(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化２１】
0005965542.tif 000028
［式中、Ｒは、ＣＯＯＨである］で示される構造により表される化合物、又は薬学的に許容しうるその塩。
【請求項２】
薬学的に許容しうる酸又は塩基との塩の形態である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
塩が、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、ヘミフマル酸塩、塩酸塩及び臭化水素塩よりなる群から選択される、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
塩が、ナトリウム又はヘミフマル酸塩である、請求項２又は３に記載の化合物。
【請求項５】
下記式（１）；（４）；及び（６）：
【化２２】
0005965542.tif 000029
よりなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
式（１）：
【化２３】
0005965542.tif 000030
で示される構造により表される、請求項１に記載の化合物、又は薬学的に許容しうるその塩。
【請求項７】
薬学的に許容しうる酸又は塩基との塩の形態である、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
塩が、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、ヘミフマル酸塩、塩酸塩及び臭化水素塩よりなる群から選択される、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
塩が、ナトリウム塩である、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
塩が、ヘミフマル酸塩である、請求項８に記載の化合物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物を、１種以上の薬学的に許容しうる賦形剤又は担体と組合せて含む、医薬組成物。
【請求項１２】
心臓の障害及び疾患、筋肉疲労、骨格筋の障害及び疾患、ＣＮＳの障害及び疾患、認知機能障害、神経筋の疾患及び障害、骨の障害及び疾患、癌悪液質、悪性高熱、糖尿病、心臓突然死、並びに乳幼児突然死症候群よりなる群から選択される症状の治療又は予防において、あるいは認知機能を改善するために使用するための、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
症状が、リアノジン受容体１（ＲｙＲ１）、リアノジン受容体２（ＲｙＲ２）、リアノジン受容体３（ＲｙＲ３）、又はこれらの組合せの異常機能と関連する、請求項１２に記載の症状の治療又は予防において使用するための請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
心臓の障害及び疾患が、不整脈の障害及び疾患（心房性及び心室性不整脈、心房及び心室細動、心房性及び心室性頻脈性不整脈、心房及び心室頻拍、カテコールアミン誘発多形性心室頻拍（ＣＰＶＴ）、並びに運動誘発性のこれらの変種よりなる群から選択される、不整脈の障害及び疾患など）；運動誘発性不整脈の障害及び疾患；心不全；鬱血性心不全；慢性心不全；急性心不全；収縮期心不全；拡張期心不全；急性非代償性心不全；心虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害；慢性閉塞性肺疾患；冠動脈血管形成術後又は心筋梗塞（ＭＩ）の血栓溶解後のＩ／Ｒ傷害；並びに高血圧よりなる群から選択される、請求項１２に記載の症状の治療又は予防において使用するための請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
筋肉疲労が、骨格筋の疾患、障害又は症状に起因する、請求項１２に記載の症状の治療又は予防において使用するための請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
骨格筋の障害、疾患又は症状が、運動誘発性筋肉疲労；長時間の運動又は高強度の運動に起因する運動誘発性筋肉疲労；先天性ミオパシー；デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、顔面肩甲上腕型ジストロフィー、筋緊張性筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）、遠位型筋ジストロフィー、エメリ・ドレフュス型筋ジストロフィー、及び眼咽頭型筋ジストロフィーのような筋ジストロフィー；脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、球脊髄性筋萎縮症（Spinal and bulbar muscular atrophy）（ＳＢＭＡ）、加齢性筋肉疲労；筋肉減少症、セントラルコア病；癌悪液質；膀胱障害；並びに失禁よりなる群から選択される、請求項１２に記載の症状の治療又は予防において使用するための請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
ＣＮＳの障害及び疾患が、アルツハイマー病（ＡＤ）、ニューロパシー、発作、パーキンソン病（ＰＤ）、及びハンチントン病（ＨＤ）よりなる群から選択され；そして神経筋の障害及び疾患が、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルー・ゲーリック病）よりなる群から選択される、請求項１２に記載の症状の治療又は予防において使用するための請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
認知機能障害が、ストレス性又は加齢性であるか、あるいは改善すべき認知機能が、短期記憶、長期記憶、注意又は学習であるか、あるいは認知機能障害が、アルツハイマー病（ＡＤ）、注意欠陥多動障害（ＡＤＨＤ）、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、全般性不安障害（ＧＡＤ）、強迫性障害（ＯＣＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、統合失調症、双極性障害、及び大鬱病よりなる群から選択される疾患又は障害と関連している、請求項１２に記載の症状の治療又は予防において使用するための請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
症状が、癌悪液質であり、骨転移を有する癌に起因するものである、請求項１２に記載の症状の治療又は予防において使用するための請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
化合物が、ＲｙＲ２へのカルスタビン２の結合を回復させるか又は増強するのに充分な用量で使用される、請求項１２に記載の症状の治療又は予防において使用するための請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
化合物が、ＲｙＲ１へのカルスタビン１の結合を回復させるか又は増強するのに充分な用量で使用される、請求項１２に記載の症状の治療又は予防において使用するための請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
化合物が、ＲｙＲチャネルを通るＣａ２＋漏出を低下させるのに充分な用量で使用される、請求項１２に記載の症状の治療又は予防において使用するための請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
心臓の障害及び疾患、筋肉疲労、骨格筋の障害及び疾患、ＣＮＳの障害及び疾患、認知機能障害、神経筋の疾患及び障害、骨の障害及び疾患、癌悪液質、悪性高熱、糖尿病、心臓突然死、並びに乳幼児突然死症候群よりなる群から選択される症状の治療又は予防において、あるいは認知機能を改善するために使用するための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物、又はその塩。
【請求項２４】
更に、目的のｍＲＮＡにおけるエクソンスキッピングを増強するための、該ｍＲＮＡ中のスプライシング配列に特異的な、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯ）の使用を含む、請求項１２に記載の症状の治療又は予防において使用するための請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯ）が、ＤＭＤ遺伝子の少なくとも１つのエクソンのスプライシング配列に特異的である、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の処置において使用するための、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物を、ＤＭＤ遺伝子の少なくとも１つのエクソンのスプライシング配列に特異的であるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯ）と組合せて含む、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を処置するための医薬組成物。
【請求項２７】
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯ）が、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２３、４５、４４、５０、５１、５２及び／又は５３のスプライシング配列に特異的である、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物の製造方法であって、下記式：
【化２４】
0005965542.tif 000031
で示される化合物を、下記式：
【化２５】
0005965542.tif 000032
［式中、Ｒａは、ＣＯＯＲ１又はＣＮであり；Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ４アルキルであり、そしてＬは、脱離基である］で示される化合物と反応させることにより、下記式：
【化２６】
0005965542.tif 000033
で示される化合物を得る工程；及び
Ｒａ基をＲ基に変換することにより、式（Ｉ）の化合物を得る工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１，４−ベンゾチアゼピン誘導体、並びに細胞におけるカルシウムチャネル機能を調節するリアノジン受容体（ＲｙＲ）と関連する障害及び疾患を処置するためのこれらの使用に関する。本発明はまた、これらの化合物を含む医薬組成物、並びにＲｙＲと関連する疾患及び症状、特に心臓、骨格筋及び中枢神経系（ＣＮＳ）の障害を処置するためのこれらの使用を開示する。
【０００２】
背景技術
筋小胞体（ＳＲ）は、とりわけ、特殊な細胞内カルシウム（Ｃａ２＋）貯蔵部位として機能する、細胞内構造である。ＲｙＲは、ＳＲにおけるチャネルであって、このチャネルは、ＳＲからその細胞の細胞質へのＣａ２＋の放出を調節するために開閉する。ＳＲから細胞質へのＣａ２＋の放出は、細胞質Ｃａ２＋濃度を上昇させる。ＲｙＲの開確率とは、ＲｙＲが任意の所定の時点で開いており；そのためＳＲから細胞質へＣａ２＋を放出できる見込みのことをいう。
【０００３】
ＲｙＲには３つのタイプがあり、その全てが高度の相同性を示す：ＲｙＲ１、ＲｙＲ２、及びＲｙＲ３。ＲｙＲ１は、主として骨格筋、及び他の組織に見られ、ＲｙＲ２は、主として心臓、及び他の組織に見られ、そしてＲｙＲ３は、脳、及び他の組織に見られる。ＲｙＲは、四量体である。ＲｙＲ複合体の一部は、４つのＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）（カルスタビン（calstabin））、具体的にはＦＫＢＰ１２（カルスタビン１）及びＦＫＢＰ１２．６（カルスタビン２）を伴う４つのＲｙＲポリペプチドにより形成される。カルスタビン１は、ＲｙＲ１及びＲｙＲ３に結合するが、一方カルスタビン２は、ＲｙＲ２に結合する。カルスタビン類は、ＲｙＲ（ＲｙＲサブユニット１個あたり１個の分子）に結合し、ＲｙＲ機能を安定化し、隣接ＲｙＲの間の連動した開閉の達成を容易にし、そしてチャネルの閉状態を安定化することによりチャネルの異常な活性化（Ｃａ２＋漏出）を防止する。
【０００４】
リアノジン受容体２及び心疾患
心臓横紋筋では、ＲｙＲ２は、興奮収縮（ＥＣ）連関及び筋収縮に必要な主要なＣａ２＋放出チャネルである。ＥＣ連関の間、活動電位の０相中の心筋細胞膜の脱分極が、電位依存性Ｃａ２＋チャネルを活性化する。順に開電位依存性チャネルを通るＣａ２＋流入は、ＲｙＲ２を介してＳＲからのＣａ２＋放出を開始させる。このプロセスは、Ｃａ２＋誘発性Ｃａ２＋放出として知られている。ＲｙＲ２が介在するＣａ２＋誘発性Ｃａ２＋放出は次に、心臓細胞において収縮性タンパク質を活性化し、その結果、心筋収縮が起こる。
【０００５】
プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）によるＲｙＲ２のリン酸化は、所定のトリガーに対して放出されるＣａ２＋の量を増やすことにより、心臓のＥＣ連関の利得を増加させる「闘争か逃走か」反応の重要な部分である。このシグナル伝達経路は、ストレスに応答する交感神経系（ＳＮＳ）の活性化によって、心拍出量の増加をもたらす機序を提供する。ＰＫＡによるＲｙＲ２のリン酸化は、チャネルからのカルスタビン２の部分的な解離をもたらし、順に開口確率の増加、及びＳＲから細胞質へのＣａ２＋の放出増加を引き起こす。
【０００６】
心不全（ＨＦ）は、血清カテコールアミンレベルが慢性的に上昇した持続的な高アドレナリン状態を特徴とする。この慢性高アドレナリン状態の１つの結果は、各ホモ四量体のＲｙＲ２チャネルの４個のＳｅｒ２８０８のうち３〜４個が慢性的にリン酸化されているように、ＲｙＲ２の永続的なＰＫＡ高リン酸化である（Marx SO, et al. Cell, 2000;101(4):365-376）。具体的には、ＲｙＲ２の慢性ＰＫＡ高リン酸化は、ＲｙＲ２チャネル高分子複合体からのチャネル安定化サブユニットのカルスタビン２の枯渇に関連している。カルスタビンの枯渇は、ＲｙＲ複合体からの拡張期ＳＲのＣａ２＋「漏出」をもたらすが、これが収縮能障害の一因となる（Marx et al., 2000）。内向き脱分極電流の活性化のために、この拡張期ＳＲのＣａ２＋「漏出」はまた、致命的な心不整脈にも関連している（Lehnart et al., J Clin Invest. 2008;118(6):2230-2245）。実際に、ＰＫＡリン酸化部位を欠いたＲｙＲ２による改変マウスは、心筋梗塞（ＭＩ）後のＨＦの進行から保護される（Wehrens XH et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2006;103(3):511-518）。更に、ＨＦにおけるＲｙＲ２の慢性ＰＫＡ高リン酸化は、ホスファターゼ（Marx et al., 2000）ＰＰ１及びＰＰ２ａ（Ｓｅｒ２８０８の脱リン酸化障害）の枯渇、並びにＲｙＲ２複合体からのｃＡＭＰ特異的４型ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ４Ｄ３）の枯渇を包含するＲｙＲ２高分子複合体のリモデリングに関連している。ＲｙＲ２複合体からのＰＤＥ４Ｄ３の枯渇は、局所ｃＡＭＰレベルの持続的上昇を引き起こす（Lehnart SE et al., Cell 2005;123(1):25-35）。このように、拡張期ＳＲのＣａ２＋漏出は、ＨＦの進行と不整脈の一因となる。更には、最近の報告は、ＲｙＲ２の構成的ＰＫＡ高リン酸化を模倣する、ＲｙＲ２−Ｓ２８０８Ｄ＋／＋（アスパラギン酸がセリン２８０８を置換）ノックインマウスが、カルスタビン２の枯渇及び漏出性ＲｙＲ２を示すことを実証している。ＲｙＲ２−Ｓ２８０８Ｄ＋／＋マウスは、年齢依存性心筋症を発症し、ＲｙＲ２酸化及びニトロシル化の上昇、ＳＲのＣａ２＋貯蔵量の減少、並びに拡張期ＳＲのＣａ２＋漏出の増加を示している。心筋梗塞後、ＲｙＲ２−Ｓ２８０８Ｄ＋／＋マウスは、ＷＴ同腹仔と比較して、死亡率の増加を示す。ＲｙＲ２-カルスタビン２の相互作用を安定化する１，４−ベンゾチアゼピン誘導体である（WO 2007/024717）Ｓ１０７での処置は、ＷＴとＲｙＲ２−Ｓ２８０８Ｄ＋／＋マウスの両方で、ＲｙＲ２介在性拡張期ＳＲのＣａ２＋漏出を阻害して、ＨＦの進行を抑えた（Shan et al., J Clin Invest. 2010 Dec 1;120(12):4375-87）。
