(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）  Ｒ1−ＣＯ−ＣＯＯＨ  ［式中、Ｒ1は３〜７つの炭素原子を有する分枝アルキル基である］を有する２−ケトカルボン酸またはそれらの塩の製造方法であって、以下の段階
ａ）  微生物を培地中で成長させて、２−ケトカルボン酸またはそれらの塩を含有する培養ブロスを準備する、発酵段階、
ｂ）  段階ａ）において得られた発酵ブロスを、イオン交換、抽出工程、蒸留工程からなる群から選択される１つまたはそれより多くの段階に供する段階、
ｃ）  段階ｂ）において得られた生成物を、さらなる濃縮、沈殿または結晶化、またはそれらの組み合わせに供し、且つ、２−ケトカルボン酸またはそれらの塩を得る段階
を含み、且つ、
２−ケトカルボン酸またはその塩の純度が、６０質量％またはそれより高く、且つ、
発酵段階のために使用される微生物が、コリネバクテリウムグルタミクムであり、且つ、
コリネバクテリウム菌株が、以下：
トランスアミナーゼＢ  （Ｅ．Ｃ．２．６．１．４２、ｉｌｖＥ−遺伝子により符号化）およびピルビン酸デヒドロゲナーゼのＥ１サブユニット（Ｅ．Ｃ．１．２．４．１、ａｃｅＥ遺伝子により符号化）のタンパク質において、欠失または減少されているものであり、且つ、さらに
コリネバクテリウム菌株において、以下：
ｉｌｖＢＮ（アセトヒドロキシ酸シンターゼを符号化している遺伝子、Ｅ．Ｃ．４．１．３．１８）、ｉｌｖＣ（アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼを符号化している遺伝子、Ｅ．Ｃ．１．１．１．８６）およびｉｌｖＤ（ジヒドロキシ酸デヒドラターゼを符号化している遺伝子、Ｅ．Ｃ．４．２．１．９）の遺伝子が過剰発現し、
前記２−ケトカルボン酸が２−ケトイソ吉草酸であること、
を特徴とする、
前記製造方法。
【請求項２】
以下の段階：
ａ）  微生物を培地中で成長させて、２−ケトイソ吉草酸またはそれらの塩を含有する培養ブロスを準備する、発酵段階、
ｂ）  段階ａ）において得られた発酵ブロスを、該発酵ブロスのｐＨシフトを伴う蒸留工程に供する段階
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
以下の段階：
ａ）  微生物を培地中で成長させて、２−ケトイソ吉草酸またはそれらの塩を含有する培養ブロスを準備する、発酵段階、
ｂ）  段階ａ）において得られた発酵ブロスを、イオン交換に供する段階
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
段階ｂ）において得られた溶出液を、イオン交換、抽出または蒸留の群から選択される１つまたはそれより多くのさらなる精製段階に供する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
以下の段階：
ａ）  微生物を培地中で成長させて、２−ケトイソ吉草酸またはそれらの塩を含有する培養ブロスを準備する、発酵段階、
ｂ）  段階ａ）において得られた発酵ブロスを、イオン交換に供する段階、および
ｃ）  段階ｂ）において得られた溶出液を、イオン交換、抽出または蒸留の群から選択される１つまたはそれより多くのさらなる精製段階に供する段階、および
ｄ）  段階ｃ）において得られた生成物を、さらなる濃縮、沈殿または結晶化段階またはそれらの組み合わせに供して、且つ２−ケトイソ吉草酸またはそれらの塩を得る段階
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
２−ケトイソ吉草酸またはその塩の純度が、８０質量％またはそれより高い、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
２−ケトイソ吉草酸またはその塩の純度が、９０質量％またはそれより高い、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
