(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製ＤＮＡの保存に適したセルロースマトリックスであって、当該マトリックスがイヌリンで含浸された状態にある、セルロースマトリックス。
【請求項２】
イヌリン及びＰＥＧで含浸された状態にある、請求項１記載のセルロースマトリックス。
【請求項３】
核酸の添加前にイヌリンを含む溶液でセルロースマトリックスを処理することによって、セルロースマトリックスから溶出される精製ＤＮＡの収率を増大させる方法。
【請求項４】
前記溶液のイヌリン濃度が２０％以下である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
セルロースマトリックスがＰＥＧでも処理されているか、或いはＰＥＧを含む緩衝液中でＤＮＡを適用する、請求項３又は請求項４記載の方法。
【請求項６】
ＰＥＧが１０％以下の濃度である、請求項５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固体マトリックス上での遺伝子材料の保存、特に固体マトリックスに適用する前に精製しておいたＤＮＡの保存に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸、特にＤＮＡの保存は典型的には溶液中で冷蔵を用いて４℃で数日間又は−２０以下の温度でさらに長期間達成される。これはコストがかかり、静的保存のための大きなスペースを要する。核酸試料を輸送する必要がある場合は大きな問題となり、試料はドライアイス中で出荷されることが多い。
【０００３】
Ｂｕｒｇｏｙｎｅの国際公開第９０／０３９５９号には、生体試料（通常は血液）を固体マトリックスに適用し、固体マトリックスに結合した試薬で細胞を溶解させる方法について記載されている。放出されたＤＮＡは固体マトリックスに保持される。これらの試料は室温で長期間保存することができた。
【０００４】
米国特許第５９３９２５９号及び国際公開第０３／０１６５５２号には、固体マトリックスに結合したＤＮＡをさらに研究するため溶出することができる技術が記載されている。しかし、多くの場合、固体マトリックスに適用した精製ＤＮＡの回収で得られるＤＮＡの回収率は定量的リアルタイムＰＣＲで測定して約４０％である。ＤＮＡを室温で長期間保存することのできる簡単な方法で、しかも適用したＤＮＡの回収率が大きい方法に対するニーズが存在していることは明らかである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第９０／０３９５９号
【特許文献２】米国特許第５９３９２５９号
【特許文献３】国際公開第０３／０１６５５２号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
今回、固体マトリックスにイヌリン（植物に存在する多糖類）を添加すると、固体マトリックスから溶出することのできる適用ＤＮＡの割合が大幅に増大するという予想外の知見が得られた。これは、精製ＤＮＡを固体マトリックスに適用したときに特に顕著である。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】イヌリンの構造を示す図。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
様々な化学物質を固体マトリックスに添加して、固体マトリックスからのＤＮＡの回収率に対するそれらの効果について研究した。特に、ＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅ（Ｗｈａｔｍａｎ社製）として知られる固体マトリックスが、本発明の実施に特に有用であることが判明した。ただし、その他の種類の固体マトリックスも本発明で使用できると考えられる。固体マトリックスの多くはセルロース系である。固体マトリックスを、２Ｍグアニジンイソチオシアネートに希釈した試薬溶液で処理した。大半の化学物質は、ＤＮＡの回収率に対してほとんど或いは全く効果がなかった。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は濃度約１０％で、ＤＮＡの回収量が少し増大した。ＰＥＧはエチレングリコール単位の長鎖ポリマーである。ＰＥＧは様々な分子量で調製され、分子量は１分子当たりの平均単位数で決まる。ＭＷ４００、１０００及び３３５０のポリマーについて評価した。ＰＥＧ１０００で、適用ＤＮＡの回収結果（データ示さず）が最良となることが認められ、残りの試験ではＰＥＧ１０００を使用した（以下、ＰＥＧと呼ぶ。）。約２５％のＰＥＧ濃度では結果が実験毎に変動したが、これは、かかる濃度での固体マトリックスのコーティングプロセスに若干のばらつきがあることを示唆している。
【０００９】
固体マトリックスを植物多糖類イヌリンで処理すると、固体マトリックスから溶出されるＤＮＡ量が増大することが認められた。固体マトリックスに濃度２０％以下のイヌリンを添加すると、固体マトリックスからのＤＮＡの回収率が、イヌリンを添加しないときの２５〜４０％から８０％に増大することが判明した。イヌリンの添加と併せて１０％のＰＥＧを添加すると、ＤＮＡの回収率が約８５％まで増大することが認められた。
【００１０】
イヌリンは多くの植物にみられる天然多糖類である。その構造を図１に示す。エステル化のような簡単な修飾が可能であり、適用した精製ＤＮＡの向上した溶出が依然として達成されると考えられる。
【００１１】
精製ＤＮＡは、イヌリンで処理しておいた固体マトリックスに、核酸化学で常用される緩衝液中で適用することができる。適用緩衝液に１０％以下のＰＥＧを配合してもよい。固体マトリックスに適用する前のＤＮＡは、様々な標準実験技術で精製することができる。
