(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
レンチニュラ・エドデス（Lentinulla edodes，シイタケ）の菌糸体を培養して得られた培養液に植物組織原料としての米糠および酵素としてのα−アミラーゼ、ペクチナーゼを混合して反応させた後、失活させ、その液部を濃縮してなるＡＨＣＣ（Active Hexose Correlated Compound）を含むことを特徴とする、ｉＮＯＳ（誘導型一酸化窒素合成酵素）ｍＲＮＡとその塩基配列に相補的な配列を有するアンチセンスＲＮＡとのハイブリダイズ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｉＮＯＳ（誘導型一酸化窒素合成酵素；inducible nitric oxide synthase）の発現制御を目的とする担子菌培養物由来の組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内における一酸化窒素（ＮＯ）は、マクロファージ、血管内皮細胞、神経領域等各所から産生するとされ、その作用としては殺菌作用、血管弛緩作用、あるいは神経情報伝達物質としても作用している。
【０００３】
一酸化窒素が産生する際に介在しているのが、一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ；nitric oxide synthase）であり、ＮＯＳは体内の作動場所により誘導型ＮＯＳ（ｉＮＯＳ；inducible NOS）、神経型ＮＯＳ（ｎＮＯＳ；neuronal NOS）、及び血管内皮型ＮＯＳ（ｅＮＯＳ；endothelial NOS）の３つに分類され、特にｉＮＯＳによるＮＯ産生はその他のＮＯ合成システムである神経型ＮＯＳ及び血管内皮型ＮＯＳに比較すると、長時間その活性が持続し、より多量のＮＯ（１μＭ以上）が産生されることが知られている。
【０００４】
ｉＮＯＳは主に、マクロファージ、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、消化管上皮細胞、気管支上皮細胞、肝細胞、ミクログリア細胞等において、細胞毒素や感染や炎症性病巣で産生されるＩＬ−１β（Interleukin - 1β）、ＴＮＦ−α（Tumor Necrosis Factor - α）、ＩＦＮ−γ（Interferon - γ）等の炎症性サイトカインの攻撃をうけて発現し、ＮＯを産生する。過剰に生成するＮＯは、生体の感染防御反応での主要な炎症性メディエーターとして機能している。
【０００５】
ｉＮＯＳの発現は、炎症反応や細菌、真菌、ウイルス、原虫など多様な病原体の感染に伴いもたらされる。例えば、グラム陰性菌の普遍的な構成成分であるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）やグラム陽性菌の細胞壁の成分であるリポタイコ酸（ＬＴＡ）の刺激により、あるいは炎症性サイトカインの間接的な産生誘導を介して、ｉＮＯＳの誘導がもたらされることが知られている。また最近では、各種ウイルスの生体内増殖でも、ＮＯ合成の亢進が明らかにされており、この場合のｉＮＯＳの誘導は、主にＩＬ−１β、ＩＦＮ−γなどの炎症性サイトカインの産生を介していることが分かっている。
【０００６】
ｉＮＯＳ由来のＮＯは殺菌、抗ウイルス、抗寄生虫、抗腫瘍作用を示し、生体系の生命維持においてなくてはならない存在である。しかし一方、炎症反応等によってｉＮＯＳが活性化され過剰なＮＯを産生すると、活性酸素と反応して生じた強いパーオキシナイトライト（ペルオキシ亜硝酸、過酸化亜硝酸）はＤＮＡを損傷し、突然変異や発がんを惹起する等の負の作用が起こる。
【０００７】
種々の要因によりｉＮＯＳが過剰に発現し、過剰なＮＯを産生することにより、毒性ショックやある種のサイトカインによる治療等による全身性血圧低下、血圧応答低下、自己免疫疾患、炎症、関節炎、リウマチ性関節炎、糖尿病、炎症性腸疾患、血管機能不全、病因性血管拡張、組織損傷、心臓血管系虚血、痛感過敏症、脳虚血、悪液質、がん等の種々の疾病を引き起こすことが明らかになっている。
【０００８】
従って、ｉＮＯＳの発現を制御することは生体防御やＮＯの過剰産生が関与する疾患、例えば、発がんや炎症性疾患、細菌感染等によるエンドトキシンショックなどの治療・予防の面において非常に重要である。
