(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１試薬及び第２試薬よりなるクレアチンキナーゼ活性測定試薬であって、第１試薬がアデノシン５’−二リン酸又はこの塩、ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）若しくはβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）又はこれらの塩、チオール化合物、及びグルコースを含み、かつ当該グルコースの濃度が０．５ｍＭ〜１０ｍＭにあり、第２試薬がクレアチンリン酸又はこの塩、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを含み、かつグルコースを含まないか又は１０ｍＭ以下の濃度のグルコースを含むものであることを特徴とする、クレアチンキナーゼ活性測定試薬。
【請求項２】
第１試薬のグルコースの濃度が１．２５ｍＭ〜５ｍＭである、請求項１記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬。
【請求項３】
第１試薬のグルコースの濃度が２ｍＭ〜５ｍＭである、請求項１〜請求項２のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬。
【請求項４】
第２試薬がグルコースを含まないか又は５ｍＭ以下の濃度のグルコースを含むものである、請求項１〜請求項３のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬。
【請求項５】
第２試薬がグルコースを含まないものである、請求項１〜請求項４のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬。
【請求項６】
第１試薬の、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの活性値が、２００Ｕｎｉｔ／Ｌ〜５，０００Ｕｎｉｔ／Ｌである、請求項１〜請求項５のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬。
【請求項７】
第２試薬の、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの活性値が、試料と第１試薬と第２試薬が混合された最終反応液において５００Ｕｎｉｔ／Ｌ以上となるように調整されている、請求項１〜請求項６のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬。
【請求項８】
第１試薬及び第２試薬が液状試薬である、請求項１〜請求項７のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬。
【請求項９】
β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）若しくはこの塩に替えてβ−チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）若しくはこの塩を用い、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）若しくはこの塩に替えてβ−チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）若しくはこの塩を用い、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）若しくはこの塩に替えてβ−チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）若しくはこの塩を用い、又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）若しくはこの塩に替えてβ−チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）若しくはこの塩を用いる、請求項１〜請求項８のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、長期間、安定でありかつ正確に測定を行うことができるクレアチンキナーゼ活性の測定試薬等に関するものである。本発明は、臨床検査分野において特に重要な生体由来試料中のクレアチンキナーゼ活性の測定に好適なものである。
【背景技術】
【０００２】
クレアチンキナーゼ（ＣＫ、クレアチンホスホキナーゼ、又はＣＰＫ）〔以下、「ＣＫ」ということがある。〕［Ｅ．Ｃ．２．７．３．２］は、アデノシン５’−三リン酸〔以下、アデノシン５’−三リン酸又はこの塩を「ＡＴＰ」ということがある。〕又はアデノシン５’−二リン酸〔以下、アデノシン５’−二リン酸又はこの塩を「ＡＤＰ」ということがある。〕を補酵素とし、下記の反応を触媒する酵素である。
【化１】
0005982608.tif 000002
クレアチンキナーゼは、骨格筋、心筋及び脳等に分布し、エネルギー代謝上重要な役割を果たしている酵素である。
そして、このクレアチンキナーゼは、二量体酵素であり、Ｍ型（筋型）とＢ型（脳型）のサブユニットの組み合わせにより、ＭＭ型（ＣＫ−３）、ＭＢ型（ＣＫ−２）及びＢＢ型（ＣＫ−１）の３種のアイソザイムが存在し、生体組織中では骨格筋にＭＭ型が、心筋にＭＭ型とＭＢ型が、脳にＢＢ型が多く存在する。
生体由来試料中のクレアチンキナーゼ活性は、急性心筋梗塞等の虚血性心疾患、多発性筋炎又は進行性筋ジストロフィー症等の原発性筋疾患、及び甲状腺機能異常等の疾病において高値となるため、生体由来試料中のクレアチンキナーゼ活性の測定はこれらの疾病の診断にとって大変有用なものである。
また、心筋に多く存在しているクレアチンキナーゼのＭＢ型アイソザイムの測定は、心筋梗塞に特異性の高い検査として重要視されている。
クレアチンキナーゼ活性の測定は、主として、下記の反応式で示されるクレアチンキナーゼ活性の測定反応、すなわち、「クレアチンキナーゼが触媒として働く、クレアチンリン酸又はこの塩とＡＤＰから、クレアチンとＡＴＰを生成する反応」、「ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼが触媒として働く、グルコースとＡＴＰから、グルコース−６−リン酸とＡＤＰを生成する反応」、及び「グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼが触媒として働く、グルコース−６−リン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）から、６−ホスホグルコン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）を生成する反応」、により生成するβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）の生成速度を３４０ｎｍにおける吸光度の増加速度より算出する方法により行われている。〔以下、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）又はこの塩を「ＮＡＤ＋」ということがあり、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）又はこの塩を「ＮＡＤＰ＋」ということがあり、この「ＮＡＤ＋」と「ＮＡＤＰ＋」を総称して「ＮＡＤ（Ｐ）＋」ということがあり、そして、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）又はこの塩を「ＮＡＤＨ」ということがあり、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）又はこの塩を「ＮＡＤＰＨ」ということがあり、この「ＮＡＤＨ」と「ＮＡＤＰＨ」を総称して「ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ」ということがある。〕
【化２】
0005982608.tif 000003
ところで、赤血球、筋肉又は肝臓等に存在するアデニル酸キナーゼ（ミオキナーゼ）は、下記の反応を触媒する。
【化３】
0005982608.tif 000004
よって、溶血した試料等の試料中にアデニル酸キナーゼが存在すると、クレアチンキナーゼ活性測定試薬中に含まれるＡＤＰ２分子よりＡＴＰとアデノシン５’−一リン酸〔以下、アデノシン５’−一リン酸又はこの塩を「ＡＭＰ」ということがある。〕が生成し、この生じたＡＴＰよりヘキソキナーゼ（又はグルコキナーゼ）及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（グルコース−６−リン酸脱水素酵素）の触媒する反応によりＮＡＤ（Ｐ）Ｈが生成する。
従って、試料中にアデニル酸キナーゼが存在すると、本来はクレアチンキナーゼの存在により生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈが、アデニル酸キナーゼの存在により生成してしまい、試料中のクレアチンキナーゼ活性測定値に正の誤差を与えてしまうことになる。
【化４】
0005982608.tif 000005
これに対して、第１試薬と試料の混合液に第２試薬を混合した最終反応液より得られるシグナルの量又はシグナルの変化量から、第１試薬を試料と混合した混合液より得られるシグナルの量又はシグナルの変化量を差し引き、この差の値より試料中のクレアチンキナーゼ活性値を求めることにより、例え、試料中にアデニル酸キナーゼが存在しても、正確なクレアチンキナーゼ活性値が得られる、いわゆるダブルカイネティック法が考えられ、広く使用されるようになった。
これは、試料が溶血等によりアデニル酸キナーゼを含むものであっても、第１試薬と試料の混合後の測定により得られるアデニル酸キナーゼの反応に由来する測定値（吸光度変化量）を、第１試薬と試料の混合液に第２試薬を混合した後の測定により得られるアデニル酸キナーゼの反応に由来する吸光度変化量とクレアチンキナーゼの反応に由来する吸光度変化量の両方を含む測定値（吸光度変化量）から差し引くことにより、アデニル酸キナーゼの存在により生じる正誤差が差し引かれた、正確なクレアチンキナーゼの活性値が得られる方法である。
ところで、クレアチンキナーゼは、血清等の生体由来試料中で、温度依存性の不可逆的失活と活性中心のＳＨ基がブロックされることによる可逆的失活により速やかに不活性化されるので、活性測定時にチオール化合物を存在させ、予備加温（予備インキュベーション）を行うことにより、クレアチンキナーゼを活性化してその活性値を測定する必要がある。
このクレアチンキナーゼの活性化剤であるチオール化合物としては、種々のものが使用されてきたが、近年は、無臭で取り扱い易く安価なことからＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）が広く用いられてきた（特許文献１参照。）。
ところが、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインは溶液中では不安定であり、そのＳＨ基が少しずつ酸化されることによりクレアチンキナーゼを活性化する能力が低下してしまい、クレアチンキナーゼ活性の測定値も負の誤差を生じるようになる。
更に、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインの酸化物は、クレアチンキナーゼの活性を阻害するとの報告もある（非特許文献１参照。）。
また、クレアチンキナーゼの活性化剤として用いられる還元型グルタチオン及びジチオスレイトールなどの他のチオール化合物も溶液中で更に不安定であり、測定値に誤差を生じさせるようになるものであった。
このように、チオール化合物を含むクレアチンキナーゼ活性測定試薬及びチオール化合物を存在させるクレアチンキナーゼ活性測定方法は不安定なものであり、長期間測定に使用することができないものであった。
チオール化合物であるＮ−アセチル−Ｌ−システインを安定化することができ、３７℃での保存で最長１４日間使用することができる測定試薬として、ジチオスレイトール、メルカプトエタノール又はチオグリセロールなどのＮ−アセチル−Ｌ−システイン以外のチオール化合物（ＳＨ基含有化合物）とＮ−アセチル−Ｌ−システインとを含有するクレアチンキナーゼ活性測定試薬が開示されている（特許文献２参照。）。
しかしこれは、ジチオスレイトールが高価であること、メルカプトエタノールは悪臭を放つこと、そしてチオグリセロールは溶液状のため凍結乾燥に適さないことなどの難点を有するものであった。
また、やはりチオール化合物であるＮ−アセチル−Ｌ−システインを安定化することができ、４℃での保存で２８日間使用することが可能な測定試薬として、少なくともＮ−アセチル−Ｌ−システイン及びエチレンジアミン四酢酸塩を含む試薬群とマグネシウムを含む試薬群に分けて構成若しくは調製するクレアチンキナーゼ活性測定試薬が開示されている（特許文献３参照。）。
しかしこれは、第１試薬中にマグネシウムが存在せずヘキソキナーゼ（又はグルコキナーゼ）及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼによる反応が進行しないため、前記のダブルカイネティック法による測定を行うことができないものであった。
長期間正確にクレアチンキナーゼ活性の測定を行うことができるという効果を有する測定試薬として、チオール化合物を含むクレアチンキナーゼ活性測定試薬において、亜硫酸等の硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩を含有するクレアチンキナーゼ活性測定試薬が発明された（特許文献４参照。）。
また、顕著な機能低下なしに２℃〜８℃で１２ヵ月まで安定な液状の測定試薬として、グルコースとは異なり、酵素的にリン酸化され得るヘキソースをグルコースに加え、又はこれの代わりにヘキソキナーゼの基質として使用し、ヘキソキナーゼ反応で生成するグルコース−６−リン酸と異なるヘキソース−６−リン酸を、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼと異なるヘキソース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを使用して直接測定するか、又は酵素的異性体化の後にグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼによってグルコ−ス−６−リン酸として測定するクレアチンキナーゼ活性測定方法、及びこの測定方法のためのクレアチンキナーゼ活性測定試薬が開示されている（特許文献５参照。）。
そして、長期間安定な液状の測定試薬として、２つの別個の試薬成分に分割されており、検出のために試薬成分を相互に混合する形式のものにおいて、Ｇ６ＰＤＨ（グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）が１つの成分中に含まれており、チオグリセロールが、少なくとも１つの他の物質とともに他の成分に含まれているクレアチンキナーゼ活性測定試薬が開示されている（特許文献６参照。）。
更に、２〜８℃で長期貯蔵した後の非常にすぐれた安定性を特徴とする測定試薬として、亜硫酸等の有機又は無機イオウ化合物又はイオウ塩をクレアチンキナーゼ活性化物質に対してサブモル量で含むクレアチンキナーゼ活性測定試薬が開示されている（特許文献７参照。）。
また、長期間安定な測定試薬として、第１試薬中のグルコース濃度が０．０５〜０．４ｍＭであり、かつ第２試薬中のグルコース濃度が第１試薬と第２試薬とを混合した時のグルコース終濃度で１６〜２５ｍＭになるように調整されているクレアチンキナーゼ活性測定試薬が開示されている（特許文献８参照。）。
更に、長期保存が可能な測定試薬として、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン等のクレアチンキナーゼ活性化剤と、アミノメタンスルホン酸とを含有するクレアチンキナーゼ活性測定試薬が開示されている（特許文献９参照。）。
しかしながら、近年の液状の活性測定試薬の普及に伴い、クレアチンキナーゼ活性測定試薬の製造、流通、保管及び使用の各段階を通じての更なる安定性の向上が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開昭４９−１０６３９７号公報
【特許文献２】特開昭６１−２８９９００号公報
【特許文献３】特開昭６２−１０４５９８号公報
【特許文献４】特開平９−７０２９８号公報
【特許文献５】特開平１１−１９６８９９号公報
【特許文献６】特開２０００−１８９１９５号公報
【特許文献７】特表２００３−５１７２６４号公報
【特許文献８】特開２００５−１３０７７３号公報
【特許文献９】特開２００７−４９９３１号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｇｅｒｈａｒｄｔら，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，３９巻，７３７頁〜７４２頁，１９７９年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前記のように、従来のクレアチンキナーゼ活性測定試薬及びクレアチンキナーゼ活性測定方法は不安定なものであり、長期間の保存及び使用が難しく、更なる安定性の向上が要望されるものであった。
本発明者らは、この従来のクレアチンキナーゼ活性測定試薬及びクレアチンキナーゼ活性測定方法が有する難点の解消を目指して鋭意検討を行った結果、第１試薬及び第２試薬よりなるクレアチンキナーゼ活性測定試薬において、第１試薬が０．５ｍＭ〜１０ｍＭの濃度のグルコースを含み、かつ第２試薬がグルコースを含まないか又は１０ｍＭ以下の濃度のグルコースを含むことにより、長期間安定かつ正確にクレアチンキナーゼ活性を測定することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下の発明を包含するものである。
（１）  第１試薬及び第２試薬よりなるクレアチンキナーゼ活性測定試薬であって、第１試薬が０．５ｍＭ〜１０ｍＭの濃度のグルコースを含み、かつ第２試薬がグルコースを含まないか又は１０ｍＭ以下の濃度のグルコースを含むことを特徴とする、クレアチンキナーゼ活性測定試薬。
（２）  第１試薬及び第２試薬よりなるクレアチンキナーゼ活性測定試薬であって、第１試薬がアデノシン５’−二リン酸又はこの塩、ＡＴＰとグルコースからＡＤＰとグルコース−６−リン酸を生成する反応を触媒する酵素、グルコース−６−リン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）から６−ホスホグルコン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）とＨ＋を生成する反応を触媒する酵素、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）若しくはβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）又はこれらの塩、チオール化合物、及びグルコースを含み、かつ当該グルコースの濃度が０．５ｍＭ〜１０ｍＭにあり、第２試薬がクレアチンリン酸又はこの塩を含み、かつグルコースを含まないか又は１０ｍＭ以下の濃度のグルコースを含むものであることを特徴とする、前記（１）記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬。
（３）  第１試薬のグルコースの濃度が１．２５ｍＭ〜５ｍＭである、前記（１）又は（２）記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬。
（４）  第１試薬のグルコースの濃度が２ｍＭ〜５ｍＭである、前記（１）〜（３）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬。
（５）  第２試薬がグルコースを含まないか又は５ｍＭ以下の濃度のグルコースを含むものである、前記（１）〜（４）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬。
（６）  第２試薬がグルコースを含まないものである、前記（１）〜（５）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬。
（７）  第２試薬が、グルコース−６−リン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）から６−ホスホグルコン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）とＨ＋を生成する反応を触媒する酵素を含むものである、前記（１）〜（６）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬。
（８）  第１試薬及び第２試薬が、グルコース−６−リン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）から６−ホスホグルコン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）とＨ＋を生成する反応を触媒する酵素を含むものである、前記（１）〜（７）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬。
（９）  第１試薬の、グルコース−６−リン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）から６−ホスホグルコン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）とＨ＋を生成する反応を触媒する酵素の活性値が、２００Ｕｎｉｔ／Ｌ〜５，０００Ｕｎｉｔ／Ｌである、前記（１）〜（８）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬。
（１０）  第１試薬の、グルコース−６−リン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）から６−ホスホグルコン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）とＨ＋を生成する反応を触媒する酵素の活性値が、５００Ｕｎｉｔ／Ｌ〜２，０００Ｕｎｉｔ／Ｌである、前記（１）〜（９）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬。
（１１）  第１試薬の、グルコース−６−リン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）から６−ホスホグルコン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）とＨ＋を生成する反応を触媒する酵素の活性値が、５００Ｕｎｉｔ／Ｌ〜１，０００Ｕｎｉｔ／Ｌである、前記（１）〜（１０）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬。
（１２）  第２試薬の、グルコース−６−リン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）から６−ホスホグルコン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）とＨ＋を生成する反応を触媒する酵素の活性値が、試料と第１試薬と第２試薬が混合された最終反応液において５００Ｕｎｉｔ／Ｌ以上となるように調整されている、前記（１）〜（１１）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬。
（１３）  第２試薬の、グルコース−６−リン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）から６−ホスホグルコン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）とＨ＋を生成する反応を触媒する酵素の活性値が、試料と第１試薬と第２試薬が混合された最終反応液において８００Ｕｎｉｔ／Ｌ以上となるように調整されている、前記（１）〜（１２）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬。
（１４）  第２試薬の、グルコース−６−リン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）から６−ホスホグルコン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）とＨ＋を生成する反応を触媒する酵素の活性値が、試料と第１試薬と第２試薬が混合された最終反応液において１，６００Ｕｎｉｔ／Ｌ以上となるように調整されている、前記（１）〜（１３）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬。
（１５）  ＡＴＰとグルコースからＡＤＰとグルコース−６−リン酸を生成する反応を触媒する酵素が、ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼである、前記（１）〜（１４）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬。
（１６）  グルコース−６−リン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）から６−ホスホグルコン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）とＨ＋を生成する反応を触媒する酵素が、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼである、前記（１）〜（１５）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬。
（１７）  第１試薬及び第２試薬が液状試薬である、前記（１）〜（１６）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬。
（１８）  β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）若しくはこの塩に替えてβ−チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）若しくはこの塩を用い、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）若しくはこの塩に替えてβ−チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）若しくはこの塩を用い、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）若しくはこの塩に替えてβ−チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）若しくはこの塩を用い、又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）若しくはこの塩に替えてβ−チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）若しくはこの塩を用いる、前記（１）〜（１７）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬は、長期間安定に保つことができ、かつ長期間正確にクレアチンキナーゼ活性の測定を行うことができるという効果を有するものである。
また、本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬は、長期間、高値域における直線性を維持することができるという効果を有するものである。
更に、本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬は、溶血した試料等におけるアデニル酸キナーゼによる正の誤差を補正することができるダブルカイネティック法を適用可能なものであって、かつ上記の効果を奏するものである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
Ｉ．クレアチンキナーゼ活性測定試薬
本発明において、クレアチンキナーゼ活性測定試薬（ＣＫ活性測定試薬）は、第１試薬及び第２試薬よりなるものである。すなわち、第１試薬及び第２試薬よりなる測定試薬キットである。
以下、詳細に説明を行う。
１．グルコース
（１）第１試薬
本発明において、第１試薬は、グルコースを０．５ｍＭ以上の濃度で含む。
第１試薬が含むグルコースの濃度が０．５ｍＭ未満であると、前記のダブルカイネティック法における第１試薬と試料とを混合した後の混合液における、試料に含まれていたアデニル酸キナーゼに由来する一連の反応が十分に行われず、このアデニル酸キナーゼによる反応に由来するシグナルの量（又はシグナルの変化量）を正確に測定することができない。
また、本発明においては、第２試薬がグルコースを含まないか又は１０ｍＭ以下の濃度のグルコースを含むものであるので、第１試薬が含むグルコースの濃度が０．５ｍＭ未満であると、第１試薬と試料の混合液に第２試薬を混合した後の最終反応液における、クレアチンキナーゼ（及びアデニル酸キナーゼ）による反応が十分に行われず、この反応に由来するシグナルの量（又はシグナルの変化量）を正確に測定することができない。
なお、より高い活性値のクレアチンキナーゼの測定に対応することが可能となるので、第１試薬が含むグルコースの濃度は１．２５ｍＭ以上であることが好ましく、２ｍＭ以上であることがより好ましい。
また、本発明において、第１試薬が含むグルコースの濃度は、１０ｍＭ以下とする必要がある。
第１試薬が、１０ｍＭを超える濃度のグルコースを含むと、「試薬を長期間安定に保つことができ、かつ長期間正確にクレアチンキナーゼ活性の測定を行うことができる」という本発明の効果を、十分に得ることができなくなる。
