(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体調製物を生産する方法であって、
（ａ）抗体の様々なアイソフォームを含むクエン酸緩衝液をカチオン交換クロマトグラフィー材に添加する工程と、
（ｂ）第１導電率を有する第１溶液をカチオン交換クロマトグラフィー材に添加し、抗体アイソフォームのカチオン交換クロマトグラフィー材への吸着が維持される工程と、
（ｃ）第２導電率を有する第２溶液をカチオン交換クロマトグラフィー材に添加して抗体調製物を得る工程、を有し、
第１溶液の導電率が４ｍＳ／ｃｍから５ｍＳ／ｃｍであることを特徴とし、
第２溶液の導電率が第１溶液の導電率を１０％以下で上回り、
カチオン交換クロマトグラフィー材が膨張性マトリックスを有し、
第１溶液が第２溶液にシングルステップで変更される、方法。
【請求項２】
抗体調製物を生産する方法であって、
（ａ）抗体をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養し、抗体を細胞又は培地から回収する工程と、
（ｂ）少なくとも１つのカラムクロマトグラフィーの工程により抗体を精製する工程、を有し、該少なくとも１つのクロマトグラフィーの工程が、
（ｉ）カチオン交換クロマトグラフィー材に抗体の様々なアイソフォームを含むクエン酸緩衝液を添加する工程と、
（ｉｉ）第１導電率を有する第１溶液をカチオン交換クロマトグラフィー材に添加し、抗体アイソフォームのカチオン交換クロマトグラフィー材との結合が維持される工程と、
（ｉｉｉ）第２導電率を有する第２溶液をカチオン交換クロマトグラフィー材に添加して抗体調製物を生産する工程、を有し、
第１溶液の導電率が４ｍＳ／ｃｍから５ｍＳ／ｃｍであることを特徴とし、
第２溶液の導電率が第１溶液の導電率を１０％以下で上回り、
カチオン交換クロマトグラフィー材が膨張性マトリックスを有し、
第１溶液が第２溶液にシングルステップで変更される、方法。
【請求項３】
膨張性マトリックスがアガロースであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
カチオン交換クロマトグラフィー材が強カチオン交換クロマトグラフィー材であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
強カチオン交換クロマトグラフィー材がスルホプロピル-カチオン交換クロマトグラフィー材であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
シングルステップが１００ｖｏｌ％の第１溶液から１００ｖｏｌ％の第２溶液への変更であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
第１溶液が２０ｍＭクエン酸ナトリウム及び１０ｍＭ塩化ナトリウム、又は２５ｍＭトリス及び１０ｍＭ塩化ナトリウムを含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
第２溶液が２０ｍＭクエン酸ナトリウム及び５ｍＭ塩化ナトリウム、又は２５ｍＭトリス及び７０ｍＭ塩化ナトリウムを含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
抗体が抗ＨＥＲ２抗体であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
抗ＨＥＲ２抗体が抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブ又は抗ＨＥＲ２抗体ペルツズマブであることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
強カチオン交換クロマトグラフィー材上でのステップ溶出法を有する抗体調製物を得る方法を報告する。
【背景技術】
【０００２】
様々な方法が公知であり、タンパク質精製に広く使用され、例えば微生物タンパク質を用いたアフィニティークロマトグラフィー（例えばＡタンパク質やＧタンパク質アフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（例えばカチオン交換（カルボキシメチル樹脂）、アニオン交換（アミノエチル樹脂）及びミックスモード交換）、チオフィリック吸着（例えばベータ-メルカプトエタノール及び他のＳＨリガンドを用いる）、疎水性相互作用又は芳香族吸着クロマトグラフィー（例えばフェニルセファロース、アザ-アレノフィリック樹脂又はｍ-アミノフェニルボロン酸を用いる）、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー（例えばＮｉ(ＩＩ)-及びＣｕ(ＩＩ)-アフィニティー材を用いる）、分子ふるいクロマトグラフィー及び電気泳動法（ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動など）（Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102）がある。
【０００３】
薬学的抗体の産業的な精製、特にクロマトグラフィープロセスの開発、操作及び実証がBiotechnol Gen. Eng. Rev. 18 (2001) 301-327誌でFahrner, R.L.らによって報告されている。Follman, D.K. and Fahrner, R.L. (J. Chrom. A 1024 (2004) 79-85) は、タンパク質Ａなしの３つのクロマトグラフィーのステップを用いる抗体精製プロセスの因子スクリーニングを報告している。高電荷密度をもつイオン交換媒体による細胞培地の上澄み液からのヒトモノクローナル抗体のキャプチャーがNecina, R., ら (Biotechnol. and Bioeng. 60 (1998) 689-698) に報告されている。イオン交換クロマトグラフィーによるタンパク質精製が国際公開第99/057134号に報告されている。国際公開第2004/076485号では、タンパク質Ａとイオン交換クロマトグラフィーによる抗体精製が報告されている。米国特許第5,429,746号では抗体精製が報告されている。タンパク質精製が国際公開第2003/066662号に報告されている。
【０００４】
国際公開第2006/125599号では、抗体精製法が報告されている。タンパク質Ａとイオン交換クロマトグラフィーによる抗体精製が国際公開第2004/076485号に報告されている。
【発明の概要】
【０００５】
抗体アイソフォームのクロマトグラフィーによる分離及び／又は濃縮は、カチオン交換クロマトグラフィー材の移動相の導電率が適度に増加することで可能であることが見いだされている。必要とされる導電率の増加は高くて５０％、すなわち、第２溶液の導電率は第１溶液の導電率の１０１％から１５０％である。
【０００６】
したがって、ここで報告される一態様は、抗体調製物を提供する方法であって、方法は、
（ａ）抗体の様々なアイソフォームを含む緩衝液をカチオン交換クロマトグラフィー材に添加する工程と、
（ｂ）第１導電率を有する第１溶液をカチオン交換クロマトグラフィー材に添加し、抗体アイソフォームとカチオン交換クロマトグラフィー材との結合が維持される工程と、
（ｃ）第２導電率を有する第２溶液をカチオン交換クロマトグラフィー材に添加し抗体調製物を得る工程
を有し、第２溶液の導電率が第１溶液の導電率を少なくとも１％ただし５０％以下で上回る。
【０００７】
一実施態様では、第２溶液の導電率は第１溶液の導電率を少なくとも１％ただし２０％以下で上回る。
【０００８】
一実施態様では、第２溶液の導電率は第１溶液の導電率を少なくとも１％ただし１５％以下で上回る。
【０００９】
一実施態様では、第２溶液の導電率は第１溶液の導電率を少なくとも１％ただし１０％以下で上回る。
【００１０】
一実施態様では、工程（ａ）の溶液と工程（ｂ）の溶液の導電率は同じである。一実施態様では、抗体の様々なアイソフォームを含む緩衝液は、第１導電率を有し、第１溶液も同じ（第１）導電率を有する。
【００１１】
一実施態様では、カチオン交換クロマトグラフィー材は、膨張性マトリックスを有する。一実施態様では、膨張性マトリックスはアガロースである。
【００１２】
一実施態様では、カチオン交換クロマトグラフィー材は強カチオン交換クロマトグラフィー材である。一実施態様では、強カチオン交換クロマトグラフィー材はスルホプロピル-カチオン交換クロマトグラフィー材である。
【００１３】
一実施態様では、第１溶液は１ステップで第２溶液に変更される。一実施態様では、１ステップは第１溶液１００ｖｏｌ％から第２溶液１００ｖｏｌ％への変更である。
