外殻をコートしていることが、共焦点顕微鏡(図２)により示される。この図および他の全ての図においてＥＰＦＰは緑、ｍＣｈｅｒｒｙは赤で示され、マージした像におけるこれらの蛋白質の重なりは、黄色で示される。
【００７８】
本発明の組成物は、様々な方法で、１種類以上のペプチドまたは蛋白質を含むことができる。本発明の組成物は、少なくとも１つのペプチド／蛋白質または少なくとも１種類のペプチド／蛋白質がＡＳＣスペック中にある場合、少なくとも１つのペプチド／蛋白質または、その外殻をコートする少なくとも１つのペプチド／蛋白質を輸送することができる。
【００７９】
ｍＣｈｅｒｒｙ (配列番号: 3)、ＥＧＦＰ (配列番号: 2)、ＡＳＣ蛋白質 (配列番号: 1) およびＦＧＦ２蛋白質 (配列番号: 10)からなるＡＰＣスペック間の相互作用は、これまでのところ報告されていない。
【００８０】
実施例4 
ｍＣｈｅｒｒｙ-ＦＧＦ２と、ＥＧＦＰ-ＡＳＣ融合蛋白質をコードする融合ＤＮＡ配列の作製
ｍＣｈｅｒｒｙ-ＦＧＦ２融合蛋白質をコードするpmCherry-C3-FGF2 (18kDaアイソフォーム)をクローニングするために、ＦＧＦ２遺伝子の18kDaのアイソフォームのｃＤＮＡを、HeLa細胞から単離したＲＮＡを用いて合成したｃＤＮＡライブラリーから、HindIII_Fgf2_F (ctataagcttatggcagccgggagcatcacc)およびEcoRI_Fgf2_R (atgaattcagctcttagcagacattggaag)のプライマーを用いて増幅した。HindIIIおよびEcoRI酵素で消化したＰＣＲ産物を、同じ酵素で消化したpmCherry-C3.1ベクターにライゲーションすることによりクローニングした。
【００８１】
ＥＧＦＰ-ＡＳＣ融合蛋白質をコードするpEGFP-C3-ASCプラスミドのクローニングのために、ヒトＡＳＣ蛋白質をコードするＤＮＡ配列を、HindIII-EcoRI酵素を用いてpcDNA3-ASCプラスミドを消化して切り出し、このＤＮＡ配列を同じ酵素で消化したEGFP-C3ベクターのマルチクローニングサイトにライゲーションすることにより、ＥＧＦＰ-ＡＳＣ融合蛋白質のコード配列を作製した。pEGFP-C3ベクターは、Clontechより購入した。
【００８２】
実施例5
ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックの外殻の、ＥＧＦＰに融合したペプチドによる、疎水性相互作用を介したコーティング
抗原および／または生理活性分子が、実施例３に示すように、ＡＳＣスペック担体の外殻をコーティングすることができない場合、疎水性の構造に結合させなければならない。 
【００８３】
例えば、親水性のＥＧＦＰ蛋白質 (ＥＧＦＰ-ストップ、配列番号: 2) をコードするプラスミドを、ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣをコードするプラスミドと共遺伝子導入した場合、該ＥＧＦＰ蛋白質 (配列番号: 2) は、ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣ融合蛋白質からなるＡＳＣスペック担体とは共局在せず、ＡＳＣスペック担体の外殻をコートしていなかった (図３Ａ〜Ｃ)。
【００８４】
しかし、融合蛋白質をＥＧＦＰ蛋白質(配列番号: 2) および疎水性ペプチド 1 (配列番号: 4)を用いて作製し、この融合蛋白質をコードするプラスミドをｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣをコードするプラスミドと共遺伝子導入した場合、ＥＧＦＰ-ペプチド1は、ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣ融合蛋白質からなるＡＳＣスペック担体の外殻をコートしていた (図３Ｄ〜Ｆ)。
【００８５】
融合蛋白質をＥＧＦＰ蛋白質 (配列番号: 2) および疎水性ペプチド 2 (配列番号: 8) またはペプチド 3 (配列番号: 9)から作製した場合、これらの融合蛋白質は、ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックの外殻をコートしていなかった (図３Ｇ〜Ｌ)。ペプチド1 (配列番号: 4)、ペプチド2 (配列番号: 8)およびペプチド 3 (配列番号: 9)は、26アミノ酸の長さである。
【００８６】
