(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子改変ボルデテラ・パータシス株であって、百日咳毒素Ｓ１遺伝子はＡｒｇ９→Ｌｙｓ９及びＧｌｕ１２９→Ｇｌｙ１２９変異を有するが、抗生物質耐性遺伝子は組み込まれておらず、無毒化百日咳毒素（ｒＰＴ）を発現することができる遺伝子改変ボルデテラ・パータシス株。
【請求項２】
トハマ株に由来する、請求項１に記載の遺伝子改変ボルデテラ・パータシス株。
【請求項３】
（ａ）遺伝子改変ボルデテラ・パータシス株の染色体の非機能性領域にｐｔｘオペロンのコピーを少なくとも一つ組み込むことによって更に改変されており、組み込まれたｐｔｘオペロンは、変異Ａｒｇ９→Ｌｙｓ９及びＧｌｕ１２９→Ｇｌｙ１２９を含むように改変されたＳ１遺伝子とＳ２〜Ｓ５遺伝子のセットを含んでおり、こうして改変された株は、染色体内に離れて位置する少なくとも２種のｐｔｘオペロンを有し、１種のｐｔｘオペロンのみを有する株と比較して高いレベルの無毒化百日咳毒素を発現することができ、及び／又は
（ｂ）遺伝子改変ボルデテラ・パータシス株の染色体の非機能性領域にパータクチンをコードするｐｒｎ遺伝子のコピーを少なくとも一つ組み込むことによって更に改変されており、こうして改変された株は、染色体内に離れて位置する少なくとも２種のｐｒｎ遺伝子を有し、１種のｐｒｎ遺伝子のみを有する株と比較して高いレベルのパータクチンを発現することができる、
請求項１に記載の遺伝子改変ボルデテラ・パータシス株。
【請求項４】
ｐｔｘオペロン及び／又はｐｒｎ遺伝子のコピーは、非機能性偽遺伝子内又は非機能性偽遺伝子間に組み込まれている、請求項３に記載の遺伝子改変ボルデテラ・パータシス株。
【請求項５】
ｐｔｘオペロンの一を超えるコピー及び／又はｐｒｎ遺伝子の一を超えるコピーが挿入された、請求項３に記載の遺伝子改変ボルデテラ・パータシス株。
【請求項６】
少なくとも二種のｐｔｘオペロン及び／又は少なくともの二種のｐｒｎ遺伝子を含む、請求項３に記載の遺伝子改変ボルデテラ・パータシス株。
【請求項７】
請求項１に記載の遺伝子改変ボルデテラ・パータシス株を製造する方法であって、ボルデテラ・パータシス株内のＳ１遺伝子に変異Ａｒｇ９→Ｌｙｓ９及びＧｌｕ１２９→Ｇｌｙ１２９を導入する段階を含み、抗生物質耐性遺伝子を組み込んでいない、無毒化百日咳毒素（ｒＰＴ）を発現することができる遺伝子改変ボルデテラ・パータシス株を得る方法。
【請求項８】
下記式（１）に示すベクターｐＳＳ４２４５を用いて、抗生物質耐性遺伝子を組み込まずにＳ１変異を導入する、請求項７に記載の方法。
【化１】
0005966018.tif 000007
【請求項９】
ボルデテラ・パータシス株がトハマ株である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）遺伝子改変ボルデテラ・パータシス株の染色体の非機能性領域にｐｔｘオペロンのコピーを少なくとも一つ組み込む段階を更に含み、組み込まれたｐｔｘオペロンは、変異Ａｒｇ９→Ｌｙｓ９及びＧｌｕ１２９→Ｇｌｙ１２９を含むように改変されたＳ１遺伝子とＳ２〜Ｓ５遺伝子のセットを含んでおり、これによって、染色体内に離れて位置する少なくとも２種のｐｔｘオペロンを有し、１種のｐｔｘオペロンのみを有する株と比較して高いレベルの無毒化百日咳毒素を発現することができ、及び／又は
（ｂ）遺伝子改変ボルデテラ・パータシス株の染色体の非機能性領域にパータクチンをコードするｐｒｎ遺伝子のコピーを少なくとも一つ組み込む段階を更に含み、これによって、染色体内に離れて位置する少なくとも２種のｐｒｎ遺伝子を有し、１種のｐｒｎ遺伝子のみを有する株と比較して高いレベルのパータクチンを発現することができる
抗生物質耐性遺伝子を組み込まずに、前記ｐｔｘオペロン及び／又はｐｒｎ遺伝子を組み込む、
請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
下記式（１）に示すベクターｐＳＳ４２４５を用いて、抗生物質耐性遺伝子を組み込まずにｐｔｘオペロン及び／又はｐｒｎ遺伝子のコピーを導入する、請求項１０に記載の方法。
【化２】
0005966018.tif 000008
【請求項１２】
ｐｔｘオペロン及び／又はｐｒｎ遺伝子を非機能性偽遺伝子内又は非機能性偽遺伝子間に組み込む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ｐｔｘオペロンのコピーとｐｒｎ遺伝子のコピーを遺伝子改変ボルデテラ・パータシス株の染色体に挿入する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
ｐｔｘオペロンの一を超えるコピーを遺伝子改変ボルデテラ・パータシス株の染色体に挿入し、及び／又はｐｒｎ遺伝子の一を超えるコピーを遺伝子改変ボルデテラ・パータシス株の染色体に挿入する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
ボルデテラ・パータシス抗原を製造する方法であって、
（ｉ）請求項１に記載の遺伝子改変ボルデテラ・パータシス株を培地内で培養し、該株内に存在する遺伝子によってコードされた無毒化百日咳毒素（ｒＰＴ）、パータクチン及び繊維状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）を含む抗原を発現させる段階と、
（ｉｉ）培地若しくは細胞抽出物から該抗原を回収する段階とを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異や更なる遺伝子のコピーを組込みむためにベクターｐＳＳ４２４５を用い、トハマ（Tohama）と命名された親株に由来する組換えボルデテラ・パータシス（Bordetella pertussis）株の構築に関する。
【背景技術】
【０００２】
パータシス、即ち百日咳は、上気道のボルデテラ・パータシス感染に起因する重篤な小児疾患である［１］。Ｂ．パータシスの死滅全細胞で構成されたワクチンは数十年に亘って使用されている。該ワクチンは、ジフテリア・破傷風・百日咳の三種混合ワクチンとして、或はＢ型肝炎やヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae）ｂ菌侵襲性疾患に対する免疫をももたらす新たな混合ワクチンとして投与される［２］。該死滅全細胞に関連するエンドトキシンや他の菌体内毒素のレベルが高く、その安全性プロファイルに問題があるため、数か国では、全細胞ワクチンの使用が減少、抑制、更には禁止されている［３、４］。
【０００３】
無細胞ワクチン（全細胞を含まず、ごく一部又は十分に精製された細菌抗原を含んでいる事実にちなんで命名）は、１９８１年に日本に導入された［５］。無細胞ワクチン中の抗原成分の純度が高いことは、臨床安全性プロファイルが改善されていると解釈された。このようなワクチンは、その安全性や有効性が広範な実地試験で立証された後、９０年代半ばに先進工業国に導入された［６］。しかし、無細胞ワクチンのコストが著しく高いため、ＷＨＯによる予防接種拡大普及計画への広範な導入は妨げられた。
【０００４】
Ｂ．パータシスの主な病原性因子は百日咳毒素（ＰＴ）であり［７、８］、百日咳トキソイド（ＰＴｄ）は無細胞ワクチン中の主な抗原である［８］。ホルムアルデヒドによる簡単な処理で不活性化することができるジフテリア毒素や破傷風毒素とは異なり、ＰＴは、化学的手段で不活性化することが困難であることが分かっている［９］。現在、商業生産には様々な不活性化プロセスが用いられている。全てのプロセスにおいては、化学処理に起因するＰＴの広範な変性が共通している。遺伝的に不活性化された毒素（ｒＰＴ）を用いて２種の候補ワクチンが調査され［１０〜１２］、これらの候補の内の１種は実地での有効性試験に採り入れられている［１１〜１２］。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、ｒＰＴを含むワクチンはまだ使用されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１の実施形態においては、遺伝子改変ボルデテラ・パータシス株であって、百日咳毒素Ｓ１遺伝子はＡｒｇ９→Ｌｙｓ９及びＧｌｕ１２９→Ｇｌｙ１２９変異を有するが、抗生物質耐性遺伝子は組み込まれておらず、無毒化百日咳毒素（ｒＰＴ）を発現することができる改変ボルデテラ・パータシス株を提供する。
