(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出対象の生体分子と特異的に結合するアプタマーと、
前記アプタマーの一端に結合し、出力される信号がセンサ感部との距離に対応して変化するシグナル分子と、
前記アプタマーの他端に結合して前記アプタマーと前記センサ感部とを接着する接着分子と
を備える生体分子検出分子と、
前記生体分子検出分子が前記接着分子で接着している前記センサ感部と
を備え、
前記センサ感部は、酸化グラフェンから構成されていることを特徴とする生体分子検出素子。
【請求項２】
請求項１記載の生体分子検出素子において、
前記接着分子は、ピレンが骨格に含まれていることを特徴とする生体分子検出素子。
【請求項３】
請求項２記載の生体分子検出素子において、
前記接着分子は、ピレンブタジエン酸であることを特徴とする生体分子検出素子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の生体分子検出素子において、
前記シグナル分子は、前記アプタマーに結合可能な蛍光色素分子であり、前記信号は、蛍光であることを特徴とする生体分子検出素子。
【請求項５】
検出対象の生体分子と特異的に結合するアプタマーを作製する第１工程と、
出力される信号がセンサ感部との距離に対応して変化するシグナル分子を前記アプタマーの一端に結合させる第２工程と、
前記アプタマーと前記センサ感部とを接着する接着分子を前記アプタマーの他端に結合させる第３工程と、
前記アプタマーの前記接着分子を、前記センサ感部の表面に接着させる第４工程と
を備え、
前記センサ感部は、酸化グラフェンから構成する
ことを特徴とする生体分子検出素子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的とする生体分子を検出する生体分子検出素子および生体分子検出素子の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体分子検出方法には、検出対象となる標的生体分子を選択的に認識する生体分子検出分子を用い、生体分子検出分子と標的生体分子である例えばタンパク質との結合によって起こる分子構造の変化や反応物質の生成などの化学現象を、光や電気などの信号に変換して検出する方法がある。この方法で用いられる生体分子検出分子としては、生体由来の分子（核酸，アミノ酸，抗体，核酸，脂質，糖鎖，イオンチャネルなど）がある。標的生体分子と生体分子検出分子との結合によって起こる生体分子検出分子の特異的な構造変化を利用することで、標的生体分子との高い選択性を確保することができる。
【０００３】
構造変化を利用した生体分子検出分子の例として、標的生体分子との結合により構造変化するアプタマー（標的生体分子に特異的に結合する核酸またはペプチドから構成されるリガンド）を用いることができる。アプタマーは、一般的に、特定の標的生体分子との結合によってある特定の構造へと変化することが知られている、さらに、配列設計により、構造変化後のアプタマーの構造を精密に設計できることも知られている。アプタマーの標的生体分子としては、多岐にわたる生体分子が開示されており、例えば、各種タンパク質，酵素，ペプチド，抗体，レセプター，ホルモン，アミノ酸，抗生物質、また、その他の種々の化合物などが報告されている（非特許文献１参照）。
【０００４】
アプタマーを利用した生体分子検出法においては、アプタマーの構造変化を検出可能な信号に変換する手法として、アプタマーの予め設計した部位に種々のシグナル分子を修飾（付加）することが有用である。シグナル分子を修飾したアプタマーが標的生体分子との複合体を形成すると、シグナル分子とセンサ感部となる物質との距離が変化して出力される信号が変化するため、検出可能な信号変化として検知することが可能となる。ここで用いられるシグナル分子は、検出方法によって異なる。例えば、蛍光検出を用いる場合、シグナル分子としては各種の蛍光分子を用い、センサ感部には酸化グラフェンなどの蛍光クエンチャー（励起エネルギー吸収物質）を用いることができる（非特許文献２参照）。
【０００５】
蛍光分子は、センサ感部との距離が遠くなると、センサ感部によるクエンチング効率が低下する。この状態は、例えば、蛍光顕微鏡などを用いることで観察（検出）できる。蛍光分子をシグナル分子として用いる構成では、標的生体分子とアプタマーとの複合体形成による、蛍光分子とセンサ感部とが離間したことによる発光強度の増加を用いて検出を行う（非特許文献３参照）。このため、標的生体分子を検出する前の初期段階では、アプタマーに修飾されている（結合している）蛍光分子を可能な範囲でセンサ感部の近傍に配置し、クエンチング効率が最大となっていることが望ましい。一方で、アプタマーが標的生体分子と複合体を形成した後は、クエンチングが起こらない距離に蛍光分子がセンサ感部から遠ざかることが望ましい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】T. Hermann and D. J. Patel, "Adaptive Recognition by Nucleic Acid Aptamers", SCIENCE, vol.287, pp.820-825, 2000.
