(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列を有する親プロテアーゼの単離プロテアーゼ変異体を含む組成物であって、前記変異体が、親プロテアーゼと比較して、アミノ酸置換：Ｓ０２４Ｇ＋Ｓ０５３Ｇ＋Ｓ０７８Ｎ＋Ｓ１０１Ｎ＋Ｇ１２８Ａ＋Ｙ２１７Ｑと、Ａ１１６Ｔ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ２４３Ｖ、Ｇ０２４Ｅ−Ａ１１６Ｔ、Ｋ０４３Ｙ、Ｎ０７６Ｄ−Ａ１１６Ｔ、Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ０３３Ｔ−Ｓ０６３Ｇ、Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ００１Ｅ−Ｓ２４９Ａ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１２８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ、Ａ０８８Ｔ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｓ２４９Ａ、Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ、Ａ１２８Ｓ、Ａ１２８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１２８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ１２８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ１２８Ｓ−Ｔ１５８Ｓ、Ｇ０２４Ｅ−Ａ０８８Ｔ、Ｇ０２４Ｅ−Ａ１２８Ｓ、Ｇ０２４Ｅ−Ｇ１３１Ｈ、Ｇ０２４Ｅ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ０２４Ｅ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ０２４Ｅ−Ｎ２１８Ｓ、Ｇ０２４Ｅ−Ｎ２４３Ｖ、Ｇ０２４Ｅ−Ｓ１６２Ｇ、Ｇ０２４Ｅ−Ｓ２４９Ａ、Ｇ０２４Ｅ−Ｔ１５８Ｓ、Ｇ１３１Ｈ、Ｇ１３１Ｈ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４９Ａ、Ｋ０４３Ｙ−Ａ０８８Ｔ、Ｋ０４３Ｙ−Ａ１１６Ｔ、Ｋ２５６Ｒ、Ｎ０７６Ｄ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ、Ｎ１０９Ｇ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ２４３Ｖ、Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４９Ａ、Ｑ１０３Ｈ−Ａ１２８Ｓ、Ｑ１０３Ｈ−Ｇ１３１Ｈ、Ｑ１０３Ｈ−Ｋ２５６Ｒ、Ｑ１０３Ｈ−Ｌ２５７Ｇ、Ｑ１０３Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ｑ１０３Ｈ−Ｓ２４８Ｎ、Ｑ１０３Ｈ−Ｓ２４９Ａ、Ｑ１０３Ｈ−Ｔ１５８Ｓ、Ｑ２０６Ｄ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ０３３Ｔ−Ａ１２８Ｓ、Ｓ０３３Ｔ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ０７６Ｄ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ２１８Ｓ、Ｓ０３３Ｔ−Ｓ２４８Ｎ、Ｓ０３３Ｔ−Ｔ１５８Ｓ、Ｓ０６３Ｇ−Ａ１２８Ｓ、Ｓ０６３Ｇ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０６３Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ０６３Ｇ−Ｓ１６２Ｇ、Ｓ０６３Ｇ−Ｔ１５８Ｓ、Ｓ１６２Ｇ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ２４９Ａ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、およびＴ１５８Ｓ−Ｓ２４９Ａからなる群から選択される少なくとも１組の追加のアミノ酸置換とを含むアミノ酸配列を含み、前記変異体がタンパク質分解活性を有し、かつ前記変異体の各アミノ酸配列が、前記変異体のアミノ酸配列を配列番号２とアライメントさせることにより決定されるものとして、親プロテアーゼにおけるアミノ酸位置に対応させて番号付けされ、前記単離プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列が、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する、組成物。
【請求項２】
前記プロテアーゼ変異体が、配列番号２の親プロテアーゼに対し−１、０又は＋１の合計正味電荷を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物が、界面活性剤、ビルダー、キレート剤、移染防止剤、分散剤、１以上の追加の酵素、酵素安定剤、触媒材料、漂白活性剤、過酸化水素、過酸化水素供給源、予形成過酸、ポリマー分散剤、粘度汚れ除去／再付着防止剤、増白剤、抑泡剤、染料、香料、香料送達系、構造弾性化剤、布地用柔軟剤、担体、屈水性誘発物質、加工助剤、溶媒、顔料、及びこれらの混合物からなる群から選択される補助剤成分を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が、サブチリシン（ＥＣ３．４．２１．６２）プロテアーゼを免疫当量ではない第２のプロテアーゼとして含み、ここで前記サブチリシン（ＥＣ３．４．２１．６２）プロテアーゼは冷水ＧＧ３６変異体プロテアーゼである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、セロビオース脱水素酵素、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、リケナーゼグルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、及びこれらの混合物から選択される追加の酵素を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が洗剤組成物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、冷水プロテアーゼ（cold water protease）を含む布地ケア製品及びホームケア製品、並びに布地ケア製品及びホームケア製品の製造方法及び使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
洗剤製造業者は、製品中にプロテアーゼを組み込むことで、良好な染み（血液などの）クリーニングを提供する。しかしながら、持続力、並びにより低い洗浄温度が好まれるという消費者動向を前提とすると、消費者の期待に沿うような利益を提供することが次第に困難になりつつあり、これらの洗濯洗剤組成物のクリーニング特性及び洗いたて特性の改善が必要とされたままである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明者らは、布地ケア製品及びホームケア製品（例えば、色相剤（hueing agent）、洗浄用ポリマー及び／又は香料カプセルを含む、洗濯洗剤組成物）に更に特定の冷水プロテアーゼを組み込むことで、白色度、知覚される白色度、及び／又は洗いたて感が改善されることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、１以上の冷水プロテアーゼを含む布地ケア製品及びホームケア製品、並びにこのような製品の製造及び使用プロセスに関する。このような組成物は、改善されたクリーニング特性及び洗いたて特性を提供する。このような冷水プロテアーゼは、サブチリシンＢＰＮ’及びＢａｃｉｌｌｕｓ  Ｌｅｎｔｕｓから誘導されるサブチリシンを含む、親酵素のアミノ酸を１つ以上置換、挿入及び／又は欠失させることで、親酵素から誘導することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】ｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’−ｖ３のプラスミドマップを提供する。
【図２】ｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’−ｖ３＋Ｓ７８Ｎのプラスミドマップを提供する。
【図３】ｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’ｐａｒｔｉａｌ  ｏｐｔのプラスミドマップを提供する。
【図４】ｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’−ｖ３６のプラスミドマップを提供する。
【図５】ＢＰＮ’（配列番号２）及びＧＧ３６（配列番号７５５）を含む参照成熟サブチリシンプロテアーゼのアライメントを提供する。各種冷水プロテアーゼ変異体が挙げられる、本明細書に記載の各種プロテアーゼ変異体の各アミノ酸位置は、図５に示されるように、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓのサブチリシンプロテアーゼＢＰＮ’のアミノ酸配列とアライメントすることで決定されるものとして、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓのサブチリシンプロテアーゼＢＰＮ’（配列番号２）のアミノ酸配列中の対応するアミノ酸位置の番号付けに従い番号付けされる。したがって、本明細書において別段の記載のない限り、置換位置はＢＰＮ’との関係で与えられる。
【図６】ｐＨＰＬＴ−ＧＧ３６のプラスミドマップを提供する。
【図７】ｐＲＡ６８のプラスミドマップを提供する。
【図８】ｐＲＡ９６のプラスミドマップを提供する。
【図９】ｐＡＣ−ＦＮＡｒｅのプラスミドマップを提供する。
【図１０】方法又は対象とするＩＳＤライブラリ構築の略図。
【図１１】ｐＡＣ−ＦＮＡ１０のプラスミドマップを提供する。
【図１２】ｐＨＰＬＴ−ＦＮＡのプラスミドマップを提供する。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
定義
本明細書で使用するとき、「布地用及び家庭用製品」は、概して販売されている形態で使用又は消費されることが意図され、布地、硬質面並びに布地ケア及びホームケアの領域の任意の他の表面を処理（例えば、エア・フレッシュナー及び香り送達系を含む空気ケア、車ケア、食器洗浄、布地コンディショニング（柔軟化及び／又はフレッシュニングを含む）、洗濯洗浄、洗濯時及びすすぎ時添加剤及び／又はケア剤、フロアクリーナー及び便器クリーナーが挙げられる硬質面洗浄剤及び／又は処理剤、並びに他の消費者又は組織用途の洗浄が挙げられる）するための製品又はデバイスを意味する。
【０００７】
本明細書で使用するとき、用語「クリーニング及び／又は処理組成物」は、別途記載のない限り、布地ケア製品及びホームケア製品を含む布地ケア製品及びホームケア製品の部分集合である。このような製品としては、限定するものではないが、布地、硬質面並びに布地ケア及びホームケアの領域の任意の他の表面処理用の製品（例えば、エア・フレッシュナー及び香り送達系などの空気ケア、車ケア、食器洗浄、布地コンディショニング（柔軟化及び／又はフレッシュニングが挙げられる）、洗濯洗浄、洗濯時及びすすぎ時添加剤及び／又はケア剤、硬質表面洗浄及び／又は処理剤、（床及び便器クリーナー）、顆粒又は粉末形態の多目的又は「ヘビーデューティー」洗浄剤、特にクリーニング用洗剤、液体、ゲル、又はペースト形態の多目的洗浄剤、特にいわゆるヘビーデューティー液体型、おしゃれ着用（fine-fabric）液体洗剤、食器手洗い用洗剤又はライトデューティー食器洗浄剤、特に高起泡型のもの、食洗機用食器洗浄剤（家庭用及び業務用の、様々な錠剤型、粒剤型、液剤型及びすすぎ助剤型洗浄剤）：車又はカーペット洗浄剤、便器クリーナーを含む風呂場クリーナー、並びにクリーニング助剤（漂白剤及び「染み抜きスティック」又は前処理型、又は乾燥機用シート（dryer added sheet）などの、基材に負担をかける製品（substrate-laden product））が挙げられる。
【０００８】
本明細書で使用するとき、用語「布地及び／若しくは硬質表面洗浄及び／又は処理組成物」は、別途記載のない限り、顆粒又は粉末状の多目的すなわち「ヘビーデューティー」洗浄剤、特にクリーニング用洗剤、液体、ゲル、又はペースト形態の多目的洗浄剤、特にいわゆるヘビーデューティー液体型、おしゃれ着用液体洗剤、食器手洗い用洗浄剤又はライトデューティー食器洗浄剤、特に高起泡型のもの、家庭用及び業務用の各種の錠剤型、粒剤型、液剤型、及びすすぎ補助剤型を含む食洗機用洗剤、液体洗浄剤及び殺菌剤、車又はカーペット洗浄剤、便器クリーナーを含む浴室クリーナー、液体、固体、及び／又は乾燥機用シート形態であり得る柔軟化及び／又はフレッシュニングを含む布地コンディショニング製品、並びにクリーニング助剤（漂白剤及び「染み抜きスティック」又は前処理型、又は乾燥機用シート（dryer added sheet）などの、基材に負担をかける製品（substrate-laden product））が挙げられる洗浄及び処理組成物の部分集合である。適用可能であるこのような製品のすべては、標準形態又は濃縮形態であり得、又は特定の態様では、このような製品は、更には非水性であり得る程度に高濃縮された形態であり得る。
【０００９】
本明細書で使用するとき、「ａ」及び「ａｎ」のような冠詞は、特許請求の範囲で使用されるときには、１つ以上の請求又は記載されるものを意味するものと理解される。
【００１０】
本明細書で使用するとき、用語「包含する（include）」、「包含する（includes）」及び「包含している（including）」は、非限定的であるように意味される。
【００１１】
本明細書で使用するとき、用語「固体」は、顆粒、粉末、塊、及び錠剤の製品形態を包含する。
【００１２】
本明細書で使用するとき、用語「流体」は、液体、ゲル、ペースト及びガスの製品形態を包含する。
【００１３】
本明細書で使用する時、用語「部位」は、布地、衣類及び硬質面を包含する。
【００１４】
特記しない限り、成分又は組成物の濃度はすべて、当該成分又は組成物の活性部分に関するものであり、このような成分又は組成物の市販の供給源に存在し得る不純物、例えば残留溶媒又は副生成物は除外される。
【００１５】
百分率及び比率はすべて、特に指示しない限り、重量で計算される。百分率及び比率はすべて、特に指示しない限り、組成物全体を基準にして計算される。
【００１６】
本明細書全体にわたって記載されるあらゆる最大数値限定は、それより小さいあらゆる数値限定を、そのような小さい数値限定が本明細書に明示的に記載されたものとして包含すると理解されるべきである。本明細書全体を通じて記載される最小数値限定は、それより大きいあらゆる数値限定を、そのような大きい数値限定が本明細書に明確に記載されているかのように包含する。本明細書全体を通して記載される数値範囲は、そのようなより広い数値範囲内に入るそれよりも狭いあらゆる数値範囲を、そのようなより狭い数値範囲がすべて本明細書に明確に記載されているかのように包含する。
【００１７】
１以上のプロテアーゼを含む布地ケア製品及びホームケア製品
プロテアーゼ及び１以上の補助成分を含む組成物であって、このプロテアーゼは以下のものからなる群から選択され、この組成物は布地ケア製品及びホームケア製品である、組成物：
ａ）試験方法２及び／又は試験方法３で定義される、配列番号４を有する酵素と比較したときに、ｐＨ  ８及び１６℃（６０°Ｆ）下でのＢＭＩで、１超、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１〜約１０、１〜約８又は更には１〜約５の性能指数を有する、冷水プロテアーゼ、
ｂ）試験方法２及び／又は試験方法３で定義される、配列番号６を有する酵素と比較したときに、ｐＨ  ８及び１６℃（６０°Ｆ）下でのＢＭＩで、少なくとも１、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１〜約１０、１〜約８又は更には１〜約５の性能指数を有する、冷水プロテアーゼ、
ｃ）以下のものからなる群から選択される冷水プロテアーゼ：
（ｉ）親プロテアーゼの変異体：この親プロテアーゼは配列番号４と少なくとも６０％、又は８０％、又は８５％、又は９０％、又は９５％、又は９６％、又は９７％、又は９８％、又は９９％、又は更には１００％の同一性を有し、この変異体は次の変異群から選択される変異群を含む：Ｐ２１０Ｓ、Ｐ２１０Ｓ−Ｎ２１８Ａ、Ｓ０６３Ｔ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ａ−Ｓ１８３Ｔ−Ｔ２４４Ｎ、Ｎ０６１Ａ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ２２４Ａ、Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｐ１２９Ｔ−Ｑ１８５Ｔ、Ｓ０６３Ｔ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ａ、Ｓ０７８Ｎ−Ｐ１２９Ｔ、Ｓ０６３Ｔ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ａ−Ｓ１８３Ｔ及びＳ０６３Ｔ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ａ−Ｔ２４４Ｉ、
（ｉｉ）親プロテアーゼの変異体：この親プロテアーゼは配列番号２と少なくとも６０％、又は８０％、又は８５％、又は９０％、又は９５％、又は９６％、又は９７％、又は９８％、又は９９％、又は更には１００％の同一性を有し、この変異体は次の変異群から選択される変異群を含む：
Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ１６７Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｖ２０３Ｙ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ｓ−Ｖ２０３Ｙ−Ｙ２１７Ｑ、Ｖ０６８Ａ−Ａ０９２Ｇ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｉ１１１Ｖ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０３８Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４９Ｎ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ及びＳ２４Ｇ−Ｓ５３Ｇ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、
（ｉｉｉ）親プロテアーゼの変異体：この親プロテアーゼは配列番号２と少なくとも６０％、又は８０％、又は８５％、又は９０％、又は９５％、又は９６％、又は９７％、又は９８％、又は９９％、又は更には１００％の同一性を有し、この変異体は、次の変異、Ｘ２４Ｇ／Ｒ、Ｘ５３Ｇ、Ｘ７８Ｎ、Ｘ１０１Ｎ、Ｘ１２８Ａ／Ｓ及びＸ２１７Ｌ／Ｑを３つ、４つ、５つ、又は６つ含み、次の変異群から選択される変異群を少なくとも１つ含んでいてもよい：
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Ｒ−Ｌ２５７Ｇ−Ｑ２７１Ｈ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｖ１４３Ａ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｉ２３４Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｖ１４３Ｆ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ１１６Ｔ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｖ１４９Ｉ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｑ２７１Ｈ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｉ２６８Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｇ２１１Ｖ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｑ２７５Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ａ１３７Ｖ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２３７Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ１４５Ｆ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｑ２７１Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｉ２６８Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｓ−Ａ１１６Ｔ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ２１８Ｓ、Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｓ１０５Ｐ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ２４８Ｎ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｓ０１８Ｆ−Ｓ１６２Ｌ、Ｓ０１８Ｐ−Ｄ１２０Ｎ、Ｐ０１４Ｔ−Ｓ０３７Ｔ、Ｓ００９Ｔ−Ｋ１４１Ｒ、Ｓ１６１Ｐ−Ｓ１６２Ｌ、Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１４Ｓ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１４Ｓ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ１８３Ｌ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ１８３Ｖ、Ｎ１０９Ｍ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｓ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｍ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ６３Ｇ−Ａ１２８Ｓ、Ｎ１０９Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ６１Ｓ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０１Ｑ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ、Ｎ６１Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｐ１２９Ｓ−Ｓ１３０Ｔ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｎ−Ｑ２１７Ｌ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｒ−Ｑ２１７Ｅ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｌ−Ｑ２１７Ｌ、Ｓ０６３Ｇ、Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｌ、Ｓ０６３Ｎ及びＳ０６３Ｎ−Ｑ２１７Ｌ、
ｄ）以下のものからなる群から選択される冷水プロテアーゼ：
（ｉ）親プロテアーゼの変異体：この親プロテアーゼは配列番号４と少なくとも６０％、又は８０％、又は８５％、又は９０％、又は９５％、又は９６％、又は９７％、又は９８％、又は９９％、又は更には１００％の同一性を有し、この変異体は次の変異群から選択される変異群を含む：Ｅ１５６Ｓ−Ｐ２１０Ｓ、Ｐ２１０Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ｙ１０４Ｆ−Ｅ１５６Ｓ−Ｐ２１０Ｉ、Ｅ１５６Ａ−Ｐ２１０Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ｎ２１８Ａ、Ｎ０６１Ａ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ０８７Ｅ−Ｓ２２４Ａ、Ｑ０５９Ｖ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ２１１Ａ、Ｑ０５９Ｖ−Ｓ０７８Ｎ−Ｖ１４７Ｑ、Ｑ０５９Ｖ−Ｓ０７８Ｎ、Ｑ０５９Ｖ−Ｓ０７８Ｎ−Ｉ１０８Ｖ−Ｎ２５２Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｐ１２９Ｔ、Ｓ０７８Ｎ−Ｇ２１１Ａ、Ｓ０７８Ｎ−Ｑ１８５Ｔ、Ｓ０７８Ｎ−Ｖ１４７Ｑ、Ｓ０７８Ｎ、Ｓ０７８Ｎ−Ｓ２２４Ａ、Ｓ０７８Ｎ−Ｓ２２４Ａ−Ａ２７４Ｄ、Ｓ０７８Ｎ−Ｉ１０８Ｖ−Ｖ１４７Ｑ、Ｎ０６１Ａ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ２２４Ａ、Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｐ１２９Ｔ−Ｑ１８５Ｔ及びＳ０７８Ｎ−Ｐ１２９Ｔ、
（ｉｉ）親プロテアーゼの変異体：この親プロテアーゼは配列番号２と少なくとも６０％、又は８０％、又は８５％、又は９０％、又は９５％、又は９６％、又は９７％、又は９８％、又は９９％、又は更には１００％の同一性を有し、この変異体は次の変異群から選択される変異群を含む：Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｉ１１１Ｖ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ１６７Ａ、Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｌ０９６Ｔ−Ｇ０９７Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ｓ−Ｖ２０３Ｙ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０８９Ｙ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｖ０６８Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ、Ｇ０９７Ａ−Ｌ１２６Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｉ１１１Ｖ−Ｙ１６７Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｍ１２４Ｖ−Ｙ１６７Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｐ０５２Ｌ−Ｖ０６８Ａ−Ｇ０９７Ａ、Ｓ０８９Ｙ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ、Ｖ０６８Ａ−Ａ０９２Ｇ−Ｇ０９７Ａ、Ｖ０６８Ａ−Ａ０９２Ｇ−Ｉ１１１Ｖ、Ｖ０６８Ａ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ、Ｖ０６８Ａ−Ｓ０８９Ｙ−Ｉ１１１Ｖ、Ｙ１０４Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ｓ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｎ１２３Ｑ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｎ１２３Ｑ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｎ１２３Ｑ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｎ１２３Ｑ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ１０２Ａ−Ｐ１２９Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１００Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１００Ｎ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１００Ｑ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ１０２Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｐ１２９Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６２Ｑ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｎ１２３Ｑ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１００Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１０２Ａ−Ｐ１２９Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｍ１２４Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ１０２Ａ−Ｐ１２９Ｓ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ１０２Ａ−Ｐ１２９Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１００Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１０２Ａ−Ｐ１２９Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｍ１２４Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１００Ｄ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１００Ｑ−Ｓ１０１Ｎ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１００Ｑ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ１００Ｎ−Ｇ１０２Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１００Ｎ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｍ１２４Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｍ１２４Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｎ１２３Ｑ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｉ０３５Ｖ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｓ１３０Ｇ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０３８Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ、Ｓ０２４Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ａ１１６Ｓ−Ｇ１２８Ａ、Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０３８Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４９Ｎ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ及びＴ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、
（ｉｉｉ）親プロテアーゼの変異体：この親プロテアーゼは配列番号２と少なくとも６０％、又は８０％、又は８５％、又は９０％、又は９５％、又は９６％、又は９７％、又は９８％、又は９９％、又は更には１００％の同一性を有し、この変異体は次の変異、Ｘ２４Ｇ／Ｒ、Ｘ５３Ｇ、Ｘ７８Ｎ、Ｘ１０１Ｎ、Ｘ１２８Ａ／Ｓ及びＸ２１７Ｌ／Ｑを３つ、４つ、５つ、又は６つ含み、この変異体は、次の変異群から選択される変異群を少なくとも１つ含んでいてもよい：Ａ００１Ｇ、Ａ００１Ｙ、Ａ０１３Ｇ、Ａ０１３Ｖ、Ａ０１５Ｆ、Ａ０１５Ｇ、Ａ０１５Ｋ、Ａ０１５Ｍ、Ａ０１５Ｐ、Ａ０１５Ｔ、Ａ０１５Ｗ、Ａ０１５Ｙ、Ａ０２９Ｇ、Ａ０７３Ｓ、Ａ０８８Ｃ、Ａ０８８Ｉ、Ａ０８８Ｌ、Ａ０８８Ｔ、Ａ０８８Ｖ、Ａ０９８Ｄ、Ａ０９８Ｋ、Ａ０９８Ｐ、Ａ０９８Ｒ、Ａ０９８Ｗ、Ａ１１６Ｄ、Ａ１１６Ｅ、Ａ１１６Ｒ、Ａ１２８Ｓ、Ａ１３３Ｌ、Ａ１３３Ｍ、Ａ１３３Ｓ、Ａ１３４Ｇ、Ａ１３４Ｓ、Ａ１３７Ｎ、Ａ１３７Ｖ、Ａ１４４Ｍ、Ａ１４４Ｑ、Ａ１４４Ｓ、Ａ１４４Ｔ、Ａ１４４Ｖ、Ａ１５１Ｃ、Ａ１７６Ｓ、Ａ１７６Ｔ、Ａ１７９Ｓ、Ａ２１６Ｇ、Ａ２１６Ｌ、Ａ２１６Ｐ、Ａ２１６Ｑ、Ａ２１６Ｓ、Ａ２１６Ｔ、Ａ２１６Ｙ、Ａ２２８Ｔ、Ａ２３０Ｃ、Ａ２３１Ｃ、Ａ２７２Ｉ、Ａ２７２Ｌ、Ａ２７２Ｑ、Ａ２７２Ｓ、Ａ２７２Ｔ、Ａ２７２Ｗ、Ａ２７３Ｓ、Ａ２７４Ｇ、Ａ２７４Ｌ、Ａ２７４Ｑ、Ａ２７４Ｔ、Ａ２７４Ｖ、Ｄ０４１Ｅ、Ｄ０９９Ｇ、Ｄ０９９Ｎ、Ｄ１２０Ａ、Ｄ１２０Ｋ、Ｄ１２０Ｑ、Ｄ１２０Ｒ、Ｄ１２０Ｓ、Ｄ１４０Ｅ、Ｄ１８１Ｓ、Ｄ２５９Ｅ、Ｅ０５４Ｄ、Ｅ１５６Ｄ、Ｅ１５６Ｔ、Ｅ２５１Ｖ、Ｆ２６１Ｇ、Ｆ２６１Ｈ、Ｆ２６１Ｌ、Ｆ２６１Ｒ、Ｆ２６１Ｓ、Ｆ２６１Ｔ、Ｆ２６１Ｖ、Ｆ２６１Ｗ、Ｇ００７Ａ、Ｇ００７Ｓ、Ｇ０２０Ａ、Ｇ０２０Ｄ、Ｇ０２０Ｓ、Ｇ０２４Ｎ、Ｇ０２４Ｒ、Ｇ０２４Ｓ、Ｇ０２４Ｔ、Ｇ０２４Ｖ、Ｇ０２４Ｗ、Ｇ０５３Ｈ、Ｇ０５３Ｋ、Ｇ０５３Ｎ、Ｇ０５３Ｔ、Ｇ０９７Ａ、Ｇ０９７Ｄ、Ｇ０９７Ｔ、Ｇ１３１Ａ、Ｇ１３１Ｈ、Ｇ１３１Ｐ、Ｇ１３１Ｑ、Ｇ１３１Ｔ、Ｇ１３１Ｖ、Ｇ１６０Ｈ、Ｇ１６０Ｐ、Ｇ１６６Ａ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６６Ｔ、Ｇ２１１Ａ、Ｇ２１１Ｄ、Ｇ２１１Ｍ、Ｇ２１１Ｎ、Ｇ２１１Ｐ、Ｇ２１１Ｑ、Ｇ２１１Ｒ、Ｇ２１１Ｗ、Ｇ２１５Ａ、Ｇ２１５Ｎ、Ｇ２１５Ｖ、Ｈ０１７Ｌ、Ｈ０１７Ｍ、Ｈ０１７Ｔ、Ｈ０１７Ｖ、Ｈ０１７Ｙ、Ｈ０３９Ａ、Ｈ０３９Ｃ、Ｈ０３９Ｎ、Ｈ２２６Ｆ、Ｈ２２６Ｉ、Ｈ２２６Ｍ、Ｈ２２６Ｓ、Ｈ２２６Ｖ、Ｈ２２６Ｙ、Ｉ０３５Ｖ、Ｉ０７９Ａ、Ｉ０７９Ｓ、Ｉ０７９Ｔ、Ｉ０７９Ｖ、Ｉ０７９Ｗ、Ｉ１０８Ｖ、Ｉ１１５Ｌ、Ｉ１２２Ａ、Ｉ２３４Ｌ、Ｉ２３４Ｖ、Ｋ０１２Ｒ、Ｋ０２７Ｒ、Ｋ１３６Ｒ、Ｋ１４１Ｆ、Ｋ２１３Ｗ、Ｋ２３７Ｒ、Ｋ２５６Ｒ、Ｋ２６５Ｑ、Ｌ０１６Ａ、Ｌ０１６Ｆ、Ｌ０１６Ｉ、Ｌ０１６Ｓ、Ｌ０１６Ｖ、Ｌ０４２Ｉ、Ｌ０７５Ａ、Ｌ０７５Ｍ、Ｌ０７５Ｑ、Ｌ０７５Ｖ、Ｌ０７５Ｙ、Ｌ０８２Ｋ、Ｌ０８２Ｍ、Ｌ０８２Ｑ、Ｌ０８２Ｖ、Ｌ０９０Ｉ、Ｌ１９６Ｉ、Ｌ１９６Ｖ、Ｌ２０９Ｑ、Ｌ２０９Ｗ、Ｌ２３３Ａ、Ｌ２３３Ｑ、Ｌ２３３Ｖ、Ｌ２３５Ｉ、Ｌ２３５Ｋ、Ｌ２５０Ｉ、Ｌ２５７Ａ、Ｌ２５７Ｈ、Ｌ２５７Ｑ、Ｌ２５７Ｓ、Ｌ２５７Ｙ、Ｌ２６７Ｑ、Ｌ２６７Ｒ、Ｌ２６７Ｓ、Ｌ２６７Ｔ、Ｍ１９９Ｖ、Ｎ０２５Ｆ、Ｎ０２５Ｇ、Ｎ０２５Ｈ、Ｎ０２５Ｋ、Ｎ０２５Ｌ、Ｎ０２５Ｍ、Ｎ０２５Ｓ、Ｎ０２５Ｙ、Ｎ０６１Ｆ、Ｎ０６１Ｈ、Ｎ０６１Ｐ、Ｎ０６１Ｓ、Ｎ０６１Ｔ、Ｎ０６１Ｖ、Ｎ０６１Ｗ、Ｎ０７６Ｇ、Ｎ０７６Ｗ、Ｎ０７８Ｓ、Ｎ０７８Ｔ、Ｎ０７８Ｖ、Ｎ１０１Ａ、Ｎ１０１Ｈ、Ｎ１０１Ｌ、Ｎ１０１Ｔ、Ｎ１０９Ｋ、Ｎ１０９Ｒ、Ｎ１１７Ａ、Ｎ１１７Ｅ、Ｎ１１７Ｈ、Ｎ１１７Ｋ、Ｎ１１８Ｇ、Ｎ１８４Ｇ、Ｎ１８４Ｈ、Ｎ１８４Ｉ、Ｎ１８４Ｓ、Ｎ１８４Ｖ、Ｎ２１２Ａ、Ｎ２１２Ｆ、Ｎ２１２Ｉ、Ｎ２１２Ｋ、Ｎ２１２Ｐ、Ｎ２１２Ｑ、Ｎ２１２Ｓ、Ｎ２１２Ｙ、Ｎ２１８Ａ、Ｎ２１８Ｈ、Ｎ２１８Ｌ、Ｎ２１８Ｓ、Ｎ２４０Ｅ、Ｎ２４０Ｈ、Ｎ２４０Ｌ、Ｎ２４０Ｒ、Ｎ２４０Ｔ、Ｎ２４３Ａ、Ｎ２４３Ｑ、Ｎ２４３Ｔ、Ｎ２４３Ｖ、Ｎ２５２Ａ、Ｎ２５２Ｋ、Ｎ２５２Ｌ、Ｎ２５２Ｑ、Ｎ２５２Ｒ、Ｎ２５２Ｓ、Ｎ２５２Ｔ、Ｎ２６９Ｑ、Ｎ２６９Ｓ、Ｐ０１４Ｇ、Ｐ０１４Ｑ、Ｐ０１４Ｔ、Ｐ０４０Ａ、Ｐ０４０Ｈ、Ｐ０４０Ｓ、Ｐ０４０Ｔ、Ｐ０４０Ｖ、Ｐ０４０Ｙ、Ｐ０８６Ａ、Ｐ０８６Ｃ、Ｐ０８６Ｆ、Ｐ０８６Ｈ、Ｐ０８６Ｓ、Ｐ１２９Ｄ、Ｐ１２９Ｇ、Ｐ１２９Ｋ、Ｐ１２９Ｔ、Ｐ１７２Ａ、Ｐ１７２Ｑ、Ｐ１９４Ａ、Ｐ１９４Ｇ、Ｐ１９４Ｌ、Ｐ１９４Ｍ、Ｐ１９４Ｓ、Ｐ１９４Ｖ、Ｐ１９４Ｙ、Ｐ２１０Ｇ、Ｐ２１０Ｒ、Ｐ２１０Ｖ、Ｑ００２Ａ、Ｑ００２Ｓ、Ｑ０１０Ａ、Ｑ０１０Ｆ、Ｑ０１０Ｈ、Ｑ０１０Ｉ、Ｑ０１０Ｌ、Ｑ０１０Ｎ、Ｑ０１０Ｓ、Ｑ０１０Ｔ、Ｑ０１９Ａ、Ｑ０１９Ｇ、Ｑ０１９Ｎ、Ｑ０１９Ｓ、Ｑ０１９Ｔ、Ｑ０１９Ｖ、Ｑ０１９Ｗ、Ｑ０５９Ｉ、Ｑ１０３Ｌ、Ｑ１０３Ｓ、Ｑ１８５Ａ、Ｑ１８５Ｈ、Ｑ１８５Ｌ、Ｑ１８５Ｔ、Ｑ１８５Ｙ、Ｑ２０６Ｐ、Ｑ２０６Ｓ、Ｑ２０６Ｙ、Ｑ２１７Ｉ、Ｑ２１７Ｎ、Ｑ２１７Ｓ、Ｑ２１７Ｔ、Ｑ２４５Ｋ、Ｑ２７５Ｄ、Ｑ２７５Ｓ、Ｑ２７５Ｗ、Ｓ００３Ａ、Ｓ００３Ｇ、Ｓ００３Ｈ、Ｓ００３Ｍ、Ｓ００３Ｐ、Ｓ００３Ｑ、Ｓ００３Ｔ、Ｓ００３Ｖ、Ｓ００９Ｉ、Ｓ００９Ｌ、Ｓ００９Ｐ、Ｓ００９Ｔ、Ｓ００９Ｗ、Ｓ０１８Ａ、Ｓ０１８Ｇ、Ｓ０１８Ｉ、Ｓ０１８Ｌ、Ｓ０１８Ｍ、Ｓ０１８Ｎ、Ｓ０１８Ｐ、Ｓ０１８Ｖ、Ｓ０１８Ｗ、Ｓ０３３Ｔ、Ｓ０３７Ｑ、Ｓ０３７Ｔ、Ｓ０３７Ｖ、Ｓ０３８Ｇ、Ｓ０３８Ｈ、Ｓ０３８Ｋ、Ｓ０３８Ｑ、Ｓ０３８Ｔ、Ｓ０６３Ｋ、Ｓ０６３Ｎ、Ｓ０６３Ｑ、Ｓ０６３Ｔ、Ｓ０８７Ａ、Ｓ０８７Ｆ、Ｓ０８７Ｇ、Ｓ０８７Ｑ、Ｓ０８７Ｔ、Ｓ０８９Ｌ、Ｓ０８９Ｍ、Ｓ０８９Ｎ、Ｓ０８９Ｑ、Ｓ０８９Ｔ、Ｓ０８９Ｗ、Ｓ１３０Ａ、Ｓ１３０Ｆ、Ｓ１３０Ｇ、Ｓ１３０Ｌ、Ｓ１３０Ｖ、Ｓ１４５Ａ、Ｓ１４５Ｈ、Ｓ１４５Ｍ、Ｓ１４５Ｖ、Ｓ１５９Ａ、Ｓ１５９Ｇ、Ｓ１５９Ｈ、Ｓ１５９Ｑ、Ｓ１５９Ｒ、Ｓ１６１Ａ、Ｓ１６１Ｇ、Ｓ１６１Ｈ、Ｓ１６１Ｌ、Ｓ１６１Ｍ、Ｓ１６１Ｐ、Ｓ１６１Ｑ、Ｓ１６１Ｗ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１６２Ｆ、Ｓ１６２Ｇ、Ｓ１６２Ｌ、Ｓ１６２Ｎ、Ｓ１６２Ｐ、Ｓ１６２Ｒ、Ｓ１６２Ｖ、Ｓ１６３Ｐ、Ｓ１７３Ａ、Ｓ１７３Ｇ、Ｓ１８２Ａ、Ｓ１８２Ｈ、Ｓ１８２Ｋ、Ｓ１８２Ｌ、Ｓ１８２Ｎ、Ｓ１８２Ｐ、Ｓ１８２Ｑ、Ｓ１８２Ｔ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１８３Ｇ、Ｓ１８３Ｈ、Ｓ１８３Ｑ、Ｓ１８８Ａ、Ｓ１８８Ｇ、Ｓ１８８Ｔ、Ｓ１８８Ｖ、Ｓ１９１Ａ、Ｓ２０４Ａ、Ｓ２０４Ｉ、Ｓ２０４Ｌ、Ｓ２０４Ｑ、Ｓ２０４Ｖ、Ｓ２２４Ｃ、Ｓ２３６Ａ、Ｓ２３６Ｎ、Ｓ２３６Ｑ、Ｓ２４８Ａ、Ｓ２４８Ｆ、Ｓ２４８Ｇ、Ｓ２４８Ｉ、Ｓ２４８Ｋ、Ｓ２４８Ｌ、Ｓ２４８Ｍ、Ｓ２４８Ｎ、Ｓ２４８Ｑ、Ｓ２４８Ｔ、Ｓ２４８Ｖ、Ｓ２４９Ａ、Ｓ２４９Ｃ、Ｓ２４９Ｈ、Ｓ２４９Ｑ、Ｓ２４９Ｔ、Ｓ２４９Ｗ、Ｓ２４９Ｙ、Ｓ２６０Ｈ、Ｓ２６０Ｎ、Ｓ２６０Ｐ、Ｓ２６０Ｔ、Ｔ０２２Ｈ、Ｔ０２２Ｋ、Ｔ０２２Ｎ、Ｔ０２２Ｒ、Ｔ０２２Ｓ、Ｔ０２２Ｙ、Ｔ０５５Ａ、Ｔ０５５Ｇ、Ｔ０５５Ｌ、Ｔ０５５Ｎ、Ｔ０５５Ｐ、Ｔ０５５Ｑ、Ｔ０７１Ｓ、Ｔ１５８Ｈ、Ｔ１５８Ｓ、Ｔ１６４Ｎ、Ｔ２０８Ｃ、Ｔ２０８Ｌ、Ｔ２２０Ｓ、Ｔ２４２Ｎ、Ｔ２４４Ａ、Ｔ２４４Ｇ、Ｔ２４４Ｈ、Ｔ２４４Ｉ、Ｔ２４４Ｑ、Ｔ２４４Ｓ、Ｔ２４４Ｖ、Ｔ２４４Ｗ、Ｔ２５３Ａ、Ｔ２５３Ｇ、Ｔ２５３Ｈ、Ｔ２５３Ｑ、Ｔ２５４Ｖ、Ｔ２５５Ａ、Ｔ２５５Ｇ、Ｔ２５５Ｈ、Ｔ２５５Ｉ、Ｔ２５５Ｑ、Ｔ２５５Ｙ、Ｖ００４Ｇ、Ｖ００４Ｎ、Ｖ００４Ｒ、Ｖ００８Ａ、Ｖ００８Ｃ、Ｖ００８Ｍ、Ｖ０２６Ｉ、Ｖ０４４Ｉ、Ｖ０４４Ｌ、Ｖ０４５Ｈ、Ｖ０４５Ｋ、Ｖ０４５Ｌ、Ｖ０４５Ｍ、Ｖ０４５Ｑ、Ｖ０４５Ｓ、Ｖ０４５Ｗ、Ｖ０４５Ｙ、Ｖ０５１Ｉ、Ｖ０８１Ｌ、Ｖ０８１Ｑ、Ｖ０８１Ｔ、Ｖ０８４Ａ、Ｖ０８４Ｓ、Ｖ０８４Ｔ、Ｖ０９３Ｉ、Ｖ１２１Ｉ、Ｖ１４３Ｎ、Ｖ１４３Ｓ、Ｖ１４３Ｙ、Ｖ１４７Ｃ、Ｖ１４７Ｉ、Ｖ１４７Ｌ、Ｖ１４７Ｔ、Ｖ１８０Ｉ、Ｖ１８０Ｌ、Ｖ１８０Ｔ、Ｖ１９２Ａ、Ｖ１９２Ｓ、Ｖ１９２Ｔ、Ｖ１９８Ｉ、Ｖ１９８Ｌ、Ｖ１９８Ｍ、Ｖ２０３Ｈ、Ｖ２０３Ｉ、Ｖ２０３Ｌ、Ｖ２０３Ｎ、Ｖ２０３Ｑ、Ｖ２０３Ｔ、Ｖ２０３Ｗ、Ｖ２０３Ｙ、Ｖ２７０Ａ、Ｖ２７０Ｓ、Ｖ２７０Ｔ、Ｗ２４１Ｍ、Ｗ２４１Ｙ、Ｙ００６Ｇ、Ｙ００６Ｈ、Ｙ００６Ｉ、Ｙ００６Ｋ、Ｙ００６Ｌ、Ｙ００６Ｐ、Ｙ００６Ｑ、Ｙ００６Ｔ、Ｙ００６Ｖ、Ｙ００６Ｗ、Ｙ０２１Ａ、Ｙ０２１Ｄ、Ｙ０２１Ｅ、Ｙ０２１Ｌ、Ｙ０２１Ｑ、Ｙ０２１Ｒ、Ｙ０２１Ｓ、Ｙ１０４Ｆ、Ｙ１０４Ｉ、Ｙ２１４Ｌ、Ｙ２１４Ｖ、Ｙ２１４Ｗ、Ｙ２６２Ａ、Ｙ２６２Ｇ、Ｙ２６２Ｌ、Ｙ２６２Ｎ、Ｙ２６２Ｓ、Ｙ２６２Ｗ、Ｙ２６３Ｇ、Ｙ２６３Ｗ、Ａ００１Ｆ、Ａ００１Ｋ、Ａ００１Ｌ、Ａ００１Ｍ、Ａ００１Ｑ、Ａ００１Ｒ、Ａ００１Ｓ、Ａ００１Ｔ、Ａ００１Ｖ、Ａ０１３Ｃ、Ａ０１３Ｓ、Ａ０１５Ｄ、Ａ０１５Ｅ、Ａ０１５Ｌ、Ａ０１５Ｒ、Ａ０４８Ｓ、Ａ０７３Ｎ、Ａ０７３Ｔ、Ａ０７４Ｇ、Ａ０７４Ｓ、Ａ０８５Ｃ、Ａ０８５Ｇ、Ａ０８５Ｓ、Ａ０８５Ｖ、Ａ０８８Ｍ、Ａ０８８Ｓ、Ａ０９２Ｓ、Ａ０９８Ｇ、Ａ１１４Ｇ、Ａ１３３Ｐ、Ａ１３７Ｅ、Ａ１３７Ｈ、Ａ１４４Ｇ、Ａ１４４Ｈ、Ａ１４４Ｋ、Ａ１４４Ｌ、Ａ１４４Ｎ、Ａ１５３Ｓ、Ａ１５３Ｖ、Ａ１７６Ｃ、Ａ１７９Ｇ、Ａ１８７Ｇ、Ａ１８７Ｓ、Ａ２００Ｇ、Ａ２１６Ｗ、Ａ２２３Ｓ、Ａ２２８Ｓ、Ａ２３０Ｔ、Ａ２３０Ｖ、Ａ２３１Ｖ、Ａ２３２Ｃ、Ａ２３２Ｖ、Ａ２７２Ｅ、Ａ２７２Ｇ、Ａ２７２Ｋ、Ａ２７２Ｐ、Ａ２７３Ｇ、Ａ２７３Ｌ、Ａ２７３Ｖ、Ａ２７４Ｍ、Ａ２７４Ｒ、Ｄ０３６Ｅ、Ｄ０９９Ａ、Ｄ０９９Ｑ、Ｄ１２０Ｅ、Ｄ１８１Ａ、Ｄ１８１Ｇ、Ｄ２５９Ａ、Ｄ２５９Ｇ、Ｄ２５９Ｑ、Ｄ２５９Ｔ、Ｅ１５６Ａ、Ｅ１５６Ｓ、Ｅ２５１Ｉ、Ｅ２５１Ｌ、Ｅ２５１Ｑ、Ｅ２５１Ｔ、Ｆ０５８Ｙ、Ｆ２６１Ｃ、Ｆ２６１Ｄ、Ｆ２６１Ｋ、Ｆ２６１Ｐ、Ｇ０２０Ｅ、Ｇ０２０Ｆ、Ｇ０２０Ｈ、Ｇ０２０Ｌ、Ｇ０２０Ｎ、Ｇ０２０Ｑ、Ｇ０２０Ｒ、Ｇ０２０Ｔ、Ｇ０２０Ｙ、Ｇ０２４Ａ、Ｇ０２４Ｐ、Ｇ０５３Ａ、Ｇ０５３Ｄ、Ｇ０５３Ｅ、Ｇ０５３Ｆ、Ｇ０５３Ｌ、Ｇ０５３Ｑ、Ｇ０５３Ｓ、Ｇ０５３Ｙ、Ｇ０９７Ｋ、Ｇ０９７Ｍ、Ｇ１５７Ａ、Ｇ１５７Ｓ、Ｇ１６０Ａ、Ｇ１６０Ｌ、Ｇ１６６Ｃ、Ｇ１６６Ｉ、Ｇ１６６Ｑ、Ｇ１６９Ａ、Ｇ２１１Ｋ、Ｇ２１５Ｈ、Ｇ２１５Ｌ、Ｇ２１５Ｓ、Ｇ２１５Ｔ、Ｇ２１５Ｗ、Ｇ２５８Ｓ、Ｈ０１７Ｉ、Ｈ０３９Ｓ、Ｈ２２６Ｌ、Ｈ２３８Ｎ、Ｈ２３８Ｙ、Ｉ０１１Ｌ、Ｉ０１１Ｖ、Ｉ０３１Ｌ、Ｉ０７９Ｆ、Ｉ０７９Ｋ、Ｉ０７９Ｌ、Ｉ０７９Ｍ、Ｉ０７９Ｑ、Ｉ２０５Ａ、Ｉ２０５Ｖ、Ｉ２６８Ｌ、Ｉ２６８Ｍ、Ｋ０１２Ｇ、Ｋ０４３Ｆ、Ｋ０４３Ｈ、Ｋ０４３Ｉ、Ｋ０４３Ｎ、Ｋ０４３Ｑ、Ｋ０４３Ｔ、Ｋ１４１Ａ、Ｋ１４１Ｒ、Ｋ１４１Ｗ、Ｋ１７０Ａ、Ｋ２１３Ａ、Ｋ２１３Ｇ、Ｋ２１３Ｈ、Ｋ２１３Ｉ、Ｋ２１３Ｌ、Ｋ２１３Ｎ、Ｋ２１３Ｑ、Ｋ２１３Ｒ、Ｋ２１３Ｓ、Ｋ２１３Ｔ、Ｋ２１３Ｖ、Ｋ２３７Ａ、Ｋ２３７Ｈ、Ｋ２３７Ｉ、Ｋ２３７Ｌ、Ｋ２３７Ｎ、Ｋ２３７Ｓ、Ｋ２５６Ａ、Ｋ２５６Ｇ、Ｋ２５６Ｈ、Ｋ２５６Ｍ、Ｋ２５６Ｐ、Ｋ２５６Ｑ、Ｋ２５６Ｗ、Ｋ２６５Ｈ、Ｌ０１６Ｅ、Ｌ０４２Ｖ、Ｌ０７５Ｇ、Ｌ０７５Ｈ、Ｌ０７５Ｉ、Ｌ０７５Ｔ、Ｌ０８２Ａ、Ｌ０８２Ｆ、Ｌ０８２Ｈ、Ｌ０８２Ｒ、Ｌ０８２Ｓ、Ｌ０８２Ｔ、Ｌ０９０Ｍ、Ｌ１３５Ｆ、Ｌ１９６Ｍ、Ｌ２０９Ｃ、Ｌ２０９Ｈ、Ｌ２０９Ｓ、Ｌ２３３Ｓ、Ｌ２３５Ｍ、Ｌ２３５Ｒ、Ｌ２３５Ｗ、Ｌ２５７Ｃ、Ｌ２５７Ｇ、Ｌ２６７Ｆ、Ｍ０５０Ｙ、Ｍ１１９Ｃ、Ｍ１１９Ｉ、Ｍ１２４Ｌ、Ｎ０２５Ｃ、Ｎ０２５Ｅ、Ｎ０２５Ｐ、Ｎ０６１Ａ、Ｎ０６１Ｇ、Ｎ０６１Ｉ、Ｎ０６１Ｋ、Ｎ０６１Ｌ、Ｎ０６１Ｑ、Ｎ０６１Ｒ、Ｎ０６２Ｓ、Ｎ０６２Ｔ、Ｎ０７６Ａ、Ｎ０７６Ｐ、Ｎ０７６Ｑ、Ｎ０７６Ｓ、Ｎ０７６Ｔ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Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｉ２３４Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２３７Ｒ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｓ００３Ｐ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｓ００３Ｐ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ１０５Ｈ−Ｗ１０６Ｇ−Ｉ１０７Ｌ−Ｉ１０８Ｓ−Ｎ１０９Ａ−Ｇ１１０Ａ−Ｉ１１１Ｓ−Ｅ１１２Ｎ−Ｗ１１３Ｇ−Ａ１１４Ｐ、Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２３３Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｖ００４Ｌ−Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１３３Ｖ−Ｓ２６０Ｎ、Ｎ０６１Ｓ−Ｓ２６０Ｐ、Ｐ０１４Ｔ−Ｓ０３７Ｔ、Ｓ００９Ｔ−Ｋ１４１Ｆ、Ｓ００９Ｔ−Ｋ１４１Ｒ、Ｓ０１８Ｆ−Ｓ１６２Ｌ、Ｓ０１８Ｌ−Ｙ０２１Ｓ、Ｓ０１８Ｐ−Ｄ１２０Ｎ、Ｓ０１８Ｔ−Ｓ１６２Ｐ、Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ、Ｓ０１８Ｙ−Ｋ２１３Ｒ、Ｓ１６１Ｐ−Ｓ１６２Ｌ、Ｓ１６１Ｐ−Ｓ２６０Ｐ、Ｔ２５３Ａ−Ｓ２６０Ｐ、Ａ１３４Ｔ−Ｓ２６０Ｇ、Ｉ１１５Ｖ−Ｎ１８４Ｙ、Ｎ０２５Ｋ−Ｓ０３７Ｐ、Ｑ０１０Ｌ−Ｓ０３７Ｐ、Ｑ０１９Ｌ−Ｓ２６０Ｎ、Ｑ０１９Ｌ−Ｓ２６０Ｐ、Ｓ０３７Ｐ−Ｔ２５４Ｓ、Ｓ１６１Ｐ−Ｔ２５３Ａ、Ｎ０６１Ｓ−Ｓ２６０Ｐ、Ｑ０１０Ｌ−Ｓ０３７Ｐ、Ｓ００９Ｔ−Ｋ１４１Ｆ、Ｓ０１８Ｌ−Ｙ０２１Ｓ、Ｓ０１８Ｔ−Ｓ１６２Ｐ、Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ、Ｓ０１８Ｙ−Ｋ２１３Ｒ、Ｓ０３７Ｐ−Ｔ２５４Ｓ、Ｓ１６１Ｐ−Ｓ２６０Ｐ、Ｓ１６１Ｐ−Ｔ２５３Ａ、Ｔ２５３Ａ−Ｓ２６０Ｐ、Ａ１３３Ｖ−Ｓ２６０Ｎ、Ａ１３４Ｔ−Ｓ２６０Ｇ、Ｉ１１５Ｔ−Ｓ１８３Ｔ、Ｉ１１５Ｖ−Ｎ１８４Ｙ、Ｎ０６１Ｄ−Ｓ２６０Ｉ、Ｑ０１９Ｌ−Ｓ２６０Ｎ、Ｑ０１９Ｌ−Ｓ２６０Ｐ、Ｓ１８３Ｔ−Ｓ２４９Ｒ、Ｎ６１Ｄ−Ｑ２０６Ｒ、Ｙ２６２Ｎ−Ｑ２７５Ｒ、Ｋ４３Ｒ−Ｎ７６Ｓ、Ｋ１７０Ｒ−Ｄ２５９Ｇ、Ｙ６Ｆ−Ｓ２４９Ｃ、Ｑ１９Ａ−Ｎ１０９Ｓ、Ｈ１７Ｌ−Ｑ１９Ａ、Ｑ１９Ｒ−Ｑ１８５Ｒ、Ｓ１８Ｙ−Ｖ２０３Ａ、Ｓ１６１Ｅ−Ｓ２６０Ｔ、Ｓ１８Ｋ−Ｖ２０３Ｉ、Ｖ４Ａ−Ｔ５５Ａ、Ｎ２５２Ｓ−Ｌ２５７Ｈ、Ｓ２４９Ｒ−Ｙ２６２Ｈ、Ｎ６１Ｌ−Ｑ２０６Ｈ、Ｎ１８４Ｙ−Ｙ２６２Ｎ、Ｑ１９Ｒ−Ｎ２５Ｄ、Ａ７４Ｓ−Ｐ１２９Ｑ、Ｋ２７Ｒ−Ｄ１２０Ｈ、Ｖ４Ａ−Ｔ５５Ａ、Ｙ２１Ｈ−Ｎ２５２Ｈ、Ｋ２７Ｒ−Ｎ２６９Ｄ、Ａ９８Ｔ−Ｔ１５８Ａ、Ｉ７９Ｖ−Ｑ２１７Ｈ、Ｓ９Ｌ−Ｎ２１８Ｓ、Ｖ４Ａ−Ｙ６Ｆ、Ｖ２０３Ａ−Ｑ２１７Ｒ、Ｔ２２Ｓ−Ｔ２４２Ｓ、Ｎ７６Ｐ−Ｎ２１２Ｓ、Ｓ３７Ｔ−Ｓ２６０Ｐ、Ｔ５５Ａ−Ｖ１４７Ａ、Ｖ４Ａ−Ｙ６Ｆ、Ｙ２６２Ｎ−Ｑ２７５Ｒ、Ｇ１６０Ｒ−Ｔ２４４Ａ、Ｎ２５Ｄ−Ｑ１８５Ｒ、Ｇ２１１Ｖ−Ｔ２４４Ａ、Ｓ９Ｌ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ１４４Ｈ−Ｔ２４４Ａ、Ｙ２１Ｈ−Ｎ２５２Ｈ、Ａ１Ｙ−Ｑ２７５Ｒ、Ｖ１９８Ｌ−Ｄ２５９Ｇ、Ｋ１４１Ｉ−Ｓ２４８Ｎ、Ｓ１８３Ｔ−Ｒ１８６Ｋ、Ｓ１６１Ｅ−Ｑ１８５Ｈ、Ｐ１２９Ｓ−Ｋ１３６Ｒ、Ｋ４３Ｎ−Ｓ１６３Ｔ、Ｓ３７Ｇ−Ｑ２７５Ｈ、Ｙ６Ｆ−Ｓ２４９Ｃ、Ｎ６２Ｙ−Ｔ２４４Ａ、Ｓ２６０Ｐ−Ｑ２７５Ｒ、Ｓ３３Ｔ−Ｔ５５Ｐ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ６１Ｇ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｔ５５Ｐ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｇ１６９Ａ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４９Ｑ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ６１Ｇ−Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ７６Ｄ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ７６Ｄ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ６１Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ１Ｇ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４９Ｑ、Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１４Ｓ−Ａ１２８Ｓ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１４Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ１８３Ｌ−Ｓ２２４Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１４Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１４Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ６１Ｇ−Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１４Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ１８３Ｌ−Ｓ２２４Ａ、Ｎ６１Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ１８３Ｌ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ７６Ｄ、Ｎ１０９Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ、Ｎ１０１Ｑ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｐ１２９Ｓ−Ｓ１３０Ｔ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｍ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ６３Ｇ−Ｎ７６Ｄ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１６９Ａ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ０６２Ｌ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｇ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｌ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｌ−Ｑ２１７Ｌ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｎ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｒ、Ｓ０６３Ｇ、Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｌ、Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｌ−Ｍ２２２Ｓ、Ｓ０６３Ｌ−Ｑ２１７Ｌ、Ｓ０６３Ｎ、Ｓ０６３Ｎ−Ｑ２１７Ｌ、Ｄ０９９Ｎ−Ｋ１４１Ｙ−Ｋ２１３Ｑ、Ｄ０９９Ｎ−Ｋ１４１Ｙ−Ｋ２５６Ｑ、Ｋ０４３Ｔ−Ｋ１４１Ｙ−Ｅ１５６Ｑ、Ｎ０６２Ｌ−Ｑ２１７Ｅ、Ｎ０６２Ｌ−Ｑ２１７Ｌ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｅ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｌ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｎ−Ｑ２１７Ｌ、Ｎ０６２Ｓ−Ｑ２１７Ｌ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｇ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｌ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｎ−Ｑ２１７Ｌ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｒ−Ｑ２１７Ｅ、Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｅ、Ｓ０６３Ｎ−Ｑ２１７Ｅ、Ｓ０６３Ｒ、Ｓ０６３Ｒ−Ｑ２１７Ｅ及びＳ０６３Ｒ−Ｑ２１７Ｌ、
ｅ）以下のものからなる群から選択されるプロテアーゼ：
（ｉ）親プロテアーゼの変異体：この親プロテアーゼは配列番号４と少なくとも６０％、又は８０％、又は８５％、又は９０％、又は９５％、又は９６％、又は９７％、又は９８％、又は９９％、又は更には１００％の同一性を有し、この変異体は次の変異群から選択される変異群を含む：Ｑ０５９Ｖ−Ｓ０７８Ｎ−Ｉ１０８Ｖ−Ｖ１４７Ｑ−Ｇ２１１Ａ−Ｎ２５２Ｑ、Ｓ０７８Ｎ−Ｉ１０８Ｖ−Ｖ１４７Ｑ−Ｇ２１１Ａ、Ｓ０７８Ｎ−Ｓ０８７Ｅ−Ｍ１２４Ｉ−Ｓ２２４Ａ、Ｓ０７８Ｎ−Ｉ１０８Ｖ−Ｖ１４７Ｑ−Ｎ２５２Ｑ、Ｓ０７８Ｎ−Ｉ１０８Ｖ−Ｖ１４７Ｑ−Ｇ２１１Ａ−Ｎ２５２Ｑ、及びＱ０５９Ｖ−Ｓ０７８Ｎ−Ｉ１０８Ｖ−Ｖ１４７Ｑ−Ｇ２１１Ａ−Ｎ２５２Ｑ、
（ｉｉ）親プロテアーゼの変異体：この親プロテアーゼは配列番号２と少なくとも６０％、又は８０％、又は８５％、又は９０％、又は９５％、又は９６％、又は９７％、又は９８％、又は９９％、又は更には１００％の同一性を有し、この変異体は次の変異群から選択される変異群を含む：Ｇ０９７Ａ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ１６７Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｖ０６８Ａ−Ｙ１６７Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ１６７Ａ、Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ１６７Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｖ０６８Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ１６７Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ１６７Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｐ０５２Ｌ−Ｖ０６８Ａ−Ｉ１１１Ｖ、Ｇ０９７Ａ−Ｎ１２３Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１００Ｄ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１０２Ａ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ１０２Ａ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１０２Ａ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｎ１２３Ｑ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ１０２Ａ−Ｎ１２３Ｑ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ１０２Ａ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｎ１２３Ｑ−Ｙ２１７Ｑ、及びＧ１０２Ａ−Ｎ１２３Ｑ−Ｙ２１７Ｑ、並びに
（ｉｉｉ）親プロテアーゼの変異体：この親プロテアーゼは配列番号２と少なくとも６０％、又は８０％、又は８５％、又は９０％、又は９５％、又は９６％、又は９７％、又は９８％、又は９９％、又は更には１００％の同一性を有し、この変異体は次の変異、Ｘ２４Ｇ／Ｒ、Ｘ５３Ｇ、Ｘ７８Ｎ、Ｘ１０１Ｎ、Ｘ１２８Ａ／Ｓ及びＸ２１７Ｌ／Ｑを３つ、４つ、５つ、又は６つ含み、次の変異群から選択される変異群を少なくとも１つ含んでいてもよい：Ａ００１Ｄ、Ａ００１Ｈ、Ａ００１Ｎ、Ａ０１５Ｃ、Ａ０４８Ｃ、Ａ０４８Ｅ、Ａ０８５Ｔ、Ａ１３３Ｒ、Ａ１３７Ｒ、Ａ１４２Ｃ、Ａ１４４Ｄ、Ａ１４４Ｒ、Ａ１５２Ｓ、Ａ１５３Ｇ、Ａ１８７Ｐ、Ａ１８７Ｑ、Ａ１８７Ｔ、Ａ１８７Ｖ、Ａ２１６Ｒ、Ａ２３０Ｓ、Ａ２７２Ｒ、Ａ２７３Ｈ、Ａ２７３Ｔ、Ａ２７４Ｈ、Ｄ０３６Ｎ、Ｄ０３６Ｓ、Ｄ１８１Ｈ、Ｄ１８１Ｔ、Ｄ２５９Ｎ、Ｄ２５９Ｐ、Ｄ２５９Ｓ、Ｅ１５６Ｇ、Ｅ１５６Ｈ、Ｅ１５６Ｌ、Ｅ１５６Ｑ、Ｅ１５６Ｖ、Ｅ２５１Ｃ、Ｆ１８９Ｓ、Ｆ１８９Ｔ、Ｆ１８９Ｗ、Ｆ１８９Ｙ、Ｆ２６１Ｅ、Ｇ０２０Ｃ、Ｇ０２４Ｄ、Ｇ０５３Ｍ、Ｇ０５３Ｒ、Ｇ０９７Ｒ、Ｇ１３１Ｄ、Ｇ１３１Ｒ、Ｇ１５７Ｎ、Ｇ１６０Ｒ、Ｇ１６０Ｖ、Ｇ１６６Ｌ、Ｇ１６６Ｗ、Ｇ２１１Ｅ、Ｇ２１５Ｄ、Ｇ２５８Ａ、Ｇ２５８Ｄ、Ｇ２５８Ｐ、Ｉ０１１Ｔ、Ｉ０３１Ｃ、Ｉ０７９Ｅ、Ｉ０７９Ｒ、Ｉ１７５Ｌ、Ｉ２０５Ｃ、Ｋ０１２Ｈ、Ｋ０１２Ｎ、Ｋ０２７Ａ、Ｋ０２７Ｎ、Ｋ０２７Ｓ、Ｋ０４３Ａ、Ｋ０４３Ｄ、Ｋ０４３Ｅ、Ｋ０４３Ｇ、Ｋ０４３Ｌ、Ｋ０４３Ｍ、Ｋ０４３Ｐ、Ｋ０４３Ｖ、Ｋ０４３Ｗ、Ｋ０４３Ｙ、Ｋ１３６Ｈ、Ｋ１４１Ｈ、Ｋ１４１Ｌ、Ｋ１４１Ｍ、Ｋ１４１Ｎ、Ｋ１４１Ｑ、Ｋ１４１Ｔ、Ｋ１４１Ｖ、Ｋ１７０Ｇ、Ｋ１７０Ｓ、Ｋ２３７Ｔ、Ｋ２３７Ｖ、Ｋ２５６Ｄ、Ｋ２５６Ｓ、Ｋ２５６Ｔ、Ｋ２５６Ｖ、Ｋ２６５Ｎ、Ｋ２６５Ｓ、Ｌ０４２Ｆ、Ｌ０４２Ｍ、Ｌ０８２Ｅ、Ｌ２０９Ａ、Ｌ２０９Ｅ、Ｌ２０９Ｇ、Ｌ２０９Ｒ、Ｌ２３３Ｇ、Ｌ２３５Ｖ、Ｌ２５７Ｄ、Ｌ２５７Ｅ、Ｌ２５７Ｐ、Ｌ２５７Ｒ、Ｌ２５７Ｗ、Ｌ２６７Ｅ、Ｍ０５０Ｌ、Ｎ０５６Ｄ、Ｎ０５６Ｓ、Ｎ０６１Ｃ、Ｎ０６１Ｄ、Ｎ０６２Ａ、Ｎ０６２Ｈ、Ｎ０６２Ｌ、Ｎ０６２Ｖ、Ｎ０６２Ｙ、Ｎ０７６Ｄ、Ｎ０７６Ｌ、Ｎ０７６Ｍ、Ｎ０７８Ｄ、Ｎ０７８Ｆ、Ｎ１０１Ｄ、Ｎ１０１Ｒ、Ｎ１１８Ａ、Ｎ２１２Ｃ、Ｎ２１２Ｅ、Ｎ２１８Ｃ、Ｎ２１８Ｄ、Ｎ２１８Ｅ、Ｎ２５２Ｄ、Ｎ２５２Ｅ、Ｐ０１４Ｆ、Ｐ０１４Ｋ、Ｐ０５７Ａ、Ｐ０５７Ｗ、Ｐ１７２Ｒ、Ｐ１９４Ｅ、Ｐ２０１Ｔ、Ｐ２１０Ｅ、Ｑ０５９Ｃ、Ｑ０５９Ｄ、Ｑ０５９Ｒ、Ｑ１８５Ｅ、Ｑ２０６Ｄ、Ｑ２１７Ａ、Ｑ２１７Ｋ、Ｑ２１７Ｒ、Ｑ２４５Ａ、Ｑ２４５Ｄ、Ｑ２４５Ｅ、Ｑ２４５Ｈ、Ｑ２４５Ｒ、Ｑ２７１Ｅ、Ｑ２７１Ｆ、Ｑ２７１Ｒ、Ｑ２７１Ｗ、Ｑ２７５Ｇ、Ｑ２７５ＩＲ１８６Ｉ、Ｒ１８６Ｌ、Ｒ１８６Ｖ、Ｒ１８６Ｗ、Ｓ００３Ｅ、Ｓ００９Ｃ、Ｓ００９Ｅ、Ｓ０１８Ｃ、Ｓ０３７Ｄ、Ｓ０３７Ｅ、Ｓ０３７Ｈ、Ｓ０３７Ｒ、Ｓ０３７Ｙ、Ｓ０３８Ｄ、Ｓ０３８Ｐ、Ｓ０３８Ｒ、Ｓ０３８Ｙ、Ｓ０６３Ｌ、Ｓ０８７Ｄ、Ｓ０８７Ｒ、Ｓ０８９Ｃ、Ｓ０８９Ｅ、Ｓ１３０Ｃ、Ｓ１３０Ｒ、Ｓ１４５Ｄ、Ｓ１５９Ｃ、Ｓ１５９Ｐ、Ｓ１６１Ｃ、Ｓ１７３Ｔ、Ｓ１８２Ｃ、Ｓ１８８Ｅ、Ｓ１８８Ｆ、Ｓ１８８Ｋ、Ｓ１８８Ｌ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１８８Ｗ、Ｓ１９０Ａ、Ｓ１９０Ｇ、Ｓ１９０Ｔ、Ｓ２０４Ｒ、Ｓ２３６Ｄ、Ｓ２３６Ｅ、Ｓ２４８Ｃ、Ｓ２４８Ｅ、Ｓ２６０Ｃ、Ｓ２６０Ｅ、Ｓ２６０Ｒ、Ｔ０２２Ｐ、Ｔ０５５Ｃ、Ｔ０５５Ｗ、Ｔ０７１Ａ、Ｔ１５８Ｄ、Ｔ１５８Ｅ、Ｔ１５８Ｐ、Ｔ１５８Ｒ、Ｔ１５８Ｙ、Ｔ１６４Ｒ、Ｔ２４２Ｄ、Ｔ２４２Ｇ、Ｔ２５５Ｃ、Ｖ００４Ｅ、Ｖ００４Ｔ、Ｖ０４５Ｃ、Ｖ０４５Ｄ、Ｖ０４５Ｒ、Ｖ０４５Ｔ、Ｖ０５１Ｈ、Ｖ０８１Ｒ、Ｖ１４３Ｃ、Ｖ１４３Ｅ、Ｖ１４３Ｇ、Ｖ１９２Ｇ、Ｖ２０３Ｃ、Ｖ２０３Ｄ、Ｖ２０３Ｅ、Ｖ２０３Ｍ、Ｖ２０３Ｒ、Ｖ２７０Ｇ、Ｗ２４１Ｌ、Ｙ２１４Ｈ、Ｙ２１４Ｑ、Ａ００１Ｅ、Ａ１３３Ｅ、Ａ１８７Ｌ、Ａ１８７Ｎ、Ａ２１６Ｃ、Ａ２１６Ｈ、Ａ２７３Ｑ、Ｄ０９９Ｈ、Ｄ２５９Ｈ、Ｅ１５６Ｃ、Ｅ１９５Ｇ、Ｆ１８９Ｈ、Ｇ１３１Ｃ、Ｇ１４６Ａ、Ｇ１６６Ｖ、Ｇ２１５Ｃ、Ｇ２１５Ｅ、Ｉ１０７Ｌ、Ｋ０１２Ａ、Ｋ０１２Ｓ、Ｋ０１２Ｔ、Ｋ０４３Ｃ、Ｋ１７０Ｃ、Ｋ２５６Ｃ、Ｋ２５６Ｅ、Ｋ２６５Ｇ、Ｋ２６５Ｙ、Ｌ２３３ＥＭ２２２Ｆ、Ｍ２２２Ｓ、Ｎ０６２Ｑ、Ｎ０７６Ｅ、Ｎ０７８Ｅ、Ｎ１８４Ｐ、Ｎ２１８Ｒ、Ｐ００５Ｖ、Ｐ０１４Ｄ、Ｑ００２Ｋ、Ｑ００２Ｌ、Ｑ００２Ｒ、Ｑ０１０Ｗ、Ｑ２７１Ｃ、Ｒ１８６Ｈ、Ｓ０４９Ｃ、Ｓ０６３Ｃ、Ｓ０６３Ｄ、Ｓ１０５Ｔ、Ｓ１８８Ｃ、Ｓ１９０Ｃ、Ｓ２０４Ｅ、Ｔ０５５Ｒ、Ｔ１６４Ｇ、Ｖ００４Ｄ、Ｖ０４４Ｔ、Ｖ０４５Ｉ、Ｖ１６５Ｃ、Ｖ１８０Ｓ、Ｙ００６Ｃ、Ｙ００６Ｄ、Ｙ００６Ｅ、Ｙ１０４Ｔ、Ａ００１Ｃ、Ａ１８７Ｃ、Ａ２３０Ｇ、Ａ２７３Ｄ、Ａ２７３Ｐ、Ｄ０３６Ｑ、Ｆ１８９Ｇ、Ｆ１８９Ｌ、Ｆ１８９Ｒ、Ｇ１５７Ｔ、Ｇ１７８Ａ、Ｉ０３１Ｆ、Ｉ１１１Ｍ、Ｋ０１２Ｆ、Ｋ０１２Ｌ、Ｋ０２７Ｔ、Ｋ０４３Ｒ、Ｋ１３６Ｇ、Ｋ１４１Ｇ、Ｋ１７０Ｑ、Ｍ２２２Ａ、Ｍ２２２Ｌ、Ｎ０６２Ｒ、Ｎ１１７Ｇ、Ｎ２６９Ｃ、Ｐ００５Ｗ、Ｐ１２９Ｖ、Ｐ２３９Ａ、Ｐ２３９Ｈ、Ｐ２３９Ｔ、Ｑ０５９Ｗ、Ｑ２１７Ｇ、Ｑ２７５Ａ、Ｒ１８６Ａ、Ｓ１９１Ｇ、Ｔ１６４Ａ、Ｔ２２０Ａ、Ａ００１Ｐ、Ａ１８７Ｆ、Ａ１８７Ｗ、Ａ２７３Ｒ、Ｄ０４１Ｃ、Ｄ０６０Ｇ、Ｄ１９７Ｔ、Ｆ１８９Ａ、Ｇ０４６Ｄ、Ｇ１５７Ｐ、Ｋ０１２Ｃ、Ｋ０１２Ｅ、Ｋ０１２Ｗ、Ｌ０４２Ｃ、Ｍ２２２Ｔ、Ｎ０６２Ｃ、Ｐ２３９Ｇ、Ｐ２３９Ｎ、Ｑ２１７Ｃ、Ｒ１８６Ｍ、Ｓ０４９Ｔ、Ｓ０８９Ｐ、Ｓ１２５Ａ、Ｓ１７３Ｖ、Ｖ０４４Ａ、Ａ００１Ｅ、Ａ００１Ｅ−Ａ１２８Ｓ、Ａ００１Ｅ−Ｇ０２４Ｅ、Ａ００１Ｅ−Ｇ１３１Ｈ、Ａ００１Ｅ−Ｇ１６９Ａ、Ａ００１Ｅ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ００１Ｅ−２１８Ｓ、Ａ００１Ｅ−Ｑ１０３Ｈ、Ａ００１Ｅ−Ｓ０６３Ｇ、Ａ００１Ｅ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ００１Ｅ−Ｓ２４９Ａ、Ｇ０２４Ｅ−Ｎ０７６Ｄ、Ｋ０４３Ｙ−Ｎ０７６Ｄ、Ｋ０４３Ｙ−Ｑ２０６Ｄ、Ｎ０７６Ｄ−Ａ１１６Ｔ、Ｎ０７６Ｄ−Ｇ１６９Ａ、Ｎ０７６Ｄ−Ｑ２０６Ｄ、Ｑ１０３Ｈ−Ｑ２０６Ｄ、Ｓ０３３Ｔ−Ｇ１６９Ａ、Ｓ０３３Ｔ−Ｓ０６３Ｇ−Ｑ１０３Ｈ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｇ１６９Ａ−Ｎ２４３Ｐ、Ｓ０３３Ｔ−Ｓ０６３Ｇ−Ｑ１０３Ｈ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｇ１６９Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ００１Ｅ−Ｋ０４３Ｙ、Ａ００１Ｅ−Ｎ０７６Ｄ、Ａ００１Ｅ−Ｎ０７６Ｄ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ、Ａ００１Ｅ−Ｑ２０６Ｄ、Ｇ０２４Ｅ−Ｑ２０６Ｄ、Ａ００１Ｅ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ００１Ｅ−Ｇ１３１Ｈ−Ｇ１６９Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ００１Ｅ−Ｓ０３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１６９Ａ、Ａ１１６Ｔ−Ｑ２０６Ｄ、Ｇ１６９Ａ−Ｓ２４９Ａ、Ｋ０４３Ｙ−Ｇ１６９Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１６９Ａ、Ｐ０４０Ｅ−Ｎ１０９Ｇ−１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ、Ｑ２０６Ｄ−Ｌ２５７Ｇ、Ｓ０３３Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｐ、Ｓ０３３Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ０３３Ｔ−Ｐ０４０Ｅ−Ｑ１０３Ｈ−Ｎ１０９Ｇ、Ｓ０３３Ｔ−Ｑ１０３Ｈ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ、Ｓ０６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ、Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２０６Ｄ、Ｔ１５８Ｓ−Ｑ２０６Ｄ、Ａ００１Ｅ−Ｎ０７６Ｄ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ、Ａ０１５Ｓ−Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ０９８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｋ１４１Ｅ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｉ１０７Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｄ１４０Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｉ２６８Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｖ１４９Ａ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｄ１４０Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｄ１４０Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｋ１４１Ｅ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｑ２７１Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｖ１４９Ｌ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ−Ｑ２７１Ｋ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ−Ｑ２７Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｙ１０４Ｈ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｋ１４１Ｅ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ−Ｎ２６９Ｄ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｑ２７１Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１５７Ｅ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３
Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｉ２６８Ｖ、Ｉ１０７Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｌ０９０Ｉ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ−Ｑ２７１Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｗ２４１Ｒ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｋ１４１Ｅ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｓ００３Ｐ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｓ００３Ｐ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｖ００４Ａ−Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｙ００６Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｙ１０４Ｈ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｉ２３４Ｔ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｖ１４９Ｌ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｉ１０７Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ａ２２３Ｇ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｋ２１３Ｎ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ａ２３２Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｄ１４０Ｇ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｍ１２４Ｉ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｖ１４８Ａ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｔ２５５Ｋ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｑ２４５Ｋ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｗ２４１Ｒ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｖ１５０Ａ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｉ１０７Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｋ１４１Ｅ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｇ１４６Ｃ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１３８Ｅ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｆ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｖ２０３Ｉ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｄ１４０Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｅ２５１Ｋ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｉ１０８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｋ１４１Ｅ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｗ２４１Ｒ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ０６５Ｄ−Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０４５Ｓ−Ｓ２３６Ｇ、Ｇ０２４Ａ−Ｓ０３７Ｗ、Ｉ０３１Ｖ−Ｓ０３８Ｗ、Ｎ０６１Ｄ−Ｓ２６０Ｉ、Ｑ０１０Ｒ−Ｓ０３７Ｔ、Ｉ１１５Ｔ−Ｓ１８３Ｔ、Ｎ０２５Ｋ−Ｐ１２９Ｋ、Ｎ０２５Ｋ−Ｐ１２９Ｒ、Ａ０４５Ｓ−Ｓ２３６Ｙ、Ｓ１６２Ｌ−Ｄ１８１Ｈ、Ｉ０３１Ｖ−Ｓ０３８Ｗ、Ｎ０２５Ｋ−Ｓ０３７Ｐ、Ｎ０２５Ｋ−Ｐ１２９Ｒ、Ｙ２１Ｈ−Ｄ２５９Ｇ、Ａ１３３Ｖ−Ｄ２５９Ｎ、Ｉ７９Ｖ−Ｑ２１７Ｈ、Ｓ１８Ｋ−Ｖ２０３Ｉ、Ｔ１５８Ａ−Ｄ２５９Ｐ、Ｎ６１Ｋ−Ｎ２５２Ｋ、Ｋ４３Ｎ−Ｑ２１７Ｒ、Ｑ２０６Ｒ−Ｓ２６０Ｐ、Ｖ１９８Ｌ−Ｄ２５９Ｇ、Ｓ１６１Ｅ−Ｓ２６０Ｔ、Ｇ１６０Ａ−Ｄ２５９Ｇ、Ａ１Ｙ−Ｑ２７５Ｒ、Ａ２００Ｔ−Ｈ２２６Ｌ、Ｑ２１７Ｒ−Ｔ２４４Ａ、Ｓ２６０Ｐ−Ｑ２７５Ｒ、Ｔ１５８Ｉ−Ｄ２５９Ｎ、Ｌ７５Ｉ−Ｎ７６Ｄ、Ｓ１６１Ｅ−Ｑ１８５Ｈ、Ｙ２１Ｈ−Ｓ３７Ｅ、Ｓ２４９Ｒ−Ｑ２７５Ｒ、Ｎ７６Ｔ−Ｎ２１２Ｄ、Ｓ２６０Ｐ−Ｑ２７５Ｌ、Ｇ１３１Ｓ−Ｋ２６５Ｎ、Ｖ４Ａ−Ｓ２４９Ｎ、Ｎ２５Ｄ−Ｑ１８５Ｒ、Ｋ４３Ｒ−Ｎ７６Ｓ、Ｓ１８３Ｄ−Ｑ２０６Ｒ、Ｑ１０Ｒ−Ｑ２７５Ｋ、Ｋ４３Ｎ−Ｓ１６３Ｔ、Ｎ２５Ｄ−Ｖ２６Ａ、Ｓ２６０Ｐ−Ｑ２７５Ｌ、Ｋ１４１Ｉ−Ｓ２４８Ｎ、Ｌ１６Ｑ−Ｑ２１７Ｈ、Ｋ２７Ｒ−Ｎ２６９Ｔ、Ｐ２１０Ｓ−Ｎ２１２Ｄ、Ｎ１１８Ｇ−Ｖ１２１Ａ、Ｇ２１５Ｄ−Ｄ２５９Ｖ、Ｎ６２Ｙ−Ｇ９７Ｄ、Ｖ４Ｅ−Ｓ２６０Ｐ、Ｋ２７Ｅ−Ｙ９１Ｆ、Ｙ６Ｄ−Ｔ５５Ａ、Ｎ７７Ｄ−Ｎ２５２Ｔ、Ｎ２５Ｋ−Ｈ２３８Ｒ、Ｖ４４Ａ−Ｑ２０６Ｈ、Ｓ３７Ｐ−Ｓ２６０Ｆ、Ｖ４４Ａ−Ｑ２０６Ｒ、Ｉ３１Ｌ−Ｓ３３Ｔ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１６９Ａ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ１Ｇ−Ｉ３１Ｌ−Ｓ３３Ｔ−Ｔ５５Ｐ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｇ１６９Ａ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４９Ｑ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ６１Ｇ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｇ１６９Ａ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１６９Ａ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｔ５５Ｐ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４９Ｑ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ７６Ｄ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ｎ７６Ｄ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ、Ｄ０９９Ｎ、Ｋ１４１Ｙ−Ｅ１５６Ｑ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｌ−Ｑ２１７Ｌ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｎ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｎ−Ｑ２１７Ｅ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｒ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｒ−Ｑ２１７Ｌ、Ｎ０６２Ｓ−Ｑ２１７Ｅ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｅ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｒ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｎ−Ｑ２１７Ｒ、Ｓ０６３Ｇ−Ｓ１２５Ａ、Ｄ０６０Ｇ−Ｑ２１７Ｌ、Ｄ１２０Ｎ−Ｋ１４１Ｙ−Ｋ２１３Ｑ、Ｋ０４３Ｔ−Ｄ０９９Ｎ−Ｄ１２０Ｎ−Ｋ１４１Ｙ、Ｋ０４３Ｔ−Ｄ０９９Ｎ−Ｋ１４１Ｙ−Ｋ２５６Ｑ、Ｋ０４３Ｔ−Ｋ２３７Ａ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｒ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｇ−Ｓ１２５Ａ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｌ−Ｑ２１７Ｅ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｎ−Ｓ１２５Ａ−Ｑ２１７Ｌ、Ｎ０６２Ｓ−Ｑ２１７Ｒ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｌ−Ｑ２１７Ｅ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｒ−Ｑ２１７Ｌ、Ｓ０６３Ｇ−Ｍ２２２Ｓ、Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｒ、Ｋ１４１Ｙ−Ｄ１９７Ｎ、Ｎ０６２Ｌ−Ｑ２１７Ｒ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｌ−Ｍ２２２Ｓ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｌ−Ｑ２１７Ｒ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｎ−Ｑ２１７Ｒ、Ｎ０６２Ｓ−Ｑ２１７Ｇ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｇ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｌ−Ｍ２２２Ｌ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｇ−Ｓ１２５Ａ−Ｑ２１７Ｌ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｎ−Ｑ２１７Ｅ、Ｑ２１７Ｇ、Ｓ０３３Ｇ−Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｇ、Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｇ、Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｌ−Ｍ２２２Ｌ、Ｓ０６３Ｇ−Ｓ１２５Ａ−Ｑ２１７Ｒ、Ｓ０６３Ｌ−Ｑ２１７Ｒ、Ｓ０６３Ｎ−Ｍ２２２Ｓ、Ｓ０６３Ｎ−Ｑ２１７Ｒ、Ｓ０６３Ｎ−Ｓ１２５Ａ−Ｑ２１７Ｌ、Ｓ０６３Ｒ−Ｑ２１７Ｒ、Ｓ０６３Ｒ−Ｓ１２５Ａ−Ｑ２１７Ｌ、Ｄ０９９Ｎ−Ｅ１５６Ｑ−Ｋ２５６Ｑ、Ｅ１５６Ｑ、Ｋ０１２Ｔ−Ｄ０９９Ｎ−Ｋ２１３Ｑ、Ｋ０１２Ｔ−Ｋ２５６Ｑ、Ｋ０４３Ｔ−Ｄ０９９Ｎ−Ｋ１４１Ｙ−Ｋ２１３Ｑ、Ｋ０４３Ｔ−Ｅ１５６Ｑ、Ｋ１４１Ｙ−Ｋ２１３Ｑ、Ｎ０６２Ｌ−Ｑ２１７Ｇ、Ｎ０６２Ｌ−Ｑ２１７Ｌ−Ｍ２２２Ｌ、Ｎ０６２Ｌ−Ｑ２１７Ｌ−Ｍ２２２Ｓ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｇ−Ｍ２２２Ｓ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｌ−Ｍ２２２Ｌ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｒ−Ｍ２２２Ｓ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｎ−Ｑ２１７Ｌ−Ｍ２２２Ｓ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｎ−Ｓ１２５Ａ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｒ−Ｓ１２５Ａ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ１２５Ａ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｇ−Ｍ２２２Ｓ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｇ−Ｍ２２２Ｓ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｇ−Ｓ１２５Ａ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｎ−Ｑ２１７Ｌ−Ｍ２２２Ｌ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｎ−Ｓ１２５Ａ−Ｑ２１７Ｌ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｒ−Ｑ２１７Ｇ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｒ−Ｑ２１７Ｌ−Ｍ２２２Ｓ、Ｑ２１７Ｇ−Ｍ２２２Ｓ、Ｑ２１７Ｌ−Ｍ２２２Ｓ、Ｑ２１７Ｒ、Ｓ０３３Ｇ−Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｒ、Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｅ−Ｍ２２２Ｓ、Ｓ０６３Ｇ−Ｓ１２５Ａ−Ｑ２１７Ｇ、Ｓ０６３Ｌ−Ｑ２１７Ｅ、Ｓ０６３Ｎ−Ｑ２１７Ｇ、Ｓ０６３Ｎ−Ｑ２１７Ｇ−Ｍ２２２Ｓ、Ｓ０６３Ｎ−Ｑ２１７Ｌ−Ｍ２２２Ｓ、Ｓ０６３Ｒ−Ｑ２１７Ｌ−Ｍ２２２Ｓ、及びＳ０６３Ｒ−Ｓ１２５Ａ、
ｆ）親プロテアーゼの変異体：この変異体はＸ０２４Ｇ／Ｒ、Ｘ０５３Ｇ、Ｘ０７８Ｎ、Ｘ１０１Ｎ、Ｘ１２８Ａ／Ｓ及びＸ２１７Ｌ／Ｑからなる群から選択された３〜６個のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、ここで、この変異体はタンパク質分解活性を有する、
ｇ）プロテアーゼ変異体：この変異体はタンパク質分解活性を有し、かつ配列番号２のアミノ酸位置に対応する次の位置２４、５３、７８、９７、１０１、１２８、及び２１７からなる群から選択されるアミノ酸位置にて２〜７個の変更を含むアミノ酸配列を含み、この場合、各変更は独立して次の（ｉ）〜（ｉｉｉ）である：
（ｉ）上記位置を占有しているアミノ酸残基の上流又は下流の１つ以上のアミノ酸残基の挿入、
（ｉｉ）上記位置を占有しているアミノ酸残基の欠失、又は
（ｉｉｉ）異なるアミノ酸残基による、上記位置を占有しているアミノ酸残基の置換、
ｈ）親プロテアーゼの変異体：この変異体は親プロテアーゼに対して１５個以下の変更を有するアミノ酸配列を含み、この場合、変更は挿入、欠失又は置換から独立して選択され、及びこの変更には位置２４及び５３でのグリシン置換、位置７８及び１０１でのアスパラギン置換、位置１２８でのアラニン又はセリン置換、及び位置２１７でのグルタミン置換が挙げられ、この親プロテアーゼは配列番号２と配列が少なくとも９０％の同一性を有し、かつこの変異体のタンパク質分解活性が親プロテアーゼと比べて増加する、
ｉ）親プロテアーゼ変異体：この親プロテアーゼは配列番号２と配列が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、又は９７％の同一性を有し、この変異体は配列番号２の配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、又は９７％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、この変異体は位置２４及び５３でのグリシン置換、位置７８及び１０１でのアスパラギン置換、位置１２８でのアラニン又はセリン置換、及び位置２１７でのグルタミン置換を含み、かつこの変異体のタンパク質分解活性がこの親プロテアーゼと比べて増加する、
ｊ）これらの混合物。
【００１８】
この組成物の一態様では、この冷水プロテアーゼは、試験方法２又は試験方法３で定義される、配列番号４を有する酵素と比較したときに、ｐＨ  ８及び１６℃（６０°Ｆ）下でのＢＭＩで、１超、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、少なくとも１〜約１０、少なくとも１〜約８、又は更には少なくとも１〜約５である性能指数を有し、又はこの冷水プロテアーゼは、試験方法２及び／又は試験方法３で定義される、配列番号６を有する酵素と比較したときに、ｐＨ  ８及び１６℃（６０°Ｆ）下でのＢＭＩで、少なくとも１、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．０〜約１０、１．０〜約８、又は更には１．０〜約５である性能指数を有し、かつこの冷水プロテアーゼは以下のものからなる群から選択される：
ａ）配列番号４を有する親プロテアーゼの変異体：この変異体は次の変異群から選択される変異群を含む：Ｐ２１０Ｓ、Ｐ２１０Ｓ−Ｎ２１８Ａ、Ｓ０６３Ｔ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ａ−Ｓ１８３Ｔ−Ｔ２４４Ｎ、Ｎ０６１Ａ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ２２４Ａ、Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｐ１２９Ｔ−Ｑ１８５Ｔ、Ｓ０６３Ｔ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ａ、Ｓ０７８Ｎ−Ｐ１２９Ｔ、Ｓ０６３Ｔ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ａ−Ｓ１８３Ｔ及びＳ０６３Ｔ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ａ−Ｔ２４４Ｉ、
ｂ）配列番号２を有する親プロテアーゼの変異体：この変異体は以下の変異群から選択される変異群を含む：Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ１６７Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｖ２０３Ｙ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ｓ−Ｖ２０３Ｙ−Ｙ２１７Ｑ、Ｖ０６８Ａ−Ａ０９２Ｇ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｉ１１１Ｖ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０３８Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４９Ｎ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ及びＳ２４Ｇ−Ｓ５３Ｇ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、
ｃ）配列番号６を有する親プロテアーゼ変異体：この変異体は以下の変異群から選択される変異群を含む：Ａ１１６Ｖ、Ｇ１６０Ｓ、Ｉ１１１Ｌ、Ｉ１１５Ｖ、Ｎ１０９Ｓ、Ｎ１１７Ｍ、Ｐ００５Ｇ、Ｑ０５９Ｖ、Ｔ１６４Ｓ、Ｙ２６２Ｍ、Ａ０１５Ｑ、Ａ０１５Ｓ、Ａ０９８Ｅ、Ａ０９８Ｎ、Ａ０９８Ｓ、Ａ０９８Ｔ、Ａ０９８Ｖ、Ａ０９８Ｙ、Ａ１１４Ｓ、Ａ１１４Ｔ、Ａ１１６Ｇ、Ａ１１６Ｌ、Ａ１１６Ｓ、Ａ１１６Ｔ、Ａ１１６Ｗ、Ａ１３３Ｇ、Ａ１３３Ｈ、Ａ１３３Ｔ、Ａ１３３Ｖ、Ａ１３７Ｇ、Ａ１３７Ｉ、Ａ１３７Ｌ、Ａ１３７Ｓ、Ａ１３７Ｔ、Ａ１３８Ｓ、Ａ２１６Ｅ、Ａ２１６Ｆ、Ａ２１６Ｖ、Ｄ０９９Ｓ、Ｄ１８１Ｅ、Ｆ２６１Ａ、Ｆ２６１Ｑ、Ｇ０２４Ｆ、Ｇ０２４Ｉ、Ｇ０２４Ｑ、Ｇ０２４Ｙ、Ｇ０９７Ｓ、Ｇ１６０Ｔ、Ｇ２１１Ｌ、Ｇ２１１Ｖ、Ｈ０１７Ｆ、Ｈ０１７Ｗ、Ｈ０３９Ｖ、Ｈ２２６Ａ、Ｉ０３１Ｖ、Ｉ１１１Ｖ、Ｉ２６８Ｖ、Ｋ１７０Ｒ、Ｋ２６５Ｒ、Ｌ０１６Ｑ、Ｌ０１６Ｔ、Ｌ１３５Ｍ、Ｌ２０９Ｔ、Ｌ２０９Ｖ、Ｌ２３３Ｍ、Ｌ２５７Ｔ、Ｌ２５７Ｖ、Ｌ２６７Ａ、Ｌ２６７Ｖ、Ｎ０２５Ａ、Ｎ０２５Ｉ、Ｎ０２５Ｑ、Ｎ０２５Ｒ、Ｎ０２５Ｔ、Ｎ０２５Ｖ、Ｎ１０１Ｉ、Ｎ１０１Ｑ、Ｎ１０１Ｓ、Ｎ１０９Ａ、Ｎ１０９Ｇ、Ｎ１０９Ｈ、Ｎ１０９Ｌ、Ｎ１０９Ｍ、Ｎ１０９Ｑ、Ｎ１０９Ｔ、Ｎ１１７Ｑ、Ｎ１８４Ａ、Ｎ１８４Ｌ、Ｎ１８４Ｔ、Ｎ１８４Ｗ、Ｎ２１２Ｇ、Ｎ２１２Ｌ、Ｎ２１２Ｖ、Ｎ２４３Ｐ、Ｎ２５２Ｇ、Ｎ２５２Ｍ、Ｐ００５Ｔ、Ｐ０１４Ｓ、Ｐ０４０Ｇ、Ｐ０４０Ｌ、Ｐ０４０Ｑ、Ｐ１２９Ａ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１７２Ｇ、Ｐ１７２Ｓ、Ｐ１９４Ｑ、Ｐ２１０Ａ、Ｐ２１０Ｓ、Ｑ１８５Ｆ、Ｑ１８５Ｇ、Ｑ１８５Ｉ、Ｑ１８５Ｍ、Ｑ１８５Ｎ、Ｑ１８５Ｓ、Ｑ２７５Ｈ、Ｒ１８６Ｋ、Ｓ００９Ａ、Ｓ００９Ｇ、Ｓ００９Ｈ、Ｓ００９Ｍ、Ｓ０１８Ｔ、Ｓ１３０Ｔ、Ｓ１３２Ｎ、Ｓ１４５Ｋ、Ｓ１５９Ｔ、Ｓ１６１Ｉ、Ｓ１６１Ｋ、Ｓ１６１Ｎ、Ｓ１６１Ｔ、Ｓ１６２Ｉ、Ｓ１６２Ｍ、Ｓ１６２Ｙ、Ｓ１６３Ｇ、Ｓ１８２Ｆ、Ｓ１８２Ｇ、Ｓ１８２Ｖ、Ｓ１８２Ｗ、Ｓ１８３Ｆ、Ｓ１８３Ｌ、Ｓ１８３Ｍ、Ｓ１８３Ｔ、Ｓ１８３Ｖ、Ｓ１８３Ｗ、Ｓ２２４Ａ、Ｓ２３６Ｔ、Ｓ２４９Ｖ、Ｔ０２２Ａ、Ｔ０２２Ｇ、Ｔ０２２Ｑ、Ｔ０２２Ｖ、Ｔ２０８Ｖ、Ｔ２４２Ｓ、Ｔ２５３Ｎ、Ｔ２５３Ｓ、Ｔ２５４Ａ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５５Ｌ、Ｔ２５５Ｓ、Ｔ２５５Ｖ、Ｖ００４Ａ、Ｖ００４Ｐ、Ｖ００４Ｗ、Ｖ０８４Ｃ、Ｖ１３９Ｃ、Ｖ１６５Ｍ、Ｖ２０３Ｆ、Ｙ０２１Ｋ、Ｙ０２１Ｎ、Ｙ０２１Ｔ、Ｙ０２１Ｖ、Ｙ１６７Ｆ、Ｙ１７１Ｆ、Ｙ２１４Ｆ、Ｙ２６２Ｆ、Ｙ２６２Ｔ、Ａ０８８Ｔ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ、Ｎ０６１Ｓ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２６０Ｐ、Ｓ００９Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｋ１４１Ｒ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ００９Ｔ−Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｋ１４１Ｒ、Ｓ１６２Ｇ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ２４３Ｖ、Ｇ０２４Ｅ−Ａ１１６Ｔ、Ｋ０４３Ｙ、Ｎ０７６Ｄ−Ａ１１６Ｔ、Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ０３３Ｔ−Ｓ０６３Ｇ、Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ００１Ｅ−Ｓ２４９Ａ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１２８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｓ２４９Ａ、Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ、Ａ１２８Ｓ、Ａ１２８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１２８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ１２８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ１２８Ｓ−Ｔ１５８Ｓ、Ｇ０２４Ｅ−Ａ０８８Ｔ、Ｇ０２４Ｅ−Ａ１２８Ｓ、Ｇ０２４Ｅ−Ｇ１３１Ｈ、Ｇ０２４Ｅ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ０２４Ｅ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ０２４Ｅ−Ｎ２１８Ｓ、Ｇ０２４Ｅ−Ｎ２４３Ｖ、Ｇ０２４Ｅ−Ｓ１６２Ｇ、Ｇ０２４Ｅ−Ｓ２４９Ａ、Ｇ０２４Ｅ−Ｔ１５８Ｓ、Ｇ１３１Ｈ、Ｇ１３１Ｈ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４９Ａ、Ｋ０４３Ｙ−Ａ０８８Ｔ、Ｋ０４３Ｙ−Ａ１１６Ｔ、Ｋ２５６Ｒ、Ｎ０７６Ｄ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ、Ｎ１０９Ｇ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ２４３Ｖ、Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４９Ａ、Ｑ１０３Ｈ−Ａ１２８Ｓ、Ｑ１０３Ｈ−Ｇ１３１Ｈ、Ｑ１０３Ｈ−Ｋ２５６Ｒ、Ｑ１０３Ｈ−Ｌ２５７Ｇ、Ｑ１０３Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ｑ１０３Ｈ−Ｓ２４８Ｎ、Ｑ１０３Ｈ−Ｓ２４９Ａ、Ｑ１０３Ｈ−Ｔ１５８Ｓ、Ｑ２０６Ｄ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ０３３Ｔ−Ａ１２８Ｓ、Ｓ０３３Ｔ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ０７６Ｄ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ２１８Ｓ、Ｓ０３３Ｔ−Ｓ２４８Ｎ、Ｓ０３３Ｔ−Ｔ１５８Ｓ、Ｓ０６３Ｇ−Ａ１２８Ｓ、Ｓ０６３Ｇ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０６３Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ０６３Ｇ−Ｓ１６２Ｇ、Ｓ０６３Ｇ−Ｔ１５８Ｓ、Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ２４９Ａ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４９Ａ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ａ１５３Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１４Ｓ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｙ００６Ｈ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１２Ｄ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｖ１４８Ａ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ  Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ−Ｎ２６９Ｓ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｓ００３Ｐ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｖ１４７Ａ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１���Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｗ２４１Ｒ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ａ２７４Ｄ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ−Ｑ２７１Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｉ２３４Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１
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−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ−Ｑ２７１Ｈ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｖ１４３Ａ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｉ２３４Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｖ１４３Ｆ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ１１６Ｔ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｖ１４９Ｉ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｑ２７１Ｈ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｉ２６８Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｇ２１１Ｖ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｑ２７５Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ａ１３７Ｖ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２３７Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ１４５Ｆ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｑ２７１Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｉ２６８Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｓ−Ａ１１６Ｔ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ２１８Ｓ、Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｓ１０５Ｐ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ２４８Ｎ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｓ０１８Ｆ−Ｓ１６２Ｌ、Ｓ０１８Ｐ−Ｄ１２０Ｎ、Ｐ０１４Ｔ−Ｓ０３７Ｔ、Ｓ００９Ｔ−Ｋ１４１Ｒ、Ｓ１６１Ｐ−Ｓ１６２Ｌ、Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１４Ｓ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１４Ｓ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ１８３Ｌ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ１８３Ｖ、Ｎ１０９Ｍ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｓ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｍ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ６３Ｇ−Ａ１２８Ｓ、Ｎ１０９Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ６１Ｓ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０１Ｑ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ、Ｎ６１Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｐ１２９Ｓ−Ｓ１３０Ｔ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｎ−Ｑ２１７Ｌ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｒ−Ｑ２１７Ｅ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｌ−Ｑ２１７Ｌ、Ｓ０６３Ｇ、Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｌ、Ｓ０６３Ｎ及びＳ０６３Ｎ−Ｑ２１７Ｌ。
【００１９】
この組成物の一態様では、この親プロテアーゼが配列番号２と少なくとも６０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するプロテアーゼ変異体は、アミノ酸置換：
Ｓ０２４Ｇ＋Ｓ０５３Ｇ＋Ｓ０７８Ｎ＋Ｓ１０１Ｎ＋Ｇ１２８Ａ／Ｓ＋Ｙ２１７Ｑ／Ｌ／Ｄ、並びに以下の変異群から選択される１つ以上の置換群を含んでいてもよい：
Ａ０８８Ｔ＋Ｎ１０９Ｇ＋Ａ１１６Ｔ＋Ｇ１３１Ｈ＋Ｎ２４３Ｖ＋Ｌ２５７Ｇ、Ｓ０３３Ｔ＋Ｎ０７６Ｄ、Ｓ００９Ｔ＋Ｎ１０９Ｇ＋Ｋ１４１Ｒ＋Ｎ２４３Ｖ、Ｓ１６２Ｇ＋Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ＋Ａ１１６Ｔ、Ｎ１０９Ｇ＋Ｌ２５７Ｇ、Ｓ１６２Ｇ＋Ｌ２５７Ｇ、Ｎ０６１Ｇ＋Ｎ１０９Ｇ＋Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ＋Ｎ２４３Ｖ＋Ｓ２４８Ａ、Ｓ０３３Ｔ＋Ｎ０７６Ｄ＋Ｎ１０９Ｇ＋Ｎ２１８Ｓ＋Ｎ２４３Ｖ＋Ｓ２４８Ｎ＋Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ＋Ａ１１６Ｔ＋Ｎ２４３Ｖ＋Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ＋Ｎ１０９Ｇ＋Ａ１１６Ｔ＋Ｇ１３１Ｈ＋Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ＋Ｎ１０９Ｇ、Ｎ１０９Ｇ＋Ｎ２４３Ｖ、Ｔ１５８Ｓ＋Ｌ２５７Ｇ、Ｎ０６１Ｓ＋Ｎ１０９Ｇ＋Ｎ２４３Ｖ、Ｐ０４０Ａ＋Ｎ１０９Ｇ＋Ｎ２４３Ｖ＋Ｓ２４８Ｎ＋Ｋ２５６Ｒ、Ｓ００９Ｔ＋Ｓ０１８Ｔ＋Ｙ０２１Ｎ＋Ｎ１０９Ｇ＋Ｋ１４１Ｒ、Ａ０８８Ｔ＋Ｎ１０９Ｇ＋Ａ１１６Ｔ＋Ｔ１５８Ｓ＋Ｎ２４３Ｖ＋Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ＋Ｎ１０９Ｇ＋Ａ１１６Ｔ＋Ｔ１５８Ｓ＋Ｎ２１８Ｓ＋Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ＋Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ＋Ｎ２４３Ｖ＋Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０６３Ｇ＋Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０６３Ｇ＋Ｎ１０９Ｇ、Ｓ０６３Ｇ、Ｓ０６３Ｇ＋Ｎ０７６Ｄ、Ｓ０３３Ｔ＋Ｎ０７６Ｄ＋Ｎ２１８Ｓ及びＮ０７６Ｄ＋Ｎ２１８Ｓ。
【００２０】
この組成物の一態様では、このプロテアーゼは配列番号６を有する親プロテアーゼ変異体であり、この変異体は以下のアミノ酸置換群を１つ以上含む：Ａ０８８Ｔ＋Ｎ１０９Ｇ＋Ａ１１６Ｔ＋Ｇ１３１Ｈ＋Ｎ２４３Ｖ＋Ｌ２５７Ｇ、Ｓ０３３Ｔ＋Ｎ０７６Ｄ、Ｓ００９Ｔ＋Ｎ１０９Ｇ＋Ａ１２８Ｓ＋Ｋ１４１Ｒ＋Ｎ２４３Ｖ、Ｓ１６２Ｇ＋Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ＋Ａ１１６Ｔ、Ｎ１０９Ｇ＋Ｌ２５７Ｇ、Ｓ１６２Ｇ＋Ｌ２５７Ｇ、Ｎ０６１Ｇ＋Ｎ１０９Ｇ＋Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ＋Ａ１２８Ｓ＋Ｎ２４３Ｖ＋Ｓ２４８Ａ、Ｓ０３３Ｔ＋Ｎ０７６Ｄ＋Ｎ１０９Ｇ＋Ａ１２８Ｓ＋Ｎ２１８Ｓ＋Ｎ２４３Ｖ＋Ｓ２４８Ｎ＋Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ＋Ａ１１６Ｔ＋Ｎ２４３Ｖ＋Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ＋Ｎ１０９Ｇ＋Ａ１１６Ｔ＋Ｇ１３１Ｈ＋Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ＋Ｎ１０９Ｇ、Ｎ１０９Ｇ＋Ｎ２４３Ｖ、Ｔ１５８Ｓ＋Ｌ２５７Ｇ、Ｎ０６１Ｓ＋Ｎ１０９Ｇ＋Ｎ２４３Ｖ、Ｐ０４０Ａ＋Ｎ１０９Ｇ＋Ａ１２８Ｓ＋Ｎ２４３Ｖ＋Ｓ２４８Ｎ＋Ｋ２５６Ｒ、Ｓ００９Ｔ＋Ｓ０１８Ｔ＋Ｙ０２１Ｎ＋Ｎ１０９Ｇ＋Ａ１２８Ｓ＋Ｋ１４１Ｒ、Ａ０８８Ｔ＋Ｎ１０９Ｇ＋Ａ１１６Ｔ＋Ｔ１５８Ｓ＋Ｎ２４３Ｖ＋Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ＋Ｎ１０９Ｇ＋Ａ１１６Ｔ＋Ｔ１５８Ｓ＋Ｎ２１８Ｓ＋Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ＋Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ＋Ａ１２８Ｓ＋Ｎ２４３Ｖ＋Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０６３Ｇ＋Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０６３Ｇ＋Ｎ１０９Ｇ、Ｓ０６３Ｇ＋Ａ１２８Ｓ、Ｓ０６３Ｇ＋Ｎ０７６Ｄ、Ｓ０３３Ｔ＋Ｎ０７６Ｄ＋Ａ１２８Ｓ＋Ｎ２１８Ｓ及びＮ０７６Ｄ＋Ｎ２１８Ｓ。
【００２１】
この組成物の一態様では、この親プロテアーゼはサブチリシンプロテアーゼである。
【００２２】
この組成物の一態様では、この親プロテアーゼはＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ・サブチリシンプロテアーゼＢＰＮ’（配列番号２）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（以前はＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓとして分類されていた）、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂ．ｌａｕｔｕｓ、及びＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓからなる群から選択されるサブチリシンプロテアーゼである。
【００２３】
この組成物の一態様では、この冷水プロテアーゼは親プロテアーゼの変異体であり、この冷水プロテアーゼは、以下（ａ）及び（ｂ）群から選択される合計３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個の変異を含み、変異のうち少なくとも１つは次の（ａ）群から選択される：
ａ）１、９、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、３３、４３、７６、１０２、１０９、１３７、１４１、１５８、１６９、２０４、２１０、２１８、２４３、２４８、２４９、２５６、２５７、２６０、及び２６９、並びに
ｂ）２４、２５、４０、５２、５３、５５、５８、５９、６１、６２、６３、６８、７８、８６、８７、８８、８９、９２、９６、９７、１００、１０１、１０３、１０４、１０６、１１１、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１２３、１２４、１２５、１２６、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１４４、１４５、１５９、１６１、１６２、１６７、１９４、２０３、２０６、２１３、２１７、２２７、２３２、２３９、２４０、２４２、２６５、２６７、及び２７５。
【００２４】
この組成物の一態様では、上記配列番号２を有する親プロテアーゼの変異体は、以下（ａ）及び（ｂ）群から選択される合計３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個の変異を含み、変異のうち少なくとも１つは次の（ａ）群から選択される：
（ａ）Ａ１Ｅ／Ｔ、Ｓ９／Ｔ、Ｐ１４Ｌ、Ａ１５Ｌ、Ｌ１６Ｃ、Ｈ１７Ｔ、Ｓ１８Ｌ／Ｔ、Ｑ１９Ｋ、Ｇ２０Ａ、Ｙ２１Ｎ／Ｔ、Ｔ２２Ｌ、Ｇ２３Ｅ、Ｓ３３Ｔ、Ｋ４３Ｙ、Ｎ７６Ｄ、Ｇ１０２Ａ、Ｎ１０９Ａ／Ｓ／Ｇ、Ａ１３７Ｖ、Ｋ１４１Ｒ、Ｔ１５８Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ２０４Ｅ、Ｐ２１０Ｓ、Ｎ２１８Ｓ、Ｎ２４３Ｐ／Ｖ、Ｓ２４８Ｎ／Ａ、Ｓ２４９Ａ、Ｋ２５６Ｒ、Ｌ２５７Ｇ、Ｓ２６０Ｐ、及びＮ２６９Ｄ、並びに
（ｂ）Ｓ２４Ｇ／Ｒ／Ｅ、Ｎ２５Ｇ、Ｐ４０Ａ／Ｅ、Ｐ５２Ｌ、Ｓ５３Ｇ、Ｔ５５Ｐ、Ｆ５８Ｇ、Ｑ５９Ｓ、Ｎ６１Ｅ／Ｐ／Ｇ／Ｓ、Ｎ６２Ｑ／Ｒ／Ｓ、Ｓ６３Ｇ／Ｈ、Ｖ６８Ａ、Ｓ７８Ｎ、Ｐ８６Ｓ、Ｓ８７Ｄ／Ｇ、Ａ８８Ｔ／Ｖ、Ｓ８９Ｙ、Ａ９２Ｇ、Ｌ９６Ｔ、Ｇ９７Ａ、Ｇ１００Ｎ／Ｑ／Ｔ、Ｓ１０１Ｎ、Ｑ１０３Ｅ／Ｈ、Ｙ１０４Ｎ、Ｗ１０６Ｆ、Ｉ１１１Ｖ、Ａ１１４Ｇ、Ｉ１１５Ｖ、Ａ１１６Ｎ／Ｔ、Ｎ１１７Ｓ、Ｎ１１８Ｇ、Ｎ１２３Ａ／Ｇ／Ｑ／Ｖ、Ｍ１２４Ｉ／Ｖ、Ｓ１２５Ａ、Ｌ１２６Ａ、Ｇ１２８Ａ／Ｓ、Ｐ１２９Ｅ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｓ１３０Ｇ、Ｇ１３１Ｓ／Ｈ、Ｓ１３２Ｎ、Ａ１３３Ｖ、Ａ１３４Ｔ、Ａ１４４Ｋ、Ｓ１４５Ｄ、Ｓ１５９Ｋ、Ｓ１６１Ｐ、Ｓ１６２Ｇ／Ｋ、Ｙ１６７Ａ、Ｐ１９４Ｌ、Ｖ２０３Ｙ、Ｑ２０６Ｄ／Ｅ、Ｋ２１３Ｌ、Ｙ２１７Ｑ／Ｌ／Ｄ、Ｖ２２７Ｔ、Ａ２３２Ｔ、Ｐ２３９Ｒ／Ｖ、Ｎ２４０Ｋ、Ｔ２４２Ｒ、Ｋ２６５Ｎ、Ｌ２６７Ｖ、及びＱ２７５Ｅ。
【００２５】
この組成物の一態様では、この親プロテアーゼの変異体は、ＢＰＮ’野生型に対し−１、０又は＋１の合計正味電荷を有する。
【００２６】
この組成物の一態様では、組成物は次の：界面活性剤、ビルダー、キレート剤、移染防止剤、分散剤、１以上の追加の酵素、酵素安定剤、触媒材料、漂白活性剤、過酸化水素、過酸化水素供給源、予形成過酸（preformed peracid）、分散剤ポリマー、粘度汚れ除去／再付着防止剤、増白剤、抑泡剤（suds suppressor）、染料、香料、香料送達系、構造弾性化剤、布地用柔軟剤、担体、屈水性誘発物質、加工助剤、溶媒、顔料、及びこれらの混合物からなる群から選択される補助成分を含む。
【００２７】
この組成物の一態様では、この組成物は、香料を含むカプセル、色相剤、両親媒性の洗浄用ポリマー、増白剤、キレート剤、及びこれらの混合物からなる群から選択された材料を含む。
【００２８】
この組成物の一態様では、組成物は以下のａ）、ｂ）、ｃ）及びｄ）を含む群から選択された、免疫当量ではない第２のプロテアーゼを含む：
ａ）サブチリシン（ＥＣ  ３．４．２１．６２）、
ｂ）トリプシン様又はキモトリプシン様プロテアーゼ、
ｃ）メタロプロテアーゼ、並びに
ｄ）これらの混合物。
【００２９】
この組成物の一態様では、この組成物はサブチリシン（ＥＣ  ３．４．２１．６２）プロテアーゼを免疫当量ではない第２のプロテアーゼとして含み、このサブチリシン（ＥＣ  ３．４．２１．６２）プロテアーゼは冷水用ＧＧ３６変異体プロテアーゼである。
【００３０】
この組成物の一態様では、この組成物は、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、セロビオース脱水素酵素、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、リケナーゼ、グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、又はこれらの混合物からなる群から選択された追加の酵素を含む。
【００３１】
この組成物の一態様では、この組成物は以下のａ）、ｂ）、ｃ）及びｄ）からなる群から選択された追加の酵素を含む：
ａ）第１洗浄用リパーゼ、
ｂ）バチルスｓｐ．ＮＣＩＢ  １２２８９、ＮＣＩＢ  １２５１２、ＮＣＩＢ  １２５１３、ＤＳＭ  ９３７５  ＤＳＭ  １２３６８、ＤＳＭＺ番号１２６４９、ＫＳＭ  ＡＰ１３７８、ＫＳＭ  Ｋ３６又はＫＳＭ  Ｋ３８から誘導される野生型のアルカリンα−アミラーゼと９０％超相同であるα−アミラーゼ、
ｃ）微生物から誘導されるエンドグルカナーゼ、並びに
ｄ）これらの混合物。
【００３２】
この組成物の一態様では、この組成物は、以下のａ）、ｂ）、及びｃ）からなる群から選択された材料を含む：
ａ）アルコールエトキシサルフェート型界面活性剤、
ｂ）ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＨＥＤＰ（ヒドロキシエタンジホスホン酸）、ＤＴＰＭＰ（ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸））、エチレンジアミン二コハク酸（ＥＤＤＳ）、１，２−ジヒドロキシベンゼン−３，５−ジスルホン酸二ナトリウム塩水和物、及びこのようなキレートの誘導体からなる群から選択されたキレート剤、並びに
ｃ）これらの混合物。
【００３３】
この組成物の一態様では、この組成物は、以下のａ）、ｂ）、及びｃ）からなる群から選択された材料を含む：
ａ）アルキル鎖長が１０〜１４でかつエトキシル化度が１〜４であるアルコールエトキシサルフェート型界面活性剤、
ｂ）ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＨＥＤＰ（ヒドロキシエタンジホスホン酸）、ＤＴＰＭＰ（ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸））、エチレンジアミン二コハク酸（ＥＤＤＳ）、１，２−ジヒドロキシベンゼン−３，５−ジスルホン酸二ナトリウム塩水和物、及びこのようなキレートの誘導体からなる群から選択されたキレート剤、並びに
ｃ）これらの混合物。
【００３４】
この組成物の一態様では、この組成物は、組成物の合計重量に基づき、約１重量％〜約５重量％の濃度でキレート剤を含む。
【００３５】
この組成物の一態様では、この組成物は以下のａ）、ｂ）、及びｃ）からなる群から選択された布地色相剤を含む：
ａ）染料、
ｂ）カチオン性塩基性染料及びスメクタイト粘土を少なくとも１種含む、染料−粘土共役体、並びに
ｃ）これらの混合物。
【００３６】
この組成物の一態様では、この組成物は以下のａ）、ｂ）、及びｃ）からなる群から選択された布地色相剤を含む：
ａ）小分子染料、高分子染料及びこれらの混合物、
ｂ）カチオン性塩基性染料及びスメクタイト粘土を少なくとも１種含む、染料−粘土共役体、並びに
ｃ）これらの混合物。
【００３７】
この組成物の一態様では、この組成物は、組成物の合計重量に基づき、以下のａ）及びｂ）を含む：
ａ）約０．０００５重量％〜約０．１重量％の冷水プロテアーゼ、並びに
ｂ）以下の（ｉ）、（ｉｉ）及び／又は（ｉｉｉ）のうちの１つ以上、
（ｉ）約０．００００３重量％〜約０．１重量％の布地色相剤、
（ｉｉ）約０．００１重量％〜約５重量％の香料カプセル、
（ｉｉｉ）約０．１重量％〜約５重量％の両親媒性の洗浄用ポリマー。
【００３８】
この組成物の一態様では、この組成物は単独の単位用量形態であるか、又は複数区画を有する単位用量形態である。
【００３９】
この組成物の一態様では、この組成物は複数区画を有する単位容量形態であり、少なくとも１種のプロテアーゼが任意の追加の酵素及び／又はキレート剤とは異なる区画に存在する。
【００４０】
一態様では、冷水プロテアーゼと、香料を含むカプセル、ＧＧ３６変異体プロテアーゼ、色相剤、両親媒性の洗浄用ポリマー、及びこれらの混合物からなる群から選択された材料とを含む、布地ケア製品及びホームケア製品である組成物が開示される。
【００４１】