なお、本発明における試薬の安定化の効果をより高めることが可能となるので、第１試薬が含むグルコースの濃度は、５ｍＭ以下であることが好ましい。
上述した理由により、本発明において、第１試薬は、０．５ｍＭ〜１０ｍＭの濃度のグルコースを含む。そして、この第１試薬が含むグルコースの濃度は、１．２５ｍＭ〜５ｍＭであることが好ましく、２ｍＭ〜５ｍＭであることがより好ましい。
（２）第２試薬
本発明において、第２試薬は、グルコースを含まないか又は１０ｍＭ以下の濃度のグルコースを含む。
第２試薬が、１０ｍＭを超える濃度のグルコースを含むと、「試薬を長期間安定に保つことができ、かつ長期間正確にクレアチンキナーゼ活性の測定を行うことができる」という本発明の効果を十分に得ることができなくなる。
なお、本発明における試薬の安定化の効果をより高めることが可能となるので、第２試薬が含むグルコースの濃度は、５ｍＭ以下であることが好ましく、第２試薬がグルコースを含まないことがより好ましい。
２．アデノシン５’−二リン酸又はこの塩
本発明において、第１試薬は、「アデノシン５’−二リン酸又はこの塩」（ＡＤＰ）を含む。
なお、第２試薬にも、この「アデノシン５’−二リン酸又はこの塩」（ＡＤＰ）を含ませても良いが、このことは必須ではない。
この「アデノシン５’−二リン酸又はこの塩」（ＡＤＰ）の「この塩」としては、特に限定はなく、例えば、リチウム、ナトリウム若しくはカリウムなどのアルカリ金属塩、又はマグネシウム若しくはカルシウムなどのアルカリ土類金属塩等を挙げることができる。
この「アデノシン５’−二リン酸又はこの塩」（ＡＤＰ）の濃度であるが、試料と第１試薬と第２試薬が混合された最終反応液において、０．５ｍＭ以上であることが好ましい。
なお、この最終反応液における濃度に上限は特にはないが、コストのことを考えると５０ｍＭ迄で十分である。
また、この最終反応液における濃度は、より好ましくは０．５ｍＭ〜１０ｍＭであり、特に好ましくは１ｍＭ〜５ｍＭである。
例えば、第１試薬が含む「アデノシン５’−二リン酸又はこの塩」（ＡＤＰ）の濃度は、０．６２５ｍＭ〜６２．５ｍＭであることが好ましく、０．６２５ｍＭ〜１２．５ｍＭであることがより好ましく、１．２５ｍＭ〜６．２５ｍＭであることが特に好ましい。
また、例えば、「アデノシン５’−二リン酸又はこの塩」（ＡＤＰ）を、第１試薬と第２試薬の両方に含ませる場合、第１試薬が含む「アデノシン５’−二リン酸又はこの塩」（ＡＤＰ）の濃度は、０．４１５ｍＭ〜４１．５ｍＭであることが好ましく、０．４１５ｍＭ〜８．３ｍＭであることがより好ましく、０．８３ｍＭ〜４．１５ｍＭであることが特に好ましい。
また、この場合、第２試薬が含む「アデノシン５’−二リン酸又はこの塩」（ＡＤＰ）の濃度は、０．８３５ｍＭ〜８３．５ｍＭであることが好ましく、０．８３５ｍＭ〜１６．７ｍＭであることがより好ましく、１．６７ｍＭ〜８．３５ｍＭであることが特に好ましい。
３．ＡＴＰとグルコースからＡＤＰとグルコース−６−リン酸を生成する反応を触媒する酵素
本発明において、第１試薬は、「ＡＴＰとグルコースからＡＤＰとグルコース−６−リン酸を生成する反応を触媒する酵素」を含む。
なお、第２試薬にも、この「ＡＴＰとグルコースからＡＤＰとグルコース−６−リン酸を生成する反応を触媒する酵素」を、含ませても良いが、このことは必須ではない。
この「ＡＴＰとグルコースからＡＤＰとグルコース−６−リン酸を生成する反応を触媒する酵素」は、特に限定はなく、ＡＴＰとグルコースからＡＤＰとグルコース−６−リン酸を生成する反応を触媒することができる酵素であれば良く、その由来についても限定はなく、例えば、ＹｅａｓｔやＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓなどの微生物、動物若しくは植物などに由来するもの、又は遺伝子組み換え技術などにより調製したもの等を挙げることができる。
この「ＡＴＰとグルコースからＡＤＰとグルコース−６−リン酸を生成する反応を触媒する酵素」としては、例えば、ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼ等を挙げることができる。
この「ＡＴＰとグルコースからＡＤＰとグルコース−６−リン酸を生成する反応を触媒する酵素」の活性値であるが、試料と第１試薬と第２試薬が混合された最終反応液において、３００Ｕｎｉｔ／Ｌ（単位／Ｌ）以上であることが好ましい。
なお、この最終反応液における活性値に上限は特にはないが、コストのことを考えると６，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ迄で十分である。
また、この最終反応液における活性値は、より好ましくは５００Ｕｎｉｔ／Ｌ〜５，０００Ｕｎｉｔ／Ｌであり、特に好ましくは７００Ｕｎｉｔ／Ｌ〜３，５００Ｕｎｉｔ／Ｌである。
第１試薬が含む「ＡＴＰとグルコースからＡＤＰとグルコース−６−リン酸を生成する反応を触媒する酵素」の活性値は、前記のダブルカイネティック法を適用したときに試料に含まれるアデニル酸キナーゼの活性値の測定が可能な活性値であることが好ましく、例えば、３７５Ｕｎｉｔ／Ｌ〜７，５００Ｕｎｉｔ／Ｌであることが好ましく、６２５Ｕｎｉｔ／Ｌ〜６，２５０Ｕｎｉｔ／Ｌであることがより好ましく、８７５Ｕｎｉｔ／Ｌ〜４，３７５Ｕｎｉｔ／Ｌであることが特に好ましい。
なお、前記した「ＡＴＰとグルコースからＡＤＰとグルコース−６−リン酸を生成する反応を触媒する酵素」の活性値であるが、酵素の活性値はその酵素活性測定方法の種々の条件により得られる活性値が異なることが知られている。
前記又は後記の「ＡＴＰとグルコースからＡＤＰとグルコース−６−リン酸を生成する反応を触媒する酵素」の活性値は、オリエンタル酵母工業社のカタログ（２００６年６月改訂版）の「ヘキソキナーゼ〔ＨＫ〕（ＧＲＡＤＥ−Ｓ）ｆｒｏｍ  Ｙｅａｓｔ」（第２９頁）の「分析方法」に記載された酵素活性測定方法により求めた活性値である。
すなわち、５０ｍｇ／ｍＬのグルコースを含む０．１Ｍのトリエタノールアミン−塩酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）の２．４０ｍＬ、０．１Ｍの塩化マグネシウム溶液の０．３０ｍＬ、１０ｍＭのＡＴＰ溶液の０．１５ｍＬ、１０ｍＭのＮＡＤＰ＋溶液の０．１５ｍＬ、及び５００Ｕｎｉｔ／ｍＬのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ溶液の０．０１ｍＬを順次添加し、混合し、調製した反応液に、約３Ｕｎｉｔ／ｍＬとなるようにした「ＡＴＰとグルコースからＡＤＰとグルコース−６−リン酸を生成する反応を触媒する酵素」の溶液の０．０２ｍＬを添加し、２５℃で反応を行わせ、波長３４０ｎｍ、光路長１ｃｍで、吸光度の測定を行う。
そして、次の計算式により、この「ＡＴＰとグルコースからＡＤＰとグルコース−６−リン酸を生成する反応を触媒する酵素」の活性値を算出する。
活性値〔Ｕｎｉｔ／ｍＬ〕＝（ΔＡ／ｍｉｎ×Ｖ×Ｄ）÷（６．２×ｄ×ｖ）
なお、ここで、「ΔＡ／ｍｉｎ」は測定により得られた３４０ｎｍにおける１分間当たりの吸光度変化量であって、「ＡＴＰとグルコースからＡＤＰとグルコース−６−リン酸を生成する反応を触媒する酵素」を存在させないブランク反応の吸光度変化量を差し引き補正を行なったもの、「Ｖ」は最終液量（３．０３ｍＬ）、「Ｄ」は酵素希釈率、「６．２」の値は３４０ｎｍにおけるＮＡＤＰＨのミリモル分子吸光係数（Ｌ×ｍｍｏｌ−１×ｃｍ−１）、「ｄ」は光路長（１ｃｍ）及び「ｖ」は酵素液量（０．０２ｍＬ）を表す。
４．グルコース−６−リン酸とＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋から６−ホスホグルコン酸とＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨとＨ＋を生成する反応を触媒する酵素
本発明において、第１試薬は、「グルコース−６−リン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）〔ＮＡＤ＋〕又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）〔ＮＡＤＰ＋〕から６−ホスホグルコン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）〔ＮＡＤＨ〕又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）〔ＮＡＤＰＨ〕とＨ＋を生成する反応を触媒する酵素」を含む。
なお、この「グルコース−６−リン酸とＮＡＤ（Ｐ）＋から６−ホスホグルコン酸とＮＡＤ（Ｐ）ＨとＨ＋を生成する反応を触媒する酵素」を、第１試薬と第２試薬の両方に含ませても良い。第１試薬と第２試薬の両方に含ませることにより、試薬の安定性が更に改善されるので好ましい。
この「グルコース−６−リン酸とＮＡＤ（Ｐ）＋から６−ホスホグルコン酸とＮＡＤ（Ｐ）ＨとＨ＋を生成する反応を触媒する酵素」は、特に限定はなく、グルコース−６−リン酸とＮＡＤ（Ｐ）＋から６−ホスホグルコン酸とＮＡＤ（Ｐ）ＨとＨ＋を生成する反応を触媒することができる酵素であれば良く、その由来についても限定はなく、例えば、ＹｅａｓｔやＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓなどの微生物、動物若しくは植物などに由来するもの、又は遺伝子組み換え技術などにより調製したもの等を挙げることができる。
この「グルコース−６−リン酸とＮＡＤ（Ｐ）＋から６−ホスホグルコン酸とＮＡＤ（Ｐ）ＨとＨ＋を生成する反応を触媒する酵素」として、例えば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ等を挙げることができる。
この「グルコース−６−リン酸とＮＡＤ（Ｐ）＋から６−ホスホグルコン酸とＮＡＤ（Ｐ）ＨとＨ＋を生成する反応を触媒する酵素」の活性値であるが、試料と第１試薬と第２試薬が混合された最終反応液において、１６０Ｕｎｉｔ／Ｌ以上であることが好ましい。
なお、この最終反応液における活性値に上限は特にはないが、コストのことを考えると４，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ迄で十分である。
また、この最終反応液における活性値は、より好ましくは４００Ｕｎｉｔ／Ｌ〜２，４００Ｕｎｉｔ／Ｌであり、特に好ましくは８００Ｕｎｉｔ／Ｌ〜１，６００Ｕｎｉｔ／Ｌである。
「グルコース−６−リン酸とＮＡＤ（Ｐ）＋から６−ホスホグルコン酸とＮＡＤ（Ｐ）ＨとＨ＋を生成する反応を触媒する酵素」を、第１試薬にのみ含ませる場合、この酵素の第１試薬における活性値は、前記のダブルカイネティック法を適用したときに試料に含まれるアデニル酸キナーゼの活性値の測定が可能な活性値であることが好ましく、例えば、２００Ｕｎｉｔ／Ｌ〜５，０００Ｕｎｉｔ／Ｌであることが好ましく、５００Ｕｎｉｔ／Ｌ〜３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌであることがより好ましく、１，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ〜２，０００Ｕｎｉｔ／Ｌであることが特に好ましい。
また、「グルコース−６−リン酸とＮＡＤ（Ｐ）＋から６−ホスホグルコン酸とＮＡＤ（Ｐ）ＨとＨ＋を生成する反応を触媒する酵素」を、第１試薬と第２試薬の両方に含ませることにより、試薬の安定性が更に改善されるが、この場合、第１試薬が含む「グルコース−６−リン酸とＮＡＤ（Ｐ）＋から６−ホスホグルコン酸とＮＡＤ（Ｐ）ＨとＨ＋を生成する反応を触媒する酵素」の活性値は、２００Ｕｎｉｔ／Ｌ〜５，０００Ｕｎｉｔ／Ｌであることが好ましく、５００Ｕｎｉｔ／Ｌ〜３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌであることがより好ましく、１，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ〜２，０００Ｕｎｉｔ／Ｌであることが特に好ましい。
また、この場合、第２試薬が含む「グルコース−６−リン酸とＮＡＤ（Ｐ）＋から６−ホスホグルコン酸とＮＡＤ（Ｐ）ＨとＨ＋を生成する反応を触媒する酵素」の活性値は、５００Ｕｎｉｔ／Ｌ以上であることが好ましく、８００Ｕｎｉｔ／Ｌ以上であることがより好ましく、１，６００Ｕｎｉｔ／Ｌ以上であることが特に好ましい。なお、この第２試薬における活性値に上限は特にはないが、コストのことを考えると１２，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ迄で十分である。
なお、前記した「グルコース−６−リン酸とＮＡＤ（Ｐ）＋から６−ホスホグルコン酸とＮＡＤ（Ｐ）ＨとＨ＋を生成する反応を触媒する酵素」の活性値であるが、酵素の活性値はその酵素活性測定方法の種々の条件により得られる活性値が異なることが知られている。
前記又は後記の「グルコース−６−リン酸とＮＡＤ（Ｐ）＋から６−ホスホグルコン酸とＮＡＤ（Ｐ）ＨとＨ＋を生成する反応を触媒する酵素」の活性値は、オリエンタル酵母工業社のカタログ（２００６年６月改訂版）の「グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ〔Ｇ−６−ＰＤＨ〕ｆｒｏｍ  Ｙｅａｓｔ」（第２４頁）の「分析方法」に記載された酵素活性測定方法により求めた活性値である。
すなわち、０．１Ｍのグリシルグリシン緩衝液（ｐＨ８．５）の２．５０ｍＬ、０．２Ｍの塩化マグネシウム溶液の０．３０ｍＬ、１０ｍＭのグルコース−６−リン酸の０．１５ｍＬ、及び１０ｍＭのＮＡＤＰ＋溶液の０．１５ｍＬを順次添加し、混合し、調製した反応液に、約３Ｕｎｉｔ／ｍＬとなるようにした「グルコース−６−リン酸とＮＡＤ（Ｐ）＋から６−ホスホグルコン酸とＮＡＤ（Ｐ）ＨとＨ＋を生成する反応を触媒する酵素」の溶液の０．０２ｍＬを添加し、２５℃で反応を行わせ、波長３４０ｎｍ、光路長１ｃｍで、吸光度の測定を行う。
そして、次の計算式により、この「グルコース−６−リン酸とＮＡＤ（Ｐ）＋から６−ホスホグルコン酸とＮＡＤ（Ｐ）ＨとＨ＋を生成する反応を触媒する酵素」の活性値を算出する。
活性値〔Ｕｎｉｔ／ｍＬ〕＝（ΔＡ／ｍｉｎ×Ｖ×Ｄ）÷（６．２×ｄ×ｖ）
なお、ここで、「ΔＡ／ｍｉｎ」は測定により得られた３４０ｎｍにおける１分間当たりの吸光度変化量であって、「グルコース−６−リン酸とＮＡＤ（Ｐ）＋から６−ホスホグルコン酸とＮＡＤ（Ｐ）ＨとＨ＋を生成する反応を触媒する酵素」を存在させないブランク反応の吸光度変化量を差し引き補正を行なったもの、「Ｖ」は最終液量（３．１２ｍＬ）、「Ｄ」は酵素希釈率、「６．２」の値は３４０ｎｍにおけるＮＡＤＰＨのミリモル分子吸光係数（Ｌ×ｍｍｏｌ−１×ｃｍ−１）、「ｄ」は光路長（１ｃｍ）及び「ｖ」は酵素液量（０．０２ｍＬ）を表す。
５．ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋
本発明において、第１試薬は、「β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）〔ＮＡＤ＋〕若しくはβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）〔ＮＡＤＰ＋〕又はこれらの塩」を含む。
なお、第２試薬にも、この「ＮＡＤ＋若しくはＮＡＤＰ＋又はこれらの塩」を含ませても良いが、このことは必須ではない。
この「ＮＡＤ＋若しくはＮＡＤＰ＋又はこれらの塩」の「これらの塩」としては、特に限定はなく、例えば、リチウム、ナトリウム若しくはカリウムなどのアルカリ金属塩、又はマグネシウム若しくはカルシウムなどのアルカリ土類金属塩等を挙げることができる。
この「ＮＡＤ＋若しくはＮＡＤＰ＋又はこれらの塩」の濃度であるが、試料と第１試薬と第２試薬が混合された最終反応液において、０．９ｍＭ以上であることが好ましい。
なお、この最終反応液における濃度に上限は特にはないが、コストのことを考えると１５ｍＭ迄で十分である。
また、この最終反応液における濃度は、より好ましくは１．４ｍＭ〜１０ｍＭであり、特に好ましくは２ｍＭ〜４ｍＭである。
例えば、第１試薬が含む「ＮＡＤ＋若しくはＮＡＤＰ＋又はこれらの塩」の濃度は、１．１３ｍＭ〜１８．７５ｍＭであることが好ましく、１．７５ｍＭ〜１２．５ｍＭであることがより好ましく、２．５ｍＭ〜５ｍＭであることが特に好ましい。
なお、本発明においては、ＮＡＤ＋に替えてβ−チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）若しくはこの塩を用いてもよく、ＮＡＤＨに替えてβ−チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）若しくはこの塩を用いてもよく、ＮＡＤＰ＋に替えてβ−チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）若しくはこの塩を用いてもよく、又はＮＡＤＰＨに替えてβ−チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）若しくはこの塩を用いてもよい。〔以下、β−チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）又はこの塩を「チオＮＡＤ＋」ということがあり、β−チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）又はこの塩を「チオＮＡＤＰ＋」ということがあり、この「チオＮＡＤ＋」と「チオＮＡＤＰ＋」を総称して「チオＮＡＤ（Ｐ）＋」ということがあり、そして、β−チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）又はこの塩を「チオＮＡＤＨ」ということがあり、β−チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）又はこの塩を「チオＮＡＤＰＨ」ということがあり、この「チオＮＡＤＨ」と「チオＮＡＤＰＨ」を総称して「チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈ」ということがある。〕
そして、本発明においては、「グルコース−６−リン酸とＮＡＤ（Ｐ）＋から６−ホスホグルコン酸とＮＡＤ（Ｐ）ＨとＨ＋を生成する反応を触媒する酵素」及び６−ホスホグルコン酸脱水素酵素のいずれにおいても、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋に替えてチオＮＡＤ＋又はチオＮＡＤＰ＋をそれぞれ用いることができ、この場合、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨに替わって、これらの酵素が触媒する反応によりチオＮＡＤＨ又はチオＮＡＤＰＨがそれぞれ生成する。
６．クレアチンリン酸又はこの塩
本発明において、第２試薬は、「クレアチンリン酸又はこの塩」を含む。
この「クレアチンリン酸又はこの塩」の「この塩」としては、特に限定はなく、例えば、リチウム、ナトリウム若しくはカリウムなどのアルカリ金属塩、又はマグネシウム若しくはカルシウムなどのアルカリ土類金属塩等を挙げることができる。
この「クレアチンリン酸又はこの塩」の濃度であるが、試料と第１試薬と第２試薬が混合された最終反応液において、１０ｍＭ以上であることが好ましい。
なお、この最終反応液における濃度に上限は特にはないが、コストのことを考えると１００ｍＭ迄で十分である。
また、この最終反応液における濃度は、より好ましくは１５ｍＭ〜７５ｍＭであり、特に好ましくは２５ｍＭ〜５０ｍＭである。
例えば、「クレアチンリン酸又はこの塩」を第２試薬にのみ含ませる場合、この第２試薬における濃度は、５０ｍＭ〜５００ｍＭであることが好ましく、７５ｍＭ〜３７５ｍＭであることがより好ましく、１２５ｍＭ〜２５０ｍＭであることが特に好ましい。
７．チオール化合物
本発明においては、第１試薬は、チオール化合物を含む。
なお、第２試薬にも、このチオール化合物を含ませても良いが、このことは必須ではない。
このチオール化合物としては、ＳＨ基を有する化合物であれば良く、他に特に限定はなく、例えば、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、チオグリセロール、ジチオスレイトール、還元型グルタチオン、システイン、ジチオエリスリトール、臭化２−アミノエチルイソチオウロニウム、２−チオグルコース、チオグリコール酸、２−メルカプトエタノール、Ｎ−グアニル−Ｌ−システイン、メルカプト酢酸、メルカプトコハク酸、２−メルカプトエタンスルホン酸、又はシステアミン等を挙げることができる。
このチオール化合物としては、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインが好ましい。
このチオール化合物の濃度であるが、試料と第１試薬と第２試薬が混合された最終反応液において、１．６ｍＭ以上であることが好ましい。
なお、この最終反応液における濃度に上限は特にはないが、コストのことを考えると８０ｍＭ迄で十分である。
また、この最終反応液における濃度は、より好ましくは４ｍＭ〜６４ｍＭであり、特に好ましくは８ｍＭ〜４８ｍＭである。
例えば、チオール化合物を第１試薬にのみ含ませる場合、この第１試薬における濃度は、２ｍＭ〜１００ｍＭであることが好ましく、５ｍＭ〜８０ｍＭであることがより好ましく、１０ｍＭ〜６０ｍＭであることが特に好ましい。
８．還元物質
本発明においては、還元物質を、第１試薬、第２試薬、又は第１試薬と第２試薬の両方、に含ませることが好ましい。
前記のチオール化合物は酸化され易く不安定であり、チオール化合物の酸化物はクレアチンキナーゼの活性を阻害するとの報告もあり、クレアチンキナーゼの活性の維持、更にはクレアチンキナーゼの活性化のためには、これと共存（接触）するチオール化合物を還元状態に保つ必要がある。
これに対し、還元物質をチオール化合物に接触させることにより、チオール化合物が酸化されるのを抑制し還元状態に保ち、又は酸化されたチオール化合物を還元状態に戻すことができるので好ましい。
なお、この還元物質は、第１試薬及び第２試薬の内、チオール化合物と同じ試薬に含ませ、この試薬中でチオール化合物と還元物質とを接触させて、チオール化合物の還元状態を維持するようにしても良い。
また、この還元物質を、第１試薬及び第２試薬の内、チオール化合物とは別の試薬に含ませ、最終反応液（試料と第１試薬と第２試薬の混合液）においてチオール化合物と還元物質とを接触させて、保存中に酸化されたチオール化合物が還元状態に戻るようにしても良い。
この還元物質としては、チオール化合物と接触させることにより、このチオール化合物の還元状態を維持し、又は酸化状態となったチオール化合物を還元状態に戻すことができるものであれば、特に限定なく用いることができる。
より具体的には、この還元物質として、例えば、「硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩」等を挙げることができる。
この「硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸」としては、例えば、スルホキシル酸〔Ｈ２ＳＯ２〕、亜硫酸〔Ｈ２ＳＯ３〕、チオ亜硫酸〔Ｈ２Ｓ２Ｏ２〕、チオ硫酸〔Ｈ２Ｓ２Ｏ３〕、亜ジチオン酸〔Ｈ２Ｓ２Ｏ４〕、二亜硫酸〔Ｈ２Ｓ２Ｏ５〕、ジチオン酸〔Ｈ２Ｓ２Ｏ６〕、二硫酸〔Ｈ２Ｓ２Ｏ７〕、又はポリチオン酸〔Ｈ２ＳｘＯ６（ｘ＝３、４‥‥）〕等を挙げることができる。
また、この「硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩」の「これらの塩」とは、前記の「硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸」のプロトンとして解離しうる水素の一部又は全部がアルカリ金属、アルカリ土類金属、その他の金属又は塩基性基で置換された化合物のことである。
例えば、このアルカリ金属としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム又はセシウム等を挙げることができ、アルカリ土類金属としては、ベリリウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム又はバリウム等を挙げることができ、そして塩基性基としては、アンモニウム基等を挙げることができる。
この還元物質の濃度であるが、試料と第１試薬と第２試薬が混合された最終反応液において、０．０００８％（ｗ／ｖ）以上であることが好ましい。
なお、この最終反応液における濃度に上限は特にはないが、コストのことを考えると０．８％（ｗ／ｖ）迄で十分である。
また、この最終反応液における濃度は、より好ましくは０．００４％（ｗ／ｖ）〜０．４％（ｗ／ｖ）であり、特に好ましくは０．００８％（ｗ／ｖ）〜０．１６％（ｗ／ｖ）である。
例えば、還元物質を第１試薬にのみ含ませる場合、この第１試薬における濃度は、０．００１％（ｗ／ｖ）〜１％（ｗ／ｖ）であることが好ましく、０．００５％（ｗ／ｖ）〜０．５％（ｗ／ｖ）であることがより好ましく、０．０１％（ｗ／ｖ）〜０．２％（ｗ／ｖ）であることが特に好ましい。
また、例えば、還元物質を第１試薬と第２試薬の両方に含ませる場合、第１試薬が含む還元物質の濃度は、０．０００８％（ｗ／ｖ）〜０．８％（ｗ／ｖ）であることが好ましく、０．００４％（ｗ／ｖ）〜０．４％（ｗ／ｖ）であることがより好ましく、０．００８％（ｗ／ｖ）〜０．１６％（ｗ／ｖ）であることが特に好ましい。
また、この場合、第２試薬が含む還元物質の濃度は、０．０００８％（ｗ／ｖ）〜０．８％（ｗ／ｖ）であることが好ましく、０．００４％（ｗ／ｖ）〜０．４％（ｗ／ｖ）であることがより好ましく、０．００８％（ｗ／ｖ）〜０．１６％（ｗ／ｖ）であることが特に好ましい。
そして、例えば、還元物質を第２試薬にのみ含ませる場合、この第２試薬における濃度は、０．００４％（ｗ／ｖ）〜４％（ｗ／ｖ）であることが好ましく、０．０２％（ｗ／ｖ）〜２％（ｗ／ｖ）であることがより好ましく、０．０４％（ｗ／ｖ）〜０．８％（ｗ／ｖ）であることが特に好ましい。
９．マグネシウムイオン
本発明においては、マグネシウムイオンを、第１試薬、第２試薬、又は第１試薬と第２試薬の両方、に含ませることができる。
前記の「ＡＴＰとグルコースからＡＤＰとグルコース−６−リン酸を生成する反応を触媒する酵素」の反応のため、マグネシウムイオンを含ませることが好ましい。
なお、このマグネシウムイオンは、第１試薬、又は第１試薬と第２試薬の両方に含ませることがより好ましく、第１試薬に含ませることが特に好ましい。
このマグネシウムイオンとしては、特に限定はなく、例えば、マグネシウムイオンを含む塩等を挙げることができる。
このマグネシウムイオンを含む塩についても、特に限定はなく、ハロゲンイオン又は有機酸の酸基等の酸基と、マグネシウムイオンとからなる化合物であればよい。
このマグネシウムイオンを含む塩としては、例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、又は硫酸マグネシウム等を挙げることができる。
このマグネシウムイオンを含む塩としては、酢酸マグネシウムが好ましい。
マグネシウムイオン（又はマグネシウムイオンを含む塩）の濃度であるが、試料と第１試薬と第２試薬が混合された最終反応液において、０．８ｍＭ以上であることが好ましい。
なお、この最終反応液における濃度に上限は特にはないが、コストのことを考えると４０ｍＭ迄で十分である。
また、この最終反応液における濃度は、より好ましくは４ｍＭ〜２４ｍＭであり、特に好ましくは８ｍＭ〜１６ｍＭである。
例えば、マグネシウムイオン（又はマグネシウムイオンを含む塩）を第１試薬にのみ含ませる場合、この第１試薬における濃度は、１ｍＭ〜５０ｍＭであることが好ましく、５ｍＭ〜３０ｍＭであることがより好ましく、１０ｍＭ〜２０ｍＭであることが特に好ましい。
１０．キレート剤
本発明においては、「キレート剤又はこの塩」を、第１試薬、第２試薬、又は第１試薬と第２試薬の両方、に含ませることができる。
Ｃａ２＋、Ｆｅ３＋又はＣｕ２＋等の金属イオンは、クレアチンキナーゼ活性を競合的に阻害するが、これに対し、「キレート剤又はこの塩」を存在させることにより、この金属イオンによるクレアチンキナーゼ活性の阻害を抑制し、また、前記のチオール化合物を安定化することができるので、「キレート剤又はこの塩」を含ませることが好ましい。
なお、この「キレート剤又はこの塩」は、第１試薬、又は第１試薬と第２試薬の両方に含ませることがより好ましく、第１試薬に含ませることが特に好ましい。
この「キレート剤又はこの塩」としては、特に限定はなく、金属イオンと結合することができるものであればよい。
この「キレート剤又はこの塩」としては、例えば、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸〔ＥＤＴＡ〕、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノフェニル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸〔ＢＡＰＴＡ〕、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン〔Ｂｉｃｉｎｅ〕、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸〔ＣｙＤＴＡ〕、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−五酢酸〔ＤＴＰＡ〕、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二プロピオン酸〔ＥＤＤＰ〕、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸〔ＥＤＴＡ−ＯＨ〕、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸〔ＧＥＤＴＡ（ＥＧＴＡ）〕、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸〔ＨＩＤＡ〕、イミノジ酢酸〔ＩＤＡ〕、ニトリロ三酢酸〔ＮＴＡ〕、ニトリロトリ（メチルホスホン酸）〔ＮＴＰＯ〕、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（２−ピリジルメチル）エチレンジアミン〔ＴＰＥＮ〕、若しくはトリエチレンテトラミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’，Ｎ’’’−六酢酸〔ＴＴＨＡ〕、又はこれらの塩等を挙げることができる。
