(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
流路と、前記流路に接続された注入口及び排出口とを有する、細胞または細菌の分析に用いるフローセルであって、
前記流路内には、前記細胞または細菌を捕捉する捕捉構造体が設けられ、前記捕捉構造体は死水域を形成する構造であり、前記死水域に前記細胞または細菌を捕捉し、
前記捕捉構造体は、前記細胞または細菌を通すスリットを有するスリット部材と、該スリット部材の下流側に該スリット部材に対向して設けられ、前記細胞または細菌を収容する収容部材とを備えていることを特徴とするフローセル。
【請求項２】
請求項１において、
前記収容部材は、Ｕ字型の湾曲形状を有することを特徴とする、フローセル。
【請求項３】
請求項２において、
前記収容部材は、前記スリットに対向する位置に窪みを有することを特徴とする、フローセル。
【請求項４】
請求項１において、
前記捕捉構造体は、液が流れる方向及びその方向に直行する方向に行列状に並んでおり、
捕捉構造体は、行方向に等間隔に並んでおり、
偶数行目に配置された隣接する捕捉構造体の略中間に、奇数行目の捕捉構造体が配置されていることを特徴とする、フローセル。
【請求項５】
請求項１において、
前記捕捉構造体の高さは、前記流路の高さと同じであることを特徴とする、フローセル。
【請求項６】
請求項１において、
前記捕捉構造体は、一対の平行な曲線波形の構造体であり、この曲線波形は、周期性を持っており、かつ、各周期の波形は対称であり、
一対の構造体の一方は、上端にスリットを有しており、他方は、下端にスリットを有しており、それぞれのスリットは所定の間隔で設けられていることを特徴とする、フローセル。
【請求項７】
請求項１において、
前記捕捉構造体の捕捉率は下流側に近づくにつれて高くなることを特徴とする、フローセル。
【請求項８】
請求項７において、
前記捕捉構造体の大きさは、下流側に近づくにつれて大きくなることを特徴とする、フローセル。
【請求項９】
請求項７において、
前記スリット部材のスリットの間隔は、下流側に近づくにつれて大きくなることを特徴とする、フローセル。
【請求項１０】
請求項７において、
前記捕捉構造体の行方向の数は、下流側に近づくにつれて多くなることを特徴とする、フローセル。
【請求項１１】
流路と、前記流路に接続された注入口及び排出口とを有する、フローセルを用いて細胞または細菌の分析を行う分析方法であって、
前記流路内に設けられた、前記細胞または細菌を捕捉する捕捉構造体によって死水域を形成し、前記死水域に前記細胞または細菌を捕捉する工程を有し、
前記捕捉構造体は、前記細胞または細菌を通すスリットを有するスリット部材と、該スリット部材の下流側に該スリット部材に対向して設けられ、前記細胞または細菌を収容する収容部材とを備えており、
前記細胞または細菌に対して、前記スリットの間隔が大きく、かつ、前記スリット部材と前記収容部材との隙間の間隔よりも大きいことを特徴とする分析方法。
【請求項１２】
請求項１１において、
前記細胞または細菌が細菌、細胞、またはそれらの少なくともいずれか一方と微粒子との結合体のいずれかであることを特徴とする、分析方法。
【請求項１３】
請求項１１において、
捕捉した細胞または細菌を検出する工程を有することを特徴とする、分析方法。
【請求項１４】
請求項１３において、
前記検出する工程では、ラマン、明視野、暗視野、位相差、微分干渉、蛍光、発光、電子顕微鏡のいずれかを用いることを特徴とする、分析方法。
【請求項１５】
請求項１３において、
前記検出する工程後に、送液速度、または送液速度と送液方向を変化させて細胞または細菌を回収する工程を有することを特徴とする、分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞または細菌などの生体関連物質を含む溶液をデバイスへ送液して、それら全てを単一かつ独立した位置に配置して、分析を行うフローセル、これを用いた分析装置、及び分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞や細菌などの生体関連物質の解析は、培養法で生体関連物質を増殖してから多数の生体関連物質の平均値を求める手法で行うのが一般的である。これに対して、近年単一の生体関連物質を解析する方法が提案されており、細胞応答や抑制のメカニズム、細胞−細胞相互作用、幹細胞分化の研究が行われている。その結果、多数の生体関連物質の平均化された振る舞いと、単一の生体関連物質の振る舞いが大きく異なることが明らかとなっている。本方法では１個の生体関連物質を解析できることから、培養法で増殖が困難な生体関連物質や数の少ない生体関連物質を解析できるだけではなく、培養可能な生体関連物質を増殖させる工程を省いて早期に解析することもできる。このことにより現状培養困難と言われる９９.９％の細菌や、幹細胞など数の少ない患者由来の細胞や細菌を早期に解析できることが期待されるため、単一の生体関連物質の解析はますます重要となっている。近年では血液中に存在するがん細胞であるＣＴＣ（Circulating Tumor Cell）や細菌の同定も行われている。
【０００３】
単一の生体関連物質を解析するためには、複数の生体関連物質を、単一かつ独立した位置に配置する必要がある。ここで、独立した位置とは、単一の生体関連物質を分析する装置において、それらが識別できる位置にあることを意味する。生体関連物質を単一かつ独立した位置に配置する方法は、非特許文献１のレビュー論文に記載されているように、流体力学を利用した方法、電気、光、磁気、超音波などの外力を利用する方法、表面処理や化学結合を利用する方法に大別できる。ここで注意すべき点は、生体関連物質を配置する際に、生体関連物質の表現形が変わらないようにすることである。例えば表面処理や化学結合により生体関連物質を配置する場合には、生体関連物質が化学変化や構造変化を起こす可能性があり、実際とは異なる生体関連物質の振る舞いを分析してしまう可能性がある。また外力を用いた方法は制御が難しいため、流体力学のみに基づく生体関連物質の配置方法が最も望ましいと考えられる。従って以下流体力学に基づく生体関連物質の配置方法の報告について、概要と課題を説明する。
【０００４】
単一の生体関連物質を解析する最も一般的な方法は、スライドガラスとカバーガラスの間に生体関連物質を含む溶液を封入して観察する方法である。アガロースゲルやブロッキング剤（ＢＳＡ、Caseinなど）を塗布したスライドガラスを用いることで、生体関連物質の変性や非特異吸着を防ぐ方法があるほか、生体関連物質を含む溶液をマイクロチップの流路へ送液してから静止状態で観察する方法もある。いずれの方法も、生体関連物質を含む溶液の濃度を調製することで、生体関連物質を単一かつ独立した位置に配置できる。例えば、スライドガラスとカバーガラス（２０mm×２０mm）との間の隙間（０.０２５mm）の部分に１０μｌの生体関連物質を含む溶液を封入した場合を考える。生体関連物質を平均１mm間隔で配置したい場合には４×１０4個／ml（４０個／μｌ）、平均０.１mm間隔で配置したい場合には４×１０6個／ml（４０００個／μｌ）にそれぞれ生体関連物質を含む溶液を調製すればよい。但し上述の方法では、生体関連物質がスライドガラスやカバーガラスなどへ非特異吸着した場合を除いて、生体関連物質の位置はブラウン運動や生体関連物質自体の運動性などにより不規則に変化する。従って生体関連物質が観察視野から外れると再び同一の生体関連物質を特定することが困難であること、生体関連物質同士の間隔はあくまで平均値であるために、生体関連物質は常に独立した位置に存在するわけではなく別の生体関連物質と隣接する場合があること（この場合、分析装置では生体関連物質同士が隣接していることは識別できない）、生体関連物質の動きを追従することが困難であることが課題である。また生体関連物質を含む微量な溶液（この場合は１０μｌ）しか解析に用いることができない。
【０００５】
また別の方法として、マイクロタイタープレートを用いた方法がある。これはｆＬ（１０-15Ｌ）からｐＬ（１０-12Ｌ）の大きさのマイクロウエルが多数作製されたマイクロタイタープレートに、濃度を調整した生体関連物質を含む溶液を分注して、確率的に１つの細菌が１つのマイクロウエルに入るようにしたものである。更にマイクロウエルの大きさを配置したい生体関連物質の大きさより少しだけ大きく設計することで、複数の生体関連物質が同じマイクロウエルへ入らないようにできる。この方法を用いて８０−９０％のマイクロウエルに単一の細胞（数十μｍ）を導入した例が報告されている。但し例えば細菌のように大きさが数μｍと小さい場合、形状が球状ではなく棒状の場合、それ自体が運動性を有する場合には適用がより困難となる。またマイクロウエルとカバーガラスの隙間が液体で満たされている場合、運動性を有する細菌などが流出する可能性がある。またマイクロウエル内の溶液を交換するためには、置換効率が悪いために多くの液量と時間を要するほか、生体関連物質の回収が困難な課題がある。また生体関連物質を含む微量な溶液しか解析に用いることができない。
【０００６】
生体関連物質を含む微量な溶液しか解析できない課題を解決する方法として、マイクロチップの流路内に生体関連物質を捕捉するための構造体を設けておき、生体関連物質を含む溶液を流しながら捕捉する方法がある。生体関連物質を必要な量だけ送液できるため、生体関連物質を含む溶液の濃度を調製する必要が無く、非常に希薄な溶液でも使用することができる。以下本方法に基づく生体関連物質の配置方法の報告について、概要と課題を説明する。
