(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）の構造を持つベルベノン誘導体または薬学的に許容可能なその塩を有効成分として含有する退行性脳疾患の予防または治療用薬学組成物：
【化１】
0005934839.tif 000011
前記式で、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、それぞれ独立して水素原子、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩから選択されたハロゲン原子、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ３アルキル基、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ基、アミノ基、Ｃ１〜Ｃ３アルキルアミン基、Ｃ１〜Ｃ３アルキルジアミン基、炭素数５〜８の芳香環、炭素数５〜８のシクロ環、及び炭素数５〜８のヘテロ芳香環で構成された群から選択された一つ以上の置換基であり、
Ｘ、Ｙ及びＺは、それぞれ独立して炭素原子またはＮ、Ｏ及びＳ原子で構成された群から選択された一つ以上のヘテロ原子であり、
0005934839.tif 000012
は、二重結合または単一結合を意味する。
【請求項２】
前記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５はそれぞれ独立して水素原子、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩから選択されたハロゲン原子、ヒドロキシ基、メチル基、エチル基、メトキシ基、エトキシ基、アミノ基、炭素数５〜６の芳香環、炭素数５〜６のシクロ環、及び炭素数５〜６のヘテロ芳香環で構成された群から選択された一つ以上の置換基であることを特徴とする請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項３】
前記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５はそれぞれ独立してＦ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩから選択されたハロゲン原子、ヒドロキシ基、メチル基、メトキシ基、フェニル基、ピロール基、及びピリジン基で構成された群から選択された一つ以上の置換基であることを特徴とする請求項２に記載の薬学組成物。
【請求項４】
前記Ｘ、Ｙ及びＺはそれぞれ独立して炭素原子及びＮ原子で構成された群から選択された一つ以上の原子であることを特徴とする請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項５】
前記薬学組成物は、次のような化合物群から選択される化合物を含むことを特徴とする請求項１に記載の薬学組成物：
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（４−ヒドロキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ａ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（４−ヒドロキシ−２−メトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｂ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（３，４−ジヒドロキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクルロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｃ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（３−ブロモ−４−ヒドロキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｄ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（４−ヒドロキシ−２，６−ジメトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｅ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（３，４−ジヒドロキシ−５−メトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｆ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（３−ヒドロキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｇ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（２−ヒドロキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｈ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（２−ヒドロキシ−４−メトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｉ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−６，６−ジメチル−４−スチリルビシクルロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ａ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（４−フルオロスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｂ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（４−メトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｃ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（２−（ビフェニル−４−イル）ビニール）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｄ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（４−（１Ｈ−ピロール−１−イル）スチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｅ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（３，４−ジメトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｆ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（３，５−ジメトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｇ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（２，５−ジメトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｈ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（５−ブロモ−２−メトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｉ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−６，６−ジメチル−４−（（Ｅ）−２−（ピリジン−２−イル）ビニール）ビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（５ａ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−６，６−ジメチル−４−（（Ｅ）−２−（ピリジン−３−イル）ビニール）ビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（５ｂ）；及び
（１Ｓ，５Ｒ）−６，６−ジメチル−４−（（Ｅ）−２−（ピリジン−４−イル）ビニール）ビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（５ｃ）。
【請求項６】
前記退行性脳疾患は、脳卒中、中風、痴呆、アルツハイマー疾患、パーキンソン疾患、またはハンチントン疾患であることを特徴とする請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項７】
前記退行性脳疾患は、脳卒中であることを特徴とする請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項８】
下記一般式（１）の構造を持つベルベノン誘導体または薬学的に許容可能なその塩を有効成分として含有する退行性脳疾患の予防または改善用健康機能食品：
【化２】
0005934839.tif 000013
前記式で、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、それぞれ独立して水素原子、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩから選択されたハロゲン原子、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ３アルキル基、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ基、アミノ基、Ｃ１〜Ｃ３アルキルアミン基、Ｃ１〜Ｃ３アルキルジアミン基、炭素数５〜８の芳香環、炭素数５〜８のシクロ環、及び炭素数５〜８のヘテロ芳香環で構成された群から選択された一つ以上の置換基であり、
Ｘ、Ｙ及びＺは、それぞれ独立して炭素原子またはＮ、Ｏ及びＳ原子で構成された群から選択された一つ以上のヘテロ原子であり、
0005934839.tif 000014
は、二重結合または単一結合を意味する。
【請求項９】
前記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５はそれぞれ独立して水素原子、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩから選択されたハロゲン原子、ヒドロキシ基、メチル基、エチル基、メトキシ基、エトキシ基、アミノ基、炭素数５〜６の芳香環、炭素数５〜６のシクロ環、及び炭素数５〜６のヘテロ芳香環で構成された群から選択された一つ以上の置換基であることを特徴とする請求項８に記載の健康機能食品。
【請求項１０】
前記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５はそれぞれ独立してＦ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩから選択されたハロゲン原子、ヒドロキシ基、メチル基、メトキシ基、フェニル基、ピロール基、及びピリジン基で構成された群から選択された一つ以上の置換基であることを特徴とする請求項９に記載の健康機能食品。
【請求項１１】
前記Ｘ、Ｙ及びＺはそれぞれ独立して炭素原子及びＮ原子で構成された群から選択された一つ以上の原子であることを特徴とする請求項８に記載の健康機能食品。
【請求項１２】
前記健康機能食品は、次のような化合物群から選択される化合物を含むことを特徴とする請求項８に記載の健康機能食品：
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（４−ヒドロキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ａ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（４−ヒドロキシ−２−メトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｂ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（３，４−ジヒドロキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクルロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｃ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（３−ブロモ−４−ヒドロキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｄ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（４−ヒドロキシ−２，６−ジメトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｅ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（３，４−ジヒドロキシ−５−メトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｆ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（３−ヒドロキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｇ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（２−ヒドロキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｈ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（２−ヒドロキシ−４−メトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｉ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−６，６−ジメチル−４−スチリルビシクルロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ａ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（４−フルオロスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｂ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（４−メトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｃ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（２−（ビフェニル−４−イル）ビニール）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｄ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（４−（１Ｈ−ピロール−１−イル）スチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｅ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（３，４−ジメトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｆ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（３，５−ジメトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｇ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（２，５−ジメトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｈ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（５−ブロモ−２−メトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｉ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−６，６−ジメチル−４−（（Ｅ）−２−（ピリジン−２−イル）ビニール）ビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（５ａ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−６，６−ジメチル−４−（（Ｅ）−２−（ピリジン−３−イル）ビニール）ビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（５ｂ）；及び
（１Ｓ，５Ｒ）−６，６−ジメチル−４−（（Ｅ）−２−（ピリジン−４−イル）ビニール）ビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（５ｃ）。
【請求項１３】
前記退行性脳疾患は、脳卒中、中風、痴呆、アルツハイマー疾患、パーキンソン疾患、またはハンチントン疾患であることを特徴とする請求項８に記載の健康機能食品。
【請求項１４】
前記退行性脳疾患は、脳卒中であることを特徴とする請求項１３に記載の健康機能食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ベルベノン誘導体の新しい用途である退行性脳疾患治療用用途に関し、より詳細には興奮細胞毒性による神経細胞死滅抑制、酸化的ストレス抑制及び血管内炎症性細胞（大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）と好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ））等の脳損傷部位での移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）または浸潤（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）に対する抑制活性を持つベルベノン誘導体またはその塩を含有する組成物で、退行性脳疾患の予防または治療用薬学組成物及び前記組成物を利用した退行性脳疾患の予防または治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
