(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２０のアミノ酸配列からなるヒトｃ−Ｋｉｔの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に特異的に結合する抗体であって、前記抗体は重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、前記ＨＣＶＲはＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含み、前記ＬＣＶＲはＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ１はＳＹＷＩＧ（配列番号１）であり、ＣＤＲＨ２はＩＩＹＰＧＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧ（配列番号２）であり、ＣＤＲＨ３はＨＧＲＧＹＮＧＹＥＧＡＦＤＩ（配列番号３）であり、ＣＤＲＬ１はＲＡＳＱＧＩＳＳＡＬＡ（配列番号４）であり、ＣＤＲＬ２はＤＡＳＳＬＥＳ（配列番号５）であり、ＣＤＲＬ３はＣＱＱＦＮＳＹＰＬＴ（配列番号６）である、抗体。
【請求項２】
前記ＬＣＶＲアミノ酸配列は配列番号１３であり、前記ＨＣＶＲアミノ酸配列は配列番号７である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖アミノ酸配列は配列番号９であり、前記軽鎖アミノ酸配列は配列番号１５である、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
２本の重鎖および２本の軽鎖を含み、前記重鎖アミノ酸配列の各々は配列番号９であり、前記軽鎖アミノ酸配列の各々は配列番号１５である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体の抗原結合断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトｃ−Ｋｉｔの細胞外ドメインに特異的に結合する抗体、これらの抗体を含む医薬組成物ならびに腫瘍、癌および／または細胞増殖性疾患などのｃ−Ｋｉｔの発現および／または活性に関連する疾患または障害を治療する際のそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｃ−Ｋｉｔは、例えば幹細胞因子（ＳＣＦ）受容体またはＣＤ−１１７としても知られている受容体チロシンキナーゼである。ｃ−Ｋｉｔおよびそのリガンド、ＳＣＦは、造血、メラニン形成、赤血球生成、精子形成、発癌、線維症、炎症、肥満細胞分化および増殖ならびに免疫学的過程を含む様々な生物学的機能を媒介する。
【０００３】
グリベック（ＧＬＥＥＶＥＣ）（登録商標）（メシル酸イマチニブ）およびスーテント（ＳＵＴＥＮＴ）（登録商標）（リンゴ酸スニチニブ）が、ｃ−Ｋｉｔを含む多重受容体チロシンキナーゼを阻害する、承認され、市販されている薬学的低分子製品である。しかしながら、現在、このような治療は一般に、それらの承認された適用において制限された利点を与えることが明確になっている。なぜなら、腫瘍細胞は多くの場合、変異的に媒介される薬剤耐性を有するかまたは急速に生じるからである。
【０００４】
ヒトｃ−Ｋｉｔに対する抗体は以前に報告されている。しかしながら、公知のｃ−Ｋｉｔ抗体は癌の治療の使用に望ましいレベルに満たない。なぜなら、それらは、腫瘍細胞中でｃ−Ｋｉｔアゴニスト活性、例えばｃ−Ｋｉｔリン酸化を刺激するｃ−Ｋｉｔ内在化を阻害するか、または治療的抗癌剤としてそれらの効果的な使用に最適である他の属性を欠くからである。例えば、特許文献１は、ヒト化ｃ−Ｋｉｔ抗体ならびに主に肥満細胞、造血、メラニン形成および精子形成に対する抗体の効果に関するそれらに関連するデータを開示している。特に、特許文献１に記載されている抗体は、「ＳＣＦ媒介性ｃ−Ｋｉｔリン酸化およびＭＯ７ｅ細胞中の内在化を強く阻害する」ことが報告されていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００７／１２７３１７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明は、ヒトｃ−Ｋｉｔの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を特異的に標的とする代替のモノクローナル抗体を提供する。本発明はまた、腫瘍細胞中でｃ−Ｋｉｔアゴニスト活性、例えばｃ−Ｋｉｔリン酸化を誘導せずに原形質膜に結合したｃ−Ｋｉｔの内在化および／または分解を誘導できるヒトｃ−ＫｉｔのＥＣＤを特異的に標的とし、および／または治療的抗癌剤としてのそれらの効果的な使用に有益である他の臨床属性（例えば改良された溶解性、インビトロもしくはインビボでの安定性、または他の薬物速度論的特性）を有するモノクローナル抗体を提供する。このような抗体は、癌を治療するのにより効果的であり、有益には、変異により媒介される薬剤耐性の獲得を遅延もしくは予防し、および／または公知の療法に抵抗性のある癌を治療すると予想される。したがって、本明細書に記載されるｃ−Ｋｉｔ抗体は当該技術分野における重要な必要性を満たす。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一態様は、配列番号２０のアミノ酸配列からなるヒトｃ−Ｋｉｔの細胞外ドメインに特異的に結合する抗体であって、その抗体は重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、ＨＣＶＲはＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲはＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ１はＳＹＷＩＧ（配列番号１）であり、ＣＤＲＨ２はＩＩＹＰＧＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧ（配列番号２）であり、ＣＤＲＨ３はＨＧＲＧＹＮＧＹＥＧＡＦＤＩ（配列番号３）であり、ＣＤＲＬ１はＲＡＳＱＧＩＳＳＡＬＡ（配列番号４）であり、ＣＤＲＬ２はＤＡＳＳＬＥＳ（配列番号５）であり、ＣＤＲＬ３はＣＱＱＦＮＳＹＰＬＴ（配列番号６）である、抗体に関する。
【０００８】
本発明の別の態様は、配列番号２０のアミノ酸配列からなるヒトｃ−Ｋｉｔの細胞外ドメインに特異的に結合する抗体であって、その抗体はＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含み、ＨＣＶＲはＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲはＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ１はＳＹＷＩＧ（配列番号１）であり、ＣＤＲＨ２はＩＩＹＰＧＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧ（配列番号２）であり、ＣＤＲＨ３はＨＧＲＧＹＮＧＹＥＧＡＦＤＩ（配列番号３）であり、ＣＤＲＬ１はＲＡＳＱＧＩＳＳＡＬＡ（配列番号４）であり、ＣＤＲＬ２はＤＡＳＳＬＥＳ（配列番号５）であり、ＣＤＲＬ３はＣＱＱＦＮＳＹＰＬＴ（配列番号６）である、抗体と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを含む、医薬組成物に関する。
【０００９】
一態様において、本発明は、療法に使用するための、配列番号２０のアミノ酸配列からなるヒトｃ−Ｋｉｔの細胞外ドメインに特異的に結合する抗体であって、その抗体はＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含み、ＨＣＶＲはＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲはＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ１はＳＹＷＩＧ（配列番号１）であり、ＣＤＲＨ２はＩＩＹＰＧＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧ（配列番号２）であり、ＣＤＲＨ３はＨＧＲＧＹＮＧＹＥＧＡＦＤＩ（配列番号３）であり、ＣＤＲＬ１はＲＡＳＱＧＩＳＳＡＬＡ（配列番号４）であり、ＣＤＲＬ２はＤＡＳＳＬＥＳ（配列番号５）であり、ＣＤＲＬ３はＣＱＱＦＮＳＹＰＬＴ（配列番号６）である、抗体を提供する。
【００１０】
本発明の別の態様は、癌を治療するのに使用するための、配列番号２０のアミノ酸配列からなるヒトｃ−Ｋｉｔの細胞外ドメインに特異的に結合する抗体であって、その抗体はＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含み、ＨＣＶＲはＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲはＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ１はＳＹＷＩＧ（配列番号１）であり、ＣＤＲＨ２はＩＩＹＰＧＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧ（配列番号２）であり、ＣＤＲＨ３はＨＧＲＧＹＮＧＹＥＧＡＦＤＩ（配列番号３）であり、ＣＤＲＬ１はＲＡＳＱＧＩＳＳＡＬＡ（配列番号４）であり、ＣＤＲＬ２はＤＡＳＳＬＥＳ（配列番号５）であり、ＣＤＲＬ３はＣＱＱＦＮＳＹＰＬＴ（配列番号６）である、抗体を提供する。
【００１１】
本発明の別の態様は、癌、腫瘍および／または細胞増殖障害を治療するための医薬を製造するための、配列番号２０のアミノ酸配列からなるヒトｃ−Ｋｉｔの細胞外ドメインに特異的に結合する抗体であって、その抗体はＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含み、ＨＣＶＲはＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲはＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ１はＳＹＷＩＧ（配列番号１）であり、ＣＤＲＨ２はＩＩＹＰＧＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧ（配列番号２）であり、ＣＤＲＨ３はＨＧＲＧＹＮＧＹＥＧＡＦＤＩ（配列番号３）であり、ＣＤＲＬ１はＲＡＳＱＧＩＳＳＡＬＡ（配列番号４）であり、ＣＤＲＬ２はＤＡＳＳＬＥＳ（配列番号５）であり、ＣＤＲＬ３はＣＱＱＦＮＳＹＰＬＴ（配列番号６）である、抗体の使用を提供する。
【００１２】
