(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
底部と側壁とを有するプラスチック材料を含む細胞培養容器であって、
底部に、細胞を収容するためのマイクロウェルが一つ以上配置されており、
マイクロウェルが底面と側面と開口部とを有し、
マイクロウェルの側面に凹凸構造が形成されており、
凸部の凹部に対する高さが５μm以上である、
細胞培養容器。
【請求項２】
マイクロウェルの側面が親水性面である、請求項１に記載の細胞培養容器。
【請求項３】
凹凸構造が、２以上のライン状の凹凸構造である、請求項１または２に記載の細胞培養容器。
【請求項４】
２以上のライン状の凹凸構造が、マイクロウェルの側面に沿って傾いて配置されており、該傾きが垂直方向に対して３０°以下である、請求項３に記載の細胞培養容器。
【請求項５】
凹凸構造が、２以上のドット状の突起および／または２以上のドット状の窪みによって構成される、請求項１または２に記載の細胞培養容器。
【請求項６】
マイクロウェルの開口部の開口幅が０．１ｍｍ以上１ｍｍ以下である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞培養容器。
【請求項７】
マイクロウェルの底面が、平滑な表面である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞培養容器。
【請求項８】
マイクロウェルの底面の表面粗さが、３μｍ以下の最大高さ（Ｒｙ）である、請求項７に記載の細胞培養容器。
【請求項９】
２以上のライン状の凹凸構造において、凸部の幅および凹部の幅が、開口部の外縁部分の長さの１／３２０〜１／４の範囲である、請求項３、４および６〜８のいずれか１項に記載の細胞培養容器。
【請求項１０】
２以上のライン状の凹凸構造において、凸部の凹部に対する高さが、開口部の開口幅の１／１０００〜１／１．５の範囲である、請求項３、４および６〜９のいずれか１項に記載の細胞培養容器。
【請求項１１】
２以上のライン状の凹凸構造において、凸部の幅に対する凸部の高さの比が、０．１〜１．５の範囲である、請求項３、４および６〜１０のいずれか１項に記載の細胞培養容器。
【請求項１２】
２以上のライン状の凹凸構造において、凸部の幅および凹部の幅が、１５〜７０μｍの範囲である、請求項３、４および６〜１１のいずれか１項に記載の細胞培養容器。
【請求項１３】
２以上のライン状の凹凸構造において、凸部の凹部に対する高さが、５〜７０μｍの範囲である、請求項３、４および６〜１２のいずれか１項に記載の細胞培養容器。
【請求項１４】
マイクロウェルの底面が、細胞培養容器の底部の表面に対して下向きの傾斜面を有する逆円錐形状であり、
マイクロウェルの側面が、細胞培養容器の底部の表面に直交する直線に対して傾斜しており、
２以上のライン状の凹凸構造において、マイクロウェルの底面の重心を通り、且つ細胞培養容器の底部と平行な面に直交する面における凸部の断面が方形状または円弧状の形状である、請求項３、４および６〜１３のいずれか１項に記載の細胞培養容器。
【請求項１５】
細胞培養容器の底部が、マイクロウェルおよびマイクロウェルの周囲を含めて親水性面である、請求項１〜１４のいずれか1項に記載の細胞培養容器。
【請求項１６】
親水性面の水接触角が７０°以下である、請求項１５に記載の細胞培養容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、受精卵などの個別管理が必要な細胞を培養するための細胞培養容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
培養系で精子と卵子とを体外受精させて受精卵（接合子）を作製して、さらに受精卵を卵割、桑実胚、胚盤胞の段階を経て、透明帯から孵化した脱出胚盤胞の段階まで培養することが可能となり、この卵割から胚盤胞の段階にある受精卵を子宮に移植して産子を得る補助的生殖技術（ＡＲＴ）が、家畜領域のみならずヒトの不妊医療でも確立されている。【０００３】
しかし、体外受精による妊娠成功率は必ずしも高くはなく、たとえばヒトにおいては、その妊娠成功率は、依然として２５〜３５％程度に留まっている。その原因の一つとして、培養において子宮への移植に適した良質な受精卵を得られる確率が高くないことが挙げられる。培養された受精卵は、専門家が顕微鏡で個別に観察することにより、子宮への移植に適した良質な受精卵であるか否か判別されている。【０００４】
体外受精においては、容器中に培養液のドロップを作り、この中に受精卵を入れて体外培養するマイクロドロップ法が用いられることが多い。従来、このマイクロドロップ法には、細胞培養容器として、底面が単一平面であり、直径が３０〜６０ｍｍのシャーレが使用され、シャーレの底面に、培養液のドロップを、間隔をあけて複数個作製し、その中で細胞を培養する方法が使用されてきた。【０００５】
通常のシャーレでドロップを作成すると、受精卵自身の細胞運動やドロップ内の対流によって受精卵の位置が変わってしまい、その中で培養して観察していた受精卵の特定が難しくなるという問題があった。したがって、受精卵の位置を制御できる手段が求められていた。【０００６】
受精卵の培養効果をより効率的にするためには受精卵同士の相互作用（パラクライン効果）を利用することが好ましいとされている。これらの効果を利用しつつ、受精卵の位置を制御する目的で、シャーレの底面に受精卵のサイズと同程度のマイクロウェルを形成し、複数個のマイクロウェルを覆うように培養液のドロップを添加し、培養液で満たされたマイクロウェルに受精卵を配置して培養を行うシステムが知られている。それにより複数の受精卵の位置を制御して個別観察を可能としつつ、少量の培養液の中で複数の受精卵の培養を行うことができ、パラクライン効果を利用できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第４７２４８５４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、受精卵培養を行う際に、マイクロウェルを有する細胞培養容器を利用すると、マイクロウェルのサイズが小さいため培養液を入れる際に気泡がウェル内に残ってしまい、気泡を抜くための作業が必要で作業が煩雑であるという課題を見出した。【０００９】
したがって本発明は、細胞を収容するためのマイクロウェルを有する培養容器を用いたマイクロドロップ法による細胞培養において、マイクロウェル内に気泡が残りにくく、培養作業性を向上させることが可能な細胞培養容器を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、マイクロウェルの側面に凹凸構造を形成することにより、上記課題が解決できることを見出した。【００１１】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。【００１２】
（１）底部と側壁とを有する細胞培養容器であって、
底部に、細胞を収容するためのマイクロウェルが一つ以上配置されており、
マイクロウェルが底面と側面と開口部とを有し、
マイクロウェルの側面に凹凸構造が形成されている、
細胞培養容器。【００１３】
（２）マイクロウェルの側面が親水性面である、（１）に記載の細胞培養容器。【００１４】
（３）凹凸構造が、２以上のライン状の凹凸構造である、（１）または（２）に記載の細胞培養容器。【００１５】
（４）凹凸構造が、２以上のドット状の突起および／または２以上のドット状の窪みによって構成される、（１）または（２）に記載の細胞培養容器。【００１６】
（５）マイクロウェルの開口部の開口幅が０．１ｍｍ以上１ｍｍ以下である、（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞培養容器。【００１７】
（６）マイクロウェルの底面が、平滑な表面である、（１）〜（５）のいずれかに記載の細胞培養容器。【００１８】
（７）マイクロウェルの底面の表面粗さが、３μｍ以下の最大高さ（Ｒｙ）である、（６）に記載の細胞培養容器。【００１９】
（８）２以上のライン状の凹凸構造において、凸部の幅および凹部の幅が、開口部の外縁部分の長さの１／３２０〜１／４の範囲である、（３）および（５）〜（７）のいずれかに記載の細胞培養容器。【００２０】
