(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルを処理するためのデバイスであって、
当該デバイスは１つ以上の流路を備えており、その流路は、流体の吸上げ、及び／又は、毛細管流動を支持し得る幾何学的に形作られた吸水性材料を具備してなる、デバイスにおいて、
当該デバイスは更に、
流体サンプル（当該サンプルはターゲットを含む）のアリコートを受容するためのサンプル受容ゾーンと、
前記ターゲットを結合させる及び／又は純化するための第１の捕獲ゾーンと、
前記サンプル受容ゾーンと前記第１の捕獲ゾーンとを結ぶ毛細管流動の流路と、
１つ以上の溶液供給ゾーンと、
を備えており、
前記溶液供給ゾーンの各々は、前記吸水性材料を具備する２つの溶液流路を介して前記毛細管流動の流路又は前記第１の捕獲ゾーンに接続されており、
前記２つの溶液流路は、前記サンプル受容ゾーンの下流において、前記毛細管流動の流路又は前記第１の捕獲ゾーンの両側縁にそれぞれ結合点を形成すると共に、
前記２つの溶液流路の各々は、アッセイ開始時に前記アリコート及び溶液のすべてが加えられた後で、所望の時間ないし順序で、対応する溶液を前記毛細管流動の流路又は前記第１の捕獲ゾーンに搬送するためのものである、ことを特徴とするデバイス。
【請求項２】
前記吸水性材料が、ニトロセルロース、濾紙、又は、グラスファイバーである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記第１の捕獲ゾーンは、前記ターゲットを結合させるためのリガンド、シリカ、グラスファイバー、及び／又は、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）膜を備える、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】
前記サンプル受容ゾーンと前記第１の捕獲ゾーンとの間に配置されると共にこれらゾーンと毛細管流動にて接触する第２の捕獲ゾーンを更に備えており、
この第２の捕獲ゾーンは、前記ターゲットを含んでいる生物学的粒子及び／又は細胞を捕獲するためのものである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項５】
前記第２の捕獲ゾーンは、免疫−捕獲ゾーンである、請求項４に記載のデバイス。
【請求項６】
前記第２の捕獲ゾーンは、目的の生物学的粒子または細胞に結合するためのリガンドを備える、請求項４に記載のデバイス。
【請求項７】
前記リガンドは、抗体、又は、オリゴヌクレオチドである、請求項６に記載のデバイス。
【請求項８】
前記第２の捕獲ゾーンと毛細管流動にて接触する溶解ゾーンを更に備え、
この溶解ゾーンは、生物学的粒子及び／又は細胞の溶解、並びに、そこからの核酸の遊離のためのものである、請求項４〜７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項９】
前記第１の捕獲ゾーンと毛細管流動にて接触する１つ以上のアッセイゾーンを更に備える、請求項１〜８のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記１つ以上のアッセイゾーンは、一緒になってサンドイッチ核酸ハイブリダイゼーションアッセイのための核酸および標識構成成分を形成する、請求項９に記載のデバイス。
【請求項１１】
前記第１の捕獲ゾーンの下流にあって当該第１の捕獲ゾーンと毛細管流動にて接触する核酸増幅ゾーンを更に備える、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１２】
前記ゾーンの１つ以上が、前記吸水性材料を備える、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記幾何学的に形作られた吸水性材料は、前記ゾーンのうちの少なくとも二つを結合する１つ又はそれ以上の流路を形成している、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１４】
前記溶液供給ゾーンのうちの一つは、洗浄緩衝液、溶解緩衝液、及び、核酸増幅緩衝液からなる群から選択される溶液を含む流体を供給するものである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記ゾーンおよび流路は、前記吸水性材料を含む単一の膜から作られている、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１６】
前記流路の１つ以上は、第２の材料を備える、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１７】
前記第２の材料は、セルロースエステル、グラスファイバー、ポリエーテルスルホン、綿、無水ポリアクリルアミド、シリカゲル、又は、ポリエチレングリコールである、請求項１６に記載のデバイス。
【請求項１８】
前記吸水性材料の組成、並びに／又は、前記流路の少なくとも一つの長さ及び／又は幅は、前記少なくとも一つの流路における流体流動の流速を受動的に制御するように選択されている、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１９】
前記ターゲットは核酸を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２０】
前記流路の領域は、増幅インヒビタやその他の望ましくないサンプルマトリクス混入物の活性を除去又は減少するように改修されている、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２１】
請求項１に記載のデバイスと共に使用するための幾何学的に規定されたストリップであって、吸水性材料を含むストリップ。
【請求項２２】
サンプルを処理する方法であって、当該方法は、
ターゲットを含むサンプルをサンプル受容ゾーンに配置する工程と、
前記サンプルをサンプル受容ゾーンに配置する工程と同時に、１種以上の溶液をそれぞれの溶液供給ゾーンに配置する工程と、
流体の吸上げ、及び／又は、毛細管流動を支持し得る幾何学的に形作られた吸水性材料を経由する流路に沿って、流体の吸上げ、及び／又は、毛細管流動によって前記ターゲットを捕獲ゾーンに輸送する工程と、
前記ターゲットを、前記捕獲ゾーンの第１のリガンドに結合する工程であって、それによってサンプル中における他の成分に対するターゲットの濃度を増大させる、結合工程と、
前記流路又は前記捕獲ゾーンの両側縁にそれぞれ接続されてなる、各溶液用の分離した２つの流路を経由して、前記１種以上の溶液を、所望の時間で前記捕獲ゾーンに輸送する工程と、
を備えており、前記分離した２つの流路の各々は、吸水性材料を含むと共に、前記サンプル受容ゾーンを回避している、ことを特徴とする方法。
【請求項２３】
前記捕獲ゾーンから前記他の成分を除去する工程を更に備える、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記結合工程は、ＤＮＡもしくはＲＮＡをシリカもしくはオリゴヌクレオチドと結合すること、又は、核酸、プロテインもしくは低分子の陰イオンもしくは陽イオンで媒介された濃縮のための官能化された基質を提供することを含む、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ターゲットは、核酸を含み、
溶解物及び／又は洗浄緩衝液を、核酸親和性マトリックスと毛細管流動性の材料を介して連結されているところの、緩衝液交換が起きる領域に加えること、そして、直接的に核酸を精製することを更に備える、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記溶液の少なくとも一種は、緩衝液であり、
前記吸水性材料は、吸水性材料の所望のゾーンにある別の溶液またはサンプルと、所望の時間で、受動的な緩衝液交換を自動的に行うように構成されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
吸収性材料の組成、及び／又は、前記流路または前記分離した流路の少なくとも一つの長さ及び／又は幅、を選択することにより、前記サンプル、ターゲット、溶解物、洗浄緩衝液、及び／又は、少なくとも一つの溶液の相対的な流速を受動的に制御することを更に備える、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１のリガンドは、前記捕獲ゾーンの吸水性材料に取り付けられている、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記サンプルは、核酸を含有した複数の生物学的な粒子又は細胞を含み、
溶解緩衝液を含む溶液を用いて前記生物学的な粒子又は細胞を溶解すること、それにより、前記生物学的な粒子又は細胞からターゲットを解放することを更に備える、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記溶解の工程に先んじて、前記生物学的な粒子又は細胞の一つ以上の表面と第２のリガンドを反応させることにより、前記生物学的な粒子又は細胞の濃度を増大させることを更に備える、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記第２のリガンドは、抗体、オリゴヌクレオチド、ポリサッカライド(polysaccharide)、又は、炭水化物(carbohydrate)を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記第２のリガンドは、前記吸水性材料に取り付けられている、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記吸水性材料を経由する洗浄緩衝液流路に沿っての流体吸上げ及び／又は毛細管流動によって運ばれた洗浄緩衝液で、前記溶解緩衝液を除去すること、そしてそれにより、洗浄緩衝液を溶解緩衝液と受動的に交換することを更に備える請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
一種以上の溶液を用いて、欲しくない溶解物、欲しくないサンプル成分、細胞混入物、マトリックス混入物、化学的混入物、及び／又は、増幅インヒビタ（増幅阻害剤）を除去することを更に備える、請求項２２〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも一種の溶液は、洗浄緩衝液である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ターゲットを増幅することを更に備える、請求項２２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ターゲットは核酸であり、前記増幅する工程は、核酸増幅緩衝液を用いることを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記増幅に先んじて、前記ターゲットを溶出することを更に備える、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記増幅工程に先んじて、前記捕獲ゾーンをパンチアウトすることを更に備える、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ターゲットは核酸を含む、請求項２２〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記第２の材料は、前記吸水性材料における少なくとも一種の流体の流動を制御すべく選択されている、ことを特徴とする請求項１６に記載のデバイス。
【請求項４２】
前記第２の材料は、前記吸水性材料の連続性を妨げるように配置されている、請求項１６に記載のデバイス。
【請求項４３】
前記第２の材料は、混入物の移動を低減または不可能にする、請求項１６に記載のデバイス。
【請求項４４】
前記第２の材料は、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）、インヒビタ封鎖剤、又は、陽イオン交換リガンドを含む、請求項１６に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［連邦政府が支援する研究開発のもとでなされた発明に対する権利に関する声明］
本発明は、米国エネルギー省が与えた、契約番号ＤＥ−ＡＣ５２−ＮＡ２５３９６のもとで政府の支援でなされた。
【０００２】
［関連出願］
本出願は、２００８年５月５日出願の米国仮特許出願第６１／１２６，６４５号についての優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
生物学的サンプルマトリクスの多様な性質のために、証明力の無い（又は非試用の）サンプル構成（成分）の複雑な混合物中に存在する場合でさえ微量な分析物の収集を可能にする、堅調だが一般的な前段階のサンプル処理方法の必要性が示されている［非特許文献５］。これらの課題は多くの場合、有効な免疫学的または分子の分析的な技術に対して交絡している物質の存在によって悪化される。例えば、ヒトの組織由来のサンプルは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に使用されるＤＮＡポリメラーゼに対して阻害性であることが公知の複雑なポリサッカライド、ヘモグロビン、鉄および他の物質を含む可能性が高い。同様に、環境の構成成分、例えば、土壌または植物物質が混入した環境のサンプルまたは微量のサンプルはさらに、ＰＣＲおよび徹底的な核酸分析にとって重要な他の酵素反応に対して強力に阻害性であるフミン酸などの有機物も含み得る。
【０００４】
多様な生物学的サンプルに適用可能な信頼できる核酸単離方法は、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方について報告されている［非特許文献５〜１１］が、このような方法は、労働集約的であり、実験装置に依存し、かつ完了するのに数時間を要し、その結果サンプル処理が限定され、サンプル在庫が大きくなる［非特許文献１２］。下流の酵素操作、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、酵素活性に対して阻害性のマトリクス構成成分の存在によって有害に影響される場合があり、これによって、信頼できるサンプル調製が不可欠となる［非特許文献５］。ヘモグロビン、鉄および複雑なポリサッカライドは一般に、生物学的サンプル中で遭遇されるが、追加的な阻害性化合物、例えば、フミン酸が、多くの場合、土壌、植物物質または腐敗物を含む環境的に収集されたサンプルに伴う［非特許文献１３〜１５］。さらに、診断サンプルおよび法医学的サンプル中の多くの分析物の微量の性質、ならびに密接に関連するが証明力の無い（又は非試用の）大量の構成成分が、分析的な課題に大きく寄与する［非特許文献１６〜２０］。
【０００５】
側方流動イムノクロマトグラフィは十分確立されており、かつ長年にわたってタンパク質および低分子の検出のために用いられている［非特許文献２１、２２］。実際、側方流動の間の免疫−捕獲は、治療の現場（例えば、Ａ型連鎖球菌抗原）、および自宅（例えば、妊娠テスト）において広範な用途を見出している、迅速な携帯型のイムノアッセイ(immuno-assays)の基礎である。これらのアッセイは、検出のエンドポイントとして側方流動の間に免疫−捕獲を利用するが、本発明者らは、混合されたサンプルから少ない標的（細胞、ウイルス、胞子）を回収することを可能にするように設計されたサンプル調製戦略における最初の工程として、迅速かつ効率的な免疫−捕獲を得る手段と同じ原理を用いることを提唱する。一旦、静止期で捕獲されれば、次に、これらの標的を核酸単離のためのさらなる処理に供してもよいし、または他の分析のために収集してもよい。
【０００６】
