(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む神経成長因子の、中高年男性性機能低下症候群を治療するための点鼻型薬物の調製における応用であって、前記点鼻型薬物は点鼻投与方式で中高年男性の性機能低下症候群へ投与される、前記応用。
【請求項２】
前記薬物は、有効量の前記神経成長因子の外、さらに老年男性性機能低下症候群の治療に有効な一種又は多種の他の薬物活性成分を含む請求項１に記載の応用。
【請求項３】
他の薬物活性成分が黄体形成ホルモン、又は血小板由来成長因子ＡＡである、請求項２に記載の応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医薬技術分野に属し、神経成長因子の第二医学用途に関する。具体的には、本発明は、ヒト神経細胞成長因子の中高年男性の性機能低下症候群を治療するための薬物の調製における応用に関する。経鼻投与又は睾丸静脈注射の手段により、ヒト、ラットやマウスに由来する神経細胞成長因子を投与して、ヒト中高年男性の遅発性性腺機能低下症候群を治療することができる。
【背景技術】
【０００２】
ヒト遅発性性腺機能低下症候群（ｌａｔｅ  ｏｎｓｅｔ  ｈｙｐｏｇｏｎａｄｉｓｍ  ｉｎ  ｍａｌｅｓ，ＬＯＨ）は中高年男性に多発する一種の加齢に関連する睾丸機能減退であり、その主な特徴は、性欲と勃起の質（特に夜間勃起）の減退、脳力と空間定位能力の降下を伴った気分変化、筋肉容積と筋力の降下を伴った除脂肪体重（Ｌｅａｎ  ｂｏｄｙ  ｍａｓｓ，ＬＢＭ）の減少、体毛減少と皮膚変化、骨密度降下及び内臓脂肪増加等を含む（非特許文献１；非特許文献２）。遅発性性腺機能低下症候群は一般的に４５〜５５歳に多発し、早くて４０歳又は６５歳まで遅れることがあり、発病原因は視床下部−下垂体−睾丸系の機能減退やライディッヒ細胞の衰退と関係がある（非特許文献３；非特許文献４）。
【０００３】
ライディッヒ細胞（ｌｅｙｄｉｇ  ｃｅｌｌ，ＬＣ）は、テストステロンを合成及び分泌する機能を有する細胞であり、雄性体内における雄性ホルモンの最も主要な源である。人体血清中のテストステロンは、間葉細胞が脳下垂体に分泌された黄体形成ホルモン（Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ，ＬＨ）の刺激を受けて生じたものであり、且つ一連の負のフィードバック機構によって調節される。臨床研究によれば、男性視床下部−下垂体軸機能は加齢に伴って徐々に低下することで、黄体形成ホルモンのパルス放出の度合いが弱まり、最終的にライディッヒ細胞が雄性ホルモンを合成及び分泌することに影響する（非特許文献５）。また、ライディッヒ細胞は分化発育過程において四つの顕著に異なる段階、すなわち、ライディッヒ幹細胞（Ｓｔｅｍ  ｌｅｙｄｉｇ  ｃｅｌｌ、ＳＬＣ）、ライディッヒ前駆細胞（Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｌｅｙｄｉｇ  ｃｅｌｌ、ＰＬＣ）、ライディッヒ未熟細胞（Ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｌｅｙｄｉｇ  ｃｅｌｌ、ＩＬＣ）及びライディッヒ成熟細胞（Ａｄｕｌｔ  ｌｅｙｄｉｇ  ｃｅｌｌ、ＡＬＣ）に分けられる。しかし、これらの発育過程において増殖分化異常、数量減少及びホルモン合成分泌機能減退のために、体内雄性ホルモン欠乏を引き起こす（非特許文献６；非特許文献７）。
【０００４】
現在、中高年遅発性性腺機能低下症候群を臨床的に治療するには、主にテストステロン補充療法を利用し、しかし、この療法は定期的にテストステロンを注射する必要がある外、顕著な安全性問題も存在する。まず、長期的にテストステロンを定量補充する場合、患者はニキビが出やすく赤血球増加症にかかりやすくなる。次に、血清テストステロン濃度の大幅な変動を引き起こしやすく、さらに患者の気分と遅発性性腺機能低下症候群症状の顕著な起伏をもたらす。そして、患者には、水、ナトリウム貯留及び陰茎の異常勃起、排尿しにくい等の不良反応が現れやすく、さらには肝臓と腎臓の機能にダメージを与えたり、前立腺癌等の病気をもたらす（非特許文献８；非特許文献９）。
【０００５】
神経成長因子（ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ＮＧＦ）は哺乳動物での最も重要な生物活性分子の一つであり、大脳、顎下腺、心臓、虹彩、皮膚、及び睾丸等の組織に分布している。神経システムに対して、神経成長因子は、神経元発育、軸索成長、伝達物質合成を促進する及び神経細胞アポトーシスを抑える等の機能を有する。心血管、免疫、生殖等の他のシステムに対して、神経成長因子は、主に免疫システム機能を調節する、部分腫瘍細胞の有糸分裂を抑える及び傷口癒合を促進する等に発現する（非特許文献１０）。
【０００６】
自然の神経成長因子はα、β、γの三つのサブユニットからなり、その主な活性部位はβサブユニットである。神経システムにおいて、神経成長因子は受容体（ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＮＧＦＲ）と結合した後、神経成長因子受容体が導くエンドサイトーシスメカニズムによって内在化し、軸索鞘被覆小胞を形成し、軸索を介し、微小管に沿って胞体まで逆行運送される。最後に、タイロシンタンパクキナーゼ、アシルイノシトールカルシウム、内因性シクロアデノシン等の第二メッセンジャーシステムの転導により、一連のカスケード反応を起動してその生物学効力を発揮する（非特許文献１１）。現在、マウス由来の神経成長因子は既にヒト注射用神経保護類薬物として開発され、薬物ブランドは恩経▲復▼（アモイ北大之路生物工程株式会社）、金路捷（武漢海特生物製薬株式会社）及び▲蘇▼▲勝▼生（北京舒泰神薬業株式会社）を含む。ラット由来の神経成長因子及び遺伝子工学手段により得られたヒト神経成長因子も既に同じ生物学機能を有することが証明された（非特許文献１２）。
【０００７】
神経システムにおいて比較的に多く分布している外、神経成長因子と神経成長因子受容体は睾丸組織中にも広く存在する。近年、研究によれば、神経成長因子は自己分泌或いは傍分泌の手段により精原細胞（Ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｉｃ  Ｃｅｌｌ）、セルトリ細胞（Ｓｅｒｔｏｌｉ  Ｃｅｌｌ）及びライディッヒ細胞（ＬＣ）に作用し、精子の形成と成熟、テストステロンの合成と分泌及び睾丸組織の発育を促進する（非特許文献１３）。これまで既にコブラ毒神経成長因子を利用して男性生殖欠陥を治療してゴシポールが雄性造精機能に対する影響を低下させたが（特許文献１）、神経成長因子は遅発性性腺機能低下症候群を治療することに用いられるかどうかについて未だに報道されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】中国特許出願公開第００１１６１９２．Ｘ号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】王璽坤ら、中華男科学雑誌、２０１２，１８（５）：４７５−４７７