【０００９】
従来、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉：RNA interference）と呼ばれる、二本鎖のＲＮＡで標的となるｍＲＮＡを切断して転写を抑制する方法が知られているが、通常ＲＮＡｉは２０塩基対程度の塩基長であり（特許文献１：特開２００５−１３２２４号公報）、その二本鎖オリゴヌクレオチド及びそのアンチセンスＲＮＡのスクリーニング方法が開示されている。また、小核酸分子、例えば短干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を用いるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により、インターロイキン遺伝子、インターロイキンスーパーファミリー遺伝子、または遺伝子発現および／または活性のインターロイキン経路に関与する遺伝子の発現及び活性を調節するのに有用な化合物に関して開示されている（特許文献２：特開２００５−５２４３９３号公報）。
【００１０】
細胞内にアンチセンスＲＮＡが存在すると、それと相補的なｍＲＮＡとハイブリダイズし、ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳が阻害されるために遺伝子の発現を阻害することができる。人為的にアンチセンスＲＮＡを細胞内に導入すれば、ターゲット遺伝子の発現を阻害することができるので、現在、遺伝子の機能を解明する技術として使われており、医薬品への応用も検討されている。ｉＮＯＳ遺伝子に関してはこれまで、アンチセンスＲＮＡの存在は確認されていなかった。また、これまで、ｍＲＮＡからの転写に際してｍＲＮＡの安定化に寄与しているタンパク質の存在が示唆されていた（非特許文献１：Eur. J. Pharmacol. 500: 255-266 (2004)）が、その詳細については不明であり、ｉＮＯＳの発現制御に関しては不明な点が多かった。
【００１１】
【特許文献１】特開２００５−１３２２４号公報
【特許文献２】特開２００５−５２４３９３号公報
【非特許文献１】Eur. J. Pharmacol. 500: 255-266 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、ｉＮＯＳ（誘導型一酸化窒素合成酵素；inducible nitric oxide synthase）の発現制御を目的とする担子菌培養物由来の組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、ｉＮＯＳの発現制御に関して鋭意研究を重ねた結果、細胞内において、ｍＲＮＡに相補的な配列を持つ一本鎖ＲＮＡ（アンチセンス転写物（アンチセンストランスクリプト））が存在し、それが従来のアンチセンスＲＮＡとは異なり、ｍＲＮＡの安定化に寄与しているケースがあることを見出し、さらに、この一本鎖ＲＮＡ（アンチセンス転写物）に相補的な配列を持つセンスオリゴヌクレオチドを用いて、アンチセンス転写物にハイブリダイズしてそのはたらきを抑制することでｍＲＮＡの安定性に干渉し、その結果ｉＮＯＳの発現を抑制し、ＮＯの過剰産生を抑制する方法を見出し、同日付けで特許出願している。
【００１４】
本発明者らはまた、担子菌菌糸体を植物組織原料存在下で液体培養し酵素反応を経て得られる組成物について、サイトカイン産生能回復剤組成物（特開２００１−１０６６３７号公報）、抗癌剤の副作用軽減剤（特開平１１−１５８０８０号公報）、サイトカイン産生能増強（国際公開第０２／０６２８１３号パンフレット）などの生理活性を見いだし特許出願している。
【００１５】
本発明者らはさらに前記特許出願に鑑み、ｉＮＯＳｍＲＮＡの安定化に関与する物質に関して鋭意研究を重ねた結果、担子菌菌糸体を植物組織原料存在下で液体培養し酵素反応を経て得られる組成物に、このＳ化センスオリゴと同様に、すなわちアンチセンストランスクリプトによるｉＮＯＳｍＲＮＡの安定化を阻害し、ｉＮＯＳの発現を抑制し、その結果ＮＯの産生を抑制する働きがあることを見出し、本発明を完成させた。
【００１６】
すなわち、本発明は以下の担子菌菌糸体培養抽出物を含むＮＯ産生抑制活性を有する組成物、及びｉＮＯＳ産生量の抑制方法に関する。
