(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現させた大腸菌、当該発現させた大腸菌の死菌を含む組成物または当該発現させた大腸菌から得られたポリペプチドであって下記（ｂ）の核酸にコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドに、末端にフルクトース残基を含む糖質および受容体基質を接触させる工程を有する、フルクトースが付加された糖質の製造方法；
（ａ）下記（ア）〜（エ）のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸；
（ア）配列番号６に示すＰｇｓＡタンパク質のアミノ酸配列、
（イ）アミノ酸配列（ア）において、１〜３８個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ下記（ｂ）の核酸にコードされるアミノ酸配列からなるβ−フルクトフラノシダーゼを大腸菌の細胞表面に発現させるアンカータンパク質の機能を有するアミノ酸配列、
（ウ）配列番号３４に示すＣａｐＡタンパク質のアミノ酸配列、
（エ）アミノ酸配列（ウ）において、１〜３９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ下記（ｂ）の核酸にコードされるアミノ酸配列からなるβ−フルクトフラノシダーゼを大腸菌の細胞表面に発現させるアンカータンパク質の機能を有するアミノ酸配列、
（ｂ）β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードする核酸。
【請求項２】
下記（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現可能に含む大腸菌または下記（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現させた大腸菌；
（ａ）下記（ア）〜（エ）のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸；
（ア）配列番号６に示すＰｇｓＡタンパク質のアミノ酸配列、
（イ）アミノ酸配列（ア）において、１〜３８個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ下記（ｂ）の核酸にコードされるアミノ酸配列からなるβ−フルクトフラノシダーゼを大腸菌の細胞表面に発現させるアンカータンパク質の機能を有するアミノ酸配列、
（ウ）配列番号３４に示すＣａｐＡタンパク質のアミノ酸配列、
（エ）アミノ酸配列（ウ）において、１〜３９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ下記（ｂ）の核酸にコードされるアミノ酸配列からなるβ−フルクトフラノシダーゼを大腸菌の細胞表面に発現させるアンカータンパク質の機能を有するアミノ酸配列、
（ｂ）β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードする核酸。
【請求項３】
下記（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現させた大腸菌の死菌を含む組成物；
（ａ）下記（ア）〜（エ）のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸；
（ア）配列番号６に示すＰｇｓＡタンパク質のアミノ酸配列、
（イ）アミノ酸配列（ア）において、１〜３８個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ下記（ｂ）の核酸にコードされるアミノ酸配列からなるβ−フルクトフラノシダーゼを大腸菌の細胞表面に発現させるアンカータンパク質の機能を有するアミノ酸配列、
（ウ）配列番号３４に示すＣａｐＡタンパク質のアミノ酸配列、
（エ）アミノ酸配列（ウ）において、１〜３９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ下記（ｂ）の核酸にコードされるアミノ酸配列からなるβ−フルクトフラノシダーゼを大腸菌の細胞表面に発現させるアンカータンパク質の機能を有するアミノ酸配列、
（ｂ）β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードする核酸。
【請求項４】
下記（ｂ）の核酸にコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドの製造方法であって、下記（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして大腸菌に発現させる工程を有する前記製造方法；
（ａ）下記（ア）〜（エ）のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸；
（ア）配列番号６に示すＰｇｓＡタンパク質のアミノ酸配列、
（イ）アミノ酸配列（ア）において、１〜３８個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ下記（ｂ）の核酸にコードされるアミノ酸配列からなるβ−フルクトフラノシダーゼを大腸菌の細胞表面に発現させるアンカータンパク質の機能を有するアミノ酸配列、
（ウ）配列番号３４に示すＣａｐＡタンパク質のアミノ酸配列、
（エ）アミノ酸配列（ウ）において、１〜３９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ下記（ｂ）の核酸にコードされるアミノ酸配列からなるβ−フルクトフラノシダーゼを大腸菌の細胞表面に発現させるアンカータンパク質の機能を有するアミノ酸配列、
（ｂ）β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードする核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フルクトースが付加された糖質の製造方法に関し、特に、β−フルクトフラノシダーゼによりフルクトースが付加された糖質を効率的に製造することができる製造方法、当該製造方法に用いることができる大腸菌、組成物およびポリペプチド、ならびに当該製造方法により製造されたフルクトースが付加された糖質に関する。
【背景技術】
【０００２】
β−フルクトフラノシダーゼは、末端にフルクトース残基を含む糖質のフルクトースを認識して加水分解する酵素である。β−フルクトフラノシダーゼの中には、加水分解によって生じたフルクトースを受容体基質に転移させる活性を有するものも存在する。すなわち、当該活性を有するβ−フルクトフラノシダーゼによって、糖質や糖質以外の物質にフルクトースを転移させることにより、フルクトースが付加された糖質を製造することができる。
【０００３】
β−フルクトフラノシダーゼによるフルクトースが付加された糖質の製造方法としては、これまでに、例えば、β−フルクトフラノシダーゼを保持するコウジ菌菌糸固定化担体に糖基質を接触させる方法（特許文献１）や、ザイモモナス モビリス由来のレバンスクラーゼまたは菌体外インベルターゼを用いる方法（特許文献２）が、それぞれ開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１３−２５２０５６号公報
【特許文献２】特開２００６−６７９５８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１に記載の方法は、生来β−フルクトフラノシダーゼを有するコウジ菌の菌糸を珪藻土やパーライトといった担体に固定化してオリゴ糖を製造する方法であり、外来のβ−フルクトフラノシダーゼを用いて、簡便かつ効率的にオリゴ糖を製造するのは容易でない。なぜなら、この方法では、外来のβ−フルクトフラノシダーゼを導入してオリゴ糖を製造する際は、正確な評価のため、予めコウジ菌の内在性β−フルクトフラノシダーゼの活性を欠損させる必要があり、取り扱いの容易さに欠けるからである。特許文献２に記載の方法もまた、ザイモモナス モビリス由来のβ−フルクトフラノシダーゼを用いてフルクトース配糖体を製造する方法であり、β−フルクトフラノシダーゼの由来を問わず、フルクトース配糖体を製造することができる方法ではない。
【０００６】
本発明は、このような問題点を解決するためになされたものであって、生来β−フルクトフラノシダーゼを有しないことから、導入したβ−フルクトフラノシダーゼの活性評価が容易で、かつ形質転換や培養といった取り扱いも容易な大腸菌に外来のβ−フルクトフラノシダーゼを発現させることにより、β−フルクトフラノシダーゼの由来を問わず、効率的かつ簡便にフルクトースが付加された糖質を製造することができる製造方法、当該製造方法に用いることができる大腸菌、組成物およびポリペプチド、ならびに当該製造方法により製造されたフルクトースが付加された糖質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意研究の結果、細胞表面に発現させるためのアンカータンパク質とβ−フルクトフラノシダーゼとを１のポリペプチドとして発現させた大腸菌を用いることにより、効率的かつ簡便にフルクトースが付加された糖質を製造することができることを見出して、下記の各発明を完成した。
【０００８】
（１）本発明に係るフルクトースが付加された糖質の製造方法は、下記（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現させた大腸菌、当該発現させた大腸菌の死菌を含む組成物または当該発現させた大腸菌から得られたポリペプチドであって下記（ｂ）の核酸にコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドに、末端にフルクトース残基を含む糖質および受容体基質を接触させる工程を有する；（ａ）配列番号６に示すＰｇｓＡタンパク質のアミノ酸配列または配列番号３４に示すＣａｐＡタンパク質のアミノ酸配列のいずれかと４５％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸、（ｂ）β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードする核酸。
【０００９】
（２）本発明に係る大腸菌は、下記（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現可能に含む大腸菌または下記（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現させた大腸菌である；（ａ）配列番号６に示すＰｇｓＡタンパク質のアミノ酸配列または配列番号３４に示すＣａｐＡタンパク質のアミノ酸配列のいずれかと４５％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸、（ｂ）β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードする核酸。
【００１０】
（３）本発明に係る組成物は、下記（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現させた大腸菌の死菌を含む組成物である；（ａ）配列番号６に示すＰｇｓＡタンパク質のアミノ酸配列または配列番号３４に示すＣａｐＡタンパク質のアミノ酸配列のいずれかと４５％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸、（ｂ）β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードする核酸。
【００１１】
（４）本発明に係るポリペプチドは、下記（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現させた大腸菌から得られたポリペプチドであって、下記（ｂ）の核酸にコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドである；（ａ）配列番号６に示すＰｇｓＡタンパク質のアミノ酸配列または配列番号３４に示すＣａｐＡタンパク質のアミノ酸配列のいずれかと４５％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸、（ｂ）β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードする核酸。
【００１２】
（５）本発明に係るフルクトースが付加された糖質は、（１）に記載の製造方法により製造された、フルクトースが付加された糖質である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係るフルクトースが付加された糖質の製造方法、もしくは当該製造方法に用いることができる大腸菌、組成物またはポリペプチドによれば、種々の生物由来のβ−フルクトフラノシダーゼを用いて、簡便かつ効率的にフルクトースが付加された糖質を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明に係る「（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現させた大腸菌」の一実施形態を模式的に示す図である。
【図２】ｐＨＴ４３−ｐｇｓＡ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターまたはｐＨＴ４３プラスミドにより形質転換した組換えサブティリス菌に４５％スクロース溶液を接触させて得た反応液中の糖組成を示すＨＰＬＣチャートである。
【図３】ｐＷＨ１５２０−ｃａｐＡ＿ｏｐｔｉ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターまたはｐＷＨ１５２０プラスミドにより形質転換した組換えメガテリウム菌に４５％スクロース溶液を接触させて得た反応液中の糖組成を示すＨＰＬＣチャートである。
【図４】ｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターにより形質転換した組換え大腸菌に、受容体基質としてヒドロキノンを、供与体基質としてスクロースを接触させて得た反応液（サンプル反応液）および各種のコントロール反応液（コントロール反応液Ｎｏ．１〜３）中の物質の組成を示すＨＰＬＣチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明に係るフルクトースが付加された糖質の製造方法、当該製造方法に用いることができる大腸菌、組成物およびポリペプチド、ならびに当該製造方法により製造されたフルクトースが付加された糖質について詳細に説明する。
【００１６】
本発明において、「糖質」には、Ｃｎ（Ｈ２Ｏ）ｍで表される化合物のほか、多価アルコールのアルデヒド、ケトン誘導体、それらに近縁の誘導体や縮合体が含まれる。すなわち、本発明に係る「糖質」には、単糖やオリゴ糖、多糖のほか、これらがタンパク質や脂質などと共有結合した複合脂質、単糖やオリゴ糖の還元基にアルコール、フェノール、サポニン、色素などの色素などのアグリコンが結合した配糖体が含まれる（岩波生物学事典第４版；岩波書店発行、２００５年）。また、本発明に係る「糖質」は、「糖」や「炭水化物」と交換可能に用いられる場合がある。