【０００７】
非特許文献２では、約１０μｍのＣＤ３４細胞を捕捉するための構造体として、細胞より小さい数μｍのスリットを３箇所設けた籠形状の捕捉構造体を用いている。生体関連物質を含む溶液を送液することで、上記スリット部を溶液が通過して、籠形状の捕捉構造体に溶液が導入される。なお籠形状の捕捉構造体がスリットを有さない場合には、溶液を送液する前に存在する空気（気泡）を追い出すことが困難となるため、実用的ではない。上記スリット部から生体関連物質を含む溶液が排出される分だけ、生体関連物質を含む溶液を籠形状の捕捉構造体に導入できる。その際に生体関連物質が導入されるとスリットを通過できないために、籠形状の捕捉構造体に捕捉される。籠形状の捕捉構造体は、ＣＤ３４細胞と類似した大きさであるため、複数のＣＤ３４細胞が同一の捕捉構造体に入る確率を下げ、大部分の捕捉構造体に単一のＣＤ３４細胞を捕捉することができる。捕捉構造体のスリットの幅や数を変えることで、捕捉構造体に導入できる生体関連物質を含む溶液の割合が変わるため、結果として生体関連物質を捕捉する捕捉率が変化する。この場合には以下４つの課題がある。一つ目は、大きさ既知の生体関連物質であればスリット幅をそれ未満に設定することで、生体関連物質を捕捉できるが、生体関連物質の大きさが小さくなるほど狭い幅のスリットを作製する必要がある。例えばＣＤ３４細胞は約１０μｍだが、細菌の短軸は約０.５〜１.０μｍである。スリット幅の設計値にスリットの最大加工誤差を加えた値が、生体関連物質の大きさ未満でなければならないため、０.１μｍ単位の高い加工精度が要求される。従って製造コストが高くなる。また狭い幅のスリットを用いることで生体関連物質の捕捉率は低くなる。二つ目は、捕捉構造体を生体関連物質の大きさと類似させることで、複数の生体関連物質が同一の捕捉構造体に捕捉される確率を下げ、大部分の捕捉構造体に単一の生体関連物質を捕捉しているが、生体関連物質の大きさや形状に広がりがある場合には、１つの捕捉構造体に複数の生体関連物質が捕捉されてしまう。例えば細菌の長さは、短軸（約０.２〜１.０μｍ）と長軸（約１〜１０μｍ）であり、広い範囲に亘る。三つ目は、全ての生体関連物質を捕捉構造体に捕捉できておらず、捕捉された生体関連物質のみを解析対象としているため、重要な情報を見逃す恐れがあることや生体関連物質の個数を定量できない課題がある。四つ目は、生体関連物質がスリット部に引き込まれる力を受け続けることで、生体関連物質にストレスが発生して表現形が変わる可能性があることである。特許文献１では、一見スリットを有さない捕捉構造体に見えるが、Ｚ方向に２μｍの隙間があり、非特許文献２のスリットと同様の機能を有している。
【０００８】
非特許文献３では、約０.８μｍのスリットを有する捕捉構造体を用いて、単一の大腸菌を異なる捕捉構造体位置に捕捉している。非特許文献２や特許文献１とは異なり、捕捉構造体を生体関連物質の大きさより十分大きくし、かつ生体関連物質が捕捉される確率を下げることで、結果的に同一の捕捉構造体に単一の生体関連物質を捕捉している。但し以下の課題を抱えている。一つ目は、０.８μｍ以下の大腸菌は捕捉されないことである。更に大腸菌は、条件によって自身の短軸の半分の流路でも通過できることが非特許文献４で報告されている。この場合１.６μｍの大腸菌でも条件によっては通過することになる。二つ目は、全ての生体関連物質を捕捉構造体に捕捉できておらず、またその条件も検討されていないことである。三つ目は、生体関連物質がスリット部に引き込まれる力を受け続けることで、生体関連物質にストレスが発生して表現形が変わる可能性があることである。四つ目は、非特許文献３で述べられているが、高速で送液した場合に、細菌が溶解する可能性があることである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＵＳ２０１０／０００３６６６
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Analytica Chimica Acta 649 (2009) 141-157
【非特許文献２】Biomicrofluidics 5, 024106 (2011)
【非特許文献３】Lab Chip, 2011, 11, 1089
【非特許文献４】PNAS, 2009, 106, 14861-66
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記背景技術を纏めると、細胞または細菌などの生体関連物質全てを単一かつ独立した位置に配置するには、次のような課題がある。
【００１２】
１．生体関連物質が小さいほど狭い幅のスリットを作製しなければならない。
狭い幅のスリットを作製すると製造コストが高くなる。また狭い幅のスリットを用いることで生体関連物質の捕捉率は低くなる。捕捉構造体がスリットを有さない場合には、溶液を送液する前に存在する空気（気泡）を追い出すことが困難となる。
【００１３】
２．生体関連物質をスリットで捕捉するため、外力が加わりストレスが発生する。
生体関連物質にストレスが加わると、表現形が変わる可能性がある。またスリットに挟まっている生体関連物質に対して、流れ場からのせん断力も発生する。
【００１４】
３．高速で送液したときに、生体関連物質が溶解する可能性がある。
上記背景技術で説明した方法を用いて、部分的に解決できている課題もあるが全てではない。本発明は、これらの要請全てに応えることのできる分析装置を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明による分析に用いるフローセルは、流路と、前記流路に接続された注入口及び排出口とを有する、生体関連物質の分析に用いるフローセルであって、前記流路内には、前記生体関連物質を捕捉する捕捉構造体が設けられ、前記捕捉構造体は死水域を形成する構造であり、前記死水域に前記生体関連物質を捕捉する。
【発明の効果】
【００１６】
細胞または細菌などの生体関連物質を含む溶液をデバイスへ送液して、単一かつ独立した位置に配置して、分析できる。上記した以外の、課題、構成および効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】捕捉構造体の一例を示す概略図。
【図２】捕捉構造体への流体シミュレーションの一例。
【図３】捕捉構造体への流体シミュレーションの一例。
【図４】捕捉構造体への流体シミュレーションの一例。
【図５】全ての生体関連物質を捕捉するためのパラメータに関する概略図。
【図６】捕捉率と捕捉構造体数。（送液方向）
【図７】捕捉構造体数（送液方向）とチャネル長さ。
【図８】少なくとも２個以上の生体関連物質が同一の捕捉構造体に捕捉される確率。
【図９】２個の生体関連物質が同一の捕捉構造体に捕捉される確率。
【図１０】３個の生体関連物質が同一の捕捉構造体に捕捉される確率。
【図１１】捕捉構造体の一例を示す概略図。
【図１２】分析装置の一例を示す概略図。
【図１３】分析装置の一例を示す概略図。
【図１４】フローセルの一例を示す概略図。
【図１５】サンプリングノズルの洗浄時の制御手順の例を示すフローチャート。
【図１６】フローセル内部洗浄時の制御手順の例を示すフローチャート。
【図１７】試薬容器から試薬を吸引する手順の例を示すフローチャート。
【図１８】フローセルへの試薬注入の手順の例を示すフローチャート。
【図１９】サンプリングノズルの注入ポートへの挿入・離脱、及びマイクロシリンジのプランジャの駆動のタイミングと、フローセル内の圧力変化の関係を示す模式図。
【図２０】検出の手順の例を示すフローチャート。
【図２１】回収の手順の例を示すフローチャート。
【図２２】列ごとの捕捉率を変えた構造体の一例を示す概略図。
【図２３】列ごとの捕捉率を変えた構造体の一例を示す概略図。
【図２４】列ごとの捕捉率を変えた構造体の一例を示す概略図。
【図２５】捕捉構造体の一例を示す概略図。
【図２６】捕捉構造体の死水域を広げた一例を示す概略図。
【図２７】捕捉構造体の変形例を示す概略図。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。本発明は、複数の生体関連物質を単一かつ独立した位置に配置して、分析を行う方式の分析装置一般に適用可能である。ここでは、本発明を細菌分析に適用した場合の例について説明する。
【００１９】