【０００７】
ベクターｐＳＳ４２４５を用いれば、抗生物質耐性遺伝子を組み込まずにＳ１変異を導入することができる。
【０００８】
該改変株は、ベクターｐＳＳ４２４５を用いて改変トハマ株の染色体の非機能性領域にｐｔｘオペロンのコピーを組み込むことによって更に改変することができ、組み込まれたｐｔｘオペロンは、変異Ａｒｇ９→Ｌｙｓ９及びＧｌｕ１２９→Ｇｌｙ１２９を含むように改変されたＳ１遺伝子とＳ２〜Ｓ５遺伝子のセットを含んでおり、こうして改変された株は、トハマ染色体内に離れて位置する２種のｐｔｘオペロンを有するが、抗生物質耐性遺伝子を組み込んでおらず、１種のｐｔｘオペロンのみを有する株と比較して高いレベルの無毒化百日咳毒素を発現することができる。
【０００９】
ｐｔｘオペロンのコピーは、非機能性偽遺伝子内又は非機能性偽遺伝子間に組み込むことができる。
【００１０】
ｐｔｘオペロンのコピーは、推定アンモニウムトランスポーター偽遺伝子ａｍｔＢと推定自己トランスポーター偽遺伝子との間に組み込むことができる。
【００１１】
組み込まれたｐｔｘオペロンのコピーは、ｐｔｘ−ｐｔｌオペロンプロモーターの制御下とすることができる。
【００１２】
該改変株にはｐｔｌオペロンの更なるコピーを組み込まないようにすることができる。
【００１３】
該改変株には改変ｐｔｘオペロンの一を超えるコピーを挿入することができる。
【００１４】
該改変株は、ベクターｐＳＳ４２４５を用いて改変トハマ株の染色体の非機能性領域にパータクチンをコードするｐｒｎ遺伝子のコピーを組み込むことによって更に改変することができ、こうして改変されたトハマ株は、トハマ染色体内に離れて位置する２種のｐｒｎ遺伝子を有するが、抗生物質耐性遺伝子を組み込んでおらず、１種のｐｒｎ遺伝子のみを有する株と比較して高いレベルのパータクチンを発現することができる。
【００１５】
挿入されたｐｒｎ遺伝子は、非機能性偽遺伝子内又は非機能性偽遺伝子間に配置することができる。
【００１６】
ｐｒｎ遺伝子のコピーは、疑似推定グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ遺伝子と疑似推定アスパラギン酸ラセマーゼ遺伝子との間に組み込むことができる。
【００１７】
ｐｒｎ遺伝子のコピーは、ｐｒｎプロモーターの制御下とすることができる。
【００１８】
該改変株にはｐｒｎ遺伝子の一を超えるコピーを挿入することができ、少なくとも２種の改変ｐｔｘオペロンと少なくとも２種のｐｒｎ遺伝子を含むことができる。
【００１９】
野生型トハマ株の機能性遺伝子は、除去、置換又は不活性化されていないことが好ましい。
【００２０】
本発明の第２の実施形態においては、上記改変Ｂ．パータシス株を製造する方法であって、Ｂ．パータシス株内のＳ１遺伝子に変異Ａｒｇ９→Ｌｙｓ９及びＧｌｕ１２９→Ｇｌｙ１２９を導入する段階を含み、抗生物質耐性遺伝子を組み込んでいない、無毒化百日咳毒素（ｒＰＴ）を発現することができる改変株を得る方法を提供する。
【００２１】
該方法は、ベクターｐＳＳ４２４５を用いて改変トハマ株の染色体の非機能性領域にｐｔｘオペロンのコピーを組み込む段階を更に含むことができ、組み込まれたｐｔｘオペロンは、変異Ａｒｇ９→Ｌｙｓ９及びＧｌｕ１２９→Ｇｌｙ１２９を含むように改変されたＳ１遺伝子とＳ２〜Ｓ５遺伝子のセットを含んでおり、これによって、トハマ染色体内に離れて位置する２種のｐｔｘオペロンを有し、抗生物質耐性遺伝子を組み込んでいない改変トハマ株を製造し、該改変トハマ株は、１種のｐｔｘオペロンのみを有する株と比較して高いレベルの無毒化百日咳毒素を発現することができる。
【００２２】
該方法は、ベクターｐＳＳ４２４５を用いて改変トハマ株の染色体の非機能性領域にパータクチンをコードするｐｒｎ遺伝子のコピーを組み込む段階を更に含み、これによって、トハマ染色体内に離れて位置する２種のｐｒｎ遺伝子を有し、抗生物質耐性遺伝子を組み込んでいない改変トハマ株を製造し、該改変トハマ株は、１種のｐｒｎ遺伝子のみを有する株と比較して高いレベルのパータクチンを発現することができる。
【００２３】
改変ｐｔｘオペロン及び／又はｐｒｎ遺伝子の一を超えるコピーをトハマ株の染色体に挿入することができる。
【００２４】
本発明の第３の実施形態においては、ボルデテラ・パータシス抗原を製造する方法であって、
上述の遺伝子改変Ｂ．パータシス株を培地内で培養し、該株内に存在する遺伝子によってコードされた無毒化百日咳毒素（ｒＰＴ）、パータクチン及び繊維状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）を含む抗原を発現させる段階と、培地若しくは細胞抽出物から該抗原を回収する段階とを含む方法を提供する。
【００２５】
ＰＴ抗原及びＦＨＡ抗原は培地から回収することができるが、ＰＲＮ抗原は、高温処理等の抽出手続きによって培地から一部、細胞から一部回収することができる。
【００２６】
凝集原２及び／又は３も発現させて回収することができる。
【００２７】
本発明の第４の実施形態においては、上述の方法によって製造した抗原を提供する。
【００２８】
対象における百日咳感染の予防、特に、百日咳感染を予防するための無細胞ワクチンの製造に該抗原を用いることができる。
【００２９】
本発明の第４の実施形態においては、上述のように製造された抗原を含む無細胞ワクチンを提供する。該抗原は、無毒化百日咳毒素及び／又はパータクチンとすることができる。該ワクチンは、ＦＨＡ、凝集原２及び／又は凝集原３、及び／又は他の疾患、例えば、ジフテリア、破傷風、Ｂ型肝炎、ポリオ及びヘモフィルス・インフルエンザｂ菌の内の一以上の疾患を予防又は治療するための抗原を更に含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１：対立遺伝子交換ベクターｐＳＳ４２４５の概略構造。
【図２】図２：対立遺伝子交換ベクターｐＳＳ４２４５に改変Ｓ１遺伝子を構築するためのベクター。Ａ：Ｓ１フランキング領域間に挿入されたクロラムフェニコール耐性カセットでＳ１遺伝子を置換するための対立遺伝子交換要素。Ｂ：改変Ｓ１遺伝子をｐｔｘ−ｐｔｌオペロン内の正確な位置に戻すための対立遺伝子交換要素。対立遺伝子交換を行うため、これらのベクターを直線化し、ｐＳＳ４２４５に挿入した後、大腸菌ＳＭ１０からの接合伝達によってＢ．パータシスに導入する。
【図３】図３：対立遺伝子交換手続き。Ａ：クロラムフェニコール耐性マーカーによるＳ１遺伝子の置換につながる二重組換え事象。Ｂ：改変Ｓ１遺伝子の元の位置への再挿入につながる二重組換え事象。
【図４】図４：ｐｔｘオペロンの第２のコピーをＢ．パータシス染色体に挿入するためのベクター。Ａ：ｐｔｘオペロンの第２のコピーの挿入部位は、各々が２種のフレームシフト変異を有する２種の放棄された遺伝子の間で選択した。Ｂ：クロラムフェニコールマーカーを選択部位に挿入するのに用いた対立遺伝子交換要素。Ｃ：元のプロモーターを有するｐｔｘオペロンの概略構造。ｐｔｘ−ｐｔｌターミネーターをクローン化し、Ｓ３遺伝子を超えた位置に挿入した。最終的にはこのクラスターをＳＳ４２４５誘導体に組み込んでクロラムフェニコールマーカーを置換し、第２の対立遺伝子交換事象をもたらしてＰＴ構造遺伝子の第２のコピーを挿入した。
【図５】図５：Ｂｐ−ＷＷＣ及びＢｐ−ＷＷＤにおけるＲ９Ｋ及びＥ１２９Ｇ変異の確認。ＰＴ構造クラスターの２種のコピーを有する株Ｂｐ−ＷＷＤに関する変異付近の生の配列データを示す。Ｂ．パータシス・トハマ（コンセンサス配列）と誘導体Ｂｐ−ＷＷＣ及びＢｐ−ＷＷＤに関する対応配列アラインメントを示す。
【図６】図６：ｐｒｎ遺伝子の第２のコピーをＢ．パータシス染色体に挿入するためのベクター。Ａ：ｐｒｎ遺伝子の第２のコピーの挿入部位は、フレームシフト変異と欠失を有する２種の放棄された遺伝子の間で選択した。Ｂ：標的組み込み部位に隣接し、ｆｈａプロモーターの制御下にあるｐｒｎ遺伝子の概略構造。Ｃ：標的組み込み部位に隣接し、自身のプロモーターの制御下にあるｐｒｎ遺伝子の概略構造。