冷水プロテアーゼと、香料を含むカプセル、ＧＧ３６変異体プロテアーゼ、色相剤、両親媒性の洗浄用ポリマー、及びこれらの混合物からなる群から選択された材料と、を含む上記組成物の一態様では、冷水プロテアーゼは配列番号２（サブチリシンＢＰＮ’）を有するプロテアーゼの変異体であり、この変異体は以下の変異、挿入又は欠失の組み合わせを１つ以上含む：Ｓ１８２Ｅ、Ｎ１０９Ｉ、Ｎ１０９Ｄ−Ｙ２１７Ｌ−Ｓ２４８Ｒ、Ｎ１０９Ｄ−Ｓ１８８Ｒ−Ｙ２１７Ｌ、Ｓ８７Ｄ−Ｙ２１７Ｌ−Ｓ２４８Ｒ、Ｓ８７Ｒ−Ｎ１０９Ｄ−Ｙ２１７Ｌ−Ｓ２４８Ｒ、Ｓ８７Ｒ−Ｎ１０９Ｄ−Ｓ１８８Ｄ−Ｙ２１７Ｌ−Ｓ２４８Ｒ、Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ、Ｍ１２４Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ６２Ｑ−Ｇ９７Ａ、Ｓ８９Ｙ−Ｍ１２４Ｖ、Ｖ６８Ａ、Ｖ６８Ａ−Ａ９２Ｇ、Ｖ６８Ａ−Ｇ９７Ａ、Ｖ６８Ａ−Ｉ１１１Ｖ、Ｖ６８Ａ−Ｓ８９Ｙ、Ｖ６８Ａ−Ｖ２２７Ｔ、Ｖ６８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｗ１０６Ｆ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ９７Ａ−Ｌ１２６Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ９７Ａ−Ｍ１２４Ｖ−Ｌ１２６Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ９７Ａ−Ｎ１２３Ｇ−Ｙ２１７Ｑ、Ｌ９６Ｔ−Ｇ９７Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｍ１２４Ｖ−Ｌ１２６Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ６２Ｑ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ６２Ｑ−Ｇ９７Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ９７Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｍ、Ｇ９７Ｇ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｅ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ９７Ｍ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｅ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ９７Ｄ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ９７Ｍ−Ｇ１２８Ｇ−Ｙ２１７Ｍ、Ｇ９７Ｇ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ９７Ｓ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ９７Ｇ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ９７Ｓ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｅ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｌ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｎ、Ｇ９７Ｑ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｌ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｍ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｓ、Ｇ９７Ｄ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ９７Ｍ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ９７Ｑ−Ｇ１２８Ｇ−Ｙ２１７Ｄ−Ｓ８７Ｙ、Ｇ９７Ｓ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｎ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｔ、Ｇ９７Ｄ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｅ、Ｇ９７Ｄ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｌ、Ｇ９７Ｇ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｅ−Ｓ７８Ｐ−Ａ２７２Ｔ、Ｇ９７Ｔ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｄ、Ｇ９７Ｄ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｉ、Ｇ９７Ｑ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ９７Ｇ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｄ、Ｇ９７Ｑ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｎ、Ｇ９７Ｓ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｍ、Ｇ９７Ｓ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｎ、Ｇ９７Ｓ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｍ、Ｇ９７Ｅ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｍ、Ｇ９７Ｓ−Ｇ１２８Ｐ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ９７Ｔ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ９７Ｄ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ−Ａ７３Ｔ、Ｇ９７Ｅ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｎ、Ｇ９７Ｇ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｉ、Ｇ９７Ｑ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｄ、Ｇ９７Ｑ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｍ、Ｇ９７Ｒ−Ｇ１２８Ｔ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ１６２Ｐ、Ｇ９７Ｓ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｄ、Ｇ９７Ｔ−Ｇ１２８Ｐ−Ｙ２１７Ｉ、Ｇ９７Ｑ−Ｇ１２８Ｇ−Ｙ２１７Ｅ、Ｇ９７Ｃ−Ｇ１２８Ｇ−Ｙ２１７Ｎ、Ｇ９７Ｄ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｈ、Ｇ９７Ｍ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｌ、Ｇ９７Ｍ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｎ、Ｇ９７Ｓ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｅ、Ｇ９７Ｍ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｉ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ｐ−Ｙ２１７Ａ、Ｇ９７Ｒ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｄ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ１４５Ｄ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｐ２３９Ｒ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ６１Ｅ−Ｐ１２９Ｅ−Ｓ１６２Ｋ−Ｋ２１３Ｌ−Ｎ２４０Ｋ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ６１Ｅ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｐ４０Ｅ−Ａ１４４Ｋ−Ｋ２１３Ｌ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｐ１２９Ｅ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ６１Ｅ−Ｐ１２９Ｅ−Ｓ１５９Ｋ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｋ２１３Ｌ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ８７Ｄ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｑ２０６Ｅ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｒ−Ｐ４０Ｅ−Ｓ１４５Ｄ−Ｓ１５９Ｋ−Ｋ２１３Ｌ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｋ２６５Ｎ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｒ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｐ４０Ｅ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｑ２７５Ｅ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｐ１２９Ｅ−Ｓ１４５Ｄ−Ｎ２４０Ｋ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ａ１４４Ｋ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ１５９Ｋ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ１６２Ｋ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ２４０Ｋ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ５３Ｇ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ７８Ｎ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ５３Ｇ−Ｓ７８Ｎ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ５３Ｇ−Ｉ１１１Ｖ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ５３Ｇ−Ｎ１１７Ｓ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ５３Ｇ−Ｓ１３２Ｎ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｙ１０４Ｎ−Ｓ１３２Ｎ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ５３Ｇ−Ｓ７８Ｎ−Ｉ１１１Ｖ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ５３Ｇ−Ｓ７８Ｎ−Ｎ１１７Ｓ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ５３Ｇ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ１３２Ｎ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ５３Ｇ−Ｙ１０４Ｎ−Ｓ１３２Ｎ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ７８Ｎ−Ｙ１０４Ｎ−Ｓ１３２Ｎ、Ｙ２１７Ｌ−Ｖ０６８Ｃ−Ａ０６９Ｇ、Ｙ２１７Ｌ−Ｉ０７９Ｆ−Ａ０９８Ｇ、Ｙ２１７Ｌ−Ｐ０８６Ｔ−Ｓ１０１Ｄ−Ｑ１０３Ｓ−Ｖ１４７Ｉ、Ｙ２１７Ｌ−Ａ０８８Ｔ−Ｐ１２９Ｓ−Ｇ１４６Ｄ、Ｙ２１７Ｌ−Ｖ０９３Ｉ−Ｇ１２８Ｄ−Ｐ１２９Ｒ、Ｙ２１７Ｌ−Ｚ０９６．０１Ｄ−Ａ０９８Ｒ、Ｙ２１７Ｌ−Ｚ０９６．０１Ｈ−Ａ０９８Ｇ、Ｙ２１７Ｌ−Ｇ０９７Ｓ−Ｚ０９７．０１Ｓ−Ａ０９８Ｇ−Ａ２７３Ｔ、Ｙ２１７Ｌ−Ａ０９８Ｓ−Ｄ０９９Ｇ−Ｇ１００Ｄ、Ｙ２１７Ｌ−Ｚ０９８．０１Ｎ、Ｙ２１７Ｌ−Ｄ０９９Ｇ−Ｚ０９９．０１Ｎ、Ｙ２１７Ｌ−Ｄ０９９Ｇ−Ｚ０９９．０１Ｓ、Ｙ２１７Ｌ−Ｄ０９９Ｖ−Ｓ１０１Ｄ、Ｙ２１７Ｌ−Ｚ０９９．０１Ｓ、Ｙ２１７Ｌ−Ｇ１００Ｄ、Ｙ２１７Ｌ−Ｓ１０１Ｄ−Ｑ１０３Ｈ、Ｙ２１７Ｌ−Ｓ１０１Ｇ−Ａ１５１Ｖ、Ｙ２１７Ｌ−Ｓ１０１Ｈ−Ｇ１０２Ｓ、Ｙ２１７Ｌ−Ｓ１０１Ｈ−Ｑ１０３Ｄ、Ｙ２１７Ｌ−Ｇ１０２Ｒ−Ｑ１０３Ｃ−Ｙ１０４Ｃ−Ｖ１９２Ｉ、Ｙ２１７Ｌ−Ｑ１０３Ｄ、Ｙ２１７Ｌ−Ｖ１２１Ｉ−Ｉ１２２Ｓ−Ｎ１２３Ｃ、Ｙ２１７Ｌ−Ｖ１２１Ｌ−Ｎ１２３Ｃ、Ｙ２１７Ｌ−Ｉ１２２Ｓ−Ｎ１２３Ｓ、Ｙ２１７Ｌ−Ｍ１２４Ｉ、Ｙ２１７Ｌ−Ｍ１２４Ｖ、Ｙ２１７Ｌ−Ｌ１２６Ｆ−Ｐ１２９Ｚ−Ｓ１８２Ｎ、Ｙ２１７Ｌ−Ｌ１２６Ｙ、Ｙ２１７Ｌ−Ｇ１２７Ｓ−Ｐ１２９Ｄ、Ｙ２１７Ｌ−Ｚ１２７．０１Ｎ−Ｇ１２８Ｓ−Ｐ１２９Ｓ、Ｙ２１７Ｌ−Ｇ１２８Ｈ−Ｐ１２９Ｙ、Ｙ２１７Ｌ−Ｇ１２８Ｓ−Ｐ１２９Ｄ、Ｙ２１７Ｌ−Ｇ１２８Ｓ−Ｐ１２９Ｄ−Ｓ２４８Ｒ、Ｙ２１７Ｌ−Ｇ１２８Ｓ−Ｐ１２９Ｇ、Ｙ２１７Ｌ−Ｐ１２９Ｇ−Ｇ１３１Ｚ、Ｙ２１７Ｌ−Ｐ１２９Ｇ−Ｓ１３０Ｈ−Ｓ１３２Ｚ、Ｙ２１７Ｌ−Ｐ１２９Ｈ−Ｇ１３１Ｚ、Ｙ２１７Ｌ−Ｐ１２９Ｌ、Ｙ２１７Ｌ−Ｐ１２９Ｓ−Ｓ１３０Ｈ−Ｓ１３２Ｚ、Ｙ２１７Ｌ−Ｐ１２９Ｚ、Ｙ２１７Ｌ−Ｐ１２９Ｚ−Ｓ１３０Ｇ、Ｙ２１７Ｌ−Ｐ１２９Ｚ−Ｓ１３０Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ１３２Ｈ、Ｙ２１７Ｌ−Ｐ１２９Ｚ−Ｓ１３０Ｈ、Ｙ２１７Ｌ−Ｓ１３０Ｖ−Ｇ１３１Ｄ−Ｓ１３２Ｉ、Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ−Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｈ−Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ８７Ｇ−Ａ８８Ｖ−Ｓ８９Ａ−Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｐ８６Ｓ−Ｓ８７Ｇ−Ａ８８Ｖ−Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｑ５９Ｓ−Ｎ６１Ｐ−Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ６１Ｐ−Ｎ６２Ｓ−Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｐ１２９Ｑ−Ｓ１３０Ｇ−Ｇ１３１Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｌ７５Ｓ−Ｎ７６Ｙ−Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｖ２０３Ｙ−Ｙ２１７Ｑ、Ｔ５５Ｐ−Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ａ８８Ｖ−Ｌ９０Ｉ−Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｇ２１１Ｒ−Ｎ２１２Ｓ−Ｋ２１３Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ２３Ａ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｔ２２Ｎ−Ｓ２４Ａ−Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ２４Ｒ−Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ９７Ａ−Ａ９８Ｓ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｔ１５８Ｇ−Ｓ１５９Ｇ−Ｙ２１７Ｑ、Ｑ５９Ｅ−Ｎ６１Ｐ−Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ９７Ａ−Ａ９８Ｅ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｐ８６Ｓ−Ｓ８７Ｇ−Ａ８８Ｖ−Ａ１１６Ｎ−Ｎ１１７Ｓ−Ｎ１１８Ｇ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ６３Ｔ−Ｐ８６Ｓ−Ｓ８７Ｇ−Ａ８８Ｖ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｐ８６Ｓ−Ｓ８７Ｇ−Ａ８８Ｖ−Ｐ２３９Ｒ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｎ６１Ｐ−Ｎ６２Ｓ−Ｐ１９４Ｌ−Ａ２３２Ｔ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｐ１２９Ｑ−Ｓ１３０Ｇ−Ｇ１３１Ｓ−Ａ１３３Ｖ−Ｌ２６７Ｖ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ａ１３４Ｔ−Ｌ２６７Ｖ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｒ−Ｐ４０Ｅ−Ｐ１２９Ｅ−Ｓ１５９Ｋ−Ｋ２６５Ｒ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ａ１３４Ｔ−Ｇ２１１Ｔ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｒ−Ｐ１２９Ｅ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｉ１１１Ｖ−Ｓ１６１Ｐ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｔ５５Ｐ−Ｐ１２９Ｑ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｉ１１５Ｖ−Ｌ２６７Ｖ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｐ８６Ｓ−Ｓ８７Ｇ−Ａ８８Ｖ−Ａ１１６Ｓ−Ｎ１１７Ｇ−Ｎ１１８Ｒ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｖ２０３Ｙ−Ｌ２６７Ｖ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｖ２０３Ｙ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｐ５２Ｓ−Ｔ５５Ｐ−Ｖ２０３Ｙ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｑ５９Ｓ−Ｎ６１Ｐ−Ａ１１６Ｓ−Ｎ１１７Ｇ−Ｎ１１８Ｒ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｐ１２９Ｑ−Ｓ１３０Ｇ−Ｇ１３１Ｓ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｐ８６Ｓ−Ｓ８７Ｇ−Ａ８８Ｖ−Ｔ２４２Ｒ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｐ４０Ｅ−Ｔ５５Ｐ−Ｎ２６９Ｋ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｇ２３Ａ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ａ１１６Ｎ−Ｎ１１７Ｓ−Ｎ１１８Ｇ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｖ８Ｌ−Ｎ２５Ｙ−Ｐ１２９Ｑ−Ｓ１３０Ｇ−Ｇ１３１Ｓ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｓ５３Ｇ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ−Ｓ１０１Ｎ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｇ２１１Ｔ−Ｌ２６７Ｖ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｒ−Ａ１１６Ｎ−Ｎ１１７Ｓ−Ｎ１１８Ｇ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｒ−Ａ１２８Ｓ−Ｐ１２９Ｇ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｐ１２９Ｑ−Ｓ１３０Ｇ−Ｇ１３１Ｓ−Ｎ２４０Ｋ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ２５Ｙ−Ｐ１２９Ｑ−Ｓ１３０Ｇ−Ｇ１３１Ｓ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ−Ａ１３４Ｔ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｐ１２９Ｑ−Ｓ１３０Ｇ−Ｇ１３１Ｓ−Ｌ２６７Ｖ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ８７Ｇ−Ａ８８Ｖ−Ｓ８９Ａ−Ａ１１６Ｎ−Ｎ１１７Ｓ−Ｎ１１８Ｇ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ６１Ｐ−Ｐ１２９Ｑ−Ｓ１３０Ｇ−Ｇ１３１Ｓ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ−Ｓ１０１Ｎ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｔ５５Ｐ−Ｐ１２９Ｖ−Ｐ
１９４Ｓ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｔ５５Ｐ−Ｐ１２９Ｖ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｔ５５Ｐ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｔ５５Ｐ−Ｓ７８Ｎ−Ｉ１１５Ｖ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ２５Ｙ−Ｓ８７Ｇ−Ａ８８Ｖ−Ｓ８９Ａ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ａ１３４Ｔ−Ｎ２４０Ｋ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｒ−Ｑ５９Ｓ−Ｎ６１Ｐ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｇ２３Ａ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｐ２３９Ｒ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｔ５５Ｐ−Ａ１１６Ｓ−Ｎ１１７Ｇ−Ｎ１１８Ｒ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ａ１３４Ｔ−Ｓ１６１Ｐ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｓ５３Ｇ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｖ２０３Ｙ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ２５Ｙ−Ｑ５９Ｓ−Ｎ６１Ｐ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ２５Ｙ−Ｐ１２９Ｑ−Ｓ１３０Ｇ−Ｇ１３１Ｓ−Ａ１３７Ｔ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｇ２３Ａ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｈ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｔ５５Ｐ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｖ２０３Ｙ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｐ１２９Ｑ−Ｎ２４０Ｋ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｔ５５Ｐ−Ａ１３４Ｔ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ２５Ｙ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｈ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ−Ｐ１２９Ｓ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｔ５５Ｐ−Ｌ７５Ｈ−Ｎ７６Ｇ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｓ５３Ｇ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ−Ｓ１０１Ｎ−Ｖ２０３Ｙ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｔ５５Ｐ−Ｉ１１５Ｖ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｔ５５Ｐ−Ａ１１６Ｎ−Ｎ１１７Ｓ−Ｎ１１８Ｇ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ａ１１６Ｎ−Ｎ１１７Ｓ−Ｎ１１８Ｇ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｒ−Ｐ１２９Ｑ−Ｓ１３０Ｇ−Ｇ１３１Ｓ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｇ２３Ａ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｇ２１１Ｒ−Ｎ２１２Ｓ−Ｋ２１３Ｖ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｔ５５Ｐ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｖ２０３Ｙ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｔ５５Ｐ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ−Ｓ１０１Ｎ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｉ１１５Ｖ−Ａ２７３Ｓ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ２５Ｙ−Ｔ５５Ｐ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｓ５３Ｇ−Ｔ５５Ｐ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ−Ｓ１０１Ｎ−Ｖ２０３Ｙ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｑ５９Ｓ−Ｎ６１Ｐ−Ｎ２４０Ｋ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ１６１Ｐ−Ｌ２６７Ｖ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｓ５３Ｇ−Ｔ５５Ｐ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ−Ｓ１０１Ｎ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ−Ｓ１０１Ｎ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ１０１Ｎ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｓ５３Ｇ−Ｔ５５Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｖ２０３Ｙ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ２４０Ｋ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｓ５３Ｇ−Ｔ５５Ｐ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ−Ｓ１０１Ｎ−Ｖ２０３Ｙ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｔ５５Ｐ−Ｓ１０１Ｎ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｈ−Ａ１２８Ｓ−Ｐ１２９Ｑ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ８９Ｙ−Ｐ１２９Ｑ−Ｓ１３０Ｇ−Ｇ１３１Ｓ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｐ１２９Ｑ−Ｓ１３０Ｇ−Ｇ１３１Ｓ−Ｖ２０３Ｙ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｉ１１５Ｖ−Ｎ２４０Ｋ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ５３Ｇ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ−Ｓ１０１Ｎ−Ｖ２０３Ｙ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ１６１Ｐ−Ｖ２０３Ｙ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ−Ｎ２４０Ｋ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ−Ｐ２３９Ｒ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｔ５５Ｐ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ−Ｓ１０１Ｎ−Ｖ２０３Ｙ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｉ１１５Ｖ−Ａ１３４Ｔ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｙ６Ｑ−Ｐ１２９Ｑ−Ｓ１３０Ｇ−Ｇ１３１Ｓ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｔ５５Ｐ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ８９Ｙ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｔ５５Ｐ−Ｓ７８Ｎ−Ａ８８Ｖ−Ｓ１０１Ｎ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｈ−Ｓ７８Ｎ−Ｉ１１１Ｖ−Ａ１３４Ｔ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｓ５３Ｇ−Ｔ５５Ｐ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｓ５３Ｇ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｖ２０３Ｙ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ５３Ｇ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｖ２０３Ｙ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ５３Ｇ−Ｔ５５Ｐ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｖ２０３Ｙ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ５３Ｇ−Ｔ５５Ｐ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ−Ｓ１０１Ｎ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ２４０Ｋ−Ａ２７３Ｓ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ−Ｓ１０１Ｎ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｑ５９Ｓ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｈ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ１６１Ｐ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｈ−Ｓ７８Ｎ−Ｉ１１１Ｖ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｔ５５Ｐ−Ａ１２８Ｓ−Ｐ１２９Ｑ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｖ２０３Ｙ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ６１Ｅ−Ａ１４４Ｋ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ａ１３４Ｔ−Ｐ２３９Ｒ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｓ５３Ｇ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ１０１Ｎ−Ｖ２０３Ｙ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｓ５３Ｇ−Ｔ５５Ｐ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｖ２０３Ｙ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ−Ｓ１０１Ｎ−Ｖ２０３Ｙ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｔ５５Ｐ−Ｎ２４０Ｋ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ−Ｓ１０１Ｎ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｐ１２９Ｑ−Ｓ１３０Ｇ−Ｇ１３１Ｓ−Ｐ２３９Ｒ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ５３Ｇ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ１０１Ｎ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｉ１１１Ｖ−Ｐ１２９Ｑ−Ｇ２１１Ｔ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｓ５３Ｇ−Ｓ１０１Ｎ−Ｖ２０３Ｙ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｑ５９Ｓ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ８７Ｇ−Ａ８８Ｖ−Ｓ８９Ａ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ−Ｓ１０１Ｎ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｐ１２９Ｑ−Ｓ１３０Ｇ−Ｇ１３１Ｓ−Ｓ１６２Ｋ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｔ５５Ｐ−Ｐ１２９Ｑ−Ｓ１３０Ｇ−Ｇ１３１Ｓ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｔ５５Ｐ−Ｖ２０３Ｙ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ８７Ｇ−Ａ８８Ｖ−Ｓ８９Ａ−Ｐ１２９Ｑ−Ｓ１３０Ｇ−Ｇ１３１Ｓ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｓ５３Ｇ−Ｔ５５Ｐ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｉ１１１Ｖ−Ｐ１２９Ｑ−Ｓ１３０Ｇ−Ｇ１３１Ｓ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｉ１１１Ｖ−Ａ２７３Ｓ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｔ２２Ｎ−Ｓ２４Ａ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｈ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ５３Ｇ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ−Ｓ１０１Ｎ−Ｐ１２９Ｓ−Ｖ２０３Ｙ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ１５９Ｋ−Ｌ２６７Ｖ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｐ４０Ｅ−Ｓ５３Ｙ−Ｓ７８Ｙ−Ｐ８６Ｓ−Ｓ８７Ｇ−Ａ８８Ｖ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｒ−Ｓ１４５Ｄ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｉ１１１Ｖ−Ｓ１５９Ｋ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｔ５５Ｐ−Ｐ１２９Ｌ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｑ５９Ｓ−Ｎ６１Ｐ−Ｖ２０３Ｙ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｔ５５Ｐ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ−Ｓ１０１Ｎ−Ｖ２０３Ｙ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｓ５３Ｇ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ５３Ｇ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ−Ｓ１０１Ｎ−Ｖ２０３Ｙ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ８９Ｙ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｒ−Ｐ１２９Ｖ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ８７Ｇ−Ａ８８Ｖ−Ｓ８９Ａ−Ａ１１６Ｎ−Ｎ１１７Ｓ−Ｎ１１８Ｇ−Ｐ１７２Ｈ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｉ１１１Ｖ−Ａ１３４Ｔ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｑ５９Ｓ−Ｎ６１Ｐ−Ｐ１２９Ｑ−Ｓ１３０Ｇ−Ｇ１３１Ｓ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｐ５Ｓ−Ｓ８７Ｇ−Ａ８８Ｖ−Ｓ８９Ａ−Ａ１１６Ｇ−Ｎ１１７Ｒ、Ｙ２１７Ｑ−Ｎ６１Ｐ−Ａ９７Ｇ−Ｇ１０２Ａ−Ａ１２８Ｇ−Ｐ１２９Ｓ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｓ５３Ｇ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ７８Ｎ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ１４５Ｄ−Ｓ１５９Ｋ−Ｎ２４０Ｋ−Ｑ２７５Ｅ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｔ５５Ｐ−Ａ１２８Ｓ−Ｐ１２９Ｄ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｇ２３Ａ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｐ１２９Ｄ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｓ５３Ｇ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ−Ｖ２０３Ｙ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｉ１１１Ｖ−Ｐ２３９Ｒ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ８７Ｇ−Ａ８８Ｖ−Ｓ８９Ａ−Ｓ１６２Ｋ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ−Ｉ１１５Ｖ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｔ５５Ｐ−Ｓ７８Ｎ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｔ５５Ｐ−Ａ９２Ｇ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｓ５３Ｇ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ−Ｖ２０３Ｙ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｔ２２Ｎ−Ｓ２４Ａ−Ｔ５５Ｐ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ５３Ｇ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ−Ｓ１０１Ｎ−Ｖ２０３Ｙ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｓ５３Ｇ−Ｔ５５Ｐ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｐ１２９Ｑ−Ｓ１３０Ｇ−Ｇ１３１Ｓ−Ｓ１５９Ｋ、Ｇ９７Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ６１Ｐ−Ｎ６２Ｑ−Ｇ１００Ｎ−Ａ１２８Ｇ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｒ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ１８２Ｐ−Ｌ２６７Ｖ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｐ２３９Ｒ−Ａ２７３Ｓ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ５３Ｇ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ−Ｓ１０１Ｎ−Ｖ２０３Ｙ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｐ１２９Ｑ−Ｓ１３０Ｇ−Ｇ１３１Ｓ−Ｔ２４２Ｒ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ３Ｆ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ−Ｇ２１１Ｔ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８
Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｌ７５Ｈ−Ｎ７６Ｇ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ５３Ｇ−Ｔ５５Ｐ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ−Ａ１４４Ｋ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ−Ｖ２０３Ｙ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｑ５９Ｓ−Ｎ６１Ｐ−Ａ１１６Ｎ−Ｎ１１７Ｓ−Ｎ１１８Ｇ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ−Ｉ１１１Ｖ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｒ−Ｓ１４５Ｄ−Ｐ２３９Ｒ−Ｑ２７５Ｅ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ１４５Ｄ−Ａ２７３Ｓ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｋ１４１Ｅ−Ｔ２４２Ｒ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ−Ｓ１０１Ｎ−Ｖ２０３Ｙ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ａ１１６Ｎ−Ｎ１１７Ｓ−Ｎ１１８Ｇ−Ｐ１２９Ｑ−Ｓ１３０Ｇ−Ｇ１３１Ｓ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ８９Ｙ−Ｇ２１１Ｔ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ８７Ｇ−Ａ８８Ｖ−Ｓ８９Ａ−Ａ１１６Ｎ−Ｎ１１７Ｓ−Ｎ１１８Ｇ−Ａ１４４Ｔ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ−Ｓ１０１Ｎ−Ｖ２０３Ｙ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｐ１２９Ｖ、Ｇ９７Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ６１Ｐ−Ａ１２８Ｇ−Ｐ１２９Ｓ−Ｓ１３０Ｐ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｔ５５Ｐ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ−Ｇ１１０Ｃ−Ｓ１３０Ｐ、Ｇ９７Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ１２３Ｇ−Ａ１２８Ｇ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ６１Ｐ−Ｎ６２Ｑ−Ｇ１００Ｎ−Ｇ１０２Ａ−Ｍ１２４Ｉ、Ｓ７８Ｎ−Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ａ１３７Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ６１Ｐ−Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｓ１３０Ｐ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ９７Ａ−Ｑ１０３Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ６３Ｔ−Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１０２Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ９７Ａ−Ｎ１０９Ｄ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４８Ｒ、Ｓ８７Ｒ−Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｓ１８８Ｄ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ８７Ｄ−Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４８Ｒ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｓ１８８Ｄ−Ｓ２４８Ｒ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｓ２４８Ｄ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ７８Ｎ−Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｌ２６７Ｖ、Ｓ７８Ｎ−Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ１６１Ｐ、Ｓ７８Ｎ−Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｉ１１５Ｖ、Ｓ７８Ｎ−Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ａ２７３Ｓ、Ｓ７８Ｎ−Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｇ２１１Ｔ、Ｓ７８Ｎ−Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ７８Ｎ−Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｉ１１１Ｖ、Ｓ７８Ｎ−Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｖ１４７Ｌ、Ｓ７８Ｎ−Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｉ１０８Ｖ、Ｓ７８Ｎ−Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ８９Ｙ、Ｓ７８Ｎ−Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ａ１３８Ｔ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ａ１３４Ｔ−Ｋ２１３Ｌ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｇ２３Ａ−Ｓ２４Ｇ−Ｎ２５Ｇ−Ｐ１２９Ｖ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｒ−Ｐ２３９Ｒ、Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４Ｒ−Ｓ８７Ｔ−Ａ８８Ｌ−Ｓ８９Ｇ。
【００４２】
冷水プロテアーゼと、香料を含むカプセル、ＧＧ３６変異体プロテアーゼ、色相剤、両親媒性の洗浄用ポリマー、及びこれらの混合物からなる群から選択された材料と、を含む上記組成物の一態様では、上記配列番号２を有するプロテアーゼの変異体は、位置２４、２５、４０、５２、５３、５５、５８、５９、６１、６２、６３、６８、７８、８６、８７、８８、８９、９２、９６、９７、１００、１０１、１０３、１０４、１０６、１１１、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１２３、１２４、１２５、１２６、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１４４、１４５、１５９、１６１、１６２、１６７、１９４、２０３、２０６、２１３、２１７、２２７、２３２、２３９、２４０、２４２、２６５、２６７、及び２７５を含む位置群に、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個の変異を含む。
【００４３】
冷水プロテアーゼと、香料を含むカプセル、ＧＧ３６変異体プロテアーゼ、色相剤、両親媒性の洗浄用ポリマー、及びこれらの混合物からなる群から選択された材料と、を含む上記組成物の一態様では、上記配列番号２を有するプロテアーゼの変異体は、以下（ａ）及び（ｂ）群から選択される合計３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個の変異を含む：
（ａ）Ｎ６１Ｅ、Ａ１４４Ｋ、Ｐ１２９Ｅ、Ｐ２３９Ｒ、Ｐ４０Ｅ、Ｑ１０３Ｅ、Ｑ２０６Ｅ、Ｑ２７５Ｅ、Ｓ１４５Ｄ、Ｓ１５９Ｋ、Ｓ１６２Ｋ、Ｓ２４Ｒ、Ｓ６３Ｈ、Ｓ８７Ｄ、及びＴ２４２Ｒからなる群から選択される電荷変異（charged mutation）、並びに
（ｂ）Ａ１１４Ｇ、Ａ１１６Ｎ、Ａ１３３Ｖ、Ａ１３４Ｔ、Ａ２３２Ｔ、Ａ８８Ｖ、Ａ９２Ｇ、Ｆ５８Ｇ、Ｇ１００Ｔ、Ｇ１２８Ａ、Ｇ１３１Ｓ、Ｇ９７Ａ、Ｉ１１１Ｖ、Ｉ１１５Ｖ、Ｋ２１３Ｌ、Ｋ２６５Ｎ、Ｌ１２６Ａ、Ｌ２６７Ｖ、Ｌ９６Ｔ、Ｍ１２４Ｖ、Ｎ１１７Ｓ、Ｎ１１８Ｇ、Ｎ１２３Ｇ、Ｎ２４０Ｋ、Ｎ２５Ｇ、Ｎ６１Ｐ、Ｎ６２Ｑ、Ｎ６２Ｒ、Ｎ６２Ｓ、Ｐ１２９Ｑ、Ｐ１２９Ｖ、Ｐ１９４Ｌ、Ｐ２３９Ｖ、Ｐ５２Ｌ、Ｐ８６Ｓ、Ｑ５９Ｓ、Ｓ１０１Ｎ、Ｓ１２５Ａ、Ｓ１３０Ｇ、Ｓ１３２Ｎ、Ｓ１６１Ｐ、Ｓ２４Ｇ、Ｓ５３Ｇ、Ｓ７８Ｎ、Ｓ８７Ｇ、Ｓ８９Ｙ、Ｔ５５Ｐ、Ｖ２０３Ｙ、Ｖ２２７Ｔ、Ｖ６８Ａ、Ｗ１０６Ｆ、Ｙ１０４Ｎ、Ｙ１６７Ａ、及びＹ２１７Ｑからなる群から選択された中性変異（neutral mutation）。
【００４４】
冷水プロテアーゼと、香料を含むカプセル、ＧＧ３６変異体プロテアーゼ、色相剤、両親媒性の洗浄用ポリマー、及びこれらの混合物からなる群から選択された材料と、を含む上記組成物の一態様では、上記配列番号２を有するプロテアーゼの変異体は、１つ以上の変異を含み、かつＢＰＮ’野生型に対し−１、０又は＋１の合計正味電荷を有する。
【００４５】
冷水プロテアーゼと、香料を含むカプセル、ＧＧ３６変異体プロテアーゼ、色相剤、両親媒性の洗浄用ポリマー、及びこれらの混合物からなる群から選択された材料と、を含む上記組成物の一態様では、上記組成物は界面活性剤、ビルダー、キレート剤、移染防止剤、分散剤、１以上の追加の酵素、酵素安定剤、触媒材料、漂白活性剤、過酸化水素、過酸化水素供給源、予形成過酸、分散剤ポリマー、粘土汚れ除去／再付着防止剤、増白剤、抑泡剤、染料、香料、香料送達系、構造弾性化剤、布地用柔軟剤、担体、屈水性誘発物質、加工助剤、溶媒、顔料、及びこれらの混合物からなる群から選択される補助成分を含む。
【００４６】
冷水プロテアーゼと、香料を含むカプセル、ＧＧ３６変異体プロテアーゼ、色相剤、両親媒性の洗浄用ポリマー、及びこれらの混合物からなる群から選択された材料と、を含む上記組成物の一態様では、上記組成物はサブチリシン（ＥＣ  ３．４．２１．６２）プロテアーゼを免疫当量ではない第３のプロテアーゼとして含み、ここで上記サブチリシン（ＥＣ  ３．４．２１．６２）プロテアーゼは冷水用ＧＧ３６変異体プロテアーゼである。
【００４７】
冷水プロテアーゼと、香料を含むカプセル、ＧＧ３６変異体プロテアーゼ、色相剤、両親媒性の洗浄用ポリマー、及びこれらの混合物からなる群から選択された材料と、を含む上記組成物の一態様では、上記組成物は、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、セロビオース脱水素酵素、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、リケナーゼ、グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、又はこれらの混合物からなる群から選択された追加の酵素を含む。
【００４８】
冷水プロテアーゼと、香料を含むカプセル、ＧＧ３６変異体プロテアーゼ、色相剤、両親媒性の洗浄用ポリマー、及びこれらの混合物からなる群から選択された材料と、を含む上記組成物の一態様では、上記組成物は以下のａ）、ｂ）、ｃ）及びｄ）からなる群から選択された追加の酵素を含む：
ａ）第１洗浄用リパーゼ、
ｂ）バチルスｓｐ．ＮＣＩＢ  １２２８９、ＮＣＩＢ  １２５１２、ＮＣＩＢ  １２５１３、ＤＳＭ  ９３７５  ＤＳＭ  １２３６８、ＤＳＭＺ番号１２６４９、ＫＳＭ  ＡＰ１３７８、ＫＳＭ  Ｋ３６又はＫＳＭ  Ｋ３８から誘導される野生型アルカリンα−アミラーゼと９０％超相同であるα−アミラーゼ、
ｃ）微生物から誘導されたエンドグルカナーゼ、並びに
ｄ）これらの混合物。
【００４９】
冷水プロテアーゼと、香料を含むカプセル、ＧＧ３６変異体プロテアーゼ、色相剤、両親媒性の洗浄用ポリマー、及びこれらの混合物からなる群から選択された材料と、を含む上記組成物の一態様では、上記組成物は以下のａ）、ｂ）、及びｃ）からなる群から選択された材料を含む：
ａ）アルコールエトキシサルフェート型界面活性剤、
ｂ）ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＨＥＤＰ（ヒドロキシエタンジホスホン酸）、ＤＴＰＭＰ（ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸））、エチレンジアミン二コハク酸（ＥＤＤＳ）、１，２−ジヒドロキシベンゼン−３，５−ジスルホン酸二ナトリウム塩水和物、及びこのようなキレートの誘導体からなる群から選択されたキレート剤、並びに
ｃ）これらの混合物。
【００５０】
冷水プロテアーゼと、香料を含むカプセル、ＧＧ３６変異体プロテアーゼ、色相剤、両親媒性の洗浄用ポリマー、及びこれらの混合物からなる群から選択された材料と、を含む上記組成物の一態様では、上記組成物は以下のａ）、ｂ）、及びｃ）からなる群から選択された材料を含む：
ａ）アルキル鎖長が１０〜１４でかつエトキシル化度が１〜４であるアルコールエトキシサルフェート型界面活性剤、
ｂ）ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＨＥＤＰ（ヒドロキシエタンジホスホン酸）、ＤＴＰＭＰ（ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸））、エチレンジアミン二コハク酸（ＥＤＤＳ）、１，２−ジヒドロキシベンゼン−３，５−ジスルホン酸二ナトリウム塩水和物、及びこのようなキレートの誘導体からなる群から選択されたキレート剤、並びに
ｃ）これらの混合物。
【００５１】
冷水プロテアーゼと、香料を含むカプセル、ＧＧ３６変異体プロテアーゼ、色相剤、両親媒性の洗浄用ポリマー、及びこれらの混合物からなる群から選択された材料と、を含む上記組成物の一態様では、上記組成物は、組成物の合計重量に基づき、約１重量％〜約５重量％の濃度でキレート剤を含む。
【００５２】
冷水プロテアーゼと、香料を含むカプセル、ＧＧ３６変異体プロテアーゼ、色相剤、両親媒性の洗浄用ポリマー、及びこれらの混合物からなる群から選択された材料と、を含む上記組成物の一態様では、上記組成物は以下のａ）、ｂ）、及びｃ）からなる群から選択された布地色相剤を含む
ａ）染料、
ｂ）カチオン性塩基性染料及びスメクタイト粘土を少なくとも１種含む、染料−粘土共役体、並びに
ｃ）これらの混合物。
【００５３】
冷水プロテアーゼと、香料を含むカプセル、ＧＧ３６変異体プロテアーゼ、色相剤、両親媒性の洗浄用ポリマー、及びこれらの混合物からなる群から選択された材料と、を含む上記組成物の一態様では、上記組成物は以下のａ）、ｂ）、及びｃ）からなる群から選択された布地色相剤を含む
ａ）小分子染料、高分子染料及びこれらの混合物、
ｂ）カチオン性塩基性染料及びスメクタイト粘土を少なくとも１種含む、染料−粘土共役体、並びに
ｃ）これらの混合物。
【００５４】
冷水プロテアーゼと、香料を含むカプセル、ＧＧ３６変異体プロテアーゼ、色相剤、両親媒性の洗浄用ポリマー、及びこれらの混合物からなる群から選択された材料と、を含む上記組成物の一態様では、上記組成物は、組成物の合計重量に基づき、以下のａ）及びｂ）を含む：
ａ）約０．０００５重量％〜約０．１重量％の冷水プロテアーゼ、並びに
ｂ）以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）のうちの１つ以上：
（ｉ）約０．００００３重量％〜約０．１重量％の布地色相剤、
（ｉｉ）約０．００１重量％〜約５重量％の香料カプセル、
（ｉｉｉ）約０．１重量％〜約５重量％の両親媒性の洗浄用ポリマー、
（ｉｖ）約０．００００３重量％〜約０．１重量％のＧＧ３６変異体プロテアーゼ。
【００５５】
冷水プロテアーゼと、香料を含むカプセル、ＧＧ３６変異体プロテアーゼ、色相剤、両親媒性の洗浄用ポリマー、及びこれらの混合物からなる群から選択された材料と、を含む上記組成物の一態様では、上記組成物は単独の単位用量形態であるか、又は複数区画を有する単位用量形態である。
【００５６】
冷水プロテアーゼと、香料を含むカプセル、ＧＧ３６変異体プロテアーゼ、色相剤、両親媒性の洗浄用ポリマー、及びこれらの混合物からなる群から選択された材料と、を含む上記組成物の一態様では、上記組成物は複数区画を有する単位容量形態であり、少なくとも１種のプロテアーゼが任意の追加の酵素及び／又はキレート剤とは異なる区画に存在する。
【００５７】
１以上の冷水プロテアーゼと、香料を含むカプセル、色相剤、両親媒性の洗浄用ポリマー、及びこれらの混合物からなる群から選択された材料と、を含み得、上記の組成物の任意の態様の残部が１以上の補助材料から構成される、布地用及びホーム製品が開示される。
【００５８】
上記布地ケア製品及びホームケア製品の一態様では、上記布地ケア製品及びホームケア製品は、布地ケア製品及びホームケア製品の合計重量に基づき、約０．０００５重量％〜約０．１重量％、約０．００１重量％〜約０．０５重量％、又は更には約０．００２重量％〜約０．０３重量％の上記冷水プロテアーゼを含み得る。
【００５９】
上記布地ケア製品及びホームケア製品の一態様では、上記布地ケア製品及びホームケア製品は、布地ケア製品及びホームケア製品の合計重量に基づき、約０．００００３重量％〜約０．１重量％、約０．００００８重量％〜約０．０５重量％、又は更には約０．０００１重量％〜約０．０４重量％の布地色相剤を含み得る。
【００６０】
上記布地ケア製品及びホームケア製品の一態様では、上記布地ケア製品及びホームケア製品は、布地ケア製品及びホームケア製品の合計重量に基づき、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．０１重量％〜約２重量％、又は更には約０．０３重量％〜約０．５重量％の香料カプセルを含み得る。
【００６１】
上記布地ケア製品及びホームケア製品の一態様では、上記布地ケア製品及びホームケア製品は、布地ケア製品及びホームケア製品の合計重量に基づき、約０．１重量％〜約５重量％、約０．２５重量％〜約２．５重量％、又は更には約０．３重量％〜約１．５重量％の両親媒性の洗浄用ポリマーを含み得る。
【００６２】
冷水プロテアーゼ
「布地ケア製品及びホームケア製品」の項で開示されている冷水プロテアーゼに加え、好適な冷水プロテアーゼ変異体は、以下の４つの基準のうちの１つ以上を示す酵素である：
（ａ）試験方法２及び／又は試験方法３で定義される、ｐＨ  ８及び１６℃（６０°Ｆ）下でのＢＭＩで、Ｐｕｒａｆｅｃｔ  Ｐｒｉｍｅ（変異Ｙ２１７Ｌを有する配列番号２）と比較したときに、性能指数が少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．１〜約１０、１．１〜約８、又は更には１．１〜約５である、
（ｂ）試験方法２及び／又は試験方法３で定義される、ｐＨ  ８及び１６℃（６０°Ｆ）下でのＢＭＩで、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較したときに、性能指数が少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．３〜約１０、１．３〜約８又は更には１．３〜約５である、
（ｃ）試験方法２及び／又は試験方法３で定義される、ｐＨ  ８及び１６℃（６０°Ｆ）下でのＢＭＩで、配列番号４と比較したときに、性能指数が少なくとも０．９、少なくとも１．０、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、０．９〜約１０、０．９〜約８又は更には０．９〜約５である、
（ｄ）試験方法２及び／又は試験方法３で定義される、ｐＨ  ８及び１６℃（６０°Ｆ）下でのＢＭＩで、配列番号６と比較したときに、性能指数が少なくとも０．９、少なくとも１．０、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、０．９〜約１０、０．９〜約８、又は更には０．９〜約５である。
【００６３】
このようなプロテアーゼの例は、本明細書の実施例２〜１８及び３１に見出すことができる。上記に定義されるような冷水プロテアーゼは、布地ケア製品及びホームケア製品に使用することができる。したがって、一態様では（in pne aspect）、このような冷水プロテアーゼを含む、布地ケア製品及びホームケア製品が開示される。
【００６４】
本発明のＧＧ３６プロテアーゼ
好適なＧＧ３６プロテアーゼは、実施例１９〜３０に記載の変異体から選択することができる。一態様では、ＧＧ３６冷水プロテアーゼは、シリーズ１のＧＧ３６冷水プロテアーゼであり得る。
【００６５】
好適なシリーズ１のＧＧ３６冷水プロテアーゼ変異体としては、親プロテアーゼから誘導された酵素が挙げられ、この親プロテアーゼの配列は、配列番号７５５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％又は１００％の同一性を有し、変異体は以下の特性ａ）、ｂ）、及びｃ）のうち１つ以上を有する：
ａ）試験方法４の性能指数が少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．１〜約１０、１．１〜約８、又は更には１．１〜約５である、
ｂ）試験方法５の性能指数が少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．１〜約１０、１．１〜約８、又は更には１．１〜約５である、
ｃ）試験方法６の性能指数が少なくとも１．０、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．０〜約１０、１．０〜約８、又は更には１．０〜約５である。
【００６６】
好適なシリーズ１のＧＧ３６冷水プロテアーゼは、サブチリシンから誘導することができ、特に配列番号７５５のＢａｃｉｌｌｕｓ  Ｌｅｎｔｕｓのサブチリシンから誘導されるものであり、一態様では、以下の変異のうちの１つ以上を含み得る：
Ａ１Ｒ、Ｑ２Ｓ、Ｖ４Ｒ、Ｖ４Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｒ１０Ｓ、Ｐ１４Ｋ、Ａ１６Ｓ、Ｈ１７Ｒ、Ｎ１８Ｒ、Ｇ２０Ｒ、Ｔ２２Ａ、Ｔ２２Ｒ、Ｓ２４Ｒ、Ｓ２４Ｗ、Ｇ２５Ｒ、Ｇ２５Ｖ、Ｖ２６Ｆ、Ｌ４２Ｉ、Ｎ４３Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｇ４６Ｒ、Ｐ５２Ｆ、Ｐ５２Ｅ、Ｐ５２Ｎ、Ｔ５７Ｒ、Ｑ５９Ａ、Ｎ６２Ｅ、Ｎ６２Ｑ、Ｖ６８Ａ、Ｖ６８Ｃ、Ｔ７１Ｇ、Ｉ７２Ｃ、Ａ７４Ｃ、Ｌ７５Ａ、Ｌ７５Ｆ、Ｌ７５Ｒ、Ｎ７６Ｄ、Ｓ７８Ｒ、Ｌ８２Ｒ、Ｐ８６Ｗ、Ｅ８９Ｐ、Ｅ８９Ｔ、Ｅ８９Ｇ、Ｅ８９Ｈ、Ｅ８９Ｉ、Ｅ８９Ｖ、Ｅ８９Ｗ、Ｙ９１Ｎ、Ｋ９４Ｎ、Ｇ１００Ｓ、Ｓ１０１Ａ、Ｓ１０１Ｎ、Ｓ１０１Ｇ、Ｓ１０１Ｄ、Ｓ１０３Ｇ、Ｓ１０３Ｎ、Ｖ１０４Ｌ、Ｖ１０４Ｉ、Ｓ１０６Ｖ、Ｓ１０６Ｇ、Ａ１０８Ｉ、Ｌ１１１Ｖ、Ｅ１１２Ｖ、Ｇ１１５Ｋ、Ｇ１１５Ｒ、Ｎ１１７Ｆ、Ｇ１１８Ｉ、Ｖ１２１Ｆ、Ｓ１２８Ｄ、Ｓ１２８Ｆ、Ｓ１２８Ｌ、Ｓ１２８Ｎ、Ｐ１２９Ｅ、Ｓ１４４Ｒ、Ｌ１４８Ｉ、Ａ１５８Ｅ、Ｇ１５９Ｅ、Ｓ１６０Ｄ、Ｓ１６６Ｄ、Ｎ１８５Ｅ、Ｎ１８５Ｉ、Ｒ１８６Ｈ、Ｓ１８８Ｅ、Ｓ１８８Ｄ、Ｄ１９７Ｆ、Ｖ２０３Ｅ、Ｙ２０９Ｓ、Ｙ２０９Ｎ、Ｙ２０９Ｆ、Ｙ２０９Ｔ、Ｙ２０９Ｅ、Ｙ２０９Ｈ、Ｙ２０９Ｇ、Ｐ２１０Ｒ、Ｓ２１２Ｉ、Ｓ２１２Ｆ、Ｙ２１４Ｆ、Ａ２１５Ｎ、Ａ２１５Ｄ、Ａ２１５Ｅ、Ｌ２１７Ｅ、Ｌ２１７Ｎ、Ｔ２２４Ａ、Ａ２３０Ｅ、Ａ２３１Ｉ、Ｑ２３６Ｆ、Ｎ２３８Ｒ、Ｎ２３８Ｋ、Ｐ２３９Ｋ、Ｐ２３９Ｇ、Ｐ２３９Ｒ、Ｐ２３９Ｓ、Ｗ２４１Ｒ、Ｓ２４２Ｒ、Ｓ２４２Ｌ、Ｎ２４３Ｒ、Ｖ２４４Ｒ、Ｎ２４８Ｉ、Ｎ２４８Ｖ、Ｈ２４９Ｒ、Ｌ２５０Ｉ、Ｎ２５２Ｒ、Ｔ２５３Ｒ、Ｌ２６２Ｄ、Ｙ２６３Ｆ、Ｓ２６５Ｆ、Ｌ２６７Ｖ、Ｌ２６７Ｎ、Ｎ２６９Ｉ、Ｎ２６９Ｒ、Ｅ２７１Ｆ、Ｅ２７１Ｉ、Ｅ２７１Ｈ、Ｅ２７１Ｐ、Ｅ２７１Ｔ、Ｅ２７１Ｖ、Ｅ２７１Ｌ、及び／又はＡ２７２Ｆ。
【００６７】
一態様では、好適なシリーズ１のＧＧ３６冷水プロテアーゼとしてはサブチリシンが挙げられ、特に配列番号７５５のＢａｃｉｌｌｕｓ  Ｌｅｎｔｕｓのサブチリシンが挙げられ、サブチリシンは、以下の変異、挿入又は欠失の組み合わせを１つ以上含み得る：
Ｔ０２２Ｒ−Ｓ０２４Ｒ、Ｓ００９Ａ−Ｅ２７１Ｌ、Ｎ０１８Ｒ−Ｗ２４１Ｒ、Ｎ０１８Ｒ−Ｇ１１５Ｒ、Ｎ０４３Ｒ−Ｈ２４９Ｒ、Ｇ０２０Ｒ−Ｈ２４９Ｒ、Ｖ００４Ｒ−Ｈ２４９Ｒ、Ｇ０２０Ｒ−Ｓ０２４Ｒ、Ｎ０１８Ｒ−Ｈ２４９Ｒ、Ｓ００９Ａ−Ｇ０２０Ｒ、Ｇ０２０Ｒ−Ｗ２４１Ｒ、Ｓ００９Ａ−Ｓ０７８Ｒ、Ｇ０２０Ｒ−Ｇ１１５Ｒ、Ｎ０１８Ｒ−Ｓ０２４Ｒ、Ｓ０２４Ｒ−Ｓ２４２Ｒ、Ｔ０２２Ｒ−Ｇ１１５Ｒ、Ｎ０１８Ｒ−Ｎ０４３Ｒ、Ｇ０２０Ｒ−Ｎ０４３Ｒ、Ｎ０１８Ｒ−Ｓ２４２Ｒ、Ｓ２４２Ｒ−Ｎ２６９Ｒ、Ｎ０１８Ｒ−Ｖ２４４Ｒ、Ｓ０２４Ｒ−Ｎ２６９Ｒ、Ｇ０２０Ｒ−Ｅ２７１Ｌ、Ｓ０２４Ｒ−Ｅ２７１Ｌ、Ｖ００４Ｒ−Ｓ００９Ａ、Ｇ０２０Ｒ−Ｎ２６９Ｒ、Ａ００１Ｒ−Ｓ０２４Ｒ、Ｖ２４４Ｒ−Ｅ２７１Ｌ、Ｓ００９Ａ−Ｎ０１８Ｒ、Ｗ２４１Ｒ−Ｅ２７１Ｌ、Ｖ００４Ｒ−Ｓ０２４Ｒ、Ｓ００９Ａ−Ｈ２４９Ｒ、Ｓ００９Ａ−Ｔ０２２Ｒ、Ｎ０６２Ｅ−Ｐ１２９Ｅ、Ｎ０６２Ｅ−Ｇ１５９Ｅ、Ａ０１６Ｓ−Ｌ１４８Ｉ、Ａ１５８Ｅ−Ｈ２４９Ｒ、Ａ０１６Ｓ−Ｎ０６２Ｅ、Ｌ１１１Ｖ−Ｓ１８８Ｄ、Ｔ０２２Ａ−Ｎ０６２Ｅ、Ｎ０６２Ｅ−Ｌ１４８Ｉ、Ｔ０２２Ａ−Ｐ１２９Ｅ、Ｎ０６２Ｅ−Ｅ２７１Ｆ、Ｎ０６２Ｅ−Ａ１５８Ｅ、Ａ０１６Ｓ−Ｇ１５９Ｅ、Ｎ０６２Ｅ−Ｒ１８６Ｈ、Ｓ１２８Ｎ−Ｇ１５９Ｅ、Ｎ０６２Ｅ−Ｓ１８８Ｄ、Ｎ０６２Ｅ−Ｓ１２８Ｎ、Ｌ１４８Ｉ−Ｇ１５９Ｅ、Ｓ１０３Ｇ−Ａ１５８Ｅ、Ｌ１１１Ｖ−Ｇ１５９Ｅ、Ａ１５８Ｅ−Ｅ２７１Ｆ、Ａ０１６Ｓ−Ｓ１８８Ｄ、Ｔ０２２Ａ−Ｌ１１１Ｖ、Ｓ１２８Ｎ−Ａ１５８Ｅ、Ａ０１６Ｓ−Ａ１５８Ｅ、Ｖ１０４Ｌ−Ａ１５８Ｅ、Ｓ１２８Ｎ−Ｒ１８６Ｈ、Ｇ１５９Ｅ−Ｙ２０９Ｅ、Ｎ０６２Ｅ−Ｓ１０１Ａ、Ｌ１１１Ｖ−Ｙ２０９Ｅ、Ｌ１４８Ｉ−Ｓ１８８Ｄ、Ｓ１０１Ａ−Ｙ２０９Ｅ、Ｔ０２２Ａ−Ｓ１８８Ｄ、Ａ０１６Ｓ−Ｔ０２２Ａ、Ｓ１２８Ｎ−Ｐ１２９Ｅ、Ａ０１６Ｓ−Ｙ２０９Ｅ、Ａ０１６Ｓ−Ｓ１２８Ｎ、Ｔ０２２Ａ−Ｅ０８９Ｐ、Ｓ１２８Ｎ−Ｙ２０９Ｅ、Ｅ０８９Ｐ−Ａ１５８Ｅ、Ｎ０６２Ｅ−Ｓ１０３Ｇ、Ｒ１８６Ｈ−Ｅ２７１Ｆ、Ａ０１６Ｓ−Ｐ１２９Ｅ、Ｅ０８９Ｐ−Ｇ１５９Ｅ、Ｌ１１１Ｖ−Ｈ２４９Ｒ、Ｓ１０１Ａ−Ｐ１２９Ｅ、Ｌ１４８Ｉ−Ｙ２０９Ｅ、Ｔ０２２Ａ−Ｇ１５９Ｅ、Ｐ１２９Ｅ−Ｈ２４９Ｒ、Ｐ１２９Ｅ−Ｙ２０９Ｅ、Ｖ１０４Ｌ−Ｐ１２９Ｅ、Ｓ１２８Ｎ−Ｓ１８８Ｄ、Ｌ１１１Ｖ−Ａ１５８Ｅ、Ｔ０２２Ａ−Ａ１５８Ｅ、Ｎ０６２Ｅ−Ｙ２０９Ｅ、Ｎ０６２Ｅ−Ｈ２４９Ｒ、Ｓ１０１Ａ−Ｒ１８６Ｈ、Ｅ０８９Ｐ−Ｐ１２９Ｅ、Ｐ１２９Ｅ−Ｅ２７１、Ｔ２２Ａ−Ｌ１１１Ｖ−Ｇ１５９Ｅ、Ｓ１０１Ａ−Ｓ１０３Ｇ−Ｖ１０４Ｌ−Ｙ２０９Ｅ、Ｓ１０１Ａ−Ｓ１０３Ｇ−Ｖ１０４Ｌ−Ｇ１５９Ｅ、Ｓ１０１Ａ−Ｓ１０３Ｇ−Ｖ１０４Ｌ−Ｓ１８８Ｄ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ｇ１５９Ｄ、Ｔ２２Ａ−Ｓ１０３Ｇ−Ｇ１５９Ｅ、Ｔ２２Ａ−Ｓ１２８Ｎ−Ｅ２７１Ｆ−Ｙ２０９Ｅ、Ｔ２２Ａ−Ｙ２０９Ｅ−Ｅ２７１Ｆ、Ｔ２２Ａ−Ｓ１０１Ａ−Ｙ２０９Ｅ、Ｓ１０１Ａ−Ｙ２０９Ｅ−Ｅ２７１Ｆ、Ｔ２２Ａ−Ｌ１１１Ｖ−Ｓ１２８Ｎ、Ｔ２２Ａ−Ｓ１０１Ａ−Ｇ１５９Ｅ、Ｓ１０１Ａ−Ｓ１０３Ｇ−Ｖ１０４Ｌ、Ｔ２２Ａ−Ｓ１０１Ａ−Ｓ１０３Ｇ−Ｖ１０４Ｌ、Ｓ１０１Ａ−Ｓ１０３Ｇ−Ｖ１０４Ｌ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ、Ｓ１０１Ａ−Ｓ１０３Ｇ−Ｖ１０４Ｌ−Ｓ１２８Ｎ、Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２３６Ｈ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｎ２５２Ｋ、Ｓ１０１Ｇ−Ｖ１０４Ｉ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２３６Ｈ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｎ２５２Ｋ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２３６Ｈ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｎ２５２Ｋ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｌ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２３６Ｈ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｎ２５２Ｋ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｌ−Ｇ１５９Ｄ−Ｑ２３６Ｈ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｎ２５２Ｋ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｌ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｎ２５２Ｋ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｌ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２３６Ｈ−Ｎ２４８Ｄ−Ｎ２５２Ｋ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｌ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２３６Ｈ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２５２Ｋ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｌ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２３６Ｈ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ、Ｎ６２Ｅ−Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｅ２７１Ｆ、Ｎ６２Ｅ−Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｈ２４９Ｒ、Ｔ２２Ａ−Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｈ２４９Ｒ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｓ２４Ｒ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｔ２５３Ｒ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ａ１５８Ｅ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｈ２４９Ｒ、Ｔ２２Ａ−Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｅ２７１Ｆ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ｇ１５９Ｅ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｈ２４９Ｒ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｎ２３８Ｒ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ａ１５８Ｅ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｅ２７１Ｆ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｅ２７１Ｆ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｎ７６Ｄ、及び／又はＳ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ｇ１５９Ｅ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｅ２７１Ｆ。
【００６８】
一態様では、好適なシリーズ１のＧＧ３６冷水プロテアーゼとしては、サブチリシン変異体、特に配列番号７５５のＢａｃｉｌｌｕｓ  Ｌｅｎｔｕｓのサブチリシンが挙げられ、この変異体は位置１、２、４、９、１０、１４、１６、１７、１８、２０、２２、２４、２５、２６、４２、４３、４６、５２、５７、５９、６２、６８、７１、７２、７４、７５、７６、７８、８２、８６、８９、９１、９４、１００、１０１、１０３、１０４、１０６、１０８、１１１、１１２、１１５、１１７、１１８、１２１、１２８、１２９、１４４、１４８、１５８、１５９、１６０、１６６、１８５、１８６、１８８、１９７、２０３、２０９、２１０、２１２、２１４、２１５、２１７、２２４、２３０、２３１、２３６、２３８、２３９、２４１、２４２、２４３、２４４、２４８、２４９、２５０、２５２、２５３、２６２、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１及び２７２を含む位置群に、変異を３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個含む。
【００６９】
一態様では、好適なシリーズ１のＧＧ３６冷水プロテアーゼとしては、サブチリシン変異体、特に配列番号７５５のＢａｃｉｌｌｕｓ  Ｌｅｎｔｕｓのサブチリシンが挙げられ、変異体は：Ａ１Ｒ、Ｑ２Ｓ、Ｖ４Ｒ、Ｖ４Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｒ１０Ｓ、Ｐ１４Ｋ、Ａ１６Ｓ、Ｈ１７Ｒ、Ｎ１８Ｒ、Ｇ２０Ｒ、Ｔ２２Ａ、Ｔ２２Ｒ、Ｓ２４Ｒ、Ｓ２４Ｗ、Ｇ２５Ｒ、Ｇ２５Ｖ、Ｖ２６Ｆ、Ｌ４２Ｉ、Ｎ４３Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｇ４６Ｒ、Ｐ５２Ｆ、Ｐ５２Ｅ、Ｐ５２Ｎ、Ｔ５７Ｒ、Ｑ５９Ａ、Ｎ６２Ｅ、Ｎ６２Ｑ、Ｖ６８Ａ、Ｖ６８Ｃ、Ｔ７１Ｇ、Ｉ７２Ｃ、Ａ７４Ｃ、Ｌ７５Ａ、Ｌ７５Ｆ、Ｌ７５Ｒ、Ｎ７６Ｄ、Ｓ７８Ｒ、Ｌ８２Ｒ、Ｐ８６Ｗ、Ｅ８９Ｐ、Ｅ８９Ｔ、Ｅ８９Ｇ、Ｅ８９Ｈ、Ｅ８９Ｉ、Ｅ８９Ｖ、Ｅ８９Ｗ、Ｙ９１Ｎ、Ｋ９４Ｎ、Ｇ１００Ｓ、Ｓ１０１Ａ、Ｓ１０１Ｎ、Ｓ１０１Ｇ、Ｓ１０１Ｄ、Ｓ１０３Ｇ、Ｓ１０３Ｎ、Ｖ１０４Ｌ、Ｖ１０４Ｉ、Ｓ１０６Ｖ、Ｓ１０６Ｇ、Ａ１０８Ｉ、Ｌ１１１Ｖ、Ｅ１１２Ｖ、Ｇ１１５Ｋ、Ｇ１１５Ｒ、Ｎ１１７Ｆ、Ｇ１１８Ｉ、Ｖ１２１Ｆ、Ｓ１２８Ｄ、Ｓ１２８Ｆ、Ｓ１２８Ｌ、Ｓ１２８Ｎ、Ｐ１２９Ｅ、Ｓ１４４Ｒ、Ｌ１４８Ｉ、Ａ１５８Ｅ、Ｇ１５９Ｅ、Ｓ１６０Ｄ、Ｓ１６６Ｄ、Ｎ１８５Ｅ、Ｎ１８５Ｉ、Ｒ１８６Ｈ、Ｓ１８８Ｅ、Ｓ１８８Ｄ、Ｄ１９７Ｆ、Ｖ２０３Ｅ、Ｙ２０９Ｓ、Ｙ２０９Ｎ、Ｙ２０９Ｆ、Ｙ２０９Ｔ、Ｙ２０９Ｅ、Ｙ２０９Ｈ、Ｙ２０９Ｇ、Ｐ２１０Ｒ、Ｓ２１２Ｉ、Ｓ２１２Ｆ、Ｙ２１４Ｆ、Ａ２１５Ｎ、Ａ２１５Ｄ、Ａ２１５Ｅ、Ｌ２１７Ｅ、Ｌ２１７Ｎ、Ｔ２２４Ａ、Ａ２３０Ｅ、Ａ２３１Ｉ、Ｑ２３６Ｆ、Ｎ２３８Ｒ、Ｎ２３８Ｋ、Ｐ２３９Ｋ、Ｐ２３９Ｇ、Ｐ２３９Ｒ、Ｐ２３９Ｓ、Ｗ２４１Ｒ、Ｓ２４２Ｒ、Ｓ２４２Ｌ、Ｎ２４３Ｒ、Ｖ２４４Ｒ、Ｎ２４８Ｉ、Ｎ２４８Ｖ、Ｈ２４９Ｒ、Ｌ２５０Ｉ、Ｎ２５２Ｒ、Ｔ２５３Ｒ、Ｌ２６２Ｄ、Ｙ２６３Ｆ、Ｓ２６５Ｆ、Ｌ２６７Ｖ、Ｌ２６７Ｎ、Ｎ２６９Ｉ、Ｎ２６９Ｒ、Ｅ２７１Ｆ、Ｅ２７１Ｉ、Ｅ２７１Ｈ、Ｅ２７１Ｐ、Ｅ２７１Ｔ、Ｅ２７１Ｖ、Ｅ２７１Ｌ及びＡ２７２Ｆを含む群から選択される、合計３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個の変異を含み、並びに次の変異、Ｓ１０３Ａ、Ｇ１５９Ｄ、Ｑ２３６Ｈ、Ｑ２４５Ｒ、Ｎ２４８Ｄ及びＮ２５２Ｋを１つ以上含んでいてもよい。
【００７０】
一態様では、上記シリーズ１のＧＧ３６冷水プロテアーゼは、配列番号７５５を有するサブチリシンＧＧ３６の変異体であり、１つ以上の変異を含み、かつサブチリシンＧＧ３６野生型に対して−５、−４、−３、−２、−１又は０の合計正味電荷を有する上記変異体が開示される。
【００７１】
一態様では、上記シリーズ１のＧＧ３６冷水プロテアーゼは、イオン強度の低い冷水プロテアーゼである。このようなイオン強度の低いプロテアーゼは、配列番号７５５を有するサブチリシンＧＧ３６の変異体であり、１つ以上の変異を含み、かつサブチリシンＧＧ３６野生型に対して−５、−４、−３、−２、−１又は０の合計正味電荷を有する上記変異体が開示される。これらの変異は、次の変異のうちの２つ以上から選択され：
（ａ）Ａ１Ｒ、Ｑ２Ｓ、Ｖ４Ｒ、Ｖ４Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｒ１０Ｓ、Ｐ１４Ｋ、Ａ１６Ｓ、Ｔ２２Ａ、Ｔ２２Ｒ、Ｓ２４Ｒ、Ｇ２５Ｖ、Ｖ２６Ｆ、Ｌ４２Ｉ、Ｐ５２Ｆ、Ｐ５２Ｅ、Ｐ５２Ｎ、Ｎ６２Ｅ、Ｎ６２Ｑ、Ｖ６８Ａ、Ｖ６８Ｃ、Ｔ７１Ｇ、Ｉ７２Ｃ、Ａ７４Ｃ、Ｌ７５Ａ、Ｌ７５Ｆ、Ｓ７８Ｒ、Ｅ８９Ｐ、Ｅ８９Ｔ、Ｅ８９Ｇ、Ｅ８９Ｈ、Ｅ８９Ｗ、Ｙ９１Ｎ、Ｋ９４Ｎ、Ｇ１００Ｓ、Ｓ１０１Ａ、Ｓ１０１Ｎ、Ｓ１０１Ｇ、Ｓ１０１Ｄ、Ｓ１０３Ｇ、Ｓ１０３Ｎ、Ｖ１０４Ｌ、Ｖ１０４Ｉ、Ａ１０８Ｉ、Ｌ１１１Ｖ、Ｅ１１２Ｖ、Ｇ１１５Ｋ、Ｎ１１７Ｆ、Ｖ１２１Ｆ、Ｓ１２８Ｄ、Ｓ１２８Ｆ、Ｓ１２８Ｌ、Ｓ１２８Ｎ、Ｐ１２９Ｅ、Ｌ１４８Ｉ、Ａ１５８Ｅ、Ｇ１５９Ｅ、Ｓ１６０Ｄ、Ｓ１６６Ｄ、Ｎ１８５Ｅ、Ｒ１８６Ｈ、Ｓ１８８Ｅ、Ｓ１８８Ｄ、Ｖ２０３Ｅ、Ｙ２０９Ｓ、Ｙ２０９Ｎ、Ｙ２０９Ｆ、Ｙ２０９Ｔ、Ｙ２０９Ｅ、Ｙ２０９Ｈ、Ｙ２０９Ｇ、Ｐ２１０Ｒ、Ｓ２１２Ｉ、Ｓ２１２Ｆ、Ｙ２１４Ｆ、Ａ２１５Ｎ、Ａ２１５Ｄ、Ａ２１５Ｅ、Ｌ２１７Ｅ、Ｌ２１７Ｎ、Ｔ２２４Ａ、Ａ２３０Ｅ、Ａ２３１Ｉ、Ｑ２３６Ｆ、Ｎ２３８Ｒ、Ｎ２３８Ｋ、Ｐ２３９Ｋ、Ｐ２３９Ｇ、Ｐ２３９Ｒ、Ｎ２４８Ｖ、Ｈ２４９Ｒ、Ｌ２５０Ｉ、Ｌ２６２Ｄ、Ｙ２６３Ｆ、Ｓ２６５Ｆ、Ｌ２６７Ｖ、Ｌ２６７Ｎ．Ｎ２６９Ｉ、Ｎ２６９Ｒ、Ｅ２７１Ｆ、Ｅ２７１Ｉ、Ｅ２７１Ｈ及びＡ２７２Ｆ、並びに／あるいは
（ｂ）以下の変異の組み合わせのうちの１つ以上から選択される：Ｎ０６２Ｅ−Ｐ１２９Ｅ、Ｎ０６２Ｅ−Ｇ１５９Ｅ、Ａ０１６Ｓ−Ｌ１４８Ｉ、Ａ１５８Ｅ−Ｈ２４９Ｒ、Ａ０１６Ｓ−Ｎ０６２Ｅ、Ｌ１１１Ｖ−Ｓ１８８Ｄ、Ｔ０２２Ａ−Ｎ０６２Ｅ、Ｎ０６２Ｅ−Ｌ１４８Ｉ、Ｔ０２２Ａ−Ｐ１２９Ｅ、Ｎ０６２Ｅ−Ｅ２７１Ｆ、Ｎ０６２Ｅ−Ａ１５８Ｅ、Ａ０１６Ｓ−Ｇ１５９Ｅ、Ｎ０６２Ｅ−Ｒ１８６Ｈ、Ｓ１２８Ｎ−Ｇ１５９Ｅ、Ｎ０６２Ｅ−Ｓ１８８Ｄ、Ｎ０６２Ｅ−Ｓ１２８Ｎ、Ｌ１４８Ｉ−Ｇ１５９Ｅ、Ｓ１０３Ｇ−Ａ１５８Ｅ、Ｌ１１１Ｖ−Ｇ１５９Ｅ、Ａ１５８Ｅ−Ｅ２７１Ｆ、Ａ０１６Ｓ−Ｓ１８８Ｄ、Ｔ０２２Ａ−Ｌ１１１Ｖ、Ｓ１２８Ｎ−Ａ１５８Ｅ、Ａ０１６Ｓ−Ａ１５８Ｅ、Ｖ１０４Ｌ−Ａ１５８Ｅ、Ｓ１２８Ｎ−Ｒ１８６Ｈ、Ｇ１５９Ｅ−Ｙ２０９Ｅ、Ｎ０６２Ｅ−Ｓ１０１Ａ、Ｌ１１１Ｖ−Ｙ２０９Ｅ、Ｌ１４８Ｉ−Ｓ１８８Ｄ、Ｓ１０１Ａ−Ｙ２０９Ｅ、Ｔ０２２Ａ−Ｓ１８８Ｄ、Ａ０１６Ｓ−Ｔ０２２Ａ、Ｓ１２８Ｎ−Ｐ１２９Ｅ、Ａ０１６Ｓ−Ｙ２０９Ｅ、Ａ０１６Ｓ−Ｓ１２８Ｎ、Ｔ０２２Ａ−Ｅ０８９Ｐ、Ｓ１２８Ｎ−Ｙ２０９Ｅ、Ｅ０８９Ｐ−Ａ１５８Ｅ、Ｎ０６２Ｅ−Ｓ１０３Ｇ、Ｒ１８６Ｈ−Ｅ２７１Ｆ、Ａ０１６Ｓ−Ｐ１２９Ｅ、Ｅ０８９Ｐ−Ｇ１５９Ｅ、Ｌ１１１Ｖ−Ｈ２４９Ｒ、Ｓ１０１Ａ−Ｐ１２９Ｅ、Ｌ１４８Ｉ−Ｙ２０９Ｅ、Ｔ０２２Ａ−Ｇ１５９Ｅ、Ｐ１２９Ｅ−Ｈ２４９Ｒ、Ｐ１２９Ｅ−Ｙ２０９Ｅ、Ｖ１０４Ｌ−Ｐ１２９Ｅ、Ｓ１２８Ｎ−Ｓ１８８Ｄ、Ｌ１１１Ｖ−Ａ１５８Ｅ、Ｔ０２２Ａ−Ａ１５８Ｅ、Ｎ０６２Ｅ−Ｙ２０９Ｅ、Ｎ０６２Ｅ−Ｈ２４９Ｒ、Ｓ１０１Ａ−Ｒ１８６Ｈ、Ｅ０８９Ｐ−Ｐ１２９Ｅ、Ｐ１２９Ｅ−Ｅ２７１Ｆ、Ｔ２２Ａ−Ｌ１１１Ｖ−Ｇ１５９Ｅ、Ｓ１０１Ａ−Ｓ１０３Ｇ−Ｖ１０４Ｌ−Ｙ２０９Ｅ、Ｓ１０１Ａ−Ｓ１０３Ｇ−Ｖ１０４Ｌ−Ｇ１５９Ｅ、Ｓ１０１Ａ−Ｓ１０３Ｇ−Ｖ１０４Ｌ−Ｓ１８８Ｄ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ｇ１５９Ｄ、Ｔ２２Ａ−Ｓ１０３Ｇ−Ｇ１５９Ｅ、Ｔ２２Ａ−Ｓ１２８Ｎ−Ｅ２７１Ｆ−Ｙ２０９Ｅ、Ｔ２２Ａ−Ｙ２０９Ｅ−Ｅ２７１Ｆ、Ｔ２２Ａ−Ｓ１０１Ａ−Ｙ２０９Ｅ、Ｓ１０１Ａ−Ｙ２０９Ｅ−Ｅ２７１Ｆ、Ｔ２２Ａ−Ｌ１１１Ｖ−Ｓ１２８Ｎ、Ｔ２２Ａ−Ｓ１０１Ａ−Ｇ１５９Ｅ、Ｓ１０１Ａ−Ｓ１０３Ｇ−Ｖ１０４Ｌ、Ｔ２２Ａ−Ｓ１０１Ａ−Ｓ１０３Ｇ−Ｖ１０４Ｌ、Ｓ１０１Ａ−Ｓ１０３Ｇ−Ｖ１０４Ｌ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ、Ｓ１０１Ａ−Ｓ１０３Ｇ−Ｖ１０４Ｌ−Ｓ１２８Ｎ、Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２３６Ｈ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｎ２５２Ｋ、Ｓ１０１Ｇ−Ｖ１０４Ｉ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２３６Ｈ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｎ２５２Ｋ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２３６Ｈ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｎ２５２Ｋ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｌ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２３６Ｈ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｎ２５２Ｋ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｌ−Ｇ１５９Ｄ−Ｑ２３６Ｈ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｎ２５２Ｋ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｌ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｎ２５２Ｋ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｌ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２３６Ｈ−Ｎ２４８Ｄ−Ｎ２５２Ｋ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｌ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２３６Ｈ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２５２Ｋ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｌ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２３６Ｈ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ、Ｎ６２Ｅ−Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｅ２７１Ｆ、Ｎ６２Ｅ−Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｈ２４９Ｒ、Ｔ２２Ａ−Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｈ２４９Ｒ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｓ２４Ｒ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｔ２５３Ｒ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ａ１５８Ｅ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｈ２４９Ｒ、Ｔ２２Ａ−Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｅ２７１Ｆ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ｇ１５９Ｅ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｈ２４９Ｒ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｎ２３８Ｒ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ａ１５８Ｅ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｅ２７１Ｆ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｅ２７１Ｆ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｎ７６Ｄ及びＳ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ｇ１５９Ｅ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｅ２７１Ｆ。
【００７２】
一態様では、上記イオン強度の低いシリーズ１のＧＧ３６冷水プロテアーゼは、水に希釈される洗剤組成物の部分を形成し、典型的には洗濯機内で、伝導度が約０．１ｍＳ／ｃｍ〜約３ｍＳ／ｃｍ、約０．３ｍＳ／ｃｍ〜約２．５ｍＳ／ｃｍ、又は更には約０．５ｍＳ／ｃｍ〜約２ｍＳ／ｃｍである洗浄液を形成する。
【００７３】
一態様では、シリーズ１のＧＧ３６冷水プロテアーゼは、イオン強度の高い冷水プロテアーゼである。このようなイオン強度の高いプロテアーゼは、配列番号７５５を有するサブチリシンＧＧ３６の変異体であり、２つ以上の変異を含み、かつサブチリシンＧＧ３６野生型に対して＋５、＋４、＋３、＋２、＋１又は０の合計正味電荷を有する上記変異体が開示される。これらの変異は次のものから選択される：
ａ）以下の変異のうちの２つ以上：Ｖ４Ｒ、Ｈ１７Ｒ、Ｎ１８Ｒ、Ｇ２０Ｒ、Ｔ２２Ｒ、Ｓ２４Ｒ、Ｓ２４Ｗ、Ｇ２５Ｒ、Ｎ４３Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｇ４６Ｒ、Ｐ５２Ｆ、Ｐ５２Ｎ、Ｔ５７Ｒ、Ｑ５９Ａ、Ｎ６２Ｑ、Ｔ７１Ｇ、Ｌ７５Ｒ、Ｎ７６Ｄ、Ｓ７８Ｒ、Ｌ８２Ｒ、Ｐ８６Ｗ、Ｅ８９Ｐ、Ｅ８９Ｗ、Ｅ８９Ｔ、Ｅ８９Ｉ、Ｅ８９Ｈ、Ｅ８９Ｖ、Ｖ１０４Ｌ、Ｓ１０６Ｖ、Ｓ１０６Ｇ、Ｇ１１５Ｒ、Ｇ１１８Ｉ、Ｖ１２１Ｆ、Ｓ１４４Ｒ、Ｎ１８５Ｉ、Ｄ１９７Ｆ、Ｙ２０９Ｎ、Ｙ２０９Ｓ、Ｌ２１７Ｅ、Ａ２３１Ｉ、Ｐ２３９Ｒ、Ｐ２３９Ｓ、Ｗ２４１Ｒ、Ｓ２４２Ｒ、Ｓ２４２Ｌ、Ｎ２４３Ｒ、Ｖ２４４Ｒ、Ｎ２４８Ｉ、Ｈ２４９Ｒ、Ｎ２５２Ｒ、Ｔ２５３Ｒ、Ｅ２７１Ｔ、Ｅ２７１Ｖ、Ｅ２７１Ｌ、Ｅ２７１Ｈ、Ｅ２７１Ｆ、Ｅ２７１Ｐ、Ａ１Ｒ、Ｓ９Ａ、Ｓ２１２Ｆ及びＮ２６９Ｒ、並びに／又は
ｂ）以下の変異のうちの１つ以上：Ｔ０２２Ｒ−Ｓ０２４Ｒ、Ｓ００９Ａ−Ｅ２７１Ｌ、Ｎ０１８Ｒ−Ｗ２４１Ｒ、Ｎ０１８Ｒ−Ｇ１１５Ｒ、Ｎ０４３Ｒ−Ｈ２４９Ｒ、Ｇ０２０Ｒ−Ｈ２４９Ｒ、Ｖ００４Ｒ−Ｈ２４９Ｒ、Ｇ０２０Ｒ−Ｓ０２４Ｒ、Ｎ０１８Ｒ−Ｈ２４９Ｒ、Ｓ００９Ａ−Ｇ０２０Ｒ、Ｇ０２０Ｒ−Ｗ２４１Ｒ、Ｓ００９Ａ−Ｓ０７８Ｒ、Ｇ０２０Ｒ−Ｇ１１５Ｒ、Ｎ０１８Ｒ−Ｓ０２４Ｒ、Ｓ０２４Ｒ−Ｓ２４２Ｒ、Ｔ０２２Ｒ−Ｇ１１５Ｒ、Ｎ０１８Ｒ−Ｎ０４３Ｒ、Ｇ０２０Ｒ−Ｎ０４３Ｒ、Ｎ０１８Ｒ−Ｓ２４２Ｒ、Ｓ２４２Ｒ−Ｎ２６９Ｒ、Ｎ０１８Ｒ−Ｖ２４４Ｒ、Ｓ０２４Ｒ−Ｎ２６９Ｒ、Ｇ０２０Ｒ−Ｅ２７１Ｌ、Ｓ０２４Ｒ−Ｅ２７１Ｌ、Ｖ００４Ｒ−Ｓ００９Ａ、Ｇ０２０Ｒ−Ｎ２６９Ｒ、Ａ００１Ｒ−Ｓ０２４Ｒ、Ｖ２４４Ｒ−Ｅ２７１Ｌ、Ｓ００９Ａ−Ｎ０１８Ｒ、Ｗ２４１Ｒ−Ｅ２７１Ｌ、Ｖ００４Ｒ−Ｓ０２４Ｒ、Ｓ００９Ａ−Ｈ２４９Ｒ、Ｓ００９Ａ−Ｔ０２２Ｒ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｅ２７１Ｆ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ａ１５８Ｅ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｅ２７１Ｆ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ａ１５８Ｅ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｈ２４９Ｒ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｓ２４Ｒ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｌ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２３６Ｈ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２５２Ｋ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｌ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２３６Ｈ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ−Ｎ２５２Ｋ。
【００７４】
一態様では、上記イオン強度の高いシリーズ１のＧＧ３６冷水プロテアーゼは、水に希釈される洗剤組成物の一部を形成し、典型的には洗濯機内で、伝導度が約３ｍＳ／ｃｍ〜約３０ｍＳ／ｃｍ、約３．５ｍＳ／ｃｍ〜約２０ｍＳ／ｃｍ、又は更には約４ｍＳ／ｃｍ〜約１０ｍＳ／ｃｍである洗浄液を形成する。
【００７５】
シリーズ１のＧＧ３６冷水プロテアーゼ変異体の電荷は、配列番号７５５のアミノ酸配列を有する、野生型のサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼに対するものとして表される。負電荷を１つ付与するアミノ酸はＤ及びＥであり、正電荷を１つ付与するアミノ酸はＲ、Ｈ及びＫである。配列番号７５５に対して電荷を変化させる任意のアミノ酸変化を使用することで、シリーズ１のＧＧ３６冷水プロテアーゼ変異体の電荷を算出する。例えば、野生型の、電荷が中性である位置に負電荷変異を導入すると、正味−１の電荷がシリーズ１のＧＧ３６冷水プロテアーゼ変異体に加えられる一方で、野生型の正電荷のアミノ酸残基（Ｒ、Ｈ、又はＫ）に負電荷変異（Ｄ又はＥ）を導入すると、正味−２の電荷が加えられることになる。配列番号７５５のアミノ酸配列を有するサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼ野生型と比較した場合に異なっている、シリーズ１のＧＧ３６冷水プロテアーゼ変異体のすべてのアミノ酸残基の電荷変化の合計は、シリーズ１のＧＧ３６冷水プロテアーゼ変異体の電荷変化として与えられる。理論に束縛されるものではないが、以下（ａ）及び（ｂ）のように考えられる：
（ａ）シリーズ１のＧＧ３６冷水プロテアーゼの、伝導度の低い洗濯洗剤溶液に使用するのに好ましい電荷範囲は−５、−４、−３、−２、−１、０であり、特に−２、−１である、
（ｂ）シリーズ１のＧＧ３６冷水プロテアーゼの、伝導度の高い洗濯洗剤溶液に使用するのに好ましい電荷範囲は＋５、＋４、＋３、＋２、＋１、０であり、特に＋２、＋１である。電荷を正確に選択することで、冷水用クリーニング性能を、予想を超えるほど改善することができる。
【００７６】
「伝導度の低い溶液」は、約０．１ｍＳ／ｃｍ〜約３ｍＳ／ｃｍ、約０．３ｍＳ／ｃｍ〜約２．５ｍＳ／ｃｍ、又は更には約０．５ｍＳ／ｃｍ〜約２ｍＳ／ｃｍの伝導度を有するものとして定義される。
【００７７】
「伝導度の高い溶液」は、約３ｍＳ／ｃｍ〜約３０ｍＳ／ｃｍ、約３．５ｍＳ／ｃｍ〜約２０ｍＳ／ｃｍ、又は更には約４ｍＳ／ｃｍ〜約１０ｍＳ／ｃｍの伝導度を有するものとして定義される。
【００７８】
上記実施例は非限定例として見るべきである。冷水性能を最適化させるために変異を組み合わせると、更なる位置に変異を導入することで、酵素電荷の平衡をとることもできる。
【００７９】
プロテアーゼのアミノ酸番号付け、酵素命名法及び追加定義
本特許では、アミノ酸位置の番号付けに、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓのサブチリシンＢＰＮ’の番号付けシステムを使用する。それぞれシリーズ１のＧＧ３６冷水プロテアーゼ変異体が挙げられる各プロテアーゼ変異体の各アミノ酸位置は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列中の、対応するアミノ酸位置の番号付けに従って、変異体プロテアーゼアミノ酸配列をＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓのサブチリシンＢＰＮ’アミノ酸配列とアライメントすることで決定されるものとして番号付けされる。
【００８０】
別の番号付けスキームは、配列番号７５５のアミノ酸配列を有する、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの特定のアミノ酸配列を番号付けするものである。本明細書に記載の、シリーズ１のＧＧ３６冷水プロテアーゼ変異体が挙げられるプロテアーゼ変異体のアミノ酸位置に、この別の番号付けスキームを用いて番号付けされたものはない。
【００８１】
本明細書でのシリーズ１のＧＧ３６冷水プロテアーゼ変異体の記載では、参照しやすさのために、以下の命名法が使用される：オリジナルのアミノ酸：位置：置換アミノ酸。
【００８２】
変異体は、親アミノ酸の１文字コード、続いて３桁の数字による位置番号、次に変異アミノ酸の１文字コードにより名付けられる。例えば、位置８７でグリシン（Ｇ）がセリン（Ｓ）に置き換わる変異が生じている場合、「Ｇ０８７Ｓ」又は「Ｇ８７Ｓ」と表される。複数の変異は、「−」を変異の間に挿入することで示される。位置８７及び９０での変異は、「Ｇ０８７Ｓ−Ａ０９０Ｙ」又は「Ｇ８７Ｓ−Ａ９０Ｙ」又は「Ｇ８７Ｓ＋Ａ９０Ｙ」、又は「Ｇ０８７Ｓ＋Ａ０９０Ｙ」のように表される。欠失に関しては、１文字コード「Ｚ」が使用される。親配列に対する挿入に関し、「Ｚ」は位置番号の左側に存在する。欠失に関し、１文字コード「Ｚ」は、位置番号の右側に存在する。挿入に関し、位置番号は、アミノ酸を挿入する前のものであり、各アミノ酸に対し０．０１が加えられる。例えば、３つのアミノ酸；アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、及びチロシン（Ｙ）が、位置８７及び８８の間に挿入された場合、「Ｚ０８７．０１Ａ−Ｚ０８７．０２Ｓ−Ｚ０８７．０３Ｙ．」と記される。したがって、上記のすべての変異に加え、位置１００での欠失を組み合わせると：「Ｇ０８７Ｓ−Ｚ０８７．０１Ａ−Ｚ０８７．０２Ｓ−Ｚ０８７．０３Ｙ−Ａ０９０Ｙ−Ａ１００Ｚ」になる。
【００８３】
すべての場合において、一般に認められたＩＵＰＡＣの一文字又は三文字アミノ酸略記を採用する。単独の文字Ｘは、２０個のアミノ酸のいずれかを指す。
【００８４】
アミノ酸配列又は核酸配列に関して、用語「野生型」は、アミノ酸配列又は核酸配列がネイティブであるか、又は天然に生じた配列であることを意味する。本明細書で使用するとき、用語「天然に生じた」は、自然に見出される（すなわち、組み換え法により操作を受けていない）任意のものを指す（例えば、タンパク質、アミノ酸、又は核酸配列）。本明細書で使用するとき、用語「天然に生じたものではない」は、自然界に見出すことのない任意のものを指す（例えば、研究室で製造される組み換え核酸）。
【００８５】
本明細書でアミノ酸残基の位置に関して使用するとき、用語「対応する（「corresponding to」又は「corresponds to」又は「corresponds」）」は、タンパク質又はペプチド中の数え上げられた位置のアミノ酸残基、あるいはタンパク質又はペプチド中の数え上げられた残基に対して類似、相同、又は等価であるアミノ酸残基を指す。本明細書で使用するとき、用語「対応する領域」は、概して、関連するタンパク質又は参照タンパク質に従っての類似の位置を指す。
【００８６】
用語「から誘導される」及び「から得られる」は、対象とする生物株により産生されるあるいは産生され得るプロテアーゼだけでなく、このような株から単離されるＤＮＡ配列によりコードされるプロテアーゼ、及びこのようなＤＮＡ配列を含有している宿主生物で産生されるプロテアーゼも指す。更にこれらの用語は、合成ＤＮＡ配列及び／又はｃＤＮＡ由来のＤＮＡ配列によりコードされ、かつ対象とするプロテアーゼと同一の特徴を有する、プロテアーゼを指す。例示すると、「バチルスから誘導されるプロテアーゼ」は、バチルスにより天然に産生された、タンパク質分解活性を有する酵素、並びにバチルス供給源により産生されるが、遺伝子工学技術の使用を介して、セリンプロテアーゼをコードしている核酸でバチルスではない生命体を形質転換することにより産生される、セリンプロテアーゼ様の酵素を指す。
【００８７】
２つの核酸又はポリペプチド配列の文脈において、用語「同一」は、以下の配列比較又は解析アルゴリズムのうちの１つを用いて評価する際に、最も一致するようにアライメントしたときに、２つの配列中の残基が同じのものであることを指す。
【００８８】
本明細書で使用するとき、用語「相同の遺伝子」は、互いに対応し、かつ同一であるか又は互いに非常に類似している、異なるが通常は関連する種由来の遺伝子のペアを指す。用語は、種分化（すなわち、新種の発生）により分離される遺伝子（例えば、オルソロガス遺伝子）、並びに遺伝子複製により分離されている遺伝子（例えば、パラロガス遺伝子）を包含する。
【００８９】
用語、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドの「成熟」形態は、シグナルペプチド配列及びプロペプチド配列を含まない、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドの機能形態を指す。
【００９０】
本明細書で使用するとき、用語「相同性」は、配列の類似性又は同一性を指し、同一性を指す方が好ましい。相同性は、当該技術分野において既知の標準的な技術を用いて判定することができる（例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２［１９８１］；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３［１９７０＼；Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４［１９８８］；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡなどのソフトウェアプログラム；並びにＤｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：３８７〜３９５［１９８４］を参照されたい）。有用なアルゴリズムの一例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、累進ペアワイズアライメントを用いて、関連する配列群から複数の配列アライメントを作成する。このアルゴリズムは、アライメントを作成するために使用されるクラスタの関係性を示す、樹形図をプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅの累進アライメント法を単純化したものを使用する（Ｆｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１〜３６０［１９８７］を参照されたい）。この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐにより記載されるものと類似のものである（Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１〜１５３［１９８９］を参照されたい）。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターは、デフォルトのギャップ・ウェイト：３．００、デフォルトのギャップ長・ウェイト：０．１０、及びエンド・ギャップのウェイト化を含む。有用なアルゴリズムの他の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌらにより記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０［１９９０］；並びにＫａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５７８７［１９９３］を参照されたい）。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムはＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：４６０〜４８０［１９９６］を参照されたい）。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、いくつかの検索パラメーターを用いる。このパラメーターのほとんどにデフォルト値を設定する。調節可能なパラメーターは、以下の値に設定する：ｏｖｅｒｌａｐ  ｓｐａｎ＝１、ｏｖｅｒｌａｐ  ｆｒａｃｔｉｏｎ＝０．１２５、ｗｏｒｄ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ  Ｓ及びＨＳＰ  Ｓ２パラメーターは、動的な値であり、検索される対象となる配列に対し、特定のデータベースの特定の配列及び組成物の組成に基づきプログラム自体によって制定される。しかしながら、値は感度が上昇するよう調整することができる。
【００９１】
参照配列と対象とする試験配列との配列同一率は、当業者により用意に判定することができる。ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列により共有される同一率は、配列をアライメントし、当該技術分野において既知の方法により同一性を判定することによって分子間での配列情報を直接比較することにより、判定される。配列類似性を判定するのに好適なアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３〜４１０［１９９０］を参照されたい）。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、米国国立生物工学情報センター（the National Center for Biotechnology Information）により公開されている。このアルゴリズムは、まず始めに、データベース配列中の同じ長さのワードとアライメントさせた場合に、クエリー配列中の、何らかの正に値付けされた閾値スコアＴと一致するか又は基準を満たす長さＷの短い配列を同定することで、ＨＳＰ（high scoring sequence pairs）を同定することを包含する。これらの最初に隣接するワードは、ヒットすると、それらのワードを含有しているより長いＨＳＰを発見するための開始点として機能する。ワードのヒットは、累積アライメントスコアが増加し得る限り、比較される２つの配列の各々の両方向に向かって進められる。ヒットするワードの延長は、累積アライメントスコアが、得られる最大の値から、数量Ｘだけ落ち込んだ場合、累積スコアが０以下になった場合、又はいずれかの配列が末端に達した場合に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、及びＸは、アライメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、ワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５［１９９２］を参照されたい）：アライメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ’５、Ｎ’−４、及び両方のストランドの比較をデフォルトとして使用する。
【００９２】
次いで、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、類似する２つの配列間の統計解析を実行する（例えば、上掲Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌを参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の測定法のうちの１つは、偶然に生じ得る２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致による見込みを識別する、最小合計類似度（smallest sum probability）（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸をセリンプロテアーゼの核酸と比較した際の最小合計類似度が、約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、及び最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は本発明のセリンプロテアーゼ核酸と類似していると考えられる。セリンプロテアーゼポリペプチドをコードしている試験核酸は、最小合計類似度の比較結果が約０．５未満、及びより好ましくは約０．２未満である場合に、特定のセリンプロテアーゼ核酸と類似していると考えられる。
【００９３】
２つ以上の核酸又はポリペプチド配列についての文脈において、「同一率（percent identical又はpercent identity）」は、２つ以上の配列を最も一致するように比較及びアライメントし、配列比較アルゴリズムを用いて又は目視検査を用いて判定したときに、２つ以上の配列が、同一であるか、あるいは核酸残基又はアミノ酸残基と、表記される割合で同一であることを指すものである。参照（すなわち、クエリー）アミノ酸配列に対する、対象とするアミノ酸配列の、「配列同一率」又は「同一率（％）」又は「配列同一率（％）」又は「アミノ酸配列同一率」は、対象とするアミノ酸配列が、配列を最適にアライメントした際の比較長さにわたってクエリーアミノ酸配列に対して表記される割合（すなわち、アミノ酸とアミノ酸を並べたときの同一度）だけ同一であることを意味する。したがって、２つのアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一率８０％又は同一率８０％は、最適にアライメントした２つのアミノ酸配列中のアミノ酸残基のうち８０％が同一であることを意味する。参照（すなわち、クエリー）核酸配列に対する、対象とする核酸配列の、「配列同一率」又は「同一率（％）」又は「配列同一率（％）」又は「核酸配列同一率（％）」は、対象とする核酸配列が、配列を最適にアライメントした際の比較長さにわたってクエリー配列に対して表記される割合（すなわち、ヌクレオチドとヌクレオチドを並べたときの同一度）だけ同一であることを意味する。したがって、２つの核酸配列に対するヌクレオチド配列同一率８０％又は同一率８０％は、最適にアライメントした２つの核酸配列中のヌクレオチド残基のうち８０％が同一であることを意味する。
【００９４】
一部の実施形態では、クエリー配列に対する対象とする配列の「配列同一率又は配列同一率（％）」、又は「同一率（％）」は、２つの配列を最適にアライメントし、比較長さにわたって、２つの最適にアライメントした配列を比較することで、算出することができる。最適なアライメントにおいて、両方の配列の残基が一致している位置の数は、一致する位置の数を求め、一致する位置の数を比較長さ（別途記載のない限り、クエリー配列の長さである）のうちの位置の合計数で除することで決定される。得られる数に１００を乗じることで、クエリー配列に対する対象とする配列の配列同一率を算出する。
【００９５】
「最適なアライメント」又は「最適にアライメントされた」は、最も高い同一率のスコアを与える、２つ（又は２つ以上）の配列のアライメントを指す。例えば、２つのタンパク質配列の最適なアライメントは、各配列中の同一のアミノ酸残基が最多数アライメントされるように、配列を手動でアライメントさせることで、あるいはソフトウェアプログラム又は本明細書に記載の若しくは当該技術分野において既知の手順を用いることで、達成することができる。例えば、２つの核酸配列の最適なアライメントは、各配列中の同一のヌクレオチド残基が最多数アライメントされるように、配列を手動でアライメントさせることで、あるいはソフトウェアプログラム又は本明細書に記載の若しくは当該技術分野において既知の手順を用いることで、達成することができる。
【００９６】
一部の実施形態では、２つのポリペプチド配列は、配列対に関し可能性のある最も高い類似性スコアが得られるように、定義されたアミノ酸置換行列、ギャップ開始ペナルティ（ギャップオープンペナルティとも呼ばれる）、及びギャップ伸長ペナルティなどの定義されたパラメーターを用いてアライメントされたときに、「最適にアライメントされた」と見なされる。ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（上掲のＨｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆを参照されたい）は、多くの場合、ポリペプチド配列アライメントアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ）でデフォルトのスコア置換行列として使用される。アライメントされた配列のうちの一方に導入された単独のアミノ酸ギャップに対し、ギャップ開始ペナルティが課せられ、ギャップの各残基位置に対しギャップ伸長ペナルティが課せられる。採用される例示的なアライメントパラメーターは：ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列、ギャップ開始ペナルティ＝１１、及びギャップ伸長ペナルティ＝１である。アライメントスコアは、アラインメントが開始及び終了する（例えば、アライメント・ウインドウ）各配列のアミノ酸位置によって、及び、最も高い類似性スコアが得られるように、配列の他方又は両方に１つ以上のギャップを挿入することによっても、決定される。
【００９７】
２つ以上の配列間の最適なアライメントは、目視検査により手動で、又は限定するものではないが、例えば、アミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰプログラム、及び核酸配列用のＢＬＡＳＴＮプログラムなどのように、コンピュータを用いることで決定することができる（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９〜３４０２（１９９７）を参照されたい；ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）ｗｅｂｓｉｔｅも参照されたい）。
【００９８】
適切な布地色相剤
蛍光増白剤は、少なくとも何らかの可視光線を放出する。対照的に、布地色相剤は、可視光線スペクトルの少なくとも一部を吸収するため、表面の色合いを変えることができる。適切な布地色相剤としては、本明細書の試験方法の項に記載の試験方法１の要件を満たす染料、染料−粘土共役体、及び顔料が挙げられる。好適な染料としては、小分子染料及びポリマー染料が挙げられる。適切な小分子染料としては、ダイレクトブルー、ダイレクトレッド、ダイレクトバイオレット、アシッドブルー、アシッドレッド、アシッドバイオレット、ベーシックブルー、ベーシックバイオレット、及びベーシックレッドのカラーインデックス（Ｃ．Ｉ．）分類に該当する染料、又はこれらの混合物からなる群から選択される小分子染料が挙げられ、例えば次のものが挙げられる。
【００９９】
（１）以下の式のトリス−アゾ系ダイレクトブルー染料
【化１】
0005882904.tif 000002
式中、ナプチル環Ａ、Ｂ、及びＣの少なくとも２つがスルホネート基で置換されており、環Ｃは、５位をＮＨ２又はＮＨＰｈ基で置換してもよく、Ｘは、２つ以下のスルホネート基で置換されているベンジル又はナフチル環であり、２位をＯＨ基で置換してもよく、更にＮＨ２又はＮＨＰｈ基で置換してもよい。
【０１００】
（２）以下の式のビス−アゾ系ダイレクトバイオレット染料
【化２】
0005882904.tif 000003
式中、ＺはＨ又はフェニルであり、環Ａは、好ましくは矢印で示される位置がメチル及びメトキシ基で置換されており、環Ａはナフチル環であってもよく、Ｙ基はベンジル又はナフチル環であり、サルフェート基で置換されており、メチル基で１又は２置換されてもよい。
【０１０１】
（３）以下の式のブルー又はレッドアシッド染料
【化３】
0005882904.tif 000004
式中、Ｘ及びＹの少なくとも１つは芳香族基でなければならない。一態様では、芳香族基は双方とも、置換ベンジル又はナフチル基であってよく、このベンジル又はナフチル基はアルキル、アルキルオキシ、又はアリールオキシ基などの非水溶化基で置換してよく、Ｘ及びＹはスルホネート又はカルボキシレートなどの水溶化基で置換しなくてもよい。別の態様では、Ｘはニトロ基で置換したベンジル基であり、Ｙはベンジル基である。
【０１０２】
（４）以下の構造のレッドアシッド染料
【化４】
0005882904.tif 000005
式中、Ｂはアルキル、アルキルオキシ、又はアリールオキシ基などの非水溶化基で置換されてもよいナフチル又はベンジル基であり、Ｂはスルホネート又はカルボキシレートなどの水溶化基で置換しなくてもよい。
【０１０３】
（５）以下の構造のジアゾ染料
【化５】
0005882904.tif 000006
式中、Ｘ及びＹは、互いに独立してそれぞれ、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル又はＣ１〜Ｃ４−アルコキシであり、Ｒαは水素又はアリールであり、ＺはＣ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４−アルコキシ、ハロゲン、ヒドロキシル又はカルボニルであり、ｎは１又は２であり、ｍは０、１又は２であり、並びにこれらの対応する塩、並びにこれらの混合物である。
【０１０４】
（６）以下の構造のトリフェニルメタン染料
【化６】
0005882904.tif 000007
【化７】
0005882904.tif 000008
及びそれらの混合物が挙げられる。
【０１０５】
