(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィールドフロー分画装置であって、チャンネル閉じ込め手段を備え、前記閉じ込められたチャンネルは、すべての側部を面によって囲まれており、
Ａ．前記チャンネルに沿って通過する移動相を含むチャンネルフローを提供し、調整する手段と、
Ｂ．試料アリコートを前記移動相に導入する手段と、
Ｃ．前記チャンネルに沿った複数の別個の領域の各々で、前記チャンネルフローに本質的に垂直な、単位チャンネル面積当りの別個のクロスフローを前記移動相に提供し、制御する手段とを有し、
前記チャンネル閉じ込め手段は、ベースプレート要素を含み、前記ベースプレート要素は、上が開口しており前記ベースプレート要素内に横たわるように作製された１組の分離された区画を含み、前記開口はすべて、前記ベースプレート要素の底面に平行な同一平面に横たわっており、
前記チャンネル閉じ込め手段は、前記ベースプレート要素の前記区画開口上に横たわる透過性がありセグメント化されたフリット要素をさらに含み、各前記フリット要素は、その下の対応する区画を覆っており、
前記チャンネル閉じ込め手段は、
前記セグメント化されたフリット要素を覆う透過性膜と、
前記透過性膜上のスペーサ手段とをさらに含み、前記スペーサ手段から一部分が切り抜かれることによって、全側部を前記スペーサの残りの領域によって囲まれたチャンネル切り抜き領域が設けられており、前記切り抜き領域は、前記透過性膜の下方に横たわる前記セグメント化されたフリット要素に亘っており、
前記スペーサ手段上に横たわり、前記スペーサ手段から切り抜かれた前記チャンネル領域を封止し、前記チャンネル切り抜きの上方に適切に位置決めされた３つのポートを提供するトッププレート要素をさらに含み、前記３つのポートは順に、
ｉ．移動相の流通と、
ii．前記試料アリコートの注入と、
iii．前記移動相流によって前記チャンネル切り抜きを通して運ばれた前記試料の流出とを可能にし、
前記チャンネル切り抜きに導入された流体を前記チャンネル切り抜きを通してまたは前記透過性膜および前記フリット要素を通してその下の区画の中まで流れるように制限するように、前記チャンネル閉じ込め手段を封止するための手段をさらに含む、フィールドフロー分画装置。
【請求項２】
前記チャンネル閉じ込め手段を封止するための前記手段は、前記チャンネルの変形またはＯリングである、請求項１に記載のフィールドフロー分画装置。
【請求項３】
前記チャンネルに沿った複数の別個の領域の各々で単位チャンネル面積当りの別個のクロスフローを提供する前記手段は、
各区画の底面にある出口ポートを含み、前記出口ポートは、そこに入った流体が前記透過性膜およびその上方に横たわる対応するフリット要素を通してそこから流出することを可能にし、
そのような各出口ポートから独立流体流制御手段までの流体接続手段をさらに含み、前記独立流体流制御手段によって、各対応する区画からの前記流出が制御されることによって、前記試料アリコートが前記対応する区画手段に亘って移動するときに前記試料アリコートに対する対応するクロスフローの独立した制御を可能にしており、このようにして、前記チャンネルの各セグメント化された領域でクロスフローフィールドを独立して提供する、請求項１または請求項２に記載のフィールドフロー分画装置。
【請求項４】
前記トッププレート要素は、透過性フリットを含み、前記透過性フリットを通して、前記チャンネルフローに垂直な移動相からなる２次流が送り込まれ、前記２次流は、前記セグメント化された領域の全クロスフロー必要量の供給源を提供する、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のフィールドフロー分画装置。
【請求項５】
前記トッププレート要素は、前記トッププレート要素を通るフローに対して不透過性であり、すべての制御されるセグメント化された領域に必要な全クロスフロー供給源は、チャンネル流入とチャンネル流出との差がセグメント化された全領域の総クロスフローと等しいようにチャンネル流出を制限することによって提供される、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のフィールドフロー分画装置。
【請求項６】
フィールドフロー分画装置であって、チャンネル閉じ込め手段を備え、前記閉じ込められたチャンネルは、すべての側部を面によって囲まれており、
Ａ．前記チャンネルに沿って通過する移動相を含むチャンネルフローを提供し、調整する手段と、
Ｂ．試料アリコートを前記移動相に導入する手段と、
Ｃ．前記チャンネルに沿った複数の別個の領域の各々で、前記チャンネルフローに本質的に垂直な、単位チャンネル面積当りの別個のクロスフローを前記移動相に提供し、制御する手段とを有し、
前記すべての側面を囲まれたチャンネルは、中空透過性繊維を含み、
前記チャンネル閉じ込め手段は、単位チャンネル面積当りの別個のクロスフローを提供する前記手段として、前記中空透過性繊維を取囲む区画に分割された容器を含む、フィールドフロー分画装置。
【請求項７】
前記透過性膜は、透過性が互いに異なる領域にセグメント化されている、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のフィールドフロー分画装置。
【請求項８】
前記中空透過性繊維は、透過性が異なる別個のセグメントを含む、請求項６に記載のフィールドフロー分画装置。
【請求項９】
移動相に注入された液中の試料アリコートの大きさおよび組成がさまざまな粒子を分離および処理する方法であって、
Ａ．チャンネルを設けるステップを備え、前記チャンネルは、
１）前記移動相の流入を可能にするポートと、前記試料アリコートの注入を可能にするポートと、前記移動相中の試料アリコートがそこに加わるクロスフローを受けた後に前記移動相中の試料アリコートの流出を可能にするポートとを含み、
