(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）患者から分離された膠芽腫組織を４以上の区画に分けて、各区画で一つ以上の切片を収集し、そして前記の収集した切片を混合して、全体膠芽腫組織の４以上の切片の各々から均質に混合された膠芽腫組織切片を調製する工程と、
（ｂ）前記収集された各切片の混合物から膠芽腫細胞を単一細胞単位に分離する工程と、（ｃ）前記（ｂ）工程で分離された膠芽腫細胞を含有する移植用試料を免疫欠乏したマウスの脳に正位的に移植する工程と、を含む、膠芽腫マウスモデルの製造方法。
【請求項２】
前記（ａ）工程では、前記膠芽腫組織の４以上の区画で１ｍｍ３〜８ｍｍ３の一つ以上の切片を収集することを特徴とする請求項１に記載の膠芽腫マウスモデルの製造方法。
【請求項３】
前記（ｂ）工程で収集された各切片の混合物の体積は患者から分離された膠芽腫組織体積の３０〜１００％であることを特徴とする請求項１に記載の膠芽腫マウスモデルの製造方法。
【請求項４】
前記（ｂ）工程と前記（ｃ）工程との間に単一細胞単位に分離された試料から赤血球を除去する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の膠芽腫マウスモデルの製造方法。
【請求項５】
前記赤血球の除去は、パーコール濃度勾配遠心分離によって実行されることを特徴とする請求項４に記載の膠芽腫マウスモデルの製造方法。
【請求項６】
前記（ｃ）工程で免疫欠乏したマウスの脳に正位的に移植される移植用試料内に含まれる膠芽腫細胞の数は１×１０５〜５×１０５個であることを特徴とする請求項１に記載の膠芽腫マウスモデルの製造方法。
【請求項７】
前記移植用試料は、５〜１５μＬの体積を持つことを特徴とする請求項６に記載の膠芽腫マウスモデルの製造方法。
【請求項８】
前記（ｂ）工程は、前記収集された各切片の混合物を順次機械的分解及び酵素的分解させて、単一細胞単位に分離することを特徴とする請求項１に記載の膠芽腫マウスモデルの製造方法。
【請求項９】
前記酵素的分解は、タンパク質加水分解酵素及びＤＮＡ分解酵素を含む酵素混合物によって実行されることを特徴とする請求項８に記載の膠芽腫マウスモデルの製造方法。
【請求項１０】
前記移植用試料は、免疫欠乏したマウスの脳の左側１．５〜２．５ｍｍ、全面部ブレグマから０．５〜１．５ｍｍ、及び硬膜から１．８〜２．２ｍｍの深さで移植されることを特徴とする請求項１に記載の膠芽腫マウスモデルの製造方法。
【請求項１１】
前記免疫欠乏したマウスはＮＯＧ（ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ、ＩＬ−２ＲγＫＯ）マウスであることを特徴とする請求項１に記載の膠芽腫マウスモデルの製造方法。
【請求項１２】
前記膠芽腫マウスモデルは、前記患者の膠芽腫と遺伝的特性及び形態学的特性が同じことを特徴とする請求項１に記載の膠芽腫マウスモデルの製造方法。
【請求項１３】
請求項１から請求項１２のいずれかに記載の方法によって製造された膠芽腫マウスモデル。
【請求項１４】
請求項１３に記載の膠芽腫マウスモデルまたはこれから由来した膠芽腫細胞を治療候補物質で処理する工程を含むことを特徴とする、膠芽腫治療剤をスクリーニングする方法。
【請求項１５】
前記方法は、治療候補物質で処理されたマウスモデルまたはそれから由来された膠芽腫細胞の治療効果を確認する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１４に記載の膠芽腫治療剤をスクリーニングする方法。
【請求項１６】
前記方法は、治療候補物質で処理されたマウスモデルの予後を確認する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１４に記載の膠芽腫治療剤をスクリーニングする方法。
【請求項１７】
（Ａ）請求項１３に記載の膠芽腫マウスモデルに対して膠芽腫候補治療方法を行う工程；及び
（Ｂ）前記候補治療方法が実行されたマウスモデルの治療効を確認する工程を含む、患者オーダーメード型膠芽腫治療方法の選択のための情報提供方法。
【請求項１８】
前記候補治療方法は、化学的療法、放射線療法、外科的療法、免疫細胞治療法、またはこれらの組み合わせであることを特徴とする請求項１７に記載の患者オーダーメード型膠芽腫治療方法の選択のための情報提供方法。
【請求項１９】
前記（Ｂ）工程は、マウスモデルの予後を確認する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１７に記載の患者オーダーメード型膠芽腫治療方法の選択のための情報提供方法。
【請求項２０】
前記化学的療法は、治療候補物質で前記マウスモデルを処理して行われることを特徴とする請求項１８に記載の患者オーダーメード型膠芽腫治療方法の選択のための情報提供方法。
【請求項２１】
前記免疫細胞治療法は、樹枝状細胞治療法であることを特徴とする請求項１８に記載の患者オーダーメード型膠芽腫治療方法の選択のための情報提供方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（ａ）患者から分離された膠芽腫組織を４以上の区画に分けて、各区画で一つ以上の切片を収集する工程と、（ｂ）前記収集された各切片の混合物を単一細胞（single cell）単位で膠芽腫細胞を分離する工程と、（ｃ）前記（ｂ）工程で分離された膠芽腫細胞を含有する移植用試料を免疫欠乏したマウスの脳に正位的に移植する工程と、を含む、膠芽腫マウスモデルの製造方法、前記方法で製造された膠芽腫マウスモデル、前記マウスモデルを利用して患者オーダーメード型膠芽腫治療剤をスクリーニングする方法、及び前記マウスモデルを利用した患者オーダーメード型膠芽腫治療方法の選択のための情報提供方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経膠腫（glioma）は、原発性脳腫瘍（primary brain tumor）の６０％を占める腫瘍であって、発生頻度が高く治療が難しく、現在でも放射線治療の他には特別な治療法がない悪性腫瘍である。そのうち最も悪性に分類されている膠芽腫（glioblastoma、ＧＢＭ）の場合、他の癌と比較すると、放射線及び抗癌剤治療に対する抵抗性が非常に高くて、一度診断されると平均余命がただ１年に過ぎない。また、このような脳腫瘍の場合、血液脳関門があって、治療のための薬物の伝達が容易ではない。特に相対的に脳神経生物学に対する理解が不足して、それに対する治療剤開発が遅く進行されている。さらに、膠芽腫は、他の脳腫瘍と比較すると、攻撃的変異（aggressive variant）を示して、これを早期に治療しなければ数週以内に致命的な結果を招くようになる。従って、膠芽腫の治療には外科的処置以外に放射線治療及び化学薬物治療が共に実行されている。しかし、このような化学薬物治療は、耐性変異株の発生、腫瘍幹細胞による再発などの原因によって限界に至った状況であるため、新しい治療法を開発しなければならない必要性が求められているのが現状である。
【０００３】
最近、システム生物学（systems biology）及び生物情報学技法（bioinformatics tools）の飛躍的発展により膠芽腫の発生と病症の進行に関連したものと考えられる意味のある遺伝的欠陥及び遺伝子発現パターンが報告されている。しかし、臨床成果を代表できる分子マーカー（molecular marker）の発掘成果はまったくないのが実情である。特に、遺伝子発現分析が転写体（trascriptome）レベルに留まっていて、実際の癌組織でのタンパク質発現程度を代弁できない限界がある。このような問題点を解決する方案として、膠芽腫を最も適切に模倣する動物モデルを用いる方法が摸索されている。このような動物モデルは、膠芽腫の進行の様子を研究するのに活用できる。また、膠芽腫に対する新しい治療戦略の探索及び既存治療戦略の適切な結合に伴う研究に活用でき、膠芽腫の治療に効果を示す新しい抗腫瘍物質の効能検索に使用できると予想されている。これに伴い、ヌードマウスのような細胞性免疫機能が欠乏した動物モデルを用いたり、膠芽腫が誘発された動物モデルを開発するための研究が活発に進められている。これと関連して、ヒト由来膠芽腫を移植して動物モデルを製造した例がある（Diao Yi, et al., Cancer Investigation, 29:229-239, 2011, EGFR Gene Overexpression Retained in an Invasive Xenograft Model by Solid Orthotopic Transplantation of Human Glioblastoma Multiforme Into Nude Mice）。前記論文では、患者由来膠芽腫の特定部位（一つの部位）の片だけを用いて製造した移植用試料を利用してマウスモデルを製造したところ、実際に母体癌と同じ形態学的、遺伝学的、病理学的特性を示すマウスモデルを製造するには困難があった。また、従来にはマウスに移植する移植用試料を製造する際に、患者から収得した組織に対する酵素的分解時タンパク質加水分解酵素を用いたが、この場合粘性によって細胞を単細胞単位に分離するのに困難があった。さらに、患者から収得した移植用試料から赤血球を取り除くために通常はフィコール濃度勾配遠心分離方法（Ficoll Gradient）が用いられたが、この場合血液除去効率が低い問題点があった。
【０００４】
膠芽腫が発病した患者を治療するためには、患者の遺伝的、生理的及び環境的特性を考慮しなければならないだけでなく、膠芽腫の進行水準に合わせて、化学的療法、放射線療法、外科的療法、免疫細胞治療法などの様々な治療方法を適用しなければならない。しかし、上述した動物モデルは、このような患者の個人的な特性を反映することが不可能であるため、前記動物モデルは、治療方法または治療剤の開発に活用されるものに過ぎず、実際の患者オーダーメード型治療に使用される幅が少なかった。万一、患者それぞれの遺伝学的及び生理学的環境条件を最大限模写できる動物モデルを開発できるならば、各患者に対するオーダーメード型治療を行って治療成功率を大幅に向上させることができると予想されている。
