(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）オオムギ植物においてデンプン合成酵素IIa（SSIIa）遺伝子の発現を下方制御する、内在性SSIIa遺伝子中の変異または外来性核酸分子、を含み、前記変異は、オオムギ植物において野生型SSIIa遺伝子に比較してSSIIa遺伝子の発現を低下させる変異、および／または、オオムギ植物において野生型デンプン合成酵素IIa（SSIIa）ポリペプチドに比較して低下したデンプン合成活性を有するデンプン合成酵素IIa（SSIIa）ポリペプチドの発現を生じさせる変異であり、
（ii）野生型オオムギ穀粒に比較してSSIIaポリペプチドのレベル又は活性が低下しており、および、
（iii）デンプン含有量が少なくとも41％(w/w)であり、
ａｍｏ１−ＡＣ３８アレルに対してホモ接合であって、前記ａｍｏ１−ＡＣ３８アレルが高アミロース性グラシェルオオムギ栽培種のａｍｏ１遺伝子と同じ変異を有する、
オオムギ穀粒。
【請求項２】
デンプン含有量が少なくとも４７％（ｗ／ｗ）である、請求項１に記載のオオムギ穀粒。
【請求項３】
デンプン含有量が４１〜６５％（ｗ／ｗ）である、請求項１に記載のオオムギ穀粒。
【請求項４】
穀粒中の総デンプン量に対する割合でアミロース含有量が少なくとも５０％である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の穀粒。
【請求項５】
穀粒中の総デンプン量に対する割合でアミロース含有量が少なくとも６０％である、請求項４記載の穀粒。
【請求項６】
（ｉ）β−グルカン含有量が５〜９％（ｗ／ｗ）である、または、
（ii）フルクタン含有量が３〜１１％（ｗ／ｗ）である、または、
（iii）フルクタン含有量が３〜１１％（ｗ／ｗ）であって、前記フルクタンの重合度が３〜１２である、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の穀粒。
【請求項７】
ＳＳＩＩａのレベルまたは活性が、オオムギ植物においてSSIIa遺伝子の発現を下方制御する外来性核酸分子によって低下する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の穀粒であって、前記外来性核酸分子が、内在性のＳＳＩＩａ発現を下方制御する遺伝子サイレンシングキメラ遺伝子、アンチセンスRNA、リボザイム、コサプレッションRNA、ｄｓＲＮＡ分子、ヘアピンＲＮＡ分子またはマイクロＲＮＡを含む、前記穀粒。
【請求項８】
全穀粒またはひき割り粒、挽いた粒、精粒、精白粒、粗挽き粒、ロールにかけた粒または搗精粒である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の穀粒。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の穀粒を生産できるオオムギ植物。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の穀粒から生成されるオオムギ全粒または粉。
【請求項１１】
（ｉ）請求項１〜８のいずれか１項に記載のオオムギ穀粒を入手または生成し、
（ｉｉ）前記穀粒を加工して製品を製造することを含む、
食物製品または飲料製品を製造する方法。
【請求項１２】
製品が、全粒、粉、デンプン、ふすま、β−グルカン、フルクタン、非デンプン多糖ならびに、ひき割り粒、挽いた粒、精粒、精白粒、粗挽き粒、ロールにかけた粒または搗精粒からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
食物製品または飲料製品が、穀粒、粉、朝食用シリアル、ビスケット、マフィン、ミューズリーバー、麺類、甘味料、低カロリー添加剤、増量剤、食物繊維、粘着防止剤、保存料、プロバイオティック剤などであるか、あるいはこれらの任意の組み合わせである、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ｉ）野生型オオムギ穀粒に比較してSSIIaポリペプチドのレベルまたは活性が低下しており、および、
（ii）デンプン含有量が少なくとも４１％(w/w)、
である穀粒を生産できるオオムギ植物を生産する方法であって、
（ａ）オオムギ植物に、対照植物に対して内在性デンプン合成酵素ＩＩａ（ＳＳＩＩａ）のレベルまたは活性を下方制御する作用因子あるいは、前記オオムギ植物においてＳＳＩＩａをコードする内在性遺伝子の変異を導入し、
（ｂ）前記オオムギ植物にａｍｏ１遺伝子の前記活性を低下させる変異を導入することを含み、前記変異が高アミロース性グラシェルオオムギ栽培種のａｍｏ１遺伝子における変異と同じ変異であり、
（ｃ）前記穀粒を生産するオオムギ植物を選択することを含む、
前記方法。
【請求項１５】
オオムギ植物を栽培し、穀粒を収穫することを含む、請求項１〜８のオオムギ穀粒を生産する方法。
【請求項１６】
製品における難消化性デンプン、食物繊維、水溶性炭水化物、β−グルカン、フルクタンまたは非デンプン炭水化物のレベルを高める、あるいは前記製品のグリセミック指数（ＧＩ）を下げるための、製品の製造に使用する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のオオムギ穀粒、請求項９記載の植物または請求項１０記載のオオムギ全粒または粉。
【請求項１７】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の穀粒、請求項９記載の植物、または請求項１０記載の全粒または粉から単離したデンプン、β−グルカンまたはフルクタンの、食物における甘味料、低カロリー添加剤、増量剤、食物繊維、粘着防止剤、保存料、プロバイオティック剤など、あるいはこれらの任意の組み合わせとしての使用。
【請求項１８】
乾燥重量基準で少なくとも１０％のレベルで食物成分を含む食物製品であって、前記食物成分が、請求項１〜８のいずれか１項に記載のオオムギ穀粒または当該オオムギ穀粒から得られる全粒または粉であり、前記全粒または粉が、（ｉ）野生型オオムギ穀粒または粉と比較してレベルまたは活性の低下したＳＳＩＩａタンパク質を含み、（ii）デンプン含有量が少なくとも４１％（ｗ／ｗ）である、前記食物製品。
【請求項１９】
パン、バンズ、朝食用シリアル、ケーキ、ビスケット、ペストリー、クラッカー、マフィン、ピザ、クロワッサン、ベーグル、プレッツェル、パスタ、麺類、製菓材料、ベーキングミックス、スープ、ソース、増粘安定剤、菓子類および他のデンプン質の商品からなる群から選択される、請求項１８に記載の食物製品。
【請求項２０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のオオムギ穀粒または請求項１０に記載のオオムギ全粒または粉と、別の食物または飲料成分とを混合することを含む、食物または飲料を調製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、レベルまたは活性の低下したＳＳＩＩａタンパク質を含み、比較的高収量で所望のデンプンおよび非デンプン構成成分を得られる、変種オオムギ植物およびその穀粒について説明するものである。
【背景技術】
【０００２】
野生型のオオムギ種子では、デンプンの約５０〜６０％が胚乳に含まれる。このデンプンは、約２５％のアミロースと７５％のアミロペクチンで構成される。アミロースは、大部分が直鎖状のα−（１−４）結合グルコシル鎖で若干のα−（１−６）結合グルカン鎖を含み、分子量は１０4〜１０5である。アミロペクチンは、大部分が高度分岐グルカンであり、３〜６０個のグルコシル単位を含むα−（１−４）結合グルコシル鎖がα−（１，６）−結合で連結されているためグルコシル結合の約５〜６％はα−（１，６）−結合で、分子量は１０5〜１０6である。
【０００３】
穀類のデンプン生合成には、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ（ＥＣ  ２．７．７．２７）、デンプン合成酵素（ＥＣ  ２．４．１．２１）、デンプン分枝酵素（ＥＣ  ２．４．１．１８）、デンプン枝切り酵素（ＥＣ  ３．２．１．４１および３．２．１．６８）をはじめとする一連の酵素が関与している。ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ酵素の触媒によるグルコース−１−ＰおよびＡＴＰからのＡＤＰ−グルコース合成が、デンプン合成で最初になされるステップである。次に、このＡＤＰ−グルコースが、グルコースをデンプンの既存のα−（１−４）結合グルコシル鎖の非還元末端に転位させるデンプン合成酵素によるデンプン合成用の基質として用いられる。デンプン分枝酵素によって、α−（１−４）結合グルカンの領域を切断し、続いて短いグルカンをデンプンのα−（１−４）結合グルカン上に移動させることで、α−（１−６）結合で結合されたデンプンの分岐グルカン鎖を形成する。枝切り酵素によって過剰なα−（１−６）結合グルカン鎖を除去し、デンプンが規定の構造に維持される（Ｋｏｓｓｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｌｌｏｙｄ，  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ，  １９：  １７１〜２２６，  ２０００；  Ｒａｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｅｒｅａｌ  Ｓｃｉ，  ３１：  ９１〜１１０，  ２０００；  Ｓｍｉｔｈ，  Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，  ２：  ３３５〜３４１，  ２００１；  Ｍｏｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，  １１９：  ５５〜５８，  ２００１；  Ｍｏｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉ，  ５０：  ２１７〜２２４，  ２００３ａ；  Ｍｏｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｓｔａｒｃｈ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｌａｎｔｓ  ａｎｄ  ａｌｇａｅ．  Ｉｎ：  Ｐｌａｘｔｏｎ  ＷＣ，  ＭｃＭａｎｕｓ  ＭＴ  （ｅｄｓ）  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．  Ａｎｎｕａｌ  ｐｌａｎｔ  ｒｅｖｉｅｗｓ，  ｖｏｌ  ２２，  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  ｐｐ  ２５８〜２８９，  ２００６；  Ｂａｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｒｅｌｌ，  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ，  ５４：  ２０７〜２３３，  ２００３；  Ｊａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ，  ６：  ２１５〜２２２，  ２００３；  Ｔｅｔｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｏｔ，  ５５：  ２１３１〜２１４５，  ２００４における考察を参照のこと）。
【０００４】
コメゲノムでは１０個のデンプン合成酵素遺伝子が同定され（Ｈｉｒｏｓｅ  ａｎｄ  Ｔｅｒａｏ，  Ｐｌａｎｔａ，  ２２０：  ９〜１６，  ２００４）、デンプン粒結合型デンプン合成酵素（ＧＢＳＳ）、デンプン合成酵素Ｉ（ＳＳＩ）、デンプン合成酵素ＩＩ（ＳＳＩＩ）、デンプン合成酵素ＩＩＩ（ＳＳＩＩＩ）、デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）という５つの異なるクラスに大別される（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｕｎｃｔ  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  ３：  ７６〜８５，  ２００３）。コメではＧＢＳＳに２種類のアイソフォーム（ＧＢＳＳＩおよびＧＢＳＳＩＩ）があり、ＳＳＩには１種類のアイソフォーム、ＳＳＩＩには３種類のアイソフォーム（ＳＳＩＩａ［ＳＳＩＩ−３］、ＳＳＩＩｂ［ＳＳＩＩ−２］、ＳＳＩＩｃ［ＳＳＩＩ−１］）、ＳＳＩＩＩには２種類のアイソフォーム（ＳＳＩＩＩａ［ＳＳＩＩＩ−２］およびＳＳＩＩＩｂ［ＳＳＩＩＩ−１］）、ＳＳＩＶには２種類のアイソフォーム（ＳＳＩＶａ［ＳＳＩＶ−１］およびＳＳＩＶｂ［ＳＳＩＶ−２］）がある（Ｈｉｒｏｓｅ  ａｎｄ  Ｔｅｒａｏ，  ２００４（上掲）；  Ｆｕｊｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，  １４４：  ２００９〜２０２３，  ２００７）。ＳＳＩ、ＳＳＩＩａ、ＧＢＳＳＩに対応するタンパク質がデンプン粒で検出されたのに対し、ＳＳＩＩＩａタンパク質はアミロプラスチドの可溶相においてのみ検出されている（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，  １２３：  ６１３〜６２４，  ２０００）。デンプン粒の最終構造を決めるにあたってこれらのデンプン合成酵素が個々に果たす役割と相互に作用しながら果たす役割の正確な内容については大部分が不明確なままであるが、いくつかのデンプン合成酵素の潜在的な役割であれば、異なる器官と異なる種でキャラクタライズされている。
【０００５】
デンプン合成酵素の変異体が、いくつかの禾穀種における役割を判断する上で有用であった。ＧＢＳＳＩはアミロースの生合成で極めて重要な役割を果たす（Ｂａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ８６（３）：  ３４９〜５２，  １９９６）が、これはアミロペクチンの長鎖の合成にも寄与しているかもしれない（Ｍａｄｄｅｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２６９（４０）：  ２５１５０〜７，  １９９４；  Ｄｅｎｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １１２（２）：７７９〜８５，  １９９６）。デンプンの特性に対する影響が、オオムギおよびコムギのＧＢＳＳＩヌル変異体で検討されてきた（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｒｅａｌ  Ｓｃｉ  ３０：  １８３〜１９１，  １９９９；  Ｙａｍａｍｏｒｉ  ａｎｄ  Ｑｕｙｎｈ，  Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ，  １００：  ３２〜３８，  ２０００）。ＧＢＳＳＩヌル変異体オオムギは、野生型と比較してアミロース含有量が５％未満であった（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９（上掲））。コムギのＧＢＳＳＩヌル変異体もアミロース含有量が低かった（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｅｒｅａｌ  Ｓｃｉ，  ３７：  １９５−２０４，  ２００３；  Ｍｉｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，  １０８：  ９１〜９５，  １９９９；  Ｍｉｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，  １２３：  ３５３〜３５９，  ２００２）。また、ＧＢＳＳＩヌル変異体コムギは、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）で測定した場合にピーク糊化温度およびエンタルピーが野生型由来のものよりも高かった（Ｙａｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｅｒｅａｌ  Ｓｃｉ，  ２４：  １３１〜１３７，  １９９６）。
【０００６】
ＳＳＩ、ＳＳＩＩａ、ＳＳＩＩＩは、デンプン分子内で利用できる非還元末端の特定サブセットの伸長に関わるアミロペクチン合成に主として関与していると考えられている。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）およびコメのＳＳＩヌル変異体に関する研究によって、ＳＳＩがシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の葉デンプン（Ｄｅｌｖａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ４３（３）：  ３９８〜４１２，  ２００５）およびコメの胚乳デンプン（Ｆｕｊｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １４０：  １０７０〜１０８４，  ２００６）におけるアミロペクチンクラスターの小さな外鎖（８〜１２ｄｐ）の生合成に関与していることが示された。オオムギおよびコムギＳＳＩＩａ変異体由来のデンプンでは、ＤＰ３〜８の鎖が長くなり、ＳＳＩＩａ酵素がＤＰ３〜８の短いグルカン鎖をＤＰ１２〜３５の長いグルカン鎖へと伸長させる際に何らかの役割を果たすことが分かった（Ｍｏｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ３４：  １７３〜１８５，  ２００３ｂ；  Ｙａｍａｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ，  １０１：  ２１〜２９，  ２０００；  Ｋｏｎｉｋ−Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ，  １１５：  １０５３〜１０６５，  ２００７）。トウモロコシおよびコメでＳＳＩＩＩａが欠失すると、アミロース表現型が増加するとともに、極長鎖（トウモロコシでＤＰ＞５０またはコメでＤＰ＞３０）の割合が小さくなり、糊化温度が若干低くなった（Ｊａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍ．  ７６：  ６２９〜６３７，  １９９９；  Ｆｕｊｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７（上掲））。ＳＳＩＶが欠如したシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）変異体では、プラスチド内のデンプン粒が大きくて少数のようであり、デンプン粒の形成を刺激する上でＳＳＩＶタンパク質が何らかの役割を果たすのではないかと考えられる（Ｒｏｌｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ４９：  ４９２〜５０４，  ２００７）。
【発明の概要】
【０００７】
オオムギＳＳＩＩａ変異体は、デンプン生合成の低下により、デンプン含有量が少なく種子の重量も軽い高アミロース表現型を有することが分かっている。ＳＳＩＩａをコードする遺伝子のヌル変異に対してホモ接合性であった変異体オオムギ系統Ｍ２９２およびＭ３４２が、オオムギの変種である「Ｈｉｍａｌａｙａ」穀粒をアジ化ナトリウムで処理して変異誘発した後に得られた。変異体種子は当初、しわ粒の表現型に基づいて変異誘発した個体群の後代穀粒から選択された。変異体系統を、その変化したデンプン特性、ＳＳＩＩａタンパク質レベルおよび活性の低下によってさらにキャラクタライズし、遺伝的には、ＳＳＩＩａをコードする遺伝子のタンパク質コード領域における中途終止コドンの有無によってキャラクタライズした（Ｍｏｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３ｂ（上掲）、その内容全体を本明細書に援用する）。これによって、胚乳でＳＳＩＩａ酵素が失われた。しかしながら、ＳＳＩＩａ変異体穀粒ではデンプンの含有量も実質的に低下し、オオムギ植物を圃場で育てた場合に、これが収量の穏やかな低下と関連していた。高アミロース表現型を保ったままで収量を改善できるか否か、あるいはどのようにしてそれができるかは、知られていなかった。
【０００８】
このため、農業生産力の改善された高アミロースオオムギには需要がある。
【０００９】
本明細書をとおして、文脈上そうでない必要がある場合を除いて、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」という単語または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」または「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などのバリエーションは、表記の要素または整数あるいは要素群または整数群を含むが、他の要素または整数あるいは要素群または整数群を除外するものではないことを意味するものと理解されよう。
【００１０】
本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかにそうでない場合を除いて、複数の態様も含む。よって、たとえば、「変異（ａ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）」とあれば、単一の変異ならびに２つ以上の変異を含む。「作用因子（ａｎ  ａｇｅｎｔ）」とあれば、１種類の作用因子ならびに２種類以上の作用因子も含むといった具合である。
【００１１】
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列識別子番号（配列番号）で示される。配列番号は、配列識別子＜４００＞１（配列番号１）、＜４００＞２（配列番号２）といった具合に数字が対応している。配列識別子の概要を表８にあげておく。配列表については、特許請求の範囲の後ろに添付してある。
【００１２】
本明細書では、遺伝子および他の遺伝物質（たとえば、ｍＲＮＡ、核酸コンストラクトなど）をイタリックで表記し、そのタンパク質発現産物をイタリックではない形で表記する。このため、たとえばデンプン合成酵素ＩＩ（ＳＳＩＩ）ポリペプチドは、ＳＳＩＩ核酸配列の発現産物である。
【００１３】
ＳＳＩＩａ分子の核酸およびアミノ酸配列の代表例を、表８にさらに記載した配列表にあげておく。
【００１４】
本明細書に引用した刊行物の詳細については、明細書の末尾にまとめてある。
【００１５】
既存刊行物（またはそれに由来する情報）あるいは周知のあらゆる印刷物に対する本明細書の参照は、それらの既存刊行物（またはそれに由来する情報）あるいは周知の印刷物が本明細書の属する努力傾注分野における一般的な知識の一部をなすと承認または了解または何ら示唆するものではなく、そのようにみなされるべきではない。
【００１６】
本明細書に記載の各実施形態は、特に明記しないかぎり、変更すべきところを適宜変更して、あらゆる実施形態に適用される。
【００１７】
一実施形態において、本発明は、レベルまたは活性の低下したＳＳＩＩａタンパク質を含み、デンプン含有量が少なくとも４１％（ｗ／ｗ）であるオオムギ穀粒を提供するものである。穀粒、これを用いて得られる生成物ならびに、穀粒を入手、同定または利用する方法が、少なくともこれら２つの特徴によって特徴付けられる。特に、「デンプン含有量」とは全穀粒のデンプン含有量である。これは、たとえば精粒のほうが「デンプン含有量」が高くなるであろうことが理由である。いくつかの実施形態では、オオムギ穀粒のデンプン含有量が少なくとも４３％（ｗ／ｗ）、少なくとも４５％（ｗ／ｗ）、少なくとも４７％（ｗ／ｗ）、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）であり、あるいは、デンプン含有量が４１〜６５％（ｗ／ｗ）である。
【００１８】
関連の実施形態では、穀粒のアミロース含有量が、穀粒中の総デンプン量に対する割合で少なくとも５０％または少なくとも６０％である。さらに、いくつかの実施形態では、穀粒のβ−グルカン含有量が５〜９％（ｗ／ｗ）であるか、あるいは９％（ｗ／ｗ）を上回る。
【００１９】
もうひとつの実施形態では、穀粒のフルクタン含有量が３〜１１％（ｗ／ｗ）または４〜１１％である。好都合なことに、フルクタンの重合度が約３〜約１２である。
【００２０】
関連の別の実施形態では、穀粒が、ＳＳＩＩａ活性を有するポリペプチドをコードする内在性遺伝子における変異を含み、この変異が、オオムギ植物のＳＳＩＩａをコードする遺伝子の発現を減少させるか、レベルまたは活性の低下したＳＳＩＩａの発現につながる。例示的な一実施形態では、ｓｅｘ６−２９２アレルに対してホモ接合性の植物または穀粒が得られる。いくつかの実施形態では、オオムギ植物におけるＳＳＩＩａをコードする遺伝子の発現を下方制御する外来性核酸分子によってＳＳＩＩａのレベルを低下させる。ここで、いくつかの実施形態では、外来性核酸分子が、内在性のＳＳＩＩ発現を下方制御する遺伝子サイレンシングキメラ遺伝子、アンチセンス、リボザイム、コサプレッション、ｄｓＲＮＡ分子、ヘアピンＲＮＡ分子またはマイクロＲＮＡを含む。
【００２１】
好ましい実施形態において、本発明は、ａｍｏ１遺伝子の活性を低下させる遺伝的変異をさらに含む、オオムギ穀粒を提供するものである。好都合なことに、本明細書にてさらに説明するように、Ｈｉｍａｌａｙａ変種のオオムギ穀粒に対する低下など未改変の対照に対してａｍｏ１遺伝子の活性を低下させる。例示的な一実施形態では、遺伝的変異が、ａｍｏ１遺伝子の変異を含む。別の例では、植物またはその植物から得られる穀粒が、ａｍｏ１−ＡＣ３８アレルに対してホモ接合性である（Ｓｃｈｏｎｄｅｌｍａｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，  １０９：  ２７４〜２８１，  １９９２、その内容全体を本明細書に援用する）。一実施形態では、オオムギ穀粒が、ａｍｏ１遺伝子の変異を含み、ＳＳＩＩａ以外のデンプン合成酵素の活性が低下し、好ましくはＧＢＳＳのレベルが低下し、一層好ましくはＧＢＳＳＩのレベルが低下している。また、穀粒が、リジンのレベルを上昇させた（タンパク質１００ｇあたり＞４ｇ）ものであってもよい。このような穀粒を得るには、オオムギのプロワショヌパナ（Ｐｒｏｗａｓｈｏｎｕｐａｎａ）変種と高アミロース性グラシェル大麦などのａｍｏ１変異体座位を含むオオムギとを交配させればよい。
【００２２】
穀粒は、限定することなく、全穀粒またはひき割り粒、挽いた粒、精粒、精白粒、粗挽き粒、ロールにかけた粒または搗精粒など、有用な形態であればどのような形態であってもよい。
【００２３】
本発明は、本明細書にて説明する穀粒を生成できるオオムギ植物ならびに、オオムギ全粒またはその穀粒から生成される粉にまでおよぶ。
【００２４】
いくつかの実施形態において、本発明は、デンプン含有量が少なくとも４１％（ｗ／ｗ）のオオムギ穀粒であって、穀粒が変異体ＳＳＩＩａおよび変異体ａｍｏ１遺伝子を含むオオムギ穀粒を提供するものである。いくつかの実施形態では、ＳＳＩＩａ変異がｓｅｘ６−２９２アレルである。いくつかの実施形態では、ｓｅｘ６−２９２変異などの機能の喪失ＳＳＩＩａ変異およびａｍｏ１変異を含む穀粒を入手または生成し、これを加工して食物製品または飲料製品を製造する。
【００２５】
もうひとつの態様において、本発明は、食物製品または飲料製品を製造する方法であって、（ｉ）本明細書で説明するようなオオムギ穀粒を入手または生成し、（ｉｉ）この穀粒を加工して製品を製造する方法を提供するものである。この製品は、好都合なことに、全粒、粉、デンプン、ふすま、β−グルカン、フルクタン、非デンプン多糖ならびに、ひき割り粒、挽いた粒、精粒、精白粒、粗挽き粒、ロールにかけた粒または搗精粒からなる群から選択されるものであってもよい。加工済みのオオムギ穀粒をそのまま利用してもよいし、もうひとつの実施形態では、加工済みの穀粒を１種類以上の他の成分と混合して、食物製品または飲料製品を製造する。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、（ｉｉｉ）オオムギ穀粒またはこれを用いて得られる生成物のデンプン、デンプン含有量、アミロース、アミロペクチン、β−グルカン、フルクタン、非デンプン多糖、食物繊維または難消化性デンプンのレベルまたはタイプを評価することを含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、食物製品または飲料製品が、穀粒、粉、朝食用シリアル、ビスケット、マフィン、ミューズリーバー、麺類、甘味料、低カロリー添加剤、増量剤、食物繊維、粘着防止剤、保存料、プロバイオティック剤など、あるいはこれらの任意の組み合わせである。食物製品は、押出成形した朝食用シリアルまたはスナックなどの押出成形した食物製品あるいは、フレーク状の製品またはロールにかけた製品であってもよい。食物製品は、製菓材料またはベーキングミックスなどの食物製品の一成分であってもよい。
【００２７】
もうひとつの実施形態において、本発明は、オオムギ植物を作出する、あるいは、レベルまたは活性の低下したＳＳＩＩａタンパク質を含み、デンプン含有量が少なくとも４１％である穀粒を生成できる方法であって、（ｉ）前記植物に、対照植物に対して植物における内在性デンプン合成酵素ＩＩ（ＳＳＩＩ）のレベルまたは活性を下方制御する作用因子あるいは、植物においてＳＳＩＩをコードする内在性遺伝子の変異を導入し、（ｉｉ）穀粒を生産するオオムギ植物を選択することを含む方法を提供するものである。いくつかの実施形態では、この方法は、植物に、ａｍｏ１遺伝子の活性を低下させる遺伝的変異を導入することをさらに含む。作用因子は、好都合なことに、内在性のＳＳＩＩ発現を下方制御する、遺伝子サイレンシングキメラ遺伝子、アンチセンス、リボザイム、コサプレッション、ｄｓＲＮＡ分子、ヘアピンＲＮＡまたは他の外来性核酸分子など、内在性のＳＳＩＩ遺伝子発現を下方制御する核酸分子を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、この方法は、オオムギ穀粒またはこれを用いて得られる製品におけるデンプン、デンプン含有量、アミロース、アミロペクチン、β−グルカン、フルクタン、非デンプン多糖、食物繊維または難消化性デンプンのレベル、活性および／またはタイプを評価することをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法が、１種類以上の遺伝子マーカーを用いて植物を分析することを含む。いくつかの実施形態では、レベルまたは活性の低下したＳＳＩＩａタンパク質が、対照植物または作用因子若しくは変異の導入前の植物の場合に比して２５％未満、１０％未満、５％未満または基本的にこれを欠いている。
【００２９】
いくつかの実施形態において、本発明は、オオムギ植物を成長させ、穀粒を収穫するステップを含む、標記のオオムギ穀粒を生成する方法を提供するものである。もうひとつの実施形態において、本発明は、製品における難消化性デンプン、食物繊維、水溶性炭水化物、β−グルカン、フルクタンまたは非デンプン炭水化物のレベルを高める、あるいは前記製品のグリセミック指数（ＧＩ）を小さくするための前記製品の製造に使用する場合の、あるいは使用される、本明細書で開示する植物または穀粒または全粒または粉を提供するものである。本発明の植物、穀粒または全粒粉から単離したフルクタン、デンプンまたはβ−グルカンを、たとえば、食物において、甘味料、低カロリー添加剤、増量剤、食物繊維、粘着防止剤、保存料、プロバイオティック剤またはこれらの任意の組み合わせとして使用する。よって、いくつかの実施形態では、本発明の植物、穀粒、全粒または粉から単離した穀粒、粉、全粒、デンプン、β−グルカンまたはフルクタンを、食物製品における難消化性デンプン、食物繊維、水溶性炭水化物、β−グルカン、フルクタンのレベルを高める、あるいは前記食物製品のグリセミック指数（ＧＩ）を小さくするための前記食物製品の製造に使用する。いくつかの実施形態では、アミロース、β−グルカンおよびフルクタン、好ましくは難消化性デンプンのレベルが高まる。このため、本発明は、乾燥重量基準で少なくとも１０％のレベルで食物成分を含む食物製品であって、食物成分が、少なくとも４１％のデンプン（ｗ／ｗ）を含む本明細書で説明するような前記オオムギ穀粒またはこのオオムギ穀粒から得られる全粒または粉である食物製品を企図するものであり、全粒または粉の少なくとも４１％（ｗ／ｗ）のデンプンコンストラクトおよびＳＳＩＩａのレベルまたは活性が低下している。いくつかの実施形態では、全粒または粉が、重量基準で３〜１１％のフルクタン（ｗ／ｗ）または４〜１１％（ｗ／ｗ）フルクタンを含む。
