(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＷＴ１タンパク質に由来するヘルパーエピトープ及びＷＴ１タンパク質に由来するキラーエピトープを含む融合ポリペプチドであって、該融合ポリペプチド１分子あたり前記ヘルパーエピトープと前記キラーエピトープとを合わせて３個含み、かつ前記ヘルパーエピトープのアミノ酸配列が配列番号：２〜３９に記載のアミノ酸配列から選択される少なくとも一のアミノ酸配列であり、かつ前記キラーエピトープのアミノ酸配列が配列番号：４０〜４５に記載のアミノ酸配列から選択される少なくとも一のアミノ酸配列である、前記融合ポリペプチド。
【請求項２】
前記融合ポリペプチド１分子あたり１個の前記ヘルパーエピトープと２個の前記キラーエピトープとを含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
前記ヘルパーエピトープの両側に前記キラーエピトープが結合している、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
前記ヘルパーエピトープのアミノ酸配列が、配列番号：５に記載のアミノ酸配列であり、かつ前記キラーエピトープのアミノ酸配列が、配列番号：４０及び／又は４４に記載のアミノ酸配列である、請求項１〜３のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
前記ヘルパーエピトープのアミノ酸配列が、配列番号：５に記載のアミノ酸配列であり、前記ヘルパーエピトープのアミノ末端側に結合している前記キラーエピトープのアミノ酸配列が、配列番号：４０に記載のアミノ酸配列であり、かつ前記ヘルパーエピトープのカルボキシル末端側に結合している前記キラーエピトープのアミノ酸配列が、配列番号：４４に記載のアミノ酸配列である、請求項３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のうちのいずれか一項に記載の融合ポリペプチドを有効成分として含有する抗腫瘍剤。
【請求項７】
請求項１〜５のうちのいずれか一項に記載の融合ポリペプチドと単核球とをインキュベーションする工程、及び前記インキュベーションした単核球と抗原提示細胞とをインキュベーションする工程を含む、ＷＴ１タンパク質を発現している腫瘍細胞に対してサイトカインを産生するＴ細胞をインビトロで製造する方法。
【請求項８】
請求項１〜５のうちのいずれか一項に記載の融合ポリペプチド及び抗原提示細胞を有効成分とする抗腫瘍剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん免疫療法に利用可能な、ウィルムス（Ｗｉｌｍｓ）腫瘍遺伝子ＷＴ１にコードされるＷＴ１タンパク質由来の抗原性ポリペプチドと、当該ポリペプチドに特異的なＴ細胞を製造する方法と、当該ポリペプチド等を含む抗腫瘍剤とに関する。
【背景技術】
【０００２】
難治性の疾患であるがん（悪性新生物）に対する治療法の一つに、患者個体の持つ免疫系を利用してがん細胞を退縮させる、いわゆるがん免疫療法が挙げられる。この方法における重要な点は、如何にして免疫系にがん細胞を異物として認識させ、がん細胞に対して攻撃性を有する免疫細胞を導くかである。【０００３】
抗腫瘍免疫に関与する重要な免疫細胞に、細胞表面蛋白質であるＣＤ８を発現しているＴ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞）と、細胞表面蛋白質であるＣＤ４を発現しているＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）とがある。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、活性化された場合、ＨＬＡクラスＩ分子に結合する抗原を提示している細胞を溶解するＴ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ＣＴＬ）である。ＣＤ４＋Ｔ細胞はサイトカインを分泌するＴｈ細胞であって、ＭＨＣクラスＩＩ分子により抗原を提示するマクロファージ及び／又は樹状細胞等により活性化され、ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導及び維持のためのヘルパー機能を発揮する。また、Ｔｈ細胞は分泌するサイトカインの種類によってＴｈ１細胞（ＩＦＮ−γ等を産生する細胞）、Ｔｈ２細胞（インターロイキン−４等を産生する細胞）及びＴｈ０細胞（サイトカイン産生能は低いか、あるいはＩＦＮ−γ、ＩＬ−４等を共に産生する細胞）に分類されることが知られており、各細胞の役割も解明されつつある。またＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子陰性腫瘍（ＭＨＣクラスＩＩ−腫瘍）に対する間接的な機構によって、例えばマクロファージの活性化やキラーＴ細胞、ＮＫ細胞を介して、またはＭＨＣクラスＩＩ陽性腫瘍に対する直接的な機構によって、エフェクター機能を持つこともできる。【０００４】
これまで、ヒトのがん免疫治療におけるＴ細胞の研究は、ＣＤ８＋ＨＬＡクラスＩ拘束性ＣＴＬ応答の同定及び誘導に焦点が絞られていた（特許文献１）。ＣＤ４＋Ｔ細胞については、がん抗原の一つであるチロシナ一ゼとそのＣＤ４＋Ｔ細胞に対するエピトープ（ヘルパーエピトープ）の同定が報告されている（特許文献２）。チロシナ一ゼは、メラノサイト系列の正常細胞及び腫瘍細胞の中で発現され、ＣＤ４＋メラノーマ反応性Ｔ細胞の特異的標的として示された、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するメラノーマ会合性組織特異的抗原である（非特許文献１）。しかし、チロシナ一ゼは限られた型の腫瘍でのみ発現する抗原であり、がん免疫治療における有望ながん抗原であるとは言い難い。【０００５】
本発明者らの一部は、ＭＡＧＥと称される、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識される腫瘍特異抗原をコードしている遺伝子ファミリーに着目し、その内の一つであるＭＡＧＥ−Ａ４タンパク質に由来するポリペプチド断片ががんワクチンペプチド（ヘルパーエピトープ）として有用であることを見いだしている（特許文献３）。しかし、ＭＡＧＥ−Ａ４タンパク質が発現しているがんの種類には制限があるため、より多くの種類のがんに対しても免疫応答を誘導し得る新たなポリペプチドの創出に対する期待は、依然として高い。【０００６】
一方、ＷＴ１タンパク質は、白血病や種々の固形がんで高発現しているウィルムス（Ｗｉｌｍｓ）腫瘍遺伝子ＷＴ１にコードされているタンパク質である。がんワクチンペプチドの候補として期待され、多くの研究者によってＷＴ１タンパク質に由来する多数のヘルパーエピトープやキラーエピトープが報告されている、がん関連タンパク質の代表例である（特許文献４〜６、非特許文献１〜３）。【０００７】
また、このようなヘルパーエピトープやキラーエピトープによって誘導される免疫応答は、ＨＬＡ遺伝子の多型性によって制御（拘束）される（後述の表１〜５「ＨＬＡ拘束性」  参照）。また、同一のＨＬＡアレルを有する患者に由来するＴ細胞間でもヘルパーエピトープやキラーエピトープによる免疫応答に関し、その有無や強弱に差異があることも知られている。ゆえに、由来の異なる多くのＴ細胞を刺激し、より多くの種類のがんに対して、より強い免疫応答を誘導し得るポリペプチドが求められている。【０００８】