（９）２以上のライン状の凹凸構造において、凸部の凹部に対する高さが、開口部の開口幅の１／１０００〜１／１．５の範囲である、（３）および（５）〜（８）のいずれかに記載の細胞培養容器。【００２１】
（１０）２以上のライン状の凹凸構造において、凸部の幅に対する凸部の高さの比が、０．１〜１．５の範囲である、（３）および（５）〜（９）のいずれかに記載の細胞培養容器。【００２２】
（１１）２以上のライン状の凹凸構造において、凸部の幅および凹部の幅が、１５〜７０μｍの範囲である、（３）および（５）〜（１０）のいずれかに記載の細胞培養容器。【００２３】
（１２）２以上のライン状の凹凸構造において、凸部の凹部に対する高さが、１〜７０μｍの範囲である、（３）および（５）〜（１１）のいずれかに記載の細胞培養容器。【００２４】
（１３）マイクロウェルの底面が、細胞培養容器の底部の表面に対して下向きの傾斜面を有する逆円錐形状であり、
マイクロウェルの側面が、細胞培養容器の底部の表面に直交する直線に対して傾斜しており、
２以上のライン状の凹凸構造において、マイクロウェルの底面の重心を通り且つ細胞培養容器の底部と平行な面に直交する面における凸部の断面が方形状または円弧状の形状である、（３）および（５）〜（１２）のいずれかに記載の細胞培養容器。【００２５】
（１４）底部と側壁とを有する細胞培養容器であって、
底部に、細胞を収容するためのマイクロウェルが一つ以上配置されており、
マイクロウェルが底面と側面と開口部とを有し、
細胞培養容器の底部が、マイクロウェルおよびマイクロウェルの周囲を含めて親水性面である、
細胞培養容器。【００２６】
（１５）親水性面の水接触角が７０°以下である、（１）〜（１４）のいずれかに記載の細胞培養容器。
【発明の効果】
【００２７】
本発明により、培養作業性が向上した細胞培養容器が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の細胞培養容器の一実施形態の上面図を示す概略図である。
【図２】本発明の細胞培養容器の一実施形態の垂直断面図を示す概略図である。
【図３】本発明のマイクロウェルの一実施形態の拡大斜視図を示す概略図である。
【図４】図３のマイクロウェルの上面図を示す概略図である。
【図５】本発明のマイクロウェルの一実施形態の拡大斜視図を示す概略図である。
【図６】本発明のマイクロウェルの一実施形態の拡大斜視図を示す概略図である。
【図７】本発明の細胞培養容器を用いた細胞培養方法の一実施形態の垂直断面図を示す概略図である。
【図８Ａ】本発明のマイクロウェルの一実施形態の拡大斜視図を示す概略図である。
【図８Ｂ】図８Ａのマイクロウェルの上面図を示す概略図である。
【図８Ｃ】図８ＢのマイクロウェルのＸ−Ｘ’断面図を示す概略図である。
【図９Ａ】本発明のマイクロウェルの一実施形態の拡大斜視図を示す概略図である。
【図９Ｂ】図９Ａのマイクロウェルの上面図を示す概略図である。
【図９Ｃ】図９ＢのマイクロウェルのＸ−Ｘ’断面図を示す概略図である。
【図１０Ａ】本発明のマイクロウェルの一実施形態の拡大斜視図を示す概略図である。
【図１０Ｂ】図１０Ａのマイクロウェルの上面図を示す概略図である。
【図１０Ｃ】図１０ＢのマイクロウェルのＸ−Ｘ’断面図を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明について説明する。
【００３０】
本発明の細胞培養容器の一実施形態の概略図を図１〜４に示す。図１は上面図を、図２は垂直断面図を、図３はマイクロウェルの拡大斜視図を示し、図４はマイクロウェルの拡大上面図を示す。
【００３１】
図１〜４に示されるように、本発明の細胞培養容器１は、
底部２と側壁３とを有し、
底部２に、細胞を収容するためのマイクロウェル４が一つ以上配置されており、
マイクロウェル４が底面５と側面６と開口部７とを有し、
マイクロウェルの側面６に凹凸構造８が形成されている、
ことを特徴とする。
【００３２】
なお、図１および図２には、複数のマイクロウェルを囲む内壁９が記載されているが、内壁は必須の構成要件ではない。
【００３３】
細胞を収容するためのマイクロウェルの側面に凹凸構造を形成することにより、マイクロウェルに培養液を滴下したときに、気泡が残りにくく、気泡を抜くための作業が必要ないため、培養作業性を向上させることができる。
【００３４】
マイクロウェルは、底面と側面と開口部を有し、凹部を形成する。マイクロウェル側面の凹凸構造は特に制限されないが、微小なマイクロウェルの側面に形成することから、微小な凹凸構造であることが好ましい。また、マイクロウェルの側面全体において気泡抜けを向上させる観点から、凹凸構造は、マイクロウェルの側面全体に形成されていることが好ましい。本発明において、「凹凸構造が、マイクロウェルの側面全体に形成されている」とは、例えば、マイクロウェルの側面の総面積に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、とりわけ好ましくは約１００％の領域が、凹凸構造が形成されている領域であることを意味する。凹凸構造は、マイクロウェルの側面だけでなく、マイクロウェルの開口部の周囲や、マイクロウェルの底面に形成されていてもよい。細胞培養容器の底部全面に形成されていてもよい。しかし、マイクロウェルに細胞を収容して顕微鏡等で観察することを考慮すると、マイクロウェルの底面には、凹凸構造が形成されていないことが好ましい。本発明において、「マイクロウェルの底面に凹凸構造が形成されていない」とは、例えば、マイクロウェルの底面の総面積に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、とりわけ好ましくは約１００％の領域が、凹凸構造が形成されていない領域であることを意味する。マイクロウェルの底面に、凹凸構造が形成されていると、光の屈折や透過性が低下することで、収容した細胞を顕微鏡観察する際に影響を与えることがあるため好ましくない。ただし、その場合であっても、製造プロセスに起因してどうしても形成されてしまうような凹凸構造、すなわち、本発明の凹凸構造の幅や深さよりも微細な凹凸構造の存在を排除するものではない。
【００３５】
マイクロウェルの底面は、平滑な表面であることが好ましい。本発明において、「マイクロウェルの底面が、平滑な表面である」とは、例えば、マイクロウェルの底面の総面積に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、とりわけ好ましくは約１００％の領域が、平滑な表面であることを意味する。例えば、マイクロウェルの底面が下記で説明する底面幅を有する場合、例えば０．１ｍｍ以上、好ましくは０．１２ｍｍ以上、より好ましくは０．１５ｍｍ以上の直径を有する円形の領域が、平滑な表面であることが好ましい。上記円形の直径は、Ｘ＋ｍ（ここでＸは観察対象となる細胞の最大径を表す）と規定することもできる。ここで、ｍは、好ましくは０．０１ｍｍ以上、さらに好ましくは０．０２ｍｍ以上である。また、本発明において、「平滑な表面」とは、可能な限り小さい表面粗さであることを意味する。例えば、マイクロウェルの底面の表面粗さは、３μｍ以下の最大高さ（Ｒｙ）であることが好ましく、１μｍ以下のＲｙであることがより好ましく、０．５μｍ以下のＲｙであることがさらに好ましい。本明細書において、最大高さ（Ｒｙ）は、粗さ曲線からその平均線の方向に基準長さだけを抜き取り、この抜き取り部分における山頂線と谷底線との間隔を粗さ曲線の縦倍率方向に測定した値（マイクロメートル単位）を意味する。本発明の細胞培養容器では、観察対象となる細胞をマイクロウェルに収容して、培養および観察を行う。細胞の観察を行う場合、通常は、以下において説明する観察装置を用いて、マイクロウェルの底面方向または開口部方向から細胞の画像を取得する。この際、マイクロウェルの底面に本発明の凹凸構造の幅や深さよりも微細な凹凸構造、すなわち微細な山および谷が多数存在する場合、該底面の表面粗さが大きくなり、結果として細胞の画像が不鮮明となる可能性がある。それ故、マイクロウェルの底面が、上記の特徴を有する平滑な表面である場合、細胞の観察において鮮明な画像を取得することができる。