疎水性ペプチド1 (配列番号: 4) のより短いバージョンでも、疎水性の性質によりＡＳＣスペックの外殻をコートし、ＡＳＣスペックとともに本発明の組成物を形成できるかどうかを試験した。これらの短縮化したペプチド配列は、長いバージョンのペプチド1の中の１９、１２および８アミノ酸である。これらの短縮化ペプチドのうち、ＥＧＦＰ-ペプチド1_19aa融合蛋白質のみが、１９アミノ酸の長さのペプチド1_19aa (配列番号: 5)がＥＧＦＰ蛋白質 (配列番号: 2)との融合蛋白質であった場合に、ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックの外殻をコートした（図４Ａ〜Ｃ)。融合蛋白質を、ペプチド１のさらに短いバージョンである、ペプチド1_12aa (配列番号: 6)またはペプチド1_8aa (配列番号: 7)とＥＧＦＰ (配列番号: 2)で作製した場合、これらの融合蛋白質は、ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックの外殻をコートしていなかった (図４Ｄ〜Ｉ)。したがって、蛋白質をＡＳＣスペックに負荷するために必要な疎水性ペプチドの最短の長さは、少なくとも13アミノ酸と考えられる。
【００８７】
上述のペプチドの疎水性親水性指標のグラフを示す(図５)。疎水性親水性指標グラフおよび算出した平均疎水性値(表１)によれば、ペプチド1 (配列番号: 4) およびその短いバージョンは、ペプチド2 (配列番号: 8) およびペプチド3 (配列番号: 9)に比較して疎水性が高いと考えられる。表１に示すペプチドの電荷と、ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックに負荷され得る性質の間には何の関連も見られていない。ＡＳＣ蛋白質(配列番号: 1) の表面は、進化的に保存された疎水性アミノ酸が豊富であり、これらのアミノ酸がＡＳＣ蛋白質 (配列番号: 1) 多量体形成に重要であることが以前示されている (Moriya et al. 2005)。これらを合わせて考えると、ＥＧＦＰ-ペプチド1とＥＧＦＰ-ペプチド1_19aa融合蛋白質が、ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックに負荷され得る原因は、その疎水性の構造であることが示されている。
【表１】
0006026645.tif 000002
【００８８】
疎水性親水性指標のグラフ(図５) および表1に示す、pH= 7.0におけるペプチドの電位の算出値は、http://www.innovagen.se/custom-peptide-synthesis/peptide-property-calculator/peptide-property-calculator.aspのアプリケーションを用いて算出した。表１に示す疎水性の平均値は、http://www.bbcm.univ.trieste.it/~tossi/HydroCalc/HydroMCalc.htmlのアプリケーションを用いて算出した。
【００８９】
ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣと、ＥＧＦＰ-ペプチドX (Xはペプチド1 (配列番号: 4)、ペプチド1_19aa (配列番号: 5)、ペプチド1_12aa (配列番号: 6)、ペプチド1_8aa (配列番号: 7)、ペプチド2 (配列番号: 8)ペプチド3 (配列番号: 9) )をコードするプラスミドの共遺伝子導入および、細胞培養からのスペックの精製は、実施例３と同様に行った。 
【００９０】
ＥＧＦＰ-Ｘプラスミドのクローニングは以下のように行った:
pEGFP-ペプチド1、pEGFP-ペプチド2、pEGFP-ペプチド3
pEGFP-C3ベクターのマルチクローニングサイトがコードする２６アミノ酸の長さの配列の２２アミノ酸のセクションを、同じ長さの３つのランダムに選択したペプチドに切り替えた。これらのペプチドは、pcDNA3ベクターのアンピシリン耐性遺伝子から選択された３つの連続した配列である。ペプチド1 (配列番号: 4) を、プライマーBglII_Amp1_F (ataagatcttatgagtattcaacatttccgtgtc)およびEcoRI_Amp1_R(tgaattcaaaaaacaggaaggcaaaatgcc)、ペプチド2 (配列番号: 8) を、プライマーBglII_Amp2_F (tctagatcttgctcacccagaaacgctggtg)およびEcoRI_Amp2_R(tgaattcagtaacccactcgtgcacccaac)、ペプチド3 (配列番号: 9) を、プライマーBglII_Amp3_F (ataagatcttatcgaactggatctcaacagcg) およびEcoRI_Amp3_R (tgaattcacattggaaaacgttcttcgg)を用いてＰＣＲで増幅し、PCR産物とベクターをBglII-EcoRIで消化し、お互いにライゲーションすることにより、pEGFP-C3ベクターのBglII-EcoRIサイトの間に挿入した。
