(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多発性骨髄腫と診断された患者の疾患転帰または予後を、該患者を高リスクまたは低リスクのカテゴリーに分類することによって判定するための方法であって、
（i）前記患者由来の試料において、表1に記載の92種の遺伝子のセットからの個々の各遺伝子の発現レベルを決定する段階であって、前記試料が前記患者の形質細胞由来のmRNAを含む、前記段階；および
（ii）前記表1に記載の92種の遺伝子のセットからの個々の各遺伝子の発現レベルを用いて、前記患者を高リスクまたは低リスクのカテゴリーに分類する段階
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記92種の遺伝子の個々の各遺伝子を検出するためのプローブセットを提供する段階；
前記プローブセットを、前記患者由来のmRNAを含む試料と接触させる段階；および
前記92種の遺伝子の個々の各遺伝子の発現レベルを決定する段階
をさらに含む、請求項1記載の方法：
【請求項３】
前記各段階が、遺伝子チップ上で行われることを特徴とする、請求項2記載の方法。
【請求項４】
a）表1に記載の少なくとも92種の遺伝子のセットを検出するためのプローブを含む遺伝子チップを提供する段階、
b）前記遺伝子チップを、患者由来のmRNAを含む試料と接触させる段階、
c）前記試料における前記92種の遺伝子のセットからの個々の各遺伝子の発現レベルを決定する段階、
d）正規化された発現値を得る目的で、前記発現レベルを平均／分散正規化を用いて正規化する段階、
e）前記正規化された発現値と表1に記載のβ値とを乗算して、個々のプローブに関する計算値を得る段階、
f）前記個々のプローブの計算値の積算によってEMC-92スコアを決定する段階
を含み、
EMC-92スコアが所定の閾値を上回ることによって、前記患者が高リスクカテゴリーに分類されることが指し示され、スコアが前記所定の閾値以下であることによって、前記患者が低リスクカテゴリーに分類されることが指し示される、請求項3記載の方法。
【請求項５】
個々の各遺伝子が少なくとも1つのプローブによって検出される、請求項1〜4いずれか一項記載の方法。
【請求項６】
個々の各遺伝子が多数のプローブによって検出される、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
序論
本発明は、分子診断学の分野にあり、多発性骨髄腫と診断された患者から得られた試料を分類するための方法に関する。本発明はまた、多発性骨髄腫と診断された個体の予後を判定するための方法、ならびに多発性骨髄腫と診断された個体の治療に対する反応の予測のための方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
多発性骨髄腫（MM）は、骨髄における悪性の単クローン性形質細胞の蓄積を特徴とする。全生存期間（OS）の中央値は3〜4年であるが、患者毎に大きく異なる。現在は、MM患者を3つの予後カテゴリーに分類するために、血清β2mおよびアルブミンに基づく国際病期分類システム（ISS）が臨床的に幅広く用いられている[1]。
【０００３】
細胞遺伝学に基づき、MMの生物現象および予後との関連から、MMの2つのクラスを鑑別することができる。患者のほぼ60％である高二倍体MMは、複数の奇数番目染色体（3、5、7、9、11、15、19および21）のトリソミーを特徴とし、予後が比較的良好である。患者のほぼ40％である非高二倍体MMは、CCND1、CCND3、MAF、MAFBまたはFGFR3／MMSETの転写活性化を引き起こす、14q32での免疫グロブリン重鎖遺伝子が関わる再発性転座を特徴とする[2,3]。CCND1が関わる転座t(11;14)は予後が比較的良好であるが、一方、FGFR3およびMMSETが関わる転座t(4;14)は、予後不良である[4,5]。MAF癌遺伝子が関わる転座t(14;16)およびt(14;20)も不良な予後をもたらすが、これについては近年議論がある[6]。加えて、従来の核型分析によって検出されたdel(17p)、del(13q)および1q-gainも、予後不良と関連性があることが報告されている[7]。
【０００４】
遺伝子発現分析に基づき、MMに関する分類がいくつか発表されており、それには、アーカンソー医科大学（UAMS）分類、および本発明者ら自身のグループによるさらに最近の分類が含まれる。骨髄腫のUAMS分子的分類は、転座クラスターMS、MFおよびCD-1／2、さらには高二倍体クラスター（HY）、増殖関連遺伝子を伴うクラスター（PR）、ならびに骨疾患が低率であることを特徴とするクラスター（LB）を含む、7つの別個の遺伝子発現クラスターからなる[8]。本発明者らのMM分類では、さらに3つのクラスターが得られている：NFκB、CTAおよびPRL3[9]。
