(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミュータントインターロイキン-２（ＩＬ-２）ポリペプチドであって、高親和性ＩＬ-２受容体に対する前記ミュータントＩＬ-２ポリペプチドの親和性を無効にするか又は低減し、中間親和性ＩＬ-２受容体に対する前記ミュータントＩＬ-２ポリペプチドの親和性を保つ(各々、野生型ＩＬ-２ポリペプチドと比較)少なくとも３つのアミノ酸変異を含んでなり、前記少なくとも３つのアミノ酸変異がヒトＩＬ-２（配列番号：１）の残基４２、４５、及び７２に対応する位置にあり、且つ
ヒトＩＬ-２の残基７２に対応する位置にある前記アミノ酸変異がアミノ酸置換Ｌ７２Ｇであり、ヒトＩＬ-２の残基４２に対応する位置にある前記アミノ酸変異がアミノ酸置換Ｆ４２Ａであり、ヒトＩＬ-２の残基４５に対応する位置にある前記アミノ酸変異がアミノ酸置換Ｙ４５Ａである、ミュータントＩＬ-２ポリペプチド。
【請求項２】
ヒトＩＬ-２の残基３に対応する位置でＩＬ-２のＯ-糖鎖付加部位を除去するアミノ酸変異を更に含んでなる、請求項１に記載のミュータントＩＬ-２ポリペプチド。
【請求項３】
ヒトＩＬ-２の残基３に対応する位置でＩＬ-２のＯ-糖鎖付加部位を除去する前記アミノ酸変異が、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｇ、Ｔ３Ｑ、Ｔ３Ｅ、Ｔ３Ｎ、Ｔ３Ｄ、Ｔ３Ｒ、Ｔ３Ｋ、及びＴ３Ｐからなる群から選択されるアミノ酸置換である、請求項２に記載のミュータントＩＬ-２ポリペプチド。
【請求項４】
ヒトＩＬ-２の残基３に対応する位置でＩＬ-２のＯ-糖鎖付加部位を除去する前記アミノ酸変異が、アミノ酸置換Ｔ３Ａである、請求項２又は３に記載のミュータントＩＬ-２ポリペプチド。
【請求項５】
ヒトＩＬ-２の残基１２５に対応する位置にあるアミノ酸変異を更に含んでなる、請求項１から４の何れか一項に記載のミュータントＩＬ-２ポリペプチド。
【請求項６】
更なるアミノ酸変異がアミノ酸置換Ｃ１２５Ａである、請求項５に記載のミュータントＩＬ-２ポリペプチド。
【請求項７】
ヒトＩＬ-２分子である、請求項１から６の何れか一項に記載のミュータントＩＬ-２ポリペプチド。
【請求項８】
前記ミュータントＩＬ-２ポリペプチドが配列番号：１９の配列を含む、請求項１から７の何れか一項に記載のミュータントＩＬ-２ポリペプチド。
【請求項９】
前記ミュータントＩＬ-２ポリペプチドが非ＩＬ-２部分に連結される、請求項１から８の何れか一項に記載のミュータントＩＬ-２ポリペプチド。
【請求項１０】
前記ミュータントＩＬ-２ポリペプチドが第一非ＩＬ-２部分及び第二非ＩＬ-２部分に連結される、請求項１から９の何れか一項に記載のミュータントＩＬ-２ポリペプチド。
【請求項１１】
前記ミュータントＩＬ-２ポリペプチドが、前記第一非ＩＬ-２部分とカルボキシ末端ペプチド結合を、前記第二非ＩＬ-２部分とアミノ末端ペプチド結合を共有する、請求項１０に記載のミュータントＩＬ-２ポリペプチド。
【請求項１２】
前記非ＩＬ-２部分が抗原結合部分である、請求項９から１１の何れか一項に記載のミュータントＩＬ-２ポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１から８の何れか一項に記載のミュータントＩＬ-２ポリペプチド、及び抗原結合部分を含んでなる、イムノコンジュゲート。
【請求項１４】
前記ミュータントＩＬ-２ポリペプチドが、前記抗原結合部分とアミノ-又はカルボキシ-末端ペプチド結合を共有する、請求項１３に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１５】
前記イムノコンジュゲートが第一及び第二抗原結合部分を含む、請求項１３又は１４に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１６】
前記ミュータントＩＬ-２ポリペプチドが前記第一抗原結合部分とアミノ-又はカルボキシ-末端ペプチド結合を共有し、前記第二抗原結合部分がｉ)前記ミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はｉｉ)前記第一抗原結合部分とアミノ-又はカルボキシ-末端ペプチド結合を共有する、請求項１５に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１７】
前記抗原結合部分が抗体又は抗体断片である、請求項１２に記載のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又は請求項１３から１６の何れか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１８】
前記抗原結合部分がＦａｂ分子及びｓｃＦｖ分子から選択される、請求項１２に記載のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又は請求項１３から１６の何れか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１９】
前記抗原結合部分が免疫グロブリン分子、特にＩｇＧ分子である、請求項１２に記載のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又は請求項１３から１６の何れか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２０】
前記抗原結合部分が腫瘍細胞上又は腫瘍細胞環境中に提示される抗原を指向する、請求項１２に記載のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又は請求項１３から１９の何れか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２１】
請求項１から２０の何れか一項に記載のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートをコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２２】
請求項２１に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、発現ベクター。
【請求項２３】
請求項２１に記載のポリヌクレオチド又は請求項２２に記載の発現ベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項２４】
ミュータントＩＬ-２ポリペプチド、又はそのイムノコンジュゲートを生産する方法であって、ミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの発現に適した条件下で請求項２３に記載の宿主細胞を培養することを含んでなり、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドが高親和性ＩＬ-２受容体に対する前記ミュータントＩＬ-２ポリペプチドの親和性を無効にするか又は低減し、中間親和性ＩＬ-２受容体に対する前記ミュータントＩＬ-２ポリペプチドの親和性を保つ(各々、野生型ＩＬ-２ポリペプチドと比較)少なくとも３つのアミノ酸変異を含んでなり、前記少なくとも３つのアミノ酸変異がヒトＩＬ-２（配列番号：１）の残基４２、４５、及び７２に対応する位置にあり、且つヒトＩＬ-２の残基７２に対応する位置にある前記アミノ酸変異がアミノ酸置換Ｌ７２Ｇであり、ヒトＩＬ-２の残基４２に対応する位置にある前記アミノ酸変異がアミノ酸置換Ｆ４２Ａであり、ヒトＩＬ-２の残基４５に対応する位置にある前記アミノ酸変異がアミノ酸置換Ｙ４５Ａである、方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法によって生産される、ミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲート。
【請求項２６】
請求項１から２０又は２５の何れか一項に記載のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲート、及び薬学的に許容可能な担体を含んでなる、薬学的組成物。
【請求項２７】
それを必要としている個体における疾患の治療における使用のための請求項１から２０又は２５の何れか一項に記載のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲート。
【請求項２８】
前記疾患が癌である、請求項２７に記載のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲート。
【請求項２９】
それを必要としている個体における疾患の治療のための医薬の製造のための請求項１から２０又は２５の何れか一項に記載のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの使用。
【請求項３０】
薬学的に許容可能な形態における請求項１から２０又は２５の何れか一項に記載のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを含む治療的に有効な量の組成物を含んでなる、個体における疾患の治療のための医薬。
【請求項３１】
前記疾患が癌である、請求項３０に記載の医薬。
【請求項３２】
薬学的に許容可能な形態における請求項１から２０又は２５の何れか一項に記載のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを含む有効量の組成物を含んでなる、個体の免疫系を刺激するための医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(発明の分野)
本発明は一般的にミュータントインターロイキン-２ポリペプチドに関する。より具体的には、発明は、免疫療法剤としての使用のための改善された特性を呈するミュータントＩＬ-２ポリペプチドに関する。加えて、発明は、前記ミュータントＩＬ-２ポリペプチドを含んでなるイムノコンジュゲート、ミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートをコードするポリヌクレオチド分子、及びこのようなポリヌクレオチド分子を含んでなるベクター及び宿主細胞に関する。発明は更に、ミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲート、それを含んでなる薬学的組成物を生産する方法、及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ-細胞増殖因子(ＴＣＧＦ)としても知られるインターロイキン-２(ＩＬ-２)は、リンパ球生成、生存及びホメオスタシスにおいて中心的役割を果たす１５．５ｋＤａの球状糖タンパク質である。それは１３３アミノ酸の長さを有し、その機能に不可欠な四次構造を形成する４つの逆平行両親媒性α-ヘリックスから成る(Smith, Science 240, 1169-76 (1988); Bazan, Science 257, 410-413 (1992))。異なる種からのＩＬ-２の配列は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ０００５７７(ヒト)、ＮＰ０３２３９２(マウス)、ＮＰ４４６２８８(ラット)又はＮＰ５１７４２５(チンパンジー)の下で見られる。
【０００３】
ＩＬ-２はＩＬ-２受容体(ＩＬ-２Ｒ)への結合によってその活性を伝え、受容体は最高で３つの個々のサブユニットから成り、その異なる会合は、ＩＬ-２に対するそれらの親和性において異なる受容体形態を生成しうる。α(ＣＤ２５)、β(ＣＤ１２２)、及びγ(γｃ、ＣＤ１３２)サブユニットの会合は、ＩＬ-２の三量体高親和性受容体を生じる。β及びγ-サブユニットから成る二量体ＩＬ-２受容体は、中間親和性ＩＬ-２Ｒと呼ばれる。α-サブユニットは単量体低親和性ＩＬ-２受容体を形成する。二量体中間親和性ＩＬ-２受容体は三量体高親和性受容体よりおよそ１００-倍低い親和性でＩＬ-２に結合するが、二量体及び三量体ＩＬ-２受容体変異体の双方とも、ＩＬ-２結合によってシグナルを伝達できる(Minami等, Annu Rev Immunol 11, 245-268 (1993))。このように、α-サブユニット、ＣＤ２５はＩＬ-２シグナル伝達に必須ではない。それはその受容体への高親和性結合を与えるが、βサブユニット、ＣＤ１２２、及びγ-サブユニットがシグナル伝達に決定的である(Krieg等, Proc Natl Acad Sci 107, 11906-11 (2010))。ＣＤ２５を含む三量体ＩＬ-２受容体は、(休止)ＣＤ４＋フォークヘッドボックスＰ３(ＦｏｘＰ３)＋制御性Ｔ(Ｔｒｅｇ)細胞によって発現される。それらはまた一般的な活性化Ｔ-細胞上に一過性に誘導されるが、静止状態ではこれらの細胞は二量体ＩＬ-２受容体のみを発現する。Ｔｒｅｇ細胞は一貫してインビボにおいて最高レベルのＣＤ２５を発現する(Fontenot等, Nature Immunol 6, 1142-51 (2005))。
【０００４】
ＩＬ-２は活性化Ｔ-細胞、特にＣＤ４＋ヘルパーＴ-細胞によって主に合成される。それはＴ-細胞の増殖及び分化を刺激し、細胞傷害性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)の生成及び細胞傷害性細胞及びリンホカイン活性化キラー(ＬＡＫ)細胞への末梢血リンパ球の分化を誘導し、Ｔ-細胞によるサイトカイン及び細胞溶解性分子発現を促進し、Ｂ-細胞の増殖及び分化及びＢ-細胞による免疫グロブリンの合成を促進し、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞の生成、増殖及び活性を刺激する(例えばWaldmann, Nat Rev Immunol 6, 595-601 (2009); Olejniczak and Kasprzak, Med Sci Monit 14, RA179-89 (2008); Malek, Annu Rev Immunol 26, 453-79 (2008)に総説)。
【０００５】
インビボにおいてリンパ球集団を増殖し、これらの細胞のエフェクター機能を増加する能力は、ＩＬ-２に抗腫瘍効果を与え、特定の転移癌についてＩＬ-２免疫療法を魅力的な治療オプションにする。結果的に、高用量ＩＬ-２治療は、転移性腎細胞癌及び悪性メラノーマの患者における使用に承認されてきた。