【０００７】
更には、ＲｙＲ２は、これを細胞の酸化還元状態に高感受性にさせる約３３個の遊離チオール残基を含有する。システイン酸化は、ＲｙＲの開口及びＳＲのＣａ２＋漏出の達成を容易にする。Shanらは２０１０年、ＲｙＲ２の酸化及びニトロシル化並びにＲｙＲ２からの安定化サブユニットのカルスタビン２の解離が、ＳＲのＣａ２＋漏出を誘導することを実証した。
【０００８】
カテコールアミン誘発性多形性心室頻拍（ＣＰＶＴ）は、構造的に正常な心臓を持つ個体の遺伝性疾患である。５０人以上の異なるＲｙＲ２変異が、ＣＰＶＴに関係づけられている。ＣＰＶＴ患者は、幼児から成人年齢まで失神及び心臓突然死（ＳＣＤ）を経験し、３５歳までに死亡率が最大５０％に上る。ＣＰＶＴの個体は、運動を行うと心室性不整脈を起こすが、安静時には不整脈を発症しない。ＣＰＶＴ関連のＲｙＲ２変異は、カルスタビン２サブユニットの結合低下に起因する「漏出性」ＲｙＲ２チャネルをもたらす（Lehnart et al., 2008）。ＲｙＲ２中のＲ２４７４Ｓ変異についてヘテロ接合のマウス（ＲｙＲ２−Ｒ２４７４Ｓマウス）は、（心不整脈が存在しない場合に発生した）自発的な全身性強直間代発作、運動誘発性心室性不整脈、及びＳＣＤを呈する。Ｓ１０７での処置は、、変異体ＲｙＲ２−Ｒ２４７４Ｓチャネルへのカルスタビン２の結合を増強し、チャネル漏出を阻害し、心不整脈を防止し、そして発作閾値を上昇させた（Lehnart et al., 2008）。
【０００９】
リアノジン受容体１及び骨格筋疾患
骨格筋の収縮は、ＲｙＲ１を介するＳＲのＣａ２＋放出によって活性化される。横行（Ｔ）小管膜の脱分極は、ジヒドロピリジン受容体電位センサー（Ｃａｖ１．１）を活性化し、そしてこれは順に直接的なタンパク質−タンパク質相互作用を介してＲｙＲ１チャネルを活性化し、ＳＲのＣａ２＋貯蔵の放出を引き起こす。Ｃａ２＋がトロポニンＣに結合することにより、アクチン−ミオシン架橋が起こり、サルコメアを短縮する。
【００１０】
長期の筋肉のストレス（マラソン走行時など）状態では、又は心不全のような疾患では、これらは両方ともＳＮＳの慢性的な活性化を特徴としているが、骨格筋機能は、恐らく変化したＥＣ連関のために損なわれている。特に、筋肉の各収縮の間にＳＲから放出されるＣａ２＋の量が減少し、異常なＣａ２＋の放出事象が起こり得、そしてＣａ２＋の再取り込みは遅くなる（Reiken, S et al., 2003. J. Cell Biol. 160:919-928）。これらの観察は、骨格筋におけるＳＮＳの慢性的活性化の有害作用が、少なくとも部分的にはＣａ２＋シグナル伝達の欠陥に起因する可能性があることを示唆している。
【００１１】
ＲｙＲ１高分子複合体は、ＰＫＡとホスホジエステラーゼ４Ｄ３（ＰＤＥ４Ｄ３）、タンパク質ホスファターゼ１（ＰＰ１）とカルスタビン１を包含するチャネル機能を調節するタンパク質の足場構造を形成する、５６０kDaのＲｙＲ１サブユニットの四量体で構成される。Ａキナーゼアンカータンパク質（ｍＡＫＡＰ）は、ＰＫＡ及びＰＤＥ４Ｄ３をＲｙＲ１に対して標的とするが、一方スピノフィリンは、ＰＰ１をこのチャネルに対して標的とする（Marx et al. 2000; Brillantes et al., Cell, 1994, 77, 513-523; Bellinger et al. J. Clin. Invest. 2008, 118, 445-53）。ＰＫＡ、ＰＰ１、及びＰＤＥ４Ｄ３の触媒及び調節サブユニットは、Ｓｅｒ２８４３（マウスではＳｅｒ２８４４）でのＲｙＲ１のＰＫＡ介在性リン酸化を調節する。Ｓｅｒ２８４４でのＲｙＲ１のＰＫＡ介在性リン酸化は、細胞質Ｃａ２＋へのチャネルの感受性を増大させ、ＲｙＲ１に対するカルスタビン１の結合親和性を低下させ、そしてチャネルの閉状態を不安定化することが証明されている（Reiken et al., 2003; Marx, S.O. et al., Science, 1998, 281:818-821）。骨格筋におけるカルスタビン１濃度は、およそ２００nMであり、そしてＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化は、ＲｙＲ１に対するカルスタビン１の結合親和性をおよそ１００〜２００nMから６００nM以上まで低下させることが報告されている。よって、生理条件下では、Ｓｅｒ２８４３でのＲｙＲ１のＰＫＡリン酸化に起因するＲｙＲ１に対するカルスタビン１の結合親和性の低下は、ＲｙＲ１複合体中に存在するカルスタビン１の量を実質的に減少させるのに十分である。Ｓｅｒ２８４３でのＲｙＲ１の慢性ＰＫＡ高リン酸化（各ＲｙＲ１のホモ四量体に存在する４個のＰＫＡ  Ｓｅｒ２８４３部位のうち３又は４個のＰＫＡリン酸化と定義される）は、「漏出性」チャネル（即ち、安静時の開口を起こしやすいチャネル）をもたらし、そしてこれが、心不全を有する個体において起こるような永続的な高アドレナリン状態に関連付けられる骨格筋機能不全の一因となる（Reiken et al., 2003）。
【００１２】
更に、システイン残基上の遊離スルフヒドリル基のニトロシル化（Ｓ−ニトロシル化）によるような、リン酸化以外の翻訳後修飾によるＲｙＲ１の調節は、チャネル酸化と同様に、ＲｙＲ１チャネル活性を増加させることが報告されている。ＲｙＲ１のＳ−ニトロシル化及び酸化は、ＲｙＲ１へのカルスタビン１の結合を減少させることがそれぞれ証明されている。
【００１３】
以前にBellingerらによって報告（Proc. Natl. Acad. Sci. 2008, 105(6):2198-2002）されたように、マウス及びヒトでの過度の運動中、ＲｙＲ１は、次第にＰＫＡ高リン酸化され、Ｓ−ニトロシル化され、そしてＰＤＥ４Ｄ３及びカルスタビン１の枯渇が起こり、その結果、マウスの運動能力を低下させる「漏出性」チャネルが生じる。Ｓ１０７での処置は、ＲｙＲ１複合体からのカルスタビン１の枯渇を防止し、力の発生及び運動能力を改善し、そしてＣａ２＋依存性中性プロテアーゼのカルパイン活性及び血漿クレアチニンキナーゼレベルを低下させた。
【００１４】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、主たる致死的小児遺伝性疾患の１つである。ＤＭＤは、Ｘ染色体連鎖疾患であり、男児出生３，５００人に１人が罹患し、そして典型的には呼吸不全又は心不全から生後３０歳までに死をもたらす。ＤＭＤに関連するジストロフィンの変異により、ジストロフィンタンパク質が完全に失われ、その結果、筋線維鞘下の細胞骨格と細胞外マトリックスの間のつながりが分断される。このつながりは、収縮誘発性傷害に対して筋肉を保護及び安定化するために不可欠である。現在のところ、ＤＭＤには治療法がなく、診療所での多くの処置は姑息的である。第Ｉ／II相臨床試験における新たな治療介入は、エクソンスキッピング、ミオスタチン阻害、及びユートロフィンのアップレギュレーションである。しかし、エクソンスキッピング、及びユートロフィンのアップレギュレーションを支える全身送達には、問題が存在する。更に、第Ｉ／II相臨床試験では、筋肉のサイズを大きくするためのミオスタチンの不活化が、筋肉強度又は機能の改善を示さなかった。ジストロフィンの変異に起因する筋線維鞘の不安定性は、カスケード効果を有する。１つの主要な効果は、細胞質Ｃａ２＋濃度の増加であり、これがＣａ２＋依存性プロテアーゼ（カルパイン類）の活性化につながる。別の効果は、炎症及びｉＮＯＳ活性の上昇であり、これがタンパク質、脂質、及びＤＮＡの酸化／ニトロシル化を引き起こしうる。ＤＭＤの筋肉の病理は進行性であり、筋線維鞘の不安定性をはるかに超える。そしてこの病理は、筋線維鞘の不安定性と一致して、更なる傷害に対する感受性を増加させている。最近、ＲｙＲ１の過度の酸化又はニトロシル化が、カルスタビン１とＲｙＲ１複合体との相互作用を分断することができ、これが筋ジストロフィーのマウスモデル（ｍｄｘ）においてのＲｙＲ１漏出及び筋脱力につながり、そしてＳ１０７での処置が、このマウスモデルにおいて筋機能の指標を改善することが実証された（Bellinger, A. et al. 2009, Nature Medicine, 15:325-330）。
【００１５】
筋肉量と力の加齢に伴う減量（筋肉減少症）は、身体障害及び死亡率の上昇の一因となる。Andersson, D.ら（Cell Metab. 2011 Aug 3;14(2):196-207）は、老齢（２４月齢）マウスからのＲｙＲ１は、若い（３〜６月齢）成体からのＲｙＲ１と比較して、酸化され、システインがニトロシル化され、そしてカルスタビン１が枯渇していることを報告した。このＲｙＲ１チャネル複合体リモデリングの結果、開確率の上昇した「漏出性」チャネルが生じ、骨格筋での細胞内カルシウム漏出につながる。老齢マウスをＳ１０７で処置すると、ＲｙＲ１へのカルスタビン１の結合が安定化し、細胞内カルシウム漏出が減少し、活性酸素種（ＲＯＳ）が低下し、そして強縮性Ｃａ２＋放出、筋特異的な力、及び運動能力が増強された。
【００１６】
ＰＣＴ国際特許公開WO 2005/094457、WO 2006/101496及びWO 2007/024717は、１，４−ベンゾチアゼピン誘導体、並びにとりわけ、心臓、骨格筋及び認知の障害の治療におけるその使用を開示している。
【００１７】
ＰＣＴ国際特許公開WO 2008/060332は、筋ジストロフィーのような病変を患う対象における、あるいは持続した長期及び／又は激しい運動、又は慢性ストレスの結果としての筋肉疲労に苦しむ対象における、筋肉疲労を治療するための１，４−ベンゾチアゼピン誘導体の使用に関する。
【００１８】
ＰＣＴ国際特許公開WO 2008/021432は、神経系に影響を及ぼす疾患、障害及び症状の治療及び/又は予防のための１，４−ベンゾチアゼピン誘導体の使用に関する。
【００１９】
ＰＣＴ国際特許公開WO 2012/019076は、心虚血／再潅流傷害の治療及び／又は予防のための１，４−ベンゾチアゼピン誘導体の使用に関する。Fauconnierら、Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108（32）:13258-63は、カスパーゼ８の活性化が介在するＲｙＲ漏出が、心筋虚血−再灌流後の左心室傷害につながり、そしてＳ１０７での処置が、ＳＲのＣａ２＋漏出を阻害し、心室性不整脈、梗塞サイズ、及び再灌流の１５日後の左心室リモデリングを減少させることを報告した。
【００２０】
ＰＣＴ国際特許公開WO 2012/019071は、筋肉減少症の治療及び／又は予防のための１，４−ベンゾチアゼピン誘導体の使用に関する。
【００２１】
ＰＣＴ国際特許公開WO 2012/037105は、ストレス誘発性の神経障害及び疾患の治療及び／又は予防のための１，４−ベンゾチアゼピン誘導体の使用に関する。
【００２２】
骨格筋及び心臓の障害及び疾患を包含する、ＲｙＲに関連した障害及び疾患の治療に有効な新規化合物を同定するニーズが存在する。より具体的には、例えば、ＲｙＲチャネルの漏出を修復し、そしてＰＫＡ−リン酸化／酸化／ニトロシル化されたＲｙＲへの、及び突然変異ＲｙＲ（言い換えればカルスタビンに対する親和性が減少しているか、又はカルスタビンに結合しないＲｙＲ）へのカルスタビンの結合を増強することにより、ＲｙＲ関連障害を治療するために使用できる新規物質を同定するニーズが依然として存在する。
【００２３】
発明の要約
本発明は、新規な１，４−ベンゾチアゼピン誘導体、及びその薬学的に許容しうる塩を提供する。幾つかの実施態様において、本発明の化合物は、リアノジン受容体（ＲｙＲ）カルシウムチャンネルスタビライザーであり、「Rycals（商標）」と呼ばれることもある。本発明は更に、ＲｙＲと関連する障害及び疾患を治療するためのこれらの化合物の使用方法を提供する。
【００２４】
本発明の化合物は、WO 2007/024717に記載される１，４−ベンゾチアゼピン誘導体からの選択である。WO 2007/024717は、構造的に類似の化合物を記載しているが、本明細書に更に記載されるとおり、これらの化合物は、非常に不安定であることが判明しているので、薬物としてのそれらの治療的有用性は限られている。よって本出願の根底にある問題は、薬理学的に活性であるだけでなく、高い代謝安定性などの好ましい特性をも有しているため、ＲｙＲと関連する疾患及び症状、例えば、心臓、骨格筋及び中枢神経系（ＣＮＳ）の障害を治療する薬物として適している、代替１，４−ベンゾチアゼピン誘導体を提供することである。予想外にも、式（Ｉ）の化合物は薬理学的に活性であるばかりでなく、安定でもあるため、本発明の根底にある問題に対する技術的解決策を提供することが発見された。
【００２５】
本発明の化合物は、式（Ｉ）：
【化１】
0005965542.tif 000002
［式中、Ｒは、ＣＯＯＨである］で示される構造及び薬学的に許容しうるその塩により表される。
【００２６】
式（Ｉ）の化合物は、薬学的に許容しうる酸又は塩基との塩の形態で存在してもよい。このような塩は、好ましくは、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、ヘミフマル酸塩、塩酸塩及び臭化水素塩よりなる群から選択され、それぞれの可能性が本発明の別個の実施態様を表している。目下１つの好ましい塩は、ナトリウム塩である。別の目下好ましい塩は、ヘミフマル酸塩である。
【００２７】
幾つかの特定の実施態様において、本化合物は、化合物１、化合物４及び化合物６、並びに薬学的に許容しうるその塩よりなる群から選択される。これらの化合物の構造は、本明細書に後述される。
【００２８】
好ましい実施態様において、本化合物は、化合物１：
【化２】
0005965542.tif 000003
で示される構造又は薬学的に許容しうるその塩により表される。
【００２９】
幾つかの実施態様において、化合物１は、親化合物として提供される。しかし他の実施態様において、化合物１は、薬学的に許容しうる酸又は塩基との塩の形態で提供される。好ましくは、このような塩は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、ヘミフマル酸塩、塩酸塩及び臭化水素酸塩よりなる群から選択され、それぞれの可能性が本発明の別個の実施態様を表している。目下１つの好ましい塩は、ナトリウム塩である。別の目下好ましい塩は、ヘミフマル酸塩である。
【００３０】
本発明はまた、本発明の化合物、及びその塩の合成方法を提供する。
【００３１】