【非特許文献２】郭応禄と李宏軍，中華男科学雑誌、２００４，１０（８）：５６３−５６６
【非特許文献３】Ｗａｎｇら、Ｊ．Ａｎｄｒｏｌ．，２００９，３２（１）：１−１０
【非特許文献４】Ｃｈｅｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｄｏｇｙ，２００２，１４３（５）：１６３７−１６４２
【非特許文献５】陳為想ら、内モンゴル漢方薬、２０１２，３１（５）：１１７−１１８
【非特許文献６】Ｇｅら、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２００５，７２（６）：１４０５−１４１５
【非特許文献７】５．Ｇｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００６，１０３：２７１９−２７２４
【非特許文献８】史虹莉、中国臨床保健雑誌、２００９，１２（４）：３８６−３８８
【非特許文献９】範暁博ら、中華男科学雑誌、２０１０，１６（１）：６８−７１
【非特許文献１０】Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉら、２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １１：５５１−５５５
【非特許文献１１】Ｒｉｂａｔｔｉら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．，２００９，９０（６）：６１５−６２０
【非特許文献１２】Ｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２２３：２２５−２３７
【非特許文献１３】Ｈａｏ  Ｙｕ−ｊｕａｎと張映、国外牧畜学、２０１１，３１（２）：８９−９０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の主な目的は、神経成長因子の中高年男性性腺機能低下症候群を治療するための薬物の調製における応用を提供することにある。この応用において、経鼻投与又は睾丸静脈注射の手段により、神経成長因子又はそれと他の相関治療剤との組成物を患者の体内に送り、下垂体が黄体形成ホルモンの分泌を増加させ、睾丸ライディッヒ幹細胞の増殖分化を誘導することを促進することで、睾丸と血清におけるテストステロン含有量を増加させ、最終的に中高年男性性機能低下症候群を改善又は治癒する。
【００１１】
神経成長因子は既に商品化された薬物になったため、その組成、構造及び性質はいずれも既知なものであり、異なる薬物剤形の調製も本分野の常識であり、そのため、神経成長因子の新たな用途は既に確認できることを前提にして、神経成長因子や対応するベクターから調製された異なる薬物剤形も当業者にとって容易に実現できるものである。
【００１２】
本発明に用いる神経成長因子は、ヒト神経成長因子、マウス神経成長因子及びラット神経成長因子を含んでもいいが、これらに限定されることはない。好ましくは、本発明に用いる神経成長因子はそのβサブユニットアミノ酸配列であり、より好ましくは、前記神経成長因子のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１〜３に示される通りである。
【００１３】
当業者は、本発明に用いる神経成長因子は対応する動物体又は組織中から抽出する（主にマウス神経成長因子とラット神経成長因子である）、或いは遺伝子工学方法により適当な発現宿主の中で発現させて対応する組み換え神経成長因子を得ることができることを理解すべきである。
【００１４】
本発明者は研究していたところ、神経成長因子を主な有効成分として調製した中高年男性性腺機能低下症候群を治療する薬物の作用は以下の通りであることがわかった。
【００１５】
１．前記薬物の、老化促進マウス血清と睾丸の中でテストステロンが低く偏ることに対する治療作用
【００１６】
オス老化促進マウス（Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ｐｒｏｎｅ−８、ＳＡＭＰ８、３２週齢、２６±２グラム／匹）を研究対象として、且つ同種の正常マウス（Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｍｏｕｓｅ  ｐｒｏｎｅ−１、ＳＡＭ  Ｒｌ、３２週齢、２６±２グラム／匹）を選んで正常対照組として用いた。マウス神経成長因子を０．９％の生理食塩水で１ミリグラム／ミリリットル（ｍｇ／ｍＬ）まで希釈し、そして２５０マイクログラム／キログラム体重（μｇ／ｋｇ）になるように点鼻の形で投与し、２日間毎に一回投与し、５週間連続的に投与した。モデル組はオス老化促進マウス（Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ｐｒｏｎｅ−８、ＳＡＭ  Ｐ８、３２週齢、２６±２グラム／匹）を研究対象として、正常対照組と同様に、０．９％の生理食塩水で点鼻を行い、溶液量と投与時間は実験組と同じである。実験終了後に、血清と睾丸を収集した。その後、放射性免疫検出方法で血清及び睾丸内テストステロンの含有量を検出し、蛍光定量鎖式ポリメラーゼ方法及びタンパク交雑方法でテストステロンの合成と分泌過程におけるいくつかの律速酵素の発現状況を検証した。血清テストステロン含有量分析の面では、神経成長因子治療組マウスの血清において、そのテストステロンの平均含有量は１８．０９ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）であり、正常組の１２．３倍であるが、生理食塩水のみをプラシーボとするモデル組では、その血清中のテストステロン含有量は正常対照組の５．１％だけである。睾丸内テストステロン含有量分析の面では、マウス神経成長因子治療組マウスの睾丸内テストステロン含有量は正常対照組と同程度であり、両者の間には顕著な差異がないが、いずれもモデル組より２．５倍高くなっている。この実験結果により、神経成長因子は極めて顕著に老化促進マウス血清と睾丸中テストステロンの含有量を改善できることを明らかにした。