退行性脳疾患（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｂｒａｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）は、脳神経細胞が機能できなくなったため生じる老化と関係する病気であり、老齢化人口の急速な増加と共に、退行性脳疾患に対する社会的関心が大きくなっている。退行性脳疾患は、臨床的に現れる主な症状と犯される脳部位を考慮して区分されて、アルツハイマー症候群（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、パーキンソン症候群（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ハンチントン症候群（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、多発性硬化症及び筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）等が含まれる。
【０００３】
退行性脳疾患は、脳神経界の情報伝達に最も重要な脳神経細胞の死滅、脳神経細胞と脳神経細胞との間の情報を伝達するシナプスの形成や機能上の問題、脳神経の電気的活動性の異常的症状や減少によるものと知られているが、未だに根源的な治療が難しく、発病原因も明かされていない状態である。
【０００４】
最近細胞分子学的技術水準の向上で退行性脳疾患の原因糾明及び治療剤開発が活発に進行中であり、退行性脳疾患治療剤開発研究は、（１）コリン作用の抑制、（２）ＮＭＤＡ（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ）受容体拮抗機序、（３）β−ａｍｙｌｏｉｄまたはタウ（Ｔａｕ）タンパク質代謝過程の分子・細胞生物学的研究、β−ａｍｙｌｏｉｄの原因タンパク質を抗原にしたワクチン開発と治療抗体の開発、（４）神経栄養因子（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）の発現誘導、（５）原因タンパク質による神経細胞の酸化的損傷を抑制できる抗酸化剤開発及び（６）炎症細胞の過度な流入及び活性による炎症反応を抑制できる抗炎症剤開発など多角度の機序で研究されている（Sonkusare et al., Pharmacological Research, 51(1), 1-17, 2005; Stanaione et al., Ann 1st Super Sanita, 47(1), 49-54, 2011; Halperin et al., Neurotherapeutics, 6(1), 128-140, 2009）。
【０００５】
コリン作用の抑制剤であるＡＣｈＥ抑制剤は、ＡＣｈの分解を抑制してコリン性神経伝達物質の活性を回復させるもので、現在タクリン（ｔａｒｃｒｉｅｎ）、ドネペジル（ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ）、リバスチグミン（ｒｉｖａｓｔｉｇｍｉｎｅ）、ガランタミン（ｇａｌａｎｔｈａｍｉｎｅ）がＦＤＡ承認を受けて市販中にある。
【０００６】
酸化的ストレスは、アルツハイマー症候群、パーキンソン症候群、ハンチントン症候群のような中枢神経系の退行性脳疾患の重要な要因と明らかになった（Jin DQ et al, Biochemical and Biophysical Research Communications, 331, 1264-1269, 2005; Lim CS et al, Biological and Pharmaceutical Bulletin, 29, 1212-1216, 2006）。
【０００７】
虚血性血管疾患患者（心筋梗塞、脳卒中、血栓症）は、世界的に２００７年に２，５００万人であり、２０１７年には２，８００万人と持続的に増加すると予測されて（ＤａｔａＭｏｎｉｔｏｒ、２００７）多くのＯＥＣＤ会員国で、虚血性血管疾患（１０万人当たり２２６．６人、２００４年）による死亡原因が最も多く、癌疾患（１６５．６人）がその次であった。脳卒中は、脳の血管破裂による脳組織損傷が特徴とされる出血性脳卒中と、脳に供給される血流の流れが遮断されて脳梗塞が誘発される虚血性脳卒中で区別され、脳卒中は、年度によって異なるが、癌と共に国内死亡原因の１、２位を争う非常に発病頻度が高い疾患であり（統計庁２００２から２００８年までの資料）脳卒中による国内死亡率はＯＥＣＤ国のうち２位になっている。２００８年米国心臓学会（ＡＨＡ）の報告によると、これらの虚血性血管疾患の治療及び管理のために脳卒中に年間６５５億ドルの莫大な費用が支出されているが、脳卒中治療剤市場は１３億ドルに過ぎない実情である。したがって、数年内に効果が立証された脳卒中治療薬品が市販される場合に２２０億ドル以上の潜在市場価値を持っている虚血性脳卒中治療剤の研究開発努力が活発に行われている。
【０００８】
我が国の場合、脳卒中は単一疾患で死亡原因第１位を占めることによって、米国、カナダ、オーストラリアなどの先進国に比べて高いことが明らかになって、脳卒中は運動、感覚機能の損傷、及び記憶、学習、演算、推理など高次機能の阻害を引き起こして、生活の質を破壊して患者が死亡に達する時まで本人とその家族に多くの精神的、肉体的苦痛を引き起こして、また現代社会の老齢化傾向で、老人人口が急速に増加しており、最近の傾向を見ると、脳卒中発生と発生後生存期間の増加は大きい社会的問題となっている。したがって、脳卒中に対する症状軽減及び治療薬物の開発が求められている。
【０００９】
しかし、前述したように、脳卒中の臨床的な重要性と大きい市場などにもかかわらず、脳卒中に対する治療剤開発は依然として不十分であり、臨床的に許された脳卒中の治療剤はｔｉｓｓｕｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ｔ−ＰＡ）を除いてはないのが現状である。脳卒中は、様々な原因によって発生して、脳梗塞、脳出血、くも膜下出血など、原因疾患がそれぞれ異なる多様な疾患を包括する。また、脳卒中は、動脈硬化、アミロイド脳血管病症、動脈剥離などの多様な脳血管疾患によって誘発され、不整脈や冠状動脈疾患によって心因性塞栓症によっても脳卒中が発生する。このように原因は様々であるが、細胞生物学的には血液供給の低下とこれによる細胞死滅の誘発という同じ機序と思われているので、虚血による脳細胞の死滅機序に対する理解は、脳卒中の予防、調節及び治療法開発の基盤になる重要な技術である。
【００１０】
国内外的に多くの研究者たちがこのような神経細胞の死滅に対する機序を研究することによって、脳疾患を防ごうと努力してきた。脳卒中の場合に、現在明確な治療剤が開発されておらず、臨床的には脳血管に生成された血栓を溶解するために用いられている唯一の治療剤であるｔ−ＰＡも多くの臨床医が、脳出血などの副作用を憂慮して使用を敬遠している。今まで多くの研究者たちが、興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸受容体に対する拮抗剤や抗酸化剤を虚血性脳卒中治療剤として開発しようとしたが、薬効が微小だったり薬の毒性があったりしたため、いずれも失敗に終わっている。
【００１１】
患者が脳卒中発生後病院救急室に到着するまで数時間が過ぎるのが通常であり、脳卒中の発生後数分から数時間内に神経細胞は過度なグルタミン酸の遊離による興奮性神経毒性によって一次損傷を受けて、時間が過ぎると酸素及び窒素ラジカルの過度な生成に暴露されて二次的損傷を受けることになる。数十時間が経つと、炎症反応によって持続的で激しい損傷を受けることになり、したがって興奮性神経毒性遮断物質の使用は現実的に難しいので、臨床的に無意味である。前述した通り、脳卒中は単一原因で引き起こされる疾患でなく多様な細胞死滅の経路と機序により脳損傷を起こす疾患である。最近互いに異なる機序を持つ薬の複合処方による脳卒中治療相乗作用を得ようと試みられている。例えば、アスピリンとｄｉｐｙｒｉｄａｍｏｌｅを共に投与する場合に、アスピリン単独投与に比べて脳卒中治療の予後を良くし（Chatuvedi S., Clin Therap, 30(7), 1196-205, 2008）また、１７β−ＥｓｔｒａｄｉｏｌとｔＰＡの複合処方は、１７β−ＥｓｔｒａｄｉｏｌがｔＰＡ投与によるｕｒｏｋｉｎａｓｅ、ＭＭＰ２、及びＭＭＰ９の発現増加で生じる脳出血の副作用を減らすことによって、虚血性脳卒中患者で治療時間を増やすことができる効果を示した（Liu R. et al., J Pharmacol Exp Ther, 332(3), 1006-12, 2010）。ＮＭＤＡ受容体遮断物質であるメマンチン（Ｍｅｍａｎｔｉｎｅ）とベータアドレナリンｂｅｔａ２受容体アゴニストであるＣｌｅｎｂｕｔｅｒｏｌの複合投与は、永久的局所虚血モデルで虚血性脳損傷を抑制する効果を相乗的に示しており（Culmsee C. et al., Stroke, 35(5), 1197-202, 2004）またメマンチンとカルシウムイオン遮断物質であるＴｏｐｉｒａｍａｔｅの複合投与は、新生ラットで低酸素症による脳損傷を相乗的に抑制した（Lie C. et al., Brain Res, 1282, 173-82, 2009）。しかしこのような研究結果は、多くは症状を緩和させるのが目的であり、脳組織保護機序に基づいた相乗的効果は得られなかった。
【００１２】
虚血による脳組織の損傷を理解して、これを抑制するための薬を開発するためには、虚血後脳組織の損傷機序と経路を理解しなければならない。一般に、虚血後脳細胞の損傷や死滅は、非常に多様な原因によって引き起こされる。例えば、興奮細胞毒性（ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）、周辺−梗塞脱分極、酸化的ストレス、及び炎症などが虚血による脳損傷の進行と関連があると知られている（Dirnagl et al., Trends Neurosci., 22, 391-397, 1999）。したがって、虚血性脳損傷の複雑な要因の非常に多様で、一時的な様子（例えば、発病及び疾患程度）を理解して病理生態学的カスケード（ｃａｓｃａｄｅ）を適切に遮断することが必要である。
【００１３】
興奮性細胞毒性による神経細胞死滅は、グルタミン酸受容体拮抗剤によって抑制され、グルタミン酸が作用するイオン性受容体はＡＭＰＡ（α−ａｍｉｎｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｉｓｏ−ｘａｚｏｌｅｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ｋａｉｎａｔｅ、ＮＭＤＡ（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ）の受容体であり、特にＮＭＤＡ受容体活性に対する細胞死滅が多く研究された（Standridge J.B., Clin.Ther., 26(5), 615-630, 2004）。しかし、このような努力に比べてＮＭＤＡ受容体遮断剤は薬効が微小であったり、毒性があったりして、臨床試験に成功した事例がない。ＮＭＤＡ受容体遮断剤であるＭＫ−８０１は、虚血性脳損傷を顕著に減少させたが、治療可能時間域（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔｉｍｅ  ｗｉｎｄｏｗ）が非常に狭いとの大きい短所があって、ＭＫ−８０１は、ラット及びジャービル（ｇｅｒｂｉｌｓ）で誘発された局所的虚血症の発病後1時間以内に投与してのみ神経細胞保護効果が示された（Margaill et al., J Cereb Blood Flow Metab, 16, 107-113, 1996; Hatfield RH et al., Eur J Pharmacol, 216, 1-7, 1992）。また、ＭＫ−８０１は虚血症以後神経細胞死を遅延させたが治療数週後神経回復または最終生存率を改善させられなかった（Valtysson J. et al., Acta Neurochir (Wien), 129, 58-63, 1994; Von Lubitz DK et al., Eur J Pharmacol, 233, 95-100, 1993）。興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸の受容体中にはＮＭＤＡ受容体と共にＡＭＰＡ受容体があり、このＡＭＰＡ受容体に対する拮抗剤もＭＣＡＯ２８日後に神経学的欠損の有意的な保護効果を示さなかった（Colbourne F et al., Stroke, 30, 662-668, 1999）。ＮＭＤＡまたはＡＭＰＡ受容体拮抗剤の短い治療学的範囲及び短期間治療効果は、このような受容体が単に初期虚血症カスケードで一時的な役割だけすることを意味して、拮抗剤による影響を受けない他の病態生理学的過程が後期脳虚血損傷に寄与することと見なされる。
【００１４】
他の多様な退行性疾患と同様に虚血性脳卒中で酸化的ストレスは、細胞の死滅や機能喪失に非常に大きい影響を及ぼす。したがって、抗酸化剤を利用した虚血性脳卒中に対する治療効果に対する研究が活発に行われている（Salama M. et al., Co-Enzyme Q10 to Treat Neurological Disorders: Basic Mechanisms, Clinical Outcomes, and Future Research Direction. CNS Neurol Disord Drug Targets. 2013; Rodrigo R. et al., Oxidative Stress and Pathophysiology of Ischemic Stroke: Novel Therapeutic Opportunities. CNS Neurol Disord Drug Targets. 2013）。日本の場合、脳卒中治療剤として坑酸化効果を主機序とするＥｄａｒａｖｏｎｅが市販されている（Firuzi O et al., Curr Med Chem., 18（25), 3871-88, 2011; Yoshida H. et al., CNS Drug Rev., 12(1), 9-20. 2006）。
【００１５】
虚血後興奮性細胞毒性が始まった後、数時間が過ぎれば脳損傷部位で炎症反応が始まってこれは数日〜数週間持続して脳損傷をより一層悪化させることになる。したがって、最近では抗炎症剤を利用した虚血性脳卒中に対する治療への試みは非常に活発になされている（Price CJ et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry, 74, 1476-1484, 2003; Salama M, Co-Enzyme Q10 to Treat Neurological Disorders: Basic Mechanisms, Clinical Outcomes, and Future Research Direction. CNS Neurol Disord Drug Targets. 2013; Rodrigo R. et al., Oxidative Stress and Pathophysiology of Ischemic Stroke: Novel Therapeutic Opportunities. CNS Neurol Disord Drug Targets. 2013）。また、最近では血管から流入して入ってきた炎症細胞が虚血性脳卒中で脳損傷の増大に重要な役割を果たすと報告されている（Kang GH et al., J Neurol Sci., 15, 318(1-2), 25-30, 2012; Choi IYet al., Am J Pathol, 179(4), 2042-52, 2012; Choi YK et al., Free Radic Res., 44(8), 925-35, 2010; Choi IY et al., Free Radic Res., 44(5), 541-51, 2010; Lee JC et al., Glia, 50(2), 168-81, 2005）。またｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ  Ｂ２受容体を介した抗炎症反応が虚血性脳組織の損傷を抑制すると報告された（Choi IY et al., Am J Pathol, 182(3), 928-39, 2013）。
【００１６】
したがって、多様な細胞保護作用を持つ薬の開発は、脳卒中の完全な治療のために必須といえる。このような目的を達成するために、すなわち多様な細胞保護機序を持つ物質（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｄｒｕｇ）の開発のために本発明者は（１Ｓ）−（−）−ベルベノン（ｖｅｒｂｅｎｏｎｅ）の誘導体を開発した。（１Ｓ）−（−）−ベルベノンは、キクイムシによって宿主である木樹脂前駆体であるａ−ピネン（ｐｉｎｅｎｅ）から生成される天然抗−凝集フェロモン（ａｎｔｉ−ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｐｈｅｒｏｍｏｎｅ）である。（１Ｓ）−（−）−ベルベノンを含有した精油は、坑菌作用、駆虫作用などといった生物学的活性を示すことが報告された（Bernarde WA, Z Naturforsch C, 65, 588-93, 2010; Martinez-Velazquez M., J Med Entomol, 48, 822-827, 2011）。またＷＯ２０００／６３１５９には、ベルベノン［（１Ｓ，５Ｓ）−４，６，６−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｂｉｃｙｃｌｏ［３．３．３］ｈｅｐｔ−３−ｅｎ−２ｏｎｅ）］及びこれの誘導体が気道の抗炎症効果があることが開示されている。
【００１７】
しかし、前記文献のどこにもベルベノン誘導体の神経細胞死滅及び酸化的ストレスの減少、脳虚血性損傷阻害効果及び炎症性細胞の移動に対する阻害効果に対することが全く開示も暗示もされていない。
【００１８】
そこで、本発明者等は、神経細胞死滅及び酸化的ストレスの減少、脳虚血性損傷及び炎症反応に及ぼすベルベノン誘導体の効果を知るために、低酸素性−虚血性ラットモデルを使ってＮＭＤＡ−誘導興奮細胞毒性及び細胞死を測定し、坑酸化活性に対する実験を行ってベルベノン誘導体が退行性脳疾患治療効果があることを最初に確認した。より詳細には、本発明のベルベノン誘導体が神経細胞死及び酸化的ストレス減少し、さらにｉｎ ｖｉｖｏ実験結果、優秀な脳虚血性損傷及び炎症反応に対する阻害効果を示すことを確認して、本発明を完成することになった。
【発明の概要】
【００１９】
本発明の目的は、退行性脳疾患予防及び治療効果を持つベルベノン誘導体の新規用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
前記目的を達成するために、本発明は下記一般式（１）の構造を持つベルベノン誘導体または薬学的に許容可能なその塩を有効成分として含有する退行性脳疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する:
【化１】
0005934839.tif 000002
前記式で、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、それぞれ独立して水素原子、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩから選択されたハロゲン原子、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ３アルキル基、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ基、アミノ基、Ｃ１〜Ｃ３アルキルアミン基、Ｃ１〜Ｃ３アルキルジアミン基、炭素数５〜８の芳香環、炭素数５〜８のシクロ環、及び炭素数５〜８のヘテロ芳香環で構成された群から選択された一つ以上の置換基であり、