病原体の検出および同定のための核酸ベースのアッセイは、選択性、特異性および解像をもたらす。これらの特徴によって、核酸分析は強力な診断および法医学的技術となる。それにもかかわらず、核酸調製のための多くの技術は、臨床の血液標本などの比較的豊富なサンプルからの単離に集中してきた。しかし、多くの適用では、多くの場合、多様な起源の複雑な混合サンプル中で微量の構成成分を単離および特定する必要性に取り組まなければならない。ＤＮＡベースのアッセイとは対照的に、イムノアッセイは、低コストの、容易に用いられる方式で、広範に受け入れられており、おそらくその最も顕著なのは、クロマトグラフィの側方流動イムノアッセイである［非特許文献２３］。側方流動アッセイはまた、携帯型アッセイまたはディップスティックアッセイとしても公知であって、容易に用いられる低コストの方式で迅速な抗原検出が必要とされる広範な適用に用いられる。側方流動イムノアッセイは、病原の特定、診断ならびに環境および農業の調査に首尾よく使用されている［非特許文献４］。いくつかのクロマトグラフィの側方流動アッセイが、種々の検出技術を用いて核酸配列の検出について記載されている［非特許文献２４〜２８］。早期の研究では、サンプルの導入後のディップスティックの時間浪費的な操作に依拠するやっかいな酵素検出戦略［非特許文献２５、２６］および多重の適用にはあまり適していない検出スキーム［非特許文献２４、２７］を利用した。
【０００７】
さらに近年記載される、側方流動マイクロアレイ（ＬＦＭ）は、多重核酸検出のための小型化側方流動ベースの方法である［非特許文献１］。このアプローチは、多数の核酸配列を単一アッセイで検出することを可能にする小型の側方流動クロマトグラフィストリップのＤＮＡマイクロアレイ様の様式を利用する。このデバイスの表面積の減少によって伝統的な側方流動デバイス型の要因を上回るいくつかの利点が得られる。サンプル容積は１０μＬまで低下され、その結果、試薬の消費が減り、同様にサンプル輸送時間が減る。さらに、側方流動マイクロアレイ（ＬＦＭ）によって示されるハイブリダイゼーション時間は、標準的なガラス基板マイクロアレイに比較して有意に短くなり、これによって典型的には、数時間のサンプルとのハイブリダイズが可能になり、同様に、さらに迅速なハイブリダイゼーションを容易にするマイクロ流体システムを利用するさらに複雑なマイクロアレイの実行が可能になる［非特許文献１、２９、３０］。この側方流動基板を通じた対流の流体運動、および使用される膜基板の底の抜けた細孔によって、ビーズに基づくカラムクロマトグラフィに比較して優れたクロマトグラフィ能力が生じる［非特許文献３１〜３４］。これらの要因によって、分析物の２５０ａｍｏｌ未満のハイブリダイゼーションに基づく検出が２分間で得られる［非特許文献１］。ＬＦＭはさらに、米国特許出願番号第１１／８９４，９１０号、およびＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１８５３７に記載されている。
【０００８】
ＬＦＭプラットフォームは、炭疽病の病原因子であるＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの迅速なアッセイを開発するために用いられており、かつ１μｇの総ヒトＲＮＡからなる複雑な核酸バックグラウンドに存在する場合、２〜３個程度の少ないＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ細胞からＲＮＡを検出することが示されている［非特許文献１］。報告されたＬＦＭアプローチは、ＲＮＡ単離のための標準的な実験室の方法、および核酸配列ベース増幅として公知の等温ＲＮＡ増幅スキーム（ＮＡＳＢＡ）を利用した［非特許文献３５〜３７］。おそらく最も重要なことに、ＬＦＭによって例示される側方流動の最小化によって、サンプル調製指示のための流体またはマイクロ流体システムとの統合に適した物理的な構成が得られる。
【０００９】
ＬＦＭベースのタンパク質および核酸の検出と簡易化サンプル処理方法との統合によって、広範なサンプルタイプの処理およびスクリーニングのためのいくつかの潜在的な利点が得られるであろうし、この統合は望ましい。同様に、分析物を追跡および／または希釈するために適用可能なさらに堅調なサンプル調製方法は一般に、治療の現場および現場に配置されたアッセイにおける核酸の増幅および検出を促進する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｃａｒｔｅｒ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ  Ｒ．Ｂ．Ｃａｒｙ，Ｌａｔｅｒａｌ  ｆｌｏｗ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄ  ｌａｔｅｒａｌ  ｆｌｏｗ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２００７．３５（１０）：ｐ．ｅ７４．
【非特許文献２】Ｂａｅｕｍｎｅｒ，Ａ．Ｊ．，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ｆｏｒ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｐｏｌｌｕｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ｆｏｏｄ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔｓ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏａｎａｌ  Ｃｈｅｍ，２００３．３７７（３）：ｐ．４３４−４４５．
【非特許文献３】Ｐｒｉｓｔｏｕｐｉｌ，Ｔ．Ｉ．，Ｍｉｃｒｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｏｎ  ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｒｅｖ，１９７０．１２（２）：ｐ．１０９−１２５．
【非特許文献４】Ｋｏｈｎ，Ｊ．，Ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９６８．１５（６）：ｐ．８６３−８６５．
【非特許文献５】Ｙａｎｇ，Ｓ．ａｎｄ  Ｒ．Ｅ．Ｒｏｔｈｍａｎ，ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：ｕｓｅｓ，ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ，ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ−ｃａｒｅ  ｓｅｔｔｉｎｇｓ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，２００４．４（６）：ｐ．３３７−３４８．
【非特許文献６】Ｋｏｃｈ，Ｗ．Ｈ．，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｐｌａｔｆｏｒｍｓ  ｆｏｒ  ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｓｓａｙｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ，２００４．３（９）：ｐ．７４９−７６１．
【非特許文献７】Ｍａｃｋａｙ，Ｉ．Ｍ．，Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ，２００４．１０（３）：ｐ．１９０−２１２．
【非特許文献８】Ｃｉｒｉｎｏ，Ｎ．Ｍ．，Ｋ．Ａ．Ｍｕｓｓｅｒ，ａｎｄ  Ｃ．Ｅｇａｎ，Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｐｌａｔｆｏｒｍｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｔｈｒｅａｔ  ａｇｅｎｔｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ，２００４．４（６）：ｐ．８４１−８５７．
【非特許文献９】Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．Ｇ．，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９７．６３（１０）：ｐ．３７４１−３７５１．
【非特許文献１０】Ａｋａｎｅ，Ａ．，Ｋ．Ｍａｔｓｕｂａｒａ，Ｈ．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｓ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，ａｎｄ  Ｋ．Ｋｉｍｕｒａ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｍｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｃｏｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｗｉｔｈ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  （ＤＮＡ）  ｆｒｏｍ  ｂｌｏｏｄｓｔａｉｎｓ，ａ  ｍａｊｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  （ＰＣＲ）  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｓｃｉ，１９９４．３９（２）：ｐ．３６２−３７２．
【非特許文献１１】Ｍｏｎｔｅｉｒｏ，Ｌ．，Ｄ．Ｂｏｎｎｅｍａｉｓｏｎ，Ａ．Ｖｅｋｒｉｓ，Ｋ．Ｇ．Ｐｅｔｒｙ，Ｊ．Ｂｏｎｎｅｔ，Ｒ．Ｖｉｄａｌ，Ｊ．Ｃａｂｒｉｔａ，ａｎｄ  Ｆ．Ｍｅｇｒａｕｄ，Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ａｓ  ＰＣＲ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎ  ｆｅｃｅｓ：Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ｍｏｄｅｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９７．３５（４）：ｐ．９９５−９９８．
【非特許文献１２】Ｗｉｃｋｅｎｈｅｉｓｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｔｒａｃｅ  ＤＮＡ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ，ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｏｒｙ，ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｔｒａｃｅ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｋｉｎ  ｃｏｎｔａｃｔ．Ｊ  Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｓｃｉ，２００２．４７（３）：ｐ．４４２−４５０．
【非特許文献１３】Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｋ．，Ｄ．Ｓ．Ｈｉｌｌ，Ｃ．Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｔ．Ｒ．Ｂｕｒｒｏｕｇｈｅｓ，ａｎｄ  Ｐ．Ｇｉｌｌ，Ｕｓｅ  ｏｆ  ｌａｓｅｒ  ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｇｒｅａｔｌｙ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｔｈｅ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｓｐｅｒｍ  ｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  ｓｌｉｄｅｓ．Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｓｃｉ  Ｉｎｔ，２００３．１３７（１）：ｐ．２８−３６．
【非特許文献１４】Ｇｉｌｌ，Ｐ．，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｗ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ＤＮＡ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．Ｃｒｏａｔ  Ｍｅｄ  Ｊ，２００１．４２（３）：ｐ．２２９−２３２．
【非特許文献１５】Ｇｉｌｌ，Ｐ．，Ｊ．Ｗｈｉｔａｋｅｒ，Ｃ．Ｆｌａｘｍａｎ，Ｎ．Ｂｒｏｗｎ，ａｎｄ  Ｊ．Ｂｕｃｋｌｅｔｏｎ，Ａｎ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｉｇｏｒ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ  ｒｕｌｅｓ  ｆｏｒ  ＳＴＲｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ  １００  ｐｇ  ｏｆ  ＤＮＡ．Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｓｃｉ  Ｉｎｔ，２０００．１１２（１）：ｐ．１７−４０．
【非特許文献１６】Ｊｏｂｌｉｎｇ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ  Ｐ．Ｇｉｌｌ，Ｅｎｃｏｄｅｄ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ：ＤＮＡ  ｉｎ  ｆｏｒｅｎｓｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ，２００４．５（１０）：ｐ．７３９−７５１．
【非特許文献１７】Ｌｏｎｎｂｅｒｇ，Ｍ．ａｎｄ  Ｊ．Ｃａｒｌｓｓｏｎ，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｔｈｉｎ  ｍｉｃｒｏｐｏｒｏｕｓ  ｂｅｄ  ｏｆ  ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ．Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ａｐｐｌ，２００１．７６３（１−２）：ｐ．１０７−１２０．
【非特許文献１８】Ｔｅｎｎｉｋｏｖ，Ｔ．Ｂ．ａｎｄ  Ｆ．Ｓｖｅｃ，Ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ，ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ  ｍｏｄｅｓ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，１９９３．６４６：ｐ．２７９−２８８．
【非特許文献１９】Ｔｅｎｎｉｋｏｖａ，Ｔ．Ｂ．ａｎｄ  Ｒ．Ｆｒｅｉｔａｇ，Ａｎ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ  ｄｉｓｋｓ  ａｓ  ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ  ｐｈａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｂｉｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｊ．Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，２０００．２３：ｐ．２７−３８．