テストステロンの合成と分泌はライディッヒ細胞が脳下垂体が分泌した黄体形成ホルモン（Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ，ＬＨ）の刺激を受けて生じたものであり、従って、点鼻の形で脳部に入ったマウス神経成長因子は視床下部と下垂体に作用でき、睾丸のテストステロンを分泌する機能を改善及び増加させる。更なる分子メカニズム研究により、生理食塩水で処理したモデル組に比べて、マウス神経成長因子処理組のマウスライディッヒ細胞中のステロイドホルモン産生急性調節タンパク（Ｓｔｅｒｏｉｄｏｇｅｎｉｃ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｓｔａｒ）の発現量は２倍以上顕著に上昇したことが示され、この結果から、マウス神経成長因子処理組マウスの血液中に黄体形成ホルモンが多くなり、そしてライディッヒ細胞を制御してより多くのテストステロンを合成することを証明した。
【００１７】
２．前記薬物は老化促進マウスの睾丸ライディッヒ幹細胞の増殖と分化を促進する
【００１８】
ライディッヒ細胞は分化発育過程において四つの顕著に異なる段階、すなわち、ライディッヒ幹細胞（Ｓｔｅｍ  ｌｅｙｄｉｇ  ｃｅｌｌ，ＳＬＣ）、ライディッヒ前駆細胞（Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｌｅｙｄｉｇ  ｃｅｌｌ，ＰＬＣ）、ライディッヒ未熟細胞（Ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｌｅｙｄｉｇ  ｃｅｌｌ，ＩＬＣ）及びライディッヒ成熟細胞（Ａｄｕｌｔ  ｌｅｙｄｉｇ  ｃｅｌｌ，ＡＬＣ）に分けられる。これらの発育過程において、増殖分化異常、数量減少及びホルモン合成分泌機能減退のために、体内の雄性ホルモン欠乏につながる。ライディッヒ細胞の発育分化は一般的に胚胎発生と青春期初期だけに限られ、ライディッヒ成熟細胞が一旦形成されると、雄性が老衰状態に入っても、その数量は顕著に変化することはない。しかし、近年の研究により、ライディッヒ幹細胞は改めて増殖して新しいライディッヒ成熟細胞に分化できることが明らかにされた。間葉細胞の再生過程もライディッヒ前駆細胞、ライディッヒ未熟細胞及びライディッヒ成熟細胞の段階を経て、且つ全ての雄性ホルモンシンセターゼのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）発現及びその生理機能はいずれも正常なライディッヒ細胞とは顕著な差異がない。この結果から、睾丸において“沈黙”状態のライディッヒ幹細胞が存在し、これらの細胞は再びテストステロン合成能力を有するライディッヒ成熟細胞まで増殖及び分化発育でき、しかもこのような再生能力は雄性年齢とは関係ないことを有力的に証明した（Ｓｔａｎｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，２０１２：Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１５３（１０）：５００２−５０１０）。
【００１９】
雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（１２〜１６週齢、２５０±２０グラム／匹、中山大学実験動物センターから購入され、免許証番号：ＳＣＸＫ２０１１−００２９）を実験する前の７日目にエタンジメタンスルホナート（Ｅｔｈａｎｅ  ｄｉｍｅｔｈａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ、ＥＤＳ）（９０ミリグラム／キログラム体重、ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、二酸化炭素で窒息死させた後、睾丸を取り出し、そして曲精細管を分離し、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地において（０．１％の子牛血清アルブミンを含む）、３４℃で１６時間培養した。その後、曲精細管を２４孔板に分け、異なる濃度のラット神経成長因子及び黄体形成ホルモンを加えて２４時間処理した。蛍光染色剤で細胞核に対し染色を行い、共焦点レーザー及び蛍光顕微鏡で観察し、その結果、黄体形成ホルモン（ＬＨ）を単独で使用することはＳＬＣを“活性化”できないが、ラット神経成長因子はＳＬＣの顕著な増殖と分化の開始を促進でき、且つこの増殖効果はラット神経成長因子と濃度依存効力を示すことを明らかにした（図４）。また、ＳＬＣは曲精細管表面に分布され、そして神経成長因子と神経成長因子受容体も睾丸組織中に広く存在し、従って、ラット神経成長因子を含む薬物は睾丸静脈注射によりＳＬＣを誘導し増殖分化を行う。
【００２０】
更なる研究より、１００ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）のヒト神経成長因子、０．１％の子牛血清アルブミン及び１ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）黄体形成ホルモンを含む培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２，ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）を用いて、曲精細管を連続的に８週間培養した後、培養液中のテストステロンは検出でき、最高で５．４ナノグラム／孔（ｎｇ／ｗｅｌｌ、図５）に達したことを明らかにした。この結果より、黄体形成ホルモン及びヒト神経成長因子は睾丸ライディッヒ幹細胞の増殖と成体間葉細胞まで分化発育することを促進でき、且つテストステロンを合成と分泌することができることを証明できた。
【００２１】
上述した研究結果では、マウス、ラット及びヒト由来の神経成長因子は単独で又はその他の相関薬剤と組み合わせて薬物組成物の形で中高年男性性腺機能低下症候群の治療に用いられることを十分に証明し、その中で、前記薬物組成物の形は点鼻剤、注射剤又は粉末注射剤を含む。また、薬物組成物はその他の相関活性成分を含有してもいいが、さらに安定剤、浸透圧を変える塩、バッファー、又は酸化防止剤を含有してもいい。
【００２２】
