(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の少なくとも１つのアイソタイプの存在又はレベルを検出するための方法であって、
（ａ）標識化抗ＴＮＦα薬、及び１つ又は複数の、異なる抗体アイソタイプに特異的な標識化抗Ｉｇ抗体を、抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の少なくとも１つのアイソタイプを有する又は有すると推測される試料と接触させて、標識化抗ＴＮＦα薬と標識化抗Ｉｇ抗体とそれぞれの自己抗体アイソタイプとの間で標識化複合体を形成させるステップであり、標識化抗ＴＮＦα薬と標識化抗Ｉｇ抗体とが異なる標識を含むステップと、
（ｂ）標識化複合体をサイズ排除クロマトグラフィーに供して、異なる自己抗体アイソタイプを有する標識化複合体を、互いに、遊離の標識化抗ＴＮＦα薬から、及び／又は遊離の標識化抗Ｉｇ抗体から分離するステップと、
（ｃ）標識化複合体を検出し、それにより、抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の少なくとも１つのアイソタイプの存在又はレベルを検出するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
抗ＴＮＦα薬が、レミケード（商標）（インフリキシマブ）、ヒュミラ（商標）（アダリムマブ）、エンブレル（商標）（エタネルセプト）、シムジア（登録商標）（セルトリズマブペゴル）及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体が、ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）、ヒト抗ヒト化抗体（ＨＡＨＡ）、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
標識化抗ＴＮＦα薬と１つ又は複数の標識化抗Ｉｇ抗体とが、少なくとも１つのアイソタイプの異なるエピトープに結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つのアイソタイプが、少なくとも２、３、４又は５つ以上の複数のアイソタイプを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つのアイソタイプが、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭのアイソタイプ、それらのサブクラス、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
複数の標識化抗Ｉｇ抗体が、少なくとも２、３、４又は５つ以上の、異なる抗体アイソタイプに特異的な標識化抗Ｉｇ抗体を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
１つ又は複数の標識化抗Ｉｇ抗体が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭのアイソタイプ、それらのサブクラス、並びにそれらの組合せのうちの１つ又は複数に特異的な抗体からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
試料が、全血、血清又は血漿である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体が、ＨＡＣＡであり、試料が、レミケード（商標）（インフリキシマブ）療法を受けている対象から得られたものである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体が、ＨＡＨＡであり、試料が、ヒュミラ（商標）（アダリムマブ）療法を受けている対象から得られたものである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
標識化抗ＴＮＦα薬が、蛍光物質標識化抗ＴＮＦα薬である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
標識化抗Ｉｇ抗体が、蛍光物質標識化抗Ｉｇ抗体である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
複数の、異なる抗体アイソタイプに特異的な標識化抗Ｉｇ抗体がそれぞれ、同じ標識又は異なる標識を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
標識化複合体が、蛍光標識の検出を使用して検出される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
標識化複合体が、標識化抗ＴＮＦα薬及び標識化抗Ｉｇ抗体の両方の、自己抗体アイソタイプに対する近接性結合により発生するシグナルに基づいて検出される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
シグナルが、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）により検出される蛍光シグナルを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
サイズ排除クロマトグラフィーが、サイズ排除−高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
［０００１］本出願は、２０１０年１０月１８日に出願の米国特許仮出願第６１／３９４，２６９号に対する優先権を主張し、その全体の開示が、全ての目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
［発明の背景］
［０００２］自己免疫障害は、重要かつ広範な医学的問題である。例えば、関節リウマチ（ＲＡ）は、米国内で２００万人超が罹患している自己免疫疾患である。ＲＡは、関節の慢性炎症を引き起こし、典型的には、関節の破壊及び機能的身体障害を引き起こす可能性を有する進行性の疾病である。関節リウマチの原因は不明であるが、遺伝的素因、感染性病原体及び環境要因が全て、疾患の病因に関係があるとされている。活動性ＲＡの場合、症状は、疲労、食欲の欠如、軽度の発熱、筋肉及び関節の痛み及び硬直を含む場合がある。また、疾患の再燃の間には、滑膜の炎症に起因して、関節が頻繁に赤くなり、腫れ、痛み及び圧痛を伴うこともある。さらに、ＲＡは全身性疾患であることから、炎症が、眼及び口の腺、肺の内壁、心膜、並びに血管を含めた、関節以外の臓器及び身体領域に影響を及ぼす可能性もある。
【０００３】
［０００３］ＲＡ及び他の自己免疫障害の管理のための従来の治療は、即効性の「第一選択薬」及びより遅効性の「第二選択薬」を含む。第一選択薬は、疼痛及び炎症を低下させる。そのような第一選択薬の例として、アスピリン、ナプロキセン、イブプロフェン  エトドラク及び他の非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、並びに副腎皮質ステロイドが挙げられ、これらの薬物は、経口投与するか又は組織及び関節内に直接注射する。第二選択薬は、疾患の寛解を促し、進行性の関節の破壊を予防し、また、疾患修飾性抗リウマチ薬又はＤＭＡＲＤとも呼ばれる。第二選択薬の例として、金、ヒドロクロロキン（ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）、アザルフィジン、並びに免疫抑制剤、例として、メトトレキサート、アザチオプリン、シクロホスファミド、クロラムブシル及びシクロスポリンが挙げられる。しかし、これらの薬物のうちの多くが、有害な副作用を有する可能性がある。したがって、関節リウマチ及び他の自己免疫障害のための追加の療法が求められている。
【０００４】
［０００４］腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）は、単核球及びマクロファージを含めた、多数の細胞型が産生するサイトカインであり、特定のマウス腫瘍の壊死を誘導する能力に基づいて当初同定された。続いて、悪液質と関連がある、カケクチンと呼ばれている因子が、ＴＮＦαと同一であることが示された。ＴＮＦαは、ショック、敗血症、感染、自己免疫疾患、ＲＡ、クローン病、移植片拒絶及び移植片対宿主病を含めた、多様な他のヒトの疾患及び障害の病態生理に関係があるとされている。
【０００５】
［０００５］多様なヒト障害におけるヒトＴＮＦα（ｈＴＮＦα）の有害な役割に起因して、ｈＴＮＦα活性を阻害又は相殺するための治療戦略が設計されている。特に、ｈＴＮＦαに結合し、ｈＴＮＦαを中和する抗体が、ｈＴＮＦα活性を阻害するための手段として探求されている。そのような抗体の最早期のもののいくつかは、ｈＴＮＦαを用いて免疫化したマウスのリンパ球から調製したハイブリドーマが分泌したマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）であった（例えば、米国特許第５，２３１，０２４号を参照されたい）。これらのマウス抗ｈＴＮＦα抗体はしばしば、ｈＴＮＦαに対して高い親和性を示し、ｈＴＮＦα活性を中和することが可能であったが、これらのマウス抗ｈＴＮＦα抗体のｉｎ  ｖｉｖｏにおける使用は、マウス抗体のヒトへの投与と関連がある問題、例として、短い血清半減期、特定のヒトエフェクター機能を誘発し得ないこと、及びヒトにおけるマウス抗体に対する望まれない免疫応答の惹起（「ヒト抗マウス抗体」（ＨＡＭＡ）反応）によって制限されてきた。
【０００６】
［０００６］より最近になって、生物学的療法が、自己免疫障害、例として、関節リウマチの治療に適用されるようになった。例えば、４つのＴＮＦα阻害剤、すなわち、キメラ抗ＴＮＦα  ｍＡｂのレミケード（ＲＥＭＩＣＡＤＥ）（商標）（インフリキシマブ）、ＴＮＦＲ−Ｉｇ  Ｆｃ融合タンパク質のエンブレル（ＥＮＢＲＥＬ）（商標）（エタネルセプト）、ヒト抗ＴＮＦα  ｍＡｂのヒュミラ（ＨＵＭＩＲＡ）（商標）（アダリムマブ）、及びペグ化Ｆａｂ断片のシムジア（ＣＩＭＺＩＡ）（登録商標）（セルトリズマブペゴル）、が、関節リウマチの治療のためにＦＤＡの承認を得ている。また、シムジア（登録商標）は、中等度から重度のクローン病（ＣＤ）の治療のためにも使用される。そのような生物学的製剤療法が、関節リウマチ、及び他の自己免疫障害、例として、ＣＤの治療における成功を実証しているが、そのような療法に対して、治療する対象が全て、応答する又は良好に応答するとは限らない。
【０００７】
［０００７］さらに、ＴＮＦα阻害剤の投与は、薬物に対する免疫応答を誘導し、抗薬物抗体（ＡＤＡ）、例として、ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）、ヒト抗ヒト化抗体（ＨＡＨＡ）及びヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）の産生をもたらす可能性もある。そのようなＨＡＣＡ、ＨＡＨＡ又はＨＡＭＡの免疫応答は、過敏性反応、並びに免疫療法剤のＴＮＦα阻害剤の薬物動態及び体内分布の劇的な変化と関連がある可能性があり、薬物を用いたさらなる治療を妨げる。さらに、ＨＡＣＡ、ＨＡＨＡ又はＨＡＭＡの特定のアイソタイプの存在は、抗ＴＮＦα療法を投与している対象における異なる臨床転帰とも関連がある。
【０００８】
［０００８］したがって、当技術分野では、試料中の特異的なＡＤＡアイソタイプ又はＡＤＡアイソタイプの特定の組合せの存在又はレベルを検出するためのアッセイが求められている。また、当技術分野では、抗ＴＮＦα療法の適切なコースを選択するための方法、抗ＴＮＦα療法をモニターするための方法、及び／又は治療の決定を導くための方法も求められている。本発明は、これらの必要性を満たし、その上、関連がある利点ももたらす。
【０００９】
［発明の概要］
［０００９］本発明は、試料中の１つ又は複数の抗薬物抗体（ＡＤＡ）アイソタイプの決定のためのアッセイ方法を提供する。非限定的な例として、本発明のアッセイは、抗ＴＮＦα薬、例として、レミケード（商標）（インフリキシマブ）又はヒュミラ（商標）（アダリムマブ）を投与しているＡＤＡ陽性患者から得られた試料中の異なるＡＤＡアイソタイプを決定するのに特に有用である。また、本発明は、ＴＮＦα媒介型の疾患又は障害の治療のためにＴＮＦα阻害剤を投与している対象において、療法を最適化するための方法、及び／又は毒性を低下させるための方法も提供する。
【００１０】
［００１０］一態様では、本発明は、試料中の抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の少なくとも１つのアイソタイプ（例えば、複数のアイソタイプ）の存在（若しくは不在）又はレベルを検出するための方法であって、
（ａ）標識化抗ＴＮＦα薬を、抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の少なくとも１つのアイソタイプを有する又は有すると推測される試料と接触させて、標識化抗ＴＮＦα薬とそれぞれの自己抗体アイソタイプとの間で標識化複合体を形成させるステップと、
（ｂ）標識化複合体をサイズ排除クロマトグラフィーに供して、異なる自己抗体アイソタイプを有する標識化複合体を、互いに、及び／又は遊離の標識化抗ＴＮＦα薬から分離するステップと、
（ｃ）標識化複合体を検出し、それにより、抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の少なくとも１つのアイソタイプの存在（若しくは不在）又はレベルを検出するステップと
を含む方法を提供する。
【００１１】
［００１１］いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦα薬は、レミケード（商標）（インフリキシマブ）、ヒュミラ（商標）（アダリムマブ）、エンブレル（商標）（エタネルセプト）、シムジア（登録商標）（セルトリズマブペゴル）及びそれらの組合せからなる群から選択される。他の実施形態では、抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体（例えば、抗薬物抗体又は「ＡＤＡ」）は、ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）、ヒト抗ヒト化抗体（ＨＡＨＡ）、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）及びそれらの組合せからなる群から選択される。
【００１２】
［００１２］特定の実施形態では、少なくとも１つのアイソタイプは、少なくとも２、３、４又は５つ以上の複数のアイソタイプを含む。他の実施形態では、少なくとも１つのアイソタイプは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭのアイソタイプ、それらのサブクラス、並びにそれらの組合せからなる群から選択される。場合によっては、試料は、全血、血清又は血漿である。
【００１３】
［００１３］いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体は、ＨＡＣＡであり、試料を、レミケード（商標）（インフリキシマブ）療法を受けている対象から得る。特定の他の実施形態では、抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体は、ＨＡＨＡであり、試料を、ヒュミラ（商標）（アダリムマブ）療法を受けている対象から得る。
【００１４】
［００１４］場合によっては、標識化抗ＴＮＦα薬は、蛍光物質標識化抗ＴＮＦα薬である。特定の実施形態では、標識化複合体を、蛍光標識の検出を使用して検出する。特定の実施形態では、それぞれの自己抗体アイソタイプを、その保持時間により、特徴付け、又は同定し、又は検出する。他の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーは、サイズ排除−高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）である。
【００１５】
［００１５］関連の一態様では、本発明は、試料中の抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の少なくとも１つのアイソタイプ（例えば、複数のアイソタイプ）の存在（若しくは不在）又はレベルを検出するための方法であって、
（ａ）標識化抗ＴＮＦα薬、及び１つ又は複数の、異なる抗体アイソタイプに特異的な標識化抗Ｉｇ抗体を、抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の少なくとも１つのアイソタイプを有する又は有すると推測される試料と接触させて、標識化抗ＴＮＦα薬と標識化抗Ｉｇ抗体とそれぞれの自己抗体アイソタイプとの間で標識化複合体を形成させるステップであり、標識化抗ＴＮＦα薬と標識化抗Ｉｇ抗体とが異なる標識を含むステップと、
（ｂ）標識化複合体をサイズ排除クロマトグラフィーに供して、異なる自己抗体アイソタイプを有する標識化複合体を、互いに、遊離の標識化抗ＴＮＦα薬から、及び／又は遊離の標識化抗Ｉｇ抗体から分離するステップと、
（ｃ）標識化複合体を検出し、それにより、抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の少なくとも１つのアイソタイプの存在（若しくは不在）又はレベルを検出するステップと
を含む方法を提供する。
【００１６】
［００１６］いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦα薬は、レミケード（商標）（インフリキシマブ）、ヒュミラ（商標）（アダリムマブ）、エンブレル（商標）（エタネルセプト）、シムジア（登録商標）（セルトリズマブペゴル）及びそれらの組合せからなる群から選択される。他の実施形態では、抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体（例えば、抗薬物抗体又は「ＡＤＡ」）は、ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）、ヒト抗ヒト化抗体（ＨＡＨＡ）、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）及びそれらの組合せからなる群から選択される。
【００１７】
［００１７］特定の実施形態では、標識化抗ＴＮＦα薬と１つ又は複数の標識化抗Ｉｇ抗体とは、少なくとも１つのアイソタイプの異なるエピトープに結合する。１つの非限定的な例として、標識化抗ＴＮＦα薬と標識化抗Ｉｇアイソタイプ特異的抗体とは、特定の自己抗体アイソタイプの異なるエピトープに結合する。
【００１８】
［００１８］特定の実施形態では、少なくとも１つのアイソタイプは、少なくとも２、３、４又は５つ以上の複数のアイソタイプを含む。他の実施形態では、少なくとも１つのアイソタイプは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭのアイソタイプ、それらのサブクラス、並びにそれらの組合せからなる群から選択される。
【００１９】
［００１９］いくつかの実施形態では、複数の標識化抗Ｉｇ抗体は、少なくとも２、３、４又は５つ以上の、異なる抗体アイソタイプに特異的な標識化抗Ｉｇ抗体を含む。他の実施形態では、１つ又は複数の標識化抗Ｉｇ抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭのアイソタイプ、それらのサブクラス、並びにそれらの組合せのうちの１つ又は複数に特異的な抗体からなる群から選択される。場合によっては、試料は、全血、血清又は血漿である。
【００２０】
［００２０］いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体は、ＨＡＣＡであり、試料を、レミケード（商標）（インフリキシマブ）療法を受けている対象から得る。特定の他の実施形態では、抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体は、ＨＡＨＡであり、試料を、ヒュミラ（商標）（アダリムマブ）療法を受けている対象から得る。
【００２１】
［００２１］場合によっては、標識化抗ＴＮＦα薬は、蛍光物質標識化抗ＴＮＦα薬である。特定の他の場合には、標識化抗Ｉｇ抗体は、蛍光物質標識化抗Ｉｇ抗体である。複数の、異なる抗体アイソタイプに特異的な標識化抗Ｉｇ抗体はそれぞれ、同じ標識を含んでもよく、又は異なる標識を含んでもよい。１つの非限定的な例では、複数の標識化抗Ｉｇアイソタイプ特異的抗体をそれぞれ、アレクサ−５３２を用いて標識し、標識化抗ＴＮＦα薬を、アレクサ−４８８を用いて標識する。
【００２２】
［００２２］いくつかの実施形態では、標識化複合体を、蛍光標識の検出を使用して検出する。特定の実施形態では、標識化複合体を、標識化抗ＴＮＦα薬及び標識化抗Ｉｇ抗体の両方の、自己抗体アイソタイプに対する近接性結合（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ）により発生するシグナルに基づいて検出する。特定の場合には、シグナルは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）により検出される蛍光シグナルを含む。他の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーは、サイズ排除−高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）である。特定の実施形態では、それぞれの自己抗体アイソタイプを、その保持時間により、特徴付け、又は同定し、又は検出する。
【００２３】
［００２３］さらに別の態様では、本発明は、ＴＮＦα媒介型の疾患又は障害の治療のための療法のコースを投与している対象において、療法を最適化するための方法、及び／又は毒性を低下させるための方法であって、
（ａ）対象から得られた試料を分析して、試料中の１つ又は複数のマーカーの存在、レベル又は遺伝子型を決定するステップと、
（ｂ）統計学的アルゴリズムを、ステップ（ａ）において決定した１つ又は複数のマーカーの存在、レベル又は遺伝子型に適用するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）において適用した統計学的アルゴリズムに基づいて、対象のための療法のコースの今後の用量を決定するステップ、又は異なる療法のコースを対象に投与すべきであるかどうかを決定するステップと
を含む方法を提供する。
【００２４】
［００２４］非限定的な例として、患者試料（例えば、抗ＴＮＦ薬物療法を受けている患者から得られた血清試料）中の、以下のクラスの生化学的マーカー、血清学的マーカー及び／又は遺伝学的マーカーのうちの１、２、３、４、５又は全６つの存在、レベル又は遺伝子型を、検出、測定又は決定することができる：
（１）抗ＴＮＦ薬のレベル（例えば、遊離の抗ＴＮＦα治療用抗体のレベル）、
（２）抗薬物抗体（ＡＤＡ）のレベル（例えば、抗ＴＮＦ薬に対する自己抗体のレベル）、
（３）ＴＮＦαのレベル、
（４）１、２、３、４、５、６又は７つ以上の追加のサイトカイン（例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０等）並びに／又は炎症の他の機構についてのマーカー（例えば、炎症性マーカー、例として、ＣＲＰ、ＳＡＡ、ＩＣＡＭ−１及び／若しくはＶＣＡＭ−１）のレベル、
（５）炎症経路遺伝子等の１つ又は複数の遺伝学的マーカー中の１つ又は複数の突然変異の存在又は不在、例えば、１つ又は複数の炎症性マーカー中の変異体対立遺伝子（例えば、ＳＮＰ）、例えば、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５（例えば、米国特許第７，５９２，４３７号に記載されているＳＮＰ８、ＳＮＰ１２及び／若しくはＳＮＰ１３）、ＡＴＧ１６Ｌ１（例えば、Ｌａｋａｔｏｓら、Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ、４０（２００８）８６７〜８７３頁に記載されているｒｓ２２４１８８０（Ｔ３００Ａ）ＳＮＰ）、ＩＬ２３Ｒ（例えば、Ｌａｋａｔｏｓらに記載されているｒｓ１１２０９０２６（Ｒ３８１Ｑ）ＳＮＰ）、例えば、Ｇａｓｃｈｅら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ＆  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（２００３）１５：５９９〜６０６頁）に記載されているヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子並びに／又はサイトカイン遺伝子、さらに、ＩＢＤ５遺伝子座に属するＤＬＧ５及び／又はＯＣＴＮ遺伝子等の存在又は不在、
（６）複数の時点における（例えば、第２８週時、第６０週時等の）上記の生化学的マーカー及び／又は血清学的マーカーのうちの１つ又は複数のレベル、さらに、
（７）それらの組合せ。
【００２５】
［００２５］特定の実施形態では、次いで、単一の統計学的アルゴリズム又は２つ以上の統計学的アルゴリズムの組合せを、試料中の検出、測定又は決定した１つ又は複数（例えば、２、３、４、５、６又は７つ以上の組合せ）のマーカーの存在、レベル（濃度レベル）又は遺伝子型に適用し、それにより、抗ＴＮＦ薬に関して、療法を最適化すること、毒性を低下させること、及び／又は治療処置の有効性をモニターすることができる。したがって、本発明の方法は、患者の免疫状態を決定することによって、患者の管理を決定する場合に有用性を見出す。
【００２６】
［００２６］抗ＴＮＦ薬（例えば、抗ＴＮＦα抗体）、並びに抗薬物抗体（ＡＤＡ）、例として、ＨＡＣＡ及びＨＡＨＡを検出するための方法は、国際公開第２０１１／０５６５９０号パンフレットにさらに記載されており、その全体の開示が、全ての目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【００２７】
［００２７］以下の詳細な説明及び図から、本発明の他の目的、特徴及び利点が当業者には明らかであろう。
【００２８】
［図面の簡単な説明］
［００２８］図１は、サイズ排除ＨＰＬＣを使用して、ＴＮＦα−アレクサ６４７とヒュミラ（商標）との間の結合を検出する、本発明のアッセイの例示的な実施形態を示す図である。
【００２９】
［００２９］図２は、ＴＮＦα−アレクサ６４７に対するヒュミラ（商標）の結合の用量反応曲線を示すグラフである。
【００３０】
［００３０］図３は、細胞架橋アッセイとして知られている、ＨＡＣＡのレベルを測定するための、ＥＬＩＳＡに基づく現在の方法を示す図である。
【００３１】
［００３１］図４は、レミケード（商標）に対して生成したＨＡＣＡ／ＨＡＨＡの濃度を測定するための、本発明の自己抗体の検出アッセイの例示的な概要を示す図である。
【００３２】
［００３２］図５は、レミケード（商標）−アレクサ６４７に対する抗ヒトＩｇＧ抗体の結合の用量反応分析を示す図である。
【００３３】
［００３３］図６は、レミケード（商標）−アレクサ６４７に対する抗ヒトＩｇＧ抗体の結合の第２の用量反応分析を示す図である。
【００３４】
［００３４］図７は、レミケード（商標）−アレクサ６４７に対する抗ヒトＩｇＧ抗体の結合の用量反応曲線を示すグラフである。
【００３５】
［００３５］図８は、正常ヒト血清及びＨＡＣＡ陽性血清中におけるレミケード（商標）−アレクサ６４７の免疫複合体形成を示す図である。
【００３６】
［００３６］図９は、本発明の細胞架橋アッセイ又は移動度シフトアッセイを使用して実施した、２０人の患者の血清試料から得られたＨＡＣＡの測定の概要を示す表である。
【００３７】
［００３７］図１０は、ＨＡＣＡの血清濃度を測定するための現在の方法及び本発明の新規のＨＡＣＡアッセイの概要及び比較を示す表である。
【００３８】
［００３８］図１１は、正常な（ＮＨＳ）又はＨＡＣＡ陽性（ＨＰＳ）の血清と共にインキュベートした蛍光物質（Ｆｌ）標識化ＩＦＸのＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示す図である。ＨＡＣＡ陽性血清の量を増加させて、インキュベーション混合物に添加すると、ＩＦＸ−Ｆｌのピークが、より高い分子質量が溶出する位置、すなわち、Ｃ１及びＣ２に用量依存的にシフトした。
【００３９】
［００３９］図１２は、移動度シフトアッセイにより決定した場合の、ＨＡＣＡ陽性血清の希釈度を増加させて生成した結合している及び遊離のＩＦＸ−Ｆｌの用量反応曲線を示すグラフである。（Ａ）ＨＡＣＡ陽性血清の希釈度を増加させて、３７．５ｎｇのＩＦＸ−Ｆｌと共にインキュベートした。希釈度がより高い（ＨＡＣＡがより少ない）ほど、より多くの遊離のＩＦＸ−Ｆｌが、ＳＥ−ＨＰＬＣ分析において見出された。（Ｂ）ＨＡＣＡ陽性血清の希釈度を増加させて、３７．５ｎｇのＩＦＸ−Ｆｌと共にインキュベートした。希釈度がより高い（ＨＡＣＡがより少ない）ほど、より少ない、ＨＡＣＡに結合しているＩＦＸ−Ｆｌが、ＳＥ−ＨＰＬＣ分析において見出された。
【００４０】
［００４０］図１３は、正常血清（ＮＨＳ）又はＩＦＸを加えた血清と共にインキュベートしたＴＮＦα−ＦｌのＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示す図である。ＩＦＸを加えた血清の量を増加させて、インキュベーション混合物に添加すると、ＴＮＦαの蛍光ピークが、より高い分子質量が溶出する位置に用量依存的にシフトした。
【００４１】
［００４１］図１４は、移動度シフトアッセイにより決定した場合の、ＩＦＸを加えた血清の希釈度を増加させて生成した結合している及び遊離のＴＮＦαの用量反応曲線を示す図である。ＩＦＸの濃度を増加させて、インキュベーション混合物に添加すると、遊離のＴＮＦαのパーセントが減少し、一方、結合しているＴＮＦαのパーセントは増加した。
【００４２】
［００４２］図１５は、移動度シフトアッセイによる、ＩＦＸを用いて治療するＩＢＤ患者における相対的なＨＡＣＡレベル及びＩＦＸ濃度の異なる時点の測定を示すグラフである。
【００４３】
