(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体またはそれらのフラグメントであって、
該抗体および該フラグメントが、黄色ブドウ球菌エピトープに対するものであり、
該エピトープが、DSM ACC2987の受託番号のもとにＤＳＭＺに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって分泌されるモノクローナル抗体によって認識され、
前記エピトープが、黄色ブドウ球菌で露出しており、配列番号１５、１７〜１９、２１〜２６、３２〜３４および５７の配列の１つを有するアミノ酸と、少なくとも１３のアミノ酸において同一のアミノ酸配列を少なくとも１包含し、
前記抗体およびそれらのフラグメントが、第一の可変領域を有する重鎖および第二の可変領域を有する軽鎖を有し、
該第一の可変領域が、配列番号２の配列を包含し、該第二の可変領域が、配列番号４の配列を包含する、前記抗体またはそれらのフラグメント。
【請求項２】
抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体またはフラグメント。
【請求項３】
モノクローナル抗体またはDSM ACC2987の受託番号のもとにＤＳＭＺに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって分泌されるモノクローナル抗体が、ＩｇＧ型の抗体である、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ／ｃフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のフラグメント。
【請求項５】
抗体が、動物の抗体、ヒト抗体、植物、卵または真菌で生産される抗体、細胞株の細胞で生産される組み換え抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメント。
【請求項６】
エピトープが、配列番号１５、１７〜１９、２１〜２６、３２〜３４および５７の配列の１つを有するアミノ酸と、少なくとも１４のアミノ酸において同一のアミノ酸配列を少なくとも１包含する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメント。
【請求項７】
薬剤として用いる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントを含む組成物。
【請求項８】
薬剤が、黄色ブドウ球菌の感染を有するヒトまたは動物の処置に用いられる、請求項７に記載の抗体またはフラグメントを含む組成物。
【請求項９】
ヒトまたは動物が、感染が原因による乳腺炎または敗血症を有する、請求項８に記載の抗体またはフラグメントを含む組成物。
【請求項１０】
抗体またはフラグメントが、黄色ブドウ球菌の少なくとも１の追加的なエピトープに対する他の抗体またはこれら他の抗体のフラグメントとの混合物中に存在する、請求項７〜９のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントを含む組成物。
【請求項１１】
抗体またはフラグメントが、少なくとも１の抗生物質との混合物中に存在する、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントを含む組成物。
【請求項１２】
抗体またはフラグメントが、哺乳動物の血漿との混合物中に存在する、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントを含む組成物。
【請求項１３】
薬剤が、全身および／または局所適用のための薬剤である、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントを含む組成物。
【請求項１４】
黄色ブドウ球菌の検出のための請求項１〜６のいずれか一項に記載する抗体またはフラグメントを含む、キット。
【請求項１５】
黄色ブドウ球菌の検出のための請求項１〜６のいずれか一項に記載する抗体またはフラグメントの使用。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか一項に記載する抗体を生産する、ハイブリドーマ生産株。
【請求項１７】
ハイブリドーマ細胞株が、DSM ACC2987の受託番号のもとにＤＭＳＺに寄託された細胞株である、請求項１６に記載のハイブリドーマ細胞株。
【請求項１８】
動物（ヒトを除く）の処置方法であって、動物（ヒトを除く）が、黄色ブドウ球菌の感染を有するか、または該感染を受けるリスクがあり、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントを該動物（ヒトを除く）に投与する、前記方法。
【請求項１９】
動物（ヒトを除く）が、感染が原因による乳腺炎または敗血症を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
抗体またはフラグメントが、黄色ブドウ球菌の少なくとも１の追加的なエピトープに対する他の抗体またはこれら他の抗体のフラグメントとの混合物中に存在する、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
