(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１３のアミノ酸配列において、２６５番目のアスパラギン酸、２８５番目のアスパラギン酸、３２３番目のアスパラギン酸、３３８番目のアスパラギン酸の４残基が塩基性アミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含むことを特徴とするビリルビンオキシダーゼ。
【請求項２】
塩基性アミノ酸がアルギニンであることを特徴とする請求項１に記載のビリルビンオキシダーゼ。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のビリルビンオキシダーゼが含有されていることを特徴とするケラチン繊維用染色剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マルチ銅オキシダーゼ及びこれを用いたケラチン繊維用染色剤に関し、更に詳しくは、通常の染色条件においてマイナスに荷電しにくいマルチ銅オキシダーゼと、毛髪や頭皮の損傷、かぶれが少なく、且つ染色性に優れたケラチン繊維用染色剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、この種の染色剤、例えば染毛剤としては、パラフェニレンジアミン等のジアミン系酸化染料と過酸化水素等の酸化剤を主要成分とした酸化型染毛剤が一般的に使用されている。酸化剤としては、従来は過酸化水素がよく用いられていたが、過酸化水素はその酸化作用が非常に強力であるため、アルカリと共に使用すれば、頭髪に対して使用した場合に毛髪や頭皮を損傷してしまう。また、ジアミン系酸化染料はアレルゲンとして作用するが、頭皮が損傷しているとジアミン系酸化染料が頭皮を透過しやすくなり、重篤なかぶれを誘発する問題を生じる。
このような問題を解消するため、近年では過酸化水素に替えてマルチ銅オキシダーゼの一種であるラッカーゼを配合したケラチン繊維の酸化染色組成物や毛髪化粧料が使用されている（特許文献１、２）。
【０００３】
また、近年では、銅エフレックスオキシダーゼ（以下、ＣｕｅＯと称する）やビリルビンオキシダーゼ（以下、ＢＯＤと称する）といった別種のマルチ銅オキシダーゼを改変して、インドールやパラフェニレンジアミンを酸化できるケラチン繊維染色用組成物も提案されている（特許文献３）。
なお、ＣｕｅＯは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのペリプラズム側の酵素を銅誘導型損傷から保護する働きをするタンパク質である。また、ＢＯＤは、例えばミロセシウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ）属またはコプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）属に属する微生物等から得られ、ビリルビンの血中濃度が上昇する病気である黄疸の治療薬として使用されるタンパク質である（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００２−５０９０９１号公報
【特許文献２】特開２００２−４７１４４号公報
【特許文献３】再公表特許２００７／０６３６１４号公報
【特許文献４】特許２６３２５１８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記した従来のオキシダーゼを酸化型ケラチン繊維用染色剤の酸化剤として使用した場合、過酸化水素を使用したものと比較して染色性が劣るため、これを補うために酸化染料を大量に配合する必要が生じるが、大量に使用した場合には、頭皮に目立つ損傷がない場合でもジアミン系酸化染料が頭皮に浸透してしまい、結局、かぶれの問題は十分には解消されない。
【０００６】
そこで、オキシダーゼを使用した染色剤の染色性が低い原因について鋭意研究したところ、ヒト頭髪の等電点が３．０〜５．５程度（通常は３．７前後）であり、オキシダーゼの等電点も同程度であるが、染毛工程はこれよりも高いｐＨの範囲（６．５〜１１．０程度）で施されるため頭髪とオキシダーゼが双方ともマイナスに帯電することになり、これが染色性に悪影響を与えていると考えられる。
詳述すれば、双方がマイナスに強く帯電していれば染色工程においてオキシダーゼと頭髪は互いに反発するので、オキシダーゼは頭髪とは離れた位置に移動してから酸化染料を酸化することになり、結局、発色した酸化染料分子は頭髪からは遠く離れた位置に分布すると考えられる。その結果、発色した酸化染料が頭髪に吸収されにくくなり、染色後に薬液を洗い流す際に発色した酸化染料分子の多くが洗い流されてしまい染色性が低くなると推察される。
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決するべく鋭意研究の結果、染毛工程においてオキシダーゼのマイナスの電荷が減少すれば、好ましくはプラスに帯電していれば、オキシダーゼが毛髪と反発しにくくなり、好ましくは引き付けられ、発色した酸化染料も頭髪の近傍に分布するため酸化染料が頭髪に吸着されやすくなって課題が解決できるとの知見を得、本発明を完成するに至った。
即ち本発明は、上記従来技術の問題点を解消し、ｐＨが高い環境で使用してもマイナスに荷電しにくいオキシダーゼを提供し、さらに使用時に毛髪や頭皮を損傷せず、かぶれが少ないだけでなく、染色性に優れたケラチン繊維用染色剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の特徴は、配列番号１３のアミノ酸配列において、２６５番目のアスパラギン酸、２８５番目のアスパラギン酸、３２３番目のアスパラギン酸、３３８番目のアスパラギン酸の４残基が塩基性アミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含むビリルビンオキシダーゼである。
【００１１】
本発明の更に他の特徴は、塩基性アミノ酸がアルギニンである上記のビリルビンオキシダーゼである。
