(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
関節を治療するキットにおいて、
高分子量ヒアルロン酸を含む第１の成分と、
凍結乾燥硫酸ムコ多糖類のファミリーを含む第２の成分であって、前記第１の成分と分離されており、かつ前記第１の成分の粘度を一時的に低減するのに有効である、第２の成分、と、
前記第１および第２の成分の混合物を注入する注射器と、
を含む、キット。
【請求項２】
請求項１に記載のキットにおいて、
前記硫酸ムコ多糖類のファミリーは、コンドロイチン硫酸を含む、キット。
【請求項３】
請求項１に記載のキットにおいて、
グルコサミンを含む第３の成分、
をさらに含む、キット。
【請求項４】
請求項３に記載のキットにおいて、
前記グルコサミンは、凍結乾燥される、キット。
【請求項５】
請求項１に記載のキットにおいて、
前記第１および第２の成分が組み合わせられて混合物を形成すると、前記第１および第２の成分は、１：０．００５〜１：１００の範囲の、第１の成分対第２の成分の割合で、前記混合物中に存在する、キット。
【請求項６】
請求項１に記載のキットにおいて、
前記注射器は、前記第１の成分を収容する第１のチャンバ、および前記第２の成分を収容する第２の容器を有し、
前記注射器は、前記第１および第２の成分を混合するために前記第２の成分を前記第１のチャンバに注入するように構成されたプランジャーを含む、キット。
【請求項７】
請求項１に記載のキットにおいて、
前記第２の成分は、容器内に入れられ、前記注射器は、前記第１の成分を収容する第１のチャンバ、および前記容器を前記注射器に取り外し可能に連結するコネクタを含み、前記注射器の前記第１のチャンバ内部にスライド可能に配されたプランジャーが、前記第１および第２の成分を混合するように前記第１の成分を前記容器に注入することができる、キット。
【請求項８】
請求項１に記載のキットにおいて、
前記ヒアルロン酸は、凍結乾燥される、キット。
【請求項９】
請求項１に記載のキットにおいて、
前記ヒアルロン酸は、１ＭＤａ〜４ＭＤａの範囲の分子量を有する、キット。
【請求項１０】
請求項１に記載のキットにおいて、
前記ヒアルロン酸は、少なくとも７ｍｇ／ｍＬの濃度を有する、キット。
【請求項１１】
請求項１に記載のキットにおいて、
前記第１および第２の成分を可溶化させるように構成された流体をさらに含む、キット。
【請求項１２】
請求項１１に記載のキットにおいて、
前記流体は、水、食塩水、および緩衝液からなる群から選択される、キット。
【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【０００１】
〔発明の分野〕
本発明は、概して、関節を治療する組成物および方法に関する。
【０００２】
〔発明の背景〕
関節炎の最も一般的な形態である変形性関節症（「ＯＡ」）は、関節の骨、軟骨および滑膜における変性（関節の漸進的な劣化）の、または異常な変化により特徴付けられるある種の関節炎である。ＯＡは、患者の疼痛、腫脹、および硬直を結果として生じる炎症を時に伴う、向かい合った関節表面の進行性磨耗によってしばしば特徴付けられる。ＯＡは、関節への外傷後、関節の感染後、または単に加齢の結果として、１つまたは複数の関節で生じ得る。さらに、異常な解剖学的構造がＯＡの初期発生の一因となり得るという新たな証拠がある。
【０００３】
ＯＡの治療には、一般的に、運動もしくは理学療法、ライフスタイルの変更、および鎮痛薬の組み合わせが含まれる。アセトアミノフェンは、典型的には、最初に使用されるＯＡ治療である。軽度から中等度の症状では、有効性は、イブプロフェンなどの非ステロイド性抗炎症薬（「ＮＳＡＩＤ」）と同様である。さらに重篤な症状では、ＮＳＡＩＤは、より有効となり得る。しかしながら、より有効である一方で、重篤な症例でのＮＳＡＩＤは、胃腸出血および腎臓の合併症などの重い副作用と関連がある。別の種類のＮＳＡＩＤ、ＣＯＸ−２選択的阻害薬（セレコキシブなど）は、ＮＳＡＩＤと同様に有効であるが、副作用の点では、より安全というものではない。ジクロフェナクを含む、局所的用途に使用できるＮＳＡＩＤがいくつかある。典型的には、それらは、経口投与より全身性の副作用が少なく、少なくともいくつかの治療効果を有している。モルヒネおよびフェンタニールなどのオピオイド鎮痛薬は疼痛を改善するが、この恩恵を、頻繁な有害事象が上回り、そのため、オピオイド鎮痛薬は日常的に使用されない。関節内ステロイド注入も、ＯＡ治療で使用され、疼痛緩和には非常に有効である。しかしながら、疼痛緩和の持続力は、４〜６週間に限られており、付随的な軟骨損傷を含み得る悪影響がある。疼痛が弱くなってきたら、関節置換手術を使用して、可動性および生活の質を改善することができる。疾患を遅らせたり逆行させたりする、実績ある治療はない。
【０００４】
アセトアミノフェンのような単純な鎮痛薬または運動および理学療法により適切な疼痛緩和を得られない患者では、ヒアルロン酸（ＨＡ）の関節内注入により、症候性疼痛に対処し、関節全置換手術の必要性を遅らせる、別の治療オプションが与えられる。自然のＨＡの濃度（concentration）が、ＯＡに罹っている個体において不十分であることが分かっており、したがって、外因性ＨＡの関節注入がこれらの分子を補充し、滑液の粘弾性特性を回復すると考えられる。関節を滑らかにし、かつ保護する（cushioning）のに関与するのは、この特性である。ＨＡが、細胞表面レセプターへの結合を通じて生物活性を有し、また、炎症緩和において役割を有し得るという証拠もある。作用のメカニズムにかかわらず、疼痛緩和は、治療過程後約６カ月間観察される。米国市場におけるＨＡ製品の治療過程は、単回注入製品から、この疼痛緩和持続力を達成するのに週に３〜５回の注入を必要とする他のものまで、さまざまであってよい。
【０００５】
ＯＡに関係した疼痛および構造的変性に取り組むため、ＯＡ関節を治療する改善された方法および組成物、特に、１つまたは複数のＧＡＧと組み合わせられたＨＡを用いて関節を治療する、改善された方法および組成物、に対する必要性が残っている。
【０００６】
〔発明の概要〕
本発明は、概して、関節の病気、例えば変形性関節症および／またはそれに関係する疼痛を治療する組成物ならびに方法を提供する。一実施形態では、関節を治療するキットを提供し、このキットは、ヒアルロン酸（「ＨＡ」）を含む第１の成分と、凍結乾燥グリコサミノグリカン（「ＧＡＧ」）を含む第２の成分と、第１および第２の成分の混合物を注入する注射器と、を含む。さまざまなＧＡＧを使用することができるが、一実施形態では、ＧＡＧは、コンドロイチン硫酸を含む。このキットは、いくつかの実施形態では凍結乾燥され得る、グルコサミンなどの第３の成分も含んでよい。
【０００７】
これらの成分の組成は、さまざまであってよい。一実施形態では、第１および第２の成分を組み合わせて混合物が形成されると、第１および第２の成分は、重量で約１：０．００５〜１：１００の範囲の、第１の成分対第２の成分の割合で、混合物内に存在する。他の態様では、ヒアルロン酸を凍結乾燥させてよい。例示的な一実施形態では、ヒアルロン酸は、約１．６６１×１０−１８ｇ〜６．６４２×１０−１８ｇ（約１００万ダルトン（ＭＤａ）〜４ＭＤａ）の範囲の分子量、少なくとも約５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも約７ｍｇ／ｍＬの濃度を有する。このキットは、第１および第２の成分を可溶化するのに有効な流体を含む第３の成分も含んでよい。その流体は、例えば、水、食塩水、および／または緩衝液であってよい。
【０００８】
注射器はさまざまな構成を有することができ、一実施形態では、注射器は、第１の成分を収容する第１のチャンバと、第２の成分を収容する第２の容器と、第１および第２の成分を混合するため第２の成分を第１のチャンバ内に注入するように構成されたプランジャーと、を有する。別の実施形態では、第２の成分は、容器内部に入れられてよく、注射器は、第１の成分を収容する第１のチャンバと、その容器を注射器に取り外し可能に連結するコネクタと、を含んでよく、注射器の第１のチャンバ内部にスライド可能に配されたプランジャーが、第１および第２の成分を混合するように、第１の成分を容器に注入することができる。
【０００９】