抗体またはフラグメントが、投与される前に、哺乳動物の血漿との混合物中に存在する、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
抗体またはフラグメントが、全身的に投与される、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
抗体またはフラグメントが、少なくとも１の抗生物質とともに投与される、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus（＝S. aureus））エピトープに対する抗体またはそれらのフラグメント、これら抗体またはフラグメントを含むキット、これら抗体またはフラグメントの使用、これら抗体を生産するハイブリドーマ細胞株および処置の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
FEMS Imunol. Med. Microbial. 2000 Oct.; 29(2), pages 145 to 153では、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus（ＭＲＳＡ））が原因による敗血症の間にインビボで発現した免疫優性構造が知られている。これら構造は、２９ｋＤａタンパク質ＩｓａＡおよび１７ｋＤａタンパク質ＩｓａＢである。これらタンパク質が、ＭＲＳＡに対する抗体ベースの治療の開発のための潜在的なターゲットとして役立つかもしれないことが述べられている。
【０００３】
Ohlsen, Kらの"Development of antibody-based therapy targeting immunodominant antigens of Staphylococcus aureus"、the 59th annual conference of the Deutsche Gesellschaft fuer Hygiene und Mikrobiologie e.V. on September 2007の公表となった要旨集の１２８頁およびLorenz, Uらの"Therapeutische Effektivitaet von monoklonalen Antikoerpern gegen Staphylococcus aureus in einem Sepsis- und Abszess-Mausmodell", Chirurgisches Forum 2008, Springer Berlin Heidelberg, 29th May 2008, issue 17, pp. 225-226では、２つの動物感染モデルにおいて、免疫優性抗原ＩｓａＡをターゲットする最初のマウスモノクローナル抗体の適用が知られている。該研究は、抗ＩｓａＡ ＭＡＢの適用が、両感染モデルにおいて、感染負荷を下げることを明らかにした。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、黄色ブドウ球菌が原因による感染の処置および黄色ブドウ球菌の検出のために十分に適切である、新規な抗体またはそれらのフラグメントを提供することである。さらに、これら抗体またはフラグメントを含むキット、これら抗体またはフラグメントの使用、これら抗体またはフラグメントを分泌するハイブリドーマ細胞株および処置の方法が提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
この目的は、請求項１、８、１５、１６、１７および１９の主題によって解決される。本発明の態様は、請求項２〜７、９〜１４、１８および２０〜２４に開示される。
【０００６】
本発明によると、抗体またはそれらのフラグメントが提供され、ここで、該抗体またはフラグメントは、DSM ACC2987またはDSM ACC2988の受託番号のもとに、"Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany"（ＤＳＭＺ）に寄託されたハイブリドーマ細胞株によって分泌される、さらなるモノクローナル抗体によって認識される黄色ブドウ球菌エピトープに対する。受託番号DSM ACC2987のもとにDSMZに寄託されたハイブリドーマ細胞株は、さらに「細胞株DSM ACC2987」として示し、受託番号DSM ACC2988のもとにDSMZに寄託されたハイブリドーマ細胞株は、さらに「細胞株DSM ACC2988」として示す。細胞株DSM ACC2987およびDSM ACC2988によって分泌されるさらなるモノクローナル抗体は、モノクローナルマウス抗体である。
【０００７】
