(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたヒトの内乳動脈由来細胞であって、前記細胞が培養中に自己複製して増殖することができ、前記細胞が細胞−表面マーカーＨＬＡ−１について発現陽性であり、細胞−表面マーカーＣＤ１０、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＣＤ１４１及びＫＤＲ／Ｆｌｋ−１のそれぞれについて発現陰性であり、
前記ヒトの内乳動脈由来細胞は、血管および心臓血管組織のための足場上で増殖でき、
前記細胞が、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１６６について更に発現陽性であり、ＣＤ１５、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ６２ｐ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１３８、ＣＤ１４６、ＶＥ−カドヘリン、及びＨＬＡ−２について更に発現陰性である、
細胞。
【請求項２】
前記細胞が、脂肪細胞、心筋細胞、及び内皮細胞に分化可能である、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
ヒトの内乳動脈由来細胞を培養する方法であって、
ａ．酵素混合物を提供する工程であって、前記酵素混合物が、メタロプロテアーゼ酵素、中性プロテアーゼ酵素、粘液溶解性酵素、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される消化酵素から構成される、工程と、
ｂ．前記動脈から内膜層を除去し、かつ外部残屑を除去するために、前記酵素混合物中で、６０分間、与えられたヒトの内乳動脈をインキュベートし、部分的に消化された動脈を提供する工程と、
ｃ．前記部分的に消化された動脈を新しい酵素混合物中に移し、消化された材料を提供するのに十分な時間、消化を継続する工程と、
ｄ．前記消化された材料から前記細胞を単離する工程であって、前記細胞が、細胞−表面マーカーＨＬＡ−１について発現陽性であり、細胞−表面マーカーＣＤ１０、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＣＤ１４１及びＫＤＲ／Ｆｌｋ−１のそれぞれについて発現陰性であり、ＣＤ１５、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ６２ｐ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１３８、ＣＤ１４６、ＶＥ−カドヘリン、及びＨＬＡ−２について更に発現陰性である工程と、
ｅ．コラーゲンをコーティングした組織培養用容器上で前記細胞を培養する工程と、を含み、
前記培養された細胞は、血管および心臓血管組織のための足場上で増殖できる、
方法。
【請求項４】
前記酵素混合物が、コラゲナーゼ及びディスパーゼから構成される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記消化された材料を提供するのに十分な時間が、３０分間〜６０分間の範囲内である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記酵素混合物を消化された材料で飽和させるのに十分な時間が、６０分間である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法によってヒトの内乳動脈から単離された細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、米国特許仮出願第６１／２４７，２２８号の非暫定出願である。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般的に哺乳類内乳動脈から単離された哺乳類乳動脈由来細胞に関する。本発明は更に、哺乳類内乳動脈由来細胞の単離方法に関する。単離された内乳動脈由来細胞を足場と組み合わせ、組織工学デバイスにおいて使用する方法が提供される。
【背景技術】
【０００３】
内胸動脈としても知られる内乳動脈は、前胸壁及び乳腺を灌流する。内乳動脈は、伏在静脈グラフトと比較して優れた長期間開存性を有し、冠動脈（cornonary artery）バイパス術において第１選択の血管であるとされている。冠動脈及び頸動脈と比較して、乳動脈は動脈硬化（arthrosclerosis）に対して高い抵抗性を示す。伏在静脈と比べて、この内乳動脈の移植片動脈硬化に対する長期間抵抗性は、少なくとも部分的にはその優れた内皮細胞機能に起因すると考えられている。加えて、内乳動脈の機械的損傷に対する応答も、冠動脈と異なる。ヒト冠動脈は、細胞遊走及び細胞増殖を促進することによりバルーン血管形成術に応答し、新生内膜の形成と、症例のうち約４０％の再狭窄に至る。しかしながら、冠動脈及び伏在静脈グラフトとは異なり、経皮経管的血管形成術後の内乳動脈グラフトには再狭窄はみられなかった。したがって、内乳動脈は、血管前駆細胞の有用な組織源となり得る。
【０００４】
軟骨、骨、及び脂肪から構成される異所性組織が動脈壁内部に形成できることは、十分に立証されている。この現象は異形成と呼ばれ、多分化能前駆細胞が動脈壁内に存在し得ることを示唆する。動脈壁内の骨形成分化及び軟骨形成分化は、臨床的には血管へのカルシウム沈着とみなされ、この種の石灰化は心臓血管障害の増加と関連する。血管のカルシウム沈着は大動脈の硬さを増加させることが知られており、収縮期高血圧、冠不全、左心室肥大、虚血、及びうっ血性心不全の原因となる。実際に、冠動脈血栓の原因となる粥腫の約８５％は石灰化されている。動脈壁内の前駆細胞が、粥腫形成、カルシウム沈着、及び動脈硬化においてある役割を果たす場合があると示唆されている。したがって、これらの細胞が血管病変及び修復にどのように寄与するのかを理解することで、心臓血管適応に対する治療の改善をもたらし得る。
【０００５】
現在は、多くの研究者が、血管生理における幹細胞の役割を理解することに集中している。成人の器官は、器官の維持及び障害後の修復に関与する幹細胞を含むことが示されている。したがって、全てではなくとも多くのタイプの器官組織から成人前駆細胞を単離できると考えられる。その結果、これらの組織特異性前駆細胞を組織特異性の治療目的に利用し得る。
【０００６】
最近Ｚｉｎｇｉｎらは、成人ヒト血管壁に「血管原性域」が存在することを示した。この実験では、ヒト内胸動脈から推定前駆細胞を単離した。細胞を回収するために、動脈を刻み、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて３７℃で５分間消化した。非消化組織を濾過により除去した。懸濁液を遠心分離し、得られた細胞ペレットを内皮増殖培地に再懸濁して、コラーゲン又はフィブロネクチンをコーティングしたディッシュにまいた。これらの細胞はＣＤ３４の発現を示した。ＫＤＲ／Ｆｌｋ１及びＣＤ４５を発現する前駆細胞が、内乳動脈の血管壁内に存在することも示された。これらのデータは、内乳動脈壁の内部に前駆細胞のプールがあることを示唆する。
【０００７】
製造可能で動脈硬化に抵抗性のある血管壁前駆細胞の同定及び単離は、細胞治療及び組織工学用途に有益であることを証明するであろう。内乳動脈に特有の抗動脈硬化特性及び機械的特性を利用しようとして、我々は、ヒト内乳動脈から特有の前駆細胞を単離して特徴付け、組織工学用途におけるそれらの有用性を評価した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
我々は、哺乳類内乳動脈から単離された哺乳類内乳動脈由来細胞について開示する。哺乳類内乳動脈由来細胞の単離方法も提供する。哺乳類内乳動脈由来細胞を、細胞形態、増殖能、表面マーカーの表現型、分泌タンパク質、遺伝子発現、多分化能分化、及びインビボ血管新生促進活性について特徴付けた。これらの細胞は、細胞工学及び組織工学用途の両方に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】形態。ｉＭＡＣ（内乳動脈由来細胞）を、コラーゲンをコーティングした組織培養用フラスコで培養し、継代数２（Ａ）、継代数７（Ｂ）及び継代数２３（Ｃ）において位相差画像を得た。細胞は、均質な繊維芽細胞の形態を示す。
【図２】成長速度。コラーゲンをコーティングしたフラスコでｉＭＡＣを８１日間培養した。３〜５日ごとに細胞を回収してカウントし、集団倍加を決定した。培養は、少なくとも４１．９回の集団倍加を達成することができた。
【図３】毛細血管形成。ｉＭＡＣ及びヒト内乳動脈内皮細胞（ＥＣ）を、マトリゲルをコーティングしたプレートで別々に培養し、毛細血管形成を観察した。ｉＭＡＣ増殖培地、内皮増殖培地−２（ＥＧＭ−２）、又は平滑筋細胞用分化培地（ＳＭＣ培地）の異なる３種の培地内で細胞を培養した。ｉＭＡＣ増殖培地又はＥＧＭ−２内で成長したｉＭＡＣ培養物において、高密度な毛細血管形成が観察された。１００×の倍率で画像を得た。
【図４】脂肪生成。ｉＭＡＣを脂肪生成誘導培地で１５日間培養した。誘導後５、１０、及び１５日目にＯｉｌ  Ｒｅｄ−Ｏで培養物を固定し、染色した。細胞内の脂質の小滴は赤く染まる。左下のパネルに示す培養５日目の画像は４００×の倍率で得た。他の画像は全て２００×の倍率で得た。
【図５】細胞浸潤／毛細血管密度。データのバーは、評価した総面積あたりの細胞／毛細血管から構成される面積の平均割合を表す。Ｎ＝５又は６。エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を表す。
【図６】成長速度。細胞は、消化酵素に３０、６０、９０、１２０、１５０分間さらした内乳動脈から単離された。続いて、これらの各時点で得た細胞を、細胞が老化するまで組織培養用プレートで培養した。成長期間中に、細胞が１回の集団倍加を達成できなかったとき、老化と判定した。累積集団倍加（ＰＤ）を決定した。
【図７】内皮細胞分化：ｉＭＡＣは、内皮細胞用分化培地で処理後、内皮細胞マーカーを上方制御する。発現（％）は、ｉＭＡＣ細胞培養群における、検査したマーカーを発現する細胞の割合を表す。ｉＭＡＣ細胞用標準培地で増殖後に検査したマーカーを発現する細胞の割合（白色バー）。分化培地で増殖後に検査したマーカーを発現する細胞の割合（黒色バー）。