他の態様では、関節を治療する方法が提供され、この方法は、混合物を形成するために、ヒアルロン酸を含む第１の成分を、凍結乾燥グリコサミノグリカンを含む第２の成分と組み合わせることと、その混合物を関節に注入することと、を含む。グリコサミノグリカンは、例えばコンドロイチン硫酸であってよい。キットはまた、グルコサミンなどの第３の成分を含んでよい。ある態様では、存在する場合には、グルコサミンは凍結乾燥されてよい。成分を組み合わせると、混合物の粘度は、組み合わせる前のヒアルロン酸の粘度より低くなる。別の実施形態では、ヒアルロン酸は凍結乾燥され、第１および第２の成分は、混合物を形成するために第１および第２の成分を組み合わせる前、または組み合わせている間に、可溶化される。第１および第２の成分は、例えばバイアル内で組み合わせられて、注射器内に引き込まれることができ、この注射器は、混合物を関節に注入するのに使用され得る。例示的な実施形態では、混合物の形成後、例えば、混合物の形成から約３０分以内に、第１および第２の成分を注射器内に引き込む。別の実施形態では、第１の成分は、注射器の第１のチャンバ内部に入れられ、第２の成分は、注射器の第２のチャンバ内部に入れられ、第１および第２の成分を組み合わせることは、第１の成分を第２のチャンバ内へ注入することを含む。さらに別の実施形態では、第１および第２の成分を組み合わせることは、第１の成分が入った容器を、第２の成分が入った注射器に連結することと、第２の成分を注射器から容器内に注入することと、を含む。
【００１０】
第１の成分は、さまざまな濃度および分子量を有してよいが、一実施形態では、濃度は、少なくとも約５ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは少なくとも約７ｍｇ／ｍＬであり、分子量は、約１．６６１×１０−１８ｇ〜６．６４２×１０−１８ｇ（約１ＭＤａ〜４ＭＤａ）の範囲である。例示的な実施形態では、第１および第２の成分は、混合物中に約１：０．００５〜１：１００の割合で存在する。
【００１１】
添付図面は、前述の特徴、利点、および目的が明確になり、詳細に理解され得るように、本明細書に含まれている。これらの図面は、明細書の一部を形成する。しかしながら、添付図面は、例示的な実施形態を示しており、範囲を限定すると考えられるべきではないことに注意されたい。
【００１２】
〔発明の詳細な説明〕
概して、本発明は、変形性関節症および／またはそれに関わる疼痛などの関節の病気を治療する組成物および方法を提供する。組成物および方法は、第１の成分、すなわちヒアルロン酸（「ＨＡ」）を、ＨＡの粘度を少なくとも一時的に低減するのに有効な、凍結乾燥した第２の成分と組み合わせて利用する。例示的な実施形態では、第２の成分は、１つまたは複数のグリコサミノグリカン（「ＧＡＧ」）、例えば、ＣＳ４および／またはＣＳ６を含むコンドロイチン硫酸（「ＣＳ」）、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、およびケラタン硫酸、である。組成物は、グルコサミン（「ＧｌｃＮ」）などの、他の関節用サプリメントをオプションとして含み得る。
【００１３】
凍結乾燥ＧＡＧの使用には、ＨＡの粘度を少なくとも一時的に低減する効果があり、そのため、凍結乾燥ＧＡＧとＨＡとから形成した組成物は、ＨＡ単独の粘度より（少なくとも一時的に）著しく低い粘度を有することが、分かっている。高分子量および高濃度でＨＡを使用することが望ましいが、ＨＡの粘度は、分子量および濃度が増大するにつれて著しく増大する。その結果、ＨＡは、典型的には、低い分子量および濃度で使用されて、術中の混合を可能にするか、あるいは、ＨＡは製造中に混合される。使用目的の時点より前、例えば製造時にＨＡを混合することにより、ＨＡ組成物の安定性および貯蔵寿命に関する問題が生じ得る。凍結乾燥ＧＡＧがＨＡの粘度を少なくとも一時的に低減するのに有効であるという発見により、高い分子量および濃度のＨＡを使用することができるようになり、したがって、ＨＡをＧＡＧと術中に、すなわち、手術直前または手術中に混合することができ、それにより、組成物の安定性および貯蔵寿命の問題がなくなる。この粘度の低減は、ボルテックスミキサー（vortexer）、ミキサー、もしくはスパチュラなどの機械的補助器具を使用せずに、混合を行うのに十分である。したがって、ＨＡとＣＳとを組み合わせる製剤を作るために無菌性を損ない得る（compromise）特定の器具または攪拌器に対する必要性がある。
【００１４】
第１の成分
第１の成分ＨＡは、さまざまな処方を有することができ、さまざまな濃度および分子量で供給され得る。用語「ヒアルロン酸」、「ヒアルロナン」、および「ＨＡ」は、本明細書では互換可能に使用され、ヒアルロン酸またはヒアルロン酸の塩、中でも、例えばナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、およびカルシウム塩、を指す。これらの用語は、自然のヒアルロン酸だけでなく、他の微量元素を有するヒアルロン酸、もしくは他の元素を有するさまざまな組成物中のヒアルロン酸も含むことも意図されている。用語「ヒアルロン酸」、「ヒアルロナン」、および「ＨＡ」は、ＨＡの化学誘導体、もしくはポリマー誘導体、もしくは架橋誘導体を含む。ＨＡに行われ得る化学修飾の例には、ＨＡの４つの反応基、すなわちアセトアミド、カルボキシル、ヒドロキシル、および還元末端、との物質の任意の反応が含まれる。本出願で使用されるＨＡは、自然製剤、合成製剤、またはそれらの組み合わせを含むことが意図されている。ＨＡは、液体もしくは固体製剤で供給されてよく、ＨＡは、純正液体形態であるか、または様々な濃度で溶媒中にあってよい。
【００１５】
ＨＡは、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）であり、具体的には、ＨＡは、交互のグルクロン酸およびＮ-アセチルグルコサミン単位で作られた、直鎖多糖類である。ＨＡは、コラーゲンに付着した軟骨の細胞外基質にも見られる粘弾性物質である。特に、ＨＡは、関節軟骨の弾性特性を与える凝集プロテオグリカンの重要な構成成分である。ＨＡは、関節を保護する軟骨を強くかつ可撓性に保つのに役立つだけでなく、関節を潤滑する滑液の供給増大にも役立つ。ＨＡの異常は、結合組織障害において、共通のテーマ（common thread）である。したがって、ＨＡは、結合組織障害の防止、治療、またはその外科的修復の補助のために、使用され得る。
【００１６】
ＨＡは、さまざまな分子量で、本発明の組成物および方法に使用され得る。ＨＡはポリマー分子（polymeric molecule）であるので、ＨＡ成分は、さまざまな範囲の分子量を呈することができ、ＨＡのほとんどの平均モーダル分子量製剤（almost any average of modal molecular weight formulation of HA）を、本発明の組成物および方法で使用することができ、これには、低分子量（「ＬＷＭ」）ヒアルロナン（約８．３０３×１０−１９〜１．１６２×１０−１８ｇ（約５００〜７００キロダルトン（ｋＤａ））、中間分子量（「ＭＭＷ」）ヒアルロナン（１．１６２×１０−１８〜１．６６１×１０−１８ｇ（７００〜１０００ｋＤａ））、および高分子量（「ＨＭＷ」）ヒアルロナン（１．６６１×１０−１８〜６．６４２×１０−１８ｇ（１００万〜４００万ダルトン（ＭＤａ）））が含まれる。ある例示的な実施形態では、ＨＡは、少なくとも約８．３０３×１０−１９ｇ（約５００ｋＤａ）の分子量を有し、さらに好ましくは、ＨＡは、少なくとも約１．６６１×１０−１８ｇ（約１ＭＤａ）の分子量を有する高分子量（「ＨＷＭ」）ＨＡである。分子量は、例えば、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００ｋＤａまたはそれ以上、またはその範囲内で導き出せる任意の範囲であってよい。化学修飾されたＨＡは、前述したのとかなり異なる分子量を有し得ることが予測される。架橋されたＨＡは、前述したものよりもはるかに高い分子量を有し得る。それにもかかわらず、これらの物質は、好ましくは、製剤中で非架橋のＨＡまたはわずかに架橋されたＨＡと組み合わされる場合、本発明でも適用可能である。
【００１７】
混合物中に存在するＨＡの濃度もさまざまであってよいが、例示的な実施形態では、ＨＡは、薬剤的に有効な量で供給される。例示的な実施形態では、ＨＡは、少なくとも約５ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは少なくとも約７ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは少なくとも約１５ｍｇ／ｍＬの濃度を有し、いくつかの実施形態では、濃度は、少なくとも約２０ｍｇ／ｍＬであってよい。ＨＡの適切な濃度には、約５ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、７ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、９ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１１ｍｇ／ｍｇ、１２ｍｇ／ｍＬ、１３ｍｇ／ｍＬ、１４ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、１６ｍｇ／ｍＬ、１７ｍｇ／ｍＬ、１８ｍｇ／ｍＬ、１９ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、２１ｍｇ／ｍＬ、２２ｍｇ／ｍＬ、２３ｍｇ／ｍＬ、２４ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、２６ｍｇ／ｍＬ、２７ｍｇ／ｍＬ、２８ｍｇ／ｍＬ、２９ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、３１ｍｇ／ｍＬ、３２ｍｇ／ｍＬ、３３ｍｇ／ｍＬ、３４ｍｇ／ｍＬ、３５ｍｇ／ｍＬ、３６ｍｇ／ｍＬ、３７ｍｇ／ｍＬ、３８ｍｇ／ｍＬ、３９ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、４１ｍｇ／ｍＬ、４２ｍｇ／ｍＬ、４３ｍｇ／ｍＬ、４４ｍｇ／ｍＬ、４５ｍｇ／ｍＬ、４６ｍｇ／ｍＬ、４７ｍｇ／ｍＬ、４８ｍｇ／ｍＬ、４９ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、５１ｍｇ／ｍＬ、５２ｍｇ／ｍＬ、５３ｍｇ／ｍＬ、５４ｍｇ／ｍＬ、５５ｍｇ／ｍＬ、５６ｍｇ／ｍＬ、５７ｍｇ／ｍＬ、５８ｍｇ／ｍＬ、５９ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、またはそれ以上、またはその範囲内で導き出せる任意の範囲が含まれる。
