(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で示される環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩。
【化１】
0005878302.tif 000011
［式（１）中、Ｒ１は置換基を有していてもよい炭素数が７、８又は９のアシル基を示し、Ｒ２はメチル基又は水素原子を示し、Ｒ３はエチル基又はメチル基を示す。］
【請求項２】
上記式（１）中のＲ１の置換基が水酸基である請求項１に記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩。
【請求項３】
上記式（１）中のＲ１が、３−ヒドロキシ−５−メチル−ヘキサノイル基、３−ヒドロキシ−６−メチル−ヘプタノイル基又は３−ヒドロキシ−７−メチル−オクタノイル基である請求項１に記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩。
【請求項４】
上記式（１）中のＲ１が３−ヒドロキシ−５−メチル−ヘキサノイル基であり、Ｒ２がメチル基であり、Ｒ３がエチル基である請求項１に記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩。
【請求項５】
上記式（１）中のＲ１が３−ヒドロキシ−７−メチル−オクタノイル基であり、Ｒ２がメチル基であり、Ｒ３がエチル基である請求項１に記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩。
【請求項６】
請求項１ないし請求項５の何れかの請求項に記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩の製造方法であって、該環状ペプチド化合物を産生する能力を有する、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属するＲＨ２１８０−５株、又は該環状ペプチド化合物を産生する能力を有するＲＨ２１８０−５株の変異株を培養し、その培養物から製造することを特徴とする環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩の製造方法。
【請求項７】
請求項１ないし請求項５の何れかの請求項に記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩を、製薬学的に許容し得る担体と共に含んでなる感染症治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な化学構造を有する化合物とその製造方法、及びその化合物を含有する感染症治療薬とその化合物を産生する新規微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗生物質は、感染症の治療に必要不可欠なものとなっている。しかしながら、抗生物質の過度の使用はそれに対する耐性菌を生み、その結果多くの薬剤に耐性を有する多剤耐性菌が出現し臨床上大きな問題となっている。特にメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（以下、「ＭＲＳＡ」と略記する）は、臨床現場での出現頻度が高く、社会的な問題に発展している。更に、ＭＲＳＡに対する最終的な治療薬として用いられることの多いバンコマイシンに対して耐性を有する腸球菌（バンコマイシン耐性腸球菌、以下、「ＶＲＥ」と略記する）も、本邦の臨床現場から分離されるようになり、多剤耐性菌に対する新たな治療薬の提供が切望されている。
【０００３】
そのような新たな治療薬として完全化学合成による合成抗生物質であるリネゾリドが知られている。また、各種の微生物の産生する抗生物質の中から、上記の多剤耐性菌に有効性を示す抗生物質を見出すための検討も多数行われている（特許文献１〜３）。これらのうち、特許文献１と２には、上記の多剤耐性菌に有効性を示す抗生物質を産生するリソバクター属に属する微生物とその微生物を用いた抗生物質の製造方法が記載されている。
【０００４】
一方、本発明者は、抗生物質の探索に有用に用いられる、カイコ（カイコガの幼虫）を実験動物とする「カイコ黄色ブドウ球菌感染モデル」（特許文献４）を構築し、その検討を進めていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第３３３９２３５号公報
【特許文献２】特許第４０５４５７６号公報
【特許文献３】特許第４０５７４２６号公報
【特許文献４】特開２００７−３２７９６４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記特許文献２と３には、ＭＲＳＡだけでなくＶＲＥに対しても有効性を示す抗生物質が記載されている。しかしながら、従来の報告例の多くは、特許文献１のようにＭＲＳＡに対する有効性だけが記載されており、ＶＲＥに対する有効性を示す抗生物質はほとんど報告されていないのが現状である。そこで耐性菌の出現の可能性を考慮すると、ＭＲＳＡだけでなくＶＲＥにも有効性を示し、特許文献２、特許文献３等の既存の抗生物質とは異なる化学構造を有し、耐性菌に対する作用機序も既存の治療薬と異なることが期待できる抗生物質の選択肢を更に増やす必要がある。
【０００７】
また、従来の報告例のほとんどは、最小発育阻止濃度（以下、「ＭＩＣ」と略記することがある）で評価したインビトロにおける抗菌活性を中心に抗生物質が選択されており、インビボにおける治療効果を含めた評価によって抗生物質が選択された例はほとんどなく、最後に治療効果の篩が残っているため、実用化へのハードルが高いという問題がある。
【０００８】
以上より、本発明の課題は、従来の薬剤とは異なる化学構造を有する新規な化合物を提供することにあり、更には、多剤耐性菌にも有効な新規な化合物を提供することにある。
【０００９】
また、多くの候補化合物から目的の化合物を選別する際に、抗菌活性だけでなく、治療効果も含めて評価して選別することで、既に実用化へのハードルが低くなっている「治療効果の高い新規な化合物」を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、土壌等の多くの試料から分離した多種の微生物が産生する有用性の高い抗生物質を選別するために、培養上清中の抗生物質を分離・精製する方法として、まず、得られた各分画の抗菌活性を、黄色ブドウ球菌に対するＭＩＣ値で評価し、次いで、抗菌活性の認められた試料に対して、先に記載した特許文献４のカイコを実験動物として用いた「カイコ黄色ブドウ球菌感染モデル」を用いて、各分画の治療効果も併せて評価する方法を採用した。
【００１１】
その結果、国内各地で採取した土壌中から分離した土壌細菌１４，３４６株のうち、その培養上清にＭＩＣによる判定で黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性を認めた菌株が３，４８７株あり、それらの菌の培養上清について、「カイコ黄色ブドウ球菌感染モデル」における治療効果を検討したところ、治療効果を示した微生物は４５株に減少した。このことから、従来のＭＩＣで抗菌活性のみを評価した場合は、それによって「治療効果」まで評価されたものではないことが確認された。
【００１２】
そして、この４５株の培養上清の抗菌スペクトルを詳細に検討したところ、新規な化合物を産生する新規な微生物が含まれていることを確認した。更に、４５株中にＭＲＳＡとＶＲＥの両者に抗菌活性を示す化合物を産生する微生物が含まれていることを確認した。更に、その微生物の培養上清から得られた抗生物質中に、カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルだけでなくマウス黄色ブドウ球菌感染モデルに対しても、既存薬のバンコマイシンと比較して高い治療効果を示す新規な化合物が含まれていることを見出した。
【００１３】
また、上記「マウス黄色ブドウ球菌感染モデル」において高い治療効果を示した抗生物質についてその化学構造を含めて詳細に検討したところ、その抗生物質は新規な化学構造を有する環状ペプチド化合物であることを確認した。また、培養上清中には、かかる物質以外にも同様の化学構造を有する関連の環状ペプチド化合物が含まれていること、それらも、かかる物質同様の抗菌スペクトルを示すことを確認した。
【００１４】
更に、以上の新規抗生物質を産生する微生物は、その性状の分析や１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列等の解析結果、新規な化学構造を有する環状ペプチド化合物を産生していること等から、リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する新規微生物（以下、「ＲＨ２１８０−５」と表記する）であることも判明し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は、以下を提供するものである。