この「キレート剤又はこの塩」としては、ＥＤＴＡ又はＥＤＴＡ２ナトリウム塩が好ましい。
「キレート剤又はこの塩」の濃度であるが、試料と第１試薬と第２試薬が混合された最終反応液において、０．０８ｍＭ以上であることが好ましい。
なお、この最終反応液における濃度に上限は特にはないが、コストのことを考えると８ｍＭ迄で十分である。
また、この最終反応液における濃度は、より好ましくは０．４ｍＭ〜３．２ｍＭであり、特に好ましくは０．８ｍＭ〜２．４ｍＭである。
例えば、「キレート剤又はこの塩」を第１試薬にのみ含ませる場合、この第１試薬における濃度は、０．１ｍＭ〜１０ｍＭであることが好ましく、０．５ｍＭ〜４ｍＭであることがより好ましく、１ｍＭ〜３ｍＭであることが特に好ましい。
１１．アデニル酸キナーゼ阻害剤
本発明においては、アデニル酸キナーゼの阻害剤を、第１試薬、第２試薬、又は第１試薬と第２試薬の両方、に含ませることができる。
前記の通り、試料中にアデニル酸キナーゼが存在すると、クレアチンキナーゼ活性の測定値に正誤差が生じるが、アデニル酸キナーゼの阻害剤の存在により、クレアチンキナーゼ活性測定におけるアデニル酸キナーゼに由来する正誤差を抑制できるので、アデニル酸キナーゼの阻害剤を試薬に含ませることが好ましい。
なお、このアデニル酸キナーゼの阻害剤は、第１試薬、又は第１試薬と第２試薬の両方に含ませることがより好ましく、第１試薬に含ませることが特に好ましい。
このアデニル酸キナーゼの阻害剤としては、特に限定はなく、アデニル酸キナーゼの活性を阻害することができる能力を持つものであればよい。
このアデニル酸キナーゼの阻害剤としては、例えば、アデノシン５’−一リン酸若しくはこの塩（ＡＭＰ）、Ｐ１，Ｐ５−ジアデノシン−５’−ペンタリン酸（ＡＰ５Ａ）、ジアデノシン−５’−テトラリン酸（ＡＰ４Ａ）若しくはジアデノシン−５’−ヘキサリン酸（ＡＰ６Ａ）などのジアデノシンポリリン酸又はこの塩、あるいはフッ素イオン若しくはフッ化物等を挙げることができる。
このアデニル酸キナーゼの阻害剤の濃度であるが、第１試薬において、１μＭ〜１００μＭであることが好ましい。
また、このアデニル酸キナーゼの阻害剤の第２試薬における濃度は、ダブルカイネティック法により測定を行ったときに、アデニル酸キナーゼの活性に基づく誤差を有効に補正することができる濃度であれば良い。
１２．ｐＨ
（１）最終反応液のｐＨ
本発明において、試料と第１試薬と第２試薬が混合された最終反応液のｐＨは、ｐＨ６．０（３０℃）〜ｐＨ７．２（３０℃）であることが好ましく、ｐＨ６．４（３０℃）〜ｐＨ６．８（３０℃）であることがより好ましく、ｐＨ６．６（３０℃）〜ｐＨ６．８（３０℃）であることが特に好ましい。
（２）第１試薬のｐＨ
本発明において、第１試薬のｐＨは、ｐＨ５．６（３０℃）〜ｐＨ６．６（３０℃）にあることが好ましく、ｐＨ６．０（３０℃）〜ｐＨ６．６（３０℃）にあることがより好ましく、ｐＨ６．３（３０℃）〜ｐＨ６．６（３０℃）にあることが特に好ましい。
（３）第２試薬のｐＨ
本発明において、第２試薬のｐＨは、試料及び第１試薬と第２試薬が混合された際に、前記（１）の「最終反応液のｐＨ」に記載したｐＨとなるようなｐＨであれば良い。
なお、第２試薬に含まれるクレアチンリン酸又はこの塩の安定性を考えると、第２試薬のｐＨは、ｐＨ７．０（３０℃）〜ｐＨ１１．０（３０℃）にあることが好ましく、ｐＨ７．５（３０℃）〜ｐＨ１０．０（３０℃）にあることがより好ましく、ｐＨ８．０（３０℃）〜ｐＨ９．０（３０℃）にあることが特に好ましい。
１３．緩衝剤
本発明においては、緩衝剤を、第１試薬、第２試薬、又は第１試薬と第２試薬の両方、に含ませることができる。
前記の「１２．ｐＨ」において記載したｐＨに、最終反応液、第１試薬、及び第２試薬をそれぞれ設定することができるように、これらのｐＨ域において緩衝能を有する緩衝剤を、緩衝能を有する濃度において、第１試薬、第２試薬に含ませることが好ましい。
このような緩衝剤としては、例えば、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、リン酸、リン酸塩、ホウ酸、ホウ酸塩、グリシン、グリシルグリシン、イミダゾール、又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〔Ｔｒｉｓ〕等を挙げることができる。
この緩衝剤としては、イミダゾールが好ましい。
１４．他の成分
本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬には、前記の成分の他に、以下の成分を含ませることができる。
（１）６−ホスホグルコノラクトナーゼ
本発明においては、６−ホスホグルコノラクトナーゼを、第１試薬、第２試薬、又は第１試薬と第２試薬の両方、に含ませることができる。
６−ホスホグルコノラクトナーゼを含ませることにより、測定範囲を拡げ、直線性を改善することができるので、好ましい。
なお、この６−ホスホグルコノラクトナーゼは、第１試薬、又は第１試薬と第２試薬の両方に含ませることがより好ましく、第１試薬に含ませることが特に好ましい。
この６−ホスホグルコノラクトナーゼは、特に限定はなく、６−ホスホグルコノラクトンを６−ホスホグルコン酸に加水分解する反応を触媒することができる酵素であれば良く、その由来についても限定はなく、例えば、ＹｅａｓｔやＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓなどの微生物、動物若しくは植物などに由来するもの、又は遺伝子組み換え技術などにより調製したもの等を挙げることができる。
この６−ホスホグルコノラクトナーゼの活性値であるが、試料と第１試薬と第２試薬が混合された最終反応液において、８Ｕｎｉｔ／Ｌ以上であることが好ましい。
なお、この最終反応液における活性値に上限は特にはないが、コストのことを考えると４，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ迄で十分である。
また、この最終反応液における活性値は、より好ましくは３２０Ｕｎｉｔ／Ｌ〜２，０００Ｕｎｉｔ／Ｌであり、特に好ましくは４８０Ｕｎｉｔ／Ｌ〜８００Ｕｎｉｔ／Ｌである。
例えば、第１試薬が含む６−ホスホグルコノラクトナーゼの活性値は、１０Ｕｎｉｔ／Ｌ〜５，０００Ｕｎｉｔ／Ｌであることが好ましく、４００Ｕｎｉｔ／Ｌ〜２，５００Ｕｎｉｔ／Ｌであることがより好ましく、６００Ｕｎｉｔ／Ｌ〜１，０００Ｕｎｉｔ／Ｌであることが特に好ましい。
なお、前記した６−ホスホグルコノラクトナーゼの活性値であるが、酵素の活性値はその酵素活性測定方法の種々の条件により得られる活性値が異なることが知られている。
前記又は後記の６−ホスホグルコノラクトナーゼの活性値は、ロシュ・ダイアグノスティック社が定めた酵素活性測定方法により求めた活性値である。
すなわち、まず、試料測定のため、３０ｍＭの塩化ナトリウム、及び２ｍＭの塩化マグネシウムを含む０．１ＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）の０．８５５ｍＬ、１２．７ｍＭのＮＡＤＰ水溶液の０．０５０ｍＬ、５００Ｕｎｉｔ／ｍＬのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ水溶液の０．０２０ｍＬ、及び２００Ｕｎｉｔ／ｍＬの６−ホスホグルコン酸脱水素酵素水溶液の０．０１０ｍＬを順次添加し、混合し、調製した混合液を２５℃で静置した後、この混合液に１０ｍＭのグルコース−６−リン酸水溶液の０．０１５ｍＬを添加し、混合し、調製した反応液を２５℃で正確に２分間静置した後、この反応液にその６−ホスホグルコノラクトナーゼの活性値が約８０〜２００ｍＵｎｉｔ／ｍＬとなるように希釈した試料の０．０５０ｍＬを添加し、混合し、２５℃で反応を行わせ、波長３４０ｎｍ（又は波長３６５ｎｍ）、光路長１ｃｍで、吸光度変化の測定をおよそ１０分間行い、１分間当りの吸光度変化量〔ΔＡ／ｍｉｎ（ｓａｍｐｌｅ）〕を求める。
また、試薬盲検（試薬ブランク）測定のため、３０ｍＭの塩化ナトリウム、及び２ｍＭの塩化マグネシウムを含む０．１ＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）の０．９０５ｍＬ、１２．７ｍＭのＮＡＤＰ水溶液の０．０５０ｍＬ、５００Ｕｎｉｔ／ｍＬのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ水溶液の０．０２０ｍＬ、及び２００Ｕｎｉｔ／ｍＬの６−ホスホグルコン酸脱水素酵素水溶液の０．０１０ｍＬを順次添加し、混合し、調製した混合液を２５℃で静置した後、この混合液に１０ｍＭのグルコース−６−リン酸水溶液の０．０１５ｍＬを添加し、混合し、調製した反応液を２５℃で正確に２分間静置した後、この反応液を２５℃において、波長３４０ｎｍ（又は波長３６５ｎｍ）、光路長１ｃｍで、吸光度変化の測定をおよそ１０分間行い、１分間当りの吸光度変化量〔ΔＡ／ｍｉｎ（ｂｌａｎｋ）〕を求める。
次に、以下の計算式により、この６−ホスホグルコノラクトナーゼの活性値を算出する。
活性値〔Ｕｎｉｔ／ｍＬ〕＝１．０÷（ε×０．０５×１．０）×ΔＡ／ｍｉｎ
なお、ここで、「ΔＡ／ｍｉｎ」は前記の測定で求めた「ΔＡ／ｍｉｎ（ｓａｍｐｌｅ）」から「ΔＡ／ｍｉｎ（ｂｌａｎｋ）」を差し引いたもの（ΔＡ／ｍｉｎ（ｓａｍｐｌｅ）−ΔＡ／ｍｉｎ（ｂｌａｎｋ））であり、また「ε」は波長３４０ｎｍにおいては「ε３４０＝６．３（Ｌ・ｍＭ−１・ｃｍ−１）」であり、波長３６５ｎｍにおいては「ε３６５＝３．５（Ｌ・ｍＭ−１・ｃｍ−１）」である。
（２）６−ホスホグルコン酸脱水素酵素
本発明においては、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素を、第１試薬、第２試薬、又は第１試薬と第２試薬の両方、に含ませることができる。
６−ホスホグルコン酸脱水素酵素を含ませることにより、前記の「グルコース−６−リン酸とＮＡＤ（Ｐ）＋から６−ホスホグルコン酸とＮＡＤ（Ｐ）ＨとＨ＋を生成する反応を触媒する酵素」の反応により生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈに加え、この６−ホスホグルコン酸脱水素酵素による反応からもＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成させることができ、よって、クレアチンキナーゼによるクレアチンリン酸とＡＤＰからクレアチンとＡＴＰを生成する一回の反応から、２分子のＮＡＤ（Ｐ）Ｈを得ることができ、その結果クレアチンキナーゼ活性値を高感度に測定することができるので好ましい。
この６−ホスホグルコン酸脱水素酵素は、特に限定はなく、６−ホスホグルコン酸とＮＡＤ（Ｐ）＋からＤ−リブロース−５−リン酸とＮＡＤ（Ｐ）ＨとＨ＋を生成する反応を触媒することができる酵素であれば良く、その由来についても限定はなく、例えば、微生物、動物若しくは植物などに由来するもの、又は遺伝子組み換え技術などにより調製したもの等を挙げることができる。
（３）抗ＣＫ−Ｍサブユニット抗体、抗ＣＫ−Ｂサブユニット抗体
本発明においては、クレアチンキナーゼのＭ型サブユニットに対する抗体である抗ＣＫ−Ｍサブユニット抗体、又はクレアチンキナーゼのＢ型サブユニットに対する抗体である抗ＣＫ−Ｂサブユニット抗体を、第１試薬、第２試薬、又は第１試薬と第２試薬の両方、に含ませることにより、クレアチンキナーゼのＭＢ型アイソザイムの分別測定、クレアチンキナーゼのＭＭ型アイソザイムの分別測定、又はクレアチンキナーゼのＢＢ型アイソザイムの分別測定を行うことができる。
この抗ＣＫ−Ｍサブユニット抗体は、特に限定はなく、クレアチンキナーゼのＭ型サブユニットに結合し、このＭ型サブユニットの活性を阻害することができるものであれば良い。
また、抗ＣＫ−Ｂサブユニット抗体は、特に限定はなく、クレアチンキナーゼのＢ型サブユニットに結合し、このＢ型サブユニットの活性を阻害することができるものであれば良い。
これらの抗ＣＫ−Ｍサブユニット抗体及び抗ＣＫ−Ｂサブユニット抗体はそれぞれ、ポリクローナル抗体でも、モノクローナル抗体でも、又は抗血清でもよく、その由来についても特に限定はない。
また、これらの抗体はそれぞれ、抗体の断片〔Ｆａｂ若しくはＦ（ａｂ’）２など〕、若しくは一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）であってもよく、又は遺伝子組み換え技術などにより免疫原（ＣＫ−Ｍサブユニット、又はＣＫ−Ｂサブユニット）を免疫する動物とは異なる動物種のアミノ酸配列に変化させた抗体（キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト化抗体など）等であっても良い。
（４）その他の成分
本発明においては、更に、他の酵素；他の酵素の基質；他の補酵素；他のイオン若しくはこれを含む塩；アルブミン若しくはカゼインなどのタンパク質；非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤若しくは陽イオン性界面活性剤などの界面活性化物質；アジ化ナトリウム、抗生物質若しくは合成抗菌剤などの防腐剤；他の糖類若しくは高分子化合物などの安定化剤；活性化剤；アスコルビン酸オキシダーゼなどの試料中に含まれる測定妨害物質の消去若しくは影響の抑制に関わる物質；又は他の試薬成分等を、適宜必要に応じて、第１試薬、第２試薬、又は第１試薬及び第２試薬に、含ませることができる。
なお、これらを含ませる際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（ｗ／ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（ｗ／ｖ）が好ましい。
また、前記の各界面活性剤の具体例としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤；酢酸ベタインなどの両性界面活性剤；又は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
１５．液状試薬
本発明においては、第１試薬、第２試薬、又は第１試薬と第２試薬の両方が、溶液よりなる試薬、すなわち液状試薬である場合に好適である。
特に、第１試薬及び第２試薬が液状試薬である場合に好適である。
１６．３試薬以上よりなるクレアチンキナーゼ活性測定試薬
以上、第１試薬及び第２試薬よりなるクレアチンキナーゼ活性測定試薬について記載したが、本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬は、前記の第１試薬、前記の第２試薬、及び他の試薬（一つ又は二つ以上の試薬）よりなるものであっても良い。つまり、これらの試薬よりなる測定試薬キットであって良い。
すなわち、本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬は、「０．５ｍＭ〜１０ｍＭの濃度のグルコースを含む第１試薬」、「グルコースを含まないか又は１０ｍＭ以下の濃度のグルコースを含む第２試薬」、及び「一つ又は二つ以上の他の試薬」よりなるものであっても良い。
そして、本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬においては、前記の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１及び１３の各項、並びに１４の（１）〜（４）の各項に記載したそれぞれの試薬成分を、この「０．５ｍＭ〜１０ｍＭの濃度のグルコースを含む第１試薬」、「グルコースを含まないか又は１０ｍＭ以下の濃度のグルコースを含む第２試薬」、及び／又は「一つ又は二つ以上の他の試薬」に含ませたものであっても良い。
１７．その他の試薬との組合せ
なお、本発明においては、クレアチンキナーゼ活性測定試薬は、そのもの単独にて、販売し、又は試料中のクレアチンキナーゼ活性値の測定に使用することができる。
また、本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬は、前記した試薬以外のその他の試薬と組み合わせて、販売し、又は試料中のクレアチンキナーゼ活性値の測定に使用することもできる。
前記した試薬以外のその他の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、標識物質を含有する試薬、校正（キャリブレーション）を行うための物質を含有する試薬、又は精度管理を行うための物質を含有する試薬等を挙げることができる。
ＩＩ．クレアチンキナーゼ活性測定方法
本発明において、クレアチンキナーゼ活性測定方法（ＣＫ活性測定方法）は、前記の「Ｉ．クレアチンキナーゼ活性測定試薬」に記載したクレアチンキナーゼ活性測定試薬を使用して測定を行うことができる。
以下、詳細に説明を行う。
１．本発明のクレアチンキナーゼ活性測定方法
本発明のクレアチンキナーゼ活性測定方法は、以下の発明を包含するものである。
（１）  第１試薬を試料と混合し、その後これに第２試薬を混合し、得られるシグナルの量又はシグナルの変化量を測定するクレアチンキナーゼ活性測定方法において、第１試薬が０．５ｍＭ〜１０ｍＭの濃度のグルコースを含み、かつ第２試薬がグルコースを含まないか又は１０ｍＭ以下の濃度のグルコースを含むことを特徴とする、クレアチンキナーゼ活性測定方法。
（２）  アデノシン５’−二リン酸又はこの塩、ＡＴＰとグルコースからＡＤＰとグルコース−６−リン酸を生成する反応を触媒する酵素、グルコース−６−リン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）から６−ホスホグルコン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）とＨ＋を生成する反応を触媒する酵素、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）若しくはβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）又はこれらの塩、チオール化合物、及びグルコースを含み、かつ当該グルコースの濃度が０．５ｍＭ〜１０ｍＭにある第１試薬を、試料と混合し、その後これに、クレアチンリン酸又はこの塩を含み、かつグルコースを含まないか又は１０ｍＭ以下の濃度のグルコースを含む第２試薬を混合し、得られるシグナルの量又はシグナルの変化量を測定することを特徴とする、前記（１）記載のクレアチンキナーゼ活性測定方法。
（３）  第１試薬と試料の混合液に第２試薬を混合した最終反応液における反応より得られるシグナルの量又はシグナルの変化量から、第１試薬を試料と混合した混合液における反応より得られるシグナルの量又はシグナルの変化量を差し引き、この差の値より試料中のクレアチンキナーゼ活性値を求める、前記（１）又は（２）記載のクレアチンキナーゼ活性測定方法。
（４）  第１試薬のグルコースの濃度が１．２５ｍＭ〜５ｍＭである、前記（１）〜（３）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定方法。
（５）  第１試薬のグルコースの濃度が２ｍＭ〜５ｍＭである、前記（１）〜（４）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定方法。
（６）  第２試薬がグルコースを含まないか又は５ｍＭ以下の濃度のグルコースを含むものである、前記（１）〜（５）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定方法。
（７）  第２試薬がグルコースを含まないものである、前記（１）〜（６）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定方法。
（８）  第２試薬が、グルコース−６−リン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）から６−ホスホグルコン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）とＨ＋を生成する反応を触媒する酵素を含むものである、前記（１）〜（７）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定方法。
（９）  第１試薬及び第２試薬が、グルコース−６−リン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）から６−ホスホグルコン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）とＨ＋を生成する反応を触媒する酵素を含むものである、前記（１）〜（８）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定方法。
（１０）  第１試薬の、グルコース−６−リン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）から６−ホスホグルコン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）とＨ＋を生成する反応を触媒する酵素の活性値が、２００Ｕｎｉｔ／Ｌ〜５，０００Ｕｎｉｔ／Ｌである、前記（１）〜（９）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定方法。
（１１）  第１試薬の、グルコース−６−リン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）から６−ホスホグルコン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）とＨ＋を生成する反応を触媒する酵素の活性値が、５００Ｕｎｉｔ／Ｌ〜２，０００Ｕｎｉｔ／Ｌである、前記（１）〜（１０）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定方法。
（１２）  第１試薬の、グルコース−６−リン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）から６−ホスホグルコン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）とＨ＋を生成する反応を触媒する酵素の活性値が、５００Ｕｎｉｔ／Ｌ〜１，０００Ｕｎｉｔ／Ｌである、前記（１）〜（１１）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定方法。
（１３）  第２試薬の、グルコース−６−リン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）から６−ホスホグルコン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）とＨ＋を生成する反応を触媒する酵素の活性値が、試料と第１試薬と第２試薬が混合された最終反応液において５００Ｕｎｉｔ／Ｌ以上となるように調整されている、前記（１）〜（１２）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定方法。
（１４）  第２試薬の、グルコース−６−リン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）から６−ホスホグルコン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）とＨ＋を生成する反応を触媒する酵素の活性値が、試料と第１試薬と第２試薬が混合された最終反応液において８００Ｕｎｉｔ／Ｌ以上となるように調整されている、前記（１）〜（１３）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定方法。
（１５）  第２試薬の、グルコース−６−リン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）から６−ホスホグルコン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）とＨ＋を生成する反応を触媒する酵素の活性値が、試料と第１試薬と第２試薬が混合された最終反応液において１，６００Ｕｎｉｔ／Ｌ以上となるように調整されている、前記（１）〜（１４）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定方法。
（１６）  ＡＴＰとグルコースからＡＤＰとグルコース−６−リン酸を生成する反応を触媒する酵素が、ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼである、前記（１）〜（１５）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定方法。
（１７）  グルコース−６−リン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）から６−ホスホグルコン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）とＨ＋を生成する反応を触媒する酵素が、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼである、前記（１）〜（１６）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定方法。
（１８）  第１試薬及び第２試薬が液状試薬である、前記（１）〜（１７）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定方法。
（１９）  β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）若しくはこの塩に替えてβ−チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）若しくはこの塩を用い、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）若しくはこの塩に替えてβ−チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）若しくはこの塩を用い、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）若しくはこの塩に替えてβ−チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）若しくはこの塩を用い、又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）若しくはこの塩に替えてβ−チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）若しくはこの塩を用いる、前記（１）〜（１８）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定方法。
２．試料
本発明のクレアチンキナーゼ活性測定方法における試料としては、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）を含む可能性がある試料であれば特に限定されない。
この試料としては、例えば、ヒト若しくは動物に由来する試料等を挙げることができる。
ヒト若しくは動物に由来する試料としては、特に限定されず、例えば、ヒト或いは動物の、血液、血清、血漿、尿、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水、若しくは羊水などの体液；大便などの排泄物；脳、心臓、腎臓、若しくは肝臓などの臓器；毛髪、皮膚、爪、筋肉、若しくは神経などの組織；又は細胞等を挙げることができる。
なお、本発明において測定に用いる試料は、液体である必要があるので、もし試料が液体でない場合には、抽出処理又は可溶化処理等の前処理を既知の方法に従って行い、液体試料とすればよい。
また、試料は、必要に応じて、希釈又は濃縮処理等を行ってもよい。
３．クレアチンキナーゼ活性測定の具体的方法
本発明におけるクレアチンキナーゼ活性測定方法について、以下、より具体的に記載する。
（１）段階１
まず、第１試薬と試料を混合して混合液を調製する。
なお、この第１試薬の詳細は、前記の「Ｉ．クレアチンキナーゼ活性測定試薬」に記載した通りである。
この混合する第１試薬及び試料の量は、第２試薬の量、試料中に含まれるクレアチンキナーゼの活性値、発色物質若しくは紫外部吸収物質などに由来するシグナルの感度、使用する分析装置の仕様等、又は他の条件に応じて適宜決めればよい。
なお、一般的には、試料は０．５〜５０μＬ、第１試薬は２０〜６００μＬの範囲で使用すればよい。
この混合液の調製後、インキュベートを行う。
このインキュベートの時間は、特に制限はないのであるが、通常は２０分以内であることが好ましく、１０分以内であることがより好ましく、５分以内であることが特に好ましい。
また、インキュベートする際の温度は、前記の混合液が凍結する温度より上の温度であればよい。
なお、一般的に反応時の温度は、高い程、反応速度が高くなるので好ましい。
しかし、温度が高すぎると反応に係わる酵素が変性、失活してしまうので、インキュベートする際の温度は、本発明の測定の反応に係わる酵素が変性、失活する温度未満の温度とする必要がある。
このインキュベートする際の温度は、通常は２〜７０℃であるが、２０〜３７℃が好ましく、３０〜３７℃がより好ましい。なお、前記の本発明の測定の反応に係わる酵素が耐熱性酵素であれば更に高温でも良い。
この第１試薬と試料の混合液の調製及びインキュベートにより、試料中に含まれていたクレアチンキナーゼと、第１試薬に含まれる試薬成分とが接触し、これらの成分による反応が始まる。