［００４３］図１６は、患者の管理、すなわち、ＩＦＸを用いて治療するＩＢＤ患者の血清中のＨＡＣＡレベル及びＩＦＸ濃度の異なる時点の測定を示すグラフである。
【００４４】
［００４４］図１７は、（Ａ）非中和自己抗体の存在、又は（Ｂ）中和自己抗体、例として、ＨＡＣＡの存在を検出するための、本発明のアッセイの例示的な実施形態を示す図である。
【００４５】
［００４５］図１８は、中和自己抗体、例として、ＨＡＣＡの存在を検出するための、本発明のアッセイの代替の実施形態を示す図である。
【００４６】
［００４６］図１９は、異なる量の抗ヒトＩｇＧの存在下で正常ヒト血清（ＮＨＳ）と共にインキュベートしたＦｌ標識化ＡＤＬの移動度シフトのプロファイルを示す図である。抗ヒトＩｇＧの量を増加させて、インキュベーション混合物に添加すると、遊離Ｆｌ−ＡＤＬのピーク（ＦＡ）が、より高い分子質量が溶出する位置、すなわち、Ｃ１及びＣ２に用量依存的にシフトし、一方、内部対照（ＩＣ）は変化しなかった。
【００４７】
［００４７］図２０は、抗ヒトＩｇＧの、遊離Ｆｌ−ＡＤＬのシフトに対する用量反応曲線を示すグラフである。抗ヒトＩｇＧの量を増加させて、３７．５ｎｇのＦｌ−ＡＤＬ及び内部対照と共にインキュベートした。より多くの抗体を反応混合物に添加するほど、遊離Ｆｌ−ＡＤＬ対内部対照の比が低下した。
【００４８】
［００４８］図２１は、異なる量のＡＤＬの存在下で正常ヒト血清（ＮＨＳ）と共にインキュベートしたＦｌ標識化ＴＮＦ−αの移動度シフトのプロファイルを示す図である。Ｅｘ＝４９４ｎｍ；Ｅｍ＝５１９ｎｍ。ＡＤＬの量を増加させて、インキュベーション混合物に添加すると、遊離ＴＮＦ−Ｆｌのピーク（ＦＴ）が、より高い分子質量が溶出する位置に用量依存的にシフトし、一方、内部対照（ＩＣ）のピークは変化しなかった。
【００４９】
［００４９］図２２は、ＡＤＬの、遊離ＴＮＦ−α−Ｆｌのシフトに対する用量反応曲線を示すグラフである。ＡＤＬの量を増加させて、１００ｎｇのＴＮＦ−α−Ｆｌ及び内部対照と共にインキュベートした。より多くの抗体ＡＤＬを反応混合物に添加するほど、遊離ＴＮＦ−α−Ｆｌ対内部対照の比が低下した。
【００５０】
［００５０］図２３は、ＨＡＣＡ陽性患者の血清中の異なるＡＤＡアイソタイプの溶出時間を示すグラフである。
【００５１】
［００５１］図２４は、実施例８に記載の研究において使用した１００個の対照試料の平均のプロットを示す図である。
【００５２】
［００５２］図２５は、実施例８に記載の研究において使用した１００個のＨＡＣＡ陽性試料の平均のプロットを示す図である。
【００５３】
［００５３］図２６は、実施例８に記載の研究において使用した１００個の対照試料及び１００個のＨＡＣＡ陽性試料について、主要ピークの（すなわち、標識化レミケードのシグナル強度に対応する）シグナルを並べて比較するグラフである。
【００５４】
［００５４］図２７は、図２６から得られた主要ピークのデータについての受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線を示すグラフである。曲線下面積（ＡＵＣ）は、０．９８６であった。
【００５５】
［００５５］図２８は、実施例８に記載の研究において使用した１００個のＨＡＣＡ陽性試料について、Ｘ軸上の非主要ピーク（これらは、ＩｇＧピーク、ＩｇＡピーク及びＩｇＭピークの和に相当する）対Ｙ軸上の主要ピークのプロットを示すグラフである。
【００５６】
［００５６］図２９は、実施例８に記載の研究において使用した２００個の試料全てについての、ＩｇＧピーク対ＩｇＡピーク対ＩｇＭピークのプロットを示すグラフである。
【００５７】
［００５７］図３０は、本発明の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）による自己抗体アイソタイピングアッセイのフォーマットを示す概略図である。
【００５８】
［００５８］図３１は、ＦＲＥＴに基づく、本発明の自己抗体アイソタイピングアッセイの結果を示すグラフである。
【００５９】
［発明の詳細な説明］
Ｉ．序論
［００５９］ＴＮＦαは、炎症性疾患、自己免疫疾患、ウイルス、細菌及び寄生生物の感染、悪性腫瘍、並びに／又は神経変性疾患に関係があるとされており、関節リウマチ（ＲＡ）及びクローン病（ＣＤ）等の疾患における特定の生物学的療法に有用な標的である。ＴＮＦα阻害剤、例として、抗ＴＮＦα抗体は、重要なクラスの治療剤である。しかし、ＴＮＦα阻害剤の投与は、薬物に対する免疫応答を誘導し、抗薬物抗体（ＡＤＡ）の産生をもたらす可能性があり、それにより薬物を用いたさらなる治療を妨げる。さらに、特定のＡＤＡアイソタイプの存在は、抗ＴＮＦα療法を投与している対象における異なる臨床転帰と関連がある場合もある。
【００６０】
［００６０］本発明は、サイズ排除クロマトグラフィーを使用する均一移動度シフトアッセイが、試料中の１つ又は複数のＡＤＡアイソタイプの存在又はレベルを測定するのに特に好都合であるという発見に一部基づいている。非限定的な例として、本発明のアッセイは、抗ＴＮＦα薬、例として、レミケード（商標）（インフリキシマブ）又はヒュミラ（商標）（アダリムマブ）を投与しているＡＤＡ陽性患者から得られた試料中の異なるＡＤＡアイソタイプを決定するのに特に有用である。
【００６１】
［００６１］特に、本発明は、洗浄のステップを必要としない、「混合し、読み取る」ＡＤＡアイソタイピングアッセイを提供する。結果として、複合体を形成した試薬と複合体を形成しなかった試薬とが互いに容易に分離される。さらに、本発明のアッセイを使用すれば、遊離の抗ＴＮＦα薬からの潜在的な干渉はいずれも最小限に留まる。対照的に、自己抗体レベルを測定するための典型的なＥＬＩＳＡは、ＴＮＦα阻害剤が身体から排除されるまで実施することができず、排除は３ヶ月かかり得る。さらに、本発明は一般に、抗ＴＮＦα抗体に加えて、多種多様な抗ＴＮＦα治療剤にも適用できる。また、本発明のアッセイは、抗原の固体表面への付着を回避し、無関係のＩｇＧの非特異的結合を排除し、弱い親和性を有する抗体を検出し、現時点で利用可能な検出方法、例として、酵素イムノアッセイを上回る感度及び特異性の増加も示すので好都合である。
【００６２】
［００６２］抗ＴＮＦα生物学的製剤（例えば、抗ＴＮＦα抗体）及び抗ＴＮＦα生物学的製剤に対して生成された自己抗体（例えば、ＡＤＡアイソタイプ）の血清濃度を測定することの重要性は、ＦＤＡが、薬物動態学的研究及び耐容性（例えば、免疫応答）研究を臨床治験の間に実施することを要求しているという事実により示される。また、本発明は、これらの薬物を投与している患者をモニターして、患者が正当な用量を与えられており、薬物が身体から急速に除かれ過ぎておらず、患者が薬物に対する免疫応答を発生させていないことを確かめる場合にも有用性を見出す。さらに、本発明は、最初の薬物に関する不成功に起因する異なる薬物間の切換えを導くのにも有用である。
【００６３】
［００６３］また、本発明は、ＴＮＦα媒介型の疾患又は障害の治療のためにＴＮＦα阻害剤を投与している対象において、療法を最適化するための方法、及び／又は毒性を低下させるための方法も提供する。さらに、本発明は、一つには、抗ＴＮＦ薬物療法を投与している又は投与しようとしている患者のために治療の決定を導くのに有用な情報をもたらすことによって、抗ＴＮＦ薬、例として、インフリキシマブ又はアダリムマブの投与と関連がある現在の制限に対処し、そうした制限も克服するので、特に好都合である。
【００６４】
ＩＩ．定義
［００６４］本明細書で使用する場合、別段の特定がない限り、以下の用語は、それらの用語に与えた意味を有する。
【００６５】
［００６５］用語「ＴＮＦα」は、本明細書で使用する場合、１７キロダルトンの分泌型及び２６キロダルトンの膜結合型として存在するヒトサイトカインを含むことを意図し、ＴＮＦαの生物学的に活性な形態が、非共有結合性の１７キロダルトンの分子の三量体から構成される。ＴＮＦαの構造は、例えば、Ｊｏｎｅｓら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ、３３８：２２５〜２２８頁にさらに記載されている。用語ＴＮＦαは、ヒトＴＮＦα、組換えヒトＴＮＦα（ｒｈＴＮＦα）、又はヒトＴＮＦαタンパク質に対して少なくとも約８０％の同一性を有するポリペプチドを含むことを意図する。ヒトＴＮＦαは、３５個のアミノ酸（ａａ）の細胞質ドメイン、２１個のａａの膜貫通セグメント、及び１７７個のａａの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）からなる（Ｐｅｎｎｉｃａら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７２４）。ＥＣＤ内で、ヒトＴＮＦαは、アカゲザルのＴＮＦαと９７％のａａ配列同一性を共有し、ウシ、イヌ、コットンラット、ウマ、ネコ、マウス、ブタ及びラットのＴＮＦαと７１％〜９２％のａａ配列同一性を共有する。ＴＮＦαは、標準的な組換え発現の方法により調製するか、又は商業的に購入する（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２１０−ＴＡ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎ．）ことができる。
【００６６】
［００６６］用語「ＴＮＦα阻害剤」又は「ＴＮＦα薬」は、タンパク質、抗体、抗体断片、融合タンパク質（例えば、Ｉｇ融合タンパク質又はＦｃ融合タンパク質）、多価結合性タンパク質（例えば、ＤＶＤ  Ｉｇ）、小型分子ＴＮＦαアンタゴニスト、並びにそれらの類似の天然若しくは非天然に存在する分子及び／又は組換えの形態及び／又は工学的に作製された形態を含めた作用剤であって、例として、ＴＮＦαの、ＴＮＦαについての細胞表面受容体との相互作用を阻害すること、ＴＮＦαタンパク質の産生を阻害すること、ＴＮＦα遺伝子の発現を阻害すること、細胞からのＴＮＦαの分泌を阻害すること、ＴＮＦα受容体のシグナル伝達を阻害すること、又は結果として、対象においてＴＮＦα活性の減少をもたらす任意の他の手段によって、ＴＮＦα活性を直接的又は間接的に阻害する作用剤を包含することを意図する。用語「ＴＮＦα阻害剤」又は「ＴＮＦα薬」は、好ましくは、ＴＮＦα活性を妨げる作用剤を含む。ＴＮＦα薬の例として、エタネルセプト（エンブレル（商標）、Ａｍｇｅｎ）、インフリキシマブ（レミケード（商標）、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ）、ヒト抗ＴＮＦモノクローナル抗体のアダリムマブ（Ｄ２Ｅ７／ヒュミラ（商標）、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＣＤＰ５７１（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）及びＣＤＰ８７０（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）、並びにＴＮＦα活性を阻害し、したがって、ＴＮＦα活性が有害である障害（例えば、ＲＡ）に罹患している又は罹患しているリスクがある対象に投与する場合、障害が治療される、他の化合物が挙げられる。
【００６７】
［００６７］用語「免疫グロブリンアイソタイプ」又は「抗体アイソタイプ」は、重鎖及び／又は軽鎖の定常領域中に遺伝子の変動及び／又は差を含む関連がある抗体のファミリーの任意のメンバーを含む。抗体アイソタイプの非限定的な例として、（１）重鎖アイソタイプ、例として、α（例えば、ＩｇＡ、又はそのサブクラス、例として、ＩｇＡ１及び／若しくはＩｇＡ２）、δ（例えば、ＩｇＤ）、γ（例えば、ＩｇＧ、又はそのサブクラス、例として、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及び／若しくはＩｇＧ４）、ε（例えば、ＩｇＥ）、μ（例えば、ＩｇＭ）、並びに（２）軽鎖アイソタイプ、例として、κ及びλが挙げられる。
【００６８】
［００６８］用語「サイズ排除クロマトグラフィー」（ＳＥＣ）は、溶液中の分子を、分子のサイズ及び／又は流体力学的体積に基づいて分離するクロマトグラフィーの方法を含むことを意図する。サイズ排除クロマトグラフィーは、大型分子又は巨大分子複合体、例として、タンパク質及びタンパク質のコンジュゲートに適用される。典型的には、水溶液を使用して、試料を、カラムを通して移動させる場合、当該技法は、ゲルろ過クロマトグラフィーとして知られている。
【００６９】
［００６９］用語「複合体」、「免疫複合体」、「コンジュゲート」及び「イムノコンジュゲート」として、これらに限定されないが、抗ＴＮＦα薬に（例えば、非共有結合性手段により）結合しているＴＮＦα、抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体に（例えば、非共有結合性手段により）結合している抗ＴＮＦα薬、ＴＮＦα及び抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の両方に（例えば、非共有結合性手段により）結合している抗ＴＮＦα薬、抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体のアイソタイプに（例えば、非共有結合性手段により）結合している抗ＴＮＦα薬、並びに抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体のアイソタイプに（例えば、非共有結合性手段により）結合している抗ＴＮＦα薬と抗Ｉｇアイソタイプ特異的抗体が挙げられる。
【００７０】
［００７０］本明細書で使用する場合、用語「標識化」により修飾されている実体は、実験的に検出可能である別の分子又は化学的実体とコンジュゲートしている任意の実体、分子、タンパク質、酵素、抗体、抗体断片、サイトカイン又は関連の種を含む。標識化実体のための標識として適切な化学種として、これらに限定されないが、蛍光染料（例えば、アレクサフルオール（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ）（登録商標）染料、例として、アレクサフルオール（登録商標）４８８、５３２又は６４７）、量子ドット、光学染料、発光染料、及び放射性核種、例えば、１２５Ｉが挙げられる。
【００７１】
［００７１］句「蛍光標識の検出」は、蛍光標識を検出するための手段を含む。検出のための手段として、これらに限定されないが、クロマトグラフィー機器、例として、これらに限定されないが、サイズ排除−高速液体クロマトグラフィー、例として、これらに限定されないが、Ａｇｉｌｅｎｔ−１２００ＨＰＬＣシステムと共に一般に組み込まれる分光計、蛍光光度計、光度計、検出デバイスが挙げられる。
【００７２】
［００７２］用語「療法を最適化すること」又は「療法を最適化する」は、特定の療法の用量（例えば、有効な量若しくはレベル）及び／又はタイプを最適化することを含む。例えば、抗ＴＮＦα薬の用量を最適化することは、対象に今後投与する抗ＴＮＦα薬の量を増加又は減少させることを含む。特定の場合には、抗ＴＮＦα薬のタイプを最適化することは、投与する抗ＴＮＦα薬を、１つの薬物から異なる薬物（例えば、異なる抗ＴＮＦα薬）に変化させることを含む。特定の他の場合には、療法を最適化することは、免疫抑制薬と組み合わせて、抗ＴＮＦα薬の用量を（例えば、以前の用量より増加させた、減少させた用量、又は以前の用量と同じ用量で）同時投与することを含むことができる。
【００７３】
［００７３］用語「療法のコース」は、ＴＮＦα媒介型の疾患又は障害と関連がある１つ又は複数の症状を和らげる又は予防するために行う任意の治療のためのアプローチを含む。この用語は、ＴＮＦα媒介型の疾患又は障害を有する個体の健康状態を改善するのに有用な任意の化合物、薬物、手順及び／又はレジメンを投与することを網羅し、本明細書に記載する治療剤のうちのいずれかを含む。当業者であれば、本発明の方法を使用して、ＴＮＦα、抗ＴＮＦα薬及び／又は抗薬物抗体の存在又は濃度レベルに基づいて、療法のコース又は現在の療法のコースの用量のいずれかを変化させる（例えば、増加又は減少させる）ことができることを理解するであろう。
【００７４】
［００７４］用語「免疫抑制剤」は、免疫抑制作用、例えば、照射、又は薬物、例として、抗代謝剤、抗リンパ球血清、抗体等の投与による場合の免疫応答の阻止又は減少を発生させることが可能である任意の物質を含む。適切な免疫抑制剤の例として、非限定的に、チオプリン系薬物、例として、アザチオプリン（ＡＺＡ）及びその代謝産物；抗代謝剤、例として、メトトレキサート（ＭＴＸ）；シロリムス（ラパマイシン）；テムシロリムス；エベロリムス；タクロリムス（ＦＫ−５０６）；ＦＫ−７７８；抗リンパ球グロブリン抗体、抗胸腺細胞グロブリン抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、並びに抗体−毒素のコンジュゲート；シクロスポリン；ミコフェノール酸；ミゾリビンモノホスファート；スコパロン；酢酸グラチラマー；それらの代謝産物；それらの薬学的に許容できる塩；それらの誘導体；それらのプロドラッグ；並びにそれらの組合せが挙げられる。
【００７５】
［００７５］用語「チオプリン系薬物」は、アザチオプリン（ＡＺＡ）、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）又は治療有効性を有する任意のそれらの代謝産物を含み、非限定的に、６−チオグアニン（６−ＴＧ）、６−メチルメルカプトプリンリボシド、６−チオイノシンヌクレオチド（例えば、６−チオイノシン一リン酸、６−チオイノシン二リン酸、６−チオイノシン三リン酸）、６−チオグアニンヌクレオチド（例えば、６−チオグアノシン一リン酸、６−チオグアノシン二リン酸、６−チオグアノシン三リン酸）、６−チオキサントシンヌクレオチド（例えば、６−チオキサントシン一リン酸、６−チオキサントシン二リン酸、６−チオキサントシン三リン酸）、それらの誘導体、それらの類似体、及びそれらの組合せを含む。
【００７６】
［００７６］用語「試料」は、個体から得られた任意の生物学的標本を含む。本発明において使用するのに適切な試料として、非限定的に、全血、血漿、血清、唾液、尿、便、涙、任意の他の体液、組織試料（例えば、生検）、及びそれらの細胞抽出物（例えば、赤血球抽出物）が挙げられる。好ましい実施形態では、試料は、血清試料である。当業者であれば、試料、例として、血清試料を、分析の前に希釈することができることを理解するであろう。特定の場合には、用語「試料」は、これらに限定されないが、血液、身体組織、血清、リンパ液、リンパ節組織、脾臓組織、骨髄、又はこれらの組織のうちの１つ若しくは複数から得られた免疫グロブリン濃縮画分を含む。特定の他の場合には、用語「試料」は、血清を含むか、又は血清若しくは血液から得られた免疫グロブリン濃縮画分である。特定の場合には、用語「試料」は、体液を含む。
【００７７】
［００７７］用語「ＴＮＦα阻害剤に対する応答性を予測すること」は、ＴＮＦα阻害剤を用いた対象の治療が、対象において有効である（例えば、測定可能な利益を対象にもたらす）か又はそうでない可能性を評価する能力を指すことを意図する。特に、治療が有効であるか又は有効でない可能性を評価するそのような能力は典型的には、治療を開始し、有効性の指標（例えば、測定可能な利益の指標）が対象内において観察されるようになってから発揮される。特に好ましいＴＮＦα阻害剤は、関節リウマチ（ＲＡ）の治療の場合にヒトにおいて使用するためにＦＤＡの承認を得ている生物学的薬剤であり、それらの薬剤は、本明細書に記載され、これらに限定されないが、アダリムマブ（ヒュミラ（商標））、インフリキシマブ（レミケード（商標））及びエタネルセプト（エンブレル（商標））を含む。
【００７８】
［００７８］用語「対象」、「患者」又は「個体」は、典型的にはヒトを指すが、また、例えば、他の霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ブタ等を含めて、他の動物も指す。
【００７９】
ＩＩＩ．実施形態の記載
［００７９］本発明は、試料中の１つ又は複数の抗薬物抗体（ＡＤＡ）アイソタイプの決定のためのアッセイ方法を提供する。非限定的な例として、本発明のアッセイは、抗ＴＮＦα薬、例として、レミケード（商標）（インフリキシマブ）又はヒュミラ（商標）（アダリムマブ）を投与しているＡＤＡ陽性患者から得られた試料中の異なるＡＤＡアイソタイプを決定するのに特に有用である。また、本発明は、ＴＮＦα媒介型の疾患又は障害の治療のためにＴＮＦα阻害剤を投与している対象において、療法を最適化するための方法、及び／又は毒性を低下させるための方法も提供する。
【００８０】
［００８０］一態様では、本発明は、試料中の抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の少なくとも１つのアイソタイプ（例えば、複数のアイソタイプ）の存在（若しくは不在）又はレベルを検出するための方法であって、
（ａ）標識化抗ＴＮＦα薬（例えば、標識化抗ＴＮＦα抗体）を、抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の少なくとも１つのアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及び／又はＩｇＭ）を有する又は有すると推測される試料と接触させて、標識化抗ＴＮＦα薬とそれぞれの自己抗体アイソタイプとの間で標識化複合体（すなわち、免疫複合体又はコンジュゲート）を形成させる（すなわち、標識化抗ＴＮＦα薬と自己抗体アイソタイプとを互いに非共有結合性につなぐ）ステップと、
（ｂ）標識化複合体をサイズ排除クロマトグラフィーに供して、異なる自己抗体アイソタイプを有する標識化複合体を、互いに、及び／又は遊離の標識化抗ＴＮＦα薬から分離するステップと、
（ｃ）標識化複合体を検出し、それにより、抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の少なくとも１つのアイソタイプの存在（若しくは不在）又はレベルを検出するステップと
を含む方法を提供する。
【００８１】
［００８１］関連の一態様では、本発明は、試料中の抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の少なくとも１つのアイソタイプ（例えば、複数のアイソタイプ）の存在（若しくは不在）又はレベルを検出するための方法であって、
（ａ）標識化抗ＴＮＦα薬（例えば、標識化抗ＴＮＦα抗体）、及び異なる抗体アイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及び／又はＩｇＭのアイソタイプ）に特異的な標識化抗Ｉｇ抗体の１つ又は複数を、抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の少なくとも１つのアイソタイプを有する又は有すると推測される試料と接触させて、標識化抗ＴＮＦα薬と標識化抗Ｉｇ抗体とそれぞれの自己抗体アイソタイプとの間で標識化複合体（すなわち、免疫複合体又はコンジュゲート）を形成させる（すなわち、標識化複合体の構成成分を互いに非共有結合性につなぐ）ステップであり、標識化抗ＴＮＦα薬と標識化抗Ｉｇ抗体とが異なる標識を含むステップと、
（ｂ）標識化複合体をサイズ排除クロマトグラフィーに供して、異なる自己抗体アイソタイプを有する標識化複合体を、互いに、遊離の標識化抗ＴＮＦα薬から、及び／又は遊離の標識化抗Ｉｇ抗体から分離するステップと、
（ｃ）標識化複合体を検出し、それにより、抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の少なくとも１つのアイソタイプの存在（若しくは不在）又はレベルを検出するステップと
を含む方法を提供する。
【００８２】
［００８２］いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦα薬は、レミケード（商標）（インフリキシマブ）、ヒュミラ（商標）（アダリムマブ）、エンブレル（商標）（エタネルセプト）、シムジア（登録商標）（セルトリズマブペゴル）及びそれらの組合せからなる群から選択される。
【００８３】
［００８３］特定の実施形態では、方法は、抗ＴＮＦα薬物療法を投与している対象から得られた試料、例として、全血、血清又は血漿の試料中の少なくとも１、２、３、４又は５つ以上の抗体アイソタイプの（濃度）レベルを測定するのに有用である。場合によっては、方法は、抗ＴＮＦα薬物療法、例として、インフリキシマブ（ＩＦＸ）を投与しているＡＤＡ陽性患者中の異なる抗薬物抗体（ＡＤＡ）アイソタイプ、例として、ＡＴＩ（すなわち、ＩＦＸに対する抗体；「ＨＡＣＡ」）の異なるアイソタイプを決定するのに有用である。他の場合には、方法は、抗ＴＮＦα薬物療法、例として、アダリムマブを投与しているＡＤＡ陽性患者中の異なるＡＤＡアイソタイプ、例として、ＡＴＡ（すなわち、アダリムマブに対する抗体；「ＨＡＨＡ」）の異なるアイソタイプを決定するのに有用である。抗体アイソタイプの非限定的な例として、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭが挙げられる。特定の実施形態では、本発明の方法は、特異的なＡＤＡアイソタイプ又はＡＤＡアイソタイプの特定の組合せの存在又はレベルに基づいて、抗ＴＮＦα薬物療法を投与している患者における異なる臨床転帰を関連付けるのを援助又は支援する。
【００８４】
［００８４］抗ＴＮＦα薬、又は抗体アイソタイプに特異的な抗Ｉｇ抗体を、多様な検出可能な基（複数可）を用いて標識することができる。特定の実施形態では、抗ＴＮＦα薬及び／又は抗Ｉｇアイソタイプ特異的抗体を、蛍光物質又は蛍光染料を用いて標識する。本明細書に記載する抗ＴＮＦα薬及び抗Ｉｇアイソタイプ特異的抗体に結合させることができる、標識として使用するのに適している蛍光物質の非限定的な例として、全体が、全ての目的で参照により本明細書に組み込まれるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅに列挙されているものが挙げられる（Ｒ．Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ−Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１０版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（２００５）を参照されたい）。そのような例示的な蛍光物質として、これらに限定されないが、アレクサフルオール（登録商標）染料、例として、アレクサフルオール（登録商標）３５０、アレクサフルオール（登録商標）４０５、アレクサフルオール（登録商標）４３０、アレクサフルオール（登録商標）４８８、アレクサフルオール（登録商標）５１４、アレクサフルオール（登録商標）５３２、アレクサフルオール（登録商標）５４６、アレクサフルオール（登録商標）５５５、アレクサフルオール（登録商標）５６８、アレクサフルオール（登録商標）５９４、アレクサフルオール（登録商標）６１０、アレクサフルオール（登録商標）６３３、アレクサフルオール（登録商標）６３５、アレクサフルオール（登録商標）６４７、アレクサフルオール（登録商標）６６０、アレクサフルオール（登録商標）６８０、アレクサフルオール（登録商標）７００、アレクサフルオール（登録商標）７５０及び／又はアレクサフルオール（登録商標）７９０、並びに他の蛍光物質が挙げられ、他の蛍光物質には、非限定的に、ダンシルクロリド（ＤＮＳ−Ｃｌ）、５−（ヨードアセトアミド）フルオロセイン（ｆｌｕｏｒｏｓｃｅｉｎ）（５−ＩＡＦ）、フルオロセイン（ｆｌｕｏｒｏｓｃｅｉｎ）５−イソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン５−（及び６−）イソチオシアナート（ＴＲＩＴＣ）、６−アクリロイル−２−ジメチルアミノナフタレン（アクリロダン）、７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３，−ジアゾール−４−イルクロリド（ＮＢＤ−Ｃｌ）、臭化エチジウム、ルシファーイエロー、５−カルボキシローダミン６Ｇ塩酸塩、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）（商標）スルホニルクロリド、ＢＯＤＩＰＹ（商標）、ナフタルアミン（ｎａｐｈｔｈａｌａｍｉｎｅ）スルホン酸（例えば、１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸（ＡＮＳ）、６−（ｐ−トルイジニル）ナフタレン−２−スルホン酸（ＴＮＳ）等）、アントロイル脂肪酸、ＤＰＨ、パリナリン酸、ＴＭＡ−ＤＰＨ、フルオレニル脂肪酸、フルオレセイン−ホスファチジルエタノールアミン、テキサスレッド−ホスファチジルエタノールアミン、ピレニル−ホファチジルコリン（ｐｈｏｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、フルオレニル−ホスフォチジルコリン（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、メロシアニン５４０、１−（３−スルホナトプロピル）−４−［β−［２［（ジ−ｎ−ブチルアミノ）−６ナフチル］ビニル］ピリジニウムベタイン（ナフチルスチリル）、３，３’ジプロピルチアジカルボシアニン（ｄｉＳ−Ｃ３−（５））、４−（ｐ−ジペンチルアミノスチリル）−１−メチルピリジニウム（ｄｉ−５−ＡＳＰ）、Ｃｙ−３ヨードアセトアミド、Ｃｙ−５−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｃｙ−７−イソチオシアナート、ローダミン８００、ＩＲ−１２５、チアゾールオレンジ、アズールＢ、ナイルブルー、フタロシアニンＡｌ、Ｏｘａｘｉｎｅ  １，４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、ＴＯＴＯ、アクリジンオレンジ、エチジウムホモダイマー、Ｎ（エトキシカルボニルメチル）−６−メトキシキノリニウム（ＭＱＡＥ）、Ｆｕｒａ−２、カルシウムグリーン、カルボキシＳＮＡＲＦ−６、ＢＡＰＴＡ、クマリン、植物性蛍光物質（ｐｈｙｔｏｆｌｕｏｒ）、コロネン、金属−配位子の錯体、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＲＳ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＤＹ６７６、ＤＹ６８０、ＤＹ６８２、ＤＹ７８０、及びそれらの混合物がある。追加の適切な蛍光物質として、酵素−補助因子、ランタニド、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、又はそれらの突然変異体及び派生体が挙げられる。１つの非限定的な例では、複数の抗Ｉｇアイソタイプ特異的抗体をそれぞれ、アレクサ−５３２を用いて標識し、抗ＴＮＦα薬を、アレクサ−４８８を用いて標識する。