【０００６】
しかしながら、ＩＬ-２は免疫応答において二重の機能を有し、エフェクター細胞の増殖及び活性を媒介するのみでなく、末梢免疫寛容の維持に決定的に関与する。
【０００７】
末梢自己寛容の基礎をなす主なメカニズムは、Ｔ-細胞におけるＩＬ-２誘導による活性化誘導細胞死(ＡＩＣＤ)である。ＡＩＣＤは、細胞表面に発現されるデスレセプター、例えばＣＤ９５(Ｆａｓとしても知られる)又はＴＮＦ受容体の会合を通して、完全に活性化されたＴ-細胞がプログラム細胞死を起こすプロセスである。高親和性ＩＬ-２受容体を発現する抗原活性化Ｔ-細胞(ＩＬ-２への事前の曝露後)が増殖中に、Ｔ-細胞受容体(ＴＣＲ)／ＣＤ３複合体を介して抗原によって再刺激される時、Ｆａｓリガンド(ＦａｓＬ)及び／又は腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)の発現が誘導され、細胞をＦａｓ-媒介アポトーシスに感受性にする。このプロセスはＩＬ-２依存性(Lenardo, Nature 353, 858-61 (1991))であり、ＳＴＡＴ５に媒介される。Ｔリンパ球におけるＡＩＣＤのプロセスでは、寛容は自己抗原に対してだけでなく、腫瘍抗原などの明らかに宿主の構造の一部ではない持続的抗原に対して確立される。
【０００８】
更に、ＩＬ-２は、サプレッサーＴ-細胞としても知られる末梢ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ(Ｔｒｅｇ)細胞(Fontenot等, Nature Immunol 6, 1142-51 (2005); D’Cruz and Klein, Nature Immunol 6, 1152-59 (2005); Maloy and Powrie, Nature Immunol 6, 1171-72 (2005)の維持にも関与する。それらは、Ｔ-細胞ヘルプ及び活性化を阻害することにより細胞-細胞接触を通して、又はＩＬ-１０又はＴＧＦ-β等の免疫抑制サイトカインの放出を通して、エフェクターＴ-細胞がそれらの(自己-)標的を破壊するのを抑制する。Ｔｒｅｇ細胞の枯渇は、ＩＬ-２誘導による抗腫瘍免疫を増強させることが知られている(Imai等, Cancer Sci 98, 416-23 (2007))。
【０００９】
従って、ＩＬ-２の存在下では、生成されたＣＴＬは腫瘍を自己として認識しＡＩＣＤを起こすか、又は免疫反応はＩＬ-２依存Ｔｒｅｇ細胞によって阻害されうることから、ＩＬ-２は腫瘍増殖の阻害に最適ではない。
【００１０】
ＩＬ-２免疫療法に関する更なる懸念は、組換えヒトＩＬ-２治療によって生じる副作用である。高用量ＩＬ-２治療を受けている患者はしばしば深刻な心血管、肺、腎臓、肝臓、胃腸、神経学的、皮膚、血液学的及び全身性の有害事象を経験し、これは集中的なモニタリング及び入院患者の管理を必要とする。これらの副作用の大部分は、いわゆる血管（又は毛細管）漏出症候群（ＶＬＳ）、複数の臓器における血管外漏出を導く血管透過性における病変増加（例えば肺及び皮膚の浮腫及び肝細胞傷害を導く）及び血管内液欠乏（血圧の低下及び心拍数の代償性増加を導く）の形成によって説明できる。ＩＬ-２の撤退以外にＶＬＳの治療はない。低用量ＩＬ-２レジメンがＶＬＳを回避するために患者において試験されてきたが、最適以下治療効果のみであった。ＶＬＳは、ＩＬ-２-活性化ＮＫ細胞からの腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)-αなどの炎症性サイトカインの放出によって引き起こされると信じられていたが、最近になって、ＩＬ-２誘導による肺水腫は、低〜中レベルの機能性αβγＩＬ-２受容体を発現する肺内皮細胞へのＩＬ-２の直接の結合から生じることが示された(Krieg等, Proc Nat Acad Sci USA 107, 11906-11 (2010))。
【００１１】
幾つかのアプローチがＩＬ-２免疫療法に伴うこれらの問題を解消するためにとられてきた。例えば、ＩＬ-２と特定の抗ＩＬ-２モノクローナル抗体との組合せがインビボでのＩＬ-２の治療効果を増強することが分かった(Kamimura等, J Immunol 177, 306-14 (2006); Boyman等, Science 311, 1924-27 (2006))。別のアプローチでは、ＩＬ-２を、その毒性を低減させるため及び／又はその効果を増加させるために様々な方法で変異させた。Hu等(Blood 101, 4853-4861 (2003), US Pat.Publ.No. 2003/0124678)は、ＩＬ-２の血管透過性活性を除去するためにトリプトファンによってＩＬ-２の位置３８におけるアルギニン残基を置換した。Shanafelt等(Nature Biotechnol 18, 1197-1202 (2000))は、ＮＫ細胞に対するＴ細胞への選択性を増強するためにアスパラギン８８をアルギニンに変異させた。Heaton等(Cancer Res 53, 2597-602 (1993); US Pat.No. 5,229,109)は、ＮＫ細胞からの炎症性サイトカインの分泌を低減させるために２つの変異Ａｒｇ３８Ａｌａ及びＰｈｅ４２Ｌｙｓを導入した。Gillies等(US Pat.Publ.No. 2007/0036752)は、ＶＬＳを低減させるために、中間親和性ＩＬ-２受容体に対する親和性に寄与するＩＬ-２の３残基を置換した（Ａｓｐ２０Ｔｈｒ、Ａｓｎ８８Ａｒｇ、及びＧｌｎ１２６Ａｓｐ）。Gillies等(WO2008/0034473)はまた、効果の増強のために、ＣＤ２５との相互作用及びＴｒｅｇ細胞の活性化を低減させるために、アミノ酸置換Ａｒｇ３８Ｔｒｐ及びＰｈｅ４２ＬｙｓによってＣＤ２５とのＩＬ-２のインターフェースを変異させた。同じ目的で、Wittrup等(WO 2009/061853)は、ＣＤ２５に対する親和性が増強されるが、受容体を活性化しない、従ってアンタゴニストとして作用するＩＬ-２ミュータントを生産した。導入された変異は、受容体のβ-及び／又はγ-サブユニットとの相互作用を破壊することを目的とした。
【００１２】
しかしながら、知られたＩＬ-２ミュータントの何れも、ＩＬ-２免疫療法に伴う上記の全ての問題、すなわちＶＬＳの誘導により生じる毒性、ＡＩＣＤの誘導により生じる腫瘍寛容、及びＴｒｅｇ細胞の活性化により生じる免疫抑制を解消することが示されなかった。従って、ＩＬ-２タンパク質の治療有用性を更に増強するための当分野におけるニーズが残っている。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は一部には、ＩＬ-２と、三量体高親和性ＩＬ-２受容体のα-サブユニットとの相互作用が、ＩＬ-２免疫療法と関連する問題に関与するという認識に基づく。
【００１４】
従って、第一の態様では、発明は、高親和性ＩＬ-２受容体に対するミュータントＩＬ-２ポリペプチドの親和性を無効にするか又は低減し、中間親和性ＩＬ-２受容体に対するミュータントＩＬ-２ポリペプチドの親和性を保つ(各々、野生型ＩＬ-２ポリペプチドと比較)第一アミノ酸変異を含んでなるミュータントインターロイキン-２(ＩＬ-２)ポリペプチドを提供する。一実施態様では、前記第一アミノ酸変異は、ヒトＩＬ-２の残基７２に対応する位置にある。一実施態様では、前記第一アミノ酸変異は、Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２Ｒ、及びＬ７２Ｋの群から選択されるアミノ酸置換である。より特異的な実施態様では、前記第一アミノ酸変異はアミノ酸置換Ｌ７２Ｇである。ある実施態様では、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドは、高親和性ＩＬ-２受容体に対するミュータントＩＬ-２ポリペプチドの親和性を無効にするか又は低減し、中間親和性ＩＬ-２受容体に対するミュータントＩＬ-２ポリペプチドの親和性を保つ(各々、野生型ＩＬ-２ポリペプチドと比較)第二アミノ酸変異を含む。一実施態様では、前記第二アミノ酸変異は、ヒトＩＬ-２の残基３５、３８、４２、４３、及び４５に対応する位置から選択される位置である。特異的な実施態様では、前記第二アミノ酸変異は、ヒトＩＬ-２の残基４２に対応する位置にある。より特異的な実施態様では、前記第二アミノ酸変異は、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、及びＦ４２Ｋの群から選択されるアミノ酸置換である。更により特異的な実施態様では、前記第二アミノ酸変異はアミノ酸置換Ｆ４２Ａである。ある実施態様では、ミュータントインターロイキン-２ポリペプチドは、高親和性ＩＬ-２受容体に対するミュータントＩＬ-２ポリペプチドの親和性を無効にするか又は低減し、中間親和性ＩＬ-２受容体に対するミュータントＩＬ-２ポリペプチドの親和性を保つ(各々、野生型ＩＬ-２ポリペプチドと比較)第三アミノ酸変異を含む。特定の実施態様では、ミュータントインターロイキン-２ポリペプチドは、高親和性ＩＬ-２受容体に対するミュータントＩＬ-２ポリペプチドの親和性を無効にするか又は低減し、中間親和性ＩＬ-２受容体に対するミュータントＩＬ-２ポリペプチドの親和性を保つ(各々、野生型ＩＬ-２ポリペプチドと比較)３つのアミノ酸変異を含み、前記３つのアミノ酸変異はヒトＩＬ-２の残基４２、４５、及び７２に対応する位置にある。一実施態様では、前記３つのアミノ酸変異は、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、Ｆ４２Ｋ、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、Ｙ４５Ｋ、Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２Ｒ、及びＬ７２Ｋの群から選択されるアミノ酸置換である。特異的な実施態様では、前記３つのアミノ酸変異はアミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇである。ある実施態様では、ミュータントインターロイキン-２ポリペプチドは、ヒトＩＬ-２の残基３に対応する位置でＩＬ-２のＯ-糖鎖付加部位を除去するア��ノ酸変異を更に含む。一実施態様では、ヒトＩＬ-２の残基３に対応する位置でＩＬ-２のＯ-糖鎖付加部位を除去するアミノ酸変異は、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｇ、Ｔ３Ｑ、Ｔ３Ｅ、Ｔ３Ｎ、Ｔ３Ｄ、Ｔ３Ｒ、Ｔ３Ｋ、及びＴ３Ｐの群から選択されるアミノ酸置換である。特異的な実施態様では、ヒトＩＬ-２の残基３に対応する位置でＩＬ-２のＯ-糖鎖付加部位を除去するアミノ酸変異は、Ｔ３Ａである。ある実施態様では、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドは基本的に完全長ＩＬ-２分子、特にヒト完全長ＩＬ-２分子である。
【００１５】
発明は、非ＩＬ-２部分に連結されたミュータントインターロイキン-２ポリペプチドを提供する。ある実施態様では、前記非ＩＬ-２部分はターゲティング部分である。ある実施態様では、前記非ＩＬ-２部分は抗原結合部分である。一実施態様では、前記抗原結合部分は抗体である。別の実施態様では、前記抗原結合部分は抗体断片である。より特異的な実施態様では、前記抗原結合部分は、Ｆａｂ分子及びｓｃＦｖ分子から選択される。特定の実施態様では、前記抗原結合部分はＦａｂ分子である。別の実施態様では、前記抗原結合部分はｓｃＦｖ分子である。特定の実施態様では、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドは第一及び第二非ＩＬ-２部分に連結される。このような一実施態様では、ミュータントインターロイキン-２ポリペプチドは、前記第一非ＩＬ-２部分とカルボキシ末端ペプチド結合を、前記第二非ＩＬ-２部分とアミノ末端ペプチド結合を共有する。一実施態様では、前記抗原結合部分は免疫グロブリン分子である。より特異的な実施態様では、前記抗原結合部分はＩｇＧクラス、特にＩｇＧ１サブクラス、免疫グロブリン分子である。ある実施態様では、前記抗原結合部分は腫瘍細胞上又は腫瘍細胞環境中において提示される抗原、特に線維芽細胞活性化タンパク質(ＦＡＰ)、テネイシン-ＣのＡ１ドメイン(ＴＮＣＡ１)、テネイシン-ＣのＡ２ドメイン(ＴＮＣＡ２)、フィブロネクチンのエクストラドメイン(ＥＤＢ)、癌胎児抗原(ＣＥＡ)及びメラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(ＭＣＳＰ)の群から選択される抗原に向けられる。
【００１６】
また発明によって提供されるのは、ここに記載のミュータントＩＬ-２ポリペプチド及び抗原結合部分を含んでなるイムノコンジュゲートである。発明によるイムノコンジュゲートの一実施態様では、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドは、前記抗原結合部分とアミノ-又はカルボキシ-末端ペプチド結合を共有する。特定の実施態様では、イムノコンジュゲートは第一及び第二抗原結合部分を含む。このような一実施態様では、発明によるイムノコンジュゲートに含まれるミュータントＩＬ-２ポリペプチドは第一抗原結合部分とアミノ-又はカルボキシ-末端ペプチド結合を共有し、第二抗原結合部分はｉ)ミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はｉｉ)前記第一抗原結合部分とアミノ-又はカルボキシ-末端ペプチド結合を共有する。一実施態様では、発明によるイムノコンジュゲートに含まれる抗原結合部分は抗体であり、別の実施態様では、前記抗原結合部分は抗体断片である。特異的な実施態様では、前記抗原結合部分は、Ｆａｂ分子及びｓｃＦｖ分子から選択される。特定の実施態様では、前記抗原結合部分はＦａｂ分子である。別の特定の実施態様では、前記抗原結合部分は免疫グロブリン分子である。より特異的な実施態様では、前記抗原結合部分はＩｇＧクラス、特にＩｇＧ１サブクラス、免疫グロブリン分子である。ある実施態様では、前記抗原結合部分は腫瘍細胞上又は腫瘍細胞環境中において提示される抗原、特に線維芽細胞活性化タンパク質(ＦＡＰ)、テネイシン-ＣのＡ１ドメイン(ＴＮＣＡ１)、テネイシン-ＣのＡ２ドメイン(ＴＮＣＡ２)、フィブロネクチンのエクストラドメイン(ＥＤＢ)、癌胎児抗原(ＣＥＡ)及びメラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(ＭＣＳＰ)の群から選択される抗原に向けられる。