【図７】図７：ＣＨＯ細胞クラスタリング試験。細胞をコンフルエント近くまで増殖した後、ＰＴの希釈物を添加し、２日後にクラスタリングをスコア化した。Ａ：８００ｎｇのＰＴ（Ｂｐ−ＷＷＣ株）。Ｂ：対照、ＰＴの添加なし。Ｃ：検出閾値に相当する２．６ｐｇの野生型ＰＴ（トハマ株）。Ｄ：４３ｐｇの野生型ＰＴ（トハマ株）。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本明細書では、トハマと命名された親株に由来する組換えボルデテラ・パータシス株について記載する。この新しい株は、対立遺伝子交換ベクターｐＳＳ４２４５を用いた相同組換えによって得られる［４１］。このベクターによって、如何なる副変異をも残さずに細菌染色体の一部の置換を行うことができる。
【００３２】
ＰＴ、ＦＨＡ及びパータクチン（ＰＲＮ）の遺伝子はクローン化され、配列決定されている［３５〜３９］。百日咳毒素は、単一プロモーターから発現される５種の異なる構造遺伝子によってコードされる６種のポリペプチドサブユニットで構成された複合タンパク質である。百日咳毒素の酵素活性や毒性活性の大部分は、サブユニットＳ１によって媒介されるが、その細胞結合特性や分裂促進特性は、Ｂ−サブユニットを構成する他のサブユニットに起因する。
【００３３】
第１の実施形態においては、ＰＴサブユニットＳ１をコードするセグメントを置換し、毒性活性の不活性化を引き起こす２種の変異を導入した。第２の実施形態においては、プロモーターとｐｔｌターミネーターを有し、上述の変異を含むｐｔｘ−ｐｔｌオペロンの５種のＰＴ構造遺伝子のｐｔｘクラスターの第２のコピーを染色体の他の位置に挿入した。ｐｔｘ−ｐｔｌオペロンに存在するｐｔｌ補助遺伝子の組織は改変しなかった。この株から産生するｒＰＴの量は増加した。第３の実施形態においては、ｐｒｎ遺伝子の第２のコピーを染色体に挿入した。いずれの場合においても、放棄された遺伝子座を挿入部位として選択して不要な遺伝子変異の導入を回避し、抗原発現を自己プロモーターで駆動することによって、親トハマ株と同様の調節に付した。
【００３４】
ＰＴ、ましてやＰＲＮは高密度培養における制限抗原であるが、ＦＨＡは、このような条件下でＢ．パータシスによって天然に過剰産生する。ＰＲＮは組換え大腸菌又はピキア・パストリス（Pichia pastoris）から高収率で得ることができた［１４、１５］が、ＰＴサブユニットのみは大腸菌で発現させることはできたものの、成熟毒素に会合させることができず、有望なワクチン候補として考えるには免疫原性が不十分であった［１６］。成熟毒素の会合及び分泌には、後の段階で発見される、ｐｔｘ−ｐｔｌオペロンのｐｔｌセクションの一部である数種の補助遺伝子が必要であることが現在では分かっている［１７］。
【００３５】
遺伝子コピー数の操作による産生増強によって細菌性毒素の産生が増強されることが報告されている［１８、１９］（特にＰＴの場合［２０］）が、この場合、タンデムに反復されたマルチコピープラスミドベクター又は遺伝子を主に用いる。この結果、特に産生設定において、株の遺伝的安定性がもたらされることがある。例えば、マルチコピープラスミドベクターを用いてリー（Lee）ら［４０］によって得られたＢ．パータシス株の場合、ＰＴ産生の増加は示されず、プラスミドが再編成されたか、ＰＴオペロンが欠失したか、又は接合完了体が無毒相への変換を経た。
【００３６】
Ｂ．パータシスで以前に用いられた対立遺伝子交換ベクターに反し、ｐＳＳ４２４５の場合、染色体上では補助的変異（特に、以前の対立遺伝子交換手続きで必要とした自発性ストレプトマイシン耐性変異体の選択に起因するｒｐｓＬに影響を及ぼす変異）を必要としないか、或はそのような変異を残さない［２２］。このようなハウスキーピング遺伝子に影響を及ぼす変異は、病原性を弱める、即ち、ＰＴやＦＨＡ、ＰＲＮ等の病原性因子の発現を弱めることがある。本発明の株は、他の抗原（特にＦＨＡ）のレベルを変えることなく、手頃な価格の無細胞百日咳ワクチンの製造に用いることができる。
【００３７】
結果
Ｂ．パータシス染色体におけるＳ１遺伝子の変異
２種の変異Ｒ９Ｋ及びＥ１２９ＧをサブユニットＳ１に導入するため、２段階アプローチを利用し、これらの変異の１種の損失を引き起こし得る、２種の変異間領域における組換えの可能性を回避した。このアプローチにより、選択培地での簡易レプリカ平板法によって所望のコロニーを選択することができる。先ず、野生型Ｓ１遺伝子がクロラムフェニコール耐性遺伝子（ＣｍＲ）（図２Ａ）又は所望の変異を含む改変Ｓ１遺伝子（図２Ｂ）（いずれもＳ１上流域及び下流域の１．２〜１．５ｋＢに隣接）で置換されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋中で２種の大腸菌ベクターを構築した。次に、これらのベクターを処理し、そのインサートをｐＳＳ４２４５に導入した。これらの誘導体を大腸菌ＳＭ１０に導入し、Ｂ．パータシス株トハマへの接合伝達及び対立遺伝子交換を行った。プラスミドｐＳＳ５Ｃｍ３によって、Ｓ１遺伝子がＣｍＲマーカーで置換された（図３Ａ）。プラスミドｐＳＳ５Ｓ１３−９Ｋ−１２９Ｇによって、Ｓ１遺伝子がその元の位置（この段階では２種の所望の変異を有する）に回復された（図３Ｂ）。選択培地で分離菌を選択した後、予想される位置でのＣｍＲ遺伝子と改変Ｓ１遺伝子の統合をＰＣＲ増幅によって確認した（データは示さず）。予想される位置での変異Ｓ１遺伝子の組み込みは、Ｓ１遺伝子内部で上流５’及び３’下流フランキング領域に結合することが可能な所定のプライマーを用いたＰＣＲで確認されたように明らかであった（データは示さず）。更なる同化のために選択されたクローンのＳ１遺伝子における変異は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。新しい株をＢｐ−ＷＷＣと命名した。
【００３８】
ＰＴ構造遺伝子の第２のセットのための第２の組み込み部位の挿入
Ｂ．パータシスに適合し得るマルチコピープラスミドに全ｐｔｘ−ｐｔｌオペロンを挿入してＰＴ発現を増加させる最初の試みにおいては、有用な株を送達することができなかったが、これは、ＰＴの過剰発現が潜在的に有毒であり、生存可能な株を得るにはＰＴ発現をある限界内にとどめる必要があることを示唆している。ＰＴ毒素の収率を高めるため、ＰＴ構造遺伝子の第２のセットをＢｐ−ＷＷＣ染色体に導入した。挿入標的部位を特定するため、Ｂ．パータシス・トハマゲノムの配列をスキャンし、多くの偽遺伝子を同定した。推定アンモニウムトランスポーター遺伝子と推定自己トランスポーター遺伝子との間のＤＮＡ配列を挿入用に選択した（ｐｏｓｎ．２，９０３，９８８〜２，９０５，２２８及び２，９０５，２９１〜２，９０８，２７７）。これらの遺伝子は各々、その機能性を損ねるフレームシフト変異を有する（図４Ａ）。先のセクションで概説した一般的な戦略に従った。先ず、選択組み込み部位に隣接する領域内にＣｍＲ遺伝子を挿入して大腸菌ベクターｐＳＫＰＤ５Ｃｍ３を構築した（図４Ｂ）。対象となる配列をｐＳＳ４２４５に挿入した後、ＣｍＲマーカーによって対立遺伝子交換を選択した。設計位置でのＣｍＲ遺伝子の組み込みをＰＣＲによって確認した（データは示さず）。第２のベクターにおいては、Ｓ３遺伝子を同一のフランキング領域内に挿入した後、５種のＰＴ構造遺伝子Ｓ１〜Ｓ３をｐｔｘプロモーター及びｐｔｌターミネーターと共に挿入し、Ｓ１内に２種の変異を含むベクターｐＳＫｐｔｘｔｅｒを得た（図４Ｃ）。標的組み込み部位への対立遺伝子交換によって、ＰＴ構造遺伝子の機能性クラスターの第２のコピーがＢｐ−ＷＷＣ株に挿入された。新しい株をＢｐ−ＷＷＤと命名した。組み込みの結果は、ｐｔｘオペロン内部で上流域又は下流域に結合しているプライマーを用いた増幅によって確認したが、これによって、組換えが生じた領域は破壊されずに、予想された組み込みが行われたことが分かった。
【００３９】
Ｓ１遺伝子の配列決定とＲ９Ｋ及びＥ１２９Ｇ変異の確認