２）前記チャンネルに沿った複数の領域を含み、各前記領域は、前記試料を含む移動相に対して本質的に垂直な、制御されたクロスフローを加える独立した手段を設けられており、
Ｂ．前記試料アリコートを前記移動相に前記試料注入ポートを通して注入するステップと、
Ｃ．前記チャンネルの各前記領域の前記流入する移動相および前記クロスフローを前記粒子の最適な分離および処理を提供するようにプログラミングするステップとをさらに備え、
前記チャンネルは、ベースプレート要素を含み、前記ベースプレート要素は、上が開口しており前記ベースプレート要素内に横たわるように作製された１組の分離された区画を含み、前記開口はすべて、前記ベースプレート要素の底面に平行な同一平面に横たわっており、
前記チャンネルは、前記ベースプレート要素の前記区画開口上に横たわる透過性がありセグメント化されたフリット要素をさらに含み、各前記フリット要素は、その下の対応する区画を覆っており、
前記チャンネルは、
前記セグメント化されたフリット要素を覆う透過性膜と、
前記透過性膜上のスペーサ手段をさらに含み、前記スペーサ手段から一部分が切り抜かれることによって、全側部を前記スペーサの残りの領域によって囲まれたチャンネル切り抜き領域が設けられており、前記切り抜き領域は、前記透過性膜の下方に横たわる前記セグメント化されたフリット要素に亘っており、
前記スペーサ手段上に横たわり、前記スペーサ手段から切り抜かれた前記チャンネル領域を封止し、前記チャンネル切り抜きの上方に適切に位置決めされた３つのポートを提供するトッププレート要素をさらに含み、前記３つのポートは順に、
ｉ．移動相の流通と、
ii．前記試料アリコートの注入と、
iii．前記移動相流によって前記チャンネル切り抜きを通して運ばれた前記試料の流出とを可能にし、
前記チャンネル切り抜きに導入された流体を前記チャンネル切り抜きを通してまたは前記透過性膜および前記フリット要素を通してその下の区画の中まで流れるようにチャンネル閉じ込め手段を封止するための手段をさらに含む、方法。
【請求項１０】
前記チャンネル閉じ込め手段を封止するための前記手段は、前記チャンネルの変形またはＯリングである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
移動相に注入された液中の試料アリコートの大きさおよび組成がさまざまな粒子を分離および処理する方法であって、
Ａ．チャンネルを設けるステップを備え、前記チャンネルは、
１）前記移動相の流入を可能にするポートと、前記試料アリコートの注入を可能にするポートと、前記移動相中の試料アリコートがそこに加わるクロスフローを受けた後に前記移動相中の試料アリコートの流出を可能にするポートとを含み、
２）前記チャンネルに沿った複数の領域を含み、各前記領域は、前記試料を含む移動相に対して本質的に垂直な、制御されたクロスフローを加える独立した手段を設けられており、
Ｂ．前記試料アリコートを前記移動相に前記試料注入ポートを通して注入するステップと、
Ｃ．前記チャンネルの各前記領域の前記流入する移動相および前記クロスフローを前記粒子の最適な分離および処理を提供するようにプログラミングするステップとをさらに備え、
前記チャンネルは、中空透過性繊維と、
一方の端部にあり、そこを通して移動相がそこを通して送り込まれる手段と、
試料アリコートを前記移動相に注入する手段と、
前記繊維に沿った複数の別個の領域の各々で、前記チャンネルに沿ったフローの方向に本質的に垂直な、単位繊維長当りの別個のクロスフローを提供する手段とを有し、
前記チャンネルは、単位繊維長当りの別個のクロスフローを提供する手段として、前記中空透過性繊維を取囲む区画に分割された容器を含む、方法。
【請求項１２】
前記試料アリコートは、適切なセグメント化されたクロスフローを制御することによって前記試料アリコートから特定の大きさの粒子を分離するように処理される、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願および特許
以下の特許および出願は、分離された分子および小粒子の類似したキャラクタリゼーションに関する:
Ｐ．Ｊ．ワイアット（Wyatt）およびＭ．ウェイダ（Weida）、米国特許第６，７７４，９９４号（２００４年８月１０日）「懸濁液中の粒子の絶対数密度を求めるための方法および装置（Method and apparatus for determining absolute number densities of particles in suspension）」、
Ｐ．Ｊ．ワイアット、Ｍ．Ｈ．チェン（Chen）およびＤ．Ｎ．ビジャルパンド（Villalpando）、２００８年６月９日出願、米国特許出願連続番号第１２／１５７，３６７号「非対称流フィールドフローフラクショネーションを用いて小粒子の分離を最適化するための方法および装置（Method and apparatus for optimizing the separation of small particles using Asymmetric Flow Field Flow Fractionation）」。
【背景技術】
【０００２】
背景
この明細書全体を通して、用語「粒子」は、タイプおよび大きさがさまざまな分子、ナノ粒子、ウイルス様粒子、リポソーム、エマルション、バクテリア、コロイドなどであってもよい液体試料アリコートの構成成分を指す。それらの大きさの範囲は、１ｎｍ〜数千マイクロメートルに亘ってもよい。
【０００３】
フィールドフローフラクショネーション（Field Flow Fractionation）すなわちＦＦＦによる溶液中の粒子の分離は、Ｊ．Ｃ．ギディングス（Giddings）によって広範に研究および開発され、１９６０年代初めに始まった。こういった技術の原理は、チャンネルに拘束された試料とフローの方向に垂直に加えられる印加フィールドとの相互作用にある。目下注目されているそれらの技術の中には、チャンネル内のフロー中の試料に垂直な２次フローを導入することにより、印加フィールドが得られるクロスフローＦＦＦがあり、対称流（Symmetric Flow）すなわちＳＦｌＦＦＦと呼ばれることが多い。非対称（Asymmetric Flow）ＦＦＦすなわちＡ４Ｆ、および中空繊維（Hollow Fiber）すなわちＨ４Ｆフロー分離を含めて、この技術には、いくつかの変形例がある。