【００９１】
pEGFP-ペプチド１の短いバージョン
アンピシリン耐性遺伝子からクローニングした、15、8および4アミノ酸の長さのバージョンのペプチド1を、pEGFP-C3ベクターのBglII-EcoRIサイトに、並べたオリゴヌクレオチドをライゲーションすることによりサブクローニングした (15、8および4アミノ酸の長さのペプチドは、最初にYSDL配列を有する19、12、8アミノ酸の長さのペプチドを形成する)。オリゴヌクレオチドpEGFP-ペプチド1_19aa (配列番号: 5)、amp1_19aa_F (gatcttgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgttttttg)およびamp1_19aa_R (aattcaaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacaa) のクローニング; オリゴヌクレオチドpEGFP-ペプチド1_12aa (配列番号: 6)、amp1_12aa_F (gatcttgcggcattttgccttcctgttttttg) およびamp1_12aa_R(aattcaaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaa)のクローニング; オリゴヌクレオチドpEGFP-ペプチド1_8aa (配列番号: 7)のクローニングのために、オリゴヌクレオチドamp1_8aa_F (gatcttcttcctgttttttg) およびamp1_8aa_R (aattcaaaaaacaggaagaa) を95℃にて５分間変性させ、１時間で室温にゆっくりと冷却した。 この方法により、相補的な配列に自己アニーリングしたオリゴヌクレオチドを、かかる自己アニーリングオリゴヌクレオチドとベクターをBglIIとEcoRIで消化し、お互いにライゲーションすることによって、pEGFP-C3ベクターのBglIIサイトとEcoRIサイトの間にクローニングした。
【００９２】
融合蛋白質は、好ましい抗原/生理活性分子のコード配列を、ペプチド1、ペプチド1_19aaまたは、抗原/生理活性分子のＡＳＣスペックへの負荷を達成する他の任意のペプチドコード配列のＮ末端またはＣ末端にクローニングすることにより作製し得る。
【００９３】
実施例6
炎症性刺激による、ＥＧＦＰ-ＡＳＣを安定的に発現するＴＨＰ-1細胞の刺激
抗原および／または生理活性分子を負荷したＡＳＣスペックを含む本発明の組成物は、ＡＳＣ蛋白質に融合した抗原および／または生理活性分子を、炎症性刺激で誘導可能な細胞株で発現させ、続いて、該細胞を炎症性刺激で刺激することにより合成し得る。
【００９４】
該炎症性刺激は、ＮＬＲＰ３、ＮＬＲＣ４またはＡＩＭ２インフラマソームを引き起こす任意の刺激であってよい。ＮＬＲＰ３インフラマソームは、尿素一ナトリウム (monosodium urea (MSU))、尿酸、アスベスト、シリカ、水酸化アルミニウム、ＡＴＰ、細胞膜損傷物質、例えばナイジェリシン、ＵＶＢ、ヒアルロナン、アミロイド-β線維、ピロリン酸カルシウム脱水結晶により引き起こされ; ＮＬＲＣ４インフラマソームは、フラジェリンにより引き起こされ、ＡＩＭ２インフラマソームは、サイトゾルＤＮＡまたはＤＮＡ類似体 (ポリＡ:Ｔ)により引き起こされ得る(Franchi et al., 2009, Jin et al., 2010)。
【００９５】
ＥＧＦＰ-ＡＳＣを安定して発現する細胞株を作製するために、ＴＨＰ-１細胞に対してレンチウイルス形質導入法を用いた。レンチウイルスの作製のために、ＥＧＦＰ-ＡＳＣ融合蛋白質をコードするレンチウイルスプラスミドpLenti-Ef1a-EGFP-ASCを、ヘルパープラスミド(pCMVΔR8.74およびpMD2.G)とともに、HEK 293 FT細胞に共遺伝子導入した (100mmディッシュに播いた５，０００，０００個の細胞あたり、それぞれ３つのプラスミドを４μg遺伝子導入した)。遺伝子導入の２日後、レンチウイルスを含む細胞培養上清を0.45μmフィルターに通し、ポリブレン(最終濃度: 4μg/ml)と混合した。続いて、レンチウイルスを含む上清をTHP-1細胞に添加し、5時間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞培養上清を変え、ＥＧＦＰ-ＡＳＣ融合蛋白質を発現する細胞数の増加を5日間観察した。5日目の最後に、各ウェルに１つの細胞が入り、単一の細胞由来の安定細胞株のコロニーを確立できるように、細胞を９６ウェルに播いた。 