本発明はまた、１種以上の本発明の化合物、及び少なくとも１種の添加剤又は賦形剤、例えば、充填剤、希釈剤、結合剤、崩壊剤、緩衝剤、着色料、乳化剤、香味改善剤、ゲル化剤、流動促進剤、保存料、可溶化剤、安定剤、懸濁剤、甘味料、等張化剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、膨潤剤、遅延剤、潤滑剤、吸収剤、及び増粘剤を含む、医薬組成物を提供する。この組成物は、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、分包剤、懸濁剤、又は錠剤の投与剤形として提供することができる。
【００３２】
本発明は更に、心臓、骨格筋、認知、ＣＮＳ及び神経筋の障害及び疾患のような、ＲｙＲと関連する種々の障害、疾患及び症状を治療又は予防する方法であって、このような処置を必要とする対象に、ＲｙＲと関連する障害又は疾患を予防又は治療するのに有効な量の式（Ｉ）の化合物又はその塩を投与することを含む方法を提供する。本発明はまた、対象におけるＲｙＲ（ＲｙＲ１、ＲｙＲ２及びＲｙＲ３を包含する）の漏出を予防又は治療する方法であって、この対象にＲｙＲの漏出を予防又は治療するのに有効な量の式（Ｉ）の化合物又はその塩を投与することを包含する方法を提供する。
【００３３】
更に、本発明は、対象におけるＲｙＲとカルスタビンとの結合を調節する方法であって、この対象にＲｙＲ結合カルスタビンの量を調節するのに有効な量の式（Ｉ）の化合物又はその塩を投与することを包含する方法を提供する。
【００３４】
本発明は更に、心臓、骨格筋及び認知／ＣＮＳの障害及び疾患のような、ＲｙＲと関連する障害、疾患及び症状の治療及び／又は予防用の医薬品の製造のための式（Ｉ）の化合物の使用に関する。別の実施態様において、本発明は、ＲｙＲの漏出の予防又は治療用の医薬品の製造のための式（Ｉ）の化合物の使用に関する。別の実施態様において、本発明は、ＲｙＲ結合カルスタビンの量の調節用の医薬品の製造のための式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
【００３５】
本発明の方法は、インビトロ系（例えば、培養細胞又は組織）又はインビボ（例えば、非ヒト動物又はヒトにおいて）で実施することができる。
【００３６】
幾つかの実施態様において、本発明の化合物は、本明細書で更に説明されるように、目的のｍＲＮＡ、例えば、ＤＭＤ遺伝子におけるエクソンスキッピングを増強するために、エクソンスキッピング療法、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯ）と組合せて提供される。本発明の他の特色及び利点は、以下の詳細な説明及び図面から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１Ａ】１００nMの化合物１の非存在下（−）又は存在下でのＰＫＡリン酸化ＲｙＲ２へのカルスタビン２の結合を示す、カルスタビン２抗体によるイムノブロット。（＋）：非ＰＫＡリン酸化ＲｙＲ２へのカルスタビン結合。Ｓ３６（US 7,544,678）は、陽性対照として使用する。
【図１Ｂ】１００nMの化合物２、化合物３又は化合物４の非存在下（−）又は存在下でのＰＫＡリン酸化ＲｙＲ２へのカルスタビン２の結合を示す、カルスタビン２抗体によるイムノブロット。（＋）：非ＰＫＡリン酸化ＲｙＲ２へのカルスタビン結合。Ｓ３６は、陽性対照として使用する。
【図１Ｃ】指示濃度の化合物１又は化合物４の非存在下（Neg）又は存在下でのＰＫＡリン酸化ＲｙＲ１へのカルスタビン１の結合を示す、カルスタビン１抗体によるイムノブロット。（Pos）：非ＰＫＡリン酸化ＲｙＲ１へのカルスタビン結合。Ｓ３６は、陽性対照として使用する。
【図２】図２Ａ：浸透圧ポンプでビヒクル（５０：５０  ＤＭＳＯ／ＰＥＧ）、イソプロテレノール単独（ＩＳＯ）又は指示濃度の化合物１と一緒のイソプロテレノールを投与したマウスの脛骨筋溶解物から免疫沈降させたＲｙＲ１複合体中のカルスタビン１のレベルを示す、カルスタビン１抗体によるイムノブロット。Ｓ３６は、３．６mMで対照として使用する。図２Ｂ：ＲｙＲ１へのカルスタビン１再結合％の定量。
【図３】虚血−再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害により誘発されたラット慢性心不全モデル。Ｉ／Ｒプロトコールのために、冠動脈左前下行枝（ＬＡＤ）を１時間閉塞した。
【図４】飲用水中の化合物１の５mg/kg/日（５ＭＫ）又は１０mg/kg/日（１０ＭＫ）で処置したラットと、対するビヒクル（Ｈ２Ｏ）処置及び偽操作したラットの左室（ＬＶ）容積及び駆出率（ＥＦ）。慢性心不全は、虚血−再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害により誘発させた。ＬＡＤ動脈を１時間閉塞した；処置は、再灌流の１週間後に開始して、３ヶ月間続けた。処置の１、２又は３ヶ月後に心エコー検査のパラメーターを得た。図４Ａ：ＬＶ拡張末期容積；図４Ｂ：ＬＶ収縮末期容積；図４Ｃ：ＥＦ。図４Ａ及び４Ｂ：§Ｐ＜０．００１  対偽操作；*Ｐ＜０．０５  対ビヒクル；†Ｐ＜０．００１  対ビヒクル。図４Ｃ：§Ｐ＜０．００１  対偽操作、†Ｐ＜０．００１  対ビヒクル。
【図５】飲用水中の化合物１の５mg/kg/日（５ＭＫ）及び１０mg/kg/日（１０ＭＫ）で処置したラットと、対するビヒクル（Ｈ２Ｏ）処置及び偽操作したラットの、図５Ａ〜Ｃは、体重（ＢＷ）（５Ａ）、梗塞サイズ（５Ｂ）、及びＬＶ重量（５Ｃ）を、そして図５Ｄは、コラーゲン含量を表す。慢性心不全は、虚血−再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害により誘発させた。ＬＡＤ動脈を１時間閉塞した；処置は、再灌流の１週間後に開始して、３ヶ月間続けた。処置の３ヶ月後にパラメーターを測定した。図５Ａ〜Ｃ：有意差なし。図５Ｄ：†††Ｐ＜０．００１  対偽操作；*Ｐ＜０．０５  対ビヒクル。
【図６】侵襲的血行動態解析：飲用水中の化合物１の５mg/kg/日（５ＭＫ）又は１０mg/kg/日（１０ＭＫ）で処置したラットと、対するビヒクル（Ｈ２Ｏ）処置及び偽操作したラットの、左室収縮期圧（ＬＶ  ＳＰ）（６Ａ）、ｄＰ／ｄｔ  ｍａｘ（６Ｂ）；及びｄＰ／ｄｔ  ｍｉｎ（６Ｃ）。慢性心不全は、虚血−再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害により誘発させた。ＬＡＤ動脈を１時間閉塞した；処置は、再灌流の１週間後に開始して、３ヶ月間続けた。処置の３ヶ月後に血行動態パラメーターを測定した。図６Ａ：有意差なし。図６Ｂ：§Ｐ＜０．０５  対偽操作；*Ｐ＜０．０５  対ビヒクル。図６Ｃ：†Ｐ＜０．０１  対偽操作；*Ｐ＜０．０５  対ビヒクル。
【図７】時刻に対する化合物１の血漿濃度（μM）。
【図８】飲用水中の化合物１又は化合物Ａの５mg/kg/日（５ＭＫ）で処置したラットと、対するビヒクル（Ｈ２Ｏ）処置及び偽操作したラットのＥＦ。ＬＡＤ動脈を１時間閉塞した；処置は、再灌流の１週間後に開始して、３ヶ月間続けた。処置の１、２又は３ヶ月後に心エコー検査のパラメーターを得た。§Ｐ＜０．００１  対偽操作；*Ｐ＜０．０５  対ビヒクル；†Ｐ＜０．００１  対ビヒクル。
【図９】ビヒクル（Ｈ２Ｏ）処置対照と比較した、ｍｄｘ及びＷＴマウスの自発身体活動に及ぼす化合物１の作用。ビヒクル対照と比較した、飲用水中に１０及び５０mg/kg/日（標的用量）で投与したｍｄｘマウスの１〜１９日目の活動についてＰ＜０．００１。
【図１０】ＥＤＬ筋の比筋力・周波数関係。（Ａ）ビヒクル（Ｈ２Ｏ）処置対照と比較した、飲用水中で投与の化合物１（５、１０及び５０mg/kg/日（標的用量））で処置したｍｄｘマウス（ｎ＝５）。５０mg/kg/日用量について、１５０Hz以上の周波数でｐ＜０．０５。（Ｂ）ビヒクル（Ｈ２Ｏ）処置対照と比較した、飲用水中で投与の化合物１（５０mg/kg/日（標的用量））で処置したＷＴ、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４）。
【図１１】ビヒクル（Ｈ２Ｏ）又は飲用水中で投与の化合物１（５０mg/kg/日（標的用量））で処置したｍｄｘ及びＷＴマウスの平均体重（１２Ａ）及び平均水消費量（１２Ｂ）。
【００３８】
発明の詳細な説明
当然のことながら、詳細な説明及び特定の実施例は、本発明の種々の実施態様を示すものの、この詳細な説明から当業者には、本発明の本質及び範囲内での種々の変更及び改変が明らかとなるため、例証としてのみ与えられる。
【００３９】
本明細書及び添付の請求の範囲に使用されるとき、単数形の「ａ」、「an」及び「the」は、特に別段の明記がない限り複数形の参照部分を包含する。本明細書に言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が引用例として取り込まれる。
【００４０】
「Rycals（商標）」という用語は、本発明により提供される数字により指定される特定化合物だけでなく、本発明により提供される一般式（Ｉ）又は（IA）の、そして本明細書では集合的に「本発明の化合物」と呼ばれる化合物により表される、リアノジン受容体カルシウムチャネル安定剤のことをいう。
【００４１】
化合物
幾つかの実施態様において、本発明の化合物は、式（IA）：
【００４２】
【化３】
0005965542.tif 000004
［式中、
Ｒは、ＣＯＯＨ若しくはその生物学的等価体、ＣＯＯＲ１又はＣＮであり；そして
Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ４アルキルである］で示される構造及び薬学的に許容しうるその塩により表される。
【００４３】
幾つかの好ましい実施態様において、式（IA）中のＲは、カルボン酸（ＣＯＯＨ）である。他の好ましい実施態様において、式（IA）中のＲは、カルボン酸生物学的等価体、例えば、テトラゾールである。あるいは、カルボン酸生物学的等価体は、１，２，４−オキサジアゾール−５（４Ｈ）−オン、１，２，４−チアジアゾール−５（４Ｈ）−オン、１，２，４−オキサジアゾール−５（４Ｈ）−チオン、１，３，４−オキサジアゾール−２（３Ｈ）−チオン、４−メチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−５（４Ｈ）−チオン、５−フルオロオロチン酸などのような、酸性複素環であってもよい。更なるカルボン酸生物学的等価体は、例えば、Hamada, Y. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006; 16:4354-4359; Herr, R.J. et al., Bioorg. Med. Chem. 2002; 10: 3379-3393; Olesen, P.H., Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 2001; 4: 471; Patani. G.A. et al., J. Chem. Rev. 1996; 96:3147; Kimura, T. et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006; 16: 2380-2386;及びKohara, Y. et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1995; 5(17): 1903-1908に記載されている。上記参考文献のそれぞれの内容は、引用例として本明細書に取り込まれる。
【００４４】
１つの好ましい実施態様において、本発明の化合物は、ＲがＣＯＯＨである式（IA）の構造及び薬学的に許容しうるその塩（即ち、式（Ｉ）の化合物）により表される。
【００４５】
他の好ましい実施態様において、式（IA）中のＲは、フェニル環の４位（即ち、ベンゾチアゼピン環の７位）にある。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施態様を表す。式（IA）又は（Ｉ）の化合物は、薬学的に許容しうる酸又は塩基との塩の形態で存在してもよい。このような塩は、好ましくはナトリウム、カリウム、マグネシウム、ヘミフマル酸塩、塩酸塩及び臭化水素塩よりなる群から選択され、それぞれの可能性が本発明の別個の実施態様を表している。目下１つの好ましい塩は、ナトリウム塩である。別の目下好ましい塩は、ヘミフマル酸塩である。
【００４６】
幾つかの特定の実施態様において、本化合物は、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、及び化合物１２、並びに薬学的に許容しうるその塩よりなる群から選択される。これらの化合物は、下記構造により表される：
【化４】
0005965542.tif 000005
0005965542.tif 000006
0005965542.tif 000007
0005965542.tif 000008
【００４７】
化学的定義：
「アルキル」という用語は、本明細書に使用されるとき、１〜４個の炭素原子を有する直鎖又は分岐状の飽和炭化水素のことをいう（「Ｃ１−Ｃ４アルキル」）。代表的アルキル基は、特に限定されないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec−ブチル、及びtert−ブチルを包含する。このアルキル基は、非置換であっても、又はハロゲン、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルコキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アミド、アルキルアミド、ジアルキルアミド、ニトロ、アミノ、シアノ、Ｎ３、オキソ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシル、チオ、チオアルキル及びチオアリールから選択される１個以上の基により置換されていてもよい。
【００４８】
本発明の化合物は、その互変異性体として存在してもよい。全てのこのような互変異性体は、本発明の一部として本明細書中で検討されている。
【００４９】
鏡像体及びジアステレオマー体を包含する、本発明の化合物の全ての立体異性体（例えば、種々の置換基上の不斉炭素に起因して存在できるもの）は、本発明の範囲内入るものである。本発明の化合物の個々の立体異性体は、例えば、実質的に他の異性体を含まない（例えば、ある特定の活性を有する純粋な又は実質的に純粋な光学異性体として）か、又は例えば、ラセミ体として、若しくは一方の立体異性体が豊富な混合物として混合されていてもよい。本発明のキラル中心は、IUPAC 1974 Recommendationsにより定義されるＳ又はＲ立体配置を有することができる。ラセミ体は、例えば、分別結晶化、ジアステレオマー誘導体の分離若しくは結晶化、又はキラルカラムクロマトグラフィーによる分離のような、物理的方法により分割することができる。個々の光学異性体は、特に限定されないが、例えば、光学活性酸又は塩基との塩形成と、これに続く結晶化のような従来法を包含する、任意の適切な方法によりラセミ体から得ることができる。
【００５０】
本発明の化合物は、その調製に続いて、好ましくは単離及び精製することにより、重量で約９０％以上の、約９５％以上の、そして更に好ましくは約９９％を超える量の化合物（「実質的に純粋な」化合物）を含有する組成物が得られ、次にこれを本明細書に記載されるように使用又は処方する。このような本発明の「実質的に純粋な」化合物もまた、本発明の一部として本明細書に含まれるものである。
【００５１】
治療的使用
