(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１からなる成熟ヒトＣＤ２４の配列を含むＣＤ２４タンパク質を含む、哺乳動物における関節リウマチの処置のための薬学的組成物であって、該ＣＤ２４タンパク質は、配列番号１のすぐＣ末端にアラニンもバリンも含まない、薬学的組成物。
【請求項２】
前記ＣＤ２４タンパク質がヒトＣＤ２４の細胞外ドメインを含み、該細胞外ドメインは前記成熟ＣＤ２４のＮ末端に融合されている、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記細胞外ドメインが配列番号４の配列からなる、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記ＣＤ２４タンパク質が可溶性である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記ＣＤ２４タンパク質がグリコシル化されている、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記ＣＤ２４タンパク質が、前記成熟ＣＤ２４のＮ末端またはＣ末端に融合されている、哺乳動物免疫グロブリン（Ｉｇ）の一部をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記Ｉｇの一部が、ヒトＩｇタンパク質のＦｃ部分である、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記Ｆｃ部分が、前記ヒトＩｇタンパク質のヒンジ領域およびＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインからなり、前記Ｉｇが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびＩｇＡからなる群より選択される、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記Ｆｃ部分が、ＩｇＭのヒンジ領域およびＣＨ３ドメインおよびＣＨ４ドメインからなる、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記ＣＤ２４タンパク質が、真核生物のタンパク質発現系を使用して産生される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記発現系が、チャイニーズハムスター卵巣細胞系統に含まれるベクターまたは複製欠損レトロウイルスベクターを含む、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記複製欠損レトロウイルスベクターが真核細胞のゲノムに安定に組込まれる、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記ＣＤ２４タンパク質の配列が配列番号５からなる、請求項８に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
これは、２０１０年４月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／３２９，０７８号の利益を主張する。この内容は、参考として本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、関節リウマチを治療するための組成物および方法に関連する。
【背景技術】
【０００３】
このセクションは、背景の情報（これは、必ずしも先行技術ではない）、および本開示の一般的な概要（これは、本開示の完全な範囲または本開示の特徴の全ての包括的な開示ではない）を提供する。
【０００４】
ＣＤ２４は、熱安定性抗原として公知である（１（非特許文献１））。それは、グリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）−アンカー分子として発現し（２（非特許文献２））、そして異なる系統において広い分布を有する（３（非特許文献３））。ＣＤ２４の、未熟細胞に発現する傾向のために、それはまた幹細胞マーカーの一部として、およびリンパ球分化のために使用されてきた。ＣＤ２４に関連する最初の機能は、抗原特異的Ｔ細胞反応の共起刺激活性である（４−６）。インビボ研究は、リンパ系臓器におけるＴ細胞活性化の共起刺激因子（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）として、ＣＤ２４は余分であるが、ＣＤ２８の非存在下では必須になることを示した（７、８）。これは、それほど「共起刺激因子リッチ」ではない局所の標的臓器にはあてはまらない。この考えと一致して、本発明者らは、ＣＤ２４の標的化変異を有するマウスが、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）の誘発に完全に抵抗性であることを示した（９）（１０）。
【０００５】
ヒトＣＤ２４の多型は、多発性硬化症および関節リウマチ（ＲＡ）を含む、いくつかの自己免疫疾患のリスクおよび進行と関連する（１１−１５）。多発性硬化症の場合、本発明者らは、マウスＣＤ２４の細胞外部分およびヒトＩｇＧ１Ｆｃから成る可溶性ＣＤ２４が、実験的自己免疫疾患、多発性硬化症のマウスモデルの臨床症状を改善したことを報告した（９）。本発明者らのうち一人による、より最近の研究は、ＣＤ２４は危険関連分子パターン（ＤＡＭＰ）と相互作用し、そしてそれに対する宿主反応を抑制することを示した（１６）。
【０００６】
ＲＡは、ヒト集団の０．５−１％に罹患する。多くの疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）が現在利用可能であるが、生物学的ＤＭＡＲＤのゴールドスタンダード、腫瘍壊死因子アルファを標的とする治療薬でさえ、処置を受けた患者の５０％未満でしか、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  Ｃｒｉｔｅｒｉａにしたがって５０％の改善（ＡＣＲ５０）を引き起こさない（１７）。ＲＡの治療は利用可能でない。従って、ＲＡのさらなる治療薬を試験することが必要である。ＲＡは、関節における自己免疫疾患と考えられるが、疾患の原因は大部分不明なままである。多くの研究が、関節リウマチの病因にＴ細胞を関係づけた（１８）。より最近には、抗体の移動が、マウスの関節の炎症の発生を引き起こし得ることを示した（１９−２１）。病変の病理は、ヒト関節リウマチに似ている。
【０００７】
抗体によるＲＡの受動伝達による研究から確立された最も興味深いコンセプトの１つは、その抗体が普遍的に発現するタンパク質に特異的でも、組織特異的自己免疫疾患を観察し得ることである（１９−２１）。この考えは、共通の病因にも関わらず、異なる臓器／組織の自己免疫疾患は、異なる処置を必要とし得ることを示唆するので、重要である。この考えを支持して、多発性硬化症の処置に広く使用されるインターフェロンβは、ＲＡの処置にほとんど効果を示さない（２２）。
【０００８】