本発明による抗体は、完全な免疫グロブリン分子、好ましくはＩｇＭｓ、ＩｇＤｓ、ＩｇＥｓ、ＩｇＡｓまたはＩｇＧｓであり、より好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４を包含する一方で、フラグメントは、ＦａｂフラグメントまたはＶ−、ＶＨ−またはＣＤＲ−領域のような、かかる免疫グロブリン分子の部分を包含する。さらに、抗体は、キメラのおよびヒト化した抗体のような、修飾および／または変化した抗体を包含する。抗体は、修飾または変化したモノクローナルまたはポリクローナル抗体、ならびに、組み換えもしくは合成的に産生したまたは合成した抗体も包含する。フラグメントは、抗体フラグメント、ならびに、分離した軽鎖および重鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ／ｃ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２のような、それらの部分も包含する。本発明の抗体は、二機能性抗体（bifunctional antibodies）のような抗体派生物、および、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、二重特異性（bispecific）ｓｃＦｖｓまたは抗体融合タンパク質のような抗体構築物（antibody construct）も包含する。すべての抗体派生物は、ハイブリドーマ細胞株のDSM ACC2987またはDSM ACC2988によって分泌される、さらなるモノクローナル抗体によって認識される黄色ブドウ球菌エピトープに由来する、すなわち、それらに対する抗体の結合特異性を奏する。
【０００８】
細胞株DSM ACC2987によって分泌される、さらなるモノクローナル抗体によって認識されるエピトープは、免疫優性の黄色ブドウ球菌抗原ＩｓａＡに位置する。細胞株DSM ACC2988によって分泌される、さらなるモノクローナル抗体によって認識されるエピトープは、免疫優性の黄色ブドウ球菌抗原ＩｓａＢに位置する。本発明の発明者らは、本発明による抗体によって認識されるエピトープは、とくに黄色ブドウ球菌で露出していることを見出した。これらエピトープに対する抗体またはそれらのフラグメントは、黄色ブドウ球菌の検出および黄色ブドウ球菌の感染の処置に十分に適切である。異なる菌株における異なる程度の発現および抗体の変異が原因となる黄色ブドウ球菌の高度な多様性のため、他の抗体によっては認識されない追加のエピトープを認識するすべての抗体は、黄色ブドウ球菌の検出、ならびに、黄色ブドウ球菌感染の治療に有用である。
【０００９】
抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってもよい。とくに、抗体は、さらなるモノクローナル抗体、すなわち、ハイブリドーマ細胞株DSM ACC2987またはDSM ACC2988によって分泌される抗体であってもよい。これら抗体は、黄色ブドウ球菌の検出ならびに感染の処置に非常に有用である。それらは、非常に高い親和性および特異性を奏する。ハイブリドーマ細胞株DSM ACC2987によって分泌される抗体の、これら抗体によって認識されるエピトープに対する高い親和性は、該エピトープに対する該抗体の結合についての低いＫＤ値によって示される。≦１８ｐＭのＫＤ値の決定方法によって、この結合について１７ｎＭと決定された（図６および７および対応する本文を参照）。
【００１０】
モノクローナル抗体またはハイブリドーマ細胞株DSM ACC2987および／またはDSM ACC2988によって分泌される抗体は、ＩｇＧ型、とくにＩｇＧ１型またはＩｇＧ２ｂ型の抗体であってもよい。フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ／ｃフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントであってもよい。黄色ブドウ球菌の細胞壁が、Ｆｃ部を介して免疫グロブリンと非特異的に結合するプロテインＡを含むため、これらフラグメントはとくに黄色ブドウ球菌の検出に有用である。
【００１１】
抗体は、動物の抗体、すなわち、動物で生産される抗体、とくにマウス、ウシまたはラクダの抗体、ヒト抗体、植物、卵または真菌、とくにSaccharomycesで生産される抗体、細胞株の細胞で生産される組み換え抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体であってもよい。ヒト化抗体は、例えば、DSM ACC2987またはDSM ACC2988のハイブリドーマ細胞株によって分泌されるモノクローナル抗体などのモノクローナルマウス抗体の結合部分およびヒト抗体の非結合部分を含むモノクローナル抗体であってもよい。
【００１２】
各抗体は、第一の可変領域を有する重鎖および第二の可変領域を有する軽鎖を有してもよく、
ここで、ハイブリドーマ細胞株は、DSM ACC2987であって、ここで、第一の可変領域は、配列番号２の配列と、少なくとも９０％同一、とくに少なくとも９２．５％同一、とくに少なくとも９５％同一、とくに少なくとも９７．５％同一、とくに１００％同一のアミノ酸配列を包含し、ここで、第二の可変領域は、配列番号４の配列と、少なくとも９０％同一、とくに少なくとも９２．５％同一、とくに少なくとも９５％同一、とくに少なくとも９７．５％同一、とくに１００％同一のアミノ酸配列を包含し、
または、
ここで、ハイブリドーマ細胞株は、DSM ACC2988であって、ここで、第一の可変領域は、配列番号６の配列と、少なくとも９０％同一、とくに少なくとも９２．５％同一、とくに少なくとも９５％同一、とくに少なくとも９７．５％同一、とくに１００％同一のアミノ酸配列を包含し、ここで、第二の可変領域は、配列番号８の配列と、少なくとも９０％同一、とくに少なくとも９２．５％同一、とくに少なくとも９５％同一、とくに少なくとも９７．５％同一、とくに１００％同一のアミノ酸配列を包含する。