【００１４】
一実施態様では、第１溶液は第２溶液に直線グラジエントで変更される。一実施態様では、直線グラジエントは約３０カラムボリュームである。一実施態様では、直線グラジエントは約２０カラムボリュームである。
【００１５】
一実施態様では、第１溶液は２０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む。
【００１６】
一実施態様では、第２溶液は２０ｍＭのクエン酸ナトリウムと５ｍＭの塩化ナトリウムを含む。
【００１７】
一実施態様では、第１溶液は２５ｍＭのトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンと１０ｍＭの塩化ナトリウムを含む。
【００１８】
一実施態様では、第２溶液は２５ｍＭのトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンと７０ｍＭの塩化ナトリウムを含む。
【００１９】
一実施態様では、第２溶液は２５ｍＭのトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンと４５ｍＭの塩化ナトリウムを含む。
【００２０】
一実施態様では、第１及び第２溶液は水溶液である。
【００２１】
一実施態様では、抗体は抗ＨＥＲ２抗体である。一実施態様では、抗ＨＥＲ２抗体は抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブ又は抗ＨＥＲ２抗体ペルツズマブである。一実施態様では、抗ＨＥＲ２抗体はヒト化抗ＨＥＲ２抗体である。
【００２２】
ここでは別の態様として、ここで報告される方法により得られる抗体調製物が報告される。一実施態様では、抗体は抗ＨＥＲ２抗体である。
【００２３】
ここで報告される別の態様は、抗体調製物を生産する方法であって、
（ａ）抗体をコードする核酸を有する哺乳動物細胞を培養し、抗体を細胞又は培地から回収する工程と、
（ｂ）少なくとも１つのクロマトグラフィーの工程により抗体を精製する工程を有し、この少なくとも１つのクロマトグラフィーの工程が、
（ｉ）カチオン交換クロマトグラフィー材に抗体の様々なアイソフォームを含む緩衝液を添加する工程と、
（ｉｉ）第１導電率を有する第１溶液をカチオン交換クロマトグラフィー材に添加し、抗体アイソフォームとカチオン交換クロマトグラフィー材との結合が維持される工程と、
（ｉｉｉ）第２導電率を有する第２溶液をカチオン交換クロマトグラフィー材に添加し抗体調製物を生産する工程を有し、
第２溶液の導電率が第１溶液の導電率を少なくとも１％ただし１０％以下で上回る。
【００２４】
ここに報告される全態様の一実施態様では、第１溶液が４ｍＳ／ｃｍから５ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。
【発明の説明】
【００２５】
ここでは、（ｉ）抗体の様々なアイソフォームを含む緩衝液をカチオン交換クロマトグラフィー材に添加する工程と、（ｉｉ）第１導電率を有する第１溶液をカチオン交換クロマトグラフィー材に添加し、抗体アイソフォームとカチオン交換クロマトグラフィー材との結合が維持される工程と、（ｉｉｉ）第２導電率を有する第２溶液をカチオン交換クロマトグラフィー材に添加して抗体調製物を得る工程を有し、第２溶液の導電率が第１溶液の導電率を５０％以下で上回る、抗体調製物を得る方法が報告される。
【００２６】
一般に、組換えにより生産されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＢＨＫ、Ｓｐ２／０、ＣＨＯ又はＨＥＫ細胞などの産生細胞の培養上澄み液から回収される。これに付随して、他のタンパク化合物並びに別の抗体アイソフォームも回収される。抗体アイソフォームは、糖鎖付加パターン、重鎖Ｃ末端側リジンの不均一性、及びアスパラギン又はグルタミンアミノ酸残基の部分的脱アミノ化といった軽微な構造上の特徴が違うだけである。
【００２７】
一般的なクロマトグラフィー法を使用して、抗体をカチオン交換クロマトグラフィーカラム／材から単一の（対称の）ピークで回収する（例えば実施例６と図５を参照）。
【００２８】
カチオン交換クロマトグラフィー法を用いて抗体アイソフォームを濃縮又は部分的に違いに分離できることが今や知られている。分離／濃縮は、特に微細な勾配を有するグラジエントを用いて、ｐＨグラジエントや塩グラジエントを用いる結合・溶出クロマトグラフィー法で得られる。
【００２９】
抗体調製物中の抗体アイソフォームの濃縮が、移動相の適度な導電率の増加を有するカラムクロマトグラフィーにより可能であることが知られている。
【００３０】
一実施態様では、導電率の増加は５０％以下、すなわち導電率は１００％から少なくとも１０１％まで、高くて１５０％の増加、すなわち始めの第１レベルから第２レベルへと高くなり、抗体を溶出させる。
【００３１】
一実施態様では、導電率の増加は１０％以下、すなわち導電率は１００％から少なくとも１０１％まで、高くて１１０％の増加、すなわち始めの第１レベルから第２レベルへと高くなり、抗体を溶出させる。
【００３２】
カチオン交換クロマトグラフィー材のマトリックスは膨張性マトリックスでなければならないことが知られている。
【００３３】
一実施態様では、マトリックスは架橋結合した糖類である。一実施態様では、糖類は多糖類である。一実施態様では、多糖類はアガロースすなわちグリコシド結合のＤ-ガラクトースと３,６-無水-Ｌ-ガラクトースからなる多糖である。
【００３４】
増加は１ステップの形態でありうる。従って、増加は、溶出溶液の完全な変更、すなわち１００％の第１緩衝液から１００％の第２（＝溶出）緩衝液により行ってよい。
【００３５】
増加は直線グラジエントの形態でありうる。従って、増加は、溶出溶液の直線的変更、すなわち１００％の第１緩衝液から５０〜１００％の第２（＝溶出）緩衝液により行ってよい。
【００３６】
一実施態様では、第１溶液は第２溶液に直線グラジエントで変更される。一実施態様では、直線グラジエントは約５０カラムボリュームである。一実施態様では、直線グラジエントは約３０カラムボリュームである。一実施態様では、直線グラジエントは約２０カラムボリュームである。
【００３７】
一般的なクロマトグラフィー法とそれらの用途は当業者には既知である。例えばHeftmann, E., (編), Chromatography, 5版, Part A: Fundamentals and Techniques, Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992); Deyl, Z., (編) Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, vol. 60, Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998); Poole, C.F., and Poole, S.K., Chromatography Today, Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer Verlag, (1982); Sambrook, J.ら, (編), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989); 又はAusubel, F.M.ら, (編), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, (1998) を参照されたい。
【００３８】
以下の表には、一般的に使用される一部の緩衝液の導電率を参照として記載する。
［表］
0005838221.tif 000002
0005838221.tif 000003
0005838221.tif 000004
【００３９】
「に添加する」という用語は、溶液をクロマトグラフィー材と接触させる部分的工程を意味する。この用語は、（ａ）溶液を、クロマトグラフィー材が充填されたクロマトグラフィー装置に添加すること、又は（ｂ）クロマトグラフィー材を溶液に加えることのいずれかを意味する。（ａ）の場合は溶液が装置を通過し、クロマトグラフィー材と溶液中に含有される物質の相互作用を可能にする。例えばｐＨ、導電率、塩濃度、温度及び／又は流量などの条件により、溶液の物質によってはクロマトグラフィー材と結合できるものもあれば、クロマトグラフィー材から回収されるものもある。溶液中に残存するか又はクロマトグラフィー材から回収された物質は、フロースルー中に認められる。「フロースルー」とは、装置通過後に得られる溶液を指し、添加された溶液か、又はカラムの洗浄に使用されるか若しくはクロマトグラフィー材に結合した物質を溶出させる緩衝液のいずれかでよい。一実施態様では、装置はカラム又はカセットである。（ｂ）の場合、クロマトグラフィー材は、例えば固体として溶液（例えば精製を目的とする物質を含有）に添加してクロマトグラフィー材と溶液中の物質の相互作用を可能にしうる。相互作用後、クロマトグラフィー材は例えば濾過により回収され、クロマトグラフィー材に結合した物質も一緒に溶液から回収されるが、クロマトグラフィー材に結合しなかった物質は溶液中に残存する。