１．担子菌（キノコ類）菌糸体の培養抽出物を含有することを特徴とするｉＮＯＳ（誘導型一酸化窒素合成酵素）ｍＲＮＡの分解を促進するＮＯ産生抑制活性を有する組成物。
２．担子菌が、レンチニュラ・エドデス（Lentinulla edodes，シイタケ）、グリフォラ・フロンドサ（Grifola frondosa、マイタケ）、ガノデルマ・ルシダム（Ganoderma lucidum，マンネンタケ）、ガノデルマ・アパラナタム（Ganoderma applanatum，コフキサルノコシカケ）、シゾフィラム・コミュネ（Schizophyllum commune，スエヒロタケ）から１種以上選ばれる前記１に記載のＮＯ産生抑制活性を有する組成物。
３．担子菌（キノコ類）菌糸体の培養抽出物が、ＡＨＣＣ（Active Hexose Correlated Compound）である前記１または２に記載のＮＯ産生抑制活性を有する組成物。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の担子菌菌糸体培養抽出物は、ＮＯの過剰産生が関与する疾患である、炎症性疾患や、細菌感染によるエンドトキシンショック、発がん等に対して有効な医薬組成物、すなわち医薬として、あるいはそれらに対して有効な健康食品組成物、すなわち健康食品として用いることが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明のｉＮＯＳ（誘導型一酸化窒素合成酵素）ｍＲＮＡの分解を促進するＮＯ産生抑制活性を有する組成物（以下、「本発明組成物」とする。）は、担子菌（キノコ類）を培養した菌糸体から抽出物される成分を含有する。菌種、培養条件、抽出条件、及び本発明組成物を含有する剤の形状及びその処方等の詳細は以下の通りである。
【００１９】
（１）菌種
本発明に用いる担子菌の例としては、例えば、レンチニュラ・エドデス（Lentinulla edodes，シイタケ）、アガリクス・ビスポラス（Agaricus bisporus，マッシュルーム）、グリフォラ・フロンドサ（Grifola frondosa，マイタケ）、フォリオタ・ナメコ（Pholiota nameko，ナメコ）、プリュロタス・オストレアタス（Pleurotus ostreatus，ヒラタケ）、フラムリナ・ヴェラチペス（Flammulina velutipes，エノキタケ）、ガノデルマ・ルシダム（Ganoderma lucidum，マンネンタケ）、アウリカラリア・アウリカラ（Auricularia auricula，キクラゲ）、ガノデルマ・アパラナタム（Ganoderma applanatum，コフキサルノコシカケ）、コリオラス・ルシダム（Corioluslucidum，カワラタケ）、グリフォラ・アンベラッタ（Grifola umbellate，チョレイマイタケ）、シゾフィラム・コミュネ（Schizophyllum commune，スエヒロタケ）、ヴォルヴァリエラ・ヴォルヴァセアエ（Volvariella volvaceae，フクロタケ）等が挙げられる。これらは単独で、または数種類組み合わせて用いることができる。これらの中でも、レンチニュラ・エドデス（Lentinulla edodes，シイタケ）、グリフォラ・フロンドサ（Grifola frondosa、マイタケ）、ガノデルマ・ルシダム（Ganoderma lucidum，マンネンタケ）、ガノデルマ・アパラナタム（Ganoderma applanatum，コフキサルノコシカケ）、シゾフィラム・コミュネ（Schizophyllum commune，スエヒロタケ）が好ましい。
【００２０】
（２）培養条件
本発明においては、上記の菌を植物組織原料の存在下において培養する。植物組織原料は、植物組織に由来するものであれば特に制限されず、おがくず等を用いることも可能であるが、草本類植物由来の材料、例えば、米ぬか、ふすま、バガス、とうもろこしの根茎、稲藁、麦藁、大豆かす等が好ましい。これらは単独で用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよい。かかる原料を用いることにより、効率的に有効成分を得ることができる。これらの原料において熱水に溶解する成分が特に有用であり、従って、熱水で抽出した抽出液が好適に用いられる。
