(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性阻害剤、またはチロシンキナーゼ阻害剤と同様に機能する薬剤による治療に関して生体試料を分類する方法であり、
（ａ）１組の染色体ハイブリッド形成プローブとヒト患者から得た生体試料を、試料中に染色体がある場合、プローブの染色体へのハイブリッド形成を可能にするのに十分な条件下において、接触させる段階であって、（ｉ）１つのプローブが、試料中の細胞におけるヒト染色体７のコピー数を検出するように設計され、（ｉｉ）１つのプローブが、試料中の細胞におけるヒト染色体遺伝子座１０ｑ２３．３のコピー数を検出するように設計され、かつ、（ｉｉｉ）１つのプローブが、試料中の細胞におけるヒト染色体遺伝子座３ｑ２６．３のコピー数を検出するように設計される、段階と、
（ｂ）ヒト染色体７、ヒト染色体遺伝子座１０ｑ２３．３、およびヒト染色体遺伝子座３ｑ２６．３の各々のコピー数を決定する段階と、
（ｃ）正常な各々のコピー数に対し、１０ｑ２３．３の損失、３ｑ２６．３の増加および染色体７の損失のコピー数プロファイルを有するかについて、段階（ｂ）の結果に基づいて試料を分類する段階と
（ｄ）正常な各々のコピー数に対し、１０ｑ２３．３の損失、３ｑ２６．３の増加および染色体７の損失が検出された場合に、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性阻害剤、またはチロシンキナーゼ阻害剤と同様に機能する薬剤による治療に抵抗を示すヒト患者であると分類する段階、
を含む、方法。
【請求項２】
生体試料が肺生検試料である、請求項１の方法。
【請求項３】
生体試料が、過去に非小細胞肺癌を有すると診断された患者からのものである、請求項１の方法。
【請求項４】
プローブのうちの１つが、遺伝子座１０ｑ２３．３のＰＴＥＮ遺伝子中に存在する少なくとも１つの核酸配列とハイブリッド形成するように設計される、請求項１の方法。
【請求項５】
プローブのうちの１つが、遺伝子座３ｑ２６．３のＰＩＫ３ＣＡ遺伝子中に存在する少なくとも１つの核酸配列とハイブリッド形成するように設計される、請求項１の方法。
【請求項６】
プローブのうちの１つが、ヒト染色体７動原体において少なくとも１つの核酸配列とハイブリッド形成するように設計される、請求項１の方法。
【請求項７】
プローブのうちの１つが、遺伝子座１０ｑ２３．３のＰＴＥＮ遺伝子中に存在する少なくとも１つの核酸配列とハイブリッド形成するように設計され、プローブのうちの１つが、遺伝子座３ｑ２６．３のＰＩＫ３ＣＡ遺伝子中に存在する少なくとも１つの核酸配列とハイブリッド形成するように設計され、かつ、プローブのうちの１つが、ヒト染色体７動原体において少なくとも１つの核酸配列とハイブリッド形成するように設計される、請求項１の方法。
【請求項８】
各々のプローブが、蛍光標識され、かつ同時に検出することができる、請求項１の方法。
【請求項９】
プローブのうちの１つが、遺伝子座７ｐ１２のヒトＥＧＦＲ遺伝子において少なくとも１つの核酸配列とハイブリッド形成するように設計される、請求項１の方法。
【請求項１０】
プローブのうちの１つが、遺伝子座１０ｑ２３．３のＰＴＥＮ遺伝子中に存在する少なくとも１つの核酸配列とハイブリッド形成するように設計され、かつ、プローブのうちの１つが、遺伝子座３ｑ２６．３のＰＩＫ３ＣＡ遺伝子中に存在する少なくとも１つの核酸配列とハイブリッド形成するように設計される、請求項９の方法。
【請求項１１】
コピー数を決定する段階（ｂ）が、試料中の少なくとも４０個の細胞を評価することを含む、請求項１の方法。
【請求項１２】
１０ｑ２３．３の損失のコピー数プロファイルが、細胞の２０％以上がＰＴＥＮの２未満のコピーを有するという決定を含む、請求項１の方法。
【請求項１３】
１０ｑ２３．３の損失のコピー数プロファイルが、試料中の評価可能な細胞における染色体７の平均コピー数が４未満であるという決定を含む、請求項１の方法。
【請求項１４】
１０ｑ２３．３の損失のコピー数プロファイルが、試料中の評価可能な細胞の４０％以上がＰＩＫ３ＣＡの２より多いコピーを有するという決定を含む、請求項１の方法。
【請求項１５】
ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性阻害剤、またはチロシンキナーゼ阻害剤と同様に機能する薬剤による治療に関して生体試料を分類する方法であり、該方法は、
（ａ）１組の染色体ハイブリッド形成プローブとヒト患者から得た生体試料を、試料中に染色体がある場合、プローブの染色体へのハイブリッド形成を可能にするのに十分な条件下において、接触させる段階であって、（ｉ）１つのプローブが、試料中の細胞におけるヒト染色体遺伝子座１０ｑ２３．３のコピー数を検出するように設計され、かつ、（ｉｉ）１つのプローブが、試料中の細胞におけるヒト染色体遺伝子座３ｑ２６．３のコピー数を検出するように設計される、段階と、
（ｂ）ヒト染色体遺伝子座１０ｑ２３．３、およびヒト染色体遺伝子座３ｑ２６．３の各々のコピー数を決定する段階と、
（ｃ）正常な各々のコピー数に対し、１０ｑ２３．３の損失、および３ｑ２６．３の増加のコピー数プロファイルを有するかについて、段階（ｂ）の結果に基づいて試料を分類する段階と、
（ｄ）正常な各々のコピー数に対し、１０ｑ２３．３の損失、および３ｑ２６．３の増加が検出された場合に、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性阻害剤、またはチロシンキナーゼ阻害剤と同様に機能する薬剤による治療に抵抗を示すヒト患者であると分類する段階、
を含む、方法。
【請求項１６】
生体試料が肺生検試料である、請求項１５の方法。
【請求項１７】
生体試料が、過去に非小細胞肺癌を有すると診断された患者からのものである、請求項１５の方法。
【請求項１８】
プローブのうちの１つが、遺伝子座１０ｑ２３．３のＰＴＥＮ遺伝子中に存在する少なくとも１つの核酸配列とハイブリッド形成するように設計される、請求項１５の方法。
【請求項１９】
プローブのうちの１つが、遺伝子座３ｑ２６．３のＰＩＫ３ＣＡ遺伝子中に存在する少なくとも１つの核酸配列とハイブリッド形成するように設計される、請求項１５の方法。
【請求項２０】
プローブのうちの１つが、遺伝子座１０ｑ２３．３のＰＴＥＮ遺伝子中に存在する少なくとも１つの核酸配列とハイブリッド形成するように設計され、かつ、プローブのうちの１つが、遺伝子座３ｑ２６．３のＰＩＫ３ＣＡ遺伝子中に存在する少なくとも１つの核酸配列とハイブリッド形成するように設計される、請求項１５の方法。
【請求項２１】
１０ｑ２３．３の損失のコピー数プロファイルが、細胞の２０％以上がＰＴＥＮの２未満のコピーを有するという決定を含む、請求項１５の方法。
【請求項２２】
１０ｑ２３．３の損失のコピー数プロファイルが、試料中の評価可能な細胞の４０％以上がＰＩＫ３ＣＡの２より多いコピーを有するという決定を含む、請求項１５の方法。
【請求項２３】
ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性阻害剤、またはチロシンキナーゼ阻害剤と同様に機能する薬剤がゲフィチニブである請求項１の方法。
【請求項２４】
ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性阻害剤、またはチロシンキナーゼ阻害剤と同様に機能する薬剤がゲフィチニブである請求項１５の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年７月９日に出願された米国仮出願番号６１／２２４，２８１（その全体が参照により本明細書中に組み込まれている。）の優先権を主張する。
【０００２】
エキソン１９と２１におけるＥＧＦＲ突然変異、および高いＥＧＦＲコピー数は、ＮＳＣＬＣ患者におけるＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）に対する感度の増加に関係し、ＫＲＡＳ突然変異、ＭＥＴ発現、およびＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ突然変異は、抵抗に関連している。臨床前モデルでは、ＥＧＦＲ下流マーカーは、ＥＧＦＲの感度または抵抗において重要であった。本研究では、発明者らは、ゲフィチニブで治療された患者の結果に対する、異常なＰＴＥＮおよびＰＩＫ３ＣＡ遺伝子コピー数の影響について調査した。
