(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの参考用遺伝子を検出するための組成物を製造するための、LUC7L2、TRIM27、GPBP1、ARL8B、UBQLN1、PAPOLA、CUL1、DIMT1L、FBXW2及びSPG21からなる群から選択される一又は複数の参考用遺伝子のヌクレオチド配列に特異的に結合するプライマー対又はプローブの使用。
【請求項２】
前記プライマー対が、前記遺伝子のセンス配列に一致する長さ１０〜５０ｂｐのセンスプライマー及び前記遺伝子のアンチセンス配列に一致する長さ１０〜５０ｂｐ のアンチセンスプライマーからなる、請求項１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内部標準遺伝子（Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｇｅｎｅｓ；ＥＲＧ）を発掘するための遺伝子発現データ処理、分析方法及び前記方法によって得られた内部標準遺伝子を特異的に増幅することができるプライマー対及び／またはプローブを含む遺伝子発現率定量用組成物に関するもので、より詳細には、ＥＳＴ、ＳＡＧＥ及びマイクロアレイデータを対象に、ゼロ比率及び変動係数を使用して同定するデータ処理、分析方法と前記方法によって得られた内部標準遺伝子を特異的に増幅することができるプライマー対及び／またはプローブを含む遺伝子発現率定量用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
各々の細胞には、５万〜１０万個程度の遺伝子があるが、細胞は、選択的に遺伝子を使用する。その中のかなり多数が、細胞自体の生命維持活動や日常的な活動をするための遺伝子である。このような遺伝子をハウスキーピング遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅ；以下、ＨＫＧ）と呼ぶ。また、内部標準遺伝子は、特定遺伝子の機能を明らかにしたり、特定機能の遺伝子を探索したり、特定条件の生物体の発現様相作成及びその他の多様な分子生物学的目的によって、特定あるいは多数の遺伝子発現量の比較のために開発された伝令ＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ；以下ｍＲＮＡ）の定量分析を使用する多様な遺伝子発現測定法において、測定しようとする標的遺伝子のｍＲＮＡの発現量の相対的定量化のための標準化に活用されているハウスキーピング遺伝子を意味する。
【０００３】
内部標準遺伝子は、他の試料との間の比較的正確な遺伝子発現比較のために、ｍＲＮＡ発現量の標準化に最も普遍的に使用されてきた（Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅ  Ｊ等，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ，２００２年，第３（７）巻，ＲＥＳＥＡＲＣＨ００３４頁）。すなわち、伝統的な逆転写重合酵素連鎖反応法（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：以下、ＲＴ−ＰＣＲ）から、最近開発された定量的リアルタイム重合酵素連鎖反応法（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ：以下、ｑＲＴ−ＰＣＲ）、遺伝子発現系列分析（ｓｅｒｉａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：以下、ＳＡＧＥ）及びマイクロアレイ（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）に至る遺伝子発現分析法に、内部標準遺伝子を普遍的に使用している。内部標準遺伝子として通常的に活用されるグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：以下、ＧＡＰＤＨ）及びβ−アクチン（β−ａｃｔｉｎ：以下、ＡＣＴＢ）の遺伝子は、前記遺伝子が細胞及び組織の種類に関わらず、サンプル間に一定水準で発現し、実験的処理によって変わらないものであるという仮定の下で、適切な検証なしに使用されてきている。
【０００４】
しかし、伝統的な内部標準遺伝子の発現が、組織及び細胞の種類によって異なり、試料の処理、発生学的段階及び病理学的状態を含む実験条件によって調節され得るという事実は、すでによく知られている（Ｂｅｒｅｔａ  Ｊ  ａｎｄ  Ｂｅｒｅｔａ  Ｍ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ値，１９９５年，第２１７（１）卷，３６３−３６９頁；Ｔｒｉｃａｒｉｃｏ  Ｃ等，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００２年，第３０９（２）卷，２９３−３０頁；Ｔｈｅｌｌｉｎ  Ｏ等，Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９９年，第７５（２−３）卷，２９１−２９５頁；Ｒｕｂｉｅ  Ｃ等，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ，２００５年，第１９（２）卷，１０１−１０９頁；Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ  ＴＤ  ａｎｄ  Ｚａｋｒａｊｓｅｋ  ＢＡ，Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０００年，第４６（１−２）卷，６９−８１頁；Ｚｈｏｎｇ  Ｈ  ａｎｄ  ＪＳｉｍｏｎｓ  Ｗ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，１９９９年，第２５９（３）卷，５２３−５２６頁；Ｓｅｌｖｅｙ  Ｓ等，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ，２００１年，第１５（５）卷，３０７−３１１頁；Ｗｕ  ＹＹ  ａｎｄ  ＬＲｅｅｓ  Ｊ，Ａｃｔａ  Ｄｅｒｍ  Ｖｅｎｅｒｅｏｌ，２０００年，第８０（１）卷，２−３頁；Ｌｅｅ  ＰＤ等，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，２００２年，第１２（２）卷，２９２−２９７頁；Ｈａｍａｌａｉｎｅｎ  ＨＫ等，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００１年，第２９９（１）卷，６３−７０頁）。相対定量時、不適切な内部標準遺伝子を使用することにより、誤った発現分析がなされ得る。このような憂慮は、すでに多くの研究者によって提議されている（Ｔｒｉｃａｒｉｃｏ  Ｃ等，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００２年，第３０９（２）卷，２９３−３００頁；Ｄｈｅｄａ  Ｋ等，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００５年，第卷，２００５年，第３４４（１）卷，１４１−１４３頁；ｄｅ  Ｋｏｋ  ＪＢ等，Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ，２００５年，第８５（１）卷，１５４−１５９頁；Ｂｒｕｎｎｅｒ  ＡＭ等，ＢＭＣ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ，２００４年，第４卷，１４頁）。ノーザンブロットや伝統的なＲＴ−ＰＣＲのような定性的な性向を帯びたｍＲＮＡ量の比較分析では、正確な標準化が必要ないこともあるが、高い敏感度と正確性の結果を示す遺伝子発現測定法であるｑＲＴ−ＰＣＲの場合は、特に、適切な内部標準遺伝子の選択は、非常に重要である（Ｈｕｇｇｅｔｔ  Ｊ等，Ｇｅｎｅｓ  Ｉｍｍｕｎ，２００５年，第６（４）卷，２７９−２８４頁）。
【０００５】
伝統的な内部標準遺伝子の適切な検証及び、さらに相応しい内部標準遺伝子探索の大切さが認識されるようになり、普遍的に使用される内部標準遺伝子の中で特定実験条件で最も適切な遺伝子を選択したり、ｍＲＮＡ定量のために一般的に使用される伝統的な内部標準遺伝子より優れた新しい遺伝子を捜すために多くの研究が行なわれてきている。しかし、大部分の既存研究は、普遍的に使用される内部標準遺伝子の中で、特定実験システムや制限された組織で最も安定的な発現を示す遺伝子を選択することに集中されてきた（Ｇｏｉｄｉｎ  Ｄ等，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００１年，第２９５（１）卷，１７−２１頁；Ｈａｌｌｅｒ  Ｆ等，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００４  年，第３３５（１）卷，１−９頁；Ｏｈｌ  Ｆ等，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，２００５年，第８３（１２）卷，１０１４−１０２４頁；Ｒａｄｏｎｉｃ  Ａ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，２００４年，第３１３（４）卷，８５６−８６２頁）。現在、ｑＲＴ−ＰＣＲ結果を使用して多数の内部標準遺伝子の中から最も相応しい遺伝子を捜すいくつかのプログラムが存在する（Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅ  Ｊ等，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ，２００２年，第３（７）卷，ｐ．ＲＥＳＥＡＲＣＨ００３４頁；Ｐｆａｆｆｌ  ＭＷ等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ，２００４年，第２６（６）卷，５０９−１５頁；Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ＣＬ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００４年，第６４（１５）卷，５２４５−５２５０頁）。
【０００６】
併せて、新しい内部標準遺伝子の探索は、主にマイクロアレイデータに基づいてきた（Ｈａｍａｌａｉｎｅｎ  ＨＫ等，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００１年，第２９９（１）卷，６３−７０頁；Ｈｏｅｒｎｄｌｉ  ＦＪ等，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００４年，第３３５（１）卷，３０−４１頁；Ｃｚｅｃｈｏｗｓｋｉ  Ｔ等，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００５年，第１３９（１）卷，５−１７頁；Ｊｉｎ  Ｐ等，ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００４年，第５（１）卷，５５頁；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ＭＳ等，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ，２００４年，第７６（４）卷，５１２−５１８頁；Ｓｈｕｌｚｈｅｎｋｏ  Ｎ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，２００５年，第３３７（１）卷，３０６−１２頁）。しかし、すでに報告されたように、マイクロアレイは、その方法上でプローブと意図しない転写体との不正確な交差混成化、他のプローブセットと混成化効率及びプローブと転写体の結合時の不正確性のようないくつかの類問題点及び制限（誤謬）を有している（Ｈａｖｅｒｔｙ  ＰＭ等，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００４年，第２０（１８）卷，３４３１−３４４１頁；ｖａｎ  Ｒｕｉｓｓｅｎ  Ｆ等，ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００５年，第６卷，９１頁）。また、発現遺伝子（以下、ＥＳＴ）及びＳＡＧＥが試料（ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）全体の転写体の発現様相を見られるのとは異なり、マイクロアレイは、チップ上にある遺伝子の発現のみ測定することができるという限界がある（ｖａｎ  Ｒｕｉｓｓｅｎ  Ｆ等，ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００５年，第６卷，９１頁）。それで、多くの方法で生成された遺伝子発現データを一緒に使用することが、一つの方法によって生成されたデータの制約点を補完し得ることが期待されている。例えば、ＳＡＧＥ方法は、ＥＳＴより少ない量で存在する転写体（ｌｏｗ  ａｂｕｎｄａｎｃｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ）を測定するのに、さらに敏感な方法である（Ｓｕｎ  Ｍ等，ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００４年，第５（１）卷，１−４頁）。
【０００７】
理想的な内部標準遺伝子が存在しないこともあり得るが、多くの大規模遺伝子発現データを通じて、大部分の実験条件に適用し得る伝統的な内部標準遺伝子よりさらに理想的な普遍的に使用可能な内部標準遺伝子を捜すことは、可能である。
【０００８】
それで、本発明者等は、公開されたＥＳＴ及びＳＡＧＥ遺伝子発現量データとともに、マイクロアレイデータを使用して、さらに多くの試料からさらに安定した発現を示すことによって、特定組織や研究に限られないで普遍的に遺伝子発現標準化に有用に使用することができる、既存遺伝子よりより優れた新しい内部標準遺伝子を発掘するための遺伝子発現データの処理方法と、前記の方法によって発掘された内部標準遺伝子を明らかにすることで本発明を完成した。
【発明の概要】
【０００９】
（発明が解決しようとする課題）
本発明の目的は、既存の内部標準遺伝子よりさらに安定した発現を示すことによって遺伝子発現標準化に有用に使用され得る新しい内部標準遺伝子を発掘するために、統計的概念を導入した相異する遺伝子発現データの統合的処理、分析方法と前記内部標準遺伝子を増幅させることができるプライマー対及び／またはプローブを含む遺伝子発現率定量用組成物を提供する。
【００１０】
（課題を解決するための手段）
前記目的を達成するために、本発明は、
１）ＥＳＴ、ＳＡＧＥ及びマイクロアレイデータセットで遺伝子の発現量を数値化する工程と、２）工程１）の遺伝子発現量とゼロ比率を使用して、多くの組織で常に発現される遺伝子を同定する工程を含む、内部標準遺伝子（ＥＲＧ）候補の選別方法を提供する。
【００１１】
また、前記方法によって選別された内部標準遺伝子候補を検出することができる検出試薬を含む、前記内部標準遺伝子候補の検出用組成物を提供する。
【００１２】
また、本発明は、１）定量対象遺伝子を増幅することができるプライマー対及び／またはプローブを使用して前記定量対象遺伝子をリアルタイムＰＣＲで増幅して、前記組成物を使用して試料に含まれている内部標準遺伝子候補をリアルタイムＰＣＲで増幅する工程と、２）工程１）の定量対象遺伝子の発現程度及び内部標準遺伝子候補の発現程度を標準化する工程を含む、定量対象遺伝子の発現量定量方法を提供する。
【００１３】
また、本発明は、前記方法で選別された内部標準遺伝子候補の変動係数（ＣＶ）を測定して、変動係数が低い順に内部標準遺伝子を順位付けする工程を含む参考用遺伝子（guide genes）の選別方法を提供する。
【００１４】
また、本発明は、前記方法によって同定された参考用遺伝子を検出することができる検出試薬を含む前記参考用遺伝子の検出用組成物を提供する。
【００１５】
また、本発明は、１）被検体のＲＮＡからｃＤＮＡを合成する工程と、
２）工程１）のｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡにして対象遺伝子を増幅することができるプライマー対及び／またはプローブを使用して前記対象遺伝子をリアルタイムＰＣＲで増幅して、前記組成物を使用して、試料に含まれている内部標準遺伝子候補をリアルタイムＰＣＲで増幅する工程、及び、３）工程２）の対象遺伝子の発現程度及び内部標準遺伝子候補の発現程度を標準化する工程とを含む、対象遺伝子の発現量定量方法を提供する。
【００１６】
同時に、本発明は、１）被検体から得られたゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡにして、対象遺伝子を増幅することができるプライマー対及び／またはプローブを使用して前記対象遺伝子をリアルタイムＰＣＲで増幅して、前記組成物を使用して試料に含まれている内部標準遺伝子候補をリアルタイムＰＣＲで増幅する工程、及び、２）工程１）の対象遺伝子の発現程度及び内部標準遺伝子候補の発現程度を標準化する工程を含む、対象遺伝子のゲノムＤＮＡ内の増幅有無鑑別方法を提供する。
【００１７】
（発明の効果）
本発明の方法は、「ゼロ比率」及びＣＶの概念を導入することによって相異しているデータベースの資料を統合的に分析して、標準遺伝子を発掘しようとする目的に適合使用することができ、発掘された２，０８７個の遺伝子は、大部分の組織で発現されるハウスキーピング遺伝子であり、発現安定性検証を通じて、相対的遺伝子発現分析時に参考用標準遺伝子として有用に使用され得、前記２，０８７個の遺伝子の中で１３個の標準遺伝子は、ＧＡＰＤＨ及びＡＣＴＢのような既存の標準遺伝子よりさらに安定的な発現と同時に、さらに低い発現量を示すので、相対的に発現量が少ない生体内の普遍的な遺伝子の標準化にさらに適合する。
[本発明1001]
1）ＥＳＴ、ＳＡＧＥ及びマイクロアレイデータセットで遺伝子の発現量を数値化する工程、及び
2）工程1）の数値化された遺伝子発現量とそれらのゼロ比率を使用して多くの組織で常に発現される遺伝子を同定する工程、
とを含む内部標準遺伝子（Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｇｅｎｅｓ；ＥＲＧ）候補の選別方法。
[本発明1002]
工程1）の遺伝子発現量数値化が、下記の数式1及び2を使用することを特徴とする本発明1001の方法：
＜数式1＞
ＥＳＴ遺伝子発現量＝特定ライブラリ内の特定遺伝子のＥＳＴの数／特定のライブラリ内全体ＥＳＴの数×1，000，000
＜数式2＞
ＳＡＧＥ遺伝子発現量＝特定ライブラリ内の特定遺伝子のタグの数／特定のライブラリ内全体タグの数×1，000，000。
[本発明1003]
工程1）のデータセットが、ＣＧＡＰ  ＥＳＴ（Hs_ExprData.dat）、ＳＡＧＥ（Hs_short.frequencies.gz及びHs_long.frequencies.gz）及びマイクロアレイ（Affymetrix HG-U133,CA）由来のｍＲＮＡ発現量数値データからなることを特徴とする本発明1001の方法。
[本発明1004]
工程2）のゼロ比率が、下記の数式3で記載されることを特徴とする本発明1001の方法：
＜数式3＞
ゼロ比率＝特定遺伝子が発現されない組織の個数／総組織の個数。
[本発明1005]
本発明1001の方法によって選別された少なくとも1つの内部標準遺伝子候補を検出するための組成物であって、内部標準遺伝子候補にハイブリダイズ可能な検出試薬を含む、組成物。
[本発明1006]