【非特許文献２０】Ｔｈｏｍｍｅｓ，Ｊ．ａｎｄ  Ｍ．Ｋｕｌａ，Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−  Ａｎ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｃｅｐｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１９９５．１１：ｐ．３５７−３６７．
【非特許文献２１】Ｐｅｙｔａｖｉ，Ｒ．，Ｆ．Ｒ．Ｒａｙｍｏｎｄ，Ｄ．Ｇａｇｎｅ，Ｆ．Ｊ．Ｐｉｃａｒｄ，Ｇ．Ｊｉａ，Ｊ．Ｚｏｖａｌ，Ｍ．Ｍａｄｏｕ，Ｋ．Ｂｏｉｓｓｉｎｏｔ，Ｍ．Ｂｏｉｓｓｉｎｏｔ，Ｌ．Ｂｉｓｓｏｎｎｅｔｔｅ，Ｍ．Ｏｕｅｌｌｅｔｔｅ，ａｎｄ  Ｍ．Ｇ．Ｂｅｒｇｅｒｏｎ，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｄｅｖｉｃｅ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  （＜１５  ｍｉｎ）  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ，２００５．５１（１０）：ｐ．１８３６−１８４４．
【非特許文献２２】Ｗｅｉ，Ｃ．Ｗ．，Ｊ．Ｙ．Ｃｈｅｎｇ，Ｃ．Ｔ．Ｈｕａｎｇ，Ｍ．Ｈ．Ｙｅｎ，ａｎｄ  Ｔ．Ｈ．Ｙｏｕｎｇ，Ｕｓｉｎｇ  ａ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｄｅｖｉｃｅ  ｆｏｒ  １  ｍｉｃｒｏｌ  ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ５００  ｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２００５．３３（８）：ｐ．ｅ７８．
【非特許文献２３】Ｃｏｍｐｔｏｎ，Ｊ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ，１９９１．３５０（６３１３）：ｐ．９１−９２．
【非特許文献２４】Ｋｉｅｖｉｔｓ，Ｔ．，Ｂ．ｖａｎ  Ｇｅｍｅｎ，Ｄ．ｖａｎ  Ｓｔｒｉｊｐ，Ｒ．Ｓｃｈｕｋｋｉｎｋ，Ｍ．Ｄｉｒｃｋｓ，Ｈ．Ａｄｒｉａａｎｓｅ，Ｌ．Ｍａｌｅｋ，Ｒ．Ｓｏｏｋｎａｎａｎ，ａｎｄ  Ｐ．Ｌｅｎｓ，ＮＡＳＢＡ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９１．３５（３）：ｐ．２７３−２８６．
【非特許文献２５】Ｍａｌｅｋ，Ｌ．，Ｒ．Ｓｏｏｋｎａｎａｎ，ａｎｄ  Ｊ．Ｃｏｍｐｔｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  （ＮＡＳＢＡ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，１９９４．２８：ｐ．２５３−２６０．
【非特許文献２６】Ｗｅｔｚｅｌ，Ｔ．，Ｔ．Ｃａｎｄｒｅｓｓｅ，Ｇ．Ｍａｃｑｕａｉｒｅ，Ｍ．Ｒａｖｅｌｏｎａｎｄｒｏ，ａｎｄ  Ｊ．Ｄｕｎｅｚ，Ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｃａｐｔｕｒｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｌｕｍ  ｐｏｘ  ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９２．３９（１−２）：ｐ．２７−３７．
【非特許文献２７】Ｌｅｏｎｅ，Ｇ．，Ｈ．Ｂ．ｖａｎ  Ｓｃｈｉｊｎｄｅｌ，Ｂ．ｖａｎ  Ｇｅｍｅｎ，ａｎｄ  Ｃ．Ｄ．Ｓｃｈｏｅｎ，Ｄｉｒｅｃｔ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｔａｔｏ  ｌｅａｆｒｏｌｌ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｐｏｔａｔｏ  ｔｕｂｅｒｓ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｏｃａｐｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ＮＡＳＢＡ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９７．６６（１）：ｐ．１９−２７．
【非特許文献２８】Ｒｏｍｅｒｏ，Ａ．，Ｂ．Ｂｌａｎｃｏ−Ｕｒｇｏｉｔｉ，ａｎｄ  Ｆ．Ｐｏｎｚ，Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｌｏｎｇ  ＲＮＡ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅ  ｕｓｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｃａｐｔｕｒｅ−ｌｏｎｇ  ＲＴ−ＰＣＲ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９７．６６（１）：ｐ．１５９−１６３．
【非特許文献２９】Ｃｈａｎｔｅａｕ，Ｓ．，Ｌ．Ｒａｈａｌｉｓｏｎ，Ｍ．Ｒａｔｓｉｔｏｒａｈｉｎａ，Ｍａｈａｆａｌｙ，Ｍ．Ｒａｓｏｌｏｍａｈａｒｏ，Ｐ．Ｂｏｉｓｉｅｒ，Ｔ．Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｊ．Ａｌｄｒｉｃｈ，Ａ．Ｋｅｌｅｈｅｒ，Ｃ．Ｍｏｒｇａｎ，ａｎｄ  Ｊ．Ｂｕｒａｎｓ，Ｅａｒｌｙ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｂｕｂｏｎｉｃ  ｐｌａｇｕｅ  ｕｓｉｎｇ  Ｆ１  ａｎｔｉｇｅｎ  ｃａｐｔｕｒｅ  ＥＬＩＳＡ  ａｓｓａｙ  ａｎｄ  ｒａｐｉｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｏｌｄ  ｄｉｐｓｔｉｃｋ，ｌｎｔ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０００．２９０（３）：ｐ．２７９−  ２８３．
【非特許文献３０】Ｆｕｋｕｔａ，Ｓ．，Ｋ．Ｏｈｉｓｈｉ，Ｋ．Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｙ．Ｍｉｚｕｋａｍｉ，Ａ．Ｉｓｈｉｄａ，ａｎｄ  Ｍ．Ｋａｎｂｅ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｃａｐｔｕｒｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｏｍａｔｏ  ｓｐｏｔｔｅｄ  ｗｉｌｔ  ｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００４．１２１（１）：ｐ．４９−５５．
【非特許文献３１】Ｙｏｕｎｇ，Ｃ．Ｃ．，Ｒ．Ｌ．Ｂｕｒｇｈｏｆｆ，Ｌ．Ｇ．Ｋｅｉｍ，Ｖ．Ｍｉｎａｋ−Ｂｅｒｎｅｒｏ，Ｊ．Ｒ．Ｌｕｔｅ，ａｎｄ  Ｓ．Ｍ．Ｈｉｎｔｏｎ，Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ−Ａｇａｒｏｓｅ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ−Ａｍｐｌｉｆｉａｂｌｅ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  Ｓｏｉｌｓ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９３．５９（６）：ｐ．１９７２−１９７４．
【非特許文献３２】Ｋｏｏｎｊｕｌ，Ｐ．Ｋ．，Ｗ．Ｆ．Ｂｒａｎｄｔ，Ｊ．Ｍ．Ｆａｒｒａｎｔ，ａｎｄ  Ｇ．Ｇ．Ｌｉｎｄｓｅｙ，Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｒｅｖｅｒｓｅｓ  ｔｈｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｉｃ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１９９９．２７（３）：ｐ．９１５−９１６．
【非特許文献３３】Ｂｅｒｔｈｅｌｅｔ，Ｍ．，Ｌ．Ｇ．Ｗｈｙｔｅ，ａｎｄ  Ｃ．Ｗ．Ｇｒｅｅｒ，Ｒａｐｉｄ，ｄｉｒｅｃｔ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｓｏｉｌｓ  ｆｏｒ  ＰＣＲ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｏｌｙｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎｓ．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ，１９９６．１３８（１）：ｐ．１７−２２．
【非特許文献３４】Ｔｓａｉ，Ｙ．Ｌ．ａｎｄ  Ｂ．Ｈ．Ｏｌｓｏｎ，Ｒａｐｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍｉｃ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｓｅｄｉｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９２．５８（７）：ｐ．２２９２−２２９５．
【非特許文献３５】Ｊａｃｏｂｉ，Ｖ．，Ｇ．Ｄ．Ｂａｃｈａｎｄ，Ｒ．Ｃ．Ｈａｍｅｌｉｎ，ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｃａｓｔｅｌｌｏ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｉｍｍｕｎｏｃａｐｔｕｒｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｏｍａｔｏ  ａｎｄ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９８．７４（２）：ｐ．１６７−１７８．
【非特許文献３６】Ｓｔｅｒｎｅ，Ｍ．，Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｎｔｈｒａｘ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｐｒｅｐａｒｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｖｉｒｕｌｅｎｔ  （ｕｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ．Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ  Ｊ  Ｖｅｔ  Ｓｃｉ  Ａｎｉｍ  Ｉｎｄ，１９３９．１３：ｐ．３０７−３１２．
【非特許文献３７】Ｌｏｅｎｓ，Ｋ．，Ｋ．Ｂｅｒｇｓ，Ｄ．Ｕｒｓｉ，Ｈ．Ｇｏｏｓｓｅｎｓ，ａｎｄ  Ｍ．ｌｅｖｅｎ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ  ｅａｓｙ  ＭＡＧ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００７．４５（２）：ｐ．４２１−４２５．
【非特許文献３８】Ｂｉａｇｉｎｉ，Ｒ．Ｅ．，Ｄ．Ｌ．Ｓａｍｍｏｎｓ，Ｊ．Ｐ．Ｓｍｉｔｈ，Ｂ．Ａ．ＭａｃＫｅｎｚｉｅ，Ｃ．Ａ．Ｓｔｒｉｌｅｙ，Ｊ．Ｅ．Ｓｎａｗｄｅｒ，Ｓ．Ａ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，ａｎｄ  Ｃ．Ｐ．Ｑｕｉｎｎ，Ｒａｐｉｄ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ−ｆｌｏｗ  ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｄｅｖｉｃｅ  ｔｏ  ｍｅａｓｕｒｅ  ａｎｔｉ−ａｎｔｈｒａｘ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｇ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ．Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００６．１３（５）：ｐ．５４１−５４６．
【非特許文献３９】Ｓｉｎｇｈ，Ｓ．Ｋ．，Ｐ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ａ．Ｋｏｓｈｋｉｎ，ａｎｄ  Ｊ．Ｗｅｎｇｅｌ，ＬＮＡ  （ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８．４：ｐ．４５５−４５６．
【非特許文献４０】Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｎ．，Ｐ．Ｓ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｄ．Ｃ．Ｊｅｆｆａｒｅｓ，Ｊ．Ｅｒｉｋｓｅｎ，Ｈ．Ｏｈｌｓｓｏｎ，Ｐ．Ａｒｃｔａｎｄｅｒ，ａｎｄ  Ｓ．Ｋａｕｐｐｉｎｅｎ，Ｄｉｒｅｃｔ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（Ａ）＋  ＲＮＡ  ｆｒｏｍ  ４  Ｍ  ｇｕａｎｉｄｉｎｅ  ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｌｙｓｅｄ  ｃｅｌｌ  ｅｘｔｒａｃｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ−ｏｌｉｇｏ（Ｔ）  ｃａｐｔｕｒｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２００４．３２（７）：ｐ．ｅ６４．
【非特許文献４１】Ｌｏｃｋｌｅｙ，Ａ．Ｋ．，Ｃ．Ｇ．Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．Ｓ．Ｂｒｕｃｅ，Ｓ．Ｊ．Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ａｎｄ  Ｒ．Ｇ．Ｂａｒｄｓｌｅｙ，Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｓｅｄ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｏｎ  ａ  ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１９９７．２５（６）：ｐ．１３１３−１３１４．
【非特許文献４２】Ｐｅｍｏｖ，Ａ．，Ｈ．Ｍｏｄｉ，Ｄ．Ｐ．Ｃｈａｎｄｌｅｒ，ａｎｄ  Ｓ．Ｂａｖｙｋｉｎ，  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＰＣＲ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２００５．３３（２）：ｐ．ｅ１１．
【非特許文献４３】Ｐａｎｎｕｃｃｉ，Ｊ．，Ｈ．Ｃａｉ，Ｐ．Ｅ．Ｐａｒｄｉｎｇｔｏｎ，Ｅ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ．Ｔ．Ｏｋｉｎａｋａ，Ｃ．Ｒ．Ｋｕｓｋｅ，ａｎｄ  Ｒ．Ｂ．Ｃａｒｙ，Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ：ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ，２００４．２０（４）：ｐ．７０６−７１８．
