(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（Ｉ）に示す構造を有するフルクトシル化マンギフェリン：
【化１】
0005934348.tif 000008
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ水素であり、Ｒはフルクトースモノグリコシルまたは２つのフルクトースが接続したオリゴサッカルリであり、その構造は式（ＩＩ）に示すとおりである：
【化２】
0005934348.tif 000009
式中、ｎ＝０〜１である。
【請求項２】
請求項１記載のフルクトシル化マンギフェリンの調製方法であって、
フルクトシル化酵素活性を有する物質であるアルスロバクター属細菌に由来するフルクトシル化酵素を、マンギフェリンを含む変換液に加え、生物学的変換反応を行い、マンギフェリンをフルクトシル化マンギフェリンに変換し、前記変換液にはマンギフェリン及びグリコシル供与体であるサッカロースを含み；変換反応終了後、前記変換液内の菌体細胞又は菌体タンパク質を除去して樹脂精製を行い、その後樹脂精製で得られたフルクトシル化マンギフェリン留分を回転蒸発又は冷凍乾燥後に、マンギフェリン粉末又は結晶体を得ることを含む、方法。
【請求項３】
前記フルクトシル化酵素活性を有する物質には、フルクトシル化酵素活性を有する発酵液、発酵液上澄み、精製されたフルクトシル化酵素とフルクトシル化酵素組換発現タンパク質が含まれる、請求項２に記載の調製方法。
【請求項４】
前記フルクトシル化酵素がβ−Ｄ−フルクトフラノシダーゼである、請求項３に記載の調製方法。
【請求項５】
前記β−Ｄ−フルクトフラノシダーゼは、アルスロバクター属細菌に由来し、その分子量は約６０ｋＤａ、Ｎ端前の５個のアミノ酸配列はそれぞれＡＴＥＰＶである、請求項４に記載の調製方法。
【請求項６】
前記発酵液又は発酵液上澄みは、フルクトシル化酵素活性を有する微生物であるアルスロバクター属細菌の発酵により得られる、請求項２〜５のいずれかに記載の調製方法。
【請求項７】
前記微生物がアルスロバクター・ニコチアナエＸＭ６であり、その保存番号はＣＣＴＣＣ  Ｍ２０１０１６４である、請求項６に記載の調製方法。
【請求項８】
前記微生物発酵が、サッカロース５〜８０ｇ／Ｌ、ペプトン５〜５０ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４０．４〜４ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２０．５〜５ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４０．１〜２ｇ／Ｌを含み、ｐＨ６〜８の発酵培地により、２５〜４０℃、１０〜４００ｒｐｍの条件で振とうフラスコを用いて振とう又は発酵槽で撹拌して通気し、回転速度通気量は１〜６ｖｖｍ、１０〜４００ｒｐｍで、６〜４８時間発酵することである、請求項６又は７に記載の調製方法。
【請求項９】
前記微生物発酵が、サッカロース１５ｇ／Ｌ、ペプトン２５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４２ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２２ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４０．２ｇ／Ｌを含み、ｐＨ７．５の発酵培地により、３０℃、２４０ｒｐｍの条件で振とうフラスコを用いて１６時間振とう又は発酵槽で撹拌して通気し、回転速度通気量は４ｖｖｍ、３００ｒｐｍで、６時間発酵することである、請求項６又は７に記載の調製方法。
【請求項１０】
前記生物学的変換反応は非水相反応条件の下で行い、前記非水相反応条件とは：１０〜４００ｒｐｍの条件で振とうフラスコを用いて振とう又は発酵槽で撹拌し、５〜５０％の親水性有機溶剤、マンギフェリンの濃度は０．１〜７０ｇ／Ｌで、マンギフェリンとグリコシル供与体の混合比はモル比１：１〜１：２００で、１０％〜５０％の発酵液又は発酵液上澄みを加え、前記発酵液又は発酵液上澄みはフルクトシル化酵素１０〜１００Ｕ／ｍＬを含み、ｐＨ４〜８の緩衝液に２５〜４０℃で６〜４００時間反応させる、請求項２〜９のいずれかに記載の調製方法。
【請求項１１】
前記親水性有機溶剤は、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、メタノール、アセトン及びエタノールの中から１種又は数種選択される、請求項１０記載の調製方法。
【請求項１２】
前記非水相反応条件が：２０％のジメチルスルホキシド、マンギフェリン６２．７ｇ／Ｌを採用し、サッカロース２００ｇ／Ｌをグリコシル供与体とし、２０％の発酵液上澄みを加え、前記発酵液上澄みはフルクトシル化酵素３０Ｕ／ｍＬを含み、１／１５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ６．８６のリン酸塩緩衝液に３０℃、３００ｒｐｍで３６０時間攪拌して変換するものである、請求項１０又は１１に記載の調製方法。
【請求項１３】
前記樹脂精製は、フルクトシル化マンギフェリンを含む変換液をＡＢ−８マクロ孔質樹脂により吸着させ、吸着後、溶離液で残りのグリコシル供与体を洗い落とし、その後、溶離液で勾配溶離又は段階溶離させることにより、フルクトシル化マンギフェリンを得る、請求項２〜１２のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項１４】