従って、本発明のほかの形態では、本発明はさらに中高年男性遅発性性腺機能低下症候群を治療する方法を提供し、前記方法は、ラット神経成長因子、マウス神経成長因子又は遺伝子工学の方法で得られたヒト由来の神経成長因子を、４０マイクログラム／キログラム体重（μｇ／ｋｇ）の投薬量で点鼻投与により被験者（主に遅発性性腺機能低下症候群を患う中高年男性）に使用し、一日おきに一回、計１０回投与して１クールにして、それぞれのクールが終了した後に血液中テストステロンの含有量を検出し、血液中テストステロンの含有量が正常レベルに達するまで、血液中テストステロンの含有量に基づいて、さらに次のクールの治療が必要であるかどうかを判断すること、或いは、ラット神経成長因子、マウス神経成長因子又は遺伝子工学の方法で得られたヒト由来の神経成長因子を、１〜３マイクログラム／キログラム体重（μｇ／ｋｇ）の投薬量で睾丸静脈投与方式により被験者（主に遅発性性腺機能低下症候群を患う中高年男性）に使用し、週に一回、計４回投与して１クールにし、それぞれのクールが終了した後に血液中テストステロンの含有量を検出し、血液中テストステロンの含有量が正常レベルに達するまで、血液中テストステロンの含有量に基づいて、さらに次のクールの治療が必要であるかどうかを判断することを含む。
【００２３】
以下の図面に参照する詳しい説明から、本発明の上記の特徴とメリットはさらに明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】曲精細管表面睾丸ライディッヒ幹細胞の増殖と分布を示す図である。
【図２】ラット神経成長因子で誘導される睾丸ライディッヒ幹細胞増殖の分析を示す図である。
【図３】テストステロンの合成経路における鍵酵素遺伝子発現の定量分析を示す図である。
【図４】放射性免疫方法分析培地におけるテストステロン含有量を示す図である。
【図５】老化促進マウス血清テストステロン含有量の分析を示す図である。
【図６】老化促進マウス睾丸内テストステロン含有量の分析を示す図である。
【図７】老化促進マウスライディッヒ細胞内でテストステロンを合成及び分泌する鍵酵素遺伝子の定量ＰＣＲ検証分析を示す図である。
【図８】老化促進マウス曲精細管においてセルトリ細胞テストステロン輸送タンパク質の発現分析状況を示す図である。
【図９】老化促進マウス睾丸総タンパク交雑の検出結果分析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
図１は、曲精細管表面睾丸ライディッヒ幹細胞の増殖と分布を示す図であり（緑の蛍光部分は核酸転写活動を行っている細胞核を示す）、ＬＨ＝黄体形成ホルモン（ＬＨ、２８０ｎｇ／ｍｌ）＋インシュリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム培地添加剤（Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−Ｓｏｄｉｕｍ  Ｓｅｌｅｎｉｔｅ，ＩＴＳ）、ＰＤＧＦ  ＡＡ＝インシュリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム培地添加剤（ＩＴＳ）＋血小板由来成長因子ＡＡ（ＰＤＧＦ  ＡＡ）、ＮＧＦ  ２００＝インシュリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム培地添加剤（ＩＴＳ）＋ラット神経成長因子（２００ｎｇ／ｍｌ）；ＮＧＦ１００＝インシュリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム培地添加剤（ＩＴＳ）＋ラット神経成長因子（１００ｎｇ／ｍｌ）；ＮＧＦ１０＝インシュリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム培地添加剤（ＩＴＳ）＋ラット神経成長因子１０（１０ｎｇ／ｍｌ）；血小板由来成長因子ＡＡ（ＰＤＧＦＡＡ）の濃度は１０ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）であり、黄体形成ホルモン（ＬＨ）濃度は２８０ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）であり、２４時間処理した後、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ（Ｒ）ＥｄＵ  ＨＣＳ  Ａｓｓａｙｓキット（商品番号：Ｃ１０３５２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入される）で核染色を行い、オリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ）蛍光顕微鏡（１００Ｘ）で撮影した。
【００２６】
図２は、ラット神経成長因子で誘導される睾丸ライディッヒ幹細胞増殖の分析を示す図である。
【００２７】
図３は、テストステロンの合成経路における鍵酵素遺伝子発現の定量分析を示す図であり、ラット神経成長因子の作動濃度は２００ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）、１００ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）、１０ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）であり、血小板由来成長因子ＡＡ（ＰＤＧＦＡＡ）の濃度は１０ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）であり、黄体形成ホルモン（ＬＨ）の濃度は２８０ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）であり、処理時間は７２時間であり、その後、上述した各種細胞因子を含む培地をそれぞれインシュリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム培地添加剤（ＩＴＳ）＋黄体形成ホルモン（ＬＨ）の培地に変更して、継続的に２１日目まで培養し、３．５日間ごとに培地を一回入れ替え、１４日目と２１日目のサンプルを集めてリボ核酸（ＲＮＡ）を抽出し、逆転写キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入され、商品番号：１１７５３５００）で１マイクログラム（μｇ）のＲＮＡを逆転写し、蛍光定量鎖式ポリメラーゼ反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）で各遺伝子の発現状況を検証した。インシュリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム培地添加剤（ＩＴＳ）組を対照組として、参照はリボソームタンパクＳ１６遺伝子（ＲＰＳ１６、そのプライマー配列は深▲溝▼華大遺伝子研究院より合成される）であり、＊＊＊はＩＴＳと比較して、ｐ＜０．００１を表示し、＊＊はＩＴＳと比較して、ｐ＜０．０１を表示し、＊はＩＴＳと比較して、ｐ＜０．０５を表示し、ｎ＝５である。ａ＊＊＊は黄体形成ホルモン（ＬＨ）と比較して、Ｐ＜０．００１を表示し、ｂ＊＊は、黄体形成ホルモン（ＬＨ）と比較して、Ｐ＜０．０１を表示し、ｃ＊は黄体形成ホルモン（ＬＨ）と比較して、Ｐ＜０．０５を表示し、ｎ＝５である。