【００１２】
本発明の更に他の特徴は、上記のビリルビンオキシダーゼが含有されているケラチン繊維用染色剤である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のマルチ銅オキシダーゼは、カルボキシ末端側に塩基性アミノ酸残基が付加されるか、あるいは特定のアミノ酸残基が塩基性アミノ酸残基に置換することにより、等電点が高くされているので、ｐＨが高い条件化で使用する場合でもマイナスに荷電しにくい。従って、通常、アルカリ条件で行われる染毛工程においてもマイナスに荷電する頭髪との反発力を小さくすることができ、あるいは吸着させることができる。このため、オキシダーゼが頭髪の近傍で作用しやすくなり、発色した酸化染料も頭髪の近傍に分布しやすくなるので、染色性を向上させることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明において、ケラチン繊維とは毛髪、羊毛等のケラチンを主成分とする繊維が含まれ、また、前記毛髪には頭髪の他、毛髪からなるウイッグ等も含まれる。以下の記載において、ケラチン繊維として毛髪（頭髪）を例に挙げて説明する。
本発明のマルチ銅オキシダーゼは、カルボキシル末端に塩基性アミノ酸を所定数付加するか、あるいは特定の酸性アミノ酸残基を塩基性アミノ酸に置換したことを特徴とする。
また、本発明のケラチン繊維用染色剤は上記のマルチ銅オキシダーゼが配合されることを特徴とする。
【００１５】
本発明に係る等電点が高いオキシダーゼを得るには、オキシダーゼの表面に塩基性を示す官能基を付加する方法が挙げられる。具体的には、所定の箇所に塩基性アミノ酸を付加するか、あるいはオキシダーゼを構成するアミノ酸残基のうち特定のものを塩基性アミノ酸に置き換える方法が例示できる。アミノ酸を付加する場合には、折り畳まれて立体構造が形成されたときに表面にでる場所であって、付加しても立体構造に大きな変化がない場所（例えばアミノ末端またはカルボキシ末端等）を選択して付加する。アミノ酸残基を塩基性アミノ酸に置き換える場合は、折り畳まれて立体構造が形成されたときに表面に出るものであって、且つ塩基性アミノ酸でなく（好ましくは酸性アミノ酸）、さらに置き換えても立体構造に大きな変化がないアミノ酸残基（酸化染料を酸化する機能に影響が出ないもの）を選択して置き換える。
【００１６】
更に具体的には、上記のようなオキシダーゼは、配列番号１のｒＣｕｅＯのカルボキシ末端側に塩基性アミノ酸残基を４残基以上、好ましくは７残基以上付加することにより得られる。なお、配列番号１のｒＣｕｅＯはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のＣｕｅＯからヘリックス５、ヘリックス６及びヘリックス７を除去し、かわりにスペーサを挿入してなる組換えタンパク質である。配列番号１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列の例を配列番号２に示す。
なお、配列番号１に示したｒＣｕｅＯは成熟タンパク質のものであるが、ベースになるアミノ酸配列は未成熟タンパク質のものであってもよいし、その他、当該アミノ酸配列のアミノ末端側やカルボキシ末端側には、酵素活性や本願発明の効果が損なわれない限り、ヒスチジンタグ等のアフィニティタグやシグナルペプチその他の構造が付加されていてもよい。
未成熟タンパク質のアミノ酸配列であってヒスチジンタグが付されたものを配列番号３に、そのＤＮＡの塩基配列の例を配列番号４に示す。
【００１７】
付加するアミノ酸残基の数について詳述すれば、塩基性アミノ酸残基の中でも最も塩基性が高いアルギニンを使用すれば付加する残基が少なくて済み、最も塩基性が低いヒスチジンを使用すれば付加する残基を多くする必要が生じ、リシンはその中間となる傾向がある。具体的には、塩基性アミノ酸残基がアルギニンのみからなる場合は４残基以上、好ましくは６残基以上であり、リシンのみからなる場合は６残基以上、好ましくは８残基以上であり（リシン及びアルギニンからなる場合も同様）、ヒスチジンのみからなる場合は７残基以上、好ましくは１０残基以上（ヒスチジン、リシン、アルギニンの混合である場合も同様）である。
【００１８】
付加するアミノ酸の数については、本発明の原理からいえば上限は特に無いが、酵素が失活するｐＨ以上に等電点を高くしても効果は薄いため、現実的には２０残基以下、又は３０残基以下である。また、同じアミノ酸残基を連続して付加した場合、翻訳効率が低下し発現量が低下する恐れがある。これを防ぐため、２種又は３種の塩基性アミノ酸残基を交互に配列したり、同じアミノ酸残基が隣り合わせになる場合でも使用するコドンを変える等の方法により、同じコドンが連続して多数配列されるのを防ぐほうが好ましい。
【００１９】
付加する残基はリシン、アルギニン、ヒスチジンのいずれでも良いが、塩基性が最も高いアルギニンが好ましく、次にリシンが好ましい。なお、カルボキシ末端側に付加するアミノ酸残基の中に塩基性でないアミノ酸残基が混入してもよいが、塩基性アミノ酸だけを連続して付加したほうが好ましい。塩基性でないアミノ酸を混入させる場合は、その分塩基性アミノ酸残基の数を増やす（好ましくは７残基以上）、または特に塩基性の高いアルギニン残基を付加することにより、全体として等電点が高く保たれるようにする。
【００２０】
上記の方法による好ましいｍＣｕｅＯのアミノ酸配列を配列番号５に示す。この例は配列番号１のｒＣｕｅＯのカルボキシ末端側に６個のアルギニン残基を付加したものである。なお、配列番号５のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の例を配列番号６に示す。また、配列番号５のｍＣｕｅＯの未成熟タンパク質のアミノ酸配列を配列番号７に、そのＤＮＡ配列の例を配列番号８に示す。
【００２１】