【０００５】
このような背景下、本発明者等は、膠芽腫患者の遺伝的、形態学的及び病理学的特性を同様に示す膠芽腫マウスモデルを確立しようと鋭意努力した結果、膠芽腫患者から分離された膠芽腫組織の様々な部位で収集した膠芽腫組織切片の混合物から製造された移植用試料をマウス脳に正位的に移植する場合、母体癌の遺伝的、形態学的及び病理学的特性を同様に示す膠芽腫マウスモデルを確立する可能性があることを確認した。また、このようなマウスモデルを確立するための最適条件を開発して、本発明を完成した。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、（ａ）患者から分離された膠芽腫組織を４以上の区画に分けて、各区画で一つ以上の切片を収集する工程と、（ｂ）前記収集された各切片の混合物を単一細胞単位で膠芽腫細胞を分離する工程と、（ｃ）前記（ｂ）工程で分離された膠芽腫細胞を含有する移植用試料を免疫欠乏したマウスの脳に正位的に移植する工程と、を含む、膠芽腫マウスモデルの製造方法を提供する。
【０００７】
本発明はまた、前記方法により生産されたマウスモデル、前記マウスモデルを使用した、膠芽腫治療剤をスクリーニングする方法、及び前記マウスモデルを使用した、患者オーダーメード型膠芽腫治療方法の選択のための情報提供方法を提供する。
【０００８】
本発明に係る膠芽腫マウスモデルは、母体癌の遺伝的、形態学的及び病理学的特性を同様に示すため、安全でかつ効果的に患者オーダーメード型膠芽腫治療剤の発掘または、治療方法の選択が可能で有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】膠芽腫患者の臨床結果及び初代培養された膠芽腫細胞の実験結果を示す。
【図２】膠芽腫の手術サンプルから由来した、初代培養及び正位的異種移植動物モデルを示す図である。（Ａ）厳密に分離した膠芽腫細胞のＮＥＢ条件での培養、または、免疫欠乏したマウスの脳に正位的に移植し、ＰＣＮＡに対する免疫組織化学実験結果を正位的異種移植腫瘍に対して示した。矢印は、ＰＣＮＡ染色を介して表示された、移植された癌の部分を示す。（Ｂ）Ｆｉｓｈｅｒの正確検定法（ｐ＝０．０９）で分析した、厳密に分離した膠芽腫細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ球形細胞形成能（sphere formation）とｉｎ  ｖｉｖｏ癌化能（tumorigenecity）との間の相関関係を示したグラフである。（Ｃ）ｉｎ  ｖｉｖｏ癌化能を持つ膠芽腫（ｎ＝４０）のＰＦＳ（progressive-free survival）及びＯＳ（overall survival）を癌化の可能性がない膠芽腫の場合（ｎ＝１６）とＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存分析法（Kaplan-Meier plots）及びログランク検定法（log rank test）を利用して比較した結果を示したグラフである。
【図３】母体膠芽腫（parental GBMs）及びこれの正位的異種移植腫瘍の形態学的及び病理学的特徴を比較した結果を示した図であって、母体癌とそれから作られた正位的異種移植癌の浸潤性（Ａ）、増殖指標（Ｂ）及び微細血管強度（Ｃ）を分析して比較した結果を示した。（Ａ）母体癌及び異種移植癌の浸潤性は、ＭＲＩ及び病理学的セクションそれぞれで主な組織（main mass）の径と転移した距離を比較して決めた。（Ｂ）増殖指標の場合、Ｋｉ−６７（母体癌）またはＰＣＮＡ（正位的異種移植腫瘍）に対して免疫化学分析を行って、次に無作為的に選択した１００個の細胞のうち陽性細胞の数を測定して計算した。前記表は３回繰り返し実験の平均値を示し、その平均値は統計学的分析に利用した。（Ｃ）微細血管密度はＣＤ３１に対する免疫化学分析法によって分析した。三つの顕微鏡観察部位を２００倍解像度で、無作為的に選択しており、ＣＤ３１陽性微細血管の数を算出した。三つの値の平均は、統計学的分析に利用した。
【図４】ＭＲＩで確認した母体癌の浸潤程度及びこれに対応する正位的異種移植された腫瘍の浸潤度を示す図である。母体腫瘍の浸潤程度は、ＲＡＮＯ基準によりＭＲＩ  Ｔ２／ＦＬＡＩＲイメージを用いて分析した。患者腫瘍の浸潤度は、下記基準によって定義した。０＝「非浸潤（no invasion）」、１（ｍｉｌｄ）＝「浸潤距離（distance of invasion）＜２×腫瘍塊りの径（diameter of tumor mass）」、２（ｍｏｄｅｒａｔｅ）＝「２×腫瘍塊りの径＜浸潤距離＜３×腫瘍塊りの径」、及び３（ｓｅｖｅｒｅ）＝２（ｍｏｄｅｒａｔｅ）＝「３×腫瘍塊りの径＜浸潤距離」。正位的異種移植腫瘍の浸潤度は、パラフィンセクションでＹ＝「浸透距離（distance of infiltration）＞２×主な塊りの径（diameter of main mass）」として定義した。転移程度に応じた代表的なＭＲＩ及び組織学結果を示すために、１（ｍｉｌｄ）、２（ｍｏｄｅｒａｔｅ）、または３（ｓｅｖｅｒｅ）浸透に対する三つの母体腫瘍のＭＲＩスキャンイメージ及びこれに対応する正位的異種移植腫瘍の組織学を示した。
【図５】母体腫瘍及び正位的異種移植腫瘍の分子的特徴を示す図である。短鎖縦列反復配列（short tandem repeat、ＳＴＲ）（Ａ）、遺伝子コピー数多様性（genomic copy number variation）（Ｂ）、ＴＰ５３とＩＤＨ１の遺伝的突然変異（Ｃ）及び母体膠芽腫の遺伝子発現パターン（Ｄ及びＥ）を、母体癌及びこれから由来した正位的異種移植腫瘍と互いに比較したものである。（Ｂ）遺伝子コピー数多様性は、比較遺伝子混成化アレイ（array-comparative genomic hybridization、ａＣＧＨ、左側）で分析して、右側に膠芽腫で頻繁に変形されると報告された遺伝子の遺伝子コピー数多様性を要約しておいた（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ：灰色コラム、Ｄｅｌｅｔｅｄ：灰色コラム）。（Ｃ）特異的突然変異は、太字で表示し、Ｗｔは本来の形態を示したものである。（Ｄ）５８個の膠芽腫標本の亜型を近接模型予測（Nearest Template Prediction）法を利用して決めた結果を示したものである。（Ｅ）母体膠芽腫及びこれに対応する正位的異種移植腫瘍間の遺伝子産物発現を免疫組織化学染色法的に比較した結果を示したものである。
【図６】母体癌及びこれに対応する正位的異種移植癌の治療反応性に対する機能的比較を行った実験結果を示した図である。（Ａ）ＰＣ−ＮＳ０７−４４８、ＰＣ−ＮＳ０７−４６４、ＰＣ−ＮＳ０８−５７８、ＰＣ−ＮＳ０９−７８０または８２７から由来した正位的異種移植癌は対照群のためにそれぞれ８個、１５個、９個、９個及び４個；放射線照射群のために９個、９個、１０個、９個及び４個ずつ分配した。次に、放射線照射群に対して毎日２Ｇｙずつ計５日間照射する、５０％の生存率を通過する全脳放射線照射治療法を行った。全体生存率（ＯＳ）を計算すると、全体脳の放射線照射によって生存率が増加する結果を示した（＊、Ｐ＜０．０５、左側）。正位的異種移植癌の生存率増加は、母体癌のＰＦＳ（右側）と関連している結果を示した。誤差バーは標準偏差である。（Ｂ）ＭＧＭＴプロモーターのメチル化状態は、メチル化特異的ＰＣＲ（左側、Ｍ；メチル化−特異的プライマーまたはｇＤＮＡのメチル化された対照群、ＵＭ；メチル化−特異的プライマーまたはメチル化されていない対照群ｇＤＮＡ）を行った結果で表示した。ＰＣ−ＮＳ０７−４６４またはＰＣ−ＮＳ０９−５５９から由来した正位的異種移植癌（Ｃ；対照群それぞれ９個と１０個の標本、ＴＭＺ；それぞれ７個、９個の標本）にＴＭＺを処理した（毎日６５ｍｇ／ｋｇ、経口投与）。全体生存率を算出して、ＴＭＺ化学治療によって生存率が増加した（＊、Ｐ＜０．０５）。（Ｃ）ＰＣ−ＮＳ０７−４４８、ＰＣ−ＮＳ０７−４６４、ＰＣ−ＮＳ０９−５５９またはＰＣ−ＮＳ０９−７４８から由来した正位的異種移植癌を、対照群に対してそれぞれ８、８、７、７個、ベバシズマブ治療群に対してそれぞれ９、１１、７及び６個に分けて、ベバシズマブ治療群の場合、１０ｍｇ／ｋｇの量で一週間に二回腹腔内注入した。ベバシズマブ処理による異種移植癌の形態学的な変化は、Ｈ＆Ｅ染色とヒト核に対する免疫組織化学分析法で分析した（下側、ＰＣ−ＮＳ０７−４６４）。
【図７】異種移植腫瘍に対するｉｎ  ｖｉｖｏ全体脳放射線照射及びＲＲ（radiation-response）特徴を示した図である。（Ａ）ＰＣ−ＮＳ０７−４４８、ＰＣ−ＮＳ０７−４６４、ＰＣ−ＮＳ０８−５７８、ＰＣ−ＮＳ０９−７８０または８２７由来の異種移植腫瘍［対照群の場合、ｎ＝８、１５、９、９及び４、放射線照射群の場合、ｎ＝９、９、１０、９及び４］に対して全体脳放射線照射治療を行った（毎日２Ｇｙで５日間）。放射線照射が生存率期間に及ぼす影響に対しては、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロット及びｌｏｇ−ｒａｎｋ検定で分析した。（Ｂ）ＲＲ特徴は、ｉｎ  ｖｉｖｏ放射線治療を受けたＰＣ−ＮＳ０７−４４８及びＰＣ−ＮＳ０７−４６４異種移植腫瘍のｍＲＮＡ発現分析で定義した（左側）。ＲＲ特徴に基づいて、ＲＥＭＢＲＡＮＤＴデータセットの高危険神経膠腫を４４８−類似グループ及び４６４−類似グループで系統的にクラスタして、４４８−類似グループ及び４６４−類似グループの高危険神経膠腫及び膠芽腫のＯＳは、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロット及びｌｏｇ−ｒａｎｋ検定で分析した。
