(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号1〜58290で表される58,290個のSNP遺伝子座からなることを特徴とする水稲遺伝子型決定用のSNP分子マーカー組み合わせからなるＤＮＡチップ。
【請求項２】
配列番号1〜58290で表されるヌクレオチド配列を有する58,290個のSNP遺伝子座からなる水稲全ゲノムＤＮＡチップ。
【請求項３】
水稲の遺伝資源遺伝子フィンガープリント分析における請求項2に記載のチップの応用方法であって、水稲ゲノムDNAの抽出工程と、得られた抽出物のDNAサンプルの品質測定工程と、品質測定サンプルについての遺伝子チップの測定工程と、測定された遺伝子チップについてのデータ分析工程とからなる、方法。
【請求項４】
水稲の雑種後代遺伝子型鑑定における請求項2に記載のチップの応用方法であって、水稲ゲノムDNAの抽出工程と、得られた抽出物のDNAサンプルの品質測定工程と、品質測定サンプルについての遺伝子チップの測定工程と、測定された遺伝子チップについてのデータ分析工程とからなる、方法。
【請求項５】
水稲の品種同定における請求項2に記載のチップの応用方法であって、水稲ゲノムDNAの抽出工程と、得られた抽出物のDNAサンプルの品質測定工程と、品質測定サンプルについての遺伝子チップの測定工程と、測定された遺伝子チップについてのデータ分析工程とからなる、方法。
【請求項６】
水稲育種材料の測定における請求項2に記載のチップの応用方法であって、水稲ゲノムDNAの抽出工程と、得られた抽出物のDNAサンプルの品質測定工程と、品質測定サンプルについての遺伝子チップの測定工程と、測定された遺伝子チップについてのデータ分析工程とからなる、方法。
【請求項７】
水稲全ゲノムの関連分析における請求項2に記載のチップの応用方法であって、水稲ゲノムDNAの抽出工程と、得られた抽出物のDNAサンプルの品質測定工程と、品質測定サンプルについての遺伝子チップの測定工程と、測定された遺伝子チップについてのデータ分析工程とからなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲノミクス、分子生物学、バイオインフォマティクス及び分子植物育種の分野に関し、具体的には、水稲全ゲノム育種チップ及びその応用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、DNAシークエンシング技術は、画期的な進展が取られてきて、第二世代のDNAシークエンシング技術の発展によって、ゲノムシークエンシングの効率を大幅に向上させて、シークエンシングの時間とコストを大幅に低減させ、機能的ゲノムの研究に大きな便利性をもたらした。水稲については、2010年に、中国の水稲分子生物学者は、第二世代のDNAシークエンシング技術を利用して、517個の中国水稲地方品種材料に対してのリシーケンスを完成し、高密度的な水稲ハプロタイプマップ（HapMap）を作成し、全ゲノムワイド関連解析（GWAS）の研究方法を利用して、インド型稲品種の14個の重要な農業形質を関連解析し、これらの農業形質に関連する候補遺伝子座を同定して、さらに、効率よく、高速、成熟、安定且つ精確的な、コストの低いハイスループット遺伝子型同定法を確立した（特許文献１）。その後、シークエンシングされる水稲の数量を950個の水稲品種に拡大して、関連解析によって、より多くの出穂期と収穫量を制御する関連サイトを発見した（特許文献２）。華中農業大学の科学者は、Illuminaシークエンシング技術を利用して、明恢63と珍汕97及びその相互交配分離群体の全ゲノムリシーケンスを完了し、ハイスループットの群体遺伝子型決定の方法を開発し、27万個のSNPマークを含む明恢63と珍汕97との相互交配分離群体である210個の組換え自殖系統の、超高密度遺伝連鎖地図を構築して、QTLマッピング解析において強力な効果を表した（特許文献３、特許文献４）。最近、中国農業科学院、深セン華大遺伝子研究院、及び国際水稲研究所は、協力合意を締結して、世界的に3000個の水稲核心遺伝資源のリシーケンスプロジェクトを開始して、水稲全ゲノム分子育種の全面的な展開を示した。2010年の年末までに、水稲では、600個あまりの遺伝子を成功的にクローンして、その中には、多くの遺伝子は、収穫量、品質、耐生物や非生物脅迫、栄養利用効率などのような重要な農業形質を制御し、これらの遺伝子は、育種の潜在力を大きく有する（特許文献５）。2012年までに、水稲では、クローンされた遺伝子の数量は、800個を超えた。これらの水稲の機能的ゲノムの研究成果は、水稲の分子育種に重要なベースデータを提供した。
【０００３】
分子マーカー技術（Molecular marker technologies）は、分子育種の重要なツールである。RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism、制限断片長多型）及びSSR（Simple Sequence Repeat、単純反復配列）技術のような伝統的な分子マーカー技術は、機能的ゲノムの研究に重要な役割を果たしている。しかし、伝統的な分子マーカー技術には、多くの限界性が存在し、例えば、スループットが低く、数量が少なく、操作が複雑であるため、大規模な商業的育種のニーズを満たすことができない。目的遺伝子を精確に制御し、遺伝的背景を効果的に選択し、育種品種を正確に分析及び同定するために、ハイスループット分子マーカー技術を開発し利用する必要がある。現在、ハイスループット分子マーカー技術のプラットフォームは二つがあり、一つは、第二世代のシークエンシング技術に基づくものであり、もう一つは、遺伝子チップ技術に基づくものである。中には、遺伝子チップに基づく分子マーカー技術は、主に、SNP遺伝子チップ（特許文献６）、SFP（Single Feature Polymorphism，単独形体多型）（特許文献７）、DArT技術（Diversity Array Technology，多様性チップ技術）（特許文献８）、RAD（Restriction site Associated DNA，制限酵素認識部位に関わるDNA）（特許文献９、特許文献１０）などがある。SNP遺伝子座は、分布が広く及び検査が自動化を実現しやすい利点を有して、SNPチップは、遺伝子チップ技術では、大規模な商業的育種に最適する遺伝子型分類技術である。現在、トウモロコシにおいて、Illumina Infinium MaizeSNP50チップは、遺伝資源同定及び関連分析に用いられている（特許文献１１、特許文献１２）。水稲において、Affymetrix GeneChip Rice 44K遺伝子チップは、水稲の遺伝資源の遺伝多様性分析及び全ゲノム関連分析に用いられているが（特許文献１３）、密度が異なるIllumina GoldenGate SNP遺伝子チップは、水稲分子育種に用いられている（特許文献１４、特許文献１５、特許文献１６）。
【０００４】
