(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のａ）工程とｂ）工程からＡＤＡＭのプロテアーゼの反応進行が確認され、かつ、以下のａ）工程とｃ）工程からＡＤＡＭ作用の阻害が確認された物質をＡＤＡＭ作用阻害物質と判定することを特徴とするＡＤＡＭ作用阻害物質のスクリーニング方法。
ａ）ＡＤＡＭのプロテアーゼ活性を備え又はＡＤＡＭのプロテアーゼ活性を備えさせる検体（ただし、ヒト個体を除く。）にスクリーニング対象物質を投与又は導入する工程。
ｂ）上記ａ）工程によってＡＤＡＭのプロテアーゼ活性及びスクリーニング対象物質を備えた前記検体において、ＡＤＡＭのプロテアーゼの反応進行を確認する工程。
ｃ）上記ａ）工程によってＡＤＡＭのプロテアーゼ活性及びスクリーニング対象物質を備えた前記検体において、仮足の保持阻害又は仮足の形成阻害を確認する工程。
【請求項２】
前記ａ）工程における検体が、細胞、器官、組織、又は個体であることを特徴とする請求項１に記載のＡＤＡＭ作用阻害物質のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記ＡＤＡＭが、ヒトＡＤＡＭ又はヘビ毒ＡＤＡＭであることを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載のＡＤＡＭ作用阻害物質のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記ＡＤＡＭ作用阻害物質のスクリーニング方法が、前記ａ）工程と以下のｄ）工程からＡＤＡＭ特異性を確認することを含むことを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれかに記載のＡＤＡＭ作用阻害物質のスクリーニング方法。
ｄ）スクリーニング対象物質が投与又は導入された検体におけるＡＤＡＭ以外のプロテアーゼのプロテアーゼ活性の残存を確認する工程。
【請求項５】
仮足を形成可能である検体（ただし、ヒト個体を除く。）に対して、ＡＤＡＭを用いることを特徴とする仮足の保持方法。
【請求項６】
ＡＤＡＭを有効成分とすることを特徴とする仮足保持剤。
【請求項７】
以下のｅ）及びｆ）の各工程を順序不同で含む処理工程を行い、その後以下のｇ）工程を含む確認工程により仮足の制御が確認された物質を仮足の制御物質と判定することを特徴とする仮足の制御物質のスクリーニング方法。
ｅ）検体（ただし、ヒト個体を除く。）である細胞、器官、組織、又は個体にＡＤＡＭを投与又は導入する工程。
ｆ）検体（ただし、ヒト個体を除く。）である細胞、器官、組織、又は個体にスクリーニング対象物質を投与又は導入する工程。
ｇ）仮足の制御を確認する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＤＡＭ作用阻害物質のスクリーニング方法、仮足の保持方法、仮足保持剤、仮足の制御物質のスクリーニング方法、及びＡＤＡＭ作用阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘビ毒は大別して２種存在し、ガラガラヘビ等が有する出血性ヘビ毒とコブラ等が有する神経性ヘビ毒がある。
【０００３】
下記の非特許文献１〜４に開示されているように、ｖａｓｃｕｌａｒ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（以下、ＶＡＰと称する）１及び２は、出血性ヘビ毒素として本願発明者らによってガラガラヘビ毒から単離された蛋白質であり、血管内皮細胞に対して激しいアポトーシス小胞の生成を伴うアポトーシスを誘導する。また、本願発明者らは、ＶＡＰ１、ＶＡＰ２がＡＤＡＭファミリーのホモログであることも確認している。
【０００４】
ＡＤＡＭとは、ａ−ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅの略称であり、ディスインテグリンドメイン及びメタロプロテアーゼドメインを有する蛋白質である。Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ（以下、ＭＭＰと称する）もメタロプロテアーゼドメインを有する蛋白質であり、創傷治癒等に関与すると考えられている。これらの蛋白質のメタロプロテアーゼ部位は活性中心に金属イオンを有しており、活性化されて蛋白質の切断を行う。また、下記特許文献１〜３におけるＡＤＡＭ阻害剤が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００５−５３３７８９号公報  この特許文献１は、ＡＤＡＭ−１０蛋白質の阻害に有用な化合物を開示する。
【特許文献２】特開２００８−１８４３８７号公報  この特許文献２は、アスコルビン酸誘導体であるＡＤＡＭ阻害剤を開示する。
【特許文献３】特開２００８−２０１７７２号公報  この特許文献３は、アルキルグルコシドであるＡＤＡＭ阻害剤を開示する。
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Masuda, S., Hayashi, H., Araki, S., 1998. Two vascularapoptosis-inducing proteins from snake venom are members of the metalloprotease/disintegrin family. Eur. J. Biochem. 253, 36-41.
【非特許文献２】Masuda, S., Ohta, T., Kaji,K., Fox, J.W., Hayashi, H., Araki, S., 2000. cDNAcloning and characterization of vascular apoptosis-inducing protein 1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 278, 197-204.
【非特許文献３】Maruyama, J., Hayashi, H., Miao, J., Sawada, H., Araki, S., 2005.Severe cell fragmentation in the endothelial cell apoptosis induced by snakeapoptosis toxin VAP1 is an apoptotic characteristic controlled by caspases. Toxicon 46, 1-6.
【非特許文献４】Kikushima, Y.,Nakamura, S., Ohshima, Y., Shibuya, T., Miao, J.Y., Hayashi, H., Nikai, T., Araki, S., 2008. Hemorrhagic activity of thevascular apoptosis-inducing proteins VAP1 and VAP2 from Crotalus atrox.Toxicon 52, 589-593.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＡＤＡＭは種々の疾患に関与していることが明らかになっておりＡＤＡＭ阻害剤による当該疾患の治療が行われているが、従来のＡＤＡＭ阻害剤では以下のような問題があった。
【０００８】
なお、本願において、ＡＤＡＭのメタロプロテアーゼ部位によるプロテアーゼ反応をシグナル伝達の過程に含むシグナル伝達系をＡＤＡＭシグナル伝達系と称する。当該ＡＤＡＭシグナル伝達系は、ＡＤＡＭを投与・導入等することで引き起こされるシグナルの伝達系も含む。ＡＤＡＭの上流とは、ＡＤＡＭシグナル伝達系において、ＡＤＡＭによるプロテアーゼ反応より前の段階を指す。同様にＡＤＡＭの下流とは、ＡＤＡＭによるプロテアーゼ反応より後の段階を指す。
【０００９】
まず、標的となるＡＤＡＭのメタロプロテアーゼ部位は、ＭＭＰ等の他の蛋白質のメタロプロテアーゼ部位と非常に相同性が高く、ＡＤＡＭのメタロプロテアーゼ特異的阻害剤の創製は困難であった。その一方で、各メタロプロテアーゼ部位を有する蛋白質は生体内における発現部位、量、時期等が厳密に調節され、恒常性が維持されている。
【００１０】
ＡＤＡＭのメタロプロテアーゼ部位の直接的な阻害剤としては、例えば上記特許文献１に開示されているヒドロキサム酸のような金属イオンキレート部を含むペプチド様構造を持つ化合物がある。当該直接的な阻害剤は、ＡＤＡＭのメタロプロテアーゼ部位のみでなくＭＭＰ等の他の蛋白質のメタロプロテアーゼ部位にも直接的に作用するため当該他の蛋白質の働きが阻害されてしまい、副作用が大きいという問題があった。
【００１１】
ＡＤＡＭの間接的な阻害剤としては、例えば上記特許文献２及び特許文献３に記載のＡＤＡＭ阻害剤がある。これらはＴＮＦ−αの遊離阻害効果を評価したものであり、ＡＤＡＭの上流のシグナル伝達を阻害するものである。このようなＡＤＡＭの上流のシグナル伝達を阻害する場合、ＡＤＡＭの直接作用の一つである細胞増殖因子の遊離が抑制され、正常の細胞増殖を抑制するなどの副作用が起こるという問題があった。
【００１２】
以上のように、従来、ＡＤＡＭの下流に働きかけてＡＤＡＭ作用を阻害するという阻害剤の開示はなかった。また、ヘビ毒が引き起こす出血に関しては、メタロプロテアーゼが血管蛋白質を分解することが原因と考えられてきた。
【００１３】
上述の問題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、本願発明者は、ガラガラヘビ毒が引き起こす出血は単に血管を構成する蛋白質の分解によって引き起こされるのではなく、ＡＤＡＭのホモログであるＶＡＰの関与するシグナル伝達の結果であることを突き止めた。このことから、例えば、ＡＤＡＭシグナル伝達系によるシグナル伝達の結果である複数の作用は、ＡＤＡＭの下流のシグナル伝達系の制御によりそれぞれ別個に阻害することができると推測された。そして、本願発明者はＡＤＡＭの下流のシグナル伝達を阻害する物質を見出し、更には、ＡＤＡＭ作用を特異的に阻害する物質を見出した。即ち、ＡＤＡＭ上流のシグナル伝達を阻害せず、また、ＭＭＰ等の他の蛋白質のメタロプロテアーゼ部位の活性を残存させたままＡＤＡＭの作用を阻害できることを見出した。
【００１４】
また、本願発明者はＶＡＰ１、ＶＡＰ２の引き起こすアポトーシスについての研究を重ねていく上で、ＶＡＰの引き起こすアポトーシスにおいては仮足が保持されるという興味深い知見を得た。ゆえに、ＡＤＡＭは、仮足についての研究、特に仮足の制御物質のスクリーニングにも有用であることを見出した。
【００１５】
本願発明者はこれらの研究に基づき、本発明を完成させた。そこで、ＡＤＡＭ作用阻害物質のスクリーニング方法、仮足の保持方法、仮足保持剤、仮足の制御物質のスクリーニング方法、及びＡＤＡＭ作用阻害剤を提供することを本発明が解決すべき課題とする。
【００１６】
なお、本願においてＡＤＡＭの作用（以下、ＡＤＡＭ作用とも称する）とは、第１に、ＡＤＡＭシグナル伝達系によるシグナル伝達の結果である作用を指す。例えば、上述のＡＤＡＭのホモログであるＶＡＰ１及びＶＡＰ２においては、「激しいアポトーシス小胞の生成」や「仮足の保持」はＡＤＡＭの作用に該当する。後述の通り、ＶＡＰ１及びＶＡＰ２をマウス皮内に投与すると投与部位において出血が引き起こされるが、「出血」もＡＤＡＭの作用に該当する。第２に、ＡＤＡＭの量や活性の変化に起因する場合は、シグナル伝達系におけるシグナルの増幅や減少により引き起こされる作用も含む。また、ＶＡＰ１及びＶＡＰ２はヘビ毒に由来する物質であるので、「激しいアポトーシス小胞の生成」や「仮足の保持」はヘビ毒の作用でもある。
【００１７】
本願発明においてＡＤＡＭの作用の阻害（以下、ＡＤＡＭ作用阻害とも称する）とは、１以上のＡＤＡＭ作用を阻害することに加え、ＡＤＡＭ作用を軽減・抑制することを含む概念である。同様にヘビ毒の作用の阻害とは、１以上のヘビ毒の作用を阻害することに加え、ヘビ毒の作用を軽減・抑制することを含む概念である。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
（第１発明）
上記課題を解決するための本願第１発明の構成は、
以下のａ）工程とｂ）工程からＡＤＡＭのプロテアーゼの反応進行が確認され、かつ、以下のａ）工程とｃ）工程からＡＤＡＭ作用の阻害が確認された物質をＡＤＡＭ作用阻害物質と判定する、ＡＤＡＭ作用阻害物質のスクリーニング方法である。
ａ）ＡＤＡＭのプロテアーゼ活性を備え又はＡＤＡＭのプロテアーゼ活性を備えさせる検体にスクリーニング対象物質を投与又は導入する工程。
ｂ）上記ａ）工程によってＡＤＡＭのプロテアーゼ活性及びスクリーニング対象物質を備えた検体において、ＡＤＡＭのプロテアーゼの反応進行を確認する工程。
ｃ）上記ａ）工程によってＡＤＡＭのプロテアーゼ活性及びスクリーニング対象物質を備えた検体において、ＡＤＡＭ作用の阻害を確認する工程。