本発明は、ＲｙＲと関連する症状、障害及び疾患を治療することができる化合物を提供する。更に特には、本発明は、ＲｙＲ１、ＲｙＲ２及び／又はＲｙＲ３チャネルであってよい、ＲｙＲチャネルの漏出を回復させることができる化合物を提供する。１つの実施態様において、本発明の化合物は、ＲｙＲとカルスタビン（例えば、ＲｙＲ１とカルスタビン１；ＲｙＲ２とカルスタビン２；及びＲｙＲ３とカルスタビン１）の会合を増強及び／又は解離を阻害する。「ＲｙＲと関連する症状、障害及び疾患」は、ＲｙＲを調節することにより治療及び／又は予防できる障害及び疾患を意味し、そして特に限定されないが、心臓の障害及び疾患、筋肉疲労、骨格筋の障害及び疾患、ＣＮＳの障害及び疾患、認知機能障害、神経筋の疾患及び障害、認知機能改善、骨の障害及び疾患、癌悪液質、悪性高熱、糖尿病、心臓突然死、並びに乳幼児突然死症候群を包含する。
【００５２】
よって１つの実施態様において、本発明は、心臓の障害及び疾患、筋肉疲労、骨格筋の障害及び疾患、ＣＮＳの障害及び疾患、認知機能障害、神経筋の疾患及び障害、骨の障害及び疾患、癌悪液質、悪性高熱、糖尿病、心臓突然死、並びに乳幼児突然死症候群よりなる群から選択される症状を治療又は予防するか、あるいは認知機能を改善する方法であって、治療有効量の本明細書に記載される式（Ｉ）若しくは（IA）の化合物、又はその塩を、そのような処置を達成するために、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法に関する。目下１つの好ましい化合物は、式（１）の化合物である。
【００５３】
別の実施態様において、本発明は、心臓の障害及び疾患、筋肉疲労、骨格筋の障害及び疾患、ＣＮＳの障害及び疾患、神経筋の疾患及び障害、認知機能障害、骨の障害及び疾患、癌悪液質、悪性高熱、糖尿病、心臓突然死、並びに乳幼児突然死症候群よりなる群から選択される症状を治療又は予防するか、あるいは認知機能を改善するための医薬品の製造のための、有効量の本明細書に記載される式（Ｉ）若しくは（IA）の化合物、又はその塩の使用に関する。目下１つの好ましい化合物は、式（１）の化合物である。
【００５４】
別の実施態様において、本発明は、心臓の障害及び疾患、筋肉疲労、骨格筋の障害及び疾患、ＣＮＳの障害及び疾患、認知機能障害、神経筋の疾患及び障害、骨の障害及び疾患、癌悪液質、悪性高熱、糖尿病、心臓突然死、並びに乳幼児突然死症候群よりなる群から選択される症状を治療又は予防するか、あるいは認知機能を改善するための医薬品の製造に使用するための、本明細書に記載される式（Ｉ）若しくは（IA）の化合物、又はその塩に関する。目下１つの好ましい化合物は、式（１）の化合物である。
【００５５】
１つの実施態様において、この症状、障害又は疾患は、ＲｙＲ１の異常機能と関連する。別の実施態様において、この症状、障害又は疾患は、ＲｙＲ２の異常機能と関連する。別の実施態様において、この症状、障害又は疾患は、ＲｙＲ３の異常機能と関連する。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施態様を表す。
【００５６】
心臓の障害及び疾患は、特に限定されないが、不整脈の障害及び疾患、運動誘発性不整脈の障害及び疾患、心不全、鬱血性心不全、慢性心不全、急性心不全、収縮期心不全、拡張期心不全、急性非代償性心不全、心虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害（冠動脈血管形成術後又は心筋梗塞（ＭＩ）の血栓溶解後のＩ／Ｒ傷害を包含する）、慢性閉塞性肺疾患、及び高血圧を包含する。不整脈の障害及び疾患は、特に限定されないが、心房性及び心室性不整脈、心房及び心室細動、心房性及び心室性頻脈性不整脈、心房及び心室頻拍、カテコールアミン誘発多形性心室頻拍（ＣＰＶＴ）、並びに運動誘発性のこれらの変種を包含する。
【００５７】
本発明の化合物はまた、長時間の運動又は高強度の運動に起因するか、あるいは筋骨格疾患によって引き起こされる筋肉疲労を処置するのにも有用である。筋肉の障害及び疾患の例は、特に限定されないが、骨格筋疲労、セントラルコア病、運動誘発性骨格筋疲労、膀胱障害、失禁、加齢性筋肉疲労、筋肉減少症、先天性ミオパシー、骨格筋ミオパシー及び／又は萎縮、癌悪液質、コア・ロッドのミオパシー（myopathy with cores and rods）、ミトコンドリアミオパシー［例えば、Kearns-Sayre症候群、ＭＥＬＡＳ（ミトコンドリアミオパシー、脳症、乳酸アシドーシス、及び脳卒中）症候群、及びＭＥＲＲＦ（赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌスてんかん）症候群］、内分泌性ミオパシー、筋肉の糖原病［例えば、Pompe病、Andersen病、及びCori病］、ミオグロビン尿症［例えば、McArdle病、垂井病、及びDiMauro病］、皮膚筋炎、骨化性筋炎、家族性周期性四肢麻痺、多発性筋炎、封入体筋炎、神経性筋強直症、全身強直症候群、悪性高熱、普通の筋痙攣、テタニー、重症筋無力症、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、球脊髄性筋萎縮症（Spinal and bulbar muscular atrophy）（ＳＢＭＡ、またspinobulbar muscular atrophy、bulbo-spinal atrophy、Ｘ連鎖性球脊髄性神経障害（X-linked bulbospinal neuropathy）（ＸＢＳＮ）、１型Ｘ連鎖性脊髄性筋萎縮症（X-linked spinal muscular atrophy type 1）（ＳＭＡＸ１）、及びKennedy病（ＫＤ）としても知られている）、及び筋ジストロフィーを包含する。好ましい骨格筋障害は、特に限定されないが、運動誘発性骨格筋疲労、先天性ミオパシー、筋ジストロフィー、加齢性筋肉疲労、筋肉減少症、セントラルコア病、癌悪液質、膀胱障害、及び尿失禁を包含する。
【００５８】
筋ジストロフィーの例は、特に限定されないが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）、遠位型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型ジストロフィー、筋緊張性筋ジストロフィー、エメリ・ドレフュス型筋ジストロフィー、及び眼球咽頭型筋ジストロフィーを包含し、現在のところＤＭＤが好ましい。
【００５９】
本明細書中に使用される先天性筋ジストロフィーとは、出生時に存在している筋ジストロフィーのことをいう。ＣＭＤは、遺伝子変異に基づいて分類される：１）骨格筋線維の基底膜又は細胞外マトリックスの構造タンパク質をコードする遺伝子；２）推定又は実証グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（これは次に、基底膜の外膜タンパク質であるジストログリカンのグリコシル化に影響を与える）；３）その他。ＣＭＤの例は、特に限定されないが、ラミニン−α２−欠損ＣＭＤ（ＭＤＣ１Ａ）、ウルリッヒＣＭＧ（ＵＣＭＤ１、２及び３）、ウォーカー・ワールブルグ症候群（ＷＷＳ）、筋・目・脳病（ＭＥＢ）、福山ＣＭＤ（ＦＣＭＤ）、ＣＭＤ＋二次的ラミニン欠損１（ＭＤＣ１Ｂ）、ＣＭＤ＋二次的ラミニン欠損２（ＭＤＣ１Ｃ）、精神遅滞と脳回肥厚症を伴うＣＭＤ（ＭＤＣ１Ｄ）、及び１型筋ジストロフィーを伴う脊椎硬直症（ＲＳＭＤ１）を包含する。
【００６０】
認知機能障害は、特に限定されないが、記憶喪失、年齢依存性記憶喪失、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、注意欠陥多動障害（ＡＤＨＤ）、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、全般性不安障害（ＧＡＤ）、強迫性障害（ＯＣＤ）、統合失調症、双極性障害、又は大鬱病と関連するか、又はこれらを包含する。
【００６１】
ＣＮＳの障害及び疾患は、特に限定されないが、アルツハイマー病（ＡＤ）、ニューロパシー、発作、パーキンソン病（ＰＤ）、及びハンチントン病（ＨＤ）を包含する。
【００６２】
神経筋の障害及び疾患は、特に限定されないが、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルー・ゲーリック病）を包含する。
【００６３】
幾つかの実施態様において、本発明の化合物は、認知機能を改善するが、この機能は、短期記憶、長期記憶、注意、学習、及びこれらの任意の組合せから選択することができる。
【００６４】
幾つかの実施形態において、本発明の化合物は、癌悪液質、即ち、一般に癌と関連する筋力低下、そして好ましくは骨転移のような転移性癌における筋力低下の処置に有用である。筋力低下と筋萎縮（悪液質）は、癌患者における共通の腫瘍随伴症状である。このような症状は、かなりの疲労の原因となり、患者の生活の質を劇的に低下させる。本発明は、特定タイプの癌、例えば、骨転移を有する前立腺癌及び乳癌では、ＲｙＲ１が酸化され、それが誘発してＲｙＲ１が「漏出性」になるという発見に一部基づく、癌患者における筋力低下を治療及び予防するための方法を提供する。更に、Rycal化合物の投与による漏出の防止が、筋機能を改善することが見い出された。典型的な癌としては、特に限定されないが、乳癌、前立腺癌、骨癌、膵臓癌、肺癌、結腸癌、及び消化管癌を包含する。
【００６５】
エクソンスキッピング療法：
幾つかの実施形態において、本発明の化合物は、アンチセンス介在性エクソンスキッピングを増強することによってｍＲＮＡスプライシングを調節する（例えば、増強する）。スプライシングのこの調節は、目的のスプライシング配列に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯ）の存在下で達成される。本発明の幾つかの実施態様において、式（Ｉ）又は（IA）の化合物とＡＯとは、式（Ｉ）又は（IA）の化合物が、ＡＯ介在性エクソンスキッピングを増強する場で、相乗的に作用することができる。よって幾つかの実施形態において、本発明は、漏出性ＲｙＲと関連する、本明細書に記載される任意の症状の治療又は予防に使用するための医薬組成物に関し、更には目的のｍＲＮＡにおけるエクソンスキッピングを増強するための、ｍＲＮＡ配列中のスプライシング配列に特異的なアンチセンスＡＯの使用を含む。
【００６６】
本発明の化合物によるエクソンスキッピング増強のための１つの特定の実施形態は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）に関係する。ＤＭＤは、患者の生涯にわたる進行性の筋力低下によって特徴づけられる致死性Ｘ連鎖劣性疾患である。ＤＭＤは、ジストロフィンタンパク質の産生を切断する、ＤＭＤ遺伝子のアウトオブフレームの複数のエクソン欠失が主な原因である。ジストロフィン発現の消失だけでは、ＤＭＤの病態生理を説明できない。ジストロフィン糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）の破壊もまた、酸化ストレス、ミトコンドリアのＣａ２＋過負荷及びアポトーシス、筋肉へのＣａ２＋の流入増加、並びに病的Ｃａ２＋シグナル伝達をもたらす。ＤＭＤには治癒的治療法は存在せず、唯一の実証薬物治療は、コルチコステロイドであり、そしてこれは、歩行期間を延ばしうるが、相当な副作用を有する。アンチセンスオリゴヌクレオチド介在性エクソンスキッピングは、ＤＭＤリーディングフレームを回復させ、完全なジストロフィン糖タンパク質複合体を発現させることを目的とする、有望な治療アプローチである。現在までに、低レベルのジストロフィンタンパク質が、この方法によってヒトにおいて産生されている。Kendallら（Sci Transl Med, 2012, 4(164), p. 164ra160）は、Dantrolene及び他のＲｙＲモジュレーターのような特定の低分子が、アンチセンスオリゴマーに誘導されたエクソンスキッピングを促進することにより、ＤＭＤのマウスモデルであるｍｄｘマウスの骨格筋におけるｍＲＮＡのリーディングフレーム、筋線維鞘のジストロフィンタンパク質、及びジストロフィン糖タンパク質複合体を回復させるエクソンスキッピングを増加させることを報告した。
【００６７】
よって１つの実施形態において、本発明は、ＤＭＤ遺伝子の１つ以上のエクソン、例えば、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２３、４５、４４、５０、５１、５２及び／又は５３のスプライシング配列に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯ）と組合せた、本発明の式（Ｉ）又は（IA）の化合物を、それを必要とする対象に投与することより、ＤＭＤを処置するための方法に関する。好ましいＡＯは、特に限定されないが、ＤＭＤ遺伝子のＤＭＤエクソン２３、５０及び／又は５１を標的とするＡＯ、例えば２’−Ｏ−メチル（２’ＯＭｅ）ホスホロチオエート又はホスホロジアミデート・モルホリノ（ＰＭＯ）ＡＯを包含する。そのようなＡＯの例としては、特に限定されないが、Pro051/GSK2402968、AVI4658/Eteplirsen、及びPMO E23モルホリノ（5'-GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT-3'）を包含する。
【００６８】
本明細書において互換的に使用される薬剤の「有効量」、「充分な量」又は「治療有効量」という用語は、臨床結果を包含する、有益な又は所望の結果を達成するのに充分な量であり、そのようなものとして「有効量」又はその変化形は、それが適用される文脈に依存する。その反応は、ある実施態様では予防的であり、他の実施態様では治療的であり、また他の実施態様ではこれらの組合せである。「有効量」という用語はまた、「治療有効」であり、そして望ましくない副作用を回避するか又は実質的に減衰させる、本発明の化合物の量を包含する。
【００６９】
本明細書に使用されるとき、及び当該分野においてよく理解されるとき、「処置」は、臨床結果を包含する、有益な又は所望の結果を得るためのアプローチである。有益な又は所望の臨床結果は、特に限定されないが、１つ以上の症候又は症状の軽減又は改善、疾患の範囲の縮小、疾患の安定化（即ち、増悪しない）状態、疾患の拡大の防止、疾患の進行の遅延又は減速、病状の改善又は緩和及び寛解（部分的であろうと全面的であろうと）を包含することができる（検出可能であろうと検出不能であろうと）。「処置」はまた、処置を受けない場合に予想される生存期間に比較した生存期間の延長を意味することができる。
【００７０】
医薬組成物
本発明の化合物は、インビボでの投与に適した生物学的に適合性の形でヒト対象に投与するための医薬組成物に処方される。別の態様によれば、本発明は、薬学的に許容しうる希釈剤及び／又は担体と混合した本発明の化合物を含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容しうる担体は、好ましくはその組成物の他の成分と適合性であり、かつそのレシピエントに対して有害でないという意味で「許容しうる」ものである。
【００７１】
本化合物は単独で投与してもよいが、好ましくは１種以上の薬学的に許容しうる担体と共に投与される。本明細書で用いられる薬学的に許容しうる担体は、医薬品製剤用の材料として使用され、そして充填剤、希釈剤、結合剤、崩壊剤、緩衝剤、着色料、乳化剤、香味改善剤、ゲル化剤、流動促進剤、保存料、可溶化剤、安定剤、懸濁剤、甘味料、等張化剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、膨潤剤、遅延剤、潤滑剤、吸収剤、及び増粘剤のいずれか１種以上として組み込まれる、種々の有機又は無機材料から選択することができる。
【００７２】