Ｘ、Ｙ及びＺは、それぞれ独立して炭素原子またはＮ、Ｏ及びＳ原子で構成された群から選択された一つ以上のヘテロ原子であり、
0005934839.tif 000003
は、二重結合または単一結合を意味する。
【００２１】
本発明において、前記ベルベノン誘導体は、神経細胞死及び酸化的ストレスを減少させて脳虚血性損傷を抑制して炎症性細胞の移動を抑制することを特徴とする。
【００２２】
本発明において、前記退行性脳疾患は、脳卒中、中風、痴呆、アルツハイマー疾患、パーキンソン疾患、またはハンチントン疾患、具体的には、脳卒中、血管性痴呆及びアルツハイマー痴呆、より好ましくは、脳卒中、さらに好ましくは、虚血性脳卒中疾患を含むことを特徴とする。
【００２３】
本発明において、前記組成物は、薬学組成物の製造に通常用いられる適切な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含むことを特徴とする。
【００２４】
本発明において、前記組成物は、カルシウムチャネル遮断剤、抗酸化剤、グルタミン酸拮抗剤、抗凝固剤、抗高血圧剤、抗血栓剤、抗ヒスタミン剤、消炎鎮痛剤、抗癌剤及び抗生剤からなる群で選択された一つ以上の薬剤と共に製剤化したり併用して用いることを特徴とする。
【００２５】
本発明は、前記一般式（１）の構造を持つベルベノン誘導体または薬学的に許容可能なその塩の退行性脳疾患の予防または治療のための用途を提供する。
【００２６】
本発明は、前記一般式（１）の構造を持つベルベノン誘導体または薬学的に許容可能なその塩を利用して退行性脳疾患を予防または治療する方法を提供する。
【００２７】
本発明は、前記一般式（１）の構造を持つベルベノン誘導体または薬学的に許容可能なその塩を対象に処理（投与）する工程を含む退行性脳疾患を予防または治療する方法を提供する。
【００２８】
本発明はまた、前記一般式（１）の構造を持つベルベノン誘導体を有効成分として含有する退行性脳疾患の予防または改善用健康機能食品を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の化合物誘導体によるラット皮質神経細胞保護作用を示した図である。
【図２】本発明の化合物誘導体によるＮＭＤＡ−誘導興奮性毒性に対する効果を示した図である。
【図３】本発明の化合物誘導体による細胞内酸化的ストレス抑制効果を示した図である。
【図４】本発明の化合物誘導体による生体内局所脳虚血症モデルでの虚血性損傷、脳浮腫及び神経学的欠損減少効果を示した図である。
【図５】本発明の化合物誘導体による生体内局所脳虚血症モデルでの虚血性損傷脳組織での坑酸化活性増加効果を示した図である。
【図６】本発明の化合物誘導体による生体内局所脳虚血症モデルでの虚血性損傷脳組織での炎症性細胞の移動及び浸潤抑制効果を示した図である。
【図７】本発明の化合物誘導体による体内局所脳虚血症モデルでの虚血性損傷脳組織でのサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）発現抑制効果を示した図である。
【図８】本発明の化合物誘導体による体内局所脳虚血症モデルでの虚血性損傷脳組織周辺の血液脳関門透過性増加抑制効果を示した図である。
【図９】本発明の化合物誘導体による体内局所脳虚血症モデルでの虚血性損傷を受けたラットの長期生存率及び神経学的欠損回復率増進効果を示した図である。
【図１０】本発明の化合物誘導体が、体内出血性脳卒中モデルでの自己血液によって誘導された血腫に対する有意的な増加が見られないことを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
一観点において、本発明は、下記一般式（１）の構造を持つベルベノン誘導体または薬学的に許容可能なその塩を有効成分として含有する退行性脳疾患の予防または治療用薬学組成物に関する：
【化２】
0005934839.tif 000004
前記式で、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、それぞれ独立して水素原子、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩから選択されたハロゲン原子、ヒドロキシ基、Ｃ１〜Ｃ３アルキル基、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ基、アミノ基、Ｃ１〜Ｃ３アルキルアミン基、Ｃ１〜Ｃ３アルキルジアミン基、炭素数５〜８の芳香環、炭素数５〜８のシクロ環、及び炭素数５〜８のヘテロ芳香環で構成された群から選択された一つ以上の置換基であり、
Ｘ、Ｙ及びＺは、それぞれ独立して炭素原子またはＮ、Ｏ及びＳ原子で構成された群から選択された一つ以上のヘテロ原子であり、
0005934839.tif 000005
は、二重結合または単一結合を意味する。
【００３１】
前記一般式（１）に属する化合物群中、好ましくはＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５はそれぞれ独立して水素原子、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩから選択されたハロゲン原子、ヒドロキシ基、メチル基、エチル基、メトキシ基、エトキシ基、アミノ基、炭素数５〜６の芳香環、炭素数５〜６のシクロ環、及び炭素数５〜６のヘテロ芳香環で構成された群から選択された一つ以上の置換基、より好ましくは水素原子、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩから選択されたハロゲン原子、ヒドロキシ基、メチル基、メトキシ基、フェニル基、ピロール基、及びピリジン基で構成された群から選択された一つ以上の置換基である化合物群であり；Ｘ、Ｙ及びＺはそれぞれ独立して炭素原子またはＮ、Ｏ及びＳ原子で構成された群から選択された一つ以上のヘテロ原子、より好ましくは炭素原子及びＮ原子で構成された群から選択された一つ以上の原子である化合物群である。
【００３２】
前記一般式（１）に属する化合物群中最も好ましい化合物は、次のような化合物から選択される；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（４−ヒドロキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ａ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（４−ヒドロキシ−２−メトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｂ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（３，４−ジヒドロキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクルロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｃ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（３−ブロモ−４−ヒドロキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｄ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（４−ヒドロキシ−２，６−ジメトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｅ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（３，４−ジヒドロキシ−５−メトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｆ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（３−ヒドロキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｇ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（２−ヒドロキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｈ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（２−ヒドロキシ−４−メトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｉ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−６，６−ジメチル−４−スチリルビシクルロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ａ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（４−フルオロスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｂ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（４−メトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｃ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（２−（ビフェニル−４−イル）ビニール）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｄ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（４−（１Ｈ−ピロール−１−イル）スチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｅ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（３，４−ジメトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｆ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（３，５−ジメトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｇ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（２，５−ジメトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｈ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−４−（５−ブロモ−２−メトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｉ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−６，６−ジメチル−４−（（Ｅ）−２−（ピリジン−２−イル）ビニール）ビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（５ａ）；
（１Ｓ，５Ｒ）−６，６−ジメチル−４−（（Ｅ）−２−（ピリジン−３−イル）ビニール）ビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（５ｂ）；及び
（１Ｓ，５Ｒ）−６，６−ジメチル−４−（（Ｅ）−２−（ピリジン−４−イル）ビニール）ビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（５ｃ）。
【００３３】
前記一般式（１）で表示される本発明の化合物は、当技術分野で通常の方法により薬学的に許容可能な塩及び溶媒化物で製造されることができる。
【００３４】
薬学的に許容可能な塩は薬学的に許容可能な遊離酸（ｆｒｅｅ  ａｃｉｄ）により形成された酸付加塩が有用である。酸付加塩は通常の方法、例えば化合物を過量の酸水溶液に溶解させて、この塩を水混和性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンまたはアセトニトリルを使って沈殿させて製造する。同モール量の化合物及び水の中の酸またはアルコール（例、グリコールモノメチルエーテル）を加熱して引き続き前記混合物を蒸発させて乾燥させたり、または析出された塩を吸引ろ過させることができる。
【００３５】
この時、遊離酸としては有機酸と無機酸が使用でき、無機酸としては塩酸、リン酸、硫酸、硝酸、酒石酸などが使用できて、有機酸としてはメタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、マレイン酸（ｍａｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、コハク酸、シュウ酸、安息香酸、酒石酸、フマル酸、フェニルグリコール酸、プロピオン酸（ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、クエン酸（ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ）、乳酸（ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）、グリコール酸（ｇｌｙｃｏｌｌｉｃ  ａｃｉｄ）、グルコン酸（ｇｌｕｃｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ガラクツロン酸、グルタミン酸、グルタル酸（ｇｌｕｔａｒｉｃ  ａｃｉｄ）、グルクロン酸（ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、アスパラギン酸、アスコルビン酸、カーボン酸、バニリン酸、ヒドロヨウ素酸などを使うことができる。
【００３６】
また、塩基を用いて薬学的に許容可能な金属塩を作ることができる。アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩は、例えば化合物を過量のアルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物溶液中に溶解して、非溶解化合物塩をろ過した後、余液を蒸発、乾燥させて得る。この時、金属塩としては、特にナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩を製造することが製薬上適して、また、これに対応する銀塩はアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩を適当な銀塩（例えば、硝酸銀）と反応させて得る。
【００３７】
前記一般式（１）の構造を持つ化合物の薬学的に許容可能な塩は、特に指示されない限り、一般式（１）の構造を持つ化合物に存在し得る酸性または塩基性基の塩を含む。例えば、薬学的に許容可能な塩としては、ヒドロキシ基のナトリウム、カルシウム及びカリウム塩が含まれて、アミノ基のその他薬学的に許容可能な塩としては、ヒドロブロマイド、硫酸塩、水素硫酸塩、リン酸塩、水素リン酸塩、二水素リン酸塩、アセテート、サクシネート、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホネート（メシーレート）及びｐ−トルエンスルホネート（トシレート）塩があって、当業界で知られた塩の製造方法や製造過程を介して製造されることができる。
【００３８】
前記一般式（１）の化合物は、当業界に公示された合成方法で製造可能で、下記の反応式に図示された方法によって化学的に合成されることができるが、これらの例に限定されるのではない。
【００３９】
【化３】
0005934839.tif 000006
【００４０】
商用で購入可能な使用可能な（１Ｓ）−（−）−ベルベノン（１）を塩基条件下にヒドロキシル−スチリル基を持つベンズアルデヒド体誘導体（２ａ−ｉ）と縮合反応を行った後に、酸で脱保護化反応を行ってアルコキシまたはブロモ置換基またはフェノール性官能基を持つ多様なベルベノン誘導体（３ａ−ｉ）を製造可能である。
【００４１】
【化４】
0005934839.tif 000007
【００４２】
【化５】
0005934839.tif 000008
【００４３】
さらに他の誘導体の合成法として、商用で購入可能な使用可能な（１Ｓ）−（−）−ベルベノン（１）を前記反応式１と類似する方法を行って多様な官能基を持つ誘導体にスチリル基（ｓｔｙｒｙｌ）を導入して芳香環を持つ多様なベルベノン誘導体（４ａ−ｉ、５ａ−ｃ）を製造可能である。
【００４４】
本発明では、ベルベノン誘導体の新規な効能である退行性脳疾患治療効果を分析するために、ＮＭＤＡ−誘導興奮細胞毒性及び細胞内酸化的ストレスを抑制して、坑酸化活性を増加させて、炎症性細胞の移動及び浸潤を抑制して、サイトカインの発現を抑制することを確認した。前記確認結果を下実施例などに詳細に説明した。
【００４５】
他の観点において、本発明は、前記一般式（１）の構造を持つベルベノン誘導体または薬学的に許容可能なその塩の退行性脳疾患の予防または治療のための用途に関する。
【００４６】
本発明は、前記一般式（１）の構造を持つベルベノン誘導体または薬学的に許容可能なその塩を有効成分として含有する退行性脳疾患の予防または治療用薬学組成物及び前記一般式（１）の構造を持つベルベノン誘導体または薬学的に許容可能なその塩を利用して退行性脳疾患を予防または治療する方法に関する。
【００４７】
一具現例で、前記一般式（１）の構造を持つベルベノン誘導体または薬学的に許容可能なその塩を対象に処理（投与）する工程を含む退行性脳疾患を予防または治療する方法に関する。ここで、前記処理または投与とは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで実行されてもよい。
【００４８】
本発明において、退行性脳疾患は、脳卒中、中風、痴呆、アルツハイマー疾患（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、パーキンソン疾患（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ハンチントン疾患（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、多発性硬化症及び筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）等が含まれて、脳疾患は、脳神経界の情報伝達に最も重要な脳神経細胞の死滅、脳神経細胞と脳神経細胞との間の情報を伝達するシナプスの形成や機能上の問題、脳神経の電気的活動性の異常症状や減少による疾患を意味する。
【００４９】
本発明において、退行性脳疾患は、より好ましくは脳卒中、さらに好ましくは虚血性脳卒中疾患を含むことを特徴とする。
【００５０】