本発明の別の態様は、必要とするヒトにおける癌を治療する方法であって、配列番号２０のアミノ酸配列からなるヒトｃ−Ｋｉｔの細胞外ドメインに特異的に結合する治療有効量の抗体を前記ヒトに投与することを含み、その抗体はＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含み、ＨＣＶＲはＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲは、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ１はＳＹＷＩＧ（配列番号１）であり、ＣＤＲＨ２はＩＩＹＰＧＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧ（配列番号２）であり、ＣＤＲＨ３はＨＧＲＧＹＮＧＹＥＧＡＦＤＩ（配列番号３）であり、ＣＤＲＬ１はＲＡＳＱＧＩＳＳＡＬＡ（配列番号４）であり、ＣＤＲＬ２はＤＡＳＳＬＥＳ（配列番号５）であり、ＣＤＲＬ３はＣＱＱＦＮＳＹＰＬＴ（配列番号６）である、方法を提供する。
【００１３】
一態様において、本発明は、必要とするヒトにおける癌を治療する方法であって、治療有効量の少なくとも１種の他の治療剤と併せて、配列番号２０のアミノ酸配列からなるヒトｃ−Ｋｉｔの細胞外ドメインに特異的に結合する治療有効量の抗体を前記ヒトに投与することを含み、その抗体はＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含み、ＨＣＶＲはＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲはＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ１はＳＹＷＩＧ（配列番号１）であり、ＣＤＲＨ２はＩＩＹＰＧＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧ（配列番号２）であり、ＣＤＲＨ３はＨＧＲＧＹＮＧＹＥＧＡＦＤＩ（配列番号３）であり、ＣＤＲＬ１はＲＡＳＱＧＩＳＳＡＬＡ（配列番号４）であり、ＣＤＲＬ２はＤＡＳＳＬＥＳ（配列番号５）であり、ＣＤＲＬ３はＣＱＱＦＮＳＹＰＬＴ（配列番号６）である、方法を提供する。好ましい実施形態において、他の治療剤は抗癌剤である。
【００１４】
本発明の別の態様は、本発明のｃ−Ｋｉｔ抗体をコードする単離された核酸分子、核酸分子を含む発現ベクターおよび核酸分子を含む宿主細胞を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、抗ｃ−Ｋｉｔ  ｍＡｂ、ＣＫ６によるインビトロでの細胞の処理前後に、ヒト腫瘍細胞株、Ｍｏ７ｅおよびＧＩＳＴ８８２の全細胞溶解物中で検出された全ｃ−Ｋｉｔのウェスタンブロットを示す。抗ｃ−Ｋｉｔ  ｍＡｂ  ＣＫ６は、時間依存性様式でヒト腫瘍細胞株により発現されたｃ−Ｋｉｔの分解を劇的に誘導した。
【図２】図２は、抗ｃ−Ｋｉｔ  ｍＡｂ、ＣＫ６を有するおよび有さないヒト腫瘍細胞株、ＧＩＳＴ８８２の全細胞溶解物中で検出された全ｃ−Ｋｉｔのウェスタンブロットを示す。時間依存性様式でＧＩＳＴ８８２ヒト腫瘍細胞により発現されたｃ−Ｋｉｔの分解を顕著に誘導するので、抗ｃ−Ｋｉｔ  ｍＡｂ  ＣＫ６は観測されない。
【図３】図３は、抗ｃ−Ｋｉｔ  ｍＡｂ、ＣＫ６を有するおよび有さない、ヒト腫瘍細胞株、Ｍｏ７ｅの全細胞溶解物中で検出された全ｃ−Ｋｉｔのウェスタンブロットを示す。時間依存性様式でＭｏ７ｅヒト腫瘍細胞株により発現されたｃ−Ｋｉｔの分解を顕著に誘導するので、抗ｃ−Ｋｉｔ  ｍＡｂ  ＣＫ６は観測されない。
【図４】図４は、抗ｃ−Ｋｉｔ  ｍＡｂ、ＣＫ６を有するおよび有さない、ヒト腫瘍細胞株、Ｍａｌｍ−３Ｍの全細胞溶解物中で検出された全ｃ−Ｋｉｔのウェスタンブロットを示す。時間依存性様式でＭａｌｍ−３Ｍヒト腫瘍細胞により発現されたｃ−Ｋｉｔの分解を顕著に誘導するので、抗ｃ−Ｋｉｔ  ｍＡｂ  ＣＫ６は観測されない。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、例えば腫瘍、癌および／または細胞増殖障害などのｃ−Ｋｉｔの発現および／または活性に関連する疾患または障害の治療に有用であるヒトｃ−ＫｉｔのＥＣＤに特異的に結合する抗体を提供する。
【００１７】
本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、他に示さない限り、モノクローナル抗体を指す。「モノクローナル抗体」およびその省略形である「ｍＡｂ」は、例えば任意の真核、原核またはファージクローンを含む、単一コピーまたはクローンに由来する抗体を指すことを意図し、抗体が産生される方法ではない。本明細書で使用する抗体は、配列番号２０のアミノ酸配列からなるヒトｃ−ＫｉｔのＥＣＤに結合する抗原結合部分、例えばＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片またはＦ（ａｂ’）２断片を含むインタクトな抗体（完全または完全長Ｆｃ領域を含む）またはその一部もしくは断片であってもよい。例えば、ｃ−ＫｉｔのＥＣＤに結合でき、本発明に包含される抗体断片としては、限定されないが、インタクトな鎖間ジスルフィド結合を有する（Ｆａｂ’）２などの二価断片、ＬＣＶＲ−ＣＬおよびＨＣＶＲ−ＣＨ１ドメインからなり、（例えばパパイン消化による）重鎖ヒンジ領域を保有しない抗体の断片を指すＦａｂ（断片、抗原結合）などの一価断片、重鎖ヒンジ領域を保有するＦａｂ、（例えばプラスミン消化による）Ｆａｃｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ジスルフィド結合を欠くＦａｂ’、（例えばペプシンまたはプラスミン消化による）ｐＦｃ’、Ｆｄ（例えばペプシン消化、部分的還元および再凝集による）および（例えば分子生物学的技術による；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ２６９−３１５，１９９４を参照のこと）ＦｖまたはｓｃＦｖが挙げられる。抗体断片はまた、配列番号２０のアミノ酸配列からなるヒトｃ−ＫｉｔのＥＣＤに特異的に結合する二重特異性抗体、三重特異性抗体などを含む抗体断片から形成される、例えばドメイン欠失抗体、線形抗体、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、多価単鎖抗体、多特異的抗体を含むと意図される。抗原結合断片または部分が特異的であるかどうかに関わらず、本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、他に示されない限り、このような断片または部分ならびに単鎖形態を含むことが理解される。
【００１８】
軽鎖は１つの可変ドメイン（本明細書でＬＣＶＲと省略する）および／または１つの定常ドメイン（本明細書でＣＬと省略する）を含んでもよい。ヒト抗体の軽鎖（免疫グロブリン）はカッパ（Ｋ）軽鎖またはラムダ（λ）軽鎖のいずれかである。本明細書で使用する場合、発現ＬＣＶＲは、カッパ型軽鎖（ＶＫ）由来またはラムダ型軽鎖（Ｖλ）由来の両方の可変領域を含むことを意図する。重鎖はまた、１つの可変ドメイン（本明細書でＨＣＶＲと省略する）および／または抗体のクラスもしくはアイソタイプに応じて、３もしくは４個の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４；本明細書でまとめてＣＨと省略する）を含んでもよい。ヒトＩｇＧ１は本発明の抗体についての好ましいアイソタイプである。
【００１９】
超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの領域は、フレームワーク（本明細書でＦＲと省略する）と呼ばれる少しの可変領域により支持される、ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲの各々に見出される。アミノ酸は、Ｋａｂａｔの慣例（Ｋａｂａｔら，Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９０：３８２−９３（１９７１）；Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１））に従って特定のＣＤＲ領域またはドメインに割り当てられる。各々のＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは、以下の順序：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端に配置される３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲドメインからなる抗体の部分は設計されたＦｖ（可変断片）であり、抗原結合部位を構成する。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は１本のポリペプチド鎖上にＬＣＶＲドメインおよびＨＣＶＲドメインを含有する抗体断片であり、一方のドメインのＮ末端および他方のドメインのＣ末端はフレキシブルなリンカーにより結合される。
【００２０】
本明細書で使用する場合、「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に対応する可変領域および定常領域を有する抗体を含む（Ｋａｂａｔら，前出に記載されている）。
【００２１】
抗体特異性とは、抗原の特定のエピトープに対する抗体の選択的認識を指す。ｃ−Ｋｉｔに対する本発明の抗体の特異性は親和性および／または結合性に基づいて決定されてもよい。抗体との抗原の解離についての平衡定数（ＫＤ）により表される親和性は、抗原決定基と抗体結合部位との間の結合強度の尺度となる。ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）３０００などの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサが、本明細書に開示される抗体の結合キネティクスおよび親和性を測定するために使用されてもよい。ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）システムはデキストランバイオセンサマトリクス内の相互作用分子のタンパク質濃度の変化を検出するためにＳＰＲの光学特性を利用する。ＫＤ値を含む抗ｃ−Ｋｉｔモノクローナル抗体の結合キネティクスは以下の実施例４に本質的に記載されているようにＳＰＲバイオセンサにより決定され得る。
【００２２】
ｃ−ＫｉｔのＥＣＤに対するｃ−Ｋｉｔ抗体の親和性に関して本明細書で使用する場合、「特異的に結合する」という用語は、他に示さない限り、本明細書に本質的に記載したＳＰＲバイオセンサの使用を含む、当該技術分野において公知の一般的な方法により決定して、約２×１０−１０Ｍ未満、好ましくは約２×１０−１０Ｍから約２×１０−１２ＭのＫＤを意味することを意図する。
【００２３】
