(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトｐ７５腫瘍壊死因子受容体の細胞外リガンド結合部が、ヒトＩｇＧのＦｃドメインに融合された融合タンパク質の安定化用組成物であって、アンモニウム塩と、ｐＨが５．５乃至６．５である緩衝液の形態で添加されたコハク酸塩とを含有する、組成物。
【請求項２】
前記コハク酸塩は、５乃至２００ｍＭの濃度で含有されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記アンモニウム塩は、タンパク質とＦｃドメインの融合タンパク質の凝集を抑制することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記アンモニウム塩は、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、及び硝酸アンモニウムの中から選択されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記アンモニウム塩は、５乃至５００ｍＭの濃度で含有されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記安定化用組成物は、賦形剤をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質の安定化用組成物。
【請求項７】
前記賦形剤は、塩基性アミノ酸、糖及び界面活性剤の中から選択される１種以上であることを特徴とする請求項６に記載の融合タンパク質の安定化用組成物。
【請求項８】
前記賦形剤は、スクロース、またはリジン、または、両方であることを特徴とする請求項６に記載の融合タンパク質の安定化用組成物。
【請求項９】
ヒトｐ７５腫瘍壊死因子受容体の細胞外リガンド結合部が、ヒトＩｇＧのＦｃドメインに融合された融合タンパク質と、アンモニウム塩と、ｐＨが５．５乃至６．５である緩衝液の形態で添加されたコハク酸塩とを含有する関節炎治療用組成物。
【請求項１０】
前記アンモニウム塩は、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、及び硝酸アンモニウムの中から選択されることを特徴とする請求項９に記載の関節炎治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生理活性を有するタンパク質とＦｃドメインの融合タンパク質の安定化用組成物に関し、アンモニウム塩またはアンモニウム塩とコハク酸塩（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）を含有する組成物を利用してタンパク質とＦｃドメインの融合タンパク質を安定化させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
疾患の治療目的で用いられている抗体医薬品は、細胞株作製技術、細胞培養技術、精製技術など高難易度の生物工程技術が適用されるバイオ医薬品として既存の薬物より優れた薬効及び安全性が立証されたことにより、日々その需要が増加している。例えば、ヒトｐ７５腫瘍壊死因子受容体（ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の細胞外（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）リガンド結合部をヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに融合して製造された融合タンパク質（ＴＮＦＲ：Ｆｃエタナーセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）がリューマチ関節炎治療剤として用いられていて、その他にも生理活性物質の体内半減期を増加させるために、ＧＬＰ−１Ｒ作用剤（ａｇｏｎｉｓｔ）にＦｃドメインが融合した融合タンパク質を糖尿病治療剤として開発しようとする試みがあってＵＳ２００４−０５５８６２７；Ｃｈｕｎｇ，Ｈ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ，１７０，２０１１）、ｈＧＨ、ＥＰＯなどの生理活性物質をＦｃドメインに融合して体内半減期を増加させようとする試みがあった（ＫＲ１０−２００８−７０１８０１２）。また、最近ではＶＥＧＦ受容体とＦｃドメインと結合した物質（ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）が湿性黄斑変性（ＷＡＭＤ）治療剤として許可を受けて用いられている。
しかし、前記のような融合タンパク質は、その構造が大きく複雑で、物理的不安定性によって発生する凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）を形成するとの問題点がある。このような凝集を誘発する要因は、タンパク質の生産及び保管過程において多様に存在する。
【０００３】
例えば、以下の要因中一つ以上の要因によって凝集が発生する可能性がある。精製時には、最適な条件でないｐＨ、塩の種類、塩の濃度、温度、空気との接触、撹はん速度などが影響を及ぼして、剤形化時にはタンパク質の濃縮条件が影響を及ぼしかねない。そして、緩衝液交換時にはフィルター通過、撹はんなどが影響を及ぼして、保存時には温度変化、ｐＨ変化、空気との接触、撹はんなどが凝集現象に影響を及ぼしかねない。その他にもタンパク質を含んだ剤形が光に曝される場合にも凝集が発生する可能性があって、包装容器の材質も凝集を発生するようにする原因となる恐れがある（Ｈａｍａｄａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：４００，２００９）。
【０００４】
緩衝液融合タンパク質に現れる凝集現状の最も主な原因は、構造変化によって抗体タンパク質の疏水性部位が露出する場合、発生する。即ち、タンパク質分子の疏水性部位が集まって凝集が形成されることで、このように形成された凝集は、抗体タンパク質間に共有結合が発生して、非可逆的な形態に進行されることがあるという（Ｈａｍａｄａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：３４８，２００９）。
【０００５】