等電点が高いオキシダーゼの別例としては、配列番号１に示したｒＣｕｅＯのアミノ酸残基のうち、６９番目のグルタミン酸、８２番目のグルタミン酸、３２８番目のアスパラギン酸、３４０番目のアスパラギン酸の４つのうち少なくとも２つを塩基性アミノ酸に置き換えたものが例示できる。これらのアミノ酸残基は配列番号１のｒＣｕｅＯにおいて、置き換えたときに等電点が特に顕著に上昇するアミノ酸残基であり、これらのうち少なくとも２つを塩基性アミノ酸（アルギニン）に置き換えたときに等電点が７．６を超えることが実験により明らかになった。なお、上記４つのアミノ酸残基は、配列番号３に示した未成熟タンパク質のアミノ酸配列では、９７番目のグルタミン酸、１１０番目のグルタミン酸、３５６番目のアスパラギン酸、３６８番目のアスパラギン酸に相当する。
上記の例と同様、本例のｍＣｕｅＯも未成熟タンパク質のアミノ酸配列であってよく、その他、アミノ酸配列のアミノ末端側やカルボキシ末端側には、酵素活性や本願発明の効果が損なわれない限り、ヒスチジンタグ等のアフィニティタグやシグナルペプチその他の構造を付加することができる。
【００２２】
なお、上記の４残基（６９番目、８２番目、３２８番目、３４０番目）すべてをアルギニンに置換した例を配列番号９に、そのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の例を配列番号１０に示す。また、上記配列番号９に示したｍＣｕｅＯの未成熟タンパク質であってヒスチジンタグを付したもののアミノ酸配列を配列番号１１に、そのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の例を配列番号１２に示す。
【００２３】
等電点が高いオキシダーゼのさらなる別例としては、配列番号１３に示したｗｔＢＯＤのアミノ酸配列のうち、２４２番目のアスパラギン酸、２４５番目のアスパラギン酸、２６１番目のグルタミン酸、２６５番目のアスパラギン酸、２８５番目のアスパラギン酸、３１０番目のアスパラギン酸、３２２番目のアスパラギン酸、３２３番目のアスパラギン酸、３２８番目のアスパラギン酸、３３８番目のアスパラギン酸の１０個のうち少なくとも４つを塩基性アミノ酸に置き換えたものが例示できる。なお、配列番号１３のｗｔＢＯＤはＭｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ  ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ由来の野生型ＢＯＤである。
上記１０個のアミノ酸残基は配列番号１３のｗｔＢＯＤにおいて、塩基性アミノ酸残基に置換すれば等電点が特に顕著に上昇するアミノ酸残基であり、これらのうち４つを塩基性アミノ酸（アルギニン）に置き換えたときの等電点が４．９になることが実験により明らかになった。また、置換するアミノ酸残基が多いほど等電点が高くなる。配列番号１３のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列の例を配列番号１４に示す。
【００２４】
なお、配列番号１３に示したｗｔＢＯＤは成熟タンパク質のものであるが、ベースになるアミノ酸配列は未成熟タンパク質のものであってもよいし、その他、アミノ酸配列のアミノ末端側やカルボキシ末端側に、酵素活性や本願発明の効果が損なわれない限り、ヒスチジンタグ等のアフィニティタグやシグナルペプチその他の構造が付加されたものであってもよい。
配列番号１３に示したｗｔＢＯＤの未成熟タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１５に、ＤＮＡの塩基配列の例を配列番号１６に示す。配列番号１５に示した未成熟タンパク質のアミノ酸配列では上記１０個のアミノ酸残基は、それぞれ２８０番目のアスパラギン酸、２８３番目のアスパラギン酸、２９９番目のグルタミン酸、３０３番目のアスパラギン酸、３２３番目のアスパラギン酸、３４８番目のアスパラギン酸、３６０番目のアスパラギン酸、３６１番目のアスパラギン酸、３６６番目のアスパラギン酸、３７６番目のアスパラギン酸に相当する。
【００２５】
上記の方法による好ましいｍＢＯＤのアミノ酸配列を配列番号１７に示す。この例は配列番号１３のｗｔＢＯＤの上記１０残基（２４２番目、２４５番目、２６１番目、２６５番目、２８５番目、３１０番目、３２２番目、３２３番目酸、３２８番目、３３８番目）の全てをアルギニン残基に変更したものである。なお、配列番号１７のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の例を配列番号１８に示す。また、配列番号１７のｍＢＯＤの未成熟タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１９に、そのＤＮＡ配列の例を配列番号２０に示す。
【００２６】
カルボキシ末端に塩基性アミノ酸残基を付加されたオキシダーゼや、特定のアミノ酸残基が塩基性アミノ酸に置き換えられたオキシダーゼを得る方法は特に限定されないが、例えば所望のアミノ酸配列をコードする塩基配列（遺伝子）を発現ベクターに組み込み、適当な宿主に導入して培養し、しかる後、得られた粗酵素液を精製する定法が全て好適に採用できる。
【００２７】
カルボキシ末端に塩基性アミノ酸残基が付加されたオキシダーゼの塩基配列（遺伝子）は定法により得ることができるが、その方法を配列番号１に示したｒＣｕｅＯのカルボキシ末端にアルギニン残基を付加する場合に基づいて例示すれば、配列番号２１の塩基配列（配列番号４のＤＮＡ配列に終止コドンを加えたもの）における終始コドンの前側に直接塩基性アミノ酸のコドンを所定数だけ付加（配列番号２２）してもよいし、配列番号２３のように終止コドンの前に制限酵素切断部位（配列番号２３の場合はＳｐｌＩ切断部位）のみを付加して、既に確立された塩基配列であるポリアルギニンリンカー（配列番号２４）を制限酵素切断部位に挿入してもよい。
【００２８】
配列番号２２のように直接塩基性アミノ酸のコドンを所定数（配列番号２２の例ではアルギニン６残基分）付加したり、配列番号２３のように制限酵素切断部位を付加する方法は特に限定されないが、例えばＰＣＲ法を応用した方法で製造することができる。