【００１７】
発明は、ここに記載のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートをコードする単離ポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクター、及びポリヌクレオチド又は発現ベクターを含んでなる宿主細胞を提供する。
【００１８】
また提供されるのは、ここに記載のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを製造する方法、ここに記載のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲート及び薬学的に許容可能な担体を含んでなる薬学的組成物、及びここに記載のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを使用する方法である。
【００１９】
特に、発明は、それを必要とする個体における疾患の治療における使用のための、ここに記載のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを包含する。特定の実施態様では、前記疾患は癌でる。特定の実施態様では、個体はヒトである。
【００２０】
また発明によって包含されるのは、それを必要としている個体における疾患の治療のための医薬の製造のための、ここに記載のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの使用である。
【００２１】
更に提供されるのは、個体における疾患を治療する方法であって、ここに記載のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを含んでなる治療的に有効な量の組成物を前記個体に投与することを含んでなる方法である。前記疾患は、好ましくは癌である。
【００２２】
また提供されるのは、薬学的に許容可能な形態におけるここに記載のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを含んでなる有効量の組成物を前記個体に投与することを含んでなる個体の免疫系を刺激する方法である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
(発明の詳細な説明)
定義
用語は、以下において別段の定めがある場合を除き、当分野で一般的に使用される通りにここで使用される。
【００２４】
「インターロイキン-２」又は「ＩＬ-２」なる用語は、ここで使用される場合、別段の定めがある場合を除き、霊長類(例えばヒト)及び齧歯類(例えばマウス及びラット)等の哺乳類を含む何れかの脊椎動物供給源からの何れかの天然ＩＬ-２を指す。用語は、非プロセスＩＬ-２並びに細胞におけるプロセシングから生じる何れかの形態のＩＬ-２を包含する。用語はまた、天然に生じるＩＬ-２の変異体、例えばスプライスバリアント又は対立遺伝子変異体を包含する。例示的なヒトＩＬ-２のアミノ酸配列を配列番号：１に示す。非プロセスヒトＩＬ-２は、成熟ＩＬ-２分子では不在である配列番号：２７２の配列を有するＮ-末端２０アミノ酸シグナルペプチドを更に含む。
【００２５】
「ＩＬ-２ミュータント」又は「ミュータントＩＬ-２ポリペプチド」なる用語は、ここで使用される場合、完全長ＩＬ-２、ＩＬ-２の切断形態、ＩＬ-２が融合又は化学コンジュゲーション等によって別の分子に連結されている形態を含む様々な形態のＩＬ-２分子の何れかのミュータント形態を包含することを意図する。「完全長」とは、ＩＬ-２に指して使用する場合、成熟した天然長ＩＬ-２分子を意味することを意図する。例えば、完全長ヒトＩＬ-２とは１３３アミノ酸を有する分子を指す(例えば配列番号：１を参照)。様々な形態のＩＬ-２ミュータントは、ＩＬ-２とＣＤ２５との相互作用に影響する少なくとも一つのアミノ酸変異を有することを特徴とする。この変異は、通常その位置にある野生型アミノ酸残基の置換、欠失、切断又は修飾を含みうる。アミノ酸置換によって得られる変異が好ましい。別段の定めがある場合を除き、ＩＬ-２ミュータントはここでは、ＩＬ-２ミュータントペプチド配列、ＩＬ-２ミュータントポリペプチド、ＩＬ-２ミュータントタンパク質又はＩＬ-２ミュータント類似体を指しうる。
【００２６】
ＩＬ-２の様々な形態の命名はここでは、配列番号：１に示す配列に対して為される。様々な命名が同じ変異を示すためにここで使用されうる。例えば、位置４２のフェニルアラニンからアラニンへの変異は４２Ａ、Ａ４２、Ａ４２、Ｆ４２Ａ、又はＰｈｅ４２Ａｌａとして示されうる。
【００２７】
「アミノ酸変異」なる用語は、ここで使用される場合、アミノ酸置換、欠失、挿入、及び修飾を包含することを意味する。置換、欠失、挿入、及び修飾の何れかの組合せが最終コンストラクトを得るためになされてもよいが、ただし、最終コンストラクトが例えばＣＤ２５への低減された結合など所望の特性を保有することとする。アミノ酸配列欠失及び挿入は、アミノ酸のアミノ-及び／又はカルボキシル-末端欠失及び挿入を含む。末端欠失の例は、完全長ヒトＩＬ-２の位置１におけるアラニン残基の欠失である。好ましいアミノ酸変異はアミノ酸置換である。例えばＩＬ-２ポリペプチドの結合特徴の変更のためには、非保存アミノ酸置換、すなわち異なる構造的及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸による一アミノ酸の置換が特に好ましい。好ましいアミノ酸置換は、親水性アミノ酸による疎水性の置換を含む。アミノ酸置換は、非天然に生じるアミノ酸又は天然に生じるアミノ酸誘導体による２０の標準的アミノ酸の置換を含む(例えば４-ヒドロキシプロリン、３-メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５-ヒドロキシリジン)。アミノ酸変異は、当分野でよく知られた遺伝学的又は化学的方法を使用して生成されうる。遺伝学的方法は、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等を含みうる。化学的修飾など、遺伝子工学以外の方法によるアミノ酸の側鎖基の変更方法がまた有用でありうることが考えられる。
【００２８】
ここで使用される場合、ＩＬ-２の「野生型」形態は、野生型形態がミュータントＩＬ-２ポリペプチドの各アミノ酸位置に野生型アミノ酸を有する以外はミュータントＩＬ-２ポリペプチドと同じであるＩＬ-２の形態である。例えば、ＩＬ-２ミュータントが完全長ＩＬ-２(すなわち何れかの他の分子に融合又はコンジュゲートされていないＩＬ-２)である場合、このミュータントの野生型形態は完全長天然ＩＬ-２である。ＩＬ-２ミュータントがＩＬ-２とＩＬ-２の下流にコードされた別のポリペプチド(例えば抗体鎖)との間の融合である場合、このＩＬ-２ミュータントの野生型形態は同じ下流ポリペプチドに融合された野生型アミノ酸配列を有するＩＬ-２である。更に、ＩＬ-２ミュータントがＩＬ-２の切断形態(ＩＬ-２の非切断部分内の変異又は修飾配列)である場合、このＩＬ-２ミュータントの野生型形態は、野生型配列を有する同様に切断されたＩＬ-２である。対応するＩＬ-２の野生型形態に対する様々な形態のＩＬ-２ミュータントのＩＬ-２受容体結合親和性又は生物学的活性の比較では、野生型なる用語は、天然に生じる天然ＩＬ-２と比較してＩＬ-２受容体結合に影響しない一又は複数のアミノ酸変異、例えばヒトＩＬ-２の残基１２５に対応する位置のシステインのアラニンへの置換を含んでなるＩＬ-２の形態を包含する。幾つかの実施態様では、本発明の目的のための野生型ＩＬ-２はアミノ酸置換Ｃ１２５Ａ(配列番号：３を参照)を含む。発明によるある実施態様では、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドが比較される野生型ＩＬ-２ポリペプチドは、配列番号：１のアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドが比較される野生型ＩＬ-２ポリペプチドは、配列番号：３のアミノ酸配列を含む。
【００２９】
「ＣＤ２５」又は「ＩＬ-２受容体のα-サブユニット」なる用語は、ここで使用される場合、別段の定めがある場合を除き、霊長類(例えばヒト)及び齧歯類(例えばマウス及びラット)等の哺乳類を含む何れかの脊椎動物供給源からの何れかの天然ＣＤ２５を指す。用語は「完全長」の非プロセスＣＤ２５並びに細胞におけるプロセシングから生じるＣＤ２５の何れかの形態を包含する。用語はまた、天然に生じるＣＤ２５の変異体、例えばスプライスバリアント又は対立遺伝子変異体を包含する。ある実施態様では、ＣＤ２５はヒトＣＤ２５である。例示的なヒトＣＤ２５のアミノ酸配列(シグナル配列、Ａｖｉ-タグ及びＨｉｓ-タグを伴う)を配列番号：２７８に示す。
【００３０】
「高親和性ＩＬ-２受容体」なる用語は、ここで使用される場合、受容体γ-サブユニット(共通サイトカイン受容体γ-サブユニット、γｃ、又はＣＤ１３２としても知られる)、受容体β-サブユニット(ＣＤ１２２又はｐ７０としても知られる)及び受容体α-サブユニット(ＣＤ２５又はｐ５５としても知られる)から成るＩＬ-２受容体のヘテロ三量体形態を指す。一方、「中間親和性ＩＬ-２受容体」なる用語は、γ-サブユニット及びβ-サブユニットのみを含みα-サブユニットを持たないＩＬ-２受容体を指す(総説については、例えばOlejniczak and Kasprzak, Med Sci Monit 14, RA179-189 (2008)を参照)。
【００３１】
「親和性」とは、分子の単一結合部位(例えば受容体)及びその結合パートナー(例えばリガンド)間の非共有結合相互作用の全合計の強さを指す。別段の定めがある場合を除き、ここで使用される場合、「結合親和性」とは、結合対(例えば受容体及びリガンド)のメンバー間の１：１相互作用を反映する内因性結合親和性を指す。分子ＸとそのパートナーＹの親和性は一般的に、解離及び会合速度定数(それぞれｋｏｆｆ及びｋｏｎ)の比である解離定数(ＫＤ)によって表される。このように、速度定数の比が同じである限り、等しい親和性は異なる速度定数を含みうる。親和性は、ここに記載されるものを含む分野で知られた十分に確立された方法によって測定できる。
【００３２】
様々な形態のＩＬ-２受容体に対するミュータント又は野生型ＩＬ-２ポリペプチドの親和性は、BIAcore instrument(GE Healthcare)等の標準的な器具及び組換え発現によって得られうる受容体サブユニットを使用して、表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)によって、実施例に説明する方法に従って決定できる(例えばShanafelt等, Nature Biotechnol 18, 1197-1202 (2000)を参照)。あるいは、異なる形態のＩＬ-２受容体に対するＩＬ-２ミュータントの結合親和性は、何れかのこのような形態の受容体を発現すると知られている細胞株を使用して評価されうる。結合親和性を測定するための特異的な説明的、例示的実施態様を以下に記載する。
【００３３】
「制御性Ｔ-細胞」又は「Ｔｒｅｇ細胞」とは、他のＴ-細胞の応答を抑制できる特別なタイプのＣＤ４＋Ｔ-細胞を意味する。Ｔｒｅｇ細胞は、ＩＬ-２受容体のα-サブユニット(ＣＤ２５)及び転写因子フォークヘッドボックスＰ３(ＦＯＸＰ３)の発現によって特徴づけられ(Sakaguchi, Annu Rev Immunol 22, 531-62 (2004))、腫瘍によって発現されるものを含む抗原に対する末梢自己寛容の誘導及び維持において重要な役割を果たす。Ｔｒｅｇ細胞は、それらの機能及び発生及びそれらの抑制性特性の誘導にＩＬ-２を必要とする。
【００３４】
ここで使用される場合、「エフェクター細胞」なる用語は、ＩＬ-２の細胞傷害性効果を媒介するリンパ球の集団を指す。エフェクター細胞は、エフェクターＴ-細胞、例えばＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ-細胞、ＮＫ細胞、リンホカイン活性化キラー(ＬＡＫ)細胞及びマクロファージ／単球を含む。
【００３５】
ここで使用される場合、「抗原結合部分」なる用語は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一実施態様では、抗原結合部分は、それが結合された実体(例えばサイトカイン又は第二抗原結合部分)を、標的部位、例えば抗原決定基を有する特定のタイプの腫瘍細胞又は腫瘍間質へ向けることができる。抗原結合部分は、ここに更に定義される抗体及びその断片を含む。好ましい抗原結合部分は、抗体重鎖可変領域及び抗体軽鎖可変領域を含んでなる抗体の抗原結合ドメインを含む。ある実施態様では、抗原結合部分は、ここに更に定義され、当分野で知られている抗体定常領域を含みうる。有用な重鎖定常領域は、５つのアイソタイプ：α、δ、ε、γ、又はμの何れかを含む。有用な軽鎖定常領域は、２つのアイソタイプ：κ及びλの何れかを含む。
【００３６】
「特異的に結合する」とは、結合が抗原に対して選択的であり、望まないか又は非特異的相互作用と区別できることを意味する。特定の抗原決定基に結合する抗原結合部分の能力は、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)又は当業者によく知られた他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術(BIAcore instrumentにおいて分析される) (Liljeblad等, Glyco J 17, 323-329 (2000))、及び一般的な結合アッセイ(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))によって測定されうる。
【００３７】
ここで使用される場合、「抗原決定基」なる用語は「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合し、抗原結合部分-抗原複合体を形成するポリペプチド巨大分子上の部位(例えば近接ストレッチのアミノ酸又は非近接アミノ酸から成るコンホメーション構造)を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上、ウィルス感染細胞の表面上、他の疾患細胞の表面上、血清中に遊離して、及び／又は細胞外マトリックス(ECM)中に見られうる。
