(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Symbiodinium属の藻類を培地中で培養し、培養物から脂肪酸組成におけるラウリン酸の含有割合が３質量％以上である油脂を採取し、当該油脂からラウリン酸を分離、取得することを特徴とする、ラウリン酸の製造方法。
【請求項２】
Symbiodinium藻類が、Symbiodinium microadriaticumである請求項１記載の方法。
【請求項３】
Symbiodinium藻類が、Zooxanthella microadriatica LB2281株又は当該LB2281株と同一の菌学的性質を有する藻類株である請求項２記載の方法。
【請求項４】
照度３００〜１００００ルクスの光照射下で、７〜１２０日間培養する請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、藻類を用いたラウリン酸を構成脂肪酸として含有する油脂（以下、単に「ラウリン酸含有油脂」とも称する）の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラウリン酸は、ヤシ油やパーム核油に多く含まれる主な脂肪酸で、各種界面活性剤の原料や食品などに使用される。
ラウリン酸は、その供給源がヤシやパーム核に限定されており、そのため栽培地域が限定される。さらに、ラウリン酸の原料として耕地を利用することは、今後バイオディーゼルや、食料用途と競合することも懸念される。また、熱帯雨林の破壊という問題も付随する。
従って、ヤシやパーム核に頼らない、ラウリン酸供給技術の開発が望まれていた。
【０００３】
一方、ラウリン酸供給生物として、光合成を行わず従属栄養で増殖する渦鞭毛藻であるCrypthecodinium choniiがラウリン酸を高含有（１５．７％／総脂質中）することが知られている（非特許文献１）。
【０００４】
炭素源コストなどの観点より、光合成（独立栄養）により増殖でき、且つラウリン酸をより多く含有する藻類が望まれるが、斯かる藻類では、ラウリン酸を１〜２％程度含有するNeochloris oleoabundansが知られているだけで（非特許文献２）、ラウリン酸をそれ以上含有する藻類はこれまでに知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Phytochemistry,(1988)27,1679-1683
【非特許文献２】J Ind Microbiol Biotechnol (2009) 36:821-826
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、Symbiodinium属の藻類を培地中で培養し、培養物から脂肪酸組成におけるラウリン酸の含有割合が３質量％以上である油脂を採取することを含む、ラウリン酸を構成脂肪酸として含有する油脂の製造方法に係るものである。
また、当該油脂よりラウリン酸を分離、取得するラウリン酸の製造方法に係るものである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明は、藻類を用いたラウリン酸供給方法を提供することに関する。
【０００８】
本発明者らは、ラウリン酸供給生物について検討したところ、光合成をするタイプの渦鞭毛藻であるSymbiodinium属藻類がラウリン酸を高濃度で含有し、これを用いることにより、構成脂肪酸としてラウリン酸を高含有する油脂を効率良く製造できることを見出した。
【０００９】
本発明の方法によれば、容易に増殖可能な藻類を用いることから、ヤシやパーム核の如く栽培地域が限定されたり、食料用途等の競合が発生することなく、効率良くラウリン酸を構成脂肪酸として高含有する油脂を製造することができる。また、本発明の方法によれば、熱帯雨林の破壊も回避可能である。
【００１０】
本発明のラウリン酸含有油脂の製造方法は、Symbiodinium属藻類を培地中で培養し、培養物から脂肪酸組成におけるラウリン酸の含有割合が３質量％以上である油脂を採取するものである。
ここで、脂肪酸組成におけるラウリン酸の含有割合が３質量％以上である油脂としては、油脂中の全構成脂肪酸中のラウリン酸の含有割合が３質量％以上、好ましくは５〜６０質量％、より好ましくは１０〜６０質量％の油脂が挙げられる。