【０００４】
他のＦＦＦ技術には、重力／遠心クロス力がチャンネルフローの流れに垂直に加えられる沈降（Sedimentation）ＦＦＦすなわちＳｄＦＦＦ、電場がチャンネルフローに垂直に加えられる電気（Electrical）ＦＦＦすなわちＥＦＦＦ、および温度勾配が横方向に（transversely）加えられる熱（Thermal）ＦＦＦすなわちＴｈＦＦＦが含まれる。特定のＦＦＦ技術の適用は、対応する装置によってなされるので、上記の適用をあるタイプの「フィールドフロー分画装置」と本明細書中において称する。
【０００５】
これらフィールドフロー分画装置のすべてに共通するものは、流体すなわち移動相であり、この移動相の中に試料のアリコートが注入され、この試料アリコートは、クロスフィールドを加えることによって構成成分画分へと分離される。フィールドフロー分画装置の多くでは、試料アリコートがチャンネルを流れ進む間に、チャンネルフロー量および加えられるクロスフィールドの強度を制御および変化させることが可能である。これらのフィールドフロー分画装置にまた共通することは、クロスフィールドおよびチャンネルフロー量のみを、またその時は、分離が起こっている領域全体に亘ってのみを変動させてもよいことである。そのようなプログラミングは、多種多様な粒子クラスに対して効果的な分離を生じさせることができるが、このプログラミングには、関連する限界がある。
【０００６】
そのような限界の例は、対称流クロスフロー分画装置による粒子の分離に関する。試料アリコートがチャンネルを移動し進みながら非立体的分離を受け始めるにつれて、より小さい粒子がより大きいものの先を行く。クロスフロー量を上げることによって、すべての種（species）の分離は続くが、より大きな画分は、それらよりも大きさが小さい道連れらに一層遅れをとり始める。クロスフローが十分にあると、より小さい粒子が既にチャンネルを渡り終えて、それらの関連するフラクショネーションをもたらしている一方で、これらのより大きな粒子は、相当減速されることがある。このときまでに、より小さい画分は、分離されてはいるものの著しく希釈されてしまっていることがあるため、それらの局所的ピークは、広幅化されており、それらの関連する濃度は低下している。チャンネルを離れると、さまざまな検出手段を用いるその後の分析は、そのような対応して非常に低濃度の画分を検出することができないことがある。まだ保持されているより大きな粒子は、チャンネルを通過し終えかつチャンネル中で分離するのに十分な時間がないことがあるが、より小さい粒子は、チャンネルを離れてから随分経ち、したがってもはやそれらの分離を続けるのに必要なクロス力を受けていないことがある。実際、たとえば５００から１０００ｎｍの範囲内の相当より大きい粒子の分離は、５から１０ｎｍの範囲内の粒子を分離するのに必要かも知れないチャンネルおよびクロスフロー量と相当異なるチャンネルおよびクロスフロー量を必要とする。非常に大きなサイズ範囲に亘る大きさを有する試料の分離には、そのような試料アリコートが選択されたチャンネルを通過する間の相対チャネルおよびクロスフロー量のプログラミングにおける相当な柔軟性が必要である。１つの大きさ群のフラクショネーションが最適であっても、別の大きさ群のフラクショネーションが等価であることまたは比較し得るものであることすら確実とならない。
【０００７】
そのようなＦＦＦ分離について引続き存在する問題は、これらの技術が歴史的に、チャンネル内の局所的フロー状態を変化させることができない点にある。これまでは、フラクショネーションプロセスの制御は、ＦＦＦ方法を問わず、チャンネル全体を対象としていた。本明細書中に記載されるこの発明の方法およびフィールドフロー分画装置は、加えられたフローおよび力に対する局所化された制御を可能にすることを主な目的とする。これにより、フローおよび力を、分画チャンネルの全長に亘って特定の局所的領域で制御することができる。
【０００８】
提示される新しいフラクショネーション方法は、クロスフローに基づいた分離の文脈で大部分例示されるであろうが、当業者には自明であるように、開示される方法は、他のフィールドフローフラクショネーションに等しく適用可能であろう。そのようなフィールドフロー分画装置のうち最も重要なクラスは、単にそれを引用する科学論文の数という点で、非対称流フィールドフローフラクショネーションすなわちＡ４Ｆと称され、カール−グスタフ・オーランド（Karl-Gustav Wahlund）によって発明されたものである。この技術を後に簡単に概説する。
【０００９】
Ａ４Ｆ分画装置は、以前に開発された対称流フィールド分画装置すなわちＳＦｌＦＦＦの変更例であると考えられている。この以前の装置において、クロスフローは、チャンネルに別個のポンプによって提供される。よって、各フローは、別個のポンプによって生成されることによって、クロスフロー対称性が得られる。一方Ａ４Ｆでは、効果的なクロスフローは、チャンネル流出を流入に対して制限することによって確立される。この２つのフローの差は、効果的なクロスフローとなる。Ａ４Ｆ分画装置は、従来のＳＦｌＦＦＦ装置の２つの基本フローフィールドを単一のポンプで生成するため、対称クロスフローＦＦＦの結果特性のうち多くは、Ａ４Ｆに対しても有効であるとみなされている。これらのうち１つは、たとえばいわゆる分画力Ｆであり、これはクロスフローｆxにクロスフローのチャンネルフローｆcに対する比率の平方根を掛けた積に比例する。すなわち以下のとおりである。
【００１０】
【数１】
0005960948.tif 000002
