(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）βig-h3の四番目のfas-1ドメインからＨ１及びＨ２部位を除去したアミノ酸鎖(dhFas-1)ドメイン；ｂ）MMP(Matrix  metalloproteinase)基質；及び、ｃ）RGDを含むペプチドを含む融合ペプチドであって、
前記ａ）dhFas-1ドメインは、配列番号１又は３のアミノ酸配列で表示され、
前記ｂ）MMP基質は、配列番号５乃至８のアミノ酸配列で表示され、及び
前記ｃ）RGDを含むペプチドは、配列番号９又は10のアミノ酸配列で表示されることを特徴とするペプチド。
【請求項２】
前記ａ）dhFas-1ドメインと、前記ｂ）MMP基質間にリンカーペプチドを追加して含み、この時前記リンカーペプチドは、１乃至５個のアミノ酸で構成された請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ｂ）MMP基質と、前記ｃ）RGDを含むペプチド間にリンカーペプチドを追加して含み、この時前記リンカーペプチドは、１個乃至５個のアミノ酸で構成されたものである請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドは、配列番号11乃至17で表示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
前記リンカーペプチドは、LE又はEFであることを特徴とする請求項３に記載のペプチド。
【請求項６】
前記リンカーペプチドは、VD又はVDGであることを特徴とする請求項２に記載のペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の融合ペプチドを符号化するポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドは、配列番号18乃至24の配列で表示される塩基配列を含むことを特徴とする請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
プロモータ及びこれと作動可能に連結された請求項７又は８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む炎症性疾患の予防及び治療用薬学的組成物であって、
前記炎症性疾患は、リウマチ性関節炎、脊椎炎、硬直性脊椎、ライタスシンドローム(Reiter's  syndrome)、乾癬性関節炎、炎症性腸疾患を同伴した脊椎炎、青少年関節症、青少年交錯関節症、反応性関節症及び脈管炎シンドロームを同伴した関節炎からなる群より選ばれる薬学的組成物。
【請求項１２】
請求項９に記載のベクターを有効成分として含む炎症性疾患の予防及び治療用薬学的組成物であって、
前記炎症性疾患は、リウマチ性関節炎、脊椎炎、硬直性脊椎、ライタスシンドローム(Reiter's  syndrome)、乾癬性関節炎、炎症性腸疾患を同伴した脊椎炎、青少年関節症、青少年交錯関節症、反応性関節症及び脈管炎シンドロームを同伴した関節炎からなる群より選ばれる薬学的組成物。
【請求項１３】
治療剤に使用される請求項１〜６のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１４】
炎症性疾患の予防及び治療剤を製造するための請求項１〜６のいずれかに記載のペプチドの使用であって、
前記炎症性疾患は、リウマチ性関節炎、脊椎炎、硬直性脊椎、ライタスシンドローム(Reiter's  syndrome)、乾癬性関節炎、炎症性腸疾患を同伴した脊椎炎、青少年関節症、青少年交錯関節症、反応性関節症及び脈管炎シンドロームを同伴した関節炎からなる群より選ばれるペプチドの使用。
【請求項１５】
炎症性疾患の予防及び治療剤を製造するための請求項９に記載のベクターの使用であって、
前記炎症性疾患は、リウマチ性関節炎、脊椎炎、硬直性脊椎、ライタスシンドローム(Reiter's  syndrome)、乾癬性関節炎、炎症性腸疾患を同伴した脊椎炎、青少年関節症、青少年交錯関節症、反応性関節症及び脈管炎シンドロームを同伴した関節炎からなる群より選ばれるベクターの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は2010年12月02日に出願された大韓民国特許出願第10-2010-0121894号を優先権主張し、前記明細書全体は本出願の参考文献である。
【０００２】
本発明はＭＭＰ基質で連結したβig-h3単片ペプチド及びそのリウマチ性関節炎予防及び治療用途に関するものであり、より詳細にはβig-h3の４番目のFAS-1ドメインからＨ１及びＨ２部位を除去したアミノ酸鎖(dhFas-1)、マトリクスメタロプロテナーゼ（MMP,  matrix  metalloproteinase)により分解されるアミノ酸鎖(MMP基質)、及びRGDを含むアミノ酸鎖が順に連結されたペプチド及びそのリウマチ性関節炎予防及び治療用途に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
リウマチ性関節炎(rheumatoid  arthritis,  RA)は関節を含む全身に慢性炎症を起こす自己免疫性疾患であり、男性より女性の方が多く発病しており、その原因に対しては未だに明確に究明されたものがなく、ただ、遺伝的要因と環境的要因等により誘発されるものと推測されているだけである。従って、リウマチ性関節炎の発病原因を究明するための多くの研究等が進行されており、最近に至り遺伝的因子がリウマチ性関節炎の感受性及び予後診断に重要な役割をし、全般的な免疫反応に亘る後成遺伝的(epigenetic)制御の不均衡がリウマチ性関節炎を含む自己免疫性疾患を起こすと言う内容が報告されている(Richardson  B.et  al.,  Clin  Immunol,109,  72-79,2003)。
【０００４】
リウマチ性関節炎の炎症は、主に人体内関節の滑膜(Synovial  membrane)に発生し、特に６週以上炎症が持続することを意味する。一応リウマチ性関節炎が始まると、活膜組織の血液から多様な炎症細胞からなる“パンヌス(Pannus)”と言う塊を形成して、これが軟骨を破壊し、関節の変形をもたらして関節周囲にある骨も弱化させる。このような関節炎症の結果、関節が腫上がり痛みを感じて関節の運動範囲が制限されるようになり、関節周囲が赤変して触れば暖かみが感じられるようになる。
【０００５】
この疾患は人体免疫機能に異常が来るもので、換言すれば正常な場合、我々の体内で細菌のような外部の異物質に対して、からだを防御する役割をすべき免疫系が原因不明の理由により我々自身のからだを自ら攻撃することで発生する病気である。この状態を“自己免疫”と称し、このような原理により多くの関節、特に腕の関節に対称的に炎症を起こして数年乃至数十年に亙って関節を徐々に破壊させ、たまには関節ばかりでなく、肺、心臓、眼、血管、神経等多くの臓器に害をもたらすこともある。さらに、この疾病は主に30代前後の人生の活動期に発生して身体機能に障害を誘発し、生そのものの質を落として作業能力を低下させ、莫大な経済的損失をもたらす。
【０００６】
現在までリウマチ性関節炎の発病原因に対して多くの研究がなされたにも拘らず、リウマチ性関節炎の確実な原因は未だに究明されないままである。しかし、リウマチ性関節炎に対する臨床的治療方法等は多様に開発されており、これは一般補助的療法、薬物療法、手術的療法等に分けられる。一般的に、リウマチ性関節炎の治療はこの疾病が慢性関節炎による関節痛症と関節の変形、機能の消失を誘発するので痛症と炎症を抑制して、関節の機能消失を最少化して正常生活に復帰することに治療の目的を置いている。現在ひろく使用される治療方法は薬物療法であるが、これはその症状によってアスピリン＆非ステロイド性消炎剤、低容量経口ステロイド剤、抗マラリア製剤(antimalarial  drug)、スルファサラジン(sulfasalazine)、金製剤(Gold  compounds)、ペニシラミン(penicillamine)、免疫抑制剤（メソトレキセート(MTX)、イミューラン(Immuran)等）の抗リウマチ性薬剤(DMARDs)、関節内ステロイド剤注射及び生物学的製剤である腫瘍壊死因子遮断剤(etanercept,  inflixmab,  adalimumab)、インターロイキン-1受容体拮抗剤(anakinra)、抗-CD20抗体(rituximab)等が使用される。しかし、このような薬物療法は胃腸障害、肝障害、腎臓機能障害、感染等の副作用が発生し易い短所がある。従って、副作用が少なくリウマチ性関節炎の諸症状である炎症、浮腫、異常な腎血管生成、骨及び軟骨組織浸食等を改善するより進歩した治療剤の開発が至急な実情である。
【０００７】
コラーゲン誘発関節炎(collagen-induced  arthritis,  CIA)はＴリンパ球性リウマチ性関節炎の動物モデルとして使用されてきた（Autoimmunity  to  TypeIIcollagen:  Experimental  model  of  arthritis,J.Exp.Med.146;857-868(1977))。関節炎にかかりやすい実験用マウスにコラーゲンIIを注射すると２週内にパンヌス形成、骨、軟骨の浸食と共に関節炎が誘発される。リウマチ性関節炎と同様にコラーゲン誘発関節炎もコラーゲンに対する体液性、細胞性免疫反応を引起こす。
【０００８】
一方、細胞の基質蛋白は組織の骨格を構成する場合において、重要な役割をする構成成分にして、多くの研究を通じて組織の形態ばかりでなく、機能を維持、調節する場合においても中心的な役割をすることが究明されてきた。Transforming  growth  factor−β(TGF−β)により誘導される基質のTGF-β-inducible  gene-h3(βig-h3)は、分子構造が最近究明された蛋白であって、細胞の付着、移住、分化及び増殖等の機能調節に重要な役割を担う。TGF-βの関連遺伝子として知られたβig-h3は、Skonier等により初めて同定された遺伝子であって、TGF-β1を処理した人体肺腺癌腫細胞株であるA549細胞株より、cDNA資料選別中同定され、TGF-β1で処理後二日目に20倍以上の増加を示したものとして報告された(Stonier,J.et  al.,DNA  cell  Biol.11,511,1992)。βig-h3のDNA配列分析により、βig-h3  蛋白質は、アミノ末端分泌配列(amino-terminal  secretory  sequence)と幾つかのインテグリン(integrin)に対してリガンド識別(ligand  recognition)が可能なカルボキシ末端(carboxy-terminal)Arg-Gly-Asp(RGD)配列を有する683個のアミノ酸で構成されていることが明らかになった。
【０００９】
本発明者等は、βig-h3の機能に対して研究中、βig-h3の四番目のfas-1ドメインからＨ１及びＨ２部位を除去した断片（以下、‘dhFas-1’と称す、ヒトのdhFas-1は‘hsdhFas-1’、マウスdhFas-1は‘mdhFas-1と称す）が、リウマチ性関節炎組織から分離された滑膜細胞の付着と移住を遮断するばかりでなく、リウマチ性関節炎の動物モデルであるマウスのコラーゲン誘導関節炎(collagen-induced  arthritis,CIA)モデルで高容量投与の際、リウマチ性関節炎治療効果があることを見出した（大韓民国特許公開公報第10-2009-0050667号）。
【００１０】
しかし、dhFas-1の場合、有意的な効能を示すには多量のdhFas-1を投与しなければならないことから安全性、経済性の面で問題になり得るので、このような短所を補完できる新たな治療剤の開発が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ここに、本発明者等は、dhFas-1の治療効率を高めるための方法に関して研究を重ねる中、dhFas-1  断片にRGDを含むアミノ酸鎖を連結させる場合、その効果がはっきり増加はしなかったが、このmdhFas-1とRGDペプチドをマトリクスメタロプロテナーゼ（MMP,  matrix  metalloproteinase)により分解される５個乃至10個のアミノ酸（MMP基質）で構成されたアミノ酸鎖で連結して、関節炎部位から選択的に切断されるようにする場合、関節炎治療効果が並外れて増加することを究明した。さらに、前記MMP基質はMMP-1又はMMP-3により分解される基質（MMP1基質、MMP3基質又はMMP共通(consensus)基質）の場合、その効果が一層優れていることを見出し本発明を完成した。
【００１２】
従って、本発明の目的はβig-h3の四番目のfas-1ドメインからＨ１及びＨ２部位を除去したアミノ酸鎖(dhFas-1);  MMP1基質、MMP3基質及びMMP共通基質からなる群より選ばれた  MMP基質；及びRGDを含むアミノ酸鎖が順に連結されたペプチドを提供することである。
【００１３】
さらに、本発明の他の目的は、前記ペプチドを符号化するポリヌクレオチドを提供することである。
【００１４】
さらに、本発明の他の目的は、プロモータ及びこれと作動可能に連結された前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供することである。
【００１５】
さらに、本発明の他の目的は、前記ベクターで形質転換された宿主細胞を提供することである。
【００１６】
さらに、本発明の他の目的は、前記ペプチドを有効成分として含むリウマチ性関節炎の予防及び治療用薬学的組成物を提供することである。
【００１７】
さらに、本発明の他の目的は、前記ベクターを有効成分として含むリウマチ性関節炎の予防及び治療用薬学的組成物を提供することである。
さらに、本発明の他の目的は、βig-h3の四番目のfas-1ドメインからＨ１及びＨ２部位を除去したアミノ酸鎖(dhFas-1);  MMP1基質、MMP3基質及びMMP共通基質からなる群より選ばれた  MMP基質；及びRGDを含むアミノ酸鎖が順に連結されたペプチドをこれを必要とする個体に有効量で投与することを特徴とするリウマチ性関節炎の予防及び治療方法を提供することである。
【００１８】
さらに、本発明の他の目的は、プロモータ及びこれと作動可能に連結されたβig-h3の四番目のfas-1ドメインからＨ１及びＨ２部位を除去したアミノ酸鎖(dhFas-1);  MMP1基質、MMP3基質及びMMP共通基質からなる群より選ばれたMMP基質；及びRGDを含むアミノ酸鎖が順に連結されたペプチドを符号化するポリヌクレオチドを含むベクターをこれを必要とする個体に有効量で投与することを特徴とするリウマチ性関節炎の予防及び治療方法を提供することである。