【非特許文献２】E. Treossi et al. , "High-Contrast Visualization of Graphene Oxide on Dye-Sensitized Glass, Quartz, and Silicon by Fluorescence Quenching", J. AM. CHEM. SOC. , vol.131, pp.15576-15577, 2009.
【非特許文献３】H. Chang et al. , "Graphene Fluorescence Resonance Energy Transfer Aptasensor for the Thrombin Detection", Analytical Chemistry, vol.82, no.6, pp.2341-2346, 2010.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述したように、アプタマーを利用した生体分子検出法においては、シグナル分子が結合しているアプタマーが、標的生体分子との複合体を形成したことにより、シグナル分子とセンサ感部となる物質との距離が変化することで、検出信号に変化を生じさせている。従って、シグナル分子とセンサ感部となる物質との距離の制御が重要である。
【０００８】
ところで、このシグナル分子（蛍光分子）による信号（発光）変化の検出は、センサ感部の箇所（センサ感部表面）で行うことが重要となる。しかしながら、アプタマーは、対象となる生体分子と複合体を形成したことにより、センサ感部より大きく離間する場合が発生する。この場合、例えば、アプタマーに結合している蛍光分子は発光することになるが、この発光を、センサ感部の箇所で検出することができなくなる。例えば、基板表面で起こる現象を検出するチップ型のデバイスの上で、上述した生体分子検出法を実現使用とする場合、シグナル分子が結合しているアプタマー（生体分子検出分子）が、センサ感部より大きく離間すると、アプタマーがデバイス上にない状態となる場合があり、これでは、検出をすることができない。
【０００９】
本発明は、以上のような問題点を解消するためになされたものであり、センサ感部の箇所において、シグナル分子による信号が検出できるようにすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係る生体分子検出素子は、検出対象の生体分子と特異的に結合するアプタマーと、アプタマーの一端に結合し、出力される信号がセンサ感部との距離に対応して変化するシグナル分子と、アプタマーの他端に結合してアプタマーとセンサ感部とを接着する接着分子とを備える。
【００１１】
上記生体分子検出素子において、接着分子は、ピレンが骨格に含まれていればよい。例えば、接着分子は、ピレンブタジエン酸であればよい。
【００１２】
上記生体分子検出素子において、シグナル分子は、アプタマーに結合可能な蛍光色素分子であり、信号は、蛍光であればよい。
【００１３】
上記生体分子検出素子は、接着分子で接着しているセンサ感部を備え、センサ感部は、酸化グラフェンから構成されている。
【００１４】
また、本発明に係る生体分子検出素子の製造方法は、検出対象の生体分子と特異的に結合するアプタマーを作製する第１工程と、出力される信号がセンサ感部との距離に対応して変化するシグナル分子をアプタマーの一端に結合させる第２工程と、アプタマーとセンサ感部とを接着する接着分子をアプタマーの他端に結合させる第３工程と、アプタマーの接着分子を、センサ感部の表面に接着させる第４工程とを備え、センサ感部は、酸化グラフェンから構成する。
【発明の効果】
【００１５】
以上説明したことにより、本発明によれば、センサ感部の箇所において、シグナル分子による信号が検出できるようになるという優れた効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、本発明の実施の形態における生体分子検出素子の構成を示す構成図である。
【図２】図２は、本発明の実施の形態における生体分子検出素子の構成を示す構成図である。
【図３】図３は、本発明の実施の形態における生体分子検出素子の作製について説明するフローチャートである。
【図４】図４は、本発明の実施の形態における生体分子検出素子の作製について説明するフローチャートである。
【図５】図５は、実施例１における生体分子検出素子を用いてトロンビンを検出した結果を示す特性図である。