【００１９】
第１発明はａ）〜ｃ）の各工程を少なくとも１回ずつ含むものであればよい。例えば、ａ）、ｂ）、ｃ）又はａ）、ｃ）、ｂ）の順序で各工程を行い、そのａ）及びｂ）工程からＡＤＡＭのプロテアーゼの反応進行を確認し、ａ）及びｃ）工程からＡＤＡＭ作用の阻害を確認しても良い。また、実験系を２つに別け、ａ）とｂ）工程からＡＤＡＭのプロテアーゼの反応進行を確認し、ａ）とｃ）工程からＡＤＡＭ作用の阻害を確認し、これらの結果を総合してＡＤＡＭ作用阻害物質を判定しても良い。
【００２０】
（第２発明）
上記課題を解決するための本願第２発明の構成は、
前記ａ）工程における検体が、細胞、器官、組織、又は個体であって、ｃ）工程におけるＡＤＡＭ作用の阻害が、仮足の保持阻害又は仮足の形成阻害である、第１発明に記載のＡＤＡＭ作用阻害物質のスクリーニング方法である。
【００２１】
（第３発明）
上記課題を解決するための本願第３発明の構成は、
前記ａ）工程における検体が、器官、組織、又は個体であって、ｃ）工程におけるＡＤＡＭ作用の阻害が、出血の阻害である、第１発明に記載のＡＤＡＭ作用阻害物質のスクリーニング方法である。
【００２２】
（第４発明）
上記課題を解決するための本願第４発明の構成は、
前記ＡＤＡＭ作用阻害物質のスクリーニング方法が、前記ａ）工程と以下のｄ）工程からＡＤＡＭ特異性を確認することを含む、第１発明〜第３発明のいずれかに記載のＡＤＡＭ作用阻害物質のスクリーニング方法である。
ｄ）スクリーニング対象物質が投与又は導入された検体におけるＡＤＡＭではないプロテアーゼのプロテアーゼ活性の残存を確認する工程。
【００２３】
第４発明は、ａ）〜ｄ）の各工程を少なくとも１回ずつ含むものであればよい。例えば、ａ）工程の後、ｂ）〜ｄ）の各工程を順序不同で行い、そのａ）及びｂ）工程からＡＤＡＭのプロテアーゼの反応進行を確認し、ａ）及びｃ）工程からＡＤＡＭ作用の阻害を確認し、ａ）及びｄ）工程からＡＤＡＭ特異性を確認しても良い。また、実験系を複数に別けてもよいことは、上述の第１発明と同様である。
【００２４】
（第５発明）
上記課題を解決するための本願第５発明の構成は、仮足を形成可能である検体に対して、ヘビ毒を用いる仮足の保持方法である。
【００２５】
（第６発明）
上記課題を解決するための本願第６発明の構成は、ヘビ毒を有効成分とする仮足保持剤である。
【００２６】
（第７発明）
上記課題を解決するための本願第７発明の構成は、
以下のｅ）及びｆ）の各工程を順序不同で含む処理工程を行い、その後以下のｇ）工程を含む確認工程により仮足の制御が確認された物質を仮足の制御物質と判定する、仮足の制御物質のスクリーニング方法である。
ｅ）検体である細胞、器官、組織、又は個体にヘビ毒を投与又は導入する工程。
ｆ）検体である細胞、器官、組織、又は個体にスクリーニング対象物質を投与又は導入する工程。
ｇ）仮足の制御を確認する工程。
【００２７】
第７発明はｅ）〜ｇ）の各工程を少なくとも１回ずつ含むものであればよい。処理工程は、ｅ）及びｆ）工程を同時に行っても良いし、いずれか一方を先に行い、他の一方を後に行ってもよい。検体にはヘビ毒及びスクリーニング対象物質が投与又は導入される。
【００２８】
（第８発明）
上記課題を解決するための本願第８発明の構成は、
イソキノリン骨格に対して、リンカーを介在させて又は介在させずに、アルキルポリアミン又はその誘導体における一個のアミノ基を構成する窒素原子が結合した構造を有する化合物及びその塩から選ばれる１種以上を有効成分として含有する、ＡＤＡＭ作用阻害剤である。
【００２９】
（第９発明）
上記課題を解決するための本願第９発明の構成は、
前記リンカーが、硫黄又はりんのオキソ酸から選ばれるものである、第８発明に記載のＡＤＡＭ作用阻害剤である。
【００３０】
（第１０発明）
上記課題を解決するための本願第１０発明の構成は、
前記リンカーが、あるいはリンカーが介在しない場合にはアルキルポリアミン又はその誘導体が、イソキノリン骨格の５位の炭素原子に結合している、第８発明又は第９発明に記載のＡＤＡＭ作用阻害剤である。
【００３１】
（第１１発明）
上記課題を解決するための本願第１１発明の構成は、
前記ＡＤＡＭ作用阻害剤の有効成分である化合物が、下記一般式（Ｉ）で示される構造を有する化合物である、第８発明〜第１０発明のいずれかに記載のＡＤＡＭ作用阻害剤である。
〔一般式（Ｉ）〕
0005888667.tif 000002
[一般式（Ｉ）中、ＸはＳＯ２又はＰＯ２Ｈを示し、当該硫黄原子またはりん原子にイソキノリン及び窒素原子が結合しており；
Ｒ１は以下の（イ）又は（ロ）を示し；
（イ）水素、ハロゲン、水酸基、チオール基、アルデヒド基、カルボキシル基、シアノ基又はニトロ基。
（ロ）炭化水素基、アルコキシ基、チオアルコキシ基、アリルオキシ基、アリルチオ基、エーテル基、チオエーテル基、エステル基もしくはチオエステル基であって、これらの基は炭素数１〜５の直鎖の又は分岐を有する飽和又は不飽和のものであり、かつハロゲン化、水酸化、チオール化、アルデヒド化、オキソ化、カルボキシル化、シアノ化又はニトロ化されていてもよい。
Ｒ２は炭素数１〜５の直鎖の又は分岐を有する飽和又は不飽和炭化水素基を示し；
Ｒ３は下記一般式（ＩＩ）、一般式（ＩＩＩ）又は一般式（ＩＶ）で示される置換基を示す。
〔一般式（ＩＩ）〕
0005888667.tif 000003
（一般式（ＩＩ）中、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ以下の（ハ）〜（ヘ）のいずれかを示し、Ｒ４とＲ５は同一であってもよく、相違していてもよい。
（ハ）水素、ハロゲン、水酸基、チオール基、アルデヒド基、チオアルデヒド基、カルボキシル基、シアノ基、アジド基、ニトロ基、ピリジル基、ピロリジニル基、チエニル基もしくはフラニル基。
（ニ）アミノ基、アミジノ基、グアニジノ基、ウレイド基、ヒドラジノ基、ジアゼニル基もしくはヒドロキシアミノ基であって、これらの基は、第１に炭素数１〜５の直鎖の又は分岐の飽和又は不飽和の炭化水素基を有してもよく、第２に、第１に記載した炭化水素基も含めて、ハロゲン化、水酸化、チオール化、アルデヒド化、オキソ化、カルボキシル化、シアノ化又はニトロ化されていてもよい。
（ホ）置換基を有し又は有さないアリール基、ナフチル基もしくはアントラセニル基。
（ヘ）置換基を有し又は有しない直鎖、分岐又は環状の炭素数１〜２０の飽和又は不飽和の炭化水素基、アルコキシ基、チオアルコキシ基、アリルオキシ基、アリルチオ基、エーテル基、チオエーテル基、エステル基もしくはチオエステル基。
なお、（ホ）及び（ヘ）にいう「置換基」はハロゲン、水酸基、チオール基、アルデヒド基、チオアルデヒド基、カルボキシル基、シアノ基、アジド基、ニトロ基、ピリジル基、ピロリジニル基、チエニル基、フラニル基、フェニル基、ハロゲン化フェニル基、ベンジル基、ハロゲン化ベンジル基、ベンゾイル基又はハロゲン化ベンゾイル基であり、
その中でも、（ホ）にいう「置換基」では、上記の選択肢に加え、更に、炭化水素基、アルコキシ基、チオアルコキシ基、アリルオキシ基、アリルチオ基、エーテル基、チオエーテル基、エステル基、チオエステル基が含まれ、これらの基は、炭素数１〜５であり、飽和又は不飽和の直鎖状又は分岐状であり、かつ、ハロゲン化、水酸化、チオール化、アルデヒド化、オキソ化、カルボキシル化、シアノ化、又はニトロ化されていてもよい。）
〔一般式（ＩＩＩ）〕
0005888667.tif 000004
（一般式（ＩＩＩ）中、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ、Ｒ６とＲ７が１以上の箇所で互いに結合を形成できる、一般式（ＩＩ）におけるＲ４、Ｒ５が選択しうる基を示す）。
〔一般式（ＩＶ）〕
0005888667.tif 000005
（一般式（ＩＶ）中、Ｒ８は以下の（ト）〜（リ）のいずれかを示す。
（ト）水素、ハロゲン、水酸基、チオール基、ピリジル基、ピロリジニル基、チエニル基、もしくはフラニル基。
（チ）置換基を有し又は有さないアリール基、ナフチル基、もしくはアントラセニル基。
（リ）置換基を有し又は有しない直鎖、分岐又は環状の炭素数１〜２０の飽和又は不飽和の炭化水素基、アルコキシ基、チオアルコキシ基、アリルオキシ基、アリルチオ基、エーテル基、チオエーテル基、エステル基もしくはチオエステル基。
なお、（チ）及び（リ）にいう「置換基」はハロゲン、水酸基、チオール基、アルデヒド基、チオアルデヒド基、カルボキシル基、シアノ基、アジド基、ニトロ基、ピリジル基、ピロリジニル基、チエニル基、フラニル基、フェニル基、ハロゲン化フェニル基、ベンジル基、ハロゲン化ベンジル基、ベンゾイル基又はハロゲン化ベンゾイル基であり、
その中でも、（チ）にいう「置換基」では、上記の選択肢に加え、更に、炭化水素基、アルコキシ基、チオアルコキシ基、アリルオキシ基、アリルチオ基、エーテル基、チオエーテル基、エステル基及びチオエステル基が含まれ、これらの基は、炭素数１〜５であり、飽和又は不飽和の直鎖状又は分岐状であり、かつ、ハロゲン化、水酸化、チオール化、アルデヒド化、オキソ化、カルボキシル化、シアノ化、又はニトロ化されていてもよい。）]
【００３２】
（第１２発明）
上記課題を解決するための本願第１２発明の構成は、
イソキノリン骨格に対して、リンカーを介在させて又は介在させずに、互いに１位と４位の関係にある２個の窒素原子を含む含窒素６員環構造体又はその誘導体の一方の前記窒素原子が結合した構造を有する化合物及びその塩から選ばれる１種以上を有効成分として含有する、ＡＤＡＭ作用阻害剤である。
【００３３】
（第１３発明）
上記課題を解決するための本願第１３発明の構成は、
前記リンカーが、硫黄又はりんのオキソ酸から選ばれるものである、第１２発明に記載のＡＤＡＭ作用阻害剤である。
【００３４】
（第１４発明）
上記課題を解決するための本願第１４発明の構成は、
前記リンカーが、あるいはリンカーが介在しない場合には前記含窒素６員環構造体又はその誘導体が、イソキノリン骨格の５位の炭素原子に結合している、第１２発明又は第１３発明に記載のＡＤＡＭ作用阻害剤である。
【００３５】
（第１５発明）
上記課題を解決するための本願第１５発明の構成は、
前記ＡＤＡＭ作用阻害剤の有効成分である化合物が、下記一般式（Ｖ）で示される構造を有する化合物である、第１２発明〜第１４発明のいずれかに記載のＡＤＡＭ作用阻害剤である。
〔一般式（Ｖ）〕
0005888667.tif 000006
[一般式（Ｖ）中、ＸはＳＯ２又はＰＯ２Ｈを示し、当該硫黄原子またはりん原子にイソキノリン及び窒素原子が結合しており；
Ｒ１１は下記一般式（ＶＩ）、一般式（ＶＩＩ）又は一般式（ＶＩＩＩ）で示される置換基を示す。
〔一般式（ＶＩ）〕
0005888667.tif 000007
（一般式（ＶＩ）中、Ｒ２１〜Ｒ２９は単結合でも、以下に挙げる二重結合であってもよく、Ｒ２１〜Ｒ２９が単結合で結合している場合は、Ｒ２１〜Ｒ２９はそれぞれ以下の（い）〜（は）のいずれかを示し、Ｒ２１〜Ｒ２９はそれぞれ互いに同一であってもよく、相違していてもよい。
（い）水素、ハロゲン、水酸基、チオール基、アルデヒド基、チオアルデヒド基、カルボキシル基、シアノ基、アジド基、もしくはニトロ基。
（ろ）アミノ基、アミジノ基、グアニジノ基、ウレイド基、ヒドラジノ基、ジアゼニル基もしくはヒドロキシアミノ基であって、これらの基は、第１に炭素数１〜５の直鎖の又は分岐の飽和又は不飽和の炭化水素基を有してもよく、第２に、第１に記載した炭化水素基も含めて、ハロゲン化、水酸化、チオール化、アルデヒド化、オキソ化、カルボキシル化、シアノ化又はニトロ化されていてもよい。
（は）置換基を有し又は有しない直鎖、分岐又は環状の炭素数１〜１０の飽和又は不飽和の炭化水素基、アルコキシ基、チオアルコキシ基、アリルオキシ基、アリルチオ基、エーテル基、チオエーテル基、エステル基もしくはチオエステル基。
Ｒ２１とＲ２２、Ｒ２３とＲ２４、Ｒ２６とＲ２７、Ｒ２８とＲ２９が二重結合で結合している場合は、Ｒ２１とＲ２２、Ｒ２３とＲ２４、Ｒ２６とＲ２７、Ｒ２８とＲ２９はそれぞれ以下の（に）〜（ほ）のいずれかを示し、Ｒ２１とＲ２２、Ｒ２３とＲ２４、Ｒ２６とＲ２７、Ｒ２８とＲ２９はそれぞれ互いに同一であってもよく、相違していてもよい。
（に）オキソ基もしくはチオキシ基。
（ほ）置換基を有し又は有さないヒドロキシイミノ基もしくはヒドラゾノ基。
なお、（は）及び（ほ）にいう「置換基」はハロゲン、水酸基、チオール基、アルデヒド基、チオアルデヒド基、又はカルボキシル基である。）
〔一般式（ＶＩＩ）〕
0005888667.tif 000008
（一般式（ＶＩＩ）中、Ｒ３１〜Ｒ３７は単結合でも、以下に挙げる二重結合であってもよく、Ｒ３１〜Ｒ３７が単結合で結合している場合は、Ｒ３１〜Ｒ３７はそれぞれ上記一般式（ＶＩ）における（い）〜（は）のいずれかを示し、Ｒ３１〜Ｒ３７はそれぞれ互いに同一であってもよく、相違していてもよい。