【００３８】
ここで使用される場合、「ポリペプチド」なる用語は、アミド結合(ペプチド結合としても知られる)によって線形に結合される単量体(アミノ酸)から成る分子を指す。「ポリペプチド」なる用語は、２以上のアミノ酸の何れかの鎖を指し、特定長の産物を指すものではない。このように、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は２以上アミノ酸の鎖を指すために使用される何れかの他の用語が、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、「ポリペプチド」なる用語はこれらの何れかの用語の代わりに又は互換的に使用されうる。「ポリペプチド」なる用語は、限定するものではないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、知られている保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質切断、又は非天然発生アミノ酸による修飾を含む、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指す。ポリペプチドは、天然生物学的供給源に由来するか又は組換え技術によって生産され得るが、必ずしも指定の核酸配列から翻訳される必要はない。それは化学合成を含む何れかの方法において生成されうる。発明のポリペプチドは、約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１，０００以上、又は２，０００以上のアミノ酸のサイズでありうる。ポリペプチドは定められた三次元構造を有しうるが、それらは必ずしもこのような構造を有する必要はない。定められた三次元構造を有するポリペプチドはフォールディングと呼ばれ、定められた三次元構造を持たず、多数の異なるコンホメーションを採用しうるポリペプチドは非フォールディングと呼ばれる。
【００３９】
「単離された」ポリペプチド又は変異体、又はその誘導体は、その天然環境中ではないポリペプチドを意図する。特定レベルの精製は必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然又は自然環境から取り出されうる。何れかの好適な技術によって分離、分画化、又は部分的又は実質的に精製される天然又は組換えポリペプチドのように、宿主細胞において発現された組換え生産されたポリペプチド及びタンパク質は、発明の目的のために単離されることが考えられる。
【００４０】
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、特定の参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を測定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ(ＤＮＡＳＴＡＲ)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインメントするための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用することによって得られる。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁, ワシントンD.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテック社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから公的に入手可能であり、ソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ(登録商標)Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸ(登録商標)オペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され変動しない。アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ-２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ-２のＡ及びＢのプログラムアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限りは、ここでの全ての％アミノ酸配列同一性値は、直ぐ上のパラグラフに示したようにＡＬＩＧＮ-２コンピュータプログラムを用いて得られる。
【００４１】
「ポリヌクレオチド」なる用語は、単離された核酸分子又はコンストラクト、例えばメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)、ウィルス由来ＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ(ｐＤＮＡ)を指す。ポリヌクレオチドは、一般的なホスホジエステル結合又は非一般的な結合(例えば、ペプチド核酸(ＰＮＡ)に見られるようなアミド結合)を含みうる。「核酸分子」なる用語は、ポリヌクレオチドに存在する何れかの一又は複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
【００４２】
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドとは、それの天然環境から採られた核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡを意図する。例えば、ベクターに含まれる治療用ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されていると考えられる。単離されたポリヌクレオチドの更なる例は、異種性宿主細胞に維持された組換えポリヌクレオチド又は溶液中における(部分的又は実質的に)精製されたポリヌクレオチドを含む。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含有する細胞に含有されるポリヌクレオチド分子を含むが、ポリヌクレオチド分子は染色体外に、又はそれの染色体上の位置と異なる染色体上の位置に存在する。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のインビボ又はインビトロＲＮＡ転写物、並びにプラス及びマイナス鎖形態、及び二本鎖形態を含む。本発明による単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、合成的に生産されたこのような分子を更に含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーター等の調節要素であるか又はそれを含みうる。
【００４３】
本発明の参照ヌクレオチド配列に少なくとも例えば９５％「同一な」ヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり最大で５つの点変異を含みうる以外は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列に同一であることを意図する。言い換えると、参照ヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るには、参照配列における最大で５％までのヌクレオチドが欠失されるか又は別のヌクレオチドで置換されうるか、又は参照配列における全体ヌクレオチドの最大で５％までの数のヌクレオチドが参照配列に挿入されうる。参照配列のこれらの変更は、参照ヌクレオチド配列の５’又は３’末端位置か、又はこれらの末端位置の間のどこかで、参照配列の残基中に個々に、又は参照配列内の一又は複数の近接するグループ中に散在して生じうる。実際に、何れかの特定のポリヌクレオチド配列が本発明のヌクレオチド配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一かどうかは、知られたコンピュータープログラム、例えばポリペプチドについて上記したもの(例えばＡＬＩＧＮ-２)を使用して一般的に決定できる。
【００４４】
「発現カセット」なる用語は、標的細胞において特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸要素を伴う、組換え又は合成によって生成されるポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、色素体ＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片に組み込まれうる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、他の配列の中でもとりわけ、転写される核酸配列及びプロモーターを含む。ある実施態様では、発明の発現カセットは、発明のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートをコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
【００４５】
「ベクター」又は「発現ベクター」なる用語は、「発現コンストラクト」と同義であり、導入及び標的細胞において作動的に関連した特定の遺伝子の発現の命令のために使用されるDNA分子を指す。用語は、自己複製型の核酸構造体としてのベクター並びに導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、多量の安定mRNAの転写を可能にする。一旦発現ベクターが標的細胞内に入ると、遺伝子にコードされたリボ核酸分子又はタンパク質は細胞の転写及び／又は翻訳機構によって生産される。一実施態様では、発明の発現ベクターは、発明のミュータントIL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートをコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
【００４６】
「人工的」なる用語は、合成の又は非宿主細胞由来の組成物、例えば化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを指す。
【００４７】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」なる用語は、互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、このような細胞の子孫を含む。宿主細胞は「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含み、一次形質転換細胞、及び継代の数に関わらずそれらに由来する子孫を含む。子孫は親細胞に対して核酸内容物が完全に同一でなくてもよく、変異を含みうる。元の形質転換細胞においてスクリーニング又は選択されるのと同じ機能又は生物学的活性を有するミュータント子孫がここでは含まれる。
【００４８】
「抗体」なる用語はここでは最も広義な意味において使用され、様々な抗体構造を包含し、限定するものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、及びそれらが所望の抗原結合活性を呈する限り抗体断片を含む。
【００４９】
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」なる用語は、ここでは互換的に使用され、天然抗体構造に実質的に類似な構造を有するか、又はここに定義されるFc領域を有する重鎖を有する抗体を指す。
【００５０】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例は、限定するものではないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’-ＳＨ、Ｆ(ａｂ’)２、ダイアボディ、線状抗体、単鎖抗体分子(例えばｓｃＦｖ)、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体を含む。特定の抗体断片の総説については、Hudson等, Nat Med 9, 129-134 (2003)を参照のこと。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えばPluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照のこと;またWO93/16185;及び米国特許第5,571,894号及び同第5,587,458号を参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含んでなり、増加されたインビボ半減期を有するＦａｂ及びＦ(ａｂ’)２断片の考察については、米国特許第5,869,046号を参照のこと。ダイアボディは、二価又は二重特異性でありうる２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、EP404,097; WO1993/01161; Hudson等, Nat Med 9, 129-134 (2003);及びHollinger等, Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディはまた、Hudson等, Nat Med 9, 129-134 (2003)に記載されている。抗体断片は様々な技術によって製造可能であり、限定するものではないが、ここに記載のようにインタクトな抗体のタンパク質消化並びに組換え宿主細胞(例えば大腸菌又はファージ)による生産を含む。
【００５１】