本発明の一態様は、配列番号２０のアミノ酸配列からなるヒトｃ−ＫｉｔのＥＣＤに特異的に結合する抗体であって、その抗体はＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含み、ＨＣＶＲはＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲはＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ１はＳＹＷＩＧ（配列番号１）であり、ＣＤＲＨ２はＩＩＹＰＧＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧ（配列番号２）であり、ＣＤＲＨ３はＨＧＲＧＹＮＧＹＥＧＡＦＤＩ（配列番号３）であり、ＣＤＲＬ１はＲＡＳＱＧＩＳＳＡＬＡ（配列番号４）であり、ＣＤＲＬ２はＤＡＳＳＬＥＳ（配列番号５）であり、ＣＤＲＬ３はＣＱＱＦＮＳＹＰＬＴ（配列番号６）である、抗体に関する。一部の実施形態において、本発明の抗体はＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを含み、ＬＣＶＲアミノ酸配列は、ＡＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＳＡＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＳＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＦＮＳＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１３）であり、ＨＣＶＲアミノ酸配列は、ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＡＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＲＦＴＳＹＷＩＧＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＩＩＹＰＧＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧＱＶＴＩＳＡＧＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＨＧＲＧＹＮＧＹＥＧＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ（配列番号７）である。
【００２４】
一部の実施形態において、本発明の抗体は重鎖および軽鎖を含み、重鎖アミノ酸配列は配列番号９であり、軽鎖アミノ酸配列は配列番号１５である。
【００２５】
他の実施形態において、本発明の抗体は２本の重鎖および２本の軽鎖を含み、重鎖アミノ酸配列の各々は配列番号９であり、軽鎖アミノ酸配列の各々は配列番号１５である。
【００２６】
本発明の別の態様は、配列番号２０のアミノ酸配列からなるヒトｃ−ＫｉｔのＥＣＤに特異的に結合する抗体であって、その抗体はＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含み、ＨＣＶＲはＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲはＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ１はＳＹＷＩＧ（配列番号１）であり、ＣＤＲＨ２はＩＩＹＰＧＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧ（配列番号２）であり、ＣＤＲＨ３はＨＧＲＧＹＮＧＹＥＧＡＦＤＩ（配列番号３）であり、ＣＤＲＬ１はＲＡＳＱＧＩＳＳＡＬＡ（配列番号４）であり、ＣＤＲＬ２はＤＡＳＳＬＥＳ（配列番号５）であり、ＣＤＲＬ３はＣＱＱＦＮＳＹＰＬＴ（配列番号６）であり、その抗体は、１）ヒトＳＣＦに結合するヒトｃ−Ｋｉｔの阻害、２）ヒトｃ−Ｋｉｔの完全な拮抗作用、３）ＳＣＦ依存性シグナル伝達経路の阻害、４）ヒトｃ−ＫｉｔのＳＣＦ依存性活性化の阻害、５）ヒトｃ−Ｋｉｔ内在化の誘導、６）ヒトｃ−Ｋｉｔ分解の誘導、７）インビトロでの腫瘍細胞増殖の阻害、８）インビボでの腫瘍細胞増殖の阻害、および９）約２×１０−１０Ｍ未満のＫＤでのヒトｃ−ＫｉｔのＥＣＤへの結合から選択される少なくとも１つの特性を有する、抗体に関する。好ましくは、そのような抗体は１）〜９）から選択される少なくとも２つの特性を有する。より好ましくは、そのような抗体は１）〜９）から選択される少なくとも３つの特性を有する。さらにより好ましくは、そのような抗体は１）〜９）から選択される少なくとも４つの特性を有する。さらにより好ましくは、そのような抗体は１）〜９）から選択される少なくとも５つの特性を有する。最も好ましくは、そのような抗体は１）から９）の特性を有する。
【００２７】
一部の実施形態において、本発明は、２５℃でＳＰＲにより測定した場合、約２×１０−１０Ｍ未満、好ましくは約２×１０−１０Ｍから約２×１０−１２Ｍ、より好ましくは約１００ｐＭから約５ｐＭ、さらにより好ましくは約１００ｐＭから約１０ｐＭ、さらにより好ましくは約７５ｐＭから約２５ｐＭ、さらにより好ましくは約７５ｐＭから約５０ｐＭ、または最も好ましくは約７０ｐＭから約６０ｐＭのＫＤで、配列番号２０のアミノ酸配列からなるヒトｃ−ＫｉｔのＥＣＤに特異的に結合する抗体を提供する。
【００２８】
一部の実施形態において、本発明は、配列番号２０のアミノ酸配列からなるヒトｃ−ＫｉｔのＥＣＤに特異的に結合する抗体であって、ｃ−ＫｉｔのＥＣＤへの抗体の結合はｃ−Ｋｉｔの内在化を誘導する、抗体を提供する。好ましくはｃ−Ｋｉｔ受容体のＥＣＤへの抗体の結合は、約１時間、３７℃にて、約１μｇ／ｍｌの前記抗体での腫瘍細胞の処理後、以下の実施例６に本質的に記載したｃ−Ｋｉｔ内在化のインビトロアッセイにおいてＦＡＣＳにより測定した場合、腫瘍細胞の表面上で発現されたｃ−Ｋｉｔの少なくとも５０％の内在化を誘導する。より好ましくは、ｃ−Ｋｉｔ受容体のＥＣＤへの抗体の結合は、約６時間、３７℃にて、約１μｇ／ｍｌの前記抗体での腫瘍細胞の処理後、以下の実施例６に本質的に記載したｃ−Ｋｉｔ内在化のインビトロアッセイにおいてＦＡＣＳにより測定した場合、腫瘍細胞の表面上で発現されたｃ−Ｋｉｔの少なくとも７５％の内在化を誘導する。
【００２９】
一部の実施形態において、本発明は、配列番号２０のアミノ酸配列からなるヒトｃ−ＫｉｔのＥＣＤに特異的に結合する抗体であって、ｃ−ＫｉｔのＥＣＤへの抗体の結合が、腫瘍細胞により発現された原形質膜に結合したｃ−Ｋｉｔの分解を誘発する、抗体を提供する。好ましくは、ｃ−ＫｉｔのＥＣＤへの抗体の結合は、約１２時間、３７℃にて、約１００ｎｇ／ｍｌの前記抗体での腫瘍細胞の処理後、以下の実施例７に本質的に記載したｃ−Ｋｉｔ分解のインビトロアッセイにより測定した場合、腫瘍細胞により発現された原形質膜に結合したｃ−Ｋｉｔの少なくとも５０％の分解を誘発する。より好ましくは、ｃ−ＫｉｔのＥＣＤへの抗体の結合は、約２４時間、３７℃にて約１００ｎｇ／ｍｌの前記抗体での腫瘍細胞の処理後、以下の実施例７に本質的に記載したｃ−Ｋｉｔ分解のインビトロアッセイにより測定した場合、腫瘍細胞により発現された原形質膜に結合したｃ−Ｋｉｔの少なくとも７５％の分解を誘発する。
【００３０】
一部の実施形態において、本発明は、配列番号２０のアミノ酸配列からなるヒトｃ−ＫｉｔのＥＣＤに特異的に結合する抗体であって、ｃ−ＫｉｔのＥＣＤへの抗体の結合は、インビトロ腫瘍細胞ベースのアッセイにおいてｃ−Ｋｉｔおよび／またはＭＡＰＫのＳＣＦ誘導性リン酸化を阻害する、抗体を提供する。好ましくは、ｃ−Ｋｉｔ抗体は、約１ｎＭ未満、より好ましくは約１ｎＭから約１ｐＭ、さらにより好ましくは約５００ｐＭから約５ｐＭ、さらにより好ましくは約５００ｐＭから約１０ｐＭ、さらにより好ましくは約５００ｐＭから約１００ｐＭ、さらにより好ましくは約５００ｐＭから約２５０ｐＭ、または最も好ましくは約３００ｐＭのＩＣ５０で、インビトロ腫瘍細胞ベースのアッセイにおいてｃ−Ｋｉｔおよび／またはＭＡＰＫのＳＣＦ誘導性リン酸化を阻害する。
【００３１】
一部の実施形態において、本発明は、配列番号２０のアミノ酸配列からなるヒトｃ−ＫｉｔのＥＣＤに特異的に結合する抗体であって、ｃ−ＫｉｔのＥＣＤへの抗体の結合は、以下の実施例１１に本質的に記載したように実施したインビボアッセイにおいて腫瘍細胞増殖を阻害する、抗体を提供する。好ましくは、ｃ−ＫｉｔのＥＣＤへの抗体の結合は、以下の実施例１１に本質的に記載したように実施したインビボアッセイにおいて腫瘍細胞増殖を少なくとも約３０％阻害する。より好ましくは、ｃ−ＫｉｔのＥＣＤへの抗体の結合は、以下の実施例１１に本質的に記載したように実施したインビボアッセイにおいて腫瘍細胞増殖を少なくとも約５０％阻害する。さらにより好ましくは、ｃ−ＫｉｔのＥＣＤへの抗体の結合は、以下の実施例１１に本質的に記載したように実施したインビボアッセイにおいて、白血病、小細胞肺癌、黒色腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、ユーイング肉腫、腎癌、および／もしくは神経芽細胞腫細胞増殖を少なくとも約３０％、またはさらにより好ましくは少なくとも約６０％阻害する。
【００３２】
一態様において、本発明は、高いリガンド依存性またはリガンド依存性ｃ−Ｋｉｔ活性に関連する障害を治療するための方法であって、前記方法は、このような治療を必要とするヒトに、配列番号２０のアミノ酸配列からなるヒトｃ−ＫｉｔのＥＣＤに特異的に結合する有効量の抗体を投与することを含み、その抗体はＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含み、ＨＣＶＲはＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲはＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ１はＳＹＷＩＧ（配列番号１）であり、ＣＤＲＨ２はＩＩＹＰＧＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧ（配列番号２）であり、ＣＤＲＨ３はＨＧＲＧＹＮＧＹＥＧＡＦＤＩ（配列番号３）であり、ＣＤＲＬ１はＲＡＳＱＧＩＳＳＡＬＡ（配列番号４）であり、ＣＤＲＬ２はＤＡＳＳＬＥＳ（配列番号５）であり、ＣＤＲＬ３はＣＱＱＦＮＳＹＰＬＴ（配列番号６）である、方法を提供する。一実施形態において、前記障害は癌である。
【００３３】
「障害」または「疾患」は、本発明の抗体または方法による治療から利益を受ける任意の病態である。これは、慢性および急性障害またはヒトが問題のある障害にかかりやすいそれらの病理学的病態を含む疾患を含む。例えば、本発明の抗体を用いて治療される障害としては、悪性および良性腫瘍；限定されないが、白血病、小細胞肺癌、黒色腫、ＧＩＳＴ、ユーイング肉腫、腎癌、および神経芽細胞腫を含む癌腫、白血病、芽細胞腫および肉腫が挙げられる。好ましくは、本発明の抗体を用いて治療される障害としては、ｃ−Ｋｉｔ依存性悪性および良性腫瘍；限定されないが、ｃ−Ｋｉｔ依存性白血病、小細胞肺癌、黒色腫、ＧＩＳＴ、ユーイング肉腫、腎癌、および神経芽細胞腫を含むｃＫｉｔ依存性癌腫、白血病、芽細胞腫、および肉腫が挙げられる。
【００３４】