【００１１】
対称分画装置のためのクロスフロー供給源は、チャンネルフローから独立しているため、両者は変化されてもよく、チャンネル長に亘って一定であるだろう。一方Ａ４Ｆ装置については、チャンネルフローは、チャンネルの長さに沿って常に変化し、試料がチャンネルを出る直前に最小に達する。
【００１２】
チャンネルフローのこの減少を補い、かつ単位面積当りのクロスフローの関連する定常性を実現するために、さまざまな技術が採用されている。これらには、移動相流入量を変化させ、クロスフローに対するインピーダンスを変えることによってクロスフローをプログラミングすることが含まれる。出口近くでチャンネルフローをより大きく保つべく、台形および指数関数的なものを含めてさまざまなチャンネル形状が試されている。先細りになったチャンネルは、その長さに沿ってその幅が減っており、単位面積当りのチャンネルフローが、対応するクロスフローを提供するのに必要なその減少を補うのに十分に増加されることを可能にする。
【００１３】
Ａ４Ｆ分画装置には、その表面的な単純さにも拘らず、他に難しい点がある。まず、ＳＦｌＦＦＦとＡ４Ｆとの両方に共通の問題がある。チャンネルを規定する４つの面は異なる材料からなり、それらのうち１つが理論上の予期される層流パターンから逸脱することがあることである。実際、蓄積壁のフリット支持された膜は、軟らかく多孔質であり、これは、一般的にはステンレス鋼管からなる側部であるすべての壁が滑らかであり、同じ材料からなる典型的な沈降フィールドフロー分画装置すなわちＳｄＦＦＦとは非常に異なる。そのような面によって閉じ込められた層流は、壁でゼロに達する接線流を備えた予想される放物線状のフロープロファイルを生じる。しかしながら、Ａ４ＦおよびＳＦｌＦＦＦフローの両方について、膜境界での状態はよく理解されていない。
【００１４】
この発明は、Ａ４Ｆ分画装置およびその関連する適用方法を参照することによって、異なるタイプのフリット支持構造および関連する１組のクロスフロー調整器により、より高い汎用性を有する新しいタイプの分離能力を確立することを主要な目的とする。この発明のフリット構造は、単位膜面積当りのクロスフローがチャンネルの異なる領域で可変であることを可能にするであろう。この可変性により、フラクショネーションを受ける試料のより大きな粒子成分の選択的な濾過という、この発明の別の目的が達成される。この発明の別の目的は、チャンネル内で先に分解／分離された広幅化されている、種ピークを鋭くすることである。
【００１５】
この新しい、この発明のＡ４Ｆベースの分画装置のすべての目的は、関連するチャンネルに沿った不連続な領域でのクロスフィールドの外部制御を可能にするように変形し得るＦＦＦ技術の殆どのクラスに対して適用可能である。これらには、対称クロスフロー分画装置、中空繊維分画装置、およびある程度は、電気フィールドフロー分画装置が含まれる。
【００１６】
この発明の方法のさらなる目的は、この方法が外れ値粒子集団を捕捉し、識別する能力の向上である。ひいてはこれを、そのような望ましくないかつ危険な可能性のある粒子の混入を受けることがある特定のクラスの溶液を浄化するために適当な状況で用いて、この溶液を必要なきれいな状態に戻してもよい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】米国特許第６，７７４，９９４号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００９／０３０１９４２号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
ＳＦｌＦＦＦコンセプトおよびＡ４Ｆコンセプトの基本構造に基づいた新しいタイプのフィールドフローフラクショネーションが説明され、膜支持フリットは、チャンネルフローの方向に対して横方向の（transverse）別個の領域／区画からなり、各区画は、対応して別個のプログラム可能で各区画を通るクロスフローを備えている。このセグメント化された構造は、新しいクラスの分離に基づくフラクショネーションを実現することを可能にする。たとえば、旧来のＡ４Ｆ装置による試料のフラクショネーションの後、この装置によって分離された画分に関連するピークは、分解はされているものの、分画されていない注入された試料アリコートのピーク幅に対して希釈され広幅化されたままである。この発明の装置では、分離されたピークをチャンネルに沿った異なる領域で再濃縮し、鋭くすることができる。
【００１９】
以下本明細書中において区画化されたフィールドフローフラクショネーション（Compartmentalized Field Flow Fractionation）すなわちＣＦＦＦと称される新しい装置は、外れ値を捕捉および／または保持するためにも適用されてもよい。一旦捕捉されると、そのような粒子は、後の分析のために保持されるか、または溶液から完全に除去されてもよい。この後者の用途は、免疫抗原性の可能性がある粒子の混入を受けた医薬品をこの医薬品の以前のきれいな状態に戻すために用いられてもよい。この用途のためには、チャンネルの初期領域は、指定された大きさのしきい値を超える粒子を保持または著しく遅延させるのに十分なクロスフローを提供するようにプログラムされ、その一方で、より小さい粒子からなる画分は、Ａ４Ｆ装置を通ってより速やかに進む。より小さい粒子のチャンネル出口ポートでの出現に続いて、遅延された粒子は、チャンネルから出現次第捕捉または除去されるために放出される。
【００２０】
チャンネルの異なる領域でクロスフローを調整する能力は、試料のチャンネルを通しての輸送中に、選択的な粒子移動制限を逐次的に課すことを可能にする。よって、付随するより小さな画分は、より大きな試料構成成分に対して選択的に加速されることによって、そこから分離される。一旦そのように分離されたならば、そのような試料は、この試料がより後の領域に達したらこの試料の局所的チャンネル移動を制限することにより再濃縮されてもよい。