自動化配列決定を用いて所望の変異の存在を確認した。Ｓ１遺伝子の２種のコピーが組み込まれた株Ｂｐ−ＷＷＤの場合、ＰＣＲ増幅によって、原理的には２種の遺伝子のコピーの混合物が得られる。インサートの内の１種における予期しない点変異が、対応する位置における二重ヌクレオチド割り当てとして出現し得る。Ｒ９Ｋ及びＥ１２９Ｇ位置における蛍光シグナルの単一ピークはＢｐ−ＷＷＣ上の正しい配列を示しており、該ピークから、Ｂｐ−ＷＷＤ内のＳ１の２種のコピーが同一の変異を有していることが分かった。２種の所望な変異付近の配列を図５に示す。図５には、株Ｂｐ−ＷＷＤの配列決定記録と野生型トハマ、Ｂｐ−ＷＷＣ及びＢｐ−ＷＷＤの配列アラインメントが示されている。
【００４０】
ＰＲＮ遺伝子の第２のコピーのＢｐ−ＷＷＤ株への挿入
ＰＲＮ産生が制限されているため、ｆｈａプロモーターと自身のターミネーターの制御下にあるｐｒｎ構造遺伝子の第２のコピーをＢｐ−ＷＷＤ染色体内の２種の偽遺伝子間、即ち、推定グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ偽遺伝子と推定アスパラギン酸ラセマーゼ偽遺伝子との間に挿入した（図６Ａ）。ＣｍＲ遺伝子が選択挿入部位に隣接する上流域と下流域との間に挿入されたｐＳＫＰＤ２Ｃｍ３大腸菌ベクターを構築した。ＦＨＡプロモーターの制御下で同様のフランキング領域とｐｒｎ遺伝子を用いて他のベクターを構築した（図６Ｂ）。所望の位置にＣｍＲマーカーを挿入した後、通常の対立遺伝子交換選択及びスクリーニング手続きを用いてＣｍＲ遺伝子をｐｒｎ機能性ブロックで置換した。
【００４１】
この構築物から単離されたＢ．パータシス株はＰＲＮを発現せず、他の抗原のレベルは最終的には検出不可能であった。強いＦＨＡプロモーターの制御下で過剰産生し、ＰＲＮ産生能力を失ったエスケープ変異体のみ又は全ての病原性因子が生存可能である場合にはＰＲＮ産物が有毒であることが暫定的に結論付けられた。従って、ｆｈａプロモーターの代わりに天然ｐｒｎプロモーターを導入することが決定された。ｐＳＫＰＤ２５ＦｐＰＲＮ３を用いてＦＨＡプロモーターを元のＰＲＮプロモーターで置換し、自身の天然プロモーターとターミネーターを有する機能性ブロックを得た（図６Ｃ）。通常の対立遺伝子交換手続きによってこの機能性ブロックを選択部位で挿入し、自身のプロモーターの制御下にあるｐｒｎ遺伝子の第２の非タンデム反復コピーを有する株を得た。予想される挿入の確認は、ｐｒｎ遺伝子内部でフランキング領域に結合しているプライマーを用いたＰＣＲ増幅によって行った。この株は通常は生存可能であり、Ｂｐ−ＷＷＥと命名した。
【００４２】
ＰＴ及びＰＲＮ構築物の遺伝的安定性
株Ｂｐ−ＷＷＥを培養し、ＭＳＳ培地で連続的に継代培養して計５０世代程度とした。最終培養物を希釈し、ＭＳＳ−寒天に播種した。３０個の単離コロニーをランダムに採取した。ＰＣＲによって３０個のコロニーのＳ１遺伝子及びｐｒｎ遺伝子について解析した（データは示さず）。その結果、全てのコロニーは、予想された位置にＳ１遺伝子とｐｒｎ遺伝子の２種のコピーを含んでいることが分かった。
【００４３】
振盪フラスコ内でのＰＴ及びＦＨＡの発現
振盪フラスコ培養におけるＰＴ及びＦＨＡの産生をＥＬＩＳＡによって解析した。振盪フラスコ培養は全て、ヘプタキス（２，６−Ｏ−ジメチル）−β−シクロデキストリンを含む変法スタイナー−ショルテ培地（ＭＳＳ）で行った［２３、２４］。株Ｂｐ−ＷＷＣ及びＢｐ−ＷＷＤの結果を表１及び表２に示す。Ｂｐ−ＷＷＣや野生株トハマと比べて株Ｂｐ−ＷＷＤにおけるＰＴの産生は約２倍であったが、これは、構造遺伝子クラスターのコピー数と発現レベルとの予想された相関性を示している。
【００４４】
表１：トハマ株、Ｂｐ−ＷＷＣ株及びＢｐ−ＷＷＤ株によるＰＴ産生。細胞の増殖は、振盪フラスコを用い、ＭＳＳ培地中で４８時間（実験番号１）又は２０〜２４時間（実験番号２）行った。２個の別々のフラスコにおける結果を実験番号２に示す。遠心分離によって回収した後、上清のアッセイは、ウサギポリクローナル抗体を用いた直接ＥＬＩＳＡ（実験番号１）、又はウサギポリクローナル抗体を捕捉試薬として用い、Ｓ２特異的モノクローナル抗体（アブカム）を検出に用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによって行った。
【００４５】
【表１】
0005966018.tif 000002
【００４６】
表２：Ｂｐ−ＷＷＣ株、Ｂｐ−ＷＷＤ株及びＢｐ−ＷＷＥ株によるＰＴ及びＦＨＡ産生。細胞の増殖は、振盪フラスコを用い、ＭＳＳ培地中で２４時間又は３６時間行った。遠心分離によって回収した後、ＰＴ及びＦＨＡに関する上清のアッセイは、ウサギポリクローナル抗体を捕捉試薬として用い、Ｓ２特異的モノクローナル抗体（アブカム）又はＦＨＡモノクローナル試薬（ＮＩＢＳＣ）を検出に用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによって行った。 
【００４７】
【表２】
0005966018.tif 000003
【００４８】
振盪フラスコ内でのＰＲＮの発現
ＭＳＳ培地中で増殖したＢｐ−ＷＷＣ、Ｂｐ−ＷＷＤ及びＢｐ−ＷＷＥの振盪フラスコ培養におけるＰＲＮの産生。ＰＲＮのその膜結合型前駆体からの遊離は、未確認プロテアーゼによる不正確な切断の結果である［２５］ため、ＰＲＮ発現をウェスタンブロット濃度測定解析によって確認し、抗原の完全性についても評価した。高密度発酵槽培養においては、ＰＲＮの大部分が膜結合型前駆体から培養上清に自発的に遊離される（未発表の所見）ことも分かった。従って、導入された遺伝子改変によってこの特性が改変されるかどうか調べた。ＰＲＮのアッセイは、清澄化した培養上清及び分離細胞の６０℃抽出物に対して行った。結果を表３に示す。Ｂｐ−ＷＷＣ及びＢｐ−ＷＷＤにおけるＰＲＮ毒素の量は同等であった。Ｂｐ−ＷＷＥにおいては２倍に増加したことが分かったが、これも、遺伝子コピー数と発現レベルとの良好な相関性を示している。これらのフラスコ培養においては、培養上清中に存在するＰＲＮの割合は小さいままか又は無視できるレベルであったが、Ｂｐ−ＷＷＥの場合には上清中のＰＲＮの割合も増加した。
【００４９】
表３：Ｂｐ−ＷＷＣ株、Ｂｐ−ＷＷＤ株及びＢｐ−ＷＷＥ株によるＰＲＮ産生。細胞の増殖は、振盪フラスコ中で４８時間行った。遠心分離によって上清と細胞を分離した。細胞を元の培養体積の抽出バッファーに懸濁させ、３０分間で６０℃まで加熱した後、再度遠心分離を行って抽出物を採取した。ＰＲＮのアッセイはウェスタンブロットによって両方の画分で行った。
【００５０】
【表３】
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【００５１】
これら全てのフラスコ培養におけるＰＲＮのレベルは、同様の条件下でのＰＴやＦＨＡの濃度よりも十分に低かった。ＰＲＮはＰＴに比べて効率良く産生しないが、この結果は、高密度発酵槽培養で一般に得られている知見を反映していない。この相違は、次の事実、即ち、ＰＲＮが細胞表面タンパク質である一方、ＰＴやＦＨＡは振盪フラスコ内で必然的に分泌され、増殖時間は細胞溶解や抗原分解を回避するために制限されるため、バイオマス増殖時間は２４〜３６時間に制限され、培養物は最大ＯＤ６５０が１〜１．５に達することがあり、これによってＰＲＮの主要源が制限されるという事実によって説明される。
【００５２】
ＰＴ不活性化の評価
培養上清からのＰＴの精製は、オッセンギス（Ozcengiz）のプロセス［２６］の変法、即ち、最初の硫酸アンモニウム沈殿をリガンド交換クロマトグラフィーで代用する［２７、２８］方法で行った。野生型Ｂ．パータシス及びＢｐ−ＷＷＣ（遺伝的に不活性化したＰＴ）由来のＰＴ毒素の毒性を解析し、ＣＨＯ細胞クラスタリング試験［２９］によって比較した。この試験は、ＰＴに関して報告された他の機能的アッセイに比べて感度が遥かに高い。Ｂ．パータシス・トハマ株から精製された天然毒素は、クラスタリング終点が２．６ｐｇ／ウェルであることが示された。遺伝的に不活性化されたＰＴは、この試験で得られた最高濃度（即ち、０．８〜１．６μｇ／サンプル）でもクラスタリングを促進しなかった（図７）。従って、ＰＴの低溶解度による制限を考慮すると、この試験から、毒性が５×１０５〜１０６倍低下することが分かる。この結果から、ＰＴサブユニットＳ１における２種のアミノ酸置換をもたらす５種のヌクレオチド置換によって、Ｂｐ−ＷＷＣ由来のＰＴ毒素がうまく不活性化されたことが分かる。