本発明の別の態様は、ヒトにおける癌を治療する方法であって、このような治療を必要とする前記ヒトに、本発明の有効量のｃ−Ｋｉｔ抗体を投与することを含み、癌は、白血病、小細胞肺癌、黒色腫、ＧＩＳＴ、ユーイング肉腫、腎癌、および神経芽細胞腫からなる群から選択される、方法に関する。好ましくは、癌はｃ−Ｋｉｔ依存性である。
【００３５】
一態様において、本発明は、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤と共に本発明の１つ以上のｃ−Ｋｉｔ抗体を含む医薬組成物を提供する。
【００３６】
一態様において、本発明は、療法に使用するために本明細書に記載したｃ−Ｋｉｔ抗体を提供する。
【００３７】
一態様において、本発明は、癌の治療に使用するための本明細書に記載したｃ−Ｋｉｔ抗体のいずれかを提供する。
【００３８】
一態様において、本発明は、癌の治療に使用するための本明細書に記載したｃ−Ｋｉｔ抗体のいずれかを提供し、癌は、白血病、小細胞肺癌、黒色腫、ＧＩＳＴ、ユーイング肉腫、腎癌、および神経芽細胞腫からなる群から選択される。好ましくは、癌はｃ−Ｋｉｔ依存性である。
【００３９】
さらなる態様において、本発明は、癌、腫瘍および／または細胞増殖障害を治療するための医薬の製造における本明細書に記載したｃ−Ｋｉｔ抗体の使用を提供する。好ましくは、癌はｃ−Ｋｉｔ依存性である。
【００４０】
一態様において、本発明は、有効量の別の治療剤（抗血管新生剤、別の抗体、化学療法剤、細胞毒性剤、免疫抑制剤、サイトカイン、細胞傷害性放射線治療、コルチコステロイドまたは抗嘔吐剤など）と併せて、本明細書に記載した治療有効量のｃ−Ｋｉｔ抗体の投与を含む方法を提供する。例えば、本明細書に記載したｃ−Ｋｉｔ抗体は、種々の腫瘍性または非腫瘍性病態を治療するために１種以上の異なる抗癌剤および／または抗血管新生剤と併せて使用されてもよい。種々の実施形態において、本発明のｃ−Ｋｉｔ抗体は、別の抗癌剤などの１種以上の他の治療剤との治療開始前、間、実質的に同時または後に投与されてもよい。好ましくは、他の抗癌剤の少なくとも１つは、イマチニブ、スニチニブ、シタラビン（ａｒａＣ）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、シスプラチンおよびエトポシドからなる群から選択される。
【００４１】
本発明の別の態様は、上述のｃ−Ｋｉｔ抗体、核酸分子を含む発現ベクター、および核酸分子を含む宿主細胞のいずれかをコードする単離した核酸分子に関する。本発明は、上述のｃ−Ｋｉｔ抗体のいずれかを精製する方法をさらに提供する。
【００４２】
本発明の別の態様は、配列番号２０のアミノ酸配列からなるヒトｃ−ＫｉｔのＥＣＤに特異的に結合する抗体であって、その抗体はＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含み、ＨＣＶＲはＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲはＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ１はＳＹＷＩＧ（配列番号１）であり、ＣＤＲＨ２はＩＩＹＰＧＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧ（配列番号２）であり、ＣＤＲＨ３はＨＧＲＧＹＮＧＹＥＧＡＦＤＩ（配列番号３）であり、ＣＤＲＬ１はＲＡＳＱＧＩＳＳＡＬＡ（配列番号４）であり、ＣＤＲＬ２はＤＡＳＳＬＥＳ（配列番号５）であり、ＣＤＲＬ３はＣＱＱＦＮＳＹＰＬＴ（配列番号６）であり、抗体の結合が、ｃ−Ｋｉｔ内在化を誘導し、ならびに／あるいはｃ−Ｋｉｔの分解および／またはｃ−Ｋｉｔおよび／もしくはＭＡＰＫの減少したリン酸化を誘導する、抗体に関する。
【００４３】
本発明の別の態様は、配列番号２０のアミノ酸配列からなるヒトｃ−ＫｉｔのＥＣＤに特異的に結合する抗体であって、その抗体はＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含み、ＨＣＶＲはＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲはＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ１はＳＹＷＩＧ（配列番号１）であり、ＣＤＲＨ２はＩＩＹＰＧＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧ（配列番号２）であり、ＣＤＲＨ３はＨＧＲＧＹＮＧＹＥＧＡＦＤＩ（配列番号３）であり、ＣＤＲＬ１はＲＡＳＱＧＩＳＳＡＬＡ（配列番号４）であり、ＣＤＲＬ２はＤＡＳＳＬＥＳ（配列番号５）であり、ＣＤＲＬ３はＣＱＱＦＮＳＹＰＬＴ（配列番号６）であり、抗体の結合はインビトロでの腫瘍細胞増殖を阻害し、および／またはインビボでの腫瘍細胞増殖を減少させる、抗体に関する。
【００４４】
本発明の別の抗体は、配列番号２０のアミノ酸配列からなるヒトｃ−ＫｉｔのＥＣＤに特異的に結合する抗体であって、その抗体はＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含み、ＨＣＶＲはＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲはＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ１はＳＹＷＩＧ（配列番号１）であり、ＣＤＲＨ２はＩＩＹＰＧＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧ（配列番号２）であり、ＣＤＲＨ３はＨＧＲＧＹＮＧＹＥＧＡＦＤＩ（配列番号３）であり、ＣＤＲＬ１はＲＡＳＱＧＩＳＳＡＬＡ（配列番号４）であり、ＣＤＲＬ２はＤＡＳＳＬＥＳ（配列番号５）であり、ＣＤＲＬ３はＣＱＱＦＮＳＹＰＬＴ（配列番号６）であり、抗体の結合が、ｃ−Ｋｉｔの内在化および／または分解を誘導し、ならびに／あるいはｃ−Ｋｉｔおよび／もしくはＭＡＰＫのリン酸化を減少させ、インビトロでの腫瘍細胞増殖を阻害し、および／またはインビボでの腫瘍細胞増殖を減少させる、抗体に関する。
【００４５】
ベクターの形質転換および本発明の抗体の発現のための好ましい宿主細胞は哺乳動物細胞、例えば、ＮＳ０細胞（非分泌性（０）マウス骨髄腫細胞）、２９３、ＳＰ２０およびＣＨＯ細胞ならびにリンパ腫、骨髄腫、またはハイブリドーマ細胞などのリンパ系起源の他の細胞株である。酵母などの他の真核性宿主が代替として使用されてもよい。
【００４６】
ｃ−Ｋｉｔ抗体に関する「単離された」抗体は、その天然環境の成分から同定され、分離され、および／または回収された抗体である。その天然環境の汚染成分は、抗体についての診断または治療的使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク性または非タンパク性溶質が挙げられ得る。好ましい実施形態において、本発明の抗体は、（１）ローリー（Ｌｏｗｒｙ）法により測定して９５重量％超の抗体、最も好ましくは９９重量％超に精製され、（２）スピニングカップシーケネターを用いてＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度に精製され、あるいは（３）クマシーブルーまたは好ましくは銀染色を用いて還元または非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均質となるまで精製される。本発明のｃ−Ｋｉｔ抗体に関連する「単離された」という用語は、抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないので組換え細胞内のインサイチュでの抗体を含んでもよい。本発明のｃ−Ｋｉｔ抗体は、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムによる沈殿、その後の生理食塩水に対する透析、イオン交換クロマトグラフィー、限定されないが、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーを含む親和性または免疫親和性クロマトグラフィー、ならびにゲル濾過またはゾーン電気泳動を含む、当該技術分野において公知の任意の方法により単離または精製されてもよい。
【００４７】
さらに、本発明は、発現配列、プロモーターおよび／またはエンハンサー配列などの対照配列に作動可能に連結される以前に記載したポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを提供する。細菌などの原核細胞系および限定されないが酵母を含む真核細胞系および哺乳動物細胞培養系において抗体ポリペプチドを効果的に合成するための様々な発現ベクターが開発されている。本発明のベクターは、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列のセグメントを含んでもよい。
【００４８】
本発明はまた、以前に記載した組換えベクターを含有する組換え宿主細胞を提供する。本発明の抗体はハイブリドーマ以外の細胞株内で発現されてもよい。本発明に係る抗体をコードする配列を含む核酸が適切な哺乳動物宿主細胞の形質転換に使用されてもよい。
【００４９】
特定の好ましい細胞株は、目的のタンパク質の高レベルの発現、構成的発現および宿主タンパク質由来の最小の汚染物質に基づいて選択される。発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当該技術分野において周知であり、限定されないが、ＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞などの多くの不死化細胞株およびリンパ腫、骨髄腫またはハイブリドーマ細胞などのリンパ系起源の細胞株を含む他のものを含む。
【００５０】
本明細書に記載した有効量のｃ−Ｋｉｔ抗体をヒトに投与することによってヒトにおける腫瘍増殖および／または癌を治療する方法もまた、本発明により提供される。本発明に従って治療される適切な病態はヒトｃ−Ｋｉｔを発現する細胞に関連する。いかなる特定の機構にも束縛されることを意図しないが、本方法は、例えば、腫瘍性増殖がｃ−Ｋｉｔ依存性であるものを含む、癌細胞の増殖の治療を提供する。
【００５１】
本発明の文脈において、「治療」または「治療する」とは、内在する病態または疾患もしくは障害に関連する望ましくない生理学的変化の進行を阻害すること、遅延させること、減少させること、または反転させること、病態の臨床症状を改善させることあるいは病態の臨床症状の出現を防止することを含む治療的処置を指す。有益または望ましい臨床結果としては、限定されないが、症状の軽減、疾患または障害の程度の減衰、疾患または障害の安定化（すなわち疾患または障害が悪化しない）、疾患または障害の進行の先延ばしまたは遅延、疾患または障害の改善または緩和、ならびに検出可能であるか検出不可能であるかに関わらず、疾患または障害の鎮静（部分的であろうと全体であろうと）が挙げられる。治療はまた、治療を受けなかった場合の予想される生存率と比較して延長された生存率を意味する。治療を必要とするヒトは既に疾患を有するヒトである。一実施形態において、本発明は医薬として使用されてもよい。