段階ａ）において得られた培養ブロスが、少なくとも１０ｇ／ｌの２−ケトイソ吉草酸またはそれらの塩を含有する、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
段階ａ）において得られた培養ブロスが、少なくとも１５ｇ／ｌの２−ケトイソ吉草酸またはそれらの塩を含有する、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
段階ａ）において得られた培養ブロスが、少なくとも２０ｇ／ｌの２−ケトイソ吉草酸またはそれらの塩を含有する、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
段階ａ）において得られた培養ブロスが、少なくとも４０ｇ／ｌの２−ケトイソ吉草酸またはそれらの塩を含有する、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
培養ブロスをイオン交換段階（ｂ）に適用する前に、細胞および／または細胞破片を培養ブロスから除去する追加的な段階を行う、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記除去を、ろ過、遠心分離、沈殿により、または前記方法の組み合わせによって行う、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
細胞および／または細胞破片を培養ブロスから除去した後、且つ、段階ｂ）の前に、イオン交換樹脂または炭を使用することによって予備精製を行う、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
段階ｂ）において、カチオン樹脂を使用することによってイオン交換を行う、請求項１から１４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
段階ｃ）において、イオン交換のためにアニオン樹脂を使用する、請求項１から１４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
段階ｃ）の蒸留が、蒸気蒸留である、請求項１から１６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
蒸留を、１０〜１００℃の温度で行う、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
蒸留を、１０〜１００ｍｂａｒの圧力で行う、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
沈殿および結晶化段階である段階ｄ）において、２−ケトイソ吉草酸が、Ｃａ2+、Ｍｇ2+、Ｎａ+、Ｋ+からなる群から選択されるものとの塩として、またはアミノ酸を伴う塩として得られる、請求項１から１９までのいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２−ケトカルボン酸、特に２−ケトイソ吉草酸、２−ケト−４−メチルペンタン酸、および／または２−ケト−３−メチルペンタン酸の、発酵段階を使用した製造方法に関する。
【０００２】
２−ケトカルボン酸は薬学において有用な化合物であり、且つ、除草剤および殺菌剤の合成のために使用される。２−ケトカルボン酸は、ＬＤＬコレステロール、トリグリセリド、および血漿中の遊離基の水準を低減することが知られている。特に、２−ケトイソ吉草酸は、腎不全の患者のための栄養補助食品として使用される。
【０００３】
２−ケトカルボン酸、例えば２−ケトイソバレレートを、化学合成により製造することは、従来技術において公知である。例えば、化学合成による２−ケトイソバレレートの製造は、ＣｒＯ3を使用してそれぞれの２−ヒドロキシイソ吉草酸エチルエステルを酸化すること、および次に該エステルを鹸化して２−ケトイソバレレートをもたらすことによる、２つの段階で行われる。この方法は、高温、毒性のＣｒＯ3、および様々な環境に有害な溶剤の使用という欠点を含む。
【０００４】