【００５３】
考察
これらの実験における無標識遺伝子挿入及び置換は、Ｂ．パータシスにおいてベクターとしてｐＳＳ４２４５を用いることによって成功した。プラスミドの切除を引き起こす第２の相同組換えを行った後、ｃｒｅ−ｌｏｘシステム［３０］やボルデテラで用いる初期の対立遺伝子交換手続き［２２］に対し、染色体内には抗菌性遺伝子マーカーや瘢痕は残されていなかった。遺伝的に不活性化されたＰＴ毒素の過剰産生は、ｐｔｘ遺伝子のタンデム反復又はｆｈａ遺伝子へ挿入された他のコピーを用いて１９９２年に報告された［２０］。得られた株によってＰＴが最大８０ｍｇ／Ｌまで過剰産生した。タンデム反復遺伝子は、遺伝的不安定性の原因となり得ることが知られている。こうした理由で、Ｂ．パータシスのゲノム配列をスキャンして適切な組み込み部位を見出した。２種の偽遺伝子のターミネーター間のＤＮＡ位置をｐｔｘクラスターの組み込み部位として選択した。事前の試みによって示唆されているように、このような病原性因子の過剰産生は細胞代謝に負荷をかけ、その結果、増殖速度が低下し、最終的には遺伝的不安定性を招く場合があるため、ＰＴ構造クラスターのコピー数を２に制限した。
【００５４】
本発明者らは、より高い発現を駆動するｆｈａプロモーターによるｐｒｎ遺伝子の過剰発現がＢ．パータシス細胞に対して明らかに有害であり、より高いＰＴ発現に関連する可能性があることを報告した。本発明者らの知見からは、ＰＲＮプロモーターをより強いプロモーターで置換することによるＰＲＮ発現の増加は確認されていなかった［２１］。従って、天然ＰＲＮプロモーターの制御下で遺伝子コピー数を増加させるアプローチを選択した。第２の遺伝子コピーのｆｈａプロモーターを天然ｐｒｎプロモーターで置換して、ＰＲＮ遺伝子の第２のコピーを有し、その天然プロモーターが染色体上の他の位置に挿入された株を作出した。宿主細胞に対するＰＲＮの毒性は大腸菌でも報告された［３１］。次に、ｆｈａプロモーターを天然ｐｒｎプロモーターで置換して、得られた株は振盪フラスコ内で正常な増殖を示し、それに応じて２倍量のＰＲＮが産生した。培養上清と細胞抽出物との間のＰＲＮの分配は多少変化し、上清中の全ＰＲＮの割合は大きくなったが、振盪フラスコ内で上清中に自発的に遊離した量は最小限であった。
【００５５】
グルタミン酸炭素源の代謝によるアンモニアの遊離に起因する急激なｐＨ上昇や中毒のため、振盪フラスコ内での増殖は制限される［３２］が、これによって、最適な発酵槽条件下で可能性のある株に関する有益な指標が得られる。ＰＴの発現が増加する安定株（Ｂｐ−ＷＷＤ）の構築、又は２種の制限抗原ＰＴ及びＰＲＮの発現が増加する安定株（Ｂｐ−ＷＷＥ）の構築が示された。Ｂｐ−ＷＷＤの場合、ＰＴのみの産生が増強され、産生するＰＲＮの量は不十分となり得るため、この場合には、組換え大腸菌又はピキア・パストリスでＰＲＮを単独供給することが示されるであろう。Ｂｐ−ＷＷＥの場合、２種の抗原ＰＴとＰＲＮのレベルが同等に増加するため、これら２種の抗原のマッチング量は高密度培養においても得られることが予想され、これによって製造操作が簡略化される。
【００５６】
結論
遺伝的に不活性化されたＰＴのＳ１：：Ｒ９Ｋ−Ｅ１２９Ｇサブユニットを含むＢ．パータシス株を、如何なるマーカーや瘢痕も染色体内に残さずに構築した。染色体上の２種の偽遺伝子間にｐｔｘ−ｐｔｌオペロンプロモーター及びｐｔｌターミネーターの制御下で５種の構造遺伝子（Ｓ１変異のｐｔｘ）を組み込むことによって、振盪フラスコ内でＰＴ毒素が２倍に増加したことが分かった。ＰＴの不活性化はＣＨＯ細胞クラスタリングアッセイによって確認した。更に、染色体上の別の位置で他の偽遺伝子間にｐｒｎ遺伝子の第２のコピーを組み込むことによってＰＲＮ産生が増加した。この株は振盪フラスコ継代培養において遺伝的に安定であることが見出され、大規模な（＞１０００Ｌ）発酵に必要とされるよりも多い世代数が再現された。これらの株（特に、ＰＴ及びＰＲＮ抗原の相対量がワクチンの組成にマッチするＢｐ−ＷＷＥ）は、手頃な価格の無細胞百日咳ワクチンの製造を可能にする上で有用であることが示されたが、これは、十分な免疫原性のために天然抗原が必要とする用量が低下し、２種の制限抗原ＰＴ及びＰＲＮに対する株の生産性が向上することによるコスト削減に寄与する。
【００５７】
方法
細菌株、プラスミド及び培養条件
本研究に用いた化学物質及び試薬は全て、分子生物学グレード又は分析グレードであった。化学物質はメルク及びシグマから購入した。細菌培養培地はディフコ（米国）及びメルク（ドイツ）から入手した。制限酵素及び修飾酵素はニュー・イングランド・バイオラボ（米国）から購入した。
【００５８】
大腸菌ＤＨ５α（インビトロジェン、米国）をクローニング宿主として用いた。この株の増殖は、ルリア・ベルターニ培地（ＬＢ）中、３７℃で行った。大腸菌ＤＨ５α形質転換体の増殖は、適切な抗生物質（アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）又はクロラムフェニコール（１５μｇ／ｍＬ））を添加したＬＢ中で行った。大腸菌ＳＭ１０は、アール・Ｓ．スティビッツ（Earle S. Stibitz）博士（米国食品医薬品局生物製品評価研究センター、細菌、寄生虫及びアレルゲン製品部）から入手し、接合ドナー株として用いた。この株の増殖は、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ中、３７℃で行った。大腸菌ＳＭ１０形質転換体の増殖は、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）及びネオマイシン（１０μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ中で行った。Ｂ．パータシス・トハマはＡＴＣＣから入手し、ＡＴＣＣ寄託番号ＢＡＡ−５８９を有する（ボルデテラ・パータシス・トハマＰｈ．Ｉ染色体寄託番号ＮＣ＿００２９２９、ＥＭＢＬ／ジェンバンク寄託番号ＢＸ４７０２４８、ウェルカム・トラスト・サンガー研究所から入手可能な配列（http://www.sanger.ac.uk/resources/downloads/bacteria/bordetella.html）［４２］）。
【００５９】
Ｂ．パータシス株の増殖は、ボルデー−ジャング（ＢＧ）寒天培地又は変法スタイナー−ショルテ培地（ＭＳＳ）にて３５℃で行った。プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋はストラタジーン（米国）から入手し、ｐＳＳ４２４５はアール・Ｓ．スティビッツ博士から入手し、ｐＡＣＹＣ１８４はニュー・イングランド・バイオラボ（米国）から入手した。
【００６０】
【表４】
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【００６１】
Ｓ１フランキング領域のクローニング及びクロラムフェニコール遺伝子の挿入
Ｂ．パータシス株トハマの染色体ＤＮＡを原料として用いた。５’Ｆ−ＰＴ−ＳａｌＩ及び５’Ｒ−ＰＴ−ＭＣＳプライマーを用いたＰＣＲによってＳ１遺伝子の上流域を増幅した。後者のプライマーは、ＫｐｎＩ、ＸｂａＩ、ＢｇｌＩＩ及びＮｏｔＩ部位を含む。増幅産物をアガロースゲルから回収し、ＱＩＡＥＸ  ＩＩ抽出キット（キアゲン）によって精製した。１２８７ｂｐの増幅産物をＳａｌＩ及びＮｏｔＩで消化し、同じ酵素で消化した大腸菌ベクターｐＳＫΔＫｐｎＩにクローン化した。ｐＳＫΔＫｐｎＩは、ＫｐｎＩ部位が消化によって除去され、クレノウ酵素で埋められ、再環状化されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋の誘導体である。得られた構築物を熱ショックによって大腸菌ＤＨ５αのコンピテント細胞に形質転換し、ｐＳＫ５’と命名した。同様に、３’Ｆ−ＰＴＸｂａＩ及び３’Ｒ−ＰＴ−ＢｇｌＩＩプライマーを用いた増幅によって下流域を得た。１５３１ｂｐの産物をＸｂａＩ及びＢｇｌＩＩで消化し、回収した断片を同じ酵素で消化したｐＳＫ５’に挿入し、ｐＳＫ５３を得た。