【００９６】
ＥＧＦＰ-ＡＳＣ融合蛋白質を安定して発現するＴＨＰ-１単球細胞株を、0.5μM PMAとともに3時間インキュベーションして、マクロファージの特徴が得られるように分化させた。分化細胞を150μg/ml ＭＳＵで8時間刺激してＮＬＲＰ３インフラマソームを活性化し、細胞によるＥＧＦＰ-ＡＳＣスペックの合成を観察した。ＡＳＣスペックの細胞培養からの精製工程の残りは、実施例１と同様に行った。
【００９７】
ＥＧＦＰ-ＡＳＣ融合蛋白質のTHP-1単球細胞株へのレンチウイルスによる形質導入のために、ＥＧＦＰ-ＡＳＣをコードするＤＮＡ配列をpEGFP-C3-ASCプラスミドから、NheI-NotI酵素で消化して切り出し、同じ酵素で消化したpLenti-Ef1aベクターにライゲーションすることによりクローニングした。pLenti-Ef1aベクターの骨格は、pLenti-EF1a-hChR2(H134R)-EYFP-WPREプラスミドより得た。pLenti-EF1a-hChR2(H134R)-EYFP-WPREプラスミドおよびヘルパープラスミドであるpCMVΔR8.74およびpMD2.Gは、Deisseroth Lab (Stanford University, Stanford, USA)よりご供与頂いた。
【００９８】
ＥＧＦＰ-ＡＳＣを安定に発現するTHP-1細胞では、炎症性刺激(例えばMSU)がなければ、ＥＧＦＰ-ＡＳＣ融合蛋白質は、サイトゾル中に分散して存在していた。細胞を150μg/ml MSUで８時間刺激した場合、ＥＧＦＰ-ＡＳＣスペックが合成された。
【００９９】
融合蛋白質は、好ましい抗原/生理活性分子のコード配列をＡＳＣ蛋白質(配列番号: 1) のコード配列のＮ末端に、例えばＥＧＦＰ-ＡＳＣとなるように、または該蛋白質コード配列のＣ末端または内部にクローニングすることにより作製してよい。
【０１００】
実施例7
試験管内における本発明の組成物の合成
抗原または生理活性分子は、細菌発現系において、ＡＳＣ蛋白質との融合蛋白質として作製し得る。あるいは、該抗原/生理活性分子およびＡＳＣ蛋白質は、細菌遺伝子発現系にて別々に（融合蛋白質としてではなく）作製し得る。その後、＜50mM KClを含む溶液中で３７℃にてインキュベーションすることにより、精製した融合蛋白質または別々に発現させた蛋白質から、試験管内にて本発明の組成物を形成した。 
【０１０１】
例として、6X ヒスチジン-ＥＧＦＰ-ＡＳＣ融合蛋白質のコード配列をpETM-20ベクター骨格にクローニングして入れ、該プラスミドをRosetta2 pLysSバクテリア株に入れて形質転換を行った。pET系による調節遺伝子発現を、15℃にて0.4 mM IPTGにより一晩誘導した。細菌株をTerrific Broth (水1L中、トリプトン12g、酵母エキス24g、グリセロール 4ml、KH2PO4 0.017 M、K2HPO4 0.072M)中で増殖させた。蛋白質精製は、先行文献(Alba, 2007)に記載されているように行った。細菌の沈殿物を8000rpmにて15分間遠心分離し、20 mM Tris pH＝8、500 mM NaCl、5mM イミダゾールおよび5M塩化グアニジニウムを含む溶液に再懸濁し、超音波破砕した。細胞の細片を13000 rpmにて45分間遠心分離し、上清をHis-精製カラム (Pierce)に通した。該カラムを20 mMイミダゾールを含む溶液で洗浄し、蛋白質を200mM イミダゾールを含む溶液で溶出した。溶出物のpHをpH=4に下げ、pH=4にて水に対して透析した。
【０１０２】
試験管内のスペック合成を先行文献に記載されているように行った(Fernandes-Alnemri et al., 2007)。精製および透析した10 ng/μl ＥＧＦＰ-ＡＳＣ蛋白質を、30 mM Tris-HCl pH 7.5含有溶液中で 37℃にて１時間インキュベーションした。
【０１０３】
pETM20-6X-His-EGFP-ASCプラスミドをクローニングするために、ＥＧＦＰ-ＡＳＣ融合蛋白質をコードするＤＮＡ配列をpEGFP-C3-ASCプラスミドから、NcoI-NotI酵素により消化して切り出し、同じ酵素で消化した、6X Hisを含むpETM20ベクターにこの配列をライゲーションすることによりクローニングした。