なお、前記のダブルカイネティック法により測定を行う場合、試料中にアデニル酸キナーゼが存在するときには、このインキュベートにより、試料中に含まれていたアデニル酸キナーゼが触媒する反応が進み、このアデニル酸キナーゼの活性値に応じた量のシグナル〔ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ等〕が生成する。
例えば、アデニル酸キナーゼ、「ＡＴＰとグルコースからＡＤＰとグルコース−６−リン酸を生成する反応を触媒する酵素」、及び「グルコース−６−リン酸とＮＡＤ（Ｐ）＋から６−ホスホグルコン酸とＮＡＤ（Ｐ）ＨとＨ＋を生成する反応を触媒する酵素」による一連の反応により、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが生成する。
この生成したシグナルの量又はシグナルの変化量を測定し、試料中に含まれていたアデニル酸キナーゼの活性値に由来するシグナルの量又はシグナルの変化量を測定する。
このシグナルの量又はシグナルの変化量の測定は、反応中に吸光度等の増減を測定、つまり反応の速度を測定する反応速度法（レート法）により行っても良いし、又は反応が停止した後若しくは反応を停止させた後に吸光度等の増減を測定する終点法（エンドポイント法）により行っても良い。
このシグナルを生じる物質がＮＡＤ（Ｐ）Ｈ〔すなわち、ＮＡＤＨ、又はＮＡＤＰＨ〕の場合、３４０ｎｍ及びこの近辺に吸光度の吸収を持つので、この３４０ｎｍにおける吸光度の単位時間（例えば１分間）当たりの変化量、すなわち吸光度の変化速度（増加速度）を求めれば良い。
（２）段階２
次に、前記の段階１で調製した第１試薬と試料の混合液に、第２試薬を混合する。これを最終反応液とする。
なお、この第２試薬の詳細は、前記の「Ｉ．クレアチンキナーゼ活性測定試薬」に記載した通りである。
この混合する第２試薬の量は、試料及び第１試薬の量、試料中に含まれるクレアチンキナーゼの活性値、発色物質若しくは紫外部吸収物質などに由来するシグナルの感度、使用する分析装置の仕様等、又は他の条件に応じて適宜決めれば良い。
なお、一般的には、第２試薬は１０〜４００μＬの範囲で使用すれば良い。
この最終反応液の調製後、インキュベートを行う。
このインキュベートの時間は、特に制限はないのであるが、通常は２０分以内であることが好ましく、１０分以内であることがより好ましく、５分以内であることが特に好ましい。
また、インキュベートする際の温度は、前記の最終反応液が凍結する温度より上の温度であればよい。
なお、一般的に反応時の温度は、高い程、反応速度が高くなるので好ましい。
しかし、温度が高すぎると反応に係わる酵素が変性、失活してしまうので、インキュベートする際の温度は、本発明の測定の反応に係わる酵素が変性、失活する温度未満の温度とする必要がある。
このインキュベートする際の温度は、通常は２〜７０℃であるが、２０〜３７℃が好ましく、３０〜３７℃がより好ましい。なお、前記の本発明の測定の反応に係わる酵素が耐熱性酵素であれば更に高温でも良い。
この最終反応液の調製及びインキュベートにより、前記の段階１における反応に引き続き、この段階２における反応が開始し、クレアチンキナーゼ活性測定の反応が進められる。
そして、この反応の進行により得られるシグナルの量又はシグナルの変化量、すなわち、試料中に含まれていたクレアチンキナーゼの活性値に対応したシグナルの量又はシグナルの変化量を測定する。
このシグナルを生じる物質がＮＡＤ（Ｐ）Ｈ〔すなわち、ＮＡＤＨ、又はＮＡＤＰＨ〕の場合、３４０ｎｍ及びこの近辺に吸光度の吸収を持つので、この３４０ｎｍにおける吸光度の単位時間（例えば１分間）当たりの変化量、すなわち吸光度の変化速度（増加速度）を求めれば良い。
また、測定したシグナルの量又はシグナルの変化量より、試料中に含まれていたクレアチンキナーゼの活性値を算出することは、シグナルを生じる物質のモル吸光係数を基に、測定した吸光度などより算出する方法、又は活性値若しくは濃度が分かっている標準物質の吸光度などと対比して算出する方法等の方法により行えば良い。
なお、この段階２における反応により得られたシグナルの量又はシグナルの変化量は、試料中に含まれていたクレアチンキナーゼの活性値に由来するシグナルの量又はシグナルの変化量と、試料中に含まれていたアデニル酸キナーゼの活性値に由来するシグナルの量又はシグナルの変化量が合わさったものである。
これに対し、前記のダブルカイネティック法により測定を行う場合、前記の段階１における反応により得られたシグナルの量又はシグナルの変化量は、試料中に含まれていたアデニル酸キナーゼの活性値に由来するシグナルの量又はシグナルの変化量である。
そこで、このダブルカイネティック法により測定を行う場合は、この段階２において得られたシグナルの量又はシグナルの変化量から、前記の段階１において得られたシグナルの量又はシグナルの変化量を差し引き、この差の値より、試料中に含まれていたクレアチンキナーゼの活性値を求める。
これにより、試料中のアデニル酸キナーゼの存在により生じる正誤差が差し引かれた、クレアチンキナーゼの正確な活性値を得ることができる。
（３）  なお、前記の段階１、段階２のそれぞれにおける測定操作は、測定者自身が用手法により行っても良いし、又は自動分析装置等の装置を使用して行っても良い。
また、前記の「Ｉ．クレアチンキナーゼ活性測定試薬」の「１６．３試薬以上よりなるクレアチンキナーゼ活性測定試薬」に記載したように、クレアチンキナーゼ活性測定試薬が、第１試薬、第２試薬、及び他の試薬（一つ又は二つ以上の試薬）よりなる場合、すなわち３以上の試薬よりなる場合は、これらの試薬を使用して測定を行うのに必要な数の段階（必要に応じ２段階又は３段階以上の段階）を経て測定反応を行わせ、試料中のクレアチンキナーゼ活性の測定を行えば良い。
（４）  前記の段階１における反応及び段階２における反応の具体例を下に示す。
【化５】
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（５）  なお、本発明においては、ＮＡＤ＋に替えてチオＮＡＤ＋を用いてもよく、ＮＡＤＨに替えてチオＮＡＤＨを用いてもよく、ＮＡＤＰ＋に替えてチオＮＡＤＰ＋を用いてもよく、又はＮＡＤＰＨに替えてチオＮＡＤＰＨを用いてもよい。
そして、本発明においては、「グルコース−６−リン酸とＮＡＤ（Ｐ）＋から６−ホスホグルコン酸とＮＡＤ（Ｐ）ＨとＨ＋を生成する反応を触媒する酵素」及び６−ホスホグルコン酸脱水素酵素のいずれにおいても、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋に替えてチオＮＡＤ＋又はチオＮＡＤＰ＋をそれぞれ用いることができ、この場合、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨに替わって、これらの酵素が触媒する反応によりチオＮＡＤＨ又はチオＮＡＤＰＨがそれぞれ生成する。
４．本発明のクレアチンキナーゼ活性測定方法の効果
本発明のクレアチンキナーゼ活性測定方法によれば、長期間正確にクレアチンキナーゼ活性の測定を行うことができる。すなわち、正確なクレアチンキナーゼ活性測定値を、長期間に亘り提供することができる。
また、長期間、高値域における直線性を維持することができる。
更に、溶血した試料等におけるアデニル酸キナーゼによる正の誤差を補正することができるダブルカイネティック法を適用することが可能なものである。
ＩＩＩ．クレアチンキナーゼ活性測定試薬の安定化方法
本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬（ＣＫ活性測定試薬）の安定化方法であるが、前記の本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬の構成により当該測定試薬の安定化を図ることができるものである。
以下、詳細に説明を行う。
１．本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬の安定化方法
本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬の安定化方法は、以下の発明を包含するものである。
（１）  第１試薬及び第２試薬よりなるクレアチンキナーゼ活性測定試薬の安定化方法であって、第１試薬が０．５ｍＭ〜１０ｍＭの濃度のグルコースを含み、かつ第２試薬がグルコースを含まないか又は１０ｍＭ以下の濃度のグルコースを含むことを特徴とする、クレアチンキナーゼ活性測定試薬の安定化方法。
（２）  第１試薬及び第２試薬よりなるクレアチンキナーゼ活性測定試薬の安定化方法であって、第１試薬がアデノシン５’−二リン酸又はこの塩、ＡＴＰとグルコースからＡＤＰとグルコース−６−リン酸を生成する反応を触媒する酵素、グルコース−６−リン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）から６−ホスホグルコン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）とＨ＋を生成する反応を触媒する酵素、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）若しくはβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）又はこれらの塩、チオール化合物、及びグルコースを含み、かつ当該グルコースの濃度を０．５ｍＭ〜１０ｍＭとし、第２試薬がクレアチンリン酸又はこの塩を含み、かつグルコースを含まないか又は１０ｍＭ以下の濃度のグルコースを含むことを特徴とする、前記（１）記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬の安定化方法。
（３）  第１試薬のグルコースの濃度が１．２５ｍＭ〜５ｍＭである、前記（１）又は（２）記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬の安定化方法。
（４）  第１試薬のグルコースの濃度が２ｍＭ〜５ｍＭである、前記（１）〜（３）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬の安定化方法。
（５）  第２試薬がグルコースを含まないか又は５ｍＭ以下の濃度のグルコースを含むものである、前記（１）〜（４）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬の安定化方法。
（６）  第２試薬がグルコースを含まないものである、前記（１）〜（５）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬の安定化方法。
（７）  第２試薬が、グルコース−６−リン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）から６−ホスホグルコン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）とＨ＋を生成する反応を触媒する酵素を含むものである、前記（１）〜（６）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬の安定化方法。
（８）  第１試薬及び第２試薬が、グルコース−６−リン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）から６−ホスホグルコン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）とＨ＋を生成する反応を触媒する酵素を含むものである、前記（１）〜（７）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬の安定化方法。
（９）  第１試薬の、グルコース−６−リン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）から６−ホスホグルコン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）とＨ＋を生成する反応を触媒する酵素の活性値が、２００Ｕｎｉｔ／Ｌ〜５，０００Ｕｎｉｔ／Ｌである、前記（１）〜（８）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬の安定化方法。
（１０）  第１試薬の、グルコース−６−リン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）から６−ホスホグルコン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）とＨ＋を生成する反応を触媒する酵素の活性値が、５００Ｕｎｉｔ／Ｌ〜２，０００Ｕｎｉｔ／Ｌである、前記（１）〜（９）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬の安定化方法。
（１１）  第１試薬の、グルコース−６−リン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）から６−ホスホグルコン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）とＨ＋を生成する反応を触媒する酵素の活性値が、５００Ｕｎｉｔ／Ｌ〜１，０００Ｕｎｉｔ／Ｌである、前記（１）〜（１０）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬の安定化方法。
（１２）  第２試薬の、グルコース−６−リン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）から６−ホスホグルコン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）とＨ＋を生成する反応を触媒する酵素の活性値が、試料と第１試薬と第２試薬が混合された最終反応液において５００Ｕｎｉｔ／Ｌ以上となるように調整されている、前記（１）〜（１１）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬の安定化方法。
（１３）  第２試薬の、グルコース−６−リン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）から６−ホスホグルコン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）とＨ＋を生成する反応を触媒する酵素の活性値が、試料と第１試薬と第２試薬が混合された最終反応液において８００Ｕｎｉｔ／Ｌ以上となるように調整されている、前記（１）〜（１２）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬の安定化方法。
（１４）  第２試薬の、グルコース−６−リン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）から６−ホスホグルコン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）とＨ＋を生成する反応を触媒する酵素の活性値が、試料と第１試薬と第２試薬が混合された最終反応液において１，６００Ｕｎｉｔ／Ｌ以上となるように調整されている、前記（１）〜（１３）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬の安定化方法。
（１５）  ＡＴＰとグルコースからＡＤＰとグルコース−６−リン酸を生成する反応を触媒する酵素が、ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼである、前記（１）〜（１４）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬の安定化方法。
（１６）  グルコース−６−リン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）から６−ホスホグルコン酸とβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）とＨ＋を生成する反応を触媒する酵素が、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼである、前記（１）〜（１５）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬の安定化方法。
（１７）  第１試薬及び第２試薬が液状試薬である、前記（１）〜（１６）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬の安定化方法。
（１８）  β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）若しくはこの塩に替えてβ−チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）若しくはこの塩を用い、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）若しくはこの塩に替えてβ−チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）若しくはこの塩を用い、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）若しくはこの塩に替えてβ−チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）若しくはこの塩を用い、又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）若しくはこの塩に替えてβ−チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）若しくはこの塩を用いる、前記（１）〜（１７）のいずれか一項記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬の安定化方法。
前記の通り、第１試薬及び第２試薬よりなるクレアチンキナーゼ活性測定試薬において、第１試薬が０．５ｍＭ〜１０ｍＭの濃度のグルコースを含み、かつ第２試薬がグルコースを含まないか又は１０ｍＭ以下の濃度のグルコースを含むことにより、クレアチンキナーゼ活性測定試薬を安定化することができる。
すなわち、本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬の安定化方法は、本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬により達成することができる。
よって、本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬の安定化方法の詳細は、前記の「Ｉ．クレアチンキナーゼ活性測定試薬」に記載した通りである。
２．本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬の安定化方法の効果
本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬の安定化方法によれば、クレアチンキナーゼ活性測定試薬を長期間安定に保つことができる。これにより、長期間正確にクレアチンキナーゼ活性の測定を行うことができる。すなわち、正確なクレアチンキナーゼ活性測定値を、長期間に亘り提供することができる。
また、クレアチンキナーゼ活性測定試薬において、長期間、高値域における直線性を維持することができる。
【実施例】
【０００９】
以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこの実施例の記載により限定されるものではない。
〔実施例１〕（本発明の保存時の安定化の効果の確認−１）
本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬における保存時の安定化効果を確認した。
具体的には、本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬の第１試薬を、３７℃で７日間保存した際の安定化の効果を確認した。
１．クレアチンキナーゼ活性測定試薬
（１）第１試薬
（ａ）第１試薬〔本発明（１ｍＭ）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、０．１Ｎ酢酸でｐＨをｐＨ６．５（２０℃）に調整して、１ｍＭの濃度のグルコースを含む、第１試薬〔本発明（１ｍＭ）〕を調製した。
Ｄ−グルコース（無水）  １．００ｍＭ
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ〔ロシュ・ダイアグノスティックス社、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来〕  １，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ヘキソキナーゼ〔ロシュ・ダイアグノスティックス社、Ｙｅａｓｔ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来〕  ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
イミダゾール  １００ｍＭ
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩  ２ｍＭ
アジ化ナトリウム  ７．７ｍＭ
酢酸マグネシウム（４水和物）  １０ｍＭ
ＡＤＰ一カリウム塩  ２ｍＭ
Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン〔ロシュ・ダイアグノスティックス社〕  ２７ｍＭ
ＮＡＤＰ（酸化型）二ナトリウム塩  ２．７ｍＭ
ＡＭＰ二ナトリウム塩  ６．７ｍＭ
ジアデノシンペンタリン酸三リチウム塩  １３μＭ
二亜硫酸カリウム〔ナカライテスク社〕  １．４ｍＭ
（ｂ）第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、０．１Ｎ酢酸でｐＨをｐＨ６．５（２０℃）に調整して、５ｍＭの濃度のグルコースを含む、第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕を調製した。
Ｄ−グルコース（無水）  ５．００ｍＭ
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ〔ロシュ・ダイアグノスティックス社、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来〕  １，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ヘキソキナーゼ〔ロシュ・ダイアグノスティックス社、Ｙｅａｓｔ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来〕  ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
イミダゾール  １００ｍＭ
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩  ２ｍＭ
アジ化ナトリウム  ７．７ｍＭ
酢酸マグネシウム（４水和物）  １０ｍＭ
ＡＤＰ一カリウム塩  ２ｍＭ
Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン〔ロシュ・ダイアグノスティックス社〕  ２７ｍＭ
ＮＡＤＰ（酸化型）二ナトリウム塩  ２．７ｍＭ
ＡＭＰ二ナトリウム塩  ６．７ｍＭ
ジアデノシンペンタリン酸三リチウム塩  １３μＭ
二亜硫酸カリウム〔ナカライテスク社〕  １．４ｍＭ
（ｃ）第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、０．１Ｎ酢酸でｐＨをｐＨ６．５（２０℃）に調整して、１０ｍＭの濃度のグルコースを含む、第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕を調製した。
Ｄ−グルコース（無水）  １０．０ｍＭ
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ〔ロシュ・ダイアグノスティックス社、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来〕  １，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ヘキソキナーゼ〔ロシュ・ダイアグノスティックス社、Ｙｅａｓｔ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来〕  ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
イミダゾール  １００ｍＭ
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩  ２ｍＭ
アジ化ナトリウム  ７．７ｍＭ
酢酸マグネシウム（４水和物）  １０ｍＭ
ＡＤＰ一カリウム塩  ２ｍＭ
Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン〔ロシュ・ダイアグノスティックス社〕  ２７ｍＭ
ＮＡＤＰ（酸化型）二ナトリウム塩  ２．７ｍＭ
ＡＭＰ二ナトリウム塩  ６．７ｍＭ
ジアデノシンペンタリン酸三リチウム塩  １３μＭ
二亜硫酸カリウム〔ナカライテスク社〕  １．４ｍＭ
（ｄ）第１試薬〔従来発明（２５ｍＭ）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、０．１Ｎ酢酸でｐＨをｐＨ６．５（２０℃）に調整して、２５ｍＭの濃度のグルコースを含む、第１試薬〔従来発明（２５ｍＭ）〕を調製した。
Ｄ−グルコース（無水）  ２５．０ｍＭ
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ〔ロシュ・ダイアグノスティックス社、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来〕  １，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ヘキソキナーゼ〔ロシュ・ダイアグノスティックス社、Ｙｅａｓｔ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来〕  ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
イミダゾール  １００ｍＭ
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩  ２ｍＭ
アジ化ナトリウム  ７．７ｍＭ
酢酸マグネシウム（４水和物）  １０ｍＭ
ＡＤＰ一カリウム塩  ２ｍＭ
Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン〔ロシュ・ダイアグノスティックス社〕  ２７ｍＭ
ＮＡＤＰ（酸化型）二ナトリウム塩  ２．７ｍＭ
ＡＭＰ二ナトリウム塩  ６．７ｍＭ
ジアデノシンペンタリン酸三リチウム塩  １３μＭ
二亜硫酸カリウム〔ナカライテスク社〕  １．４ｍＭ
（ｅ）第１試薬〔対照試薬〕
市販のクレアチンキナーゼ活性測定試薬「アキュラスオート  ＣＫ−ＪＳ」の第１試薬〔製造販売元：シノテスト社、製造番号：Ａ９２１〕を、第１試薬〔対照試薬〕とした。
（２）第２試薬
（ａ）第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、０．１Ｎ酢酸でｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、グルコースを含まない（つまり０ｍＭである）、第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕を調製した。
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ〔ロシュ・ダイアグノスティックス社、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来〕  ４，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
イミダゾール  １２０ｍＭ
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩  ２ｍＭ
アジ化ナトリウム  ７．７ｍＭ
酢酸マグネシウム（４水和物）  １０ｍＭ
ＡＤＰ一カリウム塩  ２ｍＭ
ジアデノシンペンタリン酸三リチウム塩  ２６μＭ
クレアチンリン酸二ナトリウム塩  １２０ｍＭ
（ｂ）第２試薬〔対照試薬〕
市販のクレアチンキナーゼ活性測定試薬「アキュラスオート  ＣＫ−ＪＳ」の第２試薬〔製造販売元：シノテスト社、製造番号：Ａ９１２〕を、第２試薬〔対照試薬〕とした。
２．試料
（１）コントロール血清−１
市販の精度管理用コントロール血清である「Ａａｌｔｏ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｉ  Ｙ」〔輸入・発売元：シノテスト社〕を、「コントロール血清−１」として用いた。
（２）コントロール血清−２
市販の精度管理用コントロール血清である「Ａａｌｔｏ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＣＲＰＩＩ  Ｕ」〔輸入・発売元：シノテスト社〕を、「コントロール血清−２」として用いた。
（３）希釈試料
ヒト血清試料にラビットのクレアチンキナーゼＭＭアイソザイムを添加したものを調製し（添加血清試料）、この添加血清試料を、「試料希釈液」（５．０ｍＭコハク酸緩衝液〔ｐＨ７．０（２０℃）〕）により、それぞれ１／１０、２／１０、３／１０、４／１０、５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、及び９／１０となるように希釈し、下記の「試料−１」〜「試料−９」を調製した。
また、前記の添加血清試料を、「試料−１０」（１０／１０）とした。
（ａ）「試料−１」：  添加血清試料を１／１０希釈