【００６２】
プラスミドｐＡＣＹＣ１８４からＣｍＲ遺伝子を得た。プライマーＣｍＦ−ＫｐｎＩ及びＣｍＲ−ＸｂａＩを用いて該遺伝子を増幅した。１２９５ｂｐのＰＣＲ産物を精製し、ＫｐｎＩ及びＸｂａＩで消化し、同じ酵素で切断したｐＳＫ５３に挿入した。得られたプラスミドをｐＳＫ５Ｃｍ３と命名した。このプラスミドは、ＳＩ遺伝子の５’−上流域及び３’−下流域に隣接するクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む（図２Ａ）。
【００６３】
相同組換えによるＳＩ遺伝子の交換
Ｂ．パータシスへの対立遺伝子交換を行うため、新しく開発したベクターｐＳＳ４２４５（図１）を用いた。このベクターに関する完全な記載はまだ公表されていないため、その構造の概略を本明細書にて報告する。このベクターは、ボルデテラ種における対立遺伝子交換のために特異的に設計された。対象となる遺伝子やその染色体上のフランキング配列を挿入することができるマルチリンカークローニング部位を含み、大腸菌内でベクターやその誘導体を選択するのに用いる数種の抗生物質（アンピシリン等）耐性遺伝子を含む。複製開始点はｐＢＲ３２２に由来するが、これは、該ベクターが大腸菌内では複製可能であるが、Ｂ．パータシス内では自殺することを意味する。Ｔｎ５に由来するストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子も存在し、この遺伝子は、Ｂ．パータシスに対してはストレプトマイシン耐性をもたらすが、大腸菌にはもたらさない［３３］。大腸菌ドナーとＢ．パータシスレシピエントとの間の接合伝達は、プラスミドＲＰ４由来の伝達起点の存在によって生じ得る。これには、ドナー株として大腸菌ＳＭ１０を用いることが必要であり、ＲＰ４由来の必要な接合機能をトランスに（in trans）もたらす［２２］。接合は、レシピエントであるＢ．パータシスとドナーである大腸菌を、これら２種の細菌の増殖をサポートする寒天プレート上で一緒に画線することによってのみ生じる。ベクターはＢ．パータシス内では自殺するため、対象となる遺伝子に隣接する一領域における相同組換えによって全ベクターとそのＳｔｒＲマーカーを組み込んだＢ．パータシス細胞に対してストレプトマイシンを選択し、それと同時に大腸菌ドナーを排除する。この共組み込みと排除を解決するため、ベクターの大部分は対象となる遺伝子を保存し、ｐＳＳ４２４５はＩ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼ遺伝子と共に対応する切断部位を取り込む（図１）［３４］。ヌクレアーゼをｐｔｘ−ｐｔｌオペロンプロモーターの制御下に置く。Ｂ．パータシス染色体上には対応する切断部位が存在しない。融合体の選択は調節条件下で行う必要があるが、この場合、ＰＴを含むＢ．パータシスの全ての病原性因子が抑制される。この条件は、接合プロセスで用いるＭＳＳ−寒天プレートに２０ｍＭのニコチン酸を添加することによって得られた。ニコチン酸を添加せずにＭＳＳ−寒天に接合完了体混合物を移すとｐｔｘプロモーター抑制が緩和されるため、Ｉ−ＳｃｅＩヌクレアーゼが発現する。これによって、組み込まれたベクターのヌクレアーゼ部位のレベルで細菌染色体内で二重鎖切断が生じる。この事象は修復されなければ致死的である。ＤＮＡ損傷も修復に向けたＳＯＳ応答を活性化し、組換え頻度は２〜３ログで増加し、損傷は第２の相同組換えによって最終的には排除される［３４］。いずれの場合においても、ベクターの大部分を損失する。第２の組換えが同じフランキング領域内で生じた場合には元の株が再生し、他のフランキング領域内で生じた場合には所望の株が得られる。略同じサイズのフランキング領域と同様に、クロラムフェニコール耐性状態についてスクリーニングする必要のあるコロニーは少数であり、得られる２種類の株、即ち、親株と組換え株は略同等に分布する。
【００６４】
プラスミドｐＳＫ５Ｃｍ３をＳａｃＩ及びＢｇｌＩＩで消化し、回収した断片をＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで切断したｐＳＳ４２４５に連結させた。大腸菌ＳＭ１０に形質転換した後、得られたプラスミドをｐＳＳ５Ｃｍ３と命名した。Ｂ．パータシス株トハマの新鮮な培養物（ニコチン酸（２０ｍＭ）を添加したＭＳＳ−寒天にて４日間）とベクター含有大腸菌ＳＭ１０の新鮮な培養物（アンピシリン、カナマイシン及びクロラムフェニコールを添加したＬＢ−寒天にて一晩）を擦り取り、ニコチン酸（２０ｍＭ）及びＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）を添加したＬＢ：ＭＳＳ（１：１）を含む寒天プレート上で混合した。３５℃で３時間経過させた後、ニコチン酸（２０ｍＭ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ）及びクロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）を添加したＭＳＳに混合物を塗布した。クロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）を添加したＭＳＳ−寒天上にスワブ増殖物を画線し、第２の組換え事象に備えた。得られた単一コロニーをレプリカ平板法で試験し、ＳｍＳ及びＣｍＲ表現型を有する少数のコロニーを保持して更なる試験に備えた（図３Ａ）。Ｂ．パータシス特異的プライマーを用いたＰＣＲ増幅によって、コロニーがＢ．パータシスであることを確認した。ＣｍＲ遺伝子が設計位置で組み込まれたことの確認は、ＣｍＲ遺伝子の内部で上流５’フランキング領域に特異的に結合するプライマー（５’Ｆ−ｉｎｔ及び５’ＲＣＭ−ｉｎｔプライマー）及び３’下流フランキング領域に特異的に結合するプライマー（３’ＦＣＭ−ｉｎｔ及び３’Ｒ−ｉｎｔプライマー）を用いたＰＣＲによって行った。ＰＣＲ解析から、５’及び３’フランキング領域が存在し、ＣｍＲ遺伝子がＳ１遺伝子の代わりに予想された位置で挿入されたことが確認された。また、これらの確認によって、対立遺伝子交換プロセスは、組換えが生じたＳ１フランキング領域内で如何なる変化も引き起こさなかったことも分かった。
【００６５】
改変Ｓ１遺伝子の構築
Ｓ１遺伝子をＰＣＲ増幅によってクローン化し、部位特異的ＰＣＲ変異誘発によって変異させた。プライマーＳ１Ｆ−ＰＴ−ＫｐｎＩ及びＳ１Ｒ−ＰＴＸｂａＩを用いて染色体ＤＮＡ由来の遺伝子を増幅した。精製したＰＣＲ産物をＸｂａＩ及びＫｐｎＩで消化し、回収した９０８ｂｐの断片を同じ酵素で切断したｐＳＫ５３に連結させた。形質転換及びコロニー選択後、得られたプラスミドをｐＳＫ５Ｓ１３と命名した。
【００６６】
部位特異的ＰＣＲ変異誘発には、配列ミスマッチＣＧＣ→ＡＡＧを有する内部Ｆ−Ｒ９Ｋ及びＲ−Ｒ９Ｋプライマーを用い、Ｒ９Ｋ置換を引き起こした。これらのプライマーは別々の反応サイクルで用いた。次に、増幅産物を混合し、アニーリング後に増幅を４〜５サイクル継続させた。次に、外側プライマーを反応に添加して所望の変異を含む全Ｓ１断片を得た。同様の手続きを行い、内部ミスマッチプライマーＦ−Ｅ１２９Ｇ及びＲ−Ｅ１２９Ｇを用いて第２の変異をもたらし、配列ＧＡＡ→ＧＧＧを得て、Ｅ１２９Ｇ置換を引き起こした。
【００６７】
得られた断片をＸｂａＩ及びＫｐｎＩで消化し、同じ酵素で切断したｐＳＫ５３に挿入し、プラスミドｐＳＫ５Ｓ１３−９Ｋ−１２９Ｇを得た（図２Ｂ）。これをＳａｃＩ及びＢｇｌＩＩで消化し、回収した断片をＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで切断したｐＳＳ４２４５に連結させた。大腸菌ＳＭ１０に形質転換した後、得られたプラスミドをｐＳＳ５Ｓ１３−９Ｋ−１２９Ｇと命名した。
【００６８】