【０００５】
遺伝子発現は、ISSおよび細胞遺伝学と比較して、生存に関する差異のさらに多くを説明することができる。遺伝子発現に基づく最初の生存シグネチャーの1つは、UAMS-70遺伝子分類指標であり、さらに精緻化されたUAMS-17遺伝子分類指標である[10,11]。他の分類指標には、Millenniumシグネチャー、MRC-IX-6遺伝子シグネチャーおよびIFM分類指標が含まれる[12〜14]。加えて、最近発表された遺伝子発現増殖指数（GPI）などのシグネチャーは形質細胞増殖を予測することも報告されている[15]。
【０００６】
本研究の目的は、標準的な導入治療またはボルテゾミブ導入のいずれかによる治療を受け、その後にいずれの場合にも高用量メルファランおよび維持を受けたMM患者の遺伝子発現プロファイル（GEP）に基づいて、予後シグネチャーを開発することにあった。
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは、本明細書において、高リスクの患者と低リスクの患者とを鑑別することができる、92種の遺伝子のセットを含む分類指標を提供する。新たに診断された多発性骨髄腫（MM）患者の生存分析において、本分類指標は優れた成績をもたらし、低リスク群への分類では全生存期間が良好な患者が同定され、一方、高リスクと同定された群では有意に不良な全生存率が示された。
【０００８】
本発明はしたがって、多発性骨髄腫と診断された患者の疾患転帰または予後を、該患者を高リスクまたは低リスクのカテゴリーに分類することによって判定するための方法であって、
a）表1に記載の少なくとも92種の遺伝子のセットを検出するためのプローブを含む遺伝子チップを提供する段階、
b）遺伝子チップを、患者由来のmRNAを含む試料と接触させる段階、
c）試料における92種の遺伝子のセットの発現レベルを決定する段階、
d）正規化された発現値を得る目的で、発現レベルを平均／分散正規化を用いて正規化する段階、
e）正規化された発現値と表1に記載のβ値とを乗算して、個々のプローブに関する計算値を得る段階、
f）個々のプローブの計算値の積算によってEMC-92スコアを決定する段階
を含み、
EMC-92スコアが所定の閾値を上回ることによって該患者が高リスクカテゴリーに分類されることが指し示され、または所定の閾値以下であることによって該患者が低リスクカテゴリーに分類されることが指し示される、方法に関する。
以下に、本発明の基本的な諸特徴および種々の態様を列挙する。
［１］
多発性骨髄腫と診断された患者の疾患転帰または予後を、該患者を高リスクまたは低リスクのカテゴリーに分類することによって判定するための方法であって、
a）表1に記載の少なくとも92種の遺伝子のセットを検出するためのプローブを含む遺伝子チップを提供する段階、
b）該遺伝子チップを、患者由来のmRNAを含む試料と接触させる段階、
c）該試料における該92種の遺伝子のセットからの個々の各遺伝子の発現レベルを決定する段階、
d）正規化された発現値を得る目的で、該発現レベルを平均／分散正規化を用いて正規化する段階、
e）該正規化された発現値と表1に記載のβ値とを乗算して、個々のプローブに関する計算値を得る段階、
f）該個々のプローブの計算値の積算によってEMC-92スコアを決定する段階
を含み、
EMC-92スコアが所定の閾値を上回ることによって、該患者が高リスクカテゴリーに分類されることが指し示され、スコアが該所定の閾値以下であることによって、該患者が低リスクカテゴリーに分類されることが指し示される、方法。
［２］
前記所定の閾値が0.827である、［1］記載の方法。
［３］
前記試料が形質細胞を含む、［1］または［2］記載の方法。
［４］
個々の各遺伝子が少なくとも1つのプローブによって検出される、［1］〜［3］いずれか一項記載の方法。
［５］
個々の各遺伝子が多数のプローブによって検出される、［4］記載の方法。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明者らは、本明細書において、高リスクの患者と低リスクの患者とを鑑別することができる、92種の遺伝子のセットを含む分類指標を提供する。新たに診断された多発性骨髄腫（MM）患者の生存分析において、本分類指標は優れた成績をもたらし、低リスク群への分類では全生存期間が良好な患者が同定され、一方、高リスクと同定された群では有意に不良な全生存率が示された。
【００１０】