具体的には、基礎となるオキシダーゼをコードする塩基配列をＰＣＲ法で増幅する際に、３’側プライマーとして終止コドンの前に付加したい塩基配列が挿入されたものを用いればよい。
ＰＣＲ法の反応条件は特に限定されないが、９６℃で３０秒の変性、５５℃で１分間のアニーリング、７２℃で１分間の伸長からなる単位を１サイクルとし、このサイクルを２５回繰り返す条件を例示することができる。
【００２９】
また、特定のアミノ酸残基が塩基性アミノ酸に置き換えられたオキシダーゼの塩基配列を得る方法も特に限定されず、周知の方法に従い、通常のオキシダーゼをコードする遺伝子に部位特異的変異を導入すればよい。このような部位特異的変異は、市販のキットを用いて容易に行うことができる。なお、使用できる市販のキットとしては、例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商品名）  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ（商品名）  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＣＯＮＥＴＥＣＨ社製）が例示できる。
【００３０】
上記のように作成した塩基配列は適切な発現ベクターに組み込まれる。使用可能な発現ベクターは特に限定されないが、大腸菌用の発現ベクターとして使用できるプラスミドとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１９等を挙げることができる。この中でもｐＵＣ１８が好ましい。
また、酵母用の発現ベクターとして使用できるプラスミドとしては、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ６、ｐＡＯ８１５、ｐＧＡＰＺ等を挙げることができる。このなかでもｐＰＩＣ９Ｋが好ましい。
【００３１】
所望のオキシダーゼをコードする塩基配列を上記の発現ベクターに組み込む方法は特に限定されず、周知の方法を用いることができる。その一例を示せば、Ｔａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（商品名：タカラバイオ社製）を用い、１６℃で一晩反応させることにより行うことができる。
【００３２】
所望の塩基配列が組み込まれた発現ベクター（組換えベクター）は適切な宿主に導入される。用いられる宿主としては特に限定されず、微生物、動物細胞、植物細胞のいずれでもよいが、取り扱い性の点で微生物を用いるのが好ましく、特に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）やメタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）が好ましい。
菌株も特に限定されないが、大腸菌を使用する場合は、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＢＬ２１、ＪＭ１０９、ＮＭ５２２、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＤＨ１０Ｂが例示でき、このなかでもＢＬ２１が好ましい。メタノール資化酵母を使用する場合は、ＧＳ１１５、ＫＭ７１、ＳＭＤ１１６８が例示でき、このなかでもＧＳ１１５が好ましい。
【００３３】
組換えベクターを宿主に導入する方法は特に限定されず、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、パーティクルガンのような公知の方法が全て好適に使用できる。
【００３４】
上記のように組換えベクターが導入された宿主（形質転換体）は定法に従い培養される。使用される培地は特に限定されず、具体的には宿主が大腸菌である場合にはＬＢ培地やＭ９−ｇｌｕｃｏｓｅ培地等の周知のものが例示できる。また、培地には必要に応じ、塩化銅、イソプロピル  チオ−β−Ｄ−ガラクシド（ＩＰＴＧ）、アンピシリン等の薬剤を添加してもよい。培養条件も特に限定されないが、２８〜３７℃で１〜２４時間培養すればよい。また、必要に応じ、通気や攪拌を行ってもよい。
宿主がメタノール資化酵母の場合、使用できる培地としてはＹＰＤ培地、ＭＤ培地、ＭＢＢ培地等の周知のものが例示できる。また、培地には塩化銅、メタノール、Ｇ４１８等の薬剤を添加してもよい。培養条件も特に限定されないが、２０〜３２℃、好ましくは３０℃で２〜７日培養すればよい。また、必要に応じ、通気や攪拌を行ってもよい。
【００３５】
本発明のマルチ銅オキシダーゼは、上記した宿主を培養した培地から得ることができる。培地から所望のオキシダーゼを得る方法は特に限定されないが、培養液の上澄みから得られたタンパク質や、オスモティックショック法により宿主を破壊して得られたタンパク質を精製する方法が例示できる。
精製方法も特に限定されないが、塩析、溶媒沈殿、透析法、限外濾過法、ポリアクリルアミド電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、等電点電気泳動法等、公知の方法が全て好適に利用できる。
【００３６】
上記のように作成したマルチ銅オキシダーゼはケラチン繊維用染色剤における酸化剤として有用である。