他の態様では、好適な小分子染料としては、以下のものからなる群から選択される小分子染料が挙げられる：カラーインデックス（Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｄｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏｌｏｕｒｉｓｔｓ，Ｂｒａｄｆｏｒｄ，ＵＫ）番号：１，４−ナフタレンジオン、１−［２−［２−［４−［［４−（アセチルオキシ）ブチル］エチルアミノ］−２−メチルフェニル］ジアゼニル］−５−ニトロ−３−チエニル］−エタノン、１−ヒドロキシ−２−（１−ナフタレニルアゾ）−ナフタレンジスルホン酸イオン（２−）、１−ヒドロキシ−２−［［４−（フェニルアゾ）フェニル］アゾ］−ナフタレンジスルホン酸イオン（２−）、２−［（１Ｅ）−［４−［ビス（３−メトキシ−３−オキソプロピル）アミノ］−２−メチルフェニル］アゾ］−５−ニトロ−３−チオフェンカルボン酸エチルエステル、２−［［４−［（２−シアノエチル）エチルアミノ］フェニル］アゾ］−５−（フェニルアゾ）−３−チオフェンカルボニトリル、２−［２−［４−［（２−シアノエチル）エチルアミノ］フェニル］ジアゼニル］−５−［２−（４−ニトロフェニル）ジアゼニル］−３−チオフェンカルボニトリル、２−ヒドロキシ−１−（１−ナフタレニルアゾ）−ナフタレンジスルホン酸イオン（２−）、２−ヒドロキシ−１−［［４−（フェニルアゾ）フェニル］アゾ］−ナフタレンジスルホン酸イオン（２−）、４，４’−［［４−（ジメチルアミノ）−２，５−シクロヘキサジエン−１−イリデン］メチレン］ビス［Ｎ，Ｎ−ジメチル−ベンゼンアミン、６−ヒドロキシ−５−［（４−メトキシフェニル）アゾ］−２−ナフタレンスルホン酸一ナトリウム塩、６−ヒドロキシ−５−［（４−メチルフェニル）アゾ］−２−ナフタレンスルホン酸一ナトリウム塩、７−ヒドロキシ−８−［［４−（フェニルアゾ）フェニル］アゾ］−１，３−ナフタレンジスルホン酸イオン（２−）、７−ヒドロキシ−８−［２−（１−ナフタレニル）ジアゼニル］−１，３−ナフタレンジスルホン酸イオン（２−）、８−ヒドロキシ−７−［２−（１−ナフタレニル）ジアゼニル］−１，３−ナフタレンジスルホン酸イオン（２−）、８−ヒドロキシ−７−［２−［４−（２−フェニルジアゼニル）フェニル］ジアゼニル］−１，３−ナフタレンジスルホン酸イオン（２−）、アシッド・ブラック１、アシッド・ブラック２４、アシッド・ブルー１１３、アシッド・ブルー１５、アシッド・ブルー１７、アシッド・ブルー２５、アシッド・ブルー２９、アシッド・ブルー３、アシッド・ブルー４０、アシッド・ブルー４５、アシッド・ブルー６２、アシッド・ブルー７、アシッド・ブルー７５、アシッド・ブルー８０、アシッド・ブルー８３、アシッド・ブルー９、アシッド・ブルー９０、アシッド・グリーン２７、アシッド・オレンジ１２、アシッド・オレンジ７、アシッド・レッド１４、アシッド・レッド１５０、アシッド・レッド１５１、アシッド・レッド１７、アシッド・レッド１８、アシッド・レッド２６６、アシッド・レッド２７、アシッド・レッド４、アシッド・レッド５１、アシッド・レッド５２、アシッド・レッド７３、アシッド・レッド８７、アシッド・レッド８８、アシッド・レッド９２、アシッド・レッド９４、アシッド・レッド９���、アシッド・バイオレット１５、アシッド・バイオレット１７、アシッド・バイオレット２４、アシッド・バイオレット４３、アシッド・バイオレット４９、ベーシック・ブルー１５９、ベーシック・ブルー１６、ベーシック・ブルー２２、ベーシック・ブルー３、ベーシック・ブルー４７、ベーシック・ブルー６６、ベーシック・ブルー７５、ベーシック・ブルー９、ベーシック・バイオレット１、ベーシック・バイオレット２、ベーシック・バイオレット３、ベーシック・バイオレット４、ベーシック・バイオレット１０、ベーシック・バイオレット３５、Ｃ．Ｉ．アシッド・ブラック１、Ｃ．Ｉ．アシッド・ブルー１０、Ｃ．Ｉ．アシッド・ブルー１１３、Ｃ．Ｉ．アシッド・ブルー２５、Ｃ．Ｉ．アシッド・ブルー２９、Ｃ．Ｉ．アシッド・ブルー２９０  Ｃ．Ｉ．アシッド・レッド１０３、Ｃ．Ｉ．アシッド・レッド１５０、Ｃ．Ｉ．アシッド・レッド５２、Ｃ．Ｉ．アシッド・レッド７３、Ｃ．Ｉ．アシッド・レッド８８、Ｃ．Ｉ．アシッド・レッド９１、Ｃ．Ｉ．アシッド・バイオレット１７、Ｃ．Ｉ．アシッド・バイオレット４３、Ｃ．Ｉ．ダイレクト・ブルー１、Ｃ．Ｉ．ダイレクト・ブルー１２０、Ｃ．Ｉ．ダイレクト・ブルー３４、Ｃ．Ｉ．ダイレクト・ブルー７０、Ｃ．Ｉ．ダイレクト・ブルー７１、Ｃ．Ｉ．ダイレクト・ブルー７２、Ｃ．Ｉ．ダイレクト・ブルー８２、Ｃ．Ｉ．ダイレクト・バイオレット５１、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー１０、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー１００、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー１０１、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー１０２、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー１０６：１、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー１１、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー１２、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー１２１、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー１２２、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー１２４、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー１２５、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー１２８、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー１３０、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー１３３、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー１３７、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー１３８、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー１３９、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー１４２、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー１４６、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー１４８、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー１４９、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー１６５、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー１６５：１、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー１６５：２、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー１６５：３、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー１７１、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー１７３、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー１７４、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー１７５、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー１７７、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー１８３、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー１８７、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー１８９、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー１９３、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー１９４、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２００、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２０１、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２０２、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２０５、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２０６、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２０７、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２０９、��．Ｉ．ディスパース・ブルー２１、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２１０、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２１１、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２１２、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２１９、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２２０、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２２２、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２２４、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２２５、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２４８、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２５２、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２５３、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２５４、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２５５、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２５６、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２５７、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２５８、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２５９、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２６０、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２６４、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２６５、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２６６、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２６７、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２６８、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２６９、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２７０、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２７８、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２７９、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２８１、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２８３、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２８４、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２８５、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２８６、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２８７、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２９０、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２９１、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２９４、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー２９５、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３０、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３０１、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３０３、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３０４、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３０５、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３１３、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３１５、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３１６、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３１７、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３２１、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３２２、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３２４、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３２８、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３３、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３３０、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３３３、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３３５、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３３６、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３３７、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３３８、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３３９、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３４０、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３４１、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３４２、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３４３、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３４４、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３４５、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３４６、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３５１、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３５２、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３５３、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３５５、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３５６、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３５７Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３５８、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３６、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３６０、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３６６、Ｃ．��．ディスパース・ブルー３６８、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３６９、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３７１、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３７３、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３７４、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３７５、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３７６、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３７８、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー３８、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー４２、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー４３、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー４４、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー４７、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー７９、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー７９：１、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー７９：２、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー７９：３、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー８２、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー８５、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー８８、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー９０、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー９４、Ｃ．Ｉ．ディスパース・ブルー９６、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット１０、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット１００、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット１０２、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット１０３、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット１０４、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット１０６、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット１０７、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット１２、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット１３、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット１６、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット２、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット２４、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット２５、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット３、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット３３、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット３９、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット４２、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット４３、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット４５、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット４８、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット４９、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット５、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット５０、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット５３、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット５４、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット５５、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット５８、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット６、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット６０、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット６３、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット６６
、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット６９、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット７、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット７５、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット７６、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット７７、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット８２、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット８６、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット８８、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット９、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット９１、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット９２、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット９３、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット９３：１、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット９４、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット９５、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット９６、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット９７、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット９８、Ｃ．Ｉ．ディスパース・バイオレット９９、Ｃ．Ｉ．リアクティブ・ブラック５、Ｃ．Ｉ．リアクティブ・ブルー１９、Ｃ．Ｉ．リアクティブ・ブルー４、Ｃ．Ｉ．リアクティブ・レッド２、Ｃ．Ｉ．ソルベント・ブルー４３、Ｃ．Ｉ．ソルベント・ブルー４３、Ｃ．Ｉ．ソルベント・レッド１４、Ｃ．Ｉ．アシッド・ブラック２４、Ｃ．Ｉ．アシッド・ブルー１１３、Ｃ．Ｉ．アシッド・ブルー２９、Ｃ．Ｉ．ダイレクト・バイオレット７、Ｃ．Ｉ．フード・レッド１４、ジアニックスバイオレットＣＣ、ダイレクト・ブルー１、ダイレクト・ブルー７１、ダイレクト・ブルー７５、ダイレクト・ブルー７８、ダイレクト・ブルー８０、ダイレクト・ブルー２７９、ダイレクト・バイオレット１１、ダイレクト・バイオレット３１、ダイレクト・バイオレット３５、ダイレクト・バイオレット４８、ダイレクト・バイオレット５、ダイレクト・バイオレット５１、ダイレクト・バイオレット６６、ダイレクト・バイオレット９、ディスパース・ブルー１０６、ディスパース・ブルー１４８、ディスパース・ブルー１６５、ディスパース・ブルー３、ディスパース・ブルー３５４、ディスパース・ブルー３６４、ディスパース・ブルー３６７、ディスパース・ブルー５６、ディスパース・ブルー７７、ディスパース・ブルー７９、ディスパース・ブルー７９：１、ディスパース・レッド１、ディスパース・レッド１５、ディスパース・バイオレット２６、ディスパース・バイオレット２７、ディスパース・バイオレット２８、ディスパース・バイオレット６３、ディスパース・バイオレット７７、エオシンＹ、エタノール、２，２’−［［４−［（３，５−ジニトロ−２−チエニル）アゾ］フェニル］イミノ］ビス−二酢酸（エステル）、ルモゲンＦブルー６５０、ルモゲンＦバイオレット５７０、Ｎ−［２−［２−（３−アセチル−５−ニトロ−２−チエニル）ジアゼニル］−５−（ジエチルアミノ）フェニル］−アセトアミド、Ｎ−［２−［２−（４−クロロ−３−シアノ−５−ホルミル−２−チエニル）ジアゼニル］−５−（ジエチルアミノ）フェニル］−アセトアミド、Ｎ−［５−［ビス（２−メトキシエチル）アミノ］−２−［２−（５−ニトロ−２，１−ベンゾイソチアゾール−３−イル）ジアゼニル］フェニル］−アセトアミド、Ｎ−［５−［ビス［２−（アセチルオキシ）エチル］アミノ］−２−［（２−ブロモ−４，６−ジニトロフェニル）アゾ］フェニル］−アセトアミド、ナフタルイミド、誘導体、オイル・ブラック８６０、フロキシンＢ、ピラゾール、ローズ・ベンガル、６−ヒドロキシ−５−（４−イソプロピルフェニルアゾ）−２−ナフタレンスルホン酸ナトリウム塩、ソルベント・ブラック３、ソルベント・ブルー１４、ソルベント・ブルー３５、ソルベント・ブルー５８、ソルベント・ブルー５９、ソルベント・レッド２４、ソルベント・バイオレット１３、ソルベント・バイオレット８、スーダン・レッド３８０、トリフェニルメタン、及びトリフェニルメタン、これらの誘導体又は混合物。
【０１０６】
好適な高分子染料には、共役色原体を含むポリマー（染料−ポリマー共役体）、ポリマーの骨格に共重合した色原体を有するポリマー、及びこれらの混合物からなる群から選択される高分子染料が挙げられる。
【０１０７】
別の態様では、適切なポリマー染料としては、Ｌｉｑｕｉｔｉｎｔ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｋｅｎ（Ｓｐａｒｔａｎｂｕｒｇ，Ｓｏｕｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ，ＵＳＡ））の名称で市販されている布地直接着色剤、及び少なくとも１つの反応染料と、ヒドロキシル部分、１級アミン部分、２級アミン部分、チオール部分、及びこれらの混合物からなる群から選択される部分を含むポリマーからなる群から選択されるポリマーから形成されている染料−ポリマー共役体が挙げられる。更に別の態様では、好適なポリマー染料としては、Ｌｉｑｕｉｔｉｎｔ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｋｅｎ（Ｓｐａｒｔａｎｂｕｒｇ，Ｓｏｕｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ，ＵＳＡ））バイオレットＣＴ、リアクティブブルー、リアクティブバイオレット、又はリアクティブレッド染料で共役されているカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）（例えば、Ｍｅｇａｚｙｍｅ（Ｗｉｃｋｌｏｗ，Ｉｒｅｌａｎｄ）からＡＺＯ−ＣＭ−セルロースの商品名、商品コードＳ−ＡＣＭＣで市販されているＣ．Ｉ．リアクティブブルー１９で共役されているＣＭＣ）、アルコキシル化トリフェニール−メタン重合着色料、アルコキシル化チオフェン重合着色料、及びこれらの混合物からなる群から選択されるポリマー染料が挙げられる。
【０１０８】
適切な染料粘土共役体としては、少なくとも１つのカチオン性／塩基性染料とスメクタイト粘土を含む群から選択される染料粘土共役体、及びこれらの混合物が挙げられる。別の態様では、好適な染料粘土共役体としては、以下のＣ．Ｉ．からなる群から選択される１つのカチオン性／塩基性染料からなる群から選択される染料粘土共役体が挙げられる。ベーシックイエロー１〜１０８、Ｃ．Ｉ．ベーシックオレンジ１〜６９、Ｃ．Ｉ．ベーシックレッド１〜１１８、Ｃ．Ｉ．ベーシックバイオレット１〜５１、Ｃ．Ｉ．ベーシックブルー１〜１６４、Ｃ．Ｉ．ベーシックグリーン１〜１４、Ｃ．Ｉ．ベーシックブラウン１〜２３、ＣＩベーシックブラック１〜１１、及びモンモリロナイト粘土、ヘクトライト粘土、サポナイト粘土、及びそれらの組合せからなる群から選択される粘土。別の態様では、好適な染料粘土共役体としては以下の群から選択される染料粘土共役体が挙げられる。モンモリロナイトベーシックブルーＢ７  Ｃ．Ｉ．４２５９５共役体、モンモリロナイトベーシックブルーＢ９  Ｃ．Ｉ．５２０１５共役体、モンモリロナイトベーシックバイオレットＶ３  Ｃ．Ｉ．４２５５５共役体、モンモリロナイトベーシックグリーンＧ１  Ｃ．Ｉ．４２０４０共役体、モンモリロナイトベーシックレッドＲ１  Ｃ．Ｉ．４５１６０共役体、モンモリロナイトＣ．Ｉ．ベーシックブラック２共役体、ヘクトライトベーシックブルーＢ７  Ｃ．Ｉ．４２５９５共役体、ヘクトライトトベーシックブルーＢ９  Ｃ．Ｉ．５２０１５共役体、ヘクトライトベーシックバイオレットＶ３  Ｃ．Ｉ．４２５５５共役体、ヘクトライトベーシックグリーンＧ１  Ｃ．Ｉ．４２０４０共役体、ヘクトライトベーシックレッドＲ１  Ｃ．Ｉ．４５１６０共役体、ヘクトライトＣ．Ｉ．ベーシックブラック２共役体、サポナイトベーシックブルーＢ７  Ｃ．Ｉ．４２５９５共役体、サポナイトベーシックブルーＢ９  Ｃ．Ｉ．５２０１５共役体、サポナイトベーシックバイオレットＶ３  Ｃ．Ｉ．４２５５５共役体、サポナイトベーシックグリーンＧ１  Ｃ．Ｉ．４２０４０共役体、サポナイトベーシックレッドＲ１  Ｃ．Ｉ．４５１６０共役体、サポナイトＣ．Ｉ．ベーシックブラック２共役体及びこれらの混合物。
【０１０９】
適切な顔料としては、フラバントロン（flavanthrone）、インダントロン、１〜４個の塩素原子を有する塩素化インダントロン、ピラントロン（pyranthrone）、ジクロロピラントロン（dichloropyranthrone）、モノブロモジクロロピラントロン（monobromodichloropyranthrone）、ジブロモジクロロピラントロン（dibromodichloropyranthrone）、テトラブロモピラントロン（tetrabromopyranthrone）、ペリレン−３，４，９，１０−テトラカルボン酸ジイミド（イミド基はＣ１〜Ｃ３−アルキル又はフェニル又は置換されていないか又は複素環式ラジカルで置換されていてもよく、フェニル及び複素環式ラジカルは更に水溶性を付与しない置換を有していてもよい）、アントラピリミジンカルボン酸アミド、ビオラントロン（violanthrone）、イソビオラントロン（isoviolanthrone）、ジオキサジン染料、銅フタロシアニン（１分子当たり２個以下の塩素原子を有していてもよい）、ポリクロロ−銅フタロシアニン、又はポリブロモクロロ−銅フタロシアニン（１分子当たり１４個以下の臭素原子を有する）、及びこれらの混合物からなる群から選択される顔料が挙げられる。
【０１１０】
別の態様において、好適な顔料には、ウルトラマリンブルー（Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｂｌｕｅ  ２９）、ウルトラマリンバイオレット（Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  １５）、及びこれらの混合物からなる群から選択される顔料が挙げられる。
【０１１１】
前述の布地色相剤は、組合せて使用することができる（布地色相剤の任意の混合物を使用することができる）。適切な布地色相剤は、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ）、Ｃｉｂａ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＢＡＳＦ（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｄａｙｇｌｏ  Ｃｏｌｏｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｕｍｂａｉ、Ｉｎｄｉａ）、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｄｙｅｓｔｕｆｆｓ  Ｃｏｒｐ．（Ｅａｓｔ  Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ、Ｒｈｏｄｅ  Ｉｓｌａｎｄ、ＵＳＡ）、Ｄｙｓｔａｒ（Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｌａｎｘｅｓｓ（Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍｅｇａｚｙｍｅ（Ｗｉｃｋｌｏｗ、Ｉｒｅｌａｎｄ）、Ｃｌａｒｉａｎｔ（Ｍｕｔｔｅｎｚ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ａｖｅｃｉａ（Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＵＫ）から購入可能であり、及び／又は本明細書に記載の実施例に従って調製可能である。
【０１１２】
好適な色調剤については、詳しくは米国特許第７，２０８，４５９（Ｂ２）号に記述されている。
【０１１３】
カプセル
一態様では、カプセルは、コアと、内側表面及び外側表面を有するシェルと、を含む。ここで、シェルはコアを封入する。
【０１１４】
このカプセルの一態様では、このコアは、香料、増白剤、染料、防虫剤、シリコーン、ワックス、香味料、ビタミン、布地用柔軟剤、スキンケア剤、一態様ではパラフィン、酵素、抗菌剤、漂白剤、感覚剤、及びこれらの混合物なる群から選択された材料を含むことができ、並びにこのシェルはポリエチレン、ポリアミド、ポリスチレン、ポリイソプレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリアクリレート、アミノ樹脂、一態様では、アミノ樹脂は、ポリウレア、ポリウレタン、及び／又はポリウレアウレエタン（一態様では、ポリウレアにはポリオキシメチレンウレアを含み得る）、及び／又はメラミンホルムアルデヒドを含み得る、ポリオレフィン、多糖、一態様では、多糖にはアルギネート及び／又はキトサンを含み得る、ゼラチン、セラック、エポキシ樹脂、ビニルポリマー、水溶性無機物、シリコーン、及びこれらの混合物からなる群から選択された材料を含むことができる。
【０１１５】
このカプセルの一態様では、このコアは香料を含んでよい。
【０１１６】
このカプセルの一態様では、このシェルはメラミンホルムアルデヒド、及び／又は架橋したメラミンホルムアルデヒドを含んでよい。
【０１１７】
一態様では、コア材料及びシェルを含むことができ、このシェルがこのコア材料を少なくとも部分的に取り囲む、好適なカプセルが開示される。このカプセルの少なくとも７５％、８５％、又は更には９０％は、約０．２ＭＰａ〜約１０ＭＰａ、約０．４ＭＰａ〜約５ＭＰａ、約０．６ＭＰａ〜約３．５ＭＰａ、又は更には約０．７ＭＰａ〜約３ＭＰａの破壊強度、並びに０％〜約３０％、０％〜約２０％、又は更には０％〜約５％の有益剤漏出率を有し得る。
【０１１８】
一態様では、このカプセルの少なくとも７５％、８５％、又は更には９０％は、約１マイクロメートル〜約８０マイクロメートル、約５マイクロメートル〜６０マイクロメートル、約１０マイクロメートル〜約５０マイクロメートル、又は更には約１５マイクロメートル〜約４０マイクロメートルの粒径を有し得る。
【０１１９】
一態様では、このカプセルの少なくとも７５％、８５％、又は更には９０％は、約３０ｎｍ〜約２５０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１８０ｎｍ、又は更には約１００ｎｍ〜約１６０ｎｍの粒子壁厚を有し得る。
【０１２０】
一態様では、このカプセルのコア材料は、香料原料、並びに／又は場合によりヒマシ油（caster oil）、ココナッツ油、綿実油、ブドウ油、菜種、大豆油、コーン油、パーム油、亜麻仁油、ベニバナ油、オリーブ油、ピーナッツ油、ココナッツ油、パーム核油、ヒマシ油（castor oil）、レモン油及びこれらの混合物などの、純粋植物油又はブレンドされた植物油などの、植物油、植物油のエステル、ジブチルアジパート、ジブチルフタレート、ブチルベンジルアジパート、ベンジルオクチルアジパート、トリクレシルホスフェート、トリオクチルホスフェート及びこれらの混合物などのエステル、約８０℃を超える沸点を有する直鎖若しくは分枝鎖炭化水素などの、直鎖若しくは分枝鎖炭化水素、部分水素化テルフェニル、ジアルキルフタレート、モノイソプロピルビフェニルなどのアルキルビフェニル、ジプロピルナフタレンなどのアルキル化ナフタレン、ケロシンなどの石油スピリット、鉱油及びこれらの混合物、ベンゼン、トルエン及びこれらの混合物などの芳香族溶媒、シリコーン油、並びにこれらの混合物からなる群から選択される材料からなる群から選択される材料を含んでもよい。
【０１２１】
一態様では、このカプセルの壁材料は、アルデヒドとアミンの反応生成物などの好適な樹脂を含んでもよく、好適なアルデヒドとしてはホルムアルデヒドが挙げられる。好適なアミンとしては、メラミン、尿素、ベンゾグアナミン、グリコールウリル、及びこれらの混合物が挙げられる。好適なメラミンとしては、メチロールメラミン、メチル化メチロールメラミン、イミノメラミン及びこれらの混合物が挙げられる。好適な尿素としては、ジメチロール尿素、メチル化ジメチロール尿素、尿素−レゾルシノール、及びこれらの混合物が挙げられる。
【０１２２】
一態様では、好適なホルムアルデヒドスカベンジャーをカプセル（例えばカプセルスラリー）と共に選択することができ、及び／又はカプセルをこのような布地ケア製品及びホームケア製品に加える前に、加えるときに、加えた後に選択することができる。
【０１２３】
好適なカプセル剤は、米国特許第２００８／０３０５９８２（Ａ１）号、及び／又は同第２００９／０２４７４４９（Ａ１）号の教示に従うことにより、製造することができる。あるいは、好適なカプセル剤は、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  Ｐａｐｅｒｓ  Ｉｎｃ．（Ａｐｐｌｅｔｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＵＳＡ）から購入することもできる。
【０１２４】
加えて、カプセルを製造するための材料は、Ｓｏｌｕｔｉａ  Ｉｎｃ．（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．），Ｃｙｔｅｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｗｅｓｔ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ  Ｕ．Ｓ．Ａ．），ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．），ＣＰ  Ｋｅｌｃｏ  Ｃｏｒｐ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）；ＢＡＳＦ  ＡＧ（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；Ｒｈｏｄｉａ  Ｃｏｒｐ．（Ｃｒａｎｂｕｒｙ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  Ｃｏｒｐ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌａｗａｒｅ，ＵＳＡ）；Ａｇｒｉｕｍ  Ｉｎｃ．（Ｃａｌｇａｒｙ，Ａｌｂｅｒｔａ，Ｃａｎａｄａ）、ＩＳＰ（Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ  Ｕ．Ｓ．Ａ．）、Ａｋｚｏ  Ｎｏｂｅｌ（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）；Ｓｔｒｏｅｖｅｒ  Ｓｈｅｌｌａｃ  Ｂｒｅｍｅｎ（Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ，ＵＳＡ）；Ｂａｙｅｒ  ＡＧ（Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）から得ることができる。
【０１２５】
両親媒性の洗浄用ポリマー
好ましくは、両親媒性の洗浄用ポリマーは、以下の一般構造式：ビス（（Ｃ２Ｈ５Ｏ）（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ）（ＣＨ３）−Ｎ＋−ＣｘＨ２ｘ−Ｎ＋−（ＣＨ３）−ビス（（Ｃ２Ｈ５Ｏ）（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ）を有する化合物、又はこれらの硫酸化若しくはスルホン酸化変異体であり、式中、ｎ＝２０〜３０であり、かつｘ＝３〜８である。
【０１２６】
本発明の両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマーは、布地及び表面からグリース粒子を除去するように親水性と疎水性の特性が釣り合っている任意のアルコキシル化ポリマーを示す。本発明の両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマーの特定の実施形態は、コア構造と、そのコア構造に結合した複数のアルコキシレート基と、を含む。
【０１２７】
コア構造は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）
【化８】
0005882904.tif 000009
の繰り返し単位を縮合形態で含むポリアルキレンイミン構造（式中、＃は、各場合において、窒素原子と式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）の２つの隣接する繰り返し単位のＡ１基の遊離結合部位との間の結合の半分を示し、＊は、各場合において、アルコキシレート基のうちの１つに対する結合の半分を示し、Ａ１は、直鎖又は分枝鎖のＣ２〜Ｃ６−アルキレンから独立して選択され、ポリアルキレンイミン構造は、式（Ｉ）の１繰り返し単位、式（ＩＩ）のｘ繰り返し単位、式（ＩＩＩ）のｙ繰り返し単位及び式（ＩＶ）のｙ＋１繰り返し単位からなり、ｘ及びｙは、各場合において、０〜約１５０の範囲の値を有し、ポリアルキレンイミンコア構造の平均重量平均分子量Ｍｗは、約６０〜約１０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲の値である）を含んでもよい。
【０１２８】
あるいは、コア構造は、式（Ｉ．ａ）及び／又は（Ｉ．ｂ）のＮ−（ヒドロキシアルキル）アミンから選択される少なくとも１つの化合物の縮合生成物のポリアルカノールアミン構造
【化９】
0005882904.tif 000010
（式中、Ａは、Ｃ１〜Ｃ６−アルキレンから独立して選択され、Ｒ１、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ２＊、Ｒ３、Ｒ３＊、Ｒ４、Ｒ４＊、Ｒ５及びＲ５＊は、水素、アルキル、シクロアルキル又はアリールから独立して選択され、後者３つの言及されたラジカルは置換されてもよく、Ｒ６は、水素、アルキル、シクロアルキル又はアリールから選択され、後者３つの言及されたラジカルは置換されてもよい）を含んでもよい。
【０１２９】
コア構造に結合した複数のアルキレンオキシ基は、式（Ｖ）のアルキレンオキシ単位
【化１０】
0005882904.tif 000011
（式中、＊は、各場合において、式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＶ）の繰り返し単位の窒素原子に対する結合の半分を示し、Ａ２は、各場合において、１，２−プロピレン、１，２−ブチレン及び１，２−イソブチレンから独立して選択され、Ａ３は、１，２−プロピレンであり、Ｒは、各場合において、水素及びＣ１〜Ｃ４−アルキルから独立して選択され、ｍは０〜約２の範囲の平均値を有し、ｎは約２０〜約５０の範囲の平均値を有し、ｐは約１０〜約５０の範囲の平均値を有する）から独立して選択される。
【０１３０】
両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマーの特定の実施形態は、内側ポリエチレンオキシドブロックと外側ポリプロピレンオキシドブロックとを有するアルコキシル化ポリアルキレンイミンから選択されてもよく、エトキシル化度及びプロポキシル化度は特定の制限値を上回りも下回りもしない。本発明によるアルコキシル化ポリアルキレンイミンの特定の実施形態では、ポリエチレンブロックのポリプロピレンブロックに対する比率（ｎ／ｐ）の最小値は約０．６であり、最大値は約１．５（ｘ＋２ｙ＋１）１／２である。約０．８〜約１．２（ｘ＋２ｙ＋１）１／２のｎ／ｐ比率を有するアルコキシル化ポリアルキレンイミンは、特に有益な特性を有することが判明している。
【０１３１】
本発明によるアルコキシル化ポリアルキレンイミンは第一級、第二級及び第三級アミン窒素原子からなる主鎖を有し、これらの窒素原子はアルキレンラジカルＡにより互いに結合し、ランダムに配列される。ポリアルキレンイミン主鎖の主鎖及び側鎖を開始又は終端し、その残りの水素原子が引き続いてアルキレンオキシ単位により置換される第一級アミノ部分は、それぞれ式（Ｉ）又は（ＩＶ）の繰り返し単位と呼ばれる。残りの水素原子が引き続いてアルキレンオキシ単位により置換される第二級アミノ部分は、式（ＩＩ）の繰り返し単位と呼ばれる。主鎖と側鎖に分岐する第三級アミノ部分は、式（ＩＩＩ）の繰り返し単位と呼ばれる。
【０１３２】
環化がポリアルキレンイミン主鎖の形成時に生じ得るので、環状アミノ部分が主鎖内に小程度まで存在することも可能である。環状アミノ部分を含有するこのようなポリアルキレンイミンは、無論、非環状第一級及び第二級アミノ部分からなるものと同様にアルコキシル化される。
【０１３３】
窒素原子及びＡ１基からなるポリアルキレンイミン主鎖は、約６０〜約１０，０００ｇ／モル、好ましくは約１００〜約８，０００ｇ／モル、より好ましくは約５００〜約６，０００ｇ／モルの平均分子量Ｍｗを有する。
【０１３４】
和（ｘ＋２ｙ＋１）は、１つの個々のポリアルキレンイミン主鎖内に存在するアルキレンイミン単位の総数に相当し、それゆえにポリアルキレンイミン主鎖の分子量に直接関わる。しかしながら、指定で与えられた値は、混合物中に存在するすべてのポリアルキレンイミンの数平均に関わる。和（ｘ＋２ｙ＋２）は、１つの個々のポリアルキレンイミン主鎖内に存在するアミノ基の総数に相当する。
【０１３５】
アミノ窒素原子に接続するラジカルＡ１は、１，２−エチレン、１，２−プロピレン、１，２−ブチレン、１，２−イソブチレン、１，２−ペンタンジイル、１，２−ヘキサンジイル又はヘキサメチレンなどの、同一又は異なる、直鎖又は分枝鎖Ｃ２〜Ｃ６−アルキレンラジカルであり得る。好ましい分枝状アルキレンは、１，２−プロピレンである。好ましい直鎖アルキレンは、エチレン及びヘキサメチレンである。より好ましいアルキレンは、１，２−エチレンである。
【０１３６】
ポリアルキレンイミン主鎖の第一級及び第二級アミノ基の水素原子は、式（Ｖ）のアルキレンオキシ単位により置換される。
【化１１】
0005882904.tif 000012
この式では、可変因子は、好ましくは、以下に与えられる意味のうちの１つを有する。
【０１３７】
Ａ２は、各場合において、１，２−プロピレン、１，２−ブチレン及び１，２−イソブチレンから選択され、好ましくはＡ２は、１，２−プロピレンである。Ａ３は１，２−プロピレンであり、Ｒは、各場合において、水素及びＣ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル及びｔｅｒｔ−ブチルなど）から選択され、好ましくはＲは水素である。添え字ｍは、各場合において、０〜約２の値を有し、好ましくはｍは０又はおよそ１であり、より好ましくはｍは０である。添え字ｎは、約２０〜約５０の範囲、好ましくは約２２〜約４０の範囲、より好ましくは約２４〜約３０の範囲の平均値を有する。添え字ｐは、約１０〜約５０の範囲、好ましくは約１１〜約４０の範囲、より好ましくは約１２〜約３０の範囲の平均値を有する。
【０１３８】
好ましくは、式（Ｖ）のアルキレンオキシ単位は、アルコキシレートブロックの非ランダム配列である。非ランダム配列により、［−Ａ２−Ｏ−］ｍが１番目に付加され（すなわち、式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の繰り返し単位の窒素原子に対する結合に最も近接している）、［−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−］ｎが２番目に付加され、［−Ａ３−Ｏ−］ｐが３番目に付加されることが意味される。この配向は、内側ポリエチレンオキシドブロックと外側ポリプロピレンオキシドブロックとを有するアルコキシル化ポリアルキレンイミンを提供する。
【０１３９】
式（Ｖ）のこれらのアルキレンオキシ単位のかなりの部分は、エチレンオキシ単位−［ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）］ｎ−及びプロピレンオキシ単位−［ＣＨ２−ＣＨ２（ＣＨ３）−Ｏ］ｐ−により形成される。アルキレンオキシ単位はまた追加的に、小さな比率のプロピレンオキシ又はブチレンオキシ単位−［Ａ２−Ｏ］ｍ−を有してもよく、すなわち、水素原子で飽和したポリアルキレンイミン主鎖は、存在するＮＨ−部分１モル当たりで最大約２モル、特に約０．５〜約１．５モル、特に約０．８〜約１．２モルの、少量のプロピレンオキシド又はブチレンオキシドと最初に反応させてもよい、すなわち、初期にアルコキシル化させてもよい。
【０１４０】
ポリアルキレンイミン主鎖のこの最初の修飾により、必要である場合には、アルコキシル化における反応混合物の粘性を低下させることができる。しかしながら、修飾は一般にアルコキシル化ポリアルキレンイミンの性能特性に影響せず、したがって、好ましい尺度を構成しない。
【０１４１】
両親媒性のアルコキシル化グリース洗浄用ポリマーは、限定するものではないが、洗剤が挙げられる本発明の布地ケア製品及びホームケア製品中に、布地ケア製品及びホームケア製品の約０．０５重量％〜１０重量％の範囲の濃度で存在する。布地ケア製品及びホームケア製品の実施形態は、約０．１％〜約５重量％を含み得る。より具体的には、本実施形態は、約０．２５〜約２．５％のグリース洗浄ポリマーを含んでもよい。
【０１４２】
免疫当量ではない酵素、及び／又は追加の酵素
布地ケア製品及びホームケア製品は、洗浄性能及び／又は布地ケア効果を提供する１つ以上の酵素を含むことができる。好適な酵素の例としては、限定するものではないが、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、ペクテートリアーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ及びアミラーゼ、又はこれらの混合物が挙げられる。典型的な組み合わせは酵素反応混液であり、例えば、プロテアーゼ及びリパーゼをアミラーゼとともに含んでよい。布地ケア製品及びホームケア製品中に存在する場合、上記追加の酵素は、布地ケア製品及びホームケア製品の、約０．００００１重量％〜約２重量％、約０．０００１重量％〜約１重量％、又は更には約０．００１重量％〜約０．５重量％の酵素タンパク質濃度で存在し得る。
【０１４３】
一態様では、好ましい酵素としてはプロテアーゼが挙げられる。好適なプロテアーゼとしては、サブチリシン（ＥＣ  ３．４．２１．６２）のような、中性又はアルカリ性の微生物セリンプロテアーゼなどの、メタロプロテアーゼ及びセリンプロテアーゼが挙げられる。好適なプロテアーゼとしては、動物、植物又は微生物由来のものが挙げられる。一態様では、このような好適なプロテアーゼは微生物由来のものであり得る。好適なプロテアーゼとしては、前述の好適なプロテアーゼの化学修飾変異体又は遺伝子組み換え変異体が挙げられる。一態様では、好適なプロテアーゼは、アルカリ性微生物プロテアーゼ又は／及びトリプシン型プロテアーゼなどのセリンプロテアーゼであり得る。好適な中性又はアルカリ性プロテアーゼの例としては、以下のものが挙げられる：
（ａ）サブチリシン（ＥＣ  ３．４．２１．６２）（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ、Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉなどのＢａｃｉｌｌｕｓから誘導されたものを含む）（米国特許第６，３１２，９３６（Ｂ１）号、同第５，６７９，６３０号、同第４，７６０，０２５号、同第７，２６２，０４２号及び国際公開第０９／０２１８６７号に記載）。
【０１４４】
（ｂ）トリプシン（例えばブタ又はウシ由来）などのトリプシン型又はキモトリプシン型プロテアーゼ（国際公開第８９／０６２７０号に記述されているフサリウムプロテアーゼ、及び同第０５／０５２１６１号及び同第０５／０５２１４６号に記述されているＣｅｌｌｕｍｏｎａｓに由来するキモトリプシンプロテアーゼを含む）。
【０１４５】
（ｃ）メタロプロテアーゼ（国際公開第０７／０４４９９３（Ａ２）号に記述されているＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓから誘導されたものを含む）。
【０１４６】
好ましいプロテアーゼとしては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ又はＢａｃｉｌｌｕｓ  Ｌｅｎｔｕｓから誘導されるものが挙げられる。
【０１４７】
好適な市販のプロテアーゼ酵素としては：Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ（Ｄｅｎｍａｒｋ）より、Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）、Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）、Ｐｒｉｍａｓｅ（登録商標）、Ｄｕｒａｚｙｍ（登録商標）、Ｐｏｌａｒｚｙｍｅ（登録商標）、Ｋａｎｎａｓｅ（登録商標）、Ｌｉｑｕａｎａｓｅ（登録商標）、Ｌｉｑｕａｎａｓｅ  Ｕｌｔｒａ（登録商標）、Ｓａｖｉｎａｓｅ  Ｕｌｔｒａ（登録商標）、Ｏｖｏｚｙｍｅ（登録商標）、Ｎｅｕｔｒａｓｅ（登録商標）、Ｅｖｅｒｌａｓｅ（登録商標）及びＥｓｐｅｒａｓｅ（登録商標）の商品名で販売されているもの、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌより、Ｍａｘａｔａｓｅ（登録商標）、Ｍａｘａｃａｌ（登録商標）、Ｍａｘａｐｅｍ（登録商標）、Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ  Ｐｒｉｍｅ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ  Ｏｘ（登録商標）、ＦＮ３（登録商標）、ＦＮ４（登録商標）、Ｅｘｃｅｌｌａｓｅ（登録商標）及びＰｕｒａｆｅｃｔ  ＯＸＰ（登録商標）の商品名で販売されているもの、Ｓｏｌｖａｙ  Ｅｎｚｙｍｅｓより、Ｏｐｔｉｃｌｅａｎ（登録商標）及びＯｐｔｉｍａｓｅ（登録商標）の商品名で販売されているもの、Ｈｅｎｋｅｌ／Ｋｅｍｉｒａより入手可能なもの、すなわちＢＬＡＰ（以下の変異Ｓ９９Ｄ＋Ｓ１０１Ｒ＋Ｓ１０３Ａ＋Ｖ１０４Ｉ＋Ｇ１５９Ｓを有する、米国特許第５，３５２，６０４号の図２９で示される配列、以降ＢＬＡＰとして参照する）、ＢＬＡＰ  Ｒ（Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ｖ１９９Ｍ＋Ｖ２０５Ｉ＋Ｌ２１７Ｄを有するＢＬＡＰ）、ＢＬＡＰ  Ｘ（Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ｖ２０５Ｉを有するＢＬＡＰ）及びＢＬＡＰ  Ｆ４９（Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ａ１９４Ｐ＋Ｖ１９９Ｍ＋Ｖ２０５Ｉ＋Ｌ２１７Ｄを有するＢＬＡＰ）、並びに花王のＫＡＰ（変異Ａ２３０Ｖ＋Ｓ２５６Ｇ＋Ｓ２５９Ｎを有するＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓのサブチリシン）が挙げられる。
【０１４８】
一態様では、布地ケア製品及びホームケア製品は、本発明の冷水プロテアーゼに対して免疫当量ではないプロテアーゼを含み得る。本発明の目的に関し、免疫的当量のプロテアーゼはＢＰＮ’と同一性の高いものであり（＞８０％）、かつ同じ抗体で交差反応し得るものである。好適な、免疫当量ではない酵素としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｌｅｎｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉから誘導されるもの、及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓから誘導されるメタロプロテアーゼが挙げられる。
【０１４９】
好適なα−アミラーゼとしては、細菌又は真菌起源のものが挙げられる。化学操作された又は遺伝子操作された変異体（変異型）が含まれる。好ましいアルカリ性α−アミラーゼは、バチルスの菌種から、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、又は他のバチルス種、例えばバチルス種ＮＣＩＢ  １２２８９、ＮＣＩＢ  １２５１２、ＮＣＩＢ  １２５１３、ＤＳＭ  ９３７５（米国特許第７，１５３，８１８号）、ＤＳＭ  １２３６８、ＤＳＭＺ  ｎｏ．１２６４９、ＫＳＭ  ＡＰ１３７８（国際公開第９７／００３２４号）、ＫＳＭ  Ｋ３６又はＫＳＭ  Ｋ３８（欧州特許第１，０２２，３３４号）に由来する。好ましいアミラーゼとしては、以下のものが挙げられる。
【０１５０】
（ａ）国際公開第９４／０２５９７号、同第９４／１８３１４号、同第９６／２３８７４号、及び同第９７／４３４２４号に記載の変異体、特に、国際公開第９６／２３８７４号のＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２としてリストされた酵素に対して、以下の位置：１５、２３、１０５、１０６、１２４、１２８、１３３、１５４、１５６、１８１、１８８、１９０、１９７、２０２、２０８、２０９、２４３、２６４、３０４、３０５、３９１、４０８及び４４４のうちの１つ以上が置換された変異体。
【０１５１】
（ｂ）米国特許第５，８５６，１６４号及び国際公開第９９／２３２１１号、同第９６／２３８７３号、同第００／６００６０号、及び同第０６／００２６４３号に記載された変異体、特に国際公開第０６／００２６４３号でＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２としてリストされたＡＡ５６０酵素に対して、以下の位置：
２６、３０、３３、８２、３７、１０６、１１８、１２８、１３３、１４９、１５０、１６０、１７８、１８２、１８６、１９３、２０３、２１４、２３１、２５６、２５７、２５８、２６９、２７０、２７２、２８３、２９５、２９６、２９８、２９９、３０３、３０４、３０５、３１１、３１４、３１５、３１８、３１９、３３９、３４５、３６１、３７８、３８３、４１９、４２１、４３７、４４１、４４４、４４５、４４６、４４７、４５０、４６１、４７１、４８２、４８４のうちの１つ以上が置換された変異体であって、好ましくはＤ１８３＊及びＧ１８４＊の欠損を含有する変異体。
【０１５２】
（ｃ）国際公開第０６／００２６４３号でのＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４（バチルスＳＰ７２２からの野生型酵素）と少なくとも９０％の同一性を呈し、特に位置１８３及び１８４で欠損を有する変異体、並びに本明細書に参照により組み込まれる国際公開第００／６００６０号に記載の変異体。
【０１５３】
（ｄ）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．７０７（米国特許第６，０９３，５６２号の配列番号７）の野生型酵素と少なくとも９５％の同一性を呈する変異体、特に以下の変異Ｍ２０２、Ｍ２０８、Ｓ２５５、Ｒ１７２、及び／又はＭ２６１を１つ以上含む変異体。好ましくはこのアミラーゼは、Ｍ２０２Ｌ、Ｍ２０２Ｖ、Ｍ２０２Ｓ、Ｍ２０２Ｔ、Ｍ２０２Ｉ、Ｍ２０２Ｑ、Ｍ２０２Ｗ、Ｓ２５５Ｎ及び／又はＲ１７２Ｑの１つ以上を含む。特に好ましいのは、Ｍ２０２Ｌ又はＭ２０２Ｔの変異を含むものである。
【０１５４】
好適な市販のα−アミラーゼとしては、ＤＵＲＡＭＹＬ（登録商標）、ＬＩＱＵＥＺＹＭＥ（登録商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（登録商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ  ＵＬＴＲＡ（登録商標）、ＮＡＴＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＳＵＰＲＡＭＹＬ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ  ＰＬＵＳ（登録商標）、ＦＵＮＧＡＭＹＬ（登録商標）及びＢＡＮ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ、Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＫＥＭＺＹＭ（登録商標）ＡＴ  ９０００（Ｂｉｏｚｙｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｔｒａｄｉｎｇ  ＧｍｂＨ：Ｗｅｈｌｉｓｔｒａｓｓｅ  ２７ｂ  Ａ−１２００  Ｗｉｅｎ  Ａｕｓｔｒｉａ）、ＲＡＰＩＤＡＳＥ（登録商標）、ＰＵＲＡＳＴＡＲ（登録商標）、ＥＮＺＹＳＩＺＥ（登録商標）、ＯＰＴＩＳＩＺＥ  ＨＴ  ＰＬＵＳ（登録商標）及びＰＵＲＡＳＴＡＲ  ＯＸＡＭ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ：Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））及びＫＡＭ（登録商標）（花王：日本、１０３−８２１０、東京都中央区日本橋茅場町１丁目１４番１０号）が挙げられる。一態様では、好適なアミラーゼとしては、ＮＡＴＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（登録商標）、及びＳＴＡＩＮＺＹＭＥ  ＰＬＵＳ（登録商標）と、これらの混合物が挙げられる。
【０１５５】
一態様では、このような追加の酵素は：米国特許第６，９３９，７０２（Ｂ１）号及び米国特許出願公開第２００９／０２１７４６４号に記載されるもののような、「第１サイクルリパーゼ」が挙げられる、リパーゼからなる群から選択されてよい。一態様では、リパーゼは第１洗浄用リパーゼであり、好ましくはＴ２３１Ｒ及びＮ２３３Ｒ変異を含む、子嚢菌（Thermomyces lanuginosus）由来の野生型リパーゼの変異体である。野生型配列は、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ登録番号Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｏ５９９５２の２６９個のアミノ酸（アミノ酸２３〜２９１）（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）由来）である。好ましいリパーゼとしては、商品名Ｌｉｐｅｘ（登録商標）及びＬｉｐｏｌｅｘ（登録商標）で販売されているものが挙げられる。
【０１５６】
一態様では、他の好ましい酵素としては、７，１４１，４０３Ｂ２の配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９４％、９７％及び更には９９％の同一性を有し、バチルス属のメンバーに対しエンド−β−１，４−グルカナーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．２．１．４）を呈する、微生物から誘導されたエンドグルカナーゼ（例えばバクテリアの内因性ポリペプチド）が挙げられる。好適なエンドグルカナーゼは、商品名Ｃｅｌｌｕｃｌｅａｎ（登録商標）及びＷｈｉｔｅｚｙｍｅ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ））で販売されている。
【０１５７】
他の好ましい酵素としては、商品名Ｐｅｃｔａｗａｓｈ（登録商標）、Ｐｅｃｔａｗａｙ（登録商標）、及び商品名Ｍａｎｎａｗａｙ（登録商標）で販売されている（すべてＮｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）から市販）マンナナーゼ、並びにＰｕｒａｂｒｉｔｅ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．：Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で販売されているペクチン酸リアーゼが挙げられる。
【０１５８】
補助材料
本発明の目的上必須ではないが、以下に例示されている補助剤の非限定的なリストは、即時布地ケア製品及びホームケア製品に用いるのに適するもののリストであり、例えば、洗浄性能を補助若しくは向上させるために、洗浄すべき基材の処理のために、又は香料、着色剤、染料などを用いる場合のように布地ケア製品及びホームケア製品の審美性を変化させるために、本発明の特定の実施形態に組み込むのが望ましい。組み込みに関して上記に引用した任意の材料に加え、補助成分は任意の布地ケア製品及びホームケア製品に任意の濃度で組み込まれる。これらの追加の成分の正確な性質、及びこれらの組み込み濃度は、布地ケア製品及びホームケア製品の物理形態、並びに布地ケア製品及びホームケア製品が使用される洗浄操作の性質に依存して決まる。好適な補助剤物質としては、限定するものではないが、界面活性剤、ビルダー、キレート剤、移染防止剤、分散剤、追加の酵素及び酵素安定剤、触媒物質、漂白活性化剤、過酸化水素、過酸化水素源、予備形成済み過酸、ポリマー分散剤、粘土汚れ除去／再付着防止剤、増白剤、泡抑制剤、染料、香料、構造伸縮性付与剤、柔軟仕上げ剤、担体、屈水性誘発物質、加工助剤、溶媒、及び／又は顔料が挙げられる。下記開示に加えて、このような他の補助剤の好適な例、及び使用のレベルは、米国特許第５，５７６，２８２号、同第６，３０６，８１２（Ｂ１）号及び同第６，３２６，３４８（Ｂ１）号に見られ、これらは参照により組み込まれる。
【０１５９】
記載するとき、補助剤成分は、出願者らの布地ケア製品及びホームケア製品に必須ではない。したがって、出願者らの布地ケア製品及びホームケア製品のある種の実施形態は、以下の補助剤材料を１以上含まない：界面活性剤、ビルダー、キレート剤、移染防止剤、分散剤、追加の酵素、及び酵素安定剤、触媒材料、漂白活性剤、過酸化水素、過酸化水素供給源、予形成過酸、分散剤ポリマー、粘度汚れ除去／再付着防止剤、増白剤、抑泡剤、染料、香料、香料送達系、構造弾性化剤、布地用柔軟剤、担体、屈水性誘発物質、加工助剤、溶媒、及び／又は顔料。しかし、１つ以上の補助剤が存在する場合、このような１つ以上の補助剤は、以下に詳述されるように存在することも可能である。
【０１６０】
香料送達系及び香料−本発明の組成物は原香料を含んでもよく、及び／又は商品棚から始まる合計香料サイクルを通して、所望の香り体験を生成することと組み合わせることができる香料技術系を含んでもよい。好適な香料としては、長続きのする香料、及び／又はｑｕａｄｒａｎｔ香料が挙げられる。このような原香料に関する実施例は、米国特許第５，５００，１３８号、同第５，５００，１５４号、同第６，４９１，７２８号、同第５，５００，１３７号及び同第５，７８０，４０４号に開示されている。好適な香料送達系、特定の香料送達系の製造方法及びかかる香料送達系の使用が、米国特許出願第２００７／０２７５８６６（Ａ１）号に開示されている。このような香料送達系としては、以下のものが挙げられる。
【０１６１】
ポリマー支援型送達（ＰＡＤ）：この香料送達技術は、香料物質を送達するうえでポリマー性材料を用いるものである。古典的なコアセルベーション、水溶性又は部分水溶性〜非水溶性の荷電又は中性ポリマー、液晶、ホットメルト、ヒドロゲル、香料付与プラスチック、マイクロカプセル、ナノ−、及びマイクロラテックス、ポリマー性フィルム形成剤、ポリマー性吸収剤、ポリマー性吸着剤などが一部の例である。ＰＡＤには限定するものではないが、以下のものが挙げられる。
【０１６２】
ａ．）マトリックス系：芳香剤をポリマーマトリックス又は粒子中に溶解又は分散させる。香料は例えば、１）製品に配合する前にポリマー中に分散させるか、又は２）製品の配合時又は配合後にポリマーとは別に添加すればよい。ポリマーからの香料の拡散は、所望の表面（部位）に付着又は塗布されたポリマー性マトリックス系から香料を放出させるか、あるいはその放出速度を増加させるうえで一般的な誘因であるが、香料の放出を制御する他の多くの誘因が知られている。ポリマー性粒子、フィルム、溶液などの内部又は外部への吸収、及び／又は吸着はこの技術の側面である。有機材料（例えば、ラテックス）からなるナノ−又はマイクロ粒子がその例である。好適な粒子としては、限定するものではないが、ポリアセタール、ポリアクリレート、ポリアクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリアリールエーテルケトン、ポリブタジエン、ポリブチレン、ポリブチレンテレフタレート、ポリクロロプレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリシクロヘキシレンジメチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリクロロプレン、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリケトン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリエーテルイミド、ポリエーテルスルホン、ポリエチレンクロリネート、ポリイミド、ポリイソプレン、ポリ乳酸、ポリメチルペンテン、ポリフェニレンオキシド、ポリフェニレンスルフィド、ポリフタルアミド、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、並びにアクリロニトリル−ブタジエン、酢酸セルロース、エチレン−酢酸ビニル、エチレンビニルアルコール、スチレン−ブタジエン、酢酸ビニル−エチレン、及びこれらの混合物などに基づいたポリマー又はコポリマーなどの広範な材料が挙げられる。
【０１６３】
「標準的な」系とは、ポリマーに結合した予備充填された香料を香料の放出の瞬間まで保持することを意図して香料で予備充填されたもののことを指す。こうしたポリマーは、未希釈の製品の匂いを抑制し、香料の放出速度に応じてブルーム、及び／又は持続性の効果も与え得る。こうした系における課題の１つは、１）製品内安定性（必要時まで担体内部に香料を保持すること）と、２）適時放出（使用時又は乾燥部位から）との理想的なバランスを実現することである。こうした安定性の実現は、製品内保存時、及び製品のエイジング時に特に重要である。この課題は、ヘビーデューティー液体洗濯用洗剤などの、水ベースの界面活性剤含有製品において特に明らかである。利用可能な多くの「標準的」マトリックス系は、水ベースの製品に配合した場合に効果的に「平衡」系となる。許容可能な製品内拡散安定性及び放出のための利用可能な誘因（例えば、摩擦）を有する「平衡」系又はリザーバ系を選択することができる。「平衡」系とは、香料及びポリマーを製品に別々に添加することができ、香料とポリマーとの間の平衡相互作用によって１つ以上の消費者接触点において効果をもたらすものである（これに対して、ポリマー支援型送達技術を有さない自由香料制御がある）。このポリマーも香料で予備充填することができるが、香料の一部又は全部が製品内保存時に拡散し、所望の香料原材料（ＰＲＭ）がポリマーに結合した平衡状態に達する場合がある。するとポリマーは香料を表面へと輸送し、典型的には、香料が拡散することで放出が行われる。こうした平衡系ポリマーの使用は、未希釈の製品の未希釈の匂いの強度を低下させる可能性を有する（通常、予備充填された標準系の場合に特にそうした傾向がある）。こうしたポリマーの蓄積は放出プロファイルを「一定化」し、持続性を高めることができる。上記に示したように、こうした持続性は初期の強度を抑制することによって得られ、配合者が、より高いインパクト又は低い嗅覚閾値（ＯＤＴ）又は低いコバッツ・インデックス（ＫＩ）のＰＲＭを用いて、初期強度が強過ぎたり、変質することのないＦＭＯＴの効果を得ることが可能となる。所望の消費者の接触点に影響を与えるためには香料の放出は、適用のタイムフレーム内で生じることが重要である。好適なマイクロ粒子、及びマイクロラテックス並びにその製造方法は米国特許出願第２００５／０００３９８０（Ａ１）号に見出すことができる。マトリックス系は更にホットメルト接着剤、及び芳香性プラスチックを含む。更に、疎水的に改質された多糖を香料添加製品に配合することによって香料蓄積を増加させ、及び／又は香料放出を改変することができる。例えば多糖及びナノラテックスを含むこうしたマトリクス系はすべて、ＰＡＤリザーバ系等の他のＰＡＤ系を含む他のＰＤＴと組み合わせて香料マイクロカプセル（ＰＭＣ）の形態とすることができる。ポリマー支援型送達（ＰＡＤ）マトリックス系としては下記の参考文献に記載のものが挙げられる：米国特許出願第２００４／０１１０６４８（Ａ１）号、同第２００４／００９２４１４（Ａ１）号、同第２００４／００９１４４５（Ａ１）号、及び同第２００４／００８７４７６（Ａ１）号、並びに米国特許第６，５３１，４４４号、同第６，０２４，９４３号、同第６，０４２，７９２号、同第６，０５１，５４０号、同第４，５４０，７２１号、及び同第４，９７３，４２２号。
【０１６４】
ＰＤＴとして使用することが可能なポリマーの例としてはシリコーンもあり、ポリマー支援型送達「マトリックス系」と同様の様式で香料効果を与えるものである。このようなＰＤＴは、シリコーン支援型送達（ＳＡＤ）と呼ばれる。シリコーンを香料で予備充填したり、シリコーンをＰＡＤについて述べたような平衡系として使用することができる。好適なシリコーン並びにその製造方法は、国際公開第２００５／１０２２６１号、米国特許出願第２００５／０１２４５３０（Ａ１）号、同第２００５／０１４３２８２（Ａ１）号、及び国際公開第２００３／０１５７３６号に見出すことができる。米国特許出願第２００６／００３９１３（Ａ１）号に記載されるように機能化したシリコーンを使用することも可能である。シリコーンの例としては、ポリジメチルシロキサン及びポリアルキルジメチルシロキサンが挙げられる。他の例としてはアミン機能性を有するものがあり、これを用いてアミン支援型送達（ＡＡＤ）、及び／又はポリマー支援型送達（ＰＡＤ）、及び／又はアミン反応生成物（ＡＲＰ）に関連した効果を与えることができる。他のこうした実施例を米国特許第４，９１１，８５２号、米国特許出願第２００４／００５８８４５（Ａ１）号、同第２００４／００９２４２５（Ａ１）号、及び同第２００５／０００３９８０（Ａ１）号に見出すことができる。
【０１６５】
ｂ．）リザーバ系：リザーバ系はコア／シェル型技術、すなわちフレグランスが保護シェルとして機能し得る香料放出制御膜によって包囲される技術としても知られる。マイクロカプセル内部の物質がコア、内部相、又は充填物と呼ばれるのに対して、壁は時としてシェル、コーティング、又は膜と呼ばれる。マイクロ粒子、感圧カプセル又はマイクロカプセルはこうした技術の例である。本発明のマイクロカプセルは、限定するものではないが、コーティング、押出し、スプレー乾燥、界面重合、その場での重合、及びマトリクス重合などの様々な方法によって形成される。使用可能なシェル材料は水に対する安定性が大きく異なる。最も安定したものとして、水溶液（又は製品）中に特定のＰＲＭをより長期にわたって保持することが可能なポリオキシメチレン尿素（ＰＭＵ）系材料がある。こうした系には、限定するものではないが、尿素−ホルムアルデヒド、及び／又はメラミン−ホルムアルデヒドが含まれる。例えば架橋度に応じて水に速やかに又はゆっくりと溶解するようにゼラチン系マイクロカプセルを調製してもよい。多くの他のカプセル壁材料が入手可能であり、観察される香料の拡散安定性の程度が異なっている。理論に束縛されるものではないが、例えば一旦所定の表面に付着したカプセルからの香料の放出速度は、通常、製品内の香料拡散安定性の逆の次数である。このため、例えば尿素−ホルムアルデヒド、及びメラミン−ホルムアルデヒドマイクロカプセルは通常、機械力（例、摩擦力、圧力、剪断応力）などの、カプセルを破壊して香料（フレグランス）の放出速度を増大させる、拡散以外（拡散に加えて）の放出機構を香料の放出のために必要とする。他の誘因としては、融解、溶解、加水分解又は他の化学反応、電磁放射などが挙げられる。予備充填されたマイクロカプセルの使用には、製品内安定性、及び使用時及び／又は表面上（部位上）放出の適正な比に加えてＰＲＭの適切な選択が求められる。尿素−ホルムアルデヒド、及び／又はメラミン−ホルムアルデヒドに基づいたマイクロカプセルは特に中性に近い水溶液中で比較的安定している。他の好適なマイクロカプセルとしては、ウレタン材料、アクリル、及び／又はビニルアルコールを含むシェルを有する、マイクロカプセルが挙げられる。これらの材料は摩擦誘因を必要とする場合があるが、これはすべての製品用途に適用できるものではない。他のマイクロカプセル材料（例、ゼラチン）は水性製品中では不安定な場合があり、製品内エイジングした場合に（自由香料制御に対して）効果が低下する場合もある擦ると香りが出る（スクラッチアンドスニッフ）技術はＰＡＤの更なる別の例である。香料マイクロカプセル（ＰＭＣ）としては、以下の参考文献に記載のもの：米国特許出願第２００３／０１２５２２２（Ａ１）号、同第２００３／２１５４１７（Ａ１）号、同第２００３／２１６４８８（Ａ１）号、同第２００３／１５８３４４（Ａ１）号、同第２００３／１６５６９２（Ａ１）号、同第２００４／０７１７４２（Ａ１）号、同第２００４／０７１７４６（Ａ１）号、同第２００４／０７２７１９（Ａ１）号、同第２００４／０７２７２０（Ａ１）号、同第２００６／００３９９３４（Ａ１）号、同第２００３／２０３８２９（Ａ１）号、同第２００３／１９５１３３（Ａ１）号、同第２００４／０８７４７７（Ａ１）号、同第２００４／０１０６５３６（Ａ１）号、並びに、米国特許第６，６４５，４７９（Ｂ１）号、同第６，２００，９４９（Ｂ１）号、同第４，８８２，２２０号、同第４，９１７，９２０号、同第４，５１４，４６１号、同第６，１０６，８７５号及び同第４，２３４，６２７号、同第３，５９４，３２８号、並びに米国再発行特許第３２７１３号、を挙げることができる。
【０１６６】
分子支援型送達（ＭＡＤ）：非ポリマー物質又は分子も香料の送達を向上させるうえで機能し得る。理論に束縛されるものではないが、香料は有機物質と非共有結合的に相互作用する場合があり、香料の蓄積、及び／又は放出に影響する。こうした有機物質の非限定的な例としては、限定するものではないが、有機油、ロウ、鉱物油、ペトロラタム、脂肪酸又はエステルなどの疎水性物質、糖、界面活性剤、リポソーム、更には他の香料原材料（香油）、並びにボディーオイル及び／又は他のソイルなどの天然油が挙げられる。香料定着剤は更なる別の例である。一態様では、非ポリマー性材料又は分子は約２よりも大きいＣＬｏｇＰ値を有する。分子支援型送達（ＭＡＤ）には、更に米国特許第７，１１９，０６０号及び同第５，５０６，２０１号に記載のものが含まれ得る。
【０１６７】
繊維支援型送達（ＦＡＤ）：部位の選択又は使用は、それ自体香料の送達を向上させる可能性がある。実際、部位それ自体が香料送達技術であり得る。例えば、綿又はポリエステルなどの異なる種類の布は、香料をひき付ける、及び／又は保持する、及び／又は放出する能力に関して異なる性質を有する。繊維の表面又は内部に蓄積される香料の量は、繊維の選択によって、更に繊維の履歴又は処理によって、並びにあらゆる繊維コーティング又は処理によって変化し得る。繊維は織り繊維でも不織繊維でもよく、天然繊維でも合成繊維でもよい。天然繊維としては植物、動物、及び地質学的プロセスによって作られるものが挙げられ、綿、リネン、黄麻、亜麻、カラムシ、サイザルアサ、及び紙や布の製造に用いられる繊維が挙げられるがこれらに限定されない。繊維支援型送達は、サーモメカニカルパルプ、晒又は未晒クラフト、又は亜硫酸パルプなどの木質繊維の使用からなり得る。動物繊維は、主として絹、腱、腸線、及び毛髪（ウールなど）などの特定のタンパク質からなるものである。合成化学物質に基づいたポリマー繊維としては、限定するものではないが、ポリアミドナイロン、ＰＥＴ又はＰＢＴポリエステル、フェノール−ホルムアルデヒド（ＰＦ）、ポリビニルアルコール繊維（ＰＶＯＨ）、ポリ塩化ビニル繊維（ＰＶＣ）、ポリオレフィン（ＰＰ、及びＰＥ）及びアクリルポリマーが含まれる。こうした繊維はすべて香料で予備充填し、次いで自由香料、及び／又は１以上の香料送達技術を含んでも含まなくてもよい製品に添加することができる。一態様では、香料で充填する前に繊維を製品に添加し、次いで繊維中に拡散し得る香料を製品に添加することによって繊維を香料で充填してもよい。理論に束縛されるものではないが、香料は例えば、製品の保存時に繊維表面に吸収されるか繊維内部に吸着され、後に１以上のモーメント・オブ・トゥルース又は消費者接触点において放出されうる。
【０１６８】
アミン支援型送達（ＡＡＤ）：アミン支援型送達技術の手法は、アミン基を含有する材料を使用することによって香料の蓄積量を増大させ、製品使用時の香料放出性を改変するものである。この手法では、製品への添加に先立って香料原材料とアミンとを予め複合又は予め反応させる必要がない。一態様では、本発明で使用するのに適したアミン含有ＡＡＤ材料は、例えばポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのポリアルキルイミン若しくはポリビニルアミン（ＰＶＡｍ）などの非芳香族、又は例えばアントラニレートなどの芳香族であってよい。こうした材料はポリマー性又は非ポリマー性であってよい。一態様では、こうした材料には少なくとも１種類の第１級アミンが含まれる。この技術は、アミンの機能性によって低ＯＤＴの香料の香り（例、アルデヒド、ケトン、エノン）の持続性を高めるとともにその放出制御を可能とし、理論に束縛されるものではないが、更にポリマー性アミンのポリマー支援型送達による他のＰＲＭの送達を可能とするものである。この技術を用いない場合、揮発性のトップノートが失われるのが早過ぎ、トップノートに対するミドル、及びベースノートの比が高くなってしまう。ポリマー性アミンの使用により、より高濃度のトップノート、及び他のＰＲＭを使用することで未希釈の製品の匂いが理想よりも強くなり過ぎないように新鮮さを持続したり、トップノート及び他のＰＲＭをより効率的に利用することが可能となる。一態様では、ＡＡＤ系は中性付近よりも高いｐＨにおいてＰＲＭを効果的に送達する。理論に束縛されるものではないが、ＡＡＤ系のより多くのアミンが脱プロトン化されるような条件下では、不飽和ケトン、及びダマスコーンなどのエノンを含むアルデヒド、並びにケトンなどのＰＲＭに対する、脱プロトン化されたアミンの親和性が高くなる可能性がある。別の一態様では、ポリマー性アミンは中性付近よりも低いｐＨにおいてＰＲＭを効果的に送達する。理論に束縛されるものではないが、ＡＡＤ系のより多くのアミンがプロトン化されるような条件下では、アルデヒド、及びケトンなどのＰＲＭに対する、プロトン化されたアミンの親和性が低くなり、幅広いＰＲＭに対してポリマー骨格の親和性が高くなる可能性がある。こうした態様では、ポリマー支援型送達によってより高い香料効果が送達され得る。すなわち、こうした系はＡＡＤの下位に分類されるものであり、アミン−ポリマー支援型送達すなわちＡＰＡＤと呼ぶことができる。ｐＨが７よりも低い組成物でＡＰＡＤを用いるような場合には、こうしたＡＰＡＤ系はポリマー支援型送達（ＰＡＤ）と考えることもできる。更なる別の態様では、ＡＡＤ、及びＰＡＤ系はアニオン界面活性剤又はポリマーなどの他の物質と相互作用してコアセルベート、及び／又はコアセルベート状の系を形成する。別の態様では、例えば硫黄、リン、セレニウムなどの窒素以外のヘテロ原子を含む物質をアミン化合物の代わりに使用することができる。更なる別の態様では、上記の代替化合物をアミン化合物と組み合わせて使用することができる。更なる別の態様では、１個の分子がアミン部分と、例えばチオール、ホスフィン、及びセレノールなどの１個以上の代替ヘテロ原子部分とを有していてもよい。好適なＡＡＤ系並びにその製造方法は、米国特許出願第２００５／０００３９８０（Ａ１）号、同第２００３／０１９９４２２（Ａ１）号、同第２００３／００３６４８９（Ａ１）号、同第２００４／０２２００７４（Ａ１）号、及び米国特許第６，１０３，６７８号に見出すことができる。
【０１６９】
シクロデキストリン送達系（ＣＤ）：この技術手法は、環状オリゴ糖又はシクロデキストリンを用いて香料の送達を向上させる。通常は香料とシクロデキストリン（ＣＤ）との複合体を形成する。こうした複合体は、予め形成してもよく、その場で形成してもよく、部位の表面上又は内部で形成してもよい。理論に束縛されるものではないが、特に他の補助成分（例、界面活性剤）が、シクロデキストリンの内腔をめぐって香料と競合するような高濃度で存在しない場合には、水の損失によって平衡状態がＣＤ−香料複合体側に移動し得る。後の時点で水との接触や含水量の増大が起こった場合にブルーム効果が得られる可能性がある。更に、シクロデキストリンによって香料の配合者によるＰＲＭの選択の柔軟性が高められる。シクロデキストリンは所望の香料安定性、蓄積、及び放出効果を得るうえで香料で予備充填しても香料とは別に添加してもよい。好適なＣＤ並びにその製造方法は、米国特許出願第２００５／０００３９８０（Ａ１）号、及び同第２００６／０２６３３１３（Ａ１）号、並びに米国特許第５，５５２，３７８号、同第３，８１２，０１１号、同第４，３１７，８８１号、同第４，４１８，１４４号、及び同第４，３７８，９２３号に見出すことができる。
【０１７０】
デンプン封入アコード（ＳＥＡ）：デンプン封入アコード（ＳＥＡ）技術の使用により、例えばデンプンなどの成分を加えて液体香料を固体に転化することによって香料の性質を改変することが可能である。その効果としては、製品保存時の香料の保持率が特に非水性条件下において向上することが挙げられる。水分との接触時には香料のブルームが引き起こされ得る。デンプンによって製品の配合者は、通常であればＳＥＡの非存在下では使用できないＰＲＭ又はＰＲＭの濃度を選択することが可能となることから、他のモーメント・オブ・トゥルースにおける効果が更に得られる可能性がある。別の技術の例としては、香料を液体から固体に転化するうえでシリカなどの他の有機、及び無機材料を使用することが挙げられる。好適なＳＥＡ並びにその製造方法は、米国特許出願第２００５／０００３９８０（Ａ１）号及び米国特許第６，４５８，７５４（Ｂ１）号に見ることができる。
【０１７１】
一態様では、ＳＥＡは、デンプンと、水と、デンプン−水混合物のｐＨを少なくとも０．２５単位だけ低下させるのに十分な量で混合物に組み込まれる酸と、香料とを含む混合物を調製し、この混合物を噴霧化及び乾燥させて、封入香料を形成することによって形成されてよい。香料封入プロセスの第１の工程では、デンプンと、水と、香料と、酸とを含む水性混合物を調製する。これらの成分は、任意の順番で加えてよいが、通常は、デンプン−水混合物を最初に調製し、次に、連続して又は同時に、酸及び香料を追加する。それらを連続して追加した場合、酸は、封入成分に先だって追加してよい。あるいはまた、酸は、封入成分の後に追加してもよい。水性混合物中のデンプン濃度は、下限が５〜１０重量％、上限が６０あるいは７５重量％であることも可能である。一般的には、混合物内のデンプン濃度は、２０〜５０重量％、より一般的には水性混合物中にておよそ２５〜４５重量％である。
【０１７２】
好適なデンプンは、生デンプン、前ゼラチン化デンプン、塊茎とマメ科植物と穀草及び穀類から誘導された加工デンプン、例えばトウモロコシデンプン、小麦デンプン、コメデンプン、ワキシートウモロコシデンプン、オートデンプン、カッサバデンプン、ワキシー大麦、ワキシーコメデンプン、スウィートコメデンプン、アミオカ、ポテトデンプン、タピオカデンプン及びこれらの混合物から調製できる。加工デンプンは、本発明に用いるのに特に好適であり得、これらには、加水分解デンプン、酸処理デンプン、疎水性基を有するデンプン、例えば長鎖炭化水素（Ｃ５以上）のデンプンエステル、酢酸デンプン、デンプンオクテニルサクシネート及びその混合物が含まれる。一態様では、デンプンオクテニルサクシネートなどのデンプンエステルを使用する。
【０１７３】
「加水分解デンプン」という用語は、デンプン、好ましくはトウモロコシデンプンの酸及び／又は酵素による加水分解で典型的に得られるオリゴ糖型物質を意味する。デンプン／水−混合物中に、デンプンエステルを含むことが好ましい。特に好ましいものは、デンプン分子の１，４結合を非還元末端から開裂させて、短鎖糖を生成し、実質的にデンプン基部の高分子量部分を維持しつつ高耐酸化性を提供することのできる少なくとも１つの酵素によって分解された疎水基、又は疎水基及び親水基の両方を含有するデンプン誘導体、を含む修飾デンプンである。水性デンプン混合物はまた、デンプン用可塑剤も含んでもよい。好適な例としては、単糖、二糖、オリゴ糖、及びグルコース、スクロース、ソルビトール、アラビアゴム、グアーガム並びにマルトデキストリンのようなマルトデキストリンが挙げられる。
【０１７４】
本発明のプロセスに使用される酸は、任意の酸でよい。例としては、硫酸、硝酸、塩酸、スルファミン酸及びホスホネートが挙げられる。一態様では、有機カルボン酸を使用する。別の態様では、１個を超えるカルボン酸基を含む有機酸を使用する。好適な有機酸の例としては、クエン酸、酒石酸、マイレン酸、リンゴ酸、コハク酸、セバシン酸、アジピン酸、イタコン酸、酢酸及びアスコルビン酸などが挙げられる。一態様では、クエン酸などの飽和酸が採用される。
【０１７５】
封入に好適な香料は、ＨＩＡ香料、通常の標準圧力である約１０１．３ｋＰａ（７６０ｍｍＨｇ）にて測定された、２７５℃以下の沸点を有するようなもの、オクタノール／水分配係数Ｐが約２０００以上であり、臭気検知閾値が５０億分率（ｐｐｂ）以下であるものを含む。一態様では、香料は、２以上のｌｏｇＰを有してよい。好適な香料は、３−（４−ｔ−ブチルフェニル）−２−メチルプロパナール、３−（４−ｔ−ブチルフェニル）−プロパナール、３−（４−イソプロピルフェニル）−２−メチルプロパナール、３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−２−メチルプロパナール、及び２，６−ジメチル−５−ヘプテナール、α−ダマスコン、δ−ダマスコン、イソ−ダマスコン、β−ダマセノン、６，７−ジヒドロ−１，１，２，３，３−ペンタメチル−４（５Ｈ）−インダノン、メチル−７，３−ジヒドロ−２Ｈ−１，５−ベンゾジオキセピン−３−オン、２−［２−（４−メチル−３−シクロヘキセニル−１−イル）プロピル］シクロペンタン−２−オン、２−ｓｅｃ−ブチルシクロヘキサノン、及びα−ジヒドロイオノン、リナロール、エチルリナロール、テトラヒドロリナロール、並びにジヒドロミルセノールからなる群から選択され得る。
【０１７６】
好適な成分は、Ｇｉｖａｕｄａｎ（Ｍｏｕｎｔ  Ｏｌｉｖｅ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｌａｖｏｒｓ  ＆  Ｆｒａｇｒａｎｃｅｓ（Ｓｏｕｔｈ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）、又はＱｕｅｓｔ（Ｎａａｒｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手可能である。
【０１７７】
デンプン、水、香料及び酸を含む水性混合物を形成後、混合物を高剪断下で混合し、デンプン水溶液で、封入成分のエマルション又は分散体を形成する。
【０１７８】
次に、酸及び香料を含む水性混合物が噴霧化及び乾燥される処理の最終段階では、任意の好適な手法が用いられてよい。好適な手法には、噴霧乾燥、押出し、噴霧冷却／結晶化法、流動床コーティングを含む当技術分野において既知のもの、界面重合を促進する相間移動触媒の利用が挙げられるが、これらに限定されない。チャンバの壁に軽く給油したり、又は湿分を実質的に取り除いた事前に調整した空気を使う非常に乾燥した塔を使うなど当技術分野において既知の方法を使って、スプレー効率を高めてよい。
【０１７９】
無機担体送達系（ＺＩＣ）：この技術は香料を送達するうえで多孔質のゼオライト又は他の無機材料を使用することに関する。香料で充填したゼオライトを、例えば香料充填ゼオライト（ＰＬＺ）をコーティングするために用いられる補助成分とともに、又はこのような補助成分は用いずに使用して、製品保存時、又は使用時、又は乾燥した部位からの香料放出特性を変化させることが可能である。好適なゼオライト、及び無機担体並びにその製造方法は、米国特許出願第２００５／０００３９８０（Ａ１）号、並びに米国特許第５，８５８，９５９号、同第６，２４５，７３２（Ｂ１）号、同第６，０４８，８３０号、及び同第４，５３９，１３５号に見出すことができる。シリカはＺＩＣの別の形態である。好適な無機担体の別の例としては無機チューブがあり、その場合香料又は他の活性物質がナノ又はマイクロチューブの内腔内に収容される。好ましくは、香料を充填した無機チューブ（香料充填チューブ又はＰＬＴ）は、ハロイサイト、又はハロイサイトと他の無機材料（他の粘土を含む）との混合物のような、鉱物性のナノ又はマイクロチューブである。ＰＬＴ技術は、製品内拡散安定性、所望の部位への蓄積を向上させ、充填された香料の放出速度を制御する目的でチューブの内側、及び／又は外側に更なる成分を有してもよい。デンプン封入体などのモノマー性、及び／又はポリマー性材料を用いてＰＬＴをコーティング、プラギング、キャッピング又は封入することが可能である。好適なＰＬＴ系並びにその製造方法は米国特許第５，６５１，９７６号に見出すことができる。
【０１８０】
プロ香料（ＰＰ）：この技術は、１つ以上のＰＲＭと１つ以上の担体との間に共有結合を有する材料を形成するために、香料材料と他の基材又は化学物質とを反応させることで得られる香料技術を指す。ＰＲＭはプロＰＲＭ（すなわちプロ香料）と呼ばれる新たな材料へと変換され、これは水や光などの誘因に曝されると最初のＰＲＭを放出する。プロ香料は、香料付着性、持続性、安定性、保持率を増加させるように、香料送達特性を向上させ得るものである。プロ香料には、モノマー性（非ポリマー性）又はポリマー性のものがある。プロ香料は予め形成してもよく、製品内保存時又は湿潤又は乾燥部位に存在しうるような平衡条件下でその場で形成してもよい。プロ香料の非限定的な例としては、マイケル付加物（例えば、β−アミノケトン）、芳香族又は非芳香族イミン（シッフ塩基）、オキサゾリジン、β−ケトエステル、及びオルトエステルが挙げられる。別の態様には、例えばアルファ、ベータ−不飽和ケトン、アルデヒド又はカルボキシルエステルなどの、ＰＲＭを放出可能な１以上のベータ−オキシ又はベータ−チオカルボニル部分を有する化合物が含まれる。香料を放出させるための一般的な誘因は水との接触であるが、他の誘因として、酵素、熱、光、ｐＨ変化、自動酸化、平衡のシフト、濃度又はイオン強度の変化などがある。水ベースの製品では、光誘因プロ香料が特に適している。こうした光プロ香料（ＰＰＰ）には、限定するものではないが、誘発時にクマリン誘導体、及び香料、及び／又はプロ香料を放出するものが含まれる。放出されたプロ香料は、上記に述べた誘因のいずれかによって１以上のＰＲＭを放出しうる。一態様では、光プロ香料は、光、及び／又は水分誘因に曝された場合に窒素系プロ香料を放出する。別の態様では、光プロ香料から放出された窒素系プロ香料は、例えばアルデヒド、ケトン（エノンを含む）、及びアルコールから選択される１以上のＰＲＭを放出する。更なる別の態様では、ＰＰＰはジヒドロキシクマリン誘導体を放出する。光誘因プロ香料は、クマリン誘導体、及び香料アルコールを放出するエステルであってもよい。一態様では、プロ香料は米国特許出願第２００６／００２０４５９（Ａ１）号に記載のジメトキシベンゾイン誘導体である。別の態様では、プロ香料は、電磁放射に暴露されるとアルコールを放出する３’，５’−ジメトキシベンゾイン（ＤＭＢ）誘導体である。更なる別の態様では、プロ香料は、リナロール、テトラヒドロリナロール、又はジヒドロミルセノールなどの第３級アルコールを含む１以上の低ＯＤＴのＰＲＭを放出する。好適なプロ香料並びにその製造方法は、米国特許第７，０１８，９７８（Ｂ２）号、同第６，９８７，０８４（Ｂ２）号、同第６，９５６，０１３（Ｂ２）号、同第６，８６１，４０２（Ｂ１）号、同第６，５４４，９４５（Ｂ１）号、同第６，０９３，６９１号、同第６，２７７，７９６（Ｂ１）号、同第６，１６５，９５３号、同第６，３１６，３９７（Ｂ１）号、同第６，４３７，１５０（Ｂ１）号、同第６，４７９，６８２（Ｂ１）号、同第６，０９６，９１８号、同第６，２１８，３５５（Ｂ１）号、同第６，１３３，２２８号、同第６，１４７，０３７号、同第７，１０９，１５３Ｂ２号、同��７，０７１，１５１（Ｂ２）号、同第６，９８７，０８４（Ｂ２）号、同第６，６１０，６４６（Ｂ２）号、及び同第５，９５８，８７０号、並びに米国特許出願第２００５／０００３９８０（Ａ１）号、及び同第２００６／０２２３７２６（Ａ１）号に見出すことができる。
【０１８１】
ａ．）アミン反応生成物（ＡＲＰ）：本願の目的では、ＡＲＰは、ＰＰの下位に分類されるものである。アミン官能基が１つ以上のＰＲＭと予備反応してアミン反応生成物（ＡＲＰ）を生成することから、「反応性」ポリマー性アミンという呼び方をすることもできる。一般に、反応性アミンは第１級、及び／又は第２級アミンであり、ポリマー又はモノマー（非ポリマー）の一部であり得る。こうしたＡＲＰは更なるＰＲＭと混合することでポリマー支援型送達、及び／又はアミン支援型送達の効果を与えることも可能である。ポリマー性アミンの非限定的な例としては、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのポリアルキルイミン、又はポリビニルアミン（ＰＶＡｍ）に基づいたポリマーが挙げられる。モノマー性（非ポリマー性）アミンの非限定的な例としては、２−アミノエタノール、及びこのアルキル置換誘導体などのヒドロキシルアミン、並びにアントラニレートなどの芳香族アミンが挙げられる。ＡＲＰは香料と予め混合してもよく、リーブオン又はリンスオフの用途では香料と別に添加してもよい。別の態様では、例えば酸素、硫黄、リン又はセレニウムなどの窒素以外のヘテロ原子を含む物質をアミン化合物の代わりに使用することができる。更なる別の態様では、上記の代替化合物をアミン化合物と組み合わせて使用することができる。更なる別の態様では、１個の分子がアミン部分と、例えばチオール、ホスフィン、及びセレノールなどの１個以上の代替ヘテロ原子部分とを有していてもよい。その効果としては、香料の送達が向上すること、及び香料の放出制御がある。好適なＡＲＰ並びにその製造方法は、米国特許出願第２００５／０００３９８０（Ａ１）号、及び米国特許第６，４１３，９２０（Ｂ１）号に見出すことができる。
【０１８２】
一態様では、アミンと反応してアミン反応生成物を形成するアミン反応生成物の香料成分は、ケトン部分及び／又はアルデヒド部分を含む香料から選択される。一態様では、このような香料は、少なくとも５個の炭素原子を含有する鎖を含む。一態様では、ケトン部分を含む好適な香料は、α−ダマスコン、δ−ダマスコン、イソダマスコン、カルボン、γ−メチル−イオノン、イソ−Ｅ−Ｓｕｐｅｒ、２，４，４，７−テトラメチル−オクト−６−エン−３−オン、ベンジルアセトン、β−ダマスコン、ダマセノン、メチルジヒドロジャスモネート、メチルセドリロン、及びこれらの混合物から選択されてよい。一態様では、アルデヒド部分を含む好適な香料は、１−デカナール、ベンズアルデヒド、フロルヒドラル、２，４−ジメチル−３−シクロヘキセン−１−カルボキシアルデヒド、シス／トランス−３，７−ジメチル−２，６−オクタジエン−１−アール、ヘリオトロピン、２，４，６−トリメチル−３−シクロヘキセン−１−カルボキシアルデヒド、２，６−ノナジエナール、α−ｎ−アミルシンナミックアルデヒド、α−ｎ−ヘキシルシンナミックアルデヒド、Ｐ．Ｔ．ブシナール、リラール、サイマール、メチルノニルアセトアルデヒド、ヘキサナール、トランス−２−ヘキセナール、及びこれらの混合物から選択されてよい。一態様では、好適な香料は、ウンデシレンアルデヒド、ウンデカラクトンγ、ヘリオトロピン、ドデカラクトンγ、ｐ−アニスアルデヒド、パラヒドロキシフェニルブタノン、サイマール、ベンジルアセトン、イオノンα、Ｐ．Ｔ．ブシナール、ダマセノン、イオノンβ及びメチル−ノニルケトン、並びに／又はそれらの混合物から選択されてよい。典型的には、香料の濃度は、アミン反応生成物の１０重量％〜９０重量％、３０重量％〜８５重量％、又は更に４５重量％〜８０重量％であってよい。一態様では、好適なアミン反応生成物は、Ｌｕｐａｓｏｌポリマーのようなポリエチレンイミンポリマーと、以下のα−ダマスコン、δ−ダマスコン、カルボン、ヘジオン、フロルヒドラル、リリアール、ヘリオトロピン、γ−メチル−イオノン及び２，４−ジメチル−３−シクロヘキセン−１−カルボキシアルデヒドの１つ以上との反応によって得られるものであり、アミン反応生成物は、アストラモルデンドリマーとカルボンとの反応によって得られるものであり、アミン反応生成物は、エチル−４−アミノベンゾエートと２，４−ジメチル−３−シクロヘキセン−１−カルボキシアルデヒドとの反応によって得られるものである。一態様では、好適なアミン反応生成物は、Ｌｕｐａｓｏｌ  ＨＦとδ−ダマスコン、ＬｕｐａｓｏｌＧ３５とα−ダマスコン、ＬｕｐａｓｏｌＧ１００と２，４−ジメチル−３−シクロヘキセン−１−カルボキシアルデヒド、エチル−４−アミノベンゾエートと２，４−ジメチル−３−シクロヘキセン−１−カルボキシアルデヒドとの反応によって得られるものである。
【０１８３】
一態様では、化合物を含有する１級及び／又は２級アミンは、アントラニル酸メチルの１％ジプロピレングリコール溶液よりも低い臭気強度指数によって特徴付けられる。
【０１８４】
好適な１級アミン化合物の構造式は、次の通りである：
Ｂ−（ＮＨ２）ｎ
式中、Ｂは担体材料であり、ｎは少なくとも１である添字である。
【０１８５】
２級アミン基を含む好適な化合物は、化合物が任意の−ＮＨ２部分の代わりに１つ以上の−ＮＨ−部分を含んでいる以外は、上と同様の構造を有し得る。したがって、このようなアミン化合物は次式を有し得る：
Ｂ−（ＮＨ２）ｎ；Ｂ−（ＮＨ）ｎ；Ｂ−（ＮＨ）ｎ−（ＮＨ２）ｎ
式中、Ｂは担体材料であり、ｎはそれぞれ独立して少なくとも１である添字である。
【０１８６】
一態様では、Ｂ担体は、基本骨格に炭素をもたない又は実質的にもたない無機、あるいは本質的に炭素結合骨格を有する有機担体であってもよい。
【０１８７】
好適な無機担体としては、アミノ誘導体化したオルガノシラン、シロキサン、シラザン、アルマン、アルミニウムシロキサン、又はアルミニウムシリケート化合物のモノ若しくはポリマー又は有機−有機シリコーンコポリマーが挙げられる。こうした担体の典型的な例は、ジアミノアルキルシロキサン、［Ｈ２ＮＣＨ２（ＣＨ３）２Ｓｉ］Ｏ、又はオルガノアミノシラン、（Ｃ６Ｈ５）３ＳｉＮＨ２のような、少なくとも１つの１級アミン部分のあるオルガノシロキサンである（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｓｉｌｉｃｏｎｅ，Ｗ．Ｎｏｌｌ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．１９９８，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐｐ  ２０９，１０６）。１つ以上のオルガノシリルヒドラシン部分を含むモノ若しくはポリマー又は有機−有機シリコンコポリマーもまた適している。このような担体物質の典型的な例は、Ｎ，Ｎ’−ビス（トリメチルシリル）ヒドラジン（Ｍｅ３Ｓｉ）２ＮＮＨ２である。
【０１８８】
有機担体を含む典型的に好適なアミンとしては、アミノアリール誘導体、ポリアミン、アミノ酸及びその誘導体、置換アミン及びアミド、グルカミン、デンドリマー、及びアミノ置換単糖、アミノ置換二糖、アミノ置換オリゴ糖、アミノ置換多糖が挙げられる。
【０１８９】
アミン化合物は、リンカー又はセルロース置換基で分断又は置換されていてよい。このアミン化合物についての一般式は、以下の通りのものである：
ＮＨ２ｎ−Ｌｍ−Ｂ−Ｌｍ−Ｒｍ＊
（式中、それぞれのｍは、０又は少なくとも１である添字であり、ｎは、前に定義した通りの少なくとも１である添字である）。上記から分かるように、アミン基は、以下で説明する種類によって示されるように、担体分子と連結している。１級及び／又は２級アミン基は、担体基と直接連結しているか、リンカー基Ｌを介して連結している。担体はまた、Ｒ＊置換基で置換されていてもよく、更にＲ＊は、担体と直接、又はリンカー基Ｌを介して連結していてよい。Ｒ＊はまた、例えば３級アミン基やアミド基のような分岐基も含むことができる。
【０１９０】
本発明の目的に関しては、アミン化合物が、少なくとも１つの１級及び／又は２級アミン基を含んで、香料アルデヒド及び／又はケトンと反応して反応生成物を形成する、ということが重要であるこのような反応は、シッフ塩基を形成するので、典型的にはシッフ塩基反応として知られる。アミン化合物は、アミン官能基を１つだけ有しているとは限らない。実際、アミン化合物が２つ以上のアミン官能基を含有していて、それにより、アミン化合物が数個のアルデヒド及び／又はケトンと反応可能になるのがより好ましい。そのために、混合アルデヒド及び／又はケトンを有する反応生成物が得られ、それによりこれらの芳香が混ざり合って放出され得ることとなる。
【０１９１】
漂白剤−本発明の布地ケア製品及びホームケア製品は、１以上の漂白剤を含み得る。漂白触媒以外の適切な漂白剤としては、光漂白剤、漂白活性化剤、過酸化水素、過酸化水素源、予備形成済み過酸、及びこれらの混合物が挙げられる。概して、漂白剤を使用する場合、本発明の布地ケア製品及びホームケア製品は、対象とする布地ケア製品及びホームケア製品の、約０．１重量％〜約５０重量％、又は更には約０．１重量％〜約２５重量％の漂白剤を含み得る。適切な漂白剤の例としては、以下のものが挙げられる：
（１）光漂白剤、例えば、スルホン化亜鉛フタロシアニン、スルホン化アルミニウムフタロシアニン、キサンテン染料、及びこれらの混合物。
【０１９２】
（２）予備形成済み過酸、適切な予備形成済み過酸としては、過カルボン酸及び塩、過炭酸及び塩、ペルイミド酸及び塩、ペルオキシ一硫酸及び塩（例えばオキソン（Oxone）（登録商標）など）、並びに、これらの混合物からなる群から選択される化合物が挙げられるが、これらに限らない。適切な過カルボン酸としては、化学式Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−Ｏ−Ｍを有する疎水性及び親水性過酸が挙げられる（式中、Ｒはアルキル基であり、分枝状であってもよく、過酸が疎水性の場合には、６〜１４個の炭素原子、又は８〜１２個の炭素原子を有し、過酸が親水性の場合には、６個未満の炭素原子、又は更には４個未満の炭素原子を有し、Ｍは、対イオン（例えば、ナトリウム、カリウム又は水素）である）、
（３）アルカリ金属塩、例えば、過ホウ酸塩（通常は、一又は四水和物）、過炭酸塩、過硫酸塩、過リン酸塩、過ケイ酸塩、及びこれらの混合物のナトリウム塩を含む、過酸化水素供給源（例えば、無機過水和物塩）。本発明の一態様では、無機過水和物塩は、過ホウ酸ナトリウム塩、過炭酸ナトリウム塩、及びこれらの混合物のナトリウム塩からなる群から選択される。採用される場合、無機過水和物塩は、典型的には、布地ケア製品及びホームケア製品全体の０．０５〜４０重量％、又は１〜３０重量％の量で存在し、典型的にはコーティングされ得る結晶質の固体として布地ケア製品及びホームケア製品に組み込まれる。好適なコーティングとしては、無機塩（アルカリ金属ケイ酸塩、炭酸塩若しくはホウ酸塩、又はこれらの混合物など）、又は有機物質（水溶性若しくは分散性ポリマー、ワックス、油又は脂肪石鹸など）が挙げられる、並びに
（４）Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｌを有する漂白活性化剤（式中、Ｒはアルキル基であり、分枝状であってもよく、漂白活性化剤が疎水性の場合には、６〜１４個の炭素原子、又は８〜１２個の炭素原子を有し、漂白活性化剤が親水性の場合、６個未満の炭素原子、又は更に４個未満の炭素原子を有し、Ｌは脱離基である）。好適な脱離基の例は、安息香酸及びそれらの誘導体−特にベンゼンスルホネートである。好適な漂白活性化剤としては、ドデカノイルオキシベンゼンスルホネート、デカノイルオキシベンゼンスルホネート、デカノイルオキシ安息香酸又はその塩、３，５，５−トリメチルヘキサノイルオキシベンゼンスルホネート、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）及びノナノイルオキシベンゼンスルホネート（ＮＯＢＳ）が挙げられる。好適な漂白活性化剤はまた、国際公開第９８／１７７６７号に開示されている。任意の好適な漂白活性化剤を使用してよく、本発明の一態様では、対象とする布地ケア製品及びホームケア製品は、ＮＯＢＳ、ＴＡＥＤ、又はこれらの混合物を含んでよい。
【０１９３】
存在する場合、過酸及び／又は漂白活性剤は、概して、布地ケア製品及びホームケア製品に基づき約０．１〜約６０重量％、約０．５〜約４０重量％、又は更には約０．６〜約１０重量％の量で布地ケア製品及びホームケア製品中に存在する。１つ以上の疎水性の過酸又はそれらの前駆体は、１つ以上の親水性過酸又はそれらの前駆体と組み合わせて使用してもよい。
【０１９４】
過酸化水素源及び過酸又は漂白活性化剤の量は、有効酸素（過酸化物源からのもの）と過酸とのモル比が１：１〜３５：１、又は更に２：１〜１０：１になるように選択してもよい。
【０１９５】
界面活性剤−本発明に従う布地ケア製品及びホームケア製品は、界面活性剤又は界面活性剤系を含むことができ、ここで、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤、双極性イオン性界面活性剤、半極性非イオン性界面活性剤、及びこれらの混合物から選択され得る。存在する場合、界面活性剤は、典型的には、対象とする布地ケア製品及びホームケア製品の約０．１重量％〜約６０重量％、約１重量％〜約５０重量％、又は更には約５重量％〜約４０重量％の濃度で存在する。
【０１９６】
ビルダー−本発明の布地ケア製品及びホームケア製品は、１以上の洗剤ビルダー又はビルダー系を含み得る。ビルダーを使用する場合、対象とする布地ケア製品及びホームケア製品は、典型的には対象とする布地ケア製品及びホームケア製品の少なくとも約１重量％、約５重量％〜約６０重量％、又は更には約１０重量％〜約４０重量％のビルダーを含み得る。
【０１９７】
ビルダーとしては、限定するものではないが、ポリホスフェートのアルカリ金属塩、アンモニウム塩及びアルカノールアンモニウム塩、アルカリ金属ケイ酸塩、アルカリ土類及びアルカリ金属の炭酸塩、アルミノケイ酸塩ビルダーポリカルボキシレート化合物、エーテルヒドロキシポリカルボキシレート、無水マレイン酸とエチレン又はビニルメチルエーテルとのコポリマー、１，３，５−トリヒドロキシベンゼン−２，４，６−トリスルホン酸及びカルボキシメチルオキシコハク酸、エチレンジアミン四酢酸及びニトリロ三酢酸のようなポリ酢酸の様々なアルカリ金属塩、アンモニウム塩及び置換アンモニウム塩、並びに、例えばメリト酸、コハク酸、クエン酸、オキシジコハク酸、ポリマレイン酸、ベンゼン１，３，５−トリカルボン酸、カルボキシメチルオキシコハク酸などのポリカルボキシレート、並びにこれらの可溶性塩が挙げられる。
【０１９８】
キレート剤−本明細書の布地ケア製品及びホームケア製品はキレート剤を含有し得る。好適なキレート剤としては、銅、鉄及び／又はマンガンキレート剤、並びにこれらの混合物が挙げられる。キレート剤を使用する場合、対象とする布地ケア製品及びホームケア製品は、布地ケア製品及びホームケア製品の約０．００５重量％〜約１５重量％、又は更には約３．０重量％〜約１０重量％のキレート剤を含み得る。好適なキレート剤としては、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＨＥＤＰ（ヒドロキシエタンジホスホン酸）、ＤＴＰＭＰ（ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸））、１，２−ジヒドロキシベンゼン−３，５−ジスルホン酸二ナトリウム塩水和物、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、エチレンジアミン二コハク酸（ＥＤＤＳ）、Ｎ−ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、Ｎ−ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＥＩＤＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、エチレンジアミンテトラプロピオン酸（ＥＤＴＰ）、及びこれらの誘導体が挙げられる。
【０１９９】
移染防止剤−本発明の布地ケア製品及びホームケア製品は１以上の移染防止剤も含み得る。好適なポリマー移染防止剤としては、限定するものではないが、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンとＮ−ビニルイミダゾールのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドン及びポリビニルイミダゾール又はこれらの混合物が挙げられる。対象とする布地ケア製品及びホームケア製品中に存在する場合、移染防止剤は、布地ケア製品及びホームケア製品の約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．０１重量％〜約５重量％、又は更には約０．１重量％〜約３重量％の濃度で存在し得る。
【０２００】
増白剤−本発明の布地ケア製品及びホームケア製品は、洗浄する物品に色合いを付けることのできる追加成分（蛍光光沢剤など）も含み得る。好適な蛍光増白剤濃度としては、約０．０１重量％、約０．０５重量％、約０．１重量％、更には約０．２重量％の低い濃度から、０．５重量％、又は更には最高で０．７５重量％までが挙げられる。
【０２０１】
分散剤−本発明の布地ケア製品及びホームケア製品は分散剤も含有し得る。好適な水溶性有機物質としては、ホモポリマー又はコポリマーの酸又はそれらの塩が挙げられ、それらのうちのポリカルボン酸は、互いに炭素原子２個を超えない程度に離れている少なくとも２個のカルボキシルラジカルを含む。
【０２０２】
酵素安定剤−洗剤で使用する酵素は種々の技法により安定化させることができる。本明細書に用いられる酵素は、カルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンを酵素に供給する最終布地ケア製品及びホームケア製品中に、それらのイオンの水溶性供給源を存在させることよって安定化させることができる。プロテアーゼを含む水性布地ケア製品及びホームケア製品の場合、可逆性プロテアーゼ阻害剤（ホウ素化合物など）又は化合物（ギ酸カルシウム、ギ酸ナトリウム及び１，２−プロパンジオールなど）を加えて更に安定性を改善することができる。
【０２０３】
触媒金属錯体−本出願人らの組成物は、触媒金属錯体を包含してもよい。金属含有漂白触媒の１つの種類は、銅、鉄、チタン、ルテニウム、タングステン、モリブデン、又はマンガンのカチオンのような、限定された漂白触媒活性の遷移金属カチオン、亜鉛又はアルミニウムのカチオンのような、漂白触媒活性をほとんど又は全くもたない補助金属カチオン、並びに触媒金属及び補助金属のカチオンに対して限定された安定度定数を有する金属イオン封鎖剤、特にエチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）及びそれらの水溶性の塩を含む触媒系である。このような触媒は、米国特許第４，４３０，２４３号に開示されている。
【０２０４】
所望する場合、本明細書の組成物はマンガン化合物により触媒可能である。このような化合物及び使用量は、当該技術分野で周知であり、例えば、米国特許第５，５７６，２８２号に開示されているマンガン系触媒が挙げられる。
【０２０５】
本明細書において有用なコバルト漂白触媒は既知であり、例えば、米国特許第５，５９７，９３６号、米国特許第５，５９５，９６７号に記載される。このようなコバルト触媒は、例えば米国特許第５，５９７，９３６号及び米国特許第５，５９５，９６７号に教示されているような、既知の手順によって容易に調製される。
【０２０６】
本明細書の組成物はまた、配位子の遷移金属錯体（例えば、ビスピドン（bispidone）（国際公開第０５／０４２５３２（Ａ１）号）及び／又は大多環式剛性配位子（「ＭＲＬ」と略される）を適切に含んでもよい。実際問題として、限定するためではないが、本明細書の組成物及び方法は、水性洗浄媒体において、少なくとも１億分の１のオーダーの活性ＭＲＬ種を提供するように調整することができ、典型的には約０．００５ｐｐｍ〜約２５ｐｐｍ、約０．０５ｐｐｍ〜約１０ｐｐｍ、又は更に約０．１ｐｐｍ〜約５ｐｐｍのＭＲＬを洗浄溶液中に提供する。
【０２０７】
遷移金属漂白触媒における好適な遷移金属としては、例えばマンガン、鉄、及びクロムが挙げられる。好適なＭＲＬとしては、５，１２−ジエチル−１，５，８，１２−テトラアザビシクロ［６．６．２］ヘキサデカンが挙げられる。
【０２０８】
好適な遷移金属ＭＲＬは、例えば国際公開第００／３２６０１号、及び米国特許第６，２２５，４６４号にて教示される既知の手順によって容易に調製される。
【０２０９】
溶媒−好適な溶媒としては、水及び他の溶媒（例えば、親油性流体）が挙げられる。好適な親油性流体の例としては、シロキサン、他のシリコーン、炭化水素、グリコールエーテル、グリセリンエーテルなどのグリセリン誘導体、ペルフルオロ化アミン、ペルフルオロ化及びハイドロフルオロエーテル溶媒、低揮発性の非フッ素化有機溶媒、ジオール溶媒、環境に優しいその他の溶媒、並びにこれらの混合物が挙げられる。
【０２１０】
布地ケア製品及びホームケア製品の製造プロセス
本発明の布地ケア製品及びホームケア製品はいずれかの適切な形状で配合可能であり、配合者により選択されるいずれかのプロセスによって調製可能であり、それらの非限定例は、出願者らの実施例、及び米国特許第４，９９０，２８０号、同第２００３００８７７９１（Ａ１）号、同第２００３００８７７９０（Ａ１）号、同第２００５０００３９８３（Ａ１）号、同第２００４００４８７６４（Ａ１）号、同第４，７６２，６３６号、同第６，２９１，４１２号、同第２００５０２２７８９１（Ａ１）号、欧州特許第１０７０１１５（Ａ２）号、米国特許第５，８７９，５８４号、同第５，６９１，２９７号、同第５，５７４，００５号、同第５，５６９，６４５号、同第５，５６５，４２２号、同第５，５１６，４４８号、同第５，４８９，３９２号、同第５，４８６，３０３号に記載される。これらのすべては参照により本案件に組み込まれる。
【０２１１】
使用方法
本発明は、ある場所、とりわけ表面又は布地をクリーニング及び／又は処理する方法を含む。一態様では、所望により洗浄する工程及び／又は表面若しくは布地をすすぐ工程、表面若しくは布地を本明細書に開示される任意の布地ケア製品及びホームケア製品と接触させて、次いで所望により表面若しくは布地を洗浄及び／又はすすぐ工程、を含む、方法が開示される。
【０２１２】
本明細書で使用するとき、用語「洗浄すること」には、限定するものではないが、こすること、及び機械的に撹拌することが含まれる。このような表面又は布地を乾燥させることは、家庭環境又は工業環境のいずれかで採用される、一般的な手段のうちの任意の１つにより実行することができる。このような手段としては、限定するものではないが、太陽光、赤外光、紫外光及びマイクロ波照射が挙げられる電磁放射線の存在下又は非存在下で、５０６．６〜１．０ｋＰａ（５〜０．０１気圧）の圧力下、室温又は高温での、強制空気又は静止空気乾燥が挙げられる。一態様では、上記乾燥は、アイロンを使用することで室温を超える温度で達成することができる。この場合、例えば上記布地は比較的短時間又は更には長時間にわたってアイロンと直接接触させてよく、ここで、圧力は、重力による常圧を超えるものであってよく、あるいは常圧であってよい。他の態様では、上記乾燥は乾燥機を用いることで、室温を超える温度で達成することができる。布地を乾燥させるための装置は周知であり、衣類乾燥機としてしばしば参照される。衣類に加えて、このような電化製品はタオル、シート、枕カバー、おむつなどの多くの他の物品を乾燥させるためにも使用され、このような装置は、世界の多くの国で、実質的に、布地を乾燥させるための物干し用ロープを使用する代わりになる、一般的で便利なものとして受け入れられている。今日使用されているほとんどの乾燥機は、布地が乾燥機内で回転しているときに、熱風に布地上を通過させ及び／又は熱風に布地を透過させる。空気は例えば電気的に、ガスの炎により、又は更にはマイクロ波照射のいずれかにより加熱することができる。このような空気は、約１５℃〜約４００℃、約２５℃〜約２００℃、約３５℃〜約１００℃、又は更には約４０℃〜約８５℃に加熱することができ、表面及び／又は布地を乾燥させるために乾燥機で使用される。当業者に理解されるように、本発明の洗浄組成物は理想的には洗濯用途に用いるのに適している。それゆえに、本発明は布地を洗濯するための方法を含む。この方法は、洗濯されるべき布地を本出願の洗浄組成物の少なくとも１つの実施形態、洗浄添加剤又はこれらの混合物を含む洗浄洗濯溶液と接触させる工程を含む。布地は、標準的な消費者の使用条件又は組織使用条件で洗濯することが可能なほとんどの任意の布地を含み得る。溶液のｐＨは約８〜約１０．５であるのが好ましい。組成物は、溶液中で約５００ｐｐｍ〜約１５，０００ｐｐｍの濃度で用いてよい。水温は、典型的には約５℃〜約９０℃の範囲である。水対布地の比率は典型的には、約１：１〜約３０：１である。
【０２１３】
試験方法
試験方法１
染料又は顔料物質が本発明の意図する布地色調剤であるかどうかを定義するための手順プロトコルを以下に記載する。
１．）２つのターゴトメーターポットに英国Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｕｐｏｎ  Ｔｙｎｅの水道水（総硬度約１２グレイン／米ガロン（Ｎｏｒｔｈｕｍｂｒｉａｎ  Ｗａｔｅｒ，Ｐｉｔｙ  Ｍｅ，Ｄｕｒｈａｍ，Ｃｏ．Ｄｕｒｈａｍ，ＵＫ）から供給）を８００ｍＬ注ぐ。
２）ポットをターゴトメーターに挿入する。試験中は水温を３０℃に制御し、撹拌を４０ｒｐｍに設定する。
３）各ポットにＩＥＣ−Ｂ洗剤（ＩＥＣ  ６０４５６Ｗａｓｈｉｎｇ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｂａｓｅ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  Ｔｙｐｅ  Ｂ）、ｗｆｋ（Ｂｒｕｇｇｅｎ−Ｂｒａｃｈｔ））から供給）を４．８ｇ加える。
４）２分後、第１のポットに活性着色剤を２．０ｍｇ加える。
５）１分後、５ｃｍ×５ｃｍの材料見本に切断した平坦な綿肌着（（Ｗａｒｗｉｃｋ  Ｅｑｕｅｓｔ）（Ｃｏｎｓｅｔｔ，Ｃｏｕｎｔｙ  Ｄｕｒｈａｍ，ＵＫ）から供給）５０ｇを各ポットに加える。
６）１０分後、ポットを排水し、硬度１４．４（イギリスクラーク硬度）を有しカルシウム対マグネシウムのモル比が３：１の冷水（１６℃）を再充填する。
７）２分間すすいだ後、布地を取り出す。
８）同じ処理を用いて工程３〜７を更に３サイクル繰り返す。
９）布地を収集し、屋内で１２時間自然乾燥させる。
１０）Ｄ６５光源及びＵＶＡ遮断フィルタを取り付けたＨｕｎｔｅｒ  Ｍｉｎｉｓｃａｎスペクトロメーターを使用して材料見本を分析し、ハンターａ（赤−緑軸）及びハンターｂ（黄−青軸）値を得る。
１１）各組の布地についてハンターａ及びハンターｂ値の平均値を計算する。着色剤で処理した評価対象布地がａ軸又はｂ軸のいずれかにおいて平均で０．２単位より大きい色相の差を示した場合、本発明の意図する布地色調剤であると判断される。
【０２１４】
試験方法２−試験方法２では、表１−３の洗剤組成物１、２又は４を用いてＢＭＩマイクロスウォッチアッセイ（BMI microswatch assay）を実行する。洗剤を硬度１．５９ｇ／Ｌ（６ｇｐｇ）の水に溶解させ、温度を１６℃に調整する。次いで、記載されるＢＭＩマイクロスウォッチアッセイ毎に酵素変異体の性能を測定する。性能指数は、配列番号２、配列番号４又は配列番号６の酵素変異体の性能を比較することで決定される。これらのすべての場合で酵素投与量は１ｐｐｍである。この方法は実施例３１に更に詳細に記載される。