本分類指標を、全生存期間（OS）が不良な患者と標準的OSの患者とを鑑別する実験的設定で検証した。このために、HOVON65／GMMG-HD4データを訓練用セットとして用いて、SPCAモデルを構築した（以下の実験の項を参照）。単変量Cox回帰分析において、1088種という多くのプローブセットが無増悪生存期間（PFS）と関連性があることが見いだされた（FDR＜10％）。これらのプローブセットに基づき、本発明者らは、92種のプローブセットを伴う分類指標を開発した（表1）。この分類指標を、EMC-92遺伝子シグネチャーと名づける。
【００１１】
（表１）
0006026529.tif 000002
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0006026529.tif 000004
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【００１２】
二分するためのカットオフ閾値は、全生存期間が2年未満の患者という、高リスク患者についての臨床的意義のある定義を基準にした。これは、訓練用セットにおいて21.7％という割合になり、カットオフ値は0.827となった。4つのデータセット、TT2（n＝351）[11]、TT3（n＝208）[11]、MRC-IX（n＝247）[14]およびAPEX（n＝264）[12]のすべてにおいて、EMC-92遺伝子シグネチャーは高リスク群を識別し、それは標準リスク群とは有意に隔たっていた（図1a〜d）。
【００１３】
新たに診断された患者を含むデータセットにおいて、EMC-92遺伝子シグネチャーは、高リスク集団を平均17.7％で選別し、それらはOSが有意に短く、ハザード比は3.52（p＝2.5×10-8＝；TT2）、2.7（p＝0.07＝2；TT3）および2.38（p＝3.6×10-6＝；MRC-IX）であった。再発設定でも、EMC-92遺伝子シグネチャーは、3.14という高いハザード比で高リスク患者を選び出した（p＝5.3×10-9＝；APEX）。この後者の研究における高リスク患者の割合は、MRC-IX研究およびTT2研究と比較して低かったが、有意ではなかった（15.9％、n＝264 vs. 19.6％、n＝；p＝0.2）（表1.1）。
【００１４】
多変量共分散分析において、EMC-92遺伝子シグネチャーは、標準的な予後因子および臨床的特徴のほとんどと独立していた。3つのデータセットをこの分析に利用することができた：HOVON65／GMMG-HD4、APEX、およびMRC-IX。HOVON65／GMMG-HD4研究に対する多変量分析により、EMC-92-シグネチャーとともに、del(17p)、β2m［3.5mg／L以上］および同種移植が、生存期間がより短いことと有意に関連し、一方、WHOステータス[0]は、生存期間がより長いことと有意に関連していることが見いだされた。APEXでは、アルブミンレベル、ISSおよびIgGアイソタイプが有意に関連していることが見いだされた。MRC-IXについては、主としてISSに関連した共変が見いだされた。WHO[2]、1q gainおよびIGH splitは、明らかな寄与を示した。IGH splitは、IGH座位の細胞遺伝学的異常を有するすべての患者を表している。この場合、年齢は低いものの有意なハザード比であった。3つのデータセットのすべてで、EMC-92遺伝子シグネチャーは、利用可能な変数に対する補正後も依然として、生存に関する強力な予測因子であった。
【００１５】
最近傍分類によって、4つの検証用セットすべての試料に分子クラスターラベルを割り当てた。分子クラスターと高リスクアウトカムとの関連に関するロジスティック回帰により、高リスク分類とMF、MS、PRおよびHYクラスターとの有意な関連が明らかになった。
【００１６】
UAMS-17-遺伝子およびEMC-92-遺伝子セットを独立データセット（すなわち、TT3、MRC-IXおよびAPEX）において比較したところ、EMC-92遺伝子シグネチャーにより、有意に高い割合の患者が高リスクとして分類された（p＝0.009）。さらに、推定ハザード比（高リスク／標準リスク）も、TT3研究を除き、EMC-92遺伝子分類指標における方が高かった。
【００１７】
MRCIX研究集団において、UAMS-17遺伝子分類指標によって見逃された31人の患者を、EMC-92遺伝子分類指標のみが正しく高リスク患者と同定した（共通の高リスク群、中程度の高リスク群および標準リスク群についての50％生存期間はそれぞれ11カ月、24カ月および51カ月）。さらに、10人の患者についてはUAMS-17遺伝子分類指標のみが高リスク患者と同定したが、EMC92遺伝子分類指標によって高リスクと分類された31人の患者と比較するとハザード比が低かった。