【００３０】
他のいくつかの実施形態では、全粒または粉のβ−グルカン含有量が５〜９％（ｗ／ｗ）であるか、あるいは９％（ｗ／ｗ）を上回る。他の実施形態では、全粒または粉が、全粒または粉中の総デンプン量に対する割合で５０％または６０％のアミロースを含む。
【００３１】
例示的な一実施形態では、オオムギがｓｅｘ６−２９２アレルを含む。
【００３２】
もうひとつの例示的な実施形態では、製品が、パン、バンズ、朝食用シリアル、ケーキ、ビスケット、ペストリー、クラッカー、マフィン、ピザ、クロワッサン、ベーグル、プレッツェル、パスタ、麺類、製菓材料、ベーキングミックス、スープ、ソース、増粘安定剤、菓子類、トルティヤ、グラノーラバー、スナックおよび他のデンプン質の商品からなる群から選択される。製品は、高エネルギの飲み物またはスムージーなどの飲料であってもよい。
【００３３】
もうひとつの実施形態において、本発明は、本明細書で説明するような植物または穀粒から単離した穀粒または粉を、食物製品中におけるデンプン、アミロース、アミロペクチン、β−グルカン、フルクタン、非デンプン多糖、食物繊維または難消化性デンプンのうちの１種類または２種類以上のレベルを高めるための食物製品の製造で使用する用途を与えるものである。
【００３４】
もうひとつの実施形態において、本発明は、デンプン、アミロース、アミロペクチン、β−グルカン、フルクタン、非デンプン多糖、食物繊維または難消化性デンプンのうちの１種類または２種類以上のレベルが高められたオオムギ穀粒の変種を同定する方法を提供するものである。いくつかの実施形態では、この方法が、（ｉ）合成または異化作用によってデンプンを変化させたオオムギ穀粒を入手し、（ｉｉ）穀粒中におけるデンプン、アミロース、アミロペクチン、β−グルカン、フルクタン、非デンプン多糖、食物繊維または難消化性デンプンの１種類または２種類以上の量を求めることを含む。別の実施形態では、この方法が、（ｉｉｉ）（ｉｉ）のレベルを、合成または異化作用によってデンプンを変化させていない野生型穀粒または親植物または他の対照植物の穀粒でのレベルと比較することを含む。さらに別の実施形態では、この方法が、（ｉｉ）におけるレベルが変化させた穀粒で増えている場合に、穀粒を選択することを含む。いくつかの実施形態では、この方法が、ステップ（ｉ）の前に変異誘発または植物細胞のトランスフォーメーションを含む。好ましい実施形態では、オオムギ穀粒が、ａｍｏ１遺伝子に変異を含み、ＳＳＩＩａ、ＳＳＩＩＩａまたはＧＢＳＳであってもよいデンプン合成酵素の活性が低下（ＧＢＳＳＩのレベル低下など）している。このような穀粒を入手するには、オオムギ変異体Ｍ２９２またはｓｅｘ６−２９２アレルを含む他のオオムギまたはプロワショヌパナ（Ｐｒｏｗａｓｈｏｎｕｐａｎａ）変種と、高アミロース性グラシェル大麦などのａｍｏ１変異体座位を含むオオムギとを交配させればよい。
【００３５】
もうひとつの態様において、本発明は、デンプン、アミロース、アミロペクチン、β−グルカン、フルクタン、非デンプン多糖、食物繊維または難消化性デンプンのオオムギ穀粒などの禾穀類の穀粒におけるレベルの値を求める方法であって、本発明による少なくとも４１％のデンプン（ｗ／ｗ）を含む穀粒を入手するステップと、デンプン、アミロース、アミロペクチン、β−グルカン、フルクタン、非デンプン多糖、食物繊維または難消化性デンプンを抽出すべく穀粒を加工するステップと、穀粒中のデンプン、アミロース、アミロペクチン、β−グルカン、フルクタン、非デンプン多糖、食物繊維または難消化性デンプンの量を求めるべく抽出したデンプン、アミロース、アミロペクチン、β−グルカン、フルクタン、非デンプン多糖、食物繊維または難消化性デンプンの量を測定するステップと、を含む方法を提供するものである。
【００３６】
もうひとつの実施形態において、本発明は、オオムギ穀粒またはこのオオムギ穀粒から得られる製品を、現時点で開示された方法によって、別の食物または飲料成分と混合することを含む、食物または飲料を調理するための方法を提供するものである。よって、この方法は、（ｉ）レベルまたは活性の低下したＳＳＩＩａタンパク質を含み、デンプン含有量が少なくとも４１％（ｗ／ｗ）であるオオムギ穀粒を入手または生成し、（ｉｉ）穀粒を加工して製品を製造することを含む。この製品は、好都合なことに、全粒、粉、デンプン、ふすま、β−グルカン、フルクタン、非デンプン多糖ならびに、ひき割り粒、挽いた粒、精粒、精白粒、粗挽き粒、ロールにかけた粒または搗精粒からなる群から選択されるものであってもよい。この方法は、製品を別の食物製品または飲料製品またはその前身製品と混合することをさらに含む。
【００３７】
本発明はさらに、デンプン、アミロース、アミロペクチン、β−グルカン、フルクタン、非デンプン多糖、食物繊維または難消化性デンプンを提供して、哺乳動物における１種類以上の健康指標を改善する方法であって、哺乳動物に、レベルまたは活性の低下したＳＳＩＩａタンパク質を含み、デンプン含有量が少なくとも４１％（ｗ／ｗ）である、オオムギ穀粒、このオオムギ穀粒から得られる全粒または粉あるいは、それから得られる食物または飲料を含む組成物または本明細書で説明するような食物製品を投与することを含む方法を提供するものである。いくつかの実施形態では、穀粒、粉、デンプン、アミロース、アミロペクチン、β−グルカン、フルクタン、非デンプン多糖、食物繊維または難消化性デンプンが、食品、飲料または医薬組成物の形態である。いくつかの実施形態では、穀粒または粉が、フルクタン製品の形態である。いくつかの実施形態では、１種類以上の健康指標が、有益な腸内細菌数の増加、異常腺窩巣数の減少、無機物吸収量の増大、インスリンレベルの低下、グリセミック指数の減少、グリセミック負荷の低下、血糖減少、血圧低下、体重減少、血中コレステロールレベルの低下、ＨＤＬコレステロールレベルの低下、骨密度増加、カルシウムレベルの上昇、排便頻度の増加または血清心血管プロフィールの改善である。
【００３８】
関連の実施形態では、本発明は、被検体での食餌デンプン、デンプン含有量、アミロース、アミロペクチン、β−グルカン、フルクタン、非デンプン多糖、食物繊維または難消化性デンプンのレベルの低さに関連する症状の１種類以上の症候を寛解させるための方法であって、本明細書に記載したような穀粒あるいは、当該穀粒から得られるデンプン、アミロース、アミロペクチン、β−グルカン、フルクタン、非デンプン多糖、食物繊維または難消化性デンプンのうちの１種類以上を含む加工製品を、１種類以上の症候を寛解させるのに十分な時間および条件下で被検体に経口投与することを含む、前記方法を提供するものである。
【００３９】
この方法のいくつかの実施形態では、症状が、糖尿病、肥満症、心疾患、高血圧症、便秘、骨粗鬆症および癌からなる群から選択される。
【００４０】
本方法または組成物から利益を得られるであろう、あらゆる被検体が包含される。「被検体」という用語は、限定することなく、ヒトおよび非ヒト霊長類、ウシ、ブタまたはニワトリなどの家畜動物あるいは、仔ウシまたは仔ブタなどの若い動物、イヌまたはネコ、ウマなどのコンパニオンアニマル、実験室での試験動物、捕獲した野生動物、爬虫類および両棲類、魚類および鳥類を含む。被検体は、これがヒトであるか非ヒト生物であるかを問わず、患者、個体、被検体、動物、宿主またはレシピエントと呼ぶこともある。特定の実施形態では、被検体がヒトである。
【００４１】
上記の概要は、どのような形でも本発明のあらゆる実施形態についての包括的な記述とはみなされず、みなされるべきものでもない。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】種子を写真で示したものであり、種子形態を示す。使用した系統は、野生型系統（ＨＨ２１およびＨＨ６１）、ａｍｏ１変異体（ＨＨ１７およびＨＨ３０）、ＳＳＩＩａ変異体（ＨＨ３５およびＨＨ  ５０）、Ｈｉｍａｌａｙａ２９２とＨＡＧとの間のＢＣ３Ｆ６個体群由来のＳＳＩＩａ−ａｍｏ１二重変異体（ＨＨ４およびＨＨ８８）である。２種類の親系統と２種類の対照系統も使用した。
【図２】野生型、ＳＳＩＩａ−ａｍｏ１、ｓｓＩＩａ−ａｍｏ１、ｓｓＩＩａ−ａｍｏ１の４種類の遺伝型について種子乾燥重量のパーセンテージとしてのデンプン含有量を示す棒グラフである。
【００４３】
表の簡単な説明
表１は、オオムギ全粒のＲＳ含有量およびＧＩレベルを示すものである。
表２は、１００％オオムギ全粒を用いて製造したパンのＲＳ含有量およびＧＩレベルを示すものである。
表３は、遺伝型が３０％または１００％オオムギ粉を用いて製造したパンのＲＳ含有量に対する効果についての統計分析結果を示すものである。
表４は、３０％オオムギ粉を用いて製造したパンのＲＳ含有量およびＧＩレベルを示すものである。
表５は、遺伝型が１００％オオムギ粉を用いて製造したパンのＲＳ含有量（デンプン１ｇあたりのＲＳ（単位ｍｇ））に対する効果についての統計分析結果を示すものである。
表６は、遺伝型が３０％オオムギ粉を用いて製造したパンのＲＳ含有量（デンプン１ｇあたりのＲＳ（単位ｍｇ））に対する効果についての統計分析結果を示すものである。
表７は、遺伝型が３０％または１００％オオムギ粉を用いて製造したパン１０ｇのＧＩレベルに対する効果についての統計分析結果を示すものである。
表８は、本明細書に示した配列番号の説明を示すものである。
表９は、アミノ酸の下位分類を示すものである。
表１０は、典型的なアミノ酸置換を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明は、ａｍｏ１遺伝子の活性を低下させる遺伝的変異とともにＳＳＩＩａ遺伝子の機能喪失変異を含む変種では、ＳＳＩＩａ変異体オオムギ、特に高アミロースおよびフルクタンの農学的な利点をさらに高めることができるという驚くべき発見に立脚するものである。特に、図２に示すように、オオムギ二重変異体でＳＳＩＩａ単一変異体よりもデンプンレベルの増加が認められた。
【００４５】
よって、一実施形態において、本発明は、レベルまたは活性の低下したＳＳＩＩａタンパク質を含み、デンプン含有量が少なくとも４１％（ｗ／ｗ）であるオオムギ穀粒を提供するものである。関連の実施形態では、穀粒のアミロース含有量が、穀粒中の総デンプン量に対する割合で少なくとも５０％または少なくとも６０％である。さらに、いくつかの実施形態では、穀粒のβ−グルカン含有量が５〜９％（ｗ／ｗ）であるか、あるいは９％（ｗ／ｗ）を上回る。もうひとつの実施形態では、穀粒のフルクタン含有量が３〜１１％（ｗ／ｗ）または４〜１１％である。もうひとつの実施形態では、穀粒のリジン含有量が、タンパク質１００ｇあたり少なくとも４ｇである。
【００４６】
デンプンは、グルコシド残基のみで構成され、アミロースおよびアミロペクチンという２つのタイプの分子として見られる。これらは、分子の大きさまたは他の特性に基づいて区別可能である。アミロース分子がα−１，４結合グルコシド単位で構成される基本的に直鎖状のポリマーであるのに対し、アミロペクチンは、α−１，４結合グルコシド単位の多くの直鎖を結合しているα−１，６グルコシド結合を有する高度分岐分子である。アミロペクチンは、グルコース単位が数万から数十万の大きさで、その５パーセント前後がα−１，６分岐である大きな分子からなる。一方、アミロースは、大きさが数百から数千グルコシド残基の分子で構成され、分岐は１パーセント未満である（その考察については、Ｂｕｌｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，  ２３：  ８５〜１１２，  １９９８を参照のこと）。野生型禾穀類のデンプンは一般に、２０〜３０％のアミロースを含有し、残りがアミロペクチンである。
【００４７】
高等植物の胚乳におけるデンプンの合成は、４つの重要なステップを触媒する一連の酵素によってなされる。第１に、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼが、Ｇ−１−ＰおよびＡＴＰからのＡＤＰ−グルコースの合成によって、デンプンのモノマー前駆体を活性化する。第２に、活性化されたグルコシルドナーであるＡＤＰ−グルコースを、デンプン合成酵素によって既存のα１−４結合の非還元末端に転位させる。第３に、デンプン分枝酵素が、α−１，４結合グルカン領域の切断によって分岐点を導入した後、切断後の鎖をアクセプター鎖まで移動させ、新たなα−１，６結合を形成する。デンプン分枝酵素は、α−１，６結合をα−ポリグルカンに導入し、アミロペクチンの形成時に不可欠の役割を果たすことのできる唯一の酵素である。最後に、デンプン枝切り酵素が、いくつかの分岐結合を除去するが、これらの酵素が働く機序は解明されていない。
【００４８】
高等植物での正常なデンプン粒合成には少なくともこれら４つの活性が必要なのは明らかであるとはいえ、高等植物の胚乳では４つの活性の各々で複数のアイソフォームが見出され、変異解析に基づいて、あるいはトランスジェニック手法を用いる遺伝子発現レベルの改変によって、個々のアイソフォームについて具体的な役割が提唱されている。禾穀類の胚乳では、４つのクラスのデンプン合成酵素が禾穀類の胚乳に見出されている。すなわち、デンプン粒だけに局在するアイソフォームである、アミロース合成に不可欠なデンプン粒結合型デンプン合成酵素（ＧＢＳＳ）と、粒画分と可溶性画分との間で区切られた２つの形態（ＳＳＩ，  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，  １２０：  １１４７〜１１５５，  １９９９ａ，  ＳＳＩＩ，  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ９８：  １２０８〜１２１６，  １９９９ｂ）と、可溶性画分全体に存在する４番目の形態であるＳＳＩＩＩ（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，  ３７３：  １３５〜１４６，  ２０００；  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９ｂ（上掲）；  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００（上掲））である。ＳＳＩＩおよびＳＳＩＩＩでの変異は、アミロペクチンの構造を変化させることが示されている（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  １０：  ３９９〜４１２，  １９９８；  Ｃｒａｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １０：  ４１３〜４２６，  １９９８）。ＳＳＩ活性に対する役割を規定する変異については何ら説明されていない。
【００４９】
禾穀類の胚乳では、分枝酵素Ｉ（ＳＢＥＩ）、分枝酵素ＩＩａ（ＳＢＥＩＩａ）、分枝酵素ＩＩｂ（ＳＢＥＩＩｂ）という３つの形態の分枝酵素が発現される（Ｈｅｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｂｏｙｅｒ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ２０：  ４８３〜４９２，  １９８２；  Ｂｏｙｅｒ  ａｎｄ  Ｐｒｅｉｓｓ，  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ６１：  ３２１〜３３４，  １９７８；  Ｍｉｚｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １１２：  ６４３〜６５１，  １９９２；  Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ，  １３７：  ２１５〜２１５，  １９９７）。ＳＢＥ配列をアライメントしたところ、ヌクレオチドレベルとアミノ酸レベルの両方で配列の類似性が高いことが明らかになり、ＳＢＥＩ、ＳＢＥＩＩａ、ＳＢＥＩＩｂクラスのグループ分けが可能である。
【００５０】
高等植物には、イソアミラーゼタイプの枝切り酵素とプルラナーゼタイプの枝切り酵素という２つのタイプの枝切り酵素が存在し、その基質特異性に基づいて定義される（Ｍｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，  １２２：  ９８９〜９９７，  ２０００）。トウモロコシおよびコメのＳｕｇａｒｙ−１変異が、両方の枝切り酵素の欠乏と関連している（Ｊａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  ７：  ４１７〜４２９，  １９９５；  Ｋｕｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，  １２１：  ３９９〜４０９，  １９９９）が、原因変異はイソアミラーゼタイプの枝切り酵素遺伝子と同じ場所にマップされる。
【００５１】
Ｍ２９２またはＭ３４２と称されるオオムギの変異体形態では、アミロースデンプン表現型が増加し、アミロペクチンデンプン表現型が減少していることが示されている。この表現型は、人間の健康に対して有益なのかどうかが疑わしい（Ｍｏｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ３４：  １７３〜１８５，  ２００３ｂ；  Ｔｏｐｐｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔａｒｃｈ／Ｓｔａｅｒｋｅ  ５５：  ５３９〜５４５，  ２００３；  Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｕｔｒ．  １３４：  ８３１〜８３５，  ２００４ａ；  Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｎｕｔｒ．  ９２：  ６０７〜６１５，  ２００４ｂ）。これは、国際特許出願第ＰＣＴ／ＡＵ０１／０１４５２号（国際公開第０２／３７９５５号パンフレット）（その開示内容を本明細書に援用する）に記載されているように、オオムギの染色体７Ｈに局在するデンプン合成酵素ＩＩａ遺伝子（ＳＳＩＩａ）における変異によって引き起こされる。
【００５２】
デンプン合成酵素ＩＩａ（ＳＳＩＩａ）遺伝子内に終止コドンが存在する結果、オオムギｓｅｘ６変異が生じた。終止コドンは転写物翻訳の中途での終了につながる。この変異体の胚乳ではＳＳＩＩａタンパク質は検出できなかった（Ｍｏｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３（上掲））。ＳＳＩＩａ活性が失われると、アミロペクチンの合成が８０％減少して残りのアミロペクチンポリマーでは全般的に鎖長分布が変化し、結果としてアミロース：アミロペクチン比が変わるため、穀粒のデンプンは約７０％のアミロースを含有することとなった。
【００５３】
いくつかの実施形態において、本発明は、穀粒におけるデンプンと非デンプン構成成分の収量を上げることで、オオムギ植物の有用性を改善するものである。改変が穀粒に限定されることもあれば、改変が植物全体（そのさまざまな組織および部分）にわたることもある。本明細書で使用する場合、「改変している」または「改変された」とは植物または穀粒における変化を意味し、この変化については、デンプン合成酵素ＩＩのレベルまたは活性が低下するかぎりにおいて、量、活性、生成率、不活性化率、分解率、発症の遅延、早期発症、材料の追加または除去、変異またはこれらの任意の組み合わせにおける増減であってもよい。これらの表現は、該当する遺伝子またはタンパク質の機能レベルの上昇または低下のいずれかを含む。「機能レベル」とは、活性タンパク質のレベルを示すものと理解されたい。機能レベルは、宿主細胞中に存在する実際のタンパク質のレベルとタンパク質の比活性との組み合わせである。このため、たとえば、宿主細胞における実際のタンパク質濃度の上昇または低下（これはそのタンパク質をコードする遺伝子の発現を変化させることで容易に達成される）させることによって機能レベルを改変してもよい。また、タンパク質の比活性を調節することで機能レベルを改変してもよい。このような比活性の上昇または低下については、比活性が高いまたは低い変種タンパク質を発現させるか、あるいは関連のあるタンパク質をコードする内在性遺伝子を、このような変種をコードするアレルで置き換えて達成すればよい。比活性の上昇または低下を、エフェクター分子の発現を改変して達成してもよい。特定の実施形態では、適切なコード配列の発現レベルあるいは酵素の活性または量を、基準の発現レベルの少なくとも約１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％あるいは、基準の発現レベルに比して少なくとも約１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％または少なくとも１０００％高いか、少なくとも約１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％低くなるように、あるいは検出できないレベルまで低下するように、選択する。
【００５４】
ＳＳＩＩレベルまたは活性の所望の低下を区別するためのもうひとつの方法に、改変された植物またはその植物から得られる穀粒におけるレベルの上昇またはフルクタンのさまざまな形態の増加を定量化することがある。
【００５５】
本明細書で使用する場合、「改変する」、「変化させる」、「増加／上昇／増大している」、「増加／上昇／増大した」、「減少／低下している」、「減少／低下した」、「阻害された」、「変異体」などは、相対的すなわち野生型または変化していない状態または対照状態と比較しての表現だと考えられる。いくつかの実施形態では野生型植物が適切な「対照植物」であるが、多くの状況では当業者らが従来技術における通常の技術を用いて対照植物を決定しなければならない。
【００５６】
「タンパク質のレベル」とは、たとえば、ウェスタンブロット解析または他の免疫学的な手段など、従来技術において周知のどのような手段で測定してもよい特定タンパク質、たとえばＳＳＩＩの量を示す。
【００５７】
「酵素活性のレベル」とは、酵素アッセイで測定した特定酵素の量を示す。
【００５８】
「ＳＳＩＩａタンパク質の活性」とは、酵素アッセイで測定した特定酵素の量を示す。
【００５９】
より活性のある若しくは活性の低いタンパク質が産生される場合、変異体における酵素の活性レベルが変化することがあるが、タンパク質自体の発現レベル（量）は変化しないことに注意されたい。逆に、タンパク質の量が変化するが活性（単位タンパク質あたりの活性）は同じまま保たれるかもしれない。たとえば、酵素をコードする遺伝子の発現が転写的にまたは転写後に減少すると、量が減少して活性も低下することがある。特定の実施形態では、ＳＳＩＩの活性またはタンパク質のレベルの低下が、未改変のオオムギの穀粒でのタンパク質または活性のレベルと比較すると少なくとも４０％または少なくとも６０％の低下、あるいは少なくとも７５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の低下である。タンパク質または酵素活性または遺伝子発現のレベルの低下は、葉、種子または穀粒の発育におけるどの段階でも生じ得るものであり、特に光合成が起こる日中あるいは、発育中の胚乳でデンプンが合成されている登熟期、あるいは穀粒が成熟するまで発育するあらゆる段階で生じ得る。「野生型」という表現は、本明細書で使用する場合、遺伝学分野での通常の意味を有し、本明細書で教示するような未改変のオオムギ、栽培種または遺伝型を含む。たとえば、Ｈｉｍａｌａｙａ栽培種などのいくつかの好ましい「野生型」オオムギ変種を本明細書で説明する。
【００６０】
ＳＳＩＩａ遺伝子の発現を部分的または完全に阻害することで改変表現型を達成することもできる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロッティングなどの従来技術において周知の手法を加水分解された穀粒および加水分解されていない穀粒ならびにその画分で実施し、デンプン形成酵素に対する改変が起こっている植物または穀粒を同定する。これらの方法として、本明細書に記載の方法あるいは、マイクロアレイ分析、電気泳動、クロマトグラフィ（ペーパクロマトグラフィ、薄層クロマトグラフィ、ガスクロマトグラフィ、ガス−液体クロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ）法などの方法による植物の分析があげられる。分離プロファイルを既知の同一性についての標準と比較するか、あるいは質量分析および核磁気共鳴分光法などの分析手法によって、一般に別々の構成成分が同定される。たとえば、実施例９、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  Ｔｈｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｈｉｇｈｅｒ  Ｐｌａｎｔｓ，  Ｃｏｒｄｕｓ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｈｅｒｓｔ，  ＵＳＡ，  １９８０；  Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２６６：  ７７〜８４，  １９９９；  Ｖｅｒｏｎｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｚ．  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈ．，  ２４：  ２６３〜２６９，  １９９９；  Ｈｅｎｄｒｉｘ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  ４７：  ４２３〜４３２，  ２００１；  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．，  ３３１：  １４９〜１６１，  ２００１；および本明細書にあげた引用例を参照すればよい。当業者間で周知の標準的なプロトコールを用いて、炭水化物をアッセイすることが可能である。
【００６１】
ＳＳＩＩａレベルまたは活性の変化は、１種類以上の遺伝的変動をオオムギ植物に導入して達成できるものである。すなわち、遺伝的変動は、直接的にまたは間接的に生長または発育時の植物部位における酵素活性またはレベルの変化につながり、結果として、本明細書で説明する酵素、デンプンおよびフルクタン改変につながる。遺伝的変動は、たとえばトランスフォーメーションまたは変異導入によって植物または前駆細胞に導入される異種のポリヌクレオチドであってもよい。その後、植物育種の従来技術において周知のように、交配によって異なる遺伝的背景に遺伝的変動を導入してもよい。いくつかの実施形態では、ＳＳＩＩａのレベルまたは機能的活性を、対応する対照植物に対して約８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満または１５％未満、適宜約１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満または１％未満のレベルまで下方制御し、好ましくは穀粒のデンプン含有量におけるアミロースに対する割合で、デンプンまたは非デンプン構成成分のレベルを上昇させる。好ましい実施形態では、レベルの上昇が対照の少なくとも２倍である。好ましくは、本実施形態では、この減少によって、同じ環境条件下で生育させた場合の対応する対照植物と比較して、一般に少なくとも約５０％または５５％、特に少なくとも約６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％である、フルクタンレベルなどの非デンプン多糖の実質的な上昇が生じ、あるいはそれよりも大きいフルクタンレベルの上昇が生じる。必要なＳＳＩＩａレベルまたは活性の低下量は、植物の種または株の環境要因といった他の要因に左右されることがある。しかしながら、このとき必要とされる場合がある最適化はいずれも、本明細書で説明するものを含む常法を用いて達成可能なものであると考えられる。
【００６２】
ＳＳＩＩａレベルの低下については、たとえばＳＳＩＩａを下方制御する異種ポリヌクレオチドの発現を駆動するための構成的プロモーターを用いて、植物全体の組織で達成してもよい。組織特異的または発生学的に調節されたプロモーターを用いて、好ましくはシンク組織、一層好ましくは発育中の胚乳で達成できる。「シンク細胞」および「シンク組織」とは、本明細書で使用する場合、二酸化炭素固定以外の形態で、すなわち糖または他の炭水化物として細胞に入った有機炭素の正味の流入物を含む細胞、組織または器官を示す。植物では、シンク組織は、すべての非光合成組織、および、他の光合成細胞によって固定された有機炭素、あるいは周囲の培地または環境から直接的二酸化炭素固定以外の手段で得られる有機炭素の正味の流入物を含む光合成組織を含む。
【００６３】
遺伝子
いくつかの実施形態において、本発明には、遺伝子の活性の改変ならびにキメラ遺伝子の作製および使用が関与する。本明細書で使用する場合、「遺伝子」という用語は、タンパク質コード領域を含むまたは細胞で転写されるが翻訳はされないデオキシリボヌクレオチド配列ならびに、関連の非コード領域および調節領域を含む。このような関連領域は一般に、いずれかの側に約２ｋｂの距離で５’末端と３’末端の両方のコード領域または転写領域に隣接して局在する。この点に関して、遺伝子が、特定の遺伝子と自然に関連しているプロモーター、エンハンサー、終止および／またはポリアデニル化シグナルなどの制御シグナルあるいは異種の制御シグナルを含むものであってもよく、この場合、遺伝子は「キメラ遺伝子」と呼ばれる。コード領域の５’に局在し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳配列と呼ばれる。コード領域の３’または下流に局在し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻訳配列と呼ばれる。「遺伝子」という用語は、遺伝子のゲノム形態とｃＤＮＡの両方を包含する。
【００６４】
「デンプン合成酵素ＩＩ遺伝子」、「ＳＳＩＩ」などは、本明細書で使用する場合、当業者が他のデンプン合成酵素または他のタンパク質と容易に区別可能なオオムギにおけるデンプン合成酵素ＩＩ（ＳＳＩＩ）をコードするヌクレオチド配列を示す。好ましい実施形態では、オオムギのＳＳＩＩ遺伝子が、配列番号１で示すｃＤＮＡ配列との同一性が少なくとも８０％である配列を有するヌクレオチドを含む、オオムギに存在するものであってもよいしオオムギから単離または誘導したものであってもよい核酸分子を示す。好ましい実施形態では、ＳＳＩＩ遺伝子がＳＳＩＩａ遺伝子であるか、ＳＳＩＩタンパク質がＳＳＩＩａタンパク質であり、その各々を本明細書にて開示する本発明のあらゆる態様に適用できる。Ｍ２９２由来のＳＳＩＩａ遺伝子のｃＤＮＡのヌクレオチド配列を、配列番号９で提示する。
【００６５】
転写領域を含む遺伝子のゲノム形態またはクローンを、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と呼ばれる非コード配列で中断してもよい。「イントロン」とは、本明細書で使用する場合、一次ＲＮＡ転写物の一部として転写されるが成熟ｍＲＮＡ分子には存在しない遺伝子のセグメントである。イントロンは、核または一次転写物から除去または「切り出される」。よって、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）にはイントロンが存在しない。イントロンは、エンハンサーなどの調節エレメントを含むものであってもよい。「エキソン」とは、本明細書で使用する場合、ＲＮＡ分子が翻訳されないときに成熟ｍＲＮＡまたは成熟ＲＮＡ分子に存在するＲＮＡ配列相当のＤＮＡ領域を示す。ｍＲＮＡは、翻訳時に新生ポリペプチドでのアミノ酸の配列または順序を特定するよう機能する。「遺伝子」という用語は、本明細書に記載の本発明のタンパク質の全部または一部をコードする合成分子または融合分子ならびに、上記のいずれかに対する相補ヌクレオチド配列を含む。細胞での染色体外維持または宿主ゲノムへの組込みを目的として、適当なベクターに遺伝子を導入してもよい。
【００６６】