（ｂ）「試料−２」：  添加血清試料を２／１０希釈
（ｃ）「試料−３」：  添加血清試料を３／１０希釈
（ｄ）「試料−４」：  添加血清試料を４／１０希釈
（ｅ）「試料−５」：  添加血清試料を５／１０希釈
（ｆ）「試料−６」：  添加血清試料を６／１０希釈
（ｇ）「試料−７」：  添加血清試料を７／１０希釈
（ｈ）「試料−８」：  添加血清試料を８／１０希釈
（ｉ）「試料−９」：  添加血清試料を９／１０希釈
（ｊ）「試料−１０」：  添加血清試料
（４）不含試料
前記（３）における「試料希釈液」を、クレアチンキナーゼを含まない、クレアチンキナーゼ活性値が０Ｕｎｉｔ／Ｌ（単位／Ｌ）の試料、すなわち「不含試料」とした。
３．試薬の保存
（１）３７℃での保存
前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（１ｍＭ）〕、（ｂ）の第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕、（ｃ）の第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕、及び（ｄ）の第１試薬〔従来発明（２５ｍＭ）〕については、それぞれ３７℃で暗所に７日間保存した。
（２）５℃での保存
前記１の（１）の（ｅ）の第１試薬〔対照試薬〕、前記１の（２）の（ａ）の第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕、及び（ｂ）の第２試薬〔対照試薬〕については、それぞれ５℃で暗所に７日間保存した。
４．試料のクレアチンキナーゼ活性値の測定
前記２の各試料のクレアチンキナーゼ活性値の測定は、東芝メディカルシステムズ社の自動分析装置ＴＢＡ−１２０ＦＲを使用して、ダブルカイネティック法により行った。
（１）  前記２の（１）〜（４）のそれぞれの試料５．６μＬに、前記３の（１）で３７℃にて７日間保存した前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（１ｍＭ）〕の１６０μＬを添加し、３７℃で反応させた。
［０１９２］
（２）  次に、８ポイント（第１試薬添加後１３６．１８秒）から１６ポイント（第１試薬添加後２８０．４６秒）に掛けての吸光度変化量を主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍにて測定した〔「測光１」〕。（試料中に含まれていたアデニル酸キナーゼの活性値に応じた吸光度変化量の測定）
（３）  次に、１６ポイント（第１試薬添加後２８０．４６秒）から１７ポイント（第１試薬添加後２９８．４９秒）の間に、前記３の（２）で５℃にて７日間保存した前記１の（２）の（ａ）の第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕の４０μＬを添加し、３７℃で反応させた。
（４）  次に、２４ポイント（第１試薬添加後４２４．７４秒）から３３ポイント（第１試薬添加後５８７．０５秒）に掛けての吸光度変化量を主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍにて測定した〔「測光２」〕。（試料中に含まれていたクレアチンキナーゼの活性値に応じた吸光度変化量と、試料中に含まれていたアデニル酸キナーゼの活性値に応じた吸光度変化量が合わさった吸光度変化量の測定）
（５）  次に、試料に含まれていたクレアチンキナーゼの活性値を、下記の計算式により求めた。
クレアチンキナーゼ活性値（Ｕｎｉｔ／Ｌ）＝｛（ΔＡ２−ΔＲＢ２）−ｃ×（ΔＡ１−ΔＲＢ１）｝×（Ｓ＋Ｖ１＋Ｖ２）×１０６÷（Ｋ×ｄ×Ｓ）＝｛（ΔＡ２−ΔＲＢ２）−０．８０５×（ΔＡ１−ΔＲＢ１）｝×５．８３×１０３
なお、この計算式において、ΔＡ１は「測光１」において測定した１分間当りの吸光度変化量（Ａｂｓ／ｍｉｎ）を、ΔＡ２は「測光２」において測定した１分間当りの吸光度変化量（Ａｂｓ／ｍｉｎ）を、ΔＲＢ１は試料が前記の「不含試料」であるときの「測光１」において測定した１分間当りの吸光度変化量〔試薬盲検値〕（Ａｂｓ／ｍｉｎ）を、ΔＲＢ２は試料が前記の「不含試料」であるときの「測光２」において測定した１分間当りの吸光度変化量〔試薬盲検値〕（Ａｂｓ／ｍｉｎ）を、Ｓは試料の量〔５．６μＬ〕を、Ｖ１は第１試薬の量〔１６０μＬ〕を、Ｖ２は第２試薬の量〔４０μＬ〕を、ｃは液量補正係数〔（Ｓ＋Ｖ１）÷（Ｓ＋Ｖ１＋Ｖ２）＝０．８０５〕を、ＫはＮＡＤＰＨの理論モル吸光係数〔６．３０×１０３Ｌ・ｍｏｌｅ−１・ｃｍ−１（主波長：３４０ｎｍ、副波長：４０５ｎｍ）〕、及びｄはセルの光路長〔１．００ｃｍ〕を表す。
（６）  また、前記（１）において、前記３の（１）で３７℃にて７日間保存した第１試薬〔本発明（１ｍＭ）〕に替えて、前記３の（１）で３７℃にて７日間保存した前記１の（１）の（ｂ）の第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、第１試薬として前記の第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕を用いた場合の各試料のクレアチンキナーゼの活性値を得た。
（７）  更に、前記（１）において、前記３の（１）で３７℃にて７日間保存した第１試薬〔本発明（１ｍＭ）〕に替えて、前記３の（１）で３７℃にて７日間保存した前記１の（１）の（ｃ）の第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、第１試薬として前記の第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕を用いた場合の各試料のクレアチンキナーゼの活性値を得た。
（８）  また、前記（１）において、前記３の（１）で３７℃にて７日間保存した第１試薬〔本発明（１ｍＭ）〕に替えて、前記３の（１）で３７℃にて７日間保存した前記１の（１）の（ｄ）の第１試薬〔従来発明（２５ｍＭ）〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、第１試薬として前記の第１試薬〔従来発明（２５ｍＭ）〕を用いた場合の各試料のクレアチンキナーゼの活性値を得た。
（９）  更に、前記（１）において、前記３の（１）で３７℃にて７日間保存した第１試薬〔本発明（１ｍＭ）〕に替えて、前記３の（２）で５℃にて７日間保存した前記１の（１）の（ｅ）の第１試薬〔対照試薬〕を用いること、及び、前記（３）において、前記３の（２）で５℃にて７日間保存した第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕に替えて、前記３の（２）で５℃にて７日間保存した前記１の（２）の（ｂ）の第２試薬〔対照試薬〕を用いること、以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、第１試薬として前記の第１試薬〔対照試薬〕を用い、そして第２試薬として前記の第２試薬〔対照試薬〕を用いた場合の各試料のクレアチンキナーゼの活性値を得た。
５．測定結果
前記４において各試料のクレアチンキナーゼ活性値の測定を行って得られた結果のうち、試料が前記のコントロール血清−１、又はコントロール血清−２の場合のものを表１に、試料が前記の試料−１〜試料−１０の場合のものを表２に示した。
なお、この表１及び表２において、「〔１〕活性値」の欄に示した値は各試料のクレアチンキナーゼの活性値〔Ｕｎｉｔ／Ｌ〕を示す。
また、「〔２〕活性値差」の欄に示した値は、各試料における「〔１〕活性値」の欄の値から、同じ試料の第１試薬及び第２試薬ともが「対照試薬」である場合の「〔１〕活性値」の欄の値を差し引いた差の値〔Ｕｎｉｔ／Ｌ〕を示す。
そして、「〔３〕相対比率」の欄に示した値は、各試料における「〔１〕活性値」の欄の値を、同じ試料の第１試薬及び第２試薬ともが「対照試薬」である場合の「〔１〕活性値」の欄の値で除した値をパーセント表示で示す。
【表１】
0005982608.tif 000007
【表２】
0005982608.tif 000008
６．考察
（１）  表１において、試料がコントロール血清−１、又はコントロール血清−２であるとき、第１試薬が３７℃で７日間保存した第１試薬〔従来発明（２５ｍＭ）〕である場合には、５℃で７日間保存した第１試薬〔対照試薬〕の場合に比べて、測定値が３．１％〜３．４％低い値となっている。
これに対して、第１試薬が３７℃で７日間保存した第１試薬〔本発明（１ｍＭ）〕、第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕、又は第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕である場合には、５℃で７日間保存した第１試薬〔対照試薬〕の場合に比べて、測定値は２．１％〜２．６％低い値となっている。
この第１試薬を３７℃又は５℃で７日間保存した結果より、第１試薬のグルコース濃度が１ｍＭ、５ｍＭ、又は１０ｍＭである場合は、第１試薬のグルコース濃度が２５ｍＭである場合に比較して、測定試薬保存時の測定値の低下度が小さく、安定化されていることが分かる。
（２）  表２において、試料が試料−１〜試料−１０であるとき、第１試薬が３７℃で７日間保存した第１試薬〔従来発明（２５ｍＭ）〕である場合には、５℃で７日間保存した第１試薬〔対照試薬〕の場合に比べて、測定値が３．３％〜４５．３％低い値となっている。
特に、そのクレアチンキナーゼ活性値が高い試料ほど測定試薬保存による測定値の低下度は大きく、例えば、試料−８においてはその測定値は３５．０％低く、試料−９においてはその測定値は４０．２％低く、そして試料−１０においてはその測定値は４５．３％低いものとなっている。
これに対して、第１試薬が３７℃で７日間保存した第１試薬〔本発明（１ｍＭ）〕、第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕、又は第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕である場合には、５℃で７日間保存した第１試薬〔対照試薬〕の場合に比べて、測定値は１．３％〜１７．７％低い値となっている。
この場合も、そのクレアチンキナーゼ活性値が高い試料ほど測定試薬保存による測定値の低下度は大きいが、その測定値の低下度は、例えば、試料−８では８．５％〜１２．９％であり、試料−９では９．７％〜１５．１％であり、そして試料−１０では１１．６％〜１７．７％である。
この第１試薬を３７℃又は５℃で７日間保存した結果より、第１試薬のグルコース濃度が１ｍＭ、５ｍＭ、又は１０ｍＭである場合は、第１試薬のグルコース濃度が２５ｍＭである場合に比較して、測定試薬保存時の測定値の低下度には大きな差異があり、測定値の低下が抑制され、安定化されていることが分かる。
（３）  以上のことより、第１試薬が０．５ｍＭ〜１０ｍＭの濃度のグルコースを含み、かつ第２試薬がグルコースを含まないか又は１０ｍＭ以下の濃度のグルコースを含むことを特徴とする本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬は、従来のクレアチンキナーゼ活性測定試薬に比べ、３７℃という非常に過酷な条件での保存時においても、その測定値の低下が抑制され、安定化されたものであり、すなわち、本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬は、長期間安定に保つことができ、かつ長期間正確にクレアチンキナーゼ活性の測定を行うことができるという効果を有するものであることが確かめられた。
また、本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬は、従来のクレアチンキナーゼ活性測定試薬に比べ、特にクレアチンキナーゼ活性値が高い高値域における測定値の低下の抑制に効果があるものであり、すなわち、本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬は、長期間、高値域における直線性を維持することができるという効果を有するものであることが確かめられた。
〔実施例２〕（本発明の保存時の安定化の効果の確認−２）
本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬における保存時の安定化効果を確認した。
具体的には、本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬の第１試薬を、５℃、３７℃それぞれで７日間保存した際の安定化の効果を確認した。
１．クレアチンキナーゼ活性測定試薬
（１）第１試薬
（ａ）第１試薬〔従来発明（０ｍＭ）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、０．１Ｎ酢酸でｐＨをｐＨ６．５（２０℃）に調整して、グルコースを含まない（つまり０ｍＭである）、第１試薬〔従来発明（０ｍＭ）〕を調製した。
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ〔ロシュ・ダイアグノスティックス社、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来〕  １，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ヘキソキナーゼ〔ロシュ・ダイアグノスティックス社、Ｙｅａｓｔ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来〕  ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
イミダゾール  １００ｍＭ
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩  ２ｍＭ
アジ化ナトリウム  ７．７ｍＭ
酢酸マグネシウム（４水和物）  １０ｍＭ
ＡＤＰ一カリウム塩  ２ｍＭ
Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン〔ロシュ・ダイアグノスティックス社〕  ２７ｍＭ
ＮＡＤＰ（酸化型）二ナトリウム塩  ２．７ｍＭ
ＡＭＰ二ナトリウム塩  ６．７ｍＭ
ジアデノシンペンタリン酸三リチウム塩  １３μＭ
二亜硫酸カリウム〔ナカライテスク社〕  １．４ｍＭ
（ｂ）第１試薬〔従来発明（０．０７８１ｍＭ）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、０．１Ｎ酢酸でｐＨをｐＨ６．５（２０℃）に調整して、０．０７８１ｍＭの濃度のグルコースを含む、第１試薬〔従来発明（０．０７８１ｍＭ）〕を調製した。
Ｄ−グルコース（無水）  ０．０７８１ｍＭ
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ〔ロシュ・ダイアグノスティックス社、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来〕  １，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ヘキソキナーゼ〔ロシュ・ダイアグノスティックス社、Ｙｅａｓｔ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来〕  ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
イミダゾール  １００ｍＭ
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩  ２ｍＭ
アジ化ナトリウム  ７．７ｍＭ
酢酸マグネシウム（４水和物）  １０ｍＭ
ＡＤＰ一カリウム塩  ２ｍＭ
Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン〔ロシュ・ダイアグノスティックス社〕  ２７ｍＭ
ＮＡＤＰ（酸化型）二ナトリウム塩  ２．７ｍＭ
ＡＭＰ二ナトリウム塩  ６．７ｍＭ
ジアデノシンペンタリン酸三リチウム塩  １３μＭ
二亜硫酸カリウム〔ナカライテスク社〕  １．４ｍＭ
（ｃ）第１試薬〔従来発明（０．１５６ｍＭ）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、０．１Ｎ酢酸でｐＨをｐＨ６．５（２０℃）に調整して、０．１５６ｍＭの濃度のグルコースを含む、第１試薬〔従来発明（０．１５６ｍＭ）〕を調製した。
Ｄ−グルコース（無水）  ０．１５６ｍＭ
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ〔ロシュ・ダイアグノスティックス社、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来〕  １，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ヘキソキナーゼ〔ロシュ・ダイアグノスティックス社、Ｙｅａｓｔ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来〕  ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
イミダゾール  １００ｍＭ
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩  ２ｍＭ
アジ化ナトリウム  ７．７ｍＭ
酢酸マグネシウム（４水和物）  １０ｍＭ
ＡＤＰ一カリウム塩  ２ｍＭ
Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン〔ロシュ・ダイアグノスティックス社〕  ２７ｍＭ
ＮＡＤＰ（酸化型）二ナトリウム塩  ２．７ｍＭ
ＡＭＰ二ナトリウム塩  ６．７ｍＭ
ジアデノシンペンタリン酸三リチウム塩  １３μＭ
二亜硫酸カリウム〔ナカライテスク社〕  １．４ｍＭ
（ｄ）第１試薬〔従来発明（０．３１３ｍＭ）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、０．１Ｎ酢酸でｐＨをｐＨ６．５（２０℃）に調整して、０．３１３ｍＭの濃度のグルコースを含む、第１試薬〔従来発明（０．３１３ｍＭ）〕を調製した。
Ｄ−グルコース（無水）  ０．３１３ｍＭ
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ〔ロシュ・ダイアグノスティックス社、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来〕  １，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ヘキソキナーゼ〔ロシュ・ダイアグノスティックス社、Ｙｅａｓｔ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来〕  ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
イミダゾール  １００ｍＭ
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩  ２ｍＭ
アジ化ナトリウム  ７．７ｍＭ
酢酸マグネシウム（４水和物）  １０ｍＭ
ＡＤＰ一カリウム塩  ２ｍＭ
Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン〔ロシュ・ダイアグノスティックス社〕  ２７ｍＭ
ＮＡＤＰ（酸化型）二ナトリウム塩  ２．７ｍＭ
ＡＭＰ二ナトリウム塩  ６．７ｍＭ
ジアデノシンペンタリン酸三リチウム塩  １３μＭ
二亜硫酸カリウム〔ナカライテスク社〕  １．４ｍＭ
（ｅ）第１試薬〔本発明（０．６２５ｍＭ）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、０．１Ｎ酢酸でｐＨをｐＨ６．５（２０℃）に調整して、０．６２５ｍＭの濃度のグルコースを含む、第１試薬〔本発明（０．６２５ｍＭ）〕を調製した。
Ｄ−グルコース（無水）  ０．６２５ｍＭ
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ〔ロシュ・ダイアグノスティックス社、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来〕  １，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ヘキソキナーゼ〔ロシュ・ダイアグノスティックス社、Ｙｅａｓｔ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来〕  ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
イミダゾール  １００ｍＭ
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩  ２ｍＭ
アジ化ナトリウム  ７．７ｍＭ
酢酸マグネシウム（４水和物）  １０ｍＭ
ＡＤＰ一カリウム塩  ２ｍＭ
Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン〔ロシュ・ダイアグノスティックス社〕  ２７ｍＭ
ＮＡＤＰ（酸化型）二ナトリウム塩  ２．７ｍＭ
ＡＭＰ二ナトリウム塩  ６．７ｍＭ
ジアデノシンペンタリン酸三リチウム塩  １３μＭ
二亜硫酸カリウム〔ナカライテスク社〕  １．４ｍＭ
（ｆ）第１試薬〔本発明（１．２５ｍＭ）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、０．１Ｎ酢酸でｐＨをｐＨ６．５（２０℃）に調整して、１．２５ｍＭの濃度のグルコースを含む、第１試薬〔本発明（１．２５ｍＭ）〕を調製した。
Ｄ−グルコース（無水）  １．２５ｍＭ
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ〔ロシュ・ダイアグノスティックス社、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来〕  １，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ヘキソキナーゼ〔ロシュ・ダイアグノスティックス社、Ｙｅａｓｔ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来〕  ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
イミダゾール  １００ｍＭ
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩  ２ｍＭ
アジ化ナトリウム  ７．７ｍＭ
酢酸マグネシウム（４水和物）  １０ｍＭ
ＡＤＰ一カリウム塩  ２ｍＭ
Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン〔ロシュ・ダイアグノスティックス社〕  ２７ｍＭ
ＮＡＤＰ（酸化型）二ナトリウム塩  ２．７ｍＭ
ＡＭＰ二ナトリウム塩  ６．７ｍＭ
ジアデノシンペンタリン酸三リチウム塩  １３μＭ
二亜硫酸カリウム〔ナカライテスク社〕  １．４ｍＭ
（ｇ）第１試薬〔本発明（２．５ｍＭ）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、０．１Ｎ酢酸でｐＨをｐＨ６．５（２０℃）に調整して、２．５ｍＭの濃度のグルコースを含む、第１試薬〔本発明（２．５ｍＭ）〕を調製した。
Ｄ−グルコース（無水）  ２．５０ｍＭ
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ〔ロシュ・ダイアグノスティックス社、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来〕  １，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ヘキソキナーゼ〔ロシュ・ダイアグノスティックス社、Ｙｅａｓｔ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来〕  ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
イミダゾール  １００ｍＭ
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩  ２ｍＭ
アジ化ナトリウム  ７．７ｍＭ
酢酸マグネシウム（４水和物）  １０ｍＭ
ＡＤＰ一カリウム塩  ２ｍＭ
Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン〔ロシュ・ダイアグノスティックス社〕  ２７ｍＭ
ＮＡＤＰ（酸化型）二ナトリウム塩  ２．７ｍＭ
ＡＭＰ二ナトリウム塩  ６．７ｍＭ
ジアデノシンペンタリン酸三リチウム塩  １３μＭ
二亜硫酸カリウム〔ナカライテスク社〕  １．４ｍＭ
（ｈ）第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕
前記の実施例１の１の（１）の（ｂ）の「第１試薬〔本発明５ｍＭ〕」を、「第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕」として用いた。
（ｉ）第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕
前記の実施例１の１の（１）の（ｃ）の「第１試薬〔本発明１０ｍＭ〕」を、「第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕」として用いた。
（ｊ）第１試薬〔対照試薬〕
市販のクレアチンキナーゼ活性測定試薬「アキュラスオート  ＣＫ−ＪＳ」の第１試薬〔製造販売元：シノテスト社、製造番号：Ｅ９１３〕を、第１試薬〔対照試薬〕とした。
（２）第２試薬
（ａ）第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕
前記の実施例１の１の（２）の（ａ）の「第２試薬〔本発明０ｍＭ〕」を、「第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕」として用いた。
（ｂ）第２試薬〔対照試薬〕
市販のクレアチンキナーゼ活性測定試薬「アキュラスオート  ＣＫ−ＪＳ」の第２試薬〔製造販売元：シノテスト社、製造番号：Ｅ９２３〕を、第２試薬〔対照試薬〕とした。
２．試料
（１）希釈試料
ヒト血清試料にラビットのクレアチンキナーゼＭＭアイソザイムを添加したものを調製し（添加血清試料）、この添加血清試料を、「試料希釈液」（５．０ｍＭコハク酸緩衝液〔ｐＨ７．０（２０℃）〕）により、それぞれ１／１０、２／１０、３／１０、４／１０、５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、及び９／１０となるように希釈し、下記の「試料−ａ」〜「試料−ｉ」を調製した。
また、前記の添加血清試料を、「試料−ｊ」（１０／１０）とした。
（ａ）「試料−ａ」：  添加血清試料を１／１０希釈
（ｂ）「試料−ｂ」：  添加血清試料を２／１０希釈
（ｃ）「試料−ｃ」：  添加血清試料を３／１０希釈
（ｄ）「試料−ｄ」：  添加血清試料を４／１０希釈
（ｅ）「試料−ｅ」：  添加血清試料を５／１０希釈
（ｆ）「試料−ｆ」：  添加血清試料を６／１０希釈
（ｇ）「試料−ｇ」：  添加血清試料を７／１０希釈
（ｈ）「試料−ｈ」：  添加血清試料を８／１０希釈
（ｉ）「試料−ｉ」：  添加血清試料を９／１０希釈
（ｊ）「試料−ｊ」：  添加血清試料
（２）不含試料
前記（１）における「試料希釈液」を、クレアチンキナーゼを含まない、クレアチンキナーゼ活性値が０Ｕｎｉｔ／Ｌ（単位／Ｌ）の試料、すなわち「不含試料」とした。
３．試薬の保存
（１）３７℃での保存
前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（１ｍＭ）〕、（ｂ）の第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕、（ｃ）の第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕、及び（ｄ）の第１試薬〔従来発明（２５ｍＭ）〕については、それぞれ３７℃で暗所に７日間保存した。
（２）５℃での保存
前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（１ｍＭ）〕、（ｂ）の第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕、（ｃ）の第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕、及び（ｄ）の第１試薬〔従来発明（２５ｍＭ）〕については、５℃においても、それぞれ暗所に７日間保存した。
また、前記１の（１）の（ｅ）の第１試薬〔対照試薬〕、前記１の（２）の（ａ）の第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕、及び（ｂ）の第２試薬〔対照試薬〕についても、それぞれ５℃で暗所に７日間保存した。
４．試料のクレアチンキナーゼ活性値の測定
前記２の各試料のクレアチンキナーゼ活性値の測定は、東芝メディカルシステムズ社の自動分析装置ＴＢＡ−１２０ＦＲを使用して、ダブルカイネティック法により行った。
（１）  前記２の（１）〜（２）のそれぞれの試料５．６μＬに、前記３の（１）で３７℃にて７日間保存した前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔従来発明（０ｍＭ）〕の１６０μＬを添加し、３７℃で反応させた。
（２）  次に、８ポイント（第１試薬添加後１３６．１８秒）から１６ポイント（第１試薬添加後２８０．４６秒）に掛けての吸光度変化量を主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍにて測定した〔「測光１」〕。（試料中に含まれていたアデニル酸キナーゼの活性値に応じた吸光度変化量の測定）