図１は、本発明による捕捉構造体の一例を示す概略図である。捕捉構造体１は、スリットを有する構造体１ａとスリットを有さない構造体１ｂが一対である構造体であり、複数配置されている。スリットを有する構造体１ａは、スリットを有する構造体の左側１ａLとスリットを有する構造体の右側１ａRから構成され、その間にはスリット２が存在する。図１の上側にある注入口（図１４ご参照）から図示しない生体関連物質４を含む溶液を注入し、流路３を通して送液され、図１の下側にある排出口（図１４ご参照）から排出される。捕捉構造体１の高さは流路の高さと等しいとする。この過程において、図示しない生体関連物質４を含む溶液は、ある確率で、スリットを有する構造体１ａに流入し、スリット２を通過して、スリットを有する構造体１ａとスリットを有さない構造体１ｂの２箇所の隙間から流出する。この際に、ある確率で、生体関連物質４は死水域５で捕捉される。死水域５は、流れのない場所あるいは流れがあっても渦状の場所で流量の疎通に関係のない領域である。スリット２を通過した生体関連物質４は、拡散、慣性力、またはその運動性により、ある確率で死水域５に捕捉される。死水域５は、急拡大部、急縮小部、湾曲部などの領域に形成される。スリットを有さない構造体１ｂの死水域に近い場所にくぼみをつけるなど構造を最適化することで、死水域５の領域を広げることも可能である。死水域５に捕捉された生体関連物質４は、流体の力を殆ど受けない。従って生体関連物質４にストレスは発生せず、溶解することもない。また死水域５の下流側は、スリットを有さない構造体１ｂが存在する。従って生体関連物質４が小さくても、死水域５から下流側へ流れることはない。スリットを有する構造体１ａは、スリット２を通して、スリットを有さない構造体１ｂの流路下流側から生体関連物質４を含む溶液を流路上流側へ満たす作用があるため、気泡が除去しやすい。スリットを有する構造体１ａとスリットを有さない構造体１ｂは、楕円弧の一部から構成されているが、これ以外にも円弧の一部や三角形の一部から構成することもできる。構造体形状の違いにより、流れの違いが発生し、結果として生体関連物質４の捕捉率の違いとなる。
【００２０】
図２Ａは、幅１mmの流路の中央部に前記捕捉構造体を置き、左側から右側へ１mm／ｓの流速で送液した時の流体シミュレーション結果である。前記スリットの幅は５μｍである。また図２Ｂは、前記捕捉構造体の領域を拡大した図であり、溶液が流れる方向を矢印で示している。これより、前記スリットを通過した溶液は、スリットを有する構造体１ａとスリットを有さない構造体１ｂの２箇所の隙間へ向かって、分岐して流出される。従って分岐する領域において、前記死水域が形成される。
【００２１】
一方図３Ａは、幅１mmの流路の中央部からずらした部分に前記捕捉構造体を置き、左側から右側へ１mm／ｓの流速で送液した時の流体シミュレーション結果である。前記スリットの幅は５μｍである。また図３Ｂは、前記捕捉構造体の領域を拡大した図であり、溶液が流れる方向を矢印で示している。これより、前記スリットを通過した溶液は、スリットを有する構造体１ａとスリットを有さない構造体１ｂの２箇所の隙間のうち１箇所へ向かって流出される。また一方の隙間から他方の隙間へ向かう流れが形成されている。従って図２とは異なり、分岐する領域が無いため、前記死水域は形成されない。
【００２２】
また図４Ａは、幅１mmの流路の中央部からずらした部分に前記捕捉構造体を置き、左側から右側へ１mm／ｓの流速で送液した時の流体シミュレーション結果である。前記スリットの幅が３０μｍである以外は、図３と同じ条件である。また図４Ｂは、前記捕捉構造体の領域を拡大した図であり、溶液が流れる方向を矢印で示している。これより、前記スリットを通過した溶液は、スリットを有する構造体１ａとスリットを有さない構造体１ｂの２箇所の隙間へ向かって、分岐して流出される。従って図３の場合と異なり、分岐する領域において、前記死水域が形成される。ゆえに、前記スリットを有する構造体は、前記スリットの幅などのパラメータを調整することで、死水域を形成できる利点がある。
【００２３】
次に全ての前記生体関連物質を捕捉する条件について説明する。まず前記捕捉構造体への前記生体関連物質の捕捉率（／１捕捉構造体）は、［α：（前記捕捉構造体へ流入する流量）／（全流量）］×［β：前記捕捉構造体における前記生体関連物質の捕捉率］で計算される。βは０〜１の範囲であるが、前記パラメータを調整することでβ＝１（前記捕捉構造体に流入した前記生体関連物質が全て捕捉）になるとすると、捕捉率（／１捕捉構造体）はαで近似できる。もちろんαに安全係数を乗じてもよい。従って捕捉率（／１捕捉構造体）は、［（前記スリットの幅）×（前記スリットにおける平均流速）］／［（前記流路の幅）／（前記流路の平均流速）］で計算できる。図３の例では、捕捉率（／１捕捉構造体）は、［（０.００５mm）／（０.０００４mm／ｓ）］／［（１mm）／（１mm／ｓ）］で０.０００００２と計算される。これは、１００万個の前記生体関連物質のうち２個を前記捕捉構造体へ捕捉できる確率である。同様に図３の５μｍからスリット幅のみを３０μｍに変えた図４の例では、捕捉率（／１捕捉構造体）は、［（０.０３mm）／（０.００１６mm／ｓ）］／［（１mm）／（１mm／ｓ）］で０.００００５と約２５倍となる。ゆえに、前記スリットを有する構造体は、前記捕捉構造体同士の間隔、前記スリットの幅、前記流路の幅、流速などのパラメータを調整することで、捕捉率（／１捕捉構造体）を調整できる利点がある。例えば図４の流路の幅１mmを０.３６mmに変えるだけで、捕捉率（／１捕捉構造体）は、０.００１と大きくなる。但し図２〜図４に示すように、前記生体関連物質を含む溶液は、前記捕捉構造体に流入する直前に流れ方向が変わるが、前記生体関連物質には慣性力が働くため、急激には方向を変えることができず、前記捕捉構造体へ流入しやすくなる。従って実際の捕捉率（／１捕捉構造体）は、流量比の計算結果より高くなる。従って流速が速いほど、慣性力は強く働くため、実際の捕捉率（／１捕捉構造体）は高くなる。
【００２４】
図５は、全ての細菌を捕捉する条件を計算するためのパラメータである。１個の捕捉構造体での捕捉率がわかれば、全ての前記生体関連物質を捕捉する条件を計算することができる。#Bacteriaは、前記捕捉構造体へ送液する前の細菌数であり、#Non-trapped Bacteriaは前記捕捉構造体へ送液した後の細菌数である。送液方向はFlow directionの矢印で示された方向である。Trap rateは、細菌が前記捕捉構造体へ捕捉される割合であり、［（#Bacteria）−（#Non-trapped Bacteria）］／（#Bacteria）で計算される。前記捕捉構造体は、半円の弧で簡略化して示しており、隣接する前記捕捉構造体の間隔を、Ｔrap interval (x)とTrap interval (y)とした。ここでｘ方向は送液方向と平行な向きで、ｙ方向はそれと垂直な向きとする。また#Trap Object (Column)は、ｙ方向に並べられた捕捉構造体数であり、#Trap Object (Row)は、ｘ方向に並べられた捕捉構造体数である。Channel lengthは送液方向（ｘ方向）の捕捉構造体が形成された流路の長さであり、Trap interval (x)×#Trap Object (Row)で計算される。同様にChannel widthはｙ方向の捕捉構造体が形成された流路の長さであり、Trap interval (y)×#Trap Object (Column)で計算される。Trap rate (/width)は、ｙ方向に配置された捕捉構造体１列を通過した時の捕捉率を示す。#Trapped bacteria (1st column)は、１列目の捕捉構造体において捕捉される細菌数であり、［Trap rate (/width)］×（#Bacteria）で計算される。#Trapped bacteria (1st column)は、通過する捕捉構造体の列が増えるにつれて小さくなる。Trap rate (/width)は、図２〜図４において、流路の幅がTrap interval (y)とした時の捕捉率（／１捕捉構造体）と等しい。なぜならば、Trap interval (y)あたりの捕捉構造体の捕捉率と、それを複数個並列に並べた場合の捕捉率は同じになるためである。
【００２５】
図６は、Trap rate (/width)を０.０００１から０.１まで振った時のTrap rateと#Trap object (Row)との関係である。Trap rate (/width)が０.０１の時、９５％捕捉するには３００列、９９％捕捉するには４７０列、９９.９％捕捉するには７００列の捕捉構造体を送液方向（ｘ方向）に配置する必要がある。またＴrap rate (/width)が０.００１の時、９５％捕捉するには３０００列、９９％捕捉するには４７００列、９９.９％捕捉するには７０００列の捕捉構造体を送液方向（ｘ方向）に配置する必要がある。
【００２６】
図７は、Trap interval (x)を１０から１０００μｍまで振った時の#Trap object (Row)とChannel length (mm)との関係である。Trap interval (x)が１００μｍの時、Trap rate (/width)が０.０１で９９.９％捕捉する７００列の捕捉構造体を配置する場合には７０mm、Trap rate (/width)が０.００１で９９.９％捕捉する７０００列の捕捉構造体を配置する場合には７００mmのChannel lengthが必要となる。一般的なマイクロチップが、ユーザーが扱いやすい大きさで、ハガキ程度の大きさ（１００mm×１５０mm）が上限であると考えると、７００mmのChannel lengthを実現させるためには、蛇行流路などで実現する必要がある。最大の#Trap object (Row)を見積もるためには、細菌を捕捉するための最小の捕捉構造体の大きさを求めて、最小のTrap interval (x)を求めておく。また蛇行流路などを含めたChannel lengthの最大値を求めておき、最小のTrap interval (x)で割り算をして算出できる。
【００２７】