Ｒ３４とＲ３５、Ｒ３６とＲ３７が二重結合で結合している場合は、Ｒ３４とＲ３５、Ｒ３６とＲ３７はそれぞれ上記一般式（ＶＩ）における（に）〜（ほ）のいずれかを示し、Ｒ３４とＲ３５、Ｒ３６とＲ３７は同一であってもよく、相違していてもよい。
なお、「置換基」に関しても上記一般式（ＶＩ）と同様である。）
〔一般式（ＶＩＩＩ）〕
0005888667.tif 000009
（一般式（ＶＩＩＩ）中、Ｒ４１〜Ｒ４５はそれぞれ、上記一般式（ＶＩ）における（い）〜（は）のいずれかを示し、Ｒ４１〜Ｒ４５はそれぞれ互いに同一であってもよく、相違していてもよい。
なお、「置換基」に関しても上記一般式（ＶＩ）と同様である。）]
【００３６】
（第１６発明）
上記課題を解決するための本願第１６発明の構成は、
第１発明〜第４発明のいずれかに記載のＡＤＡＭ作用阻害物質のスクリーニング方法を用いて選抜される物質が、下記一般式（ＩＸ）又は一般式（Ｘ）に該当する化合物であり、これらの化合物及びその塩から選ばれる１種以上を有効成分として含有する、ＡＤＡＭ作用阻害剤である。
〔一般式（ＩＸ）〕
0005888667.tif 000010
（一般式（ＩＸ）中、ＸはＳＯ２又はＰＯ２Ｈを示し、当該硫黄原子またはりん原子にイソキノリン及び窒素原子が結合しており；Ｒ５１及びＲ５２はそれぞれ水素又は任意の置換基である。）
〔一般式（Ｘ）〕
0005888667.tif 000011
（一般式（Ｘ）中、ＸはＳＯ２又はＰＯ２Ｈを示し、当該硫黄原子またはりん原子にイソキノリン及び窒素原子が結合しており；Ｒ６１〜Ｒ６９はそれぞれ水素又は任意の置換基である。）
【発明の効果】
【００３７】
（第１発明）
第１発明によって、ＡＤＡＭの下流に働きかけてＡＤＡＭ作用を阻害する物質のスクリーニング方法が提供される。
【００３８】
（第２発明）
第２発明によって、仮足の保持阻害又は仮足の形成阻害活性を指標としたＡＤＡＭ作用阻害物質のスクリーニング方法が提供される。ＡＤＡＭのホモログであるＶＡＰは血管内皮細胞に対してアポトーシスを引き起こし、当該アポトーシスにおいては仮足が形成・保持される。よって、仮足の形成、仮足の保持はＡＤＡＭ作用であるので、仮足の保持阻害、仮足の形成阻害をする物質は、ＡＤＡＭ作用を阻害する物質である。
【００３９】
（第３発明）
第３発明によって、出血の阻害、特に血液凝固系ではなく血管に働きかけることによる出血の阻害活性を指標としたＡＤＡＭ作用阻害物質のスクリーニング方法が提供される。ＡＤＡＭのホモログであるＶＡＰは細胞間マトリックスであるコラーゲンは分解しないが、血管内皮細胞のアポトーシスを誘導する。更に、従来はプロテアーゼが血管蛋白質を分解することにより出血すると考えられてきたのであるが、ＶＡＰのプロテアーゼ反応は進行しても出血は抑止されるという本願発明者による新たな知見により、ＡＤＡＭ下流の信号伝達系が出血、特に血管に原因を有する出血に関与することが明らかとなった。よって、血管に原因を有する出血はＡＤＡＭ作用であるので、ＡＤＡＭ下流に働きかけ、かつ、出血を阻害する物質は、ＡＤＡＭ作用を阻害する。
【００４０】
（第４発明）
第４発明によって、ＡＤＡＭ特異性のあるＡＤＡＭ作用阻害物質のスクリーニング方法が提供される。従来から、ＡＤＡＭのメタロプロテアーゼ特異的阻害剤の創製は困難であったが、ＡＤＡＭ下流に働きかけてＡＤＡＭ作用を阻害し、かつ、ＡＤＡＭ特異性を有する物質は、ＡＤＡＭのメタロプロテアーゼ特異的阻害剤に近似した効果を有することが期待できる。言い換えれば、ＡＤＡＭではないプロテアーゼのプロテアーゼ活性が残存することは副作用が少ないことを意味する。
【００４１】
（第５発明、第６発明）
第５発明によって、有用な仮足の保持方法が提供される。また、第６発明によって、有用な仮足保持剤が提供される。
本願発明者はヘビ毒の引き起こすアポトーシスにおいては、仮足の形成の他、仮足が保持されることを見出し、この点に特に着目した。通常、仮足は動的に形成・消失等の変化をする。仮足の静的な状態を作り出すことにより、仮足の構造の研究や、仮足を維持することの効果の研究、仮足の制御剤の開発等の途が提供される。
ヘビ毒の他、ＡＤＡＭを用いても仮足の形成、仮足の保持がされる。よって、ＡＤＡＭを用いた場合でも、ヘビ毒を用いた場合と同様の効果が得られる。
【００４２】
（第７発明）
第７発明によって、有用な仮足の制御物質のスクリーニング方法が提供される。仮足は動的に形成・消失等の変化をするが、ヘビ毒は仮足を保持する、即ち、仮足の静的な状態を作り出すことができる。これにより、まず、制御物質のスクリーニング系を長時間安定して保つことが可能となる。更に、当該静的な状態からの変化は、スクリーニング対象物質が有する仮足の制御効果として認識することができる。
ヘビ毒の他、ＡＤＡＭを用いても仮足の形成、仮足の保持がされる。よって、ＡＤＡＭを用いた場合でも、ヘビ毒を用いた場合と同様の効果が得られる。
【００４３】
（第８発明〜第１１発明、第１２発明〜第１５発明及び第１６発明）
本願第８発明〜第１１発明、第１２発明〜第１５発明及び第１６発明によって、有用なＡＤＡＭ作用阻害剤が提供される。これらのＡＤＡＭ作用阻害剤は、ＡＤＡＭのプロテアーゼ反応を阻害せずにＡＤＡＭの作用を阻害する。即ち、ＡＤＡＭの下流のシグナル伝達に働きかけると考えられえる。これによって従来のＡＤＡＭ阻害剤における副作用の問題が解消される。
更には、ＭＭＰ等の他の蛋白質のプロテアーゼ活性が残存する場合は、特異性の高いＡＤＡＭ阻害剤が提供される。
その他、従来有効なＡＤＡＭ阻害剤が殆ど提供されていなかったため、ＡＤＡＭの関与が示唆されながらも見出されていなかったヘビ咬症出血阻害剤などのように、ＡＤＡＭ作用が関与する疾患において従来に治療薬が存在しなかった疾患に対する治療薬が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】化１〜５及び化１１〜１３についての出血量を、コントロールに対する相対比で示す棒グラフである（コントロールの表示は省略）。
【図２】化１４及び化１５についての出血量を、コントロールに対する相対比で示す棒グラフである。
【図３】化１１及び化１６〜化１９についての出血量を、コントロールに対する相対比で示す棒グラフである。
【図４】化４及び化３の投与結果を示す写真である。
【図５】化１１及び化１６〜化１９の投与結果を示す写真である。
【図６】ＶＡＰの反応進行に対して、化４が与える影響を調べた結果を示す。
【図７】生存因子除去によるアポトーシス及びヘビ毒ＡＤＡＭによる仮足の保持の過程を経時的に示す。
【図８】化６の影響を示す写真である。
【図９】ＶＡＰ１はコラーゲンを分解しないことを示す。
【図１０】ヘビ毒ＡＤＡＭが引き起こす出血についての、推測モデルを示す。
【図１１】コラゲナーゼの作用に対する、ＡＤＡＭ作用阻害物質の影響を示す。
【図１２】ヘビ毒による突起状の仮足の形成・保持と、化２による仮足の形成抑制を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
次に、本発明を実施するための形態を、その最良の形態を含めて説明する。
【００４６】
〔ＡＤＡＭ作用阻害物質のスクリーニング方法〕
本発明のＡＤＡＭ作用阻害物質のスクリーニング方法は、以下のａ）工程とｂ）工程からＡＤＡＭのプロテアーゼの反応進行が確認され、かつ、以下のａ）工程とｃ）工程からＡＤＡＭ作用の阻害が確認された物質をＡＤＡＭ作用阻害物質と判定するものである。
ａ）ＡＤＡＭのプロテアーゼ活性を備え又はＡＤＡＭのプロテアーゼ活性を備えさせる検体にスクリーニング対象物質を投与又は導入する工程。
ｂ）上記ａ）工程によってＡＤＡＭのプロテアーゼ活性及びスクリーニング対象物質を備えた検体において、ＡＤＡＭのプロテアーゼの反応進行を確認する工程。
ｃ）上記ａ）工程によってＡＤＡＭのプロテアーゼ活性及びスクリーニング対象物質を備えた検体において、ＡＤＡＭ作用の阻害を確認する工程。
【００４７】
本発明のＡＤＡＭ作用阻害物質のスクリーニング方法において、検体は特に限定されない。細胞、器官、組織、又は個体を含む他、ＡＤＡＭシグナル伝達系を構築又は再現したin vitro の系も検体とすることができる。これらのうち、細胞、器官、組織、個体を好ましい検体として例示でき、細胞、個体を更に好ましい検体として例示できる。
【００４８】
細胞は特に限定されないが、血管内皮細胞、白血球細胞等を例示することができる。
【００４９】
器官は特に限定されないが、血管、脳、肝臓、肺等を例示することができる。
【００５０】
組織は特に限定されないが、上皮組織、結合組織、筋組織等を例示することができる。
【００５１】
個体は特に限定されないが、マウス、ラット、ヒト等を例示することができる。
後述のように仮足がポドソームを伴う仮足である場合、検体としては、白血球、マクロファージ、血管内皮細胞、破骨細胞、であることが好ましく、血管内皮細胞、マクロファージ、であることがより好ましい。
【００５２】
上記した検体は、ＡＤＡＭのプロテアーゼ活性を備え又はＡＤＡＭのプロテアーゼ活性を備えさせることが必要となる。言い換えれば、検体はＡＤＡＭのプロテアーゼ活性を有することが必要であるが、検体へのスクリーニング対象物質の投与や導入と、検体がＡＤＡＭのプロテアーゼ活性を備えることの順序は特に限定されない。
【００５３】
検体がＡＤＡＭのプロテアーゼ活性を備える方法は特に限定されない。検体にＡＤＡＭそのものを添加、混合しても良いし、投与しても良いし、遺伝子発現を利用して検体にＡＤＡＭを導入しても良い。検体そのものがＡＤＡＭのプロテアーゼ活性を有し、ＡＤＡＭ作用が備わっている場合は特に検体を操作する必要はない。
【００５４】
ＡＤＡＭは特に限定されないが、ヘビ毒ＡＤＡＭ、ヒトＡＤＡＭ、マウスＡＤＡＭを例示することができ、ヘビ毒ＡＤＡＭ、ヒトＡＤＡＭを好ましく例示することができ、ヘビ毒ＡＤＡＭにおいても出血性ヘビ毒ＡＤＡＭを特に好ましく例示することができる。ヘビ毒ＡＤＡＭは、ＶＡＰ１及びＶＡＰ２等の出血性ヘビ毒素を含む概念である。
【００５５】
ＡＤＡＭ作用は特に限定されないが、出血、血管退縮、仮足の形成、仮足の保持、激しいアポトーシス小胞の生成などを例示することができる。
【００５６】
ＡＤＡＭ作用の阻害は特に限定されないが、出血阻害、血管強化、仮足の形成阻害、仮足の保持阻害、アポトーシス抑制などを例示することができる。出血阻害、仮足の保持阻害、仮足の形成阻害を好ましく例示することができ、出血阻害、仮足の保持阻害を特に好ましく例示することができる。
【００５７】
仮足とは、細胞質の突出によって形成される部位をいう。通常、仮足は動的に形成・消失等の変化をする。仮足は、ポドソームを伴う仮足となる場合がある。ポドソームは浸潤のためにプロテアーゼの放出を行うことが知られている。
【００５８】
仮足の形成阻害とは、仮足を形成しないということの他、形成される仮足の数、仮足の伸張・拡大の抑制を含む概念である。
【００５９】
仮足の保持とは、形成された仮足が突出を維持すること、及び仮足の形成されている時間が長期化することを含む概念である。生存因子の除去により引き起こされるアポトーシスにおいては、アポトーシスが始まると仮足が形成される一方で、仮足は形成後１時間で消失してしまう。一方、ヘビ毒においては、一度形成された仮足が１時間のみならず６時間を越えても保持される。即ち、仮足の保持は、仮足の形成されている時間が長期化することを含む。
【００６０】
仮足の保持阻害とは、形成された仮足が突出を維持すること、及び仮足の形成されている時間が長期化することの阻害を指す。即ち、保持阻害の結果、仮足は再び動的な変化を見せることとなる。ＡＤＡＭ作用阻害物質をスクリーニングする観点からは、仮足の保持が阻害された結果、仮足が結果的に消失していくことが好ましい。
【００６１】
ＡＤＡＭ作用阻害物質のスクリーニング方法においては、スクリーニング系のコントロールの仮足の保持は、少なくとも１時間あれば良い。例えば、ヘビ毒ＡＤＡＭ、ＶＡＰ１又はＶＡＰ２を用いることによって実現できる。仮に、スクリーニング対象物質の影響で仮足が保持時間の経過前、上記の例であれば１時間以内に消失すれば、仮足の保持阻害であるとすることができる。一方、後述の仮足保持方法、仮足保持剤に関しては、保持時間が１時間以上であることが好ましく、更に、３時間以上、６時間以上、２４時間以上など、保持時間が長いことがより好ましい。仮足の保持時間は、実質的なＡＤＡＭの投与量により調節可能である。
【００６２】
当該仮足の形成や保持の阻害を確認する方法としては、顕微鏡を用いた経時観察が例示できる。例えば、培養細胞にＶＡＰを投与した場合は当該細胞の挙動を観察すればよいし、個体であるマウスにＶＡＰを投与してＡＤＡＭのプロテアーゼ活性を備えさせた場合、ＶＡＰの投与部位を切除して、当該切除部位を顕微鏡を用いて観察することにより、仮足の形成阻害又は仮足の保持阻害を確認することができる。
【００６３】
