(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）クラミジア・トラコマチス  ２３Ｓ  ｒＲＮＡ中の特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーを前記ＲＮＡにハイブリダイズさせ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記ＲＮＡを鋳型として前記第二プライマーを伸張し、特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成して前記ＲＮＡとのＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を生成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素により、前記ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（３）前記特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーを前記（２）で得られる１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記ＤＮＡを鋳型として前記第一プライマーを伸張して（ここで第二のプライマー又は第一のプライマーのいずれか一方はその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されている）、特定塩基配列又は特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡ転写産物を生成させる工程、
（５）該ＲＮＡ転写産物を前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型とすることで、ＲＮＡ転写産物を連鎖的に生成させる工程、及び、
（６）生成したＲＮＡ転写産物量を測定する工程、
を含むことを特徴とする、クラミジア・トラコマチス  ２３Ｓ  ｒＲＮＡの特定塩基配列を増幅し検出する方法であって、
前記第一のプライマーが配列番号６又は７に記載の塩基配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号１７又は１８に記載の塩基配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記方法。
【請求項２】
（１）配列番号１７又は１８に記載の塩基配列に相補的な配列からなる第二のプライマーを前記ＲＮＡにハイブリダイズさせ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記ＲＮＡを鋳型として前記第二プライマーを伸張し、特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成して前記ＲＮＡとのＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を生成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素により、前記ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（３）配列番号６又は７に記載の塩基配列に相補的な配列からなる第一のプライマーを前記（２）で得られる１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記ＤＮＡを鋳型として前記第一プライマーを伸張して（ここで第一のプライマーの５’末端にはＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されている）、特定塩基配列又は特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡ転写産物を生成させる工程、
（５）該ＲＮＡ転写産物を前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型とすることで、ＲＮＡ転写産物を連鎖的に生成させる工程、及び、
（６）生成したＲＮＡ転写産物量を測定する工程、を含み、
ここで工程（３）に先だち、第一のプライマーとの相同領域の５’末端部位と重複して該部位から５’方向に隣接する領域に相補的な、配列番号１又は２に記載の塩基配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドとリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素により、前記特定塩基配列の５’末端部位でクラミジア・トラコマチス  ２３Ｓ  ｒＲＮＡを切断する工程を実施することを特徴とする、請求項１に記載のクラミジア・トラコマチス  ３Ｓ  ｒＲＮＡの特定塩基配列を増幅し検出する方法。
【請求項３】
試料中のクラミジア・トラコマチス  ２３Ｓ  ｒＲＮＡの特定塩基配列を増幅し検出するための試薬であって、配列番号６又は７に記載の塩基配列に相補的な配列からなる第一のプライマーと、配列番号１７又は１８に記載の塩基配列に相補的な配列からなる第二のプライマーを含むことを特徴とする、前記試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、迅速、かつ高感度にクラミジア・トラコマチスＲＮＡを検出する方法、及び該方法を用いた検出試薬に関する。本発明は、臨床検査、公衆衛生、食品検査、食中毒検査の分野に有用である。
【背景技術】
【０００２】
クラミジア・トラコマチスはクラミジア科に属するグラム陰性の偏性細胞内寄生性の真性細菌であり、性器クラミジア感染症の原因微生物である。性器クラミジア感染症は、主に性行為で感染し、男性では尿道炎や精巣上体炎を、女性では子宮頚管炎や骨盤内炎症性疾患を発症するが、特別な症状が見られない場合（無症候性感染）も多い。
【０００３】
日本において性器クラミジア感染症は、厚生労働省により定点把握４疾患に指定されており、発生動向調査が行われている。それによると、男性においては、性器クラミジア感染症が定点把握４疾患の約４０％を占め、女性においては、約６０％と多い疾患である（非特許文献１）。性器クラミジア感染症を放置すると、精巣上体炎や骨盤内炎症性疾患へと進行することあり、不妊症や流早産の原因となる場合や、分娩時の産道感染により、新生児結膜炎や新生児肺炎を発症することがある。そのため、本菌への感染が判明した場合、確実に治療することが必要であり、感染が疑われる患者や妊婦に対し、クラミジア・トラコマチス検査を実施することは大変重要である。
【０００４】
従来、臨床的には抗原検査や核酸検査によりクラミジア・トラコマチスの検出が行われてきた。抗原検査は、クラミジア科、又はクラミジア・トラコマチスに特異的な抗原を検出する方法であり、手技が簡単で、比較的迅速に結果が得られる。核酸検査は、クラミジア・トラコマチスに特異的な遺伝子（ＤＮＡやＲＮＡ）を検出する方法であり、ＤＮＡを増幅して検出するＰＣＲ法やＳＤＡ法（ｓｔａｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＲＮＡを増幅し検出するＴＭＡ法（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（特許文献１）等がある。いずれの核酸検査も、感度、特異性ともに従来の抗原検査と比較して高く、また、非侵襲的である尿検体を用いることができるという特徴がある。
【０００５】
クラミジア治療のためには、被験者から検体（尿、尿道擦過物、子宮頚管擦過物、咽頭擦過物等）を採取後、極めて迅速に検出結果を得て、それに基づいて適切な薬剤を処方することが重要である。しかし、既存の核酸検査では、検査結果を得るまでに概ね４から５時間程度を要する。
【０００６】