この点に関し、本発明者らによって、ヘルパーエピトープ１個とキラーエピトープ１個とを結合させた長鎖ポリペプチド（ヘルパー／キラー−ハイブリッドエピトープロングペプチド；Ｈ／Ｋ−ＨＥＬＰ）が開発されており、さらにこのＨ／Ｋ−ＨＥＬＰを用いることによって、該ヘルパーエピトープ及び該キラーエピトープを混合して用いた場合に比べ、抗原特異的な免疫応答（抗原特異的なＣＴＬ及びＴｈ細胞の産生）をより効率良く誘導できることも明らかにされている（非特許文献４）。また、かかるＨ／Ｋ−ＨＥＬＰに関しては、ＭＡＧＥタンパク質由来のヘルパーエピトープ１個とＭＡＧＥタンパク質由来のキラーエピトープ１個とを結合させてなるＨ／Ｋ−ＨＥＬＰを大腸がんが肺に転移したヒト患者に投与することによって、ＭＡＧＥに対して特異的な免疫応答が強く誘導され、当該患者における腫瘍増殖並びにＣＥＡ腫瘍マーカーが有意に減少することも、本発明者によって実証されている（非特許文献４及び５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第９５／１９７８３号
【特許文献２】国際公開第９７／１１６６９号
【特許文献３】国際公開第２００８／０５３５７９号
【特許文献４】国際公開第２００７／０４７７６４号
【特許文献５】国際公開第００／１８７９５号
【特許文献６】特開２００６−２８０３２４号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｏｋａ  Ｙ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００８年１２月、１５巻、２９号、３０５２〜３０６１ページ
【非特許文献２】Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｈ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、２００６年７月、５５巻、７号、８５０〜８６０ページ
【非特許文献３】Ｂｏｒｂｕｌｅｖｙｃｈ  ＯＹら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１０年９月、４７巻、１５号、２５１９〜２５２４ページ
【非特許文献４】大竹淳矢ら、「ヘルパー／キラーハイブリッドロングペプチド（Ｈ／Ｋ−ＨＥＬＰ）はショートペプチドに比べて優れたがん抗原特異的Ｔｈ１，Ｔｃ１細胞誘導能を示す」、第７１回日本癌学会学術総会記事、２０１２年８月３０日発行、１０１ページ
【非特許文献５】Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｎ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．、２０１２年１月、１０３巻、１号、１５０〜１５３ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、由来の異なる多くのＴ細胞を刺激し、多くの種類のがんに対して、免疫応答を強く誘導することを可能とするポリペプチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、前記目的を達成すべく、白血病や種々の固形がんで高発現している腫瘍遺伝子ＷＴ１にコードされているタンパク質に着目し、ＷＴ１タンパク質由来のヘルパーエピトープ１個とＷＴ１タンパク質由来のキラーエピトープ１個とを結合させてなるＨ／Ｋ−ＨＥＬＰを調製してＴ細胞を刺激し、これらエピトープを混合してＴ細胞を刺激する場合と比較した。しかしながら、予想に反して、非特許文献４及び５において確認されていた免疫応答の亢進等は確認することができなかった。【００１３】
一方、ＷＴ１タンパク質由来のヘルパーエピトープとキラーエピトープとを合わせて３個以上結合してなるＨ／Ｋ−ＨＥＬＰによってＴ細胞を刺激した場合には、これらエピトープを混合してＴ細胞を刺激する場合と比較し、由来の異なるより多くのＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激し、サイトカイン（ＩＦＮ−γ）を産生するＴｈ１細胞及びＣＴＬをより多く誘導できることを見出した。さらに、ヘルパーエピトープの両側にキラーエピトープが結合しているＨ／Ｋ−ＨＥＬＰによりＴ細胞を刺激することによって、ヘルパーエピトープの片方の側にキラーエピトープが２個結合しているＨ／Ｋ−ＨＥＬＰにてＴ細胞を刺激した場合と比較して、由来の異なるより多くのＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激し、ＩＦＮ−γを産生するＴｈ１細胞をより多く誘導できることを見出し、下記の各発明を完成させた。【００１４】
＜１＞  ＷＴ１タンパク質に由来するヘルパーエピトープ及びＷＴ１タンパク質に由来するキラーエピトープを含む融合ポリペプチドであって、該融合ポリペプチド１分子あたり前記ヘルパーエピトープと前記キラーエピトープとを合わせて３〜６個含むポリペプチド。
＜２＞  前記融合ポリペプチド１分子あたり１個の前記ヘルパーエピトープと２個の前記キラーエピトープとを含む、＜１＞に記載のポリペプチド。
＜３＞  前記ヘルパーエピトープの両側に前記キラーエピトープが結合している、＜２＞に記載のポリペプチド。
＜４＞  前記ヘルパーエピトープのアミノ酸配列は、配列番号：２〜３９に記載のアミノ酸配列から選択される少なくとも一のアミノ酸配列であり、かつ前記キラーエピトープのアミノ酸配列は、配列番号：４０〜４５に記載のアミノ酸配列から選択される少なくとも一のアミノ酸配列である、＜１＞〜＜３＞のうちのいずれか一に記載のポリペプチド。
＜５＞  前記ヘルパーエピトープのアミノ酸配列が、配列番号：５に記載のアミノ酸配列であり、かつ前記キラーエピトープのアミノ酸配列が、配列番号：４０及び／又は４４に記載のアミノ酸配列である、＜２＞に記載のポリペプチド。
＜６＞  前記ヘルパーエピトープのアミノ酸配列が、配列番号：５に記載のアミノ酸配列であり、前記ヘルパーエピトープのアミノ末端側に結合している前記キラーエピトープのアミノ酸配列が、配列番号：４０に記載のアミノ酸配列であり、かつ前記ヘルパーエピトープのカルボキシル末端側に結合している前記キラーエピトープのアミノ酸配列が、配列番号：４４に記載のアミノ酸配列である、＜３＞に記載のポリペプチド。
＜７＞  ＜１＞〜＜６＞のうちのいずれか一に記載のポリペプチドを有効成分として含有する抗腫瘍剤。
＜８＞  ＜１＞〜＜６＞のうちのいずれか一に記載のポリペプチドと単核球とをインキュベーションする工程、及び前記インキュベーションした単核球と抗原提示細胞とをインキュベーションする工程を含む、ＷＴ１タンパク質を発現している腫瘍細胞に対してサイトカインを産生するＴ細胞をインビトロで製造する方法。
＜９＞  ＜８＞に記載の製造方法により製造されたＴ細胞を有効成分として含有する抗腫瘍剤。
＜１０＞  ＜１＞〜＜６＞のうちのいずれか一に記載のポリペプチドをさらに含む、＜９＞に記載の抗腫瘍剤。
＜１１＞  ＜１＞〜＜６＞のうちのいずれか一に記載のポリペプチド及び抗原提示細胞を有効成分とする抗腫瘍剤。
＜１２＞  ＜１＞〜＜６＞のうちのいずれか一に記載のポリペプチドによってパルスされた抗原提示細胞を有効成分とする抗腫瘍剤。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、由来の異なる多くのＴ細胞を刺激し、多くの種類のがんに対して、ＩＦＮ−γ等のサイトカインの産生等の免疫応答を強く誘導することを可能とするポリペプチドを提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＷＴ１タンパク質由来のポリペプチドを用いて、末梢血単核細胞から該ポリペプチド特異的に免疫応答するＴ細胞（抗原特異的Ｔ細胞）を誘導する方法を示す、概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
＜本発明のＷＴ１タンパク質に由来する抗原性ポリペプチド＞