【０００３】
方法：ホルマリン固定パラフィンを埋め込んだ組織、および８１人のゲフィチニブＮＳＣＬＣ患者からの細胞ペレットを、ＥＧＦＲ、ＰＴＥＮ、ＰＩＫ３ＣＡ、動原体（ｃｅｎ）３、７および１０に特異的なプローブによる蛍光原位置ハイブリッド形成（ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（ＦＩＳＨ）によって分析した。７２の試料が、６つのプローブすべてにおいて結果を生じた。患者は、過去に少なくとも１つの化学療法レジメンで治療されたか、または化学療法に不適格であると考えられた。ＦＩＳＨシグナルを、試料当たり４０個以上の細胞で計測して、各遺伝子座のコピー数を得た。種々の分類子は、ゲノムのコピー数に由来し、また、一連の遮断値を適用して、目的反応（ＯＲ）、無増悪生存率（ＰＦＳ）および粗生存率（ＯＳ）によって患者を分類した。試料のうち５５のＥＧＦＲ突然変異状態（エキソン１９および２１）が得られた。
【０００４】
結果：ＰＴＥＮの損失（ＰＴＥＮの２未満のコピーを有する細胞の２０％以上）、および低いｃｅｎ７コピー数（平均ｃｅｎ７コピー／４個未満の細胞）はそれぞれ、低いＯＳと有意に関連し、また、高いＰＩＫ３ＣＡコピー数（ＰＩＫ３ＣＡの２より多いコピーを有する細胞の４０％以上）、および低いＥＧＦＲコピー数（ＥＧＦＲの２より多いコピーを有する７５％未満の細胞）は、低いＯＳの傾向を示した。ＰＴＥＮと高いＰＩＫ３ＣＡコピー数を合わせた損失、または高いＰＩＫ３ＣＡコピー数、ＰＴＥＮの損失と、低いＥＧＦＲコピー数もしくは低いｃｅｎ７コピー数のいずれかとの３つの方法の組合せは、低いＯＳと低いＰＦＳに有意に関係していた。２２人の患者（３１％）は、高いＰＩＫ３ＣＡコピー数、ＰＴＥＮの損失、および低いｃｅｎ７コピー数の腫瘍を有していた。また、これらの患者は、他の５０人の患者での、第３７３日目と比較して、中間の第１３２日目のＯＳ（ｐ＜０．０００１のカプラン−マイヤー分析、ログランクテスト）、第１２８日目と比較して、中間の第６２日目のＰＦＳ（ｐ＝０．０００７）、および２２％と比較して、０％のＯＲ（ｐ＝０．０１５、両側のフィッシャーの正確な検定）を示した。ＥＧＦＲ突然変異を有しない３７人の患者では、分類子は、依然として有意であった（中間ＯＳ：第１２８日目対第３８０日目、ｐ＜０．０００１、中間ＰＦＳ：第６２日目対第１０２日目、ｐ＝０．０１９）。ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮおよびｃｅｎ７  ＦＩＳＨ状態、性別、組織学およびＥＧＦＲ突然変異状態を含む多変量解析では、３つのＦＩＳＨパラメーターはすべて、依然として、有意にＯＳと関係していた。
【０００５】
結論：これらのデータは、ゲフィチニブが、比較的高いＰＴＥＮの損失およびＰＩＫ３ＣＡの増加、低いレベルのＥＧＦＲまたはｃｅｎ７を有する腫瘍、ならびに十分な研究グループまたはＥＧＦＲ突然変異のないサブグループのいずれかにおいて、比較的効果がないことを示す。後の研究で確認されれば、ＥＧＦＲ  ＴＫＩ’ｓとの併用で選択される薬剤を潜在的に含む代替治療を、腫瘍にこのプロファイルがある患者に考慮する必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の方法は、ＥＧＦＲ受容タンパク質の小分子阻害剤である、ゲフィチニブなどのチロシンキナーゼ阻害剤に対する反応を示す、個別のコピー数プロファイルによって、癌患者または癌の疑いのある患者の組織試料を分類するのに使用する、臨床検査室分析である。本発明は、好ましくは、２または３つのヒト染色体遺伝子座：１０ｑ２３．３、３ｑ２６．３と染色体７、好ましくはその動原体または遺伝子座７ｐ１２のいずれかでコピー数を決定するのに染色体ハイブリッド形成プローブを使用する、蛍光原位置ハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）に基づいた原位置ハイブリッド形成分析の使用である。肺組織試料中の細胞におけるこれらの遺伝子座のコピー数の決定を用いて、チロシンキナーゼ阻害剤に対する抵抗または反応のいずれかを示す、コピー数プロファイルを有するものとして、試料を分類することができる。