選別された内部標準遺伝子候補が、Accession No. Hs 120(PRDX6), Accession No. Hs 142(SULT1A1), Accession No. Hs 202(BZRP), Accession No. Hs 429(ATP5G3), Accession No. Hs 695(CSTB), Accession No. Hs 808(HNRPF), Accession No. Hs 861(MAPK3), Accession No. Hs 1063(SNRPC), Accession No. Hs 1103(TGFB1), Accession No. Hs 2430(TCFL1), Accession No. Hs 2533(ALDH9A1), Accession No. Hs 2795(LDHA), Accession No. Hs 2853(PCBP1), Accession No. Hs 3100(KARS), Accession No. Hs 3254(MRPL23), Accession No. Hs 3353(G3BP), Accession No. Hs 3416(ADFP), Accession No. Hs 439(STOML2), Accession No. Hs 3530(FUSIP1), Accession No. Hs 3989(PLXNB2), Accession No. Hs 4055(KLF6), Accession No. Hs 4742(GPAA1), Accession No. Hs 4747(DKC1), Accession No. Hs 4766(FAM32A), Accession No. Hs 4859(CCNL1), Accession No. Hs 4997(RBM23), Accession No. Hs 4998(TMOD3), Accession No. Hs 5062(TM4SF8), Accession No. Hs 5086(MGC10433), Accession No. Hs 5120(DNCL1), Accession No. Hs 5158(ILK), Accession No. Hs 5245(FLJ20643), Accession No. Hs 5258(MAGED1), Accession No. Hs 5268(ZDHHC4), Accession No. Hs 5298(ADIPOR1), Accession No. Hs 5308(UBA52), Accession No. Hs 5324(C2orf25), Accession No. Hs 5345(RNPEPL1), Accession No. Hs 5662(GNB2L1), Accession No. Hs 5710(CREG1), Accession No. Hs 5719(CNAP1), Accession No. Hs 5912(FBXO7), Accession No. Hs 5947(RAB8A), Accession No. Hs 6396(JTB), Accession No. Hs 6454(RGS19IP1), Accession No. Hs 6459(GPR172A), Accession No. Hs 6551(ATP6AP1), Accession No. Hs 6891(SFRS6), Accession No. Hs 7101(ANAPC5), Accession No. Hs 7236(NOSIP), Accession No. Hs 7476(ATP6V0B), Accession No. Hs 7527(DKFZP566E144), Accession No. Hs 7744(NDUFV1), Accession No. Hs 7753(CALU), Accession No. Hs 7768(FIBP), Accession No. Hs 7862(PNRC2), Accession No. Hs 7910(RYBP), Accession No. Hs 7917(HIG1), Accession No. Hs 8102(RPS20), Accession No. Hs 8372(UQCR), Accession No. Hs 8737(WDR6), Accession No. Hs 8752(TMEM4), Accession No. Hs 8765(DDX42), Accession No. Hs 8859(CANT1), Accession No. Hs 8867(CYR61), Accession No. Hs 9003(FLJ13868), Accession No. Hs 9015(MGC52000), Accession No. Hs 9043(C14orf120), Accession No. Hs 9234(NIFIE14), Accession No. Hs 9235(NME4), Accession No. Hs 9527(C2orf28), Accession No. Hs 9534(SEC11L1), Accession No. Hs 9573(ABCF1), Accession No. Hs 9589(UBQLN1), Accession No. Hs 9788(NDFIP1), Accession No. Hs 9825(CGI-128), Accession No. Hs 9857(DCXR), Accession No. Hs 10326(COPE), Accession No. Hs 10842(RAN), Accession No. Hs 10848(BMS1L), Accession No. Hs 11125(SPCS1), Accession No. Hs 11184(UBE2R2), Accession No. Hs 11223(IDH1), Accession No. Hs 11355(TMPO), Accession No. Hs 11463(UMP-CMPK), Accession No. Hs 12013(ABCE1), Accession No. Hs 12084(TUFM), Accession No. Hs 12102(SNX3), Accession No. Hs 12107(BC-2), Accession No. Hs 12109(WDR39), Accession No. Hs 12144(KIAA1033), Accession No. Hs 12152(SRPRB), Accession No. Hs 12272(BECN1), Accession No. Hs 12341(ADAR), Accession No. Hs 12457(NUP133), Accession No. Hs 12865(NSFL1C), Accession No. Hs 13662(MGC5508), Accession No. Hs 14317(NOLA3), Accession No. Hs 14333(FLJ10349), Accession No. Hs 14745(C10orf9), Accession No. Hs 14839(POLR2G), Accession No. Hs 14846(SLC7A1), Accession No. Hs 14894(TGOLN2), Accession No. Hs 15277(C16orf33), Accession No. Hs 15591(COPS6), Accession No. Hs 15738(RAB7), Accession No. Hs 16059(HSPC009), Accession No. Hs 16130(E2-230K), Accession No. Hs 16349(KIAA0431), Accession No. Hs 17118(FLJ11730), Accession No. Hs 17250(MGC4767), Accession No. Hs 17680(FUCA2), Accession No. Hs 17731(FLJ12892), Accession No. Hs 17883(PPM1G), Accession No. Hs 18069(LGMN), Accession No. Hs 18128(C20orf44), Accession No. Hs 18349(MRPL15), Accession No. Hs 19673(MAF1), Accession No. Hs 20013(P29), Accession No. Hs 20107(KNS2), Accession No. Hs 20157(CDK5RAP3), Accession No. Hs 20521(HRMT1L2), Accession No. Hs 20529(LOC127262), Accession No. Hs 20573(IGF1R), Accession No. Hs 20716(TIMM17A), Accession No. Hs 22393(DENR), Accession No. Hs 22543(UBE3A), Accession No. Hs 22546(CYBASC3), Accession No. Hs 22616(KIAA0664), Accession No. Hs 23033(LOC92912), Accession No. Hs 23111(FARSLA), Accession No. Hs 23978(SAFB), Accession No. Hs 24301(POLR2E), Accession No. Hs 24379(TRAPPC1), Accession No. Hs 24601(FBLN1), Accession No. Hs 24950(RGS5), Accession No. Hs 25155(NET1), Accession No. Hs 25450(SLC29A1), Accession No. Hs 25723(MTVR1), Accession No. Hs 26010(PFKP), Accession No. Hs 26023(FOXJ3), Accession No. Hs 26136(MGC14156), Accession No. Hs 26232(MAN2C1), Accession No. Hs 26403(GSTZ1), Accession No. Hs 26518(TM4SF7), Accession No. Hs 27222(NOLA2), Accession No. Hs 28491(SAT), Accession No. Hs 28914(APRT), Accession No. Hs 29203(GBL), Accession No. Hs 29665(CLSTN1), Accession No. Hs 30011(MGC2963), Accession No. Hs 30026(HSPC182), Accession No. Hs 30345(TRAP1), Accession No. Hs 30954(PMVK), Accession No. Hs 31053(CKAP1), Accession No. Hs 31334(C20orf14), Accession No. Hs 31387(DKFZP564J0123), Accession No. Hs 34045(CDCA4), Accession No. Hs 34576(TAX1BP1), Accession No. Hs 34906(BLOC1S2), Accession No. Hs 35052(TEGT), Accession No. Hs 35828(MARK3), Accession No. Hs 36587(PPP1R7), Accession No. Hs 36927(HSPH1), Accession No. Hs 37616(STRA13), Accession No. Hs 37916(DPP7), Accession No. Hs 42806(Cab45), Accession No. Hs 43297(MTPN), Accession No. Hs 47062(POLR2I), Accession No. Hs 50098(NDUFA4), Accession No. Hs 50308(HIP2), Accession No. Hs 50425(TEBP), Accession No. Hs 53066(HSPBP1), Accession No. Hs 54277(FAM50A), Accession No. Hs 54457(CD81), Accession No. Hs 54642(MAT2B), Accession No. Hs 54649(RY1), Accession No. Hs 55682(EIF3S7), Accession No. Hs 55847(MRPL51), Accession No. Hs 58488(CTNNAL1), Accession No. Hs 58992(SMC4L1), Accession No. Hs 59486(HSDL2), Accession No. Hs 61812(PTPN12), Accession No. Hs 65234(DDX27), Accession No. Hs 65238(RNF40), Accession No. Hs 66048(BPY2IP1), Accession No. Hs 66915(C22orf16), Accession No. Hs 68714(SFRS1), Accession No. Hs 9293(HEXB), Accession No. Hs 69554(RNF126), Accession No. Hs 69855(UNR), Accession No. 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No. Hs 520287(C6orf111), Accession No. Hs 520313(CD164), Accession No. Hs 520383(STX7), Accession No. Hs 520421(PERP), Accession No. Hs 520459(GTF2I), Accession No. Hs 520623(C7orf27), Accession No. Hs 520640(ACTB), Accession No. Hs 520740(SCRN1), Accession No. Hs 520794(YKT6), Accession No. Hs 520898(CTSB), Accession No. Hs 520943(WBSCR1), Accession No. Hs 520967(MDH2), Accession No. Hs 520973(HSPB1), Accession No. Hs 520974(YWHAG), Accession No. Hs 521064(ZNF655), Accession No. Hs 521151(FLJ22301), Accession No. Hs 521289(REPIN1), Accession No. Hs 521487(MGC8721), Accession No. Hs 521640(RAD23B), Accession No. Hs 521809(COBRA1), Accession No. Hs 521903(LY6E), Accession No. Hs 521924(SIAHBP1), Accession No. Hs 521969(NDUFB11), Accession No. Hs 521973(WDR13), Accession No. Hs 522074(DSIPI), Accession No. Hs 522110(CREB3), Accession No. Hs 522114(CLTA), Accession No. Hs 522310(NANS), Accession No. Hs 522373(GSN), Accession No. Hs 522394(HSPA5), Accession No. Hs 522463(EEF1A1), Accession No. Hs 522507(FBXW5), Accession No. Hs 522584(TMSB4X), Accession No. Hs 522590(EIF1AX), Accession No. Hs 522632(TIMP1), Accession No. Hs 522665(MAGED2), Accession No. Hs 522675(FLJ12525), Accession No. Hs 522752(PSMD10), Accession No. Hs 522817(BCAP31), Accession No. Hs 522819(IRAK1), Accession No. Hs 522823(EMD), Accession No. Hs 522932(NCOA4), Accession No. Hs 522995(EIF4EBP2), Accession No. Hs 523004(PSAP), Accession No. Hs 523012(DDIT4), Accession No. Hs 523054(SMP1), Accession No. Hs 523131(TRAPPC3), Accession No. Hs 523145(DDOST), Accession No. Hs 523215(NDUFB8), Accession No. Hs 523238(NOLC1), Accession No. Hs 523262(C1orf8), Accession No. Hs 523299(EIF3S10), Accession No. Hs 523302(PRDX3), Accession No. Hs 523560(HSPCA), Accession No. Hs 523680(SSRP1), Accession No. Hs 523789(TncRNA), Accession No. Hs 523829(POLD4), Accession No. Hs 523836(GSTP1), Accession No. Hs 523852(CCND1), Accession No. Hs 523875(INPPL1), Accession No. Hs 524009(AASDHPPT), Accession No. Hs 524081(DPAGT1), Accession No. Hs 524084(RNF26), Accession No. Hs 524161(RSU1), Accession No. Hs 524171(RAD52), Accession No. Hs 524183(FKBP4), Accession No. Hs 524195(ARHGAP21), Accession No. Hs 524214(MLF2), Accession No. Hs 524219(TPI1), Accession No. Hs 524271(PHC2), Accession No. Hs 524367(CBARA1), Accession No. Hs 524395(TUBA3), Accession No. Hs 524464(ATP5G2), Accession No. Hs 524502(RNF41), Accession No. Hs 524530(CTDSP2), Accession No. Hs 524590(RAB21), Accession No. Hs 524599(NAP1L1), Accession No. Hs 524690(PPIE), Accession No. Hs 524788(RAB35), Accession No. Hs 524809(RSN), Accession No. Hs 524899(SAP18), Accession No. Hs 524920(ZFP91), Accession No. Hs 524969(Ufm1), Accession No. Hs 525134(FLJ20277), Accession No. Hs 525163(ANKRD10), Accession No. Hs 525232(LRP10), Accession No. Hs 525238(C14orf119), Accession No. Hs 525330(ARF6), Accession No. Hs 525391(FLJ20580), Accession No. Hs 525527(RER1), Accession No. Hs 525626(PACS1L), Accession No. Hs 525899(C6orf49), Accession No. Hs 526464(PML), Accession No. Hs 526521(MDH1), Accession No. Hs 527105(HNRPDL), Accession No. Hs 527193(RPS23), Accession No. Hs 527348(AKAP9), Accession No. Hs 527412(ASAH1), Accession No. Hs 527861(OS-9), Accession No. Hs 527862(PKD1), Accession No. Hs 527980(DUT), A
