(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象とする遺伝子に作動可能に連結したサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、発現増強エレメント、TPL、VAIおよびII遺伝子、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列および抗生物質マーカーからなる発現ベクターであって、発現増強エレメントが、配列番号５に記載されているヌクレオチド配列を有するクロマチン結合領域である発現ベクター。
【請求項２】
a)イントロンをさらに含む、請求項1に記載の発現ベクター。
【請求項３】
b)内部リボソーム結合部位をさらに含む、請求項2に記載の発現ベクター。
【請求項４】
クロマチン結合領域が適切なマトリックス結合領域である、請求項1に記載の発現ベクター。
【請求項５】
クロマチン結合領域が適切な足場結合領域である、請求項1に記載の発現ベクター。
【請求項６】
マトリックス結合領域がショウジョウバエScs境界エレメント、hspSAP MAR、cLysMAR、マウスT細胞受容体TCRα、ラット遺伝子座調節領域、およびβ-グロビンMARから選択される、請求項4に記載の発現ベクター。
【請求項７】
マトリックス結合領域がcLysMARである、請求項4または6に記載の発現ベクター。
【請求項８】
内部リボソーム結合部位が脳心筋炎ウイルスIRESである、請求項3に記載の発現ベクター。
【請求項９】
内部リボソーム結合部位が配列番号14に記載されているヌクレオチド配列を有する、請求項8に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
VAIおよびII遺伝子が配列番号3に記載されているヌクレオチド配列を有する、請求項1に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
TPLが配列番号2に記載されているヌクレオチド配列を有する、請求項1に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
イントロンが配列番号1に記載されているヌクレオチド配列を有する、請求項2に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
対象とする遺伝子が、
組織プラスミノーゲンアクチベータ、TNK-TPA、ダルベポエチン、エリスロポエチン、インスリン、GCSF、インターロイキン、腫瘍壊死因子、インターフェロン、TNFR-IgGFc、
リツキシマブ、ベバシズマブ、アダリムマブ、トラスツズマブ、
GLP-I、GLP-II、IGF-I、IGF-II、血小板由来増殖因子、FVII、FVIII、FIVおよびFXIII、エキセンジン-3、エキセンジン4、転写因子MYT-2、NF-κΒ抑制因子NRF、AML1/RUNX1、Gtxホメオドメインタンパク質、
真核生物翻訳開始因子4G(elF4G)a、真核生物翻訳開始因子4G1(elF4Gl)aからなる群より選択される翻訳因子、
細胞死関連タンパク質5(DAP5)、c-myc、L-myc、Pim-1、プロテインキナーゼp58PITSLRE、p53、
卵胞刺激ホルモン、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、およびヒト黄体形成ホルモン、
免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(BiP)、熱ショックタンパク質70、ミトコンドリアH+-ATPシンターゼのβ-サブユニット、オルニチンデカルボキシラーゼ、コネキシン32および43、HIF-1a、ならびにAPCからなる群より選択されるタンパク質、ペプチドまたはそれらのアナログをコードする、請求項1に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
抗生物質マーカーがカナマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、およびネオマイシンからなる群より選択される、請求項1に記載の発現ベクター。
【請求項１５】
発現カセットのどちらかの側でcLysMARがクローニングされる、請求項1から14のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１６】
a)ＣＭＶプロモーター、
b)VAIおよびII遺伝子、
c)TPL、
d)キメライントロン、
e)抗生物質マーカー、
f)マトリックス結合領域、及び
h)ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列
に作動可能に連結した、対象とする遺伝子を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１７】
対象とする遺伝子が、g)内部リボソーム結合部位に作動可能に連結している、請求項16に記載の発現ベクター。
【請求項１８】
受託番号MTCC5655を有する、請求項1から17のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１９】
受託番号MTCC5656を有する、請求項1から17のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項２０】
受託番号MTCC5657を有する、請求項1から17のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項２１】
請求項1から20のいずれか一項に記載のベクターで形質転換した宿主細胞。
【請求項２２】
CHOおよびBHK細胞系から選択される、請求項21に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
タンパク質またはペプチドを産生するための方法であって、
a)対象とする遺伝子を含む、請求項1から20のいずれか一項に記載の発現ベクターを構築するステップ、
b)対象とするタンパク質またはペプチドを発現する適切な宿主細胞中で前記発現ベクターを形質転換するステップ
を含む方法。
【請求項２４】
タンパク質またはペプチドを産生するための方法であって、
a)対象とする遺伝子を含む、請求項1から20のいずれか一項に記載の発現ベクターを構築するステップ、
b)適切な宿主細胞中で前記発現ベクターをトランスフェクトするステップ、
c)対象とするタンパク質またはペプチドを発現する適切なトランスフェクト宿主細胞を選択するステップ、
d)請求項1から20のいずれか一項に記載の発現ベクターでステップ(c)において選択した適切な宿主細胞をさらにリトランスフェクトするステップ、
e)対象とするタンパク質またはペプチドを発現する適切なリトランスフェクト宿主細胞を選択するステップ
を含む方法。
【請求項２５】
発現ベクターが受託番号MTCC5655を有する、請求項23または24に記載の方法。
【請求項２６】
発現ベクターが受託番号MTCC5656を有する、請求項23または24に記載の方法。
【請求項２７】
発現ベクターが受託番号MTCC5657を有する、請求項23または24に記載の方法。
【請求項２８】
タンパク質またはペプチドが、
組織プラスミノーゲンアクチベータ、TNK-TPA、ダルベポエチン、エリスロポエチン、インスリン、GCSF、インターロイキン、腫瘍壊死因子、インターフェロン、TNFR-IgGFc、
リツキシマブ、ベバシズマブ、アダリムマブ、トラスツズマブ、
GLP-I、GLP-II、IGF-I、IGF-II、血小板由来増殖因子、FVII、FVIII、FIVおよびFXIII、エキセンジン-3、エキセンジン4、
卵胞刺激ホルモン、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、およびヒト黄体形成ホルモン
からなる群より選択される、請求項23または24に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え治療用タンパク質の高レベル発現用の新規な発現ベクターに関する。特に本発明は、組換えタンパク質をコードする遺伝子配列、およびマトリックス結合領域などの少なくとも1つの作動可能に連結した発現増強エレメントを有する発現ベクターを開示する。前記ベクターは、他の制御エレメントをさらに含むことができる。別の実施形態では、本発明は、前記発現ベクターでトランスフェクトした哺乳動物細胞を含む。
【背景技術】
【０００２】
治療用タンパク質の需要が多いことは、小分子ベースの薬剤と比較して毒性の有意に明らかな低いリスクをもたらす、それらの一般的に非常に特異的な標的作用に主に起因する。全てのこのような患者に優しい性質を有するにもかかわらず、大部分の治療用タンパク質は、それらが非常に高価であり続けるため、世界中の大部分の人には依然として入手しにくい状態にある。したがって、生活の質を有意に改善する、エリスロポエチン、ダルベポエチン、TNKase、エタネルセプト、ゴナドトロピンのような命を救う薬剤または他の重要な薬剤、およびリツキシマブ、トラスツズマブおよび他の治療用モノクローナル抗体などのような多くの抗癌モノクローナル薬剤は非常に少ない割合の人にのみ与えられ、一方で世界中の大部分の疾患を有する人はそれらを得ることができない。したがって、これらの薬剤のコストを下げることが早急に必要である。
【０００３】
それらの低い生産収率のため生じるこの高コストの大部分は、それらの製造と関係がある。クローンの生産収率は、培養条件(培地構成成分、温度、pHなど)および下流精製プロセスのような外的要因、ならびにベクター、およびプロモーター、転写または翻訳増強エレメントなどのようなその制御エレメント、およびそれらの適切な方向の選択、およびさらに適切な宿主細胞の選択のような内的要因などの、いくつかの要因の選択に依存する。哺乳動物細胞は、それが自然なグリコシル化能力を有するので、組換え治療用タンパク質の高い発現を得るのに最も有望な発現系である。さらに、このような発現系中での翻訳後修飾は、タンパク質を発現するヒト細胞中で見られる翻訳後修飾により類似している可能性があり、したがって生理的活性をもたらす。しかしながら、真核生物細胞中の発現レベルは、別の内的要因、すなわち宿主細胞ゲノム中への対象とする遺伝子を含む組換え発現構築物の組み込み部位にも大きく依存する。
【０００４】
所望のタンパク質をコードする、対象とする遺伝子を含む組換え発現プラスミドを通常使用して、安定したCHOトランスフェクタントまたは他の哺乳動物トランスフェクタントを作製し、所望の組換えタンパク質を発現する。真核生物の過剰発現に理想的な系は、強力で安定したまたは長期の発現を可能にする位置に、標的細胞ゲノム中の発現カセットの組み込みを有し得る。しかしながら、大部分の現在の方法は、宿主細胞ゲノム中へのプラスミドDNAのランダムな組み込みのみを実施する。このようなトランスフェクションプロセスから生じるクローン集団中の発現レベルが非常に変動的であることは、文献から明らかである(Brian K Lucas et al、Nucleic Acids Research、1996、Vol.24、No.9、R.T.Schimke et al、Br.J.Cancer(1985)、51、459〜465頁、Wurtele H、et al、Gene Ther.2003 Oct;10(21):1791〜9頁。Biotechnol Prog.2000年9月〜10月;16(5):710〜5頁、Yoshikawa T et al、Biotechnol Prog.2000年9月〜10月;16(5):710〜5頁、Kim NS、et al、Biotechnol Prog.2001年1月〜2月;17(l):69〜75頁)。さらに、高レベルで所望の組換えタンパク質を発現することができる、安定的に組み込まれた組換え遺伝子を有するトランスフェクトーマの頻度は非常に低い。
【０００５】