【図８】平滑筋細胞分化：平滑筋細胞用分化培地で処理前及び処理後、依然として平滑筋細胞マーカーが発現した。発現（％）は、ｉＭＡＣ培養群における、検査したマーカーを発現する細胞の割合を表す。ｉＭＡＣ細胞用標準培地で増殖後に検査したマーカーを発現する細胞の割合（白色バー）。分化培地で増殖後に検査したマーカーを発現する細胞の割合（黒色バー）。
【図９】心筋細胞分化：心筋細胞用分化培地でｉＭＡＣを培養後、心筋細胞マーカーが上方制御された。発現（％）は、ｉＭＡＣ培養群における、検査したマーカーを発現する細胞の割合を表す。ｉＭＡＣ細胞用標準培地で増殖後に検査したマーカーを発現する細胞の割合（白色バー）。分化培地で増殖後に検査したマーカーを発現する細胞の割合（黒色バー）。
【図１０】ｉＭＡＣ−播種された管状足場の組織像。管状足場をｉＭＡＣ細胞と共に内表面及び外表面の両側に播種し、バイオリアクターチャンバで１０日間培養した。この時に、足場をホルマリンで固定し、ヘマトキシリン及びエオジンで染色した。
【図１１】ｉＭＡＣ細胞と共に播種された静電紡糸されたＰＣＬ足場のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色。静電紡糸された管状ＰＣＬ足場をｉＭＡＣ細胞と共に播種し、バイオリアクターチャンバで３日間培養した。細胞を室温で３時間インキュベートすることにより模擬輸送し、その後標準的な細胞培養インキュベーターに戻した。示した時間で足場断片を切り離し、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色液を用いて染色した。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、特定の方法、試薬、化合物、組成物、又は生物系に限定されないことが理解され、これらは当然のことながら可変である。また、本明細書に使用される用語は、単に特定の実施形態を説明するためのものであり、限定するものではないことを理解されたい。本明細書及び添付の「特許請求の範囲」において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を包含する。
【００１１】
別段の規定がない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されている意味と同一の意味を有する。本明細書に記載されているものと同様又は同等の任意の方法及び材料を、本発明の試験を実施するために使用できるが、好ましい材料及び方法を本明細書に記載する。本発明の記載及び請求には、以下の用語が使用される。
【００１２】
「本発明の細胞」は、哺乳類内乳動脈由来細胞を意味する。「分化」は、非特殊化の（「中立の」）又は比較的特殊化されていない細胞が、例えば血管細胞などの特殊化した細胞の特徴を獲得するプロセスである。「分化した、又は分化を誘発された細胞」は、細胞系内でより特殊化した（「傾倒した」）状況を呈している細胞である。分化プロセスに適用した際の用語「傾倒した」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合に分化し続ける分化経路の地点に進行しており、通常の環境下で異なる細胞型に分化し、又は未分化の細胞型に戻ることができない細胞を指す。「系特異的なマーカー」は、対象とする系の細胞の表現型に特異的に関連した特徴を指し、中立細胞の対象とする系への分化を評価する際に使用することができる。
【００１３】
本明細書で用いるとき「内乳動脈由来細胞」は、哺乳類内乳動脈から単離された細胞である。内乳動脈由来細胞は、同等の潜在能力を有する娘細胞を産生するのに加え、脂肪細胞などの細胞を生じることができ、又は１つ以上のタイプの組織、例えば血管組織を生じることができる。これらの細胞は内乳動脈から「単離」されるが、これは酵素消化による周囲組織からの細胞の分離を意味する。「消化された材料」は、酵素溶液で処理された後に、哺乳類内乳動脈から単離された細胞及び組織を意味する。この消化された材料は廃棄されるか、組織培養用容器に直接蒔かれるかのいずれかである。「消化された材料」内に含まれる細胞は、組織培養用容器に付着でき、培養中に増殖できる。
【００１４】
「条件培地」は、特定の細胞又は細胞集団が培養され、その後除去される培地である。細胞は、この培地で培養される間に、他の細胞に対する栄養的支援を提供できる細胞性因子を分泌する。このような細胞性因子として、ホルモン、サイトカイン、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、タンパク質、抗体、及び顆粒が挙げられるが、これらに限定されない。細胞性因子を含む培地が条件培地である。
【００１５】
一般には「栄養素」は、細胞の生存、成長、増殖、成熟、分化、及び／若しくは維持を促進する、又は細胞活動の増加を刺激する物質として定義される。本明細書で用いられる「栄養的支援」は、細胞の生存、成長、増殖、成熟、分化、及び／若しくは維持の促進能、又は細胞活動の増加の刺激能を意味する。本発明の哺乳類内乳動脈由来細胞は、成長因子、サイトカイン、及び分化因子を含むが、これらに限定されない栄養素を産生する。「遺伝子発現」は、遺伝子のＲＮＡ産物への転写、及び任意に１つ以上のポリペプチド配列への翻訳を意味する。
【００１６】
一実施形態では、単離された哺乳類内乳動脈由来細胞が提供される。この細胞は、培養中に自己複製して増殖することができ、このとき細胞は、細胞−表面マーカーＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１６６及びＨＬＡ−１のそれぞれについて発現陽性であり、細胞−表面マーカーＣＤ１０、ＣＤ１５、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ６２ｐ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４１、ＣＤ１４６、ＶＥ−カドヘリン、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、及びＨＬＡ−２のそれぞれについて発現陰性である。
【００１７】
別の実施形態では、哺乳類内乳動脈由来細胞は、細胞−表面マーカーＨＬＡ−１について発現陽性であり、細胞−表面マーカーＣＤ  １０、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＣＤ１４１、及びＫＤＲ／Ｆｌｋ−１のそれぞれについて発現陰性である。
【００１８】
更に別の実施形態では、哺乳類内乳動脈由来細胞は、更にＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１６６について発現陽性であり、更にＣＤ１５、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ６２ｐ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１３８、ＣＤ１４６、ＶＥ−カドヘリン、及びＨＬＡ−２について発現陰性である。
【００１９】
別の実施形態では、哺乳類内乳動脈由来細胞は、栄養素β２ミクログロブリン、クレアチンキナーゼ−ＭＢ、ＥＮＡ−７８、エンドセリン−１、エオタキシン、脂肪酸結合タンパク質、フェリチン、塩基性ＦＧＦ、インターロイキン−６、インターロイキン−８、インスリン、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、幹細胞因子、ＴＩＭＰ−１、ＶＣＡＭ−１、及びＶＥＧＦを分泌することができる。この細胞はフォンヴィルブランド因子又はＰＤＧＦ−ｂｂを分泌しない。
【００２０】
更に別の実施形態では、単離された哺乳類内乳動脈由来細胞が提供され、かかる細胞は、培養中に自己複製して増殖することができ、このとき細胞は、ＣＤ１３、ケモカインリガンド２、エフリンＡ２、エフリンＡ３、エンドグリン、内皮細胞ＰＡＳドメインタンパク質１、繊維芽細胞成長因子−２、繊維芽細胞成長因子受容体−３、低酸素誘導因子−１、マトリックスメタロプロテアーゼ（Matrix metalenoprotinase）−２、ニューロピリン−１、胎盤成長因子、ウロキナーゼ、トロンボスポンジン−２、ＴＩＭＰ阻害物質−１、ＴＩＭＰ阻害物質−３、ＴＮＦ−１２ａ、トロポニンＴタイプ−１、ＶＥＧＦ−Ｂ及びＶＥＧＦ−Ｃ、ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅモチーフ含有３３（ＴＲＩＭ３３）、ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス１１（ＳＯＸ−１１）、Ｎｏｔｃｈホモログ２（ドロソフィラ）（ＮＯＴＣＨ−２）、システインリッチ膜貫通型ＢＭＰ制御因子１（ＣＲＩＭ−１）、ホメオボックスＤ９（ＨＯＸＤ９）及びＰＯＵクラス３ホメオボックス３（ＰＯＵ３Ｆ３）の遺伝子発現が陽性である。
【００２１】
一実施形態では、哺乳類内乳動脈由来細胞を単離する方法を提供する。この方法は、内乳動脈組織を得る工程と、動脈を２回の工程で順次消化して消化された材料を得る工程と、消化された材料から細胞を得る工程と、増殖培地中で細胞を培養して内乳動脈由来細胞を提供する工程と、を含む。第１の消化工程は、メタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、及び／又は粘液溶解性酵素の存在下で、動脈を部分的に消化するのに十分な時間、組織をインキュベートし、これにより動脈外部の残屑及び内膜層を除去する工程を含む。好適な酵素として、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、及びヒアルロニダーゼ、並びにこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、動脈は、コラゲナーゼ及びディスパーゼで消化される。一実施形態では、動脈は、第１の消化工程において酵素混合物と約６０分間インキュベートされる。その後、部分的に消化された動脈を酵素混合物から除き、第２の消化工程において、内乳動脈由来細胞を含む消化された材料を得るのに十分な時間、新しい酵素混合物中に置かれる。一実施形態では、動脈は、第２の消化工程において酵素混合物と約３０分間〜約６０分間インキュベートされる。別の実施形態では、動脈は、第２の消化工程において酵素混合物と約６０分間インキュベートされる。続いて、消化された材料から単離された細胞を、コラーゲンをコーティングした組織培養用容器に蒔き、標準的な条件で増殖培地中で培養する。短い培養時間の後、形態、表面マーカー発現、遺伝子発現、栄養素分泌、及び多分化能分化について細胞を特徴付ける。