【０１０４】
融合蛋白質は、好ましい抗原/生理活性分子のコード配列を、例えば6X ヒスチジン-ＥＧＦＰ-ＡＳＣのように、ＡＳＣ蛋白質 (配列番号: 1) コード配列のＮ末端に置いてクローニングするか、または該蛋白質コード配列のＣ末端または内部に置くことにより作製し得る。
【０１０５】
実施例8
抗原/生理活性分子に融合したＡＳＣ蛋白質(配列番号: 1)を細菌に発現させた場合、融合蛋白質は封入体に捕捉される。この実施例に記載の方法を用いることにより、封入体または試験管内ＡＳＣスペック由来のＡＳＣ蛋白質の微粒子凝集体を合成し得る。
【０１０６】
6X ヒスチジン-ＥＧＦＰ-ＡＳＣ融合蛋白質を、pETM-20ベクター骨格に入れ、該プラスミドを用いて、Rosetta2 pLysS細菌種を形質転換した。pET系制御性の遺伝子発現を0.4mM IPTGによって、15℃にて一晩誘導した。該細菌株をTerrific Broth (水1 L中、トリプトン12g、酵母エキス24g、グリセロール 4ml、KH2PO4 0.017M、K2HPO4 0.072M)中で増殖させた。細菌30 mlを8000 rpmにて15分間遠心分離した。細菌の沈殿物をTriton X-100溶液(1% Triton X-100、150 mM NaCl、2 mM EDTA、20 mM Tris-HCl pH=7.5) 10 mlに再懸濁し、30℃にて15分間インキュベーションした。インキュベーションの間に、Rosetta2 pLysS株に存在する、Ｔ７リゾチーム酵素が細菌の細胞壁を消化した。続いて、細菌の沈殿物を超音波破砕し、14000rpmにて15分間遠心分離した。上清相は、細菌の可溶蛋白質に富んでおり、この相は廃棄した。次に、沈殿物を1% SDSを含むＰＢＳ溶液で再懸濁し、14000rpmにて15分間遠心分離した。この時、上清は封入体から抽出された6X-ヒスチジン-ＥＧＦＰ-ＡＳＣ融合蛋白質に富んでいた。上清に対してアセトンを１：４の体積比で混合して、蛋白質を沈殿化させ、この時、ＳＤＳはアセトンにより、ＳＤＳ中に残留する。該混合物を14000rpmにて１分間遠心分離し、上清を廃棄した。蛋白質沈殿を４倍量のアセトンでさらに２回洗浄した。該沈殿に１倍量のPBSを添加して超音波破砕した。この、封入体から抽出したＡＳＣ融合蛋白質から試験管内でスペックを合成する方法を、Triton X-100/SDS/アセトン (ＴＳＡ)法と称する。
【０１０７】
ＴＳＡ法を用いて6X ヒスチジン-ＥＧＦＰ-ＡＳＣ融合蛋白質から合成した生成物を、共焦点顕微鏡法により試験すると、マイクロサイズのスペック構造が観察された。
【０１０８】
融合蛋白質は、好ましい抗原/生理活性分子コード配列を、例えば6X ヒスチジン-ＥＧＦＰ-ＡＳＣのように、ＡＳＣ蛋白質 (配列番号: 1) コード配列のＮ末端に、または該蛋白質コード配列のＣ末端もしくは内部に入るようにクローニングすることにより作製し得る。
【０１０９】
実施例 9
様々なＡＳＣホモログを用いたＡＳＣスペック担体の入手
融合蛋白質は、抗原/生理活性分子とＡＳＣ蛋白質のゼブラフィッシュホモログ (配列番号: 11)を用いて作製した。例として、ＥＧＦＰ-ｚＡＳＣ融合蛋白質をコードするプラスミドを、実施例１に記載するようにHEK 293 FT細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入および細胞培養からのＡＳＣスペックの精製は、実施例１に記載するように行った。
【０１１０】
ＥＧＦＰ-ｚＡＳＣ融合蛋白質をコードするプラスミドをクローニングするために、ＡＳＣ蛋白質のゼブラフィッシュのホモログ(ｚＡＳＣ)コード配列を、9日齢のゼブラフィッシュ胚由来のＲＮＡから合成したｃＤＮＡから、プライマーSacI_zAsc_F (atagagctcatggcggaatctttcaaggag) およびEcoRI_zAsc_R (agaattctactgagcatcctcaaggtc) を用いて増幅し、ＰＣＲ産物および pEGFP-C3プラスミドを、SacI-EcoRI酵素で消化し、お互いにライゲーションすることによりクローニングした。ゼブラフィッシュのｃＤＮＡは、Xalid Bayramli氏 (Bogazici University, Istanbul, Turkey)よりご供与頂いた。
【０１１１】
融合蛋白質は、好ましい抗原/生理活性分子コード配列を、例えば、ＥＧＦＰ-ｚＡＳＣのように、ｚＡＳＣ蛋白質 (配列番号: 11) コード配列のＮ末端、あるいは該蛋白質コード配列のＣ末端または内部になるようにクローニングすることにより作製し得る。