通常、多数の安定的にトランスフェクトされた細胞をスクリーニングして、高レベルで組換えタンパク質を発現するクローンを同定しなければならない。これは主に、組み込み部位のゲノム環境の影響に原因があると考えられる。哺乳動物ゲノムは実際大きく、その約0.1%のみが転写活性化配列を含有するからである(Little(1993)Nature366:204)。発現に影響を与える組み込み部位のこの現象は「位置効果」と呼ばれる。位置効果は、以下のメカニズム-1)組み込まれた遺伝子の発現の制御に関与し得る組み込み部位付近の制御エレメントの存在、2)組み込み部位におけるクロマチン構造、3)組み込み部位におけるDNAメチル化活性のいずれかまたは全てによって、プラスまたはマイナス式に組み込まれた遺伝子の発現レベルを制御する。位置効果のマイナスの影響は、DNAメチル化またはヒストン脱アセチル化を介した遺伝子サイレンシングと同程度強烈である可能性がある。
【０００６】
したがって、CHO細胞のゲノム中へのランダムなプラスミド組み込みの技術が、高レベルの遺伝子発現を可能にする転写活性化領域への組換え遺伝子の挿入を常にもたらす可能性は非常に低い。これは、高発現クローンを発見するためスクリーニングする必要があるクローンの数が、非常に多い可能性があることを意味する。
【０００７】
ランダムな組み込みに関する問題を克服するため、ゲノム中に部位特異的な形式で所望の遺伝子を組み込むための系の発見が文献中に記載されており、限られた成功で使用されている。例えば、いくつかのグループは、ゲノムの転写活性化部位中への対象とする遺伝子の部位特異的組換え介在型導入用の特定酵素を使用している。CreおよびFLPなどのリコンビナーゼは、同じ標的部位で組み込みと切除の両方を行う(Sauer、B.(1994)Curr Opin.Biotechnol、5、521〜527頁、Sternberg et al、J Mol Biol、1981、150、467〜486頁、Broach et al、Cell、1980、21、501〜508頁)。しかしながら、これらのリコンビナーゼは哺乳動物細胞中で組み込みを効率良く行うが、それらが介在する実質的な組み込み頻度は、過剰な逆反応のために低い。したがって、安定した高発現の問題は依然として解決されていない。
【０００８】
伝統的に、安定した高産生細胞系を得るために、メトトレキサート(MTX)介在遺伝子増幅プロセスなどの遺伝子コピー数を増大するための方法が通常行われている。トランスフェクションに、所望の表現型を有する単細胞クローンの広範囲にわたる検索を続ける。さらに、各増分レベルで細胞が安定化するのに十分な時間をもたらしながら、メトトレキサートのレベルは一般にわずかな増分で増大する。したがって、トランスフェクトした哺乳動物細胞からの発現を増大させるこのプロセスは、時間を浪費し大きな労働力を要するものである。
【０００９】
真核生物遺伝子の転写は、様々なシスおよびトランス作用制御エレメントによって制御される(Dillon et.al、(1993)Trends Genet. 9:134)。最も特徴付けられているシスエレメントの2つはプロモーターとエンハンサーである。プロモーターは、遺伝子のコード配列に対する5'に隣接したDNA配列である。それらは、基本転写機構を形成するトランス作用転写因子に関する多数の結合部位を含む。同様に、エンハンサーもトランス作用転写因子に関する多数の結合部位で構成されるが、コード配列のはるか上流もしくは下流、またはさらにイントロン内で見ることができる。これらのエレメントは、方向と無関係な形式で作用する可能性もある。プロモーターとエンハンサーの活性は一過的発現系中で検出することができ、それらは組織特異的であり得るかまたはあり得ないエレメントを含有する。
【００１０】
本発明の本発明者らは、組換えタンパク質の高い発現レベルを得るためのa)CMVプロモーター、b)イントロン、c)TPL、d)VA遺伝子およびe)ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列などの制御エレメントの併用効果を、その出願WO2007017903中で既に開示している。
【００１１】
別のカテゴリーのシス作用制御エレメントは、クロマチン構造を制御すると考えられるエレメントであり、遺伝子座調節領域(LCR)[Grosveld et.al、(1987)Cell 51:975]、マトリックス結合領域(MAR)[Phi-Van et.al、(1990)Mol.Cell.Biol. 10:2302]、足場結合領域(SAR)[Gasser and Laemmli(1987)Trens Genet. 3:16]、インスレーターエレメント[Kellum and Schedl(1991)Cell 64:941]および核マトリックス結合DNA[Bode J et.al、(1992)Science 255:195]を含む。
【００１２】
MARとSARはそれらが長距離で作用することができる点で類似したエンハンサーであるが、それらの影響が安定的に形質転換された細胞系またはトランスジェニック動物においてのみ検出可能である点で独自である。LCRも、それらが位置および方向依存的であり、組織特異的な形式で活性化する点で他の型のエンハンサーと異なる。
【００１３】
SAR/MARエレメントは、位置効果の欠点を取り除くため、および発現構築物において高活性遺伝子をもたらすために使用されている。SAR/MARエレメントは、隣接する宿主細胞クロマチンエレメントが、導入遺伝子の発現の影響を受けるのを妨げる。MARは活発に転写される遺伝子周辺の領域からだけでなく、セントロメアおよびテロメア領域からも単離されている。それらは転写活性を制御することにより所望の遺伝子の発現を増大させる。
【００１４】
例えばショウジョウバエScs境界エレメント、hspSAP MAR、マウスT細胞受容体TCRα、ラット遺伝子座調節領域、β-グロビンMAR、アポリポタンパク質B SARエレメントなどのいくつかの異なるMAR/SARが、既存の文献において異なる種および異なる高発現遺伝子から報告されている。大部分のこれらのエレメントは、CHO細胞中で所望の遺伝子の発現レベルにおいて低度から中程度の改善を示した(P.A.Girod and Nicolas Mermod、Gene Transfer and Expression in Mammalian Cell、2003)。対照的に、ニワトリリゾチームMAR(cLysMAR)は、MARエレメントが存在しなかった対照と比較して5〜6倍高い発現レベルを有することが示された(P.A.Girod and Nicolas Mermod、Gene Transfer and Expression in Mammalian Cell、2003)。さらに、同じMARを発現カセットに隣接する両側で使用したとき、発現レベルの4〜5倍のさらなる増大が観察される(P.A.Girod and Nicolas Mermod、Gene Transfer and Expression in Mammalian Cell、2003)。したがって、cLysMARが従来技術で報告された最も有望なエレメントであったことは明らかである。cLysMARはニワトリリゾチーム遺伝子のはるか上流に局在する(Phi-Van and Stratling、EMBO、7、3、655〜64頁、1988)。形質転換動物細胞系では、このMARは導入遺伝子の発現の全体的レベルを増大し、レポーター遺伝子周辺に置かれたとき、その位置依存的変動性を低減することが示されている(Stief et al、Nature、341、343〜345頁、1989)。この影響は異種プロモーターおよび細胞(Phi-Van et al、Molecular and Cellular Biology、10、5、2302〜2307頁、1990)、および導入遺伝子の発現の組織特異性に及ぶことが分かっている(McKnight et al、1992)。
【００１５】
米国特許第7422874号は、βガラクトシダーゼレポーター遺伝子、scu-PA遺伝子およびTGF-βSRII遺伝子の発現を増大させるための、PMSベクター構築物における制御エレメント-pSV-galまたはpCMV-galプロモーター、MCS部位および転写終結部位と組み合わせたβ-グロビンMARの使用を記載する。彼らは、クローンの88%において、βガラクトシダーゼに関して20ug/細胞百万個の中程度の発現レベルを得ることができた。彼らは、MAR以外前述のベクターと同じ制御エレメントからなる対照ベクター構築物と比較して、4倍を超える発現レベルを有するscu-PAに関するクローンを作製することもできた。遺伝子増幅用のMARとDHFR系をTGF-βSRII遺伝子の発現において一緒に使用したとき、彼らは、トランスフェクション後100ng/細胞百万個/1日、および最大1uM MTXの数ラウンドのMTX介在遺伝子増幅後10ug/細胞百万個/1日を産生する主要クローンを作製することができた。しかしながら、この特許で得られた発現レベルは、今日TNKase、ダルベポエチンなどの生体治療用タンパク質、およびモノクローナル抗体に関して工業的に実現可能ではない。
【００１６】
米国特許第7371542号は、LTBR-Fc(リンホトキシンβ受容体-IgGFc融合タンパク質)の発現を増大させるための、発現ベクター構築物における制御エレメント-CMVプロモーター、イントロン、OriPおよびポリAと組み合わせたβIFN S/MARの使用を記載し、MAR以外前述のベクターと同じ制御エレメントからなる対照ベクターと比較して、CHO細胞において発現レベルの4.5倍の改善を得た。彼らは、発現ベクターにおけるβIFNS/MARの使用は、ベクターpCEP-LTBR-Fcを使用して293EBNA細胞において発現レベルを6.3倍増大することも発見した。しかしながら、発現レベルは依然として非常に低かった(5日間中20mg/L)。ベクターpCB_SMl_LTBR-Fcは、9日間中40mg/Lの生産性を有する293EBNA細胞においてクローンを与えることができた。しかしながら、この特許で得られた生産性レベルは、このような生体治療用分子に関して望ましいものとはほど遠い。
【００１７】
米国特許第5731178号は、プロモーターおよびエンハンサーを含むベクター構築物においてcLysMARを使用することによる、所望の遺伝子の発現の増強を記載する。彼らは、安定的トランスフェクションにおけるcLysMARエレメントの使用は、エンハンサーおよびプロモーターエレメントと組み合わせてmarエレメントを使用すると、エンハンサーおよびプロモーターのみからなる対照構築物より、10倍を超えてレポーター遺伝子CATの活性を改善することはできたが、しかしながら、MARエレメントはそれ自体いかなる大きな影響も示すことができなかったことを示した。
【００１８】
Poljak et al、(1994)Nucleic Acid Res、22(21):4386〜94頁)は、SV40プロモーターおよびエンハンサーと組み合わせてcLysMARを使用したときの、約15倍のCATレポーター遺伝子の発現の増大を報告する。cLysMAR自体は所望の遺伝子の発現を増大する際に非常に微力であり、そうではなくそれはわずかな低減を示したことが分かった。
【００１９】
したがって前述の例は、当業者に知られている標準的な制御エレメントを含む対照ベクター構築物はそれら自体、高発現をサポートするのに十分でなかった事実を実証する。さらに、MAR/SARとの組合せ後でさえ、発現レベルは、組換え治療剤の実現可能な生産に工業的に必要とされるレベルまで増大しなかった。したがって、エレメントの独自の組合せが、所望の発現レベルを得るために依然として必要とされた。
【００２０】
したがって、治療用タンパク質の発現をさらに増大してそれらを一層利用しやすくする重大な必要性が、産業界に存在することが明らかとなる。したがって、MARと相互依存的形式に作用して異種標的遺伝子に関する増大した発現をもたらすことができる、発現ベクターにおけるエレメントの組合せが必要であると思われる。本発明の本発明者らは、制御エレメントの独自の組合せの一斉作用が、時間を節約する形式で組換えタンパク質の最適な発現に必要とされることを以後証明している。