【００１１】
本発明において用いられる藻類は、渦鞭毛藻網（Dinophyceae）のSymbiodinium属藻類の脂肪酸組成におけるラウリン酸の含有割合が３質量％以上の油脂生産能を有するものであれば何れの株でもよい。
【００１２】
本発明の藻類は、例えば、次のようなスクリーニング法に従って選択することができる。
ｉ）培養容器に滅菌した培地（淡水用としてＷＡ培地（表２参照）、海水用としてダイゴＩＭＫ培地（表３参照））を分注する。
ii）藻類株を培地に接種し、室温（２２℃〜２４℃）、照度約３０００ルクス、１２時間明暗条件下で静置培養する。
iii）藻体を回収し、油脂を抽出し、脂肪酸をメチルエステル化し、その組成を分析して、ラウリン酸含有油脂を産生している藻類株を選択する。
iv）油脂中に全脂肪酸あたり、ラウリン酸を３質量％以上含有する藻類株を選択する。
【００１３】
好適な藻類としては、例えば、Symbiodinium microadriaticum、Symbiodinium goreaui、Symbiodinium linucheae、Symbiodinium bermudense、Symbiodinium meandrinae、Symbiodinium californium、Symbiodinium kawagutii、Symbiodinium corculorum、Symbiodinium consortia、Symbiodinium muscatinei、Symbiodinium freudenthal、Symbiodinium pulchrorum、Symbiodinium pilosum、Symbiodinium sp.等が挙げられる。Symbiodinium microadriaticumは慣用的にZooxanthella microadriatica、もしくはGymnodinium microadriaticumと呼称、記載される場合がある。同様に、Symbiodinium linuchaeは慣用的にGymnodinium linuchaeと呼称、記載される場合がある。Symbiodinium microadriaticumとしてより好ましくはZooxanthella microadriatica LB2281株（The culture collection of algae at University of Texas at Austin (UTEX)より入手可能）、又は当該LB2281株と実質的に同一の藻類学的性質を有する株を挙げることができる。LB2281株と実質的に同一の藻類学的性質を有する株としては、例えば、Symbiodinium sp. CCMP2948株、Symbiodinium sp. CCMP2592株、Symbiodinium microadriaticum CCMP827株、Symbiodinium microadriaticum CCMP2458株等が挙げられる。
【００１４】
LB2281株の藻類学的性質は、以下のとおりである。LB2281株と同一の種に属する菌株、LB2281株と実質的に同一の菌学的性質を有する菌株は、斯かる性質に基づいて同定することができる。
＜LB2281株の藻類学的性質＞
ｉ）サンゴ、貝やイソギンチャク，有孔虫、放散虫などの他の原生生物や、軟体動物、腔腸動物などの内部に共生。
ii）鞭毛は細胞腹部から出る。横溝がある。
iii）細胞外被に板状構造（鎧板, thecal plate）がない。
【００１５】
また、上述したLB2281株又は当該LB2281株と実質的に同一の菌学的性質を有する菌株の変異株も本発明の藻類に包含される。
例えば、ラウリン酸を野性株より高含量で含む油脂を産生するように設計された変異株が包含される。
また、本発明のSymbiodinium属藻類由来の遺伝子は、ラウリン酸高含有油脂を産生するために利用することができる。
【００１６】
本発明のSymbiodinium属藻類の培養は、天然海水又は人工海水で調製した適当な培地中で、光照射下、微細藻類に用いられる一般的培養手段を用いることにより行うことができる。
【００１７】
培地としては、天然海水又は人工海水をベースに、窒素源、リン源、金属塩、ビタミン類等を添加した公知のものを使用できる。