改変Ｓ１遺伝子をＢ．パータシス染色体内の元の位置に戻すための対立遺伝子交換を上述のように行ったが、クロラムフェニコールによる接合完了体の選択は行わなかった。この場合、所望の株は該マーカーを損失したため、所望の表現型ＣｍＳ及びＳｍＳを有するコロニーを特定するのにレプリカ平板法によるスクリーニングが必要であった。得られたトハマ誘導体をＢｐ−ＷＷＣと命名した（図３Ｂ）。設計位置でのＳ１変異遺伝子の組み込みは、所定のプライマーを用いたＰＣＲによって確認した。該プライマーは、Ｓ１遺伝子内部で上流５’フランキング領域に結合することができ（５’Ｆ−ｉｎｔ及びＲ−Ｒ９Ｋプライマー）、３’下流フランキング領域を結合することができた（Ｆ−Ｅ１２９Ｇ及び３’Ｒ−ｉｎｔプライマー）。
【００６９】
５種のＰＴ構造遺伝子の第２のセットの挿入
先ず、標的挿入部位に隣接する配列（図４Ａ）をクローン化してｐＳＫＰＤ５Ｃｍ３を得た。上流の１６８８ｂｐの断片をプライマー５’Ｆ−ＰＤ−ＡｐａＩ及び５’Ｒ−ＰＤ−ＭＣＳで増幅し、ＡｐａＩ及びＫｐｎＩで消化し、同じ酵素で切断したｐＳＫ５Ｃｍ３に連結させてｐＳＫＰＤ５’−Ｃｍを得た。下流の２９８０ｂｐの断片をプライマー３’Ｆ−ＰＤ−ＭＣＳ及び３’Ｒ−ＰＤ−ＢｇｌＩＩで増幅し、ＸｂａＩ及びＢｇｌＩＩで消化し、同じ酵素で切断したｐＳＫＰＤ５’−Ｃｍに連結させた。得られたプラスミドをｐＳＫＰＤ５Ｃｍ３と命名した（図４Ｂ）。
【００７０】
このプラスミドをＮｏｔＩ及びＢｇｌＩＩで消化し、ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩで消化したｐＳＳ４２４５に連結させて接合構築物を得た。得られたプラスミドをｐＳＳＰＤ５３−Ｃｍと命名した。ＳｍＳ及びＣｍＲについての接合伝達及び選択によって所望のＢ．パータシス誘導体Ｂｐ−ＰＤ５３−Ｃｍが得られたが、無傷の上流、下流及びＣｍＲインサートの存在をＰＣＲ増幅によって確認した。該プライマーは、ＣｍＲ遺伝子内部で上流５’フランキング領域に結合することができ（５’ＦＰＤ−ｉｎｔ及び５’ＲＣＭ−ｉｎｔプライマー）、３’下流フランキング領域に結合することができた（３’ＦＣＭ−ｉｎｔ及び３’ＲＰＤ−ｉｎｔプライマー）。
【００７１】
Ｓ３遺伝子に隣接するｐｔｘ−ｐｔｌターミネーターを挿入して、プロモーターを有するｐｔｘオペロンの機能性コピーを得た。プライマーＰｔｘＦ−ＢａｍＨＩ及びＰｔｘＲ−ＭＣＳを用いて、オペロンプロモーターを有するＰＴの５種の構造遺伝子（改変Ｓ１、Ｓ２、Ｓ４、Ｓ５及びＳ３）をＢｐ−ＷＷＣＤＮＡから増幅した。３４６９ｂｐの増幅産物をＢａｍＨＩ及びＳｐｅＩで消化し、回収した断片を同じ酵素で切断したｐＳＫΔＲＩに連結させてｐＳＫｐｔｘを得た。ｐＳＫΔＲＩは、ＥｃｏＲＩ部位が消化によって除去され、クレノウ酵素で埋められ、再環状化されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋のバリアントである。
【００７２】
次に、ｐｔｘ−ｐｔｌオペロンターミネーターをＴｅｒＦ−ＥｃｏＲＩ及びＴｅｒＲ−ＳｐｅＩプライマーで増幅した。２２３ｂｐの産物をＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩで二重消化し、同じ酵素で切断したｐＳＫｐｔｘに連結させた。形質転換及びコロニー選択後、得られたプラスミドをｐＳＫｐｔｘｔｅｒと命名した（図４Ｃ）。次に、このプラスミドをＢａｍＨＩ及びＳｐｅＩで二重消化し、同じ酵素で切断したｐＳＳＰＤ５Ｃｍ３に連結させて接合ベクターｐＳＳＰＤｐｔｘｔｅｒを得た。ＳｍＳ及びＣｍＳコロニーに対するレプリカスクリーニングを用い、Ｂｐ−ＰＤ５３Ｃｍへの対立遺伝子交換を上述のように行ってＢｐ−ＷＷＤと命名された株を得た。設計位置でのＳ１変異遺伝子の組み込みは、所定のプライマーを用いたＰＣＲによって確認した。該プライマーは、Ｓ１遺伝子内部で上流５’フランキング領域に結合することができ（５’ＦＰＤ−ｉｎｔ及びＲ−Ｒ９Ｋプライマー）、３’下流フランキング領域を結合することができた（Ｆ−Ｅ１２９Ｇ及び３’ＲＰＤ−ｉｎｔプライマー）。
【００７３】
ＰＲＮ構造遺伝子の第２のコピーの挿入
ＰＲＮ構造遺伝子の第２のコピーを組み込むために選択した標的部位へのクロラムフェニコール耐性遺伝子の組み込み。
ＢａｍＨＩ部位が欠如したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋の誘導体の構築を、酵素による消化、クレノウ酵素による埋め込み及び連結によって行った。得られたプラスミドを大腸菌に形質転換し、ｐＳＫΔＨ１と命名した。
【００７４】
Ｂ．パータシス・トハマ株の配列をスキャンし、偽遺伝子を特定した。推定グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ偽遺伝子と推定アスパラギン酸ラセマーゼ偽遺伝子との間のＤＮＡ配列を挿入部位として選択した（ｐｏｓｎ．１，３４４，７１０〜１，３４５，６８５及び１，３４５，６９３〜１，３４６，０４９）。これらの遺伝子はフレームシフト変異を有しており、機能的ではない（図６Ａ）。
【００７５】
ＳｐｅＩを有するプライマー（５’Ｆ−ＰＤ２−ＳｐｅＩ）とＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ制限部位を含むマルチリンカーを有するプライマー（５’Ｒ−ＰＤ２−ＭＣＳ）を用いて標的挿入部位に対する５’−上流域を増幅した。増幅産物をゲル電気泳動によって単離し、ＳｐｅＩ及びＮｏｔＩで二重消化した。得られた断片を同じ酵素で消化したｐＳＫΔＨ１の断片に連結させた。得られたプラスミドを大腸菌に形質転換し、ｐＳＫＰＤ２５と命名した。ＸｂａＩ制限部位を有するプライマー（３’Ｆ−ＰＤ２−ＸｂａＩ）及びＮｏｔＩ制限部位を有するプライマー（３’Ｒ−ＰＤ２−ＮｏｔＩ）を用いて３’−下流断片を同様に増幅した。同じ酵素で消化した後、得られた断片を同じ酵素で消化したｐＳＫＰＤ２５の断片に連結させた。得られたプラスミドを大腸菌に形質転換し、ｐＳＫＰＤ２５３と命名した。
【００７６】
ＢａｍＨＩ制限部位を有するプライマー（ＣｍＦ−ＢａｍＨＩ）及びＸｂａＩ制限部位を有するプライマー（ＣｍＲ−ＸｂａＩ）を用いたプラスミドｐＡＣＹＣ１８４からのＰＣＲ増幅によってクロラムフェニコール耐性部位を得た。ＰＣＲ産物をこれら２種の酵素で消化し、同じ酵素で切断したｐＳＫＰＤ２５３にクローン化した。連結後、得られたプラスミドを大腸菌に形質転換し、制限酵素解析によって確認し、ｐＳＫＰＤ２５Ｃｍ３と命名した。
【００７７】
制限酵素マッピングによって確認した後、プラスミドをＮｏｔＩ及びＳｐｅＩで消化し、得られた断片を同じ酵素で二重消化したｐＳＳ４２４５に連結させた。得られたプラスミドをｐＳＳＰ２Ｄ５Ｃｍ３と命名し、大腸菌ＳＭ１０に形質転換した。
【００７８】
Ｂｐ−ＷＷＤをレシピエントＢ．パータシス株として用いて上述のように接合を行い、ＣｍＲ及びＳｍＳ単一コロニーを選択した。設計位置でのＣｍＲ遺伝子の組み込みは、ＣｍＲ遺伝子内部で上流５’フランキング領域のみに特異的に結合するプライマー（５’ＦＰＤ２−ｉｎｔ及び５’ＲＣＭ−ｉｎｔプライマー）及び３’下流フランキング領域のみに特異的に結合するプライマー（３’ＦＣＭ−ｉｎｔ及び３’ＲＰＤ２−ｉｎｔプライマー）を用いたＰＣＲによって確認した。
【００７９】
ｆｈａプロモーターの制御下でのｐｒｎ遺伝子の組み込み
ＡＴＧ開始コドン（Ｆ）で開始するプライマーとＸｂａＩ（Ｒ）制限部位を有するプライマーを用いてＢ．パータシスＤＮＡからＰＲＮの構造遺伝子を増幅した。コード領域及びターミネーターのみを含む２８０８ｂｐの増幅産物を「Ａ」テーリングプロトコル（プロメガ）によって処理した。得られた断片をｐＧＥＭ−Ｔイージーベクターにクローン化した。得られたｐＧＥＭ−ＴＰＲＮと命名されたプラスミドを制限酵素解析によって確認した。強いＦＨＡプロモーターによって駆動されるＰＲＮ遺伝子の第２のコピーを得るための最初の検査において、ＦＨＡプロモーターをＰＣＲ増幅によってＢ．パータシスＤＮＡから単離し、ＰＲＮ遺伝子の前方に挿入した。ＢａｍＨＩを有するプライマー（ＦＨＡｐｒｏＦ−ＢａｍＨＩ）とＮｄｅＩ−ＸｂａＩを含むポリリンカーを有するプライマー（ＦＨＡＲ−ＭＣＳ）によってＦＨＡプロモーターを増幅した。精製産物をＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで切断した後、回収したＤＮＡ断片を同じ酵素で切断したｐＳＫＰＤ２５３に連結させた。得られたｐＳＫＰＤ２５３Ｆｐと命名されたプラスミドを制限酵素解析によって確認した。このプラスミドをＮｄｅＩ及びＸｂａＩで切断した後、ＰＲＮＦ−ＮｄｅＩ及びＰＲＮＲ−ＸｂａＩプライマーによってｐＧＥＭＴＰＲＮから増幅し、同じ酵素で切断したｐｒｎ遺伝子のＰＣＲ産物と連結させた。得られたプラスミドをｐＳＫＰＤ２５ＦｐＰＲＮ３と命名した（図６Ｂ）。このプラスミドをＮｏｔＩ及びＳｐｅＩで消化し、同じ酵素で消化したｐＳＳ４２４５に連結させることによって接合構築物を得た。得られたプラスミドをｐＳＳＰＤ２ＦｐＰＲＮと命名した。この構築物をＢｐ−ＷＷＤ染色体の選択位置で挿入し、上述の通常の対立遺伝子交換手続きとスクリーニングを用いて導入したクロラムフェニコール耐性マーカーを置換した。