【００３６】
なお、マイクロウェルの底面の表面粗さは、例えば、本発明の細胞培養容器を作製する際に使用する金型の表面に磨き処理を行う等の手段によって、該金型の加工精度を高めることにより、小さい値とすることができる。
【００３７】
凹凸構造の形状は、気泡抜けを向上させる形状であれば、特に制限されないが、２以上のライン状の凹凸構造や、２以上のドット状の突起および／または２以上のドット状の窪みによって構成される凹凸構造が挙げられる。
【００３８】
２以上のライン状の凹凸構造としては、２以上のライン状の凸部がスペースを挟んで連続して形成されている構造や、２以上のライン状の凹部がスペースを挟んで連続して形成されている構造などが挙げられる。２以上のライン状の凸部がスペースを挟んで連続して形成されている構造は、スペース部分を凹部とみなすことができるので、実質的には、２以上のライン状の凹部がスペースを挟んで連続して形成されている構造ともいえる。以下、凸部をラインとし、凹部をスペースとして説明する。ライン状の凸部は、マイクロウェルの底面から開口部に向かう方向に形成されていることが好ましい。例えば、マイクロウェルの底面と平行な面上に配置されるようなライン、すなわちマイクロウェルの底面と平行な面上のマイクロウェル側面に沿ったリング状のラインも考えられるが、マイクロウェルを射出成形などで製造する場合に加工が難しく、気泡抜け効果も弱いと考えられる。マイクロウェルの側面が底面に垂直な場合は、ライン状の凸部も、底面に垂直に形成されていることが好ましいが、マイクロウェル側面に沿って多少傾いていてもよい。その場合、傾きは垂直方向に対して３０°以下であることが好ましい。ここで、傾きは、マイクロウェル側面の展開図において、垂直な場合のラインに対する角度として規定できる。
【００３９】
マイクロウェルの側面が底面に対して傾斜している場合には、例えば、図３および４に示すように、ライン状の凸部も底面に対してマイクロウェル側面と同じ角度で傾斜するが、底面の重心を通り底面に垂直な面と側面との交線上にライン状凸部が存在するように形成されていることが好ましい。この場合も、例えば、図５に示すように、ラインがマイクロウェル側面に沿って多少傾いていてもよく、傾きは垂直方向に対して３０°以下であることが好ましい。この場合も、傾きは、マイクロウェル側面の展開図における、傾きのない場合のライン（すなわち、図３のライン）に対する角度として規定できる。また、ラインおよびスペースは、直線でも曲線でもよいが、成形が容易であること、および気泡抜け効果が高いことから直線であることが好ましい。
【００４０】
２以上のライン状の凹凸構造において、２以上のライン状の凸部は、いずれも実質的に略同一の幅および高さを有することが好ましい。また、２以上のスペースに相当する凹部は、いずれも実質的に略同一の幅および高さ（深さ）を有することが好ましい。
【００４１】
２以上のライン状の凹凸構造において、ライン状の凸部の幅（例えば、図４のＸ１、図８ＢのＸ１１、図９ＢのＸ２１、図１０ＢのＸ３１）およびスペースに相当する凹部の幅（例えば、図４のＸ２、図８ＢのＸ１２、図９ＢのＸ２２、図１０ＢのＸ３２）は、開口部の外縁部分の長さの、１／３１４０〜１／４．５の範囲、好ましくは１／３１４〜１／４．５の範囲、さらに好ましくは１／１６５〜１／１５の範囲、特に好ましくは１／８２．５〜１／１５の範囲である。
【００４２】
ライン状の凹凸構造において、1個のライン状の凸部の幅およびスペースに相当する1個の凹部の幅は、それぞれ実質的に略一定であることが好ましい。この場合、ライン状の凸部の幅（例えば、図４のＸ１、図８ＢのＸ１１、図９ＢのＸ２１、図１０ＢのＸ３１）は、好ましくは０．１μｍ以上、より好ましくは１μｍ以上、さらに好ましくは１０μｍ以上、特に好ましくは１５μｍ以上、とりわけ好ましくは２０μｍ以上であり、好ましくは１００μｍ以下、より好ましくは７０μｍ以下、さらに好ましくは５０μｍ以下であり、好ましくは１〜７０μｍの範囲、より好ましくは１０〜７０μｍの範囲、さらに好ましくは１５〜７０μｍの範囲、特に好ましくは２０〜７０μｍの範囲である。スペースに相当する凹部の幅（例えば、図４のＸ２、図８ＢのＸ１２、図９ＢのＸ２２、図１０ＢのＸ３２）は、好ましくは０．１μｍ以上、より好ましくは１μｍ以上、さらに好ましくは１０μｍ以上であり、好ましくは１００μｍ以下、より好ましくは７０μｍ以下、さらに好ましくは５０μｍ以下であり、好ましくは１〜７０μｍの範囲、より好ましくは１０〜７０μｍの範囲、さらに好ましくは１５〜７０μｍの範囲、特に好ましくは２０〜７０μｍの範囲である。なお、本発明の細胞培養容器において、ライン状の凸部の幅およびスペースに相当する凹部の幅は、例えば、三次元測定レーザー顕微鏡によって任意のマイクロウェルにおける複数の凹凸構造の凸部の幅および凹部の幅を測定し、該測定値の平均値をそれぞれ算出することにより、決定することができる。
【００４３】
凸部および凹部幅を一定以上とすることで、加工成形精度が悪くなるおそれを回避できる。また、一定以下とすることで、マイクロウェルの構造に対して凹凸構造が大きくなり形状の作成が困難になることを回避できる。好ましくは、ライン状の凸部の幅と凹部の幅は同一である。成形加工時には幅が同じほうが、樹脂の流動性を制御しやすく加工精度が向上すると考えられる。
【００４４】
ライン状の凹凸構造において、マイクロウェルの底面の重心を通り且つ細胞培養容器の底部と平行な面に直交する面におけるライン状の凸部の断面は、方形状または円弧状の形状であることが好ましい。ここで、マイクロウェルの底面の重心は、マイクロウェルの底面の外縁を含む本発明の細胞培養容器の底部と平行な面にマイクロウェルの底面を投影した図形における重心を意味する。ライン状の凸部の断面が方形状の場合、該凸部の断面は、以下において説明する高さ（例えば、図４のＹ、図８ＣのＹ１０、図９ＣのＹ２０）を有する方形状であることが好ましい。この場合、凸部の角部分は、丸みを帯びている、すなわち曲率を有していてもよい。ライン状の凸部の断面が円弧状の場合、該凸部の断面は、以下において説明する高さ（例えば、図１０ＣのＹ３０）を有し、１００〜５００μｍの範囲、好ましくは２００〜４００μｍの範囲の曲率半径を有する円弧状であることが好ましい。上記の場合、２つのライン状の凸部の間に存在する凹部は、該２つのライン状の凸部のスペース部分となる。それ故、マイクロウェルの底面の重心を通り且つ細胞培養容器の底部と平行な面に直交する面における凹部の断面は、マイクロウェルの側面の断面と同一となる。
【００４５】
また、ライン状の凸部のスペース部分（凹部）に対する高さ（例えば、図４のＹ、図８ＣのＹ１０、図９ＣのＹ２０、図１０ＣのＹ３０）は、好ましくは０．１μｍ以上、より好ましくは１μｍ以上、さらに好ましくは５μｍ以上であり、好ましくは１００μｍ以下、より好ましくは７０μｍ以下、さらに好ましくは５０μｍ以下であり、好ましくは１〜７０μｍの範囲、より好ましくは５〜７０μｍの範囲あるいは１〜５０μｍの範囲、さらに好ましくは５〜５０μｍの範囲である。ライン状の凹凸構造において、各凸部の凹部に対する高さが実質的に一定の場合（例えば、図８Ａ〜Ｃの細胞培養容器の凹凸構造１８および図９Ａ〜Ｃの細胞培養容器の凹凸構造２８の如くライン状の凸部の断面が方形状の場合）、上記の値は、各凸部の天面の凹部の底面からの垂直距離（例えば、図８ＣのＹ１０）を意味する。ライン状の凹凸構造において、各凸部の凹部に対する高さが一定ではない場合（例えば、図１０Ａ〜Ｃの細胞培養容器の凹凸構造３８）、上記の値は、各凸部の天面の凹部の底面からの垂直距離の最大値、すなわち各凸部の凹部に対する最大高さ（例えば、図１０ＣのＹ３０）を意味する。ライン状の凸部の幅に対する高さの比（例えば、図４のＹ／Ｘ１、図８ＢおよびＣのＹ１０／Ｘ１１、図９ＢおよびＣのＹ２０／Ｘ２１、図１０ＢおよびＣのＹ３０／Ｘ３１）は、好ましくは０．０５以上、より好ましくは０．１以上、さらに好ましくは０．２以上、特に好ましくは０．３以上であり、好ましくは１．５以下、より好ましくは１．０以下であり、好ましくは０．０５〜１．５の範囲、より好ましくは０．１〜１．５の範囲、さらに好ましくは０．２〜１．５の範囲、特に好ましくは０．２〜１．０の範囲、とりわけ好ましくは０．３〜１．０の範囲である。なお、本発明の細胞培養容器において、凸部の凹部に対する高さは、例えば、三次元測定レーザー顕微鏡によって任意のマイクロウェルにおける複数の凸部の高さを測定し、該測定値の平均値を算出することにより、決定することができる。また、凸部の幅に対する高さの比は、前記で説明した手段によって決定された凸部の幅および高さの値を用いて算出することができる。