【００１８】
EMC-92分類指標の優位性は、APEX集団においてさらに明らかであった。この場合、24人の患者がEMC-92分類指標においてのみ高リスクと同定され、彼らはUAMS-17分類指標では見逃されていた。これらの24人の患者は、20カ月後の全生存率が14％である一群を形成し、一方、EMC-92およびUAMS-17分類指標の両方で同定された高リスク集団は、20カ月後に全生存率25％を示した。
【００１９】
加えて、UAMS-70-遺伝子、MRC-IX-6遺伝子シグネチャー、GPIスコア、MillenniumシグネチャーおよびIFMシグネチャーも、これらのデータセットに適用した。2つの分類指標を同時に含めた上で研究および年齢に対して補正する、プールした独立データセットに基づくペアワイズ多変量分析において、EMC-92遺伝子分類指標は全分類指標の中でハザード比が最も高く、p値が最も低かった。
【００２０】
EMC-92遺伝子分類指標とUAMS-17遺伝子分類指標との間の高リスク患者の共通部分は、集団全体のほぼ8％であった。患者の約14％が、これらの分類指標のいずれか一方によって高リスクと分類された。共通する高リスク群は、ハザード比（HR＝5.40；p＝3.1×10-3；TT3）、（HR＝3.84；p＝5×10-7；MRC-IX）および（HR＝3.39；p＝1.9×10-5；APEX）によって示されるように、共通する標準リスク群と比較して最も大きな差を示した。いずれかのシグネチャーによってのみ高リスクと分類された14％の患者は、中程度のハザード比を示した。UAMS-17遺伝子による高リスク群では、TT3、MRX-IXおよびAPEXについて、4.08（p＝7.6×10-2）、1.92（p＝7.7×10-2）および2.31（p＝2.3×10-2）というハザード比が得られた。EMC-92遺伝子による高リスク群では、TT3、MRX-IXおよびAPEXについて、0（p＝1.0、イベントなし）、1.98（p＝2.9×10-34）および3.21（p＝1.6×10-6）というハザード比が得られた。
【００２１】
臨床診療において、MM患者の予後予測は主としてISS病期および間期蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）に基づいて行われる。FISHによって検出されるいくつかの染色体異常は、予後と関連性がある[25]。del(17p)は最も重要とみなされており、好ましくない転帰と関連しており、患者の9％に存在する[26,27]。それでもなお、この欠失を有する患者の60％は特異的な不良転帰を呈しない[28]。染色体異常t(4;14)、del(17p)およびISSの組み合わせにより、予後不良な患者がさらに明確に線引きされる[29]。
【００２２】
これまで、UAMS分類では、MS、MFおよびPRクラスターがより短いPFSおよびOSを示し、一方、クラスターHY、LB、CD-1およびCD-2は、より長いPFSおよびOSと関連していた[8]。今回、本発明者らは、HOVON65分類のGEPに基づくクラスターにおけるPFSおよびOSのばらつきについて評価した。VAD投与患者ではクラスター間でのPFSおよびOSの有意差が実証され、MFサブグループで生存期間が明らかに短かったが、一方、ボルテゾミブ（PAD）投与患者では有意差が全く見いだされなかった。
【００２３】
ボルテゾミブに基づく治療は、del(13q)などのある種の予後不良マーカーに打ち勝って、ISS-3、del(17p)およびt(4;14)などの予後不良マーカーを有する患者において、より良好なPFSおよびOSをもたらすことが示されている[16]。染色体マーカーおよびHOVON65 GEPに基づく分類はいずれも治療によって変化し、高リスク患者を正しく診断するために適用することはできない。このため、高リスクGEPシグネチャーを開発した。
【００２４】
従来の分類指標にはUAMS-17/70遺伝子分類指標およびMRC-IX-6遺伝子分類指標が含まれ、これらは両方とも独立データセットにおける予測が可能である[11,14]。対照的に、MillenniumシグネチャーおよびIFMシグネチャーは、独立した検証用セットにおいてそれほど確たる成績を実証していない[12,13]。
【００２５】
本明細書において提示したEMC-92遺伝子発現シグネチャーは、さまざまな（導入）レジメンにわたって、高リスクの患者と標準リスクMMとを識別する能力が高い。UAMS TT2（サリドマイドに基づく）[17]、TT3（ボルテゾミブに基づく）[18]およびMRC-IX試験（若齢患者および高齢患者の両方におけるサリドマイド維持）[19,20]における検証により、これらの独立した試験環境における優れた成績が示された。これは、モデルの連続フィッティング（適合度の指標）ならびに臨床状況における実用上の要求である高リスク／標準リスクに二分したアウトプットのいずれについても当てはまる。