前記のような理由で凝集した融合タンパク質または抗体タンパク質は、大抵活性が減少したり時間が過ぎると共に活性を失ってしまう。また、これらのタンパク質は、凝集する場合、凝集しなかった状態では現れなかった抗原性を有するうになって、人体に注射する場合、抗体（ａｎｔｉｄｒｕｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＡＤＡ）の生成を誘発させることがある。従って、現状はこのような融合タンパク質の凝集を減少させる方法及び減少した凝集水準を持つ融合タンパク質の安定化された剤形が求められる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  ＸＩ，２０１０，ｐｐ  ２７１−２９１）。
【０００６】
このような目的で凝集を防止する賦形剤を添加したりｐＨまたは緩衝液（ｂｕｆｆｅｒ）組成を調節する方法が試みられた例がある。抗体タンパク質の疏水性グループが分子の表面に露出して疏水性グループ同士が結合をすることで発生する場合、凝集を防止する賦形剤としては、露出した疏水性グループを安定化できる方法が活用される。例えば、アルギニン、リジン、プロリン、ヒスチジン、グリシンなどのようなアミノ酸（ＵＳ４３６２６６１Ａ，ＵＳ７６４８７０２）、ポリソルベート基盤界面活性剤、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）のような両親媒性高分子、デキストランのような多糖体、スクロース、マルトーズ、トレハロースなどの単糖または二糖類（ＵＳ５９４５０９８Ａ）が用いられた例がある。
【０００７】
しかし、タンパク質とＦｃドメインの融合タンパク質の場合には、一般に生成される抗体タンパク質よりその安定性がより落ちて凝集体を形成しようとする傾向がその他のタンパク質または抗体タンパク質より強い。このようなＦｃ−融合タンパク質の凝集現象を防止するためにポリソルベートのような界面活性剤を加えて剤形が製造された例がある（Ｓｔｅｖｅｎ  Ｊ．Ｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ＸＩ：１１５，２０１０）。
そこで、本発明者等は、アンモニウム塩、またはアンモニウム塩とコハク酸塩（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）を含有する組成物が、タンパク質とＦｃドメインの融合タンパク質の凝集を抑制して長期間保管が容易なようにその安定性を増加させる可能性があることを確認して、本発明を完成するようになった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００４／０５５８６２７号明細書
【特許文献２】韓国公開特許第１０−２００８−７０１８０１２号公報
【特許文献３】米国特許第４３６２６６１号明細書
【特許文献４】米国特許第７６４８７０２号明細書
【特許文献５】米国特許第５９４５０９８号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｃｈｕｎｇ，Ｈ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ，１７０，２０１１
【非特許文献２】Ｈａｍａｄａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：４００，２００９
【非特許文献３】Ｈａｍａｄａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：３４８，２００９
【非特許文献４】Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  ＸＩ，２０１０，ｐｐ  ２７１−２９１
【非特許文献５】Ｓｔｅｖｅｎ  Ｊ．Ｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ＸＩ：１１５，２０１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、生理活性を有するタンパク質とＦｃドメインの融合タンパク質の凝集を抑制して、融合タンパク質の安全性を高めることができる安定化用組成物及びそのような組成物を利用してＦｃ−融合タンパク質を安定化させる方法を提供するところにある。
本発明の他の目的は、前記安定化用組成物を含む疾病の予防及び治療用組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記目的を達成するために、本発明はアンモニウム塩、またはアンモニウム塩とコハク酸塩を含有する、Ｆｃ−融合タンパク質の安定化用組成物及びこれを含む疾病の予防及び治療用組成物を提供する。
本発明は、他の形態として、Ｆｃ−融合タンパク質を含有する組成物にアンモニウム塩、またはアンモニウム塩とコハク酸塩を加えて前記融合タンパク質を安定化させる方法を提供する。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
アンモニウム塩を含有する、タンパク質とＦｃドメインの融合タンパク質の安定化用組成物。
（項目２）
コハク酸塩（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）をさらに含むことを特徴とする項目１に記載の融合タンパク質の安定化用組成物。
（項目３）
前記コハク酸塩は、５乃至２００ｍＭの濃度で含有されることを特徴とする項目２に記載の組成物。
（項目４）
前記コハク酸塩は、ｐＨが５．５乃至６．５である緩衝液の役割を果たすことを特徴とする項目２または項目３に記載の組成物。
（項目５）
前記アンモニウム塩は、タンパク質とＦｃドメインの融合タンパク質の凝集を抑制することを特徴とする項目１に記載の組成物。
（項目６）
前記アンモニウム塩は、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、及び硝酸アンモニウムの中から選択されることを特徴とする項目１に記載の組成物。
（項目７）
前記アンモニウム塩は、５乃至５００ｍＭの濃度で含有されることを特徴とする項目１に記載の組成物。
（項目８）
前記融合タンパク質は、ヒトｐ７５腫瘍壊死因子受容体の細胞外リガンド結合部が、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したことを特徴とする項目１に記載の組成物。
（項目９）
前記安定化用組成物は、賦形剤をさらに含むことを特徴とする項目１に記載の融合タンパク質の安定化用組成物。
（項目１０）
前記賦形剤は、塩基性アミノ酸、糖及び界面活性剤の中から選択される１種以上であることを特徴とする項目９に記載の融合タンパク質の安定化用組成物。
