(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蒸気相の過酢酸流を形成するため、約３５００ｐｐｍ〜約１０，０００ｐｐｍの濃度の過酢酸溶液を加熱ガス流に添加する工程と、
前記蒸気相の過酢酸流により表面を処理する工程であって、過酢酸が約５７〜約７５℃において気体状であり、蒸気の飽和度が約８５％未満である工程と、を含む、
表面滅菌方法。
【請求項２】
前記表面がプラスチックで構成されている、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記表面がポリエチレンテレフタレートである、
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記処理が過酸化水素開始剤の非存在下で実施される、
請求項１に記載の方法。
【請求項５】
過酢酸の濃度が少なくとも約３７５０ｐｐｍである、
請求項１に記載の方法。
【請求項６】
過酢酸の濃度が約３７５０〜約４２５０ｐｐｍである、
請求項１に記載の方法。
【請求項７】
蒸気の飽和度が約７５〜約８５％である、
請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、約５７〜約７５℃において少なくとも約３５００ｐｐｍの濃度で過酢酸を含有する蒸気により表面を処理する工程を含む、表面滅菌方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）等の成形用プラスチックで構成されているプラスチックボトルの使用は、過去数十年の間に大きく拡大してきた。このようなプラスチックボトルは、ほとんど壊れることがなく、重さはガラスのわずか１０分の１程度であり、透明性に優れ、ボトルの内容物に味を付与することがないため、今日の社会に定着している。無菌充填されるあらゆる容器と同様、プラスチックボトルは、無菌充填および貯蔵寿命要件を実現するため、機能的に滅菌され、バクテリア（例えば、ボツリヌス菌（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ））またはカビ等の微量の汚染物質を充填前に除去しなければならない。一般に、容器は、予め製造されて使用される直前までまとめて保管されるため、通常の保管条件下では汚染され易い。プラスチック容器の中には、プラスチック・チューブまたはプラグとして保管され、充填機に入れられる前に熱風でブロー成形されるものもあるが、プラスチックボトルは融解温度が低いため、このブロー成形工程の間に必ずしも内面が滅菌される訳ではなく、追加処理が必要となる。プラスチックボトルは、充填前に無菌状態となるようにガラスまたは金属の容器に対して施すことができるようなより厳しい処理（時間および温度）には耐えられないという、固有の難題がある。したがって、プラスチックボトルは、消耗品を充填される前に、病原微生物に汚染されるリスクが最小限に抑えられていることを保証するために、滅菌されることが不可欠である。消費者の需要を満たすために莫大な数のこのようなプラスチックボトルが必要とされるため、こうした滅菌が、効果を損なわずに迅速に成されることが望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
過酢酸（ペルオキシ酢酸ともいう）「ＰＡＡ」は、滅菌剤として知られる一方、先行技術によれば、ＰＡＡの水性製剤はＰＥＴ製の容器の急速滅菌には適さないことが示されている。そのため、米国特許第６，７９０，３８０号明細書の開示によれば、有害なバクテリアの形成を防ぐため、滅菌剤の温度もしくは濃度を上げるか、または処理時間を延ばすことが必要となる。しかしながら、この公報によれば、それらの選択肢は、ＰＡＡ水溶液を用いたＰＥＴの滅菌にはどれも望ましくない。ＰＡＡ溶液を加熱すると、ＰＥＴボトルを変形させる傾向があり、一方、濃度を上げると、過酸化水素および／または酢酸の残留物が望ましくないほどに増加する。処理時間の延長は、処理過程の進行を大幅に遅らせるため望ましくない。
【０００４】