【００１３】
上述のように特徴付けられた第一の可変領域および第二の可変領域は、エピトープに対する高い親和性および特異性を有する結合部位を一緒に形成する。
【００１４】
配列番号２によって、第一の可変領域をコードするＤＮＡ配列の候補の一つは、配列番号１の配列である。配列番号１は、細胞株DSM ACC2987によって分泌される抗体の第一の可変領域をコードする配列である。配列番号４による第二の可変領域は、配列番号３の配列によってコードされてもよい。配列番号３は、細胞株DSM ACC2987によって分泌される抗体の第二の可変領域をコードする配列である。
【００１５】
配列番号６による第一の可変領域は、細胞株DSM ACC2988によって分泌される抗体の第一の可変領域をコードする配列である配列番号５によってコードされてもよい。配列番号８による第二の可変領域は、配列番号７の配列によってコードされてもよい。配列番号７は、細胞株DSM ACC2988によって分泌される抗体の第二の可変領域をコードする配列である。
【００１６】
ハイブリドーマ細胞株がDSM ACC2987、すなわち、エピトープが免疫優性の黄色ブドウ球菌抗原ＩｓａＡに位置する場合、エピトープは、配列表による配列番号１５、１７〜１９、２１〜２６、３２〜３４および５７の配列の１つを有するアミノ酸と、少なくとも１０、とくに少なくとも１１、とくに少なくとも１２、とくに少なくとも１３、とくに少なくとも１４、とくに１５において同一のアミノ酸配列を少なくとも１つ包含してもよい。
【００１７】
エピトープマッピングは、配列番号１５、１７〜１９、２１〜２６、３２〜３４および５７が、エピトープに対する抗体またはフラグメントの結合に関与することを明らかにした。エピトープは、上記に特定されるように、１を超えるアミノ酸配列を包含する。エピトープは、ＩｓａＡのアミノ酸配列中で互いに離れて位置する２またはそれ以上の配列によってすら形成されてよい。
【００１８】
本発明による抗体またはフラグメントは、薬剤として使用してもよい。とくにそれらは、ヒトまたは動物が、とくにメチシリン耐性またはメチシリン感受性の黄色ブドウ球菌である黄色ブドウ球菌に感染している、または、かかる感染を受けるリスクがある、ヒトまたは動物の処置用薬剤として使用してもよい。ヒトまたは動物は、感染が原因による乳腺炎または敗血症を有していてもよい。乳腺炎は、ウシ乳房炎であってもよい。雌ウシがウシ乳房炎を有する場合、使用可能な牛乳は該雌ウシによって生産されず、この場合には通常、雌ウシは抗生物質で処置され、その場合にはこの雌ウシによって生産された牛乳は、抗生物質がこの雌ウシの牛乳から含まれなくなるまで、廃棄しなければならない。通常の処置のこの不都合は、ウシ乳房炎の処置用薬剤としての本発明による抗体またはフラグメントの使用によって、避けることができる。
【００１９】
薬剤は、全身および／または局所適用に調製される薬剤であってもよい。本発明者らは、深刻な黄色ブドウ球菌感染の、本発明による抗体またはフラグメントを用いる処置は、死亡率および処置したヒトまたは動物の臓器における黄色ブドウ球菌数の顕著な低下をもたらしたことを認識した。さらに、本発明者らは、多形核白血球による貪食性の黄色ブドウ球菌細菌の死滅は、本発明による抗体が黄色ブドウ球菌細菌に結合している場合に、これら抗体のない黄色ブドウ球菌細菌と比較して、有意に高められることを認識した。
【００２０】
抗体またはフラグメントは、黄色ブドウ球菌の少なくとも１つの追加的なエピトープに対する他の抗体またはこれら他の抗体のフラグメントとの混合物中に存在してもよい。このさらなるエピトープは、エピトープが位置する抗原、すなわちＩｓａＡまたはＩｓａＢ、またはさらなる抗原の上に位置してもよい。薬剤としてのかかる混合物の使用は、単に本発明による抗体またはフラグメントを含む薬剤の使用より効率的になり得る。これは、異なる菌株での異なる程度の抗原発現の原因となる黄色ブドウ球菌の高度な多様性のためであり得、抗体またはフラグメント単独よりも、より多くの細菌が抗体またはフラグメントの混合物によって認識される。
【００２１】
抗体またはフラグメントは、少なくとも１の抗生物質との混合物中に存在してもよい。薬剤で処置されるヒトまたは動物において、変異した黄色ブドウ球菌は、一般的な黄色ブドウ球菌に加えて存在し得る。変異した黄色ブドウ球菌は、本発明による抗体またはフラグメントによって認識されない変異したＩｓａＡおよび／またはＩｓａＢを有し得る。この場合に、抗生物質は、変異した黄色ブドウ球菌に対して効果的となり得る。
【００２２】
本発明の抗体またはフラグメントは、哺乳動物の血漿、とくにヒトの血漿との混合物中に存在してもよい。本発明者らは、血漿と混合した本発明による抗体またはフラグメントは、生理食塩水中に含まれる本発明による抗体またはフラグメントよりも、さらにいっそう効率的となり得ることを見出した。
【００２３】
本発明は、黄色ブドウ球菌の検出のための、本発明による抗体またはフラグメントを含むキットにも関する。かかるキットは、診断の目的に使用されてもよい。
本発明はさらに、黄色ブドウ球菌の検出、とくに非常に特異的な検出のための本発明による抗体またはフラグメントの使用に関する。