【００４０】
「結合・溶出モード」という用語は、クロマトグラフィーの工程の操作モードを意味し、精製を目的とする物質を含有する溶液がクロマトグラフィー材に添加されると、目的とする物質がクロマトグラフィー材に結合する。こうして目的とする物質はクロマトグラフィー材上に留まるが、目的としない物質はフロースルー又は上澄み液と一緒に除去される。目的とする物質は後に第２工程でクロマトグラフィー材から溶出溶液と一緒に回収される。一実施態様では、ここに報告される方法が結合・溶出モードで操作される。
【００４１】
ここに報告される方法で使用される溶液は、未精製か緩衝された溶液である。「緩衝液」は、溶解した緩衝剤により、酸性又は塩基性の物質の添加又は放出によるｐＨの変化をなくした溶液である。このような特性をもつ任意の緩衝剤が使用されうる。一般に、薬学的に許容可能な緩衝剤が使用される。一実施態様では、緩衝液は、リン酸及び／又はその塩からなるリン酸緩衝液、酢酸とその塩からなる酢酸緩衝液、クエン酸及び／又はその塩からなるクエン酸緩衝液、モルホリン緩衝液、２-(Ｎ-モルホリノ)エタンスルホン緩衝液、ヒスチジン緩衝液、グリシン緩衝液又はトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン（トリス（ＴＲＩＳ））緩衝液からなる群より選ばれる。別の実施態様では、緩衝液は、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、又はヒスチジン緩衝液からなる群より選ばれる。緩衝液は、例えば塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、クエン酸ナトリウム又はクエン酸カリウムなどの追加の塩を含みうる。
【００４２】
「グラジエント溶出」及び「グラジエント溶出法」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、溶出すなわちクロマトグラフィー材からの結合化合物の回収をもたらす溶液の導電率が連続的に変更すなわち上げ下げされる、すなわち、溶出をもたらす物質の１％又は２％以内の濃度変更の小さなステップの連続で濃度を変更させる方法を意味する。この「連続的溶出」では、例えばｐＨ、イオン強度、塩濃度及びクロマトグラフィーのフローなどの１または複数の条件を直線的、指数的又は漸近的に変更させてよい。一実施態様では、変更は直線的である。
【００４３】
「ステップ溶出」という用語は、例えば溶出すなわちクロマトグラフィー材からの結合化合物の回収をもたらす物質の濃度を一度にすなわちある値／レベルから別の値／レベルに直接上昇または降下させる方法を意味する。この「ステップ溶出」では、例えばｐＨ、イオン強度、塩濃度及びクロマトグラフィーのフローなどの１または複数の条件を、第１の値例えば開始値から第２の値例えば最終値に一度に変えてよい。このように、条件は、直線的変更と比べて増分的すなわちステップ的に変更される。
【００４４】
「イオン交換クロマトグラフィー材」という用語は、非移動性の高分子量のマトリックスであり、イオン交換クロマトグラフィーの固定相として使用される共有結合した電荷を帯びた置換基を有する。全体的に電荷を中性にするため、共有結合していないカウンターイオンはそこに結合される。「イオン交換クロマトグラフィー材」は、その共有結合していないカウンターイオンを周囲の溶液の同様に電荷を帯びたイオンと交換する能力がある。交換可能なイオンの電荷により、「イオン交換樹脂」はカチオン交換樹脂又はアニオン交換樹脂を意味する。電荷を帯びた基（置換基）の性質により、「イオン交換樹脂」は、例えばカチオン交換樹脂の場合は、スルホン酸樹脂（Ｓ）、スルホプロピル樹脂（ＳＰ）又はカルボキシメチル樹脂（ＣＭ）を意味する。
【００４５】
イオン交換材、すなわち固定相の様々な種類が多数の企業から様々な名称で入手可能であり、例えば、カチオン交換材Ｂｉｏ−Ｒｅｘ（登録商標）（例えばタイプ70）、Ｃｈｅｌｅｘ（登録商標）（例えばタイプ100）、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（登録商標）（例えばタイプCM, High S, 25 S)、ＡＧ（登録商標）（例えばタイプ50W, MP）が全てBioRad Laboratories社から入手可能、ＷＣＸ  ２がCiphergen社から入手可能、Ｄｏｗｅｘ（登録商標）ＭＡＣ−３からDowケミカル社から入手可能、ムスタングＣ及びムスタングＳがPall Corporationから入手可能、セルロースＣＭ（例えばタイプ23, 52）、ハイパーＤ、パーティスフィアがWhatman plc.社から入手可能、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲＣ（例えばタイプ76, 747, 748）、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＧＴ  ７３、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）（例えばタイプSP, CM, 650M）が全てTosoh Bioscience GmbHより入手可能、ＣＭ  １５００及びＣＭ  ３０００がBioChrom Labs社から入手可能、ＳＰ−セファロースＴＭ、ＣＭ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭがＧＥヘルスケア社より入手可能、Ｐｏｒｏｓ樹脂がPerSeptive Biosystems社より入手可能、Ａｓａｈｉｐａｋ  ＥＳ（例えばタイプ502C）、ＣＸｐａｋ  Ｐ、ＩＥＣ  ＣＭ（例えばタイプ825, 2825, 5025, LG）、ＩＥＣ  ＳＰ（例えばタイプ420N, 825）、ＩＥＣ  ＱＡ（例えばタイプLG, 825）がShoko America Inc.より入手可能、５０Ｗカチオン交換樹脂がEichrom Technologies Incより入手可能、などがある。一実施態様では、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｓ若しくは２５Ｓ、ＭａｃｒｏＣａｐ  ＳＰ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＳＰ  ６５０Ｍ、Ｓｏｕｒｃｅ  Ｓ、ＳＰセファロース、ＰＯＬＹＣＡＴ  Ａ、Ｍｏｎｏ  Ｓ又はＨｉｇｈｓｃｒｅｅｎ  ＳＰなどのカチオン交換材は強カチオン交換材である。
【００４６】
当業者には、例えばポリペプチドのアミノ酸配列を、このアミノ酸配列をコードする対応の核酸配列に変換する手順及び方法は公知である。従って、核酸は、それぞれヌクレオチドからなる核酸配列と、それによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列により特徴づけられる。
【００４７】
本明細書内で使用される「結合に適した条件下で」という用語及び文法的に同等の用語は、例えば抗体アイソフォームなどの目的とする物質が、固体相、例えばイオン交換材と接触させられるとこれに結合することを示す。これは、目的とする物質が必ずしも１００％結合されることは意味しないが、目的とする物質の事実上１００％が、すなわち目的とする物質の少なくとも５０％が、好ましくは目的とする物質の少なくとも７５％が、目的とする物質の８５％が、より好ましくは目的とする物質の少なくとも９５％が、固定相に結合される。
【００４８】