【００１７】
本発明において、「フルクトースが付加された糖質」とは、構成物質として１以上のフルクース残基を含む化合物をいう。本発明に係る「フルクトースが付加された糖質」として、具体的には、例えば、フルクトースとフルクトース以外の単糖とが結合してなる二糖や、ニストースあるいはケストースなどのフルクトース残基を含むオリゴ糖、フルクトース残基を含む多糖のほか、フルクトース残基を含む糖アルコールや、フルクトースと糖以外の物質（アグリコン）が結合してなる配糖体などを挙げることができる。
【００１８】
なお、本発明において、オリゴ糖は、３〜十数個程度の単糖が結合してなる糖をいい、「少糖」、「寡糖」と交換可能に用いられる。また、配糖体は、一般に、糖と糖以外の物質（アグリコン）とが結合した有機化合物をいい（百科事典マイペディア；日立ソリューションズ・ビジネス社、２０１０年５月）、詳細には、糖のヘミアセタール性またはヘミケタール性ヒドロキシ基が、糖以外の物質の原子あるいは反応基で置換した化合物をいう（生化学事典第４版；東京化学同人社発行、２００７年１２月）。本発明に係る配糖体は、天然に存在するものでも人工的に合成したものでもよく、Ｏ−グリコシドのほか、Ｎ−グリコシド、Ｓ−グリコシド、Ｃ−グリコシドが含まれる。
【００１９】
本発明に係るフルクトースが付加された糖質の製造方法は、
Ａ）下記（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現させた大腸菌、
（ａ）配列番号６に示すＰｇｓＡタンパク質のアミノ酸配列または配列番号３４に示すＣａｐＡタンパク質のアミノ酸配列のいずれかと４５％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸、
（ｂ）β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードする核酸、
Ｂ）上記（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現させた大腸菌の死菌を含む組成物、
Ｃ）上記（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現させた大腸菌から得られたポリペプチドであって上記（ｂ）の核酸にコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
以上Ａ）〜Ｃ）のいずれかに、末端にフルクトース残基を含む糖質および受容体基質を接触させる工程を有する。
【００２０】
ここで、Ａ）の「（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現させた大腸菌」の一実施形態を、模式的に図１に示す。図１に示すように、（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現させた大腸菌の一実施形態においては、（ａ）の核酸にコードされた、ＰｇｓＡタンパク質のアミノ酸配列またはＣａｐＡタンパク質のアミノ酸配列のいずれかと４５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質の部分が大腸菌の細胞膜に結合することにより、（ｂ）の核酸にコードされたβ−フルクトフラノシダーゼの部分が大腸菌の細胞表面に発現していると、本発明者らは考えている。
【００２１】
なお、本発明において「核酸」は、複数のヌクレオチドがリン酸ジエステル結合により結合してなる化合物をいい、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）でもよくリボ核酸（ＲＮＡ）でもよい。また、本発明において「ポリペプチド」は、複数のアミノ酸がペプチド結合により結合してなる化合物をいい、その配列長は問わず、タンパク質と交換可能に用いられる場合がある。
【００２２】
本発明において、「（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現させる」とは、上記（ａ）の核酸にコードされるアミノ酸配列と、上記（ｂ）の核酸にコードされるアミノ酸配列とを、１本のポリペプチドとして発現させることをいう。ここで、当該１本のポリペプチドにおいて、（ａ）の核酸にコードされるアミノ酸配列と（ｂ）の核酸にコードされるアミノ酸配列との順序は問わず、どちらがアミノ末端側でもよく、どちらがカルボキシル末端側でもよい。また、当該１本のポリペプチドは、（ａ）の核酸にコードされるアミノ酸配列および（ｂ）の核酸にコードされるアミノ酸配列のみからなるものでもよく、（ａ）の核酸にコードされるアミノ酸配列と（ｂ）の核酸にコードされるアミノ酸配列との間やそれらのアミノ酸配列のアミノ末端および／またはカルボキシル末端に、１または複数個の他のアミノ酸が挿入または付加されていてもよい。
【００２３】
（ａ）の「配列番号６に示すＰｇｓＡタンパク質のアミノ酸配列または配列番号３４に示すＣａｐＡタンパク質のアミノ酸配列のいずれかと４５％以上の同一性を有するアミノ酸配列」は、（ｂ）の核酸にコードされるアミノ酸配列からなるβ−フルクトフラノシダーゼを大腸菌の細胞表面に発現させるためのアンカータンパク質（以下、単に「アンカータンパク質」という場合がある。）のアミノ酸配列である。ここで、「配列番号６に示すＰｇｓＡタンパク質」は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のアンカータンパク質であり、「配列番号３４に示すＣａｐＡタンパク質」は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＤＳＭ３１９株由来のアンカータンパク質である。本発明においては、後述する実施例４で示すように、ＰｇｓＡタンパク質のアミノ酸配列またはＣａｐＡタンパク質のアミノ酸配列のいずれかと４５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質を、β−フルクトフラノシダーゼを大腸菌の細胞表面に発現させるためのアンカータンパク質として用いることができる。
【００２４】
配列番号６に示すＰｇｓＡタンパク質のアミノ酸配列または配列番号３４に示すＣａｐＡタンパク質のアミノ酸配列とそれ以外のアミノ酸配列との同一性は、常法に従って確認することができ、例えば、ＦＡＳＴＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ＪＰ／ｔｏｏｌｓ／ｆａｓｔａ／）、Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ.)、Ｐｏｓｉｔｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｔｅｒａｔｅｄ  ＢＬＡＳＴ（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ.）などのプログラムを用いて確認することができる。なお、「同一性」とは一致性を指し、「ｉｄｅｎｔｉｔｙ」と交換可能に用いられる。
【００２５】
配列番号６に示すＰｇｓＡタンパク質のアミノ酸配列または配列番号３４に示すＣａｐＡタンパク質のアミノ酸配列のいずれかと４５％以上の同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号６または配列番号３４のアミノ酸配列において、配列番号６または配列番号３４のアミノ酸配列との同一性が４５％未満とならない範囲で１または複数個のアミノ酸を欠失、置換、挿入または付加することにより得ることができる。また、常法に従い、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＰＩＲ）、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＴｒＥＭＢＬ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＰＲＦ）、ＧｅｎＰｅｐｔ（ＮＣＢＩ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ）などのアミノ酸配列データベースから、ＦＡＳＴＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ＪＰ／ｔｏｏｌｓ／ｆａｓｔａ／）、Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ.)、Ｐｏｓｉｔｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｔｅｒａｔｅｄ  ＢＬＡＳＴ（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ.）などのプログラムを用いて配列番号６または配列番号３４のアミノ酸配列とのホモロジー検索をすることにより得ることができる。
【００２６】
配列番号６に示すＰｇｓＡタンパク質のアミノ酸配列または配列番号３４に示すＣａｐＡタンパク質のアミノ酸配列のいずれかと４５％以上の同一性を有するアミノ酸配列は、細菌や酵母、カビ、植物などのいずれの生物に由来するものでもよい。配列番号６に示すＰｇｓＡタンパク質のアミノ酸配列または配列番号３４に示すＣａｐＡタンパク質のアミノ酸配列のいずれかと４５％以上の同一性を有するアミノ酸配列として、具体的には、例えば、配列番号６または配列番号３４のアミノ酸配列において、配列番号６または配列番号３４のアミノ酸配列との同一性が４５％未満とならない範囲で１または複数個のアミノ酸を欠失、置換、挿入または付加したアミノ酸配列を挙げることができる。また、配列番号６に示すＰｇｓＡタンパク質のアミノ酸配列と４５％以上の同一性を有するアミノ酸配列としては、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｅｑｕｉｅｎｓｉｓ由来アンカータンパク質のアミノ酸配列（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）ＷＰ＿０２４７１４２６０．１；同一性９６％）や、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ由来アンカータンパク質のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＷＰ＿０３３２６６７１．１；同一性８６％）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉａｍｅｎｓｉｓ由来アンカータンパク質のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＷＰ＿０１６９３７７３３．１；同一性７８％）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ由来アンカータンパク質のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＷＰ＿００６６３９３１６．１；同一性６６％）などを挙げることができる。また、配列番号３４に示すＣａｐＡタンパク質のアミノ酸配列と４５％以上の同一性を有するアミノ酸配列としては、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌｅｘｕｓ由来アンカータンパク質のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＷＰ＿０２５９０８２３３．１；同一性７３％）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ由来アンカータンパク質のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＷＰ＿００１２５３１５３．１；同一性５３％）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ由来アンカータンパク質のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＷＰ＿００１９９６１６２．１；同一性５３％）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｕｓ由来アンカータンパク質のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＷＰ＿０１９３９３３９５．１；同一性５２％）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ由来アンカータンパク質のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＷＰ＿００１１７００４９．１；同一性５１％）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍｕ由来アンカータンパク質のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ  ＷＰ＿０１３０８２０９１．１；同一性５１％）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｍｉｓ由来アンカータンパク質のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＡＧＳ７７９４７．１；同一性４７％）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｆｅｎｓｉｓ由来アンカータンパク質のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＷＰ＿０２４４２３６６９．１；同一性４７％）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ由来アンカータンパク質のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＷＰ＿０１７３６０００４．１；同一性４７％）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｒａｔｏｓｐｈｅｒｉｃｕｓ由来アンカータンパク質のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＷＰ＿００７���９７５１６．１；同一性４７％）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉａｍｅｎｓｉｓ由来アンカータンパク質のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＷＰ＿０１６９３７７３３．１；同一性４７％）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｌｌｉｓｍｏｒｔｉｓ由来アンカータンパク質のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＷＰ＿０１０３２８８２４．１；同一性４６％）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｊａｖｅｎｓｉｓ由来アンカータンパク質のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＷＰ＿０１０３３２１１５．１；同一性４６％）などを挙げることができる。