また近年、北欧においてｃｒｙｐｔｉｃ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡの一部が欠損したクラミジア・トラコマチスの変異株（ＣＴスウェーデン株）が発見されたが（非特許文献２）、既存の核酸検査の中にはこのような変異株のＤＮＡ欠損部位を増幅領域とするものがあり、この変異株を検出することができない（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許３２４１７１７号公報
【特許文献２】特開２０００−１４４００号
【特許文献３】特開２００１−３７５００号
【特許文献４】特許２６５０１５９号公報
【特許文献５】特許３１５２９２７号公報
【特許文献６】特開平８−２１１０５０号公報
【特許文献７】特開２００１−１３１４７号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】小野寺昭一（２００９）、日本臨牀、Ｖｏｌ．６７、Ｎｏ．１、５−１５
【非特許文献２】Ｒｉｐａ．Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．（２００６）、Ｅｕｒｏｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  Ｖｏｌ．１１、（４５）
【非特許文献３】病原体検出情報、Ｖｏｌ．２９、Ｎｏ．９（Ｎｏ．３４３）Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００８、９−１０
【非特許文献４】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１４，７７−８６
【非特許文献５】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２４，４９９２−４９９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで本発明の目的は、核酸検査が有する高感度、高特異性という特徴を損なうことなく、短時間のうちに検出結果が得られる方法を提供することにある。また前記に加え、本発明はクラミジア・トラコマチスの遺伝子において、前記したような変異が生じにい部分を検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、クラミジア・トラコマチスの遺伝子において、変異が生じにくい部分を見出すとともに、当該部分を短時間のうちに高感度かつ高特異的に検出可能な方法を見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、前記目的を達成する本発明は、試料中のクラミジア・トラコマチス  ２３Ｓ  ｒＲＮＡの特定塩基配列を増幅し検出する方法であって、前記特定塩基配列の増幅が、配列番号１０に記載の塩基配列から連続して選択される１５塩基以上の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列からなる第一のプライマー、及び、配列番号１９に記載の塩基配列から連続して選択される１５塩基以上の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列からなる第二のプライマーを用いてなされることを特徴とする、クラミジア・トラコマチス２３ＳｒＲＮＡの特定塩基配列を増幅し検出する方法である。また本発明は、特に好ましく以下の工程を含むことを特徴とする、クラミジア・トラコマチス２３ＳｒＲＮＡの特定塩基配列を増幅し検出する方法である。
【００１１】
（１）クラミジア・トラコマチス  ２３Ｓ  ｒＲＮＡ中の特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーを前記ＲＮＡにハイブリダイズさせ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記ＲＮＡを鋳型として前記第二プライマーを伸張し、特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成して前記ＲＮＡとのＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を生成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素により、前記ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（３）前記特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーを前記（２）で得られる１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記ＤＮＡを鋳型として前記第一プライマーを伸張して（ここで第二のプライマー又は第一のプライマーのいずれか一方はその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されている）、特定塩基配列又は特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡ転写産物を生成させる工程、
（５）該ＲＮＡ転写産物を前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型とすることで、ＲＮＡ転写産物を連鎖的に生成させる工程、及び、
（６）生成したＲＮＡ転写産物量を測定する工程。
【００１２】
そして本発明は、試料中のクラミジア・トラコマチス  ２３Ｓ  ｒＲＮＡの特定塩基配列を増幅し検出するための試薬であって、配列番号６又は７に記載の塩基配列から連続して選択される１５塩基以上の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた第一のプライマー、配列番号１７又は１８に記載の塩基配列から連続して選択される１５塩基以上の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた前記第二のプライマーを含むことを特徴とする。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明では、食品、飲料水、湖沼や河川の水等の環境水、糞便、嘔吐物、そして鼻腔、咽頭、尿道、子宮頚管等のぬぐい液やうがい液、更には血液、尿、その他の分泌液、体液又は組織洗浄液等の生体由来試料を試料として実施することができる。また本発明では、前記した生体試料等から核酸を予め抽出し、これを適当な溶液に懸濁したもの等を試料とすることもできる。また本発明では、後述する酵素反応等を阻害し得る妨害物質を事前に除去等しておくことが好ましい。
【００１４】
本発明の検出対象であるクラミジア・トラコマチスは、クラミジア科菌に属するものであるが、クラミジア科菌には性器クラミジア感染症の原因菌であるクラミジア・トラコマチスの他に、クラミジア肺炎の原因菌であるクラミドフィラ・ニューモニエ、オウム病の原因菌であるクラミドフィラ・シッタシなど、ヒトへの感染性を有する種類が複数種知られている。これらのクラミジア科菌の中から検出対象であるクラミジア・トラコマチスを高感度で高特異的に検出するために、本発明は、クラミジア・トラコマチスの細胞当たりの含有量が多いリボゾーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）中のクラミジア・トラコマチスに特異的な部分を検出するものである。またかかる部分は、前述したような菌株自体の変化に際しても、その保存性が比較的高いことから、本発明では、クラミジア・トラコマチスに変異が生じたとしてもなおも検出が可能である。
【００１５】
本発明がクラミジア・トラコマチスの検出のために増幅及び検出対象とするそのｒＲＮＡの「部分」とは、クラミジア・トラコマチスの２３Ｓ  ｒＲＮＡに見いだされ、後述する第一のプライマーと相同領域の５’末端から後述する第二のプライマーと相補領域の３’末端までの部分（以下、この部分を「特定塩基配列」という）である。本発明を実施することにより、試料中にクラミジア・トラコマチスが存在する場合、特定塩基配列を有する核酸が増幅される。従って、増幅工程において、又は、増幅工程の後に、特定塩基配列を有する核酸が存在するか否かを検出することにより試料中にクラミジア・トラコマチスが存在したか否かを知ることができ、更にはその初期量（クラミジア・トラコマチスの２３Ｓ  ｒＲＮＡの初期コピー数）をも知ることができる。