生合成において、２−ケトカルボン酸は、それぞれのアミノ酸のための直接的な前駆体であり、例えば、２−ケトイソバレレートはアミノ酸バリンの直接的な前駆体である。微生物中で、２−ケトイソバレレートは細胞内で生成され、且つ、培地中に排出される。先行技術において、２−ケト酸は、発酵によるそれぞれのアミノ酸の製造のための前駆体として使用されることが記載されている（ＧＢ２１６１１５９号；  ＧＢ２１４７５７９号）。
【０００５】
文献内で、微生物が２−ケトカルボン酸、例えば２−ケトイソバレレートを生成することが知られているにもかかわらず、これまで、発酵の使用により、２−ケトカルボン酸を高純度で製造し且つ単離するための方法が記載されているのではなく、２−ケトカルボン酸は中間生成物またはアミノ酸の製造のための出発物質（ｅｄｕｃｔ）としてのみ言及されていた。
【０００６】
問題および解決
本発明の目的は、２−ケトカルボン酸、特に２−ケトイソバレレート、２−ケト−４−メチルペンタン酸、および／または２−ケト−３−メチルペンタン酸の製造方法であって、化学合成の欠点を回避する、製造方法を提供することであった。
【０００７】
この課題は、一般式（Ｉ）  Ｒ1−ＣＯ−ＣＯＯＨ  ［式中、Ｒ1は３〜７つの炭素原子を有する分枝アルキル基である］を有する２−ケトカルボン酸、またはそれらの塩の製造方法であって、以下の段階
ａ）  微生物を培地中で成長させて、２−ケトカルボン酸またはそれらの塩を含有する培養ブロスを準備する、発酵段階
ｂ）  段階ａ）において得られた発酵ブロスを、イオン交換、抽出工程、蒸留工程からなる群から選択される１つまたはそれより多くの段階に供する段階
を含む製造方法によって解決される。
【０００８】
本発明の好ましい実施態様において、該工程は以下の段階を含む：
ａ）  微生物を培地中で成長させて、２−ケトカルボン酸またはそれらの塩を含有する培養ブロスを準備する発酵段階、
ｂ）  段階ａ）において得られた発酵ブロスをイオン交換に供する段階、
ｃ）  好ましくは、段階ｂ）において得られた溶出液を、イオン交換、抽出または蒸留からなる群から選択される１つまたはそれより多くのさらなる精製段階に供する段階、
ｄ）  好ましくは段階ｃ）で得られた生成物を、さらなる濃縮、沈殿または結晶化段階、またはそれらの組み合わせに供して、且つ、２−ケトカルボン酸またはそれらの塩を得る段階。
【０００９】
本発明の好ましい実施態様において、該工程は以下の段階を含む：
ａ）  微生物を培地中で成長させて、２−ケトカルボン酸またはそれらの塩を含有する培養ブロスを準備する発酵段階、
ｂ）  段階ａ）において得られた発酵ブロスを、発酵ブロスの初めのｐＨシフト（ｐＨ１への酸性化）の後、蒸留工程（水の添加を用いて、塔底（ｓｕｍｐ）が枯渇するまでの蒸気蒸留）のみに供する段階。
【００１０】
この実施態様は、イオン交換処理の使用を回避する。驚くべきことに、この段階を用いて、ケト酸を非常に選択的に発酵ブロスから除去でき、且つ、他の有機酸は蒸留塔底に留まっていた。
【００１１】
好ましい方法において、２−ケトカルボン酸は、一般式Ｒ1−ＣＯ−ＣＯＯＨ  ［式中、Ｒ1は３、４または５つの炭素原子を有する分枝アルキル基である］を有する化合物、またはそれらの塩である。
【００１２】
さらに好ましくは、Ｒ1は、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、３−メチルブチルからなる群から選択される。なおさらに好ましいＲ1は、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルからなる群から選択される。
【００１３】
特に好ましい方法において、２−ケトカルボン酸は２−ケトイソ吉草酸またはそれらの塩である。
【００１４】
本発明のさらに好ましい実施態様において、段階ａ）において得られた培養ブロスは、少なくとも１０ｇ／ｌ、好ましくは少なくとも１５ｇ／ｌ、およびさらに好ましくは少なくとも２０ｇ／ｌ、および最も好ましくは少なくとも４０ｇ／ｌの２−ケトカルボン酸、好ましくは２−ケトイソ吉草酸またはそれらの塩を含有する。
【００１５】