ccession No. Hs 528050(HARS), Accession No. Hs 528222(NDUFS4), Accession No. Hs 528300(PITRM1), Accession No. Hs 528305(DDX17), Accession No. Hs 528572(SCAM-1), Accession No. Hs 528668(RPL6), Accession No. Hs 528780(GSPT1), Accession No. Hs 528803(UQCRC2), Accession No. Hs 529059(EIF3S4), Accession No. Hs 529132(SEPW1), Accession No. Hs 529244(NCK2), Accession No. Hs 529280(ANAPC7), Accession No. Hs 529303(ARPC2), Accession No. Hs 529369(AFAP), Accession No. Hs 529400(IFNAR1), Accession No. Hs 529420(UBE2G2), Accession No. Hs 529591(TLOC1), Accession No. Hs 529618(TFRC), Accession No. Hs 529631(RPL35A), Accession No. Hs 529782(VCP), Accession No. Hs 529798(BTF3), Accession No. Hs 529862(CSNK1A1), Accession No. Hs 529890(CANX), Accession No. Hs 529892(SQSTM1), Accession No. Hs 529957(SEC63), Accession No. Hs 530096(EIF3S2), Accession No. Hs 530118(LUC7L2), Accession No. Hs 530291(ANXA11), Accession No. Hs 530314(SSNA1), Accession No. Hs 530331(PDHA1), Accession No. Hs 530381(PIM3), Accession No. Hs 530412(PAI-RBP1), Accession No. Hs 530436(STXBP3), Accession No. Hs 530479(PMF1), Accession No. Hs 530687(RNH), Accession No. Hs 530734(MRPL16), Accession No. Hs 530753(FLJ20625), Accession No. Hs 530823(COPS7A), Accession No. Hs 530862(PRKAG1), Accession No. Hs 531081(LGALS3), Accession No. Hs 531089(PSMA3), Accession No. Hs 531176(SARS), Accession No. Hs 531330(CBWD1), Accession No. Hs 531614(BTBD14B), Accession No. Hs 531752(RANBP3), Accession No. Hs 531856(GAS5), Accession No. Hs 531876(DNCL2A), Accession No. Hs 531879(RAD1), Accession No. Hs 532359(RPL5), Accession No. Hs 532399(KIAA0663), Accession No. Hs 532755(GTL3), Accession No. Hs 532790(NMT1), Accession No. Hs 532793(KPNB1), Accession No. Hs 532803(HN1), Accession No. Hs 532826(MCL1), Accession No. Hs 532853(NDUFB7), Accession No. Hs 533030(HRIHFB2122), Accession No. Hs 533059(TUBB), Accession No. Hs 533122(SFRS10), Accession No. Hs 533136(LRPAP1), Accession No. Hs 533192(TOMM20), Accession No. Hs 533222(HSA9761), Accession No. Hs 533245(DDX46), Accession No. Hs 533282(NONO), Accession No. Hs 533308(PPP2R5D), Accession No. Hs 533317(VIM), Accession No. Hs 533437(TCEB1), Accession No. Hs 533440(WWP1), Accession No. Hs 533474(PPP1R8), Accession No. Hs 533479(LYPLA2), Accession No. Hs 533526(ATRX), Accession No. Hs 533624(H3F3A), Accession No. Hs 533712(RBM4), Accession No. Hs 533732(SRP14), Accession No. Hs 533771(STUB1), Accession No. Hs 533782(KRT8), Accession No. Hs 533977(TXNIP), Accession No. Hs 533985(EXOC7), Accession No. Hs 533986(ZNF258), Accession No. Hs 534125(HLA-C), Accession No. Hs 534168(NDUFA1), Accession No. Hs 534212(SEC22L1), Accession No. Hs 534255(B2M), Accession No. Hs 534307(CCND3), Accession No. Hs 534314(EIF5A), Accession No. Hs 534326(ITGB4BP), Accession No. Hs 534338(PPP4C), Accession No. Hs 534346(RPS7), Accession No. Hs 534350(SMARCB1), Accession No. Hs 534453(GRIM19), Accession No. Hs 534456(ANAPC11), Accession No. Hs 534457(C14orf166), Accession No. Hs 534473(TOMM22), Accession No. Hs 534483(MGC2941), Accession No. Hs 536275(PACS1), Accession No. Hs 541269(NDUFB9), Accession No. Hs 546248(CTSD), Accession No. Hs 546250(DNCI2), Accession No. Hs 546253(FDFT1), Accession No. Hs 546261(HNRPA1), Accession No. Hs 546269(RPL10A), Accession No. Hs 546271(PCBP2), Accession No. Hs 546286(RPS3), Accession No. Hs 546289(RPS12), Accession No. Hs 546290(RPS18), Accession No. Hs 546291(NET-5), Accession No. Hs 546339(SMAP), Accession No. Hs 546356(RPL13A), Accession No. Hs 546394(HSPC016), Accession No. Hs 547759(SSBP3), Accession No. Hs 549178(C9orf86), Accession No. Hs 552590(HTF9C), Accession No. Hs 553496(PGM3), Accession No. Hs 553512(C3F), Accession No. Hs 554767(NUP88), Accession No. Hs 554776(SREBF1), Accession No. Hs 554894(FLJ12953), Accession No. Hs 554896(MGC11257), Accession No. Hs 555194(FAM36A), Accession No. Hs 555866(C1QBP), Accession No. Hs 555873(HNRPAB), Accession No. Hs 555875(IDH3A), Accession No. Hs 555889(PSMC2), Accession No. Hs 555890(RBBP4), Accession No. Hs 555911(RBM8A), Accession No. Hs 555969(RIC8), Accession No. Hs 555971(PP1201), Accession No. Hs 555973(MRPS25), Accession No. Hs 555994(LONP), Accession No. Hs 556267(FBXL10), Accession No. Hs 556461(NDUFV2), Accession No. Hs 556795(PAICS), Accession No. Hs 557550(NPM1), Accession No. Hs 558296(ACP1), Accession No. Hs 558313(COX6A1), Accession No. Hs 558322(EEF1B2), Accession No. Hs 558325(EIF5), Accession No. Hs 558328(FKBP5), Accession No. Hs 558330(FTL), Accession No. Hs 558338(HSPE1), Accession No. Hs 558345(IK), Accession No. Hs 558354(LAMR1), Accession No. Hs 558360(NDUFB4), Accession No. Hs 558361(NME2), Accession No. Hs 558362(NUMA1), Accession No. Hs 558376(RAC1), Accession No. Hs 558381(RNU65), Accession No. Hs 558382(RPL15), Accession No. Hs 558383(RPL18A), Accession No. Hs 558384(RPL19), Accession No. Hs 558385(RPL23A), Accession No. Hs 558386(RPL34), Accession No. Hs 558388(RPS3A), Accession No. Hs 558389(RPS8), Accession No. Hs 558390(RPS24), Accession No. Hs 558391(RPS26), Accession No. Hs 558396(SCD), Accession No. Hs 558424(CSDA), Accession No. Hs 558426(EIF3S5), Accession No. Hs 558429(G10), Accession No. Hs 558431(RPL14), Accession No. Hs 558442(PDCD6IP), Accession No. Hs 558448(TXNL2), Accession No. Hs 558453(ATP5L), Accession No. Hs 558454(NUDC), Accession No. Hs 558458(COPS8), Accession No. Hs 558473(C18orf10), Accession No. Hs 558499(8D6A), Accession No. Hs 558511(PSARL), Accession No. Hs 558521(C2orf33), Accession No. Hs 558591(ORMDL1), Accession No. Hs 558825(PDE4DIP), Accession No. Hs 558995, Accession No. Hs 567260(CD2BP2), Accession No. Hs 567263(C1orf43), Accession No. Hs 567267(ATP2C1)及び Accession No. Hs 567279(HCNGP)からなる群から選択される一つまたはふたつ以上の遺伝子であることを特徴とする、本発明1005の組成物。
[本発明1007]
検出試薬が、内部標準遺伝子候補を増幅することができるプライマー対及び／またはプローブを含む、本発明1005の組成物。
[本発明1008]
プライマー対が、前記遺伝子のセンス配列に一致する長さ10〜50ｂｐのセンスプライマー及び前記遺伝子のアンチセンス配列に一致する長さ10〜50ｂｐ のアンチセンスプライマーからなる、本発明1007の組成物。
[本発明1009]
センスプライマーの長さが、12〜30ｂｐである、本発明1008の組成物。
[本発明1010]
アンチセンスプライマーの長さが、12〜30ｂｐである、本発明1008の組成物。
[本発明1011]
前記遺伝子の検出が、マイクロアレイ、ＳＡＧＥ（Ｓｅｒｉａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）またはｑＲＴ−ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）方法で測定される、本発明1005の組成物。
[本発明1012]
本発明1001の方法で選別された内部標準遺伝子候補の変動係数（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｏｆ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ，ＣＶ）を測定する工程；および
変動係数が低い順に内部標準遺伝子を順位付けする工程
とを含む、参考用遺伝子（guide genes）の選別方法。
[本発明1013]
参考用遺伝子が人体の大部分の組織で発現する、本発明1012の方法。
[本発明1014]
参考用遺伝子が、異なった資料間の遺伝子発現を相対的に定量するために、発現量の標準化に使用し得る、本発明1012の方法。
[本発明1015]
ある組織と他の組織とで遺伝子発現が大きく変化するにつれて、変動係数が大きくなる、本発明1012の方法。
[本発明1016]
本発明1012の方法によって同定された参考用遺伝子の少なくとも一つを検出する検出用組成物であって、該参考遺伝子を増幅することができる検出試薬を含む、前記参考用遺伝子の検出用組成物。
[本発明1017]
本発明において有用である参考用遺伝子が、Accession No. Hs 500775(ZNF207), Accession No. Hs 446427(OAZ1), Accession No. Hs 530118(LUC7L2), Accession No. Hs 208597(CTBP1), Accession No. Hs 440382(TRIM27), Accession No. Hs 444279(GPBP1), Accession No. Hs 250009(ARL8B), Accession No. Hs 9589(UBQLN1), Accession No. Hs 253726(PAPOLA), Accession No. Hs 146806(CUL1), Accession No. Hs 533222(DIMT1L), Accession No. Hs 494985(FBXW2)及び Accession No. Hs 242458(SPG21)からなる群から選択される一つまたはふたつ以上の遺伝子である、本発明1016の組成物。
[本発明1018]
検出試薬が、参考用遺伝子を増幅することができるプライマー対及び／またはプローブを含む、本発明1016の組成物。
[本発明1019]
参考用遺伝子が、細胞内の多くの低存在量の転写体と同様に低い発現量を示す、本発明1016の組成物。
[本発明1020]
プライマー対が、前記遺伝子のセンス配列に一致する長さ10〜50ｂｐのセンスプライマー及び前記遺伝子のアンチセンス配列に一致する長さ10〜50ｂｐ のアンチセンスプライマーからなる、本発明1018の組成物。
[本発明1021]
センスプライマーの長さが、12〜30ｂｐである、本発明1020の組成物。
[本発明1022]
アンチセンスプライマーの長さが、12〜30ｂｐである、本発明1020の組成物。
[本発明1023]
遺伝子検出が、マイクロアレイ、ＳＡＧＥまたは、ｑＲＴ−ＰＣＲ方法で測定される、本発明1020の組成物。
[本発明1024]
1）被検体のＲＮＡからｃＤＮＡを合成する工程、
2）工程1）のｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして、プライマー対及び／またはプローブを使用して前記対象遺伝子を増幅するためにリアルタイムＰＣＲを行い、その後に本発明1005の組成物を使用して内部標準遺伝子を増幅するためにリアルタイムＰＣＲを行う工程；及び
3）工程2）の対象遺伝子の発現量を内部標準遺伝子の発現量に対して標準化する工程
とを含む、対象遺伝子の発現量定量方法。
[本発明1025]
1）被検体のＲＮＡからｃＤＮＡを合成する工程、
2）工程1）のｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして、プライマー対及び／またはプローブを使用して前記対象遺伝子増幅するためにリアルタイムＰＣＲを行い、その後に本発明1016の組成物を使用して内部標準遺伝子を増幅するためにリアルタイムＰＣＲを行う工程；及び
3）工程2）の対象遺伝子の発現量を内部標準遺伝子の発現量に対して標準化する工程
とを含む、対象遺伝子の発現量定量方法。
[本発明1026]
1）被検体のゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして、プライマー対及び／またはプローブを使用して前記対象遺伝子をリアルタイムＰＣＲで増幅し、その後に本発明1005の組成物を使用して内部標準遺伝子候補を増幅するためにリアルタイムＰＣＲを行う工程；及び
2）工程1）の対象遺伝子の発現量を内部標準遺伝子候補の発現量に対して標準化する工程
とを含む、ゲノムＤＮＡ内の対象遺伝子の増幅を同定するための方法。
[本発明1027]
1）被検体のゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして、プライマー対及び／またはプローブを使用して前記対象遺伝子をリアルタイムＰＣＲで増幅し、その後に本発明1016の組成物を使用して内部標準遺伝子候補を増幅するためにリアルタイムＰＣＲを行う工程；及び
2）工程1）の対象遺伝子の発現量を内部標準遺伝子候補の発現量に対して標準化する工程
とを含む、対象遺伝子のゲノムＤＮＡ内の増幅を同定するための方法。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、内部標準遺伝子（ＥＲＧ）発掘方法を示す模式図である。