【００２１】
培地には、上記植物組織原料の他に各種の炭素源あるいは窒素源を添加してもよい。炭素源の例としては、ブドウ糖、ショ類、マルトース、サッカロース、上白糖、黒糖、糖蜜、廃糖蜜、マルツエキス等が挙げられる。窒素源の例としては、肉エキス、ペプトン、グルテンミール、大豆粉、乾燥酵母、酵母エキス、硫酸アンモニウム、酒石酸アンモニウム塩、尿素等が挙げられる。その他、必要に応じて、ナトリウム塩、マグネシウム塩、マンガン塩、鉄塩、カルシウム塩、リン酸塩等の無機塩類や、イノシトール、ビタミンＢ１塩酸塩、Ｌ−アスパラギン、ビオチン等のビタミン類を添加してもよい。培養は、通常の中温菌の培養に準じればよく、ｐＨ２〜６、１０〜４５℃、好ましくは１５〜３０℃の温度で行なう。培養を継続する時間は、菌の量や植物組織原料の形態にもよるが、通常は４〜２０日間、好ましくは６〜１２日間程度である。
【００２２】
（３）抽出条件
抽出は、上記混合物にセルラーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、ペクチナーゼ、キチナーゼ等の酵素を加え、至適温度条件にて２〜２０時間反応を行なって菌体を破砕し、その後、加熱処理して酵素反応を失活させ、該処理物から遠心分離等により菌糸体残渣を除去して行なう。得られる液部分が本発明の有効成分を含有している。有効成分の具体的な構造等は不明であるが、置換基を有する多糖類を主成分とし、その他に、植物組織原料由来の物質、菌糸体由来の物質、菌の代謝産物等を含有し、これらが相乗的に作用しているものと考えられる。
【００２３】
（４）本発明組成物を含有する剤の形状及びその処方
本発明組成物は、上記のようにして得られた混合物に必要に応じ乾燥等の処理を行ない、種々の形状、形態となし得るが、例えば薬理学的、製剤学的に認容される製造助剤を加えることにより常法に従って製造される。製造助剤の例としては、ショ糖、でんぷん、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、グルコース、セルロース、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤の他、慣用の結合剤、崩壊剤、滑沢剤、保存剤、安定化剤、分散剤、希釈剤、香料、甘味料等が挙げられる。経口投与剤および非経口投与剤のいずれも可能である。経口投与剤としては、散剤、顆粒剤、カプセル剤、マイクロカプセル剤、錠剤、トローチ剤などの固形製剤、あるいはドリンク剤、シロップ剤、エリキシル剤などの液状製剤とすることができる。また、非経口投与剤としては注射剤、軟膏剤あるいは座薬等とすることができる。本発明の抗癌剤の副作用軽減剤の投与量は、治療すべき個々の患者の年令、体重および症状、剤形等によっても増減されるが、一般的には薬剤０．１〜６ｇ、好ましくは０．２〜１．８ｇを一日１〜３回投与される。
【００２４】
（５）急性毒性
本発明組成物は、非常に毒性の低いものであり、医薬として使用するためには十分安全であると判断できる。
【００２５】
本発明組成物としては、上記の方法で得られるもの以外にも、ｉＮＯＳ（誘導型一酸化窒素合成酵素）ｍＲＮＡの分解を促進するＮＯ産生抑制活性を有するものであれば、市販の担子菌（キノコ類）菌糸体の培養抽出物をも含む。具体的にはＡＨＣＣ（Active Hexose Correlated Compound）が好適に用いられる。
【実施例】
【００２６】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【００２７】
実施例１： 
以下の方法により、ラットｉＮＯＳのｍＲＮＡに対して、遺伝子のアンチセンス鎖から転写された「アンチセンス転写物」が存在するかどうか調べ、この「アンチセンス転写物」がセンス遺伝子産物の産生の制御にどのように関わっているかを調べた。なお、ラットｉＮＯＳのｍＲＮＡの塩基配列は、DDBJ/EMBL/GenBank 国際塩基配列データベース（http://www.ddbj.nig.ac.jp/、http://www.ebi.ac.uk/embl/、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/）によって既知である。