【００２２】
別の実施形態では、心臓血管疾患の診断及び予後評価、並びに医薬品開発の方法を提供し、この方法は、統計的に有意な個体集団から哺乳類内乳動脈由来細胞を単離する工程と、統計的に有意な個体集団からの哺乳類内乳動脈由来細胞を培養して増殖し、哺乳類内乳動脈由来細胞である複数の細胞培養物を確立する工程と、哺乳類内乳動脈由来細胞培養物を１つ以上の生物学的又は薬理学的薬剤と接触させる工程と、１つ以上の生物学的又は薬理学的薬剤に対する１つ以上の細胞応答を特定する工程と、統計的に有意な集団の個体からの哺乳類内乳動脈由来細胞培養物の１つ以上の細胞応答を比較する工程と、を含み、哺乳類内乳動脈由来細胞を用いて生物学的又は薬理学的薬剤に対する細胞応答を特徴付ける。本発明の哺乳類内乳動脈由来細胞をインビトロで用いて、薬理学的薬剤、成長／制御因子、及び抗炎症剤の有効性及び細胞障害性について様々な化合物をスクリーニングできる。このため、本発明の細胞又は上記組織培養物は、インビトロで維持され、試験される化合物に曝露される。細胞障害性化合物の活性は、培養中の細胞の障害能又は死滅能により測定できる。これは生体染色技術により容易に評価できる。成長／制御因子の影響は、インビトロでの生細胞の数、例えば、総細胞数及び分化細胞数を解析することにより評価できる。種特異性細胞性抗原を確定する抗体を用いる免疫細胞化学的手技を利用するなど、標準的な細胞学的及び／又は組織学的手技を用いて達成できる。
【００２３】
本発明の細胞及び組織は、生理学的又は病理学的状態の研究においてモデル系として使用できる。本発明の細胞及び組織はまた、サイトカイン、成長因子、例えば、炎症性メディエーター、例えば、ＩＬ−１、ＴＮＦ、及びプロスタグランジンの作用機序の研究にも使用できる。加えて、細胞障害性及び／又は薬理学的薬剤は、特定の患者に最も有効なもの、例えば動脈硬化及びその他心臓血管病変を逆行させる、縮小する、又は予防するものとしてスクリーニングされ得る。続いて、インビトロでの有効性が立証される薬剤を、患者の治療的処置に用いることができた。
【００２４】
別の実施形態では、ｉＭＡＣを、許容できるマトリックス、例えば製薬上許容できるマトリックスと共に投与してよい。マトリックスは生分解性であってよい。マトリックスは、細胞の成長及び分化を促進する更なる遺伝物質、サイトカイン、成長因子、又はその他因子を提供することもできる。投与前に細胞をカプセル化してもよい。カプセル化細胞は、ポリマーカプセル内に含まれてよい。本明細書に記載の担体デバイス、足場、又はマトリックスの調製に用いたポリマーは、生分解性かつ生体適合性である。生分解性ポリマーは、湿った体内組織にさらされると、容易に分解して小さなセグメントになる。セグメントは、次いで、体内に吸収されるか、又は体内を通過する。より具体的には、生分解されたセグメントは、セグメントの痕跡又は残留物が体内に永続的に保持されないように、体内に吸収されるか又は体内を通過するため、永続的な慢性の異物反応を誘発しない。哺乳類内乳動脈由来細胞数が増加したものを含む本発明の増殖した細胞調製物を用いて、組織工学デバイス、例えば人工血管又は他の心臓血管系デバイスを構築できる、細胞を、合成ポリマーの性質で構成される足場と組み合わせる、又は足場上に播種することができる。続いて、これらのデバイスを疾患状態の、又は損傷を受けた動物又はヒト患者に移植できる。血管新生、細胞生存、及び組織修復の促進を目的に、哺乳類内乳動脈由来細胞をデバイス内においても利用することができる。組織工学／器官再建の分野における重要な課題は、治療用デバイスの十分な血管新生化方法である。価値のある任意の構築物について、微小血管コンポーネントを含むように生成させなければならない。これら毛細血管は、構築物が十分に栄養素を供給し、適切にガス交換し、かつ老廃物を除去することを確実にするであろう。ｉＭＡＣは血管新生促進活性を有し、組織工学用途の価値を有することができる。
【００２５】
遺伝子治療の別の用途では、薬剤耐性遺伝子を細胞内に導入することによって、正常な哺乳類内乳動脈由来細胞に薬剤耐性をもたらすことで、通常は危険であるとみなされる高濃度の薬剤の使用を可能にする。特に、抗ガン剤に対する薬剤耐性を有する遺伝子の導入、例えば、哺乳類内乳動脈由来細胞を含む増殖した細胞調製物への多剤耐性遺伝子の導入により、高濃度抗ガン剤を用いる治療の実施が可能である。標的タンパク質をコードする遺伝子を、好適なプロモーター制御下の哺乳類内乳動脈由来細胞に導入することにより、不足タンパク質を誘導し発現することもできる。タンパク質発現を制御し、インビボにおける天然の発現で得られるものと同じ活性を得ることができる。また、リボザイム、アンチセンス核酸など、又は別の好適な遺伝子をコードする遺伝子を哺乳類内乳動脈由来細胞に挿入し、細胞中の特定の遺伝子産物の発現を制御する、又は疾患に対する感受性を阻害することもできる。例えば、アンチセンス核酸又はリボザイムを発現するように哺乳類内乳動脈由来細胞を遺伝子修飾し、これにより標的器官におけるＨＩＶ、ＨＴＬＶ−Ｉ、及びＨＴＬＶ−ＩＩを含むが、これらに限定されない病原体の成長を抑制してよい。
【００２６】
本発明は、哺乳類内乳動脈由来細胞を形成する可能性がある細胞の増殖、分化、又は生存に影響する薬剤を同定する方法を特徴とする。このような薬剤の例は、小分子、抗体、及び細胞外タンパク質である。同定された薬剤の特徴を確認し、動物における安全性及び有効性を評価できる。別の態様では、本発明は、哺乳類内乳動脈由来細胞を形成する可能性がある細胞の増殖、分化、又は生存に、これらの細胞を上記方法で同定した薬剤（１種又は複数種）と接触させることにより、影響を及ぼす方法について熟慮する。同定された薬剤を医薬品として処方できる。
【００２７】
分化した細胞が、免疫拒絶を回避するために治療される患者由来であることが好ましい。しかしながら、自己細胞がない場合、細胞が必要な栄養素及び酸素、並びに細胞が分泌する治療用因子に対して透過性であるが、液性免疫因子及び細胞に対して不透過性であるカプセル内に、分化した細胞を封入することが有用であり得る。好ましくは、カプセル材料は低アレルギー性であり、標的組織内に容易にかつ安定的に位置され、移植された構造体に更なる保護性を提供する。
【００２８】
免疫拒絶からの保護は、当該分野において既知の任意の方法に従って、分化した細胞の遺伝子修飾により提供されてもよい。米国特許第５，２８６，６３２号、同第５，３２０，９６２号、同第５，３４２，７６１号、並びに国際公開第１９９０／１１３５４号、同第１９９２／０３９１７号、同第１９９３／０４１６９号、及び同第１９９５／１７９１１号に開示されるような方法を用いて自己抗体及びＣＴＬ抵抗性細胞を産生できる。あるいは、耐性分化転換細胞の選択は、これら細胞を、自己抗体、又はＩＤＤ関連ＣＴＬ、又はＩＤＤ特異的自己抗原で活性化されたＣＴＬの存在下で培養することにより達成される。これらの手技の結果として、抗体又はＴリンパ球依存性機序による破壊抵抗性が増した細胞が生成される。本明細書で開示するように、このような細胞を適当な宿主の適当な組織に移植でき、自己免疫過程による破壊に対する抵抗性が増す。
【００２９】
同様に、分化した細胞のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）特性を、任意に、分化した細胞を、選択された、正常で、同種リンパ球で、かつ生存している細胞に曝す繰り返しプロセスにより改変してよい。あるいは、部位特異的突然変異誘発の手法を用いて、分化した細胞、及び改変した分化した細胞の表面からＨＬＡマーカーを除き、これにより生成されたものを移植が必要なレシピエント哺乳類に移植する。
【００３０】
本発明の哺乳類内乳動脈由来細胞を凍結保存し、「細胞バンク」で維持又は保存してよい。本発明の細胞の凍結保存を、既知の方法に従って実施してよい。例えば、ただし制限する目的ではないが、「凍結培地」、例えば、０〜９５パーセントのＦＢＳ、及び凍結保護剤である０〜１０パーセントのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を更に含む培地（５〜１０パーセントのグリセロールを含む、又は含まない）中に、例えば、約０．５〜１０×１０６個／ミリリットルの細胞密度で、細胞を懸濁してよい。あるいは、グルコース、スクロース、マルトース、及びトレハロースを含むが、これらに限定されない炭水化物など、その他の凍結保護剤を使用できる。細胞をガラス製又はプラスチック製のアンプル又はその他容器に分注し、続いてこれを密封して、凍結速度制御フリーザーの冷凍室に移す。最適な凍結速度は、経験的に決定され得る。速度のプログラムが可能なフリーザーは、例えば、融解熱が使用できることから、−１〜−１０℃／分の温度変化をもたらすことができる。アンプルが−１８０℃に達すると、液体窒素保管区域に移される。凍結保存された細胞は長期間保存できるが、少なくとも５年ごとに生存率の維持について確認しなくてはならない。凍結保存された本発明の細胞は細胞バンクを構成し、その一部を解凍することにより「引き出し」、必要に応じて用いることができる。一般には解凍は、例えばアンプルを液体窒素から３７℃の水浴に移すことで、迅速に行わなければならない。解凍されたアンプル内容物は、１０パーセントＦＢＳで調節したＤＭＥＭなど適当な培地を含む培養容器に、無菌状態で直ちに移さなくてはならない。あるいは、全内乳動脈、又は内乳動脈の切断した部分若しくは切り刻んだ片を、同様に凍結保存してもよい。続いて、解凍された全動脈、動脈の一部、又は切り刻んだ動脈片から、哺乳類内乳動脈由来細胞を単離してよい。
【００３１】
更なる実施形態では、本発明の哺乳類内乳動脈由来細胞をインビトロで培養し、条件培地又は細胞可溶化物を高収率で産生することができる。例えば、特定の対象とする生物由来物質（例えば、成長因子、制御因子、又はペプチドホルモン）を天然に産生するか、又は生物由来物質を産生するよう遺伝子改変されているかのいずれかであるような細胞は、例えば三次元細胞培養系を用いてクローン的に増殖できる。細胞が生物由来物質を栄養培地に排泄する場合、例えばいくつか例を挙げると、タンパク質分画沈殿法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、電気泳動、及びＨＰＬＣなどの標準的な分離技術を用いて、使用済みの培地又は条件培地からその物質を容易に単離できる。「バイオリアクター」を用いて、例えばインビトロ三次元培養物に栄養を与えるために流動法を利用することができる。本質的には、新しい培地が三次元培養物を通過するとき、生物由来物質が培養物から除去され、続いて上記のように流出物から単離できる。あるいは、対象とする生物由来物質は細胞内に留まることもでき、この場合、回収は細胞の溶解が必要となり得る。その後、任意の１つ以上の上記手技を用いて、生物由来物質を精製できる。