【０２１５】
試験方法３−試験方法３では、表１−３の洗剤組成物１、２又は４を用いてＢＭＩマイクロスウォッチアッセイを実施する。洗剤を硬度１．５９ｇ／Ｌ（６ｇｐｇ）の水に溶解させ、温度を１６℃に調整する。次いで、記載されるＢＭＩマイクロスウォッチアッセイ毎に酵素変異体の性能を測定する。性能指数は、配列番号２、配列番号４又は配列番号６の酵素変異体の性能を比較することで決定される。これらのすべての場合で酵素投与量は０．４ｐｐｍである。この方法は実施例１に更に詳細に記載される。
【０２１６】
試験方法４−試験方法４では、表１９−４の洗剤組成物１０を用いてＢＭＩマイクロスウォッチアッセイを実施する。洗剤を硬度３．１７ｇ／Ｌ（１２ｇｐｇ）の水に溶解させ、温度を１６℃に調整する。次いで、記載されるＢＭＩマイクロスウォッチアッセイ毎に酵素変異体の性能を測定する。性能指数は、配列番号７５５の酵素の変異体の性能を比較することで決定される。すべての場合で酵素投与量は１．６ｐｐｍである。性能指数１．１以上の酵素が、シリーズ１のＧＧ３６冷水プロテアーゼとして示される。この方法は実施例１９に更に詳細に記載される。
【０２１７】
試験方法５−試験方法５では、表１９−４の洗剤組成物７を用いてＢＭＩマイクロスウォッチアッセイを実施する。洗剤を硬度１．５９ｇ／Ｌ（６ｇｐｇ）の水に溶解させ、温度を１６℃に調整する。次いで、記載されるＢＭＩマイクロスウォッチアッセイ毎に酵素変異体の性能を測定する。性能指数は、配列番号７５５の酵素の変異体の性能を比較することで決定される。すべての場合で酵素投与量は４ｐｐｍである。性能指数１．１以上の酵素が、シリーズ１のＧＧ３６冷水プロテアーゼとして示される。この方法は実施例１９に更に詳細に記載される。
【０２１８】
試験方法６−試験方法６では、表１９−４の洗剤組成物７を用いてＢＭＩマイクロスウォッチアッセイを実施する。洗剤を硬度１．５９ｇ／Ｌ（６ｇｐｇ）の水に溶解させ、温度を１６℃に調整する。次いで、記載されるＢＭＩマイクロスウォッチアッセイ毎に酵素変異体の性能を測定する。性能指数は、変異体の性能を参照酵素（Ａ１５８Ｅ変異が存在する配列番号７５５の酵素）と比較することで決定される。これらのすべての場合で酵素投与量は４ｐｐｍである。性能指数１．０以上の酵素が、シリーズ１のＧＧ３６冷水プロテアーゼとして示される。この方法は実施例１９に更に詳細に記載される。
【０２１９】
試験方法７−水溶液の伝導度をＡＳＴＭ  Ｄ１１２５標準法に従ってアッセイし、単位ミリジーメンス／ｃｍ（本特許ではｍＳ／ｃｍと略記）で記録した。
【０２２０】
実験
以降の実験についての開示では、以下の略記が適用される：ＰＩ（性能指数）、ｐｐｍ（１００万分率）、Ｍ（モル濃度）、ｍＭ（ミリモル濃度）、μＭ（マイクロモル濃度）、ｎＭ（ナノモル濃度）、ｍｏｌ（モル）、ｍｍｏｌ（ミリモル）、μｍｏｌ（マイクロモル）、ｎｍｏｌ（ナノモル）、ｇｍ（グラム）、ｍｇ（ミリグラム）、μｇ（マイクログラム）、ｐｇ（ピコグラム）、Ｌ（リットル）、ｍｌ及びｍＬ（ミリリットル）、μｌ及びμＬ（マイクロリットル）、ｃｍ（センチメートル）、ｍｍ（ミリメートル）、μｍ（マイクロメートル）、ｎｍ（ナノメートル）、Ｕ（ユニット）、Ｖ（ボルト）、ＭＷ（分子量）、ｓｅｃ（秒）、ｍｉｎ（分）、ｈ及びｈｒ（時間）、℃（セルシウス度）、ＱＳ（十分量）、ＮＤ（実施せず）、ｒｐｍ（毎分回転数）、ＧＨ（ドイツ硬度）、Ｈ２Ｏ（水）、ｄＨ２Ｏ（脱イオン水）、ＨＣｌ（塩酸）、ａａ（アミノ酸）、ｂｐ（塩基対）、ｋｂ（キロ塩基対）、ｋＤ（キロダルトン）、ｃＤＮＡ（コピー又は相補的ＤＮＡ）、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、ｓｓＤＮＡ（単鎖ＤＮＡ）、ｄｓＤＮＡ（２本鎖ＤＮＡ）、ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド三リン酸）、ＲＮＡ（リボ核酸）、ＭｇＣｌ２（塩化マグネシウム）、ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）、ｗ／ｖ（体積対重量）、ｖ／ｖ（体積対体積）、ｗ／ｗ（重量対重量）、ｇ（重さ）、ＯＤ（光学密度）、ｐｐｍ（１００万分率）、ダルベッコリン酸緩衝溶液（ＤＰＢＳ）、ＳＯＣ（２％バクトトリプトン、０．５％バクト酵母抽出物、１０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ）、テリフィック培地（ＴＢ、１２ｇ／Ｌバクトトリプトン、２４ｇ／Ｌグリセロール、２．３１ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、及び１２．５４ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４）、ＯＤ２８０（２８０ｎｍでの光学密度）、ＯＤ６００（６００ｎｍでの光学密度）、Ａ４０５（４０５ｎｍでの吸光度）、Ｖｍａｘ（酵素触媒反応の飽和最大速度）、ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水［１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのナトリウムリン酸緩衝液、ｐＨ  ７．２］）、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．２５％  ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０）、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ−［２−エタンスルホン酸］）、ＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水）、トリス−ＨＣｌ（トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン−塩酸塩）、トリシン（Ｎ−［トリス−（ヒドロキシメチル）−メチル］−グリシン）、ＣＨＥＳ（２−（Ｎ−シクロ−ヘキシルアミノ）エタン−スルホン酸）、ＴＡＰＳ（３−｛［トリス−（ヒドロキシメチル）−メチル］−アミノ｝−プロパンスルホン酸）、ＣＡＰＳ（３−（シクロ−ヘキシルアミノ）−プロパン−スルホン酸、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ＤＴＴ（１，４−ジチオ−ＤＬ−トレイトール）、ＳＡ（シナピン酸（ｓ，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシケイ皮酸）、ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）、Ｇｌｕｔ及びＧＳＨ（還元グルタチオン）、ＧＳＳＧ（酸化グルタチオン���、ＴＣＥＰ（トリス［２−カルボキシエチル］ホスフィン）、Ｃｉ（キュリー）、ｍＣｉ（ミリキュリー）、μＣｉ（マイクロキュリー）、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）、ＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相高速液体クロマトグラフィー）、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化法−飛空時間型）、Ｔｓ（トシル）、Ｂｎ（ベンジル）、Ｐｈ（フェニル）、Ｍｓ（メシル）、Ｅｔ（エチル）、Ｍｅ（メチル）、Ｔａｑ（サーマス・アクアチクスＤＮＡポリメラーゼ）、クレノウ（ＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグメント（クレノウ）フラグメント））、ＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン五酢酸）、ｂｌａ（β−ラクタマーゼ又はアンピシリン耐性遺伝子）、ＨＤＬ（ヘビー・デューティー液体）、ＨＤＤ（ヘビー・デューティー粉末洗剤）、ＨＳＧ（高起泡顆粒洗剤）、ＣＥＥ（中央及び東ヨーロッパ）、ＷＥ（西ヨーロッパ）、洗剤を参照する際に使用する場合のＮＡ（北アメリカ）、洗剤を参照する際に使用する場合の日本及びＪＰＮ（日本）、ＭＴＰ（マイクロタイタープレート）、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｒｅｎｏ，ＮＶ）、Ｂａｓｅｃｌｅａｒ（Ｂａｓｅｃｌｅａｒ  ＢＶ，Ｉｎｃ．，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）、Ａｒｇｏ（Ａｒｇｏ  ＢｉｏＡｎａｌｙｔｉｃａ，Ｍｏｒｒｉｓ  Ｐｌａｉｎｓ，ＮＪ）、Ｓｅｉｔｚ  ＥＫＳ（ＳｅｉｔｚＳｃｈｅｎｋ  Ｆｉｌｔｅｒｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｍｂＨ，Ｂａｄ  Ｋｒｅｕｚｎａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｐａｌｌ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ，ＮＹ及びＢａｄ  Ｋｒｅｕｚｎａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ  Ｒａｎｃｈｏ，ＣＡ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）、Ａｃｃｅｌｒｙｓ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃｏ．，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）、ＣＦＴ（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、Ｐ＆Ｇ及びＰｒｏｃｔｅｒ  ＆  Ｇａｍｂｌｅ（Ｐｒｏｃｔｅｒ  ＆  Ｇａｍｂｌｅ，Ｉｎｃ．，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃｈａｌｆｏｎｔ  Ｓｔ．Ｇｉｌｅｓ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）、ＤＮＡ２．０（ＤＮＡ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）、ＯＸＯＩＤ（Ｏｘｏｉｄ，Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ，Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，ＵＫ）、Ｍｅｇａｚｙｍｅ（Ｍｅ��ａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｒｅｌａｎｄ  Ｌｔｄ．，Ｂｒａｙ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｐａｒｋ，Ｂｒａｙ，Ｃｏ．，Ｗｉｃｋｌｏｗ，Ｉｒｅｌａｎｄ）、Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ  Ｏｙ，Ｅｓｐｏｏ，Ｆｉｎｌａｎｄ）、Ｋｅｌｃｏ（ＣＰ  Ｋｅｌｃｏ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）、Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）、ＮＥＮ（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、Ｐｈａｒｍａ  ＡＳ（Ｐｈａｒｍａ  ＡＳ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）、Ｄｙｎａｌ（Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）、Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，ＴＸ）、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、Ｓｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ及び／又はＣｌｏｎｔｅｃｈ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）、ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｈｉｇｈ  Ｐｏｉｎｔ，ＮＣ）、Ｏｌｉｇｏｓ  Ｅｔｃ（Ｏｌｉｇｏｓ  Ｅｔｃ．Ｉｎｃ，Ｗｉｌｓｏｎｖｉｌｌｅ，ＯＲ）、Ｂａｃｈｅｍ（Ｂａｃｈｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．，Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）、Ｄｉｆｃｏ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、Ｏｘｏｉｄ（Ｏｘｏｉｄ  Ｉｎｃ．，Ｏｇｄｅｎｓｂｕｒｇ，ＮＹ）、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ）、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ又はＧｉｂｃｏ  ＢＲＬ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＮＥＢ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、Ｓｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、タカラ（タカラバイオ株式会社、大津、日本）、Ｒｏｃｈｅ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｇｅｎｅ  Ｏｒａｃｌｅ（Ｇｅｎｅ  Ｏｒａｃｌｅ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）、ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）、Ｑｉａｇｅｎ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）、Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  Ｉｎｔｌ．，Ｓａｃｏ，Ｍａｉｎｅ）、Ａｐｔａｇｅｎ（Ａｐｔａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）、Ｓｏｒｖａｌｌ（Ｓｏｒｖａｌｌ  ｂｒａｎｄ，ｆｒｏｍ  Ｋｅｎｄｒｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ａｓｈｅｖｉｌｌｅ，ＮＣ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｃｏｒｐ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、Ｓｉｅｇｆｒｉｅｄ  Ｈａｎｄｅｌ（Ｓｉｅｇｆｒｉｅｄ  Ｈａｎｄｅｌ  ＡＧ，Ｚｏｆｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、Ｍａｒｓｈ（Ｍａｒｓｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｇｅｎｅａｒｔ  ＧｍｂＨ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）、（Ｂｉａｃｏｒｅ（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）、ＳｙｎＰｅｐ（ＳｙｎＰｅｐ，Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡ）、Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ（Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ  ｂｒａｎｄ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｉｎｇｏｅｓ，ＮＪ）、Ｗａｔｅｒｓ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）、Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、Ｄｉｏｎｅｘ（Ｄｉｏｎｅｘ，Ｃｏｒｐ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）、Ｍｏｎｓａｎｔｏ（Ｍｏｎｓａｎｔｏ  Ｃｏ．，
Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｗｉｎｔｅｒｓｈａｌｌ（Ｗｉｎｔｅｒｓｈａｌｌ  ＡＧ，Ｋａｓｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＢＡＳＦ（ＢＡＳＦ  Ｃｏ．，Ｆｌｏｒｈａｍ  Ｐａｒｋ，ＮＪ）、Ｈｕｎｔｓｍａｎ（Ｈｕｎｔｓｍａｎ  Ｐｅｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ，ＵＴ）、Ｓｈｅｌｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｈｅｌｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）、Ｓｔｅｐａｎ（Ｓｔｅｐａｎ，Ｎｏｒｔｈｆｉｅｌｄ，ＩＬ）、Ｃｌａｒｉａｎｔ（Ｃｌａｒｉａｎｔ，Ｓｕｌｚｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｚｅｏｌｉｔｅ（Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｚｅｏｌｉｔｅ  Ｌｔｄ．，Ｇｒａｙｓ，Ｅｓｓｅｘ，ＵＫ）、Ｊｕｎｇｂｕｎｚｌａｕｅｒ（Ｊｕｎｇｂｕｎｚｌａｕｅｒ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｓｏｌｖａｙ（Ｓｏｌｖａｙ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、３Ｖ  Ｓｉｇｍａ（３Ｖ  Ｓｉｇｍａ，Ｂｅｒｇａｍｏ，Ｉｔａｌｙ）、Ｉｎｎｏｓｐｅｃ（Ｉｎｎｏｓｐｅｃ，Ｅｌｌｅｓｍｅｒｅ  Ｐｏｒｔ，ＵＫ）、Ｔｈｅｒｍｐｈｏｓ（Ｔｈｅｒｍｐｈｏｓ，Ｖｌｉｓｓｉｇｇｅｎ−Ｏｓｔ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、Ｃｉｂａ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ（Ｃｉｂａ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｂａｒｒｙ，ＵＫ）、Ｅｎｉｃｈｅｍ（Ｅｎｉｃｈｅｍ  Ｉｂｅｒｉｃａ，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＡＧ（Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＡＧ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ，ＮＶ，Ｄｅｌｆｔ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ）、Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ  Ｉｎｃ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ）、ＲＢ（Ｒｅｃｋｉｔｔ−Ｂｅｎｃｋｉｓｅｒ，Ｓｌｏｕｇｈ，ＵＫ）、及びＭｉｃｒｏｓｏｆｔ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，Ｉｎｃ．，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）。
【０２２１】
北アメリカ（ＮＡ）及び西ヨーロッパ（ＷＥ）のヘビー・デューティー液体洗濯（ＨＤＬ）洗剤に関しては、予め計量した液体洗剤（ガラス瓶内）を、９５℃のウォーターバスに２時間にわたって配置することで、市販の洗剤中に存在する酵素の加熱不活性化を実施する。ＮＡ及びＷＥ自動食器洗浄用（ＡＤＷ：auto dish washing）洗剤を加熱不活性化するためのインキュベート時間は８時間である。不活性化率を正確に判定するために、未加熱及び加熱洗剤のどちらも、洗剤を溶解させて５分以内にアッセイする。酵素活性はＡＡＰＦアッセイにより試験する。
【０２２２】
加熱不活性化した洗剤の酵素活性の試験に関しては、洗剤の希釈標準溶液は加熱不活性化母液から調製した。所望の条件に一致するよう、適切な硬度の水（例えば、１．５９ｇ／Ｌ（６ｇｐｇ）又は３．１７ｇ／Ｌ（１２ｇｐｇ））及び緩衝剤を洗剤溶液に加える。瓶をボルテックスにかけるか反転させるかして溶液を混合する。以下の表は本明細書で使用される市販の洗剤及び試験条件の一部についての情報を提供する。一部の実験では、追加の及び／又は他の市販の洗剤が以下の実施例で使用されることが見出される。
【０２２３】
【表１】
0005882904.tif 000013
【０２２４】
一部の更なる態様では、以下の溶液の使用が見出される：
【表２】
0005882904.tif 000014
【０２２５】
実施例は純粋に本発明の例示を目的とするものであり、したがって、決して本発明を限定することを意図するものではなく、また、本発明の上記の態様及び実施形態を記載し、詳述するものである。前述の実施例及び発明を実施するための形態は、実例として提供されるものであり、制限を目的とするものではない。
【０２２６】
ＢＰＮ’変異体又はパート１実施例
洗剤の表
ＢＰＮ’変異体（又はパート１）実施例のアッセイで使用される洗剤組成物を表１−３に示す。ＢＰＮ’変異体タンパク質サンプルを、パート１実施例１に記載のような洗剤組成物に添加することで、様々な試験特性をアッセイした。
【０２２７】
以下は、頂部充填式自動洗浄装置（１、２  ＆  ４）、及び前側充填式洗浄装置（３）に好適な液体洗濯洗剤組成物である。
【表３】
0005882904.tif 000015
１  ランダムグラフトコポリマーは、ポリエチレンオキシド主鎖と複数のポリビニルアセテート側鎖とを有する、ポリビニルアセテートグラフト化ポリエチレンオキシドコポリマーである。ポリエチレンオキシド主鎖の分子量は約６０００であり、ポリエチレンオキシドとポリビニルアセテートとの重量比は約４０：６０であり、５０個のエチレンオキシド単位当たりのグラフト点は１以下である。
２  −ＮＨにつき２０個のエトキシル基を有するポリエチレンイミン（ＭＷ＝６００）。
３  両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマーは、−ＮＨにつき２４個のエトキシル基、及び−ＮＨにつき１６個のプロポキシル基を有するポリエチレンイミン（ＭＷ＝６００）である。
【０２２８】
本発明のプロテアーゼ変異体ポリペプチドを製造するためのベクター、細胞、及び方法
本発明のプロテアーゼ変異体（本発明の冷水プロテアーゼなど）をコードする改変ポリヌクレオチドを生成するのに好適な様々な方法が当該技術分野において既知であり、限定するものではないが、例えば、部分飽和変異、系統的変異導入法、挿入変異、欠失変異、ランダム変異、部位特異的変異誘導、及び定向進化、並びに様々な他の組み換え手法が挙げられる。改変ポリヌクレオチド及びタンパク質（例えばプロテアーゼ変異体）の製造方法としては、ＤＮＡシャフリング方法論（例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ  ＷＰ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１（２２）：１０７４７〜５１（１９９４）を参照されたい）、遺伝子の非相同組み換えに基づく方法、例えば、ＩＴＣＨＹ（Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．７：２１３９〜４４［１９９９］）、ＳＣＲＡＴＣＨＹ（Ｌｕｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１１２４８〜５３［２００１］）、ＳＨＩＰＲＥＣ（Ｓｉｅｂｅｒら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：４５６〜６０［２００１］）、ＮＲＲ（Ｂｉｔｔｋｅｒら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１０２４〜９［２００１］、Ｂｉｔｔｋｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１：７０１１〜６［２００４］）、オリゴヌクレオチドを使用して、ランダム変異及び対象変異、欠失及び／又は挿入を挿入することによる方法（Ｎｅｓｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１２５１〜５［２００２］、Ｃｏｃｏら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１２４６〜５０［２００２］、Ｚｈａら、Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．４：３４〜９［２００３］、Ｇｌａｓｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３９０３〜１３［１９９２］）が挙げられる。Ａｒｋｉｎ及びＹｏｕｖａｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：２９７〜３００（１９９２）；Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０８：５６４〜８６（１９９１）も参照されたい。
【０２２９】
一態様では、完全長の親ポリヌクレオチドを適切な発現プラスミド中にライゲーションし、以降の変異導入方法を用いることで本発明の改変プロテアーゼの作成が促進されるが、他の方法を使用することもできる。方法は、Ｐｉｓａｒｃｈｉｋらにより記載される方法（Ｐｉｓａｒｃｈｉｋら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌｅｃｔ．２０：２５７〜２６５［２００７］）に基づくものである。一態様では、認識配列の外側を制限酵素が切断すると、任意のヌクレオチド配列を実際に消化することが可能になり、かつ制限部位（restriction site scar）の損壊が防止されるなどの更なる利点が提供される。
【０２３０】
１つのアプローチでは、完全長のプロテアーゼをコードしている、天然に生じる遺伝子を得て、配列決定をし、１つ以上のアミノ酸変異（例えば、欠失、挿入、置換）の形成が所望される一箇所以上の部位を捜査する。配列を変化させて所望の配列と一致させるための遺伝子変異は、概して既知の方法を踏まえるプライマー伸長法により実施される。Ｅａｍ１１０４Ｉ制限部位を含ませて、変異の所望される部位の左側及び右側に向かうフラグメントをＰＣＲにより増幅する。左側及び右側フラグメントをＥａｍ１１０４Ｉで消化し、相補的な３塩基が突出した複数のフラグメントを生成し、次いでこれらのフラグメントをプールし、ライゲーションして、１以上の変異を含有している改変配列のライブラリを作成する。この方法は、フレームシフト変異の発生を避けるものである。すべてのオリゴヌクレオチドが同様の制限部位を有するように合成することができ、かつ同様の他の方法では必要とされる、制限部位を生成するための合成リンカーが必要とされないことから、この方法は変異導入プロセスを単純なものにする。
【０２３１】
パート１実施例
（実施例１）
アッセイ
以下に示されるような様々なアッセイを用いた。以下に提供されるプロトコルからの任意の派生が、続く実施例に示される。
【０２３２】
Ａ．９６ウェルマイクロタイタープレートでタンパク質含量を測定するためのＴＣＡアッセイ。
ＢＰＮ’及びＢＰＮ’変異体に関し、このアッセイは、３３〜３７℃にて、加湿エアレーション下で、２３０〜２５０ｒｐｍで振盪させながら３〜４日増殖させた、マイクロタイタープレートの、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細菌培養上清の濾過物を用いて開始した。新しい９６ウェルの平底マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）をアッセイに使用した。最初に、１００μＬ／ウェルの０．２５Ｎ  ＨＣｌを各ウェルに配置した。次いで、培養ブロス濾過物２５μＬを加えた。次いで、「ブランク」読み取り値を得るために、４０５ｎｍでの光散乱／吸光度（プレートリーダーの５秒混合モードを使用）を測定した。試験のため、１００μＬ／ウェルの３０％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）をプレートに配置し、室温で１０分にわたってインキュベートした。次いで、４０５ｎｍでの光散乱／吸光度（プレートリーダーの５秒混合モードを使用）を測定した。装置はＢｉｏｍｅｋ  ＦＸロボット（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）及びＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ（３４０型、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）ＭＴＰリーダーを使用した。ＭＴＰはＣｏｓｔａｒから得た（９０１７型）。
【０２３３】
計算は、ＴＣＡを用いる試験読み取り値から、ブランク（ＴＣＡ不使用）を減算することで実施され、サンプル中のタンパク質含量が相対的に測定された。必要に応じて、既知の変換係数を用い、クローンのＡＡＰＦアッセイにより、ＴＣＡ読み取り値を較正することで、検量線を生成させることができる。しかしながら、ＴＣＡ結果は１ｍＬあたり２５０〜２５００マイクログラムのタンパク質濃度（ｐｐｍ）に対して直線であることから、良好に機能する変異体を選択するために、酵素性能に対して直接プロットすることができる。サンプルの濁度／光散乱は、培養上清中の沈殿可能な合計タンパク質の量に相関して増加する。
【０２３４】
Ｂ．９６ウェルマイクロタイタープレートでのＡＡＰＦプロテアーゼアッセイ
本発明のプロテアーゼ及び変異体のプロテアーゼ活性を測定するために、Ｎ−スクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−フェニル−ｐ−ニトロアニリド（ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ）の加水分解を計測した。使用した試薬溶液は、以下のものであった：０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０を含有している１００ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ  ８．６）（トリス希釈緩衝液）、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２及び０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０を含有している１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ  ８．６）（トリス／Ｃａ緩衝液）、並びに１６０ｍＭ  ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ／ＤＭＳＯ（ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ保存溶液）（Ｓｉｇｍａ：Ｓ−７３８８）。ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ希釈標準溶液を調製するために、１ｍＬのｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ原液を１００ｍＬのトリス／Ｃａ緩衝液に加え、少なくとも１０秒にわたってウェルをよく混合した。１０μＬの希釈プロテアーゼ溶液を各ウェルに加え、直ちに１ｍｇ／ｍＬのｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ希釈標準溶液１９０μＬを加えてアッセイを実施した。溶液を５秒にわたって混合し、吸光度の変化を、２５℃にて、４０５ｎｍで、ＭＴＰリーダーの動的解析モードにより読み取りした（５分毎に２５回読み取り）。プロテアーゼ活性はＡＵとして表記される（活性＝ΔＯＤ・ｍｉｎ−１ｍＬ−１）。
【０２３５】
Ｃ．試験方法３のＢＭＩマイクロスウォッチアッセイ
血液ミルク（Blood milk）及びインク（ＢＭＩ）染色した、直径５．５ミリメートルの円形マイクロスウォッチをＣＦＴから得た。スウォッチを切りだす前に、布地（ＥＭＰＡ  １１６）を水で洗浄した。９６ウェル非結合マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３６４１）の各ウェルにマイクロスウォッチを１つずつ配置した。アッセイに使用した洗剤には、洗剤組成物１、洗剤組成物２及び洗剤組成物４が含まれた。洗剤をミリＱ（脱イオン）水で濃度０．７８８ｇ／Ｌの使用強度に希釈した。５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ８．２又はｐＨ  ７．２）を洗剤に加えることで、これらの洗剤をそれぞれｐＨ  ８又はｐＨ  ７に緩衝化させた。更に、１リットルあたり１．５９グラム（ガロンあたり６グレイン（ｇｐｇ））の水硬度（３：１のＣａ：Ｍｇ−ＣａＣｌ２：ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）を添加した。洗剤溶液を、１６℃でのアッセイのためにアイスウォーターバスで（３２℃でのアッセイのためには室温で）前平衡化し、循環リザーバ（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＦＸ）に注入した。次いで、マイクロスウォッチを含有しているＭＴＰの各ウェルに所望の洗剤溶液１９０μＬを加えた。この混合物に、酵素を希釈した１０μＬのマスター希釈溶液を加え、酵素濃度およそ０．４〜０．５μｇ／ｍＬにした。マスター希釈物は８μｇ／ｍＬの培養上清から調製した。培養上清及びＢＰＮ’−ｖ３又はＢＰＮ’−ｖ３６親対照の、およその酵素濃度は、既知の濃度の精製ＢＰＮ’−ｖ３又はＢＰＮ’−ｖ３６標準の濃度を元にして、ＡＡＰＦプロテアーゼ活性アッセイを用いて測定した。ＭＴＰをテープで封止し、冷蔵保管される牛乳の場合１６℃に又は卓上で３２℃に予め設定したｉＥＭＳ恒温器／振盪機（Ｔｈｅｒｍｏ／Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）内に、１４００ｒｐｍで撹拌しながら２０分間定置した。適切な条件下でのインキュベーション後、各プレートから封止テープを取り外し、各ウェルから１２５μＬの溶液（より少量の選別のため手によりピペット操作を行う場合には１５０μＬ）を新しいＭＴＰ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ９０１７）に移した。１２５μＬ〜１５０μＬの溶液／ウェルを含有させた新しいＭＴＰを、ＭＴＰ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘリーダー（３４０型、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用い、６００ｎｍで（５秒混合モードのプレートリーダーにより）読み取りした。ブランク対照にはマイクロスウォッチ及び洗剤は含有させたが、酵素は含有させなかった。得られた吸光度値をブランク値（酵素を除く基質）について補正し、加水分解活性を測定した。各サンプル（変異体）に関し、性能指数を以下に記載するように算出した。１６℃（６０°Ｆ）及びｐＨ  ８にて実施するこのＢＭＩマイクロスウォッチアッセイを、本明細書では「試験方法３」として参照する。
【０２３６】
Ｄ．安定性アッセイ
水に希釈した４０％濃洗剤組成物３の存在下で、プロテアーゼ変異体の安定性を測定した。試薬は、ミリＱ水で５０％に希釈した洗剤組成物３、１０ｍＭ  ＭＥＳ  ０．０１％  ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０（ｐＨ  ５．８）マスター希釈緩衝液、ＡＡＰＦ試薬を使用した：プロトコルＡＡＰＦアッセイを参照されたい。装置は、希釈酵素を洗剤に希釈するための平底ＭＴＰ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ９０１７）、並びにｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡプレート、Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４  ＭＴＰリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、ｉＥＭＳ恒温器／振盪機（１ｍｍ振幅）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、封止テープ：Ｎｕｎｃ（２３６３６６）、循環リザーバ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｆｘ）を使用した。
【０２３７】
まず始めに洗剤組成物３を水で５０％に希釈する。この洗剤を室温に維持し、循環リザーバを循環させた。ｉＥＭＳ恒温器／振盪機（Ｔｈｅｒｍｏ／Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を予め４３℃に設定した。マスター希釈緩衝液を含有させたプレートで、培養上清を約２０ｐｐｍ濃度に希釈した（マスター希釈プレート）。次いで、５０％洗剤組成物３を１６０μＬ含有しているプレートに、マスター希釈プレートから４０μＬのサンプルを加え、最終インキュベーション濃度４ｐｐｍを得た。含有物を混合し、室温で維持し、これらのプレートで三つ組ＡＡＰＦアッセイを直ちに実施して、ストレス負荷していない読み取り値として記録した。上記工程のサンプル２０μＬを１９０μＬのｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ希釈標準溶液に加えるようＡＡＰＦアッセイを改変した。プレートを直ちにシーリングテープで覆い、４３℃のｉＥＭＳ震盪機に、６５０ｒｐｍにて３０分の間配置した。３０分間インキュベーションした後、これらのストレス負荷プレートで３つ組みＡＡＰＦアッセイを実施し、ストレス負荷した場合の読み取り値を記録した。次のように残留及び開始ＡＡＰＦ比を算出することにより、サンプルの安定性を測定した：残効性（％）＝［ｍＯＤ．ｍｉｎ−１ストレス負荷］＊１００／［ｍＯＤ．ｍｉｎ−１ストレス未負荷］各サンプル（変異体）に関し、性能指数を以下に記載するように算出した。
【０２３８】
Ｅ．ＬＡＳ／ＥＤＴＡ安定性アッセイ
代表的なアニオン性界面活性剤（ＬＡＳ＝直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、具体的には、ドデシルベンゼン硫酸ナトリウムＤＯＢＳ）及びＥＤＴＡ二ナトリウムの存在下でのプロテアーゼ変異体の安定性を、所定の条件下でのインキュベーション後に測定し、かつＡＡＰＦアッセイを用いて残効性を測定した。試薬は、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩（ＤＯＢＳ，Ｓｉｇｍａ  Ｎｏ．Ｄ−２５２５）、ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０（Ｓｉｇｍａ  Ｎｏ．Ｐ−８０７４）、ＥＤＴＡ二ナトリウム（Ｓｉｅｇｆｒｉｅｄ  Ｈａｎｄｅｌ  Ｎｏ．１６４５９９−０２）、ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｎｏ．Ｈ−７５２３）、未負荷緩衝液：５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（１１．９ｇ／Ｌ）＋０．００５％  ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０（ｐＨ  ８．０）、負荷緩衝液：５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（１１．９ｇ／Ｌ）、０．１％（ｗ／ｖ）ＤＯＢＳ（１ｇ／Ｌ）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（３．３６ｇ／Ｌ）（ｐＨ  ８．０）、参照プロテアーゼ及びプロテアーゼ変異体培養上清（２００〜４００μｇ／ｍＬのタンパク質を含有）を使用した。装置は、希釈プレートとしてのＶ又はＵ底ＭＴＰ（それぞれＧｒｅｉｎｅｒ  ６５１１０１及び６５０１６１）、未負荷及びＬＡＳ／ＥＤＴＡ緩衝液用平底ＭＴＰ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ９０１７）、並びにｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡプレート、Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４  ＭＴＰリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、ｉＥＭＳ恒温器／振盪機（１ｍｍ振幅）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、及びＮｕｎｃ封止テープ（２３６３６６）を使用した。
【０２３９】
ｉＥＭＳ恒温器／振盪機（Ｔｈｅｒｍｏ／Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）は２９℃に設定した。培養上清を、未負荷緩衝液を含有しているプレートで約２５ｐｐｍ濃度に希釈した（マスター希釈プレート）。次いで、マスター希釈プレートから、２０μＬのサンプルを、未負荷緩衝液を１８０μＬ含有しているプレートに加え、最終インキュベーション濃度２．５ｐｐｍを得た。含有物を混合し、室温で維持し、このプレートでＡＡＰＦアッセイを実施した。次いで、マスター希釈プレートから、２０μＬのサンプルを、１８０μＬ負荷緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（１１．９ｇ／Ｌ）、０．１％（ｗ／ｖ）ＤＯＢＳ（１ｇ／Ｌ）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（３．３６ｇ／Ｌ）（ｐＨ  ８．０））を含有しているプレートに加えた。溶液を混合し、直ちに、２９℃のｉＥＭＳ震盪機に４００ｒｐｍで３０分間配置した。３０分インキュベーションした後、ＡＡＰＦアッセイを負荷プレートで実施した。次のように残留及び開始ＡＡＰＦ比を算出することにより、サンプルの安定性を測定した：残効性（％）＝［ｍＯＤ．ｍｉｎ−１ストレス負荷］＊１００／［ｍＯＤ．ｍｉｎ−１ストレス未負荷］各サンプル（変異体）に関し、性能指数を以下に記載するように算出した。
【０２４０】
性能指数
性能指数により、同様のタンパク質濃度下での変異体性能（実測値）と標準又は参照プロテアーゼ酵素性能（理論値）との比較が得られる。理論値は、標準／参照プロテアーゼの性能投与応答曲線（performance dose response curve）のパラメーターを用いて（すなわちラングミュア等式を用いて性能曲線を生成することで）算出することができる。性能指数（ＰＩ）が１超（ＰＩ＞１）の場合は、標準又は参照プロテアーゼ（例えば、野生型プロテアーゼ又はその他のプロテアーゼ変異体であり得る）と比較して、変異体がより良好なものであることが特定され、一方でＰＩが１（ＰＩ＝１）である場合は、変異体が標準又は参照プロテアーゼと同様に機能することが特定され、及びＰＩが１未満（ＰＩ＜１）の場合は、変異体の機能性が標準又は参照プロテアーゼよりも悪いことが特定される。したがって、ＰＩは、優れた変異体（例えば、標準／参照プロテアーゼと比較してタンパク質分解活性がより強い変異体）、並びに特定の状況下での使用が望ましくない変異体（例えば、標準／参照プロテアーゼよりもタンパク質分解活性が低い変異体）を特定する。
【０２４１】
参照又は標準プロテアーゼよりも性能指数の値が小さい本発明のプロテアーゼ変異体は、値の小ささにも関わらず本明細書に記載の用途及び方法で有用であることには気を付けなければならない。例えば、タンパク質分解活性を有する参照又は標準プロテアーゼよりも性能指数が低い本発明のプロテアーゼ変異体は、限定するものではないが、本発明の組成物に使用するのに有用であり、例えば、様々な表面及び品物（例えば、洗濯、布地、及び食卓用食器類、及びパーソナルケア用品及び組成物が含まれる）などをクリーニングするためのクリーニング組成物（限定するものではないが、例えば、洗剤クリーニング組成物が挙げられる）に使用するのに有用であり、このようなプロテアーゼ変異体は、同様に本明細書に記載される布地ケア製品及びホームケア製品及び組成物、並びに布地ケア及びホームケア用ではない製品及び組成物、並びに本発明の方法（限定するものではないが、例えば、本明細書に記載されるクリーニング方法、パーソナルケアの方法など）に有用である。
【０２４２】
以下に示される様々な用語は変異体を記載するために使用される：有害でない変異体はＰＩ＞０．０５であり、有害な変異体はＰＩが０．０５以下であり、組み合わせ可能な変異体は少なくとも１つの特性について性能指数が０．２以上であり、かつすべての特性について＞０．０５である。組み合わせ可能な変異体は、１以上の所望の特性について適切な性能インデックスを有する送達タンパク質と組み合わせることができる。これらのデータは、任意のサブチリシン／サブチラーゼ又はプロテアーゼを設計するために使用される。サブチラーゼ又はプロテアーゼが、１つ以上の特定の位置でサブチリシンＢＰＮ’と異なるアミノ酸を有するように設計された場合でさえも、これらのデータは、ＢＰＮ’野生型アミノ酸の置換を含む最良の置換の選択を特定することにより、所望の特性を変更するアミノ酸置換を特定するのに使用される。
【０２４３】
（実施例２）
ＢＰＮ’ライブラリの構築及びＢＰＮ’変異体のクリーニング性能
ａ）ライブラリ構築に使用されるＢＰＮ’−ｖ３発現カセットの説明
コンビナトリアルライブラリの構築に使用されるＢＰＮ’−ｖ３（Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ置換を含有しているＢＰＮ’プロテアーゼ）発現カセットは、ａｐｒＥ−ＢＰＮ’ハイブリッドリーダー配列（すなわち、シグナル配列）、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来のＢＰＮ’プロ及びＢＰＮ’成熟配列を含む、ＢＰＮ’発現カセットを用いて作成された。ＤＮＡ配列を以下に配列番号１として示し、ＢＰＮ’前駆タンパク質をコードしている配列を以下に配列番号１６８として示す。
［配列表１］
0005882904.tif 000016
【０２４４】
配列番号１のヌクレオチド配列において、成熟プロテアーゼをコードしているＤＮＡ配列を太字で示し、リーダー配列（ａｐｒＥ−ＢＰＮ’ハイブリッドリーダー配列）をコードしているヌクレオチド配列は標準テキスト（下線なし）で示し、及びプロ配列（ＢＰＮ’）をコードしているヌクレオチド配列には下線を付する。配列番号１６８にＢＰＮ’前駆タンパク質のアミノ酸配列（ａｐｒＥ−ＢＰＮ’ハイブリッドリーダー配列、ＢＰＮ’プロ配列、及びＢＰＮ’成熟タンパク質配列）を示す。太字の箇所は成熟サブチリシンＢＰＮ’プロテアーゼを示す。
［配列表２］
0005882904.tif 000017
【０２４５】
成熟サブチリシンＢＰＮ’プロテアーゼのアミノ酸配列を配列番号２として示す。
【０２４６】
成熟ＢＰＮ’−ｖ３遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号３のものである（ＢＰＮ’−ｖ３発現カセットで使用されるシグナル配列及びプロペプチド配列は、配列番号１に示されるＢＰＮ’と同様である）。成熟ＢＰＮ’−ｖ３プロテアーゼ変異体のタンパク質配列は、配列番号４のものである（ＢＰＮ’−ｖ３発現カセットで使用されるシグナル配列及びプロペプチド配列は、配列番号１６８に示されるＢＰＮ’と同様である）。
【０２４７】
ｂ）ｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’−ｖ３プラスミドを用いるコンビナトリアルライブラリの構築
上記のＢＰＮ’−ｖ３発現カセットを含有しているｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’−ｖ３プラスミド（図１を参照されたい）を、クローニング用のテンプレートＤＮＡとして使用して、ＢＰＮ’−ｖ３から誘導された変異体を得た。ベクターｐＨＰＬＴ（米国特許第６，５６６，１１２号、図４）は、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＬＡＴプロモーター（「Ｐｌａｔ」）と、ＬＡＴシグナルペプチドをコードしている配列（「プレＬＡＴ」）を含有する。プラスミドｐＵＢ１１０に由来する更なるプラスミド成分はＭｃＫｅｎｚｉｅら、Ｐｌａｓｍｉｄ  １５（２）：９３〜１０３（１９８６）に開示される：「ｏｒｉ−ｐＵＢ」はｐＵＢ１１０の複製起点であり「ｎｅｏ」はｐＵＢ１１０のネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子であり、「終結領域」はＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのアミラーゼの転写終結領域である。
【０２４８】
コンビナトリアルＤＮＡライブラリはＤＮＡ  ２．０で合成され、個々のライゲーション反応により供給された。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの効率的な形質転換については、場合によっては、Ｉｌｌｕｓｔｒａ  Ｔｅｍｐｌｉｐｈｉキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いるローリング・サークル型増幅（ＲＣＡ）により、ライゲーション反応混合物からＤＮＡを増幅させた。反応は製造元のプロトコルに従って実施した。１マイクロリットルの、１０倍希釈した増幅ＤＮＡを使用して、コンピテントなＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞（ΔａｐｒＥ，ΔｎｐｒＥ，ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ−ｐｈｌｅｏ）５０μＬを形質転換させた。形質転換混合物を３７℃にて１時間にわたって振盪した。形質転換混合物の１０マイクロリットルアリコートを、１０μｇ／ｍＬのネオマイシン（Ｔｅｋｎｏｖａ）を添加したスキムミルク（１．６％）Ｌｕｒｉａ寒天プレートに蒔いた。
【０２４９】
スキムミルクプレート上にハローを形成した形質転換体をつつき、１０μｇ／ｍＬのネオマイシンを添加した１５０μＬのルリアブロス（ＬＢ）培地を含有しているマイクロタイタープレートに植菌した。マイクロタイタープレートにＥｎｚｙｓｃｒｅｅｎ  ｌｉｄ（Ｅｎｚｙｓｃｒｅｅｎ）を用い、プレートを３７℃、７０〜８０％湿度にて、２５０〜３００ｒｐｍで振盪させながら一晩増殖させた。一晩培養したプレートを使用し、９６ピンの複製ツール（Ｅｎｚｙｓｃｒｅｅｎ）を用いて、２．５μｇ／ｍＬのネオマイシンを添加した１８０μＬのＭＢＤ培地（ＭＯＰＳ系合成培地）を含有している新しいマイクロタイタープレートに接種した。ＮＨ４Ｃｌ、ＦｅＳＯ４、及びＣａＣｌ２を基本培地から除外したこと、３ｍＭのＫ２ＨＰＯ４を用いたこと、並びに、６０ｍＭの尿素、及び、２１０ｇ／Ｌのグルコースと３５０ｇ／Ｌマルトデキストリンとから作製した１００ｍＬの溶液を含有させたこと、を除き、ＭＢＤ培地は本質的に当該技術分野において既知であるように調製した（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１９：７３６〜７４７［１９７４］を参照されたい）。１ｇ／ＬのＢＤバクト酵母抽出物を添加し、ＫＯＨでｐＨを７．４に調整した。微量栄養素は、４００ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５０ｍｇのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＮａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ、１０ｍＬの１Ｍ  ＣａＣｌ２、及び１０ｍＬの０．５Ｍのクエン酸ナトリウムを１リットル中に含有している、１００Ｘ原液からなっていた。プロテアーゼ変異体を発現させるために、Ｅｎｚｙｓｃｒｅｅｎ  ｌｉｄｓ（Ｅｎｚｙｓｃｒｅｅｎ）を用いて、ＭＢＤ培地を含有しているマイクロタイタープレートで、３７℃、７０〜８０％湿度にて、２５０〜３００ｒｐｍで、６４時間にわたって増殖させた。翌日、培養物をマイクロフィルタプレート（０．２２ｕｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過し、プロテアーゼ変異体を含有している得られた濾液を生化学的解析に使用した。
【０２５０】
１６℃及びｐＨ  ８での洗剤組成物１のＢＭＩマイクロスウォッチアッセイ、並びに１６℃及びｐＨ  ８での洗剤組成物２のＢＭＩマイクロスウォッチアッセイを用いて、プロテアーゼ変異体をクリーニング性能について試験した。タンパク質含量はＴＣＡアッセイを用いて測定した。実施例１に記載のようにアッセイを実施し、試験方法３のようにＢＰＮ’−ｖ３（ＰＩ値１を有する）と比較して性能インデックスを算出した。
【０２５１】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物１のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、サブチリシンＢＰＮ’プロテアーゼ変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０超、少なくとも１．１、１．０超〜約５のＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）はアミノ酸置換Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑの組を含み、ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、このＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいてＢＰＮ’−ｖ３に対し１．１であるＰＩ値を有し、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつこのアッセイでのＢＰＮ’のＰＩ値よりも大きいＰＩ値を有する。本発明には、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しているプロテアーゼ変異体を含み、変異体はアミノ酸置換Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑを含むアミノ酸配列を有し、ここで、変異のアミノ酸位置は配列番号２の配列と対応させて番号付けされる。本アッセイにおいて、配列番号２と比較してタンパク質分解活性が向上しているプロテアーゼ変異体も包含され、変異体は、配列番号２の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＧ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑアミノ酸置換を含み、ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされる。同様に、ＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’と比較してタンパク質分解活性が向上している、並びに／あるいはＢＰＮ’（配列番号２）及び／又はＢＰＮ’−ｖ３のＰＩ値を超えるＰＩ値を有する、サブチリシンプロテアーゼ変異体が提供され、変異体は配列番号２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％の同一性を有するアミノ酸配列、並びにＸ０９７Ａ−Ｘ１２８Ａ−Ｘ２１０Ｓ−Ｘ２１７Ｑ置換を含み、ここで、変異の位置は配列番号２の配列と対応させて番号付けされ、及び、変異体はＧ０９７Ａ、Ｇ１２８Ａ、Ｐ２１０Ｓ、及びＹ２１７Ｑの群から選択された少なくとも１つの置換を含んでいてもよい。このようなプロテアーゼ変異体は、単離物、組み換え体、実質的な純品、又は非天然に生じたプロテアーゼ変異体であり得る。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、プロテアーゼ変異体を含むクリーニング組成物）、並びに本明細書の以降に詳細に記載されるようなこのような変異体を用いるクリーニング方法、が含まれる。
【０２５２】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物１のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して約１．０に相当するＰＩ値（すなわち、ＢＰＮ’−ｖ３にほぼ相当するＰＩ値）を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）は、Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｅ１５６Ｓ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ２１８Ａ、Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ２１８Ｓ、及びＧ０９７Ａ−Ｙ１０４Ｆ−Ｇ１２８Ａ−Ｅ１５６Ｓ−Ｐ２１０Ｉ−Ｙ２１７Ｑからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本ＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、あるいはＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０のＰＩ値を有する、プロテアーゼの変異体を含み、変異体は、配列番号２の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。同様に、ＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’と比較してタンパク質分解活性が向上している、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０のＰＩ値を有する、サブチリシンプロテアーゼ変異体が提供され、変異体は配列番号２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、変異体はＸ０９７Ａ、Ｘ１０４Ｆ、Ｘ１２８Ａ、Ｘ１５６Ａ／Ｓ、Ｘ２１０Ｉ／Ｓ、Ｘ２１７Ｑ、Ｘ２１８Ａ／Ｓの群から選択された少なくとも１つの置換を含み、Ｇ０９７Ａ、Ｙ１０４Ｆ、Ｇ１２８Ａ、Ｅ１５６Ａ／Ｓ、Ｐ２１０Ｉ／Ｓ、Ｙ２１７Ｑ、及びＮ２１８Ａ／Ｓの群から選択された少なくとも１つの置換を含んでいてもよいものである。ここで変異の位置は配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０２５３】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物１のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して約０．９のＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）は、Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｅ１５６Ａ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ２１８Ｓ及びＧ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ２１８Ａからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで変異の位置は配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、タンパク質分解活性を有し、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して０．９のＰＩ値を有する、及び／又はＢＰＮ’と比較してタンパク質分解活性が向上している、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は、配列番号２の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくとも１つのこのような変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０２５４】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物２のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０超〜約５のＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）は、Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｅ１５６Ａ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ２１８Ａ及びＧ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含み、ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。本発明は、本ＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０超〜約５のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい。同様に、ＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’と比較してタンパク質分解活性が向上している、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３と比較して１超のＰＩ値を有する、サブチリシンプロテアーゼ変異体が提供され、変異体は配列番号２と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、変異体はＸ０９７Ａ、Ｘ１０４Ｆ、Ｘ１２８Ａ、Ｘ１５６Ａ／Ｓ、Ｘ２１０Ｉ／Ｓ、Ｘ２１７Ｑ、Ｘ２１８Ａ／Ｓの群から選択された少なくとも１つの置換を含み、少なくとも１つの置換がＧ０９７Ａ、Ｙ１０４Ｆ、Ｇ１２８Ａ、Ｅ１５６Ａ／Ｓ、Ｐ２１０Ｉ／Ｓ、Ｙ２１７Ｑ、及びＮ２１８Ａ／Ｓの群から選択されてもよいものである。変異の位置は配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくとも１つのこのような変異体を含むクリーニング組成物）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０２５５】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物２のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して約１．０に相当するＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）は、Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（すなわちＢＰＮ’−ｖ３）、Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｅ１５６Ｓ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ及びＧ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ２１８Ｓからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含み、ここで、変異の位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、タンパク質分解活性を有し、かつＢＰＮ’よりもタンパク質分解活性が向上している。本発明は、本アッセイにおいて、タンパク質分解活性を有する、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０のＰＩ値を有する、及び／又はＢＰＮ’と比較してタンパク質分解活性が向上している、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は、配列番号２の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異の位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくとも１つのこのような変異体を含むクリーニング組成物）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０２５６】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物２のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して約０．９のＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）は、Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｅ１５６Ａ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ２１８Ｓ、Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ２１８Ａ及びＧ０９７Ａ−Ｙ１０４Ｆ−Ｇ１２８Ａ−Ｅ１５６Ｓ−Ｐ２１０Ｉ−Ｙ２１７Ｑからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで変異の位置は配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、本アッセイにおいて、タンパク質分解活性を有する、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して０．９のＰＩ値を有する、及び／又はＢＰＮ’と比較してタンパク質分解活性が向上している、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は、配列番号２の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくとも１つのこのような変異体を含むクリーニング組成物）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０２５７】
（実施例３）
コンビナトリアルライブラリの作成及び変異体ＢＰＮ’−ｖ３＋Ｓ７８Ｎのクリーニング性能
ａ）ＢＰＮ’−ｖ３＋Ｓ７８Ｎ変異体及びこの変異体から誘導される合成遺伝子配列の説明
Ｇｅｎｅ  Ｏｒａｃｌｅは、８つの遺伝子をｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’−ｖ３＋Ｓ７８Ｎ（ＢＰＮ’−Ｓ７８Ｎ−Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ）親プラスミド（図２を参照されたい）に合成及びクローン化した。これらの遺伝子のうちいくつかをテンプレート（親）として使用し、コンビナトリアルライブラリを作成した。当該技術分野において既知の標準的な分子生物学的手法を用いてＢＰＮ’−ｖ３＋Ｓ７８Ｎ変異体を生成した。ＢＰＮ’−ｖ３＋Ｓ７８Ｎ変異体をコードしているヌクレオチド配列は配列番号７のものであり、ＢＰＮ’−ｖ３＋Ｓ７８Ｎ変異体のアミノ酸配列は配列番号８のものである。遺伝子ＧｃＭ９０−９６及びＧｃＭ１００のヌクレオチド配列及びタンパク質配列を以下に示す。
【０２５８】
【表４】
0005882904.tif 000018
【０２５９】
ｂ）合成遺伝子ＧｃＭ９０−９４及びＧｃＭ１００を用いるコンビナトリアルライブラリＣＧ１〜ＣＧ５及びＣＧ８の構築
【０２６０】
【表５】
0005882904.tif 000019
【０２６１】
各合成遺伝子をｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’−Ｓ７８Ｎ−Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ親分子に組み込んだ。６つの合成遺伝子ＧｃＭ９０−９４を含有しているプラスミドを得て、ＧｃＭ１００をテンプレートとして用いて各位置でコンビナトリアルライブラリを作成した（表３−１）。２つの更なる遺伝子、ＧｃＭ９５及びＧｃＭ９６も解析のため同様に合成したが、ライブラリのための親ＤＮＡとしては使用しなかった。これらの遺伝子は、ｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’−Ｓ７８Ｎ−Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ親分子のトップに９つの変異を有する。
【０２６２】
合成遺伝子ＧｃＭ９０−９４及びＧｃＭ１００を含有している親プラスミド（テンプレートＤＮＡ）は、２マイクログラムのＤＮＡ及びメチラーゼ（ＮＥＢ）を用い、ＮＥＢプロトコルに従ってメチル化した。次いでＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いてメチル化ＤＮＡを精製した。ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）多部位特異的変異誘導キット（「ＱＣＭＳキット」、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、製造元のプロトコルに従って（各プライマーをプロトコルに示されている５０ｎｇの代わりに８６．５ｎｇ使用したライブラリＣＧ３及びＣＧ４は除く）、コンビナトリアルライブラリＣＧ１〜５及びＣＧ８を作成した（それぞれのテンプレート及びプライマーの組み合わせについては表３−１を参照されたい）。各ライブラリに、所望の置換を導入するために使用されたすべてのプライマーは、表３−１に列挙する。Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによりこれらが合成され、提供された。各ライブラリのＱＣＭＳ反応の完了後、０．５〜１μＬのＤｐｎＩ（ＱＣＭＳキット）を加え３７℃で１〜４時間インキュベートし、続いて更に０．５〜１μＬのＤｐｎＩを加え、更に３７℃で１〜４時間インキュベートすることでテンプレートＤＮＡを消化した。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓを効率的に形質転換させるため、ＱＣＭＳ反応混合物のＤＮＡを形質転換前に増幅させ、かつ形質転換体を実施例２に記載のように増殖させた。
【０２６３】
更なる変異体ＢＰＮ’−ｖ３＋Ｓ７８ＮをＤＮＡ２．０により生成した。それぞれ以下の置換をＢＰＮ’−ｖ３＋Ｓ７８Ｎ親分子に導入した：Ｑ５９Ｇ、Ｎ６２Ｑ、Ｖ６８Ａ、Ｓ８９Ｙ、Ａ９２Ｇ、Ｉ１０８Ｖ、Ｉ１１５Ｖ、Ｍ１２４Ｔ、Ｐ１２９Ｌ、Ａ１３８Ｔ、Ｖ１４７Ｌ、Ｓ１６１Ｐ、Ｙ１６７Ａ、Ｐ１７２Ｖ、Ｇ２１１Ｔ、Ｌ２６７Ｖ、及びＡ２７３Ｓ。
【０２６４】
上記のすべてのコンビナトリアルライブラリ変異体及びＤＮＡ２．０で合成した変異体を、１６℃及びｐＨ  ８での洗剤組成物１の試験方法３のＢＭＩマイクロスウォッチアッセイ、並びに１６℃及びｐＨ  ８での洗剤組成物２のＢＭＩマイクロスウォッチアッセイを用いて、クリーニング性能について試験した。タンパク質含量はＴＣＡアッセイを用いて測定した。実施例１に記載のようにアッセイを実施し、配列番号４の酵素（ＰＩ値１．０を有する）と比較して性能インデックスを算出した。
【０２６５】
以降、ＢＰＮ’変異体は、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物１のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、配列番号４の酵素と比較して１．０超、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．０超〜約１０、１．０超〜約８、又は１．０超〜約５のＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）は、Ｓ０６３Ｔ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｓ１８３Ｔ−Ｙ２１７Ｑ−Ｔ２４４Ｎ、Ｎ０６１Ａ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２２４Ａ、Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｐ１２９Ｔ−Ｑ１８５Ｔ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０６３Ｔ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｓ１８３Ｔ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０６３Ｔ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０６３Ｔ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｔ２４４Ｉ、及びＳ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｐ１２９Ｔ−Ｙ２１７Ｑからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’及びＢＰＮ’−ｖ３よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本ＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３と比較して１超〜約５のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくとも１つのこのような変異体を含むクリーニング組成物）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０２６６】
同様に、このＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’と比較してタンパク質分解活性が向上している、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０超〜約５のＰＩ値を有する、サブチリシンプロテアーゼ変異体が提供され、変異体は配列番号２と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、変異体はＸ０４０Ｅ、Ｘ０５３Ｇ、Ｘ０５９Ｖ、Ｘ０６１Ａ、Ｘ０６２Ｈ／Ｑ、Ｘ０６８Ａ、Ｘ０７８Ｎ、Ｘ０８７Ｅ、Ｘ１０１Ａ、Ｘ１０２Ａ、Ｘ１０８Ｖ、Ｘ１２４Ｉ、Ｘ１２５Ａ、Ｘ１２６Ｖ、Ｘ１２９Ｔ、Ｘ１４７Ｑ、Ｘ１５９Ｄ、Ｘ１８３Ｔ、Ｘ１８５Ｔ、Ｘ２１１Ａ、Ｘ２２４Ａ、Ｘ２４４Ｉ／Ｎ、Ｘ２５２Ｑ、及びＸ２７４Ｄの群から選択された少なくとも１つの置換を含み、Ｘ０４０Ｅ、Ｘ０５３Ｇ、Ｘ０５９Ｖ、Ｘ０６１Ａ、Ｘ０６２Ｈ／Ｑ、Ｘ０６８Ａ、Ｘ０７８Ｎ、Ｘ０８７Ｅ、Ｘ１０１Ａ、Ｘ１０２Ａ、Ｘ１０８Ｖ、Ｍ１２４Ｉ、Ｓ１２５Ａ、Ｌ１２６Ｖ、Ｐ１２９Ｔ、Ｖ１４７Ｑ、Ｓ１５９Ｄ、Ｓ１８３Ｔ、Ｑ１８５Ｔ、Ｇ２１１Ａ、Ｓ２２４Ａ、Ｔ２４４Ｉ／Ｎ、Ｎ２５２Ｑ、及びＡ２７４Ｄの群の群から選択された少なくとも１つの置換を含んでいてもよいものである。ここで変異の位置は配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくとも１つのこのような変異体を含むクリーニング組成物）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０２６７】
以降、ＢＰＮ’変異体は、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物１のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、配列番号４（あるいはＢＰＮ’−ｖ３と言及される）の酵素と比較して約１．０に相当するＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）は、Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ａ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ０８７Ｅ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２２４Ａ、Ｑ０５９Ｖ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｇ２１１Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｑ０５９Ｖ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｖ１４７Ｑ−Ｙ２１７Ｑ、Ｑ０５９Ｖ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｑ０５９Ｖ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１０８Ｖ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ２５２Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｐ１２９Ｔ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｇ２１１Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｑ１８５Ｔ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｖ１４７Ｑ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２２４Ａ、及びＳ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２２４Ａ−Ａ２７４Ｄからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本ＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０のＰＩ値を有するプロテアーゼの変異体を含み、変異体は、配列番号２の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくとも１つのこのような変異体を含むクリーニング組成物）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０２６８】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物１のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して約０．９のＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）はアミノ酸置換Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１０８Ｖ−Ｇ１２８Ａ−Ｖ１４７Ｑ−Ｙ２１７Ｑの組を含むものである。ここで、変異の位置は配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、本アッセイにおいて、タンパク質分解活性を有する、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して０．９のＰＩ値を有する、及び／又はＢＰＮ’と比較してタンパク質分解活性が向上している、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は、配列番号２と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％  又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに上記アミノ酸置換の組を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくとも１つのこのような変異体を含むクリーニング組成物）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０２６９】
以降、ＢＰＮ’変異体は、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物１のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して０．５以上０．９未満のＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）は、Ｑ０５９Ｖ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１０８Ｖ−Ｇ１２８Ａ−Ｖ１４７Ｑ−Ｇ２１１Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ２５２Ｑ、Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１０８Ｖ−Ｇ１２８Ａ−Ｖ１４７Ｑ−Ｇ２１１Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１０８Ｖ−Ｇ１２８Ａ−Ｖ１４７Ｑ−Ｇ２１１Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ２５２Ｑ、Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１０８Ｖ−Ｇ１２８Ａ−Ｖ１４７Ｑ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ２５２Ｑ、及びＳ０７８Ｎ−Ｓ０８７Ｅ−Ｇ０９７Ａ−Ｍ１２４Ｉ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２２４Ａからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、タンパク質分解活性を有するプロテアーゼ変異体を含み、変異体は、配列番号２の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異の位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくとも１つのこのような変異体を含むクリーニング組成物）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０２７０】
以降、ＢＰＮ’変異体は、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物２のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３の酵素と比較して１．０超、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．０超〜約１０、１．０超〜約８、又は１．０超〜約５のＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）は、Ｓ０６３Ｔ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｓ１８３Ｔ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０６３Ｔ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｓ１８３Ｔ−Ｙ２１７Ｑ−Ｔ２４４Ｎ、Ｓ０６３Ｔ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、及びＳ０６３Ｔ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｔ２４４Ｉからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本ＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０超〜約５のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくとも１つのこのような変異体を含むクリーニング組成物）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０２７１】
以降、ＢＰＮ’変異体は、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物２のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して約１．０に相当するＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）は、Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ａ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２２４Ａ、Ｎ０６１Ａ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ０８７Ｅ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２２４Ａ、Ｑ０５９Ｖ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｇ２１１Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｑ０５９Ｖ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｖ１４７Ｑ−Ｙ２１７Ｑ、Ｑ０５９Ｖ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｑ０５９Ｖ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１０８Ｖ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ２５２Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｐ１２９Ｔ−Ｑ１８５Ｔ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｐ１２９Ｔ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｇ２１１Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｐ１２９Ｔ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｑ１８５Ｔ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２２４Ａ、及びＳ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２２４Ａ−Ａ２７４Ｄからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本ＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３と比較して約１のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくとも１つのこのような変異体を含むクリーニング組成物）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０２７２】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物２のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して約０．９に相当するＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）は、Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｖ１４７Ｑ−Ｙ２１７Ｑ及びＳ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１０８Ｖ−Ｇ１２８Ａ−Ｖ１４７Ｑ−Ｙ２１７Ｑからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで変異の位置は配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、本アッセイにおいて、タンパク質分解活性を有する、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して０．９のＰＩ値を有する、及び／又はＢＰＮ’と比較してタンパク質分解活性が向上している、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は、配列番号２と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、少なくとも１つのこのような変異体を含むクリーニング組成物を包含する組成物及び方法が包含され、方法は、本明細書の以降に詳細に記載されるような変異体を少なくとも１種用いるクリーニングを必要とする品物又は表面をクリーニングするための方法である。
【０２７３】
以降、ＢＰＮ’変異体は、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物２のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して０．５以上０．９未満のＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）は、Ｑ０５９Ｖ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１０８Ｖ−Ｇ１２８Ａ−Ｖ１４７Ｑ−Ｇ２１１Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ２５２Ｑ、Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１０８Ｖ−Ｇ１２８Ａ−Ｖ１４７Ｑ−Ｇ２１１Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１０８Ｖ−Ｇ１２８Ａ−Ｖ１４７Ｑ−Ｇ２１１Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ２５２Ｑ、Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１０８Ｖ−Ｇ１２８Ａ−Ｖ１４７Ｑ−Ｙ２１７Ｑ−Ｎ２５２Ｑ、及びＳ０７８Ｎ−Ｓ０８７Ｅ−Ｇ０９７Ａ−Ｍ１２４Ｉ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２２４Ａからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、タンパク質分解活性を有するプロテアーゼ変異体を含み、変異体は、配列番号２の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異の位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、少なくとも１つのこのような変異体を含むクリーニング組成物を包含する組成物及び方法が包含され、方法は、本明細書の以降に詳細に記載されるような変異体を少なくとも１種用いるクリーニングを必要とする品物又は表面をクリーニングするための方法である。
【０２７４】
（実施例４）
ＢＰＮ’変異体の生成及びクリーニング性能
ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）多部位特異的変異誘導によるＢＰＮ’変異体ＬＣ１−ＬＣ４の生成
ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）多部位特異的変異誘導キットを用い、異なる親プラスミドからＢＰＮ’変異体を構築した。ＮＥＢ  Ｄａｍメチラーゼキットを用いて、親プラスミド（表４−１）を、７７．５μＬのＨ２０＋１０μＬの１０Ｘ緩衝液＋０．２５μＬのＳＡＭ＋２ｕＬのＤＡＭメチラーゼ＋１０ｕＬのミニプレップＤＮＡ（約１５０ｎｇ／μＬ）を含有させた反応液中で、３７℃で一晩メチル化した。メチル化したプラスミドＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＰＣＲ精製キットを用い精製した。２．５μＬの５Ｘ緩衝液＋０．５μＬのプライマー１（２５μＭ）＋０．５μＬのプライマー２（２５μＭ）＋１μＬのｄＮＴＰ’ｓ＋１μＬの酵素ブレンド＋１８μＬのＨ２Ｏ＋１．５μＬのＤＮＡを含有させた反応混合液で、各ＤＮＡテンプレートに対してＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）による多部位特異的変異誘導反応を行った。使用したＰＣＲプログラムは以下の通りであった：９５℃で１分、（９５℃で１分、５３℃で１分、６５℃で９：３９分）×２９サイクル、６５℃で１０分、４℃で保持。プライマー配列は表４−２に示される。すべての反応で、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＰＴＣ−２００  Ｐｅｌｔｉｅｒ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒを用いてＰＣＲを実施した。１μＬのＤｐｎＩをＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）多部位特異的変異誘導反応物に加え、３７℃で一晩置くことでＰＣＲサンプルから親ＤＮＡを除去した。形質転換頻度を増加させるために、製造元のプロトコルに従ってＩｌｌｕｓｔｒａ  ＴｅｍｐｌｉＰｈｉキットを用い、ローリング・サークル型増幅（ＲＣＡ）させることで、ＤｐｎＩ消化した反応物を増幅させた。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞（ΔａｐｒＥ，ΔｎｐｒＥ，ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ−ｐｈｌｅｏ）を、各１μＬのＲＣＡ反応物で形質転換し、形質転換させた細胞を、１０ｐｐｍのネオマイシンを含有しているＬＡ＋１．６％スキムミルクプレートに蒔き、３７℃で一晩インキュベートした。一晩増殖物からコロニーを選択し、「ｐｕＲｅＴａｑ  Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  ＰＣＲ  Ｂｅａｄｓ」（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて配列決定するためにコロニーＰＣＲを実施した。ＰＣＲ及び配列決定に使用したプライマーは、ｐＨＰＬＴ  Ｆ１（／５Ｐｈｏｓ／ＴＡＣＡＴＡＴＧＡＧＴＴＡＴＧＣＡＧＴＴＴＧ（配列番号５４））及びｐＨＰＬＴ  ｓｅｑ  Ｒ１（／５ＰＨＯＳ／ＴＴＡＴＣＣＴＴＴＡＣＣＴＴＧＴＣＴＣ（配列番号５５））であった。適切な配列を有するコロニーを凍結した。実施例２に記載のように、尿素を含有しているＭＯＰＳ系培地中で、３７℃で６８時間にわたり、９６ウェルマイクロタイタープレートでＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ形質転換体を増殖させることで、ＢＰＮ’変異体タンパク質を産生させた。
【０２７５】
【表６】
0005882904.tif 000020
【０２７６】
【表７】
0005882904.tif 000021
【０２７７】
更なるＢＰＮ’変異体ＬＣ５〜ＬＣ３７の生成
ＢＰＮ’核酸を親遺伝子として含有させた発現プラスミドｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’ｐａｒｔｉａｌ  ｏｐｔ（図３を参照されたい）を用いて、連続的にＬＣ５〜ＬＣ３７と名付けられた更に３３種のＢＰＮ’変異体をＤＮＡ  ２．０により生成した。ＢＰＮ’変異体ＬＣ５〜ＬＣ３７はそれぞれ次のようなものである：ＢＰＮ’−Ｐ５２Ｌ−Ｖ６８Ａ−Ｇ９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ、ＢＰＮ’−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ１６７Ａ−Ｙ２１７Ｑ、ＢＰＮ’−Ｙ１０４Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、ＢＰＮ’−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ１６７Ａ−Ｙ２１７Ｑ、ＢＰＮ’−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、ＢＰＮ’−Ｐ５２Ｌ−Ｖ６８Ａ−Ｇ９７Ａ、ＢＰＮ’−Ｇ９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ、ＢＰＮ’−Ｖ６８Ａ−Ａ９２Ｇ−Ｇ９７Ａ、ＢＰＮ’−Ｇ９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ１６７Ａ−Ｙ２１７Ｑ、ＢＰＮ’−Ｐ５２Ｌ−Ｖ６８Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、ＢＰＮ’−Ｐ５２Ｌ−Ｖ６８Ａ−Ｉ１１１Ｖ、ＢＰＮ’−Ｖ６８Ａ−Ａ９２Ｇ−Ｉ１１１Ｖ、ＢＰＮ’−Ｐ５２Ｌ−Ｖ６８Ａ−Ｇ９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、ＢＰＮ’−Ｖ６８Ａ−Ｇ９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ、ＢＰＮ’−Ｇ９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、ＢＰＮ’−Ｇ９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ１６７Ａ、ＢＰＮ’−Ｓ８９Ｙ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ、ＢＰＮ’−Ｖ６８Ａ−Ｓ８９Ｙ−Ｉ１１１Ｖ、ＢＰＮ’−Ｖ６８Ａ−Ａ９２Ｇ−Ｙ２１７Ｑ、ＢＰＮ’−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ１６７Ａ−Ｙ２１７Ｑ、ＢＰＮ’−Ｇ９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ１６７Ａ−Ｙ２１７Ｑ、ＢＰＮ’−Ｇ９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、ＢＰＮ’−Ｖ６８Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ１６７Ａ−Ｙ２１７Ｑ、ＢＰＮ’−Ｉ１１１Ｖ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、ＢＰＮ’−Ｇ９７Ａ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、ＢＰＮ’−Ｖ６８Ａ−Ｙ１６７Ａ−Ｙ２１７Ｑ、ＢＰＮ’−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ１６７Ａ、ＢＰＮ’−Ｎ６２Ｑ−Ｇ９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ、ＢＰＮ’−Ｇ９７Ａ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ１６７Ａ−Ｙ２１７Ｑ、ＢＰＮ’−Ｇ９７Ａ−Ｌ１２６Ａ−Ｙ２１７Ｑ、ＢＰＮ’−Ｖ６８Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、ＢＰＮ’−Ｓ８９Ｙ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、及びＢＰＮ’−Ｌ９６Ｔ−Ｇ９７Ａ−Ｙ２１７Ｑ。同様に、プラスミドｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’ｐａｒｔｉａｌ  ｏｐｔもＤＮＡ２．０により作成した。
【０２７８】
実施例２に記載のように、形質転換体をつつき、マイクロタイタープレートに植菌し、増殖させた。１６℃及びｐＨ  ８での洗剤組成物２のＢＭＩマイクロスウォッチアッセイを用いて、変異体をクリーニング性能についてアッセイした。タンパク質含量はＴＣＡアッセイを用いて測定した。実施例１に記載のようにアッセイを実施し、ＢＰＮ’−ｖ３（ＰＩ値１．０を有する）と比較して性能インデックスを算出した。
【０２７９】
以降、ＢＰＮ’変異体は、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物２のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０超、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．０超〜約１０、１．０超〜約８、又は１．０超〜約５のＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）は、Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ１６７Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｖ２０３Ｙ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ｓ−Ｖ２０３Ｙ−Ｙ２１７Ｑ、及びＶ０６８Ａ−Ａ０９２Ｇ−Ｙ２１７Ｑからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本ＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０超〜約５のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。同様に、ＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’と比較してタンパク質分解活性が向上している、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０超のＰＩ値を有する、サブチリシンプロテアーゼ変異体が提供され、変異体は配列番号２と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、変異体はＸ０２４Ｇ、Ｘ０２５Ｇ、Ｘ０５２Ｌ、Ｘ０５３Ｇ、Ｘ０５５Ｐ、Ｘ０６１Ｐ、Ｘ０６２Ｑ、Ｘ０６８Ａ、Ｘ０８９Ｙ、Ｘ０９２Ｇ、Ｘ０９６Ｔ、Ｘ０９７Ａ、Ｘ１０１Ｎ、Ｘ１０４Ｎ、Ｘ１１１Ｖ、Ｘ１２４Ｖ、Ｘ１２６Ａ、Ｘ１２８Ａ／Ｓ、Ｘ１６７Ａ、Ｘ２０３Ｙ、及びＸ２１７Ｑの群から選択された少なくとも１つの置換を含み、Ｓ０２４Ｇ、Ｎ０２５Ｇ、Ｐ０５２Ｌ、Ｓ０５３Ｇ、Ｔ０５５Ｐ、Ｎ０６１Ｐ、Ｎ０６２Ｑ、Ｖ０６８Ａ、Ｓ０８９Ｙ、Ａ０９２Ｇ、Ｌ０９６Ｔ、Ｇ０９７Ａ、Ｓ１０１Ｎ、Ｙ１０４Ｎ、Ｉ１１１Ｖ、Ｍ１２４Ｖ、Ｌ１２６Ａ、Ｇ１２８Ａ／Ｓ、Ｙ１６７Ａ、Ｖ２０３Ｙ、Ｙ２１７Ｑの群から選択された少なくとも１つの置換���含んでいてもよいものである。ここで、変異の位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０２８０】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物２のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して約１．０に相当するＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）は、Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｉ１１１Ｖ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ１６７Ａ、Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｌ０９６Ｔ−Ｇ０９７Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ｓ−Ｖ２０３Ｙ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０８９Ｙ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、及びＶ０６８Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ２１７Ｑからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。本発明は、本ＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０のＰＩ値を有するプロテアーゼの変異体を含み、変異体は、配列番号２の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、ＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きく、かつＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０のＰＩ値を有する。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０２８１】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物２のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して約０．９のＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）は、Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ、Ｇ０９７Ａ−Ｌ１２６Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｉ１１１Ｖ−Ｙ１６７Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｍ１２４Ｖ−Ｙ１６７Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｐ０５２Ｌ−Ｖ０６８Ａ−Ｇ０９７Ａ、Ｓ０８９Ｙ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ、Ｖ０６８Ａ−Ａ０９２Ｇ−Ｇ０９７Ａ、Ｖ０６８Ａ−Ａ０９２Ｇ−Ｉ１１１Ｖ、Ｖ０６８Ａ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ、Ｖ０６８Ａ−Ｓ０８９Ｙ−Ｉ１１１Ｖ、及びＹ１０４Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異の位置は配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、本アッセイにおいて、タンパク質分解活性を有する、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して０．９のＰＩ値を有する、及び／又はＢＰＮ’と比較してタンパク質分解活性が向上している、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は、配列番号２と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０２８２】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物２のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して０．５以上０．９未満のＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）は、Ｇ０９７Ａ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ１６７Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｖ０６８Ａ−Ｙ１６７Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ１６７Ａ、Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ１６７Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｖ０６８Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ１６７Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ１６７Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｐ０５２Ｌ−Ｖ０６８Ａ−Ｉ１１１Ｖからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異の位置は配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、タンパク質分解活性を有するプロテアーゼ変異体を含み、変異体は、配列番号２の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異の位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０２８３】
（実施例５）
ＢＰＮ’変異体のクリーニング性能
親ＢＰＮ’に基づく変異体をＤＮＡ  ２．０を用いて作成した。実施例２に記載のように変異体を増殖させ、１６℃及びｐＨ  ８での洗剤組成物１のＢＭＩマイクロスウォッチアッセイ、１６℃及びｐＨ  ８での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチアッセイ、並びに１６℃及びｐＨ  ８での洗剤組成物４の卵マイクロスウォッチアッセイで、クリーニング性能について試験した。タンパク質含量はＴＣＡアッセイを用いて測定した。実施例１に記載のようにアッセイを実施し、ＢＰＮ’−ｖ３（ＰＩ値１．０を有する）と比較して性能インデックスを算出した。
【０２８４】
以降、ＢＰＮ’変異体は、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０超、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．０超〜約１０、１．０超〜約８、又は１．０超〜約５のＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）は、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｉ１１１Ｖ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本ＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０超〜約５のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０２８５】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して約１．０に相当するＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）は、Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ｓ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｎ１２３Ｑ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｎ１２３Ｑ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｎ１２３Ｑ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｎ１２３Ｑ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ１０２Ａ−Ｐ１２９Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１００Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１００Ｎ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１００Ｑ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ１０２Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｐ１２９Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６２Ｑ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｎ１２３Ｑ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１００Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１０２Ａ−Ｐ１２９Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｍ１２４Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ１０２Ａ−Ｐ１２９Ｓ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ１０２Ａ−Ｐ１２９Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１００Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３−Ｎ０６���Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１０２Ａ−Ｐ１２９Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ２１７Ｑからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本ＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０２８６】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物１のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して約０．９のＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）は、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｍ１２４Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１００Ｄ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１００Ｑ−Ｓ１０１Ｎ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１００Ｑ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ１００Ｎ−Ｇ１０２Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１００Ｎ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｍ１２４Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｍ１２４Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｎ１２３Ｑ−Ｙ２１７Ｑからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異の位置は配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、本アッセイにおいて、タンパク質分解活性を有する、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して０．９のＰＩ値を有する、及び／又はＢＰＮ’と比較してタンパク質分解活性が向上している、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は、配列番号２と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０２８７】
同様に、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物１又は４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’と比較してタンパク質分解活性が向上している、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０超のＰＩ値を有する、サブチリシンプロテアーゼ変異体が提供され、変異体は配列番号２と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、変異体はＸ０２４Ｇ、Ｘ０２５Ｇ、Ｘ０５３Ｇ、Ｘ０６１Ｐ、Ｘ０６２Ｑ、Ｘ０７８Ｎ、Ｘ０９７Ａ、Ｘ１００Ｄ／Ｎ／Ｑ、Ｘ１０１Ｎ、Ｘ１０２Ａ、Ｘ１１１Ｖ、Ｘ１２３Ａ／Ｑ／Ｖ、Ｘ１２４Ｉ／Ｖ、Ｘ１２８Ａ／Ｓ、Ｘ１２９Ｓ、Ｘ２１０Ｓ、Ｘ２１７Ｑの群から選択された少なくとも１つの置換を含み、Ｓ０２４Ｇ、Ｎ０２５Ｇ、Ｓ０５３Ｇ、Ｎ０６１Ｐ、Ｎ０６２Ｑ、Ｓ０７８Ｎ、Ｇ０９７Ａ、Ｇ１００Ｄ／Ｎ／Ｑ、Ｓ１０１Ｎ、Ｇ１０２Ａ、Ｉ１１１Ｖ、Ｎ１２３Ａ／Ｑ／Ｖ、Ｍ１２４Ｉ／Ｖ、Ｇ１２８Ａ／Ｓ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ２１０Ｓ、及びＹ２１７Ｑの群から選択された少なくとも１つの置換を含んでいてもよいものである。ここで、変異のアミノ酸位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０２８８】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して０．５以上０．９未満のＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）は、Ｇ０９７Ａ−Ｎ１２３Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｎ１２３Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ１０２Ａ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１０２Ａ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｎ１２３Ｑ−Ｙ２１７Ｑ、及びＧ１０２Ａ−Ｎ１２３Ｑ−Ｙ２１７Ｑからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異の位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、タンパク質分解活性を有するプロテアーゼ変異体を含み、変異体は、配列番号２の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異の位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０２８９】