【００２７】
ここで、本発明において「配列番号６または配列番号３４のアミノ酸配列において、配列番号６または配列番号３４のアミノ酸配列との同一性が４５％未満とならない範囲で１または複数個のアミノ酸を欠失、置換、挿入または付加したアミノ酸配列」という場合の、欠失、置換、挿入または付加するアミノ酸の個数は、例えば、１〜２００個、１〜１８０個、１〜１６０個、１〜１４０個、１〜１２０個、１〜１００個、１〜８０個、好ましくは１〜６０個、より好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜４０個、よりさらに好ましくは１〜３０個を挙げることができる。
【００２８】
本発明に係る「β−フルクトフラノシダーゼ」は、末端にフルクトース残基を含む糖質のフルクトースを認識して加水分解するフルクトース加水分解活性と、加水分解によって生じたフルクトースを受容体基質に転移させるフルクトース転移活性とを有する酵素である。本発明に係る「β−フルクトフラノシダーゼ」は、酵母、カビ、植物などの生物に由来する野生型のβ−フルクトフラノシダーゼであってもよく、野生型のβ−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、１または２以上のアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列からなるβ−フルクトフラノシダーゼであってもよい。なお、本発明において、「β−フルクトフラノシダーゼ」は、「フルクトシルトランスフェラーゼ」、「サッカラーゼ」、「β−Ｄ−フルクトフラノシダーゼ」、「インベルターゼ」、「インバーターゼ」または「インベルチン」と交換可能に用いられる場合がある。
【００２９】
ここで、本発明において、「受容体基質」とは、β−フルクトフラノシダーゼのフルクトース転移活性により、フルクトースの転移を受けて、フルクトースが付加され得る物質をいう。また、「供与体基質」とは、β−フルクトフラノシダーゼのフルクトース加水分解活性によりフルクトースの加水分解を受けて、受容体基質にフルクトースを供与することができる物質をいう。
【００３０】
すなわち、本発明において、「末端にフルクトース残基を含む糖質」とは、供与体基質を指す。本発明に係る「末端にフルクトース残基を含む糖質」として、具体的には、例えば、スクロースなどの末端にフルクトース残基を含む二糖やケストースなどの末端にフルクトース残基を含むオリゴ糖、末端にフルクトース残基を含む多糖のほか、末端にフルクトース残基を含む糖アルコールや末端にフルクトース残基を含む配糖体などを挙げることができる。
【００３１】
また、本発明に係る「受容体基質」は、後述する実施例６（１）および（２）に示すように、単糖や二糖、オリゴ糖、配糖体などの糖質であってもよく、ヒドロキノンなどの糖質以外の物質であってもよい。本発明に係るフルクトースが付加された糖質の製造方法においては、例えば、受容体基質を単糖とすれば二糖を製造し、受容体基質を二糖やオリゴ糖とすればオリゴ糖を製造し、受容体基質を糖以外の物質とすれば配糖体を製造することができる。
【００３２】
なお、本発明に係るフルクトースが付加された糖質の製造方法において、「末端にフルクトース残基を含む糖質」と「受容体基質」とは、同じ物質であってもよく、異なる物質であってもよい。
【００３３】
本発明に係る「β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列」として、具体的には、例えば、Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ ｉｎｄｉｃａ ｓｕｂｓｐ．ｉｎｄｉｃａ ＡＴＣＣ９０３９由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＢ９５６４３．１；配列番号２）や、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｈｙｍａｔｕｍ ＳＴＭ８１５由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＣ７５１０９．１；配列番号１８）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ ＩＦＯ４３０３由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＧＡＡ８８１０１．１；配列番号２２）などを挙げることができる。
【００３４】
本発明において、上記（ａ）の配列番号６に示すＰｇｓＡタンパク質のアミノ酸配列または配列番号３４に示すＣａｐＡタンパク質のアミノ酸配列のいずれかと４５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、あるいは、上記（ｂ）のβ−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（以下、「所定のアミノ酸配列」という。）をコードする核酸は、所定のアミノ酸配列からなるタンパク質を発現する生物から抽出した核酸を鋳型にして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことにより得ることができる。また、所定のアミノ酸配列を基にして、コドンとアミノ酸との対応関係を示す公知の遺伝暗号に従って核酸の配列を特定した後、市販されている種々の核酸合成機を用いて合成することもできる。
【００３５】
本発明に係る「大腸菌」（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ)は、上記（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現させることができる限り、どのような菌株でもよい。
【００３６】
本発明に係る「（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現させた大腸菌」は、常法に従って、（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現するように設計した核酸を大腸菌に導入することにより得ることができる。そのような方法として、例えば、後述する実施例１（２）および実施例１（５）に示す方法を挙げることができる。すなわち、まず、１のベクターのプロモーター配列とターミネーター配列との間に（ａ）および（ｂ）の核酸を挿入して、組換えベクターを得る。このとき、（ａ）の核酸と（ｂ）の核酸との間に、終始コドンが含まれないようにすれば、当該組み換えベクターを導入した大腸菌において、（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現させることができる。続いて、得られた組換えベクターを大腸菌に導入して一定期間培養することにより、（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現させた大腸菌を得ることができる。
【００３７】
次に、上記Ｂ）の、本発明に係る「（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現させた大腸菌の死菌を含む組成物」は、（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現させた大腸菌の死菌を含む限り、その形態は問わず、例えば、粉末状でもよく液体状でもよい。上記Ｂ）の組成物は、例えば、上述の、本発明に係る（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現させた大腸菌を溶菌、殺菌あるいは滅菌することにより得ることができる。ここで、大腸菌を溶菌、殺菌あるいは滅菌する方法は、細菌に対して一般的に用いられる溶菌方法、殺菌方法あるいは滅菌方法を挙げることができ、具体的には、例えば、高張液に大腸菌を懸濁する方法や、大腸菌を破砕、磨砕、凍結融解、超音波処理あるいは熱処理する方法を挙げることができる。また、上記Ｂ）の組成物は、（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現させた大腸菌の死菌に相当する成分を含む限り、塩沈澱、溶媒沈澱、透析、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、等電点電気泳動などの何らかの処理に供したものでもよく、処理に供していないものでもよい。
【００３８】
次に、上記Ｃ）の、本発明に係る「（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現させた大腸菌から得られたポリペプチドであって上記（ｂ）の核酸にコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド」は、（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現させた大腸菌から得られたポリペプチドであり、かつ、上記（ｂ）の核酸にコードされるアミノ酸配列を含む限り、上記（ｂ）の核酸にコードされるアミノ酸配列のみからなるポリペプチドでもよく、上記（ｂ）の核酸にコードされるアミノ酸配列のアミノ末端および／またはカルボキシル末端に、１または複数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。
【００３９】
上記Ｃ）のポリペプチドは、例えば、（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現させた大腸菌から、常法に従いポリペプチドを抽出ないし精製することにより得ることができる。ポリペプチドを抽出ないし精製する方法としては、例えば、破砕、磨砕、緩衝液への懸濁、凍結融解、超音波処理、遠心分離、熱処理、塩沈澱、溶媒沈澱、透析、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、等電点電気泳動などの方法を挙げることができる。また、より簡便には、（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現させた大腸菌を、そのまま、本発明に係る上記Ｃ）のポリペプチドとして得てもよい。すなわち、上記Ｃ）のポリペプチドは、（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現させた大腸菌の細胞膜に結合した状態のものでもよく、当該大腸菌の細胞膜に結合していない状態のものでもよい。
【００４０】
本発明に係るフルクトースが付加された糖質の製造方法において、上記Ａ）〜Ｃ）のいずれかに、末端にフルクトース残基を含む糖質および受容体基質を接触させる方法としては、例えば、上記Ａ）〜Ｃ）のいずれかを、末端にフルクトース残基を含む糖質および受容体基質を含む溶液に添加し、３０℃〜５０℃で一定時間程度静置あるいは振盪する方法を挙げることができる。
【００４１】
本発明に係るフルクトースが付加された糖質の製造方法には、本発明の特徴を損なわない限り、他の工程を有してもよく、例えば、クロマトグラフィーによるフルクトースが付加された糖質の分離工程や煎糖などの結晶化工程、乾燥工程、洗浄工程、濾過工程、殺菌工程、食品添加物を添加する工程などを有してもよい。
【００４２】
次に、本発明は、大腸菌を提供する。本発明に係る大腸菌は、下記（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現可能に含む大腸菌または下記（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現させた大腸菌である；
（ａ）配列番号６に示すＰｇｓＡタンパク質のアミノ酸配列または配列番号３４に示すＣａｐＡタンパク質のアミノ酸配列のいずれかと４５％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸、
（ｂ）β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードする核酸。
なお、本発明に係る大腸菌において、上述した本発明に係るフルクトースが付加された糖質の製造方法と同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。
【００４３】
ここで、「（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現可能に含む大腸菌」とは、（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現できる態様で含むが、未だ（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現していない大腸菌をいう。
【００４４】
本発明に係る「（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現可能に含む大腸菌」は、上述の、本発明に係る「（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現させた大腸菌」を得る方法と同様の方法において、転写開始に何らかの誘導因子を必要とする発現誘導型のプロモーター配列や、リプレッサーの解離が必要なオペレーター配列を用いることにより、得ることができる。
すなわち、発現誘導型のプロモーター配列を用いた場合は、誘導因子を与えずに培養すれば、「（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現可能に含む大腸菌」を得ることができる。このような発現誘導型のプロモーター配列としては、例えば、アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター配列（誘導因子；アルコール、Ｗａｒｉｎｇ ＲＢら、Ｇｅｎｅ、第７９巻、第１１９〜１３０頁、１９８９年）、α−アミラーゼ遺伝子のプロモーター配列（誘導因子；澱粉やマルトースなど、Ｔａｄａ Ｓ．ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、第２２９巻、第３０１〜３０６頁、１９９１年)、ＴｈｉＡ などのアスペルギルス属菌由来のプロモーター配列（誘導因子；チアミン、Ｓｈｏｊｉ ＪＹら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、第２４４巻、第４１〜４６頁、２００５年）などを挙げることができる。