【実施例】
【００３２】
（実施例１）
細胞単離の最適化
組織消化に必要な最適時間を決定するため、最初の実験を実施した。ヒト内乳動脈の一部５センチメートルを、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）から入手した。血液及び残屑を除去するために、動脈をトリミングして、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ−低グルコース、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄した。続いて、動脈全体を５０ミリリットル容のコニカルチューブに移した。
【００３３】
次いで、０．２５ユニット／ミリリットルのコラゲナーゼ（Ｓｅｒｖａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及び２．５ユニット／ミリリットルのディスパーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ  ＩＮ）を含む酵素混合物中において、様々な時間で組織を消化した。続いて、酵素混合物を内皮増殖培地−２（ＥＧＭ−２）（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）と混合した。組織、ＥＧＭ−２、及び消化酵素を含むコニカルチューブを、２２５ｒｐｍで時間を増加させて（３０、６０、９０、１２０、１５０分間）、軌道振とう器において３７℃でインキュベートした。各時間の終了時点で、得られた消化された材料から細胞を単離した。続いて、部分的に消化された動脈を新しい酵素及びＥＧＭ−２の混合物を含む５０ｍＬ容のコニカルチューブに移し、残りの時間３７℃で更に消化した。各時間の終了時点で、得られた消化物を１５０×ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。ペレットを２０ミリリットルのＥＧＭ−２に再懸濁した。続いて、細胞懸濁液を７０マイクロメートルのナイロンであるＢＤ  ＦＡＬＣＯＮ  Ｃｅｌｌ  ｓｔｒａｉｎｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を通して濾過した。次に濾液を、ＥＧＭ−２（全容積５０ミリリットル）に再懸濁し、１５０×ｇで５分間遠心分離した。上清を吸引し、１５ミリリットルの別の新しいＥＧＭ−２に細胞を再懸濁し、５０μｇ／ｃｍ２のラット尾部タイプＩコラーゲン（Ｉｎａｍｅｄ、Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）でコーティングした組織培養用フラスコに蒔いた。次いでこの細胞を３７℃、５％  ＣＯ２で培養した。続いて増殖能を評価した。単離された細胞を、タイプＩラット尾部コラーゲンをコーティングしたＴ７５フラスコ上、ＥＧＭ−２中において５０００個細胞／ｃｍ２で蒔き、５％二酸化炭素中３７℃で培養した。細胞は３〜５日ごとに継代された。各継代において、細胞をＴｙｐｌｅＬＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で回収してカウントし、Ｇｕａｖａ製の装置（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）を用いて生存率を測定した。次に、集団倍加［ｌｎ（最終的に得られた細胞／蒔いた初期細胞数）／ｌｎ２］を計算した。
【００３４】
データは、動脈を順次消化することにより、細胞が内乳動脈から単離されたことを示した。３０分又は６０分の時間のものから得られた細胞の成長は不十分であった（図６）。９０分の時間のものから単離された細胞は、最大の増殖能を有していることを示した。したがって、動脈の外部残屑及び内膜層の除去には、動脈を最初に約６０分間消化することが必要であると決定した。増殖能を最大に有する細胞を得るためには、最初の６０分間の消化後、続いて動脈を新しい酵素混合物に移し、追加の３０〜６０分間更に消化することを必要とする。この連続消化法により、動脈の内膜層由来の任意の細胞、及び動脈の摘出後に残った任意の外部残屑由来の細胞を排除すると同時に、動脈の外膜／内側層内に位置する細胞の単離を可能にする。
【００３５】
（実施例２）
ヒト内乳動脈由来細胞の単離
次に、最適消化時間（実施例１に記載）を適用して内乳動脈由来細胞を単離した。ヒト内乳動脈の一部５センチメートルを、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）から入手した。血液及び残屑を除去するために、動脈をトリミングして、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ−低グルコース、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄した。続いて、動脈全体を５０ミリリットル容のコニカルチューブに移した。
【００３６】
次いで、０．２５ユニット／ミリリットルのコラゲナーゼ（Ｓｅｒｖａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及び２．５ユニット／ミリリットルのディスパーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ  ＩＮ）を含む酵素混合物中において組織を消化した。次に、酵素混合物をｉＭＡＣ増殖培地（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）、Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン（５０ユニット／ミリリットル）及びストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ、Ｇｉｂｃｏ）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む）と混合した。組織、ｉＭＡＣ増殖培地及び消化酵素を含有するコニカルチューブを、２２５ｒｐｍで１時間、軌道振とう器にて３７℃でインキュベートした。続いて、部分的に消化された動脈を新しい酵素及びｉＭＡＣ増殖培地の混合物を含む５０ｍＬ容のコニカルチューブに移し、３７℃で１時間更に消化した。次に、消化した動脈を５０ｍＬ容のコニカルチューブから除去し、廃棄した。次に、得られた消化物を１５０×ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。ペレットを２０ミリリットルのｉＭＡＣ増殖培地に再懸濁した。続いて、細胞懸濁液を７０マイクロメートルのナイロンであるＢＤ  ＦＡＬＣＯＮ  Ｃｅｌｌ  ｓｔｒａｉｎｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を通して濾過した。次に濾液を、ｉＭＡＣ増殖培地（全容積５０ミリリットル）に再懸濁し、１５０×ｇで５分間遠心分離した。上清を吸引し、１５ミリリットルの別の新しいｉＭＡＣ増殖培地に細胞を再懸濁し、５０μｇ／ｃｍ２のラット尾部タイプＩコラーゲン（Ｉｎａｍｅｄ、Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）でコーティングした組織培養用フラスコに蒔いた。次いでこの細胞を３７℃、５％  ＣＯ２で培養した。細胞を２〜１０回継代して培養し、次に、標準的な凍結保存法を用いて、凍結保護剤溶液（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１０％  ＦＢＳ）中１〜２ｅ６個／ｍＬの細胞数で凍結保存した（cryopreseved）。
【００３７】
（実施例３）
ヒト内乳動脈由来細胞の形態
実施例２に記載されるように単離された新しいｉＭＡＣを、タイプＩラット尾部コラーゲンをコーティングしたＴ７５フラスコ上、ｉＭＡＣ増殖培地中において５０００個細胞／ｃｍ２で蒔き、５％二酸化炭素中３７℃で培養した。細胞は３〜５日ごとに継代された。各継代において、細胞をＴｙｐｌｅＬＥ（Ｇｉｂｃｏ）で回収してカウントし、Ｇｕａｖａ製の装置（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）を用いて生存率を測定した。形態的評価には、ｉＭＡＣを光学顕微鏡で評価し、細胞の形態的特徴をＮｉｋｏｎ製の顕微鏡及びＬＣＤデジタルカメラを用いて観察した。
【００３８】
ｉＭＡＣを光学顕微鏡で評価し、細胞の形態的特徴をＮｉｋｏｎ製の顕微鏡及びＬＣＤデジタルカメラを用いて観察した（図１）。ｉＭＡＣの培養では、一貫して繊維芽細胞形態を示した。形態は、後期継代数（継代数２３）において安定していた。
【００３９】
（実施例４）
ヒト内乳動脈由来細胞の増殖能
実施例２に記載されるように単離された新しいｉＭＡＣを、タイプＩラット尾部コラーゲンをコーティングしたＴ７５フラスコ上、ｉＭＡＣ増殖培地中において５０００個細胞／ｃｍ２で蒔き、５％二酸化炭素中３７℃で培養した。細胞は３〜５日ごとに継代された。各継代において、細胞をＴｙｐｌｅＬＥ（Ｇｉｂｃｏ）で回収してカウントし、Ｇｕａｖａ製の装置（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）を用いて生存率を測定した。次に、集団倍加［ｌｎ（最終的に得られた細胞／蒔いた初期細胞数）／ｌｎ２］を計算した。培養中の増殖能についてｉＭＡＣ培養物を分析した（図２、表１）。細胞集団を、老化に至るまで数か月間連続的に継代した。試験期間中に、細胞が１回超の集団倍加を達成できなかったとき、老化と判定した。培養８６日間後、データは、コラーゲンをコーティングしたフラスコ上でｉＭＡＣ増殖培地において増殖したｉＭＡＣは、少なくとも継代数２５回、かつ４１．９回の集団倍加に達するまで、増殖できることを示す。平均倍加時間は４８時間／倍加であり、１０Ｅ１８個を超える細胞を１つの５ｃｍ長の内乳動脈から得ることができた。