【００２１】
米国特許第7129062号は、2つの組換えタンパク質-ルシフェラーゼおよび抗Rhesus D IgGの発現を約20倍増大させるための、1つのベクターが対象とする遺伝子を含み第2のベクターがcLysMARを含む2個より多い無関係なベクターのコトランスフェクション、および彼らがさらに、このコトランスフェクション戦略を使用し200mg/Lでヒト抗Rhesus D IgGを生成できたことを記載する。しかしながら、文献中(DNA Cloning: Mammalian systems;By David M.Glover、B. D.Hames)およびさらに本発明者らの経験において、コトランスフェクションによりトランスフェクト集団内の不均質性および変動性が増大することは十分報告されている。さらに本発明は、一回トランスフェクションの使用により望ましい収率を得た。
【００２２】
US20080102523は、SV40プロモーター-エンハンサーおよび/またはCMVプロモーター、起点部位、およびポリA領域からなる対照ベクター構築物と比較して、βガラクトシダーゼの発現を3倍および免疫グロブリンの発現を6倍増大させるための、β-グロビンMARの使用を記載する。前述の特許出願は、MTX介在遺伝子増幅プロセスとβ-グロビンMAR制御エレメントの助力の両方により、発現の中程度の増大のみを得て、したがってプロセス全体は単調で時間を浪費するものとなる。これは、制御エレメントのその独自の組合せにより、MTX-DHFR選択法のような如何なる長期の単調な方法も使用せずに、本発明者らが高発現を得ている本発明とは対照的である。
【００２３】
米国特許第5888774号は、ヒトアポリポタンパク質BSARエレメントの使用によるエリスロポエチンの高発現を記載し、EPO/細胞百万個/24時間の1500〜1700IUの発現を報告する。本発明者らにより所有されるWO2007017903は、168時間培養中11,830IU/ml(91μg/ml)の発現レベルで組換えヒトエリスロポエチンを生成するための方法を記載し、これは2366〜3549IU/106細胞/24時間または18.2〜27.3μg/106細胞/24時間と同等であり、米国特許第5888774号中で報告された値より著しく高い。さらに本発明は、いくつかの治療用タンパク質に関して、WO2007017903のベクターより有意に発現レベルをさらに増大する。
【００２４】
したがって、真核生物宿主細胞の生産性をさらに増大するため、新規な発現ベクターを開発することは依然として望ましい。驚くことに、過去数十年間に当技術分野で生まれた多量の知識があるにもかかわらず、今日当業者でさえ、内的因子または制御エレメントの組合せを簡単に採集および選択して、相当高い発現をもたらし得る発現ベクターを設計することはできない。さらに、高発現ベクターを作製するための適切なエレメントの組合せは当業者により通常推定され得ない。ベクターを使用した対象とする所望遺伝子の高発現は単に一エレメントのみに起因し得るわけではなく、適切なエレメントの組合せが、安定した高発現細胞系を得るのに望ましいからである。したがって本発明は、例えば転写の増大によるmRNAレベルの増大、その安定性の増大、および翻訳効率の増大によるmRNA分子の寿命の延長の、多数の役割を有し、CMVプロモーター、イントロン、TPL、およびVA遺伝子などの他の制御エレメントと組み合わせて、ニワトリリゾチームMARエレメントのような発現増強エレメントを含み、したがって相互依存的に働きトランスフェクト哺乳動物宿主細胞中で組換えタンパク質の高く安定した発現をもたらす、新規な発現ベクターを提供することにより、この問題に対する解決策を提供する。シスまたはトランス方向でcLysMARと隣接した発現カセットからなる、本発明の発現ベクターにおけるこれらのエレメントの組合せは、トランスフェクト細胞系での治療用タンパク質の安定した、高い発現をもたらす。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２５】
【特許文献１】WO2007017903
【特許文献２】米国特許第7422874号
【特許文献３】米国特許第7371542号
【特許文献４】米国特許第5731178号
【特許文献５】米国特許第7129062号
【特許文献６】US20080102523
【特許文献７】米国特許第5888774号
【非特許文献】
【００２６】
【非特許文献１】Brian K Lucas et al、Nucleic Acids Research、1996、Vol.24、No.9
【非特許文献２】R.T.Schimke et al、Br.J.Cancer(1985)、51、459〜465頁
【非特許文献３】Wurtele H、et al、Gene Ther.2003 Oct;10(21):1791〜9頁
【非特許文献４】Biotechnol Prog.2000年9月〜10月;16(5):710〜5頁
【非特許文献５】Yoshikawa T et al、Biotechnol Prog.2000年9月〜10月;16(5):710〜5頁
【非特許文献６】Kim NS、et al、Biotechnol Prog.2001年1月〜2月;17(l):69〜75頁
【非特許文献７】Little(1993)Nature366:204
【非特許文献８】Sauer、B.(1994)Curr Opin.Biotechnol、5、521〜527頁
【非特許文献９】Sternberg et al、J Mol Biol、1981、150、467〜486頁
【非特許文献１０】Broach et al、Cell、1980、21、501〜508頁
【非特許文献１１】Dillon et.al、(1993)Trends Genet. 9:134
【非特許文献１２】Grosveld et.al、(1987)Cell 51:975
【非特許文献１３】Phi-Van et.al、(1990)Mol.Cell.Biol. 10:2302
【非特許文献１４】Gasser and Laemmli(1987)Trens Genet. 3:16
【非特許文献１５】Kellum and Schedl(1991)Cell 64:941
【非特許文献１６】Bode J et.al、(1992)Science 255:195
【非特許文献１７】P.A.Girod and Nicolas Mermod、Gene Transfer and Expression in Mammalian Cell、2003
【非特許文献１８】Phi-Van and Stratling、EMBO、7、3、655〜64頁、1988
【非特許文献１９】Stief et al、Nature、341、343〜345頁、1989
【非特許文献２０】Phi-Van et al、Molecular and Cellular Biology、10、5、2302〜2307頁、1990
【非特許文献２１】Poljak et al、(1994)Nucleic Acid Res、22(21):4386〜94頁
【非特許文献２２】DNA Cloning: Mammalian systems;By David M.Glover、B. D.Hames
【非特許文献２３】SAMBROOK、J.;FRITSCH、E.F.and MANIATIS、T.Molecular-Cloning: a laboratory manual.2nded.N.Y.、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989.1659頁
【非特許文献２４】Phi-Van、L.and Stratiing、W.H,Biochemistry35(33)、10735〜10742頁(1996)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
本発明は、哺乳動物細胞中での対象とするタンパク質の発現効率を増大する発現ベクターを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
一実施形態では、本発明は、対象とする遺伝子に作動可能に連結したプロモーター、発現増強エレメント、他の制御エレメント、すなわちTPL、VAIおよびII遺伝子またはそれらの変異体、翻訳終結因子および抗生物質マーカーを含む発現ベクターであって、発現増強エレメントがクロマチン結合領域である新規な発現ベクターを提供する。
【００２９】
一実施形態では、本発明は、治療用タンパク質およびペプチドの発現用の新規な発現ベクター構築物であって、MARおよび/またはSARから選択される発現増強エレメントと組み合わせて、クローニング部位に作動可能に連結したプロモーター、対象とする遺伝子、翻訳終結因子、TPL、VAIおよびII遺伝子、適切な抗生物質マーカーを含む発現ベクター構築物を提供する。
【００３０】
別の実施形態では、本発明は、治療用タンパク質およびペプチドの発現用の新規な発現ベクター構築物であって、MARおよび/またはSARから選択される発現増強エレメントと組み合わせて、クローニング部位に作動可能に連結したプロモーター、対象とする遺伝子、BGHなどの翻訳終結因子、イントロン、適切なマーカーおよび場合によっては内部リボソーム結合部位を含む発現ベクター構築物を提供する。
【００３１】
一実施形態では、本発明は、治療用タンパク質およびペプチドの発現用の新規な発現ベクター構築物であって、MARおよび/またはSARから選択される発現増強エレメントと組み合わせて、クローニング部位に作動可能に連結したプロモーター、対象とする遺伝子、BGHなどの翻訳終結因子、TPL、VAIおよびII遺伝子、イントロン、適切な抗生物質マーカーおよび場合によっては内部リボソーム結合部位を含む発現ベクター構築物を提供する。
【００３２】
さらに別の実施形態では、本発明は、本発明の実施形態による発現ベクターでトランスフェクトした哺乳動物宿主細胞において、対象とする遺伝子を発現させるための方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】pZRCIIのベクター略図である。
【図２】pZRCIIIのベクター略図である。
【図３】pZRCIII-TNK-Hygのベクター略図である。
【図４】pZRCIII-Darbe-Hygのベクター略図である。
【図５】pZRCIII-エタネルセプト-Hygのベクター略図である。
【図６】pZRCIII-FSHα-IRES-FSHβ-Hygベクターのベクター略図である。
【図７】pZRCIII-FSHβ-IRES-FSHα-Hygベクターのベクター略図である。
【図８】pZRCIII-TNK-Puroのベクター略図である。
【図９】pZRCIII-DARBE-Puroのベクター略図である。
【図１０】pZRCIII-FSHα-IRES-FSHβ-Puroベクターのベクター略図である。
【図１１】pZRCIII-FSHα-IRES-FSHβ-Neoベクターのベクター略図である。
【図１２】pZRCIII-FSHβ-IRES-FSHα-Neoベクターのベクター略図である。
【図１３】pZRCIII-エタネルセプト-Neoのベクター略図である。
【図１４】pZRCIII-TNK-Neoのベクター略図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
定義
クロマチン結合領域は、タンパク質核マトリックスとのその相互作用を介して形状的制約があるDNAループを形成する、クロマチンの構造構成要素である。
【００３５】
使用した略語:
CMV-サイトメガロウイルス
TPL-トリプレットリーダー
VA遺伝子またはVAIおよびII遺伝子-ウイルス結合RNA遺伝子IおよびII
BGH-ウシ成長ホルモン
【００３６】
本発明は、哺乳動物宿主細胞中で治療用タンパク質およびペプチドの発現の効率を有意に増大させる、新規な発現ベクターを提供する。新規なベクターは位置効果に関する欠点をさらに取り除き、制御エレメントの独自の組合せで得られる高い転写および翻訳という利点を加える。
