(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種の上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）発現細胞の増殖を抑制するための細胞増殖抑制剤であって、
（１）以下の（Ａ）及び（Ｂ）にそれぞれ特徴を記載した抗体：
（Ａ）ＥＧＦＲに対して特異的に結合する人為的に製造された抗ＥＧＦＲ抗体であって、エピトープがＥＧＦＲの細胞外ドメインを構成する４つのサブドメインのうちのＮ末端側から数えて４番目のシステイン−リッチサブドメイン２（Ｃ２）にあってＮ末端側から数えて３番目のリガンド結合ドメイン２（Ｌ２）になく、
重鎖可変領域（ＶＨ領域）は、配列番号１に示すアミノ酸配列を有しており、且つ、
軽鎖可変領域（ＶＬ領域）は、配列番号２に示すアミノ酸配列を有している、抗ＥＧＦＲ抗体；
（Ｂ）ＥＧＦＲに対して特異的に結合する人為的に製造された抗ＥＧＦＲ抗体であって、エピトープがＥＧＦＲの細胞外ドメインを構成する４つのサブドメインのうちのＮ末端側から数えて１番目のリガンド結合ドメイン１（Ｌ１）にあってＮ末端側から数えて２番目のシステイン−リッチサブドメイン１（Ｃ１）になく、
重鎖可変領域（ＶＨ領域）は、配列番号３に示すアミノ酸配列を有しており、且つ、
軽鎖可変領域（ＶＬ領域）は、配列番号４に示すアミノ酸配列を有している、抗ＥＧＦＲ抗体；
のうちのいずれか一方若しくは両方の抗体と、
（２）少なくとも１種の薬学的に許容される担体と、
を含むことを特徴とする、細胞増殖抑制剤。
【請求項２】
前記抗体は、前記ＶＨ領域及び前記ＶＬ領域に加えてさらにヒト型ＩｇＧの重鎖定常領域（ＣＨ領域）と軽鎖定常領域（ＣＬ領域）とを含むヒト型ＩｇＧに形成されていることを特徴とする、請求項１に記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項３】
前記ＥＧＦＲ発現細胞がＫＲＡＳ遺伝子変異型の悪性腫瘍細胞である、当該ＫＲＡＳ遺伝子変異型の悪性腫瘍細胞の増殖を抑制するための請求項１又は２に記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項４】
上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に対して特異的に結合する人為的に製造された抗ＥＧＦＲ抗体であって、
エピトープがＥＧＦＲの細胞外ドメインを構成する４つのサブドメインのうちのＮ末端側から数えて４番目のシステイン−リッチサブドメイン２（Ｃ２）にあってＮ末端側から数えて３番目のリガンド結合ドメイン２（Ｌ２）になく、
重鎖可変領域（ＶＨ領域）は、配列番号１に示すアミノ酸配列を有しており、且つ、
軽鎖可変領域（ＶＬ領域）は、配列番号２に示すアミノ酸配列を有していることを特徴とする、抗ＥＧＦＲ抗体。
【請求項５】
上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に対して特異的に結合する人為的に製造された抗ＥＧＦＲ抗体であって、
エピトープがＥＧＦＲの細胞外ドメインを構成する４つのサブドメインのうちのＮ末端側から数えて１番目のリガンド結合ドメイン１（Ｌ１）にあってＮ末端側から数えて２番目のシステイン−リッチサブドメイン１（Ｃ１）になく、
重鎖可変領域（ＶＨ領域）は、配列番号３に示すアミノ酸配列を有しており、且つ、
軽鎖可変領域（ＶＬ領域）は、配列番号４に示すアミノ酸配列を有していることを特徴とする、抗ＥＧＦＲ抗体。
【請求項６】
前記ＶＨ領域及び前記ＶＬ領域に加えてさらにヒト型ＩｇＧの重鎖定常領域（ＣＨ領域）と軽鎖定常領域（ＣＬ領域）とを含む、ヒト型ＩｇＧに形成されていることを特徴とする、請求項４又は５に記載の抗ＥＧＦＲ抗体。
【請求項７】
少なくとも１種の上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）発現細胞の増殖をインビトロにおいて抑制する方法であって、
請求項４〜６のいずれかに記載の抗ＥＧＦＲ抗体を対象とするインビトロにおいて培養しているＥＧＦＲ発現細胞に付与することを特徴とする、細胞増殖抑制方法。
【請求項８】
前記インビトロにおいて培養しているＥＧＦＲ発現細胞がＫＲＡＳ遺伝子変異型の悪性腫瘍細胞である、当該ＫＲＡＳ遺伝子変異型の悪性腫瘍細胞の増殖を抑制するための請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項４又は５に記載の抗ＥＧＦＲ抗体を遺伝子工学的に製造するために使用されるポリヌクレオチド材料であって、以下の（１）または（２）：
（１）．配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と、配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列とを有する；
または、
（２）．配列番号３に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と、配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列とを有する；
の何れかを特徴とする、ポリヌクレオチド材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工的に設計された抗体とその利用に関する。詳しくは、ヒト細胞の上皮増殖因子受容体の細胞に特異的に結合する人工抗体とその利用に関する。