【００１８】
一実施形態では、第１の成分は、高い分子量（例えば、１．６６１×１０−１８ｇ〜６．６４２×１０−１８ｇ（１〜４ＭＤａ））、および約７〜４０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度を有するＨＡを含む。そのような１つの製品は、Anika Therapeutics, Inc.（Bedford, MA）により製造される、Orthovisc（登録商標）である。Orthovisc（登録商標）は、ヒアルロナンの、無菌の非発熱性で透明な粘弾性溶液である。Orthovisc（登録商標）は、生理食塩水に溶解され、１５ｍｇ／ｍＬの公称濃度を有する、高分子量（１．６６１×１０−１８〜４．８１６×１０−１８ｇ（１．０〜２．９ＭＤａ））で超高純度の天然ヒアルロナンのみからなる。Orthovisc（登録商標）は、細菌発酵により単離される。当業者は、ＨＭＷのＨＡを、ShiseidoおよびLifecoreなどのいくつかの供給源から得ることができることを理解するであろう。これらの特徴を有する、米国におけるＨＡ製品の別の例は、Euflexxa（登録商標）である。
【００１９】
第２の成分
本発明の方法および組成物に使用される第２の成分も、さまざまな構成を有してよいが、例示的な実施形態では、第２の成分は、凍結乾燥グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）である。用語「グリコサミノグリカン」または「ＧＡＧ」は、典型的には、ヘパリン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、およびそれらのそれぞれの誘導体を含む、硫酸ムコ多糖類のファミリーを、互換的に指す。
【００２０】
グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）は、反復二糖類単位（repeating disaccharide unit）を含む長い直鎖多糖類（long unbranched polysaccharides）である。二糖類単位は、２つの修飾された糖、Ｎ-アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）もしくはＮ-アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）のいずれか、およびグルクロン酸もしくはイズロン酸などのウロン酸を含有する。ＧＡＧは、非常にマイナスに帯電した分子で、混合物に高い粘度を与える、拡張された立体構造（extended conformation）を有する。ＧＡＧは、主に、細胞の表面上、または細胞外基質（ＥＣＭ）内、に位置する。ＧＡＧの高い粘度により低い圧縮性が達成され、これにより、これらの分子は、関節の潤滑流体にとって理想的なものとなる。したがって、ＧＡＧは、炎症過程を鈍化させるのに役立つことができる。同時に、それらの剛性により、細胞に構造的完全性がもたらされ、また、細胞間の通路がもたらされて、細胞移動が可能となる。さらに、ＣＳなどのＧＡＧは、滑液内で見られており、関節の健康において役割を果たし得る。したがって、ＨＡと同時にＣＳを送達できる療法を有するのは理にかなっている。ＣＳはＨＡの効力を高め得ると考えられる。しかしながら、われわれは、ＣＳ存在下でのＨＡが経時的に分解し得ることを観察した。したがって、この分解が起きるのを防ぐために、ＨＡは使用されるまで冷蔵保存される必要がある。しかしながら、ほとんどの診療所および病院は、これらのタイプの製品を冷蔵庫に保存する容量を有していないことが分かっているので、ＨＡおよびＧＡＧを室温で保存する能力を保持しながら、ＨＡおよびＧＡＧを組み合わせることができる製品を提供する方法を見つける必要があった。
【００２１】
製剤の安定性を増大させる１つの方法は、注入直前または注入時に希釈剤で再懸濁され得る凍結乾燥製品として、製品を提供することである。例えば、凍結乾燥ＧＡＧは、注入直前または注入時にＨＡゲルで再懸濁するように提供され得る。残念ながら、高分子量および／または高濃度のＨＡは、非常に粘性である。この高い粘度であっても、外科医は、製剤を関節内に送達することができる。これは、ＨＡ、特に非架橋ＨＡは、ずり速度（shear rate）の増大につれて粘度が低下するためである。このずり減粘と呼ばれる現象は、ＨＡが針を通って押された場合に生じる。ＨＡはずり減粘するか（shear thins）または粘度が低減し、このことは、患者の関節への注入を容易にするのを助ける。ＨＡが機械力を受けていない場合、粘度は高いままであり、機械補助もしくは混合システムなしでＨＡに別の活性物質（active）を溶解または混合することは困難になる。
【００２２】
ＨＡをＧＡＧ、特に凍結乾燥ＧＡＧと組み合わせた場合、ＧＡＧは、いったん溶解すると、混合を起こすことができるよう十分に、ＨＡの粘度を少なくとも一時的に低減させ得ることが、分かっている。液体ＧＡＧ製剤に対する凍結乾燥ＧＡＧ製剤の利点は、より高い濃度でＨＡ成分を使用できることである。液体ＧＡＧを、ＨＡと組み合わせることができるが、液体ＧＡＧとＨＡとのこのような混合物は、より低い濃度のＨＡをもたらす。臨床環境で疼痛緩和の持続力をもたらすには、より高い濃度のＨＡが望ましいと考えられる。さまざまなＧＡＧを使用することができるが、特定の例示的な実施形態では、凍結乾燥ＧＡＧは、硫酸処理され、さらに具体的には、ＣＳ４および／またはＣＳ６を含むコンドロイチン硫酸（ＣＳ）、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、およびケラタン硫酸のうち１つまたは複数である。
【００２３】
ＧＡＧは、さまざまな分子量を有し得るが、特定の例示的な実施形態では、分子量は、約８．３０３×１０−２１〜１．６６１×１０−１８ｇ（約５〜１，０００ｋＤａ）の範囲、さらに好ましくは約９．９６３×１０−２１〜８．３０３×１０−１９ｇ（約６〜５００ｋＤａ）の範囲、さらに好ましくは約１．１６２×１０−２０〜４．９８２×１０−１９ｇ（約７〜３００ｋＤａ）の範囲、さらに好ましくは約１．３２８×１０−２０〜３．３２１×１０−１９ｇ（約８〜２００ｋＤａ）の範囲、さらに好ましくは約１．４９４×１０−２０〜１．６６１×１０−１９ｇ（約９〜１００ｋＤａ）の範囲、最も好ましくは約１．６６１×１０−２０〜１．３２８×１０−１９ｇ（約１０〜８０ｋＤａ）の範囲である。他の実施形態では、ＧＡＧ断片の分子量は、約８．３０３×１０−２１ｇ（約５ｋＤａ）より低く、さらに好ましくは約４．９８２×１０−２１ｇ（約３ｋＤａ）より低い。
【００２４】