本発明に係る薬学組成物の投与経路は、これらに限定されるものではないが、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下または直腸が含まれる。経口及び非経口投与が望ましい。本願に用いられた用語「非経口」とは、皮下、血内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、硬膜、病巣内及び頭蓋骨内注射または注入技術を含む。本発明の薬学組成物は、また直腸投与のための座薬の形態で投与される。
【００５１】
本発明の薬学組成物はこれらに限定されるのではないが、カプセル、精製及び水性懸濁液及び溶液を含んで経口的に許容されるいかなる容量型でも経口投与される。経口用精製の場合、よく使われる担体としてはラクトース及びとうもろこし澱粉が含まれる。さらに、マグネシウムステアレートのような潤滑剤が典型的に添加される。カプセル型として経口投与する場合、有用な希釈剤としては、ラクトース及び乾燥されたとうもろこし澱粉が含まれる。水性懸濁液が経口投与される際に活性成分は、乳化剤及び懸濁化剤と配合される。必要に応じて、甘美剤及び／または風味剤及び／または着色剤が添加される。
【００５２】
本発明の薬学組成物は、用いられた特定化合物の活性、年令、体重、一般的な健康、性別、規定式、投与時間、投与経路、排出率、薬品配合及び予防または治療される特定疾患の重症を含んだ多くの要因によって多様に変わる。本発明に係る医薬組成物は、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラーリ、懸濁剤に剤形できる。
【００５３】
本発明において、前記薬学組成物は、カルシウムチャンネル遮断剤、抗酸化剤、グルタミン拮抗剤、抗凝固剤、抗高血圧剤、抗血栓剤、抗ヒスタミン剤、消炎鎮痛剤、抗癌剤及び抗生剤からなる群で選択された一つ以上の薬剤と共に製剤化するか、併用する。
【００５４】
また他の観点において、本発明は、前記一般式（１）の構造を持つベルベノン誘導体または薬学的に許容可能なその塩を有効成分として含有する退行性脳疾患の予防または治療用薬学組成物を投与する工程を含む退行性脳疾患を予防または治療する方法に関する。
【００５５】
本発明の薬学組成物及び予防または治療方法は、神経細胞死及び酸化的ストレス減少活性が優れて、毒性及び副作用が少ない天然物由来のベルベノン誘導体を利用したため、有用に使用できる。
【００５６】
他の観点において、本発明は、退行性脳疾患の予防及び改善効果を持つ前記一般式（１）を持つベルベノン誘導体またはこれの薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する食品または食品添加剤に関する。
【００５７】
本発明の機能性食品は、炎症予防のための薬剤、食品及び飲料等に多様に利用される。本発明の機能性食品は、例えば、各種食品類、キャンディ、チョコレート、飲料、ガム、茶、ビタミン複合剤、健康補助食品類などがあって、粉末、顆粒、精製、カプセルまたは飲料の形態で使える。 
【００５８】
本発明の機能性食品に有効成分として含まれたベルベノン誘導体は、下記の生物学的メカニズムを分析した結果によって神経細胞保護作用、酸化的ストレス抑制及びサイトカイン発現抑制活性が優れることが明らかであるため、食品に使う場合、優れた効能を示すことは、当業者に自明である。
【００５９】
本発明に係る薬学組成物は、各々通常の方法により剤形化できるが、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾール等の剤形、外用剤、座薬及び滅菌注射溶液の形態で剤形化して用いられる。組成物に含まれる担体、賦形剤及び希釈剤としてはラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニールピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、マグネシウムステアレート及び鉱物油が挙げられる（ＰＦ−Ｂ１１６６＿２０１２）（ＰＦ−Ｂ１１３０）。製剤化する場合には、通常用いる充鎮剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤等の希釈剤または賦形剤を用いて調剤される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、前記化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、カルシウムカーボネート（ｃａｌｃｉｕｍ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロースまたはラクトース、ゼラチン等を混ぜて調製される。また、単純な賦形剤以外にマグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も用いられる。経口のための液状製剤には、懸濁剤、内容液剤、油剤、シロップ剤等が該当し、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に種々の賦形剤、例えば湿潤剤、甘味制、芳香剤、保存剤等が含まれる。非経口投与のための製剤には滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、油剤、凍結乾燥製剤、座薬が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステル等が用いられる。座薬の基剤としては、ウィテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、クリセロゼラチン等が用いられる。
【００６０】
本発明の薬学組成物の好ましい投与量は、患者の状態及び体重、病気の程度、薬品形態、投与経路及び期間により異なるが、当業者によって適宜選択される。しかし、好ましい効果を得るために、本発明の薬学組成物は、１日０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｇ／ｋｇで、好ましくは１ｍｇ／ｋｇ〜１ｇ／ｋｇで投与した方が良い。投与は一日一回投与してもよく、数回に分けて経口投与してもよい。前記投与量は、いかなる面においても本発明の範囲を限定するものではない。
【００６１】
前記一般式（１）の構造を持つベルベノン誘導体(たは薬学的に許容可能なその塩を)有効成分として含有する退行性脳疾患の予防または改善用健康機能食品に関する。
【００６２】
本発明の化合物を含む健康機能食品は、退行性脳疾患の予防または改善のための薬剤、食品及び飲料等に多様に利用される。本発明の化合物を添加可能な健康機能食品は、例えば、各種食品類、飲料、ガム、茶、ビタミン複合剤、健康補助食品類などがあって、粉末、顆粒、精製、カプセルまたは飲料の形態で使える。
【００６３】
本発明の化合物を添加可能な食品形態は、キャンディ類の各種食品類、飲み物、ガム、茶、ビタミン複合剤、または健康補助食品である食品などを含む。
【００６４】
本発明の化合物は、退行性脳疾患の予防及び改善を目的に食品または飲料に添加される。この時、食品または飲料中の前記化合物の量は、一般的に本発明の健康機能食品組成物は全体食品重量の０．０１〜１５重量％に加えられ、健康飲料組成物は、１００ｍＬを基準に０．０２〜１０ｇ、望ましくは０．３〜１ｇの割合で加えられる。
【００６５】
本発明の健康飲料組成物は、指示された割合で必須成分として前記化合物混合物を含有する他には液体成分には特別な制限はなく、通常の飲料と共に種々の香味剤または天然炭水化物等を追加成分として含有してもよい。前記天然炭水化物としては、モノサッカライド、例えば、ブドウ糖、果糖等、ジサッカライド、例えば、マルトース、スクロース等、ポリサッカライド、例えば、デキストリン、シクロデキストリン等のような通常の糖及びキシリトール、ソルビトール、エリスリトール等の糖アルコールである。前記以外の香味剤として、天然香味剤(タウマチン、ステビア抽出物(例えば、レバウジオシドＡ、クルチルリチン)及び合成香味剤(サッカリン、アスパルテーム等)を有利に使用できる。前記天然炭水化物の比は、本発明の組成物１００ｍＬ当り一般に約１〜２０ｇ、望ましくは約５〜１２ｇである。
【００６６】
前記の他に本発明の組成物は種々の栄養剤、ビタミン、鉱物(電解質)、合成風味剤及び天然風味剤等の風味剤、着色剤及び充填鎮剤(チーズ、チョコレート等)、ペクト酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使われる炭酸化剤等を含有してもよい。その他に本発明の組成物は、天然果物ジュース及び果物ジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含有してもよい。これらの成分は、独立的にまたは組合せて用いてもよい。このような添加剤の比はさほど重要ではないが本発明の組成物１００重量部当り０〜約２０重量部の範囲で選択されることが一般的である。
【００６７】
本発明の組成物は、組成物総重量に対して前記化合物を０．０１〜９９％重量で含む。しかし、前記のような組成は必ずしもこれに対し限定されるのではなくて、患者の状態及び疾患の種類及び進行程度により変更してもよい。
【００６８】
本発明の化合物を含む組成物は、薬学的組成物の製造に通常用いられる適切な担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含んでも良い。
【実施例】
【００６９】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００７０】
≪実施例１：ベルベノン誘導体の製造方法≫
試薬及び機器
試薬級（１Ｓ）−（−）−ベルベノン、アルデヒド（ａｌｄｅｈｙｄｅｓ）、メチルクロロメチルエーテル（ｍｅｔｈｙｌｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒ；ＭＯＭ−Ｃｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ；ＤＩＰＥＡ）、水酸化カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍｈｙｄｒｏｘｉｄｅ；ＫＯＨ）、及びナトリウムメトキシド（ｓｏｄｉｕｍ  ｍｅｔｈｏｘｉｄｅ；ＮａＯＣＨ３）を市中で購入して、購入したすべての試薬及び溶媒は高純度で、水酸化カルシウムで蒸留したジクロロメタンを除いて追加精製過程を経ることなくすぐ用いて、特に言及しない限り、反応は真空処理された乾燥ガラス容器（ｖａｃｕｕｍ−ｆｌａｍｅ  ｄｒｉｅｄ  ｇｌａｓｓｗａｒｅ）で乾燥窒素大気下で実行された。薄層クロマトグラフィー法（Ｔｈｉｎ−ｌａｙｅｒ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＴＬＣ）は、ＵＶで可視化するシリカゲル（Ｍｅｒｃｋ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４）を使ってカラムクロマトグラフィーは、シリカゲル（E. Merck silica gel, 70-230, 230-400mesh）を用いた。１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、機器（Ｖａｒｉａｎ）で５００ＭＨｚで測定して、化学シフト（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｈｉｆｔ）は、内部標準薬（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｓｔａｎｄａｒｄ（ＣＤＣｌ３：ｄ７．２６ｐｐｍ）として用いたＴＭＳ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｓｉｌａｎｅ）から移動をｐｐｍで記録して、結合定数（ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）をヘルツ（ｈｅｒｔｚ）で記録した。多重度（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ）は、下記のような略語を使った：ｓｉｎｇｌｅｔ（ｓ）、ｄｏｕｂｌｅｔ（ｄ）、ｄｏｕｂｌｅｔ  ｏｆ  ｄｏｕｂｌｅｔ  （ｄｄ）、ｄｏｕｂｌｅｔ  ｏｆ  ｄｏｕｂｌｅｔ  ｏｆ  ｄｏｕｂｌｅｔ（ｄｄｄ）、ｔｒｉｐｌｅｔ（ｔ）、ｔｒｉｐｌｅｔ  ｏｆ  ｄｏｕｂｌｅｔ（ｔｄ）、ｄｏｕｂｌｅｔ  ｏｆ  ｔｒｉｐｌｅｔ（ｄｔ）、ｑｕａｒｔｅｔ（ｑ）、ｍｕｌｔｉｐｌｅｔ（ｍ）及びｂｒｏａｄ（ｂｒ）。高解像質量スペクトル（Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｍａｓｓｓｐｅｃｔｒａ；ＨＲＭＳ）は、機器（ＷａｔｅｒｓＱ−ＴＯＦ  ｍｉｃｒｏ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）で記録して、分光回転率（Ｏｐｔｉｃａｌ  ｒｏｔａｔｉｏｎ）は、機器（ＪＡＳＣＯ  ｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ  ｍｏｄｅ  ｌＰ−２０００）を利用して５８９ｎｍで測定した。すべての化合物純度は、下記の条件の逆相（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｈａｓｅ）ＨＰＬＣで測定して、その純度は＞９５％であった：方法１（Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ａ：ｗａｔｅｒ，Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｂ：ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）−流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ：９０％  ｏｆ  Ｂ  ｉｎ  ２０ｍｉｎ；方法２（Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ａ：ｗａｔｅｒ，Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｂ：ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ：Ｆｒｏｍ  ４０％  ｏｆ  Ｂ  ｔｏ  １００％  ｉｎ  ４０ｍｉｎ。牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）は、ハイクロン社（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）から購入して用いて、培養液（ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ，ＮＢＭ）及び補充剤（Ｂ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）は、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒ��ｓｂａｄ，ＣＡ）から購入して用いた。すべての化学物質及び試薬は、シグマアルドリッチ  社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入して用いた。
【００７１】
≪実施例１−１：（１Ｓ，５Ｒ）−４−（４−（メトキシメトキシ）スチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（２ａ）化合物の製造≫
アルドール縮合反応（ａｌｄｏｌ  ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）で（１Ｓ）−（−）−ベルベノンからジエン体（ｄｉｅｎｅ）を得るために、（１Ｓ）−（−）−ベルベノン（１，２００ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）を４−（メトキシメトキシ）ベンズアルデヒド（３３２ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）とＭｅＯＨ（７ｍＬ）で撹はんしてＫＯＨ（１４９ｍｇ、２．６６ｍｍｏｌ）で処理した。反応混合物を６時間６０℃で撹はんして室温で冷却させた。少量の水を添加して混合物を２４時間室温で放置した。前記混合物を減圧濃縮して黄色産物を得て、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、下記の物性値を示す黄色固体状の（１Ｓ，５Ｒ）−４−（４−（メトキシメトキシ）スチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（２ａ）［（１Ｓ，５Ｒ）−４−（４−（ｍｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙ）ｓｔｙｒｙｌ）−６，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｉｃｙｃｌｏ［３．１．１］ｈｅｐｔ−３−ｅｎ−２−ｏｎｅ（２ａ）］を収得して、下記の実験例の試料として用いた。（３５３ｍｇ、収率８９％）。
ｍｐ８８−９０℃；
［ａ］２０Ｄ−２１１．６°（ｃ１．０，ＭｅＯＨ）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）：ｄ７．４５（ｄ，Ｊ＝８．８０Ｈｚ，２Ｈ），７．０４（ｄ，Ｊ＝８．８０Ｈｚ，２Ｈ），６．８１−６．９２（ｍ，２Ｈ），５．９０（ｓ，１Ｈ），５．２０（ｓ，２Ｈ），３．４８（ｓ，３Ｈ），３．０３−３．１７（ｍ，１Ｈ），２．９１（ｄｔ，Ｊ＝９．４８，５．５３Ｈｚ，１Ｈ），２．７２（ｔ，Ｊ＝５．６２Ｈｚ，１Ｈ），２．１２（ｄ，Ｊ＝９．２９Ｈｚ，１Ｈ），１．５８（ｓ，３Ｈ），１．０１（ｓ，３Ｈ）；
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）；ｄ２０４．２５，１６４．５７，１５８．００，１３４．５１，１２９．７５，１２８．７３，１２５．６２，１２１．８３，１１６．４４，９４．１７１，５８．０９，５６．０９，５２．７８，４３．５９，３９．９８，２６．７２，２２．１０
ＨＲＭＳ：計算値Ｃ１７Ｈ１８Ｏ２（Ｍ−Ｈ）２５３．１２２９，測定値２５３．１２２１
ＨＰＬＣ分析結果：（方法１）１００．０％（ｔＲ＝３．６７分）
【００７２】
≪実施例１−２：（１Ｓ，５Ｒ）−４−（３−メトキシ−４，５−ビス（メトキシメトキシ）スチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（２ｆ）化合物の製造≫
２ａ化合物の製造方法と類似する方法を利用して、下記の物性値を示す（１Ｓ，５Ｒ）−４−（３−メトキシ−４，５−ビス（メトキシメトキシ）スチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（２ｆ）［（１Ｓ，５Ｒ）−４−（３−ｍｅｔｈｏｘｙ−４，５−ｂｉｓ（ｍｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙ）ｓｔｙｒｙｌ）−６，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｉｃｙｃｌｏ［３．１．１］ｈｅｐｔ−３−ｅｎ−２−ｏｎｅ（２ｆ）］を収得して、下記の実験例の試料として用いた（収率９０％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）；ｄ６．９４（ｄ，Ｊ＝１．９６Ｈｚ，１Ｈ），６．８４（ｓ，２Ｈ），６．７８（ｄ，Ｊ＝１．７１Ｈｚ，１Ｈ），５．９２（ｓ，１Ｈ），５．２２（ｓ，２Ｈ），５．１５（ｓ，２Ｈ），３．８９（ｓ，３Ｈ），３．６０（ｓ，３Ｈ），３．５２（ｓ，３Ｈ），３．０９（ｔ，Ｊ＝５．７５Ｈｚ，１Ｈ），２．９０（ｄｔ，Ｊ＝９．４８，５．５３Ｈｚ，１Ｈ），２．７２（ｔｄ，Ｊ＝５．７５，１．４７Ｈｚ，１Ｈ），２．１０（ｄ，Ｊ＝９．２９Ｈｚ，１Ｈ），１．５７（ｓ，３Ｈ），１．００（ｓ，３Ｈ）；