＜１＞  下記式（１）で示される環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩。
【化１】
0005878302.tif 000002
［式（１）中、Ｒ１は置換基を有していてもよい炭素数が７、８又は９のアシル基を示し、Ｒ２はメチル基又は水素原子を示し、Ｒ３はエチル基又はメチル基を示す。］
＜２＞  上記式（１）中のＲ１の置換基が水酸基である＜１＞に記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩。
＜３＞  上記式（１）中のＲ１が、３−ヒドロキシ−５−メチル−ヘキサノイル基、３−ヒドロキシ−６−メチル−ヘプタノイル基又は３−ヒドロキシ−７−メチル−オクタノイル基である＜１＞に記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩。
＜４＞  上記式（１）中のＲ１が３−ヒドロキシ−５−メチル−ヘキサノイル基であり、Ｒ２がメチル基であり、Ｒ３がエチル基である＜１＞に記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩。
＜５＞  上記式（１）中のＲ１が３−ヒドロキシ−７−メチル−オクタノイル基であり、Ｒ２がメチル基であり、Ｒ３がエチル基である＜１＞に記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩。
＜６＞  独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属するＲＨ２１８０−５株、又はその株と同様の化合物を産生する能力を有する変異株を培養し、その培養物から得られる＜１＞ないし＜５＞の何れかに記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩。
【００１６】
＜７＞  ＜１＞ないし＜６＞の何れかに記載の環状ペプチド化合物を産生する能力を有する、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属するＲＨ２１８０−５株、又はその株と同様の化合物を産生する能力を有する変異株を培養し、その培養物から製造することを特徴とする＜１＞ないし＜６＞の何れかに記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩の製造方法。
【００１７】
＜８＞  ＜１＞ないし＜６＞の何れかに記載の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩を、製薬学的に許容し得る担体と共に含んでなる感染症治療薬。
【００１８】
＜９＞  リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物であって、＜１＞ないし＜６＞の何れかに記載の環状ペプチド化合物を産生する能力を有する独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−８７０であるＲＨ２１８０−５株、又はその株と同様の化合物を産生する能力を有する変異株。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、感染症等に有効な新規な化学構造を有する化合物を提供することができる。更には、ＭＲＳＡ、ＶＲＥ等の多くの多剤耐性菌に有効性を示す新規な化学構造を有する化合物又はその塩、及びそれらの製造方法、並びにそれらの化合物を産生する新規な微生物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＲＨ２１８０−５の培養物から得られた治療効果を示す物質を含有する画分のＯＤＳカラムによる分画結果を示す図である。縦軸は吸収強度、横軸は溶出時間（分）を示す。また別枠で表示した各ピークの欄上の数字は各ピーク物質の分子量を示す。
【図２】ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質のアミノ酸組成分析の解析結果を示す図である。
【図３】ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ分析の解析結果を示す図である。縦軸はシグナル強度、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。
【図４】ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質のＴＯＦ（Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ：飛行時間型）ＭＳのＭＳ−ＭＳ分析の解析結果を示す図である。
【図５】ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ１物質とＰｅａｋ２物質のＴＯＦ（Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ：飛行時間型）ＭＳのＭＳ−ＭＳ分析の解析結果を示す図である。
【図６】ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ３物質とＰｅａｋ４物質のＴＯＦ（Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ：飛行時間型）ＭＳのＭＳ−ＭＳ分析の解析結果を示す図である。
【図７】ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ６物質とＰｅａｋ７物質のＴＯＦ（Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ：飛行時間型）ＭＳのＭＳ−ＭＳ分析の解析結果を示す図である。
【図８】ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ８物質とＰｅａｋ９物質のＴＯＦ（Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ：飛行時間型）ＭＳのＭＳ−ＭＳ分析の解析結果を示す図である。
【図９】各解析結果から導き出されたＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の化学構造を示す図である。
【図１０】各解析結果から導き出されたＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質のアミノ酸の立体構造も明らかにした化学構造を示す図である。
【図１１】ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の溶菌活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明について説明するが、本発明は、以下の具体的態様に限定されるものではなく、技術的思想の範囲内で任意に変形することができる。
【００２２】
＜本発明の環状ペプチド化合物＞
本発明は、下記式（１）で表されることを特徴とする新規な化合物に係るものであり、３７員環の環状ペプチド構造を基本骨格とし、Ｒ１からＲ３の基の違いにより、複数の化合物が確認されている。これらは、本発明者が見出した、後述する新規微生物株であるイソバクター  エスピーＲＨ２１８０−５の培養物から、後述する最終精製段階であるＲＰ−ＨＰＬＣで分取されたピーク画分中から単離されたが、本発明の「下記式（１）で示される環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩」を得る方法は、上記方法には限定されず、如何なる方法で得られたものでもよく、微生物が産生したものには限定されない。
【００２３】
なお、それぞれの単離・精製された化合物は、以下、便宜上、上記微生物株の株名にピーク名をつけ、例えば、ピーク１から得られた化合物であれば、「ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ１物質」、又は単に「Ｐ１」と表記することとする。
【００２４】
【化２】
0005878302.tif 000003
［式（１）中、Ｒ１は置換基を有していてもよい炭素数が７、８又は９のアシル基を示し、Ｒ２はメチル基又は水素原子を示し、Ｒ３はエチル基又はメチル基を示す。］
【００２５】
上記式（１）中のＲ１は、置換基を有していてもよい炭素数が７、８又は９のアシル基を示す。上記アシル基の炭素数には「Ｃ＝Ｏ」の炭素数（１個）も含まれる。置換基を除いた「炭素数が７、８又は９のアシル基」は、「Ｒ’−Ｃ（＝Ｏ）−」で表わされ、ここで、Ｒ’は、炭素数が６、７又は８のアルキル基を示す。また、Ｒ’は直鎖であっても分岐を有していてもよいが、分岐を有していることが好ましい。また、分岐された部分はメチル基であることが好ましく、特に限定はないが、Ｒ’の「Ｃ＝Ｏ」とは反対側の末端は、「ＣＨ３（ＣＨ３）ＣＨ−」となっていることが特に好ましい。また、Ｒ’すなわちＲ１が分岐を有する場合には、上記Ｒ１の炭素数（７、８又は９）には、分岐された部分の炭素数も含まれる。また、上記式（１）中のＲ１の置換基は、水酸基であることが好ましい。