後述の実施例において示す通り、ＷＴ１タンパク質由来のヘルパーエピトープとキラーエピトープとを合わせて３個以上結合して長鎖ポリペプチドとすることで、これらエピトープを混合してＴ細胞を刺激する場合と比較し、由来の異なる多くのＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激し、サイトカインを産生するＴｈ１細胞及びＣＴＬを多く誘導することができる。一方、ＷＴ１タンパク質由来のヘルパーエピトープとキラーエピトープとを１個ずつ結合して長鎖ポリペプチドとしても、かかるＴｈ１細胞又はＣＴＬの誘導は亢進されなかった。
【００１８】
したがって、本発明のＷＴ１タンパク質由来の抗原性ポリペプチドは、ＷＴ１タンパク質に由来するヘルパーエピトープ及びＷＴ１タンパク質に由来するキラーエピトープを含む融合ポリペプチドであって、該融合ポリペプチド１分子あたり前記ヘルパーエピトープと前記キラーエピトープとを合わせて３〜６個含むポリペプチドである。
【００１９】
本発明において「ポリペプチド」とは、アミノ酸が複数連結している化合物を意味する。すなわち、所謂ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質も含まれる。また、ポリペプチドを構成するアミノ酸は、天然型であってもよく、非天然型であってもよく、アナログ（アミノ酸のＮ−アシル化物、Ｏ−アシル化物、エステル化物、酸アミド化物、アルキル化物等）であってもよい。また、アミノ酸の側鎖は、化学的に修飾（糖鎖付加、脂質付加、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化等）が施されているものであってもよい。さらに、ポリペプチドのアミノ末端や遊離のアミノ基には、ホルミル基、アセチル基、ｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）基等が結合していてもよく、本発明のペプチドのカルボニル末端や遊離のカルボキシル基には、メチル基、エチル基、ｔ−ブチル基、ベンジル基等が結合していてもよい。
【００２０】
本発明において「ＷＴ１タンパク質」とは、白血病や種々の固形がんで高発現しているウィルムス（Ｗｉｌｍｓ）腫瘍遺伝子ＷＴ１にコードされているタンパク質を意味し、ヒト由来のＷＴ１タンパク質であれば典型的には、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＭ＿０２４４２６．４で特定される塩基配列がコードするタンパク質）である。
【００２１】
また、ＷＴ１タンパク質は、このような典型的なアミノ酸配列を有するもの以外に、天然においてアミノ酸が変異したものも存在しうる。したがって、例えば、ヒトＷＴ１タンパク質には、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるものも含まれる。アミノ酸配列の置換、欠失、挿入又は付加は、一般的には、１０アミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内、３アミノ酸以内、１アミノ酸）である。
【００２２】
本発明において「ヘルパーエピトープ」とは、「Ｔｈエピトープ」又は「ＣＤ４＋ヘルパーエピトープ」とも称される、ＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激し、その免疫応答を誘導する活性を有する抗原決定基、これを構成するアミノ酸配列又は該アミノ酸配列からなる抗原性ポリペプチドのいずれかを意味する。本発明において「ヘルパーエピトープ」の長さとしては特に制限はないが、通常５〜３０アミノ酸であり、好ましくは７〜２５アミノ酸であり、より好ましくは９〜２２アミノ酸であり、特に好ましくは１６アミノ酸である。
【００２３】
なお、本発明において「免疫応答」とは、Ｔ細胞等の免疫を担う細胞が、外来性の異物（細菌、ウィルス等又はそれらの断片）又は内因性の異物（がん細胞等又はそれらの断片）を抗原として認識し、特異的に応答して行われる反応のことをいい、例えば、かかる抗原を認識することにより行われる、ＩＦＮ−γ等のサイトカインの産生、ひいてはかかるサイトカイン産生等によって誘導される細菌、ウィルス及びがん細胞等の排除が挙げられる。
【００２４】
本発明において「キラーエピトープ」とは、「ＣＴＬエピトープ」又は「細胞傷害性Ｔ細胞エピトープ」とも称される、ＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激し、その免疫応答を誘導する活性を有する抗原決定基、これを構成するアミノ酸配列又は該アミノ酸配列からなる抗原性ポリペプチドを意味する。本発明において「キラーエピトープ」の長さとしては特に制限はないが、通常５〜３０アミノ酸であり、好ましくは６〜２５アミノ酸であり、より好ましくは８〜２０アミノ酸であり、特に好ましくは９アミノ酸である。
【００２５】
抗原性ポリペプチドは、周知の技術（例えば、Ｐａｕｌ  ＷＥ編集、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、２４３〜２４７ページ、Ｒａｖｅｎ出版、１９９３年）を使用して同定され得る。抗原性ポリペプチドを同定するための技術としては、抗原特異的抗血清及び／又はＴ細胞株若しくはクローンと反応する能力を指標とした、ポリペプチドのスクリーニング方法が挙げられる。例えば、ＥＬＩＳＡ及び／又はＴ細胞反応性アッセイにおいて、実質的にＷＴ１タンパク質全長の反応性以上であるレベルであることを指標として、ＷＴ１タンパク質中のポリペプチドにおいて、抗血清及び／又はＴ細胞と反応する部分を、ＷＴ１タンパク質に由来する抗原性ポリペプチドとして選択することができる。このようなスクリーニングは、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９９８に記載されるような、当業者に周知の方法を使用して実施され得る。
【００２６】
また、エピトープを構成するアミノ酸配列は、コンピュータープログラムを利用した分析によって推測することもできる。ヘルパーエピトープのアミノ酸配列は、ＭＨＣ−ＴＨＲＥＡＤ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｓｄ．ａｂｄｎ．ａｃ．ｕｋ／〜ｇｊｌｋ／ＭＨＣ−Ｔｈｒｅａｄ／）、ＥｐｉＰｒｅｄｉｃｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｐｉｐｒｅｄｉｃｔ．ｄｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）、ＨＬＡ−ＤＲ４  ｂｉｎｄｉｎｇ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｄｃｓ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｒａｎｃｈｅｓ／ｓｕｒｇｅｒｙ／ｓｂｐｒｏｇ．ｈｔｍｌ）、ＰｒｏＰｒｅｄ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｔｅｃｈ．ｒｅｓ．ｉｎ／ｒａｇｈａｖａ／ｐｒｏｐｒｅｄ／）等のコンピュータープログラムによって推測することができる。キラーエピトープのアミノ酸配列は、ＢＩＭＡＳ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／）、ＳＶＭＨＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｂｃ．ｓｕ．ｓｅ／ｓｖｍｈｃ／）、ＰＲＥＤＥＰ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｍｄ．ｈｕｊｉ．ａｃ．ｉｌ／ｍａｒｇ／Ｔｅｐｐｒｅｄ／ｍｈｃ−ｂｉｎｄ／）、ＮｅｔＭＨＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣ／）、ＰＲＥＤＩＣＴ（ｈｔｔｐ：／／ｓｄｍｃ．ｋｒｄｌ．ｏｒｇ．ｓｇ：８０８０／ｐｒｅｄｉｃｔ／）、ＬｐＰｅｐ（ｈｔｔｐ：／／ｒｅｉｎｅｒ．ｂｕ．ｅｄｕ／ｚｈｉｐｉｎｇ／ｌｐｐｅｐ．ｈｔｍｌ）等のコンピュータープログラムによって推測することができる。また、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（ｈｔｔｐ：／／ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｂｍｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｃｏｍ／Ｓｃｒｉｐｔｓ／ＭＨＣＳｅｒｖｅｒ．ｄｌｌ／ＥｐｉＰｒｅｄｉｃｔ．ｈｔｍ）、ＲａｎｋＰｅｐ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ．ｏｒｇ／Ｔｏｏｌｓ／ｒａｎｋｐｅｐ．ｈｔｍｌ）等のコンピュータープログラムによって、キラーエピトープ及びヘルパーエピトープのアミノ酸配列を推測することもできる。