ヒトＲＡに関連する動物モデルは、ＤＭＡＲＤにおける治療薬開発の進歩に重要な役割を果たした。例えば、マウスおよびラットにおけるコラーゲン誘発関節炎は、ＲＡの治療薬の開発のために重要であった（２３）。より最近には、抗コラーゲン抗体の養子（ａｄａｐｔｉｖｅ）伝達は、マウスにおいて確固としたＲＡ様の病変を引き起こすことが示された（１９）。疾患の発症前に、ＲＡ患者において自己抗体が増加しているので（２４、２５）、コラーゲン特異的抗体の受動伝達は、ヒトＲＡの関連するモデルである。
【０００９】
ＲＡの病因は、ＤＡＭＰに対する宿主反応が関与し（２６、２７）、かつＣＤ２４分子はＤＡＭＰに対する宿主反応を負に調節するので（１６）、本発明者らは、ＲＡを処置するために可溶性ＣＤ２４を使用することの可能性を調査した。ヒト疾患への関連性および実験デザインの単純性の両方のために、ＲＡの受動伝達モデルを選択した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｔ．、Ｇ．Ｇａｌｆｒｅ、Ｄ．Ｓ．Ｓｅｃｈｅｒ、およびＣ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｍｕｒｉｎｅ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９７８）８：５３９〜５５１
【非特許文献２】Ｐｉｅｒｒｅｓ，Ｍ．、Ｐ．Ｎａｑｕｅｔ、Ｊ．Ｂａｒｂｅｔ、Ｓ．Ｍａｒｃｈｅｔｔｏ、Ｉ．Ｍａｒｉｃｓ、Ｃ．Ｄｅｖａｕｘ、Ｍ．Ｂａｒａｄ、Ｒ．ＨｙｍａｎおよびＧ．Ｒｏｕｇｏｎ、Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  ｍｕｒｉｎｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｅｔ  ｍａｒｋｅｒ  Ｊ１１ｄ  ｉｓ  ａｔｔａｃｈｅｄ  ｔｏ  ａ  ｇｌｙｃｏｓｙｌ−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｃｈｏｒ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８７）１７：１７８１〜１７８５
【非特許文献３】Ｒｏｕｇｏｎ，Ｇ．、Ｌ．Ａ．Ａｌｔｅｒｍａｎ、Ｋ．Ｄｅｎｎｉｓ、Ｘ．Ｊ．Ｇｕｏ、およびＣ．Ｋｉｎｎｏｎ、Ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｈｅａｔ−ｓｔａｂｌｅ  ａｎｔｉｇｅｎ：  ａ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｂｏｔｈ  ｔｈｅ  ｈｅｍａｔｏｌｙｍｐｈｏｉｄ  ａｎｄ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅａｇｅｓ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９１）２１：１３９７〜１４０２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
ＣＤ２４タンパク質を、関節リウマチの処置を必要とする哺乳動物に投与することによって、関節リウマチを処置するための方法が、本明細書中で提供される。そのＣＤ２４タンパク質は、成熟マウスＣＤ２４または成熟ヒトＣＤ２４、またはその改変体の配列を含み得る。成熟ヒトＣＤ２４は、配列番号１または２の配列から成り得る。成熟マウスＣＤ２４は、配列番号３の配列から成り得る。そのＣＤ２４タンパク質はまた、マウスまたはヒトＣＤ２４の細胞外ドメインを含み得、それは成熟ＣＤ２４のＮ末端に融合し得る。ＣＤ２４の細胞外ドメインは、配列番号４の配列から成り得る。ＣＤ２４タンパク質はさらに、哺乳動物免疫グロブリン（Ｉｇ）の一部を含み得、それは成熟ＣＤ２４のＮ末端またはＣ末端に融合し得る。そのＩｇの一部は、ヒトＩｇタンパク質のＦｃ部分であり得、それはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、またはＩｇＡであり得る。そのＦｃ部分は、ヒトＩｇタンパク質のヒンジ領域およびＣＨ２およびＣＨ３ドメインから成り得る。そのＦｃ部分はまた、ヒトＩｇＭのヒンジ領域およびＣＨ３およびＣＨ４ドメインから成り得る。
【００１２】
そのＣＤ２４タンパク質は、可溶性であり得、そしてグリコシル化され得る。そのＣＤ２４タンパク質を、真核生物のタンパク質発現系を用いて産生し得る。その発現系は、チャイニーズハムスター卵巣細胞系統に含まれるベクターまたは複製欠損レトロウイルスベクターを含み得る。その複製欠損レトロウイルスベクターは、真核細胞のゲノムに安定に組込まれ得る。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
関節リウマチを処置するための方法であって、該方法は、関節リウマチの処置を必要とする哺乳動物にＣＤ２４タンパク質を投与する工程を包含する、方法。
（項目２）
前記ＣＤ２４タンパク質が、成熟マウスＣＤ２４もしくは成熟ヒトＣＤ２４、またはそれらの改変体の配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記成熟ヒトＣＤ２４が、配列番号１および２からなる群より選択される配列からなり、そして前記成熟マウスＣＤ２４が、配列番号３の配列からなる、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記ＣＤ２４タンパク質がマウスＣＤ２４またはヒトＣＤ２４の細胞外ドメインを含み、該細胞外ドメインは前記成熟ＣＤ２４のＮ末端に融合されている、項目２に記載の方法。
（項目５）
前記細胞外ドメインが配列番号４の配列からなる、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記ＣＤ２４タンパク質が可溶性である、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記ＣＤ２４タンパク質がグリコシル化されている、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記ＣＤ２４タンパク質が、前記成熟ＣＤ２４のＮ末端またはＣ末端に融合されている、哺乳動物免疫グロブリン（Ｉｇ）の一部をさらに含む、項目２に記載の方法。
（項目９）
前記Ｉｇの一部が、ヒトＩｇタンパク質のＦｃ部分である、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記Ｆｃ部分が、前記ヒトＩｇタンパク質のヒンジ領域およびＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインからなり、前記Ｉｇが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびＩｇＡからなる群より選択される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記Ｆｃ部分が、ＩｇＭのヒンジ領域およびＣＨ３ドメインおよびＣＨ４ドメインからなる、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記ＣＤ２４タンパク質が、真核生物のタンパク質発現系を使用して産生される、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記発現系が、チャイニーズハムスター卵巣細胞系統に含まれるベクターまたは複製欠損レトロウイルスベクターを含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記複製欠損レトロウイルスベクターが真核細胞のゲノムに安定に組込まれる、項目１３に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ＣＤ２４融合タンパク質、ＣＤ２４ＩｇＧ１Ｆｃのアミノ酸組成である（配列番号５）。下線部の２６アミノ酸は、ＣＤ２４のシグナルペプチドである（配列番号４）。配列の四角で囲った太字の部分は、融合タンパク質に使用した成熟ＣＤ２４タンパク質である（配列番号１）。通常は成熟ＣＤ２４タンパク質に存在する、最後のアミノ酸（ＡまたはＶ）は、免疫原性を回避するために、構築物から欠失させた。下線を引いておらず、太字でない文字は、ヒンジ領域およびＣＨ１およびＣＨ２ドメインを含む、ＩｇＧ１Ｆｃの配列である（配列番号６）。