「免疫グロブリン分子」なる用語は、天然に生じる抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合される２つの軽鎖及び２つの重鎖から成る約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ-からＣ-末端へ、各重鎖は、可変重ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(ＶＨ)と、その後の重鎖定常ドメインとも呼ばれる３つの定常ドメイン(ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３)とを有する。同様に、Ｎ-からＣ-末端へ、各軽鎖は、可変軽ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(ＶＬ)と、その後の軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽(ＣＬ)ドメインを有する。免疫グロブリンの重鎖は、α(ＩｇＡ)、δ(ＩｇＤ)、ε(ＩｇＥ)、γ(ＩｇＧ)、又はμ(ＩｇＭ)と呼ばれる５クラスの内の一つに割り当てられ得、その幾つかはサブクラス、例えばγ１(ＩｇＧ１)、γ２(ＩｇＧ２)、γ３(ＩｇＧ３)、γ４(ＩｇＧ４)、α１(ＩｇＡ１)及びα２(ＩｇＡ２)に更に分けられうる。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２タイプの内の一つに割り当てられうる。免疫グロブリンは基本的に、免疫グロブリンヒンジ領域で連結される２つのＦａｂ分子及びＦｃドメインから成る。
【００５２】
「抗原結合ドメイン」なる用語は、抗原の一部又は全部に相補的であり、それに特異的に結合する領域を含む抗体の部分を指す。抗原結合ドメインは、例えば一又は複数の抗体可変ドメイン(抗体可変領域とも呼ばれる)によって提供されうる。好ましくは、抗原結合ドメインは抗体軽鎖可変領域(ＶＬ)及び抗体重鎖可変領域(ＶＨ)を含む。
【００５３】
「可変領域」又は「可変ドメイン」なる用語は、抗原への抗体の結合に関与する抗体重又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン(それぞれＶＨ及びＶＬ)は一般的に類似な構造を有し、各ドメインは４つの保存フレームワーク領域(ＦＲ)及び３つの超可変領域(ＨＶＲ)を含んでなる。例えばKindt等, Kuby Immunology, 6th ed., W.H.Freeman and Co., page 91 (2007)を参照のこと。単一VH又はVLドメインが、抗原結合特異性の付与に十分でありうる。
【００５４】
「超可変領域」又は「ＨＶＲ」なる用語は、ここで使用される場合、配列において超可変であり及び／又は構造的に定められたループ(「超可変ループ」)を形成する抗体可変ドメインの領域の各々を指す。一般的に、天然４鎖抗体は６つのＨＶＲを含む；ＶＨ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３)に３つ、そしてＶＬ(Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)に３つ。ＨＶＲは一般的に超可変ループ及び／又は相補性決定領域(ＣＤＲ)からアミノ酸残基を含み、後者は最も高い配列可変性のものであり、及び／又は抗原認識に関与する。ＶＨにおけるＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは超可変ループを形成するアミノ酸残基を一般的に含む。超可変領域(ＨＶＲ)は「相補性決定領域」(ＣＤＲ)とも呼ばれ、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の部分を指す場合に、ここでは互換的に使用される。この特定の領域は、Kabat等, U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983)及びChothia等, J Mol Biol 196:901-917 (1987)に記載されており、定義は互いに比較した時、アミノ酸残基の重複又はサブセットを含む。しかしながら、抗体又はその変異体のＣＤＲを指すための何れかの定義の適用は、ここで定義され使用されるように用語の範囲内であることを意図する。上記の引用の各々に定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基を、比較として下の表１に示す。特定のＣＤＲを包含する正確な残基番号は、ＣＤＲの配列及びサイズに依存して様々であろう。当業者は、どの残基が抗体の可変領域アミノ酸配列を与える特定のＣＤＲ含むかをルーチン的に決定できる。
0005878182.tif 000002
【００５５】
Kabat等はまた、任意の抗体に適用可能な可変領域配列に対する番号付けシステムを定義した。当業者は、配列自体以上の何れかの実験データに頼ることなく、「Kabat番号付け」のこのシステムを任意の可変領域配列に明確に割り当てることでできる。ここで使用される場合、「Kabat番号付け」とは、Kabat等, U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)に記載される番号付けシステムを指す。別段の定めがある場合を除き、抗体可変領域における特定アミノ酸残基位置の番号付けへの言及は、Kabat番号付けシステムに従う。
【００５６】
配列表のポリペプチド配列(すなわち配列番号：２３、２５、２７、２９、３１、３３等)は、Kabat番号付けシステムに従って番号付けされていない。しかしながら、Kabat番号付けへの配列表の配列の番号付けの変換は、当業者の通常の技術の十分範囲内である。
【００５７】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、は、超可変領域(ＨＶＲ)残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは一般的に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４から成る。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、ＶＨ(又はＶＬ)において以下の配列において一般的に出現する：ＦＲ１-Ｈ１(Ｌ１)-ＦＲ２-Ｈ２(Ｌ２)-ＦＲ３-Ｈ３(Ｌ３)-ＦＲ４。
【００５８】
抗体の「クラス」は、その重鎖によって所有される定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。５つの主用なクラスの抗体：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらの幾つかはサブクラス(アイソタイプ)、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分けられうる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。
【００５９】
「Ｆｃ領域」なる用語は、ここでは、少なくとも定常領域の一部を有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界は若干異なりうるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端へ延在すると通常定義される。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン(Ｌｙｓ４４７)は、存在する場合と存在しない場合がある。
【００６０】
「ヘテロ二量体化促進修飾」は、ホモ二量体を形成するポリペプチドと同一なポリペプチドとの会合を低減するか防止する、ペプチド骨格の操作又はポリペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖の翻訳後修飾である。ヘテロ二量体化促進修飾は、ここで使用される場合、二量体を形成することが所望される２つのポリペプチドの各々に為される別々の修飾を特に含み、２つのポリペプチドの会合を促進するために修飾は互いに相補的である。例えば、ヘテロ二量体化促進修飾は、その会合をそれぞれ立体的又は静電気的に好ましくするために、二量体を形成することが所望されるポリペプチドの一方又は双方の構造又は電荷を変更しうる。ヘテロ二量体化は、重鎖の各々に融合された更なるイムノコンジュゲート要素(例えばＩＬ-２ポリペプチド)が同じではない２つの免疫グロブリン重鎖など、２つの非同一ポリペプチド間で生じる。本発明のイムノコンジュゲートでは、ヘテロ二量体化促進修飾は免疫グロブリン分子の重鎖、特にＦｃドメインにある。幾つかの実施態様では、ヘテロ二量体化促進修飾は、アミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む。特定の実施態様では、ヘテロ二量体化促進修飾は、２つの免疫グロブリン重鎖の各々における別々のアミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む。
【００６１】
「エフェクター機能」なる用語は、抗体に言及して使用される場合、抗体のＦｃ領域に起因するそれらの生物学的活性を指し、抗体アイソタイプによって異なる。抗体エフェクター機能の例は：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害(ＣＤＣ)、Ｆｃ受容体結合、抗体依存細胞媒介細胞傷害(ＡＤＣＣ)、抗体依存細胞食作用(ＡＤＣＰ)、サイトカイン分泌、細胞表面受容体(例えばＢ細胞受容体)の下方制御、及びＢ細胞活性化を含む。
【００６２】
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域による結合後に、エフェクター機能を実施させるために受容体-担持細胞を刺激するシグナル伝達イベントを誘発させるＦｃ受容体である。Ｆｃ受容体はＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）を含む。
【００６３】
ここで使用される場合、「操作(engineer、engineered、engineering)」なる用語は、天然に生じるか又は組換えのポリペプチド又はその断片のペプチド骨格の何れかの修飾又は翻訳後修飾を含むと考えられる。操作は、アミノ酸配列の、糖鎖付加パターンの、又は個々のアミノ酸の側鎖基の修飾、並びにこれらのアプローチの組合せを含む。
【００６４】
ここで使用される場合、「イムノコンジュゲート」なる用語は、少なくとも一つのＩＬ-２部分及び少なくとも一つの抗原結合部分を含むポリペプチド分子を指す。ある実施態様では、イムノコンジュゲートは、少なくとも一つのＩＬ-２部分、及び少なくとも２つの抗原結合部分を含む。発明による特定のイムノコンジュゲートは、一又は複数のリンカー配列によって連結される一つのＩＬ-２部分及び２つの抗原結合部分から基本的に成る。抗原結合部分は、様々な相互作用によって、またここに記載される様々な配置において、ＩＬ-２部分に連結されうる。
【００６５】
ここで使用される場合、「コントロール抗原結合部分」なる用語は、他の抗原結合部分及びエフェクター部分を含まないで存在する場合の抗原結合部分を指す。例えば、コントロール抗原結合部分と発明のＦａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートを比較するとき、コントロール抗原結合部分は遊離Ｆａｂであり、Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲート及び遊離Ｆａｂ分子は双方とも同じ抗原決定基に特異的に結合できる。
【００６６】
ここで使用される場合、抗原結合部分等に対する「第一」及び「第二」なる用語は、二以上の各タイプの部分がある時に、区別の利便性のために使用される。これらの用語の使用は、別段に定める場合を除き、イムノコンジュゲートの特異的な順序又は方向を与えることを意図しない。
【００６７】
「有効な量」の薬剤とは、投与される細胞又は組織において生理学的変化をもたらすために必要な量を指す。
【００６８】
「治療的に有効な量」の薬剤、例えば薬学的組成物とは、所望の治療的又は予防的結果を達成するための、必要な投与量及び時間での有効な量を指す。治療的に有効な量の薬剤は例えば、疾患の有害作用を除去、低下、遅延、最小化又は防止させる。
【００６９】
「個体」又は「被験体」は哺乳類である。哺乳類は、限定するものではないが、家畜動物(例えばウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ)、霊長類(例えばヒト及び非ヒト霊長類、例えばサル)、ウサギ、及び齧歯類(例えばマウス及びラット)を含む。好ましくは、個体又は被験体はヒトである。
【００７０】
「薬学的組成物」なる用語は、そこに含有される活性成分の生物学的活性を有効にさせる形態であり、組成物が投与されうる被験体に対して許容できない毒性である追加成分を含有しない調製物を指す。
【００７１】
「薬学的に許容可能な担体」とは、被験体に非毒性である活性成分以外の薬学的組成物中の成分を指す。薬学的に許容可能な担体は、限定するものではないが、バッファー、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含む。
【００７２】
ここで使用される場合、「治療(treatment)」(及び「治療(treat)」又は「治療(treating)」などのその文法的バリエーション)は、治療されている個体における疾患の自然の経過を変更するための臨床的介入を指し、予防のためか又は臨床病理学の経過中に実施されうる。治療の望ましい効果は、限定するものではないが、疾患の発生又は再発の防止、症状の軽減、疾患の何れかの直接的又は間接的病理学的結果の縮小、転移の防止、疾患進行の割合の低下、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後改善を含む。幾つかの実施態様では、発明の抗体は、疾患の発生を遅延するためか又は疾患の進行を遅くするために使用される。
【００７３】
(実施態様の詳細な説明)
本発明は、免疫療法について改善された特性を有するミュータントＩＬ-２ポリペプチドを提供することを目的とする。特に、発明は、毒性に寄与するがＩＬ-２の効果には本質的ではないＩＬ-２の薬理学的特性を除去することを目的とする。上記のように、異なる形態のＩＬ-２受容体は異なるサブユニットから成り、ＩＬ-２について異なる親和性を呈する。β及びγ受容体サブユニットから成る中間親和性ＩＬ-２受容体は、休止エフェクター細胞において発現され、ＩＬ-２シグナル伝達に十分である。加えて受容体のα-サブユニットを含んでなる高親和性ＩＬ-２受容体は、制御性Ｔ(Ｔｒｅｇ)細胞並びに活性化エフェクター細胞において主に発現され、ＩＬ-２によるその会合はＴｒｅｇ細胞媒介免疫抑制又は活性化誘導細胞死(ＡＩＣＤ)をそれぞれ促進しうる。従って、理論に縛られるものではないが、ＩＬ-２受容体のα-サブユニットに対するＩＬ-２の親和性の低減又は無効化は、ＩＬ-２誘導による制御性Ｔ-細胞によるエフェクター細胞機能の下方制御、及びＡＩＣＤのプロセスによる腫瘍寛容の形成を低減させる。一方、中間親和性ＩＬ-２受容体に対する親和性の維持は、ＩＬ-２によるＮＫ及びＴ-細胞などのエフェクター細胞の増殖及び活性化の誘導を保護する。