米国特許第６，５３６，１８８号明細書および同第６，９４５，０１３号明細書には、霧状の過酸化水素を用いてＰＥＴボトルの内部を殺菌することが開示されている。さらにこれらの公報によれば、オキソニア（１５〜４０重量％の過酸化水素、７〜１３重量％の酢酸、および５〜１０重量％のＰＡＡを含有する混合物）を使用することもできる。しかしながら、さらにこれらの公報によれば、この殺菌剤をまず活性化した後、複数の乾燥ステーションを用いて除去することが必要となる。
【０００５】
米国特許出願公開第２０１０／０１９６１９７号明細書には、希釈ＰＡＡ溶液の真の蒸気（浮遊液体粒子を含む霧とは対照的なものとして）を用いて表面を滅菌することが開示されている。しかしながら、この公報によれば、この蒸気は、約８０〜約１２０℃の温度で接触時間を約１５〜４０分間として使用するものである。ＰＥＴのガラス転移温度は約７５℃であるため、これより高温ではＰＥＴボトルが変形する可能性があることに注意しなければならない。さらに、このような長い接触時間では、多数のボトルを急速滅菌することはできない。
【０００６】
したがって、滅菌剤としてＰＡＡを用いてＰＥＴボトルを急速滅菌する方法が開発されれば望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、約５７〜約７５℃において少なくとも約３５００ｐｐｍの濃度で過酢酸を含有する蒸気により表面を処理する工程を含む、表面滅菌方法に関する。
この方法は、過酸化水素開始剤の非存在下で実施されるのが好ましく、特にポリエチレンテレフタレートボトルの滅菌に適している。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、約５７〜約７５℃において少なくとも約３５００ｐｐｍの濃度である過酢酸を含有する蒸気により表面を処理する工程を含む、表面滅菌方法に関する。
【０００９】
蒸気という用語は、本明細書で使用する際、過酢酸が実質的に完全に気体である状態を意味するものとする。これは霧（ｍｉｓｔ）や濃霧（ｆｏｇ）とは対照を成し、霧や濃霧は空気中に浮遊している液滴をかなりの割合で含む
【００１０】
過酢酸は、典型的には、酢酸、過酸化水素、および過酢酸の含水平衡混合物の形で使用され、これらの成分の重量比はおよそ３５：１０：１５である。この組成物は、鉱酸触媒（硫酸、硝酸、またはリン酸）、界面活性剤（アニオン性ラウリレート、ソルビタン、およびこれらそれぞれのエステル、即ちポリエチレンソルビタンモノラウリレート等）、および混合過酸溶液を形成する短鎖（C３−C１２）脂肪酸エステル等の他の成分と同様に、典型的には、ホスホン酸またはホスホン酸塩等の安定剤、即ちデイクエスト（Ｄｅｑｕｅｓｔ、登録商標）２０１０、またはジピコリン酸等の金属イオン封鎖剤をさらに含有していてもよい。
【００１１】
本発明の方法は、過酸化水素活性剤（紫外線等）の非存在下で実施されるのが好ましい。このような活性剤が使用された場合、蒸気相のＰＡＡの活性が低下することが偶然判明しためである。
【００１２】
ペルオキシ酢酸は、加熱ガス流に導入される前に、少なくとも約３，５００百万分率（ｐｐｍ）の濃度まで水を加えて希釈されることが好ましい。ＰＡＡの濃度は、より高い濃度であってもよいが、処理表面上に残る可能性がある過酸化物または酢酸の残留物の量を減らすため、好ましくは約１０，０００ｐｐｍ未満、より好ましくは約８，０００ｐｐｍ未満である。最も好ましいのは、ＰＡＡが約３，７５０〜４，２５０ｐｐｍの濃度まで希釈されることである。
【００１３】
加熱ガス流は、典型的には無菌の空気であるが、窒素、ＣＯ２、または不活性希ガスキャリア等の他のガスを使用してもよい。このガス流は、典型的には少なくとも約３００℃の温度まで、好ましくは最低温度が約２５０℃となるまで加熱され、使用に際して十分に冷却できるのであれば３５０℃を超えていてもよい。熱風は、周囲温度の滅菌溶液を添加して急速気化させることにより、所望の温度まで冷却される。確実に過酢酸を蒸気の状態で使用するために、ＰＡＡ溶液は、加熱ガス流に対して、加熱ガス流の飽和度が確実に１００％未満となるような割合で添加されるのが好ましい。好ましくは、ＰＡＡは、加熱ガス流の飽和度が約７５〜約８５％となるような割合で添加される。飽和度を約８０％にするには、気流流量が約３０リットル／分の加熱ガス流に対して、ＰＡＡ溶液をおよそ５ｍｌ／分（約１滴／秒に相当）の割合で添加すればよい。