なお、本出願は２０１０年６月４日に出願された日本国特許出願２０１０−１２８６２３号に基づく優先権を主張しており、当該日本国出願の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
【背景技術】
【０００２】
上皮増殖因子（Epidermal Growth Factor：上皮成長因子ともいう。以下「ＥＧＦ」と記載する。）が細胞の表面に存在するレセプター（受容体）、即ち上皮増殖因子受容体（Epidermal Growth Factor Receptor：上皮成長因子受容体ともいう。以下「ＥＧＦＲ」と記載する。）の細胞外ドメインにリガンドとして結合することによって、細胞の成長や増殖が促進することが知られている。特に、ＥＧＦＲは種々の腫瘍細胞表面において過剰に発現しており、かかる腫瘍の増殖や悪性化に深く関わっていることが明らかになっている。
このため、ＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合をブロックしてＥＧＦＲの関与するシグナル伝達を遮断し、その結果として悪性腫瘍細胞の増殖を抑えることのできる薬剤、特にＥＧＦＲに特異的に結合する抗体（抗ＥＧＦＲ抗体）を主体とする抗体医薬（抗腫瘍剤）の開発が行われている。例えば、ＥＧＦと競合的にＥＧＦＲに結合し、それによってＥＧＦＲの活性化やダイマー化を阻み得る抗ＥＧＦＲ抗体として、マツズマブ（ＭＡＴＵＺＵＭＡＢ）やセツキシマブ（ＣＥＴＵＸＩＭＡＢ）が知られており、大腸癌等の悪性腫瘍細胞の増殖抑制（増殖阻害）に関して一定の効果をあげている。特許文献１には、従来のこの種の抗体の一例とその生産例が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】日本国特許公開公報第２００６−２５７９４号
【特許文献２】国際公開第ＷＯ２００３／０４４１９８号
【発明の概要】
【０００４】
しかしながら、上述したような従来の抗ＥＧＦＲ抗体（例えば上記セツキシマブ）は、ある種の大腸がんのようなＫＲＡＳ遺伝子変異型の悪性腫瘍細胞（がん細胞）に対しては効果（細胞増殖抑制作用）が極めて低く実質的に無効であることが報告されている。従って、このようなＫＲＡＳ遺伝子変異型の悪性腫瘍細胞に対しても細胞増殖抑制効果の高い抗体医薬の開発が望まれている。
そこで、本発明は、かかる従来の課題を解決すべく創出されたものであり、ＥＧＦＲを高率に発現する細胞であって例えば従来の抗体医薬が芳しい効果を上げられなかったＫＲＡＳ遺伝子変異型の細胞に対しても、好ましい細胞増殖抑制効果を奏する新たな細胞増殖抑制剤（細胞増殖阻害剤）の提供を目的とする。また、そのような細胞増殖抑制剤の成分として用いられる新たな抗ＥＧＦＲ抗体の創出を他の目的とする。また、本発明は、ここで開示される抗ＥＧＦＲ抗体を使用することにより、目的とするＥＧＦＲ発現細胞（特にはＫＲＡＳ遺伝子変異型の悪性腫瘍細胞）の増殖を抑制する（阻害する）方法の提供を他の目的とする。
【０００５】
ヒトの上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）の細胞外ドメイン（典型的には６２１アミノ酸残基から構成される。）は、さらに４つのサブドメイン、即ち、２４個のアミノ酸残基からなる分泌シグナル配列に続いてアミノ酸配列のＮ末端側から
（１）．「リガンド結合サブドメイン１（以下「Ｌ１ドメイン」という。：典型的には、上記シグナル配列に続くＮ末端から第２５番目〜第１８９番目までの１６５アミノ酸残基からなるドメイン）」、
（２）．「システインリッチサブドメイン１（以下「Ｃ１ドメイン」という。：典型的には、上記Ｌ１ドメインに続く第１９０番目〜第３３３番目までの１４４アミノ酸残基からなるドメイン）」、
（３）．「リガンド結合サブドメイン２（以下「Ｌ２ドメイン」という。：典型的には、上記Ｃ１ドメインに続く第３３４番目〜第５０５番目までの１７２アミノ酸残基からなるドメイン）」、
（４）．「システインリッチサブドメイン２（以下「Ｃ２ドメイン」という。：典型的には、上記Ｌ２ドメインに続く第５０６番目〜第６４５番目までの典型的には１４０アミノ酸残基からなるドメイン）」、
の順に並ぶ４つのサブドメインから構成されているところ、上記特許文献１に記載されているような従来の抗ＥＧＦＲ抗体は、主として上記（３）のＬ２ドメインに結合する性質を有する。
本発明者は、保有するファージライブラリー由来であり、従来のものとはエピトープが異なる抗ＥＧＦＲ抗体を人為的に作製し、得られた幾つかの抗ＥＧＦＲ抗体の単独又は組合せの使用により、従来は抗体医薬の使用では高い細胞増殖抑制効果が認められなかった所謂ＫＲＡＳ遺伝子変異型の細胞（例えば大腸がん細胞）の増殖を好適に抑制し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、ここで開示される一つの抗体は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に対して特異的に結合する人為的に製造された抗ＥＧＦＲ抗体であって、エピトープがＥＧＦＲの細胞外ドメインを構成する４つのサブドメインのうちのＮ末端側から数えて４番目のシステイン−リッチサブドメイン２（Ｃ２）にあり、
重鎖可変領域（ＶＨ領域）は、配列番号１に示すアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて成る前記特異的結合能を維持した改変アミノ酸配列を有しており、且つ、