本発明のケラチン繊維用染色剤に用いられる酸化染料としては、上記のマルチ銅オキシダーゼにより酸化できるものであればどのようなものでも使用できる。具体的には、パラフェニレンジアミン、５−アミノオルトクレゾール、オルトアミノフェノール、メタアミノフェノール、パラアミノフェノール、２，４−ジアミノフェノール、２，６−ジアミノピリジン、５−（２−ヒドロキシエチルアミノ）−２−メチルフェノール、Ｎ，Ｎ−ビス（β−ヒドロキシ）−パラフェニレンジアミン硫酸塩、パラニトロ−オルトフェニレンジアミン、パラニトロ−２′，４′−ジアミノアゾベンゼン硫酸ナトリウム、トルエン−２，５−ジアミン、５−アミノオルトクレゾール硫酸塩、パラアミノフェノール硫酸塩、オルトクロロ−パラフェニレンジアミン硫酸塩、４，４′−ジアミノジフェニルアミン硫酸塩、パラメチルアミノフェノール硫酸塩、パラフェニレンジアミン硫酸塩、メタフェニレンジアミン硫酸塩、トルエン−２，５−ジアミン硫酸塩、２，４−ジアミノフェノキシエタノール塩酸塩、トルエン−２，５−ジアミン塩酸塩、メタフェニレンジアミン塩酸塩、２，４−ジアミノフェノール塩酸塩、３，３′−イミノジフェノール、パラフェニレンジアミン塩酸塩、Ｎ−フェニル−パラフェニレンジアミン塩酸塩、Ｎ−フェニル−パラフェニレンジアミン酢酸塩、１，５−ジヒドロキシナフタレン、トリレン−３，４−ジアミン、パラメチルアミノフェノール、Ｎ，Ｎ′−ビス（４−アミノフェニル）−２，５−ジアミノ−１，４−キノンジイミン、オルトアミノフェノール硫酸塩、２，４−ジアミノフェノール硫酸塩、メタアミノフェノール硫酸塩が挙げられるが、基質特異性の関係でこの中でも特にパラフェニレンジアミン、パラアミノフェノール、オルトアミノフェノール、２，４−ジアミノフェノール、トルエン−２，５−ジアミンおよびこれらの塩等が好ましい。これらは単独で又は必要に応じ２種以上組み合わせて用いられる。
【００３７】
本発明においては、染料として、インドリン化合物や、インドール化合物を用いることもできる。
インドリン化合物としては特に限定されないが、例えば、インドリン、５，６−ジヒドロキシインドリン、Ｎ−メチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、Ｎ−エチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、Ｎ−ブチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、４−ヒドロキシ−５−メトキシインドリン、６−ヒドロキシ−７−メトキシインドリン、６，７−ジヒドロキシインドリン、４，５−ジヒドロキシインドリン、４−メトキシ−６−ヒドロキシインドリン、Ｎ−ヘキシル−５，６−ジヒドロキシインドリン、２−メチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、３−メチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、４−ヒドロキシインドリン、２，３−ジメチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、２−メチル−５−エチル−６−ヒドロキシインドリン、２−メチル−５−ヒドロキシ−６−β−ヒドロキシエチルインドリン、４−ヒドロキシプロピルインドリン、２−ヒドロキシ−３−メトキシインドリン、６−ヒドロキシ−５−メトキシインドリン、６−ヒドロキシインドリン、５−ヒドロキシインドリン、７−ヒドロキシインドリン、７−アミノインドリン、５−アミノインドリン、４−アミノインドリン、５，６−ジヒドロキシインドリンカルボン酸、１−メチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、これらの塩類等を挙げることができる。これらは単独で又は必要に応じ２種以上組み合わせて用いられる。
【００３８】
インドール化合物としては特に限定されないが、例えば、４，５−ジヒドロキシインドール、５，６−ジヒドロキシインドール、６，７−ジヒドロキシインドール、Ｎ−メチル−５，６−ジヒドロキシインドール、Ｎ−エチル−５，６−ジヒドロキシインドール、Ｎ−ヘキシル−５，６−ジヒドロキシインドール、２−メチル−５，６−ジヒドロキシインドール、３−メチル−５，６−ジヒドロキシインドール、４−ヒドロキシインドール、２，３−ジメチル−５，６−ジヒドロキシインドール、２−メチル−５−エチル−６−ヒドロキシインドール、２−メチル−５−ヒドロキシ−６−β−ヒドロキシエチルインドール、４−ヒドロキシプロピルインドール、２−ヒドロキシ−３−メトキシインドール、４−ヒドロキシ−５−メトキシインドール、６−ヒドロキシ−７−メトキシインドール、６−ヒドロキシ−５−メトキシインドール、６−ヒドロキシインドール、５−ヒドロキシインドール、７−ヒドロキシインドール、７−アミノインドール、５−アミノインドール、４−アミノインドール、５，６−ジヒドロキシインド−ルカルボン酸、１−メチル−５，６−ジヒドロキシインドール、およびこれらの塩等を挙げることができる。これらは単独で又は必要に応じ２種以上組み合わせて用いられる。
【００３９】
本発明のケラチン繊維用染色剤には、必要に応じ、酸化染料以外の染料や色素を含有させることもできる。これらの色素や染料としては、タール色素、ＨＣ染料、塩基性染料、直接染料等が例示でき、これらは単独で又は必要に応じ２種以上組み合わせて用いられる。これらの色素や染料を含有させることにより、多彩な色調に染毛することが可能である。
このようなタール色素としては、昭和４１年８月３１日公布の厚生省令第３０号「医薬品等に使用することができるタール色素を定める省令」によって指定されている色素が挙げられる。また、ＨＣ染料としては、ＨＣ青２、ＨＣ橙１、ＨＣ赤１、ＨＣ赤３、ＨＣ黄２、ＨＣ黄４等が挙げられ、塩基性染料としては、塩基性青９９、塩基性茶１６、塩基性茶１７、塩基性赤５１、塩基性赤７６、塩基性黄５７等が挙げられ、直接染料としては、２−アミノ−６−クロロ−４−ニトロフェノール、３−メチルアミノ−４−ニトロフェノキシエタノール、２−アミノ−３−ニトロフェノール、４−ヒドロキシプロピルアミノ−３−ニトロフェノール等が挙げられる。これらは単独で又は必要に応じ２種以上組み合わせて用いられる。
【００４０】
本発明のケラチン繊維用染色剤には、本発明の効果を損なわない範囲で、通常、化粧品やケラチン繊維用染色剤に常用される各種成分を含有させることができる。