【００１９】
さらに、本発明の他の目的は、βig-h3の四番目のfas-1ドメインからＨ１及びＨ２部位を除去したアミノ酸鎖(dhFas-1);  MMP1基質、MMP3基質及びMMP共通基質からなる群より選ばれたMMP基質；及びRGDを含むアミノ酸鎖が順に連結されたペプチドのリウマチ性関節炎の予防及び治療剤を製造するための用途を提供することである。
【００２０】
さらに、本発明の他の目的は、プロモータ及びこれと作動可能に連結されたβig-h3の四番目のfas-1ドメインからＨ１及びＨ２部位を除去したアミノ酸鎖(dhFas-1);  MMP1基質、MMP3基質及びMMP共通基質からなる群より選ばれたMMP基質；及びRGDを含むアミノ酸鎖が順に連結されたペプチドを符号化するポリヌクレオチドを含むベクターのリウマチ性関節炎の予防及び治療剤製造する為の用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
前記のような目的を達成するために、本発明はβig-h3の四番目のfas-1ドメインからＨ１及びＨ２部位を除去したアミノ酸鎖(dhFas-1);MMP1基質、MMP3基質及びMMP共通基質からなる群より選ばれた  MMP基質；及びRGDを含むアミノ酸鎖が順に連結されたペプチドを提供する。
【００２２】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は前記ペプチドを符号化するポリヌクレオチドを提供する。
【００２３】
本発明の他の目的を達成するために、本発明はプロモータ及びこれと作動可能に連結された前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００２４】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は前記ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【００２５】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は前記ペプチドを有効成分として含むリウマチ性関節炎の予防及び治療用薬学的組成物を提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は前記ベクターを有効成分として含むリウマチ性関節炎の予防及び治療用薬学的組成物を提供する。
【００２６】
本発明の他の目的を達成するために、本発明はβig-h3の四番目のfas-1ドメインからＨ１及びＨ２部位を除去したアミノ酸鎖(dhFas-1);  MMP1基質、MMP3基質及びMMP共通基質からなる群より選ばれたMMP基質；及びRGDを含むアミノ酸鎖が順に連結されたペプチドを、これを必要とする個体に有効量で投与することを特徴とするリウマチ性関節炎の予防及び治療方法を提供する。
【００２７】
本発明の他の目的を達成するために、本発明はプロモータ及びこれと作動可能に連結されたβig-h3の四番目のfas-1ドメインからＨ１及びＨ２部位を除去したアミノ酸鎖(dhFas-1);MMP1基質、MMP3基質及びMMP共通基質からなる群より選ばれたMMP基質；及びRGDを含むアミノ酸鎖が順に連結されたペプチドを符号化するポリヌクレオチドを含むベクターを、これを必要とする個体に有効量で投与することを特徴とするリウマチ性関節炎の予防及び治療方法を提供する。
【００２８】
本発明の他の目的を達成するために、本発明はβig-h3の四番目のfas-1ドメインからＨ１及びＨ２部位を除去したアミノ酸鎖(dhFas-1);  MMP1基質、MMP3基質及びMMP共通基質からなる群より選ばれたMMP基質；及びRGDを含むアミノ酸鎖が順に連結されたペプチドのリウマチ性関節炎の予防及び治療剤を製造するための用途を提供する。
【００２９】
本発明の他の目的を達成するために、本発明はプロモータ及びこれと作動可能に連結されたβig-h3の四番目のfas-1ドメインからＨ１及びＨ２部位を除去したアミノ酸鎖(dhFas-1);MMP1基質、MMP3基質及びMMP共通基質からなる群より選ばれたMMP基質；及びRGDを含むアミノ酸鎖が順に連結されたペプチドを符号化するポリヌクレオチドを含むベクターのリウマチ性関節炎の予防及び治療剤を製造するための用途を提供する。
【００３０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３１】
本発明は、βig-h3の四番目のfas-1ドメインからＨ１及びＨ２部位を除去したアミノ酸鎖(dhFas-1);  MMP1基質、MMP3基質及びMMP共通基質からなる群より選ばれたMMP基質；及びRGDを含むアミノ酸鎖が順に連結されたペプチドを提供する。
【００３２】
本発明のペプチドは、βig-h3の四番目のfas-1ドメインからＨ１及びＨ２部位を除去したアミノ酸鎖(dhFas-1);  MMP1基質、MMP3基質及びMMP共通基質からなる群より選ばれたMMP基質；及びRGDを含むアミノ酸鎖が順に連結されたことを特徴とする。
【００３３】
βig-h3は、ヒトの黒色素細胞腫細胞(human  melanoma  cells)、哺乳動物の上皮細胞(mammary  epithelial  cells)、角質形成細胞(keratinocytes)及び肺繊維芽細胞(lung  fibroblasts)等を含む、多様な種類の細胞からTGF-β1により誘導される細胞の基質蛋白質(extracellular  matrix  protein)である(Skonier,J.ET  AL.,DNA  Cell  Biol.,13,571,1994)、βig-h3はRGDモチーフと共に、相同性を有する４個の繰返された内部ドメイン(internal  domain)が含まれているが、このドメインは哺乳類、昆虫、ウニ、植物、酵母及び細菌を含む多様な種類の分泌蛋白質、又は膜蛋白質から極めて保存的な配列として発見される。前記保存的配列を含む蛋白質等には、ペリオスチン(epriostin)、ファスシクリンI(fasciclin  I)、ウニ  HLC-2(sea  urchin  HLC-2)、藻類のアルガル-CAM(Algal-CAM)及びマイコバクテリウム  MPB70(mycobacterium  MPB70)等が含まれるものとして究明された(Kawamoto,T.et  al.,Biochem.Biophys.Acta.,1395,288,1998)。このような蛋白質から保存的に発見される相同性ドメイン（fas-1ドメインと称す）は110乃至140個のアミノ酸で構成され、特に相同性が高い約10個のアミノ酸で構成された二つの枝（H1及びH2）を含んでいる。
【００３４】
dhFas-1はβig-h3の四番目のfas-1ドメインからＨ１及びＨ２部位を除去したアミノ酸鎖を意味する。βig-h3蛋白質はリガンド認識部位であるRGDモチーフと、４個の内部繰返しドメインのfas-1ドメインを含んでいる。前記fas-1ドメインの内、四番目のドメインにはα3β1インテグリンと相互作用するモチーフが存在し、チロシンーヒスチジンアミノ酸配列を含み、繊維芽細胞の付着を媒介する  YHモチーフが存在する。よって、四番目のfas-1ドメインには相同性が極めて高い約10個のアミノ酸からなるH1及びH2がその内部に存在する。
【００３５】
本発明のdhFas-1は広く知られたβig-h3の四番目のfas-1ドメインからＨ１及びＨ２部位を除去したアミノ酸鎖であればどんなものでも可能であり、好ましくはマウス由来のdhFas-1(mdhFas-1)又はヒト由来のdhFas-1(hsdhFas-1)でもあって、さらに、好ましくは配列番号１又は配列番号３のアミノ酸配列で表示されるものでもある。dhFas-1は以前の方法（大韓民国特許公開公報10-2004-0086708)により製作することもできる。
【００３６】
本発明のRGDを含むアミノ酸鎖は、インテグリンを遮断する効果を有するRGD(アルギニンーグライシンーアスパラギン酸)配列を含むものであればどんなものでも可能であって、好ましくは配列番号９又は配列番号10のアミノ酸配列で表示されるアミノ酸鎖でもあり得る。MMP基質とは、マトリクスメタロプロテナーゼ（MMP,matrix  metalloproteinase)により分解される短いアミノ酸鎖を意味する。
【００３７】
リウマチ性関節炎で滑膜細胞はMMPとカテプシン(cathepsin)と言う酵素分泌を通じて、軟骨基質を破壊するものとして知られている。このようなMMPは約19種類の多様な酵素で構成され、大きくコラゲナーゼ(collagenase)、ゼラチナーぜ(gelatinase)、ストロメライシン(stromelysin)、膜性MMP(membrane  type  MMP;MT-MMP)の４種に区分され、コラゲナーゼ-1(MMP-1)、コラゲナーゼ-2(MMP-8)、コラゲナーゼ-3(MMP-13)が原形コラーゲンを破壊する主要コラゲナーゼとして知られている。
【００３８】
本発明のMMP1基質は、MMP-1により分解される短いアミノ酸鎖を意味する。MMP3基質はMMP-3により分解される短いアミノ酸鎖を意味する。MMP共通基質はMMP-1、MMP-2及びMMP-3により分解される短いアミノ酸鎖を意味する。本発明のMMP1基質、MMP3基質又はMMP共通基質は、前記dhFas-1とインテグリンを遮断する効果を有するRGDを含むアミノ酸鎖間に存在して炎症の進行が始まるところで分解され、前記dhFas-1とRGDを含むアミノ酸鎖の付着効率を増加させるものであれば、如何なる構成のアミノ酸鎖も可能であるが、好ましくはQGIA、LGLW又はLGIAで表示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸鎖でもあって、より好ましくはGPQGIAG、GPLGLWARG又はGPLGIAGのアミノ酸配列を含むアミノ酸鎖でもあり、最も好ましくは配列番号６乃至８のアミノ酸配列で表示されるアミノ酸鎖でもあり得る。
【００３９】
本発明のdhFas-1  ;MMP1基質、MMP3基質及びMMP共通基質からなる群より選ばれたMMP基質；及びRGDを含むアミノ酸鎖が順に連結されたペプチド（以下、‘dhFas-1-MMP基質）-RGD構造ペプチド’と称す、さらに、mdhFas-1、MMP1基質、及びRGDを含むアミノ酸鎖が順に連結されたペプチドは、MFK24に；mdhFas-1、MMP3基質、及びRGDを含むアミノ酸鎖が順に連結されたペプチドはMFK27に；mdhFas-1、MMP共通基質、及びRGDを含むアミノ酸鎖が順に連結されたペプチドは、MFK25に；hsdhFas-1、MMP1基質、及びRGDを含むアミノ酸鎖が順に連結されたペプチドは、hsFJ24に；hsdhFas-1、MMP3基質、及びRGDを含むアミノ酸鎖が順に連結されたペプチドは、hsFJ27に；hsdhFas-1、MMP共通基質、及びRGDを含むアミノ酸鎖が順に連結されたペプチドはhsFJ25に命名する）は、好ましくはRGDを含むアミノ酸鎖がRGDSP又はQERGDSLA配列を含むアミノ酸鎖か、又はMMP基質がGPQGIAG、GPLGLWARG又はGPLGIAGの配列を含むアミノ酸鎖でもあり得る。
【００４０】
本発明のdhFas-1-MMP基質-RGD構造ペプチドは、好ましくは前記βig-h3の四番目のfas-1ドメインからH1及びH2部位を除去したアミノ酸鎖(dhFas1)と、前記MMP1基質、MMP3基質及びMMP共通基質からなる群より選ばれたMMP基質間に、１乃至５個のアミノ酸で構成されたリンカーを含むペプチド、又は前記MMP1基質、MMP3基質及びMMP共通基質からなる群より選ばれたMMP基質と、前記RGDを含むアミノ酸鎖間に１乃至５個のアミノ酸で構成されたリンカーを含むことを特徴とするペプチドでもあり得る。
【００４１】
前記βig-h3の四番目のfas-1ドメインからＨ１及びＨ２部位を除去したアミノ酸鎖(dhFas-1)と、前記MMP1基質、MMP3基質及びMMP共通基質からなる群より選ばれたMMP基質間に含まれる、本発明の１乃至５個のアミノ酸で構成されたリンカーは、MMP基質とRGDを含むアミノ酸鎖を連結する短いペプチドで、その構成は特に制限はされないが、好ましくはVD（バリンアスパラギン酸）又はVDG（バリンアスパラギン酸グライシン）でもあり得る。
【００４２】
さらに、前記MMP1基質、MMP3基質及びMMP共通基質からなる群より選ばれたMMP基質と、前記RGDを含む本発明の１乃至５個のアミノ酸で構成されたリンカーは、MMP基質とRGDを含むアミノ酸鎖を連結する短いペプチドで、その構成は特に制限はされないが、好ましくはLE（ルシングルタミン酸）、又はEF（グルタミン酸フェニルアラニン）でもあり得る。
【００４３】
本発明のdhFas-1-MMP基質ーRGD構造ペプチドは、より好ましくはRGDを含むアミノ酸鎖がRGDSP又はQERGDSLAで表示されるアミノ酸配列からなるアミノ酸鎖か、又はMMP基質がGPQGIAG、GPLGLWARG又はGPLGIAGのアミノ酸配列からなる、アミノ酸鎖であるペプチドでもあり、最も好ましくは配列番号12乃至17で表示されるアミノ酸配列を有するペプチドでもあり得る。
【００４４】
本発明のdhFas-1-MMP基質ーRGD構造ペプチドは、dhFas-1;MMP1基質、MMP3基質及びMMP共通基質からなる群より選ばれたMMP基質；及びRGDを含むアミノ酸鎖が連結されたペプチドに対して機能的同等物でもあって、好ましくは配列番号12乃至17のアミノ酸配列を有するペプチドと機能的同等物を含む。前記機能的同等物とは、アミノ酸の付加、置換又は欠失の結果、dhFas-1-MMP基質ーRGD構造ペプチド、好ましくは配列番号12乃至17のアミノ酸配列と、少なくとも60%、好ましくは70%より好ましくは80%以上、最も好ましくは90%以上の配列相同性を有するものにして、本発明のdhFas-1-MMP基質ーRGD構造ペプチド、好ましくは配列番号12乃至17のアミノ酸配列を有するペプチドと、実質的に同質の活性を示すペプチドを意味する。ここで‘実質的に同質の活性’とは、リウマチ性関節炎の予防及び治療を意味する。前記機能的同等物には、例えば、dhFas-1-MMP基質ーRGD構造ペプチド、好ましくは配列番号12乃至17のアミノ酸配列を有するペプチドのアミノ酸の内、一部が置換されるか、欠失又は付加されたアミノ酸の配列変形体が含まれる。アミノ酸の置換は好ましくは保存的置換である。天然に存在するアミノ酸の保存的置換の例には、脂肪族アミノ酸群(Gly,Ala,Pro)、疎水性アミノ酸群(Ile,Leu,Val)、芳香族アミノ酸群(Phe,Tyr,Trp)、酸性アミノ酸群(Asp,Glu)、塩基性アミノ酸群(His,Lys,Arg,Gln,Asn)及びアミノ酸群の各アミノ酸群内部の同一なアミノ酸の置換でもあり得る。アミノ酸の欠失は好ましくは本発明のdhFas-1-MMP基質ーRGD構造ペプチド、好ましくは配列番号12乃至17のアミノ酸配列を有するペプチドの活性に直接関与しない部分に位置したアミノ酸の欠失を意味する。アミノ酸の付加は遺伝子操作過程で必要な制限酵素部位又はペプチド精製等のためのhistone  tag等を含むペプチドの活性に影響を及ぼさない範囲でアミノ酸が付加されることを意味する。