【００４６】
高さを一定以上とすることで、濡れ性の向上が得られず気泡が残るおそれを回避できる。また、一定以下とすることで、マイクロウェルの構造に対して加工成形精度が悪くなって濡れ性の向上効果が小さくなり、気泡残りが発生しやすくなるおそれを回避できる。
【００４７】
２以上のドット状の突起および／または２以上のドット状の窪みによって構成される凹凸構造においてドットの形状は特に制限されない。ドット状の突起および窪みの形状としては、錐体、錐台、柱体、ランダムな異方性凹凸状等が挙げられる。錐体状、錐台状、および柱体状の突起および窪みが加工性の点から好ましい。例えば、図６は、円柱状の突起が側面に形成されたマイクロウェルの拡大斜視図を示す。
【００４８】
錐体状突起および錐台状突起の場合は、突起の先端ほど細くなる形状が加工性の点から好ましく、錐体状窪みおよび錐台状窪みの場合は、窪みの開口側ほど開口幅が広くなる形状が加工性の点から好ましい。錐体状突起、錐台状突起および柱体状突起の幅、ならびに錐体状窪み、錐台状窪みおよび柱体状窪みの開口幅は、好ましくは０．１μｍ以上、より好ましくは１μｍ以上、さらに好ましくは５μｍ以上であり、好ましくは５０μｍ以下、より好ましくは２５μｍ以下、さらに好ましくは１０μｍ以下である。
【００４９】
突起の幅および窪みの開口幅を一定以上とすることで、加工成形精度が悪くなるおそれを回避できる。また、一定以下とすることで、マイクロウェルの構造に対して窪み部分が大きくなり形状の作成が困難になることを回避できる。
【００５０】
突起の幅は、突起の軸に垂直な切断面の図形における最大径の最大値をさし、錐体状突起、錐台状突起および柱体状突起の幅は、錐体および柱体の底面または錐台の下底の最大径をさし、底面または下底が円の場合は直径をさす。窪みの開口幅は、窪みの開口部の図形における最大径をさし、開口部の図形が円の場合は直径をさす。
【００５１】
ドット状突起の高さおよびドット状窪みの深さは、好ましくは０．１μｍ以上、より好ましくは１μｍ以上、さらに好ましくは５μｍ以上であり、好ましくは５０μｍ以下、より好ましくは２５μｍ以下、さらに好ましくは１０μｍ以下である。突起の幅に対する突起の高さの比（高さ／幅）、ならびに窪みの開口幅に対する窪みの深さの比（深さ／開口幅）は、好ましくは０．１以上、より好ましくは０．３以上であり、好ましくは１．５以下、より好ましくは１以下である。
【００５２】
突起の高さおよび窪みの深さを一定以上とすることで、加工成形精度が悪くなるおそれを回避できる。また、一定以下とすることで、マイクロウェルの構造に対して突起部分および窪み部分が大きくなり形状の作成が困難になることを回避できる。また、高さの比を一定以下とすることで、側面の窪みや突起形状を射出成形等で形成する場合に、金型から垂直剥離する際の剥離が困難になったり、形状が破壊されてしまったりする可能性を回避できる。
【００５３】
ドット状突起のピッチおよびドット状窪みのピッチは、好ましくは０．１μｍ以上、より好ましくは１μｍ以上、さらに好ましくは５μｍ以上であり、好ましくは５０μｍ以下、より好ましくは２５μｍ以下、さらに好ましくは１０μｍ以下である。
【００５４】
ピッチを一定以上とすることで、加工成形精度が悪くなるおそれを回避できる。また、一定以下とすることで、マイクロウェルの構造に対して突起部分および窪み部分が大きくなり形状の作成が困難になることを回避できる。
【００５５】
ドット状突起のピッチは、隣り合う２つの突起の間隔であり、突起の中心間の距離をさす。ここで、突起の中心は、突起の先端部における図形の重心とする。ドット状窪みのピッチは、隣り合う２つの窪みの間隔であり、窪みの中心間の距離をさす。ここで、窪みの中心は、窪みの開口部の図形の重心とする。ピッチは通常平均ピッチをさし、平均ピッチは、ある突起に関しては、近接する全ての突起とのピッチから平均値を算出したものをさし、ある窪みに関しては、近接する全ての窪みとのピッチから平均値を算出したものをさす。
【００５６】
ドット状突起とドット状窪みは混在していてもよいが、加工性の観点から、ドット状突起のみまたはドット状窪みのみが形成されていることが好ましく、ドット状突起のみが形成されていることがより好ましい。突起と窪みが混在すると金型加工や成形加工が困難になり、形状の精度が悪化する可能性があり、所望する濡れ性の向上効果が得られない可能性がある。
【００５７】
マイクロウェルの側面に凹凸構造を形成する方法については、特に制限されない。マイクロウェルを有する細胞培養容器を射出成形により製造する場合は、マイクロウェルの成形とともに側面の凹凸構造も射出成形により容易に製造することができる。あるいは、エッチングを利用した種々の方法を用いることもできる。
【００５８】
マイクロウェルの側面に凹凸構造を形成することで、既存の樹脂がもつ濡れ性に対して、親水性を向上させることができる。例えば、水やアルコール等の接触角値が小さくなり、液滴の滑りがよくなる。また、マイクロウェルの側面への凹凸構造の形成によって、凹凸構造がないものよりも気泡が除去しやすくなることで作業性が向上する。さらに、側面に形成する凹凸構造の形状やサイズを限定することでマイクロウェルの生産性を向上させることができる。
【００５９】
凹凸構造に加えて、マイクロウェルの側面を親水性面とすることにより、気泡抜け性能をさらに向上させることができる。少なくともマイクロウェルの側面が親水性面であればよいが、マイクロウェルの底面も親水性面であることが好ましく、マイクロウェルの周囲も親水性面であることがより好ましく、細胞培養容器の底部全体が親水性面であることがさらに好ましい。細胞培養容器の全体が親水性面であってもよい。本発明において、「マイクロウェルの側面が親水性面である」とは、例えば、マイクロウェルの側面の総面積に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、とりわけ好ましくは約１００％の領域が親水性面であることを意味する。また、本発明において、「マイクロウェルの底面が親水性面である」とは、例えば、マイクロウェルの底面の総面積に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、とりわけ好ましくは約１００％の領域が親水性面であることを意味する。親水性面には、容器やマイクロウェルを構成する材料自体が親水性である場合のその親水性の表面、および容器やマイクロウェルの表面を親水化処理することによりその表面を親水性面としたものが含まれる。側面以外にもマイクロウェル周囲が親水性面であることで、液体の流動性がより向上し気泡が残る可能性が低くなる。また、親水化処理する場合には、全体を一括処理する方が、生産性が高くより安定した処理を実施できる。
【００６０】
親水化処理は、当技術分野で通常用いられる方法で実施することができ、特に制限されない。例えば、プラズマ処理、コーティング処理、ＵＶ照射処理、ＥＢ照射処理、表面への親水性ポリマー等のグラフト重合処理等が挙げられるが、処理対象の形状が３次元的に微細で複雑な構造を有していても全体を均一に処理できる観点からプラズマ処理が好ましい。なお、親水化処理は、マイクロウェルを有する細胞培養容器を成形後に実施することが好ましい。
【００６１】
プラズマ処理としては、不活性ガスを用いたプラズマ処理が挙げられる。不活性ガスとしては、ヘリウム（Ｈｅ）、ネオン（Ｎｅ）、アルゴン（Ａｒ）、キセノン（Ｘｅ）等の希ガス、窒素（Ｎ２）および酸素（Ｏ２）等が挙げられる。処理対象への長期親水化保持の観点から酸素ガスやアルゴンガスを用いたプラズマ処理が好ましい。また、表面の劣化（分解やエッチング）等を防ぐ観点では、大気圧下で発生させる低温プラズマ処理が好ましい。
【００６２】