（項目１１）
前記賦形剤は、スクロース、またはリジン、または、両方であることを特徴とする項目９に記載の融合タンパク質の安定化用組成物。
（項目１２）
タンパク質とＦｃドメインの融合タンパク質を含有する組成物にアンモニウム塩を加えてタンパク質とＦｃドメインの融合タンパク質を安定化させる方法。
（項目１３）
前記組成物は、コハク酸塩（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）をさらに含むことを特徴とする項目１２に記載のタンパク質とＦｃドメインの融合タンパク質を安定化させる方法。
（項目１４）
前記コハク酸塩は、５乃至２００ｍＭの濃度で含有されることを特徴とする項目１３に記載の組成物。
（項目１５）
前記コハク酸塩は、ｐＨが５．５乃至６．５である緩衝液の形態で添加されることを特徴とする項目１３または項目１４に記載のタンパク質とＦｃドメインの融合タンパク質を安定化させる方法。
（項目１６）
前記アンモニウム塩は、タンパク質とＦｃドメインの融合タンパク質の凝集を抑制することを特徴とする項目１２に記載のタンパク質とＦｃドメインの融合タンパク質を安定化させる方法。
（項目１７）
前記アンモニウム塩は、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、及び硝酸アンモニウムの中から選択されることを特徴とする項目１２に記載のタンパク質とＦｃドメインの融合タンパク質を安定化させる方法。
（項目１８）
前記アンモニウム塩は、５乃至５００ｍＭの濃度で含有されることを特徴とする項目１２に記載のタンパク質とＦｃドメインの融合タンパク質を安定化させる方法。
（項目１９）
前記融合タンパク質は、ヒトｐ７５腫瘍壊死因子受容体の細胞外リガンド結合部が、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したことを特徴とする項目１２に記載のタンパク質とＦｃドメインの融合タンパク質を安定化させる方法。
（項目２０）
前記安定化用組成物は、賦形剤をさらに含むことを特徴とする項目１２に記載のタンパク質とＦｃドメインの融合タンパク質を安定化させる方法。
（項目２１）
前記賦形剤は、塩基性アミノ酸、糖及び界面活性剤の中から選択される１種以上であることを特徴とする項目２０に記載のタンパク質とＦｃドメインの融合タンパク質を安定化させる方法。
（項目２２）
前記賦形剤は、スクロース、またはリジン、または、両方であることを特徴とする項目２１に記載のタンパク質とＦｃドメインの融合タンパク質を安定化させる方法。
（項目２３）
ヒトｐ７５腫瘍壊死因子受容体の細胞外リガンド結合部が、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに融合された融合タンパク質とアンモニウム塩を含有する関節炎治療用組成物。
（項目２４）
前記組成物は、コハク酸塩をさらに含むことを特徴とする項目２３に記載の関節炎治療用組成物。
（項目２５）
前記コハク酸塩は、５乃至２００ｍＭの濃度で含有されることを特徴とする項目２４に記載の関節炎治療用組成物。
（項目２６）
前記コハク酸塩は、ｐＨが５．５乃至６．５である緩衝液の形態で添加されることを特徴とする項目２４または項目２５に記載の関節炎治療用組成物。
（項目２７）
前記アンモニウム塩は、タンパク質とＦｃドメインの融合タンパク質の凝集を抑制することを特徴とする項目２３に記載の関節炎治療用組成物。
（項目２８）
前記アンモニウム塩は、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、及び硝酸アンモニウムの中から選択されることを特徴とする項目２３に記載の関節炎治療用組成物。
（項目２９）
前記アンモニウム塩は、５乃至５００ｍＭの濃度で含有されることを特徴とする項目２３に記載の関節炎治療用組成物。
（項目３０）
前記安定化用組成物は、賦形剤をさらに含むことを特徴とする項目２３に記載の関節炎治療用組成物。
（項目３１）
前記賦形剤は、塩基性アミノ酸、糖及び界面活性剤の中から選択される１種以上であることを特徴とする項目３０に記載の関節炎治療用組成物。
（項目３２）
前記賦形剤は、スクロース、またはリジン、または、両方であることを特徴とする項目３０に記載の関節炎治療用組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】エタナーセプト（Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）（ＴＮＦ受容体の水溶性の部分とＦｃドメインの融合タンパク質）を種々の賦形剤（アルギニン（Ａｒｇ）、ＥＤＴＡ、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン（ＨＰ  Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）、塩化アンモニウム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、プロリン（Ｐｒｏ）、スクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）、トレハロース（Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）、ポリソルベート２０）が含まれた剤形溶液で１週間５０℃で保管した後、エタナーセプトの凝集程度を測定した結果である。
【図２】エタナーセプトを種々の賦形剤（アルギニン（Ａｒｇ）、プロリン（Ｐｒｏ）、５０ｍＭの塩化アンモニウム、１００ｍＭの塩化アンモニウム、２００ｍＭの塩化アンモニウム、スクロース、ポリソルベート２０、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン（ＨＰｃＤ））が含まれた剤形溶液で１週間５０℃で保管した後、エタナーセプトの凝集程度を測定した結果である。
【図３】３７℃で４週間エタナーセプトを塩化アンモニウムを含有する剤形で保管した後、エタナーセプトの凝集程度を測定した結果である。Ａｒｇ：アルギニン、ＡｍＣｌ：塩化アンモニウム、ＡｍＳｕｌ：硫酸アンモニウム、Ａｍ＋Ｌｙｓ：塩化アンモニウム＋リジン、Ａｍ＋ＥＤＴＡ：塩化アンモニウム＋ＥＤＴＡ、Ａｍ＋Ｐｏｌｙｓｏｒａｂａｔｅ  ２０：塩化アンモニウム＋ポリソルベート２０Ａｍ＋Ｓｕｃｒｏｓｅ：塩化アンモニウム＋スクロース