軽鎖可変領域（ＶＬ領域）は、配列番号２に示すアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて成る前記特異的結合能を維持した改変アミノ酸配列を有していることを特徴とする抗ＥＧＦＲ抗体（以下「Ｃ２ドメイン結合性抗ＥＧＦＲ抗体」という。）である。
【０００７】
また、ここで開示される他の一つの抗体は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に対して特異的に結合する人為的に製造された抗ＥＧＦＲ抗体であって、エピトープがＥＧＦＲの細胞外ドメインを構成する４つのサブドメインのうちのＮ末端側から数えて１番目のリガンド結合ドメイン１（Ｌ１）にあり、
重鎖可変領域（ＶＨ領域）は、配列番号３に示すアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて成る前記特異的結合能を維持した改変アミノ酸配列を有しており、且つ、
軽鎖可変領域（ＶＬ領域）は、配列番号４に示すアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて成る前記特異的結合能を維持した改変アミノ酸配列を有していることを特徴とする抗ＥＧＦＲ抗体（以下「Ｌ１ドメイン結合性抗ＥＧＦＲ抗体」という。）である。
ここで「エピトープ」とは、対象とする抗ＥＧＦＲ抗体が認識するＥＧＦＲの結合部分であって、高い親和性（結合活性）を有する部分をいう。従って、例えば「エピトープがＬ１ドメイン（或いはＣ２ドメイン）にある」という場合は、対象とする抗ＥＧＦＲ抗体が、細胞外ドメインの他のサブドメインと比較して、高い親和性（特異性）をもって選択的に当該Ｌ１ドメイン（或いはＣ２ドメイン）に抗原抗体反応により結合することを意味する用語である。
【０００８】
本発明者により作製された上記Ｃ２ドメイン結合性抗ＥＧＦＲ抗体ならびにＬ１ドメイン結合性抗ＥＧＦＲ抗体は、ＫＲＡＳ遺伝子変異型の細胞（例えば大腸がん等の悪性腫瘍細胞）を包含する高ＥＧＦＲ発現細胞の増殖を好適に抑制することができる。従って、ここで開示される上記人工抗体によると、ＥＧＦＲ高発現細胞（例えばＫＲＡＳ遺伝子変異型のがん細胞）の増殖を抑制する効果の高い抗体医薬を提供することができる。
【０００９】
ここで開示される抗体として好ましい一態様は、前記ＶＨ領域及び前記ＶＬ領域に加えてさらにヒト型ＩｇＧの重鎖定常領域（ＣＨ領域）と軽鎖定常領域（ＣＬ領域）とを含む、ヒト型ＩｇＧに形成されていることを特徴とする。ヒト型ＩｇＧの構成とすることによって患者に対してより好適に使用することができる。
【００１０】
また、本発明は、ここで開示される抗ＥＧＦＲ抗体を使用して調製される細胞増殖抑制剤を提供する。
即ち、ここで開示される細胞増殖抑制剤は、少なくとも１種の上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）発現細胞の増殖を抑制するための細胞増殖抑制剤（細胞増殖阻害剤）であり、以下の（Ａ）及び（Ｂ）にそれぞれ特徴を記載した抗体：
（Ａ）Ｃ２ドメイン結合性抗ＥＧＦＲ抗体：
ＥＧＦＲに対して特異的に結合する人為的に製造された抗ＥＧＦＲ抗体であって、エピトープがＥＧＦＲの細胞外ドメインを構成する４つのサブドメインのうちのＮ末端側から数えて４番目のシステイン−リッチサブドメイン２（Ｃ２）にあり、
重鎖可変領域（ＶＨ領域）は、配列番号１に示すアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて成る前記特異的結合能を維持した改変アミノ酸配列を有しており、且つ、
軽鎖可変領域（ＶＬ領域）は、配列番号２に示すアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて成る前記特異的結合能を維持した改変アミノ酸配列を有している、抗ＥＧＦＲ抗体；
（Ｂ）Ｌ１ドメイン結合性抗ＥＧＦＲ抗体：
ＥＧＦＲに対して特異的に結合する人為的に製造された抗ＥＧＦＲ抗体であって、エピトープがＥＧＦＲの細胞外ドメインを構成する４つのサブドメインのうちのＮ末端側から数えて１番目のリガンド結合ドメイン１（Ｌ１）にあり、
重鎖可変領域（ＶＨ領域）は、配列番号３に示すアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて成る前記特異的結合能を維持した改変アミノ酸配列を有しており、且つ、
軽鎖可変領域（ＶＬ領域）は、配列番号４に示すアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて成る前記特異的結合能を維持した改変アミノ酸配列を有している、抗ＥＧＦＲ抗体；
のうちのいずれか一方若しくは両方の抗体を含む。また、典型的には、少なくとも１種の薬学的に許容される担体を含む。
好ましくは、細胞増殖抑制剤に含まれる抗体は、前記ＶＨ領域及び前記ＶＬ領域に加えてさらにヒト型ＩｇＧの重鎖定常領域（ＣＨ領域）と軽鎖定常領域（ＣＬ領域）とを含むヒト型ＩｇＧに形成されている。
【００１１】
ここで開示される細胞増殖抑制剤によると、エピトープが従来の抗ＥＧＦＲ抗体とは異なる上記Ｃ２ドメイン結合性抗ＥＧＦＲ抗体及び／又はＬ１ドメイン結合性抗ＥＧＦＲ抗体を抗体成分とすることにより、一般的な高ＥＧＦＲ発現細胞のみならず、ＫＲＡＳ遺伝子変異型の細胞の増殖を抑制（阻害）することができる。
従って、本発明によると、ＥＧＦＲ発現細胞としてＫＲＡＳ遺伝子変異型の悪性腫瘍細胞を対象とする、当該ＫＲＡＳ遺伝子変異型の悪性腫瘍細胞の増殖を抑制するための細胞増殖抑制剤を提供することができる。
【００１２】