「治療用抗体」という用語は、ヒト治療用の承認を受けるために臨床試験される抗体であり、疾患治療のために個体に投与されうる。一実施態様では、抗体は治療用抗体である。別の実施態様では、治療用抗体は、モノクローナル抗体である。さらに別の実施態様では、治療用抗体は、ヒト抗体遺伝子座で形質転換された大型類人猿又は動物から得るか、ヒトモノクローナル抗体又はヒト化モノクローナル抗体である。一実施態様では、治療用抗体はヒトモノクローナル抗体である。さらに別の実施態様では、治療用抗体モノクローナルはヒト化抗体である。治療用抗体は、腫瘍性疾患（例えば非ホジキンリンパ腫、乳癌及び結腸直腸癌を含む血液系腫瘍や固形腫瘍）、免疫性疾患、中枢神経疾患、血管性疾患又は感染性疾患などの様々な疾患の治療に広く使用されている。このような抗体は、一実施態様では、ＡＬＫ、接着関連キナーゼ受容体（例えばAxl）、ＥＲＢＢ受容体（例えばEGFR, ERBB2, ERBB3, ERBB4)、エリスロポエチン産生肝細胞（EPH）受容体（例えばEphA1; EphA2, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7, EphA8, EphB1, EphB2, EphB3, EphB4, EphB5, EphB6）、繊維芽細胞成長因子（FGF）受容体（例えばFGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FGFR5）、Ｆｇｒ、ＩＧＦ１Ｒ、インスリン受容体、ＬＴＫ、Ｍ−ＣＳＦＲ、ＭＵＳＫ、血小板由来成長因子（PDGF）受容体（例えばPDGFR-A, PDGFR-B)、RET、ROR1、ROR2、ROS、RYK、血管内皮成長因子（VEGF）受容体（例えばVEGFR1/FLT1, VEGFR2/FLK1, VEGF3）、免疫グロブリン様とＥＧＦ様ドメインを有するチロシンキナーゼ（TIE）受容体（例えばTIE-1, TIE-2/TEK)、Ｔｅｃ、ＴＹＲＯ１０、インスリン様成長因子（IGF）受容体（例えばINS-R, IGF-IR, IR-R）、ジスコイジンドメイン（DD）受容体（例えばDDR1, DDR2)、ｃ-Ｍｅｔの受容体（MET）、recepteur d'origine nantais （RON、マクロファージ刺激１受容体としても知られる）、Ｆｌｔ３（フィン関連キナーゼ３）、コロニー刺激因子１
（CSF1）受容体、ｃ-ｋｉｔの受容体（KIT又はSCFR）、インスリン受容体関連（IRR）受容体、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３３、ＣＤ５２、Ｇ２５０、ＧＤ３、ＰＳＭＡ、ＣＤ５６、ＣＥＡ、ルイスＹ抗原又はＩＬ-６受容体に対する。
【００４９】
「抗体」という用語は、全抗体と抗体断片を含む様々な態様の抗体構造を包含する。ここで報告される抗体は、一実施態様ではヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体又はＴ細胞抗原枯渇抗体である。抗体の遺伝子操作は、例えばMorrison, S.L.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; 米国特許第5,202,238号及び米国特許第5,204,244号；Riechmann, L.ら, Nature 332 (1988) 323-327; Neuberger, M.S.ら, Nature 314 (1985) 268-270; Lonberg, N., Nat. Biotechnol. 23 (2005) 1117-1125に記述されている。重鎖定常領域のアミノ酸配列により、抗体は次のクラスに分類される：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ。これらのクラスの一部はさらに以下のサブクラス（アイソタイプ）、すなわちＩｇＧはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４に、又はＩｇＡはＩｇＡ１とＩｇＡ２に分けられる。抗体が属する免疫グロブリンのクラスによると、重鎖定常領域はそれぞれα（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）及びμ（ＩｇＭ）と呼ばれる。「ヒトＩｇＧ１クラスの抗体」という用語は、定常領域のアミノ酸配列がヒトＩｇＧ１由来である抗体を指す。この用語はヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体及び抗体コンジュゲートを含む。
【００５０】
非ヒト（例えば齧歯類）抗体の「ヒト化」形態とは、非ヒト抗体及びヒト抗体由来の部分的な配列を有するキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体はヒト抗体（レシピエント抗体）由来であり、超可変領域の残基が、所望の特異性と親和性を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種の超可変領域（ドナー抗体）の残基で置き換えられている。ヒト抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）残基が対応する非ヒト残基で置き換えられている例もある。また、ヒト化抗体は、さらなる修飾、例えばレシピエント抗体にもドナー抗体にも見られないアミノ酸残基を有しうる。このような修飾により、このようなレシピエント又はドナー抗体の、親配列と相同性はあるものの同一ではないバリアントが生じる。これらの修飾は、抗体の働きをさらに正確にするため行われる。
【００５１】
一般に、ヒト化抗体は少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインを実質的に含み、超可変ループの全て又は実質的に全てが非ヒトドナー抗体の超可変ループに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒトレシピエント抗体のＦＲに対応する。ヒト化抗体は、典型的にはヒト抗体の定常領域の少なくとも一部分を含んでよい。
【００５２】
非ヒト抗体のヒト化の方法が当分野で記述されている。一実施態様では、ヒト化抗体は、非ヒト源由来の１または複数のアミノ酸残基が導入されている。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば「移入」残基と呼ばれ、典型的には「移入」可変ドメインから取られる。ヒト化は、基本的にはウインターらの方法に従い超可変領域の配列を対応する非ヒト抗体の配列で置き換えることでなされ得る。従って、このような「ヒト化」抗体はキメラ抗体であり、インタクトなヒト可変ドメインよりも実質的に少ない部分が対応する非ヒト種の配列で置き換えられている。実際には、ヒト化抗体は典型的にはヒト抗体であり、一部の超可変領域残基とおそらくは一部のフレームワーク領域残基が齧歯類か非ヒト霊長類抗体の類似部位由来の残基で置き換えられている。
【００５３】
「モノクローナル抗体」という用語はここでは実質的に均質な抗体集団から得られた抗体、すなわち少量で存在しうる自然に生じる変異を除き集団を構成する個々の抗体が同一である抗体を意味する。モノクローナル抗体は特異性が高く、１つの抗原部位に対する。さらに、異なる抗原部位（決定基又はエピトープ）に対する別々の抗体を含むポリクローナル抗体調製物と違って、各モノクローナル抗体は抗原の１つの抗原部位に対する。特異性に加えてモノクローナル抗体が有利であるのは、他の抗体に汚染されず合成されうることである。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均質な抗体集団から得られた抗体の特徴を示すのであって、何らかの特別な方法で抗体を生産する必要があると解釈されるものではない。
【００５４】
「キメラ抗体」という用語は通常、組換えＤＮＡ手法により調製される、第１の種由来の可変ドメインすなわち結合領域と、別の第２のソース又は種由来の定常領域の少なくとも一部分を有する抗体を意味する。
【００５５】
抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体の鎖をコードする核酸配列に適切な修飾を導入することにより、又はペプチド合成により、調製されうる。このような修飾は、例えば、インターフェロンのアミノ酸配列内の残基の欠失及び／又は挿入及び／又は置換を含む。親抗体と同じく抗原結合特性を有するのであれば、欠失、挿入及び置換を任意組み合わせて最終的なコンストラクトを作ってよい。
【００５６】
一般的なアミノ酸置換を表１の「好ましい置換」の項目に示す。より実質的な変更を以下の表の「例示的置換」の項目に記載し、詳細はアミノ酸側鎖のクラスに関連して後述する。アミノ酸置換は抗体の鎖に導入してもよく、その産物は親抗体の生物学的活性を保持するかスクリーニングされる。
［表］
0005838221.tif 000005
【００５７】
アミノ酸は側鎖の共通の特性により分類されうる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の方向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香性：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００５８】