【図２】図２は、ＦｕｎＣａｔ（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ）によって分類された候補ＥＲＧの機能的分布を示す図である：数字：遺伝子の個数；Ａ：タンパク質の運命（折りたたみ、変形、用途）；Ｂ：細胞移動、移動促進及び移動経路；Ｃ：転写；Ｄ：細胞情報交換／信号伝達体系；Ｅ：細胞周期及びＤＮＡプロセッシング；Ｆ：蛋白質合成；Ｇ：物質代謝；Ｈ：エネルギー；Ｉ：細胞の運命；Ｊ：細胞環境の相互作用；Ｋ：環境の相互作用（体系的）；Ｌ：器官の差異；Ｍ：発達（体系的）；Ｎ：タンパク質活性規制；Ｏ：組織の差異；Ｐ：細胞構成物の生物発生説；Ｑ：細胞救出、防御及び病毒性；及びＲ：細胞形態の差異。
【図３】図３は、２，０８７個の候補ＥＲＧの４個のデータセット［ＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ）、やや短い切片のＳＡＧＥ（ｓｅｒｉａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｈｏｒｔ；ＳｈｏｒｔＳＡＧＥ）、長い切片のＳＡＧＥ（ｓｅｒｉａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｌｏｎｇ；ＬｏｎｇＳＡＧＥ）及びマイクロアレイデータセット］間の遺伝子発現量の相関関係を示す図である。
【図４】図４は、２，０８７個の候補ＥＲＧの４個のデータセット（ＥＳＴ，ＳｈｏｒｔＳＡＧＥ，ＬｏｎｇＳＡＧＥ及びマイクロアレイデータセット）間の変動係数（ＣＶ，％）の相関関係を示す図である。
【図５】図５は、各データセットでの本発明によって選別された候補ＥＲＧ及び非候補ＥＲＧ発現を比較したグラフである：箱図（Ｂｏｘ  ａｎｄ  Ｗｈｉｓｋｅｒ  ｐｌｏｔｓ）：自然ログ値（ｌｎ）で表示された発現値の分布；箱の底面：全体発現値の中で小さな順に２５％に該当する発現値；及び箱の上面：発現値の中で小さな順に７５％に該当する発現値。
【図６】図６は、本発明によって選別された１３個の内部標準遺伝子（ＥＲＧ）と任意に選択された１３個の伝統的内部標準遺伝子間の遺伝子発現量を比較したグラフである。
【図７】図７は、本発明によって選別された１３個の内部標準遺伝子（ＥＲＧ）と任意に選択された１３個の伝統的内部標準遺伝子間のＣＶ（％）比較図である。
【図８】図８は、リアルタイムＰＣＲで測定した人体凍結組織及び癌細胞株を含む４８個の各試料での新規及び伝統的ＥＲＧのｍＲＮＡ水準の分布を示す図である。
【図９】図９は、各新規及び伝統的ＥＲＧの４８個試料（凍結組織及び癌細胞株試料を含む）及び６０個のＦＦＰＥ（ｆｏｒｍａｌｉｎ−ｆｉｘｅｄ  ｐａｒａｆｆｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ）組織試料でのリアルタイムＰＣＲで測定されたＣｐ値で表現されたｍＲＮＡ水準範囲を示すグラフである。箱図の中線は、Ｃｐ値の中間値を意味し、底面はＣｐ値の小さな順に２５％に該当する値を、上面はＣｐ値の７５％に該当する値を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明で使用した用語を説明する。
【００２０】
本発明で使用された用語、「候補標準遺伝子」は、本発明の方法によって選別されたもので、多様な組織で同時に発現されるハウスキーピング遺伝子（ＨＫＧ）の特性を有する遺伝子を意味する。
【００２１】
本発明で使用された用語、「参考用遺伝子」は  、「候補標準遺伝子」中から選択されたもので、細胞内の大部分の転写体に似ている低い発現量及び低い発現量変動を示す特性を有する遺伝子で、本明細書で用語「標準遺伝子」または「内部標準遺伝子」と同一な意味で使用される。
【００２２】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００２３】
本発明は、
１）ＥＳＴ、ＳＡＧＥ及びマイクロアレイデータセットで遺伝子の発現量を数値化する工程と、
２）工程１）の遺伝子発現量とゼロ比率を使用して多くの組織で常に発現される遺伝子を同定する工程を含む、内部標準遺伝子（ＥＲＧ）候補の選別方法を提供する。
【００２４】
内部標準遺伝子（ＥＲＧ）は、他の試料との間の比較的正確な遺伝子発現比較のために、ｍＲＮＡ発現量の標準化に最も普遍的に使用されてきた遺伝子である。ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＲＴ−ＰＣＲ、遺伝子発現系列分析（ＳＡＧＥ）及びマイクロアレイに至る遺伝子発現分析法に、内部標準遺伝子を普遍的に使用している。内部標準遺伝子として通常的に活用されるグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）及び、β−アクチン（以下、ＡＣＴＢ）の遺伝子は、前記遺伝子が由来の多様性に関係なく試料間に一定の水準で発現され、実験的処理によって変わらないとの仮定の下に、適切な検証なしに使用されてきている。しかし、組織及び細胞の種類によって異なり、試料の処理、発生学的段階及び病理学的状態を含んだ実験条件によって、調節され得るという事実は、すでによく知られている。
【００２５】
そこで、本発明者等は、人体の多くの組織で類似な水準で発現するハウスキーピング遺伝子（ＨＫＧ）探索のために、まず、データセットを構成するために公開ＣＧＡＰサイト（The Cancer Genome Project,//cgap.nci.nih.gov/）からＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ）及び、ＳＡＧＥヒト遺伝子発現データとＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３（ＨＧ−Ｕ１３３）アレイセットを基盤に製作されたＧｅｎｅ  Ｌｏｇｉｃ社のＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ＤａｔａｓｕｉｔｅＴＭからマイクロアレイ遺伝子発現資料を入手した。前記のデータベースを統合してデータセットを構成したが、活用可能なデータベースは、これに限定されない。データセットから入手した発現資料を使用して、下記＜数式１＞及び＜数式２＞によって発現量を決定した。すなわち、下記の数式１では、特定のライブラリ内での特定の遺伝子のＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ）発現水準が分かり、下記の数式２では、特定のライブラリ内での特定の遺伝子のＳＡＧＥ発現水準が分かる。
【００２６】
＜数式１＞  ＥＳＴ遺伝子発現量＝特定ライブラリ内の特定遺伝子のＥＳＴの数／特定のライブラリ内全体ＥＳＴの数×１，０００，０００
【００２７】
＜数式２＞  ＳＡＧＥ遺伝子発現量＝特定ライブラリ内の特定遺伝子のタグの数／特定のライブラリ内全体タグの数×１，０００，０００
【００２８】
本発明者等は、相異したデータベースのデータを統合的に分析して、共通事項を導出するために新たに「ゼロ比率」を導入して、特定遺伝子が多くの組織にわたって、大部分の状況で発現されるハウスキーピング遺伝子（ＨＫＧ）である可能性を測定した。
【００２９】
＜数式３＞  ゼロ比率＝特定遺伝子が発現されない組織の個数／総組織の個数
【００３０】
ゼロ比率というのは、特定遺伝子が発現されない組織の個数を総組織の個数で割ったもので、ゼロ比率が低いほど、ハウスキーピング遺伝子（ＨＫＧ）である可能性が高いと言える。前記の「ゼロ比率」概念を活用してＥＳＴ、やや短い切片のＳＡＧＥ（ＳｈｏｒｔＳＡＧＥ）及び、長い切片のＳＡＧＥ（ＬｏｎｇＳＡＧＥ）データセットで、共通的にゼロ比率が低い遺伝子を選択して、これを２，０８７個の遺伝子に分類した。前記方法で分類された２，０８７個の遺伝子を下記「候補標準遺伝子」または「候補ＥＲＧ」とすることもできる。前記でゼロ比率が低いということは、ＥＳＴではゼロ比率が０．４、ＳｈｏｒｔＳＡＧＥではゼロ比率が０．１、ＬｏｎｇＳＡＧＥではゼロ比率が０．３より小さいことを意味する。他のデータベースであるマイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３，ＣＡ）データセットで、ＥＳＴとＳＡＧＥデータセットから選別された２，０８７個の遺伝子の平均遺伝子発現量及び変動係数（ＣＶ）（％）を求めた。前記２，０８７個の遺伝子の中で、１，９９０個のユニジーンクラスター（５，２３８個のプローブセット，５，３１７切片）に対する発現データが得られた。
【００３１】
その結果、４個のデータセット［ＥＳＴ、ＳｈｏｒｔＳＡＧＥ、ＬｏｎｇＳＡＧＥ及びマイクロアレイデータセット］間で平均遺伝子発現量は、有意な相関関係を示した（図３参考）。ＣＶの場合、有意性を示しはしたが、平均遺伝子発現量よりはデータセット間に低い相関関係を示した（図４参考）。
【００３２】
これと共に、各データセットの候補ＥＲＧと非ＥＲＧの遺伝子発現を比較した結果では、候補ＥＲＧの平均遺伝子発現量が、非ＥＲＧより４個のデータセット全てで有意に高かった（ｐ＜０．０００１）（図５参考）。
【００３３】
また、本発明は、前記方法によって選別された内部標準遺伝子候補を検出することができる検出試薬を含む前記内部標準遺伝子候補の検出用組成物を提供する。
【００３４】
前記選別された内部標準遺伝子候補は、下記に構成される遺伝子群から選択される一つまたはふたつ以上の遺伝子であることが好ましいが、これに限定されない：
Accession No. Hs 120(PRDX6), Accession No. Hs 142(SULT1A1), Accession No. Hs 202(BZRP), Accession No. Hs 429(ATP5G3), Accession No. Hs 695(CSTB), Accession No. Hs 808(HNRPF), Accession No. Hs 861(MAPK3), Accession No. Hs 1063(SNRPC), Accession No. Hs 1103(TGFB1), Accession No. Hs 2430(TCFL1), Accession No. Hs 2533(ALDH9A1), Accession No. Hs 2795(LDHA), Accession No. Hs 2853(PCBP1), Accession No. Hs 3100(KARS), Accession No. Hs 3254(MRPL23), Accession No. Hs 3353(G3BP), Accession No. Hs 3416(ADFP), Accession No. Hs 439(STOML2), Accession No. Hs 3530(FUSIP1), Accession No. Hs 3989(PLXNB2), Accession No. Hs 4055(KLF6), Accession No. Hs 4742(GPAA1), Accession No. Hs 4747(DKC1), Accession No. Hs 4766(FAM32A), Accession No. Hs 4859(CCNL1), Accession No. Hs 4997(RBM23), Accession No. Hs 4998(TMOD3), Accession No. Hs 5062(TM4SF8), Accession No. Hs 5086(MGC10433), Accession No. Hs 5120(DNCL1), Accession No. Hs 5158(ILK), Accession No. Hs 5245(FLJ20643), Accession No. Hs 5258(MAGED1), Accession No. Hs 5268(ZDHHC4), Accession No. Hs 5298(ADIPOR1), Accession No. Hs 5308(UBA52), Accession No. Hs 5324(C2orf25), Accession No. Hs 5345(RNPEPL1), Accession No. Hs 5662(GNB2L1), Accession No. Hs 5710(CREG1), Accession No. Hs 5719(CNAP1), Accession No. Hs 5912(FBXO7), Accession No. Hs 5947(RAB8A), Accession No. Hs 6396(JTB), Accession No. Hs 6454(RGS19IP1), Accession No. Hs 6459(GPR172A), Accession No. Hs 6551(ATP6AP1), Accession No. Hs 6891(SFRS6), Accession No. Hs 7101(ANAPC5), Accession No. Hs 7236(NOSIP), Accession No. Hs 7476(ATP6V0B), Accession No. Hs 7527(DKFZP566E144), Accession No. Hs 7744(NDUFV1), Accession No. Hs 7753(CALU), Accession No. Hs 7768(FIBP), Accession No. Hs 7862(PNRC2), Accession No. Hs 7910(RYBP), Accession No. Hs 7917(HIG1), Accession No. Hs 8102(RPS20), Accession No. Hs 8372(UQCR), Accession No. Hs 8737(WDR6), Accession No. Hs 8752(TMEM4), Accession No. Hs 8765(DDX42), Accession No. Hs 8859(CANT1), Accession No. Hs 8867(CYR61), Accession No. Hs 9003(FLJ13868), Accession No. Hs 9015(MGC52000), Accession No. Hs 9043(C14orf120), Accession No. Hs 9234(NIFIE14), Accession No. Hs 9235(NME4), Accession No. Hs 9527(C2orf28), Accession No. Hs 9534(SEC11L1), Accession No. Hs 9573(ABCF1), Accession No. Hs 9589(UBQLN1), Accession No. Hs 9788(NDFIP1), Accession No. Hs 9825(CGI-128), Accession No. Hs 9857(DCXR), Accession No. Hs 10326(COPE), Accession No. Hs 10842(RAN), Accession No. Hs 10848(BMS1L), Accession No. Hs 11125(SPCS1), Accession No. Hs 11184(UBE2R2), Accession No. Hs 11223(IDH1), Accession No. Hs 11355(TMPO), Accession No. Hs 11463(UMP-CMPK), Accession No. Hs 12013(ABCE1), Accession No. Hs 12084(TUFM), Accession No. Hs 12102(SNX3), Accession No. Hs 12107(BC-2), Accession No. Hs 12109(WDR39), Accession No. Hs 12144(KIAA1033), Accession No. Hs 12152(SRPRB), Accession No. Hs 12272(BECN1), Accession No. Hs 12341(ADAR), Accession No. Hs 12457(NUP133), Accession No. Hs 12865(NSFL1C), Accession No. Hs 13662(MGC5508), Accession No. Hs 14317(NOLA3), Accession No. Hs 14333(FLJ10349), Accession No. Hs 14745(C10orf9), Accession No. Hs 14839(POLR2G), Accession No. Hs 14846(SLC7A1), Accession No. Hs 14894(TGOLN2), Accession No. Hs 15277(C16orf33), Accession No. Hs 15591(COPS6), Accession No. Hs 15738(RAB7), Accession No. Hs 16059(HSPC009), Accession No. Hs 16130(E2-230K), Accession No. Hs 16349(KIAA0431), Accession No. Hs 17118(FLJ11730), Accession No. Hs 17250(MGC4767), Accession No. Hs 17680(FUCA2), Accession No. Hs 17731(FLJ12892), Accession No. Hs 17883(PPM1G), Accession No. Hs 18069(LGMN), Accession No. Hs 18128(C20orf44), Accession No. Hs 18349(MRPL15), Accession No. Hs 19673(MAF1), Accession No. Hs 20013(P29), Accession No. Hs 20107(KNS2), Accession No. Hs 20157(CDK5RAP3), Accession No. Hs 20521(HRMT1L2), Accession No. Hs 20529(LOC127262), Accession No. Hs 20573(IGF1R), Accession No. Hs 20716(TIMM17A), Accession No. Hs 22393(DENR), Accession No. Hs 22543(UBE3A), Accession No. Hs 22546(CYBASC3), Accession No. Hs 22616(KIAA0664), Accession No. Hs 23033(LOC92912), Accession No. Hs 23111(FARSLA), Accession No. Hs 23978(SAFB), Accession No. Hs 24301(POLR2E), Accession No. Hs 24379(TRAPPC1), Accession No. Hs 24601(FBLN1), Accession No. Hs 24950(RGS5), Accession No. Hs 25155(NET1), Accession No. Hs 25450(SLC29A1), Accession No. Hs 25723(MTVR1), Accession No. Hs 26010(PFKP), Accession No. Hs 26023(FOXJ3), Accession No. Hs 26136(MGC14156), Accession No. Hs 26232(MAN2C1), Accession No. Hs 26403(GSTZ1), Accession No. Hs 26518(TM4SF7), Accession No. Hs 27222(NOLA2), Accession No. Hs 28491(SAT), Accession No. Hs 28914(APRT), Accession No. Hs 29203(GBL), Accession No. Hs 29665(CLSTN1), Accession No. Hs 30011(MGC2963), Accession No. Hs 30026(HSPC182), Accession No. Hs 30345(TRAP1), Accession