【００８５】
［００８５］典型的には、蛍光基は、ポリメチン、フタロシアニン、シアニン、キサンテン、フルオレン、ローダミン、クマリン、フルオレセイン及びＢＯＤＩＰＹ（商標）を含む染料のカテゴリーから選択される蛍光物質である。
【００８６】
［００８６］一実施形態では、蛍光基が、約６５０〜約９００ｎｍの間の範囲において発光する近赤外（ＮＩＲ）蛍光物質である。近赤外蛍光技術の使用は、生物学的アッセイにおいて好都合である。その理由は、生体基質の自発蛍光に由来するバックグラウンドを実質的に排除する又は低下させるからである。近ＩＲ蛍光技術の別の利益は、散乱強度が波長の逆数の四乗に比例するので、励起源からの散乱光が大幅に低下することである。低いバックグラウンドの蛍光及び低い散乱から、高いシグナル対ノイズの比が得られ、この高い比は、極めて感度の高い検出に不可欠である。さらに、生物学的組織が、近ＩＲ領域（６５０ｎｍ〜９００ｎｍ）において光学的に透明なウィンドウであることも、ＮＩＲ蛍光を、光が生物学的構成成分を通って伝達することを必要とするｉｎ  ｖｉｖｏにおける画像法及び細胞内の検出に適用する場合の貴重な技術にする。この実施形態の態様内では、近赤外（ＮＩＲ）蛍光物質は、好ましくは、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＲＳ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００、アレクサフルオール（登録商標）６６０、アレクサフルオール（登録商標）６８０、アレクサフルオール（登録商標）７００、アレクサフルオール（登録商標）７５０、アレクサフルオール（登録商標）７９０、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＤＹ６７６、ＤＹ６８０、ＤＹ６８２及びＤＹ７８０からなる群から選択される。特定の実施形態では、近赤外基は、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００又はＤｙｎｏｍｉｃ  ＤＹ６７６である。
【００８７】
［００８７］蛍光標識化を、蛍光物質の化学反応性誘導体を使用して達成する。一般的な反応性基として、アミン反応性イソチオシアナート誘導体、例として、ＦＩＴＣ及びＴＲＩＴＣ（フルオレセイン及びローダミンの誘導体）、アミン反応性サクシニミジルエステル、例として、ＮＨＳ−フルオレセイン、並びにスルフヒドリル反応性マレイミド活性化フルオール、例として、フルオレセイン−５−マレイミドを含み、これらの誘導体のうちの多くが市販されている。これらの反応性染料のうちのいずれかが抗ＴＮＦα薬又は抗Ｉｇアイソタイプ特異的抗体と反応すると、蛍光物質と抗ＴＮＦα薬又は抗Ｉｇアイソタイプ特異的抗体との間で形成された安定な共有結合が得られる。
【００８８】
［００８８］特定の場合には、蛍光標識化反応に続いてしばしば、標識化標的分子から未反応の蛍光物質を全て除去することが必要になる。この除去はしばしば、蛍光物質と標識化タンパク質との間のサイズの差を生かして、サイズ排除クロマトグラフィーにより達成する。
【００８９】
［００８９］反応性蛍光染料は、多くの供給元から入手可能である。それらの色素は、標的分子内の種々の官能基につなぐために、異なる反応性基を有する状態で得ることができる。また、それらの色素は、標識化反応を実施するための全ての構成成分を含有する標識化キットとしても入手可能である。１つの特定の実施形態では、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のアレクサフルオール（登録商標）６４７Ｃ２マレイミド（Ｃａｔ．番号Ａ−２０３４７）を使用する。
【００９０】
［００９０］自己抗体アイソタイプに対する抗ＴＮＦα薬の、又は自己抗体アイソタイプに対する抗ＴＮＦα薬及び抗Ｉｇ抗体の特異的な免疫学的結合を、直接的又は間接的に検出することができる。直接的な標識は、抗体につなげた蛍光性又は発光性のタグ、金属、染料、放射性核種等を含む。特定の場合には、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）を用いて標識した抗ＴＮＦα薬又は抗Ｉｇ抗体を使用して、試料中の１つ又は複数のＡＤＡアイソタイプの存在又は濃度レベルを決定することができる。他の場合には、化学発光性の抗ＴＮＦα薬又は抗Ｉｇ抗体を使用する化学発光アッセイが、試料中のＡＤＡアイソタイプの敏感な、放射性によらない検出に適している。また、特定の場合には、蛍光色素を用いて標識した抗ＴＮＦα薬及び／又は抗Ｉｇ抗体も、試料中の１つ又は複数のＡＤＡアイソタイプの濃度レベルを決定するのに適している。蛍光色素の例として、非限定的に、アレクサフルオール（登録商標）染料、ＤＡＰＩ、フルオレセイン、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、Ｒ−フィコシアニン、Ｂ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッド及びリサミンが挙げられる。蛍光色素に連結させる二次抗体を商業的に得ることができる。非限定的な例として、ヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣが、Ｔａｇｏ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）から入手可能である。
【００９１】
［００９１］間接的な標識として、当技術分野でよく知られている種々の酵素、例として、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ等が挙げられる。西洋ワサビ−ペルオキシダーゼ検出系は、例えば、発色基質のテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と共に使用することができ、この検出系は、過酸化水素の存在下で可溶性の生成物をもたらし、この生成物は４５０ｎｍにおいて検出可能である。アルカリホスファターゼ検出系は、例えば、発色基質のリン酸ｐ−ニトロフェニルと共に使用することができ、この検出系は、４０５ｎｍにおいて容易に検出可能な可溶性の生成物をもたらす。同様に、β−ガラクトシダーゼ検出系は、発色基質のｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）と共に使用することができ、この検出系は、４１０ｎｍにおいて検出可能な可溶性の生成物をもたらす。ウレアーゼ検出系は、基質、例として、尿素−ブロモクレゾールパープル（Ｓｉｇｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）と共に使用することができる。酵素に連結させる有用な二次抗体を、いくつかの商業的供給元から得ることができ、例えば、ヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ−アルカリホスファターゼを、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ．）から購入することができる。
【００９２】
［００９２］例えば、発色基質からの色を検出するための分光光度計、放射線を検出するための放射線カウンター、例として、１２５Ｉの検出のためのガンマカウンター、又は特定の波長の光の存在下で蛍光を検出するための蛍光光度計を使用して直接的又は間接的な標識からのシグナルを分析することができる。酵素連結抗体の検出のために、分光光度計、例として、ＥＭＡＸマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ；Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）を使用して製造元の指示に従って、１つ又は複数のＡＤＡアイソタイプの量の定量分析を行うことができる。所望により、本発明のアッセイは、自動化しても又はロボットにより実施してもよく、複数の試料からのシグナルを同時に検出することができる。
【００９３】
［００９３］特定の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、本発明のアッセイにおいて使用する。ＳＥＣの基礎をなす原理は、異なるサイズの粒子が固定相を異なる速度で通って溶出する（ろ過される）ことである。こうした溶出の結果、粒子の溶液がサイズに基づいて分離される。全ての粒子が同時又はほぼ同時に充填されるならば、同じサイズの粒子は一緒に溶出する。サイズ排除カラムはそれぞれ、分離することができるある範囲の分子量を有する。排除限界は、こうした分離可能な範囲の上限の分子量と定義され、排除限界では、分子が大き過ぎて固定相中に捕捉されない。浸透限界は、分離の範囲の下限の分子量と定義され、浸透限界では、十分に小さなサイズの分子は、固定相のポア中を完全に貫通することができ、この分子質量未満の分子は全て、非常に小さいので単一のバンドとして溶出する。
【００９４】
［００９４］特定の実施形態では、溶出液を、一定体積又は画分として収集する。粒子のサイズが類似するほど、粒子が、同じ画分中にあり、別個には検出されない可能性が高まる。好ましい実施形態では、収集した画分を分光学的技法により調べて、溶出した粒子の濃度を決定する。典型的には、本発明に有用な、分光法による検出技法として、これらに限定されないが、蛍光光度法、屈折率（ＲＩ）及び紫外（ＵＶ）が挙げられる。特定の場合には、溶出体積は、分子の流体力学的体積の対数に関しておおよそ線形に減少する（すなわち、より重い部分が最初に出現する）。
【００９５】
［００９５］場合によっては、試料、例として、血清試料中に存在するＡＤＡアイソタイプの（濃度）レベルを、検量線、及び／又は１つ若しくは複数の対照と比較することができる。特定の場合には、標識化抗ＴＮＦα薬を、液相反応中で、既知の量の抗Ｉｇアイソタイプ特異的抗体と共にインキュベートして、検量線を作成することができる。
【００９６】
［００９６］特定の場合には、本発明の自己抗体アイソタイピングの方法は、近接性に基づき、したがって、標識化抗ＴＮＦα薬及び標識化抗Ｉｇアイソタイプ特異的抗体の両方の、自己抗体アイソタイプに対する近接性結合により発生するシグナルを利用する。特定の実施形態では、近接アッセイにより発生したシグナルは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）により検出することができる蛍光シグナルである。他の実施形態では、本明細書に記載するか又は当業者に知られている別の近接性に基づく方法により、シグナルを検出する。
【００９７】
［００９７］場合によっては、複数の、異なる抗体アイソタイプに特異的な標識化抗Ｉｇ抗体がそれぞれ、同じ標識を含む。他の場合には、複数の、異なる抗体アイソタイプに特異的な標識化抗Ｉｇ抗体がそれぞれ、異なる標識を含む。当業者であれば、抗体の特異的なクラス又はサブクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭのアイソタイプ、又はそれらのＩｇサブクラス、例として、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及び／若しくはＩｇＧ４）に結合する抗Ｉｇ抗体が、例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ａｂｃａｍ  ｐｌｃ等の供給元、及び他から市販されていることを理解するであろう。特定の場合には、抗Ｉｇ抗体は、特異的なＩｇサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）を検出する。特定の他の場合には、抗Ｉｇ抗体は、全てのＩｇサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）を検出する。例えば、（例えば、ヒトＩｇＡの両方のサブクラスを検出する、クローンＩＳ１１−８Ｅ１０に由来する）抗ＩｇＡ抗体、（例えば、ヒトＩｇＧアイソタイプの全てのサブクラスを検出する、クローンＩＳ１１−３Ｂ２．２．３に由来する）抗ＩｇＧ抗体、及び（例えば、ＩｇＭアイソタイプを検出する、クローンＰＪ２−２２Ｈ３に由来する）抗ＩｇＭ抗体を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨから得、本明細書に記載する方法及び当業者に知られている方法を使用して、それらの抗体に、検出可能な標識、例として、蛍光物質を結合させることによって標識することができる。場合によっては、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓキット、例として、アレクサフルオールタンパク質標識化キット及びアレクサフルオールモノクローナル標識化キット（これらは、アミン反応性アレクサフルオール色素（例えば、アレクサフルオールサクシニミジル（ＮＨＳ）エステル及び／又はアレクサフルオールテトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステル）を含む）を使用して、アレクサフルオール色素を抗体上の接近可能な一級アミン基に選択的に連結させることができる。
【００９８】
［００９８］用語「近接性」は、本明細書で使用する場合、抗ＴＮＦα薬が、抗Ｉｇアイソタイプ特異的抗体に対して、空間的に付近にあること又は近いことへの言及を含み、この場合、両方が、同じ自己抗体アイソタイプ（すなわち、抗薬物抗体アイソタイプ、例として、ＩｇＡ  ＡＴＩ）に結合する。特定の実施形態では、自己抗体アイソタイプに対する抗ＴＮＦα薬の結合が、同じ自己抗体アイソタイプに対する抗Ｉｇアイソタイプ特異的抗体の結合の付近の距離又はそうした結合に近い距離において生じる場合、検出可能なシグナルを発生させるのに十分である。いくつかの実施形態では、用語「近接性」は、標識化抗体が同じ自己抗体アイソタイプに結合する場合、検出可能なシグナルを発生させるのに十分である、標識化抗体間の距離を含む。特定の他の実施形態では、用語「近接性」は、検出可能なシグナルを発生させるのに十分である、同じ自己抗体アイソタイプに結合している抗体につながる検出可能な標識（例えば、蛍光標識）間の距離を含む。
【００９９】
［００９９］ＦＲＥＴは、２つの蛍光分子間のエネルギー移動機構を記載する。蛍光ドナーを、特異的な蛍光励起波長で励起すると、この励起状態が、長距離双極子間カップリング機構により、第２の分子、すなわち、アクセプターに非放射性に移動する。次いで、ドナーは、電子基底状態に戻る。例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．、２版（１９９９）を参照されたい。本発明の状況においては、抗ＴＮＦα薬（例えば、ＩＦＸ）を、第１の蛍光染料を含むドナーを用いて標識することができ、抗Ｉｇアイソタイプ特異的抗体（例えば、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＧ）を、第１の蛍光染料とは異なる励起及び放射のスペクトルを有する第２の蛍光染料を含むアクセプターを用いて標識することができる。検出可能な標識として使用するのに適している蛍光染料の非限定的な例を上記に記載し、それらとして、蛍光物質、例として、アレクサフルオール（登録商標）染料（例えば、アレクサフルオール（登録商標）３５０、アレクサフルオール（登録商標）４０５、アレクサフルオール（登録商標）４３０、アレクサフルオール（登録商標）４８８、アレクサフルオール（登録商標）５１４、アレクサフルオール（登録商標）５３２、アレクサフルオール（登録商標）５４６、アレクサフルオール（登録商標）５５５、アレクサフルオール（登録商標）５６８、アレクサフルオール（登録商標）５９４、アレクサフルオール（登録商標）６１０、アレクサフルオール（登録商標）６３３、アレクサフルオール（登録商標）６３５、アレクサフルオール（登録商標）６４７、アレクサフルオール（登録商標）６６０、アレクサフルオール（登録商標）６８０、アレクサフルオール（登録商標）７００、アレクサフルオール（登録商標）７５０及び／又はアレクサフルオール（登録商標）７９０）、並びに他の蛍光物質、例えば、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッド、ＴＲＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７等、それらの誘導体、並びにそれらの組合せが挙げられる。
【０１００】
［０１００］いくつかの実施形態では、自己抗体アイソタイプ（すなわち、抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体のアイソタイプ）の存在（若しくは不在）又はレベルについて取り調べようとする試料、例として、血清試料を、標識化抗ＴＮＦα薬及び標識化抗Ｉｇアイソタイプ特異的抗体の両方と共にインキュベートする。特定の抗Ｉｇアイソタイプ特異的抗体（例えば、抗ＩｇＡ）により検出される自己抗体アイソタイプ（例えば、ＩｇＡ  ＡＤＡ）が試料中に存在しない場合には、ドナーの発光を、ドナーの励起時に検出する。他方、特定の抗Ｉｇアイソタイプ特異的抗体（例えば、抗ＩｇＡ）により検出される自己抗体アイソタイプ（例えば、ＩｇＡ  ＡＤＡ）が試料中に存在する場合には、標識化抗ＴＮＦα薬及び特定の標識化抗Ｉｇアイソタイプ特異的抗体の両方と、自己抗体アイソタイプ（例えば、ＩｇＡ  ＡＴＩ）との相互作用に起因して、ドナー及びアクセプターの蛍光物質が近接するようになる（例えば、互いに約１〜約３００ｎｍ又は約１〜約２００ｎｍ、例えば、約１、５、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００ｎｍ又はそれらの任意の範囲等、あるいは約１〜約１０ｎｍ、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０ｎｍ又はそれらの任意の範囲にある）。ドナー蛍光物質からアクセプター蛍光物質への分子間ＦＲＥＴの結果、アクセプターの発光が圧倒的に観察されるようになる。例えば、抗ＴＮＦα薬上の、ドナー蛍光物質としてのアレクサ−４８８が、４８０ｎｍにおいて励起されると、一重項酸素分子の形成が誘発され、これらの分子は、チオキセン誘導体と反応して、化学発光を発生させ、この発光に続いて、抗Ｉｇアイソタイプ特異的抗体上のアクセプター蛍光物質のアレクサ−５３２が励起され、５７５ｎｍにおいて発光する。
【０１０１】
［０１０１］実施例２９は、ＦＲＥＴを使用して、少なくとも１、２、３、４又は５つ以上のＡＴＩアイソタイプ、例えば、ＩｇＡ  ＡＴＩ、ＩｇＤ  ＡＴＩ、ＩｇＥ  ＡＴＩ、ＩｇＧ  ＡＴＩ及び／又はＩｇＭ  ＡＴＩのアイソタイプ等の存在（若しくは不在）又はレベルを決定するための本発明の例示的な近接性に基づくアイソタイピングアッセイを記載する。非限定的な例として、第１の蛍光物質（「Ｆ１」）を用いて標識したＩＦＸ及び第２の蛍光物質（「Ｆ２」）を用いて標識した抗ＩｇＡ抗体を、１つ又は複数のＡＴＩアイソタイプ、例として、ＩｇＡ  ＡＴＩを含有する試料、例として、血清試料と共にインキュベートする。いくつかの実施形態では、Ｆ１及びＦ２の両方の蛍光物質が密接に近接している場合のみに、Ｆ２が、Ｆ１により励起され、Ｆ１−ＩＦＸとＦ２−抗ＩｇＡとＩｇＡ  ＡＴＩとの三成分複合体の存在及び／又はレベルが、試料中に存在するＩｇＡ  ＡＴＩアイソタイプの存在及び／又はレベルの指標となる。
【０１０２】
［０１０２］他の実施形態では、自己抗体アイソタイピング近接アッセイにより発生するシグナルは、電気泳動の技法、例として、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）を使用して検出することができる蛍光シグナルである。ＣＥ分析は一般に、高い（キロボルトのレベルの）分離電圧の存在下の小さな直径の石英製キャピラリーの内部で生じ、分離時間は数分である。本発明の状況においては、抗ＴＮＦα薬（例えば、ＩＦＸ）を、光活性化可能な酵素的ハサミを用いて標識することができ、抗Ｉｇアイソタイプ特異的抗体（例えば、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＤ、抗ＩｇＥ、抗ＩｇＧ及び／又は抗ＩｇＭ）を、電気泳動タグレポーターを用いて標識することができる。光活性化可能な酵素的ハサミ及び小型の蛍光レポーター分子のｅＴａｇ（商標）ファミリー等の電気泳動タグレポーターの非限定的な例が、米国特許第６，６７３，５５０号に記載されている。自己抗体アイソタイプ（例えば、ＩｇＡ  ＡＴＩ）に対する標識化抗ＴＮＦα薬の結合が、同じ自己抗体アイソタイプに対する標識化抗Ｉｇアイソタイプ特異的抗体の結合に近接している（例えば、互いに約１〜約３００ｎｍ又は約１〜約２００ｎｍ、例えば、約１、５、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００ｎｍ又はそれらの任意の範囲等、あるいは約１〜約１０ｎｍ、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０ｎｍ又はそれらの任意の範囲にある）場合に、光活性化可能な酵素的ハサミによる電気泳動タグレポーターの切断が誘発される。光活性による切断に続いて、放出された電気泳動タグレポーター分子を、例えば、Ｃｈａｎ−Ｈｕｉら、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎ．、１１１：１６２〜１７４頁（２００４）の記載に従って、ＣＥ分離により分析する。それに代わって、抗ＴＮＦα薬を、電気泳動タグレポーターを用いて標識することができ、抗Ｉｇアイソタイプ特異的抗体を、光活性化可能な酵素的ハサミを用いて標識することもできる。いくつかの実施形態では、複数の電気泳動タグレポーターを、複数の明確に異なる抗Ｉｇアイソタイプ特異的抗体につなぎ、マルチプレックスアッセイにおいて使用して、複数の、目的の自己抗体アイソタイプの存在（若しくは不在）又はレベルを決定することができる。
【０１０３】
［０１０３］さらに他の実施形態では、自己抗体アイソタイピング近接アッセイにより発生するシグナルは、核酸増幅の技法、例として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して検出することができるＤＮＡ増幅シグナルである。核酸の増幅のためのＰＣＲの使用は、当技術分野でよく知られており、例えば、Ｍｕｌｌｉｓら、Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ（１９９４）；及びＩｎｎｉｓら、ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、初版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）に記載されている。本発明の状況においては、抗ＴＮＦα薬（例えば、ＩＦＸ）を、第１のオリゴヌクレオチド伸長部を用いて標識することができ、抗Ｉｇアイソタイプ特異的抗体（例えば、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＤ、抗ＩｇＥ、抗ＩｇＧ及び／又は抗ＩｇＭ）を、第２のオリゴヌクレオチド伸長部を用いて標識することができる。特定の抗Ｉｇアイソタイプ特異的抗体（例えば、抗ＩｇＡ）により検出される自己抗体アイソタイプ（例えば、ＩｇＡ  ＡＴＩ）が試料中に存在しない場合には、接続部のオリゴヌクレオチドが、それぞれのオリゴヌクレオチド伸長部に独立にハイブリダイズし、この場合は、ライゲーションを促さない。他方、特定の抗Ｉｇアイソタイプ特異的抗体（例えば、抗ＩｇＡ）により検出される自己抗体アイソタイプ（例えば、ＩｇＡ  ＡＴＩ）が試料中に存在する場合には、自己抗体アイソタイプ（例えば、ＩｇＡ  ＡＴＩ）に対する標識化抗ＴＮＦα薬の結合が、同じ自己抗体アイソタイプに対する標識化抗Ｉｇアイソタイプ特異的抗体の結合に近接し（例えば、互いに約１〜約３００ｎｍ又は約１〜約２００ｎｍ、例えば、約１、５、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００ｎｍ又はそれらの任意の範囲等、あるいは約１〜約１０ｎｍ、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０ｎｍ又はそれらの任意の範囲にある）、接続部のオリゴヌクレオチドが、両方のオリゴヌクレオチド伸長部に同時にハイブリダイズするのが可能になり、それによりＤＮＡリガーゼによるオリゴヌクレオチド伸長部のライゲーションが誘発される。当業者であれば、抗Ｉｇアイソタイプ特異的抗体に対する抗ＴＮＦα薬の近接性は、オリゴヌクレオチド伸長部の長さに応じて変化し得ることを理解するであろう。したがって、反応中に、以前には存在しなかったＤＮＡ配列の新しい種が生み出され、こうしたＤＮＡ配列を、標準的なＤＮＡ増幅の技法、例として、ＰＣＲを使用して増幅することができる。オリゴヌクレオチド伸長部及び接続部のオリゴヌクレオチドは典型的には、当技術分野で知られている任意の方法により化学的に合成され、独立に、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５又は６０ヌクレオチド長のヌクレオチド配列を含む。
【０１０４】
［０１０４］さらなる実施形態では、自己抗体アイソタイピング近接アッセイにより発生するシグナルは、シグナルの増幅、例として、チラミドシグナルの増幅を使用して検出することができる化学発光シグナル又は蛍光シグナルである。本発明の状況においては、抗ＴＮＦα薬（例えば、ＩＦＸ）を、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）、又は分子酸素（Ｏ２）が電子アクセプターとして関与する酸化／還元反応を触媒する任意の他の酵素を用いて標識することができる。抗Ｉｇアイソタイプ特異的抗体（例えば、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＤ、抗ＩｇＥ、抗ＩｇＧ及び／又は抗ＩｇＭ）を、ペルオキシダーゼ、例として、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用いて、例えば、直接的に、又は結合対メンバー、例として、ビオチン／ストレプトアビジンを介して間接的に標識することができる。ペルオキシダーゼの他の例として、これらに限定されないが、カタラーゼ、クロロペルオキシダーゼ、チトクロームｃペルオキシダーゼ、好酸球ペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、甲状腺ペルオキシダーゼ、デヨードナーゼ等が挙げられる。ＧＯが、基質、例として、グルコースと接触すると、ＧＯにより、酸化剤（すなわち、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２））が発生する。特定の抗Ｉｇアイソタイプ特異的抗体（例えば、抗ＩｇＡ）により検出される自己抗体アイソタイプ（例えば、ＩｇＡ  ＡＴＩ）が試料中に存在する場合には、自己抗体アイソタイプ（例えば、ＩｇＡ  ＡＴＩ）に対する標識化抗ＴＮＦα薬の結合が、同じ自己抗体アイソタイプに対する標識化抗Ｉｇアイソタイプ特異的抗体の結合に近接し（例えば、互いに約１〜約３００ｎｍ又は約１〜約２００ｎｍ、例えば、約１、５、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００ｎｍ又はそれらの任意の範囲等、あるいは約１〜約１０ｎｍ、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０ｎｍ又はそれらの任意の範囲にある）、ＧＯにより発生したＨ２Ｏ２が、ＨＲＰに向かい、ＨＲＰと複合体を形成して、ＨＲＰ−Ｈ２Ｏ２の複合体を形成するのが可能になり、この複合体により、化学発光基質（例えば、ルミノール、イソルミノール）又は蛍光発光基質（例えば、チラミド、ビオチン−チラミド、ホモバニリン酸、酢酸４−ヒドロキシフェニル）の存在下で、増幅されたシグナルが発生する。
【０１０５】