【図６】図６は、実施例１における生体分子検出素子を用いてトロンビンを検出したときに蛍光顕微鏡により観察された状態を示す写真である。
【図７】図７は、実施例２における生体分子検出素子を用いてトロンビンを検出した結果を示す特性図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の実施の形態について図を参照して説明する。図１は、本発明の実施の形態における生体分子検出素子の構成を示す構成図である。この生体分子検出素子は、生体分子検出分子１００とセンサ感部１１１とから構成されている。
【００１８】
生体分子検出分子１００は、検出対象の生体分子と特異的に結合するアプタマー１０１と、アプタマー１０１の一端に結合し、出力される信号がセンサ感部１１１との距離に対応して変化するシグナル分子１０２と、アプタマー１０１の他端に結合してアプタマー１０１とセンサ感部１１１とを接着する接着分子１０３とを備える。なお、「アプタマー」は、検出対象の生体分子と特異的に結合する部分のことを示すものとする。
【００１９】
シグナル分子１０２は、アプタマーを用いた生体分子検出でよく用いられる蛍光分子（蛍光色素分子）であればよい。また、この場合、センサ感部１１１は、酸化グラフェンなどの蛍光クエンチャーであればよい。また、シグナル分子１０２は、フェロセンなどの電気化学的に活性な分子であってもよい。この場合、センサ感部１１１は、導電物質から構成すればよく、グラフェンなどの炭素材料でもよく、金属から構成してもよい。この構成とすることで、シグナル分子１０２とセンサ感部１１１との距離の変化が、電気信号の変化として検出できる。
【００２０】
また、接着分子１０３は、センサ感部１１１に物理吸着する分子から構成すればよい。例えば、センサ感部１１１が、酸化グラフェンなどの炭素材料から構成されている場合、ピレンが骨格に含まれている分子であればよい。ピレンが骨格に含まれている分子であれば、炭素材料に吸着（接着）させることができる。また、接着分子１０３は、センサ感部１１１に化学的に結合する分子であってもよい。例えば、センサ感部１１１がＡｕから構成されている場合、接着分子１０３は、チオール基を有する分子であればよい。
【００２１】
本実施の形態における生体分子検出素子によれば、図２に示すように、アプタマー１０１が検出対象の生体分子２０１との複合体を形成した場合も、アプタマー１０１は接着分子１０３によりセンサ感部１１１に接着しているので、生体分子検出分子１００が、センサ感部１１１より脱離することがない。この結果、上述したように複合体が形成される状態となっても、シグナル分子１０２より出力される信号は、センサ感部１１１の箇所で検出可能であり、シグナル分子１０２とセンサ感部１１１との距離の変化によって生じる検出信号は、センサ感部１１１表面近くで検出することができる。このため、例えば、基板表面の化学現象を検出するチップ型のデバイスの上で、生体分子検出分子１００を用いた生体分子の検出が可能となる。
【００２２】
以下、より詳細に説明する。シグナル分子および接着分子をアプタマーに化学結合する方法としては、アプタマーの片方の末端にアミノ基などを導入し、ここにシグナル分子または接着分子に導入したカルボキシル基もしくはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル部位を反応させて化学結合を形成する方法が好ましい。
【００２３】
また、センサ感部表面に上記のアプタマーを接着させる方法としては、種々の方法が可能である。例えば、図３に示すように、ステップＳ３０１で、センサ感部を作製し、ステップＳ３０２で作製したセンサ感部をチップとなる基板に固定した後、ステップＳ３０３で、センサ感部の表面に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル部位を有する接着分子を接着（吸着）させる。一方で、ステップＳ３０４で、アプタマーを合成し、ステップＳ３０５で、合成したアプタマーの一方の末端にシグナル分子を結合させ、他方の末端にアミノ基（接着分子結合部位）を導入する。
【００２４】
これらの後、ステップＳ３０６で、シグナル分子が結合してアミノ基が導入されたアプタマーのアミノ基の部分を、センサ感部表面に吸着している接着分子に結合させればよい。一方の末端に蛍光色素分子などが結合し、かつ他方の末端にアミノ基が導入されているアプタマーは、核酸やペプチドのカスタム合成を行う試薬メーカーなどから入手可能である。