【００３７】
一実施形態では、本発明は、対象とする遺伝子に作動可能に連結したプロモーター、発現増強エレメント、TPL、VAIおよびII遺伝子またはそれらの変異体、翻訳終結因子および抗生物質マーカーを含む発現ベクターであって、発現増強エレメントがクロマチン結合領域である新規な発現ベクターを提供する。クロマチン結合領域はMARおよびSARから選択される。
【００３８】
一実施形態では、本発明は、対象とする遺伝子に作動可能に連結したプロモーター、TPLおよびVA遺伝子IおよびII、マトリックス結合領域(MAR)/SAR、翻訳終結因子、抗生物質マーカーを含む、タンパク質およびペプチドの産生用の発現ベクターを提供する。
【００３９】
別の実施形態では、本発明は、治療用タンパク質およびペプチドの発現用の新規な発現ベクター構築物であって、MARおよび/またはSARから選択される発現増強エレメントと組み合わせて、クローニング部位に作動可能に連結したプロモーター、対象とする遺伝子、BGHなどの翻訳終結因子、イントロン、適切な抗生物質マーカーおよび場合によっては内部リボソーム結合部位を含む発現ベクター構築物を提供する。
【００４０】
一実施形態では、本発明は、治療用タンパク質およびペプチドの発現用の新規な発現ベクター構築物であって、MARおよび/またはSARから選択される発現増強エレメントと組み合わせて、クローニング部位に作動可能に連結したプロモーター、対象とする遺伝子、BGHなどの翻訳終結因子、TPL、VAIおよびII遺伝子、イントロン、適切な抗生物質マーカーおよび場合によっては内部リボソーム結合部位を含む発現ベクター構築物を提供する。
【００４１】
本発明の一実施形態によれば、プロモーターはCMVプロモーター、SV40プロモーター、アデノウイルスプロモーター、βアクチンプロモーター、メタロチオニン(metallothionin)プロモーターまたは他の原核もしくは真核ウイルスプロモーターからなる群から選択される。好ましい実施形態ではCMVプロモーターを使用する。
【００４２】
プロモーターは典型的には、それが制御する遺伝子付近、同じ鎖上および上流、すなわちセンス鎖の5'領域に向かって位置し、それは転写を容易にする。
【００４３】
本発明の一実施形態によれば、クローニング部位は、それだけには限られないが、
AatI、AatII、Acc113I、Acc16I、Acc65I、AccIII、AclNI、AseI、AsnI、Asp718I、BalI、
BamHI、BanI、BanII、BbeI、BbiII、BbsI、BbuI、Bbv16II、BclI、BcoI、BglI、BglII、BlnI、Bsh1365I、BsiEI、BsiHKAI、BsiI、BspEIBspHI、BstZI、CciNI、Cfr10I、Cfr42I、Cfr9I、CfrI、Csp45I、DrdI、DsaIEaeI、EagI、Eam1104I、Eco47III、Eco52I、Eco57I、Eco88I、Eco91I、EcoICRI、EcoO109I、EcoRI、EcoT14I、FriOI、FseI、FspI、HaeII、Hin1I、HincII、HindII、KasI、Ksp632I、KspI、KpnI、LspI、MamI、MflI、MluNI、MroI、MroNI、MspA1I、NaeI、NarI、NcoI、NdeI、NgoAIV、NheI、NotI、NspBII、NspI、NspV、PacI、PaeI、PflMI、PinAI、Ple19I、Pme55I、PmeI、Ppu10I、PpuMI、PshBI、Psp124BI、Psp5II、PspAI、PspALI、PspEI、PstI、PstNHI、PvuI、PvuII、SacI、SacII、ScaI、SfcI、SfiI、SpeI、SphI、Van91I、VneI、XhoI、XhoII、XmaI、XmaIII、Zsp2Iから選択することができる。
【００４４】
本発明の一実施形態によれば、翻訳終結因子は、ウシ成長ホルモン、アデノウイルスおよび真核ウイルス翻訳終結因子配列からなる群から選択される。好ましい実施形態では、翻訳終結因子はBGHポリAである。
【００４５】
さらなる実施形態では、内部リボソーム結合部位は、ピコルナウイルスIRES、アフソウイルスIRES、A型肝炎ウイルスIRES、C型肝炎ウイルスIRES、ペスチウイルスIRES、脳心筋炎ウイルスIRES、好ましくは脳心筋炎ウイルスIRESから選択される。
【００４６】
本発明の一実施形態によれば、マトリックス結合領域などの発現増強エレメントは、ニワトリリゾチームMAR、ショウジョウバエScs境界エレメント、hspSAP MAR、マウスT細胞受容体TCRα、ラット遺伝子座調節領域、β-グロビンMAR、およびアポリポタンパク質BSARエレメントから選択される。
【００４７】
好ましい実施形態では、ニワトリリゾチームMAR(配列番号5)は5'隣接配列または3'隣接配列でクローニングする。最も好ましい実施形態では、ニワトリリゾチームMARは転写アセンブリーの5'隣接配列と3'隣接配列の両方でクローニングする。
【００４８】
本発明において、対象とする遺伝子は当技術分野で知られている方法(SAMBROOK、J.;FRITSCH、E.F.and MANIATIS、T.Molecular-Cloning: a laboratory manual.2nded.N.Y.、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989.1659頁)に従い発現ベクターにクローニングする。本発明の一実施形態によれば、対象とする遺伝子は、組織プラスミノーゲンアクチベータ、TNK-TPA、ダルベポエチン、エリスロポエチン、インスリン、GCSF、インターロイキン、腫瘍壊死因子、インターフェロン、TNFR-IgGFcから選択される適切なタンパク質およびペプチドおよびそれらの機能性アナログ、リツキシマブ、ベバシズマブ、アダリムマブ、トラスツズマブ(一般名)などのモノクローナル抗体、およびFc領域、Fabのようなそれらの断片、GLP-I、GLP-II、IGF-I、IGF-II、血小板由来増殖因子、FVII、FVIII、FIVおよびFXIII、エキセンジン-3、エキセンジン4、MYT-2のような転写因子、NF-κΒ抑制因子NRF、AML1/RUNX1、Gtxホメオドメインタンパク質、真核生物翻訳開始因子4G(elF4G)a、真核生物翻訳開始因子4G1(elF4Gl)aのような翻訳因子、細胞死関連タンパク質5 (DAP5)、c-myc、L-myc、Pim-1のような癌遺伝子、プロテインキナーゼp58PITSLRE、p53、卵胞刺激ホルモン、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、ヒト黄体形成ホルモンなどから選択される性腺刺激ホルモンなどのホルモン、および免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(BiP)、熱ショックタンパク質70、ミトコンドリアH+-ATPシンターゼのβ-サブユニット、オルニチンデカルボキシラーゼ、コネキシン32および43、HIF-1a、APCをコードすることができる。したがって機能性アナログは、それらの原型タンパク質およびペプチドと類似もしくは同一の機能を有するタンパク質またはペプチドを意味する。
【００４９】
本発明によれば、発現ベクター構築物は、作動可能に連結したプロモーター、クローニング部位、対象とする遺伝子、翻訳終結因子、イントロン、適切な抗生物質マーカー、TPL、VA遺伝子IおよびIIをさらに含む発現アセンブリーを含む。この発現ベクターはpZRCIIと呼び配列番号4(6)で開示する。別の実施形態では、マトリックス結合領域(MAR)またはSAR好ましくはMARのような発現増強エレメントの遺伝子配列を、pZRCIIにおいてさらにクローニングする。この新規な発現ベクターはpZRCIIIと呼び配列番号6で開示する。マトリックス結合領域はpZRCIIIの5'または3'隣接領域でクローニングする。好ましい実施形態では、マトリックス結合領域はpZRCIIIの5'隣接領域と3'隣接領域の両方でクローニングする。本発明のpZRCIII構築物は従来技術で知られているベクターに優る進展であり、対象とする遺伝子の発現を有意に増強し、かつトランスフェクション効率を改善する。本発明のベクター構築物pZRCIIIは全タンパク質およびペプチドの発現に適している。
【００５０】
発現ベクターpZRCIII中に適した抗生物質マーカーは、カナマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシンおよびDHFRから選択される。別の実施形態では、発現ベクターpZRCIIIは、DHFRの遺伝子配列および/または内部リボソーム結合部位(IRES)を場合によっては有する。
【００５１】
一実施形態では、本発明は、治療用タンパク質およびペプチドの発現用の新規な発現ベクター構築物であって、MARおよび/またはSARから選択される発現増強エレメントと組み合わせて、クローニング部位に作動可能に連結したプロモーター、対象とする遺伝子、翻訳終結因子、TPL(配列番号2)、VAIおよびII遺伝子(配列番号3)、適切な抗生物質マーカーを含む発現ベクター構築物を提供する。
【００５２】
別の実施形態では、本発明は、治療用タンパク質およびペプチドの発現用の新規な発現ベクター構築物であって、MARおよび/またはSARから選択される発現増強エレメントと組み合わせて、クローニング部位に作動可能に連結したプロモーター、対象とする遺伝子、翻訳終結因子、イントロン(配列番号1)、適切なマーカーおよび場合によっては内部リボソーム結合部位を含む発現ベクター構築物を提供する。
【００５３】
望ましい発現のタンパク質およびペプチドの産生用の発現ベクターは、3エレメント、すなわちプロモーターの3'末端におけるアデノウイルストリプレットリーダー配列、アデノウイルスの主な後期転写産物の5'ドナー部位とTPL(配列番号2)の3'末端に位置するマウス免疫グロブリンの3'スプライス部位を含むハイブリッド(キメラ)イントロン、アデノウイルスVARNAIおよびII遺伝子(配列番号3)の取り込みだけには限られないが、適切なエレメントを含む。マトリックス結合領域はMluIにおける5'隣接配列、またはBGHポリA配列の末端における3'隣接配列でクローニングされる。マトリックス結合領域の方向は任意選択である。さらに、本発明のMARエレメントは、アデノウイルストリプレットリーダー配列、ハイブリッド(キメラ)イントロン、TPL(配列番号2)およびアデノウイルスVARNAIおよびII遺伝子(配列番号3)と組み合わせて所望遺伝子の発現を相互依存的に増強するだけでなく、トランスフェクション効率および所望クローンの数も増大する。
【００５４】
好ましい実施形態では、本発明は、治療用タンパク質およびペプチドの発現用の新規な発現ベクター構築物であって、MARおよび/またはSARから選択される発現増強エレメントと組み合わせて、クローニング部位に作動可能に連結したプロモーター、対象とする遺伝子、翻訳終結因子、TPL(配列番号2)、VAIおよびII遺伝子(配列番号3)、イントロン(配列番号1)、適切なマーカーおよび場合によっては内部リボソーム結合部位を含む発現ベクター構築物を提供する。一実施形態では、発現ベクターは、対象とする遺伝子に作動可能に連結したプロモーター、VAIおよびII遺伝子またはそれらの変異体、TPLまたはその変異体、キメライントロンまたはその変異体、抗生物質マーカー、マトリックス結合領域、場合によっては内部リボソーム結合部位、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列またはその変異体を含む。
【００５５】