次に全ての細菌を単一で独立した位置に配置するための条件を説明する。#Trapped bacteria (1st column)が１以下であれば、全ての細菌を単一で独立した位置に配置できる。#Trapped bacteria (1st column)は、［Trap rate (/width)］×（#Bacteria）であることから、Trap rate (/width)を１／#Bacteria以下にすればよい。例えば、#Bacteriaが１０００個であれば、Trap rate (/width)を０.００１以下にすることで、全ての細菌を単一で独立した位置に配置できる。#Bacteriaがわからない場合には、#Trapped bacteria (1st column)が１より大きくなる可能性があるため、同一の捕捉構造体に複数の細菌が捕捉される場合がある。この場合、#Bacteriaを含む溶液を分割することで#Trapped bacteria (1st column)を小さくすることや、Trap rate (/width)が十分小さくなるように設計しておくことで、#Trapped bacteria (1st column)を１以下にできる可能性はある。下表は#Trapped bacteria (1st column)が１０で、#Trap object (Column)が１００の時に、各捕捉状態の確率を計算したものである。捕捉例の欄の半円は捕捉構造体を、黒丸（●）は捕捉された細菌を示す。
【００２８】
【表１】
0005965702.tif 000002
【００２９】
図８は、#Trapped bacteria (1st column)を１から２８まで振った時の#Trap object (Column)と少なくとも２個以上の細菌が同一の捕捉構造体に捕捉される確率との関係である。これより#Trapped bacteria (1st column)が１０で、#Trap object (Column)が１００の時に、０.３７（３７％）の確率で、少なくとも２個以上の細菌が同一の捕捉構造体に捕捉される。
【００３０】
図９は#Trapped bacteria (1st column)を１から２８まで振った時の#Trap object (Column)と２細菌のみが同一の捕捉構造体に捕捉される確率との関係である。これより#Trapped bacteria (1st column)が１０で、#Trap object (Column)が１００の時に、０.７５（７５％）の確率で、２細菌のみが同一の捕捉構造体に捕捉される。複数で捕捉される確率が０.３７であることから、０.２０（＝０.３７×０.７５）の確率で２細菌のみが同一の捕捉構造体に捕捉される。この場合、残りの８細菌は単一で捕捉構造体に捕捉される。
【００３１】
図１０は#Trapped bacteria (1st column)を１から２８まで振った時の#Trap object (Column)と３細菌のみが同一の捕捉構造体に捕捉される確率との関係である。これより#Trapped bacteria (1st column)が１０で、#Trap object (Column)が１００の時に、０.０５５（５.５％）の確率で、３細菌のみが同一の捕捉構造体に捕捉される。複数で捕捉される確率が０.３７であることから、０.０２（＝０.３７×０.０５５）の確率で３細菌のみが同一の捕捉構造体に捕捉される。この場合、残りの７細菌は単一で捕捉構造体に捕捉される。以上より、#Trapped bacteria (1st column)が１０で、#Trap object (Column)が１００の時に、２個以上の細菌が同一の捕捉構造体に捕捉される確率が０.３７、そのうち２細菌のみが同一の捕捉構造体に捕捉される確率が０.２０、３細菌のみが同一の捕捉構造体に捕捉される確率が０.０２であることから、４細菌以上が同一の捕捉構造体に捕捉される確率は、０.１５［＝０.３７−（０.２０＋０.０２）］となる。また#Trapped bacteria (1st column)が大きく、#Trap object (Column)の数が少ないほど、同一の捕捉構造体に複数の細菌が捕捉される確率は大きくなる。
【００３２】
本発明の効果を以下に示す。
【００３３】
１．細菌を含む溶液の濃度を調製しなければならない。
マイクロチップの流路内に細菌を捕捉するための構造体を設けておき、細菌を含む溶液を流しながら捕捉する。細菌を含む溶液を必要な量だけ送液できるため、細菌を含む溶液の濃度を調製する必要が無く、非常に希薄な溶液でも使用できる。
【００３４】
２．細菌が小さいほど狭い幅のスリットを作製しなければならない。
スリットで細菌を捕捉する原理ではないため、狭い幅のスリットを作製する必要はない。
【００３５】
３．全ての細菌を捕捉できない。
１個あたりの捕捉構造体の捕捉率を計算することで、全ての細菌を捕捉する捕捉構造体数を算出できる。
【００３６】
４．細菌をスリットで捕捉するため、外力が加わりストレスが発生する。
スリットで細菌を捕捉するのではなく、死水域で捕捉するため、外力は加わらない。
【００３７】
５．１つの捕捉構造体に複数の細菌が捕捉される。
#Trapped bacteria (1st column)を１以下にすることで、１つの捕捉構造体に複数の細菌が捕捉されるのを回避できる。
【００３８】
６．高速で送液したときに、細菌が溶解する可能性がある。
細菌を死水域で捕捉するため、流体からの外力は加わらない。
【００３９】
また本発明は、スリットを有する構造体とスリットを有さない構造体が一対である構造体とすることで、以下３つの利点がある。
１．スリットを有する構造体は、スリットを通して、スリットを有さない構造体の流路下流側から流路上流側へ溶液を満たせるため、気泡が除去しやすい。
２．スリットを有する構造体は、スリットの幅などのパラメータを調整することで、死水域を形成できる。
３．スリットを有する構造体は、捕捉構造体同士の間隔、スリットの幅、流速などのパラメータを調整することで、捕捉率を変えることができる。捕捉率を大きくすることで、全ての生体関連物質を捕捉することができる。図１に示したスリット２は１箇所であるが、非特許文献２のように、スリットを複数個設けてもよい。
【００４０】
捕捉構造体への生体関連物質の捕捉率（／１捕捉構造体）は、［α：（捕捉構造体へ流入する流量）／（全流量）］×［β：捕捉構造体における生体関連物質の捕捉率］で計算され、αで近似できることを説明した。αが大きいほど必要な捕捉構造体数が少なくなるため、スリットの幅や流路の幅を変えることでαが０.００１まで大きくできることを説明した。
【００４１】
図１１は、αを１にするための配置の一例を示す概略図である。全ての生体関連物質４を含む溶液は、捕捉構造体のスリットを通過するため、図１の捕捉構造体同士の間隔を０にした形状とみなせる。図１１の上側にある図示しない注入口から図示しない生体関連物質４を含む溶液を注入し、流路３を通して送液され、図１１の下側にある図示しない排出口から排出される。この過程において、図示しない生体関連物質４を含む溶液は、スリット２ａを通過して、スリット２ｂまたは２ｂ′から流出する。この際に、ある確率で、生体関連物質４は死水域５で捕捉される。死水域５は、流れのない場所あるいは流れがあっても渦状の場所で流量の疎通に関係のない領域である。スリット２を通過した生体関連物質４は、拡散、慣性力、またはその運動性により、ある確率で死水域５に捕捉される。従って、フィルタのように、生体関連物質４より小さい大きさのスリット（孔）で捕捉するわけではない。また死水域に捕捉した生体関連物質４を回収することも可能である。これは、死水域に捕捉した生体関連物質４は、送液を停止すると、自身の拡散や運動性により死水域５の領域から逸脱する。次に逆方向へ送液する。つまり図１１の下側にある図示しない注入口から回収液を注入し、流路３を通してスリット２ｂまたは２ｂ′を通過して、スリット２ａから流出することで、図１１の上側にある図示しない排出口から生体関連物質４とともに回収液が排出される。図１１は上下対称の形状であるため、図１１の下側にある図示しない注入口から回収液を注入した場合、当初存在した死水域５は無くなり、代わりにスリット２ｂと２ｂ′の図上側に死水域が形成される。従って逆方向へ送液した場合でも図示しない排出口へ到達する前に捕捉される可能性がある。その場合には、再び送液を停止することで、生体関連物質４の拡散や運動性により死水域の領域から逸脱させ、その後送液するという手順を繰り返すことで、最終的に生体関連物質４を回収できる。あるいは送液方向は変えずに、送液と送液停止のみを繰り返すことで、排出口から生体関連物質を回収することもできる。生体関連物質４を回収できれば、その核酸を抽出して、ＰＣＲなどの遺伝子解析などの解析を行うこともできる。
【００４２】
図１２は、本発明による分析装置（細菌分析装置）の一例を示す概略図であり、図１２（ａ）は平面模式図、図１２（ｂ）はその正面模式図である。図のようにＸＹＺ軸を設定して説明する。
【００４３】
本実施例の分析装置は、複数の試薬容器１１を保持する試薬ラック１２を載置する試薬ラック台１３、１個又は複数個のフローセル３０を保持して移動可能なフローセルステージ３１、先端から液体を吸引・吐出することのできるサンプリングノズル２０、サンプリングノズル２０を所望の３次元位置に駆動するノズル駆動機構、サンプリングノズル２０を洗浄する洗浄槽６８、試薬注入によってフローセル３０内に捕捉された生体関連物質との反応や生体関連物質自体を分析するための検出ユニット４０を備える。サンプリングノズル２０による試薬の吸引・吐出、洗浄などは、図示しない送液システムによって実行される。送液システムについては、図１３を用いて詳述する。