【００１６】
前記した、本発明における第一のプライマーは、配列番号１０に記載の塩基配列から連続して選択される１５塩基以上の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列からなるものである。かかる第一のプライマーの中でも、配列番号６又は７に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列からなるものが好ましく、特に好ましくは配列番号６又は７に記載の配列に相補的な配列からなるものである。
本発明でいう「ストリンジェントな条件」とは、通常の状態と比較してＤＮＡ同士又はＤＮＡとＲＮＡが二重鎖を形成し難い条件をいうが、例えば、４２℃で５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム及び７５ｍＭクエン酸ナトリウムが共存する条件等が挙げられる。従って、配列番号１０に記載の塩基配列から連続して選択される１５塩基以上の塩基配列、又は、配列番号６又は７に記載の塩基配列、にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な塩基配列からなる第一のプライマーとしては、それら塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列に加え、当該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション可能な範囲で塩基の置換、欠失、付加、修飾等が生じた塩基配列からなるものであっても良い。
【００１７】
第一のプライマーの長さ（塩基数）は特に限定されないが、クラミジア・トラコマチスの２３Ｓ  ｒＲＮＡに対する十分な特異性を得るためには８塩基から５０塩基であり、好ましくは１０塩基から５０塩基、特に好ましくは１５塩基から５０塩基である。
【００１８】
本発明における第二のプライマーは、配列番号１９に記載の塩基配列から連続して選択される１５塩基以上の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列からなる。かかる第二のプライマーの中でも、配列番号１７又は１８に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列からなるものが好ましく、特に好ましくは配列番号１７又は１８に記載の配列に相補的な配列からなるものである。第二のプライマーについても配列番号１９に記載の塩基配列から連続して選択される１５塩基以上の塩基配列、又は、配列番号１７又は１８に記載の塩基配列、に対して完全に相補的な塩基配列に加え、当該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション可能な範囲で塩基の置換、欠失、付加、修飾等が生じた塩基配列からなるものであっても良い。第二のプライマーの長さ（塩基数）も特に限定されないが、クラミジア・トラコマチスの２３Ｓ  ｒＲＮＡに対する十分な特異性を得るためには８塩基から５０塩基であり、好ましくは１０塩基から５０塩基、特に好ましくは１５塩基から５０塩基である。
【００１９】
以上に説明した第一のプライマーと第二のプライマーを使用する本発明の方法は、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法又はＬＡＭＰ法といった特定塩基配列をＤＮＡとして増幅する方法においてこれらプライマーを用い、クラミジア・トラコマチスを検出する方法を含む。ＰＣＲ法等の原理及び詳細な実施方法は既に広く知られており、本発明においてもプライマー対として前記第一のプライマー及び第二のプライマーを使用し、その第一段階でＲＮＡの逆転写をする操作を実施する以外、特別の条件はない（いわゆるＲＴ−ＰＣＲ法又はＲＴ−ＬＡＭＰ法）。ＰＣＲ法では、試料中に特定塩基配列、すなわちクラミジア・トラコマチスの２３Ｓ  ｒＲＮＡが存在した場合、特定塩基配列を含むＤＮＡ及び特定塩基配列の相補的配列を含むＤＮＡが増幅される。従って、増幅の工程で、又は、増幅工程の終了後に、特定塩基配列又は特定塩基配列の相補的配列の検出を行うことにより、クラミジア・トラコマチスの存在等を検出することができる。
【００２０】
前記検出は、従来公知の方法に従えば良い。従来公知の方法として、電気泳動による方法、液体クロマトグラフィーによる方法、検出可能な標識で標識された核酸プローブによるハイブリダイゼーション法等を例示できる。核酸プローブによる方法としては、具体的に核酸配列（又はその相補的配列）に相補的な核酸を固定した固相と、検出可能なシグナルを生成する標識物質と特定塩基配列（又はその相補的配列）に相補的な核酸との結合物とを用い、それぞれをハイブリダイゼーションさせて特定塩基配列（又はその相補的配列）を含む複合体を形成させ、複合体形成に関与していない標識物質を除去（いわゆるＢ／Ｆ分離）した後、除去されなかった標識物質を検出する方法を例示することができる。中でも、検出対象となる特定塩基配列（又はその相補的配列）とハイブリダイズすることによって光学特性が変化するように設計された標識プローブを使用することが、前記したＢ／Ｆ分離の操作の省略等、操作の簡便、迅速化等の観点から好ましい。またこのような標識プローブではＢ／Ｆ分離が不要なため、密閉した容器中で検出を実施することが可能となり、容器の開閉に伴う核酸増幅産物の環境中への飛散を防止することも可能である。
【００２１】
標識プローブとしては、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した蛍光標識プローブ、インターカレーター性蛍光色素で標識したインターカレーター標識プローブ等が例示できる。インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブで、検出対象である特定塩基配列（又はその相補的配列）と相補的な２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が当該相補的２本鎖部分にインターカレートしてその蛍光特性（例えば蛍光強度）が変化するように設計された核酸プローブを用いる方法が特に好ましい。
インターカレーター性蛍光色素としては特に限定されないが、汎用されているオキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロマイド、ヘミシアニン又はこれらの誘導体を使用することができる。
【００２２】
例えばオキサゾールイエローの場合、２本鎖ＤＮＡにインターカレートすることによって５１０ｎｍの蛍光（励起波長４９０ｎｍ）が顕著に増加することが既知である。このような色素をオリゴヌクレオチドと結合するには、例えばオリゴヌクレオチドの３’末端のリン酸ジエステル部又は塩基部分に適当なリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素と結合すれば良い。なお、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブを、例えば後述する本発明の好ましい方法における工程（１）から工程（４）の際に共存させる場合には、オリゴヌクレオチドの３’末端の水酸基からの伸長を防止する目的で該３’末端の水酸基を修飾することが好ましい。
【００２３】
第一のプライマーと第二のプライマーを使用する本発明の他の方法は、特定塩基配列をＲＮＡとして増幅する方法においてこれらプライマーを用い、クラミジア・トラコマチスを検出する方法である。特定塩基配列（ＲＮＡ）をＲＮＡとして増幅する方法としては、例えばＴＲＣ法（特許文献２及び３、非特許文献４）、ＮＡＳＢＡ法（特許文献４及び５）、ＴＭＡ法を例示することができる。これらの方法は、極めて迅速にクラミジア・トラコマチスを増幅し検出することが可能であり、しかも一定温度条件下、単に試薬が投入された容器に一定量の試料を投入するのみで実施可能であることに加えて、試料中に種々のＤＮＡが混在したとしてもそれらの影響を受けないなど、本発明の特に好適な態様である。