【非特許文献４４】Ｐａｓｔｉｎｅｎ，Ｔ．，Ｍ．Ｒａｉｔｉｏ，Ｋ．Ｌｉｎｄｒｏｏｓ，Ｐ．Ｔａｉｎｏｌａ，Ｌ．Ｐｅｌｔｏｎｅｎ，ａｎｄ  Ａ．Ｃ．Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｂｙ  ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｏｎ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，２０００．１０（７）：ｐ．１０３１−１０４２．
【非特許文献４５】Ｈｕｂｅｒ，Ｍ．，Ａ．Ｍｕｎｄｌｅｉｎ，Ｅ．Ｄｏｒｎｓｔａｕｄｅｒ，Ｃ．Ｓｃｈｎｅｅｂｅｒｇｅｒ，Ｃ．Ｂ．Ｔｅｍｐｆｅｒ，Ｍ．Ｗ．Ｍｕｅｌｌｅｒ，ａｎｄ  Ｗ．Ｍ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ａｃｃｅｓｓｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｉｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｄｉｒｅｃｔ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００２．３０３（１）：ｐ．２５−３３．
【非特許文献４６】Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ，Ｃ．Ｐ．Ｓａｌｍｉ，Ｌ．Ｇｏｏｄ，Ｊ．Ｋｅｌａ，Ｔ．Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｔ．Ｈｏｋｆｅｌｔ，Ｃ．Ｂｒｏｂｅｒｇｅｒ，Ｆ．Ｐｏｒｒｅｃａ，Ｊ．Ｌａｉ，Ｋ．Ｒｅｎ，Ｍ．Ｏｓｓｉｐｏｖ，Ａ．Ｋｏｓｈｋｉｎ，Ｎ．Ｊａｋｏｂｓｅｎ，Ｊ．Ｓｋｏｕｖ，Ｈ．Ｏｅｒｕｍ，Ｍ．Ｈ．Ｊａｃｏｂｓｅｎ，ａｎｄ  Ｊ．Ｗｅｎｇｅｌ，Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｎｏｎｔｏｘｉｃ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，２０００．９７（１０）：ｐ．５６３３−５６３８．
【非特許文献４７】Ｂｒａａｓｃｈ，Ｄ．Ａ．ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｃｏｒｅｙ，Ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  （ＬＮＡ）：ｆｉｎｅ−ｔｕｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ．Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ，２００１．８（１）：ｐ．１−７．
【非特許文献４８】Ｂｏｏｍ，Ｒ．，Ｃ．Ｊ．Ｓｏｌ，Ｍ．Ｍ．Ｓａｌｉｍａｎｓ，Ｃ．Ｌ．Ｊａｎｓｅｎ，Ｐ．Ｍ．Ｗｅｒｔｈｅｉｍ−ｖａｎ  Ｄｉｌｌｅｎ，ａｎｄ  Ｊ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｎｏｏｒｄａａ，Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９０．２８（３）：ｐ．４９５−５０３．
【非特許文献４９】Ｂｏｏｍ，Ｒ．，Ｃ．Ｊ．Ｓｏｌ，Ｒ．Ｈｅｉｊｔｉｎｋ，Ｐ．Ｍ．Ｗｅｒｔｈｅｉｍ−ｖａｎ  Ｄｉｌｌｅｎ，ａｎｄ  Ｊ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｎｏｏｒｄａａ，Ｒａｐｉｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｓｅｒｕｍ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９１．２９（９）：ｐ．１８０４−１８１１．
【非特許文献５０】Ｃｈｅｅｋ，Ｂ．Ｊ．，Ａ．Ｂ．Ｓｔｅｅｌ，Ｍ．Ｐ．Ｔｏｒｒｅｓ，Ｙ．Ｙ．Ｙｕ，ａｎｄ  Ｈ．Ｙａｎｇ，Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｆｌｏｗ−ｔｈｒｕ  ｃｈｉｐ，ａ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌ  ｂｉｏｃｈｉｐ．Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ，２００１．７３（２４）：ｐ．５７７７−５７８３．
【非特許文献５１】Ｃｏｏｋ，Ａ．Ｆ．，Ｅ．Ｖｕｏｃｏｌｏ，ａｎｄ  Ｃ．Ｌ．Ｂｒａｋｅｌ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１９８８．１６（９）：ｐ．４０７７−４０９５．
【非特許文献５２】Ｄｉｎｅｖａ，Ｍ．Ａ．，Ｄ．Ｃａｎｄｏｔｔｉ，Ｆ．Ｆｌｅｔｃｈｅｒ−Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｐ．Ａｌｌａｉｎ，ａｎｄ  Ｈ．Ｌｅｅ，Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｖｉｓｕａｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｖｉｒａｌ  ａｍｐｌｉｃｏｎｓ  ｂｙ  ｄｉｐｓｔｉｃｋ  ａｓｓａｙ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００５．４３（８）：ｐ．４０１５−４０２１．
【非特許文献５３】Ｃａｐａｌｄｉ，Ｓ．，Ｒ．Ｃ．Ｇｅｔｔｓ，ａｎｄ  Ｓ．Ｄ．Ｊａｙａｓｅｎａ，Ｓｉｇｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｏｎ  ａ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ＤＮＡ  ｐｌａｔｆｏｒｍ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２０００．２８（７）：ｐ．Ｅ２１．
【非特許文献５４】Ｌｏｗｅ，Ｍ．，Ａ．Ｓｐｉｒｏ，Ｙ．Ｚ．Ｚｈａｎｇ，ａｎｄ  Ｒ．Ｇｅｔｔｓ，Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ，ｐａｒｔｉｃｌｅ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｕｓｉｎｇ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｗｉｔｈ  ３ＤＮＡ  ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ｓｉｇｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ａ，２００４．６０（２）：ｐ．１３５−１４４．
【非特許文献５５】Ｓｔｅａｒｓ，Ｒ．Ｌ．，Ｒ．Ｃ．Ｇｅｔｔｓ，ａｎｄ  Ｓ．Ｒ．Ｇｕｌｌａｎｓ，Ａ  ｎｏｖｅｌ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｕｓｉｎｇ  ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０００．３（２）：ｐ．９３−９９．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、効率的な濃度の微量サンプルおよび核酸増幅インヒビタの除去のための、極めて単純化された側方流動クロマトグラフィ核酸サンプル調製の方法、デバイスおよび統合システムを提供する。本発明は、（ａ）真核生物細胞および原核生物細胞、ウイルスおよび植物の細胞および物質を含む分析物の急速なイムノアフィニティ捕獲と、（ｂ）細胞／ウイルスの溶解後に、混入するタンパク質および他のマトリクス由来成分なしに濃縮され且つ洗浄されるべき特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列のハイブリダイゼーションベースのアフィニティ捕獲との組み合わせを可能にする、ＬＦＭ技術および受動的流体流動制御システムを利用する。本発明はまた、側方流動デバイスの状況では核酸増幅反応（すなわち、ＰＣＲ）のインヒビタを除去するための手段を提供する。
【００１２】
本発明はまた、側方流動アッセイで、およびその反応順序で用いられる、種々のかつ複数の溶液の流れを受動的に制御するための側方流動構造を提供する。一実施形態では、ＬＦＳＰデバイスの少なくともサンプル受容ゾーンは、流体の吸上げ、およびその中の少なくとも１つの流体流動の受動的制御を支持し得る幾何学的に規定された吸収材料、例えばニトロセルロースを備える。一実施形態では、本発明は、流路を規定し、かつ流体の吸上げ、およびその中の少なくとも１つの流体流動の受動的制御を支持し得る幾何学的に規定された吸収材料を備える、側方流動マトリクスを備えるデバイスを提供する。本明細書に記載される他の実施形態では、幾何学的に規定されたニトロセルロースストリップは、図５、６、７、８、９または１４Ａに本質的に示されるような構成を有する。
【００１３】
本発明のデバイスおよびシステムは容易に製造され、かつ生物学的サンプル由来の核酸の効率的な低容積のアフィニティ精製のための支持体として側方毛細管流動クロマトグラフィ基板を用いる。サンプル調製に対する本発明のアプローチによって、側方流動サンプル調製（ＬＦＳＰ）デバイスでの空間的に規定された領域での微量分析物の極めて効率的な捕獲が可能になる。この結果、基板上に固定された標的分析物の高い局所濃度が生じ、これによって広範な洗浄、および使用者の介入なしの増幅または追加のサンプル取り扱いを含む追加の操作が極めて容易になる。これらの特徴を、リアルタイムＰＣＲ、ＭＬＶＡ、遺伝子型決定および他の核酸ベースの方法などの確立された分子分析技術との互換性と一緒にすれば、側方流動サンプル濃度および処理は、環境の調査、疾患の診断およびバイオ法医学の検討のために適切な核酸を得る魅力的な手段となる。
【００１４】
一実施形態では、ＬＦＳＰデバイス（ＬＦＳＰ装置）は、側方流動マトリクスを備え、この側方流動マトリクスは、流路を規定し、かつ連続して（又は直列的に）以下の要素：（ａ）流体サンプルのアリコート（試料の分割単位）を受容するためのサンプル受容ゾーン、及び、（ｂ）目的の生物学的粒子または細胞上に存在するリガンド（又は配位子）と反応性である固定された抗体を含む、このサンプル受容ゾーンと側方流動接触する免疫−捕獲ゾーン、を備える。別の実施形態はさらに、連続して（又は直列的に）：（ｃ）目的の生物学的粒子または細胞の溶解が達成され、それによってそれからの核酸が遊離する、この免疫捕獲ゾーンと側方流動接触する溶解ゾーン、を備える。さらに別の実施形態では、ＬＦＳＰデバイスはさらに、連続して（又は直列的に）：（ｄ）一緒になってサンドイッチ核酸ハイブリダイゼーションアッセイのための核酸および標識構成成分を形成する、溶解ゾーンと側方流動接触する、１つ以上のアッセイゾーン、を備える。さらに別の実施形態では、ＬＦＳＰデバイスは、上記溶解ゾーンの下流にあってかつ上記溶解ゾーンと側方流動接触し、かつ上記アッセイゾーン（単数または複数）の上流にあって上記アッセイゾーンと側方流動接触する、核酸増幅ゾーンをさらに備える。本発明のこの態様は、後述の実施例によってさらに説明される。
【００１５】
本発明のＬＦＳＰデバイスはまた、側方流動デバイスのポリビニルピロリドン処理要素を用いて、フミン酸などの核酸増幅反応のインヒビタを捕獲および減少するための本発明の方法を組み込んでもよい。従って、上記の実施形態を参照すれば、ＬＦＳＰデバイスのさらなる実施形態は、隣接されるそのデバイスの要素（単数または複数）と側方流動接触するポリビニルピロリドンを含む前処理ゾーンをさらに備える。例えば、処理ゾーンは、免疫−捕獲ゾーンの上流でかつ免疫−捕獲ゾーンと側方流動接触する位置に配置されてもよいし、サンプルゾーンの下流でかつサンプルゾーンに側方流動接触する位置に配置されてもよい。関連の実施形態では、ポリビニルピロリドン以外のまたはそれに追加の物質が、増幅および／またはアッセイの前にサンプルマトリクスから望ましくないインヒビタまたは他の混入物を捕獲または減少するために前処理ゾーン中に組み込まれてもよい。本発明のこの態様は、後述の実施例にてさらに説明される。
【００１６】
本発明のＬＦＳＰデバイスはまた、本発明の受動的流体制御方法およびシステムを組み込んでもよい。要するに、受動的な溶液または緩衝液の流動制御は、種々の長さおよび／または幅の個々の流路がこのデバイスを用いて行われるアッセイ中で使用されるべき緩衝液の各々について規定されるが、単一の膜内に組み込まれるように、側方流動膜（例えば、ニトロセルロース膜）、または毛細管流動／流体の吸上げを支持し得る濾紙などの他の吸湿性材料を別個の形状に切断することによって達成される。本発明のこの態様は、後述の実施例にてさらに説明される。
【００１７】
本発明のＬＦＳＰデバイスは、任意のＬＦ方式で用いられてもよいが、ＬＦＭの方法、デバイスおよびシステムでの使用のために特に適合化されてもよい。ＬＦＭと統合されたＬＦＳＰを備える完全に統合されたサンプル−回答（Ｓａｍｐｌｅ−ｔｏ−ａｎｓｗｅｒ）型のアッセイデバイスが構想される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】側方流動マイクロアレイ（ＬＦＭ）は、示した数のＥ．ｃｏｌｉ細胞由来の粗溶解液でプログラムされたＮＡＳＢＡ反応で試された。陽性のハイブリダイゼーションコントロールで、ＬＦＭ上の各々のスポットの列にマークして（ＬＦＭの左側のカラムの５つのスポット）、１セットの二連のスポットがＥ．ｃｏｌｉの陽性の検出を示す（右側、底から２番目の列）。「陰性」はテンプレートコントロールなしである。「陽性」は、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙキットを用いて単離された６ｎｇのＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮＡを含む。細胞−ｃＤＮＡ型（ｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃＤＮＡ）の緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ）中で細胞を加熱することによって調製した粗溶解液を用いて２０００個程度の少ない細胞が検出できた。後述の実施例１を参照のこと。