【００４５】
さらに、前記機能的同等物の範囲には、dhFas-1-MMP基質ーRGD構造ペプチド、好ましくは配列番号12乃至17のアミノ酸配列を有するペプチドの基本骨格及びこれの生理活性を維持しながらその一部化学構造が変形されたペプチド誘導体も含まれる。例えば、本発明のペプチドの安定性、貯蔵性、揮発性又は溶解度等を変更させるための構造変更及び生理活性を維持しながらGFPのような他の蛋白質と融合で作られた融合蛋白質等がこれに含まれる。
【００４６】
本発明のペプチドを得るための遺伝子は、如何なる供給源のゲノムDNA又はcDNAからも分離可能で、好ましくはヒト又はマウスのcDNA又はゲノムライブラリーから分離することができる。本発明のペプチドを符号化する遺伝子を獲得するための一般的な方法は従来技術によく表れている（参照：Sambrook,Fitsc＆Manatis,Molecular  Cloning:A  Laboratory  Mannual,  Second  Edition(1989)）。さらに、如何なる動物の細胞でも、本発明のペプチドを符号化する遺伝子の分子クローニングのための核酸供給源として提供できる。DNAはクローンされたDNAから公知の技術により獲得することができ、好ましくは化学合成、cDNAクローニング又はゲノムDNAのクローニング、又はそれらの断片のクローニング又は望む細胞から精製された断片のクローニングにより、蛋白質を高水準に発現する細胞から製造されたcDNAライブラリーから獲得することができる［SambrookSambrook,  J.,  Fritsch,  E.  F.  and  Maniatis,  T.,  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  2nd  ed.,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory:  Cold  Spring  Harbor,  NY  (1989);  by  Silhavy,  T.  J.,  Bennan,  M.  L.  and  Enquist,  L.  W.,  Experiments  with  Gene  Fusions,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory:  Cold  Spring  Harbor,  NY  (1984);  and  by  Ausubel,  F.  M.  et  al.,  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  published  by  Greene  Publishing  Assoc.  and  Wiley-lnterscience  (1987)］。ゲノムDNA  からクローニングされた遺伝子は、符号化域に付加されて調節域とイントロンDNA域を含む。cDNAからクローニングされた遺伝子はイントロン配列を含まない。供給源がなんであろうと、遺伝子は遺伝子の伝達のための適合したベクターで分子的にクローニングされなければならない。
【００４７】
本発明のペプチド等は、当分野の熟練者が公知の方法により製造することができる。このようなペプチドは、より大きいポリペプチドの一部であって、本発明のペプチド配列を符号化するポリヌクレオチドを発現させ、原核又は真核細胞で生成させることができる。他の方法では、このようなペプチドは化学的方法により合成することができる。組換え宿主内の異種性蛋白質の発現、ポリペプチドの化学的合成及び試験管内転写のための方法は当分野において既に公知であり、文献（参照文献：Maniatis  et  al  .  ,  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual  (1989),  2nd  Ed.,  Cold  Spring  Harbor,  N.Y.;  Berger  and  Kimmel,  Methods  in  Enzymology,  Volume  152,  Guide  to  Molecular  Cloning  Techniques  (1987),  Academic  Press,  Inc.,  San  Diego,  Calif.;  Merrifield,  J.  (1969)  J.  Am.  Chem.  Soc.  91:501;  Chaiken  I.M.  (1981)  CRC  Crit.  Rev.  Biochem.  11:  255;  Kaiser  et  al.  (1989)  Ann.  Rev.  Biochem.  57:957;  and  Offord,  R.E.  (1980)  Semisynthetic  Proteins,  Wi  ley  Publ  ishing.）に追加記載されている。
【００４８】
一方、本発明はプロモータ及びこれと作動可能に連結されたdhFas-1、MMP1基質、MMP3基質及びMMP共通基質からなる群より選ばれたMMP基質；及びRGDを含むアミノ酸鎖が順に連結されたペプチド（dhFas-1-MMP基質-RGD構造ペプチド）を符号化するポリヌクレオチドを提供する。
【００４９】
前記ポリヌクレオチドは、本発明のdhFas-1-MMP基質-RGD構造ペプチドを符号化するものであれば、制限なく使用することができ、DNA、cDNA及びRNA配列を全て含む。好ましくは前記RGD構造はRGDSP又はQERGDSLAを含むアミノ酸配列からなるアミノ酸鎖でもあって、より好ましくはRGDSP又はQERGDSLAで構成されたアミノ酸配列からなるアミノ酸鎖でもある。前記MMP1基質はMMP-1により分解されるMMP基質であって、MMP3基質はMMP3により分解される基質であって、MMP共通基質はMMP1,2,3全てにより分解されるMMP基質である。
【００５０】
前記本発明のMMP1基質、MMP3基質又はMMP  共通基質は、前記dhFas-1とインテグリンを遮断する効果を有するRGDを含むアミノ酸鎖間に存在して炎症進行が始まるところで分解され、前記dhFas-1とRGDを含むアミノ酸鎖の付着効率を増加させるものであれば如何なる構成のアミノ酸鎖も可能であるが、より好ましくはQGIA,LGLW又はLGIAで表示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸鎖でもあり、より好ましくはGPQGIAG、GPLGLWARG又はGPLGIAGのアミノ酸配列を含むアミノ酸鎖である。より好ましくはGPQGIAG、GPLGLWARG又はGPLGIAGで構成されたアミノ酸配列からなるアミノ酸鎖である。
【００５１】
最も好ましくは前記ポリヌクレオチドは、配列番号19乃至24の配列で表示される塩基配列を含むものでもあり得る。
【００５２】
前記ポリヌクレオチドは天然で分離されるか、又は当業界に公知された遺伝工学的な方法により製造することもできる。
【００５３】
一方、本発明はプロモータ及び作動可能に連結されたdhFas-1;MMP1基質、MMP3基質及びMMP共通基質からなる群より選ばれたMMP基質；及びRGDを含むアミノ酸鎖が順に連結されたペプチド（dhFas-1-MMP基質-RGD構造ペプチド）を符号化するポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００５４】
本発明で“ベクター”とは、適合した宿主内でDNAを発現できる適合した調節配列に作動可能に連結されたDNA  配列を含有するDNA  製造物を意味する。ベクターはプラスミド、ファージ粒子又は簡単に潜在的ゲノム挿入物でもあり得る。適当な宿主に形質転換されると、ベクターは宿主ゲノムとは関係なく複製して機能できるか、又は一部の場合にゲノムそのものに統合されることもあり得る。プラスミドが現在ベクターの最も一般的に使用される形態であるので、本発明の明細書で“プラスミド”及び“ベクター”は、たまには相互交換的に使用される。本発明の目的上、プラスミドベクターを利用するのが好ましい。このような目的に使用できる典型的なプラスミドベクターは、（ａ）宿主細胞当り数百個のプラスミドベクターを含むように複製が効率的になされるようにする複製開始点、（ｂ）プラスミドベクターに形質転換された宿主細胞が選抜されるようにする抗生剤耐性遺伝子及び、（ｃ）外来DNA切片が挿入できる制限酵素切断部位を含む構造を有している。適切な制限酵素切断部位が存在しなくとも、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター(oligonucleotide  adaptor)又はリンカー(linker)を使用すればベクターと外来DNAを容易にライゲーション(ligation)することができる。
【００５５】
前記“プロモータ”とは、特定の宿主細胞で作動可能に連結された核酸配列の発現を調節するDNA配列を意味し、“作動可能に連結される”とは、一つの核酸断片が他の核酸断片と結合されて、その機能又は発現が他の核酸断片により影響を受けることを意味する。よって、転写を調節するための任意のオペレータ配列、適合したmRNAリボソーム結合部位をコーティングする配列及び転写及び解読の終結を調節する配列を追加して含み得る。前記プロモータは全ての時間帯に常時的に目的遺伝子の発現を誘導するプロモータ又は特定した位置、時期に目的遺伝子の発現を誘導するプロモータを使用することができる。
【００５６】
本発明のベクターはプラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター及びウィルスベクター等を含むがこれに制限はされない。適合したベクターは発現ベクターにして、プラスミド、オペレータ、開始コードン、終結コードン、ポリアデニル化シグナル及びインハンサーのような発現調節エレメント等を含むことができ、目的によって多様に製造することができる。本発明のベクターは本発明のペプチドを符号化する核酸を宿主細胞へ伝達するために使用される全ての手段であって、好ましくはベクターはレトロウィルス、ヘルペスウィルス、アデノウィルス及びアデノ関連ウィルスのようなウィルスベクターである。従って、本発明のペプチドを符号化する遺伝子はウィルスベクターを使用して、又は直接的なDNA  導入を通じて生体内、生体外又は試験管内で導入させる。標的組織内での発現は突然変異ベクターをウィルスベクター又は受容体リガンド等を利用して特定細胞に対して標的化するか、又は組織特異的プロモータを使用するか、又はその二つの方法全てを使用して実施できる。
【００５７】
DNAウィルスベクターは弱毒化された、又は欠損型DNA  ウィルス、例えば、これに制限はされないが、単純疱疹ウィルス(HSV)、パピロマウィルス、エブスタインバルウィルス(EBV)、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス(AAV)、バクシニアウィルス等を含む。ウィルス遺伝子が全部又は殆ど全部欠失された欠損型ウィルスが好ましい。欠損型ウィルスは細胞に導入された後には、複製能がなく生産的なウィルス感染を誘導することができない。従って、欠損型ウィルスベクターを使用すれば、ベクターが他の細胞を感染させる心配もなく、特定の一部域にある細胞に投与することができる。従って、特定組織は特異的に標的化することができる。
【００５８】
一方、本発明で使用された標準組換えDNA及び分子クローニング技術は、当分野で広く公知されており、次の文献に記載されている（Sambrook,  J.,  Fritsch,  E.  F.  and  Maniatis,  T.,  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  2nd  ed.,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory:  Cold  Spring  Harbor,  NY  (1989);  by  Silhavy,  T.  J.,  Bennan,  M.  L.  and  Enquist,  L.  W.,  Experiments  with  Gene  Fusions,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory:  Cold  Spring  Harbor,  NY  (1984);  and  by  Ausubel,  F.  M.  et  al.,  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  published  by  Greene  Publishing  Assoc.  and  Wiley-lnterscience(1987))。一方、本発明は、本発明のベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【００５９】
宿主細胞は挿入された配列の発現を調節するか、又は好ましい特定方式で遺伝子生成物を進行させることを選択することができる。相異した宿主細胞は蛋白質の解毒及び解毒後プロセシングと変形に対する特徴的で特異的な機構を有している。適合した細胞株又は宿主システムでは、発現された異種蛋白質の好ましい変形及びプロセシングを提供することを選択することができる。酵母における発現は生物学的活性生成物を生産することができる。真核細胞における発現は“天然”ホールディングの可能性を増加することができる。
【００６０】
