(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式：
【化１】
0006026765.tif 000006
で示されるイソプロピルメチルフェノールを有効成分とするチロシナーゼ阻害剤であって、イソプロピルメチルフェノールを０．００００１〜０．００３ｗ／ｖ％濃度で含有する、チロシナーゼ阻害剤。
【請求項２】
下記式：
【化２】
0006026765.tif 000007
で示されるイソプロピルメチルフェノールを有効成分とするメラニン生成抑制剤であって、イソプロピルメチルフェノールを０．００００１〜０．００３ｗ／ｖ％濃度で含有する、チメラニン生成抑制剤。
【請求項３】
下記式：
【化３】
0006026765.tif 000008
で示されるイソプロピルメチルフェノールを有効成分とする美白剤であって、イソプロピルメチルフェノールを０．００００１〜０．００３ｗ／ｖ％濃度で含有する、美白剤。
【請求項４】
下記式：
【化４】
0006026765.tif 000009
で示されるイソプロピルメチルフェノールを０．００００１〜０．００３ｗ／ｖ％濃度で含有する美白化粧料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラニン生成を抑制する、チロシナーゼ阻害剤、美白剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
チロシナーゼは、メラニンの生合成に関与する酵素として知られている。メラニン生成過程において、チロシナーゼはチロシンからＬ−ドーパ（3,4-ジヒドロキシ-L-フェニルアラニン）への水酸化反応、およびＬ−ドーパからドーパキノンへの酸化反応を触媒しており、生体内でチロシンからのメラニン生合成に直接影響を及ぼしている（非特許文献１）。
このような過程を経て生成されたメラニンは、生体内で紫外線による体細胞の損傷を防ぐ働きしている。その一方で、過剰なメラニン生成が、皮膚の黒化や色素沈着によるシミ・ソバカスとなることも知れられており、美容上のみならず健康面からも問題視されている。
【０００３】
そのため従来から、過剰なメラニン生成を抑制するために、チロシナーゼ活性をコントロールすることが提案されており、チロシナーゼ活性を阻害する物質の探索が行われている。例えば、ビタミンＣ、アルブチン、コウジ酸等がチロシナーゼ活性を阻害する物質として知られている。
【０００４】
一方、イソプロピルメチルフェノール（別名：ｐ−チモール）は、殺菌力、抗菌性を持ち、皮脂に増殖しやすい細菌に作用することで、従来から殺菌剤として、化粧品や医薬品等に０．０５〜０．１０質量％（５００〜１０００ｐｐｍ）の濃度で配合されている。
イソプロピルメチルフェノールの位置異性体であるチモール及びカルバクロールには、マッシュルーム由来のチロシナーゼに対して阻害活性を有すること及びマウスメラノーマＢ−１６細胞においてメラニン産生抑制作用があること（特許文献１）が報告されているが、ヒト由来チロシナーゼに対する阻害活性はこれまでに報告されておらず、イソプロピルメチルフェノールについては、チロシナーゼ阻害活性やメラニン産生抑制作用があることは、これまでに全く報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平９−２４９５４４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Int.J.Mol.Sci.2009, 10, 2440-2475
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、優れたチロシナーゼ活性阻害作用を有し、且つ安全性が高い、チロシナーゼ活性阻害剤、メラニン産生抑制剤、美白剤及び化粧料を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、上記課題に鑑み、検討を行った結果、意外にも殺菌剤として化粧料等に配合されているイソプロピルメチルフェノールに優れたヒト由来チロシナーゼ活性阻害作用があり、しかも従来殺菌剤として効果を発揮する濃度よりも低い濃度で斯かる作用があることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（４）に係るものである。
（１）イソプロピルメチルフェノールを有効成分とするチロシナーゼ阻害剤。
（２）イソプロピルメチルフェノールを有効成分とするメラニン生成抑制剤。
（３）イソプロピルメチルフェノールを有効成分とする美白剤。