【００２７】
これらコンピュータープログラムによって推測されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが、ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激し、その免疫応答を誘導する活性を有しているかは、後述の実施例において示すような、樹状細胞、末梢血細胞又は線維芽細胞を使用するインビトロ刺激アッセイに、かかるポリペプチドを供することによって、評価することができる。また、ＨＬＡを発現するトランスジェニックマウス動物を使用するインビボ刺激アッセイに、かかるポリペプチドを供することによって、評価することもできる。
【００２８】
本発明において「ＷＴ１タンパク質に由来するヘルパーエピトープ」又は「ＷＴ１タンパク質に由来するキラーエピトープ」には、天然ＷＴ１タンパク質の一部の連続したアミノ酸配列からなる抗原性ポリペプチドのみならず、その改変体も含まれる。かかる改変体としては、ＷＴ１タンパク質の一部の連続したアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるものが挙げられる。アミノ酸配列の置換、欠失、挿入又は付加は、一般的には、１０アミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内、好ましくは３アミノ酸以内、より好ましくは１アミノ酸）であり、本発明の改変体としては、ＷＴ１タンパク質の一部の連続したアミノ酸配列において、１個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるものが特に好ましい。
【００２９】
また、本発明にかかる「ＷＴ１タンパク質に由来するヘルパーエピトープ」の好適な例としては、表１に記載の配列番号：２〜３９のいずれか一に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられ、より好適な例としては、配列番号：５に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。本発明にかかる「ＷＴ１タンパク質に由来するキラーエピトープ」の好適な例としては、表５に記載の配列番号：４０〜４５のいずれか一に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられ、より好適な例としては、配列番号：４０又は４４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
【００３０】
【表１】
0006005305.tif 000002
【００３１】
【表２】
0006005305.tif 000003
【００３２】
【表３】
0006005305.tif 000004
【００３３】
【表４】
0006005305.tif 000005
【００３４】
【表５】
0006005305.tif 000006
【００３５】
なお、表１〜５に記載のポリペプチドが、ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞に対し、抗原性を有していることは、特許文献４〜６、非特許文献１〜３において実証されている。また、表１〜５に記載の通り、配列番号：９に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヘルパーエピトープ８）は、天然のＷＴ１タンパク質における１９４位アルギニン残基をチロシン残基に置換したものであり、配列番号：４２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド（キラーエピトープ３）は、天然のＷＴ１タンパク質における１９４位アルギニン残基をチロシン残基に置換したものであり、配列番号：４４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド（キラーエピトープ５）は、天然のＷＴ１タンパク質における３０４位メチオニン残基をチロシン残基に置換したものである。
【００３６】
本発明の「融合ポリペプチド」は、１分子あたり前記ヘルパーエピトープと前記キラーエピトープとを合わせて３〜６個のポリペプチドが人為的に結合してなるものである。前記ヘルパーエピトープ及び前記キラーエピトープの個数が、前記下限未満であると、由来の異なる多くのＴ細胞を刺激することができなくなり、前記上限を超えると、化学合成等により調製しにくくなる。また、本発明の融合ポリペプチドの鎖長としては特に制限はないが、好ましくは３０〜１００アミノ酸である。
【００３７】
本発明の融合ポリペプチド１分子あたりに含まれるエピトープ（前記ヘルパーエピトープ又は前記キラーエピトープ）の個数として、１のエピトープに他のエピトープが含まれている場合には、該他のエピトープの個数（１個）は含まれないものとする。例えば、表１に記載のヘルパーエピトープ７（ヒトＷＴ１タンパク質の１９０〜２０８番目のアミノ酸からなるポリペプチド）を含む本発明の融合ポリペプチドに関しては、ヒトＷＴ１タンパク質の１９０〜２０８番目のアミノ酸には表５に記載の通りキラーエピトープ７（ヒトＷＴ１タンパク質の１９４〜２０２番目のアミノ酸からなるポリペプチド）が含まれているが、該融合ポリペプチド１分子あたりに含まれるエピトープの個数に、キラーエピトープ７の個数（１個のキラーエピトープ）は含まれない。また、例えば、表１に記載のヘルパーエピトープ６（ヒトＷＴ１タンパク質の３９６〜４１７番目のアミノ酸からなるポリペプチド）を含む本発明の融合ポリペプチドに関しては、ヘルパーエピトープ２〜４（各々、ヒトＷＴ１タンパク質の３９９〜４１３番目のアミノ酸からなるポリペプチド、ヒトＷＴ１タンパク質の４０５〜４１５番目のアミノ酸からなるポリペプチド、ヒトＷＴ１タンパク質の４００〜４１５番目のアミノ酸からなるポリペプチド）が含まれているが、該融合ポリペプチド１分子あたりに含まれるエピトープの個数に、ヘルパーエピトープ２〜４（３個のヘルパーエピトープ）は含まれない。
【００３８】
本発明の「融合ポリペプチド」において、異なる配列のエピトープを各配列につき１個以上含んでいてもよく、同配列のエピトープを複数個含んでいてもよい。
【００３９】
また、本発明の「融合ポリペプチド」において、前記ヘルパーエピトープ及び前記キラーエピトープの配置については特に制限はなく、前記ヘルパーエピトープ及び前記キラーエピトープは、各々前記キラーエピトープ及び前記ヘルパーエピトープを間に挟むことなく、２個以上連続して配置されていてもよく、また、前記ヘルパーエピトープと前記キラーエピトープとが交互に配置されていてもよい。
【００４０】