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）；ｄ２０３．９２，１６４．０２，１５３．６３，１５１．１９，１３６．６４，１３４．７６，１３２．１０，１２６．９１，１２２．４３，１０８．９１，１０４．８８，９８．３７，９５．３３，５８．１９，５７．１１，５６．０７，５２．７０，４３．７８，３９．９３，２６．７０，２２．１１
【００７３】
≪実施例１−３：（１Ｓ，５Ｒ）−４−（４−ヒドロキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ａ）化合物の製造≫
ＭｅＯＨ（３ｍＬ）中２ａ化合物（２００ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ）が撹はんされる溶液に、アルドール縮合反応で（１Ｓ）−（−）−ベルベノンからジエン体を得るために、１０％ＨＣｌを滴下して反応混合物を反応が終結する時まで一夜の間放置した。飽和ＮａＨＣＯ３を添加して前記反応混合物をエチルアセテートで抽出して無水ＭｇＳＯ４で乾燥した。最終化合物をカラムクロマトグラフィーで精製及び分離して、下記の物性値を示す黄色固体状の（１Ｓ，５Ｒ）−４−（４−ヒドロキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ａ）［（１Ｓ，５Ｒ）−４−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｙｒｙｌ）−６，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｉｃｙｃｌｏ［３．１．１］ｈｅｐｔ−３−ｅｎ−２−ｏｎｅ（３ａ）］を収得して、下記の実験例の試料として用いた。（１６２ｍｇ、収率９５％）
ｍｐ８８−９０℃．
［ａ］２０Ｄ−２１１．６°（ｃ１．０，ＭｅＯＨ）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）；ｄ７．４０（ｄ，Ｊ＝８．５６Ｈｚ，２Ｈ），６．７８−６．９２（ｍ，４Ｈ），６．４５（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），５．９１（ｓ，１Ｈ），３．１２（ｔ，Ｊ＝５．７５Ｈｚ，１Ｈ），２．８８−２．９５（ｍ，１Ｈ），２．７４（ｔ，Ｊ＝５．６２Ｈｚ，１Ｈ），２．１３（ｄ，Ｊ＝９．２９Ｈｚ，１Ｈ），１．５８（ｓ，３Ｈ），１．０２（ｓ，３Ｈ）；
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）；ｄ２０５．１４，１６５．５６，１５７．３２，１３５．２４，１２９．１３，１２８．５１，１２４．８９，１２１．２９，１１６．００，５８．１０，５３．２２，４３．８６，４０．２３，２６．７９，２２．１５；
ＨＲＭＳ計算値Ｃ１７Ｈ１８Ｏ２（Ｍ−Ｈ）２５３．１２２９，測定値２５３．１２２１；
ＨＰＬＣ分析結果：（方法１）１００．０％（ｔＲ＝３．６７分）
【００７４】
≪実施例１−４：（１Ｓ，５Ｒ）−４−（４−ヒドロキシ−２−メトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｂ）化合物の製造≫
３ａ化合物の製造方法と類似する方法を利用して、下記の物性値を示す黄色固体状の（１Ｓ，５Ｒ）−４−（４−ヒドロキシ−２−メトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｂ）［（１Ｓ，５Ｒ）−４−（４−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｏｘｙｓｔｙｒｙｌ）−６，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｉｃｙｃｌｏ［３．１．１］ｈｅｐｔ−３−ｅｎ−２−ｏｎｅ（３ｂ）］を収得して、下記の実験例の試料として用いた（収率９７％）
ｍｐ７８−８０℃；
［ａ］２０Ｄ−１４０．０°（ｃ１．０，ＭｅＯＨ）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）；ｄ７．４５（ｄ，Ｊ＝８．０７Ｈｚ，１Ｈ），７．２４（ｄ，Ｊ＝１６．６３Ｈｚ，１Ｈ），６．８８（ｄ，Ｊ＝１６．３８Ｈｚ，１Ｈ），６．４２−６．４８（ｍ，２Ｈ），５．８８（ｓ，１Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ）５．６４（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），３．１６（ｔ，Ｊ＝５．７５Ｈｚ，１Ｈ），２．９１（ｄｔ，Ｊ＝９．３５，５．５９Ｈｚ，１Ｈ），２．７２（ｔｄ，Ｊ＝５．６０Ｈｚ，１Ｈ），２．１２（ｄ，Ｊ＝９．２９Ｈｚ，１Ｈ），１．５８（ｓ，３Ｈ），１．０２（ｓ，３Ｈ）；
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）；ｄ２０５．５３，１６６．７６，１５９．１７，１５８．９４，１３０．４８，１２８．４８，１２４．７５，１２０．６２，１１７．５０，１０８．１９，９９．１９，５８．１０，５５．５３，５３．２５，４３．８７，４０．３３，２６．８０，２２．１６；
ＨＲＭＳ計算値Ｃ１８Ｈ２０Ｏ３（Ｍ＋Ｈ）２８５．１４９１，測定値２８５．１４８０；
ＨＰＬＣ分析結果：（方法１）９９．４％（ｔＲ＝３．８０分）
【００７５】
≪実施例１−５：（１Ｓ，５Ｒ）−４−（３，４−ジヒドロキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｃ）化合物の製造≫
３ａ化合物の製造方法と類似する方法を利用して、下記の物性値を示す黄色固体状の（１Ｓ，５Ｒ）−４−（３，４−ジヒドロキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｃ）［（１Ｓ，５Ｒ）−４−（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｓｔｙｒｙｌ）−６，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｉｃｙｃｌｏ［３．１．１］ｈｅｐｔ−３−ｅｎ−２−ｏｎｅ（３ｃ）］を収得して、下記の実験例の試料として用いた（収率８４％）
ｍｐ６８−７０℃；
［ａ］２０Ｄ−２０８．６°（ｃ１．０，ＭｅＯＨ）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）；ｄ７．１３（ｓ，１Ｈ），６．７０−６．９６（ｍ，４Ｈ），５．９２（ｓ，１Ｈ），３．１２（ｔ，Ｊ＝５．５０Ｈｚ，１Ｈ），２．８６−２．９５（ｍ，１Ｈ），２．７１−２．８１（ｍ，１Ｈ），２．１４（ｄ，Ｊ＝９．５４Ｈｚ，１Ｈ），１．５８（ｓ，３Ｈ），１．００（ｓ，３Ｈ）；
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）；ｄ２０６．３９，１６６．９３，１４６．２３，１４４．５１，１３６．４７，１２８．７５，１２４．６２，１２１．９１，１２０．７２，１１５．３８，１１３．１７，６０．５５，５８．０４，５３．８４，４４．０１，４０．５５，２６．７８，２２．１２；
ＨＲＭＳ計算値Ｃ１７Ｈ１８Ｏ３（Ｍ−Ｈ）２６９．１１７８，測定値２６９．１１６９；
ＨＰＬＣ分析結果：（方法１）１００％（ｔＲ＝３．４７分）
【００７６】
≪実施例１−６：（１Ｓ，５Ｒ）−４−（３−ブロモ−４−ヒドロキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｄ）化合物の製造≫
３ａ化合物の製造方法と類似する方法を利用して、下記の物性値を示す黄色固体状の（１Ｓ，５Ｒ）−４−（３−ブロモ−４−ヒドロキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｄ）［（１Ｓ，５Ｒ）−４−（３−ｂｒｏｍｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｙｒｙｌ）−６，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｉｃｙｃｌｏ［３．１．１］ｈｅｐｔ−３−ｅｎ−２−ｏｎｅ（３ｄ）］を収得して、下記の実験例の試料として用いた（収率９５％）
ｍｐ２３８−２４０℃；
［ａ］２０Ｄ−１８１．４°（ｃ１．０，ＭｅＯＨ）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ）；ｄ７．７５（ｄ，Ｊ＝２．２０Ｈｚ，１Ｈ），７．４５（ｄｄ，Ｊ＝１．９６，８．５６Ｈｚ，１Ｈ），７．０２（ｄ，Ｊ＝１６．５０Ｈｚ，１Ｈ），６．９７（ｄ，Ｊ＝１６．５０Ｈｚ，１Ｈ），６．９２（ｄ，Ｊ＝８．５６Ｈｚ，１Ｈ），５．９０（ｓ，１Ｈ），３．２４（ｔ，Ｊ＝５．９９Ｈｚ，１Ｈ），２．９７（ｔｄ，Ｊ＝５．５９，９．３５Ｈｚ，１Ｈ），２．６２（ｄｔ，Ｊ＝１．５０，６．００Ｈｚ，１Ｈ），２．０５（ｄ，Ｊ＝９．５４Ｈｚ，１Ｈ），１．６０（ｓ，３Ｈ），０．９８（ｓ，３Ｈ）；
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，７５ＭＨｚ）：ｄ２０３．０２，１６５．１３，１５５．４２，１３４．４７，１３２．２９，１２９．４２，１２８．７９，１２５．７５，１２１．５９，１１７．１１，１１０．３６，５８．１６，５２．３３，４３．３０，２６．８３，２２．４３；
ＨＲＭＳ計算値Ｃ１７Ｈ１７ＢｒＯ２（Ｍ＋Ｈ）３３３．０４９０，測定値３３３．０４７９；
ＨＰＬＣ分析結果：（方法１）９８．９％（ｔＲ＝３．９１分）
【００７７】
≪実施例１−７：（１Ｓ，５Ｒ）−４−（４−ヒドロキシ−２，６−ジメトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｅ）化合物の製造≫
３ａ化合物の製造方法と類似する方法を利用して、下記の物性値を示す黄色固体状の（１Ｓ，５Ｒ）−４−（４−ヒドロキシ−２，６−ジメトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｅ）［（１Ｓ，５Ｒ）−４−（４−ｈｙｄｒｏｘｙ−２，６−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｓｔｙｒｙｌ）−６，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｉｃｙｃｌｏ［３．１．１］ｈｅｐｔ−３−ｅｎ−２−ｏｎｅ（３ｅ）］を収得して、下記の実験例の試料として用いた（収率９４％）
ｍｐ２１６−２１８℃；
［ａ］２０Ｄ−１７５．４°（ｃ１．０，ＭｅＯＨ）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，５００ＭＨｚ）；ｄ７．２８（ｄ，Ｊ＝１６．５０Ｈｚ，１Ｈ），７．２３（ｄ，Ｊ＝１６．５０Ｈｚ，１Ｈ），６．１２（ｓ，２Ｈ），５．７３（ｓ，１Ｈ），３．８０（ｓ，６Ｈ），３．１０（ｔ，Ｊ＝５．３８Ｈｚ，１Ｈ），２．８９（ｔｄ，Ｊ＝５．５０，９．０５Ｈｚ，１Ｈ），２．５３（ｔ，Ｊ＝５．５０Ｈｚ，１Ｈ），１．９３（ｄ，Ｊ＝９．２９Ｈｚ，１Ｈ），１．５３（ｓ，３Ｈ），０．９１（ｓ，３Ｈ）；
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，７５ＭＨｚ）；ｄ２０２．５６，１６６．６６，１６０．４８，１６０．２７，１２６．６８，１２６．１１，１１９．２２，１０４．６７，９２．１７，５７．５０，５５．７１，５５．６７，５１．６７，４２．５９，２６．４２，２１．９６；
ＨＲＭＳ計算値Ｃ１９Ｈ２２Ｏ４（Ｍ＋Ｈ）３１５．１５９６，測定値３１５．１５８３；
ＨＰＬＣ分析結果：（方法１）９９．３％（ｔＲ＝３．７０分）
【００７８】
≪実施例１−８：（１Ｓ，５Ｒ）−４−（３，４−ジヒドロキシ−５−メトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｆ）化合物の製造≫
３ａ化合物の製造方法と類似する方法を利用して、下記の物性値を示す黄色固体状の（１Ｓ，５Ｒ）−４−（３，４−ジヒドロキシ−５−メトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｆ）［（１Ｓ，５Ｒ）−４−（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｏｘｙｓｔｙｒｙｌ）−６，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｉｃｙｃｌｏ［３．１．１］ｈｅｐｔ−３−ｅｎ−２−ｏｎｅ（３ｆ）］を収得して、下記の実験例の試料として用いた（収率９２％）：
ｍｐ１６８−１７０℃；
［ａ］２０Ｄ−１５８．８０００°（ｃ１．０，ＭｅＯＨ）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）ｄ６．７８−６．８２（ｍ，３Ｈ），６．６４（ｄ，Ｊ＝１．４７Ｈｚ，１Ｈ），５．８２−６．０１（ｍ，３Ｈ），３．９２（ｓ，３Ｈ），３．１０（ｔ，Ｊ＝５．６２Ｈｚ，１Ｈ），２．９１（ｄｔ，Ｊ＝９．３５，５．５９Ｈｚ，１Ｈ），２．７４（ｔｄ，Ｊ＝５．６９，１．５９Ｈｚ，１Ｈ），２．１２（ｄ，Ｊ＝９．２９Ｈｚ，１Ｈ），２．０４（ｓ，２Ｈ），１．５８（ｓ，３Ｈ），１．０１（ｓ，３Ｈ）；
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）；ｄ２０４．９２，１６５．０７，１４７．２３，１４４．２４，１３５．５４，１３４．１３，１２８．０７，１２５．５０，１２１．６２，１０８．６３，５８．０８，５６．２５，５３．１２，４３．７５，４０．１８，２６．７８，２２．１６；
ＨＲＭＳ計算値Ｃ１８Ｈ２０Ｏ４（Ｍ＋Ｈ）３０１．１４４０，測定値３０１．１４５３；
ＨＰＬＣ分析結果：（方法１）１００％（ｔＲ＝３．４６分）
【００７９】
≪実施例１−９：（１Ｓ，５Ｒ）−４−（３−ヒドロキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｇ）化合物の製造≫
３ａ化合物の製造方法と類似する方法を利用して、下記の物性値を示す黄色固体状の（１Ｓ，５Ｒ）−４−（３−ヒドロキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｇ）［（１Ｓ，５Ｒ）−４−（３−ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｙｒｙｌ）−６，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｉｃｙｃｌｏ［３．１．１］ｈｅｐｔ−３−ｅｎ−２−ｏｎｅ（３ｇ）］を収得して、下記の実験例の試料として用いた（収率９８％）
ｍｐ１０６−１０８℃；
［ａ］２０Ｄ−１７６．６°（ｃ１．０，ＭｅＯＨ）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）；ｄ７．２１−７．２６（ｍ，１Ｈ），７．０１−７．０５（ｍ，２Ｈ），６．９２（ｄ，Ｊ＝１６．５０Ｈｚ，１Ｈ），６．８８（ｄ，Ｊ＝１６．５０Ｈｚ，１Ｈ），６．８３−６．８６（ｍ，１Ｈ），６．４６（ｓ，１Ｈ），５．９６（ｓ，１Ｈ），３．１１（ｔ，Ｊ＝５．７５Ｈｚ，１Ｈ），２．９３（ｔｄ，Ｊ＝５．５３，９．４８Ｈｚ，１Ｈ），２．７７（ｄｔ，Ｊ＝１．５９，５．６９Ｈｚ，１Ｈ），２．１４（ｄ，Ｊ＝９．２９Ｈｚ，１Ｈ），１．５９（ｓ，３Ｈ），１．０１（ｓ，３Ｈ）；
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）；ｄ２０５．１９，１６５．１８，１５６．５３，１３７．４２，１３５．３６，１３０．０３，１２７．４４，１２２．３７，１２０．１９，１１６．６８，１１３．６５，５８．１７，５３．３９，４３．８９，４０．２８，２６．７７，２２．１４；
ＨＲＭＳ計算値Ｃ１７Ｈ１８Ｏ２（Ｍ−Ｈ）２５３．１２２９，測定値２５３．１２２８；
ＨＰＬＣ分析結果：（方法２）９９．３％（ｔＲ＝３．７３分）
【００８０】
≪実施例１−１０：（１Ｓ，５Ｒ）−４−（２−ヒドロキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｈ）化合物の製造≫
３ａ化合物の製造方法と類似する方法を利用して、下記の物性値を示す黄色固体状の（１Ｓ，５Ｒ）−４−（２−ヒドロキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｈ）［（１Ｓ，５Ｒ）−４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｙｒｙｌ）−６，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｉｃｙｃｌｏ［３．１．１］ｈｅｐｔ−３−ｅｎ−２−ｏｎｅ（３ｈ）］を収得して、下記の実験例の試料として用いた（収率１００％）
ｍｐ１４０−１４２℃；
［ａ］２０Ｄ−２９６．６°（ｃ１．０，ＭｅＯＨ）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ）；ｄ７．５６（ｄｄ，Ｊ＝１．５９，７．７０Ｈｚ，１Ｈ），７．４２（ｄ，Ｊ＝１６．１４Ｈｚ，１Ｈ），７．１５（ｄｄ，Ｊ＝１．５９，１５．５３Ｈｚ，１Ｈ），７．１３（ｄ，Ｊ＝１６．３８Ｈｚ，１Ｈ），６．８０−６．８７（ｍ，２Ｈ），５．８９（ｓ，１Ｈ），３．２５（ｔ，Ｊ＝５．８７Ｈｚ，１Ｈ），２．９９（ｄｔ，Ｊ＝５．５３，９．４８Ｈｚ，１Ｈ），２．６５（ｔｄ，Ｊ＝１．７１，５．７５Ｈｚ，１Ｈ），２．０８（ｄ，Ｊ＝９．２９Ｈｚ，１Ｈ），１．６１（ｓ，３Ｈ），１．０１（ｓ，３Ｈ）；
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，７５ＭＨｚ）；ｄ２０７．４６，１６９．０９，１５７．５６，１３３．１０，１３１．６７，１２８．６７，１２７．６３，１２４．５５，１２２．０３，１２１．０７，１１７．０５，５９．６２，５４．５２，４５．２９，４１．４５，２７．１９，２２．５８；
ＨＲＭＳ計算値Ｃ１７Ｈ１８Ｏ２（Ｍ−Ｈ）２５３．１２２９，分析値２５３．１２１８；
ＨＰＬＣ分析結果：（方法１）９９．４％（ｔＲ＝３．８０分）
【００８１】
≪実施例１−１１：（１Ｓ，５Ｒ）−４−（２−ヒドロキシ−４−メトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｉ）化合物の製造≫
３ａ化合物の製造方法と類似する方法を利用して、下記の物性値を示す黄色ゲル状の（１Ｓ，５Ｒ）−４−（２−ヒドロキシ−４−メトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（３ｉ）［（１Ｓ，５Ｒ）−４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｏｘｙｓｔｙｒｙｌ）−６，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｉｃｙｃｌｏ［３．１．１］ｈｅｐｔ−３−ｅｎ−２−ｏｎｅ（３ｉ）］を収得して、下記の実験例の試料として用いた（収率９６％）