【００１４】
蒸気相のＰＡＡ気流の温度は、約５７〜約７５℃まで低下し、その後ガス流は、懸念される汚染物質を殺菌するのに十分な時間の間、被滅菌物に接触する。この時間は、使用する過酢酸蒸気の濃度、被滅菌物の表面の性質、滅菌される特定の汚染物質、滅菌される汚染物質の濃度等の変数によって異なる。しかしながら、接触時間が５秒程度と少なくても、試験表面を効果的に滅菌するのに十分であることが判明している。
【００１５】
本発明の方法は、ＰＥＴ製のボトルやその他の容器の滅菌に特に適している。しかしながら、金属、ガラス、プラスチック、ポリマー、およびエラストマーをはじめとする多種多様なその他の物質を、本発明の方法を用いて滅菌してもよい。
【００１６】
本願の方法は、典型的には液体の過酢酸で防除されるバクテリアで汚染された物質を滅菌するのに用いることができる。これらに含まれるものとして、バクテリア、真菌、およびウイルスのより典型的な種属、ならびに多くの場合ＰＡＡで防除される原生動物、例えば（但し、これらに限定されるものではないが）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、キャンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、インフルエンザ（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）等だけではなく、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属のバクテリアおよび芽胞（ボツリヌス菌（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）等のより病原性が高い種（型）の代用として、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）およびバチルス・アトロフェーアス（Ｂ．ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）を用いる）がある。
【００１７】
以下の実施例を提示して本発明の方法をさらに詳しく説明するが、いかなる形であっても本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００１８】
実施例１
蒸発装置の作製
様々な温度および濃度における蒸気滅菌剤を調製するために、以下の蒸発装置が作製された。直径１／２インチのステンレス鋼管は、１００ｐｓｉｇの圧縮空気供給機に接続された。管は、（気流を調整するための）ステンレス鋼製ニードル弁に接続され、この弁は、キング・モデル７９１０シリーズ  ガラス管ロータメータ（０−４０標準リットル／分）風量計に接続された。風量計は、（過酢酸溶液の沸点を優に上回る）３００°Ｆまで空気を加熱する機能を備えた電熱器に接続され、この電熱器は、蒸発ボックスに接続された。これは、ステンレス鋼製容器であり、過酢酸溶液の導入および蒸発を観察するためのガラス窓を上部に有する。蒸発ボックスは、熱損失を最小限にするために５つの面で断熱された。蒸発ボックスの底部は、バイオメガ・リサーチ・プロダクツ社の実験用加熱板の上に設置された。この加熱板は、ＰＡＡ溶液の沸点を優に上回る温度まで蒸発ボックスの底部を加熱することが可能である。
【００１９】
ステンレス鋼製１／２インチ空気管の別の分岐管は、装置内で試験される様々なＰＡＡ水溶液またはその他の滅菌溶液を入れた目盛り付きシリンダーを加圧するのに使用された。目盛り付きシリンダーは、管を通る溶液の流れを調整するニードル弁を有するステンレス鋼製１／４インチ管に接続された。この管は、蒸発ボックスの上部に接続され、それにより管から流れ出る滅菌溶液の液滴が蒸発ボックスの加熱された底部に直接落ちるようになり、十分な熱が加えられるため、溶液はフラッシュ蒸発して熱気流になる。プラチナ製熱電対線（熱蒸気流の温度を測定し調整するのに使用される）が挿入された断熱ステンレス鋼製１／２インチ管は、滅菌蒸気流を試験装置へ送る吹き出し口として機能した。