前記樹脂精製は、フルクトシル化マンギフェリンを含む変換液をＡＢ−８マクロ孔質樹脂により吸着させ、吸着後、１０倍カラムベッド体積でｐＨ４〜４．５の蒸留水を使用して残りのグリコシル供与体を洗い落とし、その後、５〜３０％のメタノール又はエタノール溶液で勾配溶離又は段階溶離することにより、フルクトシル化マンギフェリンを得る、請求項２〜１２のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項１５】
非水相反応条件において変換反応を行う時、前記吸着は、変換液の中の有機溶剤を低温蒸発で除去する、あるいは有機溶剤を２％未満の体積比まで希釈する条件下で行われる、請求項１３又は１４に記載の調製方法。
【請求項１６】
請求項１記載のフルクトシル化マンギフェリンの腫瘍関連疾病の治療用薬物の調製における使用。
【請求項１７】
治療有効量の請求項１記載のフルクトシル化マンギフェリンを含む、腫瘍関連疾病の治療用薬物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はフルクトシル化マンギフェリン並びにその調製方法および用途に関し、生物製薬の技術分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
マンギフェリンは一種のテトラヒドロキシキサントンのＣ−グルコシドであり、キサントン類フラボン類化合物に属し、例えばマンゴーの木、アーモンドの木、リュウタン及びチモ等、多種類の植物に存在する。マンギフェリンの分子式：Ｃ１９Ｈ１８Ｏ１１、分子量：４２２．３。マンギフェリンは、例えば、抗酸化、抗腫瘍、免疫調節、抗糖尿及び抗炎症等、多種の生物活性と薬理作用を有する（トウ家剛、蕈驪蘭、長春中医薬大学学報、２００８，２４（４）：４６３−４６４）。
【０００３】
マンギフェリンは広範な薬理活性を有するが、その溶解度は劣っており、その製剤の開発は厳しく制限されており、都合よく応用するために、マンギフェリンの溶解度と生物利用度を改善する必要がある。トウ家剛等（トウ家剛、袁葉、華西薬学雑誌，２００８，２３（１）：１７−１８）は、マンギフェリンの３−フェノール性ヒドロキシル基をナトリウムフェノラートに変換し、マンギフェリンのモノナトリウム塩の質量収率は９２．８％であった。マンギフェリンはナトリウム塩に変換された後、水溶性が改善され、胃腸への吸収に有利となり、それによりその生物利用度と治療効果が改善され；実験によりマンギフェリンおよびそのナトリウム塩はいずれも咳止め、去痰、抗炎作用を有し、マンギフェリンモノナトリウム塩はその水溶性が高いことから、その効果はマンギフェリンより優れており、従って、マンギフェリンモノナトリウム塩は呼吸系統の薬物として開発できる見込みがあることが分かった。Ｈｕ等(Ｈｕ  Ｈ  Ｇ，Ｗａｎｇ  Ｍ  Ｊ，Ｚｈａｏ  Ｑ  Ｊ，  Ｊ．Ｃｈｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ，２００７，１８：１３２３−１３２６)は、マンギフェリンを原料とし、アルキル化を経て一連の３，６，７−Ｏ−三置換マンギフェリン誘導体を得て、その構造はいずれも核磁気共鳴分光法により分析され、その中の化合物２〜１１が新規化合物であると確実に証明された。初歩の体外抗糖尿病活性スクリーニング結果は、同じ濃度の下、化合物５と１１のプロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ１Ｂ）の抑制率が、マンギフェリンの２倍であることをはっきりと表している。
【０００４】
複雑な構造の天然活性成分から言うと、化学合成を利用し構造改変を行った際は収率が低く、反応特異性が劣り、副産物が多いなどの欠点が存在し、特にいくつかの反応は現在化学手段を利用して実現することが難しいが、生物学的変換技術が化学合成の不足を補っている。Ｃａｎｔａｇｒｅｌ等（欧州特許申請番号：ＦＲ２００５０００２２２３  ２００５０３０４，公開番号ＦＲ２８８２７６２（Ａ１））は２株のロイコノストックメセンテロイデス由来のグリコシル基転移酵素により、マンギフェリンに対しグリコシル化改変を行い、マンギフェリンをグリコシル受容体とし、サッカロースをグリコシル供与体とする時、グリコシル−β−（１，６）−マンギフェリンが得られる（ＣＡＳＲＮ：９０８５７０−２３−０）。Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＮＲＲＬ  Ｂ−１２９９菌株を生物触媒とし、０．４ｇ／Ｌマンギフェリン、４０ｇ／Ｌサッカロースの条件の下、グリコシル化反応の収率は２５％であり、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＮＲＲＬ  ５２１−Ｆ菌株を生物触媒とし、０．４ｇ／Ｌマンギフェリン、４０ｇ／Ｌサッカロースの条件の下、グリコシル化反応の収率は２８％である。マンギフェリンをグリコシド化した後、水溶性は極めて向上するが、グリコシド化改変後の分子構造の変化がマンギフェリンの薬理活性に影響を与えるか否かについては、現在まだ関連する研究報道を見ていない。マンギフェリンは水溶性が劣っていることから、生物学的変換法を使用してマンギフェリンのグリコシル化改変を行う時、変換前のマンギフェリン濃度は一般的に低く（いずれも０．５ｇ／Ｌ以下）、生成物のモル転換率も低く（いずれも３０％以下）、これらの制限は腫瘍関連の疾病の薬理実験を行うための充分な生成物を得ることおよび後期の工業化生産にかなりの難易度をもたらした。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】フランス特許公開ＦＲ２８８２７６２（Ａ１）