さらにより好ましくは、発酵段階のために使用される微生物は、式（Ｉ）の化合物、好ましくは２−ケトイソ吉草酸、２−ケト−４−メチルペンタン酸、および２−ケト−３−メチルペンタン酸からなる群から選択される化合物またはそれらの混合物を生成するための改善された能力を有している。
【００１６】
好ましくは、発酵段階のために使用される微生物は、２−ケトイソ吉草酸、２−ケト−４−メチルペンタン酸および／または２−ケト−３−メチルペンタン酸を生成する能力が向上したコリネバクテリウム、特に好ましくはコリネバクテリウムグルタミクムである。１つまたはそれより多くのタンパク質、例えばトランスアミナーゼＢ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．４２、ｉｌｖＥ−遺伝子により符号化）、バリン−ピルビン酸トランスアミナーゼＡｖｔＡ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．６６、ａｖｔＡ−遺伝子により符号化）、またはアラニントランスアミナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．２、ａｌａＴ−遺伝子により符号化）において減少または欠失しているコリネバクテリウム菌株を使用することが特に有用である。さらに、１つまたはそれより多くのタンパク質、例えばピルビン酸デヒドロゲナーゼのＥ１サブユニット（Ｅ．Ｃ．１．２．４．１、ａｃｅＥ遺伝子により符号化）、ピルビン酸キノンオキシドレダクターゼ（Ｅ．Ｃ．１．２．２．２、ｐｑｏ遺伝子により符号化）、ホスホグルコイソメラーゼ（Ｅ．Ｃ．５．３．１．９、ｐｇｉ遺伝子により符号化）において減少または欠失しているコリネバクテリウム菌株の使用が有用である。良好な収率を達成するために、コリネバクテリウム菌株は、上述の遺伝子産物のいくつか、全て、または組み合わせにおいて、減少または欠失している。ａｃｅＥの遺伝子産物は、ピルベートのアセチルＣｏＡへの反応を触媒する。ｉｌｖＥの遺伝子産物は、２−ケトイソ吉草酸のアミノ酸バリンへのアミノ交換を触媒する（それは１モルのグルタメートを、アミノ交換反応によってアルファ−ケトグルタラートに変換する）。ａｖｔＡの遺伝子産物は、２−ケトイソ吉草酸のアミノ酸バリンへのアミノ交換を触媒する（それは１モルのアラニンを、アミノ交換反応によってピルベートに変換する）。ａｌａＴ遺伝子の遺伝子産物は、ピルベートのアラニンへの反応を触媒する。ｐｑｏの遺伝子産物は、ピルベートのアセテートへの反応を触媒する。ｐｇｉの遺伝子産物は、グルコース−６−ホスフェートからフルクトース−６−ホスフェートへの反応を触媒する。
【００１７】
さらには、コリネバクテリウム菌株は、任意の１つまたはそれより多くの、または全ての以下の好ましくは内生遺伝子ｉｌｖＢＮ（アセトヒドロキシ酸シンターゼを符号化している遺伝子、Ｅ．Ｃ．４．１．３．１８）、ｉｌｖＣ（アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼを符号化している遺伝子、Ｅ．Ｃ．１．１．１．８６）およびｉｌｖＤ（ジヒドロキシ酸デヒドラターゼを符号化している遺伝子、Ｅ．Ｃ．４．２．１．９）を過剰発現することができる。ｉｌｖＢＮ、ｉｌｖＣおよびｉｌｖＤ遺伝子は、ピルベートから２−ケトイソ吉草酸への代謝経路を示す酵素を符号化している。ケトメチルバレレートの生成のために、コリネバクテリウム菌株が、任意の１つまたはそれより多く、または全ての以下の好ましくは内生遺伝子ｉｌｖＡ（トレオニンデヒドラターゼを符号化している遺伝子、Ｅ．Ｃ．４．２．１．１６）、ｈｏｍ（ホモセリンデヒドロゲナーゼを符号化している遺伝子、Ｅ．Ｃ．１．１．１．３）、ｔｈｒＢ  （ホモセリンキナーゼを符号化している遺伝子、Ｅ．Ｃ．２．７．１．３９）、ｔｈｒＣ  （スレオニンシンターゼを符号化している遺伝子、Ｅ．Ｃ．４．２．３．１）、ｌｙｓＣ（アスパルトキナーゼを符号化している遺伝子、Ｅ．Ｃ．２．７．２．４）、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ａａｔ、Ｅ．