【００２０】
以下に記載する試験の間、熱風の気流流量は、キング・ロータメータを調節することで３０リットル／分に設定され、ニードル弁は、試験溶液が５ｍＬ／分（およそ１滴／秒）の流量で供給されるように調節され、飽和度が約８０％の熱蒸気流が生成された。電熱器の温度は、空気を３００°Ｆまで熱するように設定され、加熱板の温度は、放出される蒸気流が指定された所望の温度に達するまで調整された。
【００２１】
使用されたＰＡＡと水の希釈混合物の濃度は、ｐＨ変曲点の電位差滴定評価を採用しているメトローム８１４ＵＳＢサンプルプロセッサーを用いて測定され、構成液中のＰＡＡ含有量の測定に使用された。
【００２２】
容器の滅菌における蒸気相ＰＡＡの試験
飲料用ボトル中のバチルス・アトロフェーアスＡＴＣＣ９３７２に対する過酢酸蒸気（約６０℃、約５および１０秒間）の有効性評価
上記の蒸発装置は、Ｂ．アトロフェーアスＡＴＣＣ９３７２（飲料加工の検認試験において滅菌試験生物として通常用いられる芽胞形成バクテリア）の芽胞に対する過酢酸（ＰＡＡ）蒸気の有効性評価に使用された。ＰＥＴ水ボトルの底面は、調製バチルス・アトロフェーアス芽胞懸濁液を１０５芽胞／ボトルとなるように接種された。接種して乾燥したボトルは、クラリティー（Ｃｌａｒｉｔｙ、登録商標）過酢酸（ＦＭＣ社製）を適当に希釈して製造された様々な濃度のＰＡＡ溶液の蒸気に、約６０℃で５および１０秒間曝され、蒸気の放出時に５秒間の紫外線（過酸化水素活性剤）による処理が有りの場合と無しの場合が行われた。ボトルが計数され、好気性プレートカウント（「ＡＰＣ」）培地上に接種された。残りの培養液は、増殖確認のために以下に詳述するように培養された。
【００２３】
接種材料の調整
調製Ｂ．アトロフェーアス芽胞懸濁液は、プレスク・アイル・カルチャーズより購入した。溶液は、４０％エタノールを含有し、試験時まで実験用冷蔵庫に保管された。懸濁液は、１．３ｘ１０１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬの芽胞を含有していた。希釈液が４０％エタノールにより各試験用に調整され、ＰＡＡが４，３００ｐｐｍの試験では約１ｘ１０６芽胞／ｍＬ（目標値１ｘ１０４芽胞／ボトル）の芽胞を含有し、２０１４ｐｐｍおよび７９４７ｐｐｍの試験では約１ｘ１０７芽胞／ｍＬ（目標値１ｘ１０５芽胞／ボトル）の芽胞を含有し、試験における接種材料とされた。
【００２４】
ボトル担体の調整
市販のＰＥＴ水ボトル（０．５Ｌ．）は、内面を殺菌するため、空にされて無水エタノールでリンスされ、生物学的安全キャビネット内で一晩乾かされた。次に、ボトルは、１０μＬの適切な接種材料を内側の底面上に作業培地とともに接種された。その後、ボトルは生物学的安全キャビネット内で乾燥するまで一晩乾かされた。接種済みのボトルは、調整から１週間以内に試験に用いられた。
【００２５】
試験方法
接種済みのボトルは、蒸発装置に隣接したドラフトチャンバ内にある蒸気輸送管の末端上に設置され、ラボタイマーによる時間測定で約５および１０秒間の間、蒸気に曝された。蒸気輸送管から取り外された後すぐに、レセーン＋０．５％チオ硫酸ナトリウムを含有する５０ｍLの中和培養液が無菌法にてボトルに注がれた。側面上で液化したすべての蒸気が中和剤と確実に混合するように、ボトルは蓋をされて振られた。続いて、ボトルは５分間ソニケートされ、ボルテックスで３０秒間攪拌された後、バターフィールド緩衝液で希釈され、ＡＰＣ培地上に接種された。中和培養液入りのすべての試験ボトル、およびすべてのプレートは、予備測定前に３５±２℃で約２４時間培養され、最終測定のためにさらに数日〜２週間培養された。試験は１回だけ行われた。接種材料の対照群については、接種済みで未処理のボトルを上記のように計数して、２回実施された。培養が終了次第、ボトルは濁度により増殖を評価された。この試験の結果を以下の表１および２にまとめる。