［ａ］２０Ｄ−９１．８°（ｃ１．０，ＭｅＯＨ）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）；ｄ８．４６（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），７．３７（ｄ，Ｊ＝８．５６Ｈｚ，１Ｈ），７．２３（ｄ，Ｊ＝１６．５０Ｈｚ，１Ｈ），７．１７（ｄ，Ｊ＝１６．００Ｈｚ，１Ｈ），６．４２−６．５５（ｍ，２Ｈ），６．０４（ｓ，１Ｈ），３．７８（ｓ，３Ｈ），３．２０（ｔ，Ｊ＝５．３８Ｈｚ，１Ｈ），２．８８−２．９８（ｍ，１Ｈ），２．７６（ｔ，Ｊ＝５．１４Ｈｚ，１Ｈ），２．１７（ｄ，Ｊ＝９．５４Ｈｚ，１Ｈ），１．５９（ｓ，３Ｈ），１．０５（ｓ，３Ｈ）；
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）；ｄ２０６．５６，１６７．９４，１６１．７２，１５６．９９，１３２．２６，１３０．０９，１２５．３７，１１９．９３，１１６．２９，１０６．９０，１０１．７３，５７．９６，５５．２８，５３．７４，４３．８５，４０．６０，２６．７６，２２．１３；
ＨＲＭＳ計算値Ｃ１８Ｈ２０Ｏ３（Ｍ＋Ｈ）２８５．１４９１，測定値２８５．１４９４；
ＨＰＬＣ分析結果：（方法１）９９．２％（ｔＲ＝３．７５分）
【００８２】
≪実施例１−１２：（１Ｓ，５Ｒ）−６，６−ジメチル−４−スチリルビシクルロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ａ）化合物の製造≫
２ａ化合物の製造方法と類似する方法を利用して、下記の物性値を示す黄色ゲル状の（１Ｓ，５Ｒ）−６，６−ジメチル−４−スチリルビシクルロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ａ）［（１Ｓ，５Ｒ）−６，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−４−ｓｔｙｒｙｌｂｉｃｙｃｌｏ［３．１．１］ｈｅｐｔ−３−ｅｎ−２−ｏｎｅ（４ａ）］を収得して、下記の実験例の試料として用いた（収率９２％）
［ａ］２０Ｄ−９１．８°（ｃ１．０，ＭｅＯＨ）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）；ｄ７．５０（ｄ，Ｊ＝７．０９Ｈｚ，２Ｈ），７．３５−７．４０（ｍ，２Ｈ），７．３３（ｄ，Ｊ＝７．３４Ｈｚ，１Ｈ），６．９７（ｄ，Ｊ＝１６．００Ｈｚ，１Ｈ），６．９２（ｄ，Ｊ＝１６．００Ｈｚ，１Ｈ），５．９４（ｓ，１Ｈ），３．１２（ｔｄ，Ｊ＝１．４７，５．８７Ｈｚ，１Ｈ），２．９３（ｄｔ，Ｊ＝５．６２，９．５４Ｈｚ，１Ｈ），２．７４（ｔｄ，Ｊ＝１．７１，５．７５Ｈｚ，１Ｈ），２．１３（ｄ，Ｊ＝９．２９Ｈｚ，１Ｈ），１．５９（ｓ，３Ｈ），１．０２（ｓ，３Ｈ）；
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）；ｄ２０４．１３，１６４．２３，１３５．９９，１３４．９６，１２９．１５，１２８．８８，１２７．４２，１２７．３５，１２２．６６，５８．２３，５２．８７，４３．７６，４０．０３，２６．７８，２２．１６；
ＨＲＭＳ計算値Ｃ１７Ｈ１８Ｏ（Ｍ＋Ｈ）２３９．１４３６，測定値２３９．１４２６；
ＨＰＬＣ分析結果：（方法１）９５．０％（ｔＲ＝４．８２分）
【００８３】
≪実施例１−１３：（１Ｓ，５Ｒ）−４−（４−フルオロスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｂ）化合物の製造≫
２ａ化合物の製造方法と類似する方法を利用して、下記の物性値を示す黄色ゲル状の（１Ｓ，５Ｒ）−４−（４−フルオロスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｂ）を収得して、下記の実験例の試料として用いた（収率９２％）
［ａ］２０Ｄ−３３．２°（ｃ１．０，ＭｅＯＨ）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）；ｄ７．４６−７．５１（ｍ，２Ｈ），７．０４−７．０９（ｍ，２Ｈ），６．９０（ｄ，Ｊ＝１７．００Ｈｚ，１Ｈ），６．８６（ｄ，Ｊ＝１６．５０Ｈｚ，１Ｈ），５．９３（ｓ，１Ｈ），３．１０（ｔｄ，Ｊ＝１．３５，５．８１Ｈｚ，１Ｈ），２．９２（ｄｔ，Ｊ＝５．６２，９．２９Ｈｚ，１Ｈ），２．７４（ｔｄ，Ｊ＝１．７１，５．７５Ｈｚ，１Ｈ），２．１２（ｄ，Ｊ＝９．２９Ｈｚ，１Ｈ），１．５９（ｓ，３Ｈ），１．０２（ｓ，３Ｈ）；
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）；ｄ２０４．０４，１６４．０３，１６２．１３，１３３．６２，１３２．２１，１２９．０４，１２７．１５，１２２．６１，１１６．０２，５８．１７，５２．８３，４３．７２，３９．９９，２６．７３，２２．１２；
ＨＲＭＳ計算値Ｃ１７Ｈ１７ＦＯ（Ｍ＋Ｈ）２５７．１３４２，測定値２５７．１３４３；
ＨＰＬＣ分析結果：（方法１）９０．６％（ｔＲ＝４．５２分）
【００８４】
≪実施例１−１４：（１Ｓ，５Ｒ）−４−（４−メトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｃ）化合物の製造≫
２ａ化合物の製造方法と類似する方法を利用して、下記の物性値を示す黄色固体状の（１Ｓ，５Ｒ）−４−（４−メトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｃ）［（１Ｓ，５Ｒ）−４−（４−ｍｅｔｈｏｘｙｓｔｙｒｙｌ）−６，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｉｃｙｃｌｏ［３．１．１］ｈｅｐｔ−３−ｅｎ−２−ｏｎｅ（４ｃ）］を収得して、下記の実験例の試料として用いた（収率９０％）
ｍｐ１３８−１４０℃；
［ａ］２０Ｄ−１７２．０°（ｃ１．０，ＭｅＯＨ）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）；ｄ７．４６（ｄ，Ｊ＝８．８０Ｈｚ，２Ｈ），６．９１（ｄ，Ｊ＝９．０５Ｈｚ，２Ｈ），６．９０（ｄ，Ｊ＝１５．９０Ｈｚ，１Ｈ），６．８４（ｄ，Ｊ＝１６．５０Ｈｚ，１Ｈ），５．９０（ｓ，１Ｈ），３．８５（ｓ，３Ｈ），３．１２（ｔｄ，Ｊ＝１．３５，５．８１Ｈｚ，１Ｈ），２．９２（ｄｔ，Ｊ＝５．５３，９．４８Ｈｚ，１Ｈ），２．７３（ｔｄ，Ｊ＝１．７１，５．７５Ｈｚ，１Ｈ），２．１３（ｄ，Ｊ＝９．５４Ｈｚ，１Ｈ），１．５９（ｓ，３Ｈ），１．０３（ｓ，３Ｈ）；
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）；ｄ２０４．１７，１６４．６３，１６０．５０，１３４．６４，１２８．８３，１２８．７８，１２５．２５，１２１．６６，１１４．３５，５８．１７，５５．３４，５２．７４，４３．７６，３９．９９，２６．７６，２２．１５；
ＨＲＭＳ計算値Ｃ１８Ｈ２０Ｏ２（Ｍ＋Ｈ）２６９．１５４２，測定値２６９．１５４９；
ＨＰＬＣ分析結果：（方法１）１００％（ｔＲ＝４．５８分）
【００８５】
≪実施例１−１５：（１Ｓ，５Ｒ）−４−（２−（ビフェニル−４−イル）ビニール）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｄ）化合物の製造≫
２ａ化合物の製造方法と類似する方法を利用して、下記の物性値を示す黄色固体状の（１Ｓ，５Ｒ）−４−（２−（ビフェニル−４−イル）ビニール）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｄ）［（１Ｓ，５Ｒ）−４−（２−（ｂｉｐｈｅｎｙｌ−４−ｙｌ）ｖｉｎｙｌ）−６，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｉｃｙｃｌｏ［３．１．１］ｈｅｐｔ−３−ｅｎ−２−ｏｎｅ（４ｄ）］を収得して、下記の実験例の試料として用いた（収率９２％）
ｍｐ１４８−１５０℃；
［ａ］２０Ｄ−１５２．４°（ｃ１．０，ＭｅＯＨ）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）；ｄ７．５５−７．６５（ｍ，６Ｈ），７．４５（ｔ，Ｊ＝７．５８Ｈｚ，２Ｈ），７．３４−７．３９（ｍ，１Ｈ），７．０１（ｄ，Ｊ＝１６．５０Ｈｚ，１Ｈ），６．９６（ｄ，Ｊ＝１６．５０Ｈｚ，１Ｈ），５．９５（ｓ，１Ｈ），３．１４（ｔ，Ｊ＝５．７５Ｈｚ，１Ｈ），２．９４（ｄｔ，Ｊ＝５．５０，９．５４Ｈｚ，１Ｈ），２．７５（ｔ，Ｊ＝５．６２Ｈｚ，１Ｈ），２．１４（ｄ，Ｊ＝９．２９Ｈｚ，１Ｈ），１．６０（ｓ，３Ｈ），１．０３（ｓ，３Ｈ）；
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）；ｄ２０４．１２，１６４．２３，１４１．８６，１４０．２３，１３４．９９，１３４．５０，１２８．８７，１２７．８４，１２７．６９，１２７．５１，１２７．３８，１２６．９４，１２２．６５，５８．２４，５２．８６，４３．７７，４０．０２，２６．７９，２２．１８；
ＨＲＭＳ計算値Ｃ２３Ｈ２２Ｏ（Ｍ＋Ｈ）３１５．１７４９，測定値３１５．１７３７；
ＨＰＬＣ分析結果：（方法１）１００％（ｔＲ＝６．３５分）
【００８６】
≪実施例１−１６：（１Ｓ，５Ｒ）−４−（４−（１Ｈ−ｐｙｒｒｏｌｅ−１−イル）スチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｅ）化合物の製造≫
２ａ化合物の製造方法と類似する方法を利用して、下記の物性値を示す黄色固体状の（１Ｓ，５Ｒ）−４−（４−（１Ｈ−ピロール−１−イル）スチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｅ）［（１Ｓ，５Ｒ）−４−（４−（１Ｈ−ｐｙｒｒｏｌ−１−ｙｌ）ｓｔｙｒｙｌ）−６，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｉｃｙｃｌｏ［３．１．１］ｈｅｐｔ−３−ｅｎ−２−ｏｎｅ（４ｅ）］を収得して、下記の実験例の試料として用いた（収率４１％）
ｍｐ１４６−１４８℃；
［ａ］２０Ｄ−１４２．４°（ｃ１．０，ＭｅＯＨ）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）；ｄ７．５５（ｄ，Ｊ＝８．５６Ｈｚ，２Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ＝８．５６Ｈｚ，２Ｈ），７．１２（ｔ，Ｊ＝２．２０Ｈｚ，２Ｈ），６．９５（ｄ，Ｊ＝１６．００Ｈｚ，１Ｈ），６．９１（ｄ，Ｊ＝１６．００Ｈｚ，１Ｈ），６．３６（ｔ，Ｊ＝２．２０Ｈｚ，２Ｈ），５．９４（ｓ，１Ｈ），３．１２（ｔ，Ｊ＝５．７５Ｈｚ，１Ｈ），２．９３（ｔｄ，Ｊ＝５．５９，９．３５Ｈｚ，１Ｈ），２．７４（ｄｔ，Ｊ＝１．７１，５．７５Ｈｚ，１Ｈ），２．１３（ｄ，Ｊ＝９．２９Ｈｚ，１Ｈ），１．５９（ｓ，３Ｈ），１．０３（ｓ，３Ｈ）；
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）；ｄ２０３．９７，１６４．０３，１４０．９２，１３３．７８，１３３．２１，１２８．５７，１２７．１４，１２２．６１，１２０．２５，１１８．９５，１１０．９４，５８．１９，２５．７９，４３．７２，３９．９７，２６．７５，２２．１４；
ＨＲＭＳ計算値Ｃ２１Ｈ２１ＮＯ（Ｍ＋Ｈ）３０４．１７０１，測定値３０４．１６９１；
ＨＰＬＣ分析結果：（方法１）９４．７％（ｔＲ＝５．１０分）
【００８７】
≪実施例１−１７：（１Ｓ，５Ｒ）−４−（３，４−ジメトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｆ）化合物の製造≫
２ａ化合物の製造方法と類似する方法を利用して、下記の物性値を示す黄色ゲル状の（１Ｓ，５Ｒ）−４−（３，４−ジメトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｆ）を収得して、下記の実験例の試料として用いた（収率９２％）
［ａ］２０Ｄ−１１１．２°（ｃ１．０，ＭｅＯＨ）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）；ｄ７．０２−７．０９（ｍ，２Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝１６．００Ｈｚ，１Ｈ），６．８６（ｄ，Ｊ＝７．００Ｈｚ，１Ｈ），６．８３（ｄ，Ｊ＝１６．５０Ｈｚ，１Ｈ），５．９１（ｓ，１Ｈ），３．９３（ｓ，３Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ），３．１１（ｔ，Ｊ＝５．７５Ｈｚ，１Ｈ），２．９１（ｄｔｄ，Ｊ＝１．４７，５．５６，９．４１Ｈｚ，１Ｈ），２．７２（ｔｔ，Ｊ＝１．７４，５．７２Ｈｚ，１Ｈ），２．１１（ｄ，Ｊ＝９．２９Ｈｚ，１Ｈ），１．５８（ｓ，３Ｈ），１．０２（ｓ，３Ｈ）；
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）；ｄ２０４．０３，１６４．４６，１５０．２８，１４９．３０，１３４．８９，１２９．１０，１２５．４２，１２１．７５，１１１．２４，１０９．２９，５８．１９，５５．９４，５２．６９，４３．８２，３９．９６，２６．７６，２２．１５；
ＨＲＭＳ計算値Ｃ１９Ｈ２２Ｏ３（Ｍ＋Ｈ）２９９．１６４７，測定値２９９．１６５７；
ＨＰＬＣ分析結果：（方法２）９７．９％（ｔＲ＝９．１９分）
【００８８】
≪実施例１−１８：（１Ｓ，５Ｒ）−４−（３，５−ジメトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｇ）化合物の製造≫
２ａ化合物の製造方法と類似する方法を利用して、下記の物性値を示す黄色ゲル状の（１Ｓ，５Ｒ）−４−（３，５−ジメトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｇ）を収得して、下記の実験例の試料として用いた（収率９０％）
［ａ］２０Ｄ−９４．２°（ｃ１．０，ＭｅＯＨ）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）；ｄ６．９３（ｄ，Ｊ＝１６．００Ｈｚ，１Ｈ），６．８５（ｄ，Ｊ＝１６．００Ｈｚ，１Ｈ），６．６５（ｄ，Ｊ＝２．２０Ｈｚ，２Ｈ），６．４５（ｔ，Ｊ＝２．２０Ｈｚ，１Ｈ），５．９４（ｓ，１Ｈ），３．８２（ｓ，６Ｈ），３．１０（ｔ，Ｊ＝５．７５Ｈｚ，１Ｈ），２．９２（ｄｔ，Ｊ＝５．６２，９．５４Ｈｚ，１Ｈ），２．７４（ｔｄ，Ｊ＝１．５９，５．６９Ｈｚ，１Ｈ），２．１２（ｄ，Ｊ＝９．２９Ｈｚ，１Ｈ），１．５８（ｓ，３Ｈ），１．０２（ｓ，３Ｈ）；
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）；ｄ２０４．０４，１６３．０３，１６１．０３，１３７．８８，１３４．９３，１２７．８３，１２２．８１，１０５．３２，１０１．５１，５８．１９，５５．４０，５２．８２，４３．７３，３９．９９，２６．７３，２２．１２；
ＨＲＭＳ計算値Ｃ１９Ｈ２２Ｏ３（Ｍ＋Ｈ）２９９．１６４７，測定値２９９．１６６２；
ＨＰＬＣ分析結果：（方法１）１００％（ｔＲ＝４．５８分）
【００８９】
≪実施例１−１９：（１Ｓ，５Ｒ）−４−（２，５−ジメトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｈ）化合物の製造≫
２ａ化合物の製造方法と類似する方法を利用して、下記の物性値を示す黄色ゲル状の（１Ｓ，５Ｒ）−４−（２，５−ジメトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｈ）を収得して、下記の実験例の試料として用いた（収率９３％）
［ａ］２０Ｄ−９４．８°（ｃ１．０，ＭｅＯＨ）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）；ｄ７．２９（ｄ，Ｊ＝１６．３８Ｈｚ，１Ｈ），７．１１（ｄ，Ｊ＝２．６９Ｈｚ，１Ｈ），６．９５（ｄ，Ｊ＝１６．１４Ｈｚ，１Ｈ），６．８１−６．８８（ｍ，２Ｈ），５．９２（ｓ，１Ｈ），３．８４（ｓ，３Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），３．１６（ｄｔ，Ｊ＝１．５０，６．００Ｈｚ，１Ｈ），２．９１（ｔｄ，Ｊ＝５．６２，９．２９Ｈｚ，１Ｈ），２．７２（ｄｔ，Ｊ＝１．７１，５．７５Ｈｚ，１Ｈ），２．１１（ｄ，Ｊ＝９．２９Ｈｚ，１Ｈ），１．５８（ｓ，３Ｈ），１．０２（ｓ，３Ｈ）；
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）；ｄ２０４．１６，１６４．８３，１５３．７４，１５２．０４，１２９．５０，１２７．７４，１２５．６２，１２２．３７，１１５．８５，１１２．３４，１１１．８５，５８．２４，５６．１３，５２．７６，４３．７６，４０．０３，２６．７６，２２．１５；
ＨＲＭＳ計算値Ｃ１９Ｈ２２Ｏ３（Ｍ＋Ｈ）２９９．１６４７，測定値２９９．１６５０；
ＨＰＬＣ分析結果：（方法１）９６．４％（ｔＲ＝４．６９分）
【００９０】
≪実施例１−２０：（１Ｓ，５Ｒ）−４−（５−ブロモ−２−メトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｉ）化合物の製造≫
２ａ化合物の製造方法と類似する方法を利用して、下記の物性値を示す黄色ゲル状の（１Ｓ，５Ｒ）−４−（５−ブロモ−２−メトキシスチリル）−６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（４ｉ）を収得して、下記の実験例の試料として用いた（収率９７％）
［ａ］２０Ｄ−７１．６°（ｃ１．０，ＭｅＯＨ）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）；ｄ７．６６（ｓ，１Ｈ），７．３６（ｄｄ，Ｊ＝２．４５，８．８０Ｈｚ，１Ｈ），７．２０（ｄ，Ｊ＝１６．３８Ｈｚ，１Ｈ），６．９５（ｄ，Ｊ＝１６．１４Ｈｚ，１Ｈ），６．７７（ｄ，Ｊ＝８．８０Ｈｚ，１Ｈ），５．９３（ｓ，１Ｈ），３．８７（ｓ，３Ｈ），３．１２（ｔ，Ｊ＝５．６２Ｈｚ，１Ｈ），２．９１（ｄｔ，Ｊ＝５．３５，９．６０Ｈｚ，１Ｈ），２．７３（ｔ，Ｊ＝５．１４Ｈｚ，１Ｈ），２．１１（ｄ，Ｊ＝９．２９Ｈｚ，１Ｈ），１．５８（ｓ，３Ｈ），１．０１（ｓ，３Ｈ）；
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）；ｄ２０３．９７，１６４．３１，１５６．４０，１３２．５３，１２９．５３，１２８．６９，１２８．０９，１２７．０４，１２２．８９，１１３．２８，１１２．７５，５８．２２，５５．７７，５２．７６，４３．７１，３９．９８，２６．７３，２２．１１；
ＨＲＭＳ計算値Ｃ１８Ｈ１９ＢｒＯ２（Ｍ＋Ｈ）３４７．０６４７，測定値３４７．０６５１；
ＨＰＬＣ分析結果：（方法１）９９．０％（ｔＲ＝６．２３分）
【００９１】
≪実施例１−２１：（１Ｓ，５Ｒ）−６，６−ジメチル−４−（（Ｅ）−２−（ピリジン−２−イル）ビニール）ビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（５ａ）化合物の製造≫