【図４】４５℃で１４日間エタナーセプトをアルギニン、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム及びリジン、塩化アンモニウム及びＥＤＴＡ、塩化アンモニウム及びポリソルベート２０、塩化アンモニウム及びスクロースを含有する剤形溶液で保管した後、エタナーセプトの凝集程度を測定した結果である。Ａｒｇ：アルギニン、ＡｍＣｌ＃：塩化アンモニウム＃％ＡｍＳｕｌ：硫酸アンモニウム、Ａｍ＃＋Ｌｙｓ：塩化アンモニウム＃％＋リジン、Ａｍ＃＋Ｓｕｃ：塩化アンモニウム＃％＋スクロース
【図５】４５℃で１４日間エタナーセプトをアルギニン、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム及びリジン、塩化アンモニウム及びＥＤＴＡ、塩化アンモニウム及びポリソルベート２０、塩化アンモニウム及びスクロースを含有する剤形溶液で保管した後、エタナーセプトの凝集程度を測定した結果である。Ａｒｇ：アルギニン、ＡｍＣｌ＃：塩化アンモニウム＃％ＡｍＳｕｌ：硫酸アンモニウム、Ａｍ＃＋Ｌｙｓ：塩化アンモニウム＃％＋リジン、Ａｍ＃＋Ｓｕｃ：塩化アンモニウム＃％＋スクロース
【図６】エタナーセプトを塩化アンモニウム塩を含む種々の緩衝液（リン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、コハク酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、クエン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ）、ヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ））で５日間４５℃で保管した後、エタナーセプトの凝集程度を測定した結果である。
【図７】エタナーセプトを塩化アンモニウムを含む塩酸コハク酸緩衝液のｐＨを異ならせて作った組成物を５日間４５℃で保管した後、エタナーセプトの凝集程度を測定した結果である。
【図８】エタナーセプトを塩化アンモニウムとリジンを含む塩化コハク酸緩衝液の組成物に５、１４日間４５℃で保管した後、エタナーセプトの凝集程度を測定した結果である。Ｅｎｂｒｅｌ：市販中のエタナーセプト（エンブレル）剤形ＡｍＣｌ：塩化アンモニウム、ＡｍＣｌ＋Ｌｙｓ：塩化アンモニウム＋リジン
【発明を実施するための形態】
【００１３】
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法及び以下で詳述する實驗方法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
【００１４】
本発明で、「タンパク質とＦｃドメインの融合タンパク質」とは、抗体の不変領域であるＦｃドメインにタンパク質が融合した形態の融合タンパク質を意味して、ここでタンパク質は数個のアミノ酸がペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）結合で形成されたアミノ酸の重合体を意味し、ポリペプチドは、分子量が小さいオリゴペプチド及び分子量が大きいタンパク質と同じ意味で用いられる。従って、本発明で「タンパク質とＦｃドメインの融合タンパク質」とは「ポリペプチドとＦｃドメインの融合タンパク質」と同じ意味を持つ。
【００１５】
本発明で「タンパク質」とは、任意の生理活性を示すタンパク質またはポリペプチドで、その種類が制限されないが、好ましくはＴＮＦ−受容体、ＶＥＧＦ受容体などの種々の受容体の水溶性の部分（ｓｏｌｕｂｌｅ  ｐｏｒｔｉｏｎ）、ＧＬＰ−１類似体（ＧＬＰ−１  ａｎａｌｏｇ）及びその誘導体、ｆｌｔ３リガンド、ＣＤ４０リガンド、エリスロポエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、トロンボポエチン（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ）、カルシトニン（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ）、Ｆａｓリガンド、ＮＦ−ｋａｐｐａ  Ｂの受容体活性用リガンド（ＲＡＮＫＬ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−関連アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、胸腺ストローマ由来リンポポエチン（ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ）、顆粒球増殖促進糖タンパク質、顆粒球−大食細胞増殖促進糖タンパク質、肥満細胞成長因子、幹細胞成長因子、表皮成長因子、ＲＡＮＴＥＳ、成長ホルモン、インスリン、インスリノトロピン（ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｎ）、インスリン様成長因子、副甲状腺ホルモン（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、インターフェロン、神経成長因子、グルカゴン、インターロイキン１〜１８、増殖糖タンパク質、リンホトキシンン−β、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、白血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）、オンコスタチン−Ｍ及び細胞表面分子ＥＬＫ及びＨｅｋに対する様々なリガンド（例えば、エファ（ｅｐｈ−）関連キナーゼまたはＬＥＲＫＳなどに対するリガンド）の中から選択したものが用いられ、最も好ましくはヒトｐ７５腫瘍壊死因子受容体（ｐ７５  ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の細胞外リガンド結合部が用いられる。
【００１６】
本発明における受容体の水溶性の部分（ｓｏｌｕｂｌｅ  ｐｏｒｔｉｏｎ）は、受容体の細胞外リガンド結合部（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）、または、細胞他リガンド結合部と追加的に膜通過領域（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ）を含む領域を意味する。
【００１７】