［０１０５］近接アッセイにおいてＧＯ及びＨＲＰを使用する方法は、例えば、国際公開第２００８／０３６８０２号パンフレットに記載されており、その全体の開示が、全ての目的で参照により本明細書に組み込まれる。ビオチン−チラミドを、蛍光発光基質として使用する場合には、ＨＲＰ−Ｈ２Ｏ２の複合体が、チラミドを酸化して、反応性のチラミドラジカルを発生させ、このラジカルは、付近の求核性残基に共有結合する。活性化されたチラミドは、直接検出するか、又はシグナル検出試薬、例えば、ストレプトアビジン標識化蛍光物質、若しくはストレプトアビジン標識化ペルオキシダーゼと発色性試薬との組合せ等を添加して検出する。本発明において使用するのに適している蛍光物質の例として、これらに限定されないが、アレクサフルオール（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ）（登録商標）色素（例えば、アレクサフルオール（登録商標）３５０、アレクサフルオール（登録商標）４０５、アレクサフルオール（登録商標）４３０、アレクサフルオール（登録商標）４８８、アレクサフルオール（登録商標）５１４、アレクサフルオール（登録商標）５３２、アレクサフルオール（登録商標）５４６、アレクサフルオール（登録商標）５５５、アレクサフルオール（登録商標）５６８、アレクサフルオール（登録商標）５９４、アレクサフルオール（登録商標）６１０、アレクサフルオール（登録商標）６３３、アレクサフルオール（登録商標）６３５、アレクサフルオール（登録商標）６４７、アレクサフルオール（登録商標）６６０、アレクサフルオール（登録商標）６８０、アレクサフルオール（登録商標）７００、アレクサフルオール（登録商標）７５０及び／又はアレクサフルオール（登録商標）７９０）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、オレゴングリーン（Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ）（商標）、ローダミン、テキサスレッド、テトラローダミンイソチオシナート（ｉｓｏｔｈｉｏｃｙｎａｔｅ）（ＴＲＩＴＣ）、ＣｙＤｙｅ（商標）フルオール（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５）等を含めた、本明細書に記載する蛍光物質のうちのいずれかが挙げられる。ストレプトアビジン標識を、当技術分野でよく知られている方法を使用して、蛍光物質又はペルオキシダーゼに直接的又は間接的にカップリングすることができる。発色性試薬の非限定的な例として、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、４−クロロ−１−ナフトール（４ＣＮ）、及び／又はポルフィリノーゲンが挙げられる。
【０１０６】
［０１０６］自己抗体アイソタイピングのための本発明のアッセイの方法において使用するのに適している追加の近接性に基づく技法が、国際公開第２００８／０３６８０２号パンフレットに記載されており、その全体の開示が、全ての目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０７】
［０１０７］抗ＴＮＦ抗体、並びに抗薬物抗体、例として、ＨＡＣＡ及びＨＡＨＡを検出するための方法が、国際公開第２０１１／０５６５９０号パンフレットにさらに記載されており、その全体の開示が、全ての目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０８】
［０１０８］別の態様では、本発明は、ＴＮＦα媒介型の疾患又は障害の治療のための療法のコースを投与している対象において、療法を最適化するための方法、及び／又は毒性を低下させるための方法であって、
（ａ）対象から得られた試料を分析して、試料中の１つ又は複数のマーカーの存在、レベル又は遺伝子型を決定するステップと、
（ｂ）統計学的アルゴリズムを、ステップ（ａ）において決定した１つ又は複数のマーカーの存在、レベル又は遺伝子型に適用するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）において適用した統計学的アルゴリズムに基づいて、対象のための療法のコースの今後の用量を決定するステップ、又は異なる療法のコースを対象に投与すべきであるかどうかを決定するステップと
を含む方法を提供する。
【０１０９】
［０１０９］いくつかの実施形態では、療法のコースは、抗ＴＮＦα薬、例として、抗ＴＮＦα抗体を含む。特定の場合には、抗ＴＮＦα抗体は、レミケード（商標）（インフリキシマブ）、エンブレル（商標）（エタネルセプト）、ヒュミラ（商標）（アダリムマブ）、シムジア（登録商標）（セルトリズマブペゴル）、及びそれらの組合せからなる群から選択される。
【０１１０】
［０１１０］特定の実施形態では、１つ又は複数（例えば、複数）のマーカーは、抗ＴＮＦα薬（例えば、抗ＴＮＦα抗体）、抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体、例として、抗ＴＮＦα抗体（例えば、ＨＡＣＡ、ＨＡＨＡ、ＨＡＭＡ及び／若しくはそれらのアイソタイプ）、サイトカイン、遺伝学的マーカー、又はそれらの組合せを含む。特定の場合には、サイトカインは、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、及びそれらの組合せからなる群から選択されるメンバーである。特定の他の場合には、遺伝学的マーカーは、炎症経路遺伝子中の突然変異である。特定の実施形態では、遺伝学的マーカーは、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５、ＡＴＧ１６Ｌ１、ＩＬ２３Ｒ、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子、サイトカイン遺伝子、ＤＬＧ５、ＯＣＴＮ、及びそれらの組合せからなる群から選択される遺伝子中の突然変異である。
【０１１１】
［０１１１］他の実施形態では、療法を最適化するための方法、及び／又は毒性を低下させるための方法のステップ（ａ）は、前記試料中の２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個以上のマーカーの存在、レベル又は遺伝子型を決定するサブステップを含む。特定の実施形態では、試料は、血清、血漿、全血及び便からなる群から選択される。
【０１１２】
［０１１２］さらに他の実施形態では、統計学的アルゴリズムは、統計学的学習分類子システムを含む。特定の場合には、統計学的学習分類子システムは、ランダムフォレスト、分類−回帰ツリー（ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｒｅｅ）、ブーステッドツリー（ｂｏｏｓｔｅｄ  ｔｒｅｅ）、神経ネットワーク、サポートベクターマシン、一般的な、カイ二乗に基づく自動相互作用検出モデル、相互作用ツリー、多適応的回帰スプライン（ｍｕｌｔｉａｄａｐｔｉｖｅ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｐｌｉｎｅ）、機械学習分類子、及びそれらの組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、統計学的アルゴリズムは、単一の統計学的学習分類子システムを含む。他の実施形態では、統計学的アルゴリズムは、少なくとも２つの統計学的学習分類子システムの組合せを含む。場合によっては、少なくとも２つの統計学的学習分類子システムを並行して適用する。
【０１１３】
［０１１３］いくつかの実施形態では、療法を最適化するための方法、及び／又は毒性を低下させるための方法は、ステップ（ｃ）の前記決定から得られた結果を臨床医に送るステップをさらに含む。他の実施形態では、療法を最適化するための方法、及び／又は毒性を低下させるための方法のステップ（ｂ）は、統計学的アルゴリズムを、療法のコースの間のより早期に決定した１つ又は複数のマーカーの存在、レベル又は遺伝子型に適用するサブステップをさらに含む。
【０１１４】
［０１１４］さらなる実施形態では、療法のコースの今後の用量を、ステップ（ｂ）において適用した統計学的アルゴリズムに基づいて増加させる、減少させる、又は維持する。特定の場合には、異なる療法のコースは、異なる抗ＴＮＦα薬（例えば、抗ＴＮＦα抗体）を含む。他の場合には、異なる療法のコースは、現在の療法のコースを、免疫抑制剤と併せて含む。
【０１１５】
［０１１５］いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦα薬（例えば、抗ＴＮＦα抗体）を、
（ａ）標識化ＴＮＦαを試料と接触させて、抗ＴＮＦα薬と標識化複合体を形成させるステップと、
（ｂ）標識化複合体をサイズ排除クロマトグラフィーに供して、標識化複合体を分離するステップと、
（ｃ）標識化複合体を検出し、それにより、抗ＴＮＦα薬を検出するステップと
を含むアッセイを用いて検出する。
【０１１６】
［０１１６］特定の場合には、抗ＴＮＦα薬（例えば、抗ＴＮＦα抗体）は、レミケード（商標）（インフリキシマブ）、エンブレル（商標）（エタネルセプト）、ヒュミラ（商標）（アダリムマブ）、シムジア（登録商標）（セルトリズマブペゴル）、及びそれらの組合せからなる群から選択されるメンバーである。場合によっては、標識化ＴＮＦαは、蛍光物質標識化ＴＮＦαである。他の場合には、検出される抗ＴＮＦα薬（例えば、抗ＴＮＦα抗体）を定量化する。いくつかの実施形態では、最初に、標識化複合体が溶出し、続いて、遊離の標識化ＴＮＦαが溶出する。他の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーは、サイズ排除−高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）である。
【０１１７】
［０１１７］他の実施形態では、抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体（例えば、抗ＴＮＦα抗体）を、
（ａ）標識化抗ＴＮＦα薬を試料と接触させて、自己抗体と標識化複合体を形成させるステップと、
（ｂ）標識化複合体をサイズ排除クロマトグラフィーに供して、標識化複合体を分離するステップと、
（ｃ）標識化複合体を検出し、それにより、自己抗体を検出するステップと
を含むアッセイを用いて検出する。
【０１１８】
［０１１８］特定の場合には、自己抗体は、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）、ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）、ヒト抗ヒト化抗体（ＨＡＨＡ）、及びそれらの組合せからなる群から選択される。特定の他の場合には、標識化抗ＴＮＦα薬（例えば、抗ＴＮＦα抗体）は、レミケード（商標）（インフリキシマブ）、エンブレル（商標）（エタネルセプト）、ヒュミラ（商標）（アダリムマブ）、シムジア（登録商標）（セルトリズマブペゴル）、及びそれらの組合せからなる群から選択される。
【０１１９】
［０１１９］いくつかの実施形態では、標識化抗ＴＮＦα薬（例えば、抗ＴＮＦα抗体）は、蛍光物質標識化抗ＴＮＦα薬（例えば、抗ＴＮＦα抗体）である。他の実施形態では、検出される自己抗体を定量化する。さらなる実施形態では、最初に、標識化複合体が溶出し、続いて、遊離の標識化抗ＴＮＦα薬（例えば、抗ＴＮＦα抗体）が溶出する。特定の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーは、サイズ排除−高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）である。
【０１２０】
［０１２０］特定の実施形態では、抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体（例えば、抗ＴＮＦα抗体）を、抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の少なくとも１つのアイソタイプ（例えば、複数のアイソタイプ）の存在（若しくは不在）又はレベルを検出するための、本明細書に記載するアッセイのうちのいずれかを用いて検出する。
【０１２１】
［０１２１］他の実施形態では、国際公開第２０１１／０５６５９０号パンフレット（その全体の開示が、全ての目的で参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている、抗ＴＮＦα薬（例えば、抗ＴＮＦα抗体）、及び抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体（例えば、ＨＡＣＡ、ＨＡＨＡ、ＨＡＭＡ等）を検出するためのアッセイの方法を、療法を最適化するため及び／又は毒性を低下させるための、本明細書に記載する方法において使用することができる。
【０１２２】
［０１２２］特定の実施形態では、本発明の方法は、例えば、抗ＴＮＦ薬の今後の用量を調節若しくは改変する（例えば、増加若しくは減少させる）時期若しくは方法を決定すること、抗ＴＮＦ薬を、（例えば、増加させた、減少させた、若しくは同じ用量で）、１つ若しくは複数の免疫抑制剤、例として、メトトレキサート（ＭＴＸ）若しくはアザチオプリン（ＡＺＡ）と組み合わせる時期若しくは方法を決定すること、及び／又は現在の療法のコースを変化させる（例えば、異なる抗ＴＮＦ薬に切り換える）時期又は方法を決定することによって、抗ＴＮＦ薬物療法を投与している患者ための治療の決定を導くのに有用な情報を提供する。したがって、本発明は、患者の免疫状態を決定することによって、患者の管理を援助又は支援する場合に有用性を見出す。
【０１２３】
［０１２３］他の実施形態では、本明細書に記載するアッセイの方法を使用して、自己免疫障害（例えば、関節リウマチ、クローン病等）を有する対象における抗ＴＮＦ薬、とりわけ、抗ＴＮＦα抗体に対する許容性（例えば、毒性）を予測することができる。この方法では、対象を、１つ又は複数のＡＤＡアイソタイプの存在（若しくは不在）又はレベルについてアッセイすることによって、対象が抗ＴＮＦ薬物療法を許容する（例えば、副作用、例として、抗ＴＮＦ薬に対する免疫応答を発生させることも経験することもない）かどうかを予測することが可能になる。
【０１２４】
［０１２４］さらに他の実施形態では、本明細書に記載するアッセイの方法を使用して、自己免疫障害を有する対象において、自己免疫障害をモニターすることができ、これらの方法は、対象を、１つ又は複数のＡＤＡアイソタイプの存在（若しくは不在）又はレベルについて経時的にアッセイするステップを含む。この方法では、対象が抗ＴＮＦ薬物療法を許容するかどうかを所与の期間にわたりモニターすることが可能である。
【０１２５】
ＩＶ．統計学的解析
［０１２５］いくつかの態様では、本発明は、統計学的アルゴリズムを、１つ又は複数（例えば、２、３、４、５、６又は７つ以上の組合せ）の生化学的マーカー、血清学的マーカー及び／又は遺伝学的マーカーに適用することによって、抗ＴＮＦ薬物療法を最適化するための方法、抗ＴＮＦ薬物療法と関連がある毒性を低下させるための方法、及び／又は抗ＴＮＦ薬による治療の有効性をモニターするための方法を提供する。特定の実施形態では、抗ＴＮＦ薬物療法を投与している患者のための治療の決定を導くために、変位値解析を、１つ又は複数のマーカーの存在、レベル及び／又は遺伝子型に適用する。他の実施形態では、抗ＴＮＦ薬物療法を投与している患者のための治療の決定を導くために、より多くの統計学的学習分類子システムの１つ又は２つの組合せを、１つ又は複数のマーカーの存在、レベル及び／又は遺伝子型に適用する。本発明の方法の統計学的解析は、抗ＴＮＦ薬の今後の用量を調節若しくは改変する（例えば、増加若しくは減少させる）時期若しくは方法、抗ＴＮＦ薬を、（例えば、増加させた、減少させた、若しくは同じ用量で）、１つ若しくは複数の免疫抑制剤、例として、メトトレキサート（ＭＴＸ）若しくはアザチオプリン（ＡＺＡ）と組み合わせる時期若しくは方法、及び／又は現在の療法のコースを変化させる（例えば、異なる抗ＴＮＦ薬に切り換える）時期若しくは方法を決定するために、感度、特異性、陰性予測値、陽性予測値及び／又は全体的な精度を好都合に改善する。
【０１２６】
［０１２６］用語「統計学的解析」又は「統計学的アルゴリズム」又は「統計学的プロセス」は、変数間の関係を決定するために使用する多様な統計学的な方法及びモデルをいずれも含む。本発明において、変数は、少なくとも１つの、目的のマーカーの存在、レベル又は遺伝子型である。任意の数のマーカーを、本明細書に記載する統計学的解析を使用して解析することができる。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５又は６０個以上のマーカーの存在又はレベルを、統計学的解析に含めることができる。一実施形態では、ロジスティック回帰を使用する。別の実施形態では、線形回帰を使用する。特定の好ましい実施形態では、本発明の統計学的解析は、例えば、所与の集団内の変数としての１つ又は複数のマーカーの変位値測定を含む。変位値は、データサンプルを、（可能な限り）等しい数の観察結果を含有する群に分割する一連の「切断点」である。例えば、四分位数は、データサンプルを、（可能な限り）等しい数の観察結果を含有する４つの群に分割する値である。下位四分位点は、順序付けられたデータセットを通して下から４分の１のデータ値であり、上位四分位点は、順序付けられたデータセットを通して上から４分の１のデータ値である。五分位数は、データサンプルを、（可能な限り）等しい数の観察結果を含有する５つの群に分割する値である。また、本発明は、マーカーレベルのパーセンタイル範囲（例えば、三分位数、四分位数、五分位数等）又は累計指数（例えば、四分位数の和のスコア（ＱＳＳ）を得るためのマーカーレベルの四分位数の和等）を、統計学的解析における変数として（連続的な変数と全く同様に）使用することを含むこともできる。
【０１２７】
［０１２７］特定の実施形態では、本発明は、１つ又は複数の、目的のマーカーの存在、レベル（例えば、大きさ）及び／又は遺伝子型を、四分位数解析を使用して検出又は決定することを含む。このタイプの統計学的解析では、目的のマーカーのレベルを、参照データベースの試料に関して、第１の四分位数（＜２５％）、第２の四分位数（２５〜５０％）、第３の四分位数（５１％〜＜７５％）又は第４の四分位数（７５〜１００％）中にあると定義する。これらの四分位数にそれぞれ、１、２、３及び４の四分位数スコアを割り当てることができる。特定の場合には、試料中に検出されないマーカーに、０又は１の四分位数スコアを割り当て、一方、試料中に検出される（例えば、存在する）マーカー（例えば、試料が、マーカーについて陽性である）に、４の四分位数スコアを割り当てる。いくつかの実施形態では、四分位数１は、最も低いマーカーレベルを有する試料を示し、一方、四分位数４は、最も高いマーカーレベルを有する試料を示す。他の実施形態では、四分位数１は、特定のマーカー遺伝子型（例えば、野生型対立遺伝子）を有する試料を示し、一方、四分位数４は、別の特定のマーカー遺伝子型（例えば、対立遺伝子変異体）を有する試料を示す。参照データベースの試料は、ＴＮＦα媒介型の疾患又は障害、例えば、ＩＢＤ等を有する患者の大きなスペクトルを含むことができる。そのようなデータベースから、四分位数のカットオフを確立することができる。本発明において使用するのに適している四分位数解析の非限定的な例が、例えば、Ｍｏｗら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１２６：４１４〜２４頁（２００４）に記載されている。
【０１２８】
［０１２８］いくつかの実施形態では、本発明の統計学的解析は、１つ又は複数の統計学的学習分類子システムを含む。本明細書で使用する場合、用語「統計学的学習分類子システム」は、複雑なデータセット（例えば、目的のマーカーのパネル）に適応し、そのようなデータセットに基づいて決定を行うことが可能である機械学習アルゴリズムの技法を含む。いくつかの実施形態では、単一の統計学的学習分類子システム、例として、決定／分類ツリー（例えば、ランダムフォレスト（ＲＦ）又は分類−回帰ツリー（Ｃ＆ＲＴ））を使用する。他の実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個以上の統計学的学習分類子システムの組合せを、好ましくは、並行して使用する。統計学的学習分類子システムの例として、これらに限定されないが、誘導性の学習（例えば、決定／分類ツリー、例として、ランダムフォレスト、分類−回帰ツリー（Ｃ＆ＲＴ）、ブーステッドツリー等）、確率的で近似的に正しい（Ｐｒｏｂａｂｌｙ  Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ  Ｃｏｒｒｅｃｔ）（ＰＡＣ）学習、コネクショニスト学習（ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｉｓｔ  ｌｅａｒｎｉｎｇ）（例えば、ニューラルネットワーク（ＮＮ）、人工神経ネットワーク（ＡＮＮ）、ニューロファジィネットワーク（ＮＦＮ）、ネットワーク構造、多層パーセプトロン等のパーセプトロン、多層フィードフォワードネットワーク、ニューラルネットワークの応用、信念ネットワークにおけるベイズ学習等）、強化学習（例えば、既知の環境における受動的学習、例として、ナイーブ学習、適応動的学習及び時間差学習、未知の環境における受動的学習、未知の環境における能動的学習、行動価値関数の学習（ｌｅａｒｎｉｎｇ  ａｃｔｉｏｎ−ｖａｌｕｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）、強化学習の応用等）を使用するもの、並びに遺伝子アルゴリズム及び進化的プログラミングが挙げられる。他の統計学的学習分類子システムには、サポートベクターマシン（例えば、カーネル法）、多変量適応的回帰スプライン（ＭＡＲＳ）、レーベンバーグ−マーカートアルゴリズム、ガウス−ニュートンアルゴリズム、ガウス混合、傾斜降下アルゴリズム、及び学習ベクトル量子化（ＬＶＱ）がある。
【０１２９】
［０１２９］ランダムフォレストは、Ｌｅｏ  Ｂｒｅｉｍａｎ及びＡｄｅｌｅ  Ｃｕｔｌｅｒが開発したアルゴリズムを使用して構築される統計学的学習分類子システムである。ランダムフォレストは、多数の個別の決定ツリーを使用し、個別のツリーにより決定されたクラスのモード（すなわち、最も頻繁に出現するモード）を選ぶことによってクラスを決める。ランダムフォレスト解析は、例えば、Ｓａｌｆｏｒｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手可能なＲａｎｄｏｍＦｏｒｅｓｔｓソフトウエアを使用して実施することができる。ランダムフォレストの記載については、例えば、Ｂｒｅｉｍａｎ、Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ、４５：５〜３２頁（２００１）；及びｈｔｔｐ：／／ｓｔａｔ−ｗｗｗ．ｂｅｒｋｅｌｅｙ．ｅｄｕ／ｕｓｅｒｓ／ｂｒｅｉｍａｎ／ＲａｎｄｏｍＦｏｒｅｓｔｓ／ｃｃ＿ｈｏｍｅ．ｈｔｍを参照されたい。
【０１３０】
［０１３０］分類−回帰ツリーは、古典的な回帰モデルの適合のコンピュータを駆使した代替物を提供し、典型的には、１つ又は複数の予測因子に基づいて、断定的又は連続的な、目的の応答について、最良のモデルを決定するために使用される。分類−回帰ツリー解析は、例えば、Ｓａｌｆｏｒｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なＣ＆ＲＴソフトウエア又はＳｔａｔＳｏｆｔ，Ｉｎｃ．（Ｔｕｌｓａ、ＯＫ）から入手可能なＳｔａｔｉｓｔｉｃａデータ解析ソフトウエアを使用して実施することができる。分類−回帰ツリーの記載は、例えば、Ｂｒｅｉｍａｎら、「Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｒｅｅｓ」、Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；及びＳｔｅｉｎｂｅｒｇら、「ＣＡＲＴ：Ｔｒｅｅ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  Ｎｏｎ−Ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｓａｌｆｏｒｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９５）に見出される。
【０１３１】
［０１３１］ニューラルネットワークは、計算に対するコネクショニストアプローチに基づいて、情報処理のための数学的モデル又は計算モデルを使用する、人工ニューロンの相互接続した群である。典型的には、ニューラルネットワークは、ネットワークを通って流れる外部又は内部の情報に基づいて構造を変化させる適応システムである。ニューラルネットワークの具体例として、フィードフォワードニューラルネットワーク、例として、パーセプトロン、単一層パーセプトロン、多層パーセプトロン、逆伝搬ネットワーク、アダラインネットワーク、マダリンネットワーク、ラーンマトリックス（Ｌｅａｒｎｍａｔｒｉｘ）ネットワーク、放射基底関数（ＲＢＦ）ネットワーク、及び自己組織化マップ又はコホネン自己組織化ネットワーク；再帰型ニューラルネットワーク、例として、単純再帰型ネットワーク及びホップフィールドネットワーク；確率的ニューラルネットワーク、例として、ボルツマンマシン；モジュール型ニューラルネットワーク、例として、コミッティーオブマシン（ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｍａｃｈｉｎｅｓ）及び連想型ニューラルネットワーク；並びに他のタイプのネットワーク、例として、即時訓練型のニューラルネットワーク、スパイキングニューラルネットワーク、動的ニューラルネットワーク、及びカスケーディングニューラルネットワークが挙げられる。ニューラルネットワーク解析は、例えば、ＳｔａｔＳｏｆｔ，Ｉｎｃ．から入手可能なＳｔａｔｉｓｔｉｃａデータ解析ソフトウエアを使用して実施することができる。ニューラルネットワークの記載については、例えば、Ｆｒｅｅｍａｎら、「Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ：Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９１）；Ｚａｄｅｈ、Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、８：３３８〜３５３頁（１９６５）；Ｚａｄｅｈ、「ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ．ｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ」、３：２８〜４４頁（１９７３）；Ｇｅｒｓｈｏら、「Ｖｅｃｔｏｒ  Ｑｕａｎｔｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ」、Ｋｌｕｙｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ、Ｌｏｎｄｏｎ（１９９２）；及びＨａｓｓｏｕｎ、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ」、ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、Ｌｏｎｄｏｎ（１９９５）を参照されたい。
【０１３２】
［０１３２］サポートベクターマシンは、分類及び回帰のために使用する、一連の関連がある教師ありの学習技法であり、例えば、Ｃｒｉｓｔｉａｎｉｎｉら、「Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｍａｃｈｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｋｅｒｎｅｌ−Ｂａｓｅｄ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）に記載されている。サポートベクターマシン解析は、例えば、Ｔｈｏｒｓｔｅｎ  Ｊｏａｃｈｉｍｓ（Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）が開発したＳＶＭｌｉｇｈｔソフトウエアを使用してか、又はＣｈｉｈ−Ｃｈｕｎｇ  Ｃｈａｎｇ及びＣｈｉｈ−Ｊｅｎ  Ｌｉｎ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔａｉｗａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）が開発したＬＩＢＳＶＭソフトウエアを使用して実施することができる。
【０１３３】
［０１３３］健常個体、及びＴＮＦα媒介型の疾患又は障害、例えば、ＩＢＤ（例えば、ＣＤ及び／又はＵＣ）等を有する患者から得られた試料（例えば、血清学的試料及び／又はゲノム試料）のコホートを使用して、本明細書に記載する種々の統計学的な方法及びモデルを訓練し、試験することができる。例えば、医師、好ましくは、胃腸科医が、例えば、米国特許第６，２１８，１２９号の記載に従って、生検、大腸内視鏡検査又はイムノアッセイを使用して、ＩＢＤ又はその臨床的サブタイプを有すると診断した患者から得られた試料が、本発明の統計学的な方法及びモデルの訓練及び試験における使用に適している。また、ＩＢＤと診断された患者から得られた試料は、例えば、米国特許第５，７５０，３５５号及び第５，８３０，６７５号の記載に従って、イムノアッセイを使用してクローン病又は潰瘍性大腸炎に階層化することもできる。健常個体から得られた試料は、ＩＢＤ試料と同定されなかった試料を含むことができる。当業者であれば、本発明の統計学的な方法及びモデルの訓練及び試験において使用することができる患者試料のコホートを得るための追加の技法及び診断の判断基準が分かるであろう。
【０１３４】
［０１３４］本明細書で使用する場合、用語「感度」は、抗ＴＮＦ薬物療法を最適化するための本発明の方法、抗ＴＮＦ薬物療法と関連がある毒性を低下させるための本発明の方法、及び／又は抗ＴＮＦ薬による治療の有効性をモニターするための本発明の方法が、試料が陽性である場合、陽性の結果をもたらし、例えば、抗ＴＮＦ薬物療法に対して予測される治療応答又は抗ＴＮＦ薬物療法と関連がある毒性を示す確率を含む。感度を、真陽性と偽陰性との和で割った真陽性の結果の数として計算する。感度は本質的には、どれほど十分に本発明が、抗ＴＮＦ薬物療法に対して予測される治療応答又は抗ＴＮＦ薬物療法と関連がある毒性を示す個体を、予測される治療応答も毒性も示さない個体から正しく同定するかの尺度である。感度が少なくとも約６０％となるように、統計学的な方法及びモデルを選択することができ、したがって、感度は、例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％であり得る。
【０１３５】