Illumina会社のInfinium SNPチップ技術は、現在、成熟的な、且つ広く使用された全ゲノムSNP検定プラットフォームである。それがレーザー共焦点ファイバービーズチップ技術と特有のビーズマトリックスBeadArray技術を応用して製造されたチップは、数多いビーズを載せることができることで、大量なSNPプローブを結合することができる。現在、該会社が製造したヒトSNPチップは、数百万個のSNPマーカーを収容することができる（http://www.illumina.com）。チップの製造の際に、デオキシリボ核酸を20〜50個含んでいるSNPプローブ配列のそれぞれは、特定のビーズと結合して、ビーズの種類は、載せているSNPの数により決定されて、数千から数千万以上であり、毎種類のビーズは、特定のアドレス配列とSNPプローブ配列によりコードされ、検定される。各タイプのビーズが各チップ上に平均15〜30回繰り返すことによって、各SNPが検定される成功率と再現性を保証する。Illumina Infinium SNPチップは、ヒト、マウスなど種におけるゲノム変異の研究に広く使用されて、水稲育種分野には安定的且つよく効率的な高密度の全ゲノム育種チップが乏しい現在状況では、本発明がIllumina Infiniumプラットフォームに基づいて行われるチップ設計は、水稲の大規模な育種のニーズを満たすことができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Huangら，Genome-wide association studies of 14 agronomic traits in rice landraces. Nat Genet. 2010, 42: 961-967）
【非特許文献２】Huangら.，Genome-wide association study of flowering time and grain yield traits in a worldwide collection of rice germplasm. Nat Genet. 2011）
【非特許文献３】Xieら，Parent-independent genotyping for constructing an ultrahigh-density linkage map based on population sequencing. Proc Natl Acad Sci USA. 2010, 107: 10578-10583
【非特許文献４】Yuら，Gains in QTL detection using an ultra-high density SNP map based on population sequencing relative to traditional RFLP/SSR markers. PLoS One. 2011, 6: e17595
【非特許文献５】Jiangら，Rice functional genomics research: Progress and implications for crop genetic improvement. Biotechnol Adv. 2011, 30: 1059-1070
【非特許文献６】McNally ら，Genomewide SNP variation reveals relationships among landraces and modern varieties of rice. Proc Natl Acad Sci USA. 2009, 106: 12273-12278）
【非特許文献７】Borevitz ら，Large-scale identification of single-feature polymorphisms in complex genomes. Genome Res. 2003, 13: 513-523
【非特許文献８】Jaccoud ら，Diversity arrays: a solid state technology for sequence information independent genotyping. Nucleic Acids Res. 2001, 29: E25
【非特許文献９】Millerら，RAD marker microarrays enable rapid mapping of zebrafish mutations. Genome Biol. 2007, 8: R105
【非特許文献１０】Millerら，Rapid and cost-effective polymorphism identification and genotyping using restriction site associated DNA (RAD) markers. Genome Res. 2007, 17: 240-248
【非特許文献１１】Ganalら，A large maize (Zea mays L.) SNP genotyping array: development and germplasm genotyping, and genetic mapping to compare with the B73 reference genome. PLoS One. 2011, 6: e28334
【非特許文献１２】Cookら，Genetic architecture of maize kernel composition in the nested association mapping and inbred association panels. Plant physiology. 2011
【非特許文献１３】Zhaoら，Genome-wide association mapping reveals a rich genetic architecture of complex traits in Oryza sativa. Nat Commun. 2011, 2: 467
【非特許文献１４】Zhaoら，Genomic diversity and introgression in O. sativa reveal the impact of domestication and breeding on the rice genome. PLoS One. 2010, 5: e10780
【非特許文献１５】Chenら，Development and application of a set of breeder-friendly SNP markers for genetic analyses and molecular breeding of rice (Oryza sativa L.). Theor Appl Genet. 2011, 123: 869-879
【非特許文献１６】Thomsonら，High-throughput single nucleotide polymorphism genotyping for breeding applications in rice using the BeadXpress platform. Mol Breeding. 2011: 1-12
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、水稲全ゲノム育種チップを提供することを目的とする。
本発明は、さらに、前記水稲全ゲノム育種チップの応用を提供することを目的とする.