一実施形態では、pZRCIII-対象とする遺伝子-ハイグロマイシンベクターは、CMVプロモーターにより駆動される対象とする遺伝子に作動可能に連結した配列番号5に記載されているcLysMAR、TPL、配列番号1に記載されているキメライントロン、配列番号3に記載されているVA遺伝子IおよびII、BGHポリアデニル化および多数のクローニング部位を含有する。多数のクローニング部位はXhoI、NotIのような制限部位を含む。発現カセット中のCMVプロモーター、TPL、キメライントロンなどの他の制御エレメントおよび発現カセット外に位置するVA遺伝子と組み合わせて発現カセットの上流と下流の両方にニワトリリゾチームMARエレメントを有するベクターの多数のクローニング部位にクローニングした融合タンパク質エタネルセプト(TNFR-Fc)の化学合成遺伝子のような、対象とする任意の遺伝子を、多数のクローニング部位でクローニングすることができる。ベクターはトランスフェクタントの選択用にハイグロマイシン耐性遺伝子を有する。本発明のこの態様に従い調製したベクター構築物の一例として、pZRCIII-エタネルセプトエタネルセプト-ハイグロマイシンベクターはブダペスト条約の下に寄託され、受託番号はMTCC5656である。
【００５６】
別の実施形態では、pZRCIII-対象とする遺伝子-ネオマイシンベクターは、CMVプロモーターに作動可能に連結した配列番号5に記載されているC-Lys-MAR、TPL、配列番号1に記載されているキメライントロン、配列番号3に記載されているVA遺伝子IおよびII、BGHポリアデニル化および多数のクローニング部位を含有する。多数のクローニング部位はXhoI、NotIのような制限部位を含む。発現カセット中のCMVプロモーター、TPL、キメライントロンなどの他の制御エレメントおよび発現カセット外に位置するVA遺伝子と組み合わせて発現カセットの上流と下流の両方にニワトリリゾチームMARエレメントを有するベクターの多数のクローニング部位にクローニングした融合タンパク質エタネルセプト(TNFR-Fc)の化学合成遺伝子のような、対象とする任意の遺伝子を、多数のクローニング部位でクローニングすることができる。ベクターはトランスフェクタントの選択用にハイグロマイシン(ネオマイシン)耐性遺伝子を有する。
【００５７】
本発明のこの態様に従い調製したベクター構築物の一例として、pZRCIII-エタネルセプト-ネオマイシンベクターはブダペスト条約の下に寄託され、受託番号はMTCC5657である。
【００５８】
別の実施形態では、pZRCIII-対象とする遺伝子-IRES-ハイグロマイシンベクターは、CMVプロモーターに作動可能に連結した配列番号5に記載されているcLysMAR、TPL、配列番号1に記載されているキメライントロン、配列番号3に記載されているVA遺伝子IおよびII、BGHポリアデニル化および多数のクローニング部位を含有する。多数のクローニング部位はXhoI、NotIのような制限部位を含む。発現カセット中のCMVプロモーター、TPL、キメライントロンなどの他の制御エレメントおよび発現カセット外に位置するVA遺伝子と組み合わせて発現カセットの上流と下流の両方にニワトリリゾチームMARエレメントを有する、ベクターの多数のクローニング部位にクローニングしたFSHαおよびFSHβサブユニットおよびIRESにより互いに作動可能に連結したFSHαとFSHβサブユニットの両方の化学合成遺伝子のような、対象とする任意の遺伝子を、多数のクローニング部位でクローニングすることができる。ベクターはトランスフェクタントの選択用にハイグロマイシン耐性遺伝子を有する。本発明のこの態様に従い調製したベクター構築物の一例として、pZRCIIIFSHα-IRES- FSHβ-ハイグロマイシンベクターはブダペスト条約の下に寄託され、受託番号はMTCC5655である。
【００５９】
一実施形態では、当業者に知られている方法により、発現ベクターを哺乳動物宿主細胞にトランスフェクトする。哺乳動物宿主細胞は、タンパク質の工業生産用のよく知られているCHO(チャイニーズハムスター卵巣)細胞系、BHK(ベビーハムスター腎臓)細胞系などから選択することができる。別の実施形態では、トランスフェクトした宿主細胞を、カナマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシンから選択される適切な抗生物質を含有する異なるベクターでさらにトランスフェクトして、対象とする遺伝子の発現をさらに増大させる。
【００６０】
一実施形態では、トランスフェクトする細胞系は、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、カナマイシン、G418または他の抗生物質の使用により選択されるCHOK1である。
【００６１】
さらに、発現ベクターがDHFRの遺伝子を有する場合、DHFR選択培地、例えばメトトレキサートの使用によりトランスフェクト細胞系が選択される。この選択は、トランスフェクト細胞系に対する選択圧の段階的増大を利用するものである(Kaufman and Sharp、1982; Schimke et al、1982)。
【００６２】
さらに別の実施形態では、発現ベクターがグルタミンシンテターゼの遺伝子を有するとき、グルタミンシンテターゼ(GS)選択培地、例えばメチオニンスルホキシミン(MSX)においてトランスフェクトされた細胞系が選択される。
【００６３】
したがって本発明は、転写および翻訳を著しく増大し、遺伝子組み込みの位置効果も抑制する制御エレメントの特有な組合せを含み、したがって組換えタンパク質の安定した、高発現に相乗効果をもたらす新規な発現ベクターを提供する。さらに本発明は、時間効率の良い形式で産業規模での治療用タンパク質およびペプチド、モノクローナル抗体の産生をもたらす。大きな労働力を要する多数のクローンのスクリーニングは、典型的エレメントの存在下で劇的に減少するからである。さらに本発明の発現ベクターは、一過性と安定的発現の両方に使用することができる。
【００６４】
実施例を用いて本発明をさらに例示する。これらの実施例は単なる例示目的であり、本発明はこれらにのみ限られるわけではない。
【００６５】
（実施例）
（実施例1）
pZRCIIIベクターの構築
本発明者らの以前の特許出願WO2007017903中に記載した、全ての制御エレメント、すなわちTPL、VA、CMVプロモーター、キメライントロン、およびBGHポリアデニル化および終結配列を有する完全な転写アセンブリーは、GeneART、ドイツで化学合成された。クローニングベクターpMK(GeneART、ドイツ)でクローニングしたこの完全なアセンブリーは、pZRCIIと呼んだ(図1、配列番号4)。ニワトリリゾチームMARDNA断片(配列番号5)、(Phi-Van、L.and Stratling、W.H,Biochemistry35(33)、10735〜10742頁(1996))を化学合成し、クローニングベクターでクローニングした。2つのニワトリリゾチームMAR断片を、ベクター中に既に予め設計したSacIおよびMluI部位を使用して、pZRCIIベクター中の発現カセットの片側に隣接配列として挿入した。SacI部位を有するプライマーを使用したPCRにより、SacIオーバーハングをニワトリリゾチームMAR断片に加えた。具体的には、50mMのトリス-Cl(pH8.3)、2.5mMのMgCl2、各250μΜの4dNTPおよび5ユニットのPfuポリメラーゼを含有する50μl体積中に100ピコモルの遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、40サイクルのPCR増幅を実施した。各PCR増幅サイクルは、95℃で30秒間のインキュベーション(変性)、62℃で30秒間の(アニーリング)および72℃で2分間の(伸長)からなっていた。PCR反応の増幅産物は1%アガロースゲルで分離した。約1664塩基対サイズの所望断片をゲルから切除し、Qiagenゲル抽出キットを使用して精製した。SacI(MBI Fermentas、USA)でのベクターと精製PCR産物の両方の制限酵素による消化後、この精製DNA断片をpZRCIIベクターに連結させた。連結産物は大腸菌(E.coli)Top10F'において形質転換し、得られた形質転換体はカナマイシン耐性に基づいてスコア化した。幾つかのこのようなコロニーから単離したプラスミドDNAは、様々な制限酵素を使用した制限酵素による消化により、ニワトリリゾチームMAR断片の存在に関して分析した。pZRCIIベクター中に正確な組み込みがあることが分かった1つのこのようなプラスミドは、pZRCII1MAR(Sac)中間体ベクターと名付けた。
【００６６】
MluIオーバーハングを別のニワトリリゾチームMAR断片に加えるため、それを50mMのトリス-Cl(pH8.3)、2.5mMのMgCl2、各250μΜの4dNTPおよび5ユニットのPfuポリメラーゼを含有する50μl体積中に100ピコモルの遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用する40サイクルのPCR増幅に供した。各PCR増幅サイクルは、95℃で30秒間のインキュベーション(変性)、60℃で30秒間の(アニーリング)および72℃で2分間の(伸長)からなっていた。PCR反応の増幅産物は1%アガロースゲルで分離した。約1650塩基対サイズの所望断片をゲルから切除し、Qiagenゲル抽出キットを使用して精製した。MluI(MBI Fermentas、USA)でのベクターと精製PCR産物の両方の制限酵素による消化後、この精製DNA断片をpZRCII-lMAR(Sac)ベクターに連結させた。連結産物は大腸菌(E.coli)Top10F'において形質転換し、形質転換体はカナマイシン耐性に基づいてスコア化した。約10個のこのようなコロニーから単離したプラスミドDNAは、様々な制限酵素を使用した制限酵素による消化により、MluI位置におけるニワトリリゾチームMAR断片の存在に関して分析した。pZRCII-lMAR(Sac)ベクター中のMluI部位にcLysMARの正確な組み込みがあることが分かった1つのこのようなプラスミドはpZRCIIIと名付けた(図2、配列番号6)。
【００６７】
（実施例2）
pZRCIII-TNKベクターの構築
テネクテプラーゼ(TNKaseまたはTNK-TPA)遺伝子(配列番号7)を化学合成し、クローニングベクターpMK(Geneart、ドイツ)にクローニングした。pZRCIIベクターにおけるTNK遺伝子をクローニングするため、第1のEcoRIおよびNotIオーバーハングを、50mMのトリス-Cl(pH8.3)、2.5mMのMgCl2、各250μΜの4dNTPおよび5ユニットのPfuポリメラーゼを含有する50μl体積において100ピコモルの前述の制限部位を含有する遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用する40サイクルのPCR増幅を使用して、TNK遺伝子中に取り込んだ。各PCR増幅サイクルは、95℃で30秒間のインキュベーション(変性)、60℃で45秒間の(アニーリング)および72℃で2分間の(伸長)からなっていた。PCR反応の増幅産物は1%アガロースゲルで分離した。約1710塩基対サイズの所望断片をゲルから切除し、Qiagenゲル抽出キットを使用して精製した。TNKのこの精製DNA断片をEcoRIおよびNotIで消化し、EcoRIおよびNotI(MBI Fermentas、USA)で消化した(実施例1中に記載の)pZRCIIIベクターに連結させた。連結産物は大腸菌(E.coli)Top10F'において形質転換し、形質転換体はカナマイシン耐性に基づいてスコア化した。約10個のこのようなコロニーから単離したプラスミドDNAは、様々な制限酵素を使用した制限酵素による消化によりTNK断片の存在に関して分析した。pZRCIIIベクター中に組み込まれたTNK遺伝子を有する1つのこのようなプラスミドはpZRCIII-TNKと名付けた。
【００６８】
（実施例3）
pZRCIII-TNK-Hygベクターの構築