【図２】側方流動は、免疫−捕獲を容易にした。（Ａ）：Ａｇｄｉａ  ＴＭＶ  イムノアッセイ・ストリップを、ＳＥＢ１抽出緩衝液（Ａｇｄｉａ，Ｉｎｃ．製）中で乾燥粗タバコ葉抽出物（ＤＣＴＬＥ）の示した希釈の２００μＬを用いて流した。ＤＣＴＬＥは、摩耗メッシュ（Ａｇｄｉａ，Ｉｎｃ．製）を含むプラスチックバッグ中で３ｍｌのＳＥＢ１抽出緩衝液（Ａｇｄｉａ，Ｉｎｃ．製）中で１００ｍｇの乾燥した粗タバコ葉を粉砕することによって作製した。１：２００以上の希釈は、イムノ−アッセイでは陰性であった。（Ｂ）：リアルタイム逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、ＴＭＶ捕獲ゾーン（ＣＺ）の下、ＴＭＶ捕獲ゾーン（ＣＺ）における、およびＴＭＶ捕獲ゾーン（ＣＺ）の上の領域を検査した。２００μＬの未希釈の抽出物を側方流動に供して、引き続き、捕獲ゾーンの下、捕獲ゾーンにおける、および捕獲ゾーンの上のストリップ領域のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。ＣＺから下のストリップ領域は、２９．７というサイクル閾値（Ｃｔ）で検出可能な増幅をほとんどまたは全く示さなかった。ＣＺから採取したサンプルは、２６．３というＣｔ値でＴＭＶについて強力に正のシグナルを生じた。捕獲ゾーンの上の領域はまた、２７．１というＣｔ値で陽性の検出を生じた。従って、ニートな抽出物は、ＣＺでおよびＣＺ上でのみ明確に陽性のＰＣＲ反応を生じたが、ＣＺより下の領域はＰＣＲ増幅を阻害した。これらのデータによって、洗浄もさらなる操作もない単純な側方流動免疫−捕獲が、標的粒子の濃縮、および阻害性マトリクス構成成分の物理的隔離の両方を通じてＰＣＲ阻害を軽減し得ることが示される。重要なことに、ニートな抽出物中のＣＺ上の領域は明らかにＣＺから遊離されたウイルス粒子の結果として陽性のＰＣＲ反応を生じ、それに伴ってインヒビタのみかけ上の減損を生じる。（Ｃ）：リアルタイム逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、ＴＭＶイムノアッセイ試験ストリップのＴＭＶ捕獲ゾーン（ＣＺ）の下、ＴＭＶ捕獲ゾーン（ＣＺ）における、およびＴＭＶ捕獲ゾーン（ＣＺ）の上の領域を検査し、続いて、サンプル緩衝液中のＤＣＴＬＥの２００μＬの１：２０００希釈で試した。ＣＺの下のストリップ領域は、弱い増幅しか示さず、このことはこの希釈のインヒビタがある程度の増幅を生じることを可能にするのに十分に薄くなったことを示唆した（Ｃｔ＝２８．９）。ＣＺから採取されたサンプルは、２２．４というＣｔ値でＴＭＶの強力に正のシグナルを生じたが、このことはインヒビタ希釈と免疫−捕獲の仲介によるウイルス濃縮との複合効果が、ニートな抽出物の実験に対してさらに堅調な増幅を可能にするに至ることを示唆する（Ａ部分との比較）。捕獲ゾーン上の領域はまた、２８．０というＣｔ値で陽性の検出を生じた。
【図３】ＰＶＰサンプルパッドは、外因的に添加されたフミン酸から生じるＰＣＲ阻害を軽減する。ＤＣＴＬＥは図２と同様に生成した。抽出物の２００μＬのアリコートを０、１２、２５ｎｇのフミン酸を用いてスパイクし、標準的なサンプルパッド（未処理のパッド）または１０％のポリビニルピロリドン（分子量３６０，０００）で処理されたサンプルパッド（ＰＶＰ  Ｓａｍｐ  Ｐａｄ）のいずれかを用いてＴＭＶの側方流動免疫−捕獲に供した。捕獲ゾーンを収集して、ＲＴ−ＰＣＲに供した。１２ｎｇおよび２５ｎｇのフミン酸を追加した抽出物は、未処理のサンプルパッドでの側方流動ストリップを用いたＴＭＶ捕獲後に検出可能なＰＣＲ産物を生じることができなかったが、全てのサンプルが、ＰＶＰ処理したサンプルパッドを用いた免疫−捕獲に供された場合、検出可能なＰＣＲ産物を示した。興味深いことに、ＰＶＰ処理したサンプルパッドで流した０、１２および２５ｎｇのフミン酸サンプルは、未処理のパッドで行った０ｎｇのコントロールに対して改善したＰＣＲ増幅を呈した。「ＲＮＡ」と記したレーンは、ＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて作成された総タバコＲＮＡ調整物を利用する陽性コントロールである。
【図４】プロトタイプの側方流動基板上の受動的緩衝液流動制御。（Ａ）：サンプル（紫色）および洗浄緩衝液（ピンク色）をこのデバイスに導入したが、この基板上では依然として可視ではない。（Ｂ）：サンプル溶液がそのデバイス（フレームの上に位置する）の捕獲ゾーンに達する。（Ｃ）：サンプル通路に用いられるのよりも長くかつ狭い通路を通る毛細管流動によって、洗浄緩衝液が主要なストリップ接合部へ移動するにつれ、サンプルは捕獲ゾーンの上を流れ続ける。（Ｄ）：サンプルが消費されるにつれ、洗浄緩衝液が、サンプル緩衝液を置き換え始める。（Ｅ）：サンプルはここで捕獲ゾーンを完全に横切り、そして洗浄緩衝液は、捕獲ゾーンをあふれさせ始める。（Ｆ）：５分以内に、洗浄緩衝液は完全にサンプル緩衝液を置換した。
【図５】ニトロセルロースまたは濾紙などの吸収性物質からビニルカッターまたはレーザーカッターを用いてカットされ得る、緩衝液交換構造の例。示された構造は、２つの液体を利用するシステムを支持（サポート）する。（Ａ）：２つの流体流動のチャネルは、緩衝液交換または試薬の導入を支持する。サンプルは、実施例８に記載のような流体デバイスを使用することによって導入され得る。中央のタブは、一次溶液の取り込みに適合するようにリザーバ・チャンバ中へ降下する。第二の溶液を、この構造の一番左にある吸収領域を介して導入する。第二のリザーバ中の溶液の容積の方が大きければ、この第二の流体がこの基板の下流領域で第一の溶液を置換することが保証される。（Ｂ）：核酸またはタンパク質の捕獲のためのアフィニティマトリクスの環状のパンチに適合するように用いた幾何形状の例。（Ｃ）：より大きい流体の容積に適合するように流体システムを支持することを可能にする延長された第二の流体通路を有する幾何形状の例。
【図６】ニトロセルロースまたは濾紙などの吸収性物質からビニルカッターまたはレーザーカッターを用いてカットされ得る、緩衝液交換構造の例。示された構造は、３つの液体を利用するシステムを支持（サポート）する。（Ａ）：３つの流体インプットパッドを有する構造。一番右にあるパッドをサンプル適用のために用い、真ん中は第一緩衝液交換、例えば、染色または洗浄緩衝液に用い、一番左にあるパッドは、例えば、洗浄緩衝液または増幅試薬に適合するために最終緩衝液交換に用いる。この構造は、コンパクトな流体システム中で、第一の交換緩衝液としてコロイド金コンジュゲート抗体、および第二の交換緩衝液としてバックグラウンドを低下させる洗浄を利用するイムノ−アッセイに使用される（図１４も参照のこと）。（Ｂ）：９６ウェルプレート中に溶液を導入することを可能にするように隔てられた３つの流体投入タブを有する構造。（Ｃ）：単純なポリカーボネート流体システムでの組み込みに適切な３つの流体インプットを有する構造。
【図７】背後にニトロセルロースのあるニトロセルロース層のレーザーアブレーション（レーザー切断）を用いて、切断法によって製造される構造と同様の緩衝液交換構造を作製してもよい。（Ａ）：アブレーションによって２つの流体インプットエクスチェンジャを作製するために用いられるパターン。（Ｂ）：２つの溶液エクスチェンジパターンの別の例。（Ｃ）：背後のニトロセルロース（ＨＦ−１３５、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を、両面接着テープを用いて、ポリカーボネートのシートに重層して、（Ｂ）部分で示されるパターンを用いるレーザーアブレーションに供した。
【図８】精製されたマイクロ流体ニトロセルロース膜基板の上の受動的緩衝液流動制御。（Ａ）：受動的だが迅速かつ完全な緩衝液交換を達成するためのマイクロ流体ニトロセルロース構造の有用性を実証するため、サンプルを示す容易に可視化される色素を担持する緩衝液（青色）、溶解緩衝液（赤色）および増幅緩衝液（黄色）をこのデバイスに導入した。（Ｂ）：サンプルは広い膜通路を通した免疫−捕獲ゾーン上を流れて、サンプル流動が消費されるまで基板壁に近位の膜領域に対して溶解緩衝液および増幅緩衝液を置き換える。（Ｃ）：サンプルが消費されるにつれて、溶解緩衝液は、免疫捕獲ゾーンに侵入し、このゾーンが捕獲された粒子を分離して、下流の「ＬＮＡ−捕獲ゾーン」（Ａ部分に示される）に固定されたＬＮＡプローブ上のハイブリダイゼーションベースの捕獲のための核酸を遊離する。（Ｄ）：溶解緩衝液の消費後、ＮＡＳＢＡ増幅と適合する緩衝液がＬＮＡ−捕獲ゾーンを洗浄して、残留の溶解緩衝液を除去し、プライマーのハイブリダイゼーションを容易にする。１０μＬというサンプル、溶解および増幅の緩衝液の容積を用いて、３分以内に３つの緩衝液交換が達成される。免疫およびＬＮＡ−捕獲ゾーンの計算されたベッド容積は約２５０ｎＬであり、従って各々の緩衝液交換は、約４０のベッド容積で捕獲ゾーンを洗浄する。さらなる流動の調節は、さらなる緩衝液の洗浄および交換が可能になるように種々の長さおよび幅の追加の流路を用いて実現され得る。同様に、緩衝液の粘度を調節することは、溶解緩衝液中でインキュベーション時間などのアッセイパラメータをさらに精緻にするために用いられる場合がある。最も重要なことにはデバイスのサイズは、より大きいサンプル容積の処理に適合するように変更されてもよい。各々のパネルの右側の定規部分は１ｍｍである。（Ｅ）：ブレッドボードの３つの流体緩衝液交換システムであって、イムノ−アッセイ・ストリップを有する緩衝液交換ニトロセルロース構造の統合を示す、緩衝液交換システム。このデバイスは免疫−捕獲および実施例５に記載の洗浄実験のために使用された。
【図９】３８４ウェルのタイタープレートでの使用のために設計された受動的緩衝液交換構造。（Ａ）：３８４ウェルのタイタープレートの５つのウェルを利用する３つの流体エクスチェンジャ。中央流体インプットは、１つのウェルを占有するが、第二および第三の流体は、対称の中央軸に隣接するウェルの対に入れられる。この構造は実施例７に記載のようにイソチオシアン酸グアニジウム溶解液からの核酸捕獲のために使用された。（Ｂ）：３８４ウェル適合性緩衝液交換構造の別の例。（Ｃ）：実施例６に記載される実験のために用いられる緩衝液交換構造。
【図１０】ＳＥＢ１サンプル緩衝液中のタバコ抽出物の希釈後のＴＭＶのＬＦＭ検出。ＤＣＴＬＥ（３ｍＬのＳＥＢ１中の１００ｍｇのタバコ）を、示されたような追加のＳＥＢ１中に希釈した。（Ａ）：１００μＬのサンプル容積を側方流動免疫−捕獲に供し、受動的な緩衝液交換を用いて、２５μＬのＨ２Ｏを用いてニトロセルロースマトリクスから残留のＳＥＢ１をリンスした（洗浄なし）。捕獲ゾーンを回収して、ＮＡＳＢＡ増幅およびＬＦＭ媒介性の比色検出に供した。これらの条件下のニートなタバコ抽出物は、サンプル中の高濃度のインヒビタに起因して偽陰性のＬＦＭ結果を生じた。これらの条件下での検出を可能にするために１：２０００〜１：８０００の希釈でインヒビタの濃度を十分に下げた。１：１６，０００希釈では、クロマトグラフィマトリクス中での残留のＳＥＢ１緩衝液から生じる阻害と一緒になった低いウイルス力価におそらく起因して、検出可能なＬＦＭシグナルを生じなかった。無テンプレート陰性コントロール（ＮＴＣ）を示す。ＴＭＶ−２捕獲プローブは、ＴＭＶ由来のアンプリコンの最も鋭敏な検出をもたらした。（Ｂ）：１００μＬのサンプル容積を側方流動免疫−捕獲に供して、受動的な緩衝液交換を用いて、捕獲されたウイルスを５０μＬのＮＭＥ緩衝液（５０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７、０．５ＭのＮａＣｌ、１５％のエタノール）を用いて洗浄し、２５μＬのＨ２Ｏという最終リンスを用いてニトロセルロースマトリクスから残留の緩衝液をリンスした。捕獲ゾーンを回収して、ＮＡＳＢＡ増幅およびＬＦＭ媒介の比色検出に供した。これらの条件下のニートなタバコ抽出物は、ＬＦＭによって堅調な陽性の結果を生じた。１：２０００〜１：１６，０００という希釈もこれらの条件下で陽性であった。Ａ部分に示される洗浄なしの処理に対する検出限界の増大は、ニトロセルロース基板からの残留のＳＥＢ１緩衝液のさらに完全な除去の結果である可能性が高い。いくつかのＳＥＢ１媒介性の阻害が他の研究で注目されていた。無テンプレート陰性コントロール（ＮＴＣ）を示す。
【図１１】免疫捕獲されたおよび受動的な緩衝液交換洗浄のＴＭＶのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ。１：２０００または１：４０００の最終希釈でＤＣＴＬＥでスパイクされた土壌抽出物を、３８４ウェルプレート形式でサンプル、洗浄緩衝液および最終Ｈ２Ｏリンスに適合するように設計された緩衝液交換ニトロセルロース構造を担持するように改変されたＴＭＶイムノ−アッセイ・ストリップを用いて、免疫−捕獲および洗浄に供した（図８Ｅおよび図９Ｃを参照のこと）。土壌抽出物は、３０ｍＬのＳＥＢ１抽出緩衝液中で３ｇの土壌を用いて生成した。サンプル容積は１００μＬであった。洗浄は、５０μＬのＮＭＥ緩衝液を用いて、続いて２５μＬのＨ２Ｏ平衡を用いて行った。Ｑｉａｇｅｎ（製の）ＲＮｅａｓｙキットを用いて単離された土壌ＲＮＡを陰性コントロールとして含んだ。洗浄工程なしで、ただし、２５μＬのＨ２Ｏリンス、１：２０００および１：４０００希釈を用いて、それぞれ２８．２および２８．３という高いＣｔ値を得た。７５μＬのＮＭＥ緩衝液洗浄を含むことで、ＴＭＶの陽性の検出が生じ、ここでは１：２０００のサンプルが２６．２というＣｔ値を、そして１：４０００のサンプルが２７．２というＣｔ値を示した。
【図１２】極めて阻害性の土壌抽出物からのＴＭＶ免疫捕獲の受動的な緩衝液交換洗浄後のＰＣＲ阻害の軽減。土壌抽出物をＤＣＴＬＥを用いてスパイクして、１：２０００という最終希釈を得た。サンプルの容積は、１００μＬであったが、ＮＭＥ洗浄は５０μＬであって、最終のＨ２Ｏリンスは２５μＬであった。最終のＨ２Ｏ平衡によって、残留の洗浄緩衝液がその後のＰＣＲ反応に持ち越す可能性を低下させた。５０μＬの水に続いて２５μＬの水リンスを用いる洗浄（７５μＬのＨ２Ｏと表示）によってかすかなＰＣＲ産物が生成された。ＮＭＥ洗浄緩衝液の使用によって、堅調なＰＣＲ増幅（ＮＭＥ）が生成された。Ｑｉａｇｅｎのグアニジウムベースの溶解緩衝液であるＲＬＴを用いる洗浄では、検出可能なＰＣＲアンプリコン（ＲＬＴ）を生成できなかった。５０μＬの洗浄を排除し、ただし２５μＬのリンスを保持すれば、これらのサンプル中の検出可能なアンプリコンの欠失によって証明されるとおりインヒビタ濃度を有意に低下させることはできなかった（２５μＬ  Ｈ２Ｏ）。ＮＭＥ洗浄に供された追加のＴＭＶなしの土壌抽出サンプルは、検出可能なＴＭＶアンプリコンを生じなかった（土壌のみ（ＮＭＥ洗浄））。ＳＥＢ１抽出緩衝液単独を、さらなる陰性のコントロールとしてアッセイした（ＳＥＢ１）。さらに、陰性コントロールの免疫−捕獲実験を、未使用の土壌抽出物およびＮＭＥ緩衝液洗浄を用いて行い、この用いられた土壌からＴＭＶがないことをさらに確認した。このＴＭＶレーンは、Ｑｉａｇｅｎ（製の）ＲＮｅａｓｙキットを用いてタバコから単離されたＲＮＡを用いてプログラムされた陽性コントロールＰＣＲ反応である。
【図１３】ＲＬＴグアニジウムイソチオシアネートベースの溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．製）中で２２μｇ／μＬのタバコを粉砕することによって生成した乾燥硬化タバコ葉溶解物で試されたＲＮＡ結合マトリクスのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析。タバコ葉溶解物を、ＲＮｅａｓｙカラムシリカＲＮＡ結合マトリクスの３ｍｍの生検パンチに対して重層された図９Ａに示される構造のニトロセルロース緩衝液交換デバイスを用いて側方流動媒介の核酸捕獲に供した。１０μＬのＲＬＴタバコ抽出物をサンプルとして用いた。４０μＬ洗浄を、洗浄なしのコントロール以外は全ての実験についてＮＭＥ緩衝液を用いて行った。最初のＮＭＥ洗浄後は、８０μＬのＮＭＥ（ＮＭＥのみ）、または示したとおり０〜１Ｍに変化する濃度におけるＮａＣｌが続いた。本発明のこの態様は、実施例７にて更に説明される。
【図１４】内蔵型の受動的な緩衝液交換デバイスの構成要素。（Ａ）：流体システムの簡易支持と統合するのに適切な３流体エクスチェンジャの例。（Ｂ）：（Ａ）部に示されるエクスチェンジャの流体インプットタブに適合するようにポリカーボネートを切断するためのパターン。（Ｃ）：ポリカーボネートシートを切断するためのパターンを形成する流体リザーバ。挿入された交換構造を担持する（Ｂ）部に示される層に対して、および（Ｄ）部に示される底の層に対する積層（ラミネーション）が、統合された緩衝液交換デバイスを形成し、これによって３つの溶液は溶液インプットポートを介して導入されることが可能になる。（Ｄ）：デバスの底のピースを切断するためのパターン。（Ｅ）：ここで示される組立てられたデバイスのスキャンは、イムノ−アッセイ・ストリップに対して接触された緩衝液交換構成要素のための３ＭＭの濾紙を利用している。示されるデバイスでは、イムノ−アッセイは、一番右側のポートに対してサンプルを、真ん中のポートに対して染色試薬（抗体コンジュゲートされたコロイド性の金）を導入することによって行われ、そしてバックグラウンドを低減するための最終の洗浄緩衝液を一番左側のポートに添加する。全ての溶液をアッセイ開始時に添加する。このデバイスのサイズは、標準的な顕微鏡スライドと同様に２５ｍｍ×７５ｍｍである。