【表１】
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表１：成長速度。コラーゲンをコーティングしたフラスコでｉＭＡＣを８１日間培養した。３〜５日ごとに細胞を回収してカウントし、集団倍加及び生存率を決定した。
【００４０】
（実施例５）
ヒト内乳動脈由来細胞のインビトロ毛細血管形成
毛細血管形成には、実施例２に記載されるように単離された継代数７の凍結保存ｉＭＡＣを解凍し、マトリゲルをコーティングした２４ウェルプレート（ＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｃｅｌｌｗａｒｅ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に５０００個細胞／ｃｍ２で播種し、ｉＭＡＣ増殖培地、内皮増殖培地−２（Ｌｏｎｚａ）、又は平滑筋分化培地（Ｌｏｎｚａ）中において、３７℃、５％二酸化炭素中で３日間培養した。培養１〜５日後、毛細血管の伸長を光学顕微鏡で評価した。
【００４１】
図４は、ｉＭＡＣ増殖培地又は内皮増殖培地−２内マトリゲル上で培養されたｉＭＡＣが、毛細血管様構造体の密なネットワークに分化したことを示す。ｉＭＡＣは、平滑筋細胞分化培地中では分化しなかった。また、ヒト胸動脈由来内皮細胞（Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）もマトリゲルをコーティングしたプレート上で培養した。これらの細胞は、毛細血管構造体に分化せず、毛細血管分化はｉＭＡＣに特有であることを示した。
【００４２】
（実施例６）
ヒト内乳動脈由来細胞の脂肪生成
脂肪生成分化には、実施例２に記載されるように単離された継代数７の凍結保存（cryopreseved）ｉＭＡＣを解凍し、非コーティングの、又はタイプＩラット尾部コラーゲンをコーティングした１２ウェルプレート上に５０００個細胞／ｃｍ２で蒔き、ｉＭＡＣ増殖培地中において、３７℃、５％二酸化炭素中で培養した。細胞がほぼコンフルエンスに達したとき、ｉＭＡＣ増殖培地を脂肪生成誘導培地（Ｌｏｎｚａ）に交換し、２〜４日ごとに培地を交換しながら更に１５〜２０日間培養した。脂肪生成分化の程度を判定するため、細胞を１０％ホルマリンで固定してＯｉｌ−Ｒｅｄ−Ｏ（Ｓｉｇｍａ）で染色し、誘導５日後、１０日後、及び１５日後に画像を取得した。
【００４３】
ｉＭＡＣの培養物は、著しい脂肪細胞分化を示した。図５は、脂肪生成誘導培地で培養されたｉＭＡＣが、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ−Ｏ染色が陽性の細胞を多く産生することを示す。誘導５日後、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ−Ｏ陽性細胞は少数しか存在しない。しかし１０日後、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ−Ｏ陽性細胞数が増加した。１５日間後、培養中のほとんどの細胞が、脂肪細胞に分化した。
【００４４】
（実施例７）
ヒト内乳動脈由来細胞の表面マーカーの表現型
実施例２に記載されるように新たに単離されたｉＭＡＣについて、フローサイトメトリー分析を実施した。タイプＩコラーゲンをコーティングしたＴ７５フラスコ上、３７℃及び５％二酸化炭素において、細胞を継代数７まで増殖培地中で増殖した。接着性細胞をＰＢＳで洗浄し、ＴｙｐｌｅＬＥ（Ｇｉｂｃｏ）で剥離した。細胞を回収して遠心分離し、１×１０７個細胞／ｍＬの濃度で、３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ／ＰＢＳに再懸濁した。各特異抗体を１００マイクロリットルの細胞懸濁液に加え、混合液を暗所において、４℃で３０〜６０分間インキュベートした。インキュベート後、細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離して過剰の抗体を除去した。細胞を、３００マイクロリットルのＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメトリーで分析した。フローサイトメトリー分析は、Ｇｕａｖａ製の装置で実施した。用いた抗体を表２に示す。
表２：ｉＭＡＣ細胞表面マーカーの特徴分析に用いた抗体。
【表２】
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表３：
ｉＭＡＣの特徴をフローサイトメトリーで分析した（表３）。継代数７のｉＭＡＣ培養物は、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１６６、及びＨＬＡ−１に染色陽性であり、ＣＤ１０、ＣＤ１５、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ６２ｐ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４１、ＶＥ−カドヘリン、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、及びＨＬＡ−２に染色陰性であった。表３は、観察されたｉＭＡＣ表面マーカーの表現型を既知の細胞型の表面マーカーの表現型と比較している。
【表３】
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表３：細胞表面マーカーの表現型。表１に記載の抗体を用いて、フローサイトメトリーによりｉＭＡＣの特徴を確認した。特定の細胞型の既知の表面マーカーに従ってマーカーを構築した（細胞型）。特定の細胞型により発現される表面マーカー（細胞型発現）。検査した表面マーカーを発現するｉＭＡＣ（陽性）。検査抗体の染色特性を陰性対照の抗体染色と比較して、染色陽性を決定した。７５％を超える細胞の染色を陽性とみなした。検査した表面マーカーを発現しないｉＭＡＣ（陰性）。陰性対照抗体と比較して２５％未満の細胞が陽性の場合、染色を陰性とみなした。
【００４５】
（実施例８）
ヒト内乳動脈由来細胞の遺伝子発現
実施例２に記載されるように単離された細胞を、タイプＩコラーゲンをコーティングしたＴ７５フラスコ上、ｉＭＡＣ増殖培地中において５０００個細胞／ｃｍ２で蒔き、５％二酸化炭素中３７℃で培養した。細胞は３〜５日ごとに継代された。ＲＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を製造業者による取扱説明書に沿って用い、継代数１０のほぼコンフルエントの培養物をフラスコ内で直接溶解した。次に、総ＲＮＡを抽出し、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｏｌｉｇｏ  Ａｒｒａｙｓ（ＳＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）及びＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｏｎ  ＳＴ１．０マイクロアレイを製造業者による取扱説明書に沿って用い、遺伝子発現を評価した。
【００４６】
オリゴマーハイブリダイゼーションアレイを用いて、ｉＭＡＣの遺伝子発現特性の特徴を確認した。データは、ｉＭＡＣが、１１８種の検査した脈管形成関連遺伝子のうち１９種、例えばＣＤ１３、ケモカインリガンド２、エフリンＡ２、エフリンＡ３、エンドグリン、内皮細胞ＰＡＳドメインタンパク質１、繊維芽細胞成長因子−２、繊維芽細胞成長因子受容体−３、低酸素誘導因子−１、マトリックスメタロプロテアーゼ（Matrix metalenoprotinase）−２、ニューロピリン−１、胎盤成長因子、ウロキナーゼ、トロンボスポンジン−２、ＴＩＭＰ阻害物質−１、ＴＩＭＰ阻害物質−３、ＴＮＦ−１２ａ、トロポニンＴタイプ−１、ＶＥＧＦ−Ｂ、及びＶＥＧＦ−Ｃを発現することを示す。
【００４７】
加えて、ｉＭＡＣの培養物を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｏｎ  １．０マイクロアレイを用いるマイクロアレイ分析により評価した。表４は、発現が多い転写物トップ５００を示す。発達に関連する遺伝子のいくつか、例えば、ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅモチーフ含有３３（ＴＲＩＭ３３）、ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス１１（ＳＯＸ−１１）、Ｎｏｔｃｈホモログ２（ドロソフィラ）（ＮＯＴＣＨ−２）、システインリッチ膜貫通型ＢＭＰ制御因子１（ＣＲＩＭ−１）、ホメオボックスＤ９（ＨＯＸＤ９）及びＰＯＵクラス３ホメオボックス３（ＰＯＵ３Ｆ３）が高く発現している（表５）。
【表４】
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表４：脈管形成関連遺伝子の発現。ｉＭＡＣの培養物をオリゴマーハイブリダイゼーションアレイで評価し、続いて製造業者が提供するソフトウェアを用いて評価した。全体的なバックグラウンド値を得てから、同定されたハイブリダイゼーションシグナルから得られた値から差し引いた。ここに示す遺伝子は、バックグラウンド値を超えるレベルでｉＭＡＣが発現するものである。
【表５】
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表５：マイクロアレイ遺伝子発現分析継代数１０のｉＭＡＣ培養物を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｅｘｏｎ  ＳＴ１．０マイクロアレイを用いて評価した。最も発現が多い５００個の遺伝子を示す。ｉＭＡＣを３回測定し（サンプル１、サンプル２、サンプル３）、相対遺伝子発現を蛍光強度ユニットで表す。全体的な非特異性バックグラウンド蛍光を、各特定のハイブリダイゼーションシグナルから差し引いた。３回の測定の平均蛍光強度（平均）。標準偏差（Ｓｔｄ  Ｄｅｖ）。
【００４８】
（実施例９）
ヒト内乳動脈由来細胞の栄養素分析