本発明の「融合ポリペプチド」として、好ましくは、１分子あたり前記ヘルパーエピトープと前記キラーエピトープとを合わせて３個含むものであり、より好ましくは、１個の前記ヘルパーエピトープと２個の前記キラーエピトープとを含むものであり、さらに好ましくは、配列番号：５に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと、配列番号：４０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと、配列番号：４４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとを含むものである。
【００４１】
また、後述の実施例において示す通り、由来の異なるより多くのＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激し、抗原特異的にサイトカインを産生するＴｈ１細胞及びＣＴＬをより多く誘導できるという観点から、本発明の「融合ポリペプチド」として、さらに好ましくは、前記ヘルパーエピトープの両側に前記キラーエピトープが結合しているものであり、特に好ましくは、配列番号：５に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドのアミノ末端側に配列番号：４０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが結合しており、配列番号：５に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドのカルボキシル末端側に配列番号：４４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが結合しているものである。
【００４２】
本発明の「融合ポリペプチド」において、エピトープ間は直接的に結合されていてもよく、間接的に結合されていてもよい。かかる間接的な結合としては、例えば、リンカーポリペプチドを介した結合が挙げられる。かかるリンカーポリペプチドの長さとしては、通常１〜１００アミノ酸、好ましくは１〜５０アミノ酸、より好ましくは１〜３０アミノ酸、さらに好ましくは２〜１０アミノ酸（例えば、５アミノ酸）であり、特に好ましくは５つのグリシンからなるリンカーポリペプチドを介した結合である。
【００４３】
本発明の融合ポリペプチドは、１分子あたり前記ヘルパーエピトープと前記キラーエピトープとを合わせて３〜６個含む限り、タンパク質の分離精製に有用なタグとして汎用されているＨｉｓタグや、ＧＦＰの様なマーカータンパク質がさらに付加されていたり、またビオチン等の標識化合物が付加されていてもよい。
【００４４】
本発明の融合ポリペプチドは、それらをコードするＤＮＡに種々の公知の遺伝子組み換え手法を適用することで、当該融合ポリペプチドを組み換えタンパク質として製造することが可能である。典型的には、本発明の融合ポリペプチドをコードするＤＮＡを適当なＤＮＡ合成機を用いて合成し、当該技術分野における参考書、例えばＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年等）に紹介されている種々の手法を適当に選択あるいは組み合わせて本発明の融合ポリペプチドを発現する発現ベクターを構築し、大腸菌等の適当な宿主細胞をこの発現ベクターで形質転換させ、当該ポリペプチドを生産させればよい。その際、先に述べたように、Ｈｉｓタグの付加等の様に、組み換えポリペプチドの製造に利用される種々の操作を加えることができる。
【００４５】
また、本発明の融合ポリペプチドは、種々の保護基で修飾されたアミノ酸を原料として化学合成的に製造することもできる。融合ポリペプチドを遺伝子や宿主細胞を用いずに有機化学的に合成する方法は当業者に広く知られている。例えば、「第５版  実験化学講座１６  有機化合物の合成ＩＶ」（相本三郎ら著、日本化学会編）等は、ポリペプチドの化学合成法を種々紹介しており、本発明のポリペプチドはこれらのいずれの方法を用いても合成することができる。また、一般にペプチドシンセサイザーと称される市販機器を用いて合成することもできる。
【００４６】
＜本発明の抗腫瘍剤＞
後述の実施例において示す通り、前述の融合ポリペプチドによって、由来の異なる多くのＴ細胞を刺激し、それらの免疫応答を強く誘導することができる。したがって、本発明の融合ポリペプチドを有効成分として含有する抗腫瘍剤を提供することもできる。
【００４７】
本発明において「抗腫瘍剤」とは、Ｔ細胞を刺激し、それらの免疫応答を誘導することによって、腫瘍細胞の増殖を抑制、及び／又は該腫瘍細胞の死を誘導することのできる薬剤のことを意味する。すなわち、本発明の抗腫瘍剤には、対象に投与することにより、対象内のＴ細胞を刺激し、免疫応答を活性化することのできる薬剤（能動免疫療法のための薬剤）のみならず、対象外で刺激され、その免疫応答が活性化されたＴ細胞等を含む薬剤（受動免疫療法のための薬剤）が含まれる。
【００４８】
また、本発明の「抗腫瘍剤」の治療又は予防の対象となる腫瘍としては、ＷＴ１タンパク質が発現しているものであればよく、例えば、白血病（急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病等）及び固形がん（腎芽腫（ウィルムス腫瘍）、腎臓がん、乳がん、肺がん、甲状腺がん、胃がん、腸がん、前立腺がん、卵巣がん、黒色腫等）が挙げられる。
【００４９】
また、本発明の抗腫瘍剤の他の態様としては、本発明の融合ポリペプチド及び、該融合ポリペプチドを用いて製造される、ＷＴ１タンパク質を発現している腫瘍細胞に対してサイトカインを産生するＴ細胞を有効成分として含有する抗腫瘍剤が挙げられる。
【００５０】
かかる「ＷＴ１タンパク質を発現している腫瘍細胞に対してサイトカインを産生するＴ細胞」は、例えば、以下の方法にて製造することができる。
【００５１】
本発明の融合ポリペプチドと単核球とをインキュベーションする工程、及び
前記インキュベーションした単核球と抗原提示細胞とをインキュベーションする工程を含む方法。
【００５２】
本発明において「単核球」とはリンパ球及び単球を意味し、例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ、末梢血単核球）、臍帯血単核細胞、腫瘍組織浸潤リンパ球の態様が挙げられる。なお、腫瘍組織浸潤リンパ球とは、がんを罹患している対象から切除した腫瘍組織中又は採取した胸腹水中から分離したリンパ球のことを意味する。
【００５３】
本発明の融合ポリペプチドと単核球との「インキュベーション」は、例えば、単核球を培養している培地中に、本発明の融合ポリぺプチドを添加することにより行うことができる。また、本発明の融合ポリぺプチドを固相化したプレートにて、単核球を培養することによって行ってもよい。かかるインキュベーションの際の条件としては、単核球の維持に好適であればよく、例えば、単核球を維持するために利用される培地（例えば、血清が添加してあるＡＩＭ−Ｖ培地）にて、３７℃、５％ＣＯ２、１５分〜４８時間培養することが挙げられる。
【００５４】
このようにしてインキュベーションした単核球とインキュベーションする抗原提示細胞としては、前記インキュベーションの際に使用された本発明の融合ポリペプチドが結合し得るＨＬＡをその表面上に発現している細胞であればよく、例えば、樹状細胞、Ｂ細胞、マクロファージが挙げられる。また、本発明にかかる抗原提示細胞としては、本発明の融合ポリペプチドがパルスされた前記ＨＬＡをその表面上に発現している細胞であってもよい。また、かかる抗原提示細胞は、単核球とインキュベーションする前に、Ｘ線照射やマイトマイシン処理等により、増殖能を喪失させたものであってもよい。
【００５５】