【００４４】
分析装置の各部は制御・演算部５０の制御下にあり、制御・演算部５０は、入力部５１を介して制御・演算部５０に設定されたプログラムに従って分析装置を制御して連続運転する。制御・演算部５０のメモリには、分析の手順、試薬ラック１２に配置されている複数の試薬容器１１や洗浄槽６８の座標位置、各試薬容器に入っている試薬の種類、フローセル３０に試薬や洗浄液を注入する注入ポートの座標位置、検出ユニット４０による検出結果の処理手順等の情報が格納されている。制御・演算部５０は、メモリに格納された情報を参照しながら、分析プログラムに従って装置各部を制御し、分析を実行する。
【００４５】
サンプリングノズル２０は、一例として、先端部が外径１mm、内径０.５mm、長さ１５０mm程度の金属材料、例えばＳＵＳでできた中空ノズルであり、後述する送液システムに接続されて、先端部に試薬ラック１２に配置された所望の試薬容器１１から所要量の試薬を吸引し、フローセル３０等に吐出することができる。また、サンプリングノズル２０は、液面検知に適した材質と構造を有する。液面検知は、例えば、金属製のサンプリングノズル２０の先端が液面などの導電性領域に接触したときの静電容量変化から液面検知を行う既知の方式を用いて制御・演算部５０に設けられた液面検知部５３で実行される。液面検知部５３から出力される液面検知信号は、その後の装置制御に利用される。
【００４６】
ノズル駆動機構は、ガイドレール２１、ガイドレール２１に沿ってＸ軸方向に直線移動する直線移動ユニット２２、直線移動ユニット２２に設けられた回転軸２３の回りに回動可能なアーム２４を有する。アーム２４の回転軸２３と反対側の部分にサンプリングノズル２０が固定されている。直線移動ユニット２２は、例えば、ガイドレール２１に設けられたラックと噛み合うピニオンを有し、ピニオンをステッピングモータによって回転駆動することによって、Ｘ軸方向の所望位置に移動することができる。また、回転軸２３は、同様にステッピングモータによってＸＹ平面内に回転すると共に、Ｚ軸方向に上下動してサンプリングノズル２０の先端を所望のＺ軸方向位置に位置付けることができる。サンプリングノズル２０は、ノズル駆動機構によるＸ軸方向の直線移動、回転軸２３の回りの回転移動、Ｚ軸方向の上下移動を組み合わせることにより、試薬ラック１２に配置された任意の位置の試薬容器１１、洗浄槽６８、後述するフローセルの注入ポートにアクセスすることができる。
【００４７】
検出ユニット４０は、フローセルを照射する光源４１、及び光源からの光照射によってフローセル３０内に存在する生体関連物質から発生されたラマン光を分散させる回折格子、ミラー、フィルタ、スリット、共焦点検出用のホールなどの光学部品を通して、ＣＣＤ等の撮像装置４２で検出される。検出ユニット４０は、光学系を選択することで、明視野、暗視野、位相差、微分干渉、蛍光、発光なども可能であり、ラマン観察に限定されるものではない。
【００４８】
フローセル３０は、フローセルステージ３１によってＸＹ軸方向に移動可能である。フローセル３０は、サンプリングノズル２０を介した試薬注入や洗浄等の操作を受ける際には、図示するように検出ユニット４０の下方から外れた場所に位置し、検出ユニット４０を用いた検出を行う際には、フローセルステージ３１によって検出ユニット４０の下方位置に移動される。入力部５１から入力された入力情報、検出ユニット４０による撮像画像などの分析過程の情報、現在の装置状態や装置パラメータなどの情報、分析の全工程中での終了済み工程に関する情報、分析結果などの情報は表示部５２に表示される。
【００４９】
また一般的な生物顕微鏡の配置のように、検出ユニット４０をフローセル３０の下側に配置することも可能である。この配置では、フローセル３０の上側からサンプリングノズル２０から試薬を吐出しながら、検出ユニット４０で検出することが可能である。同様にフローセル３０は、図１２の水平配置だけではなく、傾斜配置や垂直配置も可能である。例えばフローセル３０を垂直配置して、送液しながら垂直に配置された検出ユニット４０で検出することもできる。垂直配置されたフローセル３０の下側から上側へ送液することで、フローセル３０内の気泡を除去しやすくなる。また細菌の比重が試薬の比重より軽い場合には浮力を、重い場合には重力を利用して捕捉させることもできる。
【００５０】
図１３は、本実施例の分析装置に組み込まれている送液システムの一例を示す概略図である。サンプリングノズル２０先端からの試薬の吸引・吐出、及びサンプリングノズル２０の洗浄が、この送液システムによって行われる。本実施例の送液システムは、サンプリングノズル２０の先端から試薬を秤量して吸引・吐出するためのマイクロシリンジ６０と、洗浄液をサンプリングノズル２０及び洗浄槽６８にそれぞれ供給する第１流路６２及び第２流路６３を有する。本実施例では、洗浄液タンク６４に貯留された洗浄液は、連続運転されているポンプ６５によって吸い上げられ、洗浄液循環流路６６を通して再び洗浄液タンク６４に戻される。すなわち、洗浄液はポンプ６５によって洗浄液循環流路６６を矢印方向に常時循環されている。第１電磁弁７１を介して一端が洗浄液循環流路６６と接続された第１流路６２は、他端が、マイクロシリンジ６０を介してサンプリングノズル２０の内部に連通している。同様に第２電磁弁７２を介して一端が洗浄液循環流路６６と接続された第２流路６３は、他端が、洗浄槽６８の側壁に開口している。洗浄液としては、例えば純水が使用される。
【００５１】
ノズル駆動機構によってサンプリングノズル２０の先端部を洗浄槽６８内に移動させ、その状態で、第１電磁弁７１のみを開状態にすると、ポンプ６５から圧送された洗浄液がサンプリングノズル２０を通して洗浄槽６８内に噴出され、それによってサンプリングノズル２０の内側を洗浄することができる。洗浄中、マイクロシリンジ６０のプランジャ６１は動かしても、動かさなくても良い。また、第２電磁弁７２のみを開状態にすると、洗浄槽６８の内壁から洗浄液が噴出し、それによってサンプリングノズル２０の外側を洗浄することができる。更に、第１電磁弁７１及び第２電磁弁７２を同時に開状態にすると、洗浄槽６８内でサンプリングノズル２０の内側と外側を同時に洗浄することができる。第１電磁弁７１及び第２電磁弁７２の開閉制御は、制御・演算部５０によって行われる。
【００５２】
第１流路６２を介してサンプリングノズル２０へ供給する洗浄液と第２流路６３を介して洗浄槽６８へ供給する洗浄液の割合は、第２流路６３の洗浄槽６８に近い箇所に設けられた流量調節絞り６７により設定される。サンプリングノズル２０を洗浄した洗浄液は廃液タンク６９に貯留される。図示しない廃液排出ポンプを用いて、洗浄槽６８に貯留された洗浄液を廃液タンク６９に貯留することができる。洗浄槽６８を封止して第２電磁弁７２を開放して、廃液排出ポンプで引くことで、洗浄液タンク６４から洗浄液を送液することもできる。また洗浄液タンク６４を空にして同様の操作を行い、更に第１電磁弁７１を開放することで、第１流路６２、第２流路６３、洗浄液循環流路６６の液体を除くこともできる。またポンプ６５、第２電磁弁７２、配管が正しく接続されていない場合には、洗浄槽６８から洗浄液が出ないため、サンプリングノズル２０を洗浄できない。この場合、ノズルの液面検知機能が働かないため、故障を検知することができる。また、洗浄動作を行うことで洗浄液タンク６４内の洗浄液は消費される。洗浄液タンク６４には液面センサが設置され、洗浄液タンク６４内の洗浄液が少なくなったときは、別途設置した図示しない洗浄液補充タンクから洗浄液タンク６４に洗浄液が補充される。このように、本実施例の送液システムによると、ポンプによって短時間に多量の洗浄液をサンプリングノズルの内側や外側、あるいは内側と外側の両方に供給することができ、使用後にサンプリングノズルに付着している試薬を短時間で十分に洗浄することができる。従って、試薬のコンタミネーションを回避して分析精度を向上することができる。また、洗浄時間を短縮して分析のスループットを向上することができる。
【００５３】
試薬ラック１２には温度センサとペルチェ素子等の温度調節ユニットが設けられ、試薬容器１１に保持された試薬を一定温度に維持している。例えば、試薬ラックの第１領域１２ａに保持されている試薬群は室温に維持され、第２領域１２ｂに保持されている試薬群は４℃に維持されている。試薬ラック１２の温度制御も、制御・演算部５０から行うことができる。また、試薬の種類によっては、使用直前に複数の試薬を混合してからフローセルに供給することが望ましいものがある。そのため、試薬ラック１２には、混合試薬の調製に使用するための予混合容器１４が設けられている。混合試薬の使用に当たっては、別々の試薬容器１１からサンプリングノズル２０によって吸引したそれぞれの試薬を一旦、予混合容器１４内に吐出し、予混合容器１４内で混合して調製された混合試薬を再びサンプリングノズル２０で吸引してフローセル３０に供給する。
【００５４】