【図２】図２は、哺乳動物細胞系統から発現した、ＣＤ２４ＩｇＧ１Ｆｃの精製および処理の方法を示す。
【図３】図３は、マウス（配列番号３）およびヒト（配列番号２）の成熟ＣＤ２４タンパク質間のアミノ酸配列のバリエーションである。可能性のあるグリコシル化部位は太字であり、Ｎ−グリコシル化部位は赤色である。
【図４】図４は、ＲＡに対するＣＤ２４Ｉｇの治療効果を示す。８−１０週齢のオスＢＡＬＢ／ｃマウスに、２ｍｇ／マウスのＡｒｔｈｒｉｔｏＭａｂ関節炎誘発抗体カクテル（ＭＤｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｓｔ  Ｐａｕｌ、ＭＮ）を静脈内に免疫化した。２日後、そのマウスに、ＰＢＳに溶解した９０μｇのＬＰＳをｉ．ｐ．注射した。疾患の進行を、以下のスコアシステムによって毎日モニターした。０．反応無し、正常；１．軽度、しかし足首／手首の明確な発赤および腫脹、または罹患した指の数に関わらず、個々の指に限定された明らかな発赤および腫脹；２．中程度から重度の足首／手首の発赤および腫脹；３．肢全体の発赤および腫脹；４．複数の関節が関与する、指を含む最大限に炎症を起こした四肢。示したデータは、４本の肢の複合スコアである（平均±ＳＥ）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。２つの群間の差異はまた、フィッシャーのＰＬＳＤテストに基づいて有意である。
【図５】図５は、ＣＤ２４ＩｇＧ１の薬物動態（Ｐｈａｒｍａｃｏｋｅｎｉｔｉｃｓ）の、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎコンパートメントモデル分析である。白丸は３匹のマウスの平均を示し、そして線は予測される薬物動態曲線である。ａ．１ｍｇのＣＤ２４ＩｇＧ１のｉ．ｖ．注射、ｂ．１ｍｇのＣＤ２４ＩｇＧ１のｓ．ｃ．注射、ｃ．曲線下面積（ＡＵＣ）、半減期および最高血中濃度によって測定した、血液中の抗体の全量の比較。全体的に、その差は統計学的に有意ではないが、ｓ．ｃ．注射のＡＵＣおよびＣｍａｘは、ｉ．ｖ．注射の約８０％であることに注意すること。
【図６】図６は、ＣＤ２４−ＳｉｇｌｅｃＧ（１０）相互作用が、ＰＡＭＰおよびＤＡＭＰの間を区別することを示す。Ａ．ＰＡＭＰに対する宿主反応は、ＣＤ２４−ＳｉｇｌｅｃＧ（１０）相互作用によって影響されなかった。Ｂ．ＣＤ２４−ＳｉｇｌｅｃＧ（１０）相互作用は、おそらくＳｉｇｌｅｃＧ／１０関連ＳＨＰ−１によって、ＤＡＭＰに対する宿主反応を抑制する。
【図７】図７は、ＣＤ２４Ｆｃの単回注射が、ＣＡＩＡの臨床スコアを低減することを示す。ａ．実験のダイアグラム。ＢＡＬＢ／ｃマウス（８週齢）に、ビヒクルまたは融合タンパク質のいずれかと組み合わせて、１日目にｍＡｂを与えた。３日目に、そのマウスにＬＰＳを注射し、そして３週間毎日観察した。ｂ．ＣＤ２４Ｆｃは、ＣＡＩＡの臨床スコアを低減する。融合タンパク質（１ｍｇ／マウス）またはビヒクルを、１日目に１回注射した。二重盲検（ｄｏｕｂｌｅ  ｂｌｉｎｄ）で臨床スコアを決定した。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。全部でＰＢＳ群の５２匹のマウスおよびＣＤ２４Ｆｃ群の５４匹のマウスを含む、６回の独立した実験で、ＣＤ２４の効果を再現した。
【図８】図８は、ＣＤ２４Ｆｃが、関節およびＣＡＩＡにおいて炎症性サイトカインのレベルを低減することを示す。ＣＡＩＡを、図７ａのダイアグラムのように開始および処置した。炎症性サイトカインを、ＢＤｐｈａｒｍｉｎｇｅｎのサイトカインビーズアレイによって測定した。ａ．代表的なＦＡＣＳプロファイル。ｂ．関節ホモジネートで測定した、低減されたサイトカインのまとめ（平均±ＳＥ）。
【図９】図９は、ＣＤ２４Ｆｃが、関節において軟骨の炎症および破壊を低減することを示す。７日目に、ＣＤ２４Ｆｃ処置マウスおよびコントロールマウスの両方由来の前肢および後肢を解剖し、４％パラホルムアルデヒドで２４時間固定し、続いて５％ギ酸で脱灰した。次いで肢をパラフィンに包埋し、そして長手方向の断面をＨ＆ＥおよびサフラニンＯレッド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。
【図１０】図１０は、ＣＡＩＡ誘発の５日目に投与したＣＤ２４Ｆｃの治療効果を示す。ＣＡＩＡ誘発マウスを、２つの群に無作為化し、ビヒクル（ＰＢＳ）またはＣＤ２４Ｆｃのいずれかを与えた。そのマウスを、二重盲検でスコアをつけた。３つの独立した実験の代表的なものを示す。
【図１１】図１１は、低用量のＣＤ２４Ｆｃが、ＣＡＩＡの発症を予防することを示す。ａ．実験のダイアグラム。ｂ．二重盲検でスコアをつけた、関節炎の臨床スコア。
【図１２】図１２は、Ｓｉｇｌｅｃｇが、ＣＤ２４Ｆｃの治療効果に必須であることを示す、ＷＴ（ａ）およびＳｉｇｌｅｃｇ−／−マウス（ｂ）に、担体コントロールまたはＣＤ２４Ｆｃのいずれかを、抗コラーゲンｍＡｂのカクテルと組み合わせて与えた。二重盲検で、その臨床スコアを毎日記録した。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明者らは、ＣＤ２４の可溶性形態が、関節リウマチの処置のために非常に有効であることを発見した。
【００１５】
１．定義
本明細書中で使用される用語は、特定の実施態様のみを説明する目的のためであり、そして制限することを意図しない。明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を指示しなければ、複数の指示対象を含む。
【００１６】
本明細書中における数値範囲の列挙に関して、その間にあるそれぞれの数字が、同じ程度の正確さで、明白に企図される。例えば、６−９の範囲に関して、数字７および８が、６および９に加えて企図され、そして６．０−７．０の範囲に関して、数字６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０が明白に企図される。
【００１７】
「ペプチド」または「ポリペプチド」は、アミノ酸の連結した配列であり、そして天然、合成、または天然および合成の修飾または組み合わせであり得る。
【００１８】