アルドール縮合反応で（１Ｓ）−（−）−ベルベノンからジエン体を得るために、（１Ｓ）−（−）−ベルベノン（１，２００ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）を２−ピリジンカルボキシアルデヒド（１７１ｍｇ、１．６０ｍｍｏｌ）とＭｅＯＨ（７ｍＬ）で撹はんしてＮａＯＣＨ３（ＭｅＯＨ中２５ｗｔ．％溶液、１０８ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）で処理した。反応混合物を６時間６０℃で撹はんして室温で冷却させた。少量の水を添加して混合物を２４時間室温で放置した。前記混合物を減圧濃縮して茶色の産物を得て、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、下記の物性値を示す黄色シロップ状の（１Ｓ，５Ｒ）−６，６−ジメチル−４−（（Ｅ）−２−（ピリジン−２−イル）ビニール）ビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（５ａ）［（１Ｓ，５Ｒ）−６，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−４−（（Ｅ）−２−（ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ）ｖｉｎｙｌ）ｂｉｃｙｃｌｏ［３．１．１］ｈｅｐｔ−３−ｅｎ−２−ｏｎｅ（５ａ）］を収得して、下記の実験例の試料として用いた（２５８ｍｇ、収率８１％）
［ａ］２０Ｄ−１０２．００００°（ｃ１．０，ＭｅＯＨ）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）；ｄ８．６０（ｄｄ，Ｊ＝４．７７，０．６１Ｈｚ，１Ｈ），７．６７（ｔｄ，Ｊ＝７．７０，１．７１Ｈｚ，１Ｈ），７．４５（ｄ，Ｊ＝１５．９０Ｈｚ，１Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ＝７．８３Ｈｚ，１Ｈ），７．１９（ｄｄｄ，Ｊ＝７．５２，４．８３，０．８６Ｈｚ，１Ｈ），６．９６（ｄ，Ｊ＝１５．８９Ｈｚ，１Ｈ），６．０２（ｓ，１Ｈ），３．０８−３．１４（ｍ，１Ｈ），２．８７−２．９５（ｍ，１Ｈ），２．７３（ｔｄ，Ｊ＝５．６９，１．５９Ｈｚ，１Ｈ），２．１１（ｄ，Ｊ＝９．２９Ｈｚ，１Ｈ），１．５７（ｓ，３Ｈ），１．００（ｓ，３Ｈ）；
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）；ｄ２０３．９２，１６３．５１，１５４．３３，１４９．９６，１３６．６５，１３３．９０，１３１．１５，１２４．２９，１２３．１３，５８．２７，５２．９０，４３．８６，３９．９７，２６．７１，２２．１２；
ＨＲＭＳ計算値Ｃ１６Ｈ１７ＮＯ（Ｍ＋Ｈ）２４０．１３８８，測定値２４０．１３９２；
ＨＰＬＣ分析結果：（方法１）９８．４％（ｔＲ＝４．２８分）
【００９２】
≪実施例１−２２：（１Ｓ，５Ｒ）−６，６−ジメチル−４−（（Ｅ）−２−（ピリジン−３−イル）ビニール）ビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（５ｂ）化合物の製造≫
５ａ化合物の製造方法と類似する方法を利用して、下記の物性値を示す黄色固体状の（１Ｓ，５Ｒ）−６，６−ジメチル−４−（（Ｅ）−２−（ピリジン−３−イル）ビニール）ビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（５ｂ）を収得して、下記の実験例の試料として用いた（収率７７％）
【００９３】
≪実施例１−２３：（１Ｓ，５Ｒ）−６，６−ジメチル−４−（（Ｅ）−２−（ピリジン−４−イル）ビニール）ビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（５ｃ）化合物の製造≫
５ａ化合物の製造方法と類似する方法を利用して、下記の物性値を示す黄色ゲル状の（１Ｓ，５Ｒ）−６，６−ジメチル−４−（（Ｅ）−２−（ピリジン−４−イル）ビニール）ビシクロ［３．１．１］ヘプト−３−エン−２−オン（５ｃ）を収得して、下記の実験例の試料として用いた（収率８０％）
［ａ］２０Ｄ−１５２．０°（ｃ１．０，ＭｅＯＨ）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）；ｄ８．６２（ｄ，Ｊ＝５．８７Ｈｚ，２Ｈ），７．３５（ｄ，Ｊ＝５．８７Ｈｚ，２Ｈ），７．１３（ｄ，Ｊ＝１６．１４Ｈｚ，１Ｈ），６．８４（ｄ，Ｊ＝１６．１４Ｈｚ，１Ｈ），６．０１（ｓ，１Ｈ），３．１０（ｔ，Ｊ＝５．８７Ｈｚ，１Ｈ），２．９５（ｔｄ，Ｊ＝５．６２，９．５４Ｈｚ，１Ｈ），２．７７（ｄｔ，Ｊ＝１．５９，５．６９Ｈｚ，１Ｈ），２．１３（ｄ，Ｊ＝９．５４Ｈｚ，１Ｈ），１．６０（ｓ，３Ｈ），１．０２（ｓ，３Ｈ）；
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）；ｄ２０３．５７，１６２．７８，１５０．４２，１４３．１２，１３１．８９，１３１．５７，１２４．６２，１２１．２３，５８．２４，５２．９０，４３．６８，３９．９５，２６．７０，２２．１１；
ＨＲＭＳ計算値Ｃ１６Ｈ１７ＮＯ（Ｍ＋Ｈ）２４０．１３３８，測定値２４０．１３７８；
ＨＰＬＣ分析結果：（方法１）９８．４％（ｔＲ＝４．２９分）
【００９４】
≪実施例２：興奮細胞毒性、坑酸化活性及び局所脳虚血症に対するベルベリン誘導体の効果≫
実験動物の準備
ＳＤラット（２６０−２７０グラム雄）をチャールスリバー社（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ、韓国）から供給を受けて１２時間明暗／循環周期を維持して、飲料水（食水）に自由に接近可能にして、実験前環境に馴染ませて使用し、ＮＩＨ基準（ＮＩＨ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）及び委員会（Ｋｏｒｅａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ＆  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）承認下実行された。
統計処理
データはｍｅａｎｓ±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で処理してｏｎｅ−ｗａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｖａｒｉａｎｃｅ  （ＡＮＯＶＡ）で統計的有意性を検定して、多重比較法でｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｔｅｓｔで判定してＰ値＜０．０５を有意的に判断して、ＡＮＯＶＡ分析前に分散の同質性（Ｅｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｖａｒｉａｎｃｅｓ）に対する試験法（Ｌｅｖｅｎｅ’ｓ  Ｔｅｓｔ）のＰ値を確定した（Ｐ＞０．０５）。必要時には前記データをＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  ｔｅｓｔ後Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  ｔｅｓｔを行って再分析した。
【００９５】
≪実施例２−１：興奮細胞毒性に及ぼすベルベリン誘導体の効果≫
前記実施例で収得した試料の興奮細胞毒性に及ぼす効果を確認するために、文献に開示された方法を応用して下記のように実験を行った（Ju C. et al., BBRC, 431(3), 484-489, 2013）。
【００９６】
（１）皮質神経細胞培養
皮質神経細胞（ｎｅｕｒｏｎ）（５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）は、胎児１６〜１７日ＳＤラットから収得した。すなわち、脳皮質を切断して緩衝液（Ｈａｎｋｓ’  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ＨＢＳＳ）でピペット（Ｐａｓｔｅｕｒ  ｐｉｐｅｔｔｅ）を利用して繰り返された滴定（ｔｒｉｔｕｒａｔｉｏｎ）で細胞を分離させた。細胞懸濁液（１．８×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２）をプレート（ｐｏｌｙ−Ｄ−ｌｙｓｉｎｅ（１００ｍｇ／ｍＬ）／ｌａｍｉｎｉｎ（４  ｍｇ／ｍＬ）−予備処置プレート）上に分株した。細胞を初期に１０％ＦＢＳ−添加ＮＢＭ培地に位置させて、３７℃で加湿された９６％空気／５％ＣＯ２大気下で維持させた。試験は、前記培養物の培養後１５〜１６日に行った。
【００９７】
（２）ＯＧＤ（Ｏｘｙｇｅｎ−Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ）後再酸素化
試験管低酸素性−虚血性症状を誘導するために、培養された細胞を嫌気性チャンバー（酸素部分圧＜２ｍｍＨｇ）に位置させて、前記培養物を残存酸素を除去するために、３０分間嫌気性ガス混合物（９５％Ｎ２、５％ＣＯ２）でバブルリング（ｂｕｂｂｌｉｎｇ）するブドウ糖−除去培地（ｇｌｕｃｏｓｅ−ｆｒｅｅ  ＤＭＥＭ）に取り替えて培養して、酸素欠乏（ｏｘｙｇｅｎ  ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ）のために、９０分間３７℃で培養した。９０分後、前記露出溶液を酸素化２５ｍｍｏｌ／Ｌブドウ糖含有ＤＭＥＭ培地に取り替えてＯＧＤ反応を中断させて、細胞を正常酸素条件に回復させた。ＯＧＤに露出しなかった対照細胞を好気性混合ガス（９５％ａｉｒ、５％ＣＯ２）を提供するブドウ糖（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）−含有ＤＭＥＭ培地で維持させた。ＯＧＤ／再酸素化（ｒｅ−ｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ）３０分前から細胞を試料で処置して全実験期間中維持した。
【００９８】
（３）ＮＭＤＡ（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ）−誘導興奮細胞毒性測定
プレートに１５−１８日間静置した後、皮質神経細胞を溶液（Ｍｇ２＋−除去Ｅａｒｌｅ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  （ＥＢＳＳ）；１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２及び１０ｍＭ  ｇｌｙｃｉｎｅ含有）で１０分間ＮＭＤＡ（１００ｍＭ）に露出させた。前記露出後に、細胞をＭｇＳＯ４含有ＥＢＳＳ溶液で洗浄して３７℃で５％ＣＯ２条件下で培養器で２５ｍｍｏｌ／Ｌグルコース含有ＤＭＥＭ培地で培養した。細胞をＮＭＤＡ処置３０分前から試料（１０ｍＭ）で処置した。
【００９９】
（４）細胞損傷または細胞死の測定
細胞損傷または細胞死滅は、培地で分泌されるＬＤＨ量を細胞生存率測定キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を利用して測定して、細胞生存率は、冷凍されて実験後で溶かした姉妹培養物（ｓｉｓｔｅｒ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ）で測定された、全体細胞ＬＤＨ水準に対するＬＤＨの百分率で表示した。
興奮細胞毒性は、虚血症−誘導神経細胞死、特に初期段階脳虚血症で重要な因子中一つである。ＯＧＤは、培養された皮質神経細胞を利用して、虚血症での血流供給及びエネルギー消費の急激な破壊現象を模倣した実験モデルであって、ＯＧＤによって細胞損傷を誘導してＬＤＨのようなタンパク質の培養液での分泌を促してこれを測定して細胞膜損傷及び神経細胞損傷を測定することができる。試験結果、化合物（３ａ、３ｃ及び３ｆ）が、既知のＮＭＤＡ受容体拮抗剤であるＭＫ８０１と相応する程度で、神経細胞損傷を有意的に減少させることを確認し細胞毒性は示さないことを確認した（図１）。
【０１００】
ＮＭＤＡ受容体の過度な刺激に起因した興奮性毒性は、ＯＧＤ／Ｒの間の神経損傷及び遊離ラジカル及び続く酸化的ストレスの同時多発的発生にともなう脳虚血性損傷に関与する重要な因子である。本実験結果、本発明の化合物（３ａ、３ｃ、３ｆ、３ｉ、及び５ａ）が、ＭＫ−８０１に相応する抗−興奮細胞毒性活性（ａｎｔｉ−ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ）程ではないが、培養された皮質神経細胞でのＮＭＤＡ−誘発神経損傷を有意的に減少させた（図２）。これは、本発明の化合物がＮＭＤＡ−誘発神経興奮細胞毒性の阻害が抗−虚血活性に寄与することを意味する。
【０１０１】
≪実施例２−２：ベルベノン誘導体の坑酸化活性効果≫
前記実施例で収得した試料の直接的な坑酸化活性を確認するために、文献に開示された方法を応用して下記のように実験を行った（Ju c. et al., BBRC, 431(3), 484-489, 2013; Huang D. et al., J. Agric. Food Chem., 53, 1841-1856, 2005.）
【０１０２】
（１）反応性酸素種（ＲＯＳ）の細胞内水準測定（ＤＣＦ蛍光度）
試料の直接的ラジカル消去活性を確認するために、再酸素化１時間後に、細胞内酸化力ストレスを測定するのに広範囲に利用されるＨ２ＤＣＦ−ＤＡ（２，７−ｄｉｈｙｄｒｏｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ）蛍光指示薬で染色して、２時間後細胞を２５ｍＭ  Ｇｌｕｃｏｓｅ、１．８ｍＭ  ＣａＣａｌ２、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４及び２．５ｍＭ  ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ（ｐＨ７．４）含有ＥＢＳＳ緩衝液で洗浄してＤＣＦの蛍光度を判読機器で（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ＧｅｍｉｎｉＥＭ；Ｅｘ＝４８５ｎｍ、Ｅｍ＝５３０ｎｍ）またはデジタルカメラ（ＤＦＣ４２０Ｃ、Ｌｅｉｃａ、Ｗｅｔｚｌａｒ  Ｇｅｒｍａｎｙ）付顕微鏡（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＤＭ  ＩＬ  ＨＣ  Ｆｌｕｏ、Ｌｅｉｃａ、Ｗｅｔｚｌａｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で測定した。蛍光強度は、自動蛍光度で補正（すなわち、Ｈ２ＤＣＦ−ＤＡで積載されなかった細胞の蛍光度）した。
本実験結果、化合物３ｃ及び３ｆはＯＧＤ−誘導細胞内酸化的ストレスを減少させることを確認した（図３）。
【０１０３】
（２）窒素ラジカル除去能力測定（ＤＰＰＨアッセイ法）
試料をＤＰＰＨ（２３．６μｇ／ｍＬ、ｉｎ  ｅｔｈａｎｏｌ）で混合して３７℃、暗所で３０分間培養した。試料によって減少するＤＰＰＨ吸光度を５１７ｎｍで測定した。ビタミンＣ（Ｖｉｔ．Ｃ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を対照群で使って、ＤＰＰＨ％阻害率（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅ）は、下記の式（１）によって計算した。
【０１０４】
[数１]
消去活性（％）＝［Ａｂｓｍａｘ（Ｖｉｔ．Ｃ）−Ａｂｓｓａｍｐｌｅ］／［Ａｂｓｍａｘ（Ｖｉｔ．Ｃ）−Ａｂｓｍｉｎ（Ｖｉｔ．Ｃ）］×１００  …（１）
【０１０５】
（３）酸素ラジカル吸収力（ＯＲＡＣ；ｏｘｙｇｅｎ  ｒａｄｉｃａｌ  ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  ｃａｐａｃｉｔｙ）測定
ＯＲＡＣアッセイ法を文献に開示されたとおりに実験を下記のように行った（Huang, D. et al., J. Agric. Food Chem., 53, 1841-56, 2005）。
【０１０６】
ＡＡＰＨ（６０ｍＭ）及びｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（５０ｎＭ）を緩衝液（７５ｍＭ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．４）で試料または標準液（Ｔｒｏｌｏｘ）なしに準備した。前記試料及び標準液は、５０％アセトンに溶解された７％ＲＭＣＤ（ｒａｎｄｏｍｌｙ  ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｂｅｔａ−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）で懸濁して準備した。ＲＭＣＤは、脂溶性試料の溶解度を増進させるために準備した。蛍光溶液（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、６６ｎＭ、１９０μＬ）を試料と５秒間振とうして充分混合した。３７℃で１０分間培養後、ＡＡＰＨ（５００ｍＭ、３０μＬ）を速かに添加して、蛍光度の減少水準を判読機（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ、Ｅｘ＝４８５ｎｍ、Ｅｍ＝５３０ｎｍ；ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ＧｅｍｉｎｉＥＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を利用して３７℃で９時間、５分毎に測定した。ペルオキシラジカル（ｐｅｒｏｘｙｌ  ｒａｄｉｃａｌ）の消去作用定量化のために、消去活性はＡＵＣ（ａｒｅａ−ｕｎｄｅｒ−ｔｈｅ−ｃｕｒｖｅ）を下記の式（２）により計算して純（ｎｅｔ）ＡＵＣは、式（３）により計算して試料のトロロックス当量（ＴＥ；ｔｒｏｌｏｘ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）は、トロロックス濃度増加にともなう純ＡＵＣの標準曲線（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｃｕｒｖｅ）を作って、下記の式（４）により計算した。
【０１０７】
[数２]
ＡＵＣ＝（０．５＋ｆ１／ｆ０＋ｆ２／ｆ０＋ｆ３／ｆ０＋・・・＋ｆｎ−２／ｆ０＋ｆｎ−１／ｆ０＋ｆｎ／ｆ０）×５  …（２）
（ここで、ｆ０は、０分及び時間（ｔｉｍｅ）Ｉでの最初蛍光度である。）
【０１０８】
[数３]
ネット（ｎｅｔ）ＡＵＣ＝ＡＵＣｓａｍｐｌｅ−ＡＵＣｂｌａｎｋ  …（３）
【０１０９】
[数４]
試料のトロロックス等量（ＴＥ；ｔｒｏｌｏｘｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）＝［ｎｅｔＡＵＣｓａｍｐｌｅ  ａｔ２５ｍＭ］／［ｎｅｔ  ＡＵＣｔｒｏｌｏｘ  ａｔ２５ｍＭ］  …（４）
【０１１０】