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】長春中医薬大学学報，２００８，２４（４）：４６３−４６４）。
【非特許文献２】華西薬学雑誌，２００８，２３（１）：１７−１８
【非特許文献３】Ｊ．Ｃｈｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ，２００７，１８：１３２３−１３２６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明の目的は、現在のマンギフェリングリコシル化反応の変換前の濃度が一般的に低く、生成物のモル転換率も低く、腫瘍関連の疾病の治療を行うため十分な生成物を得られないという不足に対して、一種のフルクトシル化マンギフェリンを提供することであり、それは腫瘍の疾病治療に用いられ、有効な治療効果を得ることができた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明のもう１つの目的は、前記フルクトシル化マンギフェリンの調製方法を提供することである。
【０００９】
本発明のさらにもう１つの目的は、前記フルクトシル化マンギフェリンを腫瘍関連の疾病を治療するための薬物の調製に使用する用途を提供することである。
【００１０】
前記目的に対する本発明の技術方案は以下のとおりである：
【００１１】
一方で、本発明はフルクトシル化マンギフェリンを提供し、このフルクトシル化マンギフェリンは、以下の式（Ｉ）が示す構造である：
【００１２】
【化１】
0005934348.tif 000002
【００１３】
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ水素、メチル基、エチル基、ホルミル基、アセチル基、メチルアミノ基及び硫酸基から一種類選ばれ、Ｒはフルクトースモノグリコシルまたは２つのフルクトースが接続したオリゴサッカルリであり、その構造は式（ＩＩ）に示すとおりである：
【００１４】
【化２】
0005934348.tif 000003
式中、ｎ＝０〜１である。
【００１５】
もう一方で、本発明はフルクトシル化マンギフェリンの調製方法を提供し、この方法はフルクトシル化酵素活性を有する物質を、マンギフェリンを含む変換液に加え、生物学的変換反応を行い、マンギフェリンをフルクトシル化マンギフェリンに変換することを含み、前記変換液にはマンギフェリンとグリコシル供与体を含み、好ましくは、前記グリコシル供与体がフルクトース又はサッカロースである。
【００１６】
好ましくは、前記方法が、変換反応終了後、変換液中の菌体細胞又は菌体タンパク質を除去して樹脂精製し、さらに樹脂精製で得られたフルクトシル化マンギフェリン留分を回転蒸発又は冷凍乾燥した後に、フルクトシル化マンギフェリン粉末又は結晶体を得ることを含む。
【００１７】
好ましくは、前記フルクトシル化酵素活性を有する物質には、フルクトシル化酵素活性を有する発酵液、発酵液上澄み、精製されたフルクトシル基化酵素とフルクトシル基化酵素組換発現たんぱく質が含まれる。
【００１８】
好ましくは、前記フルクトシル化酵素がβ−Ｄ−フルクトフラノシダーゼである。
【００１９】
さらに好ましくは、前記β−Ｄ−フルクトフラノシダーゼに由来することであり、その分子量は約６０ｋＤａ、Ｎ端前の５個のアミノ酸配列はそれぞれＡＴＥＰＶである。
【００２０】
好ましくは、前記発酵液又は発酵液上澄みは、フルクトシル化マンギフェリン活性を有する微生物の発酵により得ることである。
【００２１】
好ましくは、前記微生物がアルスロバクター・ニコチアナエであり、その保存番号はＣＣＴＣＣ  Ｍ２０１０１６４であり（学名：Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ  ＸＭ６、分類名：アルスロバクター・ニコチアナエＸＭ６、保存番号：ＣＣＴＣＣ  Ｍ２０１０１６４、２０１０年６月２９日に中国典型培養物保存センターに保存、住所：中国  武漢  武漢大学、郵便番号：４３００７２）である。
【００２２】
好ましくは、前記微生物発酵がサッカロース５〜８０ｇ／Ｌ、ペプトン５〜５０ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４０．４〜４ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２０．５〜５ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４０．１〜２ｇ／Ｌを含み、ｐＨ６〜８の発酵培地により、２５〜４０℃、１０〜４００ｒｐｍの条件で振とうフラスコを用いて振とう又は発酵槽で撹拌して通気し、回転速度通気量は１〜６ｖｖｍ、１０〜４００ｒｐｍで、６〜４８時間発酵することである。
【００２３】
好ましくは、前記微生物発酵がサッカロース１５ｇ／Ｌ、ペプトン２５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４２ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２２ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４０．２ｇ／Ｌを含み、ｐＨ７．５の発酵培地により、３０℃、２４０ｒｐｍの条件で振とうフラスコを用いて１６時間振とう又は発酵槽で撹拌して通気し、回転速度通気量は４ｖｖｍ、３００ｒｐｍで、６時間発酵することである。
【００２４】
好ましくは、前記生物学的変換反応が非水相反応の条件において行われることである。