真空下でのプラズマ発生時の圧力は、好ましくは１Ｐａ以下であり、好ましくは０．２Ｐａ以上、より好ましくは０．４Ｐａ以上である。プラズマ発生時のガス総流量は、特に制限されないが、通常５〜５０ｍｌ／分、好ましくは１０〜３０ｍｌ／分である。流量を上記範囲とすることにより、プラズマを発生させた際の圧力のブレを抑制することができる。プラズマに照射する時間は、好ましくは１０分以下、より好ましくは５分以下、さらに好ましくは１分以下で、かつ好ましくは２秒以上、より好ましくは１０秒以上である。照射時間が短すぎるとプラズマ処理の効果が得られにくい場合がある。プラズマ発生部に与えられる電力は、好ましくは１００Ｗ以上、より好ましくは２００Ｗ以上、さらに好ましくは３００Ｗ以上であり、好ましくは５００Ｗ以下である。電力を一定以上とすることにより、プラズマが安定するためバラつきを抑制することができる。
【００６３】
また、大気圧下でのプラズマ発生時は、ガス総流量は、特に制限されないが、例えばアルゴンガスであると通常１〜１０ｌ／分、好ましくは３〜７ｌ／分である。流量を上記範囲とすることにより、プラズマを発生させた際の圧力のブレを抑制することができる。プラズマに照射する時間は、好ましくは１０分以下、より好ましくは５分以下、さらに好ましくは１分以下で、かつ好ましくは２秒以上、より好ましくは１０秒以上である。照射時間を一定以上とすることでプラズマ処理の効果を確実に付与できる。真空下および大気圧下ともに上記のようなプラズマ照射条件とすることにより、より安定的かつ長期的に維持できる親水化処理が可能となる。
【００６４】
コーティング処理としては、親水性ポリマーによるコーティング処理が挙げられる。親水性ポリマーは、炭素成分を含み、ポリマーの主鎖もしくは側鎖に親水性の官能基を含むポリマーのことを指す。親水性ポリマーは、水溶性や水膨潤性を有する、炭素酸素結合を含む水溶性ポリマーであることが好ましい。親水性ポリマーは、恒常的に水溶性や水膨潤性を有するものであってもよいし、光、温度、ｐＨなどの所定の刺激により水溶性や水膨潤性を示すものであってもよい。
【００６５】
親水性ポリマーの具体例としては、ポリアルキレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリル酸、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド等のヒドロゲルポリマー、これらと他のモノマーとの共重合体や、グラフト重合体などが挙げられる。中でもポリアルキレングリコールは様々な分子量のものが市販されており、かつ生体適合性に優れているので好適に用いることができる。ポリアルキレングリコールの具体例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマーなどが挙げられ、本発明においては親水性ポリマーとして、ポリエチレングリコールが特に好適に用いられる。
【００６６】
上記のような親水性ポリマーなどの親水性材料で容器を形成することにより、親水化処理なしでもその表面を親水性面とすることができる。その他の親水性材料としては、ポリアクリロニトリル、ナイロン６、ポリエチレンテレフタラート、ポリアクリル酸メチル、ポリメタクリル酸メチル、フェノール樹脂などが挙げられる。
【００６７】
親水性面とは、水接触角が７０°以下である面のことをいう。親水性面の水接触角は、好ましくは６０°以下、より好ましくは５０°以下、さらに好ましくは４５°以下、特に好ましくは４０°以下であり、好ましくは１０°以上である。水接触角が上記範囲であれば、十分な親水性を有しているといえ、したがって、気泡抜け効果も高いといえる。なお、水接触角は、２３℃において測定される水接触角をさす。
【００６８】
マイクロウェルの開口部は、細胞を収容可能な開口幅を有する。ここで、マイクロウェルの開口部の開口幅は、マイクロウェルの開口部の外縁が形成する図形の最短径の長さをさす。従って、マイクロウェルの開口部の外縁が円形である場合、開口幅は円の直径に等しく、その直径は、培養する細胞の最大寸法より大きいものとなる。本発明の細胞培養容器により受精卵を培養する場合、胚盤胞の段階まで培養することが望ましいため、円形の開口部の直径は、胚盤胞の段階の細胞の最大寸法より大きいものであることが望ましい。また、マイクロウェルの開口部の開口幅（例えば図３および図４のＲ、図８ＣのＲ１０、図９ＣのＲ２０、図１０ＣのＲ３０、マイクロウェルの開口部の外縁が円形である場合はその直径）は、好ましくは０．１ｍｍ以上１ｍｍ以下である。好ましくは０．２５ｍｍ以上、より好ましくは０．２６ｍｍ以上、さらに好ましくは０．２７ｍｍ以上であり、好ましくは０．７ｍｍ未満、さらに好ましくは０．４５ｍｍ未満である。また、上記マイクロウェルの開口部の開口幅は、Ｘ＋ｍ（ここでＸは細胞の最大径を表す）と規定することもできる。ここで、ｍは、好ましくは０．０１ｍｍ以上、さらに好ましくは０．０２ｍｍ以上である。
【００６９】
マイクロウェルの深さは、マイクロウェルの開口部から最深部までを垂直に測った深さ（例えば図３のＬ、図８ＣのＬ１０、図９ＣのＬ２０、図１０ＣのＬ３０）をいい、好ましくは０．１ｍｍ以上０．５ｍｍ以下である。マイクロウェルの深さは、浅過ぎると、培養容器の輸送時や細胞の分裂時などに細胞が動き、細胞がマイクロウェルの範囲外に出てしまう恐れがあるため、確実に細胞をマイクロウェル内に保持できるように設定される。例えば、細胞をマイクロウェル内に保持するには、深さが細胞の最大径の１／３以上であることが好ましく、１／２以上であることがさらに好ましい。一方、深過ぎると、マイクロウェル内に培養液や細胞を導入することが難しくなるため、細胞をマイクロウェル内に保持しつつ、深過ぎない値になるよう適宜設定される。例えば、深さの上限をマイクロウェルの開口部の開口幅に対して３倍以下とすることができる。さらに、培養液の導入を容易にするためには、深さはマイクロウェルの開口幅の１倍以下であることが好ましく、１／２以下であることが特に好ましい。
【００７０】
マイクロウェルの底面は、細胞培養容器の使用時の配置で、水平な平面であってもよいし、最も低い位置から外縁に進むに従って高くなるような傾斜面を有していてもよい。マイクロウェルの底面は、細胞培養容器の底部の表面に対して下向きの傾斜面を有する形状であることが好ましく、細胞培養容器の底部の表面に対して下向きで且つ少なくとも一部分が直線的な傾斜である傾斜面を有する形状であることがより好ましく、細胞培養容器の底部の表面に対して下向きの傾斜面を有する逆円錐形状であることがさらに好ましく、細胞培養容器の底部の表面に対して下向きの傾斜面を有し、該底面の重心を通り且つ細胞培養容器の底部と平行な面に直交する直線を中心軸とする逆直円錐形状であることが特に好ましい。上記の傾斜面において、最も低い位置は、マイクロウェルの底面の外縁以外の領域に配置されることが好ましく、マイクロウェルの重心を通り且つ細胞培養容器の底部と平行な面に直交する直線上に配置されることがより好ましい。ここで、マイクロウェルの底面の重心は、マイクロウェルの底面の外縁を含む本発明の細胞培養容器の底部と平行な面にマイクロウェルの底面を投影した図形における重心を意味する。傾斜面を有する場合、細胞培養容器の底部の表面に対する下向きの傾斜角度、例えば、該細胞培養容器の使用時の配置で水平面に対する傾斜角度（例えば図８のθ１１、図９のθ２１、図１０のθ３１）は、好ましくは４５°以下、より好ましくは３０°以下、特に好ましくは１０°以下、とりわけ好ましくは５〜１０°の範囲、とりわけ特に好ましくは約７°である。底面が傾斜面を有することにより、細胞をマイクロウェルの中心部（最深部）に維持することができ、すなわち多少の揺れを与えても細胞が中心位置から移動しないため、顕微鏡下において細胞を探す必要がなく観察しやすいという利点がある。
【００７１】