No. Hs 30954(PMVK), Accession No. Hs 31053(CKAP1), Accession No. Hs 31334(C20orf14), Accession No. Hs 31387(DKFZP564J0123), Accession No. Hs 34045(CDCA4), Accession No. Hs 34576(TAX1BP1), Accession No. Hs 34906(BLOC1S2), Accession No. Hs 35052(TEGT), Accession No. Hs 35828(MARK3), Accession No. Hs 36587(PPP1R7), Accession No. Hs 36927(HSPH1), Accession No. Hs 37616(STRA13), Accession No. Hs 37916(DPP7), Accession No. Hs 42806(Cab45), Accession No. Hs 43297(MTPN), Accession No. Hs 47062(POLR2I), Accession No. Hs 50098(NDUFA4), Accession No. Hs 50308(HIP2), Accession No. Hs 50425(TEBP), Accession No. Hs 53066(HSPBP1), Accession No. Hs 54277(FAM50A), Accession No. Hs 54457(CD81), Accession No. Hs 54642(MAT2B), Accession No. Hs 54649(RY1), Accession No. Hs 55682(EIF3S7), Accession No. Hs 55847(MRPL51), Accession No. Hs 58488(CTNNAL1), Accession No. Hs 58992(SMC4L1), Accession No. Hs 59486(HSDL2), Accession No. Hs 61812(PTPN12), Accession No. Hs 65234(DDX27), Accession No. Hs 65238(RNF40), Accession No. Hs 66048(BPY2IP1), Accession No. Hs 66915(C22orf16), Accession No. Hs 68714(SFRS1), Accession No. Hs 9293(HEXB), Accession No. Hs 69554(RNF126), Accession No. Hs 69855(UNR), Accession No. Hs 71465(SQLE), Accession No. Hs 71787(MRPS7), Accession No. Hs 73527(CSNK2B), Accession No. Hs 73722(APEX1), Accession No. Hs 73799(GNAI3), Accession No. Hs 73965(SFRS2), Accession No. Hs 74047(ETFB), Accession No. Hs 74050(FVT1), Accession No. Hs 74137(TMP21), Accession No. Hs 74375(DVL1), Accession No. Hs 74405(YWHAQ), Accession No. Hs 74471(GJA1), Accession No. Hs 74563(OAZ2), Accession No. Hs 74564(SSR2), Accession No. Hs 74576(GDI1), Accession No. Hs 75056(TIMM13), Accession No. Hs 75061(MARCKSL1), Accession No. Hs 75066(TSN), Accession No. Hs 75087(FASTK), Accession No. Hs 75117(ILF2), Accession No. Hs 75133(TFAM), Accession No. Hs 75139(ARFIP2), Accession No. Hs 75189(DAP), Accession No. Hs 75227(NDUFA9), Accession No. Hs 75243(BRD2), Accession No. Hs 75249(ARL6IP), Accession No. Hs 75254(IRF3), Accession No. Hs 75318(TUBA1), Accession No. Hs 75348(PSME1), Accession No. Hs 75438(QDPR), Accession No. Hs 75527(ADSL), Accession No. Hs 75724(COPB2), Accession No. Hs 75798(C20orf111), Accession No. Hs 75841(C12orf8), Accession No. Hs 75890(MBTPS1), Accession No. Hs 75914(RNP24), Accession No. Hs 76111(DAG1), Accession No. Hs 76394(ECHS1), Accession No. Hs 76480(UBL4), Accession No. Hs 76662(ZDHHC16), Accession No. Hs 76686(GPX1), Accession No. Hs 76847(GANAB), Accession No. Hs 77060(PSMB6), Accession No. Hs 77269(GNAI2), Accession No. Hs 77313(CDK10), Accession No. Hs 77422(PLP2), Accession No. Hs 77558(HMGN3), Accession No. Hs 77578(USP9X), Accession No. Hs 77793(CSK), Accession No. Hs 77897(SF3A3), Accession No. Hs 77961(HLA-B), Accession No. Hs 77978(DKFZp761I2123), Accession No. Hs 78466(PSMD8), Accession No. Hs 78601(UROD), Accession No. Hs 78771(PGK1), Accession No. Hs 78880(ILVBL), Accession No. Hs 78888(DBI), Accession No. Hs 78989(ADH5), Accession No. Hs 79064(DHPS), Accession No. Hs 79081(PPP1CC), Accession No. Hs 79088(RCN2), Accession No. Hs 79101(CCNG1), Accession No. Hs 79110(NCL), Accession No. Hs 79322(QARS), Accession No. Hs 79335(SMARCD1), Accession No. Hs 79387(PSMC5), Accession No. Hs 79402(POLR2C), Accession No. Hs 79411(RPA2), Accession No. Hs 79625(C20orf149), Accession No. Hs 80545(RPL37), Accession No. Hs 80919(SYPL), Accession No. Hs 80986(ATP5G1), Accession No. Hs 81328(NFKBIA), Accession No. Hs 81424(SUMO1), Accession No. Hs 81848(RAD21), Accession No. Hs 81964(SEC24C), Accession No. Hs 82201(CSNK2A2), Accession No. Hs 82327(GSS), Accession No. Hs 82719(MGC21416), Accession No. Hs 82793(PSMB3), Accession No. Hs 82887(PPP1R11), Accession No. Hs 82890(DAD1), Accession No. Hs 82916(CCT6A), Accession No. Hs 82927(AMPD2), Accession No. Hs 83190(FASN), Accession No. Hs 83347(AAMP), Accession No. Hs 83383(PRDX4), Accession No. Hs 83734(STX4A), Accession No. Hs 83753(SNRPB), Accession No. Hs 83765(DHFR), Accession No. Hs 83916(NDUFA5), Accession No. Hs 84359(GABARAP), Accession No. Hs 84753(FLJ12442), Accession No. Hs 85155(ZFP36L1), Accession No. Hs 85769(ERBP), Accession No. Hs 85962(DERPC), Accession No. Hs 86131(FADD), Accession No. Hs 87752(MSN), Accession No. Hs 89545(PSMB4), Accession No. Hs 89643(TKT), Accession No. Hs 89649(EPHX1), Accession No. Hs 89781(UBTF), Accession No. Hs 89864(SKIV2L), Accession No. Hs 90061(PGRMC1), Accession No. Hs 90093(HSPA4), Accession No. Hs 90107(ADRM1), Accession No. Hs 90443(NDUFS8), Accession No. Hs 91142(KHSRP), Accession No. Hs 91531(MLLT6), Accession No. Hs 93659(ERP70), Accession No. Hs 93832(LOC54499), Accession No. Hs 95577(CDK4), Accession No. Hs 96530(COX11), Accession No. Hs 96852(FLJ21128), Accession No. Hs 96996(HNRPA0), Accession No. Hs 97616(SH3GL1), Accession No. Hs 97887(RCN1), Accession No. Hs 98751(FUBP3), Accession No. Hs 98791(ACTR1B), Accession No. Hs 102696(MCTS1), Accession No. Hs 102798(PSMA1), Accession No. Hs 103561(ARL6IP4), Accession No. Hs 103834(MGC5576), Accession No. Hs 104839(TIMP2), Accession No. Hs 105547(NPDC1), Accession No. Hs 106185(RALGDS), Accession No. Hs 106876(ATP6V0D1), Accession No. Hs 106909(ANAPC13), Accession No. Hs 107003(CCNB1IP1), Accession No. Hs 107101(FLJ31031), Accession No. Hs 107387(C7orf20), Accession No. Hs 107393(C3orf4), Accession No. Hs 108029(SH3BGRL), Accession No. Hs 108080(CSRP1), Accession No. Hs 108371(E2F4), Accession No. Hs 108408(APH-1A), Accession No. Hs 108957(
RPS27L), Accession No. Hs 108969(PTD008), Accession No. Hs 109051(SH3BGRL3), Accession No. Hs 109052(C14orf2), Accession No. Hs 109672(SIAT7F), Accession No. Hs 109798(C6orf48), Accession No. Hs 110695(SF3B5), Accession No. Hs 110849(ESRRA), Accession No. Hs 111286(MRPS11), Accession No. Hs 111577(ITM2C), Accession No. Hs 111801(ARS2), Accession No. Hs 112058(SIVA), Accession No. Hs 112318(TOMM7), Accession No. Hs 112955(NUDT5), Accession No. Hs 114033(SSR1), Accession No. Hs 114286(CD9), Accession No. Hs 114412(TXNL1), Accession No. Hs 115474(RFC3), Accession No. Hs 115792(EXOSC7), Accession No. Hs 116448(GLS), Accession No. Hs 117176(PABPN1), Accession No. Hs 117715(ST5), Accession No. Hs 118110(BST2), Accession No. Hs 118400(FSCN1), Accession No. Hs 118463(PNPLA2), Accession No. Hs 118638(NME1), Accession No. Hs 118722(FUT8), Accession No. Hs 118964(p66alpha), Accession No. Hs 118983(GSDMDC1), Accession No. Hs 19177(ARF3), Accession No. Hs 119192(H2AFZ), Accession No. Hs 119251(UQCRC1), Accession No. Hs 119591(AP2S1), Accession No. Hs 119598(RPL3), Accession No. Hs 120323(DNAPTP6), Accession No. Hs 121088(NUP153), Accession No. Hs 121549(CDIPT), Accession No. Hs 122363(WIPI-2), Accession No. Hs 122523(SND1), Accession No. Hs 124126(ARPC1A), Accession No. Hs 124147(FBXL11), Accession No. Hs 124246(C10orf119), Accession No. Hs 124366(BBX), Accession No. Hs 125113(CCT8), Accession No. Hs 125867(EVL), Accession No. Hs 125898(GNAS), Accession No. Hs 126497(AEBP2), Accession No. Hs 126774(RAMP), Accession No. Hs 126938(NAPA), Accession No. Hs 127092(DHX38), Accession No. Hs 127249(EAP30), Accession No. Hs 127386(MAMDC2), Accession No. Hs 127764(RAB5C), Accession No. Hs 128065(CTSC), Accession No. Hs 128199(SEPT11), Accession No. Hs 128548(WDR1), Accession No. Hs 129634(CINP), Accession No. Hs 129673(EIF4A1), Accession No. Hs 130031(TRIO), Accession No. Hs 130098(DDX23), Accession No. Hs 130293(CROP), Accession No. Hs 130413(TM9SF2), Accession No. Hs 131226(BNIP3L), Accession No. Hs 132497(PRNPIP), Accession No. Hs 132513  HSD17B12), Accession No. Hs 133892(TPM1), Accession No. Hs 134074(SLC35E1), Accession No. Hs 134688(PSMD13), Accession No. Hs 135406(CEBPZ), Accession No. Hs 136905(UREB1), Accession No. Hs 136947(RALY), Accession No. Hs 137510(NCOR2), Accession No. Hs 138860(ARHGAP1), Accession No. Hs 139896(MAEA), Accession No. Hs 140452(M6PRBP1), Accession No. Hs 142442(HP1-BP74), Accession No. Hs 143187(DDX49), Accession No. Hs 143766(DRPLA), Accession No. Hs 143873(S100A10), Accession No. Hs 144058(EBSP), Accession No. Hs 144468(MGC3234), Accession No. Hs 144835(EEF1G), Accession No. Hs 144868(VTI1B), Accession No. Hs 144941(MUF1), Accession No. Hs 144949(ZNF313), Accession No. Hs 144980(SCAMP4), Accession No. Hs 145049(PLEKHM2), Accession No. Hs 145442(MAP2K1), Accession No. Hs 145575(UBL3), Accession No. Hs 146070(TPM3), Accession No. Hs 146393(HERPUD1), Accession No. Hs 146602(QP-C), Accession No. Hs 146804(SPIN), 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Hs 534483(MGC2941), Accession No. Hs 536275(PACS1), Accession No. Hs 541269(NDUFB9), Accession No. Hs 546248(CTSD), Accession No. Hs 546250(DNCI2), Accession No. Hs 546253(FDFT1), Accession No. Hs 546261(HNRPA1), Accession No. Hs 546269(RPL10A), Accession No. Hs 546271(PCBP2), Accession No. Hs 546286(RPS3), Accession No. Hs 546289(RPS12), Accession No. Hs 546290(RPS18), Accession No. Hs 