【００５２】
本発明の方法において、治療有効量の本発明の抗体はそれを必要とするヒトに投与される。さらに、本発明の医薬組成物は治療有効量の本発明のｃ−Ｋｉｔ抗体を含んでもよい。「治療有効量」または「有効量」とは、必要な用量および投与期間で、所望の治療結果を達成するのに有効な量を指す。治療有効量の抗体は、個体の疾患病態、年齢、性別および体重、ならびに個体において所望の反応を誘発する抗体または抗体部分の能力などの要因に応じて変えてもよい。他の要因は、投与、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトか動物かどうか、投与される他の医薬、および処置が予防的か治療的かを含む。治療有効量はまた、治療的に有益な効果が抗体または抗体部分のあらゆる毒性または有害な作用を上回るものである。本明細書に記載したｃ−Ｋｉｔ抗体はヒトへの投与に特に有用であるが、それらは治療目的のために同様に他の哺乳動物に投与されてもよい。
【００５３】
投薬レジメンは最適な所望の反応（例えば治療的または予防的反応）を提供するために調節されてもよい。治療用量は安全性および効果を最適化するために当業者に公知の慣用の方法を使用して滴定されてもよい。投与スケジュールは典型的に、単一ボーラス用量または持続注入から１日当たり複数回投与（例えば４〜６時間毎）の範囲であるか、または治療する医師および患者の病態により示されるような範囲である。投薬量および頻度は患者を治療する医師により決定される。しかしながら、本発明は任意の特定の用量に限定されないことは留意すべきである。
【００５４】
本発明の抗ｃ−Ｋｉｔ抗体は、限定されないが、シタラビン（すなわちａｒａＣ）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、シスプラチンまたはエトポシドを含む、抗腫瘍剤と併せて投与されてもよい。
【００５５】
本発明において、任意の適切な方法または経路が、本発明のｃ−Ｋｉｔ抗体を投与するため、必要に応じて、抗腫瘍剤および／または他の受容体のアンタゴニストを同時投与するために使用されてもよい。本発明の併用療法において、ｃ−Ｋｉｔ抗体は、別の薬剤による治療を開始する前、間、実質的に同時、または後に投与されてもよい。
【００５６】
治療的処置の目的のために使用される場合、本発明のｃ−Ｋｉｔ抗体は、好ましくは、医薬組成物として製剤化される。このような医薬組成物およびそれを調製するためのプロセスは当該技術分野において周知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏら，ｅｄｓ．，２１ｓｔ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，２００５）を参照のこと。
【実施例】
【００５７】
実施例１：ヒトｃ−Ｋｉｔに対するヒトモノクローナル抗体
抗ヒトｃ−Ｋｉｔ  ｍＡｂ、ＣＫ６のＣＤＲのアミノ酸配列を表１に示す。
【００５８】
【表１】
0005899310.tif 000002
【００５９】
ＣＫ６  ｍＡｂ  ＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、重鎖（ＨＣ）、および軽鎖（ＬＣ）のアミノ酸配列ならびにそれらをコードするｃＤＮＡ配列を示す配列番号を以下の表２に提供する。
【００６０】
【表２】
0005899310.tif 000003
【００６１】
実施例２：ヒトＩｇＧ１抗ヒトｃ−Ｋｉｔモノクローナル抗体の発現および精製
抗ｃ−Ｋｉｔ  ｍＡｂの重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列は当該技術分野において公知の手順に従って発現ベクター中でクローニングするためにＰＣＲにより増幅され得る。例えば、重鎖可変領域（例えば配列番号８）をコードするｃＤＮＡは、フレームにおいて、ベクターｐＥＥ６．１（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ｐｌｃ，Ｓｌｏｕｇｈ，Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ，ＵＫ）中のヒト免疫グロブリン重鎖ガンマ定常領域をコードするｃＤＮＡ配列に融合され得る。全ヒト軽鎖（例えば配列番号１６）をコードするｃＤＮＡはベクターＰＥＥ１２．１（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ＰＬＣ，Ｓｌｏｕｇｈ，Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ，ＵＫ）中で直接クローニングされ得る。操作された免疫グロブリン発現ベクターは、エレクトロポレーションおよびグルタミン合成酵素選択培地中で培養された形質転換体によりＮＳ０骨髄腫細胞中で安定にトランスフェクトされ得る。安定なクローンが抗ヒトｃ−Ｋｉｔ特異的結合ＥＬＩＳＡにより抗体発現のためにスクリーニングされ得る。陽性クローンは、スピナーフラスコまたはバイオリアクタ中で抗体産生のために無血清培地培養物中で培養され得る。完全長ＩｇＧ１抗体は、タンパク質親和性クロマトグラフィー（Ｐｏｒｏｓ  Ａ，ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）により精製され得、中性緩衝生理食塩水中で溶出され得る。
【００６２】
あるいは、抗ヒトｃ−Ｋｉｔ  ｍＡｂの重鎖可変領域および軽鎖可変領域（例えばそれぞれ配列番号８および１４）をコードするｃＤＮＡ配列がクローニングされ得、フレームにおいて、ＧＳ（グルタミン合成酵素）発現ベクター中のヒト免疫グロブリン重鎖ガンマ１定常領域をコードするｃＤＮＡ配列に融合され得る。操作された免疫グロブリン発現ベクターはＣＨＯ細胞中で安定にトランスフェクトされ得る。安定なクローンはヒトｃ−Ｋｉｔに特異的に結合する抗体の発現のために確認され得る。陽性クローンはバイオリアクタ中で抗体産生のために無血清培地培養物中で増殖され得る。完全長ＩｇＧ１抗体はタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーにより精製され得、中性緩衝生理食塩水中で溶出され得る。
【００６３】
実施例３：抗ヒトｃ−Ｋｉｔモノクローナル抗体、ＣＫ６のインビトロでの結合および遮断活性
精製した抗ｃ−Ｋｉｔ  ｍＡｂのインビトロでのｃ−Ｋｉｔ結合および遮断活性は、例えば酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などの当該技術分野において公知の免疫学的、定量的技術を使用して決定できる。簡潔に述べると、９６ウェルマイクロタイタープレートを、室温（２０〜２５℃）にて１時間、１００μｌ／ウェルの１μｇ／ｍｌ組換えヒトｃ−Ｋｉｔ（ｒｈ−ｃ−Ｋｉｔ）タンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）でコーティングする。洗浄後、ウェルを３％ＰＢＳ／ミルクで遮断する。典型的に１．５μｇ／ｍｌまたは１００ｎＭで開始する、精製した抗ｃ−Ｋｉｔ  ｍＡｂの異なる希釈物を次いでｒｈ−ｃ−Ｋｉｔでコーティングしたウェルに加え、室温にて２時間インキュベートさせる。数回洗浄した（３〜５回）後、抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰがコンジュゲートした抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）の１：１０００希釈物を室温にて１時間、プレートに加える。プレートを洗浄し、ＨＲＰ基質を各ウェルに加え、青色が発生するまでインキュベートする。停止溶液を加え、吸光度を４５０ｎｍにて測定する。上記のようにＥＬＩＳＡにおいてｒｈ−ｃ−Ｋｉｔタンパク質への結合についてモノクローナル抗体ＣＫ６を試験した。結果は、約３×１０−１１ＭのＥＣ５０値でＣＫ６がｒｈ−ｃ−Ｋｉｔに結合することを示す。
【００６４】
精製したｍＡｂもまた、ｃ−Ｋｉｔおよびそのリガンドの結合を遮断するそれらの能力について試験できる。簡潔に述べると、９６ウェルマイクロタイタープレートを、室温にて１時間、１００μｌ／ウェルの１μｇ／ｍｌ  ｃ−Ｋｉｔリガンド幹細胞因子（ＳＣＦ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）でコーティングする。洗浄後、ウェルを３％ＰＢＳ／ミルクで遮断する。ｍＡｂの異なる希釈物（典型的に１５μｇ／ｍｌまたは１．０μＭにて開始する）を最初に室温にて１時間、ｒｈ−ｃ−Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共にインキュベートし、次いで室温にて２時間のさらなるインキュベーションのためにＳＣＦでコーティングしたウェルに加える。数回の洗浄（３〜５回）後、抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰがコンジュゲートした抗体の１：１０００希釈物を室温にて１時間、プレートに加える。プレートを０．２％  Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ中で洗浄し、ＨＲＰ基質を各ウェルに加え、青色が発生するまでインキュベートする。停止溶液を加え、吸光度を４５０ｎｍにて測定する。
【００６５】
上記のアッセイにおいてｃ−Ｋｉｔおよびそのリガンドの結合を遮断する能力についてモノクローナル抗体ＣＫ６を試験した。その結果は、約４×１０−１１ＭのＩＣ５０値でＣＫ６がｃ−Ｋｉｔ−リガンド相互作用を遮断することを示す。
【００６６】
実施例４：抗ｃ−Ｋｉｔモノクローナル抗体、ＣＫ６の結合キネティクス
ｒｈ−ｃ−ｋｉｔに対する抗ｃ−Ｋｉｔモノクローナル抗体の結合キネティクスは、当該技術分野において公知の方法に従ってＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）３０００またはＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）などのＳＰＲバイオセンサにより決定できる。本質的に、抗ｃＫｉｔモノクローナル抗体は、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００および結合親和性測定の間のランニング緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ−ｐＨ７．４、０．１５ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．００５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０）を使用してＳＰＲで評価できる。測定は２５℃で実施する。ｒｈ−ｃ−ｋｉｔ（ｐＨ５．０）の約１２０反応単位（ＲＵ）は標準的なアミンカップリング手順を使用してＣＭ５チップ上で固定化できる。ｍＡｂは、約３０μＬ／分の流速にて、固定化したｒｈ−ｃ−ｋｉｔに対して１８０秒間注入でき、続いてＨＢＳ−ＥＰを使用して９００秒解離する。抗ｃ−Ｋｉｔモノクローナル抗体の濃度は、２倍希釈の勾配であってもよく、１回の勾配当たり少なくとも３つの濃度であり、１回の実験当たり３回の勾配である。解離後、ｒｈ−ｃ−ｋｉｔ表面の再生は、３０μ／分にて５０ｍＭのＨＣｌの２回の３０秒の注入により達成され得る。ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００評価ソフトウェアは速度定数を決定するために使用できる。親和定数、ＫＤは速度定数Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比から算出できる。相互作用の「Ｋｏｎ、Ｍ−１ｓ−１」および「Ｋｏｆｆ、ｓ−１」速度は抗体／受容体相互作用の親和性（ＫＤ、Ｍ）を決定するために使用する。