（１）ｉＮＯＳｍＲＮＡに相補的な配列であるアンチセンス転写物の配列と領域（塩基長）の決定方法
サイトカインや急性期タンパク質など、誘導的発現の起こる遺伝子のｍＲＮＡの３'非翻訳領域（３'ＵＴＲ）には、AU-rich element（ＡＲＥ）と呼ばれる配列、すなわち５’−ＡＵＵＵＡ−３’または５’−ＡＵＵＵＵＡ−３’という配列が存在している（Proc Natl Acad Sci USA 83: 1670-1674 (1986)参照）。ＡＲＥはヒト、ラットおよびマウスのｉＮＯＳｍＲＮＡの３'ＵＴＲにも存在しているので、このＡＲＥを含む３'ＵＴＲに対応する（配列が相補的な）アンチセンス転写物が存在するかどうかを、鎖特異的ＲＴ−ＰＣＲ法により調べた。本法はオリゴｄＴプライマーのように、ｍＲＮＡだけにハイブリダイズする（ストランド（鎖）特異的な）プライマーを使って逆転写を行って相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した後、ＰＣＲ法を行ってｃＤＮＡを増幅し、ｍＲＮＡの量を測定する方法である。
【００２８】
すなわち、以下に示すｉＮＯＳ遺伝子のセンス鎖のプライマー：
５’−ＴＧＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＡＣＡＴＴＣＴＣＴ−３’（配列番号２）
を用い、培地にＩＬ−１βを添加してｉＮＯＳ ｍＲＮＡを誘導したラット初代培養肝細胞の全ＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行ないｃＤＮＡを合成した。
【００２９】
ラット初代培養肝細胞から調製したＲＮＡ（１μｇ）と２ｐｍｏｌのプライマーを混ぜてから、７０℃、１０分間加熱後、０℃に急冷した。これにReverTra Ace反応バッファー（東洋紡）、ｄＮＴＰ（Ｎ＝Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ）（最終濃度１ｍＭになるように）、20 units RNase inhibitor（東洋紡）、及び200 units ReverTra Ace逆転写酵素（東洋紡）を加え、全量を２５μｌとした。４７℃で６０分間保温して逆転写した後、７０℃、１５分間加温して逆転写酵素を失活させた。次に、5 unitsのTth RNase H（東洋紡）を加えて、３７℃、２０分間加温して鋳型ＲＮＡを分解した。合成したｃＤＮＡはエタノール沈澱を行なって回収し、２０μｌのＴＥバッファーで溶解した。
【００３０】
このようにして得られたｃＤＮＡ ２μｌに、ＰＣＲ反応バッファー（ニッポンジーン社）、ｄＮＴＰ（Ｎ＝Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ；ニッポンジーン社）（最終濃度１２５μＭになるように）、下記２種類のプライマー、順方向（Forward）プライマー４０ｐｍｏｌ、逆方向（Reverse）プライマー４０ｐｍｏｌ、1 unit Gene Taq DNAポリメラーゼ（ニッポンジーン社）、及びanti-Taq high（＝抗Taqポリメラーゼ抗体，東洋紡）#を加えて、全量を４０μｌとしてさらにＰＣＲを行なった。
順方向：
５’−ＡＣＣＡＧＧＡＧＧＣＧＣＣＡＴＣＣＣＧＣＴＧＣ−３’（配列番号３）
逆方向：
５’−ＣＴＴＧＡＴＣＡＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＴＴＡＴＴＡＡＡ−３’（配列番号４）
【００３１】
ＰＣＲの温度プロトコールには公知の方法、すなわちステップダウン法（Nishizawa M, Nakajima T, Yasuda K, Kanzaki H, Sasaguri Y, Watanabe K, and Ito S. Close kinship of human 20a-hydroxysteroid dehydrogenase gene with three aldo-keto reductase genes. Genes Cells (2000) 5, 111-125）参照）に従って行った。ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動を行った結果、１８６塩基対（ｂｐ）のバンドの増幅が見られた。