マイクロウェルの底面は、細胞を収容可能な底面幅を有する。ここで、マイクロウェルの底面の底面幅は、マイクロウェルの底面と側面との接続部によって形成される図形の最短径の長さをさす（例えば図８ＣのＲ’１０、図９ＣのＲ’２０、図１０ＣのＲ’３０）。従って、マイクロウェルの底面が円形である場合、底面幅は円の直径に等しく、その直径は、培養する細胞の最大寸法より大きいものとなる。以下において説明するように、マイクロウェルの底面と側面との接続部が曲率を有する場合、底面幅は、底面と側面との接続部が曲率を有さないと仮定した場合の該接続部によって形成される図形の最短径の長さをさす（例えば図８ＣのＲ’１０、図９ＣのＲ’２０）。本発明の細胞培養容器により受精卵を培養する場合、胚盤胞の段階まで培養することが望ましいため、マイクロウェルの底面の底面幅は、胚盤胞の段階の細胞の最大寸法より大きいものであることが望ましい。また、マイクロウェルの底面の底面幅は、好ましくは０．１ｍｍ以上１ｍｍ以下である。好ましくは０．２５ｍｍ以上、より好ましくは０．２６ｍｍ以上、さらに好ましくは０．２７ｍｍ以上であり、好ましくは０．７ｍｍ未満、さらに好ましくは０．４５ｍｍ未満である。また、上記マイクロウェルの底面の底面幅は、Ｘ＋ｍ（ここでＸは細胞の最大径を表す）と規定することもできる。ここで、ｍは、好ましくは０．０１ｍｍ以上、さらに好ましくは０．０２ｍｍ以上である。
【００７２】
マイクロウェルの側面は、細胞培養容器の使用時の配置で、水平面に垂直であってもよいし、傾斜していてもよい。マイクロウェルの側面は、細胞培養容器の底部の表面に直交する直線に対して傾斜していることが好ましい。すなわち、マイクロウェルの側面は、マイクロウェルの底面の重心を通り且つ細胞培養容器の底部と平行な面に直交する面における断面において、細胞培養容器の底部の表面に対して傾斜していることが好ましい。ここで、マイクロウェルの底面の重心は、マイクロウェルの底面の外縁を含む本発明の細胞培養容器の底部と平行な面にマイクロウェルの底面を投影した図形における重心を意味する。傾斜している場合は、マイクロウェルの底面の重心を通り且つ細胞培養容器の底部と平行な面に直交する面における断面において、細胞培養容器の底部の表面と平行な面に対するマイクロウェルの側面の傾斜角度、例えば、該細胞培養容器の使用時の配置で水平面に対する角度（例えば図３のθ、図８Ｃのθ１０、図９Ｃのθ２０、図１０Ｃのθ３０）は、好ましくは４５°以上、より好ましくは６０°以上、特に好ましくは７０°以上であり、好ましくは９０°未満、より好ましくは８５°以下、特に好ましくは８０°以下であり、好ましくは４５〜８５°の範囲、より好ましくは６０°〜８０°の範囲である。或いは、細胞培養容器の底部の表面に直交する直線に対するマイクロウェルの側面の傾斜角度、例えば、該細胞培養容器の使用時の配置で垂直な直線に対する角度（例えば図３の９０°−θ、図８Ｃの９０°−θ１０、図９Ｃの９０°−θ２０、図１０Ｃの９０°−θ３０）は、好ましくは０°超、より好ましくは５°以上、特に好ましくは１０°以上であり、好ましくは４５°以下、より好ましくは３０°以下、特に好ましくは２０°以下であり、好ましくは５〜４５°の範囲、より好ましくは１０°〜３０°の範囲である。側面がこのような角度θ（例えば図８Ｃのθ１０、図９Ｃのθ２０、図１０Ｃのθ３０）で傾斜していることにより、培養液を添加したときに、マイクロウェル内に気泡が残るのを防止できる。また、細胞がマイクロウェルから飛び出すのを防止することができ、多少の振動や横揺れを与えても細胞をマイクロウェル内に保持することができる。
【００７３】
特に好ましくは、本発明の細胞培養容器は、
マイクロウェルの底面が、細胞培養容器の底部の表面に対して下向きの傾斜面を有する逆円錐形状であり、
マイクロウェルの側面が、細胞培養容器の底部の表面に直交する直線に対して傾斜しており、
２以上のライン状の凹凸構造において、マイクロウェルの底面の重心を通り且つ細胞培養容器の底部と平行な面に直交する面における凸部の断面が方形状または円弧状の形状である。上記形状を有することにより、本発明の細胞培養容器は、培養液を添加したときに、長期間に亘ってマイクロウェル内に気泡が残るのを実質的に防止できる。また、細胞がマイクロウェルから飛び出すのを防止することができ、多少の振動や横揺れを与えても細胞をマイクロウェル内に保持することができる。
【００７４】
マイクロウェルの底面と側面との接続部や開口端、或いは２以上のライン状の凹凸構造における凸部と底面との接続部や凸部の開口端側の端部は、丸みを帯びていること、すなわち曲率を有することが好ましい。その場合、曲率は、それぞれ好ましくは０．０１ｍｍ以上、より好ましくは０．０２ｍｍ以上であり、好ましくは０．１ｍｍ以下、より好ましくは０．０７ｍｍ以下である。マイクロウェルの底面と側面との接続部や開口端、或いは２以上のライン状の凹凸構造における凸部と底面との接続部や凸部の開口端側の端部に曲率を持たせることにより、気泡がより抜けやすくなることで作業性が改善すること、およびプラスチックによる射出成形加工が容易になり歩留まりが向上するなどの効果が期待できる。
【００７５】
細胞培養容器のサイズは、特に制限されないが、開口部が好ましくは円形で、開口幅（例えば、図２のｒ）が、好ましくは３０〜６０ｍｍ、特に３５ｍｍのものが用いられる。これは従来の細胞培養に用いられているシャーレと同等のサイズであり、汎用のシャーレから簡便に作製できること、および既存の培養装置等に適合しやすいことから、上記のようなサイズのものが好ましい。
【００７６】
マイクロウェルは、細胞培養容器の底部に、少なくとも１個形成され、好ましくは４個以上、好ましくは６個以上、より好ましくは８個以上が、近接して形成されている。マイクロウェルは、複数個が近接して形成されていればよく、さらに近接していないマイクロウェルが別途形成されていてもよい。また、複数個近接して形成されたマイクロウェルの群が、複数群配置されていてもよく、それらの群は互いに近接していなくてもよい。近接するマイクロウェル間のピッチは１ｍｍ以下、好ましくは０．７ｍｍ以下、さらに好ましくは０．４５ｍｍ以下である。観察装置として、１／２インチのＣＣＤ素子、４、１０、２０倍の対物レンズを備えたものがよく用いられる。このような観察装置で、４倍の対物レンズを選択した場合の観察可能な視野はおよそ１．６ｍｍ×１．２ｍｍであり、この観察視野内に４個以上のマイクロウェルが含まれるように設計することが好ましい。ただし、上記ピッチは収容する細胞の種類に依存して異なる。上記のようなピッチでマイクロウェルを密に配置することにより、細胞を個別に管理しつつ多くの細胞を同時に培養でき、さらに顕微鏡の一視野に多くの細胞が入るため、一度に多くの細胞の画像を取得することができる。
【００７７】
マイクロウェル間のピッチは近接するマイクロウェルの中心間の距離である。マイクロウェルの中心は、マイクロウェルの開口部の外縁が形成する図形の重心とし、外縁が円形であればその円の中心をさす。マイクロウェル間のピッチは通常平均ピッチをさし、平均ピッチは、あるマイクロウェルに関しては、近接する全てのマイクロウェルとのピッチから平均値を算出したものをさす。
【００７８】
複数個近接して形成されたマイクロウェルは、例えば、図１および図２に示すように、それらを囲む内壁により、培養容器内のその他の部分と隔てられていてもよい。当該実施形態では、近接したマイクロウェルの群ごとに内壁で囲まれており、複数のマイクロウェルの群が細胞培養容器の底面に存在する場合は、群ごとに内壁で囲まれることが好ましい。通常、受精卵等の培養においては、培養容器に受精卵を含む培養液の液滴を形成し、液滴をオイルで覆うことにより培養液の乾燥が防止されている。複数個近接して形成されたマイクロウェルの群をさらに内壁で囲むことにより、その内部に培養液を収容して安定なドロップを形成し、培養液の分散を防ぐことができる。培養液をミネラルオイル等のオイルで覆う場合も同様である。
【００７９】
細胞培養容器の材質は、特に制限されない。具体的には、金属、ガラス、およびシリコン等の無機材料、プラスチック（例えば、ポリスチレン樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）で代表される有機材料を挙げることができる。細胞培養容器は、当業者に公知の方法で製造することができる。例えば、プラスチック材料からなる培養容器を製造する場合には、慣用の成形法、例えば射出成形により製造することができる。
【００８０】