本発明はさらに、本発明による抗体を産生するハイブリドーマ細胞株に関する。ハイブリドーマ細胞株は、DSM ACC2987またはDSM ACC2988の受託番号のもとにＤＳＭＺに寄託した細胞株であってもよい。
【００２４】
本発明はさらに、ヒトまたは動物が、とくにメチシリン耐性またはメチシリン感受性黄色ブドウ球菌である黄色ブドウ球菌に感染している、または、かかる感染を受けるリスクにある、ヒトまたは動物の処置方法に関し、ここで、本発明による抗体またはフラグメントは、ヒトまたは動物に投与される。抗体またはフラグメントは、黄色ブドウ球菌の量を減少させるのに、またはヒトまたは動物における黄色ブドウ球菌の除去をもたらすのに十分な投与量で投与される。抗体またはフラグメントは、適切な担体と混合してもよい。
【００２５】
ヒトまたは動物は、感染が原因による乳腺炎または敗血症を有していてもよい。抗体またはフラグメントは、他の抗体またはこれら他の抗体のフラグメントとの混合物中に存在してもよく、ここで他の抗体は黄色ブドウ球菌の少なくとも１の追加的なエピトープに対する抗体である。さらに、抗体またはフラグメントは、投与される前に、哺乳動物、とくにヒトの血漿または血液と混合してもよい。抗体またはフラグメントは、全身的に、とくに静脈内、経鼻または舌下で投与されてもよい。それらはまた、少なくとも１の抗生物質とともに投与されてもよい。
本発明の実施態様
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１ａ】図１ａは、黄色ブドウ球菌株MA12（図１ａ）の本発明による抗体を用いた免疫蛍光染色を示す。
【図１ｂ】図１ｂは、黄色ブドウ球菌ＩｓａＡノックアウト株MA12ΔisaA（図１ｂ）の本発明による抗体を用いた免疫蛍光染色を示す。
【図１ｃ】図１ｃは、黄色ブドウ球菌プロテインＡノックアウト株Cowan IΔspa::Tcr（図１ｃ）の本発明による抗体を用いた免疫蛍光染色を示す。
【図２】図２は、MAB-UK-66と比較する、MAB-IsaA29 clone 215のＩｓａＡ結合のＥＬＩＳＡデータを示す。
【図３】図３は、黄色ブドウ球菌株USA300でのi.v.による接種（i.v. challenge）および本発明によるモノクローナル抗体またはアイソタイプコントロール抗体での処置後のマウスの生存を示す。
【図４】図４は、中心静脈カテーテル、および黄色ブドウ球菌および本発明によるモノクローナル抗体で処置したマウスの臓器からの、黄色ブドウ球菌株MA12の回復を示す。
【図５】図５は、本発明による抗体の存在および不在における、多形核白血球による黄色ブドウ球菌のファゴサイトーシスを示す。
【図６】図６は、モノクローナル抗体MAB-UK-66による固定化したＩｓａＡへの結合のカイネティクスを示す。
【図７】図７は、ＩｓａＡによる固定化したモノクローナル抗体MAB-UK-66への結合のカイネティクスを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
図１ａ〜１ｃは、ハイブリドーマ細胞株DSM ACC2987によって生産され、MAB-UK-66と命名された、ＩｓａＡのエピトープに対する一次抗体としてのモノクローナル抗体での染色の結果を示す。マウスＩｇＧに対するＦＩＴＣ接合抗体が、二次抗体として使用された。
【００２８】
図１ａおよび１ｃは、黄色ブドウ球菌MA12およびCowan IΔspa::Tcrの免疫蛍光染色の陽性を示し、図１ｂは、黄色ブドウ球菌MA12ΔisaAが免疫蛍光染色されないことを示す。天然の黄色ブドウ球菌細菌に対して、黄色ブドウ球菌株Cowan IΔspa::Tcrは、プロテインＡを生産しない。プロテインＡは、抗体のＦｃ部と高い親和性を有する。細菌におけるプロテインＡの存在は、一次および二次抗体の細菌への非特異的な強い結合をもたらす。Cowan IΔspa::Tcr株は、一次抗体と結合し、ＩｓａＡの存在を示すが、プロテインＡとの抗体交差反応はない。
【００２９】
図２は、既知のモノクローナル抗体MAB-IsaA29 clone 215のＩｓａＡ結合とMAB-UK-66のＩｓａＡ結合を比較するために行われた、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）の結果を示す。MAB-IsaA29 clone 215は、"Development of antibody-based therapy targeting immunodominant of Staphylococcus aureus", Ohlsen, K. et al., page 128 of the abstract book published for the 59th annual conference of the Deutsche Gesellschaft fuer Hygiene und Mikrobiologie e.V. on September 2007およびLorenz, U. et al., "Therapeutische Effektivitaet von monoklonalen Antikoerpern gegen Staphylococcus aureus in einem Sepsis- und Abszess-Mausmodell", Chirurgisches Forum 2008, Springer Berlin Heidelberg, 29th May 2008, issue 17, pp. 225-226のアブストラクトに記載されたモノクローナル抗体である。