（４）イソプロピルメチルフェノールを０．００００１〜０．０４ｗ／ｖ％濃度で含有する化粧料。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のチロシナーゼ阻害剤、メラニン生成抑制剤、美白剤及び化粧料によれば、皮膚におけるメラニンの過剰産生を抑制でき、日焼け後の色素沈着やシミ・ソバカスを予防又は改善することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明において、「チロシナーゼ阻害」とは、チロシナーゼの活性を阻害することを意味する。ここで、チロシナーゼは、哺乳類におけるメラニン生成の鍵反応、果実や菌類における酵素的褐色化の鍵反応に関与する酵素であり、本発明ではその種類は特に限定されないが、哺乳類由来のチロシナーゼが好ましく、ヒトチロシナーゼがより好ましい。また、チロシナーゼ活性には、例えばチロシンをジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）に変換すること、ＤＯＰＡをドーパキノンに変換することが包含される。
本発明において、「美白（作用）」とは、メラニン色素の生成を抑え、余分なメラニンのない本来の肌色に戻すこと、または皮膚の黒化若しくはシミ・ソバカス等の色素沈着を防止、抑制することを意味する。
【００１２】
本発明において用いられる、イソプロピルメチルフェノールは、化粧料、医薬品、医薬部外品等に使用できるイソプロピルメチルフェノールであれば特に限定されるものではない。斯かるイソプロピルメチルフェノールは、公知の方法（例えば、ＤＥ  １０２００７０３５５１５号明細書）によって化学合成してもよく、また市販品を使用することもできる。
【００１３】
後記実施例に示すように、イソプロピルメチルフェノールは、ヒトチロシナーゼ（新生児表皮由来メラノサイト抽出物）に対して、チロシナーゼ活性（ドーパーオキダーゼ活性）を阻害する（実施例１）。斯かるチロシナーゼ活性阻害作用は、ヒト新生児表皮由来メラノサイトを用いた培養系においても同様に確認された（実施例２）。前述のように、チロシナーゼはメラニン生合成に関与する酵素であることから（前記非特許文献１）、イソプロピルメチルフェノールは、チロシナーゼ活性を阻害することでメラニン産生を抑制し、美白作用を発揮すると云える。
ここで、当該チロシナーゼ活性阻害作用は、殺菌剤として使用する場合に定められているイソプロピルメチルフェノール濃度（５００〜１０００ｐｐｍ）よりも低い濃度で認められ、その程度はチロシナーゼ活性阻害剤として公知のコウジ酸よりも高い。
【００１４】
したがって、イソプロピルメチルフェノールは、低用量で、チロシナーゼ阻害のために、或いはメラニン産生を抑制のために、或いは美白のために使用することができる。尚、当該使用は、ヒト若しくは非ヒト動物における使用であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。
【００１５】
また、イソプロピルメチルフェノールは、チロシナーゼ阻害剤、メラニン産生抑制剤、美白剤（以下、チロシナーゼ阻害剤等）として使用することができ、さらにこれらの剤を製造するために使用することができる。このとき、当該チロシナーゼ阻害剤等には、イソプロピルメチルフェノールを単独で、又はこれ以外に必要に応じて適宜選択される製剤担体等の許容されるものを使用してもよい。
【００１６】
当該チロシナーゼ阻害剤等は、それ自体、チロシナーゼ阻害、メラニン産生抑制、美白の各効果を発揮する、化粧料、医薬部外品又は医薬品であってもよく、当該化粧料等に配合して使用される素材又は製剤であってもよい。
また、チロシナーゼ阻害剤等は、チロシナーゼ阻害、メラニン産生抑制或いは美白をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した化粧品又は医薬部外品として使用することもできる。
【００１７】
上記医薬品（医薬部外品も含む）は任意の投与形態で投与され得る。投与形態としては、例えば坐剤、吸入薬、経皮吸収剤、外用剤（ローション、乳液、ゲル、クリーム、軟膏等）等による非経口投与又は錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与の何れでもよいが、好ましくは非経口投与、より好ましくは外用投与である。
このような種々の剤型の医薬製剤を調製するには、イソプロピルメチルフェノールを単独で、又は他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
【００１８】
上記化粧料（医薬部外品も含む）の形態は、皮膚外用剤、洗浄剤、メイクアップ化粧料等とすることができ、使用方法に応じて、ローション、乳液、ゲル、クリーム、軟膏剤、粉末、顆粒等の種々の剤型で提供することができる。このような種々の剤型の化粧料は、イソプロピルメチルフェノールを単独で、又は医薬部外品、皮膚化粧料及び洗浄料に配合される、油性成分、保湿剤、粉体、色素、乳化剤、可溶化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、増粘剤、薬効成分、香料、樹脂、防菌防黴剤、植物抽出物、アルコール類等を適宜組み合わせることにより調製することができる。尚、薬効成分としては、ホルモン剤やコウジ酸、アルブチン、プラセンタエキス、カミツレエキス、ルシノール等の他の美白成分が挙げられる。
【００１９】