【００２６】
具体的には、上記式（１）中のＲ１は、３−ヒドロキシ−５−メチル−ヘキサノイル基、３−ヒドロキシ−６−メチル−ヘプタノイル基又は３−ヒドロキシ−７−メチル−オクタノイル基であることが好ましい。
【００２７】
また、上記式（１）で示される「環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩」は、Ｒ１が３−ヒドロキシ−５−メチル−ヘキサノイル基であり、Ｒ２がメチル基であり、Ｒ３がエチル基であるものが好ましく、Ｒ１が３−ヒドロキシ−７−メチル−オクタノイル基であり、Ｒ２がメチル基であり、Ｒ３がエチル基であるものが好ましい。
【００２８】
式（１）中に示されるＲ１、Ｒ２、Ｒ３と各ピークから得られた物質との関係を、表１に示す。この内、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質とＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ９物質についてはＲ１、Ｒ２、Ｒ３の構造が確定しているが、他のピークから得られた物質についてはＲ１の構造が完全には確定していないので、表１中のＲ１の構造式は主に精密質量分析の結果の解析と生合成経路からによるものである。後述する各ピーク物質の抗菌スペクトルの検討結果から、Ｒ１の違いは抗菌スペクトルに特に影響を与えていないという傾向が明確に認められている。従って、少なくともこれらの側鎖は、置換基を有していてもよいアシル基であればよく、好ましくは置換基を有していてもよい炭素数が７ないし９のアシル基であればよい。
【００２９】
【表１】
0005878302.tif 000004
表１中、「高分解能質量分析」は、ＨＲ  ＴＯＦ  ＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋
【００３０】
＜本発明の環状ペプチド化合物の調製方法＞
本発明の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩の調製方法は特に限定されず、微生物が産生したものであってもよいし、合成したものであってもよいし、それらを組み合わせたものでもよい。
【００３１】
＜本発明の環状ペプチド化合物の単離精製方法＞
本発明の新規な環状ペプチド化合物の単離精製方法は、カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルにおける治療効果を指標として選択されたものであるが、その方法に特に限定されるものではなく、一般的に微生物の培養物から目的の化合物を精製する方法として用いられている方法を適宜組み合わせて実施すればよい。
【００３２】
具体的には、溶媒抽出、転溶、水沈殿、ＯＤＳカラム等によるクロマトグラフィー、ＯＤＳカラム等を用いたＲＰ−ＨＰＬＣによる分取等が挙げられる。上記溶媒抽出の溶媒や転溶の溶媒としては特に限定はないが、アセトン等の水溶性溶媒；ブタノール等の親水性溶媒；それらの混合溶媒；水と親水性溶媒との混合溶媒；水と水溶性溶媒との混合溶媒；等が好ましい。また、ＯＤＳカラムの代わりに、オクチル基やブチル基で修飾した担体、ポリスチレン系のポリマー担体等を充填したカラムを用いてもよい。
【００３３】
なお、上記した単離精製方法は一例に過ぎず、最終的に目的とする本発明の新規な環状ペプチド化合物が得られる方法であれば、如何なる単離精製方法であってもよい。
【００３４】
＜単離精製された本発明の環状ペプチド化合物の構造解析＞
以上の精製方法を実施した場合、最終的にＲＰ−ＨＰＬＣによって、ＲＨ２１８０−５の培養物から少なくとも９つのピークに分けられる９つの化合物を分取することができる（図１）。これらは、ＲＰ−ＨＰＬＣより前段階の単離精製方法によっては単一の画分中に存在する化合物群であって、また、ＵＶ吸収パターンが類似していることから、互いに類似する化合物群である。
【００３５】
これらの９つのピークのうちの主要なピークであるピーク５からのＲＰ−ＨＰＬＣ精製標品を構造解析の例として挙げる。その構造解析方法は既存の構造解析手段を適宜組み合わせて行えばよいが、次の解析手段により効率よく実施することができる。すなわち、精密質量分析による分子量測定、酸加水分解処理後のアミノ酸分析（図２）、１Ｈ−ＮＭＲと１３Ｃ−ＮＭＲによる解析（図３）、ＴＯＦ（Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ：飛行時間型）ＭＳ解析（図４はピーク５、図５はピーク１と２、図６はピーク３と４、図７はピーク６と７、図８はピーク８と９の、ＴＯＦ−ＭＳ解析結果。）、その他、ＵＶスペクトル（図１）や、赤外線吸収スペクトル（ＩＲ）で解析することができる。
【００３６】
以上の構造解析手段を実施した結果、ピーク５から得られた物質は、精密質量分析により、分子量が１６１６．９［ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳで、（Ｍ＋Ｈ）＋が、ｍ／ｚ＝１６１７．８７５５］；アミノ酸分析により、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｒｇがそれぞれ２分子、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅがそれぞれ１分子検出された（図２）。そして、最終的にピーク５から得られた物質は、式（１）のＲ１が３−ヒドロキシ−５−メチル−ヘキサノイル、Ｒ２がメチル、Ｒ３がエチルである新規な環状ペプチド骨格を有する新規な化合物であることが判明した。そしてこの新規な化合物を、「ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質」（以下、単に「Ｐ５」と記載することもある。）と命名した。
【００３７】
また、同様に、ピーク９から得られた物質は、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質のＲ１の炭素数が２つ延長した形の化合物であることが確定し、「ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ９物質」（以下、単に「Ｐ９」と記載することもある。）と命名した。また、他のピークから得られた物質も、同じ環状ペプチド構造を基本骨格として有する化合物であることが判明し、同様に「ＲＨ２１８０−５」にＰｅａｋ番号ｎを付する形で命名した（以下、単に「Ｐｎ」と記載することもある。）。
【００３８】
＜本発明の環状ペプチド化合物ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の物理化学的性状＞
以上の本発明の新規な環状ペプチド構造を有する新規な化合物のうち、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の物理化学的性状は次の通りである。
【００３９】
（１）高分解能質量分析値  ＨＲ  ＴＯＦ  ＭＳ  ｍ／ｚ  （Ｍ＋Ｈ）＋：
１６１７．８７５５
ＴＯＦ（Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ：飛行時間型）ＭＳ解析：図４
（２）１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ：図３
【００４０】
（３）溶媒への溶解性：
水、エタノール、メタノール、アセトニトリルに溶解
クロロホルムに不溶
（４）外観：白色粉末
【００４１】
＜本発明の環状ペプチド化合物の微生物を用いた製造方法＞
本発明の新規な環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩は、化学合成によっても、それを産生する微生物の培養によって得られるものであってもよく、製造方法は特に限定されないが、上記の環状ペプチド化合物を産生する能力を有する、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属するＲＨ２１８０−５株、又はその株と同様の化合物を産生する能力を有する変異株を培養し、その培養物から製造することが好ましい。
【００４２】
すなわち、本発明は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属するＲＨ２１８０−５株、又はその株と同様の化合物を産生する能力を有する変異株を培養し、その培養物から得られる前記式（１）で表わされる環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩でもある。
【００４３】
＜ＲＨ２１８０−５について＞
以下、このＲＨ２１８０−５について詳述する。
形態：本ＲＨ２１８０−５は、グラム陰性の桿菌であり、鞭毛は認められないが滑走性が認められる。子実体の形成は認められない。また抗酸性を示さない。
【００４４】
培地における生育状況：
（１）肉汁寒天平板上では薄黄色のコロニーを形成する。拡散性の色素は認められない。
（２）肉汁ゼラチン穿刺培養では内部に渡ってゼラチンを液化しながら生育する。
【００４５】
生理学的性質：本ＲＨ２１８０−５の生理学的、化学分類学的性質は以下の通りである
生理学的性質：本ＲＨ２１８０−５の生理学的、化学分類学的性質は以下の通りである
（１）生育ｐＨ（最適生育ｐＨ）：５〜９（６〜８）
（２）生育温度（至適生育温度）：１０〜４０℃（２５〜３０℃）
（３）酸素に対する態度：好気的
（４）ＭＲテスト（Ｍｅｔｈｙｌ  ｒｅｄ  ｔｅｓｔ）：−
（５）ＶＰテスト（Ｖｏｇｅｓ−Ｐｒｏｓｃａｕｅｒ  ｔｅｓｔ）：＋
（６）色素の生成（Ｐｉｇｍｅｎｔ）：＋
（７）オキシダーゼ（Ｏｘｉｄａｓｅ  ｔｅｓｔ）：＋
（８）カタラーゼ（Ｃａｔａｌａｓｅ  ｔｅｓｔ）：＋
（９）ウレアーゼ（Ｕｒｅａｓｅ  ｔｅｓｔ）：−
（１０）フォスファターゼ（Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｔｅｓｔ）：＋
（１１）カゼイン加水分解（Ｃａｓｅｉｎ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）：＋
（１２）セルロース加水分解（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）：−
（１３）ゼラチン加水分解（Ｇｅｌａｔｉｎ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）：＋
（１４）でんぷん加水分解（Ｓｔａｒｃｈ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）：−
（１５）デオキシリボヌクレアーゼ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｔｅｓｔ）：＋
（１６）硝酸塩還元（Ｎｉｔｒａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）：−
（１７）脱窒（Ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）：−
（１８）硫化水素生成（Ｈ２Ｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）：−
（１９）インドール生成（Ｉｎｄｏｌｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）：−
（２０）クエン酸塩の利用（Ｃｉｔｒａｔｅ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）：＋
（２１）ＯＦ−ｔｅｓｔ：ｏｘｉｄａｔｉｏｎ
（２２）下記の糖類等からの酸及びガスの生成能
Ｌ−アラビノース（Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｓｅ）：−
Ｄ−キシロース（Ｄ−ｘｙｌｏｓｅ）：−
Ｄ−グルコース（Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ）：＋
Ｄ−マンノース（Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ）：＋
Ｄ−フラクトース（Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ）：＋
Ｄ−ガラクトース（Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ）：−
Ｄ−マルトース（Ｄ−ｍａｌｔｏｓｅ）：＋
Ｄ−スクロース（Ｄ−ｓｕｃｒｏｓｅ）：＋
Ｄ−ラクトース（Ｄ−ｌａｃｔｏｓｅ）：＋
Ｄ−トレハロース（Ｄ−ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）：＋
Ｄ−ソルビトール（Ｄ−ｓｏｒｂｉｔｏｌ）：−
グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）：−
スターチ（ｓｔａｒｃｈ）：−
【００４６】
分子生物学的解析結果：分子生物学的な系統分類の指標として用いられている１６Ｓ  ｒＲＮＡに関するＲＨ２１８０−５の解析結果は以下の通りである。
＜＜１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列＞＞
（１２）１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列の解析結果
ＲＨ２１８０−５のコロニーから、コロニーＰＣＲにより、１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域の塩基配列を増幅し、シーケンサーによる解析を行った結果、５’末端側、３’末端側のいくつかの塩基を除く１６Ｓ  ｒＲＮＡのほぼ全長に当たる塩基配列が見出された。この塩基配列を配列表の配列番号１に示す。配列表の配列番号１の塩基配列は、１６Ｓ  ｒＲＮＡの全長ではないため、１６Ｓ  ｒＲＮＡ「領域」とした。この塩基配列をＮＣＢＩのＢＬＡＳＴで相同性検索を行ったところ、ＲＨ２１８０−５の１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域の塩基配列は、リソバクター属であるＬｙｓｏｂａｃｔｅｒ  ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ  ＤＳＮ２０４３Ｔ株の塩基配列と相同率９９％を示した。なお、上記Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ  ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓには、抗生物質産生の報告はないので、ＲＨ２１８０−５とは異なるものである。
【００４７】
以上のＲＨ２１８０−５の性質をバージース・マニュアル・オブ・システマティックバクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３  １９８９）による分類及びその他の文献の記載内容に照らし合わせ、更に、１６Ｓ  ｒＲＮＡ解析の結果を考慮して総合的に判断した結果、ＲＨ２１８０−５は、リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物であると判断した。
【００４８】
＜ＲＨ２１８０−５の新規性等＞
また、ＲＨ２１８０−５の１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域の塩基配列に一致する１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域の塩基配列を有する微生物が存在しないこと、ＲＨ２１８０−５の産生する化合物が、上記したように、新規な環状ペプチド構造を基本骨格とする新規な化合物であること、また、その化合物がＭＲＳＡだけでなくＶＲＥにも抗菌活性を示し、ＭＲＳＡによる感染症に対しマウスにおいて治療効果が確認されたこと等を含め総合的に判断した結果、ＲＨ２１８０−５は、新規な微生物株であると判断した。
【００４９】
ＲＨ２１８０−５は、千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に国内寄託され、受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−８７０（寄託日：２０１０年１月２５日）を受けており、入手可能である。
【００５０】
「ＲＨ２１８０−５」は、その後、千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、原寄託申請書を提出して、国内寄託（原寄託日：２０１０年１月２５日）から、ブダペスト条約に基づく寄託への移管申請を行ない（移管日（国際寄託日）：２０１１年５月２０日）、生存が証明され、ブダペスト条約に基づく寄託（国際寄託）への移管申請が受領された結果、受託番号「ＮＩＴＥ  ＢＰ−８７０」を受けているものである。
【００５１】
バクテリアの一般的な性状として、その菌株としての性質は変異し易いため、ＲＨ２１８０−５は、先に示した生理学的性状の範囲内に留まらない可能性も有している。また、かかる「変異」には、自然的な変異と人工的な変異の両方を含むことは言うまでもない。本発明の前記式（１）で示される環状ペプチド化合物は、ＲＨ２１８０−５（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−８７０）から変異した微生物が産生したものも含まれる。