【００２５】
また、図４に示すように、ステップＳ４０１で、センサ感部を作製し、ステップＳ３０２で作製したセンサ感部をチップとなる基板に固定する。一方で、ステップＳ４０３で、アプタマーを合成し、ステップＳ４０４で、合成したアプタマーの一方の末端にシグナル分子を結合させ、他方の末端に接着分子を結合させる。これらの後、ステップＳ４０５で、シグナル分子および接着分子が結合したアプタマーの接着分子を、センサ感部表面に接着（吸着）させればよい。
【００２６】
センサ感部表面に接着させるアプタマー（生体分子検出分子）の密度の制御は、固定時間，アプタマーの濃度，反応温度などを制御することで達成される。また、この密度は、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）法、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法、Ｘ線光電子分光（ＸＰＳ）法、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）法など種々の分析方法により確認可能である。
【００２７】
また、生体分子検出分子がセンサ感部に接着している生体分子検出素子を固定する基板としては、ガラス基板，石英基板、シリコン基板などを用いることができる。なお、これらの基板に、金属膜などが蒸着されていてもよい。
【００２８】
生体分子検出素子を固定した生体分子検出チップでは、試料溶液を直接検出部に滴下してもよい。また、流路を搭載することによって、生体分子検出素子が固定されている検出部に試料溶液を導入してもよい。流路には様々な材料が適用可能であり、流路の作製には、種々の方法があげられるが、ポリジメチルシロキサンなどの高分子樹脂を、鋳型を用いて作製する方法が好ましい。ポリスチレンなどの樹脂を用いて、射出成型法などで作製してもよい。さらに、ガラス板，石英板，アクリル板などを、ミリング法を用いて加工することで成形してもよい。
【００２９】
流路の幅は、１００μｍ〜１０００μｍ程度、流路の高さは１０μｍ〜５００μｍ程度、流路の長さは１ｍｍ〜１０ｍｍ程度が望ましい。この寸法とした流路では、毛管現象を利用して溶液を簡単に送液することが可能であり、ポンプなどの外部の駆動力を使う必要がない。また、複数本の流路を並列させる場合は、異なる流路からの液漏れを回避するため、隣り合う流路の間隔は１０μｍ以上が望ましい。
【００３０】
以下、実施例を用いて説明する。
【００３１】
［実施例１］
はじめに、実施例１について説明する。実施例１では、シグナル分子とセンサ感部の組み合わせとして蛍光分子と酸化グラフェンを用いた場合について説明する。
【００３２】
酸化グラフェンは、例えばグラファイトを化学的に酸化することで形成したものである。より詳細に説明すると、まず、ボールミルで粉砕した天然グラファイト（１ｇ）と濃硫酸（３４．５ｍｌ）とを混合し、撹拌しながらこの混合物中に硝酸ナトリウム（０．７５ｇ）を加える。これらの混合物を氷冷下におき、さらに、過マンガン酸カリウム（４．５ｇ）を徐々に加え、撹拌を２時間継続する。この後、混合物を室温に戻し、さらに、５日間撹拌を続ける。この結果、濃灰色の生成物が得られる。
【００３３】
次に、得られた生成物に、５％希硫酸（１００ｍｌ）、過酸化水素水（３ｍｌ）を加え撹拌して液状とした後、これをさらに過剰量の硫酸（３％）と過酸化水素水（０．５％）との混合溶液中に加え、遠心分離により沈殿物を分取する。引き続き、沈殿物に純水を加えて分散し、遠心分離により沈殿物を分取する。これらのことにより、最終生成物として、濃褐色の油状物質として酸化グラフェンが得られる。
【００３４】
以上のようにして得られた酸化グラフェンを、純水に加えて撹拌することで、炭素材料（酸化グラフェン）が分散した分散水溶液（均一分散水溶液）が得られる。この分散水溶液中には、大きさが約１μｍから１００μｍ四方の様々な酸化グラフェンの小片が混在している。得られた分散水溶液は、茶褐色となる。この分散水溶液中に分散している物質は、原子間力顕微鏡観察およびラマン分光分析から、単層〜３層の酸化グラフェンの小片（膜片）が主要成分であることが確認されている。
【００３５】