【００２４】
この本発明において特に好適な態様の方法は、以下の工程を含むことを特徴とするものである。
（１）クラミジア・トラコマチス  ２３Ｓ  ｒＲＮＡ中の特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーを前記ＲＮＡにハイブリダイズさせ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記ＲＮＡを鋳型として前記第二プライマーを伸張し、特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成して前記ＲＮＡとのＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を生成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素により、前記ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（３）前記特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーを前記（２）で得られる１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記ＤＮＡを鋳型として前記第一プライマーを伸張して（ここで第二のプライマー又は第一のプライマーのいずれか一方はその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されている）、特定塩基配列又は特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡ転写産物を生成させる工程、
（５）該ＲＮＡ転写産物を前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型とすることで、ＲＮＡ転写産物を連鎖的に生成させる工程、及び、
（６）生成したＲＮＡ転写産物量を測定する工程。
【００２５】
本発明において、工程（１）で使用するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、工程（２）で使用するリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素、及び工程（３）で使用するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は、いずれも公知の酵素であり、種々の酵素を選択することができる。本発明においては、上記酵素としてそれぞれ別個の酵素を使用することも可能であるが、２種以上の活性を併せ持つ酵素を用いることが試薬数の減少等の観点から好ましい。特に好ましくは前記３つの活性を併せ持つ酵素を使用することであり、かかる酵素としてレトロウイルス由来の逆転写酵素を例示することができる。より具体的には、例えば、ＡＭＶ（Ａｖｉａｎ  Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＲＡＶ（Ｒｏｕｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素又はこれらの誘導体（アミノ酸配列に変異を導入することで、活性等を向上したこれらの酵素）を具体的に例示できる。
前記工程（４）で使用するＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は、第一のプライマー又は第二のプライマーのいずれかの５’端に付加されたプロモーター配列に対応するものであれば特に制限はない。例えばバクテリアファージ由来のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼとそれに対応するプロモーター配列、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼとそれに対応するプロモーター配列又はＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼとそれに対応するプロモーター配列等を使用すること例示することができる。なお本発明においては、プロモーター配列に転写効率に影響を及ぼすことが知られている転写開始領域を付加する等しても良い。
【００２６】
上記の方法において、工程（３）で生成される２本鎖ＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列下流のセンス鎖又はアンチセンス鎖に特定塩基配列を有する。具体的には、その５’端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加された第二のプライマーを使用した場合、工程（３）で生成される２本鎖ＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列下流のアンチセンス鎖に特定塩基配列を有し、その５’端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加された第一のプライマーを使用した場合、工程（３）で生成される２本鎖ＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列下流のセンス鎖に特定塩基配列を有することになる。この結果、前者の場合には工程（４）において特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡが生成し、後者の場合には工程（４）において特定塩基配列に相同な配列のＲＮＡが生成する。そして、工程（４）で生成されたＲＮＡは、工程（１）におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となって工程（１）から工程（５）が連鎖的に生じ、ＲＮＡ転写産物が連鎖的に生成することになる。
【００２７】
このような連鎖反応を進行させるために、本発明の方法は、前記各酵素がその活性を発揮するために必要な条件で実施する。そのような条件としては、例えば、反応に際して適当な緩衝剤、マグネシウム塩、カリウム塩、ヌクレオシド−三リン酸、リボヌクレオシド−三リン酸を使用することが重要である。また例えば、増幅反応の効率を調節するためにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び糖等を使用することが好ましい。またその他の条件として、例えばＡＭＶ逆転写酵素やＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用する場合、３５℃から６５℃の範囲に反応温度を設定することが好ましく、４０℃から５０℃の範囲で設定することが特に好ましい。本発明の好ましい態様では、ＲＮＡの連鎖的増幅は一定温度で進行し、逆転写酵素及びＲＮＡポリメラーゼが活性を発揮するために適当な温度に反応温度を設定することが可能である。
【００２８】