［０１３５］用語「特異性」は、抗ＴＮＦ薬物療法を最適化するための本発明の方法、抗ＴＮＦ薬物療法と関連がある毒性を低下させるための本発明の方法、及び／又は抗ＴＮＦ薬による治療の有効性をモニターするための本発明の方法が、試料が陽性でない場合、陰性の結果をもたらし、例えば、抗ＴＮＦ薬物療法に対して予測される治療応答も抗ＴＮＦ薬物療法と関連がある毒性も示さない確率を含む。特異性を、真陰性と偽陽性との和で割った真陰性の結果の数として計算する。特異性は本質的には、どれほど十分に本発明が、抗ＴＮＦ薬物療法に対して予測される治療応答も抗ＴＮＦ薬物療法と関連がある毒性も示さない個体を、予測される治療応答又は毒性を示す個体から除外するかの尺度である。特異性が少なくとも約６０％となるように、統計学的な方法及びモデルを選択することができ、したがって、特異性は、例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％であり得る。
【０１３６】
［０１３６］用語「陰性予測値」又は「ＮＰＶ」は、抗ＴＮＦ薬物療法に対して予測される治療応答も抗ＴＮＦ薬物療法と関連がある毒性も示さないと同定された個体が実際に、予測される治療応答も毒性も示さない確率を含む。陰性予測値を、真陰性と偽陰性との和で割った真陰性の数として計算することができる。陰性予測値は、本発明の方法の特徴及び解析する集団における疾患の有病率により決定される。疾患有病率を有する集団における陰性予測値が約７０％〜約９９％の範囲となるように、統計学的な方法及びモデルを選択することができ、したがって、陰性予測値は、例えば、少なくとも約７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％であり得る。
【０１３７】
［０１３７］用語「陽性予測値」又は「ＰＰＶ」は、抗ＴＮＦ薬物療法に対して予測される治療応答又は抗ＴＮＦ薬物療法と関連がある毒性を示すと同定された個体が実際に、予測される治療応答又は毒性を示す確率を含む。陽性予測値を、真陽性と偽陽性との和で割った真陽性の数として計算することができる。陽性予測値は、本発明の方法の特徴及び解析する集団における疾患の有病率により決定される。疾患有病率を有する集団における陽性予測値が約７０％〜約９９％の範囲となるように、統計学的な方法及びモデルを選択することができ、したがって、陽性予測値は、例えば、少なくとも約７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％であり得る。
【０１３８】
［０１３８］予測値は、陰性予測値及び陽性予測値を含めて、解析する集団における疾患の有病率の影響を受ける。本発明において、統計学的な方法及びモデルを選択して、ＴＮＦα媒介型の疾患又は障害、例えば、ＩＢＤ等について特定の有病率を有する臨床集団にとって所望の臨床パラメータを得ることができる。非限定的な例として、統計学的な方法及びモデルを選択して、最高約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％又は７０％のＩＢＤ有病率を得ることができ、こうした有病率は、例えば、臨床医の診察室、例として、胃腸科医の診察室、又は一般開業医の診察室において見ることができる。
【０１３９】
［０１３９］本明細書で使用する場合、用語「全体的な一致」又は「全体的な精度」は、本発明の方法が、抗ＴＮＦ薬物療法を最適化する精度、抗ＴＮＦ薬物療法と関連がある毒性を低下させる精度、及び／又は抗ＴＮＦ薬による治療の有効性をモニターする精度を含む。全体的な精度は、試料結果の総数で割った真陽性と真陰性との和として計算し、解析する集団における疾患の有病率の影響を受ける。例えば、疾患有病率を有する患者集団における全体的な精度が少なくとも約４０％となるように、統計学的な方法及びモデルを選択することができ、したがって、全体的な精度は、例えば、少なくとも約４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％であり得る。
【０１４０】
Ｖ．炎症性マーカー
［０１４０］生化学的マーカー、血清学的マーカー、タンパク質マーカー、遺伝学的マーカー、及び他の臨床的特徴又は超音波検査による特徴を含めた、多様な炎症性マーカーが、療法を最適化するため、毒性を低下させるため、及び／又は治療剤、例として、生物学的製剤（例えば、抗ＴＮＦ薬）を用いた治療処置の有効性をモニターするために、本発明の方法において使用するのに適している。特定の態様では、本明細書に記載する方法は、炎症性マーカーのうちの１つ又は複数について決定した存在、濃度レベル及び／又は遺伝子型へのアルゴリズム（例えば、統計学的解析）の適用を活用して、抗ＴＮＦ薬物療法を最適化すること、抗ＴＮＦ薬物療法と関連がある毒性を低下させること、又は抗ＴＮＦ薬を用いた治療処置の有効性をモニターすることを援助又は支援する。
【０１４１】
［０１４１］炎症性マーカーの非限定的な例として、（ｉ）生化学的マーカー、血清学的マーカー及びタンパク質マーカー、例えば、サイトカイン、急性期タンパク質、細胞接着分子等、並びにそれらの組合せ；並びに（ｉｉ）遺伝学的マーカー、例えば、表１に記載する遺伝子のうちのいずれか（例えば、ＮＯＤ２）等が挙げられる。
【０１４２】
Ａ．サイトカイン
［０１４２］試料中の少なくとも１つのサイトカインの存在又はレベルの決定は、本発明において特に有用である。本明細書で使用する場合、用語「サイトカイン」は、様々な免疫系の機能を制御する免疫細胞が分泌する多様なポリペプチド又はタンパク質をいずれも含み、小型のサイトカイン、例として、ケモカインを網羅する。また、用語「サイトカイン」は、アディポサイトカインも含み、アディポサイトカインは、脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）が分泌するサイトカインの群を含み、例えば、体重、血球新生、血管新生、創傷治癒、インスリン抵抗性、免疫応答及び炎症応答の制御において機能する。
【０１４３】
［０１４３］特定の態様では、試料中の少なくとも１つのサイトカインの存在又はレベルを決定し、サイトカインとして、これらに限定されないが、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ関連の、アポトーシスの弱い誘導因子（ＴＷＥＡＫ）、オステオプロテジェリン（ＯＰＧ）、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−２３及びＩＬ−２７が挙げられる。特定の他の態様では、試料中の少なくとも１つのケモカイン、例えば、ＣＸＣＬ１／ＧＲＯ１／ＧＲＯα、ＣＸＣＬ２／ＧＲＯ２、ＣＸＣＬ３／ＧＲＯ３、ＣＸＣＬ４／ＰＦ−４、ＣＸＣＬ５／ＥＮＡ−７８、ＣＸＣＬ６／ＧＣＰ−２、ＣＸＣＬ７／ＮＡＰ−２、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０、ＣＸＣＬ１１／Ｉ−ＴＡＣ、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１、ＣＸＣＬ１３／ＢＣＡ−１、ＣＸＣＬ１４／ＢＲＡＫ、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７／ＤＭＣ、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ６／Ｃ１０、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３、ＣＣＬ８／ＭＣＰ−２、ＣＣＬ９／ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１１／エオタキシン、ＣＣＬ１２／ＭＣＰ−５、ＣＣＬ１３／ＭＣＰ−４、ＣＣＬ１４／ＨＣＣ−１、ＣＣＬ１５／ＭＩＰ−５、ＣＣＬ１６／ＬＥＣ、ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ、ＣＣＬ１８／ＭＩＰ−４、ＣＣＬ１９／ＭＩＰ−３β、ＣＣＬ２０／ＭＩＰ−３α、ＣＣＬ２１／ＳＬＣ、ＣＣＬ２２／ＭＤＣ、ＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ１、ＣＣＬ２４／エオタキシン−２、ＣＣＬ２５／ＴＥＣＫ、ＣＣＬ２６／エオタキシン−３、ＣＣＬ２７／ＣＴＡＣＫ、ＣＣＬ２８／ＭＥＣ、ＣＬ１、ＣＬ２及びＣＸ３ＣＬ１等の存在又はレベルを決定する。特定のさらなる態様では、試料中の少なくとも１つのアディポサイトカインの存在又はレベルを決定し、アディポサイトカインとして、これらに限定されないが、レプチン、アディポネクチン、レジスチン、活性なプラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１（ＰＡＩ−１）又は総プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１（ＰＡＩ−１）、ビスファチン及びレチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４）が挙げられる。好ましくは、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＦＮ−γ及び／又はＩＬ−１０の存在又はレベルを決定する。
【０１４４】
［０１４４］特定の場合には、特定のサイトカインの存在又はレベルを、アッセイ、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ又は増幅に基づくアッセイ等を用いて、ｍＲＮＡ発現のレベルにおいて検出する。特定の他の場合には、特定のサイトカインの存在又はレベルを、例えば、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）又は免疫組織化学的アッセイを使用して、タンパク質発現のレベルにおいて検出する。血清、血漿、唾液又は尿の試料中のサイトカイン、例として、ＩＬ−６、ＩＬ−１β又はＴＷＥＡＫの存在又はレベルを決定するのに適切なＥＬＩＳＡキットが、例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、Ｎｅｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＫＹ）、Ａｌｐｃｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓａｌｅｍ、ＮＨ）、Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ、Ｉｎｃ．（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＣＨＥＭＩＣＯＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）、Ａｎｔｉｇｅｎｉｘ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ  Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＹ）、ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）、及び／又はＢｅｎｄｅｒ  ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）から入手可能である。
【０１４５】
［０１４５］ヒトＩＬ−６ポリペプチド配列が、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００５９１に記載されている。ヒトＩＬ−６  ｍＲＮＡ（コード）配列が、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００６００に記載されている。当業者であれば、ＩＬ−６は、インターフェロンβ２（ＩＦＮＢ２）、ＨＧＦ、ＨＳＦ及びＢＳＦ２としてもまた知られていることを理解するであろう。
【０１４６】
［０１４６］ヒトＩＬ−１βポリペプチド配列が、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００５６７に記載されている。ヒトＩＬ−１β  ｍＲＮＡ（コード）配列が、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００５７６に記載されている。当業者であれば、ＩＬ−１βは、ＩＬ１Ｆ２及びＩＬ−１βとしてもまた知られていることを理解するであろう。
【０１４７】
［０１４７］ヒトＴＷＥＡＫポリペプチド配列が、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００３８００及びＡＡＣ５１９２３に記載されている。ヒトＴＷＥＡＫ  ｍＲＮＡ（コード）配列が、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３８０９及びＢＣ１０４４２０に記載されている。当業者であれば、ＴＷＥＡＫは、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１２（ＴＮＦＳＦ１２）、ＡＰＯ３リガンド（ＡＰＯ３Ｌ）、ＣＤ２５５、ＤＲ３リガンド、増殖因子誘導性１４（Ｆｎ１４）リガンド、及びＵＮＱ１８１／ＰＲＯ２０７としてもまた知られていることを理解するであろう。
【０１４８】
Ｂ．急性期タンパク質
［０１４８］また、試料中の１つ又は複数の急性期タンパク質の存在又はレベルの決定も本発明に有用である。急性期タンパク質は、血漿濃度が、炎症に応答して、増加する（正の急性期タンパク質）又は減少する（負の急性期タンパク質）タンパク質のクラスである。この応答は、急性期反応と呼ばれる（急性期応答ともまた呼ばれる）。正の急性期タンパク質の例として、これらに限定されないが、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、Ｄ−二量体タンパク質、マンノース結合タンパク質、α１−アンチトリプシン、α１−抗キモトリプシン、α２−マクログロブリン、フィブリノーゲン、プロトロンビン、第ＶＩＩＩ因子、フォン−ヴィルブランド因子、プラスミノーゲン、補体因子、フェリチン、血清アミロイドＰ構成成分、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、オロソムコイド（α１−酸性糖タンパク質、ＡＧＰ）、セルロプラスミン、ハプトグロビン、及びそれらの組合せが挙げられる。負の急性期タンパク質の非限定的な例として、アルブミン、トランスフェリン、トランスサイレチン、トランスコルチン、レチノール結合タンパク質、及びそれらの組合せが挙げられる。好ましくは、ＣＲＰ及び／又はＳＡＡの存在又はレベルを決定する。
【０１４９】
［０１４９］特定の場合には、特定の急性期タンパク質の存在又はレベルを、アッセイ、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ又は増幅に基づくアッセイ等を用いて、ｍＲＮＡ発現のレベルにおいて検出する。特定の他の場合には、特定の急性期タンパク質の存在又はレベルを、例えば、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）又は免疫組織化学的アッセイを使用して、タンパク質発現のレベルにおいて検出する。例えば、Ａｌｐｃｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓａｌｅｍ、ＮＨ）から入手可能なサンドイッチ比色分析ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、血清、血漿、尿又は便の試料中のＣＲＰのレベルを決定することができる。同様に、Ｂｉｏｍｅｄａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から入手可能なＥＬＩＳＡキットを使用して、試料中のＣＲＰレベルを検出することもできる。試料中のＣＲＰレベルを決定するための他の方法が、例えば、米国特許第６，８３８，２５０号及び第６，４０６，８６２号、並びに米国特許出願公開第２００６００２４６８２号及び第２００６００１９４１０号に記載されている。ＣＲＰレベルを決定するための追加の方法として、例えば、免疫比濁法アッセイ、迅速免疫拡散法アッセイ、及び目視による凝集アッセイが挙げられる。試料、例として、血清、血漿、唾液、尿又は便中のＳＡＡの存在又はレベルを決定するのに適切なＥＬＩＳＡキットが、例えば、Ａｎｔｉｇｅｎｉｘ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ  Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＹ）、Ａｂａｚｙｍｅ（Ｎｅｅｄｈａｍ、ＭＡ）、ＵＳＣＮ  Ｌｉｆｅ（Ｍｉｓｓｏｕｒｉ  Ｃｉｔｙ、ＴＸ）、及び／又はＵ．Ｓ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ、ＭＡ）から入手可能である。
【０１５０】
［０１５０］Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）は、炎症に応答して血中に見出されるタンパク質である（急性期タンパク質）。ＣＲＰは典型的には、肝臓、及び脂肪細胞（ｆａｔ  ｃｅｌｌ）（脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ））により産生される。ＣＲＰは、ペントラキシンファミリーのタンパク質のメンバーである。ヒトＣＲＰポリペプチド配列が、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００５５８に記載されている。ヒトＣＲＰ  ｍＲＮＡ（コード）配列が、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００５６７に記載されている。当業者であれば、ＣＲＰは、ＰＴＸ１、ＭＧＣ８８２４４及びＭＧＣ１４９８９５としてもまた知られていることを理解するであろう。
【０１５１】
［０１５１］血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）タンパク質は、血漿中の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と関連があるアポリポタンパク質のファミリーである。ＳＡＡの異なるアイソフォームが、異なるレベルで構成的に発現する（構成的ＳＡＡ）か、又は炎症性刺激に応答して発現する（急性期ＳＡＡ）。これらのタンパク質は、主に肝臓により産生される。これらのタンパク質が無脊椎動物及び脊椎動物の全体を通して保存されていることから、ＳＡＡが、全ての動物において極めて必須の役割を果たすことが示唆される。急性期血清アミロイドＡタンパク質（Ａ−ＳＡＡ）は、炎症の急性期の間に分泌される。ヒトＳＡＡポリペプチド配列が、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００３２２に記載されている。ヒトＳＡＡ  ｍＲＮＡ（コード）配列が、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００３３１に記載されている。当業者であれば、ＳＡＡは、ＰＩＧ４、ＴＰ５３Ｉ４、ＭＧＣ１１１２１６及びＳＡＡ１としてもまた知られていることを理解するであろう。
【０１５２】
Ｃ．細胞接着分子（ＩｇＳＦ  ＣＡＭ）
［０１５２］また、試料中の１つ又は複数の免疫グロブリンスーパーファミリー細胞接着分子の存在又はレベルの決定も本発明に有用である。本明細書で使用する場合、用語「免疫グロブリンスーパーファミリー細胞接着分子」（ＩｇＳＦ  ＣＡＭ）は、１つ又は複数の免疫グロブリン様の折り畳まれたドメインを有し、細胞間接着及び／又はシグナル伝達において機能する、細胞の表面上に位置する多様なポリペプチド又はタンパク質をいずれも含む。多くの場合、ＩｇＳＦ  ＣＡＭは、膜貫通型タンパク質である。ＩｇＳＦ  ＣＡＭの非限定的な例として、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ；例えば、ＮＣＡＭ−１２０、ＮＣＡＭ−１２５、ＮＣＡＭ−１４０、ＮＣＡＭ−１４５、ＮＣＡＭ−１８０、ＮＣＡＭ−１８５等）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ、例えば、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＩＣＡＭ−４及びＩＣＡＭ−５）、血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）、血小板内皮細胞接着分子−１（ＰＥＣＡＭ−１）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）、Ｌ１ＣＡＭ対して相同性を有する細胞接着分子（Ｌ１の密接な相同体）（ＣＨＬ１）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン（ＳＩＧＬＥＣ；例えば、ＳＩＧＬＥＣ−１、ＳＩＧＬＥＣ−２、ＳＩＧＬＥＣ−３、ＳＩＧＬＥＣ−４等）、ネクチン（例えば、ネクチン−１、ネクチン−２、ネクチン−３等）、並びにネクチン様分子（例えば、Ｎｅｃｌ−１、Ｎｅｃｌ−２、Ｎｅｃｌ−３、Ｎｅｃｌ−４、及びＮｅｃｌ−５）が挙げられる。好ましくは、ＩＣＡＭ−１及び／又はＶＣＡＭ−１の存在又はレベルを決定する。
【０１５３】
１．細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）
［０１５３］ＩＣＡＭ−１は、白血球及び内皮細胞の膜内に低い濃度で連続的に存在する膜貫通型細胞接着タンパク質である。サイトカインにより賦活されると、濃度が大幅に増加する。ＩＣＡＭ−１は、ＩＬ−１及びＴＮＦαにより誘導され得、血管内皮、マクロファージ及びリンパ球により発現する。ＩＢＤにおいては、炎症促進性サイトカインが、接着分子、例として、ＩＣＡＭ−１及びＶＣＡＭ−１の発現を上方制御することによって、炎症を引き起こす。接着分子の発現の増加が、より多くのリンパ球を感染組織に動員し、結果として、組織炎症をもたらす（Ｇｏｋｅら、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、３２：４８０（１９９７）；及びＲｉｊｃｋｅｎら、Ｇｕｔ、５１：５２９（２００２）を参照されたい）。ＩＣＡＭ−１は、細胞間接着分子１遺伝子（ＩＣＡＭ１；Ｅｎｔｒｅｚ  ＧｅｎｅＩＤ：３３８３；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００２０１）によりコードされ、細胞間接着分子１前駆体ポリペプチド（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００１９２）がプロセシングされて産生される。
【０１５４】
２．血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）
［０１５４］ＶＣＡＭ−１は、リンパ球、単核球、好酸球及び好塩基球の血管内皮に対する接着を媒介する膜貫通型細胞接着タンパク質である。遺伝子転写の増加の結果として、サイトカインによる（例えば、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）及びインターロイキン−１（ＩＬ−１）に応答して）内皮細胞中のＶＣＡＭ−１の上方制御が生じる。ＶＣＡＭ−１は、血管細胞接着分子１遺伝子（ＶＣＡＭ１；Ｅｎｔｒｅｚ  ＧｅｎｅＩＤ：７４１２）によりコードされ、転写物（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０７８（変異体１）又はＮＭ＿０８０６８２（変異体２））が示差的にスプライシングされ、前駆体ポリペプチドスプライスアイソフォーム（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１０６９（アイソフォームａ）又はＮＰ＿５４２４１３（アイソフォームｂ））がプロセシングされて産生される。
【０１５５】
［０１５５］特定の場合には、ＩｇＳＦ  ＣＡＭの存在又はレベルを、アッセイ、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ又は増幅に基づくアッセイ等を用いて、ｍＲＮＡ発現のレベルにおいて検出する。特定の他の場合には、ＩｇＳＦ  ＣＡＭの存在又はレベルを、例えば、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）又は免疫組織化学的アッセイを使用して、タンパク質発現のレベルにおいて検出する。試料、例として、組織試料、生検、血清、血漿、唾液、尿又は便中のＩＣＡＭ−１及び／又はＶＣＡＭ−１の存在又はレベルを決定するのに適切な抗体及び／又はＥＬＩＳＡキットが、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、及び／又はＡｂｃａｍ  Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から入手可能である。
【０１５６】
Ｄ．遺伝学的マーカー
［０１５６］また、試料中の１つ又は複数の遺伝学的マーカー中の対立遺伝子変異体の存在又は不在の決定も本発明に有用である。遺伝学的マーカーの非限定的な例として、これらに限定されないが、表１に記載するような、遺伝子型を同定することができる炎症経路遺伝子及び対応するＳＮＰのうちのいずれか（例えば、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子、ＩＬ１２／ＩＬ２３経路遺伝子等）が挙げられる。好ましくは、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子中の少なくとも１つの対立遺伝子変異体、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）の存在若しくは不在、及び／又はＩＬ１２／ＩＬ２３経路中の１つ又は複数の遺伝子の存在若しくは不在を決定する。例えば、Ｂａｒｒｅｔｔら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、４０：９５５〜６２頁（２００８）、及びＷａｎｇら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、８４：３９９〜４０５頁（２００９）を参照されたい。
【表１−１】
0005960707.tif 000002
【表１−２】
0005960707.tif 000003
【表１−３】
0005960707.tif 000004
【表１−４】
0005960707.tif 000005
【表１−５】
0005960707.tif 000006
【０１５７】
［０１５７］本発明に有用な追加のＳＮＰとして、例えば、ｒｓ２１８８９６２、ｒｓ９２８６８７９、ｒｓ１１５８４３８３、ｒｓ７７４６０８２、ｒｓ１４５６８９３、ｒｓ１５５１３９８、ｒｓ１７５８２４１６、ｒｓ３７６４１４７、ｒｓ１７３６１３５、ｒｓ４８０７５６９、ｒｓ７７５８０８０及びｒｓ８０９８６７３が挙げられる。例えば、Ｂａｒｒｅｔｔら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、４０：９５５〜６２頁（２００８）を参照されたい。
【０１５８】
１．ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５
［０１５８］ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子中の対立遺伝子変異体、例として、ＳＮＰの存在又は不在の決定は、本発明において特に有用である。本明細書で使用する場合、用語「ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５変異体」又は「ＮＯＤ２変異体」は、野生型ＮＯＤ２遺伝子と比較して１つ若しくは複数の変化を含有する、ＮＯＤ２遺伝子のヌクレオチド配列、又は野生型ＮＯＤ２ポリペプチド配列と比較して１つ若しくは複数の変化を含有する、ＮＯＤ２ポリペプチドのアミノ酸配列を含む。ＮＯＤ２は、ＣＡＲＤ１５としてもまた知られており、１６番染色体上のＩＢＤ１遺伝子座に局在していることが報告され、位置クローニング（Ｈｕｇｏｔら、Ｎａｔｕｒｅ、４１１：５９９〜６０３頁（２００１））及び位置的候補遺伝子戦略（Ｏｇｕｒａら、Ｎａｔｕｒｅ、４１１：６０３〜６０６頁（２００１）；Ｈａｍｐｅら、Ｌａｎｃｅｔ、３５７：１９２５〜１９２８頁（２００１））により同定されている。ＩＢＤ１遺伝子座は、炎症性腸疾患について、高い多点連鎖スコア（ｍｕｌｔｉｐｏｉｎｔ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｓｃｏｒｅ）（ＭＬＳ）を有する（１６ｑ１２中のマーカーＤ１６Ｓ４１１において、ＭＬＳ＝５．７）。例えば、Ｃｈｏら、Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓ．、３：１８６〜１９０頁（１９９７）；Ａｋｏｌｋａｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、９６：１１２７〜１１３２頁（２００１）；Ｏｈｍｅｎら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、５：１６７９〜１６８３頁（１９９６）；Ｐａｒｋｅｓら、Ｌａｎｃｅｔ、３４８：１５８８（１９９６）；Ｃａｖａｎａｕｇｈら、Ａｎｎ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、６２：２９１〜８頁（１９９８）；Ｂｒａｎｔら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１１５：１０５６〜１０６１頁（１９９８）；Ｃｕｒｒａｎら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１１５：１０６６〜１０７１頁（１９９８）；Ｈａｍｐｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、６４：８０８〜８１６頁（１９９９）；及びＡｎｎｅｓｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、７：５６７〜５７３頁（１９９９）を参照されたい。