次いで、この酸化グラフェンが分散した水溶液を、親水処理した基板の上に塗布する。基板に塗布する方法としては、例えば、スピンコート法、キャスト法があげられる。基板には、ガラス基板，石英基板，もしくはシリコン基板などを用いることができる。分散水溶液中の酸化グラフェンの小片は、速やかにガラス基板，石英基板，もしくはシリコン基板表面上に吸着するため、余分な酸化グラフェン分散水溶液を水洗により除去してもよい。この塗布により、単層〜３層程度の酸化グラフェンの小片からなる層が均一に形成できる。また、分散水溶液における酸化グラフェンの濃度は、０．０１〜１ｗｔ％程度とすればよい。
【００３６】
次に、接着分子を導入するため、ピレンブタジエン酸のＣＯＯＨ基をスクシンイミドで活性化したピレンブタジエン酸スクシンイミドエステルの０．５ｍＭジメチルホルムアミド溶液を、酸化グラフェンを固定した基板に滴下し、室温で１時間静置し、酸化グラフェン表面に吸着させる。これをジメチルホルムアミドで洗浄し、この後、風乾する。
【００３７】
次いで、予め３’末端に蛍光色素分子（シグナル分子）を結合させ、５’末端にアミノ基を結合させたアプタマーの水溶液（１００μＭ）を基板に滴下する。次いで、これらを室温（２３℃程度）で１時間静置し、酸化グラフェンに吸着しているピレンブタジエン酸のＣＯＯＨ基と、アプタマーの５’末端に結合させたアミノ基とを反応させ、ペプチド結合を介して結合する。これを、超純水で洗浄し、風乾する。これらのことにより、接着分子であるピレンブタジエン酸とシグナル分子である蛍光色素分子の両者が結合されているアプタマーが、酸化グラフェン表面に固定される。これらの結果、本発明の生体分子検出素子を固定した検出用チップが得られる。
【００３８】
アプタマーとしては、例えばトロンビンに特異的に結合する配列とした、５’−ＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧ−３’（非特許文献１参照）を用いることができる。また３’末端には、蛍光色素分子として、６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＡＭ）を結合させることができる。このように作製した検出用チップにおいて、酸化グラフェン表面に接着分子が接着している状態は、ＡＦＭ法などの分析方法によって確認できる。
【００３９】
なお、比較のためには、上記アプタマーの３’末端にＦＡＭを結合させ、５’末端には何も結合させていない生体分子検出分子を用いればよい。この比較のための生体分子検出分子の水溶液（１００μＭ）を、酸化グラフェンを固定した１０ｍｍ四方の酸化膜付きシリコン基板に滴下し、室温で１時間静置する。これにより、酸化グラフェン表面に、接着分子を用いずに、生体分子検出分子を配置した基板が得られる（従来）。この場合、生体分子検出分子が、酸化グラフェンに物理吸着によってある程度固定されているものと考えられる。この状態は、ＡＦＭ法などの分析方法によって確認できる。
【００４０】
以上の工程によって作製した本発明による生体分子検出チップおよび比較対象の比較チップを、共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いて観察した。まず超純水を滴下して酸化グラフェン表面の蛍光像を測定した。酸化グラフェン表面には、アプタマーと結合しているＦＡＭが配置されているが、本発明によるチップおよび比較のチップの両者とも、蛍光強度は非常に微弱であった。ＦＡＭと酸化グラフェンの距離が近いため、エネルギー移動によってＦＡＭが消光（クエンチング）していることを示している。
【００４１】
次いで、蛍光像を観察しながら、１００ユニット／ｍｌのトロンビン水溶液を滴下した。トロンビンは、検出対象の生体分子であり、上述したアプタマーと特異的に結合する。本発明によるチップにおいては、滴下後から酸化グラフェンが固定されている検出部の蛍光強度の増加が観測され、図５に示すように、約２〜３分後に強度が最大となり、徐々に強度が弱くなることが観測された。図５の（ａ）に示すトロンビン水溶液滴下直後は、図６の（ａ）に示すように、検出部において、あまり発光は確認されないが、図５の（ｂ）に示す２分後は、図６の（ｂ）に示すように、明確に発光が確認された。なお、図６は、蛍光顕微鏡観察像を示す写真である。これらの結果は、アプタマーとトロンビンとが選択的に結合したことにより、アプタマーの立体構造が変化し、これによりアプタマーに結合しているＦＡＭが、酸化グラフェンへのエネルギー移動を起こさない程度に離間して発光したことで説明できる。
【００４２】