例えば、界面活性剤としては、塩化ラウリルトリメチルアンモニウム、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム等のカチオン性界面活性剤；ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ステアリン酸ソルビタン等のノニオン性界面活性剤；セチルアルコール、セトステアリルアルコール、ステアリルアルコール、ワセリン、パラフィン、流動パラフィン、パルミチン酸セチル、パルミチン酸オクチル等の油剤；キサンタンガム、サクシノグルカン、ヒドロキシプロピルグァーガム、カチオン化グァーガム等のグァーガム類、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カチオン化セルロース等のセルロース類等の増粘剤；１，３−ＢＧ、ＰＧ、ＤＰＧ、グリセリン等の保湿剤；ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ−２Ｎａ、ＥＤＴＡ−４Ｎａ、ヒドロキシエタンジホスホン酸等のキレート剤：パラベン、メチルイソチアゾリノン等の防腐剤；エタノール、イソプロピルアルコール等の溶剤；香料等で、これらは必要に応じ、任意に組み合わせて適宜配合することができる。
【００４１】
本発明のケラチン繊維用染色剤は一剤式でも多剤式でもよいが、本発明の場合、染料と酵素を混合しても酸素がなければ発色しないので、嫌気的条件化で保存すれば一剤式の染色剤として特に好適である。
剤型も液状、乳液状、クリーム状、ジェル状、泡状、エアロゾル状等、任意の剤型とすることができ、容器も袋入り、瓶入り、ポンプ式容器入り、チューブ入り、噴霧缶入り等、どのようなものでも採用できる。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例及び比較例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら制限されないことは云うまでもない。なお、以下の記載において、％は重量％を意味する。
【００４３】
実施例１
以下の手順により、本発明の改変されたマルチ銅オキシダーゼを調製した。
（１）６ＸＡｒｇ付加型ｍＣｕｅＯ遺伝子の作製
ｒＣｕｅＯ発現プラスミドｐＵＣＣｕｅＯ  Δα５−７（特許文献３に記載されたｐＵＣ１８−ＣｕｅＯ  Δα５−７と同じ。製造方法については同［００７６］〜［００９６］を参照）を鋳型に、配列番号２５のＣｕｅＯ  Ｆ（＋）プライマーと、配列番号２６の６ＸＡｒｇタグ導入プライマーを用いて、ＰＣＲ法により配列番号８に記載された６ＸＡｒｇ付加型ｍＣｕｅＯの後半約０．７ｋｂｐの遺伝子断片を増幅した。
【００４４】
なお、ｒＣｕｅＯ発現プラスミドｐＵＣＣｕｅＯ  Δα５−７とは、ｒＣｕｅＯのカルボキシ末端アミノ酸Ｖａｌの後にヒスチジンタグ（６ＸＨｉｓタグ）を付加したタンパク質（配列番号３）をコードする遺伝子（配列番号４）に対し、開始コドンの前に制限酵素ＥｃｏＲＩ切断配列を、終止コドンの後に制限酵素ＢａｍＨＩ切断配列を導入し、クローニングベクターｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ切断部位に挿入したものである。
配列番号２５のＣｕｅＯ  Ｆ（＋）プライマーは、ｒＣｕｅＯのＯＲＦ（配列番号4 ）において７４８〜７６８番目の塩基配列に相当する。
配列番号２６の６ＸＡｒｇタグ導入プライマー塩基配列に於いて、5 ’末端から側から３〜８番目の塩基（ｇｇａｔｃｃ）はＢａｍＨＩ切断部位、９〜１１番目の塩基（ｔｔａ）は終止コドンに対するアンチコドン、１２〜２９番目の塩基（ａｃｇａｃｇａｃｇａｃｇａｃｇａｃｇ）がＡｒｇのアンチコドンを６回繰り返したもの、３０番目以降はＣｕｅＯのカルボキシ末端領域コード配列の相補配列である。
【００４５】
ＰＣＲ反応は以下に示すＰＣＲ反応液を用い、以下の反応サイクルで行なった。
（２）ＰＣＲ反応液
Ｐｗｏ  Ｓｕｐｅｒ  Ｙｉｅｌｄ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ            ５．０μｌ
ｐＵＣＣｕｅＯ  Δα５−７（１０ｎｇ／μｌ）                    １．０μｌ
ＣｕｅＯ  Ｆ（＋）プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）              １．０μｌ
６ＸＡｒｇタグ導入プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）              １．０μｌ
ｄＮＴＰ  ｍｉｘ. （２ｍＭ，東洋紡社製）                        ５．０μｌ
滅菌蒸留水                                                    ３６．５μｌ
Ｐｗｏ  Ｓｕｐｅｒ  Ｙｉｅｌｄ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ    ０．５μｌ
合計                                                          ５０．０μｌ
【００４６】
（３）ＰＣＲ反応サイクル
１）９５℃，５ｍｉｎ予熱
２）９５℃，１ｍｉｎ変性
３）５２℃，１ｍｉｎアニーリング
４）７２℃，１ｍｉｎ伸長
→２）に戻る（２５サイクル）
５）７２℃，５ｍｉｎ伸長
【００４７】
（４）ＰＣＲ増幅断片の精製
上記反応終了後、反応液を１％アガロースゲル電気泳動に供して増幅断片を分離し、キアゲン社製ＱＩＡＥＸＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて増幅断片をゲルから抽出・精製した。操作はキアゲン社の説明書に従って行なった。
【００４８】
（５）ＰＣＲ増幅断片のＴＡクローニング
精製した増幅断片をプロメガ社のｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒと連結した。連結操作はプロメガ社の説明書に従って行なった。連結反応終了後，反応液５μｌを用いて、Ｅ. ｃｏｌｉ  ＸＬ１０−Ｇｏｌｄコンピテントセルを形質転換した。形質転換菌はアンピシリンを含むＬＢ寒天培地を用いて３７℃で一晩インキュベートした。