本発明で、「Ｆｃドメイン」とは、抗体の不変領域を意味し、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインが好ましいが、これに限定されるのではなく、ヒトＩｇＧ１だけでなくＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４も用いられて、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）の中の一部または全部を含んでもよく、好ましくはＣＨ１ドメインを除いたＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びヒンジ領域を含む。
【００１８】
本発明のタンパク質とＦｃドメインの融合タンパク質は、当業界で用いられる一般的な方法で製造及び収得される。細胞内で融合タンパク質を産生する場合、融合タンパク質以外の残余物は、遠心分離、限外ろ過及び／または、クロマトグラフィー過程などから選択された一つ以上の工程を介して除去される。
【００１９】
一観点において、本発明は、アンモニウム塩を含有する、タンパク質とＦｃドメインの融合タンパク質の安定化用組成物に関する。
【００２０】
本発明で「アンモニウム塩」とは、アンモニアと酸が和合してできる塩を意味し、一般式ＮＨ４Ｘ（Ｘは１価の酸基）で表すことができる。好ましくは、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムの中から選択されるものが用いられるが、これに制限されない。
【００２１】
種々の塩は、タンパク質の溶解度を変化させるが（Ｋｕｎｚ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．Ｃｏｌｌ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．，９：１９３７，２００４）、タンパク質の溶解度程度は、表面張力の増加と関連がある。表面張力を最も大きく増加させてタンパク質の安定性を増加させる陽イオンはＮＨ４＋である。しかし、まだアンモニウム塩を利用して融合タンパク質の凝集を抑制したり、融合タンパク質を含有する組成物を安定化した例はなかった。本発明者等は、タンパク質とＦｃドメインの融合タンパク質をアンモニウム塩を含有する水溶液で保管する場合、融合タンパク質の凝集が効果的に抑制されることを発見しており、本発明は、アンモニウム塩を含有する、タンパク質とＦｃドメインの融合タンパク質の安定化用組成物を提供する。
【００２２】
本発明で、アンモニウム塩は、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、及び硝酸アンモニウムの中から選択されるものを５乃至５００ｍＭの濃度で用いることができる。本発明の実施例では、１２．５乃至２００ｍＭ濃度のアンモニウム塩を用いたが、１２．５ｍＭ以下の少量のアンモニウム塩を用いたり２００ｍＭ以上のアンモニウム塩を用いる場合にも融合タンパク質の凝集抑制効果が存在する。従って、本発明のアンモニウム塩は、ポリペプチドとＦｃドメインの融合タンパク質の凝集を効果的に抑制する。本発明の他の実施例では、ヒトｐ７５腫瘍壊死因子受容体の細胞外リガンド結合部が、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに融合した融合タンパク質を塩化アンモニウムまたは硫酸アンモニウム溶液で保管した時、アンモニウム塩溶液で保管しなかった融合タンパク質に比べて、その凝集程度が約８０％まで減少することを確認した（図１、図２）。
【００２３】
また他の観点で、本発明に係るタンパク質とＦｃドメインの融合タンパク質の安定化用組成物は、コハク酸塩（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）をさらに含んでもよく、前記コハク酸塩は、本発明のタンパク質とＦｃドメインの融合タンパク質を含有する組成物のｐＨ（水素イオン濃度）を調節して、融合タンパク質の凝集をさらに減少させるための緩衝剤の機能をする。（ａｎｏｔｈｅｒ  ａｓｐｅｃｔ）
【００２４】
前記コハク酸塩は、５乃至２００ｍＭ、さらに好ましくは２０乃至３０ｍＭ濃度になるように添加されて、コハク酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）だけでなく、当業界に公示された様々なコハク酸塩が用いられる。前記コハク酸塩を含む組成物において、コハク酸塩緩衝剤は、ｐＨが５．５乃至６．５になるように調節して、さらに好ましくはｐＨ６．０乃至６．３に調節する。ｐＨが５．５以下になったり６．５以上になれば、融合タンパク質の凝集が増加するので、前記範囲内になるのが好ましい。
【００２５】
本発明の実施例で、融合タンパク質の凝集抑制効果が立証された塩化アンモニウム賦形剤にリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、コハク酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、クエン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）、ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）緩衝液を追加で添加して、タンパク質凝集効果の差を確認し、その結果、コハク酸ナトリウムを緩衝剤として用いた剤形が、ｐＨ６．５で現在市販中のエタナーセプト（商品名Ｅｎｂｒｅｌ）剤形に用いているリン酸ナトリウムを緩衝剤として用いた剤形より凝集形成が明らかに低いことを確認した。また、ｐＨ６．０で他の緩衝剤を用いた剤形よりコハク酸塩ナトリウムを用いた剤形が、優秀な凝集抑制現象を示すことを確認することができた（図６）。また、コハク酸ナトリウム緩衝液の効果を最大化するために、様々なｐＨに調節して凝集抑制効果を観察した結果、コハク酸ナトリウム緩衝液のｐＨが低いほど凝集形成が低いことを確認して、ｐＨ６．０及びｐＨ６．３で市販中のエタナーセプト剤形（比較剤形）に比べて凝集形成が明らかに少ないことを確認することができた（図７）。
【００２６】