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ヌクネオチド配列がそれぞれ配列番号1〜 58290で表される58,290個のSNP遺伝子座からなる水稲の育種のために用いられるSNP分子マーカー組成を提供する。
【０００８】
本発明は、配列番号1〜 58290で表されるヌクネオチド配列を有する58,290個のSNP遺伝子座を含有する、Rice60Kという水稲全ゲノム育種チップを提供する。該58290個の配列の殆どは、101個の塩基から構成され、且つ、第71位の塩基が変異したものである。
【０００９】
本発明は、Illuminaシークエンシング技術を使用して、211個の水稲品種の全ゲノムをシークエンシングして、各々のサンプルがそれぞれに2.5倍のゲノムカバー率を得る。さらに、本発明は、公的データベースから水稲地方品種のシークエンシングデータを520個ダウンロードし（http://www.ebi.ac.uk/ena/，登録番号ERP000106、ERP000235とERP000236）、各々のサンプルがそれぞれに1倍のゲノムカバー率を得る（Huangら，Genome-wide association studies of 14 agronomic traits in rice landraces. Nat Genet. 2010, 42: 961-967）。合計731個の水稲品種のゲノムシークエンシングデータである。本発明に係る731個の水稲品種のゲノムは、いずれも通常の手段により得られるものである。SNPを同定・選別する工程は、以下の通りである。
【００１０】
１．731個の水稲品種のシークエンシングデータから、3,791,687個の高品質のSNP遺伝子座を選別する工程である。高品質のSNP遺伝子座を選別するには、SNP配列が特異的な配列領域に位置すること、SNP遺伝子座が塩基形式を2種類しか有さず各塩基形式が一定の比率を占めること、品種の中にできるだけヘテロ接合体遺伝子型を有しないこと、という条件を満たさなければならない。シークエンシングデータにおいて一定の誤り率を有することを考慮して、本発明は以下の条件を設定している。（1）該遺伝子座における塩基組成の比率に従って降順に並べると、第2種類の塩基の頻度が5%以上であることと、（2）第3種類の塩基を有するサンプルの数が10未満であり、且つ頻度が2.5％未満であることと（こちらの塩基はシークエンシングデータの誤りによるものである可能性が高い）、（3）ヘテロ接合体遺伝子型の頻度が5%未満であることと、（4）該SNP遺伝子座が非反復領域に位置することである。
【００１１】
２．731個の水稲品種における上記SNP遺伝子座の遺伝子型を抽出して、LD-KNNアルゴリズム（K近傍法、K nearest neighbors）を使用し、SNPの遺伝子型決定の欠損値を充填する。シークエンシングデータの被覆率が低くて、欠損したSNP遺伝子座が大量あるため、欠落値を充填する必要がある。本発明は、充填したSNP遺伝子座が次の条件を満たすことを限定する：（1）充填した欠損値の比率が50%未満である；（2）水稲ゲノムの100kbの領域において、連鎖のSNPを少なくとも1つ発見することができ、即ち、LD（Linkage disequilibrium、連鎖不平衡）のr2値（rとは、対立遺伝子頻度の相関係数（Correlation Coefficient）である。）が0.25以上である。上記条件を満足可能なSNP遺伝子座は、3,679,919個がある。
【００１２】
３．最初のスクリーニングにより、SNP遺伝子座を2,651,614個得る。SNPごとに、日本晴（TIGRの水稲ゲノムの注釈のバージョン6.1、http://rice.plantbiology.msu.edu/）、珍汕97、明恢63のSNP遺伝子座からの両側の50bp配列を抽出して、いずれかの片側の配列において、次の条件を満たすSNP遺伝子座を保留する。（1）日本晴と珍汕97、又は、日本晴と明恢63は配列が一致すること、（2）該配列は、ゲノムの他の任意領域における一致度（identity）が85%未満である。このステップでは、プローブ配列がゲノムにおける特異性と保守性を確保することである。
【００１３】
４．すべてのSNPを125,062個の連鎖群に分けた。水稲のゲノムを100kbの領域ごとに分割して、全ゲノムが3,728個の領域に分割された。各領域における任意2つのSNPの連鎖不平衡のr2値を計算して、欲張りアルゴリズム（greedy algorithm）により、r2が0.64以上であることに応じてSNPを計125,062個のグループに分けて、同じグループにおけるSNPが冗長であると考えられて、連鎖群と呼ばれる。このステップでは、スクリーニングされたSNP遺伝子座が品種の遺伝的多様性をできるだけ代表することを確保することである。
【００１４】
５．それぞれの連鎖群には、MAF（Minor Allele Frequency、マイナー対立遺伝子頻度）が最大であるSNP遺伝子座を5つ選択して、Illumina社のInfinium iSelectスコアリングシステム（http://www.illumina.com/）に提供して、採点を行って、スコアが0.6未満である遺伝子座を除去し、283,451個のSNPが得られる。
【００１５】