本明細書で使用する場合、「キメラ遺伝子」とは、その自然な場所で天然の遺伝子ではない遺伝子を示す。一般に、キメラ遺伝子は、一緒に天然には見られない調節配列および転写配列またはタンパク質コード配列を含む。このため、キメラ遺伝子は、異なる起源由来の調節配列およびコード配列を含むこともあれば、同一起源由来ではあるが天然に見られるものとは異なる形で配置された調節配列およびコード配列を含むこともある。「内在性」という用語は、本明細書では、調査対象となる植物と同一の発育段階で未改変の植物に自然に存在または産生される物質を示すものとして用いる。「内在性遺伝子」とは、生物のゲノムで自然な場所にある天然遺伝子を示す。本明細書で使用する場合、「組換え核酸分子」とは、組換えＤＮＡ技術によって作製または改変された核酸分子を示す。「外来ポリヌクレオチド」または「外来性ポリヌクレオチド」または「異種ポリヌクレオチド」などは、実験操作によって細胞のゲノムに導入される核酸を示す。これには、導入された遺伝子が天然に生じる遺伝子に比していくつかの改変（たとえば、変異、選択可能なマーカー遺伝子の存在など）を含むかぎり、その細胞に見られる遺伝子配列も含まれる。外来遺伝子または外来性遺伝子は、自然ではない生物に挿入される遺伝子、自然な宿主内の新たな場所に導入される天然遺伝子またはキメラ遺伝子であってもよい。「トランスジーン」とは、トランスフォーメーションの手順でゲノムに導入された遺伝子である。「遺伝的に改変された」という用語は、トランスフォーメーションまたは形質導入によって遺伝子を細胞に導入すること、遺伝子を細胞に変異導入して、これらの作用がなされる細胞または生物あるいはその後代における遺伝子の制御を変化させるか調節することを含む。
【００６７】
ポリヌクレオチド
説明、表、配列表を含む本発明において、さまざまなポリヌクレオチドが参照される。本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチド」または「核酸」または「核酸分子」とはヌクレオチドの高分子を意味し、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもそれらの組み合わせであってもよく、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｈｐＲＮＡを含む。たとえば自動合成装置で作られた細胞由来、ゲノム由来または合成由来のＤＮＡまたはＲＮＡであってもよいし、炭水化物、脂質、タンパク質または他の材料と組み合わせてもよく、蛍光または他の基で標識してもよいし、固体支持体に結合させて、本明細書で定義する特定の活性を発揮させるか、天然には見られない、当業者間で周知の１種類以上の改変ヌクレオチドを含むようにしてもよい。高分子は、一本鎖であってもよいし、本質的に二本鎖または部分的に二本鎖であってもよい。部分的に二本鎖のＲＮＡ分子の一例に、ヌクレオチド配列とその相補体との間の塩基対合によって形成される二本鎖ステムと、ヌクレオチド配列およびその相補体を共有結合的に結合するループ配列とを含むヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）または自己相補的ＲＮＡがある。本明細書で使用する場合、塩基対合とは、Ｇ：Ｕ塩基対をはじめとするヌクレオチド間の標準的な塩基対合を示す。「相補的」とは、２つのポリヌクレオチドが、その長さの一部に沿って、あるいは一方または両方の全長に沿って塩基対合（ハイブリダイズ）できることを意味する。「ハイブリダイズされたポリヌクレオチド」とは、ポリヌクレオチドが実際にその相補体との間で塩基対合されたことを意味する。「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では「核酸」という用語と同義に用いられる。
【００６８】
「単離された」とは、自然な状態であれば通常伴う構成成分を実質的にまたは基本的に含まない材料を意味するものとする。本明細書で使用する場合、「単離されたポリヌクレオチド」または「単離された核酸分子」とは、これがその自然な状態で関連または結合している同一タイプのポリヌクレオチド配列から少なくとも部分的に分離され、好ましくはこれを実質的にまたは本質的に含まないポリヌクレオチドを意味する。たとえば、「単離されたポリヌクレオチド」は、天然に生じる状態ではこれをフランキングする配列から精製または分離されたポリヌクレオチド（通常は自己に隣接する配列から取り除かれたＤＮＡフラグメントなど）を含む。好ましくは、単離されたポリヌクレオチドは、少なくとも９０％がタンパク質、炭水化物、脂質などの他の構成成分を含まない。「組換体ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用する場合、通常は天然に見られない形態に核酸を操作することで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成されるポリヌクレオチドを示す。たとえば、組換体ポリヌクレオチドは、発現ベクターの形態であってもよい。通常、このような発現ベクターは、ヌクレオチド配列に作動的に接続された転写および翻訳制御核酸を含む。
【００６９】
本発明は、オリゴヌクレオチドの使用について示すものである。本明細書で使用する場合、「オリゴヌクレオチド」は、最大５０ヌクレオチド長のポリヌクレオチドである。これは、ＲＮＡ、ＤＮＡあるいは、そのいずれかの組み合わせまたは誘導体であっても構わない。オリゴヌクレオチドは一般に、１０〜３０ヌクレオチド、普通は１５〜２５ヌクレオチド長の比較的短い一本鎖分子である。増幅反応でのプローブまたはプライマーとして用いられる場合、このようなオリゴヌクレオチドの最小サイズは、標的核酸分子で相補的な配列とオリゴヌクレオチドとの安定したハイブリッドの形成に必要とされるサイズである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１５ヌクレオチド長、一層好ましくは少なくとも１８ヌクレオチド長、一層好ましくは少なくとも１９ヌクレオチド長、一層好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長、なお一層好ましくは少なくとも２５ヌクレオチド長である。
【００７０】
プローブとして用いられるポリヌクレオチドは一般に、ラジオアイソトープ、ハプテン、酵素、ビオチン、蛍光分子または化学発光分子などの検出可能な標識とコンジュゲートされる。本発明のオリゴヌクレオチドは、たとえば改変されたデンプンまたはフルクタンのレベルなど、該当する形質に連鎖したＳＳＩＩまたは他の遺伝子のアレルを検出する方法において有用である。このような方法では、たとえば核酸ハイブリダイゼーションを利用し、多くの場合、これには（ＰＣＲで使用されるように）好適なポリメラーゼによるオリゴヌクレオチドプライマー伸展を含む。
【００７１】
本発明のオリゴヌクレオチドの変種は、本明細書で定義する特定のオリゴヌクレオチド分子のさまざまなサイズの分子を含むおよび／または本明細書で定義する特定のオリゴヌクレオチド分子のものに近い禾穀類ゲノムなどとハイブリダイズできるものである。たとえば変種は、別のヌクレオチドを含むものであってもよい（１、２、３、４またはそれより多く）し、標的領域とハイブリダイズできるかぎりは、もっと少ない数のヌクレオチドを含むものであってもよい。さらに、オリゴヌクレオチドが標的領域とハイブリダイズする機能に悪影響をおよぼすことなく、若干のヌクレオチドを置換してもよい。また、本明細書で定義する特定のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする場所である植物ゲノムの領域付近、たとえば５０ヌクレオチド以内でハイブリダイズする変種を容易に設計できる。プローブ、オリゴヌクレオチドなどは、本明細書にて説明する配列またはその修正版またはその変種または他の禾穀類植物からの機能的相同体に基づくものである。
【００７２】
「ポリヌクレオチド変種」および「変種」などの用語は、基準ポリヌクレオチド配列との間で実質的な配列同一性を呈するポリヌクレオチドまたはその相補形態を示す。また、これらの用語は、少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失または置換によって基準ポリヌクレオチドとは区別されるポリヌクレオチドを包含する。よって、「ポリヌクレオチド変種」および「変種」という用語は、１つ以上のヌクレオチドが付加または欠失、あるいは異なるヌクレオチドで置換されたポリヌクレオチドを含む。この点に関して、基準ポリヌクレオチドに対して変異、付加、欠失および置換を含む特定の変化をほどこすことで、変化後のポリヌクレオチドが基準ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性を保持し得ることが、従来技術において十分に理解されている。このため、これらの用語は、酵素活性または他の制御活性を呈するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドあるいは、選択的プローブまたは他のハイブリダイズ因子として作用し得るポリヌクレオチドを包含する。特に、これは同一のポリペプチドまたはアミノ酸配列をコードするが、遺伝暗号の冗長性がゆえにヌクレオチド配列は異なるポリヌクレオチドを含む。「ポリヌクレオチド変種」および「変種」という用語は、天然に生じるアレル変種も含む。
【００７３】
「〜に対応する」または「〜に対応している」とは、（ａ）基準ポリヌクレオチド配列のすべてまたは大半に対して実質的に同一または相補的なヌクレオチド配列あるいは（ｂ）ペプチドまたはタンパク質におけるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを意味するものとする。また、この表現は、その範囲内で、基準ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸の配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドも含む。２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列関係を説明するのに用いられる用語は、「基準配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」、「実質的な同一性」および「同一の」を含み、最小数のヌクレオチドまたはアミノ酸残基に関して、あるいは全長にわたって定義される。「配列同一性」および「同一性」という用語は、本明細書では同義に用いられ、比較ウィンドウ全体にわたってヌクレオチドごとあるいはアミノ酸ごとに配列が同一である度合いを示す。よって、比較のウィンドウ全体で最適にアライメントされた２つの配列同士を比較し、同一の核酸塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕなど）または同一のアミノ酸残基（など、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＭｅｔ）が両方の配列に起こる位置の数を求めて一致位置数とし、この一致位置数を比較のウィンドウ内の総位置数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り、その結果に１００をかけて配列同一性のパーセンテージを得ることで、「配列同一性のパーセンテージ」が求められる。
【００７４】
ギャップ開始ペナルティ＝５、ギャップ伸長ペナルティ＝０．３を用いるＧＡＰ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：  ４４３〜４５３，  １９７０）解析（ＧＣＧプログラム）によって、ポリヌクレオチドの％同一性を求めることが可能である。特に明記しないかぎり、問い合わせ配列は少なくとも４５ヌクレオチド長であり、ＧＡＰ解析では少なくとも４５ヌクレオチドの領域で２つの配列をアライメントする。好ましくは、問い合わせ配列が少なくとも１５０ヌクレオチド長であり、ＧＡＰ解析では少なくとも１５０ヌクレオチドの領域で２つの配列をアライメントする。一層好ましくは、問い合わせ配列が少なくとも３００ヌクレオチド長であり、ＧＡＰ解析では、それぞれの場合に少なくとも３００ヌクレオチドの領域、あるいは少なくとも４００、少なくとも５００または少なくとも６００ヌクレオチドの領域で２つの配列をアライメントする。また、たとえば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：  ３３８９，  １９９７に開示されているようなプログラムのＢＬＡＳＴファミリを参照してもよい。配列解析の詳細については、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ，  １９９４〜１９９８，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １５のユニット１９．３に見出すことが可能である。
【００７５】
ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、このような配列の配列同一性が少なくとも８０％、特に少なくとも８５％、さらに少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、なおいえば同一であるときに、「本質的に類似している」とされる。ＲＮＡ配列がＤＮＡ配列と本質的に類似している、これに対応する、あるいは特定の度合いでこれとの配列同一性を有するとされる場合、そのＤＮＡ配列のチミン（Ｔ）がＲＮＡ配列のウラシル（Ｕ）と等しいとみなされることは明らかである。
【００７６】
定義されたポリヌクレオチドに関して、上述したものを上回る％同一性の数値が好ましい実施形態を包含することになる旨は自明であろう。よって、適用可能な場合、％同一性の最小値に鑑みて、ポリヌクレオチドが、配列番号１または３〜６などの関連する所定の配列番号に対して少なくとも８０％、一層好ましくは少なくとも８５％、一層好ましくは少なくとも９０％、一層好ましくは少なくとも９１％、一層好ましくは少なくとも９２％、一層好ましくは少なくとも９３％、一層好ましくは少なくとも９４％、一層好ましくは少なくとも９５％、一層好ましくは少なくとも９６％、一層好ましくは少なくとも９７％、一層好ましくは少なくとも９８％、一層好ましくは少なくとも９９％、一層好ましくは少なくとも９９．１％、一層好ましくは少なくとも９９．２％、一層好ましくは少なくとも９９．３％、一層好ましくは少なくとも９９．４％、一層好ましくは少なくとも９９．５％、一層好ましくは少なくとも９９．６％、一層好ましくは少なくとも９９．７％、一層好ましくは少なくとも９９．８％、なお一層好ましくは少なくとも９９．９％同一のポリヌクレオチド配列を含むと好ましい。
【００７７】
好ましくは、ＳＳＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドが、８００ヌクレオチド長を超え、好ましくは９００ヌクレオチド長を超え、なお一層好ましくは１，０００または２０００ヌクレオチド長を超える。
【００７８】
本発明のポリヌクレオチドは、天然に生じる分子と比較した場合に、ヌクレオチド残基の欠失、挿入または置換である１つ以上の変異を有するものであってもよい。変異体は、天然に生じる（すなわち、天然起源から単離された）ものであってもよいし、（たとえば、核酸で部位特異的変異誘発を実施することで）合成されたものであってもよい。
【００７９】
本発明は、２つのポリヌクレオチドの相補性の程度を定義するためのハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを示す。「ストリンジェンシー」とは、本明細書で使用する場合、ハイブリダイゼーションおよび洗浄時における温度およびイオン強度条件ならびに、特定の有機溶媒の有無を示す。ストリンジェンシーが高くなればなるほど、標的ヌクレオチド配列と標識ポリヌクレオチド配列（プローブ）との間の相補性の度合いも高くなる。「ストリンジェントな条件」とは、相補的塩基の頻度が高いヌクレオチド配列だけがハイブリダイズされる温度およびイオン条件を示す。本明細書で使用する場合、「低ストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー、高ストリンジェンシーまたは極めて高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする」という表現は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄用の条件を説明するものである。ハイブリダイゼーション反応を実施するための手引きを、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （ｅｄｓ．），  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ＮＹ，  ６．３．１〜６．３．６．，  １９８９に見出すことができる。この参考文献には水性の方法と非水性の方法が記載されており、どちらを使用しても構わない。本明細書に記載の具体的なハイブリダイゼーション条件は以下のとおりである。１）低ストリンジェンシーでのハイブリダイゼーション条件は、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）で４５℃に続いて、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで５０〜５５℃にて２回洗浄するハイブリダイゼーション用、２）中程度のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣで約４５℃に続いて、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６０℃にて１回以上洗浄するハイブリダイゼーション用、３）高ストリンジェンシーでのハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣで４５℃に続いて、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃にて１回以上洗浄するハイブリダイゼーション用、４）極めて高いストリンジェンシーでのハイブリダイゼーション条件は、０．５Ｍナトリウムリン酸緩衝液、７％ＳＤＳで６５℃に続いて、０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳで６５℃にて１回以上洗浄するハイブリダイゼーション用である。
【００８０】
ポリペプチド
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は通常、同義に用いられる。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書で使用する場合、本明細書で説明するような本発明のポリペプチドの変種、変異体、改変、類似体および／または誘導体も含む。本明細書で使用する場合、「実質的に精製されたポリペプチド」とは、自然な状態では関連している脂質、核酸、他のペプチドおよび他の分子から分離されたポリペプチドを示す。好ましくは、実質的に精製されたポリペプチドは、少なくとも９０％が、自然な状態で関連している他の構成成分を含まない。「組換えポリペプチド」とは、組換え手法を用いて、すなわち、細胞、好ましくは植物細胞および一層好ましくは禾穀類植物細胞で組換体ポリヌクレオチドを発現させて作製されたポリペプチドを意味するものとする。
【００８１】
ＳＳＩＩ活性を有する例示的なポリペプチドを配列表にあげ、表８で説明する。よって、本発明は、限定することなく、配列番号２にあげられ、天然に生じる変種、その修正版、本明細書で説明するような変種（約８０％配列同一性である変種など）のアミノ酸配列を有するＳＳＩＩポリペプチドの改変を提案するものである。
【００８２】
定義されたポリペプチドに関して、上述したものを上回る％同一性の数値が好ましい実施形態を包含することになる旨は自明であろう。よって、適用可能な場合、％同一性の最小値に鑑みて、ポリペプチドが、関連する所定の配列番号２に対して少なくとも７５％、一層好ましくは少なくとも８０％、一層好ましくは少なくとも８５％、一層好ましくは少なくとも９０％、一層好ましくは少なくとも９１％、一層好ましくは少なくとも９２％、一層好ましくは少なくとも９３％、一層好ましくは少なくとも９４％、一層好ましくは少なくとも９５％、一層好ましくは少なくとも９６％、一層好ましくは少なくとも９７％、一層好ましくは少なくとも９８％、一層好ましくは少なくとも９９％、一層好ましくは少なくとも９９．１％、一層好ましくは少なくとも９９．２％、一層好ましくは少なくとも９９．３％、一層好ましくは少なくとも９９．４％、一層好ましくは少なくとも９９．５％、一層好ましくは少なくとも９９．６％、一層好ましくは少なくとも９９．７％、一層好ましくは少なくとも９９．８％、なお一層好ましくは少なくとも９９．９％同一のアミノ酸配列を含むと好ましい。
【００８３】
ギャップ開始ペナルティ＝５、ギャップ伸長ペナルティ＝０．３を用いるＧＡＰ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  １９７０（上掲））解析（ＧＣＧプログラム）によって、別のポリペプチドに対するポリペプチドの％同一性を求めることが可能である。問い合わせ配列は少なくとも１５アミノ酸長であり、ＧＡＰ解析では少なくとも１５アミノ酸の領域で２つの配列をアライメントする。一層好ましくは、問い合わせ配列が少なくとも５０アミノ酸長であり、ＧＡＰ解析では少なくとも５０アミノ酸の領域で２つの配列をアライメントする。一層好ましくは、問い合わせ配列が少なくとも１００アミノ酸長であり、ＧＡＰ解析では少なくとも１００アミノ酸の領域で２つの配列をアライメントする。なお一層好ましくは、問い合わせ配列が少なくとも２５０アミノ酸長であり、ＧＡＰ解析では少なくとも２５０アミノ酸の領域で２つの配列をアライメントする。
【００８４】
本明細書で使用する場合、ポリペプチドの「生物学的活性」フラグメントとは、全長ポリペプチドの規定の活性を維持する、全長より短い本発明のポリペプチドの一部である。特に好ましい実施形態では、生物学的活性フラグメントはデンプンを加水分解して、ＤＰが少なくとも１５のアミロース鎖を生成できるものである。生物学的活性フラグメントは、規定の活性を維持するかぎり、どのようなサイズであっても構わないが、好ましくは少なくとも２００または少なくとも２５０アミノ酸残基長である。
【００８５】
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、本発明の核酸に適当なヌクレオチドの変化を導入することによって、あるいは所望のポリペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成によって調製可能なものである。このような変異体は、たとえば、アミノ酸配列内の残基の欠失、挿入または置換を含む。最終コンストラクトに達するために、最終的なポリペプチド産物が所望の特徴を持つという条件で、１つまたは複数の欠失、挿入、置換を組み合わせることが可能である。
【００８６】
変異体（変化した）ペプチドについては、従来技術において周知の任意の技法を用いて調製可能である。たとえば、本発明のポリヌクレオチドに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異誘発を実施可能である。このようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異誘発の技法としては、好適なベクターにポリヌクレオチドをサブクローニングし、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ＸＬ−１赤色（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などの「ミューテーター」株にベクターをトランスフォームし、トランスフォーム後の細菌を好適な世代数だけ増殖させることを含む。もうひとつの例では、本発明のポリヌクレオチドに、Ｈａｒａｙａｍａ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １６：  ７６〜８２，  １９９８に大まかに説明されたＤＮＡシャッフリングの手法を適用する。これらのＤＮＡシャッフリングの手法は、コムギまたはオオムギ以外の植物種由来のＳＳＩＩ遺伝子など、本発明のものと関連する遺伝子を含むものであってもよいおよび／またはコムギまたはオオムギデンプン合成酵素ＩまたはＩＩＩ遺伝子など、類似したタンパク質をコードする同一植物由来の異なる遺伝子を含むものであってもよい。変異／変化させたＤＮＡに由来する産物は、本明細書に記載の手法を用いてスクリーニングし、たとえばデンプン合成酵素活性を有するか否かを判断することが、容易に実現できるものである。
【００８７】
アミノ酸配列変異体を設計するにあたり、変異部位の場所および変異の性質は、改変対象の特徴に左右されることになる。変異の部位については、（１）達成される結果に応じて、まずは保存されたアミノ酸の選択、次にそれよりも徹底した選択肢で置換し、（２）標的残基を欠失させ、または（３）局在部位に隣接して他の残基を挿入することなどによって、個々にまたは連続的に改変可能である。
【００８８】
アミノ酸配列の欠失は通常、約１〜１５個の残基、一層好ましくは約１〜１０個の残基、一般に約１〜５個の連続した残基の範囲である。
【００８９】
置換変異体は、除去されるポリペプチド分子の少なくとも１個のアミノ酸残基と、その場所に挿入される別の残基とを有する。置換変異誘発で最も関心の的になる部位は、活性部位として同定された部位を含む。該当する他の部位は、さまざまな株または種から得られる特定の残基が同一のものである。これらの位置が生物活性にとって重要なことがある。これらの部位、特に同じように保存された少なくとも３つの他の部位の配列内に入るものが、相対的に保存された形で置換されると好ましい。このような保存された置換を、「典型的な置換」という見出しを付して表１０に示す。
【００９０】
本発明のポリペプチドは、天然ポリペプチドの生成および回収、組換えポリペプチドの生成および回収、ポリペプチドの化学合成をはじめとするさまざまな方法で生成可能なものである。一実施形態では、ポリペプチドを生成するのに有効な条件下でポリペプチドを発現できる細胞を培養し、このポリペプチドを回収することによって、本発明の単離されたポリペプチドを生成する。培養に好ましい細胞に本発明の組換え細胞がある。有効な培養条件としては、ポリペプチドの生成を可能にする有効培地、バイオリアクター、温度、ｐＨ、酸素条件があげられるが、これに限定されるものではない。有効培地とは、本発明のポリペプチドを生成するために細胞が培養される培地を示す。このような培地は一般に、同化可能な炭素、窒素、リン酸源を有する水性媒質ならびに、適切な塩、ミネラル、金属、ビタミンなどの他の栄養塩を含む。本発明の細胞は、従来の発酵バイオリアクター、振盪フラスコ、試験管、マイクロタイター皿、ペトリ皿で培養可能なものである。培養は、組換え細胞にとって適切な温度、ｐＨ、酸素含有量で実施可能である。このような培養条件は、当業者の専門知識の範囲内である。
【００９１】
本発明は、作動的に接続または結合されたエレメントを示す。「作動的に接続された」または「作動的に結合された」などは、機能的な関係でのポリヌクレオチドエレメントの結合を示す。一般に、作動的に接続された核酸配列は連続的に結合され、必要であれば、２つのタンパク質コード領域をリーディングフレームで連続的に接合する。ＲＮＡポリメラーゼが２つのコード配列を単一のＲＮＡに転写する場合、コード配列がもうひとつのコード配列と「作動的に接続される」。これは、仮に翻訳されるのであれば、両方のコード配列に由来するアミノ酸を有する単一のポリペプチドに翻訳される。発現される配列が最終的に処理されて所望のタンパク質が産生されるかぎり、コード配列は互いに連続している必要はない。
【００９２】
本明細書で使用する場合、「ｃｉｓ−作用配列」という用語、「ｃｉｓ−作用エレメント」または「ｃｉｓ−調節領域」または「調節領域」または類似の用語は、適切に配置される、発現可能な遺伝子配列に対して接続されると遺伝子配列の発現を少なくとも部分的に制御できるヌクレオチドの配列を意味するものとしてみなされるべきである。ｃｉｓ−調節領域が、転写または転写後レベルで遺伝子配列の発現レベルおよび／または細胞型特異性および／または発育特異性を活性化、サイレンシング、増強、抑制あるいは、そうでなければ変化させることができるものであってもよいことは、当業者であれば自明であろう。本発明の特定の実施形態では、ｃｉｓ−作用配列は、発現可能な遺伝子配列の発現を増強または刺激するアクチベーター配列である。
【００９３】
転写可能なポリヌクレオチドにプロモーターまたはエンハンサーエレメントを「作動的に接続している」とは、その転写可能なポリヌクレオチド（タンパク質コードポリヌクレオチドまたは他の転写物など）をプロモーターの調節制御下におき、これがそのポリヌクレオチドの転写を制御することを意味する。異種のプロモーター／構造遺伝子の組み合わせを作製するにあたり、通常はプロモーターまたはその変種を、転写可能なポリヌクレオチドの転写開始部位から距離をあけて配置すると好ましい。この距離は、そのプロモーターと、自然な状態でこれが制御するタンパク質コード領域すなわちプロモーターの起源となった遺伝子との距離とほぼ同一である。従来技術において周知のように、この距離には、機能を損なうことなく若干のばらつきが許容可能である。同様に、調節配列エレメント（オペレータ、エンハンサーなど）の制御下で配置される転写可能なポリヌクレオチドに対する当該エレメントの好ましい配置が、それの自然な状態におけるエレメントすなわち、それの起源となった遺伝子を配置することで規定される。
【００９４】
「プロモーター」または「プロモーター配列」とは、本明細書で使用する場合、遺伝子の領域、通常はＲＮＡコード領域の上流（５’）を示し、これが該当する細胞での転写の開始およびレベルを制御する。「プロモーター」は、ＴＡＴＡボックスおよびＣＣＡＡＴボックス配列を含む古典的なゲノム遺伝子の転写調節配列と、発育および／または環境刺激に応答してまたは組織特異的または細胞型特異的な形で遺伝子発現を変化させる別の調節エレメント（すなわち上流の活性化配列、エンハンサー、サイレンサー）とを含む。プロモーターは通常、必ずというわけではないが（たとえばいくつかのＰｏｌＩＩＩプロモーター）、構造遺伝子の上流に配置され、その発現を調節する。さらに、プロモーターを含む調節エレメントは通常、遺伝子の転写開始部位の２ｋｂ以内に配置される。プロモーターは、別の特異的調節エレメントを含むものであってもよく、細胞内での発現をさらに増すおよび／またはこれが作動的に接続されている構造遺伝子の発現のタイミングまたは誘導能を変化させるために、開始部位からさらに遠位に配置される。
【００９５】
「構成的プロモーター」とは、植物の多くの組織またはすべての組織で作動的に結合された転写配列の発現を指揮するプロモーターを示す。本明細書で使用する場合、構成的という表現は、必ずしもすべての細胞型で遺伝子が同一レベルで発現されることを示すものではなく、ある程度のレベルのばらつきが検出可能なことが多いとはいえ、多岐にわたる細胞型で遺伝子が発現されることを示している。「選択的発現」とは、本明細書で使用する場合、ほぼ例外なく植物の特定の器官、たとえば胚乳、胚、葉、果実、塊茎または根での発現を示す。一実施形態では、ルビスコ小サブユニットプロモーターなどの光合成に必要な遺伝子の発現に関与するプロモーターなど、プロモーターがすべての光合成組織（植物の全地上部に相当することもある）で発現される。この用語はまた、ある器官における特定の発育段階（初期または後期胚発生または異なる成熟段階）での発現、あるいは特定の環境条件または処理によって誘導可能な発現を示すこともある。よって、選択的発現は構成的発現と対比できるものであり、後者は植物が経験するほとんどまたはすべての条件下における、植物の多くの組織またはすべての組織での発現を示す。
【００９６】
また、選択的発現は、特定の植物組織、器官または発育段階での遺伝子発現産物の区画化につながる。胚乳、サイトゾル、液胞またはアポプラスト間隙などの特定の細胞内位置における区画化は、必要な細胞区画への輸送用の適当なシグナルを遺伝子産物の構造内に含ませるか、あるいは半自律的な細胞小器官（プラスチドおよびミトコンドリア）の場合は、適当な調節配列とともにトランスジーンを細胞小器官のゲノムに直接組込むことで達成できるものである。
【００９７】
「組織特異的プロモーター」または「器官特異的プロモーター」とは、多くの他の組織または器官（すべてではないにしても好ましくは植物のほとんどの組織または器官）に対して１つの組織または器官で優先的に発現されるプロモーターである。一般に、このプロモーターは、特定の組織または器官で他の組織または器官に比して１０倍高いレベルで発現される。例示的な組織特異的プロモーターのひとつが、高分子量（ＨＭＷ）グルテニン遺伝子Ｂｘ１７に対するプロモーターである。これは、禾穀類植物の発育中の胚乳で優先的に発現される。さらに、胚乳特異的プロモーターは、高分子量グルテニンプロモーター、コムギＳＳＩプロモーター、コムギＢＥＩＩプロモーターを含む。発育中の穀粒でデンプン生合成酵素または貯蔵タンパク質をコードする遺伝子から、他の胚乳特異的プロモーターを容易に得られることもある。