図１４は、フローセルの一例を示す概略図である。図１４（ａ）はフローセルの斜視図、図１４（ｂ）は図１４（ａ）のＸ−Ｘ′断面図である。この例のフローセルは、注入ポート３２と排出ポート３３、及び液が流れる流路３４を有する。上部基板３６と下部基板３７との間に流路３４が形成されており、フローセル３０は、図１に示す捕捉構造体１が生体関連物質４を捕捉するように設計されている。流路３４は、細菌分析のための試薬や洗浄液が供給される流路として機能するとともに、反応が起こる反応チャンバとしても機能する。例えばフローセル３０に捕捉した細菌に対して、グラム染色反応を行うことにより、グラム陽性菌であれば紫色に、グラム陰性菌であればピンク色に染色されるのを検出ユニット４０で観察できる。また、流路３４のための空間を確保するために、上部基板３６と下部基板３７の間にはスペーサ３８が配置されている。スペーサ３８は、上部基板３６または下部基板３７と一体であることで、図１または図１１の捕捉構造体を有するフローセル３０を作製することができる。試薬は、注入ポート３２より注入されて、排出ポート３３より排出される。一例として、スペーサの厚さは５０〜１００μｍ、流路の幅は１〜３０mm、流路の長さは７５〜１００mmとすることができるが、これらの数値に限定されるものではない。検出ユニット４０に対向する側の上部基板３６は、励起光及び蛍光を透過することのできるガラス、石英、サファイア、ＰＤＭＳ、あるいはアクリル樹脂やシクロオレフィンポリマー等の樹脂からなる。図１４には、流路が３つ形成されたフローセル３０の例を示すが、流路の数は３つに限定されない。流路の数が多い場合、一度に多数の反応を行うことができ、高スループットの分析が可能である。ラマン分析中、フローセル３０は、フローセルステージ３１が備える温度制御ユニットによって所定の温度に制御される。
【００５５】
次に、分析装置の試薬ラック台１３に試薬ラック１２を設置し、フローセルステージ３１にフローセル３０を設置した状態から、試薬をフローセルに供給して分析を行う手順について説明する。
【００５６】
（１）サンプリングノズル洗浄
まず、サンプリングノズル２０の洗浄を行う。このときの制御・演算部５０による制御の手順を図１５に示す。制御・演算部５０は、最初にノズル駆動機構を制御して、サンプリングノズル２０を洗浄槽６８に移動する（Ｓ１１）。次に、制御・演算部５０は、ポンプ６５によって洗浄液が循環している洗浄液循環流路６６に接続されている第１電磁弁７１を制御して開状態にする（Ｓ１２）。マイクロシリンジ６０のプランジャ６１は、洗浄中であれば動かしても動かさなくてもよい。この状態では、ポンプ６５から圧送された洗浄液が、第１電磁弁７１、第１流路６２を通ってマイクロシリンジ６０に入り、そのままサンプリングノズル２０を通ってノズル先端から洗浄槽６８内に噴出される。この状態で、ノズル内側の洗浄が行われる。洗浄液としては純水を使用した。
【００５７】
次に、制御・演算部５０は、洗浄液循環流路６６に接続している第２電磁弁７２を制御して開状態にする（Ｓ１３）。すると、ポンプ６５から圧送された洗浄液が、第２電磁弁７２、第２流路６３を通って洗浄槽６８の内壁から洗浄槽内に噴出し、洗浄槽６８内に位置しているサンプリングノズル２０の外側が洗浄される。こうして、図５に示すように、サンプリングノズル２０の内側と外側の洗浄が行われる。洗浄が終了したら、制御・演算部５０は、第１電磁弁７１及び第２電磁弁７２を閉じる（Ｓ１４）。
【００５８】
なお、最初に第１電磁弁７１を開いて、次に第２電磁弁７２を開く代わりに、第１電磁弁７１と第２電磁弁７２を同時に開いてもよい。この場合には、サンプリングノズルの内側と外側の洗浄が同時に行われることになる。また、洗浄の順序を、最初にノズルの外側とし、次にノズルの内側としてもよい。
【００５９】
いずれの場合でも、サンプリングノズル内側の洗浄が終了し、第１電磁弁７１を閉じた時点で、洗浄液循環流路６６に接続されている第１流路６２から、マイクロシリンジ６０、及びサンプリングノズル２０の先端までが、洗浄液で満たされた状態になる。
【００６０】
本実施例の洗浄方法は、短時間に多量の洗浄液をサンプリングノズルの内側や外側、あるいは内側と外側の両方に供給することができ、洗浄時間を短縮して分析のスループットを向上することができる。
【００６１】
（２）フローセル洗浄
次に、フローセル３０の内部を洗浄する。このときの制御・演算部５０による制御の手順を図１６のフローチャートに示す。
【００６２】
制御・演算部５０は、ノズル駆動機構を制御して、サンプリングノズル２０をフローセル３０の注入ポート３２の上方位置に移動させる（Ｓ２１）。次に、サンプリングノズルを下降させ、ノズル先端を注入ポートに挿入させる（Ｓ２２）。次に、制御・演算部は、第１電磁弁７１を開く（Ｓ２３）。このとき、マイクロシリンジ６０のプランジャ６１は固定しておいてもよいし、動かしてもよい。すると、ポンプ６５から圧送された洗浄液が、第１電磁弁７１、第１流路６２を通ってマイクロシリンジ６０に入り、更にサンプリングノズル２０の先端から注入ポート３２を通ってフローセル３０の流路３４に流れ込み、フローセルの洗浄が行われる。フローセルの流路を洗浄した洗浄液は、廃液タンク６９に溜められる。予め設定された時間の間、第１電磁弁７１を開いてフローセルの洗浄が終了したら、制御・演算部５０は、第１電磁弁７１を閉じる（Ｓ２４）。その後、制御・演算部５０は、ノズル駆動機構を制御してサンプリングノズル２０を上昇させ、注入ポート３２から離す（Ｓ２５）。このとき、制御・演算部５０は、第１電磁弁７１を閉じて直ちにノズル駆動機構にサンプリングノズルの上昇を指令するのではなく、フローセル内における洗浄液の圧力が安定するまでの時間として予め定められた時間だけ待ってからサンプリングノズルの上昇を指令する。これについては、フローセルへの試薬注入の個所で更に詳述する。
【００６３】
（３）試薬容器からの試薬吸引
図１７のフローチャートを参照して、試薬ラック１２中の所定位置の試薬容器１１からサンプリングノズル２０によって試薬を吸引する手順について説明する。ここで試薬は、細菌を含む溶液として説明する。
【００６４】
制御・演算部５０は、予めプログラムされている手順に従って、吸引すべき試薬の種類及び吸引量を決定し、次に、メモリに格納されている試薬容器の位置と試薬の種類との対応関係の情報を参照してサンプリングノズルの移動位置を決定する。次に、制御・演算部５０は、ノズル駆動機構を制御して、サンプリングノズル２０を目的の試薬が入っている試薬容器の上方位置に移動させる（Ｓ３１）。続いて、サンプリングノズルを下降させてノズル先端を試薬容器内に挿入していく（Ｓ３２）。このとき、液面検知部５３による液面検知機能を利用して試薬容器内の試薬液面を検知する。試薬液面を検知したら、そこから更に一定距離だけサンプリングノズルを下降させ、ノズル先端が所定深さだけ試薬溶液内に挿入した状態で、サンプリングノズルを停止させる（Ｓ３３）。次に、制御・演算部５０は、マイクロシリンジ６０のプランジャ６１を吸引側に所定量だけ駆動し、サンプリングノズル２０に充填されている洗浄液の先に、決められた量の試薬を吸引して保持する（Ｓ３４）。
【００６５】
次に、制御・演算部５０は、ノズル駆動機構を制御してサンプリングノズルを上方に駆動してノズル先端を試薬容器から出し、更にサンプリングノズルを洗浄槽６８に移動させる（Ｓ３５）。その後、制御・演算部５０は、第２電磁弁７２を開く。すると、洗浄槽６８の内壁面から洗浄液が噴出し、サンプリングノズル２０の外側に付着した試薬を洗い流す（Ｓ３６）。サンプリングノズルに吸引した試薬は、洗浄されずにそのままノズル内に保持される。サンプリングノズル外側の洗浄が終わると、制御・演算部５０は、第２電磁弁７２を閉じ、ノズル駆動機構を制御してサンプリングノズル２０を上方に移動させる。
【００６６】
液面検知機能を利用してサンプリングノズル２０の先端は試薬中に必要最小限の深さだけ挿入されているため、サンプリングノズル２０の外側に付着し、洗浄槽６８で洗い流される試薬の量を常に最小限度に抑制することができる。また、試薬の液面検知を行うことの別の利点として、試薬容器の形状と液面高さの情報から試薬残量を知ることができる。これにより解析できる残り塩基数を計算したり、ユーザーに試薬交換の時期を知らせたりすることが可能になる。
【００６７】
（４）フローセルへの試薬注入
図１８のフローチャートを参照して、サンプリングノズル２０の先端に吸引・保持している試薬をフローセル３０に注入する手順について説明する。
【００６８】
最初に、制御・演算部５０は、ノズル駆動機構を制御してサンプリングノズル２０をフローセル３０の注入ポート３２の上方位置に移動させる。次に、サンプリングノズル２０を下降させ、ノズル先端を注入ポート３２に挿入させる（Ｓ４１）。続いて、制御・演算部５０は、マイクロシリンジ６０のプランジャ６１を吐出方向に駆動し、サンプリングノズル２０に充填されている洗浄液の先に吸引した試薬を、注入ポート３２を通してフローセル３０に注入する（Ｓ４２）。フローセル３０には図１に示す捕捉構造体１が多数並べられており、試薬に含まれる細菌は送液されることにより、捕捉構造体で捕捉される。制御・演算部５０は、プランジャ６１の駆動が完了した後、フローセル３０内の圧力が安定するまで待って（Ｓ４３）、ノズル駆動機構を制御してサンプリングノズルを上方に引き上げる（Ｓ４４）。
【００６９】
図１９は、注入ポートへのサンプリングノズルの挿入・離脱、及びマイクロシリンジのプランジャの駆動のタイミングと、フローセル内の圧力変化の関係を示す模式図である。横軸は時間である。図１９は、サンプリングノズル２０が時刻ｔ０にフローセルの注入ポート３２に挿入され、時刻ｔ４に注入ポート３２から上方に引き上げられることを示している。また、マイクロシリンジ６０のプランジャ６１は時刻ｔ１〜ｔ２に亘って、試薬吐出のために駆動されている。
【００７０】