蛍光強度の増加は、基板上の酸化グラフェンが固定されている部分でのみ観測されていることから、ＦＡＭと結合しているアプタマーは、トロンビンに選択的に結合した後も酸化グラフェンから脱離していないことが示された。トロンビンに選択的に結合した生体分子検出分子が、酸化グラフェン上に存在していることは、反応後のチップをＡＦＭで観測することによっても、確認可能である。
【００４３】
一方、比較チップにおいては、トロンビン滴下後においても、酸化グラフェンが固定されている検出分の蛍光強度の増加は観測されなかった。しかし、酸化グラフェンが固定されていない部分も含めて、全体的にわずかに蛍光強度が増加した。これは、アプタマーとトロンビンとが選択的に結合したことにより、比較の生体分子検出分が、酸化グラフェンから脱離して周囲の溶液中へ拡散し、ＦＡＭの発光が観測されたことで説明できる。比較の生体分子検出分が酸化グラフェンから脱離して酸化グラフェン上に存在していないことおよび、トロンビンが吸着していないことは、反応後のチップをＡＦＭで観測することによっても、確認可能である。
【００４４】
以上から、実施例１によれば、本発明を用いて、アプタマーが対象とする生体分子と複合体を形成した後も、生体分子検出分子がセンサ感部である酸化グラフェンの上に存在し、蛍光色素分子が生体分子検出分子と共に、酸化グラフェンから完全に脱離してしまう問題を回避できる。また、蛍光色素分子と酸化グラフェン表面との距離の変化によって生じる検出信号は、酸化グラフェンを固定した基板表面で検出することが可能となるという本発明の効果が示された。これにより、本発明による生体分子検出チップが実現可能なことが示された。
【００４５】
［実施例２］
次に、実施例２について説明する。上述した実施例１と同様に酸化グラフェンが分散した水溶液を合成する。基板には、親水処理した厚さ約０．１５ｍｍで１８ｍｍ四方のガラス板を用い、実施例１と同様に、スピンコート法を用いて酸化グラフェンを固定する。
【００４６】
次に、予め３’末端に蛍光色素分子を結合させ、５’末端にアミノ基を結合させたアプタマー（生体分子検出分子）を用意する。水溶液（１００μＭ）として用意する。このアプタマーに接着分子を結合させるため、ピレンブタジエン酸（接着分子）のＣＯＯＨ基をスクシンイミドで活性化したピレンブタジエン酸スクシンイミドエステルの０．５ｍＭジメチルホルムアミド溶液を上記水溶液に混合し、室温で１時間静置する。
【００４７】
このようにして、溶液中で、アプタマーの５’末端のアミノ基とピレンブタジエン酸のＣＯＯＨ基とを反応させ、ペプチド結合を介してこれらを結合する。このように接着分子を結合させたアプタマーの溶液を、酸化グラフェンを固定した基板に滴下し、室温で１時間静置し、酸化グラフェン表面に吸着（接着）させる。アプタマーの他端（５’末端）に結合した接着分子であるピレンブタジエン酸が、酸化グラフェンに吸着する。これを超純水で洗浄、風乾する。これにより、酸化グラフェン表面に、接着分子であるピレンブタジエン酸とシグナル分子である蛍光色素分子の両者が結合されているアプタマーが固定される。アプタマーおよび蛍光色素分子は、実施例１と同様のものを用いればよい。
【００４８】
次いで、ポリジメチルシロキサン樹脂を材料とし、幅５００μｍ，高さ１００μｍ，長さ１０ｍｍの形状に、鋳型を用いて成形して流路を作製する。流路の両端には、試料溶液を導入するため、直径８００μｍの貫通孔が設けられている。この流路を、上述の基板に密着させて搭載する。これらのことにより、本発明による生体分子検出素子を固定した検出用チップを得る。
【００４９】
以上の工程によって作製した本発明による生体分子検出チップを、実施例１と同様に、共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いて観察した。まず超純水を流路片側の貫通孔に滴下し、毛管現象を用いて流路に導入し、流路の内部と外部が同一視野内に観測される位置において、酸化グラフェン表面の蛍光像を測定した。酸化グラフェン表面には、アプタマーと結合しているＦＡＭが配置されているが、図７に示すように、流路の内部と外部とも、蛍光強度は非常に微弱であった。ＦＡＭと酸化グラフェンの距離が近いため、エネルギー移動によってＦＡＭが消光していることを示している。
【００５０】