【００９８】
本発明で企図されるプロモーターは、トランスフォームされる宿主植物にとって天然のものであってもよいし、別の起源から誘導されたものであってもよい（この場合、その領域が宿主植物において機能的である）。他の起源としては、ノパリン、オクタピン、マンノピンの生合成用の遺伝子のプロモーターまたは他のオピンプロモーターなどのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）Ｔ−ＤＮＡ遺伝子；ユビキチンプロモーター、たとえばトウモロコシｕｂｉ−１遺伝子由来のＵｂｉプロモーター、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）（米国特許第４，９６２，０２８号明細書などを参照のこと）またはアクチンプロモーターなどの植物由来のプロモーター；組織特異的プロモーター（Ｃｏｎｋｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許第５，４５９，２５２号明細書；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに対する国際公開第９１／１３９９２号パンフレットなどを参照のこと）；ウイルス由来のプロモーター（宿主特異的ウイルスを含む）または部分的合成プロモーターまたは完全合成プロモーターがあげられる。単子葉植物および双子葉植物で機能する多数のプロモーターが従来技術において周知（たとえば、Ｇｒｅｖｅ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．，  １：  ４９９〜５１１，  １９８３；  Ｓａｌｏｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ３：  １４１〜１４６，  １９８４；  Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  ２７：  １４３〜１５３，  １９８３；  Ｂａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２：  ２３５〜３５０，  １９８３を参照のこと；植物およびウイルスから単離されたさまざまなプロモーター、たとえばカリフラワーモザイクウイルスプロモーター（ＣａＭＶ  ３５Ｓ、１９Ｓ）を含む）。多くの組織特異的プロモーター領域が周知である。特定の組織で、あるいは特定の生育条件下での転写を優先的に提供する他の転写開始領域として、ナピン、種子ＡＣＰ、ゼインまたは他の種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子由来のものがあげられる。果実特異的プロモーターも周知であり、そのようなプロモーターの１つがＥ８プロモーターであって、Ｄｅｉｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ２：  ３３１５−３３２０，  １９９８  ａｎｄ  ＤｅｌｌａＰｅｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  １：  ５３〜６３，  １９８９に記載されている。プロモーター活性を評価するための非限定的な方法が、Ｍｅｄｂｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  ４：  １８５〜１９２，  １９９２；  Ｍｅｄｂｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ３：  ６１９〜６２６，  １９９３，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （２ｎｄ  ｅｄ．）．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ，  ＮＹ，  １９８９，  ａｎｄ  ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第５，１６４，３１６号明細書）に開示されている。
【００９９】
上記に代えてあるいは上記に加えて、プロモーターは、誘導型プロモーターあるいは、導入されたポリヌクレオチドの発現を植物の適当な発育段階で駆動できる、発育的に調節されるプロモーターであってもよい。利用できる他のｃｉｓ−作用配列として、転写および／または翻訳エンハンサーがあげられる。エンハンサー領域は当業者間で周知であり、ＡＴＧ翻訳開始コドンおよび隣接配列を含み得る。配列全体を確実に翻訳するために、開始コドンが、外来または外因性ポリヌクレオチドに関連するコード配列のリーディングフレームと一致している必要がある。翻訳制御シグナルおよび開始コドンには、さまざまな由来（天然および合成の両方）のものが可能である。翻訳開始領域は、転写開始領域の起源から得られるものであってもよいし、外来または外因性ポリヌクレオチドから得られるものであってもよい。また、この配列は、転写を駆動するのに選択されるプロモーターの起源からも誘導可能であり、ｍＲＮＡの翻訳を向上させるべく特別に改変可能である。
【０１００】
本発明の核酸コンストラクトは一般に、転写終止配列を含むことがある約５０〜１０００ヌクレオチド塩基対の３’非翻訳配列を含む。３’非翻訳配列は、転写終止シグナル（ポリアデニル化シグナルを含むものであっても含まないものであってもよい）ならびに、ｍＲＮＡプロセシングを達成できる他の任意の調節シグナルを含むものであってもよい。ポリアデニル化シグナルは、ポリアデニル酸鎖をｍＲＮＡ前駆体の３’末端に付加するのが特徴である。ポリアデニル化シグナルは通常、標準的な形態である５’ＡＡＴＡＡＡ−３’に対する相同性の存在によって認識されるが、バリエーションも普通である。ポリアデニル化シグナルを含まない転写終止配列として、連続した４つ以上のチミジンを含むＰｏｌＩまたはＰｏｌＩＩＩ  ＲＮＡポリメラーゼに対するターミネーターがあげられる。好適な３’非翻訳配列の例に、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）（Ｂｅｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，  １１：  ３６９，  １９８３）のノパリン合成酵素（ｎｏｓ）遺伝子由来のポリアデニル化シグナルを含む３’転写非翻訳領域ならびに、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のオクトピン合成酵素遺伝子由来のＴ７転写物に対するターミネーターがある。あるいは、好適な３’非翻訳配列は、ジャガイモまたはトマトのプロテアーゼ阻害因子ＩまたはＩＩ遺伝子の３’末端、ダイズの貯蔵タンパク質遺伝子、リブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ）遺伝子の小サブユニットなどの植物遺伝子由来のものであればよいが、当業者間で周知の他の３’エレメントも利用できる。あるいは、３’非翻訳調節配列を、たとえばＡｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １５３：  ２９２，  １９８７（本明細書に援用する））に記載されているように、ｄｅ  ｎｏｖｏで入手することも可能である。
【０１０１】
転写開始部位とコード配列の開始部分との間に挿入されたＤＮＡ配列すなわち、非翻訳５’リーダー配列（５’ＵＴＲ）は、遺伝子の発現に影響し得るため、特定のリーダー配列を利用することも可能である。好適なリーダー配列としては、外来または内在性のＤＮＡ配列の最適な発現を指示するために選択された配列を含むものがあげられる。たとえば、このようなリーダー配列は、Ｊｏｓｈｉ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １５：  ６６４３，  １９８７に記載されているように、ｍＲＮＡの安定性を向上させるか維持し、不適切な翻訳の開始を妨害することができる好ましいコンセンサス配列を含む。
【０１０２】
さらに、標的化配列を用いて、外来または外因性ポリヌクレオチドによってコードされる酵素を、葉緑体などの植物細胞内の細胞内区画または細胞外環境に標的化してもよい。たとえば、翻訳されたときに、輸送ペプチドまたはシグナルペプチドが酵素を細胞内または細胞外の特定の目的地に輸送できるよう、そして任意に翻訳後に除去可能なように、輸送ペプチド配列またはシグナルペプチド配列をコードする核酸配列を、本発明の選択酵素をコードする配列に作動的に結合してもよい。輸送ペプチドまたはシグナルペプチドは、小胞体、液胞、ベシクル、プラスチド、ミトコンドリア、原形質膜の膜などの細胞内の膜を介したタンパク質の輸送を促進することによって作用する。たとえば、標的化配列は、所望のタンパク質を、サイトゾルではなく液胞またはプラスチド（葉緑体など）といった特定の細胞小器官へ誘導することができる。よって、本発明の核酸コンストラクトは、プロモーター領域と外来または外因性ポリヌクレオチドとの間に作動的に結合されたプラスチド輸送ペプチドコード核酸配列をさらに含むことができる。
【０１０３】
ベクター
本発明には、遺伝子コンストラクトの操作または導入にベクターを用いることを含む。「ベクター」とは、核酸配列を挿入またはクローニングする対象となり得る、プラスミド、バクテリオファージまたは植物ウイルスなどに由来する核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子を意味するものとする。ベクターは、好ましくは１つ以上の固有の制限部位を含み、標的細胞または組織または前駆細胞またはその組織を含む規定の宿主細胞で自己複製できるか、クローニングされた配列を複製できるよう規定の宿主のゲノムに組込むことができるものである。このため、ベクターは自己複製ベクターすなわち、染色体外物質として存在するベクターであり、その複製は、直鎖プラスミドまたは閉鎖環状プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体または人工染色体などの染色体の複製とは無関係である。ベクターには、自己複製を保証するための任意の手段を含むことができる。あるいは、ベクターは、細胞に導入されるとレシピエント細胞のゲノムに組込まれ、このベクターが組込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。ベクター系が、単一のベクターまたはプラスミド、２つ以上のベクターまたはプラスミド（宿主細胞のゲノムへの導入対象となる全ＤＮＡを一緒に含有する）またはトランスポゾンを含むものであってもよい。どのベクターを選択するかは、一般にベクターを導入する対象となる細胞とベクターとの適合性に左右されることになる。また、ベクターが、好適な形質転換体の選択に使用可能な抗生物質耐性遺伝子、除草剤耐性遺伝子または他の遺伝子などの選択マーカーを含むものであってもよい。このような遺伝子の例は当業者間で周知である。
【０１０４】
本発明の核酸コンストラクトは、プラスミドなどのベクターに導入可能である。プラスミドベクターは一般に、原核生物細胞および真核生物細胞での発現カセットの容易な選択、増幅、トランスフォーメーションを提供する別の核酸配列を含み、たとえばｐＵＣ系ベクター、ｐＳＫ系ベクター、ｐＧＥＭ系ベクター、ｐＳＰ系ベクターまたはｐＢＳ系ベクターである。別の核酸配列には、ベクターの自己複製を提供する複製起点、選択可能なマーカー遺伝子（好ましくは抗生物質耐性または除草剤耐性をコードする）、核酸コンストラクトにコードされる核酸配列または遺伝子を挿入するための複数の部位を提供する独特なマルチクローニング部位、原核生物細胞および真核生物細胞（特に植物細胞）のトランスフォーメーションを強化する配列が含まれる。
【０１０５】
「マーカー遺伝子」とは、マーカー遺伝子を発現する細胞に特徴的な表現型を与えることで、マーカーをもたない細胞とトランスフォームした細胞とを区別できるようにする遺伝子を意味するものとする。選択可能なマーカー遺伝子は、選択因子（除草剤、抗生物質、放射線、熱またはトランスフォームしていない細胞に損傷を与える他の処置など）に対する耐性に基づいて「選択」可能な特質を付与するものである。スクリーニング可能なマーカー遺伝子（またはレポータ遺伝子）は、観察または試験で、すなわち「スクリーニング」によって同定可能な特質（トランスフォームしていない細胞には存在しないβ−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ＧＦＰまたは他の酵素活性など）を付与する。該当するマーカー遺伝子とヌクレオチド配列を結合させる必要はない。
【０１０６】
形質転換体の同定を容易にするために、核酸コンストラクトが、選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を、外来または外因性ポリヌクレオチドとして、あるいはこれに加えて含むと望ましい。選択された植物細胞との組み合わせで機能的であれば（すなわち選択的であれば）、実際にどのマーカーを選択するかは重要ではない。マーカー遺伝子と該当する外来または外因性ポリヌクレオチドを結合させる必要はない。これは、たとえば米国特許第４，３９９，２１６号明細書に記載されているように、植物のトランスフォーメーションでは非結合遺伝子による同時トランスフォーメーションも有効な方法のひとつだからである。
【０１０７】
細菌の選択可能なマーカーの例として、アンピシリン耐性、カナマイシン耐性、エリスロマイシン耐性、クロラムフェニコール耐性またはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与するマーカーがある。植物の形質転換体の選択用の選択可能なマーカーとしては、ハイグロマイシンＢ耐性をコードするｈｙｇ遺伝子；たとえばＰｏｔｒｙｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  １９９：  １８３，  １９８５に記載されているような、カナマイシン、パロモマイシン、Ｇ４１８などに対する耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔ）遺伝子；たとえば欧州特許出願公開第Ａ２５６２２３号明細書に記載されているような、グルタチオン由来の除草剤に対する耐性を付与するラット肝臓由来のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子；たとえば国際公開第８７／０５３２７号パンフレットに記載されているような、過発現時にグルタミン合成酵素インヒビター（たとえばホスフィノトリシン）に対する耐性を付与するグルタミン合成酵素遺伝子、たとえば欧州特許出願公開第Ａ２７５９５７号明細書に記載されているような、選択因子ホスフィノトリシンに対する耐性を付与するストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）由来のアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、たとえばＨｉｎｃｈｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ６：  ９１５，  １９８８に記載されているような、Ｎ−ホスホノメチルグリシンに対する寛容性を付与する５−エノルシキメート−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）をコードする遺伝子、たとえば国際公開第９１／０２０７１号パンフレットに記載されているような、ビアラホスに対する耐性を付与するｂａｒ遺伝子；クレブシエラ・オザエナエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｚａｅｎａｅ）由来のｂｘｎ（Ｓｔａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４２：  ４１９，  １９８８）など、ブロモキシニルに対する耐性を付与するニトリラーゼ遺伝子；メトトレキセートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（Ｔｈｉｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６３：  １２５００，  １９８８）；イミダゾリノン、スルフォニルウレアまたは他のＡＬＳ−阻害化学物質に対する耐性を付与する変異体アセトールアセテート合成酵素遺伝子（ＡＬＳ）（欧州特許出願公開第Ａ−１５４  ２０４号明細書））；５−メチルトリプトファンに対する耐性を付与する変異アントラニレート合成酵素遺伝子；または除草剤に対する耐性を付与するダラポンデハロゲナーゼ遺伝子があげられるが、これに限定されるものではない。
【０１０８】
スクリーニング可能な好ましいマーカーとしては、さまざまな発色基質が知られているβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）酵素をコードするｕｉｄＡ遺伝子、発色基質が知られている酵素をコードするβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、カルシウム感受性バイオルミネセンス検出に利用できるエクオリン遺伝子（Ｐｒａｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  １２６：  １２５９〜６８，  １９８５）；緑色蛍光タンパク質遺伝子（Ｎｉｅｄｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，  １４：  ４０３，  １９９５）；バイオルミネセンス検出を可能にするルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子（Ｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３４：  ８５６，  １９８６）、従来技術において周知の他のものがあげられるが、これに限定されるものではない。「レポーター分子」とは、本明細書で使用する場合、タンパク質産物を参照することでプロモーター活性の測定を容易にする、分析的に同定可能なシグナルを（その化学的性質により）提供する分子を意味するものとする。
【０１０９】
遺伝子発現の改変方法
植物細胞でタンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現レベルを高めるか、この植物でタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを下げることで、タンパク質、たとえば、オオムギ植物の発育中の胚乳でのデンプン合成に関与する酵素のレベルを調節して、穀粒でのフルクタンの蓄積を変化させることができる。遺伝子の発現のレベルについては、たとえばコード配列ならびに、これと作動的に接続され、細胞内で機能する転写制御エレメントを含む合成遺伝子コンストラクトを導入するなどして、細胞１個あたりのコピー数を変化させて調節すればよい。複数の形質転換体を選択し、トランスジーン組込み部位付近における内在性配列の影響に起因するトランスジーン発現の望ましいレベルおよび／または特異性を持つものをスクリーニングしてもよい。トランスジーン発現の望ましいレベルおよびパターンは、フルクタンレベルが実質的に上昇するようなものである。これについては、形質転換体からの穀粒を試験するだけで検出できる。あるいは、変異誘発穀粒の個体群または育種プログラムからの植物の個体群を、フルクタンの蓄積が変化した個々の系統についてスクリーニングしてもよい。
【０１１０】
遺伝子発現の低下は、植物細胞に導入される「遺伝子サイレンシングキメラ遺伝子」の導入と転写によって達成することもできる。遺伝子サイレンシングキメラ遺伝子は、植物細胞のゲノム、好ましくは核ゲノムに安定的に導入するか、たとえばウイルスベクターで一過的に導入すればよい。本明細書で使用する場合、「遺伝子サイレンシング作用」とは、植物細胞での標的核酸の発現の低下を示し、これはサイレンシングＲＮＡを導入することで達成可能である。このような低下は、転写の低下（クロマチンリモデリングのメチル化によるものを含む）またはＲＮＡ分子の転写後修飾の低下（ＲＮＡ分解によるものを含む）またはその両方の結果であり得る。遺伝子サイレンシングは、標的核酸または遺伝子の発現の停止と、程度または期間の点での部分的な作用を含む。サイレンシングＲＮＡの存在下における標的核酸の発現レベルは、その非存在下での発現レベルよりも低ければ十分である。発現レベルは、少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％または少なくとも約９９％低下し得る。標的核酸は、デンプンの合成または代謝、たとえばデンプンの分解に関与する遺伝子であり得るが、トランスジーンの導入時に植物細胞には存在しないこともある他の内在性遺伝子、トランスジーンまたは外因性遺伝子（ウイルス遺伝子など）も含まれる。
【０１１１】
アンチセンスＲＮＡ分子
アンチセンス手法を使用して、本発明による遺伝子発現を低下させてもよい。「アンチセンスＲＮＡ」という用語は、特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部と相補的であり、このｍＲＮＡをコードする遺伝子の発現を低下させることができるＲＮＡ分子を意味するとみなされるべきである。このような低下は一般に、配列依存的に発生し、核から細胞質へのｍＲＮＡの輸送などの転写後イベントへの干渉、ｍＲＮＡの安定性または翻訳の阻害によって生じると考えられる。アンチセンス方法を用いることは、従来技術において周知である（たとえば、Ｈａｒｔｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｅｎｄｒｅｓ，  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，  Ｋｌｕｗｅｒ，  １９９９を参照のこと）。植物でアンチセンス手法を用いることについて、Ｂｏｕｒｑｕｅ，  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．  １０５：  １２５〜１４９，  １９９５  ａｎｄ  Ｓｅｎｉｏｒ，  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｅｎｇｉｎ．  Ｒｅｖｓ．  １５：  ７９〜１１９，  １９９８に概説されている。Ｂｏｕｒｑｕｅ，  １９９５（上掲）には、遺伝子不活性化の方法として、植物系でアンチセンス配列がどのようにして利用されてきたかについて、多数の例があげられている。著者は、部分的な阻害でも系に測定可能な変化が生じる可能性が高いため、どのような酵素活性でも１００％阻害の達成は必要ないであろうとも述べている。また、Ｓｅｎｉｏｒ，  １９９８（上掲）は、現時点ではアンチセンス方法が遺伝子発現を操作するための極めて十分に確立された技法であるとしている。
【０１１２】
本明細書で使用する場合、「生理学的条件下でハイブリダイズされるアンチセンスポリヌクレオチド」という表現は、ポリヌクレオチド（完全にまたは部分的に一本鎖である）が、少なくとも、細胞内の通常の条件下で、阻害対象となる遺伝子のＲＮＡ産物すなわち一般に本明細書で提供するものなどのタンパク質をコードするｍＲＮＡとの間で二本鎖ポリヌクレオチドを形成できることを意味する。アンチセンス分子は、構造遺伝子に対応する配列あるいは、遺伝子発現またはスプライシングイベントを制御する配列用の配列を含むものであってもよい。たとえば、アンチセンス配列は、標的遺伝子のコード領域または５’−非翻訳領域（ＵＴＲ）もしくは３’−ＵＴＲまたはこれらの組み合わせと対応するものであってもよい。これは、イントロン配列（転写時または転写後に切り出されてもよい）に対して部分的に相補であってもよいが、好ましくは標的遺伝子のエキソン配列に対してのみ相補である。一般にＵＴＲの相違が広いことを考慮すれば、これらの領域を標的とすることで、遺伝子阻害の特異性が一層高くなる。
【０１１３】
アンチセンス配列の長さは、連続する少なくとも１９ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２５または３０または５０ヌクレオチド、一層好ましくは少なくとも１００、２００、５００または１０００ヌクレオチドから、最大で阻害対象となる遺伝子の全長とする。遺伝子転写物全体と相補的な全長配列を使用してもよい。この長さは、最も好ましくは１００〜２０００ヌクレオチドである。標的転写物に対するアンチセンス配列の同一性の度合いは、少なくとも９０％、一層好ましくは９５〜１００％とする。アンチセンスＲＮＡ分子は、もちろん、分子を安定させるよう機能し得る無関係な配列を含むものであってもよい。
【０１１４】
アンチセンスＲＮＡを発現させるための遺伝子コンストラクトは、プロモーター配列を「アンチセンス」の向きで標的遺伝子の一領域と結合させることによって、容易に作製できるものである。本明細書で使用する場合、アンチセンスの向きとは、植物細胞の標的遺伝子内の配列の転写および翻訳（翻訳が生じる場合）の向きに対して逆の向きを示す。このため、細胞、組織、器官、植物、穀粒など（核酸分子を含む）を含む、本発明のアンチセンスＲＮＡをコードするキメラＤＮＡなどの核酸分子も本発明によって提供される。
【０１１５】
リボザイム
「リボザイム」という用語は、本明細書で使用する場合、それぞれ別個の基質ＲＮＡを特異的に認識し、その切断を触媒するＲＮＡ分子を示す。リボザイムは一般に、標的ＲＮＡの一領域に対して相補的なヌクレオチドの領域（この領域は、たとえばリボザイムが作用する細胞内の生理学的条件下でリボザイムが標的ＲＮＡと特異的にハイブリダイズできるようにする）と、本明細書で「触媒ドメイン」と呼ぶ酵素領域とを含む。本発明で特に有用なタイプのリボザイムはハンマーヘッドリボザイム（Ｈａｓｅｌｏｆｆ  ａｎｄ  Ｇｅｒｌａｃｈ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：  ５８５−５９１，  １９８８；  Ｐｅｒｒｉｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  １１３：  １５７〜１６３，  １９９２）およびヘアピンリボザイム（Ｓｈｉｐｐｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １２：  １１７〜１２９，  １９９９）である。リボザイムをコードするＤＮＡは、従来技術において周知の方法で合成可能であり、これを該当する細胞での発現用に遺伝子コンストラクトまたは発現ベクターに組込んでもよい。よって、細胞、組織、器官、植物、穀粒など（核酸分子を含む）を含む、本発明のリボザイムをコードするキメラＤＮＡなどの核酸分子も本発明で提供される。一般に、リボザイムをコードするＤＮＡは、細胞内で機能するプロモーターおよび転写終止シグナルの制御下で、発現カセットに挿入される。トリヌクレオチド配列ＧＵＡ、ＧＵＵ、ＧＵＣを含むリボザイム切断部位について標的分子をスキャンニングして、任意の潜在的なＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位を同定してもよい。同定後は、切断部位の標的遺伝子５’および３’の領域に対応する約５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチドをあまり適さないものにする二次構造などの想定される構造的な特徴について評価してもよい。使用する場合、リボザイムは、ハンマーヘッドリボザイム、ヘアピンリボザイム、アクスヘッド（ａｘｅｈｅａｄ）リボザイム、イモリのサテライトリボザイム、テトラヒメナリボザイム、ＲＮＡｅ  Ｐリボザイムからなる群から選択されるものであればよく、標的遺伝子の配列に基づいて従来技術において周知の方法で設計される（たとえば、米国特許第５，７４１，６７９号明細書を参照のこと）。リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションしやすさを試験することで、候補標的の適切さも評価できる。
【０１１６】
本明細書に記載したアンチセンスポリヌクレオチドでの場合のように、本発明のリボザイムも、「生理学的条件」すなわち、細胞内の条件、特にコムギ細胞またはオオムギ細胞などの植物細胞内の条件下で、標的核酸分子（配列番号２として提供されるポリペプチドをコードするｍＲＮＡ）とハイブリダイズできなければならない。
【０１１７】
ＲＮＡ干渉／二重鎖ＲＮＡ
本明細書で使用する場合、「人工的に導入されたｄｓＲＮＡ分子」とは、ｄｓＲＮＡ分子の導入（このようなｄｓＲＮＡ分子をコードするキメラ遺伝子からの転写によって内在的に生じることがある）を示すが、真核生物細胞または植物細胞内での一本鎖ＲＮＡ分子からｄｓＲＮＡへの変換を示すことはない。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、遺伝子の発現を特異的に低下させる、あるいは特定のタンパク質の生成を阻害する上で特に有用である。理論に拘束されることを望むわけではないが、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９５：  １３９５９〜１３９６４，  １９９８に、ｄｓＲＮＡを用いてタンパク質の産生を低減できる機序のモデルが提唱されている。この技術は、該当する遺伝子またはその一部のｍＲＮＡと本質的に同一である配列を含むｄｓＲＮＡ分子の存在に立脚している。好都合なことに、ｄｓＲＮＡは、組換えベクターまたは宿主細胞で単一のプロモーターから生成可能であり、この場合、センス配列およびアンチセンス配列が転写されてヘアピンＲＮＡが生成されて、センス配列およびアンチセンス配列がハイブリダイズされてループ構造を形成する介在配列またはスペーサー領域を有するｄｓＲＮＡを形成するため、ヘアピンＲＮＡはステム−ループ構造を有する。本発明に適したｄｓＲＮＡ分子の設計および生成は、特にＷａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８（上掲）、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４０７：  ３１９〜３２０，  ２０００、国際公開第９９／５３０５０号パンフレット、国際公開第９９／４９０２９号パンフレット、国際公開第０１／３４８１５号パンフレットを考慮しつつ、当業者の技量の範囲内である。このため、細胞、組織、器官、植物、穀粒など（核酸分子を含む）を含む、本発明のヘアピンＲＮＡなどの二重鎖ＲＮＡをコードするキメラＤＮＡなどの核酸分子も、本発明によって提供される。
【０１１８】
一例において、不活化対象となる標的遺伝子に対して相同性を有する、少なくとも部分的に二本鎖である産物の合成を指令するＤＮＡを導入する。このため、ＤＮＡは、ＲＮＡに転写されるとハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ領域を形成可能なセンス配列とアンチセンス配列の両方を含む。好ましい実施形態では、センス配列とアンチセンス配列はスペーサー領域で分離され、スペーサー領域は、ＲＮＡに転写されると切り出されるイントロンを含む。この構成ではジーンサイレンシングの効率が高くなることが示されている（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００（上掲））。二本鎖領域は、いずれか一方または両方のＤＮＡ領域から転写される、１つまたは２つのＲＮＡ分子を含むものであってもよい。ｄｓＲＮＡは、長いセンス領域およびアンチセンス領域を有し、大半が相補的であり得るが、必ずしも完全に相補的でなくてもよい（一般に約１００ｂｐより大きく、好ましくは２００〜１０００ｂｐの範囲である塩基対合領域を形成する）長ｈｐＲＮＡとして分類されることがある。また、ｈｐＲＮＡは、サイズが約３０〜約５０ｂｐあるいは３０〜約１００ｂｐの範囲の二本鎖部分を有する、さらに小さなものであってもよい（本明細書に援用する国際公開第０４／０７３３９０号パンフレットを参照のこと）。二本鎖ＲＮＡ領域の存在は、二本鎖ＲＮＡを処理して２１〜２４ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドにし、これらのオリゴヌクレオチドを標的植物遺伝子からの相同的ＲＮＡ転写物の配列特異的切断に使用することで、標的遺伝子の活性を効率的に低減または排除する内在性の植物系からの応答の引き金となると考えられる。