混合物中に存在するＧＡＧの濃度もさまざまであってよいが、例示的な実施形態では、ＧＡＧは、薬剤的に有効な量で供給される。例示的な実施形態では、ＧＡＧは、少なくとも約０．１ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは少なくとも約２ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは少なくとも約５ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは少なくとも約７ｍｇ／ｍＬの濃度を有する。ＧＡＧの適切な濃度には、約５ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、７ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、９ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１１ｍｇ／ｍｇ、１２ｍｇ／ｍＬ、１３ｍｇ／ｍＬ、１４ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、１６ｍｇ／ｍＬ、１７ｍｇ／ｍＬ、１８ｍｇ／ｍＬ、１９ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、２１ｍｇ／ｍＬ、２２ｍｇ／ｍＬ、２３ｍｇ／ｍＬ、２４ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、２６ｍｇ／ｍＬ、２７ｍｇ／ｍＬ、２８ｍｇ／ｍＬ、２９ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、３１ｍｇ／ｍＬ、３２ｍｇ／ｍＬ、３３ｍｇ／ｍＬ、３４ｍｇ／ｍＬ、３５ｍｇ／ｍＬ、３６ｍｇ／ｍＬ、３７ｍｇ／ｍＬ、３８ｍｇ／ｍＬ、３９ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、４１ｍｇ／ｍＬ、４２ｍｇ／ｍＬ、４３ｍｇ／ｍＬ、４４ｍｇ／ｍＬ、４５ｍｇ／ｍＬ、４６ｍｇ／ｍＬ、４７ｍｇ／ｍＬ、４８ｍｇ／ｍＬ、４９ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、５１ｍｇ／ｍＬ、５２ｍｇ／ｍＬ、５３ｍｇ／ｍＬ、５４ｍｇ／ｍＬ、５５ｍｇ／ｍＬ、５６ｍｇ／ｍＬ、５７ｍｇ／ｍＬ、５８ｍｇ／ｍＬ、５９ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、またはそれ以上、またはこの範囲内で導き出せる任意の範囲が含まれる。
【００２５】
軟骨の必須成分であるコンドロイチン硫酸（ＣＳ）は、交互β（１，３）およびβ（１，４）結合により連結された硫酸Ｄ-グルクロン酸および／もしくは非硫酸Ｄ-グルクロン酸（ＧｌｃＡ）ならびにＮ-アセチル-Ｄ-ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）残渣の交互配列で構成される。これらの化合物はそれぞれ、主に約４０〜１００回の二糖類単位の反復のみからなるポリマー構造を有する。ＣＳは、ＧＡＧ成分に関して前述したように、さまざまな分子量および濃度で使用され得るが、例示的な実施形態では、ＣＳは、約１．１６１×１０−１７〜１．３２８×１０−１６ｇ（約１０，０００〜８０，０００ｋＤａ）の範囲の分子量、および約０．１〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度を有する。ＣＳは、ウシまたはネズミ（marine）の供給源から単離され得る。コンドロイチン鎖は、１００超の個々の糖を有してよく、それらはそれぞれ、さまざまな位置および量で硫酸処理され得る。コンドロイチン-４硫酸、またＮ-アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）糖の４位炭素（carbon 4）は、ウシおよびブタの鼻および気管の軟骨で見られる。これは、これらの動物の骨、肉、血液、皮膚、臍帯、および尿でも見られる。コンドロイチン-６硫酸、またＧａｌＮＡｃ糖の６位炭素（carbon 6）は、これらの動物の皮膚、臍帯、および心臓弁から単離されている。コンドロイチン-６硫酸は、コンドロイチン-４硫酸と同じ組成を有するが、わずかに異なる物理特性を有する。コンドロイチン硫酸は、コラーゲンの結合に関係し、また、水分保持に直接関わる。これらは両方とも、治癒過程を助ける特性である。用語「コンドロイチン硫酸」、「ＣＳ」、「コンドロイチン」、「コンドロイチン硫酸（chondroitin sulfuric acid）」、および「コンスリド（chonsurid）」は、本明細書で互換的に使用され、本出願全体にわたり、化学的誘導体または異性体の誘導体または架橋誘導体を包含することを、当業者は認識するであろう。
【００２６】
コンドロイチン硫酸Ｂとも呼ばれるデルマタン硫酸（ＤＳ）は、主に、β１，４もしくは１，３結合で連結されたＬ-イズロン酸とＮ-アセチル-Ｄ-ガラクトサミンとの二硫酸化および／または三硫酸化二糖類単位から作られるが、反復単位の一部が、硫酸化Ｌ-イズロン酸もしくはＤ-グルクロン酸をウロン酸として含有するか、または非硫酸化Ｎ-アセチルガラクトサミンもしくは４，６-二硫酸化Ｎ-アセチルガラクトサミンを、Ｎ-アセチルガラクトサミン-４-硫酸の代わりに含有する場合もある。ＤＳは、ＧａｌＮＡｃの存在によりコンドロイチン硫酸と定義される。ＤＳ中にイズロン酸（ＩｄｏＡ）が存在することにより、ＤＳがコンドロイチン硫酸-Ａ（４-Ｏ-硫酸化）およびコンドロイチン硫酸-Ｃ(６-Ｏ-硫酸化）と区別され、ＤＳが、やはりこの残渣を含有するヘパリンおよびＨＳになぞらえられる。デルマタン硫酸は経口摂取された場合に身体に吸収されると考えられる。ＤＳの分子量および濃度は、ＧＡＧ成分に関して前述したようにさまざまであってよいが、例示的な実施形態では、分子量は、約１．６６１×１０−２０〜１．３２８×１０−１９ｇ（約１０〜８０ｋＤａ）の範囲であり、濃度は、約０．１〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲である。細菌発酵されるため、制御され得る分子量を有するＨＡとは異なり、デルマタン硫酸は、動物組織から単離され、断片を含有し得ることを、当業者は認識するであろう。したがって、デルマタン硫酸の分子量、およびデルマタン硫酸に含有される任意の断片は、著しく異なっていてよい。用語「デルマタン硫酸」、「ＤＳ」、および「デルマタン」は、本明細書で互換的に使用され、デルマタン硫酸の硫酸化誘導体、デルマタン硫酸ベンゼトニウム塩、デルマタン硫酸ベンゼトニウム塩の過硫酸化誘導体、およびデルマタン硫酸ナトリウム塩も含むことも、当業者は認識するであろう。
【００２７】
ヘパリンおよびヘパラン硫酸（ＨＳ）は、Ｎ-アセチルグルコサミンに連結されたグルクロン酸（ＧｌｃＡ）で構成される。これらは、ウロン酸およびアミノ糖を含有する、α１−４結合二糖類反復単位で構成される。ヘパラン硫酸プロテオグリカンは、基底膜の不可欠な部分である。ＨＡは、６．６４２×１０−１９ｇ（４００ｋＤａ）ほどの分子量の大きな生体分子であり、ヘパラン硫酸鎖に共有結合したコアタンパク質で構成される。多糖類鎖の数、およびコアタンパク質の大きさは、供給源に応じてさまざまであってよい。ヘパラン硫酸プロテオグリカンは、糖部分によって線維芽細胞増殖因子、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、およびＶＥＧＦレセプターに結合し、マトリライシン（ＭＭＰ−７）および他のマトリックスメタロプロテイナーゼのドッキング分子として作用し、細胞増殖および分化において重要な役割を果たす、多機能分子である。ヘパラン硫酸プロテオグリカンはまた、ラミニン、フィブロネクチン、ＩＶ型コラーゲン、および線維芽細胞増殖因子（塩基性）（FGF-basic）を含む細胞外基質に見られるさまざまな分子に結合することによって、細胞付着を促進する。ＨＳの分子量および濃度は、ＧＡＧ成分に関して前述したようにさまざまであってよいが、例示的な実施形態では、分子量は、約４．９８２×１０−２１〜４．９８２×１０−２０ｇ（約３〜３０ｋＤａ）（組織から単離された場合）の範囲であり、濃度は、約０．１〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲である。
【００２８】
ケラタン硫酸、またケラト硫酸（ＫＳ）は、非常にマイナスに帯電しており、硝子軟骨、線維軟骨および弾性軟骨の細胞外基質中の最も豊富なプロテオグリカンであるアグリカンで主として見られる。ＫＳは、二糖類反復単位、-４ＧｌｃＮＡｃβ１３Ｇａｌβ１-で構成される。硫酸化は、ガラクトース（Ｇａｌ）もしくはＧｌｃＮＡｃのいずれかまたは両方の炭素位６（Ｃ６）で起きる。特定のＫＳ型は、３つの領域：連鎖領域（alinkage region）（その１つの末端で、ＫＳ鎖がコアタンパク質に連結される）、反復二糖類単位、およびタンパク質連鎖領域に対してＫＳ鎖の反対側の末端で発生する、鎖キャッピング領域（chain capping region）で構成される。ＫＳの分子量および濃度は、ＧＡＧ成分に関して前述したようにさまざまであってよいが、例示的な実施形態では、分子量は、約８．３０３×１０−２１〜１．６６１×１０−２０ｇ（約５〜１０ｋＤａ）（組織から単離された場合）の範囲であり、濃度は、約１〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲である。
【００２９】
凍結乾燥ＧＡＧが特に好適であるが、液体ＧＡＧも、ＨＡの粘度を少なくとも一時的に低減するのに使用され得ることを、当業者は認識するであろう。例えば、ＣＳは、粉末形態で入手され、水などの溶媒と混合されて、溶液を形成することができる。この溶液は、ＨＡと組み合わせられて、ＨＡ単独の場合と比較して粘度が低減した混合物を形成することができる。ＨＡの粘度を低減するのに有効であるが、結果として得られる混合物は、水の存在により濃度が低くなっている。したがって、液体の非凍結乾燥ＧＡＧを本発明で使用することができるが、例示的な実施形態では、ＧＡＧは、高濃度でのＨＡの使用を可能にするよう、凍結乾燥される。