【図８】癌化特徴、癌化関連経路、及び独立的なデータセットで臨床的結果との関連性を示す図である。（Ａ）１０個の非腫瘍性膠芽腫及び３６個の腫瘍性膠芽腫間に１．５倍以上の発現の差を見せる７０９個の遺伝子を行−正規化（row-normalization）した後、ヒットマップ（二次元グラフ）で示した。赤色は高発現率、青色は低発現率をそれぞれ示す。２０個の高く発現した遺伝子を持つグループは、側に示した。（Ｂ）Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存率分析は、ＲＥＭＢＲＡＮＤＴデータセットで二つの患者グループの累積したＯＳを、癌化特徴と関連して癌化または非癌化グループと比較した。（Ｃ）Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存率分析は、ＲＥＭＢＲＡＮＤＴデータセットで二つの患者グループの累積したＯＳを、ＰＩＴＸ２を上向き−または下向き−調節する各グループと比較した。（Ｄ）危険度比（自然ログスケール）及びこれの９５％信頼区間を示すｆｏｒｅｓｔ  ｐｌｏｔであって、各危険度比は、与えられた経路の算出された活性及びＲＥＭＢＲＡＮＤＴデータセットの患者のＯＳ間の関連性を示す。上位５個及び下位５個は、それぞれＢＩＯＣＡＲＴＡで殆ど上向き調節及び下向き調節された経路を示し、各グループは、癌化特性と陽性的に関連している。
【図９】前突然変異（permutation）分析及び癌化関連した経路及び独立的データセットの臨床的結果間の関係を示す図である。（Ａ）５００前突然変異分析からＰ値の分布を示すものである。各分析で「対照群」表示は生成され、各対照群のＲＥＭＢＲＡＮＤＴの患者生存率予測程度は、ログランク検定Ｐ値で定量化した。５００ログランク検定Ｐ値の二種類（黒塗り棒）は、本来特徴のＰ値（０．００００４６）より小さく、これは前突然変異分析Ｐ値を０．００４（＝２／５００）にした。（Ｂ）ＫＥＧＧ−表示された経路のＦｏｒｅｓｔプロットを示した図である。（Ｃ）ＲＥＡＣＴＯＭＥ−表示された経路のＦｏｒｅｓｔプロットを示した図である。
【図１０】独立的データセットで、転移度特性及びこれの臨床的結果との関連性を示した図である。（Ａ）マウス脳で非浸潤性である９個の膠芽腫及び浸潤性である２７個の膠芽腫間にそれぞれ異なる発現様子を示す（１．５倍以上の変化）７７７個の遺伝子を行−正規化した後、ヒットマップで示した図である。各グループで２０個の最も高い発現差を示す遺伝子に対してはプロットの側に表示した。（Ｂ）Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットとして、ＲＥＭＢＲＡＮＤＴデータセットの二つのグループの患者の累積したＯＳと、転移性特性と陽性または陰性的に関連した各グループと比較した結果を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の一つの目的は、母体癌の遺伝的、形態学的及び病理学的特性を同様に示す膠芽腫マウスモデル及びその製造方法を提供することにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、本発明により製造されたマウスモデルを利用して患者オーダーメード型膠芽腫治療剤を提供することにある。
【００１２】
本発明のさらに他の目的は、本発明により製造されたマウスモデルを利用して患者オーダーメード型膠芽腫治療方法の選択のための情報提供方法を提供することにある。
【００１３】
前記目的を達成するために、本発明は、（ａ）患者から分離された膠芽腫組織を４以上の区画に分けて、各区画で一つ以上の切片を収集する工程と、（ｂ）前記収集された各切片の混合物を単一細胞単位で膠芽腫細胞を分離する工程と、（ｃ）前記（ｂ）工程で分離された膠芽腫細胞を含有する移植用試料を免疫欠乏したマウスの脳に正位的に移植する工程と、を含む、膠芽腫マウスモデルの製造方法を提供する。
【００１４】
本発明はまた、前記膠芽腫マウスモデルまたはこれから由来した膠芽腫細胞を治療候補物質で処理する工程を含む、膠芽腫治療剤をスクリーニングする方法を提供する。
【００１５】
本発明はまた、（ａ）前記膠芽腫マウスモデルに対して膠芽腫候補治療方法を行う工程；及び（ｂ）前記候補治療方法が実行された動物モデルを飼育しながら治療効果及び予後を確認する工程を含む、患者オーダーメード型膠芽腫治療方法の選択のための情報提供方法を提供する。
【００１６】
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
【００１７】
本発明で用語、「膠芽腫（glioblastoma、ＧＢＭ）」とは、正常に脳組織に豊富に存在している神経膠細胞から始まった腫瘍を意味する。具体的に、前記膠芽腫は、全体脳腫瘍の１２〜１５％を占めて、脳膠腫の５０〜６０％を占める脳に発生する単一腫瘍のうち最も多く発生する腫瘍である。また、脳圧が急速に上昇して頭痛（朝激しい）、ムカムカ感（悪心）、嘔吐、けいれん、脳浮腫による神経機能の低下、四肢運動または感覚低下、顔マヒ、言語障害、認知機能低下、左−右区分障害などの多様な症状を示す。このような膠芽腫を治療するために、ＴＭＺ（temozolomide）に基づいた治療法などが用いられて来ているが、同じ膠芽腫患者といっても遺伝学的、病理学的状態に差があって、同じ治療法を適用しても他の効果が現れることがある。そこで、治療剤のスクリーニングなどに利用するために、患者の遺伝学的、生理学的及び病理学的状態を反映する異種移植膠芽腫マウスモデルの開発が求められた。本発明では、患者の分離された膠芽腫組織から製造した移植用試料をマウス脳に正位的に移植して、母体癌の特性をそのまま示す膠芽腫正位的異種移植マウスモデルの製造方法を開発した。特に、本発明では、膠芽腫が遺伝的に同じ癌細胞で構成されたとの理論下に癌組織一部だけを分離してマウスモデルを製造する場合、母体癌の特性をまともに示すことができない短所があったので、これを克服するために、膠芽腫組織を４以上の区画に分けて、これから特定体積の組織切片を混合して、これを移植用試料として製造する方法を最初に開発して、母体癌と同じ特性を持つ膠芽腫マウスモデルを製造した。すなわち、本発明者等は、患者の分離された膠芽腫組織の一部分だけをマウス移植に用いるよりは、患者の分離された膠芽腫組織の各部分を全部混ぜて組織の各部分が均質化された試料をマウス移植に用いて患者の形質をそのまま反映されることができる異種移植マウスを製造した。本発明者等は、患者の特性を反映するこのような正位的異種移植マウスを「アバターマウス」と命名した。
【００１８】
従って、一観点において、本発明は、（ａ）患者から分離された膠芽腫組織を４以上の区画に分けて、各区画で一つ以上の切片を収集する工程；（ｂ）前記収集された各切片の混合物を単一細胞単位に膠芽腫細胞を分離する工程；及び（ｃ）前記（ｂ）工程で分離された膠芽腫細胞を含有する移植用試料を免疫欠乏したマウスの脳に正位的に移植する工程を含む、膠芽腫マウスモデルの製造方法に関する。
【００１９】
このような膠芽腫に対する正位的異種移植マウスを製造する本発明の方法で、前記（ａ）工程と（ｂ）工程は、患者オーダーメード型膠芽腫マウスモデルを製造するための膠芽腫細胞を含む移植用試料を製造する工程である。
【００２０】
本発明で用語「膠芽腫細胞を含む移植用試料」とは、膠芽腫患者の分離された膠芽腫組織からマウスの脳に移植するために製造した試料であって、単一細胞形態の膠芽腫細胞を含む。前記試料に含まれた膠芽腫細胞は、好ましくは摘出されて３時間が過ぎない膠芽腫患者の分離された膠芽腫組織から由来したものが好ましいが、これに制限されるのではない。また、前記試料は、組織を分離した患者の膠芽腫癌の特性をよく反映できるように、分離された組織の一つの部分ではなく、患者から分離された膠芽腫組織を４以上の区画に分けて、各区画で一つ以上の切片を収集して製造することが好ましい。このように、患者から分離された膠芽腫組織を４以上の区画に分けて各区画で収得した一つ以上の切片の混合物から膠芽腫細胞を含有する移植用試料を用いてマウスモデルを製造する場合、一つの特定部位だけから収得した組織から製造した移植用試料を用いてマウスモデルを製造する場合とは異なって、患者の膠芽腫癌の特性をよく反映できる。従って、本発明でのように、膠芽腫組織を４以上の区画に分けて色々な区画から収得した切片から移植用試料を製造した方が良い。この時、４以上の区画で収得するだけで母体癌の遺伝的、形態学的及び病理学的特性を同様に示すマウスモデルの製造が可能で、その上限に制限がないが、区画の数が増えるほど時間及び負担が増加するため、１００以下の区画で切片を収集することができる。
【００２１】
また好ましくは、４以上の区画で１ｍｍ３〜８ｍｍ３の一つ以上の切片を収集して用いることができる。また好ましくは、前記（ｂ）工程で収集された各切片の混合物の体積が患者から分離された膠芽腫組織体積の３０〜１００％の体積であってもよい。
【００２２】
また、前記（ｂ）工程は、収集された各切片の混合物を単一細胞形態で分離する工程であり、これは前記各切片の混合物を順次機械的分解及び酵素的分解させて、単一細胞単位で分離してもよい。
【００２３】
前記機械的分解過程は、組織の機械的分解に用いられると知られた当業界に通常知らされた機械などを利用して実行でき、本発明の一実施例では分解機械（dissociator）を利用した。機械的分解過程を行った試料は、さらに酵素的分解過程を経ても良い。このような酵素的分解に用いられる試薬は、タンパク質加水分解酵素及びＤＮＡ分解酵素を共に含むことが好ましい。このようなタンパク質加水分解酵素としては、例えばパパイン、プロメラミンのようなシステイン加水分解酵素などがあり、ＤＮＡ分解酵素としては、ＤＮａｓｅＩなどがあるが、これに制限されない。本発明者等は、酵素的分解を行う際に、タンパク質加水分解酵素にＤＮＡ分解酵素をさらに含む場合、前記均質化過程を行って増加した点性問題を解決するに当たり効果的であることを確認した。従って、前記酵素的分解過程は、タンパク質加水分解酵素及びＤＮＡ分解酵素を共に含む試薬で行うことが好ましい。前記のような酵素的分解過程を経た試料は、選択的に単一細胞分離するか否かを確認した後、ろ過（filtration）過程を経てもよい。
【００２４】
前記ろ過過程は、単一細胞の分離に適した大きさの孔を持つフィルターを制限なしに利用することができる。本発明の一実施例では、セルストレーナーを用いて単一細胞群集（single cell population）を確保した。
【００２５】