【００２８】
図４は、放射性免疫方法分析培地におけるテストステロン含有量を示す図であり、ヒト神経成長因子の濃度は２００ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）、１００ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）、１０ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）であり、血小板由来成長因子ＡＡ（ＰＤＧＦＡＡ）の濃度は１０ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）であり、黄体形成ホルモン（ＬＨ）濃度は２８０ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）であり、処理時間は７２時間であり、その後、上述した各種細胞因子を含有する培地をそれぞれインシュリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム培地添加剤（ＩＴＳ）＋黄体形成ホルモン（ＬＨ）に変更した培地を継続的に２１日目まで培養し、３．５日間ごとに培地を一回入れ替え、１４日目と２１日目の培地上澄みを集め、放射性免疫キット（北京北方生物技術研究所から購入され、商品番号：Ｂ１０ＴＦＢ）で上澄みテストステロンを検出した。インシュリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム培地添加剤（ＩＴＳ）組を対照組として、参照は４０ＳリボソームタンパクＳ１６遺伝子（ＲＰＳ１６、そのプライマー配列は華大遺伝子研究院より合成される）であり、＊は対照組と比較して、Ｐ＜０．０５を表示し、＊＊は、対照組と比較して、Ｐ＜０．０１を表示し、＊＊＊は対照組と比較して、Ｐ＜０．００１を表示し、＊＊＊は黄体形成ホルモン（ＬＨ）と比較して、Ｐ＜０．００１を表示し、ｂ＊＊は黄体形成ホルモン（ＬＨ）と比較して、Ｐ＜０．０１を表示し、ｃ＊は黄体形成ホルモン（ＬＨ）と比較して、Ｐ＜０．０５を表示し、ｎ＝５である。
【００２９】
図５は、老化促進マウス血清テストステロン含有量の分析であり、正常マウスは同系のＳＡＭ  Ｒ１シリーズであり、モデル組マウスはＳＡＭ  Ｐ８マウス（天津中医薬大学から購入され、合格証番号：Ｗ−Ｊ津実動質Ｍ准字第００６号、２６±２グラム／匹）であり、マウス神経成長因子組マウスに対する投与量は２５０マイクログラム／キログラム体重（μｇ／ｋｇ）であり、一日おきに経鼻投与し、連続的に５週間投与し、眼球から採血し、血清を集め、放射性免疫方法で体内テストステロンを検出し、＊＊＊は、Ｐ＜０．００１ｖｓ正常を表示し、ｎ＝６である。
【００３０】
図６は、老化促進マウス睾丸内テストステロン含有量の分析を示す図であり、睾丸から被膜を取り除いた後、ホモジナイザーに置き、１：５（質量：体積）の割合で予め冷したリン酸塩バッファーに入れ、４℃で一晩振とうし、翌日に３０００回転／分で１５分間遠心した後に上澄みを取り、−２０℃で保存し、放射性免疫法でテストステロンを検出し、＊＊はＰ＜０．０１ｖｓ対照を表示し、ｎ＝４である。
【００３１】
図７は、老化促進マウスライディッヒ細胞内でテストステロンを合成と分泌する鍵酵素遺伝子の定量ＰＣＲ検証分析であり、マウス神経成長因子組マウスの投与量は２５０マイクログラム／キログラム体重（μｇ／ｋｇ）であり、鼻腔から一日おきに投与し、連続的５週間投与し、睾丸サンプルからリボ核酸（ＲＮＡ）を抽出し、逆転写キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入され、商品番号：１１７５３５００）で１マイクログラム（μｇ）のリボ核酸（ＲＮＡ）を逆転写し、４２℃で３０分間逆転写した後、８５℃で５分間処理して反応を終了させた。４０ＳリボソームタンパクＳ１６遺伝子（ＲＰＳ１６、そのプライマー配列は華大遺伝子研究院より合成される）を参照として、蛍光定量鎖式ポリメラーゼ反応（ＰＣＲ）でテストステロン合成経路における関連酵素の発現状況を検出し、＊は、対照と比較して、Ｐ＜０．０５を表示し、＊＊は、対照と比較して、Ｐ＜０．０１を表示し、＊＊＊は対照と比較して、Ｐ＜０．００１を表示し、ｎ＝４である。
【００３２】
図８は、老化促進マウス曲精細管においてセルトリ細胞テストステロン輸送タンパク質の発現分析状況を示す図であり、マウス神経成長因子組マウスの投与量は２５０マイクログラム／キログラム体重（μｇ／ｋｇ）であり、鼻腔から一日おきに投与し、連続的に５週間投与し、睾丸サンプルからリボ核酸（ＲＮＡ）を抽出し、逆転写キットで１マイクログラム（μｇ）のリボ核酸（ＲＮＡ）を転写し、４２℃で３０分間逆転写した後、８５℃で５分間処理して反応を終了させた。４０ＳリボソームタンパクＳ１６遺伝子（ＲＰＳ１６、そのプライマー配列は華大遺伝子研究院より合成される）を参照として、蛍光定量鎖式ポリメラーゼ反応（ＰＣＲ）でテストステロン合成経路における相関酵素の発現状況を検出し、＊は対照と比較して、Ｐ＜０．０５を表示し、＊＊は対照と比較して、Ｐ＜０．０１を表示し、＊＊＊は、対照と比較してＰ＜０．００１を表示し、ｎ＝４である。
【００３３】
図９は、老化促進マウス睾丸総タンパク交雑の検出結果分析を示す図であり、マウス神経成長因子組マウスの投与量は２５０マイクログラム／キログラム体重（μｇ／ｋｇ）であり、鼻腔から一日おきに投与し、連続的に５週間投与し、睾丸サンプルからタンパクを抽出し、タンパク交雑方法でタンパク発現状況を検証した。蛍光定量鎖式ポリメラーゼ反応（ＰＣＲ）でテストステロン結合タンパク（Ａｎｄｒｏｇｅｎ  Ｂｉｎｇｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，ＡＢＰ）遺伝子の発現状況を検証し、＊は対照と比較して、Ｐ＜０．０５を表示し、＊＊は対照と比較して、Ｐ＜０．０１を表示し、＊＊＊は対照と比較して、Ｐ＜０．００１を表示し、ｎ＝４である。
【００３４】
【表１】
0006026659.tif 000002
【００３５】