試薬は、マイクロシリンジ６０のプランジャ６１を駆動してコンダクタンスの小さなフローセルの流路に加圧注入されている。そのため、プランジャ６１の駆動停止直後（時刻ｔ２）にはフローセル３０内の圧力が高く、サンプリングノズル２０をすぐに注入ポート３２から引き離すと、試薬が逆流して注入ポート３２からあふれ出すことがある。本実施例では、試薬注入動作終了時刻ｔ２から、フローセル３０内の圧力が安定するまでの時間待った後、サンプリングノズル２０を注入ポート３２から離して上方に引き上げる。すなわち、サンプリングノズル２０を注入ポート３２から引き上げる時刻ｔ４を、ｔ４＞ｔ３に設定する。フローセル内の圧力が安定するまでの待ち時間（ｔ３−ｔ２）は、注入する試薬の粘性、注入速度、フローセルの流路抵抗などに依存して決まるが、典型的には０.５秒から１秒程度待てばよい。
【００７１】
フローセルへの試薬注入後、制御・演算部５０は、ノズル駆動機構を制御してサンプリングノズル２０を洗浄槽６８に移動する。そして、「（１）サンプリングノズル洗浄」に示した手順にてサンプリングノズルの内側及び外側を洗浄し、次の動作に備える。
【００７２】
なお、本実施例に示した試薬吸引及び試薬注入の手順に従うと、サンプリングプローブからフローセルに注入すべき試薬の量は、フローセルの容積に、フローセルの注入ポート３２の個所で生じるデッドスペース分の容積を余分に付加した量で十分である。デッドスペースの容積は、５μＬ以下と見積もられる。従って、フローセル３０に注入すべき試薬の量、すなわち試薬容器１１からサンプリングノズル２０に吸引すべき試薬の量は、少なくともフローセルの容積分が必要ではあるが、フローセルの容積分にせいぜい５μＬから１０μＬ程度を付加した量で十分である。従って、本実施例によると、フローセルに注入するために試薬容器から吸引する試薬量が少なく、サンプリングノズル２０の外側に付着して洗い流される試薬量が少ない。つまり、使用試薬の量が少なく、試薬の無駄も少ない。こうして、本実施例によると、高価な試薬を有効に活用することが可能になる。
【００７３】
更に、本実施例ではサンプリングノズルで試薬吸引とフローセルへの送液を実現しており、チューブと切り替えバルブを用いた方式に比べて送液時間を短縮することが可能である。また試薬キャリーオーバが非常に少なく、より純粋な試薬をフローセルに供給できる。
【００７４】
（５）検出
次に、検出の手順について、図２０のフローチャートを参照して説明する。
【００７５】
フローセル内に試薬を注入して細菌を捕捉した後、フローセル３０の温度を最適温度に制御する（Ｓ５１）。必要に応じて、制御・演算部５０は、上記「（２）フローセル洗浄」に説明した処理、又は試薬ラック１２に置かれた洗浄液（試薬）に対して「（３）試薬容器からの試薬吸引と（４）フローセルへの試薬注入」に説明した処理を実行し、セル内を洗浄することができる（Ｓ５２）。次に、制御・演算部５０は、フローセルステージ３１を駆動制御し、フローセル３０を検出ユニット４０の下方位置に移動させる（Ｓ５３）。
【００７６】
細胞や細菌などの透明な生体関連物質を確認する場合、一般的に位相差顕微鏡が用いられる。位相差顕微鏡で細菌を観察した場合、細菌の周りにハローと呼ばれる比較的強い光が発生する。細菌の大きさは数ミクロンと小さいが、ハローの大きさは顕微鏡の焦点から外れているほど大きく、数十ミクロンある場合もある。従って細菌の捕捉されている捕捉構造体を見つけるために、ハローを見つけることで、ハロー中心に細菌が存在し、更にハローの大きさで顕微鏡の焦点からのずれがわかるため、それを補正できる。次に、制御・演算部５０は、検出ユニット４０から光照射し、フローセル３０内の細菌から発せられるラマン光を検出する（Ｓ５４）。ラマン光を分析することにより、原子・分子の振動や回転運動に関する知見を得ることができるため、細菌種のグラム判定、菌種同定、菌株判定に応用できる。また一例として、グラム判定試薬や薬剤感受性試験用の試薬を、フローセル中に捕捉された細菌へ送液することで、細菌のグラム判定や薬剤感受性判定が可能である。
【００７７】
（６）回収
次に、分析した細菌の回収手順について、図２１のフローチャートを参照して説明する。
【００７８】
細菌の回収は、フローセル内での（５）の検出が終了した段階で実行する。制御・演算部５０は、ノズル駆動機構を制御してサンプリングノズル２０を反応が終了したフローセル３０の注入ポート３２に挿入する（Ｓ９１）。次に、マイクロシリンジ６０のプランジャ６１を吸引側に駆動し、フローセル３０内の細菌を吸引する（Ｓ９２）。またはフローセルの排出側に図示しないポンプを用いて、サンプリングノズル２０の方向へ送液しながら、マイクロシリンジ６０のプランジャ６１を同じ送液スピードで吸引してもよい。次に、制御・演算部５０は、ノズル駆動機構を制御してサンプリングノズル２０を試薬ラック１２に用意されている回収試薬用の容器に移動させ（Ｓ９３）、その容器内に吸引した細菌を吐出して回収する（Ｓ９４）。当然ながら、回収細菌用の容器は、サンプルごとに別々に用意する。あるいは送液方向は変えずに、送液と送液停止のみを繰り返すことで、排出口から生体関連物質を回収することもできる。細菌の回収が終わったら、制御・演算部５０は、ノズル駆動機構を制御してサンプリングノズル２０を洗浄槽６８に移動し、サンプリングノズル２０の内側及び外側の洗浄を行い、次の動作に備える。回収試薬用の容器に回収した試薬は、通常の試薬容器の試薬と同様に使用することができる。回収した細菌は、一例として、核酸を抽出してＰＣＲなどの核酸増幅法により細菌同定を行うなどの分析に利用することができる。
【００７９】
上記実施例の送液システムは、ポンプ６５を備える洗浄液循環流路６６を有し、洗浄液は洗浄液循環流路６６から電磁弁７１、７２を介して第１流路６２あるいは第２流路６３に供給する構成をとったが、洗浄液循環流路は必ずしも必須ではない。
【００８０】
以上、本発明を細菌分析に適用した実施例について説明した。しかし、本発明の適用は細菌分析だけに限られるものではなく、細胞または細菌などの生体関連物質を含む溶液をデバイスへ送液して、それらを単一かつ独立した位置に配置して、分析する方法一般に適用できる。生体関連物質とは、小分子、タンパク質、抗原抗体、ホルモン、細菌、細胞などの物質、またはそれらと微粒子などの人工物との結合物を指す。生体関連物質を捕捉したデバイスさえあれば、そのデバイスを手で持ち運んでラマン顕微鏡などに設置して分析できるほか、本発明で開示したような送液システムを用いて自動で解析することもできる。
【００８１】
なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
【００８２】
また、上記の各構成、機能、処理部、処理手段等は、それらの一部や全部を、例えば集積回路で設計する等によりハードウェアで実現してもよい。また、上記の各構成、機能等は、プロセッサがそれぞれの機能を実現するプログラムを解釈し、実行することによりソフトウェアで実現してもよい。各機能を実現するプログラム、テーブル、ファイル等の情報は、メモリやハードディスク、ＳＳＤ等の記録装置、または、ＩＣカード、ＳＤカード、ＤＶＤ等の記録媒体に置くことができる。
【００８３】
以下に様々な変形例について、その一例を説明する。まず図６と比較して、より少ない列の捕捉構造体数で同じ捕捉率を達成する方法について開示する。図６では、Trap rate (/width)が０.００１の時、９５％捕捉するには３０００列、９９％捕捉するには４７００列、９９.９％捕捉するには７０００列の捕捉構造体を送液方向（ｘ方向）に配置する必要があるとした。各列での捕捉率が等しいため、Trap rateは1-[1-{Traprate(/width)}]#Trap(x)(/Channellength)で計算している。この場合、捕捉構造体へ送液される前の細菌数である#Bacteriaが１０００個、Trap rate (/width)が０.００１とすると、１列目の捕捉構造体で捕捉される細菌数#Trapped bacteria (1st column)は１個（＝１０００×｛１−（１−０.００１）＾１｝）、２列目の捕捉構造体で捕捉される細菌数#Trapped bacteria (2nd column)は０.９９９個［＝１０００×｛１−（１−０.００１）＾２｝］、３列目の捕捉構造体で捕捉される細菌数#Trapped bacteria (3rd column)は０.９９８００１個［＝１０００×｛１−（１−０.００１）＾３｝］と減っていく。計算を続けていくと、捕捉される細菌数#Trapped bacteriaは、１００列目で０.９０５６９個、２５０列目で０.７７９個、５００列目で０.６０６９８個、１０００列目で０.３６８０６個、２０００列目で０.１３５３３５個、３０００列目で０.０４９７６２個、４０００列目で０.０１８２９７個、５０００列目で０.００６７２個、６０００列目で０.００２４７３個、７０００列目で０.０００９個と減っていく。ゆえに１０００列ごとに捕捉される細菌数は、１〜１０００列で６３２個、１０００〜２０００列で２３３個、２０００〜３０００列で８５個、３０００〜４０００列で１１個、５０００〜６０００列で４個、６０００〜７０００列で２個と少なくなっていく。７０００列より少ない列の捕捉構造体数で同じ捕捉率（９９.９％）を達成できれば、検出領域が狭くなるため、検出時間が短縮する。そのためには各列で同じ数の細菌を捕捉すればよく、これは各列での捕捉率を変えることによって達成される。