【００７４】
幾つかのＩＬ-２ミュータントが当分野に既に存在するが、発明者は、免疫療法のためにＩＬ-２に所望の特性を与えるのに特に好適なＩＬ-２ポリペプチドの新規なアミノ酸変異及びその組合せを発見した。
第一の態様では、発明は、ＩＬ-２受容体のα-サブユニットに対するミュータントＩＬ-２ポリペプチドの親和性を無効にするか又は低減し、中間親和性ＩＬ-２受容体に対するミュータントＩＬ-２ポリペプチドの親和性を保つ(各々、野生型ＩＬ-２ポリペプチドと比較)アミノ酸変異を含んでなるミュータントインターロイキン-２(ＩＬ-２)ポリペプチドを提供する。
【００７５】
ＣＤ２５に対し低下親和性を有するヒトＩＬ-２(ｈＩＬ-２)のミュータントは例えば、アミノ酸位置３５、３８、４２、４３、４５又は７２又はその組み合わせでのアミノ酸置換によって生成されうる。例示的なアミノ酸置換は、Ｋ３５Ｅ、Ｋ３５Ａ、Ｒ３８Ａ、Ｒ３８Ｅ、Ｒ３８Ｎ、Ｒ３８Ｆ、Ｒ３８Ｓ、Ｒ３８Ｌ、Ｒ３８Ｇ、Ｒ３８Ｙ、Ｒ３８Ｗ、Ｆ４２Ｌ、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、Ｆ４２Ｋ、Ｋ４３Ｅ、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、Ｙ４５Ｋ、Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２Ｒ、及びＬ７２Ｋを含む。発明による特定のＩＬ-２ミュータントは、ヒトＩＬ-２の残基４２、４５、又は７２に対応するアミノ酸位置、又はその組合せでの変異を含む。これらのミュータントは、ＩＬ-２ミュータントの野生型形態と比較して、中間親和性ＩＬ-２受容体に対して実質的に類似な結合親和性を呈し、ＩＬ-２受容体及び高親和性ＩＬ-２受容体のα-サブユニットに対して実質的に低減された親和性を有する。
【００７６】
有用なミュータントの他の特性は、ＩＬ-２受容体-担持Ｔ及び／又はＮＫ細胞の増殖を誘導する能力、ＩＬ-２受容体-担持Ｔ及び／又はＮＫ細胞におけるＩＬ-２シグナル伝達を誘導する能力、ＮＫ細胞による二次サイトカインとしてインターフェロン(ＩＦＮ)-γを生成する能力、末梢血単核球(ＰＢＭＣ)による二次サイトカイン-特にＩＬ-１０及びＴＮＦ-α-の生成を誘導する低減された能力、制御性Ｔ-細胞を活性させる低減された能力、Ｔ-細胞におけるアポトーシスを誘導する低減された能力、及びインビボでの低減された毒性プロファイルを含みうる。
【００７７】
発明による一実施態様では、高親和性ＩＬ-２受容体に対するミュータントＩＬ-２ポリペプチドの親和性を無効にするか又は低減し、中間親和性ＩＬ-２受容体に対するミュータントＩＬ-２ポリペプチドの親和性を保つアミノ酸変異は、ヒトＩＬ-２の残基７２に対応する位置である。一実施態様では、前記アミノ酸変異はアミノ酸置換である。一実施態様では、前記アミノ酸置換は、Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２Ｒ、及びＬ７２Ｋの群から選択される。より特異的な実施態様では、前記アミノ酸変異はアミノ酸置換Ｌ７２Ｇである。
【００７８】
特定の態様では、発明は、ＩＬ-２受容体のα-サブユニットに対するミュータントＩＬ-２ポリペプチドの親和性を無効にするか又は低減し、中間親和性ＩＬ-２受容体に対するミュータントＩＬ-２ポリペプチドの親和性を保つ第一及び第二アミノ酸変異を含んでなるミュータントＩＬ-２ポリペプチドを提供する。一実施態様では、前記第一アミノ酸変異は、ヒトＩＬ-２の残基７２に対応する位置にある。一実施態様では、前記第一アミノ酸変異はアミノ酸置換である。特異的な実施態様では、前記第一アミノ酸変異は、Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２Ｒ、及びＬ７２Ｋの群から選択されるアミノ酸置換である。更により特異的な実施態様では、前記アミノ酸置換はＬ７２Ｇである。前記第二アミノ酸変異は、前記第一アミノ酸変異と異なる位置である。一実施態様では、前記第二アミノ酸変異は、ヒトＩＬ-２の残基３５、３８、４２、４３及び４５に対応する位置から選択される位置である。一実施態様では、前記第二アミノ酸変異はアミノ酸置換である。特異的な実施態様では、前記アミノ酸置換は、Ｋ３５Ｅ、Ｋ３５Ａ、Ｒ３８Ａ、Ｒ３８Ｅ、Ｒ３８Ｎ、Ｒ３８Ｆ、Ｒ３８Ｓ、Ｒ３８Ｌ、Ｒ３８Ｇ、Ｒ３８Ｙ、Ｒ３８Ｗ、Ｆ４２Ｌ、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、Ｆ４２Ｋ、Ｋ４３Ｅ、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、及びＹ４５Ｋの群から選択される。特定の実施態様では、前記第二アミノ酸変異は、ヒトＩＬ-２の残基４２又は４５に対応する位置である。特異的な実施態様では、前記第二アミノ酸変異は、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、Ｆ４２Ｋ、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、及びＹ４５Ｋの群から選択されるアミノ酸置換である。より特異的な実施態様では、前記第二アミノ酸変異はアミノ酸置換Ｆ４２Ａ又はＹ４５Ａである。更に特異的な実施態様では、前記第二アミノ酸変異は、ヒトＩＬ-２の残基４２に対応する位置にある。特異的な実施態様では、前記第二アミノ酸変異は、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２
Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、及びＦ４２Ｋの群から選択されるアミノ酸置換である。より特異的な実施態様では、前記アミノ酸置換はＦ４２Ａである。別の実施態様では、前記第二アミノ酸変異は、ヒトＩＬ-２の残基４５に対応する位置である。特異的な実施態様では、前記第二アミノ酸変異は、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、及びＹ４５Ｋの群から選択されるアミノ酸置換である。より特異的な実施態様では、前記アミノ酸置換はＹ４５Ａである。ある実施態様では、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドは、ＩＬ-２受容体のα-サブユニットに対するミュータントＩＬ-２ポリペプチドの親和性を無効にするか又は低減し、中間親和性ＩＬ-２受容体に対するミュータントＩＬ-２ポリペプチドの親和性を保つ(各々、野生型ＩＬ-２ポリペプチドと比較)第三アミノ酸変異を含む。前記第三アミノ酸変異は、前記第一及び第二アミノ酸変異と異なる位置である。一実施態様では、前記第三アミノ酸変異は、ヒトＩＬ-２の残基３５、３８、４２、４３及び４５に対応する位置から選択される位置である。好ましい実施態様では、前記第三アミノ酸変異は、ヒトＩＬ-２の残基４２又は４５に対応する位置である。一実施態様では、前記第三アミノ酸変異は、ヒトＩＬ-２の残基４２に対応する位置にある。別の実施態様では、前記第三アミノ酸変異は、ヒトＩＬ-２の残基４５に対応する位置にある。一実施態様では、前記第三アミノ酸変異はアミノ酸置換である。特異的な実施態様では、前記アミノ酸置換は、Ｋ３５Ｅ、Ｋ３５Ａ、Ｒ３８Ａ、Ｒ３８Ｅ、Ｒ３８Ｎ、Ｒ３８Ｆ、Ｒ３８Ｓ、Ｒ３８Ｌ、Ｒ３８Ｇ、Ｒ３８Ｙ、Ｒ３８Ｗ、Ｆ４２Ｌ、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、Ｆ４２Ｋ、Ｋ４３Ｅ、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、及びＹ４５Ｋの群から選択される。より特異的な実施態様では、前記アミノ酸置換は、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、Ｆ４２Ｋ、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、及びＹ４５Ｋの群から選択される。更により特異的な実施態様では、前記アミノ酸
置換はＦ４２Ａ又はＹ４５Ａである。一実施態様では、前記アミノ酸置換はＦ４２Ａである。別の実施態様では、前記アミノ酸置換はＹ４５Ａである。ある実施態様では、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドは、ヒトＩＬ-２の残基３８に対応する位置にアミノ酸変異を含まない。
【００７９】
発明の更により特定の態様では、ＩＬ-２受容体のα-サブユニットに対するミュータントＩＬ-２ポリペプチドの親和性を無効にするか又は低減するが、中間親和性ＩＬ-２受容体に対するミュータントＩＬ-２ポリペプチドの親和性を保つ３つのアミノ酸変異を含んでなるミュータントＩＬ-２ポリペプチドを提供する。一実施態様では、前記３つのアミノ酸変異は、ヒトＩＬ-２の残基４２、４５及び７２に対応する位置である。一実施態様では、前記３つのアミノ酸変異はアミノ酸置換である。一実施態様では、前記３つのアミノ酸変異は、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、Ｆ４２Ｋ、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、Ｙ４５Ｋ、Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２Ｒ、及びＬ７２Ｋの群から選択されるアミノ酸置換である。特異的な実施態様では、前記３つのアミノ酸変異はアミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇである。
【００８０】
ある実施態様では、前記アミノ酸変異は、少なくとも５-倍、特異的には少なくとも１０-倍、より特異的には少なくとも２５-倍、ＩＬ-２受容体のα-サブユニットに対するミュータントＩＬ-２ポリペプチドの親和性を低減する。ＩＬ-２受容体のα-サブユニットに対するミュータントＩＬ-２ポリペプチの親和性を低減する一以上のアミノ酸変異がある実施態様では、これらのアミノ酸変異の組合せは、ＩＬ-２受容体のα-サブユニットに対するミュータントＩＬ-２ポリペプチドの親和性を少なくとも３０-倍、少なくとも５０-倍、又は少なくとも１００-倍低減しうる。一実施態様では、前記アミノ酸変異又はアミノ酸変異の組合せは、ＩＬ-２受容体のα-サブユニットに対するミュータントＩＬ-２ポリペプチドの親和性を無効にし、下記するように結合が表面プラズモン共鳴によって検出されない。
【００８１】
中間親和性受容体に対する実質的に類似な結合、すなわち、前記受容体に対するミュータントＩＬ-２ポリペプチドの親和性の保護は、ＩＬ-２ミュータントが中間親和性ＩＬ-２受容体に対しＩＬ-２ミュータントの野生型形態の約７０％より大きい親和性を呈する場合に達成される。発明のＩＬ-２ミュータントは、約８０％より大きい、更には約９０％より大きいこのような親和性を呈しうる。
【００８２】
発明者は、ＩＬ-２のＯ-糖鎖付加の除去との組合せにおけるＩＬ-２受容体のα-サブユニットについてのＩＬ-２の親和性の低減が、改善された特性を伴うＩＬ-２タンパク質をもたらすことを発見した。例えば、Ｏ-糖鎖付加部位の除去は、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドがＣＨＯ又はＨＥＫ細胞等の哺乳類細胞において発現される時に、より均一な産物をもたらす。
【００８３】
このように、ある実施態様では、発明によるミュータントＩＬ-２ポリペプチドは、ヒトＩＬ-２の残基３に対応する位置でＩＬ-２のＯ-糖鎖付加部位を除去する更なるアミノ酸変異を含む。一実施態様では、ヒトＩＬ-２の残基３に対応する位置でＩＬ-２のＯ-糖鎖付加部位を除去する前記更なるアミノ酸変異はアミノ酸置換である。例示的なアミノ酸置換は、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｇ、Ｔ３Ｑ、Ｔ３Ｅ、Ｔ３Ｎ、Ｔ３Ｄ、Ｔ３Ｒ、Ｔ３Ｋ、及びＴ３Ｐを含む。特異的な実施態様では、前記更なるアミノ酸変異はアミノ酸置換Ｔ３Ａである。
【００８４】
ある実施態様では、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドは基本的に完全長ＩＬ-２分子である。ある実施態様では、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドはヒトＩＬ-２分子である。一実施態様では、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドは、前記変異を持たない配列番号：１を含んでなるＩＬ-２ポリペプチドと比較してＩＬ-２受容体のα-サブユニットに対するミュータントＩＬ-２ポリペプチドの親和性を無効にするか又は低減し、中間親和性ＩＬ-２受容体に対するミュータントＩＬ-２ポリペプチドの親和性を保つ少なくとも一つのアミノ酸変異を持つ配列番号：１の配列を含む。別の実施態様では、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドは、前記変異を持たない配列番号：３を含んでなるＩＬ-２ポリペプチドと比較してＩＬ-２受容体のα-サブユニットに対するミュータントＩＬ-２ポリペプチドの親和性を無効にするか又は低減し、中間親和性ＩＬ-２受容体に対するミュータントＩＬ-２ポリペプチドの親和性を保つ少なくとも一つのアミノ酸変異を持つ配列番号：３の配列を含む。
【００８５】
特異的な実施態様では、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドは、活性化Ｔリンパ球細胞の増殖、活性化Ｔリンパ球細胞の分化、細胞傷害性Ｔ-細胞(ＣＴＬ)活性、活性化Ｂ細胞の増殖、活性化Ｂ細胞の分化、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞の増殖、ＮＫ細胞の分化、活性化Ｔ-細胞又はＮＫ細胞によるサイトカイン分泌、及びＮＫ／リンパ球活性化キラー(ＬＡＫ)抗腫瘍細胞傷害性から成る群から選択される一又は複数の細胞反応を誘発しうる。