ここで、例えば、窒素源としてＮａＮＯ3、ＫＮＯ3、Ｃａ（ＮＯ3）2、ＮＨ4ＮＯ3、（ＮＨ4）2ＳＯ4等、リン源としてＫ2ＨＰＯ4、ＫＨ2ＰＯ4、Ｎａ2ＨＰＯ4、ＮａＨ2ＰＯ4、グリセロリン酸ナトリウム等、金属塩としてＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2、Ｎａ2ＳＯ4、Ｋ2ＳＯ4、ＭｇＳＯ4、Ｎａ2ＣＯ3、ＮａＨＣＯ3、Ｎａ2ＳｉＯ3、Ｈ3ＢＯ3、ＭｎＣｌ2、ＭｎＳＯ4、ＦｅＣｌ3、ＦｅＳＯ4、ＣｏＣｌ2、ＺｎＳＯ4、ＣｕＳＯ4、Ｎａ2ＭｏＯ4等、ビタミン類としてＢｉｏｔｉｎ、Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｂ１２、Ｔｈｉａｍｉｎｅ−ＨＣｌ、ニコチン酸、イノシトール、葉酸、チミン等を挙げることができる。
また、上記培地にはラウリン酸含有油脂の産生を促進するため、炭素源、微量金属等を適宜添加することができる。
【００１８】
好ましい培地としては、例えば、ダイゴＩＭＫ培地、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、Ｌ１培地、ＭＮＫ培地等が挙げられる。
【００１９】
上記の培地は、調製後、適当な酸又は塩基を加えることによりｐＨを７．０〜８．０の範囲内に調整した後、オートクレーブにより殺菌して使用することが好ましい。
【００２０】
培養は、培地に接種する藻類の量は特に限定されないが、好ましくは培養培地当り１．０〜１０．０％（vol/vol）が好ましく、１．０〜５．０％（vol/vol）がより好ましい。
【００２１】
培養温度は、本発明藻類の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、一般的には１０〜３０℃で行うのが好ましく、１５〜２５℃がより好ましい。
【００２２】
光照射は、光合成が可能な条件であれば良く、人工光又は太陽光の何れでもよい。
照度は、１００〜５００００ルクスの範囲が好ましく、３００〜１００００ルクスがより好ましい。
【００２３】
培養時のｐＨは、一般的には６．５〜８．５であり、好ましくはｐＨ７．０〜８．０  である。
【００２４】
培養期間は、ラウリン酸含有油脂を高濃度に蓄積する藻体が高い濃度で増殖するよう行えばよく、例えば７〜１２０日間、好ましくは７〜３０日間、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養すればよい。
【００２５】
培養終了後、遠心分離法や濾過などの常法により、藻体を分離し、分離藻体をそのままもしくは超音波やダイノミル等によって破砕した後、例えば、クロロホルム、ヘキサン、ブタノール、メタノール、酢酸エチル等の有機溶剤による溶剤抽出を行うことにより、ラウリン酸含有油脂を採取することができる。
【００２６】
LB2281株を用いた場合、乾燥藻体１００ｇ当たりのラウリン酸含有油脂の含有量は、１０〜２０ｇ程度であり、培地１リットル当たりのラウリン酸含有油脂の生産量は、０．０５〜０．１ｇ程度に達する。
またこの場合、油脂の脂肪酸組成におけるラウリン酸含有割合は、６．０〜１５．０質量％と高濃度である。従って、培地１リットル当たりのラウリン酸の生産量としては、０．００３〜０．０１５ｇ程度と高い。
【００２７】
尚、ラウリン酸含有油脂からラウリン酸を分離するには、常法により混合脂肪酸あるいは脂肪酸エステルの状態とした後、尿素付加法、冷却分離法、高速液体クロマトグラフィー法あるいは超臨界クロマトグラフィー法などにより濃縮採取することにより行うことができる。
【実施例】
【００２８】
参考例１  藻類の培養と脂肪酸組成分析
藻類株として、The culture collection of algae at University of Texas at Austin (UTEX)より以下の２０株を入手した。
【００２９】
【表１】
0005899115.tif 000002
【００３０】
藻類の培養は、以下のように行った。淡水用としてＷＡ培地（組成は表２参照）を、海水用として、市販培地であるダイゴＩＭＫ培地（日本製薬製、組成は表３参照）を用いた。
【００３１】
【表２】
0005899115.tif 000003
【００３２】
【表３】
0005899115.tif 000004
【００３３】