【００２５】
好ましくは、前記非水相反応条件が：１０〜４００ｒｐｍの条件で振とうフラスコを用いて振とう又は発酵槽で撹拌し、５〜５０％の親水性有機溶剤、マンギフェリンの濃度は０．１〜７０ｇ／Ｌで、マンギフェリンとグリコシル供与体の混合比はモル比１：１〜１：２００で、１０％〜５０％の発酵液又は発酵液上澄みを加え、前記発酵液又は発酵液上澄みはフルクトシル化酵素１０〜１００Ｕ／ｍＬを含み、ｐＨ４〜８の緩衝液に２５〜４０℃で６〜４００時間反応させることである。
【００２６】
好ましくは、前記親水性有機溶剤が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル、メタノール、アセトン及びエタノールの中から１種又は数種選択されることである。
【００２７】
好ましくは、前記非水相反応条件が：２０％のジメチルスルホキシド、マンギフェリン６２．７ｇ／Ｌを採用し、サッカロース２００ｇ／Ｌをグリコシル供与体とし、２０％の発酵液上澄みを加え、前記発酵液上澄みはフルクトシル化酵素３０Ｕ／ｍＬを含み、１／１５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ６．８６のリン酸塩緩衝液の５Ｌ発酵槽において、３０℃、３００ｒｐｍで３６０時間攪拌して変換することである。
【００２８】
好ましくは、前記樹脂精製は、フルクトシル化マンギフェリンを含む変換液をＡＢ−８マクロ孔質樹脂により吸着させ、吸着後、溶離液で残りのグリコシル供与体を洗い落とし、その後、溶離液で勾配溶離又は段階溶離させることにより、それぞれフルクトシル化マンギフェリンを得ることである。
【００２９】
好ましくは、１０倍カラムベッド体積でｐＨ４〜４．５の蒸留水を使用して残りのグリコシル供与体を洗い落とし、その後、５〜３０％のメタノール又はエタノール溶液で勾配溶離又は段階溶離することにより、それぞれフルクトシル化マンギフェリンを得ることである。
【００３０】
好ましくは、非水相反応条件において変換反応をする時、前記吸着は、変換液の中の有機溶剤を低温蒸発で除去する、あるいは有機溶剤を２％未満の体積比まで希釈する条件下で行われることである。
【００３１】
好ましくは、前記方法が溶離液を利用して残りのマンギフェリンを洗い落とし、回収することも含むことである。
【００３２】
好ましいのは、１００％のメタノール又はエタノールを使用して、残りのマンギフェリンを洗い落とし、回収することである。
【００３３】
さらにもう一方で、本発明は、フルクトシル化マンギフェリンを腫瘍関連の疾病を治療するための薬物の調製に使用する用途を提供することである。
【００３４】
さらにもう一方で、本発明は、本文に記載しているフルクトシル化マンギフェリンを、腫瘍関連の疾病の治療に使用することを提供する。
【００３５】
またもう一方で、本発明は腫瘍関連の疾病を治療する方法を提供し、被験者に治療有効量の本発明のフルクトシル化マンギフェリンを与えることを含み、好ましくは、被験者は哺乳動物であり、哺乳動物はヒトである。
【発明の効果】
【００３６】
従来の技術と比べ、本発明が有する有益な効果は以下の通りである：
最初に、本発明者は新しいフルクトシル化マンギフェリンを発明し、実験により、この新規マンギフェリン誘導体は、体外でヒトの慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２に対し顕著な抑制作用があり、腫瘍疾病の治療に用いることができることが証明された。これはマンギフェリングリコシル化誘導体を広い薬物用途に適用することを可能にするが、既存のマンギフェリングリコシル化誘導体の薬理活性に関する報道はまだ見られない。
【００３７】
次に、この新規フルクトシル化マンギフェリンの溶解度は、マンギフェリンと比較してより優れており、マンギフェリン製品の欠陥を補い、薬を使用する際の安全性が向上し、治療効果が増しており、発展の見込みがある新薬製品である。
【００３８】
更に、本発明者は、この新規フルクトシル化マンギフェリンの生物変換方法も提供している。既存の生物変換方法でマンギフェリングリコシル化改変を行う時、マンギフェリンの水溶性が劣っていることから、マンギフェリン濃度が一般的に低く（いずれも０．５ｇ／Ｌ以下）、生成物変換率も低い（いずれも３０％以下）。一方、本発明の生物変換方法を採用したところ、２０％ＤＭＳＯの変換システムにおいて６２．７ｇ／Ｌのマンギフェリンを変換基質とした時、得られるモノフルクトシル−β（２，６）−マンギフェリン濃度は６３．０ｇ／Ｌであり、フルクトシル化マンギフェリンの変換率は８７％に達した。本発明の生物変換方法により、既存の技術で存在していた技術的難題を解決し、当該生成物を利用して、腫瘍関連の疾病の薬理試験及び後期の工業化生産を行うのに有利となった。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
添付図の要約説明
以下に、添付図と合わせて本発明の実施例を詳細に説明し、そのうち：
【図１】非水相生物学的変換マンギフェリンのＨＰＬＣクロマトグラムを表す。
【図２】モノフルクトシル−β（２，６）−マンギフェリンの１ＨＮＭＲクロマトグラムを表す。
【図３】モノフルクトシル−β（２，６）−マンギフェリンの１３ＣＮＭＲクロマトグラムを表す。
【図４】モノフルクトシル−β（２，６）−マンギフェリンのＨ−Ｈ  ＣＯＳＹクロマトグラムを表す。
【図５】モノフルクトシル−β（２，６）−マンギフェリンのＣ−Ｈ  ＨＳＱＣクロマトグラムを表す。
【図６】モノフルクトシル−β（２，６）−マンギフェリンの高分解能質量クロマトグラムを表す。
【図７】マンギフェリンの１ＨＮＭＲクロマトグラムを表す。