また、リプレッサーの解離が必要なオペレーター配列を用いた場合は、リプレッサーの解離に必要な因子を与えずに培養すれば、「（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現可能に含む大腸菌」を得ることができる。このようなオペレーター配列としては、例えば、ｌａｃオペレーター配列（リプレッサーの解離に必要な因子；ラクトースやイソプロピル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド （ＩＰＴＧ））などを挙げることができる。
【００４５】
また、本発明は、組成物を提供する。本発明に係る組成物は、上記（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現させた大腸菌の死菌を含む組成物である。また、本発明は、ポリペプチドを提供する。本発明に係るポリペプチドは、上記（ａ）および（ｂ）の核酸を１のポリペプチドとして発現させた大腸菌から得られたポリペプチドであって、上記（ｂ）の核酸にコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。なお、本発明に係る組成物およびポリペプチドにおいて、上述した本発明に係るフルクトースが付加された糖質の製造方法と同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。
【００４６】
以下、本発明について、各実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００４７】
＜実施例１＞β−フルクトフラノシダーゼ発現系の構築
（１）β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードする核酸の取得
Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ ｉｎｄｉｃａ ｓｕｂｓｐ．ｉｎｄｉｃａ ＮＢＲＣ３７４４（以下「Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ」と略記する。）のβ−フルクトフラノシダーゼのクローニングを行った。具体的には、まず、Ｂ．ＩｎｄｉｃａのゲノムＤＮＡを常法に従って抽出した。続いて、下記の配列番号３および配列番号４のプライマーを用いて、下記の条件でポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を行うことによりＢ．Ｉｎｄｉｃａ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを増幅し、常法に従ってシークエンスを行って、全長の塩基配列を決定した。Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡの全長の塩基配列を配列番号１に、また、それにコードされるＢ．Ｉｎｄｉｃａ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列を配列番号２に、それぞれ示す。
【００４８】
《Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；Ｂ．ＩｎｄｉｃａのゲノムＤＮＡ
フォワードプライマー；５’−ＡＴＧＧＣＡＡＧＴＣＧＡＴＣＧＴＴＴＡＡＴＧＴＴＴＧＴＡＴＡＣ−３’（配列番号３）
リバースプライマー；５’−ＡＣＧＴＧＧＣＧＡＴＣＡＴＣＧＡＡＡＡＣＡＴＡＡＣＣＧＧＣＡ−３’（配列番号４）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社）
反応条件；９５℃で１０秒、６０℃で２０秒および６８℃で２分を１サイクルとして３０サイクル。
【００４９】
続いて、ＳｉｇｎａｌＰ４．１サーバー(ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）を用いてβ−フルクトフラノシダーゼのシグナル配列を予測した。なお、配列番号２において、シグナル配列は１〜２８番目に相当する。
【００５０】
（２）細胞表面発現系の組換えベクターの作成
下記の条件でＰＣＲを行うことにより、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓのＰｇｓＡタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ０１６２４５．１）をコードするＤＮＡを増幅した。得られたＰＣＲ産物を常法に従って制限酵素ＮｄｅＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、これをＤＮＡ断片１とした。また、ＰＣＲ産物について、常法に従ってシークエンスを行い、ＰｇｓＡタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を確認した。ＰｇｓＡタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号５に、それにコードされるＰｇｓＡタンパク質のアミノ酸配列を配列番号６にそれぞれ示す。
【００５１】
《ＰｇｓＡタンパク質をコードするＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＩＡＭ１０２６、ＡＴＣＣ９４６６）のゲノムＤＮＡ
フォワードプライマー（下線はＮｄｅＩサイトを示す）；５’−ＡＡＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧ−３’（配列番号７）
リバースプライマー（下線はＢｇｌＩＩサイトを示す）；５’−ＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＴＴＡＧＡＴＴＴＴＡＧＴＴＴＧＴＣＡＣＴＡＴＧ−３’（配列番号８）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社）
反応条件；９５℃で１０秒、６０℃で２０秒および６８℃で２分を１サイクルとして３０サイクル。
【００５２】
次に、下記の条件でＰＣＲを行い、Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを増幅し、常法に従って制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化して、これをＤＮＡ断片２とした。
【００５３】
《Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；本実施例１（１）のＢ．ＩｎｄｉｃａのゲノムＤＮＡ
フォワードプライマー（下線はＢａｍＨＩサイトを示す）；５’−ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＴＣＧＧＧＴＴＴＡＣＣＣＧＡＴＡＣＣＧＡＣＴＣＣＧＣＡＴＴＣＧＧＧＡＣＡ−３’（配列番号９）
リバースプライマー（下線はＸｈｏＩサイトを示す）；５’−ＣＣＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＧＧＣＣＧＴＴＣＧＴＧＡＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＡＴＴＡＣＣ−３’（配列番号１０）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社）
反応条件；９５℃で１０秒、６０℃で２０秒および６８℃で２分を１サイクルとして２０サイクル。
【００５４】
続いて、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社）を用いて、添付の使用書に従いｐＣＤＦＤｕｅｔ−１プラスミド（Ｍｅｒｃｋ社）のＮｄｅＩサイトおよびＸｈｏＩサイトにＤＮＡ断片１およびＤＮＡ断片２を挿入し、これをｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターとした。
【００５５】
また、ｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターについて、常法に従って制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化した後、電気泳動を行って精製し、ＰｇｓＡタンパク質およびＢ．Ｉｎｄｉｃａ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列を１のポリペプチドとして発現し得るようにコードするＤＮＡを得て、これをＤＮＡ断片３とした。続いて、同様にＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化したｐＥＴ４２ａ(＋)プラスミド(Ｍｅｒｃｋ社)に、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ ｖｅｒ．２(東洋紡社)を用いてＤＮＡ断片３を挿入し、これをｐＥＴ−ｐｇｓＡ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターとした。
【００５６】
（３）菌体内発現系の組換えベクターの作成
下記の条件で本実施例１（２）のｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、ｐｇｓＡタンパク質をコードするＤＮＡを含まないＤＮＡを増幅し、これをＤＮＡ断片４とした。続いて、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ ｖｅｒ．２(東洋紡社)を用いて、ＤＮＡ断片４のセルフライゲーションを行い、これをｐＣＤＦ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターとした。
【００５７】
《Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挿入されたｐＣＤＦＤｕｅｔ−１プラスミド由来のＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；本実施例１（２）のｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクター
フォワードプライマー；５’− ＣＡＴＡＴＧＴＣＧＧＧＴＴＡＣＣＣＧＡＴＡＣＣＧＡＣ−３’（配列番号１１）
リバースプライマー；５’−ＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＴＡＣＴＴＡＡＣＴＡＡＴＡ−３’（配列番号１２）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社）
反応条件；９８℃で１０秒、５９℃で３０秒、６８℃で２分４０秒を１サイクルとして２５サイクル。
【００５８】
また、ｐＣＤＦ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターを、常法に従って制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化することにより、Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを得て、これをＤＮＡ断片５とした。続いて、同様にＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化したｐＥＴ４２ａ(＋)プラスミド(Ｍｅｒｃｋ社)に、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ ｖｅｒ．２(東洋紡社)を用いてＤＮＡ断片５を挿入し、これをｐＥＴ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターとした。
【００５９】
（４）菌体内発現系（可溶性）の組換えベクターの作成
下記の条件でＰＣＲを行い、Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを増幅し、これをＤＮＡ断片６とした。
【００６０】
《Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；本実施例１（３）のｐＣＤＦ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクター
フォワードプライマー；５’−ＧＡＴＧＧＴＴＣＡＡＣＴＡＧＴＴＣＧＧＧＴＴＡＣＣＣＧＡＴＡＣＣＧ−３’（配列番号１３）
リバースプライマー；５’−ＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＧＧＣＣＧＴＴＣＧＴＧＡ−３’（配列番号１４）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社）
反応条件；９８℃で１０秒、６８℃で５０を１サイクルとして２５サイクル。
【００６１】
また、下記の条件でＰＣＲを行い、ｐＥＴ４２ａ（＋）プラスミド由来のＤＮＡを増幅し、これをＤＮＡ断片７とした。
【００６２】
《ｐＥＴ４２ａ(＋)プラスミド由来のＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；ｐＥＴ４２ａ(＋)プラスミド(Ｍｅｒｃｋ社)
フォワードプライマー；５’−ＣＴＣＧＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＡＡＴＴ−３’（配列番号１５）
リバースプライマー；５’−ＡＣＴＡＧＴＴＧＡＡＣＣＡＴＣＣＧＡＴＴＴ−３’（配列番号１６）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ(東洋紡社）
反応条件；９８℃で１０秒、６８℃で２分５０秒を１サイクルとして２５サイクル。
【００６３】
続いて、Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ由来β−フルクトフラノシダーゼとｐＥＴ４２ａ（＋）プラスミドに含まれるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とが１のポリペプチドとして発現するように、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いてＤＮＡ断片６およびＤＮＡ断片７を連結し、これをｐＥＴ−ＧＳＴ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターとした。なお、ＧＳＴは可溶性タンパク質であり、ＧＳＴと目的タンパク質とを融合タンパク質として発現させることにより、目的タンパク質の可溶性が向上することが報告されている。
【００６４】
（５）形質転換および形質転換体の培養