次いで、蛍光像を観察しながら、１００ユニット／ｍｌのトロンビン水溶液を流路片側の貫通孔に滴下し、毛管現象を用いて流路に導入した。流路内部では、図７に示すように、滴下後から酸化グラフェンが固定されている検出部のみで蛍光強度の増加が観測された。これは、アプタマーとトロンビンとが選択的に結合したことにより、アプタマーの立体構造が変化し、これによりアプタマーに結合しているＦＡＭが、酸化グラフェンへのエネルギー移動を起こさない程度に遠い距離に移動して発光したことで説明できる。蛍光強度の増加は、基板上の酸化グラフェンが固定されている検出部でのみ観測されていることから、ＦＡＭと結合しているアプタマーは、トロンビンと選択的に結合した後も酸化グラフェンの上に配置されて酸化グラフェンから脱離していないことが示された。
【００５１】
以上から、実施例２によれば、アプタマーに固定したシグナル分子が、センサ感部から完全に脱離してしまう問題を回避でき、シグナル分子とセンサ感部との距離の変化によって生じる検出信号は、センサ感部の表面近くで検出することが可能となるという本発明の効果が示された。これにより、本発明による生体分子検出チップが実現可能なことが示された。
【００５２】
さらに、図７にも示したように、流路の外部では、蛍光強度の増加は観測されなかった。流路内部および外部の両方で、観測開始後から徐々に蛍光強度が弱くなることが観測されたが、これば観測のための励起光によって蛍光色素分子が劣化するためである。流路の内部と外部が同一視野内に観測される位置で蛍光像を測定することにより、反応による応答信号（流路内部）と、参照信号（流路外部）における蛍光色素分子の劣化や経時変化は同等の条件となる。以上から、本発明における生体分子検出チップを用いれば、蛍光色素分子の劣化や経時変化の影響を相殺し、正味の応答の差を精度よく測定することが可能になるという効果が得られることが示された。
【００５３】
以上に説明したように、本発明によれば、一端にセンサ分子が結合したアプタマーの他端に接着分子を結合させ、接着分子でセンサ感部に接着するようにしたので、センサ感部の箇所において、シグナル分子による信号が確実に検出できるようになる。
【００５４】
また、接着分子により接着することで、接着分子により生体分子検出分子がセンサ感部に強く固定されるようになるので、加熱などの処理を行っても生体分子検出分子が、センサ感部より脱離することが抑制できる。例えば、生体分子検出素子を検出に用いる前に、９５℃×５分程度の加熱処理が可能となる。この加熱処理により、アプタマーの構造は自由度が高くなるため、エネルギー的に安定な構造に変化させることが可能となる。この加熱を行ってから室温程度に戻したときに、エネルギー的に安定な本来の構造のままアプタマーが固まるので、検出対象の生体分子との特異的な結合をしやすい構造となり、検出の効率を向上させることができる。
【００５５】
また、上述したように耐熱性が向上するので、検出対象の生体分子の検出などを行ったとで、例えば、９５℃×５分程度の加熱処理を行うと、結合している検出対象の生体分子を分離することができ、再度、生体分子検出分子（生体分子検出素子）を検出に用いることが可能となる。
【００５６】
なお、本発明は以上に説明した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想内で、当分野において通常の知識を有する者により、多くの変形および組み合わせが実施可能であることは明白である。例えば、アプタマーは、核酸から構成したものに限らず、ペプチドから構成されたものであってもよい。また、シグナル分子や接着分子が結合しているアプタマーの端部に、更に、核酸やペプチドが配列した分子が結合していてもよい。
【００５７】
また、接着分子は、ピレンブタジエン酸などピレンが骨格に含まれているものに限らず、例えば、ベンゼンおよび多環芳香族分子（ナフタレン，アントラセン，テトラセン，ペンタセン，フェナントレン，ピレン，ペリレン，コロネン）などであってもよい。また、接着分子をアプタマーと結合させる官能基（分子）は、ブタジエン酸に限るものではなく、「−ＣＯＯＨ」および「−（ＣＨ2）nＣＯＯＨ」であってもよい。なお、ｎは、好ましくは２〜１０の範囲がよい。
【符号の説明】
【００５８】
１００…生体分子検出分子、１０１…アプタマー、１０２…シグナル分子、１０３…接着分子、１１１…センサ感部。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図６】
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