【図８】マンギフェリンの１３ＣＮＭＲクロマトグラムを表す。
【図９】ジフルクトシル−β（２，６）−マンギフェリンの１ＨＮＭＲクロマトグラムを表す。
【図１０】ジフルクトシル−β（２，６）−マンギフェリンの１３ＣＮＭＲクロマトグラムを表す。
【図１１】ジフルクトシル−β（２，６）−マンギフェリンのＨ−Ｈ  ＣＯＳＹクロマトグラムを表す。
【図１２】ジフルクトシル−β（２，６）−マンギフェリンのＣ−Ｈ  ＨＳＱＣクロマトグラムを表す。
【図１２】ジフルクトシル−β（２，６）−マンギフェリンの高分解能質量クロマトグラムを表す。
【００４０】
生体材料の保存情報
学名：Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ  ＸＭ６、分類名：アルスロバクター・ニコチアナエ  ＸＭ６、保存番号：ＣＣＴＣＣ  Ｎｏ．：Ｍ２０１０１６４、２０１０年６月２９日に中国典型培養物保存センターに保存、住所：中国  武漢  武漢大学、郵便番号：４３００７２。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
発明の実施の最適方法
理解できるのは、ここで説明する特定の実施方法は、例を挙げた方法により表すもので、それを決して本発明に対する制限とはしない。本発明の範囲に乖離しない状況の下で、本発明の主な特徴は各種実施方法に用いることができる。本分野の技術者は、通常の実験を用いるだけで、多くの同等物が全て本文で説明する特定の手順に応用できることを意識又は確認できるであろう。これらの同等物は本発明の範囲内にあると認識され、且つ特許請求によりカバーされる。
【実施例】
【００４２】
以下の実施例において、詳細に説明されていない各種のプロセス及び方法は、本分野における公知の通常の方法である。使用した試薬の出所、商品名及びその構成成分を列挙する必要のあるものは、いずれも最初に現れる際に記載し、その後、同様の試薬の使用で特に説明がない場合は、いずれも最初に記した内容と同じである。
【００４３】
実施例１；マンギフェリンを使用した非水相生物変換による、フルクトシル化マンギフェリンの調製
４０ｍＬ発酵培養の培養基２（培養基の構成については表２を参照）を２５０ｍＬの三角フラスコに入れ、１２１℃の高圧蒸気で２０ｍｉｎ滅菌後、アルスロバクター・ニコチアナエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ  ＸＭ６）（ＣＣＴＣＣ  Ｎｏ．：Ｍ２０１０１６４）を加え、３０℃、１８０ｒｐｍで１６時間振とう・発酵培養し、これを植種液として５Ｌ発酵槽に接種した。接種量は５体積％、発酵槽に入れる液量は３Ｌ、発酵槽の滅菌方法は振とうフラスコと同様とした。３０℃、３００ｒｐｍで発酵培養し、通気量は３ｖｖｍで、６時間発酵培養（ＯＤは約１０前後）した後、８０００ｒｐｍで２０ｍｉｎ遠心し、上澄み酵素液を収集した。上澄み酵素液はフルクトシル化酵素を含み、測定されたフルクトシル化酵素の酵素活性は３０Ｕ／ｍＬであった。酵素活性の測定には以下の方法を採用した：
【００４４】
０．０１ｇマンギフェリン及び１ｇサッカロースを１／１５ｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．８６）１００ｍＬに十分溶解させて、基質溶液を調製した。反応系：２ｍＬ、１／１５ｍｏｌ／Ｌのリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．８６）を取り、１８ｍＬの基質溶液に加え、３０℃で１０ｍｉｎ反応させた後、直ちに１００μＬを取り出し、９００μＬのメタノールに加えて反応を終止させ、ブランクコントロールとした。同時に、別途２ｍＬの酵素液を取って１８ｍＬの基質溶液に加え、３０℃の中に置いて１０ｍｉｎ反応させた後、直ちに１００μＬを取り出し、９００μＬのメタノールに加えて反応を終止させ、サンプルとした。その後ＨＰＬＣで測定を行った。酵素活性単位の定義は、３０℃の条件の下、毎分１μｍｏｌのマンギフェリンを変換するのに必要な酵素量を１活性単位（１Ｕは即ち１μｍｏｌ／ｍｉｎ）とする。比活性の定義は（Ｕ／ｍＬ）、単位体積（ｍＬ）酵素液中に含有する酵素活性（Ｕ）数である。
【００４５】
６００ｍＬの上澄み酵素液を、総体積３０００ｍＬの６２．７ｇ／Ｌマンギフェリン（南京沢朗医薬科技有限責任公司から購入）、２００ｇ／Ｌサッカロース、１／１５ｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．８６）を含む５Ｌ発酵槽の中に加え、３０℃、３００ｒｐｍでマンギフェリングリコシル化反応を行い、３６０時間後、４５℃で２時間加熱して変換反応を終止させた。変換液はＨＰＬＣにより：モノフルクトシル−β（２，６）−マンギフェリンが６３．０ｇ／Ｌ、ジフルクトシル基マンギフェリンが１５．７ｇ／Ｌであり、フルクトシル化マンギフェリン変換率が８７％に達することが検出された。図１に示すように、保持時間１４．７８１ｍｉｎがマンギフェリン、保持時間８．９５１ｍｉｎがモノフルクトシル−β（２，６）−マンギフェリン、保持時間５．５４１ｍｉｎがジフルクトシル−β（２，６）−マンギフェリンである。前記フルクトシル化マンギフェリンを含む変換液は、ＡＢ−８マクロ孔質樹脂の吸着（クロマトグラフィーカラム４０×６００ｍｍ、流速１０ｍＬ／ｍｉｎ）を経て、その後、１０倍のカラムベッド体積でｐＨ４〜４．５の蒸留水（氷酢酸でｐＨを調節）で残りのグリコシル供与体を洗い落とし、続いて５％〜３０％のメタノール溶液で勾配溶離し、それぞれフルクトシル化マンギフェリン（純度＞９７％）を得て、最後に１００％メタノールで洗い落とし、色素及びマンギフェリンを除去した。