このように選択的にろ過過程を経た、単一細胞形態の膠芽腫細胞を含む試料は、血液除去過程を経てもよい。このような血液除去過程は、赤血球細胞を除去する当業界の通常の多様な方法で実行されるが、パーコール（Percoll）濃度勾配遠心分離で実行されることが好ましい。本発明の一実施例では、フィコール（Ficoll）濃度勾配遠心分離方法に比べてパーコール濃度勾配遠心分離を行うと、血液除去効率がより高いこを確認した。
【００２６】
前記（ｃ）工程は、前記（ｂ）工程で分離された膠芽腫細胞を含有する移植用試料を免疫欠乏したマウスの脳に正位的に移植する工程である。
【００２７】
本発明で用語「免疫欠乏したマウス」とは、膠芽腫が発病できるように免疫システムを構成する一部構成要素を遺伝子レベルで人為的に損傷させて正常な免疫システムが具現されないように操作して製造されたマウスを意味する。前記免疫欠乏マウスとしては、神経系が形成されたマウスが使用されるが、好ましくは免疫欠乏されるように操作されたマウスである。従来には、ヌードマウスが主に用いられたが、ＮＯＧ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  Ｉｌ２ｒｇ−／−）マウスを利用してマウスモデルを製造する場合、そのモデル生成率がより改善されるとの長所があって、最も好ましくはＮＯＧ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  Ｉｌ２ｒｇ−／−）マウスを用いる。
【００２８】
前記膠芽腫細胞を含む移植用試料は、免疫欠乏したマウスの脳に正位的に移植されることを特徴とする。
【００２９】
マウス脳への正位的移植は、マウス脳の左側１．５〜２．５ｍｍ、全面部ブレグマ（bregma）から０．５〜１．５ｍｍ、及び硬膜から１．８〜２．２ｍｍの深さで実行されてもよい。このようなマウス脳へ正位的に移植する本発明の方法は、膠芽腫をマウス脇腹（flank）へ移植する場合に比べて母体癌の特性をよりよく維持させることができるメリットを持つ。
【００３０】
また、マウス脳に正位的に前記（ａ）工程の移植用試料を移植する際に、前記試料内に含まれる膠芽腫細胞の数は１×１０５〜５×１０５個が好ましく特に５〜１５μＬの体積を持つことが好ましい。細胞数が１０４以下だったり１０６以上である場合には、膠芽腫マウス疾病モデルの生成率が減少することがある。
【００３１】
このように移植された細胞が育って、移植後数週間〜数ヶ月以内に膠芽腫が形成されることになり、膠芽腫マウス疾病モデルが確立された場合には、目で観察できるほどの体重減少、頻呼吸（tachypnea）、マヒ（palsy）、またはその他これと関連した症状が現れることになる。本発明の一実施例では、異種移植された動物モデルのうち体重が２０％以上減少したものを介して疾病モデルが確立されたことを確認した。
【００３２】
前記のような過程で製造された本発明の膠芽腫異種移植マウスモデルは、母体癌（parental tumor）、すなわち前記移植された組織が由来された患者から発病した膠芽腫と遺伝的、形態学的及び分子的特性が類似する特徴を持つ。
【００３３】
従って、他の観点において、本発明は、本発明の膠芽腫マウスモデル製造方法で製造された膠芽腫マウスモデルに関する。
【００３４】
同じ膠芽腫が発病した患者といっても、その特性が個別的に異なるので、個々の患者により治療効果が異なって予後が異なることがある。従って、すべての患者に対して同じ治療方法を選択した際に、その効果が異なることもあるので、多様な膠芽腫の治療方法のうち個々の患者に特異的でかつより効果的な治療方法を選択したり新しい治療方法をスクリーニングする必要がある。本発明の患者オーダーメード型膠芽腫マウスモデルは、移植された膠芽腫細胞が由来された患者の特性をそのまま反映するので、これを利用してその患者に適した治療方法の選択をすることができる。
【００３５】
具体的に、本発明のマウスモデルの膠芽腫は、それの母体癌と浸潤性、増殖指数及び微細血管密度のような形態学的環境が同じか類似することを特徴とする。例えば、マウスモデルの膠芽腫はそれの母体癌と、ＥＧＦＲ（Epidermal growth factor receptor）、ＣＤＫ２（Cyclin-dependent kinase 2）、ＰＤＧＦＲＡ（Alpha-type platelet-derived growth factor receptor）、ＭＤＭ２（murine double minute）、ＭＤＭ４、ＭＥＴ（met proto-oncogene）、ＣＤＫ６（Cyclin-dependent kinase 6）、ＰＩＫ３ＣＡ（phosphoinositide-3-kinase, catalytic, alpha polypeptide）、ＡＫＴ３（RAC-gamma serine/threonine-protein kinase）等をコードする遺伝子が増幅されるか否かまたはＣＤＫＮ２Ａ／Ｂ（Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A/B）、ＰＴＥＮ（Phosphatase and tensin homolog）、ＣＤＫＮ２Ｃ（Cyclin-dependent kinase 4 inhibitor C）、ＲＢ１（retinoblastoma protein）、ＰＡＲＫ２（parkinson protein 2）、ＮＦ１（Neurofibromin 1）等をコードする遺伝子が欠損されるか否かのような遺伝学的環境が同じか類似し；膠芽腫のマーカータンパク質として知られているＭＢＰ（Myelin basic protein）、ＰＤＧＦＡ（Platelet-derived growth factor subunit A）、ＥＧＦＲＣＨＩ３Ｌ１（Chitinase-3-like protein 1）、ＭＡＰ２（Microtubule-associated protein 2）、ＴＯＰ２Ａ（DNA topoisomerase 2-alpha）、ＤＬＬ３（Delta-like 3）、ＳＯＸ２（SRY (sex determining region Y)-box 2）、Ｏｌｉｇ２（Oligodendrocyte transcription factor 2）等が同じか類似するレベルで発現されるが、特にこれに制限されない。
【００３６】
本発明の一実施例では、膠芽腫患者から分離された組織が摘出されてから３時間が過ぎる前に分離された組織の各部分をムラなく切り出して、全体癌組織の各部分の細胞がムラなく混ざるようにした。次に、これを機械的分解及び酵素的分解して、単一細胞単位で分離し、１．０×１０５〜２．０×１０５個の膠芽腫細胞を含んでいる１０μＬのＨＢＳＳ溶液をマウスの脳（脳の左側２ｍｍ、全面部ブレグマ１ｍｍ、硬膜から２ｍｍ深さ）に移植して、マウス全体の体重が２０％以上減少すると、疾病が発病したと見てこれを犠牲させた（実施例２）。次に、前記のとおり製造した患者オーダーメード型膠芽腫マウスモデルの母体癌との類似性を形態学的及び病理学的観点で確認した。具体的に、転移性、増殖指標及び血管強度を確認し、その結果、転移性、増殖指標及び微細血管強度共に母体癌及びそれから由来した膠芽腫が移植されたマウスモデル全部において密接な関連性を示した（実験例２）。また、ゲノムの類似性を確認した結果、コピー数及び遺伝的突然変異に対しても一致することを確認して（図５Ｂ及びＣ）、マイクロアレイを介した遺伝子発現を確認した結果、母体癌及びそれに対して対応する異種移植腫瘍共に遺伝子発現特性が類似する結果を示した（図５Ｅ）。本発明のマウスモデルは、母体癌の形態学的、病理学的及び遺伝学的特性の類似性をそのまま維持するか否かを確認した後、膠芽腫治療法に対する反応が互いに類似するか否かを確認した。その結果、放射線治療及びＴＭＺに基づいた化学的治療法共に類似する傾向性を示した（実験例４）。すなわち、前記のような結果は、本発明の方法で製造した膠芽腫マウスモデルは、移植された膠芽腫が由来した患者の特性を十分に反映するので、患者オーダーメード型治療剤の選別及び治療方法の選択などに利用できるプラットホームとして有用性を持つことが示唆された結果である。
【００３７】
また他の観点において、本発明は、前記膠芽腫マウスモデルまたはこれから由来した膠芽腫細胞を治療候補物質で処理する工程を含む、膠芽腫治療剤をスクリーニングする方法に関する。
【００３８】
この時、前記方法は、治療候補物質で処理されたマウスモデルまたはそれから由来された膠芽腫細胞の治療効果を確認する工程をさらに含んでもよい。
【００３９】
前記治療候補物質の治療効果に対する確認は、経口投与、静脈内投与、または、経皮投与のような各物質に適した方法でマウス内に投与した後、腫瘍の大きさ、転移程度及び死んだ細胞／生きている細胞間の比を測定することによって確認することができる。特に、本発明の膠芽腫マウスモデルまたはそれから由来した膠芽腫細胞は、膠芽腫が由来された患者の特性を反映するので、前記患者に適した治療剤の選別に有用に利用できる。
【００４０】
また、前記方法は、治療候補物質で処理されたマウスモデルの予後を確認する工程をさらに含んでもよい。前記予後は、病状の進行または回復に関する予測を意味する。本発明で前記予後は、患者で発病した膠芽腫を治療できる候補物質をマウスに投与した後、これの進行状況を確認して前記候補物質が膠芽腫を治療できるか否かを評価することをいう。
【００４１】
前記のように、本発明により製造された膠芽腫マウスモデルを利用すると、同じ膠芽腫を持つ患者に対して、該当候補物質または候補治療方法適用時の病状の進行や回復に対する予測が可能になる。
【００４２】
従って、また他の観点において、本発明は、（ａ）前記膠芽腫マウスモデルに対して膠芽腫候補治療方法を行う工程；及び（ｂ）前記候補治療方法が実行された動物モデルを飼育しながら治療効果及び予後を確認する工程を含む、患者オーダーメード型膠芽腫治療方法の選択のための情報提供方法に関する。
【００４３】
前記膠芽腫及びマウスモデルに対しては前記で説明したとおりである。
本発明の情報提供方法において、前記（ａ）工程は、本発明の前記膠芽腫マウスモデルに対して膠芽腫候補治療方法を行う工程である。
【００４４】
前記候補治療方法は、目的する患者で発病した膠芽腫を治療するためのオーダーメード型治療法の選別に用いられる多様な治療方法を意味するが、通常知られた可能ないずれの膠芽腫の治療方法を含んでもよい。例えば、前記候補治療方法は、化学的療法、放射線療法、外科的療法、免疫細胞治療法、またはこれらの組み合わせであってもよい。