546291(NET-5), Accession No. Hs 546339(SMAP), Accession No. Hs 546356(RPL13A), Accession No. Hs 546394(HSPC016), Accession No. Hs 547759(SSBP3), Accession No. Hs 549178(C9orf86), Accession No. Hs 552590(HTF9C), Accession No. Hs 553496(PGM3), Accession No. Hs 553512(C3F), Accession No. Hs 554767(NUP88), Accession No. Hs 554776(SREBF1), Accession No. Hs 554894(FLJ12953), Accession No. Hs 554896(MGC11257), Accession No. Hs 555194(FAM36A), Accession No. Hs 555866(C1QBP), Accession No. Hs 555873(HNRPAB), Accession No. Hs 555875(IDH3A), Accession No. Hs 555889(PSMC2), Accession No. Hs 555890(RBBP4), Accession No. Hs 555911(RBM8A), Accession No. Hs 555969(RIC8), Accession No. Hs 555971(PP1201), Accession No. Hs 555973(MRPS25), Accession No. Hs 555994(LONP), Accession No. Hs 556267(FBXL10), Accession No. Hs 556461(NDUFV2), Accession No. Hs 556795(PAICS), Accession No. Hs 557550(NPM1), Accession No. Hs 558296(ACP1), Accession No. Hs 558313(COX6A1), Accession No. Hs 558322(EEF1B2), Accession No. Hs 558325(EIF5), Accession No. Hs 558328(FKBP5), Accession No. Hs 558330(FTL), Accession No. Hs 558338(HSPE1), Accession No. Hs 558345(IK), Accession No. Hs 558354(LAMR1), Accession No. Hs 558360(NDUFB4), Accession No. Hs 558361(NME2), Accession No. Hs 558362(NUMA1), Accession No. Hs 558376(RAC1), Accession No. Hs 558381(RNU65), Accession No. Hs 558382(RPL15), Accession No. Hs 558383(RPL18A), Accession No. Hs 558384(RPL19), Accession No. Hs 558385(RPL23A), Accession No. Hs 558386(RPL34), Accession No. Hs 558388(RPS3A), Accession No. Hs 558389(RPS8), Accession No. Hs 558390(RPS24), Accession No. Hs 558391(RPS26), Accession No. Hs 558396(SCD), Accession No. Hs 558424(CSDA), Accession No. Hs 558426(EIF3S5), Accession No. Hs 558429(G10), Accession No. Hs 558431(RPL14), Accession No. Hs 558442(PDCD6IP), Accession No. Hs 558448(TXNL2), Accession No. Hs 558453(ATP5L), Accession No. Hs 558454(NUDC), Accession No. Hs 558458(COPS8), Accession No. Hs 558473(C18orf10), Accession No. Hs 558499(8D6A), Accession No. Hs 558511(PSARL), Accession No. Hs 558521(C2orf33), Accession No. Hs 558591(ORMDL1), Accession No. Hs 558825(PDE4DIP), Accession No. Hs 558995, Accession No. Hs 567260(CD2BP2), Accession No. Hs 567263(C1orf43), Accession No. Hs 567267(ATP2C1)及びAccession No. Hs 567279(HCNGP)。  また、前記検出試薬は、前記候補標準遺伝子を特異的に増幅することができるプライマー対及び／またはプローブであることが好ましいが、これに限定されない。
【００３５】
前記プライマー対は、前記遺伝子のセンス配列から選択される長さ１０〜５０ｂｐのセンスプライマー及び遺伝子のアンチセンス配列から選択される長さ１０〜５０ｂｐのアンチセンスプライマーであることが好ましい。前記センスプライマーの長さは、１２〜３０ｂｐであることが好ましく、１５〜２６ｂｐであることがさらに好ましく、１７〜２２ｂｐであることが最も好ましい。また、前記アンチセンスプライマーの長さは、１２〜３０ｂｐであることが好ましく、１５〜２６ｂｐであることがさらに好ましく、１７〜２２ｂｐであることが最も好ましいが、前記遺伝子を増幅させることができるプライマーなら、長さに制限を受けるものではない。前記プライマー対は、一般的に広く知られたプライマー製作プログラムを使用して製作することができ、前記遺伝子を増幅することさえできれば、遺伝子上でのプライマーの位置が限定されるものではない。
【００３６】
前記の方法で得られた２，０８７個の遺伝子を、ＦｕｎＣａｔ（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０，Ｒｕｅｐｐ  Ａ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２００４年，第３２卷，５５３９−４５頁）を使用して分類した結果、以前に報告されたＨＫＧの場合、代謝及びリボソームタンパク質が多く含まれたもの（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  Ｅ  ＆  Ｌｅｖａｎｏｎ  ＥＹ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ，２００３年，第１９卷，３６２−５頁；Ｈｓｉａｏ  ＬＬ等，Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００１年，第７卷，９７−１０４頁）に比べて、タンパク質の運命（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｔｅ，２３％，３０８／１３１８）及び細胞の輸送（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ，２１％，２７３／１３１８）に関与するタンパク質が、多数含まれた（図２参考）。また、前記２，０８７個の遺伝子でＣｐＧ島の頻度を分析した結果、以前の文献結果（Ｌａｒｓｅｎ  Ｆ等，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９２年，第１３卷，１０９５−１０７頁；Ｐｏｎｇｅｒ  Ｌ等，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，２００１年，第１１卷，１８５４−６０頁）と類似に高い頻度でＣｐＧ島が発見された（表１参考）。
【００３７】
前記遺伝子検出は、マイクロアレイ、ＳＡＧＥまたはｑＲＴ−ＰＣＲ方法で測定され得るが、これに限定されない。前記遺伝子の中で、ＥＳＴ及びＬｏｎｇＳＡＧＥでは、ＥＥＦ１Ａ１が最も発現量が多い転写体で、ＳｈｏｒｔＳＡＧＥでは、ＤＧＫ１、ＨＧ−Ｕ１３３マイクロアレイでは、ＲＰＬ１０Ａが各々最も多く発現される遺伝子だった（表２参考）。
【００３８】
前記のように本発明によって選別され確認された標準遺伝子は、候補標準遺伝子として発現量安定性検証を通じて、定量対象遺伝子の発現量分析時に参考に使用される標準遺伝子であり、非常に有用に使用される。
【００３９】
また、本発明は、
１）定量対象遺伝子を増幅することができるプライマー対及び／またはプローブを使用して、前記定量対象遺伝子をリアルタイムＰＣＲで増幅して、前記組成物を使用して試料に含まれている内部標準遺伝子候補をリアルタイムＰＣＲで増幅する工程と、
２）工程１）の定量対象遺伝子の発現程度及び内部標準遺伝子候補の発現程度を標準化する工程を含む、定量対象遺伝子の発現量定量方法を提供する。
【００４０】
また、本発明は、前記方法で選別された内部標準遺伝子候補の変動係数（ＣＶ）を測定して、変動係数が低い順に内部標準遺伝子を順位付けする工程を含む、遺伝子発現量測定時の参考用遺伝子の選別方法を提供する。
【００４１】
前記参考用遺伝子は、人体の大部分組織で発現する遺伝子であることを特徴とする。前記参考用遺伝子は、異なった資料間の遺伝子発現を相対的に定量するために、発現レベルの標準化に使用することができる。また、前記変動係数は、遺伝子発現量の変化が大きいほど、値が大きくなることを特徴とする。
【００４２】
本発明の候補標準遺伝子（以下、候補ＥＲＧ）の選別方法によって選別された遺伝子、ＥＳＴ、ＳｈｏｒｔＳＡＧＥ、ＬｏｎｇＳＡＧＥ及びマイクロアレイを含んだ各データセットで、各ユニジーンクラスターに対してＣＶを計算して、ＣＶが低い順に遺伝子を整列した後、候補ＥＲＧの中で多くの組織で比較的発現量が一定の標準遺伝子を選別した。その結果、各データセットでＣＶが低い順に選択した４００個（候補ＥＲＧの約２０％に該当）遺伝子の中で、４個のデータセットに共通的な１３個内部標準遺伝子を選別した（図１及び表３参考）。前記遺伝子には、Accession No. Hs 500775(ZNF207), Accession No. Hs 446427(OAZ1), Accession No. Hs 530118(LUC7L2), Accession No. Hs 208597(CTBP1), Accession No. Hs 440382(TRIM27), Accession No. Hs 444279(GPBP1), Accession No. Hs 250009(ARL8B), Accession No. Hs 9589(UBQLN1), Accession No. Hs 253726(PAPOLA), Accession No. Hs 146806(CUL1), Accession No. Hs 533222(DIMT1L), Accession No. Hs 494985(FBXW2)またはAccession No. Hs 242458(SPG21)などの標準遺伝子（ＥＲＧ）が含まれる。
【００４３】
すなわち、前記標準遺伝子は、大多数の組織で発現される２０８７個の遺伝子の中で、低い発現量変動を示す遺伝子を意味する。また、前記標準遺伝子は、細胞内に存在する大部分の転写体の低い発現量と似た発現量を示すことを特徴とする。
【００４４】
前記方法によって同定された１３個の標準遺伝子と伝統的に使用される標準遺伝子１３個（表４参考）を、遺伝子発現量及びＣＶの側面で比較した結果、伝統的標準遺伝子の中で６個は、すべてのデータセットで標準遺伝子より高い平均発現量を示し、残りの遺伝子は、内部標準遺伝子に類似か低い発現量を示した。発現量は、伝統的標準遺伝子が、内部標準遺伝子より概して大きく（図６参考）、内部標準遺伝子は、伝統的な内部標準遺伝子より相対的に低いＣＶを示した（図７参考）。
【００４５】
また、新たに発掘された１３個の遺伝子の標準遺伝子としての適合性をさらに確認するために、遺伝子発現に影響を与えることができる遺伝子コピー数変異をＤａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｖａｒｉａｎｔｓ（//projects.tcag.ca/variation/）を使用して検討した（表５参考）。その結果、新たに発掘された１３個の遺伝子の中では、ＯＡＺ１とＤＩＭＴ１Ｌだけが、コピー数変異が発見された染色体部位に位置した一方、既存の伝統的な標準遺伝子の場合は、かなり多数の遺伝子（ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、ＰＧＫ１、Ｂ２Ｍ、ＴＢＰ、ＴＦＲＣ、ＡＬＡＳ１）が、遺伝子コピー数変異が知られた部位に位置することが示された。
【００４６】
さらに、人体組織試料及び癌細胞株を入手して（表６参考）、ＥＲＧの定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を行なった（表７参考）結果、１３個の新しいＥＲＧは、人体凍結組織及び癌細胞株を含む４８個の試料全て発現された（図８参考）。新しい１３個のＥＲＧのＣｐは（Ｃｒｏｓｓｉｎｇ  Ｐｏｉｎｔ，ｑＲＴ−ＰＣＲ時、蛍光シグナルが背景シグナルを越す時点のｃｙｃｌｅ数を示す）、１９〜２９の範囲の値を示した（図９参考）。また、ｇｅＮｏｒｍ  ｖ３．４ソフトウェア（Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅ  Ｊ等，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ，２００２年，第３巻，ＲＥＳＥＡＲＣＨ００３４頁）及び、ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒソフトウェア（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ＣＬ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００４年，第６４巻，５２４５−５０頁）を使用して、前記で実施したＰＣＲ効率（表８参考）を考慮して、数式４を使用してＥＲＧの発現安定性を分析した結果、ｇｅＮｏｒｍプログラム及びＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒプログラムで計算された遺伝子発現安定性は、新たに発掘された１３個のＥＲＧの大多数が、既存の伝統的なＥＲＧより全て高かった（表９参考）。表９で、発現安定性値（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｖａｌｕｅ，Ｍ  ｂｙ  ｇｅＮｏｒｍ，Ｓ  ｂｙ  ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ）が低い値であればあるほど、高い発現安定性を意味する。
【００４７】
＜数式４＞
相対的発現量＝（１＋Ｅ）△Ｃｐ
△Ｃｐ＝平均Ｃｐ−試料Ｃｐ、
平均Ｃｐ＝最も低いＣｐ値、及び
Ｅ＝ＰＣＲ効率
【００４８】
ｇｅＮｏｒｍによって計算された値（Ｍ）とマイクロアレイ、ＬｏｎｇＳＡＧＥでのＣＶとの間に有意な相関関係はない一方、ＥＳＴ、ＳｈｏｒｔＳＡＧＥでの各ＣＶとＭ値の間には、有意な相関関係があった。同様に、ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒによって計算された安定性値（Ｓ）もマイクロアレイを除外したＥＳＴ、ＳｈｏｒｔＳＡＧＥ及びＬｏｎｇＳＡＧＥと有意な相関関係を示し、Ｍ値及びＳ値がＳｈｏｒｔＳＡＧＥのＣＶと最も高い一致度を示した（表１０参考）。
【００４９】
前記のような結果によって、本発明によって発掘された標準遺伝子（ＥＲＧ）の発現が、伝統的な遺伝子よりさらに安定的であることを確認した。
【００５０】
生体内に存在する転写体の大部分が、その発現量が少ないことを勘案すると（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ＪＡ等，Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０００年，第２（３）卷，１４３−１４７頁）、発現量が大きい内部標準遺伝子を標準化に使用することは、適合しないことがある。同一な線形倍率で測定するためには、目的遺伝子に似た発現を示す内部標準遺伝子の使用が勧められる（Ｓｚａｂｏ  Ａ等，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ，２００４年，第５（８）卷，Ｒ５９頁；ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｎｏｔｅ  Ｎｏ．ＬＣ１５／２００５年）。したがって、本発明によって選択され確認された内部標準遺伝子は、伝統的内部標準遺伝子より変化量が少なく、相対的に低い発現量を示すので、前記内部標準遺伝子を増幅させる標準化にさらに適合し、普遍的に使用することができると考えられる（Ｃｚｅｃｈｏｗｓｋｉ  Ｔ等，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００５年，第１３９（１）卷，５−１７頁）。
【００５１】
また、本発明は、前記方法によって同定された参考用遺伝子を検出することができる検出試薬を含む前記参考用遺伝子の検出用組成物を提供する。
【００５２】
前記参考用遺伝子は、細胞内に存在する大部分の転写体の低い発現量と似た低い発現量を示すことが好ましい。前記参考用遺伝子は、Accession No. Hs 500775(ZNF207), Accession No. Hs 446427(OAZ1), Accession No. Hs 530118(LUC7L2), Accession No. Hs 208597(CTBP1), Accession No. Hs 440382(TRIM27), Accession No. Hs 444279(GPBP1), Accession No. Hs 250009(ARL8B), Accession No. Hs 9589(UBQLN1), Accession No. Hs 253726(PAPOLA), Accession No. Hs 146806(CUL1), Accession No. Hs 533222(DIMT1L), Accession No. Hs 494985(FBXW2)及び  Accession No. Hs 242458(SPG21)からなる群から選択される一つまたはふたつ以上の遺伝子であることが好ましいが、これに限定されない。
【００５３】
前記検出試薬は、参考用遺伝子を特異的に増幅することができるプライマー対及び／またはプローブであることが好ましいが、これに限定されない。前記プライマー対は、前記遺伝子のセンス配列から選択される長さ１０〜５０ｂｐのセンスプライマー及び、遺伝子のアンチセンス配列から選択される長さ１０〜５０ｂｐのアンチセンスプライマーであることが好ましい。前記センスプライマーの長さは、１２〜３０ｂｐであることが好ましく、１５〜２６ｂｐであることがさらに好ましく、１７〜２２ｂｐであることが最も好ましい。また、前記アンチセンスプライマーの長さは、１２〜３０ｂｐであることが好ましく、１５〜２６ｂｐであることがさらに好ましく、１７〜２２ｂｐであることが最も好ましいが、前記遺伝子を増幅させることができるプライマーなら、長さに制限を受けるものではない。前記プライマー対は、一般に広く知られたプライマー製作プログラムを使用して製作することができ、前記遺伝子を増幅することさえできれば、遺伝子上でのプライマーの位置が限定されるものではない。
【００５４】
前記遺伝子検出は、マイクロアレイ、ＳＡＧＥまたはｑＲＴ−ＰＣＲ方法で測定されることが好ましいが、これに限定されない。