【００８０】
ｐｒｎプロモーターの制御下でのｐｒｎ遺伝子の発現
制限部位ＢａｍＨＩを有するプライマー（ＰｒｎＰｒｏＦ−ＢａｍＨＩ）及び制限部位ＮｄｅＩを有するプライマー（ＰＲＮＰｒｏＲ−ＮｄｅＩ）を用いたＢ．パータシスＤＮＡのＰＣＲ増幅によってＰＲＮプロモーターをクローン化した。プラスミドｐＳＫＰＤ２５ＦｐＰＲＮ３をＢａｍＨＩ及びＮｄｅＩで切断し、ＦＨＡプロモーターを損失した断片を得た。ＰＲＮプロモーターをその場所に連結させた。大腸菌に形質転換し、制限酵素解析によって確認した後、得られたプラスミドをｐＳＫＰＤ２５ＰＲＮ３と命名した（図６Ｃ）。該プラスミドをＮｏｔＩで切断し、同じ酵素で切断したｐＳＳ４２４５に挿入した。得られた構築物のｐＳＳＰＤ２ｐｒｎを大腸菌ＳＭ１０に導入し、対立遺伝子交換を行った。得られたＢ．パータシス株をＢｐ−ＷＷＥと命名した。設計位置でのｐｒｎ遺伝子の組み込みの確認は、ｐｒｎ遺伝子内部で上流５’フランキング領域のみに特異的に結合するプライマー（５’ＦＰＤ２−ｉｎｔ及びＰＲＮＰｒｏＲ−ＮｄｅＩプライマー）及び３’下流フランキング領域のみに特異的に結合するプライマー（ＰＲＮＦ−ｉｎｔ及び３’ＲＰＤ２−ｉｎｔプライマー）を用いたＰＣＲによって行った。
【００８１】
振盪フラスコ培養におけるＰＴ、ＦＨＡ及びＰＲＮの発現
振盪フラスコ中、メチル化β−シクロデキストリンを添加したＭＳＳ培地（１００ｍＬ）を用い、３５℃、２００ｒｐｍでＢｐ−ＷＷＣ、Ｂｐ−ＷＷＤ及びＢｐ−ＷＷＥを増殖した。増殖を３２〜４８時間行った後、培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡによってアッセイしてＰＴ及びＦＨＡの発現レベルを定量化した。ＰＲＮ発現をウェスタンブロット濃度測定解析によって確認し、抗原の完全性についても評価した。このアッセイは、清澄化した培養上清と等張バッファー中６０℃で加熱して得た細胞抽出物との両方について行った。
【００８２】
ＰＴ及びＦＨＡに対するＥＬＩＳＡアッセイ
ＰＴ又はＦＨＡに対する精製ウサギポリクローナル抗体（１：１０００、ＮＬＡＣ、タイ）を９６ウェルプレート（ＮＵＮＣマキシソープ）中、炭酸／重炭酸バッファー（ｐＨ９．６）（１００μＬ／ウェル）でコートし、４℃で一晩インキュベートした。リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４、０．１％ツイーン２０含有）（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した後、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳＴ（１００μＬ／ウェル）を用いてブロッキングを行い、その後、３７℃で１時間インキュベートした。ブロッキングバッファーを廃棄して洗浄を行った後、標準ＰＴ、ＦＨＡ又はサンプルの希釈物を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ブロッキングバッファーに溶解した抗ＰＴサブユニットＳ２マウスモノクローナル抗体（１：３０，０００、アブカム、米国）又は抗ＦＨＡマウスモノクローナル抗体（１：１０，０００、ＮＩＢＳＣ、英国）（１００μＬ）を添加し、同様の条件下でインキュベートした。ＰＢＳＴでウェルを３回洗浄した後、ウサギ抗マウス（Ｈ＋Ｌ）ＩｇＧ−ＨＲＰ接合体（アブカム、米国）のブロッキングバッファー希釈物（１：１０，０００）（１００μＬ）を二次抗体として用い、再度３７℃で１時間インキュベートした。ＰＳＴで洗浄した後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＫＰＬ、米国）（１００μＬ）を酵素基質として添加した。１Ｎ  ＨＣｌ（１００μＬ／ウェル）によって呈色反応を終了させた。マイクロタイタープレートリーダーを用い、光学濃度を４５０ｎｍで測定した。
【００８３】
ＰＲＮに対するウェスタンブロットアッセイ
標準ＰＲＮ及びサンプルの希釈物を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに溶解した後、半乾燥ブロッティングシステムを用いてＰＶＤＦ膜に移した。ＰＢＳＴに溶解した５％スキムミルクで膜を１時間ブロックした。このブロッキング溶液を廃棄した後、膜をブロッキングバッファーに溶解した抗ＰＲＮヒツジ血清（１：１０，０００、ＮＩＢＳＣ、英国）（２０ｍＬ）と共に１時間インキュベートし、その後、ＰＢＳＴで３回洗浄した。次に、膜を同様の条件下でウサギ抗ヒツジＩｇＧ−ＨＲＰ接合体（サンタクルーズ・バイオテクノロジー、米国）（２０ｍＬ）と共にインキュベートし、再度洗浄した。次に、膜を３，３’−ジアミノベンズアミジンに茶色くなるまで浸漬した。脱イオン水で２〜３回すすいで反応を終了させた後、室温で乾燥させた。膜をスキャンし、画像ファイルに変換した。専用のソフトウェアを用いたサンプル及び基準バンドのデンシトメトリー解析によってＰＲＮ濃度を求めた。
【００８４】
遺伝的安定性
株の培養をＭＳＳ培地（１００ｍＬ）中、３５℃、２００ｒｐｍで４８時間行った後、培養物（０．１ｍＬ）をＭＳＳ（１００ｍＬ）に導入し、同様の条件下でインキュベートした。この工程を更に４回繰り返した。各導入は１０世代に相当する。培養物を希釈し、ＭＳＳ寒天上に播種した。３０個の単離コロニーをランダムに選択した。選択した３０個のコロニーの内の２個をＰＣＲによって解析し、予想されるＰＴ及びＰＲＮインサートの存在を検出した。
【００８５】
ＣＨＯ細胞クラスタリングアッセイ
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞クラスタリング活性をヒューレット（Hewlett）らの方法［２８］によって確認した。即ち、１０％ウシ胎仔血清を添加したｃＲＰＭＩ１６４０培地中でＣＨＯ細胞を培養した。５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で細胞をインキュベートした。培養した細胞をトリプシン処理し、ｃＲＰＭＩ１６４０培地で２×１０４個／ｍＬに調整し、９６ウェルマイクロ培養プレートのウェルに供給した（２００μＬ／ウェル）。試験サンプル及び基準ＰＴ毒素をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）にて１０倍間隔で連続的に希釈し、希釈物（２５μＬ）をウェルに添加した。同様の条件下で４８時間インキュベートしてクラスタリングを最大限にした後、細胞をクリスタルバイオレットで染色し、写真撮影した。
【００８６】
【表５】
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【００８７】
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【図１】
0005966018.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
0005966018.tif 000014
【図７】
0005966018.tif 000015
【配列表】
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