【０１５９】
［０１５９］ヒトＮＯＤ２のｍＲＮＡ（コード）配列及びポリペプチド配列がそれぞれ、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２２１６２及びＮＰ＿０７１４４５に記載されている。さらに、ＮＯＤ２を含むヒト１６番染色体クローンＲＰ１１−３２７Ｆ２２の完全配列も、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＣ００７７２８に記載されている。さらに、他の種に由来するＮＯＤ２の配列も、ＧｅｎＢａｎｋデータベース中に見出すことができる。
【０１６０】
［０１６０］ＮＯＤ２タンパク質は、ＮＦ−カッパＢ（ＮＦ−ｋＢ）を活性化させることができるアミノ末端カスパーゼ動員ドメイン（ＣＡＲＤ）、及びいくつかのカルボキシ末端のロイシンに富む反復ドメインを含有する（Ｏｇｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６：４８１２〜４８１８頁（２００１））。ＮＯＤ２は、アポトーシス調節因子Ａｐａｆ−１／ＣＥＤ−４、及び植物病抵抗性遺伝子産物のクラスに対して構造的な相同性を有する（Ｏｇｕｒａら、上記）。植物病抵抗性遺伝子産物と同様に、ＮＯＤ２は、アミノ末端エフェクタードメイン、ヌクレオチド結合ドメイン及びロイシンに富む反復配列（ＬＲＲ）を有する。野生型ＮＯＤ２は、核内因子ＮＦ−カッパＢを活性化して、ＮＦ−カッパＢを細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）に対して応答性にする（Ｏｇｕｒａら、上記；Ｉｎｏｈａｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６：２５５１〜２５５４頁（２００１）。ＮＯＤ２は、ＬＰＳについての細胞間受容体として機能することができ、ロイシンに富む反復配列は応答性に必要である。
【０１６１】
［０１６１］ＮＯＤ２のコード領域中の３つの一塩基多型における変動が以前に記載されたことがある。これら３つのＳＮＰは、Ｒ７０２Ｗ（「ＳＮＰ８」）、Ｇ９０８Ｒ（「ＳＮＰ１２」）及び１００７ｆｓ（「ＳＮＰ１３」）と名付けられ、ＮＯＤ２遺伝子のカルボキシ末端の領域に位置する（Ｈｕｇｏｔら、上記）。ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２及びＳＮＰ１３、並びに本発明において使用するのに適したＮＯＤ２遺伝子中の追加のＳＮＰのさらなる記載を、例えば、米国特許第６，８３５，８１５号、第６，８５８，３９１号及び第７，５９２，４３７号、並びに米国特許出願公開第２００３０１９０６３９号、第２００５００５４０２１号及び第２００７００７２１８０号に見出すことができる。
【０１６２】
［０１６２］いくつかの実施形態では、ＮＯＤ２変異体が、ＮＯＤ２遺伝子座のコード領域中、例えば、ＮＯＤ２ポリペプチドのカルボキシ末端の部分中のいくつかのロイシンに富む反復配列をコードする領域内に位置する。ＮＯＤ２のロイシンに富む反復配列の領域中に位置する、そのようなＮＯＤ２変異体として、非限定的に、Ｒ７０２Ｗ（「ＳＮＰ８」）及びＧ９０８Ｒ（「ＳＮＰ１２」）が挙げられる。また、本発明に有用なＮＯＤ２変異体は、野生型ＮＯＤ２ポリペプチドによるＮＦ−カッパＢの活性化と比較して、ＮＦ−カッパＢを活性化させる能力が低下しているＮＯＤ２ポリペプチドをコードする場合もある。非限定的な例として、ＮＯＤ２変異体１００７ｆｓ（「ＳＮＰ１３」）により、切断型のＮＯＤ２ポリペプチドが生じ、この切断型ペプチドは、ＬＰＳによる賦活に応答してＮＦ−カッパＢを誘導する能力の低下を示す（Ｏｇｕｒａら、Ｎａｔｕｒｅ、４１１：６０３〜６０６頁（２００１））。
【０１６３】
［０１６３］本発明に有用なＮＯＤ２変異体は、例えば、Ｒ７０２Ｗ、Ｇ９０８Ｒ又は１００７ｆｓであり得る。Ｒ７０２Ｗ、Ｇ９０８Ｒ及び１００７ｆｓは、ＮＯＤ２のコード領域内に位置する。一実施形態では、本発明の方法を、Ｒ７０２ＷのＮＯＤ２変異体を用いて実行する。本明細書で使用する場合、用語「Ｒ７０２Ｗ」は、ＮＯＤ２遺伝子の第４エクソン内の一塩基多型を含み、この多型は、ＮＯＤ２タンパク質のアミノ酸７０２をコードするトリプレット内に生じる。野生型ＮＯＤ２対立遺伝子は、ＡＣ００７７２８配列の１３８，９９１位においてシトシン（ｃ）残基を含有し、この残基は、アミノ酸７０２においてアルギニンをコードするトリプレット内に生じる。Ｒ７０２ＷのＮＯＤ２変異体は、ＡＣ００７７２８配列の１３８，９９１位においてチミン（ｔ）残基を含有し、結果として、ＮＯＤ２タンパク質のアミノ酸７０２におけるアルギニン（Ｒ）からトリプトファン（Ｗ）への置換をもたらす。したがって、このＮＯＤ２変異体は、「Ｒ７０２Ｗ」又は「７０２Ｗ」として示され、また、Ｈｕｇｏｔら、上記の、より早期の番号付けシステムに基づいて、「Ｒ６７５Ｗ」として示す場合もある。さらに、Ｒ７０２Ｗ変異体は、「ＳＮＰ８」対立遺伝子又はＳＮＰ８における「２」対立遺伝子としてもまた知られている。Ｒ７０２Ｗ又はＳＮＰ８についてのＮＣＢＩ  ＳＮＰ  ＩＤ番号は、ｒｓ２０６６８４４である。Ｒ７０２ＷのＮＯＤ２変異体及び他のＮＯＤ２変異体の存在を、例えば、対立遺伝子識別アッセイ又は配列解析により好都合に検出することができる。
【０１６４】
［０１６４］また、本発明の方法は、Ｇ９０８ＲのＮＯＤ２変異体を用いて実行することもできる。本明細書で使用する場合、用語「Ｇ９０８Ｒ」は、ＮＯＤ２遺伝子の第８エクソン内の一塩基多型を含み、この多型は、ＮＯＤ２タンパク質アミノ酸９０８をコードするトリプレット内に生じる。アミノ酸９０８は、ＮＯＤ２遺伝子のロイシンに富む反復領域内に位置する。野生型ＮＯＤ２対立遺伝子は、ＡＣ００７７２８配列の１２８，３７７位においてグアニン（ｇ）残基を含有し、この残基は、アミノ酸９０８においてグリシンをコードするトリプレット内に生じる。Ｇ９０８ＲのＮＯＤ２変異体は、ＡＣ００７７２８配列の１２８，３７７位においてシトシン（ｃ）残基を含有し、結果として、ＮＯＤ２タンパク質アミノ酸９０８におけるグリシン（Ｇ）からアルギニン（Ｒ）への置換をもたらす。したがって、このＮＯＤ２変異体は、「Ｇ９０８Ｒ」又は「９０８Ｒ」として示され、また、Ｈｕｇｏｔら、上記の、より早期の番号付けシステムに基づいて、「Ｇ８８１Ｒ」として示す場合もある。さらに、Ｇ９０８Ｒ変異体は、「ＳＮＰ１２」対立遺伝子又はＳＮＰ１２における「２」対立遺伝子としてもまた知られている。Ｇ９０８ＲのＳＮＰ１２についてのＮＣＢＩ  ＳＮＰ  ＩＤ番号は、ｒｓ２０６６８４５である。
【０１６５】
［０１６５］また、本発明の方法は、１００７ｆｓのＮＯＤ２変異体を用いて実行することもできる。この変異体は、単一ヌクレオチドの挿入体であり、この挿入ヌクレオチドにより、ＮＯＤ２タンパク質の１０番目のロイシンに富む反復配列中にフレームシフトが生じ、続いて、未熟な終止コドンが生じる。ＮＯＤ２タンパク質の結果として生じる切断が、細菌のリポ多糖に応答する、ＮＦ−カッパＢの活性化を阻止するように見える（Ｏｇｕｒａら、上記）。本明細書で使用する場合、用語「１００７ｆｓ」は、ＮＯＤ２遺伝子の第１１エクソン内の一塩基多型を含み、この多型は、ＮＯＤ２タンパク質のアミノ酸１００７をコードするトリプレット中に生じる。１００７ｆｓ変異体は、ＡＣ００７７２８配列の１２１，１３９位において付加され、結果として、アミノ酸１００７においてフレームシフト突然変異をもたらすようになったシトシンを含有する。したがって、このＮＯＤ２変異体は、「１００７ｆｓ」として示され、また、Ｈｕｇｏｔら、上記の、より早期の番号付けシステムに基づいて、「３０２０ｉｎｓＣ」又は「９８０ｆｓ」として示すこともできる。さらに、１００７ｆｓのＮＯＤ２変異体は、「ＳＮＰ１３」対立遺伝子又はＳＮＰ１３の「２」対立遺伝子としてもまた知られている。１００７ｆｓ又はＳＮＰ１３についてのＮＣＢＩ  ＳＮＰ  ＩＤ番号は、ｒｓ２０６６８４７である。
【０１６６】
［０１６６］当業者であれば、例えば、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から得られる市販されている参照ＤＮＡを使用して、例えば、Ｃｅｎｔｒｅ  ｄ’Ｅｔｕｄｅ  ｄｕ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｅ  Ｈｕｍａｉｎ（ＣＥＰＨ）の参照個体、例として、１３４７−０２と名付けられた個体と比較して（Ｄｉｂら、Ｎａｔｕｒｅ、３８０：１５２〜１５４頁（１９９６））、特定のＮＯＤ２変異体対立遺伝子又は他の多型対立遺伝子を好都合に定義することができることを認識する。さらに、ＳＮＰに関する詳細な情報を、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のｄｂＳＮＰから得ることもできる。
【０１６７】
［０１６７］また、ＮＯＤ２変異体は、ＮＯＤ２遺伝子座の非コード領域中に位置する場合もある。非コード領域として、例えば、イントロン配列、並びに５’及び３’の非翻訳配列が挙げられる。ＮＯＤ２遺伝子の非コード領域中に位置するＮＯＤ２変異体対立遺伝子の非限定的な例が、ＪＷ１変異体であり、この変異体は、Ｓｕｇｉｍｕｒａら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、７２：５０９〜５１８頁（２００３）及び米国特許出願公開第２００７００７２１８０号に記載されている。ＮＯＤ２遺伝子の３’非翻訳領域中に位置するＮＯＤ２変異体対立遺伝子の例として、非限定的に、ＪＷ１５変異体対立遺伝子及びＪＷ１６変異体対立遺伝子が挙げられ、これらは、米国特許出願公開第２００７００７２１８０号に記載されている。ＮＯＤ２遺伝子の５’非翻訳領域（例えば、プロモーター領域）中に位置するＮＯＤ２変異体対立遺伝子の例として、非限定的に、ＪＷ１７変異体対立遺伝子及びＪＷ１８変異体対立遺伝子が挙げられ、これらは、米国特許出願公開第２００７００７２１８０号に記載されている。
【０１６８】
［０１６８］本明細書で使用する場合、用語「ＪＷ１変異体対立遺伝子」は、ＮＯＤ２遺伝子の第８介在配列（第８イントロン）のヌクレオチド１５８における遺伝子の変動を含む。ＡＣ００７７２８配列に関して、ＪＷ１変異体対立遺伝子は、１２８，１４３位に位置する。第８イントロンのヌクレオチド１５８における遺伝子の変動は、これらに限定されないが、単一ヌクレオチドの置換、複数のヌクレオチドの置換、又は１つ若しくは複数のヌクレオチドの欠失若しくは挿入であり得る。第８イントロンの野生型配列は、１５８位にシトシンを有する。非限定的な例として、ＪＷ１変異体対立遺伝子は、第８イントロンのヌクレオチド１５８において、シトシン（ｃ）からアデニン（ａ）へ、シトシン（ｃ）からグアニン（ｇ）へ、又はシトシン（ｃ）からチミン（ｔ）への置換を有し得る。一実施形態では、ＪＷ１変異体対立遺伝子は、ＮＯＤ２の第８イントロンのヌクレオチド１５８におけるシトシン（ｃ）からチミン（ｔ）への変化である。
【０１６９】
［０１６９］用語「ＪＷ１５変異体対立遺伝子」は、ＡＣ００７７２８配列の１１８，７９０位のヌクレオチドにおけるＮＯＤ２の３’非翻訳領域中の遺伝子の変動を含む。ヌクレオチド１１８，７９０における遺伝子の変動は、これらに限定されないが、単一ヌクレオチドの置換、複数のヌクレオチドの置換、又は１つ若しくは複数のヌクレオチドの欠失若しくは挿入であり得る。野生型配列は、１１８，７９０位においてアデニン（ａ）を有する。非限定的な例として、ＪＷ１５変異体対立遺伝子は、ヌクレオチド１１８，７９０において、アデニン（ａ）からシトシン（ｃ）へ、アデニン（ａ）からグアニン（ｇ）へ、又はアデニン（ａ）からチミン（ｔ）への置換を有し得る。一実施形態では、ＪＷ１５変異体対立遺伝子は、ヌクレオチド１１８，７９０におけるアデニン（ａ）からシトシン（ｃ）への変化である。
【０１７０】
［０１７０］本明細書で使用する場合、用語「ＪＷ１６変異体対立遺伝子」は、ＡＣ００７７２８配列の１１８，０３１位のヌクレオチドにおけるＮＯＤ２の３’非翻訳領域中の遺伝子の変動を含む。ヌクレオチド１１８，０３１における遺伝子の変動は、これらに限定されないが、単一ヌクレオチドの置換、複数のヌクレオチドの置換、又は１つ若しくは複数のヌクレオチドの欠失若しくは挿入であり得る。野生型配列は、１１８，０３１位においてグアニン（ｇ）を有する。非限定的な例として、ＪＷ１６変異体対立遺伝子は、ヌクレオチド１１８，０３１において、グアニン（ｇ）からシトシン（ｃ）へ、グアニン（ｇ）からアデニン（ａ）へ、又はグアニン（ｇ）からチミン（ｔ）への置換を有し得る。一実施形態では、ＪＷ１６変異体対立遺伝子は、ヌクレオチド１１８，０３１におけるグアニン（ｇ）からアデニン（ａ）への変化である。
【０１７１】
［０１７１］用語「ＪＷ１７変異体対立遺伝子」は、ＡＣ００７７２８配列の１５４，６８８位のヌクレオチドにおけるＮＯＤ２の５’非翻訳領域中の遺伝子の変動を含む。ヌクレオチド１５４，６８８における遺伝子の変動は、これらに限定されないが、単一ヌクレオチドの置換、複数のヌクレオチドの置換、又は１つ若しくは複数のヌクレオチドの欠失若しくは挿入であり得る。野生型配列は、１５４，６８８位においてシトシン（ｃ）を有する。非限定的な例として、ＪＷ１７変異体対立遺伝子は、ヌクレオチド１５４，６８８において、シトシン（ｃ）からグアニン（ｇ）へ、シトシン（ｃ）からアデニン（ａ）へ、又はシトシン（ｃ）からチミン（ｔ）への置換を有し得る。一実施形態では、ＪＷ１７変異体対立遺伝子は、ヌクレオチド１５４，６８８におけるシトシン（ｃ）からチミン（ｔ）への変化である。
【０１７２】
［０１７２］本明細書で使用する場合、用語「ＪＷ１８変異体対立遺伝子」は、ＡＣ００７７２８配列の１５４，４７１位のヌクレオチドにおけるＮＯＤ２の５’非翻訳領域中の遺伝子の変動を含む。ヌクレオチド１５４，４７１における遺伝子の変動は、これらに限定されないが、単一ヌクレオチドの置換、複数のヌクレオチドの置換、又は１つ若しくは複数のヌクレオチドの欠失若しくは挿入であり得る。野生型配列は、１５４，４７１位においてシトシン（ｃ）を有する。非限定的な例として、ＪＷ１８変異体対立遺伝子は、ヌクレオチド１５４，４７１において、シトシン（ｃ）からグアニン（ｇ）へ、シトシン（ｃ）からアデニン（ａ）へ、又はシトシン（ｃ）からチミン（ｔ）への置換を有し得る。一実施形態では、ＪＷ１８変異体対立遺伝子は、ヌクレオチド１５４，４７１におけるシトシン（ｃ）からチミン（ｔ）への変化である。
【０１７３】
［０１７３］本発明の方法は、ＮＯＤ２遺伝子座のコード領域、又は非コード領域（例えば、イントロン、若しくはプロモーター領域）中に位置する、これら又は他のＮＯＤ２変異体対立遺伝子を用いて実行することができることを理解されたい。本発明の方法は、これらに限定されないが、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２及びＳＮＰ１３の対立遺伝子、並びに他のコード領域及び非コード領域の変異体を含めた、１、２、３又は４つ以上のＮＯＤ２変異体の存在を決定することを含むことができることをさらに理解されたい。
【０１７４】
［実施例］
［０１７４］本発明を、具体例を利用してより詳細に記載する。以下の実施例は、例示の目的で提供するのであって、いかなる場合であっても、それらの実施例により本発明を制限する意図はない。当業者であれば、変化させるか又は改変しても、本質的に同じ結果を得ることができる、多様な重要でないパラメータを容易に認識するであろう。
【０１７５】
実施例１．抗ＴＮＦα生物学的製剤のレベルを測定するための新規の移動度シフトアッセイ。
［０１７５］この実施例は、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、蛍光標識化ＴＮＦαに対する抗ＴＮＦα薬の結合を検出する、患者試料（例えば、血清）中の抗ＴＮＦα薬の濃度を測定するための新規の均一アッセイを例証する。当該アッセイは好都合である。その理由は、当該アッセイが、洗浄のステップの必要性をなくすこと、可視スペクトル及び／又はＩＲスペクトル上における検出を可能にし、それにより、バックグラウンド及び血清の干渉の問題を減少させる蛍光物質を使用すること、蛍光標識検出の高い感度により、低い力価を有する患者において抗ＴＮＦα薬を検出する能力を増加させること、並びに液相反応として行われ、それにより、固体表面、例として、ＥＬＩＳＡ用プレートにつながることによってエピトープが変化する機会が低下することによる。
【０１７６】
［０１７６］例示的な一実施形態では、ＴＮＦαを、蛍光物質（例えば、アレクサ６４７）を用いて標識し、蛍光物質は、可視スペクトル及びＩＲスペクトルのいずれか又は両方上で検出することができる。標識化ＴＮＦαを液相反応中でヒト血清と共にインキュベートして、血清中に存在する抗ＴＮＦα薬を結合させる。また、標識化ＴＮＦαを液相反応中で既知の量の抗ＴＮＦα薬と共にインキュベートして、検量線を作成することもできる。インキュベーションに続いて、試料を、サイズ排除カラム上に直接充填する。標識化ＴＮＦαに対する抗ＴＮＦα薬の結合により、標識化ＴＮＦα単独と比較して、ピークの左方向へのシフトが生じる。次いで、血清試料中に存在する抗ＴＮＦα薬の濃度を、検量線及び対照と比較することができる。
【０１７７】
［０１７７］図１は、サイズ排除ＨＰＬＣを使用して、ＴＮＦα−アレクサ６４７とヒュミラ（商標）（アダリムマブ）との間の結合を検出する、本発明のアッセイの実施例を示す。図１に示すように、ＴＮＦα−アレクサ６４７に対するヒュミラ（商標）の結合が、ＴＮＦα−アレクサ６４７のピークの、左へのシフトを引き起こした。
【０１７８】
［０１７８］図２は、ＴＮＦα−アレクサ６４７に対するヒュミラ（商標）の結合の用量反応曲線を示す。特に、図２Ａは、ヒュミラ（商標）が、サイズ排除クロマトグラフィーアッセイにおいて、ＴＮＦα−アレクサ６４７のシフトを用量依存的に増加させたことを示す。図２Ｂは、サイズ排除クロマトグラフィーアッセイにおいて、１％ヒト血清の存在が、ＴＮＦα−アレクサ６４７のシフトに対して顕著な作用を示すことはなかったことを示す。図２Ｃは、サイズ排除クロマトグラフィーアッセイにおいて、プールしたＲＦ陽性血清の存在が、ＴＮＦα−アレクサ６４７のシフトに対して顕著な作用を示すことはなかったことを示す。
【０１７９】
［０１７９］したがって、この実施例は、抗ＴＮＦα薬、例として、ヒュミラ（商標）を投与している患者をモニターして、（１）適切な薬物投与量の決定を導く場合、（２）薬物の薬物動態を評価し、例えば、身体から薬物が急速に除かれ過ぎていないかどうかを決定する場合、及び（３）治療の決定を導く、例えば、現在の抗ＴＮＦα薬から異なるＴＮＦα阻害剤にか、又は別のタイプの療法に切り換えるかどうかの決定を導く場合の本発明の有用性を実証している。
【０１８０】
実施例２．ＨＡＣＡ及びＨＡＨＡのレベルを測定するための新規の移動度シフトアッセイ。
［０１８０］この実施例は、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、蛍光標識化抗ＴＮＦα薬に対する、患者試料（例えば、血清）中の自己抗体（例えば、ＨＡＣＡ及び／又はＨＡＨＡ）の結合を検出する、これらの自己抗体の濃度を測定するための新規の均一アッセイを例証する。当該アッセイは好都合である。その理由は、当該アッセイが、低い親和性のＨＡＣＡ及びＨＡＨＡを除去する洗浄のステップの必要性をなくすこと、可視スペクトル及び／又はＩＲスペクトル上における検出を可能にし、それにより、バックグラウンド及び血清の干渉の問題を減少させる蛍光物質を使用すること、蛍光標識検出の高い感度により、低い力価を有する患者においてＨＡＣＡ及びＨＡＨＡを検出する能力を増加させること、並びに液相反応として行われ、それにより、固体表面、例として、ＥＬＩＳＡ用プレートにつながることによってエピトープが変化する機会が低下することによる。
【０１８１】
［０１８１］ＴＮＦα阻害剤に対して生成される自己抗体（例えば、ＨＡＣＡ、ＨＡＨＡ等）を測定する臨床的な有用性は、ＨＡＣＡが１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇのインフリキシマブを用いて治療した関節リウマチ患者の５３％、２１％及び７％において検出された事実によって示されている。インフリキシマブを、メトトレキサートと組み合わせた場合、抗体の発生率は、より低く、１５％、７％及び０％であり、このことは、免疫抑制剤併用療法が抗薬物応答を低下させるのに有効であることを示しているが、また、高い用量の抗ＴＮＦα抗体が寛容をもたらす可能性があるであろうことも示している。クローン病の場合、さらにより高い発生率が報告された。５回目の注入後、患者の６１％がＨＡＣＡを有した。ＨＡＣＡが存在する場合、臨床応答が短縮した。Ｒｕｔｇｅｅｒｔｓ、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３４８：６０１〜６０８頁（２００３）を参照されたい。インフリキシマブ及びＨＡＣＡのレベルを、１５５人の患者において２００５〜２００８年の３年にわたり測定した遡及的研究から、ＨＡＣＡが、炎症性腸疾患を有する患者の２２．６％（Ｎ＝３５）において検出されることが実証された。Ａｆｉｆら、「Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｕｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉ−Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｗｅｅｋ；２００９年５月３０日〜６月３日；Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬにおいて提示された論文を参照されたい。著者らは、臨床症状に基づいて治療を変化させるだけでは、管理が不適切になる可能性があると結論付けた。
【０１８２】
［０１８２］均一移動度シフトアッセイは、現在の方法、例として、図３に示す、患者試料中の自己抗体（例えば、ＨＡＣＡ及び／又はＨＡＨＡ）の濃度を測定するための細胞架橋アッセイ（ｂｒｉｄｇｉｎｇ  ａｓｓａｙ）を上回って好都合である。その理由は、考案の方法が、自己抗体、例として、ＨＡＣＡの濃度を、非特異的結合及びＥＬＩＳＡ用プレートに由来する固相干渉なしで測定することが可能であり、抗ＴＮＦα薬に由来する干渉もなく（例えば、細胞架橋アッセイを用いると、ＨＡＣＡの測定を、抗ＴＮＦα薬の谷レベルにおいて行わなければならない）、抗体の多価に依存することは全くない（例えば、ＩｇＧ４抗体が、二重特異性を示し、同じ抗原と架橋結合することができないので、細胞架橋アッセイを使用すると、ＩｇＧ４抗体は検出されない）からである。したがって、本発明は、現在の方法を上回る以下の利点を少なくとも有する：抗原の固体表面への付着を回避する（変性が回避される）利点、ＩｇＧ４の作用を排除する利点、治療用抗体の谷の問題を克服する利点、弱い親和性を有する抗体を検出する利点、無関係のＩｇＧの非特異的結合を排除する利点、並びに検出の感度及び特異性を増加させる利点。
【０１８３】
［０１８３］例示的な一実施形態では、抗ＴＮＦα薬（例えば、レミケード（商標））を、蛍光物質（例えば、アレクサ６４７）を用いて標識し、蛍光物質は、可視スペクトル及びＩＲスペクトルのいずれか又は両方上で検出することができる。標識化抗ＴＮＦα薬を液相反応中でヒト血清と共にインキュベートして、血清中に存在するＨＡＣＡ及びＨＡＨＡを結合させる。また、標識化抗ＴＮＦα薬を液相反応中で既知の量の抗ＩｇＧ抗体と共にインキュベートして、検量線を作成することもできる。インキュベーションに続いて、試料を、サイズ排除カラム上に直接充填する。標識化抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の結合により、標識化薬物単独と比較して、ピークの左方向へのシフトが生じる。次いで、血清試料中に存在するＨＡＣＡ及びＨＡＨＡの濃度を、検量線及び対照と比較することができる。図４は、レミケード（商標）に対して生成したＨＡＣＡ／ＨＡＨＡの濃度を測定するための、本発明の自己抗体の検出アッセイの例示的な概要を示す。特定の場合には、高いＨＡＣＡ／ＨＡＨＡのレベルにより、レミケード（商標）を用いる現在の療法を、別の抗ＴＮＦα薬、例として、ヒュミラ（商標）に切り換えるべきであることが示される。
【０１８４】
［０１８４］このアッセイの原理は、複合体の分子量の増加に起因して、サイズ排除−高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）上において、抗体が結合しているアレクサ６４７標識化レミケード複合体に、遊離のアレクサ６４７標識化レミケードに比して、移動度のシフトが生じることに基づく。
【０１８５】
［０１８５］この実施例におけるクロマトグラフィーを、Ａｇｉｌｅｎｔ−１２００ＨＰＬＣシステム上で、５，０００〜７００，０００の分子量分画範囲を有するＢｉｏ−Ｓｅｐの３００×７．８ｍｍのＳＥＣ−３０００カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）、及び１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４の移動相を使用して、０．５ｍＬ／分の流速で、６５０ｎｍにおけるＵＶ検出を用いて実施した。各分析について、１００μＬの試料体積をカラム上に充填する。
【０１８６】
［０１８６］抗体が結合しているアレクサ６４７標識化レミケード複合体を、ＳＥ−ＨＰＬＣ分析の前に、既知の量の抗体及びアレクサ６４７標識化レミケードを、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．３の溶出用緩衝液中、室温で１時間インキュベートすることによって形成させる。
【０１８７】
［０１８７］図５は、本発明のサイズ排除クロマトグラフィーアッセイを使用して検出した場合のレミケード（商標）−アレクサ６４７に対する抗ヒトＩｇＧ抗体の結合の用量応答分析を示す。レミケード（商標）−アレクサ６４７に対する抗ＩｇＧ抗体の結合が、レミケード（商標）−アレクサ６４７のピークの、左へのシフトを引き起こした。図６は、本発明のサイズ排除クロマトグラフィーアッセイを使用して検出した場合のレミケード（商標）−アレクサ６４７に対する抗ヒトＩｇＧ抗体の結合の第２の用量応答分析を示す。レミケード（商標）−アレクサ６４７のピークの、左へのシフトによって示されるように、より高い量の抗ＩｇＧ抗体から、抗ＩｇＧ／レミケード（商標）−アレクサ６４７の複合体の形成の用量依存性の増加が生じた。図７は、レミケード（商標）−アレクサ６４７に対する抗ＩｇＧ抗体の結合の用量反応曲線を示す。
【０１８８】
［０１８８］図８は、１００μｌの注入試料を用いて、本発明のサイズ排除クロマトグラフィーアッセイを使用して検出した場合の、正常ヒト血清及びＨＡＣＡ陽性血清中におけるレミケード（商標）−アレクサ６４７の免疫複合体形成を示す。図８に示すように、レミケード（商標）−アレクサ６４７に対する、患者試料中に存在するＨＡＣＡの結合が、レミケード（商標）−アレクサ６４７のピークの、左へのシフトを引き起こした。したがって、本発明のサイズ排除クロマトグラフィーアッセイは、特に好都合である。その理由は、当該アッセイが、レミケード（商標）の存在下で、ＨＡＣＡを測定すること、患者の療法を継続しながら活用され得ること、ＨＡＣＡの弱い結合及び強い結合の両方を測定すること、混合し、読み取る移動度シフトアッセイであること、並びに標識化レミケード（商標）を使用して、ＨＡＣＡとレミケード（商標）とを平衡化する他のアプローチに拡大適用することができることによる。
【０１８９】
［０１８９］図９は、細胞架橋アッセイ又は本発明の移動度シフトアッセイを使用して実施した、２０人の患者の血清試料から得られたＨＡＣＡの測定の概要を示す。この比較研究から、提示する方法は、現在の方法を上回って、感度を増加させるに至ったことが実証されている。その理由は、細胞架橋アッセイを使用して測定した場合、ＨＡＣＡについて陰性であった３つの試料が実際には、本発明の移動度シフトアッセイを使用して測定した場合、ＨＡＣＡ陽性であったからである（患者番号ＳＫ０７０７０３０５、ＳＫ０７０７０５９５及びＳＫ０７１１００３５を参照されたい）。
【０１９０】
［０１９０］したがって、この実施例は、抗ＴＮＦα薬（例えば、レミケード（商標））を投与している患者をモニターして、薬物に対する自己抗体（例えば、ＨＡＣＡ及び／又はＨＡＨＡ）の存在又はレベルを検出する場合の本発明の有用性を実証している。本発明が有用である理由は、そのような免疫応答が、過敏性反応、並びに抗ＴＮＦα薬の薬物動態及び体内分布の劇的な変化と関連がある場合があり、そうした反応及び変化は、薬物を用いたさらなる治療を妨げるからである。
【０１９１】
［０１９１］結論として、実施例１及び２は、ＴＮＦα及び抗ＴＮＦα抗体を、アレクサ６４７を用いて効率的に標識することができることを実証している。標識化ＴＮＦα−アレクサ６４７を、抗ＴＮＦα抗体と共にインキュベートすると、標識化ＴＮＦα／抗ＴＮＦα抗体の複合体の保持時間がシフトし、シフトを引き起こす抗ＴＮＦα抗体の量を、ＨＰＬＣを用いて定量化することができた。さらに、標識化抗ＴＮＦα抗体を、抗ヒトＩｇＧ抗体と共にインキュベートすると、標識化抗ＴＮＦα抗体／抗ＩｇＧ抗体の複合体の保持時間がシフトし、シフトを引き起こす抗ＩｇＧ抗体の量を、ＨＰＬＣを用いて定量化することもできた。さらに、アッセイ系中の低い血清含有量は、ＨＰＬＣによる分析に対してほとんど作用を示さないことも示された。最後に、検量線を、抗ＴＮＦα抗体アッセイ及びＨＡＣＡ／ＨＡＨＡアッセイのために生成することができ、検量線を使用して、患者血清の抗ＴＮＦα抗体又はＨＡＣＡ／ＨＡＨＡのレベルを定量化することができた。好都合なことに、本発明は、特定の態様では、薬物及び薬物に対する抗体の両方を測定するために開発した移動度シフトアッセイ、例として、混合し、読み取る、均一アッセイを提供する。検量線を、抗ＴＮＦα生物学的製剤のレミケード及びヒュミラについて、また、レミケードに対するＨＡＣＡ抗体についても生成した。移動度シフトアッセイフォーマットは、ＥＬＩＳＡとは異なり、抗原による固体表面の被覆を排除し、無関係のＩｇＧの非特異的結合の影響を受けない。アッセイフォーマットは、単純であるが、非常に感度が高く、このフォーマットを使用して、全ての抗ＴＮＦα生物学的薬物（例えば、レミケード、ヒュミラ、エンブレル及びシムジア）、並びに患者血清中の中和抗体（抗レミケードＲｅｍｉｃａｄｅ（商標））を検出することができる。