ＡＤＡＭ作用の阻害が、出血の阻害である場合、出血の阻害とは、出血を未然に防ぐ他、出血量を抑制する等、出血を抑える概念を含むものである。この場合、検体をマウスを含む個体とすることが特に好ましい。出血阻害の判定については、例えば後述の実施例に記載の方法が好ましい。出血の阻害活性を指標とする場合、スクリーニング対象物質投与区とコントロール区を分けることが好ましい。また、スクリーニング対象物質とＡＤＡＭのプロテアーゼ活性の具備はほぼ同時であることが好ましい。
【００６４】
即ち、ＡＤＡＭ作用阻害物質は、出血阻害物質、血管強化物質、仮足の形成阻害物質、仮足の保持阻害物質、アポトーシス小胞形成阻害物質などを含む概念である。
【００６５】
スクリーニング対象物質は特に限定されない。好ましくは、化合物、蛋白質、核酸、抗体、抗原、糖質脂質等を例示することができ、更に好ましくは、化合物、蛋白質、核酸、抗体を例示することができ、特に好ましくは化合物、蛋白質を例示することができる。
【００６６】
これらスクリーニング対象物質を投与・導入する方法も特に限定されない。投与においては、添加、混合、経口投与、経皮投与、血管投与、皮下注射、腹腔内投与、皮内注射、筋肉注射を例示することができ、導入においては、検体に遺伝子を備えさせ、又は予め備えている遺伝子を用いて、スクリーニング対象物質を発現させたり、代謝などにより生産させたりすることもできる。
【００６７】
ＡＤＡＭのプロテアーゼの反応進行を確認する方法は特に限定されない。好ましくは、プロテアーゼ反応の結果物を検出する方法、プロテアーゼ反応の基質の減少を確認する方法などを例示することができる。
【００６８】
本発明のＡＤＡＭ作用阻害物質のスクリーニング方法は更に、前記ａ）工程と以下のｄ）工程からＡＤＡＭ特異性を確認することを含むものとしても良い。
ｄ）スクリーニング対象物質が投与又は導入された検体におけるＡＤＡＭではないプロテアーゼのプロテアーゼ活性の残存を確認する工程。
【００６９】
ＡＤＡＭ以外のプロテアーゼのプロテアーゼ活性の残存とは、当該プロテアーゼ活性が弱まることを含む概念であるが、活性が消失することは含まない。
【００７０】
上記ＡＤＡＭ以外のプロテアーゼは特に限定されないが、ＭＭＰ、コラゲナーゼ、アグリカナーゼ、エラスターゼ等を好ましく例示することができる。また、検体はこれらの酵素のいずれか１以上を備えることが好ましい。
【００７１】
〔仮足の保持方法、仮足保持剤〕
本発明の仮足の保持方法、仮足保持剤はＡＤＡＭを用いる。検体にＡＤＡＭそのものを添加、混合しても良いし、投与しても良いし、遺伝子発現を利用して検体にＡＤＡＭを導入しても良い。ＡＤＡＭは特に限定されないが、ヘビ毒ＡＤＡＭ、ヒトＡＤＡＭ、マウスＡＤＡＭを例示することができ、ヘビ毒ＡＤＡＭ、ヒトＡＤＡＭを好ましく例示することができる。ヒトＡＤＡＭとしては、ＡＤＡＭ２８、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ９が好ましく、ＡＤＡＭ２８がより好ましい。
本発明の仮足の保持方法、仮足保持剤はポドソームを伴う仮足を形成・保持する場合がある。ポドソームは浸潤のためにプロテアーゼの放出を行うことが知られている。ポドソームを伴う仮足の構造の研究や、仮足を維持することの効果の研究、仮足の制御剤の開発等の途も提供される。
【００７２】
ヘビ毒は特に限定されないが、出血性ヘビ毒が好ましい。出血性ヘビ毒としては、ガラガラヘビ毒、ハブ毒、マムシ毒等を好ましく例示することができ、ガラガラヘビ毒を特に好ましく例示することができる。更に、当該ヘビ毒は、出血性ヘビ毒素であるＶＡＰ１及びＶＡＰ２を含む概念である。
【００７３】
ヘビ毒は、ガラガラヘビ等の個体であるヘビから取得しても良いし、市販品であるヘビ毒を購入しても良い。また、ＶＡＰ１及びＶＡＰ２は、ガラガラヘビ毒（購入元：Ｓｉｇｍａ、和光純薬など）から上記した非特許文献４に記載の方法により取得することができる。ヒトＡＤＡＭはＥｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓなどから入手可能である。
【００７４】
仮足、仮足の保持については、上記ＡＤＡＭ作用阻害物質のスクリーニング方法に記載の内容と同様である。
【００７５】
仮足を形成可能である検体は特に限定されないが、細胞を有する検体であることが好ましく、細胞、器官、組織、個体を例示することができる。これらについては、上記ＡＤＡＭ作用阻害物質のスクリーニング方法に記載の内容と同様である。ポドソームを伴う仮足の保持方法とする場合、検体としては、白血球、マクロファージ、血管内皮細胞、破骨細胞、であることが好ましく、血管内皮細胞、マクロファージ、であることがより好ましい。
【００７６】
〔仮足の制御物質のスクリーニング方法〕
本発明の仮足の制御物質のスクリーニング方法は、以下のｅ）及びｆ）の各工程を順序不同で含む処理工程を行い、その後以下のｇ）工程を含む確認工程により仮足の制御が確認された物質を仮足の制御物質と判定するものである。
ｅ）検体である細胞、器官、組織、又は個体にＡＤＡＭを投与又は導入する工程。
ｆ）検体である細胞、器官、組織、又は個体にスクリーニング対象物質を投与又は導入する工程。
ｇ）仮足の制御を確認する工程。
【００７７】
仮足、細胞、器官、組織、個体、ＡＤＡＭ、スクリーニング対象物質、投与、導入に関しては、上記ＡＤＡＭ作用阻害物質のスクリーニング方法に記載の内容と同様である。ヘビ毒に関しては、上記仮足の保持方法、仮足保持剤に記載の内容と同様である。なお、検体としては細胞又は個体が好ましく、細胞が特に好ましい。当該細胞は、仮足を形成可能であることが要件であるが、その能力は潜在的に備えていれば足りる。
加えて、仮足は、ポドソームを伴う仮足であることが好ましい。検体は、ポドソームを伴う仮足を形成できることが好ましい。白血球、マクロファージ、血管内皮細胞、破骨細胞、であることが好ましく、血管内皮細胞、マクロファージ、であることがより好ましい。ヒトＡＤＡＭを用いる場合は、ＡＤＡＭ２８、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ９、が好ましく、ＡＤＡＭ２８、ＡＤＡＭ１２がより好ましい。ヒトＡＤＡＭはＥｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓなどから入手可能である。
【００７８】
仮足の制御とは、動的に形成・消失等の変化をする仮足の、当該動的な変化を制御することを指す。好ましくは、仮足の形成阻害、仮足の保持阻害、仮足の伸張・変形や消失、仮足の接着性の変化等を例示することができる。
【００７９】
即ち、仮足の制御物質とは、仮足の動的な変化を制御する物質である。例えば、仮足の形成阻害物質、仮足の保持阻害物質、仮足の伸張物質、仮足の変形物質、仮足を消失させる物質、仮足の接着性を変化させる物質等を例示することができる。
【００８０】
当該仮足の制御を確認する方法としては、上述のような顕微鏡を用いた経時観察が例示できるほか、抗体による仮足保持細胞の検出（染色・フローサイトメトリー含む）、酵素学的検出等によっても確認することができる。アクチン染色、フォスファチジルイノシトール２リン酸（ＰＩＰ２）抗体染色、を例示することができる。
【００８１】
〔ＡＤＡＭ作用阻害剤〕
ＡＤＡＭ作用阻害剤は特に限定されないが、出血阻害剤、血管強化剤、仮足の形成阻害剤、仮足の保持阻害剤を例示することができ、出血阻害剤、仮足の形成阻害剤、仮足の保持阻害剤のいずれかを好ましく例示できる。出血阻害剤としては、抗出血性ヘビ毒咬症剤を好ましく例示できる。
【００８２】
塩は特に限定されないが、薬学的に許容される塩が好ましい。薬学的に許容される塩は、アルカリ金属塩（例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えば、マグネシウム塩、カルシウム塩）、アンモニウム塩、コリン塩、有機アミン塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、マンガン塩、アルミニウム塩等が挙げられる。このうち、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、コリン塩、有機アミン塩が好ましい。さらに、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、コリン塩、有機アミン塩が特に好ましい。
【００８３】
本発明のＡＤＡＭ作用阻害剤は、イソキノリン骨格に対して、リンカーを介在させて又は介在させずに、アルキルポリアミン又はその誘導体における一個のアミノ基を構成する窒素原子が結合した構造を有する化合物及びその塩から選ばれる１種以上を有効成分として含有するものである。
【００８４】
アルキルポリアミン及びその誘導体は、２以上のアミノ基を有している。即ち、ここにいう「ポリ」とは「２以上」の意味である。また、アミノ基は、置換基を有するアミノ基を含む概念である。
【００８５】
イソキノリン骨格は、少なくともイソキノリンを有し、当該骨格におけるイソキノリンに対して、アルキルポリアミン、アルキルポリアミン誘導体、又はそれらのいずれかが結合したリンカー、が結合する。
【００８６】
イソキノリンの５位は、後述する一般式（Ｉ）においてＸが結合している部位である。
【００８７】
リンカーは特に限定されないが、硫黄又はりんのオキソ酸から選ばれるものが好ましい。硫黄（Ｓ）又はりん（Ｐ）のオキソ酸は特に限定されず、硫酸、スルフィン酸、スルフェン酸、りん酸、亜りん酸などを含む。これらがリンカーとなる場合は、硫黄原子（Ｓ）、りん原子（Ｐ）又は酸素原子（Ｏ）がアルキルポリアミン又はその誘導体、及びイソキノリン骨格と結合する。例えば、スルフェン酸がリンカーであれば、−ＳＯ２−となりスルフェン酸の硫黄原子がアルキルポリアミン又はその誘導体とイソキノリン骨格とを結ぶ。
【００８８】
更に、ＡＤＡＭ作用阻害剤の有効成分である化合物が、下記一般式（Ｉ）で示される構造を有する化合物であることが好ましい。
〔一般式（Ｉ）〕
0005888667.tif 000012
[一般式（Ｉ）中、ＸはＳＯ２又はＰＯ２Ｈを示し、当該硫黄原子またはりん原子にイソキノリン及び窒素原子が結合しており；
Ｒ１は以下の（イ）又は（ロ）を示し；
（イ）水素、ハロゲン、水酸基、チオール基、アルデヒド基、カルボキシル基、シアノ基又はニトロ基。
（ロ）炭化水素基、アルコキシ基、チオアルコキシ基、アリルオキシ基、アリルチオ基、エーテル基、チオエーテル基、エステル基もしくはチオエステル基であって、これらの基は炭素数１〜５の直鎖の又は分岐を有する飽和又は不飽和のものであり、かつハロゲン化、水酸化、チオール化、アルデヒド化、オキソ化、カルボキシル化、シアノ化又はニトロ化されていてもよい。
Ｒ２は炭素数１〜５の直鎖の又は分岐を有する飽和又は不飽和炭化水素基を示し；
Ｒ３は下記一般式（ＩＩ）、一般式（ＩＩＩ）又は一般式（ＩＶ）で示される置換基を示す。
〔一般式（ＩＩ）〕
0005888667.tif 000013
（一般式（ＩＩ）中、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ以下の（ハ）〜（ヘ）のいずれかを示し、Ｒ４とＲ５は同一であってもよく、相違していてもよい。
（ハ）水素、ハロゲン、水酸基、チオール基、アルデヒド基、チオアルデヒド基、カルボキシル基、シアノ基、アジド基、ニトロ基、ピリジル基、ピロリジニル基、チエニル基もしくはフラニル基。
（ニ）アミノ基、アミジノ基、グアニジノ基、ウレイド基、ヒドラジノ基、ジアゼニル基もしくはヒドロキシアミノ基であって、これらの基は、第１に炭素数１〜５の直鎖の又は分岐の飽和又は不飽和の炭化水素基を有してもよく、第２に、第１に記載した炭化水素基も含めて、ハロゲン化、水酸化、チオール化、アルデヒド化、オキソ化、カルボキシル化、シアノ化又はニトロ化されていてもよい。
（ホ）置換基を有し又は有さないアリール基、ナフチル基もしくはアントラセニル基。
（ヘ）置換基を有し又は有しない直鎖、分岐又は環状の炭素数１〜２０の飽和又は不飽和の炭化水素基、アルコキシ基、チオアルコキシ基、アリルオキシ基、アリルチオ基、エーテル基、チオエーテル基、エステル基もしくはチオエステル基。
なお、（ホ）及び（ヘ）にいう「置換基」はハロゲン、水酸基、チオール基、アルデヒド基、チオアルデヒド基、カルボキシル基、シアノ基、アジド基、ニトロ基、ピリジル基、ピロリジニル基、チエニル基、フラニル基、フェニル基、ハロゲン化フェニル基、ベンジル基、ハロゲン化ベンジル基、ベンゾイル基又はハロゲン化ベンゾイル基であり、
その中でも、（ホ）にいう「置換基」では、上記の選択肢に加え、更に、炭化水素基、アルコキシ基、チオアルコキシ基、アリルオキシ基、アリルチオ基、エーテル基、チオエーテル基、エステル基、チオエステル基が含まれ、これらの基は、炭素数１〜５であり、飽和又は不飽和の直鎖状又は分岐状であり、かつ、ハロゲン化、水酸化、チオール化、アルデヒド化、オキソ化、カルボキシル化、シアノ化、又はニトロ化されていてもよい。）
【００８９】
上記（ヘ）において、「置換基を有し又は有しない・・・飽和又は不飽和の」は、それに続く「炭化水素基、・・・もしくはチオエステル基」に係る。