【図１５】提唱された統合型サンプル調製デバイスの１つの可能性のある実施形態の画家による表現（完成予想イラスト）。このデバイスの使い捨て可能な構成要素の種々のサブシステムを、示されたとおりここに示す。安価なプラスチックハウジングおよび支持された大きい細孔のニトロセルロースから製造された、このシステムは毛細管側方流動および受動的な流動調節を利用して、分析物親和性およびハイブリダイゼーションベースの捕獲、ならびにその後のＮＡＳＢＡによる溶解、洗浄および等温増幅に必要な緩衝液交換を可能にする。サンプル容積の１０％が、イムノ−アッセイＬＦＭを用いてサンプル添加直後に問い合わされる。その後の細胞分離および溶解の結果、細胞のＲＮＡの遊離およびグアニジウムベースの緩衝液による安定化が生じる。目的のＲＮＡ配列を、ＬＮＡ捕獲オリゴヌクレオチドに対するグアニジウム緩衝液中のハイブリダイゼーションによって収集する。サンプル中に存在する細胞外ＲＮＡはまた、ＬＮＡオリゴヌクレオチド上で捕獲されなければならない。スワブ溶出緩衝液はまた、溶出効率、イムノ−アッセイ適合性およびＲＮＡ安定化特性について最適化され得る。デバイスから離れた分析のために、単純なパンチ−アウトシステムを組み込んで、細胞分離またはＬＮＡ捕獲ゾーンの手軽な収集を可能にしてもよい（図示せず）。
【図１６】陰イオン／陽イオン交換を利用する、別の統合型デバイスのレイアウトの略図。側方流動ストリップは、固定された抗体リガンド（Ｃｅｌｌ／Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｃａｐｔｕｒｅ）を用いて細胞およびウイルス標的のイムノ−アフィニティ精製のための未変性の緩衝液中で、または陰イオン交換による核酸のアフィニティ精製のための溶解液として（Ａｎｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｌｉｇａｎｄ）サンプルを受容する。インプットのサンプル次第で、洗浄緩衝液または溶解緩衝液を、Ｗａｓｈ／Ｌｙｓｉｓゾーンに対してプロトコール開始時点で導入し、ここでは液は、その吸収パッド（図示せず）から主要な基板へ、狭いニトロセルロース通路を介して流れ、サンプル溶液の完全な輸送後にのみ主要なストリップに達する。サンプル通路処理、例えば、ＰＶＰ、ＰＶＰＰまたは陽イオン交換リガンドが、増幅インヒビタ除去のために含まれてもよい。高イオン強度洗浄緩衝液は、陰イオン交換リガンドから核酸を溶出して、シリカマトリクスに対する効率的な結合を支持する静電気的な環境をもたらす。得られた精製核酸を、フリットを担持する微小遠心管中へのシリカマトリクスの溶出または収集によって回収してもよく、ここでは核酸は、少なくとも２ベッド容積（０．８μＬを超える）の低イオン強度の緩衝液（水、ＴＥなど）を用いて溶出され得る。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
別段の規定がない限り、当該分野の全用語、表記法および本明細書で用いられる他の科学的用語法は、別段の規定がない限り、本発明が属する当該分野の当業者によって通常理解される意味を有するものとする。ある場合には、通常理解される意味を有する用語は、明確さのため、および／または、すぐ参照できるように本明細書に規定されているのであって、本明細書におけるこのような定義の包含は、当該分野で通常理解されるものを上回る実質的な相違を示すと解釈されるべきではない。本明細書に記載されるかまたは引用される技術および手順は一般に十分理解されており、かつ当業者によって従来の方法論、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第３版（２００１）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｂｅｌら、編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．２００１）に記載される広範に利用されている分子クローニングの方法論などを用いて通常使用される。必要に応じて、市販のキットおよび試薬の使用を含む手順は一般には、別段の注記がない限り、製造業者の規定するプロトコールおよび／またはパラメータに従って行われる。
【００２０】
［側方流動サンプル調製方法およびシステム］
本発明は、効率的な濃度の微量サンプルおよび核酸増幅インヒビタの除去のための、極めて単純化された側方流動クロマトグラフィ核酸サンプル調製の方法、デバイスおよび統合システムを提供する。ＬＦＳＰデバイスは、本明細書に開示される本発明の種々の要素からなってもよく、この要素としては、生物学的粒子または細胞の側方流動免疫−捕獲、側方流動マトリクス内の直接的な溶解、サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイを構成する種々の要素、能動的流体／緩衝液制御システム、および核酸増幅インヒビタの活性を封鎖または軽減し得る組成物での前処理が挙げられる。
【００２１】
例えば、ＬＦＳＰデバイスは、流体サンプルのアリコート（試料の分割単位）を受容するためのサンプル受容ゾーンを、このサンプル受容ゾーンと接触した側方流動中の免疫−捕獲ゾーンと一緒に備えてもよく、このゾーンは目的の生物学的粒子または細胞上に存在するリガンドと反応性の固定された抗体を含む。このようなデバイスは、目的の生物学的粒子または細胞を捕獲するために用いられてもよく、また粒子もしくは細胞を溶解するため、およびそれから遊離された核酸を増幅するための手段を備えてもよい。このデバイスは、サンドイッチハイブリダイゼーション核酸アッセイなどの側方流動アッセイと連結されてもよいし、または統合されてもよい。好ましい実施形態では、このＬＦＳＰデバイスは、ＬＦＭデバイスまたはアッセイに連結されてもよいし、または統合されてもよい。ＬＦＭデバイスおよびアッセイは、米国特許出願第１１／８９４，９１０号に記載されている。
【００２２】
免疫−捕獲ゾーンは、例えば、以下のように調製されてもよい。リガンド（すなわち、抗体）が固定されて基板上に免疫−捕獲ゾーンが形成されるように、側方流動基板（すなわち、ニトロセルロース）を処理する。詳細には、抗体溶液を生理学的なイオン強度の緩衝液中で、経験的に見出された濃度で調製して、抗原に対する特異的な結合を得る（代表的には、０．０１ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ）。大きい細孔のニトロセルロース膜上への抗体の沈着は、多数の手段によって達成され得る。こうした手段は、手動的な適用、エアブラシ沈着、ロボット流体取り扱いシステム、または基板へのリガンドの制御され、かつ再現性の容積を沈着する同様の方法を包含するが、これらに限定されない。適切な基板としては、ＨｉＦＬｏｗ  １３５（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．製）および種々の商業的供給業者から入手可能な類似の生成物が挙げられる。一旦基板上に沈着されれば、リガンドは乾燥によっておよび／または５０００マイクロジュールの線量でのＵＶ照射によって固定される（核酸／ＬＮＡ固定の場合）。
【００２３】
本発明の側方流動免疫−捕獲の態様によって、広範な範囲の薄いサンプル容積から標的分析物を濃縮する能力が得られる。一旦デバイス捕獲ゾーンで固定されれば、標的は検出され得、そして引き続き洗浄され、溶解され、任意の遊離された核酸が増幅され得る。各々が異なる分析物に対するリガンドを担持する複数の捕獲ゾーンを組み込むことで、その後のデバイスでの分析またはデバイスを離れての分析のための目的の複数のサンプル構成要素の分離および収集が可能になる。このアプローチの多重の能力によって、複数のタンパク質性の分析物および核酸分析物を、最低限度のユーザ介入で迅速に収集する（望ましい場合には検出する）ことが可能になり、必要な時間はイムノアッセイの結果を得るためには２分未満であり、そして鋭敏な配列特異的な核酸増幅および検出を得るには６０分未満であろう。
【００２４】
免疫−捕獲およびその後の化学的および／または熱媒介性の溶解に基づく、単純化されたサンプル調製スキームでは、いくつかの要因が考慮されなければならず、これには可能性のある酵素インヒビタの除去および増幅効率に対する残留サンプル物質の影響が挙げられる。適切に調製された粗細胞溶解液がＮＡＳＢＡについて用いられ得るが（以下の実施例１を参照のこと）、出願人は、イムノアフィニティ捕獲によって複雑な混合物から分析物粒子を同時に濃縮しながら、細胞およびマトリクスの混入物をさらに減らすために工夫された方法を使用することによって、改善された感度が達成され得ると仮定した。これによって、複雑なサンプルマトリクスからウイルス粒子を隔離し得る、ＬＦＳＰの方法およびデバイスの開発がもたらされ、これによって、浄化されたウイルスサンプルが得られ、これがさらなる精製なしでその後の増幅のために適切な核酸を得るために溶解され得る。本発明のこの態様は、以下の実施例２にさらに詳細に記載されており、ここではＴＭＶ粒子が、ニトロセルロース膜の状況内でイムノアフィニティ・クロマトグラフィによって粗温浸乾燥タバコ葉から分離された。実施例２に記載される研究では、側方流動を用いて薄い分析物を部分的に規定された捕獲ゾーンに対して濃縮され得るだけでなく、捕獲ゾーンの下流のデバイスの領域が捕獲された種に対して枯渇されることが実証される。これらのデータによって、単純な側方流動イムノアッセイ法が複雑な生物学的サンプルの分離および調製についての迅速かつ費用効果的なイムノアフィニティ精製システムの基礎を形成し得るという仮説、ならびに、適切に処理された基板を用いて、下流の捕獲ゾーンで望ましくない構成成分のサンプルを枯渇し得るという主張が支持される。
【００２５】
実施例２に記載される実験で利用されるサンプルは、ＰＣＲ，およびＮＡＳＢＡ増幅などのような、複雑なポリサッカライド、有機物および酵素的な操作に対して強力に阻害性である他の構成成分の存在のおかげで極めてチャレンジングなマトリクスであり、同様に、潜在的に交絡している、証明力のない核酸（植物由来のＤＮＡおよびＲＮＡ）である。従って、実施例２に記載される結果によって、複雑な生物学的サンプルの分析における前述の側方流動媒介性免疫捕獲工程の有用性が実証され、ここでは標的の分析物は少数派の種であり、そして予備的な処理がなければ標的の直接的な増幅を妨げるＰＣＲおよびＮＡＳＢＡのインヒビタが存在する。さらに、実施例２の実験で得られる結果によって、単純な側方流動イムノ−アッセイ方法が複雑な生物学的サンプルの分離および調製のための迅速かつ費用効果的なイムノアフィニティ精製システムの基礎を形成し得るという仮説、ならびに適切に処理された基板を用いて下流の捕獲ゾーンで望ましくない構成成分のサンプルを枯渇し得るという主張が支持される。
【００２６】
［受動的なＬＦ緩衝液交換システム］
電子的な制御システム、バルブ、および動く部分を要する他の流動制御スキームの必要性を排除するため、出願人（ら）は、側方流動基板の上の緩衝液およびサンプルの流れの受動的な制御を媒介するために種々のニトロセルロース構造を開発した。ニトロセルロースまたは濾紙などの、単一の統合された側方流動膜における幾何学的に規定された流路の使用を通じて、複数の溶液／緩衝液の流速は、受動的に制御され得る。以下の実施例４に提示される実施例によってさらに説明される１つの方法論では、ニトロセルロース膜を切断して異なる溶液のための個々の流路を形成し、この流路はその膜の長さおよびまたは幅によって変化する（例えば、図４〜図９を参照のこと）。図７、８および１４に示されるプロトタイプのデバイスによって例示される幾何学的形状に加えて、当業者は、容易にしたいと意図する、アッセイにとって必要とされる複数の溶液の流路の所望の調節を、多くの他の形状が達成できることを容易に理解する。さらに、本発明のこの態様は、全ての流路が途切れることなく組み込まれている単一のニトロセルロース膜によって例示されるが、他のシステムも明白であり、このシステムとしては、流路が膜流路の長さおよび／または幅によって調節されるだけでなく、セルロースエステル、グラスファイバー、ポリエーテルスルホン、綿、無水ポリアクリルアミド、シリカゲル、およびポリエチレングリコールなどの膜物質以外の物質の配列を中断することによっても調節されるシステムが挙げられるが、これらに限定されない。正確に制御された流路および反応順序を規定することは、アッセイのタイプおよび複雑性に応じて変化することが理解されるであろう。しかし、本明細書に提供される教示に基づいて、当業者は、通常の実験を用いて特定のアッセイについて必要な制御を経験的に導くことができるであろう。
【００２７】
［統合型のシステム］
また、本発明の１つ以上の要素を組み込む完全統合型のサンプル−回答（ｓａｍｐｌｅ−ｔｏ  ａｎｓｗｅｒ）型の側方流動アッセイデバイスも想定される。例示的な統合型システムは図１５および図１６に模式的に示される。例えば、一実施形態では、ＬＦＳＰデバイスは、イムノアッセイ・スクリーニングおよびＮＡＳＢＡ増幅の両方と、続いて下流の側方流動サンドイッチハイブリダイゼーション核酸アッセイと統合される。このようなデバイスの模式的な提示は図１５に示される。
【００２８】
このようなデバイスは、側方流動適合性クロマトグラフィ支持体、例えば、ＨｉＦｌｏｗ  １３５大型細孔支持性ニトロセルロース（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を備えてもよい。この基板は、サンプル流動における所望の位置で特定の特性を付与するために、圧電作動性ピコリットル沈着システム（ｐｉｅｚｏ−ａｃｔｕａｔｅｄ  ｐｉｃｏｌｉｔｅｒ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）（ＮａｎｏＰｌｏｔｔｅｒ  ２．０，ＧｅＳｉｍ）などの流体沈着システムを用いてパターンを付けられる。例えば、免疫−捕獲ゾーンの上流の領域は、増幅インヒビタまたは他の望ましくないサンプルマトリクス混入物の活性を除去または軽減できる変更を付与するように処理される。目的の病原体に対する抗体は、毛細管側方流動の間に標的粒子がサンプル溶液から捕獲されるように配置される。さらに、受動的な流路制御を組み込むことによって、捕獲された細胞またはウイルスを溶解して、下流基板ゾーンでアフィニティ捕獲および精製のために核酸を遊離してもよい。いくつかの実施形態では、上昇した温度で溶解緩衝液中においてサンプルをインキュベートするために、ＵＳＢインターフェースまたは内部もしくは外部の電源もしくはバッテリで電力を供給される加熱要素を装備してもよい［非特許文献４９］。次いで、溶解の間に遊離される核酸は、固定、洗浄および収集のために下流のアフィニティ捕獲ゾーンに流れる。このデバイスの捕獲ゾーンは、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡまたは等温性核酸増幅反応を組み込んでもよい。
【００２９】
プロトコールの複雑さを有意に増大することなく、よりストリンジェントな洗浄条件の組み込みを可能にするために、本発明はまた、ＬＮＡ二重鎖の安定性増大を開拓するアプローチを提供する［非特許文献３９］。このスキームでは、サンプル調製デバイスは、固定されたＬＮＡオリゴヌクレオチドを担持する。これらの固定されたプローブは、グアニジウムベースの溶解緩衝液によって課される変性条件下で、標的ＲＮＡの配列特異的なハイブリダイゼーション媒介性の捕獲を可能にすると予測される。他者による以前の研究では、ＬＮＡオリゴヌクレオチドが、４Ｍのグアニジウムを含む粗細胞溶解液中に存在するＲＮＡ分子のハイブリダイゼーションによる捕獲に用いられ得ることが示されている［非特許文献４０］。ＬＮＡ捕獲プローブは、ＮＡＳＢＡ増幅プライマー結合部分と近いが重複はしていない領域にハイブリダイズするように設計される。