「実質的に同一」は、１番目および２番目のアミノ酸配列が、１，２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、または３００アミノ酸の領域にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であることを意味し得る。
【００１９】
動物を疾患から保護することに言及する場合「処置」または「処置すること」は、その疾患を予防すること、抑制すること（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ）、抑圧すること（ｒｅｐｒｅｓｓｉｎｇ）、または完全に除去することを意味する。疾患を予防することは、その疾患の発症前に本発明の組成物を動物に投与することを含む。疾患を抑制することは、疾患の誘発後であるが、その臨床的出現の前に、本発明の組成物を動物に投与することを含む。疾患を抑圧することは、疾患の臨床的出現後に、本発明の組成物を動物に投与することを含む。
【００２０】
「改変体」は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によって、アミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持するペプチドまたはポリペプチドを意味し得る。「生物学的活性」の代表的な例は、Ｔｏｌｌ様受容体に結合する、および特異的な抗体によって結合される能力を含む。改変体はまた、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわちアミノ酸を、同様の特性（例えば親水性、荷電領域の程度および分布）の異なるアミノ酸で置換することは、当該分野において典型的に小さい変化を含むと認識される。これらの小さい変化を、部分的には、当該分野において理解されるように、アミノ酸のハイドロパシー指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）を考慮することによって同定し得る。Ｋｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸のハイドロパシー指標は、その疎水性および電荷の考慮に基づく。同様のハイドロパシー指標のアミノ酸を置換し、そして依然としてタンパク質機能を保持し得ることが、当該分野で公知である。１つの局面において、±２のハイドロパシー指標を有するアミノ酸を置換する。アミノ酸の親水性をまた、生物学的機能を保持するタンパク質を生じる置換を明らかにするために使用し得る。ペプチドの状況におけるアミノ酸の親水性の考慮は、そのペプチドの最も大きい局所平均親水性の計算を可能にし、それは抗原性および免疫原性とよく関連することが報告された有用な尺度である。米国特許第４，５５４，１０１号（これは、本明細書中において完全に参考として援用される）。同様の親水性の値を有するアミノ酸の置換は、当該分野で理解されるように、生物学的活性、例えば免疫原性を保持するペプチドを生じ得る。お互いに±２以内の親水性の値を有するアミノ酸で置換を行い得る。アミノ酸の疎水性インデックス（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ）および親水性の値はどちらも、そのアミノ酸の特定の側鎖によって影響される。その観察と一致して、生物学的機能と適合性であるアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、および他の性質によって明らかになるような、アミノ酸、および特にそれらのアミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存することが理解される。
【００２１】
２．ＣＤ２４
本明細書中でＣＤ２４タンパク質が提供され、それは、ＳＥＴＴＴＧＴＳＳＮＳＳＱＳＴＳＮＳＧＬＡＰＮＰＴＮＡＴＴＫ（配列番号１）またはＳＥＴＴＴＧＴＳＳＮＳＳＱＳＴＳＮＳＧＬＡＰＮＰＴＮＡＴＴＫ（Ｖ／Ａ）（配列番号２）であり得る成熟ヒトＣＤ２４、またはＮＱＴＳＶＡＰＦＰＧＮＱＮＩＳＡＳＰＮＰＴＮＡＴＴＲＧ（配列番号３）であり得るマウスＣＤ２４、またはその改変体のアミノ酸配列を有し得る。ＣＤ２４は可溶性であり得る。ＣＤ２４はさらに、Ｎ末端シグナルペプチドを含み得、それはアミノ酸配列ＭＧＲＡＭＶＡＲＬＧＬＧＬＬＬＬＡＬＬＬＰＴＱＩＹＳ（配列番号４）を有し得る。ＣＤ２４はまた、図１または３で記載されるアミノ酸配列を有し得る。ＣＤ２４は、成熟ヒトＣＤ２４のＣ末端アミノ酸が、バリンまたはアラニンであり得るように、２つの対立遺伝子形態の１つで存在し得る。Ｃ末端バリンまたはＣ末端アラニンは免疫原性であり得、そしてその免疫原性を低減するためにＣＤ２４から削除され得る。２つの対立遺伝子間の差異は、多発性硬化症およびＲＡを含む自己免疫疾患のリスクに影響し得る。それにも関わらず、その２つの対立遺伝子形態は膜結合形態の発現レベルに影響するので、それらの変異はＣＤ２４の機能には影響しないはずである。
【００２２】
マウスおよびヒトの成熟ＣＤ２４タンパク質のアミノ酸配列におけるかなりの配列変異にも関わらず、それらは危険関連分子パターン（ＤＡＭＰ）との相互作用において機能的に等価である。ＤＡＭＰに対する宿主反応は、ＲＡの病因に重要であると考えられるので、マウスおよびヒトＣＤ２４は、ＲＡの処置において機能的に等価であり得る。主にＣ末端、およびグリコシル化部位の存在量（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）におけるマウスおよびヒトＣＤ２４の間の配列保存の結果として、特にそれらの変異がＣ末端の保存された残基に影響を与えない、またはマウスまたはヒトＣＤ２４由来のグリコシル化部位に影響を与えないなら、ＲＡを処置するためのＣＤ２４の使用において、成熟ＣＤ２４タンパク質のかなりの変異は許容され得る。
【００２３】
ａ．融合
ＣＤ２４を、そのＮ末端またはＣ末端で、ヒトまたはマウスであり得る哺乳動物Ｉｇタンパク質の一部に融合し得る。その一部は、Ｉｇタンパク質のＦｃ領域であり得る。そのＦｃ領域は、Ｉｇタンパク質のヒンジ領域およびＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含み得る。そのＩｇタンパク質は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、またはＩｇＡであり得る。そのＦｃ部分は、配列番号６を含み得る。そのＩｇタンパク質はまた、ＩｇＭであり得、そしてそのＦｃ部分はＩｇＭのヒンジ領域およびＣＨ３およびＣＨ４ドメインを含み得る。ＣＤ２４をまた、そのＮ末端またはＣ末端で、タンパク質タグに融合し得、それはＧＳＴ、Ｈｉｓ、またはＦＬＡＧであり得る。融合タンパク質の作成および融合タンパク質の精製の方法は、当該分野において周知である。
【００２４】
ｂ．産生
ＣＤ２４は、高い程度でグリコシル化され得、そして危険関連分子パターンとの共起刺激および相互作用のような、ＣＤ２４の機能に関与し得る。ＣＤ２４を、真核細胞発現系を用いて調製し得る。その発現系は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような、哺乳動物細胞におけるベクターからの発現を伴い得る。その系はまた、真核細胞に感染させるために使用し得る、複製欠損レトロウイルスベクターのような、ウイルスベクターであり得る。ＣＤ２４をまた、細胞ゲノムに組込まれたベクターまたはベクターの一部からＣＤ２４を発現する安定な細胞系統から産生し得る。その安定な細胞系統は、組込まれた複製欠損レトロウイルスベクターからＣＤ２４を発現し得る。その発現系は、ＧＰＥｘＴＭであり得る。