【００３０】
ＥＬＩＳＡは以下のように行われた：
マイクロタイタープレートの各ウェルを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中の０．５μｇ／ｍｌ濃度の組み換えＩｓａＡ−タンパク質（ｒＩｓａＡ）１００μｌの試料で一晩コーティングした後、ウェルは１％ウシ血清アルブミンで２時間ブロッキングした。上述の抗ＩｓａＡ抗体は、１対４０００の比で希釈してウェルに加えた。１ｈのインキュベーション後、西洋ワサビペルオキシダーゼ接合ウサギ抗マウスＩｇＧ(DAKO, Glostrup, Denmark)を加え、１ｈインキュベートした。その後、ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリンスルホン酸）基質(Sigma Chemical Co., Deisenhofen, Germany)を加え、１ｈインキュベートした。吸光度は、マイクロプレート自動読取機を用いて、４０５ｎｍで検出した。図１からわかるように、MAB-UK-66のｒＩｓａＡに対する結合は、既知の抗体MAB-IsaA29 clone 215のｒＩｓａＡに対する結合よりもずっと強力である。
【００３１】
効果的な抗黄色ブドウ球菌の免疫療法は、黄色ブドウ球菌の致死的投与に対してマウスを保護するはずである。インビボにおける本発明による抗体の効率について調べるため、黄色ブドウ球菌敗血症の生存モデルを以下のようにマウスで確立した：
【００３２】
年齢および性別がマッチしたＮＭＲＩマウス(Charles River, Sulzfeld, Germany）を、５×１０８のコロニー形成単位（ｃｆｕ）の黄色ブドウ球菌USA300（ＡＴＣＣ番号BAA-1556）の静脈内注射によって、０日目に投与した。処置されるマウスは、MAB-UK-66またはコントロールとしてアイソタイプマッチの抗体を静脈内に受け入れた（倍量投与法：細菌投与（bacterial challenge）の直後および２４ｈ後に、ｐＨ７．４の１００μｌのＰＢＳの容量で１５ｍｇ／ｋｇ）。動物は８日間モニターされ、致死的な病気を記録した。
保護の有意性は、Ｌｏｇ−Ｒａｎｋ／Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ検定で測定した：Ｐ＝０．０２２。結果を、図３に示す。
【００３３】
本発明による抗体のインビボでの効率をさらに調べるため、カテーテル関連黄色ブドウ球菌敗血症のモデルをマウスで次のように確立した：
年齢、性別および体重がマッチしたＮＭＲＩマウス(Charles River Wiga Deutschland GmbH, 97633 Sulzfeld, Germany)を実験に使用した。マウスは、腹腔内にキシラジンで麻酔し（８ｍｇ／ｋｇ体重）／ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ体重）、剪毛した首の左側に、水平の皮膚切開を最小で行った。手術用顕微鏡(Carl Zeiss Jena GmbH, 07745 Jena, Germany)を用いて、１０〜１６×の倍率のもとで、前方および後方の顔面静脈の分岐を露出するために、下顎の腺を単離した。単離した後方顔面静脈上の、緩い結紮糸間の静脈切開術を実行した。無菌のシングルルーメンポリエチレンカテーテル（内部直径０．２８ｍｍ×外部直径０．６ｍｍ）を、切開を通じて挿入し、上大静脈に向かって進行させた。結紮糸を結び、カテーテルを皮下にもぐらせ、正中肩甲切開を通じて体外に出した。開存性は検査され、カテーテルはヘパリン溶液で満たされ、栓で密封し、実験を通じて留置した。
【００３４】
手術の２４時間後、マウスはカテーテルによって、１×１０７ｃｆｕの黄色ブドウ球菌細菌MA12株を含む、１００μｌの黄色ブドウ球菌懸濁液で播種した。MA12株は、Ohlsen, K., Ziebuhr, W., Koller, K. P., Hell, W., Wichelhaus, T. A., and Hacker, J. "Effects of subinhibitory concentrations of antibiotics on alpha-toxin (hla) gene expression of methicillin-sensitive and methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates", Antimicrob. Agents Chemother. (1998), 42, pages 2817 to 2823に記載される看護スタッフからの粘膜単離株である。細菌懸濁液は、カテーテルルーメン内に１５分間存在するようにした。カテーテルの中身は、その後マウスの中で０．２ｍｌの０．９％生理食塩水で流された。処置されたマウスは、ハイブリドーマ細胞株DSM ACC2987によって生産された抗体を静脈注射（倍量投与法：細菌投与の直後および２４ｈ後に、１００μｌの容量で１５ｍｇ／ｋｇ）または生理食塩水の静脈注射（コントロール群）で受け取った。体重および一般的な外観を、実験の間毎日評価した。播種の５日後、マウスをＣＯ２の吸入で安楽死させた。