本発明の化合物は、特に限定されないが、経口、舌下、口腔内、非経口（静脈内、筋肉内又は皮下）、経皮（transdermal, per- or trans-cutaneous）、鼻内、膣内、直腸内、眼内、及び呼吸器内（吸入投与を介する）を包含する既知の方法によってヒト又は動物の対象に投与される。本発明の化合物はまた、特に限定されないが、対象の心筋又は骨格筋を包含する、対象の筋肉への送達を介して対象に投与することができる。１つの態様において、本化合物は、対象の心臓に挿入されたカテーテルを介した心筋細胞への標的化送達を経由して対象に投与される。他の実施形態では、本化合物は、例えば、腰椎内注射又は脳脊髄液（ＣＳＦ）中への直接の化合物の脳室内注入によるか、あるいは脳室内、髄腔内又は間質投与により、直接ＣＮＳ中に投与することができる。経口投与が目下好ましい。
【００７３】
固体経口投与用の本発明の医薬組成物は、特に錠剤又は糖衣錠、舌下錠、分包剤、ゲルカプセル剤を包含するカプセル剤、散剤、及び顆粒剤を包含し、そして液体経口、鼻内、口腔内又は眼内投与用の医薬組成物は、特に乳剤、液剤、懸濁剤、点滴剤、シロップ剤及びエアゾール剤を包含する。本化合物はまた、飲用水を介して、又は食物と一緒に懸濁剤又は液剤として投与することができる。許容しうる製剤担体の例は、特に限定されないが、とりわけ、セルロース誘導体（カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース及び微結晶性セルロースを包含する）；糖類（マンニトール、ショ糖、又は乳糖など）；グリセリン、アラビアゴム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリルフマル酸ナトリウム、生理食塩水、アルギン酸ナトリウム、デンプン、タルク及び水を包含する。
【００７４】
非経口注射用の本発明の医薬組成物は、特に水性又は非水性の分散液、懸濁液又は乳濁液であってよい無菌溶液、及びまた注射用溶液又は分散液の再構成用の無菌粉末剤を包含する。本発明の化合物は、対象の血液と等張性である無菌水溶液と合わせることができる。このような製剤は、固体の活性成分を、水溶液を生成するために、塩化ナトリウム、グリシンなどのような生理的に適合性の物質を含有し、そして生理条件に適合する緩衝ｐＨを有する水に溶解し、次に該溶液を無菌にすることにより調製される。本製剤は、密封アンプル又はバイアルのような、単位用量又は複数回用量の容器で提示される。本製剤は、特に限定されないが、筋膜上、関節包内、頭蓋内、皮内、髄腔内、筋肉内、眼窩内、腹腔内、脊髄内、胸骨内、血管内、静脈内、実質内、皮下、若しくは舌下を包含する、任意の方式の注射により、又はカテーテルを経由して対象の心臓に送達される。
【００７５】
直腸内又は膣内投与用の本発明の医薬組成物は、好ましくは坐剤であり、そして経皮（per- or trans-cutaneous）投与用の医薬組成物は、特に散剤、エアゾール剤、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤及びパッチ剤を包含する。
【００７６】
経皮投与には、本発明の化合物は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、イソプロパノール、エタノール、オレイン酸、Ｎ−メチルピロリドンなどのような、本発明の化合物に対する皮膚の浸透性を上昇させ、本化合物を皮膚を通して血流に浸透させる、皮膚浸透促進剤と合わせられる。本化合物／促進剤組成物はまた、更にエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチレン／酢酸ビニル、ポリビニルピロリドンなどのような高分子物質と合わせることにより、ゲル形状の組成物を提供してもよく、そしてこれを溶媒に溶解して、所望の粘度まで溶媒を留去し、次に裏当て材に塗布することによりパッチ剤を提供する。
【００７７】
本発明の医薬品製剤は、特に限定されないが、湿式及び乾式造粒法、又は直接圧縮法を包含する、製剤分野において周知の方法により調製される。担体の選択は、本化合物の溶解度及び化学的性質、選択される投与経路並びに標準的製剤の慣行により決定される。
【００７８】
上記の医薬組成物は、本発明を例証しているが、何らこれを限定するものではない。
【００７９】
本発明の方法により、任意のこれらの化合物は、対象における、特に対象の細胞におけるＲｙＲ結合カルスタビンのレベルの低下を制限又は防止するのに有効な量で、対象に投与することができる（又は対象の細胞と接触させる）。この量は、インビボで確立した滴定曲線の解析、並びに本明細書に開示される方法及び試験法を包含する、既知の手順に基づいて当業者には容易に決定される。対象におけるＲｙＲ結合カルスタビンのレベルの低下を制限又は防止するのに有効な本発明の化合物の適量は、約０．０１mg/kg/日〜約１００mg/kg/日（例えば、１、２、５、１０、２０、２５、５０又は１００mg/kg/日）の範囲であるか、かつ／又は約３００ng/ml〜約５，０００ng/mlの範囲の血漿レベルを達成するのに充分な量である。あるいは、本発明の化合物の量は、約１mg/kg/日〜約５０mg/kg/日の範囲である。あるいは、本発明の化合物の量は、約１０mg/kg/日〜約２０mg/kg/日の範囲である。また、投与できる約０．０１mg/kg/日又は０．０５mg/kg/日〜約５mg/kg/日又は約１０mg/kg/日の量が包含される。
【００８０】
合成方法
本発明は、更なる態様において、本発明の化合物、及びその塩の製造方法を提供する。更に具体的には、本発明は、式（Ｉ）又は（IA）の化合物、例えば、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、及び化合物１２、又はその塩の製造方法を提供する。本化合物への種々の合成経路は、実施例に記載されている。一般的な合成経路（ＲＯＳ）は、以下のスキーム１に明記される：
【００８１】
【化５】
0005965542.tif 000009
【００８２】
スキーム１において、Ｒａは、ＣＯＯＲ１又はＣＮであり；Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ４アルキルであり、そしてＬは、脱離基であって、一例として、ハロゲン、スルホン酸エステル（ＯＳＯ２Ｒ’（ここで、Ｒ’は、アルキル又はアリールである）、例えば、ＯＭｓ（メシラート）、ＯＴｓ（トシラート））などである。アミン出発物質は、アルキル化剤（上記のベンジル誘導体）と、好ましくは塩基の存在下で反応させることにより、所望の生成物又はその前駆体が得られる（Ｒ＝Ｒａ）。必要に応じて、このような前駆体は、更に反応させることにより、本明細書に後述の実験の項に例証されるように、又は当業者には知られている他の任意の方法により、Ｒａ基をＲ基に変換することができる。例えば、エステル前駆体（Ｒａ＝ＣＯＯＲ１（ここで、Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ４アルキルである））は、既知の方法により酸性又は塩基性条件下での加水分解によって対応するカルボン酸（Ｒ＝ＣＯＯＨ）に変換することができる。あるいは、ニトリル前駆体（Ｒａ＝ＣＮ）は、適切な条件下でアジ化ナトリウムとの反応によりテトラゾール（カルボン酸等価体）に、又は加水分解によりカルボン酸（Ｒ＝ＣＯＯＨ）に変換することができる。
【００８３】
アミン出発物質は、WO2009/111463若しくはWO 2007/024717に記載される方法により、又は当業者に知られている任意の他の方法により調製することができる。上記参考文献の全ての内容は、引用例として本明細書に取り込まれる。この塩基の性質は特に限定されない。好ましい塩基は、特に限定されないが、水素化物（例えば、水素化ナトリウム又はカリウム）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを包含する。他の適切な塩基は、特に限定されないが、非環式アミン類（例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジメチルフェニルアミン、ジイソプロピルエチルアミン及びトリブチルアミン）、環式アミン類（例えば、Ｎ−メチルモルホリン）及び芳香族アミン類（ジメチルアニリン、ジメチルアミノピリジン及びピリジン）よりなる群から選択される、第３級アミンのような有機塩基を包含する。
【００８４】
本反応は、溶媒の存在下又は非存在下で実施することができる。使用されるとき、溶媒の性質は、特に限定されず、例としてエステル（例えば、酢酸エチル）、エーテル（例えば、ＴＨＦ）、塩素化溶媒（例えば、ジクロロメタン又はクロロホルム）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、及びアセトニトリル若しくはトルエンのような他の溶媒、又は相互の若しくは水とのこれらの溶媒の混合物のような溶媒を包含する。
【００８５】
式（Ｉ）（式中、Ｒ＝ＣＯＯＨ）の化合物の塩は、親分子を適切な塩基、例えば、ＮａＯＨ又はＫＯＨと反応させることにより調製することができ、対応するアルカリ金属塩、例えば、ナトリウム又はカリウム塩が得られる。あるいは、エステル類（Ｒ＝ＣＯＯＲ１）は、適切な塩基との反応により塩に直接変換することができる。
【００８６】
式（Ｉ）の化合物の塩はまた、親分子を適切な酸、例えば、ＨＣｌ、フマル酸、又はパラトルエンスルホン酸と反応させることにより調製することができ、対応する塩、例えば、塩酸塩、トシラート又はヘミフマル酸塩が得られる。
【００８７】
実施例
以下の実施例は、本発明の幾つかの好ましい実施態様の例証として提供される。
【００８８】
実施例１：合成
機器：
ＮＭＲ：Bruker AVANCE III 400又はVarian Mercury 300
ＬＣ／ＭＳ：Autosampler 717Plus、Photo Diode Array Detector 2996、及びMass Detector 3100を取り付けたWaters Delta 600、又はShimadzu 210
【００８９】
７−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロベンゾ［ｆ］［１，４］チアゼピン（「アミン」）のアルキル化のための一般手順。
【００９０】
【化６】
0005965542.tif 000010
【００９１】
アミン（上記の構造）（１mmol）をジクロロメタン３mlに溶解した。この溶液に、アルキル化試薬（１mmol）、続いてＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．３４ml、２mmol）を加えた。この混合物を室温で一晩撹拌した。この溶液を直接カラム上に添加して、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（２：１、v/v）で溶出した。
【００９２】
【化７】
0005965542.tif 000011
３−（（７−メトキシ−２，３−ジヒドロベンゾ［ｆ］［１，４］チアゼピン−４（５Ｈ）−イル）メチル）安息香酸メチル：１ＨＮＭＲ(300 MHz, CDCl3): 7.96 (m, 2H), 7.46 (m, 3H), 6.70 (dd, J =8.4 Hz, 3.0 Hz, 1H), 6.50 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 4.09 (s, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.72 (s, 3H), 3.57 (s, 2H), 3.35 (m, 2H), 2.72 (m, 2H)。ＭＳ：３４４（Ｍ＋１）
【００９３】
【化８】
0005965542.tif 000012
４−（（７−メトキシ−２，３−ジヒドロベンゾ［ｆ］［１，４］チアゼピン−４（５Ｈ）−イル）メチル）安息香酸メチル：１ＨＮＭＲ (300 MHz, CDCl3): 7.99 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.46 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.37 (d, J= 8.7 Hz, 2H), 6.70 (dd, J =8.4 Hz, 3.0 Hz, 1H), 6.50 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 4.09 (s, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.72 (s, 3H), 3.57 (s, 2H), 3.35 (m, 2H), 2.72 (m, 2H)。ＭＳ：３４４（Ｍ＋１）
【００９４】
【化９】
0005965542.tif 000013
２−（（７−メトキシ−２，３−ジヒドロベンゾ［ｆ］［１，４］チアゼピン−４（５Ｈ）−イル）メチル）安息香酸メチル：本化合物は、エーテル中の２Ｍ  ＨＣｌにより塩酸塩に変換した。１ＨＮＭＲ (300 MHz, DMSO-d6): 10.33(br, 1H), 8.08 (d, J= 7.5Hz, 1H), 7.80-7.65 (m, 3H), 7.51 (d, J=8.1Hz, 1H), 7.14 (s, 1H), 6.99 (dd, J= 8.4, 2.1Hz, 1H), 4.90-4.40 (m, br, 4H), 3.88 (s, 3H), 3.78 (s, 3H), 3.40 (m, 2H), 3.26 (m, 1H), 3.11 (m, 1H)。ＭＳ：３４４（Ｍ＋１）
【００９５】
【化１０】
0005965542.tif 000014
２−（（７−メトキシ−２，３−ジヒドロベンゾ［ｆ］［１，４］チアゼピン−４（５Ｈ）−イル）メチル）ベンゾニトリル：１ＨＮＭＲ (300 MHz, CDCl3): 7.67-7.26 (m, 5H),  6.73 (d, J= 2.7 Hz, 1H), 6.74 (dd, J= 2.7,8.4 Hz, 1H), 4.14 (s, 2H), 3.78(s, 3H), 3.70 (s, 2H), 3.36 (m, 2H), 2.76 (m, 2H)。ＭＳ：３１１（Ｍ＋１）
【００９６】
【化１１】
0005965542.tif 000015
３−（（７−メトキシ−２，３−ジヒドロベンゾ［ｆ］［１，４］チアゼピン−４（５Ｈ）−イル）メチル）ベンゾニトリル：１ＨＮＭＲ (300 MHz, CDCl3): 7.64-7.42 (m, 5H),  6.74 (dd, J= 2.7,8.4 Hz, 1H), 6.48 (d, J= 2.7 Hz, 1H), 4.08 (s, 2H), 3.75(s, 3H), 3.57 (s, 2H), 3.36 (m, 2H), 2.76 (m, 2H)。ＭＳ：３１１（Ｍ＋１）
【００９７】
【化１２】
0005965542.tif 000016
４−（（７−メトキシ−２，３−ジヒドロベンゾ［ｆ］［１，４］チアゼピン−４（５Ｈ）−イル）メチル）ベンゾニトリル：１ＨＮＭＲ (300 MHz, CDCl3): 7.64 (d, J= 7.2Hz, 2H), 7.42 (m, 3H), 6.74 (dd, J= 2.7,8.4 Hz, 1H), 6.48 (d, J= 2.7 Hz, 1H), 4.08 (s, 2H), 3.75(s, 3H), 3.58 (s, 2H), 3.36 (m, 2H), 2.76 (m, 2H)。ＭＳ：３１１（Ｍ＋１）
【００９８】
エステルの加水分解（一般手順）
メチルエステル（３mmol）をＴＨＦ／メタノール／１Ｍ  ＮａＯＨ（１：１：１、v/v）３０mlに溶解した。この混合物を８時間撹拌すると、ＴＬＣではエステルの完全な消失を示した。濃ＨＣｌ  １mlを加えることにより、酸性ｐＨに調整した。有機溶媒を除去して、生成した固体を濾過により集めた。この固体を空気中で乾燥した。
【００９９】
【化１３】