実施例２に記載されるように単離された新しいｉＭＡＣを継代数７まで培養し、次にタイプＩコラーゲンをコーティングした６ウェルプレート上に、ｉＭＡＣ増殖培地において５０００個細胞／ｃｍ２で播種し、３７℃及び５％二酸化炭素で培養した。続いて、使用済みの培地を無血清培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン（５０ユニット／ミリリットル）及びストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ））に交換し、更に２０時間培養した。無血清の条件培地を１４，０００×ｇで５分間遠心分離することにより回収し、−２０℃で保管した。続いて、ＨｕｍａｎＭＡＰ  ｖ１．６  Ｉｍｍｕｎｏｐｌｅｘ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｒｕｌｅｓ−Ｂａｓｅｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いてサンプルを分析した。３つの別々のｉＭＡＣ培養物について栄養素分析を実施し、無血清の無条件培地で得られた値で基準化した。
【００４９】
ｉＭＡＣ培養物について、９０種の異なる成長因子及びサイトカインの分泌を分析した（表６、表７）。結果は、ｉＭＡＣが、増加したレベルのβ２ミクログロブリン、癌抗原１９−９、クレアチンキナーゼ−ＭＢ、ＥＮＡ−７８、エンドセリン−１、エオタキシン、脂肪酸結合タンパク質、フェリチン、塩基性ＦＧＦ、インターロイキン−６、インターロイキン−８、インスリン、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、幹細胞因子、ＴＩＭＰ−１、ＶＣＡＭ−１及びＶＥＧＦを分泌することを示す。ｉＭＡＣは、フォンヴィルブランド因子を分泌しない。
【表６】
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表６：栄養素の分泌特性。ｉＭＡＣ培養物由来の無血清培地を、成長因子及びサイトカイン分泌について評価した。３つの別々の培養物（ｉＭＡＣ  １、ｉＭＡＣ  ２、ｉＭＡＣ  ３）により示される因子の量を細胞数で基準化し、２０時間あたりの細胞１００万個あたり分泌された因子の量として表した。アッセイ検出限界（最低検出濃度）。無条件培地（細胞なし対照）。
【表７】
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表６：栄養素の分泌特性（続き）。ｉＭＡＣ培養物由来の無血清培地を、成長因子及びサイトカイン分泌について評価した。３つの別々の培養物（ｉＭＡＣ  １、ｉＭＡＣ  ２、ｉＭＡＣ  ３）により示される因子の量を細胞数で基準化し、２０時間あたりの細胞１００万個あたり分泌された因子の量として表した。アッセイ検出限界（最低検出濃度）。無条件培地（細胞なし対照）。
【表８】
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表７：分泌された因子。ｉＭＡＣ培養物由来の無血清培地を、成長因子及びサイトカイン分泌について評価した。分泌されたタンパク質を示す。これらは、細胞なし対照である無条件培地及びアッセイ検出限界値を超える量で分泌された因子である。
【００５０】
（実施例１０）
ヒト内乳動脈由来細胞のインビボ脈管形成活性
組織工学／器官再建の分野における重要な課題は、治療用デバイスの十分な血管新生化方法である。価値のある任意の構築物について、微小血管コンポーネントを含むように生成させなければならない。これら毛細血管は、構築物が十分に栄養素を供給し、適切にガス交換し、かつ老廃物を除去することを確実にするであろう。血管新生を亢進する細胞の同定は大きな価値がある。
【００５１】
我々は最近、ヒト内乳動脈と称する内乳動脈由来細胞から細胞を単離した。これらの細胞は、重要な血管新生促進特性を有し得る。この実験では、マトリゲル脈管形成アッセイを用いて、ｉＭＡＣの血管新生促進活性を評価した。マトリゲル脈管形成アッセイは、脈管形成に関するインビボ試験を含む多くの試験で最適な方法となっている。このアッセイでは、脈管形成誘発化合物、例えばｂＦＧＦをマトリゲル冷溶液に導入する。続いて、皮下投与後、マトリゲル溶液は凝固し、脈管化を誘発する宿主細胞による後続侵入を可能にする。マトリゲルプラグ内での血管新生反応の評価は、選択した切片での血管の視認性を強め、かつ血管密度の判定を可能にするために染色された組織学的プレパラートを検査することで達成される。
【表９】
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表８：実験デザイン
【００５２】
移植日に、継代数７のｉＭＡＣ（実施例２に記載されるように調製される）を３７℃で解凍し、サブコンフルエントまで培養して回収し、リン酸緩衝生理食塩水（Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋を含まない）に再懸濁した。約４００ｍＬの氷冷した成長因子低減マトリゲルマトリックス（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１２７６０−０２１）を、１×１０６のｉＭＡＣを含むＰＢＳ  １００μＬと予備混合する。加えて、５０ｎｇ／ｍＬの塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含有するマトリゲルを陽性対照として検査し、細胞負荷マトリゲルである試験物質と同様の方法で調製した。マトリゲルで希釈した細胞又はｂＦＧＦを、移植時間まで氷水上に保持した。ＳＣＩＤマウスの取り扱いは全て、フード下で実施しなくてはならない。マウスの体重をそれぞれ測定し、吸入麻酔（５．０％イソフルラン）を用いるチャンバ導入手技により導入し、手術中は、動物を１．５〜２．５％濃度のイソフルランで維持した。麻酔導入後、電動動物用バリカンを用いて、動物の背側頸部から背側腰部までの背部全体の毛刈りをした。その後、その部位をクロルヘキシジンジアセテートでこすり洗いし、アルコールですすいで乾燥し、有効ヨウ素１％の水性ヨードフォア溶液を塗布した。眼科用軟膏を目に塗布し、麻酔時間中の組織の乾燥を予防した。麻酔をかけ、手術準備ができた動物を所望の横臥位に置いた。５００μＬのマトリゲル中細胞懸濁液を、２３Ｇ針を用いてマウスの右側及び左側背部表面に皮下注射した。
【００５３】
移植１０日後に、マトリゲル足場内の毛細血管密度を組織学的に評価した。試験期間中に死亡した、又は瀕死状態で安楽死させた任意の動物について、肉眼的検査を実施した。指定の期間において、マウスをＣＯ２吸入により安楽死させた。移植部位の肉眼的観察を記録した。皮下移植部位を上部の皮膚と共に摘出した。皮下移植部位を上部の皮膚と共に二等分出した。組織の半分を、パラフィン包埋用に１０％緩衝化ホルマリン固定液に保存した。固定した標本を、組織学的処理のためにＰａｒａｇｏｎ  Ｂｉｏｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  ＭＤ）に送った。組織切片を作成し、Ｈ＆Ｅで染色した。更に、ヒト特定抗ビメンチン抗体（Ｄａｋｏ）及び抗フォンヴィルブランド因子抗体で切片を染色した。毛細血管密度／成長中細胞を、Ｐａｒａｇｏｎの技術者によって盲検的に定量化した。簡潔に言えば、各マトリゲル移植体について５枚の画像を得た。続いて、マトリゲル中の予め設定したフレームの総面積に対する、新たに形成された細胞／毛細血管で占められた面積の割合を決定した（表９）。
【００５４】
全マトリゲル外稙片について、細胞充実性の程度を決定した。図５及び表９に示すように、第１群内のマトリゲルのみの移植体では、確認される細胞又は毛細血管はほとんどなかった（総マトリゲル面積の４％）。しかし第１群と比較して、ｉＭＡＣ播種マトリゲルは、細胞浸潤及び毛細血管形成を刺激した。細胞及び毛細血管は、ｉＭＡＣ播種マトリゲル移植体の１１％±２％を占めた。細胞及び毛細血管は、ｂＦＧＦ陽性対照マトリゲル移植体の７％±１．９％を占めた。
【００５５】
このデータは、ｉＭＡＣが細胞浸潤を促進し、マトリゲル足場内の脈管形成及び微小血管系形成を刺激することを示す。したがって、血管新生及び移植可能な生物学的デバイスの全般生存率を亢進する手段を提供することにより、これらの細胞は組織工学／器官再建用途に価値があり得る。
【表１０】
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表９：細胞浸潤／毛細血管密度：得た外稙片につき５箇所の顕微鏡視野を取得し、細胞及び毛細血管で占められる面積を評価し、総面積の割合として報告した（細胞／毛細血管から構成される面積／総評価面積）。群割り当ては、評価者に対して盲検化した。処置群の詳細については表１を参照されたい。マトリゲル外稙片は検出されなかった（ＮＡ）。示されるデータを図５にグラフでまとめる。
【００５６】
（実施例１１）
ヒト内乳動脈由来細胞の内皮細胞及び平滑筋細胞分化
マトリゲル上で培養されるとき、ｉＭＡＣが毛細血管様細胞に分化することが示されている（実施例５参照）。更なる試験を実施し、ｉＭＡＣの内皮細胞、平滑筋細胞、及び心筋細胞への分化の特徴を確認した。凍結保存した（Cyropreserved）継代数１７のｉＭＡＣを解凍して、組織培養用プラスチック上に播種し、内皮細胞用分化培地（ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ＋５０ｎｇ／ｍＬ  ＶＥＧＦ）で７日間培養した。次に、ＣＤ１４４、ＣＤ３０９、ＣＤ３４、ＣＤ３１及びフォンヴィルブランド因子を含む数種の異なる内皮細胞特異的マーカーの発現について、フローサイトメトリーで細胞を評価した。結果は、内皮細胞用分化培地で培養されるとき、培養ｉＭＡＣの約２０％が、ＣＤ１４４、ＣＤ３０９、ＣＤ３１及びＣＤ３４の発現を上方制御することを示した（図７）。
【００５７】
また、継代数１７のｉＭＡＣを解凍し、組織培養用プラスチック上に播種し、平滑筋分化培地（ＭｅｓｅｎＰＲＯ  ＲＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で７日間培養し、次にＳＭＡ、ＳＭ２２、カルポニンを含む３つの異なる平滑筋細胞特異的マーカーについて、フローサイトメトリーで評価した。結果は、標準的ｉＭＡＣ増殖条件下において、ｉＭＡＣがこれら３つの平滑筋細胞マーカーを全て発現したことを示した。平滑筋細胞分化培地で培養するとき、発現パターンは変わらない（図８）。
【００５８】