【００３５】
臓器は、安楽死したマウスから無菌的に収集し、２ｍｌの生理食塩水中でホモジナイズした。さらに、上大静脈におけるカテーテルの位置を確認し、外植したカテーテルは、２ｍｌの生理食塩水で洗浄し、洗浄液を収集した。臓器ホモジネートの連続希釈液およびカテーテル液の収集物は、３７℃で少なくとも４８時間、マンニット食塩フェノールレッド寒天培地プレート上で培養した。コロニー形成単位は、ｃｆｕ／臓器またはｃｆｕ／カテーテルとして計算した。結果を、図４に示す。データは、本発明による抗体での処置が、臓器の顕著な細菌負荷の低下をもたらしたことを示す。
【００３６】
本発明による抗体のファゴサイトーシスへの効果を調べるため、Polymorphprep (Nycomed, Oslo, Norway)を用いて、ヒト好中球を製造業者の使用説明書に従って単離した。０．１％（重量／体積）のゼラチン（ＨＢＳＳ−ｇｅｌ）およびハイブリドーマ細胞株DSM ACC2987によって生産された、１５％（体積／体積）の精製MAB-UK-66抗体が補充された、ハンクス平衡化塩溶液（ＨＢＳＳ）１ｍｌ中、またはＰＢＳ（コントロール）１ｍｌ中の１×１０７ｃｆｕの黄色ブドウ球菌MA12を、低速振盪のウォーターバスにおいて、３７℃で３０分間インキュベートした。等容量の５×１０６の抗体−およびＰＢＳ−処置の黄色ブドウ球菌および最終容量１．５ｍｌの１×１０６のＰＭＮ−細胞／ｍｌ ＨＢＳＳ−ｇｅｌを３７℃、振盪下でインキュベートした。ゼロから６０分の間隔で、この懸濁液の試料を取り除き、２５０×ｇで４分間遠心分離し、そして上清中の細菌数をｃｆｕの計数によって決定した。
【００３７】
ファゴサイトーシスは、細胞外細菌パーセント数の３つの測定±ＳＤの平均値として表わした。統計学的解析は、ノンパラメトリックマンホイットニーＵ検定を用いて行った。すべての比較について、＜０．０５のＰ値は、統計学的に有意とみなした。値は、平均値±ＳＤとして表わした。図５に示す結果は、本発明による抗体の存在にかかわらず、多形核白血球によって黄色ブドウ球菌がファゴサイトーシスされたことを示す。しかしながら、本発明による抗体とともに、ファゴサイトーシスの過程は、コントロールと比較して有意に加速した。抗体は、多形核白血球による黄色ブドウ球菌のファゴサイトーシスのオプソニンとして作用する。
【００３８】
モノクローナル抗体MAB-UK-66のＩｓａＡに対する親和性を決定するため、これら抗体の固定化したＩｓａＡに対する結合カイネティクスを、BIACORE（登録商標）2000 system （GE Healthcare Europe GmbH, Munzinger Strasse 5, 79111 Freiburg, Germany）を用いて、ラベルフリーの表面プラズモン共鳴を測定する方法によって決定した。抗原の固定化のために、ＩｓａＡは、等モルのsulfo-NHS-LC-biotin (Thermo Fisher Scientific, p/a Perbio Science, Adenauerallee 113, 53113 Bonn, Germany)とともにインキュベーションしてＮ−ビオチン化した。これら条件下で、主要な分子は、モノクローナル抗体MAB-UK-66によって認識される主要なエピトープに影響を与えないまま、単一の部位のみでビオチン化した。Nickel, J., Kotzsch, A., Sebald, W., and Mueller, T. D. "A single residue of GDF-5 defines binding specificity to BMP receptor IB" J. Mol. Biol. (2005), 349, pages 933 to 947に記載されるように、バイオセンサーCM5チップのストレプトアビジンでコートしたマトリックスへの抗原の固定が行われた。固定化した抗原の量は、BIACORE（登録商標）2000 systemの方法によって測定される約１００共鳴単位（ＲＵ）に相当する。
【００３９】
ＨＢＳ１５０緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３．４ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いて、相互作用解析を行った。２５℃、１０μｌ／分の流速でセンサーグラム（sensorgrams）を記録した。会合及び解離の時間は、１０分に設定した。チップは、各サイクル後に、異なる再生溶液（Ａ：１ｍＭ ＣＨ３ＣＯＯＨ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ３； Ｂ：４Ｍ ＭｇＣｌ２； Ｃ：１ｍＭ ＣＨ３ＣＯＯＨ、１Ｍ ＮａＣｌ、６Ｍ 尿素、ｐＨ３）で２分間再生した。ＩｓａＡに固定化したこれら抗体の結合カイネティクスを、図６に示す。
【００４０】