また、本発明は、少なくとも１種の上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）発現細胞の増殖を抑制する方法であって、ここで開示されるＣ２ドメイン結合性抗ＥＧＦＲ抗体及び／又はＬ１ドメイン結合性抗ＥＧＦＲ抗体（好ましくはヒト型ＩｇＧに形成されているもの）を使用し、当該抗ＥＧＦＲ抗体を対象とするＥＧＦＲ発現細胞に付与することを特徴とする方法を提供する。
かかる細胞増殖抑制方法の好適な一態様として、ＥＧＦＲ発現細胞がＫＲＡＳ遺伝子変異型の悪性腫瘍細胞であり、当該ＫＲＡＳ遺伝子変異型の悪性腫瘍細胞の増殖を抑制するための方法が挙げられる。
【００１３】
また、本発明は、ここで開示される抗ＥＧＦＲ抗体を遺伝子工学的に製造するために使用される人為的に設計された種々のポリヌクレオチド（例えば後述する発現ベクターとして使用されるプラスミド）を提供する。典型的には、ここで開示される配列番号１〜４のうちの少なくとも一つの配列番号に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列にコードされたアミノ酸配列（即ち、ここで開示される何れかのＶＨ領域またはＶＬ領域を構成するアミノ酸配列）を備えるペプチドを発現するために人為的に設計されたポリヌクレオチドが本発明によって提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】図１Ａは、発現プラスミドベクター「ｐＨＩｇＨｚｅｏ」の概要を説明するプラスミドマップである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、発現プラスミドベクター「ｐＨＩｇＫｎｅｏ」の概要を説明するプラスミドマップである。
【図２】図２は、試験例で得られた各ＥＧＦＲ細胞外ドメイン欠失変異体ペプチドの欠失部分（左側）と、各供試抗体の結合する部分（右側）を示した図である。
【図３】図３は、時間経過に伴うＡ４３１細胞株の増殖に及ぼす各供試抗体の影響をAlamarBlue（登録商標）アッセイの結果で示すグラフである。
【図４】図４は、時間経過に伴うＡ５４９細胞株の増殖に及ぼす各供試抗体の影響をAlamarBlue（登録商標）アッセイの結果で示すグラフである。
【図５】図５は、時間経過に伴うＮＡ細胞株の増殖に及ぼす各供試抗体の影響をAlamarBlue（登録商標）アッセイの結果で示すグラフである。
【図６】図６は、時間経過に伴うＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株の増殖に及ぼす各供試抗体の影響をAlamar Blue（登録商標）アッセイの結果で示すグラフである。
【図７】図７は、Ａ５４９細胞株の増殖に及ぼす各供試抗体の異なる添加濃度（０．１，１，１０，１００μｇ／ｍＬ）における影響をAlamar Blue（登録商標）アッセイの結果で示すグラフである。
【図８】図８は、ＮＡ細胞株の増殖に及ぼす各供試抗体の異なる添加濃度（０．１，１，１０，１００μｇ／ｍＬ）における影響をAlamar Blue（登録商標）アッセイの結果で示すグラフである。
【図９】図９は、ＳＫ−ＯＶ３細胞株の増殖に及ぼす各供試抗体の異なる添加濃度（０．１，１，１０，１００μｇ／ｍＬ）における影響をAlamar Blue（登録商標）アッセイの結果で示すグラフである。
【図１０】図１０は、ＨＣＴ−１１６細胞株の増殖に及ぼす各供試抗体の異なる添加濃度（０．１，１，１０，１００μｇ／ｍＬ）における影響をAlamar Blue（登録商標）アッセイの結果で示すグラフである。
【図１１】図１１は、Ｃａｋｉ−２細胞株の増殖に及ぼす各供試抗体の異なる添加濃度（０．１，１，１０，１００μｇ／ｍＬ）における影響をAlamar Blue（登録商標）アッセイの結果で示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の好適な実施形態を説明する。なお、本明細書において特に言及している事項以外の事柄であって本発明の実施に必要な事柄（例えば遺伝子組み換え技術やタンパク質（抗体）の精製、或いはバイオアッセイに関する一般的事項）は、細胞工学、医学、薬学、有機化学、生化学、遺伝子工学、タンパク質工学、分子生物学等の分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。
本発明は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。
また、本明細書中で引用されている全ての文献の全ての内容は本明細書中に参照として組み入れられている。
【００１６】
本明細書において「人為的に製造された抗体」とは、ヒト又は動物の体内における自然な免疫反応により産生された抗体とは異なり、典型的には遺伝子工学的手法により人為的に製造された抗体をいう。
ここで「抗体」とは、典型的には重鎖と軽鎖とから構成される免疫グロブリンを示す用語であるが、ネイティブな構造の免疫グロブリン分子（典型的にはＩｇＧ、例えばヒト型のＩｇＧ）の他、種々のフラグメント抗体、例えばＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ’）２フラグメントを包含する。
また、本明細書においての「抗体」は、遺伝子工学的手法によって形成され得る抗体分子を包含する。例えば、単一のペプチド鎖上にＶＬ領域を構成するアミノ酸配列とＶＨ領域を構成するアミノ酸配列とを備える人為的に製造されたいわゆる単鎖抗体（ｓｃＦｖ）もここでいう「抗体」に包含される。
また、本明細書において「アミノ酸残基」とは、特に言及する場合を除いて、ペプチド鎖のＮ末端アミノ酸及びＣ末端アミノ酸を包含する用語である。