本発明の前記好ましい方法において、第一のプライマーの５’端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を付加し、工程（４）において特定塩基配列に相同な配列のＲＮＡを生成する場合には、前記工程（３）に先立ち、クラミジア・トラコマチス２３Ｓ  ｒＲＮＡを、その第一のプライマーとの相同領域の５’末端部位、即ち、クラミジア・トラコマチス２３Ｓ  ｒＲＮＡ中の特定塩基配列内であって、第一のプライマーと相同な領域の５’末端を含む部分配列である。切断の方法としては、例えば切断する部分配列からクラミジア・トラコマチス２３Ｓ  ｒＲＮＡの５’方向に隣接する領域に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドとリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素を使用することが好ましい。当該オリゴヌクレオチドとしては、より具体的には切断する部分配列からクラミジア・トラコマチス２３Ｓ  ｒＲＮＡの５’方向に隣接する領域に相補的な１５塩基程度の塩基配列を有し、かつ、その３’末端にある水酸基が当該オリゴヌクレオチドを起点とする伸長反応が生じないよう例えばアミノ化等、適当に修飾されているものを例示できる。このオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせてＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を生成させ、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素を作用させてＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分を消化することで、クラミジア・トラコマチス２３Ｓ  ｒＲＮＡを前記部分で切断することができる。このようにクラミジア・トラコマチス２３Ｓ  ｒＲＮＡをその特定塩基配列の５’末端部位で切断することにより、工程（３）におけるＤＮＡを鋳型とする第一のプライマーの３’端の伸長と同時に、当該ＤＮＡの３’ 末端の伸長によってＤＮＡにハイブリダイズした第一のプライマーのプロモーター配列に相補的なＤＮＡ鎖を形成して、結果として機能的な２本鎖ＤＮＡプロモーター構造を形成できるからである。
【００２９】
以上に説明した本発明の好ましい方法の中でも特に以下の（１）から（６）の工程を含み、しかも、工程（３）に先だち、第一のプライマーとの相同領域の５’末端部位と重複して該部位から５’方向に隣接する領域に相補的な、配列番号５に記載の塩基配列から連続して選択される１５塩基以上の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列からなるオリゴヌクレオチドとリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素により、前記特定塩基配列の５’末端部位でクラミジア・トラコマチス  ２３Ｓ  ｒＲＮＡを切断する工程を実施することを特徴とする方法は、クラミジア・トラコマチス  ２３Ｓ  ｒＲＮＡの特定塩基配列を迅速、高感度かつ高特異性をもって増幅し検出する方法として好ましい方法である。
【００３０】
（１）クラミジア・トラコマチス  ２３Ｓ  ｒＲＮＡ中の特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーを前記ＲＮＡにハイブリダイズさせ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記ＲＮＡを鋳型として前記第二プライマーを伸張し、特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成して前記ＲＮＡとのＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を生成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素により、前記ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（３）配列番号６又は７に記載の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた第一のプライマーを前記（２）で得られる１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記ＤＮＡを鋳型として前記第一プライマーを伸張して（ここで第一のプライマーの５’末端にはＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されている）、特定塩基配列又は特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡ転写産物を生成させる工程、
（５）該ＲＮＡ転写産物を前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型とすることで、ＲＮＡ転写産物を連鎖的に生成させる工程、及び、
（６）生成したＲＮＡ転写産物量を測定する工程。
【００３１】
本発明の好ましい一態様では、切断用オリゴヌクレオチドとして、クラミジア・トラコマチス  ２３Ｓ  ｒＲＮＡの一部に相同な配列番号５に記載の塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれるオリゴヌクレオチドを用いることができる。
本発明のより好ましい一態様では、切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１又は２に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれたオリゴヌクレオチドからなる。
【００３２】
なお、本発明中の配列番号５、１０、１９、２２はＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ｄ／ＵＷ−３／ＣＸ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿０００１１７）の部分配列の相同鎖もしく相補鎖である。
本発明中の標的ＲＮＡとは、ＲＮＡ転写産物上の特定塩基配列のうち、前記プライマーとの相同あるいは相補領域以外の配列を示し、蛍光色素で標識された核酸プローブとの相補的な結合が可能である配列を有する。よって、蛍光色素で標識された核酸プローブは、本発明中の特定塩基配列の一部と相補的な配列となる。
【００３３】
本発明中におけるＲＮＡ転写産物量の測定を、標的ＲＮＡと相補的な２本鎖を形成すると蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブ共存下で前記蛍光特性の変化を測定することによってなされることを特徴とする方法を用いることで、簡便性や迅速性、特異性が大きく向上した。
【００３４】
より好ましい態様としては、蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブは、インターカレーター性蛍光色素をリンカーを介して結合させたインターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブであることが挙げられる。
【００３５】
本発明の一態様として、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブが、クラミジア・トラコマチス  ２３Ｓ  ｒＲＮＡの一部に相補的な配列番号２２に記載の塩基配列、あるいはその相補的配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列のオリゴヌクレオチドを用いることができる。
【００３６】
本発明の好ましい一態様では、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブが、クラミジア・トラコマチス  ２３Ｓ  ｒＲＮＡの一部に相補的な配列番号２０及び２１に記載の配列、あるいはその相補的配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれたオリゴヌクレオチドからなる。
【００３７】