【００９０】
〔一般式（ＩＩＩ）〕
0005888667.tif 000014
（一般式（ＩＩＩ）中、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ、Ｒ６とＲ７が１以上の箇所で互いに結合を形成できる、一般式（ＩＩ）におけるＲ４、Ｒ５が選択しうる基を示す）。
〔一般式（ＩＶ）〕
0005888667.tif 000015
（一般式（ＩＶ）中、Ｒ８は以下の（ト）〜（リ）のいずれかを示す。
（ト）水素、ハロゲン、水酸基、チオール基、ピリジル基、ピロリジニル基、チエニル基、もしくはフラニル基。
（チ）置換基を有し又は有さないアリール基、ナフチル基、もしくはアントラセニル基。
（リ）置換基を有し又は有しない直鎖、分岐又は環状の炭素数１〜２０の飽和又は不飽和の炭化水素基、アルコキシ基、チオアルコキシ基、アリルオキシ基、アリルチオ基、エーテル基、チオエーテル基、エステル基もしくはチオエステル基。
なお、（チ）及び（リ）にいう「置換基」はハロゲン、水酸基、チオール基、アルデヒド基、チオアルデヒド基、カルボキシル基、シアノ基、アジド基、ニトロ基、ピリジル基、ピロリジニル基、チエニル基、フラニル基、フェニル基、ハロゲン化フェニル基、ベンジル基、ハロゲン化ベンジル基、ベンゾイル基又はハロゲン化ベンゾイル基であり、
その中でも、（チ）にいう「置換基」では、上記の選択肢に加え、更に、炭化水素基、アルコキシ基、チオアルコキシ基、アリルオキシ基、アリルチオ基、エーテル基、チオエーテル基、エステル基及びチオエステル基が含まれ、これらの基は、炭素数１〜５であり、飽和又は不飽和の直鎖状又は分岐状であり、かつ、ハロゲン化、水酸化、チオール化、アルデヒド化、オキソ化、カルボキシル化、シアノ化、又はニトロ化されていてもよい。）]
【００９１】
上記（リ）において、「置換基を有し又は有しない・・・飽和又は不飽和の」は、それに続く「炭化水素基、・・・もしくはチオエステル基」に係る。
【００９２】
一般式（ＩＩＩ）における「Ｒ６とＲ７が１以上の箇所で互いに結合を形成できる」とは、脱水素、脱水などにより結合を形成できるという意味である。酵素などを利用して結合を形成しても良いし、化学的な反応を経て結合を形成しても良い。
【００９３】
上記の「飽和」「不飽和」は炭化水素部分をあらわすものであり、例えば「不飽和アルコキシ基」とは、アルコキシ基のうち、アルキル部位に不飽和結合を有することを意味する。
【００９４】
上記一般式（Ｉ）において、ＸはＳＯ２が好ましい。
【００９５】
上記一般式（Ｉ）において、Ｒ１は水素、ハロゲン、水酸基、アルデヒド基又はカルボキシル基が好ましく、水素、水酸基又はアルデヒド基が更に好ましく、水素が特に好ましい。
【００９６】
Ｒ２は炭素数１〜３の直鎖の又は分岐を有する飽和又は不飽和炭化水素基が好ましく、炭素数２の飽和炭化水素基（−ＣＨ２ＣＨ２−）が特に好ましい。
【００９７】
Ｒ３は上記した一般式（ＩＩ）又は一般式（ＩＩＩ）で示される置換基が好ましく、一般式（ＩＩ）で示される置換基が特に好ましい。
【００９８】
上記した一般式（ＩＩ）においては、好ましくはＲ４及びＲ５はそれぞれ、以下に示す（ハ）、（ニ）又は（ヘ）の基である。
（ハ）水素、水酸基、アルデヒド基又はカルボキシル基。
（ニ）アミジノ基、グアニジノ基又はウレイド基。
（ヘ）置換基を有し又は有しない直鎖状又は分岐状の炭素数１〜1０の飽和又は不飽和の炭化水素基。
なお、（ヘ）にいう置換基はフェニル基、ハロゲン化フェニル基、ベンジル基、ハロゲン化ベンジル基、ベンゾイル基又はハロゲン化ベンゾイル基である。
【００９９】
上記した一般式（ＩＩ）においては、更に好ましくはＲ４は水素、水酸基、アルデヒド基又はカルボキシル基であり、Ｒ５は以下に示す（ハ）、（ニ）又は（ヘ）の基である。
（ハ）水素。
（ニ）アミジノ基、グアニジノ基又はウレイド基。
（ヘ）置換基を有し又は有しない直鎖状又は分岐状の炭素数１〜５、好ましくは１〜３の飽和又は不飽和の炭化水素基。
なお、（ヘ）にいう置換基はフェニル基、ハロゲン化フェニル基、ベンジル基、ハロゲン化ベンジル基、ベンゾイル基又はハロゲン化ベンゾイル基である。
【０１００】
上記した一般式（ＩＶ）においては、Ｒ８は水素、ハロゲン、水酸基、チオール基、ピリジル基、ピロリジニル基、チエニル基、もしくはフラニル基、置換基を有し又は有さないアリール基、ナフチル基、もしくはアントラセニル基が好ましく、水素、ハロゲン、水酸基、チオール基、ピリジル基、ピロリジニル基、チエニル基、もしくはフラニル基が特に好ましい。当該好ましい置換基は、ハロゲン、水酸基、チオール基、アルデヒド基、チオアルデヒド基、カルボキシル基、ピリジル基、ピロリジニル基、チエニル基、フラニル基、フェニル基、ハロゲン化フェニル基、ベンジル基、ハロゲン化ベンジル基、ベンゾイル基又はハロゲン化ベンゾイル基である。
【０１０１】
なお、上記の「置換基を有し又は有さない」は、それに続く「アリール基、ナフチル基、もしくはアントラセニル基」に係る。
【０１０２】
より具体的には、ＡＤＡＭ作用阻害剤の有効成分である化合物が、後述の実施例において使用される以下の化１〜化５であることが好ましい。化１〜化５の化合物は適宜市販品の購入により入手可能である。
【０１０３】
【化１】
0005888667.tif 000016
【０１０４】
【化２】
0005888667.tif 000017
【０１０５】
【化３】
0005888667.tif 000018
【０１０６】
【化４】
0005888667.tif 000019
【０１０７】
【化５】
0005888667.tif 000020
【０１０８】
また、本発明のＡＤＡＭ作用阻害剤は、イソキノリン骨格に対して、リンカーを介在させて又は介在させずに、互いに１位と４位の関係にある２個の窒素原子を含む含窒素６員環構造体又はその誘導体の一方の前記窒素原子が結合した構造を有する化合物及びその塩から選ばれる１種以上を有効成分として含有するものとすることもできる。
【０１０９】
イソキノリン骨格、リンカー、塩、ＡＤＡＭ作用阻害剤に関する記載は、上述した記載と同様である。但し、「アルキルポリアミン」に該当する部分は、「含窒素６員環構造体」となる。
【０１１０】
含窒素６員環構造体は、互いに１位と４位の関係にある２個の窒素原子を含むものである。即ち、１つの窒素原子を１位とした場合に、他の１つの窒素原子は４位に位置する（ベンゼン環に例えればパラ位である。）。
【０１１１】
イソキノリンの５位は、後述する一般式（Ｖ）においてＸが結合している部位である。
【０１１２】
更に、ＡＤＡＭ作用阻害剤の有効成分である化合物が、下記一般式（Ｖ）で示される構造を有する化合物であることも好ましい。
〔一般式（Ｖ）〕
0005888667.tif 000021
[一般式（Ｖ）中、ＸはＳＯ２又はＰＯ２Ｈを示し、当該硫黄原子またはりん原子にイソキノリン及び窒素原子が結合しており；
Ｒ１１は下記一般式（ＶＩ）、一般式（ＶＩＩ）又は一般式（ＶＩＩＩ）で示される置換基を示す。
〔一般式（ＶＩ）〕
0005888667.tif 000022
（一般式（ＶＩ）中、Ｒ２１〜Ｒ２９は単結合でも、以下に挙げる二重結合であってもよく、Ｒ２１〜Ｒ２９が単結合で結合している場合は、Ｒ２１〜Ｒ２９はそれぞれ以下の（い）〜（は）のいずれかを示し、Ｒ２１〜Ｒ２９はそれぞれ互いに同一であってもよく、相違していてもよい。
（い）水素、ハロゲン、水酸基、チオール基、アルデヒド基、チオアルデヒド基、カルボキシル基、シアノ基、アジド基、もしくはニトロ基。
（ろ）アミノ基、アミジノ基、グアニジノ基、ウレイド基、ヒドラジノ基、ジアゼニル基もしくはヒドロキシアミノ基であって、これらの基は、第１に炭素数１〜５の直鎖の又は分岐の飽和又は不飽和の炭化水素基を有してもよく、第２に、第１に記載した炭化水素基も含めて、ハロゲン化、水酸化、チオール化、アルデヒド化、オキソ化、カルボキシル化、シアノ化又はニトロ化されていてもよい。
（は）置換基を有し又は有しない直鎖、分岐又は環状の炭素数１〜１０の飽和又は不飽和の炭化水素基、アルコキシ基、チオアルコキシ基、アリルオキシ基、アリルチオ基、エーテル基、チオエーテル基、エステル基もしくはチオエステル基。
上記（は）において、「置換基を有し又は有しない・・・飽和又は不飽和の」は、それに続く「炭化水素基、・・・もしくはチオエステル基」に係る。
Ｒ２１とＲ２２、Ｒ２３とＲ２４、Ｒ２６とＲ２７、Ｒ２８とＲ２９が二重結合で結合している場合は、Ｒ２１とＲ２２、Ｒ２３とＲ２４、Ｒ２６とＲ２７、Ｒ２８とＲ２９はそれぞれ以下の（に）〜（ほ）のいずれかを示し、Ｒ２１とＲ２２、Ｒ２３とＲ２４、Ｒ２６とＲ２７、Ｒ２８とＲ２９はそれぞれ互いに同一であってもよく、相違していてもよい。
（に）オキソ基もしくはチオキシ基。
（ほ）置換基を有し又は有さないヒドロキシイミノ基もしくはヒドラゾノ基。
なお、（は）及び（ほ）にいう「置換基」はハロゲン、水酸基、チオール基、アルデヒド基、チオアルデヒド基、又はカルボキシル基である。）
〔一般式（ＶＩＩ）〕
0005888667.tif 000023
（一般式（ＶＩＩ）中、Ｒ３１〜Ｒ３７は単結合でも、以下に挙げる二重結合であってもよく、Ｒ３１〜Ｒ３７が単結合で結合している場合は、Ｒ３１〜Ｒ３７はそれぞれ上記一般式（ＶＩ）における（い）〜（は）のいずれかを示し、Ｒ３１〜Ｒ３７はそれぞれ互いに同一であってもよく、相違していてもよい。
Ｒ３４とＲ３５、Ｒ３６とＲ３７が二重結合で結合している場合は、Ｒ３４とＲ３５、Ｒ３６とＲ３７はそれぞれ上記一般式（ＶＩ）における（に）〜（ほ）のいずれかを示し、Ｒ３４とＲ３５、Ｒ３６とＲ３７は同一であってもよく、相違していてもよい。
なお、「置換基」に関しても上記一般式（ＶＩ）と同様である。）
〔一般式（ＶＩＩＩ）〕
0005888667.tif 000024
（一般式（ＶＩＩＩ）中、Ｒ４１〜Ｒ４５はそれぞれ、上記一般式（ＶＩ）における（い）〜（は）のいずれかを示し、Ｒ４１〜Ｒ４５はそれぞれ互いに同一であってもよく、相違していてもよい。
なお、「置換基」に関しても上記一般式（ＶＩ）と同様である。）]
【０１１３】
また、例えば一般式（ＶＩ）において、Ｒ２１〜Ｒ２９はすべて単結合であっても良いし、二重結合を形成できる部位においては二重結合を形成していても良い。これらの組み合わせは特に限定されない。一般式（ＶＩＩ）においても同様である。
【０１１４】
一般式（Ｖ）において、ＸはＳＯ２が好ましい。
【０１１５】
上記した一般式（ＶＩ）においてＲ２１〜Ｒ２９が単結合で結合している場合は、好ましくはＲ２１〜Ｒ２９はそれぞれ、以下に示す（い）又は（は）の基である。
（い）水素、ハロゲン、水酸基、チオール基、アルデヒド基、チオアルデヒド基又はカルボキシル基。
（は）置換基を有し又は有しない直鎖状又は分岐状の炭素数１〜５の飽和又は不飽和の炭化水素基、アルコキシ基、チオアルコキシ基、アリルオキシ基、アリルチオ基、エーテル基、チオエーテル基、エステル基もしくはチオエステル基。
なお、（は）にいう置換基はハロゲン、水酸基、アルデヒド基、又はカルボキシル基である。
【０１１６】
上記した一般式（ＶＩ）においてＲ２１〜Ｒ２９が単結合で結合している場合は、より好ましくはＲ２１〜Ｒ２９はそれぞれ、以下に示す（い）又は（は）の基である。
（い）水素、水酸基、アルデヒド基又はカルボキシル基。
（は）置換基を有し又は有しない直鎖状又は分岐状の炭素数１〜３の飽和又は不飽和の炭化水素基。
なお、（は）にいう置換基はハロゲン、水酸基、アルデヒド基、又はカルボキシル基である。
【０１１７】
これらの好ましい、より好ましい置換基については、一般式（ＶＩＩ）、一般式（ＶＩＩＩ）においても同様である。
【０１１８】
上記した一般式（ＶＩ）においてＲ２１とＲ２２、Ｒ２３とＲ２４、Ｒ２６とＲ２７、Ｒ２８とＲ２９が二重結合で結合している場合、一般式（ＶＩＩ）においてＲ３４とＲ３５、Ｒ３６とＲ３７が二重結合で結合している場合は、オキソ基であることが好ましい。
【０１１９】
より具体的には、ＡＤＡＭ作用阻害剤の有効成分である化合物が、後述の実施例において使用される以下の化６であることが好ましい。化６は市販品の購入により入手可能である。例えば、Ｓｉｇｍａ社製Ｈ−７（商品番号：Ｉ６８９１）を用いても良い。
【０１２０】
【化６】
0005888667.tif 000025
【０１２１】
また、本発明のＡＤＡＭ作用阻害剤は、上記したＡＤＡＭ作用阻害物質のスクリーニング方法を用いて選抜される物質が、下記一般式（ＩＸ）又は一般式（Ｘ）に該当する化合物であり、これらの化合物及びその塩から選ばれる１種以上を有効成分として含有するものとすることもできる。
【０１２２】
〔一般式（ＩＸ）〕
0005888667.tif 000026
（一般式（ＩＸ）中、ＸはＳＯ２又はＰＯ２Ｈを示し、当該硫黄原子またはりん原子にイソキノリン及び窒素原子が結合しており；Ｒ５１及びＲ５２はそれぞれ水素又は任意の置換基である。）
【０１２３】