上記医薬品、医薬部外品又は化粧料の全量中の、イソプロピルメチルフェノールの含有量は、通常０．００００１〜０．０４ｗ／ｖ％であり、チロシナーゼ阻害効果及び安全性の点から、好適には、０．０００１〜０．０４ｗ／ｖ％、０．０００５〜０．０４ｗ／ｖ％、０．００１〜０．０４ｗ／ｖ％、０．０００７〜０．０２ｗ／ｖ％、０．０００７〜０．００２ｗ／ｖ％、０．０００７〜０．００５ｗ／ｖ％、０．００１〜０．００５ｗ／ｖ％、０．００００１〜０．００３ｗ／ｖ％、０．０００１〜０．０１ｗ／ｖ％等が挙げられる。
尚、イソプロピルメチルフェノールは、これまで殺菌剤として、薬用化粧品（医薬部外品）や医薬品等に０．０５〜０．１０ｗ／ｖ％濃度で配合することが認められているのみであり（薬食審査発第１２２５００１号「いわゆる薬用化粧品中の有効成分リストについて」）、０．００００１〜０．０４ｗ／ｖ％で含有する薬用化粧料や化粧料はこれまでに知られていない。
【００２０】
また、上記医薬品等の投与量又は摂取量は、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、経口投与又は摂取の場合成人１人当たり、イソプロピルメチルフェノールとして、１日あたり０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇ／ｋｇとすることが好ましく、０．０００１〜５０ｍｇがより好ましく、さらに０．０００１ｍｇ〜２５ｍｇ／ｋｇとするのが好ましい。
【００２１】
上述した実施形態に関し、本発明においては以下の態様が開示される。
＜１＞イソプロピルメチルフェノールを有効成分とするチロシナーゼ阻害剤。
＜２＞イソプロピルメチルフェノールを有効成分とするメラニン生成抑制剤。
＜３＞イソプロピルメチルフェノールを有効成分とする美白剤。
＜４＞イソプロピルメチルフェノールを０．００００１〜０．０４ｗ／ｖ％濃度、好適には、０．０００１〜０．０４ｗ／ｖ％濃度、０．０００５〜０．０４ｗ／ｖ％濃度、０．００１〜０．０４ｗ／ｖ％濃度、０．０００７〜０．０２ｗ／ｖ％濃度、０．０００７〜０．００２ｗ／ｖ％濃度、０．０００７〜０．００５ｗ／ｖ％濃度、０．００１〜０．００５ｗ／ｖ％濃度、０．００００１〜０．００３％濃度、又は０．０００１〜０．０１ｗ／ｖ％濃度で含有する化粧料。
＜５＞美白化粧料である＜４＞の化粧料。
＜６＞チロシナーゼ阻害剤を製造するための、イソプロピルメチルフェノールの使用。
＜７＞メラニン生成抑制剤を製造するための、イソプロピルメチルフェノールの使用。
＜８＞美白剤を製造するための、イソプロピルメチルフェノールの使用。
＜９＞チロシナーゼ阻害に使用するためのイソプロピルメチルフェノール。
＜１０＞メラニン生成抑制に使用するためのイソプロピルメチルフェノール。
＜１１＞美白に使用するためのイソプロピルメチルフェノール。
＜１２＞イソプロピルメチルフェノールを投与又は摂取するチロシナーゼ阻害方法。
＜１３＞イソプロピルメチルフェノールを投与又は摂取するメラニン生成抑制方法。
＜１４＞イソプロピルメチルフェノールを投与又は摂取する美白方法。
【実施例】
【００２２】
実施例１  細胞抽出物を用いたイソプロピルメチルフェノールによるドーパオキシダーゼ活性抑制
（１）細胞抽出物（Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓａｔｅ）の調製
正常ヒト新生児表皮由来メラノサイト（ＮＨＥＭｓ；クラボウ社）をＴ−１７５フラスコに播種し、３７℃、５％ＣＯ2下にて培養した。培地には、ＰＭＡ（−）の増殖用添加剤（ＨＭＧＳ）を含むＭｅｄｉｕｍ  ２５４を用いた。細胞が９０％コンフルエントの密度になった時点で細胞を回収し、抽出バッファー（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．２）、１％  ＮＰ−４０、０．０１％ＳＤＳ、１００μＭ  ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍアプロチニン）を１０ｍＬ加え、超音波処理後、１５０００ｒ．ｐ．ｍ．の速度で１０分間の遠心分離により、上清を得た。
【００２３】
（２）チロシナーゼ活性の測定
上記細胞抽出物を用いてチロシナーゼ活性の測定を行った。ドーパオキシダーゼ活性測定は、ＭＢＴＨ法（Winder A. et al., 1991, Eur.J. Biochem. 198:317-326）を参考に、以下の方法で行った。９６ウェルプレートの各ウェルにＡｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ（４％ジメチルホルムアミド、１００ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ（ｐＨ７．１））を８０μＬ、２０．７ｍＭ  ＭＢＴＨ（３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン）溶液を６０μＬ、基質として５ｍＭ  Ｌ−ドーパ（Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン）溶液を４０μＬ、それぞれ加え、以下に示す試験化合物を表１の終濃度になるように２０μＬ加えた。そこに（１）で得た細胞抽出物を２０μＬ添加し、３７℃で３０〜６０分反応させた後、その呈色反応を４９０ｎｍの吸光度で測定した（Ｎ＝３）。測定値をコントロールの結果に対する相対値として表した。