かかる抗原提示細胞と単核球とのインキュベーションの際の条件としては、単核球及び抗原提示細胞の維持に好適であればよく、例えば、単核球及び抗原提示細胞を維持するために利用される培地（例えば、ＡＩＭ−Ｖ培地）にて、３７℃、５％ＣＯ２、１〜７日間にて培養することが挙げられる。また当該インキュベーションの際に、培地には、Ｔ細胞を刺激するという観点から、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＰＨＡ、抗ＣＤ３抗体、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、抗ＩＬ−４抗体又はこれらの組み合わせを培地に添加してもよい。さらに、種々のサイトカインを産生させることにより免疫応答を増強させるという観点から、ピシバニール（ＯＫ−４３２）、ＣｐＧ  ＤＮＡ等のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のアゴニスト等を培地に添加してもよい。また、この抗原提示細胞と単核球とのインキュベーションは、受動免疫療法に必要なＴ細胞数を確保するため、複数回繰り返してもよい。
【００５６】
後述の実施例に示す通り、このようにして製造されたＴ細胞には、本発明の融合ポリペプチド特異的にサイトカインを産生するＣＤ４＋Ｔ細胞（抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞）と、本発明の融合ポリペプチド特異的にサイトカインを産生するＣＤ８＋Ｔ細胞（抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞）とが含まれている。かかるＴ細胞を精製する方法としては、例えば、本発明の融合ポリペプチドを固相化した担体等を用いて分離することができる。さらに、かかるＴ細胞は、分泌されるサイトカインを指標として精製することもできる。すなわち、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４等のサイトカインを産生するので、これらに対する抗体を用いたフローサイトメトリー、アフィニティクロマトグラフィー、磁気ビーズ精製法により精製することができる。
【００５７】
一方、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α等のサイトカインを産生するので、これらに対する抗体を用いたフローサイトメトリー、アフィニティクロマトグラフィー、磁気ビーズ精製法により精製することができる。
【００５８】
また、かかるＴ細胞は、各Ｔ細胞の細胞表面に発現しているタンパク質に対する抗体を用いたフローサイトメトリー、アフィニティクロマトグラフィー、磁気ビーズ精製法により精製することができる。抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞表面に発現しているタンパク質としては、ＣＤ２９、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ等が挙げられ、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞表面に発現しているタンパク質としては、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ６３、ＣＤ６９等が挙げられる。
【００５９】
また、前述の通り、単核球を抗原特異的なＴ細胞に誘導するために、本発明の融合ポリペプチド及び抗原提示細胞は有用である。したがって、受動免疫療法によりがんを治療又は予防するための薬剤として、本発明の融合ポリペプチド及び抗原提示細胞を有効成分とする抗腫瘍剤を提供することもできる。
【００６０】
また、本発明の抗腫瘍剤に含まれるＴ細胞及び抗原提示細胞、並びに該Ｔ細胞の製造に用いられる単核球及び抗原提示細胞は、各々独立して、本発明の抗腫瘍剤が投与される対象に由来するもの（自家）であってもよく、前記対象と同種異系の関係にあってもよく、また前記対象とＨＬＡクラスの型が一致する同種異系の関係であってもよい。
【００６１】
本発明の抗腫瘍剤は、本発明の融合ポリペプチド、Ｔ細胞又は樹状細胞に、これらの作用を阻害しない範囲で、医薬の製剤化のために一般的に利用される種々の賦形剤や他の医薬活性成分等を含んでいてもよい。特に、本発明の抗腫瘍剤は、本発明の融合ポリペプチド、Ｔ細胞及び樹状細胞を安定に保持できる緩衝液又は液体培地の形態にあることが好ましい。
【００６２】
緩衝液の非限定的な例としては、中性の緩衝化生理食塩水又はリン酸緩衝化生理食塩水等を挙げることができる。また、例えばグルコース、マンノース、スクロース、デキストラン、マンニトール等の糖質、タンパク質、アミノ酸、抗酸化剤、静菌剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ又はグルタチオン）、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム、ＫＬＨ、ＱＳ２１、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、リン酸アルミニウム、ＢＣＧ、ミョウバン、ＣｐＧ  ＤＮＡ等のＴＬＲのアゴニスト）、浸透圧調節剤、懸濁剤、増粘剤及び／又は保存剤等をさらに含んでいてもよい。
【００６３】
また本発明の抗腫瘍剤において、本発明の融合ポリペプチド及びＴ細胞、並びに、本発明の融合ポリペプチド及び樹状細胞とは各々混合されている形態にあることが好ましいが、本発明の融合ポリペプチドとＴ細胞又は樹状細胞とが別々に保存され、使用時に混合して投与することのできる、いわゆるキットの形態であってもよい。
【００６４】
本発明の抗腫瘍剤は、がんの治療又は予防に用いられる公知の医薬組成物と併用してもよい。また、本発明の抗腫瘍剤は、ヒトを含む動物を対象として使用することができる。ヒト以外の動物としては特に制限はなく、種々の家畜、家禽、ペット、実験用動物等を対象とすることができる。また、本発明の抗腫瘍剤を投与される対象としては特に制限されることなく、ＷＴ１タンパク質が発現している腫瘍を罹患しているもののみならず、罹患していないものであってもよい。例えば、がんの再発予防という観点から、外科的手術、化学療法、放射線療法等によってがんを治療したものであってもよい。
【００６５】
本発明の抗腫瘍剤の投与形態としては特に制限はなく、例えば皮下注射、静脈注射、皮内注射、筋肉内注射、腫瘍組織部位への局所注射が挙げられる。本発明の抗腫瘍剤を投与する場合、その投与量は、対象の年齢、体重、症状、健康状態等に応じて、適宜選択されるが、例えば、本発明の抗腫瘍剤の投与量（有効成分換算量）は、有効成分の種類に応じて異なるが、例えば、有効成分がポリペプチドである場合には、通常、０．０１〜１０ｍｇであり、有効成分が細胞である場合には、通常、１０６〜１０１２細胞である。
【００６６】
本発明は、このように、本発明の抗腫瘍剤を対象に投与させることを特徴とする、対象におけるがんの治療又は予防するための方法をも提供する。
【００６７】
本発明の抗腫瘍剤の製品又はその説明書は、がんの治療又は予防に用いられる旨の表示を付したものであり得る。ここで「製品または説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装などに表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物などに表示を付したことを意味する。がんの治療又は予防に用いられる旨の表示においては、本発明の融合ポリペプチド、該融合ポリペプチド及び、該融合ポリペプチドを用いて製造される、ＷＴ１タンパク質を発現している腫瘍細胞に対してサイトカインを産生するＴ細胞又は該融合ポリペプチド及び樹状細胞を投与することにより、腫瘍細胞の増殖を抑制、及び／又は該腫瘍細胞の死が誘導される機序についての情報を含むことができる。
【実施例】
【００６８】
以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００６９】
＜樹状細胞の調製＞