本発明のベルベノン誘導体の坑酸化活性は、二つの異なる形態の化学反応、（１）単一電子移動−基盤アッセイ法（ｓｉｎｇｌｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ−ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙ）、すなわち、自由ラジカル生成子及び終結指示子として作用するＤＰＰＨの減少を測定するＤＰＰＨアッセイ法（２，２−ｄｉ（４−ｔｅｒｔ−ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌ）−１−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ［ＤＰＰＨ］  ａｓｓａｙ）及び（２）水素原子移動アッセイ法（ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ａｔｏｍ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｓｓａｙ）、すなわち、ＡＡＰＨ（２，２’−ａｚｏｂｉｓ−（２−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｅ）−ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）といったペルオキシラジカル生成子（ｐｅｒｏｘｙｌ  ｒａｄｉｃａｌ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）と抗酸化剤として作用する試料との酸化性蛍指示薬（ｏｘｉｄｉｚａｂｌｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅ、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）に対する競争的反応力学作用を測定する酸素ラジカル吸収能力アッセイ法（ｏｘｙｇｅｎ  ｒａｄｉｃａｌ  ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ［ＯＲＡＣ］  ａｓｓａｙ）を行った。
【０１１１】
本実験結果、ＤＰＰＨアッセイ法で大部分のフェノール基を持つスチリル誘導体（３ａ−ｆ、３ｈ−ｉ）は、ＤＰＰＨから有機窒素自由ラジカル（ｏｒｇａｎｉｃ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌｓ）への変換に対する強力でかつ、直接的な消去活性を示すことを確認した（表１参照）。この中で、化合物３ｃ及び３ｆは、同じ濃度でビタミンＣより強力な消去活性を示し、ＯＲＡＣアッセイ法では、ピロール基を持つ誘導体（４ｅ）及びフェノール基を持つすべての化合物（３ａ−ｉ）がトロロックスより強力なペルオキシラジカル消去活性を示すことを確認した（表１及び表２）。
フェニル基のメタ（ｍｅｔａ）及びパラ（ｐａｒａ）位のヒドロキシ基の導入は、遊離ラジカル消去活性を増進させることを確認した。
【０１１２】
【表１】
0005934839.tif 000009
【０１１３】
【表２】
0005934839.tif 000010
【０１１４】
≪実施例２−３：局所脳虚血症実験モデル≫
前記実施例で収得した試料の局所脳虚血症実験での効果を確認するために、文献に開示された方法を応用して下記のように実験を行った（Belayev L. et al., Stroke, 27, 1616-1622, 1996; discussion 1623）。
【０１１５】
（１）局所脳虚血症実験モデル
ラットをマスクを利用してＮ２Ｏ及びＯ２（７０：３０ｖ／ｖ）混合物中３．０％イソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）から始めて２％イソフルランを維持させて麻酔した。全実験期間中麻酔から充分に回復するまで術後期間まで体温は、直腸用温度計及び温熱パッドを利用して３７℃±０．３℃で調節及び維持させた。局所脳虚血症は、右側血管内ＭＣＡＯに誘導した。要約すれば、３−０  ｈｅａｔ−ｂｌｕｎｔｅｄ単繊維性ナイロン縫合糸（ｍｏｎｏｆｉｌａｍｅｎｔ  ｎｙｌｏｎ  ｓｕｔｕｒｅ；Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）をＭＣＡ小孔を閉塞させようと、右側外部頚動脈の切開部分内腔に挿入して、内側頚動脈に１７．５ｍｍに進入させた。前記縫合を動物が回復するように１時間半後に除去した。手術−対照群をＭＣＡＯを除いて同じ手術法で行った。生理学的数値はＭＣＡＯ１５分前及び再灌流１５分後に測定して、平均血圧は血圧器（ＭｉｃｒｏＭｅｄ，Ｌｏｕｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）で５分間測定した。血中ｐＨ、ＰａＯ２、ＰａＣＯ２及び血糖数値は分析器（Ｃｉｂａ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｅｄｆｉｅｌｄ，ＭＡ）で測定した。ＤＭＳＯで溶解させて１０％クレモフォール（ｃｒｅｍｏｐｈｏｒｅ）及び滅菌食塩水で希釈した（５％）試料（３ｆ誘導体）は、ＭＣＡＯ誘導後２時間からラットの腹腔内に投与した（１００ｍｇ／ｋｇ）。
【０１１６】
（２）梗塞体積の測定
再灌流後ラットを抱水クロラール（３．５％  ｃｈｌｏｒａｌ  ｈｙｄｒａｔｅ、５ｍＬ／ｋｇ、腹腔注射）で麻酔させた後、頚椎脱臼させた。マトリックス（ｒａｔ  ｂｒａｉｎ  ｍａｔｒｉｘ，Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ，Ｒｅｄｄｉｎｇ，ＣＡ）を利用して切断した脳動脈切片（２ｍｍ）を試薬（２％トリフェニルテトラゾリウム塩酸、シグマ−アルドリッチ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で３０分間３７℃で染色した。４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）で固定して、連続的に２日間、４℃で３０％スクロースで凍結保護させた。
【０１１７】
プレグマの＋４ｍｍ（前方）及び−６ｍｍ（後方）の間の梗塞切片を分析プログラム（ＯＰＴＩＭＡＳ５．１ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｐｒｏｇｒａｍ，ＢｉｏＳｃａｎＩｎｃ．Ｅｄｍｏｎｄｓ，ＷＡ）で測定した。脳梗塞の大きさ測定のための梗塞領域外部周りは手動で設定した。全脳梗塞体積（ｍｍ３）は文献（J Neurosci Methods (1998) 84: 9-16; J Cereb Blood Flow Metab (1990) 10: 290-293）に開示されたとおりに下記の式（５）により脳浮腫に補正して計算した。脳浮腫は、下記の式（６）のように同側／反側性脳半球領域（ｉｐｓｉｌａｔｅｒａｌ（Ｖ１）／ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ  ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｅ  ａｒｅａ（Ｖｃ））の百分率増加率で計算する。いずれも二重盲験法を測定した。
【０１１８】
[数５]
全体脳梗塞体積（ｍｍ３）＝直接測定法（ｄｉｒｅｃｔ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）による同側性体積（ＩＶｄ）×［（反側性体積（Ｖｃ））／反側性体積（Ｖｃ）］  …（５）
【０１１９】
[数６]
浮腫体積（ｅｄｅｍａ  ｖｏｌｕｍｅ）（％）＝［（同側性体積（Ｖ１）−反側性体積（Ｖｃ））／反側性体積（Ｖｃ）］×１００  …（６）
以後に組織を冷凍させて切断機（Ｌｅｉｃａ３０５０；Ｌｅｉｃａ，Ｎｕｓｓｌｏｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で１０または３０ｍｍ頚動脈切片で切断して−２０℃で保存した。
【０１２０】
（３）神経学的欠損の測定
神経学的欠損は、虚血後２４時間後に測定して、文献（Stroke, 17, 472-476, 1986）に開示された通り、４点スケールで測定する（０：神経学的欠損なし、１：前足を曲げる、２：前足曲げ及び側面を押す力に対する減少した抵抗性、回転しない、３：２と同様であるが回転する）。
【０１２１】
（４）脳組織免疫組織学的染色
前記方法のとおり準備した脳組織切片を非特異的抗体結合を抑制させるために５％血清が含まれた緩衝液で１時間常温で処理する。適正な濃度に希釈した１次抗体（ＭＰＯ抗体及びＥＤ−１−抗体、各々１：１００；Ｎｉｔｒｏｔｙｒｏｓｉｎｅ抗体、１：５０；ＩＬ−１ａ、ＩＬ−１ｂ、ＴＮＦ−ａ抗体各々１：１００）を加えて、４℃で一夜染色する。結合されなかった１次抗体を洗浄で除去した後、蛍光マーカーが重合された２次抗体で常温で１時間染色する。結合されなかった２次抗体を洗浄で除去した後、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８染色液で２０分間核を染色して洗浄してガラススライドに取り付けた後、共焦点蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０；Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，ドイツ）を用いて観察した。
【０１２２】
（５）血液脳関門透過性実験
染色液（エバンスブルー染色液、２％）は、静脈内注射時血清内アルブミンに直ちに結合して正常血液脳関門を透過できない高分子物質に変換されるが、脳虚血症を誘導したラット脳組織では、血液脳関門が損傷してエバンスブルーの透過性が増加して、染色量が増加する。前記方法とおりに局所脳虚血症を誘発したラットを２００ｍＬの生理食塩水で心臓灌流させる。脳組織を摘出して重さを測った後、試薬（トリクロロ酢酸、６０％）に漬けて４℃で２４時間処理する。組織を粉砕した後、１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離させ分離した上澄み液を取って脳組織内に残存したエバンスブルー染色液の吸光度を６１０ｎｍで測定して定量してグラム組織当たり染色液量として算出する。
【０１２３】
（６）長期生存率実験
前記方法のとおり局所脳虚血症を誘発したラットを手術前と同じ条件で手術後３週間にかけて生存率及び神経学的欠損を測定する。
【０１２４】
（７）塞栓性虚血脳卒中動物モデル
ラット（体重２７０−３００ｇ）を７０％Ｎ２Ｏと３０％Ｏ２（ｖ／ｖ）混合ガスに混合された３％イソフルランガスを用いて吸入麻酔させた後、３％イソフルランを利用して維持する。直腸温度計を挿入して、これと連結された自動ヒートパッドを用いて手術期間中ラットの体温を３７．０〜３７．９℃に維持させる。首に正中線を切開した後、右側内頸動脈（ｃｏｍｍｏｎ  ｃａｒｏｔｉｄ  ａｒｔｅｒｙ：ＣＣＡ）と右側外側頸動脈（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｃａｒｏｔｉｄ  ａｒｔｅｒｙ：ＥＣＡ）と右側内頸動脈（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｃａｒｏｔｉｄ  ａｒｔｅｒｙ：ＩＣＡ）を分離して、外側頸動脈と頸動脈を縛る。曲がった微細血管クリップを用いて内頸動脈を一時的に引き締める。外頚動脈と内頸動脈の分枝が始まる部分を小さく切開して血管注入が容易になるように注入口が外径０．３ｍｍに減らされた外径０．５８ｍｍのＰＥ−５０カテーテルを利用して生理食塩水が入った１００ｕｌハミルトンシリンジで３５ｍｍ塞栓を内頸動脈内に注入する。微細血管クリップを除去して、カテーテルを注意深く内頸動脈内に１６−１７ｍｍまで前進させて、中脳大動脈の開始点から約２ｍｍまで移動させる。カテーテルの塞栓を内頸動脈で注入する（１０ｕｌ）。塞栓注入５分後、カテーテルを取り除く。内頸動脈分枝点で縛って、切開部位を縫い合わせた後、ラットが麻酔から覚めるように放置して置く。実験に用いられる塞栓は、ドナーマウスから取った大腿動脈血を迅速にＰＥ−５０チューブに注入して常温で２時間、４℃で２２時間放置して血栓を生成させる。実験前にチューブを切って、生理食塩水が入った２３Ｇ注射針が付き１ｍＬシリンジを用いてＰＥ−１０チューブを介して変形されたＰＥ−５０カテーテルに移す。前記実験結果、一時的虚血誘導ラットモデル試験で、試料（３ｆ、５０ｍｇ／ｋｇ）の虚血後処置（Ｐｏｓｔ−ｉｓｃｈｅｍｉｃ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ；腹腔注射；脳梗塞後２時間及び７時間合わせて２回投与時）で虚血性損傷、脳浮腫及び神経学的欠損を有意的に減少させることを確認した（図４）。また、試料を投与したラットから得た脳組織切片でのニトロチロシンに対する免疫組織学的染色を介して組織内坑酸化活性を測定した結果、試料投与群で脳組織内坑酸化活性が有意的に増加したことを確認した（図５）。
【０１２５】
一方、免疫学的染色を介して脳梗塞部位及び反陰影部位への炎症性細胞の浸潤を観察した結果、ＭＰＯ抗体によって染色される好中球／単核球とＥＤ−１抗体で染色される活性化した小膠細胞／大食細胞の移動が有意的に抑制されることを確認した（図６）。さらに、ＩＬ−１ａｌｐｈａ、ＩＬ−１ｂｅｔａ、ＴＮＦ−ａｌｐｈａのように虚血性損傷で重要な役割を果たすと知られているサイトカインの組織内発現量が試料投与群で有意的に減少したことを確認した（図７）。また、虚血性損傷によって増加した血液脳関門透過性も有意的に減少させることを確認した（図８）。一時的虚血を誘導したラットモデルに試料を投薬した後、３週間長期生存率と神経学的欠損回復率に及ぼす影響を観察した結果、試料が投与されたラットの長期生存率及び神経学的欠損回復率が有意的に増進されることを確認した（図９）。虚血性脳卒中の場合、薬によって出血が増加する場合（例えば、ｔＰＡ）がたびたびあり、これは臨床的に患者の副作用（例えば、死亡や予後の悪化）を増加させることがあるので、注意を要する。しかし、本試料は、自己血液注入で塞栓性脳卒中を誘導した体内動物モデルで脳損傷の大きさに有意的な影響を与えなく、このような副作用の可能性が少ないと見える（図１０）。
【０１２６】
下記に本発明の化合物を含有する組成物の製剤例を説明するが、本発明はこれに限定するものではなく単に具体的に説明するためのものである。
【０１２７】
製剤例１．散剤の製造
化合物３ｆ                  ２００ｍｇ
乳糖                        １００ｍｇ
タルク                      １０ｍｇ
前記成分を混合して気密包に充填して散剤を製造する。
【０１２８】
製剤例２．錠剤の製造
化合物３ｃ                  ２００ｍｇ
コーンスターチ              １００ｍｇ
乳糖                        １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム    ２ｍｇ
前記成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法に従って打錠して錠剤を製造する。
【０１２９】
製剤例３．カプセル剤の製造
ＲＷ                        ２００ｍｇ
結晶性セルロース            ３ｍｇ
ラクトース                  １４．８ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム    ０．２ｍｇ
通常のカプセル剤製造方法に従って前記成分を混合してゼラチンカプセルに充電してカプセル剤を製造する。
【０１３０】
製剤例４．注射剤の製造
化合物４ｅ                  ２００ｍｇ
マンニトール                １８０ｍｇ
注射用滅菌蒸留水            ２９７４ｍｇ
Ｎａ２ＨＰＯ４、１２Ｈ２Ｏ    ２６ｍｇ
通常の注射剤の製造方法に従って、１アンプル当たり（２ｍＬ）前記の成分含有量で製造する。
【０１３１】
製剤例５．液剤の製造
化合物５ａ                  ２００ｍｇ
異性化糖                    １０ｇ
マンニトール                ５ｇ
精製水                      適量
通常の液剤の製造方法に従って、精製数にそれぞれの成分を加えて溶解させてレモンの香りを適量加えた後、前記成分を混合した後、精製水を加えて全体を１００ｍＬに調節した後、茶色のビンに充填して滅菌させて液剤を製造する。
【０１３２】
製剤例６．健康食品の製造
化合物３ａ                  １０００ｍｇ
ビタミン混合物              適量
ビタミンＡアセテート        ７０μｇ
ビタミンＥ                  １．０ｍｇ
ビタミンＢ１                ０．１３ｍｇ
ビタミンＢ                  ０．１５ｍｇ
ビタミンＢ６                ０．５ｍｇ
ビタミンＢ１２              ０．２μｇ
ビタミンＣ                  １０ｍｇ
Ｂｉｏｔｉｎ                １０μｇ
ニコチン酸アミド            １．７ｍｇ
葉酸                        ５０μｇ
パントテン酸カルシウム      ０．５ｍｇ
無機質混合物                適量
硫酸第一鉄                  １．７５ｍｇ
酸化亜鉛                    ０．８２ｍｇ
炭酸マグネシウム            ２５．３ｍｇ
第一リン酸カリウム          １５ｍｇ
第二リン酸カルシウム        ５５ｍｇ
クエン酸カリウム            ９０ｍｇ
炭酸カルシウム              １００ｍｇ
塩化マグネシウム            ２４．８ｍｇ
前記ビタミン及びミネラル混合物の組成比は、比較的健康食品に適合した成分を好ましい実施例として混合組成したが、その配合比を任意に変形実施しても構わなく、通常の健康食品製造方法に従って前記成分を混合した後、顆粒を製造して、通常の方法に従って健康食品組成物製造に用いてもよい。
【０１３３】
製剤例７．健康飲料の製造
化合物３ｆ                  １０００ｍｇ
クエン酸                    １０００ｍｇ
オリゴ糖                    １００ｇ
梅濃縮液                    ２ｇ
タウリン                    １ｇ
精製水を加えて              全体９００ｍＬ
通常の健康飲料製造方法に従って、前記成分を混合した後、約１時間８５℃で撹はん加熱した後、作られた溶液をろ過して滅菌された２Ｌ容器に取得して密封滅菌した後、冷蔵保管した後、本発明の健康飲料組成物製造に用いる。
【０１３４】
前記組成比は、比較的嗜好飲料に適合した成分を好ましい実施例として混合組成したが、需要階層、需要国、使用用途など地域的、民族的嗜好度に応じてその配合比を任意に変形実施してもよい。
【産業上の利用可能性】
【０１３５】
本発明に係るベルベノン誘導体を有効成分として含有する薬学組成物は、既存の薬学組成物に比べて優れた神経細胞保護作用、ＮＭＤＡ−誘導興奮細胞毒性抑制効果、細胞内酸化的ストレス抑制効果、及び炎症性細胞の移動抑制効果を示して、退行性脳疾患、より具体的には脳虚血性損傷を治療する効果があって、機能性食品などに活用できる。
【０１３６】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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