上記化１〜化５はＡＤＡＭ作用の阻害活性である出血阻害活性及び仮足の形成、保持阻害活性を有し、一般式（ＩＸ）に示す共通の構造が見受けられる。一方で、後述の化１１〜化１９である化合物は一般式（ＩＸ）で表される構造を有さず、かつ、ＡＤＡＭ作用阻害活性も有しない。即ち、一般式（ＩＸ）で表される共通構造を有する化合物はＡＤＡＭ作用阻害活性を有すると推測される。
【０１２４】
一般式（ＩＸ）において、ＸはＳＯ２が好ましい。
【０１２５】
上記一般式（ＩＸ）におけるＲ５１及びＲ５２はそれぞれ水素又は任意の置換基である。好ましくは、Ｒ５１及びＲ５２はそれぞれ以下の（ハ）〜（ヘ）のいずれかを示し、Ｒ５１とＲ５２は同一であってもよく、相違していてもよい。
（ハ）水素、ハロゲン、水酸基、チオール基、アルデヒド基、チオアルデヒド基、カルボキシル基、シアノ基、アジド基、ニトロ基、ピリジル基、ピロリジニル基、チエニル基もしくはフラニル基。
（ニ）アミノ基、アミジノ基、グアニジノ基、ウレイド基、ヒドラジノ基、ジアゼニル基もしくはヒドロキシアミノ基であって、これらの基は、第１に炭素数１〜５の直鎖の又は分岐の飽和又は不飽和の炭化水素基を有してもよく、第２に、第１に記載した炭化水素基も含めて、ハロゲン化、水酸化、チオール化、アルデヒド化、オキソ化、カルボキシル化、シアノ化又はニトロ化されていてもよい。
（ホ）置換基を有し又は有さないアリール基、ナフチル基もしくはアントラセニル基。
（ヘ）置換基を有し又は有しない直鎖、分岐又は環状の炭素数１〜２０の飽和又は不飽和の炭化水素基、アルコキシ基、チオアルコキシ基、アリルオキシ基、アリルチオ基、エーテル基、チオエーテル基、エステル基もしくはチオエステル基。
なお、（ホ）及び（ヘ）にいう「置換基」はハロゲン、水酸基、チオール基、アルデヒド基、チオアルデヒド基、カルボキシル基、シアノ基、アジド基、ニトロ基、ピリジル基、ピロリジニル基、チエニル基、フラニル基、フェニル基、ハロゲン化フェニル基、ベンジル基、ハロゲン化ベンジル基、ベンゾイル基又はハロゲン化ベンゾイル基であり、
その中でも、（ホ）にいう「置換基」では、上記の選択肢に加え、更に、炭化水素基、アルコキシ基、チオアルコキシ基、アリルオキシ基、アリルチオ基、エーテル基、チオエーテル基、エステル基、チオエステル基が含まれ、これらの基は、炭素数１〜５であり、飽和又は不飽和の直鎖状又は分岐状であり、かつ、ハロゲン化、水酸化、チオール化、アルデヒド化、オキソ化、カルボキシル化、シアノ化、又はニトロ化されていてもよい。）
【０１２６】
上記（ヘ）において、「置換基を有し又は有しない・・・飽和又は不飽和の」は、それに続く「炭化水素基、・・・もしくはチオエステル基」に係る。
【０１２７】
上記の「飽和」「不飽和」は炭化水素部分をあらわすものであり、例えば「不飽和アルコキシ基」とは、アルコキシ基のうち、アルキル部位に不飽和結合を有することを意味する。
【０１２８】
上記した一般式（ＩＸ）においては、好ましくはＲ５１及びＲ５２はそれぞれ、以下に示す（ハ）、（ニ）又は（ヘ）の基である。
（ハ）水素、水酸基、アルデヒド基又はカルボキシル基。
（ニ）アミジノ基、グアニジノ基又はウレイド基。
（ヘ）置換基を有し又は有しない直鎖状又は分岐状の炭素数１〜1０の飽和又は不飽和の炭化水素基。
なお、（ヘ）にいう置換基はフェニル基、ハロゲン化フェニル基、ベンジル基、ハロゲン化ベンジル基、ベンゾイル基又はハロゲン化ベンゾイル基である。
【０１２９】
上記した一般式（ＩＸ）においては、更に好ましくはＲ５１は水素、水酸基、アルデヒド基又はカルボキシル基であり、Ｒ５２は以下に示す（ハ）、（ニ）又は（ヘ）の基である。
（ハ）水素。
（ニ）アミジノ基、グアニジノ基又はウレイド基。
（ヘ）置換基を有し又は有しない直鎖状又は分岐状の炭素数１〜５、好ましくは１〜３の飽和又は不飽和の炭化水素基。
なお、（ヘ）にいう置換基はフェニル基、ハロゲン化フェニル基、ベンジル基、ハロゲン化ベンジル基、ベンゾイル基又はハロゲン化ベンゾイル基である。
【０１３０】
より具体的には、有効成分である化合物が、上記化１〜化５であることが好ましい。
【０１３１】
〔一般式（Ｘ）〕
0005888667.tif 000027
（一般式（Ｘ）中、ＸはＳＯ２又はＰＯ２Ｈを示し、当該硫黄原子またはりん原子にイソキノリン及び窒素原子が結合しており；Ｒ６１〜Ｒ６９はそれぞれ水素又は任意の置換基である。）
【０１３２】
上記化６と、後述の化１２を対比すると、化６は６員環であるのに対し化１２は７員環である点で大きく異なっている。また、化６はＡＤＡＭ作用の阻害活性である出血阻害活性及び仮足の形成、保持阻害活性を有する。一方で化１２はＡＤＡＭ作用阻害活性を有しない。よって、一般式（Ｘ）で表される構造を有する化合物はＡＤＡＭ作用阻害活性を有することが推測される。
【０１３３】
一般式（Ｘ）において、ＸはＳＯ２が好ましい。
【０１３４】
上記一般式（Ｘ）におけるＲ６１〜Ｒ６９はそれぞれ水素又は任意の置換基である。好ましくは、Ｒ６１〜Ｒ６９は単結合でも、以下に挙げる二重結合であってもよく、Ｒ６１〜Ｒ６９が単結合で結合している場合は、Ｒ６１〜Ｒ６９はそれぞれ以下の（い）〜（は）のいずれかを示し、Ｒ６１〜Ｒ６９はそれぞれ互いに同一であってもよく、相違していてもよい。
（い）水素、ハロゲン、水酸基、チオール基、アルデヒド基、チオアルデヒド基、カルボキシル基、シアノ基、アジド基、もしくはニトロ基。
（ろ）アミノ基、アミジノ基、グアニジノ基、ウレイド基、ヒドラジノ基、ジアゼニル基もしくはヒドロキシアミノ基であって、これらの基は、第１に炭素数１〜５の直鎖の又は分岐の飽和又は不飽和の炭化水素基を有してもよく、第２に、第１に記載した炭化水素基も含めて、ハロゲン化、水酸化、チオール化、アルデヒド化、オキソ化、カルボキシル化、シアノ化又はニトロ化されていてもよい。
（は）置換基を有し又は有しない直鎖、分岐又は環状の炭素数１〜１０の飽和又は不飽和の炭化水素基、アルコキシ基、チオアルコキシ基、アリルオキシ基、アリルチオ基、エーテル基、チオエーテル基、エステル基もしくはチオエステル基。
【０１３５】
上記（は）において、「置換基を有し又は有しない・・・飽和又は不飽和の」は、それに続く「炭化水素基、・・・もしくはチオエステル基」に係る。
【０１３６】
Ｒ６１とＲ６２、Ｒ６３とＲ６４、Ｒ６６とＲ６７、Ｒ６８とＲ６９が二重結合で結合している場合は、Ｒ６１とＲ６２、Ｒ６３とＲ６４、Ｒ６６とＲ６７、Ｒ６８とＲ６９はそれぞれ以下の（に）〜（ほ）のいずれかを示し、Ｒ６１とＲ６２、Ｒ６３とＲ６４、Ｒ６６とＲ６７、Ｒ６８とＲ６９はそれぞれ互いに同一であってもよく、相違していてもよい。
（に）オキソ基もしくはチオキシ基。
（ほ）置換基を有し又は有さないヒドロキシイミノ基もしくはヒドラゾノ基。
なお、（は）及び（ほ）にいう「置換基」はハロゲン、水酸基、チオール基、アルデヒド基、チオアルデヒド基、又はカルボキシル基である。）
【０１３７】
上記した一般式（Ｘ）においてＲ６１〜Ｒ６９が単結合で結合している場合は、好ましくはＲ６１〜Ｒ６９はそれぞれ、以下に示す基のいずれかである。
（い）水素、ハロゲン、水酸基、チオール基、アルデヒド基、チオアルデヒド基又はカルボキシル基。
（は）置換基を有し又は有しない直鎖状又は分岐状の炭素数１〜５の飽和又は不飽和の炭化水素基、アルコキシ基、チオアルコキシ基、アリルオキシ基、アリルチオ基、エーテル基、チオエーテル基、エステル基もしくはチオエステル基。
なお、（は）にいう置換基はハロゲン、水酸基、アルデヒド基、又はカルボキシル基である。
【０１３８】
上記した一般式（Ｘ）においてＲ６１〜Ｒ６９が単結合で結合している場合は、より好ましくはＲ６１〜Ｒ６９はそれぞれ、以下に示す基のいずれかである。
（い）水素、水酸基、アルデヒド基又はカルボキシル基。
（は）置換基を有し又は有しない直鎖状又は分岐状の炭素数１〜３の飽和又は不飽和の炭化水素基。
なお、（は）にいう置換基はハロゲン、水酸基、アルデヒド基、又はカルボキシル基である。
【０１３９】
上記した一般式（Ｘ）においてＲ６１とＲ６２、Ｒ６３とＲ６４、Ｒ６６とＲ６７、Ｒ６８とＲ６９が二重結合で結合している場合、オキソ基であることが好ましい。
【０１４０】
より具体的には、有効成分である化合物が、上記化６であることが好ましい。
【０１４１】
塩及びＡＤＡＭ作用阻害剤に関する記載は、上述した記載と同様である。
【０１４２】
〔その他〕
ＡＤＡＭ作用阻害剤の有効成分である化合物は周知の方法を適宜組み合わせることによって化学的に合成することが可能である。また、周知の方法により、当該化合物の塩を得ることができる。上述した化１〜化６に記載の化合物及びその塩は、適宜市販品を用いることができる。
【０１４３】
上記有効成分は液体、固体等の公知の各種担体と混合し、また必要に応じて安定化剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤、賦形剤、溶剤、界面活性剤、乳化剤、懸濁化剤、分散剤、保存剤、溶解補助剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤、保湿剤、結合剤、被覆剤、潤沢剤、崩壊剤、などを加え、液剤、経口投与剤、錠剤、粉剤、坐剤、外用剤、軟膏、貼布剤、点眼剤、注射剤、散剤、顆粒剤、糖衣剤、カプセル剤、ピル、懸濁剤、アンプル、注射液、などあらゆる剤としての製剤が可能である。また、薬学的に許容される剤を上記有効成分に加えることにより、医薬とすることも可能である。
【０１４４】
ＡＤＡＭ作用阻害剤の投与量は、投与対象、年齢、性別、体重、剤形あるいは投与形式等により異なるが、投与対象が哺乳類、特にヒトの成人である場合、週１日以上、投与日１日当たり有効成分換算で１〜１００ｍｇ／ｋｇ投与することが好ましい。
ＡＤＡＭ作用阻害剤が出血阻害剤、血管強化剤、仮足の形成阻害剤、仮足の保持阻害剤の場合も上記と同様である。
【０１４５】
また、ＡＤＡＭ作用阻害剤における「有効成分換算」とは、例えば、剤に含まれる有効成分が化合物である場合はその有効成分の質量であり、塩である場合は化合物の質量に換算して計算することを意味する。
【０１４６】
仮足保持剤の有効成分であるＡＤＡＭは適宜市販品を用いることができる。ヘビ毒は、ガラガラヘビ等の個体であるヘビから取得しても良いし、市販品であるヘビ毒を購入しても良い。また、ＶＡＰ１及びＶＡＰ２は、ガラガラヘビ毒（購入元：Ｓｉｇｍａ、和光純薬など）から上記した非特許文献４に記載の方法により取得することができる。
【０１４７】
上記有効成分は液体、固体等の公知の各種担体と混合し、また必要に応じて安定化剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤、賦形剤、溶剤、界面活性剤、乳化剤、懸濁化剤、分散剤、保存剤、溶解補助剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤、保湿剤、結合剤、被覆剤、潤沢剤、崩壊剤、などを加え、液剤、経口投与剤、錠剤、粉剤、坐剤、外用剤、軟膏、貼布剤、点眼剤、注射剤、散剤、顆粒剤、糖衣剤、カプセル剤、ピル、懸濁剤、アンプル、注射液、などあらゆる剤としての製剤が可能である。また、薬学的に許容される剤を上記有効成分に加えることにより、医薬とすることも可能である。
【０１４８】
仮足保持剤の投与量は、投与対象、年齢、性別、体重、剤形あるいは投与形式等により異なるが、投与対象が哺乳類、特にヒトの成人である場合、週１日以上、投与日１日当たり有効成分の質量で０．１〜１ｍｇ／ｋｇ投与することが好ましい。
【０１４９】
上述の各剤の投与回数は１回または数回に分けて投与することができる。投与計画としては、連日投与、間欠投与又はこれらの組み合わせがある。これらの投与においては医師の判断によることが必要である。
【０１５０】
上述の各剤の投与対象が細胞、器官、組織などである場合は投与量は特に限定されないが、投与対象に対してＡＤＡＭ作用阻害剤では有効成分換算で１〜１００μｇ／ｍｌ投与が好ましい。仮足保持剤では有効性分の質量で０．１〜１０μｇ／ｍｌ投与が好ましい。
【実施例】
【０１５１】
（ＶＡＰ１の取得）