（３）  次に、１６ポイント（第１試薬添加後２８０．４６秒）から１７ポイント（第１試薬添加後２９８．４９秒）の間に、前記３の（２）で５℃にて７日間保存した前記１の（２）の（ａ）の第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕の４０μＬを添加し、３７℃で反応させた。
（４）  次に、２４ポイント（第１試薬添加後４２４．７４秒）から３３ポイント（第１試薬添加後５８７．０５秒）に掛けての吸光度変化量を主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍにて測定した〔「測光２」〕。（試料中に含まれていたクレアチンキナーゼの活性値に応じた吸光度変化量と、試料中に含まれていたアデニル酸キナーゼの活性値に応じた吸光度変化量が合わさった吸光度変化量の測定）
（５）  次に、試料に含まれていたクレアチンキナーゼの活性値を、下記の計算式により求めた。
クレアチンキナーゼ活性値（Ｕｎｉｔ／Ｌ）＝｛（ΔＡ２−ΔＲＢ２）−ｃ×（ΔＡ１−ΔＲＢ１）｝×（Ｓ＋Ｖ１＋Ｖ２）×１０６÷（Ｋ×ｄ×Ｓ）＝｛（ΔＡ２−ΔＲＢ２）−０．８０５×（ΔＡ１−ΔＲＢ１）｝×５．８３×１０３
なお、この計算式において、ΔＡ１は「測光１」において測定した１分間当りの吸光度変化量（Ａｂｓ／ｍｉｎ）を、ΔＡ２は「測光２」において測定した１分間当りの吸光度変化量（Ａｂｓ／ｍｉｎ）を、ΔＲＢ１は試料が前記の「不含試料」であるときの「測光１」において測定した１分間当りの吸光度変化量〔試薬盲検値〕（Ａｂｓ／ｍｉｎ）を、ΔＲＢ２は試料が前記の「不含試料」であるときの「測光２」において測定した１分間当りの吸光度変化量〔試薬盲検値〕（Ａｂｓ／ｍｉｎ）を、Ｓは試料の量〔５．６μＬ〕を、Ｖ１は第１試薬の量〔１６０μＬ〕を、Ｖ２は第２試薬の量〔４０μＬ〕を、ｃは液量補正係数〔（Ｓ＋Ｖ１）÷（Ｓ＋Ｖ１＋Ｖ２）＝０．８０５〕を、ＫはＮＡＤＰＨの理論モル吸光係数〔６．３０×１０３Ｌ・ｍｏｌｅ−１・ｃｍ−１（主波長：３４０ｎｍ、副波長：４０５ｎｍ）〕、及びｄはセルの光路長〔１．００ｃｍ〕を表す。
（６）  また、前記（１）において、前記３の（１）で３７℃にて７日間保存した第１試薬〔従来発明（０ｍＭ）〕に替えて、前記３の（２）で５℃にて７日間保存した前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔従来発明（０ｍＭ）〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、第１試薬として前記の第１試薬〔従来発明（０ｍＭ）〕を用いた場合の各試料のクレアチンキナーゼの活性値を得た。
（７）  更に、前記（１）において、前記３の（１）で３７℃にて７日間保存した第１試薬〔従来発明（０ｍＭ）〕に替えて、前記３の（１）で３７℃にて７日間保存した前記１の（１）の（ｂ）の第１試薬〔従来発明（０．０７８１ｍＭ）〕を用いること、又は前記３の（２）で５℃にて７日間保存した前記１の（１）の（ｂ）の第１試薬〔従来発明（０．０７８１ｍＭ）〕を用いること以外は、前記（１）〜（６）の通りに操作を行い、第１試薬として前記の第１試薬〔従来発明（０．０７８１ｍＭ）〕を用いた場合の各試料のクレアチンキナーゼの活性値を得た。
（８）  また、前記（１）において、前記３の（１）で３７℃にて７日間保存した第１試薬〔従来発明（０ｍＭ）〕に替えて、前記３の（１）で３７℃にて７日間保存した前記１の（１）の（ｃ）の第１試薬〔従来発明（０．１５６ｍＭ）〕を用いること、又は前記３の（２）で５℃にて７日間保存した前記１の（１）の（ｃ）の第１試薬〔従来発明（０．１５６ｍＭ）〕を用いること以外は、前記（１）〜（６）の通りに操作を行い、第１試薬として前記の第１試薬〔従来発明（０．１５６ｍＭ）〕を用いた場合の各試料のクレアチンキナーゼの活性値を得た。
（９）  更に、前記（１）において、前記３の（１）で３７℃にて７日間保存した第１試薬〔従来発明（０ｍＭ）〕に替えて、前記３の（１）で３７℃にて７日間保存した前記１の（１）の（ｄ）の第１試薬〔従来発明（０．３１３ｍＭ）〕を用いること、又は前記３の（２）で５℃にて７日間保存した前記１の（１）の（ｄ）の第１試薬〔従来発明（０．３１３ｍＭ）〕を用いること以外は、前記（１）〜（６）の通りに操作を行い、第１試薬として前記の第１試薬〔従来発明（０．３１３ｍＭ）〕を用いた場合の各試料のクレアチンキナーゼの活性値を得た。
（１０）  また、前記（１）において、前記３の（１）で３７℃にて７日間保存した第１試薬〔従来発明（０ｍＭ）〕に替えて、前記３の（１）で３７℃にて７日間保存した前記１の（１）の（ｅ）の第１試薬〔本発明（０．６２５ｍＭ）〕を用いること、又は前記３の（２）で５℃にて７日間保存した前記１の（１）の（ｅ）の第１試薬〔本発明（０．６２５ｍＭ）〕を用いること以外は、前記（１）〜（６）の通りに操作を行い、第１試薬として前記の第１試薬〔本発明（０．６２５ｍＭ）〕を用いた場合の各試料のクレアチンキナーゼの活性値を得た。
（１１）  更に、前記（１）において、前記３の（１）で３７℃にて７日間保存した第１試薬〔従来発明（０ｍＭ）〕に替えて、前記３の（１）で３７℃にて７日間保存した前記１の（１）の（ｆ）の第１試薬〔本発明（１．２５ｍＭ）〕を用いること、又は前記３の（２）で５℃にて７日間保存した前記１の（１）の（ｆ）の第１試薬〔本発明（１．２５ｍＭ）〕を用いること以外は、前記（１）〜（６）の通りに操作を行い、第１試薬として前記の第１試薬〔本発明（１．２５ｍＭ）〕を用いた場合の各試料のクレアチンキナーゼの活性値を得た。
（１２）  また、前記（１）において、前記３の（１）で３７℃にて７日間保存した第１試薬〔従来発明（０ｍＭ）〕に替えて、前記３の（１）で３７℃にて７日間保存した前記１の（１）の（ｇ）の第１試薬〔本発明（２．５ｍＭ）〕を用いること、又は前記３の（２）で５℃にて７日間保存した前記１の（１）の（ｇ）の第１試薬〔本発明（２．５ｍＭ）〕を用いること以外は、前記（１）〜（６）の通りに操作を行い、第１試薬として前記の第１試薬〔本発明（２．５ｍＭ）〕を用いた場合の各試料のクレアチンキナーゼの活性値を得た。
（１３）  更に、前記（１）において、前記３の（１）で３７℃にて７日間保存した第１試薬〔従来発明（０ｍＭ）〕に替えて、前記３の（１）で３７℃にて７日間保存した前記１の（１）の（ｈ）の第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕を用いること、又は前記３の（２）で５℃にて７日間保存した前記１の（１）の（ｈ）の第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕を用いること以外は、前記（１）〜（６）の通りに操作を行い、第１試薬として前記の第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕を用いた場合の各試料のクレアチンキナーゼの活性値を得た。
（１４）  また、前記（１）において、前記３の（１）で３７℃にて７日間保存した第１試薬〔従来発明（０ｍＭ）〕に替えて、前記３の（１）で３７℃にて７日間保存した前記１の（１）の（ｉ）の第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕を用いること、又は前記３の（２）で５℃にて７日間保存した前記１の（１）の（ｉ）の第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕を用いること以外は、前記（１）〜（６）の通りに操作を行い、第１試薬として前記の第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕を用いた場合の各試料のクレアチンキナーゼの活性値を得た。
（１５）  更に、前記（１）において、前記３の（１）で３７℃にて７日間保存した第１試薬〔従来発明（０ｍＭ）〕に替えて、前記３の（２）で５℃にて７日間保存した前記１の（１）の（ｊ）の第１試薬〔対照試薬〕を用いること、及び、前記（３）において、前記３の（２）で５℃にて７日間保存した第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕に替えて、前記３の（２）で５℃にて７日間保存した前記１の（２）の（ｂ）の第２試薬〔対照試薬〕を用いること、以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、第１試薬として前記の第１試薬〔対照試薬〕を用い、そして第２試薬として前記の第２試薬〔対照試薬〕を用いた場合の各試料のクレアチンキナーゼの活性値を得た。
５．測定結果
前記４において各試料のクレアチンキナーゼ活性値の測定を行って得られた結果のうち、前記の第１試薬〔従来発明（０ｍＭ）〕〜第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕の保存温度が５℃の場合のものを表３に示し、そして、前記の第１試薬〔従来発明（０ｍＭ）〕〜第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕の保存温度が３７℃の場合のものを表４に示した。
なお、この表３及び表４において、「〔１〕活性値」の欄に示した値は各試料のクレアチンキナーゼの活性値〔Ｕｎｉｔ／Ｌ〕を示す。
また、「〔２〕活性値差」の欄に示した値は、各試料における「〔１〕活性値」の欄の値から、同じ試料の第１試薬及び第２試薬ともが「対照試薬」である場合の「〔１〕活性値」の欄の値を差し引いた差の値〔Ｕｎｉｔ／Ｌ〕を示す。
そして、「〔３〕相対比率」の欄に示した値は、各試料における「〔１〕活性値」の欄の値を、同じ試料の第１試薬及び第２試薬ともが「対照試薬」である場合の「〔１〕活性値」の欄の値で除した値をパーセント表示で示す。
【表３】
0005982608.tif 000009
【表４】
0005982608.tif 000010
６．考察
（１）  表３より、前記の第１試薬〔従来発明（０ｍＭ）〕〜第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕の保存温度が５℃であるとき、第１試薬が５℃で７日間保存した第１試薬〔従来発明（０ｍＭ）〕〜第１試薬〔従来発明（０．３１３ｍＭ）〕である場合には、その測定値は本来のクレアチンキナーゼ活性値よりも大幅に低いものであり、試料中のクレアチンキナーゼ活性値の測定を定量的に行うことができないものであることが分かる。
これに対して、第１試薬が５℃で７日間保存した第１試薬〔本発明（０．６２５ｍＭ）〕〜第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕である場合には、高値域まで（９／１０希釈又は１０／１０の試料まで）試料中のクレアチンキナーゼ活性値の測定を定量的に行うことができるものであることが分かる。
この第１試薬を３７℃又は５℃で７日間保存した結果より、第１試薬が０．５ｍＭ〜１０ｍＭの濃度のグルコースを含み、かつ第２試薬がグルコースを含まないか又は１０ｍＭ以下の濃度のグルコースを含むことを特徴とする本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬においては、試料中のクレアチンキナーゼ活性値の測定を高値域まで定量的に行うことができるが、第１試薬がグルコースを含まないか又はそのグルコース濃度が１０ｍＭ未満の場合には、試料中のクレアチンキナーゼ活性値の測定を定量的に行うことができないことが確かめられた。
（２）  また、表４より、前記の第１試薬〔従来発明（０ｍＭ）〕〜第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕の保存温度が３７℃であるとき、第１試薬が３７℃で７日間保存した第１試薬〔従来発明（０ｍＭ）〕〜第１試薬〔従来発明（０．３１３ｍＭ）〕である場合には、その測定値はやはり本来のクレアチンキナーゼ活性値よりも大幅に低いものであり、試料中のクレアチンキナーゼ活性値の測定を定量的に行うことができないものであることが分かる。
これに対して、第１試薬が３７℃で７日間保存した第１試薬〔本発明（０．６２５ｍＭ）〕〜第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕である場合には、高値域まで試料中のクレアチンキナーゼ活性値の測定を定量的に行うことができるものであることが分かる。
また、第１試薬が５℃で７日間保存した第１試薬〔対照試薬〕である場合の測定値に対する、第１試薬が３７℃で７日間保存した第１試薬〔本発明（０．６２５ｍＭ）〕〜第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕である場合の測定値の相対比率は、試料−ｊにおいて、第１試薬〔本発明（０．６２５ｍＭ）〕では７２．２％であり、第１試薬〔本発明（１．２５ｍＭ）〕では９４．１％であり、第１試薬〔本発明（２．５ｍＭ）〕では９５．３％であり、第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕では９５．１％であり、第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕では９４．３％である。
この第１試薬を３７℃又は５℃で７日間保存した結果より、第１試薬が第１試薬〔本発明（０．６２５ｍＭ）〕〜第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕である場合には、測定試薬保存時の測定値の低下が抑制され、安定化されていることが分かる。
すなわち、第１試薬が０．５ｍＭ〜１０ｍＭの濃度のグルコースを含み、かつ第２試薬がグルコースを含まないか又は１０ｍＭ以下の濃度のグルコースを含むことを特徴とする本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬は、第１試薬を３７℃で７日間保存した場合においても、試料中のクレアチンキナーゼ活性値の測定を高値域まで定量的に行うことができるが、第１試薬がグルコースを含まないか又はそのグルコース濃度が１０ｍＭ未満の場合には、試料中のクレアチンキナーゼ活性値の測定を定量的に行うことができないことが確かめられた。
また、本実施例により、本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬が、３７℃という非常に過酷な条件での保存時においても、その測定値の低下が抑制され、安定化されたものであり、すなわち、本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬は、長期間安定に保つことができ、かつ長期間正確にクレアチンキナーゼ活性の測定を行うことができるという効果を有するものであることが改めて確かめられた。
更に、本実施例により、本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬が、特にクレアチンキナーゼ活性値が高い高値域における測定値の低下の抑制に効果があるものであり、長期間、高値域における直線性を維持することができるという効果を有するものであることが改めて確かめられた。
〔実施例３〕（本発明の保存時の安定化の効果の確認−３）
本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬における保存時の安定化効果を確認した。
具体的には、本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬の第２試薬を、３７℃で７日間保存した際の安定化の効果を確認した。
１．クレアチンキナーゼ活性測定試薬
（１）第１試薬
・第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕
前記の実施例１の１の（１）の（ｂ）の「第１試薬〔本発明５ｍＭ〕」を、「第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕」として用いた。
（２）第２試薬
（ａ）第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕
前記の実施例１の１の（２）の（ａ）の「第２試薬〔本発明０ｍＭ〕」を、「第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕」として用いた。
（ｂ）第２試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、０．１Ｎ酢酸でｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、１０ｍＭの濃度のグルコースを含む、第２試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕を調製した。
Ｄ−グルコース（無水）  １０．０ｍＭ
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ〔ロシュ・ダイアグノスティックス社、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来〕  ４，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
イミダゾール  １２０ｍＭ
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩  ２ｍＭ
アジ化ナトリウム  ７．７ｍＭ
酢酸マグネシウム（４水和物）  １０ｍＭ
ＡＤＰ一カリウム塩  ２ｍＭ
ジアデノシンペンタリン酸三リチウム塩  ２６μＭ
クレアチンリン酸二ナトリウム塩  １２０ｍＭ
（ｃ）第２試薬〔従来発明（３０ｍＭ）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、０．１Ｎ酢酸でｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、３０ｍＭの濃度のグルコースを含む、第２試薬〔従来発明（３０ｍＭ）〕を調製した。
Ｄ−グルコース（無水）  ３０．０ｍＭ
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ〔ロシュ・ダイアグノスティックス社、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来〕  ４，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
イミダゾール  １２０ｍＭ
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩  ２ｍＭ
アジ化ナトリウム  ７．７ｍＭ
酢酸マグネシウム（４水和物）  １０ｍＭ
ＡＤＰ一カリウム塩  ２ｍＭ
ジアデノシンペンタリン酸三リチウム塩  ２６μＭ
クレアチンリン酸二ナトリウム塩  １２０ｍＭ
（ｄ）第２試薬〔従来発明（４０ｍＭ）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、０．１Ｎ酢酸でｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、４０ｍＭの濃度のグルコースを含む、第２試薬〔従来発明（４０ｍＭ）〕を調製した。
Ｄ−グルコース（無水）  ４０．０ｍＭ
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ〔ロシュ・ダイアグノスティックス社、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来〕  ４，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
イミダゾール  １２０ｍＭ
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩  ２ｍＭ
アジ化ナトリウム  ７．７ｍＭ
酢酸マグネシウム（４水和物）  １０ｍＭ
ＡＤＰ一カリウム塩  ２ｍＭ
ジアデノシンペンタリン酸三リチウム塩  ２６μＭ
クレアチンリン酸二ナトリウム塩  １２０ｍＭ
（ｅ）第２試薬〔従来発明（５０ｍＭ）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、０．１Ｎ酢酸でｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、５０ｍＭの濃度のグルコースを含む、第２試薬〔従来発明（５０ｍＭ）〕を調製した。
Ｄ−グルコース（無水）  ５０．０ｍＭ
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ〔ロシュ・ダイアグノスティックス社、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来〕  ４，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
イミダゾール  １２０ｍＭ
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩  ２ｍＭ
アジ化ナトリウム  ７．７ｍＭ
酢酸マグネシウム（４水和物）  １０ｍＭ
ＡＤＰ一カリウム塩  ２ｍＭ
ジアデノシンペンタリン酸三リチウム塩  ２６μＭ
クレアチンリン酸二ナトリウム塩  １２０ｍＭ
（ｆ）第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、０．１Ｎ酢酸でｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、６０ｍＭの濃度のグルコースを含む、第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕を調製した。
Ｄ−グルコース（無水）  ６０．０ｍＭ
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ〔ロシュ・ダイアグノスティックス社、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来〕  ４，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
イミダゾール  １２０ｍＭ
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩  ２ｍＭ
アジ化ナトリウム  ７．７ｍＭ
酢酸マグネシウム（４水和物）  １０ｍＭ
ＡＤＰ一カリウム塩  ２ｍＭ
ジアデノシンペンタリン酸三リチウム塩  ２６μＭ
クレアチンリン酸二ナトリウム塩  １２０ｍＭ
２．試料
（１）希釈試料
ヒト血清試料にラビットのクレアチンキナーゼＭＭアイソザイムを添加したものを調製し（添加血清試料）、この添加血清試料を、「試料希釈液」（５．０ｍＭコハク酸緩衝液〔ｐＨ７．０（２０℃）〕）により、それぞれ１／１０、２／１０、３／１０、４／１０、５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、及び９／１０となるように希釈し、下記の「試料−Ａ」〜「試料−Ｉ」を調製した。
また、前記の添加血清試料を、「試料−Ｊ」（１０／１０）とした。
（ａ）「試料−Ａ」：  添加血清試料を１／１０希釈
（ｂ）「試料−Ｂ」：  添加血清試料を２／１０希釈
（ｃ）「試料−Ｃ」：  添加血清試料を３／１０希釈
（ｄ）「試料−Ｄ」：  添加血清試料を４／１０希釈
（ｅ）「試料−Ｅ」：  添加血清試料を５／１０希釈
（ｆ）「試料−Ｆ」：  添加血清試料を６／１０希釈
（ｇ）「試料−Ｇ」：  添加血清試料を７／１０希釈
（ｈ）「試料−Ｈ」：  添加血清試料を８／１０希釈
（ｉ）「試料−Ｉ」：  添加血清試料を９／１０希釈
（ｊ）「試料−Ｊ」：  添加血清試料
（２）不含試料
前記（１）における「試料希釈液」を、クレアチンキナーゼを含まない、クレアチンキナーゼ活性値が０Ｕｎｉｔ／Ｌ（単位／Ｌ）の試料、すなわち「不含試料」とした。
３．試薬の保存
（１）３７℃での保存
前記１の（２）の（ａ）の第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕、（ｂ）の第２試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕、（ｃ）の第２試薬〔従来発明（３０ｍＭ）〕、（ｄ）の第２試薬〔従来発明（４０ｍＭ）〕、（ｅ）の第２試薬〔従来発明（５０ｍＭ）〕、及び（ｆ）の第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕については、それぞれ３７℃で暗所に７日間保存した。
（２）５℃での保存
前記１の（１）の第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕については、５℃で暗所に７日間保存した。
４．試料のクレアチンキナーゼ活性値の測定
前記２の各試料のクレアチンキナーゼ活性値の測定は、東芝メディカルシステムズ社の自動分析装置ＴＢＡ−１２０ＦＲを使用して、ダブルカイネティック法により行った。
（１）  前記２の（１）〜（２）のそれぞれの試料５．６μＬに、前記３の（２）で５℃にて７日間保存した前記１の（１）の第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕の１６０μＬを添加し、３７℃で反応させた。
（２）  次に、８ポイント（第１試薬添加後１３６．１８秒）から１６ポイント（第１試薬添加後２８０．４６秒）に掛けての吸光度変化量を主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍにて測定した〔「測光１」〕。（試料中に含まれていたアデニル酸キナーゼの活性値に応じた吸光度変化量の測定）
（３）  次に、１６ポイント（第１試薬添加後２８０．４６秒）から１７ポイント（第１試薬添加後２９８．４９秒）の間に、前記３の（１）で３７℃にて７日間保存した前記１の（２）の（ａ）の第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕の４０μＬを添加し、３７℃で反応させた。
（４）  次に、２４ポイント（第１試薬添加後４２４．７４秒）から３３ポイント（第１試薬添加後５８７．０５秒）に掛けての吸光度変化量を主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍにて測定した〔「測光２」〕。（試料中に含まれていたクレアチンキナーゼの活性値に応じた吸光度変化量と、試料中に含まれていたアデニル酸キナーゼの活性値に応じた吸光度変化量が合わさった吸光度変化量の測定）
（５）  次に、試料に含まれていたクレアチンキナーゼの活性値を、下記の計算式により求めた。
クレアチンキナーゼ活性値（Ｕｎｉｔ／Ｌ）＝｛（ΔＡ２−ΔＲＢ２）−ｃ×（ΔＡ１−ΔＲＢ１）｝×（Ｓ＋Ｖ１＋Ｖ２）×１０６÷（Ｋ×ｄ×Ｓ）＝｛（ΔＡ２−ΔＲＢ２）−０．８０５×（ΔＡ１−ΔＲＢ１）｝×５．８３×１０３
なお、この計算式において、ΔＡ１は「測光１」において測定した１分間当りの吸光度変化量（Ａｂｓ／ｍｉｎ）を、ΔＡ２は「測光２」において測定した１分間当りの吸光度変化量（Ａｂｓ／ｍｉｎ）を、ΔＲＢ１は試料が前記の「不含試料」であるときの「測光１」において測定した１分間当りの吸光度変化量〔試薬盲検値〕（Ａｂｓ／ｍｉｎ）を、ΔＲＢ２は試料が前記の「不含試料」であるときの「測光２」において測定した１分間当りの吸光度変化量〔試薬盲検値〕（Ａｂｓ／ｍｉｎ）を、Ｓは試料の量〔５．６μＬ〕を、Ｖ１は第１試薬の量〔１６０μＬ〕を、Ｖ２は第２試薬の量〔４０μＬ〕を、ｃは液量補正係数〔（Ｓ＋Ｖ１）÷（Ｓ＋Ｖ１＋Ｖ２）＝０．８０５〕を、ＫはＮＡＤＰＨの理論モル吸光係数〔６．３０×１０３Ｌ・ｍｏｌｅ−１・ｃｍ−１（主波長：３４０ｎｍ、副波長：４０５ｎｍ）〕、及びｄはセルの光路長〔１．００ｃｍ〕を表す。
（６）  また、前記（３）において、前記３の（１）で３７℃にて７日間保存した第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕に替えて、前記３の（１）で３７℃にて７日間保存した前記１の（２）の（ｂ）の第２試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、第２試薬として前記の第２試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕を用いた場合の各試料のクレアチンキナーゼの活性値を得た。
（７）  更に、前記（３）において、前記３の（１）で３７℃にて７日間保存した第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕に替えて、前記３の（１）で３７℃にて７日間保存した前記１の（２）の（ｃ）の第２試薬〔従来発明（３０ｍＭ）〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、第２試薬として前記の第２試薬〔従来発明（３０ｍＭ）〕を用いた場合の各試料のクレアチンキナーゼの活性値を得た。
（８）  また、前記（３）において、前記３の（１）で３７℃にて７日間保存した第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕に替えて、前記３の（１）で３７℃にて７日間保存した前記１の（２）の（ｄ）の第２試薬〔従来発明（４０ｍＭ）〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、第２試薬として前記の第２試薬〔従来発明（４０ｍＭ）〕を用いた場合の各試料のクレアチンキナーゼの活性値を得た。
（９）  更に、前記（３）において、前記３の（１）で３７℃にて７日間保存した第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕に替えて、前記３の（１）で３７℃にて７日間保存した前記１の（２）の（ｅ）の第２試薬〔従来発明（５０ｍＭ）〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、第２試薬として前記の第２試薬〔従来発明（５０ｍＭ）〕を用いた場合の各試料のクレアチンキナーゼの活性値を得た。