好ましい実施形態では、これらの遺伝子座の正常なコピー数と比較して、１０ｑ２３．３の相対的損失、３ｑ２６．３の相対的増加、および染色体７の比較的低いコピー数を有すると決定された組織試料は、これらの阻害剤に対する抵抗を示す、１０ｑ２３．３の損失、３ｑ２６．３の増加、および低いコピー数の染色体７のコピー数プロファイルを有するものとして分類される。試料が、これらの遺伝子座の他のコピー数プロファイルを有するものとして分類される場合、プロファイルは、これらの阻害剤に対する感度または反応を示す。別の好ましい実施形態では、コピー数プロファイルは、２つの遺伝子座、１０ｑ２３．３および３ｑ２６．３である。本発明は、ＥＧＦＲ経路における遺伝子のチロシンキナーゼ阻害剤のすべての形態で有用であると考えられる。また、コピー数プロファイル分類が、組織試料のＥＧＦＲ突然変異状態に依存しないので、本発明は重要である。
【０００７】
また、コピー数プロファイルが、特定の染色体異常（すなわち、１０ｑ２３．３の損失、または３ｑ２６．３の増加）を有するものとして、比較的広範囲の割合の評価が可能な試料中の細胞において統計的に有意であったので、本発明は有利である。１０ｑ２３．３の損失において、細胞の範囲は、相対的損失を示す、評価された細胞の約１３％から約３５％であり、好ましくは約２０％である。３ｑ２６．３の増加においては、細胞の範囲は、相対的増加を示す、評価された細胞の約２０％から約６２．５％であり、好ましくは約４０％である。染色体７コピー数の測定では、染色体７コピー数のロバスト統計結果が、評価された細胞の約２．７から約５．１の範囲、好ましくは、細胞当たり約４のコピーであることを示した。
【０００８】
本発明で使用するに適した原位置ハイブリッド形成染色体プローブには、共通の譲受人で同時係属する、米国特許出願「Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」（Ｌ．Ｅ．ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＪ．Ｓ．Ｃｏｏｎ、２００７年５月８日出願、ＵＳ２００７０２７５４０３Ａ１として公表。その全体が参照により本明細書中に組み込まれている。）に記載された、ＥＧＦＲおよび染色体７動原体プローブが含まれる。ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子座のコピー数の決定に使用するのに適した原位置ハイブリッド形成染色体プローブは、同時係属し共通の譲受人である米国特許出願、シリアル番号１２／２６８，７９７「Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  Ｅａｒｌｙ  Ｓｔａｇｅ  Ｎｏｎ  Ｓｍａｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ」（Ｌ．Ｅ．ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＪ．Ｓ．Ｃｏｏｎ、２００８年１１月１１日出願。その全体が参照により本明細書中に組み込まれている。以下「Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＩＩ」とする。）に記載の方法を使用して製造することができる。ここで、「Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＩＩ」は、ＰＩＫ３ＣＡの遺伝子座で核酸配列を有するヒト挿入ＤＮＡを含む、クローンから開始する。また、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＩＩ出願は、本明細書で使用するＰＴＥＮ遺伝子座とハイブリッド形成するように設計された、適切なプローブを記載する。本明細書中の有用なプローブは、ＤＮＡ系プローブに限定されず、ペプチド核酸系プローブを含む。本発明のコピー数プロファイルを決定するために使用する原位置ハイブリッド形成法は、同時係属中の米国特許出願に記載されている。各染色体遺伝子座のコピー数は、好ましくは、マニュアル式の、またはデジタル画像ソフトウエアに基づく方法を用いた、標準ＦＩＳＨ画像解析によって決定する。