一方、アミノ酸は、タンパク質の凝集を抑制する物質として知られていて、その中でも塩基性アミノ酸は、凝集防止剤として優れた役割を果す。リューマチ関節炎治療剤であるエタナーセプトの場合、アルギニンが凝集防止剤としえ用いらて（ＵＳ７６４８７０２  Ｂ２）、また、リジン、アルギニン、ヒスチジンと糖、酸性緩衝液、ポリソルベートの組み合わせでＦｃ変形抗体を安定化する剤形（ＵＳ２０１００２５４９８５）の特許が報告されたことがある。その他にも、トレハロース、スクロース、マンニトール、マルトーズなどの糖、ホスフェート、シトレートなどの陰イオン性緩衝液を用いた例がある。また、界面活性剤は、タンパク質の変性されて露出した疏水性部位に付着して溶解度を増加させることで凝集を防止できるが、代表的にはポリソルベートがＭｕｒｏｍｏｎａｂ、Ａｂｃｉｘｉｍａｂ、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、Ｄａｃｌｉｚｉｍａｂ、Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ、Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ、Ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂなどの抗体タンパク質剤形に用いられている。
【００２７】
従って、本発明に係るタンパク質とＦｃドメインの融合タンパク質の安定化用組成物には、融合タンパク質の凝集をさらに減少させるために、好ましくは、塩基性アミノ酸、糖及び界面活性剤の中から選択される１種以上の賦形剤が追加で用いられる。
【００２８】
塩基性アミノ酸としては、アルギニン、リジン、ヒスチジンなどを１乃至５０ｍＭの濃度で用いることができ、糖としては、スクロース、トレハロース、マンニトール、マルトーズなどを０．５乃至１０  ％  ｗ／ｖの濃度で、界面活性剤としては、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）、ツイン（Ｔｗｅｅｎ）、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）系列の物質を０．００１乃至０．１  ％  ｗ／ｖの濃度で用いられるが、これに制限されなく、融合タンパク質または抗体タンパク質の凝集を抑制するために当業界で用いることができる賦形剤ならば制限なしに用いられる。
【００２９】
本発明の実施例で、コハク酸塩ナトリウム緩衝液とアンモニウムイオン成分そして塩基性アミノ酸を組み合わせて凝集抑制効果を観察した結果、塩化アンモニウム、コハク酸塩及びリジンが追加された組成物の場合、エタナーセプト剤形（比較剤形）に比べて凝集形成の程度が顕著に減少することを確認した（図８）。
【００３０】
本発明は、他の観点で、タンパク質とＦｃドメインの融合タンパク質を含有する組成物にアンモニウム塩を加えてタンパク質とＦｃドメインの融合タンパク質を安定化させる方法を提供して、前記組成物にはコハク酸塩（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）をさらに含んでもよく、前記コハク酸塩は、ｐＨが５．５乃至６．５の緩衝剤形態で５乃至２００ｍＭ濃度で添加されてもよい。
【００３１】
本発明の一実施例では、タンパク質とＦｃドメインの融合タンパク質としては、市中で購入できる関節炎治療剤であるエタナーセプトとタンパク質をＣＨＯ細胞で発現させた後、これを高純度で精製して収得したものを用いた。本発明に係るアンモニウム塩が、前記融合タンパク質の凝集を抑制して、その剤形を安定化させるのに効果的であるか実験を行った結果、エタナーセプト製品の凝集防止のために用いるアルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）に比べて本発明に係るアンモニウム塩を用いる場合、融合タンパク質の凝集抑制効果がより優れることを確認することができた（実施例２）。
これにより、本発明は。好ましい例として、ヒトｐ７５腫瘍壊死因子受容体の細胞外リガンド結合部が、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに融合されたものである融合タンパク質とアンモニウム塩を含有する関節炎治療用組成物を提供する。
【実施例】
【００３２】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００３３】
実施例１
タンパク質とＦｃドメインの融合タンパク質では、エタナーセプトタンパク質を用いて本実験を行った。本発明における「ＴＮＦＲ：Ｆｃ」とは、エタナーセプトタンパク質を意味して、「ＴＮＦＲ：Ｆｃ剤形」とは、エタナーセプトタンパク質を含む剤形を意味する。
【００３４】
本実験は、ＴＮＦＲ：Ｆｃの凝集を抑制する賦形剤の効果を比較するために行った。具体的に、賦形剤の種類によって５０℃で保管したＴＮＦＲ：Ｆｃの凝集現象の差が発生するかを確認するための実験である。アルギニンを除いては米国Ａｍｇｅｎ社のＥｎｂｒｅｌ製品で用いられたのと同じ剤形の溶液を作った後、各々の賦形剤を添加して製造した水溶液を（最終濃度は、２５  ｍｇ／ｍｌ  Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ、０．６６％  ｗ／ｖスクロズ、６５ｍＭ塩化ナトリウム、１７ｍＭリン酸ナトリウム、水素イオン濃度６．４）５０℃で保管した後現れた凝集程度を比較した。各水溶液で用いられた賦形剤の最終濃度は２５ｍＭアルギニン、１００ｍＭプロリン、８０ｍＭヒスチジン、１００ｍＭグリシン、０．２Ｍ塩化アンモニウム、１０  ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０％  ｗ／ｖスクロース、２０％  ｗ／ｖトレハロース、１０％  ｗ／ｖポリエチレングリコール、０．０４％  ｗ／ｖポリソルベート２０、０．１％  ｗ／ｖヒドロキシプロピルシクロデキストリンであり、ＴＮＦＲ：Ｆｃの凝集程度は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣを利用して測定した。タンパク質を５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ  ６．８）、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０５％  ｗ／ｖアジ化ナトリウムの緩衝溶液移動相条件下でＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ（７．８Ｘ３００  ｍｍ）ＨＰＬＣ  ｃｏｌｕｍｎ（ＴＯＳＯＨ，Ｊａｐａｎ）に注入した後２８０  ｎｍでタンパク質ピークを検出した。ＴＮＦＲ：Ｆｃの凝集体は主ピークより先立ってコラムで湧出されて、凝集体のピーク面積と主ピークの面積を比較して凝集程度を計算した。
【００３５】