また、継代数１７のｉＭＡＣを心筋細胞用分化培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％  ＦＢＳ＋１０μＭ  ５−アザシチジン）で７日間培養し、次にｉｓＬ１及び筋節αアクチン（ＳＡ）の発現についてフローサイトメトリーで評価した。データは、８０％超のｉＭＡＣがｉｓＬ１を上方制御することを示した。対照的に、心筋細胞用分化培地による処理前及び処理後において１００％のｉＭＡＣがＳＡを発現する（図９）。
【００５９】
これらのデータは、ｉＭＡＣが内皮細胞及び心筋細胞に分化できることを示す。したがって、これらの細胞は、心臓血管組織工学用途に有用であり得る。
【００６０】
（実施例１２）
ヒト内乳動脈由来細胞の骨形成分化
骨形成分化には、実施例２に記載されるように、新たに単離された継代数７のｉＭＡＣを、非コーティングの１２ウェルプレート上に５０００個細胞／ｃｍ２で蒔き、ｉＭＡＣ増殖培地において、３７℃、５％二酸化炭素中で培養した。細胞がほぼコンフルエンスに達したとき、ｉＭＡＣ増殖培地を骨形成誘導培地（１０−８Ｍデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、０．２ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）、及び１０ｍＭ  βグリセロホスフェート（glycerolphosphase）（Ｓｉｇｍａ））に交換し、２〜４日ごとに培地を交換しながら更に２１日間培養した。骨形成分化の程度を判定するため、細胞を７０％氷冷エタノールで１時間固定した。水で培養物を洗浄し、１ｍＬの４０ｍＭアリザリンレッド（ｐＨ  ４．１（Ｓｉｇｍａ））で回転させながら１０分間染色した。培養物をＰＢＳで洗浄し、非特異的染色を低減した。次に、誘導後５日目、１０日目、及び２１日目に、染色された培養物の画像を取得した。ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）（Ｌｏｎｚａ）を陽性対照として用いた。
【００６１】
骨形成誘導培地への曝露２１日後、ｉＭＡＣは鉱質沈着を示さず、したがって、骨形成分化能はなかった。しかしながら、ｈＭＳＣは強い鉱質沈着を示した。
【００６２】
（実施例１３）
血管組織工学用ヒト内乳動脈由来細胞
内乳動脈に特有の抗動脈硬化特性及び機械的特性を利用しようとして、我々は新たにｉＭＡＣを単離し、血管及びその他心臓血管組織工学用途における有用性を評価する。
【００６３】
天然ポリマー又は合成ポリマーのいずれかから構成される中空管状足場上にｉＭＡＣを播種し、回転壁容器（ＲＷＶ）バイオリアクター（Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ，Ｉｎｃ．）又は潅流バイオリアクター（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて培養する。管状足場の一方を微小動脈瘤クリップ（Ｒｏｂｏｚ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）を用いて閉じ、内腔を細胞懸濁液（２５００個細胞／ｃｍ２）で満たす。もう一方を別のクリップで閉じ、細胞懸濁液を含むグラフトをＲＷＶバイオリアクター内に２４時間置いて、足場の内面上への細胞の初回播種を可能にする。反対に、管状足場を入れている培地に細胞を加えることにより、グラフトの外表面上にＩＭＡ細胞を播種する。初回の２４時間の播種時間後、クリップを外し、グラフトをバイオリアクター内で更に４〜７日間培養した。他の実験では、潅流バイオリアクター（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、播種された管状足場を生理学的脈動流及び脈動圧下で培養する。培養時間後、細胞を播種した構築物を、上記方法及び組織学的方法を用いて、細胞接着、生存率、増殖（proliferattion）及び表現型について評価する。
【００６４】
加えて、ｉＭＡＣの抗動脈硬化特性を示す。ｉＭＡＣ及びヒト大動脈平滑筋細胞（対照細胞株）を１２ウェルプレートで培養する。コンフルエンスの時点で、最大１４日間、細胞をカルシウム沈着培地（２ｍＭ無機リン酸を含む成長培地）に移す。２日ごとに、培地を新しい培地で交換する。反対に、ｉＭＡＣをカルシウム沈着培地中で平滑筋細胞と共培養する。次に、細胞を０．６Ｎ  ＨＣｌで２４時間脱石灰化する。ＨＣｌ上清のカルシウム含量を、ｏ−クレゾールフタレインコンプレクソン法（Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ））により比色分析的に決定する。脱石灰後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、０．１Ｎ  ＮａＯＨ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で可溶化する。タンパク質含量をＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で測定する。細胞層のカルシウム含量をタンパク質含量で基準化する。ｉＭＡＣを利用して組織設計された血管グラフトは、動脈硬化に対する抵抗性が高くなり得る。ＩＭＡＣはまた、改善されたグラフト弾性をもたらすこともできる。内乳動脈はバイパスグラフトにおいて上手く利用されているが、手術切開時に損傷を受けやすい。これにより、明らかにグラフトの失敗に終わる。ｉＭＡＣから構成される組織設計された血管グラフトは、従来の血管グラフト材料の優れた代替品であることが判明し得る。
【００６５】
（実施例１４）
５０／５０ポリ（ｐ−ジオキサノン−コ−グリコリド）ＰＤＯ／ＰＬＧＡの静電紡糸された管状足場を予めエタノールで濡らして、製造業者による取扱説明書に沿ってラット尾部タイプＩコラーゲンを含む０．０２Ｎ酢酸（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ  ＭＡ）中、室温で１時間コーティングし、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。次に、実施例２に記載されるように単離されたｉＭＡＣ細胞を、チューブの両側に細胞懸濁液２５μＬをゆっくりピペッティングし、３０分間室温でインキュベートすることにより、４×１０６個細胞／ｍＬの濃度でコラーゲンをコーティングしたチューブの外側に静的に播種した。続いて、播種されたチューブをバイオリアクターのチャンバ棘部（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｉｎｎｅｔｏｎｋａ，ＭＮ）上に縫合し、チャンバをｉＭＡＣ増殖培地で満たした。注射器を用いて、ｉＭＡＣ細胞懸濁液を１×１０６細胞／ｍＬで追加することにより、内腔に播種した。次に、バイオリアクターチャンバ内の播種されたチューブを、３７℃の細胞培養インキュベーター内に置いた細胞培養ボトルローラーで０．５ｒｐｍで回転させながら培養する。培養５日及び１０日後、チューブをバイオリアクターチャンバから取り出し、１０％ホルマリンで固定して、ヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）を用いて組織学的分析用に染色した。
【００６６】
組織学的な結果により、足場の空隙内にいくらか集積された状態で、静電紡糸された管状足場上にｉＭＡＣ細胞が接着され、よく増殖したことが明らかになった。図１０は、細胞を播種したチューブの組織学的断面図を示し、チューブ表面の内側及び外側両方における複数の層内での細胞の接着及び成長を示す。静電紡糸された管状足場の内側層内に移動する細胞も観察できる。
【００６７】
（実施例１５）
静電紡糸されたＰＣＬ足場を以下の方法で調製した。１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＰ、ＴＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｉｎｃ．）溶媒中、ＰＣＬ（Ｌａｋｅｓｈｏｒｅ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）１５０ｍｇ／ｍＬ溶液を調製し、一晩振とう器プレート上で暗所環境に放置し、確実にＰＣＬが全て溶解し、均質溶液を形成させた。次に、ポリマー溶液（３ｍＬ）をプラスチック製のＢｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ注射器（３ｍＬ）で吸い取り、５．５ｍＬ／時の速度で投与されるようにＫＤ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃシリンジポンプ（モデル１００）に設置した。高電圧電源（Ｓｐｅｌｌｍａｎ  ＣＺＥ１０００Ｒ、Ｓｐｅｌｌｍａｎ  Ｈｉｇｈ  Ｖｏｌｔａｇｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、溶液を含有する注射器に固定された先端が丸い１８ゲージ針に、＋２２ｋＶの電圧を印加した。針先から２０．３２ｃｍ（８インチ）離して配置され、〜４００ｒｐｍの速度で回転する直径２ｍｍの円筒形の接地したマンドレル上で、溶液を静電紡糸して、ランダム配向したファイバーの足場を作製した。１８ｃｍ／秒の平行移動速度で、マンドレルの平行移動距離は１８ｃｍであった。静電紡糸の前に、マンドレルを、アルミホイルの小切片で包み、管を取り出し易くした。静電紡糸が完了次第、マンドレルを１００％エタノールに浸漬し、ホイルのライナーをマンドレルからスライドさせて外し、管の内部から注意深く取り出した。
【００６８】
消毒したＰＣＬ静電紡糸された管状足場を１００％エタノールで予め濡らしてから０．０２Ｎ酢酸で洗浄し、製造業者の取扱説明書に従って、タイプ１ラット尾部コラーゲン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）で１時間コーティングした。次に、グラフトをｉＭＡＣ増殖培地で２回洗浄し、バイオリアクターチャンバ（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｉｎｎｅｔｉｎｋａ，ＭＮ）の棘部に縫合した。外室をｉＭＡＣ培地で満たし、１．２×１０６個細胞／ｍＬの細胞懸濁液を用いてグラフト内面に播種した。注射器を用いて内室を細胞懸濁液で満たし、次にこれに蓋をして、３７℃の細胞培養インキュベーター内部に設置した細胞培養ボトルローラーに一晩置く。次の日、内室中の培地を新しい培地と交換し、未接着細胞を全て除いた。次の日、内室中の培地を再び交換した。播種後３日目、チューブをバイオリアクターチャンバ棘部から切り離し、１０ｍＬの無血清Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で２回洗浄し、輸送のため５ｍＬの凍結用バイアルに移した。１本のサンプルを、製造業者の手順書に従い、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で分析した。サンプルを半分に切断し、一方を３時間の室温での模擬輸送後に分析し、もう一方を、５ｍＬ凍結用バイアルにおいて、細胞培養インキュベーター中３７℃で更に一晩インキュベートを行い、同様の模擬輸送後に分析した。