【０１１２】
実施例10
抗原/生理活性分子と、zＡＳＣ蛋白質からなるＡＳＣスペック担体からなる本発明の組成物の入手
抗原/生理活性分子のゼブラフィッシュＡＳＣ蛋白質 (配列番号: 11) により形成されるスペック担体への、疎水性相互作用を介した負荷の例として、ＥＧＦＰ-ｚＡＳＣ融合蛋白質およびｍＣｈｅｒｒｙ-ペプチド1 (ペプチド1、配列番号: 4) 融合蛋白質をコードするプラスミドを、HEK 293 FT細胞に共遺伝子導入した。共遺伝子導入および細胞培養物からのＡＳＣスペックの精製は、実施例３と同様に行った。共遺伝子導入の結果として、ｍＣｈｅｒｒｙ-ペプチド1による、ＥＧＦＰ-ｚＡＳＣスペックの外殻のコーティングが観察された。
【０１１３】
ｍＣｈｅｒｒｙ-ペプチド1融合蛋白質をコードするプラスミドである、pmCherry-C3.1-ペプチド1のクローニングのために、オリゴヌクレオチドである、ペプチド1_XhoI_F (tcgagtactcagatcttatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgttttttg) およびペプチド1_EcoRI_R(aattcaaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcataagatctgagtac) を95℃にて5分間変性させ、１時間でゆっくりと室温に冷却した。この方法により、該ヌクレオチドは、相補的な配列に自己アニーリングし、自己アニーリングしたオリゴヌクレオチドとベクターを、XhoIおよびEcoRIで消化し、お互いにライゲーションすることにより、pmCherry-C3.1ベクターのXhoIサイトとEcoRIサイトの間にクローニングした。
【０１１４】
実施例11
THP-1細胞に貪食された本発明の組成物の、細胞中での膜封入状態およびその緩やかな分解
実施例１に記載するように、ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣ融合蛋白質をHEK 293 FT細胞に過剰発現させることによりｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックを作製した。実施例１に記載するように、細胞培養合成したｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペック精製の結果として、直径2〜8μmのスペックを得た。ホルボール12-ミリステート13-アセテート(PMA) の処理後、マクロファージの特徴を示す、ＥＧＦＰ-ＡＳＣ蛋白質を安定して発現するTHP-1細胞を、ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックとともにインキュベーションした。2時間インキュベーションした後、ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックが、細胞質に分散した分布かつ低い濃度でＥＧＦＰ-ＡＳＣを含むTHP-1細胞に貪食されている様子が観察された(図６、t=0秒)。共焦点顕微鏡による解析により、細胞内で、安定して発現しているＥＧＦＰ-ＡＳＣおよび新しく貪食されたｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックからのシグナルは重ならないことが観察された。ＥＧＦＰ-ＡＳＣおよびｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣ蛋白質の過剰発現細胞では、これらの２つの融合蛋白質が同一のスペック内に共局在することが知られている。ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックをエンドサイトーシスし、ＥＧＦＰ-ＡＳＣ蛋白質を安定して発現するTHP-1細胞において共局在が見られないことから、ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックが、膜に封入された小器官中に存在することが示唆された。この膜に封入された小器官は、ファゴリソソームである。
【０１１５】
貪食されたｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックが膜に封入された状態であることを示す別の証拠が、アポトーシスを促進する条件下で長期間ＴＨＰ−１細胞をインキュベーションしている間に得られた。生理的条件下では、エンドサイトーシスされたスペックは、密接な膜により封入されており、この条件下で膜を識別することはできなかった。しかし、ＰＭＡ分化したＴＨＰ−１細胞を非生理的環境で、長時間インキュベーションを行う間に、細胞の細胞膜の統合性が失われた(膜小胞形成)。細胞がアポトーシスを徐々に進行させるのを促進するために、ＴＨＰ−１細胞を、ＰＢＳ中で、スライドガラスとカバーガラスの間に置き、30分より長い時間イメージングを行った。