【００２１】
多領域フリット構造は、その領域の各々が、選択可能なクロスフローをその下方の特定の区画に提供し、旧来のＡ４ＦおよびＳＦｌＦＦＦ構造内でこれまで不可能であった多種多様な分離が可能である。実際、ＣＦＦＦの機能は、装置およびその制御手段によってＦＦＦプロセスそのものの研究および用途に対する新しい展望が切り開かれるほど幅広く広範なものである。そのような一般化されたフリット構造は、単一の注入された試料内に存在することがある複雑な粒子分布を同時に分離することを可能にする。
【００２２】
セグメント化されたフリット領域に対応して、支持される膜自体もセグメント化されていて、この膜を通過する試料フラクショネーションのための選択された透過性を提供してもよく、そのとき、画分は、この膜を通して直接分流されてもよい。
【００２３】
中空繊維ＦＦＦおよび電気ＦＦＦなどの他のタイプのＦＦＦにもこの方法を適用する手段が述べられる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】標準的なＡ４Ｆチャンネルの構造および重要な要素を示す図である。
【図２】Ａ４Ｆフラクショネーションの後に多角度光散乱光度計によって９０°で検出された分解されたＢＳＡ試料の従来の分離の結果を示す図である。
【図３】単位チャンネル面積当り一定のチャンネルフローを維持するために採用される先細りになったチャンネル構造を示す図である。
【図４】この発明の区画化された構造を提供するように変形された基本Ａ４Ｆ構造を示す図である。
【図５】区画間の間隔が異なる図４の２つの重要な要素を説明する図である。
【図６】図１の従来のＡ４Ｆユニットとしての動作を可能にするように変形された図４の構造の正面、背面および上面図である。
【図７】図６の構造の同心状切欠図および側面切欠図である。
【図８】標準的な中空繊維フィールドフロー分画装置、すなわちＨ４Ｆチャンネルの構造および重要な要素を示す図である。
【図９】中空繊維分画装置のために考えられる区画化された構造を示す図である。
【図１０】特定のプログラムされた１組のクロスフローから生じる、図２の試料の凝集され豊富にある画分の予期される再凝縮の例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
非対称流ＦＦＦチャンネルの要素の概説から始める。図１に示されるＡ４Ｆチャンネルは、以下の要素とそれらを結びつける手段とからなる：
１）  封止Ｏリング３によって取囲まれた液体透過性フリット２を保持する底部アセンブリ構造１、
２）  フリット２上に横たわる透過性膜４、
３）  キャビティ６が切られている厚み約７５μｍから８００μｍのスペーサ５、および
４）  レキサン（Lexan）（登録商標）またはガラスなどの材料からなる透明なプレート８を一般的には保持するトップアセンブリ構造７。このプレートは、実現例によっては透明である必要はない。
結果として得られるサンドイッチ構造は、ボルト１３または他の手段で結び付けられている。スペーサ５にある概ね棺形状のまたは先細りになったキャビティ６は、分離が中で起こるチャンネルとして働く。トップアセンブリ構造７は通常、ポートと呼ばれる３つの孔を含み、これらの孔は、トッププレート８を貫通し、チャンネルの上方に中心決めされていて、取付具をこれらの孔に取付けることを可能にしている。これらのポートは：
１）チャンネルの始まり付近に位置し、キャリア液体いわゆる移動相がそこを通して送り込まれる移動相入口ポート９、
２）入口ポートの下流に位置し、分離される試料のアリコートがその中へチャンネルまで導入されその下で集束される試料ポート１０、および
３）分画されたアリコートがそこを通ってキャビティの端部近くでチャンネルを出る出口ポート１１である。
【００２６】
Ａ４Ｆの好ましい実施例において用いられるような単一のポンプが、移動相を入口ポート９で提供する。移動相は、以下の２つの別個のフローの供給源である：ｉ）フリットで支持された膜を通って、注入された試料に対して横方向のクロスフローを生じるフロー、およびii）この膜に平行で分画された試料と共に出口ポート１１を通ってチャンネルを出る長手方向流。出口管の直径が小さいためおよびチャンネルの下流にある検出器により生じる背圧により、試料含有チャンネルフローに対するインピーダンスは、フリットにより支持される膜およびそこを通るクロスフローによって生じるインピーダンスよりも一般的に大幅に大きい。このクロスフローは、ニードルバルブまたは遠隔制御ユニットに収容された類似のコンピュータ接続された手段によって制御される。膜４を通過するそしてそこから支持フリット２を通過する総流量は、ポート取付具１２を通る流出を制御する遠隔バルブによって制御および調整される。ワイアットテクノロジー社（Wyatt Techology Corporation）によって製造され、本明細書中で明示的に検討されるものと類似するＡ４Ｆ装置は、コンセンサス社（ConSenxus GmbH）およびポストノバ・アナリスティック社（PastNova Analystic Inc.）によって製造されている。これらは両方とも、同じタイプの分離を行なう。
【００２７】
よって移動相入口流が９で、たとえば毎分２ｍｌであり、流出制御ニードルバルブを通るフローが１２を通して０．５ｍｌ／分を提供するようにプログラムされている場合、１１を通る総流量は、１．５ｍｌ／分である。よって、単一のニードルバルブコントローラが、移動相の以下の２つの成分への分裂を調整する：膜４を通り、１２を通して出るいわゆるクロスフローの合計、および１１を通しての残りの流出。１１を通る流出は、その狭い出口および下流の検出器から生じる大きなインピーダンス／背圧を受けることを思い出されたい。支持フリットは、非常に多孔質であり、そこを通るフローに対して無視できる程度のインピーダンスを生じる。
【００２８】