【００４５】
前記化学的療法は、通常知られた抗癌活性を持つ治療剤候補物質を患者に投与して、膠芽腫を治療する方法を意味する。また、前記放射線療法は、放射線を患者に処理して膠芽腫を治療する方法であり、外科的療法は、外科手術で膠芽腫が発病した部位を摘出して膠芽腫を治療する方法である。
【００４６】
前記免疫細胞治療法は、患者の血液で抽出した末梢血液単核細胞から膠芽腫に攻撃性を示す免疫細胞を分離して、これを患者から分離した膠芽腫細胞と融合させた後、患者に抗癌ワクチンの形態で再び投与することによって、患者から発病した膠芽腫を治療する方法である。ここで、膠芽腫に攻撃性を示す免疫細胞としては樹枝状細胞を用いることが好ましいか、特にこれに制限されない。
【００４７】
下記の実施例では、本発明に係る培地を利用したヒト由来神経幹細胞の培養だけを例示したが、由来が異なる成体幹細胞を培養しても同様の効果があることは当業者には自明である。
【００４８】
以下、実施例を通して、本発明をより一層詳細に説明する。この実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこの実施例によって制限されると解釈されないことは当業界の通常の知識を有する者には自明である。また、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本例示に基づいた他の様々な変形、追加、及び置換が可能であることを当業者は理解するであろう。
【００４９】
≪実施例１：膠芽腫（ＧＢＭ）患者及び前記患者由来の初代培養細胞（primary cell）の培養≫
三星医療院（ソウル、韓国）で脳腫瘍除去手術を受けた５８人の患者から承認を得て、手術した腫瘍サンプルと臨床記録を収得しており、これに対する情報を図１に示した。具体的に、図１に、膠芽腫患者の臨床結果及び前記患者から由来した初代培養細胞の実験結果をそれぞれ示した。
この時、前記収得した手術サンプルは、前記病理学者の調査を介して、世界保健機構標準（WHO criteria）に基づいて膠芽腫に分類した。選別された手術サンプルの一部を酵素的に処理して単一細胞で分離して、分離された膠芽腫細胞は「ＮＢＥ」条件で培養した。具体的に、Ｎ２及びＢ２７（各０．５ｘ；インビトロジェン社）、及びｂＦＧＦ及びＥＧＦ（各２５ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄシステム）が追加されたニューロベイザル（Neurobasal）培地に前記分離した膠芽腫細胞を培養した。別法で、ＮＢＥ条件で厳密に分離した膠芽腫細胞は、使用前１０μｇ／ｍＬの濃度でラミニン（シグマ）がコードされたフラスコで一晩付着性培養になるようにした。
【００５０】
≪実施例２：正位的異種移植マウスモデル（orthotropic xenograft mouse model）の構築≫
動物実験は、三星医療院の倫理委員会の承認を受けて、「米国国立保健院の実験動物使用と管理に対するガイドライン及び解説書」（ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．８０−２３）に適するように実行され、正位的異種移植マウスモデルは、下記のような方法で製造した。
正位的異種移植マウスモデルの製造は大きく１）膠芽腫患者から分離した組織からマウスに移植する試料の製造工程；及び２）マウス移植工程に分けられ、その過程は下記のとおりであった。
【００５１】
（１）膠芽腫患者から分離した組織から均質化された移植試料の製造工程
マウス移植用試料は、膠芽腫患者から摘出後２〜３時間が経過しなかった新鮮な組織を利用して製造し、その製造過程は下記の表のような順序からなる。
【００５２】
【表１】
0006026653.tif 000002
【００５３】
具体的に、患者から分離された膠芽腫組織を４以上の区画に分けて、はさみ及び鉗子を用いて各区画で１ｍｍ３〜８ｍｍ３の一つ以上の切片を収集し、この時、前記収集された切片は、分離した膠芽腫組織体積の３０〜１００％の体積になるようにして、全体癌組織の各部分の細胞がムラなく混ざれるようにした。
【００５４】
本発明者等は、本マウスモデルの製造過程樹立中移植に用いられる組織の一部組織だけを用いてマウスモデルを製造する場合に比べて、全体癌組織の各部分をムラなく切り出して、これを移植試料として製造する場合、本マウスモデルの生成率が増加するだけでなく、本来患者の膠芽腫との遺伝学的、形態学的、及びマーカー発現特性の類似性、すなわち実際の患者の遺伝学的及び生理学的環境条件を最大限模写できることを確認した。そこで、本発明者等は、分離した全体癌組織の一部分を用いることなく、各部分をムラなく切り出してこれを移植試料として製造する前記のような過程を確立した。
【００５５】
次に、前記切り出した組織をはさみと鉗子を利用して組織を小さく切り出し、次に、小さく切った組織をチューブに全部移してｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳを用いてミンチ化（mincing）した。
【００５６】
前記のような機械的分解過程を経た後、酵素的分解過程を進めた。酵素的分解過程は、パパイン及びＤＮＡ加水分解酵素を含む酵素混合物と機械的分解過程を経た組織試料を３７℃インキュベーターで反応させながら行った。ここで、前記酵素混合物は、組織体積対比１：１〜１：２の量を用いた。
【００５７】
前記のような酵素過程条件の確立過程で、本発明者等はＤＮＡ分解酵素を、パパインと共に用いた場合、粘性による細胞分離の困難を解消できることを確認して、パパイン及びＤＮＡ分解酵素を共に用いる酵素的分解過程を確立した。
【００５８】
前記のような酵素的分解過程を経た後、ろ過過程を進めて単一細胞群集を確保した。ろ過過程では、細胞ストレーナーろ過を用いた。
【００５９】
次に、確保された単一細胞群集を洗浄した後、赤血球を取り除くためにパーコール濃度勾配精製過程を２０,０００ｒｐｍ、１８℃の条件で２０分間進めた。このような赤血球除去過程を経た試料の細胞数を血球計（Hemocytometer）を用いて測定して、生存率を確認した。
【００６０】
（２）均質化された移植試料の正位的異種移植工程
前記（１）の過程を経た膠芽腫細胞を含む試料をマウスの脳に正位的に移植しており、その条件は下記のとおりであった。
具体的に、１×１０５〜２．０×１０５個の細胞を含んでいる１０μＬのＨＢＳＳ（Hank's balanced salt solution）をマウスの脳に注入して、この時、マウスとしてはＮＯＧマウスを用いた。前記試料は、脳の左側２ｍｍ、全面部ブレグマ１ｍｍ、硬膜から２ｍｍ深さに移植した。本発明者等は、異種移植工程でマウスの脳に移植する細胞の数が〜１０５個を未満または、超える〜１０４個または〜１０６個であり、注入する体積も、５μＬ未満で少な過ぎたり、５０μＬ程度で多すぎる場合には、実際の患者を模写できるマウスモデルの生成率が低下することを確認して、前記のような注入最適条件を確立した。
このように異種移植したマウスは、マウスの全体体重が２０％以上減少すると、これを犠牲にさせて、脳はパラフィンまたは凍結薄片方法を用いて標本で製作した。
【００６１】
（３）従来技術との比較
患者の遺伝学的及び生理学的環境を模写できる本願発明の方法に係る膠芽腫マウスモデルの製造方法の優秀性を既存の製造方法（比較例）及び本願発明の方法の各工程による結果を互いに比較して下記の表に示した。
【００６２】
【表２】
0006026653.tif 000003
【００６３】
前記の通り、本発明者等は、移植された組織の母体組織（parental tissue）の遺伝学的及び生理学的特徴をよく維持する異種移植マウスの生成率が顕著に優秀な方法を開発した。
【００６４】
≪実施例３：組織マイクロアレイ及び免疫組織化学分析≫
母体膠芽腫とそれから作られた正位異種移植腫瘍（ＰＣ−ＮＳ０７−４６４,ＰＣ−ＮＳ０８−４９３、ＰＣ−ＮＳ０８−５３２、ＰＣ−ＮＳ０８−５５９、ＰＣ−ＮＳ０８−６０８、ＰＣ−ＮＳ０９−６２６、ＰＣ−ＮＳ０９−６３０、ＰＣ−ＮＳ０９−６３３、ＰＣ−ＮＳ０９−６６０、ＰＣ−ＮＳ０９−６９０及びＰＣ−ＮＳ０９−６９６）を対象に組織マイクロアレイ分析を行った。
免疫組織化学法の場合、各タンパク質に特異的抗体（Ｋｉ−６７、ＰＣＮＡ（ＤＡＫＯ）、ＤＬＬ３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ＳＯＸ２、Ｏｌｉｇ２、ＭＡＰ２（Ａｂｃａｍ）、ＭＢＰ、ＰＤＧＦＡ、ＥＧＦＲ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ＣＨＩ３Ｌ１、ＴＯＰ２Ａ（ＬｉｆｅＳｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＣＤ３１、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎは、母体癌に使用））を利用して行った。
【００６５】
≪実施例４：短鎖縦列反復配列（ＳＴＲ）遺伝子分析、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）分析及びＴＰ５３とＩＤＨ１に対する遺伝的突然変異分析≫
ゲノムＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ｍｉｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を利用して癌試料から分離した。ＳＴＲ分析のために、標的ＤＮＡは、ＡｍｐＦｌＳＴＲ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｌｅｒ  ＰＣＲ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて１６遺伝子座（ｌｏｃｉ）に対する複合ＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ産物は、Ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｓｉｚｅ  ｓｔａｎｄａｒｄ（ＧＳ−５００  ＬＩＺ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に混合して、これをＡＢＩ  ３１３０ｘＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒで電気泳動した。電気泳動結果は、ｓｕｐｐｌｉｅｄ  ａｌｌｅｌｉｃ  ｌａｄｄｅｒｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ  ４．０  ｓｏｆｔｗａｒｅで分析した。