SV40プロモーターおよび終結因子制御ハイグロマイシン耐性遺伝子を有する約1550塩基対サイズのハイグロマイシン転写アセンブリーを、Pfuポリメラーゼ(MBI Fermentas、USA)を使用して平滑末端処理し、KpnI(MBI Fermentas、USA)で事前に消化処理しPfuポリメラーゼを使用して平滑末端処理したpZRCIII-TNKベクターに次いで連結させた。連結産物は大腸菌(E.coli)Top10F'において形質転換し、形質転換体はカナマイシン耐性に基づいてスコア化した。幾つかのこのようなコロニーから単離したプラスミドDNAは、様々な制限酵素を使用した制限酵素による消化により、ハイグロマイシン耐性遺伝子の存在に関して分析した。pZRCIII-TNKベクター中に組み込まれたハイグロマイシン転写アセンブリーを有する1つのこのようなプラスミドはpZRCIII-TNK-Hygベクターと名付けた(図3、配列番号8)。次いでこのベクターを、自動DNAシークエンサー(ABI)を使用したDNA配列決定に供して、クローニングしたTNK遺伝子の配列を確認した。
【００６９】
（実施例4）
pZRCIII-Darbe-Hygベクターの構築
pZRC-EPO(WO2007017903)を、約600bpのダルベポエチン遺伝子断片(配列番号9および対応するDNA配列ID21)を得るためのエリスロポエチン遺伝子の部位特異的突然変異誘発を実施するための鋳型として使用し、次いでそれをTAベクターpTZ57R(MBI Fermentas)でクローニングしpTZ57R-Darbeと呼んだ。
【００７０】
pZRCIII-TNK-HygをXhoIおよびNotIで消化してTNK遺伝子を除去し、残りの高分子量DNAはダルベポエチン遺伝子挿入物との連結用のベクターとして使用した。pTZ57R-DarbeはXhoIおよびNotIで消化して約600bpのダルベポエチン遺伝子断片をゲル単離した。ベクターと挿入物の両方の連結を実施し、連結産物は大腸菌(E.coli)Top 10F'において形質転換し、形質転換体はカナマイシン耐性に基づいてスコア化した。幾つかのこのようなコロニーから単離したプラスミドDNAは、様々な制限酵素を使用した制限酵素による消化により、ダルベポエチン遺伝子の存在に関して分析した。組み込まれたダルベポエチン遺伝子を有する1つのこのようなプラスミドはpZRCIII-Darbe-Hygベクターと名付けた(図4、配列番号10)。次いでこのベクターを、自動DNAシークエンサー(ABI)を使用したDNA配列決定に供して、クローニングダルベポエチンした遺伝子の配列を確認した。
【００７１】
（実施例5）
pZRCIII-エタネルセプト-Hygベクターの構築
ベクターpZRCIII-Darbe-HygをXhoIおよびNotI酵素(MBI Fermentas)で消化し、約600bpのダルベポエチン遺伝子を除去し、約9430bpのベクター骨格を作製した。約1481bpの化学合成した、CHOコドン最適化、エタネルセプト遺伝子(配列番号11および対応するDNA配列ID22)を、XhoIおよびNotI(MBI Fermentas)を使用しクローニングベクターから単離し挿入物を得た。ベクターと挿入物の両方の連結を実施し、連結産物は大腸菌(E.coli)Top10F'において形質転換し、形質転換体はカナマイシン耐性に基づいてスコア化した。幾つかのこのようなコロニーから単離したプラスミドDNAは、様々な制限酵素を使用した制限酵素による消化により、エタネルセプト遺伝子の存在に関して分析した。組み込まれたエタネルセプト遺伝子を有する1つのこのようなプラスミドはpZRCIII-エタネルセプト-Hygベクターと名付けた(図5、配列番号12)。次いでこのベクターを、自動DNAシークエンサー(ABI)を使用したDNA配列決定に供して、クローニングしたエタネルセプト遺伝子の配列を確認した。
【００７２】
（実施例6）
pZRCIII-FSHα-IRES-FSHβ-Hygベクターの構築
a)pZRCIII-FSHα-Hygベクターの構築
約9430bpのベクター骨格を、pZRCIII-Darbe-HygベクターをXhoIおよびNotI酵素(MBI Fermentas)で消化して約600bpのダルベポエチン遺伝子を除去することにより作製した。約359bpのFSHαサブユニットの化学合成遺伝子(配列番号13および対応するDNA配列ID23)を、酵素XhoIおよびNotI(MBI Fermentas)を使用して、GeneartクローニングベクターpMAから単離した。ベクターと挿入物の両方の連結を実施し、連結産物は大腸菌(E.coli)Top10F'において形質転換し、形質転換体はカナマイシン耐性に基づいてスコア化した。幾つかのこのようなコロニーから単離したプラスミドDNAは、様々な制限酵素を使用した制限酵素による消化により、FSHαサブユニット遺伝子の存在に関して分析した。組み込まれたFSHαサブユニット遺伝子を有する1つのこのようなプラスミドはpZRCIII-FSHα-Hygベクターと名付けた。
【００７３】
b)pZRCIII-FSHα-IRES-FSHβ-Hygベクターの構築
ベクターpZRCIII-FSHα-HygをNotI(MBI Fermentas)で消化して約9790bpのベクター骨格を作製した。約591bpのIRES遺伝子断片(配列番号14)を、酵素NotIおよびXmaI(MBI Fermentas)を使用しベクターpIRESHygから単離して、第1の挿入物を得た。約401bpのFSHβサブユニットの化学合成遺伝子(配列番号15および対応するDNA配列ID24)を、酵素XmaIおよびNotI(MBI Fermentas)を使用しGeneartクローニングベクターpMAから単離して、第2の挿入物を得た。この2つの挿入物を融合させ、融合遺伝子産物を前述のベクターと連結させた。次いで連結産物は大腸菌(E.coli)Top10F'において形質転換し、形質転換体はカナマイシン耐性に基づいてスコア化した。幾つかのこのようなコロニーから単離したプラスミドDNAは、様々な制限酵素を使用した制限酵素による消化により、IRESおよびFSHβサブユニット遺伝子の存在に関して分析した。組み込まれたIRESおよびFSHβサブユニット遺伝子を有する1つのこのようなプラスミドはpZRCIII-FSHα-IRES-FSHβ-Hygベクターと名付けた(図6、配列番号16)。次いでこのベクターを、自動DNAシークエンサー(ABI)を使用したDNA配列決定に供して、クローニングしたFSHαおよびFSHβ遺伝子の配列を確認した。クローニングした遺伝子の配列は自動DNAシークエンサー(ABI)の使用により確認した。
【００７４】
（実施例7）
pZRCIII-FSHβ-IRES-FSHα-Hygベクターの構築
a)pZRCIII-FSHβ-Hygベクターの構築
FSHα、IRESおよびFSHβ遺伝子の除去後、ベクターpZRCIII-FSHα-IRES-FSHβ-HygをXhoIおよびNotI(MBI Fermentas)で消化して約9430bpのベクター骨格を作製した。約401bpのFSHβサブユニットの化学合成遺伝子を、酵素XhoIおよびNotI(MBI Fermentas)を使用して、GeneartクローニングベクターpMAから単離した。ベクターと挿入物の両方の連結を実施し、連結産物は大腸菌(E.coli)Top10F'において形質転換し、形質転換体はカナマイシン耐性に基づいてスコア化した。幾つかのこのようなコロニーから単離したプラスミドDNAは、様々な制限酵素を使用した制限酵素による消化により、FSHβサブユニット遺伝子の存在に関して分析した。組み込まれたFSHβサブユニット遺伝子を有する1つのこのようなプラスミドはpZRCIII-FSHβ-Hygベクターと名付けた。
【００７５】
b)pZRCIII-FSHβ-IRES-FSHα-Hygベクターの構築
ベクターpZRCIII-FSHβ-HygをNotI(MBI Fermentas)で消化して約9790bpのベクター骨格を作製した。約591bpのIRES遺伝子断片を、酵素NotIおよびXhoI(MBI Fermentas)を使用しベクターpIRESHygから単離して、第1の挿入物を得た(IRES)。約359bpのFSHαサブユニットの化学合成遺伝子を、酵素XhoIおよびNotI(MBI Fermentas)を使用しGeneartクローニングベクターpMAから単離して、第2の挿入物を得た。これにベクターと2つの挿入物の3片連結を続けた。次いで連結産物は大腸菌(E.coli)Top10F'において形質転換し、形質転換体はカナマイシン耐性に基づいてスコア化した。幾つかのこのようなコロニーから単離したプラスミドDNAは、様々な制限酵素を使用した制限酵素による消化により、IRESおよびFSHαサブユニット遺伝子の存在に関して分析した。組み込まれたIRESおよびFSHαサブユニット遺伝子を有する1つのこのようなプラスミドはpZRCIII-FSHβ-IRES-FSHα-Hygベクターと名付けた(図7)。クローニングした遺伝子の配列は自動DNAシークエンサー(ABI)の使用により確認した。
【００７６】
（実施例10）
pZRCIII-TNK-ピューロマイシンベクターの構築
SV40プロモーターおよび終結因子制御ピューロマイシン耐性遺伝子を有し、BamHI(MBI Fermentas、USA)でさらに消化したpZRCIII-TNK-ベクターに連結したBamH1適合末端を保持する、約1110塩基対サイズのピューロマイシン転写アセンブリー。連結産物は大腸菌(E.coli)Top10F'において形質転換し、形質転換体はカナマイシン耐性に基づいてスコア化した。幾つかのこのようなコロニーから単離したプラスミドDNAは、様々な制限酵素を使用した制限酵素による消化により、ピューロマイシン断片の存在に関して分析した。pZRCIII-TNKベクター中に組み込まれたピューロマイシン転写アセンブリーを有する1つのこのようなプラスミドはpZRCIII-TNK-Puroベクターと名付けた(図8、配列番号17)。クローニングしたTNK遺伝子の配列は自動DNAシークエンサー(ABI)の使用により確認した。
【００７７】
（実施例11）
pZRCIII-ダルベポエチン-Puroベクターの構築
pZRCIII-TNK-PuroをXhoIおよびNotI(MBI Fermentas)で消化してTNK遺伝子断片を除去した。pTZ57R-DarbeをXhoIおよびNotIで消化して、約600bpのダルベポエチン遺伝子断片をゲルから単離した。ベクターと挿入物の両方の連結を実施した。連結産物は大腸菌(E.coli)Top10F'において形質転換し、形質転換体はカナマイシン耐性に基づいてスコア化した。幾つかのこのようなコロニーから単離したプラスミドDNAは、様々な制限酵素を使用した制限酵素による消化により、ダルベポエチン遺伝子断片の存在に関して分析した。組み込まれたダルベポエチン遺伝子を有する1つのこのようなプラスミドはpZRCIII-Darbe-Puroベクターと名付けた(図9、配列番号18)。クローニングしたダルベポエチン遺伝子の配列は自動DNAシークエンサー(ABI)の使用により確認した。
【００７８】
（実施例12）
pZRCIII-FSHα-IRES-FSHβ-Puroベクターの構築
pZRCIII-FSHα-IRES-FSHβ-Hygベクターからハイグロマイシンカセットを除去し、特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCR反応を使用して、pZRCIII-Darbe-Puroから増幅したSV40プロモーターおよび終結因子制御ピューロマイシン耐性遺伝子を有する約1110塩基対サイズのピューロマイシン転写アセンブリーと置換した。得られたPCR産物は特異的エンドヌクレアーゼを使用して消化し、ベクター骨格とのさらなる連結に使用した。連結産物は大腸菌(E.coli)Top10F'において形質転換し、形質転換体はカナマイシン耐性に基づいてスコア化した。幾つかのこのようなコロニーから単離したプラスミドDNAは、様々な制限酵素を使用した制限酵素による消化により、ピューロマイシン遺伝子の存在に関して分析した。組み込まれたピューロマイシン遺伝子を有する1つのこのようなプラスミドはpZRCIII-FSHα-IRES-FSHβ-Puroベクターと名付けた(図10)。