分離前に、試料アリコートは、試料注入ポート１０で注入され、正常な移動相の流れから部分的に分裂したものにより引き起こされる逆フローが、出口ポート１１を通って導入される。２つの対向するフローは、注入された試料アリコートをその注入ポート１０の下の適所に留めることによって、試料アリコートを通常の長手方向チャンネルフローに対して横方向の小さな領域内に集束させる。この「停止流」モードは、アリコートが平衡することを可能にする。一旦平衡化されると、試料アリコートは、チャンネルフローを回復させることによって放出される。このようにして集束されたアリコートは、チャンネルフローによって前へ運ばれるにつれて分画し、横方向成分は、このアリコートを、フリットにより支持された膜、すなわち「蓄積壁」という用語が使われることが多い膜に向かって下流へ運ぶ働きをする。
【００２９】
集束を伴う停止流技術を適用して試料アリコートが平衡することを可能にする代わりに、従来のＡ４Ｆ、先に開発された対称クロスフローＦＦＦのための従来の手順は、試料が移動相に直接注入され、対称フロー分離チャンネルへの放出前の緩和を可能にするのに十分な時間、入口フリットで保持されることを規定する。
【００３０】
粒子は、一旦Ａ４Ｆユニットによって分離されると、一般的に、粒子に応じて異なるクラスの検出機器によって検査される。これらには、光散乱光度計、ＵＶ吸収計、示差屈折率検出器、示差粘度計およびそれらの組合せが含まれてもよい。そのような装置は、分離された粒子／分子をそれらのモル質量、固有の粘度測定法、大きさなどの点でキャラクタライズするために用いられる。
【００３１】
図２には、９０°光散乱信号が時間の関数として示されており、Ａ４Ｆ装置によって分画されたウシ血清アルブミン（Bovine Serum Albumin）すなわちＢＳＡ試料からのものである。なお、試料は、５つのピーク１４、１５、１６、１７および１８、加えて他の未分解の成分１９からなる。分解されたピークには、特定のいわゆるオリゴマーが含まれており、このオリゴマーは、それぞれモノマーの小さな２、３、４および５量体の凝集体である。１４にある主要なピークは、モノマー画分に対応する。このタンパク質の例に多少類似する医薬品は、凝集されたモノマーの量が無視できるものであるように製造されなくてはならない。そのようなオリゴマーは一般的には、生物学的製剤の治療活性には寄与しないが、その存在は、最小限にしなくてはならない。一層より重要であるのは、免疫抗原性反応を患者に引き起こすことがある大幅により大きい凝集体である。このようにして、生物学的製剤は、患者にとって危険なものとなり、そのような寄与の可能性を取り除かれなければならない。この発明は、これがどのようにして達成され得るかを示すことを１つの目的とする。
【００３２】
なお図２の溶離ピークの幅に注目されたい。たとえば、モノマーピーク１４は、約１６分から１８．７分までの範囲、すなわち約２．７分間の合計幅に亘って溶離する。もしこのピークを、隣接するオリゴマーピーク１５、１６、１７および１８に対するこのピークの分離にプロセス中に影響を及ぼすことなく、たとえば約１．０分に相当する範囲まで狭めることができるとしたならば、減少された０．５ｍｌの帯域内の濃度は、およそ比率２．７／１．０＝２．７だけ上昇されるであろう。望ましい場合、そのような濃度の上昇を実現することは、この発明の１つの重要な目的である。そのように狭めることによってピーク濃度を上昇させるこのプロセスを、我々は「再濃縮」と称する。
【００３３】
恐らくより一層重要であるのは、観察された最後のオリゴマー状態を越える、より大きな凝集成分の分離であろう。実際、２８分を超えて溶離する寄与は、免疫抗原性であることがある、より大きな凝集体を含む可能性についてより詳細に検査されるべきである。この発明の別の目的は、そのような寄与を後の回収および分析のために分離し、濃縮することである。加えて、そのような免疫抗原性寄与が存在することがわかっている場合は、その製品は、販売することができず、一般的に破棄される。一方、もしこのような夾雑物を取り除くことができたならば、この製品は安全と考えられたかも知れず、そのように市販され得た。この発明のさらなる目的は、そのような混入を受けた医薬品をきれいで、安全で、市販可能な状態に戻すことができることである。
【００３４】
従来のＡ４Ｆユニットのチャンネルフローは、チャンネルの長さに沿って減少する。これは、別々のポンプが一定のクロスフローおよびチャンネルフローを提供するＳＦｌＦＦＦシステムとは非常に異なる。よって、Ａ４Ｆシステムについては、分画力は、チャンネルの長さの下方で僅かに増加することがある。しかしながら、単位面積当りのチャンネルフローのクロスフローに対する比率を一定に保つために、チャンネルは通常先細りになっている。図３には、スペーサ５に切られた長さＬ、初期幅２ｗ0、最終幅２ｗLのそのようなチャンネル６が示されている。任意の位置ｘで、このチャンネルの幅は、ｗ（ｘ）＝２ｗ0（１−ｂｘ）によって与えられ、式中、以下のとおりである。
【００３５】
【数２】
0005960948.tif 000003
【００３６】
よってそのような先細りになったチャンネルに沿った任意の位置でのチャンネルフロー量は、以下のとおりである。
【００３７】
【数３】
0005960948.tif 000004
【００３８】
式中、
【００３９】
【数４】
0005960948.tif 000005
【００４０】
であり、Ｃcrは、チャンネルによって規定される膜を通る総クロスフローであり、ｆ0は、流入量であり、Ａは、０からＬまでのチャンネルの面積である。チャンネルを先細りにすることにより、局所的にクロスフローへと分流された成分を超えるチャンネルフローｆは、およそその単位面積当りの流量をｗ0／ｗ（ｘ）の比率で高められ、式中、距離ｘでのチャンネル幅は、２ｗ（ｘ）である。
【００４１】