【表１】
0006005662.tif 000002
【表２】
0006005662.tif 000003
【００２６】
上記の結果は、紫外線なしの状態で少なくとも４，３００ｐｐｍの濃度のＰＡＡを用いることで実質的に完全に滅菌されることが観察されたことを示している。紫外線が過酸化水素の活性剤として知られていることを考えると、これらの結果は驚くべきものである。
【００２７】
実施例２
残留試験
実施例１で説明した蒸発装置を用いて試験が行われ、滅菌されたボトルの表面上に残留した過酸化水素の量が測定された。ＰＥＴボトル（０．５Ｌ．）は、空にされ、純水で３回リンスされた後、約４，０００および１４，０００ｐｐｍの濃度のＰＡＡ蒸気に５秒間曝された。この処理の後、ボトルは純水で満たされ、水は低レベルの過酸化水素についてラモットＨＰ−４０滴定キットを用いて試験された。蒸気中に放出されたＰＡＡの量についても試験が行われた。このために、高範囲ＰＡＡ試験紙は予め純水で湿らされ、接種されていない代表ボトルに設置された。ボトルは蒸気に曝され、試験紙は蒸気中に存在するＰＡＡを示す色の変化について評価された。これらの試験の結果を以下の表３および４にまとめる。
【表３】
0006005662.tif 000004
【表４】
0006005662.tif 000005
【００２８】
上記の結果は、本発明の処理により、過剰量の過酸化水素を残留させることなく効果的にＰＥＴボトルを滅菌できることを示している。
【００２９】
実施例３
蒸気相のＰＡＡ濃度が２０００、３０００、および４０００ｐｐｍの時のバチルス・サブティリスの防除評価
実施例１で説明した装置および方法を用い、クラリティー（登録商標）過酢酸を純水で下記のように希釈して、ＰＡＡ濃度が２０００ｐｐｍ、３０００ｐｐｍ、および４０００ｐｐｍであるＰＡＡ溶液の蒸気が調整された。この試験は、接種済みボトルをＰＡＡ蒸気に約６０℃で５秒間曝し、５秒間の紫外線処理が有る場合と無い場合の処理に関するものだった。
【００３０】
接種材料の調整
調製Ｂ．サブティリス１９６５９芽胞懸濁液は、プレスク・アイル・カルチャーズより購入した。溶液は、４０％エタノールを含有し、試験時まで冷蔵庫に保管された。懸濁液は、１．６ｘ１０１０ＣＦＵ／ｍＬの芽胞を含有していた。希釈液が４０％エタノールにより各試験用に調整され、約１ｘ１０８芽胞／ｍＬ（目標値１ｘ１０６芽胞／ボトル）となるようにして、試験における接種材料とされた。
【００３１】
ボトル担体の調整
市販のＰＥＴ水ボトル（０．５Ｌ）は、空にされ、１０μＬの適切な接種材料を内側の底面上に作業培地とともに接種された。その後、ボトルは一晩乾かされた。
【００３２】
殺生物剤の調整
クラリティー（登録商標）過酢酸（ＦＭＣ社製）は、自動滴定装置を用いて滴定され、初期濃度が測定された。この初期濃度は、ＰＡＡの純水溶液のための希釈液を決定し、調整するのに用いられた。１１．８５ｇのクラリティー（登録商標）過酢酸と１Ｌの水から２０００ｐｐｍの溶液を、１７．７７ｇのクラリティー（登録商標）過酢酸と１Ｌの純水から３０００ｐｐｍの溶液を、そして２３．７０ｇのクラリティー（登録商標）過酢酸と１Ｌの純水から４０００ｐｐｍの溶液を得ることで、分取した殺生物剤が調整された。各溶液のうち少量は自動滴定装置での滴定用に取り置かれ、残りは蒸発装置のシリンダーに注がれた。この滴定の結果を表５に示す。
【表５】
0006005662.tif 000006
【００３３】
試験方法
実施例１で説明した装置および方法を用い、接種済みのボトルはＰＡＡ溶液の蒸気で処理された。蒸気輸送管から取り外された後すぐに、ボトルは５秒間保持されるか、または紫外線で５秒間処理された。この工程の後すぐに、レセーン＋０．５％チオ硫酸ナトリウムを含有する５０ｍLの中和培養液が無菌法にてボトルに注がれた。側面上で液化した蒸気が中和剤と確実に混合するように、ボトルは蓋をされて振られた。続いて、ボトルは５分間ソニケートされ、ボルテックスで３０秒間攪拌された後、バターフィールド緩衝液で希釈され、ＡＰＣ培地上に接種された。中和培養液入りのすべての試験ボトル、およびすべてのプレートは、予備測定前に３５±２℃で約２４〜７２時間培養され、最終測定のためにさらに数日〜２週間培養された。試験は２回行われた。接種材料の対照群についても、接種済みで未処理のボトルを上記のように計数して、２回実施された。培養が終了次第、ボトルは濁度により増殖を評価された。