健常人ボランティア６名より供与された血液から、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用い、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離した。分離したＰＢＭＣを、無血清のＡＩＭ−Ｖを用い、細胞培養フラスコ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）にて３７℃、ＣＯ２インキュベータ内で１時間培養した後、非付着性細胞を除去した。そして、フラスコ上に残った付着性細胞を、リコンビナントＧＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｗａｋｏ社製）及びリコンビナントＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｗａｋｏ社製）存在下、ＡＩＭ−Ｖ培地にて培養を開始した。培養を開始してから３日後、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４とを添加したＡＩＭ−Ｖ培地に交換し、培養を開始してから７日後トリプシンを用いて樹状細胞（ＤＣ）を回収した。このＤＣを抗原特異的Ｔ細胞の誘導、又はＴ細胞からの抗原特異的サイトカイン（ＩＦＮ−γ）産生解析の際の抗原提示細胞（ＡＰＣ：ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）として用いた。【００７０】
＜ＷＴ１タンパク質に由来するポリペプチド＞
表６に示す６種類のＷＴ１タンパク質に由来するポリペプチドを設計し、株式会社ペプチド研究所にて化学合成し、９５％以上の純度にてポリペプチドを得た。【００７１】
【表６】
0006005305.tif 000007
【００７２】
なお、ヘルパー／キラー−ハイブリッドエピトープロングペプチド（Ｈ／Ｋ−ＨＥＬＰ）１は、Ｎ末端側よりヘルパーエピトープ（ＨＥ）４とキラーエピトープ（ＫＥ）１とが５つのグリシンからなるリンカーポリペプチドを介して結合している融合ポリペプチドである。Ｈ／Ｋ−ＨＥＬＰ２は、Ｎ末端側よりＨＥ４とＫＥ１とＫＥ５とが５つのグリシンからなるリンカーポリペプチドを介して結合している融合ポリペプチドである。Ｈ／Ｋ−ＨＥＬＰ３は、Ｎ末端側よりＫＥ１とＨＥ４とＫＥ５とが５つのグリシンからなるリンカーポリペプチドを介して結合している融合ポリペプチドである。【００７３】
また、後述のＰＢＭＣの培養培地への添加は、下記４態様にて行った。
ミックス（比較例１）：ＨＥ４、ＫＥ１及びＫＥ５を各５μＭ混合したものを培地に添加
Ｈ／Ｋ−ＨＥＬＰ１（比較例２）：５μＭのＨ／Ｋ−ＨＥＬＰ１を培地に添加
Ｈ／Ｋ−ＨＥＬＰ２（実施例１）：５μＭのＨ／Ｋ−ＨＥＬＰ２を培地に添加
Ｈ／Ｋ−ＨＥＬＰ３（実施例２）：５μＭのＨ／Ｋ−ＨＥＬＰ３を培地に添加。【００７４】
＜抗原特異的Ｔｈ細胞（ＣＤ４陽性Ｔ細胞）及びＣＴＬ（ＣＤ８陽性Ｔ細胞）の誘導＞
健常人ボランティアから分離した前述のＰＢＭＣを、２４穴プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に２×１０６細胞／穴になるよう播種した。そして、前述のＷＴ１タンパク質に由来する、抗原特異的Ｔ細胞を誘導するための各ポリペプチド（５μＭ）及び血清を添加したＡＩＭ−Ｖ培地１ｍｌ／穴にて、３７℃、ＣＯ２インキュベータ内で培養を開始した。【００７５】
培養を開始してから７日後、前述のＤＣ（自己ＤＣ）を、由来を同一とするＰＢＭＣに加えた。また培地を、ＯＫ−４３２（０．１ＫＥ／ｍｌ、商品名：ピシバニール、中外製薬株式会社製）を添加した無血清のＡＩＭ−Ｖ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に交換し、２時間培養した。なお、ピシバニール（ＯＫ−４３２）は、Ａ群溶血性連鎖球菌の弱毒の自然変異株（Ｓｕ株）をペニシリンで処理して得られた製剤であり、種々のサイトカイン（免疫因子）を産生させることにより免疫増強作用を惹起することが知られている。【００７６】
そして、前記２時間の培養後、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ、協和発酵キリン株式会社製）を加えて５０分間処理した。さらに、前述の抗原特異的Ｔ細胞を誘導するための各ポリペプチド（５μＭ）存在下、自己ＤＣとＴ細胞を非動化した５％ヒトＡＢ血清（北海道赤十字センター）とを含有したＡＩＭ−Ｖ培地中で共培養し、Ｔ細胞の再刺激を行った。その２日後、リコンビナントＩＬ−２（Ｓｈｉｏｎｏｇｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｏ．Ｌｔｄ製）を最終濃度１０Ｕ／ｍｌになるように添加した。共培養開始より１４日後、自己ＤＣに前述の抗原特異的Ｔ細胞を誘導するための各ポリペプチド（５μＭ）を２時間パルスし、ＭＭＣ処理したものをＡＰＣとして、Ｔ細胞の再刺激を行った。また、共培養開始より１４日後以降は、リコンビナントＩＬ−２の添加濃度を２０Ｕ／ｍｌとして培養を行った。その後、共培養２１日目のＴ細胞を遠心分離等で回収し、次に示す抗原特異的な反応性の解析に供した。【００７７】
＜細胞内染色法（ＩＣＳ）によるＴ細胞の抗原特異的サイトカイン産生の解析＞
前述の通り誘導したＴ細胞（前記共培養２１日目のＴ細胞）を５×１０４細胞／穴になるよう、また自己ＤＣを５×１０３細胞／穴となるように、９６穴プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）の同一の穴に播種した。そして、抗原特異的な反応性を解析するための各ポリペプチド（ＨＥ４、ＫＥ１、ＫＥ５、Ｈ／Ｋ−ＨＥＬＰ１、Ｈ／Ｋ−ＨＥＬＰ２又はＨ／Ｋ−ＨＥＬＰ３）５μＭの存在下、培養を行った。また、対照群としてポリペプチドを加えない群を用意した。【００７８】
細胞内サイトカイン染色法は、定法に従い、先ず培養開始時にブレフェルディンＡ（Ｓｉｇｍａ社製）を加えて細胞内タンパク質輸送を阻害し、サイトカインを細胞内に蓄積させた。そして、１５〜２０時間培養した細胞に対し、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を検出するために、抗ＣＤ４抗体と抗サイトカイン抗体とで染色し、またＣＤ８陽性Ｔ細胞を検出するために、抗ＣＤ８抗体と抗サイトカイン抗体とで染色し、フローサイトメトリーによる解析を行った。なお、抗ＣＤ４抗体としてＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ４  ｍＡｂを、抗サイトカイン抗体としてＰｅｒＣＰ−Ｃｙ７標識マウス抗ヒトＩＦＮ−γ  ｍＡｂを、抗ＣＤ８抗体としてＡＰＣ標識マウス抗ヒトＣＤ８  ｍＡｂを用いた。また、測定にはＦＡＣＳＣａｎｔｏＴＭＩＩを、解析にはＦＡＣＳＤｉｖａＴＭ６．１（共にＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用した。【００７９】
そして、ＣＤ４陽性Ｔ細胞（Ｔｈ細胞）における抗原特異的ＩＦＮ−γ産生細胞の比率を測定し、抗原特異的な反応性を解析するための各ポリペプチド存在下における測定値において最も高い比率を選択した。次いで、この比率が対照群（ポリペプチド非添加群）における比率の２．５倍以上あり、かつその差が２％以上ある場合を、前述の抗原特異的Ｔ細胞を誘導するためのポリペプチドによってサイトカイン産生が誘導されるＴ細胞（抗原特異的Ｔ細胞）が誘導されたと評価した。また、ＣＤ８陽性Ｔ細胞（ＣＴＬ）における抗原特異的ＩＦＮ−γ産生細胞の比率も測定し、前述のＣＤ４陽性Ｔ細胞同様に、抗原特異的Ｔ細胞の誘導を評価した。得られた結果を表７に示す。表７中、「＋」は抗原特異的Ｔ細胞の誘導が認められたことを示し、「−」は抗原特異的Ｔ細胞の誘導が認められなかったことを示す。「誘導効率（％）」は供したドナーの異なる６種のＰＢＭＣから抗原特異的Ｔ細胞に誘導することのできた割合を示す。また、「最良ペプチド」とは、各ＰＢＭＣにおいて、抗原特異的ＩＦＮ−γ産生細胞の比率が最も高くなった（ポリペプチド添加群とポリペプチド非添加群との抗原特異的ＩＦＮ−γ産生細胞の比率の差が最も大きくなった）、抗原特異的Ｔ細胞を誘導するためのポリペプチドを示す。さらに、「最良ペプチド（％）」は６種のＰＢＭＣにおいて、前記最良ペプチドとして評価された割合を示す。【００８０】