【００３０】
凍結乾燥
本発明の組成物および方法に存在する成分のうち任意の１つまたは複数は、当技術分野で既知のさまざまな技術を用いて凍結乾燥され得る。凍結乾燥は、典型的には壊れやすい材料を保存するのに使用される脱水プロセスであり、材料を凍結し、その後、周囲圧力を下げ、十分な熱を加えて材料中の凍結水を固相から気相へ直接昇華させることによって、機能する。当技術分野で既知の標準的な凍結乾燥技術を使用して、成分のうち任意の１つまたは複数を凍結乾燥させることができる。例示的な実施形態では、最低でも第２の成分、すなわち１つまたは複数のＧＡＧを凍結乾燥させる。
【００３１】
凍結乾燥前に、さまざまな溶媒を使用して、凍結乾燥すべき成分を含有する水性混合物を形成することができる。例示的な実施形態では、水性混合物は、水を成分のうち１つまたは複数と組み合わせることにより準備される。その成分は、混合物中に、さまざまな量で、例えば約１〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲、さらに好ましくは約５０ｍｇ／ｍＬで存在することができる。例示的な実施形態では、組成物は、凍結乾燥前に０．２μｍフィルターなどのフィルターを用いて殺菌される。使用され得る１つの濾過技術は、無菌濾過である。
【００３２】
一実施形態では、以下のサイクルを使用して成分を凍結乾燥させることができる：
凍結：    １５分で周囲温度から５℃に。
１００分間５℃に保つ。
５０分で−４５℃まで下げる。
１８０分間−４５℃に保つ。
一次乾燥：６．６７Ｐａ（５０ｍＴｏｒｒ）の設定圧力。
１７５分で−１５℃まで上げる（Shelf Up）。
２３００分間−１５℃に保つ。
二次乾燥：１０Ｐａ（７５ｍＴｏｒｒ）の設定圧力。
２００分で２５℃まで上げる（Shelf Up）。
９００分間保つ。
サイクル終了：〜９．７３３×１０４Ｐａ（７３０Ｔｏｒｒ）まで窒素で埋め戻す（backfill）。
キャップ形成（Capping）およびクリンプ。
【００３３】
緩衝剤を加えることで、凍結乾燥製剤中のＧＡＧの溶解度および安定性が改善され得る。当技術分野で既知の生体適合性緩衝剤、例えばグリシン；酢酸のナトリウム塩、カリウム塩、もしくはカルシウム塩；クエン酸のナトリウム塩、カリウム塩、もしくはカルシウム塩；乳酸のナトリウム塩、カリウム塩、もしくはカルシウム塩；第一リン酸（mono-basic phosphate）、第二リン酸（di-basic phosphate）、第三リン酸（tri-basic phosphate）およびこれらの混合物を含む、リン酸のナトリウム塩もしくはカリウム塩を、使用することができる。緩衝剤は、充填剤として機能するように組成物に添加されたグリシンをさらに有してよい。
【００３４】
他の関節用サプリメント
本発明の成分および方法は、治療効果を高めるよう、追加の成分または関節用サプリメントを含むこともできる。例えば、グルコサミン（Ｃ６Ｈ１３ＮＯ５）（「ＧｌｃＮ」）は、ヒアルロナンの産生ならびにプロテオグリカンに必要な両方の反応を与えることにより、滑液の主要成分の合成を高めることができる。ＧｌｃＮは、４つのヒドロキシル基とアミン基とを有するアミノ糖であり、糖化タンパク質および脂質の生化学合成における、顕著な前駆体である。ＧｌｃＮは、栄養機能およびエフェクター機能を有する、自然発生分子である。例えば、ＧｌｃＮは、幹細胞成長および間葉系幹細胞の分化と適合性があり、かつこれらを促進して、軟骨細胞を形成する。ＧｌｃＮは、一般的には、軟骨の成長および発達など、組織発達および修復において役割を有し得る。一実施形態では、ＧｌｃＮは、ＣＳと共に凍結乾燥され得る。グルコサミンの塩形態は、液相において、限られた安定性を有し得る。さらに、ＧｌｃＮのＨＣｌ塩は、いったん組み合わされたＨＡを分解させるよう十分にｐＨを下げることができる。このような理由から、成分の安定性を保持するためには、凍結乾燥形態のＧｌｃＮを、注入前にＨＡゲルにより可溶化させることが、有利である。
【００３５】
ＧｌｃＮの濃度はさまざまであってよい。適切な局所濃度は、少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬ、約９ｍｇ／ｍＬ、約８ｍｇ／ｍＬ、約７ｍｇ／ｍＬ、約６ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、４．５ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、３．５ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、約２．９ｍｇ／ｍＬ、約２．８ｍｇ／ｍＬ、約２．７ｍｇ／ｍＬ、約２．６ｍｇ／ｍＬ、約２．５ｍｇ／ｍＬ、約２．４ｍｇ／ｍＬ、約２．３ｍｇ／ｍＬ、約２．２ｍｇ／ｍＬ、約２．１ｍｇ／ｍＬ、約２．０ｍｇ／ｍＬ、約１．９ｍｇ／ｍＬ、約１．８ｍｇ／ｍＬ、約１．７ｍｇ／ｍＬ、約１．６ｍｇ／ｍＬ、約１．５ｍｇ／ｍＬ、約１．４ｍｇ／ｍＬ、約１．３ｍｇ／ｍＬ、約１．２ｍｇ／ｍＬ、約１．１ｍｇ／ｍＬ、約１．０ｍｇ／ｍＬ、約０．９ｍｇ／ｍＬ、約０．８ｍｇ／ｍＬ、約０．７ｍｇ／ｍＬ、約０．６ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬなどであってよい。当業者は、薬剤学分野で既知の方法を実践するＧｌｃＮの適切な局所濃度を決定でき、その決定は、所望のＧｌｃＮ濃度を得るために目的のＧｌｃＮ組成物の性質および組成を左右するであろう。
【００３６】
本発明の組成物および方法は、例えば、アミノ酸、タンパク質、核酸、緩衝剤、界面活性剤、およびこれらの混合物を含むさまざまな他の関節治療もしくは賦形剤を含み得ることを当業者は認識するであろう。ステロイド、抗炎症剤、非ステロイド性抗炎症剤、鎮痛剤、細胞、安定剤、抗生物質、抗菌剤、抗炎症剤、成長因子、成長因子断片、小分子創傷治癒刺激薬、ホルモン、サイトカイン、ペプチド、抗体、酵素、単離細胞、血小板、免疫抑制剤、核酸、鎮痛剤、細胞型、ウィルス、ウィルス粒子、およびこれらの組み合わせ。
【００３７】
組成物
第１および第２の成分、ならびに任意の追加成分を組み合わせて、組織内に注入され得る組成物を形成することができる。前述のように、成分のうち１つまたは複数、好ましくは少なくとも第２の成分（ＧＡＧ）を凍結乾燥させ、それにより、固体とする。全成分を凍結乾燥させた場合、それらの成分を、１つまたは複数の容器内に供給し、次に、水、食塩水、緩衝剤、または他の溶媒と再構築することができる。凍結乾燥ＧＡＧとの凍結乾燥ＨＡもしくは固体のＨＡの可溶化により、ＨＡの可溶化を速くすることができる。成分のうち１つまたは複数が液体で、成分のうち１つまたは複数が固体である場合、固体成分は、第１の容器、または容器の第１のチャンバの中に供給されてよく、液体成分は、第２の容器、または容器の第２のチャンバの中に供給されてよい。固体成分は、液体成分によって、または希釈剤により、可溶化され得る。いったん成分が完全に可溶化されたら、組成物は、ＨＡ単独の粘度と比較して著しく低減された粘度を少なくとも一時的に示すので、注射器を使用して組成物を組織に注入することができる。
【００３８】
一実施形態では、第２の成分は、凍結乾燥され、第１の成分は、水性溶液中にある。これらの成分は、別個の容器または別個のチャンバの中に供給され、手術の直前、または手術中に、凍結乾燥した第２の成分を第１の成分で再構成する。特に、ＨＡは、液体形態で供給されてよく、凍結乾燥ＧＡＧをＨＡと組み合わせることができる。ＨＡ中でいったん完全に可溶化されたら、ＨＡの粘度は、少なくとも一時的に著しく低減され、２つの成分の混合を可能にし、混合物の注入を容易にする。あるいは、凍結乾燥した第２の成分を、水、食塩水、または他の溶媒と再構成し、その後、ＨＡと組み合わせて、注入可能な混合物を形成することができる。
【００３９】
別の実施形態では、第１および第２の成分の双方を凍結乾燥し、固形で供給する。これらの成分を別個の容器またはチャンバに供給してよく、あるいは、単一の容器またはチャンバに供給してもよい。これらの成分を、水、食塩水、または他の溶媒と再構成して、注入可能な混合物を形成することができる。凍結乾燥した第２の成分、例えば１つまたは複数のＧＡＧは、混合物の粘度を少なくとも一時的に低減する効果を有する。
【００４０】