【００８６】
一実施態様では、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドは、野生型ＩＬ-２ポリペプチドと比較して、制御性Ｔ-細胞においてＩＬ-２シグナル伝達を誘導する低減された能力を有する。一実施態様では、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドは、野生型ＩＬ-２ポリペプチドと比較してＴ-細胞において少ない活性化誘導細胞死(ＡＩＣＤ)を誘導する。一実施態様では、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドは、野生型ＩＬ-２ポリペプチドと比較してインビボにおいて低減された毒性プロファイルを有する。一実施態様では、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドは野生型ＩＬ-２ポリペプチドと比較して延長された血清半減期を有する。
【００８７】
発明による特定のミュータントＩＬ-２ポリペプチドは、ヒトＩＬ-２の残基３、４２、４５及び７２に対応する位置で４つのアミノ酸置換を含む。特異的なアミノ酸置換はＴ３Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇである。添付の実施例に記載するように、前記四重ミュータントＩＬ-２ポリペプチドは、ＣＤ２５に対する検出可能な結合の無、Ｔ-細胞のいてアポトーシスを誘導する低減された能力、Ｔｒｅｇ細胞においてＩＬ-２シグナル伝達を誘導する低減された能力、及びインビボにおける低減された毒性プロファイルを呈する。しかしながら、それは、エフェクター細胞においてＩＬ-２シグナル伝達を活性化する、エフェクター細胞の増殖を誘導する、及びＮＫ細胞により２次サイトカインとしてＩＦＮ-γを生成する能力を保持する。
【００８８】
更に、前記ミュータントＩＬ-２ポリペプチドは、実施例に記載のように、更なる有利な特性、例えば低減された表面疎水性、良好な安定性、及び良好な発現産出を有する。予想外には、前記ミュータントＩＬ-２ポリペプチドはまた、野生型ＩＬ-２と比較して延長された血清半減期を提供する。
【００８９】
発明のＩＬ-２ミュータントは、ＣＤ２５又は糖鎖付加部位とのＩＬ-２のインターフェイスを形成するＩＬ-２における変異を有する他に、これらの領域外のアミノ酸配列に一又は複数の変異を有しうる。ヒトＩＬ-２におけるこのような更なる変異は、増加発現又は安定性等の更なる利点を提供しうる。例えば、米国特許第４，５１８，５８４号に記載のように、位置１２５でのシステインは、中性アミノ酸、例えばセリン、アラニン、スレオニン又はバリンで置換され得、それぞれＣ１２５Ｓ ＩＬ-２、Ｃ１２５Ａ ＩＬ-２、Ｃ１２５Ｔ ＩＬ-２又はＣ１２５Ｖ ＩＬ-２をもたらす。そこに記載されるように、ＩＬ-２のＮ-末端アラニン残基が欠失されｄｅｓ-Ａ１ Ｃ１２５Ｓ又はｄｅｓ-Ａ１ Ｃ１２５Ａ等のミュータントが産出されうる。あるいは又は併せて、ＩＬ-２ミュータントは、野生型ヒトＩＬ-２の位置１０４に通常生じるメチオニンがアラニン等の中性アミノ酸で置換される変異を含みうる(米国特許第５，２０６，３４４号を参照)。得られたミュータント、例えばｄｅｓ-Ａ１ Ｍ１０４Ａ ＩＬ-２、ｄｅｓ-Ａ１ Ｍ１０４Ａ Ｃ１２５Ｓ ＩＬ-２、Ｍ１０４Ａ ＩＬ-２、Ｍ１０４Ａ Ｃ１２５Ａ ＩＬ-２、ｄｅｓ-Ａ１ Ｍ１０４Ａ Ｃ１２５Ａ ＩＬ-２、又はＭ１０４Ａ Ｃ１２５Ｓ ＩＬ-２は(これらの及び他のミュータントは米国特許第５，１１６，９４３号及びWeiger等、Eur J Biochem 180、295-300 (1989)に見出されうる)、発明の特定のＩＬ-２変異との組合せにおいて使用されうる。
【００９０】
このように、ある実施態様では、発明によるミュータントＩＬ-２ポリペプチドは、ヒトＩＬ-２の残基１２５に対応する位置で更なるアミノ酸変異を含む。一実施態様では、前記更なるアミノ酸変異はアミノ酸置換Ｃ１２５Ａである。
【００９１】
技術者は、どの更なる変異が発明の目的のために更なる利点を提供しうるかを決定することができるだろう。例えば、中間親和性ＩＬ-２受容体に対するＩＬ-２の親和性を低減するか又は無効にするＩＬ-２配列におけるアミノ酸変異、例えばＤ２０Ｔ、Ｎ８８Ｒ又はＱ１２６Ｄが(例えばＵＳ２００７／００３６７５２を参照)、発明によるミュータントＩＬ-２ポリペプチドに含むには適切でないかもしれないことを理解するだろう。
【００９２】
一実施態様では、発明のミュータントＩＬ-２ポリペプチドは、配列番号：７、配列番号：１１、配列番号：１５、及び配列番号：１９の分から選択される配列を含む。特異的な実施態様では、発明のミュータントＩＬ-２ポリペプチドは、配列番号：１５又は配列番号：１９の配列を含む。更により特異的な実施態様では、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドは配列番号：１９の配列を含む。
【００９３】
発明のミュータントＩＬ-２ポリペプチドは、ＩＬ-２融合タンパク質、例えばイムノコンジュゲートを有するＩＬ-２の関連において特に有用である。このような融合タンパク質は、非ＩＬ-２部分に融合された発明のミュータントＩＬ-２ポリペプチドを含む。非ＩＬ-２部分は、合成又は天然タンパク質又はその一部又は変異体でありうる。例示的な非ＩＬ-２部分は、アルブミン、又は抗体ドメイン、例えば免疫グロブリンの例えばＦｃドメイン又は抗原結合ドメインを含む。
【００９４】
イムノコンジュゲートを有するＩＬ-２は、抗原結合部分及びＩＬ-２部分を含んでなる融合タンパク質である。それらは、例えば腫瘍微小環境にＩＬ-２を直接ターゲティングすることによって、ＩＬ-２療法の効果を著しく増加させる。発明によると、抗原結合部分は全体抗体又は免疫グロブリン、又は抗原特異的結合親和性等の生物学的機能を有するその一部又は変異体でありうる。
【００９５】
イムノコンジュゲート療法の利点は容易に分かる。例えば、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、腫瘍特異性エピトープを認識し、腫瘍部位へのイムノコンジュゲート分子のターゲティングをもたらす。従って、高濃度のＩＬ-２が腫瘍微小環境に送達可能であり、それによって、非コンジュゲートＩＬ-２に必要とされるよりずっと低い用量のイムノコンジュゲートを使用してここに記載の様々な免疫エフェクター細胞の活性化及び増殖がもたらされる。更に、イムノコンジュゲートの形態におけるＩＬ-２の適用はサイトカイン自体の低用量化を可能にし、ＩＬ-２の望ましくない副作用の可能性を制限し、イムノコンジュゲートによる体内の特異的部位へのＩＬ-２のターゲティングはまた全身性曝露の低減を、従って非コンジュゲートＩＬ-２より少ない副作用をもたらしうる。更に、非コンジュゲートＩＬ-２と比較したイムノコンジュゲートの増加された循環半減期は、イムノコンジュゲートの効果に寄与する。しかしながら、ＩＬ-２イムノコンジュゲートのこの特性は、ＩＬ-２分子の潜在副作用を再度悪化させうる：非コンジュゲートＩＬ-２に対する血流におけるＩＬ-２イムノコンジュゲートの有意に長い循環半減期により、融合タンパク質分子のＩＬ-２又は他の部分が脈管に通常存在する成分を活性化する確率が増加される。同じことが、Fc又はアルブミンなどの別の部分に融合されたIL-2を有する他の融合タンパク質に適用され、循環におけるIL-2の延長された半減期をもたらす。従って、IL-2の野生型形態と比較して低減された毒性を有する、発明によるミュータントIL-2ポリペプチドを含んでなるイムノコンジュゲートは特に有利である。
【００９６】
従って、発明は、少なくとも一つの非ＩＬ-２部分に連結されたここに記載のミュータントＩＬ-２ポリペプチドを更に提供する。一実施態様では、ミュータントＩＬ-２ポリペプチド及び非ＩＬ-２部分は融合タンパク質を形成し、すなわちミュータントＩＬ-２ポリペプチドは非ＩＬ-２部分とペプチド結合を共有する。一実施態様では、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドは第一及び第二非ＩＬ-２部分に連結される。一実施態様では、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドは第一抗原結合部分とアミノ-又はカルボキシ-末端ペプチド結合を共有し、第二抗原結合部分はｉ)ミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はｉｉ)第一抗原結合部分とアミノ-又はカルボキシ-末端ペプチド結合を共有する。特異的な実施態様では、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドは、前記第一非ＩＬ-２部分とカルボキシ末端ペプチド結合を、前記第二非ＩＬ-２部分とアミノ末端ペプチド結合を共有する。一実施態様では、前記非ＩＬ-２部分はターゲティング部分である。特定の実施態様では、前記非ＩＬ-２部分は抗原結合部分である(したがって、下に詳細に記載するように、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドとイムノコンジュゲートを形成する)。ある実施態様では、抗原結合部分は抗体又は抗体断片である。一実施態様では、抗原結合部分は完全長抗体である。一実施態様では、抗原結合部分は免疫グロブリン分子、具体的にはＩｇＧクラス免疫グロブリン分子、より具体的にはＩｇＧ１サブクラス免疫グロブリン分子である。このような一実施態様では、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖の一つとアミノ-末端ペプチド結合を共有する。別の実施態様では、抗原結合部分は抗体断片である。幾つかの実施態様では、前記抗原結合部分は、抗体重鎖可変領域及び抗体軽鎖可変領域を含んでなる抗体の抗原結合ドメインを含む。より特異的な実施態様では、抗原結合部分はＦａｂ分子又はｓｃＦｖ分子である。特定の実施態様では、抗原結合部分はＦａｂ分子である。別の実施態様では、抗原結合部分はｓｃＦｖ分子である。一実施態様では、前記抗原結合部分は、腫瘍細胞上又は腫瘍細胞環境中に提示される抗原に向けられる。好ましい実施態様では、前記抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質(ＦＡＰ)、テネイシン-ＣのＡ１ドメイン(ＴＮＣ Ａ１)、テネイシン-ＣのＡ２ドメイン(ＴＮＣ Ａ２)、フィブロネクチンのエクストラドメインＢ(ＥＤＢ)、癌胎児抗原(ＣＥＡ)及びメラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(ＭＣＳＰ)の群から選択される。ミュータントＩＬ-２ポリペプチドが二つ以上の抗原結合部分、例えば第一及び第二抗原結合部分に連結される場合、各々の抗原結合部分は様々な形態の抗体及び抗体断片から独立して選択されうる。例えば、第一抗原結合部分はＦａｂ分子であり、第二抗原結合部分はｓｃＦｖ分子でありうる。特異的な実施態様では、前記第一及び前記第二抗原結合部分の各々はｓｃＦｖ分子であるか、又は前記第一及び前記第二抗原結合部分の各々はＦａｂ分子である。特定の実施態様では、前記第一及び前記第二抗原結合部分の各々はＦａｂ分子である。同様に、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドが二つ以上の抗原結合部分、例えば第一及び第二抗原結合部分に連結される場合、各々の抗原結合部���が向けられる抗原は独立して選択されうる。一実施態様では、前記第一及び前記第二抗原結合部分は、異なる抗原に向けられる。別の実施態様では、前記第一及び前記第二抗原結合部分は、同じ抗原に向けられる。上記のように、抗原は具体的には腫瘍細胞上又は腫瘍細胞環境中に提示される抗原、より具体的には線維芽細胞活性化タンパク質(ＦＡＰ)、テネイシン-ＣのＡ１ドメイン(ＴＮＣ Ａ１)、テネイシン-ＣのＡ２ドメイン(ＴＮＣ Ａ２)、フィブロネクチンのエクストラドメインＢ(ＥＤＢ)、癌胎児抗原(ＣＥＡ)及びメラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(ＭＣＳＰ)の群から選択される抗原である。抗原結合領域は、イムノコンジュゲートの抗原結合ドメインと関連してここに記載される何れかの特徴を単独で又は組合せにおいて更に含みうる。
【００９７】
イムノコンジュゲート