【００２６】
多変量分析でも、EMC-92遺伝子による高リスクシグネチャーは依然として、早期死亡の強力な予測因子であった。それでもなお、ISS病期判定（血清アルブミンレベルおよびβ2mレベル）は、本シグネチャーの存在下における生存に関する差異を説明するための別の主要な寄与因子であるという強い証拠がある。したがって、本シグネチャーにISSを組み入れることは、さらに優れた生存予測につながる可能性がある。
【００２７】
高リスクと分類された患者は、MF、MSおよびPR分子クラスターにおいて大きな比率を占めており、HYクラスターでは低い比率を占める。このことは以前のデータとよく相関する：HYは一般に良好な予後を有する高二倍体患者に相当する；一方で、MSおよびMFは、好ましくない予後を有すると通常は考えられている、転座t(4;14)およびt(14;16/20）を有する患者に相当する。さらに、PRは予後不良と関連することが示されている増殖クラスターに相当する[8,11,15]。このことに関連して、EMC-92遺伝子シグネチャーの経路分析により、見いだされた主要な機能の中に細胞周期調節があることが実証された。
【００２８】
EMC-92遺伝子シグネチャー、ならびに単変量分析において生存との結びつきがみられた遺伝子のセットでは、UAMS-17遺伝子シグネチャーに関して以前に示されたのと同じく[11]、染色体位置1qが極めて多かった（表1）。また、染色体4に位置するプローブセットも多い。これらのプローブセットは、MMSETおよびFGFR3が位置するpアームの遠位末端だけでなく、染色体全体にわたって散在していることが見いだされた。染色体4はこれまでは危険因子とみなされてこなかったが、この染色体に影響を及ぼす獲得（gain）および／または喪失（loss）が低い頻度で報告されている[30]。
【００２９】
EMC-92遺伝子シグネチャーを、UAMS-17/70遺伝子、MRC-IX-6遺伝子、GPIスコア、IFM分類指標およびMillennium分類指標と、多変量分析にて比較した。公開されているMMデータセットからプールした3つのデータセットを形成させ、それらのデータセットにおいて訓練されていないシグネチャーについて独立した比較を行った（Kuiper, R. et al., Leukemia 2012, 1-8、参照により本明細書に組み入れられる）。これらのシグネチャーからの出力をCox比例ハザードモデルに入力した（表2参照）。3種の比較のすべてにおいて、EMC-92シグネチャーで最も有意なハザード比（HR）が得られており、すなわち、これは全シグネチャー（Signal GeneticsによるUAMS-70を含む）の中で最も関連性の高い予後因子である。
【００３０】
（表２）EMC 92と従来の試験との比較（HR＝ハザード比）
0006026529.tif 000007
【００３１】
EMC-92遺伝子シグネチャーにより、その検証用セットに対して最も優れた二分成績が得られることが判明した。さらに、他の分類指標と比較して、高リスク患者の割合がより高い。高リスクと標準リスクとの差は、高リスクの割合が高くなるほど顕著でなくなると予想される。しかし、たとえこの高い割合であっても、EMC-92では、より小規模なリスク群を選別する他の分類指標と比較して、生存期間の差がより大きかったことに言及しておくべきであろう。
【００３２】
これらのシグネチャーを組み合わせる多変量分析において、EMC-92遺伝子シグネチャーは最も強い識別能力を有していた。
【００３３】
以上の結論として、本発明者らは、高リスク患者と標準リスクMMとを、治療レジメン、年齢および再発状況にかかわらず高度に識別する高リスクシグネチャーを開発した。臨床状況におけるこのシグネチャーの使用は、より多くの情報が与えられた上での治療上の選択につながる可能性があり、さらに潜在的には患者のより優れた転帰につながる可能性がある。
【００３４】
以上の結論として、本発明者らの研究は、臨床的、細胞遺伝学的およびGEPに基づくものという、ほとんどの公知の予後マーカーを組み入れた、ロバストな高リスクシグネチャーの開発に関するものであり、開発されたEMC-92遺伝子シグネチャーが、生存不良に関する公知のものの中で最も強力な独立した予後マーカーであることを示している。このEMC-92遺伝子シグネチャーは、今後、より強化された代替的な治療を求めるべきである、MM患者の高リスク群を選び出すことができる。