【００２５】
３．処置方法
ＣＤ２４を、関節リウマチを処置するために使用し得る。ＣＤ２４を、その必要のある被験体に投与し得る。その被験体は、ヒトのような哺乳動物であり得る。
【００２６】
ａ．組み合わせたＣＤ２４治療
ＣＤ２４を、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）のような、別の薬物と組み合わせ得る。その薬物は、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）であり得、それはプロピオン酸誘導体、酢酸誘導体、エノール酸（ｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）誘導体、フェナム酸（ｆｅｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）誘導体、または選択的Ｃｏｘ２阻害剤であり得る。その薬物はまた、コルチコステロイドまたはメトトレキサートであり得る。その薬物は、生物学的製剤であり得、それは抗ＴＮＦ−α抗体またはＴＮＦ−αに結合する融合タンパク質（Ｅｎｂｒｅｌ）のようなＴＮＦ−αアンタゴニスト、抗ＣＤ２０ｍＡｂ、２つの分子に結合するモノクローナル抗体または融合タンパク質（ＣＴＬＡ４Ｉｇ）のような共起刺激分子ＣＤ８０およびＣＤ８６のアンタゴニスト、またはＩＬ−１またはＩＬ−６のいずれかの受容体のアンタゴニストであり得る。ＣＤ２４および他の薬物を、一緒に、または逐次投与し得る。
【００２７】
ｂ．薬学的組成物
ＣＤ２４は、薬学的組成物に含まれ得、それはＣＤ２４を長期間安定に維持し得る溶媒を含み得る。その溶媒はＰＢＳであり得、それは−２０℃（−１５〜−２５℃）で、ＣＤ２４を少なくとも３６ヶ月間安定に維持し得る。その溶媒は、他の薬物と組み合わせてＣＤ２４を収容し得る。
【００２８】
ｃ．投与量
ヒトのために使用する用量を、許容可能な毒性および臨床有効性を有する用量を決定するための臨床試験によって、最終的に決定し得る。ヒトのための最初の臨床用量を、げっ歯類および非ヒト霊長類における薬物動態学および毒性試験によって推定し得る。ＣＤ２４の用量は、処置されている疾患の重症度および投与経路に依存して、０．０１ｍｇ／ｋｇから１０００ｍｇ／ｋｇであり得る、および１から５００ｍｇ／ｋｇであり得る。
【００２９】
ｄ．投与
その薬学的組成物の投与経路は、非経口であり得る。非経口投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、髄腔内、関節内および罹患した関節への直接投与を含むがこれに限らない。獣医学的使用のために、その薬剤を、通常の獣医学上の実施によって適当に許容可能な処方物として投与し得る。獣医は、特定の動物に関して最も適当な投与レジメンおよび投与経路を容易に決定し得る。薬学的組成物を、ヒト患者、ネコ、イヌ、大型動物、または鳥類に投与し得る。
【００３０】
ＣＤ２４を、他の処置と同時に、または規則正しく投与し得る。本明細書中で使用される「同時の」または「同時に」という用語は、ＣＤ２４および他の処置を４８時間、好ましくは２４時間、より好ましくは１２時間、さらにより好ましくは６時間、および最も好ましくは３時間またはそれより短い時間以内に、お互いを投与することを意味する。本明細書中で使用される「規則正しく」という用語は、他の処置とは異なる時間で、かつ反復投与と比較してある頻度での、薬剤の投与を意味する。
【００３１】
ＣＤ２４を、約１２０時間、１１８時間、１１６時間、１１４時間、１１２時間、１１０時間、１０８時間、１０６時間、１０４時間、１０２時間、１００時間、９８時間、９６時間、９４時間、９２時間、９０時間、８８時間、８６時間、８４時間、８２時間、８０時間、７８時間、７６時間、７４時間、７２時間、７０時間、６８時間、６６時間、６４時間、６２時間、６０時間、５８時間、５６時間、５４時間、５２時間、５０時間、４８時間、４６時間、４４時間、４２時間、４０時間、３８時間、３６時間、３４時間、３２時間、３０時間、２８時間、２６時間、２４時間、２２時間、２０時間、１８時間、１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、５５分、５０分、４５分、４０分、３５分、３０分、２５分、２０分、１５分、１０分、９分、８分、７分、６分、５分、４分、３分、２分、および１分を含む、別の処置の前のあらゆる時点で投与し得る。ＣＤ２４を、約１２０時間、１１８時間、１１６時間、１１４時間、１１２時間、１１０時間、１０８時間、１０６時間、１０４時間、１０２時間、１００時間、９８時間、９６時間、９４時間、９２時間、９０時間、８８時間、８６時間、８４時間、８２時間、８０時間、７８時間、７６時間、７４時間、７２時間、７０時間、６８時間、６６時間、６４時間、６２時間、６０時間、５８時間、５６時間、５４時間、５２時間、５０時間、４８時間、４６時間、４４時間、４２時間、４０時間、３８時間、３６時間、３４時間、３２時間、３０時間、２８時間、２６時間、２４時間、２２時間、２０時間、１８時間、１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、５５分、５０分、４５分、４０分、３５分、３０分、２５分、２０分、１５分、１０分、９分、８分、７分、６分、５分、４分、３分、２分、および１分を含む、ＣＤ２４の２回目の処置前のあらゆる時点で投与し得る。
【００３２】
ＣＤ２４を、約１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、２４時間、２６時間、２８時間、３０時間、３２時間、３４時間、３６時間、３８時間、４０時間、４２時間、４４時間、４６時間、４８時間、５０時間、５２時間、５４時間、５６時間、５８時間、６０時間、６２時間、６４時間、６６時間、６８時間、７０時間、７２時間、７４時間、７６時間、７８時間、８０時間、８２時間、８４時間、８６時間、８８時間、９０時間、９２時間、９４時間、９６時間、９８時間、１００時間、１０２時間、１０６時間、１０８時間、１１０時間、１１２時間、１１４時間、１１６時間、１１８時間、および１２０時間を含む、別の処置後のあらゆる時点で投与し得る。ＣＤ２４を、約１２０時間、１１８時間、１１６時間、１１４時間、１１２時間、１１０時間、１０８時間、１０６時間、１０４時間、１０２時間、１００時間、９８時間、９６時間、９４時間、９２時間、９０時間、８８時間、８６時間、８４時間、８２時間、８０時間、７８時間、７６時間、７４時間、７２時間、７０時間、６８時間、６６時間、６４時間、６２時間、６０時間、５８時間、５６時間、５４時間、５２時間、５０時間、４８時間、４６時間、４４時間、４２時間、４０時間、３８時間、３６時間、３４時間、３２時間、３０時間、２８時間、２６時間、２４時間、２２時間、２０時間、１８時間、１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、５５分、５０分、４５分、４０分、３５分、３０分、２５分、２０分、１５分、１０分、９分、８分、７分、６分、５分、４分、３分、２分、および１分を含む、以前のＣＤ２４処置後のあらゆる時点で投与し得る。