【００６６】
ａＣＧＨは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ＣＧＨ  ２４４Ｋ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙを用いて行った。ＴＰ５３とＩＤＨ１に遺伝的突然変異分析のために、ＰＣＲ反応（４０ｃｙｃｌｅｓ、９５℃３０秒、５８℃３０秒、及び７２℃３０秒の条件）を１００ｎｇのｇＤＮＡ、２００ｎＭ濃度の下記表３の各プライマー及びＭａｘｉｍｅ  ＰＣＲ  ｐｒｅｍｉｘ（ｉＮｔＲＯＮ）を利用して行った。
【００６７】
【表３】
0006026653.tif 000004
【００６８】
ＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｋｉｔで精製しており、ＡＢＩ  ３１３０ｘｌ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に基づいたＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて両方向配列分析を行った。
【００６９】
≪実施例５：遺伝子発現プロファイル分析≫
遺伝子発現プロファイリングはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  １．０  ＳＴａｒｒａｙを利用して行って、結果として得られたＣＥＬデータは、Ｒｏｂｕｓｔ  Ｍｕｌｔｉｃｈｉｐ  Ａｖｅｒａｇｉｎｇ（ＲＭＡ）過程を介して標準化した。ＰＭ（perfect match、完全一致）−ＭＭ（miss match、不完全一致）差異点モデルは、発現値を表現するのに用いた。探針ＩＤｓは、ＧＳＥＡ−Ｐプログラム（Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅホームページでダウンロードする）を用いて遺伝子名を解読した。
ＲＥＭＢＲＡＮＤＴ（Repository for Molecular Brain Neoplasia Data）データセットのために、悪性度が高い神経膠腫に対するＣＥＬファイルをホームページ（https://caintegrator.nci.nih.gov/rembrandt/）からマッチング臨床情報ファイル（matching clinical information file）と共にダウンロードした。また、前記ＣＥＬファイルは、内部加工処理されたＣＥＬファイルであり、マッチングアレイ注釈ファイル（ｆｏｒ  Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  ａｒｒａｙ）を除いて用いた。
癌遺伝体地図構築事業（ＴＣＧＡ）データセット（Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  ＡｔｌａｓＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｎｅｔｗｏｒｋ、２００８）の場合、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａ  ２．０  ａｒｒａｙを用いて生成された５５６人の膠芽腫サンプルに対する遺伝子発現データファイルは、マッチング臨床情報ファイルと共に公式ホームページからダウンロードした。遺伝子発現ファイルはレベル３型で、すでに加工された形態で提供された。
【００７０】
≪実施例６：膠芽腫亜型予測≫
膠芽腫の亜型を分類するために用いられた８４０個の標識遺伝子の中で、マイクロアレイ基礎分析を介して得られた７８７個の遺伝子を用いた。前記７８７個の遺伝子は、各遺伝子が示す特定膠芽腫亜型を示す数字で表示した（１−前神経系（proneural）、２−神経系（neural）、３−一般系（classical）、４−中肝葉系、及び５−その他）。前記標識遺伝子情報ファイル及び５８膠芽腫標本に対する遺伝子発現データを含むファイルは、Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅを介して利用可能な、近接模型予測モジュール（Nearest Template Prediction Module in GenePattern）に入力した。すべての標本は、統計学的に有意な数値を持つ、五つのカテゴリーの中の一つに分類した（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  Ｐ  ｖａｌｕｅは、０．０５以下、ｂｏｏｔｓｔｒａｐ  ｔｅｓｔで１０００個の再標本化）。
【００７１】
≪実施例７：遺伝子特性分析≫
４６個の内部加工した膠芽腫標本を癌化特徴分析に用いた。前記４６個の標本のうち腫瘍化グループ（tumorigenic group、ｎ＝３６）及び非腫瘍化グループ（nontumorigenic group、ｎ＝１０）間で異なるように発現する遺伝子（１．５倍以上の差異点）を糾明した。
腫瘍化の特徴は、それぞれ異なるように発現する遺伝子で構成して、それぞれをこれと関連した亜型及びｌｏｇ２−倍変化に対する値を表示した。この特徴は、近接模型予測モジュール（Nearest Template Prediction Module in GenePattern）に入力した。また、ＲＥＭＢＲＡＮＤＴまたはＧＣＴ形式のＴＣＧＡデータセットをモジュールに入力した。前記モジュールは、各データセットに対する標本の分類と共にファイルで出力されて加工処理した。
生存率分析（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ  ｐｌｏｔとｌｏｇ−ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ）は、Ｒ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｐａｃｋａｇｅを用いて行った。前突然変異分析で、本来の亜型の大きさは維持しながら、膠芽腫患者を腫瘍化及び非腫瘍化亜型グループに無作為的に再グループ化した。「対照群（control）」の特徴は、予後の予測のためのＲＥＭＢＲＡＮＤＴデータセットから得て適用した。混ざらなかったデータセット（Ｐ＝０．００００４６）の本来のＰ値より小さい、結果として導き出された５００ｐ値（ｌｏｇ−ｒａｎｋ  ｔｅｓｔから得られた）の部分を前突然変異分析のｐ値と決めた。
【００７２】
≪実施例８：経路分析≫
（１）生体内癌化関連経路の発掘
ＧＳＥＡ−Ｐプログラムを用いて４６個の内部基礎分析された膠芽腫標本の経路分析を行った。前記分析では、ＭＳｉｇＤＢ  ｖ３．０の遺伝子セット、特に三つの主要な経路データベースであるＫＥＧＧ、ＲＥＡＣＴＯＭＥ及びＢＩＯＣＡＲＴＡから由来した遺伝子セットを分析に用いた。遺伝子は、Ｚスコア（Ｔ−ｔｅｓｔのＴスコアで調節）により定量化された遺伝子発現差程度を利用して順位を付けて加重値を与えた。
前突然変異型変数の場合、代替オプション（遺伝子セット）をデフォルトオプション（表現型）の代わりに用いた。このような代替オプションは、より寛大なｐ値を示す傾向がある。しかし、デフォルトセッティングは、標本の数が少ない場合には過度に保守的な意味の評価をあげて、代替セッティングで有意的な切断値を通過する経路の多くは、ＲＥＭＢＲＡＮＤＴデータセットの患者生存率と関連して予想された傾向を示すためである。
【００７３】
（２）遺伝子発現データセットから経路活性化の定量
ＲＥＭＢＲＡＮＤＴデータセットから、発現値は、一般化された−遺伝子」で示した。すなわち、各遺伝子に対して各サンプルのログ発現値をすべてのサンプルの遺伝子の平均ログ発現値と相殺させた。与えられたサンプルの与えられた経路の活性を算出するために、各経路遺伝子の相対的な発現値をすべての遺伝子の相対的な発現値と比較した。ＫＳスコア（Ｐｙｔｈｏｎ  Ｓｔａｔｓ  ｐａｃｋａｇｅ）は、比較のために用いた。この時、点数は−１と１の間で決めて、与えられたサンプルのすべての遺伝子と比較して、値が０より大きければ、経路遺伝子は上向き調節されたのを示して、値が０より小さければ経路遺伝子は下向き調節されたのを示す。
Ｒ生存パッケージ（R survival package）は、（１）与えられた経路を上向きまたは下向き調節するサンプルの患者生存程度を計画して、（２）二つのグループ間の生存率の差に対する統計学的意味の評価、及び（３）全体生存率（ＯＳ、ｃｏｘ比例危険模型によって算定された値）のためのＫＳ  ｓｃｏｒｅ（経路活性化値）の危険比率を計算するために用いた。
【００７４】
≪実験例１：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養及び正位的異種移植腫瘍モデル≫
図１に示したように、５９人の患者から７１個の標本を収集した（１１人の患者から原発性及び再発性癌を共に持つ標本取得；１人の患者から原発性癌がない二つの再発性癌標本取得）。
これから正位的異種移植腫瘍モデルを製造するために、前記実施例２に記載したとおり、それぞれの標本から膠芽腫（ＧＢＭ）を単一細胞に分離して、患者から標本を分離して１２時間が経過する前に、これを免疫が欠乏したＮＯＤ／ＳＣＩＤ  Ｉｌ２ｒｇ−／−（ＮＯＧ）マウスの脳に正位的移植を行った。
【００７５】