６．本発明において、SNP遺伝子座のIllumina iSelectスコアリングシステムのスコア、MAF、及び同連鎖群のほかのSNP遺伝子座のLDのr2と遺伝子における位置を考慮して、総合スコアリングシステムが定義されている。全ての要因は、重み係数が次の通りである。（1）A/TとG/C変化のSNP（Infinium I）の重みが0であり、他のタイプのSNPの重みが20（Infinium II）（1つのSNPを検出する場合、Infinium Iでは2種類のマイクロビーズが必要であるが、Infinium IIでは1種類のマイクロビーズが必要であるので、チップに遺伝子座をなるべく多く載せるために、Infinium IIをできる限り選択する）である。（2）Illumina iSelectスコアリングシステムは、重みが10（スコアは、プローブ設計の成功率を反映する）である。（3）マイナー対立遺伝子頻度MAFは重みが40（MAFは高ければ高いほど、任意の2種類の間には多型を有する可能性が高い）である。（4）LDの平均r2値は、重みが5（r2値は、SNP間の連鎖の程度を反映する）である。（5）遺伝子領域におけるSNPの位置に基づいて、遺伝子間領域（intergenic）、イントロン（intron）、プロモーター（promoter）、5 '非翻訳領域（5'-UTR）、及び3'非翻訳領域（3'-UTR）は、重みがそれぞれ1、1.5、2、2と2.5（遺伝子の構造が異なる領域が遺伝子の機能に影響する程度によって採点する）であり、コード領域において、同義変異（synonymous）、非同義変異（non-synonymous）及び効果の大きい変異（例えば、ナンセンス突然変異、non-sense mutations）は、重みがそれぞれ2、5と10（コード領域における塩基突然変異は機能と直接的に関連する）である。
【００１６】
RICE6K水稲SNPチップ（中国発明特許、201210055775.X）における高品質の4,646個のSNP/INDEL遺伝子座と、クローンされた水稲の重要な機能遺伝子に位置する1,000個のSNP遺伝子座は、Rice60K育種チップにおけるプローブの合成にそのまま用いられて、58,290個のSNPを得て、そのヌクネオチド配列がそれぞれ配列番号1〜 58290で表される。上記58,290個の配列はいずれも101個の塩基から構成され、且つ第71位に塩基の変異が存在する。配列表から、58,290個の配列において、いずれも第71位にSNP遺伝子座が存在する。
【００１７】
以上の工程に従い同定・スクリーニングを行って、最終的にタグSNP遺伝子座（tagSNP）を合計58,290個得て、Illumina Infinium iSelect HDの設計要求に応じて、60,000種類のビーズ（beads）を必要とするので、該チップはRice60Kと名づけられる。全ての58,290個のタグSNP遺伝子座は、配列表で表れている１〜58290番目のDNA配列である。これらのタグ配列をIllumina会社に提供し、Infinium SNPチップを設計して、作成してなる。
【００１８】
本発明に係るRice60K遺伝子チップは、Infinium SNPチップ技術により製造された光ファイバ-マイクロビーズチップ（米国特許、US Patent # US 6,429,027）であり、24個のサンプルを同時に検出することができる。
【００１９】
さらに、本発明に係る上記遺伝子チップの製造方法は、（1）リシークエンシングにより多くの水稲品種のゲノム配列を得て、公的データベースにおけるほかの水稲品種のリシークエンシングデータと組み合わせて、日本晴ゲノムを参照配列として、SNP遺伝子座を分析・同定して、その中から代表的なSNPマークを選んで、そのままプローブの合成に用いられる工程と、（2）Infiniumチップの製造技術により、SNPチップを製造する工程と、（3）チップの正確性と応用効率を測定する工程とを含んでいる。前記SNPマークのそのヌクネオチド配列がそれぞれ配列番号1〜 58290で表される。
【００２０】
具体的に、本発明は、
（1）測定の必要に応じて、水稲の種、葉などの組織からゲノムDNAを抽出する（ただし、水稲の若い葉からのDNA抽出に対して、Promega又はQiagen植物ゲノム抽出キットで抽出することを勧めて、水稲種子胚乳からのDNA抽出に対して、CWBIO社の複雑植物ゲノム抽出キット（SurePlant DNA Kit）で抽出することを勧める）水稲ゲノムDNAの抽出工程と、
（2）質量分率1％のアガロースゲル電気泳動で測定し、ゲル現像システムにより電気泳動の結果を判定して、ゲノムDNAの完全性をよく保証し、且つ、このゲノムDNAフラグメントの長さが10kbを超えて、紫外線分光光度計でゲノムDNAの濃度を測定し、DNAの濃度を工作濃度である10〜50 ng/μlに希釈したDNAサンプルの品質測定工程と、
（3）Illumina Infiniumの遺伝子チップ測定における標準操作手順に従って操作して、チップに対しての走査は、Illumina HiScanチップスキャナーを使用するものである遺伝子チップの測定工程と、
（4）Illumina HiScanの走査結果をGenomeStudioソフトウェアにより遺伝子型を分析して、R言語でプログラミングを行い、遺伝子型の比較結果が得られるデータ分析工程とを
備える、水稲DNAサンプルの測定におけるRice60K水稲全ゲノム育種チップの応用を提供する。
【００２１】
さらに、本発明は、水稲の遺伝資源遺伝子指紋分析における上記水稲全ゲノム育種チップRice60Kの応用を提供する。
【００２２】
本発明は、水稲の雑種遺伝子型後代同定における上記水稲全ゲノム育種チップRice60Kの応用を提供する。
【００２３】
本発明は、水稲の品種同定における上記水稲全ゲノム育種チップRice60Kの応用を提供する。
【００２４】
本発明は、水稲育種材料の測定における上記水稲全ゲノム育種チップRice60Kの応用を提供する。
【００２５】
本発明は、水稲全ゲノムの関連分析における上記水稲全ゲノム育種チップRice60Kの応用を提供する。
【発明の効果】
【００２６】
他の分子マーカー検出システムと比べると、本発明は、以下の利点と効果を有している。
（1）SSRのような伝統的な分子マーカーと比べると、スループットが高く、単一のマーカーのデータのコストが低い利点などを有する。伝統的な方法によれば、水稲ゲノムにおいて200個の多型SSRマーカーが開発されたのは難しかったが、Rice60K育種チップは、任意の2つの品種、２つのインド型稲品種、２つの粳稲（ジャポニカ）品種、又は１つのインド型稲品種と１つの粳稲品種を測定する際に、それぞれ14,000、10,000、8,000、19,000個の高品質の多型SNP遺伝子座を得ることができる。
【００２７】