また、本明細書において上記ＶＨ領域若しくはＶＬ領域を構成する所定のアミノ酸配列について「改変アミノ酸配列」とは、当該所定のアミノ酸配列が有する抗原結合能を損なうことなく、１〜数個（例えば１個又は２個又は３個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成されたアミノ酸配列をいう。例えば、１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が保守的に置換したいわゆる同類置換（conservative amino acid replacement）によって生じた配列（例えば塩基性アミノ酸残基が別の塩基性アミノ酸残基に置換した配列や酸性アミノ酸残基が別の酸性アミノ酸残基に置換した配列）、或いは、所定のアミノ酸配列について１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が付加（挿入）した若しくは欠失した配列等は、本明細書でいうところの改変アミノ酸配列に包含される典型例である。
また、本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、複数のヌクレオチドがリン酸ジエステル結合で結ばれたポリマー（核酸）を指す用語であり、ヌクレオチドの数によって限定されない。種々の長さのＤＮＡフラグメントが本明細書におけるポリヌクレオチドに包含される。
また、「人為的に設計されたポリヌクレオチド」とは、そのヌクレオチド鎖（全長）がそれ単独で自然界に存在するものではなく、化学合成或いは生合成（即ち遺伝子工学に基づく生産）によって人為的に合成されたポリヌクレオチドをいう。例えば、ここで開示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む組換えプラスミドＤＮＡ、組換えファージＤＮＡ等は、本明細書における人為的に設計されたポリヌクレオチドに包含される典型例である。
【００１７】
本発明によって提供される細胞増殖抑制剤は、本発明者によって創出された少なくとも１種の抗体（即ちＣ２ドメイン結合性抗ＥＧＦＲ抗体及び／又はＬ１ドメイン結合性抗ＥＧＦＲ抗体）を含み、少なくとも１種のＥＧＦＲ発現細胞の増殖を抑えることにより特徴付けられる組成物であり、その他の含有成分や薬剤としての調製法、保存法、使用法、等は従来の抗体医薬（抗体を含む薬学上の組成物）と同様でよく、特に限定されない。例えば、薬学的に許容される担体として、生理食塩水、ＰＢＳその他のバッファー類、リンゲル溶液等が挙げられる。また、添加剤として、各種の抗生物質、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、キレート剤、色素、保存料、各種のビタミンや酵素等が挙げられる。
【００１８】
本発明者は、本発明者らが構築・保有するファージ提示型の単鎖抗体ライブラリー（この種のライブラリーの製造例は上記特許文献２が参考になる。）から既知の抗ヒトＥＧＦＲモノクローナル抗体をいわゆるガイド分子として使用したスクリーニングを行うことによって、従来の抗ＥＧＦＲ抗体とはエピトープの異なる新たな単鎖抗体（ｓｃＦｖ）を複数種類選抜し、それらｓｃＦｖの可変領域に対応するアミノ酸配列ならびに該アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を同定することによって本発明を完成するに至った。
即ち、ここで開示される一つの好適な抗ＥＧＦＲ抗体（Ｃ２ドメイン結合性抗ＥＧＦＲ抗体）は、ＶＨ領域に配列番号１に示すアミノ酸配列（或いはその改変アミノ酸配列）を有すること、及び／又は、ＶＬ領域に配列番号２に示すアミノ酸配列（或いはその改変アミノ酸配列）を有すること、によって特徴付けられる抗体であり、エピトープをＣ２ドメインに有する新規な人為的に作製された抗体である。
また、ここで開示される他の一つの好適な抗ＥＧＦＲ抗体（Ｌ１ドメイン結合性抗ＥＧＦＲ抗体）は、ＶＨ領域に配列番号３に示すアミノ酸配列（或いはその改変アミノ酸配列）を有すること、及び／又は、ＶＬ領域に配列番号４に示すアミノ酸配列（或いはその改変アミノ酸配列）を有すること、によって特徴付けられる抗体であり、エピトープをＬ１ドメインに有する新規な人為的に作製された抗体である。
【００１９】
ここで開示される抗体は、エピトープに結合する可変領域のアミノ酸配列が明らかであるため、遺伝子工学的手法によって容易に製造することができる。
例えば、上記ライブラリーから得られた単鎖抗体（ｓｃＦｖ）の状態でも抗体医薬として十分使用することができるが、生体内での結合親和性の向上や物理的安定性を付与するために完全型の抗体（例えばヒト型ＩｇＧ）に形成されることが好ましい。後述する実施例に示すように、ｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドベクターからＶＨ領域をコードするヌクレオチド配列（ＶＨ遺伝子）とＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列を（ＶＬ遺伝子）を一般的なＰＣＲ技法を用いて増幅し、これを定常領域（ＣＨ領域及びＣＬ領域）を有する抗体発現ベクター（プラスミド等）に導入し、所定の宿主細胞（典型的にはＣＨＯ細胞（Chinese Hamster Ovary Cell）等の動物細胞）で発現させることにより、容易に製造することができる。
従って、本発明は、ここで開示されるＶＨ領域及び／又はＶＬ領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド情報（即ちヌクレオチド配列）を利用することを特徴とする、抗ＥＧＦＲ抗体の製造方法を提供するものである。