Ｃ．２．６．１．１）、アスパルテートセミアルデヒド（ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｓｅ）デヒドロゲナーゼ（ａｓｄ、Ｅ．Ｃ．１．２．１．１１）、ピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ、Ｅ．Ｃ．６．４．１．１）を過剰発現することもできる。ケトイソカプロエート生成のために、コリネバクテリウム菌株は任意の１つまたはそれより多く、または全ての以下の好ましくは内生遺伝子  ｌｅｕＡ（２−イソプロピルマレートシンターゼを符号化している遺伝子  （Ｅ．Ｃ．２．３．３．１３）、ｌｅｕＢ（３−イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ、Ｅ．Ｃ．１．１．１．８５）、ｌｅｕＣＤ（３−イソプロピルマレートデヒドラターゼ、Ｅ．Ｃ．４．２．１．３３）を過剰発現することもできる。
【００１８】
特に好ましい実施態様において、菌株コリネバクテリウムは、遺伝子型Δ−ａｃｅＥ、Δ−ｉｌｖＥを有し、且つ遺伝子ｉｌｖＢＮ、ｉｌｖＣおよびｉｌｖＤを過剰発現し、且つ、２−ケトイソ吉草酸の製造のために使用される。
【００１９】
コリネバクテリウムの他に、他の菌株、酵母、並びに真菌微生物、例えば大腸菌、バシラス属、ブレビバクテリウム属、プセウドモナス属、ストレプトミセス属を、本発明の発酵工程のために使用できる。
【００２０】
さらに好ましい実施態様において、培養ブロスをイオン交換段階（ｂ）に適用する前に、細胞および／または細胞破片を培養ブロスから除去する追加的な段階を行い、その際、この除去を好ましくはろ過、遠心分離、沈殿により、または前記方法の組み合わせによる行う。
【００２１】
組み換え技術は当業者に公知である。以下の表は、使用された遺伝子のアクセッション番号を包含する。
【００２２】
【表１】
0005882202.tif 000002
【００２３】
さらには、細胞および／または細胞破片を培養ブロスから除去した後、且つ、段階ｂ）の前に、イオン交換樹脂または炭を使用することによって予備精製を行ってよい。
【００２４】
該方法の好ましい実施態様においては、段階ｂ）においてカチオン樹脂をイオン交換段階のために使用する。この段階は、アミノ酸およびカチオンを除去するために用いられる。好ましくは、カチオン樹脂は、スルホン官能性を有する強酸性交換樹脂、即ち、スルホン酸基を含む樹脂を含む。
【００２５】
さらに好ましい実施態様においては、段階ｃ）においてイオン交換のためにアニオン樹脂を使用する。この段階は、２−ケトカルボン酸（２−オキソカルボン酸）以外の酸を除去するために用いられる。好ましくは、アニオン樹脂は、アミン官能性を有する弱塩基性交換樹脂を含む。所望の生成物は、好ましくは、強酸、好ましくは塩酸を用いて、アニオン樹脂から溶出される。さらに好ましくは、アニオン樹脂からの溶出のための前記酸のモル濃度は、０．１Ｎ〜４Ｎ、さらに好ましくは１Ｎ〜３Ｎ、および最も好ましくは２．５Ｎ〜３Ｎである。
【００２６】
選択的な実施態様においては、段階ｃ）において蒸留、好ましくは蒸気蒸留を実施する。さらに好ましくは、該蒸留を１０〜８５℃、さらに好ましくは２０〜７５℃、さらにより好ましくは２５〜７０℃、および特に好ましくは３５〜６５℃の温度で実施する。
【００２７】
さらに好ましい実施態様においては、蒸留に供された初めの溶液は１〜１０、好ましくは１〜２のｐＨを有する。
【００２８】
該蒸留を好ましくは１０〜１００ｍｂａｒ、さらに好ましくは２０〜８０ｍｂａｒ、さらにより好ましくは２０〜６５ｍｂａｒ、および特に好ましくは２０〜２５ｍｂａｒの圧力で行う。
【００２９】
本発明のさらに好ましい方法においては、沈殿および結晶化段階である段階ｄ）において、２−ケトカルボン酸が、Ｃａ2+、Ｍｇ2+、Ｎａ+、Ｋ+からなる群から選択されるものとの塩として、またはアミノ酸を伴う塩として得られる。特に好ましくは、溶液のｐＨは５．０〜６．０、好ましくは５．５〜６．０に、好ましくはＣａＣＯ3の添加によって設定される。引き続き、該溶液を減圧下で濃縮する。