【００１２】
考慮すべき重要な点は、高いＤＮＡ回収率が時間を経ても（つまり室温での長期保存で）維持されることである。少なくとも２３日間はＤＮＡを向上した収率で回収できることが判明した。この収率の向上は保存期間をさらに長くした場合にも見込まれる。室温は通常約２０℃〜２５℃であり、典型値は２０℃である。
【実施例】
【００１３】
以下の実施例は例示にすぎず、特許請求の範囲によって定まる本発明を限定するものではない。
【００１４】
実施例１：マトリックスの化学修飾
固体マトリックスはＷｈａｔｍａｎ社製のＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅ  ９０３マトリックスであった。
１）グアニジンチオシアネートの４Ｍ原液を調製し、様々な濃度の試薬を用いて２Ｍに希釈した。
２）グアニジンチオシアネート／試薬混合物を入れたトレーに９０３マトリックス（２．２５インチ×２．２５インチ）を入れ、１０秒間穏やかに振盪した。
３）２つのヘアドライヤー（Ｓｉｍｐｌｙ  Ｂａｓｉｃ  ＤＳ−７２７）を用いて、金属製ラック上でマトリックスを１０分間乾燥させた（２つのヘアドライヤーとマトリックスが一直線に並ぶように、一方をマトリックスの１５ｃｍ上に３０°の角度で置き、他方をマトリックスの２５ｃｍ下に３０°の角度で置いた）。さらに、気流なしで２１±２℃で一晩乾燥させた。
４）使用時までマトリックスをデシケーター内で室温で保存した。
【００１５】
実施例２：試験固体マトリックスへのＤＮＡの適用
ヒトＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ）を１６０ｎｇ／μｌの濃度で試験固体マトリックスにスポットした。通常、予めくり抜いておいた直径５ｍｍディスクのマトリックスを使用した。ディスクは室温で最低３時間乾燥させた。
【００１６】
実施例３：固体マトリックスからのＤＮＡの溶出
１）各乾燥ディスクを１．５ｍｌ滅菌マイクロチューブに入れ、５００μｌのｄＨ２Ｏで計５秒間の３回のパルスボルテックスによって洗浄した。
２）ディスクを、１００μｌのｄＨ２Ｏが入った０．５ｍｌのマイクロチューブに移し、ディスクが完全に水に浸るようにした。
３）マイクロチューブを９８℃のヒートブロックに３０分間置いた。
４）マイクロチューブを６０秒間パルスボルテックスし、短く遠心した。
５）ディスクを残して、溶出液を新たな０．５ｍｌチューブに移した。溶出液は定量までの間４℃で保存した。
【００１７】
実施例４：溶出液中のＤＮＡの定量
７９００ＨＴ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたＱＰＣＲによって、溶出液中のＤＮＡの定量を行った。反応は、ＲＮａｓｅ  Ｐアッセイ及びＴＡＱＭＡＮ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて設定した。実験に用いたものと同じＲｏｃｈｅ社製ＤＮＡの１０〜０．０１ｎｇ／μｌの逐次希釈液を用いて４点標準曲線を作製した。初期ＱＰＣＲ定量は９６ウェルプレートで行い、手動で設定した。液体ハンドリングロボットの導入及び検証後、３８４ウェルプレートを用してその後の定量を行った。９６及び３８４ウェルプレートの両方を検証し、互いに対比して方法間の整合性をチェックした。
【００１８】
結果
結果（表１）は、イヌリン又はＰＥＧを含浸したマトリックスは、ＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅだけの場合と比較して、ＤＮＡ回収率が増大していることを示す。さらに、１０％のＰＥＧを含有するスポット用緩衝液を使用すると、ＤＮＡ収率がさらに増大した（ＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅ＋２０％イヌリンと併用すると８５％）。
【００１９】
【表１】
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２０％のイヌリンを含有するマトリックスが、適用した精製ＤＮＡの最高の回収率％を示した。ＰＥＧはマトリックス含浸化学物質の可能な添加剤としても同定されたので、２０％イヌリンと１０％ＰＥＧとの組合せで含浸したＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅも調製してさらに検討した。１０％のＰＥＧを含有するスポット用緩衝液を修飾マトリックス化学物質と併用すると収率がさらに増すことが確認した。
【００２０】
精製ＤＮＡを適用したディスクを室温のデシケーター内で保存した実験からも結果を得た。結果は、マトリックスをイヌリンで処理すると、同様の向上したＤＮＡの回収率で、ディスクをＤＮＡ溶出まで２３日間以上保存できることを示していた。
【００２１】
結果は、試験マトリックスへのＤＮＡの適量量及び回収量を１ｎｇ程度の低さから１μｇ（試験した最大値）程度の高さまでとすることができ、イヌリン処理の改善効果が依然として観察されることも示していた。
【００２２】
いずれかの実施形態に関して記載した特徴を単独で用いてもよいし、或いは他の特徴と組合せて用いてもよく、その他の実施形態の又は他の実施形態の組合せの１以上の特徴と組合せて使用してもよいことが明らかであろう。さらに、特許請求の範囲に記載された本発明の技術的範囲から逸脱せずに、明細書に記載されていない均等物及び変更も採用することができる。
【図１】
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