１週間５０℃に保管した結果、ＴＮＦＲ：Ｆｃタンパク質の凝集現象は、賦形剤の種類によって大きく異なることが分かった。冷蔵条件である４℃で保管したタンパク質（凝集防止賦形剤がない対照群）ではほとんど凝集現象が現れなかった反面、５０℃では賦形剤の種類に関係なくほとんどのタンパク質が凝集形態に変化した（図１）。その中でも、界面活性剤成分であるポリソルベート２０、ヒドロキシプロピルシクロデキストリンや両親媒性高分子であるポリエチレングリコール、金属イオン除去剤であるＥＤＴＡ、アミノ酸系列賦形剤であるアルギニン、プロリン、ヒスチジン、グリシンなどは、凝集現象を全く抑制できなかった（図１）。しかし、糖系列賦形剤であるスクロース、トレハロースは、他の賦形剤より少し良い凝集形成防止効果があった。また、他の賦形剤の場合は、ほとんどのＴＮＦＲ：Ｆｃが凝集するのに対して、塩化アンモニウムを賦形剤として用いた場合には、約５０％のタンパク質だけが凝集形態に変化したのを確認することができた。
前記結果から、厳しい条件でＴＮＦＲ：Ｆｃの凝集現象がアンモニウム塩の使用によって効果的に抑制されることが分かった。
【００３６】
実施例２
タンパク質とＦｃドメインの融合タンパク質で、ＴＮＦＲ：Ｆｃを用いて本実験を行った。本実験は、ＴＮＦＲ：Ｆｃの凝集を抑制するために用いられている賦形剤であるアルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）と他の賦形剤を用いた場合の凝集程度を比較するために行った。
【００３７】
比較対象として選択した賦形剤は、プロリン、塩化アンモニウム、スクロース、ポリソルベート２０とヒドロキシプロピルシクロデキストリンである。最終濃度１０  ｍｇ／ｍｌのＴＮＦＲ：Ｆｃ、１％  ｗ／ｖスクロース、１００ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸ナトリウム、水素イオン濃度６．４のアルギニンを除いた陰性対照薬と、２５ｍＭアルギニンが含まれた陽性対照薬を製造した。そして陰性対照薬に賦形剤が各々１００ｍＭプロリン、５０〜２００ｍＭ塩化アンモニウム、２０  ％  ｗ／ｖスクロース、０．０４％  ｗ／ｖポリソルベート２０、０．１  ％  ｗ／ｖヒドロキシプロピルシクロデキストリンに置き換えた剤形を各々試験した。各々の剤形は、実施例１と同様に５０℃で１週間保管した。凝集現象を調べるために、実施例１と同様にＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いた。
【００３８】
ＴＮＦＲ：Ｆｃを５０℃で１週間保管した結果、アルギニンが含まれた剤形では、約１０％程度の凝集現象が発見された（図２）。しかし、他のアミノ酸であるプロリンは、凝集防止効果が微小であって、抗体タンパク質の剤形に多く含まれる凝集防止剤であるポリソルベート２０、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン（ＨＰＣＤ）も凝集防止効果が殆どないことが分かった。しかし、代表的なタンパク質安定化剤であるスクロースの場合、過量（２０％  ｗ／ｖ）を添加した場合には凝集防止効果がアルギニンの場合より優れていた。実施例１で優れた安定化効果を見せた塩化アンモニウムは、添加される濃度が増加するほど凝集防止効果も増加することを確認できて（図２参照）、５０ｍＭの塩化アンモニウムを用いた場合、２５  ｍＭのアルギニンを用いた場合より凝集抑制効果が優れていることを確認することができた。
【００３９】
実施例３
本実施例では、高温で凝集抑制効果が立証された塩化アンモニウム賦形剤の凝集抑制効果をより詳しく立証するために、実験温度を３７℃に変えて実験を行った。本実験は、賦形剤としては、塩化アンモニウム以外のアンモニウム塩である硫酸アンモニウムと一般にタンパク質凝集抑制能力があると知らされた他の賦形剤との組み合わせによる凝集抑制効果を立証するために行った。具体的に、最終濃度が２５ｍｇ／ｍｌのＴＮＦＲ：Ｆｃ、１％  ｗ／ｖスクロース、１００ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸ナトリウム、水素イオン濃度６．４の安定化緩衝液条件で、各賦形剤を添加した後、３７℃で４週保管後実験を行った。
【００４０】
凝集抑制のための賦形剤が入っていなかった安定化緩衝液組成（陰性対照剤形）、最終濃度が２５ｍＭのアルギニンが含まれた剤形（陽性対照剤形）、５０ｍＭの塩化アンモニウムが含まれた剤形、２５ｍＭの硫酸アンモニウム、５０ｍＭの塩化アンモニウムと１ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭの塩化アンモニウムと０．１％  ｗ／ｖのポリソルベート２０、５０ｍＭの塩化アンモニウムと５％  ｗ／ｖのスクロース、５０ｍＭの塩化アンモニウムと２５ｍＭのリジンが含まれた剤形を用いた。各剤形は、３７℃で４週間保管した。凝集抑制効果は、実施例１と同様にＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて観察した。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
ＴＮＦＲ：Ｆｃを３７℃で４週間保管した結果、アンモニウム塩を含む剤形が、タンパク質の凝集現象を効果的に抑制することを確認することができて、硫酸アンモニウムも塩化アンモニウムと類似するように凝集を抑制することを確認することができた。また、興味深いことにＥＤＴＡ、ポリソルベート２０といった賦形剤は、塩化アンモニウムと組み合わせて用いた時、陰性対照剤形より凝集現象がさらに多く発生したが、スクロース及びリジンを塩化アンモニウムと組み合わせて用いた場合には、塩化アンモニウムだけ単独で用いた場合に比べて凝集程度がさらに減少したことを確認することができた（図３及び表１）。
【００４３】
実施例４
本実験は、融合タンパク質の凝集抑制効果が立証された塩化アンモニウム賦形剤の濃度毎の抑制効果を調べるためのもので、３７℃より高温で行った。本実験では、ＴＮＦＲ：Ｆｃの微細な凝集現状の差を確実に調べるために、温度を４５℃に設定して実験を行った。
【００４４】
具体的に、塩化アンモニウムと硫酸アンモニウム、そして一般にタンパク質凝集抑制効果があると知らされた他の賦形剤との組み合わせによるＴＮＦＲ：Ｆｃの凝集抑制効果を調べるために、本実験を行った。最終濃度が５０ｍｇ／ｍｌのＴＮＦＲ：Ｆｃを１％  ｗ／ｖスクロース、１００ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸ナトリウム、水素イオン濃度６．４の安定化緩衝液条件で４５℃に保管した剤形溶液でアンモニウム塩の凝集抑制効果を観察した。