以降、ＢＰＮ’変異体は、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物１のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０超、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．０超〜約１０、１．０超〜約８、又は１．０超〜約５のＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）は、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、及びＳ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｉ１１１Ｖ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本ＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０超〜約５のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０２９０】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物１のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して約１．０に相当するＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）は、Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ｓ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｎ１２３Ｑ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｎ１２３Ｑ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｎ１２３Ｑ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ１０２Ａ−Ｐ１２９Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１００Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１００Ｑ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１００Ｎ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ１０２Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｐ１２９Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６２Ｑ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｎ１２３Ｑ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１００Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１０２Ａ−Ｐ１２９Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ１０２Ａ−Ｐ１２９Ｓ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ１０２Ａ−Ｐ１２９Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１０２Ａ−Ｐ１２９Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、及びＳ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ２１７Ｑからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配���番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本ＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０に相当するＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０２９１】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物１のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して約０．９のＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）は、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｍ１２４Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｎ１２３Ｑ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１００Ｎ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１００Ｑ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１００Ｑ−Ｓ１０１Ｎ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ１００Ｎ−Ｇ１０２Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｍ１２４Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｍ１２４Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｍ１２４Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｎ１２３Ｑ−Ｙ２１７Ｑ、及びＳ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１００Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｙ２１７Ｑからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異の位置は配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、本アッセイにおいて、タンパク質分解活性を有する、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して０．９のＰＩ値を有する、及び／又はＢＰＮ’と比較してタンパク質分解活性が向上している、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は、配列番号２と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０２９２】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物１のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して０．５以上０．９未満に相当するＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）は、Ｇ０９７Ａ−Ｎ１２３Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｎ１２３Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１００Ｄ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１０２Ａ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ１０２Ａ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｎ１２３Ｑ−Ｙ２１７Ｑ、及びＧ１０２Ａ−Ｎ１２３Ｑ−Ｙ２１７Ｑからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異の位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、タンパク質分解活性を有するプロテアーゼ変異体を含み、変異体は、配列番号２の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異の位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０２９３】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４の卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０超〜約５のＰＩを有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）はアミノ酸置換Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑの組を含み、ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本ＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３と比較して１超〜約５のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつアミノ酸置換Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑを含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０２９４】
以降、ＢＰＮ’変異体は、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４の卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して約１．０に相当するＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）は、Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ１０２Ａ−Ｐ１２９Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ｓ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｉ１１１Ｖ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０２９５】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４の卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して０．５以上０．９以下のＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）は、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｍ１２４Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｎ１２３Ｑ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ１０２Ａ−Ｐ１２９Ｓ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｎ１２３Ｑ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１０２Ａ−Ｐ１２９Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｎ１２３Ｑ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１００Ｎ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｎ１２３Ｑ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｎ１２３Ｑ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１００Ｑ−Ｐ２１０Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｎ１２３Ｑ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｍ１２４Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｍ１２４Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｍ１２４Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１００Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１０２Ａ−Ｐ１２９Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ１０２Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｐ１２９Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ１０２Ａ−Ｐ１２９Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６２Ｑ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｍ１２４Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０���２Ｑ−Ｇ１００Ｎ−Ｇ１０２Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１００Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１００Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１００Ｎ−Ｉ１１１Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１００Ｑ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１０２Ａ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｎ１２３Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｎ１２３Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ１０２Ａ−Ｎ１２３Ｑ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１００Ｑ−Ｓ１０１Ｎ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｉ１１１Ｖ−Ｎ１２３Ｑ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ０６２Ｑ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１００Ｄ−Ｙ２１７Ｑ、及びＮ０６１Ｐ−Ｇ１０２Ａ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異の位置は配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、タンパク質分解活性を有し、及び／又は本卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して０．５以上０．９以下のＰＩ値を有するプロテアーゼの変異体を含み、変異体は配列番号２と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０２９６】
同様に、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４の卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’と比較してタンパク質分解活性が向上している、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０超〜約５のＰＩ値を有する、サブチリシンプロテアーゼ変異体が提供され、変異体は配列番号２と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、変異体はＸ０２４Ｇ、Ｘ０２５Ｇ、Ｘ０５３Ｇ、Ｘ０６１Ｐ、Ｘ０６２Ｑ、Ｘ０７８Ｎ、Ｘ０９７Ａ、Ｘ１００Ｄ／Ｎ／Ｑ、Ｘ１０１Ｎ、Ｘ１０２Ａ、Ｘ１１１Ｖ、Ｘ１２３Ａ／Ｑ／Ｖ、Ｘ１２４Ｉ／Ｖ、Ｘ１２８Ａ／Ｓ、Ｘ１２９Ｓ、Ｘ２１０Ｓ、及びＸ２１７Ｑの群から選択された少なくとも１つの置換を含み、Ｓ０２４Ｇ、Ｎ０２５Ｇ、Ｓ０５３Ｇ、Ｎ０６１Ｐ、Ｎ０６２Ｑ、Ｓ０７８Ｎ、Ｇ０９７Ａ、Ｇ１００Ｄ／Ｎ／Ｑ、Ｓ１０１Ｎ、Ｇ１０２Ａ、Ｉ１１１Ｖ、Ｎ１２３Ａ／Ｑ／Ｖ、Ｍ１２４Ｉ／Ｖ、Ｇ１２８Ａ／Ｓ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ２１０Ｓ、及びＹ２１７Ｑの群から選択された少なくとも１つの置換を含んでいてもよいものである。ここで、変異のアミノ酸位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０２９７】
（実施例６）
ＢＰＮ’変異体の構築及びクリーニング性能
親ＢＰＮ’に基づくＢＰＮ’コンビナトリアルライブラリをＤＮＡ２．０により作成し、ライゲーション反応により供給した。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓを効率的に形質転換させるため、ライゲーション反応混合物中のＤＮＡを形質転換前に増幅させ、かつ形質転換体を実施例２に記載のように増殖させた。これらの変異体を、１６℃及びｐＨ  ８での洗剤組成物１及び洗剤組成物４の、試験方法３のＢＭＩマイクロスウォッチアッセイ、並びに１６℃及びｐＨ  ８での洗剤組成物４の卵マイクロスウォッチアッセイを用いて、クリーニング性能について試験した。ＴＣＡアッセイを用いてタンパク質含量を測定し、かつＡＡＰＦアッセイを用いてプロテアーゼ活性をアッセイした。実施例１に記載のようにアッセイを実施し、ＢＰＮ’−ｖ３（ＰＩ値１．０を有する）と比較して性能インデックスを算出した。
【０２９８】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物１のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０超、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．０超〜約１０、１．０超〜約８、又は１．０超〜約５のＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）は、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０３８Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ���Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４９Ｎ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、及びＴ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本ＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０超〜約５のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。
【０２９９】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物１のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して約１．０のＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）は、Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｉ０３５Ｖ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｓ１３０Ｇ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０３８Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ、Ｓ０２４Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ａ１１６Ｓ−Ｇ１２８Ａ、及びＴ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’と比較してタンパク質分解活性が向上し���おり、かつＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本ＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３００】
同様に、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物１の本ＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’と比較してタンパク質分解活性が向上している、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０超のＰＩ値を有する、サブチリシンプロテアーゼ変異体が提供され、変異体は配列番号２と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、変異体はＸ０２４Ｇ、Ｘ０２５Ｇ、Ｘ０３５Ｖ、Ｘ０３８Ｇ、Ｘ０５３Ｇ、Ｘ０５５Ｐ、Ｘ０６１Ｐ、Ｘ０７８Ｎ、Ｘ０９７Ａ、Ｘ１０１Ｎ、Ｘ１１６Ｓ、Ｘ１２８Ａ／Ｓ、Ｘ１３０Ｇ、Ｘ２１６Ｑ、Ｘ２１７Ｑ、及びＸ２４９Ｎの群から選択された少なくとも１つの置換を含み、Ｓ０２４Ｇ、Ｎ０２５Ｇ、Ｉ０３５Ｖ、Ｓ０３８Ｇ、Ｓ０５３Ｇ、Ｔ０５５Ｐ、Ｎ０６１Ｐ、Ｓ０７８Ｎ、Ｇ０９７Ａ、Ｓ１０１Ｎ、Ａ１１６Ｓ、Ｇ１２８Ａ／Ｓ、Ｓ１３０Ｇ、Ｙ２１６Ｑ、Ｙ２１７Ｑ、及びＳ２４９Ｎの群から選択された少なくとも１つの置換を含んでいてもよいものである。ここで、変異のアミノ酸位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３０１】
以降、ＢＰＮ’変異体は、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０超、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．０超〜約１０、１．０超〜約８、又は１．０超〜約５のＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）は、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、及びＴ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本ＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０超〜約５のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。
【０３０２】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４の、試験方法３のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して約１．０に相当するＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）は、Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０３８Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｉ０３５Ｖ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｓ１３０Ｇ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ���２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０３８Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ、Ｓ０２４Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４９Ｎ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、及びＴ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本ＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列���号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３０３】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４の、試験方法３のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して約０．９のＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）は、Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ａ１１６Ｓ−Ｇ１２８Ａ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｙ２１７Ｑからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異の位置は配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、タンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上し得る。本発明は、本アッセイにおいて、タンパク質分解活性を有する、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して０．９のＰＩ値を有する、及び／又はＢＰＮ’と比較してタンパク質分解活性が向上している、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は、配列番号２と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３０４】
以降、ＢＰＮ’変異体は、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４の卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０超、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．０超〜約１０、１．０超〜約８、又は１．０超〜約５のＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）は、Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０６１Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０超〜約５のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。
【０３０５】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４の卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して約１．０に相当するＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）は、Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０３８Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ａ１１６Ｓ−Ｇ１２８Ａ、Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７���−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｉ０３５Ｖ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｙ２１７Ｑからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくとも１つのこのような変異体を含むクリーニング組成物）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３０６】
以降、ＢＰＮ’変異体は、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４の卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して約０．９のＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）は、Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ、Ｓ０２４Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４９Ｎ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０３８Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、及びＳ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｓ１３０Ｇ−Ｙ２１７Ｑからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異の位置は配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、本アッセイにおいて、タンパク質分解活性を有し、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して０．９のＰＩ値を有する、及び／又はＢＰＮ’と比較してタンパク質分解活性が向上している、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は、配列番号２と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３０７】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４の卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して約０．８のＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）はアミノ酸置換Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑを含む。ここで、変異の位置は配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。本発明は、本アッセイにおいて、タンパク質分解活性を有する、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して０．８のＰＩ値を有する、及び／又はＢＰＮ’と比較してタンパク質分解活性が向上している、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は、配列番号２と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列、並びにアミノ酸置換Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑを含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３０８】
以降、ＡＡＰＦタンパク質分解アッセイにおいて、ＢＰＮ’変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０超、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．０超〜約１０、１超〜約１２、４超〜約１２、又は１超〜約５のＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）は、Ｓ０２４Ｇ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ、Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ、Ｎ０６１Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０３８Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４９Ｎ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ａ１１６Ｓ−Ｇ１２８Ａ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０３８Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｔ０５５Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ、及びＳ０２４Ｇ−Ｎ０２５Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｎ０６１Ｐ−Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｓ１３０Ｇ−Ｙ２１７Ｑからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’プロテアーゼ（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本ＡＡＰＦアッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０超〜約５のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。
【０３０９】
以降、ＢＰＮ’変異体は、ＡＡＰＦタンパク質分解アッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して約１．０に相当するＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）はアミノ酸置換Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑを含む。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’プロテアーゼ（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本ＡＡＰＦアッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０に相当するＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつアミノ酸置換Ｇ０９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑを含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３１０】
（実施例７）
ＢＰＮ’−ｖ３６の部位評価ライブラリの構築及びＢＰＮ’−ｖ３６変異体のクリーニング性能
ＢＰＮ’−ｖ３６の部位評価ライブラリの構築
ＢＰＮ’−ｖ３６のアミノ酸配列は配列番号６のものであり、及びＢＰＮ’−ｖ３６プロテアーゼ変異体をコードしている核酸配列は配列番号５のものである。
【０３１１】
ＢＰＮ’−ｖ３６のアミノ酸配列は、配列番号２のサブチリシンＢＰＮ’アミノ酸配列を参照することにより表わすことができる。すなわち、ＢＰＮ’−ｖ３６は、６つのアミノ酸置換Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑを有する、配列番号２のサブチリシンＢＰＮ’配列として表すことができる。アミノ酸配列ＢＰＮ’−ｖ３６は、便宜上ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ又はＢＰＮ’＋Ｓ０２４Ｇ＋Ｓ０５３Ｇ＋Ｓ０７８Ｎ＋Ｓ１０１Ｎ＋Ｇ１２８Ａ＋Ｙ２１７Ｑとして表記することもできる。本明細書を通して、別途指定のない限り、アミノ酸配列の各アミノ酸位置は、変異体のアミノ酸配列をＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓのサブチリシンＢＰＮ’アミノ酸配列とアライメントさせることにより決定されるものとして、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓの配列番号２として示されるサブチリシンＢＰＮ’アミノ酸配列中のアミノ酸位置に対応させて番号付けされる。
【０３１２】
融合ＰＣＲにより、成熟ＢＰＮ’−ｖ３６（すなわち、ＢＰＮ’−Ｓ２４Ｇ−Ｓ５３Ｇ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ）タンパク質の各単独のアミノ酸位置毎に部位評価ライブラリ（ＳＥＬ）を作成した。
【０３１３】
ＢＰＮ’−ｖ３６プロテアーゼ中の、変異させる各コドンに関し、部分的に重複している相補的な（変異原性の、順方向及び逆方向）プライマー対を設計した。各変異原性プライマーには、各側に少なくとも１５ヌクレオチド隣接させた中央にＮＮＳ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴ、及びＳ＝Ｇ又はＣ）変異原性コドンを含有させた。所定の位置のライブラリを作成するために、共通の順方向遺伝子のフランキングプライマー（Ｐ４９７４、配列番号６０）及び変異原性ＮＮＳ逆方向プライマー、あるいは共通の逆方向遺伝子のフランキングプライマー（Ｐ４９７６、配列番号６１）及び変異原性ＮＮＳ順方向プライマーのいずれかを用いて、２つのＰＣＲ反応を実施した。これらのＰＣＲ反応は、２種のＰＣＲフラグメントを生成した。一方は変異ＢＰＮ’−ｖ３６遺伝子（５’遺伝子フラグメント）の５’側半分をコードするものであり、他方は変異ＢＰＮ’−ｖ３６遺伝子の３’側半分をコードするものである（３’遺伝子フラグメント）。
【０３１４】
各ＰＣＲ増幅反応には、３０ｐｍｏｌの各プライマー及び１００ｎｇのＢＰＮ’−ｖ３６親テンプレートＤＮＡ（ｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’−ｖ３６プラスミド、図４を参照されたい）を含有させた。増幅はＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いて実施した。ＰＣＲ反応（２０μＬ）は、まず始めに９５℃で２．５分加熱した後、続いて９４℃で１５秒の変性、５５℃で１５秒のアニーリング、及び７２℃で４０秒の伸長を３０サイクル行った。増幅させた後、５’及び３’遺伝子フラグメントを、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ゲルバンド精製用キットによりゲルから精製し、混合して（各フラグメントにつき５０ｎｇ）、プライマーＰ４９７３（配列番号６２）及びＰ４９５０（配列番号６３）を用いて再度ＰＣＲで増幅させて、完全長の遺伝子フラグメントを生成した。伸長工程を７２℃で２分にわたって実施したことを除き、ＰＣＲ条件は上記の条件と同様のものであった。完全長のＤＮＡフラグメントをＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ゲルバンド精製用キットによりゲルから精製し、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同様の制限酵素で消化したｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’ｐａｒｔｉａｌ  ｏｐｔベクターでライゲーションした。Ｉｌｌｕｓｔｒａ  Ｔｅｍｐｌｉｐｈｉキットでローリング・サークル型増幅法を用い、ライゲーション混合物を製造元（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の推奨に従って増幅させることで、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓに形質転換させるための多量体ＤＮＡを生成した。この目的のため、１μＬのライゲーション混合物と５μＬのサンプル緩衝液を混合し、９５℃で３分間加熱し、氷中で冷却した。次に、５μＬの反応緩衝液及び０．２μＬの酵素を各チューブに加え、続いて３０℃で１０時間にわたってインキュベートした。ローリング・サークル型増幅産物を１００倍希釈し、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞の形質転換に用いた（ΔａｐｒＥ，ΔｎｐｒＥ，ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ−ｐｈｌｅｏ）。形質転換混合物のアリコートを、１．６％のスキムミルク及び１０μｇ／ｍＬのネオマイシンを含有しているＬＢプレートに蒔き、３７℃で一晩インキュベートした。続いて、ハローを有するコロニーを、１０μｇ／ｍＬのネオマイシンを含有している１５０μＬのＬＢ培地に接種した。翌日、培養物は１５％のグリセロールと共に凍結させるか、あるいは実施例２に記載されるような生化学的解析のためにＭＤＢ培地で増殖させた。
【０３１５】
ＢＰＮ’−ｖ３６変異体のクリーニング性能
１６℃及びｐＨ  ８での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチアッセイ、並びに１６℃及びｐＨ  ８での洗剤組成物４の卵マイクロスウォッチアッセイを用いて、ＢＰＮ’−ｖ３６ＳＥＬ由来のタンパク質変異体をクリーニング性能について試験した。タンパク質含量はＴＣＡアッセイを用いて測定した。実施例１に記載のようにアッセイを実施し、ＢＰＮ’−ｖ３６（すなわちＢＰＮ’−Ｓ２４Ｇ−Ｓ５３Ｇ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ）と比較して性能インデックスを算出した。
【０３１６】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して１．０超、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．０超〜約１０、１．０超〜約８、又は１．０超〜約５のＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）（すなわち、ＢＰＮ’−ｖ３６）は、Ａ１１６Ｖ、Ｇ１６０Ｓ、Ｉ１１１Ｌ、Ｉ１１５Ｖ、Ｎ１０９Ｓ、Ｎ１１７Ｍ、Ｐ００５Ｇ、Ｑ０５９Ｖ、Ｔ１６４Ｓ、Ｙ２６２Ｍ、Ａ０１５Ｑ、Ａ０１５Ｓ、Ａ０９８Ｅ、Ａ０９８Ｎ、Ａ０９８Ｓ、Ａ０９８Ｔ、Ａ０９８Ｖ、Ａ０９８Ｙ、Ａ１１４Ｓ、Ａ１１４Ｔ、Ａ１１６Ｇ、Ａ１１６Ｌ、Ａ１１６Ｓ、Ａ１１６Ｔ、Ａ１１６Ｗ、Ａ１３３Ｇ、Ａ１３３Ｈ、Ａ１３３Ｔ、Ａ１３３Ｖ、Ａ１３７Ｇ、Ａ１３７Ｉ、Ａ１３７Ｌ、Ａ１３７Ｓ、Ａ１３７Ｔ、Ａ１３８Ｓ、Ａ２１６Ｅ、Ａ２１６Ｆ、Ａ２１６Ｖ、Ｄ０９９Ｓ、Ｄ１８１Ｅ、Ｆ２６１Ａ、Ｆ２６１Ｑ、Ｇ０２４Ｆ、Ｇ０２４Ｉ、Ｇ０２４Ｑ、Ｇ０２４Ｙ、Ｇ０９７Ｓ、Ｇ１６０Ｔ、Ｇ２１１Ｌ、Ｇ２１１Ｖ、Ｈ０１７Ｆ、Ｈ０１７Ｗ、Ｈ０３９Ｖ、Ｈ２２６Ａ、Ｉ０３１Ｖ、Ｉ１１１Ｖ、Ｉ２６８Ｖ、Ｋ１７０Ｒ、Ｋ２６５Ｒ、Ｌ０１６Ｑ、Ｌ０１６Ｔ、Ｌ１３５Ｍ、Ｌ２０９Ｔ、Ｌ２０９Ｖ、Ｌ２３３Ｍ、Ｌ２５７Ｔ、Ｌ２５７Ｖ、Ｌ２６７Ａ、Ｌ２６７Ｖ、Ｎ０２５Ａ、Ｎ０２５Ｉ、Ｎ０２５Ｑ、Ｎ０２５Ｒ、Ｎ０２５Ｔ、Ｎ０２５Ｖ、Ｎ１０１Ｉ、Ｎ１０１Ｑ、Ｎ１０１Ｓ、Ｎ１０９Ａ、Ｎ１０９Ｇ、Ｎ１０９Ｈ、Ｎ１０９Ｌ、Ｎ１０９Ｍ、Ｎ１０９Ｑ、Ｎ１０９Ｔ、Ｎ１１７Ｑ、Ｎ１８４Ａ、Ｎ１８４Ｌ、Ｎ１８４Ｔ、Ｎ１８４Ｗ、Ｎ２１２Ｇ、Ｎ２１２Ｌ、Ｎ２１２Ｖ、Ｎ２４３Ｐ、Ｎ２５２Ｇ、Ｎ２５２Ｍ、Ｐ００５Ｔ、Ｐ０１４Ｓ、Ｐ０４０Ｇ、Ｐ０４０Ｌ、Ｐ０４０Ｑ、Ｐ１２９Ａ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１７２Ｇ、Ｐ１７２Ｓ、Ｐ１９４Ｑ、Ｐ２１０Ａ、Ｐ２１０Ｓ、Ｑ１８５Ｆ、Ｑ１８５Ｇ、Ｑ１８５Ｉ、Ｑ１８５Ｍ、Ｑ１８５Ｎ、Ｑ１８５Ｓ、Ｑ２７５Ｈ、Ｒ１８６Ｋ、Ｓ００９Ａ、Ｓ００９Ｇ、Ｓ００９Ｈ、Ｓ００９Ｍ、Ｓ０１８Ｔ、Ｓ１３０Ｔ、Ｓ１３２Ｎ、Ｓ１４５Ｋ、Ｓ１５９Ｔ、Ｓ１６１Ｉ、Ｓ１６１Ｋ、Ｓ１６１Ｎ、Ｓ１６１Ｔ、Ｓ１６２Ｉ、Ｓ１６２Ｍ、Ｓ１６２Ｙ、Ｓ１６３Ｇ、Ｓ１８２Ｆ、Ｓ１８２Ｇ、Ｓ１８２Ｖ、Ｓ１８２Ｗ、Ｓ１８３Ｆ、Ｓ１８３Ｌ、Ｓ１８３Ｍ、Ｓ１８３Ｔ、Ｓ１８３Ｖ、Ｓ１８３Ｗ、Ｓ２２４Ａ、Ｓ２３６Ｔ、Ｓ２４９Ｖ、Ｔ０２２Ａ、Ｔ０２２Ｇ、Ｔ０２２Ｑ、Ｔ０２２Ｖ、Ｔ２０８Ｖ、Ｔ２４２Ｓ、Ｔ２５３Ｎ、Ｔ２５３Ｓ、Ｔ２５４Ａ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５５Ｌ、Ｔ２５５Ｓ、Ｔ２５５Ｖ、Ｖ００４Ａ、Ｖ００４Ｐ、Ｖ００４Ｗ、Ｖ０８４Ｃ、Ｖ１３９Ｃ、Ｖ１６５Ｍ、Ｖ２０３Ｆ、Ｙ０２１Ｋ、Ｙ０２１Ｎ、Ｙ０２１Ｔ、Ｙ０２１Ｖ、Ｙ１６７Ｆ、Ｙ１７１Ｆ、Ｙ２１４Ｆ、Ｙ２６２Ｆ、及びＹ２６２Ｔからなる群から選択された少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。ここで、変異のアミ���酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本ＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較してタンパク質分解活性が向上している、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して１超〜約５のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１、２、３、４、５又は６以上のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３１７】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して約１．０に相当するＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、ＢＰＮ’−ｖ３６、Ａ００１Ｇ、Ａ００１Ｙ、Ａ０１３Ｇ、Ａ０１３Ｖ、Ａ０１５Ｆ、Ａ０１５Ｇ、Ａ０１５Ｋ、Ａ０１５Ｍ、Ａ０１５Ｐ、Ａ０１５Ｔ、Ａ０１５Ｗ、Ａ０１５Ｙ、Ａ０２９Ｇ、Ａ０７３Ｓ、Ａ０８８Ｃ、Ａ０８８Ｉ、Ａ０８８Ｌ、Ａ０８８Ｔ、Ａ０８８Ｖ、Ａ０９８Ｄ、Ａ０９８Ｋ、Ａ０９８Ｐ、Ａ０９８Ｒ、Ａ０９８Ｗ、Ａ１１６Ｄ、Ａ１１６Ｅ、Ａ１１６Ｒ、Ａ１２８Ｓ、Ａ１３３Ｌ、Ａ１３３Ｍ、Ａ１３３Ｓ、Ａ１３４Ｇ、Ａ１３４Ｓ、Ａ１３７Ｎ、Ａ１３７Ｖ、Ａ１４４Ｍ、Ａ１４４Ｑ、Ａ１４４Ｓ、Ａ１４４Ｔ、Ａ１４４Ｖ、Ａ１５１Ｃ、Ａ１７６Ｓ、Ａ１７６Ｔ、Ａ１７９Ｓ、Ａ２１６Ｇ、Ａ２１６Ｌ、Ａ２１６Ｐ、Ａ２１６Ｑ、Ａ２１６Ｓ、Ａ２１６Ｔ、Ａ２１６Ｙ、Ａ２２８Ｔ、Ａ２３０Ｃ、Ａ２３１Ｃ、Ａ２７２Ｉ、Ａ２７２Ｌ、Ａ２７２Ｑ、Ａ２７２Ｓ、Ａ２７２Ｔ、Ａ２７２Ｗ、Ａ２７３Ｓ、Ａ２７４Ｇ、Ａ２７４Ｌ、Ａ２７４Ｑ、Ａ２７４Ｔ、Ａ２７４Ｖ、Ｄ０４１Ｅ、Ｄ０９９Ｇ、Ｄ０９９Ｎ、Ｄ１２０Ａ、Ｄ１２０Ｋ、Ｄ１２０Ｑ、Ｄ１２０Ｒ、Ｄ１２０Ｓ、Ｄ１４０Ｅ、Ｄ１８１Ｓ、Ｄ２５９Ｅ、Ｅ０５４Ｄ、Ｅ１５６Ｄ、Ｅ１５６Ｔ、Ｅ２５１Ｖ、Ｆ２６１Ｇ、Ｆ２６１Ｈ、Ｆ２６１Ｌ、Ｆ２６１Ｒ、Ｆ２６１Ｓ、Ｆ２６１Ｔ、Ｆ２６１Ｖ、Ｆ２６１Ｗ、Ｇ００７Ａ、Ｇ００７Ｓ、Ｇ０２０Ａ、Ｇ０２０Ｄ、Ｇ０２０Ｓ、Ｇ０２４Ｎ、Ｇ０２４Ｒ、Ｇ０２４Ｓ、Ｇ０２４Ｔ、Ｇ０２４Ｖ、Ｇ０２４Ｗ、Ｇ０５３Ｈ、Ｇ０５３Ｋ、Ｇ０５３Ｎ、Ｇ０５３Ｔ、Ｇ０９７Ａ、Ｇ０９７Ｄ、Ｇ０９７Ｔ、Ｇ１３１Ａ、Ｇ１３１Ｈ、Ｇ１３１Ｐ、Ｇ１３１Ｑ、Ｇ１３１Ｔ、Ｇ１３１Ｖ、Ｇ１６０Ｈ、Ｇ１６０Ｐ、Ｇ１６６Ａ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６６Ｔ、Ｇ２１１Ａ、Ｇ２１１Ｄ、Ｇ２１１Ｍ、Ｇ２１１Ｎ、Ｇ２１１Ｐ、Ｇ２１１Ｑ、Ｇ２１１Ｒ、Ｇ２１１Ｗ、Ｇ２１５Ａ、Ｇ２１５Ｎ、Ｇ２１５Ｖ、Ｈ０１７Ｌ、Ｈ０１７Ｍ、Ｈ０１７Ｔ、Ｈ０１７Ｖ、Ｈ０１７Ｙ、Ｈ０３９Ａ、Ｈ０３９Ｃ、Ｈ０３９Ｎ、Ｈ２２６Ｆ、Ｈ２２６Ｉ、Ｈ２２６Ｍ、Ｈ２２６Ｓ、Ｈ２２６Ｖ、Ｈ２２６Ｙ、Ｉ０３５Ｖ、Ｉ０７９Ａ、Ｉ０７９Ｓ、Ｉ０７９Ｔ、Ｉ０７９Ｖ、Ｉ０７９Ｗ、Ｉ１０８Ｖ、Ｉ１１５Ｌ、Ｉ１２２Ａ、Ｉ２３４Ｌ、Ｉ２３４Ｖ、Ｋ０１２Ｒ、Ｋ０２７Ｒ、Ｋ１３６Ｒ、Ｋ１４１Ｆ、Ｋ２１３Ｗ、Ｋ２３７Ｒ、Ｋ２５６Ｒ、Ｋ２６５Ｑ、Ｌ０１６Ａ、Ｌ０１６Ｆ、Ｌ０１６Ｉ、Ｌ０１６Ｓ、Ｌ０１６Ｖ、Ｌ０４２Ｉ、Ｌ０７５Ａ、Ｌ０７５Ｍ、Ｌ０７５Ｑ、Ｌ０７５Ｖ、Ｌ０７５Ｙ、Ｌ０８２Ｋ、Ｌ０８２Ｍ、Ｌ０８２Ｑ、Ｌ０８２Ｖ、Ｌ０９０Ｉ、Ｌ１９６Ｉ、Ｌ１９６Ｖ、Ｌ２０９Ｑ、Ｌ２０９Ｗ、Ｌ２３３Ａ、Ｌ２３３Ｑ、Ｌ２３３Ｖ、Ｌ２３５Ｉ、Ｌ２３５Ｋ、Ｌ２５０Ｉ、Ｌ２５７Ａ、Ｌ２５７Ｈ、Ｌ２５７Ｑ、Ｌ２５７Ｓ、Ｌ２５７Ｙ、Ｌ２６７Ｑ、Ｌ２６７Ｒ、Ｌ２６７Ｓ、Ｌ２６７Ｔ、Ｍ１９９Ｖ、Ｎ０２５Ｆ、Ｎ０２５Ｇ、Ｎ���２５Ｈ、Ｎ０２５Ｋ、Ｎ０２５Ｌ、Ｎ０２５Ｍ、Ｎ０２５Ｓ、Ｎ０２５Ｙ、Ｎ０６１Ｆ、Ｎ０６１Ｈ、Ｎ０６１Ｐ、Ｎ０６１Ｓ、Ｎ０６１Ｔ、Ｎ０６１Ｖ、Ｎ０６１Ｗ、Ｎ０７６Ｇ、Ｎ０７６Ｗ、Ｎ０７８Ｓ、Ｎ０７８Ｔ、Ｎ０７８Ｖ、Ｎ１０１Ａ、Ｎ１０１Ｈ、Ｎ１０１Ｌ、Ｎ１０１Ｔ、Ｎ１０９Ｋ、Ｎ１０９Ｒ、Ｎ１１７Ａ、Ｎ１１７Ｅ、Ｎ１１７Ｈ、Ｎ１１７Ｋ、Ｎ１１８Ｇ、Ｎ１８４Ｇ、Ｎ１８４Ｈ、Ｎ１８４Ｉ、Ｎ１８４Ｓ、Ｎ１８４Ｖ、Ｎ２１２Ａ、Ｎ２１２Ｆ、Ｎ２１２Ｉ、Ｎ２１２Ｋ、Ｎ２１２Ｐ、Ｎ２１２Ｑ、Ｎ２１２Ｓ、Ｎ２１２Ｙ、Ｎ２１８Ａ、Ｎ２１８Ｈ、Ｎ２１８Ｌ、Ｎ２１８Ｓ、Ｎ２４０Ｅ、Ｎ２４０Ｈ、Ｎ２４０Ｌ、Ｎ２４０Ｒ、Ｎ２４０Ｔ、Ｎ２４３Ａ、Ｎ２４３Ｑ、Ｎ２４３Ｔ、Ｎ２４３Ｖ、Ｎ２５２Ａ、Ｎ２５２Ｋ、Ｎ２５２Ｌ、Ｎ２５２Ｑ、Ｎ２５２Ｒ、Ｎ２５２Ｓ、Ｎ２５２Ｔ、Ｎ２６９Ｑ、Ｎ２６９Ｓ、Ｐ０１４Ｇ、Ｐ０１４Ｑ、Ｐ０１４Ｔ、Ｐ０４０Ａ、Ｐ０４０Ｈ、Ｐ０４０Ｓ、Ｐ０４０Ｔ、Ｐ０４０Ｖ、Ｐ０４０Ｙ、Ｐ０８６Ａ、Ｐ０８６Ｃ、Ｐ０８６Ｆ、Ｐ０８６Ｈ、Ｐ０８６Ｓ、Ｐ１２９Ｄ、Ｐ１２９Ｇ、Ｐ１２９Ｋ、Ｐ１２９Ｔ、Ｐ１７２Ａ、Ｐ１７２Ｑ、Ｐ１９４Ａ、Ｐ１９４Ｇ、Ｐ１９４Ｌ、Ｐ１９４Ｍ、Ｐ１９４Ｓ、Ｐ１９４Ｖ、Ｐ１９４Ｙ、Ｐ２１０Ｇ、Ｐ２１０Ｒ、Ｐ２１０Ｖ、Ｑ００２Ａ、Ｑ００２Ｓ、Ｑ０１０Ａ、Ｑ０１０Ｆ、Ｑ０１０Ｈ、Ｑ０１０Ｉ、Ｑ０１０Ｌ、Ｑ０１０Ｎ、Ｑ０１０Ｓ、Ｑ０１０Ｔ、Ｑ０１９Ａ、Ｑ０１９Ｇ、Ｑ０１９Ｎ、Ｑ０１９Ｓ、Ｑ０１９Ｔ、Ｑ０１９Ｖ、Ｑ０１９Ｗ、Ｑ０５９Ｉ、Ｑ１０３Ｌ、Ｑ１０３Ｓ、Ｑ１８５Ａ、Ｑ１８５Ｈ、Ｑ１８５Ｌ、Ｑ１８５Ｔ、Ｑ１８５Ｙ、Ｑ２０６Ｐ、Ｑ２０６Ｓ、Ｑ２０６Ｙ、Ｑ２１７Ｉ、Ｑ２１７Ｎ、Ｑ２１７Ｓ、Ｑ２１７Ｔ、Ｑ２４５Ｋ、Ｑ２７５Ｄ、Ｑ２７５Ｓ、Ｑ２７５Ｗ、Ｓ００３Ａ、Ｓ００３Ｇ、Ｓ００３Ｈ、Ｓ００３Ｍ、Ｓ００３Ｐ、Ｓ００３Ｑ、Ｓ００３Ｔ、Ｓ００３Ｖ、Ｓ００９Ｉ、Ｓ００９Ｌ、Ｓ００９Ｐ、Ｓ００９Ｔ、Ｓ００９Ｗ、Ｓ０１８Ａ、Ｓ０１８Ｇ、Ｓ０１８Ｉ、Ｓ０１８Ｌ、Ｓ０１８Ｍ、Ｓ０１８Ｎ、Ｓ０１８Ｐ、Ｓ０１８Ｖ、Ｓ０１８Ｗ、Ｓ０３３Ｔ、Ｓ０３７Ｑ、Ｓ０３７Ｔ、Ｓ０３７Ｖ、Ｓ０３８Ｇ、Ｓ０３８Ｈ、Ｓ０３８Ｋ、Ｓ０３８Ｑ、Ｓ０３８Ｔ、Ｓ０６３Ｋ、Ｓ０６３Ｎ、Ｓ０６３Ｑ、Ｓ０６３Ｔ、Ｓ０８７Ａ、Ｓ０８７Ｆ、Ｓ０８７Ｇ、Ｓ０８７Ｑ、Ｓ０８７Ｔ、Ｓ０８９Ｌ、Ｓ０８９Ｍ、Ｓ０８９Ｎ、Ｓ０８９Ｑ、Ｓ０８９Ｔ、Ｓ０８９Ｗ、Ｓ１３０Ａ、Ｓ１３０Ｆ、Ｓ１３０Ｇ、Ｓ１３０Ｌ、Ｓ１３０Ｖ、Ｓ１４５Ａ、Ｓ１４５Ｈ、Ｓ１４５Ｍ、Ｓ１４５Ｖ、Ｓ１５９Ａ、Ｓ１５９Ｇ、Ｓ１５９Ｈ、Ｓ１５９Ｑ、Ｓ１５９Ｒ、Ｓ１６１Ａ、Ｓ１６１Ｇ、Ｓ１６１Ｈ、Ｓ１６１Ｌ、Ｓ１６１Ｍ、Ｓ１６１Ｐ、Ｓ１６１Ｑ、Ｓ１６１Ｗ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１６２Ｆ、Ｓ１６２Ｇ、Ｓ１６２Ｌ、Ｓ１６２Ｎ、Ｓ１６２Ｐ、Ｓ１６２Ｒ、Ｓ１６２Ｖ、Ｓ１６３Ｐ、Ｓ１７３Ａ、Ｓ１７３Ｇ、Ｓ１８２Ａ、Ｓ１８２Ｈ、Ｓ１８２Ｋ、Ｓ１８２Ｌ、Ｓ１８２Ｎ、Ｓ１８２Ｐ、Ｓ１８２Ｑ、Ｓ１８２Ｔ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１８３Ｇ、Ｓ１８３Ｈ、Ｓ１８３Ｑ、Ｓ１８８Ａ、Ｓ１８８Ｇ、Ｓ１８８Ｔ、Ｓ１８８Ｖ、Ｓ１９１Ａ、Ｓ２０４Ａ、Ｓ２０４���、Ｓ２０４Ｌ、Ｓ２０４Ｑ、Ｓ２０４Ｖ、Ｓ２２４Ｃ、Ｓ２３６Ａ、Ｓ２３６Ｎ、Ｓ２３６Ｑ、Ｓ２４８Ａ、Ｓ２４８Ｆ、Ｓ２４８Ｇ、Ｓ２４８Ｉ、Ｓ２４８Ｋ、Ｓ２４８Ｌ、Ｓ２４８Ｍ、Ｓ２４８Ｎ、Ｓ２４８Ｑ、Ｓ２４８Ｔ、Ｓ２４８Ｖ、Ｓ２４９Ａ、Ｓ２４９Ｃ、Ｓ２４９Ｈ、Ｓ２４９Ｑ、Ｓ２４９Ｔ、Ｓ２４９Ｗ、Ｓ２４９Ｙ、Ｓ２６０Ｈ、Ｓ２６０Ｎ、Ｓ２６０Ｐ、Ｓ２６０Ｔ、Ｔ０２２Ｈ、Ｔ０２２Ｋ、Ｔ０２２Ｎ、Ｔ０２２Ｒ、Ｔ０２２Ｓ、Ｔ０２２Ｙ、Ｔ０５５Ａ、Ｔ０５５Ｇ、Ｔ０５５Ｌ、Ｔ０５５Ｎ、Ｔ０５５Ｐ、Ｔ０５５Ｑ、Ｔ０７１Ｓ、Ｔ１５８Ｈ、Ｔ１５８Ｓ、Ｔ１６４Ｎ、Ｔ２０８Ｃ、Ｔ２０８Ｌ、Ｔ２２０Ｓ、Ｔ２４２Ｎ、Ｔ２４４Ａ、Ｔ２４４Ｇ、Ｔ２４４Ｈ、Ｔ２４４Ｉ、Ｔ２４４Ｑ、Ｔ２４４Ｓ、Ｔ２４４Ｖ、Ｔ２４４Ｗ、Ｔ２５３Ａ、Ｔ２５３Ｇ、Ｔ２５３Ｈ、Ｔ２５３Ｑ、Ｔ２５４Ｖ、Ｔ２５５Ａ、Ｔ２５５Ｇ、Ｔ２５５Ｈ、Ｔ２５５Ｉ、Ｔ２５５Ｑ、Ｔ２５５Ｙ、Ｖ００４Ｇ、Ｖ００４Ｎ、Ｖ００４Ｒ、Ｖ００８Ａ、Ｖ００８Ｃ、Ｖ００８Ｍ、Ｖ０２６Ｉ、Ｖ０４４Ｉ、Ｖ０４４Ｌ、Ｖ０４５Ｈ、Ｖ０４５Ｋ、Ｖ０４５Ｌ、Ｖ０４５Ｍ、Ｖ０４５Ｑ、Ｖ０４５Ｓ、Ｖ０４５Ｖ、Ｖ０４５Ｗ、Ｖ０４５Ｙ、Ｖ０５１Ｉ、Ｖ０８１Ｌ、Ｖ０８１Ｑ、Ｖ０８１Ｔ、Ｖ０８４Ａ、Ｖ０８４Ｓ、Ｖ０８４Ｔ、Ｖ０９３Ｉ、Ｖ１２１Ｉ、Ｖ１４３Ｎ、Ｖ１４３Ｓ、Ｖ１４３Ｙ、Ｖ１４７Ｃ、Ｖ１４７Ｉ、Ｖ１４７Ｌ、Ｖ１４７Ｔ、Ｖ１８０Ｉ、Ｖ１８０Ｌ、Ｖ１８０Ｔ、Ｖ１９２Ａ、Ｖ１９２Ｓ、Ｖ１９２Ｔ、Ｖ１９８Ｉ、Ｖ１９８Ｌ、Ｖ１９８Ｍ、Ｖ２０３Ｈ、Ｖ２０３Ｉ、Ｖ２０３Ｌ、Ｖ２０３Ｎ、Ｖ２０３Ｑ、Ｖ２０３Ｔ、Ｖ２０３Ｗ、Ｖ２０３Ｙ、Ｖ２７０Ａ、Ｖ２７０Ｓ、Ｖ２７０Ｔ、Ｗ２４１Ｍ、Ｗ２４１Ｙ、Ｙ００６Ｇ、Ｙ００６Ｈ、Ｙ００６Ｉ、Ｙ００６Ｋ、Ｙ００６Ｌ、Ｙ００６Ｐ、Ｙ００６Ｑ、Ｙ００６Ｔ、Ｙ００６Ｖ、Ｙ００６Ｗ、Ｙ０２１Ａ、Ｙ０２１Ｄ、Ｙ０２１Ｅ、Ｙ０２１Ｌ、Ｙ０２１Ｑ、Ｙ０２１Ｒ、Ｙ０２１Ｓ、Ｙ１０４Ｆ、Ｙ１０４Ｉ、Ｙ２１４Ｌ、Ｙ２１４Ｖ、Ｙ２１４Ｗ、Ｙ２６２Ａ、Ｙ２６２Ｇ、Ｙ２６２Ｌ、Ｙ２６２Ｎ、Ｙ２６２Ｓ、Ｙ２６２Ｗ、Ｙ２６３Ｇ、及びＹ２６３Ｗからなる群から選択された少なくとも１つの変異含む。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。したがって、例えば、本発明は、Ａ１２８Ｓ置換を含むアミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）（例えば、ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ｓ−Ｙ２１７Ｑ）を包含する。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本ＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して約１．０のＰＩ値を有する、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して約１．０のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５���、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１、２、３、４、５又は６以上のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３１８】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して約０．９に相当するＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、Ａ００１Ｆ、Ａ００１Ｋ、Ａ００１Ｌ、Ａ００１Ｍ、Ａ００１Ｑ、Ａ００１Ｒ、Ａ００１Ｓ、Ａ００１Ｔ、Ａ００１Ｖ、Ａ０１３Ｃ、Ａ０１３Ｓ、Ａ０１５Ｄ、Ａ０１５Ｅ、Ａ０１５Ｌ、Ａ０１５Ｒ、Ａ０４８Ｓ、Ａ０７３Ｎ、Ａ０７３Ｔ、Ａ０７４Ｇ、Ａ０７４Ｓ、Ａ０８５Ｃ、Ａ０８５Ｇ、Ａ０８５Ｓ、Ａ０８５Ｖ、Ａ０８８Ｍ、Ａ０８８Ｓ、Ａ０９２Ｓ、Ａ０９８Ｇ、Ａ１１４Ｇ、Ａ１３３Ｐ、Ａ１３７Ｅ、Ａ１３７Ｈ、Ａ１４４Ｇ、Ａ１４４Ｈ、Ａ１４４Ｋ、Ａ１４４Ｌ、Ａ１４４Ｎ、Ａ１５３Ｓ、Ａ１５３Ｖ、Ａ１７６Ｃ、Ａ１７９Ｇ、Ａ１８７Ｇ、Ａ１８７Ｓ、Ａ２００Ｇ、Ａ２１６Ｗ、Ａ２２３Ｓ、Ａ２２８Ｓ、Ａ２３０Ｔ、Ａ２３０Ｖ、Ａ２３１Ｖ、Ａ２３２Ｃ、Ａ２３２Ｖ、Ａ２７２Ｅ、Ａ２７２Ｇ、Ａ２７２Ｋ、Ａ２７２Ｐ、Ａ２７３Ｇ、Ａ２７３Ｌ、Ａ２７３Ｖ、Ａ２７４Ｍ、Ａ２７４Ｒ、Ｄ０３６Ｅ、Ｄ０９９Ａ、Ｄ０９９Ｑ、Ｄ１２０Ｅ、Ｄ１８１Ａ、Ｄ１８１Ｇ、Ｄ２５９Ａ、Ｄ２５９Ｇ、Ｄ２５９Ｑ、Ｄ２５９Ｔ、Ｅ１５６Ａ、Ｅ１５６Ｓ、Ｅ２５１Ｉ、Ｅ２５１Ｌ、Ｅ２５１Ｑ、Ｅ２５１Ｔ、Ｆ０５８Ｙ、Ｆ２６１Ｃ、Ｆ２６１Ｄ、Ｆ２６１Ｋ、Ｆ２６１Ｐ、Ｇ０２０Ｅ、Ｇ０２０Ｆ、Ｇ０２０Ｈ、Ｇ０２０Ｌ、Ｇ０２０Ｎ、Ｇ０２０Ｑ、Ｇ０２０Ｒ、Ｇ０２０Ｔ、Ｇ０２０Ｙ、Ｇ０２４Ａ、Ｇ０２４Ｐ、Ｇ０５３Ａ、Ｇ０５３Ｄ、Ｇ０５３Ｅ、Ｇ０５３Ｆ、Ｇ０５３Ｌ、Ｇ０５３Ｑ、Ｇ０５３Ｓ、Ｇ０５３Ｙ、Ｇ０９７Ｋ、Ｇ０９７Ｍ、Ｇ１５７Ａ、Ｇ１５７Ｓ、Ｇ１６０Ａ、Ｇ１６０Ｌ、Ｇ１６６Ｃ、Ｇ１６６Ｉ、Ｇ１６６Ｑ、Ｇ１６９Ａ、Ｇ２１１Ｋ、Ｇ２１５Ｈ、Ｇ２１５Ｌ、Ｇ２１５Ｓ、Ｇ２１５Ｔ、Ｇ２１５Ｗ、Ｇ２５８Ｓ、Ｈ０１７Ｉ、Ｈ０３９Ｓ、Ｈ２２６Ｌ、Ｈ２３８Ｎ、Ｈ２３８Ｙ、Ｉ０１１Ｌ、Ｉ０１１Ｖ、Ｉ０３１Ｌ、Ｉ０７９Ｆ、Ｉ０７９Ｋ、Ｉ０７９Ｌ、Ｉ０７９Ｍ、Ｉ０７９Ｑ、Ｉ２０５Ａ、Ｉ２０５Ｖ、Ｉ２６８Ｌ、Ｉ２６８Ｍ、Ｋ０１２Ｇ、Ｋ０４３Ｆ、Ｋ０４３Ｈ、Ｋ０４３Ｉ、Ｋ０４３Ｎ、Ｋ０４３Ｑ、Ｋ０４３Ｔ、Ｋ１４１Ａ、Ｋ１４１Ｒ、Ｋ１４１Ｗ、Ｋ１７０Ａ、Ｋ２１３Ａ、Ｋ２１３Ｇ、Ｋ２１３Ｈ、Ｋ２１３Ｉ、Ｋ２１３Ｌ、Ｋ２１３Ｎ、Ｋ２１３Ｑ、Ｋ２１３Ｒ、Ｋ２１３Ｓ、Ｋ２１３Ｔ、Ｋ２１３Ｖ、Ｋ２３７Ａ、Ｋ２３７Ｈ、Ｋ２３７Ｉ、Ｋ２３７Ｌ、Ｋ２３７Ｎ、Ｋ２３７Ｓ、Ｋ２５６Ａ、Ｋ２５６Ｇ、Ｋ２５６Ｈ、Ｋ２５６Ｍ、Ｋ２５６Ｐ、Ｋ２５６Ｑ、Ｋ２５６Ｗ、Ｋ２６５Ｈ、Ｌ０１６Ｅ、Ｌ０４２Ｖ、Ｌ０７５Ｇ、Ｌ０７５Ｈ、Ｌ０７５Ｉ、Ｌ０７５Ｔ、Ｌ０８２Ａ、Ｌ０８２Ｆ、Ｌ０８２Ｈ、Ｌ０８２Ｒ、Ｌ０８２Ｓ、Ｌ０８２Ｔ、Ｌ０９０Ｍ、Ｌ１３５Ｆ、Ｌ１９６Ｍ、Ｌ２０９Ｃ、Ｌ２０９Ｈ、Ｌ２０９Ｓ、Ｌ２３３Ｓ、Ｌ２３５Ｍ、Ｌ２３５Ｒ、Ｌ２３５Ｗ、Ｌ２５７Ｃ、Ｌ２５７Ｇ、Ｌ２６７Ｆ、Ｍ０５０Ｙ、Ｍ１１９Ｃ、Ｍ１１９Ｉ、Ｍ１２４Ｌ、Ｎ０２５Ｃ、Ｎ０２５���、Ｎ０２５Ｐ、Ｎ０６１Ａ、Ｎ０６１Ｇ、Ｎ０６１Ｉ、Ｎ０６１Ｋ、Ｎ０６１Ｌ、Ｎ０６１Ｑ、Ｎ０６１Ｒ、Ｎ０６２Ｓ、Ｎ０６２Ｔ、Ｎ０７６Ａ、Ｎ０７６Ｐ、Ｎ０７６Ｑ、Ｎ０７６Ｓ、Ｎ０７６Ｔ、Ｎ０７６Ｖ、Ｎ０７８Ｇ、Ｎ０７８Ｈ、Ｎ０７８Ｋ、Ｎ０７８Ｐ、Ｎ０７８Ｑ、Ｎ０７８Ｒ、Ｎ１０１Ｆ、Ｎ１１７Ｒ、Ｎ１１７Ｓ、Ｎ１１８Ｄ、Ｎ１１８Ｈ、Ｎ１１８Ｑ、Ｎ１１８Ｒ、Ｎ１１８Ｓ、Ｎ１１８Ｔ、Ｎ１８４Ｃ、Ｎ１８４Ｅ、Ｎ１８４Ｒ、Ｎ２１２Ｄ、Ｎ２１２Ｒ、Ｎ２１２Ｗ、Ｎ２１８Ｆ、Ｎ２１８Ｇ、Ｎ２１８Ｍ、Ｎ２１８Ｐ、Ｎ２１８Ｔ、Ｎ２１８Ｖ、Ｎ２１８Ｗ、Ｎ２４０Ａ、Ｎ２４０Ｇ、Ｎ２４０Ｑ、Ｎ２４０Ｓ、Ｎ２４０Ｗ、Ｎ２４３Ｃ、Ｎ２４３Ｇ、Ｎ２４３Ｓ、Ｎ２５２Ｖ、Ｎ２６９Ｈ、Ｐ００５Ａ、Ｐ００５Ｄ、Ｐ００５Ｍ、Ｐ００５Ｑ、Ｐ０１４Ａ、Ｐ０１４Ｍ、Ｐ０１４Ｒ、Ｐ０１４Ｖ、Ｐ０４０Ｆ、Ｐ０４０Ｒ、Ｐ０４０Ｗ、Ｐ１２９Ｅ、Ｐ１２９Ｒ、Ｐ１７２Ｅ、Ｐ１７２Ｋ、Ｐ１９４Ｈ、Ｐ１９４Ｒ、Ｐ１９４Ｗ、Ｐ２０１Ａ、Ｐ２０１Ｇ、Ｐ２１０Ｌ、Ｐ２３９Ｋ、Ｐ２３９Ｒ、Ｑ００２Ｄ、Ｑ００２Ｅ、Ｑ００２Ｇ、Ｑ００２Ｉ、Ｑ００２Ｐ、Ｑ００２Ｖ、Ｑ０１０Ｄ、Ｑ０１０Ｒ、Ｑ０１９Ｃ、Ｑ０１９Ｄ、Ｑ０１９Ｅ、Ｑ０１９Ｈ、Ｑ０１９Ｌ、Ｑ０１９Ｐ、Ｑ０１９Ｒ、Ｑ０５９Ａ、Ｑ０５９Ｅ、Ｑ０５９Ｌ、Ｑ０５９Ｓ、Ｑ０５９Ｔ、Ｑ１０３Ｗ、Ｑ１８５Ｄ、Ｑ１８５Ｋ、Ｑ１８５Ｒ、Ｑ１８５Ｗ、Ｑ２０６Ｇ、Ｑ２０６Ｈ、Ｑ２０６Ｌ、Ｑ２０６Ｖ、Ｑ２０６Ｗ、Ｑ２１７Ｅ、Ｑ２１７Ｆ、Ｑ２１７Ｈ、Ｑ２１７Ｌ、Ｑ２１７Ｖ、Ｑ２４５Ｍ、Ｑ２７１Ａ、Ｑ２７１Ｄ、Ｑ２７１Ｇ、Ｑ２７１Ｌ、Ｑ２７１Ｐ、Ｑ２７１Ｔ、Ｑ２７１Ｙ、Ｑ２７５Ｆ、Ｑ２７５Ｌ、Ｑ２７５Ｐ、Ｑ２７５Ｒ、Ｓ００３Ｄ、Ｓ００３Ｆ、Ｓ００３Ｋ、Ｓ００３Ｒ、Ｓ００９Ｋ、Ｓ０１８Ｄ、Ｓ０１８Ｒ、Ｓ０３７Ａ、Ｓ０３７Ｇ、Ｓ０３７Ｋ、Ｓ０３７Ｌ、Ｓ０３７Ｐ、Ｓ０３８Ｍ、Ｓ０６３Ａ、Ｓ０６３Ｆ、Ｓ０６３Ｇ、Ｓ０６３Ｍ、Ｓ０６３Ｒ、Ｓ０６３Ｙ、Ｓ０８７Ｃ、Ｓ０８７Ｋ、Ｓ０８７Ｌ、Ｓ０８７Ｍ、Ｓ０８７Ｎ、Ｓ０８７Ｙ、Ｓ０８９Ａ、Ｓ０８９Ｄ、Ｓ０８９Ｆ、Ｓ０８９Ｇ、Ｓ０８９Ｈ、Ｓ０８９Ｉ、Ｓ０８９Ｋ、Ｓ０８９Ｒ、Ｓ０８９Ｖ、Ｓ０８９Ｙ、Ｓ１３０Ｄ、Ｓ１３０Ｅ、Ｓ１３０Ｋ、Ｓ１３０Ｗ、Ｓ１４５Ｇ、Ｓ１４５Ｌ、Ｓ１４５Ｒ、Ｓ１４５Ｔ、Ｓ１５９Ｄ、Ｓ１５９Ｌ、Ｓ１５９Ｗ、Ｓ１６１Ｅ、Ｓ１６１Ｒ、Ｓ１６２Ｃ、Ｓ１６２Ｅ、Ｓ１６２Ｗ、Ｓ１６３Ａ、Ｓ１８２Ｅ、Ｓ１８２Ｒ、Ｓ１８３Ｃ、Ｓ１８３Ｄ、Ｓ１８３Ｐ、Ｓ１８３Ｒ、Ｓ１８８Ｄ、Ｓ１８８Ｐ、Ｓ２０４Ｇ、Ｓ２０４Ｙ、Ｓ２０７Ｇ、Ｓ２２４Ｇ、Ｓ２２４Ｔ、Ｓ２３６Ｃ、Ｓ２３６Ｇ、Ｓ２４８Ｄ、Ｓ２４８Ｈ、Ｓ２４８Ｒ、Ｓ２４９Ｅ、Ｓ２４９Ｌ、Ｓ２４９Ｒ、Ｓ２６０Ａ、Ｓ２６０Ｇ、Ｓ２６０Ｋ、Ｓ２６０Ｑ、Ｓ２６０Ｖ、Ｓ２６０Ｙ、Ｔ０２２Ｌ、Ｔ０５５Ｄ、Ｔ０５５Ｅ、Ｔ０５５Ｉ、Ｔ０５５Ｋ、Ｔ０５５Ｍ、Ｔ０５５Ｓ、Ｔ０５５Ｖ、Ｔ０５５Ｙ、Ｔ１５８Ａ、Ｔ１５８Ｇ、Ｔ１５８Ｌ、Ｔ１５８Ｑ、Ｔ１５８Ｖ、Ｔ１６４Ｋ、Ｔ１６４Ｑ、Ｔ２０８Ｓ、Ｔ２４４Ｄ、Ｔ２４４Ｅ、Ｔ２４４Ｒ、Ｔ２５３Ｅ、Ｔ２５３Ｒ、Ｔ２５３Ｙ、Ｔ２５４Ｇ、Ｔ���５５Ｄ、Ｔ２５５Ｅ、Ｔ２５５Ｋ、Ｔ２５５Ｒ、Ｖ０２６Ａ、Ｖ０２８Ｉ、Ｖ０２８Ｌ、Ｖ０３０Ｉ、Ｖ０４４Ｃ、Ｖ０４４Ｐ、Ｖ０４５Ｅ、Ｖ０４５Ｇ、Ｖ０４５Ｎ、Ｖ０７２Ｌ、Ｖ０８１Ａ、Ｖ０８１Ｇ、Ｖ０８１Ｈ、Ｖ０８１Ｓ、Ｖ０８４Ｉ、Ｖ０８４Ｍ、Ｖ０９５Ａ、Ｖ０９５Ｃ、Ｖ１４３Ａ、Ｖ１４３Ｆ、Ｖ１４３Ｈ、Ｖ１４３Ｑ、Ｖ１４３Ｔ、Ｖ１４３Ｗ、Ｖ１４７Ａ、Ｖ１４７Ｑ、Ｖ１４７Ｓ、Ｖ１４８Ｉ、Ｖ１４８Ｌ、Ｖ１４９Ｃ、Ｖ１４９Ｉ、Ｖ１４９Ｌ、Ｖ１６５Ｌ、Ｖ１８０Ａ、Ｖ１８０Ｃ、Ｖ１８０Ｍ、Ｖ１９２Ｃ、Ｖ１９２Ｆ、Ｖ１９２Ｉ、Ｖ１９２Ｑ、Ｖ１９２Ｙ、Ｖ２０３Ａ、Ｖ２０３Ｇ、Ｖ２０３Ｋ、Ｖ２０３Ｓ、Ｖ２７０Ｃ、Ｖ２７０Ｌ、Ｖ２７０Ｐ、Ｗ２４１Ｆ、Ｙ００６Ａ、Ｙ００６Ｍ、Ｙ００６Ｎ、Ｙ００６Ｒ、Ｙ００６Ｓ、Ｙ０２１Ｃ、Ｙ０９１Ｗ、Ｙ１０４Ｖ、Ｙ１０４Ｗ、Ｙ２６２Ｃ、Ｙ２６２Ｄ、Ｙ２６２Ｅ、Ｙ２６２Ｈ、Ｙ２６２Ｉ、Ｙ２６２Ｒ、及びＹ２６２Ｖからなる群から選択された少なくとも１つの変異含む。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上し得、かつ／あるいは、ＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい場合がある。本発明は、本ＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、タンパク質分解活性を有する、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して約０．９のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１、２、３、４、５又は６以上のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３１９】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４の試験方法３のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．５以上０．９未満のＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ２４Ｇ−Ｓ５３Ｇ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、Ａ００１Ｄ、Ａ００１Ｈ、Ａ００１Ｎ、Ａ０１５Ｃ、Ａ０４８Ｃ、Ａ０４８Ｅ、Ａ０８５Ｔ、Ａ１３３Ｒ、Ａ１３７Ｒ、Ａ１４２Ｃ、Ａ１４４Ｄ、Ａ１４４Ｒ、Ａ１５２Ｓ、Ａ１５３Ｇ、Ａ１８７Ｐ、Ａ１８７Ｑ、Ａ１８７Ｔ、Ａ１８７Ｖ、Ａ２１６Ｒ、Ａ２３０Ｓ、Ａ２７２Ｒ、Ａ２７３Ｈ、Ａ２７３Ｔ、Ａ２７４Ｈ、Ｄ０３６Ｎ、Ｄ０３６Ｓ、Ｄ１８１Ｈ、Ｄ１８１Ｔ、Ｄ２５９Ｎ、Ｄ２５９Ｐ、Ｄ２５９Ｓ、Ｅ１５６Ｇ、Ｅ１５６Ｈ、Ｅ１５６Ｌ、Ｅ１５６Ｑ、Ｅ１５６Ｖ、Ｅ２５１Ｃ、Ｆ１８９Ｓ、Ｆ１８９Ｔ、Ｆ１８９Ｗ、Ｆ１８９Ｙ、Ｆ２６１Ｅ、Ｇ０２０Ｃ、Ｇ０２４Ｄ、Ｇ０５３Ｍ、Ｇ０５３Ｒ、Ｇ０９７Ｒ、Ｇ１３１Ｄ、Ｇ１３１Ｒ、Ｇ１５７Ｎ、Ｇ１６０Ｒ、Ｇ１６０Ｖ、Ｇ１６６Ｌ、Ｇ１６６Ｗ、Ｇ２１１Ｅ、Ｇ２１５Ｄ、Ｇ２５８Ａ、Ｇ２５８Ｄ、Ｇ２５８Ｐ、Ｉ０１１Ｔ、Ｉ０３１Ｃ、Ｉ０７９Ｅ、Ｉ０７９Ｒ、Ｉ１７５Ｌ、Ｉ２０５Ｃ、Ｋ０１２Ｈ、Ｋ０１２Ｎ、Ｋ０２７Ａ、Ｋ０２７Ｎ、Ｋ０２７Ｓ、Ｋ０４３Ａ、Ｋ０４３Ｄ、Ｋ０４３Ｅ、Ｋ０４３Ｇ、Ｋ０４３Ｌ、Ｋ０４３Ｍ、Ｋ０４３Ｐ、Ｋ０４３Ｖ、Ｋ０４３Ｗ、Ｋ０４３Ｙ、Ｋ１３６Ｈ、Ｋ１４１Ｈ、Ｋ１４１Ｌ、Ｋ１４１Ｍ、Ｋ１４１Ｎ、Ｋ１４１Ｑ、Ｋ１４１Ｔ、Ｋ１４１Ｖ、Ｋ１７０Ｇ、Ｋ１７０Ｓ、Ｋ２３７Ｔ、Ｋ２３７Ｖ、Ｋ２５６Ｄ、Ｋ２５６Ｓ、Ｋ２５６Ｔ、Ｋ２５６Ｖ、Ｋ２６５Ｎ、Ｋ２６５Ｓ、Ｌ０４２Ｆ、Ｌ０４２Ｍ、Ｌ０８２Ｅ、Ｌ２０９Ａ、Ｌ２０９Ｅ、Ｌ２０９Ｇ、Ｌ２０９Ｒ、Ｌ２３３Ｇ、Ｌ２３５Ｖ、Ｌ２５７Ｄ、Ｌ２５７Ｅ、Ｌ２５７Ｐ、Ｌ２５７Ｒ、Ｌ２５７Ｗ、Ｌ２６７Ｅ、Ｍ０５０Ｌ、Ｎ０５６Ｄ、Ｎ０５６Ｓ、Ｎ０６１Ｃ、Ｎ０６１Ｄ、Ｎ０６２Ａ、Ｎ０６２Ｈ、Ｎ０６２Ｌ、Ｎ０６２Ｖ、Ｎ０６２Ｙ、Ｎ０７６Ｄ、Ｎ０７６Ｌ、Ｎ０７６Ｍ、Ｎ０７８Ｄ、Ｎ０７８Ｆ、Ｎ１０１Ｄ、Ｎ１０１Ｒ、Ｎ１１８Ａ、Ｎ２１２Ｃ、Ｎ２１２Ｅ、Ｎ２１８Ｃ、Ｎ２１８Ｄ、Ｎ２１８Ｅ、Ｎ２５２Ｄ、Ｎ２５２Ｅ、Ｐ０１４Ｆ、Ｐ０１４Ｋ、Ｐ０５７Ａ、Ｐ０５７Ｗ、Ｐ１７２Ｒ、Ｐ１９４Ｅ、Ｐ２０１Ｔ、Ｐ２１０Ｅ、Ｑ０５９Ｃ、Ｑ０５９Ｄ、Ｑ０５９Ｒ、Ｑ１８５Ｅ、Ｑ２０６Ｄ、Ｑ２１７Ａ、Ｑ２１７Ｋ、Ｑ２１７Ｒ、Ｑ２４５Ａ、Ｑ２４５Ｄ、Ｑ２４５Ｅ、Ｑ２４５Ｈ、Ｑ２４５Ｒ、Ｑ２７１Ｅ、Ｑ２７１Ｆ、Ｑ２７１Ｒ、Ｑ２７１Ｗ、Ｑ２７５Ｇ、Ｑ２７５Ｉ、Ｒ１８６Ｉ、Ｒ１８６Ｌ、Ｒ１８６Ｖ、Ｒ１８６Ｗ、Ｓ００３Ｅ、Ｓ００９Ｃ、Ｓ００９Ｅ、Ｓ０１８Ｃ、Ｓ０３７Ｄ、Ｓ０３７Ｅ、Ｓ０３７Ｈ、Ｓ０３７Ｒ、Ｓ０３７Ｙ、Ｓ０３８Ｄ、Ｓ０３８Ｐ、Ｓ０３８Ｒ、Ｓ０３８Ｙ、Ｓ０６３Ｌ、Ｓ０８７Ｄ、Ｓ０８７Ｒ、Ｓ０８９Ｃ、Ｓ０８９Ｅ、Ｓ１３０Ｃ、Ｓ１３０Ｒ、Ｓ１４５Ｄ、Ｓ１５９Ｃ、Ｓ１５９Ｐ、Ｓ１６１Ｃ、Ｓ１７３Ｔ、Ｓ１８２Ｃ、Ｓ１８８Ｅ、Ｓ１８８Ｆ、Ｓ１８８Ｋ、Ｓ１８８Ｌ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１８８Ｗ���Ｓ１９０Ａ、Ｓ１９０Ｇ、Ｓ１９０Ｔ、Ｓ２０４Ｒ、Ｓ２３６Ｄ、Ｓ２３６Ｅ、Ｓ２４８Ｃ、Ｓ２４８Ｅ、Ｓ２６０Ｃ、Ｓ２６０Ｅ、Ｓ２６０Ｒ、Ｔ０２２Ｐ、Ｔ０５５Ｃ、Ｔ０５５Ｗ、Ｔ０７１Ａ、Ｔ１５８Ｄ、Ｔ１５８Ｅ、Ｔ１５８Ｐ、Ｔ１５８Ｒ、Ｔ１５８Ｙ、Ｔ１６４Ｒ、Ｔ２４２Ｄ、Ｔ２４２Ｇ、Ｔ２５５Ｃ、Ｖ００４Ｅ、Ｖ００４Ｔ、Ｖ０４５Ｃ、Ｖ０４５Ｄ、Ｖ０４５Ｒ、Ｖ０４５Ｔ、Ｖ０５１Ｈ、Ｖ０８１Ｒ、Ｖ１４３Ｃ、Ｖ１４３Ｅ、Ｖ１４３Ｇ、Ｖ１９２Ｇ、Ｖ２０３Ｃ、Ｖ２０３Ｄ、Ｖ２０３Ｅ、Ｖ２０３Ｍ、Ｖ２０３Ｒ、Ｖ２７０Ｇ、Ｗ２４１Ｌ、Ｙ２１４Ｈ、Ｙ２１４Ｑ、Ａ００１Ｅ、Ａ１３３Ｅ、Ａ１８７Ｌ、Ａ１８７Ｎ、Ａ２１６Ｃ、Ａ２１６Ｈ、Ａ２７３Ｑ、Ｄ０９９Ｈ、Ｄ２５９Ｈ、Ｅ１５６Ｃ、Ｅ１９５Ｇ、Ｆ１８９Ｈ、Ｇ１３１Ｃ、Ｇ１４６Ａ、Ｇ１６６Ｖ、Ｇ２１５Ｃ、Ｇ２１５Ｅ、Ｉ１０７Ｌ、Ｋ０１２Ａ、Ｋ０１２Ｓ、Ｋ０１２Ｔ、Ｋ０４３Ｃ、Ｋ１７０Ｃ、Ｋ２５６Ｃ、Ｋ２５６Ｅ、Ｋ２６５Ｇ、Ｋ２６５Ｙ、Ｌ２３３Ｅ、Ｍ２２２Ｆ、Ｍ２２２Ｓ、Ｎ０６２Ｑ、Ｎ０７６Ｅ、Ｎ０７８Ｅ、Ｎ１８４Ｐ、Ｎ２１８Ｒ、Ｐ００５Ｖ、Ｐ０１４Ｄ、Ｑ００２Ｋ、Ｑ００２Ｌ、Ｑ００２Ｒ、Ｑ０１０Ｗ、Ｑ２７１Ｃ、Ｒ１８６Ｈ、Ｓ０４９Ｃ、Ｓ０６３Ｃ、Ｓ０６３Ｄ、Ｓ１０５Ｔ、Ｓ１８８Ｃ、Ｓ１９０Ｃ、Ｓ２０４Ｅ、Ｔ０５５Ｒ、Ｔ１６４Ｇ、Ｖ００４Ｄ、Ｖ０４４Ｔ、Ｖ０４５Ｉ、Ｖ１６５Ｃ、Ｖ１８０Ｓ、Ｙ００６Ｃ、Ｙ００６Ｄ、Ｙ００６Ｅ、Ｙ１０４Ｔ、Ａ００１Ｃ、Ａ１８７Ｃ、Ａ２３０Ｇ、Ａ２７３Ｄ、Ａ２７３Ｐ、Ｄ０３６Ｑ、Ｆ１８９Ｇ、Ｆ１８９Ｌ、Ｆ１８９Ｒ、Ｇ１５７Ｔ、Ｇ１７８Ａ、Ｉ０３１Ｆ、Ｉ１１１Ｍ、Ｋ０１２Ｆ、Ｋ０１２Ｌ、Ｋ０２７Ｔ、Ｋ０４３Ｒ、Ｋ１３６Ｇ、Ｋ１４１Ｇ、Ｋ１７０Ｑ、Ｍ２２２Ａ、Ｍ２２２Ｌ、Ｎ０６２Ｒ、Ｎ１１７Ｇ、Ｎ２６９Ｃ、Ｐ００５Ｗ、Ｐ１２９Ｖ、Ｐ２３９Ａ、Ｐ２３９Ｈ、Ｐ２３９Ｔ、Ｑ０５９Ｗ、Ｑ２１７Ｇ、Ｑ２７５Ａ、Ｒ１８６Ａ、Ｓ１９１Ｇ、Ｔ１６４Ａ、Ｔ２２０Ａ、Ａ００１Ｐ、Ａ１８７Ｆ、Ａ１８７Ｗ、Ａ２７３Ｒ、Ｄ０４１Ｃ、Ｄ０６０Ｇ、Ｄ１９７Ｔ、Ｆ１８９Ａ、Ｇ０４６Ｄ、Ｇ１５７Ｐ、Ｋ０１２Ｃ、Ｋ０１２Ｅ、Ｋ０１２Ｗ、Ｌ０４２Ｃ、Ｍ２２２Ｔ、Ｎ０６２Ｃ、Ｐ２３９Ｇ、Ｐ２３９Ｎ、Ｑ２１７Ｃ、Ｒ１８６Ｍ、Ｓ０４９Ｔ、Ｓ０８９Ｐ、Ｓ１２５Ａ、Ｓ１７３Ｖ、及びＶ０４４Ａからなる群から選択された少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、タンパク質分解活性を有する、及び／又は本ＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイ（試験法３）において、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．５以上０．９未満のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１、２、３、４、５又は６以上のアミノ酸置換を含むものである。ここで、���異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３２０】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４の卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して、１．０超、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．０超〜約１０、１．０超〜約８、又は１．０超〜約５のＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、Ａ２１６Ｅ、Ｌ０９０Ｉ、Ａ０９８Ｒ、Ａ０９８Ｗ、Ａ０９８Ｙ、Ａ１１６Ｇ、Ａ１１６Ｒ、Ａ１１６Ｓ、Ａ１３３Ｍ、Ｉ１０７Ｌ、Ｉ１１５Ｖ、Ｍ１２４Ｌ、Ｎ１０１Ｉ、Ｎ１０９Ｈ、Ｎ１０９Ｓ、Ｎ１０９Ｔ、Ｎ１１７Ｒ、Ｐ００５Ｇ、Ｑ１８５Ｌ、Ｓ０８９Ｖ、Ｖ０９５Ａ、Ａ０１５Ｙ、Ａ０２９Ｇ、Ａ０９８Ｄ、Ａ０９８Ｅ、Ａ０９８Ｇ、Ａ０９８Ｎ、Ａ０９８Ｓ、Ａ０９８Ｔ、Ａ０９８Ｖ、Ａ１１４Ｓ、Ａ１１４Ｔ、Ａ１１６Ｅ、Ａ１１６Ｌ、Ａ１１６Ｔ、Ａ１１６Ｖ、Ａ１３３Ｈ、Ａ１３３Ｌ、Ａ１３３Ｓ、Ａ１３７Ｇ、Ａ１３７Ｉ、Ａ１３７Ｌ、Ａ１３７Ｓ、Ａ１３７Ｖ、Ａ１３８Ｓ、Ａ１４４Ｓ、Ａ１４４Ｖ、Ａ１７６Ｓ、Ａ１７６Ｔ、Ａ１８７Ｔ、Ａ２１６Ｆ、Ａ２１６Ｐ、Ａ２１６Ｑ、Ａ２１６Ｒ、Ａ２１６Ｓ、Ａ２１６Ｔ、Ａ２１６Ｖ、Ａ２１６Ｙ、Ｄ０４１Ｅ、Ｄ１２０Ａ、Ｄ１２０Ｅ、Ｄ１２０Ｑ、Ｄ１２０Ｒ、Ｄ１２０Ｓ、Ｄ１８１Ｓ、Ｇ０２０Ａ、Ｇ０２０Ｓ、Ｇ０２４Ａ、Ｇ０９７Ａ、Ｇ０９７Ｄ、Ｇ０９７Ｓ、Ｇ１３１Ｑ、Ｇ１６０Ｓ、Ｇ１６６Ｉ、Ｇ２１１Ｌ、Ｇ２１５Ｎ、Ｈ０３９Ｎ、Ｈ２３８Ｎ、Ｉ１１１Ｌ、Ｉ１１１Ｖ、Ｉ１２２Ａ、Ｌ０７５Ｉ、Ｌ０７５Ｑ、Ｌ１３５Ｍ、Ｌ２０９Ｔ、Ｌ２０９Ｖ、Ｌ２３３Ｖ、Ｌ２３５Ｍ、Ｌ２３５Ｒ、Ｌ２５７Ａ、Ｍ１１９Ｉ、Ｎ０２５Ａ、Ｎ０２５Ｇ、Ｎ０２５Ｔ、Ｎ０６１Ｋ、Ｎ１０１Ｆ、Ｎ１０１Ｈ、Ｎ１０１Ｌ、Ｎ１０１Ｑ、Ｎ１０１Ｒ、Ｎ１０１Ｓ、Ｎ１０１Ｔ、Ｎ１０９Ａ、Ｎ１０９Ｇ、Ｎ１０９Ｋ、Ｎ１０９Ｌ、Ｎ１１７Ｅ、Ｎ１１７Ｈ、Ｎ１１７Ｋ、Ｎ１１７Ｓ、Ｎ２１２Ｇ、Ｎ２１２Ｓ、Ｎ２１８Ｆ、Ｎ２１８Ｇ、Ｎ２１８Ｈ、Ｎ２１８Ｌ、Ｎ２１８Ｓ、Ｎ２１８Ｗ、Ｎ２４０Ｑ、Ｎ２５２Ｍ、Ｎ２５２Ｒ、Ｎ２５２Ｓ、Ｐ００５Ｔ、Ｐ０４０Ａ、Ｐ０４０Ｇ、Ｐ０４０Ｔ、Ｐ１２９Ｄ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１９４Ｓ、Ｐ２１０Ｒ、Ｑ０１９Ｒ、Ｑ０１９Ｗ、Ｑ１０３Ｌ、Ｑ１０３Ｗ、Ｑ１８５Ａ、Ｑ１８５Ｇ、Ｑ１８５Ｍ、Ｑ１８５Ｒ、Ｑ１８５Ｔ、Ｑ２０６Ｇ、Ｑ２０６Ｙ、Ｑ２１７Ａ、Ｑ２１７Ｅ、Ｑ２１７Ｒ、Ｑ２１７Ｓ、Ｑ２１７Ｔ、Ｓ００３Ｑ、Ｓ００９Ｈ、Ｓ０１８Ｍ、Ｓ０３３Ｔ、Ｓ１３０Ａ、Ｓ１３０Ｆ、Ｓ１３０Ｇ、Ｓ１３０Ｔ、Ｓ１３０Ｖ、Ｓ１４５Ｔ、Ｓ１５９Ａ、Ｓ１６１Ｎ、Ｓ１６１Ｔ、Ｓ１６２Ｖ、Ｓ１６２Ｙ、Ｓ１８２Ｌ、Ｓ１８２Ｗ、Ｓ１８３Ｆ、Ｓ１８３Ｌ、Ｓ１８３Ｖ、Ｓ１８３Ｗ、Ｓ１８８Ｋ、Ｓ１８８Ｗ、Ｓ２３６Ｑ、Ｓ２３６Ｔ、Ｓ２４８Ｌ、Ｔ０２２Ｈ、Ｔ０２２Ｋ、Ｔ２０８Ｃ、Ｔ２５３Ｈ、Ｔ２５５Ｖ、Ｖ０４４Ｉ、Ｖ１２１Ｉ、Ｖ１３９Ｃ、Ｖ１４３Ｈ、Ｖ１４３Ｑ、Ｖ１４３Ｔ、Ｖ１���３Ｗ、Ｖ１４３Ｙ、Ｙ００６Ｋ、Ｙ０２１Ａ、Ｙ１０４Ｗ、Ａ００１Ｆ、Ａ００１Ｇ、Ａ００１Ｈ、Ａ００１Ｋ、Ａ００１Ｌ、Ａ００１Ｑ、Ａ００１Ｓ、Ａ００１Ｙ、Ａ０１３Ｖ、Ａ０１５Ｇ、Ａ０１５Ｋ、Ａ０１５Ｒ、Ａ０１５Ｓ、Ａ０１５Ｔ、Ａ０１５Ｗ、Ａ０４８Ｓ、Ａ０７３Ｎ、Ａ０７３Ｓ、Ａ０９２Ｓ、Ａ０９８Ｋ、Ａ０９８Ｐ、Ａ１１６Ｄ、Ａ１１６Ｗ、Ａ１２８Ｓ、Ａ１３３Ｐ、Ａ１３３Ｔ、Ａ１３３Ｖ、Ａ１３４Ｇ、Ａ１３４Ｓ、Ａ１３７Ｈ、Ａ１３７Ｎ、Ａ１３７Ｔ、Ａ１４４Ｄ、Ａ１４４Ｋ、Ａ１４４Ｌ、Ａ１４４Ｍ、Ａ１４４Ｎ、Ａ１４４Ｒ、Ａ１７９Ｇ、Ａ１７９Ｓ、Ａ１８７Ｖ、Ａ２１６Ｇ、Ａ２１６Ｌ、Ａ２１６Ｗ、Ａ２２３Ｓ、Ａ２３０Ｃ、Ａ２７２Ｋ、Ａ２７２Ｌ、Ａ２７２Ｐ、Ａ２７２Ｓ、Ａ２７２Ｔ、Ａ２７２Ｗ、Ａ２７３Ｇ、Ａ２７３Ｓ、Ａ２７４Ｇ、Ａ２７４Ｍ、Ａ２７４Ｔ、Ｄ１２０Ｋ、Ｄ１４０Ｅ、Ｄ１８１Ａ、Ｄ１８１Ｅ、Ｄ１８１Ｇ、Ｄ１８１Ｈ、Ｄ１８１Ｔ、Ｄ２５９Ｅ、Ｄ２５９Ｎ、Ｄ２５９Ｑ、Ｅ０５４Ｄ、Ｅ１５６Ｄ、Ｅ１５６Ｔ、Ｅ２５１Ｌ、Ｅ２５１Ｔ、Ｅ２５１Ｖ、Ｆ０５８Ｙ、Ｆ１８９Ｗ、Ｆ２６１Ｋ、Ｆ２６１Ｑ、Ｆ２６１Ｒ、Ｇ００７Ａ、Ｇ００７Ｓ、Ｇ０２０Ｆ、Ｇ０２０Ｈ、Ｇ０２０Ｎ、Ｇ０２０Ｑ、Ｇ０２０Ｔ、Ｇ０２０Ｙ、Ｇ０２４Ｆ、Ｇ０２４Ｑ、Ｇ０２４Ｒ、Ｇ０２４Ｔ、Ｇ０２４Ｖ、Ｇ０２４Ｗ、Ｇ０２４Ｙ、Ｇ０５３Ｔ、Ｇ０９７Ｋ、Ｇ０９７Ｍ、Ｇ０９７Ｒ、Ｇ０９７Ｔ、Ｇ１３１Ａ、Ｇ１３１Ｈ、Ｇ１３１Ｐ、Ｇ１３１Ｒ、Ｇ１３１Ｔ、Ｇ１３１Ｖ、Ｇ１６０Ｈ、Ｇ１６０Ｔ、Ｇ１６６Ｃ、Ｇ１６６Ｑ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６６Ｔ、Ｇ２１１Ａ、Ｇ２１１Ｄ、Ｇ２１１Ｋ、Ｇ２１１Ｍ、Ｇ２１１Ｎ、Ｇ２１１Ｑ、Ｇ２１１Ｒ、Ｇ２１１Ｖ、Ｇ２１１Ｗ、Ｇ２１５Ｓ、Ｇ２１５Ｔ、Ｇ２１５Ｗ、Ｈ０１７Ｔ、Ｈ０１７Ｗ、Ｈ０１７Ｙ、Ｈ０３９Ｖ、Ｈ２２６Ａ、Ｈ２２６Ｆ、Ｈ２２６Ｉ、Ｈ２２６Ｌ、Ｈ２２６Ｍ、Ｈ２２６Ｖ、Ｉ０３５Ｖ、Ｉ０７９Ａ、Ｉ０７９Ｓ、Ｉ１０８Ｖ、Ｉ２０５Ｖ、Ｉ２３４Ｌ、Ｉ２３４Ｖ、Ｉ２６８Ｖ、Ｋ０１２Ｓ、Ｋ０４３Ｐ、Ｋ１３６Ｈ、Ｋ１３６Ｒ、Ｋ１４１Ａ、Ｋ１４１Ｆ、Ｋ１４１Ｔ、Ｋ１４１Ｗ、Ｋ１７０Ａ、Ｋ１７０Ｇ、Ｋ１７０Ｒ、Ｋ２１３Ａ、Ｋ２１３Ｒ、Ｋ２１３Ｓ、Ｋ２３７Ａ、Ｋ２３７Ｈ、Ｋ２３７Ｌ、Ｋ２３７Ｓ、Ｋ２３７Ｖ、Ｋ２５６Ａ、Ｋ２５６Ｇ、Ｋ２５６Ｈ、Ｋ２５６Ｍ、Ｋ２５６Ｐ、Ｋ２５６Ｑ、Ｋ２５６Ｒ、Ｌ０１６Ａ、Ｌ０１６Ｑ、Ｌ０１６Ｔ、Ｌ０１６Ｖ、Ｌ０４２Ｖ、Ｌ０７５Ｍ、Ｌ０７５Ｔ、Ｌ０８２Ｍ、Ｌ０８２Ｖ、Ｌ１３５Ｆ、Ｌ１９６Ｉ、Ｌ２０９Ｈ、Ｌ２０９Ｑ、Ｌ２０９Ｒ、Ｌ２０９Ｓ、Ｌ２０９Ｗ、Ｌ２３３Ａ、Ｌ２３３Ｍ、Ｌ２３３Ｑ、Ｌ２３５Ｉ、Ｌ２３５Ｋ、Ｌ２５０Ｉ、Ｌ２５７Ｓ、Ｌ２５７Ｔ、Ｌ２５７Ｖ、Ｌ２６７Ａ、Ｌ２６７Ｑ、Ｌ２６７Ｔ、Ｌ２６７Ｖ、Ｍ１１９Ｃ、Ｍ１９９Ｖ、Ｎ０２５Ｃ、Ｎ０２５Ｅ、Ｎ０２５Ｆ、Ｎ０２５Ｉ、Ｎ０２５Ｋ、Ｎ０２５Ｌ、Ｎ０２５Ｍ、Ｎ０２５Ｑ、Ｎ０２５Ｖ、Ｎ０２５Ｙ、Ｎ０６１Ｆ、Ｎ０６１Ｐ、Ｎ０６１Ｓ、Ｎ０６１Ｔ、Ｎ０７６Ｇ、Ｎ０７８Ｓ、Ｎ１０１Ａ、Ｎ１０９Ｍ、Ｎ１０９Ｑ、Ｎ１０９Ｒ、Ｎ１１７Ａ、Ｎ１１７Ｍ、Ｎ１１７Ｑ、Ｎ１１８Ｄ、Ｎ１１８Ｇ、Ｎ１１８Ｈ���Ｎ１１８Ｑ、Ｎ１１８Ｒ、Ｎ１１８Ｓ、Ｎ１８４Ａ、Ｎ１８４Ｃ、Ｎ１８４Ｇ、Ｎ１８４Ｌ、Ｎ１８４Ｒ、Ｎ１８４Ｓ、Ｎ１８４Ｔ、Ｎ１８４Ｖ、Ｎ１８４Ｗ、Ｎ２１２Ｃ、Ｎ２１２Ｆ、Ｎ２１２Ｉ、Ｎ２１２Ｋ、Ｎ２１２Ｌ、Ｎ２１２Ｐ、Ｎ２１２Ｑ、Ｎ２１２Ｒ、Ｎ２１２Ｖ、Ｎ２１２Ｗ、Ｎ２１２Ｙ、Ｎ２１８Ａ、Ｎ２１８Ｐ、Ｎ２１８Ｔ、Ｎ２４０Ａ、Ｎ２４０Ｅ、Ｎ２４０Ｇ、Ｎ２４０Ｈ、Ｎ２４０Ｌ、Ｎ２４０Ｒ、Ｎ２４０Ｓ、Ｎ２４０Ｔ、Ｎ２４３Ｃ、Ｎ２４３Ｑ、Ｎ２４３Ｔ、Ｎ２４３Ｖ、Ｎ２５２Ａ、Ｎ２５２Ｇ、Ｎ２５２Ｋ、Ｎ２５２Ｑ、Ｐ０１４Ｇ、Ｐ０１４Ｑ、Ｐ０１４Ｒ、Ｐ０１４Ｓ、Ｐ０１４Ｔ、Ｐ０４０Ｆ、Ｐ０４０Ｌ、Ｐ０４０Ｑ、Ｐ０４０Ｓ、Ｐ０４０Ｖ、Ｐ０８６Ｃ、Ｐ０８６Ｈ、Ｐ０８６Ｓ、Ｐ１２９Ａ、Ｐ１２９Ｅ、Ｐ１２９Ｇ、Ｐ１２９Ｋ、Ｐ１２９Ｒ、Ｐ１７２Ａ、Ｐ１７２Ｋ、Ｐ１７２Ｑ、Ｐ１７２Ｓ、Ｐ１９４Ａ、Ｐ１９４Ｇ、Ｐ１９４Ｈ、Ｐ１９４Ｌ、Ｐ１９４Ｍ、Ｐ１９４Ｑ、Ｐ１９４Ｒ、Ｐ１９４Ｖ、Ｐ１９４Ｗ、Ｐ１９４Ｙ、Ｐ２１０Ａ、Ｐ２１０Ｇ、Ｐ２１０Ｌ、Ｐ２１０Ｓ、Ｐ２３９Ｋ、Ｐ２３９Ｒ、Ｑ００２Ａ、Ｑ００２Ｓ、Ｑ０１０Ａ、Ｑ０１０Ｎ、Ｑ０１０Ｒ、Ｑ０１０Ｔ、Ｑ０１９Ａ、Ｑ０１９Ｃ、Ｑ０１９Ｄ、Ｑ０１９Ｇ、Ｑ０１９Ｓ、Ｑ０１９Ｔ、Ｑ０１９Ｖ、Ｑ０５９Ｉ、Ｑ０５９Ｖ、Ｑ１０３Ｓ、Ｑ１８５Ｆ、Ｑ１８５Ｈ、Ｑ１８５Ｉ、Ｑ１８５Ｋ、Ｑ１８５Ｎ、Ｑ１８５Ｓ、Ｑ１８５Ｙ、Ｑ２０６Ｈ、Ｑ２０６Ｌ、Ｑ２０６Ｐ、Ｑ２０６Ｗ、Ｑ２１７Ｆ、Ｑ２１７Ｈ、Ｑ２１７Ｉ、Ｑ２１７Ｋ、Ｑ２１７Ｌ、Ｑ２１７Ｎ、Ｑ２１７Ｖ、Ｑ２７１Ｇ、Ｑ２７１Ｒ、Ｑ２７１Ｔ、Ｑ２７５Ｆ、Ｑ２７５Ｐ、Ｑ２７５Ｒ、Ｒ１８６Ａ、Ｒ１８６Ｉ、Ｒ１８６Ｋ、Ｓ００３Ａ、Ｓ００３Ｆ、Ｓ００３Ｇ、Ｓ００３Ｈ、Ｓ００３Ｋ、Ｓ００３Ｒ、Ｓ００３Ｔ、Ｓ００９Ｔ、Ｓ０１８Ｎ、Ｓ０１８Ｔ、Ｓ０３７Ｇ、Ｓ０３７Ｔ、Ｓ０３７Ｖ、Ｓ０３８Ｇ、Ｓ０３８Ｑ、Ｓ０６３Ｎ、Ｓ０６３Ｑ、Ｓ０６３Ｔ、Ｓ０８９Ｍ、Ｓ０８９Ｎ、Ｓ１３０Ｋ、Ｓ１３０Ｌ、Ｓ１３０Ｒ、Ｓ１３０Ｗ、Ｓ１３２Ｎ、Ｓ１４５Ｇ、Ｓ１４５Ｋ、Ｓ１４５Ｍ、Ｓ１４５Ｒ、Ｓ１４５Ｖ、Ｓ１５９Ｃ、Ｓ１５９Ｈ、Ｓ１５９Ｌ、Ｓ１５９Ｑ、Ｓ１５９Ｒ、Ｓ１５９Ｔ、Ｓ１５９Ｗ、Ｓ１６１Ａ、Ｓ１６１Ｃ、Ｓ１６１Ｇ、Ｓ１６１Ｈ、Ｓ１６１Ｉ、Ｓ１６１Ｋ、Ｓ１６１Ｐ、Ｓ１６１Ｑ、Ｓ１６１Ｒ、Ｓ１６２Ｆ、Ｓ１６２Ｇ、Ｓ１６２Ｉ、Ｓ１６２Ｌ、Ｓ１６２Ｍ、Ｓ１６２Ｎ、Ｓ１６２Ｐ、Ｓ１６２Ｒ、Ｓ１６３Ｇ、Ｓ１７３Ａ、Ｓ１７３Ｇ、Ｓ１８２Ｆ、Ｓ１８２Ｇ、Ｓ１８２Ｋ、Ｓ１８２Ｎ、Ｓ１８２Ｑ、Ｓ１８２Ｖ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１８３Ｍ、Ｓ１８３Ｑ、Ｓ１８３Ｒ、Ｓ１８３Ｔ、Ｓ１８８Ａ、Ｓ１８８Ｆ、Ｓ１８８Ｇ、Ｓ１８８Ｐ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１８８Ｔ、Ｓ１８８Ｖ、Ｓ１９０Ｃ、Ｓ２０４Ａ、Ｓ２０４Ｇ、Ｓ２０４Ｉ、Ｓ２０４Ｌ、Ｓ２０４Ｑ、Ｓ２０４Ｒ、Ｓ２０４Ｖ、Ｓ２０７Ｇ、Ｓ２２４Ａ、Ｓ２２４Ｔ、Ｓ２３６Ｃ、Ｓ２３６Ｄ、Ｓ２３６Ｅ、Ｓ２３６Ｇ、Ｓ２３６Ｎ、Ｓ２４８Ａ、Ｓ２４８Ｆ、Ｓ２４８Ｋ、Ｓ２４８Ｍ、Ｓ２４８Ｔ、Ｓ２４９Ａ、Ｓ２４９Ｒ、Ｓ２４９Ｔ、Ｓ２４９Ｖ、Ｓ２４９Ｗ、Ｓ２４９Ｙ、Ｓ２６０Ｇ、Ｓ２６０Ｈ、Ｓ２���０Ｋ、Ｓ２６０Ｎ、Ｔ０２２Ａ、Ｔ０２２Ｇ、Ｔ０２２Ｑ、Ｔ０２２Ｓ、Ｔ０２２Ｖ、Ｔ０２２Ｙ、Ｔ０５５Ａ、Ｔ０５５Ｋ、Ｔ１５８Ａ、Ｔ１５８Ｓ、Ｔ２０８Ｌ、Ｔ２０８Ｓ、Ｔ２０８Ｖ、Ｔ２２０Ｓ、Ｔ２４２Ｄ、Ｔ２４２Ｎ、Ｔ２４２Ｓ、Ｔ２４４Ｅ、Ｔ２４４Ｇ、Ｔ２４４Ｉ、Ｔ２４４Ｒ、Ｔ２４４Ｖ、Ｔ２４４Ｗ、Ｔ２５３Ａ、Ｔ２５３Ｇ、Ｔ２５３Ｎ、Ｔ２５３Ｓ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５４Ｖ、Ｔ２５５Ｈ、Ｔ２５５Ｉ、Ｔ２５５Ｋ、Ｔ２５５Ｌ、Ｔ２５５Ｑ、Ｔ２５５Ｒ、Ｔ２５５Ｓ、Ｔ２５５Ｙ、Ｖ００４Ａ、Ｖ００４Ｎ、Ｖ００４Ｐ、Ｖ００４Ｗ、Ｖ００８Ａ、Ｖ００８Ｍ、Ｖ０２６Ｉ、Ｖ０４５Ｓ、Ｖ０４５Ｗ、Ｖ０５１Ｉ、Ｖ０８１Ｑ、Ｖ０８１Ｔ、Ｖ０８４Ｃ、Ｖ０９３Ｉ、Ｖ０９５Ｃ、Ｖ１４３Ａ、Ｖ１４３Ｅ、Ｖ１４３Ｆ、Ｖ１４３Ｎ、Ｖ１４３Ｓ、Ｖ１４７Ｉ、Ｖ１４７Ｌ、Ｖ１４７Ｓ、Ｖ１４７Ｔ、Ｖ１４８Ｉ、Ｖ１４９Ｃ、Ｖ１４９Ｉ、Ｖ１６５Ｍ、Ｖ１８０Ａ、Ｖ１８０Ｃ、Ｖ１８０Ｉ、Ｖ１８０Ｌ、Ｖ１８０Ｔ、Ｖ１９２Ａ、Ｖ１９２Ｃ、Ｖ１９２Ｉ、Ｖ１９２Ｓ、Ｖ１９２Ｔ、Ｖ１９２Ｙ、Ｖ１９８Ｌ、Ｖ２０３Ａ、Ｖ２０３Ｆ、Ｖ２０３Ｋ、Ｖ２０３Ｌ、Ｖ２０３Ｍ、Ｖ２０３Ｎ、Ｖ２０３Ｙ、Ｗ２４１Ｙ、Ｙ００６Ａ、Ｙ００６Ｇ、Ｙ００６Ｈ、Ｙ００６Ｌ、Ｙ００６Ｎ、Ｙ００６Ｐ、Ｙ００６Ｑ、Ｙ００６Ｔ、Ｙ０２１Ｅ、Ｙ０２１Ｋ、Ｙ０２１Ｌ、Ｙ０２１Ｎ、Ｙ０２１Ｑ、Ｙ０２１Ｒ、Ｙ０２１Ｓ、Ｙ０２１Ｔ、Ｙ１０４Ｆ、Ｙ１０４Ｉ、Ｙ１０４Ｖ、Ｙ１７１Ｆ、Ｙ２１４Ｆ、Ｙ２１４Ｌ、Ｙ２１４Ｗ、Ｙ２６２Ｆ、及びＹ２６２Ｓからなる群から選択された少なくとも１つのアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい。本発明は、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、ＢＰＮ’−ｖ３及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較してタンパク質分解活性が向上している、及び／又は本卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して１．０超〜約５のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％
、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１、２、３、４、５又は６以上のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３２１】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４の卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して、約１．０のＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、ＢＰＮ’−ｖ３６、Ａ００１Ｄ、Ａ００１Ｍ、Ａ００１Ｎ、Ａ００１Ｒ、Ａ００１Ｔ、Ａ００１Ｖ、Ａ０１３Ｃ、Ａ０１３Ｇ、Ａ０１３Ｓ、Ａ０１５Ｄ、Ａ０１５Ｆ、Ａ０１５Ｌ、Ａ０１５Ｍ、Ａ０１５Ｐ、Ａ０１５Ｑ、Ａ０７４Ｇ、Ａ０７４Ｓ、Ａ０８５Ｓ、Ａ０８５Ｔ、Ａ０８５Ｖ、Ａ０８８Ｃ、Ａ０８８Ｌ、Ａ０８８Ｓ、Ａ０８８Ｔ、Ａ０８８Ｖ、Ａ１３３Ｅ、Ａ１３３Ｇ、Ａ１３３Ｒ、Ａ１３７Ｅ、Ａ１４４Ｇ、Ａ１４４Ｈ、Ａ１４４Ｑ、Ａ１４４Ｔ、Ａ１５１Ｃ、Ａ１５２Ｓ、Ａ１５３Ｇ、Ａ１５３Ｓ、Ａ１５３Ｖ、Ａ１７６Ｃ、Ａ１８７Ｇ、Ａ１８７Ｑ、Ａ１８７Ｓ、Ａ２００Ｇ、Ａ２２８Ｓ、Ａ２２８Ｔ、Ａ２３０Ｔ、Ａ２３０Ｖ、Ａ２３１Ｃ、Ａ２３１Ｖ、Ａ２３２Ｃ、Ａ２３２Ｖ、Ａ２７２Ｅ、Ａ２７２Ｇ、Ａ２７２Ｉ、Ａ２７２Ｑ、Ａ２７２Ｒ、Ａ２７３Ｌ、Ａ２７３Ｖ、Ａ２７４Ｌ、Ａ２７４Ｑ、Ａ２７４Ｒ、Ａ２７４Ｖ、Ｄ０３６Ｅ、Ｄ２５９Ａ、Ｄ２５９Ｇ、Ｄ２５９Ｐ、Ｄ２５９Ｓ、Ｄ２５９Ｔ、Ｅ１５６Ａ、Ｅ１５６Ｓ、Ｅ１５６Ｖ、Ｅ１９５Ｇ、Ｅ２５１Ｃ、Ｅ２５１Ｉ、Ｅ２５１Ｑ、Ｆ１８９Ｙ、Ｆ２６１Ａ、Ｆ２６１Ｇ、Ｆ２６１Ｈ、Ｆ２６１Ｌ、Ｆ２６１Ｐ、Ｆ２６１Ｓ、Ｆ２６１Ｔ、Ｆ２６１Ｖ、Ｆ２６１Ｗ、Ｇ０２０Ｃ、Ｇ０２０Ｄ、Ｇ０２０Ｅ、Ｇ０２０Ｌ、Ｇ０２０Ｒ、Ｇ０２４Ｄ、Ｇ０２４Ｉ、Ｇ０２４Ｎ、Ｇ０２４Ｐ、Ｇ０２４Ｓ、Ｇ０５３Ａ、Ｇ０５３Ｄ、Ｇ０５３Ｆ、Ｇ０５３Ｈ、Ｇ０５３Ｋ、Ｇ０５３Ｎ、Ｇ０５３Ｓ、Ｇ０５３Ｙ、Ｇ１５７Ａ、Ｇ１５７Ｓ、Ｇ１６０Ａ、Ｇ１６０Ｌ、Ｇ１６０Ｐ、Ｇ１６０Ｒ、Ｇ１６６Ａ、Ｇ１６６Ｌ、Ｇ１６６Ｖ、Ｇ１６６Ｗ、Ｇ１６９Ａ、Ｇ２１１Ｅ、Ｇ２１１Ｐ、Ｇ２１５Ａ、Ｇ２１５Ｄ、Ｇ２１５Ｅ、Ｇ２１５Ｈ、Ｇ２１５Ｖ、Ｇ２５８Ｄ、Ｇ２５８Ｓ、Ｈ０１７Ｆ、Ｈ０１７Ｉ、Ｈ０１７Ｌ、Ｈ０１７Ｍ、Ｈ０１７Ｖ、Ｈ０３９Ｃ、Ｈ２２６Ｓ、Ｈ２２６Ｙ、Ｉ０１１Ｔ、Ｉ０１１Ｖ、Ｉ０３１Ｃ、Ｉ０３１Ｌ、Ｉ０３１Ｖ、Ｉ０７９Ｆ、Ｉ０７９Ｋ、Ｉ０７９Ｌ、Ｉ０７９Ｍ、Ｉ０７９Ｑ、Ｉ０７９Ｒ、Ｉ０７９Ｔ、Ｉ０７９Ｖ、Ｉ０７９Ｗ、Ｉ１１５Ｌ、Ｉ２０５Ａ、Ｉ２０５Ｃ、Ｉ２６８Ｌ、Ｋ０１２Ｒ、Ｋ０１２Ｔ、Ｋ０２７Ｒ、Ｋ０４３Ａ、Ｋ０４３Ｅ、Ｋ０４３Ｆ、Ｋ０４３Ｈ、Ｋ０４３Ｉ、Ｋ０４３Ｍ、Ｋ０４３Ｎ、Ｋ０４３Ｑ、Ｋ０４３Ｔ、Ｋ０４３Ｖ、Ｋ０４３Ｙ、Ｋ１４１Ｈ、Ｋ１４１Ｑ、Ｋ１４１Ｖ、Ｋ１７０Ｓ、Ｋ２１３Ｇ、Ｋ２１３Ｈ、Ｋ２１３Ｉ、Ｋ２１３Ｌ、Ｋ２１３Ｎ、Ｋ２１３Ｑ、Ｋ２１３Ｔ、Ｋ２１３Ｗ、Ｋ２３７Ｉ、Ｋ２３７Ｎ、Ｋ２３７Ｒ、Ｋ２３７Ｔ、Ｋ２５６Ｃ、Ｋ２５６Ｅ、Ｋ２５６Ｓ、Ｋ２５６Ｔ、Ｋ２５６Ｖ、Ｋ２５６Ｗ、Ｋ２６５Ｈ、Ｋ２６５Ｒ、Ｌ０１６Ｅ、Ｌ０１６Ｆ、Ｌ０１６Ｉ、Ｌ０１６Ｓ、Ｌ０４２Ｉ、Ｌ０４２Ｍ、Ｌ０７５Ａ、Ｌ０７５Ｈ、Ｌ０７５Ｙ、Ｌ０８２Ｋ、Ｌ０８２Ｑ、Ｌ０８２Ｔ、Ｌ１９６Ｍ、Ｌ１９６Ｖ、���２０９Ａ、Ｌ２０９Ｃ、Ｌ２０９Ｅ、Ｌ２０９Ｇ、Ｌ２３５Ｗ、Ｌ２５７Ｃ、Ｌ２５７Ｈ、Ｌ２５７Ｑ、Ｌ２５７Ｙ、Ｌ２６７Ｅ、Ｌ２６７Ｆ、Ｌ２６７Ｒ、Ｌ２６７Ｓ、Ｍ０５０Ｙ、Ｎ０２５Ｈ、Ｎ０２５Ｐ、Ｎ０２５Ｓ、Ｎ０５６Ｄ、Ｎ０６１Ａ、Ｎ０６１Ｃ、Ｎ０６１Ｄ、Ｎ０６１Ｇ、Ｎ０６１Ｈ、Ｎ０６１Ｉ、Ｎ０６１Ｌ、Ｎ０６１Ｑ、Ｎ０６１Ｒ、Ｎ０６１Ｖ、Ｎ０６１Ｗ、Ｎ０６２Ａ、Ｎ０６２Ｓ、Ｎ０６２Ｖ、Ｎ０７６Ａ、Ｎ０７６Ｅ、Ｎ０７６Ｌ、Ｎ０７６Ｍ、Ｎ０７６Ｑ、Ｎ０７６Ｓ、Ｎ０７６Ｔ、Ｎ０７６Ｗ、Ｎ０７８Ｇ、Ｎ０７８Ｈ、Ｎ０７８Ｋ、Ｎ０７８Ｐ、Ｎ０７８Ｑ、Ｎ０７８Ｔ、Ｎ１０１Ｄ、Ｎ１１８Ａ、Ｎ１１８Ｔ、Ｎ１８４Ｅ、Ｎ１８４Ｈ、Ｎ１８４Ｉ、Ｎ２１２Ａ、Ｎ２１２Ｄ、Ｎ２１２Ｅ、Ｎ２１８Ｃ、Ｎ２１８Ｄ、Ｎ２１８Ｅ、Ｎ２１８Ｍ、Ｎ２１８Ｒ、Ｎ２１８Ｖ、Ｎ２４０Ｗ、Ｎ２４３Ａ、Ｎ２４３Ｇ、Ｎ２４３Ｐ、Ｎ２４３Ｓ、Ｎ２５２Ｄ、Ｎ２５２Ｅ、Ｎ２５２Ｌ、Ｎ２５２Ｔ、Ｎ２５２Ｖ、Ｎ２６９Ｓ、Ｐ００５Ａ、Ｐ００５Ｄ、Ｐ００５Ｍ、Ｐ００５Ｑ、Ｐ０１４Ａ、Ｐ０１４Ｄ、Ｐ０１４Ｆ、Ｐ０１４Ｍ、Ｐ０１４Ｖ、Ｐ０４０Ｈ、Ｐ０４０Ｒ、Ｐ０４０Ｗ、Ｐ０４０Ｙ、Ｐ０８６Ａ、Ｐ１２９Ｔ、Ｐ１７２Ｅ、Ｐ１７２Ｇ、Ｐ１７２Ｒ、Ｐ１９４Ｅ、Ｐ２０１Ａ、Ｐ２０１Ｇ、Ｐ２１０Ｅ、Ｐ２１０Ｖ、Ｑ００２Ｅ、Ｑ００２Ｇ、Ｑ０１０Ｄ、Ｑ０１０Ｆ、Ｑ０１０Ｈ、Ｑ０１０Ｉ、Ｑ０１０Ｌ、Ｑ０１０Ｓ、Ｑ０１９Ｅ、Ｑ０１９Ｈ、Ｑ０１９Ｎ、Ｑ０５９Ａ、Ｑ０５９Ｌ、Ｑ０５９Ｒ、Ｑ０５９Ｓ、Ｑ０５９Ｔ、Ｑ１８５Ｄ、Ｑ１８５Ｅ、Ｑ２０６Ｄ、Ｑ２０６Ｓ、Ｑ２０６Ｖ、Ｑ２１７Ｇ、Ｑ２４５Ｄ、Ｑ２４５Ｅ、Ｑ２４５Ｋ、Ｑ２４５Ｍ、Ｑ２４５Ｒ、Ｑ２７１Ａ、Ｑ２７１Ｆ、Ｑ２７１Ｐ、Ｑ２７１Ｙ、Ｑ２７５Ｄ、Ｑ２７５Ｈ、Ｑ２７５Ｉ、Ｑ２７５Ｌ、Ｑ２７５Ｓ、Ｑ２７５Ｗ、Ｒ１８６Ｈ、Ｒ１８６Ｌ、Ｒ１８６Ｖ、Ｒ１８６Ｗ、Ｓ００３Ｄ、Ｓ００３Ｅ、Ｓ００３Ｍ、Ｓ００３Ｐ、Ｓ００３Ｖ、Ｓ００９Ａ、Ｓ００９Ｅ、Ｓ００９Ｇ、Ｓ００９Ｉ、Ｓ００９Ｋ、Ｓ００９Ｍ、Ｓ００９Ｐ、Ｓ００９Ｗ、Ｓ０１８Ａ、Ｓ０１８Ｇ、Ｓ０１８Ｉ、Ｓ０１８Ｌ、Ｓ０１８Ｐ、Ｓ０１８Ｒ、Ｓ０１８Ｖ、Ｓ０１８Ｗ、Ｓ０３７Ａ、Ｓ０３７Ｄ、Ｓ０３７Ｑ、Ｓ０３７Ｒ、Ｓ０３７Ｙ、Ｓ０３８Ｄ、Ｓ０３８Ｈ、Ｓ０３８Ｋ、Ｓ０３８Ｍ、Ｓ０３８Ｒ、Ｓ０３８Ｔ、Ｓ０６３Ａ、Ｓ０６３Ｇ、Ｓ０６３Ｋ、Ｓ０６３Ｍ、Ｓ０６３Ｒ、Ｓ０８７Ａ、Ｓ０８７Ｄ、Ｓ０８７Ｆ、Ｓ０８７Ｇ、Ｓ０８７Ｑ、Ｓ０８７Ｔ、Ｓ０８９Ａ、Ｓ０８９Ｃ、Ｓ０８９Ｈ、Ｓ０８９Ｉ、Ｓ０８９Ｋ、Ｓ０８９Ｌ、Ｓ０８９Ｑ、Ｓ０８９Ｒ、Ｓ０８９Ｔ、Ｓ０８９Ｙ、Ｓ１３０Ｄ、Ｓ１３０Ｅ、Ｓ１４５Ａ、Ｓ１４５Ｈ、Ｓ１４５Ｌ、Ｓ１５９Ｇ、Ｓ１６１Ｅ、Ｓ１６１Ｌ、Ｓ１６１Ｍ、Ｓ１６１Ｗ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１６２Ｃ、Ｓ１６２Ｅ、Ｓ１６２Ｗ、Ｓ１６３Ｐ、Ｓ１７３Ｔ、Ｓ１８２Ａ、Ｓ１８２Ｃ、Ｓ１８２Ｅ、Ｓ１８２Ｈ、Ｓ１８２Ｒ、Ｓ１８２Ｔ、Ｓ１８３Ｃ、Ｓ１８３Ｄ、Ｓ１８３Ｇ、Ｓ１８３Ｈ、Ｓ１８８Ｃ、Ｓ１８８Ｄ、Ｓ１８８Ｅ、Ｓ１８８Ｌ、Ｓ１９０Ｔ、Ｓ１９１Ａ、Ｓ２０４Ｙ、Ｓ２２４Ｃ、Ｓ２３６Ａ、Ｓ２４８Ｃ、Ｓ２４８Ｄ、Ｓ２４８Ｇ、Ｓ２４���Ｉ、Ｓ２４８Ｎ、Ｓ２４８Ｑ、Ｓ２４８Ｒ、Ｓ２４８Ｖ、Ｓ２４９Ｃ、Ｓ２４９Ｈ、Ｓ２４９Ｌ、Ｓ２４９Ｑ、Ｓ２６０Ａ、Ｓ２６０Ｃ、Ｓ２６０Ｅ、Ｓ２６０Ｐ、Ｓ２６０Ｑ、Ｓ２６０Ｒ、Ｓ２６０Ｔ、Ｔ０２２Ｌ、Ｔ０２２Ｎ、Ｔ０２２Ｒ、Ｔ０５５Ｃ、Ｔ０５５Ｄ、Ｔ０５５Ｇ、Ｔ０５５Ｉ、Ｔ０５５Ｌ、Ｔ０５５Ｎ、Ｔ０５５Ｑ、Ｔ０５５Ｓ、Ｔ０５５Ｖ、Ｔ０５５Ｙ、Ｔ０７１Ａ、Ｔ０７１Ｓ、Ｔ１５８Ｇ、Ｔ１５８Ｈ、Ｔ１５８Ｌ、Ｔ１５８Ｐ、Ｔ１５８Ｑ、Ｔ１５８Ｒ、Ｔ１５８Ｖ、Ｔ１５８Ｙ、Ｔ１６４Ｎ、Ｔ１６４Ｓ、Ｔ２４４Ａ、Ｔ２４４Ｄ、Ｔ２４４Ｈ、Ｔ２４４Ｑ、Ｔ２４４Ｓ、Ｔ２５３Ｑ、Ｔ２５３Ｒ、Ｔ２５３Ｙ、Ｔ２５４Ａ、Ｔ２５４Ｇ、Ｔ２５５Ａ、Ｔ２５５Ｄ、Ｔ２５５Ｅ、Ｖ００４Ｅ、Ｖ００４Ｇ、Ｖ００４Ｒ、Ｖ００８Ｃ、Ｖ０２６Ａ、Ｖ０２８Ｌ、Ｖ０３０Ｉ、Ｖ０４４Ｃ、Ｖ０４５Ｄ、Ｖ０４５Ｅ、Ｖ０４５Ｈ、Ｖ０４５Ｍ、Ｖ０４５Ｑ、Ｖ０４５Ｙ、Ｖ０７２Ｌ、Ｖ０８１Ｌ、Ｖ０８１Ｓ、Ｖ０８４Ａ、Ｖ０８４Ｉ、Ｖ０８４Ｍ、Ｖ０８４Ｔ、Ｖ１４３Ｃ、Ｖ１４７Ｃ、Ｖ１４７Ｑ、Ｖ１４９Ｌ、Ｖ１６５Ｌ、Ｖ１８０Ｍ、Ｖ１９２Ｆ、Ｖ１９２Ｇ、Ｖ１９２Ｑ、Ｖ１９８Ｉ、Ｖ１９８Ｍ、Ｖ２０３Ｃ、Ｖ２０３Ｅ、Ｖ２０３Ｈ、Ｖ２０３Ｉ、Ｖ２０３Ｑ、Ｖ２０３Ｒ、Ｖ２０３Ｔ、Ｖ２０３Ｗ、Ｖ２７０Ａ、Ｖ２７０Ｌ、Ｖ２７０Ｔ、Ｗ２４１Ｆ、Ｗ２４１Ｍ、Ｙ００６Ｃ、Ｙ００６Ｄ、Ｙ００６Ｅ、Ｙ００６Ｉ、Ｙ００６Ｍ、Ｙ００６Ｒ、Ｙ００６Ｓ、Ｙ００６Ｖ、Ｙ００６Ｗ、Ｙ０２１Ｃ、Ｙ０２１Ｄ、Ｙ０２１Ｖ、Ｙ０９１Ｗ、Ｙ１６７Ｆ、Ｙ２１４Ｖ、Ｙ２６２Ａ、Ｙ２６２Ｃ、Ｙ２６２Ｉ、Ｙ２６２Ｍ、Ｙ２６２Ｒ、Ｙ２６２Ｔ、Ｙ２６２Ｖ、及びＹ２６２Ｗからなる群から選択された少なくとも１つのアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して約１．０のＰＩ値を有する、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して約１．０のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１、２、３、４、５又は６以上のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３２２】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４の卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して、約０．９に相当するＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、Ａ００１Ｅ、Ａ０１５Ｃ、Ａ０１５Ｅ、Ａ０４８Ｃ、Ａ０４８Ｅ、Ａ０７３Ｔ、Ａ０８５Ｃ、Ａ０８５Ｇ、Ａ０８８Ｉ、Ａ０８８Ｍ、Ａ１１４Ｇ、Ａ１３７Ｒ、Ａ１８７Ｌ、Ａ１８７Ｎ、Ａ１８７Ｐ、Ａ１８７Ｗ、Ａ２１６Ｃ、Ａ２３０Ｓ、Ａ２７３Ｄ、Ａ２７３Ｈ、Ａ２７３Ｔ、Ｄ０３６Ｎ、Ｄ０９９Ｎ、Ｄ２５９Ｈ、Ｅ１５６Ｃ、Ｅ１５６Ｇ、Ｅ１５６Ｈ、Ｅ１５６Ｑ、Ｆ１８９Ｈ、Ｆ１８９Ｒ、Ｆ１８９Ｓ、Ｆ１８９Ｔ、Ｆ２６１Ｃ、Ｆ２６１Ｄ、Ｆ２６１Ｅ、Ｇ０５３Ｅ、Ｇ０５３Ｍ、Ｇ０５３Ｑ、Ｇ１３１Ｃ、Ｇ１３１Ｄ、Ｇ１５７Ｎ、Ｇ１６０Ｖ、Ｇ２１５Ｃ、Ｇ２１５Ｌ、Ｇ２５８Ａ、Ｈ０３９Ａ、Ｉ０１１Ｌ、Ｉ０７９Ｅ、Ｉ２６８Ｍ、Ｋ０１２Ａ、Ｋ０１２Ｇ、Ｋ０１２Ｈ、Ｋ０１２Ｎ、Ｋ０２７Ｎ、Ｋ０４３Ｃ、Ｋ０４３Ｄ、Ｋ０４３Ｇ、Ｋ０４３Ｌ、Ｋ０４３Ｗ、Ｋ１３６Ｇ、Ｋ１４１Ｇ、Ｋ１４１Ｌ、Ｋ１４１Ｍ、Ｋ１４１Ｎ、Ｋ１４１Ｒ、Ｋ１７０Ｃ、Ｋ１７０Ｑ、Ｋ２１３Ｖ、Ｋ２５６Ｄ、Ｋ２６５Ｇ、Ｋ２６５Ｎ、Ｋ２６５Ｑ、Ｋ２６５Ｓ、Ｌ０８２Ａ、Ｌ０８２Ｆ、Ｌ０８２Ｈ、Ｌ０８２Ｒ、Ｌ０８２Ｓ、Ｌ０９０Ｍ、Ｌ２３３Ｓ、Ｌ２３５Ｖ、Ｌ２５７Ｅ、Ｌ２５７Ｇ、Ｌ２５７Ｒ、Ｌ２５７Ｗ、Ｍ２２２Ｓ、Ｎ０２５Ｒ、Ｎ０６２Ｈ、Ｎ０６２Ｔ、Ｎ０７６Ｄ、Ｎ０７６Ｐ、Ｎ０７８Ｄ、Ｎ０７８Ｅ、Ｎ０７８Ｆ、Ｎ０７８Ｒ、Ｎ０７８Ｖ、Ｎ２６９Ｈ、Ｎ２６９Ｑ、Ｐ０１４Ｋ、Ｐ０５７Ａ、Ｐ０８６Ｆ、Ｐ２０１Ｔ、Ｑ００２Ｄ、Ｑ００２Ｉ、Ｑ００２Ｐ、Ｑ００２Ｖ、Ｑ０１９Ｌ、Ｑ０１９Ｐ、Ｑ０５９Ｃ、Ｑ０５９Ｄ、Ｑ０５９Ｅ、Ｑ１８５Ｗ、Ｑ２７１Ｃ、Ｑ２７１Ｄ、Ｑ２７１Ｅ、Ｑ２７１Ｌ、Ｑ２７１Ｗ、Ｑ２７５Ｇ、Ｒ１８６Ｍ、Ｓ００９Ｃ、Ｓ００９Ｌ、Ｓ０１８Ｄ、Ｓ０３７Ｅ、Ｓ０３７Ｈ、Ｓ０３７Ｋ、Ｓ０３７Ｌ、Ｓ０３７Ｐ、Ｓ０３８Ｐ、Ｓ０６３Ｃ、Ｓ０６３Ｄ、Ｓ０６３Ｆ、Ｓ０６３Ｌ、Ｓ０６３Ｙ、Ｓ０８７Ｌ、Ｓ０８７Ｎ、Ｓ０８７Ｒ、Ｓ０８７Ｙ、Ｓ０８９Ｄ、Ｓ０８９Ｆ、Ｓ０８９Ｇ、Ｓ０８９Ｗ、Ｓ１０５Ｔ、Ｓ１２５Ａ、Ｓ１３０Ｃ、Ｓ１５９Ｄ、Ｓ１５９Ｐ、Ｓ１６３Ａ、Ｓ１８２Ｐ、Ｓ１８３Ｐ、Ｓ１９０Ａ、Ｓ１９０Ｇ、Ｓ２０４Ｅ、Ｓ２２４Ｇ、Ｓ２４８Ｅ、Ｓ２４８Ｈ、Ｓ２４９Ｅ、Ｓ２６０Ｖ、Ｓ２６０Ｙ、Ｔ０５５Ｍ、Ｔ０５５Ｒ、Ｔ０５５Ｗ、Ｔ１５８Ｄ、Ｔ１５８Ｅ、Ｔ１６４Ｇ、Ｔ１６４Ｋ、Ｔ１６４Ｑ、Ｔ２２０Ａ、Ｔ２４２Ｇ、Ｔ２５３Ｅ、Ｔ２５５Ｃ、Ｔ２５５Ｇ、Ｖ００４Ｄ、Ｖ０４４Ｌ、Ｖ０４４Ｐ、Ｖ０４５Ｃ、Ｖ０４５Ｇ、Ｖ０４５Ｌ、Ｖ０４５Ｎ、Ｖ０４５Ｒ、Ｖ０４５Ｖ、Ｖ０８１Ａ、Ｖ０８１Ｇ、Ｖ０８１Ｈ、Ｖ０８４Ｓ、Ｖ１４７Ａ、Ｖ２０３Ｄ、Ｖ２０３Ｇ、Ｖ２７０Ｃ、Ｖ２７０Ｐ、Ｖ２７０Ｓ、Ｗ２４１Ｌ、Ｙ１０４Ｔ、Ｙ２１４Ｑ、Ｙ２６２Ｄ、Ｙ２６２Ｅ、Ｙ２６２Ｇ、Ｙ２６２Ｈ、Ｙ２６２Ｌ、Ｙ２６２Ｎ、Ｙ２６３Ｇ、及びＹ２６３Ｗからなる���から選択された少なくとも１つのアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、本卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して約０．９のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１、２、３、４、５又は６以上のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３２３】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４の卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して、０．５以上０．９未満のＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、Ａ００１Ｃ、Ａ１４２Ｃ、Ａ１８７Ｃ、Ａ２１６Ｈ、Ａ２７３Ｑ、Ａ２７４Ｈ、Ｄ０３６Ｑ、Ｄ０３６Ｓ、Ｄ０９９Ｓ、Ｄ１９７Ｔ、Ｅ１５６Ｌ、Ｆ１８９Ａ、Ｆ１８９Ｌ、Ｇ０５３Ｌ、Ｇ０５３Ｒ、Ｇ１５７Ｐ、Ｇ１７８Ａ、Ｇ２５８Ｐ、Ｈ０３９Ｓ、Ｈ２３８Ｙ、Ｋ０１２Ｃ、Ｋ０１２Ｅ、Ｋ０１２Ｌ、Ｋ０１２Ｗ、Ｋ１３６Ｅ、Ｋ２６５Ｙ、Ｌ０７５Ｇ、Ｌ０７５Ｖ、Ｌ０８２Ｅ、Ｌ１２６Ｗ、Ｌ２５７Ｄ、Ｌ２５７Ｐ、Ｍ０５０Ｌ、Ｍ２２２Ａ、Ｍ２２２Ｆ、Ｍ２２２Ｌ、Ｎ０５６Ｓ、Ｎ０６２Ｃ、Ｎ０６２Ｌ、Ｎ０６２Ｙ、Ｎ２６９Ｃ、Ｐ０５７Ｗ、Ｑ００２Ｋ、Ｑ００２Ｌ、Ｑ２１７Ｃ、Ｑ２４５Ａ、Ｑ２４５Ｈ、Ｓ０１８Ｃ、Ｓ０３８Ｙ、Ｓ０４９Ｃ、Ｓ０８７Ｃ、Ｓ０８７Ｋ、Ｓ１４５Ｄ、Ｓ１９１Ｇ、Ｔ０２２Ｐ、Ｔ０５５Ｅ、Ｔ１６４Ａ、Ｔ１６４Ｒ、Ｖ０４５Ｋ、Ｖ０５１Ｈ、Ｖ０８１Ｒ、Ｖ１４３Ｇ、Ｖ１４８Ｌ、Ｖ１８０Ｓ、Ｖ２０３Ｓ、Ｖ２７０Ｇ、Ｙ２１４Ｈ、Ａ１８７Ｆ、Ａ２７３Ｐ、Ｆ１８９Ｇ、Ｇ０４６Ｄ、Ｇ１４６Ａ、Ｇ１５７Ｔ、Ｉ０３１Ｆ、Ｉ１７５Ｌ、Ｋ０１２Ｆ、Ｋ０２７Ｔ、Ｌ０４２Ｆ、Ｌ２３３Ｅ、Ｌ２３３Ｇ、Ｍ２２２Ｔ、Ｎ０６２Ｒ、Ｎ１８４Ｐ、Ｐ００５Ｖ、Ｐ００５Ｗ、Ｐ１２９Ｖ、Ｐ２３９Ｎ、Ｐ２３９Ｔ、Ｑ０１０Ｗ、Ｑ０５９Ｗ、Ｑ２７５Ａ、Ｖ００４Ｔ、Ｖ１６５Ｃ、Ａ１２８Ｈ、Ａ２３０Ｇ、Ｄ０４１Ｃ、Ｈ０６７Ｔ、Ｋ０２７Ｓ、Ｋ０４３Ｒ、Ｌ０９０Ｔ、Ｎ０６２Ｑ、Ｎ１１７Ｇ、Ｐ２２５Ｇ、Ｐ２２５Ｓ、Ｐ２３９Ｇ、Ｐ２３９Ｈ、Ｑ００２Ｒ、Ｓ０８９Ｅ、Ｖ０４４Ａ、Ｖ０４５Ｉ、Ａ００１Ｐ、Ａ２７３Ｒ、Ｄ０４１Ｎ、Ｄ０９９Ａ、Ｄ０９９Ｈ、Ｄ０９９Ｑ、Ｆ０５８Ｇ、Ｉ１１１Ｍ、Ｌ０４２Ｃ、Ｎ１１８Ｌ、Ｐ２３９Ａ、Ｓ０４９Ｎ、Ｓ０８９Ｐ、Ｓ１７３Ｖ、Ｔ２４２Ｐ、Ｖ０４４Ｔ、及びＶ０４５Ｔからなる群から選択された少なくとも１つのアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、本卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、タンパク質分解活性を有する、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．５以上０．９未満のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１、２、３、４、５又は６以上のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げら���る）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３２４】
（実施例８）
親ＢＰＮ’−ｖ３６に基づく更なるコンビナトリアル変異体のクリーニング性能
ＤＮＡ２．０により親ＢＰＮ’−ｖ３６（ＢＰＮ’−Ｓ２４Ｇ−Ｓ５３Ｇ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ）に基づく更なるコンビナトリアル変異体を作成し、提供した。１６℃及びｐＨ  ８での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチアッセイ、１６℃及びｐＨ  ７での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチアッセイ、１６℃及びｐＨ  ８での洗剤組成物４の卵マイクロスウォッチアッセイ、並びに１６℃及びｐＨ  ８での洗剤組成物４の植物マイクロスウォッチアッセイで、クリーニング性能について試験した。ＴＣＡアッセイを用いてタンパク質含量を測定し、かつＡＡＰＦアッセイを用いてプロテアーゼ活性をアッセイした。実施例１に記載のようにすべてのアッセイを実施し、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して性能インデックスを算出した。
【０３２５】
以降、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して１．０超、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．０超〜約１０、１．０超〜約８、又は１．０超〜約５のＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、Ａ０８８Ｔ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ、Ｎ０６１Ｓ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２６０Ｐ、Ｓ００９Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｋ１４１Ｒ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ００９Ｔ−Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｋ１４１Ｒ、及びＳ１６２Ｇ−Ｋ２５６Ｒからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３、及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３及びＢＰＮ’−ｖ３６よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本ＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３、及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較してタンパク質分解活性が向上している、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０超〜約５のＰＩ値を有する、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して１．０超〜約５のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。
【０３２６】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して、約１．０に相当するＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、ＢＰＮ’−ｖ３６、Ａ０８８Ｔ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ、Ａ０８８Ｔ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｑ１０３Ｈ、Ａ０８８Ｔ−Ｓ１６２Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｓ２４９Ａ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ、Ａ１１６Ｔ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ、Ａ１１６Ｔ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ１１６Ｔ−Ｓ１６２Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ１１６Ｔ−Ｓ２４９Ａ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ、Ａ１２８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１２８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１２８Ｓ−Ｓ１６２Ｇ、Ａ１２８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ１２８Ｓ−Ｓ２４９Ａ、Ａ１２８Ｓ−Ｔ１５８Ｓ、Ｇ０２４Ｅ−Ａ１１６Ｔ、Ｇ０２４Ｅ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ０２４Ｅ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ０２４Ｅ−Ｎ１０９Ｇ、Ｇ０２４Ｅ−Ｎ２４３Ｖ、Ｇ０２４Ｅ−Ｔ１５８Ｓ、Ｇ１３１Ｈ、Ｇ１３１Ｈ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１３１Ｈ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１３１Ｈ−Ｓ１６２Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ、Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４９Ａ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ、Ｋ０４３Ｙ−Ａ０８８Ｔ、Ｋ０４３Ｙ−Ｋ２５６Ｒ、Ｋ０４３Ｙ−Ｎ２４３Ｖ、Ｋ２５６Ｒ、Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｌ２５７Ｇ、Ｎ０６１Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ０６１Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２６０Ｐ、Ｎ０６１Ｓ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｓ２６０Ｐ、Ｎ０６１Ｓ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２６０Ｐ、Ｎ０６１Ｓ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ０７６Ｄ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ０７６Ｄ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ０７６Ｄ−Ｎ１０９Ｇ、Ｎ０７６Ｄ−Ｔ１５８Ｓ、Ｎ１０９Ａ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ａ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ１６２Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ、Ｎ１０９Ｇ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｐ−Ｓ２４８Ａ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ���Ｎ２４３Ｐ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ａ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｓ１６２Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｓ２４９Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ、Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ２４３Ｖ、Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４９Ａ、Ｐ０４０Ａ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｑ１０３Ｈ−Ａ１１６Ｔ、Ｑ１０３Ｈ−Ａ１２８Ｓ、Ｑ１０３Ｈ−Ｇ１３１Ｈ、Ｑ１０３Ｈ−Ｋ２５６Ｒ、Ｑ１０３Ｈ−Ｌ２５７Ｇ、Ｑ１０３Ｈ−Ｎ１０９Ｇ、Ｑ１０３Ｈ−Ｎ２１８Ｓ、Ｑ１０３Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ｑ１０３Ｈ−Ｓ１６２Ｇ、Ｑ１０３Ｈ−Ｓ２４８Ｎ、Ｑ１０３Ｈ−Ｓ２４９Ａ、Ｑ１０３Ｈ−Ｔ１５８Ｓ、Ｓ００９Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｋ１４１Ｒ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ００９Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｋ１４１Ｒ、Ｓ００９Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｋ１４１Ｒ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ００９Ｔ−Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ−Ａ１２８Ｓ−Ｋ１４１Ｒ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ−Ｎ０６１Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２６０Ｐ、Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ−Ｎ０６１Ｓ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２６０Ｐ、Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ、Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｐ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ０３３Ｔ−Ｑ１０３Ｈ、Ｓ０３３Ｔ−Ｔ１５８Ｓ、Ｓ０６３Ｇ、Ｓ０６３Ｇ−Ａ０８８Ｔ、Ｓ０６３Ｇ−Ａ１２８Ｓ、Ｓ０６３Ｇ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０６３Ｇ−Ｌ２５７Ｇ、Ｓ０６３Ｇ−Ｎ０７６Ｄ、Ｓ０６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ、Ｓ０６３Ｇ−Ｑ１０３Ｈ、Ｓ０６３Ｇ−Ｓ１６２Ｇ、Ｓ０６３Ｇ−Ｓ２４８Ｎ、Ｓ０６３Ｇ−Ｔ１５８Ｓ、Ｓ１６２Ｇ、Ｓ１６２Ｇ−Ｌ２５７Ｇ、Ｓ１６２Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ１６２Ｇ−Ｓ２４８Ｎ、Ｓ２４８Ｎ、Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｓ２４９Ａ、Ｔ１５８Ｓ、Ｔ１５８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、及びＴ１５８Ｓ−Ｓ２４９Ａからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本ＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０のＰＩ値を有す���、及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較して１．０のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３２７】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイ（試験方法３）において、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して、約０．９に相当するＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、Ａ００１Ｅ−Ａ０８８Ｔ、Ａ００１Ｅ−Ａ１１６Ｔ、Ａ００１Ｅ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ００１Ｅ−Ｇ１３１Ｈ−Ｇ１６９Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ００１Ｅ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ００１Ｅ−Ｎ１０９Ｇ、Ａ００１Ｅ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ００１Ｅ−Ｓ０３３Ｔ、Ａ００１Ｅ−Ｓ０３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ００１Ｅ−Ｓ０３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ００１Ｅ−Ｓ１６２Ｇ、Ａ００１Ｅ−Ｔ１５８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１２８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１６９Ａ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｑ２０６Ｄ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１６９Ａ、Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ１１６Ｔ−Ｑ２０６Ｄ、Ａ１２８Ｓ、Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ、Ａ１２８Ｓ−Ｇ１６９Ａ、Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ１２８Ｓ−Ｑ２０６Ｄ、Ｇ０２４Ｅ、Ｇ０２４Ｅ−Ａ０８８Ｔ、Ｇ０２４Ｅ−Ａ１２８Ｓ、Ｇ０２４Ｅ−Ｇ１３１Ｈ、Ｇ０２４Ｅ−Ｋ０４３Ｙ、Ｇ０２４Ｅ−Ｎ２１８Ｓ、Ｇ０２４Ｅ−Ｑ１０３Ｈ、Ｇ０２４Ｅ−Ｓ０３３Ｔ、Ｇ０２４Ｅ−Ｓ０６３Ｇ、Ｇ０２４Ｅ−Ｓ１６２Ｇ、Ｇ０２４Ｅ−Ｓ２４８Ｎ、Ｇ０２４Ｅ−Ｓ２４９Ａ、Ｇ１３１Ｈ−Ｇ１６９Ａ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ｇ１３１Ｈ−Ｑ２０６Ｄ、Ｇ１６９Ａ、Ｇ１６９Ａ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１６９Ａ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１６９Ａ−Ｎ２１８Ｓ、Ｇ１６９Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｇ１６９Ａ−Ｑ２０６Ｄ、Ｇ１６９Ａ−Ｓ２４８Ｎ、Ｇ１６９Ａ−Ｓ２４９Ａ、Ｋ０４３Ｙ、Ｋ０４３Ｙ−Ａ１１６Ｔ、Ｋ０４３Ｙ−Ａ１２８Ｓ、Ｋ０４３Ｙ−Ｇ１３１Ｈ、Ｋ０４３Ｙ−Ｇ１６９Ａ、Ｋ０４３Ｙ−Ｌ２５７Ｇ、Ｋ０４３Ｙ−Ｎ１０９Ｇ、Ｋ０４３Ｙ−Ｎ２１８Ｓ、Ｋ０４３Ｙ−Ｑ１０３Ｈ、Ｋ０４３Ｙ−Ｓ０６３Ｇ、Ｋ０４３Ｙ−Ｓ１６２Ｇ、Ｋ０４３Ｙ−Ｓ２４８Ｎ、Ｋ０４３Ｙ−Ｓ２４９Ａ、Ｋ０４３Ｙ−Ｔ１５８Ｓ、Ｎ０７６Ｄ、Ｎ０７６Ｄ−Ａ０８８Ｔ、Ｎ０７６Ｄ−Ａ１２８Ｓ、Ｎ０７６Ｄ−Ｇ１３１Ｈ、Ｎ０７６Ｄ−Ｎ２１８Ｓ、Ｎ０７６Ｄ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ０７６Ｄ−Ｑ１０３Ｈ、Ｎ０７６Ｄ−Ｓ１６２Ｇ、Ｎ０７６Ｄ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ０７６Ｄ−Ｓ２４９Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１６９Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ｑ２０６Ｄ、Ｎ１０９Ｇ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ２１８Ｓ、Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４９Ａ、Ｐ０４０Ｅ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ、Ｑ１０３Ｈ、Ｑ１０３Ｈ−Ｇ１６９Ａ、Ｑ２０６Ｄ、Ｑ２０６Ｄ−Ｋ２５６Ｒ、Ｑ２０６Ｄ−Ｌ２５７Ｇ、Ｑ２０６Ｄ−Ｎ２１８Ｓ、Ｑ２０６Ｄ−Ｎ２４３Ｖ、Ｑ２０６Ｄ−Ｓ２４８Ｎ、Ｑ２０６Ｄ−Ｓ２４９Ａ、Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ−Ｓ０３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０３３Ｔ、Ｓ０３３Ｔ−Ａ０８８Ｔ、Ｓ０３３Ｔ−Ａ１１６Ｔ、Ｓ０３３Ｔ−Ａ１２８Ｓ、Ｓ０３３Ｔ−Ａ���２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｐ、Ｓ０３３Ｔ−Ｇ１３１Ｈ、Ｓ０３３Ｔ−Ｋ０４３Ｙ、Ｓ０３３Ｔ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０３３Ｔ−Ｌ２５７Ｇ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ０７６Ｄ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ０７６Ｄ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ０７６Ｄ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ２１８Ｓ、Ｓ０３３Ｔ−Ｐ０４０Ｅ−Ｑ１０３Ｈ−Ｎ１０９Ｇ、Ｓ０３３Ｔ−Ｑ１０３Ｈ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ、Ｓ０３３Ｔ−Ｑ２０６Ｄ、Ｓ０３３Ｔ−Ｓ０６３Ｇ、Ｓ０３３Ｔ−Ｓ１６２Ｇ、Ｓ０３３Ｔ−Ｓ２４８Ｎ、Ｓ０３３Ｔ−Ｓ２４９Ａ、Ｓ０６３Ｇ−Ａ１１６Ｔ、Ｓ０６３Ｇ−Ｇ１３１Ｈ、Ｓ０６３Ｇ−Ｇ１６９Ａ、Ｓ０６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ、Ｓ０６３Ｇ−Ｎ２１８Ｓ、Ｓ０６３Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２０６Ｄ、Ｓ０６３Ｇ−Ｓ２４９Ａ、Ｓ１６２Ｇ−Ｇ１６９Ａ、Ｓ１６２Ｇ−Ｎ２１８Ｓ、Ｓ１６２Ｇ−Ｑ２０６Ｄ、Ｓ１６２Ｇ−Ｓ２４９Ａ、Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ２４８Ｎ−Ｓ２４９Ａ、Ｓ２４９Ａ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ２４９Ａ−Ｌ２５７Ｇ、Ｔ１５８Ｓ−Ｇ１６９Ａ、Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ｔ１５８Ｓ−Ｑ２０６Ｄ、及びＴ１５８Ｓ−Ｓ１６２Ｇからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、本ＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．９のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組の酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３２８】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイ（試験方法３）において、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して、０．５以上０．９未満のＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、Ａ００１Ｅ、Ａ００１Ｅ−Ａ１２８Ｓ、Ａ００１Ｅ−Ｇ０２４Ｅ、Ａ００１Ｅ−Ｇ１３１Ｈ、Ａ００１Ｅ−Ｇ１６９Ａ、Ａ００１Ｅ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ００１Ｅ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ００１Ｅ−Ｑ１０３Ｈ、Ａ００１Ｅ−Ｓ０６３Ｇ、Ａ００１Ｅ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ００１Ｅ−Ｓ２４９Ａ、Ｇ０２４Ｅ−Ｎ０７６Ｄ、Ｋ０４３Ｙ−Ｎ０７６Ｄ、Ｋ０４３Ｙ−Ｑ２０６Ｄ、Ｎ０７６Ｄ−Ａ１１６Ｔ、Ｎ０７６Ｄ−Ｇ１６９Ａ、Ｎ０７６Ｄ−Ｑ２０６Ｄ、Ｑ１０３Ｈ−Ｑ２０６Ｄ、Ｓ０３３Ｔ−Ｇ１６９Ａ、Ｓ０３３Ｔ−Ｓ０６３Ｇ−Ｑ１０３Ｈ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｇ１６９Ａ−Ｎ２４３Ｐ、Ｓ０３３Ｔ−Ｓ０６３Ｇ−Ｑ１０３Ｈ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｇ１６９Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ００１Ｅ−Ｋ０４３Ｙ、Ａ００１Ｅ−Ｎ０７６Ｄ、Ａ００１Ｅ−Ｎ０７６Ｄ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ、Ａ００１Ｅ−Ｑ２０６Ｄ、及びＧ０２４Ｅ−Ｑ２０６Ｄからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、本ＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、タンパク質分解活性を有する、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．５以上０．９未満のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組の酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３２９】