【００３０】
好ましくは、本発明の方法によって達成される、２−ケトカルボン酸またはその塩の純度は、６０質量％またはそれより高く、さらに好ましくは８０質量％またはそれより高く、最も好ましくは９０％またはそれより高い。
【００３１】
さらに好ましくは、少なくとも５０質量％の２−ケトカルボン酸、好ましくは２−ケトイソバレレートの全体的な収率が達成される。
【００３２】
さらに好ましい実施態様において、発酵用の培地は炭素源として再生可能な原料、好ましくはグルコース、サッカロースの群から選択される原料を含有する。
【００３３】
本発明は、上述の本発明による方法によって得られる、一般式（Ｉ）  Ｒ1−ＣＯ−ＣＯＯＨ  ［式中、Ｒ1は３〜７つの炭素原子を有する分枝アルキル基である］を有する２−ケトカルボン酸、またはその塩、好ましくは２−ケトイソ吉草酸またはそれらの塩であって、６０質量％より高い、好ましくは８０質量％より高い、特に好ましくは９０質量％より高い純度を有するものも提供する。
【００３４】
実施例
実施例１：  ２−ケトイソバレレートの製造  （（ｉ）イオン交換、（ｉｉ）蒸留）
遺伝子型Δ−ａｃｅＥ、Δ−ｉｌｖＥを有し、且つ遺伝子ｉｌｖＢＮ、ｉｌｖＣおよびｉｌｖＤを過剰発現するコリネバクテリウムグルタミクム菌株を、振盪フラスコ内でＬＢ培地を用い、定常相に達するまで培養した。培地は炭素源および窒素源を含有していた。培養ブロスを遠心分離して細胞および細胞破片を除去した。培養ブロスの上澄みは、ｐＨ６．７を有し、且つ、５ｇ／ｌの２−ケトイソバレレートを含有した。
【００３５】
引き続き、その上澄みを強カチオン樹脂（アンバーライト  ＦＰＣ  ２２Ｎａ）上で浸出させて、アミノ酸およびカチオン（主にＮａ+）を除去した。この段階のために、培養ブロス（上澄み）１０００ｍｌあたり３５０ｍｌの樹脂体積が使用された。その後、該樹脂を１体積のＨ2Ｏを用いて洗浄し、そして溶出液留分を、ブリックス０．１未満（水溶液１００部あたり（糖として）溶解された固体の、屈折計による濃度測定）に達するまで収集した。
【００３６】
ブリックス７を有する溶出液をビュッヒ（Ｂｕｅｃｈ）蒸発器にて、６０℃の温度および２０〜２５ｍｂａｒの圧力で濃縮した。その受領物（ｒｅｃｅｉｐｔ）を、もはやさらなる蒸留が生じなくなるまで収集し、且つ、油性の残留物が得られた。その油性の残留物をＨ2Ｏと共に添加し、且つ、もはや蒸留が生じなくなるまで濃縮を継続した。この段階を、関連の蒸留受領物が全体的に０．１未満のブリックスを有するまで、何度も繰り返した。
【００３７】
引き続き、蒸留からの全ての受領物を貯め、且つ、ｐＨ５．５〜６．０に到達するまでＣａＣＯ3を添加した。該溶液を１〜５時間、２−ケトイソバレレートの質量あたり２質量％の活性炭を使用して脱色した。その後、該溶液を０．４５μｍのメンブレンを通してろ過して、炭を除去した。
【００３８】
ろ液を、ビュッヒの蒸発器にて４０〜４５℃の温度および２０〜２５ｍｂａｒの圧力で、結晶の懸濁液が得られるまで濃縮した。該懸濁液をゆっくりと２０℃まで冷却し、そして２０℃で少なくとも１時間後、結晶をガラス製漏斗にてろ過し、そしてＨ2Ｏを用いて洗浄した。
【００３９】
湿ったケークを真空下、４０〜４５℃の温度で、一定の質量に到達するまで乾燥し、引き続き、２−ケトイソバレレートのＣａ2+塩として分析した。ＨＰＬＣによる分析は、前記２−ケトイソバレレート塩の純度が９０質量％より高いことを示した（表１参照）。
【００４０】
表１：  実施例１によって得られた２−ケトイソバレレートの純度
【表２】
0005882202.tif 000003
【００４１】
実施例２：  ２−ケトイソバレレートの製造  （（ｉ）カチオンイオン交換、（ｉｉ）アニオンイオン交換）
遺伝子型Δ−ａｃｅＥ、Δ−ｉｌｖＥを有し、且つ遺伝子ｉｌｖＢＮ、ｉｌｖＣおよびｉｌｖＤを過剰発現するコリネバクテリウムグルタミクム菌株を、振盪フラスコ内でＬＢ培地を用い、定常相に達するまで培養した。培地は炭素源および窒素源を含有していた。培養ブロスを遠心分離して細胞および細胞破片を除去した。培養ブロスの上澄みは、ｐＨ６．７を有し、且つ、５ｇ／ｌの２−ケトイソバレレートを含有していた。