【００３５】
したがって、本発明は、多発性骨髄腫と診断された患者の疾患転帰または予後を、該患者を高リスクまたは低リスクのカテゴリーに分類することによって判定するための方法であって、
a）表1に記載の少なくとも92種の遺伝子のセットを検出するためのプローブを含む遺伝子チップを提供する段階、
b）遺伝子チップを、患者由来のmRNAを含む試料と接触させる段階、
c）試料における92種の遺伝子のセットの発現レベルを決定する段階、
d）正規化された発現値を得る目的で、発現レベルを平均／分散正規化を用いて正規化する段階、
e）正規化された発現値と表1に記載のβ値とを乗算して、個々のプローブに関する計算値を得る段階、
f）個々のプローブの計算値の積算によってEMC-92スコアを決定する段階
を含み、
EMC-92スコアが所定の閾値を上回ることによってその患者が高リスクカテゴリーに分類されることが指し示され、スコアが該閾値以下であることによってその患者が低リスクカテゴリーに分類されることが指し示される、方法に関する。
【００３６】
本明細書においてさらに詳細に説明するように、好ましい閾値の値は少なくとも0.75であり、特に好ましい閾値の値は0.827である。
【００３７】
以上をまとめると、本発明者らは、本明細書において、HOVON65／GMMG-HD4臨床試験を基にしたEMC-92シグネチャーの作成および検証について報告している。ISS病期および細胞遺伝学的異常などの従来の予後マーカーは、MMにおける転帰予測の精度を高める目的で、遺伝子発現に基づくシグネチャーによって補強されてきた。より精度の高い予後予測は、高リスクMM患者の生存を改善することを特に目的とする治療計画の開発につながる可能性がある。
【００３８】
臨床的意義の点からは、シグネチャーは、リスク群をできるだけ明確に分けることができる能力、および関連性のあるサイズの安定した群を予測する能力の両方を有しなければならない。EMC-92シグネチャーはこの両方の基準を満たす。すべての検証用セットにおいて、高リスク群の患者を有意に判定することができ、高リスク患者の割合も検証用セットを通じて安定していた。検証用セットは、サリドマイド（MRC-IX、TT2）およびボルテゾミブ（APEX、TT3）を含む、異なる投薬レジメンに相当する。また、本シグネチャーは、移植適格患者（例えば、TT3）および移植非適格患者（MRC-IXのサブセット）の両方と、さらには新たに診断された患者（例えば、TT2）および再発患者（APEX）と関連性がある。対照的に、検証用セットにおけるIFM-15シグネチャーおよびMILLENNIUM-100シグネチャーの予測は、MRC-IXおよびTT3などの独立したデータセットにおいて有意性に達しない。
【００３９】
以上の結論として、本発明者らは、高リスクMMと標準リスクMMとを、治療レジメン、年齢および再発状況にかかわらず高度に識別するリスクシグネチャーを開発した。臨床状況におけるこのシグネチャーの使用は、より多くの情報が与えられた上での治療上の選択につながる可能性があり、さらに潜在的には患者のより優れた転帰につながる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】全生存期間の予測におけるEMC-92分類指標の成績。4つの検証用セットにおける固定カットオフ値0.827の高リスクシグネチャー。A：UAMS Total Therapy 2。B：UAMS Total Therapy 3。C：MRC-IX。D：APEX。
【図２】HOVON-65／GMMG-HD4 OSにおけるEMC-92シグネチャーの閾値とログランク成績との関係。本モデルは少なくとも0.75の閾値で最適な成績を有する。高リスクに関するカットオフは、訓練用セットにおいてOS 2年未満を高リスクと定義していることに基づいており、それは閾値0.827に対応する。
【実施例】
【００４１】
実施例1：患者
これまでに記載された5つのデータセットを用いたが、それらについては、生存、ならびに骨髄腫患者の骨髄吸引液から得られた精製形質細胞のGEPも入手可能であった。これらは、HOVON65／GMMG-HD4（N＝320）（GSE19784）[9]、Total Therapy 2（TT2）（n＝351）[11]、TT3（n＝208）（GSE2658）[11]、MRC-IX（n＝247）（GSE15695）[14]およびAPEX（n＝264）（GSE9782）[12]である。
【００４２】