（１０）  また、前記（３）において、前記３の（１）で３７℃にて７日間保存した第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕に替えて、前記３の（１）で３７℃にて７日間保存した前記１の（２）の（ｆ）の第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、第２試薬として前記の第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕を用いた場合の各試料のクレアチンキナーゼの活性値を得た。
５．測定結果
前記４において各試料のクレアチンキナーゼ活性値の測定を行って得られた結果を、表５に示した。
なお、この表５において、「〔１〕活性値」の欄に示した値は各試料のクレアチンキナーゼの活性値〔Ｕｎｉｔ／Ｌ〕を示す。
また、「〔２〕活性値差」の欄に示した値は、各試料における「〔１〕活性値」の欄の値から、同じ試料の、第１試薬が第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕＜５℃・暗所・７日間保存＞であり、そして第２試薬が第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕＜３７℃・暗所・７日間保存＞である場合の「〔１〕活性値」の欄の値を差し引いた差の値〔Ｕｎｉｔ／Ｌ〕を示す。
また、「〔３〕相対比率」の欄に示した値は、各試料における「〔１〕活性値」の欄の値を、同じ試料の、第１試薬が第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕＜５℃・暗所・７日間保存＞であり、そして第２試薬が第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕＜３７℃・暗所・７日間保存＞である場合の「〔１〕活性値」の欄の値で除した値をパーセント表示で示す。
【表５】
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６．考察
（１）  表５において、第２試薬が３７℃で７日間保存した第２試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕である場合の測定値は、やはり３７℃で７日間保存した第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕の場合の測定値と、ほぼ同一の値となっている。
これに対して、第２試薬が３７℃で７日間保存した第２試薬〔従来発明（３０ｍＭ）〕、第２試薬〔従来発明（４０ｍＭ）〕、第２試薬〔従来発明（５０ｍＭ）〕、又は第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕である場合には、３７℃で７日間保存した第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕の場合に比べて、その測定値は低い値となっている。
この場合、そのクレアチンキナーゼ活性値が高い試料ほど測定試薬保存による測定値の低下度は大きい傾向にあり、その測定値の低下度（表５の「〔２〕活性値差」の値）は、例えば、試料が「試料−Ｈ」〜「試料−Ｊ」においては、第２試薬が第２試薬〔従来発明（３０ｍＭ）〕の場合には−３Ｕｎｉｔ／Ｌ〜−１９Ｕｎｉｔ／Ｌであり、第２試薬〔従来発明（４０ｍＭ）〕の場合には−２９Ｕｎｉｔ／Ｌ〜−３９Ｕｎｉｔ／Ｌであり、第２試薬〔従来発明（５０ｍＭ）〕の場合には−４４Ｕｎｉｔ／Ｌ〜−５３Ｕｎｉｔ／Ｌであり、そして、第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕の場合には−７０Ｕｎｉｔ／Ｌ〜−８６Ｕｎｉｔ／Ｌである。
この第２試薬を３７℃で７日間保存した結果より、第２試薬のグルコース濃度が、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、又は６０ｍＭである場合には、第２試薬がグルコースを含まないか又は１０ｍＭ以下の濃度のグルコースを含む場合に比較して、測定試薬保存時の測定値の低下度には大きな差異があり、測定値が低下してしまっていることが分かる。
そして、第２試薬がグルコースを含まないか又は１０ｍＭ以下の濃度のグルコースを含む場合には、測定値の低下が抑制され、安定化されていることが分かる。
（２）  以上のことより、第１試薬が０．５ｍＭ〜１０ｍＭの濃度のグルコースを含み、かつ第２試薬がグルコースを含まないか又は１０ｍＭ以下の濃度のグルコースを含むことを特徴とする本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬は、従来のクレアチンキナーゼ活性測定試薬に比べ、３７℃という非常に過酷な条件での保存時においても、その測定値の低下が抑制され、安定化されたものであり、すなわち、本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬は、長期間安定に保つことができ、かつ長期間正確にクレアチンキナーゼ活性の測定を行うことができるという効果を有するものであることが改めて確かめられた。
また、本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬は、従来のクレアチンキナーゼ活性測定試薬に比べ、特にクレアチンキナーゼ活性値が高い高値域における測定値の低下の抑制に効果があるものであり、すなわち、本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬は、長期間、高値域における直線性を維持することができるという効果を有するものであることが改めて確かめられた。
〔実施例４〕（本発明の保存時の安定化の効果の確認−４）
本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬における保存時の安定化効果を確認した。
具体的には、本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬において、第１試薬は測定時に調製したもの又は５℃で１０ヶ月間保存したものを使用し、第２試薬は５℃で１０ヶ月間保存したもの（又は測定時に調製したもの）を使用し、安定化の効果を確認した。
１．クレアチンキナーゼ活性測定試薬
（１）第１試薬
（ａ）第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕
前記の実施例１の１の（１）の（ｂ）の「第１試薬〔本発明５ｍＭ〕」を、「第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕」として用いた。
（ｂ）第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕
前記の実施例１の１の（１）の（ｃ）の「第１試薬〔本発明１０ｍＭ〕」を、「第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕」として用いた。
（２）第２試薬
（ａ）第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕
前記の実施例１の１の（２）の（ａ）の「第２試薬〔本発明０ｍＭ〕」を、「第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕」として用いた。
（ｂ）第２試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕
前記の実施例３の１の（２）の（ｂ）の「第２試薬〔本発明１０ｍＭ〕」を、「第２試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕」として用いた。
（ｃ）第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕
前記の実施例３の１の（２）の（ｆ）の「第２試薬〔従来発明６０ｍＭ〕」を、「第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕」として用いた。
２．試料
（１）希釈試料
ヒト血清試料にヒトのクレアチンキナーゼＢＢアイソザイムを添加したものを調製し（添加血清試料）、この添加血清試料を「試料希釈液」（５．０ｍＭコハク酸緩衝液〔ｐＨ７．０（２０℃）〕）により、それぞれ１／１０、２／１０、３／１０、４／１０、５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、及び９／１０となるように希釈し、下記の「試料−（１）」〜「試料−（９）」を調製した。
また、前記の添加血清試料を「試料−（１０）」（１０／１０）とした。
（ａ）「試料−（１）」：  添加血清試料を１／１０希釈
（ｂ）「試料−（２）」：  添加血清試料を２／１０希釈
（ｃ）「試料−（３）」：  添加血清試料を３／１０希釈
（ｄ）「試料−（４）」：  添加血清試料を４／１０希釈
（ｅ）「試料−（５）」：  添加血清試料を５／１０希釈
（ｆ）「試料−（６）」：  添加血清試料を６／１０希釈
（ｇ）「試料−（７）」：  添加血清試料を７／１０希釈
（ｈ）「試料−（８）」：  添加血清試料を８／１０希釈
（ｉ）「試料−（９）」：  添加血清試料を９／１０希釈
（ｊ）「試料−（１０）」：  添加血清試料
（２）不含試料
前記（１）における「試料希釈液」を、クレアチンキナーゼを含まない、クレアチンキナーゼ活性値が０Ｕｎｉｔ／Ｌ（単位／Ｌ）の試料、すなわち「不含試料」とした。
３．試薬の保存又は測定時の調製
（１）５℃での保存
前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕、及び（ｂ）の第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕については、それぞれ５℃で暗所に１０ヶ月間保存した。
また、前記１の（２）の（ａ）の第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕、（ｂ）の第２試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕、及び（ｃ）の第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕についても、それぞれ５℃で暗所に１０ヶ月間保存した。
（２）測定時の調製
前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕、及び（ｂ）の第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕については、下記４の試料のクレアチンキナーゼ活性値の測定時にも調製を行い、測定に使用した。
また、前記１の（２）の（ｃ）の第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕については、これも下記４の試料のクレアチンキナーゼ活性値の測定時にも調製を行い、測定に使用した。
４．試料のクレアチンキナーゼ活性値の測定
前記２の各試料のクレアチンキナーゼ活性値の測定は、東芝メディカルシステムズ社の自動分析装置ＴＢＡ−１２０ＦＲを使用して、ダブルカイネティック法により行った。
（１）  前記２の（１）〜（２）のそれぞれの試料５．６μＬに、前記３の（２）の通りこの測定時に調製した前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕の１６０μＬを添加し、３７℃で反応させた。
（２）  次に、８ポイント（第１試薬添加後１３６．１８秒）から１６ポイント（第１試薬添加後２８０．４６秒）に掛けての吸光度変化量を主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍにて測定した〔「測光１」〕。（試料中に含まれていたアデニル酸キナーゼの活性値に応じた吸光度変化量の測定）
（３）  次に、１６ポイント（第１試薬添加後２８０．４６秒）から１７ポイント（第１試薬添加後２９８．４９秒）の間に、前記３の（１）で５℃にて１０ヶ月間保存した前記１の（２）の（ａ）の第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕の４０μＬを添加し、３７℃で反応させた。
（４）  次に、２４ポイント（第１試薬添加後４２４．７４秒）から３３ポイント（第１試薬添加後５８７．０５秒）に掛けての吸光度変化量を主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍにて測定した〔「測光２」〕。（試料中に含まれていたクレアチンキナーゼの活性値に応じた吸光度変化量と、試料中に含まれていたアデニル酸キナーゼの活性値に応じた吸光度変化量が合わさった吸光度変化量の測定）
（５）  次に、試料に含まれていたクレアチンキナーゼの活性値を、下記の計算式により求めた。
クレアチンキナーゼ活性値（Ｕｎｉｔ／Ｌ）＝｛（ΔＡ２−ΔＲＢ２）−ｃ×（ΔＡ１−ΔＲＢ１）｝×（Ｓ＋Ｖ１＋Ｖ２）×１０６÷（Ｋ×ｄ×Ｓ）＝｛（ΔＡ２−ΔＲＢ２）−０．８０５×（ΔＡ１−ΔＲＢ１）｝×５．８３×１０３
なお、この計算式において、ΔＡ１は「測光１」において測定した１分間当りの吸光度変化量（Ａｂｓ／ｍｉｎ）を、ΔＡ２は「測光２」において測定した１分間当りの吸光度変化量（Ａｂｓ／ｍｉｎ）を、ΔＲＢ１は試料が前記の「不含試料」であるときの「測光１」において測定した１分間当りの吸光度変化量〔試薬盲検値〕（Ａｂｓ／ｍｉｎ）を、ΔＲＢ２は試料が前記の「不含試料」であるときの「測光２」において測定した１分間当りの吸光度変化量〔試薬盲検値〕（Ａｂｓ／ｍｉｎ）を、Ｓは試料の量〔５．６μＬ〕を、Ｖ１は第１試薬の量〔１６０μＬ〕を、Ｖ２は第２試薬の量〔４０μＬ〕を、ｃは液量補正係数〔（Ｓ＋Ｖ１）÷（Ｓ＋Ｖ１＋Ｖ２）＝０．８０５〕を、ＫはＮＡＤＰＨの理論モル吸光係数〔６．３０×１０３Ｌ・ｍｏｌｅ−１・ｃｍ−１（主波長：３４０ｎｍ、副波長：４０５ｎｍ）〕、及びｄはセルの光路長〔１．００ｃｍ〕を表す。
（６）  また、前記（３）において、前記３の（１）で５℃にて１０ヶ月間保存した第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕に替えて、前記３の（１）で５℃にて１０ヶ月間保存した前記１の（２）の（ｂ）の第２試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、第２試薬として前記の第２試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞を用いた場合の各試料のクレアチンキナーゼの活性値を得た。
（７）  更に、前記（３）において、前記３の（１）で５℃にて１０ヶ月間保存した第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕に替えて、前記３の（１）で５℃にて１０ヶ月間保存した前記１の（２）の（ｃ）の第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、第２試薬として前記の第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞を用いた場合の各試料のクレアチンキナーゼの活性値を得た。
（８）  また、前記（３）において、前記３の（１）で５℃にて１０ヶ月間保存した第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕に替えて、前記３の（２）の通りこの測定時に調製した前記１の（２）の（ｃ）の第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、第２試薬として前記の第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕＜測定時調製＞を用いた場合の各試料のクレアチンキナーゼの活性値を得た。
（９）  更に、前記（１）において、前記３の（２）の通りこの測定時に調製した前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕に替えて、前記３の（２）の通りこの測定時に調製した前記１の（１）の（ｂ）の第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕を用いること以外は、前記（１）〜（８）の通りに操作を行い、第１試薬として前記の第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕＜測定時調製＞を用い、第２試薬として前記の第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞、第２試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞、第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞、又は第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕＜測定時調製＞をそれぞれ用いた場合の各試料のクレアチンキナーゼの活性値を得た。
（１０）  また、前記（１）において、前記３の（２）の通りこの測定時に調製した前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕に替えて、前記３の（１）で５℃にて１０ヶ月間保存した前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕を用いること以外は、前記（１）〜（８）の通りに操作を行い、第１試薬として前記の第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞を用い、第２試薬として前記の第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞、第２試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞、第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞、又は第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕＜測定時調製＞をそれぞれ用いた場合の各試料のクレアチンキナーゼの活性値を得た。
（１１）  更に、前記（１）において、前記３の（２）の通りこの測定時に調製した前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕に替えて、前記３の（１）で５℃にて１０ヶ月間保存した前記１の（１）の（ｂ）の第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕を用いること以外は、前記（１）〜（８）の通りに操作を行い、第１試薬として前記の第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞を用い、第２試薬として前記の第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞、第２試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞、第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞、又は第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕＜測定時調製＞をそれぞれ用いた場合の各試料のクレアチンキナーゼの活性値を得た。
５．測定結果
（１）第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕＜測定時調製＞使用時
前記４の（１）〜（８）における、第１試薬として前記の第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕＜測定時調製＞を用い、第２試薬として前記の第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞、第２試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞、第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞、又は第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕＜測定時調製＞をそれぞれ用いた場合の各試料のクレアチンキナーゼの活性値の測定結果を、表６に示した。
なお、この表６において、「〔１〕活性値」の欄に示した値は各試料のクレアチンキナーゼの活性値〔Ｕｎｉｔ／Ｌ〕を示す。
また、「〔２〕活性値差」の欄に示した値は、各試料における「〔１〕活性値」の欄の値から、同じ試料の、第１試薬が第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕＜測定時調製＞であり、そして第２試薬が第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕＜測定時調製＞である場合の「〔１〕活性値」の欄の値を差し引いた差の値〔Ｕｎｉｔ／Ｌ〕を示す。
また、「〔３〕相対比率」の欄に示した値は、各試料における「〔１〕活性値」の欄の値を、同じ試料の、第１試薬が第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕＜測定時調製＞であり、そして第２試薬が第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕＜測定時調製＞である場合の「〔１〕活性値」の欄の値で除した値をパーセント表示で示す。
（２）第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕＜測定時調製＞使用時
前記４の（９）における、第１試薬として前記の第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕＜測定時調製＞を用い、第２試薬として前記の第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞、第２試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞、第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞、又は第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕＜測定時調製＞をそれぞれ用いた場合の各試料のクレアチンキナーゼの活性値の測定結果を、表７に示した。
なお、この表７において、「〔１〕活性値」の欄に示した値は各試料のクレアチンキナーゼの活性値〔Ｕｎｉｔ／Ｌ〕を示す。
また、「〔２〕活性値差」の欄に示した値は、各試料における「〔１〕活性値」の欄の値から、同じ試料の、第１試薬が第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕＜測定時調製＞であり、そして第２試薬が第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕＜測定時調製＞である場合の「〔１〕活性値」の欄の値を差し引いた差の値〔Ｕｎｉｔ／Ｌ〕を示す。
また、「〔３〕相対比率」の欄に示した値は、各試料における「〔１〕活性値」の欄の値を、同じ試料の、第１試薬が第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕＜測定時調製＞であり、そして第２試薬が第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕＜測定時調製＞である場合の「〔１〕活性値」の欄の値で除した値をパーセント表示で示す。
（３）第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞使用時
前記４の（１０）における、第１試薬として前記の第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞を用い、第２試薬として前記の第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞、第２試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞、第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞、又は第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕＜測定時調製＞をそれぞれ用いた場合の各試料のクレアチンキナーゼの活性値の測定結果を、表８に示した。
なお、この表８において、「〔１〕活性値」の欄に示した値は各試料のクレアチンキナーゼの活性値〔Ｕｎｉｔ／Ｌ〕を示す。
また、「〔２〕活性値差」の欄に示した値は、各試料における「〔１〕活性値」の欄の値から、同じ試料の、第１試薬が第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞であり、そして第２試薬が第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕＜測定時調製＞である場合の「〔１〕活性値」の欄の値を差し引いた差の値〔Ｕｎｉｔ／Ｌ〕を示す。
また、「〔３〕相対比率」の欄に示した値は、各試料における「〔１〕活性値」の欄の値を、同じ試料の、第１試薬が第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞であり、そして第２試薬が第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕＜測定時調製＞である場合の「〔１〕活性値」の欄の値で除した値をパーセント表示で示す。
（４）第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞使用時
前記４の（１１）における、第１試薬として前記の第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞を用い、第２試薬として前記の第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞、第２試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞、第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞、又は第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕＜測定時調製＞をそれぞれ用いた場合の各試料のクレアチンキナーゼの活性値の測定結果を、表９に示した。
なお、この表９において、「〔１〕活性値」の欄に示した値は各試料のクレアチンキナーゼの活性値〔Ｕｎｉｔ／Ｌ〕を示す。
また、「〔２〕活性値差」の欄に示した値は、各試料における「〔１〕活性値」の欄の値から、同じ試料の、第１試薬が第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞であり、そして第２試薬が第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕＜測定時調製＞である場合の「〔１〕活性値」の欄の値を差し引いた差の値〔Ｕｎｉｔ／Ｌ〕を示す。
また、「〔３〕相対比率」の欄に示した値は、各試料における「〔１〕活性値」の欄の値を、同じ試料の、第１試薬が第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞であり、そして第２試薬が第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕＜測定時調製＞である場合の「〔１〕活性値」の欄の値で除した値をパーセント表示で示す。
【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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６．考察
（１）第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕＜測定時調製＞使用時
第１試薬が第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕＜測定時調製＞であるときの測定結果を示した表６において、第２試薬が５℃で１０ヶ月間保存した第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕である場合の測定値は、やはり５℃で１０ヶ月間保存した第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕や第２試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕の場合の測定値に比べ、低い値となっている。
この場合、そのクレアチンキナーゼ活性値が高い試料ほど測定試薬保存による測定値の低下度は大きい傾向にあり、その測定値の低下度（表６の「〔２〕活性値差」の値）は、例えば、試料が「試料−（８）」〜「試料−（１０）」においては、第２試薬が第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞の場合には−２９１Ｕｎｉｔ／Ｌ〜−３６５Ｕｎｉｔ／Ｌであり、第２試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞の場合には−２７４Ｕｎｉｔ／Ｌ〜−２９０Ｕｎｉｔ／Ｌであり、そして、第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞の場合には−３９０Ｕｎｉｔ／Ｌ〜−４５８Ｕｎｉｔ／Ｌである。