非一般的な置換は、これらのクラスの１のメンバーを別のクラスと交換することを伴いうる。
【００５９】
Hudziak, R.M.ら, Mol. Cell. Biol. 9 (1989) 1165-1172は、ヒト乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３を使用することを特徴とするＨＥＲ２抗体のパネルの作製について記述している。抗体曝露後のＳＫ−ＢＲ−３細胞の類似細胞の増殖は、７２時間後単層のクリスタルバイオレット染色により決定された。このアッセイを使用して、細胞増殖を５６％阻害した４Ｄ５と呼ばれる抗体により最大の阻害が得られた。このアッセイではパネルの他の抗体による細胞増殖の減少の程度はより低かった。抗体４Ｄ５はまた、ＨＥＲ-２を過剰発現する乳癌腫瘍細胞株を、ＴＮＦ-αの細胞毒性効果に対し感作させることが見いだされた（米国特許第5,677,171号も参照のこと）。Hudziak, R.M.らに論じられるＨＥＲ２抗体はまた、Fendly, B.M.ら, Cancer Research 50 (1990) 1550-1558; Kotts, C.E.ら, In Vitro 26 (1990) 59A; Sarup, J.C.ら, Growth Regulation 1 (1991) 72-82; Shepard, H.M.ら, J. Clin. Immunol. 11 (1991) 117-127; Kumar, R.ら, Mol. Cell. Biol. 11 (1991) 979-986; Lewis, G.D.ら, Cancer Immunol. Immunother. 37 (1993) 255-263; Pietras, R.J.ら, Oncogene 9 (1994) 1829-1838; Vitetta, E.S.ら, Cancer Research 54 (1994) 5301-5309; Sliwkowski, M.X.ら, J. Biol. Chem. 269 (1994) 14661-14665; Scott, G.K.ら, J. Biol. Chem. 266 (1991) 14300-14305; D'souza, B.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. 91 (1994) 7202-7206; Lewis, G.D.ら, Cancer Research 56 (1996) 1457-1465; 及びSchaefer, G.ら, Oncogene 15 (1997) 1385-1394でも特徴づけられている。
【００６０】
組換えヒト化バージョンのマウスＨＥＲ２抗体４Ｄ５（huMAb4D5-8, rhuMab HER2, トラスツズマブ又はハーセプチン（登録商標）；米国特許第5,821,337号参照）は、広範な抗癌治療を以前に受けている、ＨＥＲ２を過剰発現する転移性乳癌患者において臨床的に活性がある（Baselga, J.ら, J. Clin. Oncol. 14 (1996) 737-744）。トラスツズマブは、ＨＥＲ２タンパク質を過剰発現する腫瘍を有する転移性乳癌患者の治療のために、１９９８年９月２５日食品医薬品局より販売承認を取得した。
【００６１】
米国特許第5,821,337号の表３に記載のｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７及びｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８（ハーセプチン（登録商標））を含むヒト化抗ＥｒｂＢ２抗体は本明細書に参照として明白に組み込まれ、ヒト化５２０Ｃ９（国際公開第93/21319号）と国際公開第01/000245号に記載のヒト化２Ｃ４抗体は本明細書に参照として明白に組み込まれる。
【００６２】
様々な特性をもつ他のＨＥＲ２がTagliabue, E.ら, Int. J. Cancer 47 (1991) 933-937; McKenzie, S.J.ら, Oncogene 4 (1989) 543-548; Maier, L.A.ら, Cancer Res. 51 (1991) 5361-5369; Bacus, S.S.ら, Molecular Carcinogenesis 3 (1990) 350-362; Stancovski, I.ら, PNAS USA 88 (1991) 8691-8695; Bacus, S.S.ら, Cancer Research 52 (1992) 2580-2589; Xu, F.ら, Int. J. Cancer 53 (1993) 401-408; 国際公開第94/00136号; Kasprzyk, P.G.ら, Cancer Research 52 (1992) 2771-2776; Hancock, M.C.ら, Cancer Res. 51 (1991) 4575-4580; Shawver, L.K.ら, Cancer Res. 54 (1994) 1367-1373; Arteaga, C.L.ら, Cancer Res. 54 (1994) 3758-3765; Harwerth, I.M.ら, J. Biol. Chem. 267 (1992) 15160-15167; 米国特許第5,783,186号; 及び Klapper, L.N.ら, Oncogene 14 (1997) 2099-2109に記載されている。
【００６３】
ペルツズマブ（例えば国際公開第01/000245号参照）は、ＨＥＲ二量体化阻害剤（ＨＤＩ）として知られる最初の新クラスの薬剤である。ペルツズマブはＨＥＲ２の二量体化ドメインに結合してＨＥＲ２が活性な二量体受容体複合体を形成する能力を阻害するので、最終的に細胞成長と分割をもたらす下流のシグナルカスケードが阻害される（Franklin, M.C., Cancer Cell 5 (2004) 317-328参照）。ペルツズマブは、ＨＥＲ２の細胞外ドメインに対する完全ヒト化組換えモノクローナル抗体である。ペルツズマブがヒト上皮細胞のＨＥＲ２に結合すると、ＨＥＲ２が他のＨＥＲファミリーメンバー（EGFR、HER3、HER4を含む）と結合しての複合体の形成及びおそらくＨＥＲ２のホモ二量体化も阻害される。複合体の形成を阻害することで、ペルツズマブは、成長刺激効果並びにＨＥＲ１、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４のリガンド（ＥＧＦ、ＴＧＦα、アンフィレグリン及びヘレグリン）に活性化される細胞生存シグナルを阻止する。ペルツズマブの別名は２Ｃ４である。ペルツズマブは、ヒトＩｇＧ１（Ｋ）フレームワーク配列に基づく完全ヒト化組換えモノクローナル抗体である。ペルツズマブは、２つの重鎖（４４９残基）と２つの軽鎖（２１４残基）で構成される。トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））と比べ、ペルツズマブは軽鎖で１２アミノ酸が異なり、ＩｇＧ１重鎖で２９アミノ酸が異なる。
【００６４】
「疎水性」という用語は、主要な又は全ての分子間作用がファンデルワース相互作用により主に特徴づけられる化合物を意味する。この文脈での「主に」という用語は、基本的には、親水性の化合物もまた可能であることを意味し、各分析物の化学的及び／又は物理的性質の一般的な特徴にとってあまり重要ではない。本発明の文脈での「疎水性」の反語は、「親水性」という用語であり、水素結合により特徴づけられる強い極性及び／又はプロトン性の特徴を有する化合物を指す。一実施態様では、イオン交換クロマトグラフィー剤のマトリックスは疎水性マトリックスである。
【００６５】
「プロトン性」という用語は、プロトン（単数又は複数）を有する及び／又は放出する及び／又は水素結合（単数又は複数）を形成する特性を意味し、例えば水、アルコール、アミンなどがある。分子からのプロトン放出は、当業者には解離としても知られる。もっとも単純なプロトン性溶媒は水であり、プロトンとヒドロキシルイオンに単純に解離する。公知のプロトン性溶媒は例えばアルコール類であり、一般にプロトンの放出は、以前のヒドロキシル基の負に帯電した酸素原子から離れるヒドロキシル基で生じるが、これは電気的陰性の酸素原子は結果として生じる負電荷を安定させることができるからである。カルボン酸でも、カルボキシル官能からのプロトンの放出が例えば特定の溶液中で溶解されるような特定の物質との化学的反応をもたらさないのであれば、プロトン性溶媒とみなされうる。プロトン性溶媒の他の群としては、アミノ基中に「プロトン」厳密には水素原子及びフリーな電子対を対応する窒素原子に有して水素結合を形成するアミン類がある。