各列で捕捉する細菌数は、図７に説明した通り、複数の細菌が同じ捕捉構造体に捕捉されない１個以下の個数であることが望ましい。従って以下各列で１個の細菌を捕捉する場合について説明する。捕捉構造体へ送液される前の細菌数である#Bacteriaが１０００個、Trap rate (/width)が０.００１とすると、１列目の捕捉構造体で捕捉される細菌数#Trapped bacteria (1st column)は１個（＝１０００×｛１−（１−０.００１）＾１｝）、２列目の捕捉構造体で捕捉される細菌数#Trapped bacteria (2nd column)は０.９９９個［＝１０００×｛１−（１−０.００１）＾２｝］と減っていく。２列目の捕捉構造体で捕捉される細菌数#Trapped bacteria (2nd column)を１列目同様に１個にするためには、２列目のTrap rate (/width)を０.００１から０.００１００１００１［＝１／（１０００−（２−１））］に上げればよい。同様に３列目は０.００１００２００４［＝１／（１０００−（３−１））］、１００列目は０.００１１０９８７８［＝１／（１０００−（１００−１））］、２５０列目は０.００１３３１５５８［＝１／（１０００−（２５０−１））］、５００列目は０.００１９９６００８［＝１／（１０００−（５００−１））］、７５０列目は０.００３８９８４０６４［＝１／（１０００−（７５０−１））］、９００列目は０.００９９００９９［＝１／（１０００−（９００−１））］、９９０列目は０.０９０９０９０［＝１／（１０００−（９９０−１））］、９９９列目は０.５［＝１／（１０００−（９９９−１））］、１０００列目は１［＝１／（１０００−（１０００−１））］とすればよい。９９.９％の捕捉率でいい場合には、１０００列目のTrap rate (/width)が１の捕捉構造体は不要となる。捕捉構造体へ送液される前の細菌数である#Bacteriaが１０００個で、各列で１個の細菌を捕捉するため、１０００列あれば全ての細菌を捕捉できる。これはTrap rate (/width)が全ての列で０.００１である場合（７０００列で９９.９％の捕捉率）と比較して、１／７の列数である。従って図７に示すChannel lengthも１／７で済むほか、検出時間も短縮できる。以上が図６と比較してより少ない列の捕捉構造体数で同じ捕捉率を達成する原理である。ここでTrap rate (/width)が変えられることは、図２〜図４で説明した通りであり、前記スリットの幅、前記流路の幅、流速などのパラメータを流体シミュレーション等により調整することで達成できる。その一例を図２２に示す。図２２は、流路３の下流側になるほど捕捉構造体１を大きくすることで、捕捉構造体同志の間を抜ける液量を下げることにより、Trap rate (/width)を大きくしている。最終的にTrap rate (/width)を１にする場合、図１１に開示した構造体のように捕捉構造体同志の間を抜ける流量を０とすることも可能である。各列での捕捉構造体数を変えずに配置できるため、構造体中心の間隔を等しくできる。但しTrap rate (/width)が１の場合は、全ての細菌を捕捉できるため、この限りではない。捕捉構造体を大きくする場合、図２２は全ての捕捉構造体１の寸法を拡大しているが、捕捉構造体１の厚さなどある特定の寸法のみを変えてもよい。図２３は、流路３の下流側になるほどスリット２の幅を大きくすることで、Ｔrap rate (/width)を大きくしている。各列での捕捉構造体数を変えずに配置できるため、構造体中心の間隔と外形を等しくできる。スリット２の幅に制約はないが、１〜５０μｍとすることが好ましい。最終的にTrap rate (/width)を１にしたい場合、スリット２幅を大きくするだけでは限界がある。その場合には、図１１に開示した構造体のように捕捉構造体同志の間を抜ける流量を０とする構造体と組み合わせることで実現できる。図２４は、流路３の下流側になるほど捕捉構造体１の数を増やすことで、Trap rate (/width)を大きくしている。最終的にTrap rate (/width)を１にする場合、図１１に開示した構造体のように捕捉構造体同志の間を抜ける流量を０とすることも可能である。この場合、捕捉構造体１の外形は等しくできるが、各列での捕捉構造体数と構造体中心の間隔が変わる。図２２〜図２４の構成の一部を他の構成に置き換えること、またある構成に他の構成を加えること、またある構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能であることは言うまでもない。
【００８４】
次に図２５は、生体関連物質４の大きさがスリット２の幅より小さいが、スリットを有する構造体１ａとスリットを有さない構造体１ｂの２箇所の隙間より大きい場合について記載した。この条件が成立する場合、生体関連物質４はスリット２を通過できるが、スリットを有する構造体１ａとスリットを有さない構造体１ｂの２箇所の隙間は通過できない。従って生体関連物質４は捕捉構造体１に確実に捕捉される。一旦生体関連物質４が捕捉構造体１に捕捉されると、スリットを有する構造体１ａとスリットを有さない構造体１ｂの２箇所の隙間が部分的に塞がれるため、Trap rate (/width)は生体関連物質４を捕捉する前と比較して小さくなる。従って複数の生体関連物質４が同一の捕捉構造体１に捕捉される確率が小さくなる。ゆえに多くの捕捉構造体１で単一の生体関連物質４を捕捉できる。本方法は生体関連物質４の短軸が好ましくは５μｍ以上ある場合に有効と考えられるため、細胞一般に適用可能である。特に血球細胞と比較して変形が小さいＣＴＣ（Circulating Tumor Cell）などの血液中のがん細胞や、幹細胞（ｉＰＳ、ＥＳ細胞）などに適用することができる。更には捕捉されると捕捉率が大きく低下する。一方図１では、生体関連物質４の大きさがスリット２の幅より小さく、スリットを有する構造体１ａとスリットを有さない構造体１ｂの２箇所の隙間より小さいため、生体関連物質４は全てではなく、ある確率で死水域５に捕捉される。
【００８５】
また図２６は、死水域５の領域を広げるために、スリットを有さない構造体１ｂにくぼみを設けたものである。これによりスリットを通過した生体関連物質の捕捉率を向上できる。
【００８６】
また図２７は、捕捉構造体の変形例である。図２７（ａ）は、スリットを有する構造体１ａとスリットを有さない構造体１ｂの頂点の一部を滑らかにするために、丸みをつけたものである。丸みをつけることで、流体流れの剥離を無くするなどの効果がある。流体シミュレーションなどを活用して、流れを安定させる形状を実現できるため、図２７（ａ）のスリット部も流線形にすることも可能である。図２７（ｂ）は、スリットを有する構造体１ａが三角形の一部から構成されている捕捉構造体である。このようにスリットを有する構造体１ａとスリットを有さない構造体１ｂの形状は、円弧、楕円弧、三角形の一部から構成することができる。また必要に応じて双曲線など他の形状を取り入れてもよい。図２７（ｃ）は、スリットを有する構造体１ａに半円形状を２つ加えた構造体とすることで生体関連物質４を回収できるようにしたものである。半円形状を加えることで、スリットを有さない構造体１ｂからスリットを有する構造体１ａの方向に送液した時に、死水域５からスリットを有する構造体１ａの方向に送液できるため、生体関連物質４を回収できる。一方半円形状が無い場合には、死水域５からスリットを有する構造体１ａの方向に送液できないため、生体関連物質４の回収は困難となる。図２７（ｄ）は、スリットを有する構造体１ａが２つのスリットを持つ場合である。この場合も死水域５に生体関連物質４を捕捉することができる。スリット２の位置はスリットを有する構造体１ａに対して線対称な位置であるが、図２７（ｅ）に示すように線対称ではない位置に配置することもできる。これはスリットを有する構造体１ａとスリットを有さない構造体１ｂの２箇所の隙間の流量が異なる場合などに有効である。
【符号の説明】
【００８７】
１  補足構造体
１ａ  スリットを有する構造体
１ａL  スリットを有する構造体の左側
１ａR  スリットを有する構造体の右側
１ｂ  スリットを有さない構造体
２、２ａ、２ｂ  スリット
３、３４  流路
４  生体関連物質
５  死水域
１１  試薬容器
１２  試薬ラック
１３  試薬ラック台
１４  予混合容器
２０  サンプリングノズル
２１  ガイドレール
２２  直線移動ユニット
２３  回転軸
２４  アーム
３０  フローセル
３１  フローセルステージ
３２  注入ポート
３３  排出ポート
３６  上部基板
３７  下部基板
３８  スペーサ
４０  検出ユニット
４１  光源
４２  撮像装置
５０  制御・演算部
５１  入力部
５２  表示部
５３  液面検知部
６０  マイクロシリンジ
６１  プランジャ
６２  第１流路
６３  第２流路
６４  洗浄液タンク
６５  ポンプ
６６  洗浄液循環流路
６７  流量調節絞り
６８  洗浄槽
６９  廃液タンク
７１  第１電磁弁
７２  第２電磁弁
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
0005965702.tif 000021
【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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