この第２試薬を５℃で１０ヶ月間保存（又は測定時調製）した結果より、第２試薬のグルコース濃度が６０ｍＭである場合には、第２試薬がグルコースを含まないか又は１０ｍＭ以下の濃度のグルコースを含む場合に比較して、測定試薬保存時の測定値の低下度には大きな差異があり、測定値が低下してしまっていることが分かる。
そして、第２試薬がグルコースを含まないか又は１０ｍＭ以下の濃度のグルコースを含む場合には、測定値の低下が抑制され、安定化されていることが分かる。
（２）第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕＜測定時調製＞使用時
第１試薬が第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕＜測定時調製＞であるときの測定結果を示した表７において、第２試薬が５℃で１０ヶ月間保存した第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕である場合の測定値は、やはり５℃で１０ヶ月間保存した第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕や第２試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕の場合の測定値に比べ、低い値となっている。
この場合も、そのクレアチンキナーゼ活性値が高い試料ほど測定試薬保存による測定値の低下度は大きい傾向にあり、その測定値の低下度（表７の「〔２〕活性値差」の値）は、例えば、試料が「試料−（８）」〜「試料−（１０）」においては、第２試薬が第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞の場合には−２９４Ｕｎｉｔ／Ｌ〜−３４１Ｕｎｉｔ／Ｌであり、第２試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞の場合には−２７８Ｕｎｉｔ／Ｌ〜−２８５Ｕｎｉｔ／Ｌであり、そして、第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞の場合には−３７９Ｕｎｉｔ／Ｌ〜−４３９Ｕｎｉｔ／Ｌである。
この第２試薬を５℃で１０ヶ月間保存（又は測定時調製）した結果より、第２試薬のグルコース濃度が６０ｍＭである場合には、第２試薬がグルコースを含まないか又は１０ｍＭ以下の濃度のグルコースを含む場合に比較して、測定試薬保存時の測定値の低下度には大きな差異があり、測定値が低下してしまっていることが分かる。
そして、第２試薬がグルコースを含まないか又は１０ｍＭ以下の濃度のグルコースを含む場合には、測定値の低下が抑制され、安定化されていることが分かる。
（３）第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞使用時
第１試薬が第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞であるときの測定結果を示した表８において、第２試薬が５℃で１０ヶ月間保存した第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕である場合の測定値は、やはり５℃で１０ヶ月間保存した第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕や第２試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕の場合の測定値に比べ、低い値となっている。
この場合も、そのクレアチンキナーゼ活性値が高い試料ほど測定試薬保存による測定値の低下度は大きい傾向にあり、その測定値の低下度（表８の「〔２〕活性値差」の値）は、例えば、試料が「試料−（８）」〜「試料−（１０）」においては、第２試薬が第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞の場合には−５９８Ｕｎｉｔ／Ｌ〜−７０４Ｕｎｉｔ／Ｌであり、第２試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞の場合には−５６０Ｕｎｉｔ／Ｌ〜−６７４Ｕｎｉｔ／Ｌであり、そして、第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞の場合には−８５１Ｕｎｉｔ／Ｌ〜−１，１２２Ｕｎｉｔ／Ｌである。
この第２試薬を５℃で１０ヶ月間保存（又は測定時調製）した結果より、第２試薬のグルコース濃度が６０ｍＭである場合には、第２試薬がグルコースを含まないか又は１０ｍＭ以下の濃度のグルコースを含む場合に比較して、測定試薬保存時の測定値の低下度には大きな差異があり、測定値が低下してしまっていることが分かる。
更に、この第２試薬のグルコース濃度が６０ｍＭである場合の測定値の低下度は、このように第１試薬を５℃にて１０ヶ月間保存したときは、前記（１）及び（２）のように第１試薬が測定時に調製されたものであるときに比べ、より大きいものであることが分かる。
そして、第２試薬がグルコースを含まないか又は１０ｍＭ以下の濃度のグルコースを含む場合には、測定値の低下が抑制され、安定化されていることが分かる。
（４）第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞使用時
第１試薬が第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞であるときの測定結果を示した表９において、第２試薬が５℃で１０ヶ月間保存した第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕である場合の測定値は、やはり５℃で１０ヶ月間保存した第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕や第２試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕の場合の測定値に比べ、低い値となっている。
この場合も、そのクレアチンキナーゼ活性値が高い試料ほど測定試薬保存による測定値の低下度は大きい傾向にあり、その測定値の低下度（表９の「〔２〕活性値差」の値）は、例えば、試料が「試料−（８）」〜「試料−（１０）」においては、第２試薬が第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞の場合には−６５２Ｕｎｉｔ／Ｌ〜−７６９Ｕｎｉｔ／Ｌであり、第２試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞の場合には−６１７Ｕｎｉｔ／Ｌ〜−７５１Ｕｎｉｔ／Ｌであり、そして、第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１０ヶ月間保存＞の場合には−１，０５７Ｕｎｉｔ／Ｌ〜−１，２７９Ｕｎｉｔ／Ｌである。
この第２試薬を５℃で１０ヶ月間保存（又は測定時調製）した結果より、第２試薬のグルコース濃度が６０ｍＭである場合には、第２試薬がグルコースを含まないか又は１０ｍＭ以下の濃度のグルコースを含む場合に比較して、測定試薬保存時の測定値の低下度には大きな差異があり、測定値が低下してしまっていることが分かる。
更に、この第２試薬のグルコース濃度が６０ｍＭである場合の測定値の低下度は、このように第１試薬を５℃にて１０ヶ月間保存したときは、前記（１）及び（２）のように第１試薬が測定時に調製されたものであるときに比べ、より大きいものであることが分かる。
そして、第２試薬がグルコースを含まないか又は１０ｍＭ以下の濃度のグルコースを含む場合には、測定値の低下が抑制され、安定化されていることが分かる。
（５）まとめ
以上のことより、第１試薬が０．５ｍＭ〜１０ｍＭの濃度のグルコースを含み、かつ第２試薬がグルコースを含まないか又は１０ｍＭ以下の濃度のグルコースを含むことを特徴とする本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬は、従来のクレアチンキナーゼ活性測定試薬に比べ、５℃にて１０ヶ月間という長期間の保存時においても、その測定値の低下が抑制され、安定化されたものであり、すなわち、本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬は、長期間安定に保つことができ、かつ長期間正確にクレアチンキナーゼ活性の測定を行うことができるという効果を有するものであることが改めて確かめられた。
また、本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬は、従来のクレアチンキナーゼ活性測定試薬に比べ、特にクレアチンキナーゼ活性値が高い高値域における測定値の低下の抑制に効果があるものであり、すなわち、本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬は、長期間、高値域における直線性を維持することができるという効果を有するものであることが改めて確かめられた。
〔実施例５〕（本発明の保存時の安定化の効果の確認−５）
本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬における保存時の安定化効果を確認した。
具体的には、本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬において、第１試薬は５℃で１２ヶ月間保存したもの（又は測定時に調製したもの）を使用し、第２試薬は５℃で１２ヶ月間保存したもの（又は測定時に調製したもの）を使用し、安定化の効果を確認した。
１．クレアチンキナーゼ活性測定試薬
（１）第１試薬
（ａ）第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕
前記の実施例１の１の（１）の（ｂ）の「第１試薬〔本発明５ｍＭ〕」を、「第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕」として用いた。
（ｂ）第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕
前記の実施例１の１の（１）の（ｃ）の「第１試薬〔本発明１０ｍＭ〕」を、「第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕」として用いた。
（ｃ）第１試薬〔従来発明（２５ｍＭ）〕
前記の実施例１の１の（１）の（ｄ）の「第１試薬〔従来発明２５ｍＭ〕」を、「第１試薬〔従来発明（２５ｍＭ）〕」として用いた。
（２）第２試薬
（ａ）第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕
前記の実施例１の１の（２）の（ａ）の「第２試薬〔本発明０ｍＭ〕」を、「第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕」として用いた。
（ｂ）第２試薬〔従来発明（３０ｍＭ）〕
前記の実施例３の１の（２）の（ｃ）の「第２試薬〔従来発明３０ｍＭ〕」を、「第２試薬〔従来発明（３０ｍＭ）〕」として用いた。
（ｃ）第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕
前記の実施例３の１の（２）の（ｆ）の「第２試薬〔従来発明６０ｍＭ〕」を、「第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕」として用いた。
２．試料
（１）希釈試料
ヒト血清試料にヒトのクレアチンキナーゼＢＢアイソザイムを添加したものを調製し（添加血清試料）、この添加血清試料を「試料希釈液」（５．０ｍＭコハク酸緩衝液〔ｐＨ７．０（２０℃）〕）により、それぞれ１／１０、２／１０、３／１０、４／１０、５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、及び９／１０となるように希釈し、下記の「試料−〔１〕」〜「試料−〔９〕」を調製した。
また、前記の添加血清試料を「試料−〔１０〕」（１０／１０）とした。
（ａ）「試料−〔１〕」：  添加血清試料を１／１０希釈
（ｂ）「試料−〔２〕」：  添加血清試料を２／１０希釈
（ｃ）「試料−〔３〕」：  添加血清試料を３／１０希釈
（ｄ）「試料−〔４〕」：  添加血清試料を４／１０希釈
（ｅ）「試料−〔５〕」：  添加血清試料を５／１０希釈
（ｆ）「試料−〔６〕」：  添加血清試料を６／１０希釈
（ｇ）「試料−〔７〕」：  添加血清試料を７／１０希釈
（ｈ）「試料−〔８〕」：  添加血清試料を８／１０希釈
（ｉ）「試料−〔９〕」：  添加血清試料を９／１０希釈
（ｊ）「試料−〔１０〕」：  添加血清試料
（２）不含試料
前記（１）における「試料希釈液」を、クレアチンキナーゼを含まない、クレアチンキナーゼ活性値が０Ｕｎｉｔ／Ｌ（単位／Ｌ）の試料、すなわち「不含試料」とした。
３．試薬の保存又は測定時の調製
（１）５℃での保存
前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕、（ｂ）の第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕、及び（ｃ）第１試薬〔従来発明（２５ｍＭ）〕については、それぞれ５℃で暗所に１２ヶ月間保存した。
また、前記１の（２）の（ａ）の第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕、（ｂ）の第２試薬〔従来発明（３０ｍＭ）〕、及び（ｃ）の第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕についても、それぞれ５℃で暗所に１２ヶ月間保存した。
（２）測定時の調製
前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕については、下記４の試料のクレアチンキナーゼ活性値の測定時にも調製を行い、第１試薬の対照試薬として測定に使用した。
また、前記１の（２）の（ｃ）の第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕については、これも下記４の試料のクレアチンキナーゼ活性値の測定時にも調製を行い、第２試薬の対照試薬として測定に使用した。
４．試料のクレアチンキナーゼ活性値の測定
前記２の各試料のクレアチンキナーゼ活性値の測定は、東芝メディカルシステムズ社の自動分析装置ＴＢＡ−１２０ＦＲを使用して、ダブルカイネティック法により行った。
（１）  前記２の（１）〜（２）のそれぞれの試料５．６μＬに、前記３の（１）で５℃にて１２ヶ月保存した前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕の１６０μＬを添加し、３７℃で反応させた。
（２）  次に、８ポイント（第１試薬添加後１３６．１８秒）から１６ポイント（第１試薬添加後２８０．４６秒）に掛けての吸光度変化量を主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍにて測定した〔「測光１」〕。（試料中に含まれていたアデニル酸キナーゼの活性値に応じた吸光度変化量の測定）
（３）  次に、１６ポイント（第１試薬添加後２８０．４６秒）から１７ポイント（第１試薬添加後２９８．４９秒）の間に、前記３の（１）で５℃にて１２ヶ月間保存した前記１の（２）の（ａ）の第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕の４０μＬを添加し、３７℃で反応させた。
（４）  次に、２４ポイント（第１試薬添加後４２４．７４秒）から３３ポイント（第１試薬添加後５８７．０５秒）に掛けての吸光度変化量を主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍにて測定した〔「測光２」〕。（試料中に含まれていたクレアチンキナーゼの活性値に応じた吸光度変化量と、試料中に含まれていたアデニル酸キナーゼの活性値に応じた吸光度変化量が合わさった吸光度変化量の測定）
（５）  次に、試料に含まれていたクレアチンキナーゼの活性値を、下記の計算式により求めた。
クレアチンキナーゼ活性値（Ｕｎｉｔ／Ｌ）＝｛（ΔＡ２−ΔＲＢ２）−ｃ×（ΔＡ１−ΔＲＢ１）｝×（Ｓ＋Ｖ１＋Ｖ２）×１０６÷（Ｋ×ｄ×Ｓ）＝｛（ΔＡ２−ΔＲＢ２）−０．８０５×（ΔＡ１−ΔＲＢ１）｝×５．８３×１０３
なお、この計算式において、ΔＡ１は「測光１」において測定した１分間当りの吸光度変化量（Ａｂｓ／ｍｉｎ）を、ΔＡ２は「測光２」において測定した１分間当りの吸光度変化量（Ａｂｓ／ｍｉｎ）を、ΔＲＢ１は試料が前記の「不含試料」であるときの「測光１」において測定した１分間当りの吸光度変化量〔試薬盲検値〕（Ａｂｓ／ｍｉｎ）を、ΔＲＢ２は試料が前記の「不含試料」であるときの「測光２」において測定した１分間当りの吸光度変化量〔試薬盲検値〕（Ａｂｓ／ｍｉｎ）を、Ｓは試料の量〔５．６μＬ〕を、Ｖ１は第１試薬の量〔１６０μＬ〕を、Ｖ２は第２試薬の量〔４０μＬ〕を、ｃは液量補正係数〔（Ｓ＋Ｖ１）÷（Ｓ＋Ｖ１＋Ｖ２）＝０．８０５〕を、ＫはＮＡＤＰＨの理論モル吸光係数〔６．３０×１０３Ｌ・ｍｏｌｅ−１・ｃｍ−１（主波長：３４０ｎｍ、副波長：４０５ｎｍ）〕、及びｄはセルの光路長〔１．００ｃｍ〕を表す。
（６）  また、前記（１）において、前記３の（１）で５℃にて１２ヶ月間保存した第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕に替えて、前記３の（１）で５℃にて１２ヶ月間保存した前記１の（１）の（ｂ）の第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、第１試薬として前記の第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１２ヶ月間保存＞を用いた場合の各試料のクレアチンキナーゼの活性値を得た。
（７）  更に、前記（１）において、前記３の（１）で５℃にて１２ヶ月間保存した第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕に替えて、前記３の（１）で５℃にて１２ヶ月間保存した前記１の（１）の（ｃ）の第１試薬〔従来発明（２５ｍＭ）〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、第１試薬として前記の第１試薬〔従来発明（２５ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１２ヶ月間保存＞を用いた場合の各試料のクレアチンキナーゼの活性値を得た。
（８）  また、前記（３）において、前記３の（１）で５℃にて１２ヶ月間保存した第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕に替えて、前記３の（１）で５℃にて１２ヶ月間保存した前記１の（２）の（ｂ）の第２試薬〔従来発明（３０ｍＭ）〕を用いること以外は、前記（１）〜（７）の通りに操作を行い、第１試薬として前記の第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１２ヶ月間保存＞、第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１２ヶ月間保存＞、又は第１試薬〔従来発明（２５ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１２ヶ月間保存＞をそれぞれ用い、第２試薬として前記の第２試薬〔従来発明（３０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１２ヶ月間保存＞を用いた場合の各試料のクレアチンキナーゼの活性値を得た。
（９）  更に、前記（３）において、前記３の（１）で５℃にて１２ヶ月間保存した第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕に替えて、前記３の（１）で５℃にて１２ヶ月間保存した前記１の（２）の（ｃ）の第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕を用いること以外は、前記（１）〜（７）の通りに操作を行い、第１試薬として前記の第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１２ヶ月間保存＞、第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１２ヶ月間保存＞、又は第１試薬〔従来発明（２５ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１２ヶ月間保存＞をそれぞれ用い、第２試薬として前記の第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１２ヶ月間保存＞を用いた場合の各試料のクレアチンキナーゼの活性値を得た。
（１０）  また、〔Ａ〕前記（１）において、前記３の（１）で５℃にて１２ヶ月間保存した第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕に替えて、前記３の（２）の通りこの測定時に調製した前記の第１試薬の対照試薬を用いること、及び、〔Ｂ〕前記（３）において、前記３の（１）で５℃にて１２ヶ月間保存した第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕に替えて、前記３の（２）の通りこの測定時に調製した前記の第２試薬の対照試薬を用いることの、これら〔Ａ〕と〔Ｂ〕以外のことは、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、前記の第１試薬の対照試薬、及び前記の第２試薬の対照試薬を用いた場合の各試料のクレアチンキナーゼの活性値を得た。
５．測定結果
前記４における各試料のクレアチンキナーゼの活性値の測定結果を、表１０に示した。
なお、この表１０において、「〔１〕活性値」の欄に示した値は各試料のクレアチンキナーゼの活性値〔Ｕｎｉｔ／Ｌ〕を示す。
また、「〔２〕活性値差」の欄に示した値は、各試料における「〔１〕活性値」の欄の値から、同じ試料の、第１試薬が前記の第１試薬の対照試薬であり、そして第２試薬が前記の第２試薬の対照試薬である場合の「〔１〕活性値」の欄の値を差し引いた差の値〔Ｕｎｉｔ／Ｌ〕を示す。
また、「〔３〕相対比率」の欄に示した値は、各試料における「〔１〕活性値」の欄の値を、同じ試料の、第１試薬が前記の第１試薬の対照試薬であり、そして第２試薬が前記の第２試薬の対照試薬である場合の「〔１〕活性値」の欄の値で除した値をパーセント表示で示す。
【表１０】
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６．考察
（１）第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１２ヶ月間保存＞使用時
表１０で、第２試薬が第２試薬〔本発明（０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１２ヶ月間保存＞であるときの測定結果において、第１試薬が５℃で１２ヶ月間保存した第１試薬〔従来発明（２５ｍＭ）〕である場合の測定値は、５℃で１２ヶ月間保存した第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕や第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕の場合の測定値に比べ、低くなる傾向にある。
この場合、そのクレアチンキナーゼ活性値が高い試料ほど測定試薬保存による測定値の低下度は大きい傾向にあり、その測定値の低下度（表１０の「〔２〕活性値差」の値）は、例えば、試料が「試料−〔８〕」〜「試料−〔１０〕」においては、第１試薬が第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１２ヶ月間保存＞の場合には−３２Ｕｎｉｔ／Ｌ〜−１１７Ｕｎｉｔ／Ｌであり、第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１２ヶ月間保存＞の場合には−８８Ｕｎｉｔ／Ｌ〜−４８７Ｕｎｉｔ／Ｌであり、そして、第１試薬〔従来発明（２５ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１２ヶ月間保存＞の場合には−１５７Ｕｎｉｔ／Ｌ〜−６６０Ｕｎｉｔ／Ｌである。
（２）第２試薬〔従来発明（３０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１２ヶ月間保存＞使用時
表１０で、第２試薬が第２試薬〔従来発明（３０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１２ヶ月間保存＞であるときの測定結果においても、第１試薬が５℃で１２ヶ月間保存した第１試薬〔従来発明（２５ｍＭ）〕である場合の測定値は、５℃で１２ヶ月間保存した第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕や第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕の場合の測定値に比べ、低くなる傾向にある。
この場合においても、そのクレアチンキナーゼ活性値が高い試料ほど測定試薬保存による測定値の低下度は大きい傾向にあり、その測定値の低下度（表１０の「〔２〕活性値差」の値）は、例えば、試料が「試料−〔８〕」〜「試料−〔１０〕」においては、第１試薬が第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１２ヶ月間保存＞の場合には６４Ｕｎｉｔ／Ｌ〜−４５７Ｕｎｉｔ／Ｌであり、第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１２ヶ月間保存＞の場合には−３６９Ｕｎｉｔ／Ｌ〜−４７２Ｕｎｉｔ／Ｌであり、そして、第１試薬〔従来発明（２５ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１２ヶ月間保存＞の場合には−４０３Ｕｎｉｔ／Ｌ〜−５００Ｕｎｉｔ／Ｌである。
（３）第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１２ヶ月間保存＞使用時
表１０で、第２試薬が第２試薬〔従来発明（６０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１２ヶ月間保存＞であるときの測定結果においても、第１試薬が５℃で１２ヶ月間保存した第１試薬〔従来発明（２５ｍＭ）〕である場合の測定値は、５℃で１２ヶ月間保存した第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕や第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕の場合の測定値に比べ、低くなる傾向にある。
この場合においても、そのクレアチンキナーゼ活性値が高い試料ほど測定試薬保存による測定値の低下度は大きい傾向にあり、その測定値の低下度（表１０の「〔２〕活性値差」の値）は、例えば、試料が「試料−〔８〕」〜「試料−〔１０〕」においては、第１試薬が第１試薬〔本発明（５ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１２ヶ月間保存＞の場合には−１８８Ｕｎｉｔ／Ｌ〜−６８８Ｕｎｉｔ／Ｌであり、第１試薬〔本発明（１０ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１２ヶ月間保存＞の場合には−３００Ｕｎｉｔ／Ｌ〜−７０２Ｕｎｉｔ／Ｌであり、そして、第１試薬〔従来発明（２５ｍＭ）〕＜５℃・暗所・１２ヶ月間保存＞の場合には−３２０Ｕｎｉｔ／Ｌ〜−８０３Ｕｎｉｔ／Ｌである。
（４）第１試薬についてのまとめ
前記の通り、第１試薬を５℃で１２ヶ月間保存（又は測定時調製）した結果より、第１試薬のグルコース濃度が２５ｍＭである場合には、第１試薬のグルコース濃度が５ｍＭ又は１０ｍＭである場合に比較して、測定試薬保存時の測定値の低下度には差異があり、測定値が低下する傾向にあることが分かる。
そして、第１試薬のグルコース濃度が５ｍＭ又は１０ｍＭである場合には、いずれの場合においても、測定値の低下が抑制され、安定化されていることが分かる。
（５）第２試薬についてのまとめ
前記の通り、第２試薬を５℃で１２ヶ月間保存（又は測定時調製）した結果より、第２試薬のグルコース濃度が３０ｍＭ又は６０ｍＭである場合には、第２試薬のグルコース濃度が０ｍＭである場合（すなわち、第２試薬がグルコースを含まない場合）に比較して、測定試薬保存時の測定値の低下度には差異があり、測定値が低下する傾向にあることが分かる。
そして、第２試薬がグルコースを含まない場合（０ｍＭの場合）には、測定値の低下が抑制され、安定化されていることが分かる。
（６）総まとめ
以上のことより、第１試薬が０．５ｍＭ〜１０ｍＭの濃度のグルコースを含み、かつ第２試薬がグルコースを含まないか又は１０ｍＭ以下の濃度のグルコースを含むことを特徴とする本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬は、従来のクレアチンキナーゼ活性測定試薬に比べ、５℃にて１２ヶ月間という更なる長期間の保存時においても、その測定値の低下が抑制され、安定化されたものであり、すなわち、本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬は、長期間安定に保つことができ、かつ長期間正確にクレアチンキナーゼ活性の測定を行うことができるという効果を有するものであることが改めて確かめられた。
また、本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬は、従来のクレアチンキナーゼ活性測定試薬に比べ、特にクレアチンキナーゼ活性値が高い高値域における測定値の低下の抑制に効果があるものであり、すなわち、本発明のクレアチンキナーゼ活性測定試薬は、長期間、高値域における直線性を維持することができるという効果を有するものであることが改めて確かめられた。