【００３０】
支持（サポート）されたニトロセルロースシステムの１つの利点は、その膜に対して化学的修飾を容易に行えることである。先行技術の報告では、陽イオン交換および陰イオン交換クロマトグラフィの両方について固定された官能基を導入するためにニトロセルロースの共有結合的および吸着性の改変の詳細な方法がある［非特許文献１７］。複数の膜システムの規定されたゾーンまたは構成要素の膜で固定された陰イオン交換リガンドを生じる処理がまた、核酸の結合および精製のために含まれてもよい。これには、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）およびジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）官能基が挙げられるが、これらに限定されない。この両方ともイオン交換クロマトグラフィに基づいて膜に用いられている［非特許文献１７］。さらに、一般的な核酸サンプル混入物の輸送を軽減または防止するために核酸親和性リガンドの上流の領域を処理してもよい。このような改変としては、例えば、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）［非特許文献３１〜３３］、新規なインヒビタ封鎖剤（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｓｅｑｕｅｓｔｅｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）（例えば、ＰＩＲ，Ｊ．Ｄｕｎｂａｒ，ＬＡＮＬ，ｐｅｒｓ．ｃｏｍｍ．）および陽イオン交換リガンドを挙げることができる。
【実施例】
【００３１】
［実施例１］  粗細菌細胞溶解液由来のＲＮＡのＮＡＳＢＡ増幅
増幅のためにテンプレートＲＮＡを供給するための粗溶解液を用いる実現可能性を評価するために、Ｅ．ｃｏｌｉ溶解液由来のＮＡＳＢＡ増幅の有効性を検査した。細胞−ｃＤＮＡ（ｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃＤＮＡ）型の緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ）に対して種々の量のＥ．ｃｏｌｉ液体培養物の量を添加すること、および１０分間７５℃まで加熱することによって、溶解液を調製した。この方法は、粗Ｌ．ｍｏｎｃｙｔｏｇｅｎｅｓの溶解液からのＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）のための適切なテンプレートを生成することが報告された［非特許文献４９］。溶解液を１：５希釈して、２μＬの得られた物質を１０μＬのＮＡＳＢＡ反応に用いた。
【００３２】
構成的に発現されたｍＲＮＡ，ｒｐｌＶを、ＮＡＳＢＡ標的として用いた［非特許文献５０］。ＮＡＳＢＡ  Ｐ１およびＰ２プライマー配列は以下のとおりであった：
ＥＣ−ｒｐｌＶ−Ｐ１：
５’−ａａｔｔｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｇａａｇｇＣＣＡＴＣＧＴＴＧＴＧＴＴＣＡＧＣＧＴＴＡ−３’［配列番号１］
および
ＥＣ−ｒｐｌＶ−Ｐ２：
５’−ｇａｔｇｃａ  ａｇｇｔｃｇ  ｃａｔ  ａｔｇ  ａｇＡＡＣＴＡＴＣＧＣＴＡＡＡＣＡＴＣＧＣＣＡ−３’［配列番号２］。
【００３３】
Ｐ１配列における小文字は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモータ配列を示す。Ｐ２配列の小文字は、ハイブリダイゼーション・サンドイッチ・アッセイ媒介性検出のために用いられるタグ配列を表す。ＬＦＭでのｒｐｌＶ捕獲および検出について用いられる配列は捕獲プローブであった：
ｒｐｌＶ−ｃａｐ：５’−ＣＴＧＣＴＣＡＧＡＡＧＧＴＴＣＧＣＣＴＴ−３’［配列番号３］
および検出プローブ：
ＵＮＩ−ｄｅｔ−５Ｔｂｉｏ：５’−ＴＴ−Ｕ−ｂｉｏｔｉｎ−ＴＴＴＴ−Ｕ−ｂｉｏｔｉｎ−ＴＴＴＴ−Ｕ−ｂｉｏｔｉｎ−ＴＴＴＴＴＴＴ  ｇａｔ  ｇｃａ  ａｇｇ  ｔｃｇ  ｃａｔ  ａｔｇ  ａｇ  −３’［配列番号４］。
【００３４】
ＮＡＳＢＡ反応は４１℃で６０分間進行され、その後に４μＬを取り出して、ストレプトアビジンにコンジュゲートされた染色されたポリスチレンマイクロスフェアによって媒介される比色検出を用いてＬＦＭによりｒｐｌＶアンプリコンについてアッセイした。
【００３５】
図１に示される結果は、示された細胞数由来の粗溶解液を有するＮＡＳＢＡ反応に対する曝露後のＬＦＭ膜を示す。２０００個程度の少ない細胞を、ＬＦＭによって、その後のＮＡＳＢＡ増幅によって、テンプレートを供給するために粗全細胞溶解液を用いて検出し得る。この実験によって、グアニジウムの存在下において変性条件下で調製された粗溶解液をＮＡＳＢＡテンプレートとして首尾よく用い得ることが示される。サンプル調製のための１つの提唱された側方流動方法がグアニジウム緩衝液中で標的ＲＮＡの配列特異的な捕獲およびストリンジェントな洗浄を可能にすることを考慮すれば、粗溶解液で得られた２０００個の細胞の検出限界は有意に改善され得る可能性が高い。
【００３６】
［実施例２］  葉の組織内に含まれるＴＭＶ粒子由来の分析物の側方流動濃縮、およびその後の増幅
本実施例では、核酸の単離または増幅の前の分析物を濃縮する手段としての側方流動が促進する免疫−捕獲の有用性を、タバコ・モザイク・ウイルス（ＴＭＶ）で検討した。
【００３７】
図２Ａ〜図２Ｃは、免疫捕獲ゾーン（図２Ａに示される）の下（サンプルパッドに近位）、免疫捕獲ゾーンにおいて、および免疫捕獲ゾーンの上（サンプルパッドに遠位）の側方流動基板の領域でプログラムされた２００μＬの粗温浸タバコの側方流動およびその後の増幅（逆転写酵素ＰＣＲ）反応の間のタバコ・モザイク・ウイルス（ＴＭＶ）粒子のイムノアフィニティ捕獲および濃縮の結果を示す。この捕獲ゾーンはウイルス粒子が極めて豊富であるが、阻害性構成成分の相対濃度が低下している。ここで示された、捕獲ゾーンの算出されたベッド容積に基づいて、２００μＬ〜２００ｎＬのサンプル容積の１０００倍の低下によってまた、その後の洗浄を容易にしてさらにインヒビタの濃度を低下させる。
【００３８】
側方流動を用いて、薄い分析物を空間的に規定された捕獲ゾーンへ濃縮することができるだけでなく、捕獲ゾーンの下流のデバイスの領域が捕獲された種に対して枯渇されることもこれらのデータによって示される。これらのデータによって、単純な側方流動イムノアッセイ方法が、複雑な生物学的サンプルの分離および調製のための迅速かつ費用効果的なイムノアフィニティ精製システムのための基礎を形成し得るという出願人らの仮説、ならびに、適切に処理された基板を用いて下流の捕獲ゾーンで望ましくない構成成分のサンプルを枯渇し得るという主張が支持される。
【００３９】
［実施例３］
ポリビニルピロリドンを用いる増幅インヒビタの側方流動減少
本実施例によって、ポリビニルピロリドン処理されたサンプルパッドが、側方流動を介してＰＣＲインヒビタを枯渇し得ることが示される。
【００４０】
ＰＣＲに対して阻害性の粗サンプル構成成分が側方流動の間に枯渇され得るという、出願人らの予備的研究の経過中になされた観察では、特定の基板処理が、捕獲された標的細胞または粒子からの核酸の増幅をさらに容易にし得るということが示唆された。この仮説を試験するために、吸収性のサンプルパッドをポリビニルピロリドン（ＭＷ＝３６０，０００）の１０％溶液で処理して［非特許文献３１〜３３］、ＰＶＰ処理されたまたは未処理のサンプルパッドのいずれかを担持するデバイス上で側方流動免疫−捕獲後（実施例２、上記）温浸された葉の組織から濃縮されたＴＭＶのＲＴ−ＰＣＲ増幅を評価した。
【００４１】
これらの反応は、ＴＭＶ検出について以前に報告されたプライマーセットを利用した［非特許文献３５］。ＲＴ−ＰＣＲ反応に直接添加されたニートなタバコ抽出物は、インヒビタを枯渇するための事前の免疫−捕獲なしにＴＭＶに陰性であった。この解釈と一致して、抽出物の１：５０希釈は、さらに低いインヒビタ濃度におそらく起因してＰＣＲで陽性であった。
【００４２】
図３に示されるとおり、ＰＶＰサンプルパッドは、強力なＰＣＲインヒビタである、外因性に添加されたフミン酸からの阻害を軽減したが［非特許文献９，３４］、未処理のサンプルパッドは阻害を軽減しなかった。おそらく最も重要なことには、ＰＶＰ処理されたサンプルパッドの使用によって、外因性に添加されたインヒビタが存在しなくても未処理のサンプルパッドに対して増幅が有意に改善される結果となった。１２ｎｇおよび２５ｎｇのフミン酸補充抽出物は、未処理のサンプルパッドでの側方流動ストリップを用いてＴＭＶ捕獲後に検出可能なＰＣＲ産物を生じることができなかったが、全てのサンプルが、ＰＶＰ処理されたサンプルパッドを用いて免疫−捕獲に供された場合、検出可能なＰＣＲ産物を示した（図３）。興味深いことに、ＰＶＰ処理されたサンプルパッド上を流された０、１２および２５ｎｇのフミン酸サンプルは、未処理のパッドで処理された０ｎｇのコントロールに対して改善されたＰＣＲ増幅を示した（図３）。
【００４３】
［実施例４］  側方流動システム中の複数の溶液の流動を受動的に制御するための幾何学的な構造
本実施例は、流体流動の速度および容積を制御する幾何学的に規定されたニトロセルロースストリップの特性を利用する、受動的側方流動緩衝液制御システムのプロトタイプ（試作品）を示す。プロトタイプのニトロセルロースまたは他の吸収材料ベースのデバイスを迅速に作製するために、ビニルカッター（Ｒｏｌａｎｄ  ＧＸ−２４  ＣＡＭＭ−１）またはレーザーの切断／彫刻システム（３０Ｗ  ＣＯ２レーザーを装備したＶｅｒｓａＬａｓｅｒ  ＶＬ−３００（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．））を用いて吸収物質のシートから小型の構造を切り出すための方法が開発された（図４〜図９）。さらに、背後にあるニトロセルロースシートからのニトロセルロースのレーザーアブレーション（レーザー切断）によって、流動制御および緩衝液交換構成要素としての使用に適切な平坦なニトロセルロース構造の製造が可能になる（図７）。多数の異なる形状のニトロセルロース構造を、側方流動方式の受動的毛細管吸上げによって２つの流体（図４、図５および図７）および３つの流体（図６、８および９）を交換する際のその有用性について評価した。
【００４４】
プロトタイプデバイスを用いる流体流動制御を図４に示す。この初期型プロトタイプでは、２つの異なる緩衝液が、ニトロセルロースストリップに切断される幾何的特性を変えることによって規定される種々の経路を通じた毛細管流によって種々の速度で移動する。
【００４５】
さらに洗練されたプロトタイプのデバイスを、ビニルカッターを用いて製造して、図８Ａ〜図８Ｄに示した。異なる溶液について規定されたニトロセルロース通路の長さおよび幅を変化させることによって、このデバイスは、デバイス上の規定された反応ゾーンに対して３つの異なる溶液の一時的制御を管理することができた。図８に示されるとおり、サンプル、溶解緩衝液および増幅緩衝液をデバイスに導入する（図８Ａ）。サンプル緩衝液は、広い膜通路を通じて免疫−捕獲ゾーンの上に流れて、サンプル流が消費されるまで、溶解緩衝液および増幅緩衝液を基板壁に近位の膜領域へ置き換える（図８Ｂ）。サンプルが消費されるにつれて、溶解緩衝液は、免疫−捕獲ゾーンに侵入して、下流の「ＬＮＡ−捕獲ゾーン」で固定されたＬＮＡプローブ上のハイブリダイゼーションベースの捕獲のために、捕獲された粒子を破壊して核酸を遊離する（図８Ａに示される）。溶解緩衝液の消費後、ＮＡＳＢＡ増幅に適切な緩衝液は、ＬＮＡ−捕獲ゾーンを洗浄して、残留の溶解緩衝液を除去し、プライマーのハイブリダイゼーションを容易にする。３分以内に、１０μＬのサンプル、溶解緩衝液および増幅緩衝液の容積を用いて３つの緩衝液交換が達成される。免疫−捕獲ゾーンおよびＬＮＡ−捕獲ゾーンの算出されたベッド容積は約２５０ｎＬであり、従って各々の緩衝液交換は、約４０ベッド容積で捕獲ゾーンを洗浄する。さらに流体流動調節は、種々の長さおよび幅の追加の流路を用いて実現されて、さらなる緩衝液の洗浄および交換が可能になり得る。同様に、緩衝液の粘度の調節を用いて、溶解緩衝液中におけるインキュベーション時間のようなアッセイパラメータをさらに洗練してもよい。最も重要なことに、デバイスサイズは、より大きいサンプル容積の処理に適合するように変更され得る。各パネルの右側の定規部分は１ｍｍである。
【００４６】
［実施例５］  増幅有効性を増大するために免疫捕獲された標的を受動的に洗浄するための幾何学的構造
ＲＴ−ＰＣＲアンプリコンのリアルタイム検出およびＮＡＳＢＡ反応産物のＬＦＭ検出を使用する実験から得た結果によって、サンプルマトリクスの残留の阻害性構成成分が、免疫捕獲されたウイルスと会合して残るか、またはクロマトグラフィ基板の含まれたベッド容積に残ることが示された。これらのデータによって、側方流動免疫−捕獲後の緩衝液洗浄が複雑なサンプルマトリクスからの増幅効率を増大する簡易だが有効な手段を提供し得ることが示唆された。この仮説を試験するために、側方流動ストリップを、捕獲ゾーンラインに抗ＴＭＶ抗体を、およびコントロールラインにコロイド金コンジュゲートされた検出抗体に結合し得るコントロール抗体を担持するニトロセルロースイムノアッセイストリップ上へ受動的緩衝液交換を媒介するように設計されたニトロセルロース構造を積層することによって、捕獲ゾーンの回収および核酸増幅の前に緩衝液洗浄に供した。
【００４７】
側方流動基板の緩衝液洗浄を達成するのに必要な使用者の介入のレベルを最小限にするために、側方流動ストリップを、受動的な緩衝液交換を達成するように設計された形状へ背景のニトロセルロース切断に積層した。これらのデバイスによって、洗浄緩衝液でのサンプルの迅速な交換およびＰＣＲの前に超純粋Ｈ２Ｏ中での最終の平衡化によって、ＰＣＲの能力に対する残留の洗浄緩衝液の潜在的な影響を減じることが可能になった。用いられるデバイスは図８Ｅに示される。１００μＬのサンプル容積を用いた。洗浄緩衝液の容積は５０μＬであって、その後の最終リンスは２５μＬのＨ２Ｏを用いて残留の緩衝液構成成分を除去した。サンプル、洗浄緩衝液およびＨ２Ｏを、アッセイ開始時点で３８４ウェルのプレートの対応するウェルに添加した。毛細管輸送の終了後、捕獲ゾーンを回収して、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる分析に供した。
【００４８】
側方流動ストリップの捕獲ゾーンでウイルスのイムノアフィニティ固定と適合した組成物を用いて緩衝液を特定するために、ニートなタバコ抽出物を用いて生成されたＴＭＶ免疫−ストリップ捕獲ゾーンシグナルに対する種々の洗浄緩衝液の効果を評価した。これらの研究によると、ここでＮＭＥ（０．５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＭＯＰＳ  ｐＨ７．０、１５％のエタノール）と呼ばれる、２００μＬのエタノール含有洗浄緩衝液の毛細管吸上げ後、捕獲ゾーンから隔離された金粒子の視覚的に検出可能な溶出は現れなかった。捕獲ゾーンシグナルに対するＮＭＥの効果とは対照的に、グアニジウムイソチオシアネート含有緩衝液ＲＬＴ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）では、検出粒子の捕獲ゾーンを急速に浄化した。
【００４９】
ＳＥＢ１中のＤＣＴＬＥの種々の希釈での受動的な緩衝液交換構造に対して積層されたＴＭＶイムノ−アッセイ・ストリップのチャレンジ（試み）後、５０μＬのＮＭＥ洗浄を用いて、捕獲ゾーンを回収して、ＮＡＳＢＡ増幅およびＬＦＭによるアンプリコン検出に供した。これらの研究によって、未希釈のＤＣＴＬＥに曝されたストリップから回収された捕獲ゾーン物質でプログラムされた反応物中において以前に観察されたＮＡＳＢＡ増幅の軽減が明らかになった（図１０Ａと図１０Ｂを比較のこと）。さらに、ＮＭＥ緩衝液洗浄の結果、少なくとも１：１６，０００というＤＣＴＬＥ希釈でのＴＭＶの検出が得られ、これによってクロマトグラフィ基板からのＤＣＴＬＥ希釈に使用されるＳＥＢ１抽出緩衝液のさらに完全な除去が、増幅効率をさらに増大することが示唆された。