（2） 他の遺伝子チップのプラットフォームにおける遺伝子型決定システムと比べると、再現性に優れて、スループットが高く、データ分析が簡単である利点などを有する。Rice60K育種チップにより水稲サンプルを測定する技術は、再現性が99.99%以上に至ることができ、これは、従来のほかの遺伝子型決定プラットフォームにより実現できないものである。
【００２８】
(3) 第二世代のシークエンシングプラットフォームにおける遺伝子型決定システムと比べると、データ分析が簡単で、異なる実験室におけるデータの間に比較可能性を有する利点などがある。シークエンシング技術の発展に従って、配列決定のコストが絶えず低くなって、シークエンシングのスループットが絶えず向上している。しかし、シークエンシングのデータ分析に対しての要求もますます高くなって、分析するために専門的な解析ソフトウェア及びバイオインフォマティクスの専門家を必要とする。これに対して、Rice60K育種チップのプラットフォームにおけるデータ分析が非常に簡単である。シークエンシングはランダム性を有して、異なるバッチに得られる低いカバー率のシークエンシングデータの間に直接的に比較するのは難しく、ディープシーケンシングのコストは現在相変わらず高い。これに対して、Rice60K育種チップにおけるマーカーの大部分は固定であるので、異なるバッチに得られるデータの間に比較するのは非常に便利である。その一方、二代目シークエンシングシステムにより得られた大量のシークエンシングデータは、遺伝子チップの設計に重要なベースデータを提供している。従って、二代目シークエンシングと遺伝子チップシステムは、相補的である。
【００２９】
（4）本発明に係るRice60Kチップは、前に出願を提出したRice6Kチップ（中国発明特許、201210055775.X）と比べると、より広い適用性を有する。1）Rice60Kチップでは、マーカー選択に係れる品種は、より多く、範囲がより広い。Rice6Kチップは、主に520個あまりの水稲地方品種に対してのシークエンシングデータから同定・選択されたものである。これに対して、Rice60Kチップにおけるマーカーは、730個あまりの水稲品種由来のものであって、この前の中国地方品種も世界各地から収集された水稲ミニコア遺伝資源リポジトリにおける品種も含んでいて、さらに、中国で広く栽培された水稲雑種の親を含んでいる。2）Rice60Kチップにおけるマーカーで代表された遺伝的な多様性はより豊かである。一般的に、粳稲品種の間の差＜インド型稲品種の間の差＜粳稲とインド型稲の亜種の間の差、の関係があり、Rice6Kチップは、主に粳稲とインド型稲の亜種の間の差に対して設計されて、亜種の間、特に粳稲品種の間における多型性SNPの比率は少ない。一方、Rice60K育種チップにおけるマーカーは、できるだけ水稲亜種内の品種の間、特に粳稲品種の間における違い遺伝子座を選択することで、Rice60K育種チップは、水稲亜種の間の雑種群の測定によく使用できるだけでなく、亜種内の雑種群の測定（実施例6を参照）にもよく使用できる。3）Rice60Kチップには、機能遺伝子に関連する遺伝子座を大量に含んでいる。まず、Rice60Kチップにおけるマーカーは、遺伝子コード領域のSNP遺伝子座を選択する傾向があり、特に遺伝子の機能変化を影響する遺伝子座、例えばナンセンス突然変異を選択する。Rice6Kチップのプローブを設計する時に、このような考慮はされない。次に、Rice60Kチップは、水稲においてクローンされた重要な機能遺伝子における1000個のSNP遺伝子座を含んでいる。一方、Rice6Kチップにおける機能遺伝子座は少ない。4）Rice60K育種チップは、Rice6Kチップにおける高品質のSNP遺伝子座を含んでいるので、Rice60Kチップにおけるマーカーはより多く、ゲノムにおける分布密度がより高い。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図1は水稲全ゲノムにおける、Rice60K水稲全ゲノム育種チップの51,599個のSNPマーカーの分布の模式図である。参照ゲノムは日本晴（TIGR水稲ゲノム注釈6.1版）である。染色体における折れ線は、100-kb領域ごとにSNP遺伝子座の連続線を示し、最大値を25 SNP/100-kbとして、染色体におけるドットは、動原体の位置を示す。
【図２】図2は195個の水稲のホモ接合遺伝子型樹形図(grouping chart)である。2品種同士の遺伝子型の違い遺伝子座の数の、全ての遺伝子座に対する比率を距離として、階層的クラスター分析法により195個の水稲サンプルの遺伝子型をクラスターして、サンプルの番号は1〜195である。左側ではインド型稲群であり、右側では粳稲群であり、中では中間型である。
【図３】図3はRice60Kチップで異なる型の水稲を測定して得られた多型性SNP数の分布の模式図である。任意の2種類の間における多型性SNP遺伝子座の分布ヒストグラムである。A図は任意の2種類の間のことを示す図であり、B図はインド型稲と粳稲の2亜種の間のことを示す図であり、C図はインド型稲品種の間のことであり、D図は粳稲品種の間のことである。
【図４】図4は4つの分離集団の代表的なファミリーの遺伝子型の模式図である。染色体における一つ一つの線は、1つのSNP遺伝子座を代表して、グレーは母親（珍汕97）ホモ接合遺伝子型を示し、黒は父親ホモ接合遺伝子型を示す。A図は珍汕97/明恢63RIL群の1つのファミリーを示す図であり、B図は珍汕97/チベット2号の1つのファミリーを示す図であり、Ｃ図は日本晴導入珍汕97の1つの導入系を示す図であり、D図は普通野生稲（IRGC-105491）導入珍汕97の1つの導入系を示す図である。
【図５】図5は5つの異なる由来の蜀恢527サンプルのSNP遺伝子座の遺伝子型決定を比較する模式図である。図中には、グレーの線は標準蜀恢527サンプルと一致するSNP遺伝子座を代表し、黒い線は標準蜀恢527サンプルと一致しないSNP遺伝子座を代表する。
【図６】図6はRice6K及びRice60Kチップにより空育131改良品系A8の遺伝的背景を測定した結果の模式図である。図中には、線なしの染色体領域は背景応答が受容体親株（receptor parent）である空育131の遺伝子型と一致するものであり、黒い線はヘテロ接合遺伝子型のSNP遺伝子座を示す。三角状の矢印は目標遺伝子であるPi2にある位置を指す。6AはRice6Kの測定結果を示し、6BはRice60Kの測定結果を示す。