培養容器として滅菌した１６ｍｍ×１５０ｍｍのカルチャーチューブ（ＶＷＲ製）とスポンジ栓（６０８８２−１６７：ＶＷＲ製）を使用し、滅菌した培地を１０ｍＬ分注した。藻類株は液体培地からは１００μＬ、固体培地からは１白金耳相当新しい培地に接種し、室温（２２℃〜２４℃）、蛍光灯下、照度約３０００  ｌｕｘ、１２時間明暗条件下で静置培養した。
藻類の培養液から３０００ｒｐｍ、３０分にて遠心分離した沈殿画分を得た。沈殿画分を８０℃にて約３時間から１６時間乾燥させ、乾燥藻体とした。乾燥藻体の重量を測定後、０．５ｍＬの１％食塩水にて懸濁し、内部標準として５ｍｇ／ｍＬの７−ペンタデカノンを１０μＬ添加後、０．５ｍＬのクロロホルムおよび１ｍＬのメタノールを培養液に添加して激しく攪拌後３０分間放置し、その後さらに０．５ｍＬのクロロホルムおよび０．５ｍＬの１．５％ＫＣｌを添加して攪拌後、３０００ｒｐｍ、１５分遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。
【００３４】
調製した脂質画分約５００μＬを窒素にて乾固後、０．５Ｎ  水酸化カリウム／メタノール溶液７００μＬを添加し、８０℃で３０分恒温した。続いて１ｍＬの１４％三フッ化ホウ素溶液（ＳＩＧＭＡ製）を添加し８０℃にて２０分恒温し、その後ヘキサン、飽和食塩水を各１ｍＬ添加し室温にて３０分放置後、上層であるヘキサン層を回収した後、ＧＣにて分析した。
【００３５】
装置はＨＰ  ７８９０Ａ  ＧＣ−ＦＩＤ（Ａｇｉｌｅｎｔ製）、カラムはＤＢ−１  ＭＳ  ３０ｍ×２００μｍ×０．２５μｍ（Ｊ＆Ｗ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）、移動相に高純度ヘリウムを用い、流量１ｍＬ／分、昇温プログラムは、１００℃（１分）、５℃／分、２８０℃（２０分）で行った。飽和脂肪酸のコントロールとして、ラウリン酸メチル（Ｃ１２）、ミリスチン酸メチル（Ｃ１４）、パルミチン酸メチル（Ｃ１６）、ステアリン酸メチル（Ｃ１８）を、不飽和脂肪酸はパルミトレイン酸メチル（Ｃ１６：１）、オレイン酸メチル（Ｃ１８：１）、リノール酸メチル（Ｃ１８：２）、リノレン酸メチル（Ｃ１８：３）、エイコサペンタエン酸メチル（Ｃ２０：５）、ドコサヘキサエン酸メチル（Ｃ２２：６）を購入し（全てＳＩＧＭＡ製）、分析した。脂肪酸の同定は、これら標準物質とのリテンションタイムと同一かどうかにより判断した。また、ラウリン酸に関してはＧＣ−ＭＳによる同定も行った。鎖長数１６の多価不飽和脂肪酸に関しては、GC-MSによる解析結果から推定した。表記はC16:x(x=2または3)とし、xは不飽和脂肪酸数を示した。装置はＨＰ７８９０Ａ  ＧＣ及び５９７５Ｃ  ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ製）、カラムはＤＢ−１  ｍｓ  ３０ｍ×２００μｍ×０．２５μｍ（Ｊ＆Ｗ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）、移動相に高純度ヘリウムを用い、流量１ｍＬ／分、昇温プログラムは、１００℃（１分）、５℃／分、２８０℃（２０分）で行った。ＧＣ分析にて検出した脂肪酸エステル量を、内部標準を基準に算出し、その総量を総脂肪酸量とした。また総脂肪酸量を乾燥藻体量で除し１００を乗じた値を脂肪酸含量（％）とした。
各種藻類の脂肪酸組成データを表４に示した。
【００３６】
【表４】
0005899115.tif 000005
【００３７】
様々な藻類の脂質組成を分析したが、ラウリン酸を蓄積する藻類は認められなかった。
【００３８】
実施例１
実験に用いた藻類株として、ＵＴＥＸよりDinophyceaeに属するZooxanthella microadriatica LB2281株を入手した。
藻類の培養には、ダイゴＩＭＫ培地を用いた。培養容器に滅菌した１６ｍｍ×１５０ｍｍのカルチャーチューブ（ＶＷＲ製）とスポンジ栓（６０８８２−１６７：ＶＷＲ製）を使用し、滅菌した培地を１０ｍＬ分注した。液体培地からは１００μＬ、固体培地からは１白金耳相当新しい培地に接種し、室温（２２℃〜２４℃）、蛍光灯下、照度約３０００  ｌｕｘ、１２時間明暗条件下で59日間培養した。
その後、参考例１と同様にして、藻体の回収、脂質の抽出、メチルエステル化、ＧＣ分析を行い、脂肪酸組成の解析を行った。結果を表５に示した。
【００３９】
【表５】
0005899115.tif 000006
【００４０】