非特許文献２に記載の増田らのＶＡＰ１の精製法に則り、ニシダイヤガラガラヘビ（Ｃ．ａｔｒｏｘ）の粗毒(ＳＩＧＭＡ社製：製品名Ｓｎａｋｅ  ｖｅｎｏｍ，Ｃｒｏｔａｌｕｓ  ａｔｒｏｘ  （Ｖ７０００）)を２５ｍＭ  ＮａＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ(２５ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．０），１ｍＭ  ＣａＣｌ２)に溶解し、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｃ２５（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）ｃｏｌｕｍｎ（１．５ｃｍ×９ｃｍ）を用いて精製を行い、ＮａＣｌ濃度勾配(２５ｍＭ−５００ｍＭ，１５０ｍｌ)により溶出を行った。得られた各画分を非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ポリアクリルアミドゲル（分離ゲル９．７３％Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ社Ａ８８８７），０，２７％Ｂｉｓ−ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ社Ｍ７２７９）、０．１％ＳＤＳ，０．３７５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）の溶液１０ｍｌに１０％過硫酸アンモニウム０．０４ｍｌとＴＥＭＥＤ０．００５ｍｌを添加してゲル化）、ゲルサイズ横９０ｍｍｘ縦８０ｍｍｘ厚さ１ｍｍに対し、泳動バッファ（０．０２５Ｍ  Ｔｒｉｓ，０．１９２Ｍグリシン、０．１％ＳＤＳ）で２０ｍＡの定電流で泳動。分子量マーカーはＳｉｇｍａ社製  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔｓ  ３０，０００−２００，０００  ｆｏｒ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＭＷＳＤＳ２００）  を使用。）を行い、銀染色によって１１０ｋＤａにバンドの検出が確認された画分をＶＡＰ１の溶出画分とした。さらにｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ（生化学工業）ｃｏｌｕｍｎ（１．５ｃｍ×８．５ｃｍ）を用い、上記の溶出画分に等量の２５ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）を混和し、カラムに添加した。Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ濃度勾配（０．２５ｍＭ−５００ｍＭ，１５０ｍｌ）により溶出を行った。得られた各画分を上述と同様の非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、銀染色によって１１０ｋＤａにＶＡＰ１の単一なバンドを確認した。この１１０ｋＤａのバンドを含む画分を精製ＶＡＰ１標品として用いた。
【０１５２】
（ＶＡＰ２の取得）
ＶＡＰ１精製一段階目のＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｃ２５  ｃｏｌｕｍｎで得られた各画分を非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、銀染色によって６０ｋＤａのバンドが検出された画分をＶＡＰ２溶出画分として用いた。さらに精製を行うために、非特許文献１に記載の増田らのＶＡＰ２の精製法に則って、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ  ｃｏｌｕｍｎ（０．８ｃｍ×３ｃｍ）を用いて行った。ＶＡＰ２溶出画分に等量の１Ｍ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（１Ｍ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０），１ｍＭ  ＣａＣｌ２)を混和し、カラムに添加した。Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ濃度勾配（５００ｍＭ−０ｍＭ）により溶出を行った。得られた各画分を上記ＶＡＰ１の取得と同様の非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、銀染色によって６０ｋＤａにＶＡＰ２のバンドを確認した。この６０ｋＤａのバンドを含む画分を精製ＶＡＰ２標品として用いた。
【０１５３】
（ＶＡＰ１、ＶＡＰ２及びヒトＡＤＡＭのホモロジー）
ＶＡＰ１及びＶＡＰ２のアミノ酸配列は本願発明者が特定しており、下記の文献に記載されている。
ＶＡＰ１：非特許文献２、ＶＡＰ２：Masuda
S, Maeda H, Miao JY, Hayashi H, Araki S.  cDNA
Cloning and Some Additional Peptide Characterization of a Single-Chain Vascular
Apoptosis-Inducing Protein, VAP2.  Endothelium. 2007; 14(2):89-96.
【０１５４】
ＶＡＰ１、ＶＡＰ２とヒトＡＤＡM２８は、アミノ酸配列の一致度はそれぞれ４１％、４２％である（ＢＬＡＳＴホモロジー検索より）。この数値は、ヒトＡＤＡＭ２８と最も近いヒトＡＤＡＭは順にヒトＡＤＡＭ７、ヒトＡＤＡＭ１２で、アミノ酸配列の一致度はそれぞれ４１％、３６％であることを考えれば、ＶＡＰ１、ＶＡＰ２はヒトＡＤＡＭの強いホモログであると言える。また立体構造に関しては、プロテアーゼドメインの立体構造偏差は、立体構造の分かっているヒトＡＤＡM３３と比べて、ＶＡＰ１との立体構造偏差ＲＭＳＤ（Ｒｏｏｔ  Ｍｅａｎ  Ｓｑｕａｒｅ  Ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）は０．９８７Å（オングストローム）であり、非常に高い構造の一致を示している。したがってＶＡＰ１，ＶＡＰ２はＡＤＡＭファミリーのホモログであることが非常に強く示唆される。
【０１５５】
（ＡＤＡＭ作用阻害物質の探索）
ＶＡＰの引き起こす出血をＡＤＡＭ作用とし、上記化１〜化６及び以下の化１１〜化１９についてＡＤＡＭ作用の阻害活性を測定した。以降の実施例において、これらの化合物は適宜市販品を購入して用いた。
【０１５６】
【化１１】
0005888667.tif 000028
【０１５７】
【化１２】
0005888667.tif 000029
【０１５８】
【化１３】
0005888667.tif 000030
【０１５９】
【化１４】
0005888667.tif 000031
【０１６０】
【化１５】
0005888667.tif 000032
【０１６１】
【化１６】
0005888667.tif 000033
【０１６２】
【化１７】
0005888667.tif 000034
【０１６３】
【化１８】
0005888667.tif 000035
【０１６４】
【化１９】
0005888667.tif 000036
【０１６５】
ＶＡＰの引き起こす出血活性は以下のように測定した。動物は、ＩＣＲマウスの成体（２カ月齢以降）を用いた。マウスの背中の皮膚は出血を見るのに適しており、ヘビ毒の活性を見るのによく利用される。マウスの背中の皮膚内に皮内注射をすることにより、ＶＡＰの出血活性を測定した。
【０１６６】
マウスの尻尾を固定し、マウスを落ち着かせたのち、背中の毛を丁寧にはさみで切り、毛刈部位を４×４ｃｍの大きさにした。当該毛刈部位をエタノールで消毒したのち、注射器（テルモシリンジ1ｍｌ、テルモ注射針２７Ｇ×３／４’’）を用いて注射液を注入した。注射液は１ｍｇ／ｍｌの精製ＶＡＰ１標品溶液１０μｌと１０ｍＭの各化合物溶液（なお、コントロールにはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ―）またはジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を用い、ＶＡＰ１のみの投与となるようにした）１０μｌを混合したものを用いた。注入４時間後にジエチルエーテルによって犠牲にし、背中から出血斑のある部分の皮膚を剥ぎとり観察した。
【０１６７】
各化合物について試験は３連行い、出血量の平均値は、コントロールに対する相対比で化１が０．３６、化２が０．３２、化３が０．２１、化４が０．１６、化５が０．４０、化６が０．３８、化１１が１．４８、化１２が１．３８、化１３が１．３３、化１４が１．２０、化１５が１．４８、化１６が１．２６、化１７が１．３０、化１８が１．１３、化１９が１．３６であった。
【０１６８】
図１は、化１〜５及び化１１〜１３についての出血量を、コントロールに対する相対比で示す棒グラフであり、１となっているのはＶＡＰ１のみを投与したコントロールの出血量である。図２は、化１４及び化１５についての出血量を、コントロールに対する相対比で示す棒グラフである。図３は、化１１及び化１６〜化１９についての出血量を、コントロールに対する相対比で示す棒グラフである。各バーには、標準偏差も示してある。なお、化６については図示を省略する。
【０１６９】
次に、上述の注射実験と同様の手順で、化３及び化４についてＶＡＰ２を用いた出血活性の測定を行った。注射液には精製ＶＡＰ１標品ではなく精製ＶＡＰ２標品を混合した。図４は化４（上段）及び化３（下段）の投与結果を示す写真である。左側はＶＡＰ２のみを投与（コントロール）した結果であり、右側はＶＡＰ２と化４又は化３の混合剤を投与した結果である。化３及び化４は出血阻害活性を示した。
【０１７０】
図５は、化１１及び化１６〜化１９の投与結果を示す写真である。図４同様、左側はＶＡＰ１のみを投与（コントロール）した結果であり、右側はＶＡＰ１と各化合物の混合剤を投与した結果である。化１１及び化１６〜化１９は、出血阻害活性を示さなかった。
【０１７１】
実験結果より、化１〜化６は出血阻害活性が認められた。上述のようにＶＡＰ１及びＶＡＰ２はＡＤＡＭのホモログであるので、化１〜化６はＡＤＡＭ作用阻害活性を示す物質である。化１〜化６はイソキノリンに対し、リンカーであるスルフェン酸（−ＳＯ２−）を介して窒素原子が結合するという共通の構造が見受けられる。
【０１７２】
（ＡＤＡＭの下流の確認）
化合物がＶＡＰのタンパク質分解活性を直接阻害していないかどうかを以下の方法により調べた。切断はＶＡＰ１の分解基質の１つであるフィブロネクチンが切断されるか否かによって判断した。なお、ＤＭＳＯは溶液中に化４を溶かし込む目的で使用した。
【０１７３】
（１）コントロールとして、フィブロネクチン（図６中では「ｆｉｂ」とも表現する）又はＶＡＰ１のみ、（２）１ｍｇ／ｍｌの精製ＶＡＰ１標品５０ｍＭリン酸緩衝液溶液１０μｌ及びフィブロネクチン２００μｇを混合したもの（実験結果は図６中左から３列目に示す）、（３）１ｍｇ／ｍｌの精製ＶＡＰ１標品５０ｍＭリン酸緩衝液溶液１０μｌとＤＭＳＯ  １０μｌの混合物をフィブロネクチン２００μｇと混合したもの（実験結果は図６中左から４列目に示す）、（４）１ｍｇ／ｍｌの精製ＶＡＰ１標品５０ｍＭリン酸緩衝液溶液１０μｌと「化４」５．２ｍｇ/ｍｌのＤＭＳＯ溶液１０μｌの混合物とフィブロネクチン２００μgを混合したもの（実験結果は図６中最も右側の列に示し、図中ではＤＭＳＯの記載は省略する）をそれぞれリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ―）（ｐＨ７．０））１００μｌ中で、それぞれ２４時間、３７℃でインキュベートした。これらの混合液を回収しＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったあと、銀染色を施した。
【０１７４】
実験結果を図６に示す。上記（２）〜（４）の結果から明らかであるように化４が存在しても、ＶＡＰ１の反応が進行することが確認できた。化１〜化６の他の化合物についても同様の結果を得た。
【０１７５】
また、ＶＡＰ１とＶＡＰ２のホモロジー及び上述したＡＤＡＭ作用阻害物質の探索の実験結果から、ＶＡＰ２においても同様の現象が見られることが推測された。
【０１７６】
即ち、化１〜化６はＡＤＡＭシグナル伝達系におけるＡＤＡＭの下流に働きかけることが示された。
【０１７７】
（ＶＡＰと仮足）
ヘビ毒ＡＤＡＭであるＶＡＰ１と血管内皮細胞を用いて、ＶＡＰの引き起こす仮足の形成、保持について調べた。
【０１７８】
細胞はＪａｆｆｅらの方法(Jaffe,
E. A., Nachman, R. L., Becher,
C. G., and Minick, R. C. (1973) Culture of human
endothelial cells derived from umbilical veins. J. Clin. Invest. 52,
2745-2756.)によって得たヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を使用した。培養液はＭＣＤＢ１０５培養液(Ｓｉｇｍａ社製)に、混合後の最終濃度でウシ胎仔血清を１０％（ｖ／ｖ）および、ＦＧＦ  ７０ｎｇ／ｍｌ (ＬｏｂｂおよびＦｅｔｔの方法 (Lobb,
R. R., and Fett, J. W. (1984) Purification of two
distinct growth factors bovine neural tissue by heparin affinity
chromatography. Biochemistry 23,
6295-6299) でウシの脳より抽出) 、ヘパリン１００μｇ／ｍｌを加えた物を用いた。培養条件としては、ＨＵＶＥＣを０．１％ゼラチンコートしたプラスチックディッシュ上にまき、培養液により３７℃、５％ＣＯ２、９５％  ａｉｒの条件で培養を行った。