すべての見かけの結合親和性は、Biaevaluation software 2.2.4を用いて計算した。相互作用の親和性ｋｏｎ（＜１０６Ｍ−１ｓ−１）およびｋｏｆｆ（＜１０−２ｓ−１）は、１：１ラングミュア結合モデル（1:1 Langmuir binding model）に対するカイネティクスデータを、ｋｏｎおよびｋｏｆｆをフィッティングすることにより計算した。この方法によって、解離定数ＫＤを決定した。解離定数ＫＤは、（抗体およびそれぞれの抗原などの）２つの相互作用する分子間の親和性を示す。低いＫＤ値は、高い親和性を示し、高いＫＤは低い親和性を示す。この方法で決定したＫＤ値の標準偏差は、５０％以下である。したがって、２倍以上の結合親和性の差異は有意とみなす。
【００４１】
上記測定条件下で、MAB-UK-66抗体は、評価不可能な低い解離速度（slow off-rates）が原因で、２９ｋＤａ ＩｓａＡ抗原と不可逆的に相互作用する。カイネティック速度定数の評価が１０−５秒−１に制限されるため、観察された解離速度はその値よりも小さくなるはずである。解離速度を１０−５秒−１と設定することにより、会合率（on rate）を、１．８×１０−１１Ｍの解離定数の値を生じる５．６×１０５Ｍ−１秒−１と決定することができた。したがって、この相互作用のＫＤ値は、＜１．８×１０−１１Ｍである。重要なことに、抗原との相互作用後に、上記の再生溶液を用いて、抗体をチップ表面から取り除くことはできなかった。これは、大変強力であり、非常に特異的な相互作用を示す。
【００４２】
モノクローナル抗体MAB-UK-66のＩｓａＡに対する高い親和性を確認するため、BIACORE（登録商標）2000 system (GE Healthcare Europe GmbH, Munzinger Strasse 5, 79111 Freiburg, Germany)を用いて、ラベルフリーの表面プラズモン共鳴の方法によって、ＩｓａＡの固定化した抗体に対する結合カイネティクスを決定した。抗体MAB-UK-66の可逆的な固定化は、製造業者の使用説明書(Mouse Antibody Capture Kit, GE Healthcare)に従って、高密度（１８７０００共鳴単位ＲＵ）に共有結合でCM5センサーの表面に連結した、抗マウスＦｃ抗体を使用して行われた。
【００４３】
抗マウスＦｃ表面上に捕捉された抗体MAB-UK-66の平均量は、約６４０ＲＵに相当する。ブランクの抗マウスＦｃ表面は、非特異的な結合をモニタリングおよびリファレンスを差し引くためのコントロール表面として使用した。相互作用解析は、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて行った。センサーグラムは、２５℃、３０μｌ／分の流速で記録した。会合および解離の時間は、それぞれ３および１５分に設定した。１０ｍＭ グリシンｐＨ１．７のショートパルスを用いる各サイクル後に、抗Ｆｃ捕捉表面を再生した。固定化したモノクローナル抗体MAB-UK-66に対するＩｓａＡの結合カイネティクスを、図７に示す。
【００４４】
会合（ｋｏｎ）および解離（ｋｏｆｆ）の親和性および速度定数は、１：１ラングミュア結合モデルに得られたセンサーグラムをフィッティングする、BIAevaluation software 4.0.1を用いて計算した。この方法において、１．７ｎＭの解離定数ＫＤを、２回の独立した測定で決定した。MAB-UK-66およびＩｓａＡ間の相互作用の会合および解離の速度定数は、それぞれ１．８×１０５Ｍ−１ｓ−１（ｋｏｎ）および２．９×１０−４ｓ−１（ｋｏｆｆ）と決定した。
【００４５】
上記の測定条件下で、MAB-UK-66抗体は、すでにMAB-UK-66抗体の固定化したＩｓａＡの結合によって決定されたように、強力で非常に特異的な相互作用を確認する、高い親和性および低い解離速度で２９ｋＤａ ＩｓａＡ抗原と相互作用する。
【００４６】
本発明による抗体またはフラグメントによって認識されるＩｓａＡのエピトープを特徴付けるため、エピトープマッピングを行った。このため、１５アミノ酸長のオリゴペプチドを合成した。オリゴヌクレオチドの各配列は、ＩｓａＡの１５アミノ酸の配列と同一である。各オリゴヌクレオチドは、それに続く全配列の部分を表わすオリゴヌクレオチドと１１アミノ酸の重複を有する。オリゴヌクレオチドの配列は、配列表の配列番号９〜６４の配列である。
【００４７】
各オリゴヌクレオチドは、スライドガラス上の小さなスポットに固定化された。ハイブリドーマ細胞株DSM ACC2987によって分泌されるモノクローナル抗体の、およびコントロール抗体の、これらスポットへの結合は、これら抗体とともにインキュベーションすることにより、蛍光標識された二次抗体の結合および蛍光強度を検出することによって検討された。その結果を次の表に示す。
【００４８】
【表１】
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【表２】
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【００４９】
上記表からわかるように、配列番号１５、１７〜１９、２１〜２６、３２〜３４および５７の配列は、細胞株DSM ACC2987によって分泌される抗体のエピトープ結合に関与している。 
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【配列表】
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