Zooxanthella microadriatica（ＬＢ２２８１株）において、総脂肪酸中１３．２％のラウリン酸の蓄積が認められた。
【００４１】
実施例２  ラウリン酸高含有油脂の生産
【００４２】
ラウリン酸高含有油脂の生産は以下のように行った。
Zooxanthella microadriatica（ＬＢ２２８１株）を、１６ｍｍ×１５０ｍｍのカルチャーチューブ（ＩＭＫ培地１０ｍＬ仕込み）にて室温（２２℃〜２４℃）、照度約３０００  ｌｕｘ、１２時間明暗条件下で４週間静置培養した種培養液を、５００ｍＬ容坂口フラスコ（ＩＭＫ培地２００ｍＬ仕込み）に２％（ｖ／ｖ）植菌し、室温（２２〜２４℃）、照度約３０００  ｌｕｘ、１２時間明暗条件下で３８日間静置培養した。培養液を３０００ｒｐｍで３０分間遠心して集菌し、１％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム水溶液で１回洗菌を行った。
【００４３】
２００ｍＬの培養液から回収した藻体を、８０℃にて約１６時間乾燥させた。乾燥藻体にクロロホルム／メタノール（Ｃ／Ｍ）（１：１）４ｍＬを加えた。超音波を照射しながら、４０℃で、３０分間抽出した後、再びＣ／Ｍ（１：１）４ｍＬを加えて再び同様に抽出した。回収した上清（２回分、約８ｍＬ）をメンブレンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製  Ｍｉｌｌｅｘ−ＬＨ，Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ＰＴＦＥ，０．４５μｍ，φ２５ｍｍ）で濾過し、濾液を１５ｍＬ  スクリュー管に回収し、遠心エバポレーターで乾燥し、ＬＢ２２８１の油脂画分１９．４ｍｇを得た。
【００４４】
油脂組成を実施例１記載と同様の方法にて分析したところ、油脂画分中の脂肪酸含量は３４．４％、総脂肪酸中のラウリン酸の割合は７．８％であった。これにより１９．４ｍｇ中の油脂画分より、ラウリン酸０．５１８ｍｇを得た。
【００４５】
実施例３  渦鞭毛藻におけるラウリン酸の蓄積
実験に用いた藻類株として、ＵＴＥＸよりDinophyceaeに属するZooxanthella microadriatica LB2282株、The Provasoli-Guillard National Center for Culture of Marine Phytoplankton（ＣＣＭＰ）よりSymbiodinium sp. CCMP2948株を入手した。
藻類の培養には、ダイゴＩＭＫ培地を用いた。培養容器に滅菌した１６ｍｍ×１５０ｍｍのカルチャーチューブ（ＶＷＲ製）とスポンジ栓（６０８８２−１６７：ＶＷＲ製）を使用し、滅菌した培地を１０ｍＬ分注した。液体培地からは１００μＬ、固体培地からは１白金耳相当新しい培地に接種し、室温（20℃）、蛍光灯下、照度約３０００  ｌｕｘ、１２時間明暗条件下で約2ヶ月間培養した。
その後、参考例１と同様にして、藻体の回収、脂質の抽出、メチルエステル化、ＧＣ分析を行い、脂肪酸組成の解析を行った。結果を表６に示した。
【００４６】
【表６】
0005899115.tif 000007
【００４７】
Symbiodinium（Zooxanthella）属において、総脂肪酸中3質量％以上のラウリン酸の蓄積が認められた。
【００４８】
実施例４  渦鞭毛藻におけるラウリン酸の蓄積
実験に用いた藻類株として、ＣＣＭＰよりSymbiodinium sp. CCMP2592株、Symbiodinium microadriaticum CCMP827株、CCMP2458株を入手した。
藻類の培養には、ダイゴＩＭＫ培地を用いた。培養容器に滅菌した１６ｍｍ×１５０ｍｍのカルチャーチューブ（ＶＷＲ製）とスポンジ栓（６０８８２−１６７：ＶＷＲ製）を使用し、滅菌した培地を１０ｍＬ分注した。液体培地からは１００μＬ、固体培地からは１白金耳相当新しい培地に接種し、室温（20℃）、蛍光灯下、照度約３０００  ｌｕｘ、１２時間明暗条件下で42日間培養した。
その後、参考例１と同様にして、藻体の回収、脂質の抽出、メチルエステル化、ＧＣ分析を行い、脂肪酸組成の解析を行った。結果を表７に示した。
【００４９】
【表７】
0005899115.tif 000008
【００５０】
Symbiodinium属において、総脂肪酸中3質量％以上のラウリン酸の蓄積が認められた。