【００４６】
純度＞９７％のフルクトシル化マンギフェリンを、それぞれ４５℃で回転蒸発又は冷凍乾燥させた後に、モノフルクトシル−β（２，６）−マンギフェリン粉末又は結晶体１５８．５ｇ、ジフルクトシル−β（２，６）−マンギフェリン粉末又は結晶体３９．１ｇを得た。
【００４７】
測定により、２５℃における、モノフルクトシル−β（２，６）−マンギフェリンの溶解度は３５０ｇ／Ｌ、ジフルクトシル−β（２，６）−マンギフェリンの溶解度は１２００ｇ／Ｌであった。これは、同条件下でのマンギフェリンの溶解度（０．１ｇ／Ｌ）の、それぞれ３．５×１０３倍及び１．２×１０４倍であった。
【００４８】
前記モノフルクトシル−β（２，６）−マンギフェリンは：ＨＲ−ＭＳ：ｍ／ｚ５８３．１３０３［Ｍ−Ｈ］−、元素構成はＣ２５Ｈ２７Ｏ１６（図６）で、Ｍ−Ｈ計算値は５８３．１２９９で、ＤＭＳＯにおける１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲ化学シフトの特徴はそれぞれ以下のとおり：
【００４９】
lH-NMR(500MHz, DMSO-d6) δ: 13.75(1H, s, 1-OH), 7.38(1H, s, H-8), 6.86(1H, s, H-5), 6.36(1H, s, H-4), 4.59(1H, d, J=9.8 Hz, H-l'), 3.92-4.00(2H, m, 20 H-2'/H-4"), 3.77-3.89(2H, m, H-5/H-6"), 3.50-3.56(3H, m, H-5", H-6', H-6"), 3.20-3.42(7H, m, H-2', H-3', H-4', H-6', 2H-1", H-3")（図２、図４、図５）。
【００５０】
13C-NMR(500MHz, DMSO-d6) δ: 179.1, 163.8, 161.7, 156.3, 154.1, 150.8, 143.7, 111.7, 108.1, 107.4, 104.2(C-2"), 102.6, 101.3, 93.4, 82.1(C-5"), 79.6, 78.7, 76.7, 75.2(C-5'), 73.1, 70.7, 70.2, 62.4(C-6'), 61.9(C-6"), 61.3（図３）。
【００５１】
マンギフェリンのＤＭＳＯにおける１Ｈ−ＮＭＲと１３Ｃ−ＮＭＲ化学シフトの特徴はそれぞれ以下のとおり：
【００５２】
lH-NMR(500MHz, DMSO-d6) δ: 13.75(1H, s, 1-OH), 10.63(1H, s, 6-OH), 10.52(1H, s, 3-OH), 9.74(1H, s, 7-OH), 7.38(1H, s, H-8), 6.86(1H, s, H-5), 6.37(1H, s, H-4), 4.60(1H, d, J=9.8 Hz, H-l'), 4.04(1H, m, H-2'), 3.42, 3.70(2H, m, H-6'), 3.12-3.23(3H, m, H-3', H-4', H-5')（図７）。
【００５３】
13C-NMR(500MHz, DMSO-d6) δ: 179.0, 163.8, 161.7, 156.2, 153.9,150.7, 143.7, 111.7, 108.1, 107.6, 102.6, 101.3, 93.3, 81.5(C-5'), 78.9, 73.1, 70.6, 70.2, 61.5(C-6')（図 ８）。
【００５４】
ジフルクトシル−β（２，６）−マンギフェリンについて質量分析を行ったところ、図１３に示すとおり、ＨＲ−ＭＳ：偏差＝２０．０ｐｐｍ／ＤＢＥ：ｍｉｎ＝−１．５、ｍａｘ＝２０．０、フィルター、単元素、そしてイオンマススペクトラムまで選択せず、使用する元素はＣ：０−５０、Ｈ：０−１００、Ｏ：０−５０、有限の４つの結果（表１を参照）（各元素について３０の近い結果がある）において計算し得られた公式２０２、ｍ／ｚ７４５．１８１８［Ｍ−Ｈ］−、元素の組成はＣ３１Ｈ３７Ｏ２１、Ｍ−Ｈ計算値；７４５．１８２７。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
ＤＭＳＯにおける１Ｈ−ＮＭＲと１３Ｃ−ＮＭＲ化学シフトの特徴はそれぞれ以下のとおりである。
【００５７】
lH-NMR(500MHz, DMSO-d6) δ: 13.75(1H, s, 1-OH), 7.38(1H, s, H-8), 6.86(1H, s, H-5), 6.37(1H, s, H-4), 4.60(1H, d, J=9.8 Hz, H-l'), 3.94-4.02(3H, m, H-2', H-4", H-4m), 3.71-3.85(4H, m, H-5', H-6', H-5", H-6m), 3.48-3.61（5H, m, H-6', H-3", H-6", H-5'", H-6m), 3.18-3.43(9H, m, H-3', H-4', 2H-1", H-3", H-6", 2H-1'", H-3m)（図９、図１１、図 １２）。
【００５８】
13C-NMR(500MHz, DMSO-d6) δ: 179.1, 163.7, 161.7, 156.3, 154.1, 150.8,111.7, 108.1, 107.3, 104.3(C-2"), 104.2(C-2'"), 102.6, 101.4, 93.4, 80.3, 82.0(C-5"'), 79.6, 78.3, 76.5, 76.3, 75.7(C-5"), 75.2(C-5'), 73.2, 70.8, 70.3, 62.9(C-6'), 62.5(C-6"), 62.2(C-6'"), 61.3, 60.9（図１０）。