0005965542.tif 000017
３−（（７−メトキシ−２，３−ジヒドロベンゾ［ｆ］［１，４］チアゼピン−４（５Ｈ）−イル）メチル）安息香酸：これは、ＥｔＯＡｃを溶媒とする抽出により得た。１ＨＮＭＲ (300 MHz, CDCl3): 8.10 (s, 1H), 8.04 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.80 (br, 1H), 7.46 (m, 2H), 6.80 (m, 2H), 4.40 (s, 2H), 3.90 (s, 2H), 3.76 (s, 3H), 3.42 (s, 2H), 2.86 (s, 2H)。ＭＳ：３３０（Ｍ＋１）、３２８（Ｍ−１）。
【０１００】
【化１４】
0005965542.tif 000018
４−（（７−メトキシ−２，３−ジヒドロベンゾ［ｆ］［１，４］チアゼピン−４（５Ｈ）−イル）メチル）安息香酸：これは、ＥｔＯＡｃを溶媒とする抽出により得た。１ＨＮＭＲ (300 MHz, CDCl3): 8.02 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.46 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.42 (d, J= 8.7 Hz, 2H), 6.70 (dd, J =8.4 Hz, 3.0 Hz, 1H), 6.50 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 4.11 (s, 2H), 3.72 (s, 3H), 3.62 (s, 2H), 3.35 (m, 2H), 2.76 (m, 2H)。ＭＳ：３３０（Ｍ＋１）、３２８（Ｍ−１）。
【０１０１】
化合物１、ナトリウム塩：
化合物１のナトリウム塩は、ＥｔＯＨ中のＮａＯＨ  １当量を用いて親分子から調製した（塩の融点：＞２９０℃）。
１ＨＮＭＲ (DMSO-D6, 600MHz), δ (ppm) : 7.77 (2H, m), 7.41 (1H, d), 7.13 (2H, m), 6.75 (1H, dd), 6.63 (1H, d), 4.00 (2H, s), 3.70 (3H, s), 3.49 (2H, s), 3.18 (2H, m), 2.70 (2H, m)。
【０１０２】
化合物１、ヘミフマル酸塩：
化合物１（中性形）１．６ｇ及びフマル酸２６５mgを丸底フラスコに導入した。アセトン１８mL及び水２mLの添加後、この反応混合物を還流した。部分的な可溶化を観測し（しかし完全な清澄化ではない）、続いて沈殿を観測した。次にこの反応混合物を一晩還流した。冷却後、残留固体を濾過により単離し、アセトン３mLで洗浄して真空下（４０℃／１０mbar）で４時間乾燥した。
１ＨＮＭＲ (DMSO-D6, 600MHz), δ (ppm): 12.97 (2H, bs), 7.90 (2H, m), 7.43 (1H, d), 7.40 (2H, m), 6.77 (1H, dd), 6.64 (1H, d), 6.62 (1H, s), 4.03 (2H, s), 3.70(3H, s), 3.58 (2H, s), 3.20 (2H, m), 2.72 (2H, m)。
【０１０３】
【化１５】
0005965542.tif 000019
２−（（７−メトキシ−２，３−ジヒドロベンゾ［ｆ］［１，４］チアゼピン−４（５Ｈ）−イル）メチル）安息香酸：本化合物は、エーテル中の２Ｍ  ＨＣｌにより塩酸塩に変換した。１ＨＮＭＲ (300 MHz, DMSO-d6): 10.10(br, 1H), 8.08 (d, J= 7.5Hz, 1H), 7.66-7.51 (m, 4H), 7.17 (d, J= 2.1Hz, 1H), 6.99 (dd, J= 8.4, 2.1Hz, 1H), 4.80-4.40 (m, br, 4H), 3.78 (s, 3H), 3.46 (m, 2H), 3.13 (m, 2H)。ＭＳ：３３０（Ｍ＋１）、３２８（Ｍ−１）。
【０１０４】
テトラゾールの合成（一般手順）
ニトリル前駆体（３．２２mmol）、アジ化ナトリウム（８３０mg、１２．９mmol）及びトリエチルアミン塩酸塩（１．７２ｇ、１２．９mmol）を無水ＤＭＦ  ４０ml中で１００℃で５日間撹拌した。ＤＭＦを高真空下で除去して、残渣を水と混合した。この水溶液をジクロロメタン（３×１００ml）で抽出した。この純粋な化合物をカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／メタノール）により精製した。
【０１０５】
【化１６】
0005965542.tif 000020
４−（２−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンジル）−７−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロベンゾ［ｆ］［１，４］チアゼピン：
１ＨＮＭＲ (300 MHz, CDCl3及びわずかなCD3OD): 8.30 (d, J= 8.7Hz, 1H), 7.53 (m, 2H). 7.14 (t, J= 7.8Hz, 1H), 7.20 (d, J= 7.5Hz,1H),  6.84 (dd, J= 2.7,8.4 Hz, 1H), 6.69 (d, J= 2.7 Hz, 1H), 4.46 (s, 2H), 3.80(s, 2H), 3.75 (s, 2H), 3.43 (m, 2H), 2.96 (m, 2H)。ＭＳ：３５４（Ｍ＋１）、３５２（Ｍ−１）
【０１０６】
【化１７】
0005965542.tif 000021
４−（３−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンジル）−７−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロベンゾ［ｆ］［１，４］チアゼピン：
１ＨＮＭＲ (300 MHz, CDCl3): 8.16 (s, 1H), 7.90 (d, J=7.5Hz, 1H), 7.40 (d, J= 8.4Hz, 1H),7.20 (m, 2H), 6.74 (dd, J= 2.7,8.4 Hz, 1H), 6.58 (d, J= 2.7 Hz, 1H), 4.18 (s, 2H), 3.75(s, 5H), 3.36 (m, 2H), 2.76 (m, 2H)。ＭＳ：３５４（Ｍ＋１）、３５２（Ｍ−１）
【０１０７】
【化１８】
0005965542.tif 000022
４−（４−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンジル）−７−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロベンゾ［ｆ］［１，４］チアゼピン：
１ＨＮＭＲ (300 MHz, CDCl3及び一滴のCD3OD): 7.99 (d, J= 7.2Hz, 2H), 7.42 (m, 3H), 6.74 (dd, J= 2.7,8.4 Hz, 1H), 6.53 (d, J= 2.7 Hz, 1H), 4.10 (s, 2H), 3.71(s, 3H), 3.58 (s, 2H), 3.36 (m, 2H), 2.76 (m, 2H)。ＭＳ：３５４（Ｍ＋１）、３５２（Ｍ−１）
【０１０８】
７−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロベンゾ［ｆ］［１，４］チアゼピン（「アミン」）の合成。
【０１０９】
【化１９】
0005965542.tif 000023
【０１１０】
２−（４−メトキシフェニルチオ）エタンアミン（１）
４−メトキシチオフェノール（５０ｇ、０．３５７mol）、２−クロロエチルアミン一塩酸塩（３９．８ｇ、０．３４３mol）、Ｋ２ＣＯ３（７８．８ｇ、０．５７mol）及びジイソプロピルエチルアミン（３２mL、０．１７８mol）をＴＨＦ  ２００mL中で混合した。この混合物を減圧下で５分間脱気して、アルゴン下で一晩還流した。溶媒を除去して、水（３００mL）をフラスコに加えた。この混合物をジクロロメタン（３×２００mL）で抽出した。有機層を集め、ジクロロメタンを除去して濃ＨＣｌ  ５０mLを加え、続いて水２００mLを加えた。この溶液を１：１  ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（３×２００mL）で抽出した。水層を２Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ１０に調整して、ジクロロメタン（３×２００mL）で抽出した。合わせた有機溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒の除去により、標的化合物６１ｇを無色の液体として収率９７％で得た。
１Ｈ−ＮＭＲ (300 MHz, CDCl3): 7.35(d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.81 (d, J= 8.7 Hz, 2H), 3.77 (s, 3H), 2.88-2.80 (m, 4H), 1.44 (s, 2H)。
【０１１１】
２−（４−メトキシフェニルチオ）エチルカルバミン酸ベンジル（２）
第１法
化合物１（８．０ｇ、４３．７mmol）、重炭酸ナトリウム（１２．１ｇ、１４４mmol）、水（１００mL）及びジクロロメタン（２００mL）を含有するフラスコに、クロロギ酸ベンジル（８．２ｇ、４８．１mmol、ジクロロメタン１００mLに希釈）を０℃で滴下により加えた。添加後、この混合物を室温で５時間撹拌した。有機層を集めて、水溶液をジクロロメタン１００mLで抽出した。合わせた有機溶液を硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を除去して、生じた固体をＴＨＦ／ヘキサン（１：１０）２００mLで粉砕した。この固体を集めて、乾燥すると、標的生成物（１２．９ｇ）が収率９３％で残った。
【０１１２】
代替法
ジクロロメタン２００mL中の化合物１（１０ｇ、５４．６mmol）及びトリエチルアミン（１５mL、１０６mmol）の溶液に、クロロギ酸ベンジル（７．２４mL、５１．５mmol、ジクロロメタン１００mLに希釈）を０℃で滴下により加えた。添加後、この溶液を室温で１時間撹拌した。固体を濾過により除去した。この溶液を０．１Ｍ  ＨＣｌ  １００mL及び飽和炭酸ナトリウム１００mLで抽出して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒の除去により、白色の固体を得、これをＴＨＦ／ヘキサン（１：２０）２００mL中で３時間撹拌した。固体を濾過により集めることによって、標的化合物１４．２ｇを収率８７％で得た。
１Ｈ−ＮＭＲ (300 MHz, CDCl3): 7.35(m, 7H), 6.83 (d, J= 8.7 Hz, 2H), 5.07 (m, 3H), 3.77 (s, 3H), 3.10 (q, J = 6.3 Hz, 2H), 2.92 (t, J= 6.3 Hz, 2H)。
【０１１３】
７−メトキシ−２，３−ジヒドロベンゾ［ｆ］［１，４］チアゼピン−４（５Ｈ）−カルボン酸ベンジル（３）
トルエン２５０mL中の化合物２（７．３ｇ、２３mmol）、パラホルムアルデヒド（６．９ｇ、０．２３mol）及びｐ−トルエンスルホン酸（１．４５ｇ、７．６mmol）の混合物を７０℃で一晩撹拌した。室温に冷却後、固体を濾別した。この溶液を飽和炭酸ナトリウム（１００mL）で抽出して、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒の除去後、標的生成物（７．４ｇ）を液体として収率９７％で得た。
１Ｈ−ＮＭＲ (300 MHz, CDCl3): 7.44 (d, J= 8.1 Hz, 0.77H), 7.32 (m, 5.60H), 7.07 (d, J= 2.7 Hz, 0.33H), 6.68 (m, 1.30H), 5.04 (s, 2H), 4.59 (ss, 2H), 3.96 (br, 1.80), 3.80 (ss, 1.23 H), 3.55 (s, 1.97H), 2.76 (m, 2H)。
【０１１４】
７−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロベンゾ［ｆ］［１，４］チアゼピン臭化水素酸塩（アミン）（４ＨＢｒ塩）
第１法
ＨＢｒの溶液（酢酸中３３％、１０mL）を化合物３（４．２ｇ、１２．８mmol）に加えた。添加後、二酸化炭素が発生し始めて、白色の固体が生成した。この混合物を室温で更に２時間静置した。ジエチルエーテル（１５０mL）をこの混合物に加え、これを３０分間撹拌した。濾過により固体を集めて、ジエチルエーテルで洗浄した。固体を真空下で乾燥することにより、標的化合物３．４０ｇを収率９１．８％で得た。
１Ｈ−ＮＭＲ (300 MHz, DMSO-d6): 9.02 (br, 2H), 7.52 (d, J= 8.1 Hz, 1H), 7.27 (d, J= 3.3 Hz, 1H), 6.92 (dd, J= 8.4, 2.7 Hz, 1H), 4.41 (s, 2H), 3.77 (s, 3H), 3.53 (m, 2H), 2.96 (m, 2H)。
【０１１５】
代替法（遊離塩基（４ａ））
化合物３（１０ｇ、３０mmol）を濃ＨＣｌ  ５０mL、水５０mL及びジオキサン３０mLと混合した。この混合物を１００℃で一晩撹拌した。室温に冷却後、溶媒の大部分とＨＣｌとを減圧下で除去した。水（１００mL）をこの溶液に加えて、固体を濾別した。この水溶液をＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１、３×１００mL）で抽出して、ＮａＯＨ  １５ｇを加えることにより塩基性にした。この混合物をジクロロメタン（３×１５０mL）で抽出した。合わせた溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒の除去により、液体を得、これを室温で静置後、標的化合物６．２ｇが残った。
１Ｈ−ＮＭＲ (300 MHz, CDCl3): 7.42 (d, J= 8.1 Hz, 1H), 6.78 (d, J= 2.7 Hz, H), 6.68 (dd, J= 2.7, 8.1 Hz, 1H), 4.08 (s, 2H), 3.96 (br, 1.80), 3.76 (s, 3 H), 3.38 (m, 2H), 2.68 (m, 2H)。
【０１１６】
実施例２：ＰＫＡリン酸化ＲｙＲ２へのカルスタビン２の結合
以前報告（Marx et al., 2000; Kaftan et al., Circ. Res., 1996, 78:990-97）されたとおり心臓ＳＲ膜を調製した。抗カルスタビン抗体（１：１，０００）（Jayaraman et al., J. Biol. Chem., 1992, 267:9474-77）により室温で１時間、報告されたとおりミクロソーム（５０μg）のイムノブロットを実施した（Reiken et al., Circulation, 107:2459-66, 2003）。ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ（１：５，０００希釈；Transduction Laboratories, Lexington, Ky.）とのインキュベーション後、ＥＣＬ（Amersham Pharmacia, Piscataway, N.J.）を用いてブロットを展開させて、Ｘ線フィルム上で検出したか、又は赤外色素で標識した二次抗体に曝露して、Li-Cor Biosciences製の装置（モデルOdyssey）で可視化した。特に断りない限り、化合物は１００nMの濃度で試験した。代表的なカルスタビン２結合試験法は、以下に提示される。