【０１１９】
ハイブリダイズするセンス配列とアンチセンス配列の長さは各々、連続する少なくとも１９ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２７または３０または５０ヌクレオチド、一層好ましくは少なくとも１００、２００または５００ヌクレオチドから、最大で遺伝子転写物全体に対応する全長配列とする。この長さは、最も好ましくは１００〜２０００ヌクレオチドである。標的転写物に対するセンス配列およびアンチセンス配列の同一性の度合いは、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、一層好ましくは９５〜１００％とする。配列が長くなればなるほど、全体的な配列同一性のための要件が厳密でなくなる。ＲＮＡ分子は、もちろん、分子を安定させるよう機能し得る無関係な配列を含むものであってもよい。ＲＮＡ分子は、異なる標的ＲＮＡを標的して、２つ以上の標的遺伝子の発現を低減できるようにする異なる配列間のハイブリッドであってもよいし、多重遺伝子ファミリなどの関連した標的遺伝子のファミリに対応する１つの配列であってもよい。ｄｓＲＮＡで使用する配列は、好ましくは、標的遺伝子のエキソン配列に対応し、５’および／または３’未翻訳配列またはタンパク質コード配列またはこれらの任意の組み合わせと対応するものであってもよい。
【０１２０】
ｄｓＲＮＡ形成コンストラクトを発現させるのに用いられるプロモーターは、破壊のために標的される細胞系列で得られるｄｓＲＮＡが遺伝子産物に特異的であれば、どのようなタイプのプロモーターであってもよい。あるいは、プロモーターが、特定の発育系譜の細胞だけで発現されるという点で系譜特異的であってもよい。これは、標的ではない細胞系譜で発現される遺伝子との間である程度の相同性のオーバーラップが観察される場合に有利な場合がある。また、プロモーターは、外部から制御される因子によって、あるいは細胞内環境因子によって誘導可能であってもよい。一般に、ＲＮＡ分子はＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの制御下で発現される。後者の例にはｔＲＮＡまたはｓｎＲＮＡプロモーターが含まれる。
【０１２１】
他のサイレンシングＲＮＡは、国際公開第０１／１２８２４号パンフレットまたは米国特許第６，４２３，８８５号明細書（両文書を本明細書に援用する）に記載されているように、標的遺伝子のＲＮＡ転写物のヌクレオチド配列の相補体との配列同一性が少なくとも９５％の連続した少なくとも２０ヌクレオチドを含む、「非ポリアデニル化ＲＮＡ」であってもよい。さらに別のタイプのサイレンシングＲＮＡに、標的核酸配列またはその相補体との配列同一性が少なくとも９５％の連続した少なくとも２０ヌクレオチドを含み、国際公開第０３／０７６６１９号パンフレットに記載されているような大部分が二本鎖である領域を含む、国際公開第０３／０７６６１９号パンフレット（本明細書に援用する）記載されているようなＲＮＡ分子がある。
【０１２２】
マイクロＲＮＡ調節は、従来のＲＮＡｉ／ＰＴＧＳから派生した、遺伝子調節のために進化したＲＮＡサイレンシング経路の特化した派生技術である。マイクロＲＮＡは、特徴的な部分的逆方向反復の状態で編成された遺伝子様エレメントでコードされる、特定クラスの小ＲＮＡである。転写されると、マイクロＲＮＡ遺伝子は部分的に塩基対合されたステム−ループの前駆体ＲＮＡを生じさせ、そこからマイクロＲＮＡがプロセッシングされる。マイクロＲＮＡは一般に、約２１ヌクレオチド長である。遊離されたｍｉＲＮＡは、配列特異的に遺伝子を抑制するアルゴノートタンパク質の特定のサブセットを含むＲＩＳＣ様複合体に取り込まれる（たとえば、本明細書に援用するＭｉｌｌａｒ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ，  Ｆｕｎｃｔ  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  ５：  １２９〜１３５，  ２００５；  Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖｅｌｏｐ  １５：  ２００〜２０５，  ２００５；  Ａｌｍｅｉｄａ  ａｎｄ  Ａｌｌｓｈｉｒｅ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １５：  ２５１〜２５８，  ２００５を参照のこと）。
【０１２３】
コサプレッション
遺伝子発現を特異的に低減するのに使用できる別の分子生物学的手法に、コサプレッションがある。コサプレッションの機序は十分に理解されてはいないが、転写後型ジーンサイレンシング（ＰＴＧＳ）を必要とすると考えられ、その点に関して、アンチセンス抑制の多くの例と非常によく似ている場合がある。コサプレッションでは、発現用のプロモーターに対して「センスの向き」で、ある遺伝子またはそのフラグメントの余分なコピーを植物に導入する必要がある。本明細書で使用する場合、センスの向きとは、標的遺伝子の配列に対して当該配列の転写および翻訳（翻訳が生じる場合）と同一の向きであることを示す。センスフラグメントのサイズ、標的遺伝子領域に対するその対応関係、標的遺伝子に対するその相同性の度合いについては、上述したアンチセンス配列の場合と同様である。いくつかの事例では、遺伝子配列の追加のコピーが標的植物遺伝子の発現に干渉する。コサプレッションの手法を実施する方法については、ＷＯ９７／２０９３６号パンフレットの特許明細書ならびに欧州特許明細書第０４６５５７２号を参照する。アンチセンス、コサプレッションまたは二本鎖ＲＮＡ分子もまた、ＷＯ０３／０７６６１９号パンフレットに記載されているように、大部分が二本鎖のＲＮＡ領域（好ましくは核局在シグナルを含む）を含むものであってもよい。
【０１２４】
遺伝子発現を低減する上記の技術のいずれを使用しても、複数の遺伝子の活性を協調的に低下させることが可能である。たとえば、共通する複数の遺伝子の一領域を標的することで、あるＲＮＡ分子を関連する遺伝子のファミリに標的することが可能である。あるいは、多数の領域を１つのＲＮＡ分子に導入する（各領域が異なる遺伝子を標的する）ことで、無関係の複数遺伝子を標的することが可能である。これは、単一のプロモーターの制御下で複数の領域を融合させることによって、容易に達成可能なものである。
【０１２５】
植物細胞への核酸の導入／トランスフォーメーションのための方法
核酸分子を植物宿主細胞内に導入するのに多数の手法を利用でき、これらの手法は当業者間で周知である。「トランスフォーメーション」という用語は、外来または外因性核酸を導入することによる、細菌または植物などの生物の遺伝型が変化することを意味する。「形質転換体」とは、そのようにして変化させた生物を意味するものとする。本明細書で使用する場合、「トランスジェニック」という用語は、遺伝的に改変された植物を示し、前記植物では、導入された外来または外因性遺伝子または配列の組込みまたは複製可能な非組込み形態での安定的な維持によって、内在性ゲノムが補充または改変される。「トランスジーン」とは、植物のゲノムに導入される外来または外因性遺伝子または配列を意味するものとする。核酸分子は植物のゲノムに安定的に組込まれても、染色体外物質として複製されてもよい。「ゲノム」とは、細胞、植物または植物部位の継承される遺伝的相補体全体を意味するものとし、染色体ＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、染色体外ＤＮＡ分子を含む。植物材料に関して本明細書で使用する場合、「再生」という表現は、植物細胞、植物細胞群、植物部位から（たとえば胚、胚盤、プロトプラスト、カルスまたは他の組織から）分化した植物全体を成長させることを意味するが、種子からの植物の成長は含まない。
【０１２６】
どのトランスフォーメーション技術を選択するかについては、特定の植物種をトランスフォームする効率ならびに、選択される特定の方法論に関する本発明を実施する者の経験および好みで決められることになる。核酸コンストラクトを植物細胞に導入するためのトランスフォーメーション系の特定の選択肢については、許容可能なレベルで核酸を移動できるかぎり本発明にとって本質的ではなく、本発明に対する限定でもないことが、当業者であれば自明であろう。植物を改善するためのトランスフォーメーション系の実用的な実施の手引きが、Ｂｉｒｃｈ，  Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ４８：  ２９７〜３２６，  １９９７によって提供されている。
【０１２７】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の腫瘍誘発（Ｔｉ）プラスミドのＴ−ＤＮＡを使用して、外来または外因性ポリヌクレオチドを導入し、発現させてもよい（たとえば、Ｕｍｂｅｃｋ、米国特許第５，００４，８６３号明細書および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／０２４８０号パンフレットを参照のこと）。本発明のコンストラクトは、Ｔｉプラスミドを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を利用して植物細胞に導入できるものである。トランスフォーメーションビヒクルとしてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）培養を用いるとき、トランスフォーム後の組織での正常な非発癌性の分化が可能なように、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の非発癌性株をベクターキャリアとして使用するのがもっとも有利である。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（アグロバクテリウム）がバイナリーＴｉプラスミド系を有すると好ましい。このようなバイナリー系は、（１）トランスファーＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）を植物に導入するのに必須の病原性領域を有する第１のＴｉプラスミド、（２）キメラプラスミドを含む。キメラプラスミドは、移動対象となる核酸をフランキングする、野生型ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域の少なくとも一方の境界領域を含む。バイナリーＴｉプラスミド系は、たとえばＤｅ  Ｆｒａｍｏｎｄ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １：  ２６２，  １９８３およびＨｏｅｋｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３０３：  １７９，  １９８３に記載されているように、植物細胞のトランスフォームに有効であることが示されている。このようなバイナリー系は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）でＴｉプラスミドへの組込みを必要としないため、特に好ましい。
【０１２８】
アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の使用を必要とする方法としては、（ａ）培養した単離プロトプラストとアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）との共培養；（ｂ）植物細胞または組織のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）によるトランスフォーメーション；（ｃ）種子、尖部または分裂組織のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）によるトランスフォーメーション、または（ｄ）Ｂｅｃｈｔｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃ．Ｒ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｐａｒｉｓ，  ３１６：  １１９４，  １９９３に記載されているようなフローラルディップ法などのｉｎ  ｐｌａｎｔａでの接種またはコムギでの接種（本明細書に援用する国際公開第００／６３３９８号パンフレットに記載されているようなもの）があげられるが、これに限定されるものではない。この手法は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細胞懸濁液の浸潤を利用したものである。あるいは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの毛状根誘発（Ｒｉ）プラスミドをベクターとして用いてキメラコンストラクトを導入してもよい。
【０１２９】
外来性核酸の導入によって遺伝的変異を導入し、プロトプラストまたは未熟な植物胚を再生するために、コムギおよびオオムギなどの禾穀類植物をトランスフォーメーションする方法は従来技術において周知であり、たとえばＷａｎ  ａｎｄ  Ｌｅｍａｕｘ，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １０４：  ３７〜４８，  １９９４，  Ｔｉｎｇａｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  １１：  １３６９〜１３７６，  １９９７、カナダ特許出願第２，０９２，５８８号、オーストラリア特許出願第６１７８１／９４号、オーストラリア特許第６６７９３９号、米国特許第６，１００，４４７号明細書、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／１０６２１号、米国特許第５，５８９，６１７号明細書、米国特許第６，５４１，２５７号明細書を参照のこと。好ましくは、トランスジェニック植物が、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）によるトランスフォーメーション手法で作出される。所望の核酸コンストラクトを保持するベクターを、外植片または組織培養植物の禾穀類細胞に導入してもよい。再生可能な細胞は、好ましくは未熟胚の胚盤、成熟胚、これらに由来するカルスまたは分裂組織由来である。未熟胚は、好ましくは開花の約１０〜１５日後の花序から得たものである。
【０１３０】
また、たとえばＦｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８２：  ５８２４，  １９８５およびＳｈｉｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３８：  ２７４−２７６，  １９８９に記載されているようにして、電気穿孔によって遺伝子コンストラクトを植物細胞に導入することも可能である。この技法では、関連する核酸配列を含むベクターまたは核酸の存在下で、植物プロトプラストを電気穿孔する。高電界強度の電気インパルスは膜を可逆的に透過処理して核酸の導入を可能にする。電気穿孔後の植物プロトプラストは細胞壁を再構成し、分裂し、植物カルスを形成する。
【０１３１】
植物細胞に核酸コンストラクトを導入するもうひとつの方法として、たとえばＫｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２７：  ７０，  １９８７に記載されているように、導入対象となる核酸が小さなビーズまたは粒子のマトリックス内あるいはその表面に含まれた小粒子による高速弾道貫通がある（パーティクルボンバードメントまたは微粒子銃としても知られる）。
【０１３２】
あるいは、機械的または化学的手段を用いて植物細胞と接触させることで、核酸コンストラクトを植物細胞に導入することも可能である。たとえば、マイクロピペットを使用して、植物細胞への直接的なマイクロインジェクションによって核酸を機械的に移動させることが可能である。あるいは、細胞によって取り込まれる遺伝物質との間で沈殿複合体を形成するポリエチレングリコールを用いることで、核酸を植物細胞に移動させてもよい。
【０１３３】
変異導入
本発明の植物を作製し、変異導入後に同定可能である。これにより、トランスジェニックではない植物、いくつかの市場で望ましい植物を提供できる。
【０１３４】
変異体は、天然に生じるもの（すなわち天然起源から単離されるもの）であってもよいし、合成（たとえば核酸で変異誘発を実施することによる）されたものでも誘導されたものでもよい。通常、前駆体の植物細胞、組織、種子または植物に変異誘発し、ヌクレオチド置換、欠失、付加および／またはコドン改変などの単一変異または多重変異を生じさせることができる。本出願の文脈では、「誘導変異」とは人工的に誘導した遺伝的変異であり、化学的、放射線または生物学に基づく変異誘発であり、これはたとえばトランスポゾンまたはＴ−ＤＮＡ挿入の結果であってもよい。好ましい変異は、遺伝子を完全に不活化する、ナンセンス変異、フレームシフト変異、挿入変異またはスプライス部位変種などのヌル変異である。ヌクレオチド挿入誘導体は、単一ヌクレオチドまたは多重ヌクレオチドの配列内挿入ならびに５’および３’末端融合を含む。挿入ヌクレオチド配列変種は、１つ以上のヌクレオチドがヌクレオチド配列に導入されるものであるが、得られる産物を適宜スクリーニングすれば、ランダム挿入でも得られる。欠失変種は、配列から１つ以上のヌクレオチドが除去されることを特徴とする。好ましくは、変異体の遺伝子は、野生型遺伝子に対してヌクレオチドの配列に１つの挿入または欠失だけを有する。置換ヌクレオチド変種は、配列の少なくとも１つのヌクレオチドが除去されて、その場所に異なるヌクレオチドが挿入されたものである。野生型遺伝子に対して変異体遺伝子で置換に影響されるヌクレオチドの好ましい数は、最大で１０ヌクレオチド、一層好ましくは最大で９、８、７、６、５、４、３または２ヌクレオチド、あるいは１ヌクレオチドだけである。このような置換は、この置換がコドンによって規定されるアミノ酸を変化させないという点で、「サイレント」であってもよい。あるいは、保存的置換基を設計し、１つのアミノ酸を似たような作用の別のアミノ酸に変更する。一般的な保存的置換は、表１０の「典型的な置換」に基づいて作製されるものである。
【０１３５】
「変異」という用語は、本明細書で使用する場合、遺伝子の活性に影響しないサイレントヌクレオチド置換は含まず、したがって遺伝子の活性に影響する遺伝子配列の変更だけを含む。「多型」という用語は、このようなサイレントヌクレオチド置換を含む、ヌクレオチド配列のあらゆる変化を示す。
【０１３６】
好ましい実施形態では、植物が、ＳＳＩＩ遺伝子の少なくとも一部またはこのような遺伝子のフレームシフトまたはスプライス部位バリエーションの欠失を含む。
【０１３７】
もうひとつの好ましい実施形態では、植物が、従来技術において周知のＡＣ３８アレルなどのａｍｏ１遺伝子における変異を含む。
【０１３８】
変異誘発については、従来技術において周知の種子のＥＭＳまたはアジ化ナトリウム（Ｚｗａｒ  ａｎｄ  Ｃｈａｎｄｌｅｒ，  Ｐｌａｎｔａ  １９７：  ３９〜４８，  １９９５）処理、あるいはガンマ線照射などの化学的な手段または放射線による手段で実施可能である。
【０１３９】
化学的変異誘発は、欠失よりもヌクレオチド置換を好む傾向がある。新規な植物栽培種を作出するための変異育種に有効な技法として、重イオンビーム（ＨＩＢ）照射が知られている。たとえば、Ｈａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｉｏｎ  ｂｅａｍ  ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｉｃｅ．  Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ２００７，  Ｅｉｇｈｔｅｅｎｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ２３７〜２３９，  ２００７およびＫａｚａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５：  １１３〜１１７，  ２００８を参照のこと。イオンビーム照射には、ＤＮＡ損傷の量とＤＮＡ欠失の大きさを決める生物学的作用を得るのに線量（ｇｙ）とＬＥＴ（線エネルギー付与、ｋｅＶ／ｕｍ）という２つの物理的な要因があり、変異誘発の所望の度合いに応じてこれらを調節することが可能である。ＨＩＢでは、多くが欠失を含む変異体の集合が生成され、これを特定のＳＳＩＩａまたはＡｍｏ１遺伝子について変異についてスクリーニングすればよい。変異誘発ゲノムにおける非連鎖の作用を除去して低減するために、同定された変異体を反復親としての未変異コムギ植物と戻し交配する。
【０１４０】
部位特異的変異体の作製に有用な生物学的作用因子として、内在性の修復機序を刺激するＤＮＡに二本鎖切断を含む酵素があげられる。これは、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、トランスポサーゼ、部位特異的リコンビナーゼを含む。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、たとえば、ゲノム内での部位特異的切断を容易にし、内在性または他の末端結合修復機序で欠失または挿入を導入してギャップを修復できるようにする。ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術については、Ｌｅ  Ｐｒｏｖｏｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８（３）：  １３４〜１４１，  ２００９に概説されている。Ｄｕｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３３（１８）：  ５９７８〜５９９０，  ２００５およびＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  １０６：  ９７〜１０５，  ２０１０もまた参照されたい。
【０１４１】
変異体の単離については、変異誘発植物または種子をスクリーニングして達成してもよい。たとえば、オオムギ植物の変異誘発個体群を、葉または穀粒デンプンにおけるＳＳＩＩａ活性についてスクリーニングし、ＳＳＩＩａまたはａｍｏ１遺伝子の変異はＰＣＲまたはヘテロ二重鎖ベースのアッセイで、ＳＳＩＩタンパク質の損失についてはＥＬＩＳＡでスクリーニングすればよい。倍数体植物では、機能的活性を完全に欠く変異体を探索できるように、すでに１つまたは２つのＳＳＩＩ活性を欠く遺伝子型、たとえば３つのゲノムのうち２つでＳＳＩＩ遺伝子がすでに変異体であるコムギ植物でスクリーニングを実施すると好ましい。あるいは、変異誘発した個体群でＥＭＳなどの作用剤を用いた「ティリング」などの手法を用いて変異を同定してもよい（Ｓｌａｄｅ  ａｎｄ  Ｋｎａｕｆ，  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．  １４：  １０９〜１１５，  ２００５）。その後、この変異体と所望の遺伝的背景をもつ植物とを交配し、さらに適切な回数の戻し交配を実施して、もとの望ましくない親の背景を消すことで、このような変異を所望の遺伝的背景に導入してもよい。
【０１４２】
変異は、変異導入によって植物に直接導入されたものでもよいし、２つの親植物（一方が導入された変異を含む）同士の交配によって植物に間接的に導入されたものでもよい。禾穀類植物などの改変された植物は、トランスジェニックであっても非トランスジェニックであってもよい。変異導入を利用して、該当する機能を欠いた非トランスジェニック植物を作製してもよい。また、本発明は、この植物から得られる穀粒または他の植物部位ならびに、所望の特徴を有する植物の作出に使用できる植物の繁殖材料、たとえば培養組織または細胞にまでおよぶ。本発明は、明らかに、このような植物またはこのような植物から得られる穀粒を生産または同定する方法にまでおよぶ。
【０１４３】
本発明の植物はＴＩＬＬＩＮＧ（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｌｏｃａｌ  Ｌｅｓｉｏｎｓ  ＩＮ  Ｇｅｎｏｍｅｓ）（ティリング）として知られているプロセスを用いて作出可能なものである。第１のステップでは、細胞、種子、花粉または他の植物部位を化学的変異原または放射線で処理することによって、新規な単一塩基対変化などの導入された変異を植物の個体群で誘導した後、植物を１世代進めて変異を安定的に継承する。ＤＮＡを抽出し、この個体群の全メンバーの種子を保存し、長期にわたって繰り返し利用できるリソースを創り出す。
【０１４４】
ＴＩＬＬＩＮＧアッセイ用に、該当する単一の遺伝子標的を特異的に増幅させるためのＰＣＲプライマーを設計する。標的が遺伝子ファミリのメンバーである場合、あるいは倍数体ゲノムの一部である場合は、特異性が特に重要である。次に、色素標識プライマーを使用して、複数の個体で構成されるプールＤＮＡからのＰＣＲ産物を増幅することが可能である。これらのＰＣＲ産物を変性させ、再アニーリングしてミスマッチ塩基対を形成できるようにする。ミスマッチまたはヘテロ二重鎖は、天然に生じる単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）（すなわち、この個体群のいくつかの植物が同一の多型を持つ可能性が高い）と誘導ＳＮＰ（すなわち、変異を呈する可能性が高い植物がまれにしかない）の両方を示す。ヘテロ二重鎖形成後に、ミスマッチＤＮＡを認識して切断するＣｅｌＩなどのエンドヌクレアーゼを使用することが、ＴＩＬＬＩＮＧ個体群に含まれる新規なＳＮＰを発見する上で重要である。
【０１４５】
この手法を用いて、数千もの植物をスクリーニングして、任意の遺伝子またはゲノムの特定領域における単一塩基変化ならびに小さな挿入または欠失（１〜３０ｂｐ）を有するあらゆる個体を同定することが可能である。アッセイされるゲノムフラグメントの大きさは、０．３から１．６ｋｂの範囲であればよい。８倍のプール、１．４ｋｂのフラグメント（ノイズがゆえにＳＮＰ検出が困難である場合のフラグメントの末端については除外する）、１アッセイあたり９６レーンという組み合わせで、アッセイ１回あたり最大１００万塩基対までのゲノムＤＮＡのスクリーニングが可能になり、ＴＩＬＬＩＮＧを高スループットの技法にしている。ＴＩＬＬＩＮＧについては、本明細書に援用するＳｌａｄｅ  ａｎｄ  Ｋｎａｕｆ，  ２００５（上掲）およびＨｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １３５：  ６３０〜６３６，  ２００４にさらに説明されている。
【０１４６】
変異の効率的な検出を可能にするだけでなく、高スループットのＴＩＬＬＩＮＧ技術は天然の多型の検出にも理想的である。このため、既知の配列に対してヘテロ二重鎖を形成して未知の相同的ＤＮＡを調べることで、多型部位の数と場所が明らかになる。少なくともいくつかの反復数多型を含むヌクレオチドの変化と小さな挿入および欠失の両方が同定される。これは、エコティリングと呼ばれている（Ｃｏｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ３７：  ７７８〜７８６，  ２００４）。
【０１４７】
それぞれのＳＮＰを、数ヌクレオチド以内でのそのおおよその位置によって記録する。よって、その流動性に基づいて、各ハプロタイプをアーカイブ化することが可能である。ミスマッチ切断アッセイで用いられる同一の増幅ＤＮＡのアリコートを使用して、比較的わずかな努力を付け加えるだけで配列データを得ることができる。多型に対する近さに応じて左または右の配列決定プライマーを単一反応用に選択する。シークェンチャーソフトウェアで複数回のアラインメントを実施して塩基の変化を発見する。これを事例ごとにゲルバンドで確認した。
【０１４８】
エコティリングは完全配列決定よりも安価に実施可能なものであり、現在ほとんどのＳＮＰの発見に用いられている方法である。変異誘発した植物から得られるＤＮＡプールではなく、エコタイプＤＮＡのアレイを含むプレートをスクリーニングすることができる。検出は、ほぼ塩基対の解像度でゲル上でなされ、背景パターンもレーン間で一律であるので、同一サイズのバンドを一致させることが可能であって、単一のステップでＳＮＰを発見して遺伝型を決定できる。このように、最終的なＳＮＰの配列決定が単純かつ効率的で、スクリーニングに用いる同一ＰＣＲ産物のアリコートをＤＮＡ配列決定に適用できるという事実によって、その利点がさらに大きくなる。
【０１４９】
遺伝的連鎖
本明細書で使用する場合、「遺伝的に連鎖している」という表現は、マーカーの座位と第２の座位が、減数分裂の５０％を超えて（ランダムではないなど）一緒に受け継がれるほど染色体上で十分に近接していることを示す。この定義は、マーカー座位と第２の座位が同一遺伝子の一部を形成する状況を含む。さらに、この定義は、マーカー座位が該当する特質と関連する多型を含む（換言すれば、マーカー座位が表現型と直接的に「連鎖」している）状況を含む。このため、１世代ごとに座位間で観察される組換えの割合（センチモルガン（ｃＭ））は５０未満になるであろう。本発明の特定の実施形態では、遺伝的に連鎖している座位が、染色体上で、４５、３５、２５、１５、１０、５、４、３、２，または１ｃＭまたはそれ未満離れている。好ましくは、マーカーが５ｃＭまたは２ｃＭ未満離れており、最も好ましくは約０ｃＭ離れている。
【０１５０】
本明細書で使用する場合、「他の遺伝子マーカー」とは、コムギまたはオオムギなどの禾穀類植物の所望の特質と連鎖した分子であれば、どのような分子であってもよい。このようなマーカーは、当業者間で周知であり、耐病性、収量、植物の形態、穀粒の品質などの特質ならびに、穀粒の色、種子のジベレリン酸含有量、植物の高さ、花の色などの他の休眠特質を決める遺伝子と連鎖した分子マーカーを含む。
【０１５１】
マーカー利用選抜は、古典的な育種プログラムで反復親との戻し交配をする際に必要なヘテロ接合植物の選抜する十分に知られた方法である。各戻し交配世代の植物個体群は、戻し交配個体群に通常は１：１の比で存在する該当する遺伝子に対してヘテロ接合であり、この遺伝子の２つのアレルを区別するのに分子マーカーを用いることが可能である。たとえば若い苗条からＤＮＡを抽出し、浸透性交配させた望ましい特質について特異的マーカーを用いて試験することで、さらに戻し交配するための植物が早い段階で選抜される一方で、エネルギおよび資源は一層少数の植物に集約される。
【０１５２】
ＳＳＩＩまたは他の遺伝子のアレルを検出できる従来技術において周知の分子生物学的技法を、本発明の方法で用いることができる。このような方法としては、核酸増幅、核酸の配列決定、適宜標識したプローブによる核酸ハイブリダイゼーション、一本鎖配座解析（ＳＳＣＡ）、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、ヘテロ二重鎖解析（ＨＥＴ）、化学的切断解析（ＣＣＭ）、触媒的核酸切断またはこれらの組み合わせを使用すること（たとえば、Ｌｅｍｉｅｕｘ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  １：  ３０１〜３１１，  ２０００；  Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｕｓｔ  Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｒｅｓ  ５２：  １０４３〜１０７７，  ２００１を参照のこと）があげられるが、これに限定されるものではない。また、本発明は、フルクタンの蓄積を変化させる（たとえば）ＳＳＩＩ遺伝子のアレルと連鎖した多型の検出に分子マーカー手法を用いることを含む。このような方法は、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、ＲＡＰＤ、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）、マイクロサテライト（単純反復配列、ＳＳＲ）多型の検出または解析を含む。近接して連鎖したマーカーについては、Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１（上掲）が概説したＢｕｌｋｅｄ  Ｓｅｇｒｅｇａｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓなどの従来技術において周知の方法で容易に入手可能である。
【０１５３】