【００５２】
＜ＲＨ２１８０−５の培養方法＞
以下に、ＲＨ２１８０−５の培養方法について記載する。本発明の新規な環状ペプチド構造を有する新規な化合物を産生するＲＨ２１８０−５の培養方法は、リソバクター属の微生物に対して行われる一般的な培養方法に準じて行えばよい。具体的には、ＲＨ２１８０−５を、ＹＭＥ培地、ＳＧＭ培地、ＣＤＹ培地、ＹＰＧＭ培地等の栄養源含有培地に接種し、好気的条件下で培養を行う。培地中の炭素源としては、例えば、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、シュクロース、デンプン、デキストリン、グリセリン、糖蜜、水飴、油脂類等の有機炭素化合物が用いられ、窒素源としては、肉エキス、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、胚芽、大豆粉、尿素、アミノ酸、アンモニウム塩等の有機・無機窒素化合物を用いることができる。また、塩類は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩、鉄塩、銅塩、亜鉛塩、コバルト塩等の無機塩類を必要に応じて適宜添加する。更に、ビオチン、ビタミンＢ１、シスチン、オレイン酸メチル、ラード油等の生育促進物質を添加することが、目的物の産生量を増加させる点で好ましい。また、シリコン油、界面活性剤等の消泡剤を添加してもよい。
【００５３】
培養条件は、先に記したように好気的条件下で培養することが好ましく、液体培養法であれば通気攪拌培養が望ましい。小規模であればフラスコによる振とう培養法を用いてもよい。培養温度は２０℃〜４０℃で可能であるが、２５℃〜３５℃間に保つことが好ましく、３０℃近辺で行うことがより好ましい。培養ｐＨは、６〜８が好ましく、７付近で行うことが特に好ましい。培養期間は、用いた培地組成、培養温度等により変動するファクターであるが、ＲＨ２１８０−５の場合、通常は１〜２０日間程度、好ましくは３〜７日間程度の短期間に充分な量の目的物を確保することができる。
【００５４】
＜ＲＨ２１８０−５の培養物からの本発明の環状ペプチド化合物の調製方法＞
ＲＨ２１８０−５の培養物から、本発明の「前記式（１）で示される環状ペプチド化合物」を得る方法としては、通常の微生物培養物から生理活性物質を得る方法が挙げられる。ここで培養物とは、培養上清、培養菌体、培養菌体破砕物を含むものである。例えば、培養物に抽出処理としてアセトン等の適当な有機溶媒を加えて懸濁した後に、遠心分離やろ過膜分離等を行って菌体と分離した抽出上清に対して、通常用いられる単離精製処理を加えればよい。また必要に応じて残った菌体残渣を摩砕処理等してから再度抽出処理を行ってもよい。
【００５５】
また、本発明の「前記式（１）で示される環状ペプチド化合物」の調製にあたり、通常実施されるＭＩＣによる抗菌活性の確認だけでなく、特許文献４に記載のカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルを用いた治療効果（ＥＤ５０）を指標として単離精製方法の取捨選択を行っている（実施例１の表２参照）。
【００５６】
実施例１の表２は、ＲＨ２１８０−５の培養液から分画・精製される各精製段階の検体の抗菌活性ＭＩＣと、カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルにより測定した治療効果ＥＤ５０をまとめたものである。その結果は、ＥＤ５０がアセトン抽出段階の９０から０．３へと、３００倍に濃縮されているのに対し、ＭＩＣは、この場合に行った単離精製方法では、２５からへ５と、５倍に濃縮されているに過ぎないことを示している。
【００５７】
つまり、本発明の前記式（１）で示される環状ペプチド化合物は、ＭＩＣだけでなくカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルを用いた治療効果を指標として選択された単離精製方法を用いることによって効果的に見出されたものと考えることができる。なぜならば、従来から行われているＭＩＣのみを指標として目的物の単離精製を行った場合には、抗菌活性は高いが治療効果の点では有効でない抗菌活性成分が濃縮されてしまい、生体内で治療効果の高い抗生物質を見逃していた可能性が考えられるからである。
【００５８】
＜抗菌スペクトル＞
本発明の前記式（１）で示される環状ペプチド化合物の示す抗菌スペクトルは、先に記載したＭＩＣによって検討することができる。それによって、例えば、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５、Ｐｅａｋ６、Ｐｅａｋ９の各物質は、黄色ブドウ球菌、腸球菌等のグラム陽性細菌に対して抗菌活性を示し、更に、ＭＲＳＡだけでなくＶＲＥに対しても通常の細菌とまったく同じ抗菌活性を示し、多くの多剤耐性菌に有効な物質であることを確認することができる（試験例１の表３、試験例４の表６参照）。
【００５９】
先の各ピーク物質、すなわち、前記式（１）で示される環状ペプチド化合物の、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ３、ＭＲＳＡ４）、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）と同じ菌種の薬剤感受性菌である黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ１）と腸球菌（ＥＦ１）に対するＭＩＣによる抗菌スペクトルを検討した結果（ピーク１物質は未実施）、ＭＳＳＡ１とＭＲＳＡ３及びＭＲＳＡ４、ＥＦ１とＶＲＥ間で各ピーク物質はほぼ同様のＭＩＣ値を示し、本発明の一群の化合物が、バンコマイシン耐性を含む薬剤耐性の影響を受けていないことを確認することができた（試験例２の表４参照）。
【００６０】
本発明の前記式（１）で示される新規な環状ペプチド構造を有する新規な化合物は、少なくとも、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）の両者に抗菌活性を示す化合物が含まれる。
【００６１】
以上から、本発明の新規な環状ペプチド構造を有する新規な化合物は、例えば、本発明の新規な微生物ＲＨ２１８０−５（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−８７０）の培養液から製造することができ、少なくとも多剤耐性菌のＭＲＳＡ及びＶＲＥに対して抗菌活性を有する新規な化合物を含んでいることが確認できる。なお、先に挙げた微生物の培養方法、精製方法等は、本発明の化合物を見出すために選択された一例であって、効率よく大量に製造する必要がある場合等、目的に応じて別種の製造方法を選択することは当然行われることである。
【００６２】
＜感染症治療薬＞
前記式（１）で表わされる環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩を、製薬学的に許容し得る担体と共に含んでなる感染症治療薬は、感染症に対して優れた治療効果を奏する。特に、本発明の前記式（１）で表わされる、新規な環状ペプチド構造を有する化合物又はその製薬学的に許容される塩は、カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルだけでなく、後述するようにマウス黄色ブドウ球菌感染モデルでも、バンコマイシンに比して高い治療効果が確認されたものがあり、感染症治療薬の有効成分として好適に用いることができる。
【００６３】
上記の感染症治療薬中の、本発明化合物の含有量には特に制限はなく、目的や投与方法に応じて含有量を適宜選択して用いればよい。また、通常の抗生物質を製剤化する際に用いられる担体や賦形剤、その他の添加剤を、適宜、剤形等の要求に応じて本発明の化合物の薬理効果を損なわない範囲内で選択して用いればよい。
【００６４】
前記の感染症治療薬の剤形は、投与の目的や方法に応じて適宜選択すればよく、例えば、粉末、顆粒、カプセル、錠剤、液剤等の経口投与用；注射剤、経静脈剤、坐剤、経皮、経鼻、経腸、吸入剤等の非経口投与用の何れにも本発明の化合物は用いることができる。経口投与のための賦形剤としては、乳糖、ブドウ糖、デンプン、ポリビニルピロリドン等、公知の賦形剤を用いることができ、液剤とする場合は、本発明の化合物に、不活性な溶媒、例えば、精製水、エタノール等と共に、薬学的に許容される乳剤、懸濁剤、可溶化剤、甘味剤、ｐＨ調整剤、芳香剤、防腐剤等を含有させて用いることができる。
【００６５】
注射剤として用いる場合は、注射用の蒸留水や生理食塩水のような無菌の水性液剤を用いることができ、非水性の液剤としては、オリーブ油等の植物油；エタノール、ポリエチレングリコール、ブチレングリコール等のアルコール類等を用いることができる。更に、等張化剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、シクロデキストリン等の溶解補助剤を含んでいてもよい。