本発明のベクターを安定で連続的にクローニング及び発現することができる宿主細胞は、当業界に公知の如何なる宿主細胞でも利用することができ、例えば、E.  coli  JM109,  E.  coli  BL21DE,  E.  coli  DH5α,  E.  coli  RR1,  E.  coli  LE392,  E.  coli  B,  E.  coli  X  1776,  E.  coli  W3110等を使用することができ、さらに、アクロバクテリウムＡ４のようなアクロバクテリウム属菌株、バシラスサブチリス(Bacillus  subtilis)のようなバシリー(bacilli)、サルモネラチフィミュリム(Salmonella  typhimurium)又はセラチアマルケセンス(Serratia  marcescens)のような、さらに異なる腸内細菌及び多様なシュードモナス(Pseudomonas)属菌株が宿主細胞として利用することができる。
【００６１】
さらに、本発明のベクターを真核細胞に形質転換させる場合には、宿主細胞としてイースト(Saccharomyce  cerevisiae)、昆虫細胞及びヒトの細胞（例えば、CHO細胞株(Chinese  hamster  ovary),W138,BHK,COS-7,293,HepG2,3T3,RIN及びMDCK細胞株）等が利用できる。
【００６２】
本発明で宿主細胞は好ましくはE.coliでもあり得る。
【００６３】
ベクターを宿主細胞内に伝達して宿主細胞を形質転換させる方法は、公知の方法であれば如何なるものでも可能であり、特に制限はされない。例えば、リン酸カルシウム沈殿法（calciumphosphate  precipitation)、DEAE-dextran法、電気穿孔法(electroration)、直接微細注入法(direct  microinjection)、DNA  ローディングリポソーム(DNA  loaded  liposome)法、リフォフェクタミン-DNA複合体(liofectamine-DNA  complex)法、細胞音波粉砕法(cell  sonication)、高速微細噴射(high  velocity  microprojectile)を利用した遺伝子爆撃法(gene  bombardment)、多陽イオン(polycation)法及び受容体媒介形質転移法(receptor-mediated  transfection)により形質転換することができる。この技術等の内、一部は生体内又は生体外使用のために改良することができる。
【００６４】
宿主細胞内に注入されたベクターは宿主細胞内で発現することができ、このような場合には大量の組換えペプチド又は蛋白質を得るようになる。例えば、ベクターがlacプロモータを含む場合には、宿主細胞にIPTGを処理して遺伝子発現を誘導することができる。
【００６５】
本発明の方法において、形質転換された宿主細胞の培養は当業界で一般的に利用される培地を利用して実施することができる。例えば、形質転換体が原核細胞（例えば、E.coli）の場合、LB(Luria-Bertani)培地を利用して形質転換体を培養することができる。形質転換体が動物細胞の場合には、例えば、Eagle's  minimum  essential  medium,  Eagle,  H.  Science  130:432(1959)）を利用して形質転換体を培養することができる。
【００６６】
形質転換体の多様な培養方法は当業者に公知されており、Sambrook  et  al.,  Molecular  Cloning,  A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press(2001)に開示されていて、この文献は本明細書に参照として挿入される。
【００６７】
本発明のペプチドはリウマチ性関節炎を治療する効能が優れている。本発明の炎症性疾患には、これに限定はされないが、浮腫、炎症性腸疾患、腹膜炎、蜂窩織炎、膵臓炎、骨髄炎、ショックを誘発するトラウマ、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、包嚢性繊維腫、急性気管支炎、慢性気管支炎、急性細気管支炎、慢性細気管支炎、骨関節炎、痛風、脊椎炎、硬直性脊椎、ライタスシンドローム(Reiter's  syndrom)、乾癬性関節炎、炎症性腸疾患を同伴した脊椎炎、青少年関節症、青少年交錯関節症、反応性関節症、感染性関節炎、感染後関節炎、リン菌関節炎、結核関節炎、ウィルス関節炎、真菌関節炎、梅毒関節炎、ライム病、脈管炎シンドロームを同伴した関節炎、多発性動脈炎、過敏性脈管炎、ウェグナー肉芽腫症、多発性筋肉痛、巨大細胞動脈炎、カルシウム結晶蓄積関節炎、胃痛風、関節性関節炎、滑液嚢炎、痩果炎、テニス・エルボー、神経性関節炎、関節血症、ヘーノホシェーンライン紫斑病、多心性膜内組織球症、異常血色素症、ヘモグロビン痛、家族性地中海熱、バセット病(Behcet's  disease)、全身性紅斑性嚢瘡、多発性硬化症、肺血症、肺血症ショック、急性呼吸器痛症シンドローム、複合器官異常、慢性閉鎖性肺疾患、リウマチ性性関節炎、急性呼吸不全症候群がある。さらに、炎症性疾患は急性及び慢性湿疹、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、皮膚炎性脱毛、剥落性皮膚炎、日光性皮膚炎及び乾癬等がある。好ましくは、本発明の炎症性疾患はリウマチ性性関節炎である。
【００６８】
このような本発明組成物の特徴は実施例で確認される。
【００６９】
本発明の一実施例では本発明のmdhFas-1-MMP基質-RGD構造ペプチド(MFK24,MFK25)、mdhFas-1，hsdhFas-1及びmdhFas-1-RGD構造ペプチド(MFK12)を製作して滑膜細胞付着及び移住抑制効能を測定した。
【００７０】
その結果、MFK24及びMFK25の場合、既存のYH18モチーフ、mdhFas-1及び本発明のmdhFas-1構造変形ペプチドに比べて細胞付着及び移住抑制効果が並外れて優れたことを確認した。さらに、mdhFas-1とRGDSPを各々又は混合して同一な細胞付着試験を実施して、MFK24と比較した結果、MFK24が最も卓越な細胞付着抑制効果を示すことを確認した（実施例３，比較例１及び比較例２参照）。
【００７１】
本発明の他の一実施例では、コラーゲン誘導関節炎マウスモデルルから本発明のペプチドの関節炎治療効果を確認した。
【００７２】
本発明のペプチドを一定期間投与しながら関節炎指数を測定して対照群と比較した結果、対照群のmdhFas-1及びMFK12の場合、30mg/kg体重を投与した群から関節炎抑制効果が表れ、MMP-2により分解されるMMP2基質を含むmdhFas-1-MMP2基質-RGD構造ペプチド（以下、'MFK23'と称す）の場合、関節炎抑制効果が未備ではあるが、MMP-1により分解されるMMP1基質を含む本発明のペプチドの場合、0.1mg/kg体重を投与した群でも優れた関節炎抑制効果が持続されることを確認した。
【００７３】
さらに、実験対象マウスの脚組織を検査した結果、本発明のペプチドを投与した群は0.1mg/kg体重を投与した群でも滑膜細胞の増殖が抑制され、軟骨及び骨の形態破壊程度が減少することを観察することができ、炎症媒介物質の量を測定した結果、本発明のペプチドを投与した群は、0.1mg/kg体重を投与した場合にも効果的に炎症媒介物質を抑制することを確認した。
【００７４】
MFK12の場合、10mg/kg体重を投与した群では関節部位が破壊され、滑膜細胞の過多増殖が観察されて、血管新生と細胞付着蛋白質の発現が対照群くらい増加されていることを確認し、30mg/kg体重を投与した場合、治療効果が多少表れることを確認した。炎症媒介物質測定結果からも、MFK12は10mg/kg体重を投与した群は対照群と比較して炎症媒介物質発現量に有意的差がなく、30mg/kg体重を投与した場合、発現量減少が表れることを確認した（実施例４、比較例３及び比較例４参照）。
【００７５】
これで本発明のペプチドは既存のペプチドに比べて関節炎治療効果が100倍以上優れていることを確認した。
【００７６】
従って、本発明のdhFas-1-MMP基質-RGD構造ペプチドは、dhFas-1、MFK12に比べて極めて少ない投与量でもリウマチ性関節炎に対する効果が優れたことを確認した。
【００７７】
従って、本発明は前記dhFas-1-MMP基質-RGD構造ペプチドを有効成分として含むリウマチ性関節炎の予防及び治療用薬学的組成物を提供する。
【００７８】
本発明の組成物はβig-h3の四番目のfas-1ドメインから、Ｈ１及びＨ２部位を除去したアミノ酸鎖(dhFas-1);MMP1基質、MMP3基質及びMMP共通基質からなる群より選ばれたMMP基質；及びさらに、RGDを含むアミノ酸鎖が順に連結されたペプチドを有効成分として含むことを特徴とする。
【００７９】
MP1基質はMMP-1により分解される短いアミノ酸鎖を意味する。MMP3基質はMMP-3により分解される短いアミノ酸鎖を意味する。MMPconsensus基質はMMP-1、MMP-2及びMMP-3により分解される短いアミノ酸鎖を意味する。
【００８０】
本発明のMMP1基質、MMP3基質及びMMP共通基質からなる群より選ばれたMMP基質は好ましくは、QGIA,LGLW又はLGIAを含むアミノ酸配列からなるアミノ酸鎖でもあり、より好ましくはGPQGIA，GPLGLWARG又はGPLGIGで構成されたアミノ酸配列からなるアミノ酸鎖でもある。
【００８１】
前記RGDを含むアミノ酸鎖はRGDSP又はQERGDSLAで表示されるアミノ酸配列からなるアミノ酸鎖であることを特徴とする、リウマチ性関節炎の予防及び治療用薬学的組成物でもある。より好ましくは前記ペプチドが配列番号12乃至17で表示されるアミノ酸配列を有するペプチドでもあって、これの機能的同等物も含む。本発明のdhFas-1-MMP基質-RGD構造ペプチドを利用する場合、dhFas-1を利用する場合に比べて、少ない用量でもより優れた効能を表すことができ、その断片の長さが比較的短く蛋白質間で互いに固まらないので、剤形化する過程で調節が遥かに容易で薬剤伝達の面でも有利である。
【００８２】
さらに、前記dhFas-1-MMP基質-RGD構造ペプチドを符号化するポリヌクレオチドを含むベクターを生体内で発現させ、リウマチ性関節炎の予防及び治療に有効な物質を生産できるので、本発明は前記dhFas-1-MMP基質-RGD構造ペプチドを符号化するポリヌクレオチドを含むベクターを有効成分として含むリウマチ性関節炎の予防及び治療用薬学的組成物を提供する。
【００８３】
本発明に伴う組成物が適用できる疾患はリウマチ性関節炎である。
【００８４】
本発明に伴う薬学的組成物は、dhFas-1-MMP基質-RGD構造ペプチド、又は前記dhFas-1-MMP基質-RGD構造ペプチドを符号化するポリヌクレオチドを含むベクターを単独で含有するか、又は一つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を追加して含有することができる。
【００８５】
薬学的に許容される担体には、例えば、経投与用担体又は非経口投与用担体を追加して含むことができる。経投与用担体はラクトース、澱粉、セルロース誘導体、マグネシウムステアリン酸、ステアリン酸等を含み得る。従って、ペプチド製剤に対する経投与用に使用される多様な薬剤伝達物質を含むことができる。さらに、非経口投与用担体は水、適合したオイル、食塩水、水性グルコース及びグリコール等を含むことができて、安定化剤及び保存剤を追加して含むことができる。適合した安定化剤には、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム又はアスコルビン酸のような抗酸化剤がある。適合した保存剤にはベンズアルコニウムクロライド、メチル又はプロピルパラベン及びクロロブタノールがある。その他の薬学的に許容される担体には、下記の文献に記載されていることを参考にすることができる（Remington's  Pharmaceutical  Sciences,  19th  ed.,  Mack  Publishing  Company,  Easton,  PA,  1995）。
【００８６】
本発明の組成物はヒトを初めとする哺乳動物に如何なる方法を用いてでも投与することができる。例えば、経又は非経口的に投与することができる。非経口的な投与方法にはこれに限定はされないが、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、境膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下又は直腸内投与でもあり得る。
【００８７】
本発明の薬学的組成物は上述した通り、投与経路によって経口投与用又は非経口投与用製剤に剤形化することができる。
【００８８】
経投与用製剤の場合に、本発明の組成物は、粉末、顆粒、錠剤、丸剤、糖衣錠剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液等で当業界に公知された方法を利用して剤形化することができる。例えば、経用製剤は活性成分を固体賦形剤と配合した後、これを粉砕して適合した補助剤を添加して、顆粒混合物に加工することにより、錠剤又は糖衣製剤を収得することができる。適合した賦形剤の例には、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール及びマルチトール等を含む糖類と、トウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉、及び馬鈴薯澱粉等を含む澱粉類、セルロース、メチルセルロース、ナトリウム、カルボキシメチルセルロース及びヒドロキシプロフィールメチルセルロース等を含むセルロース類、ゼラチン、ポリビニルピロリドン等のような充填剤が含まれることもある。さらに、場合によっては架橋結合ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸又はナトリウムアルギナート等を崩解剤として添加することができる。さらには、前記薬学的組成物は抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤及び防腐剤等を追加して含むことができる。
【００８９】
非経口投与用製剤の場合には、注射剤、クリーム剤、ローション剤、外用軟膏剤、オイル剤、保湿剤、ゲル剤、エアロゾル及び鼻腔吸込み剤の形態で当業界に公知された方法で剤形化することができる。これらの剤形は全ての製薬化学に一般的に公知された処方箋である文献(Remington's  Pharmaceutical  Sciences,  19th  ed.,  Mack  Publishing  Company,  Easton,  PA,  1995)に記載されている。
【００９０】