【００６７】
モノクローナル抗体ＣＫ６をヒトｃ−Ｋｉｔタンパク質へのその結合キネティクスについて試験した。測定は２５℃で得た。ｍＡｂ  ＣＫ６についてＫＤ、Ｋｏｎ、およびＫＯＦＦ速度を表３に提示する。
【００６８】
【表３】
0005899310.tif 000004
【００６９】
実施例５：抗ヒトｃ−Ｋｉｔモノクローナル抗体、ＣＫ６の種特異性
抗ヒトｃ−Ｋｉｔ  ｍＡｂの種結合特異性は、ＥＬＩＳＡにおいてヒト、カニクイザルおよびマウスｃ−Ｋｉｔタンパク質に対する抗体の反応性を測定することにより決定できる。簡潔に述べると、９６ウェルマイクロタイタープレートを、１００μｌ／ウェルの１μｇ／ｍｌ組換えヒトｃ−Ｋｉｔタンパク質（ｒｈ−ｃ−Ｋｉｔ）または市販（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で得られる組換えマウスｃ−Ｋｉｔ（ｒｍ−ｃ−Ｋｉｔ；Ｇｌｎ２６−Ｔｈｒ５１９）またはカニクイザルｃ−Ｋｉｔ（組換えて調製したｃｙｎｏ−ｃ−Ｋｉｔ；Ｍｅｔ１−Ｈｉｓ５４９）で室温にて１時間、コーティングする。洗浄後、ウェルを３％ＰＢＳ／ミルクで遮断する。ヒト抗ヒト−ｃ−Ｋｉｔ  ｍＡｂの連続希釈物を次いでｃ−Ｋｉｔでコーティングしたウェルに加え、室温にて２時間インキュベートする。数回洗浄した後、結合したヒト抗体を検出するために、抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰがコンジュゲートした抗体の１：１０００希釈物を室温にて１時間プレートに加える。プレートを洗浄し、ＨＲＰ基質を各ウェルに加え、青色が発生するまでインキュベートする。停止溶液を加え、吸光度を４５０ｎｍにて測定する。その結果は、ＣＫ６が（５．７×１０−１１ＭのＥＣ５０で）ｒｈ−ｃ−Ｋｉｔ、カニクイザルｃ−Ｋｉｔに結合するが、ｒｍ−ｃ−Ｋｉｔに有意に結合しないことを示す（表４）。
【００７０】
【表４】
0005899310.tif 000005
【００７１】
【表５】
0005899310.tif 000006
【００７２】
ｃ−Ｋｉｔ  ｍＡｂの種特異性を、フローサイトメトリー分析に基づいて、ヒトＭｏ７ｅおよびマウスＰ８１５細胞の表面上で発現した原形質膜に結合したｃ−Ｋｉｔに対するそれらの結合についてさらに試験できる（例えば国際公開第２００４／００７７３５号を参照のこと）。簡潔に述べると、全体の生きているヒトＭｏ７ｅおよびマウスＰ８１５細胞を一晩血清飢餓させ、冷遮断緩衝液（ＰＢＳ中の５％ＦＢＳ）中で３回洗浄し、次いで１００μｌの緩衝液中に再懸濁する。抗ｃ−Ｋｉｔ抗体を１．０μｇ／ｍｌにて加え、混合物を４℃にて３０分間インキュベートする。二次蛍光コンジュゲート抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を１．０μｇ／ｍｌにて加えて、フローサイトメトリー分析により細胞表面に結合したヒト抗体を検出する。結果は、細胞ベースのアッセイにおいて、ＣＫ６が、ヒト腫瘍細胞（すなわちＭｏ７ｅ）により発現される原形質膜が結合したヒトｃ−Ｋｉｔに結合するが、マウス腫瘍細胞（すなわちｐ８１５）により発現される原形質膜が結合したマウス（ｐ８１５）ｃ−Ｋｉｔに結合しないことを示す。
【００７３】
【表６】
0005899310.tif 000007
【００７４】
ｃ−Ｋｉｔ  ｍＡｂの種特異性は、単離したカニクイザル骨髄細胞の表面上で発現される原形質膜が結合したｃ−Ｋｉｔに対するｍＡｂの結合を測定することによってさらに試験できる。簡潔に述べると、ＤＰＢＳ上清中の骨髄を、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ１０７７密度勾配上で層状にして血液成分を分離する。遠心分離後、白血球を界面から採取し、ＡＣＫ溶解緩衝液中で迅速にリンスして、いくらかの残っている赤血球を除去する。次いで単離した白血球をＣＫ６、続いてフィコエリトリンがコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧ二次抗体で標識し、ＦＡＣＳ分析に供する。
【００７５】
【表７】
0005899310.tif 000008
【００７６】
ＣＫ６  ｍＡｂを使用したｃ−Ｋｉｔ発現についてのカニクイザル骨髄細胞のＦＡＣＳ分析により、ＣＫ６が、骨髄細胞の細胞表面上で発現される原形質膜が結合したカニクイザルｃ−Ｋｉｔに結合することが示される。
【００７７】
実施例６：インビトロでのｃ−Ｋｉｔ内在化アッセイ
ヒトｃ−Ｋｉｔ発現細胞に対して向けられるｃ−Ｋｉｔ  ｍＡｂの中和活性を測定するためにインビトロの細胞ベースアッセイを使用できる。ｃ−Ｋｉｔ  ｍＡｂにより誘導される内在化に基づき得るこのようなアッセイは、以下に簡潔に記載した蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析を利用できる。
【００７８】
１×１０６個の細胞／ｍｌの濃度にて、血清飢餓させた、ｃ−Ｋｉｔ発現Ｍｏ７ｅ細胞を４℃にて１時間インキュベートする。抗ｃ−Ｋｉｔ抗体を、１μｇ／ｍｌの濃度にて、４℃および３７℃で異なる時間間隔の間、インキュベートした細胞に加える。細胞を２００μｌの遮断緩衝液（ＰＢＳ中の５％ウシ胎仔血清）中で３回洗浄して、結合していない抗体を除去する。細胞を１００μｌの遮断緩衝液中に再懸濁する。フィコエリトリンがコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ−ガンマ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を、結合抗体の存在を検出するために、陰性対照として以前に抗体暴露されていない細胞に加える。この時点から可能な場合、細胞を暗所で維持する。細胞を４℃にて３０分間インキュベートし、上記のように洗浄する。次いで細胞試料を、蛍光標識した細胞を検出する多色検出アッセイシステム（例えば、Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ））に供する。
【００７９】
細胞表面上の平均蛍光強度は、ｃ−Ｋｉｔ抗体による処理後、細胞表面上に残っているｃ−Ｋｉｔ分子の量を表す。代表的な実験からのデータは、３７℃での抗ｃ−Ｋｉｔ  ｍＡｂ  ＣＫ６との細胞の１時間、６時間および２４時間のインキュベーション後の細胞表面ｃ−Ｋｉｔの時間依存性の減少を示す（表８を参照のこと）。４℃でのＣＫ６との細胞のインキュベーションの結果、ｃ−Ｋｉｔ含量の取るに足らない変化が生じた（陰性対照）。これらのデータは、抗ｃ−Ｋｉｔ  ｍＡｂ  ＣＫ６がインビトロにてｃ−Ｋｉｔを発現する細胞においてｃ−Ｋｉｔの内在化を劇的に誘導することを示す。
【００８０】
【表８】
0005899310.tif 000009
【００８１】
実施例７：インビトロでのｃ−Ｋｉｔ分解アッセイ
３７℃でのｃ−Ｋｉｔ  ｍＡｂによる腫瘍細胞の処理後、細胞溶解物に見出される全ｃ−Ｋｉｔの量により測定して、ｃ−Ｋｉｔの分解を誘導するためのｃ−Ｋｉｔ  ｍＡｂの能力を測定するためにインビトロでの細胞ベースのアッセイを使用できる。簡潔に述べると、ｃ−Ｋｉｔを発現するヒト細胞株（例えばＭｏ７ｅおよびＧＩＳＴ８８２）を、３ｍｌの無血清培地中で３×１０６個の細胞／ｍｌの密度にて６ウェルディッシュ中に播種する。ＣＫ６抗体（１００ｎｇ／ｍｌ）をウェルに加え、３７℃にて４８、２４および１２時間インキュベートする。細胞の１つのウェルを対照として未処理のままにする。処理時間の直後、細胞を冷ＰＢＳ中で洗浄し、１００μｌの溶解緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＰＰｉ、５０ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、プロテアーゼ阻害剤カクテル）中で溶解させる。氷上での１０分のインキュベーション後、細胞を４℃で１５分間、１２，０００ｇにて遠心分離する。上清を収集し、還元条件下でウェスタンブロット分析に供する。ブロットを抗ヒトｃ−Ｋｉｔ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；カタログ番号３４−８８００）を用いてプローブして、種々の時間のＣＫ６とのインキュベーション前後の細胞中の全ｃ−Ｋｉｔの量を検出する。その結果は、ｃ−Ｋｉｔ  ｍＡｂ、ＣＫ６とのインキュベーションの１２時間後、未処理の細胞と比較してｃ−Ｋｉｔの顕著な分解を示す（表９）。ＣＫ６により誘導されたｃ−Ｋｉｔの分解は時間依存的に増加する。科学文献の以前の報告から予測されるように、３７℃での１２、２４および４８時間のＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）による腫瘍細胞の処理後、ｃ−Ｋｉｔの分解は観測されなかった（データは示さず）。
【００８２】
【表９】
0005899310.tif 000010
【００８３】
実施例７ａ：インビトロでのｃ−Ｋｉｔ分解アッセイ
ｃ−Ｋｉｔを発現するヒト細胞株（例えばＧＩＳＴ８８２、Ｍｏ７ｅおよびＭａｌｍ−３Ｍ）を、１０％血清を使用する１つのＭｏ７ｅアッセイ以外の全てについて３ｍｌの無血清培地中の３×１０６個の細胞／ｍｌの密度にて６ウェルディッシュ中に播種する。種々の濃度にてＣＫ６抗体またはＳＣＦをウェルに加え、３７℃で２４または４８時間インキュベートする。細胞の１つのウェルは対照として未処理のままにする。処理時間の直後、細胞を冷ＰＢＳ中で洗浄し、１００μｌ溶解緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＰＰｉ、５０ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、プロテアーゼ阻害剤カクテル）中に溶解させる。氷上での１０分のインキュベーション後、４℃で１５分間、１２，０００ｇにて細胞を遠心分離する。上清を収集し、還元条件下でウェスタンブロット分析に供する。ブロットを抗ヒトｃ−Ｋｉｔ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；カタログ番号３４−８８００またはＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ；カタログ番号３３０８）を用いてプローブして、ＣＫ６またはＳＣＦとのインキュベーションの前後、細胞中の全ｃ−Ｋｉｔの量を検出する。その結果は、ｃ−Ｋｉｔ  ｍＡｂ、ＣＫ６とのインキュベーション後、未処理の細胞と比較してｃ−Ｋｉｔの顕著な分解を示さない。０％血清を使用した場合、３７℃にて２４時間、ＳＣＦ（１ｕｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌ）によるＭｏ７ｅ腫瘍細胞の処理後、ｃ−Ｋｉｔの分解が観測される。１０％血清を使用した場合、ＳＣＦにより誘導される分解は現れない。（反復、ＧＩＳＴ８８２＝１、Ｍｏ７ｅ＝３、およびＭａｌｍ−３Ｍ＝１）。同等のタンパク質負荷を実証するために、ブロットを抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ａｍｂｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；カタログ番号ＡＭ４３００）を用いて再プローブする。