「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）は、複製コピーが、「上流」および「下流」のプライマーからなる「プライマー対」または「プライマーセット」と、ＤＮＡポリメラーゼなどの重合触媒、一般に熱安定性ポリメラーゼ酵素を用いて、標的ポリヌクレオチドから作られる反応である。ＰＣＲの方法は従来技術において周知であり、たとえば「ＰＣＲ」に教示されている（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍｏｌｌｅｒ（Ｅｄ），ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｔｄ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  ２０００）。ＰＣＲは、ＳＳＩＩ遺伝子を発現する植物細胞から単離したｍＲＮＡを逆転写して入手したｃＤＮＡあるいは、植物から単離したゲノムＤＮＡで実施可能なものである。
【０１５４】
プライマーは、標的配列との間で配列特異的にハイブリダイズし、ＰＣＲ中に伸長され得るオリゴヌクレオチド配列である。単位複製配列またはＰＣＲ産物またはＰＣＲフラグメントまたは増幅産物は、プライマーおよび新規に合成された標的配列のコピーを含む伸長産物である。多重ＰＣＲ系は、２つ以上の単位複製配列が同時生成される複数セットのプライマーを含む。プライマーは標的配列と完全に一致するものであってもよいし、制限酵素または触媒核酸認識／切断部位を特定の標的配列内に導入させる内部のミスマッチ塩基を含むものであってもよい。また、プライマーは、単位複製配列の捕捉または検出を容易にするために、別の配列を含むおよび／または改変または標識されたヌクレオチドを含むものであってもよい。ＤＮＡの熱変性、プライマーと相補的な配列とのアニーリング、アニール後のプライマーのポリメラーゼによる伸長のサイクルを繰り返すことで、標的配列が指数関数的に増幅される。標的または標的配列または鋳型という用語は、増幅される核酸配列を示す。
【０１５５】
ヌクレオチド配列の直接的配列決定のための方法は当業者間で周知であり、たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（上掲）およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（上掲）に見出すことができる。配列決定については、任意の好適な方法、たとえばジデオキ配列決定法、化学的配列決定またはこれらのバリエーションで実施可能である。直接的配列決定には、特定の配列における塩基対のバリエーションを求められる利点がある。
【０１５６】
植物
本明細書で使用する場合、名詞としての「植物」という用語は植物全体を示すが、形容詞として用いられるときには、植物に存在する、植物から得られる、植物から誘導される、あるいは植物に関連する物質、たとえば植物器官（葉、茎、根、花など）、単一細胞（花粉など）、種子、植物細胞などを示す。根と苗条が出現した小植物および発芽種子も「植物」の意味に含まれる。本明細書で使用する場合、「植物部位」という用語は、植物から得られ、植物のゲノムＤＮＡを含む１つ以上の植物組織または器官を示す。植物部位は、栄養構造（たとえば葉、茎）、根、花の器官／構造、種子（胚、胚乳、種皮を含む）、植物組織（たとえば維管束組織、地中組織など）、その細胞および後代を含む。本明細書で使用する場合、「植物細胞」という用語は、植物から得られる細胞または植物内の細胞を示し、プロトプラストまたは植物から誘導される他の細胞、配偶子形成細胞、植物全体に再生される細胞を含む。植物細胞は、培養中の細胞であってもよい。「植物組織」とは、植物中または植物から得られる（「外植片」）分化組織あるいは、未熟胚または成熟胚から誘導される未分化組織、種子、根、苗条、果実、花粉、クラウンゴールなどの腫瘍組織、培養中の植物細胞のさまざまな形態での凝集塊（カルスなど）を意味するものとする。種子中または種子から得られる典型的な植物組織は、胚乳、胚盤、アリューロン層、胚である。よって、本発明は、植物および植物部位ならびにこれらを含む産物、特にフルクタンを含む穀粒を含む。
【０１５７】
本明細書で使用する場合、「穀粒」という用語は、一般に圃場で商業的に収穫されたものなどの植物の成熟種子を示す。よって、この用語は、収穫後の種子および収穫できる状態で植物に残っている種子を含む。コムギまたはオオムギなどの禾穀類の成熟穀粒は通常、水分含有量が約１８〜２０％未満である。
【０１５８】
本明細書で使用する場合、「トランスジェニック植物」とは、同一種、変種または栽培種の野生型植物には見られない遺伝子コンストラクトを含む植物を示す。すなわち、トランスジェニック植物（トランスフォームした植物）は、トランスフォーメーション前には含まれなかった遺伝物質（トランスジーン）を含む。トランスジーンは、植物細胞または別の植物細胞あるいは非植物起源または合成配列から入手されるか誘導される遺伝子配列を含むものであってもよい。一般に、トランスジーンは、トランスフォーメーションによるなど人間による操作で植物に導入されるが、当業者が認識しているどのような方法でも使用可能である。遺伝物質は、好ましくは安定的に植物ゲノムに組込まれる。導入される遺伝物質は、同一の種で天然に生じる配列を含み得るが、エレメントの順番が再編成されているか、あるいは異なる編成、たとえばアンチセンス配列である。このような配列を含む植物を、本明細書では「トランスジェニック植物」に含めている。「非トランスジェニック植物」は、組換えＤＮＡ手法で遺伝物質を導入する遺伝的な改変がなされていない植物である。好ましい実施形態では、トランスジェニック植物は、導入されたあらゆる遺伝子（トランスジーン）に対してホモ接合であるため、それらの後代が所望の表現型を遺伝的に分離することはない。
【０１５９】
本明細書で使用する場合、「対応する非トランスジェニック植物」という表現は、トランスジェニック植物に対してアイソジェニックであるが該当するトランスジーンを持たない植物を示す。好ましくは、対応する非トランスジェニック植物は、該当するトランスジェニック植物の前駆体と同一栽培種または変種あるいは、このコンストラクトを欠く同胞植物系統（「分離個体」と呼ばれることが多い）と同一栽培種または変種であるか、または「空ベクター」コンストラクトを用いてトランスフォームされ、非トランスジェニック植物であり得る、同一栽培種または変種の植物である。本明細書で使用する場合、「野生型」とは、本発明による改変がほどこされていない細胞、組織または植物を示す。野生型細胞、組織または植物を、外来性核酸の発現レベルまたは特質改変の程度および性質を、本明細書で説明するように改変した細胞、組織または植物と比較するための対照として使用してもよい。
【０１６０】
本発明の文脈で定義されるトランスジェニック植物は、組換え手法を用いて遺伝的に改変された植物の後代を含み、この場合、後代が該当するトランスジーンを含む。このような後代は、一次トランスジェニック植物の自家受粉によって、あるいはこのような植物を同一種の別の植物と交配することで得られるものである。これは通常、所望の植物または植物器官における本明細書で定義した少なくとも１つのタンパク質／酵素の産生を調節するためのものであろう。トランスジェニック植物部分には、培養組織、カルス、プロトプラストなど、トランスジーンを含む前記植物のあらゆる部分および細胞が含まれる。
【０１６１】
トランスフォームした植物におけるトランスジーンの存在を判断するにあたって、いくつかの方法のうちどれを用いてもよい。たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、トランスフォームした植物に固有の配列を増幅し、増幅産物をゲル電気泳動または他の方法で検出すればよい。従来の方法で植物からＤＮＡを抽出し、特定のＤＮＡを増幅するプライマーを用いてＰＣＲ反応を実施する。その有無で、トランスフォームされた植物とトランスフォームされていない植物とが区別される。たとえば、コンストラクトに読み込まれているトランスフォーメーションベクターからＤＮＡの領域を増幅するプライマーを設計してもよく、リバースプライマーは該当する遺伝子から設計される。植物がうまくトランスフォームされていれば、これらのプライマーはフラグメントだけを増幅することになる。ポジティブ形質転換体を確認するための別の方法に、従来技術において周知のサザンブロットハイブリダイゼーションがある。トランスフォームされた植物も同定できる、すなわち、トランスフォームされていない植物または野生型植物とは表現型（たとえば選択可能なマーカー遺伝子が存在することで生じる表現型、あるいは植物の穀粒のフルクタン含有量の変化という表現型によって生じる表現型、あるいは関連する表現型、たとえばデンプン合成酵素活性の変化など）で区別される。
【０１６２】
本明細書で使用する場合、「発芽」は、吸水後に種皮から根端が出現することを示す。「発芽率」は、吸水後の一定期間（７日または１０日など）内に発芽した種子の個体群内での歩合を示す。種子の個体群を数日間にわたって毎日評価し、経時的な発芽歩合を求めることが可能である。本発明の種子に関して、「実質的に同じ発芽率」という表現が本明細書で使用される場合、トランスジェニック種子の発芽率が、同系統の野生型種子と同じ少なくとも９０％であることを意味する。
【０１６３】
本明細書で使用する場合、「オオムギ」という用語は、ホルデウム（Ｈｏｒｄｅｕｍ）属の種を示し、その前駆体ならびに他の種との交配によって作出される子孫も含まれる。この植物が、たとえば、ホルデウム・ヴルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）の株または栽培種または変種など、商業的に栽培されるホルデウム（Ｈｏｒｄｅｕｍ）種のものあるいは、穀粒の量産に適したものであると好ましい。
【０１６４】
食品の製造
もうひとつの態様では、本発明は、食品または飼料の製造に有用なオオムギ植物および穀粒ならびに、それを用いて得られる生成物を提供するものであり、穀粒のデンプンレベルが対応するＳＳＩＩａ変異体穀粒に比して上昇し、非デンプン構成成分のレベルも対応する野生型穀粒に比して上昇している。好ましくは、穀粒を得る植物は、発育時に胚乳におけるＳＳＩＩａ活性レベルが低下するものである。本発明の植物は、食品の製造、特に商業的な食品の製造に有用である。このような食物製造には、商業的な食品製造における成分であり得る粉、生地または他の製品の製造を含むことがある。食品の製造で用いるのに望ましい一実施形態では、植物の種子または穀粒のフルクタン含有量が野生型植物に比して増加している。この穀粒は、分解酵素、特にα−アミラーゼまたはβ−アミラーゼなどの１種類以上のアミラーゼの活性レベルが、穀粒においてこのような分解酵素をコードする遺伝子の発現を低減するトランスジーンまたは誘導変異が存在することで低下したものであってもよい。このような穀粒から得られる粉または生地は、パンの製造または他の食品の製造に望ましい特性を有する。
【０１６５】
この植物の望ましい遺伝的背景では、農学的な収量や他の特徴が考慮されるであろう。このような特徴には、冬型もしくは春型を有することが望ましいか否か、農業生産力、耐病性および非生物的ストレス耐性が含まれることがある。他の栽培領域では、他の変種が適するであろう。本発明の植物変種は、少なくともいくつかの栽培領域で、対応する野生型変種での収量８０％以上の収量を提供すると好ましく、一層好ましくは８５％以上の収量、なお一層好ましくは９０％以上の収量である。収量は、管理下にある野外実験で容易に測定可能である。
【０１６６】
別の実施形態では、穀粒のデンプン含有量が少なくとも約４２％、少なくとも約４３％、少なくとも約４５％、少なくとも約４７％、少なくとも約５０％または少なくとも約５５％（ｗ／ｗ）、最大で６５％であり、一層好ましくは、野生型に比して低下していない。商業的に栽培した野生型のオオムギ穀粒は通常、ある程度は生育させる栽培種次第で、デンプン含有量が５５〜６５％の範囲である。あるいは、本発明の種子または穀粒は、デンプン含有量が野生型植物由来の穀粒の場合に比して少なくとも９０％であり、好ましくは少なくとも９５％である。他の望ましい特徴として、穀粒の製粉しやすさ、特に穀粒の硬度があげられる。さらに値の大きい植物を作出する別の要因に、穀粒からのフルクタンまたはデンプン抽出の度合い（抽出率が高ければ高いほど有用である）、タンパク質含有量、アミロース対アミロペクチン比あるいは、穀粒製品の食物繊維の含有量にも寄与するβ−グルカンなどの他の非デンプン多糖の含有量がある。穀粒の形状も、植物の商業的な有用性に影響し得る別の特徴であり、よって、穀粒の形状が、穀粒を製粉しやすいかどうかに影響する可能性がある。
【０１６７】
デンプンは、標準的な方法、たとえばＳｃｈｕｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｋａｍｍｉｏｖｉｒｔａ，  Ｓｔａｒｃｈ，  ４３：  ３８７−３８９，  １９９１を用いて本発明の穀粒（たとえばコムギの穀粒）から容易に単離される。工業規模では、湿式製粉または乾式製粉を用いることが可能である。デンプン粒の大きさは、デンプン加工業では重要であり、小さめのＢ粒から大きめのＡ粒が分離される。
【０１６８】
食物製品
また、本発明は、生成物、好ましくは難消化性デンプン、食物繊維、アミロース、β−グルカン、フルクタンあるいは、本発明の植物または穀粒から得られる他の構成成分が増加した生成物を用いて製造される食物、飲料または医薬品を包含する。そのような食物の製造には、加工済みの穀粒、全粒、粉、ドウあるいは、商業的な食物製造における成分となり得る他の製品の製造を含むことがある。難消化性デンプン、食物繊維、アミロース、β−グルカンまたはフルクタンを含有する、本発明の穀粒または当該穀粒から誘導される生成物を、ヒトが消費するさまざまな食物に応用することができる。本明細書で使用する場合、「ヒト」はホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）を示す。この穀粒は、食物加工の手順で容易に利用できるため、本発明は、本発明の植物の加工穀粒または全粒から得られる生成物の精白粒、挽いた粒、粗挽き粒、搗精粒またはロールにかけた粒（粉を含む）を含む。これらの製品については、その後、さまざまな食物製品、たとえばデンプン質の製品（朝食用シリアル、パン、ケーキ、ビスケットなど）または食品添加物（増粘剤または結合剤）で使用してもよいし、飲料、麺類、パスタまたは即席スープを製造する目的で使用してもよい。本発明の穀粒または穀粒から得られる製品は、特に朝食用シリアルまたは押出成形された製品に望ましい。デンプンまたは他の構成成分は、脂肪または油製品（マーガリンまたはショートニング、サラダドレッシングなど）、卵製品（マヨネーズなど）、乳製品（アイスクリーム、ヨーグルトまたはチーズ）、禾穀類製品（コムギ粉など）、果汁、他の食物または食物材料に加えることができる。また、デンプンあるいは他の構成成分を加工して、飲料または食物（パン、ケーキ、ビスケット、朝食用シリアル、パスタ、麺類またはソース）にしてもよい。フルクタンも低カロリー甘味料製品として有用である。
【０１６９】
パンでは、粉または全粒の形態であってもよいフルクタンを含む成分で、何ら変化していない粉または全粒の１０％（ｗ／ｗ）以上を置き換えてもよく、何ら変化していない粉または全粒の好ましくは少なくとも３０％、なお一層好ましくは少なくとも５０％を置き換えることができる。したがって、配合物としては、たとえば、粉７０部、高フルクタンデンプン３０部、脂肪２部、塩２部、改良剤１部、イースト２．５部にできよう。パンの製造は、ラピッドドウ（ｒａｐｉｄ  ｄｏｕｇｈ）法または当業者間で周知の他の手法で実施できる。
【０１７０】
あるいは、本発明の製品を、デンプン質を主成分とするパスタ製品に取り入れてもよい。このパスタ組成物に用いる本発明のフルクタンの量は、デンプン質材料の総重量に対して５〜２０％（ｗ／ｗ）の範囲、特に１０〜２０％の範囲であればよい。当業者であれば、好適な他のデンプン質材料を容易に選択するであろう。乾燥卵または液状卵（卵黄、卵白または両方）または高タンパク質物質（牛乳タンパク質または魚タンパク質など）といった他の材料を組成物に添加してもよい。ビタミン、ミネラル、カルシウム塩、アミノ酸、リン酸水素二ナトリウムなどの緩衝剤、調味料、ガム、グルテンまたはモノステアリン酸グリセリルを添加してもよい。
【０１７１】
本発明の植物の他の食用部分を、人間が消費する食物または動物が使用する飼料として用いることができる。たとえば、これらのいずれかに由来する本発明の細胞を含む、これらの葉、茎、抽出物または一部を、人間または動物での消費用に使用できる。本発明の植物およびその一部の難消化性デンプン、食物繊維、アミロース、β−グルカンまたはフルクタン含有量の増加によって、これらの材料を、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリなどの家禽類、他の動物用の飼料などの動物の飼料として用いる上での利点が得られることがある。
【０１７２】
方法
本発明の生成物または化合物を、従来の配合法で調製される医薬組成物に配合することが可能である。たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８th  Ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ，  Ｕ．Ｓ．Ａ．  １９９０）を参照のこと。この組成物は、活性剤または薬学的に許容される誘導活性剤を含むものであってもよい。これらの組成物は、活性物質のうちの１つに加えて、薬学的に許容される補形剤、キャリア、緩衝液、安定剤または従来技術において周知の他の材料を含むものであってもよい。このような材料は、無毒でなければならず、活性成分の効力に干渉しないものでなければならない。キャリアは、投与に望ましい調製物の形態に応じて多岐にわたる形態を取り得る。
【０１７３】
経口投与用に、化合物を、カプセル、ピル、錠剤、トローチ、粉末、懸濁液またはエマルションなどの固体製剤または液体製剤に処方可能である。経口剤形の組成物を調製する際、経口液体製剤（たとえば、懸濁液、エリキシル剤、溶液など）であれば、たとえば水、グリコール、油、アルコール、香味料、保存料、着色料、懸濁剤など；あるいは、経口固体製剤（たとえば、粉末、カプセル、錠剤など）であれば、デンプン、糖、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、バインダー、崩壊剤などのキャリアといった通常の製剤用媒質を利用できる。投与しやすさから、錠剤およびカプセルが最も好都合な経口単位剤形となり、この場合、明らかに固体製剤キャリアを使用する。必要に応じて、標準的な手法で錠剤を糖衣錠または腸溶錠にしてもよい。
【０１７４】
活性因子を、好ましくは治療有効量で投与する。実際の投与量および投与速度ならびにスケジュールは、治療対象となる症状の性質および重篤度に左右される。薬用量、タイミングなどの判断といった治療の処方は、一般開業医または専門家の責任の範囲内であり、一般に、治療対象となる障害、個々の患者の症状、送達部位、投与方法、医師が判断できる他の要因を考慮する。手法およびプロトコールの例が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，（上掲）に見出される。
【０１７５】
食物または飲料または医薬品を、小売用またはバルク形態で包装してもよい。また、本発明は、本発明の食物、飲料または医薬品を調製する方法、このような食物または飲料を調製するためのレシピまたは指示を提供するものである。この方法は、植物または植物部位を採取するステップ、穀粒を他の植物部位から分離するステップ、粉砕するステップ、抽出するステップ、製粉するステップ、調理するステップ、缶詰にするステップ、包装するステップあるいは、従来技術において周知の他の加工ステップを含むものであってもよい。この方法またはレシピまたは指示には、本発明の植物生成物を加工するステップおよび／またはこれを他の食物成分と混合するステップ、たとえば混合物または生成物をたとえば少なくとも１００℃まで加熱または焼成するステップを含むことができる。この方法は、製品を販売しやすいようにこれを包装するステップを含むものであってもよい。
【０１７６】
工業的用途
本植物製品、好ましくは穀粒を、たとえばエタノールなどの工業製品の製造に用いることができる。
【０１７７】
本発明について、以下の非限定的な実施例によってさらに説明する。
【実施例】
【０１７８】
実施例１：例示的な方法および材料
植物材料
使用するオオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）系統を、本明細書ではｓｅｘ６−２９２アレルと表記するＳＳＩＩａ変異を含む親のＨｉｍａｌａｙａ２９２変種（Ｍ２９２（配列番号９〜１１）、Ｍｏｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３ｂ（上掲））と高アミロース性グラシェル大麦変種（ＨＡＧ、ＡＣ３８とも呼ぶ）との交配で開始して、戻し交配個体群から得た。好適な親の変種は、当該技術分野において入手可能である。ＨＡＧ変種、たとえば（高アミロース性グラシェル大麦、ＡＣ３８とも呼ぶ）は、ＣＳＩＲＯまたはＡｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｗｉｎｔｅｒ  Ｃｅｒｅａｌｓ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｔａｍｗｏｒｔｈ，  ＮＳＷから入手可能である。オオムギ植物を、標準的な方法を用いて温室で交配した。Ｈｉｍａｌａｙａ２９２（雄性）からＨＡＧ（雌性）に３回戻し交配した後、単粒法（ＳＳＤ）で３世代交配して、戻し交配個体群を生成した。３代目の戻し交配で得られた種子をＢＣ３Ｆ１と名付け、３代目のＳＳＤで得られた種子をＢＣ３Ｆ４と名付けた。各系統の種子の量を増やすために、さらに２世代または３世代栽培した。これらをＢＣ３Ｆ６またはＢＣ３Ｆ７世代と称し、本研究に利用した。
【０１７９】
７０のＢＣ３Ｆ６オオムギ系統を、ポットに入れたこと以外は自然なままの条件で、２００５年にＣＳＩＲＯ  Ｐｌａｎｔ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｃａｎｂｅｒｒａで栽培した。選択した種子組成物とパラメータを確認するために、種子の重量、アミロース含有量、ＳＳＩＩａおよびａｍｏ１変異の存在を基準に選択したＢＣ３Ｆ７オオムギ系統のサブセットを、ＣＳＩＲＯ  Ｐｌａｎｔ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，  Ｃａｎｂｅｒｒａにて、自然光の入るガラス温室内で、温度を１８℃（夜）および２４℃（日中）とするか、Ｙａｎｃｏ，  Ｎｅｗ  Ｓｏｕｔｈ  Ｗａｌｅｓ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａの圃場のいずれかで、２００７年に栽培した。
【０１８０】
囲まれた穂状花序を含む止め葉の頂部に芒が最初に現れた２日後の開花期に、オオムギの穂状花序を標識した。開花後（ＤＰＡ）２０日目に発育中の種子を収穫し、胚を取り除いた後、発育中の胚乳を切断面から押し出して、−８０℃で保管した。
【０１８１】
本明細書で説明するような他の変種を、商業的にまたはＡｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｗｉｎｔｅｒ  Ｃｅｒｅａｌｓ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｔａｍｗｏｒｔｈ，  ＮＳＷ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａから入手した。
【０１８２】
ＰＣＲ増幅によるＢＣ３Ｆ６個体群の遺伝型判定
戻し交配個体群のＢＣ３Ｆ６世代のコムギの若葉を採取し、凍結乾燥させた（フリーザーＦＴＳ  ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｓｔｏｎｅ  Ｒｉｄｇｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。ｆａｓｔ  ＤＮＡRキットを使用し、提供元の指示に従ってゲノムＤＮＡを単離した（Ｑ−ＢＩＯｇｅｎｅ）。
【０１８３】
ＳＳＩＩａ変異の遺伝型判定のために、ＳＳＩＩａ  ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ｎｏ：ＡＹ１３３２４９）のヌクレオチド１６１６で開始するプライマーＳＳＩＩａＦ（５’−ＣＣＴＧＧＡＡＣＡＣＴＴＣＡＧＡＣＴＧＴＡＣＧ−３’（配列番号３））と、ヌクレオチド２０４４で開始するＳＳＩＩａＲ（５’−ＡＧＣＡＴＣＡＣＣＡＧＣＴＧＣＡＣＧＴＣＣＴ−３’（配列番号４））を使用して、Ｍｏｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３ｂ（上掲）によって説明されているように、Ｈｉｍａｌａｙａ２９２のヌクレオチド１８２９でＳＳＩＩａ変異部位にわたる４５１ｂｐの産物のＰＣＲ増幅を実施した（配列番号９も参照のこと）。マイクロサテライトＰＣＲマーカーＥＢｍａｃ０５０１を使用して、ａｍｏ１変異を検出した。これが染色体１Ｈの６８．０ｃＭに局在し、同じく６８．０ｃＭのａｍｏ１座位と密に連鎖しているためである。Ｐｒｉｍｅｒｓ  ＨＨａｃ０５０１Ｆ（５’  ＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＡＣＴＴＡＡＧＴＧＣＣＡＴＧＣＡＡＡＧ  ３’（配列番号５）およびＨＨａｃ０５０１Ｒ（５’  ＡＧＧＧＡＣＡＡＡＡＡＴＧＧＣＴＡＡＧ  ３’（配列番号６））（ＧｒａｉｎＧｅｎｅｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ）を使用して、ＰＣＲフラグメントをａｍｏ１座位から増幅した。
【０１８４】
各２０μlのＰＣＲ反応で、５０ｎｇのゲノムＤＮＡ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、０．１２５ｍＭの各ｄＮＴＰ、１０ｐｍｏｌのプライマー、０．５Ｍのグリシンベタイン、１μlのＤＭＳＯ、１．５ＵのＨｏｔｓｔａｒ  Ｔａｑポリメラーゼ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用した。ＨＹＢＡＩＤ  ＰＣＲ  Ｅｘｐｒｅｓｓ装置（Ｉｎｔｅｒｇｒａｔｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、９５℃で５分間を１サイクル、９４℃で４５秒間を３５サイクル、５８℃で３０秒間、７２℃で１分間、７２℃で１０分間を１サイクル、２５℃で１分間を１サイクルでＰＣＲ反応を実施した。ＳＳＩＩａ変異の検出用のＰＣＲ産物を制限酵素ＮｌａＩＶで３７℃にて一晩かけて消化した。消化された（ＳＳＩＩａ変異用）ＰＣＲフラグメントと消化されなかった（ａｍｏ１変異用）ＰＣＲフラグメントの両方を２％アガロースゲルで分離し、ＧｅｌＲｅｄ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）染色後にゲルドキュメンタリー（ｄｏｃｕｍｅｎｔａｒｙ）（ＵＶｉｔｅｃ）で可視化した。
【０１８５】
Ｈｉｍａｌａｙａ２９２×ＨＡＧ間の戻し交配オオムギ個体群からのオオムギ系統の遺伝型を判定するために、プライマーＳＳＩＩａＦおよびＳＳＩＩａＲを上述したようにして親の系統Ｈｉｍａｌａｙａ２９２からのＳＳＩＩａ変異の検出に使用し、マイクロサテライトマーカーＥＢｍａｃ０５０１を親の系統ＨＡＧからのａｍｏ１座位の検出に使用した。ＳＳＩＩａ変異については、ＰＣＲ産物をＮｌａＩＶで消化して、変異型と野生型のＳＳＩＩａアレルを区別するゲル電気泳動を実施した後、３タイプのＰＣＲフラグメントパターンが明らかになった。３４７ｂｐの単一のＤＮＡフラグメントが変異型ＳＳＩＩａ遺伝子の存在を示し、単一の２３６ｂｐのＤＮＡフラグメントが野生型ＳＳＩＩａ遺伝子の存在を示し、３４７ｂｐと２３６ｂｐの両フラグメントの存在が、ヘテロ接合遺伝型系統の存在を示した。ＨＡＧからのａｍｏ１変異については、ＥＢｍａｃ０５０１マイクロサテライトマーカーでも３つのＰＣＲ断片化パターンが得られた。１６７ｂｐのフラグメントがａｍｏ１変異体から検出され、１４１ｂｐのフラグメントが野生型系統から検出され、１６７ｂｐと１４１ｂｐの両フラグメントがヘテロ接合系統で検出された。
【０１８６】
穀粒の特徴
成熟時に植物から穀粒を収穫した。特に明記しないかぎり、種子１００個を３つ組で秤量して、平均粒重を求めた。選択した系統の粒重についても、Ｙａｎｃｏ，ＮＳＷでのＢＣ３Ｆ７圃場栽培材料の３つ組で種子５００粒の平均粒重として求めた。標準的な核磁気共鳴（ＮＭＲ）法によって、Ｏｘｆｏｒｄ  ４０００  ＮＭＲ  Ｍａｇｎｅｔ（Ｏｘｆｏｒｄ  ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）を用いて穀粒の種子水分含有量を測定した。Ｓｉｎｇｌｅ−Ｋｅｒｎｅｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎシステム４１００（Ｐｅｒｔｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．  Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，  ＩＬ  ６２７０７  ＵＳＡ）を用いて、ＲＡＣＩ  Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ試験法１２−０１で穀粒のテクスチャを測定した。種子の整粒具合を、しわ型、半整粒および整粒の３つのカテゴリーに分けた。
【０１８７】
オオムギ種子断面の顕微鏡検査と走査型電子顕微鏡
剃刀の刃で一部を切断して、オオムギ種子中央部の厚さ約１ｍｍの横断面を生成し、写真撮影をした。これに金粒子を被覆し、１５ＫＶで動作しているＪＳＭ−６４００  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ＳＥＭ）で調べた。
【０１８８】
穀粒の製粉
サイクロンミル（Ｃｙｃｌｏｔｅｃ  １０９３，  Ｔｅｃａｔｏｒ，  Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、０．５ｍｍの篩に通るであろう全粒まで穀粒を挽いた。この全粒を以下の分析に使用した。
【０１８９】
β−グルカンおよびペントサン分析
Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｍｅｔｈｏｄ（ＡＡＣＣ３２．２３）に記載されているようにして、３つの複製試料の各々について全粒２０ｍｇを使用し、β−グルカン含有量をアッセイした。Ｂｅｌｌ（１９８５）の方法で、３つの複製試料の各々について全粒２０ｍｇを使用し、ペントサン含有量を測定した。
【０１９０】
デンプン抽出
プロテアーゼ抽出法（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｅｒｅａｌ  Ｓｃｉ，  ２：  ２５７〜２７１，  １９８４）に続いて水洗してテーリングを取り除き、全粒からデンプンを単離した。次に、デンプンをアセトンで洗浄し、室温にて風乾した（Ｋｏｎｉｋ−Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７（上掲））。
【０１９１】
総デンプン量の分析
Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｍｅｔｈｏｄ（ＡＡＣＣ７６．１３）に記載されているようにして、３つの複製試料の各々について全粒２０ｍｇを使用し、穀粒の全デンプン含有量をアッセイした。
【０１９２】
デンプンの組成および特徴の分析
穀粒のデンプン中のアミロースおよびアミロペクチン含有量あるいは、アミロース対アミロペクチンの比を、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−２Ｂゲル濾過によって、以下のようにして求めた（ゲル濾過法）。約１０ｍｇの全デンプンを１Ｍ  ＮａＯＨ３．０ｍｌに溶解させ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−２Ｂカラムでのクロマトグラフィで分子量に基づいて分画した（Ｒｅｇｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  １０３：  ３５４６〜３５５１，  ２００６）。デンプンアッセイキット（Ｓｉｇｍａ）を使用して、提供元の指示に従ってカラムからの各画分におけるデンプンの量を測定した。アミロペクチン（第１のピーク、高めの分子量）およびアミロース（第２のピーク、低めの分子量）の全量を算出し、比または含有量を求めた。
【０１９３】