本発明組成物のdhFas-1-MMP基質-RGD構造ペプチドの総有効量は、単一投与量で患者に投与することができ、多重投与量で長期間投与される分割治療方法(fractionated  treatment  protocol)により、投与することができる。本発明の薬学的組成物は疾患の程度により、有効成分の含量を異にすることができる。好ましくは本発明の組成物のdhFas-1-MMP基質-RGD構造ペプチドの好ましい用量は１日当り患者の体重1kgにつき、約0.01μg乃至1,000mg、最も好ましくは、0.1μg乃至100mgでもあり得る。しかし、前記dhFas-1-MMP基質-RGD構造ペプチドの用量は薬学的組成物の投与経路及び治療回数ばかりでなく、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食餌及び排泄率等多様な要因等を考慮して患者に対する有効投与量が決定されるので、このような点を考慮することにより、当分野の通常の知識を有する者であれば、前記dhFas-1-MMP基質-RGD構造ペプチドを、リウマチ性関節炎の予防及び治療剤としての特定した用途に伴う適切な有効投与量を決定することができる。本発明に伴う薬学的組成物は本発明の効果を示す限りその剤形、投与経路及び投与方法に特に制限はされない。
【発明の効果】
【００９１】
従って、本発明のdhFas-1-MMP基質-RGD構造ペプチドは、リウマチ性関節炎の予防及び治療用薬学的組成物は、リウマチ性関節炎部位の滑膜細胞の付着及び移動を抑制して、リウマチ性関節炎の拡大を防ぎ、免疫細胞の浸潤を抑制させてリウマチ性関節炎の予防及び治療に効果的に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】図１は、hsdhFas-1(ヒトのβig-h3のfas-1ドメインの構造変形ペプチド)のsequenceとhsdhFas-1組換えペプチドが発現されたことを示す免疫ブロットの結果である。
【図２】図２は、mdhFas-1(マウスのβig-h3のfas-1ドメインの構造変形ペプチド)のsequenceとmdhFas-1組換えペプチドが発現されたことを示す免疫ブロットの結果である。
【図３】図３は、βig-h3が媒介されたNIH3T3細胞株の付着(A)及び移動(B)がhsdhFas-1により、濃度依存的に抑制されることを示す免疫ブロットの結果である(付着率(%):対照群を100%にした時の相対的細胞付着率、移動率(%):対照群を100%にした時の相対的細胞移動率）、濃度(uM):添加されたペプチドの濃度）。
【図４】図４は、βig-h3が媒介されたNIH3T3細胞株の付着(A)及び移動(B)がmdhFas-1により、濃度依存的に抑制されることを示す免疫ブロットの結果である(付着率(%):対照群を100%にした時の相対的細胞付着率、移動率(%):対照群を100%にした時の相対的細胞移動率）、濃度(uM):添加されたペプチドの濃度）。
【図５】図５は、mdhFas-1にアミノ酸配列RGDSPが結合したペプチド(MFK12)のsequenceとMFK12の組換えペプチドが発現されたことを示す免疫ブロットの結果である。
【図６】図６は、βig-h3が媒介されたNIH3T3細胞株の付着(A)及び移動(B)が、MFK12により、濃度依存的に抑制されることを示す結果である(付着率(%):対照群を100%にした時の相対的細胞付着率、移動率(%):対照群を100%にした時の相対的細胞移動率）、濃度(uM):添加されたペプチドの濃度）。
【図７】図７は、MFK23のsequenceとMFK23組換えペプチドが発現されたことを示す免疫ブロットの結果である。
【図８】図８は、MFK24のsequenceとMFK24組換えペプチドが発現されたことを示す免疫ブロットの結果である。
【図９】図９は、MFK25のsequenceとMFK25組換えペプチドが発現されたことを示す免疫ブロットの結果である。
【図１０】図１０は、MMP-2基質を有しているMFK23ペプチドの、MMP-1,-2,-3とCathepsin  K,L,Dの酵素消化試験した結果である(MFK23(ug):投与したMFK23ペプチドの量(ug);MMP1(ng)、;MMP2(ng)、MMP3(ng)：消化酵素試験に使用されたMMP（マトリクスメタロプロチナーゼ、matrix  metalloproteinase）１、MMP2又はMMP3の量；Cathepsin  D(ng)、Cathepsin  L(ng)、Cathepsin  K(ng)：消化酵素試験に使用されたカテプシンD,L又はカテプシンKの量；Ab-histidine:抗ヒスチジン抗体が結合したペプチドの量；Ab-bigh3：抗-Bigh抗体が結合したペプチドの量；標準比(histidine/big-h3):histidineの量をbig-h3の量で分けた比率）。
【図１１】図１１は、MMP-1基質を有しているMFK24ペプチドのMMP-1,-2,-3とCathepsin  K,L,Dの酵素消化試験した結果である(MFK24(ug):投与したMFK24ペプチドの量(ug);MMP1(ng)、;MMP2(ng)、MMP3(ng)：消化酵素試験に使用されたMMP（マトリクスメタロプロチナーゼ、matrix  metalloproteinase）１、MMP2又はMMP3の量；Cathepsin  D(ng)、Cathepsin  L(ng)、Cathepsin  K(ng)：消化酵素試験に使用されたカテプシンD,L又はカテプシンKの量；Ab-histidine:抗ヒスチジン抗体が結合したペプチドの量；Ab-bigh3：抗-Bigh抗体が結合したペプチドの量；標準比(histidine/big-h3):histidineの量をbig-h3の量で分けた比率）。
【図１２】図１２は、MMP-consensus基質を有している、MFK25ペプチドのMMP-1,-2,-3とCathepsin  K,L,Dの酵素消化試験した結果である(MFK25(ug):投与したMFK25ペプチドの量(ug);MMP1(ng)、;MMP2(ng)、MMP3(ng)：消化酵素試験に使用されたMMP（マトリクスメタロプロチナーゼ、matrix  metalloproteinase）１、MMP2又はMMP3の量；Cathepsin  D(ng)、Cathepsin  L(ng)、Cathepsin  K(ng)：消化酵素試験に使用されたカテプシンD,L又はカテプシンKの量；Ab-histidine:抗ヒスチジン抗体が結合したペプチドの量；Ab-bigh3：抗-Bigh抗体が結合したペプチドの量；標準比(histidine/big-h3):histidineの量をbig-h3の量で分けた比率）。
【図１３】図１３は、ヒトの滑膜細胞から分泌されるMMP1により切断されるMFK24ペプチド酵素消化を試験した結果である（βig-h3  ：抗βig-h3で測定されたペプチドの量；Histidine:抗histidineで測定したペプチドの量；MMP-1:MMP-1の量；notreatment;MFK24を処理しない場合；MFK24  3hours:MFK24を処理３時間後測定したもの；MFK24  6  hours:MFK24を処理６時間後測定したもの；purified  MFK24:精製されたMFK24を対象にした抗βig-h3、抗-histigineを処理して測定したもの）。
【図１４】図１４は、βig-h3が媒介されたNIH3T3細胞株の付着(A)及び移動(B)がMFK23により濃度依存的に抑制されることを示した結果である(付着率(%):対照群を100%にした時の相対的細胞付着率、移動率(%):対照群を100%にした時の相対的細胞移動率）、濃度(uM):添加されたペプチドの濃度）。
【図１５】図１５は、βig-h3が媒介されたNIH3T3細胞株の付着(A)及び移動(B)がMFK24により濃度依存的に抑制されることを示した結果である。図15CはMFK24とdhFas-1ペプチド、RGDSPペプチド及びdhFas-1ペプチドとRGDSPペプチドの混合組成物のNIH3T3細胞株付着抑制程度を比較試験した結果のグラフである(付着率(%):対照群を100%にした時の相対的細胞付着率、移動率(%):対照群を100%にした時の相対的細胞移動率）、濃度(uM):添加されたペプチドの濃度、MFK24:添加されたMFK24の濃度、dhFas-1:添加されたdhFas-1の濃度、RGDSP:添加されたアミノ酸配列RGDSPで構成されたペプチドの濃度）。
【図１６】図１６は、βig-h3が媒介されたNIH3T3細胞株の付着(A)及び移動(B)が、MFK25により濃度依存的に抑制されることを示した結果である(付着率(%):対照群を100%にした時の相対的細胞付着率、移動率(%):対照群を100%にした時の相対的細胞移動率）、濃度(uM):添加されたペプチドの濃度）。
【図１７】図１７は、マウスCIAモデルからMFK23による関節炎抑制効果を臨床関節炎指数で測定した結果（A)と、対象マウスの体重を測定した結果(B)である(臨床的関節炎指数；日数:関節炎誘導のためのコラーゲン注射投与後経過日数；コントロール:ペプチドの代わりにPBSを投与した対照群；MFK23  1mg/kg、MFK23  10mg/kg、MFK23  30mg/kg:毎日1mg/kg体重、10mg/kg体重、30mg/kg体重の量でMFK23を投与した群；体重(g);前:ペプチド投与前（22日目）;後:ペプチド投与後（48日目))。
【図１８】図１８は、MFK23を処理したCIAマウスモデルの滑膜組織にHE染色を行って観察した結果である(コントロール:ペプチドの代わりにPBSを投与した対照群；1mg/kg、10mg/kg、30mg/kg:毎日1mg/kg体重、10mg/kg体重、30mg/kg体重の量でMFK23を投与した群；H＆E:ヘマトキシリン、エオシン染色結果の写真；CD31:  endothelial  cell  marerである抗CD31抗体を利用した免疫組織化学検査結果の写真；ICAM-1:抗ICAM-1(intercellular  adhesion  molecule-1)抗体を利用した免疫組織化学検査結果の写真）。
【図１９】図１９は、マウスCIAモデルからMFK24による関節炎抑制効果を臨床関節炎指数で測定した結果（A)と、対象マウスの体重を測定した結果(B)である(臨床的関節炎指数；日数:関節炎誘導のためのコラーゲン注射投与後経過日数；コントロール:ペプチドの代わりにPBSを投与した対照群；MFK24  0.1mg/kg、MFK24  1mg/kg、MFK24  10mg/kg、MFK2430mg/kg:毎日0.1mg/kg体重、1mg/kg体重、10mg/kg体重、30mg/kg体重の量でMFK24を投与した群；体重(g);前:ペプチド投与前（22日目）;後:ペプチド投与後（48日目))。
【図２０】図２０は、MFK24を処理したCIAマウスモデルの滑膜組織にHE染色を行って観察した結果である(control:ペプチドの代わりにPBSを投与した対照群；0.1mg/kg、1mg/kg、10mg/kg:毎日0.1mg/kg体重、1mg/kg体重及び10mg/kg体重の量でMFK24を投与した群；H＆E:ヘマトキシリン、エオシン染色結果の写真）。
【図２１】図２１は、MFK24を処理したCIAマウスモデルの関節組織から炎症媒介物質の転写体数を測定した値である(コントロール:ペプチドの代わりにPBSを投与した対照群；1mg/kg、10mg/kg、30mg/kg：毎日1mg/kg体重、10mg/kg体重及び30mg/kg体重の量でMFK24を投与した群；TNF-α：腫瘍壊死因子アルファ；RANKL:Receptor  Activator  for  Nuclear  Factorκ  B  Ligand;IL-1β:インターロイキン1ベータ；CCL-2:ケモカイン(C-Cモチーフ)リガンド2;  MMP-1:マトリクスメタロプロチナーゼ-1；MMP-3:マトリクスメタロプロチナーゼ-3;IL-6:インターロイキン6;VCAM-1:導管細胞接着分子-1)。
【図２２】図２２は、MFK24を処理したCIAマウスモデルから、ICAM-1とRANKLの発現が処理した濃度依存的に抑制されることを示す免疫ブロットの結果である（ノーマル:関節炎誘導をしていない群；コントロール:ペプチドの代わりにPBSを投与した対照群；1mg/kg、10mg/kg、30mg/kg：毎日1mg/kg体重、10mg/kg体重及び30mg/kg体重の量でMFK24を投与した群；RANKL:Receptor  Activator  for  Nuclear  Factorκ  B  Ligand;  ICAM-1:細胞間接着分子-1；GAPDH:Glyceraldehyde  3-phosphate  dehydrogenase)。
【図２３】図２３は、マウスCIAモデルからmdhFas-1による関節炎抑制効果を臨床関節炎指数で測定した結果(A)と対象マウスの体重を測定した結果(B)である(臨床的関節炎指数；日数:関節炎誘導のためのコラーゲン注射投与後経過日数；コントロール:ペプチドの代わりにPBSを投与した対照群；mdhFas-1  10mg/kg、mdhFas-1  30mg/kg：毎日10mg/kg体重、30mg/kg体重の量でmdhFas-1を投与した群；体重(g);前:ペプチド投与前（22日目）;後:ペプチド投与後（48日目))。
【図２４】図２４は、マウスCIAモデルからMFK12による関節炎抑制効果を臨床関節炎指数で測定した結果(A)と、対象マウスの体重を測定した結果(B)である((臨床的関節炎指数；日数:関節炎誘導のためのコラーゲン注射投与後経過日数；コントロール:ペプチドの代わりにPBSを投与した対照群；MFK12  10mg/kg,MFK12  30mg/kg：毎日10mg/kg体重、30mg/kg体重の量でMFK12を投与した群；体重(g);前:ペプチド投与前（22日目）;後:ペプチド投与後（48日目))。
【図２５】図２５は、MFK12を処理したCIAマウスモデルの滑膜組織にHE染色を行い観察した結果である(コントロール:ペプチドの代わりにPBSを投与した対照群；10mg/kg、30mg/kg：毎日10mg/kg体重、30mg/kg体重の量でMFK12を投与した群；H＆E:ヘマトキシリン、エオシン染色結果の写真；CD31:endothelial  cell  marerである抗CD31抗体を利用した免疫組織化学検査結果の写真；ICAM-1:抗ICAM-1(intercellular  adhesion  molecule-1)抗体を利用した免疫組織化学検査結果の写真）。