【００５９】
実施例２；非水相生物変換を用いたマンギフェリンからフルクトシル化マンギフェリンの調製。
４０ｍＬの発酵培養培地２（培地組成は表２を参照）を２５０ｍＬの三角フラスコに入れ、１２１℃の高圧蒸気で２０ｍｉｎ滅菌した後、アルスロバクター・ニコチアナエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ  ＸＭ６）（ＣＣＴＣＣ  Ｍ２０１０１６４）を加え、３０℃、１８０ｒｐｍで１６時間振とうして発酵培養し（ＯＤは約１０前後）、その後、８０００ｒｐｍで２０ｍｉｎ遠心し、上澄み酵素液を収集した。上澄み酵素液に含まれるフルクトシル化酵素は３０Ｕ／ｍＬであった。
【００６０】
４ｍＬの上澄み酵素液を、総体積２０ｍＬの２０．９ｇ／Ｌマンギフェリン、２００ｇ／Ｌサッカロース、２０％ＤＭＳＯを含むリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．８６）の２５０ｍＬ共栓三角フラスコに加え、３０℃、１８０ｒｐｍで振とう変換させ、９６時間後、４５℃で２時間加熱して変換反応を終結させた。変換液はＨＰＬＣにより：モノフルクトシル−β（２，６）−マンギフェリンが２１．９ｇ／Ｌ、ジフルクトシル−β（２，６）−マンギフェリンが８．２ｇ／Ｌ、フルクトシル化マンギフェリンの変換率が９７．８％に達することが検出された。
【００６１】
前記フルクトシル化マンギフェリンを含む変換液を１０倍に希釈後、ＡＢ−８マクロ孔質樹脂による吸着（クロマトグラフィーカラム２０×６００ｍｍ、流速１０ｍＬ／ｍｉｎ）を経て、その後、１０倍のカラムベッド体積でｐＨ４〜４．５の蒸留水（氷酢酸によりｐＨを調節）で残りのグリコシル供与体を洗い落とし、続いて５％〜３０％のメタノール溶液で勾配溶離し、それぞれフルクトシル化マンギフェリン（純度＞９７％）を得て、最後に１００％のメタノールで洗い落として色素及びマンギフェリンを除去した。純度＞９７％のフルクトシル化マンギフェリンをそれぞれ４５℃で回転蒸発又は冷凍乾燥させた後、モノフルクトシル−β（２，６）−マンギフェリン粉末或いは結晶体０．３６４ｇ、ジフルクトシル−β（２，６）−マンギフェリン粉末或いは結晶体０．１３６ｇを得た。
【００６２】
実施例３；異なる発酵及び変換条件が生成物形成に与える影響
４０ｍＬの発酵培養培地（培養基構成は表２を参照）を２５０ｍＬの三角フラスコに入れ、１２１℃の高圧蒸気で２０ｍｉｎ滅菌した後、アルスロバクター・ニコチアナエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ  ＸＭ６）（ＣＣＴＣＣ  Ｍ２０１０１６４）を加え、異なる発酵条件下（発酵条件は表２を参照）で振とうして発酵培養後、８０００ｒｐｍで２０ｍｉｎ遠心し、上澄み酵素液を収集した。上澄み酵素液に含まれるフルクトシル化酵素は１０〜１００Ｕ／ｍＬであった。２０％の上澄み酵素液を変換系に加え、異なる変換条件下（変換条件は表３を参照）、振とうして変換した後に４５℃で２時間加熱して変換反応を終結させ、変換液をＨＰＬＣにより分析した。
【００６３】
菌の発酵条件及び変換条件の相違は、マンギフェリングリコシル化生成物の形成にいずれも異なる影響を与え、表２及び表３は、異なる条件の下でマンギフェリングリコシル化反応を行う時の主な生成物、モノフルクトシル化マンギフェリン及びジフルクトシル基化マンギフェリンのモル転換率の変化を示している。
【００６４】
【表２】
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【００６５】
【表３】
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【００６６】
表３の結果から、非水相変換の利点は、変換系におけるマンギフェリン濃度を７０ｇ／Ｌまで増やせることにある。好ましい非水相変換条件の下、変換率は８７％に達し、変換生成物濃度は顕著に向上し（６２．７ｇ／Ｌマンギフェリンの場合、変換総生成物は７８．７ｇ／Ｌにまで達する）、かつ溶剤の選択と変換生成物の比率制御により、非水相変換のこれらの優勢は、工業化生産に有利となる。
【００６７】
実施例４；モノフルクトシル−β（２，６）−マンギフェリンの腫瘍細胞増殖に対する抑制作用実験
１．細胞株及び薬品
ヒトの慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２は、中国科学院上海細胞研究所細胞庫から購入し、マンギフェリンは、南京浄朗医薬科技有限責任公司より購入した。モノフルクトシル−β（２，６）−マンギフェリンは本発明の方法により調製し、高速液体クロマトグラフにより検出した純度は９９％以上であった。
【００６８】
２．実験薬物及び溶剤の調製
薬液の貯蔵：８．４４ｍｇのマンギフェリン粉末を秤取し、２ｍＬのＤＭＳＯに溶解させて、１０ｍｍｏｌ／Ｌのマンギフェリンを調製し；１１．６８ｍｇのモノフルクトシル−β（２，６）−マンギフェリン粉末を秤取し、２ｍＬのＤＭＳＯに溶解させて、１０ｍｍｏｌ／Ｌのモノフルクトシル−β（２，６）−マンギフェリンを調製し；０．２２μｍのフィルターで濾過して、１０００μＬ／ｄｏｆｆで個別包装して、−２０℃で保存して、同時に０．２２μｍフィルターで高濃度ＤＭＳＯを濾過し、対照グループのために備える。
【００６９】
細胞培養液：ＲＰＭ  Ｉ−１６４０培地（粉剤）を１包み取り、三回蒸留した蒸留水８００ｍＬの三回蒸留水（三回蒸留した蒸留水）に溶かし、マグネチックスターラーで少なくとも３０分間、完全に溶解するまで撹拌し、次いでＮａＨＣＯ３を２ｇ追加し、充分に溶解させた後、１Ｌに定容した。０．２２ｐｍ口径のフィルターで濾過して除菌し、血清を加え、血清の最終濃度を１０％にして、４℃で保存した。