【０１１６】
細胞膜の変形と同時に、ファゴリソソームの膜も変形し、広がった。したがって、貪食されたＡＳＣスペックがファゴリソソーム中で膜に封入されている様子が見えるようになった。さらに、ファゴリソソームの内部の、球形のスペック構造の外部が、ＡＳＣスペックから離れたｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣで満たされている様子がはっきりと観察された(図６、t=600秒〜t=1100秒)。ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペック担体は、明視野顕微鏡像では、ファゴリソソーム中の固体の球形の構造であることが識別できた。ファゴリソソーム小器官由来のｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣシグナルの大部分は、この構造から出ていた。図６では、ファゴリソソームの中であるが、球形のスペック構造の外側である空間におけるｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣシグナルを示すために、球形構造におけるシグナルを飽和させたため、２つの領域の相違は明確ではなかった。それにもかかわらず、ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペック担体からのシグナルは、ファゴリソソーム中に分散しているｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣシグナルよりもはるかに強く、このことは、ファゴリソソーム中の分解が遅く、制御されたものであることを示唆している。さらに、この時間の間には、ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックの完全な分解が見られないことが、共焦点顕微鏡により観察され、ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックが、溶液中、37℃にて少なくとも３０日の間安定性を示すことから、ファゴリソソームの制御された分解は、数時間または数日間かかり得ることが示唆された。
【０１１７】
THP-1細胞は、ＡＳＣスペックの貪食ではなく、非生理的条件に長期間暴露したことによりアポトーシスを起こした。様々な時間、ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックとともにインキュベーションしたTHP-1細胞は、イメージングの最初の５〜１０分では膜の統合性が維持されていたが、２０分前後では細胞死が観察された。さらに、細胞は、同じ時間、増殖チャンバーで試験した場合、その膜統合性を保持できた。
【０１１８】
実施例12
本発明の組成物を含むファゴリソソームからの管状小胞のくびれ切れ
ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックを貪食した、ＥＧＦＰ-ＡＳＣを安定に発現するTHP-1細胞を、増殖チャンバーを用いて細胞の培養条件を維持しながらタイムラプス撮影を行った場合、ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックが、細胞内でその球状の構造を保持しており、その一方で、ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣを含む管状の小胞がファゴリソソームからくびれ切れる様子が観察された(図７)。貪食されたスペックの完全な分解に必要な時間はわからない。それにもかかわらず、この発見により、ＡＳＣスペック担体により輸送された抗原は、ファゴリソソーム中で、制御された方法で分解され、管状小胞中でファゴリソソーム小器官を離れることにより、抗原提示経路に入り得ることが示唆される。抗原提示経路に入るためには、この種類の小胞が、MHCクラスII分子を含む小胞と融合し、細胞膜に到達しなければならない。
【０１１９】