【００８４】
実施例８：ｃ−Ｋｉｔ依存性ヒト癌細胞株の同定
大部分の成体組織にわたるｃ−Ｋｉｔ発現の欠如に起因して、腫瘍内のｃ−Ｋｉｔ発現の検出は通常、ｃ−Ｋｉｔ依存性細胞増殖を示唆している。ヒト癌由来の細胞株は、フローサイトメトリー分析、続いてｃ−Ｋｉｔ関連細胞ベースのリン酸化および生存アッセイを使用してｃ−Ｋｉｔ発現について試験できる。
【００８５】
手短に述べると、フローサイトメトリー分析によるｃ−Ｋｉｔ発現に関して、１．０×１０６個の全ての生細胞を一晩血清飢餓させて、遮断緩衝液（ＰＢＳ中の５％のウシ胎仔血清）中で３回洗浄し、次いで１００μｌの遮断緩衝液中に再懸濁する。抗ｃ−Ｋｉｔ抗体または対照抗体を１．０μｇ／ｍｌにて加え、混合物を４℃にて３０分間インキュベートする。細胞を上記のように洗浄して、過剰または未結合の抗体を除去する。細胞を再び、１００μｌの遮断緩衝液中に再懸濁し、次いで蛍光標識した二次抗体とインキュベートして、細胞に結合した一次抗体を検出する。細胞を４℃にて３０分間インキュベートし、蛍光標識した抗体を加えてから暗所に維持する。細胞を上記のように洗浄して、未結合の抗体を除去し、１００μｌの遮断緩衝液中に再懸濁する。無関係の抗体対照試料を含み得る、細胞試料を次いで、蛍光標識した細胞を検出する多色検出アッセイシステム（例えば、Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ））に供する。細胞表面における平均蛍光強度は、無関係の抗体対照と比較した細胞表面上のｃ−Ｋｉｔ分子の量を表す。
【００８６】
ウェスタンブロットによるｃ−Ｋｉｔ発現に関して、３．０×１０６個の細胞を一晩血清飢餓させ、次いで冷ＰＢＳ中で洗浄する。細胞を氷上で１０分間、１００μｌの氷冷溶解緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＰＰｉ、５０ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、プロテアーゼ阻害剤カクテル）中に溶解させる。４℃で１５分間、１２，０００ｒｐｍにて遠心分離により細胞残渣をペレット化する。上清を収集し、還元条件下でウェスタンブロット分析に供する。ブロットを、抗ヒトｃ−Ｋｉｔ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）および適切なＨＲＰ標識した二次抗体を用いてプローブして、細胞に存在するｃ−Ｋｉｔの量を検出する。
【００８７】
ｃ−Ｋｉｔ状態は、ｃ−ＫｉｔリガンドＳＣＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，ＮＪ）による刺激を用いたまたは用いない処理後、上記のように細胞を溶解することによって決定され得る。細胞溶解物はリン酸化ｃ−Ｋｉｔに特異的な抗体プローブを使用してウェスタンブロット分析に供される。刺激していないおよび刺激した細胞の両方について、ブロットにおけるバンドの存在は、ｃ−Ｋｉｔにおいて活性化変異が存在し、それによりｃ−Ｋｉｔがそのリガンドの非存在下でさえもリン酸化されるか、または細胞株が、過剰発現しているループにおいてその独自のリガンドを産生しているかのいずれかを示す。リガンドの存在下でのみリン酸化される細胞株は過剰発現している野生型（ＷＴ）である。
【００８８】
【表１０】
0005899310.tif 000011
【００８９】
この実施例に本質的に記載したように行った分析に基づいて、白血病、黒色腫、ＳＣＬＣ、ユーイング肉腫およびＧＩＳＴ由来の１５個の細胞株がｃ−Ｋｉｔ依存性であることを決定した（表１０を参照のこと）。各々の細胞株についてのｃ−Ｋｉｔ状態は文献調査および配列分析により確認した。
【００９０】
実施例９：インビトロでのｃ−ＫｉｔおよびＭＡＰキナーゼリン酸化アッセイ
ｃ−ＫｉｔとのＳＣＦの相互作用は、細胞質ドメインのチロシン残基の自己リン酸化を生じる、ｃ−Ｋｉｔ二量化を誘発する。ｃ−Ｋｉｔの下流で、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ、Ｓｒｃファミリーメンバー、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路およびＲａｓ−Ｒａｆ−ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードを含む、多重シグナル変換成分が活性化される。
【００９１】
ＳＣＦに反応するｃ−ＫｉｔおよびＭＡＰＫリン酸化を阻害する抗ヒトｃ−Ｋｉｔ  ｍＡｂの能力は以下の手順に従うインビトロでの細胞ベースアッセイにおいて決定され得る。簡潔に述べると、上記の実施例８のように、ｃ−Ｋｉｔ依存性細胞株を一晩血清飢餓にさせる。次いでそれらを、３７℃にて１時間、抗ｃ−Ｋｉｔ  ｍＡｂの異なる希釈物、典型的に１００ｎＭ〜０．１ｎＭの範囲でインキュベートする。次いで細胞を、３７℃にて１５分間、５ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ（Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓまたはＰｅｐｒｏｔｅｃｈ）で刺激する。次いで細胞を、冷ＰＢＳ中ですぐに洗浄し、細胞タンパク質を抽出するために、氷上で１０分間、１００μｌの氷冷溶解緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＰＰｉ、５０ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、プロテアーゼ阻害剤カクテル）中で溶解する。細胞残渣を、４℃にて１５分間、１２，０００ｒｐｍで遠心分離によりペレット化する。上清を回収し、還元条件下でウェスタンブロット分析に供する。ブロットを、リン酸特異的抗ヒトｃ−ＫｉｔまたはＭＡＰＫ抗体および適したＨＲＰ標識二次抗体を用いてプローブして、我々の実験条件下でｃ−ＫｉｔおよびＭＡＰキナーゼのリン酸化のレベルを検出する。
【００９２】
モノクローナル抗体ＣＫ６を、Ｍｏ７ｅ白血病細胞においてＳＣＦに反応するｃ−ＫｉｔおよびＭＡＰＫリン酸化を阻害するその能力について試験した。リン酸化阻害アッセイにおいてｍＡｂ  ＣＫ６のＩＣ５０は３００ｐＭであると決定する。これらの結果により、抗ｃ−Ｋｉｔ  ｍＡｂ  ＣＫ６が、ｃ−Ｋｉｔ活性化およびその下流シグナル伝達を効果的に遮断し得ることが実証される。
【００９３】
実施例１０：インビトロでの腫瘍細胞増殖阻害アッセイ
本発明のｃ−Ｋｉｔモノクローナル抗体による腫瘍細胞増殖の阻害は、多くの商業的に利用可能な細胞生存アッセイキットのいずれか１つを使用してインビトロアッセイにおいて試験できる。より具体的には、腫瘍細胞増殖を阻害するＣＫ６の能力を、製造業者の指示書に従って商業的に利用可能な細胞生存キット（例えば、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存アッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を使用して試験した。
【００９４】
抗ｃ−Ｋｉｔモノクローナル抗体ＣＫ６は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存アッセイキットの使用により決定した場合、約３００ｐＭ（データは示さず）のＩＣ５０でＭｏ７ｅ細胞の細胞生存を阻害すると決定した。
【００９５】
実施例１１：インビボでの腫瘍細胞増殖阻害アッセイ
本発明の抗ｃ−Ｋｉｔ抗体の抗腫瘍効果を、当該技術分野において本質的に公知であり、広範に使用されるインビボでの異種移植片モデルに関してさらに試験できる。
【００９６】
手短に記載すると、ｃ−Ｋｉｔ依存性ヒト癌細胞株を培地中で増殖させ、次いで１匹のマウス当たり２００万〜１００００万個の細胞を無胸腺ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）のひ腹内に皮下注射する。抗ｃ−Ｋｉｔ  ｍＡｂをＰＢＳ（ｐＨ７．２）中に希釈し、４または４０ｍｇ／ｋｇにて静脈注射により投与する。腫瘍サイズが約１８０〜３６０ｍｍ３に到達すると、マウスを無作為化し、対照（例えば１０μｌ／ｇのＵＳＰ生理食塩水）および処置群（例えば４または４０ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ  ＣＫ６）に分ける。さらに、処置群は、適切な化学療法薬または適切なＲＴＫ阻害剤を単独でまたは本発明の抗体と併せて含んでもよい。抗体および生理食塩水対照は、４週間の間、１週間に３回投与される。腫瘍細胞増殖の阻害は、処置過程の間、１週間に２回、腫瘍体積の３次元キャリパー測定により決定される。腫瘍体積は以下のように計算できる：
腫瘍体積（ｍｍ３）＝（腫瘍の長さ）（腫瘍の幅２）（π／６）
式中、腫瘍の長さは皮膚表面に平行した腫瘍の最大寸法であり、幅は皮膚表面に平行した長さに垂直な最大寸法である。体重もまた、毒性の一般的尺度として処置過程の間、頻繁に測定してもよい。Ｔ／Ｃ％およびＰ値はＲＭ  ＡＮＯＶＡにより計算し、ここで、
Ｔ／Ｃ％＝［（処置体積／開始体積）／（対照体積／開始体積）］＊１００であり、Ｐ値は生理食塩水に関して計算する。
【００９７】
処置としてＣＫ６を使用した種々のｃ−Ｋｉｔ関連異種移植片モデルからのデータを表１１〜１４に示す。
【００９８】
【表１１】
0005899310.tif 000012
【００９９】
【表１２】
0005899310.tif 000013
【０１００】
【表１３】
0005899310.tif 000014
【０１０１】
【表１４】
0005899310.tif 000015
【０１０２】