【００５５】
また、本発明は、
１）被検体のＲＮＡからｃＤＮＡを合成する工程と、
２）工程１）のｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡにして対象遺伝子を増幅することができるプライマー対及び／またはプローブを使用して前記対象遺伝子をリアルタイムＰＣＲで増幅して、前記組成物を使用して試料に含まれている内部標準遺伝子候補をリアルタイムＰＣＲで増幅する工程、及び
３）工程２）の対象遺伝子の発現程度及び内部標準遺伝子候補の発現程度を標準化する工程とを含む、対象遺伝子の発現量定量方法を提供する。
【００５６】
同時に、本発明は、
１）被検体から得られたゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡにして対象遺伝子を増幅することができるプライマー対及び／またはプローブを使用して前記対象遺伝子をリアルタイムＰＣＲで増幅し、前記組成物を使用して試料に含まれている内部標準遺伝子候補をリアルタイムＰＣＲで増幅する工程と、
２）工程１）の対象遺伝子の発現程度及び内部標準遺伝子候補の発現程度を標準化する工程を含む、対象遺伝子のゲノムＤＮＡ内の増幅有無鑑別方法を提供する。
【００５７】
以下、本発明を実施例及び実験例により、詳しく説明する。但し、下記の実施例及び実験例は、本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容を限定するものではない。
【実施例】
【００５８】
＜実施例１＞遺伝子発現データセットの構築
ＥＳＴ及びＳＡＧＥヒト遺伝子発現データは、公開ＣＧＡＰサイト（The Cancer Genome Project, //cgap.nci.nih.gov/）から収集した。マイクロアレイ遺伝子発現資料は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  ａｒｒａｙ  ｓｅｔを基盤に製作されたＧｅｎｅ  Ｌｏｇｉｃ社のＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ＤａｔａｓｕｉｔｅＴＭから入手した。
【００５９】
ＣＧＡＰサイトから収集して完成されたＥＳＴのデータセットは、Hs_LibData.dat(31/Oct/05)ファイルにある総８，６３３個の遺伝子ライブラリ中の下記の条件、すなわち、
１）標準化作業を経ない（ｎｏｎ−ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）、及び
２）シーケンスの核酸数字が＞１０，０００を満足する７７個の選択されたライブラリを含んだ。各ライブラリのＥＳＴ発現頻度は、Hs_ExprData.dat(31/Oct/05)ファイルで入手した。７７個のライブラリを含むＥＳＴデータセットは、正常及び腫瘍サンプルを含んだ互いに異なる２９個の組織及び２６，１１７個のユニジーンクラスターで構成された。
【００６０】
また、やや短い切片のＳＡＧＥ（以下；ＳｈｏｒｔＳＡＧＥ）及び長い切片のＳＡＧＥ（以下；ＬｏｎｇＳＡＧＥ）データセットは、３８，２９０個のユニジーンクラスターを含む２８０個のライブラリ（発現量表示ファイル名：Hs_short.frequencies.gz,05/Dec/06）及び、２１，８６８個のユニジーンクラスターを含む４６個のライブラリ（発現量表示ファイル名：Hs_long.frequencies.gz,05/Dec/06）を各々使用して生成した。また、ファイル名：Hs_short.best_gene.gz(05/Dec/06）及びファイル名：Hs_long.best_gene.gz(05/Dec/06）を使用して、各ユニジーンクラスターにＳＡＧＥタグを対応させた。ＳｈｏｒｔＳＡＧＥ及びＬｏｎｇＳＡＧＥデータセットは、正常及び腫瘍サンプルを含む、各々２８個及び９個の互いに異なる組織でのＳＡＧＥ発現量の情報で構成された。
【００６１】
同時に、マイクロアレイデータセットは、脳、乳房、大腸、食道、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、卵巣、膵膓、前立腺、直腸及び胃を含む、１３個組織の５６７サンプルから得られたＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子発現資料を含む（表１１）。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（ＣＡ）のＨＧ−Ｕ１３３と４４，７６０個の互いに異なるプローブセット［総４４，９２８プローブセット］でマイクロアレイデータセットを構成した。
【００６２】
＜実施例２＞候補ＥＲＧの選別
本発明は、実施例１のデータセットを統合してデータセット内のユニジーンクラスターに対して、各々の発現量を分析して、人体の大多数の組織で発現するハウスキーピング遺伝子（ＨＫＧ）の探索に使用した。
【００６３】
ＥＳＴデータセットの遺伝子発現量は、数式１によって特定ライブラリ内で該当の遺伝子のＥＳＴ数を、与えられた前記ライブラリ内の全体ＥＳＴ数で割って、それに１，０００，０００を掛けて計算した。
【００６４】
ＳＡＧＥデータセットの遺伝子発現量は、数式２によって特定ライブラリ内で該当の遺伝子のタグの数を、全体タグ数で割った値に、１，０００，０００を掛けて計算した。
【００６５】
＜数式１＞ＥＳＴ遺伝子発現量＝特定ライブラリ内の特定遺伝子のＥＳＴの数／特定のライブラリ内全体ＥＳＴの数×１，０００，０００
【００６６】
＜数式２＞ＳＡＧＥ遺伝子発現量＝特定ライブラリ内の特定遺伝子のタグの数／特定のライブラリ内全体タグの数×１，０００，０００
【００６７】
同時に、マイクロアレイデータセットの発現量は、アフィメトリクスマイクロアレイスイート５．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｃ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ５．０）の分析アルゴリズムを使用して、各転写体別に計算された信号強度として示した。また、データセット内のすべてのライブラリで特定遺伝子の発現量の平均値を平均遺伝子発現量と定義した。
【００６８】
内部標準遺伝子を発掘するために、まず、ＥＳＴ及びＳＡＧＥデータセットを使用して、大部分の組織で発現されるＨＫＧを捜した。特定遺伝子が多くの組織にわたって大部分の状況で発現されるＨＫＧである可能性を測定するために、ＥＳＴとＳＡＧＥのデータセットに含まれるすべての組織の中で、前記遺伝子が発現されない組織の比率を計算した。一つの組織に該当する多くのライブラリの中で一つのライブラリでも前記遺伝子の発現が探知されれば、その遺伝子は、該当の組織で発現されるものみなして、比較対象になる組織の総個数と前記遺伝子が発現しない組織の数の比率でゼロの比率を定義した。すなわち、ゼロの比率の「０」値は、データセットに含まれているすべての組織で発現されるということを、反対に「１」は、前記のどんな組織でも発現されないということを示す。
【００６９】
＜数式３＞ゼロ比率＝特定遺伝子が発現されない組織の個数／総組織の個数
【００７０】
ＥＳＴとＳＡＧＥデータセットのゼロ比率に対するカットオフ値は、２，６００プローブを含むＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ９５Ａチップ（ＣＡ）を使用して、４７個の互いに異なる人体組織及び細胞株から得た１０１個の試料を対象にした以前のマイクロアレイデータから確認された５７５個のＨＫＧ大多数が含まれるように（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  Ｅ  ａｎｄ  Ｌｅｖａｎｏｎ  ＥＹ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ，２００３年，第１９（７）卷，３６２−３６５頁）、データセットに対して個別的に決めた。ＥＳＴでは、ゼロ比率が０．４未満（ＥＳＴ，４，０２７ユニジーンクラスター）、ＳｈｏｒｔＳＡＧＥでは０．１未満（４，７５８ユニジーンクラスター）、そして、ＬｏｎｇＳＡＧＥでは０．３未満（４，５６９ユニジーンクラスター）である遺伝子が、各々選別された。前記３個のデータセットで共通的な２，０８７個の遺伝子が選択された。
【００７１】
Ｕ９５Ａによる結果の５７５個の遺伝子中、ＥＳＴでは４５１（７８．４３％）個、ＳｈｏｒｔＳＡＧＥでは４４６（７７．５７％）個及びＬｏｎｇＳＡＧＥでは４４６（７７．５７％）個の遺伝子が、ＨＫＧに各々含まれた。また、前記の５７５個のＨＫＧの中で、いくつかの遺伝子のゼロ比率が予想外の０．５より大きい値を示したりしたが、５７５個のＨＫＧ大部分は、本発明のデータセット、ＥＳＴ、ＳｈｏｒｔＳＡＧＥ及びＬｏｎｇＳＡＧＥで低いゼロ比率を示した。また、ＲＰＬＰ０、ＡＣＴＢ、ＰＰＩＡ、ＧＡＰＤＨ、ＰＧＫ１、Ｂ２Ｍ及びＴＦＲＣのような伝統的な内部標準遺伝子が、２，０８７個のＨＫＧに含まれた。
【００７２】
また、マイクロアレイデータセット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３，ＣＡ）で、ＥＳＴとＳＡＧＥデータセットで選別されたＨＫＧの平均遺伝子発現量及びＣＶ（％）を求めた。ＨＫＧに該当する５，２３８の互いに異なるプローブセット（５３１７断片、１，９９０ユニジーンクラスターに対する遺伝子発現データ）のマイクロアレイ発現データが得られた。
【００７３】
ユニジーンクラスターを使用して、各々のデータセットを対応させ、ＨＧ−Ｕ１３３チップ上には一つの遺伝子またはユニジーンクラスターに対して多様な発現強度を示す多くのプローブセットが対応する場合がある。この場合、多くのプローブセットの中で最も低いＣＶを示すプローブセットを選択した。
【００７４】
前記で得た２，０８７個のＨＫＧを下記では、「候補ＥＲＧ」または「候補標準遺伝子」と称した。
【００７５】
＜実験例１＞候補ＥＲＧの特性分析
＜１−１＞候補ＥＲＧの機能的分類
前記で得られた２，０８７個の遺伝子をＦｕｎＣａｔ（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０，Ｒｕｅｐｐ，Ａ．，等，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２００４年，第３２巻，５５３９−４５頁）を使用して分類した。
【００７６】
その結果、２，０８７個の候補ＥＲＧの中で、１６８９個のユニジーンクラスター（ＵｎｉＧｅｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒｓ）のＧＯ期（ｔｅｒｍｓ）がＭＩＰＳ（Ｍｕｎｉｃｈ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）ＦｕｎＣａｔ（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ）に割り当てされた。１６８９個のユニジーンクラスター中で生物学的過程（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓ）に該当するＧＯ期（ｔｅｒｍｓ）に割り当てされた１３１８個のユニジーンクラスターが機能的に分類された。１３１８個の遺伝子は、多様な基本的な細胞機能に関与することを示したが、以前報告されたＨＫＧの場合、代謝及びリボソームタンパク質がたくさん含まれたもの（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ｅ．ａｎｄ  Ｌｅｖａｎｏｎ，Ｅ．Ｙ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ，２００３年，第１９卷，３６２−５頁；Ｈｓｉａｏ，Ｌ．Ｌ．，等，Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００１年，第７卷，９７−１０４頁）に比べてタンパク質の運命（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｔｅ，２３％，３０８／１３１８）及び細胞の輸送（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ，２１％，２７３／１３１８）に関与するタンパク質が多数含まれた（図２）。
【００７７】
＜１−２＞候補ＥＲＧのＣｐＧ島（ＣｐＧ  ｉｓｌａｎｄ）分析
本発明のＥＲＧの注釈が付いた転写開始点（ａｎｎｏｔａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｓｔａｒｔ）の上位配列（ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）は、ＵＣＳＣサイト（//hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg18/bigZips/）から入手した。転写開始点から１０００、２０００及び５０００ｂｐ前部分（ｂａｓｅｓ  ｕｐｓｔｒｅａｍ）のＣｐＧ島を、ＣｐＧＩＥプログラム（Ｗａｎｇ，Ｙ  ＆  Ｌｅｕｎｇ，ＦＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００４年，第２０巻，１１７０−７頁）を使用して、ＤＮＡ配列は５００ｂｐより長く、Ｇ＋Ｃを５５％含み、ＣｐＧ観察値／期待値（Ｏｂｓｅｒｖｅｄ／Ｅｘｐｅｃｔｅｄ）が０．６５（Ｔａｋａｉ  Ｄ  ＆  Ｊｏｎｅｓ  ＰＡ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，２００２年，第９９卷，３７４０−５頁）であるものを基準にして捜した。
【００７８】
候補ＥＲＧ及び非候補ＥＲＧの間ＣｐＧ島を有した遺伝子頻度の統計学的有意性は、Ｚ−テスト（Ｚ−ｔｅｓｔ，Ｒ  ｐｒｏｇｒａｍ，//www.R-project.org）を使用して分析し、ｐ＜０．０５を有意なものとみなした。
【００７９】
大部分の候補ＥＲＧは、以前の文献結果（Ｌａｒｓｅｎ，Ｆ．，等，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９２年，第１３卷，１０９５−１０７頁；Ｐｏｎｇｅｒ，Ｌ．，等，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，２００１年，第１１卷，１８５４−６０、４２頁）と類似に前部分配列で高い頻度で（１０００ｂｐ；７０％、２０００ｂｐ；７３％、５０００ｂｐ；７６％）ＣｐＧ島を有することが示れた一方、非候補ＥＲＧの前部分では、低い頻度で発見された（ｐ＜０．００１、表１）。
【００８０】
（表１）候補ＥＲＧ及び非候補ＥＲＧの転写開始位置前部分配列でＣｐＧ島を有した遺伝子の比率比較
0005934036.tif 000002
【００８１】
＜実験例２＞相関分析
二群間の線形関係測定の尺度である相関係数を使用した分析を施行し、ｐ＜０．０５なら有意なものとみなした。すべての計算及び分布図の作成は、統計分析用プログラムであるＲ−パッケージ（Ｒ−ｐａｃｋａｇｅ；//www.r-project.org）を使用して行なった。
【００８２】
まず、４個のデータセットから選別された候補ＥＲＧを、遺伝子発現量及びＣＶの側面で比較するため、ピアソン及びスピアマン順位相関分析を各々行なった。その結果、図３は候補ＥＲＧの４個のデータセット間の遺伝子発現に対する分布図で、４個のデータセット間の遺伝子発現で有意な相関関係が観察された。ＳｈｏｒｔＳＡＧＥとＬｏｎｇＳＡＧＥのスピアマン相関係数値が０．８５３（ｐ＜０．０００１）で最も高かった。ＥＳＴとマイクロアレイは、最も低い０．３３９（ｐ＜０．０００１）のスピアマン相関係数値を示した。
【００８３】
また、各データセット別に多くのライブラリでの候補ＥＲＧの発現量の一貫性を調査するためにＣＶ（％）を求めて、前記と同じくピアソン及びスピアマン順位相関分析を各々行なった。ＣＶの場合、有意な相関関係（ｐ≦０．００１）を示したりしたが、遺伝子発現の相関関係よりは、データセット間の低い相関関係（スピアマン相関係数＜０．５）を示した（図４）。
【００８４】
前記の結果は、分析される試料の種類や数によって発現量の差があり得るため、各データセットに含まれた組織の種類及び試料数の差に起因したものであり得る。
【００８５】
＜実験例３＞候補ＥＲＧと非候補ＥＲＧ間の比較
候補ＥＲＧ及び非候補ＥＲＧ間の平均遺伝子発現に有意な差があるのかどうか、ｔ−検定を使用して評価した。図５は、各データセットの候補ＥＲＧ及び非候補ＥＲＧの遺伝子発現分布を示す。予想したとおり候補ＥＲＧの平均遺伝子発現量が、非候補ＥＲＧより４個のデータセット全てで有意に高かった（ｐ＜０．０００１）。前記の結果は、以前の報告と一致する（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  Ｅ  ａｎｄ  Ｌｅｖａｎｏｎ  ＥＹ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ，２００３年，第１９（７）卷，３６２−３６５頁）。
【００８６】
ＥＳＴでは７３．８３−９３２４．８７、ＳｈｏｒｔＳＡＧＥでは２８．５８−４０８６．２５、ＬｏｎｇＳＡＧＥでは１７．４７−４６２１．６０、ＨＧ−Ｕ１３３マイクロアレイでは１．４７−１８５９８．２６範囲の発現を各々示した。かなり多数のリボソームタンパク質は、４個のデータセット全て、最も発現量が高い遺伝子に属した。ＥＳＴ及びＬｏｎｇＳＡＧＥではＥＥＦ１Ａ１が、ＳｈｏｒｔＳＡＧＥではＤＧＫ１が、ＨＧ−Ｕ１３３マイクロアレイではＲＰＬ１０Ａが各々最も多く発現される遺伝子だった（表２）。
【００８７】
（表２）２０８７個の候補内部標準遺伝子のリスト
0005934036.tif 000003
0005934036.tif 000004
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Ｍｅａｎ：平均遺伝子発現量、ＣＶ：変動係数、０’ｓ  Ｐ：ゼロ比率
【００８８】
＜実施例３＞内部標準遺伝子（ＥＲＧ）の発掘
内部標準遺伝子は、下記の過程によって前記候補標準遺伝子の中から追加で選択した。
【００８９】
まず、ＥＳＴ、ＳｈｏｒｔＳＡＧＥ、ＬｏｎｇＳＡＧＥ及びマイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３，ＣＡ）を含んだ各データセットで、各々のユニジーンクラスターに対してＣＶを計算して、ＣＶが低い順に遺伝子を整列した。ＣＶが低い順に、各々のデータセットから４００個の遺伝子を選別した後（候補ＥＲＧの約２０％に該当）、４個のデータセットで共通に選別された内部標準遺伝子１３個を発掘した（表３）。内部標準遺伝子には、Accession No. Hs 500775(ZNF207), Accession No. Hs 446427(OAZ1), Accession No. Hs 530118(LUC7L2), Accession No. Hs 208597(CTBP1), Accession No. Hs 440382(TRIM27), Accession No. Hs 444279(GPBP1), Accession No. Hs 250009(ARL8B), Accession No. Hs 9589(UBQLN1), Accession No. Hs 253726(PAPOLA), Accession No. Hs 146806(CUL1), Accession No. Hs 533222(DIMT1L), Accession No. Hs 494985(FBXW2)及びAccession No. Hs 242458(SPG21)が含まれる。
【００９０】
Ｇｅｎｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙは、Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ  ｓｉｔｅ(//www.geneontology.org/)で検索した。
【００９１】