【００７０】
ＰＢＳリン酸塩緩衝液：８００ｍＬ蒸留水中に、８ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＣｌ、１．４４ｇのＮａ２ＰＯ４と０．２４ｇのＫＨ２ＰＯ４を溶解し、ＨＣｌを使用して溶液のｐＨ値を７．４に調節し、水を加えて１Ｌに定容し、高圧蒸気で２０分滅菌し、低温で保存する。
【００７１】
ＭＴＴ応用液：５００ｍｇのＭＴＴ粉剤を秤取して、１００ｍＬのＰＢＳに加え、撹拌して溶解後、０．２２ｐｍ孔径のフィルターで濾過して除菌し、個別包装の後、４℃で光を避けて保存する。
【００７２】
三成分含有溶解溶液：ＳＤＳを２５ｇ、イソプロパノールを１２．５ｍＬ、濃塩酸を２．５ｍＬ取り、三回蒸留水を使用して１Ｌに定容し、低温で保存する。
【００７３】
３．主要な試薬と測定器具
高速液体クロマトグラフ（アメリカＤＩＯＮＥＸ社  型番：Ｐ６００）、マイクロプレートリーダ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社  型番：ｓｐｅｃｔｒａ  ＭＡＸ  １９０／ＧＥＭＩＮＩＸＳ）、ＣＯ２培養器（Ｆｏｒｍａ社  型番：３１１１）、低速遠心機（Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｔ  型番：ＰＩＣＯ−１７）、倒立顕微鏡（ｌｅｉｃａ社  型番：ＤＭＩＬ）、オービタルシェーカー（南京大学儀器（測定器具）公司  型番：ＴＹ−８０Ｓ）、仔牛血清（ＧｉｂａｃｏＢＲＬ社）、ＲＰＭＩ１６４０（アメリカＧｉｂｃｏ社）、ペニシリンＧナトリウム塩（ＡＭＲＥＳＣＯ社）、硫酸ストレプトマイシン（ＡＭＲＥＳＣＯ社）、トリプシン（ＡＭＲＥＳＣＯ社）、ＭＴＴ（ＡＭＲＥＳＣＯ社）。
【００７４】
４．細胞培養
Ｋ−５６２細胞は、ＲＰＭＩ−１６４０完全培地により、３７℃で５％ＣＯ２飽和湿度の培養器で培養した。該完全培地は、体積分率が１０％の不活化仔牛血清、１００Ｕペニシリン及びストレプトマイシンを含む。
【００７５】
５．実験方法
５．１  Ｋ５６２細胞毒性試験
対数増殖期のＫ−５６２細胞を取り、濃度を１×１０５個／ｍＬまで調整し、９６穴培養プレートに加え、各穴に細胞懸濁液を９０μＬずつ加えた。各実験グループは、異なる最終濃度（１、５、１０、２０、５０、１００、１５０、２００μｍｏｌ／Ｌ）のマンギフェリン又はモノフルクトシル−β（２，６）−マンギフェリンで処理し、各穴に薬を１０ｕＬ加えて、ＤＭＳＯ溶剤対照グループには２０μＬ  ＰＢＳ中に相応する薬物を含む溶剤を加え、ブランクコントロールグループには２０μＬ  ＰＢＳを加えた。各薬物濃度は６個の複孔を設けた。培養プレートを細胞培養器に戻し、４８時間後に２０μＬのＭＴＴ（５ｍｇ／ｍＬ）溶液を加え、引き続き培養器の中で４時間培養後、各穴に三成分含有溶解溶液１００ｕＬを加え、一晩結晶が充分溶解するのを待った。振とう器で２０分間振とうし、全自動マイクロプレートリーダを用いて４９０ｎｍの下で吸光度を測定し、平均抑制率を計算した。抑制率（％）＝（対照グループＡ４９０−実験グループＡ４９０）／対照グループＡ４９０）とし、重複して３回実験を行った。
【００７６】
統計処理
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００３ソフト内の関連分析と、Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定を使用し、データを表示した。
【００７７】
実験結果
７．１；マンギフェリン誘導体がヒトの慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２の増殖に与える影響
【００７８】
【表４】
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【００７９】
ＭＴＴ法で分析後の統計結果（表４参照）は、マンギフェリンと比べて、モノフルクトシル−β（２，６）−マンギフェリンは、作用から４８時間後にＫ５６２細胞の細胞数が顕著に減少することを説明している。同じ時間における対照グループと比較すると、モノフルクトシル−β（２，６）−マンギフェリンが低用量の１μｍｏｌ／Ｌの時にその結果に顕著的な差異があり（Ｐ＜０．０５）、用量が１５０及び２００μｍｏｌ／Ｌの時にこの差異は極めて顕著であり（Ｐ＜０．００１）、Ｋ５６２細胞の抑制率はそれぞれ３６．５３％及び４１．４８％に達した。モノフルクトシル−β（２，６）−マンギフェリンは、明らかにヒトの慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２の増殖を抑制することができ、Ｋ５６２細胞増殖の抑制作用はマンギフェリンを上回り、また、抑制率は用量の増加に伴い増加している。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１】
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【図６】
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【図９】
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【図１０】
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