【図２６】図２６は、MFK12を処理したCIAマウスモデルの関節組織から、炎症媒介物質の転写体数を測定した値である(コントロール:ペプチドの代わりにPBSを投与した対照群；10mg/kg、30mg/kg：毎日10mg/kg体重及び30mg/kg体重の量でMFK12を投与した群；TNF-α：腫瘍壊死因子アルファ；RANKL:Receptor  Activator  for  Nuciear  Factorκ  B  Ligand;  IL-1β:インターロイキン1ベータ；CCL-2:ケモカイン(C-Cモチーフ)リガンド2;MMP-1:マトリクスメタロプロチナーゼ-1；MMP-3:マトリクスメタロプロチナーゼ-3;IL-6:インターロイキン6;VCAM-1:導管細胞接着分子-1)。
【図２７】図２７は、MFK12を処理したCIAマウスモデルから、ICAM-1とRANKLの発現が処理した濃度依存的に抑制されることを示す免疫ブロット結果である(normal:関節炎誘導をしていない群；control:ペプチドの代わりにPBSを投与した対照群；10mg/kg、30mg/kg：毎日10mg/kg体重及び30mg/kg体重の量でMFK12を投与した群；RANKL:Receptor  Activator  for  Nuclear  Factorκ  B  Ligand;  ICAM-1:細胞間接着分子-1;GAPDH:Glyceraldehyde  3-phosphate  dehydrogenase)。
【図２８】図２８は、mdhFas-1を基本構造としたペプチドにMMP3基質ペプチド及びQERGDSLAペプチドを結合させたペプチドのMFK27のsequenceである。
【図２９】図２９は、hsdhFas-1を基本構造としたペプチドにMMP1基質ペプチド及びQERGDSLAペプチドを結合させたペプチドのhsFJ24のsequenceである。
【図３０】図３０は、hsdhFas-1を基本構造としたペプチドにMMPconsensus基質ペプチド及びQERGDSLAペプチドを結合させたペプチドのhsFJ25のsequenceである。
【図３１】図３１は、HsFJ27配列及びHsFJ27組換えペプチドの発現を示す免疫プロットである。
【図３２】図３２は、βig-h3媒介性NIH3T3細胞株の付着がMFK27に濃度依存的に抑制されたことを示した結果である（付着率(%):細胞付着（対照群を100%にした時の相対的付着））。
【図３３】図３３は、βig-h3媒介性FLS細胞株の付着がHsFJ24に濃度依存的に抑制されたことを示した結果である（付着率(%):細胞付着（対照群を100%にした時の相対的付着））。
【図３４】図３４は、βig-h3媒介性FLS細胞株の付着がHsFJ25に濃度依存的に抑制されたことを示した結果である（付着率(%):細胞付着（対照群を100%にした時の相対的付着））。
【図３５】図３５は、βig-h3媒介性FLS細胞株の付着がHsFJ27に濃度依存的に抑制されたことを示した結果である（付着率(%):細胞付着（対照群を100%にした時の相対的付着））。
【発明を実施するための形態】
【００９３】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
【００９４】
ただし、下記実施例は本発明を例示するのみ、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
【００９５】
比較例１
dhFas-1ペプチドを利用した細胞の付着及び移住に及ぼす影響調査
ヒトのβig-h3のfas-1ドメインの構造変形ペプチドを組換えペプチドで合成した（以下、'hsdhFas-1ペプチド'と称す）（図１参照）。
【００９６】
96ウェルプレートにヒトのβig-h3を5ug/mlの濃度で入れて、４℃で14時間コーティングした。DMEM＋0.5%BSA(Bovine  Serum  Albumin)培地にヒトの繊維芽細胞(NIH3T3)を入れて、hsdhFas-1ペプチドを濃度別に投与して混ぜて、37℃で30分間培養した後、コーティングされたウェルに分株した。これを２時間培養した後、PBSで洗浄して付着されていない細胞を除去し、細胞内β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(β-N-acetylglucosaminidase)により、活性化される基質(4-Nitrophenyl  N-acetyl-β-D-glucosaminida,Sigma,米国）を添加して37℃で１時間培養した。その後グリシンEDTA溶液(0.5M  EDTA,50mM  glycine,pH  10.4)を添加して，付着された細胞数により発色される程度を吸光度で測定した。
【００９７】
hsdhFas-1ペプチドの滑膜細胞の付着と、移動遮断効果を検証した結果、（図３）に示した通り、ヒトの滑膜細胞では濃度依存的にβig-h3  媒介付着を遮断することを確認した。
【００９８】
さらに、マウスβig-h3のfas-1ドメインの構造変形ペプチドを組換えペプチドで合成して（以下、'mdhFas-1ペプチド'と称す、（図２）参照）、マウス細胞株であるNH3T3細胞株を利用して同一の方法でmdhFas-1ペプチドの滑膜細胞付着と移動遮断効果を試験した。
【００９９】
その結果、（図４）に示した通り、mdhFas-1もhsdhFas-1のように、濃度依存的にβig-h3媒介付着及び移住を遮断することを確認した。
【０１００】
比較例２
MFK12ペプチドを利用した細胞の付着及び移住に及ぼす影響調査
マウスCIAモデルにおいてmdhFas-1治療の際、濃度依存的に関節炎活性を抑制する結果を基に低用量投与時に、高い治療効果を表わせるペプチドをデザインするために、mdhFas-1を基本構造としたペプチドに、RGDSPペプチドを結合させたペプチドを製作した（以下、'MFK12ペプチド'と称す）（図５参照）。
【０１０１】
mdhFas-1-RGD構造ペプチドをpET29b発現ベクターにクローニングして、これをE.coli  BL21(DE3),BL21(DE3)pLyss又は、Rosetta(DE3)に形質転換させた。形質転換された大腸菌を培養してmdhFas-1-RGD構造ペプチドを発現させた。
【０１０２】
マウスβig-h3の四番目fas-1ドメインから、Ｈ１及びＨ２部位を除去したペプチド（名称：mdhFas-1)を符号化する遺伝子をマウスβig-h3(NM-009369)を鋳型にして、プライマー(forward  5‘-TATCATATGCAAGCCATGCC-3’,reverse  5'-TCACCGAATTCCATGATGTC-3’)を利用してPCRで増幅した。増幅された産物をpET  29b発現ベクターに制限酵素Nde  IとEcoR  Iを利用してクローニングした後、RGDSPペプチドもまたプライマー(forward  5'-AATTCGGAGGACGAGGAGATTCACCCGATGATGATGATGATC-3'、reverse  5'-TCGAGATCATCATCATCATCGGGTGAATCTCCTCGTCCTCCG-3'を鋳型にして相補結合させた後、dhFas-1-sequenceが挿入されたpET  29b発現ベクターに制限酵素EcoR  IとXhoIに挿入し、これをE.coli  BL21DEに形質転換させた。
【０１０３】
【表１】
0005982394.tif 000002
【０１０４】
マウスの繊維芽細胞であるNIH3T3細胞にMFK12ペプチドを利用して比較、例１と同一の方法で細胞付着及び移住実験を行った。
【０１０５】
その結果、図６に示した通り、MFK12の場合、比較例１の場合に比べて低い濃度でも細胞移住及び付着を抑制することを確認した。
【０１０６】
実施例１
dhFas-1-MMP基質-RGD構造ペプチドの製作及び分離
１−１．  mdhFas-1-MMP基質RGD構造ペプチドの製作及び分離Ｉ
mdhFas-1-MMP基質RGD構造ペプチドを、pET29b発現ベクターにクローニングし、これをE.coli  BL21(DE3)、BL21(DE3)pLyss又はRosetta(DE3)に形質転換させた。形質転換された大腸菌を培養してmdhFas-1-MMP基質RGD構造ペプチドを発現させた。mdhFas-1を基本構造としたペプチドに、MMP1基質ペプチド及びQERGDSLAペプチドを結合させたペプチドを'MFK24ペプチド'と称し（図８参照）、mdhFas-1を基本構造としたペプチドにMMP共通基質ペプチド及びQERGDSLAペプチドを結合させたペプチドを'MFK25ペプチド'とした（図９参照）。
【０１０７】
マウスβig-h3の四番目fas-1ドメインから、Ｈ１及びＨ２部位を除去したペプチド(mdhFas-1)を符号化する遺伝子を、マウスβig-h3(NM-009369)を鋳型にして、プライマー(forward  5‘-TATCATATGCAAGCCATGCC-3’,reverse  5-TCACCGAATTCCATGATGTC-3’)利用してPCRで増幅した。
【０１０８】
増幅された産物をpET  29b発現ベクターに制限酵素NdeIとEcoR  Iを利用してクローニングした後、MMP基質sequence用プライマー(MMP1基質用プライマーforward  5'-AATTCGGACCACAAGGAATAGCAGGAG-3'、reverse  5'-TCGACTCCTGCTATTCCTTGTGGTCCG-3'MMP2基質用プライマーforward  5'-AATTCGGACCACTGGGAGTCCGAGGAG-3'、reverse  5'-TCGACTCCTCGGCTCCCAGTGGTCCG-3'、共通基質用プライマーforward  5'AATTCGGACCACTGGGAQTAGACAGGAG-3'reverse  5'-TCGACTCCTGCTATTCCCCAGTGGTCCG-3')を鋳型にして相補結合させた後、dhFas-1が挿入されたpET29b発現ベクターの制限酵素EcoR  IとSal  Iに挿入させた。
【０１０９】
QERGDSLAペプチドもまた、プライマー(forward  5'-TCCACCAAGAACGAGGAGATTCTCTGGCAC-3'、reverse  5'-TCGAGTGAGAATCTCCTCGTTCTTGG-3')を鋳型にして相補結合させた後、dhFas-1-MMP基質sequenceが挿入されたpET29b発現ベクターに制限酵素Sal  IとXHO  Iに挿入して、これをE.coli  BL21DEに形質転換させた。
【０１１０】
【表２】
0005982394.tif 000003
【０１１１】
１−２．mdhFas-1-MMP基質RGD構造ペプチドの製作及び分離II
mdhFas-1-MMP基質RGD構造ペプチドをpET29b発現ベクターにクローニングして、これをE.coli  BL21(DE3)、BL21(DE3)pLyss又はRosetta(DE3)に形質転換させた。形質転換された大腸菌を培養してmdhFas-1-MMP基質RGD構造ペプチドを発現させた。mdhFas-1を基本構造としたペプチドにMMP3基質ペプチド及びQERGDSLAペプチドを結合させたペプチドを'MFK27ペプチド'とした（図28参照）。
【０１１２】
mdhFas-1-MMP基質RGD構造ペプチドの大腸菌での発現を向上させるために、マウスβig-h3のsignal  peptide  sequenceをマウスβig-h3(NM-009369)を鋳型にプライマー(forward  5‘-AGTACATATGATGGCGCTCCT-3’,reverse  5-'AGTACATATGATGGCGCTCCT-3’)を利用してPCRで増幅し、増幅された産物をpET  29b発現ベクターに制限酵素NdeIとBgl  IIを利用してクローニングした。
【０１１３】
四番目のfas-1ドメインから、Ｈ１及びＨ２部位を除去したペプチド（名称：mdhFas-1)を符号化する遺伝子を、マウスβig-h3(NM-009369)を鋳型にして、プライマー(forward  5‘-ACAGATCTCAAGCCATGCCT-3’、reverse  5'-ACGAATTCCATGATGTAGGT-3’)を利用してPCRで増幅し、増幅された産物を、前記signal  peptide  sequenceが挿入されたpET  29b発現ベクターに制限酵素Bgl  IIとEcoR  Iを利用してクローニングした。
【０１１４】
MMP3基質用プライマー(forward  5‘-AATTCGCACCACTGGGACTGTGGGCAAGAGGAG-3'、reverse  5-TCGACTCCTCTTGCCCACAGTCCCAGTGGTCCG-3')を鋳型に相補結合させた後、前記signal  peptide  sequence及びdhFas-1が挿入されたpET29b発現ベクターの制限酵素EcoR  Iと  Sal  Iに挿入させた。
【０１１５】
QERGDSLAペプチドもまた、プライマー(forward  5'-TCGACCAAGAACGAGGAGATTCTCTGGCAC-3'reverse5'-TCGAGTGCCAGAGAATCTCCTCGTTCTTGG-3')を鋳型にして相補結合させた後、前記signal  peptide  sequence、dhFas-1及びMMP3基質sequenceが挿入された、pET29b発現ベクターに制限酵素Sal  IとXho  Iに挿入して、これをE.coliBL21DEに形質転換させた。
【０１１６】
【表３】
0005982394.tif 000004
【０１１７】
１−３．hsdhFas-1-MMP基質-RGD構造ペプチドの製作及び分離Ｉ
hsdhFas-1  MMP基質RGD構造ペプチドを、pET29b発現ベクターにクローニングし、これをE.coliBL21(DE3)、BL21(DE3)pLyes又はRosetta(DE3)に形質転換させた。形質転換された大腸菌を培養してhsdhFas-1-MMP基質RGD構造ペプチドを発現させた。hsdhFas-1を基本構造としたペプチドに、MMP1基質ペプチド及びQERGDSLAペプチドを結合させたペプチドを'hsdhFas-1ペプチド'と称し（図29参照）、hsdhFas-1を基本構造としたペプチドに、MMP共通基質ペプチド及びQERGDSLAペプチドを結合させたペプチドを'hsdhFas-1ペプチド'とした（図30参照）。
【０１１８】