本発明の一態様として、切断用オリゴヌクレオチドは、配列番号５に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列であるオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくとも一種のオリゴヌクレオチドからなり、第一のプライマーは、その５’末端にプロモーター配列を有しており、配列番号１０に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列であるオリゴヌクレオチドからなり、第二のプライマーは配列番号１９に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列であるオリゴヌクレオチドからなり、さらに、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブは、配列番号２２に記載の塩基配列、あるいはその相補的配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列であるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
【００３８】
より好ましくは、前記切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１及び２に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれたオリゴヌクレオチドからなり、また、第一のプライマーは、配列番号６又は７に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれたオリゴヌクレオチドからなり、第二のプライマーは配列番号１７及び１８に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれたオリゴヌクレオチドからなる。
【００３９】
さらに、好ましくは、前記切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１及び２に記載の配列の相補鎖から選ばれたオリゴヌクレオチドからなり、第一のプライマーは、配列番号６又は７に記載の配列の相補鎖から選ばれたオリゴヌクレオチドからなり、さらに、第二のプライマーは配列番号１７及び１８に記載の配列の相補鎖から選ばれたオリゴヌクレオチドからなる。
【００４０】
本発明の一態様として、試料に少なくとも、５’末端にＴ７プロモーター配列を有する第一のプライマー（配列番号１０に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの５’末端にＴ７プロモーター配列（配列番号２３）を付加した配列、第二のプライマー（配列番号１９に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド）、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブ（配列番号２２に示す配列、あるいはその相補的配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能である配列）、切断用オリゴヌクレオチド（配列番号５に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド）、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、緩衝剤、マグネシウム塩、カリウム塩、ヌクレオシド−三リン酸、リボヌクレオシド−三リン酸、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む増幅試薬を添加し、反応温度３５から６５℃（好ましくは４０から５０℃）の一定温度で反応させると同時に反応液の蛍光強度を経時的に測定する方法を提供する。
【００４１】
前記態様において、最も好ましくは、前記切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１及び２に記載の塩基配列に相補的な配列から選ばれるオリゴヌクレオチドからなり、第一のプライマーは、配列番号６又は７に記載の塩基配列に相補的な配列から選ばれるオリゴヌクレオチドからなり、さらに、第二のプライマーは配列番号１７及び１８に記載の塩基配列に相補的な配列から選ばれるオリゴヌクレオチドからなる。
【００４２】
前記態様においては、蛍光強度を経時的に測定することから有意な蛍光増加が認められた任意の時間で測定を終了することが可能であり、核酸増幅及び測定をあわせて通例３０分以内で終了することが可能である。
【００４３】
また、前記測定試薬に含まれる全ての試料を単一の容器に封入可能な点は特筆すべきである。即ち、一定量の試料をかかる単一の容器に分注するという操作さえ実施すれば、その後は自動的にクラミジア・トラコマチス  ２３Ｓ  ｒＲＮＡを増幅し検出することができる。
この容器は、例えば蛍光色素が発する信号を外部から測定可能なように、少なくともその一部分が透明な材料で構成されてさえいれば良く、試料を分注した後に密閉することが可能なものはコンタミネーションの防止のうえで特に好ましい。
【００４４】
前記態様のＲＮＡ増幅・測定方法は、一段階、一定温度で実施可能であるため、ＲＴ−ＰＣＲに比べて簡便で自動化に適した方法であるといえる。本発明によりクラミジア・トラコマチス  ２３Ｓ  ｒＲＮＡを高特異的、高感度、迅速、簡便、一定温度、かつ一段階の同時測定が可能となった。
【発明の効果】
【００４５】
本発明は、
（１）クラミジア・トラコマチス  ２３Ｓ  ｒＲＮＡ中の特定塩基配列を鋳型とし、第一のプライマー及び第二のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼなどの核酸重合酵素を用いて、前記特定塩基配列を含む核酸を増幅する工程、
（２）該核酸増幅産物を測定する工程、
からなるクラミジア・トラコマチス  ２３Ｓ  ｒＲＮＡの検出方法において、前記第一のプライマー配列番号１０に記載の配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列であるオリゴヌクレトチドからなり、かつ第二のプライマーが配列番号１９に記載の配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた少なくとも１種類以上のオリゴヌクレトチドからなることを特徴としている。
本発明により、試料中に含まれる微量なクラミジア・トラコマチス  ２３Ｓ  ｒＲＮＡを遺伝子群／遺伝子型を問わず迅速、かつ高感度に増幅、検出することが可能となった。
【００４６】
さらに、プロモーター配列を有する第一のプライマー、又は第二のプライマーを用いて得られるＲＮＡ転写産物量を測定する工程において、標的ＲＮＡと相補的２本鎖を形成するとシグナル特性が変化するように設計された核酸プローブを共存させ、増幅されたクラミジア・トラコマチス  ２３Ｓ  ｒＲＮＡの特定核酸に由来する蛍光強度の増加を経時的に測定することにより、クラミジア・トラコマチス  ２３Ｓ  ｒＲＮＡの検出を簡便、迅速、かつ高感度に行なうことが可能となった。
【００４７】
本発明の検出方法を用いたクラミジア・トラコマチスの検出試薬は、試料中に含まれているクラミジア・トラコマチスを高感度に検出することができ、さらに、従来技術と比較すると圧倒的に迅速である、という特徴を有している。そのため、検査結果を迅速に医師に提示することが可能となり、感染拡大防止、及び、適切な薬剤の投与による耐性菌の発生の防止に本発明が寄与するものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】実施例２で作製したインターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブの構造。Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４は塩基を示す。Ｉｓｈｉｇｕｒｏら（非特許文献５）の方法に従いリン酸ジエステル部分にリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素（オキサゾールイエロー）を結合させたプローブ。なお、３’末端の水酸基からの伸長反応を防止するために３’末端の水酸基はグリコール酸修飾がなされている。
【図２】本発明で使用した標準ＲＮＡの塩基配列と、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿０００１１７の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子領域（８７８０３９から８８０９０２）の塩基配列の対応図である。