【００６６】
「移動相」という用語は、クロマトグラフィーカラムから分析物を溶出するのに適した水及び／又は水性バッファー及び有機溶媒の任意の混合物を指す。「溶出」又は「溶出する」という用語は、本発明の文脈では当業者に知られるとおりの意味を有し、流体が浸透した固体又は吸着剤すなわち物質（単数又は複数）が吸着されたカラム剤の吸着物質（単数又は複数）の溶解又は任意で除去を意味する。
【００６７】
「吸着」という用語は、流体すなわち移動相の物質が、流体がある物質とともに形成する境界相に累積することを指し、境界相はその表面に物質を吸着することができる。この吸着により、特定の表面に吸着された物質が累積する。表面に物質を累積させることができる物質は、しばしば吸着剤と呼ばれ、吸着される物質は吸着物と呼ばれる。吸着という用語は、表面への累積後、累積物が吸着固体や累遺体の内部に浸透することも意味する「吸収」という用語と通常は区別して使われる。一般に、吸着は、物質、通常は分子が吸着剤の表面に接着し、各表面に累積する物理的プロセスである。この接着を担う力は、化学的結合よりも物理的力であると考えられているので、吸着は、当分野では、物理的な吸着すなわち物理吸着としても知られているが、必ずしも物質が表面に化学結合することを排除するものではない。物質が表面に吸着するのに必要な物理的力は、多くの場合はファンデルワース力、ロンドン力又は双極子／双極子相互作用であり、例えば水素結合や双極子誘導双極子相互作用などがあり、これらの用語は上述のように使用されるか、吸着の文脈で通常使用されるものである。
【００６８】
（カラム）クロマトグラフィーでは、通常溶媒は溶出液すなわち溶出剤として使用され、溶出される物質（単数又は複数）が少なくとも十分に溶解可能である。
【００６９】
「膨張性マトリックス」は、三次元ネットワークの形成において互いに化学的又は物理的に結合したモノマーを基本とする任意の膨張性ポリマーゲルである。化学的結合性は結合形成により達成されるが、膨張性マトリックスの物理的構造は、ポリマーの各セグメントの単一の領域間の静電的、疎水的及又は双極子／双極子相互作用に基づきうる。「膨張性マトリックス」は、一実施態様では、三次元ネットワークが化学的結合形成を通じて得られるポリマーゲルを意味する。ネットワーク自体は、１または複数の異なる成分からなりうる。適切な溶媒の存在下、ネットワークは、各溶媒が取込み体積の平衡体積が得られるまで三次元ネットワークに同時に取り込まれて膨張する。ネットワークが膨張した状態を表す別の用語としてゲルが知られ、非膨張状態はゲル化剤（gelator）として知られる。本発明の文脈では、膨張性マトリックスは、ゲル化剤という用語の意味も包含する。
【００７０】
「膨張性マトリックス」という用語は、親水性であるが水不溶性の、溶媒としての水の存在下で膨張するポリマーのみを意味する。膨張性マトリックスの水に対する親和性は、ポリマーネットワークの救済（salvation）とエントロピー効果による。水以外にも純粋な親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール及びジメチルホルムアミド並びに可変量でこれらの有機溶媒をそれぞれ含む水性溶液も、膨張性マトリックスの膨張をもたらし、ここで親水性という用語は上述のとおり理解される。従って、膨張性マトリックスとは、ネットワークに水を取り込んで膨張するゲルに限定されず、親水性の有機溶媒及び／又はその水性溶液及び／又は可変成分の混合物の存在下で膨張するゲルも含む。
【００７１】
膨張性マトリックスを含む文脈において、架橋結合は非常に重要である。なぜなら、架橋結合によって三次元構造がもたらされ、マトリックスが膨張する挙動を可能にする空洞が形成されるからである。さらに、架橋結合の程度は、得られる膨張性マトリックスの孔のサイズを左右する。
【００７２】
したがって、ここで報告される一態様は、抗体調製物中の抗体アイソフォームを濃縮する方法であって、
（ａ）抗体の様々なアイソフォームを含む緩衝液をカチオン交換クロマトグラフィー材に添加する工程と、
（ｂ）第１導電率を有する第１溶液をカチオン交換クロマトグラフィー材に添加し、抗体アイソフォームとカチオン交換クロマトグラフィー材との結合が維持される工程と、
（ｃ）第２導電率を有する第２溶液をカチオン交換クロマトグラフィー材に添加し、抗体アイソフォームが濃縮された抗体調製物を得る工程
を有し、第２溶液の導電率が第１溶液の導電率を５０％以下で上回る。
【００７３】
一実施態様は、抗体調製物中の抗体アイソフォームを濃縮する方法であって、
（ａ）抗体の様々なアイソフォームを含む緩衝液をカチオン交換クロマトグラフィー材に添加する工程と、
（ｂ）第１導電率を有する第１溶液をカチオン交換クロマトグラフィー材に添加し、抗体アイソフォームとカチオン交換クロマトグラフィー材との結合が維持される工程と、
（ｃ）第２導電率を有する第２溶液をカチオン交換クロマトグラフィー材に添加し、抗体アイソフォームが濃縮された抗体調製物を得る工程
を有し、第２溶液の導電率が第１溶液の導電率を１０％以下で上回る。
【００７４】
工程（ａ）の溶液は、一実施態様では工程（ｂ）の溶液と同じ導電率を有する。
【００７５】
「抗体アイソフォーム」という用語は、同じ抗体の別のアイソフォームに対しわずかに異なる抗体のバージョンを意味する。「同じ抗体」とは、特定のアイソフォームの修飾（単数又は複数）を除いて同じアミノ酸配列を有する抗体である。抗体をコードする配列の転写又は翻訳の途中で抗体の異なる形態が生じることや、細胞からの抗体のプロセシング及び分泌から、生成、形成及び保存中の分解から生じる差異もある。抗体アイソフォームは、アミノ酸配列、多量体化、糖鎖付加及び他の翻訳後の修飾において異なりうる。「グリコフォーム」とは、様々なバージョンのグリコタンパク質に翻訳後修飾により異なる多糖類が結合したアイソフォームである。抗体の重鎖Ｃ末端側のリジン残基のプロセシングもまた、抗体構造の多様性の原因となりうる。
【００７６】
抗体調製物中の抗体アイソフォームは、カチオン交換カラムクロマトグラフィー法を用いて濃縮又は部分的分離も可能であることが見いだされている。これは、直線的又はステップの、ｐＨ又は塩グラジエントを用いる結合・溶出クロマトグラフィー法を用いてクロマトグラフィー材から抗体を回収することで得られうる。この方法は、わずかな勾配、すなわち開始値の５０％以下、特に開始値の１０％以下の相対的なｐＨ値の変化又は導電率の増加を有するグラジエントを使用すると特に有効である。異なる抗体アイソフォームは、少なくともセミ分離（semi-detached）ピークとして対応するクロマトグラム中に目視できるので、抗体調製物のアイソフォーム組成は、クロマトグラムの各ピークにまたがる選択され組み合わされた溶出断片に基づき調節可能である。
【００７７】
詳細には、抗体調製物中の抗体アイソフォームの濃縮は、カチオン交換クロマトグラフィー材に添加される移動相の導電率の適切な増加により得られうることがわかっている。
【００７８】
「抗体調製物」という用語は、同じ抗体の異なるアイソフォームを含む混合物を意味する。
【００７９】
図１では、２０ｖｏｌ％の溶出バッファーから６０ｖｏｌ％の溶出バッファーの直線グラジエントを用いたカラムクロマトグラフィー分離の溶出クロマトグラムを示す（洗浄バッファーは２０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、溶出バッファーは２０ｍＭのクエン酸ナトリウムと１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む）。抗体アイソフォームが単一のピークで回収されていることがわかる。単一のプレピークが見られる。
【００８０】
図２では、２４ｖｏｌ％の溶出バッファーのステップグラジエントを用いたカラムクロマトグラフィー分離の溶出クロマトグラムを示す（洗浄バッファーは２０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、溶出バッファーは２０ｍＭのクエン酸ナトリウムと１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む）。抗体アイソフォームがセミ分離ピークで回収されていることがわかる。
【００８１】
図３では、１５ｖｏｌ％の溶出バッファーのステップグラジエントを用いたカラムクロマトグラフィー分離の溶出クロマトグラムを示す（洗浄バッファーは２０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、溶出バッファーは２０ｍＭのクエン酸ナトリウムと８０ｍＭの塩化ナトリウムを含む）。抗体アイソフォームが２つのセミ分離ピークで回収されていることがわかり、最初のピークはプレピークを示している。