【００３３】
以下の実施例を、本発明の方法を説明するために提供し、そして決してその方法の使用を制限しない。
【実施例】
【００３４】
実施例１
可溶性ＣＤ２４タンパク質
ＣＤ２４の細胞外ドメインを、ＩｇＧ１Ｆｃに融合した。そのＣＤ２４融合タンパク質のアミノ酸組成を、図１で提供する。次いでＣＤ２４Ｉｇ融合タンパク質の発現を駆動する、複製欠損レトロウイルスベクターを作製した。ＧＰＥｘＴＭ（遺伝子産物発現（ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）のアクロニム）システムは、いくつかの重要な利点を提供し、その最も重要なものは、平均で、細胞あたり＞１０００個の挿入があるが、挿入あたり１コピーのみであることである。さらに、レトロウイルスは転写活性遺伝子座に優先的に挿入するので、ＧＰＥｘＴＭは、標的タンパク質の高レベルの発現を生じた。高収量のＣＤ２４Ｉｇを産生する安定な細胞系統を産生した。それに加えて、４５グラムのＧＬＰグレード産物および〜１００グラムのｃＧＭＰグレード産物を産生した。バイオリアクターから回収した培地の下流の処理に使用する方法を、下記のフローチャートにまとめる（図２）。
【００３５】
回収物の清澄化
バイオリアクター培養培地を、Ｃｕｎｏ６０Ｍ０２Ｍａｘｉｍｉｚｅｒデプスフィルター、続いてＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｏｐｔｉｃａｐ  ０．２２μｍフィルターを用いて、清澄化した。ろ液を、滅菌収集バッグへ集めた。ＥＬＩＳＡによるＣＤ２４−Ｆｃ収量の定量のためにサンプルを得た。
【００３６】
プロテインＡ捕捉
清澄化した培地を、プロテインＡ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ）のカラムに、１６ｇ／Ｌを超えない樹脂の濃度で（ＥＬＩＳＡに基づいて）、および４分の接触時間で通過させた。そのカラムを、平衡化緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ＋０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）、次いで１０ｍＭのクエン酸ナトリウム／クエン酸、ｐＨ６．０で、５ｃｖ洗浄した。結合したＣＤ２４Ｉｇを、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム／クエン酸、ｐＨ３．５を用いてカラムから溶出した。
【００３７】
ウイルス不活性化
プロテインＡ溶出画分を、すぐに２Ｍの塩酸を加えることによってｐＨを３．０にし、そして周囲温度で３０分間、このｐＨに維持した。次いで１ＭのＴｒｉｓ塩基を加えることによってｐＨ５．０にし、そして０．６５μｍのグラスファイバーフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓａｒｔｏｐｕｒｅ  ＧＦ２）および０．２μｍ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ２）を用いて滅菌収集バッグへろ過して、清澄化した。
【００３８】
ＳＰ−セファロースクロマトグラフィー
ウイルス不活性化物質を、ＳＰ−セファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のカラムに、２５ｇ／Ｌを超えない樹脂の濃度で（１．２２のＡ２８０ｎｍ＝１ｍｇ／ｍＬに基づいて）、そして２５０ｃｍ／ｈｒの線形の流量で添加した。そのカラムを、平衡化緩衝液（１０ｍＭのクエン酸ナトリウム／クエン酸、ｐＨ５．０）で洗浄し、そして結合したＣＤ２４Ｉｇを、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム／クエン酸＋０．２ＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０を用いてカラムから溶出した。流出液を、滅菌収集バッグに収集した。
【００３９】
Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑクロマトグラフィー
ＳＰ−セファロース溶出液を、１ＭのＴｒｉｓ塩基を加えることによってｐＨ７．５に調整し、そして伝導率を低減するためにＷＦＩで希釈した。希釈した物質を、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑフィルター（Ｐａｌｌ）に、０．５ｇ／Ｌを超えない樹脂の濃度で（１．２２のＡ２８０＝１ｍｇ／ｍＬに基づく）、そして５カラム容積／分の流量で添加した。そのフィルターを、平衡化緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５）で洗浄し、そしてＣＤ２４−Ｆｃは、フロースルーに含まれており、そして滅菌収集バッグに収集した。
【００４０】
ウイルスろ過
Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑフロースルーを、次いで０．２ｍＭのフィルターおよびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＮＦＰウイルスフィルター（名目上の孔径２０ｎｍ）を通して３０ｐｓｉの一定の圧力でろ過し、そして滅菌収集バッグに収集した。
【００４１】
濃縮および最終的な処方
その産物を、２８０ｎｍでの吸光度によって決定した、約１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度で、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．２に、１０ｋＤａ限外ろ過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｒｅｐ／Ｓｃａｌｅ）を用いて濃縮およびダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｅ）した。バイオセーフティ（ｂｉｏｓａｆｅｔｙ）キャビネットにある間に、バルクから分析サンプルを抜き出した。ラベリングを行い、そしてサンプルを試験のためにＱＣに送達し、一方バルクアリコートを、放出を継続させる２℃〜８℃で保存した。
【００４２】
ウイルスクリアランス試験
ウイルスクリアランスの確認を、ＣＨＭで調製されたサンプルに対して、Ｃａｒｄｉｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ、ＮＣにおいて行った。Ｇａｌａ  Ｂｉｏｔｅｃｈの資格のある科学者が、Ｃａｒｄｉｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｖｉｒａｌ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ施設において、Ｃａｒｄｉｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈの職員の助けをかりて、クロマトグラフィーおよびろ過工程を行った。スケールダウン手順を、２００Ｌのスケールの過程から開発した。２つのウイルスを、この試験において使用するために選択した。最初のものは異種栄養性マウス白血病ウイルス（ＸＭｕＬｖ）であり、それはレトロウイルス科の、８０ｎｍ〜１３０ｎｍのサイズのエンベロープ型ＲＮＡウイルスである。２番目は、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）であり、それは１８ｎｍ〜２６ｎｍのサイズの無エンベロープ型ＤＮＡウイルスである。これは頑強なウイルスであると考えられ、そしてＸＭｕＬｖよりも、精製プロトコールを通して、はるかにより低いウイルスの低減を示すことが予期された。