例示的な実施形態では、成分は、手術中、すなわち手術直前または手術の間に組み合わせられるように構成される。組み合わせられると、成分は、結果として得られる、すぐに使える組成物または混合物を形成でき、これは、さまざまな量で組成物中に存在する各成分を有している。すぐに使える組成物の各成分の量はさまざまであってよいが、例示的な実施形態では、第２の成分、例えば１つまたは複数のＧＡＧが、第１の成分、例えばＨＡの粘度を低減するのに十分な量で存在する。例えば、第１の成分、例えばＨＡ、および第２の成分、例えばＧＡＧは、第１の成分対第２の成分の割合が約１：０．００１〜１：２００の範囲で、一部の実施形態では約１：０．００５〜１：１００で、混合されてよい。したがって、すぐに使える組成物中の第１の成分の、結果として得られる濃度は、全組成物の約０．６重量％〜４重量％以上の範囲であってよく、すぐに使える組成物中の第２の成分の、結果として得られる濃度は、約０．００１％〜１０％の範囲であってよい。さらに好ましくは、第１の成分は、全組成物の約０．６重量％、１重量％、１．５重量％、２重量％、２．５重量％、３重量％、３．５重量％、４重量％以上の濃度で、すぐに使える組成物中に存在してよく、第２の成分は、全組成物の約０．００１重量％、０．０１重量％、０．１重量％、１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％以上の濃度で、すぐに使える組成物中に存在してよい。例示的な実施形態では、開示する組成物中に存在するＨＡの量は、全組成物の約１．５〜２．５重量％であり、開示する組成物中に存在するＧＡＧの量は、全組成物の約０．００１〜１０重量％である。
【００４１】
成分のうち１つまたは複数を可溶化するのに使用され得る他の溶媒には、例えば、食塩水もしくは他の塩溶液、緩衝溶液、例えばリン酸緩衝生理食塩水、ヒスチジン、乳酸塩、琥珀酸塩、グリシン、およびグルタミン酸塩、デキストロース、グリセロール、水、ならびにこれらの組み合わせが含まれる。組成物は、生理学的に相溶性の他の成分、例えば分散媒、抗菌剤、および抗真菌薬、等張剤、および吸収遅延薬なども含んでよい。等張剤は、例えば、組成物中の、デキストロースなどの糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムなどの塩を含む。組成物は、組成物の貯蔵寿命または有効性を高める、湿潤剤または乳化剤、防腐剤または緩衝液などの補助物質を少量含むこともできる。
【００４２】
成分および／または、結果として得られる組成物は、当技術分野で既知のさまざまな技術を使用して、使用前に殺菌され得る。無菌の注入可能な混合物は、治療的に有効もしくは有益な量の活性化合物を、必要に応じて、１つの成分もしくは成分の組み合わせを有する適切な溶媒に組み込み、その後、無菌濾過して、無菌製剤を生じることにより、準備され得る。一般的に、塩基性分散媒体および任意の必要な他の成分を含有する無菌ビヒクルに、ＨＡなどの化合物を組み込むことによって、分散物が準備される。無菌の注入可能な混合物の準備のための無菌粉末の場合、一部の方法は、組成物および先に無菌濾過されたその混合物からの任意の所望の追加成分の粉末を生じる、真空乾燥成分およびフリーズドライ成分の調製を含み得る。
【００４３】
使用方法
使用中、第１および第２の成分を手術中に組み合わせ、その後、例えば注入により、治療部位に送達することができる。一実施形態では、第１および第２の成分を前述のように組み合わせて、混合物または組成物を形成することができる。凍結乾燥した第２の成分、例えば１つまたは複数のＧＡＧを、第１の成分、例えばＨＡと組み合わせることは、ＨＡ混合物の粘度の一時的な低減を少なくとも一時的に誘発することができ、さらに扱いやすくなり、組み合わせたＨＡ／ＧＡＧ混合物を注射器内に入れ、患者に注入することができる。ある実施形態では、組成物を組織に注入する前に凍結乾燥成分が完全に可溶化するのに、しばらくの間（an amount of time）待つことが必要となり得る。凍結乾燥した第２の成分が第１の成分、または溶媒に可溶化するのにかかる時間は、使用する具体的な第２の成分、ならびに成分の分子量および濃度によって異なってよい。概して、第２の成分が第１の成分に完全に可溶化するか、または溶媒で再構成されるのに１０秒〜３０分かかり得る。
【００４４】
いったん凍結乾燥成分が完全に可溶化し、第１の成分、例えばＨＡの粘度が著しく低減したら、粘度は、しばらくの間、低減したままであり、この時間もやはり、使用する具体的な材料、ならびに組成物中の成分の分子量および濃度によって異なり得る。ある実施形態では、いったん第２の成分が完全に可溶化したら、組成物を組織に注入するのに望ましい時間は、約１〜６０分、さらに好ましくは１〜３０分の範囲であってよく、さらに好ましくは、この時間は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０分またはそれ以上、またはこの範囲内の任意の変数のいずれかであってよい。
【００４５】
送達システム
前述したように、本発明の組成物および方法に使用される成分は、好ましくは手術中に組み合わせられるように構成される。したがって、これらの成分は、キットの一部として供給され得る。一実施形態では、キットは、ＨＡなどの第１の成分、および，少なくとも１つのＧＡＧなどの第２の成分を含むことができる。キットは、前述のように追加成分を含むこともできる。その成分は、バイアルまたは注射器などのハウジングの、単一の容器もしくはチャンバ、または別々の容器もしくはチャンバの中に収容され得る。
【００４６】
例示的な実施形態では、成分は、単一の混合および送達装置に供給される。単一送達能力（single delivery capability）の利点には、薬剤投与の速度および容易さが増大すること；接続部の数を減らすことにより院内感染のリスクが減少すること；薬剤投与もしくは順序を誤るリスクが低下すること；ならびに、投与前に組み合わせを必要とする組成物がさらに迅速に送達されることが含まれる。
【００４７】
図１は、二重チャンバ注射器１０の形態をした混合および送達システムの一実施形態を示す。図示のとおり、二重チャンバ注射器１０は、概して、弁１６により分離された近位チャンバ１２および遠位チャンバ１４を有するハウジングを含む。プランジャー１８が、近位チャンバ１２内部にスライド可能に配されており、近位チャンバ１２内部に存在する流体を遠位チャンバ１４に注入することにより、成分を混合するように構成されている。一実施形態では、第１の成分、例えば液体ＨＡが、近位チャンバ１２内に存在してよく、第２の成分、例えば凍結乾燥ＧＡＧが遠位チャンバ１４内に存在してよい。プランジャー１８は、近位チャンバ１２の中を前進して、第２の成分、例えば１つまたは複数の凍結乾燥したＧＡＧを収容する遠位チャンバ１４内に、第１の成分、例えば液体ＨＡを注入することができる。別の実施形態では、近位チャンバ１２は、水もしくは食塩水などの溶媒を収容することができ、遠位チャンバ１４は、固形で成分のすべてを収容することができる。例えば、遠位チャンバ１４は、凍結乾燥ＨＡもしくは固形のＨＡ、および１つまたは複数の凍結乾燥ＧＡＧを収容することができる。プランジャー１８は、近位チャンバ１２の中を前進して、遠位チャンバ１４に溶媒を注入することができ、それにより、遠位チャンバ１４で成分を可溶化する。いったん全成分が遠位チャンバ１４内で組み合わせられ、任意の固体が完全に可溶化されたら、混合物は、例えば針を二重チャンバ注射器の遠位端部に取り付けることによって、組織に送達されることができる。
【００４８】
図２は、MixJect（登録商標）の商品名で商業的に販売されている混合および送達システム２０の別の実施形態を示す。この実施形態では、システムは、注射器２４とバイアル２６との間に連結された流体制御組立体２２を含む。注射器２４は、液体ＨＡもしくは溶媒などの液体を収容することができる第１のチャンバ２４ａを画定し、バイアルは、１つまたは複数の凍結乾燥ＧＡＧなどの固体を収容することができる第２のチャンバ２６ａを画定している。注射器２４を通してプランジャー２８を配備することにより、制御システムを通してバイアル２６内へと液体が注入され、バイアルでは、固体が液体により可溶化される。いったん成分が完全に可溶化されたら、バイアル２６をひっくり返してよく、プランジャー２８を後退させて、混合物を注射器２４のチャンバ２４ａ内へ戻すことができる。次に、バイアル２６をシステムから取り外してよく、混合物は、注射器から針２９を通して組織へ注入され得る。
【００４９】
当技術分野で既知の任意の二重チャンバシステムを使用してよいこと、ならびにそれらのチャンバは、単一のチャンバになるよう混ざり合う（mix into）別々の注射器プランジャーを備えた隣り合うチャンバ、または単一のプランジャーを備えた線形チャンバであってよいことを、当業者は認識するであろう。
【００５０】
予め満たされた注射器は、送達可能な正確な用量の所望の化合物および希釈剤を収容することができる。非限定的な例として、予め満たされた注射器は、約０．１ｍＬ、０．２ｍＬ、０．３ｍＬ、０．４ｍＬ、０．５ｍＬ、０．６ｍＬ、０．７ｍＬ、０．８ｍＬ、０．９ｍＬ、１．０ｍＬ、１．５ｍＬ、２ｍＬ、２．５ｍＬ、３ｍＬ、３．５ｍＬ、４ｍＬ、４．５ｍＬ、５ｍＬ、５．５ｍＬ、６ｍＬ、６．５ｍＬ、７ｍＬ、７．５ｍＬ、８ｍＬ、８．５ｍＬ、９ｍＬ、９．５ｍＬ、１０ｍＬまたはそれ以上、またはそれらの任意の派生物（derivative）の容量を収容し得る。