細胞培養容器は、培養細胞の非特異的接着を防止し、また培養液のドロップが表面張力によって偏ることを防止する観点から、プラズマ処理などの表面親水化処理することが好ましい。製造後の容器に付着している菌数（バイオバーデン数）が１００ｃｆｕ／容器以下であることが好ましい。また、さらにγ線滅菌などの滅菌処理を施されていることがより好ましい。
【００８１】
細胞培養容器は、受精卵の発育を促進するような表面処理または表面コートがなされていてもよい。特に、受精卵の発育を促進するために、他の器官の細胞（例えば、子宮内膜細胞や卵管上皮細胞）と共培養をする場合、これらの細胞をあらかじめ培養容器に接着させる必要がある。このような場合に、培養容器の表面に細胞接着性の材料をコートすると有利である。
【００８２】
培養対象となる細胞は、特に制限されないが、例えば、受精卵、卵細胞、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）およびｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）が挙げられる。卵細胞は、未受精の卵細胞をさし、未成熟卵母細胞および成熟卵母細胞が含まれる。受精卵は、受精後、卵割により２細胞期、４細胞期、８細胞期と細胞数が増えていき、桑実胚を経て、胚盤胞へと発生する。受精卵には、２細胞胚、４細胞胚および８細胞胚などの初期胚、桑実胚、胚盤胞（初期胚盤胞、拡張胚盤胞および脱出胚盤胞を含む）が含まれる。胚盤胞は、胎盤を形成する潜在能力がある外部細胞と胚を形成する潜在能力がある内部細胞塊からなる胚を意味する。ＥＳ細胞は胚盤胞の内部細胞塊から得られる未分化な多能性または全能性細胞をさす。ｉＰＳ細胞は、体細胞（主に線維芽細胞）へ数種類の遺伝子（転写因子）を導入することにより、ＥＳ細胞に似た分化万能性を持たせた細胞をさす。すなわち、本実施形態において細胞には、受精卵や胚盤胞のように複数の細胞の集合体も包含される。
【００８３】
細胞培養容器は、好ましくは哺乳動物および鳥類の細胞、特に哺乳動物の細胞の培養に好適である。哺乳動物は、温血脊椎動物をさし、例えば、ヒトおよびサルなどの霊長類、マウス、ラットおよびウサギなどの齧歯類、イヌおよびネコなどの愛玩動物、ならびにウシ、ウマおよびブタなどの家畜が挙げられる。一実施形態において細胞培養容器は、ヒトの受精卵の培養に特に好適である。
【００８４】
通常、マイクロウェルを覆うように培養液Ａを添加した後、培養液を覆うようにオイルＢを添加し、さらに培養液中に細胞Ｃを添加する。これらの作業は、通常ピペットやガラスキャピラリー等の器具を用いて実施される。本実施形態の細胞培養容器は、開口が大きいので、これらの操作を比較的容易に実施できる（図７）。
【００８５】
培養は、通常、細胞培養容器を培養細胞の発育および維持に必要なガスを含む環境雰囲気および一定の環境温度をもたらすインキュベータに入れることにより実施される。必要なガスには、水蒸気、遊離酸素（Ｏ２）および二酸化炭素（ＣＯ２）が含まれる。環境温度とＣＯ２含有量を調節することにより、培養液のｐＨを一定時間内に安定させることができる。安定なＣＯ２含有量と安定な温度により安定なｐＨが得られる。画像比較プログラムにより、培養中の細胞の画像を予め保存された画像と比較することにより、培養の際の温度、ガスおよび培養液などの培養条件を調節することもできる。
【００８６】
例えば受精卵を培養する場合には、通常、培養後に、子宮への移植に適した良質な受精卵であるか否かが判別される。判別は自動で行ってもよいし、顕微鏡等により手動で行ってもよい。培養細胞の自動判別においては、顕微鏡により取得された培養容器内の細胞の画像をＣＣＤカメラ等の検出装置によって撮像し、得られた像を輪郭抽出処理に付し、画像中の細胞に該当する部分を抽出し、抽出された細胞の画像を画像解析装置で解析することによりその質を判別することができる。画像の輪郭抽出処理については、例えば、特開２００６−３３７１１０に記載された処理を利用できる。
【００８７】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
【実施例】
【００８８】
＜比較例＞
開口部が直径３３５μｍの円形であり、底面が直径２８５μｍの円形であり、深さが１５０μｍのマイクロウェルであって、側面が８０°で傾斜している（θ＝８０°）マイクロウェルが、底部に２５個（５×５）形成されたポリスチレン製の細胞培養容器を作製した。各マイクロウェルに水を１００μＬずつ滴下した。その結果、すべてのマイクロウェルに気泡が残った。気泡を容易に抜くことができず、細胞培養を実施できなかった。【００８９】
＜実施例１＞
比較例で作製した細胞培養容器をプラズマ処理により親水化し、半年間保管したものについて、容器表面の水接触角を測定したところ、５０°であった。【００９０】
各マイクロウェルに水を１００μＬずつ滴下したところ、気泡が数個残ったものの容器の側面を簡単にたたくと気泡は容易に取り除くことができた。よってどのマイクロウェルでも培養を行うことができた。【００９１】
＜実施例２＞
比較例で作製した細胞培養容器をプラズマ処理により親水化し、２年間保管したものについて、容器表面の水接触角を測定したところ、６０°であった。【００９２】
各マイクロウェルに水を１００μＬずつ滴下したところ、気泡が残って容器の側面をたたいても取り除くことができないマイクロウェルが数個あった。【００９３】
＜実施例３＞
開口部が直径３３５μｍの円形であり、底面が直径２８５μｍの円形であり、深さが１５０μｍのマイクロウェルであって、図１〜図４に示すように、マイクロウェル側面に幅（Ｘ１）が２０μｍで深さ（Ｙ）が５μｍのライン状の凹凸構造を有し、側面が８０°で傾斜している（θ＝８０°）マイクロウェルが、底部に２５個（５×５）形成された細胞培養容器を作製した。【００９４】
各マイクロウェルに水を１００μＬずつ滴下した。その結果、気泡はほとんど残ったが容器の側面を簡単にたたくと気泡は容易に取り除くことができた。よってどのマイクロウェルでも培養を行うことができた。【００９５】
＜実施例４＞
実施例３で作製し、プラズマ処理により親水化した細胞培養容器を半年間保管したものについて、容器表面（凹凸構造がない部分）の水接触角を測定したところ、５０°であった。別途ライン状凹凸構造上の水接触角が測定できるように実施例３でマイクロウェル側面に作成したライン状凹凸構造と同様の構造を水平な表面に成形した板を作成し、同様のプラズマ処理を行ったサンプルについて水接触角を測定したところ、半年間保管したものは水接触角が１０°であった。【００９６】
各マイクロウェルに水を１００μＬずつ滴下したところ、気泡は一つも残らなかった。よってどのマイクロウェルでも培養を行うことができた。【００９７】
＜実施例５＞
実施例３で作製し、プラズマ処理により親水化した細胞培養容器を２年間保管したものについて、容器表面（凹凸構造がない部分）の水接触角を測定したところ、６０°であった。また、別途ライン状凹凸構造上の水接触角が測定できるように実施例３でマイクロウェル側面に作成したライン状凹凸構造と同様の構造を水平な表面に成形した板を作成し、同様のプラズマ処理を行ったサンプルについて水接触角を測定したところ、２年間保管したものは３０°であった。【００９８】
各マイクロウェルに水を１００μＬずつ滴下したところ、気泡は一つも残らなかった。よってどのマイクロウェルでも培養を行うことができた。【００９９】
＜実施例６＞
実施例３で作製し、プラズマ処理により親水化した細胞培養容器を２年半保管したものについて、容器表面（凹凸構造がない部分）の水接触角を測定したところ、７０°であった。また、別途ライン状凹凸構造上の水接触角が測定できるように実施例３でマイクロウェル側面に作成したライン状凹凸構造と同様の構造を水平な表面に成形した板を作成し、同様のプラズマ処理を行ったサンプルについて水接触角を測定したところ、２年半保管したものは５０°であった。【０１００】
各マイクロウェルに水を１００μＬずつ滴下したところ、気泡が数個残ったものの容器の側面を簡単にたたくと気泡は容易に取り除くことができた。【０１０１】
上記の結果を以下の表１にまとめる。
【表１】
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結果の表示
×：すべてのマイクロウェルに気泡が残り、気泡を容易に抜くことができず、細胞培養を実施できなかった。