【実施例】
【００４９】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００５０】
実施例１  標準ＲＮＡの調製
後述の実施例で使用したクラミジア・トラコマチス  ２３Ｓ  ｒＲＮＡ（以降、標準ＲＮＡと表記）は（１）から（２）に示す方法で調製した。
（１）クラミジア・トラコマチスＵＷ−３／Ｃｘ株（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＶＲ−８８５）のＲＮＡ抽出物を用い、２３Ｓ  ｒＲＮＡ塩基配列領域の２本鎖ＤＮＡを調製した（なお、該ＤＮＡの５’末端側にはＳＰ６プロモーターを付加している）。
（２）（１）で調製した２本鎖ＤＮＡを、定法に従い、ｐＵＣ１９プラスミドのマルチクローニングサイトに挿入し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。
（３）（２）の形質転換大腸菌の培養物からプラスミドを抽出し、挿入ＤＮＡの３’末端側を制限酵素で消化し、直鎖状のＤＮＡを調製した。
（４）（３）で調製したＤＮＡを鋳型として、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写を実施し、引き続きＤＮａｓｅ  Ｉ処理により前記２本鎖ＤＮＡを完全消化した後、ＲＮＡを精製し、標準ＲＮＡを調製した。該ＲＮＡは２６０ｎｍにおける吸光度を測定して定量した。
【００５１】
なお、標準ＲＮＡは、クラミジア・トラコマチスの２３Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列を含み、全長は約３０００塩基（該ＲＮＡの５’末端にはＳＰ６プロモーターに由来する８塩基が付加されている）である。
【００５２】
また、今回調製した標準ＲＮＡの塩基配列を解析した結果、プライマー・プローブ設計に用いたＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿０００１１７の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子領域（８７８０３９から８８０９０２）の塩基配列に対し、完全一致していることを確認した。
【００５３】
実施例２  インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブの調製
インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブを調製した。非特許文献５に記載の方法で、
配列番号２０に記載の配列の５’末端から１０番目のＡと１１番目のＴの間、
配列番号２１に記載の配列の５’末端から１０番目のＣと１１番目のＧの間、
のリン酸ジエステル部分に、それぞれリンカーを介してオキサゾールイエローを結合させたオキサゾールイエロー標識核酸プローブを調製した（図１）。
【００５４】
実施例３  クラミジア・トラコマチス  ２３Ｓ  ｒＲＮＡ検出用プライマーセットの検討
表１に示した組み合わせの第一のプライマー、第二のプライマー、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブ（以降、ＩＮＡＦプローブと表記）、切断用オリゴヌクレオチドを用いて、（１）から（４）に示す方法で、標準ＲＮＡの測定を行い、検出性能、特異性等について評価を行った。
【００５５】
【表１】
0005838550.tif 000002
【００５６】
【表２】
0005838550.tif 000003
【００５７】
（１）前記標準ＲＮＡをＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５Ｕ／μＬ  リボヌクレアーゼインヒビター、５．０ｍＭ  ＤＴＴ）を用いて、１０４コピー／５μＬになるように希釈し、これらをＲＮＡ試料として用いた。
（２）以下の組成の反応液２０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｄｏｍｅ  Ｃａｐ  ＰＣＲ  Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、これに前記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。
【００５８】
反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）
１７ｍＭ  塩化マグネシウム
１００ｍＭ  塩化カリウム
１ｍＭ  ＤＴＴ
各０．２５ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３．０ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．６ｍＭ  ＩＴＰ
各０．５μＭ  第一のプライマー：該プライマーは、各配列番号記載の塩基配列の５’末端にＴ７プロモータ配列（配列番号２３）が付加されている
０．５μＭ  第二のプライマー
２５ｎＭ  ＩＮＡＦプローブ：該プローブは実施例２で調製したもの
各０．０８μＭ  切断用オリゴヌクレオチド：該オリゴヌクレオチドの３’末端の水酸基はアミノ基で修飾されている
６Ｕ  リボヌクレアーゼインヒビター（タカラバイオ製）
１３．０％  ＤＭＳＯ
（３）上記の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、予め４３℃で２分間保温した酵素液５μＬを添加した。
【００５９】
酵素液の組成：反応時（３０μＬ中）の最終濃度
２．０％  ソルビトール
６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素  （ライフサイエンス製）
１４２Ｕ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ  （インビトロジェン製）
３．６μｇ  牛血清アルブミン
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。
【００６０】
酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした結果を表１から７に示した。
【００６１】
表１、２、３は標準ＲＮＡを、表５はオウム病クラミジア標準ＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．Ｕ６８４４７）及び肺炎クラミジア（ＴＷ−１８３株）核酸抽出物を、表６はナイセリア属菌核酸抽出物をそれぞれ使用した。
【００６２】
クラミジア科菌及びナイセリア属菌の核酸抽出には、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を使用した。
表中のＮｅｇａとは、標的核酸の代わりに注射用蒸留水を加えて反応させたものである。表中における「判定」とは、標準ＲＮＡの検出時間、Ｎｅｇａの測定結果、蛍光強度比などから総合的に判断したものであり、良好なものから順番に「◎」「○」「△」「×」と記載した。
【００６３】
表３は、表１の組合せの中で、良好な性能であると判断したＧ、Ｐ、ＡＣ、ＡＥ、ＡＫ、ＡＳのオリゴヌクレオチドの組合せをさらに選抜するため、３０コピー／５μＬの標準ＲＮＡを測定したときの結果を示した。
【００６４】
表４は、表３の組み合わせの中で、良好な性能であると判断したＧ，Ｐ，ＡＫの組み合わせのオリゴヌクレオチドをさらに選抜するため、１０、３０、１０２コピー／５μＬの標準ＲＮＡを測定したときの結果を示した。
【００６５】
表５は、表３の組み合わせの中で、良好な性能であると判断したＧ，Ｐ，ＡＫの組み合わせのオリゴヌクレオチドをさらに選抜するため、１０１０コピー／５μＬのオウム病クラミジア標準ＲＮＡ、及び肺炎クラミジア核酸抽出物を測定したときの結果を示した。
【００６６】