【００２０】
ここで開示される細胞増殖抑制剤は、本発明者が創出した少なくとも一種のＣ２ドメイン結合性抗ＥＧＦＲ抗体及び／又はＬ１ドメイン結合性抗ＥＧＦＲ抗体を抗体成分として使用する結果、後述する実施例からも明らかなように、従来のこの種の抗体が無効であったＫＲＡＳ遺伝子変異型の高ＥＧＦＲ発現細胞（例えば転移性大腸癌の細胞）に対してもＫＲＡＳ遺伝子無変異型の高ＥＧＦＲ発現細胞と同様に、その細胞増殖を効果的に抑制することができる。
従って、本発明によると、ここで開示される少なくとも一種のＣ２ドメイン結合性抗ＥＧＦＲ抗体及び／又はＬ１ドメイン結合性抗ＥＧＦＲ抗体（即ち該抗体を含む薬剤組成物）を患者に投与することを特徴とする、転移性大腸癌のようなＫＲＡＳ遺伝子変異型の高ＥＧＦＲ発現細胞からなる悪性腫瘍を制御する方法を提供することができる。
【００２１】
なお、ここで開示される細胞増殖抑制剤の患者への投与量や投与頻度或いは投与の態様（経口投与、皮下注射、静脈内注射、灌腸、等）は、対象とする患者（症状）の状態や、投与先（悪性腫瘍）の形態ならびに使用する細胞増殖抑制剤（薬剤組成物）の形状、抗体の形態（例えばｓｃＦｖか或いは完全ヒト型ＩｇＧかなど）、含まれる抗体の濃度、抗体以外の副成分の有無やその濃度、等によって適宜異なり得る設計事項である。当業者は事情に応じて周知技術である抗体エンジニアリングの知見に加えて薬学上、臨床医学上、生理学上或いは衛生学上の知見に基づいて、適切な形態の細胞増殖抑制剤を調製し得、さらに所定の患者の体内或いは患者から取り出した組織や細胞の培養物に適切な形態の細胞増殖抑制剤（抗体医薬）を適切な量で投与（添加）することができる。このこと自体は、本発明を特徴付けるものではないため、これ以上の詳細な説明は省略する。
【００２２】
以下の実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明を以下の実施例に記載のものに限定することを意図したものではない。
【００２３】
＜試験例１：抗ＥＧＦＲ抗体の製造＞
予め用意してあったファージ提示型単鎖抗体（ｓｃＦｖ）ライブラリーに対し、発明者らが創出したマウス由来の抗ヒトＥＧＦＲモノクローナル抗体であって現在では市販もされている「Ｂ４Ｇ７」モノクローナル抗体をガイド分子とするスクリーニングを実施し、ガイド分子の近傍に結合するｓｃＦｖ提示ファージを選択的に回収し、最終的には計４つの新規な抗ＥＧＦＲ単鎖抗体（ｓｃＦｖ）と該抗体をコードする遺伝子が得られた。
【００２４】
得られたｓｃＦｖ遺伝子を所定のプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅し、ＶＨ領域のヌクレオチド配列と該配列にコードされるアミノ酸配列、ならびにＶＬ領域のヌクレオチド配列と該配列にコードされるアミノ酸配列を同定した。
得られた４つの抗体試料（サンプルＮｏ．４５、Ｎｏ．３８、Ｎｏ．４０、Ｎｏ．４２とする。）についてのアミノ酸配列ならびにヌクレオチド配列情報は以下のとおり。
【００２５】
【表１】
0005965838.tif 000002
【００２６】
【表２】
0005965838.tif 000003
【００２７】
【表３】
0005965838.tif 000004
【００２８】
【表４】
0005965838.tif 000005
【００２９】
次に、上記得られた各サンプルｓｃＦｖの配列情報を利用して、ヒト型ＩｇＧを遺伝子組換え技法により作製した。
図１Ａのプラスミドマップに示す発現プラスミドベクター「ｐＨＩｇＨｚｅｏ」ならびに図１Ｂのプラスミドマップに示す発現プラスミドベクター「ｐＨＩｇＫｎｅｏ」を使用した。ｐＨＩｇＨｚｅｏの全ヌクレオチド配列を配列番号１７に示し、ｐＨＩｇＫｎｅｏの全ヌクレオチド配列を配列番号１８に示す。
図１Ａのプラスミドマップに示すように、ｐＨＩｇＨｚｅｏは、ヒト型ＩｇＧ１の重鎖定常領域（ＣＨ領域）をコードする遺伝子（ＣＨ１〜ＣＨ３）を有している。他方、図１Ｂのプラスミドマップに示すように、ｐＨＩｇＫｎｅｏは、ヒト型ＩｇＧ１の軽鎖（κ鎖）定常領域（ＣＬ領域）をコードする遺伝子（ＣＫ１）を有している。これらプラスミドベクターは、図示されるように、２箇所の制限酵素Ｅｓｐ３Ｉの切断サイト（Ｅｓｐ３Ｉの認識部位は、配列番号１７の第６１９位〜第６２５位のａｇａｇａｃｇと第２３３６位〜第２３４１位のｇｔｃｔｃｇ、配列番号１８の第６２２位〜第６２７位のｇａｇａｃｇと第２３１９位〜第２３２４位のｇｔｃｔｃｇに認められる。）を有しており、当該Ｅｓｐ３Ｉで処理することにより開裂した部位（切断サイト）に、目的とするＶＨ領域アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（以下「ＶＨコード遺伝子」という。）あるいは、ＶＬ領域アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（以下「ＶＬコード遺伝子」という。）を挿入することができる。
具体的には、Ｅｓｐ３Ｉで酵素処理した各プラスミドベクター５０ｎｇに対して、いずれかのサンプルＮｏ．のＶＨコード遺伝子およびＶＬコード遺伝子をそれぞれ１０ｎｇ添加し、市販(Clontech社製品）のIn-Fusion Advantage PCR Cloning Kitを製品マニュアルに準じて使用することにより、目的のＶＨコード遺伝子（即ち、配列番号９、１１、１３、１５に示すいずれかのヌクレオチド配列）がＥｓｐ３Ｉ切断サイトに組み込まれた組換えｐＨＩｇＨｚｅｏを得た。同様に、目的のＶＬコード遺伝子（即ち、配列番号１０、１２、１４、１６に示すいずれかのヌクレオチド配列）がＥｓｐ３Ｉ切断サイトに組み込まれた組換えｐＨＩｇＫｎｅｏを得た。