△：気泡が残り、容器の側面を簡単にたたいても細胞培養を行うことができないマイクロウェルが存在した。
○：気泡は残るが、容器の側面を簡単にたたくと気泡は容易に取り除くことができ、どのマイクロウェルでも細胞培養を行うことができた。
◎：気泡は一つも残らず、どのマイクロウェルでも細胞培養を行うことができた。【０１０２】
なお、上記実施例において、水接触角の測定は協和界面科学製ＤＭ−３００を用いて測定した。具体的には、マイクロシリンジに水１μＬの液滴を作製し、液滴を滴下後１秒後に、滴下した液滴の形状からθ／２法で接触角を測定した。【０１０３】
＜実施例７＞
マイクロウェルが底部に２５個（５×５）形成されており、該マイクロウェルの開口部（Ｒ１０）が直径３３５μｍの円形であり、該マイクロウェルの底面（Ｒ’１０）が直径２８５μｍの円形であり、該マイクロウェルの深さ（Ｌ１０）が１６１μｍであり、該マイクロウェルの底面が、該細胞培養容器の底部の表面に対して下向きにθ１１＝約７°の傾斜面を有し、該底面の重心（すなわち円形の中心）を通り且つ細胞培養容器の底部と平行な面に直交する直線を中心軸とする逆直円錐形状であり、該マイクロウェルの側面が、該細胞培養容器の底部の表面に直交する直線に対して約２０°傾斜している（すなわち、該マイクロウェルの底面の重心を通り且つ細胞培養容器の底部と平行な面に直交する面における断面において、該マイクロウェルの側面は、該細胞培養容器の底部の表面と平行な面に対してθ１０＝約８０°傾斜している）、ポリスチレン製の細胞培養容器を、射出成形によって作製した。図８に示すように、前記細胞培養容器のマイクロウェルの側面には、凸部の幅（Ｘ１１）および凹部の幅（Ｘ１２）が２５μｍであり、マイクロウェルの底面の重心を通る該底面に直交する面における凸部の断面が、１０μｍの高さ（Ｙ１０）を有する方形状である、ライン状の凹凸構造を形成した。前記細胞培養容器のマイクロウェルの底面の表面粗さは、０．５μｍの最大高さ（Ｒｙ）であった。なお、マイクロウェルの底面の表面粗さは、高精度形状測定システム（KS-1100、KEYENCE社製）を用いて、２μmの測定ピッチで観察した三次元形状データから、マイクロウェルの底面の測定データを抽出し、Ｒｙ値を計算することによって決定した。【０１０４】
得られた細胞培養容器をプラズマ処理により親水化し、半年間保管したものについて、容器表面（凹凸構造がない部分）の水接触角を測定したところ、５０°であった。これに対し、ライン状の凹凸構造の部分の水接触角を測定したところ、１０°であった。プラズマ処理後、２年間保管した細胞培養容器の場合、容器表面（凹凸構造がない部分）の水接触角は６０°であった。これに対し、ライン状の凹凸構造の部分の水接触角を測定したところ、３０°であった。【０１０５】
プラズマ処理後、半年間保管した細胞培養容器のマイクロウェル部分に１００μＬの水を滴下したところ、気泡は一つも残らずに培養が可能であった。同様に、プラズマ処理後、２年間保管した細胞培養容器のマイクロウェル部分に１００μＬの水を滴下したところ、気泡は一つも残らずに培養が可能であった。【０１０６】
＜実施例８＞
実施例７の細胞培養容器において、凸部の幅（Ｘ２１）および凹部の幅（Ｘ２２）を５０μｍ、凸部の高さ（Ｙ２０）を１０μｍに変更した以外は実施例７と同様の特徴を有するポリスチレン製の細胞培養容器を、射出成形によって作製した（図９）。【０１０７】
得られた細胞培養容器をプラズマ処理により親水化し、半年間保管したものについて、容器表面（凹凸構造がない部分）の水接触角を測定したところ、５０°であった。これに対し、ライン状の凹凸構造の部分の水接触角を測定したところ、１５°であった。プラズマ処理後、２年間保管した細胞培養容器の場合、容器表面（凹凸構造がない部分）の水接触角は６０°であった。これに対し、ライン状の凹凸構造の部分の水接触角を測定したところ、３５°であった。【０１０８】
プラズマ処理後、半年間保管した細胞培養容器のマイクロウェル部分に１００μＬの水を滴下したところ、気泡は一つも残らずに培養が可能であった。同様に、プラズマ処理後、２年間保管した細胞培養容器のマイクロウェル部分に１００μＬの水を滴下したところ、気泡は一つも残らずに培養が可能であった。【０１０９】
＜実施例９＞
マイクロウェルが底部に２５個（５×５）形成されており、該マイクロウェルの開口部（Ｒ３０）が直径５２５μｍの円形であり、該マイクロウェルの底面（Ｒ’３０）が直径２８５μｍの円形であり、該マイクロウェルの深さ（Ｌ３０）が２３９μｍであり、該マイクロウェルの底面が、該細胞培養容器の底部の表面に対して下向きにθ３１＝約７°の傾斜面を有し、該底面の重心（すなわち円形の中心）を通り且つ細胞培養容器の底部と平行な面に直交する直線を中心軸とする逆直円錐形状であり、該マイクロウェルの側面が、該細胞培養容器の底部の表面に直交する直線に対して約２９°傾斜している（すなわち、該マイクロウェルの底面の重心を通る該底面に直交する面における断面において、該マイクロウェルの側面は、該細胞培養容器の底部の表面と平行な面に対してθ３０＝約６１°傾斜している）、ポリスチレン製の細胞培養容器を、射出成形によって作製した。図１０に示すように、前記細胞培養容器のマイクロウェルの側面には、凸部の幅（Ｘ３１）および凹部の幅（Ｘ３２）が２５μｍであり、マイクロウェルの底面の重心を通り且つ細胞培養容器の底部と平行な面に直交する面における凸部の断面が、１０μｍの最大高さ（Ｙ３０）を有し、３００μｍの曲率半径を有する円弧状の形状である、ライン状の凹凸構造を形成した。前記細胞培養容器のマイクロウェルの底面の表面粗さは、０．５μｍの最大高さ（Ｒｙ）であった。なお、マイクロウェルの底面の表面粗さは、高精度形状測定システム（KS-1100、KEYENCE社製）を用いて、２μmの測定ピッチで観察した三次元形状データから、マイクロウェルの底面の測定データを抽出し、Ｒｙ値を計算することによって決定した。【０１１０】
得られた細胞培養容器をプラズマ処理により親水化し、半年間保管したものについて、容器表面（凹凸構造がない部分）の水接触角を測定したところ、５０°であった。これに対し、ライン状の凹凸構造の部分の水接触角を測定したところ、１０°であった。プラズマ処理後、２年間保管した細胞培養容器の場合、容器表面（凹凸構造がない部分）の水接触角は６０°であった。これに対し、ライン状の凹凸構造の部分の水接触角を測定したところ、３０°であった。【０１１１】
プラズマ処理後、半年間保管した細胞培養容器のマイクロウェル部分に１００μＬの水を滴下したところ、気泡は一つも残らずに培養が可能であった。同様に、プラズマ処理後、２年間保管した細胞培養容器のマイクロウェル部分に１００μＬの水を滴下したところ、気泡は一つも残らずに培養が可能であった。【０１１２】
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願第2013-188598号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。【０１１３】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【符号の説明】
【０１１４】
１：細胞培養容器
２：底部
３：側壁
４，１４，２４，３４：マイクロウェル
５，１５，２５，３５：マイクロウェル底面
６，１６，２６，３６：マイクロウェル側面
７，１７，２７，３７：マイクロウェル開口部
８，１８，２８，３８：凹凸構造
９：内壁
ｒ：細胞培養容器の開口幅
Ｒ，Ｒ１０，Ｒ２０，Ｒ３０：マイクロウェルの開口幅
Ｒ’１０，Ｒ’２０，Ｒ’３０：マイクロウェルの底面幅
Ｌ，Ｌ１０，Ｌ２０，Ｌ３０：マイクロウェルの深さ
θ，θ１０，θ２０，θ３０：マイクロウェル側面の傾斜角度
θ１１，θ２１，θ３１：マイクロウェル底面の傾斜角度
Ｘ１，Ｘ１１，Ｘ２１，Ｘ３１：凸部の幅
Ｘ２，Ｘ１２，Ｘ２２，Ｘ３２：凹部の幅
Ｙ，Ｙ１０，Ｙ２０，Ｙ３０：凸部の高さ
Ａ：培養液
Ｂ：オイル
Ｃ：細胞
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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