【００６６】
以上のように製剤化した本発明の化合物の投与量は、症状、年齢、性別、剤形、投与方法、１日の投与回数等を考慮して適宜決定すればよいが、一般的な投与量は、成人１日当たり１０ｍｇ〜１０００ｍｇである。しかしながら、多剤耐性菌に対する治療で多用される重症化患者に点滴によって経静脈剤として用いられる場合等には更に多い投与量を必要とする場合もあり得る。
【実施例】
【００６７】
以下、実施例、試験例及び検討例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例等の具体的範囲に限定されるものではない。
【００６８】
実施例１
＜ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の単離精製＞
（１）抗菌活性を有する微生物のＭＩＣによる探索
各地から採取した土壌を生理食塩水に懸濁し、その上清をＧＡ培地及びＨＶ培地に塗布し、３０℃でインキュベート後に生育した菌を分離し、ＹＭＥ培地又はＳＧＭ培地、ＣＤＹ培地にて３０℃で５日間培養した。アセトンを等量加え、懸濁後に遠心分離しその上清をエバポレーションした。得られた残存物を生理食塩水で希釈後に黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性を微量液体希釈法によるＭＩＣにて評価した。その結果、１４３４６株中、３４８７株の培養上清に抗菌活性が認められた。
【００６９】
（２）カイコ黄色ブドウ球菌感染モデル（以下、「カイコモデル」と略記する。）を用いた治療活性物質を産生する微生物株の検討
先の抗菌活性が認められた３４８７株の検体を、特許文献４に記載のカイコモデルに供してその治療効果を検討したところ、４５株の培養上清に治療効果が認められた。
【００７０】
（３）カイコモデルを用いた治療効果を指標とした治療活性物質の精製
上記４５株中、沖縄で採取された土壌から分離されたＲＨ２１８０−５について、培養上清からの治療活性物質の精製を実施した。ＲＨ２１８０−５は、後述する１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列の解析、産生物質の傾向等から、新規リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物と判定された。
【００７１】
ＲＨ２１８０−５を、ＹＭＥ培地１２００ｍＬに接種して培養し、培養物の５０質量％アセトン抽出物からカイコモデルにおける治療効果を指標に治療効果を示す抗生物質の精製方法を検討した。その結果、ブタノール転溶、水沈殿、ＯＤＳカラムによるクロマトグラフィー、更にＯＤＳカラムを用いたＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相ＨＰＬＣ）により、治療効果を示す抗生物質が精製された。その結果を表２に示す。
【００７２】
【表２】
0005878302.tif 000005
【００７３】
表２に示したように、以上の精製工程により、治療効果（ＥＤ５０値）の比活性は、アセトン抽出物の３００倍に上昇した。一方、抗菌活性（ＭＩＣ）の上昇は５倍に留まった。これは、精製の出発材料であるアセトン抽出物の示す抗菌活性には最終精製物の治療効果を示す抗生物質以外の物質も関与し、今回選択された精製工程により、それらの物質を除去できているためと推定された。表２中、全活性「ｕｎｉｔ」とは、体重１ｇの黄色ブドウ球菌に感染したカイコの、５０％の確率で生存に必要な活性量と定義される。
【００７４】
また、上記ＲＰ−ＨＰＬＣにおいて、ＵＶ吸収パターンの類似した９つの化合物が検出されていることから、ＲＨ２１８０−５は少なくとも９つの関連化合物を産生していることが確認された（図１のＨＰＬＣのＵＶ吸収パターン参照）。
【００７５】
実施例２
＜ＲＨ２１８０−５の培養とＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の製造＞
ＲＨ２１８０−５の斜面培養から白金耳で菌を掻き取り、１００ｍＬのＹＭＥ培地を入れた５００ｍＬ容の三角フラスコに接種し、３０℃で３日間振とう培養を行い種培養液とした。次いで、この種培養液１．０ｍＬを、先の液体培地１００ｍＬを入れた５００ｍＬ容の三角フラスコ１２本に接種し、３０℃で５日間振とう培養を行った。
【００７６】
このようにして得た培養液にアセトンを等量混合し、この混合液を充分に攪拌した後に遠心分離を行い、遠心上清をエバポレーションしてアセトンを除去した。次いで、この試料をブタノール転溶に供した。ブタノール転溶はアセトン抽出物を８０ｍＬの水に懸濁し、等量のブタノールを添加して充分に振とうした後、静置、分液ロートにてブタノール層を分取し、減圧乾固後水沈殿に供した。水沈殿は先の試料を８０ｍＬの水に懸濁し、遠心後に水を取り除き、沈殿物を分取した。
【００７７】
ブタノール抽出物残渣７５ｍｇのサンプルを６０％メタノールに溶解し、Ｗａｔｅｒｓ、Ｓｅｐ−ｐａＫ（Ｗａｔｅｒｓ社：登録商標）Ｃ１８、２５ｍＬを用いて、０．１％ＴＦＡを含む６０％〜１００％メタノールで、１０％ごとに２０ｍＬの液で溶出させた。その結果、７０％〜８０％メタノール画分で治療効果を示す画分が溶出された。
【００７８】
先の治療効果を示す画分をプールして乾固させ、内２２ｍｇを５０％メタノールに溶解し、Ｓｅｎｓｈｕ  ＰａＫ  ＳＰ−１００  ＯＤＳカラム（センシュー科学：直径２０ｍｍＸ長さ２５０ｍｍ）を用いて、７５％〜９５％メタノール＋０．１％ＴＦＡにて溶出させた。この条件のＲＰ−ＨＰＬＣにより治療効果を示す画分は、それぞれ単一物質からなる９つのピークを示す物質に分画された。
【００７９】
以上のＲＰ−ＨＰＬＣにおいて、治療効果を示す画分は、ピーク５を主要成分とする９つの類似したＵＶ吸収パターン（ＵＶ装置Ｗａｔｅｒｓ２９９６  ｐｈｏｔｏ  ｄｉｏｄｅ  ａｒｒａｙ）を有する化合物群からなっていることが確認された（図１参照）。
以上の操作により、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質を５．３ｍｇ得た。また、同様の方法で、ピーク１、ピーク２、ピーク３、ピーク４、ピーク６、ピーク７、ピーク８、ピーク９の各ピークからそれぞれのピーク物質を得た。
【００８０】
検討例１
＜ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の構造解析＞
ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質を、ブルカー・ダルトニクス社（ＢｒｕｋｅｒＤａｌｔｏｎｉｃｓ）ＢｉｏＴＯＦ−Ｑ質量分析器による精密質量分析に供した結果、分子量は１６１７．８７４３であることが分かった。
【００８１】
また、６Ｎ塩酸下、１０５℃で一晩加水分解処理をした後に、日立アミノ酸分析機によりアミノ酸分析を行ったところ、各々２分子のＴｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇと、各々１分子のＳｅｒ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅが検出された（図２）。
【００８２】
更に、日本電子ＥＣＡ−５００ＮＭＲによる１Ｈ、１３Ｃ−ＮＭＲ解析（図３）、ＴＯＦ−ＭＳ解析（図４）の結果、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は、式（１）のＲ１が３−ヒドロキシ−５−メチル−ヘキサノイル、Ｒ２がメチル、Ｒ３がエチルである環状ペプチド化合物であり、図９に示す新規骨格を有する化合物であることが明らかとなった。
【００８３】
更に、酸加水分解を行ったＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質について、キラルカラムによるＤ，Ｌ体の決定を行ったところ、Ｉｌｅ，Ｓｅｒ，Ｌｅｕ，２個のＴｈｒはＬ体で、Ｎ−ＭｅＰｈｅ，２個のＡｒｇ，ＴｒｐはＤ体であることが明らかになった。
ＧｌｎとＧｌｕについては、酸加水分解の結果では両方ともＧｌｕとなり、Ｄ，Ｌ体が１：１で検出されたため、グルタミンおよびグルタミン酸を含むペプチドに対して、ビス（１，１―トリフルオロアセトキシ）ヨードベンゼンを反応させることにより、グルタミンをジアミノ酪酸に変換し、加水分解後、反応しなかったグルタミン酸について、キラルカラムによる絶対配置の決定を行ったところ、ＧｌｎがＤ体、ＧｌｕがＬ体であることが明らかになった。（この分解法によるペプチドのＤ，Ｌ体の決定法は本願において初めて行われた新規の方法である。）
【００８４】
脂肪酸鎖の水酸基については、改良モッシャー法により絶対配置Ｒを決定した。