ヒトのβig-h3の四番目のfas-1ドメインから、Ｈ１及びＨ２部位を除去したペプチド（名称：  hsdhFas-1)を符号化する遺伝子をヒトのβig-h3(M77349)を鋳型にして、プライマー(forward  5‘-TATATCATATGCGAGCCCTG-3’、reverse  5-TATATCATATGCGAGCCCTG-3’)を利用してPCRで増幅した。増幅された産物をpET  29b発現ベクターに制限酵素NdeIとEcoR  Iを利用して、クローニングした後、MMP基質sequence用プライマー（MMP1基質用プライマーforward  5'-AATTCGGACCACAAGGAATAGCAGGAG-3'reverse  5'-TCGACTCCTGCTATTCCTTGTGGTCCG-3'、MMP3基質用プライマーforward  5'AATTCGGACCACTGGGACTGTGGGCAAGAGGAG-3'、reverse  5'-AATTCGGACCACTGGGACTGTGGGCAAGAGGAG-3'、consensus基質用プライマーforward  5'AATTCGGACCACTGGGAGCAGGAG-3'、reverse-TCGACTCCTGCTATTCCAGTGGTCCG-3')を鋳型にして、相補結合させた後、dhFas-1が挿入されたpET29b発現ベクターの制限酵素EcoR  IとSal  Iに挿入させた。QERGDSLAペプチドもまた、プライマーforward  5'TCGACCAAGAACGAGGAGATTCTCTGGCAC-3'、reverse  5'-TCGAGTGCCAGAGAATCTCCTCGTTCTTGG-3')を鋳型にして、相補結合させた後、dhFas-1  MMP基質sequenceが挿入されたpET29b発現ベクターに制限酵素Sal  IとXho-Iに挿入してこれをE.coli  BL21DEに形質転換させた。
【０１１９】
【表４】
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【０１２０】
１−４．hsdhFas-1-MMP基質-RGD構造ペプチドの製作及び分離II
hsdhFas-1-MMP基質-RGD構造ペプチドをpET29b発現ベクターにクローニングし、これをE.coli  BL21(DE3)、BL21(DE3)pLyss又はRosetta(DE3)に形質転換させた。形質転換された大腸菌を培養してhsdhFas-1-MMP基質-RGD構造ペプチドを発現させた。hsdhFas-1を基本構造としたペプチドにMMP3基質ペプチドを結合させたペプチドを'hsFJ27ペプチド'と称した（図31参照）。
【０１２１】
hsdhFas-1-MMP3基質-RGD構造ペプチドの大腸菌での発現を向上させるために、ヒトのβig-h3のsignal  peptide  sequenceをヒトのβig-h3(M77349)を鋳型に、プライマー(forward  5'-ATGCATATGATGGCGCTCTTC-3'、reverse  5'-AAATAATCTCGCCAGGGTCGC-3')を利用してPCRで増幅した。増幅された産物をpET29b発現ベクターに制限酵素Nde  IとBgl  IIを利用してクローニングした。
【０１２２】
四番目のfas-1ドメインから、Ｈ１及びＨ２部位を除去したペプチド（名称：hsdhFas-1)を符号化する遺伝子をヒトのβig-h3(M77349)を鋳型にして、プライマー(forward  5'-AAGATCTTTCCGAGCCCTG-3'、reverse  5'-ACCGAATTCCATGATGTCAGG-3')を利用してPCRで増幅し、増幅された産物を前記signal  peptide  sequenceが挿入されたpET29b発現ベクターに制限酵素Bgl  IIとEcoR  Iを利用してクローニングした。
【０１２３】
MMP3基質用プライマー(forward  5'-AATTCGGACCACTGGGACTGTGGGCAAGAGGAG-3'、reverse  5'-TCGACTCCTCTTGCCCACAGTCCCAGTGGTCCG−3')を鋳型にして相補結合させた後、前記signal  peptide  sequence及びdhFas-1が挿入されたpET29b発現ベクターの制限酵素EcoRS  IとSal  Iに挿入させた。
【０１２４】
QERGDSLAペプチドもまた、プライマー(forward  5'-TCGACCAAGAACGAGGAGATTCTCTGGCAC-3'、reverse  5'-TCGAGTGCCAGAGAATCTCCTCGTTCTTGG-3')を鋳型にして相補結合させた後、signal  peptide  sequence及びdhFas-1及びMMP3基質sequenceが挿入されたpET29b発現ベクターに制限酵素Sal  IとXho  Iに挿入してこれをE.coli  BL21DEに形質転換させた。
【０１２５】
【表５】
0005982394.tif 000006
【０１２６】
【表６】
0005982394.tif 000007
【０１２７】
１−５．dhFas-1-MMP基質-RGD構造ペプチドの分離、確認
前記実施例１−１乃至１−４から形質転換された菌株を培養して、dhFas-1-MMP基質-RGD構造ペプチドを過発現させて分離、確認した。
【０１２８】
過発現させた培養液を４℃、2000gで20分間遠心分離して上層液を捨てて細胞のみをまとめた。100ml培養液当り  4ml溶液バッファー(lysis  buffer;50mM  Tris-Cl(pH8.0),500mM  NaCl,0.5mM  EDTA,1mM  PMSF,1mM  DTT,1%  Triton  X-114)を、細胞ペレットに入れて解き放して、超音波で細胞を粉砕した。粉砕した細胞を４℃、13000rpmで15分間遠心分離して上層液を50mlチューブに移した。Ni-NTAアガロースビード(Ni-NTAAgarose  bead,QIAGEN)を混ぜて3mlをチューブに移し、付着バッファー(binding  buffer;50mM  Tris-Cl(pH8.0),500mM  NaCl,5mM  Imidazole(pH7.8)で２回洗浄した。洗浄した50%の懸濁液状態のNi-NTAアガロースビードに上層液を入れて４℃で撹拌機で２時間結合させた後、コラムに移して４℃でNi-NTAアガロースビードを10倍嵩の洗浄バッファー(washing  buffer;50mM  Tris-Cl(pH8.0),500mM  NaCl,20mM  Imidazole(pH7.8),0.1%  Triton  X-114)を入れて洗浄し、非特異的に結合した蛋白質を除去した。溶出バッファー(elution  buffer;50mM  Tris-Cl(pH8.0),500mM  NaCl,300mM  Imidazole(pH7.8)で本発明のペプチドを抽出した。生産された組換え蛋白質でLPS(Lipopolysaccharide)は、マウス当り1  EU以下に維持するために、Triton  X-114を利用してLPSを除去し、分離されたペプチドからLPS除去用コラム(Cambrex,Germany)を利用して再度除去した。
【０１２９】
その結果、図７乃至図９に示した通り、MFK23、MFK24、MFK25、MFK27、HsFJ24、HsFJ25及びHsFJ27が過発現され、精製過程を通じて分離されたことを確認した。
【０１３０】
実施例２
mdhFas-1-MMP基質-RGD構造ペプチドの酵素消化試験
MFK24及びMFK25が特定MMP等により切断されるか否かを確認するために、酵素分析と培養分析を行った。
【０１３１】
２−１．  mdhFas-1-MMP基質-RGD構造ペプチドの酵素消化試験
合成されたmdhFas-1-MMP基質構造変形蛋白質3ugをMMP1(5ng,10ng及び50ng)、MMP2(100ng,200ng及び800ng)、MMP3(10ng,50ng及び100ng)、cathepsin  D(5ng,10ng及び50ng)、cathepsin  L(100ng,200ng及び800ng)、cathepsin  K(10ng,50ng及び100ng)、と共にenzyme  buffer(150mM  NaCl,5mM  CaCl2、20mM  Tris-HCl  pH7.5)に混ぜて、37℃で４時間反応させた。15%  polyacrylamide  gelで電気泳動した後、Nitrocellulose  Membrane(Schleicher＆Schuell)に移して3%  BSAが含まれたTBST溶液(20mmole/L  Tris-HCl,137  mmole//1  NaCl,0.1%  Tween-20)で、常温で１時間blockingした後、TBST溶液で10分ずつ３回洗浄後、１時間primary  antibody(anti-Histidine又はanti-Bigh3)と反応させた。TBST溶液で10分ずつ３回洗浄後、horseradish  peroxidase(HRP)が付着したsecondary  antibodyと１時間反応させて、TBST溶液で10分ずつ３回洗浄後、ECL(Amersham  Biosciences,UK)で発色してmd  hFas-1-MMP基質RGD構造ペプチドの量の変化を確認した。
【０１３２】
その結果、(図10)に示した通り、MFK23はMMP-2  酵素処理後、濃度依存的に切断されることを確認して、MMP-1やMMP-3のような他の種類のMMP処理の際には、切断されていないことを確認した。さらに、cysteine  proteaseであるカテプシンK,L及びD処理時にも切断されていないことを確認した。
【０１３３】
MFK24の場合、（図11）に示した通り、MMP-1酵素処理後、濃度依存的に切断されることを確認し、MMP-2やMMP-3のような他の種類のMMP酵素又はカテプシンK,L及びD処理時には切断されていないことを確認した。
【０１３４】
MFK25の場合、（図12）に示した通り、MMP-1、MMP-2及びMMP-3処理時に、全て濃度依存的に切断されることを確認した。特に、MMP-1とMMP-3により、よく切断されることを確認した。しかし、システイン蛋白質分解酵素であるカテプシンK,L及びD処理時には切断されていないことを確認した。
【０１３５】
２−２．mdhFas-1-MMP基質RGD構造ペプチド酵素消化培養分析
MFK24が細胞に付着しながら実際MMP-1により切断されるか、否かを確認するために、ヒトのRA-FLS（リウマチ性関節炎がある関節から由来した滑膜細胞）にIL-1βを処理してMMP-1の発現を増幅させて、MFK24を培地に添加して培養した。
【０１３６】
DMEM＋10%  FBS(fetal  bovine  serum)＋2%  penicillin,streptomycin培地にヒトの滑膜細胞株を２日間育成後、0.1ng/ml  IL-1βを添加して24時間刺激を与えた。mdhFas-1-MMP基質RGD構造ペプチドを1uMで処理して、３時間、６時間刺激後、mdhFas-1を認識する抗βig-h3  抗体と、Ｃ末端のhistidine-tagを認識する抗histidine抗体を利用してペプチドの量を確認した。
【０１３７】
その結果、（図13）に示した通り、抗ヒスチジン抗体を利用した場合が、抗βig-h3抗体を利用した場合より、MFK24の量が少なく確認された。従って、MFK24が滑膜細胞から分泌されたMMP-1により切断されることを確認した。
【０１３８】
実施例３
mdhFas-1-MMP基質RGD構造ペプチドの細胞株機能調節試験
３−１．細胞付着試験
96ウェルプレートにβig-h3を5ug/mlの濃度で入れて、４℃で14時間コーティングした。DMEM＋0.5%BSA(Bovine  Serum  Albumin)培地にマウス繊維芽細胞(NIH3T3)を入れて、MFK24又はMFK25を濃度別に投与して混ぜた後、37℃で30分間培養した後、コーティングウェルに分株した。これを２時間培養した後、PBSで洗浄して付着されていない細胞を除去し、細胞内β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(β-N-acetylglucosaminidase)により、活性化される基質(4-Nitrophenyl  N-acetyl-β-D-glucosaminidase  ,Sigma,米国)を添加して37℃で１時間培養した。その後グリシンEDTA溶液(0.5M  EDTA,50mM  glycine,pH  10.4)を添加して、付着された細胞数によって発色される程度を吸光度で測定した。
【０１３９】
その結果、（図14）に示した通り、MFK23の場合、5uM以上の濃度で処理したとき、付着を抑制することを確認した。
【０１４０】
（図15）及び（図16）に示した通り、MFK24とMFK25はYH18モチーフ又はmdhFas-1を単独で処理するか又は、これを同時に処理する場合に比べて極めて低い濃度でも細胞付着を抑制することを確認した。
【０１４１】
その結果、（図32）に示した通り、MFK27の場合、１uM以上の濃度で処理したとき、付着を抑制することを確認した。
【０１４２】
３−２．細胞移住試験
細胞が移動できる大きさの8umの孔を有するトランスウェル(transwell)のフィルタ下面に、βig-h3を４℃で12時間乃至14時間培養してコーティングした。DMEM＋0.5%BSA培地にNIH3T3を入れて、MFK24又はMFK25を濃度別に投与して混ぜた後、37℃で30分間培養した後、コーティングされたウェルの上位チャンバー(upper  chamber)に接種して７時間かけて37℃で培養した。その後、パラホルムアルデヒド(paraformaldehyde)でフィルタ下面に移動した細胞を固定した後、クリスタルバイオレット(crystal  violet)を利用して移動した細胞を染色した。滅菌された綿棒で移動せずに上位チャンバーに残った細胞を拭取り、下面に移動した細胞数を顕微鏡で計数した。
【０１４３】
その結果、（図14）に示した通り、MFK23の場合、10uM又は30uMを処理した時、抑制効果を示すことを確認した。
【０１４４】
（図15）及び（図16）に示した通り、MFK24とMFK25も細胞移住を抑制することを確認した。
【０１４５】
mdhFas-1とRGSPD（アミノ酸鎖RGSPDで構成されたペプチド）をそれぞれ、又は混合して同一な細胞付着試験を行いMFK24とその結果を比較した。
【０１４６】
その結果、（図15）に示した通り、MFK24は0.5uM濃度で80%以上の高い付着抑制効果を示したことに比べて、mdhFas-1は同一濃度で50%、RGDSPは0%の付着抑制効果を示し、これを同時に処理した場合にも50%程度の付着抑制効果を示し、MFK24がmdhFas-1とRGSPDに比べて効果的に細胞付着を抑制することを確認した。
【０１４７】
これでmdhFas-1-MMP基質RGD構造ペプチドは、mdhFas-1、RGDSP、YH18モチーフに比べてリウマチ性関節炎に対する効果がはるかに優れたことを確認した。
【０１４８】
実施例４
hdhFas-1-MMP基質-RGD構造ペプチドの細胞株機能調節試験
３−１．細胞付着試験