【０１９２】
実施例３．新規の移動度シフトアッセイを使用する、患者血清中のヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）及びインフリキシマブ（ＩＦＸ）のレベルの測定。
要約
［０１９２］背景：インフリキシマブ（ＩＦＸ）は、ＴＮＦαに対するキメラモノクローナル抗体治療剤であり、この治療剤は、自己免疫疾患、例として、関節リウマチ（ＲＡ）及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を治療するのに有効であることが示されている。しかし、ＩＦＸに対する抗体が、一部のＩＦＸ治療患者において、ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）の検出を通して見出され、ＨＡＣＡは、薬物の有効性を低下させるか又は有害作用を引き起こす可能性がある。個々の患者においてＨＡＣＡ及びＩＦＸのレベルをモニターすることは、ＩＦＸの投与及びＩＦＸを用いる治療を最適化するのを支援することができる。ＨＡＣＡを検出するための現在の方法は、固相アッセイに基づいており、これらの方法は、血行中のＩＦＸの存在がＨＡＣＡの存在をマスクする可能性があり、したがって、ＩＦＸの投与の少なくとも８週間後にようやく測定を行うことができるという事実によって制限される。さらに、この時間の経過は、血液循環中の高分子量の免疫複合体の急速なクリアランスにより、アッセイをさらに混乱させる。本発明者らは、これらの欠点を克服するために、ＩＦＸを用いて治療する患者中のＩＦＸ及びＨＡＣＡの血清レベルを測定するための新しい方法を開発し、評価するに至った。
【０１９３】
［０１９３］方法：新規の非放射標識性、液相、サイズ排除（ＳＥ）−ＨＰＬＣ移動度シフトアッセイを開発して、ＩＦＸを用いて治療する患者から得られた血清中のＨＡＣＡ及びＩＦＸのレベルを測定した。免疫複合体（例えば、ＴＮＦα／ＩＦＸ又はＩＦＸ／ＨＡＣＡ）、遊離のＴＮＦα又はＩＦＸ、及び結合型／遊離の比を、高い感度で決定及び計算することができる。異なる濃度のＩＦＸ又はプールしたＨＡＣＡ陽性血清と共にインキュベートすることによって生成した検量線を用いて、ＩＦＸ又はＨＡＣＡの血清濃度を決定した。本発明者らは、この新規アッセイを使用して、再発に至った、ＩＦＸを用いて治療するＩＢＤ患者から収集した血清中のＩＦＸ及びＨＡＣＡのレベルを測定し、結果を、従来の細胞架橋ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｂｒｉｄｇｅ  ＥＬＩＳＡ  ａｓｓａｙ）により得られた結果と比較するに至った。
【０１９４】
［０１９４］結果：用量反応曲線を、新規アッセイから高い感度で生成した。ＨＡＣＡの検出を、過剰なＩＦＸの存在下で実証した。ＩＦＸを用いて治療する患者から得られた１１７個の血清試料中、６５個の試料が検出限界を上回るＩＦＸレベルを有することを見出し、平均は、１１．０＋６．９ｍｇ／ｍＬであった。ＨＡＣＡレベルについては、３３個（２８．２％）の試料が陽性であることを見出し、一方、細胞架橋ＥＬＩＳＡアッセイは、わずか２４個の陽性試料を検出したに過ぎない。また、本発明者らは、細胞架橋アッセイにより決定した試料から、９つの偽陰性及び９つの偽陽性も同定した。１１人の患者において、ＩＦＸ治療のコースの間に、ＨＡＣＡレベルが増加することを見出し、一方、ＩＦＸレベルは顕著に減少することを見出した。
【０１９５】
［０１９５］結論：新規の非放射標識性、液相、移動度シフトアッセイを開発して、ＩＦＸを用いて治療する患者から得られた血清中のＩＦＸ及びＨＡＣＡのレベルを測定するに至った。当該アッセイは、高い感度及び精度を有し、得られた結果には、再現性があった。この新規アッセイを好都合に使用して、ＨＡＣＡ及びＩＦＸのレベルを、患者の療法を継続しながら測定することができる。
【０１９６】
序論
［０１９６］腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）は、自己免疫疾患、例として、クローン病（ＣＤ）及び関節リウマチ（ＲＡ）の病変形成において極めて重要な役割を果たす。ＴＮＦαを、治療用抗体、例として、インフリキシマブ（ヒト−マウスのキメラモノクローナルＩｇＧ１κ）又はアダリムマブ（完全ヒトモノクローナル抗体）を用いて遮断することによって、ＣＤ及びＲＡにおける疾患活性が低下することは十分に記載されている。しかし、約３０〜４０％の患者が、抗ＴＮＦα療法に応答せず、一部の患者は、十分な応答を欠くことに起因して、より高い用量又は投与頻度による調節が必要になる。個々の患者における薬物の生物学的利用率及び薬物動態の差が、治療の不成功に寄与し得る。患者にＨＡＣＡ／ＨＡＨＡを発生させる、薬物の免疫原性により、軽度のアレルギー応答からアナフィラキシー性ショックまでの様々な有害反応が生じる可能性があるであろう。これらの問題は今では、多くの研究者、薬物規制機関、健康保険会社及び薬物製造者が認識している。さらに、１つの抗ＴＮＦα薬に対する続発性の応答不全を示した多くの患者が、他の抗ＴＮＦα薬への切換えから利益を得、このことから、治療のために使用するタンパク質に対して特異的に作られる中和抗体の役割も示唆される（Ｒａｄｓｔａｋｅら、Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．、６８（１１）：１７３９〜４５頁（２００９））。したがって、薬物投与を、個々の患者に合わせて手直しすることができ、長期の療法を、患者に対するリスクがほとんど又は全くなく、有効かつ経済的に行うことができるように、患者を薬物及びＨＡＣＡ／ＨＡＨＡのレベルについてモニターすることが正当化される（Ｂｅｎｄｔｚｅｎら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、４４（７）：７７４〜８１頁（２００９））。
【０１９７】
［０１９７］いくつかの酵素結合イムノアッセイが、薬物及びＨＡＣＡ／ＨＡＨＡの循環レベルを評価するために使用されている。図１０は、本発明の新規のＨＡＣＡアッセイと比較した、ＨＡＣＡの測定のために利用可能な現在のアッセイの概要を示す。現在の方法の制限のうちの１つは、血行中に測定可能な量の薬物がある場合、抗体のレベルを測定するのが困難であることである。ＩＦＸの投与の少なくとも８週間後にようやく測定を実施することができる、ＨＡＣＡを検出するための現在の固相法とは対照的に、本発明の新規アッセイは、非放射標識性、液相、サイズ排除（ＳＥ）−ＨＰＬＣアッセイであり、ＩＦＸを用いる治療を継続しながら、患者から得られた血清中のＨＡＣＡ及びＩＦＸのレベルを測定することが可能である。
【０１９８】
［０１９８］患者において、抗ＴＮＦα生物学的薬物及びＴＮＦα生物学的薬物に対する抗体の血清濃度を測定することについての理論的根拠を、以下に示す：（１）臨床治験におけるＰＫ研究のため、（２）生物学的薬物に対する患者の免疫応答をモニターすることが、ＦＤＡにより、臨床治験の間に要求される場合がある、（３）ＨＡＣＡ又はＨＡＨＡを測定することによって、生物学的薬物に対する患者の応答をモニターして、各患者についての薬物投与量を導くため、及び（４）最初の薬物が成功しない場合に、異なる、生物学的薬物に切り換えるための手引きとして使用するため。
【０１９９】
方法
［０１９９］患者血清中のインフリキシマブ（ＩＦＸ）のレベルのＳＥ−ＨＰＬＣ分析。ヒト組換えＴＮＦαを、蛍光物質（「Ｆｌ」、例えば、アレクサフルオール（登録商標）４８８等）を用いて、製造元の指示に従って標識した。標識化ＴＮＦαを、異なる量のＩＦＸ又は患者血清と共に室温で１時間インキュベートした。１００μｌの体積の試料を、ＨＰＬＣシステム上のサイズ排除クロマトグラフィーにより解析した。ＦＬＤを使用して遊離ＴＮＦα−Ｆｌ及び結合しているＴＮＦα−Ｆｌ免疫複合体をそれらの保持時間に基づいてモニターした。血清ＩＦＸレベルを、検量線から計算した。
【０２００】
［０２００］患者血清中のＨＡＣＡのレベルのＳＥ−ＨＰＬＣ分析。精製ＩＦＸを、Ｆｌを用いて標識した。標識化ＩＦＸを、異なる希釈度のプールしたＨＡＣＡ陽性血清又は希釈した患者血清と共に室温で１時間インキュベートした。１００μｌの体積の試料を、ＨＰＬＣシステム上のサイズ排除クロマトグラフィーにより解析した。ＦＬＤを使用して、遊離ＩＦＸ−Ｆｌ及び結合しているＩＦＸ−Ｆｌ免疫複合体をそれらの保持時間に基づいてモニターした。結合しているＩＦＸ−Ｆｌと遊離ＩＦＸ−Ｆｌとの比を使用して、ＨＡＣＡのレベルを決定した。
【０２０１】
［０２０１］血清中のＨＡＣＡを測定するための移動度シフトアッセイの手順。このアッセイの原理は、複合体の分子量の増加に起因して、サイズ排除−高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）上において、ＨＡＣＡが結合しているＦｌ標識化インフリキシマブ（ＩＦＸ）複合体に、遊離のＦｌ標識化ＩＦＸに比して、移動度のシフトが生じることに基づく。クロマトグラフィーを、Ａｇｉｌｅｎｔ−１２００ＨＰＬＣシステム中で、５，０００〜７００，０００の分子量分画範囲を有するＢｉｏ−Ｓｅｐの３００×７．８ｍｍのＳＥＣ−３０００カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）、及び１×ＰＢＳ、ｐＨ７．３の移動相を使用して、０．５〜１．０ｍＬ／分の流速で、ＦＬＤ検出を用いて実施する。各分析について、１００μＬの試料体積をカラム上に充填する。ＨＡＣＡが結合しているＦｌ標識化ＩＦＸ複合体を、ＳＥ−ＨＰＬＣ分析の前に、ＩＦＸ治療患者から得られた血清及びＦｌ標識化ＩＦＸを、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４の溶出用緩衝液中、室温で１時間インキュベートすることによって形成する。また、アッセイの妥当性を確認するために、各種の干渉物質、例として、リウマチ因子及びＴＮＦ−αの存在下でもアッセイを行った。
【０２０２】
結果
［０２０２］図１１は、高分子量の複合体の移動度のシフトに起因する、遊離のＩＦＸ−Ｆｌからの、ＨＡＣＡが結合しているＩＦＸ−Ｆｌ複合体の分離を示す。パネルｃ及びｄに見られるように、蛍光ピークの保持時間が、２１．８分から１５．５〜１９．０分にシフトした。より多くのＨＡＣＡが反応混合物中に存在するほど、より少ない遊離のＩＦＸ−Ｆｌがクロマトグラム中に留まり、より多くの免疫複合体が形成される。図１２は、ＨＡＣＡの付加が引き起こした蛍光ピークのシフトの用量反応曲線を示す。本発明者らは、ＨＡＣＡ陽性の試料を使用して、１：１０００の希釈度の血清を用いて、ピークのシフトを検出することができた。
【０２０３】
［０２０３］図１３は、高分子量の複合体の移動度のシフトに起因する、遊離のＴＮＦα−Ｆｌからの、ＩＦＸが結合しているＴＮＦα−Ｆｌ複合体の分離を示す。パネルｃ及びｄに見られるように、蛍光ピークの保持時間が、２４分から１３〜１９．５分にシフトした。より多くのＩＦＸが反応混合物中に存在するほど、より少ない遊離のＴＮＦα−Ｆｌがクロマトグラム中に留まり、より多くの免疫複合体が形成される。図１４は、ＩＦＸの付加が引き起こしたＴＮＦα−Ｆｌのピークのシフトの用量反応曲線を示す。付加したＩＦＸに基づくと、検出限界は、血清中において、１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＸである。
【０２０４】
［０２０４］細胞架橋アッセイにより測定したＨＡＣＡ陽性患者及びＨＡＣＡ陰性患者から得られた血清試料を試験することによって、本発明の新規の移動度シフトアッセイの妥当性を確認した（表２）。本発明者らは、このアッセイを使用して、５０人の健常な対象及び１１７人のＩＦＸを用いて治療するＩＢＤ患者から得られた血清試料を分析するに至った。５０個の健常対象の試料は全て、検出限界を下回るＩＦＸのレベルを有し、一方、患者試料のうち６５個は、１１．０μｇ／ｍｌの平均ＩＦＸ濃度を有する。表３に、細胞架橋アッセイ及び移動度シフトアッセイにより測定した健常な対照及びＩＦＸを用いて治療するＩＢＤ患者の血清中のＨＡＣＡのレベルを示す。細胞架橋アッセイは、移動度シフトアッセイよりも少ないＨＡＣＡ陽性患者を検出し、より多くの偽陰性及びより多くの偽陽性を検出した。
【表２】
0005960707.tif 000007
【表３】
0005960707.tif 000008
【０２０５】
［０２０５］図１５は、ＩＦＸ治療のコースの間のＩＢＤ患者における、ＨＡＣＡのレベルとＩＦＸ濃度との関係を示す。ＨＡＣＡは、早くもＶ１０（第３０週）に検出することができ、ＩＦＸ治療の間に一部の患者において増加し続けた。図１６は、ＨＡＣＡを、本発明のアッセイを使用して、ＩＦＸの存在下で検出することができることを示す。血清中のＨＡＣＡのより高いレベルは、ＩＦＸのより低いレベルと関連があり、この関連性を検出することができるであろう（例えば、生物学的利用率の低下）。したがって、ＩＦＸを用いる治療を継続しながら、ＨＡＣＡを早期に検出することによって、医師及び／又は患者を、他の抗ＴＮＦ薬に切り換えるか又はＩＦＸの用量を増加させるように導くことができる。
【０２０６】
［０２０６］（ＣＶパラメータに基づく）アッセイ内及びアッセイ間の正確さ、並びに干渉物質に対する感受性の観点から、アッセイの妥当性を確認した。この分析を、以下の表に示す。
【表４】
0005960707.tif 000009
【表５】
0005960707.tif 000010
【表６】
0005960707.tif 000011
【０２０７】
結論
［０２０７］抗ＴＮＦα生物学的薬物は、蛍光物質（「Ｆｌ」）を用いて容易に標識することができ、ＨＡＣＡ／ＨＡＨＡを測定するために使用する移動度シフトアッセイフォーマットは、均一アッセイであり、典型的なＥＬＩＳＡとは異なり、抗原による固体表面の被覆も、複数回の洗浄のステップ及びインキュベーションのステップもない。Ｆｌ標識化ＩＦＸをＨＡＣＡ陽性血清とインキュベートすると、免疫複合体が形成され、この免疫複合体は、ＳＥ−ＨＰＬＣにおいて、遊離のＦｌ標識化ＩＦＸと比較して、異なる位置に溶出し、したがって、ＨＡＣＡの量を定量化することができる。他の血清成分の存在は、移動度シフトアッセイに対して作用をほとんど示さない。移動度シフトアッセイフォーマットは、ＥＬＩＳＡとは異なり、無関係のＩｇＧの非特異的結合の影響を受けず、ＩｇＧ４アイソタイプを検出する。健常血清試料は、Ｆｌ標識化ＩＦＸの移動度のシフトを引き起こさず、ＩＦＸを用いて治療する患者の２８．２％がＨＡＣＡを有することが本発明のアッセイにより見出された。したがって、本明細書に記載するアッセイフォーマットは、非常に感度が高く、患者血清中の全ての生物学的薬物（例えば、レミケード、ヒュミラ、エンブレル及びシムジア）並びにそれらの抗体（例えば、抗レミケード、抗ヒュミラ、抗エンブレル及び抗シムジア）を検出するために適用することができる。とりわけ、ＨＡＣＡを、本発明の移動度シフトアッセイを使用して、ＩＦＸの存在下で検出することができるので、ＩＦＸを用いる治療を継続しながら、ＨＡＣＡを早期に検出することによって、医師及び／又は患者を、他の抗ＴＮＦ薬に切り換えるか又はＩＦＸの今後の用量を増加させるように導くことができる。
【０２０８】
［０２０８］本発明者らは、新規の非放射標識性、液相、ＳＥ−ＨＰＬＣアッセイを開発して、ＩＦＸを用いて治療する患者から得られた血清試料中のＩＦＸ及びＨＡＣＡのレベルを測定するに至った。新規アッセイは、高い感度、精度及び正確さを有し、結果には、高い再現性があり、これらのことは、このアッセイを多数のヒト血清試料の日常的な試験に適したものにする。新しいアッセイフォーマットは、ＥＬＩＳＡとは異なり、抗原による固体表面の被覆を排除し、無関係のＩｇＧの非特異的結合の影響を受けない。本明細書に記載するアッセイフォーマットのこれらの利点は、試験の偽陰性及び偽陽性の結果を低下させる。好都合なことに、本発明のアッセイフォーマットは、非常に感度が高く、患者の療法を継続しながら、血清中に存在する全ての生物学的薬物及びそれらの抗体を検出するために使用することができる。
【０２０９】
実施例４．新規の移動度シフトアッセイを使用する、患者血清中の中和ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）と非中和ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）との間の区別。
［０２０９］この実施例は、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、蛍光標識化ＴＮＦαの存在下で、蛍光標識化抗ＴＮＦα薬に対する、自己抗体（例えば、ＨＡＣＡ）の結合を検出して、患者試料（例えば、血清）中のこれらの自己抗体の濃度を測定するため、及びそのような自己抗体が中和自己抗体であるか又は非中和自己抗体であるかを決定するための新規の均一アッセイを示す。これらのアッセイは好都合である。その理由は、当該アッセイが、低い親和性のＨＡＣＡを除去する洗浄のステップの必要性をなくすこと、可視スペクトル及び／又はＩＲスペクトル上における検出を可能にし、それにより、バックグラウンド及び血清の干渉の問題を減少させる、明確に異なる蛍光物質を使用すること、蛍光標識検出の高い感度により、低い力価を有する患者において中和ＨＡＣＡ又は非中和ＨＡＣＡを検出する能力を増加させること、並びに液相反応として行われ、それにより、固体表面、例として、ＥＬＩＳＡ用プレートにつながることによってエピトープが変化する機会が低下することによる。
【０２１０】
［０２１０］例示的な一実施形態では、抗ＴＮＦα薬（例えば、レミケード（商標））を、蛍光物質「Ｆ１」を用いて標識し（例えば、図１７Ａを参照されたい）、蛍光物質は、可視スペクトル及びＩＲスペクトルのいずれか又は両方上で検出することができる。同様に、ＴＮＦαも、蛍光物質「Ｆ２」を用いて標識し（例えば、図１７Ａを参照されたい）、この蛍光物質もまた、可視スペクトル及びＩＲスペクトルのいずれか又は両方上で検出することができ、「Ｆ１」と「Ｆ２」とは、異なる蛍光物質である。標識化抗ＴＮＦα薬を、液相反応中でヒト血清と共にインキュベートし、標識化ＴＮＦαを反応に添加して、血清中に存在する標識化抗ＴＮＦα薬、標識化ＴＮＦα及び／又はＨＡＣＡの間で複合体（すなわち、免疫複合体）を形成させる。インキュベーションに続いて、試料を、サイズ排除カラム上に直接充填する。自己抗体（例えば、ＨＡＣＡ）及び標識化ＴＮＦαの両方の、標識化抗ＴＮＦα薬に対する結合により、自己抗体と標識化抗ＴＮＦα薬との間の二成分複合体（例えば、図１７Ａの「免疫複合体２」）、標識化薬物単独又は標識化ＴＮＦα単独と比較して、ピークの左方向へのシフトが生じる（例えば、図１７Ａの「免疫複合体１」）。自己抗体（例えば、ＨＡＣＡ）と標識化ＴＮＦαと標識化抗ＴＮＦα薬との、この三成分複合体の存在は、血清試料中に存在する自己抗体が、自己抗体（例えば、ＨＡＣＡ）の非中和形態であり、したがって、自己抗体は、抗ＴＮＦα抗体とＴＮＦαとの間の結合を妨げないことを示している。１つの特定の実施形態では、図１７Ａに示すように、非中和ＨＡＣＡが血清中に存在する場合には、Ｆ１−レミケード（商標）及びＦ２−ＴＮＦαの両方について、シフトを観察し、結果として、免疫複合体１のピーク及び免疫複合体２のピークの両方の増加、並びに遊離のＦ１−レミケード（商標）のピーク及び遊離のＦ２−ＴＮＦαのピークの減少が生じる。しかし、自己抗体（例えば、ＨＡＣＡ）と標識化ＴＮＦαと標識化抗ＴＮＦα薬との三成分複合体の不在下における、自己抗体（例えば、ＨＡＣＡ）と標識化抗ＴＮＦα薬との間の二成分複合体の存在（例えば、図１７Ｂの「免疫複合体２」）は、血清試料中に存在する自己抗体が、自己抗体（例えば、ＨＡＣＡ）の中和形態であり、したがって、自己抗体は、抗ＴＮＦα抗体とＴＮＦαとの間の結合を妨げることを示している。１つの特定の実施形態では、図１７Ｂに示すように、中和ＨＡＣＡが血清中に存在する場合には、Ｆ１−レミケード（商標）について、シフトを観察し、結果として、免疫複合体２のピークの増加、遊離のＦ１−レミケード（商標）のピークの減少が生じ、遊離のＦ２−ＴＮＦαのピークには変化が生じない。特定の場合には、中和ＨＡＣＡの存在が、レミケード（商標）を用いる現在の療法を、別の抗ＴＮＦα薬、例として、ヒュミラ（商標）に切り換えるべきであることを示している。
【０２１１】
［０２１１］代替の実施形態では、最初に、標識化抗ＴＮＦα薬を、液相反応中でヒト血清と共にインキュベートして、標識化抗ＴＮＦα薬と血清中に存在するＨＡＣＡとの間で複合体（すなわち、免疫複合体）を形成させる。インキュベーションに続いて、試料を、第１のサイズ排除カラム上に直接充填する。標識化抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体（例えば、ＨＡＣＡ）の結合により、標識化薬物単独と比較して、ピークの左方向へのシフトが生じる（例えば、図１８の「免疫複合体２」）。次いで、標識化ＴＮＦαを反応に添加して、標識化ＴＮＦαが、標識化抗ＴＮＦα薬に対する結合について、自己抗体（例えば、ＨＡＣＡ）に置き換わり（例えば、自己抗体（例えば、ＨＡＣＡ）と競合し）、それにより、標識化抗ＴＮＦα薬と標識化ＴＮＦαとの間で複合体（すなわち、免疫複合体）を形成することが可能であるかどうかを決定する。インキュベーションに続いて、試料を、第２のサイズ排除カラム上に直接充填する。標識化ＴＮＦαに対する標識化抗ＴＮＦα薬の結合により、標識化ＴＮＦα単独と比較して、ピークの左方向へのシフトが生じる（例えば、図１８の「免疫複合体３」）。標識化ＴＮＦαの添加による、自己抗体（例えば、ＨＡＣＡ）と標識化抗ＴＮＦα薬との間の結合の破壊は、血清試料中に存在する自己抗体が、自己抗体（例えば、ＨＡＣＡ）の中和形態であり、したがって、自己抗体が、抗ＴＮＦα抗体とＴＮＦαとの間の結合を妨げることを示している。特定の場合には、中和ＨＡＣＡの存在が、レミケード（商標）を用いる現在の療法を、別の抗ＴＮＦα薬、例として、ヒュミラ（商標）に切り換えるべきであることを示している。
実施例５．新規の均一移動度シフトアッセイを使用する、患者血清中のアダリムマブに対するヒト抗薬物抗体（ＡＤＡ）の分析。
【０２１２】
［０２１２］背景及び目的：ＴＮＦ−αに対するモノクローナル抗体、例として、インフリキシマブ（ＩＦＸ）、アダリムマブ（ヒュミラ（商標））及びセルトリズマブが、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）及び他の炎症性障害を治療するのに有効であることが示されている。抗薬物抗体（ＡＤＡ）は、薬物の有効性を低下させる可能性及び／又は有害作用を引き起こす可能性がある。しかし、ＡＤＡが、キメラ抗体インフリキシマブを用いて治療する患者においてのみならず、また、ヒト化抗体アダリムマブを用いて治療する患者においても見出されている。個々の患者においてＡＤＡ及び薬物のレベルをモニターすることによって、患者の治療及び患者への投与を最適化するのを支援することができる。本発明者らは、非放射性、標識化、液相、均一移動度シフトアッセイを開発して、患者から得られた血清中のＨＡＣＡ（ヒト抗キメラ抗体）及びＩＦＸの両方を正確に測定するに至った。このアッセイの方法は、ＨＡＣＡを検出するための現在の固相アッセイの主要な制限、すなわち、血行中のＩＦＸの存在下でＨＡＣＡを正確に検出し得ないことを克服する。本研究において、本発明者らは、ヒト化抗体薬物のアダリムマブを用いて治療する患者においてＡＤＡ及び薬物の血清レベルを測定するための、この新しい方法を評価するに至った。
【０２１３】
［０２１３］方法：移動度シフトアッセイは、サイズ排除による分離の際に、遊離の抗原の保持時間が、抗原−抗体の免疫複合体に比してシフトすることに基づく。蛍光物質標識化アダリムマブ又は蛍光物質標識化ＴＮＦ−α、及び内部対照を、血清試料と混合して、ＡＤＡ又は薬物の存在下で、遊離のアダリムマブ及び遊離のＴＮＦ−αの移動度のシフトを測定した。遊離のアダリムマブ又は遊離のＴＮＦ−αの、内部対照に対する比の変化が、免疫複合体形成の指標となる。異なる濃度の抗ヒトＩｇＧ抗体又は精製アダリムマブと共にインキュベートすることによって生成した検量線を用いて、ＡＤＡ又はアダリムマブの血清濃度を決定した。本発明者らは、移動度シフトアッセイを使用して、応答を失ってしまった、アダリムマブを用いて治療するＩＢＤ患者から収集した血清中のアダリムマブ及びＡＤＡのレベルを測定した。
【０２１４】
［０２１４］結果：標識化アダリムマブの移動度のシフトの測定のために、用量反応曲線を、抗ヒトＩｇＧ抗体に関して生成した。アッセイの検出限界は、１ｎｇの抗ヒトＩｇＧであった。５０人の健常な対照から得られた血清を、ＡＤＡについて試験し、全ての試料が、検出限界を下回るＡＤＡのレベルを有した（すなわち、遊離の標識化アダリムマブのシフトは生じなかった）。また、外から添加したアダリムマブの存在下でも、ＡＤＡの検出を実証した。本発明者らは、アダリムマブを用いて治療する患者において薬物濃度を測定するために、標識化ＴＮＦ−αの移動度のシフトに関して、異なる量のアダリムマブを用いて、検量線を生成し、アダリムマブの検出限界は、１０ｎｇであった。
【０２１５】
［０２１５］結論：本発明の非放射性、標識化、液相、均一移動度シフトアッセイを適用して、アダリムマブを用いて治療する患者から得られた血清試料中のＡＤＡ及びアダリムマブのレベルを測定するに至った。アッセイは、再現性があり、高い感度及び精度を有することが見出され、アダリムマブを用いて治療する患者から得られた血清試料中のＡＤＡのレベルを評価するために使用することができる。
【０２１６】
実施例６．新規の独占所有権のある移動度シフトアッセイを使用する、患者血清中のアダリムマブに対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）の分析。
要約
［０２１６］背景：抗ＴＮＦ−α薬、例として、インフリキシマブ（ＩＦＸ）及びアダリムマブ（ＡＤＬ）が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を治療するのに有効であることが示されている。しかし、治療患者においてＡＤＡが誘導されると、薬物の有効性が低下する可能性及び／又は有害作用が生じる可能性がある。実際に、ＡＤＡが、ＩＦＸを用いて治療する患者においてのみならず、また、ＡＤＬを用いて治療する患者においても見出されている。個々の患者においてＡＤＡ及び薬物のレベルをモニターすることによって、患者の治療及び患者への投与を最適化するのを支援することができる。本発明者らは、独占所有権のある移動度シフトアッセイを開発して、ＩＦＸ治療患者から得られた血清中のＨＡＣＡ（ヒト抗キメラ抗体）及びＩＦＸの両方を正確に測定するに至った。このアッセイは、ＨＡＣＡを検出するための現在の固相アッセイの主要な制限、すなわち、血行中のＩＦＸの存在下でＨＡＣＡを正確に検出し得ないことを克服する。本研究において、本発明者らは、完全ヒト抗体薬物のＡＤＬを用いて治療する患者においてＡＤＡ及び薬物の血清レベルを測定するための、この新しいアッセイを評価するに至った。
【０２１７】
［０２１７］方法：移動度シフトアッセイは、サイズ排除クロマトグラフィー上において、抗原−抗体の免疫複合体の保持時間が、遊離の抗原に比してシフトすることに基づく。蛍光物質標識化ＡＤＬ又は蛍光物質標識化ＴＮＦ−α、及び内部対照を、血清試料と混合して、ＡＤＡ又は薬物の存在下で、標識化ＡＤＬ及び標識化ＴＮＦ−αの移動度のシフトを測定した。遊離のＡＤＬ又は遊離のＴＮＦ−αの、内部対照に対する比の変化が、免疫複合体形成の指標となる。異なる濃度の抗ヒトＩｇＧ抗体又は精製ＡＤＬと共にインキュベートすることによって生成した検量線を用いて、ＡＤＡ又はＡＤＬの血清濃度を決定した。本発明者らは、このアッセイを使用して、ＡＤＬを用いて治療するＩＢＤ患者から収集した血清中のＡＤＬ及びＡＤＡのレベルを測定した。
【０２１８】
［０２１８］結果：標識化ＡＤＬの移動度のシフトの測定のために、用量反応曲線を、抗ヒトＩｇＧ抗体に関して生成した。アッセイの検出限界は、１０ｎｇの抗ヒトＩｇＧであった。１００人の健常な対照から得られた血清を、ＡＤＡについて試験し、全ての試料が、検出限界を下回るＡＤＡのレベルを有した（遊離の標識化ＡＤＬのシフトは生じなかった）。ＡＤＬを用いて治療するＩＢＤ患者の試料１１４個のうち５つにおいて、ＡＤＡの検出が実証された。本発明者らは、ＡＤＬを用いて治療する患者において薬物濃度を測定するために、標識化ＴＮＦ−αのシフトに関して、異なる量のＡＤＬを用いて、検量線を生成し、検出限界は、１０ｎｇであった。
【０２１９】
［０２１９］結論：本発明者らは、本発明者らの独占所有権のある、非放射性、標識化、液相、均一移動度シフトアッセイを適用して、ＡＤＬを用いて治療する患者から得られた血清中のＡＤＡ及びＡＤＬのレベルを測定するに至った。アッセイは、再現性があり、高い感度及び精度を有し、ＡＤＬを用いて治療する患者から得られた血清試料中のＡＤＡのレベルを評価するのに有用である。
【０２２０】
序論
［０２２０］抗腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）生物学的製剤、例として、インフリキシマブ（ＩＦＸ）、エタネルセプト、アダリムマブ（ＡＤＬ）及びセルトリズマブペゴルは、クローン病（ＣＤ）及び関節リウマチ（ＲＡ）を含めた、いくつかの自己免疫疾患において、疾患活性を低下させることが示されている。しかし、患者の中には、抗ＴＮＦ−α療法に応答しないものもおり、一方、十分な応答を欠くことに起因して、より高い投与量若しくはより頻繁な投与を必要とするもの、又は注入に対する反応を発生させるものもいる。
【０２２１】