【図７】図7は黄華占の家系の粒幅-形質関連解析によるマンハッタン図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下の実施例は本発明を説明するためのものであるが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。本発明の精神及び要旨を逸脱しない場合、本発明に係る方法、工程又は条件を補正又は変更することは、本発明の範囲に属する。特に説明しない場合、実施例に使用した技術手段は本分野によく知られる一般的な手段である。
【００３２】
実施例1  Rice60K水稲全ゲノム育種チップの製造方法
本発明では、Illuminaシークエンシングを用いて、211個の水稲品種（表1を参照）に対して全ゲノムをシークエンシングして、各々のサンプルについて2.5倍のゲノムカバー率を得た。同時に、本発明では、公的データベースから水稲地方品種のシークエンシングデータを520個ダウンロードし（http://www.ebi.ac.uk/ena/，登録番号ERP000106、ERP000235とERP000236）、各々のサンプルについて1倍のゲノムカバー率を得た（Huangら，Genome-wide association studies of 14 agronomic traits in rice landraces. Nat Genet. 2010, 42: 961-967）。合計731個の水稲品種のゲノムシークエンシングデータである。本発明に係る731個の水稲品種のゲノムシークエンシングのデータを得た。SNPを同定・選別する工程は、以下の通りである。
【００３３】
【表１ａ】
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【表１ｂ】
0005960917.tif 000003
【００３４】
1．731個の水稲品種のシークエンシングデータから、3,791,687個の高品質のSNP遺伝子座が同定された。高品質のSNP遺伝子座としては、（1）該遺伝子座における塩基組成の比率に従って数値が大きい方から降順に並べると、第2種類の塩基の頻度が5%以上である条件と、（2）第3種類の塩基を有するサンプルの数が10未満であり、且つ頻度が2.5％未満である条件と、（3）ヘテロ接合体遺伝子型の頻度が5%未満である条件と、（4）該SNP遺伝子座が非反復領域に位置する条件を満たす。
【００３５】
2．731個の水稲品種における上記SNP遺伝子座の遺伝子型を抽出して、LD-KNNアルゴリズム（K近傍法、K nearest neighbors）を使用し、SNPの遺伝子型決定の欠損値を充填している。遺伝子型の欠損値を充填することができるSNP遺伝子座は3,679,919個がある。これらの遺伝子座は充填した後に、（1）充填した欠損値の比率が50%未満である条件；（2）水稲ゲノムの100kbの領域において、連鎖のSNPを少なくとも1つ発見することができ、即ち、LD（Linkage disequilibrium、連鎖不平衡）のr2値（rとは、対立遺伝子頻度の相関係数（Correlation Coefficient）である。）が0.25以上である条件を満たす。
【００３６】
3．最初のスクリーニングにより、2,651,614個のSNP遺伝子座が得られる。SNPごとについて、日本晴、珍汕97、明恢63のSNP遺伝子座からの両側の50bp配列を抽出して、いずれかの片側の配列において、（1）日本晴と珍汕97、又は、日本晴と明恢63は配列が一致する条件、（2）該配列は、ゲノムの他の任意領域における一致度（identity）が85%未満である条件を満たすSNP遺伝子座を保留する。
【００３７】
4．すべてのSNPを125,062個の連鎖群に分けた。水稲のゲノムを100kbごとのbin（小さなセグメント）に分割して、全ゲノムが3,728個の容器(bin)に分割された。各容器における任意2つのSNPの連鎖不平衡のr2値を計算して、欲張りアルゴリズム（greedy algorithm）により、r2が0.64以上であることに応じてSNPをグループに分けて、同じグループにおけるSNPが冗長であると考えられる。
【００３８】
5．それぞれの連鎖群には、MAF（Minor Allele Frequency、マイナー対立遺伝子頻度）が最大であるSNP遺伝子座を5つ選択して、Illumina社のInfinium iSelectスコアリングシステム（http://www.illumina.com/）に提供して、採点を行って、スコアが0.6未満である遺伝子座を除去する。
【００３９】
6．本発明において、SNP遺伝子座のIllumina iSelectスコアリングシステムのスコア、MAF、及び同連鎖群のほかのSNP遺伝子座のLDの平均r2値と遺伝子における位置を考慮して、特別の総合スコアリングシステムが定義されている。全ての要因重みは経験によりパラメータが決定された。パラメータは、次の通りである。（1）A/TとG/C変化のSNP（Infinium I）の重みが0であり、他のタイプのSNPの重みが20（Infinium II）である。（2）Illumina iSelectスコアリングシステムは、重みが10である。（3）マイナー対立遺伝子頻度MAFは重みが40である。（4）LDの平均r2値は、重みが5である。（5）遺伝子領域におけるSNPの位置に基づいて、遺伝子間領域（intergenic）、イントロン（intron）、プロモーター（promoter）、5 '非翻訳領域（5'-UTR）、及び3'非翻訳領域（3'-UTR）は、重みがそれぞれ1、1.5、2、2と2.5であり、コード領域において同義変異（synonymous）、非同義変異（non-synonymous）及び効果の大きい変異（例えば、ナンセンス突然変異、non-sense mutations）は、重みがそれぞれ2、5と10である。
【００４０】