本実施例１（２）のｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターおよびｐＥＴ−ｐｇｓＡ−ｉｎｄｉｃａ組み換えベクター、本実施例１（３）のｐＣＤＦ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターおよびｐＥＴ−ｉｎｄｉｃａ組み換えベクター、ならびに本実施例１（４）のｐＥＴ−ＧＳＴ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターを、大腸菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）株のコンピテントセル（コスモバイオ社）に導入して、形質転換体として組換え大腸菌を得た。
【００６５】
これを３７℃で一晩プレート培養した後、組換え大腸菌のクローンをピックアップしてＭ９ ＳＥＥＤ培地１ｍＬに植菌し、３０℃、２２０ｒｐｍで２０時間振盪培養した。続いて、培養液のうち１０μＬをＭ９ Ｍａｉｎ培地２ｍＬに植え継ぎ、２５℃、２２０ｒｐｍで２４時間振盪培養した。Ｍ９ ＳＥＥＤ培地およびＭ９ Ｍａｉｎ培地の組成を以下に示す。なお、Ｍ９ ＳＥＥＤ培地およびＭ９ Ｍａｉｎ培地中の抗生物質は、ｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターおよびｐＣＤＦ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターにより形質転換した大腸菌についてはストレプトマイシン（終濃度５０μｇ／ｍＬ）を、ｐＥＴ−ｐｇｓＡ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクター、ｐＥＴ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターおよびｐＥＴ−ＧＳＴ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターにより形質転換した大腸菌についてはカナマイシン（終濃度３０μｇ／ｍＬ）を、それぞれ用いた。
【００６６】
Ｍ９ ＳＥＥＤ培地（計１００ｍＬ）；水  ７２ｍＬ、５×Ｍ９塩  ２０ｍＬ、２０％  カザミノ酸  ５ｍＬ、２０％ Ｄ−グルコース  ２ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ チミン  １ｍＬ、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２  ０．２ｍＬ、２．５Ｍ  ＭｇＣｌ２  ４０μＬ、１００ｍｇ／ｍＬ ＦｅＳＯ４  ２８μＬ、抗生物質
【００６７】
Ｍ９ Ｍａｉｎ培地（計１００ｍＬ）；水  ６７ｍＬ、５×Ｍ９塩  ２０ｍＬ、２０％  カザミノ酸  ５ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ チミン  １ｍＬ、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２  ０．２ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ ＦｅＳＯ４  ２８μＬ、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ １（Ｏ．Ｎ．Ｅ．；Ｍｅｒｃｋ社）Ｓｏｌ．１  ２ｍＬ、Ｏ．Ｎ．Ｅ．Ｓｏｌ．２  ５ｍＬ、Ｏ．Ｎ．Ｅ．Ｓｏｌ．３  １００μＬ、抗生物質
【００６８】
＜実施例２＞細胞表面発現系の効果の検討
（１）酵素反応
実施例１（５）の組換え大腸菌の培養液２ｍＬを用意し、その後、培養液を１２０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離することにより組換え大腸菌を回収して、菌体の湿重量を測定した。また、３０（ｗ／ｗ）％のスクロースを含む０．０４Ｍのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）を調製し、これを３０％スクロース溶液とした。組換え大腸菌の培養液２ｍＬに３０％スクロース溶液３５０μＬを添加して懸濁し、これを３０℃、２００ｒｐｍで３時間振盪することによりβ−フルクトフラノシダーゼの酵素反応を行い、これを反応液とした。なお、大腸菌は溶質濃度３０（ｗ／ｗ）％程度の溶液に接すると、浸透圧により菌体から水分が流出して溶菌する。
【００６９】
（２）糖組成の確認
本実施例２（１）の反応液５０μＬに水９５０μＬを加えることにより希釈した後、１００℃で１０分間加熱した。続いて、４℃、１５０００×ｇで１０分間遠心分離を行って上清を回収し、孔径０．４５μｍのフィルターで濾過して、得られた濾液をＨＰＬＣサンプルとした。次に、ＨＰＬＣサンプルを下記の条件でＨＰＬＣに供して、反応液に含まれる各糖（単糖；フルクトースおよびグルコース、二糖；スクロース、三糖以上のオリゴ糖；ケストースやニストースなど）の割合を確認した。各糖の割合は、検出された全ピークの面積の総和に対する各ピークの面積の割合として、面積百分率で算出した。
【００７０】
《ＨＰＬＣの条件》
カラム；ＳＨＯＤＥＸ ＫＳ ８０２(８.０φ×３００ｍｍ)  ２本
移動相；水
流速；１．０ｍＬ／分
注入量；２０μＬ
温度；５０℃
検出；示差屈折率検出器（ＲＩＤ；昭和電工社）
【００７１】
次に、酵素反応に使用したスクロースの質量（１１８．６５ｍｇ；スクロース溶液３５０μＬに含まれていたスクロースの質量）に三糖以上のオリゴ糖の面積百分率を乗じて、三糖以上のオリゴ糖の量を算出し、これをオリゴ糖生成量とした。また、オリゴ糖生成量を菌体重量で除して、菌体重量あたりのオリゴ糖生成量を百分率で算出し、これをオリゴ糖生成率とした。また、酵素反応に使用したスクロースの質量（１１８．６５ｍｇ）に、１００％からスクロースの面積百分率を減じた値を乗じることにより、スクロース消費量を算出した。また、スクロース消費量を菌体重量で除して、菌体重量あたりのスクロース消費量を百分率で算出し、これをスクロース消費率とした。その結果を表１に示す。
【００７２】
【表１】
0005882415.tif 000002
【００７３】
表１に示すように、ｐＣＤＦ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターにより形質転換した大腸菌の反応液ではオリゴ糖生成率は１１．９％であったのに対して、ｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターにより形質転換した大腸菌の反応液では７８．６％であり、オリゴ糖生成率が６．６倍以上大きかった。また、ｐＥＴ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターおよびｐＥＴ−ＧＳＴ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターにより形質転換した大腸菌の反応液では、オリゴ糖生成率はそれぞれ２７．１％および１１．３％であったのに対して、ｐＥＴ−ｐｇｓＡ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターにより形質転換した大腸菌の反応液では１１６．４％であり、オリゴ糖生成率がそれぞれ４．２倍以上、および１０．３倍以上大きかった。
【００７４】
すなわち、ｐＣＤＦ−Ｄｕｅｔ１プラスミドに由来する組換えベクターおよびｐＥＴ４２ａ（＋）プラスミドに由来する組換えベクターのいずれを用いた場合も、β−フルクトフラノシダーゼを大腸菌の細胞表面に発現させると、β−フルクトフラノシダーゼを菌体内に発現させた場合あるいは菌体内に可溶性タンパク質として発現させた場合と比較して、オリゴ糖の生成効率が顕著に大きくなることが明らかになった。これらの結果から、形質転換に用いるベクターの種類にはかかわらず、細胞表面に発現させるためのアンカータンパク質とβ−フルクトフラノシダーゼとを１のポリペプチドとして発現させると、極めて効率的にフルクトースが付加された糖質を製造することができることが示された。
【００７５】
＜実施例３＞β−フルクトフラノシダーゼの由来の検討
細胞表面に発現させるためのアンカータンパク質とβ−フルクトフラノシダーゼとを１のポリペプチドとして発現させることにより効率的にフルクトースが付加された糖質を製造することができるという効果が、β−フルクトフラノシダーゼの由来にかかわらず発揮されるか否かを検討した。具体的には、Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ由来β−フルクトフラノシダーゼと同じファミリー６８に属するＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｈｙｍａｔｕｍ ＳＴＭ８１５（以下「Ｂｕｒｋ」と略記する。）のβ−フルクトフラノシダーゼ、およびファミリー３２に属するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ ＩＦＯ４３０３（以下「Ｋａｗａｃｈｉｉ」と略記する。）のβ−フルクトフラノシダーゼについて検討した。
【００７６】
（１）β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードする核酸の取得
［１−１］Ｂｕｒｋ由来β−フルクトフラノシダーゼ
実施例１（１）に記載の方法により、Ｂｕｒｋのβ−フルクトフラノシダーゼのクローニングおよびシークエンスを行った。ただし、ＰＣＲの条件は下記のとおりとした。Ｂｕｒｋ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡの全長の塩基配列を配列番号１７に、それにコードされるＢｕｒｋ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列を配列番号１８に、それぞれ示す。なお、配列番号１８において、シグナル配列は１〜３５番目に相当する。
【００７７】
《Ｂｕｒｋ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；ＢｕｒｋのゲノムＤＮＡ
フォワードプライマー；５’−ＡＡＡＣＴＡＡＡＡＴＣＴＡＡＡＡＧＡＴＣＴＣＡＧＡＣＴＧＣＡＡＣＧＣＣＡＧＧＣＴＴＣＣＣＣＧ−３’（配列番号１９）
リバースプライマー；５’−ＧＧＴＴＴＣＴＴＴＡＣＣＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＧＧＣＴＧＴＴＧＣＣＧＣＣＣＴＧＣＣＣＧＴＴＴＣＣ−３’（配列番号２０）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社）
反応条件；９４℃で１５秒、５８℃で２０秒および６８℃で２分を１サイクルとして２１サイクル。
【００７８】
［１−２］Ｋａｗａｃｈｉｉ由来β−フルクトフラノシダーゼ
次に、Ｋａｗａｃｈｉｉのβ−フルクトフラノシダーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＧＡＡ８８１０１．１）をコードするＤＮＡをジェンスクリプト社に依頼して人工合成して取得した。Ｋａｗａｃｈｉｉ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡの全長の塩基配列を配列番号２１に、それにコードされるｋａｗａｃｈｉｉ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列を配列番号２２にそれぞれ示す。なお、配列番号２２において、シグナル配列は１〜２４番目に相当する。
【００７９】
（２）細胞表面発現系の組換えベクターの作成
［２−１］Ｂｕｒｋ由来β−フルクトフラノシダーゼ
本実施例３（１）［１−１］で行ったＰＣＲにより増幅したＢｕｒｋ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを、ＤＮＡ断片８とした。また、下記の条件でＰＣＲを行うことにより、ＰｇｓＡタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されたｐＣＤＦＤｕｅｔ−１プラスミド由来のＤＮＡであって、Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含まないＤＮＡを増幅し、これをＤＮＡ断片９とした。
【００８０】
《ＰｇｓＡタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されたｐＣＤＦＤｕｅｔ−１プラスミド由来のＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；実施例１（２）のｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクター
フォワードプライマー；５’−ＴＣＴＧＧＴＡＡＡＧＡＡＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＧＡＡＡＴＴＴ−３’（配列番号２３）
リバースプライマー；５’−ＴＴＴＡＧＡＴＴＴＴＡＧＴＴＴＧＴＣＡＣＴＡＴＧＡＴＣＡＡＴ−３’（配列番号２４）
反応条件；９８℃で１０秒、６８℃で２分２５秒を１サイクルとして２５サイクル。
【００８１】
続いて、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて、添付の使用書に従いＤＮＡ断片８およびＤＮＡ断片９を連結し、これをｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ−ｂｕｒｋ組換えベクターとした。
【００８２】
［２−２］Ｋａｗａｃｈｉｉ由来β−フルクトフラノシダーゼ
下記の条件でＰＣＲを行うことにより、Ｋａｗａｃｈｉｉ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを増幅し、これをＤＮＡ断片１０とした。
【００８３】
《Ｋａｗａｃｈｉｉ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；本実施例３（１）［１−２］のＫａｗａｃｈｉｉ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
フォワードプライマー；５’−ＡＡＡＴＣＴＡＡＡＡＧＡＴＣＣＴＣＣＧＴＧＧＴＣＡＴＣＧＡＣＴＡＣ−３’（配列番号２５）
リバースプライマー；５’−ＴＴＴＡＣＣＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＡＴＡＣＴＧＡＣＧＡＴＣＣＧＧＣ−３’（配列番号２６）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社）
反応条件；９８℃で１０秒、６８℃で５０秒を１サイクルとして２５サイクル。
【００８４】
また、下記の条件で実施例１（２）のｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含まないＤＮＡを増幅し、これをＤＮＡ断片１１とした。
【００８５】
《ＰｇｓＡタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されたｐＣＤＦＤｕｅｔ−１プラスミド由来のＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；実施例１（２）のｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクター
フォワードプライマー；５’−ＣＴＣＧＡＧＴＣＴＧＧＴＡＡＡＧＡＡＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＧＡＡＡ−３’（配列番号２７）
リバースプライマー；５’−ＧＧＡＴＣＴＴＴＴＡＧＡＴＴＴＴＡＧＴＴＴＧＴＣＡＣＴＡＴＧＡＴＣＡＡ−３’（配列番号２８）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社）
反応条件；９８℃で１０秒、６８℃で２分２５秒を１サイクルとして２５サイクル。
【００８６】
続いて、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて、添付の使用書に従いＤＮＡ断片１０およびＤＮＡ断片１１を連結し、これをｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ−ｋａｗａｃｈｉｉ組換えベクターとした。
【００８７】
（３）菌体内発現系の組換えベクターの作成
［３−１］Ｂｕｒｋ由来β−フルクトフラノシダーゼ
下記の条件で本実施例３（２）［２−１］のｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ−ｂｕｒｋ組換えベクターを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、ｐｇｓＡタンパク質をコードするＤＮＡを含まないＤＮＡを増幅し、これをＤＮＡ断片１２とした。続いて、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ ｖｅｒ．２(東洋紡社)を用いて、添付の使用書に従いＤＮＡ断片１２のセルフライゲーションを行い、これをｐＣＤＦ−ｂｕｒｋ組換えベクターとした。
【００８８】
《Ｂｕｒｋ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挿入されたｐＣＤＦＤｕｅｔ−１プラスミド由来のＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；本実施例３（２）［２−１］のｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ−ｂｕｒｋ組換えベクター
フォワードプライマー；５’−ＣＡＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＧＣＡＡＣＧＣＣＡＧＧＣＴ−３’（配列番号２９）
リバースプライマー；５’−ＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＴＡＣＴＴＡＡＣＴＡＡＴＡ−３’（配列番号３０）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社）
反応条件；９８℃で１０秒、５９℃で３０秒、６８℃で２分４０秒を１サイクルとして２５サイクル。
【００８９】
［３−２］Ｋａｗａｃｈｉｉ由来β−フルクトフラノシダーゼ
下記の条件で本実施例３（２）［２−２］のｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ−ｋａｗａｃｈｉｉ組換えベクターを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、ｐｇｓＡタンパク質をコードするＤＮＡを含まないＤＮＡを増幅し、これをＤＮＡ断片１３とした。続いて、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ ｖｅｒ．２(東洋紡社)を用いて、添付の使用書に従いＤＮＡ断片１３のセルフライゲーションを行い、これをｐＣＤＦ−ｋａｗａｃｈｉｉ組換えベクターとした。
【００９０】
《Ｋａｗａｃｈｉｉ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挿入されたｐＣＤＦＤｕｅｔ−１プラスミド由来のＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；本実施例３（２）［２−２］のｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ−ｋａｗａｃｈｉｉ組換えベクター
フォワードプライマー；５’−ＣＡＴＡＴＧＴＣＣＧＴＧＧＴＣＡＴＣＧＡＣＴＡＣ−３’（配列番号３１）
リバースプライマー；５’−ＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＴＡＣＴＴＡＡＣＴＡＡＴＡ−３’（配列番号３２）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社）
反応条件；９８℃で１０秒、５９℃で３０秒、６８℃で２分４０秒を１サイクルとして２５サイクル。
【００９１】
（４）形質転換および形質転換体の培養
本実施例３（２）［２−１］のｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ−ｂｕｒｋ組換えベクター、本実施例３（２）［２−２］のｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ−ｋａｗａｃｈｉｉ組換えベクター、本実施例３（３）［３−１］のｐＣＤＦ−ｂｕｒｋ組換えベクターおよび本実施例３（３）［３−２］のｐＣＤＦ−ｋａｗａｃｈｉｉ組換えベクターを、実施例１（５）に記載の方法により大腸菌に導入し、得られた組換え大腸菌を培養した。
【００９２】
（５）酵素反応およびオリゴ糖量の測定
本実施例３（４）の組換え大腸菌の培養液を用いて、実施例２（１）に記載の方法によりβ−フルクトフラノシダーゼの酵素反応を行った。その後、実施例２（２）に記載の方法により反応液に含まれる各糖の割合を測定し、オリゴ糖生成量、オリゴ糖生成率、スクロース消費量およびスクロース消費率を算出した。その結果を表２に示す。表２には、比較のため、表１に記載のｐＣＤＦ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターおよびｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターにより形質転換した大腸菌の反応液の結果も併せて示す。
【００９３】
【表２】
0005882415.tif 000003
【００９４】
表２に示すように、ｐＣＤＦ−ｂｕｒｋ組換えベクターにより形質転換した大腸菌の反応液ではオリゴ糖生成率は３７．０％であったのに対して、ｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ−ｂｕｒｋ組換えベクターにより形質転換した大腸菌の反応液では１５６．７％であり、オリゴ糖生成率が４．２倍以上大きかった。また、ｐＣＤＦ−ｋａｗａｃｈｉｉ組換えベクターにより形質転換した大腸菌の反応液ではオリゴ糖生成率は３４．５％であったのに対して、ｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ−ｋａｗａｃｈｉｉ組換えベクターにより形質転換した大腸菌の反応液では２４５．２％であり、オリゴ糖生成率が７．１倍以上大きかった。
【００９５】
すなわち、Ｂｕｒｋ由来β−フルクトフラノシダーゼおよびＫａｗａｃｈｉｉ由来β−フルクトフラノシダーゼを大腸菌の細胞表面に発現させると、Ｂ．ｉｎｄｉｃａ由来β−フルクトフラノシダーゼと同様に、菌体内に発現させた場合と比較して、オリゴ糖の生成効率が顕著に大きくなることが明らかになった。これらの結果から、β−フルクトフラノシダーゼの由来ないしファミリーの差異に関わらず、細胞表面に発現させるためのアンカータンパク質と融合して１のポリペプチドとして発現させると、極めて効率的にフルクトースが付加された糖質を製造することができることが示された。
【００９６】
＜実施例４＞アンカータンパク質の検討
細胞表面に発現させるためのアンカータンパク質とβ−フルクトフラノシダーゼとを１のポリペプチドとして発現させることにより効率的にフルクトースが付加された糖質を製造することができるという効果が、アンカータンパク質の種類にかかわらず発揮されるか否かを検討した。具体的には、ＰｇｓＡタンパク質のアミノ酸配列を基にＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）を用いて検索し、下記（ア）および（イ）のアンカータンパク質をを抽出し、これらについて検討した；
（ア）ＰｇｓＡタンパク質のアミノ酸配列と同一性が４５％であるＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＤＳＭ３１９株のＣａｐＡタンパク質、
（イ）ＰｇｓＡタンパク質のアミノ酸配列との同一性が３２％で、ＣａｐＡタンパク質のアミノ酸配列との同一性が３６％であるＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＮＢＲＣ１００５９９株のタンパク質（ｇｅｎｉｎｆｏ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒｒ（ＧＩ）番号２２６３１３３４１；以下「ｂｒｅｖタンパク質」という。）。
【００９７】
（１）細胞表面発現系の組換えベクターの作成
［１−１］ＣａｐＡタンパク質をコードするＤＮＡの増幅
ＣａｐＡタンパク質をコードするＤＮＡ配列を大腸菌において最適化したコドンでコードし、かつ、３’末端側にＢｇｌＩＩの制限酵素サイトを付加した塩基配列を設計し、これをｃａｐＡ＿ｏｐｔｉ遺伝子とした。ｃａｐＡ＿ｏｐｔｉ遺伝子の塩基配列を配列番号３３に、それにコードされるアミノ酸配列を配列番号３４に、それぞれ示す。次に、ｃａｐＡ＿ｏｐｔｉ遺伝子のＤＮＡを人工合成し、これを鋳型として下記の条件でＰＣＲを行うことにより、ＣａｐＡタンパク質をコードするＤＮＡを増幅し、これをＤＮＡ断片１４とした。
【００９８】
《ＣａｐＡタンパク質をコードするＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；人工合成したｃａｐＡ＿ｏｐｔｉ遺伝子のＤＮＡ
フォワードプライマー；５’−ＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＣＴＧＡＡＣＴＴＣＣＡＡＧ−３’（配列番号３５）
リバースプライマー；５’−ＣＧＧＧＴＡＡＣＣＣＧＡＴＴＧＡＧＡＴＣＴＡＴＴＴＧＣＣＴＧＧＧＣＴＴＣＧＴＴＣＴＴＴＴＴＧ−３’（配列番号３６）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社）
反応条件；９４℃で１５秒、５８℃で２０秒および６８℃で２分を１サイクルとして２１サイクル。
【００９９】
［１−２］ｂｒｅｖタンパク質をコードするＤＮＡの増幅
Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＮＢＲＣ１００５９９株のゲノムＤＮＡを常法に従って抽出した。続いて、下記の条件でＰＣＲを行うことにより、ｂｒｅｖタンパク質をコードするＤＮＡを増幅し、これをＤＮＡ断片１５とした。また、ＰＣＲ産物について常法に従ってシークエンスを行い、ｂｒｅｖタンパク質をコードするＤＮＡの全長の塩基配列を決定した。ｂｒｅｖタンパク質をコードするＤＮＡの全長の塩基配列を配列番号３７に、また、それにコードされるｂｒｅｖタンパク質のアミノ酸配列を配列番号３８に、それぞれ示す。
【０１００】
《ｂｒｅｖタンパク質をコードするＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＮＢＲＣ１００５９９株のゲノムＤＮＡ
フォワードプライマー；５’−ＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＡＣＧＡＧＡＡＣＡＧＡＴＣＡＡＧ−３’（配列番号３９）
リバースプライマー；５’−ＧＴＡＡＣＣＣＧＡＧＧＡＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＣＣＧＣ−３’（配列番号４０）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社）
反応条件；９８℃で１０秒、６８℃で１分１０秒を１サイクルとして４５サイクル。
【０１０１】
［１−３］組換えベクターの作成
〈１−３−１〉ＣａｐＡタンパク質
下記の条件で実施例１（２）のｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、ｐｇｓＡタンパク質をコードするＤＮＡを含まないがＢ．Ｉｎｄｉｃａ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを増幅し、これをＤＮＡ断片１６とした。続いて、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて、添付の使用書に従い本実施例４（１）［１−１］のＤＮＡ断片１４とＤＮＡ断片１６とを連結し、これをｐＣＤＦ−ｃａｐＡ＿ｏｐｔｉ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターとした。
【０１０２】
《Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挿入されたｐＣＤＦＤｕｅｔ−１プラスミド由来のＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；実施例１（２）のｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクター
フォワードプライマー；５’−ＡＧＡＴＣＴＣＡＡＴＣＧＧＧＴＴＡＣＣＣＧＡＴＡＣＣＧＡＣ−３’（配列番号４１）
リバースプライマー；５’−ＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＴＡＣＴＴＡＡＣ−３’（配列番号４２）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社）
反応条件；９８℃で１０秒、６８℃で３分２０秒を１サイクルとして２５サイクル。
【０１０３】
〈１−３−２〉ｂｒｅｖタンパク質
下記の条件で実施例１（２）のｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、ＰｇｓＡタンパク質をコードするＤＮＡを含まないＤＮＡを増幅し、これをＤＮＡ断片１７とした。続いて、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて、添付の使用書に従い本実施例４（１）［１−２］のＤＮＡ断片１５とＤＮＡ断片１７とを連結し、これをｐＣＤＦ−ｂｒｅｖ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターとした。
【０１０４】
《Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挿入されたｐＣＤＦＤｕｅｔ−１プラスミド由来のＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；実施例１（２）のｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクター
フォワードプライマー；５’−ＡＧＡＴＣＣＴＣＧＧＧＴＴＡＣＣＣＧＡＴＡＣＣＧＡ−３’（配列番号４３）
リバースプライマー；５’−ＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＴＡＣＴＴＡＡＣＴ−３’（配列番号４４）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社）
反応条件；９８℃で１０秒、６８℃で３分２０秒を１サイクルとして２５サイクル。
【０１０５】
（２）酵素反応および糖組成の確認
本実施例４（１）のｐＣＤＦ−ｃａｐＡ＿ｏｐｔｉ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターおよびｐＣＤＦ−ｂｒｅｖ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターを、実施例１（５）に記載の方法により大腸菌に導入し、得られた組換え大腸菌を培養した。続いて、これらの組換え大腸菌の培養液を用いて、実施例２（１）に記載の方法によりβ−フルクトフラノシダーゼの酵素反応を行った。その後、実施例２（２）に記載の方法により反応液に含まれる各糖の割合を測定し、オリゴ糖生成量、オリゴ糖生成率、スクロース消費量およびスクロース消費率を算出した。その結果を表３に示す。表３には、比較のため、表１に記載のｐＣＤＦ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターおよびｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターにより形質転換した大腸菌の反応液の結果も併せて示す。
【０１０６】
【表３】
0005882415.tif 000004
【０１０７】
表３に示すように、ｐＣＤＦ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターにより形質転換した大腸菌の反応液ではオリゴ糖生成率は１１．９％であったのに対して、ｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターにより形質転換した大腸菌の反応液では７８．６％、ｐＣＤＦ−ｃａｐＡ＿ｏｐｔｉ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターにより形質転換した大腸菌の反応液では３１２．２％、ｐＣＤＦ−ｂｒｅｖ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターにより形質転換した大腸菌の反応液では１．０％であった。すなわち、ｐＣＤＦ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターを用いた場合と比較して、オリゴ糖生成率は、ｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターを用いた場合は６．６倍以上、ｐＣＤＦ−ｃａｐＡ＿ｏｐｔｉ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターを用いた場合は２６．２倍以上大きかったのに対して、ｐＣＤＦ−ｂｒｅｖ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターを用いた場合はおよそ０．０８倍と小さかった。
【０１０８】
すなわち、ｂｒｅｖタンパク質によりβ−フルクトフラノシダーゼを大腸菌の細胞表面に発現させると、菌体内に発現させた場合と比較して、オリゴ糖の生成効率が小さくなる一方で、ＰｇｓＡタンパク質やＣａｐＡタンパク質によりβ−フルクトフラノシダーゼを大腸菌の細胞表面に発現させると、菌体内に発現させた場合と比較して、オリゴ糖の生成効率が顕著に大きくなることが明らかになった。これらの結果から、ＰｇｓＡタンパク質のアミノ酸配列またはＣａｐＡタンパク質のアミノ酸配列のいずれかと４５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアンカータンパク質とβ−フルクトフラノシダーゼとを１のポリペプチドとして発現させることにより、効率的にフルクトースが付加された糖質を製造することができることが明らかになった。
【０１０９】
＜実施例５＞宿主の検討
細胞表面に発現させるためのアンカータンパク質とβ−フルクトフラノシダーゼとを１のポリペプチドとして発現させることにより効率的にフルクトースが付加された糖質を製造することができるという効果が、宿主の種類にかかわらず発揮されるか否かを検討した。具体的には、ＰｇｓＡタンパク質が由来するＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＣａｐＡタンパク質が由来するＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍを宿主とした場合について検討した。
【０１１０】
（１）Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓを宿主とした場合
［１−１］組換えベクターの作成
下記の条件でＰＣＲを行うことにより、ＰｇｓＡタンパク質およびＢ．Ｉｎｄｉｃａ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを増幅し、これをＤＮＡ断片１８とした。
【０１１１】
《ＰｇｓＡタンパク質およびＢ．Ｉｎｄｉｃａ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；実施例１（２）のｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクター
フォワードプライマー；５’−ＡＡＧＧＡＧＧＡＡＧＧＡＴＣＡＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧ−３’（配列番号４５）
リバースプライマー；５’−ＣＣＣＧＧＧＧＡＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＧＧＣＣＧＴＴＣＧＴＧＡＣＡＣＣＡＴＧＧ−３’（配列番号４６）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社）
反応条件；９５℃で２０秒、５０℃で３０秒、６８℃で２分を１サイクルとして２５サイクル。
【０１１２】
また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ用分泌発現ベクターであるｐＨＴ４３プラスミド（ＭｏＢｉＴｅｃ社）の塩基配列をもとに下記配列番号４７および配列番号４８のプライマーを設計し、下記の条件でＰＣＲを行うことにより、ｐＨＴ４３プラスミド由来のＤＮＡを増幅し、これをＤＮＡ断片１９とした。
【０１１３】
《ｐＨＴ４３プラスミド由来のＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；ｐＨＴ４３プラスミド（ＭｏＢｉＴｅｃ社）
フォワードプライマー；５’−ＧＴＣＧＡＣＧＴＣＣＣＣＧＧＧＧＣＡＧＣＣＣＧＣＣＴＡＡＴＧ−３’（配列番号４７）
リバースプライマー；５’−ＴＧＡＴＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＴＴＡＡＴＴＧＧＧＡＡＴＴＧＴＴ−３’（配列番号４８）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社）
反応条件；９５℃で２０秒、６８℃で５分、６８℃で５分を１サイクルとして２５サイクル。
【０１１４】
続いて、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて添付の使用書に従いＤＮＡ断片１８とＤＮＡ断片１９とを連結し、これをｐＨＴ４３−ｐｇｓＡ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターとした。
【０１１５】
［１−２］形質転換体の作成
本実施例５（１）［１−１］のｐＨＴ４３−ｐｇｓＡ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターを、実施例１（５）に記載の方法により大腸菌に導入して組換え大腸菌を培養した後、組換え大腸菌からｐＨＴ４３−ｐｇｓＡ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターを回収した。回収したｐＨＴ４３−ｐｇｓＡ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターおよびｐＨＴ４３プラスミド（ＭｏＢｉＴｅｃ社）を、エレクトロポレーションによりＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＲＩＫ１２８５株（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ；ＴＡＫＡＲＡ社）に導入して形質転換体を得て、これを組換えサブティリス菌とした。エレクトロポレーションはＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ ＩＩ（バイオラッド社）を用いて、以下〈１〉〜〈８〉の手順で行った。
【０１１６】
〈１〉Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＲＩＫ１２８５（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ；ＴＡＫＡＲＡ社）のグリセロールストックから適量をＬＢプレートに広げ、３７℃で一晩（約１６時間）培養を行った後、シングルコロニーを突いて、２５ｍＬのＬＢ培地を入れた２５０ｍＬ容量のフラスコに植菌し、２８℃で一晩（約１６時間）前培養を行い、これを前培養液とした。
〈２〉終濃度０．５Ｍとなるようにソルビトールを添加したＬＢ培地を調製し、これを本培養培地とした。５０ｍＬの本培養培地を入れた２５０ｍＬ容量の三角フラスコに前培養液５ｍＬを加え、３７℃、２２０ｒｐｍで本培養を行い、これを本培養液とした。本培養は、濁度の値が定常期（ＯＤ６００＝０．８５〜０．９５）になるまで行った。
〈３〉本培養液の三角フラスコを氷中に１０分間以上放置した後、５０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離を行った。上清を除去した後、氷冷したＳｏｌｕｔｉｏｎ Ａ（０．５Ｍ ソルビトール、０．５Ｍ マンニトール、０．５Ｍ トレハロース、１０％ グリセロール）を用いて菌体の洗浄を４回行った。
〈４〉続いて、菌体を適当量のＳｏｌｕｔｉｏｎ Ａに懸濁した後、６０μＬずつ分注して−８０℃で保存し、これをエレクトロポレーション用菌体とした。
〈５〉エレクトロポレーション用菌体を氷中で溶解し、サンプルとしてｐＨＴ４３−ｐｇｓＡ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターを、コントロールとしてｐＨＴ４３プラスミド（ＭｏＢｉＴｅｃ社）を、それぞれ適当量加えた後、氷冷しておいた０．１ｃｍギャップのキュベットに移し、１〜１．５分間放置した。
〈６〉２２ＫＶ／ｃｍ（２５μＦ、２００Ω）でパルスをかけた後、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｂ（０．５Ｍのソルビトールおよび０．３８Ｍのマンニトールを含むＬＢ培地）を１ｍＬ加え、３７℃で３時間穏やかに振とう培養を行った。
〈７〉その培養液を３５００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、上清を除去した。１００μＬのＳｏｌｕｔｉｏｎ Ｂを加えて懸濁し、終濃度５μｇ／ｍＬのｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌを含むＬＢプレートに塗布して、３７℃で一晩培養した。
〈８〉ＬＢプレート上に出現したコロニーを、終濃度５μｇ／ｍＬのｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌおよび終濃度１ｍＭのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含むＬ培地１ｍＬに加え、３０℃、２２０ｒｐｍで２４時間旋回培養し、これを組換えサブティリス菌培養液とした。
【０１１７】
［１−４］酵素反応および糖組成の確認
４５（ｗ／ｗ）％のスクロースを含む０．０４Ｍのリン酸カリウムバッファーを調製し、これを４５％スクロース溶液とした。本実施例５（１）［１−２］〈８〉の組換えサブティリス菌培養液を４℃、３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して菌体を回収し、５００μＬの４５％スクロース溶液に懸濁し、これを３０℃、２２０ｒｐｍで２４時間振盪することによりβ−フルクトフラノシダーゼの酵素反応を行った。続いて、５０％アセトニトリル水溶液を用いて反応液を２５倍に希釈し、ＨＰＬＣサンプルとした。次に、ＨＰＬＣサンプルを下記の条件でＨＰＬＣに供して、糖組成を確認した。その結果を図２に示す。
【０１１８】
《ＨＰＬＣ分析条件》
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ Ｓｕｇａｒ−Ｄ ４．６×１５０ｍｍ
溶離液：アセトニトリル水溶液（０〜９分；７２．５〜５７．５％、９〜１１分；７２．５）％）
カラム温度：２５℃
流速：１．５ｍＬ／分
注入量：１．５μＬ
検出：コロナ荷電粒子検出器（ＣＡＤ；サーモフィッシャーサイエンティフィック社）
【０１１９】
図２に示すように、ｐＨＴ４３−ｐｇｓＡ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターにより形質転換した組換えサブティリス菌の反応液と、ｐＨＴ４３プラスミドにより形質転換した組換えサブティリス菌（コントロール）の反応液とは、ほぼ同じ形状のＨＰＬＣチャートであり、いずれにおいても、三糖以上のオリゴ糖ないしグルコースやフルクトースの生成はほとんど確認されなかった。この結果から、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓにおいて、細胞表面に発現させるためのアンカータンパク質とβ−フルクトフラノシダーゼとを１のポリペプチドとして発現させると、効率的にフルクトースが付加された糖質を製造することができないことが明らかになった。
【０１２０】
（２）Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍを宿主とした場合