【００４９】
（６）制限酵素消化
生育したコロニーからアルカリＳＤＳ法によってプラスミドを単離し、制限酵素ＮｃｏＩとＢａｍＨＩで消化した後、１％アガロースゲル電気泳動に供して消化断片を分離した。次いで、ＱＩＡＥＸＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて約０．７ｋｂｐの消化断片をゲルから抽出・精製した。
これとは別に、ｐＵＣＣｕｅＯ  Δα５−７を制限酵素ＮｃｏＩとＢａｍＨＩで消化し、同様の操作で約３．４ｋｂｐの断片を精製した。
【００５０】
（７）６ＸＡｒｇ付加型ｍＣｕｅＯ発現プラスミドの製造
ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ. ２．１（タカラバイオ社製）を用い、タカラバイオ社の説明書に従って、上記生育したコロニーから得た約０．７ｋｂｐの消化断片とｐＵＣＣｕｅＯ  Δα５−７から得た約３．４ｋｂｐの断片を連結した。連結反応終了後、反応液５μｌを用いて，Ｅ. ｃｏｌｉＸＬ１０−Ｇｏｌｄコンピテントセルを形質転換した。形質転換菌はアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し３７℃で一晩インキュベートした。
【００５１】
（８）６ＸＡｒｇ付加型ｍＣｕｅＯ発現プラスミドの確認
生育したコロニーから，アルカリＳＤＳ法によってプラスミドを単離し，得られたプラスミドの中に変異型遺伝子の配列を確認した。確認を終えたプラスミドをｐＵＣＣｕｅＯ  Δα５−７  ６Ｒとする。ｐＵＣＣｕｅＯ  Δα５−７  ６Ｒのコードする６ＸＡｒｇ付加型ｍＣｕｅＯのアミノ酸配列を配列番号７に、成熟６ＸＡｒｇ付加型ｍＣｕｅＯのアミノ酸配列を配列番号５に示す。
【００５２】
（９）６ＸＡｒｇ付加型ｍＣｕｅＯの製造及び精製
(i)形質転換体の培養
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルをｐＵＣＣｕｅＯ  Δα５−７  ６Ｒで形質転換し、形質転換菌はアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し３７℃で一晩インキュベートした。生じたコロニーを以下の二段階で培養し、６ＸＡｒｇ付加型ｍＣｕｅＯを発現させた。
前培養（試験管）：０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地４ｍｌ中、３７℃で一晩震盪培養を行なった。
本培養（２Ｌバッフル付き三角フラスコ）：１ｍＭ  ＣｕＣｌ2 、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧを添加した４００ｍｌの上記培地中、３２℃で１２時間震盪培養を行なった。
培養終了後、遠心分離により集菌し、０．８５％の塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、直ちに以下の浸透圧ショックを行なった。
【００５３】
(ii)浸透圧ショック
菌体を氷冷した２０％ショ糖、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｈ2 ＳＯ4 緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し氷水中で１０分間静置後、遠心分離によって菌体を回収した。次に、プロテアーゼ阻害剤を含む氷冷蒸留水に懸濁し、氷水中で１０分間静置後、遠心分離によって上清を回収した。得られた上清を、さらに９０，０００Ｘｇ、３０分の超遠心分離に供し、その上清を粗酵素液とした。
【００５４】
(iii) 陽イオン交換クロマトグラフィー
上記粗酵素液に、終濃度が２０ｍＭとなるようにリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を加え、同緩衝液で平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＳＰ−６５０Ｍ（東ソー社製）カラム（１００ｍｌ）に重層し、同緩衝液で洗浄した。その後、０→５００ｍＭのＮａＣｌ直線濃度勾配（４００ｍｌ）により吸着したタンパク質を容出させた。活性画分を集めて濃縮し，１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に透析した後、ｍＣｕｅＯの精製標品とした。
【００５５】
実施例２
以下の手順により、本発明の改変されたマルチ銅オキシダーゼの別例を調製した。
まず、特許第４４３７６５２号公報の［００２２］及び［００２３］に記載の方法により成熟ＢＯＤをコードするＤＮＡ断片を得て、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ法を用いて、配列番号１３番における２６５番目、２８５番目、３２３番目、３３８番目のアミノ酸残基に相当するコドンをアルギニンのコドンａｇａに置換した。
その後、同公報［００２４］〜［００３１］の方法に準じて４残基置換型ｍＢＯＤの精製標品を得た。
【００５６】
比較例１
特許文献３（再公表特許２００７／０６３６１４号公報）の［００７６］〜［０１０１］に記載されたｍＣｕｅＯ（１）と同じ方法でｒＣｕｅＯの精製標品を得た。なお、得られたｒＣｕｅＯのアミノ酸配列は配列番号２７に示されている。
【００５７】
比較例２
特許第４４３７６５２号公報の［００２２］〜［００３１］に記載された方法により得られたＢＯＤを比較例２のｗｔＢＯＤとした。なお、得られたｗｔＢＯＤのアミノ酸配列は配列番号１３に示されている。
【００５８】
実施例３
染料中間体としてパラフェニレンジアミンを含む第１剤と、オキシダーゼを含む第２剤からなる２剤式のケラチン繊維用染色剤を作成した。