以下、本発明を具体的な実施例に参照してさらに説明するが、当業者は、本発明はこれらの具体的な実施例に限られないことを理解すべきである。
【００３６】
また、当業者は、特に説明がなければ、下記の実施例における全ての試薬は市販される薬剤であることを理解すべきである。
【実施例】
【００３７】
実施例１：ラット神経成長因子がラットライディッヒ細胞に対する増殖を促進する作用を検証する。
【００３８】
材料：Ｃｏｒｎｉｎｇ１２孔板（アメリカコーニング株式会社から購入され、商品番号：３３３６）、テストステロン放射性免疫検出キット（北京北方生物技術研究所から購入され、商品番号：Ｂ１０ＴＦＢ）、ヒト神経成長因子（シグマアルドリッチ上海貿易株式会社から購入され、商品番号：Ｎ１４０８−．１ＭＧ）、ラット神経成長因子（シグマアルドリッチ上海貿易株式会社から購入され、商品番号：Ｎ２５１３−１ＭＧ）又はマウス神経成長因子（シグマアルドリッチ上海貿易株式会社から購入され、商品番号：ＳＲＰ４３０４−２０ＵＧ）、インシュリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム培地添加剤（ＩＴＳ、シグマアルドリッチ上海貿易株式会社から購入され、商品番号：１１８８４）、黄体形成ホルモン（ＬＨ，シグマアルドリッチ上海貿易株式会社から購入され、商品番号：Ｌ９７７３）、エタンジメタンスルホナート（ＥＤＳ、中山大学化工学院より合成され、合成方法はＪａｃｋｓｏｎ  Ｈ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｏｍｅ  ａｎｔｉｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｉｃ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ．Ｉｎ：Ｓｅｇａｌ  ＳＪ，Ｃｒａｚｉｅｒ  Ｒ，Ｃｏｒｆｍａｎ  ＰＡ，Ｃｏｒｄｌｉｆｆｅ  ＰＣ，ｅｄｓ．Ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｉｌｌｉｎｏｉｓ：Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ  Ｐｒｅｓｓ，１９７３；２５７−２６８．を参照）、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ（Ｒ）ＥｄＵ  ＨＣＳ  Ａｓｓａｙｓ検出キット（アメリカライフテクノロジーズ株式会社から購入され、商品番号：Ｃ１０３５２）、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（アメリカライフテクノロジーズ株式会社から購入され、商品番号：０９３０１５２ＤＫ）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｃＤＮＡ合成キットとＢｉｏ−Ｒａｄ  ＳＹＢＲ蛍光染料（アメリカバイオ・ラッド株式会社から購入され、商品番号：１７０−８８９０、１７０−８８８０）、全ＲＮＡ抽出キット（ドイツキアゲン株式会社から購入され、商品番号：７４１０４）。
【００３９】
オスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（広東省医学動物実験センターから購入され、１２週齢、２５０±２０グラム／匹）を実験する前の７日目に腹腔でエタンジメタンスルホナート（ＥＤＳ、９０ミリグラム／キログラム体重）を注射し、二酸化炭素で死亡させた後、睾丸を取り出し、氷冷したリン酸バッファー中に置き、被膜を取り除き、曲精細管を１本分離した後、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（０．１％の牛血清アルブミンとｌｘインシュリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム培地添加剤を含む）において３４℃、５％二酸化炭素の条件で一晩培養した。翌日、曲精細管を２４孔板に分け、異なる濃度の細胞因子（即ち、血小板由来成長因子ＡＡ又は神経成長因子）を加えて曲精細管を処理し、具体的には、インシュリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム培地添加剤（ＩＴＳ）組（陰性対照）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）＋インシュリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム培地添加剤（ＩＴＳ）組、血小板由来成長因子ＡＡ（ＰＤＧＦ  ＡＡ）＋インシュリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム培地添加剤（ＩＴＳ）組（陽性対照組）、インシュリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム培地添加剤（ＩＴＳ）＋ラット神経成長因子組に分け、ラット神経成長因子の濃度は２００ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）、１００ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）、１０ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）であり、血小板由来成長因子ＡＡ（ＰＤＧＦ  ＡＡ）の濃度は１０ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）であり、黄体形成ホルモン（ＬＨ）濃度は２８０ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）であり、２４時間処理した後、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ（Ｒ）ＥｄＵ  ＨＣＳ  Ａｓｓａｙｓキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司から購入され、商品番号：Ｃ１０３５２）で核染色を行った（図１のように）。
【００４０】