HOVON65／GMMG-HD4データを訓練用セットとして用いた。この多施設試験では、新たに診断された患者におけるボルテゾミブ（PAD）の有効性を標準治療（VAD）と比較した。患者は、3サイクルのVADまたはPADによる導入治療に無作為に割り当てられた[16]。合計290人の患者で経過観察およびGEPの両方が得られた[9]。
【００４３】
他の4つの独立したデータセットを検証用として用いた。TT2およびTT3という2つのデータセットは、新たに診断された患者で実施された臨床試験に由来し、いずれも複合レジメンによる治療を受けている。前者は、治療の全段階にわたってサリドマイドを投与するか投与しないかに患者を無作為に割り当てた前向き無作為化治療試験であった[17]。後者は、サリドマイドアームにボルテゾミブを追加すること以外は同じレジメンで、同じグループによって実施された[18]。TT3は、OSイベントが15件に過ぎない非常に小規模なセットであるが、ここでは完璧さを期して含めた。
【００４４】
MRC-IX試験には、新たに診断された、若齢患者および高齢患者の両方が含められた。若齢患者の治療は、ビンクリスチン有りまたは無しによる導入を行い、続いて移植を行うことからなった。高齢患者は、まずサリドマイドまたはメルファランのいずれかに基づく治療を受けた。若齢患者および高齢患者のいずれに対しても、維持期はサリドマイド有りとサリドマイド無しとの比較であった[19,20]。ここでAPEXと表記した試験およびデータセットは、APEX、SUMMITおよびCRESTという3つの試験からなった。これらの試験は、再発症例におけるボルテゾミブの有効性について検討することが目的であった[21〜23]。
【００４５】
IFMシグネチャーの基となったIFMデータセットは、GEPプラットフォームの不適合性が理由で評価されなかった[13]。
【００４６】
実施例2：遺伝子発現解析
2種類のAffymetrix遺伝子発現プラットフォームを用いた。Affymetrix GeneChip（登録商標）ヒトゲノムU133 Plus 2.0 Arrayを、HOVON65／GMMG-HD4、TT2、TT3およびMRC-IXに用い、一方、Affymetrix HG U133 A/BチップをAPEX研究に用いた。異なる研究間での検証が可能となるように、両方のプラットフォームに存在するプローブセットのみを含めた。プローブセット発現の下方境界は、HOVON65／GMMG-HD4セットにおけるbioBハイブリダイゼーション対照に対して最低発現5％と設定した。HOVON65／GMMG-HD4患者の95％以上で低発現であったプローブセットは除外した。データはすべてMAS5で正規化を行い、log2変換して、平均-分散のスケーリングを行った。
【００４７】
HOVON65／GMMG-HD4分子的分類は、以前に行われた[9]。新たな検証用試料にクラスターラベルを割り当てるために、HOVON65／GMMG-HD4を参照集合としてユークリッド最近傍アルゴリズムを用いた。
【００４８】
HOVON65／GMMG-HD4を、GEPに基づく生存分類指標を構築するための訓練用セットとして用いた。モデルは、教師あり主成分分析（SPCA）フレームワークで構築した。計算はすべて、R統計環境で、生存分析用の生存パッケージ（survival package for survival analysis）を用いて行った。高リスクに関する最適カットオフ値の決定にはmaxstatパッケージを用いた。
【００４９】
データは、Ingenuity Pathway Analysis（Ingenuity Systems（登録商標）, www.Ingenuity.Com）を用いて解析した。SPCAに基づく生存分類指標に対応する遺伝子セットと、最初の単変量ランク付け（FDR＜10％）によって生成された遺伝子セットの両方を解析した。HG U133 Plus 2.0プラットフォームおよびHG U133 A/Bプラットフォームの両方に存在するプローブセットを参照標準として用いた。P値は、Benjamini Hochberg補正を用いて多重検定に関して補正したFisher直接確率検定（右側検定）によって導き出した。
【００５０】
実施例3  発表されている遺伝子シグネチャーとの比較
本発明者らは、MMにおけるOSに関して入手可能なGEPに基づく予後シグネチャーと対比して、EMC-92シグネチャーの成績を評価することに着手した。この目的のために、以下のシグネチャーを評価した：UAMS-70、UAMS-17、UAMS-80、IFM-15、遺伝子増殖指数（GPI-50）、MRC-IX-6およびMILLENNIUM-100。
【００５１】