このバンドをゲルから切り出して精製し、塩基配列を決定したところ、上記のプライマー配列に挟まれた、ラットｉＮＯＳｍＲＮＡの３’−ＵＴＲの配列に相補的な配列であることを確認した。すなわち、ｉＮＯＳ遺伝子のセンスプライマーを用いた鎖特異的ＲＴ−ＰＣＲ法により、アンチセンス転写物の存在を証明した。
【００３２】
さらにｉＮＯＳ遺伝子のアンチセンス転写物の全構造を調べるために、ＲＡＣＥ法（Frohman MA. Rapid amplification of complementary DNA ends for generation of full-length complementary DNAs: thermal RACE. Methods Enzymol. (1993) 218: 340-356参照）による解析を試みた。ＲＡＣＥ法は既知のｃＤＮＡ配列から鎖特異的なプライマーを作製して逆転写を行い、５'側および３'側のｃＤＮＡの配列を決定する方法である。
［５’側のｃＤＮＡの配列決定］
ラット初代培養肝細胞にＩＬ−１βを添加して、ｉＮＯＳ ｍＲＮＡを誘導し、Trizol試薬（インビトロジェン）でＲＮＡを調製した。このＲＮＡを鋳型とし、配列番号２のプライマー（ｉＮＯＳのセンス（forward）プライマー；５'-TGCCCCTCCCCCACATTCTCT-３'）を使って二本鎖ｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡにＣＡカセットアダプター（cDNA PCR Library Kit（タカラバイオ(株)）に添付）を連結した後、配列番号３のプライマー（ｉＮＯＳ ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲに対するセンス（forward）プライマー）とＣＡプライマー（cDNA PCR Library Kit（タカラバイオ(株)）に添付）を使ってＰＣＲを行なった。反応液をアガロースゲル電気泳動したところ、約２５０ｂｐのサイズのバンドが増幅していた。このバンドを切り出して、pGEM-T Easyベクター（プロメガ）にクローニングして、塩基配列を決定した。
［３’側のｃＤＮＡの配列決定］
上記と同様に、ＩＬ−１βで誘導したラット初代培養肝細胞からＲＮＡを調製した。PolyATract mRNA Isolation System(プロメガ)を使って、ＰｏｌｙＡ-画分のＲＮＡを精製し、このＲＮＡを鋳型とし、アンカー配列(下線部)を付けたランダムプライマー（アンカーランダムプライマー；５'-TTCCCTCCCGTTTTCTCTGCCACTAGAATTCTCGAGCGGCCGCNNNNNNN-３'（配列番号５））を使って二本鎖ｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡにＣＡカセットアダプターを連結した後、配列番号４のプライマー（ｉＮＯＳ ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲに対するアンチセンス（reverse）プライマー）とＣＡプライマーを使ってＰＣＲを行なった。この反応液を精製して鋳型とし、ｉＮＯＳ ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲに対するアンチセンス（reverse）プライマー（５'-ATATTAGAGCAGCGGGATGGCGCCTC-３'（配列番号６））とアンカープライマー（上記の「アンカーランダムプライマー」のアンカー配列に対するプライマー；５'-ACTAGAATTCTCGAGCGGCCGC-３'（配列番号７））を使って２次ＰＣＲを行なった。反応液をアガロースゲル電気泳動したところ、２００〜５００ｂｐのサイズのバンドが増幅していた。このバンドを切り出して、pGEM-T Easyベクターにクローニングして、塩基配列を決定した。
この結果、アンチセンス転写物の全長はほぼ６００塩基以上と推定された。以下にその配列を示した（配列番号１；但し、ｃＤＮＡ配列として示す。）。すなわち、アンチセンス転写物はｉＮＯＳ ｍＲＮＡの３'ＵＴＲに対応し、転写開始点（５'側）はｉＮＯＳ ｍＲＮＡのポリＡ付加部位の相補鎖にあった。
【００３３】
（２）ｉＮＯＳｍＲＮＡに相補的なアンチセンス転写物（以下、単にアンチセンスと略す）によるｉＮＯＳｍＲＮＡの安定化