［０２２１］患者に、薬物に対する抗体を発生させる、治療用抗体の免疫原性が、治療の不成功及び注入に対する反応に寄与する可能性がある。ＩＦＸのようなキメラ抗体には、完全ヒト化抗体、例として、ＡＤＬと比較して、抗体生成を誘導する、より高い可能性がある。ＲＡ患者におけるＩＦＸに対する抗体（ＨＡＣＡ）の発生率は、１２％から４４％まで変化し、患者血清中のＩＦＸのレベル及び治療応答に反比例するようである。完全ヒト化のＡＤＬは、マウス抗体又はキメラ抗体よりも免疫原性が低いことが想定されるが、いくつかの研究は、ヒト抗ヒト化抗体（ＨＡＨＡ）の形成を報告しており、ＲＡ患者及びＣＤ患者における抗体生成の発生率が１％〜８７％であることを示している（Ａｉｋａｗａら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉ−ＴＮＦ−ａｌｐｈａ  ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｃｌｉｎ．Ｒｅｖ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３８（２〜３）：８２〜９頁（２０１０））。
【０２２２】
［０２２２］１つの抗ＴＮＦ−α薬に対して続発性の応答不全を示す多く患者が、別の抗ＴＮＦ−α薬に切り換えること、又は投与及び／若しくは投与頻度を増加させることから利益を得る場合がある。したがって、薬物投与を、個々の患者に合わせて手直しすることができるように、患者を薬物及び抗薬物抗体（ＡＤＡ）のレベルについてモニターすることが正当化される。ＡＤＡのレベルが存在する場合、このアプローチにより、正当化されるならば、用量の調節が、又は投薬の中断が可能になる。（Ｂｅｎｄｔｚｅｎら、Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｕｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、４４（７）：７７４〜８１頁（２００９）；Ａｆｉｆら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉ−ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ、Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、１０５（５）：１１３３〜９頁（２０１０））。
【０２２３】
［０２２３］いくつかのアッセイが、ＨＡＣＡ及びＨＡＨＡを測定するために開発されている。現在の方法の制限のうちの１つが、血行中に高いレベルの薬物がある場合には、ＡＤＡのレベルを確実には測定することができないことである。
【０２２４】
［０２２４］本発明者らは、ＡＤＬを用いて治療する患者から得られた血清中のＡＤＡ及びＡＤＬのレベルを測定するための、独占所有権のある、非放射標識性、液相、移動度シフトアッセイを開発するに至り、このアッセイは、血清中の薬物の存在の影響を受けない。
【０２２５】
方法
［０２２５］蛍光物質（Ｆｌ）標識化ＡＤＬを、患者血清と共にインキュベートして、免疫複合体を形成させた。Ｆｌ標識化小型ペプチドを、各反応中に、内部対照として含めた。異なる量の抗ヒトＩｇＧを使用し、検量線を生成して、ＡＤＡの血清レベルを決定した。遊離のＦｌ標識化ＡＤＬを、抗体が結合している複合体から、分子量に基づいて、サイズ排除クロマトグラフィーにより分離した。各試料から得られた遊離のＦｌ標識化ＡＤＬの内部対照に対する比を使用して、検量線からＨＡＨＡ濃度を推定した。類似の方法を使用して、Ｆｌ標識化ＴＮＦ−αを加えた患者血清試料中のＡＤＬのレベルを測定した。
【０２２６】
結果
［０２２６］図１９は、高分子量の複合体の移動度のシフトに起因する、遊離のＦｌ−ＡＤＬからの、抗ヒトＩｇＧが結合しているＦｌ−ＡＤＬ複合体の分離を示す。パネルｃ〜ｈに見られるように、蛍光ピークの保持時間が、１０．１分から７．３〜９．５分にシフトした。反応混合物中に、より多くの抗ヒトＩｇＧを添加するほど、より少ない遊離のＡＤＬがクロマトグラム中に留まり、より多くの免疫複合体が形成される（ｈ〜ｃ）。内部対照についての保持時間は、１３．５分である。
【０２２７】
［０２２７］図２０は、抗ヒトＩｇＧの添加が引き起こす蛍光ピークのシフトの用量反応曲線を示す。抗ヒトＩｇＧの濃度が増加すると、免疫複合体の形成に起因して、遊離のＡＤＬの内部対照に対する比は低下する。アッセイの感度は、１０ｎｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧである。内部対照「Ｆｌ−ＢｉｏＣｙｔ」は、緑色蛍光アレクサフルオール（登録商標）４８８蛍光物質を、ビオチン及びアルデヒドで固定可能な一級アミン（リジン）と組み合わせる、アレクサフルオール（登録商標）４８８−ビオサイチン（ＢｉｏＣｙｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に対応する。
【０２２８】
［０２２８］図２１は、高分子量の複合体の移動度のシフトに起因する、遊離のＴＮＦ−α−Ｆｌからの、ＡＤＬが結合しているＴＮＦ−α−Ｆｌ複合体の分離を示す。パネルｃ及びｊに見られるように、蛍光ピークの保持時間が、１１．９分から６．５〜１０．５分にシフトした。反応混合物中に、より多くのＡＤＬを添加するほど、より少ない遊離のＴＮＦ−α−Ｆｌのピークがクロマトグラム中に留まり、より多くの免疫複合体が形成される。
【０２２９】
［０２２９］図２２は、ＡＤＬの添加が引き起こすＴＮＦ−α−Ｆｌのピークのシフトの用量反応曲線を示す。添加したＡＤＬに基づくと、検出限界は、血清中では１０ｎｇ／ｍＬのＡＤＬである。
【０２３０】
［０２３０］表４は、１００人の健常な対象及び１１４人のＡＤＬを用いて治療するＩＢＤ患者から得られた血清試料を、本発明の移動度シフトアッセイを使用して、ＡＤＡ及びＡＤＬのレベルについて分析した場合を示す。１００個の健常対象試料は全て、検出限界を下回るＡＤＡのレベルを有し（遊離のＦｌ−ＡＤＬのシフトは生じなかった）、一方、１１４個の患者試料のうち５つは、０．０１２〜＞２０μｇ／ｍｌのＡＤＡ濃度を有した。１００個の健常対象試料におけるＡＤＬレベルの平均は、０．７６±１．０μｇ／ｍｌ（０〜９．４μｇ／ｍｌの範囲）であった。１１４個のＡＤＬを用いて治療する患者から得られた血清試料におけるＡＤＬレベルの平均は、１０．８＋１７．８μｇ／ｍｌ（０〜１３９μｇ／ｍｌの範囲）であった。５つのＡＤＡ陽性試料のうち４つは、検出不能レベルのＡＤＬを有した。
【表７】
0005960707.tif 000012
【０２３１】
結論
［０２３１］ＨＡＣＡ／ＩＦＸを測定するために使用した移動度シフトアッセイフォーマットは、均一アッセイであり、典型的なＥＬＩＳＡとは異なり、抗原による固体表面の被覆も、複数回の洗浄のステップ及びインキュベーションのステップもない。このアッセイを適用して、ＡＤＡ及び抗ＴＮＦ薬を測定することができる。患者血清に関するＡＤＡ及びＡＤＬの両方の測定については、（μｇ／ｍｌの範囲にある）アッセイの感度は、（ｍｇ／ｍｌの範囲にある）ＥＬＩＳＡ法と比較してより高い。健常対照の血清試料は、Ｆｌ標識化ＡＤＬの移動度のシフトを引き起こさず、このアッセイにより、ＡＤＬを用いて治療する患者の４．３％がＡＤＡを有することが見出された。健常対照の血清試料が、Ｆｌ標識化ＴＮＦ−αの移動度のシフトを引き起こしたが、このシフトは、ＴＮＦ−αの可溶性の遊離の受容体の存在に起因した可能性があり、ＡＤＬを用いて治療する患者におけるＡＤＬの平均は、さらにより高かった（１０．８ｍｇ／ｍｌ対０．７６ｍｇ／ｍｌ）。ＡＤＬ治療を患者に投与しながら、早期のＡＤＡの検出、及びＡＤＬの薬物レベルをモニターすることによって、医師が、適切であれば、ＡＤＬの投与量を最適化するか又は別の抗ＴＮＦ−α薬に切り換えるのが可能になり、それにより、患者の疾患の全体的な管理が最適化される。
【表８】
0005960707.tif 000013
【０２３２】
［０２３２］健常対照の血清試料は、ＦＩ標識化ＡＤＬの移動度のシフトを引き起こさなかった。予備的研究では、このアッセイにおいて、０．４μｇ／ｍｌのＡＤＬを有する患者の９．５２％がＡＤＡを有することが見出された。正常試料及び患者試料のさらなる評価を、より高い濃度のＡＤＬ−ＦＩを用いて行う。
【０２３３】
実施例７．抗ＴＮＦ薬物療法を最適化するためのコンビナトリアルアルゴリズム。
［０２３３］この実施例は、統計学的アルゴリズム、例えば、統計学的学習分類子システム等を、１つ又は複数（例えば、２、３、４、５、６又は７つ以上の組合せ）の生化学的マーカー、血清学的マーカー及び／又は遺伝学的マーカーに適用することによって、療法を最適化するため、毒性を低下させため、及び／又は治療処置の有効性をモニターするための方法を記載する。したがって、提示する実施例に記載する方法は、例えば、抗ＴＮＦ薬の今後の用量を調節若しくは改変する（例えば、増加若しくは減少させる）時期若しくは方法を決定すること、抗ＴＮＦ薬を（例えば、増加させた、減少させた、若しくは同じ用量で）、１つ若しくは複数の免疫抑制剤、例として、メトトレキサート（ＭＴＸ）若しくはアザチオプリンと組み合わせる時期若しくは方法を決定すること、及び／又は現在の療法のコースを変化させる（例えば、異なる抗ＴＮＦ薬に切り換える）時期若しくは方法を決定することによって、抗ＴＮＦ薬物療法を投与している患者ための治療の決定を導くのに有用な情報を提供する。
【０２３４】
［０２３４］非限定的な例として、患者試料（例えば、抗ＴＮＦ薬物療法を受けている患者から得られた血清試料）中の、以下のクラスの生化学的マーカー、血清学的マーカー及び／又は遺伝学的マーカーのうちの１、２、３、４、５又は全６つの存在、レベル又は遺伝子型を、検出、測定又は決定することができる：
（１）抗ＴＮＦ薬のレベル（例えば、遊離の抗ＴＮＦα治療用抗体のレベル）、
（２）抗薬物抗体（ＡＤＡ）のレベル（例えば、抗ＴＮＦ薬に対する自己抗体のレベル）、
（３）ＴＮＦαのレベル、
（４）１、２、３、４、５、６又は７つ以上の追加のサイトカイン（例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０等）並びに／又は炎症の他の機構についてのマーカー（例えば、炎症性マーカー、例として、ＣＲＰ、ＳＡＡ、ＩＣＡＭ−１及び／若しくはＶＣＡＭ−１）のレベル、
（５）炎症経路遺伝子等の１つ又は複数の遺伝学的マーカー中の１つ又は複数の突然変異の存在又は不在、例えば、１つ又は複数の炎症性マーカー中の変異体対立遺伝子（例えば、ＳＮＰ）、例えば、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５（例えば、米国特許第７，５９２，４３７号に記載されているＳＮＰ８、ＳＮＰ１２及び／若しくはＳＮＰ１３）、ＡＴＧ１６Ｌ１（例えば、Ｌａｋａｔｏｓら、Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ、４０（２００８）８６７〜８７３頁に記載されているｒｓ２２４１８８０（Ｔ３００Ａ）ＳＮＰ）、ＩＬ２３Ｒ（例えば、Ｌａｋａｔｏｓらに記載されているｒｓ１１２０９０２６（Ｒ３８１Ｑ）ＳＮＰ）、例えば、Ｇａｓｃｈｅら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ＆  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（２００３）１５：５９９〜６０６頁）に記載されているヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子並びに／又はサイトカイン遺伝子、さらに、ＩＢＤ５遺伝子座に属するＤＬＧ５及び／又はＯＣＴＮ遺伝子等の存在又は不在、
（６）複数の時点における（例えば、第２８週時、第６０週時等の）上記の生化学的マーカー及び／又は血清学的マーカーのうちの１つ又は複数のレベル、さらに、
（７）それらの組合せ。
【０２３５】
［０２３５］次いで、本明細書に記載する単一の統計学的アルゴリズム又は２つ以上の統計学的アルゴリズムの組合せを、試料中の検出、測定又は決定したマーカーの存在、濃度レベル又は遺伝子型に適用して、それにより、抗ＴＮＦ薬に関して、療法を最適化すること、毒性を低下させること、又は治療処置の有効性をモニターすることができる。したがって、この実施例に記載されている方法は、患者の免疫状態を決定することによって、患者の管理を決定する場合に有用性を見出す。
【０２３６】
［０２３６］下記の表６は、正常試料及び患者試料中のサイトカインのレベルの概要を示す。
【表９】
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【０２３７】
［０２３７］例証の目的に限って、以下のシナリオにより、どのように本発明の方法が、本明細書の記載に従って、１つ又は複数の生化学的マーカー、血清学的マーカー及び／又は遺伝学的マーカーの存在、レベル及び／又は遺伝子型に基づいて、療法を最適化すること、及び毒性（例えば、副作用）を最小限に留めるか又は低下させることを好都合に可能にするかを実証する。以下のシナリオのそれぞれにおいて、次いで、１又は２つ以上の統計学的アルゴリズムを適用して、療法を最適化すること、及び／又は抗ＴＮＦ薬と関連がある毒性を低下させることができる。
【０２３８】
シナリオ番号１：低いレベルの抗薬物抗体（ＡＤＡ）及び低いレベルの炎症性サイトカインを伴う、高いレベルの抗ＴＮＦ薬。
［０２３８］薬物レベル＝１０〜５０ｎｇ／１０μｌ；ＡＤＡレベル＝０．１〜２ｎｇ／１０μｌ；ＴＮＦαレベル＝１〜８ｐｇ／ｍｌ；ＩＬ−６レベル＝０．１〜３ｐｇ／ｍｌ；ＩＬ−１βレベル＝０．０〜２ｐｇ／ｍｌ；ＩＦＮ−γレベル＝０〜６ｐｇ／ｍｌ；ＩＬ−１０に対する抗体、検出されない。このマーカープロファイルを有する患者試料は、来診１０（「Ｖ１０」）の際に患者ＢＡＢ及びＪＡＡから得られた試料を含む。図１６ｂを参照されたい。
【０２３９】
［０２３９］抗ＴＮＦ薬物療法を投与しており、この特定のマーカープロファイルを有する患者は、抗ＴＮＦ薬（例えば、インフリキシマブ）と併せて、アザチオプリンのような免疫抑制薬を用いて治療すべきである。
【０２４０】
シナリオ番号２：低いレベルのＡＤＡ及び低いレベルの炎症性サイトカインを伴う、中位レベルの抗ＴＮＦ薬。
［０２４０］薬物レベル＝５〜２０ｎｇ／１０μｌ；ＡＤＡレベル＝０．１〜２ｎｇ／１０μｌ；ＴＮＦαレベル＝１〜８ｐｇ／ｍｌ；ＩＬ−６レベル＝０．１〜３ｐｇ／ｍｌ；ＩＬ−１βレベル＝０．０〜２ｐｇ／ｍｌ；ＩＦＮ−γレベル＝０〜６ｐｇ／ｍｌ；ＩＬ−１０に対する抗体、検出されない。このマーカープロファイルを有する患者試料は、来診１０（「Ｖ１０」）の際に患者ＤＧＯ、ＪＡＧ及びＪＪＨから得られた試料を含む。図１６ｂを参照されたい。
【０２４１】
［０２４１］抗ＴＮＦ薬物療法を投与しており、この特定のマーカープロファイルを有する患者は、より高い用量の抗ＴＮＦ薬（例えば、インフリキシマブ）と併せて、アザチオプリンのような免疫抑制薬を用いて治療すべきである。当業者であれば、現在の療法のコースを調節することができ、したがって、薬物療法を最適化する適切なより高い又はより低い用量、例えば、現在の用量よりも、少なくとも約１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０又は１００倍高い又は低い今後の用量が分かるであろう。
【０２４２】
シナリオ番号３：中位レベルのＡＤＡ及び低いレベルの炎症性サイトカインを伴う、中位レベルの抗ＴＮＦ薬。
［０２４２］薬物レベル＝５〜２０ｎｇ／１０μｌ；ＡＤＡレベル＝０．５〜１０ｎｇ／１０μｌ；ＴＮＦαレベル＝１〜８ｐｇ／ｍｌ；ＩＬ−６レベル＝０．１〜３ｐｇ／ｍｌ；ＩＬ−１βレベル＝０．０〜２ｐｇ／ｍｌ；ＩＦＮ−γレベル＝０〜６ｐｇ／ｍｌ；ＩＬ−１０に対する抗体、検出されない。このマーカープロファイルを有する患者試料は、来診１０（「Ｖ１０」）の際に患者ＪＭＭから得られた試料、及び来診１４（「Ｖ１４」）の際に患者Ｊ−Ｌから得られた試料を含む。図１６ｂを参照されたい。
【０２４３】
［０２４３］抗ＴＮＦ薬物療法を投与しており、この特定のマーカープロファイルを有する患者は、異なる薬物を用いて治療すべきである。非限定的な例として、インフリキシマブ（ＩＦＸ）療法を受けており、低いレベルの炎症性サイトカインを伴う、中位レベルのＩＦＸ及びＡＤＡ（すなわち、ＨＡＣＡ）を有する患者は、アダリムマブ（ヒュミラ（商標））を用いる療法に切り換えるべきである。
【０２４４】
シナリオ番号４：高いレベルのＡＤＡ及び高いレベルの炎症性サイトカインを伴う、低いレベルの抗ＴＮＦ薬。
［０２４４］薬物レベル：０〜５ｎｇ／１０μｌ；ＡＤＡレベル＝３．０〜５０ｎｇ／１０μｌ；ＴＮＦαレベル＝１０〜６０ｐｇ／ｍｌ；ＩＬ−６レベル＝０．１〜５０ｐｇ／ｍｌ；ＩＬ−１βレベル＝０．０〜３６６ｐｇ／ｍｌ；ＩＦＮ−γレベル＝０．１５〜１００ｐｇ／ｍｌ；ＩＬ−１０に対する抗体、検出されない。このマーカープロファイルを有する患者試料は、図１６ｂの来診１４（「Ｖ１４」）の際に全ての患者から得られた試料を含む。
【０２４５】
［０２４５］抗ＴＮＦ薬物療法を投与しており、この特定のマーカープロファイルを有する患者は、異なる薬物を用いて治療すべきである。非限定的な例として、インフリキシマブ（ＩＦＸ）療法を受けており、高いレベルのＡＤＡ（すなわち、ＨＡＣＡ）及び炎症性サイトカインを伴う、低いレベルのＩＦＸを有する患者は、アダリムマブ（ヒュミラ（商標））を用いる療法に切り換えるべきである。
【０２４６】
シナリオ番号５：高いレベルの炎症性サイトカイン。
［０２４６］高いＴＮＦαレベル（例えば、１０〜６０ｐｇ／ｍｌ）；高いＩＬ−６レベル（例えば、０．１〜５０ｐｇ／ｍｌ）；高いＩＬ−１βレベル（例えば、０．０〜３６６ｐｇ／ｍｌ）；高いＩＦＮ−γレベル（例えば、０．１５〜１００ｐｇ／ｍｌ）；高いレベルの他の炎症性分子；±の抗炎症性サイトカインに対する抗体（例えば、ＩＬ−１０に対する抗体、検出される又は検出されないのいずれか）。
【０２４７】
［０２４７］抗ＴＮＦ薬物療法を投与しており、この特定のマーカープロファイルを有する患者は、異なる薬物を用いて治療する、又はより高い用量の抗ＴＮＦ薬と併せて、メトトレキサート（ＭＴＸ）若しくはアザチオプリン（ＡＺＡ）のような免疫抑制薬を用いて治療するのいずれかとすべきである。特に、インフリキシマブ（ＩＦＸ）療法を受けている患者から得られた高いレベルの炎症性サイトカインの、このマーカープロファイルは、現在の療法のコースが働いていないことを示しており、患者は、アダリムマブ（ヒュミラ（商標））を用いる療法に切り換えるべきであるか、又はより高い用量のＩＦＸと併せて、１つ若しくは複数の免疫抑制薬を用いて治療すべきである。
【０２４８】
実施例８．異なる抗薬物抗体（ＡＤＡ）アイソタイプの決定。
［０２４８］この実施例は、抗ＴＮＦ薬物療法を投与しているＡＤＡ陽性患者における異なる抗薬物抗体（ＡＤＡ）アイソタイプの決定を記載する。抗体アイソタイプの非限定的な例として、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭが挙げられる。特定の態様では、特異的なＡＤＡアイソタイプ又はＡＤＡアイソタイプの特定の組合せの存在又はレベルの検出が、異なる臨床転帰と関連がある。
【０２４９】
［０２４９］図２３は、ＨＡＣＡ陽性患者の血清中の異なるＡＤＡアイソタイプの溶出時間を示す。特定の実施形態では、ＡＤＡが、サイズ及び適切な希釈実験に基づいて、ＩｇＭアイソタイプ（保持時間：約６．５〜７．５分）、ＩｇＡアイソタイプ（７．５〜８．５分）、又はＩｇＧアイソタイプ（８．５〜９．５分）かどうかに基づいて、抗ＴＮＦ薬物療法の治療の影響を決定することができる。標識化抗ＴＮＦ薬、例として、ヒュミラ及びレミケードについての保持時間は、約１０．８分であり、内部対照（ＩＣ）についての保持時間は、約１３．５分である。
【０２５０】
［０２５０］１つの研究では、２００個の患者試料を、本発明の方法に従ってアッセイして、サイズ排除クロマトグラフィーによりＡＤＡを検出した。試料１〜１００は、対照（例えば、正常な、健常対照の試料）であり、一方、試料１０１〜２００は、レミケード療法を投与している患者から得られ、細胞架橋アッセイによりＨＡＣＡ陽性であった。シグナルの強度（Ｙ軸）対溶出時間（Ｘ軸）の未調節のプロットを、２００個の試料全てについて生成する。次いで、以下の３つの調節をプロットに対して行った：（１）Ｙ（低い）を左のベースラインに標準化し、（２）Ｙ（高い）を右の対照のピークに標準化し、及び（３）Ｘを右の対照のピークに標準化した。
【０２５１】
［０２５１］２００個の試料全てから得られたデータを、１００個の対照試料と１００個のＨＡＣＡ陽性試料とに分け、次いで、平均した。図２４は、対照試料の平均のプロットを示す。図２５は、陽性試料の平均のプロットを示す。とりわけ、図２４及び２５のプロットの比較により、標識化レミケードについてのシグナル強度（「主要ピーク」）の減少、並びにＨＡＣＡ  ＩｇＡ（「Ａピーク」）及びＨＡＣＡ  ＩｇＧ（「Ｇピーク」）に対応する、２つの明確に異なるＡＤＡアイソタイプのピークの出現が示される。
【０２５２】
［０２５２］図２６は、１００個の対照試料及び１００個の陽性試料について、主要ピークのシグナル（すなわち、標識化レミケードのシグナル強度に対応する）を並べて比較して示す。示す値は、９．７１〜１２．２３分の溶出時間から得られた平均値である。特に、図２６は、１００個のＨＡＣＡ陽性試料については、標識化レミケードについてのシグナル強度が減少することを示し、この減少は、標識化レミケードとＨＡＣＡとの間の複合体の形成と相関する。また、図２６は、低い主要ピークのシグナル（例えば、Ｘ軸上の０と０．２との間）により証明されるように、いくつかの陽性試料が、高いレベルのＨＡＣＡを有したことも示す。図２７は、図２６から得られた主要ピークのデータについての受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。曲線下面積（ＡＵＣ）は、０．９８６であった。
【０２５３】
［０２５３］次に、主要ピーク対他のピーク（ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭ）の和について、平均値をプロットした。図２８は、１００個のＨＡＣＡ陽性試料について、Ｘ軸上の非主要ピーク（これらは、ＩｇＧピーク、ＩｇＡピーク及びＩｇＭピークの和に相当する）対Ｙ軸上の主要ピークのプロットを示す。このプロットにおいて示される直線関係を使用して、アッセイを点検することができる（すなわち、アッセイの制御）。図２９は、２００個の試料全てについての、ＩｇＧピーク対ＩｇＡピーク対ＩｇＭピークのプロットを示す。
【０２５４】
実施例９．異なるＡＤＡアイソタイプの、近接性に基づく決定。
［０２５４］この実施例は、抗ＴＮＦα薬物療法、例として、インフリキシマブ（ＩＦＸ）を投与しているＡＤＡ陽性患者における、異なる抗薬物抗体（ＡＤＡ）アイソタイプ、例として、ＡＴＩ（すなわち、ＩＦＸに対する抗体；「ＨＡＣＡ」）の異なるアイソタイプの決定のための、本発明の例示的な実施形態を記載する。ＡＴＩアイソタイプ等の抗体アイソタイプの非限定的な例として、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ（例えば、ＩｇＡ  ＡＴＩ、ＩｇＤ  ＡＴＩ、ＩｇＥ  ＡＴＩ、ＩｇＧ  ＡＴＩ、及びＩｇＭ  ＡＴＩ）が挙げられる。特定の態様では、特異的なＡＤＡアイソタイプ又はＡＤＡアイソタイプの特定の組合せの存在又はレベルの検出が、異なる臨床転帰と関連がある。
【０２５５】
［０２５５］図３０及び３１は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用して、少なくとも１、２、３、４又は５つ以上のＡＴＩアイソタイプ、例えば、ＩｇＡ  ＡＴＩ、ＩｇＤ  ＡＴＩ、ＩｇＥ  ＡＴＩ、ＩｇＧ  ＡＴＩ及び／又はＩｇＭ  ＡＴＩのアイソタイプ等の存在（若しくは不在）又はレベルを決定するための、本発明の近接性に基づくアイソタイピングアッセイの実施形態を示す。例えば、図３０は、アレクサ−５３２（抗Ｉｇ抗体、例として、抗ＩｇＡ上の「Ｆ２」標識）が、アレクサ−４８８（抗体治療剤、例として、ＩＦＸ上の「Ｆ１」標識）により、両方の蛍光物質が密接に近接している場合のみに励起され、それにより、抗Ｉｇ（例えば、抗ＩｇＡ）とＨＡＣＡ（例えば、ＩｇＡ  ＡＴＩ）とＩＦＸとの三成分複合体の存在及び／又はレベルを示すことを示す概略図を示す。特定の実施形態では、異なるＡＴＩアイソタイプ及び／又はそれらのサブクラスを、同じ又は異なる蛍光物質、例えば、アレクサ−５３２等を用いて標識した異なる抗Ｉｇを使用して決定することができる。図３１は、ＦＲＥＴに基づく、本発明のアイソタイピングアッセイの結果を示す。
【０２５６】
［０２５６］前述の発明を、明確に理解する目的で、例証及び実施例として一部詳細に記載してきたが、当業者であれば、特定の変化形態及び改変形態を、添付の特許請求の範囲内で実行することができることを理解するであろう。さらに、本明細書において提供する参考文献は、各参考文献が個々に参照により組み込まれているのと同じ程度に、それぞれの全体が参照により組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２５７】
【図１】サイズ排除ＨＰＬＣを使用して、ＴＮＦα−アレクサ６４７とヒュミラ（商標）との間の結合を検出する、本発明のアッセイの例示的な実施形態を示す図である。
【図２】ＴＮＦα−アレクサ６４７に対するヒュミラ（商標）の結合の用量反応曲線を示すグラフである。
【図３】細胞架橋アッセイとして知られている、ＨＡＣＡのレベルを測定するための、ＥＬＩＳＡに基づく現在の方法を示す図である。
【図４】レミケード（商標）に対して生成したＨＡＣＡ／ＨＡＨＡの濃度を測定するための、本発明の自己抗体の検出アッセイの例示的な概要を示す図である。
【図５】レミケード（商標）−アレクサ６４７に対する抗ヒトＩｇＧ抗体の結合の用量応答分析を示す図である。
【図６】レミケード（商標）−アレクサ６４７に対する抗ヒトＩｇＧ抗体の結合の第２の用量応答分析を示す図である。
【図７】レミケード（商標）−アレクサ６４７に対する抗ヒトＩｇＧ抗体の結合の用量反応曲線を示すグラフである。
【図８】正常ヒト血清及びＨＡＣＡ陽性血清中におけるレミケード（商標）−アレクサ６４７の免疫複合体形成を示す図である。
【図９】本発明の細胞架橋アッセイ又は移動度シフトアッセイを使用して実施した、２０人の患者の血清試料から得られたＨＡＣＡの測定の概要を示す表である。
【図１０】ＨＡＣＡの血清濃度を測定するための現在の方法及び本発明の新規のＨＡＣＡアッセイの概要及び比較を示す表である。
【図１１】正常な（ＮＨＳ）又はＨＡＣＡ陽性（ＨＰＳ）の血清と共にインキュベートした蛍光物質（Ｆｌ）標識化ＩＦＸのＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示す図である。
【図１２】移動度シフトアッセイにより決定した場合の、ＨＡＣＡ陽性血清の希釈度を増加させて生成した結合している及び遊離のＩＦＸ−Ｆｌの用量反応曲線を示すグラフである。
【図１３】正常血清（ＮＨＳ）又はＩＦＸを加えた血清と共にインキュベートしたＴＮＦα−ＦｌのＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示す図である。
【図１４】移動度シフトアッセイにより決定した場合の、ＩＦＸを加えた血清の希釈度を増加させて生成した結合している及び遊離のＴＮＦαの用量反応曲線を示す図である。
【図１５】移動度シフトアッセイによる、ＩＦＸを用いて治療するＩＢＤ患者における相対的なＨＡＣＡレベル及びＩＦＸ濃度の異なる時点の測定を示すグラフである。
【図１６】患者の管理、すなわち、ＩＦＸを用いて治療するＩＢＤ患者の血清中のＨＡＣＡレベル及びＩＦＸ濃度の異なる時点の測定を示すグラフである。
【図１７】（Ａ）非中和自己抗体の存在、又は（Ｂ）中和自己抗体、例として、ＨＡＣＡの存在を検出するための、本発明のアッセイの例示的な実施形態を示す図である。
【図１８】中和自己抗体、例として、ＨＡＣＡの存在を検出するための、本発明のアッセイの代替の実施形態を示す図である。
【図１９】異なる量の抗ヒトＩｇＧの存在下で正常ヒト血清（ＮＨＳ）と共にインキュベートしたＦｌ標識化ＡＤＬの移動度シフトのプロファイルを示す図である。
【図２０】抗ヒトＩｇＧの、遊離Ｆｌ−ＡＤＬのシフトに対する用量反応曲線を示すグラフである。
【図２１】異なる量のＡＤＬの存在下で正常ヒト血清（ＮＨＳ）と共にインキュベートしたＦｌ標識化ＴＮＦ−αの移動度シフトのプロファイルを示す図である。
【図２２】ＡＤＬの、遊離ＴＮＦ−α−Ｆｌのシフトに対する用量反応曲線を示すグラフである。
【図２３】ＨＡＣＡ陽性患者の血清中の異なるＡＤＡアイソタイプの溶出時間を示すグラフである。
【図２４】実施例８に記載の研究において使用した１００個の対照試料の平均のプロットを示す図である。
【図２５】実施例８に記載の研究において使用した１００個のＨＡＣＡ陽性試料の平均のプロットを示す図である。
【図２６】実施例８に記載の研究において使用した１００個の対照試料及び１００個のＨＡＣＡ陽性試料について、主要ピークの（すなわち、標識化レミケードのシグナル強度に対応する）シグナルを並べて比較するグラフである。
【図２７】図２６から得られた主要ピークのデータについての受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線を示すグラフである。
【図２８】実施例８に記載の研究において使用した１００個のＨＡＣＡ陽性試料について、Ｘ軸上の非主要ピーク（これらは、ＩｇＧピーク、ＩｇＡピーク及びＩｇＭピークの和に相当する）対Ｙ軸上の主要ピークのプロットを示すグラフである。
【図２９】実施例８に記載の研究において使用した２００個の試料全てについての、ＩｇＧピーク対ＩｇＡピーク対ＩｇＭピークのプロットを示すグラフである。
【図３０】本発明の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）による自己抗体アイソタイピングアッセイのフォーマットを示す概略図である。
【図３１】ＦＲＥＴに基づく、本発明の自己抗体アイソタイピングアッセイの結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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