【０１１７】
Ａ．心筋小胞体（ＣＳＲ）のＰＫＡリン酸化
反応混合物を１．５ml微量遠心管にセットした。心臓ＳＲ  ２００μgをキナーゼ緩衝液、ＰＫＡ及びＡＴＰの反応混合物に加えて最終容量を１００μlとした（以下の反応混合物）。ＡＴＰは反応を開始させるために最後に加えた。
反応混合物：
２０μl＝試料（心臓ＳＲ、２又は１０μg/μl）
１０μl＝１０×キナーゼ緩衝液（８０mM  ＭｇＣｌ２、１００mM  ＥＧＴＡ、５００mM  トリス／ＰＩＰＥＳ）、ｐＨ＝７．０
２０μl＝ＰＫＡ（２単位/μl）（Sigma # P2645）
１０μl＝１０×ＡＴＰ（１．０mM）（Sigma A 9187）
４０μl＝蒸留Ｈ２Ｏ
１．  遠心管を３０℃で３０分間インキュベートした。
２．  次に反応混合物を０．５ml厚肉ガラス管に移した。
３．  反応混合物を含有するガラス管をSorvall Centrifuge RCM120EX中でS120AT3ローターを用いて５０，０００×ｇで１０分間遠心分離した。５０，０００×ｇで１０分間の遠心分離は、ミクロソームを単離するのに充分である。
４．  生じたペレットを結合緩衝液（１０mMイミダゾール、３００mMショ糖、ｐＨ＝７．４）で４回洗浄した。各回１×結合緩衝液１００μlをガラス管に加えることによりペレットを洗浄した。ピペット先端を用いて上下に洗い流すことによりペレットを再懸濁した。最後の回転後、結合緩衝液５０μlを加えて、全てのガラス管からのペレットをプールした。反応液を−２０℃で保存した。
５．  ６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によりＣＳＲおよそ１０μgを分離して、全ＲｙＲ（5029抗体、１：３０００希釈又はAffinity Bioreagentsからのモノクローナル抗体、Cat # MA3-916、１：２０００希釈）及びＰＫＡリン酸化ＲｙＲ２（P2809抗体、１：１００００希釈）の両方のイムノブロットを解析することにより、リン酸化を確認した。
６．  アリコートを−８０℃で保存することができる。
【０１１８】
Ｂ．カルスタビン再結合試験法
１．  ＰＫＡリン酸化ＣＳＲ（およそ２０μg）を、化合物を含むか又は含まない１００μl結合緩衝液（上記）中で２５０nMカルスタビン２と共にインキュベートした。
２．  反応液を０．５ml厚肉ガラス管（Hitachi Centrifugeウェア、カタログ# B4105）にセットした。
３．  カルスタビン２を最後の試薬として反応混合物に加えた。反応は、室温で３０分間実施した。
４．  反応後、ガラス管を１００，０００ｇで１０分間遠心分離した（S120AT3ローターの付いたSorvall RCM120EX遠心分離機）。
５．  生じたペレットを１×結合緩衝液中で４℃で４回洗浄した。各洗浄後、ガラス管を５０，０００ｇで４℃で１０分間遠心分離した。
６．  最終洗浄後、上清を廃棄した。
７．  試料緩衝液（２×）２０μl［６×後述の試料緩衝液］を加えて、ピペットの先端を用いて、及び／又は短時間のボルテックスにより、ペレットを再懸濁した。この懸濁液を１．５ml微量遠心管に移した。
８．  この遠心管を９０℃で４分間加熱した。
９．  １５％  ＳＤＳ／ＰＡＧＥを用いてタンパク質を分離した。
１０．  抗ＦＫＢＰ（Jayaraman et al., J.  Biol.  Chem.  1992;267:9474-77、１：２０００）一次抗体及び適切な二次抗体によりカルスタビン２を検出した。
【０１１９】
６×試料緩衝液
７．０ml  ４×トリス−ＨＣｌ／ＳＤＳ、ｐＨ６．８
３．０ml  グリセロール（３０％最終濃度）
１．０ｇ  ＳＤＳ（１０％最終濃度）
０．９３ｇ  ＤＴＴ（０．６Ｍ  最終）
１mgブロモフェノールブルー（０．００１％最終濃度）
蒸留水で最終容量１０mlとする。
１mlアリコートを−７０℃で保存する。
【０１２０】
結果：
図１Ａは、１００nM化合物１の非存在下（−）又は存在下でのＰＫＡリン酸化ＲｙＲ２へのカルスタビン２の結合を示す、カルスタビン２抗体によるイムノブロットを表す。（＋）：非ＰＫＡリン酸化ＲｙＲ２へのカルスタビン結合。US 7,544,678に記載されたベンゾチアゼピンであるＳ３６は、対照として使用する。示されるように、化合物１は１００nMの濃度で、ＰＫＡリン酸化ＲｙＲ２からのカルスタビン２の解離を防止したか、かつ／又はＰＫＡリン酸化ＲｙＲへのカルスタビン２の（再）結合を増強した。
【０１２１】
図１Ｂに示されるように、以下の代表化合物はまた、上記のカルスタビン２再結合試験法で１００nM：化合物２、化合物３及び化合物４で試験するとき、ＰＫＡリン酸化ＲｙＲ２からのカルスタビン２の解離を防止するか、かつ／又はＰＫＡリン酸化ＲｙＲ２へのカルスタビン２の（再）結合を増強することが見い出された。
【０１２２】
実施例３：ＫＡリン酸化ＲｙＲ１へのカルスタビン１の結合
骨格筋からのＳＲ膜を実施例２と類似のやり方で、そして更には米国特許出願公開2004/0224368（これの内容は、引用例として本明細書に取り込まれる）に記載されたように調製した。ミクロソーム（５０μg）のイムノブロットは、記載されたとおり抗カルスタビン１抗体（Zymed）（１：１，０００）により実施した。実施例２に記載されたように、ブロットを展開させて定量した。
【０１２３】
図１Ｃは、指示濃度の化合物１又は化合物４の非存在下（Neg）又は存在下でのＰＫＡリン酸化ＲｙＲ１へのカルスタビン１の結合を示す、カルスタビン１抗体によるイムノブロットを表す。（Pos）：非ＰＫＡリン酸化ＲｙＲ１へのカルスタビン結合。Ｓ３６は、対照として使用する。示されるように、化合物１及び化合物４は、ＰＫＡリン酸化ＲｙＲ１からのカルスタビン１の解離を防止したか、かつ又はＰＫＡリン酸化ＲｙＲ１へのカルスタビン１の（再）結合を用量依存的に増強し、それぞれ約１００nM及び１５０nMの推定ＥＣ５０であった。
【０１２４】
実施例４：イソプロテレノール処置マウスにおけるＲｙＲ１へのカルスタビン１の再結合
ベータアドレナリン作動性受容体アゴニストである、イソプロテレノールは、ベータアドレナリン作動性受容体の過剰刺激を介してマウスの心不全を誘導する。これと同時に、ＰＫＡの活性化、ＳＲ上のＲｙＲ２のリン酸化、及びＲｙＲ２へのカルスタビン２（ＦＫＢＰ１２．６）の相互作用の低下が起こる。ＲｙＲ１がリン酸化されて、ＲｙＲ１へのカルスタビン１（ＦＫＢＰ１２）の結合の低下がもたらされる、類似の一連の事象が骨格筋において起こる。
【０１２５】
国際特許公開WO 2008/064264（この内容は、引用例として本明細書に取り込まれる）に詳細に記載されるように、野生型マウスへの長期イソプロテレノール処置は、容易に定量できるＲｙＲ生化学的性質の変化を誘導するための迅速で信頼できる方法を提供する。これらの変化は、ＲｙＲリン酸化の増加及びこれと同時のカルスタビン結合の低下を包含する。
【０１２６】
動物及び試薬
承認されたプロトコールによりＣ５７Ｂｌ／６マウスを維持して試験した。交感神経ベータアドレナリン作動性アゴニストである、イソプロテレノール（ＩＳＯ）は、Sigma（I65627）から調達して、水中の１００mg/ml原液として調製した。溶解緩衝液は、ショ糖（１mM）、ジチオトレイトール（３２０mM）、及びプロテアーゼインヒビターの錠剤１錠（１０×）を１０ml原液（１０mM  ＨＥＰＥＳ、１mM  ＥＤＴＡ、２０mM  ＮａＦ、２mM  Ｎａ３ＶＯ４）に加えることにより製造した。
【０１２７】
浸透圧ポンプの調製及び外科的移植
マウスに、皮下移植した浸透圧注入ポンプ（Alzet MiniOsmotic pump, Model 2001, Durect Corporation, Cupertino, CA）を用いて、１０mg/mlイソプロテレノール（１μl/時）を５日間連続注入した。
【０１２８】
薬物添加には、浸透圧ポンプを垂直に保持して、薬物溶液２００μlを、過剰の薬物溶液（≒２５０〜３００μl）を含有する（カニューレに取り付けられている）１mlシリンジを介してポンプに注入した。シリンジをゆっくりと持ち上げながら、ポンプが過剰充填されるまで、薬物溶液をゆっくり下向きに注入した。ポンプにキャップをする際に押しのけられた流体のオーバーフローにより、ポンプが適切に充填されたことを確認した。
【０１２９】
充填した浸透圧ポンプは、以下の工程により皮下移植した。レシピエントマウスに、０．６L/分で投与されるＯ２中の１．５〜２％イソフルランで麻酔をかけ、次にその体重を測定して記録した。次にマウスは、ノーズコーンに顔を入れ、胸を下にして発泡スチロール上に置いた。耳の後ろから頭頂部に伸びる頸部の後ろで毛皮を刈りこんだ。この領域を７０％アルコールで軽く拭き、頭頸部後ろの正中線で小切開を行った。縫合ホルダは、アルコールで消毒し、切れ目に挿入して、下部組織から皮膚を切り離すために開いた。ポンプに対応するため、この開口部は後四半部まで拡張した。充填したポンプは、開口部に挿入し、その放出部位を切開部から離して配置して、最小の張力で皮膚の下に沈められるようにした。切開部は、約５〜６針分を要する５．０ナイロン縫合糸で閉じ、その領域を７０％アルコールで軽く拭いた。手術後、マウスは、損傷や交感神経系の活性化の可能性を最小限にするために個別のケージに入れた。
【０１３０】
骨格筋の単離
マウス骨格筋組織を以下のとおり単離した。足首で皮膚を切って上に引き上げることにより、脚の筋肉を露出させた。この組織をTyrode緩衝液（１０mM  ＨＥＰＥＳ、１４０mM  ＮａＣｌ、２．６８mM  ＫＣｌ、０．４２mM  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．７mM  ＭｇＣｌ２、１１．９mM  ＮａＨＣＯ３、５mMグルコース、１．８mM  ＣａＣｌ２、ＣａＣｌ２を含まない１０×溶液から作られる１００ml  １×緩衝液に２０mg  ＣａＣｌ２を加えることにより調製）で湿らせて保持した。以下の筋肉を単離して、液体窒素中で凍結させた。長趾伸筋（ＥＤＬ）は、外側腱と、ＥＤＬと脛骨腱によって形成されたＸとの間にはさみを挿入し、膝に向かって上方に切り取り；腓骨筋を切り取ることにより腓腹筋の扇状の腱を露出させ；Ｘ下、及びＥＤＬ腱を緩めるための筋肉の下に鉗子を挿入し；ＥＤＬの腱を切断して、筋肉を引き上げ；そして最後にＥＤＬを切り離すことによって単離した。ヒラメ筋は、腓腹筋の上から腓骨筋を取り出し；アキレス腱を切断して持ち上げることにより、腓腹筋の下側にあるヒラメ筋を露出させ；膝の後ろの筋肉の上にあるヒラメ筋を切断し；そして最後にヒラメ筋を引っ張り、腓腹筋から切り離すことによって単離した。脛骨筋は、足首の前面から脛骨腱を切断し、この腱を上に引き上げ、そして脛骨からそれを切り離すことによって単離した。広筋（大腿筋）は両脚から、膝のすぐ上の筋肉を切断し、そして筋束を取り出すことによって単離した。試料は液体窒素中で凍結させた。
【０１３１】
組織溶解物からのＲｙＲ１免疫沈降
ＲｙＲ１は、ホモジネート２００〜５００μgを改変ＲＩＰＡ緩衝液（５０mM  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．９％  ＮａＣｌ、５．０mM  ＮａＦ、１．０mM  Ｎａ３ＶＯ４、０．５％  Triton-X100、及びプロテアーゼインヒビター）０．５ml中の抗ＲｙＲ１抗体（Zymed）２μlと共に４℃で１．５時間インキュベートすることにより、試料から免疫沈降させた。次にこの試料は、プロテインＡセファロースビーズ（Amersham Pharmacia Biotech, Piscatawy, NJ）と共に４℃で１時間インキュベートし、次にビーズを氷冷ＲＩＰＡで３回洗浄した。試料を９５℃に加熱して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（カルスタビン用の１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によりサイズ分画した。抗ＦＫＢＰ抗体（ＦＫＢＰ１２／１２．６、Jayaraman et al., J.  Biol.  Chem.  1992;267:9474-77）を１：２０００希釈で用いてイムノブロットを発色させた。抗体は、５％ミルク又はＴＢＳ−Ｔ（２０mM  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  Tween（登録商標）２０、０．５％  Triton X-100）に希釈した。
【０１３２】
結果
試験化合物を含むか又は含まないイソプロテレノールを含有する浸透圧ポンプを、上記のとおりマウスに移植した。マウスに、ビヒクル単独（ＤＭＳＯ／ＰＥＧ）、イソプロテレノール単独（ＩＳＯ）（０．５mg/kg/時）、又はイソプロテレノール（０．５mg/kg/時）と指示濃度の化合物１との組合せで５日間浸透圧により灌流した。６日目に、各マウスを殺処分して、骨格筋組織を単離して、ＲｙＲ１免疫沈降物中のカルスタビン１結合を分析するために使用した。
【０１３３】
イソプロテレノール処置マウスから単離された骨格筋におけるＲｙＲ１へのカルスタビン１結合の増強に及ぼす化合物１の作用は、図２Ａ（イムノブロット）及び２Ｂ（定量化グラフ）に表す。示されるように、化合物１は、骨格筋膜のＲｙＲに結合したカルスタビン１のレベルを、陽性対照として使用される別のベンゾチアゼピン誘導体（WO 2008/064264）であるＳ３６  ３．６mMの投与により観測されるレベルと同様のレベルまで増強した。同様の結果は、化合物４についても得た（データは示していない）。
【０１３４】
実施例５：ラットにおける慢性虚血後心不全のモデルでの化合物１の作用
目的
本試験の目的は、虚血−再灌流誘発性心不全のモデルにおける、心機能障害を軽減し、そして心室リモデリングを弱める、化合物１の能力を試験することであった。
【０１３５】
方法
慢性心不全は、虚血−再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害によりオスのウィスター系ラット（２２４〜２４０ｇ、１０〜１１週齢）で誘発させた。Ｉ／Ｒプロトコールのために、左前下行枝（ＬＡＤ）冠動脈を１時間閉塞した。薬物処置（飲用水中５mg/kg/日又は１０mg/kg/日）は再灌流の１週間後に開始して、３ヶ月の試験期間維持した。化合物１の効力は、ビヒクル処置及び偽操作したラットと比較して、心エコー検査により処置開始の１、２及び３ヶ月後に、そして侵襲的血行動態により３ヶ月後に評価した。心臓標本もまた、肥大及びコラーゲン含量を評価するために分析した。図３に示されるように薬物の血漿濃度を評価するために、試験最終日に各ラットから血液を採取した。試験設計は図３に表す。実験は盲検法で実施した。
【０１３６】
統計的方法
経時的に測定したパラメーターには、偽操作対ビヒクルの比較及び薬物処置の比較は、反復測定による２要因ＡＮＯＶＡによって解析する。殺処分及び形態計測で測定したパラメーターには、偽操作対ビヒクルの比較は、ｔ検定により解析し、そして薬物処置の比較は、１要因ＡＮＯＶＡとこれに続くDunnett検定により解析する。
【０１３７】
結果
偽操作ラットと比較したビヒクル処置Ｉ／Ｒラットは、左室（ＬＶ）収縮末期（ＬＶ  ＥＳＶ）及び拡張末期（ＬＶ  ＥＤＶ）容積の増大（図４Ａ及びＢ）、駆出率（ＥＦ）低下により測定される低い心機能（図４Ｃ）並びに間質コラーゲン含量の増大（図５Ｄ）を示した。５及び１０mg/kg/日で投与した化合物１は、ビヒクルに比較して１〜３ヶ月でＥＦを有意に増大させ、更にはＬＶＥＳＶ及びＬＶＥＤＶの両方を低下させ（図４Ａ〜Ｃ）、更には間質コラーゲン含量を減少させた（図５Ｄ）。
【０１３８】