発掘された遺伝子の大部分（ＺＮＦ２０７、ＯＡＺ１、ＣＴＢＰ１、ＰＡＰＯＬＡ及びＦＢＸＷ２）は、基本細胞生理学的過程の中で特に、細胞代謝（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）と関連したものだった。ＴＲＩＭ２７及びＣＵＬ１は、細胞増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）と関連した遺伝子だった。ＯＡＺ１は、ＳｈｏｒｔＳＡＧＥ及びＬｏｎｇＳＡＧＥで最も低いＣＶを示し、ＥＳＴではＣＴＢＰ１及び、マイクロアレイではＺＮＦ２０７が各々最も安定的な発現を示す遺伝子だった。ポリアミン生合成（Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）に関与するＯＡＺ１は、４個のデータセットにわたって最も高い発現量を示し、また、ＥＳＴデータセットを除外して相対的に低い変異を示した。
【００９２】
＜実験例４＞データセット間の標準遺伝子相関分析
本発明によって選別された内部標準遺伝子（ＥＲＧ）を、４個のデータセット間の遺伝子発現量及びＣＶに関して比較するため、実験例２と同一な方法でピアソン及びスピアマン順位相関分析を各々行なった。
【００９３】
その結果、遺伝子発現量は、一部データセット間で有意な相関関係を示したが、ＣＶはどのデータセット間でも有意な相関関係を示さなかった。
【００９４】
１３個のＥＲＧ発現は、スピアマン相関関係の側面では、ＥＳＴ−マイクロアレイ間（０．３７４，Ｐ＝０．２０６）、ＳｈｏｒｔＳＡＧＥ−マイクロアレイ間（０．５１１，Ｐ＝０．０７６）、有意性が観察されなかったが、ピアソン相関係数の側面で有意な相関関係を示した（ｐ＜０．００１）。データセット間でＣＶは、有意な相関関係を示さなかった（Ｐ＞０．０５）。ＳＡＧＥＳ  ｈｏｒｔ及びＬｏｎｇＳＡＧＥでは、ＣＤＣ４２及びＭＹＬ６が各々ＥＲＧの中ですべての組織で発現されながら、最も安定的な発現を示す遺伝子だった。ＨＢＰ１及びＰＳＭＣ１は、ＥＳＴ及びマイクロアレイで各々最も低いＣＶを示した。
【００９５】
＜実験例５＞遺伝子発現データセットでの新しい標準遺伝子と伝統的標準発現遺伝字間比較
本発明によって選別された１３個の内部標準遺伝子と伝統的に使用される内部標準遺伝子１３個（表４）を、遺伝子発現量及びＣＶの側面で比較した。
【００９６】
その結果、分析された伝統的な内部標準遺伝子の中で、ＲＰＬＰ０、ＡＣＴＢ、ＰＰＩＡ、ＧＡＰＤＨ、ＰＧＫ１及びＢ２Ｍは、相対的に高い発現量を示したが、ＧＵＳＢ、ＨＰＲＴ１、ＴＢＰ、ＴＦＲＣ、ＡＬＡＳ１、Ｈ６ＰＤ及びＨＭＢＳは、低い発現量を示した（図６）。前記の結果は、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して潜在性内部標準遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定した以前の研究結果と一致する（Ｒａｄｏｎｉｃ  Ａ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，２００４年，第３１３（４）巻，８５６−８６２頁）。発掘された内部標準遺伝子の発現量は、伝統的内部標準遺伝子の低発現群の発現量と類似か少し高い方だった。
【００９７】
また、新たに発掘された内部標準遺伝子は、いくつかの遺伝子を除いて伝統的な内部標準遺伝子より概して相対的に低いＣＶを示した（図７）。すなわち、相対的に低い発現量変化を示した。前記の結果は、本発明によって発掘された内部標準遺伝子の発現が、伝統的内部標準遺伝子よりさらに安定的であることを示す。
【００９８】
（表３）４つのデータベースより同定されたＥＲＧ
0005934036.tif 000049
Ｍｅａｎ：平均遺伝子発現量、ＣＶ：変動係数、０’ｓ  Ｐ：ゼロ比率
【００９９】
（表４）本発明において用いられる従来のＥＲＧ
0005934036.tif 000050
Ｍｅａｎ：平均遺伝子発現量、ＣＶ：変動係数、０’ｓ  Ｐ：ゼロ比率
【０１００】
＜実験例６＞内部標準遺伝子のコピー数変異
新たに発掘した１３個のＥＲＧｓの遺伝子コピー数変異をＤａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｖａｒｉａｎｔｓ（//projects.tcag.ca/variation/）を使用して調査した。新たに発掘された１３個内部標準遺伝子中では、ＯＡＺ１とＤＩＭＴ１Ｌの二つの遺伝子のみがコピー数変異が発見された染色体部位に位置することが示された（表５）。一方、伝統的な標準遺伝子の中で相当な数（ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、ＰＧＫ１、Ｂ２Ｍ、ＴＢＰ、ＴＦＲＣ、ＡＬＡＳ１）が、コピー数変異が知られた遺伝子部位に位置した（表５）。すなわち、上の結果によると、新たに発掘された１３個の標準遺伝子の中で、２個の遺伝子を除いた残りの遺伝子は、遺伝子コピー数に変異のない可能性が高いので、相対的遺伝子増幅測定時に参考遺伝子として使用することができることを提示している。
【０１０１】
＜実験例７＞標準遺伝子（ＥＲＧ）の検証
＜７−１＞定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を使用したＥＲＧの発現量検証
データセットから選択されたＥＲＧの発現安定性を検証するために、２６個の凍結人体組織、６０個のｆｏｒｍａｌｉｎ−ｆｉｘｅｄ、ｐａｒａｆｆｉｎ  ｅｍｂｅｄｄｅｄ（ＦＦＰＥ）人体組織及び、２２個の人体癌細胞株を含んだ総１０８個の人体試料を使用した（表６）。６０個のＦＦＰＥ組織には、乳癌１０個、正常胃腸８個、胃癌９個、正常卵巣１０個、卵巣腺腫４個、卵巣境界腫瘍９個及び卵巣癌１０個の組織が各々含まれた、この組織及び細胞株から総ＲＮＡを抽出して、凍結人体組織及び人体癌細胞株のような場合、Ａ２６０／２８０≧１．８０及びｒＲＮＡ（２８Ｓ／１８Ｓ）≧１．０を満足するＲＮＡ試料がｑＲＴ−ＰＣＲに使用された。標準方法によって、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した後、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲに使用するために１：３（ｃＤＮＡ：ＤＷ）に希釈した。使用したＰＣＲプライマー及びＵＰＬ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ）番号は、下記表７に示した。
【０１０２】
ｑＲＴ−ＰＣＲで使用した伝統的なＥＲＧは、既存の文献と商業用キットでの使用頻度及び本発明のデータベースで予測されたＣＶを基に選択された。最もよく使用されるＥＲＧである８個の遺伝子（Ｂ２Ｍ、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、ＨＭＢＳ、ＰＰＩＡ、ＨＰＲＴ１、ＴＢＰ及びＨ６ＰＤ）は、Ｔａｑｍａｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｐｌａｔｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＨＫＧ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｏｈｌ  Ｆ等，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，２００５年，第８３卷，１０１４−２４頁；ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｎｏｔｅ  Ｎｏ．ＬＣ  １５／２００５年；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，２００１年）のような商業用キットに含まれている。各遺伝子は、ＦＡＭ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ＵＰＬ  ｐｒｏｂｅ（Ｒｈｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）または、ｃｕｓｔｏｍ−ｍａｄｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｂｅ（ＴＩＢ  ＭＯＬＢＩＯＬ  ＧｍｂＨ，ドイツ）を使用して、５３０ｎｍで測定した。すべてのＰＣＲ反応は、標準方法によって、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ  ２．０（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，米国）で行なわれた。
【０１０３】
各々の遺伝子のＰＣＲ効率は、胃癌細胞株であるＭＫＮ７４細胞株のｃＤＮＡの連続的希釈方法（Ｐｆａｆｆｌ  ＭＷ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２００１年，第２９卷，ｅ４５頁）で測定して、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ４．０（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，米国）を使用して計算し、９０〜１００％の値を示した（表８）。
【０１０４】
また、各々の組織試料で、プローブ各々のＰＣＲ効率をＬｉｎＲｅｇＰＣＲプログラムで推定した（Ｒａｍａｋｅｒｓ  Ｃ等，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ，２００３年，第３３９卷，６２−６頁）。すべての測定は、三回測定して平均Ｃｐを計算した。実験的変異を最小化するために、他の組織試料での同一な遺伝子は、同一ＰＣＲ条件で測定した。Ｈ６ＰＤのＣｐ値は、肺、肝臓、乳房及び腎臓正常組織を含む４個のサンプルで測定されなかったので、後の計算から除外した。Ｃｐ値のＣＶは、３回反復実験で、５％未満だった。
【０１０５】
人体凍結組織及び癌細胞株を含む４８個の試料各々でのＨ６ＰＤを除外した２０個の遺伝子の発現を図８に示した。１３個の新しいＥＲＧは、４８個すべての試料で発現された。７個の伝統的なＥＲＧは、広い発現範囲（Ｃｐ値：１３．５２〜２９．３９）を示した一方、Ｈ６ＰＤは、いくつかの組織で発現されなかった。１３個のＥＲＧのＣｐは、１８．９０〜２８．７９の範囲の値を示した（図９）。伝統的なＥＲＧは、高く発現する遺伝子（ｍｅｄｉａｎ＜２０ｃｙｃｌｅｓ）と低く発現する遺伝子（ｍｅｄｉａｎ＞２３ｃｙｃｌｅｓ）に分けることができた。高く発現する遺伝子には、Ｂ２Ｍ、ＰＰＩＡ、ＧＡＰＤＨ及びＡＣＴＢが含まれ、ＨＰＲＴ１、ＴＢＰ、及びＨＭＢＳは、発現量が低い遺伝子に属した。ＯＡＺ１を除外した１２個のＥＲＧは、伝統的なＥＲＧの高発現群と低発現群の間の発現水準を示した。ＥＲＧｓの中でＺＮＦ２００７は、最も発現が高い遺伝子で、ＵＢＱＬＮ１、ＣＵＬ１がその次に高かった。ＯＡＺ１は、最も発現量が低い遺伝子だった。
【０１０６】
（表５）従来のＥＲＧおよび新規のＥＲＧの遺伝子コピー数変化
0005934036.tif 000051
＊遺伝子位置は、Ensemble(http://www.ensemble.org/index.html)から検索した。
＊＊ゲノム変化はGenomic Variants(http://projects.tcag.ca/variation/,Human Genome Assembly Build 36 (hg18))において検索した
【０１０７】
＜７−２＞ｑＲＴ−ＰＣＲ資料に基づく遺伝子発現安定性分析を使用したＥＲＧの検証
遺伝子発現安定性分析のために、ｇｅＮｏｒｍ  ｖ３．４ソフトウェア（Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅ  Ｊ等，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ，２００２年，第３卷，ＲＥＳＥＡＲＣＨ００３４頁）及びＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒソフトウェア（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ＣＬ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００４年，第６４卷，５２４５−５０頁）を各々使用した。ｇｅＮｏｒｍ及びＮｏｒｍｆｉｎｄｅｒ分析のために表８に提示された遺伝子のＰＣＲ効率を考慮して、Ｃｐ値を相対的発現量に変換した（ＧｅＮｏｒｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｍａｎｕａｌ，２００４年９月６日アップデート：//medgen.ugnet.be/~jvdesomp/genorm/）。相対的発現量は、下記数式４のように計算した。
【０１０８】
＜数式４＞
相対的発現量＝（１＋Ｅ）△Ｃｐ
△Ｃｐ＝平均Ｃｐ−試料Ｃｐ、
平均Ｃｐ＝最も低いＣｐ値、及び
Ｅ＝ＰＣＲ効率
【０１０９】
ｇｅＮｏｒｍまたはＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒで計算された遺伝子発現安定性（下記にｇｅＮｏｒｍで計算された安定性はＭで、ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒで計算された安定性はＳで表記する）と各々のデータセットで計算されたＣＶとの間の相関関係は、Ｒ分析ソフトウェアを（//www.R-project.org）使用して分析した。
【０１１０】
すべての遺伝子は、ｇｅＮｏｒｍプログラムで分析する場合、ｇｅＮｏｒｍプログラムのデフォルトリミット（ｄｅｆａｕｌｔ  ｌｉｍｉｔ）１．５の下の低いＭ値（＜０．９）を示し、高い発現安定性を示した（表９）。平均発現安定性Ｍの値が低いほど、さらに安定的な発現を示すことを意味する。ＧＰＢＰ１とＣＵＬ１が最も安定的な発現を示す遺伝子であることが示された。分析された遺伝子の中で、Ｂ２Ｍは、最も高いＭ値（０．８８８）を示す最も発現量が安定しない遺伝子だった。その次では、ＡＣＴＢ（０．８４３）、ＨＭＢＳ（０．８１５）、ＧＡＰＤＨ（０．７９３）の順序で不安定な発現量を示す遺伝子であることが示された。
【０１１１】
他のプログラムであるＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒを使用した場合には、ＴＢＰ及びＰＡＰＯＬＡが最も上位２個の順位に該当する遺伝子だった（表９）。ｇｅＮｏｒｍ結果と類似に、Ｂ２Ｍ、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、ＨＭＢＳ及びＨＰＲＴ１は、新しいＥＲＧよりより少し安定的でないことが示された。二つのプログラム結果は、新たに発掘されたＥＲＧの大部分が、既存の伝統的なＥＲＧより相対的にさらに高い発現安定性を示すということを証明した。さらに、ＰＣＲ効率によって計算された相対的発現量で遺伝子発現安定性をＬｉｎＲｅｇＰＣＲプログラムを使用して分析した場合にも、大部分のＥＲＧは、古典的なＥＲＧよりさらに安定的な発現を示した。
【０１１２】
ｇｅＮｏｒｍによって計算されたＭ値とマイクロアレイ、ＬｏｎｇＳＡＧＥでのＣＶ間に有意な相関関係はない一方（ｐ＞０．０５）、ＥＳＴ（ピアソン相関係数：０．６７６，ｐ＝０．００１）、ＳｈｏｒｔＳＡＧＥ（ピアソン相関係数：０．６５９，ｐ＝０．００２）での各ＣＶとＭ値の間には、有意な相関関係があった。同じく、ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒによって計算された発現安定性値（Ｓ）も、マイクロアレイを除外したＥＳＴ、ＳｈｏｒｔＳＡＧＥ及びＬｏｎｇＳＡＧＥと有意な相関関係を示した。Ｍ及びＳ値は、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘよりＥＳＴ、ＳｈｏｒｔＳＡＧＥのＣＶとさらに高い一致度を示した（表１０）。
【０１１３】
さらに、１３個の新しいＥＲＧｓが、ＲＮＡの分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）が多い組織でも使用できるかどうか試験するために、６０個のＦＦＰＥ試料においてｑＲＴ−ＰＣＲでその発現を調査した。ＤＩＭＴ１Ｌを除くすべての遺伝子が、６０個すべての試料でその発現が測定可能だった。古典的なＥＲＧｓの場合は１８．８５〜３３．０２のＣｐ範囲を、新しいＥＲＧｓの場合は２３．３３〜３１．３８のＣｐ範囲を示した（図９）。ＤＩＭＴ１Ｌは、５個の試料で増幅されなかったので、以後、安定性分析から除外した。実験に含まれた試料の種類の差にもかかわらず、いくつかの遺伝子を除いて以前の４８個の試料で観察されたのと類似の発現様相が観察された。前記結果は、本発明で新たに発掘されたＥＲＧが、ＦＦＰＥ試料での遺伝子発現測定時にも使用できるということを裏付けている。４８個の試料と同じく、ｇｅＮｏｒｍ及びＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒで計算した結果、大部分の新しいＥＲＧが、既存のＥＲＧより低い安定性値を示し、ＦＦＰＥ試料でも安定性の側面でさらに優れているということが証明された（表９）。
【０１１４】
（表６）リアルタイムPCRに用いたヒト組織およびがん細胞株
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＊：結腸の印環細胞癌の中で正常部分；及び
＊＊：絨毛膜羊膜炎の証拠はないが、病巣の石灰化があって、正常の二つの臍動脈及び一つの静脈がある未成熟胎盤。
【０１１５】
（表７）リアルタイムＰＣＲに使用されたプライマー及びＴａｑｍａｎプローブ
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【０１１６】
（表８）各々遺伝子のＰＣＲ効率
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＊：ＰＣＲ効率；ＭＫＮ７４胃癌細胞のｃＤＮＡから連続希釈して、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ４．０で計算する；
＊＊：ＰＣＲ効率；ＬｉｎＲｅｇＰＣＲ（Ｒａｍａｋｅｒｓ等，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ，２００３年，第３３９（１）巻，６２−６６頁）を使用して測定する；及び、
＃：Ｆ−ｔｔｃｔｔｇｃｔｇｇｔｃｔｔｇｃｃａｔＴｃｃｔｇｇａ−ｐ；Ｔ：ＴＡＭＲＡ−標識；Ｆ：ＦＡＭ−標識；Ｐ：ホスファート。
【０１１７】
（表９）リアルタイムＰＣＲデータに基づいてｇｅＮｏｒｍ及びＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒによって計算された新しいＥＲＧ及び既存ＥＲＧの発現安定性
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＊ＤＩＭＴ１Ｌは、分析から除外した。
Ｍ：ｇｅＮｏｒｍプログラムで計算された平均発現安定性；及び、
Ｓ：ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒプログラムで計算された安定性値。
【０１１８】
（表１０）各データセットにおけるCVとgeNormおよびNormFinderで計算された発現安定性との相関
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Ｍ：ｇｅＮｏｒｍプログラムで計算された平均発現安定性；及び、
Ｓ：ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒプログラムで計算された安定性値。
【０１１９】
（表１１）ＨＧ−Ｕ１３３アレイで１３種の組織を含む５６７試料のリスト
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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