さらに、ファゴリソソームからくびれ切れる、ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣ含有小胞は、細胞質のＥＧＦＰ-ＡＳＣとは重ならなかった。このこともまた、ファゴリソソームからくびれ切れる構造が、膜で封入された小胞であるという仮説を支持するものである。
【０１２０】
タイムラプス撮影の間、THP-1マクロファージ細胞が生存可能であるようにするために、自作の増殖チャンバーを用いた。アガロースゲルを60 mmプレートに注ぎ、該アガロースゲルからカバーガラスの大きさを一部切り取った。該アガロースゲルを37℃に加温し、ゲル中の溝を、３７℃の細胞培養培地で満たした。THP-1細胞を播いたカバーガラスを該増殖チャンバーに上下逆になるように置き、共焦点顕微鏡下でイメージングを行った。この方法により、THP-1細胞膜が少なくとも30分間は安定であった様子が観察された。
【０１２１】
実施例13
37℃での長期間のインキュベーションに対する本発明の組成物の耐性
試験管内にて、生理的温度(37℃)における、融合蛋白質として、または疎水性相互作用を介してＡＳＣスペック担体に負荷された抗原または生理活性分子からなる本組成物の安定性を測定するために、ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣをコードするプラスミドを単独で、またはＥＧＦＰ-ペプチド1をコードするプラスミド (ペプチド1、配列番号: 4)とともにHEK 293 FT細胞に遺伝子導入した。
【０１２２】
実施例１に記載するように、ＡＳＣスペックを細胞培養から単離し、ＰＢＳ溶液中で、37℃にて30日間インキュベーションした。30日目の最後に、ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックの球状構造と、ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックの外殻をコートしている、ＥＧＦＰ-ペプチド1からなる球状の殻構造が維持されている様子が観察された(図８)。
【０１２３】
実施例14
本発明の組成物の、凍結融解サイクルに対する耐性
実施例１および４に記載するように、合成および精製した本発明の組成物を、８回の連続的な凍結融解サイクル(-80℃〜+37℃)にさらした。ユニット領域にて凍結融解した組成物を共焦点顕微鏡にてイメージングを行い、カウントした。最初と最後の凍結融解サイクルの間で統計学的に有意な違いは見られなかった。例として、ｍＣｈｅｒｒｙ-ＡＳＣスペックからなる融合組成物が見られた(図９)。
【０１２４】
本明細書中で引用する文献は以下の通りである：
引用文献
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【０１２５】
【表２】
0006026645.tif 000003
【表３】
0006026645.tif 000004
【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【図１Ａ】
0006026645.tif 000010
【図１Ｂ】
0006026645.tif 000011
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図３Ｌ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図５】
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【図６Ａ】
0006026645.tif 000042
【図６Ｂ】
0006026645.tif 000043
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図６Ｊ】
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【図６Ｋ】
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【図６Ｌ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図８Ｉ】
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【図８Ｊ】
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【図９】
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【配列表】
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