侵襲的血行動態試験（３ヶ月時点）は、ビヒクルと比較した、５及び１０mg/kg/日で化合物１により処置したラットにおいてＬＶ  ｄＰ／ｄｔ  ｍａｘ及びＬＶ  ｄＰ／ｄｔ  ｍｉｎの保存を示し（図６Ｂ及びＣ）、処置によりＬＶ収縮期圧に統計的に有意な変化はなかった（図６Ａ）。
【０１３９】
処置により体重（ＢＷ）、梗塞サイズ又は肥大（ＬＶ重量）に及ぼす作用は観測されなかった（図５Ａ〜Ｃ）。薬物の血漿濃度は図７に表す。
【０１４０】
結果は、化合物１が５mg/kg/日という低い濃度で、ラットでの慢性虚血後心不全のモデルにおいて収縮期及び拡張期心機能の両方に有益な作用を発揮することを示している。
【０１４１】
化合物１は、WO 2007/024717に記載された構造的に関連するベンゾチアゼピン誘導体である化合物Ａと比較して、有意にそして驚くほど活性が高かった。図８に示されるように、５mg/kg/日の濃度で３ヶ月間投与した化合物Ａは、試験の終了時に慢性虚血後心不全ラットモデルにおいて化合物１と比較すると、収縮期及び拡張期心機能を改善できなかった。よって化合物Ａにはない化合物１の有益な作用が、ラットＣＨＦモデルにおいて５mg/kg/日の用量で３ヶ月の処置後に観測された。
【０１４２】
【化２０】
0005965542.tif 000024
【０１４３】
実施例６：マウス筋ジストロフィーモデル（ｍｄｘ）における筋機能に及ぼす化合物１の作用
目的
本試験の目的は、化合物１での処置がジストロフィン欠損マウスモデル（ｍｄｘ）における筋機能を改善するかどうかを試験することであった。
【０１４４】
方法
試験開始時６週齢でおよそ２０グラムのＣ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ−ＤＭＤｍｄｘ／Ｊ（ｍｄｘと略す、１群ｎ＝５）マウスを、６日間ホイール付きケージに順応させ、次に飲用水中に入れて４週間自由に投与させるビヒクル（Ｈ２Ｏ）又は標的用量の５mg/kg/日、１０mg/kg/日、又は５０mg/kg/日（実際の用量：それぞれ７．９mg/kg/日；１２．８mg/kg/日；及び６１．５mg/kg/日、体重で割った毎週測定される薬物溶液消費量から求めた）の化合物１のナトリウム塩（親薬物の重量に基づく；このナトリウム塩は以降この実施例では「化合物１」と呼ばれる）のいずれかでの処置を受ける群にランダム化した。週齢を適合させたＣ５７ＢＬ／６（ＷＴと略す、１群ｎ＝４）マウスを、ビヒクル（Ｈ２Ｏ）又は標的用量の５０mg/kg/日（実際の用量：６７．７mg/kg/日）の化合物１のナトリウム塩のいずれかでの処置を受ける群にランダム化した。
【０１４５】
ホイール上での自発活動、体重及び平均水消費量を最初の３週間に測定した。比筋力を４週間の処置後、試験の終了時に測定した。
【０１４６】
２４時間にわたる移動距離（Km/日）を、機能的活動の改善の指標として解析した（http://www.treat-nmd.eu/のDMD_M.2.1.002 SOPを参照のこと）。本試験の終わりに、更に本明細書に後述されるように筋力解析のために長趾伸筋（ＥＤＬ）を単離した。試験の終了時（暗サイクルの終了後、約７ＡＭ）に眼窩後放血により各マウスから血液を採取することにより、薬物の血漿濃度を評価した。実験は盲検法で実施した。
【０１４７】
筋力測定
試験の終了時に、Aurora Scientific (Aurora, Ontario, Canada)の407A Muscle Test Systemを用いる等尺性筋力解析のためにＥＤＬ筋を後肢から切断した。６−０縫合糸を各腱と結んで、ＥＤＬ筋全体、腱から腱までをＯ２／ＣＯ２（９５％／５％）で泡立てたTyrode液（単位mM：ＮａＣｌ  １２１、ＫＣｌ  ５．０、ＣａＣｌ２  １．８、ＭｇＣｌ２、ＮａＨ２ＰＯ４、ＮａＨＣＯ３  ２４、及びグルコース  ５．５）のRagnoti浴に移した。縫合糸を用いて、力変換器に接続したステンレスのフックに１つの腱を垂直に結んだ。もう一方の縫合糸を結んだ腱をAuroraシステム上の移動アーム中にしっかり締め付けた。２つの白金電極の間の電場を用いて、ＥＤＬ筋に刺激を加えて収縮させた。各実験の開始時に、最大の筋力が得られるように筋肉長を調整した。筋力・周波数関係は、増分刺激周波数（閾値上電圧で２００ミリ秒間５〜２５０Hz）を使用して収縮を始動させることにより求めた。刺激の間に筋肉は≒３分休ませた。筋力測定の終了時に、Auroraシステムに縫合糸で結ばれたままＥＤＬ筋の長さ（Lo）を腱を除いて測定した。次にＥＤＬ筋をシステムから取り出して、端の腱及び縫合糸を切り取った後に秤量した。次にＥＤＬ筋を液体窒素中で凍結した。ＥＤＬ筋の断面積（mm２）は、ＥＤＬ筋の長さ及び１．０５６mg/m３の哺乳類の筋肉密度定数（Yamada, T., et al. Arthritis and rheumatism 60:3280-3289）によってＥＤＬ筋重量を割ることによって算出した。ＥＤＬ比筋力（kN/m２）を求めるために、絶対強縮筋力をＥＤＬ筋の断面積で割った。
【０１４８】
統計的方法
統計的有意性を求めるために、２群間の比較のためにスチューデントｔ検定を使用した。全てのプールしたデータは平均±ＳＥＭとして表す。
【０１４９】
結果
ｍｄｘマウスにおいて自発運動を改善する化合物１の能力を試験した。マウスを自発的ホイール付きケージに順応させた後、自発的ホイール上のマウスの活動をコンピュータ２４／７によりモニターした。３週間にわたり収集データを１日に移動した距離に書き換えた。１０及び５０mg/kg/日（標的用量）の化合物１で処置したｍｄｘマウスは、ビヒクル（Ｈ２Ｏ）単独で処置したｍｄｘマウスと比較して、ホイール上で有意に長い距離を移動した（１日目〜１９日目でＰ＜０．００１）。処置効果は、処置開始から２〜３日目という早さで観測され、活動モニター期間を通して続いた。移動距離に及ぼす化合物１の効果は、５０mg/kg/日の化合物１で処置したＷＴマウスでは観測されなかった（図９）。更に、ＥＤＬ筋においてインビトロの筋力測定により測定すると（図１０）、化合物１処置は、ｍｄｘ筋における比筋力を用量依存的に増大させた。１５０Hz以上の刺激周波数では、５０mg/kg/日処置ｍｄｘマウスは、比筋力の統計的に有意な上昇を示した（P＜０．０５）。ＷＴマウスでは比筋力に及ぼす化合物１処置の効果は観測されなかった。
【０１５０】
図１１に示されるように、化合物１処置は、体重には影響を及ぼさなかった。水消費量に及ぼす用量依存効果は観測されなかった。化合物１の朝の血液曝露は、５mg/kg/日を投薬したｍｄｘマウスでは（平均±ＳＥＭ）３．３±０．４μM、１０mg/kg/日を投薬したｍｄｘマウスでは１０．７±０．９μM、５０mg/kg/日を投薬したｍｄｘマウスでは５２．８±１．７μM、そして５０mg/kg/日を投薬したＷＴマウスでは７２．８±７．０μMであった。総合すれば、結果は、ビヒクル処置対照と比較すると、１０mg/kg/日及び５０mg/kg/日（標的用量）の化合物１での処置は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）のネズミモデルであるｍｄｘマウスにおいて、３週間後の自発的ホイール運動及び４週間後の比筋力を改善したが、これによって筋ジストロフィーの処置における、本明細書に特許請求される化合物１及びその類似体の有用性が証明された。
【０１５１】
実施例７：代謝安定性
本発明の代表的Rycal（商標）である化合物１の代謝安定性を、WO 2007/024717に記載された構造的に関連するベンゾチアゼピン誘導体である化合物Ｂ及び化合物Ｃと比較した。
【０１５２】
Ａ．ヒト肝ミクロソームにおける代謝安定性
方法：
化合物可溶化：原液はＤＭＳＯ中に、そして使用液は１mg/ml  ＢＳＡを含有する水中に製造した。
【０１５３】
代謝の生物学的利用能予測：代謝の生物学的利用能予測（ＭＦ％）は、肝ミクロソームの全吸収を仮定したインビトロの代謝安定性測定に基づいた。簡単に述べると、未変化薬物は、ＮＡＤＰＨ（１mM）の存在下での０、５、１５、３０及び６０分のインキュベーション後のラット及びヒト肝ミクロソーム（０．３３mgタンパク質/ml）とのインキュベーション（１０−７Ｍ）に続くＬＣ−ＭＳ−ＭＳにより定量した。メタノール（v/v）で酵素反応を停止させ、遠心分離によりタンパク質を沈降させた。ml/分/gタンパク質として表されるインビトロ固有クリアランス（Clint_mic）は、インキュベーション時間に対する未変化薬物の残存濃度の傾き（ＬＮ線形化後）であった。次にインビトロClintを、０．０４５mgタンパク質/kgの肝臓、並びにラットでは１１ｇの及びヒトでは１．２kgの肝重量を用いて、インビボの全身（vivoClint）にスケールアップした。次にインビボClintは、よく撹拌したモデル（HepCl＝vivoClint×ＨＢＦ／（vivoClint＋ＨＢＦ）、ここでＨＢＦ（肝血流）はラットでは２２ml/分及びヒトでは１５００ml/分としてとられた）を用いて、肝クリアランス（HepCl）に変換した。次にＭＦ％は、以下の式（ＭＦ％＝１−HepCl／ＨＢＦ）により抽出比から推論した。結果は表１に提示される：
【０１５４】
【表１】
0005965542.tif 000025
【０１５５】
Ｂ．ラット及びヒト肝細胞における代謝安定性
化合物可溶化：原液はＤＭＳＯ中に、そして使用液は１／１０ラット血漿又は１／４ヒト血漿を含有するWilliam培地中に製造した。
【０１５６】
代謝安定性測定：化合物を１０−７Ｍで単離肝細胞（ラット肝細胞では６Ｅ＋５細胞/ml、及びヒト肝細胞では４Ｅ＋５細胞/ml）と共に３７℃でWilliam培地に希釈（ラットでは１／１０希釈、及びヒトでは１／４希釈）した同種からの血漿中でインキュベートした。サンプリング時間は、０、１０、２０、３０、６０及び１２０分で実施して、酵素反応はメタノール（v/v）で停止させた。遠心分離によりタンパク質を沈降させ、上清をＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析した。ml/分/gタンパク質として表されるClintは、肝ミクロソームについて、ヒトでは４Ｅ＋５細胞/mlについて０．１３４mgタンパク質/ml、及びラットでは６Ｅ＋５細胞/mlについて０．２０１mgタンパク質/mlの比を用いて算出した。対照薬物及び見込まれる代謝物の存在は、測定中各試料でＬＣ／ＭＣ／ＭＣによりチェックした。結果は、表２に提示される。
【０１５７】
【表２】
0005965542.tif 000026
【０１５８】
Ｃ．マウス及びラットミクロソームにおける代謝安定性
材料と方法
希釈緩衝液：５mM  ＥＤＴＡを含有するｐＨ７．４の０．１ＭトリスＨＣｌ緩衝液。
ＮＡＤＰＨ補因子溶液：希釈緩衝液２．７９mLを含有する５０mLファルコンチューブに、ＮＡＤＰＨ再生溶液Ａ  ０．４２９mL及びＮＡＤＰＨ再生溶液Ｂ  ０．０７９mLを加えた。
ミクロソーム調製：（１．５mg/mL溶液）希釈緩衝液３．３２mLを含有する５０mLファルコンチューブを３７℃で１５分間（少なくとも１０分間）予熱した。ミクロソーム（２４．６mg/mL）０．１７８mLを予熱希釈緩衝液に加えた。このミクロソーム調製物のタンパク質濃度は１．２５mg/mLであった。
試料（試験化合物）−最初の及び中間の原液：メタノール中の試験化合物の１mg/mL（化合物１には０．５mg/mLを使用した）溶液を調製した。希釈緩衝液を用いて、この最初の原液から試験化合物の１００μM中間溶液を調製した。１００μM中間溶液を希釈緩衝液を用いて希釈することにより５μM溶液を調製した。
実験：
（本実験は、１．５mLエッペンドルフ型微量遠心管で実施した）
０分インキュベーション。手順：
ａ．予熱ミクロソーム１００μLを加える
ｂ．試験化合物の５μM溶液５０μLを加える。
ｃ．冷停止溶液（氷冷メタノール）５００μLを加える
ｄ．ＮＡＤＰＨ補因子溶液１００μLをエッペンドルフ管に加える。
ａ．エッペンドルフ管をボルテックス混合する。
「ｔ」分インキュベーション
ｂ．ＮＡＤＰＨ補因子溶液１００μLをエッペンドルフ管に加える。
ｃ．試験化合物の５μM溶液５０μLを加える。
ｄ．予熱ミクロソーム１００μLを加える
ｅ．エッペンドルフ管を３７℃、３００rpmで「ｔ」分間サーモミキサーでインキュベートする。
ｆ．サーモミキサーからエッペンドルフ管を取り外す
ｇ．冷停止溶液（氷冷メタノール）５００μLを加える
ｈ．エッペンドルフ管をボルテックス混合する。
【０１５９】
「０」及び「ｔ」分インキュベートした試料は両方とも１５，０００rcfで４℃で１５分間遠心分離した。上清５００μLを取り出して、これをＬＣ／ＭＳ分析に付した（ＳＩＭ−選択イオンモニタリング）。
結果は、試験化合物残存％＝（「ｔ」分試料のＭＳ面積レスポンス／「０」分試料のＭＳ面積レスポンス）×１００として表す。使用したＭＳ面積は、二重反復注入の平均値である。
時点＝各試験化合物について０、１５、３０及び６０分
【０１６０】
陽性対照：
ラット及びマウスの肝ミクロソーム安定性実験のために２μMイミプラミン−５分及び２μMイミプラミン−１５分のインキュベーションを陽性対照として使用した。
結果は表３に提示される：
【０１６１】
【表３】
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【０１６２】
驚くべきことに、表１〜３に見られるとおり、化合物１は、マウス、ラット及びヒトミクロソームにおいて、並びにラット及びヒト肝細胞において、WO 2007/024717に開示された構造類似体化合物Ｂ及びＣ（これらは両方とも、この試験システムではインビトロの代謝安定性が低いことが見い出されたため、薬物候補として開発には不向きとなった）と比較すると有意に安定であった。驚くべきことにかつ予想外に、ＣＯＯＨ残基による先行技術化合物のＨ又はＯＨ残基の置換によって化合物１が得られ、そしてこれが全ての試験システムにおいて高い代謝安定性を示した。その構造類似体と比較した化合物１の代謝安定性の増大は、実際驚きであり、当該分野において既知の化合物に勝るこの化合物の予想外の有用性を立証する。
【０１６３】
本明細書に引用される全ての刊行物、参考文献、特許及び特許出願は、あたかもそれぞれ個々の出願、特許又は特許出願が、具体的にかつ個々にその全体が引用例として取り込まれることが示されたかのように、それと同程度にその全体が引用例として本明細書に取り込まれる。
【０１６４】
具体的な実施態様の前記の説明は、本発明の一般的性質を完全に明らかにするため、他の人達は、現在の知識を適用することにより、過度の実験をすることなく、かつ上位概念から逸することなく、このような具体的な実施態様を種々の応用のために容易に改変及び／又は適合させることができるため、このような適合及び改変は、開示された実施態様の均等物の意味及び範囲内で理解されるべきであり、かつ理解されることが意図されている。当然のことながら、本明細書に用いられた表現又は用語は、例証を目的とするものであって、限定を目的としない。種々の開示される機能を実施するための手段、材料、及び工程は、本発明から逸することなく、種々の代替形態をとることができる。
【図１Ａ】
0005965542.tif 000034
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
0005965542.tif 000040
【図６】
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【図７】
0005965542.tif 000042
【図８】
0005965542.tif 000043
【図９】
0005965542.tif 000044
【図１０】
0005965542.tif 000045
【図１１】
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