Ａ４Ｆ装置についてのチャンネルフローのクロスフローに対する比率は、チャンネルの全長を通して変化するため、チャンネルの１つの領域でこの比率を変えようとすると必然的にチャンネル全体を通してこの比率に影響が及ぶ。実際、Ａ４Ｆ動作の特性は、試料の分離および溶離中のこれらのフローのプログラミングであった。この発明までは、より局所化された制御の可能性は可能ではなく、検討もされなかった。
【００４２】
次に、図４に示される、フリットがＮ個の別々の領域２０、Ｒi、ｉ＝１、…、Ｎに分割されたこの発明の好ましい実現例を検討する。たとえば、図４に示される最初の３つの区画（およびそれらの対応するフリット領域）は、単一のより大きい区画（および対応してより大きいフリット領域）と置換えられるかもしれない。連続する区画およびフリット領域も、結合されてもよい。各領域２０の下方には、対応する区分された区画２１があり、この区画の底面を出口ポート取付具１２が通っている。そのような各出口ポート取付具１２を通るフローは、対応するプログラム可能なニードルバルブ手段Ｖi、ｉ＝１、…、Ｎによって制御されており、このニードルバルブ手段は、その支持フリット領域を通るフローを調整する。各区画／領域に１つずつ、複数のプログラム可能な調整器が外部制御ユニットに位置している。流量計調整と組合されたニードルバルブがこの目的のために選択されることが多い。各領域を通るクロスフローは、時間を個々にプログラムされてもよいため、この発明のシステムは、広い範囲の機能を提供する。より大きな粒子を一旦より小さいその道連れらから分離したならば、より小さい粒子がチャンネルを通って進む間、特定の領域に保持してもよい。別の特徴は、この発明の広幅化され希釈されている分離された種を再濃縮する能力に関する。領域およびその関連する区画は、大きさが異なってもよく、ある状況下では、フローの方向に対して横方向でないかも知れないことを認識することが重要である。図５には、異なった区画およびフリット構成の例が示されている。
【００４３】
再び図４を参照して、図中には好ましい実施例が、５つの大きさが等しい領域からなるチャンネルによって示されており、各領域は、その対応する区画を下に備えており、この実施例をその従来の形態に戻してもよい手段が容易に思い浮ぶ。図６および図７には、各区画の底面がどのように変形されてその底面にドレイン孔２２を組込み得るかが示唆されている。そのような各ドレインは、下にある共通区画２４に注いでいる。そのようなドレインのすべてを開き、個々のポート取付具１２を通る流出を制御する各ニードルバルブを閉じることによって、共通単一区画には、単一のポート取付具１２が設けられ、このポート取付具の流出は、制御ユニット内の単一の調整器によって制御される。チャンネルは、このようにして従来の動作のために元に戻されるかも知れない。そのようなドレインを同時に開き得る機械的手段を設けることが、パドル構造２３によって概略的に例示されており、このパドル構造を部分的に引張り出すことによって、流体が共通区画２４に流入し関連する流出ポート取付具１２を通って流出するように誘導するすべてのドレイン孔２２を開いてもよい。このコンセプトは、さらに拡大されて、単位面積当りのクロスフローが同じである必要があることがある選択された１組の区画に適用される区画連動を可能にしてもよい。それらの区画については、それらの調整器は、閉じられ、それらの排水バルブは、複数ドレイン孔パドル構造２３に類似する個々のパドル機構によって開かれて、共通区画２４への排水を可能にし、この共通区画は、この構造の左に個々の区画流出取付具に直角な平面に示されている単一のポート取付具１２によって制御されるであろう。
【００４４】
図６の構造は、図７ａおよび図７ｂに示される区画化された構造を通る断面をとることによって一層詳細に示されている。各区画の流出ポート取付具１２は、図６ａに示されている。なお、図６ａは、図４のユニットの底面に非常に類似しているが、共通区画２４のために働く単一の流出ポート取付具１２が追加されている。従来の動作に戻すことが、パドル要素２３を変位させそれらのポート取付具１２を通る個々のフローすべてを止めることでによってなされてもよいが、区画化された構造を従来のクロスフローユニットと単に置換える方が、殆どの実験要件について大幅に簡単であるだろう。図６ｂおよび図６ｃに示されるドレイン孔閉塞パドル２３を再位置決めすることによってチャンネルを元に戻すことが可能であってほしいと思うかも知れない主なかつ最も重要な理由は、特定のチャンネルの性能をより詳細に調べるためであろう。そのチャンネルの寸法およびもしあるならば関連した膜の変更例などの、そのチャンネルの物理的構造は、用途に応じて変化することがある。特定の区画を変動速度で通るフローが膜の特定の局所領域に影響を与えたかも知れないため、この装置をその従来の動作モードに戻すことにより、装置がそのように動作されている間に起こったかも知れない膜の変化を速やかに調べることが可能になるであろう。
【００４５】
図４には、この発明が５区画構成によって示されているが、以前に述べたように、類似のシステムは、大きさが類似するまたは異なる区画をより多くまたはより少なくさえ用いて開発されてもよいことが認識されるべきである。互いに異なる区画群を連動させる手段は、簡単に実現させることができる。よって、５区画装置において、２組の連動区画があり得、各々がその調整ニードルバルブを備えている。たとえば、最初の３つの区画および５番目の区画は、それらの流出ポート取付具１２が閉じ、それらの対応する排水孔が開くことに続いて単一の調整バルブによって単一の体積へと制御されるかも知れず、一方４番目の区画は、その流出を制御する単一のバルブによって制御され得る。
【００４６】