【００５１】
治療
この方法および組成物において有用なＨＡならびにＧＡＧは、生体内適用では、独立して、または一緒に、注射によって非経口的に、または時間をかけて漸進的な灌流によって、投与され得る。投与は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、関節内、腔内（intracavity）、または経皮的であってよい。組成物および方法が関節障害治療において活性を与え得る、症状または疾患の例には、感染症、外傷、アレルギー、代謝障害などにより引き起こされる関節炎、慢性関節リウマチなどのリウマチ（rheumatoids）、および全身性エリテマトーデス；痛風を伴う関節疾患、変形性関節症などの関節症、関節内障、関節水腫、肩こり、腰痛などが含まれる。組成物の使用、または治療される疾患のタイプに応じて効果が変化することで、薬剤は、所望の予防的および緩和的効果を与え、または、生体に重篤な影響を与えずに関節の腫脹、疼痛、炎症、および破壊（destroying）に対する治療効果さえ与えることができる。関節障害を治療する組成物を使用して、関節障害の発症を防ぎ、関節障害が発症した後には症状を改善、軽減、および治療することができる。
【００５２】
治療方法は、関節などの標的エリアに組成物を直接注入することを含み得る。注入は、毎日、毎週、１週間に数回、隔月、１ヶ月に数回、毎月のような頻度で行われてよく、または、症状の軽減をもたらすよう必要に応じた頻度で行われてもよい。関節内での使用については、関節の大きさおよび状態の重症度に応じて、関節当たり約０．１〜約５００ｍｇを注入することができる。所定の関節へのその後の注入の頻度は、その関節で症状が再発したときまで間隔をあける。例示的には、人間における組成物の投薬レベルは、膝で、関節当たり約０．１〜約５００ｍｇの注入；肩で、関節当たり約０．１〜約５００ｍｇの注入；中手骨もしくは近位指骨で、関節当たり約０．１〜約１００ｍｇの注入；肘で、関節当たり約０．１〜約３００ｍｇの注入であってよい。
【００５３】
しかしながら、任意の特定の患者に対する特定の投薬レベルは、使用される特定の化合物の活性、年齢、体重、全体的な健康、性別、食事、投与時間、投与経路、排出率、薬剤の組み合わせ、および治療を受けている特定の疾患の重症度を含む、さまざまな要因によって決まることが理解されるであろう。
【００５４】
一実施形態では、病状は、変形性関節症（ＯＡ）であり、組成物は、例えば、膝関節、肩関節、側頭下顎関節または手根中手関節、肘関節、股関節、手首関節、足首関節、および脊椎の腰部関節突起間関節（椎間関節）などの関節腔に投与される。関節内補充療法は、膝または他の罹患関節（afflicted joints）内に、数週間にわたって投与される単回または複数回の関節内注入により達成され得る。例えば、膝ＯＡのヒト患者が、１つの膝関節当たり約２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍＬまたはそれ以上の注入を、１、２、または３回受けることができる。他の関節については、投与容量は、関節の大きさに基づいて調節されてよい。
【００５５】
別の例示的な実施形態では、第１および第２の成分を有するキットを提供する。第１の成分は、２ｍＬのOrthovisc（登録商標）を含んでよく、これは、３０ｍｇのヒアルロナン、１８ｍｇの塩化ナトリウム、および最大２．０ｍＬの注射用蒸留水を含んでいる。ＨＡは、約１．６６１×１０−１８〜４．８１６×１０−１８ｇ（約１．０〜２．９ＭＤａ）の範囲の分子量を有する。第２の成分は、０．１〜１００ｍｇ／ｍＬの凍結乾燥ウシ由来ＣＳ（例えばBioiberica（Barcelona, Spain）から供給されたもので、前述のプロトコルを用いて凍結乾燥された）を含むことができる。これら２つの成分は、例えば前述の送達システムを使用して組み合わせられ、凍結乾燥ＣＳを可溶化させることができる。完全な可溶化には約Ｘ分かかり得る。いったん完全に可溶化されたら、混合物の粘度は著しく低下し、混合物を関節内に、例えば膝関節の中に注入することができる。注入は、好ましくは可溶化から５〜３０分以内に行われる。追加の注入は、合計３または４回の注入（total of three of four injections）については、１週間に１回行われてよい。標準的な関節内注入部位の準備、無菌技術、および注意を使用しなければならない。
【００５６】
実験データ
実施例１  凍結乾燥
５０ｍｇ／ｍＬのグルコサミンＨＣｌと５０ｍｇ／ｍＬのコンドロイチン硫酸とを含む混合物を準備し、０．２μｍのフィルターで濾過した。次に、混合物を、１ｍＬ／バイアルで３ｍＬのガラスバイアルに入れ、凍結乾燥した。凍結乾燥した塊（cake）は、固体で白色に見えた。凍結乾燥した各サンプルは、注入のため、水、Orthovisc、または他のＨＡゲルで再構築されることができた。これらのＨＡゲルは、１０〜２０ｍｇ／ｍＬの濃度であり、ＨＡは、ShiseidoおよびLifecoreから供給された。サンプルはまた、ＰＢＳなど他の緩衝液でも再構築され得た。
【００５７】
実施例２  粘度
さまざまな量の異なるＧＡＧを前述のとおり凍結乾燥し、ふわふわした白い塊を形成した。ＧＡＧは、Bioiberica（Barcelona, Spain）により供給されたウシ由来ＣＳ、Sigma-Aldrich（Saint Louis, MO）により供給されたヘパリン、およびSigma-Aldrich（Saint Louis, MO）により供給されたデキストラン硫酸を含む。凍結乾燥ＧＡＧはそれぞれ、約２０．８ｍｍの外径および約４０ｍｍの高さを有する５ｍＬのバイアルに入れられた。４０ｍｇの非凍結乾燥ＧＡＧも、同じ寸法を有する５ｍＬのバイアルに入れられた。Anika Therapeutics（Bedford, MA）により製造された、２ｍＬのOrthovisc（登録商標）を各バイアルに注入し、ＨＡは、ＧＡＧを完全に溶解させた。２ｍＬのOrthovisc（登録商標）のみを含む対照を、同じ寸法を有するバイアルに入れた。
【００５８】
凍結乾燥ＧＡＧを完全に可溶化させるのにかかる時間を、組成物のうちいくつかについて測定し、その結果を以下に述べる。混合物の粘度は、「流速」を判断することにより測定する。本明細書で使用する「流速」とは、バイアルが逆さまにされたときに、各バイアルの中身がバイアルの一端部からバイアルの他端部まで流れるのにかかる時間を指す。結果を以下の表１に示す。流速が１分まで増大するのにかかった時間も計測し、以下の表１に示す。表１に示すすべての結果は、３回の測定値の平均に基づいている。
【表１】
0006005935.tif 000002
【００５９】
表１に示すように、ＨＡ単独のものは、非常に粘性であり、５ｍＬの４０ｍｍ高さのバイアルの一端部から反対端部まで移動する２ｍＬのＨＡについて流速が約２０分である。ベンダーから受領したＧＡＧ粉末、または非凍結ＧＡＧと組み合わせると、低粘度の局所エリアがあった。しかしながら、すべての粉末を完全に可溶化させるのにかかる時間の間に、混合物は、高粘度に戻る。したがって、サンプルを完全に混合しMixjectシステムの注射器に戻す時間がない。一方、凍結乾燥ＧＡＧと組み合わせると、ＨＡは、ＧＡＧを比較的迅速に溶解させることができ、粘度は、少なくとも一時的に著しく低減し、混合物は、バイアルの一端部からバイアルの反対端部まで数秒で移動することができた。ヘパリンおよびデキストランを除いてほとんどの場合、粘度は、少なくとも約１５分間、著しく低減したレベルのままであった。
【００６０】
実施例３  粘度
Bioiberica（Barcelona, Spain）から入手した４０ｍｇの非凍結乾燥ＣＳ粉末を、５００μＬの水と混合した。次に、この溶液を、Anika Therapeutics（Bedford, MA）により製造された、２ｍＬのOrthovisc（登録商標）と組み合わせた。穏やかに混合してから約１〜２分後、成分が完全に混合された。流速は４５秒と測定された。
【００６１】
５００μＬの水を、Anika Therapeutics（Bedford, MA）により製造された、２ｍＬのOrthovisc（登録商標）と組み合わせた。穏やかに混合してから約３分後、流速は２６秒と測定された。
【００６２】
液体ＣＳとＨＡとの組み合わせは、水とＨＡとの組み合わせに比べ、流速の低減を示した。したがって、この実験は、ＨＡの粘度に対するＣＳの影響を証明するものである。
【００６３】
実施例４  可溶化
４０ｍｇの非凍結乾燥ＣＳ粉末を、Bioiberica（Barcelona, Spain）から入手し、Anika Therapeutics（Bedford, MA）により製造された、２ｍＬのOrthovisc（登録商標）と混合した。穏やかに混合してから約１５〜２０分後、ＣＳはＨＡ中で完全に可溶化された。粘度が低減した局所エリアは、可溶化中に観察されたが、完全な可溶化前には、ＨＡゲルは、高粘度状態に戻り、注入のため中身が別の注射器に移動することが妨げられた。