RICE6K水稲SNPチップ（中国発明特許、201210055775.X）における4,646個の高品質のSNP/INDEL遺伝子座と、クローンされた水稲の重要な機能遺伝子に位置する1000個のSNP遺伝子座は、Rice60K育種チップにおけるプローブの合成にそのまま用いられる。
【００４１】
以上の工程に従い同定・スクリーニングを行って、最終的にタグSNP遺伝子座（tagSNP）を合計58,290個得て、Illumina Infinium iSelect HDの設計要求に応じて、60,000種類のビーズ（beads）を必要とする。全ての58,290個のタグSNP遺伝子座は、配列表で表れている１〜58290番目のDNA配列である。これらのタグ配列をIllumina会社に提供し、Infinium SNPチップを設計して、作成された。チップの製造によって、測定要求を合致している有効な遺伝子座が51,599個得られて、これらの遺伝子座の全ゲノムにおける分布は図1に示された。
【００４２】
実施例2  水稲DNAサンプルの測定におけるRice60K水稲全ゲノム育種チップの応用
水稲ゲノムDNAの抽出：測定の必要に応じて、水稲の種、葉などの組織からゲノムDNAを抽出する。中には、水稲の若い葉からのDNA抽出に対して、Promega植物ゲノム抽出キット（Wizard Magnetic 96 DNA Plant System Kit、製品番号FF3760又はFF3761、北京プロメガ生物技術株式会社）で抽出することを勧めて、水稲種子胚乳からのDNA抽出に対して、CWBIO社の複雑植物ゲノム抽出キット（SurePlant DNA Kit、製品番号CW0555、北京CWBIO世紀バイオテック株式会社）で抽出することを勧める。
【００４３】
DNAサンプルの品質測定：質量分率1-1.5％（W/W）のアガロースゲル電気泳動で測定し、ゲル現像システム（Gel Doc XR System、アメリカBio-Rad会社）により電気泳動の結果を判定して、ゲノムDNAの完全性をよく保証し、且つ、このゲノムDNAフラグメントの長さが10kbを超えて、微量紫外線分光光度計（Q5000、アメリカQuawell会社）又は類似の核酸タンパク質分析装置でゲノムDNAの濃度を測定し、DNAの濃度を工作濃度である10〜50 ng/μlに調整した。
【００４４】
遺伝子チップの測定：Illumina Infiniumの遺伝子チップ測定における標準手順（Infinium HD Assay Ultra Protocol Guide、http://www.illumina.com/）に従って操作する。チップに対しての走査は、HiScanチップスキャナー（HiScan、アメリカIllumina会社）を使用する。
【００４５】
データ分析：Illumina HiScanの走査結果をGenomeStudioソフトウェア（http://www.illumina.com/）により遺伝子型を分析して、R言語（http://www.r-project.org/）でプログラミングを行い、遺伝子型の比較結果が得られる。
【００４６】
実施例3  水稲の遺伝資源遺伝子指紋分析におけるRice60K水稲全ゲノム育種チップの応用
本発明は、Rice60K育種チップを用いて、ミニコア水稲遺伝資源の270個の品種（番号WCR001〜270、中国種子集団株式会社から）を、実施例2の方法を参照して測定した。測定結果に基づいて、その中には195個の代表的なホモ接合自己交配系品種を選択して、分析を行った。Rice60K育種チップにより遺伝子型測定を行って、195個の品種をクラスター分析して、インド型稲、粳稲と中間型という三種類に分けて（図2を参照）、表現型による分類と非常に一致している。任意の2つの品種の間、インド型稲と粳稲の間、インド型稲とインド型稲の間、及び粳稲と粳稲の間には、多型性SNPの数がそれぞれ平均的に約14,000、19,000、10,000と8,000である（図3を参照）。その結果から示すように、Rice60K育種チップにおけるSNPマーカーの遺伝子座は広い適用性を有して、差異が小さい粳稲品種の間に対しても、測定及び区別をよく行うことができる。従って、Rice60K育種チップは、水稲品種の遺伝子指紋データベースを確立することに非常に適用して、育種者が品種の間の遺伝的関係を検索・比較することに便利であり、育種者が育種材料を選択することに寄与する。
【００４７】
実施例4  水稲の分離群の遺伝子型鑑定におけるRice60K水稲全ゲノム育種チップの応用
本発明は、Rice60Kチップを用いて、珍汕97/明恢63のRIL群、珍汕97/チベット2号のRIL群である2つの組換え自殖系統（RIL，Recombination inbred line）群、及び日本晴導入珍汕97の導入系、普通野生稲（IRGC-105491）導入珍汕97の導入系である2つの染色体断片置換系統（CSSL，Chromosome segment substitution line）群に対して遺伝子型を測定して（実施例2の方法を参照して行われる）、各群における1つのファミリーの遺伝子型地図は図4で示される。当該図から示すように、Rice60Kチップは、異なる群に対しても、遺伝子型決定の結果に優れて、マーカーの密度が高くて、組換えのブレークポイントが明らかである。Rice60Kチップは、伝統的な分子マーカーであるSSRにより測定できなかった二重交換領域を測定できるだけでなく、マーカーの密度が高いため、測定の結果がより精確で信頼性が高い。この結果から示すように、Rice60K水稲全ゲノム育種チップは、分子マーカー測定システムとして、水稲雑種後代の分離群に対して遺伝子型決定をよく行うことができる。
【００４８】
実施例5  水稲の品種同定におけるRice60K水稲全ゲノム育種チップの応用