これらのシグネチャーを連続変数として評価し、さらに、発表されているカットオフ値を用いても評価した（参考文献31における図2および図2a〜e、ならびに参考文献31におけるSupplemental Documents AおよびB）。全体として、EMC-92シグネチャーの成績はロバストで一貫性があり、以前に発表されたシグネチャーに比べて勝るとも劣らないことが見いだされた。具体的には、EMC-92、UAMS、MRC-IXおよびGPI-50シグネチャーは、シグネチャーの二分値および連続値の両方に関して試験したすべての検証用セットにおいて、有意性を明らかに示した。二分モデルを用いたIFM-15シグネチャーに関する5件の研究のうち3件で有意性に達し、一方、MILLENNIUM-100シグネチャーについては、4件の独立した研究のうち1件で二分モデルにおける有意な成績が得られた。このように、IFM-15シグネチャーおよびMILLENNIUM-100に対する成績の方がロバストでなかった。増殖指数GPI-50は試験した検証用セットのすべてで有意であったものの、高リスク患者の割合は、EMC-92シグネチャーまたはUAMS-80シグネチャーのいずれを用いて得られる割合と比較してもはるかに低かった。ランク付けおよび重み付けを行った高リスク割合は、GPI：10.0％、UAMS-17：12.4％、UAMS-70：13.0％、MRC-IX-6：13.3％、EMC-92：19.1％およびUAMS-80：23.4％である。どのシグネチャーが、観察された生存を最もよく説明するかを判定するために、ペアワイズ比較を行った。どの比較に関しても、EMC-92が、独立した環境で試験したOSに関する最も強力な予測因子であった（参考文献31における図3およびSupplemental Table S9）。
【００５２】
実施例4：複合リスク分類指標
EMC-92シグネチャーの成績とUAMSシグネチャーは、それらが全く異なる患者集団に由来するにもかかわらず合致していた。EMC-92シグネチャーとUAMS-70シグネチャーとの間での高リスク患者の共通部分は、本発明者らの訓練用セットおよびUAMS-70訓練用セット（すなわち、MRC-IX、TT3およびAPEX；参考文献31におけるSupplemental Table S11）のいずれとも独立したプールデータセットについて集団全体のほぼ8％であった。患者のおよそ13％が、これらのシグネチャーのいずれか1つによって高リスクと分類された。共通する高リスク群は、共通する標準リスク群と比較して、HRが最も高かった（HR＝3.87、95％CI＝2.76〜5.42、P＝3.6×10-15）。いずれかのシグネチャーによって高リスクと分類された患者は中程度のリスクを示し、すなわち、EMC-92シグネチャーについてはHR 2.42、95％CI＝1.76〜3.32であり（P＝5.1×10-8）、UAMS-70シグネチャーについてはHR 2.22、95％CI＝1.20〜4.11であった（P＝1.1×10-2；参考文献31におけるSupplemental Table S12）。
【００５３】
実施例5：EMC-92シグネチャーおよびFISH
EMC-92シグネチャーおよびUAMS-70シグネチャーによって規定される高リスク集団組成を比較するために、両方の集団における細胞遺伝学異常の頻度を、細胞遺伝学的変数が公知である独立したセット、すなわちMRC-IX（参考文献31における図4およびSupplemental Table S13）を用いて決定した。予想された通り、予後が不良な細胞遺伝学異常である1q gain、del(17p)、t(4;14)、t(14;16)、t(14;20)およびdel(13q)は高リスク集団に多く（参考文献31における図5）、一方、t(11;14)などの標準リスク細胞遺伝学異常は高リスク集団では少なかった。それに対して、EMC-92シグネチャーによって高リスクステータスを有すると判定されたMRC-IX症例では、いかなる予後不良の細胞遺伝学異常も示さなかったのは15％（39例中6例）に過ぎず、これに対して標準リスク症例では44％（168例中74例）であった（P＝1.8×10-3）。同様に、UAMS-70によって規定された高リスク患者のうち4％（23例中1例）はいかなる予後不良の細胞遺伝学的異常も有しておらず、一方、UAMS-70によって規定された標準リスク患者ではこの割合は43％（183例中79例）であった（P＝5.3×10-3）。
【００５４】
以下の参考文献は、参照により本明細書に組み入れられる。それらの内容は、本出願の不可欠な部分とみなされるべきではない。
【００５５】
参考文献
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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