【００３４】
計算
Ｌｏｇ１０減少＝平均Ｌｏｇ１０（対照群）−Ｌｏｇ１０（試験試料）
【００３５】
この試験の結果を以下の表６に示す。
【表６】
0006005662.tif 000007
【００３６】
上記の結果は、紫外線なしの状態で濃度４０００ｐｐｍのＰＡＡ蒸気を用いた場合に、完全な防除が観察されたことを示している。低濃度のＰＡＡで処理した場合は、実質的により不十分な防除が観察された。
【００３７】
実施例４
５秒間処理した飲料用ボトルにおけるバチルス・サブティリスＡＴＣＣ１９６５９に対し、約５０、５５、および６０℃において、４０００ｐｐｍのＰＡＡと比較した３５％過酸化水素蒸気の有効性評価
実施例１で説明した装置および方法を使用し（但し、以下の記載を除く）、Ｂ．サブティリス１９６５９の芽胞を用いて、５０、５５、および６０℃で５秒間暴露させた飲料用ＰＥＴボトルにおいて、４０００ｐｐｍの蒸気相過酢酸（ＰＡＡ）と比較した濃縮（約３５％）蒸気相過酸化水素の有効性を評価した
【００３８】
接種材料の調整
調製Ｂ．サブティリス１９６５９芽胞懸濁液は、プレスク・アイル・カルチャーズより購入した。溶液は、４０％エタノールを含有し、１．６ｘ１０１０ＣＦＵ／ｍＬの芽胞を含んでいた。約１ｘ１０８芽胞／ｍＬとなるように１：１００希釈液が４０％エタノールにより調整され、本実施例の作業接種材料とされた。
【００３９】
ボトル担体の調整
この試験では、市販の飲料用ＰＥＴボトル（０．５Ｌ）が使用された。ボトルは、１．６ｘ１０６芽胞／ボトルとなるように、１０μＬの芽胞接種材料を内側の底面上に作業培地とともに接種された。その後、ボトルは生物学的安全キャビネット内で一晩乾かされた。ボトルは、試験前に乾燥しているのが観察された。
【００４０】
殺生物剤の調整
ヴィゴロックス（ＶｉｇｏｒＯｘ、登録商標）ＳＰ−１５過酢酸（ＦＭＣ社製）は、自動滴定装置を用いて滴定され、初期濃度は１５．２９２９％であると測定された。この初期濃度は、４０００ｐｐｍのＰＡＡ純水溶液のための希釈液を決定し、調整するのに用いられた。比較として、デュロックス（Ｄｕｒｏｘ、登録商標）過酸化水素（過酸化水素３５．７％を含有、ＦＭＣ社製）の試料ボトルが用いられた。
【００４１】
試験方法
実施例１で説明した蒸発装置を用いて、指定温度の製剤が調整された。接種済みのボトルは、蒸気輸送管の末端上に設置され、ラボタイマーによる時間測定で約５秒間の間、蒸気に曝された。蒸気輸送管から取り外された後すぐに、レセーン＋０．５％チオ硫酸ナトリウムを含有する５０ｍLの中和培養液が無菌法にてボトルに注がれた。次に、分取した１００ｕＬずつのカタラーゼ（ワージントン・バイオケミカル、８５．５８３部／ｍｇＰおよび０．４８ｍｇＰ／ｍＬ）が、すべての残留過酸化水素を中和するために各ボトルに添加された。側面上で液化したすべての蒸気が中和剤と確実に混合するように、ボトルは蓋をされて振られた。ボトルは５分間ソニケートされ、ボルテックスで３０秒間攪拌された後、バターフィールド緩衝液で希釈され、ＡＰＣペトリフィルム培地上に接種された。中和培養液入りのすべての試験ボトル、およびすべてのプレートは、３５±２℃で約７２時間培養された後、培養器から取り出され、さらに２４時間室温に置かれた後、計数された。試験は２回行われた。接種材料の対照群についても、接種済みで未処理のボトルを上記のように計数して、２回実施された。
【００４２】
計算
Ｌｏｇ１０減少＝平均Ｌｏｇ１０（対照群）−Ｌｏｇ１０（試験試料）
【００４３】
この試験の結果を以下の表７にまとめる。
【表７】
0006005662.tif 000008
【００４４】
上記の結果は、本発明の方法によりＰＥＴボトルが実質的に完全に滅菌され、このような温度では過酸化水素を使用しても比較的効果がないことを示している。