結果からわかるように、ラット神経成長因子処理組において、２００ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）、１００ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）及び１０ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）の投薬量はいずれもライディッヒ幹細胞（Ｓｔｅｍ  Ｌｅｙｄｉｇ  Ｃｅｌｌ、ＳＬＣ）の増殖を促進できるが、１００ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）及び１０ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）処理組に比べて、２００ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）処理組は顕著に睾丸ライディッヒ幹細胞（ＳＬＣ）の増殖を促進でき（Ｐ＜０．００１ｖｓ対照）、且つその増殖促進作用は黄体形成ホルモン（ＬＨ）処理組より強く、ラット神経成長因子の睾丸ライディッヒ幹細胞（ＳＬＣ）に対する促進作用は投薬量依存効力があることを証明した。
【００４１】
実施例２：ラット神経成長因子がラット睾丸ライディッヒ幹細胞に対する分化促進作用
【００４２】
オスＳＰＲＡＧＵＥ−ＤＡＷＬＥＹラット（広東省医学動物実験中心から購入され、１２週齢、２５０±２０グラム／匹）を実験する前の７日目に腹腔でエタンジメタンスルホナート（ＥＤＳ、９０ミリグラム／キログラム体重）を注射し、二酸化炭素で死亡させた後、睾丸を取り出し、氷冷したリン酸バッファー中に置き、被膜を取り除き、血管を曲精細管から剥離し、曲精細管を１本分離し、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（０．１％牛血清アルブミンとｌｘインシュリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム培地添加剤を含む）において３４℃、５％二酸化炭素の条件で一晩培養した。翌日、曲精細管を２４孔板に分け、ラット神経成長因子を加えて処理し、ラット神経成長因子の濃度は２００ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）、１００ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）、１０ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）であり、血小板由来成長因子ＡＡ（ＰＤＧＦ  ＡＡ）の濃度は１０ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）であり、黄体形成ホルモン（ＬＨ）濃度は２８０ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）であり、処理時間は７２時間であり、その後、上述した各種細胞因子を含有する培地をそれぞれインシュリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム培地添加剤（ＩＴＳ）＋黄体形成ホルモン（ＬＨ）の培地に変更して２１日目まで継続的に培養し、３．５日間ごとに一回培地を入れ替え、１４日目と２１日目の培地上澄みを集めてテストステロン測定用にし、１４日目と２１日目のサンプルを集めてＲＮＡを抽出し、逆転写キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入され、商品番号：１１７５３５００）で１マイクログラム（μｇ）のリボ核酸（ＲＮＡ）を逆転写し、４２℃で３０分間逆転写した後、８５℃で５分間処理して反応を終了させ、４０ＳリボソームタンパクＳ１６遺伝子（ＲＰＳ１６、そのプライマー配列は華大遺伝子研究院より合成される）を参照として、蛍光定量ＰＣＲでテストステロン合成経路における相関酵素の発現状況を検証した（図２のように）。
【００４３】
１４日目に、各処理がテストステロン合成経路における各酵素の発現状況に対する影響は一様ではなく、ステロイドホルモン産生急性調節タンパク（Ｓｔｅｒｏｉｄｏｇｅｎｉｃ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＳｔＡＲ）遺伝子の面では、ラット神経成長因子１００ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）組は顕著にステロイドホルモン産生急性調節タンパク（ＳｔＡＲ）、ヒドロキシ−δ−５−ステロイド脱水素酵素、３β−及びステロイドδ−異性化酵素１（ｈｙｄｒｏｘｙ−ｄｅｌｔａ−５−ｓｔｅｒｏｉｄ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，３  ｂｅｔａ−ａｎｄ  ｓｔｅｒｏｉｄ  ｄｅｌｔａ−ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  １，ｈｓｄ３ｂｌ）及び１７β−ヒドロキシステロイド脱水素酵素３（ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ（１７−ｂｅｔａ）ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ３，ｈｓｄ１７ｂ３）の三つの遺伝子の上方制御された発現を促進し、その発現促進作用は明らかに黄体形成ホルモン（ＬＨ）処理組より優れている。ラット神経成長因子２００ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）組は１７β−ヒドロキシステロイド脱水素酵素３（Ｈｓｄｌ７ｂ３）と５α−還元酵素１（ｓｔｅｒｏｉｄ−５−ａｌｐｈａ−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，Ｓｒｄ５ａｌ）遺伝子の発現の上方制御を促進したが、ステロイドホルモン産生急性調節タンパク（ＳｔＡＲ）、ヒドロキシ−δ−５−ステロイド脱水素酵素、３β−及びステロイドδ−異性化酵素１（ｈｓｄ３ｂｌ）遺伝子の発現に対して影響を及ぼさなかった。神経成長因子１０ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）組はいずれもこれら遺伝子の発現に対して顕著な促進作用を示さなかった。