【００７９】
（実施例13）
pZRCIII-FSHα-IRES-FSHβ-Neoベクターの構築
ピューロマイシン耐性遺伝子の除去後、ベクターpZRCIII-FSHα-IRES-FSHβ-PuroをPacIおよびBamHI(MBI Fermentas)で消化して約9980bpのベクター骨格を作製した。約1518bpのネオマイシン耐性遺伝子をpcDNA3.1(Invitrogen)プラスミドから単離した。ベクターと挿入物の両方の連結を実施し、連結産物は大腸菌(E.coli)Top10F'において形質転換し、形質転換体はカナマイシン耐性に基づいてスコア化した。幾つかのこのようなコロニーから単離したプラスミドDNAは、様々な制限酵素を使用した制限酵素による消化により、ネオマイシン遺伝子断片の存在に関して分析した。組み込まれたネオマイシン耐性サブユニット遺伝子を有する1つのこのようなプラスミドはpZRCIII-FSHα-IRES-FSHβ-Neoベクターと名付けた(図11)。FSHα、IRESおよびFSHβ遺伝子の配列は自動DNAシークエンサー(ABI)の使用により確認した。
【００８０】
（実施例14）
pZRCIII-FSHβ-IRES-FSHα-Neoベクターの構築
a)pZRCIII-FSHβ-Neoベクターの構築
FSHα、IRESおよびFSHβ遺伝子の除去後、ベクターpZRCIII-FSHα-IRES-FSHβ-NeoをXhoIおよびNotI(MBI Fermentas)で消化して約9400bpのベクター骨格を作製した。約401bpのFSHβサブユニットの化学合成遺伝子を、酵素XhoIおよびNotI(MBI Fermentas)を使用して、GeneartクローニングベクターpMAから単離した。ベクターと挿入物の両方の連結を実施し、連結産物は大腸菌(E.coli)Top10F'において形質転換し、形質転換体はカナマイシン耐性に基づいてスコア化した。幾つかのこのようなコロニーから単離したプラスミドDNAは、様々な制限酵素を使用した制限酵素による消化により、FSHβサブユニット遺伝子の存在に関して分析した。組み込まれたFSHβサブユニット遺伝子を有する1つのこのようなプラスミドはpZRCIII-FSHβ-Neoベクターと名付けた。
【００８１】
b)pZRCIIIFSHβ-IRES-FSHα-Neoベクターの構築
ベクターpZRCIII-FSHβ-NeoをNotI(MBI Fermentas)で消化して約9800bpのベクター骨格を作製した。約591bpのIRES遺伝子断片を、酵素NotIおよびXhoI(MBI Fermentas)を使用しベクターpIRESHygから単離して、第1の挿入物を得た。約359bpのFSHαサブユニットの化学合成遺伝子を、酵素XhoIおよびNotI(MBI Fermentas)を使用しGeneartベクターpMAから単離して、第2の挿入物を得た。これにベクターと2つの挿入物の3片連結を続けた。次いで連結産物は大腸菌(E.coli)Top10F'において形質転換し、形質転換体はカナマイシン耐性に基づいてスコア化した。幾つかのこのようなコロニーから単離したプラスミドDNAは、様々な制限酵素を使用した制限酵素による消化により、IRESおよびFSHαサブユニット遺伝子の存在に関して分析した。組み込まれたIRESおよびFSHαサブユニット遺伝子を有する1つのこのようなプラスミドはpZRCIIIFSHβ-IRES-FSHα-Neoベクターと名付けた(図12)。クローニングした遺伝子の配列は自動DNAシークエンサー(ABI)の使用により確認した。
【００８２】
（実施例17）
pZRCIII-エタネルセプト-Neoベクターの構築
ベクターpZRCIII-FSHα-IRES-FSHβ-NeoをXhoIおよびNotI(MBI Fermentas)酵素で消化してFSHα、IRESおよびFSHβ遺伝子を除去し、エタネルセプト遺伝子のクローニングに使用する約9400bpのベクター骨格を得た。エタネルセプトの約1481bp遺伝子を、XhoIおよびNotI(MBI Fermentas)酵素を使用しベクターpZRCIII-エタネルセプト-Hygから単離して、挿入物を得た。ベクターと挿入物の両方の連結を実施し、連結産物は大腸菌(E.coli)Top10F'において形質転換し、形質転換体はカナマイシン耐性に基づいてスコア化した。約数個のこのようなコロニーから単離したプラスミドDNAは、様々な制限酵素を使用した制限酵素による消化によりエタネルセプト遺伝子の存在に関して分析した。組み込まれたエタネルセプト遺伝子を有する1つのこのようなプラスミドはpZRCIII-エタネルセプト-Neoベクターと名付けた(図13、配列番号19)。クローニングしたエタネルセプト遺伝子の配列は自動DNAシークエンサー(ABI)の使用により確認した。
【００８３】
（実施例18）
pZRCIII-TNK-Neoベクターの構築
ベクターpZRCIII-エタネルセプト-Neoを酵素XhoIおよびNotI(MBI Fermentas)で消化して約1481bpのエタネルセプト遺伝子を除去し、約9400bpのベクター構築物を得た。約1692bpのTNK遺伝子の挿入物を、XhoIおよびNotI酵素(MBI Fermentas)によるベクターpZRCIII-TNK-Hygの消化後に得た。ベクターと挿入物の両方の連結を実施し、連結産物は大腸菌(E.coli)Top10F'において形質転換し、形質転換体はカナマイシン耐性に基づいてスコア化した。幾つかのこのようなコロニーから単離したプラスミドDNAは、様々な制限酵素を使用した制限酵素による消化により、TNK遺伝子の存在に関して分析した。組み込まれたTNK遺伝子を有する1つのこのようなプラスミドはpZRCIII-TNK-Neoベクターと名付けた(図14)。クローニングしたTNK遺伝子の配列は自動DNAシークエンサー(ABI)の使用により確認した。
【００８４】
（実施例19）
エタネルセプトの発現
設定I-pZRCIII-エタネルセプト-Hygベクターを使用したCHO-K1-S細胞系における安定的トランスフェクション
Freestyle(商標)CHO-K1-S細胞を、4mMのグルタミンを補充したPowerCHO2CD培地(化学的に定義された培地、Lonza)中で通常通り培養した。細胞は攪拌下(120rpm)37℃、および5%CO2において、湿度調節機能付きインキュベーター中に保った。細胞は3日/4日毎に計数し、完全な培地交換を行った。トランスフェクションはNeonトランスフェクション系(Invitrogen)を使用して実施した。トランスフェクション1日前に、CHO-KI-S細胞を新たな培地に継代し、トランスフェクションに使用する前に少なくとも一回の倍加を可能にした。製造者(Invitrogen)により記載された標準プロトコールに従い、SgsI(AscI)線状pZRCIII-エタネルセプト-Hygプラスミドを使用してトランスフェクションを実施した。トランスフェクション後、1mLの予め温めた培養培地を含有する24ウエルプレートの1ウエルに、細胞を移した。細胞は37℃、5%CO2において湿度調節機能付きインキュベーター中に保った。翌日、ミニプールでの生成用に、4mMのグルタミンおよび600μg/mlのハイグロマイシンを補充したProCHO5培地(Lonza)中96ウエルプレート中に、トランスフェクト集団を平板培養した。15〜30日後、ELISAによる産物形成の分析のため、96ウエルプレートから上清を除去した。選択した高発現ミニプールは次いで24ウエルプレート、およびその後4mMのグルタミンおよび600μg/mlのハイグロマイシンを補充したPowerCHO2CD培地(化学的に定義された培地、Lonza)中の6ウエルプレートに移し、ELISAにより各レベルで発現レベルを分析した。高発現ミニプールを選択して、4mMのグルタミンおよび600μg/mlのハイグロマイシンを補充したProCHO5培地(Lonza)中96ウエルプレート中で単細胞限界希釈を実施した。約15〜30日後、ELISAによる産物形成の分析のため、96ウエルプレートから上清を除去した。選択した高発現クローンは次いで24ウエルプレート、およびその後4mMのグルタミンおよび600μg/mlのハイグロマイシンを補充したPowerCHO2CD培地(化学的に定義された培地、Lonza)中の6ウエルプレートに移し、ELISAにより各レベルで発現レベルを分析した。高産生クローンはリトランスフェクション用に選択した。
【００８５】
設定II-pZRCIII-エタネルセプト-Neoベクターを使用して設定Iから得たクローンの安定的リトランスフェクション
高発現クローンを選択して、設定Iのトランスフェクションと同じ手順により、SgsI(AcsI)により線状化したpZRCIII-エタネルセプト-Neoプラスミドを使用してリトランスフェクションを実施した。翌日、ミニプールでの生成用に、4mMのグルタミン、600μg/mlのハイグロマイシン、および500μg/mlのネオマイシンを補充したProCHO5培地(Lonza)中96ウエルプレート中に、トランスフェクト集団を平板培養した。15〜30日後、ELISAによる産物形成の分析のため、96ウエルプレートから上清を除去した。選択した高発現ミニプールは次いで24ウエルプレート、およびその後4mMのグルタミンを補充したPowerCHO2CD培地(化学的に定義された培地、Lonza)中6ウエルプレートに移し、ELISAにより各レベルで前記抗生物質選択圧および発現レベルを分析した。高産生ミニプールを選択して、4mMのグルタミンを補充したProCHO5培地(Lonza)中96ウエルプレート中で単細胞限界希釈を実施した。再度15〜30日後、ELISAによる産物形成の分析のため、96ウエルプレートから上清を除去した。選択した高発現クローンは次いで24ウエルプレート、およびその後4mMのグルタミンを補充したPowerCHO2CD培地(化学的に定義された培地、Lonza)中6ウエルプレートに移し、ELISAにより各レベルで発現レベルを分析した。高発現リトランスフェクトクローンを選択して、フェドバッチ形式で攪拌チューブ中の産物形成を分析した。これらの実験は、120rpm、37℃、5%CO2でシェーカー(Kuhner-Germany)上のスピンチューブにおいて、これらの選択クローンを使用して実施した。クローンは12日間で約700mg/l〜1000mg/lの範囲の生産レベルをもたらした。
【００８６】
（実施例20）
TNKの発現
設定I-pZRCIII-TNK-Hygベクターを使用したCHO-K1-S細胞系における安定的トランスフェクション
Freestyle(商標)CHO-K1-S細胞を、4mMのグルタミンを補充したPowerCHO2CD培地(化学的に定義された培地、Lonza)中で通常通り培養した。細胞は攪拌下(120rpm)37℃、および5%CO2において、湿度調節機能付きインキュベーター中に保った。細胞は3日/4日毎に計数し、完全な培地交換を行った。トランスフェクションはNeonトランスフェクション系(Invitrogen)を使用して実施した。トランスフェクション1日前に、CHO-KI-S細胞を新たな培地に継代し、トランスフェクションに使用する前に少なくとも一回の倍加を可能にした。製造者(Invitrogen)により記載された標準プロトコールに従い、SgsI(AscI)線状pZRCIII-TNK-Hygプラスミドを使用してトランスフェクションを実施した。トランスフェクション後、1mLの予め温めた培養培地を含有する24ウエルプレートの1ウエルに、細胞を移した。細胞は37℃、5%CO2において湿度調節機能付きインキュベーター中に保った。翌日、ミニプールでの生成用に、4mMのグルタミンおよび500μg/mlのハイグロマイシンを補充した PowerCHO2CD培地(化学的に定義された培地、Lonza)中96ウエルプレート中に、トランスフェクト集団を平板培養した。15〜30日後、ELISAによる産物形成の分析のため、96ウエルプレートから上清を除去した。選択した高発現ミニプールは次いで24ウエルプレート、およびその後6ウエルプレートに移し、ELISAにより各レベルで発現レベルを分析した。高発現ミニプールを選択して、4mMのグルタミンおよび500μg/mlのハイグロマイシンを補充した PowerCHO2CD培地(化学的に定義された培地、Lonza)中96ウエルプレート中で単細胞限界希釈を実施した。約15〜30日後、ELISAによる産物形成の分析のため、96ウエルプレートから上清を除去した。選択した高発現クローンは次いで24ウエルプレート、およびその後6ウエルプレートに移し、ELISAにより各レベルで発現レベルを分析した。高産生クローンはリトランスフェクション用に選択した。高発現クローンを選択して、フェドバッチ形式で攪拌チューブ中の産物形成を分析した。これらの実験は、230rpm、37℃、5%CO2でシェーカー(Kuhner-Germany)上のスピンチューブ、10ml培地で、これらの選択クローンを使用して実施した。クローンは9日間で150mg/lの生産レベルをもたらした。