【００４２】
その後、その上澄みを強カチオン樹脂（アンバーライト  ＦＰＣ  ２２Ｎａ）上で浸出させて、アミノ酸およびカチオン（主にＮａ+）を除去した。この段階のために、培養ブロス（上澄み）１０００ｍｌあたり３５０ｍｌの樹脂体積が使用された。その後、該樹脂を１体積のＨ2Ｏを用いて洗浄し、且つ、溶出液留分を、ブリックス０．１未満に到達するまで収集した。
【００４３】
ブリックス７を有する溶出液を、弱アニオン樹脂(アンバーライト  ＩＲＡ−６７）にて浸出させて、塩基性の不純物を除去した。この段階のために、培養ブロス（上澄み）１０００ｍｌあたり７５０ｍｌの樹脂体積が使用された。その後、該樹脂を、ＨＣｌ  ２．７Ｎを用いて溶出し、そして分析が塩化物の出現を示すまで、溶出液留分を収集した。
【００４４】
引き続き、塩化物のない留分を貯め、且つ、ｐＨ５．５〜６．０に到達するまでＣａＣＯ3を添加した。該溶液を１〜５時間、２−ケトイソバレレートの質量あたり２質量％の活性炭を使用して脱色した。その後、該溶液を０．４５μｍのメンブレンを通してろ過して、炭を除去した。
【００４５】
ろ液を、ビュッヒの蒸発器にて４０〜４５℃の温度および２０〜２５ｍｂａｒの圧力で、結晶の懸濁液が得られるまで濃縮した。該懸濁液をゆっくりと２０℃まで冷却し、そして２０℃で少なくとも１時間後、結晶をガラス製漏斗にてろ過し、そしてＨ2Ｏを用いて洗浄した。
【００４６】
湿ったケークを真空下、４０〜４５℃の温度で、一定の質量に到達するまで乾燥させ、引き続き、２−ケトイソバレレートのＣａ2+塩として分析した。ＨＰＬＣによる分析は、前記２−ケトイソバレレート塩の純度が８５質量％より高いことを示した（表２参照）。
【００４７】
表２：  実施例２によって得られた２−ケトイソバレレートの純度
【表３】
0005882202.tif 000004
【００４８】
実施例３
イオン交換処理をしない２−ケトイソバレレートの製造（ＤＳＰ部）
実施例１および２に従い、コリネバクテリウムグルタミクム菌株を発酵させた。発酵工程が終わったら、培養ブロスの上澄み（２７０Ｌ、ｐＨ２．６、４０ｇ／ｌの２−ケトイソバレレートを含有）を、８．２ｋｇのＮａＯＨ  ５０％を用いてｐＨ７．５に調節し、且つ、ブリックス４０（１０５ｇ／ｌの２−ケトイソバレレート）まで濃縮し（二重ジャケット反応器、７０℃、４０〜５０ｍｂａｒ）、その後２９．７ｋｇのＨ2ＳＯ4  ３０％を用いて、ｐＨ＜１．０へと酸性化した。
【００４９】
酸性化された溶液を、二重ジャケット反応器にて、温度７０℃および圧力４０〜５０ｍｂａｒで濃縮した。その受領物を、もはやさらなる蒸留が生じなくなるまで収集し、且つ、油性の残留物が得られた。油性の残留物を１０ＬのＨ2Ｏと共に添加し、且つ、もはや蒸留が生じなくなるまで濃縮を継続した。この段階を、関連の蒸留受領物が全体的に０．５未満のブリックスを有するまで、何度も繰り返した。
【００５０】
引き続き、蒸留からの全ての受領物（２３０Ｌ）を貯め、そして、ｐＨ４．５に到達するまで３．５ｋｇのＣａＣＯ3を添加した。該溶液を１〜５時間、２−ケトイソバレレートの質量あたり２質量％の活性炭を使用して脱色した。その後、該溶液を、フィルタープレスを通してろ過して、炭を除去した。
【００５１】
二重ジャケット反応器にて、生成物温度３５〜４５℃、且つ圧力４０〜５０ｍｂａｒで、結晶の懸濁液が得られるまでろ液を濃縮した。該懸濁液をゆっくりと２０℃まで冷却し、そして２０℃で少なくとも１時間後、結晶を遠心分離し、そしてＨ2Ｏを用いて洗浄した。
【００５２】
湿ったケークを真空下、４０〜４５℃の温度で、一定の質量（５．１ｋｇ）に到達するまで乾燥し、引き続き、２−ケトイソバレレートのＣａ2+塩として分析した。ＨＰＬＣによる分析は、前記２−ケトイソバレレート塩の純度が９９質量％より高いことを示した（表３参照）。
【００５３】
表３：  この実施例によって得られた２−ケトイソバレレートの純度
【表４】
0005882202.tif 000005