２１日目、ラット神経成長因子２００ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）組、ラット神経成長因子１００ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）組及び神経成長因子１０ｎｇ／ｍｌ組はいずれも顕著にステロイドホルモン産生急性調節タンパク（ＳｔＡＲ）、ヒドロキシ−δ−５−ステロイド脱水素酵素、３β−及びステロイドδ−異性化酵素１（ｈｓｄ３ｂｌ）及び１７β−ヒドロキシステロイド脱水素酵素３（ｈｓｄ１７ｂ３）の三つの遺伝子の上方制御された発現を促進し、ラット神経成長因子２００ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）組の促進作用は明らかに黄体形成ホルモン（ＬＨ）組より優れており、ラット神経成長因子１００ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）組と神経成長因子１０ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）組の促進作用は黄体形成ホルモン（ＬＨ）組ほど顕著ではなかった。５α−還元酵素１（Ｓｒｄ５ａｌ）遺伝子の面では、ラット神経成長因子１０ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）はその高い発現を促進し、その作用効果は黄体形成ホルモン（ＬＨ）組とほぼ一致する。ラット神経成長因子２００ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）組と神経成長因子１００ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）組はいずれもその高い発現を促進できなかった（図３）。
【００４４】
実施例３：放射性免疫方法で培地中のテストステロン含有量を分析する
【００４５】
９０日ＳＡＭ  Ｒ１マウス（３月齢，体重２６±２ｇ）を取り、滅菌状態でピンセットを用いてその睾丸中の曲精細管を抽出し、リン酸バッファーで６回洗い流した後、さらにＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で３回洗い流し、最終濃度が３７５マイクログラム／ミリリットル（μｇ／ｍｌ）であるエタンジメタンスルホナート（ＥＤＳ）を０．１％の子牛血清アルブミンを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に加えて、２４時間処理した。３回洗浄した後、新鮮な培地に換え、そして３４℃及び５％二酸化炭素の環境に置いて培養し、３．５日間おきに一度異なる濃度（１０、１００及び２００ナノグラム／ミリリットル）のヒト神経成長因子、黄体生成ホルモン（ＬＨ）及び血小板由来成長因子ＡＡ（ＰＤＧＦＡＡ）を含む細胞培地に換えた。最後に放射性免疫方法により培地中のテストステロン含有量を分析した。実験結果からわかるように、１４日目のとき、神経成長因子１０ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）は顕著にテストステロンの分泌を促進し、その他の各組はいずれも顕著な変化が現れなかった。２１日目のとき、各処理組のテストステロン分泌はいずれも顕著なアップレギュレーションを示し、特にラット神経成長因子１０ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）処理組のテストステロン変化は最も顕著であった。各神経成長因子処理組のテストステロン分泌を促進する能力は黄体形成ホルモン（ＬＨ）組に比べて、いずれも顕著な差異がないため、そのテストステロン分泌を促進する能力は黄体形成ホルモン（ＬＨ）組との差異は大きくないことを示す（図４）。
【００４６】
実施例４：神経成長因子が老化促進マウスに対する治療作用
【００４７】
オスＳＡＭＰ８とＳＡＭＲ１マウス（天津中医薬大学第一付属医院動物センターから購入され、８月齢、体重２６±２ｇ）１２匹：モデル組５匹、マウス神経成長因子組５匹、正常組５匹に鼻腔から一日おきに投与し、５週間連続的に投与し、神経成長因子組の投与量は２５０マイクログラム／キログラム体重（μｇ／ｋｇ）である。眼球から採血し、睾丸を集め、放射性免疫方法で体内テストステロンを検出する。蛍光定量鎖上ポリメラーゼ反応とタンパク交雑方法でこれらの酵素の異なるレベルでの発現状況を検証した。放射性免疫検証結果からわかるように、神経成長因子は顕著にモデル組マウス血清中と睾丸内のテストステロン含有量を回復させることができる。その中でテストステロンの回復レベルは正常組と同程度である（図５〜６）。蛍光定量ＰＣＲの結果より、テストステロン合成経路におけるステロイドホルモン産生急性調節タンパク（ＳｔＡＲ）、コレステロール側鎖脱離酵素（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０，ｆａｍｉｌｙ  １１，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ａ，ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  １，Ｃｙｐｌｌａｌ）、ヒドロキシ−δ−５−ステロイド脱水素酵素、３β−及びステロイドδ−異性化酵素１（ｈｓｄ３ｂｌ）、１７β−ヒドロキシステロイド脱水素酵素３（Ｈｓｄｌ７ｂ３）、５α−還元酵素１（Ｓｒｄ５ａｌ）の発現の面では、マウス神経成長因子処理組のコレステロール側鎖脱離酵素（Ｃｙｐｌｌａｌ）遺伝子の発現には顕著なアップレギュレーションの傾向が見られ（図７、図９）、テストステロンの輸送と関係あるアンドロゲン結合タンパク（ＡＢＰ）遺伝子の発現にも顕著なアップレギュレーションの傾向が見られ（図８）、その血清テストステロンと睾丸テストステロンの回復はこの二つの遺伝子発現の大量なアップレギュレーションと関係がある可能性がある。
【００４８】
例示性の実施形態に参照し、既に本発明に対して具体的な表現と説明を行ったが、当業者は、請求項に定義された本発明の趣旨や範囲から離れない条件下で、各種の様態と細部の変更を行うことができ、各種実施形態の任意な組み合わせを行うことができることを理解すべきである。従って、本発明の範囲は明細書の同等の目的や範囲内で用いられる修正を含む。
【図２】
0006026659.tif 000003
【図３】
0006026659.tif 000004
【図４】
0006026659.tif 000005
【図５】
0006026659.tif 000006
【図６】
0006026659.tif 000007
【図７】
0006026659.tif 000008
【図８】
0006026659.tif 000009
【図９】
0006026659.tif 000010
【図１】
0006026659.tif 000011
【配列表】
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