【００３０】
次いで、得られた各組換え発現ベクターを一般的なコンピテントセルである大腸菌ＴＯＰ１０コンピテントセルに導入し、５０μｇ／ｍＬ濃度となるようにゼオシン（Zeocin）若しくはカナマイシン（Kanamycin）を添加した１０％シュクロース含有ＳＯＢ培地プレート上で形質転換体をセレクトした。
次いで、目的の遺伝子（インサート）が正しくインフュージョンされたポジティブクローン、即ちＶＨ組換えｐＨＩｇＨｚｅｏとＶＬ組換えｐＨＩｇＫｎｅｏとを得るべく、２セットのプライマー、即ちＶＨ側については配列番号１９で示すｐＦＵＳＥｓｅｑ−ｆと配列番号２０で示すＣＨｓｅｑ−ｒとのセット、ＶＬ側については配列番号２１で示すＩｇＫｓｓ−ｆと配列番号２２で示すＣｋｓｅｑ−ｒとのセットを用いてコロニーＰＣＲを行い、インサートチェックを行った。
次いで、正しくインサートがインフュージョンされたポジティブクローン（大腸菌ＴＯＰ１０）を単離し、１０％シュクロース含有ＳＯＢ培地にて増殖させた。
【００３１】
こうして得られた組換え発現ベクターのうち、対象とする各サンプル（Ｎｏ．４５、３８、４０、４２）に正しく対応するＶＨ組換えｐＨＩｇＨｚｅｏとＶＬ組換えｐＨＩｇＫｎｅｏとを等量混合したものを市販（invitrogen社製品）のFreeStyle（商標）ＣＨＯ−Ｓ細胞に導入し、常法に基づいて当該細胞を培養し、二価抗体である完全ヒト型ＩｇＧ（ｈＩｇＧ）を製造した。以下、上記４種のｓｃＦｖサンプルにそれぞれ対応して得られたＩｇＧを、上記サンプル番号を引用してｈＩｇＧ４５、ｈＩｇＧ３８、ｈＩｇＧ４０、ｈＩｇＧ４２とする。
【００３２】
＜試験例２：エピトープ存在領域の確認＞
上記得られた４種の人為的に製造された抗ＥＧＦＲ抗体（ヒト型ＩｇＧ）のＥＧＦＲの結合部分について調べた。
即ち、適当なプライマーを用いたＰＣＲ技法により、ＥＧＦＲの細胞外ドメインのうちの上記４つのサブドメイン（Ｌ１、Ｃ１、Ｌ２、Ｃ２）の何れかを欠失させたＥＧＦＲ細胞外ドメイン欠失変異体ペプチドをコードする遺伝子を計４種類作製した。また、欠失なしのＥＧＦＲ細胞外ドメインペプチドをコードする遺伝子も作製した。
かかる遺伝子を組み込んだ発現ウイルスベクターを構築し、ＢＪ細胞をトランスフェクトすることにより、上記ＥＧＦＲ細胞外ドメイン欠失変異体ペプチドあるいは欠失なしのＥＧＦＲ細胞外ドメインペプチドを発現するＢＪ細胞を得た。
図２の左側は、各ＥＧＦＲ細胞外ドメイン欠失変異体ペプチドの欠失部分を示す図である。この図のΔで示す部位（数字はＮ末端から数えたときの欠失アミノ酸残基の位置と範囲を示す）が欠失部分である。なお、図示されるように、本試験例で構築したＥＧＦＲ細胞外ドメインペプチドは何れもＮ末端側にシグナル配列（ＳＳ）を有し且つＣ末端側にＥＧＦＲの膜貫通ドメイン（ＴＭ）を有すると共にさらにそのＣ末端側にＶ５−ｔａｇが付与されるように構築されている。
【００３３】
而して、ＢＪ細胞で発現された上記ＥＧＦＲ細胞外ドメイン欠失変異体ペプチドあるいは欠失なしのＥＧＦＲ細胞外ドメインペプチドを使用し、試験例１で得られたｈＩｇＧ４５、ｈＩｇＧ３８、ｈＩｇＧ４０、ｈＩｇＧ４２、更に比較対象として市販の抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体である「Ｂ４Ｇ７」及び「セツキシマブ」を用いて一般的なウェスタンブロット解析を行った。
本ウェスタンブロットにおける供試抗体の各供試ペプチドに対する結合能の対比解析、即ち細胞外ドメインを構成する４つのサブドメインのうちのどのサブドメインが欠失した場合に結合力を失うかの解析によって、図２の右側に示すように、各供試抗体の結合する部分が明らかとなった。図２の右側における各供試抗体の欄の＋で示す位置に対応する図２左側の欠失サブドメインが当該抗体の結合部分である。
即ち、図２に示す結果から明らかなように、試験例１で得られたｈＩｇＧ４５の結合部分（エピトープ）はＣ２ドメインにあり、ｈＩｇＧ３８の結合部分（エピトープ）はＬ１ドメインにあり、ｈＩｇＧ４０の結合部分（エピトープ）はＣ１ドメインにあり、そしてｈＩｇＧ４２の結合部分（エピトープ）はＣ２ドメインにあることが確認された。
【００３４】
＜試験例３：各抗ＥＧＦＲ抗体の細胞増殖抑制（阻害）性能の評価（１）＞
次に、得られた各抗体を種々の培養細胞に供給し、その細胞増殖抑制（阻害）性能をインビトロの細胞培養試験において評価した。使用したセルライン（細胞株）は、いずれも公知のＡ４３１、Ａ５４９、ＮＡ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の４種である。即ち、Ａ４３１はヒト扁平上皮がん細胞株、Ａ５４９はヒト扁平上皮肺がん細胞株、ＮＡはヒト口腔扁平上皮がん細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１はヒト乳がん細胞株である。
具体的には、細胞増殖測定用色素である「Alamar Blue（登録商標）：invitrogen社製品」を使用して、上記細胞株に対して所定濃度の抗体を添加し、所定培養時間（２４時間、４８時間、７２時間）経過した後の細胞増殖の程度を上記色素のＯＤ値で測定した。