【００４３】
実施例２
ＲＡの治療のためのＣＤ２４Ｆｃの使用
この実施例は、ＣＤ２４を、ＲＡを処置するために使用し得ることを示す。抗コラーゲン抗体は、疾患が発症する前にＲＡ患者に存在するので、および抗コラーゲン抗体は、マウスにおいてＲＡ様病理を誘発し得るので、確立されたＲＡの受動伝達モデルを、可溶性ＣＤ２４の有効性を試験するために使用した。その融合タンパク質を、ＰＢＳビヒクルに１０ｍｇ／ｍｌで溶解した。図４に示すように、４つの抗コラーゲン抗体の組み合わせは、全ての肢において重篤な臨床症状を引き起こし、ビヒクルおよびＣＤ２４Ｆｃ処置群の両方において、７日目にピークになった。その疾患は、全ての四肢の肢全体の発赤および腫脹によって特徴づけられた。指および複数の関節を含む、いくつかの四肢は、最大限の炎症を起こした。従って、可溶性タンパク質は、疾患の開始に影響を与えない。驚くべきことに、ＣＤ２４Ｆｃ処置群は、はるかにより迅速な回復を示す。臨床スコアの減少は、９日目から高度に有意であり、かつ２４日間の観察期間全体を通して続く。従って、ＣＤ２４Ｆｃは、ＲＡのための有効な処置を提供する。興味深いことに、その効果は疾患のピークの後に観察されるので、おそらくＣＤ２４をブロックすることは、炎症の開始後の、慢性疾患過程に影響を与える。
【００４４】
実施例３
ＣＤ２４薬物動態
１ｍｇのＣＤ２４ＩｇＧ１を、未処置のＣ５７ＢＬ／６マウスに注射し、そして異なる時点（５分、１時間、４時間、２４時間、４８時間、７日、１４日、および２１日）で、各時点において３匹のマウスから血液サンプルを収集した。その血清を１：１００に希釈し、そしてＣＤ２４Ｉｇのレベルを、捕捉抗体として精製抗ヒトＣＤ２４（３．３μｇ／ｍｌ）、および検出抗体としてペルオキシダーゼ結合体化ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ（５μｇ／ｍｌ）を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて検出した。図５ａに示すように、ＣＤ２４Ｉｇの減衰曲線は、タンパク質の典型的な二相性の減衰を明らかにした。最初の体内分布相は、１２．４時間の半減期を有していた。２番目の相は、中心コンパートメントからの１次消失のモデルに従う。２番目の相の半減期は９．５４日であり、それはインビボにおける抗体のものと同様である。これらのデータは、融合タンパク質が、血流中で非常に安定であることを示唆する。融合タンパク質を皮下に注射する別の研究において、ほとんど同一の９．５２日の半減期が観察された（図５ｂ）。より重要なことは、ＣＤ２４Ｉｇが血液中でピークレベルに達するまでに約４８時間かかるが、ＡＵＣによって測定される、血液中の融合タンパク質の総量は、いずれの注射経路によっても実質的に同じであった。従って、治療的観点から、異なる注射経路は、薬物の治療効果に影響を与えないはずである。この観察は、霊長類の毒性および臨床試験の実験デザインを非常に単純化した。
【００４５】
実施例４
ＲＡを処置するためのＣＤ２４
数十年の間、ＲＡは主にＴ細胞媒介性自己免疫疾患であると推定されてきた。最近２０年の間に、ＲＡの病因における抗体およびＢリンパ球の可能性のある役割が再注目されている。従って、リウマチ因子に加えて、自己反応性抗体の宿主がＲＡ患者において見出されたが、それはヒトにおいて決定的に取り組まれてこなかった。しかし、いくつかの系統の証拠が、マウスモデルにおいて、遍在性または組織特異的抗原のいずれかに特異的な抗体が、ＲＡ症状を引き起こすのに十分であることを示した。例えば、Ｋ／ＢｘＮ  ＴＣＲトランスジェニックマウス由来の抗体は、新規宿主においてＲＡ様疾患を完全に伝達し得ることが見出された。同様に、４つの抗コラーゲン抗体のカクテルが、マウスにおいてＲＡを誘発するために現在広く使用されている。このモデルは現在、ＣＡＩＡ、コラーゲン抗体誘発関節炎と呼ばれる。
【００４６】
ＣＡＩＡモデルの遺伝的分析は、補体の重要な役割を示す。他の可能性が存在するが、これらの要件は、ＲＡの病因における抗体媒介性の組織損傷の潜在的な関与を示唆する。組織損傷および炎症の間の関連は、免疫学における長年の観察である。２０年近く前、Ｍａｔｚｉｎｇｅｒは、一般に危険理論と呼ばれるものを提案した。本質的に、彼女は、免疫系は宿主において危険を感じた場合に活性化されると主張した。危険の性質は当時よく定義されなかったが、ネクローシスは、ＨＭＧＢ１および熱ショックタンパク質のような細胞内成分の放出に関連することが決定され、それらはＤＡＭＰ、危険関連分子パターンと呼ばれた。ＤＡＭＰは、炎症性サイトカインの産生および自己免疫疾患を促進することが見出された。動物モデルにおいて、ＨＭＧＢ１およびＨＳＰ９０の阻害剤は、ＲＡを寛解させることが見出された。ＤＡＭＰの関与は、ＤＡＭＰに対する宿主反応の負の調節を、ＲＡ治療のために探索し得るという展望を提起した。
【００４７】
組織損傷に対する宿主反応におけるＣＤ２４−Ｓｉｇｌｅｃ１０の相互作用
アセトアミノフェン誘発肝ネクローシスを使用し、そして炎症を確実にして、本発明者らは、ＳｉｇｌｅｃＧの相互作用によって、ＣＤ２４が、組織損傷に対する宿主反応の強力な負の調節を提供することを観察した。ＣＤ２４は、造血性細胞および他の組織幹細胞に広く発現する、ＧＰＩアンカー分子である。多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ｅｒｙｔｈｒｏｍａｔｏｓｕｓ）、ＲＡ、および巨細胞性動脈炎（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）を含む、ヒトにおける様々な自己免疫疾患の遺伝的分析は、ＣＤ２４多型および自己免疫疾患のリスクの間に有意な関連を示した。ＳｉｇｌｅｃＧは、シアル酸を含む構造を認識する能力によって規定される、Ｉ−レクチンファミリーのメンバーである。ＳｉｇｌｅｃＧは、ＣＤ２４のシアル酸を含む構造を認識し、そして樹状細胞による炎症性サイトカインの産生を負に調節する（１６）。ＣＤ２４と相互作用するその能力に関して、ヒトＳｉｇｌｅｃ１０およびマウスＳｉｇｌｅｃＧは、機能的に等価である。しかし、マウスホモログおよびヒトホモログの間に、１対１の関連が存在するかどうかは不明である。そのメカニズムはまだ完全に明らかではないが、ＳｉｇｌｅｃＧ関連ＳＨＰ１が、その負の調節に関与し得ることがもっともらしい。最近Ｓｃｉｅｎｃｅにおいて報告されたこれらのデータは、ＣＤ２４−ＳｉｇｌｅｃＧ／１０の相互作用が、ＤＡＭＰからの病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）の区別に重要な役割を果たし得る、新しいモデルを導く（図６）。