表１に示すように、第１剤はポリオキシエチレン硬化ひまし油２ｇ、乳酸１ｇ、ヒドロキシエチルセルロース１ｇ、モノエタノールアミン０．９ｇ、パラフェニレンジアミン１ｇ、及び合計２５ｇになるように精製水を加えて混合して調製した。なお、第１剤のｐＨは９．８である。
第２剤は実施例１で作られたｍＣｕｅＯの希釈液（使用時の濃度は０．５ｕｎｉｔｓ／ｇ）である。なお、本実施例に使用したｍＣｕｅＯの等電点（ｐＩ）は８．１である。
【００５９】
実施例４
表１に示すように、第１剤にカップラーとしてレゾルシン０．５ｇが含まれる他は実施例３と同様にしてケラチン繊維用染色剤を作成した。
【００６０】
実施例５
表１に示すように、第１剤に染料中間体としてパラアミノフェノール０．３ｇが含まれる他は実施例３と同様にしてケラチン繊維用染色剤を作成した。
【００６１】
実施例６
表１に示すように、第１剤にカップラーとしてメタアミノフェノール０．３ｇが含まれる他は実施例３と同様にしてケラチン繊維用染色剤を作成した。
【００６２】
実施例７
表１に示すように、第１剤にカップラーとして塩酸２，４ジアミノフェノキシエタノール０．２ｇが含まれる他は実施例３と同様にしてケラチン繊維用染色剤を作成した。
【００６３】
実施例８
表１に示すように、第１剤にカップラーとしてｐＡＯＣ（パラアミノオルトクレゾール）０．３ｇが含まれる他は実施例３と同様にしてケラチン繊維用染色剤を作成した。
【００６４】
実施例９
表１に示すように、モノエタノールアミンに代えて２８％アンモニア水３ｇ用いた他は実施例８と同様にしてケラチン繊維用染色剤を作成した。
【００６５】
【表１】
0005966448.tif 000002
【００６６】
「染毛試験」
上記した実施例３〜９のケラチン繊維用染色剤を用い、ビューラックス製白髪毛の１ｇ毛束に対して染毛試験を行った。
まず、前処理として、毛束を３８℃の流水で３０秒間水洗いして、１％ＳＤＳ液で１分間もみ洗いし、再び３８℃の流水で３０秒間水洗いしてＳＤＳ液を洗い流した後、風乾した。
次に、第１剤０．５ｇ及び第２剤１．５ｇを秤量してカップに入れて刷毛で混合し、混合液を刷毛で毛束に塗布した。毛束は扇状になるように広げ、できるだけ均一に塗布できるようにした。
塗布後、室温（２６．５℃）で１５分後放置した後、毛束を裏返して混合液を刷毛で均一に広げ、さらに室温で１５分間放置した。
その後、毛束を３８℃の流水で３０秒間水洗いしてケラチン繊維用染色剤を洗い流し、１％ＳＤＳ液を塗布してコームで２０回櫛通しして泡立てた後、３８℃の流水で流しながらコームで２０回櫛通しして１％ＳＤＳ液を洗い流した。洗浄後、水分をタオルで拭き取り、乾燥させた。
乾燥後、分光測色計（コニカミノルタ製、ＣＭ−２６００ｄ）でＬａｂ値を測定するとともに、未処理の白髪毛を基準とした色差ΔＥを算出した。結果を表２に示す。
表２に示すとおり、毛束は様々な色に染め上げられ、使用者が求める所望の色に頭髪を染色可能であることがわかる。
【００６７】
【表２】
0005966448.tif 000003
【００６８】
実施例１０及び比較例３
第１剤のｐＨが９．０になるようにモノエタノールアミンの量を変更し、第２剤として、実施例１及び比較例１で得られた酵素の希釈液（使用時の濃度は０．２５ｕｎｉｔｓ／ｇ）を用いた他は、実施例３と同様にして、実施例１０及び比較例３のケラチン繊維用染色剤を作成した。
【００６９】
実施例１１  比較例４
第１剤として、パラフェニレンジアミン（ＰＰＤ）に代えて、５，６−ジヒドロキシインドール（５，６−ＤＨＩ）０．３ｇ配合したものを用い、第２剤として実施例２及び比較例２で得られた酵素の希釈液（使用時の濃度は０．２５ｕｎｉｔｓ／ｇ）を用いた他は、実施例１０と同様にして、実施例１１及び比較例４のケラチン繊維用染色剤を作成した。
【００７０】
上記した実施例１０、１１及び比較例３、４のケラチン繊維用染色剤を用い、上記染色試験と同様の方法で染色試験を行った。酵素の等電点（ｐＩ）及び試験結果を表３に示す。
表３に示されるとおり、等電点が高いマルチ銅オキシダーゼを用いれば等電点が低い場合と比較して、染色性が優れていることがわかる。
【００７１】
【表３】
0005966448.tif 000004
【００７２】
なお、上記実施例、比較例、参考例において、各酵素の濃度は以下の条件で測定し、調製した。
キュベット（１．５ｍＬ  ＵＶディスポセル、Ｔｏｐ社製）中で、２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）０．８７５ｍＬ、各酵素（ｒＣｕｅＯ、ｍＣｕｅＯ、ｗｔＢＯＤ、ｒＢＯＤ）水溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ）０．０２５ｍＬ、及び、各基質溶液０．１ｍＬを混合し、分光光度計（ＵＶ−２４５９、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を用いて、各測定波長での吸光度の変化量を測定した（測定波長はパラフェニレンジアミンは４７０ｎｍ、５，６−ジヒドロキシインドールは３００ｎｍ）。
そして、既に判っている目標濃度（０．５及び０．２５ｕｎｉｔｓ／ｇ）におけるｗｔＣｕｅＯ及びｗｔＢＯＤの吸光度の変化量と比較し、この吸光度の変化量と同じになるように各酵素水溶液を希釈して目標濃度の酵素液とみなした。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明の改変されたマルチ銅オキシダーゼは等電点が高いので、アルカリ条件下でもマイナスに帯電しにくく、又はプラスに帯電し、当該条件下でケラチン繊維と反発しにくく、又は吸着されるのケラチン繊維用染色剤における第２剤の酸化剤として好適に使用できる。
本発明のケラチン繊維用染色剤は、酸化染料を等電点が高いオキシダーゼで酸化するため、毛髪や頭皮の損傷、かぶれが少ないばかりでなく、頭髪とオキシダーゼの反発力が小さく、或いは逆に吸着するので頭髪の近傍に発色したオキシダーゼが分布するので染色性に優れる。
【配列表】
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