あるいは、小スケール（２ｍｇデンプン）ヨウ素吸着法（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｉｇｎｅｌｅｔ，  Ｊ  Ｃｅｒｅａｌ  Ｓｃｉ，  １：  ９〜２０，  １９８３）を、Ｋｏｎｉｋ−Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７（上掲）に記載されているようにして若干改変して使用し、アミロース含有量を測定した。
【０１９４】
鎖長分布
デンプン試料の枝切り後に、Ｏ’Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｒｅｓ，  ３０７：  １〜１２，  １９９８の方法で、Ｐ／ＡＣＥ  ５５１０キャピラリー電気泳動系（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，  ＮＳＷ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて、アルゴンレーザ誘起蛍光（ＬＩＦ）検出によって、アミロペクチン鎖長分布を測定した。改変デンプンについての正規化鎖長分布を、アイソジェニックな未改変対照で得られたデンプンについての正規化分布から差し引いて、モル差のプロットを生成した。
【０１９５】
Ｐｙｒｉｓ  １示差走査熱量測定装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，  Ｎｏｒｗａｌｋ  ＣＴ，  ＵＳＡ）を使用して、デンプン試料の糊化温度特性を測定してもよい。Ｒａｐｉｄ−Ｖｉｓｃｏ−Ａｎａｌｙｓｅｒ（ＲＶＡ，  Ｎｅｗｐｏｒｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ，  Ｗａｒｒｉｅｗｏｏｄ，  Ｓｙｄｎｅｙ）にて、Ｂａｔｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔａｒｃｈ  ４８：  ３３８〜３４４，  １９９７によって報告されているような条件で、デンプン溶液の粘度を測定できる。測定可能なパラメータとしては、ピーク粘度（最大ホットペースト粘度）、保持強度、最終粘度、ペースト温度がある。ペースト特性については、Ｒａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｓｅｒで以下のようにして測定すればよい。ＤＳＣ容器にてデンプン（３．０ｇ）を蒸留水（２５．０ｍｌ）に加え、ＲＶＡ実施特性を５０℃で２分間、６分間で９５℃まで加熱、９５℃で４分間保持、４分間で５０℃まで冷却、５０℃で４分間保持とする。測定パラメータは、９５℃でのピーク粘度、９５℃での保持時間終了時の保持強度、降伏＝ピーク粘度−保持強度、５０℃での保持時間終了時の最終粘度、セットバック＝最終粘度−保持強度である。ＴｈｅｒｍｏｃｌｉｎｅソフトウェアのＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用バージョン２．２（Ｎｅｗｐｏｒｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ，  ＮＳＷ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用して、データを集めて分析してもよい。
【０１９６】
粉またはデンプンの膨潤量を、Ｋｏｎｉｋ−Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔａｒｃｈ−Ｓｔａｅｒｋｅ，  ５３：  １４〜２０，  ２００１の方法で求めることができる。粉またはデンプン試料を所定の温度（たとえば９０℃）で水に混合する前後にその試料を秤量し、糊化した材料を回収することで、吸水量を測定する。
【０１９７】
デンプン粒の形態、複屈折および粒サイズ分布
ＳＥＭ（ＪＳＭ−６４００）および光学顕微鏡法（偏光を使用）で、粒の形態を調べた。デンプン粒の形状と複屈折を（Ｙａｍａｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００（上掲））に記載されているようにして調べた。レーザ回折粒度分析装置（Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ  ２０００，  Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｍａｌｖｅｒｎ，  Ｅｎｇｌａｎｄ）を使用して、デンプンスラリーの粒サイズの分布（体積）を求めた。カットオフ径を７μmとして、小さなＢ−タイプのデンプン粒の歩合を求めた。
【０１９８】
脂質の分析
ＮＭＲによって、Ｏｘｆｏｒｄ  ４０００  ＮＭＲ  Ｍａｇｎｅｔ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，  ＵＫを使用して、全脂質含有量をアッセイすることができる。各試料について、種子１ｇを３８．８℃で６４時間乾燥させる。次に、ＮＭＲを用いて乾燥後の種子を測定し、ｃｖ．ＨｉｍａｌａｙａまたはＭ２９２穀粒から抽出した純オオムギ油対照と比較する。
【０１９９】
タンパク質含有量、脂質含有量、水分含有量、灰分含有量
自動窒素および炭素分析装置調製系を備えたＥｕｒｏｐａ  ２０−２０アイソトープ比の質量分析計で、Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄを用いる窒素含有量の測定によって、タンパク質含有量を求めた。オオムギ全粒３〜８ｍｇを使用した。オオムギ種子中のタンパク質含有量を算出するために、窒素からタンパク質への換算係数に６．２５を使用した（Ｍｏｓｓｅ  １９９０）。脂質含有量、水分含有量、灰分含有量については、ＡＯＡＣ  ９８３．２３法、ＡＡＣＣ法４４−１９、ＡＡＣＣ法０８−０１を用いて測定した。
【０２００】
全食物繊維アッセイ
Ｐｒｏｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５；  ＡＯＡＣ  ９８５．２９）の重量測定法を使用して、全粒の全食物繊維（ＴＤＦ）を求めた。二重複製の試料をアッセイした。
【０２０１】
非デンプン多糖アッセイ
Ｔｈｅａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  ＡＯＡＣ  Ｉｎｔ  ７８：  １０３０〜１０４４，  １９９５のガスクロマトグラフィ法を変更したものを使用して、非デンプン性多糖（ＮＳＰ）全体を測定した。変更内容は、１Ｍ硫酸を用いて２時間加水分解した後、遠心処理をほどこして、不溶性のＮＳＰを除去した上で、２Ｍトリフルオロ酢酸を可溶性ＮＳＰに用いて上清をさらに加水分解した。
【０２０２】
難消化性デンプンアッセイ
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの手法を使用して、難消化性デンプン（ＲＳ）含有量を求めた。この方法には、２つの段階がある。第１に模倣した生理学的条件下で各試料のデンプンを加水分解し、第２に副生物を洗浄除去し、試料の均質化と乾燥の後に残ったデンプンを求めた。消化処理の最後に定量されたデンプンは試料中の難消化性デンプン含有量を表していた。一般に、全粒の３重試料を適当な標準と一緒に人工唾液と混合し、得られるボーラスを膵臓および胃の酵素とともに生理学的ｐＨおよび温度でインキュベートした。従来の酵素による手法と分光測定を用いて消化管内容物中の残留デンプン量を求め、試料の難消化性デンプン含有量を試料重量または全デンプン含有量に対する比率で表した。
【０２０３】
１日目、５００ｍｇまでの炭水化物に相当する量の試料を１２５ｍＬのエルレンマイヤーフラスコに秤量した。１２１ｍｇのＮａＨＣＯ3と１５７ｍｇのＫＣｌとを約９０ｍＬの純水に溶解させ、１Ｍ  ＣａＣｌ2・６Ｈ2Ｏ溶液１５９μｌと４１μｌの０．４９Ｍ  ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏとを加え、０．３２Ｍ  ＨＣｌを用いてｐＨを７から７．１に調整し、体積を１００ｍＬに調整することで、炭酸緩衝液を調製した。この緩衝液を４℃で最大５日間まで保管した。炭酸緩衝液１ｍＬあたり２５０単位のα−アミラーゼ（ブタ膵臓由来のＳｉｇｍａ  Ａ−３１７６  Ｔｙｐｅ  ＶＩ−Ｂ）を含有する人工唾液溶液を調製した。食物の重量とほぼ同量の一定量の人工唾液溶液をフラスコに加えた。唾液を加えてから約１５〜２０秒後に５ｍＬのペプシンＨＣｌ溶液（０．０２Ｍ  ＨＣｌ、ｐＨ２．０中に１ｍｇ／ｍＬのペプシン（Ｓｉｇｍａ）、使用日に調製）を各フラスコに加えた。アミラーゼとこれに続くペプシンの混合は、嚥下前におけるヒトの試料咀嚼を模倣した。混合物を３７℃で３０分間、８５ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。その後、０．０２Ｍ  ＮａＯＨを５ｍＬ用いて混合物を中和した。２５ｍＬの酢酸緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ６）ならびに、酢酸緩衝液（ｐＨ６）中に２ｍｇ／ｍＬのパンクレアチン（Ｓｉｇｍａ、４×ＵＳＰ活性でブタ膵臓）および２８Ｕのクロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のアミログルコシダーゼ（ＡＭＧ、Ｓｉｇｍａ）を含むパンクレアチン酵素混合液５ｍＬを各フラスコに加えた。各フラスコにアルミホイルで蓋をし、３７℃で１６時間、８５ｒｐｍに設定した往復振動水浴中にてインキュベートした。
【０２０４】
２日目、各フラスコの内容物を定量的に５０ｍＬ容のポリプロピレンチューブに移し、２０００×ｇで１０分間、室温にて遠心処理した。上清を廃棄し、洗浄のたびにチューブを静かにボルテックスしてペレットを破砕した上で遠心処理することによって、各ペレットを２０ｍＬの水で３回洗浄した。最後の洗浄水５０ｕＬを、Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｔｒｉｎｄｅｒ試薬で試験して、遊離グルコースが存在しないことを確認した。次に、各ペレットを約６ｍＬの純水に再懸濁させ、Ｓ２５Ｎ−８Ｇ分散器具付きのＵｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘ  ＴＰ１８／１０を使用して、１０秒間かけて３回均質化した。内容物を定量的に２５ｍＬ容のメスフラスコに移し、体積に合わせた。内容物を完全に混合し、ポリプロピレン製チューブに戻した。各懸濁液の試料５ｍＬを２５ｍＬの培養試験管に移し、液体窒素ですみやかにシェルフリーズさせ、凍結乾燥した。
【０２０５】
３日目、Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｔａｒｃｈ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅキットで提供される試薬を使用して、各試料の総デンプン量を測定した。デンプン標準（Ｒｅｇｕｌａｒ  Ｍａｉｚｅ  Ｓｔａｒｃｈ，  Ｓｉｇｍａ  Ｓ−５２９６）およびアッセイ試薬ブランクを調製した。試料、対照、試薬ブランクを０．４ｍＬの８０％エタノールで湿らせて分散を促進した後、ボルテックスした。すぐに、２ｍＬのＤＭＳＯを加え、溶液をボルテックスにより混合した。チューブを沸騰水浴中に５分間配置し、ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７、５ｍＭ  ＣａＣｌ2および０．０２％アジ化ナトリウムを含有に溶解させた３ｍＬの熱安定性α−アミラーゼ（１００Ｕ／ｍｌ）をすみやかに加えた。３分間隔でボルテックス混合しつつ、沸騰水浴中で溶液をさらに１２分間インキュベートした。その後、チューブを５０℃の水浴中に配置し、４ｍＬの酢酸ナトリウム緩衝液（２００ｍＭ、ｐＨ４．５、０．０２％アジ化ナトリウムを含有）および０．１ｍＬの３００Ｕ／ｍｌアミログルコシダーゼを加えた。この混合物を１０分間隔で穏やかに混合しながら５０℃にて３０分間インキュベートした。メスフラスコで容量を２５ｍＬに調整して、十分に混合した。アリコートを２０００×ｇで１０分間遠心処理した。Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｔｒｉｎｄｅｒ試薬１．０ｍＬを用いて、チューブを室温にて暗所で最短１８分間、最長４５分間インキュベーション後に、５０５ｎｍでの吸光度を測定することで、上清５０μＬ中のグルコース量を求めた。
【０２０６】
水溶性炭水化物含有量の定量
ＬｕｎｎおよびＨａｔｃｈ，  Ｐｌａｎｔａ  １９７：  ３８５〜３９１，  １９９５の方法を以下のように改変して、全水溶性炭水化物（ＷＳＣ）を全粒から抽出した。本明細書では、ふすまを除去するためにそれ以上の分画（篩にかけるなど）をせずに成熟穀粒を製粉して得られる生成物として、全粒を定義する。したがって、全粒には穀粒のあらゆる構成成分が含まれる。
【０２０７】
オオムギ全粒（１００ｍｇ）を沸騰水浴中にて１０分間、１０ｍｌの８０％エタノール（ｖ／ｖ）で３回抽出した。各抽出物からの上清をプールし、凍結乾燥させ、２ｍｌのｍｉｌｌｉＱ水に再懸濁させた。比色マイクロタイタープレート酵素アッセイを説明されているように（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｓｃｉ  Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ  ７９：  ２３２〜２３６，  １９９９；  Ｒｕｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｕｎｃｔ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ  ３３：  ７９９〜８０９，  ２００６）使用して、スクロース、グルコース、フルクトースの量を測定した。糖、マルトース、フルクト−オリゴ糖（フルクタン）についても、Ｒｕｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６（上掲）に説明されているようにして高速陰イオン交換クロマトグラフィ（ＨＰＡＥＣ）で分析した。どちらの方法でも同等な値が得られた。
【０２０８】
マルトースレベルを判断するために、基本的にはＢｅｒｎｆｅｌｄ，  Ａｍｙｌａｓｅｓ  ａｐｌｐｈａ  ａｎｄ  ｂｅｔａ．  Ｉｎ：  Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｋａｐｌａｎ  （ｅｄｓ），  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ，  ＮＹ，  ｐ．  １４９，  １９５５に記載されているようにして、マルトース標準溶液を比較用に使用し、以下のようにしてオオムギ全粒から抽出した全糖をアッセイした。全糖を１０〜１００倍に希釈した。マルトース標準（チューブ１０本）を１ｍｌあたり０．３〜５マイクロモルとして調製した。マルトースの各希釈物（全糖またはマルトース希釈物）１ｍｌを１ｍｌのジニトロサリチル酸カラー試薬と混合した。糖溶液を１００℃で５分間インキュベートし、室温まで冷却した。１０ｍｌの試薬グレードの水を各チューブに加え、十分に混合した。Ａ540で分光光度計にて試料を測定した。ＨＰＡＥＣで上述したようにしてマルトースも求めた。
【０２０９】
酵素アッセイ
禾穀類の発育中の胚乳などの試料における総デンプン合成酵素活性については、タンパク質の抽出ならびに、Ｌｉｂｅｓｓａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ．  ７（８）：  １１１７〜１１２７，  １９９５  ｏｒ  Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １２０（１）：  ２０５〜１６，  １９９９に記載されている方法での分析によって測定すればよい。アッセイでは14Ｃ標識ＡＤＰＧ基質を使用し、デンプンポリマーへのモノマーの取り込みを測定する。抽出物中のデンプン合成酵素の個々のアイソフォームは、以下のようにしてゲル電気泳動で分離し、ゲル中でアッセイ（酵素電気泳動像）できるものである。発育中の種子などの試料からの抽出物を、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０％グリセロール、１０μＭ  Ｐｅｆａｂｌｏｃ、０．０５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）を使用して調製すればよい。緩衝液中で種子をパルプ状になるまで粉砕するか試料を均質化した後、混合物を１４，０００ｇで１５分間、４℃にて遠心処理し、上清を抜き出す。上清のタンパク質濃度を測定するには、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔまたは他の標準的な手段を使用すればよい。タンパク質抽出物を未変性ゲルにかけるのであれば、抽出物を−８０℃で保管すればよい。変性ゲル電気泳動のために、抽出物１００μlをＳＤＳおよびβ−メルカプトエタノールと混合し、混合物を沸騰水中で４分間インキュベートして、タンパク質を変性させる。４．５％ポリアクリルアミド濃縮ゲルを重畳した８％ポリアクリルアミド分離ゲルを使用して、標準的な変性ポリアクリルアミドゲルで、電気泳動を実施する。電気泳動後、緩衝液を交換するたびに少なくとも１００ｍＬの緩衝液を使用して、３０分ごとに緩衝液を交換しながらゲルを最低２時間４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に浸すことで、タンパク質を再生できる。非変性ゲルの場合は、ＳＤＳおよびβ−メルカプトエタノールを用いる変性ステップを省略し、ゲルからＳＤＳを省略する。Ｔｒｉｓ−グリシン（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１９Ｍ  グリシン）、０．１３３Ｍ硫酸アンモニウム、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、６７０μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、１ｍＭ  ＡＤＰＧ基質を含むデンプン合成酵素アッセイ緩衝液を使用し、デンプン合成酵素を検出した後、２％ＫＩ、０．２％Ｉ2ヨウ素溶液で染色して、デンプン産物を検出することもできる。
【０２１０】
あるいは、デンプン合成酵素または他のデンプン生合成酵素を、特異抗体を使用して（ＥＬＩＳＡ）試料で検出してもよい。
【０２１１】
遺伝型と種子構成成分またはデンプン特性との関係の統計分析
Ｇｅｎｓｔａｔバージョン９を用いて統計分析を実施した。粒重、総デンプン含有量、アミラーゼ含有量、β−グルカン含有量、糖含有量、デンプン粒サイズ、アミロペクチン鎖長分布について分散分析を実施して、遺伝型間のバリエーションに注目した最小有意差（ＬＳＤ、Ｐ＜０．０５）を得た。
【０２１２】
実施例２：植物の遺伝型解析
ｓｅｘ６−２９２ドナー系統（Ｈｉｍａｌａｙａ２９２）からａｍｏ１−ＡＣ３８反復親への３回の戻し交配を実施することで、ＳＳＩＩａおよびａｍｏ１座位での変異の有無に応じて分離している系統の個体群を生成した。ｓｅｘ６およびａｍｏ１座位の単独および組み合わせでのデンプン合成および穀粒組成に対する相対的な影響を調査するのに十分な固定の遺伝型を生成するために、ＢＣ３Ｆ２系統から単粒法で３世代の交配を実施した。ＳＳＩＩａ遺伝子における原因変異に対するマーカーを使用して、ＢＣ３Ｆ６系統のｓｅｘ６座位を遺伝型解析し（Ｍｏｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３ｂ（上掲））、かたや密に連鎖したマイクロサテライトマーカーＥＢｍａｃ０５０１を、実施例１で説明したようにしてａｍｏ１−３８状態の代用マーカーとして使用した。
【０２１３】
遺伝型解析をした７０のＢＣ３Ｆ６系統のうち、１４の系統がｓｅｘ６−２９２およびａｍｏ１−ＡＣ３８アレル（ｓｅｘ６−２９２／ａｍｏ１−ＡＣ３８）の両方に対してホモ接合であったためＳＳＩＩａ−ａｍｏ１二重変異体とみなし、１７の系統がｓｅｘ６−２９２および野生型ａｍｏ１−アレル（ｓｅｘ６−２９２／ａｍｏ１−ｗｔ）に対してホモ接合であったためＳＳＩＩａ単一変異体と称し、１０の系統が野生型ｓｅｘ６および変異体ａｍｏ１−ＡＣ３８アレル（ｓｅｘ６−ｗｔ／ａｍｏ１−ＡＣ３８）に対してホモ接合であったためａｍｏ１単一変異体と称したのに対し、１５の系統はｓｅｘ６およびａｍｏ１（ｓｅｘ６−ｗｔ／ａｍｏ１−ｗｔ）の両方に対して野生型で、野生型と称した。残りの系統は、ｓｅｘ６変異（７系統）またはＥＢｍａｃ０５０１マーカーのいずれかに対してヘテロ接合であった。
【０２１４】
ＨＡＧおよびＨｉｍａｌａｙａ２９２親系統間で多型であるＳＳＩＩＩａ遺伝子に対するＤＮＡマーカー（実施例３）も使用して、５６のホモ接合系統の遺伝型を判定した。この解析によって、２６の系統でＨＡＧのＳＳＩＩＩａ遺伝子の存在が示され、３０の系統でＨｉｍａｌａｙａ２９２のＳＳＩＩＩａ遺伝子の存在が示された。ＥＢｍａｃ０５０１およびＳＳＩＩＩａ遺伝子マーカーで遺伝型を判定した５６の系統のうち、５つの系統で組換え遺伝型が認められた。種子の整粒度を含む遺伝型および表現型とデンプン含有量とが相関する場合、ＥＢｍａｃ０５０１で遺伝型を判定した４つの系統ならびに、ＳＳＩＩＩａ遺伝子マーカーで遺伝型を判定した１つの系統で組換え表現型が得られた。このことから、マーカーとａｍｏ１座位との間で何らかの組換えがなされてデンプンの表現型が得られることが分かり、また、ａｍｏ１遺伝子およびＳＳＩＩＩａ遺伝子が、仮にオオムギでは密に連鎖しているとしても、遺伝的に異なることも分かった。
【０２１５】
籾付きまたは籾なし表現型では親の変種も異なっていた−ＨＡＧはオオムギの籾付き変種であるのに対し、Ｈｉｍａｌａｙａ２９２は籾なしであった。ＳＳＩＩａ−ａｍｏ１二重変異体はこの特徴で分離されるため、籾付きまたは籾なしという２つのサブグループに分類可能であった。したがって、上述したようにして区別されるオオムギ系統の４つの遺伝型を、５つの群すなわち、野生型系統、ＳＳＩＩａ単一変異体、ａｍｏ１単一変異体、籾なし二重変異体および籾付き二重変異体にカテゴリー分けした。デンプン粒分布、ＷＳＣ、ＣＥおよび種子形態の分析には５群各々から４つの系統を使用した。各遺伝型の１つの系統を胚乳構造およびデンプン粒形態に使用した。野生型１１系統、ａｍｏ１変異体９系統、ＳＳＩＩａ変異体１３系統、籾なし二重変異体４系統、籾付き二重変異体６系統を使用して、穀粒組成、アミロース含有量、粒重を以下のようにして分析した。
【０２１６】
粒重
ＢＣ３Ｆ６個体群からのホモ接合系統について、平均粒重（平均１００粒重）を測定した。平均粒重は、野生型１１系統で５２．７±５．０ｍｇ、ａｍｏ１の９系統で５２．８±２．８ｍｇ、ＳＳＩＩａ変異体１３系統で３８．７±２．５ｍｇ、籾付き二重変異体６系統で４７．６±４．５ｍｇ、籾なし二重変異体４系統で４４．７±１．０ｍｇであった。ａｍｏ１変異体系統および野生型系統の粒重間に統計的に有意な差異は認められなかった（Ｐ＜０．０５）ことから、ａｍｏ１変異が粒重に影響しないことが分かった。しかしながら、ＳＳＩＩａ単一変異体および二重変異体（籾付きおよび籾なし）の各々ならびに、それぞれ３つの他の遺伝型については、統計的に有意な差異が認められた（Ｐ＜０．０５）。２００７年の系統の別のガラス温室および野外実験では、ＢＣ３Ｆ７個体群で４つの遺伝型の粒重についても同様の観察結果が得られた。想定外かつ驚くべき結果として、ＳＳＩＩａ活性がなくアミロペクチン合成が減ることが原因だとされているＳＳＩＩａ変異の存在による粒重減少が、ａｍｏ１変異との組み合わせによって、ある程度相殺された。
【０２１７】
種子形態
各遺伝型についての代表的な４系統の無傷の種子を、双眼実体顕微鏡によって背面および縦溝側の両方で調べた。ＳＳＩＩａ単一変異体系統ではしわ型種子が生成されたのに対し、野生型およびａｍｏ１単一変異体系統では十分に膨らみのある整粒が生成された。二重変異体種子は、籾付きと籾なしの両方で、ＳＳＩＩａ変異体種子より膨らみがあるが、ａｍｏ１および野生型種子ほどは膨らんでいない中間体の表現型を有することが観察された。これらの観察結果は、粒重と一致していた。
【０２１８】
これらの遺伝型からの種子の整粒度の性質をさらに示すために、最大直径部分での種子中央部の横断面を調べた（図１）。野生型およびａｍｏ１変異体系統の横断面では、完全に満たされた胚乳が示されたのに対し、ＳＳＩＩａ変異体系統では、胚乳の充填密度がかなり低下した、不完全に満たされた（しわ型）種子が示された。ＳＳＩＩａ−ａｍｏ１二重変異体系統は、中間体の表現型を示し、胚乳はＳＳＩＩａ変異体胚乳よりは満たされているが野生型またはａｍｏ１変異体系統よりは満たされていなかった。
【０２１９】
さらに拡大率を上げて調べるために、すべての遺伝型のオオムギ種子の横断面を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で調べた。背面側の断面の表面で、野生型オオムギ穀粒に、区別できるサブアリューロン細胞層を含む大きさ約２０〜２５μｍ×２０〜２５μmの正方形のアリューロン細胞が認められ、胚乳は平らで丸い細胞で満たされて、大きさ２１０μm×１３０μm前後の細胞の境界が明確であった。ｓｅｘ６−ｗｔ／ａｍｏ１−ＡＣ３８変異体では、アリューロン細胞が矩形であり、寸法約２０〜２５μm×１０〜１５μmであった。サブアリューロン細胞が明確に区別され、胚乳には平らな細胞が含まれて、明確な細胞境界が認められた。これは、おおよそのサイズが２３０μm×３０μmの野生型系統の場合よりも長く狭かった。ｓｅｘ６−２９２／ａｍｏ１−ｗｔ変異体は、大きさ４５〜５０μm×５〜１０μmの不規則な矩形のアリューロン細胞を示し、サブアリューロン細胞は明確には区別されず、胚乳には大きさ９０〜９５μm×２５〜３０μmの不規則な細胞が満たされていた。ｓｅｘ６−２９２／ａｍｏ１−ＡＣ３８二重変異体遺伝型の場合、アリューロン細胞はほぼ正方形で大きさが約２０μm×２０μm、サブアリューロン細胞は同定できないほど区別できず、胚乳には約１１０μm×９０μmの明確な境界がある平らで丸い細胞を含んでいた。
【０２２０】
総デンプン含有量
実施例１で説明したようにして、４つの遺伝型でのＢＣ３Ｆ６種子の総デンプン含有量を測定した。デンプン含有量は、平均で野生型系統が６４．３±２．４％、ａｍｏ１変異体系統が５７．２±２．８％、ＳＳＩＩａ変異体系統が３４．９±４．０％、籾なし二重変異体系統が５０．８±２．８％、籾付き二重変異体系統が４７．６±２．３％であった（図２）。野生型系統と比較して、ａｍｏ１変異体、籾なし二重変異体、籾付き二重変異体、ＳＳＩＩａ変異体系統はそれぞれ、総デンプン量が７．１％、１３．５％、１６．７％、２９．４％と少ないものであった。これらの値は、籾なしおよび籾付き群の値が有意に異なっていない場合を除いて、５群（Ｐ＜０．０５）で統計的に異なっていた。２００７における別のガラス温室および野外実験でのＢＣ３Ｆ７穀粒に対しては５群の粒重で一貫した関係も得られた（Ｐ＜０．０５）。これらのデータから、ＳＳＩＩａ単一変異体種子と比較して、ＳＳＩＩａ−ａｍｏ１二重変異体種子で観察される粒重が増えたのは、デンプン含有量増加によるものであった。
【０２２１】
アミロース含有量
４つの遺伝型のすべての系統についてアミロース含有量を測定した。野生型系統ではアミロース含有量３２．０±３．２％、ａｍｏ１変異体では４９．５±２．７％、ＳＳＩＩａ変異体系統では５７．６±１０．０％、籾なし二重変異体６２．２±４．１％、籾付き二重変異体５９．８±２．３％の範囲であった。統計分析によって、ａｍｏ１変異体および野生型系統よりもＳＳＩＩａ変異体系統および二重変異体系統のほうが種子中のアミロース含有量が有意に高いことが示されたが、ＳＳＩＩａ変異体および二重変異体のアミロース含有量は有意に異なってはいなかった（Ｐ＜０．０５）ことから、ＳＳＩＩａ変異が穀粒の総デンプン量に対するアミロースの割合を増したことが分かった。ただし、ａｍｏ１変異を加えても、アミロースの割合がそれ以上有意には増加しなかった。遺伝型間のこれらのアミロース含有量の差異を、２００７に栽培されたＢＣ３Ｆ７系統で考慮した。
【０２２２】
デンプン鎖長分布
遺伝型がデンプン鎖長分布に対しておよぼす作用を調べるために、デンプンをＢＣ３Ｆ６交配個体群の各群４系統から単離し、Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＦＡＣＥ）によって分析した。鎖の比率を、ＤＰ６〜８、ＤＰ９〜１４、ＤＰ１５〜２４、ＤＰ３５〜３４、ＤＰ３５〜４４、ＤＰ＞４５からなる容器でプールした。ＳＳＩＩａ変異体、籾なし二重変異体および籾付き二重変異体の容器間で統計的に有意な差異は認められなかった（Ｐ＜０．０５）。しかしながら、野生型ＳＳＩＩａアレルを含む群と変異体ＳＳＩＩａアレルを含む群との間では大きな差異があった（Ｐ＜０．０５）。ＳＳＩＩａ変異体アレルを含むこれらの遺伝型では、ＤＰ６〜８の鎖の割合が高く、このサイズが鎖の１０％を超え、ＤＰ９〜１４の鎖の割合も増えていた。また、ＤＰ１５〜２４では鎖が減少した。野生型系統は、５％ＤＰ６〜８鎖長未満であった。ａｍｏ１変異体では、ＤＰ９〜１４の量が統計的に有意に低下し、ＤＰ１５−２４の量は増加した。
【０２２３】
デンプン粒のサイズ分布
ｓｅｘ６およびａｍｏ１遺伝型が胚乳デンプンにおけるデンプン粒のサイズに対しておよぼす作用を調査するために、各群ＢＣ３Ｆ６戻し交配個体群の４つの選択系統について、デンプン粒のサイズ分布を調べた。結果は、野生型、ａｍｏ１変異体、ＳＳＩＩａ変異体、籾なし二重変異体および籾付き二重変異体のＢデンプン粒（直径＜７μｍと定義）含有量が、それぞれ各系統の総デンプン量に対して２０．２±６．４％、３０．７±３．６％、１７．５±１．８％、１９．７±３．６％および１８．３±７．２％であった。ａｍｏ１変異体種子には、他の４群の種子より有意に多くのＢデンプン粒が含まれていた。
【０２２４】
直径１０μmを超える分布ピークの平均粒サイズ（Ａデンプン粒）も評価した。Ａデンプン粒の平均サイズは、野生型系統で１８．９±０．５μm、ａｍｏ１変異体で１０．９±０．３μm、ＳＳＩＩａ変異体で１６．４±２．６μm、籾なし二重変異体で１８．７±０μm、籾付き二重変異体で１７．５±０．６μmであった。統計分析によって、ａｍｏ１変異体種子に、オオムギの他の４群各々の種子よりも有意に小さなＡデンプン粒が含まれていることが分かった（Ｐ＜０．０５）。野生型、ＳＳＩＩａ変異体、籾なし二重変異体、籾付き二重変異体の種子のＡ粒間で統計的に有意な差異は認められなかった（Ｐ＜０．０５）。
【０２２５】
デンプン粒の形態
５群の系統からの精製オオムギデンプンをヨウ素で染色し、通常の光学顕微鏡下で調べた。そのアミロース含有量と一致して、すべての遺伝型のデンプン粒がヨウ素での染色後に紫色になった。偏光光学顕微鏡下では、野生型種子およびａｍｏ１種子の９０％を超えるデンプン粒で結晶デンプン粒の「マルトースクロス」複屈折のサインが認められた。しかしながら、ＳＳＩＩａ変異体または二重変異体種子の１０％未満のデンプン粒でこのような複屈折が認められた。
【０２２６】
ＳＥＭ下で観察すると、野生型系統の穀粒は正常な球形のデンプン粒を呈したのに対し、ａｍｏ１変異体遺伝型では、上述した分析の結果に一致する小さな球形のＡデンプン粒が得られた。ＳＳＩＩａおよび二重変異体種子のデンプンは、主に小さな変形デンプン粒を示した。変形デンプン粒が得られる２つの変異体のうち、ＳＳＩＩａ変異体系統では管状で細長いＡ粒（２６μｍ×１２μｍ）になるのに対し、籾なし二重変異体の種子ではＡ粒の一層顕著な管状の伸びが認められた（２８μｍ×２１μｍ）。
【０２２７】
オオムギ種子の横断面で、胚乳マトリクスにおけるデンプン粒の場所を調べた。野生型系統には、複数の平らで球形のデンプンＡ粒が複数の小さなＢデンプン粒を囲む形で含まれていたのに対し、ａｍｏ１変異体系統は、複数のゆるく詰まったデンプン粒が小さなＢデンプン粒を囲む形で含まれていた。横断面でＳＳＩＩａ変異体種子のデンプン粒を明確に識別することはできなかった。籾なし二重変異体系統では、胚乳細胞にレンズ形のデンプンＡ粒が密に詰まっていた。
【０２２８】
β−グルカン含有量
ＢＣ３Ｆ６個体群のすべての系統について、β−グルカン含有量を測定した。β−グルカン含有量は、野生型系統で６．０±０．５％（５．３％〜７．０％の範囲）、ａｍｏ１変異体系統で８．２±０．５％（７．６％〜８．４％の範囲）、ＳＳＩＩａ変異体で７．６±１．４％（５．９％〜１１．３％の範囲）、籾なし二重変異体で７．１±０．４％、籾付き二重変異体で６．５±０．８％（５．５％〜７．７％の範囲）であった。統計分析によって、ａｍｏ１変異体、ＳＳＩＩａ変異体、籾なし二重変異体種子が、野生型系統および籾付き二重変異体系統の種子より有意に多くのβ−グルカンを含有していることが示された（Ｐ＜０．０５）が、β−グルカン含有量という点では、ａｍｏ１変異体、ＳＳＩＩａ変異体、籾なし二重変異体には統計的に有意な差異は認められず、野生型と籾付き二重変異体種子との間にも統計的に有意な差異は認められなかった。