【００４８】
少なくとも２つの重複するメカニズムが、ＣＤ２４の機能を説明し得る。まず、様々なＤＡＭＰに結合することによって、ＣＤ２４は炎症性刺激を捕捉して、そのＴＬＲまたはＲＡＧＥとの相互作用を阻害し得る。この考えは、ＣＤ２４が、ＨＳＰ７０、９０、ＨＭＧＢ１およびヌクレオリン（ｎｕｃｌｅｏｌｉｎ）を含むいくつかのＤＡＭＰ分子と関連するという観察によって支持される。２番目に、おそらくＤＡＭＰと結合した後、ＣＤ２４はＳｉｇｌｅｃＧによるシグナル伝達を刺激し得る。いずれかの遺伝子の標的化変異を有するマウスは、はるかにより強力な炎症性反応を起こすので、両方のメカニズムが協同で作用し得る。実際、ＣＤ２４−／−またはＳｉｇｌｅｃＧ−／−マウスいずれか由来の骨髄から培養したＤＣは、ＨＭＧＢ１、ＨＳＰ７０、またはＨＳＰ９０のいずれかで刺激した場合、はるかに高い炎症性サイトカインを産生した。対照的に、ＬＰＳおよびＰｏｌｙＩ：ＣのようなＰＡＭＰに対するその反応においては、影響は見られなかった。これらのデータは、先天免疫系が病原体を組織損傷から区別するメカニズムを提供するだけでなく、ＣＤ２４およびＳｉｇｌｅｃＧを、組織損傷に関連する疾患の潜在的な治療標的として示唆する。
【００４９】
コラーゲン抗体誘発関節炎に対するＣＤ２４Ｆｃの治療効果
ＲＡの病因における組織損傷に対する先天免疫の疑われる役割、およびそのような反応を負に調節するＣＤ２４−ＳｉｇｌｅｃＧ／１０経路の役割を考慮して、ＲＡを処置するためにこの経路を刺激することの可能性を探索した。本質的に全ての自己免疫疾患の病因は、自己抗原に対する免疫反応および自己免疫性破壊の誘発を含む。ＣＤ２４−ＳｉｇｌｅｃＧ相互作用の新規機能に基づいて、その自己免疫性破壊期（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｐｈａｓｅ）に焦点を当てた。従って、予備的分析のために、コラーゲン抗体誘発関節炎モデルを採用して潜在的な治療効果を評価した。
【００５０】
図７ａに示すように、４つの抗コラーゲンｍＡｂのカクテル（ＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ、ＭＮ）を、２ｍｇ／マウスで１日目にｉ．ｖ．注射し、そして３日目に１００μｇ／マウスのＬＰＳ（ＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）をｉ．ｐ．注射することによって、８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスにＣＡＩＡを誘発した。そのマウスを、１日目に１ｍｇのＣＤ２４Ｆｃまたはネガティブコントロールとして等しい容積の１×ＰＢＳビヒクルのいずれかで処置した。図７ｂに示すように、ビヒクルコントロールと比較して、ＣＤ２４Ｆｃは高度に有意な治療効果を提供した。
【００５１】
ＣＤ２４Ｆｃがこのモデルで関節炎を低減するメカニズムを理解するために、ＣＤ２４Ｆｃ処置マウスまたはＰＢＳコントロール群のホモジナイズした関節からサイトカインを測定し、そしてサイトカインビーズアレイによって２００μｇの組織ホモジネートの上清を測定した。典型的な例を図８ａに示し、まとめのデータを図８ｂに示す。これらのデータは、全身性に投与したＣＤ２４が、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１（ＣＣＬ２）、およびＩＬ−１βを含む、複数の炎症性サイトカインのレベルを低減することを示した。
【００５２】
ＣＤ２４Ｆｃの効果を、図９で示したように、ＣＡＩＡマウスの滑膜関節（ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｊｏｉｎｔ）の組織学的分析によって実証する。関節炎の誘発後７日目に、Ｈ＆Ｅ染色は、ＰＢＳ群の関節滑膜が、好中球、マクロファージ、およびリンパ球を含む炎症性細胞が重度に浸潤していることを示した（図９ａ）。これは、ＣＤ２４Ｆｃ処置マウスにおいて大いに低減された（図９ｂ）。それに加えて、ＰＢＳ処置（図９ｃ）マウスにおいて、サフラニンＯレッド染色の喪失によって、重症（ｓｅｖｅｒ）の軟骨損傷が明らかになったが、ＣＤ２４Ｆｃ処置群（図９ｄ）ではなかった。
【００５３】
マウスにおいてＣＤ２４Ｆｃが進行中のＲＡに対して治療効果を有するかどうかを決定するために、ＲＡの誘発後５または７日目のいずれかに処置を開始した。図１０に示すように、ＲＡスコアの有意な減少が、ＣＤ２４Ｆｃ処置後２日目の早さで観察された。その治療効果は、さらなる処置無しでも、残りの観察期間中続いた。これらのデータはさらに、進行中の疾患に対するＣＤ２４Ｆｃの治療可能性を増強する。
【００５４】
ヒトにおけるＣＤ２４Ｆｃの治療上の用量を推定するために、ＣＤ２４Ｆｃを、広い範囲の用量で滴定した。図１１に示すように、２μｇ／マウスと少ない量が、統計学的に有意な治療効果を有するために十分である。
【００５５】
ＣＤ２４ＦｃのＳｉｇｌｅｃＧ依存性治療効果
ＣＤ２４Ｆｃが、ＳｉｇｌｅｃＧとの相互作用によってマウスを保護するかどうかを決定するために、本発明者らは、その治療効果がＳｉｇｌｅｃｇ遺伝子に依存するかどうかを決定した。Ｓｉｇｌｅｃｇ−欠損マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＥＳ細胞で産生されたので、本発明者らは、コントロールとしてＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用した。図１２ａに示すように、Ｂ６マウスはＣＡＩＡによりかかりにくいことが公知であるので、全体的な疾患スコアは、ＢＡＬＢ／ｃマウスで観察されたものより低い。それにも関わらず、ＣＤ２４Ｆｃの単回注射は、実質的にＷＴマウスにおいて臨床徴候を一掃した。重要なことに、その疾患はＳｉｇｌｅｃｇ欠損マウスにおいてより軽症であるが、ＣＤ２４Ｆｃは、治療効果を有さなかった。従って、ＣＤ２４Ｆｃの治療効果は、厳密にＳｉｇｌｅｃｇ遺伝子に依存する。
【００５６】
合わせると、本明細書中で述べたデータは、ＣＡＩＡに関するＣＤ２４Ｆｃの高い治療有効性を示す。安全性、安定性についての本発明者らの広範なデータ、および本発明者らの成功したＣＤ２４Ｆｃの製造を考慮して、全てＲＡの治療薬としての融合タンパク質の高い可能性を示す。
【００５７】
実施例５
毒性
げっ歯類および非ヒト霊長類の広範な毒性試験は、マウスおよび非ヒト霊長類における、１２．５ｍｇ／ｋｇ〜１２５ｍｇ／ｋｇの用量における薬物関連毒性を示さなかった。
【００５８】
引用された参考文献
【００５９】
【化１】
0005899206.tif 000002
【００６０】
【化２】
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【００６１】
【化３】
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【００６２】
【化４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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