【００８７】
設定IIa-pZRCIII-TNK-Puroベクターを使用して設定Iから得たクローンの安定的リトランスフェクション
高発現クローンを選択して、設定Iのトランスフェクションと同じ手順により、SgsI(AcsI)により線状化したpZRCIII-TNK-Puroプラスミドを使用してリトランスフェクションを実施した。翌日、ミニプールでの生成用に、4mMのグルタミン、500μg/mlのハイグロマイシン、および3ug/mlのピューロマイシンを補充したPowerCHO2CD培地(化学的に定義された培地、Lonza)中96ウエルプレート中に、トランスフェクト集団を平板培養した。15〜30日後、ELISAによる産物形成の分析のため、96ウエルプレートから上清を除去した。選択した高発現ミニプールは次いで24ウエルプレート、およびその後6ウエルプレートに移し、ELISAにより各レベルで発現レベルを分析した。高産生ミニプールを選択して、4mMのグルタミンを補充したPowerCHO2CD培地(化学的に定義された培地、Lonza)中96ウエルプレート中で単細胞限界希釈を実施した。再度約15〜20日後、ELISAによる産物形成の分析のため、96ウエルプレートから上清を除去した。選択した高発現クローンは次いで24ウエルプレート、およびその後6ウエルプレートに移し、ELISAにより各レベルで発現レベルを分析した。高発現クローンを選択して、フェドバッチ形式で攪拌チューブ中の産物形成を分析した。これらの実験は、120rpm、37℃、5%CO2でシェーカー(Kuhner-Germany)上のスピンチューブ内で、これらの選択クローンを使用して実施した。クローンは11日間で290mg/lの生産レベルをもたらした。
【００８８】
設定IIb-pZRCIII-TNK-Neoベクターを使用して設定Iから得たクローンの安定的リトランスフェクション
高産生クローンを選択して、設定Iのトランスフェクションと同じ手順により、SgsI(AcsI)により線状化したpZRCIII-TNK-Neoプラスミドを使用してリトランスフェクションを実施した。翌日、ミニプールでの生成用に、4mMのグルタミン、600μg/mlのハイグロマイシン、および500μg/mlのネオマイシンを補充したProCHO5培地(Lonza)中96ウエルプレート中に、トランスフェクト集団を平板培養した。15〜30日後、ELISAによる産物形成の分析のため、96ウエルプレートから上清を除去した。選択した高発現ミニプールは次いで24ウエルプレート、およびその後4mMのグルタミンを補充したPowerCHO2CD培地(化学的に定義された培地、Lonza)中6ウエルプレートに移し、ELISAにより各レベルで前記抗生物質選択圧および発現レベルを分析した。高産生ミニプールを選択して、4mMのグルタミンを補充したProCHO5培地(Lonza)中96ウエルプレート中で単細胞限界希釈を実施した。再度15〜30日後、ELISAによる産物形成の分析のため、96ウエルプレートから上清を除去した。選択した高発現クローンは次いで24ウエルプレート、およびその後4mMのグルタミンを補充したPowerCHO2CD培地(化学的に定義された培地、Lonza)中6ウエルプレートに移し、ELISAにより各レベルで発現レベルを分析した。高発現クローンを選択して、フェドバッチ形式で攪拌チューブ中の産物形成を分析した。これらの実験は、120rpm、37℃、5%CO2でシェーカー(Kuhner-Germany)上のスピンチューブ内で、これらの選択クローンを使用して実施した。クローンは10日間で390mg/lの生産レベルをもたらした。
【００８９】
（実施例21）
pZRCIII-Darbe-Hygベクターを使用したダルベポエチンの発現
設定Ｉ-pZRCIII-Darbe-Hygベクターを使用したCHO-K1-S細胞系における安定的トランスフェクション
Freestyle(商標)CHO-K1-S細胞を、4mMのグルタミンを補充したPowerCHO2CD培地(化学的に定義された培地、Lonza)中で通常通り培養した。細胞は攪拌下(120rpm)37℃、および5%CO2において、湿度調節機能付きインキュベーター中に保った。細胞は3日/4日毎に計数し、完全な培地交換を行った。トランスフェクションはNeonトランスフェクション系(Invitrogen)を使用して実施した。トランスフェクション1日前に、CHO-KI-S細胞を新たな培地に継代し、トランスフェクションに使用する前に少なくとも一回の倍加を可能にした。製造者(Invitrogen)により記載された標準プロトコールに従い、SgsI(AscI)線状pZRCIII-Darbe-Hygプラスミドを使用してトランスフェクションを実施した。DNAのトランスフェクション後、1mLの予め温めた培養培地を含有する24ウエルプレートの1ウエルに、細胞を移した。細胞は37℃、5%CO2において湿度調節機能付きインキュベーター中に保った。翌日、ミニプールでの生成用に、4mMのグルタミンおよび600μg/mlのハイグロマイシンを補充したPowerCHO2CD培地(化学的に定義された培地、Lonza)中96ウエルプレート中に、トランスフェクト集団を平板培養した。15〜20日後、ELISAによる産物形成の分析のため、96ウエルプレートから上清を除去した。選択した高発現ミニプールは次いで24ウエルプレート、およびその後6ウエルプレートに移し、ELISAにより各レベルで発現レベルを分析した。2つの高発現ミニプールを選択して、4mMのグルタミンおよび600μg/mlのハイグロマイシンを補充したProCHO5培地(Lonza)中96ウエルプレート中で単細胞限界希釈を実施した。再度15〜30日後、ELISAによる産物形成の分析のため、96ウエルプレートから上清を除去した。選択した高発現クローンは次いで24ウエルプレート、およびその後6ウエルプレートに移し、ELISAにより各レベルで発現レベルを分析した。高発現クローンを選択して、フェドバッチ形式で攪拌チューブ中の産物形成を分析した。これらの実験は、230rpm、37℃、5%CO2でシェーカー(Kuhner-Germany)上のスピンチューブ、10ml培地で、これらの選択クローンを使用して実施した。クローンは11日間で340mg/1の生産レベルをもたらした。
【００９０】
（実施例22）
FSHの発現
設定I‐pZRCIII-FSHα-IRES-FSHβ-Hygベクターを使用したCHO-K1-S細胞系における安定的トランスフェクション
Freestyle(商標)CHO-K1-S細胞を、4mMのグルタミンを補充したPowerCHO2CD培地(化学的に定義された培地、Lonza)中で通常通り培養した。細胞は攪拌下(120rpm)37℃、および5%CO2において、湿度調節機能付きインキュベーター中に保った。細胞は3日/4日毎に計数し、完全な培地交換を行った。トランスフェクションはNeonトランスフェクション系(Invitrogen)を使用して実施した。トランスフェクション1日前に、CHO-KI-S細胞を新たな培地に継代し、トランスフェクションに使用する前に少なくとも一回の倍加を可能にした。製造者(Invitrogen)により記載された標準プロトコールに従い、SgsI(AscI)線状pZRCIII-FSHα-IRES-FSHβ-Hygプラスミドを使用してトランスフェクションを実施した。トランスフェクション後、1mLの予め温めた培養培地を含有する24ウエルプレートの1ウエルに、細胞を移した。細胞は37℃、5%CO2において湿度調節機能付きインキュベーター中に保った。翌日、ミニプールでの生成用に、4mMのグルタミンおよび600μg/mlのハイグロマイシンを補充したProCHO5培地(Lonza)中96ウエルプレート中に、トランスフェクト集団を平板培養した。15〜30日後、ELISAによる産物形成の分析のため、96ウエルプレートから上清を除去した。選択した高発現ミニプールは次いで24ウエルプレート、およびその後4mMのグルタミンを補充したPowerCHO2CD培地(化学的に定義された培地、Lonza)中6ウエルプレートに移し、ELISAにより各レベルで前記抗生物質選択圧および発現レベルを分析した。高発現ミニプールを選択して、4mMのグルタミンおよび600μg/mlのハイグロマイシンを補充したProCHO5培地(Lonza)中96ウエルプレート中で単細胞限界希釈を実施した。約15〜30日後、ELISAによる産物形成の分析のため、96ウエルプレートから上清を除去した。選択した高発現クローンは次いで24ウエルプレート、およびその後4mMのグルタミンを補充したPowerCHO2CD培地(化学的に定義された培地、Lonza)中6ウエルプレートに移し、ELISAにより各レベルで前記抗生物質選択圧および発現レベルを分析した。高産生クローンはリトランスフェクション用に選択した。
【００９１】
設定II-pZRCIII-FSHα-IRES-FSHβ-Neoベクターを使用して設定Iから得たクローンの安定的リトランスフェクション
クローンを選択して、設定Iのトランスフェクションと同じ手順により、SgsI(AcsI)により線状化したpZRCIII-FSHα-IRES-FSHβ-Neoプラスミドを使用してリトランスフェクションを実施した。翌日、ミニプールでの生成用に、4mMのグルタミン、600μg/mlのハイグロマイシン、および500μg/mlのネオマイシンを補充したProCHO5培地(Lonza)中96ウエルプレート中に、トランスフェクト集団を平板培養した。15〜30日後、ELISAによる産物形成の分析のため、96ウエルプレートから上清を除去した。選択した高発現ミニプールは次いで24ウエルプレート、およびその後4mMのグルタミンを補充したPowerCHO2CD培地(化学的に定義された培地、Lonza)中6ウエルプレートに移し、ELISAにより各レベルで前記抗生物質選択圧および発現レベルを分析した。高産生リトランスフェクトミニプールを選択して、4mMのグルタミンおよび前記抗生物質選択圧を補充したProCHO5培地(Lonza)中96ウエルプレート中で単細胞限界希釈を実施した。再度15〜30日後、ELISAによる産物形成の分析のため、96ウエルプレートから上清を除去した。選択した高発現クローンは次いで24ウエルプレート、およびその後4mMのグルタミンを補充したPowerCH02CD培地(化学的に定義された培地、Lonza)中6ウエルプレートに移し、ELISAにより各レベルで前記抗生物質選択圧および発現レベルを分析した。すなわち高発現クローンを選択して、フェドバッチ形式で攪拌チューブ中の産物形成を分析した。これらの実験は、120rpm、37℃、5%CO2でシェーカー(Kuhner-Germany)上のスピンチューブで、これらの選択クローンを使用して実施した。異なるクローンで10日間内に約20mg/l〜50mg/lの範囲の生産レベルを得た。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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