即ち、１×１０４セル／ウェルの細胞濃度となるように１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ培地を含む９６ウェルプレートの各ウェルに細胞を播種し、対数増殖中期になるまで３７℃、５％ＣＯ２条件下で２日間培養した。次いでＦＣＳフリーＤＭＥＭ培地（培地の色による影響をなくすためにフェノールレッドを含まないもの）に交換し、さらに一晩培養を継続した。次いで、０．１％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地に交換するとともに、所定濃度（ここでは０．１μｇ／ｍＬ若しくは１０μｇ／ｍＬ）で供試抗体のいずれかを添加し、培養を継続した。比較対照として抗体無添加のものと、上記Ｂ４Ｇ７抗体を同濃度で添加したものを設けた。また、色素Alamar Blue（登録商標）は、ウェルあたり最終濃度１０％となるように添加しておいた。
【００３５】
抗体添加後、２４時間、４８時間そして７２時間経過後に、それぞれ、一般的な分光光度計を用いて５７０ｎｍと６００ｎｍの吸光度を測定した。結果を、図３（Ａ４３１細胞株）、図４（Ａ５４９細胞株）、図５（ＮＡ細胞株）、図６（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株）に示す。これらのグラフから明らかなように、供試抗体のうち、ＩｇＧ４５とＩｇＧ３８については、ＥＧＦＲを比較的高率に発現するＡ４３１細胞株、Ａ５４９細胞株、ＮＡ細胞株に対して顕著な細胞増殖抑制（阻害）効果が認められた。特にＫＲＡＳ遺伝子変異型の悪性腫瘍細胞由来のＡ５４９細胞株に対しても高い細胞増殖抑制（阻害）効果が認められた。図２に示すように、ＩｇＧ４２とＩｇＧ４５は、見かけ上では同じ部位（即ちＣ２ドメイン）に結合するものであるのに、上述のように細胞株に対する反応が異なったのは、ＩｇＧ４２とＩｇＧ４５それぞれの実際のエピトープがＣ２ドメインにおける２つの異なるより狭い部位にあることによると解される。このことは、従来の抗ＥＧＦＲ抗体（例えば本試験例の比較対照であるＢ４Ｇ７）では効果が認められなかったＡ５４９のようなＫＲＡＳ遺伝子変異型の悪性腫瘍に対してＩｇＧ４５及び／又はＩｇＧ３８が有効な抗体医薬として作用し得ることを示すものである。
【００３６】
＜試験例４：各抗ＥＧＦＲ抗体の細胞増殖抑制（阻害）性能の評価（２）＞
次に供試抗体の細胞増殖抑制能に関する濃度（用量）依存性（Dose
Dependency）を調べるため、上記と同様のAlamar Blue（登録商標）アッセイを行い、各抗体の添加濃度（０．１，１，１０，１００μｇ／ｍＬ）における細胞生存率（％）を調べた。
使用したセルラインは上述のＡ５４９、ＮＡに加えて新たにＳＫ−ＯＶ３（ヒト卵巣腫瘍細胞株）、ＨＣＴ−１１６（ヒト大腸がん細胞株）、Ｃａｋｉ−２（ヒト腎がん細胞株）の各細胞株を使用した。
なお、吸光度測定は、上記試験例３で説明した培養条件で所定量の抗体を添加後、７２時間経過した時点で行った。細胞生存率（％）は、以下の式：
生存率（％）＝［（抗体無添加処理の標準ＯＤ値−ＩｇＧ添加処理の標準ＯＤ値）／抗体無添加処理の標準ＯＤ値］×１００
【００３７】
結果を図７（Ａ５４９細胞株）、図８（ＮＡ細胞株）、図９（ＳＫ−ＯＶ３細胞株）、図１０（ＨＣＴ−１１６細胞株）、図１１（Ｃａｋｉ−２細胞株）に示す。
これらのグラフから明らかなように、供試抗体のうち、ＩｇＧ４５とＩｇＧ３８については、ＥＧＦＲを比較的高率に発現し、ＫＲＡＳ遺伝子が変異した悪性腫瘍細胞に対して顕著な細胞増殖抑制（阻害）効果を低濃度（典型的には１μｇ／ｍＬ以上の濃度、特に１０μｇ／ｍＬ以上の濃度）から安定して発揮させ得ることが認められた。
【００３８】
以上の試験例により、本発明によって提供される有用な抗ＥＧＦＲ抗体（即ちＩｇＧ４５ならびにＩｇＧ３８）の好適なものを説明したが、この形態に限られない。例えば、上記完全ヒト型ＩｇＧ４５や完全ヒト型ＩｇＧ３８から一般的な酵素処理で得られるＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ’）２フラグメントもここで開示される本発明の抗体に包含される典型例である。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
上述のように、ここで開示される抗ＥＧＦＲ抗体は、特にＫＲＡＳ遺伝子が変異した悪性腫瘍細胞（高ＥＧＦＲ発現細胞）に対して高い細胞増殖抑制（阻害）活性を有しているため、該抗体を含む細胞増殖抑制剤は、例えば抗がん剤等の医薬用途の組成物として利用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００４０】
配列番号１〜配列番号８  合成されたペプチド
配列番号９、１１、１３、１５  人工ＩｇＧの重鎖可変領域
配列番号１０、１２，１４、１６  人工ＩｇＧの軽鎖可変領域
配列番号１７、１８  プラスミドＤＮＡ
配列番号１９〜２２  プライマー
【図１Ａ】
0005965838.tif 000006
【図１Ｂ】
0005965838.tif 000007
【図２】
0005965838.tif 000008
【図３】
0005965838.tif 000009
【図４】
0005965838.tif 000010
【図５】
0005965838.tif 000011
【図６】
0005965838.tif 000012
【図７】
0005965838.tif 000013
【図８】
0005965838.tif 000014
【図９】
0005965838.tif 000015
【図１０】
0005965838.tif 000016
【図１１】
0005965838.tif 000017
【配列表】
0005965838000001.app