【００５０】
ＴＭＶアンプリコンのＬＦＭ検出は、ＬＦＭ基板上に固定された捕獲プローブＴＭＶ−１およびＴＭＶ−２（を利用し）、
ＴＭＶ−１：
５’ＴＴＡＴＧＣＴＡＴＡＡＣＣＡＣＣＣＡＧＧ３’［配列番号５］
ＴＭＶ−２：
５’ＴＴＡＴＧＣＴＡＴＡＡＣＣＡＣＣＣＡＧＧＡＣＧＣＧＡＴＧＡＡＡＡＡＣＧＴＣＴＧＧＣＡＡ３’［配列番号６］
ならびに検出プローブ：
ＵＮＩ−ｄｅｔ−５Ｔｂｉｏ：
５’−ＴＴ−Ｕ−ｂｉｏｔｉｎ−ＴＴＴＴ−Ｕ−ｂｉｏｔｉｎ−ＴＴＴＴ−Ｕ−ｂｉｏｔｉｎ−ＴＴＴＴＴＴＴ  ｇａｔ  ｇｃａ  ａｇｇ  ｔｃｇ  ｃａｔ  ａｔｇ  ａｇ−３’［配列番号７］
を利用し、これは、ストレプトアビジンコンジュゲートされ染色されたポリスチレンマイクロスフェア（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ）捕獲によって可視化された。
【００５１】
ＴＭＶ診断配列のＮＡＳＢＡ増幅は以下を用いて達成された：
ＴＭＶ−Ｐ１：５’ａａｔ  ｔｃｔ  ａａｔ  ａｃｇ  ａｃｔ  ｃａｃ  ｔａｔ  ａｇｇ  ｇ  ａｇａ  ＧＡＡ  ＡＧＣ  ＧＧＡ  ＣＡＧ  ＡＡＡ  ＣＣＣ  ＧＣＴ  Ｇａ  ３’［配列番号８］
ＴＭＶ−Ｐ２：５’ｇａｔ  ｇｃａ  ａｇｇ  ｔｃｇ  ｃａｔ  ａｔｇ  ａｇ  ＧＡＣ  ＣＴＧ  ＡＣＡ  ＡＡＡ  ＡＴＧ  ＧＡＧ  ＡＡＧ  ＡＴＣ  Ｔ３’［配列番号９］
【００５２】
ＴＭＶ−Ｐ２プライマーは、ＮＡＳＢＡ産物中にタグ配列を組み込み、このＮＡＳＢＡ産物がＵＮＩ−ｄｅｔ−５Ｔｂｉｏにハイブリダイズされて検出を媒介し得る。
【００５３】
［実施例６］  複雑かつ阻害性のサンプルマトリクスにおいて微量のウイルスを検出するための受動的な緩衝液交換の使用
タバコ抽出物を利用する研究によって、これらのサンプル中の高いウイルス力価は、ＴＭＶのＰＣＲベースの検出を、粗溶解物中のインヒビタを境界濃度未満まで下げるのに十分な程度まで、単に抽出物を希釈することによって達成可能とすることが明らかになった。低力価の標的ウイルスを含むインヒビタ含有サンプルを増幅しやすくする側方流動免疫−捕獲工程の有用性をさらによく評価するため、土壌抽出物を利用するサンプルを、サンプル処理手順を干渉することなくＴＭＶ診断配列のＰＣＲ増幅を完全に無効にするのに十分な酵素インヒビタ濃度を含むように工夫した。これらのサンプルによって、ＰＣＲベースの検出スキームに対する側方流動免疫捕獲の影響の評価が可能になり、増幅阻害のレベルに対する緩衝液洗浄の影響を評価するアプローチが得られる。チャレンジングなインヒビタ含有サンプルを提供するため、ＤＣＴＬＥを、図１１に示されるとおり、５０ｍＬのポリプロピレン遠心管中へ測定した３ｇの局地的に集めた土壌を用いて調製したＰＣＲ阻害性の土壌抽出物へ、１：２０００または１：４０００希釈して、３０ｍＬのＳＥＢ１抽出緩衝液（Ａｇｄｉａ，Ｉｎｃ．製）中に激しくボルテックスして、室温で一晩回転させた。得られた土壌スラリーを、ＲＮＡ単離、ＴＭＶのためのＰＣＲ試験、またはＤＣＴＬＥでスパイクされた土壌抽出物の調製のためのアリコートの回収の前に３分間落ち着かせた。
【００５４】
捕獲ゾーンを、サンプルおよび洗浄緩衝液の輸送の完了後に収集して、逆転写酵素反応に導入し、続いて１μＬのＲＴ反応をテンプレートとして用いるリアルタイムＰＣＲに導入した。土壌抽出物を特徴付けるため、土壌抽出物の総ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙプロトコールを用いて単離し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによってＴＭＶについてアッセイして、そのマトリクスがＴＭＶについて陰性であることを確認した。さらに、ＤＣＴＬＥスパイクした土壌由来のサンプルマトリクスは、１：２０００または１：４０００のいずれかのＤＣＴＬＥを含んでいる１００μＬの土壌抽出物をチャレンジされたＴＭＶアッセイストリップから回収された捕獲ゾーンを用いて、偽陰性のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ結果を生じた（図１１）。５０μＬのＮＭＥ緩衝液を用いて１：２０００という最終希釈でタバコ抽出物を含有する土壌抽出物でチャレンジされたＴＭＶアッセイストリップの受動的な毛細管流動によって媒介される洗浄では、陽性のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果（Ｃｔ＝２６．２）（図１１）、およびアガロースゲル中の明確に特定可能なバンドが生じた（図１２、ＮＭＥ）。５０μＬのＲＬＴ緩衝液での洗浄は、ＲＴ−ＰＣＲおよびゲル分析（図１２、ＲＬＴ）、またはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（図示せず）のいずれでもＴＭＶ検出には成功しなかった。さらに、土壌抽出物中のＤＣＴＬＥのさらに薄い溶液、１：４０００も、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによってＴＭＶ検出が陽性であって（図１１）、ここで５０μＬのＮＭＥ緩衝液洗浄を捕獲ゾーン回収の前に使用した場合、２７．２というＣｔ値であった。
【００５５】
［実施例７］  アフィニティマトリクスに対して結合された核酸を受動的に洗浄するための幾何学的構造
核酸がグアニジン溶解液から直接捕獲されることを可能にする受動的緩衝液交換アプローチの能力を評価するため、１μＬのＲＬＴあたり２２μｇのタバコを用いて、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＬＴグアニジウムイソチオシアネート溶解緩衝液中で乾燥硬化させたタバコの葉を浸軟することによって、タバコ溶解液を調製した。側方流動クロマトグラフィおよび緩衝液交換のためのデバイスは、レーザーカッター（ＶｅｒｓａＬａｓｅｒ  ＶＬ−３００，３０Ｗ  ＣＯ２レーザー，Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて製造した。このデバイスは、緩衝液交換構成要素のインプットテールが４．５ｍｍの間隔を隔てており、サンプルおよび緩衝液が３８４ウェルのプレートのウェルから吸収されることを可能にするように設計された。緩衝液エクスチェンジャの遠位端は、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙカラムからとった３ｍｍ径のパンチに積層された。このシリカＲＮＡ結合マトリクスを用いて、毛細管流動媒介性の緩衝液交換がウイルスＲＮＡ捕獲を支持する適切性を評価した。他の材料、例えば、グラス・ファイバー・フィルター材料も使用され得る。同様に、他の緩衝液システムを用いて、ＤＥＡＥ膜が、同様のシステムに組み込まれてもよい。
【００５６】
１０μＬのＲＬＴタバコ抽出物をサンプルとして用いた。４０μＬの洗浄を、洗浄なしのコントロール以外は全ての処理についてＮＭＥ緩衝液を用いて行い、続いて８０μＬのＮＭＥ、またはＮａＣｌを０〜１Ｍにわたる濃度で図１３に示されるとおり用いて行った。これらのデータによって、ＮＭＥ洗浄とその後の０．５ＭのＮａＣｌ洗浄で、試験された条件の最高の増幅が提供されたことが示される。洗浄しなかったサンプルは、検出可能なリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ産物を生じることができなかった。
【００５７】
［実施例８］  容易な標的富化ならびに増幅および検出の前の洗浄を支持する流体システムへの受動的緩衝液交換幾何学的構造の組み込み
コンパクトでかつ内蔵型のハウジングへ側方流動捕獲および緩衝液交換システムを組み込むために、支持的な流体システムを工夫した。この流体システムは、図１４Ｂ〜図１４Ｄに示される幾何形状へ、レーザーカッターを用いてポリカーボネートのシートを切断することによって、図１４Ａに示されるようなニトロセルロースまたは濾紙緩衝液エクスチェンジャを収容するように製造された。適切に切断されたポリカーボネートのシートを積層して、ＵＶ硬化接着剤または防水両面テープ（ＡＣＥ両面カーペットテープ５０１０６）を用いてサンプルおよび緩衝液のウェルを形成した。得られたデバイスによって、サンプルおよび洗浄緩衝液がアッセイ開始時点で導入されることを可能になったと共に、さらに使用者が介入することなくサンプルのクロマトグラフィおよび洗浄を支持した。
【００５８】
［むすび］
本明細書に引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、あたかも個々の刊行物または特許出願が参照によって援用されるものと具体的且つ個別的に示されているかのように、参照によって本明細書に援用される。
【００５９】
本発明は、本発明の個々の態様の単一の例示として意図され、そのいずれもが本発明の範囲内で機能的に等価である、本明細書に開示される実施形態によって範囲を限定されるものではない。本明細書に記載されるモデルおよび方法に加えて、本発明のモデルおよび方法に対する種々の改変が、前述の説明および教示から当業者に明らかになり、そして同様に本発明の範囲内におさまるものとする。このような改変または他の実施形態は、本発明の真の範囲および趣旨から逸脱することなく実施され得る。
【００６０】
［文献の引用］
（文献１〜５５は、非特許文献１〜５５として「先行技術文献」の欄に記載した。）
【００６１】
［付記］原出願のＰＣＴ出願時のオリジナルクレーム
（項目１）
側方流動マトリクスを備える側方流動サンプル調製（ＬＦＳＰ）デバイスであって、
前記側方流動マトリクスは、流路を規定し、且つ連続して以下の要素、即ち、
（ａ）流体サンプルのアリコートを受容するためのサンプル受容ゾーンと、
（ｂ）前記サンプル受容ゾーンと側方流動的に接触すると共に、目的の生物学的粒子または細胞上に存在するリガンドと反応性を有する固定された抗体を含む、免疫−捕獲ゾーンと、を備える、
ことを特徴とするＬＦＳＰデバイス。
（項目２）
側方流動マトリクスを備える側方流動サンプル調製（ＬＦＳＰ）デバイスであって、
前記側方流動マトリクスは、流路を規定し、且つ連続して以下の要素、即ち、
（ａ）流体サンプルのアリコートを受容するためのサンプル受容ゾーンと、
（ｂ）前記サンプル受容ゾーンと側方流動的に接触すると共に、目的の生物学的粒子または細胞上に存在するリガンドと反応性を有する固定された抗体を含む、免疫−捕獲ゾーンと、
（ｃ）前記免疫−捕獲ゾーンと側方流動的に接触すると共に、生物学的粒子または細胞の膜の溶解およびそれからの核酸の遊離を達成し得る、溶解ゾーンと、を備える、
ことを特徴とするＬＦＳＰデバイス。
（項目３）
側方流動マトリクスを備える側方流動サンプル調製（ＬＦＳＰ）デバイスであって、
前記側方流動マトリクスは、流路を規定し、且つ連続して以下の要素、即ち、
（ａ）流体サンプルのアリコートを受容するためのサンプル受容ゾーンと、
（ｂ）前記サンプル受容ゾーンと側方流動的に接触すると共に、目的の生物学的粒子または細胞上に存在するリガンドと反応性を有する固定された抗体を含む、免疫−捕獲ゾーンと、
（ｃ）前記免疫−捕獲ゾーンと側方流動的に接触すると共に、生物学的粒子または細胞の膜の溶解およびそれからの核酸の遊離を達成し得る、溶解ゾーンと、
（ｄ）前記溶解ゾーンと側方流動的に接触する１つ以上のアッセイゾーンであって、一緒になってサンドイッチ核酸ハイブリダイゼーションアッセイのための核酸および標識構成成分を形成する、１つ以上のアッセイゾーンと、を備える、
ことを特徴とするＬＦＳＰデバイス。
（項目４）
前記溶解ゾーンの下流にあって該溶解ゾーンと側方流動的に接触し、且つ、前記アッセイゾーンの上流にあって該アッセイゾーンと側方流動的に接触する、核酸増幅ゾーンを更に備える、項目２または３に記載のＬＦＳＰデバイス。
（項目５）
前記免疫−捕獲ゾーンが微小孔性の膜を備える、項目１〜４のいずれか一項に記載のＬＦＳＰデバイス。
（項目６）
前記溶解ゾーンが微小孔性の膜を備える、項目２〜５のいずれか一項に記載のＬＦＳＰデバイス。
（項目７）
前記アッセイゾーンが微小孔性の膜を備える、項目３〜６のいずれか一項に記載のＬＦＳＰデバイス。
（項目８）
前記微小孔性の膜がニトロセルロースである、項目５〜７のいずれか一項に記載のＬＦＳＰデバイス。
（項目９）
少なくとも前記サンプル受容ゾーンが、流体の吸上げ、及び、そこでの少なくとも１つの流体流動の受動的制御を支持し得る幾何学的に規定された吸収材料を備える、項目１〜８のいずれか一項に記載のＬＦＳＰデバイス。
（項目１０）
少なくとも前記サンプル受容ゾーンおよび前記免疫−捕獲ゾーンが、流体の吸上げ、及び、そこでの少なくとも１つの流体流動の受動的制御を支持し得る幾何学的に規定された吸収材料を備える、項目９に記載のＬＦＳＰデバイス。
（項目１１）
少なくとも前記サンプル受容ゾーン、前記免疫−捕獲ゾーンおよび前記溶解ゾーンが、流体の吸上げ、及び、そこでの少なくとも１つの流体流動の受動的制御を支持し得る幾何学的に規定された吸収材料を備える、項目１０に記載のＬＦＳＰデバイス。
（項目１２）
前記溶解ゾーンと側方流動的に接触する核酸結合マトリクスを更に備える、項目２〜１１のいずれか一項に記載のＬＦＳＰデバイス。
（項目１３）
前記溶解ゾーンと前記アッセイゾーンとの間にあって、その両方と側方流動的に接触する核酸結合マトリクスを更に備える、項目３〜１２のいずれか一項に記載のＬＦＳＰデバイス。
（項目１４）
前記核酸結合マトリクスが、シリカ、グラスファイバーおよびＤＥＡＥ膜からなる群から選択される、項目１２又は１３に記載のＬＦＳＰデバイス。
（項目１５）
側方流動マトリクスを備えるデバイスであって、
前記側方流動マトリクスは、流路を規定し、且つ、流体の吸上げ、及び、そこでの少なくとも１つの流体流動の受動的制御を支持し得る幾何学的に規定された吸収材料を備えている、
ことを特徴とするデバイス。
（項目１６）
前記幾何学的に規定された吸収材料が、そこでの複数の流体流動の受動的制御を可能にする、項目１５に記載のデバイス。
（項目１７）
前記幾何学的に規定された吸収材料と側方流動的に接触する核酸結合マトリクスを更に備える、項目１５又は１６に記載のデバイス。
（項目１８）
前記核酸結合マトリクスが、シリカ、グラスファイバーおよびＤＥＡＥ膜からなる群から選択される、項目１７に記載のデバイス。
（項目１９）
図５、６、７、８、９または１４Ａに本質的に示されるとおりの構成を有する幾何学的に規定されたニトロセルロース製ストリップ。
（項目２０）
前記吸収材料がニトロセルロースを含む、項目９〜１１、および１５〜１８のいずれか一項に記載のＬＦＳＰデバイス。
【図１】
0006026570.tif 000002
【図２】
0006026570.tif 000003
【図３】
0006026570.tif 000004
【図４】
0006026570.tif 000005
【図５】
0006026570.tif 000006
【図６】
0006026570.tif 000007
【図７】
0006026570.tif 000008
【図８】
0006026570.tif 000009
【図９】
0006026570.tif 000010
【図１０】
0006026570.tif 000011
【図１１】
0006026570.tif 000012
【図１２】
0006026570.tif 000013
【図１３】
0006026570.tif 000014
【図１４】
0006026570.tif 000015
【図１５】
0006026570.tif 000016
【図１６】
0006026570.tif 000017