本発明は、表現型で区別できない4種類の蜀恢527と記された種（A、B、C、D）を市場から入手して、また、蜀恢527の培養機構である四川農業大学から標準的な蜀恢527材料を対照として入手した。Rice60K水稲全ゲノム育種チップを用いて、これらの5つのサンプルを測定した（実施例2の方法を参照して行われる）。測定の結果によれば、市場から購入された4種類の蜀恢527種と対照遺伝子型との区別を比較する。蜀恢527は、数年にかけて培養されたため、ホモ接合の親株と考えられて、遺伝子型決定がヘテロ接合である遺伝子座とGenTrainScore<0.6である遺伝子座を除去して、最終的に38,310個の高品質のSNPマーカー遺伝子座を得る。5つのサンプルの遺伝子型比較は図5で示される。その結果から見ると、A及びDは、培養機構からの蜀恢527に一致して、B及びCは、蜀恢527とは違う遺伝子型が約4％であるため、B及びCは蜀恢527品種ではないと考えられる。その結果から示すように、Rice60K遺伝子チップは、水稲品種の真実性を測定することによく適用でき、測定の結果は精確で信頼性が高い。
【００４９】
実施例6  水稲育種材料の遺伝的背景の分析におけるRice60K水稲全ゲノム育種チップの応用
水稲育種材料の遺伝的背景の分析におけるRice60K水稲全ゲノム育種チップの応用効果を測定するために、本発明は、水稲品種である空育131及びその改良品系A8を測定した（実施例2の方法を参照して行われる）。A8材料は、4回の戻し交配を行ったBC4F1世代の中の1つの株であって、目的遺伝子は水稲のイモチ病抵抗性遺伝子のPi2である（Zhou ら, The eight amino-acid differences within three leucine-rich repeats between Pi2 and Piz-t resistance proteins determine the resistance specificity to Magnaporthe grisea. Mol Plant Microbe Interact. 2006, 19: 1216-1228.）。受容体親株である空育131と比べると、A8の遺伝的背景は図6で示される。図面から見ると、当該植物は、第6の染色体におけるPi2遺伝子及びその付近にある大きな断片を導入した上に、第1のおよび第12の染色体に少なくとも3つの供与体断片がある。RICE6KチップとRice60Kチップは、いずれもPi2遺伝子及びその付近領域をよく測定できるが、他の背景を測定する場合、Rice60Kチップによる効果はRICE6Kチップよりも明らかに優れた。受容体の親である空育131は粳稲であり、供与体の親であるPi2遺伝子及びその付近領域はインド型稲の断片であり、他の位置は粳稲の背景である。Rice6Kチップは、主に粳稲とインド型稲の雑種における応用に対して設計されたため、粳稲の間の雑種を測定する時に多型性が低い一方、Rice60K育種チップは、マーカーの密度が大幅に増加し、プローブを設計する際に粳稲品種の間の多型性を同時に考慮したので、粳稲の間の雑種をよく測定できる。これから見ると、育種材料の遺伝的背景の分析において、Rice60K水稲全ゲノム育種チップは、優れた効果がある。
【００５０】
実施例7  水稲の関連分析におけるRice60K水稲全ゲノム育種チップの応用
黄華占及びその家系品種を合計21個収集して、それらの重要な農業形質である粒幅のデータを調査し、黄華占及びその家系品種ゲノムの変化と粒幅との関係を分析した。Rice60Kチップにより得られた遺伝子型決定結果（実施例2の方法を参照して行われる）を品質制御して、高品質の遺伝子型決定情報をスクリーニングして得る。GenTrain Score<0.6のSNP遺伝子座は信頼性が劣るため、更なるデータ分析に用いられることができないので、サンプルからGenTrain Score<0.6のSNP遺伝子座を除去した。さらに、これらの21種類の品種において、損失率が0.2より大きい遺伝子座を除去して、欠損遺伝子座は、データの欠損で、更なるデータ分析の過程によく用いられることができなくて、最終的に、42,387個のSNPマーカー遺伝子座を得た。収集された水稲種子の粒幅形質と得られたSNPマーカー遺伝子座に基づいて、関連分析を行って、図7に示すように、マンハッタン図を得た。分析を経て、染色体において顕著的な関連性を有する遺伝子座が5つあって、位置合わせにより分かるように、染色体2号領域には既知のGW2遺伝子を含んで、染色体3号領域には既知のGS3遺伝子を含んで、及び、染色体5号には既知のGW5遺伝子を含んで、6号染色体及び10号染色体におけるQTLは新しい調節可能な遺伝子座である。従って、Rice60K SNPチップによる遺伝子型の同定は、高密度の遺伝子型決定データで、比較的精確の関連分析の結果を得ることができる。
【００５１】
以上、一般的な説明及び具体的な実施形態を用いて、本発明を詳しく説明してきたが、本発明を基礎とし、種々の改良や変形を行うことができる。これは当業者に対して自明である。従って、本発明の範囲を逸脱しない場合、このような改良や変形は本発明の保護範囲に属する。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明に係るチップは、Infiniumのチップ製造技術に基づき作製されたSNPチップであり、58,290個のSNP遺伝子座を含んで、水稲の品種資源に対する分子マーカーでの指紋分析、雑種群体後代に対する遺伝子型決定、品種の真実性に対する測定、育種材料の遺伝背景に対する分析と選別、農業形質に対する関連分析を行うことができ、重要な経済価値及び応用の見通しを有する。
【要約】
本発明は、水稲全ゲノム育種チップ及びその応用を提供する。本発明に係る水稲全ゲノム育種チップはRice60Kで、Infiniumのチップ製造技術に基づき作製されたSNPチップであり、個々のチップは24個のサンプルを同時に測定でき、58,290個のSNP遺伝子座を含んで、これらのマーカー遺伝子座は、塩基配列の番号1〜 58290で表されるDNA配列を有して、該チップは、水稲の品種資源に対する分子マーカーでの指紋分析、雑種群体後体に対する遺伝子型決定、品種の真実性に対する測定、育種材料の遺伝背景に対する分析と選別、農業形質に対する関連分析を行うことができ、応用の見通しが広い。【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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