表６は、表１から５までの検討で選抜された、最も性能の良いオリゴヌクレオチドの組み合わせを示したものである。
【００６７】
表７は、Ｐの組み合わせのオリゴヌクレオチドを用い、クラミジア・トラコマチスとともに性感染症の原因菌として一般的な淋菌、及び病原性は有しないが、咽頭、口腔内の常在菌として知られているナイセリア属菌に対する交差反応性を試験したものである。淋菌及びナイセリア属菌は、１０７ＣＦＵ／ｔｅｓｔとなるように濃度を調製した。
なお、全ての表において、Ｎ．Ｄ．とは酵素を添加して３０分後の蛍光強度比が１．２未満（陰性判定）であった試料を意味する。また、Ｎｅｇａとは、滅菌済み蒸留水をサンプルとして測定したものである。また、ゲル電気泳動における＋の数は、増幅産物に由来するバンドの濃さの程度を示したものであり、＋の数が多いほど、増幅産物量が多く生成し、−は、増幅産物が生成しなかったことを表している。
【００６８】
【表３】
0005838550.tif 000004
【００６９】
【表４】
0005838550.tif 000005
【００７０】
１０, ３０, １０＾２コピー／ｔｅｓｔ
【００７１】
【表５】
0005838550.tif 000006
【００７２】
【表６】
0005838550.tif 000007
【００７３】
【表７】
0005838550.tif 000008
【００７４】
表１から表５に示した検討結果より、クラミジア・トラコマチス  ２３Ｓ  ｒＲＮＡを検出するのに好適なオリゴヌクレオチド配列が明らかになったとともに、迅速かつ高感度、高特異的に検出することが可能なオリゴヌクレオチドの組合せを見出すことに成功した。
【００７５】
表１に示した、ＡからＡＶのオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた場合の、クラミジア・トラコマチス標準ＲＮＡの検出時間、蛍光強度比、及びＮｅｇａの測定結果より、オリゴヌクレオチドの組み合わせＧ、Ｐ、ＡＣ、ＡＥ、ＡＫ、ＡＳが良好であると判断された。
【００７６】
切断用オリゴヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４のそれぞれに相補的な配列が使用できることから、それらに対応した配列を含む、配列番号５にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な塩基配列が使用できることが分かった。
【００７７】
第一のプライマーは、配列番号６、７、８，９のそれぞれに相補的な配列が使用できることから、それらに対応した配列を含む、配列番号１０にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な塩基配列が使用できることが分かった。
【００７８】
第二のプライマーは、配列番号１５、１７、１８のそれぞれに相補的な配列が使用できることから、それらに対応した配列を含む、配列番号１９にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な塩基配列が使用できることが分かった。
【００７９】
ＩＮＡＦプローブは、配列番号２０、２１に記載の配列が使用できることから、それらに対応した配列を含む、配列番号２２に示された配列、あるいはその相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な塩基配列が使用できることが分かった。
【００８０】
すなわち、切断用オリゴヌクレオチドとして、配列番号５にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な塩基配列を用い、第一のプライマーとして、配列番号１０にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な塩基配列を用い、第二のプライマーとして、配列番号１９にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な塩基配列を用い、ＩＮＡＦプローブとして、配列番号２２にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な塩基配列、又はその相補鎖を用いることで、クラミジア・トラコマチス標準ＲＮＡを特異性良く、迅速に増幅し検出できることが分かった。
【００８１】
表３より、表１で選抜された６つの組み合わせの中から、検出感度か特に良好である３つの組み合わせ（Ｇ，Ｐ，ＡＫ）を選抜することができた。なお、ＡＣ，ＡＥ，ＡＳの組み合わせは、表２の実験ではＮｅｇａの立ち上がりは見られなかったにも関わらず、表３の実験ではＮｅｇａの立ち上がりが見られた。しかしながら、いずれの組み合わせのＮｅｇａの蛍光強度比も、Ｐｏｓｉ（３０コピ−／ｔｅｓｔ）の蛍光強度比よりも十分に小さいことが分かる。そのため、これらの組み合わせは、閾値を適切に調整することで使用は可能と考えられる。
【００８２】
表４は、表３で選抜された３つの組み合わせを用い、標準ＲＮＡの検出感度を比較したものである。いずれの組み合わせも、検出時間に差が見られるものの、いずれの組み合わせも１０コピー／ｔｅｓｔまで検出することが可能であり、最良の組み合わせを選抜するには到らなかった。
【００８３】
表５は、表３で選抜された３つの組み合わせを用い、オウム病クラミジア標準ＲＮＡ、及び肺炎クラミジア培養菌体の核酸抽出物を測定したものである。オウム病クラミジア標準ＲＮＡは、いずれの組み合わせでも、検出されなかったが、肺炎クラミジア核酸抽出物は、ＡＫの組み合わせで陽性化が見られた。組み合わせＧ、Ｐは、どちらを用いても陰性であり、クラミジア・トラコマチスに高い特異性を有していることが分かった。
しかしながら、反応液のゲル電気泳動分析の結果、組み合わせＧとＰでは、増幅産物の生成量に差が見られることが分かった。
【００８４】
表６に、最終的に選抜されたオリゴヌクレオチドの組み合わせを記載した。記載の組み合わせのオリゴヌクレオチドを含む検出試薬を使用することで、クラミジア・トラコマチスを迅速かつ高感度に検出することが可能であることが分かった。
【００８５】
表７は、オリゴヌクレオチドの組み合わせＰを用い、淋菌を含むナイセリア属菌の核酸抽出物に対する反応性を評価したものであり、試験した全ての核酸抽出物に対して陰性であり、非常に高い特異性を有していることが分かった。
実施例３  クラミジア・トラコマチス  ２３Ｓ  ｒＲＮＡの検出試薬
【００８６】
【表８】
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【００８７】
実施例２で得られた、好適なオリゴヌクレオチドの組み合わせＧとＰを用い、クラミジア・トラコマチスを迅速かつ高感度に測定可能な検出試薬の作製を試みた。
実施例２に記載の試薬組成を調製し、クラミジア・トラコマチス検出試薬を２種類（オリゴヌクレオチドの組み合わせＧとＰ）作製した。
クラミジア・トラコマチス（ＵＷ−３／Ｃｘ株）をＨｅｌａ細胞に感染させ、十分にクラミジア・トラコマチスが増殖したものから抽出したＲＮＡを、上記のクラミジア・トラコマチス検出試薬で測定を実施した。
表中の１０＾−２、１０＾−４、１０＾−６、１０＾−８とは、抽出物の希釈度合いを表しており、それぞれ、原液を１０２倍、１０４倍、１０６倍、１０８に希釈したものである。
【００８８】
表中のＲＮＡ定量値とは、濃度既知の標準ＲＮＡを測定し、その検出時間から作成した検量線より求めたＲＮＡ濃度（コピー／ｔｅｓｔ）である。
上記試薬の測定結果は、表８に示した通りであり、クラミジア・トラコマチスは、全ての希釈系列でほぼ１０分以内で陽性となり、極めて迅速かつ、高感度に測定可能であることが分かった。
【００８９】
本実施例に示した方法は、クラミジア・トラコマチスを高感度、高特異的、かつ、非常に迅速に測定することが可能であることが分かった。本実施例に示した方法が、本発明における最も好ましい系であるといえる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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