【０２２９】
これらの５群から選択されたＦ７系統の統計分析をガラス温室または圃場条件下で栽培したところ、各試験で、ａｍｏ１変異体系統の種子のほうが二重変異体系統の種子よりも多くのβ−グルカンを含むことが示された。ＳＳＩＩａ変異体または二重変異体種子間でβ−グルカン含有量に有意な差異はなかった。
【０２３０】
ペントサン含有量
５群からの系統でペントサン含有量を測定した。ペントサン含有量は、野生型系統で４．９±０．６％、ａｍｏ１変異体系統で４．９±１．１％、ＳＳＩＩａ変異体で７．３±１．４％、籾なし二重変異体で５．０±０．３％、籾付き二重変異体で６．５±１．０％であった。統計分析によって、ＳＳＩＩａ変異体系統および籾付き二重変異体の両方とも、野生型系統、ａｍｏ１変異体、籾なし二重変異体系統よりも有意に多くのペントサンを含有することが示された（Ｐ＜０．０５）が、ＳＳＩＩａ変異体系統と籾付き二重変異体との間、あるいは野生型系統、ａｍｏ１変異体、籾なし二重変異体間に、ペントサン含有量の有意な差異はなかった。
【０２３１】
灰分含有量
５群の種子で灰分含有量を測定した。灰分含有量は、野生型種子で２．５±０．１％、ａｍｏ１変異体種子で２．６±０．２％、ＳＳＩＩａ変異体種子で３．１±０．３％、籾なし二重変異体種子で２．１±０．１％、籾付き二重変異体種子で２．７±０．１％であった。野生型、ａｍｏ１変異体または籾付き二重変異体種子と比較して、ＳＳＩＩａ変異体種子は有意に多くの灰分を、籾なし二重変異体種子は有意に少ない灰分を含有していたが、野生型系統、ａｍｏ１変異体系統、籾付き二重変異体間に、灰分含有量の有意な差異は認められなかった。
【０２３２】
水溶性炭水化物
変異が単独または組み合わせでオオムギ種子における水溶性炭水化物の含有量に対しておよぼす作用を判断するために、各群の４系統を分析した。野生型種子の水溶性炭水化物の組成と比較して、ａｍｏ１種子は有意に異なるレベルの全ＷＳＣ、遊離グルコース、スクロースまたはマルトースまたはフルクタンを含有しなかった。しかしながら、ＳＳＩＩａ変異体および二重変異体種子は、これらの炭水化物各々を有意に多い量で含有していた（Ｐ＜０．０５）。ＳＳＩＩａ単一変異体の種子は、有意に多くのフルクトース、スクロース、全ＷＳＣを含有していた。
【０２３３】
タンパク質含有量
５群の種子でタンパク質含有量を測定した。タンパク質含有量は、野生型種子で１０．３±０．８％、ａｍｏ１変異体種子で１０．４±１．１％、ＳＳＩＩａ変異体種子で１２．６±０．９％、籾なし二重変異体種子で１４．６±０．６％、籾付き二重変異体種子で１３．８±１．４％であった。籾なしおよび籾付き二重変異体種子の両方とも、ＳＳＩＩａ変異体種子、野生型種子またはａｍｏ１変異体種子よりも有意に多くのタンパク質を含有していたが、籾なしおよび籾付き二重変異体種子間あるいは、ａｍｏ１変異体と野生型種子との間に、タンパク質含有量の有意な差異は認められなかった。
【０２３４】
脂質含有量
５群の種子で脂質含有量を測定した。全脂質含有量は、野生型種子で２．９±０．２％、ａｍｏ１変異体種子で３．５±０．３％、ＳＳＩＩａ変異体種子で６．４±０．９％、籾なし二重変異体種子で４．９±０．３％、籾付き二重変異体種子で５．０±０．３％であった。ＳＳＩＩａ変異体種子は、籾なしおよび籾付き二重変異体種子、野生型種子、ａｍｏ１変異体種子よりも有意に多くの脂質を含有していたが、籾なしおよび籾付き二重変異体種子間あるいは、ａｍｏ１変異体および野生型種子間には、有意な差異は認められなかった。
【０２３５】
考察
本研究の目的は、ｓｅｘ６およびａｍｏ１座位間の劣性変異の相互作用を調べることであった。これらの変異の各々が、野生型に比してアミロース表現型の増加につながり、アミロース含有量は一般にＳＳＩＩａ変異体種子のデンプン中で６０〜７０％、ａｍｏ１−ＡＣ３８種子で３５〜４５％である。ｓｅｘ６（ｓｅｘ６−ｗｔおよびｓｅｘ６−２９２）およびａｍｏ１（ａｍｏ１−ｗｔおよびａｍｏ１−ＡＣ３８）座位の４つの考えられる遺伝型の判断は、本研究では重要な態様のひとつであった。Ｓｅｘ６座位の変異体および野生型アレルは、デンプン合成酵素ＩＩａ遺伝子における原因変異に基づいて、マーカーを使用して明確に区別できるものであった。ａｍｏ１座位での変異の厳密な性質は未知のままであるため、密に連鎖したマーカー（Ｂｍａｃ０５０１、コンセンサスマップロケーション５８．０ｃＭ）を用いてａｍｏ１座位を含む染色体領域の存在をアッセイした。
【０２３６】
本研究の一目的は、これらの変異を組み合わせることによるアミロース含有量に対する影響を調べることであった。データから、ＳＳＩＩａ変異体座位を単独で持つ系統に対してＳＳＩＩａ変異体およびａｍｏ１−ＡＣ３８座位を組み合わせた場合に、アミロースの割合に統計的に有意な差異はないことが示された。しかしながら、ＳＳＩＩａおよびａｍｏ１−ＡＣ３８変異の組み合わせでは、ＳＳＩＩａ変異単独の場合よりもデンプン含有量および粒重が増すという、デンプン合成および穀粒重量に想定外の結果が生じた。
【０２３７】
オオムギＳＳＩＩａ変異体は、アミロースの比率が高いデンプンを含有していた。データから、穀粒ベースで野生型穀粒と比較してＳＳＩＩａ変異体穀粒がデンプンを平均でわずか４０％しか含まないことが示された。よって、ＳＳＩＩａ変異体種子の高アミロース表現型は、アミロペクチンが優先的に低減されることによるものであり、これは、アミロースが２５％しか減少しないのに比して７５％も減少した。ＳＳＩＩａ−ａｍｏ１二重変異体穀粒の場合、同じく野生型（３１％減少）に比してアミロペクチン合成が減少したが、種子１個あたりのアミロース含有量が増加した（３７％増加）。これらの結果は興味深く、ａｍｏ１遺伝子産物がアミロペクチン合成に関与しているだけでなく、アミロースの合成を抑制していることを示唆していた。
【０２３８】
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）での一過性のデンプン合成におけるデンプン合成酵素ＩＩＩ遺伝子の役割についての過去の研究によって、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １３８：  ６６３〜６７４，  ２００５では、デンプン合成酵素ＩＩＩが葉におけるデンプン合成のネガティブレギュレーターであると結論付けた。コメでは、ＳＳＩＩＩａおよびＳＳＩＩＩｂの２つのデンプン合成酵素ＩＩＩ遺伝子が周知である。これらの遺伝子のうち、ＳＳＩＩＩａはデンプン合成時に胚乳で発現されるのに対し、ＳＳＩＩＩｂは胚乳発育の早期には発現されるが、登熟後のデンプン合成が極めて活発になる期間には発現されない（Ｏｈｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｏ  ５６：  ３２２９〜３２４４，  ２００５）。コメにおけるＳＳＩＩＩａの変異は、デンプン含有量を減少させなかったが、アミロース含有量が約１５％から２０％に増加したことから、アミロペクチン合成の減少とこれに伴うアミロース合成の増加が生じたのではないかと示唆された（Ｆｕｊｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７（上掲））。この観察結果と一致するのは、ＧＢＳＳＩおよびＳＳＩ活性の増加であった（Ｆｕｊｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７（上掲））。Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００（上掲）は、ＳＳＩＩＩ遺伝子（ここではＳＳＩＩＩａと呼ぶ）をコムギ染色体１の短アームに配置したが、これはオオムギのａｍｏ１座位の場所とは矛盾しない場所であった。このため、ＳＳＩＩＩａ遺伝子が、ａｍｏ１座位で破壊される原因遺伝子の候補遺伝子であった。しかしながら、実験によって、ＳＳＩＩＩａタンパク質がａｍｏ１変異体で発現されてデンプン合成酵素活性を有することが示され、ＳＳＩＩＩａとａｍｏ１遺伝子との間で組換えイベントがあったことが示された。そのことは、これらが独特な遺伝子であることを表していた。
【０２３９】
ａｍｏ１変異体アレルがデンプン鎖長分布に対しておよぼす影響はわずかであった。野生型の背景では、ａｍｏ１変異体アレルが存在することで短鎖長（ＤＰ９〜１４）がわずかに減少し、ＤＰ１５〜２４画分が増加した。ＳＳＩＩａ変異体の背景では、ａｍｏ１変異体座位が鎖長分布に対しておよぼす作用が無視できるものであった。対照的に、ＳＳＩＩａ変異体アレルは、アミロペクチンの構造に大きく影響し、よって鎖長分布に大きく影響し、短鎖（ＤＰ６〜８およびＤＰ９〜１４）の割合が増加し、ＤＰ１５〜２５の鎖が減少した。
【０２４０】
ＳＳＩＩａおよびａｍｏ１変異体アレルの組み合わせによって、想定外の表現型が得られた。この表現型では、ＳＳＩＩａ変異体アレルしか含まない系統の特性と比較して、デンプン含有量および粒重が部分的に回復した。
【０２４１】
実施例３：オオムギＡＭＯ１座位に連鎖した遺伝子マーカー
ａｍｏ１変異座位は、オオムギ染色体１Ｈの約５６．５ｃＭにマッピングされている（Ｂａｒｌｅｙ−  ＢｉｎＭａｐ  ２００５，  ＧｒａｉｎＧｅｎｅ  ｄａｔａｂａｓｅ）。ａｍｏ１座位と密に連鎖した遺伝子マーカーを試験するために、オオムギ染色体１Ｈの５６．００ｃＭと６４．６０ｃＭとの間に局在する１１のＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｅａｔ）マーカー（Ｒａｍｓａｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．  １５６（４）：  １９９７−２００５，  ２０００）を選択し、２つの親の系統である高アミロース性グラシェル大麦（ＨＡＧ）およびＨｉｍａｌａｙａ２９２からのＰＣＲ産物の増幅を試験した。これらのＳＳＲマーカーは、ＥＢｍａｃ０４０５、Ｂｍａｇ０１０５、Ｂｍａｃ００６３、ＨＶＭ２０Ｆ、ＥＢｍａｃ０５６０ａ、ＥＢｍａｃ０５０１、Ｂｍａｃ００４４、Ｂｍａｃ００３２、Ｂｍａｇ０１１３、Ｂｍａｇ０２１１、Ｂｍａｇ０３５０であった。これらのＳＳＲマーカーのプライマーを、穀粒遺伝子データベースに列挙された配列に従って合成した。
【０２４２】
各２０μlのＰＣＲ反応で、５０ｎｇのゲノムＤＮＡ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、０．１２５ｍＭの各ｄＮＴＰ、１０ｐｍｏｌのプライマー、０．５Ｍのグリシンベタイン、１μlのＤＭＳＯ、１．５ＵのＨｏｔｓｔａｒ  Ｔａｑポリメラーゼ（ＱＩＡＧＥＮ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用した。ＳＳＲマーカー増幅用のＰＣＲ条件は、９５℃で４分間を１サイクル、９４℃で３０秒間を１５サイクル、６５℃から５０℃まで１サイクルごとに１℃ずつ下げて３０秒間、７２℃で１分２０秒、９４℃で１５秒間を３０サイクル、５０℃で１５秒間、７２℃で４５秒間、２５℃で１分間を１サイクルとした。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルでの電気泳動によって分離し、ＧｅｌＲｅｄ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）染色後にゲルドキュメンタリー（ｄｏｃｕｍｅｎｔａｒｙ）（ＵＶｉｔｅｃ）で可視化した。
【０２４３】
１１のＳＳＲマーカーを試験した場合、１１のマーカーのうち２つすなわち、６４．６ｃＭに局在するＢｍａｃ００３２と５８．０ｃＭに局在するＥＢｍａｃ０５０１で、ＨＡＧおよびＨｉｍａｌａｙａ２９２親の植物からのＤＮＡに異なるサイズのＰＣＲ産物が得られた。すなわち、これらのマーカーは、２つの親変種間で多型を示した。増幅産物のサイズは、Ｂｍａｃ００３２およびＥＢｍａｃ０５０１マーカーを使用すると、ＨＡＧで１７５ｂｐおよび１８９ｂｐフラグメント、Ｈｉｍａｌａｙａ２９２で２３０ｂｐおよび１５０ｂｐであった。両方のＳＳＲマーカーを使用して、７０のＢＣ３Ｆ６系統の遺伝型を判定した。Ｂｍａｃ００３２マーカーで遺伝型判定した系統ではいずれも、ＨＡＧで同一サイズのフラグメントが得られた。これは、系統がすべてＢｍａｃ００３２とａｍｏ１座位との間で組換えられ、ＳＳＲマーカーＢｍａｃ００３２がａｍｏ１座位とは密に連鎖していないことを示していた。対照的に、ＥＢｍａｃ０５０１マーカーを用いて遺伝型を判定した７０のＢＣ３Ｆ６系統のうち、５６がフラグメントパターンの一方または他方に対してホモ接合であった。５６のホモ接合系統のうち、２５でＨＡＧからのＥＢｍａｃ０５０１マーカーが示され、３１がＨｉｍａｌａｙａ２９２からのＥＢｍａｃ０５０１マーカーを呈した。これらの結果から、ＥＢｍａｃ０５０１マーカーではａｍｏ１座位との遺伝子組換えの頻度が高くないことが分かった。よって、ＳＳＲマーカーであるＥＢｍａｃ０５０１は、ａｍｏ１−ＡＣ３８座位に対する密に連鎖したマイクロサテライトマーカーである。
【０２４４】
オオムギのＳＳＩＩＩａ遺伝子に基づくマーカー
ａｍｏ１座位はオオムギのＳＳＩＩＩａ遺伝子の近くであろうと考えられていた。この可能性を試験してオオムギのＳＳＩＩＩａ遺伝子に基づくＤＮＡマーカーを開発するために、ＳＳＩＩＩａ遺伝子の一部をまず２つの親の変種から単離した。ＨＡＧおよびＨｉｍａｌａｙａ２９２由来のＤＮＡを、コムギＳＳＩＩＩａゲノムＤＮＡ配列に基づくプライマーを用いてＰＣＲフラグメントの増幅に使用した（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００（上掲））。コムギＳＳＩＩＩａ遺伝子のエキソン７に局在しているオリゴヌクレオチドプライマーＳＳＩＩＩａＦ（５’−ＧＧＡＧＧＴＣＴＣＧＧＧＧＡＴＧＴ−３’（配列番号７））と、エキソン８に局在しているＳＳＩＩＩａＲ（５’−ＧＣＴＣＣＡＧＧＡＡＧＴＡＡＡＣＧＧＴＣＡＧＧ−３’（配列番号８））を、４６４ｂｐの産物のＰＣＲ増幅に使用した。それぞれのＰＣＲ反応（２０μl）で、５０ｎｇのゲノムＤＮＡ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、０．１２５ｍＭの各ｄＮＴＰ、１０ｐｍｏｌのプライマー、０．５Ｍのグリシンベタイン、１μlのＤＭＳＯ、１．５ＵのＨｏｔｓｔａｒ  Ｔａｑポリメラーゼを使用した。９５℃で５分間を１サイクル、９４℃で４５秒間を３５サイクル、５８℃で３０秒間、７２℃で１分間、７２℃で１０分間を１サイクル、２５℃で１分間を１サイクルで、ＰＣＲ反応を実施した。各増幅で４６４ｂｐのフラグメントが生成された。このＰＣＲフラグメントを０．５単位のＳｈｒｉｍｐ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＵＳＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  ＵＳＡ）、２．５単位のＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ、１×ＰＣＲ緩衝液（ＱＩＡＧＥＮ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）で、ＵＳＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのプロトコールに従って処理し、製造業者が説明しているように、自動ＡＢＩシステムを用いて色素ターミネーターで配列決定した。
【０２４５】
４６４ｂｐのフラグメントには配列の差異があり、これによって一方のフラグメントにはＮｌａＩＶ制限部位が生じたが、他方にはなかった。よって、ＰＣＲ産物をこの酵素で処理した後、２％アガロースゲルで電気泳動すると、ＳＳＩＩＩａ遺伝子を２つの親の変種と区別する都合のよい手段になった。４６４ｂｐのＤＮＡフラグメントだけの生成ではＨｉｍａｌａｙａ２９２由来のＳＳＩＩＩａ遺伝子の存在が示され、３０３ｂｐおよび１６１ｂｐの両方のＤＮＡフラグメントの生成では、ＨＡＧからのＳＳＩＩＩａ遺伝子の存在が示された。
【０２４６】
実施例４：ＳＳＩＩａ−ａｍｏ１二重変異体の野外実験
圃場で栽培した場合のＳＳＩＩａ−ａｍｏ１二重変異体の収量性を評価するために、籾なし二重変異体３系統、籾付き二重変異体２系統、籾なしＳＳＩＩａ変異体４つ、籾付きＳＳＩＩａ変異体１系統、籾なし野生型オオムギ１系統（栽培種Ｔｏｒｒｅｎｓ）、籾付き野生型オオムギ２系統（栽培種Ｔａｎｔａｎｇａｒａ，  Ｓｌｏｏｐ）をＮａｒｒａｎｄｅｒａおよびＭｏｒｅｅ，  ＮＳＷ、Ａｕｓｔｒａｌｉａで２００８に栽培した。各オオムギ系統を、どちらの現場でも灌水条件下と非灌水（乾地）条件下の両方で栽培した。どちらの現場でも各系統について２つのプロットを各条件下にて無作為のパターンで栽培した。オオムギ種子（１２０ｇ）を各プロットに蒔いた（１９ｍ2）。
【０２４７】
各プロットを２００８年１２月に収穫した後で得られた穀粒重量を測定した。Ｎａｒｒａｎｄｅｒａでは、灌水下、二重変異体、ＳＳＩＩａ変異体および籾なし野生型系統で、１プロットあたりそれぞれ２．２３±０．１６ｋｇ、１．１４±０．５７ｋｇ、１．６５±０．７９ｋｇの穀粒が生産された。乾地条件下では、二重変異体、ＳＳＩＩａ変異体および籾なし野生型系統で、１プロットあたりそれぞれ０．５５±０．３４ｋｇ、０．１１±０．１２ｋｇ、０．４１±０．１６ｋｇの穀粒が生産された。
【０２４８】
Ｍｏｒｅｅでは、灌水下、二重変異体、ＳＳＩＩａ変異体および籾なし野生型系統で、それぞれ１．６２±０．７２ｋｇ、０．５４±０．４０ｋｇ、２．１１±０．０８ｋｇの穀粒が生産された。乾地条件下では、二重変異体、ＳＳＩＩａ変異体および籾なし野生型系統で、それぞれ０．８８±０．３３ｋｇ、０．３８±０．２７ｋｇ、１．１４±０．３４ｋｇのオオムギ穀粒が生産された。
【０２４９】
このように、どちらの現場でも、灌水条件下と非灌水条件下の両方で、籾なし二重変異体および籾なし野生型系統で、似たような収量の穀粒が生産されたが、これは籾なしＳＳＩＩａ変異体での収量よりも有意に多かった。
【０２５０】
籾付きオオムギ系統の穀粒収量：
Ｎａｒｒａｎｄｅｒａでは、灌水下で、二重変異体、ＳＳＩＩａ変異体および籾付き野生型系統で、１プロットあたりそれぞれ２．７７±０．３７ｋｇ、２．０９±０．７６ｋｇ、４．３９±２．５９ｋｇの穀粒が生産された。乾地条件下では、二重変異体、ＳＳＩＩａ変異体および籾付き野生型系統で、それぞれ０．６０±０．０６ｋｇ、０．３５±０．１４ｋｇ、０．５９±０．４６ｋｇの穀粒が生産された。
【０２５１】
Ｍｏｒｅｅでは、灌水条件下で、二重変異体、ＳＳＩＩａ変異体および籾付き野生型系統で、１プロットあたりそれぞれ２．１５±０．８１ｋｇ、１．２４±０．１２ｋｇ、２．７３±０．９６ｋｇの穀粒が生産された。乾地条件下では、二重変異体、ＳＳＩＩａ変異体および籾付き野生型系統で、１プロットあたりそれぞれ１．１９±０．４０ｋｇ、０．７６±０．６０ｋｇ、２．１３±０．２３ｋｇの穀粒が生産された。
【０２５２】
このように、どちらの現場でも、灌水条件下と非灌水条件下の両方で、籾付き野生型系統のほうが籾付き二重変異体および籾付きＳＳＩＩａ変異体系統よりも多くの穀粒が得られ、籾付き二重変異体のほうが籾付きＳＳＩＩａ変異体よりも多くの穀粒を生産した。
【０２５３】
実施例５．  食品の製造
２００８年にＹａｎｃｏ，  ＮＳＷ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａの圃場で栽培した１１のオオムギ系統から穀粒を収穫し、製粉して粉を製造した。これらの系統は、籾なし二重変異体３系統、籾付き二重変異体２系統、Ｈｉｍａｌａｙａ２９２を含むＳＳＩＩａ変異体３系統、野生型（栽培種ＴａｎｔａｎｇａｒａおよびＨｉｍａｌａｙａ）２系統、ａｍｏ１変異体（ＨＡＧ）１系統であった。これらの系統から収穫した穀粒をＱｕａｄｒｕｍａｔ  Ｊｎｒ．ミルで製粉し（Ｂｒａｂｅｎｄｅｒ  Ｑｕａｄｒｕｍａｔ  Ｊｎｒ．  Ｍｉｌｌ，  Ｃｙｒｕｌｌａ’ｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｓｙｄｎｅｙ，  ＮＳＷ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、粉を製造した。これをその後、直径３００μmの篩下においた。Ｑｕａｄｒｕｍａｔ製粉前に調整レジメ（ｔｅｍｐｅｒｉｎｇ  ｒｅｇｉｍｅ）は適用しなかった。
【０２５４】
１１のオオムギ系統それぞれについて、２つのタイプの小さな（１０ｇ）パンを焼いた。これらの試験目的で小さなローフを焼いたが、この方法は業務での量まで容易に規模を拡大可能である。一方のタイプのパンを成分として上述したように製粉したオオムギ粉１００％で作り、他方のタイプのパンを粉成分としての粉３０％と市販の小麦粉７０％のブレンドで作った。粉（１３．０２ｇ）と他の成分とを混合し、ピークドウ形成時間３５ｇミキソグラフになるまでドウにした。それぞれの場合に粉１３．０２ｇで使用したレシピは、粉１００％、塩２％、乾燥酵母１．５％、植物油２％、改良剤１．５％であった。水の添加レベルは、完全調合用に調節したｍｉｃｒｏ  Ｚ−ａｒｍ吸水値に基づくものとした。２段階のプルーフステップにて、４０℃および室内湿度８５％で、成型およびパニングを実施した。１９０℃で１４分間かけて、Ｒｏｔｅｌで焼成した。
【０２５５】
焼成後、１０ｇのパンローフを、１００％オオムギのパンのバッチでは−８０℃で３週間、３０％オオムギのパンのバッチでは１週間保管した後、実施例１で説明したようなＲＳ含有量およびＧＩレベルを分析した。ＲＳ含有量については、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの手法によって難消化性デンプン含有量を求めた。１０ｇのパンローフと適当な標準を一緒にした二重の試料を人工唾液と混合し、得られるボーラスを膵臓および胃の酵素とともに生理学的ｐＨおよび温度でインキュベートした。従来の酵素および分光光度による方法を用いて消化管内容物における残留デンプンの量を求め、試料の難消化性デンプン含有量を試料重量に対する比率で表した。
【０２５６】
ＧＩレベルを求めるには、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの手法を利用した。
【０２５７】
オオムギ全粒のＲＳ含有量
まず、オオムギ遺伝型の各群からの全粒製粉について、ＲＳ含有量とＧＩレベルを求めた。ＲＳ含有量は、ａｍｏ１変異体、籾なし二重変異体、籾付き二重変異体、ＳＳＩＩａ変異体、野生型全粒でそれぞれ０．９％、３．５±０．３％、３．４±０．１％、１．９％、０．５±０．１％であった（表１）。予想外なことに、籾なしおよび籾付き二重変異体の両方の全粒で、ａｍｏ１変異体、ＳＳＩＩａ変異体および野生型全粒に比して、それぞれＲＳ含有量が約３．５倍、２．３倍、１０倍多かった。重要なことに、籾なしおよび籾付き二重変異体の両方からの全粒に、ＳＳＩＩａ変異体からの全粒よりも有意に多くのＲＳが含まれていた。籾なし二重変異体および籾付き二重変異体全粒間、あるいはａｍｏ１変異体および野生型全粒間に、ＲＳ含有量に統計的に有意な差異は認められなかった。ＧＩレベルは５群のオオムギ全粒で異なっていたが、統計的に有意に異なってはいなかった。
【０２５８】
１００％オオムギ粉を含むパンのＲＳ含有量
１００％オオムギ粉を含むパンのＲＳ含有量を求めた。これを表２にあげておく。分析によって、粉成分として１００％オオムギ全粒で作られたパンのＲＳ含有量は、ａｍｏ１変異体、籾なし二重変異体、籾付き二重変異体、ＳＳＩＩａ変異体、野生型穀粒で２．２±０．３％、５．５±０．１％、５．６±０．３％、２．１±０．４％、０．８±０．３％であることが示された（表３）。統計分析によって、籾なしおよび籾付き二重変異体オオムギの全粒で作られたパンでは、ＲＳ含有量がＳＳＩＩａ変異体、ａｍｏ１  変異体および通常のオオムギ系統の場合よりも有意に高くなることが分かった（表３）。籾なしおよび籾付き二重変異体の粉を１００％含有するパンでＲＳ含有量に有意な差異は認められなかった。籾なしおよび籾付き二重変異体のどちらで作ったパンでも、ＳＳＩＩａ変異体、ａｍｏ１変異体および通常のオオムギから作ったパンよりもＲＳ含有量がそれぞれ２．５倍、２．５倍および６．７倍多かった（表３）。
【０２５９】
３０％オオムギ粉を含むパンのＲＳ含有量
３０％オオムギ粉を含むパンのＲＳ含有量を求めた。これを表４にあげておく。ａｍｏ１変異体、籾なし二重変異体、籾付き二重変異体、ＳＳＩＩａ変異体、野生型全粒から作られたパンのＲＳ含有量は、それぞれ１．９±０．３％、３．１±０．２％、３．０±０．１％、２．０±０．３％、０．９±０．１％であった（表３）。籾なしおよび籾付き二重変異体オオムギの両方から作ったパンでは、ＳＳＩＩａ変異体、ａｍｏ１変異体および通常のオオムギ穀粒からのパンよりもＲＳ含有量が有意に高かった（表３）。籾なしおよび籾付き二重変異体の粉を３０％含むパンでのＲＳ含有量に有意な差異は認められなかった。籾なしおよび籾付き二重変異体のパンでは、ＳＳＩＩａ変異体、ａｍｏ１変異体および通常のオオムギ系統から作ったパンよりもＲＳ含有量がそれぞれ１．６倍、１．６倍、３．３倍高かった（表３）。
【０２６０】
デンプン１ｇあたりのＲＳ（ｍｇ）でＲＳ含有量を算出し、二重変異体から作られたパンで、ＲＳ増加の性質を分析した。これらのデータを分析し、ＲＳ含有量の増加が総デンプン量の増加によるものか、あるいはデンプン構造の変化によるものかを分析した。その結果から、ａｍｏ１変異体、籾なし二重変異体、籾付き二重変異体、ＳＳＩＩａ変異体、野生型穀粒からのオオムギ１００％の粉で作られるパンは、パンのデンプン１ｇあたりＲＳが４１．７、１０５．１±２．８、１０６．９±３．３、７５．０±８．１、１６．３±４．５ｍｇであった（図４．６）。籾なし二重変異体および籾付き二重変異体のどちらのパンでも、ａｍｏ１変異体、ＳＳＩＩａ変異体および野生型穀粒からのパンよりもＲＳが約２．５倍、１．４倍、６．５倍になった。統計分析によって、オオムギの４群のいずれから作ったパンでも、野生型系統からの場合よりＲＳが多かったが、両方の二重変異体からのパンのＲＳ含有量（デンプン１ｇあたりのＲＳ（ｍｇ））は、ａｍｏ１変異体、ＳＳＩＩａ変異体からの場合よりも統計的に有意に高かった（Ｐ＜０．０５）ことが示された。ＳＳＩＩａ変異体穀粒のパンは、ａｍｏ１変異体からのものよりもＲＳが統計的に有意に多かった。
【０２６１】
１００％オオムギのパンのＧＩレベル
すべてのオオムギ系統からの１００％オオムギ粉を含むパンのＧＩレベルを求めた。これを表２にあげておく。ａｍｏ１変異体、籾なし二重変異体、籾付き二重変異体、ＳＳＩＩａ変異体および野生型穀粒からのパンのＧＩレベルは、それぞれ６８．５±２．１、６３．５±４．５、６０．８±４．１、６３．９±１０．３、８０．３±２．９であった（表７）。統計分析では、籾なしおよび籾付き二重変異体ならびにＳＳＩＩａ変異体の穀粒どちらから作られたパンでも、ａｍｏ１変異体および通常のオオムギ系統からの場合に比してＧＩが有意に低い値になる（表７）ことが分かった。籾なしおよび籾付き二重変異体ならびに、ＳＳＩＩａ変異体穀粒の１００％粉を含むパンでは、ＧＩ値に有意な差異は認められなかった。籾なしおよび籾付き二重変異体ならびに、ＳＳＩＩａ変異体穀粒からのパンでは、ＧＩレベルがａｍｏ１変異体および正常なオオムギ系統の約８０％であった（表７）。
【０２６２】
３０％オオムギパンのＧＩレベル
すべてのオオムギ系統からの３０％オオムギ粉を含むパンのＧＩレベルを求めた。これを表４にあげておく。ａｍｏ１変異体、籾なし二重変異体、籾付き二重変異体、ＳＳＩＩａ変異体、野生型系統からのパンのＧＩレベルは、それぞれ８４．５±３．５、８３．２±２．１、８３．５±０．８、８２．３±３．９、８７．８±４．５であった（表７）。５群のオオムギから作られたパンのＧＩ値は、統計的に有意に異なっていた。
【０２６３】
結論
籾なしおよび籾付き二重変異体オオムギ穀粒からの全粒は、ａｍｏ１変異体、ＳＳＩＩａ変異体および野生型穀粒からの全粒よりもＲＳ含有量が有意に高かった。両方の二重変異体からの全粒は、ａｍｏ１変異体、ＳＳＩＩａ変異体および野生型系統からの全粒に比して、ＲＳ含有量が約３．５倍、１．８倍、７．０倍高かった。同様のパターンで、二重変異体オオムギ穀粒から作られたパンは、ＳＳＩＩａ変異体、ａｍｏ１変異体および野生型オオムギから作られたパンよりもＲＳ含有量が有意に高かった。ＲＳ含有量の増加がデンプン１ｇあたりで観察されたことから、ＲＳ含有量の増加は高アミロースデンプン量の増加だけによるものではなく、デンプン構造の変化にもよるものであった。
【０２６４】
二重変異体およびＳＳＩＩａ変異体のどちらの穀粒からのパンでも、ａｍｏ１変異体および野生型穀粒の両方からの場合よりもＧＩ値が有意に低くなった。ＳＳＩＩａ−ａｍｏ１二重変異体穀粒およびＳＳＩＩａ変異体穀粒を含むパンのＧＩ値は、パンを１００％オオムギ粉で作る場合にａｍｏ１変異体および野生型穀粒を含むパンよりも約７％および２０％低かった。
【０２６５】
実施例６：フルクタンの大規模製造
約１０％フルクタンを有すると、ＳＳＩＩａおよびａｍｏ１のオオムギ穀粒変異体を使用してフルクタンおよび、高アミロースデンプンおよびβ−グルカンなどの他の産物を単離および精製することが可能である。広い土地での農業で容易に生産可能な穀粒からこのように製造すると、たとえば、チコリからのイヌリン抽出を必要とする既存のフルクタン製造方法に比してコスト効率がよくなる。
【０２６６】
フルクタンの大規模抽出は、穀粒を全粒粉に製粉した後、粉からのフルクタンを含む全糖を水に入れて抽出することで達成可能である。これは、周囲温度で実施でき、あとから混合物を遠心処理または濾過する。次に、上清を約８０℃まで加熱し、遠心処理してタンパク質を除去した上で乾燥させる。あるいは、８０％エタノールを用いて粉の抽出を実施することも可能である。この場合、続いて水／クロロホルム混合物を用いて相分離を実施し、糖およびフルクタンを含有する水性相を乾燥させて水に再度溶解させる。いずれかの方法で調製した抽出物中のスクロースを、α−グルコシダーゼを加えて酵素的に除去した後、ゲル濾過によってヘキソース（単糖）を除去し、さまざまなサイズのフルクタン画分を生成することができる。これによって、少なくとも８０％がフルクタンであるフルクタンが豊富な画分が得られる。
【０２６７】
【表１】
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【０２６８】
【表２】
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【０２６９】
【表３】
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【０２７０】
【表４】
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【０２７１】
【表５】
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【０２７２】
【表６】
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【０２７３】
【表７】
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【０２７４】
【表８】
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【０２７５】
【表９】
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【０２７６】
【表１０】
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【０２７７】
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Ｙａｍａｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ，  １０１：  ２１２９，  ２０００
Ｙａｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，    Ｊ  Ｃｅｒｅａｌ  Ｓｃｉ，  ２４：  １３１−１３７，  １９９６
Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １３８：  ６６３−６７４，  ２００５
Ｚｗａｒ  ａｎｄ  Ｃｈａｎｄｌｅｒ，  Ｐｌａｎｔａ  １９７：  ３９−４８，  １９９５
【図２】
0005982282.tif 000012
【図１】
0005982282.tif 000013
【配列表】
0005982282000001.app