【００２４】
【化１】
0006026765.tif 000002
【００２５】
（３）結果
結果を表１に示す。
イソプロピルメチルフェノールは、コウジ酸を超えるドーパオキシダーゼ活性抑制作用が濃度依存的（０．０００７５〜０．０１５ｗ／ｖ％）に認められた。一方、比較化合物１（チモール）及び比較化合物（カルバクロール）にはドーパオキシダーゼ活性抑制作用は認められなかった。
【００２６】
【表１】
0006026765.tif 000003
【００２７】
実施例２  培養細胞を用いたイソプロピルメチルフェノールによるドーパオキシダーゼ活性抑制（１）
（１）細胞培養
正常ヒト新生児表皮由来メラノサイト（ＮＨＥＭｓ；クラボウ社）を９６ウェルプレートに１×１０4細胞／ウェル（１００μＬ／ウェル）の細胞密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ2下にて培養した。培地には、ＰＭＡ（−）の増殖用添加剤（ＨＭＧＳ）を含むＭｅｄｉｕｍ  ２５４を用いた。
３日間培養した後、それぞれ培地中終濃度で１ｎＭになるように調整したＥｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１（ＥＴ−１）、ＳＣＦ、α−ＭＳＨ、Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ、ＰＧＥ2とともに、実施例１と同様の試験化合物を終濃度となるように添加し、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で３日間培養を行った。コントロールとしては、同量のＤＭＳＯを添加した。
【００２８】
（２）ドーパオキシダーゼ活性の測定
培養終了後、アラマーブルー（インビトロジェン社）試薬を２０μＬ／ウェルで添加し、２〜３時間インキュベートした後、培地の蛍光強度を測定して細胞呼吸活性を測定した。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、抽出バッファー（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．２）、１％  ＮＰ−４０、０．０１％ＳＤＳ、１００μＭ  ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍアプロチニン）を２０μＬ／ウェル、Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ（４％ジメチルホルムアミド、１００ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ（ｐＨ７．１））を２０μＬ／ウェル添加し、４℃、３時間で細胞を可溶化し、ドーパオキシダーゼ活性の測定を行った。ドーパオキシダーゼ活性測定は、ＭＢＴＨ法（Winder A. et al., 1991, Eur.J. Biochem. 198:317-326）を参考に、以下の方法で行った。
可溶化した細胞溶液の各ウェルに、上記Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒを８０μＬ、２０．７ｍＭ  ＭＢＴＨ（３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン）溶液を６０μＬ、基質として５ｍＭ  Ｌ−ドーパ（Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン）溶液を４０μＬ、それぞれ加え、３７℃で３０〜６０分反応させた後、その呈色反応を４９０ｎｍの吸光度で測定した（Ｎ＝３）。測定値をコントロールの結果に対する相対値として表した。
【００２９】
（３）結果
結果を表２に示す。
イソプロピルメチルフェノールは、コウジ酸を超えるドーパオキシダーゼ活性抑制作用が濃度依存的に認められた。一方、比較化合物１（チモール）及び比較化合物（カルバクロール）にはドーパオキシダーゼ活性抑制作用は認められなかった。また、アラマーブルー法による細胞呼吸活性の測定から、ドーパオキシダーゼ活性抑制作用が認められたイソプロピルメチルフェノール濃度は、細胞増殖に影響を及ぼさないことが確認された。
【００３０】
【表２】
0006026765.tif 000004
【００３１】
実施例３  培養細胞を用いたイソプロピルメチルフェノールによるドーパオキシダーゼ活性抑制（２）
イソプロピルメチルフェノールを表３に示す終濃度となるように添加し、実施例２と同様にしてドーパオキシダーゼ活性を測定した。結果を表３に併せて示す。
【００３２】
【表３】
0006026765.tif 000005
【００３３】
表３より、イソプロピルメチルフェノールには０．００００１〜０．００２５ｗ／ｖ％の濃度範囲で濃度依存的なドーパオキシダーゼ抑制作用が認められ、当該濃度範囲では細胞増殖に影響を及ぼさないことが確認された。