これと同時に、新鮮に分離されたＧＢＭ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ成長速度（growth kinetics）をＥＧＦとｂＦＧＦを含む無血清培地（serum free media）で培養して決めた。ニューロスフェア（neurosphere）のような増殖性細胞成長（clonogenic growth）は、ＧＢＭ幹細胞の自己複製（self renewal）に対するｉｎ  ｖｉｖｏ指標子であるため、ＧＢＭのｉｎ  ｖｉｔｒｏ成長に対する判読情報として、（径５０μｍ以上の）球形形成能を用いた。ｉｎ  ｖｉｖｏ癌形成能（tumorigenicity）は、腫瘍細胞注入後１２ヶ月内に腫瘍の形成の有無で決めた。但し、利用可能な細胞数が制限されていたので、ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍形成能に対しては一つの標本を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ球形形成能に対しては２１個の標本を実験できなかった（図１）。
【００７６】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍形成実験及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ短期培養を行いながら、本発明者等はこの二つの実験間の相関関係を決めた。ｉｎ  ｖｉｖｏ異種移植腫瘍形成は７０個の標本のうち５３個の場合（７５．７％）で組織病理学的に確認し、活発なｉｎ  ｖｉｔｒｏ球形形成及び持続的な成長を維持する場合は、５０個のサンプルのうち３４個のケース（６８．０％）で確認された（図１及び図２Ａ）。
前記のような結果は、ｉｎ  ｖｉｖｏ異種移植腫瘍とｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養との間に肯定的な関係があることを示す結果である。
【００７７】
≪実験例２：形態学的と病理学的類似点確認≫
本発明で製造した膠芽腫異種移植マウスが、母体癌の形態学的及び病理学的特徴を正確に反映するならば、本発明のマウスはｉｎ  ｓｉｔｕヒトＧＢＭに対するモデルシステムとして有用に用いられることから、下記では母体癌と異種移植腫瘍との間の形態学的及び病理学的類似性を、転移性（invasiveness）、増殖指標（proliferation index）及び血管強度（vessel intensity）の三つの観点で比較した。
【００７８】
（１）転移性（図３Ａ及び図４）の場合、各母体腫瘍の場合、ＲＡＮＯ（response assessment in neuro-oncology）基準に従って、ＭＲＩ  Ｔ２／ＦＬＡＩＲイメージを用いて分析して、転移性に対する数値は、癌の径と転移距離を互いに比較して決めた（図１）。興味深いことに、患者ＭＲＩ及び異種移植腫瘍の転移度を比較した時、母体癌の転移程度とこれに対応する異種移植腫瘍との間の転移度は非常に密接な関連性を示した（ｎ＝４２、Ｃｈｉ−Ｓｑｕａｒｅ  ｔｅｓｔ、２３  Ｐ＝０．０２９）。
（２）増殖指標（図３Ｂ）の場合、異種移植腫瘍の増殖指標とこれらの母体癌の増殖指標は、互いに非常に関連性が高い結果を示した（ｎ＝５３、Ｐｅａｒｓｏｎ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ、Ｐ＜０．００１）。
（３）微細血管強度（図３Ｃ）の場合、異種移植腫瘍のＣＤ３１−陽性微細血管密度は、それの母体血管の微細血管密度と密接な関連性を示した（ｎ＝５３、Ｐｅａｒｓｏｎ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ、Ｐ＜０．００１）。
前記のような結果は、本発明の方法で製造した膠芽腫異種移植マウスモデルが、母体癌の形態学的及び病理学的状態を十分に反映することを後押しするもので、前記マウスモデルを患者オーダーメード型薬物のスクリーニング、臨床第２相に入る前に薬物を患者に直接適用する前に効能及び副作用などを試験などに利用する可能性があることを示唆する結果である。
【００７９】
≪実験例３：ゲノムの類似性（genomic similarity）≫
母体癌とそれから由来した異種移植マウスモデルとの間の類似性をさらに検討するために、遺伝子分析を行った。
まず、各膠芽腫異種移植が特定患者に由来したことを確認するために、短鎖縦列反復配列（ＳＴＲ）遺伝子型分析を行って、各母体の癌から特異的に由来したことを確認した（図５Ａ）。
また、ａＣＧＨ及び遺伝的突然変異分析を行って、母体膠芽腫で発見された、コピー数差及び遺伝的突然変異を含む遺伝的変形がこれに対応する異種移植腫瘍でも一致するか否かを確認して、その結果これらのすべてが完全に一致することを確認した（図５Ｂ及びＣ）。
【００８０】
最近、巨大遺伝子分析研究で膠芽腫の特定遺伝子発現特徴に基づいて、これらを四つの小グループ（前神経系、神経系、一般系及び中肝葉系（mesenchymal））に分類できることが知られているので（Cancer Genome Atlas Research Network, 2008 Nature 455, 1061-1068., Phillips et al., 2006 Cancer Cell 9, 157-173., Verhaak et al., 2010 Cancer Cell 17, 98-110.）、本発明のライブラリーがこのようなすべての小グループをカバーできるのか、また、母体癌の遺伝子発現特性が正位的異種移植腫瘍でも維持されるのか否かを確認するために、グローバル遺伝子発現プロファイル分析を行った。
【００８１】
具体的に、本発明者等は５８人の膠芽腫患者手術標本のマイクロアレイ（microarray）遺伝子発現結果が有用であるか否かについて分析した（図１）。また、母体癌とそれから作られた異種移植癌を含む組織マイクロアレイ（tissue microarray、ＴＭＡ）を行った。亜型を決めるために、亜型の単一サンプルに基づいた決定のための近接模型予測アルゴリズム（Nearest Template Prediction algorithm（Ｈｏｓｈｉｄａ、２０１０））を用いた。これはデータセットで、１８個の前神経系、６個の神経系、１３個の一般系、そして１９個の中肝葉界膠芽腫を糾明した（２個は決定されていない；図１及び図５Ｄ）。
【００８２】
組織マイクロアレイの部分では、明らかな膠芽腫亜型マーカーであるＤＬＬ３、ＳＯＸ及びＯｌｉｇ２（前神経系）、ＭＢＰ（神経系）、ＰＤＧＦＡ及びＥＧＦＲ２５（前神経系）、ＣＨＩ３Ｌ１、ＭＡＰ２及びＴＯＰ２Ａ（幹細胞系）に対して免疫組織化学的分析を連続的に行った。
その結果、遺伝子発現分析で糾明された亜型を持つ母体ＧＢＭ標本及びこれに対応する異種移植腫瘍共に、それに対応する亜型マーカータンパク質が優先的に検出されることを確認した（図５Ｅ）。
【００８３】
前記のような結果は、母体癌及びそれの正位的異種移植マウスモデルが遺伝的に類似性を持っていることを示唆する結果である。
【００８４】
≪実験例４：機能的な関連性研究≫
前記実験例１〜４では、母体癌及びそれの正位的異種移植マウスモデルの遺伝的、形態的及び生理学的特性の類似性を確認して、さらには本発明者等は、膠芽腫標準治療に対する患者の特異的な反応が本発明の正位的異種移植膠芽腫マウスモデルでも繰り返されるのか確認して機能的関連性を糾明しようとした。
【００８５】
（１）放射線治療（radiation therapy）
放射線治療に対する機能的関連性を確認するために、本発明者等は、原発性腫瘍節制手術以後放射線治療を受けた５人の患者（本発明の患者ライブラリーから４人の患者、最近発表された研究で１人の患者［‘８２７'、週当りＰＦＳ＝１２８（Son et al., 2009 Cell Stem Cell 4, 440-452.）］）を無作為で選定し、異種移植マウス腫瘍に対して、ｉｎ  ｖｉｖｏ脳全体に対する放射線照射（毎日２Ｇｙずつ５日間）を行った。ＰＣ−ＮＳ０７−４４８、ＰＣ−ＮＳ０７−４６４、ＰＣ−ＮＳ０８−５７８、ＰＣ−ＮＳ０９−７８０及び８２７患者に対する腫瘍が移植されたマウスの生存率を放射線治療によりそれぞれ異なって増加して、その値は、それぞれ２１．９±７．１％、４９．８±１４．１％、４５．９±８．６％、２３．３±１９．５％及び４５．０±５．９％であった（図６Ａ及び図７Ａ）。
【００８６】
この時、生存率の増加は、母体癌のＰＦＳと肯定的な関連性を示した（図６Ａ）。具体的に、短いＰＦＳを持つ母体癌ＰＣ−ＮＳ０７−４４８及びＰＣ−ＮＳ０９−７８０患者から由来した膠芽腫異種移植マウスの場合、放射線治療による成長率増加が長いＰＦＳを持つ他の膠芽腫に比べて顕著に低い結果を示した（図６Ａ）。このような結果から、母体膠芽腫の放射線反応を本発明の異種移植マウスモデルを利用して予測できることが分かった。
さらに、放射線治療に対するそれぞれ異なる反応を示したことに対する臨床的意味をより一層糾明するために、放射線抵抗性ＰＣ−ＮＳ０７−４４８（「４４８」）及び放射線敏感性ＰＣ−ＮＳ０７−４６４（「４６４」）異種移植腫瘍の放射線治療後、遺伝子発現の変化を互いに比較して「放射線処理後反応（Radio-Response、ＲＲ）」特徴を推論して、その結果を下記の表４及び図７Ｂに示した。
【００８７】
【表４】
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【００８８】
前記遺伝子発現に基づいて、ＲＥＭＢＲＡＮＤＴデータセット（ｎ＝４６３、Madhavan et al., 2009 Mol. Cancer Res. 7, 157-167）の悪性脳腫瘍を４８８−類似グループ（ｎ＝２６７）と４６４−類似グループ（ｎ＝１９６）に分けた（図７Ｂ）。標本を２１９個の４期膠芽腫に制限した時、１７４膠芽腫及び４５膠芽腫サンプルが４４８−類似グループ及び４６４−類似グループにそれぞれクラスターされた。前記４４８−類似神経膠腫及び膠芽腫皆は４６４−類似グループに比べて非常に悪い臨床的結果を示した（図７Ｂ）。このような結果を基に、ＲＲ特性は、臨床的関連性を持つことを確認した。
【００８９】
（２）化学的治療法（chemotherapy）
膠芽腫患者は、ＭＧＭＴ遺伝子プロモーターのメチル化状態により、ＴＭＺに基づいた化学的治療法に対しそれぞれ異なる反応を示すと知られているので、本発明の異種移植マウスモデルでもそれぞれ異なる反応が再現されるか否かを確認した。