以降、ｐＨ  ７及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイ（試験方法３）において、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して、１．０超、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．０超〜約１０、１．０超〜約８、又は１．０超〜約５のＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、Ａ１１６Ｔ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ２４３Ｖ、Ｇ０２４Ｅ−Ａ１１６Ｔ、Ｋ０４３Ｙ、Ｎ０７６Ｄ−Ａ１１６Ｔ、Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ０３３Ｔ−Ｓ０６３Ｇ、Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ００１Ｅ−Ｓ２４９Ａ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１２８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ、Ａ０８８Ｔ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｓ２４９Ａ、Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ、Ａ１２８Ｓ、Ａ１２８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１２８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ１２８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ１２８Ｓ−Ｔ１５８Ｓ、Ｇ０２４Ｅ−Ａ０８８Ｔ、Ｇ０２４Ｅ−Ａ１２８Ｓ、Ｇ０２４Ｅ−Ｇ１３１Ｈ、Ｇ０２４Ｅ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ０２４Ｅ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ０２４Ｅ−Ｎ２１８Ｓ、Ｇ０２４Ｅ−Ｎ２４３Ｖ、Ｇ０２４Ｅ−Ｓ１６２Ｇ、Ｇ０２４Ｅ−Ｓ２４９Ａ、Ｇ０２４Ｅ−Ｔ１５８Ｓ、Ｇ１３１Ｈ、Ｇ１３１Ｈ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４９Ａ、Ｋ０４３Ｙ−Ａ０８８Ｔ、Ｋ０４３Ｙ−Ａ１１６Ｔ、Ｋ２５６Ｒ、Ｎ０７６Ｄ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ、Ｎ１０９Ｇ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ２４３Ｖ、Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４９Ａ、Ｑ１０３Ｈ−Ａ１２８Ｓ、Ｑ１０３Ｈ−Ｇ１３１Ｈ、Ｑ１０３Ｈ−Ｋ２５６Ｒ、Ｑ１０３Ｈ−Ｌ２５７Ｇ、Ｑ１０３Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ｑ１０３Ｈ−Ｓ２４８Ｎ、Ｑ１０３Ｈ−Ｓ２４９Ａ、Ｑ１０３Ｈ−Ｔ１５８Ｓ、Ｑ２０６Ｄ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ０３３Ｔ−Ａ１２８Ｓ、Ｓ０３３Ｔ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ０７６Ｄ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ２１８Ｓ、Ｓ０３３Ｔ−Ｓ２４８Ｎ、Ｓ０３３Ｔ−Ｔ１５８Ｓ、Ｓ０６３Ｇ−Ａ１２８Ｓ、Ｓ０６３Ｇ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０６３Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ０６３Ｇ−Ｓ１６２Ｇ、Ｓ０６３Ｇ−Ｔ１５８Ｓ、Ｓ１６２Ｇ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ２４９Ａ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、及びＴ１５８Ｓ−Ｓ２４９Ａからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’、ＢＰＮ���−ｖ３、及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３及びＢＰＮ’−ｖ３６よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本ＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、ＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３、及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較してタンパク質分解活性が向上している、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０超〜約５のＰＩ値を有する、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して１．０超〜約５のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３３０】
以降、ｐＨ  ７及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイ（試験方法３）において、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して約１．０に相当するＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、ＢＰＮ’−ｖ３６、Ａ００１Ｅ−Ａ１２８Ｓ、Ａ００１Ｅ−Ｇ１３１Ｈ、Ａ００１Ｅ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ００１Ｅ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ００１Ｅ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ００１Ｅ−Ｓ０３３Ｔ、Ａ００１Ｅ−Ｓ０６３Ｇ、Ａ００１Ｅ−Ｓ１６２Ｇ、Ａ０８８Ｔ、Ａ０８８Ｔ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｑ１０３Ｈ、Ａ０８８Ｔ−Ｓ１６２Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ、Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ、Ａ１１６Ｔ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｓ１６２Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ１１６Ｔ−Ｓ２４９Ａ、Ａ１２８Ｓ−Ｇ１６９Ａ、Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ１２８Ｓ−Ｓ１６２Ｇ、Ａ１２８Ｓ−Ｓ２４９Ａ、Ｇ０２４Ｅ、Ｇ０２４Ｅ−Ｎ１０９Ｇ、Ｇ０２４Ｅ−Ｑ１０３Ｈ、Ｇ０２４Ｅ−Ｓ０３３Ｔ、Ｇ０２４Ｅ−Ｓ０６３Ｇ、Ｇ０２４Ｅ−Ｓ２４８Ｎ、Ｇ１３１Ｈ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ｇ１３１Ｈ−Ｓ１６２Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｇ１６９Ａ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１６９Ａ−Ｓ２４８Ｎ、Ｋ０４３Ｙ−Ａ１２８Ｓ、Ｋ０４３Ｙ−Ｇ１３１Ｈ、Ｋ０４３Ｙ−Ｋ２５６Ｒ、Ｋ０４３Ｙ−Ｌ２５７Ｇ、Ｋ０４３Ｙ−Ｎ１０９Ｇ、Ｋ０４３Ｙ−Ｎ２４３Ｖ、Ｋ０４３Ｙ−Ｑ１０３Ｈ、Ｋ０４３Ｙ−Ｓ０６３Ｇ、Ｋ０４３Ｙ−Ｓ１６２Ｇ、Ｋ０４３Ｙ−Ｓ２４８Ｎ、Ｋ０４３Ｙ−Ｓ２４９Ａ、Ｋ０４３Ｙ−Ｔ１５８Ｓ、Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｌ２５７Ｇ、Ｎ０６１Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ０６１Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２６０Ｐ、Ｎ０６１Ｓ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２６０Ｐ、Ｎ０６１Ｓ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２６０Ｐ、Ｎ０７６Ｄ−Ａ０８８Ｔ、Ｎ０７６Ｄ−Ａ１２８Ｓ、Ｎ０７６Ｄ−Ｇ１６９Ａ、Ｎ０７６Ｄ−Ｎ２１８Ｓ、Ｎ０７６Ｄ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ０７６Ｄ−Ｓ１６２Ｇ、Ｎ０７６Ｄ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ０７６Ｄ−Ｔ１５８Ｓ、Ｎ１０９Ａ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ａ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ１６２Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｑ２０６Ｄ、Ｎ１０９Ｇ−Ｓ１６２Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｓ２４９Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ、Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ２１８Ｓ、Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｐ０４０Ａ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｑ１０３Ｈ、Ｑ１０３Ｈ−Ａ１１６Ｔ、Ｑ１０３Ｈ−Ｇ１６９Ａ、Ｑ１０３Ｈ−Ｎ１０９Ｇ���Ｑ１０３Ｈ−Ｎ２１８Ｓ、Ｑ１０３Ｈ−Ｓ１６２Ｇ、Ｓ００９Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｋ１４１Ｒ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ００９Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｋ１４１Ｒ、Ｓ００９Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｋ１４１Ｒ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ００９Ｔ−Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｋ１４１Ｒ、Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ、Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０３３Ｔ−Ａ０８８Ｔ、Ｓ０３３Ｔ−Ａ１１６Ｔ、Ｓ０３３Ｔ−Ｇ１３１Ｈ、Ｓ０３３Ｔ−Ｋ０４３Ｙ、Ｓ０３３Ｔ−Ｌ２５７Ｇ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ、Ｓ０３３Ｔ−Ｑ１０３Ｈ、Ｓ０３３Ｔ−Ｑ２０６Ｄ、Ｓ０３３Ｔ−Ｓ１６２Ｇ、Ｓ０３３Ｔ−Ｓ２４９Ａ、Ｓ０６３Ｇ、Ｓ０６３Ｇ−Ａ０８８Ｔ、Ｓ０６３Ｇ−Ａ１１６Ｔ、Ｓ０６３Ｇ−Ｌ２５７Ｇ、Ｓ０６３Ｇ−Ｎ０７６Ｄ、Ｓ０６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ、Ｓ０６３Ｇ−Ｎ２１８Ｓ、Ｓ０６３Ｇ−Ｑ１０３Ｈ、Ｓ０６３Ｇ−Ｓ２４８Ｎ、Ｓ０６３Ｇ−Ｓ２４９Ａ、Ｓ１６２Ｇ、Ｓ１６２Ｇ−Ｇ１６９Ａ、Ｓ１６２Ｇ−Ｌ２５７Ｇ、Ｓ１６２Ｇ−Ｎ２１８Ｓ、Ｓ１６２Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ１６２Ｇ−Ｓ２４８Ｎ、Ｓ１６２Ｇ−Ｓ２４９Ａ、Ｓ２４８Ｎ、Ｓ２４８Ｎ−Ｓ２４９Ａ、Ｓ２４９Ａ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ２４９Ａ−Ｌ２５７Ｇ、Ｔ１５８Ｓ、Ｔ１５８Ｓ−Ｇ１６９Ａ、Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ｔ１５８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、及びＴ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、ＢＰＮ’プロテアーゼ（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつ本アッセイにおいてＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本ＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０のＰＩ値を有する、及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較して１．０のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３３１】
以降、ｐＨ  ７及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイ（試験方法３）において、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して約０．９に相当するＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、Ａ００１Ｅ、Ａ００１Ｅ−Ａ０８８Ｔ、Ａ００１Ｅ−Ａ１１６Ｔ、Ａ００１Ｅ−Ｇ１６９Ａ、Ａ００１Ｅ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ００１Ｅ−Ｎ１０９Ｇ、Ａ００１Ｅ−Ｓ０３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ００１Ｅ−Ｔ１５８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１６９Ａ、Ａ０８８Ｔ−Ｑ２０６Ｄ、Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ、Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１２８Ｓ−Ｑ２０６Ｄ、Ｇ０２４Ｅ−Ｋ０４３Ｙ、Ｇ０２４Ｅ−Ｎ０７６Ｄ、Ｇ０２４Ｅ−Ｑ２０６Ｄ、Ｇ１３１Ｈ−Ｇ１６９Ａ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１３１Ｈ−Ｑ２０６Ｄ、Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ、Ｇ１６９Ａ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１６９Ａ−Ｎ２１８Ｓ、Ｇ１６９Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｇ１６９Ａ−Ｑ２０６Ｄ、Ｋ０４３Ｙ−Ｎ０７６Ｄ、Ｋ０４３Ｙ−Ｎ２１８Ｓ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ０６１Ｓ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｓ２６０Ｐ、Ｎ０６１Ｓ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ０７６Ｄ、Ｎ０７６Ｄ−Ｇ１３１Ｈ、Ｎ０７６Ｄ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ０７６Ｄ−Ｎ１０９Ｇ、Ｎ０７６Ｄ−Ｑ１０３Ｈ、Ｎ０７６Ｄ−Ｓ２４９Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｐ−Ｓ２４８Ａ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｐ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ａ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４９Ａ、Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｑ１０３Ｈ−Ｑ２０６Ｄ、Ｑ２０６Ｄ、Ｑ２０６Ｄ−Ｋ２５６Ｒ、Ｑ２０６Ｄ−Ｎ２１８Ｓ、Ｑ２０６Ｄ−Ｓ２４８Ｎ、Ｑ２０６Ｄ−Ｓ２４９Ａ、Ｓ００９Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｋ１４１Ｒ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ００９Ｔ−Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ−Ａ１２８Ｓ−Ｋ１４１Ｒ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ−Ｎ０６１Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２６０Ｐ、Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ−Ｎ０６１Ｓ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２６０Ｐ、Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ−Ｓ０３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０３３Ｔ、Ｓ０３３Ｔ−Ｇ１６９Ａ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ０７６Ｄ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ０７６Ｄ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｐ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０���３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０６３Ｇ−Ｇ１３１Ｈ、Ｓ０６３Ｇ−Ｇ１６９Ａ、Ｓ１６２Ｇ−Ｑ２０６Ｄ、及びＴ１５８Ｓ−Ｓ１６２Ｇからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、タンパク質分解活性を有し、及び／又は本ＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．９のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組の酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３３２】
以降、ｐＨ  ７及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．５以上０．９未満のＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、Ａ００１Ｅ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ００１Ｅ−Ｇ０２４Ｅ、Ａ００１Ｅ−Ｇ１３１Ｈ−Ｇ１６９Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ００１Ｅ−Ｑ１０３Ｈ、Ａ００１Ｅ−Ｓ０３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ００１Ｅ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１６９Ａ、Ａ１１６Ｔ−Ｑ２０６Ｄ、Ｇ１６９Ａ−Ｓ２４９Ａ、Ｋ０４３Ｙ−Ｇ１６９Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１６９Ａ、Ｐ０４０Ｅ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ、Ｑ２０６Ｄ−Ｌ２５７Ｇ、Ｓ０３３Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｐ、Ｓ０３３Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ０３３Ｔ−Ｐ０４０Ｅ−Ｑ１０３Ｈ−Ｎ１０９Ｇ、Ｓ０３３Ｔ−Ｑ１０３Ｈ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ、Ｓ０６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ、Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２０６Ｄ、Ｔ１５８Ｓ−Ｑ２０６Ｄ、Ａ００１Ｅ−Ｋ０４３Ｙ、Ａ００１Ｅ−Ｎ０７６Ｄ、Ａ００１Ｅ−Ｑ２０６Ｄ、Ｓ０３３Ｔ−Ｓ０６３Ｇ−Ｑ１０３Ｈ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｇ１６９Ａ−Ｎ２４３Ｐ、Ｓ０３３Ｔ−Ｓ０６３Ｇ−Ｑ１０３Ｈ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｇ１６９Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ００１Ｅ−Ｎ０７６Ｄ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ、Ｋ０４３Ｙ−Ｑ２０６Ｄ、及びＮ０７６Ｄ−Ｑ２０６Ｄからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、本アッセイにおいて、タンパク質分解活性を有する、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．５以上０．９未満のＰＩ値を有する、プロテアーゼの変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組の酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３３３】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４の卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して、１．０超、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．０超〜約１０、１．０超〜約８、又は１．０超〜約５のＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、Ａ０８８Ｔ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ０２４Ｅ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ０２４Ｅ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ、Ｎ１０９Ｇ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ、Ｓ０３３Ｔ−Ｔ１５８Ｓ、Ｓ０６３Ｇ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ００１Ｅ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１２８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１６９Ａ、Ａ０８８Ｔ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ、Ａ１１６Ｔ、Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ、Ａ１１６Ｔ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ１１６Ｔ−Ｓ１６２Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ、Ａ１２８Ｓ、Ａ１２８Ｓ−Ｇ１６９Ａ、Ａ１２８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１２８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ｇ０２４Ｅ、Ｇ０２４Ｅ−Ａ１２８Ｓ、Ｇ０２４Ｅ−Ｇ１３１Ｈ、Ｇ０２４Ｅ−Ｎ１０９Ｇ、Ｇ０２４Ｅ−Ｎ２４３Ｖ、Ｇ０２４Ｅ−Ｓ０３３Ｔ、Ｇ０２４Ｅ−Ｓ０６３Ｇ、Ｇ０２４Ｅ−Ｓ２４８Ｎ、Ｇ０２４Ｅ−Ｓ２４９Ａ、Ｇ０２４Ｅ−Ｔ１５８Ｓ、Ｇ１３１Ｈ、Ｇ１３１Ｈ−Ｇ１６９Ａ、Ｇ１３１Ｈ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ、Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４９Ａ、Ｇ１６９Ａ、Ｇ１６９Ａ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１６９Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｋ０４３Ｙ−Ａ０８８Ｔ、Ｋ０４３Ｙ−Ｎ１０９Ｇ、Ｋ２５６Ｒ、Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ０６１Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ０７６Ｄ−Ｎ１０９Ｇ、Ｎ１０９Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ、Ｎ１０９Ｇ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ、Ｎ１０９Ｇ−Ｓ１６２Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ｓ２４９Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ、Ｎ２１８Ｓ、Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ２４３Ｖ、Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４９Ａ、Ｐ０４０Ａ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｑ１０３Ｈ−Ｋ２５６Ｒ、Ｑ１０３Ｈ−Ｌ２５７Ｇ、Ｑ１０３Ｈ−Ｎ１０９Ｇ、Ｓ００９Ｔ−Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｋ１４１Ｒ、Ｓ０３３Ｔ−Ａ０８８Ｔ、Ｓ０３３Ｔ−Ａ１１６Ｔ、Ｓ０３３Ｔ−Ａ１２８Ｓ、Ｓ０３３Ｔ−Ｇ１３１Ｈ、Ｓ０３３Ｔ−Ｋ０４３Ｙ、Ｓ０３３Ｔ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０３３Ｔ−Ｌ２５７Ｇ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ０７６Ｄ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ２１８Ｓ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ０３３Ｔ−Ｑ１０３Ｈ、Ｓ０３３Ｔ−Ｓ０６３Ｇ、Ｓ０３３Ｔ−Ｓ１６２Ｇ、Ｓ０３３Ｔ−Ｓ２４８Ｎ、Ｓ０３３Ｔ−Ｓ���４９Ａ、Ｓ０６３Ｇ、Ｓ０６３Ｇ−Ａ０８８Ｔ、Ｓ０６３Ｇ−Ａ１１６Ｔ、Ｓ０６３Ｇ−Ａ１２８Ｓ、Ｓ０６３Ｇ−Ｇ１３１Ｈ、Ｓ０６３Ｇ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ、Ｓ０６３Ｇ−Ｎ２１８Ｓ、Ｓ０６３Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ０６３Ｇ−Ｓ２４８Ｎ、Ｓ０６３Ｇ−Ｓ２４９Ａ、Ｓ０６３Ｇ−Ｔ１５８Ｓ、Ｓ１６２Ｇ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ１６２Ｇ−Ｎ２１８Ｓ、Ｓ１６２Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ１６２Ｇ−Ｓ２４８Ｎ、Ｓ１６２Ｇ−Ｓ２４９Ａ、Ｓ２４８Ｎ、Ｓ２４９Ａ、Ｓ２４９Ａ−Ｌ２５７Ｇ、Ｔ１５８Ｓ、Ｔ１５８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、及びＴ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３、及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３及びＢＰＮ’−ｖ３６よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、ＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３、及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較してタンパク質分解活性が向上している、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０超〜約５のＰＩ値を有する、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して１．０超〜約５のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３３４】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４の卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して、約１．０に相当するＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、ＢＰＮ’−ｖ３６、Ａ００１Ｅ、Ａ００１Ｅ−Ａ１１６Ｔ、Ａ００１Ｅ−Ｇ１３１Ｈ、Ａ００１Ｅ−Ｇ１６９Ａ、Ａ００１Ｅ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ００１Ｅ−Ｎ１０９Ｇ、Ａ００１Ｅ−Ｓ０３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ００１Ｅ−Ｓ０６３Ｇ、Ａ００１Ｅ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ００１Ｅ−Ｓ２４９Ａ、Ａ００１Ｅ−Ｔ１５８Ｓ、Ａ０８８Ｔ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ、Ａ０８８Ｔ−Ｑ１０３Ｈ、Ａ０８８Ｔ−Ｑ２０６Ｄ、Ａ０８８Ｔ−Ｓ１６２Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｓ２４９Ａ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１６９Ａ、Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ１１６Ｔ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ１１６Ｔ−Ｓ２４９Ａ、Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ、Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ１２８Ｓ−Ｓ１６２Ｇ、Ａ１２８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ１２８Ｓ−Ｓ２４９Ａ、Ａ１２８Ｓ−Ｔ１５８Ｓ、Ｇ０２４Ｅ−Ａ０８８Ｔ、Ｇ０２４Ｅ−Ａ１１６Ｔ、Ｇ０２４Ｅ−Ｋ０４３Ｙ、Ｇ０２４Ｅ−Ｎ０７６Ｄ、Ｇ０２４Ｅ−Ｎ２１８Ｓ、Ｇ０２４Ｅ−Ｑ１０３Ｈ、Ｇ０２４Ｅ−Ｓ１６２Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１３１Ｈ−Ｓ１６２Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ、Ｇ１６９Ａ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１６９Ａ−Ｎ２１８Ｓ、Ｇ１６９Ａ−Ｑ２０６Ｄ、Ｇ１６９Ａ−Ｓ２４８Ｎ、Ｇ１６９Ａ−Ｓ２４９Ａ、Ｋ０４３Ｙ、Ｋ０４３Ｙ−Ａ１１６Ｔ、Ｋ０４３Ｙ−Ａ１２８Ｓ、Ｋ０４３Ｙ−Ｇ１６９Ａ、Ｋ０４３Ｙ−Ｋ２５６Ｒ、Ｋ０４３Ｙ−Ｌ２５７Ｇ、Ｋ０４３Ｙ−Ｎ０７６Ｄ、Ｋ０４３Ｙ−Ｎ２１８Ｓ、Ｋ０４３Ｙ−Ｎ２４３Ｖ、Ｋ０４３Ｙ−Ｓ０６３Ｇ、Ｋ０４３Ｙ−Ｓ２４８Ｎ、Ｋ０４３Ｙ−Ｓ２４９Ａ、Ｋ０４３Ｙ−Ｔ１５８Ｓ、Ｌ２５７Ｇ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ０６１Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２６０Ｐ、Ｎ０６１Ｓ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｓ２６０Ｐ、Ｎ０６１Ｓ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２６０Ｐ、Ｎ０６１Ｓ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ０７６Ｄ、Ｎ０７６Ｄ−Ａ０８８Ｔ、Ｎ０７６Ｄ−Ａ１１６Ｔ、Ｎ０７６Ｄ−Ｇ１３１Ｈ、Ｎ０７６Ｄ−Ｇ１６９Ａ、Ｎ０７６Ｄ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ０７６Ｄ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ０７６Ｄ−Ｎ２１８Ｓ、Ｎ０７６Ｄ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ０７６Ｄ−Ｑ１０３Ｈ、Ｎ０７６Ｄ−Ｓ２４９Ａ、Ｎ０７６Ｄ−Ｔ１５８Ｓ、Ｎ１０９Ａ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ａ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ���２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ１６２Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１６９Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｐ−Ｓ２４８Ａ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ａ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４９Ａ、Ｑ１０３Ｈ、Ｑ１０３Ｈ−Ａ１１６Ｔ、Ｑ１０３Ｈ−Ａ１２８Ｓ、Ｑ１０３Ｈ−Ｇ１３１Ｈ、Ｑ１０３Ｈ−Ｇ１６９Ａ、Ｑ１０３Ｈ−Ｎ２１８Ｓ、Ｑ１０３Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ｑ１０３Ｈ−Ｓ１６２Ｇ、Ｑ１０３Ｈ−Ｓ２４８Ｎ、Ｑ１０３Ｈ−Ｓ２４９Ａ、Ｑ１０３Ｈ−Ｔ１５８Ｓ、Ｑ２０６Ｄ、Ｑ２０６Ｄ−Ｌ２５７Ｇ、Ｑ２０６Ｄ−Ｎ２１８Ｓ、Ｓ００９Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｋ１４１Ｒ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ００９Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｋ１４１Ｒ、Ｓ００９Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｋ１４１Ｒ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ００９Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｋ１４１Ｒ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ００９Ｔ−Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ−Ａ１２８Ｓ−Ｋ１４１Ｒ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ、Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ−Ｓ０３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０３３Ｔ、Ｓ０３３Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ０３３Ｔ−Ｇ１６９Ａ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｐ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０３３Ｔ−Ｑ１０３Ｈ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ、Ｓ０３３Ｔ−Ｑ２０６Ｄ、Ｓ０３３Ｔ−Ｓ０６３Ｇ−Ｑ１０３Ｈ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｇ１６９Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ０６３Ｇ−Ｇ１６９Ａ、Ｓ０６３Ｇ−Ｎ０７６Ｄ、Ｓ０６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ、Ｓ０６３Ｇ−Ｑ１０３Ｈ、Ｓ０６３Ｇ−Ｓ１６２Ｇ、Ｓ１６２Ｇ、Ｓ１６２Ｇ−Ｇ１６９Ａ、Ｓ１６２Ｇ−Ｌ２５７Ｇ、Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｓ２４８Ｎ−Ｓ２４９Ａ、Ｓ２４９Ａ−Ｋ２５６Ｒ、Ｔ１５８Ｓ−Ｇ１６９Ａ、Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ｔ１５８Ｓ−Ｓ１６２Ｇ、Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、及びＴ１５８Ｓ−Ｓ２４９Ａからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’プロテアーゼ（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’（���列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０のＰＩ値を有する、及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較して１．０のＰＩ値、を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３３５】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４の卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．５以上０．９未満のＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、Ａ００１Ｅ−Ａ０８８Ｔ、Ａ００１Ｅ−Ａ１２８Ｓ、Ａ００１Ｅ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ００１Ｅ−Ｇ０２４Ｅ、Ａ００１Ｅ−Ｇ０２４Ｅ−Ｓ２０４Ｅ−Ｑ２０６Ｄ、Ａ００１Ｅ−Ｇ１３１Ｈ−Ｇ１６９Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ００１Ｅ−Ｋ０４３Ｙ、Ａ００１Ｅ−Ｎ０７６Ｄ、Ａ００１Ｅ−Ｎ０７６Ｄ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ、Ａ００１Ｅ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ００１Ｅ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ００１Ｅ−Ｑ１０３Ｈ、Ａ００１Ｅ−Ｑ２０６Ｄ、Ａ００１Ｅ−Ｓ０３３Ｔ、Ａ００１Ｅ−Ｓ０３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ００１Ｅ−Ｓ１６２Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｑ２０６Ｄ、Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１２８Ｓ−Ｑ２０６Ｄ、Ｇ０２４Ｅ−Ｑ２０６Ｄ、Ｇ１３１Ｈ−Ｑ２０６Ｄ、Ｋ０４３Ｙ−Ｇ１３１Ｈ、Ｋ０４３Ｙ−Ｑ１０３Ｈ、Ｋ０４３Ｙ−Ｑ２０６Ｄ、Ｋ０４３Ｙ−Ｓ１６２Ｇ、Ｎ０６１Ｓ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２６０Ｐ、Ｎ０７６Ｄ−Ａ１２８Ｓ、Ｎ０７６Ｄ−Ｑ２０６Ｄ、Ｎ０７６Ｄ−Ｓ１６２Ｇ、Ｎ０７６Ｄ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｐ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｑ２０６Ｄ、Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｐ０４０Ｅ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ、Ｑ１０３Ｈ−Ｑ２０６Ｄ、Ｑ２０６Ｄ−Ｋ２５６Ｒ、Ｑ２０６Ｄ−Ｎ２４３Ｖ、Ｑ２０６Ｄ−Ｓ２４８Ｎ、Ｑ２０６Ｄ−Ｓ２４９Ａ、Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ−Ｎ０６１Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２６０Ｐ、Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ−Ｎ０６１Ｓ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２６０Ｐ、Ｓ０３３Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｐ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ０７６Ｄ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ０７６Ｄ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０３３Ｔ−Ｐ０４０Ｅ−Ｑ１０３Ｈ−Ｎ１０９Ｇ、Ｓ０３３Ｔ−Ｓ０６３Ｇ−Ｑ１０３Ｈ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｇ１６９Ａ−Ｎ２４３Ｐ、Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２０６Ｄ、Ｓ１６２Ｇ−Ｑ２０６Ｄ、及びＴ１５８Ｓ−Ｑ２０６Ｄからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、本アッセイにおいて、タンパク質分解活性を有する、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．５以上０．９未満のＰＩ値を有する、プロテアーゼの変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群���ら選択された少なくとも１組の酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３３６】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４の植物マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して、１．０超、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．０超〜約１０、１．０超〜約８、又は１．０超〜約５のＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、Ｔ１５８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｋ２５６Ｒ、Ｌ２５７Ｇ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ、Ｓ１６２Ｇ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ１６２Ｇ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ０２４Ｅ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ０２４Ｅ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ０２４Ｅ−Ｓ０３３Ｔ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ、Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｓ０３３Ｔ−Ａ０８８Ｔ、Ｓ０３３Ｔ−Ａ１１６Ｔ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ０３３Ｔ−Ｑ１０３Ｈ、Ｓ１６２Ｇ−Ｎ２１８Ｓ、Ｓ１６２Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ｔ１５８Ｓ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１６９Ａ、Ａ０８８Ｔ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｓ１６２Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ、Ａ１１６Ｔ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ１２８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ１２８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ｇ０２４Ｅ−Ａ１１６Ｔ、Ｇ０２４Ｅ−Ａ１２８Ｓ、Ｇ０２４Ｅ−Ｇ１３１Ｈ、Ｇ０２４Ｅ−Ｎ２４３Ｖ、Ｇ０２４Ｅ−Ｓ２４８Ｎ、Ｇ０２４Ｅ−Ｓ２４９Ａ、Ｇ０２４Ｅ−Ｔ１５８Ｓ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ、Ｇ１６９Ａ−Ｎ２１８Ｓ、Ｇ１６９Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｇ１６９Ａ−Ｓ２４８Ｎ、Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ｓ２４９Ａ、Ｎ２１８Ｓ、Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４９Ａ、Ｎ２４３Ｖ、Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｑ１０３Ｈ−Ｎ１０９Ｇ、Ｑ１０３Ｈ−Ｎ２１８Ｓ、Ｓ０３３Ｔ−Ａ１２８Ｓ、Ｓ０３３Ｔ−Ｌ２５７Ｇ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ２１８Ｓ、Ｓ０３３Ｔ−Ｓ１６２Ｇ、Ｓ０３３Ｔ−Ｓ２４８Ｎ、Ｓ０３３Ｔ−Ｔ１５８Ｓ、Ｓ０６３Ｇ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０６３Ｇ−Ｌ２５７Ｇ、Ｓ１６２Ｇ、Ｓ１６２Ｇ−Ｇ１６９Ａ、Ｓ１６２Ｇ−Ｓ２４８Ｎ、Ｓ２４８Ｎ、Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｓ２４９Ａ、Ｔ１５８Ｓ−Ｓ１６２Ｇ、及びＴ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、ＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３、及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつ本アッセイにおいてＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３及びＢＰＮ’−ｖ３６よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本ＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’（配���番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、ＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３、及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較してタンパク質分解活性が向上している、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０超〜約５のＰＩ値を有する、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して１．０超〜約５のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３３７】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４の植物マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して約１．０に相当するＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、ＢＰＮ’−ｖ３６、Ａ００１Ｅ−Ａ０８８Ｔ、Ａ００１Ｅ−Ａ１１６Ｔ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１２８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｑ１０３Ｈ、Ａ０８８Ｔ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｓ２４９Ａ、Ａ１１６Ｔ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１６９Ａ、Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ１１６Ｔ−Ｓ１６２Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｓ２４９Ａ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ、Ａ１２８Ｓ−Ｇ１６９Ａ、Ａ１２８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１２８Ｓ−Ｓ１６２Ｇ、Ａ１２８Ｓ−Ｓ２４９Ａ、Ａ１２８Ｓ−Ｔ１５８Ｓ、Ｇ０２４Ｅ−Ａ０８８Ｔ、Ｇ０２４Ｅ−Ｋ０４３Ｙ、Ｇ０２４Ｅ−Ｎ２１８Ｓ、Ｇ０２４Ｅ−Ｑ１０３Ｈ、Ｇ０２４Ｅ−Ｓ０６３Ｇ、Ｇ０２４Ｅ−Ｓ１６２Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｇ１６９Ａ、Ｇ１３１Ｈ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ、Ｇ１３１Ｈ−Ｓ１６２Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ、Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４９Ａ、Ｇ１６９Ａ、Ｇ１６９Ａ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１６９Ａ−Ｓ２４９Ａ、Ｎ０７６Ｄ、Ｎ０７６Ｄ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ０７６Ｄ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ０７６Ｄ−Ｓ１６２Ｇ、Ｎ０７６Ｄ−Ｓ２４９Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４９Ａ、Ｑ１０３Ｈ−Ａ１１６Ｔ、Ｑ１０３Ｈ−Ｇ１６９Ａ、Ｑ１０３Ｈ−Ｋ２５６Ｒ、Ｑ１０３Ｈ−Ｌ２５７Ｇ、Ｑ１０３Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ｑ１０３Ｈ−Ｓ１６２Ｇ、Ｓ０３３Ｔ−Ｇ１３１Ｈ、Ｓ０３３Ｔ−Ｇ１６９Ａ、Ｓ０３３Ｔ−Ｋ０４３Ｙ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ０７６Ｄ、Ｓ０３３Ｔ−Ｑ２０６Ｄ、Ｓ０６３Ｇ、Ｓ０６３Ｇ−Ａ１１６Ｔ、Ｓ０６３Ｇ−Ａ１２８Ｓ、Ｓ０６３Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ０６３Ｇ−Ｓ１６２Ｇ、Ｓ０６３Ｇ−Ｓ２４８Ｎ、Ｓ０６３Ｇ−Ｓ２４９Ａ、Ｓ０６３Ｇ−Ｔ１５８Ｓ、Ｓ２４９Ａ−Ｌ２５７Ｇ、Ｔ１５８Ｓ−Ｇ１６９Ａ、及びＴ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつ本アッセイにおいてＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本ＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０のＰＩ値を有する、及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較して１．０のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるもので���る。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３３８】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４の植物マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．５以上０．９未満のＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、Ａ００１Ｅ−Ｇ１６９Ａ、Ａ００１Ｅ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ００１Ｅ−Ｎ１０９Ｇ、Ａ００１Ｅ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ、Ａ１１６Ｔ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ１２８Ｓ、Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ、Ｇ０２４Ｅ、Ｇ０２４Ｅ−Ｎ１０９Ｇ、Ｇ１３１Ｈ、Ｇ１３１Ｈ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１６９Ａ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１６９Ａ−Ｑ２０６Ｄ、Ｋ０４３Ｙ、Ｋ０４３Ｙ−Ａ０８８Ｔ、Ｋ０４３Ｙ−Ｌ２５７Ｇ、Ｋ０４３Ｙ−Ｎ１０９Ｇ、Ｎ０７６Ｄ−Ａ０８８Ｔ、Ｎ０７６Ｄ−Ｇ１３１Ｈ、Ｎ０７６Ｄ−Ｇ１６９Ａ、Ｎ０７６Ｄ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ０７６Ｄ−Ｔ１５８Ｓ、Ｎ１０９Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｓ１６２Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ、Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ｑ１０３Ｈ−Ａ１２８Ｓ、Ｑ１０３Ｈ−Ｓ２４８Ｎ、Ｑ１０３Ｈ−Ｓ２４９Ａ、Ｑ１０３Ｈ−Ｔ１５８Ｓ、Ｑ２０６Ｄ−Ｋ２５６Ｒ、Ｑ２０６Ｄ−Ｌ２５７Ｇ、Ｑ２０６Ｄ−Ｎ２１８Ｓ、Ｑ２０６Ｄ−Ｎ２４３Ｖ、Ｑ２０６Ｄ−Ｓ２４８Ｎ、Ｓ０３３Ｔ、Ｓ０３３Ｔ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０３３Ｔ−Ｓ０６３Ｇ、Ｓ０３３Ｔ−Ｓ２４９Ａ、Ｓ０６３Ｇ−Ａ０８８Ｔ、Ｓ０６３Ｇ−Ｇ１３１Ｈ、Ｓ０６３Ｇ−Ｇ１６９Ａ、Ｓ０６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ、Ｓ１６２Ｇ−Ｑ２０６Ｄ、Ｓ１６２Ｇ−Ｓ２４９Ａ、Ｓ２４８Ｎ−Ｓ２４９Ａ、Ｓ２４９Ａ−Ｋ２５６Ｒ、Ｔ１５８Ｓ−Ｑ２０６Ｄ、Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４９Ａ、Ａ００１Ｅ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ００１Ｅ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ００１Ｅ−Ｑ１０３Ｈ、Ａ００１Ｅ−Ｓ０６３Ｇ、Ａ００１Ｅ−Ｓ１６２Ｇ、Ａ００１Ｅ−Ｔ１５８Ｓ、Ｇ０２４Ｅ−Ｎ０７６Ｄ、Ｇ１３１Ｈ−Ｑ２０６Ｄ、Ｋ０４３Ｙ−Ａ１１６Ｔ、Ｋ０４３Ｙ−Ｇ１６９Ａ、Ｋ０４３Ｙ−Ｋ２５６Ｒ、Ｋ０４３Ｙ−Ｎ０７６Ｄ、Ｋ０４３Ｙ−Ｓ０６３Ｇ、Ｋ０４３Ｙ−Ｓ１６２Ｇ、Ｋ０４３Ｙ−Ｓ２４８Ｎ、Ｋ０４３Ｙ−Ｓ２４９Ａ、Ｋ０４３Ｙ−Ｔ１５８Ｓ、Ｎ０７６Ｄ−Ａ１１６Ｔ、Ｎ０７６Ｄ−Ａ１２８Ｓ、Ｎ０７６Ｄ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１６９Ａ、Ｑ１０３Ｈ、Ｑ１０３Ｈ−Ｇ１３１Ｈ、Ｑ２０６Ｄ−Ｓ２４９Ａ、Ｓ０６３Ｇ−Ｎ０７６Ｄ、Ｓ０６３Ｇ−Ｎ２１８Ｓ、Ｓ０６３Ｇ−Ｑ１０３Ｈ、Ａ００１Ｅ−Ａ１２８Ｓ、Ａ００１Ｅ−Ｇ０２４Ｅ、Ａ００１Ｅ−Ｇ１３１Ｈ、Ａ００１Ｅ−Ｎ０７６Ｄ、Ａ００１Ｅ−Ｑ２０６Ｄ、Ａ００１Ｅ−Ｓ０３３Ｔ、Ａ００１Ｅ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ００１Ｅ−Ｓ２４９Ａ、Ａ０８８Ｔ−Ｑ２０６Ｄ、Ａ１１６Ｔ−Ｑ２０６Ｄ、Ａ１２８Ｓ−Ｑ２０６Ｄ、Ｇ０２４Ｅ−Ｑ２０６Ｄ、Ｋ０４３Ｙ−Ａ１２８Ｓ、Ｋ０４３Ｙ−Ｇ１３１Ｈ、Ｋ０４３Ｙ−Ｎ２１８Ｓ、Ｋ０４３Ｙ−Ｑ１０３Ｈ、Ｎ０７６Ｄ−Ｎ１０９Ｇ、Ｎ０７６Ｄ−Ｎ２１８Ｓ、Ｎ０７６Ｄ−Ｑ１０３Ｈ、Ｎ１０９Ｇ−Ｑ２０６Ｄ、Ｑ１０３Ｈ−Ｑ２０６Ｄ、Ｑ２０６Ｄ、Ａ００１Ｅ、Ａ０���１Ｅ−Ｋ０４３Ｙ、Ｋ０４３Ｙ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２０６Ｄ、Ｎ０７６Ｄ−Ｑ２０６Ｄからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、本植物マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、タンパク質分解活性を有する、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．５以上０．９未満のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組の酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３３９】
以降、ＡＡＰＦタンパク質分解アッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して、１．０超、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．０超〜約１０、１．０超〜約８、又は１．０超〜約５のＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ０７６Ｄ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ００１Ｅ−Ｓ０３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ２１８Ｓ、Ｓ０３３Ｔ−Ｓ０６３Ｇ−Ｑ１０３Ｈ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｇ１６９Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ１２８Ｓ−Ｇ１６９Ａ、Ｓ０３３Ｔ−Ｓ０６３Ｇ−Ｑ１０３Ｈ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｇ１６９Ａ−Ｎ２４３Ｐ、Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ−Ｓ０３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０３３Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｐ、Ｐ０４０Ｅ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ、Ｓ０３３Ｔ−Ａ１２８Ｓ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１６９Ａ、Ｓ０６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ、Ｇ１６９Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０３３Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ００１Ｅ−Ｇ１６９Ａ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１６９Ａ、Ｇ１６９Ａ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｐ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１６９Ａ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ０７６Ｄ−Ｇ１６９Ａ、Ａ００１Ｅ−Ｇ１３１Ｈ−Ｇ１６９Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｇ１６９Ａ−Ｓ２４９Ａ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ、Ｇ１６９Ａ−Ｓ２４８Ｎ、Ｋ０４３Ｙ−Ｇ１６９Ａ、Ｋ０４３Ｙ−Ｎ２１８Ｓ、Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ０６３Ｇ−Ｇ１６９Ａ、Ａ００１Ｅ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ００１Ｅ−Ｓ０３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ２１８Ｓ、Ｇ０２４Ｅ−Ｎ２１８Ｓ、Ｇ０２４Ｅ−Ｓ０３３Ｔ、Ｇ１６９Ａ−Ｑ２０６Ｄ、Ｎ０７６Ｄ−Ｎ２１８Ｓ、Ｓ０３３Ｔ−Ｌ２５７Ｇ、Ｓ１６２Ｇ−Ｇ１６９Ａ、Ａ００１Ｅ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ、Ｇ１６９Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ２１８Ｓ、Ｐ０４０Ａ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ０７６Ｄ、Ａ００１Ｅ−Ｓ０３３Ｔ、Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ、Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ、Ｓ０３３Ｔ−Ｋ０４３Ｙ、Ｓ０３３Ｔ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ０３３Ｔ−Ｑ２０６Ｄ、Ｓ０６３Ｇ−Ｎ２１８Ｓ、Ｓ１６２Ｇ−Ｎ２１８Ｓ、Ｔ１５８Ｓ−Ｇ１６９Ａ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１６９Ａ、Ｇ１３１Ｈ−Ｇ１６９Ａ、Ｎ０６１Ｓ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２６０Ｐ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ａ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ００９Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｋ１４１Ｒ、Ｓ００９Ｔ−Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｋ１４１Ｒ、Ｓ０３３Ｔ−Ａ０８８Ｔ、Ｓ０３３Ｔ−Ｓ０６３Ｇ、Ｓ０３３Ｔ−Ｓ１６２Ｇ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ００１Ｅ−Ｎ０７６Ｄ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ００９Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｋ１４１Ｒ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ−Ｎ０６１Ｓ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２６０Ｐ、Ｓ０３３Ｔ−Ａ１１６Ｔ、Ｓ０３３Ｔ−Ｓ２４８Ｎ、Ｓ０３３Ｔ−Ｓ２４９Ａ、Ｓ０３３Ｔ−Ｔ１５８Ｓ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ、Ｎ１０９Ａ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ１６２Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４９Ａ、Ｑ２０６Ｄ−Ｎ２１８Ｓ、Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０３３Ｔ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ、Ｎ０６１Ｓ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２６０Ｐ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｓ００９Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｋ１４１Ｒ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ０２４Ｅ−Ａ１２８Ｓ、Ｎ０６１Ｓ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｓ２６０Ｐ、Ｎ１０９Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０３３Ｔ、Ｓ０３３Ｔ−Ｇ１３１Ｈ、Ａ００１Ｅ−Ａ１２８Ｓ、Ａ１２８Ｓ、Ａ１２８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１２８Ｓ−Ｑ２０６Ｄ、Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ００９Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｋ１４１Ｒ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ００９Ｔ−Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ−Ａ１２８Ｓ−Ｋ１４１Ｒ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１２８Ｓ、Ａ１２８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ０６１Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２６０Ｐ、Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１２８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ１２８Ｓ−Ｓ２４９Ａ、Ｎ０７６Ｄ−Ａ１２８Ｓ、Ｓ０６３Ｇ−Ａ１２８Ｓ、Ａ１２８Ｓ−Ｓ１６２Ｇ、Ａ１２８Ｓ−Ｔ１５８Ｓ、Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ−Ｎ０６１Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２６０Ｐ、Ｓ０３３Ｔ−Ｑ１０３Ｈ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ、Ｎ０６１Ｓ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ｋ０４３Ｙ−Ａ１２８Ｓ、Ｎ０６１Ｐ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ００１Ｅ−Ｇ０２４Ｅ−Ｓ２０４Ｅ−Ｑ２０６Ｄ、Ａ００１Ｅ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ、Ｇ０２４Ｅ−Ｎ１０９Ｇ、Ｋ０４３Ｙ−Ｎ１０９Ｇ、Ｎ０６１Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ０７６Ｄ−Ｎ１０９Ｇ、Ｎ１０９Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ、Ｎ１０９Ｇ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ａ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｑ２０６Ｄ、Ｓ０６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ、Ａ００１Ｅ−Ａ１１６Ｔ、Ａ００１Ｅ−Ｎ１０９Ｇ、Ａ００１Ｅ−Ｑ２０６Ｄ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ１１６Ｔ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ０２４Ｅ−Ａ１１６Ｔ、Ｇ０２４Ｅ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ０２４Ｅ−Ｎ２４３Ｖ、Ｇ０２４Ｅ−Ｑ２０６Ｄ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ｓ１６２Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｓ２４９Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ、Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ００１Ｅ−Ａ０８８Ｔ、Ａ００１Ｅ−Ｇ０２４Ｅ、Ａ００１Ｅ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ００１Ｅ−Ｎ０７６Ｄ、Ａ００１Ｅ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ、Ａ０８８Ｔ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｑ２０６Ｄ、Ａ１１６Ｔ、Ａ１１６Ｔ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ、Ｇ０２４Ｅ−Ａ０８８Ｔ、Ｇ０２４Ｅ−Ｋ０４３Ｙ、Ｇ０２４Ｅ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ０２４Ｅ−Ｎ０７６Ｄ、Ｇ０２４Ｅ−Ｓ１６２Ｇ、Ｇ０２４Ｅ−Ｓ２４８Ｎ、Ｋ０４３Ｙ−Ａ０８８Ｔ、Ｋ０４３Ｙ−Ａ１１６Ｔ、Ｋ０４３Ｙ−Ｌ２５７Ｇ、Ｋ０４３Ｙ−Ｎ２４３Ｖ、Ｋ０４３Ｙ−Ｑ２０６Ｄ、Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ０７６Ｄ−Ａ１１６Ｔ、Ｎ０７６Ｄ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ０７６Ｄ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ０７６Ｄ−Ｑ２０６Ｄ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｑ２０６Ｄ、Ｑ２０６Ｄ−Ｌ２５７Ｇ、Ｑ２０６Ｄ−Ｎ２４３Ｖ、Ｑ２０６Ｄ−Ｓ２４８Ｎ、Ｓ０６３Ｇ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０６３Ｇ−Ｌ２５７Ｇ、Ｔ１５８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ００１Ｅ、Ａ００１Ｅ−Ｋ０４３Ｙ、Ａ００１Ｅ−Ｓ１６２Ｇ、Ａ００１Ｅ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ００１Ｅ−Ｓ２４９Ａ、Ａ００１Ｅ−Ｔ１５８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｓ１６２Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｓ２４９Ａ、Ａ１１６Ｔ−Ｑ２０６Ｄ、Ａ１１６Ｔ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ１１６Ｔ−Ｓ２４９Ａ、Ｇ０２４Ｅ、Ｇ０２４Ｅ−Ｇ１３１Ｈ、Ｇ０２４Ｅ−Ｓ２４９Ａ、Ｇ０２４Ｅ−Ｔ１５８Ｓ、Ｇ１３１Ｈ、Ｇ１３１Ｈ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１３１Ｈ−Ｌ２５７Ｇ、Ｋ０４３Ｙ−Ｋ２５６Ｒ、Ｋ０４３Ｙ−Ｎ０７６Ｄ、Ｋ２５６Ｒ、Ｌ２５７Ｇ、Ｎ０７６Ｄ−Ａ０８８Ｔ、Ｎ０７６Ｄ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ０７６Ｄ−Ｓ１６２Ｇ、Ｎ０７６Ｄ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ０７６Ｄ−Ｓ２４９Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｐ−Ｓ２４８Ａ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｐ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ２４３Ｖ、Ｑ２０６Ｄ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ０３３Ｔ−Ｐ０４０Ｅ−Ｑ１０３Ｈ−Ｎ１０９Ｇ、Ｓ０６３Ｇ、Ｓ０６３Ｇ−Ａ１１６Ｔ、Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２０６Ｄ、Ｓ１６２Ｇ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ１６２Ｇ−Ｌ２５７Ｇ、Ｓ１６２Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ１６２Ｇ−Ｑ２０６Ｄ、Ｓ１６２Ｇ−Ｓ２４８Ｎ、Ｓ２４８Ｎ、Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｓ２４９Ａ、Ｓ２４９Ａ−Ｌ２５７Ｇ、Ｔ１５８Ｓ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、及びＴ１５８Ｓ−Ｑ２０６Ｄからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３、及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３及びＢＰＮ’−ｖ３６よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、ＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３、及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較してタンパク質分解活性が向上している、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０超〜約５のＰＩ値を有する、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して１．０超〜約５のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３４０】
以降、ＡＡＰＦタンパク質分解アッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して約１．０に相当するＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、ＢＰＮ’−ｖ３６、Ａ００１Ｅ−Ｇ１３１Ｈ、Ａ００１Ｅ−Ｓ０６３Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ、Ａ１１６Ｔ−Ｓ１６２Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ、Ｇ０２４Ｅ−Ｓ０６３Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１３１Ｈ−Ｑ２０６Ｄ、Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４９Ａ、Ｋ０４３Ｙ、Ｋ０４３Ｙ−Ｓ０６３Ｇ、Ｋ０４３Ｙ−Ｓ２４８Ｎ、Ｋ０４３Ｙ−Ｓ２４９Ａ、Ｋ０４３Ｙ−Ｔ１５８Ｓ、Ｎ０７６Ｄ、Ｎ０７６Ｄ−Ｇ１３１Ｈ、Ｎ０７６Ｄ−Ｔ１５８Ｓ、Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４９Ａ、Ｑ１０３Ｈ−Ｇ１６９Ａ、Ｑ２０６Ｄ−Ｓ２４９Ａ、Ｓ０６３Ｇ−Ｎ０７６Ｄ、Ｓ０６３Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ０６３Ｇ−Ｓ１６２Ｇ、Ｓ０６３Ｇ−Ｓ２４９Ａ、Ｓ０６３Ｇ−Ｔ１５８Ｓ、Ｓ１６２Ｇ、Ｓ１６２Ｇ−Ｓ２４９Ａ、Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ２４８Ｎ−Ｓ２４９Ａ、Ｓ２４９Ａ−Ｋ２５６Ｒ、Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、及びＴ１５８Ｓ−Ｓ２４９Ａからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０のＰＩ値を有する、及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較して１．０のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３４１】
以降、ＡＡＰＦタンパク質分解アッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して約０．９に相当するＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、Ｇ１３１Ｈ−Ｓ１６２Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ、Ｋ０４３Ｙ−Ｇ１３１Ｈ、Ｋ０４３Ｙ−Ｓ１６２Ｇ、Ｓ０６３Ｇ−Ａ０８８Ｔ、Ｓ０６３Ｇ−Ｇ１３１Ｈ、Ｓ０６３Ｇ−Ｓ２４８Ｎ、Ｔ１５８Ｓ−Ｓ１６２Ｇ、Ｑ１０３Ｈ−Ｎ２１８Ｓ、Ｓ０３３Ｔ−Ｑ１０３Ｈ、及びＱ１０３Ｈ−Ａ１２８Ｓからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、本アッセイにおいて、タンパク質分解活性を有する、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．９のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組の酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３４２】
同様に、ＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、プロテアーゼ活性を有する、ＢＰＮ’と比較してタンパク質分解活性が向上している、又はＢＰＮ’（配列番号２）のＰＩ値を超えるＰＩ値を有する、サブチリシンプロテアーゼ変異体も提供され、変異体は配列番号２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、変異体は、Ｘ００１Ｅ、Ｘ００９Ｔ、Ｘ０１８Ｔ、Ｘ０２１Ｎ、Ｘ０２４Ｇ、Ｘ０３３Ｔ、Ｘ０４０Ａ、Ｘ０４３Ｙ、Ｘ０６１Ｇ／Ｐ／Ｓ、Ｘ０６３Ｇ、Ｘ０７６Ｄ、Ｘ０８８Ｔ、Ｘ１０３Ｈ、Ｘ１０９Ａ／Ｇ／Ｑ／Ｓ、Ｘ１１６Ｔ、Ｘ１２８Ｓ、Ｘ１３１Ｈ、Ｘ１４１Ｒ、Ｘ１５８Ｓ、Ｘ１６２Ｇ、Ｘ１６９Ａ、Ｘ２０４Ｅ、Ｘ２０６Ｄ、Ｘ２１８Ｓ、Ｘ２４３Ｐ／Ｖ、Ｘ２４８Ａ／Ｎ、Ｘ２４９Ａ、Ｘ２５６Ｒ、Ｘ２５７Ｇ、及びＸ２６０Ｐの群から選択された少なくとも１つの置換を含む。変異の位置は配列番号２の配列と対応させて番号付けされ、Ａ００１Ｅ、Ｓ００９Ｔ、Ｓ０１８Ｔ、Ｙ０２１Ｎ、Ｓ０２４Ｇ、Ｓ０３３Ｔ、Ｐ０４０Ａ、Ｋ０４３Ｙ、Ｎ０６１Ｇ／Ｐ／Ｓ、Ｓ０６３Ｇ、Ｎ０７６Ｄ、Ａ０８８Ｔ、Ｑ１０３Ｈ、Ｎ１０９Ａ／Ｇ／Ｑ／Ｓ、Ａ１１６Ｔ、Ｇ１２８Ｓ、Ｇ１３１Ｈ、Ｋ１４１Ｒ、Ｔ１５８Ｓ、Ｓ１６２Ｇ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ２０４Ｅ、Ｑ２０６Ｄ、Ｎ２１８Ｓ、Ｎ２４３Ｐ／Ｖ、Ｓ２４８Ａ／Ｎ、Ｓ２４９Ａ、Ｋ２５６Ｒ、Ｌ２５７Ｇ、及びＳ２６０Ｐの群から選択される少なくとも１つの置換を含んでいてもよい。同様に、組成物（このようなプロテアーゼ変異体を少なくとも１つ含む洗浄組成物など）、及びこのようなプロテアーゼ変異体を少なくとも１種用いる、以降に詳細に記載されるクリーニング方法も包含される。
【０３４３】
（実施例９）
親ＢＰＮ’−ｖ３６に基づくコンビナトリアルライブラリからの変異体の構築及び変異体のクリーニング性能
ＤＮＡ  ２．０によりＢＰＮ’−ｖ３６親分子に基づくＢＰＮ’コンビナトリアルライブラリを作成し、ライゲーション反応物として供給した。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓを効率的に形質転換させるため、ライゲーション反応混合物中のＤＮＡを形質転換前に増幅させ、かつ形質転換体を実施例２に記載のように増殖させた。１６℃及びｐＨ  ８での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチアッセイ、並びに１６℃及びｐＨ  ８での洗剤組成物４の卵マイクロスウォッチアッセイを用いて、変異体をクリーニング性能について試験した。タンパク質含量はＴＣＡアッセイを用いて測定した。実施例１のようにアッセイを実施し、ＢＰＮ’−ｖ３６（すなわちＢＰＮ’−Ｓ２４Ｇ−Ｓ５３Ｇ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ）と比較して性能インデックスを算出した。
【０３４４】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して１．０超、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．０超〜約１０、１．０超〜約８、又は１．０超〜約５のＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ａ１５３Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１４Ｓ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｙ００６Ｈ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１２Ｄ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−���１３１Ｈ−Ｖ１４８Ａ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ、Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ−Ｎ２６９Ｓ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｓ００３Ｐ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｖ１４７Ａ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｗ２４１Ｒ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５���Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ａ２７４Ｄ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ−Ｑ２７１Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｉ２３４Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１３１Ｈ−Ｗ２４１Ｌ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ａ１３７Ｖ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ａ１５１Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｗ２４１Ｒ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ−Ａ２７４Ｔ、Ｎ１０９Ｇ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｐ０１４Ｌ−Ａ０１５Ｌ−Ｌ０１６Ｃ−Ｈ０１７Ｔ−Ｓ０１８Ｌ−Ｑ０１９Ｋ−Ｇ０２０Ａ−Ｙ０２１Ｔ−Ｔ０２２Ｌ−Ｇ０２３Ｅ、Ｓ００３Ｆ−Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｖ００４Ａ−Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ｖ００４Ａ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｖ００４Ｌ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、���００６Ｈ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ００１Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ａ２７３Ｔ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｎ２６９Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ
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【０３４５】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイ（試験方法３）において、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して約１．０に相当するＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、ＢＰＮ’−ｖ３６、Ａ０８８Ｔ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ａ２７４Ｔ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ａ２７４Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ���Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｎ２６９Ｄ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ａ２１６Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｄ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ａ１３８Ｖ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｔ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２���８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ−Ｉ２６８Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ���Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｔ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｖ１４９Ａ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８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１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ０２４Ｓ−Ｇ０５３Ｓ−Ｎ０７８Ｓ−Ｇ０９７Ａ−Ｎ１０１Ｓ−Ａ１２８Ｓ、Ｇ１３１Ｈ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｖ１４７Ｉ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｉ１０７Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｉ１０７Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ａ１４４Ｖ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｖ１４７Ａ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｖ１４９Ａ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｉ２６８Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｉ２６８Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｋ１４１Ｅ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｓ２６０Ｆ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ−Ｑ２７５Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｓ１８２Ｆ−Ｓ２０４Ｆ−Ｓ２０７Ｌ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２３６Ｆ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ−Ｑ２７１Ｒ、Ｐ０５７Ｑ−Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ｓ００３Ｐ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ００３Ｐ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ａ２７２Ｖ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２３３Ｓ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｎ２６９Ｄ、及びＶ００４Ａ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０のＰＩ値を有する、及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較して１．０のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３４６】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイ（試験方法３）において、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して約０．９に相当するＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、Ａ０８８Ｔ−Ａ０９８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ−Ｌ２６７Ｍ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｉ２６８Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｑ２７１Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｑ２７５Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１���８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２３７Ｒ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｎ２６９Ｄ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｑ２７５Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ���Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ−Ｉ２６８Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｗ２４１Ｌ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ａ１３８Ｖ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ−Ｑ２７５Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｌ２３３Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１���１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｖ１４９Ａ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ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【０３４７】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイ（試験方法３）において、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．５以上０．９未満のＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）はＡ０１５Ｓ−Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ０９８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｋ１４１Ｅ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｉ１０７Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｄ１４０Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｉ２６８Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｖ１４９Ａ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｄ１４０Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｄ１４０Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ���０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｋ１４１Ｅ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｑ２７１Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｖ１４９Ｌ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ−Ｑ２７１Ｋ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ−Ｑ２７１Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｙ１０４Ｈ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｋ１４１Ｅ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ−Ｎ２６９Ｄ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｑ２７１Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１５７Ｅ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｉ２６８Ｖ、Ｉ１０７Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｌ０９０Ｉ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ−Ｑ２７１Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｗ２４１Ｒ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｋ１４１Ｅ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｓ００３Ｐ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｓ００３Ｐ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｖ００４Ａ−Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｙ００６Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｙ１０４Ｈ−Ｎ１０９���−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｉ２３４Ｔ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｖ１４９Ｌ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｉ１０７Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ａ２２３Ｇ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｋ２１３Ｎ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ａ２３２Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｄ１４０Ｇ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｍ１２４Ｉ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｖ１４８Ａ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｔ２５５Ｋ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｑ２４５Ｋ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｗ２４１Ｒ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｖ１５０Ａ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｉ１０７Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｋ１４１Ｅ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｇ１４６Ｃ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１３８Ｅ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｆ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｖ２０３Ｉ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｄ１４０Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ���８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｅ２５１Ｋ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｉ１０８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｋ１４１Ｅ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｗ２４１Ｒ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、及びＧ０６５Ｄ−Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、本アッセイにおいて、タンパク質分解活性を有する、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．５以上０．９未満のＰＩ値を有する、プロテアーゼの変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組の酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３４８】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４の卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して１．０超、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．０超〜約１０、１．０超〜約８、又は１．０超〜約５のＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ−Ｎ２６９Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ａ２７３Ｔ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｉ２６８Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｓ００３Ｐ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１���８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｑ２７５Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ａ２１６Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｎ２６９Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｖ１４７Ｉ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｉ１０７Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｉ１０７Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ａ１５３Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ���Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｔ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｔ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ−Ｎ２６９Ｄ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ａ１３８Ｖ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｖ１４９Ａ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｑ２７５Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２���６Ｒ−Ｉ２６８Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｖ１４３Ａ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｖ１４７Ｉ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１４Ｓ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｉ２３４Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ−Ｑ２７１Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｉ１０７Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ａ１３７Ｖ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ａ１５１Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ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１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｋ１４１Ｒ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｉ２３４Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ａ１４４Ｖ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｖ１４９Ａ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｉ２６８Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｑ２７５Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ１４５Ｆ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ−Ａ２７４Ｔ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｓ２６０Ｆ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｓ１８２Ｆ−Ｓ２０４Ｆ−Ｓ２０７Ｌ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２３６Ｆ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ２１８Ｓ、Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ−Ｑ２７１Ｒ、Ｓ００３Ｐ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ２４８Ｎ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ａ２７２Ｖ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｖ００４Ａ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、及びＹ００６Ｈ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３、及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３及びＢＰＮ’−ｖ３６よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、ＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３、及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較してタンパク質分解活性が向上している、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０超〜約５のＰＩ値を有する、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して１．０超〜約５のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３４９】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４の卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して約１．０に相当するＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、ＢＰＮ’−ｖ３６、Ａ０１５Ｓ−Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｖ１４７Ａ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｉ２６８Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｎ２６９Ｄ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２���８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｖ１４３Ａ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ａ１３８Ｖ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｋ１４１Ｅ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｉ１０７Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ａ２２３Ｇ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ���Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ａ２３２Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｎ２６９Ｄ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｆ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｔ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｉ２６８Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｖ１４９Ａ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２���６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ−Ｑ２７５Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｑ２７１Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｖ１４９Ａ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｖ１４９Ｌ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ
２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ−Ｉ２６８Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｑ２７１Ｈ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｎ２６９Ｄ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ａ２７４Ｄ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ−Ｎ２６９Ｄ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｓ１４５Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ−Ｎ２６９Ｄ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｑ２７１Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｔ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｖ１５０Ａ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｋ１４１Ｅ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ１１６Ｔ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｖ１４９Ｉ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｑ２７１Ｈ、Ｇ０２４Ｓ−Ｇ０５３Ｓ−Ｎ０７８Ｓ−Ｇ０９７Ａ−Ｎ１０１Ｓ、Ｇ０２４Ｓ−Ｇ０５３Ｓ−Ｎ０７８Ｓ−Ｇ０９７Ａ−Ｎ１０１Ｓ−Ａ１２８Ｓ、Ｇ１３１Ｈ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４０Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｉ２６８Ｖ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ−Ｎ２６９Ｓ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｗ２４１Ｌ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｉ１０７Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｉ１０７Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｗ２４１Ｒ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｉ２６８Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｋ１４１Ｅ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｗ２４１Ｒ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｋ１４１Ｅ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ−Ｑ２７５Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｉ２６８Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｓ−Ａ１１６Ｔ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｓ００３Ｐ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２３３Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｎ２６９Ｄ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｖ００４Ｌ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、及びＹ００６Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けさ
れるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０のＰＩ値を有する、及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較して１．０のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３５０】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４の卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．５以上０．９未満のＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、Ａ０８８Ｔ−Ａ０９８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｑ２７１Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｉ２３４Ｔ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｖ１４９Ｌ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｋ１４１Ｅ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｑ２７５Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５���Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｖ１４９Ａ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１２Ｄ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１３７Ｅ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｄ１４０Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ａ１５２Ｓ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｄ１４０Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｗ２４１Ｒ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｑ２７５Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｑ２４５Ｋ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ−Ｑ２７５Ｋ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、���０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０９８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｋ１４１Ｅ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｗ２４１Ｒ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｖ１３９Ｉ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ−Ｑ２７１Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ０５３Ｓ−Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｇ１６９Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ｋ２５６Ｒ、Ｌ０９０Ｉ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２３７Ｒ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｑ２７１Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｓ００３Ｐ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ００３Ｐ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ｓ１０５Ｈ−Ｗ１０６Ｇ−Ｉ１０７Ｌ−Ｉ１０８Ｓ−Ｎ１０９Ａ−Ｇ１１０Ａ−Ｉ１１１Ｓ−Ｅ１１２Ｎ−Ｗ１１３Ｇ−Ａ１１４Ｐ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｖ００４Ａ−Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ｖ００４Ａ−Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｙ００６Ｈ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｙ１０４Ｈ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５���Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｄ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２３７Ｒ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｋ２１３Ｎ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｄ１４０Ｇ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｍ１２４Ｉ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｌ２３３Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｔ２５５Ｋ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２
１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ−Ｉ２６８Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｖ２０３Ｉ−Ｎ２１８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｙ１０４Ｈ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ１１６Ｔ−Ｄ１４０Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１５７Ｅ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｗ２４１Ｒ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ２４３Ｖ、Ｐ０１４Ｌ−Ａ０１５Ｌ−Ｌ０１６Ｃ−Ｈ０１７Ｔ−Ｓ０１８Ｌ−Ｑ０１９Ｋ−Ｇ０２０Ａ−Ｙ０２１Ｔ−Ｔ０２２Ｌ−Ｇ０２３Ｅ、Ｓ００３Ｐ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｙ１０４Ｈ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１３８Ｅ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ−Ｉ２６８Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｗ２４１Ｌ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｗ２４１Ｒ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ１１６Ｔ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ、Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｉ２３４Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ａ１３７Ｖ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｋ１４１Ｅ−Ｌ２５７Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ、Ａ０８８Ｔ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｙ１０４Ｈ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ａ１３７Ｅ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｇ０６５Ｄ−Ａ０８８Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ、Ｙ１０４Ｈ−Ｎ２１８Ｓ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｇ１３１Ｈ−Ｖ１５０Ａ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｉ１０８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ｇ１３１Ｈ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ−Ｌ２５７Ｇ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ−Ｑ２７１Ｐ、Ａ０８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｖ１４８Ａ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ０８８Ｔ−Ｙ１０４Ｈ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１５３Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｌ２５７Ｇ−Ｎ２６９Ｄ、及びＶ００４Ｍ−Ａ１１６Ｔ−Ｖ１４８Ａ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、本アッセイにおいて、タンパク質分解活性を有する、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．５以上０．９未満のＰＩ値を有する、プロテアーゼの変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組の酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３５１】
同様に、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチ又は卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６及び又はＢＰＮ−’ｖ３と比較してタンパク質分解活性が向上している、並びに／あるいはＢＰＮ’−ｖ３６と比較して１．０超のＰＩ値を有するサブチリシンプロテアーゼ変異体も提供され、変異体は、配列番号２と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｘ００１Ｒ／Ｔ、Ｘ００２Ｒ、Ｘ００３Ｆ／Ｐ、Ｘ００４Ａ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｘ００５Ｓ、Ｘ００６Ｈ、Ｘ０１４Ｌ、Ｘ０１５Ｌ／Ｓ、Ｘ０１６Ｃ、Ｘ０１７Ｔ、Ｘ０１８Ｌ、Ｘ０１９Ｋ、Ｘ０２０Ａ、Ｘ０２１Ｔ、Ｘ０２２Ｌ、Ｘ０２３Ｅ、Ｘ０２４Ｓ、Ｘ０３４Ｓ、Ｘ０５３Ｓ、Ｘ０５７Ｑ、Ｘ０６５Ｄ、Ｘ０７８Ｓ、Ｘ０８６Ｌ、Ｘ０８８Ｔ、Ｘ０９０Ｉ、Ｘ０９７Ａ、Ｘ０９８Ｓ、Ｘ１０１Ｓ、Ｘ１０４Ｈ、Ｘ１０５Ｈ／Ｐ、Ｘ１０６Ｇ、Ｘ１０７Ｌ／Ｔ、Ｘ１０８Ｓ／Ｔ、Ｘ１０９Ａ／Ｇ／Ｓ、Ｘ１１０Ａ、Ｘ１１１Ｓ、Ｘ１１２Ｎ、Ｘ１１３Ｇ、Ｘ１１４Ｐ／Ｓ、Ｘ１１６Ｔ、Ｘ１２４Ｉ、Ｘ１２８Ｓ、Ｘ１３１Ｄ／Ｈ、Ｘ１３７Ｅ／Ｖ、Ｘ１３８Ｅ／Ｖ、Ｘ１３９Ｉ、Ｘ１４０Ｇ、Ｘ１４１Ｅ／Ｒ、Ｘ１４３Ａ／Ｆ、Ｘ１４４Ｖ、Ｘ１４５Ｆ／Ｐ／Ｔ、Ｘ１４６Ｃ、Ｘ１４７Ａ／Ｉ、Ｘ１４８Ａ、Ｘ１４９Ａ／Ｉ／Ｌ、Ｘ１５０Ａ、Ｘ１５１Ｓ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５３Ｓ、Ｘ１５４Ａ、Ｘ１５５Ｐ、Ｘ１５６Ｔ、Ｘ１５７Ｅ／Ｌ、Ｘ１５８Ｍ／Ｓ、Ｘ１５９Ｅ、Ｘ１６０Ｅ、Ｘ１６１Ｌ、Ｘ１６９Ｓ、Ｘ１８２Ｆ、Ｘ２０３Ｉ、Ｘ２０４Ｆ、Ｘ２０７Ｌ、Ｘ２１１Ｖ、Ｘ２１２Ｄ、Ｘ２１３Ｎ、Ｘ２１６Ｓ、Ｘ２１８Ｓ／Ｔ、Ｘ２２３Ｇ、Ｘ２３１Ｖ、Ｘ２３２Ｓ、Ｘ２３３Ｓ、Ｘ２３４Ｔ、Ｘ２３５Ｐ、Ｘ２３６Ｆ／Ｐ、Ｘ２３７Ｎ／Ｒ、Ｘ２４０Ｈ、Ｘ２４１Ｌ／Ｒ、Ｘ２４３Ｆ／Ｖ、Ｘ２４５Ｋ、Ｘ２４８Ｎ、Ｘ２５１Ｋ、Ｘ２５５Ｋ、Ｘ２５６Ｒ、Ｘ２５７Ｇ、Ｘ２６０Ｆ、Ｘ２６７Ｍ、Ｘ２６８Ｖ、Ｘ２６９Ｄ／Ｓ、Ｘ２７１Ｈ／Ｋ／Ｐ／Ｒ、Ｘ２７２Ｇ／Ｖ、Ｘ２７３Ｔ、Ｘ２７４Ｄ／Ｌ／Ｔ／Ｖ、及びＸ２７５Ｋ／Ｒ／Ｓの群から選択された少なくとも１つの置換を含み、Ａ００１Ｒ／Ｔ、Ｑ００２Ｒ、Ｓ００３Ｆ／Ｐ、Ｖ００４Ａ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｐ００５Ｓ、Ｙ００６Ｈ、Ｐ０１４Ｌ、Ａ０１５Ｌ／Ｓ、Ｌ０１６Ｃ、Ｈ０１７Ｔ、Ｓ０１８Ｌ、Ｑ０１９Ｋ、Ｇ０２０Ａ、Ｙ０２１Ｔ、Ｔ０２２Ｌ、Ｇ０２３Ｅ、Ｇ０２４Ｓ、Ｇ０３４Ｓ、Ｇ０５３Ｓ、Ｐ０５７Ｑ、Ｇ０６５Ｄ、Ｎ０７８Ｓ、Ｐ０８６Ｌ、Ａ０８８Ｔ、Ｌ０９０Ｉ、Ｇ０９７Ａ、Ａ０９８Ｓ、Ｎ１０１Ｓ、Ｙ１０４Ｈ、Ｓ１０５Ｈ／Ｐ、Ｗ１０６Ｇ、Ｉ１０７Ｌ／Ｔ、Ｉ１０８Ｓ／Ｔ、Ｎ１０９Ａ／Ｇ／Ｓ、Ｇ１１０Ａ、Ｉ１１１Ｓ、Ｅ１１２Ｎ、Ｗ１１３Ｇ、Ａ１１４Ｐ／Ｓ、Ａ１１６Ｔ、Ｍ１２４Ｉ、Ａ１２８Ｓ、Ｇ１３１Ｄ／Ｈ、Ａ１３７Ｅ／Ｖ、Ａ１３８Ｅ／Ｖ、Ｖ１３９Ｉ、Ｄ１４０Ｇ、Ｋ１４１Ｅ／Ｒ、Ｖ１４３Ａ／Ｆ、Ａ１４４Ｖ、Ｓ１４５Ｆ／Ｐ／Ｔ、Ｇ１４６Ｃ、Ｖ１４７Ａ／Ｉ、Ｖ１４８Ａ、Ｖ１４９Ａ／Ｉ／Ｌ、Ｖ１５０Ａ、Ａ１５１Ｓ、Ａ１５２Ｓ、Ａ１５３Ｓ、Ｇ１５４Ａ、Ｎ１５５Ｐ、Ｅ１５６���、Ｇ１５７Ｅ／Ｌ、Ｔ１５８Ｍ／Ｓ、Ｓ１５９Ｅ、Ｇ１６０Ｅ、Ｓ１６１Ｌ、Ｇ１６９Ｓ、Ｓ１８２Ｆ、Ｖ２０３Ｉ、Ｓ２０４Ｆ、Ｓ２０７Ｌ、Ｇ２１１Ｖ、Ｎ２１２Ｄ、Ｋ２１３Ｎ、Ａ２１６Ｓ、Ｎ２１８Ｓ／Ｔ、Ａ２２３Ｇ、Ａ２３１Ｖ、Ａ２３２Ｓ、Ｌ２３３Ｓ、Ｉ２３４Ｔ、Ｌ２３５Ｐ、Ｓ２３６Ｆ／Ｐ、Ｋ２３７Ｎ／Ｒ、Ｎ２４０Ｈ、Ｗ２４１Ｌ／Ｒ、Ｎ２４３Ｆ／Ｖ、Ｑ２４５Ｋ、Ｓ２４８Ｎ、Ｅ２５１Ｋ、Ｔ２５５Ｋ、Ｋ２５６Ｒ、Ｌ２５７Ｇ、Ｓ２６０Ｆ、Ｌ２６７Ｍ、Ｉ２６８Ｖ、Ｎ２６９Ｄ／Ｓ、Ｑ２７１Ｈ／Ｋ／Ｐ／Ｒ、Ａ２７２Ｇ／Ｖ、Ａ２７３Ｔ、Ａ２７４Ｄ／Ｌ／Ｔ／Ｖ、Ｑ２７５Ｋ／Ｒ／Ｓの群から選択された少なくとも１つの置換を含んでいてもよい。ここで、変異のアミノ酸位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、ＢＰＮ’（配列番号２）、ＢＰＮ’−ｖ３及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつ本アッセイにおいて、ＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３及びＢＰＮ’−ｖ３６よりもＰＩ値が大きい。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３５２】
（実施例１０）
ＢＰＮ’−ｖ３６の更なる変異体の構築及び変異体のクリーニング性能
ＢＰＮ’−ｖ３６（実施例７に記載のもの）の部位評価ライブラリのＤＮＡに、エラープローンＰＣＲにより更に変異を誘発させた。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、これらのライブラリをプライマーＰ４９７３及びＰ４９５０（実施例７に記載のもの）により増幅させた。各ＰＣＲ増幅反応物には、３０ｐｍｏｌの各プライマー、１００ｎｇのテンプレートＤＮＡ（ＳＥＬｓのＢＰＮ’−ｖ３６）及び様々な量のＭｎＣｌ２を含有させた。ＰＣＲ反応（２０μＬ）は、まず始めに９５℃で２．５分加熱した後、続いて９４℃で１５秒の変性、５５℃で１５秒のアニーリング、及び７２℃で２分の伸長を３０サイクル行った。ＤＮＡフラグメントをＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ゲルバンド精製用キットによりゲルから精製し、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同様の制限酵素で消化したｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’ｐａｒｔｉａｌ  ｏｐｔベクターでライゲーションした。Ｉｌｌｕｓｔｒａ  Ｔｅｍｐｌｉｐｈｉキットでローリング・サークル型増幅法を用い、ライゲーション混合物を製造元（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の推奨に従って増幅させることで、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓに形質転換させるための多量体ＤＮＡを生成した。この目的のため、１μＬのライゲーション混合物と５μＬのサンプル緩衝液を混合し、９５℃で３分間加熱し、氷中で冷却した。次に、５μＬの反応緩衝液及び０．２μＬの酵素を各チューブに加え、続いて３０℃で１０時間にわたってインキュベートした。ローリング・サークル型増幅産物を１００倍希釈し、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞の形質転換に用いた（ΔａｐｒＥ，ΔｎｐｒＥ，ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ−ｐｈｌｅｏ）。形質転換混合物のアリコートを、１．６％のスキムミルク及び１０μｇ／ｍＬのネオマイシンを含有しているＬＢプレートに蒔き、３７℃で一晩インキュベートした。
【０３５３】
約５００，０００個のクローンをスキムミルクプレートでプレスクリーニングした。ハロー（すなわち、プロテアーゼ機能が存在していることの指標）を形成したものは非常に少なかった。ハローを生じたコロニーをつつき、１０μｇ／ｍＬのネオマイシンを含有している１５０μＬのＬＢ培地に植菌し、配列決定した（Ｑｕｉｎｔａｒａ）。プールに複数回生じ、性能効果を提供し得る変異の組み合わせを見ることで、これらのコロニーの配列を解析した。これらの変異の組み合わせの性能を評価するために、以下に記載するように融合ＰＣＲにより、ＢＰＮ’−ｖ３６バックグラウンドに二重変異を導入した。この目的のため、２〜３つの部分的に重複しているフラグメントを変異原性プライマーにより増幅させた。各変異を生成するために使用したプライマーの組み合わせを表１０−１に示し、プライマー配列を表１０−２に示す。
【０３５４】
【表８】
0005882904.tif 000022
【０３５５】
【表９−１】
0005882904.tif 000023
【０３５６】
【表９−２】
0005882904.tif 000024
【０３５７】
各ＰＣＲ増幅反応には、３０ｐｍｏｌの各プライマー及び１００ｎｇのＢＰＮ’−ｖ３６親テンプレートＤＮＡ（ｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’−ｖ３６プラスミド、図４を参照されたい）を含有させた。増幅はＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いて実施した。ＰＣＲ反応（２０μＬ）は、まず始めに９５℃で２．５分加熱した後、続いて９４℃で１５秒の変性、５５℃で１５秒のアニーリング、及び７２℃で４０秒の伸長を３０サイクル行った。増幅させた後、５’及び３’遺伝子フラグメントを、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ゲルバンド精製用キットによりゲルから精製し、混合して（各フラグメントにつき５０ｎｇ）、プライマーＰ４９７３及びＰ４９５０を用いて再度ＰＣＲで増幅させて、完全長の遺伝子フラグメントを生成した。伸長工程を７２℃で２分にわたって実施したことを除き、ＰＣＲ条件は上記の条件と同様のものであった。完全長のＤＮＡフラグメントをＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ゲルバンド精製用キットによりゲルから精製し、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同様の制限酵素で消化したｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’ｐａｒｔｉａｌ  ｏｐｔベクターでライゲーションした。Ｉｌｌｕｓｔｒａ  Ｔｅｍｐｌｉｐｈｉキットでローリング・サークル型増幅法を用い、ライゲーション混合物を製造元（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の推奨に従って増幅させることで、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓに形質転換させるための多量体ＤＮＡを生成した。この目的のため、１μＬのライゲーション混合物と５μＬのサンプル緩衝液を混合し、９５℃で３分間加熱し、氷中で冷却した。次に、５μＬの反応緩衝液及び０．２μＬの酵素を各チューブに加え、続いて３０℃で１０時間にわたってインキュベートした。ローリング・サークル型増幅産物を１００倍希釈し、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞の形質転換に用いた（ΔａｐｒＥ，ΔｎｐｒＥ，ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ−ｐｈｌｅｏ）。形質転換混合物のアリコートを、１．６％のスキムミルク及び１０μｇ／ｍＬのネオマイシンを含有しているＬＢプレートに蒔き、３７℃で一晩インキュベートした。続いて、ハローを生じたコロニーを、１０μｇ／ｍＬのネオマイシンを含有している１５０μＬのＬＢ培地に接種した。翌日、培養物は１５％のグリセロールと共に凍結させるか、あるいは実施例２に記載されるような生化学的解析のためにＭＤＢ培地で増殖させた。
【０３５８】
変異体を、１６℃及びｐＨ  ８での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチアッセイ、１６℃及びｐＨ  ７での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチアッセイ、並びに１６℃及びｐＨ  ８での洗剤組成物４の卵マイクロスウォッチアッセイを用いて、クリーニング性能について試験した。タンパク質含量はＴＣＡアッセイを用いて測定した。すべてのアッセイを実施例１に記載のように実施し、ＢＰＮ’−ｖ３６（すなわちＢＰＮ’−Ｓ２４Ｇ−Ｓ５３Ｇ−Ｓ７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ）と比較して性能インデックスを算出した。
【０３５９】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して約１．０に相当するＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、ＢＰＮ’−ｖ３６、Ａ１３３Ｖ−Ｓ２６０Ｎ、Ｎ０６１Ｓ−Ｓ２６０Ｐ、Ｐ０１４Ｔ−Ｓ０３７Ｔ、Ｓ００９Ｔ−Ｋ１４１Ｆ、Ｓ００９Ｔ−Ｋ１４１Ｒ、Ｓ０１８Ｆ−Ｓ１６２Ｌ、Ｓ０１８Ｌ−Ｙ０２１Ｓ、Ｓ０１８Ｐ−Ｄ１２０Ｎ、Ｓ０１８Ｔ−Ｓ１６２Ｐ、Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ、Ｓ０１８Ｙ−Ｋ２１３Ｒ、Ｓ１６１Ｐ−Ｓ１６２Ｌ、Ｓ１６１Ｐ−Ｓ２６０Ｐ、及びＴ２５３Ａ−Ｓ２６０Ｐからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０のＰＩ値を有する、及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較して１．０のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３６０】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して約０．９に相当するＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、Ａ１３４Ｔ−Ｓ２６０Ｇ、Ｉ１１５Ｖ−Ｎ１８４Ｙ、Ｎ０２５Ｋ−Ｓ０３７Ｐ、Ｑ０１０Ｌ−Ｓ０３７Ｐ、Ｑ０１９Ｌ−Ｓ２６０Ｎ、Ｑ０１９Ｌ−Ｓ２６０Ｐ、Ｓ０３７Ｐ−Ｔ２５４Ｓ、及びＳ１６１Ｐ−Ｔ２５３Ａからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、本アッセイにおいて、タンパク質分解活性を有する、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．９のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組の酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３６１】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．５以上０．９未満のＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、Ａ０４５Ｓ−Ｓ２３６Ｇ、Ｇ０２４Ａ−Ｓ０３７Ｗ、Ｉ０３１Ｖ−Ｓ０３８Ｗ、Ｎ０６１Ｄ−Ｓ２６０Ｉ、Ｑ０１０Ｒ−Ｓ０３７Ｔ、Ｉ１１５Ｔ−Ｓ１８３Ｔ、Ｎ０２５Ｋ−Ｐ１２９Ｋ、Ｎ０２５Ｋ−Ｐ１２９Ｒ、Ａ０４５Ｓ−Ｓ２３６Ｙ、及びＳ１６２Ｌ−Ｄ１８１Ｈからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、本アッセイにおいて、タンパク質分解活性を有する、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．５以上０．９未満のＰＩ値を有する、プロテアーゼの変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組の酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３６２】
以降、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ｐＨ  ７及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して１．０超、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．０超〜約１０、１．０超〜約８、又は１．０超〜約５のＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、Ｓ０１８Ｆ−Ｓ１６２Ｌ、Ｓ０１８Ｐ−Ｄ１２０Ｎ、Ｐ０１４Ｔ−Ｓ０３７Ｔ、Ｓ００９Ｔ−Ｋ１４１Ｒ、及びＳ１６１Ｐ−Ｓ１６２Ｌからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３、及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３及びＢＰＮ’−ｖ３６よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、ＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３、及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較してタンパク質分解活性が向上している、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０超〜約５のＰＩ値を有する、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して１．０超〜約５のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３６３】
以降、ｐＨ  ７及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して約１．０に相当するＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、ＢＰＮ’−ｖ３６、Ｎ０６１Ｓ−Ｓ２６０Ｐ、Ｑ０１０Ｌ−Ｓ０３７Ｐ、Ｓ００９Ｔ−Ｋ１４１Ｆ、Ｓ０１８Ｌ−Ｙ０２１Ｓ、Ｓ０１８Ｔ−Ｓ１６２Ｐ、Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ、Ｓ０１８Ｙ−Ｋ２１３Ｒ、Ｓ０３７Ｐ−Ｔ２５４Ｓ、Ｓ１６１Ｐ−Ｓ２６０Ｐ、Ｓ１６１Ｐ−Ｔ２５３Ａ、及びＴ２５３Ａ−Ｓ２６０Ｐからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０のＰＩ値を有する、及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較して１．０のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３６４】
以降、ｐＨ  ７及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して約０．９のＰＩ値を有するものとして定められた：ＢＰＮ’アミノ酸配列（配列番号２）は、Ａ１３３Ｖ−Ｓ２６０Ｎ、Ａ１３４Ｔ−Ｓ２６０Ｇ、Ｉ１１５Ｔ−Ｓ１８３Ｔ、Ｉ１１５Ｖ−Ｎ１８４Ｙ、Ｎ０６１Ｄ−Ｓ２６０Ｉ、Ｑ０１９Ｌ−Ｓ２６０Ｎ、及びＱ０１９Ｌ−Ｓ２６０Ｐからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異の位置は配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、本アッセイにおいて、タンパク質分解活性を有し、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して０．９のＰＩ値を有し、及び／又はＢＰＮ’と比較してタンパク質分解活性が向上している、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は、配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３６５】
以降、ｐＨ  ７及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．５以上０．９未満のＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、Ａ０４５Ｓ−Ｓ２３６Ｇ、Ｇ０２４Ａ−Ｓ０３７Ｗ、Ｑ０１０Ｒ−Ｓ０３７Ｔ、Ａ０４５Ｓ−Ｓ２３６Ｙ、Ｉ０３１Ｖ−Ｓ０３８Ｗ、Ｎ０２５Ｋ−Ｓ０３７Ｐ、Ｓ１６２Ｌ−Ｄ１８１Ｈ、及びＮ０２５Ｋ−Ｐ１２９Ｒからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、本アッセイにおいて、タンパク質分解活性を有する、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．５以上０．９未満のＰＩ値を有する、プロテアーゼの変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組の酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３６６】
以降、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４の卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して１．０超、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．０超〜約１０、１．０超〜約８、又は１．０超〜約５のＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、Ｉ０３１Ｖ−Ｓ０３８Ｗ、Ｐ０１４Ｔ−Ｓ０３７Ｔ、Ｓ０１８Ｆ−Ｓ１６２Ｌ、Ｓ０１８Ｐ−Ｄ１２０Ｎ、及びＳ１６２Ｌ−Ｄ１８１Ｈからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３、及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３及びＢＰＮ’−ｖ３６よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、ＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３、及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較してタンパク質分解活性が向上している、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０超〜約５のＰＩ値を有する、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して１．０超〜約５のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３６７】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４の卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して約１．０に相当するＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、ＢＰＮ’−ｖ３６、Ａ１３３Ｖ−Ｓ２６０Ｎ、Ａ１３４Ｔ−Ｓ２６０Ｇ、Ｇ０２４Ａ−Ｓ０３７Ｗ、Ｉ１１５Ｖ−Ｎ１８４Ｙ、Ｎ０２５Ｋ−Ｐ１２９Ｋ、Ｎ０２５Ｋ−Ｐ１２９Ｒ、Ｎ０６１Ｄ−Ｓ２６０Ｉ、Ｑ０１９Ｌ−Ｓ２６０Ｐ、Ｓ００９Ｔ−Ｋ１４１Ｆ、Ｓ００９Ｔ−Ｋ１４１Ｒ、Ｓ０１８Ｌ−Ｙ０２１Ｓ、Ｓ０１８Ｔ−Ｓ１６２Ｐ、Ｓ０１８Ｔ−Ｙ０２１Ｎ、Ｓ０１８Ｙ−Ｋ２１３Ｒ、Ｓ１６１Ｐ−Ｓ１６２Ｌ、Ｓ１６１Ｐ−Ｔ２５３Ａ、及びＴ２５３Ａ−Ｓ２６０Ｐからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０のＰＩ値を有する、及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較して１．０のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３６８】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４の卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．８以上０．９以下のＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、Ａ０４５Ｓ−Ｓ２３６Ｇ、Ａ０４５Ｓ−Ｓ２３６Ｙ、Ｉ１１５Ｔ−Ｓ１８３Ｔ、Ｎ０２５Ｋ−Ｓ０３７Ｐ、Ｎ０６１Ｓ−Ｓ２６０Ｐ、Ｑ０１０Ｌ−Ｓ０３７Ｐ、Ｑ０１０Ｒ−Ｓ０３７Ｔ、Ｑ０１９Ｌ−Ｓ２６０Ｎ、Ｓ０３７Ｐ−Ｔ２５４Ｓ、及びＳ１６１Ｐ−Ｓ２６０Ｐからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、本アッセイにおいて、タンパク質分解活性を有する、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．５以上０．９未満のＰＩ値を有する、プロテアーゼの変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組の酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３６９】
同様に、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩ又は卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較してタンパク質分解活性が向上している、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して１．０超のＰＩ値を有する、サブチリシンプロテアーゼ変異体も提供され、ここで、変異体は、配列番号２と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｘ００９Ｔ、Ｘ０１０Ｌ／Ｒ、Ｘ０１４Ｔ、Ｘ０１８Ｆ／Ｌ／Ｐ／Ｔ／Ｙ、Ｘ０１９Ｌ、Ｘ０２１Ｎ／Ｓ、Ｘ０２４Ａ、Ｘ０２５Ｋ、Ｘ０３１Ｖ、Ｘ０３７Ｐ／Ｔ／Ｗ、Ｘ０３８Ｗ、Ｘ０４５Ｓ、Ｘ０６１Ｄ／Ｓ、Ｘ１１５Ｔ／Ｖ、Ｘ１２０Ｎ、Ｘ１２９Ｋ／Ｒ、Ｘ１３３Ｖ、Ｘ１３４Ｔ、Ｘ１４１Ｆ／Ｒ、Ｘ１６１Ｐ、Ｘ１６２Ｌ／Ｐ、Ｘ１８１Ｈ、Ｘ１８３Ｔ、Ｘ１８４Ｙ、Ｘ２１３Ｒ、Ｘ２３６Ｇ／Ｙ、Ｘ２５３Ａ、Ｘ２５４Ｓ、及びＸ２６０Ｇ／Ｉ／Ｎ／Ｐの群から選択された少なくとも１つの置換を含む、少なくとも１つの置換を含み、Ｓ００９Ｔ、Ｑ０１０Ｌ／Ｒ、Ｐ０１４Ｔ、Ｓ０１８Ｆ／Ｌ／Ｐ／Ｔ／Ｙ、Ｑ０１９Ｌ、Ｙ０２１Ｎ／Ｓ、Ｇ０２４Ａ、Ｎ０２５Ｋ、Ｉ０３１Ｖ、Ｓ０３７Ｐ／Ｔ／Ｗ、Ｓ０３８Ｗ、Ａ０４５Ｓ、Ｎ０６１Ｄ／Ｓ、Ｉ１１５Ｔ／Ｖ、Ｄ１２０Ｎ、Ｐ１２９Ｋ／Ｒ、Ａ１３３Ｖ、Ａ１３４Ｔ、Ｋ１４１Ｆ／Ｒ、Ｓ１６１Ｐ、Ｓ１６２Ｌ／Ｐ、Ｄ１８１Ｈ、Ｓ１８３Ｔ、Ｎ１８４Ｙ、Ｋ２１３Ｒ、Ｓ２３６Ｇ／Ｙ、Ｔ２５３Ａ、Ｔ２５４Ｓ、及びＳ２６０Ｇ／Ｉ／Ｎ／Ｐの群から選択された少なくとも１つの置換を含んでいてもよい。ここで、変異のアミノ酸位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、ＢＰＮ’（配列番号２）、ＢＰＮ’−ｖ３及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつ本アッセイにおいて、ＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３及びＢＰＮ’−ｖ３６よりもＰＩ値が大きい。同様に、組成物（限定するものではないが、例えば、少なくともこのような１つの変異体を含むクリーニング組成物が挙げられる）、並びに少なくとも１つのこのような変異体を用いる本明細書の以降に詳細に記載されるようなクリーニング方法、が含まれる。
【０３７０】
（実施例１１）
１．コンビナトリアルライブラリＦＳ１〜ＦＳ３の生成
ＢＰＮ’発現カセットを含有しているｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’−ｖ３プラスミドをクローニング用テンプレートＤＮＡ（親プラスミド）として使用した。ＤＮＡ２．０により３つの別個のコンビナトリアルライブラリ（ＦＳ１、ＦＳ２、及びＦＳ３）を合成し、個々のライゲーション反応に用いた。ライブラリ及び導入可能な置換を表１１−１に示す。野生型残基又は表１１−１に記載の各部位での置換のいずれかが導入できるようにライブラリを設計した。
【０３７１】
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓを効率的に形質転換させるために、Ｉｌｌｕｓｔｒａ  Ｔｅｍｐｌｉｐｈｉキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いるローリング・サークル型増幅（ＲＣＡ）により、ライゲーション反応物からＤＮＡを増幅させた。反応は製造元のプロトコルに従い実施した。１マイクロリットルの、１０倍希釈した増幅ＤＮＡを使用して、コンピテントなＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞（ΔａｐｒＥ，ΔｎｐｒＥ，ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ−ｐｈｌｅｏ）５０μＬを形質転換させた。形質転換混合物を３７℃にて１時間にわたって振盪した。形質転換混合物の１０マイクロリットルアリコートを、１０μｇ／ｍＬのネオマイシン（Ｔｅｋｎｏｖａ）を添加したスキムミルク（１．６％）Ｌｕｒｉａ寒天プレートに蒔いた。
【０３７２】
形質転換体をつつき、１０μｇ／ｍＬのネオマイシンを添加した１２５〜１５０μＬのルリアブロス培地を含有しているマイクロタイタープレートに植菌した。マイクロタイタープレートにＥｎｚｙｓｃｒｅｅｎ  ｌｉｄ（Ｅｎｚｙｓｃｒｅｅｎ）を用い、プレートを３７℃、７０〜８０％湿度にて、２５０〜３００ｒｐｍで振盪させながら一晩増殖させた。１０μｇ／ｍＬのネオマイシンを添加した１９０μＬのＭＢＤ培地（ＭＯＰＳ系合成培地）を含有している新しいマイクロタイタープレートに、一晩培養プレートから７〜１０マイクロリットル接種した。ＮＨ４Ｃｌ、ＦｅＳＯ４、及びＣａＣｌ２を基本培地から除外したこと、３ｍＭのＫ２ＨＰＯ４を用いたこと、並びに、６０ｍＭの尿素、及び、２１０ｇ／Ｌのグルコースと３５０ｇ／Ｌマルトデキストリンとから作製した１００ｍＬの溶液を含有させたこと、を除き、ＭＢＤ培地は本質的に当該技術分野において既知であるように調製した（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１９：７３６〜７４７（１９７４）を参照されたい）。微量栄養素は、４００ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５０ｍｇのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＮａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ、１０ｍＬの１ＭのＣａＣｌ２、及び１０ｍＬの０．５Ｍのクエン酸ナトリウムを含有している、１リットルの１００Ｘ原液からなっていた。タンパク質発現を決定するために、Ｅｎｚｙｓｃｒｅｅｎ  ｌｉｄｓ（Ｅｎｚｙｓｃｒｅｅｎ）を用いて、ＭＢＤ培地を含有しているマイクロタイタープレートで、３７℃、７０〜８０％湿度にて、２５０〜３００ｒｐｍで、６０〜７０時間にわたって増殖させた。翌日、培養物をマイクロフィルタプレート（０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過し、得られた濾液を生化学的解析に使用した。
【０３７３】
【表１０】
0005882904.tif 000025
【０３７４】
２．ＢＰＮ’安定性を改善するための変異体の生成
ＢＰＮ’安定性を改善するために、どちらもＧｅｎｅ  Ｏｒａｃｌｅにより合成された親分子ｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ８７Ｄ又はｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｐ４０Ｅ、あるいはＧｅｎｅＡｒｔにより合成された親分子ｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ７８Ｎ及びｐＨＰＬＴ−ｐａｒｔｉａｌ  ｏｐｔ  ＦＮＡ（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓのサブチリシンＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ）のいずれかを用いて変異体を構築した。
【０３７５】
表１１−２及び１１−３に列挙されている情報は、本明細書で提供される変異体を構築するのに使用された親分子、変異体、及びプライマーを要約するものである。
【０３７６】
【表１１】
0005882904.tif 000026
【０３７７】
【表１２】
0005882904.tif 000027
【０３７８】
１０ｐｐｍのネオマイシンを含有している１．６％のスキムミルクプレートに、プラスミドを発現するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ株を画線し、３７℃で一晩増殖させた。プレートから単独のコロニーを、１０ｐｐｍのネオマイシンを含有している５ｍＬのルリアブロスで、３７℃で２５０ｒｐｍで振盪させながら一晩増殖させた。１マイクロリットルのＲｅａｄｙ  Ｌｙｓｅ  ｌｙｓｏｚｙｍｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を添加した、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ミニプレップキットプロトコルを用い、細胞の溶解を助けるために緩衝液Ｐ１で、３７℃で１５分間プラスミドを単離した。ＤＮＡ配列が正しいものであることを確認するために、加工前にプラスミドを配列決定した。ＮＥＢのＤａｍメチラーゼキットを用いて、プラスミドを、７７．５μＬの水＋１０μＬの１０Ｘ緩衝液＋０．２５μＬのＳＡＭ＋２μＬのＤＡＭメチラーゼ＋１０μＬのミニプレップＤＮＡ（約１５０ｎｇ／μＬ）を含有させた反応液中で、３７℃で一晩メチル化した。ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット（Ｚｙｍｏ）を用いて、あるいはＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＰＣＲ精製キットにより、メチル化したプラスミドＤＮＡを精製した。２．５μＬの５Ｘ緩衝液＋０．７５μＬのＱｕｉｋ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ＋０．５μＬのプライマー１（２５μＭ）＋０．５μＬのプライマー２（２５μＭ）＋１．５μＬのｄＮＴＰ＋１μＬの酵素ブレンド＋１６．２５μＬのＨ２Ｏ＋２μＬのＤＮＡを含有させた反応混合液で、各ＤＮＡテンプレートに対してＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）による多部位特異的変異誘導反応を行った。使用したＰＣＲプログラムは以下の通りであった：９５℃で１分、（９５℃で１分、５３℃で１分、６５℃で１０分）×２９サイクル、６５℃で１０分、４℃で保持。すべての反応で、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＰＴＣ−２００  Ｐｅｌｔｉｅｒ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒを用いてＰＣＲを実施した。１μＬのＤｐｎＩをＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）変異導入キットに加え、３７℃で一晩置くことでＰＣＲサンプルから親ＤＮＡを除去した。形質転換頻度を増加させるために、製造元のプロトコルに従ってＩｌｌｕｓｔｒａ  ＴｅｍｐｌｉＰｈｉキットを用い、ローリング・サークル型増幅（ＲＣＡ）させることで、ＤｐｎＩ消化した反応物を増幅させた。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞（ΔａｐｒＥ，ΔｎｐｒＥ，ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ−ｐｈｌｅｏ）を、各１μＬのＲＣＡ反応物で形質転換し、形質転換させた細胞を、１０ｐｐｍのネオマイシンを含有しているＬＡ＋１．６％スキムミルクプレートに蒔き、３７℃で一晩インキュベートした。一晩増殖物からコロニーを選択し、「ｐｕＲｅＴａｑ  Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  ＰＣＲ  Ｂｅａｄｓ」（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて配列決定するためにコロニーＰＣＲを実施した。ＰＣＲ及び配列決定に使用したプライマーは、ｐＨＰＬＴ  Ｆ１（配列番号５４）及びｐＨＰＬＴ  ｓｅｑ  Ｒ１（配列番号５５）であった。適切な配列を有するコロニーを凍結した。尿素を含有しているＭＯＰＳ系培地を用い、３７℃で６８時間にわたり、９６ウェルマイクロタイタープレートでＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ形質転換体を増殖させることで、ＢＰＮ���変異体タンパク質を産生させた。
【０３７９】
３．異なる５種の親プラスミドからのＢＰＮ’変異体の生成
表１１−４に示される、合計５種の異なるテンプレート：ＢＰＮ’−ｖ３（Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ）、ＢＰＮ’−ｖ４（Ｇ９７Ａ−Ｎ１２３Ｇ−Ｙ２１７Ｑ）、ＢＰＮ’変異体８（Ｓ８７Ｄ−Ｇ９７Ａ−Ｎ１０９Ｄ−Ｇ１２８Ａ−Ｓ１８８Ｄ−Ｓ２４８Ｒ−Ｙ２１７Ｑ）、ＢＰＮ’変異体１６（Ｓ８７Ｄ−Ｇ９７Ａ−Ｎ１０９Ｄ−Ｇ１２８Ａ−Ｓ１８８Ｄ−Ｙ２１７Ｑ）、及びＢＰＮ’変異体２１（Ｓ８７Ｒ−Ｇ９７Ａ−Ｎ１０９Ｒ−Ｇ１２８Ａ−Ｓ１８８Ｒ−Ｙ２１７Ｑ−Ｓ２４８Ｒ）を用い、ＢＰＮ’変異体を構築した。ＢＰＮ’−ｖ４及びＢＰＮ’−ｖ３の生成は、このような説明についての参照により本案件に組み込まれる、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０９／４６０６６（国際公開第０９／１４９１４４号）（２００９年、６月３日出願）に記載される。Ｇｅｎｅ  Ｏｒａｃｌｅにより、ＢＰＮ’変異体８、１６、２１を合成し、親プラスミドとして用い、更なる変異体を作成した。以下に記載するような融合ＰＣＲを用いて作成した２種の変異体（変異体５及び３３）を除き、すべての変異体はＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）変異導入キットを用いて生成した。変異体を生成するためのプライマー（表１１−５に記載）はＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより合成された。導入された変異（太字で示されるもの）、並びに使用されたプライマー及びテンプレートを表１１−４に示す。
【０３８０】
【表１３】
0005882904.tif 000028
【０３８１】
ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）変異導入によるＢＰＮ’変異体の生成
ＢＰＮ’−ｖ３、ＢＰＮ’−ｖ４、ＢＰＮ’変異体８、ＢＰＮ’変異体１６、及びＢＰＮ’変異体２１を発現するプラスミドを含有しているＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ株を、１０ｐｐｍのネオマイシンを含有している１．６％のスキムミルクプレートに画線し、３７℃で一晩増殖させた。プレートから単独のコロニーを、１０ｐｐｍのネオマイシンを含有している５ｍＬのルリアブロスで、３７℃で２５０ｒｐｍで振盪させながら一晩増殖させた。ＢＰＮ’−ｖ３、ＢＰＮ’−ｖ４、ＢＰＮ’変異体８、ＢＰＮ’変異体１６、及びＢＰＮ’変異体２１を発現しているプラスミドを、１マイクロリットルのＲｅａｄｙ  Ｌｙｓｅ  ｌｙｓｏｚｙｍｅを添加しかつ３７℃で１５分にわたってインキュベートする細胞溶解は行わずに、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ミニプレップキットプロトコルを用い単離した。ＮＥＢのＤａｍメチラーゼキットを用いて、プラスミドを、７７．７５μＬのＨ２Ｏ＋１０μＬの１０Ｘ緩衝液＋０．２５μＬのＳＡＭ＋２μＬのＤＡＭメチラーゼ＋１０μＬのミニプレップＤＮＡを含有させた反応液中で、３７℃で一晩メチル化した。メチル化したＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＰＣＲ精製キットを用い精製した。表１１−４に列挙した変異体１４、１８、及び１９を、ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ  ＬＩＧＨＴＮＩＮＧ（商標）多部位特異的変異誘導キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、２．５μＬの５Ｘ緩衝液＋０．７５μＬのＱｕｉｋ溶液＋０．５μＬのプライマー１（２５μＭ）＋０．５μＬのプライマー２（２５μＭ）＋１．５μＬのｄＮＴＰ＋１μＬの酵素ブレンド＋１６．２５μＬのＨ２Ｏ＋２μＬのＤＮＡを含有させた反応混合液で生成した。使用したＰＣＲプログラムは以下の通りであった：９５℃で２分、（９５℃で２０秒、５５℃で３０秒、６４℃で２分３０秒）×２９サイクル、６４℃で５分、４℃で保持。
【０３８２】
残りの変異体は、ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）多部位特異的変異誘導キットを用いて、２．５μＬの５Ｘ緩衝液＋０．７５μＬのＱｕｉｋ溶液＋０．５μＬのプライマー１（２５μＭ）＋０．５μＬのプライマー２（２５μＭ）＋１．５μＬのｄＮＴＰ＋１μＬの酵素ブレンド＋１６．２５μＬのＨ２Ｏ＋２μＬのＤＮＡを含有させた反応混合液で生成した。使用したＰＣＲプログラムは以下の通りであった：９５℃で１分、（９５℃で１分、５３℃で１分、６５℃で１０分）×２９サイクル、６５℃で１０分、４℃で保持。すべての反応で、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＰＴＣ−２００  Ｐｅｌｔｉｅｒ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒを用いてＰＣＲを実施した。Ｑｕｉｋ−Ｃｈａｎｇｅ反応に使用したプライマーを表１１−５に提供する。プライマーはプライマー配列（５’〜３’）で示される。
【０３８３】
【表１４】
0005882904.tif 000029
【０３８４】
１μＬのＤｐｎＩをＱｕｉｋ−Ｃｈａｎｇｅ反応物に加え、３７℃で一晩置くことでＰＣＲサンプルから親ＤＮＡを除去した。製造元のプロトコルに従ってＩｌｌｕｓｔｒａ  ＴｅｍｐｌｉＰｈｉキットを用い、ローリング・サークル型増幅（ＲＣＡ）させることで、ＤｐｎＩ消化した反応物１μＬを増幅させた。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞（ΔａｐｒＥ，ΔｎｐｒＥ，ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ−ｐｈｌｅｏ）を、各１μＬのＲＣＡ反応物で形質転換し、形質転換させた細胞を、１０ｐｐｍのネオマイシンを含有しているＬＡ＋１．６％スキムミルクプレートに蒔き、３７℃で一晩インキュベートした。一晩増殖物からコロニーを選択し、「ｐｕＲｅＴａｑ  Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  ＰＣＲ  Ｂｅａｄｓ」（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてコロニーＰＣＲを実施した。使用したＰＣＲプライマーはｐＨＰＬＴ  Ｆ１（配列番号５４）及びｐＨＰＬＴ  ｓｅｑ  Ｒ１（配列番号５５）であった。適切な配列を有するコロニーを凍結した。尿素を含有しているＭＯＰＳ系培地を用い、３７℃で６８時間にわたり、９６ウェルマイクロタイタープレートでＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ形質転換体を増殖させることで、ＢＰＮ’変異体を発現させた。
【０３８５】
融合ＰＣＲによるＢＰＮ’変異体の生成
テンプレートｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’−ｖ３から増幅させたフラグメントで融合ＰＣＲを用い、変異体５及び３３を生成した。これらの変異体を生成するために使用したＰＣＲプライマーは表１１−５に包含される。変異体５に関しては、ＢＰＮ’遺伝子の５’フラグメントは、順方向プライマーｐＨＰＬＴ  Ｆ１（配列番号５４）、及び逆方向プライマーＳ２４８Ｄ  ｒｅｖｆｕｓを用いて増幅させた。ＢＰＮ’遺伝子の３’フラグメントは、対象とする変異を含有している順方向プライマーＳ２４８Ｄ  ｆｏｒｆｕｓ及び逆方向プライマーｐＨＰＬＴ  Ｒ１を用いて増幅させた。２０ｂｐの重複配列を含有している２種の生成物は、１μＬの各フラグメントと、融合プライマーＱＣ  ＦＵＳＩＯＮ＿Ｆｏｒ１及びＱＣ  ＦＵＳＩＯＮ＿Ｒｅｖ１を最終的なＰＣＲ反応で組み合わせることで融合させた。ＰＣＲ反応は、すべてＨｅｒｃｕｌａｓｅ  ＩＩ  ＰＣＲキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の標準条件を用いて実施した。ＰＣＲミックスには、１μＬのＤＮＡポリメラーゼ、１μＬのプラスミドＤＮＡ（又は融合用フラグメントＤＮＡ）、０．５μＬのｄＮＴＰ、１．２５μＬの２５μＭの順方向プライマー、１．２５μＬの２５μＭの逆方向プライマー、１０μＬの５Ｘ緩衝液、３５μＬのＨ２Ｏを含有させた。使用したＰＣＲプログラムは以下の通りであった：９５℃で２分、（９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で「Ｘ」秒）×２９サイクル、７２℃で１分、４℃保持（「Ｘ」は増幅させるＤＮＡの１ｋＢつき１５秒）。
【０３８６】
変異体３３に関しては、ＢＰＮ’遺伝子の５’フラグメントは、テンプレートｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’−ｖ３、並びにプライマーｐＨＰＬＴ  Ｆ１（配列番号５４）及びＧ１００Ｅ＿Ｆｓｒｅｖを用いて増幅させた。プライマーＧ１００Ｅ＿Ｆｓｆｏｒ及びｐＨＰＬＴ  Ｒ１を用い、変異を含有させた３’フラグメントを増幅させた。２０ｂｐの重複配列を含有している２種の生成物は、１μＬの各フラグメントと、融合プライマーＱＣ  ＦＵＳＩＯＮ＿Ｆｏｒ１及びＱＣ  ＦＵＳＩＯＮ＿Ｒｅｖ１を最終的なＰＣＲ反応で組み合わせることで融合させた。ＰＣＲ条件は上記のものと同様であった。
【０３８７】
ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＰＣＲ精製カラムを用い、供給元により提供された条件で２種の融合生成物を精製し、ＢｇｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ酵素を用い一晩消化した。同様の酵素を用い、プラスミドｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’  ｐａｒｔｉａｌ  ｏｐｔを消化し、ベクターのバンドをゲルから抽出し、製造元の推奨に従いＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ゲル精製カラムで精製した。制限酵素ミックスには１０μＬの精製ＤＮＡ、５μＬのＲｏｃｈｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ、０．５μＬのＨｉｎｄＩＩＩ、０．５μＬのＢｇｌＩ、３４μＬのＨ２Ｏを含有させ、反応は３７℃で８時間にわたって、続いて６５℃で２０分にわたって実施した。ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＰＣＲ精製カラムを用い消化物を精製し、及びＭｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ  Ｌｉｇａｓｅキット（Ｔｅｋａｒａ）を用い、切断したベクター骨格と１６℃で一晩ライゲーションさせた。インキュベーション後、１μＬのライゲーションミックスをＩｌｌｕｓｔｒａ  ＴｅｍｐｌｉＰｈｉキットを用いて増幅させた。
【０３８８】
増幅反応に関して、１μＬのライゲーション反応ミックスを、ＴｅｍｐｌｉＰｈｉキットの５μＬのサンプル緩衝液と混合し、９５℃で３分加熱してＤＮＡを変性させた。反応物を氷中に置き、２分冷却し、次いで簡単にスピン・ダウンさせた。５マイクロリットルの反応緩衝液、及びＴｅｍｐｌｉＰｈｉキットの０．２μＬのｐｈｉ２９ポリメラーゼを加え、反応物をＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＰＣＲ  ｍａｃｈｉｎｅで３０℃で４時間にわたってインキュベートした。ｐｈｉ２９酵素は、ＰＣＲ装置中で、６５℃で１０分にわたってインキュベートすることにより、反応液中で熱失活させた。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞（ΔａｐｒＥ，ΔｎｐｒＥ，ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ−ｐｈｌｅｏ）を１μＬの反応混合物を用いて形質転換させ、形質転換体を、１０ｐｐｍのネオマイシンを含有している１．６％のスキムミルクプレート上で３７℃で一晩増殖させた。形質転換体を選択してコロニーＰＣＲを実施し、「ｐｕＲｅＴａｑ  Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  ＰＣＲ  Ｂｅａｄｓ」（Ａｍｅｒｓｈａｍ）並びにプライマーｐＨＰＬＴ  Ｆ１（配列番号５４）及びｐＨＰＬＴ  ｓｅｑＲ１（配列番号５５）を用いて配列決定した。
【０３８９】
４．ライブラリＲＣＬ４−ＲＣＬ７からのＢＰＮ’変異体の生成
ＲＣＬ４ライブラリ
「ＲＣＬ４」は、ＢＰＮ’−ｖ３をコードしている（ＢＰＮ’−Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ）遺伝子の、３つの隣接するコドンを同時にランダム化させる融合ＰＣＲにより作成された、部位飽和ライブラリ群を指す。各ライブラリ中で、３つの変異コドンに対応するアミノ酸位置は表１１−６に提供される。それぞれ３つの縮重コドンを含有している、２種の部分的に重複している相補的な変異原性プライマーを使用して、以下表１１−６に示されるように各ライブラリ内に変異を導入した。各プライマー中で、対象とする各縮重コドンの最初の２つのヌクレオチド（ＮＮＸ、Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｔ、又はＧであり、及びＸは変化していないヌクレオチドである）のみを変異させた（表１１−６）。
【０３９０】
各ライブラリを生成するために、共通の３’側の遺伝子のフランキングプライマー（Ｐ４９７６，ＣＣＴＣＴＣＧＧＴＴＡＴＧＡＧＴＴＡＧＴＴＣ、（配列番号６１））及び変異原性プライマー、あるいは共通の５’側の遺伝子のフランキングプライマー（Ｐ４９７４，ＧＣＣＴＣＡＣＡＴＴＴＧＴＧＣＣＡＣＣＴＡ、（配列番号６０））及び表１１−６で各ライブラリについて示される変異原性プライマーを用いて、２種類のＰＣＲ反応を実施した。これらのＰＣＲ反応は、２種のＰＣＲフラグメントを生成した。一方は変異ＢＰＮ’−ｖ３遺伝子（５’遺伝子フラグメント）の５’側半分をコードするものであり、他方は変異ＢＰＮ’−ｖ３遺伝子の３’側半分をコードするものである（３’遺伝子フラグメント）。各ＰＣＲ増幅反応には、３０ｐｍｏｌの各プライマー及び１００ｎｇのＢＰＮ’−ｖ３親テンプレートＤＮＡ（ｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’−ｖ３プラスミド、図１を参照されたい）を含有させた。増幅はＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いて実施した。ＰＣＲ反応（２０μＬ）は、まず始めに９５℃で２．５分加熱した後、続いて９４℃で１５秒の変性、５５℃で１５秒のアニーリング、及び７２℃で４０秒の伸長を３０サイクル行った。増幅させた後、５’及び３’遺伝子フラグメントを、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ゲルバンド精製用キットによりゲルから精製し、混合して（各フラグメントにつき５０ｎｇ）、プライマーＰ４９７３（ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＣＧＧＣＧＣＴＴＴＴＣ、配列番号６２）及びＰ４９５０（ＣＴＴＧＴＣＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡ、配列番号６３）を用いて再度ＰＣＲで増幅させて、完全長の遺伝子フラグメントを生成した。伸長工程を７２℃で２分にわたって実施したことを除き、ＰＣＲ条件は上記の条件と同様のものであった。完全長のＤＮＡフラグメントをＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ゲルバンド精製用キットによりゲルから精製し、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同様の制限酵素で消化したｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’ｐａｒｔｉａｌ  ｏｐｔベクターでライゲーションした。Ｉｌｌｕｓｔｒａ  Ｔｅｍｐｌｉｐｈｉキットでローリング・サークル型増幅法を用い、ライゲーション混合物を製造元（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の推奨に従って増幅させることで、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓに形質転換させるための多量体ＤＮＡを生成した。この目的のため、１μＬのライゲーション混合物と５μＬのサンプル緩衝液を混合し、９５℃で３分間加熱し、氷中で冷却した。次に、５μＬの反応緩衝液及び０．２μＬの酵素を各チューブに加え、続いて３０℃で１０時間にわたってインキュベートした。ローリング・サークル型増幅産物を１００倍希釈し、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞の形質転換に用いた（ΔａｐｒＥ，ΔｎｐｒＥ，ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ−ｐｈｌｅｏ）。形質転換混合物のアリコートを、１．６％のスキムミルク及び１０μｇ／ｍＬのネオマイシンを含有しているＬＢプレートに蒔き、３７℃で一晩インキュベートした。続いて、ハローを生じたコロニーを、１０μｇ／ｍＬのネオマイシンを含有している１５０μＬのＬＢ培地に接種した。
【０３９１】
【表１５−１】
0005882904.tif 000030
【０３９２】
【表１５−２】
0005882904.tif 000031
【０３９３】
【表１５−３】
0005882904.tif 000032
【０３９４】
【表１５−４】
0005882904.tif 000033
【０３９５】
【表１５−５】
0005882904.tif 000034
【０３９６】
【表１５−６】
0005882904.tif 000035
【０３９７】
【表１５−７】
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【０３９８】
【表１５−８】
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【０３９９】
【表１５−９】
0005882904.tif 000038
【０４００】
ＲＣＬ５変異体
「ＲＣＬ５」は、親（テンプレート）分子として数個のＢＰＮ’変異体を用いて融合ＰＣＲにより生成した１組のコンビナトリアル変異体を指す。各親プラスミドに導入した変異を表１１−７に示し、変異体を生成するのに使用した変異原性プライマーを表１１−８に示す。
【０４０１】
【表１６−１】
0005882904.tif 000039
【０４０２】
【表１６−２】
0005882904.tif 000040
【０４０３】
【表１６−３】
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【０４０４】
【表１７】
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【０４０５】
各変異体を生成するために、共通の３’側の遺伝子のフランキングプライマー（Ｐ４９７６，ＣＣＴＣＴＣＧＧＴＴＡＴＧＡＧＴＴＡＧＴＴＣ、配列番号６１）及び変異原性プライマー、あるいは共通の５’側の遺伝子のフランキングプライマー（Ｐ４９７４，ＧＣＣＴＣＡＣＡＴＴＴＧＴＧＣＣＡＣＣＴＡ、配列番号６０）及び表１１−８で各ライブラリについて示される変異原性プライマーを用いて、２種類のＰＣＲ反応を実施した。これらのＰＣＲ反応は、２種のＰＣＲフラグメントを生成した。一方はＢＰＮ’変異遺伝子（５’遺伝子フラグメント）の５’側半分をコードするものであり、他方はＢＰＮ’変異遺伝子の３’側半分をコードするものである（３’遺伝子フラグメント）。各ＰＣＲ増幅反応には、３０ｐｍｏｌの各プライマー及び表１１−７に列挙した１００ｎｇの親分子を含有させた。増幅はＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いて実施した。ＰＣＲ反応（２０μＬ）は、まず始めに９５℃で２．５分加熱した後、続いて９４℃で１５秒の変性、５５℃で１５秒のアニーリング、及び７２℃で４０秒の伸長を３０サイクル行った。増幅させた後、５’及び３’遺伝子フラグメントを、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ゲルバンド精製用キットによりゲルから精製し、混合して（各フラグメントにつき５０ｎｇ）、プライマーＰ４９７３（配列番号６２）及びＰ４９５０（配列番号６３）を用いて再度ＰＣＲで増幅させて、完全長の遺伝子フラグメントを生成した。伸長工程を７２℃で２分にわたって実施したことを除き、ＰＣＲ条件は上記の条件と同様のものであった。完全長のＤＮＡフラグメントをＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ゲルバンド精製用キットによりゲルから精製し、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同様の制限酵素で消化したｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’ｐａｒｔｉａｌ  ｏｐｔでライゲーションした。Ｉｌｌｕｓｔｒａ  Ｔｅｍｐｌｉｐｈｉキットでローリング・サークル型増幅法を用い、ライゲーション混合物を製造元（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）からの取扱説明書に従って増幅させることで、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓに形質転換させるための多量体ＤＮＡを生成した。この目的のため、１μＬのライゲーション混合物と５μＬのサンプル緩衝液を混合し、９５℃で３分間加熱し、氷中で冷却した。次に、５μＬの反応緩衝液及び０．２μＬの酵素を各チューブに加え、続いて３０℃で１０時間にわたってインキュベートした。ローリング・サークル型増幅産物を１００倍希釈し、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞の形質転換に用いた（ΔａｐｒＥ，ΔｎｐｒＥ，ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ−ｐｈｌｅｏ）。形質転換混合物のアリコートを、１．６％のスキムミルク及び１０μｇ／ｍＬのネオマイシンを含有しているＬＢプレートに蒔き、３７℃で一晩インキュベートした。続いて、ハローを生じたコロニーを、１０μｇ／ｍＬのネオマイシンを含有している１２０μＬのＬＢ培地に接種した。
【０４０６】
ＲＣＬ６コンビナトリアルライブラリ
「ＲＣＬ６」は、親（テンプレート）分子として数個のＢＰＮ’変異体を用いて融合ＰＣＲにより生成した１群のコンビナトリアルライブラリを指す。これらの各ライブラリの構築に、ＢＰＮ’変異体の混合物をテンプレート（親分子）として使用した。親分子の５つの異なる混合物を使用して、表１１−９に提供されるライブラリを生成した。各ライブラリに導入した変異を表１１−１０に列挙する。
【０４０７】
各変異体を生成するために、共通の３’側の遺伝子のフランキングプライマー（Ｐ４９７６，配列番号６１）及び変異原性プライマー、あるいは共通の５’側の遺伝子のフランキングプライマー（Ｐ４９７４，配列番号６０）及び表１１−１０で各ライブラリについて示される変異原性プライマーを用いて、２種類のＰＣＲ反応を実施した。これらのＰＣＲ反応は、２種のＰＣＲフラグメントを生成した。一方はＢＰＮ’変異遺伝子（５’遺伝子フラグメント）の５’側半分をコードするものであり、他方はＢＰＮ’変異遺伝子の３’側半分をコードするものである（３’遺伝子フラグメント）。各ＰＣＲ増幅反応には、３０ｐｍｏｌの各プライマー及び表１１−９に列挙した１００ｎｇの親分子を含有させた。増幅はＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いて実施した。ＰＣＲ反応（２０μＬ）は、まず始めに９５℃で２．５分加熱した後、続いて９４℃で１５秒の変性、５５℃で１５秒のアニーリング、及び７２℃で４０秒の伸長を３０サイクル行った。増幅させた後、５’及び３’遺伝子フラグメントを、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ゲルバンド精製用キットによりゲルから精製し、混合して（各フラグメントにつき５０ｎｇ）、プライマーＰ４９７３（配列番号６２）及びＰ４９５０（配列番号６３）を用いて再度ＰＣＲで増幅させて、完全長の遺伝子フラグメントを生成した。伸長工程を７２℃で２分にわたって実施したことを除き、ＰＣＲ条件は上記の条件と同様のものであった。完全長のＤＮＡフラグメントをＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ゲルバンド精製用キットによりゲルから精製し、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、同様の制限酵素で消化したｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’ｐａｒｔｉａｌ  ｏｐｔベクターでライゲーションした。Ｉｌｌｕｓｔｒａ  Ｔｅｍｐｌｉｐｈｉキットでローリング・サークル型増幅法を用い、ライゲーション混合物を製造元（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）からの取扱説明書に従って増幅させることで、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓに形質転換させるための多量体ＤＮＡを生成した。この目的のため、１μＬのライゲーション混合物と５μＬのサンプル緩衝液を混合し、９５℃で３分間加熱し、氷中で冷却した。次に、５μＬの反応緩衝液及び０．２μＬの酵素を各チューブに加え、続いて３０℃で１０時間にわたってインキュベートした。ローリング・サークル型増幅産物を１００倍希釈し、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞の形質転換に用いた（ΔａｐｒＥ，ΔｎｐｒＥ，ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ−ｐｈｌｅｏ）。形質転換混合物のアリコートを、１．６％のスキムミルク及び１０μｇ／ｍＬのネオマイシンを含有しているＬＢプレートに蒔き、３７℃で一晩インキュベートした。続いて、ハローを生じたコロニーを、１０μｇ／ｍＬのネオマイシンを含有している１５０μＬのＬＢ培地に接種した。
【０４０８】
【表１８】
0005882904.tif 000043
【０４０９】
【表１９−１】
0005882904.tif 000044
【０４１０】
【表１９−２】
0005882904.tif 000045
【０４１１】
【表１９−３】
0005882904.tif 000046
【０４１２】
【表１９−４】
0005882904.tif 000047
【０４１３】
【表１９−５】
0005882904.tif 000048
【０４１４】
【表１９−６】
0005882904.tif 000049
【０４１５】
ＲＣＬ７コンビナトリアル変異体
「ＲＣＬ７」は、親（テンプレート）プラスミドとして数個のＢＰＮ’変異体を用いて融合ＰＣＲにより生成した１組のコンビナトリアル変異体を指す。各親プラスミドに導入した変異を表１１−１１に示し、変異体を生成するのに使用した変異原性プライマーを表１１−１０に示す。
【０４１６】
各変異体を生成するために、共通の３’側の遺伝子のフランキングプライマー（Ｐ４９７６，配列番号６１）及び変異原性プライマー、あるいは共通の５’側の遺伝子のフランキングプライマー（Ｐ４９７４，配列番号６０）及び表１１−１０で各ライブラリについて示される変異原性プライマーを用いて、２種類のＰＣＲ反応を実施した。これらのＰＣＲ反応は、２種のＰＣＲフラグメントを生成した。一方はＢＰＮ’変異遺伝子（５’遺伝子フラグメント）の５’側半分をコードするものであり、他方はＢＰＮ’変異遺伝子の３’側半分をコードするものである（３’遺伝子フラグメント）。各ＰＣＲ増幅反応には、３０ｐｍｏｌの各プライマー及び表１１−１１に列挙した１００ｎｇの親分子を含有させた。増幅はＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いて実施した。ＰＣＲ反応（２０μＬ）は、まず始めに９５℃で２．５分加熱した後、続いて９４℃で１５秒の変性、５５℃で１５秒のアニーリング、及び７２℃で４０秒の伸長を３０サイクル行った。増幅させた後、５’及び３’遺伝子フラグメントを、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ゲルバンド精製用キットによりゲルから精製し、混合して（各フラグメントにつき５０ｎｇ）、プライマーＰ４９７３（配列番号６２）及びＰ４９５０（配列番号６３）を用いて再度ＰＣＲで増幅させて、完全長の遺伝子フラグメントを生成した。伸長工程を７２℃で２分にわたって実施したことを除き、ＰＣＲ条件は上記の条件と同様のものであった。完全長のＤＮＡフラグメントをＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ゲルバンド精製用キットを用いてゲルから精製し、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、同様の制限酵素で消化したｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’ｐａｒｔｉａｌ  ｏｐｔでライゲーションした。Ｉｌｌｕｓｔｒａ  Ｔｅｍｐｌｉｐｈｉキットでローリング・サークル型増幅法を用い、ライゲーション混合物を製造元（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）からの取扱説明書に従って増幅させることで、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓに形質転換させるための多量体ＤＮＡを生成した。この目的のため、１μＬのライゲーション混合物と５μＬのサンプル緩衝液を混合し、９５℃で３分間加熱し、氷中で冷却した。次に、５μＬの反応緩衝液及び０．２μＬの酵素を各チューブに加え、続いて３０℃で１０時間にわたってインキュベートした。ローリング・サークル型増幅産物を１００倍希釈し、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞の形質転換に用いた（ΔａｐｒＥ，ΔｎｐｒＥ，ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ−ｐｈｌｅｏ）。形質転換混合物のアリコートを、１．６％のスキムミルク及び１０μｇ／ｍＬのネオマイシンを含有しているＬＢプレートに蒔き、３７℃で一晩インキュベートした。続いて、ハローを有するコロニーを、１０μｇ／ｍＬのネオマイシンを含有している１２０μＬのＬＢ培地に接種した。
【０４１７】
【表２０−１】
0005882904.tif 000050
【０４１８】
【表２０−２】
0005882904.tif 000051
【０４１９】
【表２０−３】
0005882904.tif 000052
【０４２０】
【表２０−４】
0005882904.tif 000053
【０４２１】
【表２０−５】
0005882904.tif 000054
【０４２２】
【表２０−６】
0005882904.tif 000055
【０４２３】
【表２０−７】
0005882904.tif 000056
【０４２４】
（実施例１２）
洗剤の表
パート１実施例１２のアッセイで使用される洗剤の組成を表１２−１に示す。ＢＰＮ’変異体のタンパク質サンプルを、パート１実施例１に記載のような洗剤組成物に添加することで、列挙した様々な特性をアッセイした。
【表２１】
0005882904.tif 000057
１  「ランダムグラフトコポリマー」は、ポリエチレンオキシド主鎖と複数のポリビニルアセテート側鎖とを有する、ポリビニルアセテートグラフト化ポリエチレンオキシドコポリマーである。ポリエチレンオキシド主鎖の分子量は約６０００であり、ポリエチレンオキシドとポリビニルアセテートとの重量比は約４０：６０であり、５０個のエチレンオキシド単位当たりのグラフト点は１以下である。
２  ポリエチレンイミン（ＭＷ＝６００）：−ＮＨにつき２０個のエトキシル基を有する。
３  両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマーは、−ＮＨにつき２４個のエトキシル基、及び−ＮＨにつき１６個のプロポキシル基を有するポリエチレンイミン（ＭＷ＝６００）である。
【０４２５】
ＢＰＮ’のコンビナトリアル変異体の染み除去性能
実施例１１に記載のように生成したＢＰＮ’のコンビナトリアル変異体の、染み除去性能の評価実験を、ＢＭＩ染色したマイクロスウォッチを用いて実施した。アッセイを実施例１に記載のように実施した（ＢＭＩマイクロスウォッチアッセイ）。表１２−２は、ｐＨ  ８及び１６℃で洗剤組成物１で、並びにｐＨ  ８及び３２℃で洗剤組成物１でＢＭＩマイクロスウォッチアッセイを行い、並びに１６℃及びｐＨ  ８で、加熱不活性化した市販のＴＩＤＥ（登録商標）２Ｘ  Ｃｏｌｄ（Ｐｒｏｃｔｅｒ  ＆  Ｇａｍｂｌｅ）洗剤でＢＭＩマイクロスウォッチアッセイを行い、ＲＣＬ４ライブラリから生成した変異体の性能指数（ＰＩ）値を提供する。市販の洗剤配合物の加熱不活性化は、任意のタンパク質成分の内因性の酵素活性を破壊しつつ、非酵素成分の特性は保持させる。洗剤の加熱不活性化は、予め計量した液体洗剤（ガラス瓶中）を９５℃のウォーターバスに２時間にわたって配置することで行った。ＴＩＤＥ（登録商標）２Ｘ  Ｃｏｌｄ洗剤は、地元のスーパーマーケットで購入した。不活性化率を正確に判定するために、未加熱及び加熱洗剤のどちらも、洗剤を溶解させて５分以内にアッセイした。酵素活性はＡＡＰＦアッセイにより試験した。希釈標準溶液は、加熱不活性化した母液から調製した。所望される条件に一致するよう適切な硬度の水及び緩衝液を洗剤溶液に加えた（表１２−２）。瓶をボルテックスにかけるか反転させるかして溶液を混合した。
【０４２６】
【表２２】
0005882904.tif 000058
【０４２７】
表１２−３に列挙した変異体の配列は、ＢＰＮ’−ｖ３：Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑと比較したものである。ＰＩ値はＢＰＮ’−ｖ３と比較して算出する。この一覧中のすべての変異のＰＩは、試験した少なくとも１種の特性について０．５以上は切り捨てられている。「洗剤組成物（Det. Comp.）」は洗剤組成物を意味する。
【０４２８】
【表２３】
0005882904.tif 000059
【０４２９】
本発明は、タンパク質分解活性を有するプロテアーゼ変異体を含み、変異体は、配列番号２又は配列番号６の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに表１２−３のものから選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異の位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。このようなプロテアーゼ変異体は、それぞれ単離物、組み換え体、実質的な純品、又は非天然に生じたプロテアーゼ変異体であり得る。同様に、組成物（このようなプロテアーゼ変異体を少なくとも１つ含む洗浄組成物など）、及びこのようなプロテアーゼ変異体を少なくとも１種用いる、以降に詳細に記載されるクリーニング方法も包含される。
【０４３０】
表１２−４は、ｐＨ  ８及び１６℃で洗剤組成物１（表１−３）でＢＭＩマイクロスウォッチアッセイを行う、並びにｐＨ  ８及び１６℃で洗剤組成物２（表１−３）でＢＭＩマイクロスウォッチアッセイを行う、ＲＣＬ５〜７及びＦＳ１〜３から生成した変異体の性能指数（ＰＩ）値、並びに洗剤組成物３（表１−３）で測定された安定性を提供する。ＡＡＰＦ加水分解による比活性についてのＰＩ値（ＡＡＰＦ比のＰＩ）も同様に測定した。すべてのアッセイは実施例１に記載のように実施した。変異体の配列は、ＢＰＮ’−ｖ３：Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑと比較したものである。ＰＩ値はＢＰＮ’−ｖ３と比較して算出した。この一覧中のすべての変異のＰＩは、試験した少なくとも１種の特性について０．５以上は切り捨てられている。０．０１未満のＰＩ値は、太字のイタリック体で修飾して０．０１と表示させた。
【０４３１】
【表２４−１】
0005882904.tif 000060
【０４３２】
【表２４−２】
0005882904.tif 000061
【０４３３】
【表２４−３】
0005882904.tif 000062
【０４３４】
【表２４−４】
0005882904.tif 000063
【０４３５】
【表２４−５】
0005882904.tif 000064
【０４３６】
【表２４−６】
0005882904.tif 000065
【０４３７】
【表２４−７】
0005882904.tif 000066
【０４３８】
【表２４−８】
0005882904.tif 000067
【０４３９】
【表２４−９】
0005882904.tif 000068
【０４４０】
【表２４−１０】
0005882904.tif 000069
【０４４１】
【表２４−１１】
0005882904.tif 000070
【０４４２】
【表２４−１２】
0005882904.tif 000071
【０４４３】
本発明は、タンパク質分解活性を有するプロテアーゼ変異体を含み、変異体は、配列番号２又は配列番号６の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに表１２−４に列挙された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異の位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。このようなプロテアーゼ変異体は、それぞれ単離物、組み換え体、実質的な純品、又は非天然に生じたプロテアーゼ変異体であり得る。同様に、組成物（このようなプロテアーゼ変異体を少なくとも１つ含む洗浄組成物など）、及びこのようなプロテアーゼ変異体を少なくとも１種用いる、以降に詳細に記載されるクリーニング方法も包含される。
【０４４４】
表１２−５は、１６℃及びｐＨ  ８での洗剤組成物１のＢＭＩマイクロスウォッチアッセイ（洗剤組成物１，ｐＨ  ８，１６℃，ＢＭＩ  ＰＩ）における染み除去についての、並びに、ＬＡＳ／ＥＤＴＡ（ＬＡＳ／ＥＤＴＡ安定性ＰＩ）の安定性についての、ＢＰＮ’変異体（「ＢＰＮ’安定性を改善するための変異体の生成」に記載のように生成、表１１−３を参照されたい）の性能指数（ＰＩ）値を提供する。アッセイは実施例１に記載のように実施した（ＢＭＩマイクロスウォッチアッセイ、ＬＡＳ／ＥＤＴＡ安定性アッセイ）。変異体の配列は、ＢＰＮ’及びＦＮＡの両方と比較して示す。すなわち、各変異体配列は、基底のアミノ酸置換変異を有するＢＰＮ’又はＦＮＡ配列である。ＰＩ値は、親ＦＮＡ（ＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ）と比較して示す。
【０４４５】
【表２５】
0005882904.tif 000072
【０４４６】
本発明は、タンパク質分解活性を有する、及び／又はＦＮＡと比較して安定性が改善されている、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は、配列番号２又は配列番号６の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに表１２−５に列挙された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異の位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。このようなプロテアーゼ変異体は、それぞれ単離物、組み換え体、実質的な純品、又は非天然に生じたプロテアーゼ変異体であり得る。同様に、組成物（このようなプロテアーゼ変異体を少なくとも１つ含む洗浄組成物など）、及びこのようなプロテアーゼ変異体を少なくとも１種用いる、以降に詳細に記載されるクリーニング方法も包含される。
【０４４７】
表１２−６は、１６℃及びｐＨ  ８での洗剤組成物１のＢＭＩマイクロスウォッチアッセイでの染み除去についての、並びに、ＬＡＳ／ＥＤＴＡでの安定性についての、親ライブラリ：ＢＰＮ’−ｖ３：Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（「ＢＰＮ’安定性を改善するための変異体の生成」に記載のようなもの、表１１−３を参照されたい）から生成されたＢＰＮ’変異体の性能指数（ＰＩ）値を提供する。アッセイは実施例１に記載のように実施した（ＢＭＩマイクロスウォッチアッセイ及びＬＡＳ／ＥＤＴＡ安定性アッセイ）。性能指数は、ＢＰＮ’−ｖ３：Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑと比較して算出した。この一覧中のすべての変異のＰＩは、試験した少なくとも１種の特性について０．５以上は切り捨てられている。
【０４４８】
【表２６】
0005882904.tif 000073
【０４４９】
本発明は、タンパク質分解活性を有する、及びＢＰＮ’−ｖ３と比較して安定性が改善されている、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は、配列番号２又は配列番号６の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに表１２−６に列挙された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異の位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。このようなプロテアーゼ変異体は、それぞれ単離物、組み換え体、実質的な純品、又は非天然に生じたプロテアーゼ変異体であり得る。同様に、組成物（このようなプロテアーゼ変異体を少なくとも１つ含む洗浄組成物など）、及びこのようなプロテアーゼ変異体を少なくとも１種用いる、以降に詳細に記載されるクリーニング方法も包含される。
【０４５０】
表１２−７は、１６℃及びｐＨ  ８での洗剤組成物１のＢＭＩマイクロスウォッチアッセイにおける染み除去についての、ＢＰＮ’変異体（「異なる５種の親プラスミドからのＢＰＮ’変異体の生成」に記載のように生成、表１１−４を参照されたい）の性能指数（ＰＩ）値を提供する。アッセイは実施例１に記載のように実施した（ＢＭＩマイクロスウォッチアッセイ）。各変異体の性能指数は、ＢＰＮ’−ｖ３：Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑと比較して算出した。この一覧中のすべての変異のＰＩは、試験した少なくとも１種の特性について０．５以上は切り捨てられている。
【０４５１】
【表２７】
0005882904.tif 000074
【０４５２】
本発明は、タンパク質分解活性を有するプロテアーゼ変異体を含み、変異体は、配列番号２又は配列番号６の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに表１２−７から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異の位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。このようなプロテアーゼ変異体は、それぞれ単離物、組み換え体、実質的な純品、又は非天然に生じたプロテアーゼ変異体であり得る。同様に、組成物（このようなプロテアーゼ変異体を少なくとも１つ含む洗浄組成物など）、及びこのようなプロテアーゼ変異体を少なくとも１種用いる、以降に詳細に記載されるクリーニング方法も包含される。
【０４５３】
表１２−８は、１６℃及びｐＨ  ８での洗剤組成物１のＢＭＩマイクロスウォッチアッセイを用い、染み除去についての、ＢＰＮ’変異体（実施例３に記載の「コンビナトリアルライブラリの作成及び変異体ＢＰＮ’−ｖ３＋Ｓ７８Ｎのクリーニング性能」で記載されるように生成）の性能指数（ＰＩ）値を提供する。アッセイは実施例１に記載のように実施した（ＢＭＩマイクロスウォッチアッセイ）。各変異体の性能指数は、ＢＰＮ’−Ｓ７８Ｎ−Ｇ９７Ａ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑと比較して算出した。０．０１未満のＰＩ値は修飾され、太字のイタリック体で「０．０１」として記される。
【０４５４】
【表２８】
0005882904.tif 000075
【０４５５】
本発明は、タンパク質分解活性を有するプロテアーゼ変異体を含み、変異体は、配列番号２又は配列番号６の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに表１２−８に列挙された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異の位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。このようなプロテアーゼ変異体は、それぞれ単離物、組み換え体、実質的な純品、又は非天然に生じたプロテアーゼ変異体であり得る。同様に、組成物（このようなプロテアーゼ変異体を少なくとも１つ含む洗浄組成物など）、及びこのようなプロテアーゼ変異体を少なくとも１種用いる、以降に詳細に記載されるクリーニング方法も包含される。
【０４５６】
表１２−９は、１６℃及びｐＨ  ８での洗剤組成物２でのＢＭＩマイクロスウォッチアッセイにおける、染み除去についての、並びに、並びに洗剤組成物３で測定される安定性についての、ＢＰＮ’単独変異体（ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０９／４６１５６（２００９年６月３日出願、記載は本明細書に参考により組み込まれる）に記載のような融合ＰＣＲを用いて構築）の性能指数（ＰＩ）値を提供する。ＡＡＰＦ加水分解による比活性についてのＰＩ値（ＡＡＰＦ比のＰＩ）を測定した。すべてのアッセイは実施例１に記載のように実施した。性能指数値はＢＰＮ野生型と比較して算出した。０．０１未満のＰＩ値は、太字のイタリック体で「０．０１」として示す。「洗剤組成物（Det. Comp.）」は洗剤組成物を意味する。
【０４５７】
【表２９−１】
0005882904.tif 000076
【０４５８】
【表２９−２】
0005882904.tif 000077
【０４５９】
本発明は、タンパク質分解活性を有するプロテアーゼ変異体を含み、変異体は、配列番号２又は配列番号６の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに表１２−９に列挙された少なくとも１つの置換を含むものである。ここで、変異の位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。このようなプロテアーゼ変異体は、それぞれ単離物、組み換え体、実質的な純品、又は非天然に生じたプロテアーゼ変異体であり得る。同様に、組成物（このようなプロテアーゼ変異体を少なくとも１つ含む洗浄組成物など）、及びこのようなプロテアーゼ変異体を少なくとも１種用いる、以降に詳細に記載されるクリーニング方法も包含される。
【０４６０】
（実施例１３）
食器手洗い用液体洗剤組成物
この実施例では、様々な食器手洗い用液体洗剤配合物が提供される。以降、本発明の手洗い用液体洗剤組成物が提供される。これらの配合物のそれぞれにおいて、本明細書で提供される少なくとも１種のプロテアーゼ変異体は、約０．０００１〜約１０重量％の濃度で含有される。一部の代替的な態様では、必要性に応じ、配合者により決定されるものとして、他の濃度での使用も見出される。
【０４６１】
【表３０】
0005882904.tif 000078
【０４６２】
任意選択的微量成分＊：染料、乳白剤、香料、防腐剤、ヒドロトロープ、加工助剤、及び／又は安定剤
（１）直鎖アルキルベンゼンスルホン酸：ＬＡＳ：Ｃ１１．４
（２）アルキルエトキシサルフェート：ＡＥｘＳ：
（３）非イオン性：アルキルエトキシレート
（４）ジ−メチルココアルキルアミンオキシド
（５）アルコール：エタノール
（６）塩：ＮａＣｌ
（７）カチオン性変性ヒドロキシエチルセルロース（ポリクオタニウム−１０−ＵＣＡＲＥ  ＬＲ−４００（Ａｍｅｒｃｈｏｌから））
（実施例１４）
液体及び顆粒洗濯洗剤
この実施例は、液体洗濯洗剤用の様々な配合を提供する。以降、本発明の液体洗濯洗剤配合物が提供される。これらの配合物のそれぞれにおいて、本明細書で提供される少なくとも１種のプロテアーゼ変異体は、約０．０００１〜約１０重量％の濃度で含有される。一部の代替的な態様では、必要性に応じ、配合者により決定されるものとして、他の濃度での使用も見出される。
【０４６３】
前側充填式自動洗濯機に好適な液体洗濯洗剤組成物。
【表３１】
0005882904.tif 000079
【０４６４】
頂部充填式自動洗濯機に好適な液体洗濯洗剤組成物。
【表３２】
0005882904.tif 000080
【０４６５】
布地洗濯に好適な本発明に従って製造された顆粒状洗剤組成物。
【表３３】
0005882904.tif 000081
１  ランダムグラフトコポリマーは、ポリエチレンオキシド主鎖と複数のポリビニルアセテート側鎖とを有する、ポリビニルアセテートグラフト化ポリエチレンオキシドコポリマーである。ポリエチレンオキシド主鎖の分子量は約６０００であり、ポリエチレンオキシドとポリビニルアセテートとの重量比は約４０：６０であり、５０個のエチレンオキシド単位当たりのグラフト点は１以下である。
２  −ＮＨにつき２０個のエトキシル基を有するポリエチレンイミン（ＭＷ＝６００）。
３  両親媒性グリース洗浄ポリマーは、−ＮＨにつき２４個のエトキシル基、及び−ＮＨにつき１６個のプロポキシル基を有するポリエチレンイミン（ＭＷ＝６００）である。
４  次の構造を有する可逆性プロテアーゼ抑制剤。
【化１２】
0005882904.tif 000082
５  エトキシル化チオフェン色調染料については米国特許第７，２０８，４５９（Ｂ２）号に記述されている。
＊  注：製品に添加した活性タンパク質％として表される冷水プロテアーゼ（本発明のもの）を除き、すべての酵素濃度は酵素原材料％として表される。
【０４６６】
（実施例１５）
単位用量組成物
この実施例は、単位用量洗濯洗剤用の様々な配合を提供する。このような単位用量配合物には、１つ又は複数の区画を含ませることができる。
【０４６７】
以下に、本発明の単位用量洗濯洗剤配合物が提供される。
【表３４】
0005882904.tif 000083
１  −ＮＨ１個あたり２０個のエトキシル基を有するポリエチレンイミン（ＭＷ＝６００）。
【０４６８】
表１５−２：複数区画の単位用量組成物
以下に、本発明の複数区画単位用量の洗濯洗剤配合物が提供される。これらの実施例では、単位用量は３つの区画を有するが、同様の組成物を２、４、又は５区画で製造することもできる。区画を封入するために使用されるフィルムはポリビニルアルコールである。
【表３５】
0005882904.tif 000084
【０４６９】
（実施例１６）
ＢＰＮ’−ｖ３６ポリペプチド変異体のクリーニング性能
骨格鎖若しくは親配列としてＢＰＮ’−ｖ３６変異体を用いて、アミノ酸置換を２つ含むＢＰＮ’−ｖ３６ポリペプチド変異体を標準融合ＰＣＲにより構築した。この目的のため、所望の置換をコードするように調製された変異原性プライマーにより、２つ又は３つの部分的に重複しているフラグメントを増幅させた。ＰＣＲ増幅反応は、上掲パート１の実施例７に記載のように実施した。以下のＢＰＮ’−ｖ３６の２重変異体（すなわち、以下の、２つのアミノ酸置換を有するＢＰＮ’−ｖ３６）を構築した：Ｑ０１９Ｒ−Ｎ０２５Ｄ、Ａ００１Ｙ−Ｑ２７５Ｒ、Ｖ００４Ａ−Ｓ２４９Ｎ、Ｖ００４Ｅ−Ｓ２６０Ｐ、Ｖ００４Ａ−Ｔ５５Ａ、Ｙ００６Ｆ−Ｓ２４９Ｃ、Ｙ００６Ｄ−Ｔ５５Ａ、Ｖ００８Ｌ−Ｑ２７５Ｒ、Ｑ０１０Ｒ−Ｑ２７５Ｋ、Ｌ０１６Ｑ−Ｑ２１７Ｈ、Ｈ０１７Ｒ−Ｔ１５８Ａ、Ｓ１８３Ｄ−Ｑ２０６Ｒ、Ｐ２１０Ｓ−Ｎ２１２Ｄ、Ｓ０１８Ｙ−Ｖ２０３Ａ、Ｓ０１８Ｋ−Ｖ２０３Ｉ、Ｙ０２１Ｈ−Ｄ２５９Ｇ、Ｙ０２１Ｈ−Ｄ２５９Ｒ、Ｋ０２７Ｒ−Ｎ２６９Ｄ、Ｋ０２７Ｒ−Ｎ２６９Ｔ、Ｓ０３７Ｐ−Ｓ２６０Ｆ、Ｓ０３７Ｔ−Ｓ２６０Ｐ、Ｄ０４１Ｅ−Ｎ０７７Ｄ、Ｄ０４１Ｇ−Ｎ０７７Ｅ、Ｇ１６６Ｖ−Ｓ１８３Ｔ、Ｎ２５２Ｓ−Ｌ２５７Ｈ、Ｖ０４４Ａ−Ｑ２０６Ｈ、Ｖ０４４Ａ−Ｑ２０６Ｋ、Ｖ０４４Ａ−Ｑ２０６Ｒ、Ｎ０７６Ｔ−Ｎ２１２Ｄ、Ｎ０７６Ｐ−Ｎ２１２Ｓ、Ｎ０７７Ｄ−Ｎ２５２Ｄ、Ｎ０７７Ｄ−Ｎ２５２Ｔ、Ｋ１４１Ｉ−Ｓ２４８Ｎ、Ｔ１５８Ｉ−Ｄ２５９Ｎ、Ｔ１５８Ａ−Ｄ２５９Ｐ、Ｓ１６１Ｅ−Ｑ１８５Ｈ、Ｋ２３７Ｍ−Ｈ２３８Ｒ、Ｇ１６０Ａ−Ｄ２５９Ｇ、Ｇ１６０Ｒ−Ｄ２５９Ｖ、Ｇ２１５Ｒ−Ｄ２５９Ｒ、Ｇ２１５Ｄ−Ｄ２５９Ｖ、Ｎ０６１Ｄ−Ｑ２０６Ｒ、Ｎ０６１Ｌ−Ｑ２０６Ｈ、Ｓ００９Ｌ−Ｎ２１８Ｓ、Ｓ１６１Ｅ−Ｓ２６０Ｔ、Ｑ０１９Ａ−Ｎ１０９Ｓ、Ｔ０２２Ｓ−Ｇ１６６Ｖ、Ｙ０２１Ｈ−Ｎ２５２Ｈ、Ｐ１２９Ｓ−Ｋ１３６Ｒ、Ｔ０２２Ｓ−Ｔ２４２Ｓ、Ｎ０２５Ｋ−Ｈ２３８Ｒ、Ｎ０２５Ｄ−Ｑ１８５Ｒ、Ｓ０３７Ｇ−Ｑ２７５Ｈ、Ｋ０４３Ｒ−Ｎ０７６Ｓ、Ｋ０４３Ｎ−Ｑ２１７Ｒ、Ｋ０４３Ｎ−Ｓ１６３Ｔ、Ｔ０５５Ａ−Ｖ１４７Ａ、Ｎ０６１Ｋ−Ｎ２５２Ｋ、Ｎ０６２Ｙ−Ｇ０９７Ｄ、Ｙ０２１Ｈ−Ｖ０８４Ｅ、Ｙ０２１Ｈ−Ｓ０３７Ｅ、Ｎ０６２Ｙ−Ｔ２４４Ａ、Ｋ０２７Ｅ−Ｙ０９１Ｆ、Ａ０７４Ｓ−Ｐ１２９Ｑ、Ｓ２４９Ｒ−Ｑ２７５Ｒ、Ｉ０７９Ｖ−Ｑ２１７Ｈ、Ａ０９８Ｔ−Ｔ１５８Ａ、Ｋ０２７Ｒ−Ｄ１２０Ｈ、Ｑ０１９Ｒ−Ｑ１８５Ｒ、Ｇ１３１Ｓ−Ｋ２６５Ｎ、Ａ１３３Ｖ−Ｄ２５９Ｎ、Ａ１４４Ｈ−Ｔ２４４Ａ、Ｉ０３５Ｖ−Ｋ０４３Ｎ、Ｇ１６０Ｒ−Ｔ２４４Ａ、Ｓ１６１Ｐ−Ｔ２５３Ａ、Ｓ１６３Ｔ−Ｑ２４５Ｌ、Ｋ１７０Ｒ−Ｄ２５９Ｇ、Ｓ１８３Ｔ−Ｓ２４９Ｒ、Ｎ１８４Ｙ−Ｙ２６２Ｎ、Ｖ１９８Ｌ−Ｄ２５９Ｇ、Ａ２００Ｔ−Ｈ２２６Ｌ、Ｑ２０６Ｒ−Ｓ２６０Ｐ、Ｇ２１１Ｖ−Ｔ２４４Ａ、Ｑ２１７Ｒ−Ｔ２４４Ａ、Ｌ７５Ｉ−Ｎ７６Ｄ、Ｓ２６０Ｐ−Ｑ２７５Ｌ、Ｓ２６０Ｐ−Ｑ２７５Ｒ、Ｙ２６２Ｎ−Ｑ２７５Ｒ、Ｖ００４Ａ−Ｙ００６Ｆ、Ｈ０１７Ｌ−Ｑ０１９Ａ、Ｎ０２５Ｄ−Ｖ０２６Ａ、Ｎ１１８Ｇ−Ｖ１２１Ａ、Ｖ０７２Ｆ−Ｌ０７５Ｉ、Ｓ１８３Ｔ−Ｒ１８６Ｋ、Ｖ２０３Ａ−Ｑ２１７Ｒ、及びＳ２４９Ｒ−Ｙ２６２Ｈ。パートＩの実施例１に記載のように、これらの変異体のクリーニング性能を、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、並びにｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４の卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、試験した。結果は以下に提供される。
【０４７０】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’プロテアーゼ変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．９以上１．０以下のＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、ＢＰＮ’−ｖ３、ＢＰＮ’−ｖ３６、Ｓ１８３Ｔ−Ｓ２４９Ｒ、Ｎ６１Ｄ−Ｑ２０６Ｒ、Ｙ２６２Ｎ−Ｑ２７５Ｒ、Ｋ４３Ｒ−Ｎ７６Ｓ、Ｓ１８３Ｔ−Ｓ２４９Ｒ、Ｋ１７０Ｒ−Ｄ２５９Ｇ、Ｙ６Ｆ−Ｓ２４９Ｃ、Ｑ１９Ａ−Ｎ１０９Ｓ、Ｈ１７Ｌ−Ｑ１９Ａ、Ｑ１９Ｒ−Ｑ１８５Ｒ、Ｓ１８Ｙ−Ｖ２０３Ａ、Ｎ６１Ｄ−Ｑ２０６Ｒ、Ｓ１６１Ｅ−Ｓ２６０Ｔ、Ｓ１８Ｋ−Ｖ２０３Ｉ、Ｖ４Ａ−Ｔ５５Ａ、Ｎ２５２Ｓ−Ｌ２５７Ｈ、Ｓ２４９Ｒ−Ｙ２６２Ｈ、Ｎ６１Ｌ−Ｑ２０６Ｈ、Ｎ１８４Ｙ−Ｙ２６２Ｎ、Ｑ１９Ｒ−Ｎ２５Ｄ、Ｓ２４９Ｒ−Ｙ２６２Ｈ、Ａ７４Ｓ−Ｐ１２９Ｑ、Ｈ１７Ｌ−Ｑ１９Ａ、Ｋ２７Ｒ−Ｄ１２０Ｈ、Ｖ４Ａ−Ｔ５５Ａ、Ｙ２１Ｈ−Ｎ２５２Ｈ、Ｋ２７Ｒ−Ｎ２６９Ｄ、Ｋ２７Ｒ−Ｎ２６９Ｄ、Ａ９８Ｔ−Ｔ１５８Ａ、Ｉ７９Ｖ−Ｑ２１７Ｈ、Ｓ９Ｌ−Ｎ２１８Ｓ、Ｖ４Ａ−Ｙ６Ｆ、Ｓ１６１Ｐ−Ｔ２５３Ａ、Ｖ２０３Ａ−Ｑ２１７Ｒ、Ｔ２２Ｓ−Ｔ２４２Ｓ、Ｎ７６Ｐ−Ｎ２１２Ｓ、Ｋ１７０Ｒ−Ｄ２５９Ｇ、Ｓ３７Ｔ−Ｓ２６０Ｐ、Ｔ５５Ａ−Ｖ１４７Ａ、Ｑ１９Ｒ−Ｑ１８５Ｒ、Ｖ４Ａ−Ｙ６Ｆ、Ｑ１９Ａ−Ｎ１０９Ｓ、Ｙ２６２Ｎ−Ｑ２７５Ｒ、Ｇ１６０Ｒ−Ｔ２４４Ａ、Ｑ１９Ｒ−Ｎ２５Ｄ、Ｎ２５Ｄ−Ｑ１８５Ｒ、Ａ９８Ｔ−Ｔ１５８Ａ、Ｎ６１Ｌ−Ｑ２０６Ｈ、Ｇ２１１Ｖ−Ｔ２４４Ａ、Ｓ９Ｌ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ１４４Ｈ−Ｔ２４４Ａ、Ａ１４４Ｈ−Ｔ２４４Ａ、Ｓ１８Ｙ−Ｖ２０３Ａ、Ｙ２１Ｈ−Ｎ２５２Ｈ、Ａ７４Ｓ−Ｐ１２９Ｑ、Ａ１Ｙ−Ｑ２７５Ｒ、Ｖ１９８Ｌ−Ｄ２５９Ｇ、Ｔ５５Ａ−Ｖ１４７Ａ、Ｋ１４１Ｉ−Ｓ２４８Ｎ、Ｓ１８３Ｔ−Ｒ１８６Ｋ、Ｓ３７Ｔ−Ｓ２６０Ｐ、Ｋ２７Ｒ−Ｄ１２０Ｈ、Ｔ２２Ｓ−Ｔ２４２Ｓ、Ｓ１６１Ｅ−Ｑ１８５Ｈ、Ｐ１２９Ｓ−Ｋ１３６Ｒ、Ｇ２１１Ｖ−Ｔ２４４Ａ、Ｎ７６Ｐ−Ｎ２１２Ｓ、Ｋ４３Ｎ−Ｓ１６３Ｔ、Ｓ３７Ｇ−Ｑ２７５Ｈ、Ｓ１６１Ｐ−Ｔ２５３Ａ、Ｙ６Ｆ−Ｓ２４９Ｃ、Ｎ１８４Ｙ−Ｙ２６２Ｎ、Ｎ２５２Ｓ−Ｌ２５７Ｈ、Ｇ１６０Ｒ−Ｔ２４４Ａ、Ｓ３７Ｇ−Ｑ２７５Ｈ、Ｐ１２９Ｓ−Ｋ１３６Ｒ、Ｎ６２Ｙ−Ｔ２４４Ａ、及びＳ２６０Ｐ−Ｑ２７５Ｒからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつ本アッセイにおいてＢＰＮ’よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．９以上１．０以下のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９���％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、限定するものではないが、例えば少なくとも１つのこのような変異体を含むクリーニング組成物、並びに本明細書で更に詳細に記載されるようなこのようなプロテアーゼ変異体を少なくとも１つ利用するクリーニング方法も包含される。
【０４７１】
同様に、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’と比較してタンパク質分解活性が向上しているサブチリシンプロテアーゼ変異体が提供され、変異体は、配列番号２と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｘ１Ｙ、Ｘ４Ａ、Ｘ６Ｆ、Ｘ９Ｌ、Ｘ１７Ｌ、Ｘ１８Ｋ／Ｙ、Ｘ１９Ａ／Ｒ、Ｘ２１Ｈ、Ｘ２２Ｓ、Ｘ２５Ｄ、Ｘ２７Ｒ、Ｘ３７Ｇ／Ｔ、Ｘ４３Ｎ／Ｒ、Ｘ５５Ａ、Ｘ６１Ｄ／Ｌ、Ｘ６２Ｙ、Ｘ７４Ｓ、Ｘ７６Ｐ／Ｓ、Ｘ７９Ｖ、Ｘ９８Ｔ、Ｘ１０９Ｓ、Ｘ１２０Ｈ、Ｘ１２９Ｑ／Ｓ、Ｘ１３６Ｒ、Ｘ１４１Ｉ、Ｘ１４４Ｈ、Ｘ１４７Ａ、Ｘ１５８Ａ、Ｘ１６０Ｒ、Ｘ１６１Ｅ／Ｐ、Ｘ１６３Ｔ、Ｘ１７０Ｒ、Ｘ１８３Ｔ、Ｘ１８４Ｙ、Ｘ１８５Ｈ／Ｒ、Ｘ１８６Ｋ、Ｘ１９８Ｌ、Ｘ２０３Ａ／Ｉ、Ｘ２０６Ｈ／Ｒ、Ｘ２１１Ｖ、Ｘ２１２Ｓ、Ｘ２１７Ｈ／Ｒ、Ｘ２１８Ｓ、Ｘ２４２Ｓ、Ｘ２４４Ａ、Ｘ２４８Ｎ、Ｘ２４９Ｃ／Ｒ、Ｘ２５２Ｈ／Ｓ、Ｘ２５３Ａ、Ｘ２５７Ｈ、Ｘ２５９Ｇ、Ｘ２６０Ｐ／Ｔ、Ｘ２６２Ｈ／Ｎ、Ｘ２６９Ｄ、及びＸ２７５Ｈ／Ｒ、の群から選択された少なくとも１つの置換を含む、少なくとも１つの置換を含み、Ａ１Ｙ、Ｖ４Ａ、Ｙ６Ｆ、Ｓ９Ｌ、Ｈ１７Ｌ、Ｓ１８Ｋ／Ｙ、Ｑ１９Ａ／Ｒ、Ｙ２１Ｈ、Ｔ２２Ｓ、Ｎ２５Ｄ、Ｋ２７Ｒ、Ｓ３７Ｇ／Ｔ、Ｋ４３Ｎ／Ｒ、Ｔ５５Ａ、Ｎ６１Ｄ／Ｌ、Ｎ６２Ｙ、Ａ７４Ｓ、Ｎ７６Ｐ／Ｓ、Ｉ７９Ｖ、Ａ９８Ｔ、Ｎ１０９Ｓ、Ｄ１２０Ｈ、Ｐ１２９Ｑ／Ｓ、Ｋ１３６Ｒ、Ｋ１４１Ｉ、Ａ１４４Ｈ、Ｖ１４７Ａ、Ｔ１５８Ａ、Ｇ１６０Ｒ、Ｓ１６１Ｅ／Ｐ、Ｓ１６３Ｔ、Ｋ１７０Ｒ、Ｓ１８３Ｔ、Ｎ１８４Ｙ、Ｑ１８５Ｈ／Ｒ、Ｒ１８６Ｋ、Ｖ１９８Ｌ、Ｖ２０３Ａ／Ｉ、Ｑ２０６Ｈ／Ｒ、Ｇ２１１Ｖ、Ｎ２１２Ｓ、Ｑ２１７Ｈ／Ｒ、Ｎ２１８Ｓ、Ｔ２４２Ｓ、Ｔ２４４Ａ、Ｓ２４８Ｎ、Ｓ２４９Ｃ／Ｒ、Ｎ２５２Ｈ／Ｓ、Ｔ２５３Ａ、Ｌ２５７Ｈ、Ｄ２５９Ｇ、Ｓ２６０Ｐ／Ｔ、Ｙ２６２Ｈ／Ｎ、Ｎ２６９Ｄ、及びＱ２７５Ｈ／Ｒの群から選択された少なくとも１つの置換を含んでいてもよい。ここで、変異のアミノ酸位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、ＢＰＮ’（配列番号２）、ＢＰＮ’−ｖ３及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつ本アッセイにおいて、ＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３及びＢＰＮ’−ｖ３６よりもＰＩ値が大きい。同様に、限定するものではないが、例えば少なくとも１つのこのような変異体を含むクリーニング組成物、並びに本明細書で更に詳細に記載されるようなこのようなプロテアーゼ変異体を少なくとも１つ利用するクリーニング方法も包含される。
【０４７２】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、サブチリシンＢＰＮ’プロテアーゼ変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．５以上０．９未満のＰＩを有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、Ｙ２１Ｈ−Ｄ２５９Ｇ、Ｙ２１Ｈ−Ｄ２５９Ｇ、Ａ１３３Ｖ−Ｄ２５９Ｎ、Ｉ７９Ｖ−Ｑ２１７Ｈ、Ｓ１８Ｋ−Ｖ２０３Ｉ、Ｔ１５８Ａ−Ｄ２５９Ｐ、Ｎ６１Ｋ−Ｎ２５２Ｋ、Ｋ４３Ｎ−Ｑ２１７Ｒ、Ｔ１５８Ａ−Ｄ２５９Ｐ、Ｑ２０６Ｒ−Ｓ２６０Ｐ、Ａ１３３Ｖ−Ｄ２５９Ｎ、Ｖ１９８Ｌ−Ｄ２５９Ｇ、Ｎ６１Ｋ−Ｎ２５２Ｋ、Ｓ１６１Ｅ−Ｓ２６０Ｔ、Ｇ１６０Ａ−Ｄ２５９Ｇ、Ｋ４３Ｎ−Ｑ２１７Ｒ、Ａ１Ｙ−Ｑ２７５Ｒ、Ａ２００Ｔ−Ｈ２２６Ｌ、Ｑ２１７Ｒ−Ｔ２４４Ａ、Ｓ２６０Ｐ−Ｑ２７５Ｒ、Ｑ２０６Ｒ−Ｓ２６０Ｐ、Ｔ１５８Ｉ−Ｄ２５９Ｎ、Ｑ２１７Ｒ−Ｔ２４４Ａ、Ｌ７５Ｉ−Ｎ７６Ｄ、Ｓ１６１Ｅ−Ｑ１８５Ｈ、Ｙ２１Ｈ−Ｓ３７Ｅ、Ｓ２４９Ｒ−Ｑ２７５Ｒ、Ｇ１６０Ａ−Ｄ２５９Ｇ、Ｔ１５８Ｉ−Ｄ２５９Ｎ、Ｙ２１Ｈ−Ｓ３７Ｅ、Ｎ７６Ｔ−Ｎ２１２Ｄ、Ｓ２６０Ｐ−Ｑ２７５Ｌ、Ｇ１３１Ｓ−Ｋ２６５Ｎ、Ｖ４Ａ−Ｓ２４９Ｎ、Ｎ２５Ｄ−Ｑ１８５Ｒ、Ｋ４３Ｒ−Ｎ７６Ｓ、Ｓ１８３Ｄ−Ｑ２０６Ｒ、Ｑ１０Ｒ−Ｑ２７５Ｋ、Ｋ４３Ｎ−Ｓ１６３Ｔ、Ｑ１０Ｒ−Ｑ２７５Ｋ、Ｎ２５Ｄ−Ｖ２６Ａ、Ｇ１３１Ｓ−Ｋ２６５Ｎ、Ｓ２６０Ｐ−Ｑ２７５Ｌ、Ｋ１４１Ｉ−Ｓ２４８Ｎ、Ｌ１６Ｑ−Ｑ２１７Ｈ、Ｓ２４９Ｒ−Ｑ２７５Ｒ、Ｋ２７Ｒ−Ｎ２６９Ｔ、Ｐ２１０Ｓ−Ｎ２１２Ｄ、Ｌ７５Ｉ−Ｎ７６Ｄ、Ｓ１８３Ｄ−Ｑ２０６Ｒ、Ｎ１１８Ｇ−Ｖ１２１Ａ、Ｇ２１５Ｄ−Ｄ２５９Ｖ、Ｎ７６Ｔ−Ｎ２１２Ｄ、Ｖ４Ａ−Ｓ２４９Ｎ、Ｋ２７Ｒ−Ｎ２６９Ｔ、Ｎ６２Ｙ−Ｇ９７Ｄ、Ｖ４Ｅ−Ｓ２６０Ｐ、Ｇ２１５Ｄ−Ｄ２５９Ｖ、Ｋ２７Ｅ−Ｙ９１Ｆ、Ｙ６Ｄ−Ｔ５５Ａ、Ｎ７７Ｄ−Ｎ２５２Ｔ、Ｖ４Ｅ−Ｓ２６０Ｐ、Ｙ６Ｄ−Ｔ５５Ａ、Ｎ７７Ｄ−Ｎ２５２Ｔ、Ｎ２５Ｋ−Ｈ２３８Ｒ、Ｖ４４Ａ−Ｑ２０６Ｈ、Ｌ１６Ｑ−Ｑ２１７Ｈ、Ｓ３７Ｐ−Ｓ２６０Ｆ、Ｖ４４Ａ−Ｑ２０６Ｒ、Ｖ４４Ａ−Ｑ２０６Ｈ、Ｖ４４Ａ−Ｑ２０６Ｒ、及びＳ３７Ｐ−Ｓ２６０Ｆからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、本アッセイにおいて、タンパク質分解活性を有する、ＢＰＮ’と比較してタンパク質分解活性が向上している、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．５以上０．９未満のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組の酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、限定するも���ではないが、例えば少なくとも１つのこのような変異体を含むクリーニング組成物、並びに本明細書で更に詳細に記載されるようなこのようなプロテアーゼ変異体を少なくとも１つ利用するクリーニング方法も包含される。
【０４７３】
以降、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４の卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して１．０超、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．０超〜約１０、１．０超〜約８、又は１．０超〜約５のＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、Ｙ２１Ｈ−Ｄ２５９Ｇ、Ｓ１８３Ｔ−Ｓ２４９Ｒ、Ｎ６１Ｄ−Ｑ２０６Ｒ、Ｙ２６２Ｎ−Ｑ２７５Ｒ、Ｙ０２１Ｈ−Ｄ２５９Ｇ、Ｋ０４３Ｒ−Ｎ０７６Ｓ、Ｓ１８３Ｔ−Ｓ２４９Ｒ、Ａ１３３Ｖ−Ｄ２５９Ｎ、及びＩ０７９Ｖ−Ｑ２１７Ｈからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、ＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３、及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつ本アッセイにおいてＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３及びＢＰＮ’−ｖ３６よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、ＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３、及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較してタンパク質分解活性が向上している、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０超〜約５のＰＩ値を有する、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して１．０超〜約５のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、限定するものではないが、例えば少なくとも１つのこのような変異体を含むクリーニング組成物、並びに本明細書で更に詳細に記載されるようなこのようなプロテアーゼ変異体を少なくとも１つ利用するクリーニング方法も包含される。
【０４７４】
同様に、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’と比較してタンパク質分解活性が向上している、サブチリシンプロテアーゼ変異体が提供され、変異体は配列番号２と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、変異体はＸ０２１Ｈ、Ｘ０４３Ｒ、Ｘ０６１Ｄ、Ｘ０７６Ｓ、Ｘ０７９Ｖ、Ｘ１３３Ｖ、Ｘ１８３Ｔ、Ｘ２０６Ｒ、Ｘ２１７Ｈ、Ｘ２４９Ｒ、Ｘ２５９Ｇ／Ｎ、Ｘ２６２Ｎ、及びＸ２７５Ｒからなる群から選択された少なくとも１つの置換を含み、Ｙ０２１Ｈ、Ｋ０４３Ｒ、Ｎ０６１Ｄ、Ｎ０７６Ｓ、Ｉ０７９Ｖ、Ａ１３３Ｖ、Ｓ１８３Ｔ、Ｑ２０６Ｒ、Ｑ２１７Ｈ、Ｓ２４９Ｒ、Ｄ２５９Ｇ／Ｎ、Ｙ２６２Ｎ、及びＱ２７５Ｒからなる群から選択された少なくとも１つの置換を含んでいてもよいものである。ここで、変異のアミノ酸位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、ＢＰＮ’（配列番号２）、ＢＰＮ’−ｖ３及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつ本アッセイにおいて、ＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３及びＢＰＮ’−ｖ３６よりもＰＩ値が大きい。同様に、限定するものではないが、例えば少なくとも１つのこのような変異体を含むクリーニング組成物、並びに本明細書で更に詳細に記載されるようなこのようなプロテアーゼ変異体を少なくとも１つ利用するクリーニング方法も包含される。
【０４７５】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４の卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．５以上１．０以下のＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、ＢＰＮ’−ｖ３、ＢＰＮ’−ｖ３６、Ｋ１７０Ｒ−Ｄ２５９Ｇ、Ｓ１８Ｋ−Ｖ２０３Ｉ、Ｙ６Ｆ−Ｓ２４９Ｃ、Ｑ１９Ａ−Ｎ１０９Ｓ、Ｈ１７Ｌ−Ｑ１９Ａ、Ｑ１９Ｒ−Ｑ１８５Ｒ、Ｓ１８Ｙ−Ｖ２０３Ａ、Ｎ６１Ｄ−Ｑ２０６Ｒ、Ｓ１６１Ｅ−Ｓ２６０Ｔ、Ｓ１８Ｋ−Ｖ２０３Ｉ、Ｖ４Ａ−Ｔ５５Ａ、Ｎ２５２Ｓ−Ｌ２５７Ｈ、Ｓ２４９Ｒ−Ｙ２６２Ｈ、Ｎ６１Ｌ−Ｑ２０６Ｈ、Ｎ１８４Ｙ−Ｙ２６２Ｎ、Ｑ１９Ｒ−Ｎ２５Ｄ、Ｓ２４９Ｒ−Ｙ２６２Ｈ、Ａ７４Ｓ−Ｐ１２９Ｑ、Ｔ１５８Ａ−Ｄ２５９Ｐ、Ｈ１７Ｌ−Ｑ１９Ａ、Ｋ２７Ｒ−Ｄ１２０Ｈ、Ｖ４Ａ−Ｔ５５Ａ、Ｎ６１Ｋ−Ｎ２５２Ｋ、Ｙ２１Ｈ−Ｎ２５２Ｈ、Ｋ２７Ｒ−Ｎ２６９Ｄ、Ｋ４３Ｎ−Ｑ２１７Ｒ、Ｔ１５８Ａ−Ｄ２５９Ｐ、Ｑ２０６Ｒ−Ｓ２６０Ｐ、Ｋ２７Ｒ−Ｎ２６９Ｄ、Ａ９８Ｔ−Ｔ１５８Ａ、Ｉ７９Ｖ−Ｑ２１７Ｈ、Ｓ９Ｌ−Ｎ２１８Ｓ、Ｖ４Ａ−Ｙ６Ｆ、Ｓ１６１Ｐ−Ｔ２５３Ａ、Ｖ２０３Ａ−Ｑ２１７Ｒ、Ｔ２２Ｓ−Ｔ２４２Ｓ、Ｎ７６Ｐ−Ｎ２１２Ｓ、Ａ１３３Ｖ−Ｄ２５９Ｎ、Ｋ１７０Ｒ−Ｄ２５９Ｇ、Ｓ３７Ｔ−Ｓ２６０Ｐ、Ｔ５５Ａ−Ｖ１４７Ａ、Ｖ１９８Ｌ−Ｄ２５９Ｇ、Ｑ１９Ｒ−Ｑ１８５Ｒ、Ｖ４Ａ−Ｙ６Ｆ、Ｑ１９Ａ−Ｎ１０９Ｓ、Ｙ２６２Ｎ−Ｑ２７５Ｒ、Ｇ１６０Ｒ−Ｔ２４４Ａ、Ｑ１９Ｒ−Ｎ２５Ｄ、Ｎ２５Ｄ−Ｑ１８５Ｒ、Ｎ６１Ｋ−Ｎ２５２Ｋ、Ｓ１６１Ｅ−Ｓ２６０Ｔ、Ａ９８Ｔ−Ｔ１５８Ａ、Ｎ６１Ｌ−Ｑ２０６Ｈ、Ｇ２１１Ｖ−Ｔ２４４Ａ、Ｓ９Ｌ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ１４４Ｈ−Ｔ２４４Ａ、Ａ１４４Ｈ−Ｔ２４４Ａ、Ｓ１８Ｙ−Ｖ２０３Ａ、Ｙ２１Ｈ−Ｎ２５２Ｈ、Ａ７４Ｓ−Ｐ１２９Ｑ、Ｇ１６０Ａ−Ｄ２５９Ｇ、Ｋ４３Ｎ−Ｑ２１７Ｒ、Ａ１Ｙ−Ｑ２７５Ｒ、Ａ１Ｙ−Ｑ２７５Ｒ、Ａ２００Ｔ−Ｈ２２６Ｌ、Ｑ２１７Ｒ−Ｔ２４４Ａ、Ｓ２６０Ｐ−Ｑ２７５Ｒ、Ｖ１９８Ｌ−Ｄ２５９Ｇ、Ｔ５５Ａ−Ｖ１４７Ａ、Ｑ２０６Ｒ−Ｓ２６０Ｐ、Ｋ１４１Ｉ−Ｓ２４８Ｎ、Ｓ１８３Ｔ−Ｒ１８６Ｋ、Ｔ１５８Ｉ−Ｄ２５９Ｎ、Ｓ３７Ｔ−Ｓ２６０Ｐ、Ｋ２７Ｒ−Ｄ１２０Ｈ、Ｔ２２Ｓ−Ｔ２４２Ｓ、Ｑ２１７Ｒ−Ｔ２４４Ａ、Ｓ１６１Ｅ−Ｑ１８５Ｈ、Ｐ１２９Ｓ−Ｋ１３６Ｒ、Ｇ２１１Ｖ−Ｔ２４４Ａ、Ｎ７６Ｐ−Ｎ２１２Ｓ、Ｌ７５Ｉ−Ｎ７６Ｄ、Ｓ１６１Ｅ−Ｑ１８５Ｈ、Ｙ２１Ｈ−Ｓ３７Ｅ、Ｓ２４９Ｒ−Ｑ２７５Ｒ、Ｇ１６０Ａ−Ｄ２５９Ｇ、Ｋ４３Ｎ−Ｓ１６３Ｔ、Ｔ１５８Ｉ−Ｄ２５９Ｎ、Ｙ２１Ｈ−Ｓ３７Ｅ、Ｓ３７Ｇ−Ｑ２７５Ｈ、Ｓ１６１Ｐ−Ｔ２５３Ａ、Ｎ７６Ｔ−Ｎ２１２Ｄ、Ｓ２６０Ｐ−Ｑ２７５Ｌ、Ｙ６Ｆ−Ｓ２４９Ｃ、Ｎ１８４Ｙ−Ｙ２６２Ｎ、Ｇ１３１Ｓ−Ｋ２６５Ｎ、Ｖ４Ａ−Ｓ２４９Ｎ、Ｎ２５Ｄ−Ｑ１８５Ｒ、Ｎ２５２Ｓ−Ｌ２５７Ｈ、Ｋ４３Ｒ−Ｎ７６Ｓ、Ｓ１８３Ｄ−Ｑ２０６Ｒ、Ｇ１６０Ｒ−Ｔ２４４Ａ、Ｑ１０Ｒ−Ｑ２７５Ｋ、Ｓ３７Ｇ−Ｑ２７５Ｈ、Ｋ４３Ｎ−Ｓ１６３Ｔ、Ｑ１０Ｒ−Ｑ２７５Ｋ、Ｎ２５Ｄ−Ｖ２���Ａ、Ｐ１２９Ｓ−Ｋ１３６Ｒ、Ｇ１３１Ｓ−Ｋ２６５Ｎ、Ｓ２６０Ｐ−Ｑ２７５Ｌ、Ｋ１４１Ｉ−Ｓ２４８Ｎ、Ｔ２２Ｓ−Ｇ１６６Ｖ、Ｎ６２Ｙ−Ｔ２４４Ａ、Ｌ１６Ｑ−Ｑ２１７Ｈ、Ｓ２４９Ｒ−Ｑ２７５Ｒ、Ｓ２６０Ｐ−Ｑ２７５Ｒ、Ｋ２７Ｒ−Ｎ２６９Ｔ、Ｐ２１０Ｓ−Ｎ２１２Ｄ、Ｌ７５Ｉ−Ｎ７６Ｄ、Ｓ１８３Ｄ−Ｑ２０６Ｒ、Ｎ１１８Ｇ−Ｖ１２１Ａ、Ｇ２１５Ｄ−Ｄ２５９Ｖ、Ｎ７６Ｔ−Ｎ２１２Ｄ、Ｖ４Ａ−Ｓ２４９Ｎ、Ｋ２７Ｒ−Ｎ２６９Ｔ、Ｇ１６６Ｖ−Ｓ１８３Ｔ、Ｎ６２Ｙ−Ｇ９７Ｄ、Ｖ４Ｅ−Ｓ２６０Ｐ、Ｇ２１５Ｄ−Ｄ２５９Ｖ、Ｋ２７Ｅ−Ｙ９１Ｆ、Ｙ２１Ｈ−Ｄ２５９Ｒ、Ｙ６Ｄ−Ｔ５５Ａ、Ｎ７７Ｄ−Ｎ２５２Ｔ、Ｖ４Ｅ−Ｓ２６０Ｐ、Ｙ６Ｄ−Ｔ５５Ａ、Ｎ７７Ｄ−Ｎ２５２Ｔ、Ｙ２１Ｈ−Ｄ２５９Ｒ、Ｎ２５Ｋ−Ｈ２３８Ｒ、Ｎ７７Ｄ−Ｎ２５２Ｄ、Ｖ４４Ａ−Ｑ２０６Ｈ、Ｌ１６Ｑ−Ｑ２１７Ｈ、Ｖ７２Ｆ−Ｌ７５Ｉ、Ｓ３７Ｐ−Ｓ２６０Ｆ、Ｖ７２Ｆ−Ｌ７５Ｉ、Ｎ７７Ｄ−Ｎ２５２Ｄ、Ｖ４４Ａ−Ｑ２０６Ｒ、Ｓ１６３Ｔ−Ｑ２４５Ｌ、Ｖ４４Ａ−Ｑ２０６Ｈ、Ｖ４４Ａ−Ｑ２０６Ｒ、Ｓ３７Ｐ−Ｓ２６０Ｆ、Ｇ２１５Ｒ−Ｄ２５９Ｒ、Ｖ４４Ａ−Ｑ２０６Ｋ、及びＶ４４Ａ−Ｑ２０６Ｋからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、本アッセイにおいて、タンパク質分解活性を有する、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．５以上１．０以下のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組の酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、限定するものではないが、例えば少なくとも１つのこのような変異体を含むクリーニング組成物、並びに本明細書で更に詳細に記載されるようなこのようなプロテアーゼ変異体を少なくとも１つ利用するクリーニング方法も包含される。
【０４７６】
（実施例１７）
更なるＢＰＮ’−ｖ３６ポリペプチド変異体のクリーニング性能