【００６９】
残りのサンプルをＬｅｗｉｓラットの大動脈に移植した。簡潔に言うと、腎臓下大動脈の一部を外科的に除去し、細胞を播種した管状足場で置換した。続いて、ラットを４週間観察した。次に、グラフトの開存性をＣＴ血管造影法で評価し、グラフトの内径を超音波画像診断法で定期的に測定した。移植４週間後、動物を安楽死させ、グラフトを摘出して組織学的染色により検査した。
【００７０】
図１１はＬｉｖｅ／Ｄｅａｄアッセイの結果を示し、ＰＣＬ静電紡糸された管状グラフト上にｉＭＡＣが接着され、よく増殖し、３日間の培養、３時間の室温での模擬輸送、及び細胞培養インキュベーター中、３７℃で更に一晩インキュベートした後に、生存したままであることを示す。わずかな死亡細胞が明らかとなり、生存細胞には、ストレス下の、又は瀕死の細胞を示す任意の形態変化は現れなかった。
【００７１】
Ｌｅｗｉｓラットの大動脈内に移植されたｉＭＡＣを播種した足場の直径の超音波測定は、移植後最大４週間、最小限の内径変化を伴ってグラフトが開存したままであったことを示す。ＣＴ血管造影の結果においても、グラフトが開存したままであったことが示された。４週間時点におけるグラフト摘出後のヘマトキシリン（hematocylin）及びエオジンによる組織学的染色では、血栓形成は認められず、足場への細胞集積の兆候を示した。これらの結果は、ｉＭＡＣ細胞が血管組織の損傷部の修復及び再生に有用であり得ることを示唆する。
【００７２】
（実施例１６）
第２のドナーから再現性よく単離されたヒト内乳動脈由来細胞
実施例２に記載される方法を用いて、新たなヒトドナー由来の新たに得た乳動脈からｉＭＡＣを単離した。この新ロットのＩＭＡＣについて、フローサイトメトリー分析を実施した。タイプＩラット尾部コラーゲンをコーティングしたＴ７５フラスコ上、３７℃及び５％二酸化炭素において、細胞を継代数８までｉＭＡＣ増殖培地中で増殖した。接着性細胞をＰＢＳで洗浄し、ＴｙｐｌｅＬＥで剥離した。細胞を回収して遠心分離し、５×１０５個細胞／ｍＬの濃度で、３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ／ＰＢＳに再懸濁した。特異抗体を１００マイクロリットルの細胞懸濁液に加え、混合液を暗所において、４℃で３０〜６０分間インキュベートした。インキュベート後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、遠心分離して過剰の抗体を除去した。細胞を、３００マイクロリットルのＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメトリーで分析した。フローサイトメトリー分析は、Ｇｕａｖａ製の装置で実施した。用いた抗体を表１０に示す。
【表１１】
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表１０：ｉＭＡＣ細胞表面マーカーの表現型の特徴確認に用いた抗体
【００７３】
継代数８のｉＭＡＣ培養物は、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１６６及びＨＬＡ−１に染色陽性であった。ｉＭＡＣは、ＣＤ１０、ＣＤ１５、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２ｐ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１０４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４１、ＣＤ１４６、及びＨＬＡＩＩに染色陰性であった。
【００７４】
結果（表１１）は、ｉＭＡＣは異なるドナーから得たヒト内乳動脈から単離でき、一貫した再現可能な表現型を依然として維持できることを示す。実施例２に記載されるｉＭＡＣは５１歳の女性由来であり、一方本実施例に記載されるｉＭＡＣは５６歳の男性から単離された。ｉＭＡＣは間葉系幹細胞と同様のいくつかのマーカーを発現するが、ｉＭＡＣによりＣＤ１０が発現されないことが明らかである。加えて、平滑筋細胞マーカーＣＤ１４１はｉＭＡＣにより発現されない。ｉＭＡＣは、内皮細胞、又は造血細胞が典型的に発現するマーカーを発現しない。これらのデータは、実施例７に記載される我々が依然得た知見と一致する。
【００７５】
このドナーの成長特性及び分化可能性の特徴を確認するには、更なる評価が必要である。しかしながら、これらの結果に基づき、これらの細胞の特徴が過去の知見と変わらないままであると思われる。ここに記載のデータは、ｉＭＡＣが異なるヒト内乳動脈から再現性よく単離され得ることを示唆する。これは、臨床用途においてｉＭＡＣを幅広く利用する可能性を高めるものである。
【表１２】
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表１１：細胞表面マーカーの表現型。表１０に記載の抗体を用いて、フローサイトメトリーによりｉＭＡＣの特徴を確認した。特定の細胞型の既知の表面マーカーに従ってマーカーを構築した（細胞型）。特定の細胞型により発現される表面マーカー（細胞型発現）。検査した表面マーカーを発現するｉＭＡＣ（陽性）。検査抗体の染色特性を陰性対照の抗体染色と比較して、染色陽性を決定した。
【００７６】
７５％を超える細胞の染色を陽性とみなした。検査した表面マーカーを発現しないｉＭＡＣ（陰性）。陰性対照抗体と比較して２５％未満の細胞が陽性の場合、染色を陰性とみなした。
【００７７】
〔実施の態様〕
（１）  単離された哺乳類内乳動脈由来細胞であって、前記細胞が培養中に自己複製して増殖することができ、前記細胞が細胞−表面マーカーＨＬＡ−１について発現陽性であり、細胞−表面マーカーＣＤ１０、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＣＤ１４１及びＫＤＲ／Ｆｌｋ−１のそれぞれについて発現陰性である、細胞。
（２）  前記細胞が、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１６６について更に発現陽性であり、ＣＤ１５、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ６２ｐ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１３８、ＣＤ１４６、ＶＥ−カドヘリン、及びＨＬＡ−２について更に発現陰性である、実施態様１に記載の細胞。
（３）  前記細胞が、脂肪細胞、心筋細胞、及び内皮細胞に分化可能である、実施態様１に記載の細胞。
（４）  哺乳類内乳動脈由来物を単離する方法であって、
ａ．哺乳類内乳動脈を提供する工程と、
ｂ．酵素混合物を提供する工程であって、前記酵素混合物が、メタロプロテアーゼ酵素、中性プロテアーゼ酵素、粘液溶解性酵素、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される消化酵素から構成される、工程と、
ｃ．前記動脈から内膜層を除去し、かつ外部残屑を除去するのに十分な時間、前記酵素混合物中で前記哺乳類内乳動脈をインキュベートし、部分的に消化された動脈を提供する工程と、
ｄ．前記部分的に消化された動脈を新しい酵素混合物中に移し、消化された材料を提供するのに十分な時間、消化を継続する工程と、
ｅ．前記消化された材料から前記細胞を単離する工程と、
ｆ．コラーゲンをコーティングした組織培養用容器上で前記細胞を培養する工程と、を含む、方法。
（５）  前記酵素混合物が、コラゲナーゼ及びディスパーゼから構成される、実施態様４に記載の方法。
（６）  前記動脈から内膜層を除去し、かつ外部残屑を除去する時間が、約６０分間である、実施態様４に記載の方法。
（７）  前記消化された材料を提供するのに十分な時間が、約３０分間〜約６０分間の範囲内である、実施態様６に記載の方法。
（８）  前記酵素混合物を消化された材料で飽和させるのに十分な時間が、約６０分間である、実施態様４に記載の方法。
（９）  ａ．哺乳類内乳動脈を提供する工程と、
ｂ．酵素混合物を提供する工程であって、前記酵素混合物が、メタロプロテアーゼ酵素、中性プロテアーゼ酵素、粘液溶解性酵素、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される消化酵素から構成される、工程と、
ｃ．前記動脈から内膜層を除去し、かつ外部残屑を除去するのに十分な時間、前記酵素混合物中で前記哺乳類内乳動脈をインキュベートし、部分的に消化された動脈を提供する工程と、
ｄ．前記部分的に消化された動脈を新しい酵素混合物中に移し、消化された材料を提供するのに十分な時間、消化を継続する工程と、
ｅ．前記消化された材料から細胞を単離する工程と、
ｆ．コラーゲンをコーティングした組織培養用容器上で前記細胞を培養する工程と、を含む方法により、哺乳類内乳動脈から単離された細胞。
（１０）  前記酵素混合物が、コラゲナーゼ及びディスパーゼから構成される、実施態様９に記載の細胞。
【００７８】
（１１）  前記動脈から内膜層を除去し、かつ外部残屑を除去する時間が、約６０分間である、実施態様９に記載の細胞。
（１２）  前記消化された材料を提供するのに十分な時間が、約３０分間〜約６０分間の範囲内である、実施態様１１に記載の細胞。
（１３）  前記酵素混合物を消化された材料で飽和させるのに十分な時間が、約６０分間である、実施態様１２に記載の細胞。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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