その結果、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は、各アミノ酸が図１０に示す立体構造を有する新規な環状ペプチド化合物であることが分かった。
【００８５】
検討例２
＜ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ９物質の構造解析＞
構造解析に供する試料としてＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ９物質を用いる以外は検討例１と同様の構造解析手段により構造解析を行った（図５参照）。その結果、式（１）のＲ１が３−ヒドロキシ−７−メチル−オクタノイルである以外は、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質と同じ化学構造を有する環状ペプチド化合物であることが確認された。
【００８６】
また、他のピーク物質についても同様の解析を行い、表１に示すＲ１、Ｒ２、Ｒ３を有する以外は全て、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ９物質と同じ環状ペプチド骨格を有する化合物であることが確認された（図６、７、８参照）。
【００８７】
試験例１
＜本発明の環状ペプチド化合物の抗菌スペクトル検討＞
先のＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の、ＭＲＳＡ、ＶＲＥを含む各種の微生物に対する抗菌スペクトルの検討を行った。また、薬剤耐性の影響についても検討した。後者の検討には黄色ブドウ球菌と腸球菌を選択し、黄色ブドウ球菌については、薬剤耐性を示さない黄色ブドウ球菌（以下、「ＭＳＳＡ１」と略記する。）と、メチシリンを含む多くの薬剤に耐性を示すＭＲＳＡ２種（ＭＲＳＡ３、ＭＲＳＡ４；耐性薬剤については表３を参照）について、また、腸球菌については、薬剤耐性を示さない腸球菌（以下、「ＥＦ１」と略記する。）と、バンコマイシンに耐性を示す腸球菌（以下、「ＶＲＥ」と略記する。）について、各ピーク物質の示すＭＩＣ値をＣＬＳＩ（旧ＮＣＣＬＳ米国臨床検査標準委員会）に基づく微量検体希釈法によって測定した。
【００８８】
また、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ６物質とＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ９物質についても、ＭＳＳＡ１とＥＦ１、及びその薬剤耐性菌（ＭＲＳＡ３、ＭＲＳＡ４とＶＲＥ）についてＭＩＣ値を測定した。試験に供した各種の微生物とＭＩＣの測定結果を表３に示す。
【００８９】
【表３】
0005878302.tif 000006
【００９０】
表３の結果から、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は、黄色ブドウ球菌、腸球菌に抗菌活性を示すことからグラム陽性の球菌に抗菌活性を示すことが確認された。また、多剤耐性菌のＭＲＳＡ２種とＶＲＥに対しても、通常の菌（ＭＳＳＡ１とＥＦ１）と同じＭＩＣ値を示し、バンコマイシン耐性を含む多剤耐性の影響を受けないことが確認された。また、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ６物質とＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ９物質も、多剤耐性菌と通常の菌に対してＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質と同じ抗菌活性を有することが確認された。
【００９１】
試験例２
＜各ピーク物質の多剤耐性菌と薬剤耐性を有さない菌に対する抗菌活性の比較検討＞
試料量の少ないピーク１物質を除くピーク２物質からピーク９物質の８つの本発明の新規な環状ペプチド化合物について、多剤耐性菌と薬剤耐性を有さない菌に対する抗菌活性の比較検討を行った。
【００９２】
試験対象菌には、試験例１と同じ黄色ブドウ球菌と腸球菌を選択し、微生物も同じＭＳＳＡ１とＥＦ１、ＭＲＳＡ３とＭＲＳＡ４及びＶＲＥについて各ピーク物質の示すＭＩＣ値をＣＬＳＩ（旧ＮＣＣＬＳ米国臨床検査標準委員会）に基づく微量検体希釈法によって測定した。その結果を表４に示す。
【００９３】
【表４】
0005878302.tif 000007
ＭＩＣ（μｇ／ｍＬ）
【００９４】
ＭＳＳＡ１：黄色ブドウ球菌
ＭＲＳＡ３：ＯＸ，ＦＬ，ＫＭ，ＴＣ，ＥＭ耐性黄色ブドウ球菌
ＭＲＳＡ４：ＯＸ，ＦＬ，ＫＭ，ＣＰ，ＣＰＬＸ耐性黄色ブドウ球菌
ＥＦ１    ：腸球菌
ＶＲＥ    ：バンコマイシン耐性腸球菌
【００９５】
ＯＸ：オキサシリン、ＦＬ：フロモキエフ、ＫＭ：カナマイシン、
ＴＣ：テトラサイクリン、ＣＰ：クロラムフェニコール、ＥＭ：エリスロマイシン
ＣＰＬＸ：シプロフロキサシン
【００９６】
その結果、各ピーク物質の示すＭＩＣ値自体は従来報告されている抗菌剤に比べると大きい値となっているものの、通常の菌とその多剤耐性菌（ＭＳＳＡ１とＭＲＳＡ３，ＭＲＳＡ４との間、ＥＦ１とＶＲＥ間）の比較においては、ＭＩＣ値はほとんど同等の値を示し、各ピーク物質の抗菌活性は多剤耐性の影響を受けていないことが確認された。
【００９７】
なお、本発明の環状ペプチド化合物の場合、抗菌活性と治療効果は必ずしも一致していないことが確認されている。例えば、ＭＳＳＡに対するＭＩＣ値が表４の場合で６．３μｇ／ｍＬ、表３の場合で５μｇ／ｍＬを示したＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は、後述するマウス黄色ブドウ球菌感染モデルに対する治療効果（ＥＤ５０値）の検討結果ではバンコマイシンの１／３程度のＥＤ５０値を示しており、高い治療効果を示すことが確認されている。
【００９８】
ＭＩＣ値５μｇ／ｍＬや６μｇ／ｍＬは、バンコマイシンでは耐性菌の示すＭＩＣ値とされている水準であるにもかかわらず、本発明の環状ペプチド化合物が充分な治療効果を示す理由の一つとして、本発明化合物が既存薬とは異なった作用機序で抗菌活性を示し、それが治療効果に反映している可能性が考えられる。既存薬と異なった作用機序で抗菌活性を示している場合は、少なくとも現時点での耐性菌の分離頻度が低いことが予測され、本発明の環状ペプチド化合物の有利な点と考えられる。
【００９９】
試験例３
＜ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質のマウス黄色ブドウ球菌感染モデル（以下、「マウスモデル」と略記する。）における治療効果と毒性の検討＞
７％ムチン＋０．２ｍＭクエン酸鉄（III）アンモニウム（Ｆｅｒｒｉｃ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）に、黄色ブドウ球菌Ｓｍｉｔｈ株を懸濁し、６．２×１０６個（２０×ＬＤ５０）を一群５匹のマウス（ＩＣＲ雌４週齢）の腹腔に投与した。各薬剤は、以下に示す方法で先の菌株投与２時間後に皮下注射した。
【０１００】
上記マウスモデルに対して、ＰＢＳに溶解したＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質を２５ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／ｋｇ、６．３ｍｇ／ｋｇとなるよう皮下注射し、投与後翌日の生存数を測定することでその治療効果（ＥＤ５０値）を検討した（１群５匹）。同様にしてバンコマイシンについても、今回用いたマウスモデルに対するＥＤ５０値を検討した。ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の場合、ＰＢＳ投与で生存なしとなる条件で、２５ｍｇ／ｋｇの投与量でマウス全匹の生存が確認された。また、ＥＤ５０値はプロビット法により求めた。
【０１０１】
得られた結果を表５に示す。ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質はマウスモデルに対して治療効果を示し、そのＥＤ５０値は０．６ｍｇ／ｋｇとなり、同時に検討したバンコマイシンのＥＤ５０値１．６ｍｇ／ｋｇより明確に低く、黄色ブドウ球菌に対して治療効果の高い抗生物質となっていることが確認された。
【０１０２】
【表５】
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【０１０３】
また、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質をマウスに皮下投与し、投与後翌日の観察によりマウスに対するＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の急性毒性についても検討した。急性毒性は、検討した中で最も高い濃度であるＥＤ５０値の８０倍量に相当する５０ｍｇ／ｋｇまでの投与量ではマウスはまったく殺傷されず、毒性を認めなかったことから、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は低毒性であることが示唆された