【００８２】
図４では、１００ｖｏｌ％の溶出バッファーのステップグラジエントを用いたカラムクロマトグラフィー分離の溶出クロマトグラムを示す（洗浄バッファーは２０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、溶出バッファーは２０ｍＭのクエン酸ナトリウムと５ｍＭの塩化ナトリウムを含む）。抗体アイソフォームが３つのセミ分離ピークで回収されていることがわかる。
【００８３】
図５は、導電率が１００％から１５９％に増加された、シングルステップの溶出法を用いたカラムクロマトグラフィー分離の溶出クロマトグラム。抗体は単一ピークとして回収されていることがわかる。
【００８４】
図６では、１００ｖｏｌ％の第１バッファー溶液から６０ｖｏｌ％の第２バッファー溶液の直線グラジエントを用いたカラムクロマトグラフィー分離の溶出クロマトグラムを示す（第１バッファーは２５ｍＭのＴＲＩＳと１０ｍＭの塩化ナトリウムを含み、第２バッファーは２５ｍＭのＴＲＩＳと７０ｍＭの塩化ナトリウムを含み、いずれのバッファーもｐＨ値は７．４）。抗体アイソフォームが３ピークで回収されていることがわかる。
【００８５】
一実施態様では、導電率は５０％以下の増加、すなわち導電率は１５０％以下まで増加する。従って、第２溶液の導電率は第１溶液の導電率の１０１％から１５０％である。増加はシングルステップ又は直線グラジエントの形態でありうる。増加は、溶出溶液の完全な変更、すなわち第１（＝洗浄）溶液１００％から第２（＝溶出）溶液１００％への変更により実施されうる。
【００８６】
一実施態様では、導電率は１０％以下の増加、すなわち導電率は１１０％以下まで増加する。従って、第２溶液の導電率は第１溶液の導電率の１０１％から１１０％である。増加はシングルステップ又は直線グラジエントの形態でありうる。増加は、溶出溶液の完全な変更、すなわち第１（＝洗浄）溶液１００％から第２（＝溶出）溶液１００％への変更により実施されうる。
【００８７】
一実施態様では、直線グラジエントは、それぞれ異なる勾配を有する３つのグラジエントを含む。
【００８８】
一実施態様では、第１直線グラジエントは１８から２０カラムボリュームであり、第２直線グラジエントは２から４カラムボリュームであり、第３直線グラジエントは６から８カラムボリュームである。一実施態様では、第１直線グラジエント第１溶液の導電率の約１１５％まで、第２直線グラジエントは第１溶液の導電率の約１３７％まで、第３直線グラジエントは第１溶液の導電率の約１５０％までである。
【００８９】
カチオン交換クロマトグラフィー材のマトリックスは、膨張性マトリックスでなければならないこともわかっている。一実施態様では、マトリックスは架橋結合した糖類である。さらに別の実施態様では、糖類は多糖類である。別の実施態様では、多糖類はアガロースすなわちグリコシド結合のＤ-ガラクトースと３,６-無水-Ｌ-ガラクトースからなる多糖である。
【００９０】
したがって、ここで報告される別の態様は、抗体調製物を生産する方法であって、
（ａ）抗体をコードする核酸を有する哺乳動物細胞を培養し、抗体を細胞又は培地から回収する工程と、
（ｂ）少なくとも１つのクロマトグラフィーの工程により抗体を精製する工程を有し、この少なくとも１つのクロマトグラフィーの工程が、
（ｉ）カチオン交換クロマトグラフィー材に抗体の様々なアイソフォームを含む緩衝液を添加する工程と、
（ｉｉ）第１導電率を有する第１溶液をカチオン交換クロマトグラフィー材に添加し、抗体アイソフォームとカチオン交換クロマトグラフィー材との結合が維持される工程と、
（ｉｉｉ）第２導電率を有する第２溶液をカチオン交換クロマトグラフィー材に添加して抗体調製物を生産する工程を有し、
これにより第２溶液の導電率が第１溶液の導電率を１０％以下で上回る。
【００９１】
一実施態様では、方法は、大量生産の方法である。別の実施態様では、大量とは１ｇ以上の抗体調製物である。
【００９２】
以下の実施例と図は本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は請求項に記載される。本発明の精神から逸脱することなく記載の手順に変更を加えうることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】２０ｖｏｌ％の溶出バッファーから６０ｖｏｌ％の溶出バッファーの直線グラジエントを用いたカラムクロマトグラフィーによる分離の溶出クロマトグラムを示す（洗浄バッファーは２０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、溶出バッファーは２０ｍＭのクエン酸ナトリウムと１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む）。
【図２】２４ｖｏｌ％溶出バッファーのステップグラジエントを用いたカラムクロマトグラフィーによる分離の溶出クロマトグラムを示す（洗浄バッファーは２０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、溶出バッファーは２０ｍＭのクエン酸ナトリウムと１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む）。
【図３】１５ｖｏｌ％溶出バッファーのステップグラジエントを用いたカラムクロマトグラフィーによる分離の溶出クロマトグラムを示す（洗浄バッファーは２０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、溶出バッファーは２０ｍＭのクエン酸ナトリウムと８０ｍＭの塩化ナトリウムを含む）。
【図４】１００ｖｏｌ％溶出バッファーのステップグラジエントを用いたカラムクロマトグラフィーによる分離の溶出クロマトグラムを示す（洗浄バッファーは２０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、溶出バッファーは２０ｍＭのクエン酸ナトリウムと５ｍＭの塩化ナトリウムを含む）。
【図５】強カチオン交換樹脂ＳＰ−セファロースからの抗ＨＥＲ-２抗体のシングルステップの溶出；抗体のモノマー形態と凝集形態は分離されず、１つのピークとして溶出される。
【図６】６０ｖｏｌ％溶出バッファーの直線グラジエントを用いたカラムクロマトグラフィーによる分離の溶出クロマトグラムを示す（洗浄バッファーは２５ｍＭのトリスと１０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、溶出バッファーは２５トリスと７０ｍＭの塩化ナトリウムを含む）。
【実施例】
【００９４】
材料と方法
ここで報告される、方法で使用されうる例示的免疫グロブリンは、国際公開第92/022653号、国際公開第99/057134号、国際公開第97/04801号、米国特許第5,677,171号及び米国特許第5,821,337号（参照により本明細書に組み込まれる）に報告されている抗ＨＥＲ２抗体である。
分析的分子ふるいクロマトグラフィー:
樹脂：ＴＳＫ  ３０００（Tosohaas）
カラム：３００×７．８ｍｍ
流量：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
緩衝液：２５０ｍＭ塩化カリウムを含む２００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．０に調節
波長：２２０ｎｍ
分析的ＩＥ−ＨＰＬＣ
樹脂：Ｄｉｏｎｅｘ  ＰｒｏＰａｃＴＭ  ＷＣＸ−１０  分析グレード
カラム：４×２５０ｍｍ
流量：０．８ｍｌ／ｍｉｎ
バッファーＡ：１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５に調節
バッファーＢ：１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５に調節及び０．１Ｍ塩化ナトリウムを添加
開始条件：８５ｖｏｌ％バッファーＡと１５ｖｏｌ％バッファーＢ
グラジエント：５５ｖｏｌ％バッファーＢまで９カラムボリューム
検出波長：２１４ｎｍ
試料の量：５０μｇ
【００９５】
試料とカルボキシペプチダーゼＢを試料バッファーを用いて最終濃度１ｍｇ／ｍｌまで希釈する。希釈した試料溶液に１％（ｗ／ｗ）の希釈カルボキシペプチダーゼ溶液を加える。
【００９６】
実施例１
６０ｖｏｌ％溶出バッファーまでの組合せグラジエント溶出、ＳＰ−セファロース上でのクロマトグラフィー
クロマトグラフィー条件：
樹脂：ハイスクリーンＳＰ−セファロース