アンチセンスがｉＮＯＳｍＲＮＡを安定化しているかどうかを明らかにするために、アンチセンスに相補的な配列を持ち、アンチセンスにハイブリダイズする性質を持つｉＮＯＳのセンスオリゴヌクレオチド（以下、センスオリゴと略す）をラット初代培養肝細胞に導入しｉＮＯＳｍＲＮＡ量を調べた。センスオリゴはオリゴヌクレオチドにおけるホスホジエステル結合のリン酸の酸素原子の一つを硫黄原子に置換（Ｓ化）することによって、細胞内における核酸分解酵によるオリゴヌクレオチドの分解を防いだ。ＩＢＡ社（Gottingen, Germany）のMagnet assisted transfection法による遺伝子導入試薬キット（MATra-A Reagent）により、Ｓ化センスオリゴをラット初代培養肝細胞に導入した。
【００３４】
ラット初代培養肝細胞は公知の方法（J. Hepatol. 40, 616-623, 2004）で調製し、６穴プレートに（１ウェルあたり３×１０5細胞）蒔いた。２時間後に、１ウェルあたり１．５ｍｌの新しい培地（Williams' E培地（ＷＥ）に、１０％ウシ胎児血清、１０ｎＭデキサメタゾンおよび１０ｎＭインスリンを含む培地。ＷＥＳ−ＤＩと略す）と交換した。さらに４時間後、オリゴ（２μｇ）とＷＥ（２００μｌ）を混合し、次に２μｌのMATra-A Reagent（ＩＢＡ社）を混ぜて室温で２０分間静置した後、肝細胞の入っているウェルに全量を滴下した。６穴プレートを磁石盤（ＩＢＡ社）の上に載せ、室温で１５分間静置してオリゴを細胞に導入した。１０％ウシ胎児血清を含むＷＥ（１ウェルあたり１．５ｍｌ）と交換してから、一晩３７℃に置いた。翌朝、１ｎＭのＩＬ−１βを含むＷＥに培地交換し、４時間、３７℃に置いた後、全ＲＮＡを調製した。
肝細胞をＩＬ−１βで刺激すると、ｉＮＯＳｍＲＮＡの量が顕著に増加するが、上記のＳ化センスオリゴを導入してＩＬ−１βで刺激して、ＲＴ−ＰＣＲ法およびリアルタイムＰＣＲ法によるｍＲＮＡ量の測定を行った。
【００３５】
ここで用いたｉＮＯＳ遺伝子のセンス鎖配列、すなわちｉＮＯＳｍＲＮＡと同じ配列を持つＳ化オリゴヌクレオチドは以下の配列で示される。実験ではＳ２、Ｓ４とＳ５に相当する。
Ｓ２：５’−Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊ＴＣＡＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＧ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ−３’
Ｓ４：５’−Ｔ＊Ａ＊Ｇ＊ＣＴＧＣＡＴＴＧＴＧＴＡＣＡ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ−３’
Ｓ５：５’−Ｇ＊Ｔ＊Ｇ＊ＴＡＴＡＡＴＴＣＣＴＴＧＡＴ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ−３’
（Ｓ化した部分は*で示した。）
【００３６】
一方、陰性対照として塩基組成が同じでありながら配列が異なるため、ｉＮＯＳｍＲＮＡやその転写物、あるいは他のＲＮＡとハイブリダイズしないことが確認されている配列を持つ「スクランブルオリゴ」を導入した。スクランブルオリゴの配列を以下に示す。
Ｓｃｒ２：５’−Ｇ＊Ｇ＊Ｔ＊ＡＴＴＧＣＣＣＡＣＣＣＡＡＣ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｔ−３’
Ｓｃｒ４：５’−Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊ＴＣＣＡＴＡＴＧＡＴＴＡＧＡ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ−３’
Ｓｃｒ５：５’−Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊ＴＧＴＴＡＣＴＴＡＧＡＧＡＣ＊Ｔ＊Ａ＊Ｔ−３’
これらのスクランブルオリゴもセンスオリゴと同様、細胞内での分解を防ぐために、Ｓ化して用いた。「スクランブルオリゴ」についてはラットゲノムとの相同性検索により、類似の配列が存在しないことを確認してある。
【００３７】