【０１０４】
以上の結果から、ＲＨ２１８０−５の産生する本発明の抗生物質ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質（Ｐ５）は、黄色ブドウ球菌に対して、バンコマイシンに比べて優れたＥＤ５０値を示し、高い治療効果を示すと共に、ＭＩＣによる抗菌活性の検討結果から臨床上非常に問題となっているＭＲＳＡだけでなく、今後ＭＲＳＡと同様に問題化されることが予想されるＶＲＥに対しても有効性を示すという優れた特徴を有していることが確認できた。
【０１０５】
また、ＲＨ２１８０−５の培養物から単離精製された本発明の新規な環状ペプチド構造を基本骨格として有する新規な化合物９種中８種（ピーク１物質は抗菌スペクトルの検討未実施）は、共に多剤耐性菌とその同種の多剤耐性の性質を獲得していない菌株に対してほぼ同じＭＩＣ値を示した（表４）ことから、本発明の新規な環状ペプチド構造を基本骨格として有する新規な化合物は、特に多剤耐性菌に対して有効な感染症治療薬として用いられ得ることが確認できた。
【０１０６】
試験例４
＜ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の抗菌スペクトルの検討＞
先のＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の、ＭＲＳＡ、ＶＲＥを含む各種の微生物に対する抗菌スペクトルの検討を行った。１０％血清を添加した場合と血清を添加しなかった場合それぞれのＭＩＣ値をＣＬＳＩ（旧ＮＣＣＬＳ米国臨床検査標準委員会）に基づく微量検体希釈法によって測定した。測定結果を表６に示す。
【０１０７】
【表６】
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【０１０８】
表６の結果より、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は、グラム陽性菌に対し有効であり、血清の添加によって活性が上昇することが確認できた。
【０１０９】
試験例５
＜ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の殺菌活性の検討＞
ＣＡ−Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ  Ｂｒｏｔｈ培地に１．８ｘ１０８個の黄色ブドウ球菌を摂取し、先のＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質（２５μｇ／ｍＬ）、バンコマイシン（ＶＭ、５μｇ／ｍＬ）、ゲンタマイシン（ＧＭ、２．５μｇ／ｍＬ）を添加し、１５分後、３０分後、６０分後、１２０分後の生存細胞数をＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ／ｍＬ）として求めた。結果を表７に示す。
【０１１０】
【表７】
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【０１１１】
表７の結果より、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質を添加すると、バンコマイシン、ゲンタマイシンを添加した場合と比較して直ちに黄色ブドウ球菌が減少することが確認できた。
【０１１２】
試験例６
＜ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の溶菌活性の検討＞
ＣＡ−Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ  Ｂｒｏｔｈ培地に黄色ブドウ球菌液を希釈し、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質、バンコマイシン、ダプトマイシンを試験例１で用いたときの５倍の濃度で添加し、３７℃で培養した。吸光度計（島津製作所社製）を用いて、添加後の６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）を経時的に測定した。結果を図１１に示す。
【０１１３】
図１１の結果より、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質が、バンコマイシン、ダプトマイシンと比較して吸光度（ＯＤ６００）の減少が大きかったことから、溶菌活性を示すことが確認できた。
【０１１４】
実施例３
＜ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の製剤化＞
＜＜錠剤＞＞
ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質２０．０ｍｇ、ラクトース４０ｍｇ、デンプン２０ｍｇ、及び、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース５ｍｇを均一に混合した後、ヒドロキシプロピルメチルセルロース８質量％水溶液を結合剤として湿式造粒法で打錠用顆粒を製造した、これに滑沢性を与えるのに必要なステアリン酸マグネシウムを０．５ｍｇから１ｍｇ加えてから打錠機を用いて打錠し、錠剤とした。
【０１１５】
＜＜液剤＞＞
ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質１０．０ｍｇを、２質量％２−ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン水溶液１０ｍＬに溶解し、注射用液剤とした。
【０１１６】
検討例３
＜１６Ｓ  ｒＲＮＡ解析＞
ＲＨ２１８０−５の１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基をコロニーＰＣＲ法によって増幅し、増幅できたＲＮＡ断片についてシーケンサーによって解析した。その結果、５’末端側、３’末端側のいくつかの塩基を除く配列番号１に示すほぼ１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域全長に相当する塩基配列を決定した。この塩基配列を元に、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴを用いて既存のリソバクター属に属する菌株との相同性検索を行った。その結果ＲＨ２１８０−５は、既存のＬｙｓｏｂａｃｔｅｒ  ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ  ＤＳＭ  ２０４３Ｔ株と９９％の相同性を示したことから、ＲＨ２１８０−５はリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物であると考えられた。
【０１１７】
＜ＲＨ２１８０−５の新規性について＞
ＲＨ２１８０−５は、Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ  ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ  ＤＳＭ  ２０４３Ｔ株と化学的性質について相似する点が多いが、産生する生理活性物質の抗菌スペクトルが異なること、生理活性物質の本体である化合物がこれまで報告されていない新規な環状ペプチド構造を基本骨格とする「有用な薬理作用を有するＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質とその関連化合物」である点で全く異なっている。この点は、既存の菌株との大きな相違点である。よって、以上の結果から、ＲＨ２１８０−５は、リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する新規な微生物であると判定した。
【産業上の利用可能性】
【０１１８】
本発明の新規な環状ペプチド化合物は、臨床上大きな問題となっているＭＲＳＡやＶＲＥ等の多剤耐性菌に対して有効性を示すことから、新たな感染症治療薬として利用可能である。また、本発明の新規微生物株は、先の新規で有用な環状ペプチド化合物の製造に好適に利用することができる。
【受託番号】
【０１１９】
国内寄託：ＮＩＴＥ  Ｐ−８７０
ブダペスト条約に基づく寄託：ＮＩＴＥ  ＢＰ−８７０
【配列表フリーテキスト】
【０１２０】
配列番号１は、リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する未知の菌株の、１６Ｓ  ｒＲＮＡのほぼ全長にあたる塩基配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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