【００６４】
同様に、Bioiberica（Barcelona, Spain）から入手した４０ｍｇの凍結乾燥ＣＳ粉末を、Anika Therapeutics（Bedford, MA）により製造された、２ｍＬのOrthovisc（登録商標）と混合した。穏やかに混合してから約５分後、凍結乾燥ＣＳはＨＡ中で完全に可溶化され、ＨＡの粘度は、見かけ上は低減した。低減した粘度は、十分な時間にわたり保たれ、注入のため混合物を注射器に引き込むことができた。
【００６５】
用語法
「治療的に有効な量」または「有効な量」は、薬理学的作用を達成する薬剤の量である。用語「治療的に有効な量」には、例えば、予防上有効な量が含まれる。「有効な量」は、過度の副作用なしで、所望の薬理学的作用または治療上の改善を達成するのに有効な量である。例えば、有効な量とは、操作性を増大するか、または患者が関節に対する負荷に耐える能力を増大するか、または、疼痛を軽減するか、または患者が通常の活動に戻るのを可能にするか、または１つもしくは複数の関節の骨および軟骨における修復を刺激するか、または関節の歪み、疼痛、腫脹、炎症もしくは硬直を軽減する、量を指す。薬剤の有効な量は、特定の患者および疾患レベルに応じて当業者により選択される。「有効な量」または「治療的に有効な量」は、消化管運動改善薬などの治療薬の代謝の差異、および／または患者の年齢、体重、全身状態、治療している病状、治療している病状の重症度、および処方医師の判断により、患者ごとに異なってよいことが理解される。
【００６６】
「治療する」または「治療」とは、骨もしくは軟骨の障害に関わる障害もしくは疾患の任意の治療、例えば、その障害もしくは疾患の素因となり得るが、まだその障害もしくは疾患を有しているとは診断されていない患者においてその障害もしくは疾患の発症を妨げること；その障害もしくは疾患を阻止する、例えば、その障害もしくは疾患の発生もしくは進行を停止するか、その障害もしくは疾患を軽減するか、その障害もしくは疾患の退行を引き起こすか、その障害もしくは疾患により生じる状態を軽減するか、またはその障害もしくは疾患の症状を止めること、を指す。したがって、本明細書で使用される用語「治療する」は、用語「妨げる」と同義的に使用される。
【００６７】
「同時投与される（co-administered）」は、同じ製剤における、または投与のため１つの製剤になるよう組み合わせられる２つの異なる製剤における、同時投与を意味する。一実施形態では、ＨＡおよびＧＡＧは、同じ製剤における送達により同時投与される。
【００６８】
本明細書で使用される用語「患者」は、本発明の組成物および方法から利益を得ることができる、動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒト、ウマ、および犬を指す。本発明の方法から利益を得ることができる動物のタイプに制限はない。患者は、ヒトであるか、ヒトでない動物であるかにかかわらず、個体、患者、動物、宿主、またはレシピエントと呼ばれ得る。本発明の方法は、人間医学、獣医学、ならびに一般的な家畜または野生動物の畜産において適用を有する。
【００６９】
当業者は、前述した実施形態に基づいて本発明のさらなる特徴および利点を認識するであろう。したがって、本発明は、請求項により示されることを除いて、具体的に図示および説明したことによって制限されない。本明細書で引用したすべての刊行物および参考文献は、参照により全体として本明細書に明白に組み込まれる。
【００７０】
〔実施の態様〕
（１）関節を治療するキットにおいて、
ヒアルロン酸を含む第１の成分と、
凍結乾燥グリコサミノグリカンを含む第２の成分と、
前記第１および第２の成分の混合物を注入する注射器と、
を含む、キット。
（２）  実施態様１に記載のキットにおいて、
前記グリコサミノグリカンは、コンドロイチン硫酸を含む、キット。
（３）  実施態様１に記載のキットにおいて、
グルコサミンを含む第３の成分、
をさらに含む、キット。
（４）  実施態様３に記載のキットにおいて、
前記グルコサミンは、凍結乾燥される、キット。
（５）  実施態様１に記載のキットにおいて、
前記第１および第２の成分が組み合わせられて混合物を形成すると、前記第１および第２の成分は、約１：０．００５〜１：１００の範囲の、第１の成分対第２の成分の割合で、前記混合物中に存在する、キット。
【００７１】
（６）  実施態様１に記載のキットにおいて、
前記注射器は、前記第１の成分を収容する第１のチャンバ、および前記第２の成分を収容する第２の容器を有し、
前記注射器は、前記第１および第２の成分を混合するために前記第２の成分を前記第１のチャンバに注入するように構成されたプランジャーを含む、キット。
（７）  実施態様１に記載のキットにおいて、
前記第２の成分は、容器内に入れられ、前記注射器は、前記第１の成分を収容する第１のチャンバ、および前記容器を前記注射器に取り外し可能に連結するコネクタを含み、前記注射器の前記第１のチャンバ内部にスライド可能に配されたプランジャーが、前記第１および第２の成分を混合するように前記第１の成分を前記容器に注入することができる、キット。
（８）  実施態様１に記載のキットにおいて、
前記ヒアルロン酸は、凍結乾燥される、キット。
（９）  実施態様１に記載のキットにおいて、
前記ヒアルロン酸は、約１．６６１×１０−１８ｇ〜６．６４２×１０−１８ｇ（約１ＭＤａ〜４ＭＤａ）の範囲の分子量を有する、キット。
（１０）  実施態様１に記載のキットにおいて、
前記ヒアルロン酸は、少なくとも約７ｍｇ／ｍＬの濃度を有する、キット。
【００７２】
（１１）  実施態様１に記載のキットにおいて、
前記第１および第２の成分を可溶化させるように構成された流体を含む第３の成分、
をさらに含む、キット。
（１２）  実施態様１１に記載のキットにおいて、
前記第３の成分は、水、食塩水、および緩衝液からなる群から選択される、キット。
（１３）  関節を治療する方法において、
混合物を形成するよう、ヒアルロン酸を含む第１の成分を、凍結乾燥グリコサミノグリカンを含む第２の成分と組み合わせることと、
前記混合物を関節に注入することと、
を含む、方法。
（１４）  実施態様１３に記載の方法において、
前記グリコサミノグリカンは、コンドロイチン硫酸を含む、方法。
（１５）  実施態様１３に記載の方法において、
グルコサミンを含む第３の成分、
をさらに含む、方法。
【００７３】
（１６）  実施態様１５に記載の方法において、
前記グルコサミンは、凍結乾燥される、方法。
（１７）  実施態様１３に記載の方法において、
前記混合物の粘度は、組み合わせる前には、前記ヒアルロン酸の粘度より低い、方法。
（１８）  実施態様１３に記載の方法において、
前記ヒアルロン酸は、凍結乾燥され、
前記第１および第２の成分は、混合物を形成するよう前記第１および第２の成分を組み合わせる前、または組み合わせる間に可溶化される、方法。
（１９）  実施態様１３に記載の方法において、
前記第１および第２の成分は、バイアル内で組み合わせられ、注射器に引き込まれ、
前記注射器は、前記混合物を関節に注入するのに使用される、方法。
（２０）  実施態様１９に記載の方法において、
前記第１および第２の成分は、前記混合物の形成から３０分以内に前記注射器に引き込まれる、方法。
【００７４】
（２１）  実施態様１３に記載の方法において、
前記第１の成分は、注射器の第１のチャンバ内に入れられ、前記第２の成分は、前記注射器の第２のチャンバ内に入れられ、
前記第１および第２の成分を組み合わせることは、前記第１の成分を前記第２のチャンバに注入することを含む、方法。
（２２）  実施態様１３に記載の方法において、
前記第１および第２の成分を組み合わせることは、前記第１の成分が入った容器を、前記第２の成分が入った注射器に連結することと、前記第２の成分を前記注射器から前記容器へ注入することと、を含む、方法。
（２３）  実施態様１３に記載の方法において、
前記第１の成分は、約１．６６１×１０−１８ｇ〜６．６４２×１０−１８ｇ（約１ＭＤａ〜４ＭＤａ）の範囲の分子量を有する、方法。
（２４）  実施態様１３に記載の方法において、
前記第１の成分は、少なくとも約７ｍｇ／ｍＬの濃度を有する、方法。
（２５）  実施態様１３に記載の方法において、
前記第１および第２の成分は、約１：０．００５〜１：１００の割合で前記混合物中に存在する、方法。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】本発明の組成物および方法と共に使用される混合および送達システムの一実施形態の斜視図である。
【図２】本発明の組成物および方法と共に使用される混合および送達システムの別の実施形態の斜視図である。
【図１】
0006005935.tif 000003
【図２】
0006005935.tif 000004