【表７】
0006005305.tif 000008
【００８１】
表７に示した結果から明らかなように、本発明の融合ポリペプチドを用いた場合（実施例１〜２）においては、本発明の融合ポリペプチドを構成するエピトープを混合して用いた場合（比較例１）よりも、由来の異なるより多くのＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞を刺激し、サイトカイン（ＩＦＮ−γ）を産生するＴｈ１細胞及びＣＴＬを誘導することができた（表７「誘導効率（％）」の「ＣＤ４」及び「ＣＤ８」  参照）。さらに、ヘルパーエピトープの両側にキラーエピトープが結合している本発明の融合ポリペプチドを用いた場合（実施例２）においては、実施例１と比較しても、由来の異なるより多くのＣＤ４陽性Ｔ細胞を刺激し、サイトカイン（ＩＦＮ−γ）を産生するＴｈ１細胞を誘導できることが明らかになった（表７「誘導効率（％）」の「ＣＤ４」参照）。一方、キラーペプチドとヘルパーエピトープとが１個ずつ結合している融合ポリペプチドを用いた場合（比較例２）において、ＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞における抗原特異的Ｔ細胞を誘導する活性は比較例１のそれと変わらないものであった（表７「誘導効率（％）」の「ＣＤ４」及び「ＣＤ８」  参照）。【００８２】
また、表７に示す通り、本発明の融合ポリペプチドを用いた場合（実施例１〜２）においては、比較例１及び２と比較して、サイトカインを産生するＴｈ１細胞及びＣＴＬの誘導効率が高い、すなわち免疫応答が強く誘導されていることが明らかになった（表７「最良ペプチド」  参照）。さらに、ヘルパーエピトープの両側にキラーエピトープが結合している本発明の融合ポリペプチドを用いた場合（実施例２）においては、実施例１と比較しても、由来の異なるより多くのＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞を刺激し、サイトカイン（ＩＦＮ−γ）を産生するＴｈ１細胞及びＣＴＬを誘導できることが明らかになった（表７「最良ペプチド（％）」  参照）。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
以上説明したように、本発明によれば、由来の異なる多くのＴ細胞を刺激し、多くの種類のがんに対して免疫応答を強く誘導することが可能となる。【００８４】
したがって、本発明の融合ポリペプチド、並びに該融合ポリペプチド及び樹状細胞は、対象に投与することにより、対象内のＴ細胞を刺激し、免疫応答を強く活性化することができるので、がんに対する能動免疫療法のための薬剤として有用である。また、該融合ポリペプチドによって誘導される抗原特異的Ｔ細胞、及び該融合ポリペプチドによってパルスされた抗原提示細胞は、受動免疫療法のための薬剤又は抗腫瘍剤として有用である。これらの細胞は該融合ポリペプチドとともに使用されることが好ましい。
【配列表フリーテキスト】
【００８５】
配列番号：１
＜２２３＞  ヒトＷＴ１タンパク質
配列番号：２
＜２２３＞  ヘルパーエピトープ１（ＨＥ１）
配列番号：３
＜２２３＞  ヘルパーエピトープ２（ＨＥ２）
配列番号：４
＜２２３＞  ヘルパーエピトープ３（ＨＥ３）
配列番号：５
＜２２３＞  ヘルパーエピトープ４（ＨＥ４）
配列番号：６
＜２２３＞  ヘルパーエピトープ５（ＨＥ５）
配列番号：７
＜２２３＞  ヘルパーエピトープ６（ＨＥ６）
配列番号：８
＜２２３＞  ヘルパーエピトープ７（ＨＥ７）
配列番号：９
＜２２３＞  ＷＴ１タンパク質の１８０〜２０８位において１９４位のアルギニンがチロシンに置換されているアミノ酸配列からなる、ヘルパーエピトープ８（ＨＥ８）
配列番号：１０
＜２２３＞  ヘルパーエピトープ９（ＨＥ９）
配列番号：１１
＜２２３＞  ヘルパーエピトープ１０（ＨＥ１０）
配列番号：１２
＜２２３＞  ヘルパーエピトープ１１（ＨＥ１１）
配列番号：１３
＜２２３＞  ヘルパーエピトープ１２（ＨＥ１２）
配列番号：１４
＜２２３＞  ヘルパーエピトープ１３（ＨＥ１３）
配列番号：１５
＜２２３＞  ヘルパーエピトープ１４（ＨＥ１４）
配列番号：１６
＜２２３＞  ヘルパーエピトープ１５（ＨＥ１５）
配列番号：１７
＜２２３＞  ヘルパーエピトープ１６（ＨＥ１６）
配列番号：１８
＜２２３＞  ヘルパーエピトープ１７（ＨＥ１７）
配列番号：１９
＜２２３＞  ヘルパーエピトープ１８（ＨＥ１８）
配列番号：２０
＜２２３＞  ヘルパーエピトープ１９（ＨＥ１９）
配列番号：２１
＜２２３＞  ヘルパーエピトープ２０（ＨＥ２０）
配列番号：２２
＜２２３＞  ヘルパーエピトープ２１（ＨＥ２１）
配列番号：２３
＜２２３＞  ヘルパーエピトープ２２（ＨＥ２２）
配列番号：２４
＜２２３＞  ヘルパーエピトープ２３（ＨＥ２３）
配列番号：２５
＜２２３＞  ヘルパーエピトープ２４（ＨＥ２４）
配列番号：２６
＜２２３＞  ヘルパーエピトープ２５（ＨＥ２５）
配列番号：２７
＜２２３＞  ヘルパーエピトープ２６（ＨＥ２６）
配列番号：２８
＜２２３＞  ヘルパーエピトープ２７（ＨＥ２７）
配列番号：２９
＜２２３＞  ヘルパーエピトープ２８（ＨＥ２８）
配列番号：３０
＜２２３＞  ヘルパーエピトープ２９（ＨＥ２９）
配列番号：３１
＜２２３＞  ヘルパーエピトープ３０（ＨＥ３０）
配列番号：３２
＜２２３＞  ヘルパーエピトープ３１（ＨＥ３１）
配列番号：３３
＜２２３＞  ヘルパーエピトープ３２（ＨＥ３２）
配列番号：３４
＜２２３＞  ヘルパーエピトープ３３（ＨＥ３３）
配列番号：３５
＜２２３＞  ヘルパーエピトープ３４（ＨＥ３４）
配列番号：３６
＜２２３＞  ヘルパーエピトープ３５（ＨＥ３５）
配列番号：３７
＜２２３＞  ヘルパーエピトープ３６（ＨＥ３６）
配列番号：３８
＜２２３＞  ヘルパーエピトープ３７（ＨＥ３７）
配列番号：３９
＜２２３＞  ヘルパーエピトープ３８（ＨＥ３８）
配列番号：４０
＜２２３＞  キラーエピトープ１（ＫＥ１）
配列番号：４１
＜２２３＞  キラーエピトープ２（ＫＥ２）
配列番号：４２
＜２２３＞  ＷＴ１タンパク質の１９４〜２０２位において１９４位のアルギニンがチロシンに置換されているアミノ酸配列からなる、キラーエピトープ３（ＫＥ３）
配列番号：４３
＜２２３＞  キラーエピトープ４（ＫＥ４）
配列番号：４４
＜２２３＞  ＷＴ１タンパク質の３０３〜３１１位において３０４位のメチオニンがチロシンに置換されているアミノ酸配列からなる、キラーエピトープ５（ＫＥ５）
配列番号：４５
＜２２３＞  キラーエピトープ６（ＫＥ６）
配列番号：４６
＜２２３＞  Ｎ末端から順に、ＨＥ４と、５つのグリシンからなるリンカーと、ＫＥ１とが結合している、融合ポリペプチド
配列番号：４７
＜２２３＞  Ｎ末端から順に、ＨＥ４と、５つのグリシンからなるリンカーと、ＫＥ１と、５つのグリシンからなるリンカーポリペプチドと、ＫＥ５とが結合している、融合ポリペプチド
配列番号：４８
＜２２３＞  Ｎ末端から順に、ＫＥ１と、５つのグリシンからなるリンカーと、ＨＥ４と、５つのグリシンからなるリンカーポリペプチドと、ＫＥ５とが結合している、融合ポリペプチド
【図１】
0006005305.tif 000009
【配列表】
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