センス鎖（ｍＲＮＡと同じ配列を持つ鎖）と同じ配列のプライマーを用いて鎖特異的ＲＴ−ＰＣＲ法を行うと、「アンチセンス転写物」に対するｃＤＮＡのみが逆転写されるので、「アンチセンス転写物」の量を測定することができる。
【００３８】
この結果、Ｓ化センスオリゴを導入した場合にはｉＮＯＳｍＲＮＡの量が減少した。これは、Ｓ化センスオリゴが、ｉＮＯＳのアンチセンス転写物とハイブリダイズして、アンチセンス転写物が分解されたために、ｉＮＯＳｍＲＮＡも分解されたことを示している。一方、スクランブルオリゴを導入した場合には、ｉＮＯＳｍＲＮＡの量は大きく変動しなかった。
【００３９】
ｉＮＯＳと同様に、ＣＩＮＣ１は肝細胞においてＩＬ−１β刺激下で顕著なｍＲＮＡの誘導を起こす。そして、ＣＩＮＣ１のｍＲＮＡの３'非翻訳領域（３’ＵＴＲ）にも、ｉＮＯＳｍＲＮＡと同様にＡＲＥ配列が存在する。ｉＮＯＳのセンスオリゴを肝細胞に導入した際に、ＣＩＮＣ１のｍＲＮＡ量を測定したところ、オリゴを入れない場合とｍＲＮＡ量に差がなかった。すなわち、ｉＮＯＳのセンスオリゴの働きはｉＮＯＳに限定されるものであることを示していた。
以上の結果を併せると、ｉＮＯＳのセンスオリゴはｉＮＯＳアンチセンス転写物と特異的にハイブリダイズしてｉＮＯＳｍＲＮＡの分解を促進して、その結果としてｉＮＯＳｍＲＮＡの量を特異的に減少させることが示された。
【００４０】
実施例２：ＡＨＣＣによるｉＮＯＳｍＲＮＡの発現抑制のデータ、実験方法
マルツエキス（２％）、酵母エキス（０．２５％）、酒石酸アンモニウム（０．２％）を含む液体培地でシイタケ菌（Lentinulla edodes）を２４℃で１０日間通気培養して担子菌培養液３００Lを調整した。
米糠６ｋｇを３０Ｌの水に分散して液温１２０℃で２０分間撹拌して抽出した後、α−アミラーゼ、ペクチナーゼからなる酵素剤を適量加えて６０℃で１２０分間反応させ、デカンターにより固液分離して液部を回収して米糠抽出・酵素反応液を調整した。
得られた担子菌培養液：米糠抽出・酵素反応液を混合して、６０℃で２０時間撹拌して反応させ、次いで液全体を１２０℃以上に２０分間加熱して液中の酵素などを失活させ、反応液を減圧濃縮し、得られた濃縮液に賦型剤としてサイクロデキストリン含有デキストリン製剤を１７ｋｇ（固形分比として約２０％になるように）加えて凍結乾燥粉末としたものをＡＨＣＣサンプルとした。
常法（Prostaglandins 1993; 45: 459-474. 参照）に従って、ラット初代培養肝細胞をWistar雄性ラット（２００〜２２０ｇ）より調製した。この培養肝細胞（１×１０6cells/dish；３５ｍｍ）を炎症性サイトカイン ＩＬ−１β １ｎＭで刺激し、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）遺伝子の発現誘導をＡＨＣＣ（８ｍｇ／ｍｌ）の存在および非存在下で検討した。Total ＲＮＡ抽出はacid guanidinium-phenol-chloroformの方法（Anal Biochem 1987; 162: 156-159.）に従った。Total ＲＮＡ（１０μｇ）を用いてｉＮＯＳ ｍＲＮＡのレベルをノーザンブロット分析にて解析した（図１）。ｃＤＮＡプルーブとしてはrandam-primed法にて［α−32Ｐ］ｄＣＴＰでラベルしたｒａｔ ｉＮＯＳ ＤＮＡ（８３０ｂｐ）（Biochem Biophys Res Commun 1993; 191: 89-94. 参照）を用いた。内部標準としてglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（ＧＡＰＤＨ）（Gene 1990; 91: 185-191. 参照）を用いて比較した。
その結果、ＩＬ−１β刺激によるｉＮＯＳｍＲＮＡレベルにおいても、３時間後からｉＮＯＳｍＲＮＡが発現してくるのに対し、ＡＨＣＣ投与群において有意にｉＮＯＳ ｍＲＮＡの発現の抑制が認められた。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ＡＨＣＣのｉＮＯＳｍＲＮＡ誘導に対する効果を示すノーザンブロット分析による電気泳動像。
【図１】
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【配列表】
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