【０１７９】
生存因子の除去は、血清・ＦＧＦ無添加の培養液に培養液を交換することにより行った。一方、ヘビ毒によるアポトーシスにおいて添加する毒素は上述のニシダイヤガラガラヘビ（Ｃ．ａｔｒｏｘ）の粗毒を用い、最終濃度１μｇ／ｍｌになるように添加した。上記培養液の交換直後にニシダイヤガラガラヘビの粗毒を添加し、細胞をタイムラプスビデオ（位相差顕微鏡を使用）により撮影した。
【０１８０】
実験結果を図７に示す。Ａ〜Ｃは生存因子除去によるアポトーシスの過程を経時的に示すものである。０時間の細胞（Ａ）は、生存因子除去後２４時間程度でアポトーシスが始まると仮足を形成する（細胞体に比して小さなでこぼこは仮足の形成を示す）が（Ｂ）、仮足形成１時間後には仮足は消失して球形になり（Ｃ）、以降もこのままの形態である。
なお、アポトーシスで見られるのと同様なブレッビング（小胞）が仮足の形態の一つであるということは、最近の知見で分かってきたことである。例えば、以下の文献に記載されている：参考文献Ｇ．Ｔ．Ｃｈａｒｒａｓ、Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｈｉｓｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｂｌｅｂｂｉｎｇ.  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，２３１：４６６−４７８（２００８）
【０１８１】
Ｄ〜Ｆは、上述のニシダイヤガラガラヘビ粗毒による仮足の変化の過程を経時的に示すものである。０時間の細胞（Ｄ）は、生存因子除去及びニシダイヤガラガラヘビ粗毒添加後２４時間程度で、生存因子除去の場合と同様に仮足を形成するが（Ｅ）、仮足形成後６時間以上経過しても仮足は消失せず保持されたまま（Ｆ）、以降もこのままの形態を保つ。
【０１８２】
ＶＡＰ１、ＶＡＰ２についても同様の実験結果を得た。
即ち、ヘビ毒を用いるという簡便な方法で仮足の形成、仮足の保持ができることが示された。
【０１８３】
（ヘビ毒ＡＤＡＭとＡＤＡＭ作用阻害物質）
ヘビ毒ＡＤＡＭであるＶＡＰ１とＡＤＡＭ作用阻害物質である化６を用いて、仮足の形成、保持に対する化６の効果を調べた。
【０１８４】
上述と同様の方法により調製したヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）及び培養液を用いた。培養条件としては、ＨＵＶＥＣを０．１％ゼラチンコートしたプラスチックディッシュ上にまき、培養液により３７℃、５％ＣＯ２、９５％ａｉｒの条件で培養を行った。
【０１８５】
血清・ＦＧＦ無添加の培養液に培養液を交換し、コントロールは培養液の交換直後に精製した標品であるＶＡＰ１を最終濃度１０μｇ／ｍｌになるように添加し、２４時間培養を続けた。一方、化６投与区は最終濃度でＶＡＰ１が１０μｇ／ｍｌ、及び化６が３０μＭになるように添加し、２４時間培養を続けた。
【０１８６】
実験結果を図８に示す。図８Ａはコントロールの結果であり、ＶＡＰ１の添加後２４時間の細胞を示す。細胞体に比して小さなでこぼこは仮足の形成を示し、２４時間後も保持されている様子が分かる。図８ＢはＶＡＰ１及び化６の投与後２４時間の細胞を示す。細胞体は滑らかな球状になり、仮足が見られない。
また、図示は省略するが、ＶＡＰ１を添加して細胞に仮足を形成させ、その後化６を投与すると、仮足が消失した。化１〜化６の他の化合物についても、同様の結果を得た。
【０１８７】
即ち、ヘビ毒ＡＤＡＭによる仮足保持は、化１〜化６によって阻害された。また、化１〜化６によりＶＡＰによる仮足の形成が阻害された。即ち、化１〜化６はＡＤＡＭ作用阻害活性を示した。また、化１〜化６は仮足の制御活性をも示した。
【０１８８】
（ヘビ毒ＡＤＡＭの血管への作用）
以下の論文により、ヘビ毒ＡＤＡＭは血管に作用することが示されている。
Araki
S, Masuda S, Maeda H, Ying MJ, Hayashi H. Involvement of specific integrins in apoptosis induced by vascular
apoptosis-inducing protein 1.  Toxicon.
2002 May;40(5):535-42. 
【０１８９】
図９上段（コラーゲン溶液の分解）について説明する。コラーゲン５０μｇを０．２μｇの精製した標品であるＶＡＰ１またはガラガラヘビ毒２μｇと３７℃で２４時間インキュベートした。反応液は１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１ｍＭＣａＣｌ２、２．５ｍｇ／ｍｌ  α―ｇｅｌａｔｉｎ（シグマ）にＶＡＰ１を１０μｇ／ｍｌまたはガラガラヘビ毒１００μｇ／ｍｌを添加した。各サンプルをポリアクリルアミドＳＤＳ電気泳動で分画し、クーマシーブリリアントブルーで染色し、検出した。図９左側（レーン１）はコラーゲンのみインキュベートしたもの、図９中央（レーン２）はコラーゲンとＶＡＰ１をインキュベートしたもの、図９右側（レーン３）はコラーゲンとガラガラヘビ毒をインキュベートしたものである。
【０１９０】
図９下段（培養皿ゼラチンコートの分解）について説明する。コラーゲンコートされた培養皿をＶＡＰ１またはガラガラヘビ毒で５日間インキュベートし、後にヒトさい帯血管内皮細胞を植えることにより、コラーゲンの接着能力が棄損されているかどうかを調べた。コラーゲンコートした培養皿を、培養液（Ａ）、ガラガラヘビ毒素（１０μｇ／ｍｌ）添加培養液（Ｂ）、ＶＡＰ１（１μｇ／ｍｌ）添加培養液（Ｃ）で５日間インキュベートし、後にヒトさい帯血管内皮細胞を植えて６時間後の様子を光学顕微鏡で撮影した。
【０１９１】
図９に示すように、ＶＡＰ１はコラーゲンを分解しないことが示されている。即ち、ＶＡＰ１は血管の細胞外マトリックスは分解しない。
ヘビ毒ＡＤＡＭは血管内皮細胞のアポトーシスを引き起こす一方で、血管の細胞外マトリックスは分解しないことが明らかとなった。よって、図１０に示すような出血モデルを推測することができる。上記した化１〜化６は、図１０中の「信号伝達阻害物質」に該当すると推測される。
【０１９２】
（ＭＭＰであるコラゲナーゼとＡＤＡＭ作用阻害物質）
コラゲナーゼ出血へのＡＤＡＭ作用阻害物質の影響を以下のように測定した。動物は、ＩＣＲマウスの成体（２カ月齢以降）を用い、マウスの背中の皮膚内に皮内注射をすることにより、コラゲナーゼの出血活性を測定した。マウスの尻尾を固定し、マウスを落ち着かせたのち、背中の毛を丁寧にはさみで切り、毛刈部位を４×４ｃｍの大きさにした。当該毛刈部位をエタノールで消毒したのち、注射器（テルモシリンジ１ｍｌ、テルモ注射針２７Ｇ×３／４’’）を用いて注射液を注入した。注射液は０．８ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ社製、製品名Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ（Ｃ０１３０））１０μｌと１０ｍＭの「化４」溶液（なお、コントロールには溶媒ジメチルスルフォキシドを用い、投与物質がコラゲナーゼのみとなるようにした）１０μｌを混合したものを用いた。注入４時間後にジエチルエーテルによって犠牲にし、背中から出血斑のある部分の皮膚を剥ぎとり観察した。
【０１９３】
実験結果を図１１に示す。左側はコラゲナーゼのみを投与（コントロール）した結果であり、右側はコラゲナーゼと化４の混合剤を投与した結果である。また、化１〜化６の他の化合物についても同様の結果を得た。
【０１９４】
即ち、ＡＤＡＭ作用阻害物質はＭＭＰであるコラゲナーゼの作用である出血を阻害できないことが示された。これは、ＡＤＡＭ作用阻害物質が他のプロテアーゼの作用を阻害しないことを示す。言い換えれば、ＡＤＡＭの下流に作用するＡＤＡＭ作用阻害物質は副作用が少ない。また、コラゲナーゼの作用である出血を阻害できないことから、ＡＤＡＭ作用阻害物質を加えてもコラゲナーゼのプロテアーゼ活性が残存していることが合理的に推測される。
【０１９５】
（ＶＡＰと仮足−２−）
ヘビ毒及びヘビ毒ＡＤＡＭであるＶＡＰ２と、化２を用いて、仮足の形成、保持に対する化２の効果を確認的に検討した。
【０１９６】
上述の「（ＶＡＰと仮足）」と同様の方法により調製したヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）及び培養液を用いた。培養条件としては、ＨＵＶＥＣを０．１％ゼラチンコートしたスライドガラスを置いたプラスチックディッシュ上に撒き、培養液により３７℃、５％ＣＯ２，９５％ａｉｒの条件で培養を行った。
【０１９７】
血清・ＦＧＦ無添加の培養液に培養液を交換し、培養液の交換直後に上述の「（ＶＡＰ１の取得）」、「（ＶＡＰ２の取得）」に用いたニシダイヤガラガラヘビの粗毒又は精製した標品であるＶＡＰ２を最終濃度１０μｇ／ｍｌになるように添加し、４時間培養を続けた。また、化２投与区は最終濃度で上記ヘビ毒又はＶＡＰ２が１０μｇ／ｍｌ、及び化２が１０μＭになるように添加し、４時間培養を続けた。コントロールは、培養液の交換後ニシダイヤガラガラヘビの粗毒、ＶＡＰ２、及び化２の添加をせず、そのまま４時間培養を続けた。
【０１９８】
４時間培養後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、１００倍希釈したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ファロイジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社）で１時間、アクチンを染色し、その後洗浄して蛍光観察した。蛍光観察は蛍光顕微鏡ＢＺ−９０００（ＫＥＹＥＮＣＥ社）を用い、励起波長４７０ｎｍ、吸収波長５３５ｎｍ、対物レンズ４０倍で観察・撮影した。
上述の「（ＶＡＰと仮足）」の実施例においては、生存因子の除去／ニシダイヤガラガラヘビの粗毒・ＶＡＰを添加した後２４時間程度経てからアポトーシスが始まった。パラホルムアルデヒドによる固定は生存因子の除去／ニシダイヤガラガラヘビの粗毒・ＶＡＰを添加した後４時間の時点で行ったので、アポトーシスは始まっていなかった。
【０１９９】
ニシダイヤガラガラヘビの粗毒を使用した実験結果を図１２に示す。図１２Ａは培養液交換後４時間のコントロールの実験結果であり、繊維状のアクチン蛋白質の骨格が見られ、際立った仮足の形成は見られない。
【０２００】
図１２Ｂは、ニシダイヤガラガラヘビの粗毒添加後４時間の細胞を示す。骨格タンパク質であるアクチンを染色しているので、強い蛍光を示す部位はアクチンの集積を意味する。細胞の先端にアクチンの集積を伴う細長い突起状の仮足が形成されている。仮足には顆粒状またはリング状のポドソームが見られるものも多い。図１２Ｂは上記ヘビ毒添加４時間後の仮足で、この仮足は上記ヘビ毒の添加後３０分後に観察され２４時間程度まで続いた。２４時間程度すると仮足がつぶつぶしてきて、図７Ｅや図８Ａのようになった。
【０２０１】
図１２Ｃは上記ヘビ毒及び化２の添加後４時間の細胞を示す。１２Ｂに比べて突起状の仮足は少なくアクチンの集積が弱まっており、仮足の形成が抑制された。
【０２０２】
ヘビ毒ＡＤＡＭであるＶＡＰ２についても同様の結果を得た。上述の通り、ＶＡＰ２はヒトＡＤＡＭのホモログである。よって、ヘビ毒ＡＤＡＭやヒトＡＤＡＭの投与・導入等により、仮足の形成、仮足の保持ができることが有効に推測される。
【産業上の利用可能性】
【０２０３】
本発明によって、有用なＡＤＡＭ作用阻害物質のスクリーニング方法、仮足の保持方法、仮足保持剤、仮足の制御物質のスクリーニング方法、及びＡＤＡＭ作用阻害剤が提供される。
【図１】
0005888667.tif 000037
【図２】
0005888667.tif 000038
【図３】
0005888667.tif 000039
【図４】
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【図５】
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【図６】
0005888667.tif 000042
【図７】
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【図８】
0005888667.tif 000044
【図９】
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【図１０】
0005888667.tif 000046
【図１１】
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【図１２】
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