【００４５】
凝集抑制賦形剤が含まれていない安定化緩衝液組成（陰性対照剤形）。最終濃度２５ｍＭのアルギニンが含まれた剤形（養成対照剤形）、最終濃度塩化アンモニウムが各々１２．５ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ入った剤形、２５ｍＭの硫酸アンモニウム、２５ｍＭの塩化アンモニウム及び２５ｍＭのリジンまたは５％  ｗ／ｖのスクロースが含まれた剤形、５０ｍＭの塩化アンモニウム及び２５ｍＭのリジンまたは５％  ｗ／ｖのスクロースが含まれた剤形を４５℃で２週間保管した後、凝集程度を観察した。凝集抑制効果は、実施例１と同様にＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いた観察した。
【００４６】
【表２】
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【００４７】
本実験の結果、アンモニウム塩が含まれた剤形の場合、濃度によりアルギニンを含む剤形と同じかより優れた凝集抑制現象を示すことを確認することができた。また、一般にタンパク質凝集抑制効果があると知らされた他の賦形剤（リジン、スクロース）と塩化アンモニウムまたは硫酸アンモニウムを組み合わせて用いる場合、より優れた凝集抑制効果を得ることができることを確認することができた（図４、図５及び表２）。
【００４８】
実施例５
本実験は、融合タンパク質の凝集抑制効果が立証された塩化アンモニウム賦形剤の効果を最大化するために、種々の緩衝液で作った剤形溶液を４５℃に保管して凝集抑制効果を観察した。
【００４９】
具体的に、一般にタンパク質剤形に多く用いるリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、コハク酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、クエン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）、ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）緩衝液内でのタンパク質凝集効果の差を見るために試験した。最終濃度が５０  ｍｇ／ｍｌのＴＮＦＲ：Ｆｃを１００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭ塩化アンモニウム、２５ｍＭの各々の前記４種類の緩衝液の条件でｐＨ６．０とｐＨ６．５の二種類の条件で４５℃に保管した剤形溶液で凝集抑制効果を観察した。
【００５０】
凝集抑制効果は、実施例１と同様にＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて観察した。
本実験の結果、コハク酸ナトリウムを緩衝剤として用いた剤形がｐＨ６．５で他の緩衝剤を用いた剤形より凝集形成が明確に低いことを確認した。現在市販中のＥｎｂｒｅｌ剤形に用いられているリン酸ナトリウムを緩衝剤として用いた剤形がその他の剤形より凝集形成が多かった。また、ｐＨ６．０で他の緩衝剤を用いた剤形よりコハク酸ナトリウムを用いた剤形がもう少し優れた凝集抑制現象を示すことを確認することができた（図６）。
【００５１】
実施例６
本実験は、融合タンパク質の凝集抑制が優れたコハク酸ナトリウム緩衝液の効果を最大化するために様々なｐＨで調節したコハク酸ナトリウム緩衝液で作った剤形溶液を４５℃に保管して凝集抑制効果を観察した。
【００５２】
具体的に、コハク酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）緩衝液中ｐＨによるタンパク質凝集効果の差を見るために試験した。最終濃度が５０  ｍｇ／ｍｌのＴＮＦＲ：Ｆｃを１００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭ塩化アンモニウム、２５ｍＭのコハク酸ナトリウム緩衝題液の条件でｐＨ６．０、６．３、６．５、７．０の四つの条件で４５℃に保管した剤形溶液で凝集抑制効果を観察した。
【００５３】
凝集抑制効果は実施例１と同様にＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて観察した。
本実験の結果、コハク酸塩ナトリウム緩衝液のｐＨが低いほど凝集形成が低いことを確認して、ｐＨ６．０及びｐＨ６．３で市販中のエタナーセプト剤形（比較剤形）より凝集形成が少ないことを確認することができた（図７）。
【００５４】
実施例７
本実験は、融合タンパク質の凝集抑制が優れたコハク酸ナトリウム緩衝液とアンモニウムイオン成分そして塩基性アミノ酸を組み合わせた時、凝集抑制効果がより優れていることを確認するために、各成分を組み合わせて作った剤形溶液を４５℃に保管して凝集抑制効果を観察した。
【００５５】
具体的に、コハク酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）緩衝液、塩化アンモニウム、リジンを組み合わせてタンパク質凝集効果の差を見るために試験した。最終濃度が５０ｍｇ／ｍｌのＴＮＦＲ：Ｆｃを１００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭ塩化アンモニウム、２５ｍＭリジン、２５ｍＭのコハク酸塩ナトリウム緩衝題液の条件で４５℃に保管した剤形溶液で凝集抑制効果を０、５、１０及び１５日間観察した。
【００５６】
凝集抑制効果は、実施例１と同様にＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて観察した。
本実験の結果、塩化アンモニウム、コハク酸塩及びリジンが追加された組成物の場合、Ｅｎｂｒｅｌ剤形（比較剤形）より凝集形成が少ないことを確認した（図８）。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明に係るアンモニウム塩、またはアンモニウム塩とコハク酸塩を含有する組成物は、Ｆｃ−融合タンパク質の凝集を効果的に抑制するため、前記融合タンパク質の長期間保管を可能にするので、Ｆｃ−融合タンパク質を利用した医療分野に広範囲に用いることができる。
【００５８】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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