［２−１］組換えベクターの作成
下記の条件でＰＣＲを行うことにより、ＣａｐＡタンパク質およびＢ．Ｉｎｄｉｃａ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを増幅し、これをＤＮＡ断片２０とした。
【０１２１】
《ＣａｐＡタンパク質およびＢ．Ｉｎｄｉｃａ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；実施例４（１）のｐＣＤＦ−ｃａｐＡ＿ｏｐｔｉ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクター
フォワードプライマー；５’−ＡＧＧＧＧＧＡＡＡＴＧＡＣＡＡＡＴＧＡＡＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＣＴＧＡＡＣＴＴＣＣ−３’（配列番号４９）
リバースプライマー；５’−ＡＣＴＡＧＴＴＴＧＧＡＣＣＡＴＴＴＡＣＴＧＧＣＣＧＴＴＣＧＴＧＡＣＡＣＣＡＴＧＧ−３’（配列番号５０）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社）
反応条件；９４℃で１５秒、５８℃で２０秒、６８℃で３分を１サイクルとして２１サイクル。
【０１２２】
また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ用発現ベクターであるｐＷＨ１５２０プラスミド（ＭｏＢｉＴｅｃ社）の塩基配列をもとに下記配列番号５１および配列番号５２のプライマーを設計し、下記の条件でＰＣＲを行うことにより、ｐＷＨ１５２０プラスミド由来のＤＮＡを増幅し、これをＤＮＡ断片２１とした。
【０１２３】
《ｐＷＨ１５２０プラスミドのＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；ｐＷＨ１５２０プラスミド（ＭｏＢｉＴｅｃ社）
フォワードプライマー；５’−ＡＴＧＧＴＣＣＡＡＡＣＴＡＧＴＡＣＴＡＡＴＡＡＡＡＴＴＡＡＴ−３’（配列番号５１）
リバースプライマー；５’−ＴＴＧＴＣＡＴＴＴＣＣＣＣＣＴＴＴＧＡＴＴＴＡＡＧＴＧＡＡＣ−３’（配列番号５２）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社）
反応条件；９４℃で１５秒、６８℃で９分を１サイクルとして３５サイクル。
【０１２４】
続いて、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて、添付の使用書に従いＤＮＡ断片２０とＤＮＡ断片２１とを連結し、これをｐＷＨ１５２０−ｃａｐＡ＿ｏｐｔｉ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターとした。
【０１２５】
［２−２］形質転換体の作成
本実施例５（２）［２−１］のｐＷＨ１５２０−ｃａｐＡ＿ｏｐｔｉ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターを、実施例１（５）に記載の方法により大腸菌に導入して組換え大腸菌を培養した後、組換え大腸菌からｐＷＨ１５２０−ｃａｐＡ＿ｏｐｔｉ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターを回収した。回収したｐＷＨ１５２０−ｃａｐＡ＿ｏｐｔｉ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターと、コントロールとしてｐＷＨ１５２０プラスミド（ＭｏＢｉＴｅｃ社）とを、プロトプラスト法によりそれぞれＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍに導入して形質転換体を得て、これを組換えメガテリウム菌とした。プロトプラスト法は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ（Ｍｏｂｉｔｅｃ社）を用いて、添付の使用書に従って行った。得られた組換えメガテリウム菌は、終濃度１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含むＬ培地１ｍＬに加え、３０℃、２２０ｒｐｍで６時間旋回培養した後、キシロースを終濃度０．５（ｗ／ｗ）％となるよう培地に添加し、同条件でさらに１８時間旋回培養して、これを組換えメガテリウム菌培養液とした。
【０１２６】
［２−３］酵素反応および糖組成の確認
本実施例５（２）［２−２］の組換えメガテリウム菌培養液について、本実施例５（１）［１−４］に記載の方法により酵素反応を行った後、反応液の糖組成の確認を行った。その結果を図３に示す。
【０１２７】
図３に示すように、ｐＷＨ１５２０−ｃａｐＡ＿ｏｐｔｉ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターにより形質転換した組換えメガテリウム菌の反応液と、ｐＷＨ１５２０プラスミドにより形質転換した組換えメガテリウム菌の反応液とは、ほぼ同じ形状のＨＰＬＣチャートであり、いずれにおいても、三糖以上のオリゴ糖ないしグルコースやフルクトースの生成はほとんど確認されなかった。この結果から、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍにおいて、細胞表面に発現させるためのアンカータンパク質とβ−フルクトフラノシダーゼとを１のポリペプチドとして発現させると、効率的にフルクトースが付加された糖質を製造することができないことが明らかになった。
【０１２８】
以上の本実施例５（１）［１−４］および（２）［２−３］の結果から、ＰｇｓＡタンパク質はＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓに由来し、ＣａｐＡタンパク質はＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍに由来するにも関わらず、これらを宿主として、細胞表面に発現させるためのアンカータンパク質とβ−フルクトフラノシダーゼとを１のポリペプチドとして発現させた場合は、効率的にフルクトースが付加された糖質を製造することができないことが明らかになった。
【０１２９】
また、従来よりタンパク質の発現に多用される酵母は内在性のβ−フルクトフラノシダーゼを有し（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｆｃ．ｃｏ．ＪＰ/ｐｒｏｄｕｃｔ／ｋｏｕｓｏ／ｉｎｖｅｒｔａｓｅ／）、このため、外来のβ−フルクトフラノシダーゼを導入してフルクトースが付加された糖質を製造する際は、当該内在性β−フルクトフラノシダーゼの活性（スクロースの資化性）を欠損させた変異株を用いる必要があり（例えば、特許第３６２８３３６号、第２４頁（３））、β−フルクトフラノシダーゼによるフルクトースが付加された糖質の製造方法における宿主としては、汎用性や取り扱いの容易さに欠ける。
【０１３０】
以上のことから、細胞表面に発現させるためのアンカータンパク質とβ−フルクトフラノシダーゼとを１のポリペプチドとして発現させた微生物によるフルクトースが付加された糖質の製造方法における宿主としては、大腸菌が至適であることが明らかになった。
【０１３１】
＜実施例６＞受容体基質の検討
細胞表面に発現させるためのアンカータンパク質と融合して１のポリペプチドとして大腸菌に発現させたβ−フルクトフラノシダーゼにより、フルクトースの転移を受けることができる物質（受容体基質）について検討した。具体的には、単糖、二糖および配糖体、ならびに糖質以外の物質としてヒドロキノンが受容体基質となり得るか否かについて検討した。
【０１３２】
（１）単糖、二糖および配糖体
［１−１］酵素反応
実施例１（２）のｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターにより形質転換した実施例１（５）の組換え大腸菌の培養液を１２０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離に供して集菌した後、菌体湿重量にして約７ｍｇ分用意した。また、フルクトース残基の供与体基質としてスクロース（グラニュー糖；三井製糖社）を、受容体基質として単糖（Ｄ（＋）−キシロース（和光純薬社）およびＬ（＋）−アラビノース（和光純薬社））、二糖（メリビオース（和光純薬社）およびラクトース一水和物（和光純薬社））ならびに配糖体（α−メチル−Ｄ（＋）−グルコシド（和光純薬社））を用意し、表４に示す組成の基質溶液Ｎｏ．１〜５を調製した。基質溶液の溶媒は、０．０４Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）を用いた。７ｍｇの湿菌体に対して基質溶液Ｎｏ．１〜５をそれぞれ２００μＬずつ添加して懸濁し、これを、４０℃、２００ｒｐｍで１時間振盪することによりβ−フルクトフラノシダーゼの酵素反応を行い、反応液を得た。基質溶液Ｎｏ．１〜５を添加して得られた反応液を、それぞれ、反応液Ｎｏ．１〜５とした。
【０１３３】
【表４】
0005882415.tif 000005
【０１３４】
［１−２］糖組成の確認
本実施例６（１）［１−１］の反応液Ｎｏ．１〜５各５０μＬに水４５０μＬおよびアセトニトリル５００μＬを加えることにより希釈した後、７０℃で１０分間加熱した。続いて、２５℃、１５０００×ｇで１０分間遠心分離を行って上清を回収し、孔径０．４５μｍのフィルターで濾過して、得られた濾液をＨＰＬＣサンプルとした。これを下記の条件でＨＰＬＣに供して、反応液に含まれる各糖の割合を測定した。各糖の割合は、検出された全ピークの面積の総和に対する各ピークの面積の割合として、面積百分率で算出した。その結果を表５に示す。
【０１３５】
《ＨＰＬＣの条件》
カラム：ＴＯＳＯＨ ＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ８０ 粒子径５μｍ（４．６φ×２５０ｍｍ）
溶離液：アセトニトリル水溶液（反応液Ｎｏ．１〜２および５のＨＰＬＣサンプル；７８％、反応液Ｎｏ．３〜４のＨＰＬＣサンプル；７０％）
カラム温度：７０℃
流速：１．０ｍＬ／分
注入量：２０μＬ
検出；示差屈折率検出器（ＲＩＤ；昭和電工社）
【０１３６】
【表５】
0005882415.tif 000006
【０１３７】
表５に示すように、反応液Ｎｏ．１〜５のいずれにも、受容体基質に由来するオリゴ糖が含まれることが確認された。すなわち、反応液Ｎｏ．１〜５において、Ｄ（＋）−キシロース、Ｌ（＋）−アラビノース、メリビオース、ラクトース一水和物およびα−メチル−Ｄ（＋）−グルコシドにフルクトース残基が転移されて、オリゴ糖が生成したことが明らかになった。これらの結果から、糖質は、細胞表面に発現させるためのアンカータンパク質と融合して１のポリペプチドとして大腸菌に発現させたβ−フルクトフラノシダーゼの受容体基質となりうることが示された。
【０１３８】
（２）ヒドロキノン
［２−１］酵素反応
実施例１（２）のｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ−ｉｎｄｉｃａ組換えベクターにより形質転換した実施例１（５）の組換え大腸菌の培養液を、菌体の湿重量にして１０ｍｇ分用意した。また、フルクトース残基の供与体基質としてスクロース（グラニュー糖；三井製糖社）を、受容体基質としてヒドロキノン（和光純薬社）をそれぞれ用意した。５０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ６．０）１ｍＬにスクロース３４２ｍｇ（終濃度１Ｍ）およびヒドロキノン２８ｍｇ（終濃度０．２５Ｍ）を溶解し、これを基質溶液とした。１０ｍｇの湿菌体に対して５０倍量の体積の基質溶液を添加して懸濁した後、４０℃、２００ｒｐｍで１時間振盪することによりβ−フルクトフラノシダーゼの酵素反応を行い、これをサンプル反応液とした。また、下記の組成のコントロール溶液Ｎｏ．１〜３を用意し、同様に４０℃、２００ｒｐｍで１時間振盪し、コントロール反応液Ｎｏ．１〜３を得た。
【０１３９】
コントロール溶液Ｎｏ．１；１０ｍｇの湿菌体に対して、５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ６．０）を５０倍量（体積比）添加。
コントロール溶液Ｎｏ．２；基質溶液のみ（湿菌体を含まない）。
コントロール溶液Ｎｏ．３；１０ｍｇの湿菌体に対して、終濃度１Ｍのスクロースを含む５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ６．０）を５００μＬ添加。
【０１４０】
［２−２］反応液に含まれる物質の確認
本実施例６（２）［２−１］のサンプル反応液およびコントロール反応液Ｎｏ．１〜３について、本実施例６（１）［１−２］に記載の方法によりＨＰＬＣを行い、反応液に含まれる物質の確認を行った。ただし、ＨＰＬＣの条件は下記のとおりとした。その結果を図４に示す。なお、２８０ｎｍのＵＶ検出では主としてヒドロキノンおよびそれに由来する生成物が検出され、ＥＬＳＤでは主として糖およびそれに由来する生成物が検出される。
【０１４１】
《ＨＰＬＣの条件》
カラム：Ｕｎｉｓｏｎ ＵＫ−Ａｍｉｎｏ
溶離液：アセトニトリル水溶液（０〜３０分；９８〜７０％グラジエント）
カラム温度：６０℃
流速：０．４ｍＬ／分
注入量：１μＬ
検出；ＵＶ検出器（２８０ｎｍ）および蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）
【０１４２】
図４の最上段のＨＰＬＣチャートにおいて矢印で示すように、サンプル反応液においてのみ、保持時間約１２分、約１９分および約２４分にピークが確認された。同様の保持時間におけるピークは、コントロール反応液Ｎｏ．１で検出されなかったことから菌体由来のものではなく、コントロール反応液Ｎｏ．２で検出されなかったことからヒドロキノンあるいはスクロースではなく、コントロール反応液Ｎｏ．３で検出されなかったことからスクロースにβ−フルクトフラノシダーゼが作用して生成する生成物（グルコース、フルクトース、ケストースなどのオリゴ糖など）ではないことが分かる。すなわち、サンプル反応液において、ヒドロキノンにフルクトースが転移されて、配糖体が生成したことが明らかになった。これらの結果から、糖質以外の物質もまた、細胞表面に発現させるためのアンカータンパク質と融合して１のポリペプチドとして大腸菌に発現させたβ−フルクトフラノシダーゼの受容体基質となりうることが示された。
【０１４３】
以上の本実施例（１）［１−２］および（２）［２−２］の結果から、細胞表面に発現させるためのアンカータンパク質と融合して１のポリペプチドとして大腸菌に発現させたβ−フルクトフラノシダーゼにより、糖質や糖質以外の物質を受容体基質として、フルクトースが付加された糖質を製造することができることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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