区画化コンセプトのさらなる汎用的適用を例示するために、中空繊維ＦＦＦすなわちＨ４Ｆ装置を参照する。図８には、多孔質中空繊維分画装置の構造および重要な要素が示されている。剛性の容器２５が、この容器中にかつ入口取付具２７と出口ポート取付具２９との間に装填された多孔質の円筒形繊維２６を取囲んでいる。移動相は、取付具２７を通して導入され、試料は、注入ポート取付具２８を通して注入される。繊維は多孔質であるため、その浸出物は、容器２５の中に流れ、次に制御ユニットに接続された出口ポート取付具２９を通るそのようなフローの調整によって外へ流れる。多孔質繊維チャンネル２６を通るフローは、２つの部分からなり、多孔質繊維を通る横方向流と、長手方向流とである。よって、繊維は、Ａ４ＦおよびＳＦｌＦＦＦ分画装置の膜／フリット構造の役割を果たす。
【００４７】
図９には、多孔質中空繊維分画装置すなわちＨ４Ｆが、どのように変形されてＡ４Ｆ実現例に類似する区分化を可能にするかも知れないかが示されている。変形された剛性容器２５の内部構造は、区画２１に分割されており、この区画は、そこを通されている多孔質繊維２６を取囲んでいる。この繊維は、冷却されて僅かに収縮してから挿入され、、加熱されると各区画の側壁に対してぴったりと嵌ってもよい。加えて、その中で長手方向に流れている流体によって引き起こされる内部圧力は、各区画を封止するのに十分であってもよい。変形手段によって封止することができない他のタイプの多孔質中空繊維については、各々にＯリングを挿入してもよい。他の実現例には、ヒンジ止めされて２つの軸方向区画になっている区画化された容器が含まれであろう。この軸方向区画は、簡単に開くことができ、各区画を適度に封止するのに必要な適切な封止とＯリングとを備える。
【００４８】
図１０には、この発明の技術をどのように用いて図２に示される試料のより大きな凝集体１９を調べるかも知れないかが示されている。この分離の目的は、存在するこれらのより大きな凝集体１９を最も顕著なオリゴマー状態から単離し、濃縮することであるとする。また、区画は５つのみ存在するとする。ｔ＝ｔ1で、図２の試料の殆どのオリゴマーピークは、溶離し、分画装置を出てしまっている。この時間の図は、残っている種の濃度をチャンネル位置の関数として示す。なお、５つの区画位置は数字でグラフの底部に示されている。殆どの試料が分画され、チャンネルを出ると、最後の区画の中のクロスフローは著しく増加されることによって、画分１９のうち多くを最後の２つの区画で保持している。他のクロスフローは、分離全体を通してそのまま維持されているが、入口移動相流は、最後の２つの区画を通る追加的なフローに対応するために増加されている。ｔ＝ｔ2までに、残っている試料は、測度を落とし、これらの終わりの２つの区画間に溜まり始め、ｔ＝ｔ3までに、４番目の区画を通るクロスフローは、停止されており、残りの試料は、放出される直前に最後の領域で保持される。このようにして、未分解の凝集体画分１９は、明確に定義されキャラクタライズされたオリゴマー構成成分からさらに分離されている。放出されると、凝集画分は、さらなる分析および研究の対象となってもよい。
【００４９】
区画化された分画装置内で分離に用いられた膜は、個々のフリット要素においてそうであったように、均一な組成からなるとみなされたが、これらの構成成分は、互いに異なる組成からなる材料で構築されてもよい。たとえば、Ａ４Ｆ分画装置の膜４およびその区画化された変更例は、領域間で融合または他の方法で接続されたセグメント化された部分から構築されてもよい。１つのセグメントは、たとえば非多孔質であることによって、そこを通過する試料にクロスフローが影響を及ぼさないようにし得る。他の膜部分は、互いに異なる多孔性を備えた部分から構成されていてもよい。支持フリットも、互いに異なる組成からなっていることによって、そこを通るフローを膨張させるまたは制限してもよい。多孔性の高い材料で構成されたフリット部分を考え、この材料は、妨げられることなくこのフリット部を通過するかも知れない広い範囲の分子／粒子の大きさに対して透過性がある。多孔性の高い対応する膜があるので、特定の時間にそこを通り過ぎる如何なる試料も、この試料がその多孔質部分に達するときに強いクロスフローを加えることによって、殆ど完全にそこを通って運ばれてもよい。異なる区画での他のクロスフローは、それに従って変形されて、分離試料の特定の画分をそこから集め除去する手段を確立してもよい。
【００５０】
単純な区画化された分画装置の別の興味深い適用は、被分離試料の具体的に定義された画分を集めるように設計されたものであるだろう。最後の区画のみがこのように独立して動作され、その対応する膜部分は、そこを通過するかも知れない任意の試料画分に対してほぼ完全に透過性があると考える。分離の大部分について、クロスフローがこの部分を通過しないようにされるであろう。そこに特定の画分が達したときのみクロスフローが短い間作動され、画分がその対をなすチャンバの中に浸透するであろう。そのような分画装置チャンバは、体積が極めて小さいことがあるため、他の簡単に開発された手段が、そのような集められた試料をかなりの希釈なしに抽出するために必要となることがある。
【００５１】
上述の記載は、説明のために、特定の実現例をこの発明の十分な理解をもたらすために用いた。しかしながら、当業者には、具体的な詳細はこの発明を実施するために必要ではないことが明らかであるであろう。よって、この発明の特定の実施例の前述の記載は、例示および説明のために提示されたものである。前述の記載は、網羅的であることまたはこの発明を開示された正にその形態に限定することを意図されたものではなく、明らかに、多くの変形例および変更例が上記の教示に基づいて可能である。記載された特定の実施例は、この発明の原理およびその多くの実用的用途の多くのうちいくつかを最もよく説明することによって当業者がこの発明およびさまざまな実施例を企図される特定の用途に適したようなさまざまな変形例と共に最もよく利用することを可能にするために選択されたものである。以下の特許請求の範囲およびその等価物が、この発明の範囲を規定することが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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