臨床的観察に対する同意とともに、ＭＧＭＴ−非メチル化されたＰＣ−ＮＳ０９−５５９患者由来異種移植マウスのＯＳ（５５．７±３８．６％、Ｐ＜０．００１、図６Ｂ）に比べて、ＭＧＭＴ−メチル化されたＰＣ−ＮＳ０７−４６４患者由来の異種移植マウスのＯＳを延長させた結果（１４８．５±４５．４％、図６Ｂ）を示した。これは臨床的結果とも一致した。
【００９０】
（３）標的治療法（Targeted Therapy）
膠芽腫の過多血管形成特徴に照らして、膠芽腫の治療においてＶＥＧＦ−中和抗体、ベバシズマブ（bevacizumab）のような治療剤を利用した抗−新生血管生成治療法が有用に用いられると提案されたことがある。しかし、前記のような抗−新生血管生成治療法の場合、Ｕ８７ＭＧのような代表的な膠芽腫細胞株を用いた動物モデルでは、治療効果を見せる反面、基準治療対照群（standard treatment control）のＯＳと比較時、膠芽腫患者のＯＳを延長させることはできなかった。そこで、本発明者等は、ベバシズマブの抗腫瘍活性を確認して、その結果を図６に示した。
【００９１】
その結果、ＰＣ−ＮＳ０７−４４８、ＰＣ−ＮＳ０７−４６４、ＰＣ−ＮＳ０８−５５９またはＰＣ−ＮＳ０９−７４８の異種移植マウスの生存率は、ベバシズマブの処理でも好転しない結果を示した（図６Ｃ）。また、ＯＳは好転しなかったが、前記ベバシズマブを処理した異種移植腫瘍はより一層転移性が増加する結果を示した（図６Ｃ）。このような形態学的変化は、ベバシズマブを処理したヒト膠芽腫でも観察されて、膠芽腫手術標本から由来した異種移植腫瘍を臨床結果の予測に使用できることを提示した。
【００９２】
≪実験例５：ｉｎ  ｖｉｖｏ癌化可能性の遺伝的な特徴≫
前記のような結果は、初代培養された膠芽腫細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ癌化可能性はこれに対応する患者の臨床的攻撃度と関連性があることを示すので、本発明者等は、癌化された膠芽腫（ｎ＝３６、図１）及び癌化されなかった膠芽腫（ｎ＝１０）間にそれぞれ異なるように発現する７０９個の遺伝子（１．５倍以上の発現差）の構成的特徴を「癌化」と定義した（図８Ａ）。
【００９３】
このような構成的特徴を立証するために、これを二つの非依存的な膠芽腫遺伝子発現分析データセット、すなわちＴＣＧＡとＲＥＭＢＲＡＮＤＴに適用した。近接模型予測アルゴリズムは、各膠芽腫患者を二つのグループ、すなわち癌化属性と陽性的に関連しているか、陰性的に関連しているかに対する予測を可能にした。
【００９４】
その結果、各グループ間の患者生存率を比較した時、ＲＥＭＢＲＡＮＤＴデータセット（ｐ＜０．０００１、ｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ）に対して陽性グループの場合には陰性グループに比べて生存率をはるかに低い結果を示した（図８Ｂ）。
また、前突然変異分析は、このような激しい生存率に対する分離現象が偶然には起きないことを示しており（Ｐ＝０．００４）、前記癌化特徴に対する有効性を示した（図９Ａ）。このような統計的に有意な傾向は、ＴＣＧＡデータセットでも観察された（ｐ＝０．０１９）。
【００９５】
互いに異なる癌化可能性及び臨床的深刻性に対する生物学的な基盤を理解するために、ＧＳＥＡ（Gene Set Enrichment Analysis; Clark and Ma'ayan, 2011 Sci. Signal. 4, tr4, Subramanian et al., 2005 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 15545-15550）を用いて経路分析を行った。
【００９６】
その結果、ｉｎ  ｖｉｖｏ癌化可能性を持つ膠芽腫の場合、細胞周期、テロメア維持、転写、Ｎｏｔｃｈ信号伝達、またはＷｎｔ信号伝達関連経路は、上向き調節（upregulation）されている、一方神経系または免疫機能関連経路は、下向き調節（downregulation）されていることを確認した。
【００９７】
万一、これらの経路が膠芽腫の臨床悪性度に及ぼすならば、前記経路の活性を患者の生存率予測に使用できるはずだから、これを基に遺伝子発現プロフィールに基づいた各患者の経路活性化を算出する方法を創案した。具体的に、経路活性化は、−１〜１の間び値で定義しており、０より値が大きければ、上向き調節、０より値が小さければ下向き調節されたものと定義した。仮に、ＰＩＴＸ２経路（ＰＩＴＸ２は、転写因子、ＷＮＴの下向き調節作用）の経路活性化をＲＥＭＢＲＡＮＤＴデータセットの各患者に対して計算した時、前記経路を上向き調節したのは、低い生存率を示す場合に対応する結果を示した（Ｐ＝０．００２、ｌｏｇ−ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ、図８Ｃ）。
【００９８】
また、Ｃｏｘ比例危険模型（Cox proportional hazard regression）では、前記経路の高い活性は患者の良くない生存率と高い関連性を示すことを確認した（Ｐ＝０．００７、ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ  Ｗａｌｄ  ｔｅｓｔ、図８Ｄ）。ＢＩＯＣＡＲＴＡ（図８Ｄ）、ＫＥＧＧ（図９Ｂ）及びＲＥＡＣＴＯＭＥ（図９Ｃ）データベースの五つの高い上向き調節及び下向き調節経路に拡張して分析して、その結果、ｉｎ  ｖｉｖｏ癌化可能性を持つ膠芽腫で高く上向きまたは下向き調節された経路と患者の良くない、あるいは良い患者生存率と関係があると観察された（Ｐ＜０．０５全ての三つのデータベースから、ＫＳ  ｔｅｓｔ）。
【００９９】
追加的に、本発明のデータセットで、マウス脳で浸潤性腫瘍（ｎ＝２９）を見せる膠芽腫は、非浸潤性膠芽腫（ｎ＝１３）または腫瘍を形成しないケース（ｎ＝１６）と比較した時、顕著に悪い臨床的結果を示したので、転移性を見せるグループがより悪化した膠芽腫に属するか否かを確認した。そこで、２９個の「転移性（invasive）」グループと１３個の「非転移性（demarcated）」グループの遺伝子発現を比較した。
その結果、７７７個の互いに異なる発現を示す遺伝子（１．５倍以上変化）が「転移性」特徴を持つことが確認された（図１０）。このような特徴を証明するために、脳腫瘍データのための報告（ＲＥＭＢＲＡＮＤＴ）データセットを用いた。患者生存時間を二つのグループ間で比較した時、転移性グループは、非転移性グループに比べて生存率が顕著に低い結果を示して（ｐ＝０．０２７、ｌｏｇ−ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ、図１０Ｂ）、これは転移性特徴の臨床的関連の可能性を提示した。
【０１００】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須特徴を変更することなく他の具体的な形態で実施可能であることが理解できるはずである。これと関連して、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものとして理解しなければならない。本発明の範囲は、前記詳細な説明よりは、後述する特許請求範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導出されるいずれの変更または変形された形態が、本発明の範囲に含まれると解釈されなければならない。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明により製造された膠芽腫マウスモデルは、膠芽腫患者と同じ形態学的及び遺伝学的特性を示す膠芽腫を発病するところ、より安全でかつ効果的な患者オーダーメード型膠芽腫治療剤の発掘に活用できる有用である。具体的に、本発明に係るマウスモデルを利用すると、候補治療剤に対する患者の反応、薬効、副作用程度を予め予測できて、患者オーダーメード型治療剤を効果的に選別することができる。また、前記患者オーダーメード型膠芽腫動物モデルは、臨床試験結果を予め予測する前臨床仲介研究に用いられ、特に臨床第１相後臨床第２相前に前記モデルを利用して、患者を選別して薬効を予め予測できる臨床１．５相の研究材料として活用されるはずである。
【図１】
0006026653.tif 000006
【図２Ａ】
0006026653.tif 000007
【図２Ｂ】
0006026653.tif 000008
【図２Ｃ】
0006026653.tif 000009
【図３Ａ】
0006026653.tif 000010
【図３Ｂ】
0006026653.tif 000011
【図３Ｃ】
0006026653.tif 000012
【図４】
0006026653.tif 000013
【図５Ａ】
0006026653.tif 000014
【図５Ｂ】
0006026653.tif 000015
【図５Ｃ】
0006026653.tif 000016
【図５Ｄ】
0006026653.tif 000017
【図５Ｅ】
0006026653.tif 000018
【図６Ａ】
0006026653.tif 000019
【図６Ｂ】
0006026653.tif 000020
【図６Ｃ】
0006026653.tif 000021
【図７Ａ】
0006026653.tif 000022
【図７Ｂ】
0006026653.tif 000023
【図８Ａ】
0006026653.tif 000024
【図８Ｂ】
0006026653.tif 000025
【図８Ｃ】
0006026653.tif 000026
【図８Ｄ】
0006026653.tif 000027
【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
0006026653.tif 000029
【図９Ｃ】
0006026653.tif 000030
【図１０Ａ】
0006026653.tif 000031
【図１０Ｂ】
0006026653.tif 000032
【配列表】
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