96ウェルプレートにβig-h3を5ug/mlの濃度でいれて、４℃で14時間コーティングした。DMEM＋0.5%BSA(Bovine  Serum  Albumin)培地にヒトの繊維芽細胞性滑膜細胞(FLS)をいれて、HsFJ24、HsFJ25又はHsFJ27を濃度別に投与して混ぜた後、37℃で30分間培養した後、コーティングウェルに分株した。これを２時間培養した後、PBSで洗浄して付着されていない細胞を除去し、細胞内β-N-アセチルグルコサミニダーゼにより、活性化される基質(4-Nitrophenyl  N-acetyl-β-D-glucosaminidase  ,Sigma,米国)を添加して37℃で１時間培養した。その後グリシンEDTA溶液(0.5M  EDTA,50mM  glycine,pH  10.4)を添加して、付着された細胞数により発色される程度を吸光度で測定した。
【０１４９】
その結果、（図14）に示した通り、MFK23の場合、5uM以上の濃度で処理した時、付着を抑制することを確認した。
【０１５０】
（図33）乃至（図35）に示した通り、HsFJ24、HsFJ25又はHsFJ27の場合、5uM以上の、濃度で処理した時、付着を抑制することを確認した。
【０１５１】
実施例５
mdhFas-1-MMP基質RGD構造ペプチドの関節炎治療効果確認
５−１．コラーゲン誘導関節炎(Collagen-enduced  arthritis,CIA)マウスモデルの製作
ヒトのリウマチ性関節炎と類似した特徴を有するCIAマウスモデルは公知の文献(Protocol  for  the  successful  induction  of  collagen-induced  arthritis(CIA)  and  collagen  antibody-induced  arthritis(CAIA)  in  mice.  Chondrex,  Redmond,  WA）に記載された通り下記のように製作された：牛型(bovine)第２型コラーゲン100ugを、完全にフロイント補助剤(Freund's  complete  adjuvant)と混ぜてマウスの尻尾に皮下接種３週後に、牛型第２型コラーゲン100ugを不完全フロイント補助剤と混ぜてマウスの尻尾に再接種製作して実験に使用した。
【０１５２】
５−２．mdhFas-1-MMP基質RGD構造ペプチドを利用したCIAマウスの関節炎治療効果試験
CIAマウスを利用してMFK23,MFK24の関節炎治療効果を試験した。
【０１５３】
CIAモデルから関節炎の治療効果を究明するために、牛型第２型コラーゲンを２度目注射した後、関節炎が発生する時点（23日目）から４週間、毎日MFK23又はMFK24を0.1mg/kg,1mg/kg体重10mg/kg又は体重30mg/kg体重の量で、腹腔内にそれぞれ注射した。対照群では同一量のPBSを腹腔投与した。23目から50日目まで毎日臨床的関節炎指数を用いて関節炎の重症度を判定した。判定基準は下記の通りである。
【０１５４】
０；症状なし、１；一つの関節が浮腫及び軽いedema、２；２個以上の関節の重症度浮腫、３；大部分の関節で甚だしい浮腫、４；脚全体の甚だしい浮腫。
【０１５５】
その結果、（図17）に示した通り、MFK23の場合、既存のmdhFas-1（比較例３参照）より関節炎の抑制効果が低いものと確認された。
【０１５６】
MFK24の場合、（図19）に示した通り、0.1mg/kg体重を投与した場合にも、70%ほどの関節炎を抑制することを確認した。MFK24は既存のmdhFas-1又はMFK12(比較例３）及び(比較例４参照）に比べて1/100以上低い濃度においても、かえってより優れた効果を示して関節炎の抑制効果が極めて優れたことを確認した。
【０１５７】
５−３．CIAモデルからmdhFas-1-MMP基質RGD構造ペプチドの毒性検証
mdhFas-1-MMP基質RGD構造ペプチドが毒性を示すか、否かを調べるために、前記CIAモデルでの投与前（22日目）と投与後（48日目）のマウスの体重を測定し、48日目に血清と血液検査を行った。
【０１５８】
その結果、（図７）に示した通り、MFK24の場合対照群と比較した時、赤血球、白血球及び血小板数値が有意効果がなく、肝機能数値のAST,ALTに異常がなく、ビリルビン及びクレアチンもまた差がないことを確認した。
【０１５９】
さらに、体重変化はMFK24は対照群と類似した体重を維持した（図19B参照）。
【０１６０】
治療期間中に斃死したマウスはなく、血清及び血液検査と体重の比較を総合してみると、MFK24は治療時に毒性及び危険性が少ないことを確認した。
【０１６１】
【表７】
0005982394.tif 000008
【０１６２】
実施例６
mdhFas-1-MMP基質-RGD構造ペプチドの関節炎抑制機構の確認
CIAモデルから関節炎の治療効果の作用メカニズムを確認するために、牛型第２型コラーゲンを２度目注射した後、関節炎が発生する時点（23日目）から４週間後の50日目に治療群等の脚組織を分離して組織学的分析と炎症媒介物質の発現変化を調べた。
【０１６３】
６−１．mdhFas-1-MMP基質-RGD構造ペプチド投与マウスの脚組織の組織学的検査
MFK23とMFK24投与群に対してHE染色を行った。
【０１６４】
組織標本は下記の通り製作された。脚組織の皮膚を除去して10%ホルマリン溶液に入れて２日間固定した後、10%EDTA溶液に入れて脱灰過程を経た。脱灰された組織は脱水過程と透明化過程を経たあと、パラフィン包埋してマイクロトームを利用して3um厚さの切片に作った。組織切片は100%キシレン(xylene)とエタノールを利用して脱パラフィン化及び再脱水化させて、100%メタノールに0.3%過酸化水素を入れた溶液を利用して非特異的な組織内ペルオキシダーゼ(peroxidase)を遮断した。
【０１６５】
免疫組織化学検査のため、5%BSAで非特異的な蛋白質の結合を遮断した後、それぞれの一次抗体(endothelial  cell  markerであって、CD31に対する抗体とICAM-1(intercellular  adhesion  molecule-1)に対する抗体)と、４℃で12時間乃至14時間培養後、洗浄バッファー(washing  buffer;0.1%  BSA,0.2%  gelatin,  0.05%  saponin)で洗浄した。バイオチンが付着している二次抗体と常温で30分間培養後、洗浄してベクタースタチン  ABCキット(Vectastatin  ABC  kit;Vector  Laboratories,米国）で反応させ、ユキットマウンティングメデイア(Eukitt  mounting  media;  Fluka,ドイツ）でマウントして観察した。
【０１６６】
MFK23とMFK24の場合、（図18）、（図20）に示した通り、MFK23は30mg/kg体重の高い用量で投与した場合、滑膜細胞の増殖と軟骨及び骨の形態破壊程度が減少することを確認し、MFK24は全ての濃度のMFK24処理群で滑膜細胞の増殖が抑制され、軟骨及び骨の形態破壊程度が減少することを確認した。
【０１６７】
６−２．mdhFas-1-MMP基質-RGD構造ペプチド投与マウスの脚組織での炎症媒介物の変化確認
脚組織の炎症分布は部位によって多少異なる所見を示すことがあり、定量的な研究が難しいことから、マウスCIAモデルでMFK24処理後、後脚での関節炎発生に伴う炎症媒介物の変化をTaqman  探針(probe)を利用した反定量的逆転写PCR法で下記の通り測定した。
【０１６８】
マウスCIAモデルから脚組織を得て、皮膚を除去して残った組織は全て組織ホモジナイザー(homogenizer)を利用して粉砕し、抽出試薬(Easy-spimTM、Intron)を利用して総RNAを抽出した。これを定量した後、7μgのRNAでAMV逆転写酵素(Roche,0.5ul)、オリゴdT(Roche,1ul)、10mM  dNTP(Takara,2ul)RNase阻害剤(Roche,0.1ul)を利用して逆転写反応を行った。マウスTNF-α、RANKL、IL-1β、CCL-2、MMP-1、MMP-3、IL-6、VACM-1及び18SRNAの反定量的なPCRのためのプライマー(Bioneer、大田)と、Taqman探針を使用してLC480(Roche,Germany)で転写体数を求めて18S  RNA転写体に比較して定量化した。前記反定量的なPCRのためのプライマー対(pair)は（表８）の通りである。
【０１６９】
【表８】
0005982394.tif 000009
【０１７０】
MFK24の場合、（図21）に示した通り、炎症媒介物質の転写体数が関節炎対照群に比べて有意的に減少して、投与用量によってICAM-1とRANKLの炎症部位発現も減少することを確認した。特に、0.1mg/kg体重の低用量投与でも優れた効能を維持することを確認した（図22参照）。
【０１７１】
比較例３
mdhFas-1ペプチドの関節炎治療効果確認
比較例１で製作したmdhFas-1ペプチドを利用して実施例４と同一の方法でCIAマウスモデルから関節炎治療効果を測定した。
【０１７２】
その結果、mdhFas-1ペプチドを利用した場合、（図23）に示した通り、関節炎は濃度依存的に抑制され、対照群マウスと比較した時、体重変化においても変わった異常所見がなかった。関節炎抑制程度は10mg/kgを処理した場合、32%程度、30mg/kgを処理した場合、69%程度関節炎を抑制することを確認した。
【０１７３】
比較例４
MFK12ペプチドの関節炎治療効果確認
比較例２で製作したMFK12ペプチドを利用して、実施例４及び実施例５と同一の方法でCIAマウスモデルから関節炎治療効果を測定した。
【０１７４】
その結果、MFK12ペプチドを利用した場合、（図24）に示した通り、関節濃度依存的に抑制され、対照群マウスと比較した時、体重変化においても変わった異常所見がなかった。関節炎抑制程度は10mg/kgを処理した場合、27%程度、30mg/kgを処理した場合60%程度関節炎を抑制することを確認した。
【０１７５】
さらに、（図25）に示した通り、２回目の免疫化措置以降４週後の50日目に10mg/kgを処理した群は、関節炎部位が破壊されて滑膜組織細胞等が過多増殖されており、血管新生と細胞付着蛋白質の発現が対照群位増加されていることを確認した。一方30mg/kgを処理した群から滑膜組織細胞の増殖が対照群に比べて抑制され、血管新生及び付着蛋白質の発現が減少されて正常に近い脚組織の形態を示し、MFK12は30mg/kgを処理した時、治療効果があることを確認した。
【０１７６】
炎症媒介物質変化測定結果は、（図26）及び（図27）に示した通り、TNF-α、IL-6、IL-1β、ICAM-1とRANKLの発現は、10mg/kg処理したものは関節炎対照群と比較して、類似した利用した量で発現しているが、30mg/kg処理したものは関節炎対照群に比べて減少することを確認した。ICAM-1とRANKLの発現は10mg/kg処理したものは、関節炎対照群と比較して、類似した量で発現しているが、30mg/kg処理したものは関節炎対照群に比べて減少することを確認した。
【産業上の利用可能性】
【０１７７】
以上察した通り、本発明のdhFas-1-MMP基質-RGD構造ペプチドは、リウマチ性関節炎部位の滑膜細胞の付着及び移動を抑制してリウマチ性関節炎の拡大を防ぎ、免疫細胞の浸潤を抑制してリウマチ性関節炎の予防及び治療に効果的に使用することができて産業上の利用可能性が大きい。
【図１ａ】
0005982394.tif 000010
【図１ｂ】
0005982394.tif 000011
【図２ａ】
0005982394.tif 000012
【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
0005982394.tif 000018
【図７ａ】
0005982394.tif 000019
【図７ｂ】
0005982394.tif 000020
【図８ａ】
0005982394.tif 000021
【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図２８ａ】
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【図２８ｂ】
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【図２９ａ】
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【図２９ｂ】
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【図３０ａ】
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【図３０ｂ】
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【図３１ａ】
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【図３１ｂ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
0005982394.tif 000039
【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
0005982394.tif 000041
【図１０ｃ】
0005982394.tif 000042
【図１０ｄ】
0005982394.tif 000043
【図１０ｅ】
0005982394.tif 000044
【図１０ｆ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１１ｄ】
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【図１１ｅ】
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【図１１ｆ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１２ｄ】
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【図１２ｅ】
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【図１２ｆ】
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【図１３】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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