流量：１．２ｍｌ／ｍｉｎ
平衡：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．２に調節
ローディング：１ｇタンパク質／ｌクロマトグラフィー材
洗浄：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．２に調節
溶出：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．２に調節及び１００ｍＭ塩化ナトリウムを添加
溶出法：
ステップと直線グラジエントの組合せ
２０％溶出バッファーまでステップ、その後は６０％溶出バッファーまで直線グラジエント
【００９７】
溶出クロマトグラムを図１に示す。抗体アイソフォームが単一のピークで回収できることがわかる。わずかなプレピークが見られる。
【００９８】
実施例２
２４ｖｏｌ％溶出バッファーまでのステップグラジエント溶出、ＳＰ−セファロース上のクロマトグラフィー
クロマトグラフィー条件：
樹脂：ハイスクリーンＳＰ−セファロース
流量：１．２ｍｌ／ｍｉｎ
平衡：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．２に調節
ローディング：１ｇタンパク質／ｌクロマトグラフィー材
洗浄：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．２に調節
溶出：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．２に調節及び１００ｍＭ塩化ナトリウムを添加
溶出法：
シングルステップグラジエント
２４％溶出バッファーまでステップ、２０カラムボリュームで溶出
【００９９】
溶出クロマトグラムを図２に示す。抗体アイソフォームがセミ分離ピークで回収できることがわかる。
【０１００】
実施例３
１５ｖｏｌ％溶出バッファーまでのステップグラジエント溶出、ＳＰ−セファロース上のクロマトグラフィー
クロマトグラフィー条件：
樹脂：ハイスクリーン ＳＰ−セファロース
流量：１．２ｍｌ／ｍｉｎ
平衡：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．２に調節
ローディング：１ｇタンパク質／ｌクロマトグラフィー材
洗浄：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．２に調節
溶出：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．２に調節及び８０ｍＭ塩化ナトリウムを添加
溶出法：
シングルステップグラジエント
１５％溶出バッファーまでステップ、２０カラムボリューム
【０１０１】
溶出クロマトグラムを図３に示す。抗体アイソフォームは２つのセミ分離ピークで回収できることがわかり、最初のピークはプレピークを示している。
【０１０２】
実施例４
１００ｖｏｌ％溶出バッファーまでのステップグラジエント溶出、ＳＰ−セファロース上のクロマトグラフィー
クロマトグラフィー条件：
樹脂：ハイスクリーンＳＰ−セファロース
流量：１．２ｍｌ／ｍｉｎ
平衡：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．２に調節
ローディング：１ｇタンパク質／ｌクロマトグラフィー材
洗浄：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．２に調節
溶出：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．２に調節及び５ｍＭ塩化ナトリウムを添加
溶出法：
シングルステップ
１００％溶出バッファーまでシングルステップ、２０カラムボリュームで溶出
【０１０３】
溶出クロマトグラムを図４に示す。抗体アイソフォームが３つのセミ分離ピークで回収できることがわかる。
【０１０４】
実施例５
１００ｖｏｌ％溶出バッファーまでのｐＨグラジエント溶出、モノＳ強カチオン交換樹脂上のクロマトグラフィー
クロマトグラフィー条件：
樹脂：モノＳ
平衡：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．２に調節
洗浄：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．２に調節
溶出：５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５に調節
溶出法：
グラジエント溶出
０％から１００％溶出バッファー
【０１０５】
アイソフォームは３つのセミ分離ピークとして回収できる。
【０１０６】
実施例６
比較例−強カチオン交換樹脂（ＳＰ−セファロース）を用いての、モノクローナル抗ＨＥＲ-２抗体のクロマトグラフィーによる分離（国際公開第99/57134号）
強カチオン交換樹脂のＳＰ−セファロース上でのカチオン交換クロマトグラフィーを用いたモノクローナル抗ＨＥＲ２抗体（ハーセプチン（登録商標））の精製を行った。標準的条件下、すなわち、例えば塩化ナトリウムを用いたステップ溶出では、抗体のモノマー形態と凝集形態の分離は得られなかった（図５）。
クロマトグラフィー条件：
樹脂：ＳＰ−セファロース
流量：１６０ｃｍ／ｈ
平衡：２５ｍＭ２-モルホリノエタンスルホン酸、５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．６に調節
ローディング：最高２０ｇタンパク質／Ｌゲルマトリックス
洗浄：２５ｍＭ２-モルホリノエタンスルホン酸、５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．６に調節
溶出：２５ｍＭ２-モルホリノエタンスルホン酸、９５ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．６に調節
【０１０７】
モノクローナル抗ＨＥＲ-２抗体を、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを用いて第１ステップで精製した。タンパク質Ａカラムからの溶出は酸性条件下で行う（１０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ値３．０±０．５）。濾過工程の前に、抗体を含む画分のｐＨ値を濃縮トリ-ヒドロキシメチル-アミノ-メタン（トリス）バッファーでｐＨ５．６に調節する。タンパク質Ａ溶出液は、タンパク質濃度５ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌの溶液であり、クエン酸ナトリウムで希釈される。
【０１０８】
調整したタンパク質Ａ溶出液を、強カチオン交換樹脂（ＳＰ−セファロース）を含むクロマトグラフィーカラムに添加した。流量１６０ｃｍ／ｈでのローディング工程後、カラムを平衡バッファー（１０カラムボリューム）で洗浄した。結合した免疫グロブリンをシングルステップ溶出法を用いて溶出することで、ｐＨ値は一定に保たれ、導電率は塩化ナトリウム濃度の（ステップワイズの）増加で変動された。溶液クロマトグラムを図５に示す。
【０１０９】
モノマー形態と凝集形態の分離は得られなかった。
【０１１０】
実施例７
６０ｖｏｌ％溶出バッファーまでのグラジエント溶出を用いるＳｏｕｒｃｅＴＭ１５Ｓ上でのクロマトグラフィー
クロマトグラフィー条件：
樹脂：ＳｏｕｒｃｅＴＭ１５Ｓ
カラムボリューム：１．１４ｌ
流量：１００ｃｍ／ｈ
平衡：２５ｍＭトリス、１０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４に調節
ローディング：０．８８ｇタンパク質／１クロマトグラフィー材
洗浄：２５ｍＭトリス、１０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４に調節
溶出：２５ｍＭトリス、７０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４に調節
溶出法：
グラジエント
３３ｖｏｌ％溶出バッファーまで１９カラムボリューム
５０ｖｏｌ％溶出バッファーまで３カラムボリューム
６０ｖｏｌ％溶出バッファーまで７カラムボリューム
【０１１１】
溶出クロマトグラムを図６に示す。抗体アイソフォームが明白なピークで回収できることがわかる。
【図１】
0005838221.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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