これらのデータにより、抗ｃ−Ｋｉｔ  ｍＡｂ  ＣＫ６が、種々のｃ−Ｋｉｔ関連異種移植片モデルにおいて腫瘍細胞増殖を劇的に阻害することが実証される。ＣＫ６による処置により、シタラビン（ａｒａＣ）およびダカルバジン（ＤＴＩＣ）ならびにエトポシドと併用したシスプラチンなどの標準的な抗癌剤と比較してより強い抗腫瘍活性が実証された。さらに、ＤＴＩＣまたはＡｒａＣとのＣＫ６の併用により、単剤療法と比較してより強い抗腫瘍活性が実証された。同様に、シスプラチンおよびエトポシドとのＣＫ６の併用により、シスプラチンおよびエトポシド併用のみと比較してより強い抗腫瘍活性が実証された。
【０１０３】
アミノ酸およびヌクレオチド配列
>CK6-CDRH1アミノ酸配列(配列番号１)
SYWIG
>CK6-CDRH2 アミノ酸配列(配列番号２)
IIYPGDSDTRYSPSFQG
>CK6-CDRH3 アミノ酸配列(配列番号３)
HGRGYNGYEGAFDI
>CK6-CDRL1 アミノ酸配列(配列番号４)
RASQGISSALA
>CK6-CDRL2 アミノ酸配列(配列番号５)
DASSLES
>CK6-CDRL3 アミノ酸配列(配列番号６)
CQQFNSYPLT
> CK6-HCVR アミノ酸配列(配列番号７)
QVQLVQSGAAVKKPGESLKISCKGSGYRFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISAGKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARHGRGYNGYEGAFDIWGQGTMVTVSS
> CK6-HCVR cDNA 配列(配列番号８)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGCGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGGTTTACCAGCTACTGGATCGGCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCATCTATCCTGGTGACTCTGATACCAGATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGGCAAGTCCATCAGCACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGACATGGGCGTGGATATAATGGCTACGAGGGTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA
> CK6-HC アミノ酸配列(配列番号９)
QVQLVQSGAAVKKPGESLKISCKGSGYRFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISAGKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARHGRGYNGYEGAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
> CK6-HC cDNA 配列(配列番号１０)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGCGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGGTTTACCAGCTACTGGATCGGCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCATCTATCCTGGTGACTCTGATACCAGATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGGCAAGTCCATCAGCACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGACATGGGCGTGGATATAATGGCTACGAGGGTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAAGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATTCCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGCAAA
> 分泌シグナル配列を有する完全なCK6-HC aa配列(配列番号１１)
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAAVKKPGESLKISCKGSGYRFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISAGKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARHGRGYNGYEGAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>完全なCK6-HC cDNA配列(配列番号１２)
ATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTGGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGCGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGGTTTACCAGCTACTGGATCGGCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCATCTATCCTGGTGACTCTGATACCAGATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGGCAAGTCCATCAGCACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGACATGGGCGTGGATATAATGGCTACGAGGGTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAAGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATTCCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGCAAATGA
> CK6-LCVR アミノ酸配列(配列番号１３)
AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIK
> CK6-LCVR cDNA 配列(配列番号１４)
GCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCCTCCAGTTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTT
> CK6-LC アミノ酸配列(配列番号１５)
AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
> CK6-LC cDNA 配列(配列番号１６)
GCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCCTCCAGTTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTAATAGTTACCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
>分泌シグナル配列を有する完全なCK6-LC aa配列(配列番号１７)
MGWSCIILFLVATATGVHSAIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>完全なCK6-LC cDNA配列(配列番号１８)
ATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTGGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCCTCCAGTTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTAATAGTTACCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
>シグナルペプチドを有するヒトc-Kit 細胞外ドメイン (ECD) (配列番号１９)
MRGARGAWDFLCVLLLLLRVQTGSSQPSVSPGEPSPPSIHPGKSDLIVRVGDEIRLLCTD
PGFVKWTFEILDETNENKQNEWITEKAEATNTGKYTCTNKHGLSNSIYVFVRDPAKLFLV
DRSLYGKEDNDTLVRCPLTDPEVTNYSLKGCQGKPLPKDLRFIPDPKAGIMIKSVKRAYH
RLCLHCSVDQEGKSVLSEKFILKVRPAFKAVPVVSVSKASYLLREGEEFTVTCTIKDVSS
SVYSTWKRENSQTKLQEKYNSWHHGDFNYERQATLTISSARVNDSGVFMCYANNTFGSAN
VTTTLEVVDKGFINIFPMINTTVFVNDGENVDLIVEYEAFPKPEHQQWIYMNRTFTDKWE
DYPKSENESNIRYVSELHLTRLKGTEGGTYTFLVSNSDVNAAIAFNVYVNTKPEILTYDR
LVNGMLQCVAAGFPEPTIDWYFCPGTEQRCSASVLPVDVQTLNSSGPPFGKLVVQSSIDS
SAFKHNGTVECKAYNDVGKTSAYFNFAFKGNNKEQIHPHT
>シグナルペプチドを有さないヒトc-Kit細胞外ドメイン(ECD) (配列番号２０)
QPSVSPGEPSPPSIHPGKSDLIVRVGDEIRLLCTDPGFVKWTFEILDETNENKQNEWITEKAEATNT
GKYTCTNKHGLSNSIYVFVRDPAKLFLVDRSLYGKEDNDTLVRCPLTDPEVTNYSLKGCQGKPLPKD
LRFIPDPKAGIMIKSVKRAYHRLCLHCSVDQEGKSVLSEKFILKVRPAFKAVPVVSVSKASYLLREG
EEFTVTCTIKDVSSSVYSTWKRENSQTKLQEKYNSWHHGDFNYERQATLTISSARVNDSGVFMCYAN
NTFGSANVTTTLEVVDKGFINIFPMINTTVFVNDGENVDLIVEYEAFPKPEHQQWIYMNRTFTDKWE
DYPKSENESNIRYVSELHLTRLKGTEGGTYTFLVSNSDVNAAIAFNVYVNTKPEILTYDRLVNGMLQ
CVAAGFPEPTIDWYFCPGTEQRCSASVLPVDVQTLNSSGPPFGKLVVQSSIDSSAFKHNGTVECKAY
NDVGKTSAYFNFAFKGNNKEQIHPHT
【図１】
0005899310.tif 000016
【図２】
0005899310.tif 000017
【図３】
0005899310.tif 000018
【図４】
0005899310.tif 000019
【配列表】
0005899310000001.app