以下のＢＰＮ’−ｖ３６変異体を、クローニング用のテンプレートＤＮＡ（親プラスミド）としてＢＰＮ’発現カセットを含有している、ｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’−ｖ３６プラスミドを用い、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）により合成した：Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ６１Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ、Ｎ６１Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ６１Ｇ−Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ、Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ、Ｎ１０９Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｓ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｍ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ、Ｎ１０９Ｍ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｍ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１４Ｓ−Ａ１２８Ｓ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１４Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１４Ｓ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１４Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１４Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ１８３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ１８３Ｌ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ１８３Ｌ−Ｓ２２４Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１４Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ１８３Ｌ−Ｓ２２４Ａ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１４Ｓ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ１８３Ｌ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ７６Ｄ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ、Ｎ１０１Ｑ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０１Ｑ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｐ１２９Ｓ−Ｓ１３０Ｔ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｐ１２９Ｓ−Ｓ１３０Ｔ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ６１Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１６９Ａ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ７６Ｄ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１６９Ａ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｉ３１Ｌ−Ｓ３３Ｔ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１６９Ａ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ６１Ｇ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ６１Ｇ−Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ６１Ｇ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｇ１６９Ａ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｇ１６９Ａ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３���、Ｓ３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ１Ｇ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｉ３１Ｌ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４９Ｑ、Ｓ３３Ｔ−Ｔ５５Ｐ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｔ５５Ｐ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｔ５５Ｐ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４９Ｑ、Ａ１Ｇ−Ｉ３１Ｌ−Ｓ３３Ｔ−Ｔ５５Ｐ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４９Ｑ、Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｇ１６９Ａ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４９Ｑ、及びＡ１Ｇ−Ｉ３１Ｌ−Ｓ３３Ｔ−Ｔ５５Ｐ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｇ１６９Ａ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４９Ｑ。
【０４７７】
パートＩの実施例１１に記載のようにタンパク質を発現させるために、変異体を増殖させた。パートＩの実施例１に記載のように、これらの変異体の性能を、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４の卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、並びにＡＡＰＦアッセイにおいて、試験した。結果は以下に提供される。
【０４７８】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して、１．０超、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．０超〜約１０、１．０超〜約８、又は１．０超〜約５のＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１４Ｓ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１４Ｓ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ１８３Ｌ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ１８３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｍ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｓ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｍ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０１Ｑ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｐ１２９Ｓ−Ｓ１３０Ｔ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、及びＡ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、ＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３、及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつ本アッセイにおいてＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３及びＢＰＮ’−ｖ３６よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、ＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３、及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較してタンパク質分解活性が向上している、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０超〜約５のＰＩ値を有する、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して１．０超〜約５のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、限定するものではないが、例えば少なくとも１つのこのような変異体を含むクリーニング組成物、並びに本明細書で更に詳細に記載されるようなこのようなプロテアーゼ変異体を少なくとも１つ利用するクリーニング方法も包含される。
【０４７９】
同様に、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’ｖ−３６と比較してタンパク質分解活性が向上している、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して１．０以上のＰＩ値を有する、サブチリシンプロテアーゼ変異体が提供され、変異体は、配列番号２と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、変異体はＸ６１Ｇ／Ｐ／Ｓ、Ｘ６３Ｇ、Ｘ８８Ｔ、Ｘ１０１Ｑ、Ｘ１０９Ｇ／Ｍ／Ｑ／Ｓ、Ｘ１１４Ｓ、Ｘ１１６Ｔ、Ｘ１２８Ｓ、Ｘ１２９Ｓ、Ｘ１３０Ｔ、Ｘ１５８Ｓ、Ｘ１８３Ｌ／Ｖ、Ｘ２２４Ａ、Ｘ２４３Ｖ、Ｘ２４８Ａ、及びＸ２５６Ｒの群から選択された少なくとも１つの置換を含む少なくとも１つの置換を含み、Ｎ６１Ｇ／Ｐ／Ｓ、Ｓ６３Ｇ、Ａ８８Ｔ、Ｎ１０１Ｑ、Ｎ１０９Ｇ／Ｍ／Ｑ／Ｓ、Ａ１１４Ｓ、Ａ１１６Ｔ、Ａ１２８Ｓ、Ｐ１２９Ｓ、Ｓ１３０Ｔ、Ｔ１５８Ｓ、Ｓ１８３Ｌ／Ｖ、Ｓ２２４Ａ、Ｎ２４３Ｖ、Ｓ２４８Ａ、及びＫ２５６Ｒからなる群から選択された少なくとも１つの置換を含んでいてもよいものである。ここで、変異のアミノ酸位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、ＢＰＮ’（配列番号２）、ＢＰＮ’−ｖ３及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつ本アッセイにおいて、ＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３及びＢＰＮ’−ｖ３６よりもＰＩ値が大きい。同様に、限定するものではないが、例えば少なくとも１つのこのような変異体を含むクリーニング組成物、並びに本明細書で更に詳細に記載されるようなこのようなプロテアーゼ変異体を少なくとも１つ利用するクリーニング方法も包含される。
【０４８０】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して約０．９以上１．０以下のＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、Ｇ２４Ｓ−Ｇ５３Ｓ−Ｎ７８Ｓ−Ｇ９７Ａ−Ｎ１０１Ｓ−Ａ１２８Ｓ、Ｇ２４Ｓ−Ｇ５３Ｓ−Ｎ７８Ｓ−Ｇ９７Ａ−Ｎ１０１Ｓ、ＢＰＮ’−ｖ３６、Ｓ３３Ｔ−Ｔ５５Ｐ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ６１Ｇ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｔ５５Ｐ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｇ１６９Ａ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４９Ｑ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ６１Ｇ−Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ７６Ｄ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ７６Ｄ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ６１Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ１Ｇ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４９Ｑ、Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１４Ｓ−Ａ１２８Ｓ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１４Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ１８３Ｌ−Ｓ２２４Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１４Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１４Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ６１Ｇ−Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１４Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ１８３Ｌ−Ｓ２２４Ａ、Ｎ６１Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ１８３Ｌ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ７６Ｄ、Ｎ１０９Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ、Ｎ１０１Ｑ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｐ１２９Ｓ−Ｓ１３０Ｔ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｍ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ６３Ｇ−Ｎ７６Ｄ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１６９Ａ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、及びＳ３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４���Ｖからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、本アッセイにおいて、タンパク質分解活性を有する、ＢＰＮ’と比較してタンパク質分解活性が向上している、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．９以上１．０以下のＰＩ値を有するプロテアーゼの変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組の酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、限定するものではないが、例えば少なくとも１つのこのような変異体を含むクリーニング組成物、並びに本明細書で更に詳細に記載されるようなこのようなプロテアーゼ変異体を少なくとも１つ利用するクリーニング方法も包含される。
【０４８１】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して、０．５以上０．９未満のＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、Ｉ３１Ｌ−Ｓ３３Ｔ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１６９Ａ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ１Ｇ−Ｉ３１Ｌ−Ｓ３３Ｔ−Ｔ５５Ｐ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｇ１６９Ａ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４９Ｑ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ６１Ｇ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｇ１６９Ａ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１６９Ａ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｔ５５Ｐ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４９Ｑ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ７６Ｄ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ｎ７６Ｄ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ、及びＳ３３Ｔ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｇ１６９Ａ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、本アッセイにおいて、タンパク質分解活性を有する、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．５以上０．９未満のＰＩ値を有する、プロテアーゼの変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組の酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、限定するものではないが、例えば少なくとも１つのこのような変異体を含むクリーニング組成物、並びに本明細書で更に詳細に記載されるようなこのようなプロテアーゼ変異体を少なくとも１つ利用するクリーニング方法も包含される。
【０４８２】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４の卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して１．０超、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．０超〜約１０、１．０超〜約８、又は１．０超〜約５のＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、Ｓ３３Ｔ−Ｔ５５Ｐ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ６１Ｇ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｇ１６９Ａ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４９Ｑ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ６１Ｇ−Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ１Ｇ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４９Ｑ、Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１４Ｓ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１４Ｓ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ１８３Ｌ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１４Ｓ−Ａ１２８Ｓ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１４Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ１８３Ｌ−Ｓ２２４Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１４Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１４Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ６１Ｇ−Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ１８３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１４Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ１８３Ｌ−Ｓ２２４Ａ、Ｎ６１Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ、Ｎ１０９Ｍ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｓ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｍ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ６３Ｇ−Ａ１２８Ｓ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０１Ｑ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ、Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ６１Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３���、Ｓ３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１６９Ａ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｐ１２９Ｓ−Ｓ１３０Ｔ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、及びＡ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、ＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３、及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつ本アッセイにおいてＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３及びＢＰＮ’−ｖ３６よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、ＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３、及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較してタンパク質分解活性が向上している、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０超〜約５のＰＩ値を有する、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して１．０超〜約５のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、限定するものではないが、例えば少なくとも１つのこのような変異体を含むクリーニング組成物、並びに本明細書で更に詳細に記載されるようなこのようなプロテアーゼ変異体を少なくとも１つ利用するクリーニング方法も包含される。
【０４８３】
同様に、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４の卵マイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’ｖ−３６と比較してタンパク質分解活性が向上している、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して１．０超のＰＩ値を有する、サブチリシンプロテアーゼ変異体が提供され、変異体は、配列番号２と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、変異体はＸ１Ｇ、Ｘ３３Ｔ、Ｘ５５Ｐ、Ｘ６１Ｇ／Ｐ／Ｓ、Ｘ６３Ｇ、Ｘ７６Ｄ、Ｘ８８Ｔ、Ｘ１０１Ｑ、Ｘ１０９Ｇ／Ｍ／Ｑ／Ｓ、Ｘ１１４Ｓ、Ｘ１１６Ｔ、Ｘ１２８Ｓ、Ｘ１２９Ｓ、Ｘ１３０Ｔ、Ｘ１３１Ｈ、Ｘ１５８Ｓ、Ｘ１６９Ａ、Ｘ１８３Ｌ／Ｖ、Ｘ２１８Ｓ、Ｘ２２４Ａ、Ｘ２４３Ｖ、Ｘ２４８Ａ／Ｎ、Ｘ２４９Ｑ、Ｘ２５６Ｒの群から選択された少なくとも１つの置換を含む少なくとも１つの置換を含み、Ａ１Ｇ、Ｓ３３Ｔ、Ｔ５５Ｐ、Ｎ６１Ｇ／Ｐ／Ｓ、Ｓ６３Ｇ、Ｎ７６Ｄ、Ａ８８Ｔ、Ｎ１０１Ｑ、Ｎ１０９Ｇ／Ｍ／Ｑ／Ｓ、Ａ１１４Ｓ、Ａ１１６Ｔ、Ａ１２８Ｓ、Ｐ１２９Ｓ、Ｓ１３０Ｔ、Ｇ１３１Ｈ、Ｔ１５８Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８３Ｌ／Ｖ、Ｎ２１８Ｓ、Ｓ２２４Ａ、Ｎ２４３Ｖ、Ｓ２４８Ａ／Ｎ、Ｓ２４９Ｑ、Ｋ２５６Ｒの群から選択された少なくとも１つの置換を含んでいてもよいものである。ここで、変異のアミノ酸位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、ＢＰＮ’（配列番号２）、ＢＰＮ’−ｖ３及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつ本アッセイにおいて、ＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３及びＢＰＮ’−ｖ３６よりもＰＩ値が大きい。同様に、限定するものではないが、例えば少なくとも１つのこのような変異体を含むクリーニング組成物、並びに本明細書で更に詳細に記載されるようなこのようなプロテアーゼ変異体を少なくとも１つ利用するクリーニング方法も包含される。
【０４８４】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４の卵ＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．５以上１．０以下のＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、Ｓ３３Ｔ−Ｎ７６Ｄ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ｎ７６Ｄ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ、及びＳ０６３Ｇ−Ｎ７６Ｄからなる群から選択されるアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、本アッセイにおいて、タンパク質分解活性を有する、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．５以上１．０以下のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＳ３３Ｔ−Ｎ７６Ｄ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ｎ７６Ｄ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ、及びＳ０６３Ｇ−Ｎ０７６Ｄからなる群から選択されるアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、限定するものではないが、例えば少なくとも１つのこのような変異体を含むクリーニング組成物、並びに本明細書で更に詳細に記載されるようなこのようなプロテアーゼ変異体を少なくとも１つ利用するクリーニング方法も包含される。
【０４８５】
以降、ＡＡＰＦタンパク質分解アッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して１．０超、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．０超〜約１０、１．０超〜約８、又は１．０超〜約５のＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、Ｇ２４Ｓ−Ｇ５３Ｓ−Ｎ７８Ｓ−Ｇ９７Ａ−Ｎ１０１Ｓ−Ａ１２８Ｓ、Ｉ３１Ｌ−Ｓ３３Ｔ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１６９Ａ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ１Ｇ−Ｉ３１Ｌ−Ｓ３３Ｔ−Ｔ５５Ｐ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｇ１６９Ａ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４９Ｑ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ６１Ｇ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｇ１６９Ａ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１６９Ａ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｔ５５Ｐ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｔ５５Ｐ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４９Ｑ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ６１Ｇ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｔ５５Ｐ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｇ１６９Ａ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４９Ｑ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ６１Ｇ−Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ７６Ｄ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ７６Ｄ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ｎ−Ｋ２５６Ｒ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ６１Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ７６Ｄ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ｓ３３Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ、Ａ１Ｇ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４９Ｑ、Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１４Ｓ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１４Ｓ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ１８３Ｌ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１４Ｓ−Ａ１２８Ｓ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１４Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ１８３Ｌ−Ｓ２２４Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１４Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１４Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ６１Ｇ−Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ１８３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１４Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｓ２４８Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ１８３Ｌ−Ｓ２２４Ａ、Ｎ６１Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ、Ｎ７６Ｄ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ、Ｎ１０９Ｍ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ１８３Ｌ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ７６Ｄ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｓ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｍ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０１Ｑ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｐ１２９Ｓ−Ｓ１３０Ｔ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｍ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ６３Ｇ−Ａ１２８Ｓ、Ｎ１０９Ｓ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ６１Ｓ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０１Ｑ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ−Ｔ１５８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１１６Ｔ、Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ、Ａ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｇ、Ｎ１０９Ｇ−Ｋ２５６Ｒ、Ｎ６１Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ６１Ｐ−Ｓ６３Ｇ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１３１Ｈ−Ｇ１６９Ａ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１６９Ａ−Ｎ２１８Ｓ−Ｎ２４３Ｖ、Ｓ３３Ｔ−Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｎ２１８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、Ｎ１０９Ｇ−Ａ１２８Ｓ−Ｐ１２９Ｓ−Ｓ１３０Ｔ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖ、及びＡ８８Ｔ−Ｎ１０９Ｑ−Ａ１１６Ｔ−Ａ１２８Ｓ−Ｓ２２４Ａ−Ｎ２４３Ｖからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、ＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３、及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつ本アッセイにおいてＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３及びＢＰＮ’−ｖ３６よりもＰＩ値が大きい。本発明は、本アッセイにおいて、ＢＰＮ’（配列番号２）と比較してタンパク質分解活性が向上している、ＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３、及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較してタンパク質分解活性が向上している、ＢＰＮ’−ｖ３と比較して１．０超〜約５のＰＩ値を有する、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して１．０超〜約５のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、限定するものではないが、例えば少なくとも１つのこのような変異体を含むクリーニング組成物、並びに本明細書で更に詳細に記載されるようなこのようなプロテアーゼ変異体を少なくとも１つ利用するクリーニング方法も包含される。
【０４８６】
同様に、ＡＡＰＦタンパク質分解アッセイにおいて、ＢＰＮ’ｖ−３６と比較してタンパク質分解活性が向上している、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して１．０超えのＰＩ値を有する、サブチリシンプロテアーゼ変異体が提供され、変異体は、配列番号２と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、変異体はＸ１Ｇ、Ｘ３１Ｌ、Ｘ３３Ｔ、Ｘ５５Ｐ、Ｘ６１Ｇ／Ｐ／Ｓ、Ｘ６３Ｇ、Ｘ７６Ｄ、Ｘ８８Ｔ、Ｘ１０１Ｑ、Ｘ１０９Ｇ／Ｍ／Ｑ／Ｓ、Ｘ１１４Ｓ、Ｘ１１６Ｔ、Ｘ１２８Ｓ、Ｘ１２９Ｓ、Ｘ１３０Ｔ、Ｘ１３１Ｈ、Ｘ１５８Ｓ、Ｘ１６９Ａ、Ｘ１８３Ｌ／Ｖ、Ｘ２１８Ｓ、Ｘ２２４Ａ、Ｘ２４３Ｖ、Ｘ２４８Ａ／Ｎ、Ｘ２４９Ｑ、及びＸ２５６Ｒの群から選択された少なくとも１つの置換を含む少なくとも１つの置換を含み、Ａ１Ｇ、Ｉ３１Ｌ、Ｓ３３Ｔ、Ｔ５５Ｐ、Ｎ６１Ｇ／Ｐ／Ｓ、Ｓ６３Ｇ、Ｎ７６Ｄ、Ａ８８Ｔ、Ｎ１０１Ｑ、Ｎ１０９Ｇ／Ｍ／Ｑ／Ｓ、Ａ１１４Ｓ、Ａ１１６Ｔ、Ａ１２８Ｓ、Ｐ１２９Ｓ、Ｓ１３０Ｔ、Ｇ１３１Ｈ、Ｔ１５８Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８３Ｌ／Ｖ、Ｎ２１８Ｓ、Ｓ２２４Ａ、Ｎ２４３Ｖ、Ｓ２４８Ａ／Ｎ、Ｓ２４９Ｑ、及びＫ２５６Ｒの群から選択された少なくとも１つの置換を含んでいてもよいものである。ここで、変異のアミノ酸位置は配列番号２の配列の位置と対応させて番号付けされるものである。このような変異体は、ＢＰＮ’（配列番号２）、ＢＰＮ’−ｖ３及びＢＰＮ’−ｖ３６と比較してタンパク質分解活性が向上しており、かつ本アッセイにおいて、ＢＰＮ’、ＢＰＮ’−ｖ３及びＢＰＮ’−ｖ３６よりもＰＩ値が大きい。同様に、限定するものではないが、例えば少なくとも１つのこのような変異体を含むクリーニング組成物、並びに本明細書で更に詳細に記載されるようなこのようなプロテアーゼ変異体を少なくとも１つ利用するクリーニング方法も包含される。
【０４８７】
以降、ＡＡＰＦタンパク質分解アッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．５以上１．０以下のＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、アミノ酸置換Ｇ２４Ｓ−Ｇ５３Ｓ−Ｎ７８Ｓ−Ｇ９７Ａ−Ｎ１０１Ｓ又はＳ０６３Ｇ−Ｎ７６Ｄを含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、本アッセイにおいて、タンパク質分解活性を有する、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．５以上１．０以下のＰＩ値を有する、プロテアーゼの変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ置換Ｇ２４Ｓ−Ｇ５３Ｓ−Ｎ７８Ｓ−Ｇ９７Ａ−Ｎ１０１Ｓ又はＳ０６３Ｇ−Ｎ７６Ｄを含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、限定するものではないが、例えば少なくとも１つのこのような変異体を含むクリーニング組成物、並びに本明細書で更に詳細に記載されるようなこのようなプロテアーゼ変異体を少なくとも１つ利用するクリーニング方法も包含される。
【０４８８】
（実施例１８）
ＢＰＮ’−ｖ３６ポリペプチドに基づくコンビナトリアルライブラリ由来の、ポリペプチドＢＰＮ’−ｖ３６のポリペプチド変異体のクリーニング性能
ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）により２つの別個のコンビナトリアルライブラリ（ＡＪ１及びＡＪ２）を合成し、個々のライゲーション反応に用いた。ＢＰＮ’発現カセットを含有しているｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’−ｖ３６プラスミド（図４）をライブラリ構築のためのテンプレートＤＮＡ（親プラスミド）として使用した。導入可能なアミノ酸位置、及び各ライブラリの置換の一覧を表２３−１に示す。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓを形質転換させるために各ライブラリのライゲーション反応を用い、ライブラリの変異体を実施例１１に記載のようにタンパク質を発現させるために増殖させた。変異体を、実施例１に記載のように、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４（表１−３）のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて性能試験した。
【０４８９】
【表３６】
0005882904.tif 000085
【０４９０】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、０．５以上１．０以下のＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、ＢＰＮ’ｖ３６、ＢＰＮ’ｖ３（Ｇ０２４Ｓ−Ｇ０５３Ｓ−Ｎ０７８Ｓ−Ｇ０９７Ａ−Ｎ１０１Ｓ）、ＢＰＮ’ｖ３（Ｇ０２４Ｓ−Ｇ０５３Ｓ−Ｎ０７８Ｓ−Ｇ０９７Ａ−Ｎ１０１Ｓ、ＢＰＮ’  ｖ１２（Ｇ０２４Ｓ−Ｇ０５３Ｓ−Ｎ０７８Ｓ−Ｇ０９７Ａ−Ｎ１０１Ｓ−Ａ１２８Ｓ）、Ｎ０６２Ｌ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｇ、Ｎ０６２Ｓ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｌ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｌ−Ｑ２１７Ｌ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｎ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｒ、Ｑ２１７Ｅ、Ｓ０６３Ｇ、Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｌ、Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｌ−Ｍ２２２Ｓ、Ｓ０６３Ｌ−Ｑ２１７Ｌ、Ｓ０６３Ｎ、Ｓ０６３Ｎ−Ｑ２１７Ｌ、Ｄ０９９Ｎ−Ｋ１４１Ｙ−Ｋ２１３Ｑ、Ｄ０９９Ｎ−Ｋ１４１Ｙ−Ｋ２５６Ｑ、Ｋ０４３Ｔ、Ｋ０４３Ｔ−Ｋ１４１Ｙ−Ｅ１５６Ｑ、Ｎ０６２Ｌ−Ｑ２１７Ｅ、Ｎ０６２Ｌ−Ｑ２１７Ｌ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｅ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｌ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｎ−Ｑ２１７Ｌ、Ｎ０６２Ｓ−Ｑ２１７Ｌ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｇ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｌ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｎ−Ｑ２１７Ｌ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｒ−Ｑ２１７Ｅ、Ｑ２１７Ｌ、Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｅ、Ｓ０６３Ｎ−Ｑ２１７Ｅ、Ｓ０６３Ｒ、Ｓ０６３Ｒ−Ｑ２１７Ｅ、Ｓ０６３Ｒ−Ｑ２１７Ｌ，）、Ｄ０９９Ｎ−Ｋ１４１Ｙ−Ｋ２１３Ｑ、Ｄ０９９Ｎ−Ｋ１４１Ｙ−Ｋ２５６Ｑ、Ｋ０４３Ｔ、Ｋ０４３Ｔ−Ｋ１４１Ｙ−Ｅ１５６Ｑ、Ｎ０６２Ｌ−Ｑ２１７Ｅ、Ｎ０６２Ｌ−Ｑ２１７Ｌ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｅ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｌ、Ｎ０６２Ｓ−Ｑ２１７Ｌ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｇ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｌ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｎ−Ｑ２１７Ｌ、Ｑ２１７Ｌ、Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｅ、Ｓ０６３Ｎ−Ｑ２１７Ｅ、Ｓ０６３Ｒ、Ｓ０６３Ｒ−Ｑ２１７Ｅ、及びＳ０６３Ｒ−Ｑ２１７Ｌからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、本アッセイにおいて、タンパク質分解活性を有する、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．５以上１．０以下のＰＩ値を有する、プロテアーゼ変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組の酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、限定するものではないが、例えば少なくとも１つのこのような変異体を含むクリーニング組成物、並びに本明細書で更に詳細に記載されるようなこのようなプロテアーゼ変��体を少なくとも１つ利用するクリーニング方法も包含される。
【０４９１】
以降、ｐＨ  ８及び１６℃での洗剤組成物４のＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイにおいて、ＢＰＮ’−ｖ３６変異体は、ＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．５以上０．９未満のＰＩ値を有するものとして定められた：アミノ酸配列ＢＰＮ’−Ｓ０２４Ｇ−Ｓ０５３Ｇ−Ｓ０７８Ｎ−Ｓ１０１Ｎ−Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑ（配列番号６）は、Ｄ０９９Ｎ、Ｋ１４１Ｙ−Ｅ１５６Ｑ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｌ−Ｑ２１７Ｌ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｎ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｎ−Ｑ２１７Ｅ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｒ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｒ−Ｑ２１７Ｌ、Ｎ０６２Ｓ−Ｑ２１７Ｅ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｅ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｒ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｎ−Ｑ２１７Ｒ、Ｓ０６３Ｇ−Ｓ１２５Ａ、Ｄ０６０Ｇ−Ｑ２１７Ｌ、Ｄ１２０Ｎ−Ｋ１４１Ｙ−Ｋ２１３Ｑ、Ｋ０４３Ｔ−Ｄ０９９Ｎ−Ｄ１２０Ｎ−Ｋ１４１Ｙ、Ｋ０４３Ｔ−Ｄ０９９Ｎ−Ｋ１４１Ｙ−Ｋ２５６Ｑ、Ｋ０４３Ｔ−Ｋ２３７Ａ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｒ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｇ−Ｓ１２５Ａ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｌ−Ｑ２１７Ｅ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｎ−Ｓ１２５Ａ−Ｑ２１７Ｌ、Ｎ０６２Ｓ−Ｑ２１７Ｒ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｌ−Ｑ２１７Ｅ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｒ−Ｑ２１７Ｌ、Ｓ０６３Ｇ−Ｍ２２２Ｓ、Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｒ、Ｄ１２０Ｎ−Ｅ１５６Ｑ−Ｋ２５６Ｑ、Ｋ１４１Ｙ−Ｄ１９７Ｎ、Ｎ０６２Ｌ−Ｑ２１７Ｒ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｌ−Ｍ２２２Ｓ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｌ−Ｑ２１７Ｒ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｎ−Ｑ２１７Ｒ、Ｎ０６２Ｓ−Ｑ２１７Ｇ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｇ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｌ−Ｍ２２２Ｌ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｇ−Ｓ１２５Ａ−Ｑ２１７Ｌ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｎ−Ｑ２１７Ｅ、Ｑ２１７Ｇ、Ｓ０３３Ｇ−Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｇ、Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｇ、Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｌ−Ｍ２２２Ｌ、Ｓ０６３Ｇ−Ｓ１２５Ａ−Ｑ２１７Ｒ、Ｓ０６３Ｌ−Ｑ２１７Ｒ、Ｓ０６３Ｎ−Ｍ２２２Ｓ、Ｓ０６３Ｎ−Ｑ２１７Ｒ、Ｓ０６３Ｎ−Ｓ１２５Ａ−Ｑ２１７Ｌ、Ｓ０６３Ｒ−Ｑ２１７Ｒ、Ｓ０６３Ｒ−Ｓ１２５Ａ−Ｑ２１７Ｌ、Ｄ０９９Ｎ−Ｅ１５６Ｑ−Ｋ２５６Ｑ、Ｅ１５６Ｑ、Ｋ０１２Ｔ−Ｄ０９９Ｎ−Ｋ２１３Ｑ、Ｋ０１２Ｔ−Ｋ２５６Ｑ、Ｋ０４３Ｔ−Ｄ０９９Ｎ−Ｋ１４１Ｙ−Ｋ２１３Ｑ、Ｋ０４３Ｔ−Ｅ１５６Ｑ、Ｋ１４１Ｙ−Ｋ２１３Ｑ、Ｎ０６２Ｌ−Ｑ２１７Ｇ、Ｎ０６２Ｌ−Ｑ２１７Ｌ−Ｍ２２２Ｌ、Ｎ０６２Ｌ−Ｑ２１７Ｌ−Ｍ２２２Ｓ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｇ−Ｍ２２２Ｓ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｌ−Ｍ２２２Ｌ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｒ−Ｍ２２２Ｓ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｎ−Ｑ２１７Ｌ−Ｍ２２２Ｓ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｎ−Ｓ１２５Ａ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ０６３Ｒ−Ｓ１２５Ａ、Ｎ０６２Ｌ−Ｓ１２５Ａ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｇ−Ｍ２２２Ｓ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｇ−Ｍ２２２Ｓ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｇ−Ｓ１２５Ａ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｎ−Ｑ２１７Ｌ−Ｍ２２２Ｌ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｎ−Ｓ１２５Ａ−Ｑ２１７Ｌ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｒ−Ｑ２１７Ｇ、Ｎ０６２Ｓ−Ｓ０６３Ｒ−Ｑ２１７Ｌ−Ｍ２２２Ｓ、Ｑ���１７Ｇ−Ｍ２２２Ｓ、Ｑ２１７Ｌ−Ｍ２２２Ｓ、Ｑ２１７Ｒ、Ｓ０３３Ｇ−Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｒ、Ｓ０６３Ｇ−Ｑ２１７Ｅ−Ｍ２２２Ｓ、Ｓ０６３Ｇ−Ｓ１２５Ａ−Ｑ２１７Ｇ、Ｓ０６３Ｌ−Ｑ２１７Ｅ、Ｓ０６３Ｎ−Ｑ２１７Ｇ、Ｓ０６３Ｎ−Ｑ２１７Ｇ−Ｍ２２２Ｓ、Ｓ０６３Ｎ−Ｑ２１７Ｌ−Ｍ２２２Ｓ、Ｓ０６３Ｒ−Ｑ２１７Ｌ−Ｍ２２２Ｓ、及びＳ０６３Ｒ−Ｓ１２５Ａからなる群から選択された少なくとも１組のアミノ酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列と対応させて番号付けされるものである。このような変異体はタンパク質分解活性を有する。本発明は、本アッセイにおいて、タンパク質分解活性を有する、及び／又はＢＰＮ’−ｖ３６と比較して０．５以上０．９未満のＰＩ値を有する、プロテアーゼの変異体を含み、変異体は配列番号２又は配列番号６と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上記群から選択された少なくとも１組の酸置換を含むものである。ここで、変異のアミノ酸位置は、配列番号２の配列のアミノ酸位置と対応させて番号付けされるものである。同様に、限定するものではないが、例えば少なくとも１つのこのような変異体を含むクリーニング組成物、並びに本明細書で更に詳細に記載されるようなこのようなプロテアーゼ変異体を少なくとも１つ利用するクリーニング方法も包含される。
【０４９２】
パートＩＩ
冷水プロテアーゼ変異体ＧＧ３６の製造方法
冷水プロテアーゼ変異体ＧＧ３６をコードしている本発明の改変ポリヌクレオチドを生成するのに好適な様々な方法が当該技術分野において既知であり、限定するものではないが、例えば、部分飽和変異、系統的変異導入法、挿入変異、欠失変異、ランダム変異、部位特異的変異誘導、及び定向進化、並びに様々な他の組み換え手法が挙げられる。シリーズＩのＧＧ３６の冷水プロテアーゼ変異体を製造する非限定的な代表的方法は、上記表題「本発明のプロテアーゼ変異体ポリペプチドを製造するためのベクター、細胞、及び方法」の項で提供される。
【０４９３】
（実施例１９）
加熱不活性化した洗剤の酵素活性の試験に関しては、洗剤の希釈標準溶液は熱不活性化母液から調製した。所望の条件に一致するよう、適切な硬度の水（例えば、１．５９ｇ／Ｌ（６ｇｐｇ）又は３．１７ｇ／Ｌ（１２ｇｐｇ））及び緩衝剤を洗剤溶液に加える。瓶をボルテックスにかけるか反転させるかして溶液を混合する。以下の表は本明細書で使用される市販の洗剤及び試験条件の一部についての情報を提供する。一部の実験では、追加の及び／又は他の市販の洗剤が以下の実施例で使用されることが見出される。
【０４９４】
【表３７】
0005882904.tif 000086
【０４９５】
一部の更なる実施例では、以下の溶液の使用が見出される：
【表３８】
0005882904.tif 000087
【０４９６】
表１９−３は、布地の洗濯に好適な本発明に従って製造された顆粒状洗濯洗剤組成物を提供する。
【表３９】
0005882904.tif 000088
【０４９７】
表１９−３において、製品に添加した活性タンパク質％として表される冷水プロテアーゼ変異体（本発明のもの）を除き、すべての酵素濃度は酵素原材料％として表される。表１９−４は、頂部充填式自動洗浄装置（洗剤組成物７〜９）、及び前側充填式洗浄装置（洗剤組成物１０〜１１）に好適な液体洗濯洗剤組成物を提供する。試験したＧＧ３６プロテアーゼ変異体、及び／又はＢＰＮ’変異体、及び／又は本発明の冷水プロテアーゼ変異体をこれらの配合物に別個に加える。
【０４９８】
【表４０】
0005882904.tif 000089
【０４９９】
表１９−４において、界面活性剤材料は、限定するものではないが  ＢＡＳＦ（例えば、ＬＵＴＥＮＳＯＬ（登録商標））、Ｓｈｅｌｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓｔｅｐａｎ、Ｈｕｎｔｓｍａｎ、及びＣｌａｒｉａｎｔ（例えば、ＰＲＡＥＰＡＧＥＮ（登録商標））が挙げられる、任意の好適な供給元から得ることができる。ゼオライトはＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｚｅｏｌｉｔｅなどの供給元から得ることができる。クエン酸及びクエン酸ナトリウムは、Ｊｕｎｇｂｕｎｚｌａｕｅｒなどの供給元から得ることができる。過炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム及びセスキ炭酸ナトリウムは、Ｓｏｌｖａｙなどの供給元から得ることができる。アクリル酸／マレエートコポリマーは、ＢＡＳＦなどの供給元から得ることができる。カルボキシメチルセルロース及び疎水変性カルボキシメチルセルロースは、ＣＰＫｅｌｃｏなどの供給元から得ることができる。Ｃ．Ｉ．蛍光増白剤２６０は、３Ｖ  Ｓｉｇｍａから得ることができる（例えば、ＯＰＴＩＢＬＡＮＣ（登録商標）、ＯＰＴＩＢＬＡＮＣ（登録商標）２Ｍ／Ｇ、ＯＰＴＩＢＬＡＮＣ（登録商標）２ＭＧ／ＬＴ  Ｅｘｔｒａ、又はＯＰＴＩＢＬＡＮＣ（登録商標）Ｅｃｏｂｒｉｇｈｔ）。テトラナトリウムＳ，Ｓ−エチレンジアミン二コハク酸塩は、Ｉｎｎｏｓｐｅｃなどの供給元から得ることができる。テレフタレートコポリマーは、Ｃｌａｒｉａｎｔ（例えば、ＲＥＰＥＬＯＴＥＸ  ＳＦ  ２）から得ることができる。加えて、１−ヒドロキシエタン−１，１−ジホスホン酸は、Ｔｈｅｒｍｐｈｏｓから得ることができる。オキサジリジン系漂白増進剤は、式中、Ｒ１＝２−ブチルオクチルである以下の構造を有するものであり、米国特許第２００６／００８９２８４Ａ１号に従って製造される。
【０５００】
酵素、ＮＡＴＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ  ＰＬＵＳ（登録商標）、ＣＥＬＬＵＣＬＥＡＮ（登録商標）及びＭＡＮＮＡＷＡＹ（登録商標）は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓから得ることができる。フタロシアニンテトラスルホン酸亜鉛は、Ｃｉｂａ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから得ることができる（例えば、ＴＩＮＯＬＵＸ（登録商標）ＢＭＣ）。抑泡剤顆粒は、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇから得ることができる。これらの洗剤組成物において、ランダムグラフトコポリマーは、ポリエチレンオキシド主鎖と複数のポリビニルアセテート側鎖とを有する、ポリビニルアセテートグラフト化ポリエチレンオキシドコポリマーである。ポリエチレンオキシド主鎖の分子量は約６０００であり、ポリエチレンオキシドとポリビニルアセテートとの重量比は約４０：６０であり、５０個のエチレンオキシド単位当たりのグラフト点は１以下である。
【０５０１】
アッセイ及び試験方法
本実施例は、使用した様々なアッセイを記載し、更に試験方法４−６の詳細を提供する。
【０５０２】
９６ウェルマイクロタイタープレートでタンパク質含量を測定するためのＴＣＡアッセイ。
【０５０３】
ＧＧ３６及びＧＧ３６変異体に関し、このアッセイは、マイクロタイタープレートで、３７℃、加湿エアレーション下で、２５０ｒｐｍで振盪させながら２〜３日増殖させた、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ培養上清の、濾過物を用いて開始した。新しい９６ウェルの平底マイクロタイタープレート（ＭＴＰ、Ｃｏｓｔａｒ  ９０１７培地を透明なポリスチレンプレートと組み合わせた）をアッセイに使用した。最初に、１００μＬ／ウェルの０．２５Ｎ  ＨＣｌを各ウェルに配置した。次いで、濾過した培養上清を２０〜２５μＬ加え、溶液を卓上ミキサーで５〜１０秒混合した（例えば、Ｌａｂ  ｌｉｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、タイタープレート震盪機、４８２５型）。次いで「ブランク」読み取り値を得るために、４０５ｎｍで光散乱／吸光度を測定した。「試験」読み取りに関し、ＨＣｌと培養上清の混合物を含有している各ウェルに、１００μＬ／ウェルで３０％（重量／体積）トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を添加し、プレートを室温で１０分にわたってインキュベートした。卓上ミキサーで２、３秒未満で溶液を簡単に混合した後、４０５ｎｍで光散乱／吸光度を測定した。サンプルの濁度／光散乱は、培養上清中の沈殿可能な合計タンパク質の量に相関して増加する。「試験」読み取り値（ＴＣＡ添加後に上記のように得られた値）から、「ブランク」（ＴＣＡは添加せずにＨＣｌのみを添加した後に得られた値）読み取り値を減算することで計算を実施し、サンプル中のタンパク質含量の相対的特性を得た。必要に応じて、既知の変換係数を用い、クローンのＡＡＰＦアッセイにより、ＴＣＡ読み取り値を較正することで、検量線を生成させることができる。しかしながら、ＴＣＡ結果は、５０〜５００百万分率のタンパク質濃度（ｐｐｍ）（ここで、１ｐｐｍは１ｍｇ／Ｌに相当する）に対して直線であることから、所望の性能を有する変異体を選択するために、酵素性能に対して直接プロットすることができる。
【０５０４】
９６ウェルマイクロタイタープレートでのＡＡＰＦプロテアーゼアッセイ
セリンプロテアーゼ変異体のプロテアーゼ活性を測定するために、Ｎ−スクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−フェニル−ｐ−ニトロアニリド（ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ）の加水分解を計測した。使用した試薬溶液は、以下のものであった：０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０を含有している１００ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ  ８．６）（トリス希釈緩衝液）、１ｍＭ  ＣａＣｌ２及び０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０を含有している１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ  ８．６）（トリス／Ｃａ緩衝液）、並びに１６０ｍＭ  ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ／ＤＭＳＯ（ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ保存溶液）（Ｓｉｇｍａ：Ｓ−７３８８）。ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ希釈標準溶液を調製するために、１ｍＬのｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ原液を１００ｍＬのトリス／Ｃａ緩衝液に加え、少なくとも１０秒にわたってウェルを混合した。１０μＬの希釈プロテアーゼ溶液を９６ウェルＭＴＰの各ウェルに加え、直ちに１ｍｇ／ｍＬのｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ希釈標準溶液１９０μＬを加えてアッセイを実施した。溶液を５秒にわたって混合し、吸光度の変化を、２５℃にて、４０５ｎｍで、ＭＴＰリーダーの動的解析モードにより読み取りした（５分毎に２５回読み取り）。プロテアーゼ活性はＡＵとして表記される（活性＝ΔＯＤ・ｍｉｎ−１ｍＬ−１）。
【０５０５】
エグリンＣ阻害アッセイ
本明細書に記載のセリンプロテアーゼ濃度及び比活性を、エグリンｃと呼ばれる阻害剤による滴定で測定した。エグリンｃ（ｌｅｅｃｈ  Ｈｉｒｕｄｏ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ）は、サブチリシン及びＡＳＰプロテアーゼとの相互作用が強いタンパク質阻害剤であり（Ｈｅｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１：８７５５〜６６［１９９２］）、それゆえプロテアーゼ酵素濃度を測定するのに使用することができ、ひいては比活性の算出が可能になる。エグリンｃ遺伝子を合成し、標準法によりＥ．ｃｏｌｉで発現させた。特性及び阻害強度はＳｉｇｍａから購入したエグリンｃと同様であった。
【０５０６】
（ｉ）エグリンＣ原液の濃度測定
既知の比活性を有するＢａｃｉｌｌｕｓ  Ｌｅｎｔｕｓのサブチリシンサンプルを、１ｍＭのＣａＣｌ２及び０．００５％  ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０（トリス／Ｃａ緩衝液）を含有している１００ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ  ８．６）で、上記のＡＡＰＦプロテアーゼアッセイに適切な濃度に希釈した。トリス／Ｃａ緩衝液で、エグリンｃ原液の希釈物もいくつか調製した。各希釈エグリンｃ溶液のアリコートを、等量の、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｌｅｎｔｕｓの希釈サブチリシン溶液と混合した。エグリンｃの非存在下での、阻害されていないサブチリシンの活性を測定するために、エグリンｃを不含のトリス／Ｃａ緩衝液のみのアリコートも、等量の、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｌｅｎｔｕｓの希釈サブチリシン溶液と混合した。混合溶液を室温で１５〜３０分インキュベートし、次いで各サンプルのプロテアーゼ活性を上記のＡＡＰＦアッセイにより測定した。既知の比活性を有するＢａｃｉｌｌｕｓ  Ｌｅｎｔｕｓのサブチリシンを用いて、各サンプル中の活性プロテアーゼ濃度を測定した。次いで各サンプル中のエグリンｃ濃度を、トリス／Ｃａ緩衝液のみ（エグリンｃ不含）と混合した未阻害のサブチリシンサンプルと比較し、観察されるプロテアーゼ活性の減少度に基づいて算出した。したがって、希釈度及び容量が既知のエグリンｃ溶液を用い、原液中のエグリンｃの濃度を測定した。
【０５０７】
（ｉｉ）サブチリシン変異体の濃度及び比活性の測定
サブチリシン変異体サンプルを、１ｍＭのＣａＣｌ２及び０．００５％  ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０（トリス／Ｃａ緩衝液）を含有している１００ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ  ８．６）で希釈した。トリス／Ｃａ緩衝液で、既知の濃度のエグリンｃ原液の希釈物もいくつか調製した。各希釈エグリンｃ溶液のアリコートを、等量のサブチリシン変異体溶液と混合した。混合溶液を室温で１５〜３０分インキュベートし、次いで各サンプルのプロテアーゼ活性をＡＡＰＦアッセイにより測定した。各エグリンｃサンプル及び既知の濃度のエグリンｃの添加に基づくプロテアーゼ活性の減少を観察することで、各サブチリシン酵素変異体を完全に阻害するのに必要とされるエグリンｃ濃度を算出した。この濃度はサンプル中の酵素濃度と等価である。同様に、エグリンｃは不含の、トリス／Ｃａ緩衝液のみのアリコートを各サブチリシン変異体サンプルと混合し、エグリンｃの非存在下でのプロテアーゼ活性をＡＡＰＦアッセイにより測定した。次いでサブチリシン変異体の比活性を、上記のように測定した酵素濃度を用い算出した。
【０５０８】
試験方法４−６のＢＭＩマイクロスウォッチアッセイ
血液ミルク及びインク（ＢＭＩ）染色した、直径５．５ミリメートルの円形マイクロスウォッチ（ＥＭＰＡ  １１６）をＣＦＴから得た。一方法では、ＥＭＰＡ１１６  ＢＭＩ布を水で予めすすぎ、９６ウェルのマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３６４１）中に、１ウェルにつき１マイクロスウォッチ裁断する。第二の方法では、ＥＭＰＡ  １１６布を直接９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３６４１）に切り出し、次いでスウォッチを水で２度洗浄する。更に２００μＬのミリＱ水を各ウェル／スウォッチに加え、７に設定した卓上ミキサー（Ｌａｂ  ｌｉｎｅ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、タイタープレート震盪機、４８２５型）で１５分にわたって混合することですすぎを行った。洗浄液を除去し、スウォッチに再度２００μＬの水を加え、更に１５分すすぐ。洗浄水を除去し、次いでスウォッチをマイクロタイタープレートで風乾させる。
【０５０９】
洗剤組成物７〜１１（表１９−４）を、ミリＱ（脱イオン）水で、表１９−１に記載の最終的な使用濃度に希釈した。これらの洗剤を２ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ  １０．３）で緩衝化させた。更に、表１９−５に記載の最終濃度にするため、水硬度組成物（３：１  Ｃａ：Ｍｇ．−ＣａＣｌ２：ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）を各洗剤溶液に添加した。洗剤溶液を室温で０．５時間〜２時間にわたって混合し、５０ｍＬのポリプロピレンコニカルチューブで３０００×ｇで５〜１０分遠心し、３２℃アッセイのために室温で保持し、あるいは１６℃アッセイのために氷水浴で予め平衡化した。次いで、ＢＭＩマイクロスウォッチを含有しているＭＴＰの各ウェルに１９０μＬの所望の洗剤溶液を添加した。この混合物に、希釈した酵素の希釈母液を５〜１５μＬ加え、反応時酵素濃度をおよそ０．２５〜２μｇ／ｍＬに調整した。濾過した培養上清から、約２．５〜２０μｇ／ｍＬの酵素の希釈母液を調製した（上記のＴＣＡアッセイを参照されたい）。ＭＴＰをテープで封止し、冷蔵庫で予め１６℃に設定したｉＥＭＳ恒温器／振盪機（Ｔｈｅｒｍｏ／Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）に１４００ｒｐｍで撹拌しながら３０分間配置し、あるいは卓上に３２℃にて１４００ｒｐｍで撹拌しながら３０分間配置した。適切な条件下でインキュベートした後、各ウェルから溶液を１２０〜１２５μＬずつ新しいＭＴＰ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ９０１７）に移した。１２５μＬの溶液／ウェルを含有させた新しいＭＴＰを、ＭＴＰ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘリーダーを用い、６００ｎｍで（５秒混合モードのプレートリーダーにより）読み取りした。ブランク対照はマイクロスウォッチ及び洗剤は含有したが、酵素は含有しなかった。得られた吸光度値をブランク値（酵素を除く基質）について補正し、加水分解活性を測定した。各サンプル（変異体）に関し、性能指数を算出した。性能指数は、同様のタンパク質濃度下で変異体性能（実測値）と標準酵素性能（理論値）とを比較する。加えて、理論値は、標準プロテアーゼの性能投与応答曲線（performance dose response curve）のパラメーターを用いて算出することができる。性能指数（ＰＩ）が１超（ＰＩ＞１）の場合は、標準（例えば、野生型）と比較して、変異体がより良好なものであることが特定され、一方でＰＩが１（ＰＩ＝１）である場合は、変異体が標準と同様に機能することが特定され、及びＰＩが１未満（ＰＩ＜１）の場合は、変異体の働きが標準よりも悪いことが特定される。したがって、ＰＩは優れたプロテアーゼを特定し、並びに特定の状況下での使用が望ましくない変異体を特定する。
【０５１０】
【表４１】
0005882904.tif 000090
【０５１１】
ＬＡＳ／ＥＤＴＡ安定性アッセイ
代表的なアニオン性界面活性剤（ＬＡＳ＝直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、ドデシルベンゼン硫酸ナトリウムＤＯＢＳ）及びＥＤＴＡ二ナトリウムの存在下でのプロテアーゼ変異体の安定性を、所定の条件下でのインキュベーション後に測定し、かつ上記ＡＡＰＦアッセイを用いて残効性を測定した。試薬は、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩（ＤＯＢＳ，Ｓｉｇｍａ  Ｎｏ．Ｄ−２５２５）、ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０（Ｓｉｇｍａ  Ｎｏ．Ｐ−８０７４）、ＥＤＴＡ二ナトリウム（Ｓｉｅｇｆｒｉｅｄ  Ｈａｎｄｅｌ  Ｎｏ．１６４５９９−０２）、ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｎｏ．Ｈ−７５２３）、未負荷緩衝液：５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（１１．９ｇ／Ｌ）＋０．００５％  ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０（ｐＨ  ８．０）、負荷緩衝液：５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（１１．９ｇ／Ｌ）、０．１％（ｗ／ｖ）ＤＯＢＳ（１ｇ／Ｌ）、１０ｍＭのＥＤＴＡ（３．３６ｇ／Ｌ）（ｐＨ  ８．０）、参照プロテアーゼ及びプロテアーゼ変異体培養上清（２００〜４００μｇ／ｍＬのタンパク質を含有）を使用した。装置は、希釈プレートとしてＶ又はＵ底ＭＴＰ（それぞれＧｒｅｉｎｅｒ  ６５１１０１及び６５０１６１）、未負荷及びＬＡＳ／ＥＤＴＡ緩衝液用平底ＭＴＰ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ９０１７）、並びにｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡプレート、Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４ＭＴＰリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、ｉＥＭＳ恒温器／振盪機（１ｍｍ振幅）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、及び封止テープ：Ｎｕｎｃ（２３６３６６）を使用した。
【０５１２】
ｉＥＭＳ恒温器／振盪機（Ｔｈｅｒｍｏ／Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）は２９℃に設定する。培養上清を、未負荷緩衝液を含有しているプレートで約２５ｐｐｍ濃度に希釈した（マスター希釈プレート）。アッセイのため、マスター希釈プレートから、２０μＬのサンプルを、１８０μＬの未負荷緩衝液を含有しているプレートに加え、最終インキュベーション濃度２．５ｐｐｍを得た。含有物を混合し、室温で維持し、このプレートでＡＡＰＦアッセイを実施した。加えて、マスター希釈プレートから、２０μＬのサンプルを、１８０μＬ負荷緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（１１．９ｇ／Ｌ）、０．１％（ｗ／ｖ）ＤＯＢＳ（１ｇ／Ｌ）、１０ｍＭのＥＤＴＡ（３．３６ｇ／Ｌ）（ｐＨ  ８．０））を含有しているプレートに加えた。溶液を混合し、直ちに、２９℃、４００ｒｐｍのｉＥＭＳ震盪機に３０分間配置した。３０分インキュベーションした後、ＡＡＰＦアッセイを負荷プレートで実施した。次のように残留及び開始ＡＡＰＦ比を算出することにより、サンプルの安定性を測定した：残効性（％）＝［ｍＯＤ．ｍｉｎ−１ストレス負荷］＊１００／［ｍＯＤ．ｍｉｎ−１ストレス未負荷］。
【０５１３】
最終的な洗剤、水硬度及び緩衝液濃度は、使用したアッセイ系に基づいて決定した（例えば、北アメリカ、日本、西ヨーロッパ又は中央ヨーロッパ条件）。いくつかの態様では、プロテアーゼ変異体の染み除去性能は、市販の洗剤で判定される。市販の洗剤配合物の加熱不活性化は、任意のタンパク質成分の酵素活性を破壊しつつ、非酵素成分の特性は保持させる。したがって、この方法は、本発明の酵素変異体の試験に使用するために、市販の洗剤を準備するのに好適である。
【０５１４】
卵を焼付けたマイクロタイターアッセイ
このアッセイに関し、９６ウェルの焼いた卵黄基材プレートを鶏卵黄から調製する。鶏卵黄を白身から取り分け、膜嚢から出し、ミリＱ水で２０％（体積／重量）に希釈した。希釈した黄身を、電磁撹拌器を用い室温で１５分にわたって撹拌する。８チャンネルのピペットを用い、９６ウェルのＶ底プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ＃３８９４）の各ウェルの中央に、注意深く５μＬずつ分取する。プレートを９０℃で１時間にわたって焼付け、室温に放冷する。卵黄基材を焼き付けたプレートを室温で保管し、準備の一週間以内に使用した。食洗機用の洗剤を本明細書に記載のように調製し、５０℃に予熱する。８チャンネルのピペットを用い、洗剤の１９０μＬのアリコートを９６ウェルプレートの各ウェルに加える。９６チャンネルのピペット装置を用い、希釈酵素を各ウェルに１０μＬ加える。接着箔シーラーによりプレートを注意深く封止し、５０℃で３０分にわたって振盪した。１２０μＬの反応混合物を新しい９６ウェル平底プレートに移し、４０５ｎｍで吸光度／光散乱を測定した。４０５ｎｍでの吸光度／光散乱は、卵黄除去性に比例する。
【０５１５】
性能指数
性能指数は、同様のタンパク質濃度下で変異体性能（実測値）と標準酵素性能（理論値）とを比較する。加えて、理論値は、標準プロテアーゼの性能投与応答曲線のパラメーターを用いて算出することができる。以下に示される様々な用語は変異体を記載するために使用される：有害でない変異体はＰＩ＞０．０５であり、有害な変異体はＰＩ＝０．０５であり、組み合わせ可能な変異体は少なくとも１つの特性について性能指数が０．２以上であり、かつすべての特性について＞０．０５である変異体である。組み合わせ可能な変異体は、１つ以上の所望の特性について適切な性能インデックスを有する送達タンパク質と組み合わせることができる。これらのデータは、任意のサブチリシン／サブチラーゼを設計するために使用される。サブチラーゼが、特定の位置でサブチリシンＧＧ３６と異なるアミノ酸を有するように設計された場合でさえも、これらのデータは、ＧＧ３６野生型のアミノ酸の置換を含む最良の置換の選択を特定することにより、所望の特性を変更する置換を発見するのに使用される。
【０５１６】
（実施例２０）
部位評価ライブラリ（ＳＥＬ）を用いるＧＧ３６単独変異体の生成
本実施例に記載のＧＧ３６  ＳＥＬの構築は、その適切な方法、並びに遺伝子最適化、遺伝子合成、ライブラリ作成、及び解析のための技術基盤を用いＧＥＮＥＡＲＴにより実施された（国際公開第２００４／０５９５５６（Ａ３）号、欧州特許番号第０  ２００  ３６２号及び同第０  ２０１  １８４号、並びに米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号及び同第６，４７２，１８４号）。ＧＧ３６ＳＥＬは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ発現プラスミドｐＨＰＬＴ−ＧＧ３６（図６を参照）を用い、本発明者らにより予め選択された位置で作成した。このＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの発現プラスミドは、以下に示すＧＧ３６発現カセットを含有するものである：Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのＬＡＴプロモーター（Ｐｌａｔ）、並びにレプリカーゼ遺伝子（ｒｅｐｐＵＢ）、ネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）及びブレオマイシン耐性マーカー（ｂｌｅｏ）が挙げられる、ｐＵＢ１１０由来の更なる要素（ＭｃＫｅｎｚｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ，１５：９３〜１０３，１９８６）（米国特許第６，５６６，１１２号、図４を参照）。ｐＨＰＬＴ−ＧＧ３６プラスミドマップを図６に提供する。ＧＧ３６発現カセット配列は以下に提供されるものである。
【０５１７】
ＧＧ３６のＤＮＡ配列（シグナル配列は小文字で示され、プロペプチドは下線の引かれている小文字で示され、及びＧＧ３６成熟配列は大文字で示される）は以下に提供されるものである：
［配列表３］
0005882904.tif 000091
【０５１８】
ＧＧ３６のタンパク質配列（シグナル配列は小文字で示され、プロペプチドは下線の引かれている小文字で示され、及びＧＧ３６成熟プロテアーゼ配列は大文字で示される）は以下に提供されるものである：
［配列表４］
0005882904.tif 000092
【０５１９】
変異導入の方法は、対象とする部位に縮重コドン、ＮＮＳ（（Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧ）、（Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧ）、（Ｃ又はＧ））を含有する順方向及び逆方向変異原性プライマーを用い、対象とする特定のコドンにすべての可能なアミノ酸置換を同時に生成する、コドン特異的な変異法に基づくものであった。各ＧＧ３６ＳＥＬを構築するために、３種のＰＣＲ反応を実施した：２種の変異導入反応（一次ＰＣＲ１及びＰＣＲ２）では、ＮＮＳ順方向及び逆方向変異原性プライマー（２５〜４５ヌクレオチド長）を用い、成熟ＧＧ３６ＤＮＡ配列中に対象とする成熟コドンを導入し、第３の反応では２つの変異導入ＰＣＲ産物を一緒に融合させて、成熟ＧＧ３６配列中に所望の変異コドンを有するｐＨＰＬＴ−ＧＧ３６発現ベクターを構築する。
【０５２０】
本実施例で使用されるプライマー配列は以下に提供されるものである：
【表４２】
0005882904.tif 000093
【０５２１】
すべてのＰＣＲにＰｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓカタログ番号Ｆ−５３０Ｌ）を使用し、ポリメラーゼを供給している製造元のプロトコルに従い実施した。具体的には、一次ＰＣＲ１では、１μＬ（１０μＭ）の各ｐＨＰＬＴ−ＢｇｌＩＩ−Ｆｗプライマー及びＮＮＳ逆方向変異原性プライマーを使用し、一次ＰＣＲ２では、１μＬ（１０μＭ）のｐＨＰＬＴ−ＢｇｌＩＩ−Ｒｖプライマー及びＮＮＳ順方向変異導入プライマーを使用した。また、各反応には、１μＬのｐＨＰＬＴ−ＧＧ３６プラスミドテンプレートＤＮＡ（０．１〜１ｎｇ／μＬ）を含んだ。ＰＣＲには、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＰＴＣ−２００  Ｐｅｌｔｉｅｒ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒを使用した。この反応は、対象とするＧＧ３６コドンを包囲しておよそ３０ヌクレオチドが重複している、およそ２〜３ｋｂのフラグメントを２種生成した。得られたフラグメントを、１μＬの一次ＰＣＲ１反応混合物、１μＬの一次ＰＣＲ２反応混合物、及び１μＬ（１０μＭ）の各順方向及び逆方向ＳａｃＩ−Ｆｗ及びＨｉｎｄＩＩＩ−Ｒｖプライマーを用い、上記のものと同様の第３ＰＣＲで融合させた。ＧＧ３６変異体遺伝子をコードしている、増幅させた線状の８５９ｂｐのフラグメントを精製し（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを用いた）、ＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩＩ制限酵素で消化して融合フラグメントの両端に接着端を作製した。ＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩＩで消化した後に、約５０ｎｇのプラスミドｐＨＰＬＴ−ＧＧ３６も精製し、３．９ｋｂのベクター主鎖フラグメントを得た。接着端をクローニングするための製造元のプロトコルに従い、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、消化したベクターフラグメントを、酵素変異体をコードしている消化した８５９ｂｐのフラグメント５０ｎｇとライゲーションした。続いて、ライゲーション混合物を使用してＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞を国際公開第２００２／０１４４９０号に記載のように形質転換した（ΔａｐｒＥ，ΔｎｐｒＥ，ｏｐｐＡ，ΔｓｐｏＩＩＥ，ｄｅｇＵＨｙ３２，ΔａｍｙＥ：：［ｘｙｌＲ，ｐｘｙｌＡ−ｃｏｍＫ］）。
【０５２２】
更なる生化学的解析のために変異体タンパク質を発現させるべく、ＧＧ３６変異体プラスミドを保持しているＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株を、１０μｇ／ｍＬのネオマイシンを添加した１５０μＬのルリアブロス培地を含有しているマイクロタイタープレートに接種した。マイクロタイタープレートにＥｎｚｙｓｃｒｅｅｎ  ｌｉｄ（Ｅｎｚｙｓｃｒｅｅｎ）を用い、プレートを３７℃、８０％湿度にて、３００ｒｐｍで振盪させながら一晩増殖させた。１０μｇ／ｍＬのネオマイシンを添加した１９０μＬのＭＢＤ培地（ＭＯＰＳ系合成培地）を含有している新しいマイクロタイタープレートに、一晩培養プレートを１０マイクロリットル接種した。ＮＨ４Ｃｌ、ＦｅＳＯ４、及びＣａＣｌ２を基本培地から除外したこと、３ｍＭのＫ２ＨＰＯ４を用いたこと、並びに、６０ｍＭの尿素、及び、２１０ｇ／Ｌのグルコースと３５０ｇ／Ｌマルトデキストリンとから作製した１００ｍＬの溶液を含有させたこと、を除き、ＭＢＤ培地は本質的に当該技術分野において既知であるように調製した（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１９：７３６〜７４７［１９７４］を参照されたい）。微量栄養素は、４００ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５０ｍｇのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＮａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ、１０ｍＬの１ＭのＣａＣｌ２、及び１０ｍＬの０．５Ｍのクエン酸ナトリウムを含有している、１リットルの１００Ｘ原液からなっていた。タンパク質発現を決定するために、Ｅｎｚｙｓｃｒｅｅｎ  ｌｉｄｓ（Ｅｎｚｙｓｃｒｅｅｎ）を用いて、ＭＢＤ培地を含有しているマイクロタイタープレートで、３７℃、８０％湿度にて、３００ｒｐｍで、６８時間にわたって増殖させた。翌日、培養物をマイクロフィルタプレート（０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過し、得られた濾液を生化学的解析に使用した。洗剤組成物７〜１１のＴＣＡ及びＢＭＩマイクロスウォッチアッセイを、実施例１９に記載のように実施した。性能指数も、実施例１９に詳細に記載されるように、試験方法４〜６のＢＭＩアッセイに記載のように算出した。性能指数は、表２０−２中でＧＧ３６と比較して示される。以降の表中で、洗剤組成物は、上記表１９−４に示されるものと対応する。同様に、記載のように、アミノ酸位置はＢＰＮ’の番号付けに対応させて列挙される。
【０５２３】
【表４３−１】
0005882904.tif 000094
【０５２４】
【表４３−２】
0005882904.tif 000095
【０５２５】
【表４３−３】
0005882904.tif 000096
【０５２６】
【表４３−４】
0005882904.tif 000097
【０５２７】
【表４３−５】
0005882904.tif 000098
【０５２８】
【表４３−６】
0005882904.tif 000099
【０５２９】
【表４３−７】
0005882904.tif 000100
【０５３０】
【表４３−８】
0005882904.tif 000101
【０５３１】
【表４３−９】
0005882904.tif 000102
【０５３２】
【表４４】
0005882904.tif 000103
【０５３３】
【表４５】
0005882904.tif 000104
【０５３４】
（実施例２１）
ＧＧ３６変異体のＮＨＪ１及びＷＣＥ１のセットの構築及びクリーニング性能
本明細書に記載の、上記のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ発現プラスミドｐＨＰＬＴ−ＧＧ３６（図６）を用い、ＧＧ３６変異体のＮＨＪ１及びＷＣＥ１セットをＤＮＡ２．０により構築した。変異体を実施例２０に記載のようにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞で発現させ（遺伝子型：ΔａｐｒＥ，ΔｎｐｒＥ，ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ−ｐｈｌｅｏ）、かつ更に、タンパク質含量を測定するためのＴＣＡアッセイ、ＬＡＳ／ＥＤＴＡ安定性アッセイ、及び実施例１９に記載のようなＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイを用いて特徴付けした。結果を表２１−１及び２１−２に示す。以降の表中で、洗剤組成物は、上記表１９−４に示されるものと対応する。同様に、記載のように、アミノ酸位置はＢＰＮ’の番号付けに対応させて列挙される。
【０５３５】
【表４６−１】
0005882904.tif 000105
【０５３６】
【表４６−２】
0005882904.tif 000106
【０５３７】
【表４７−１】
0005882904.tif 000107
【０５３８】
【表４７−２】
0005882904.tif 000108
【０５３９】
（実施例２２）
ＧＧ３６変異体のＮＨＪ４セットの構築及びクリーニング性能
下表２２−１に記載のＧＧ３６変異体のＮＨＪ４セットを、以下に記載するように、融合ＰＣＲ又はＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）多部位特異的変異キット（「ＱＣＭＳキット」、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用し、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ発現プラスミドｐＨＰＬＴ−ＧＧ３６（図６）を用い構築した。
【０５４０】
ａ）ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）多部位特異的変異誘導による、ＮＨＪ４変異体の構築
ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）多部位特異的変異誘導を用いて生成した変異体を表２２−１に示す。製造元からの取扱説明書に従って、２マイクログラムのＤＮＡ及びＤａｍメチラーゼ（ＮＥＢ）を用い、親プラスミドｐＨＰＬＴ−ＧＧ３６（テンプレートＤＮＡ）をメチル化した。部位特異的な変異体を、製造元のプロトコルに従って、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）多部位特異的変異誘導キット（「ＱＣＭＳキット」、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により作成した。次の変異：Ｓ１０１Ａ−Ｓ１０３Ｇ−Ｖ１０４Ｌ、Ｇ１５９Ｅ、Ｔ２２Ａ、Ｙ２０９Ｅ、Ｅ２７１Ｆ、Ｓ１０１Ａ、Ｓ１０３Ｇ、Ｌ１１１Ｖ、Ｓ１２８Ｎ、Ｎ６２Ｅ、及びＳ１８８Ｄを親プラスミドに導入した。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓを効率的に形質転換するため、Ｉｌｌｕｓｔｒａ  Ｔｅｍｐｌｉｐｈｉキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、ローリング・サークル型増幅（ＲＣＡ）によりＱＣＭＳ反応混合物からＤＮＡを増幅させ、製造元のプロトコルに従い反応を実施した。１マイクロリットルの、１０倍希釈した増幅ＤＮＡを使用して、コンピテントなＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞（遺伝子型：ΔａｐｒＥ，ΔｎｐｒＥ，ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ−ｐｈｌｅｏ）５０μＬを形質転換させた。形質転換混合物を３７℃にて１時間にわたって振盪した。形質転換混合物の１０マイクロリットルアリコートを、１０μｇ／ｍＬのネオマイシン（Ｔｅｋｎｏｖａ）を添加したスキムミルク（１．６％）Ｌｕｒｉａ寒天プレートに蒔いた。続いて、プラスミドＤＮＡを抽出するため（ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎミニプレップキット、Ｑｉａｇｅｎ）、ハローを生じたコロニーを１０μｇ／ｍＬのネオマイシンを含有している１２０μＬのＬＢ培地に接種した。抽出したプラスミドを、配列決定して、所望の変異が存在しているか確認した。
【０５４１】
ｂ）伸長ＰＣＲによるＮＨＪ４変異体の構築
伸長ＰＣＲにより、ＧＧ３６のコンビナトリアルな変異体を１０種作成した。ｐＨＰＬＴプラスミドに含有させたＧＧ３６遺伝子に導入した変異の一覧は、Ｔ２２Ａ、Ｎ６２Ｅ、Ｓ１０３Ｇ、Ｓ１０３Ｇ−Ｌ１１１Ｖ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ、Ｓ１０１Ａ−Ｓ１０３Ｇ−Ｖ１０４Ｌ、Ｓ１０１Ａ、Ｓ１２８Ｎ、Ｇ１５９Ｄ、Ｇ１５９Ｅ、Ｙ２０９Ｅ、及びＬ１１１Ｖである。各変異を生成するために、変異原性プライマー並びに順方向及び逆方向プライマーを用い、所望の変異を含有しているＰＣＲフラグメントを増幅させることでＧＧ３６変異体全体を増幅させた。各ＰＣＲ増幅反応物には、３０ｐｍｏｌの各変異原性プライマー及び１００ｎｇのＤＮＡテンプレート、ｐＨＰＬＴ−ＧＧ３６プラスミドを含有させた。増幅はＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いて実施した。ＰＣＲ反応（２０μＬ）は、まず始めに９５℃で２．５分加熱した後、続いて９４℃で１５秒の変性、５５℃で１５秒のアニーリング、及び７２℃で２分の伸長を３０サイクル行った。増幅させた後、各変異体につき２〜４種のＰＣＲフラグメントをＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ゲルバンド精製用キットを用いゲルから精製し、混合した（各フラグメントにつき５０ｎｇ）。これらの混合物は、完全長の遺伝子フラグメントを生成するための伸長ＰＣＲ用のＤＮＡテンプレートとして用いた。伸長工程を７２℃で２分にわたって実施したことを除き、ＰＣＲ条件は上記の条件と同様のものであった。完全長のＤＮＡフラグメントをＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ゲルバンド精製用キットを用いてゲルから精製し、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、同様の制限酵素で消化したｐＨＰＬＴ−ＧＧ３６でライゲーションした。Ｉｌｌｕｓｔｒａ  Ｔｅｍｐｌｉｐｈｉキットでローリング・サークル型増幅法を用い、１マイクロリットルのライゲーション混合物を製造元（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）からの取扱説明書に従って増幅させることで、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓに形質転換させるための多量体ＤＮＡを生成した。ローリング・サークル型増幅産物を１００倍希釈し、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞の形質転換に用いた（遺伝子型：ΔａｐｒＥ，ΔｎｐｒＥ，ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ−ｐｈｌｅｏ）。形質転換混合物のアリコートを、１．６％のスキムミルク及び１０μｇ／ｍＬのネオマイシンを含有しているＬＢプレートに蒔き、３７℃で一晩インキュベートした。続いて、ハローを生じたコロニーを、プラスミドＤＮＡを抽出するため（ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎミニプレップキット、Ｑｉａｇｅｎ）１０μｇ／ｍＬのネオマイシンを含有している１２０μＬのルリアブロス培地に接種した。抽出したプラスミドを、配列決定して、所望の変異が存在しているか確認した。表２２−１に示される伸長ＰＣＲによる変異体生成。
【０５４２】
更なる生化学的解析のためにＮＨＪ４セットの変異体タンパク質を発現させるべく、変異体プラスミドを保持しているＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株を、１０μｇ／ｍＬのネオマイシンを添加した１５０μＬのルリアブロス培地を含有しているマイクロタイタープレートに接種した。実施例２０に記載のようにタンパク質を発現させるために培養物を増殖させ、培養物を実施例２０に記載のようにマイクロタイタープレート（０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過した。得られた濾液を生化学的解析に使用した。様々な洗剤で試験した、タンパク質含量を測定するためのエグリンｃ阻害アッセイ及びＢＭＩマイクロスウォッチアッセイを、実施例１９に記載されるように実施した。同様に、実施例１９に更に詳細が記載される、試験方法４〜６に記載のＢＭＩアッセイ下で記載されるように、性能指数を算出する。表２２−１は、これらの多重変異体に関する情報、及びこれらに関し得られる結果を提供する。ＰＩ値はＧＧ３６に対するものである。以降の表中で、洗剤組成物は、上記表１９−４に示されるものと対応する。同様に、記載のように、アミノ酸位置はＢＰＮ’の番号付けに対応させて列挙される。
【０５４３】
【表４８】
0005882904.tif 000109
【０５４４】
（実施例２３）
ＧＧ３６変異体のＮＨＪ３セットの構築及びクリーニング性能
本明細書に記載の変異体のＮＨＪ３セットは、次の変異：Ｓ１０１Ｇ、Ｓ１０３Ａ、Ｖ１０４Ｉ、Ｇ１５９Ｄ、Ａ２３２Ｖ、Ｑ２３６Ｈ、Ｑ２４５Ｒ、Ｎ２４８Ｄ、及びＮ２５２Ｋ（ＢＰＮ’番号付け）、を含有しているＧＧ３６の変異体（ＧＧ３６−９として参照）に基づくものである。これらの変異は、ＤＮＡテンプレートとしてｐＲＡ６８プラスミド（図７を参照）を使用し、部位特異的な変異導入キットＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ（ＱＣＬＤＳキット、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いることで生成した。プラスミドｐＲＡ６８は、ｐＢＮ３ベクター（Ｂａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：１１７〜１２４［１９９８］を参照）から誘導した。
【０５４５】
ＧＧ３６−９変異体のＤＮＡ配列（シグナル配列は小文字で示され、プロペプチドは下線の引かれている小文字で示され、及びＧＧ３６−９成熟配列は大文字で示される）は以下に提供されるものである：
［配列表５］
0005882904.tif 000110
【０５４６】
ＧＧ３６−９変異体のタンパク質配列（シグナル配列は小文字で示され、プロペプチドは下線の引かれている小文字で示され、及びＧＧ３６−９成熟プロテアーゼ配列は大文字で示される）は以下に提供されるものである：
［配列表６］
0005882904.tif 000111
【０５４７】
ＱＣＬＳＤキットを用いてＮＨＪ３変異体を生成するために、製造元のプロトコルに従い、各変異体用に変異原性プライマーを設計した。各変異体のための変異導入反応物は次のもの、０．５μＬの１０Ｘ緩衝液、０．５μＬのｐＲＡ６８プラスミドＤＮＡ（１６８ｎｇ／μＬ）、０．５μＬの順方向変異原性プライマー（２５μＭ）、０．５μＬの逆方向変異原性プライマー（２５μＭ）、１μＬのｄＮＴＰ（ＱＣＬＳＤキットに供給）、１．５ｕＬのＱｕｉｋ溶液（ＱＣＬＭＳキットに供給）、１μＬの酵素ブレンド（ＱＣＬＳＤキットに供給）、及び４０μＬの滅菌脱イオン水からなっており、製造元の取扱説明書の通りに反応用量５０μＬになるよう作製した。サイクルプログラムは次の通りであった：９５℃で２分を１サイクル、９５℃で２０秒、６０℃で１０秒及び６８℃で３分２２秒を１８サイクル、並びに６８℃で５分間の最終サイクルであった。次に、キットに供給されている１μＬのＤｐｎＩ制限酵素を使用して反応物中のプラスミドＤＮＡを切断し、次に２μＬの反応物を使用して上位１０位のＥ．ｃｏｌｉコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換した。３７℃で一晩増殖させた後、５０μｇ／ｍＬ（ｐｐｍ）カルベニシリンを含有しているルリアブロス培地プレート上でＥ．ｃｏｌｉ形質転換体を選択した。ＱＩＡｐｒｅｐ  ｓｐｉｎミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、５０μｇ／ｍＬ（ｐｐｍ）カルベニシリンを含有しているＬＡ培地で増殖させた４〜８個のＥ．ｃｏｌｉコロニーからプラスミドＤＮＡを抽出した。プラスミドを配列決定して、所望の変異が存在しているか確認した。次いで実施例２０に記載のようにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞を変異体プラスミドで形質転換した。エグリンｃ阻害アッセイ（実施例１９）及びＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイ（試験方法４〜６，実施例１９）を用いタンパク質含量を決定するなどといった、更なる生化学的解析を行うため、実施例２０に記載のようにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ変異体株を増殖させた。結果を下表２３−１及び２３−２に提供する。ＰＩはＧＧ３６に対する値である。以降の表中で、洗剤組成物は、上記表１９−４に示されるものと対応する。同様に、記載のように、アミノ酸位置はＢＰＮ’の番号付けに対応させて列挙される。
【０５４８】
【表４９】
0005882904.tif 000112
【０５４９】
【表５０】
0005882904.tif 000113
【０５５０】
（実施例２４）
ＧＧ３６変異体のＮＨＪ５セットの構築及びクリーニング性能
本明細書に記載の変異体のＮＨＪ５セットは、次の変異：Ｓ１０１Ｇ、Ｓ１０３Ａ、Ｖ１０４Ｉ、Ｇ１５９Ｄ、Ａ２３２Ｖ、Ｑ２４５Ｒ、Ｎ２４８Ｄ（ＢＰＮ’番号付け）、を含有しているＧＧ３６の変異体（ＧＧ３６−７として参照）に基づくものである。ｐＲＡ９６プラスミド（図８を参照）をＤＮＡテンプレートとして使用し、部位特異的な変異導入キットＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ（ＱＣＬＭＳキット）を用いることで、これらの変異を生成した。導入した変異には：Ｈ２４３Ｒ（Ｈ２４９Ｒ）、Ｅ２６５Ｆ（Ｅ２７１Ｆ）、Ｄ１５７Ｅ（Ｄ１５９Ｅ）、Ａ１５６Ｅ（Ａ１５８Ｅ）、Ａ１５６Ｅ−Ｄ１５７Ｇ（Ａ１５８Ｅ−Ｄ１５９Ｅ）、Ｔ２２Ａ、Ｎ６０Ｅ（Ｎ６２Ｅ）、Ｎ２３２Ｒ（Ｎ２３８Ｒ）、Ｄ２４２Ｒ（Ｄ２４８Ｒ）、Ｔ２４７Ｒ（Ｔ２５３Ｒ）、Ｓ２４Ｒ、Ｎ７４Ｄ（Ｎ７６Ｄ）が挙げられる（ＧＧ３６番号付け及びＢＰＮ’番号付けを括弧付して示す）。
【０５５１】
変異は実施例２３に記載の方法を用いて生成した。エグリンｃ阻害アッセイ（実施例１９）及びＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイ（実施例１９）を用いタンパク質含量を決定するなどといった、更なる生化学的解析を行うため、実施例２０に記載のようにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ変異体株を増殖させた。結果を下表２４−１に提供する。ＰＩ値はＧＧ３６に対するものである。以降の表中で、洗剤組成物は、上記表１９−４に示されるものと対応する。同様に、記載のように、アミノ酸位置はＢＰＮ’の番号付けに対応させて列挙される。
【０５５２】
ＧＧ３６−７変異体のＤＮＡ配列（シグナル配列は小文字で示され、プロペプチドは下線の引かれている小文字で示され、及びＧＧ３６−７成熟配列は大文字で示される）は以下に提供されるものである：
［配列表７］
0005882904.tif 000114
【０５５３】
ＧＧ３６−７変異体のタンパク質配列（シグナル配列は小文字で示され、プロペプチドは下線の引かれている小文字で示され、及びＧＧ３６−７成熟配列は大文字で示される）は以下に提供されるものである：
［配列表８］
0005882904.tif 000115
【０５５４】
【表５１】
0005882904.tif 000116
【０５５５】
（実施例２５）
ＮＨＪ２コンビナトリアルライブラリの構築
本実施例は、次の変異：Ａ１６Ｓ、Ｔ２２Ａ、Ｓ１０１Ａ、Ｓ１０３Ｇ、Ｖ１０４Ｌ、Ｌ１１１Ｖ、Ｓ１２８Ｎ、及びＬ１４８Ｉ（ＢＰＮ’番号付け）を１つ以上包含するＧＧ３６コンビナトリアルライブラリの構築を記載する。ＮＨＪ２コンビナトリアルライブラリの作成のため、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ発現プラスミドｐＨＰＬＴ−ＧＧ３６をＤＮＡ２．０Ｉｎｃ．に提供した。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株（遺伝子型：ΔａｐｒＥ，ΔｎｐｒＥ，ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ−ｐｈｌｅｏ）で形質転換するために、構築済みのＮＨＪ２ライブラリのライゲーション反応物が、ＤＮＡ２．０，Ｉｎｃ．から提供された。生成された、本明細書に記載の１つ又は複数の変異を含有している変異体を、本明細書に記載の方法及び洗剤組成物を用い、冷水クリーニング適用について試験する。
【０５５６】
（実施例２６）
更なるライブラリ及びＧＧ３６変異体の構築
次の変異セット：Ａ１Ｒ、Ａ２３０Ｅ、Ｅ２７１Ｌ、Ｇ１１５Ｒ、Ｇ２０Ｒ、Ｈ２４９Ｒ、Ｋ２３５Ｆ、Ｋ２７Ｖ／Ｆ／Ｌ、Ｌ７５Ｅ、Ｌ８２Ｒ、Ｎ１８Ｒ、Ｎ２６９Ｒ、Ｎ４３Ｄ、Ｎ４３Ｒ、Ｎ７６Ｄ、Ｒ４５Ｔ、Ｓ２１２Ｆ、Ｓ２４２Ｒ、Ｓ２４Ｒ、Ｓ７８Ｒ、Ｓ９Ａ、Ｔ２２Ｒ、Ｖ１２１Ｅ、Ｖ２４４Ｒ、Ｖ２８Ｅ、Ｖ３０Ｅ、Ｖ４Ｒ、Ｗ２４１Ｒ（ＢＰＮ’番号付け）を用い、更なるライブラリ及び変異体を構築する。生成された、これらの変異を１つ以上含有している変異体を、本明細書に記載の方法及び洗剤組成物を用い、冷水クリーニング適用について試験する。
【０５５７】
更にＧＧ３６変異セットを構築し、本明細書に記載の方法及び洗剤組成物を用い、冷水クリーニング適用について試験する：Ｇ２０Ｒ−Ｎ４３Ｒ−Ｈ２４９Ｒ、Ｇ２０Ｒ−Ｔ２２Ｒ−Ｎ４３Ｒ、Ｇ２０Ｒ−Ｎ４３Ｒ−Ｓ２４２Ｒ、Ｇ２０Ｒ−Ｎ４３Ｒ−Ｅ２７１Ｌ、Ｇ２０Ｒ−Ｎ４３Ｒ−Ｖ２４４Ｒ、Ｇ２０Ｒ−Ｓ２４Ｒ−Ｎ４３Ｒ−Ｓ２４２Ｒ、Ｓ９Ａ−Ｔ２２Ｒ−Ｓ７８Ｒ−Ｓ２１２Ｆ−Ｗ２４１Ｒ、Ｓ９Ａ−Ｇ２０Ｒ−Ｎ４３Ｒ−Ｓ２１２Ｆ、Ｓ９Ａ−Ｎ４３Ｒ−Ｓ２１２Ｆ、Ｇ２０Ｒ−Ｎ４３Ｒ−Ｓ２１２Ｆ、Ｇ２０Ｒ−Ｔ２２Ｒ−Ｎ４３Ｒ−Ｓ２１２Ｆ、Ｓ２４Ｒ−Ｓ７８Ｒ−Ｓ２１２Ｆ、Ｓ９Ａ−Ｎ４３Ｒ−Ｓ７８Ｒ、Ｓ９Ａ−Ｎ４３Ｒ−Ｓ７８Ｒ−Ｓ２４２Ｒ、Ｓ９Ａ−Ｇ２０Ｒ−Ｎ４３Ｒ−Ｓ７８Ｒ、Ｇ２０Ｒ−Ｓ２４Ｒ−Ｎ４３Ｒ−Ｓ７８Ｒ−Ｓ２４２Ｒ、Ｔ２２Ｒ−Ｓ２４Ｒ−Ｓ７８Ｒ−Ｓ２１２Ｆ、Ｓ９Ａ−Ｇ２０Ｒ−Ｎ４３Ｒ−Ｓ７８Ｒ−Ｓ２４２Ｒ、Ｇ２０Ｒ−Ｎ４３Ｒ−Ｓ７８Ｒ−Ｈ２４９Ｒ、Ｇ２０Ｒ−Ｎ４３Ｒ−Ｓ７８Ｒ、Ｓ９Ａ−Ｓ７８Ｒ−Ｓ２１２Ｆ、Ｓ９Ａ−Ｔ２２Ｒ−Ｎ４３Ｒ−Ｓ７８Ｒ、Ｓ９Ａ−Ｇ２０Ｒ−Ｓ２４Ｒ−Ｎ４３Ｒ、Ｓ９Ａ−Ｔ２２Ｒ−Ｓ７８Ｒ−Ｓ２１２Ｆ、Ｖ４Ｒ−Ｓ９Ａ−Ｔ２２Ｒ−Ｓ７８Ｒ−Ｓ２１２Ｆ、Ｇ２０Ｒ−Ｓ２４Ｒ−Ｎ４３Ｒ、Ａ１Ｒ−Ｓ９Ａ−Ｎ４３Ｒ、Ｇ２０Ｒ−Ｓ２４Ｒ−Ｎ４３Ｒ−Ｇ１１５Ｒ、Ｓ９Ａ−Ｓ２４Ｒ−Ｎ４３Ｒ、Ｇ２０Ｒ−Ｔ２２Ｒ−Ｓ２４Ｒ−Ｎ４３Ｒ、Ａ１Ｒ−Ｓ２４Ｒ−Ｎ４３Ｒ、Ｓ９Ａ−Ｇ２０Ｒ−Ｓ２４Ｒ−Ｎ４３Ｒ−Ｓ２４２Ｒ、Ｓ９Ａ−Ｇ２０Ｒ−Ｔ２２Ｒ−Ｓ７８Ｒ−Ｓ２１２Ｆ、Ｓ９Ａ−Ｓ２４Ｒ−Ｎ４３Ｒ−Ｖ２４４Ｒ、Ｓ９Ａ−Ｓ２４Ｒ−Ｎ４３Ｒ−Ｓ２４２Ｒ、Ｖ４Ｒ−Ｓ９Ａ−Ｔ２２Ｒ−Ｓ２４Ｒ−Ｓ２１２Ｆ及びＴ２２Ｒ−Ｓ２４Ｒ−Ｎ４３Ｒ（ＢＰＮ’番号付け）。
【０５５８】
（実施例２７）
ＧＧ３６ライブラリＷＣＥ２の構築及びクリーニング性能
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ発現プラスミドｐＨＰＬＴ−ＧＧ３６を用い、ＤＮＡ  ２．０，Ｉｎｃ．によりＷＣＥ２コンビナトリアルライブラリを生成した。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株（遺伝子型：ΔａｐｒＥ，ΔｎｐｒＥ，ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ−ｐｈｌｅｏ）で形質転換するために、構築済みＷＣＥ２ライブラリのライゲーション反応物が、ＤＮＡ２．０，Ｉｎｃ．から提供された。ＷＣＥ２ライブラリの生成に使用される変異セットは、Ａ２３０Ｅ、Ｇ２０Ｒ、Ｈ２４９Ｒ、Ｎ１８Ｒ、Ｎ４３Ｒ／Ｄ、Ｎ７６Ｄ、Ｒ４５Ｔ、Ｓ２４２Ｒ、及びＳ２４Ｒ（ＢＰＮ’番号付け）である。生成された、これらの変異を１つ以上含有している変異体を、本明細書に記載の方法及び洗剤組成物を用い、冷水クリーニング適用について試験する。
【０５５９】
（実施例２８）
ＧＧ３６変異体のＷＣＥ３セットの構築及びクリーニング性能
本実施例は、ＧＧ３６変異体、ＧＧ３６−７（実施例２３）及びＧＧ３６−９（実施例２２）に基づく変異のＷＣＥ３セットを記載する。これらの変異体は：Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ｇ１５９Ｒ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｄ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ｇ１５９Ｄ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｒ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｒ、Ｓ１０１Ｇ−Ｓ１０３Ａ−Ｖ１０４Ｉ−Ｇ１５９Ｒ−Ａ２３２Ｖ−Ｑ２４５Ｒ−Ｎ２４８Ｒ、及びＳ１０１Ｇ、Ｓ１０３Ａ、Ｖ１０４Ｉ、Ａ２３２Ｖ、Ｑ２３６Ｈ、Ｑ２４５Ｒ、及びＮ２５２Ｋである。実施例２３に記載のように、ＤＮＡテンプレートとしてｐＲＡ９６プラスミドを使用し、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ多部位特異的変異誘導キット（ＱＣＬＭＳキット、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いることで、これらの変異体を生成した。生成した変異体は、本案件に記載の方法及び洗剤組成物を用い、冷水クリーニング適用について試験することになる。
【０５６０】
（実施例２９）
ＧＧ３６の更なるライブラリ及び変異体の構築
本実施例は、ＧＧ３６変異体の構築、及びＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ発現プラスミド（例えば、ｐＨＰＬＴ−ＧＧ３６、図６）を用い、次の変異：Ａ１６Ｓ、Ｔ２２Ａ、Ｓ２４Ｒ、Ｎ６２Ｅ、Ｎ７６Ｄ、Ｅ８９Ｐ、Ｓ１０１Ａ／Ｇ、Ｓ１０３Ｇ／Ａ、Ｖ１０４Ｌ／Ｉ、Ｌ１１１Ｖ、Ｓ１２８Ｎ、Ｐ１２９Ｅ、Ａ２３２Ｖ、Ｌ１４８Ｉ、Ａ１５８Ｅ、Ｇ１５９Ｄ／Ｅ、Ｓ１６６Ｄ、Ｒ１８６Ｈ、Ｓ１８８Ｄ、Ｙ２０９Ｅ、Ｑ２３６Ｈ、Ｎ２３８Ｒ、Ｑ２４５Ｒ、Ｎ２４８Ｄ／Ｒ、Ｈ２４９Ｒ、Ｎ２５２Ｋ／Ｒ、Ｔ２５３Ｒ、Ｅ２７１Ｆ（ＢＰＮ’番号付け）、を１つ以上使用するライブラリを記載する。生成された、これらの変異を１つ以上含有している変異体を、本明細書に記載の方法及び洗剤組成物を用い、冷水クリーニング適用について試験する。
【０５６１】
（実施例３０）
ＧＧ３６の更なるライブラリ及び変異体の構築
本実施뻤꾁胣Ꞽ볯鎼볯覤闧鎽迥뎁곦꺁ꓥ낕볯ꊼ볯꺼胢ꪕ迥颻臣覼苣醼臣ꖻ룤ꢔ臣讂볯躼뷯閽뷯钽뷯貽뷯鎽菣ꒂ菣ꦃ菣꺁꟦覯臣ꒁ臣ꚁ꣨覼臣讂볯ꆼ볯늼胣놼볯뎼胣놼볯궼胣놼볯ꆼ胣놼볯늼胣놼볯랼胣뎼볯늼胣뚼볯늼胣뚼볯뎼胣뚼볯ꎼ胣ꦼ볯ꆼ胣뎼볯ꆼ胣뎼볯ꚼ胣뎼볯랼胣늼볯邼볯膀볯醼볯ꆼ胣늼볯邼볯膀볯醼볯궼胣놼볯銼볯膀볯醼볯늼胣낼볯钼볯膀볯醼볯ꚼ胣낼볯钼볯膀볯醼볯늼胣ꆼ볯閼볯膀볯醼볯뎼胣ꢼ볯鞼볯膀볯醼볯궼胣ꢼ볯鞼볯膀볯醼볯늼胣꺼볯颼볯膀볯銼볯ꚼ胣Ꞽ볯邼볯膀볯銼볯늼胣뒼볯銼볯膀볯銼볯늼胣뒼볯銼볯膀볯銼볯뚼胣뒼볯銼볯膀볯銼볯겼胣뒼볯銼볯膀볯銼볯ꆼ胣Ꞽ볯鎼볯膀볯銼볯ꚼ胣뎼볯钼볯膀볯銼볯ꚼ胣뎼볯钼볯膀볯銼볯놼胣뎼볯钼볯膀볯銼볯겼胣Ꞽ볯閼볯膀볯銼볯ꚼ胣Ꞽ볯閼볯膀볯銼볯ꚼ胣ꮼ볯鞼볯膀볯銼볯ꚼ胣ꮼ볯鞼볯膀볯銼볯뚼胣뚼볯颼볯膀볯銼볯꺼胣뚼볯颼볯膀볯銼볯뒼胣뚼볯邼볯膀볯鎼볯ꚼ胣뒼볯鎼볯膀볯鎼볯Ꞽ胣뒼볯鎼볯膀볯鎼볯낼胣ꦼ볯閼볯膀볯鎼볯뒼胣뎼볯隼볯膀볯鎼볯늼胣뒼볯颼볯膀볯鎼볯ꚼ胣뒼볯颼볯膀볯钼볯꺼胣낼볯邼볯膀볯钼볯뒼胣낼볯邼볯膀볯钼볯ꢼ胣낼볯邼볯膀볯钼볯ꦼ胣꺼볯鎼볯膀볯钼볯ꚼ胣꺼볯鎼볯膀볯钼볯뎼胣꺼볯鎼볯膀볯钼볯궼胣꺼볯鎼볯膀볯钼볯꒼胣늼볯閼볯膀볯钼볯늼胣ꆼ볯颼볯膀볯閼볯ꎼ胣뚼볯醼볯膀볯閼볯ꚼ胣뚼볯醼볯膀볯閼볯ꚼ胣낼볯銼볯膀볯閼볯꺼胣낼볯閼볯膀볯閼볯늼胣놼볯馼볯膀볯閼볯ꚼ胣놼볯馼볯膀볯隼볯낼胣꒼볯邼볯膀볯隼볯ꆼ胣꺼볯銼볯膀볯隼볯놼胣Ꞽ볯鎼볯膀볯隼볯궼胣Ꞽ볯鎼볯膀볯隼볯ꦼ胣Ꞽ볯鎼볯膀볯隼볯뎼胣Ꞽ볯鎼볯膀볯隼볯놼胣Ꞽ볯鎼볯膀볯隼볯ꖼ胣Ꞽ볯鎼볯膀볯隼볯ꚼ胣ꢼ볯钼볯膀볯隼볯ꆼ胣뚼볯颼볯膀볯隼볯꺼胣ꆼ볯馼볯膀볯隼볯낼胣ꆼ볯馼볯膀볯鞼볯Ꞽ胣ꦼ볯銼볯膀볯鞼볯ꎼ胣겼볯閼볯膀볯鞼볯ꚼ胣겼볯閼볯膀볯鞼볯늼胣꺼볯隼볯膀볯鞼볯늼胣뎼볯颼볯膀볯鞼볯ꦼ胣ꦼ볯馼볯膀볯鞼볯놼胣뚼볯醼볯膀볯颼볯ꚼ胣겼볯銼볯膀볯颼볯뚼胣겼볯銼볯膀볯颼볯궼胣ꆼ볯閼볯膀볯颼볯랼胣낼볯隼볯膀볯颼볯ꦼ胣ꖼ볯馼볯膀볯颼볯뒼胣ꖼ볯馼볯膀볯颼볯ꢼ胣ꖼ볯馼볯膀볯颼볯뚼胣ꖼ볯馼볯膀볯颼볯ꚼ胣ꖼ볯馼볯膀볯馼볯꺼胣림볯醼볯膀볯馼볯ꚼ胣ꮼ볯钼볯膀볯馼볯ꚼ胣뎼볯馼볯膀볯馼볯낼胣뎼볯馼볯膀볯馼볯궼胣Ꞽ볯邼볯뎼胣Ꞽ볯邼볯꺼胣Ꞽ볯邼볯놼胣Ꞽ볯邼볯ꦼ胣뎼볯邼볯ꆼ胣뎼볯邼볯꺼胣뎼볯邼볯Ꞽ胣뎼볯邼볯뒼胣뎼볯邼볯꒼胣뎼볯邼볯ꖼ胣뎼볯邼볯낼胣뎼볯邼볯ꚼ胣Ꞽ볯邼볯ꆼ胣Ꞽ볯邼볯뒼胣Ꞽ볯邼볯꺼胣Ꞽ볯邼볯ꢼ胣Ꞽ볯邼볯ꖼ胣뎼볯邼볯Ꞽ胣뎼볯邼볯꺼胣뎼볯邼볯꒼胣뎼볯邼볯ꆼ胣뚼볯邼볯겼胣뚼볯邼볯ꦼ胣뚼볯邼볯ꖼ胣뚼볯邼볯꒼胣뎼볯邼볯뒼胣뎼볯邼볯ꖼ胣뎼볯邼볯놼胣뎼볯邼볯Ꞽ胣뎼볯邼볯뒼胣뎼볯邼볯ꖼ胣뎼볯邼볯꒼胣뎼볯邼볯ꆼ胣뎼볯邼볯뚼胣뎼볯邼볯ꚼ胣ꦼ볯邼볯궼胣ꦼ볯邼볯ꚼ胣ꆼ볯邼볯ꦼ胣ꆼ볯邼볯Ꞽ胣놼볯邼볯궼胣겼볯醼볯뚼胣겼볯醼볯ꦼ胣ꖼ볯醼볯뚼胣ꖼ볯醼볯겼胣ꖼ볯醼볯놼胣ꆼ볯醼볯Ꞽ胣Ꞽ볯醼볯ꮼ胣Ꞽ볯醼볯늼胣꺼볯醼볯ꮼ胣꺼볯醼볯ꆼ胣꺼볯醼볯겼胣꺼볯醼볯ꚼ胣Ꞽ볯醼볯늼胣Ꞽ볯醼볯ꦼ胣궼볯醼볯ꎼ胣ꢼ볯銼볯ꆼ胣ꢼ볯銼볯ꚼ胣ꢼ볯銼볯늼胣뚼볯銼볯ꚼ胣뚼볯銼볯ꖼ胣꺼볯銼볯Ꞽ胣꺼볯銼볯ꖼ胣겼볯銼볯뎼胣뎼볯銼볯꒼胣뎼볯銼볯ꚼ胣뎼볯銼볯겼胣뎼볯銼볯꺼胣뎼볯銼볯ꢼ胣뎼볯銼볯궼胣뎼볯銼볯ꦼ胣뎼볯銼볯놼胣낼볯銼볯ꖼ胣뎼볯鎼볯ꆼ胣뎼볯鎼볯ꖼ胣ꆼ볯鎼볯Ꞽ胣뎼볯钼볯늼胣뚼볯钼볯겼胣겼볯钼볯ꦼ胣ꆼ볯閼볯ꖼ胣Ꞽ볯閼볯꒼胣Ꞽ볯閼볯ꖼ胣Ꞽ볯閼볯ꎼ胣뎼볯隼볯꒼胣뎼볯隼볯꒼胣뎼볯隼볯ꖼ胣림볯隼볯랼胣궼볯鞼볯뚼胣뚼볯鞼볯ꎼ胣꒼볯颼볯ꆼ胣놼볯颼볯늼胣꺼볯颼볯ꦼ胣꺼볯颼볯꒼胣꺼볯颼볯궼胣꺼볯颼볯ꚼ胣꺼볯颼볯늼胣꺼볯颼볯ꖼ胣꺼볯颼볯뚼胣꺼볯颼볯ꦼ胣늼볯颼볯ꢼ胣늼볯颼볯ꮼ胣뎼볯颼볯ꖼ胣뎼볯颼볯꒼胣뎼볯颼볯늼胣림볯馼볯ꢼ胣림볯馼볯랼胣ꆼ볯馼볯ꖼ胣ꆼ볯馼볯뚼胣ꆼ볯馼볯ꚼ胣꒼볯馼볯ꚼ胣ꦼ볯馼볯겼胣ꦼ볯馼볯ꚼ胣뚼볯邼볯ꖼ胣뚼볯邼볯ꎼ胣뒼볯邼볯뎼胣림볯邼볯뎼胣림볯邼볯꺼胣림볯邼볯ꚼ胣림볯邼볯뒼胣림볯邼볯ꖼ胣림볯邼볯ꢼ胣림볯邼볯Ꞽ胣림볯邼볯겼胣낼볯醼볯늼胣낼볯醼볯뚼胣낼볯醼볯겼胣Ꞽ볯醼볯놼胣Ꞽ볯醼볯늼胣뎼볯醼볯ꦼ胣뎼볯醼볯궼胣뎼볯醼볯ꚼ胣뒼볯醼볯ꆼ胣림볯醼볯ꚼ胣ꆼ볯醼볯꺼胣ꆼ볯醼볯꒼胣ꆼ볯醼볯ꖼ胣ꆼ볯醼볯ꢼ胣ꆼ볯醼볯ꚼ胣뎼볯醼볯ꚼ胣뎼볯醼볯ꆼ胣겼볯醼볯ꖼ胣겼볯醼볯꺼胣겼볯醼볯꒼胣꺼볯醼볯꒼胣꺼볯醼볯낼胣꺼볯醼볯ꖼ胣뒼볯銼볯ꆼ胣뒼볯銼볯Ꞽ胣뚼볯銼볯ꦼ胣ꆼ볯鎼볯ꖼ胣ꆼ볯鎼볯ꦼ胣ꆼ볯鎼볯ꎼ胣ꆼ볯鎼볯뚼胣겼볯鎼볯ꎼ胣뚼볯鎼볯ꚼ胣ꮼ볯鎼볯ꚼ胣놼볯鎼볯ꚼ胣놼볯鎼볯꺼胣놼볯鎼볯ꢼ胣꺼볯鎼볯늼胣꺼볯鎼볯ꮼ胣꺼볯鎼볯겼胣낼볯鎼볯ꮼ胣낼볯鎼볯Ꞽ胣낼볯鎼볯늼胣낼볯鎼볯ꢼ胣낼볯鎼볯뒼胣낼볯鎼볯꺼胣낼볯鎼볯뎼胣낼볯鎼볯ꚼ胣뎼볯钼볯늼胣랼볯钼볯늼胣뎼볯钼볯겼胣뎼볯钼볯늼胣꺼볯钼볯ꚼ胣꺼볯钼볯늼胣뚼볯钼볯늼胣놼볯钼볯늼胣ꦼ볯钼볯뎼胣꺼볯钼볯꒼胣꺼볯钼볯뚼胣꺼볯钼볯ꦼ胣꺼볯钼볯늼胣ꢼ볯钼볯늼胣ꢼ볯钼볯뒼胣겼볯閼볯ꦼ胣ꮼ볯閼볯늼胣ꮼ볯閼볯뎼胣꺼볯閼볯ꦼ胣꺼볯閼볯ꚼ胣꺼볯閼볯늼胣꺼볯閼볯ꮼ胣꺼볯閼볯ꢼ胣뒼볯閼볯ꦼ胣뒼볯閼볯늼胣뒼볯閼볯ꚼ胣ꆼ볯閼볯ꎼ胣뎼볯閼볯꺼胣Ꞽ볯閼볯늼胣뒼볯隼볯뚼胣뒼볯隼볯ꦼ胣겼볯隼볯꒼胣겼볯隼볯ꢼ胣림볯隼볯ꚼ胣뎼볯隼볯ꚼ胣겼볯隼볯뚼胣겼볯隼볯꺼胣겼볯隼볯궼胣꺼볯隼볯ꦼ胣꺼볯隼볯늼胣ꆼ볯鞼볯ꎼ胣ꖼ볯鞼볯ꦼ胣ꖼ볯鞼볯뚼胣ꖼ볯鞼볯ꢼ胣ꖼ볯鞼볯궼胣ꖼ볯鞼볯겼胣ꖼ볯鞼볯낼胣ꖼ볯鞼볯ꆼ胣ꖼ볯鞼볯ꚼ胣ꖼ볯鞼볯뒼胣ꆼ볯鞼볯ꚼ胣ꆼ볯鞼볯ꚼ胣ꆼ볯鞼볯늼胣ꆼ볯鞼볯ꚼ胣ꆼ볯鞼볯ꦼ胣誏臣뒼볯鞼볯Ꞽ胣龔裦閁苣龁胣鎁苣覂臣覤闧銂볯ꒁ믤誸郥覜臣ꚁ臣讂ꓥ낕뷤銂胣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣릖돦誏臣鞴觥蒵裦ꦉ苣ꢔ臣膀蛥뒰苣ꪃ菣讃菣낂臩ꢔ臣ꒁ臣ꚁꧨ鎨臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†볯龮雦设볯醼볯㲉牢ਾ†볯隼蓢袼볯邼볯覼臣꺁볯궼볯릂苣ꦂ菣膃볯ꚩ꣩릖돦銼볯ꮁ꿥馁苣꾂菣벃菣뎃苣Ꞁ菨ꊂ菣뮂苣㲤牢ਾ†菣궃菣ꊂ菣벂ꓥ낕뷤꺁鿦뾁駩뮎胦붃臣芸단꺁듦ꒉ臣겸껥鞁臣袼裥钀꣨覼臣ꪁ臣邙苣覼胣芸단꺁듦ꒉ藩袐觧꺁諥놆룤뮴胦隌臣膀믤辄臣뾂菣醃苣ꪳ裦蚈臣떅듧뮴胦銂ꃧ誣臣ꒁ臣膀鷩떅듧邈裥꺁觧Ꞁ臣鶿賦閁臣讂胣鞁臣貁臣ꚁ胣鎁臣릖돦꾁胣겜駧躘臣꺁藩ꂴꓥ낕뷤꺁ꧨ鎨臣뾽铧馁苣龁苣ꮁ胣芸단꺁듦ꒉ苣隺若馁苣꺁臣붥臩ꞁ臣ꎁ臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣邼볯隼볯醀⼼䥄㹖 麃苣꾂菣릂苣ꦂ菣膃볯㲚牢ਾ†볯ꚼ볯袼볯貽뷯膽뷯蒽뷯躽뷯薽뷯貼볯袽뷯₅꺼뷯钽뷯薽뷯貽뷯躽뷯鎽볯ꮁ鯧蒾볯躼볯钼뷯趽볯醼볯钼胢覼臣蚆뷥麃苣꾂菣릂苣ꦂ菣膃苣몙돦鞁胣鞾臣芀볯骞迥꾁볯骞臣麃苣꾂菣릂苣ꦂ菣膃苣膀ꇨꊝꧧꢅ뷤銂鯦늜臣鮁苣龁苣ꮁ볯隼苣Ꞃ菣궼볯낼臣蒐苣Ꞃ菣ꮁ黥뒛臣超뷧鞁臣袼臣ꪁ苣ꆁ胣Ꚃ苣ꮃ臣閺臣뎹苣ꮁ藩꺽臣讂臣ꢁ臣ꪁ臣ꎁ臣覼胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†볯궼볯麃苣꾂菣릂苣ꦂ菣膃苣莃苣ꒂ戼㹲 股뛦龃菣꾂迥뎁苣뎃苣銂郥覜臣ꚁ臣讂鯧蒾볯躼볯钼뷯趽볯邼볯銼볯ꒂ菣膃볯꺁蛥ꊽ菣ꒂ苣궃苣Ꚃ苣莃菣袼볯궼볯覼苣ꎼ볯뒼臣覂뻥龁胣릂苣ꦂ菣膃苣螈苣ꂁ臣趉臣膀룥난볯ꖼ볯낼볯₡醼볯隼볯銂냦ꞁ듦蒵臣龁胣ꢡ鷩趩藥鎽苣鶛鳩閁臣讂臣膂臣膀볯骞臣麃苣꾂菣릂苣ꦂ菣膃苣膀볯隼苣Ꞃ菣麃苣꾂菣뾂苣뾂菣鞃菣벃菣袼믤趙볯뒼볯ꢁ臣ꚁ迥ꞅ볯꺁郥Ꚃ苣ꮃ臣芞鯧ꮁ藩꺽臣龁볯馁臣辂臣膀苣Ꞃ菣꺁뫥ꮁ맥覂臣超뷧馁苣鎁臣꾁臣讁臣龁볯芀鳦躘듧뢛臣風볨꺁触鮜臣鞴觥뚺뛦銂ꫨ붣臣龁胣銼볯莄臣ꚁ볯袽뷯銽뷯辽뷯覽뷯薽뷯ꞁ맥ꆡ賥閁臣龁뻥膀볯馼볯캐겼臣鞴觥뚺뛦銂胣麃苣꾂菣릂苣ꦂ菣膃苣ꮐ鳦鞁臣蒁苣궼볯낼臣蒐苣Ꞃ菣ꮁ럦ꂊ臣龁胣鎁臣랷郥ꦉ臣膀鳦芵藩ꂴ뿦ꚺ臣醼볎뷯込뷯겼볯뒼볯ꆼ苣莃苣ꒂ臣袂苣겸껥覼臣ꪁ苣袂臣ꮁ胣醼볯캐겼臣貸蟩떅듧뚺뛦銂럦ꂊ臣龁胣궼볯낼苣蚃菣鞃臣膰귦鞁胣醼볯邼볯銽뷯趽臣릒详鞁臣貁苣鎼볯蚈雩銁룦ꢙ臣超뷧鞁臣芀臩螈臣ꆝ믤许臣ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁뻥膀郥Ꚃ苣ꮃ臣覂뫦늶苣醼볯邼볎볯骁臣낖臣蒁볯뒼볯ꮁ꟧鞁臣芀볯뒼볯₰뎼뷯薽뷯钽뷯膽볯膽뷯ꪃ菣肃菣銂铧蒁胣醼볯邼볎볯꺁뫦늶볯Ꚃ苣ꮃ苣ꮐ鳦鞁臣蒁苣낖臣蒁볯뒼볯銂胣钼볯閼뷯趽臣궪臣随苣鞁臣芀菣ꦃ菣꾂꿥ꞅ胣ꚸ臣ꮁ볯骞臣麃苣꾂菣릂苣ꦂ菣膃迥뎁듦ꒉ苣ꮐ鳦鞁臣蒁苣貁藩ꂴ臣趸郥꺁꿥ꞅ苣薌郥閁臣龁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯閼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†胣趉듦蒵胣릂苣ꦂ菣膃戼㹲 鎁臣꺨ꇩ꺁菣ꒂ苣궃苣Ꚃ苣莃菣꾁胣ꢑ鯥ꦸ뫥ꞁ胣놄苣ꪂ菣뒰臣袂苣銼볯蚈臣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