特定の態様では、発明は、ＩＬ-２受容体のα-サブユニットに対するミュータントＩＬ-２ポリペプチドの親和性を無効にするか又は低減し、中間親和性ＩＬ-２受容体に対するミュータントＩＬ-２ポリペプチドの親和性を保つ一又は複数のアミノ酸変異を含んでなるミュータントＩＬ-２ポリペプチド、及び少なくとも一つの抗原結合部分を含んでなるイムノコンジュゲートを提供する。発明による一実施態様では、ＩＬ-２受容体のα-サブユニットに対するミュータントＩＬ-２ポリペプチドの親和性を無効にするか又は低減し、中間親和性ＩＬ-２受容体に対するミュータントＩＬ-２ポリペプチドの親和性を保つアミノ酸変異は、ヒトＩＬ-２の残基４２、４５及び７２に対応する位置から選択される位置である。一実施態様では、前記アミノ酸変異はアミノ酸置換である。一実施態様では、前記アミノ酸変異は、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、Ｆ４２Ｋ、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、Ｙ４５Ｋ、Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２Ｒ、及びＬ７２Ｋの群から選択されるアミノ酸置換、より具体的にはＦ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇの群から選択されるアミノ酸置換である。一実施態様では、アミノ酸変異は、ヒトＩＬ-２の残基４２に対応する位置である。特異的な実施態様では、前記アミノ酸変異は、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、及びＦ４２の群から選択されるアミノ酸置換である。更により特異的な実施態様では、前記アミノ酸置換はＦ４２Ａである。別の実施態様では、アミノ酸変異は、ヒトＩＬ-２の残基４５に対応する位置である。特異的な実施態様では、前記アミノ酸変異は、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、及びＹ４５Ｋの群から選択されるアミノ酸置換である。更により特異的な実施態様では、前記アミノ酸置換はＹ４５Ａである。更に別の実施態様では、アミノ酸変異は、ヒトＩＬ-２の残基７２に対応する位置である。特異的な実施態様では、前記アミノ酸変異は、Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２Ｒ、及びＬ７２Ｋの群から選択されるアミノ酸置換である。更により特異的な実施態様では、前記アミノ酸置換はＬ７２Ｇである。ある実施態様では、発明によるミュータントＩＬ-２ポリペプチドは、ヒトＩＬ-２の残基３８に対応する位置にアミノ酸変異を含まない。特定の実施態様では、発明のイムノコンジュゲートに含まれるミュータントＩＬ-２ポリペプチドは、ＩＬ-２受容体のα-サブユニットに対するミュータントＩＬ-２ポリペプチドの親和性を無効にするか又は低減し、中間親和性ＩＬ-２受容体に対するミュータントＩＬ-２ポリペプチドの親和性を保つ第一及び第二アミノ酸変異を少なくとも含む。一実施態様では、前記第一及び第二アミノ酸変異は、ヒトＩＬ-２の残基４２、４５及び７２に対応する位置から選択される２つの位置である。一実施態様では、前記第一及び第二アミノ酸変異はアミノ酸置換である。一実施態様では、第一及び第二アミノ酸変異は、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、Ｆ４２Ｋ、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、Ｙ４５Ｋ、Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２Ｒ、及びＬ７２Ｋの群から選択されるアミノ酸置換である。特定の実施態様では、前記第一及び第二アミノ酸変異は、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇの群から選択されるアミノ酸置換である。ミュータントＩＬ-２ポリペプチドは、発明のミュータントＩＬ-２ポリペプチドと関連して全段落に記載される何れかの特徴を単独で又は組合せにおいて更に含みうる。一実施態様では、前記ミュータントＩＬ-２ポリペプチドは、イムノコンジュゲートに含まれる前記抗原結合部分とアミノ-又はカルボキシ-末端ペプチド結合を共有し、すなわちイムノコンジュゲートは融合タンパク質である。ある実施態様では、前記抗原結合部分は抗体又は抗体断片である。幾つかの実施態様では、前記抗原結合部分は、抗体重鎖可変領域及び抗体軽鎖可変領域を含んでなる抗体の抗原結合ドメインを含む。抗原結合領域は、抗原結合ドメインと関連して上又は下に記載される何れかの特徴を単独で又は組合せにおいて含みうる。
【００９８】
イムノコンジュゲートフォーマット
特に適切なイムノコンジュゲートフォーマットはＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１／０２０７８３に記載されており、その全体を出典明記によりここに援用する。これらのイムノコンジュゲートは少なくとも２つの抗原結合ドメインを含む。このように、一実施態様では、本発明によるイムノコンジュゲートは、少なくともここに記載の第一ミュータントＩＬ-２ポリペプチド、及び少なくとも第一及び第二抗原結合部分を含む。特定の実施態様では、前記第一及び第二抗原結合部分は、Ｆｖ分子、特にｓｃＦｖ分子、及びＦａｂ分子から成る群から独立して選択される。特異的な実施態様では、前記第一ミュータントＩＬ-２ポリペプチドは前記第一抗原結合部分とアミノ-又はカルボキシ-末端ペプチド結合を共有し、前記第二抗原結合部分はｉ)第一ミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はｉｉ)第一抗原結合部分とアミノ-又はカルボキシ-末端ペプチド結合を共有する。特定の実施態様では、イムノコンジュゲートは、一又は複数のリンカー配列で結合される第一ミュータントＩＬ-２ポリペプチド及び第一及び第二抗原結合部分から基本的に成る。このようなフォーマットは、それらが高親和性で標的抗原(例えば腫瘍抗原)に結合するという利点を有するが、ただしＩＬ-２受容体に対する単量体結合であり、従って、標的部位以外の他の位置でのＩＬ-２受容体を担持する免疫細胞へのイムノコンジュゲートのターゲティングを回避する。特定の実施態様では、第一ミュータントＩＬ-２ポリペプチドは、第一抗原結合部分とカルボキシ-末端ペプチド結合を共有し、第二抗原結合部分とアミノ-末端ペプチド結合を更に共有する。別の実施態様では、第一抗原結合部分は、第一ミュータントＩＬ-２ポリペプチドとカルボキシ-末端ペプチド結合を共有し、第二抗原結合部分とアミノ-末端ペプチド結合を更に共有する。別の実施態様では、第一抗原結合部分は、第一ミュータントＩＬ-２ポリペプチドとアミノ-末端ペプチド結合を共有し、第二抗原結合部分とカルボキシ-末端ペプチドを更に共有する。特定の実施態様では、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドは、第一重鎖可変領域とカルボキシ-末端ペプチド結合を共有し、第二重鎖可変領域とアミノ-末端ペプチド結合を更に共有する。別の実施態様では、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドは、第一軽鎖可変領域とカルボキシ-末端ペプチド結合を共有し、第二軽鎖可変領域とアミノ-末端ペプチド結合を更に共有する。別の実施態様では、第一重又は軽鎖可変領域は、カルボキシ-末端ペプチド結合によって第一ミュータントＩＬ-２ポリペプチドに結合され、アミノ-末端ペプチド結合によって第二重又は軽鎖可変領域に更に結合される。別の実施態様では、第一重又は軽鎖可変領域は、アミノ-末端ペプチド結合によって第一ミュータントＩＬ-２ポリペプチドに結合され、カルボキシ-末端ペプチド結合によって第二重又は軽鎖可変領域に更に結合される。一実施態様では、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドは、第一Ｆａｂ重又は軽鎖とカルボキシ-末端ペプチド結合を共有し、第二Ｆａｂ重又は軽鎖とアミノ-末端ペプチド結合を更に共有する。別の実施態様では、第一Ｆａｂ重又は軽鎖は、第一ミュータントＩＬ-２ポリペプチドとカルボキシ-末端ペプチド結合を共有し、第二Ｆａｂ重又は軽鎖と��ミノ-末端ペプチド結合を更に共有する。他の実施態様では、第一Ｆａｂ重又は軽鎖は、第一ミュータントＩＬ-２ポリペプチドとアミノ-末端ペプチド結合を共有し、第二Ｆａｂ重又は軽鎖とカルボキシ-末端ペプチド結合を更に共有する。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、一又は複数のｓｃＦｖ分子とアミノ-末端ペプチド結合を共有し、一又は複数のｓｃＦｖ分子とカルボキシ-末端ペプチド結合を更に共有する第一ミュータントＩＬ-２ポリペプチドを少なくとも含む。
【００９９】
他の特に適切なイムノコンジュゲートフォーマットは、抗原結合部分として免疫グロブリン分子を含む。このような一実施態様では、イムノコンジュゲートは、ここに記載の少なくとも一つのミュータントＩＬ-２ポリペプチド及び免疫グロブリン分子、具体的にはＩｇＧ分子、より具体的にはＩｇＧ１分子を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、一以下のミュータントＩＬ-２ポリペプチドを含む。一実施態様では、免疫グロブリン分子ヒトである。一実施態様では、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドは、免疫グロブリン分子とアミノ-又はカルボキシ-末端ペプチド結合を共有する。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、一又は複数のリンカー配列で結合された、ミュータントＩＬ-２ポリペプチド及び免疫グロブリン分子、具体的にはＩｇＧ分子、より具体的にはＩｇＧ１分子から基本的に成る。特異的な実施態様では、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドは、そのアミノ-末端アミノ酸で、一法の免疫グロブリン重鎖のカルボキシ-末端アミノ酸に連結される。ある実施態様では、免疫グロブリン分子は、Ｆｃドメインに、２つの同一な免疫グロブリン重鎖のヘテロ二量体化を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの２つのポリペプチド鎖間の最も広範なタンパク質-タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにおいてである。従って、一実施態様では、前記修飾はＦｃドメインのＣＨ３ドメインにおいてである。特異的な実施態様では、前記修飾は、一方の免疫グロブリン重鎖にノブ修飾を、他方の免疫グロブリン重鎖にホール修飾を含んでなるノブ-インツ-ホール修飾である。ノブ-インツ-ホール技術が、例えばUS 5,731,168; US 7,695,936; Ridgway等, Prot Eng 9, 617-621 (1996) and Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載されている。一般的に、方法は、ヘテロ二量体形成を促進させ、ホモ二量体形成を妨げるように隆起がキャビティに位置するように、第一ポリペプチドのインターフェースに隆起(「ノブ」)を、第二ポリペプチドのインターフェースに対応するキャビティ(「ホール」)を導入することを含む。隆起は、第一ポリペプチドのインターフェースからの小さいアミノ酸側鎖を、大きい側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)で置換することによって構築される。隆起に対する同一又は類似なサイズの代償性キャビティは、大きいアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)で置換することによって第二ポリペプチドのインターフェースに造られる。隆起及びキャビティは、例えば部位特異的変異誘発又はペプチド合成によって、ポリペプチドをコードする核酸を変更することによって造られうる。特異的な実施態様では、ノブ修飾は２つの免疫グロブリン重鎖の一方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ホール修飾は２つの免疫グロブリン重鎖の他方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む。更に特異的な実施態様では、ノブ修飾を含んでなる免疫グロブリン重鎖はアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃを更に含み、ホール修飾を含んでなる免疫グロブリン重鎖はアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃを更に含む。これらの２つのシステイン残基の導入は、２つの重鎖間にジスルフィド架橋の形成をもたらし、二量体を更に安定にする(Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001))。
【０１００】
特定の実施態様では、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドは、ノブ修飾を含んでなる免疫グロブリン重鎖のカルボキシ-末端アミノ酸に連結される。
【０１０１】
他の実施例では、２つの非同一なポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を促進させる修飾は、例えばＰＣＴ公開ＷＯ２００９／０８９００４に記載のような、静電気ステアリング効果を媒介する修飾を含む。一般的に、この方法は、ホモ二量体形成が静電気的に好まれず、ヘテロ二量体化が静電気的に好まれるような、荷電アミノ酸残基による、２つのポリペプチド鎖のインターフェースでの一又は複数のアミノ酸残基の置換を含む。
【０１０２】
Ｆｃドメインは、標的組織における良好な蓄積に寄与する長い血清半減期及び好ましい組織-血液分布比を含む、好ましい薬物動態特性をイムノコンジュゲートに付与する。しかしながら、同時にそれは、好ましい抗原担持細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現している細胞へのイムノコンジュゲートの望まないターゲティングを導きうる。更に、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の共活性化はサイトカイン放出を導き得、これは、ＩＬ-２ポリペプチド及びイムノコンジュゲートの長い半減期と共に、全身性投与の際に、サイトカイン受容体の過剰な活性化及び深刻な副作用をもたらす。これにより、従来のＩｇＧ-ＩＬ-２イムノコンジュゲートは、注入反応と関連すると述べられてきた(例えばKing等、J Clin Oncol 22、4463-4473 (2004)を参照)。
【０１０３】
従って、ある実施態様では、発明によるイムノコンジュゲートに含まれる免疫グロブリン分子は、Ｆｃ受容体に対して低減された結合親和性を有するように操作されている。このような一実施態様では、免疫グロブリンは、それのＦｃドメインに、Ｆｃ受容体へのイムノコンジュゲートの結合親和性を低減させる一又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、同じ一又は複数のアミノ酸変異が、２つの免疫グロブリン重鎖の各々に存在する。一実施態様では、前記アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体へのイムノコンジュゲートの結合親和性を、少なくとも２-倍、少なくとも５-倍、又は少なくとも１０-倍低減させる。Ｆｃ受容体へのイムノコンジュゲートの結合親和性を低減させる二つ以上のアミノ酸変異がある実施態様では、これらのアミノ酸変異の組合せは、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を少なくとも１０-倍、少なくとも２０-倍、又は少なくとも５０-倍低減させうる。一実施態様では、操作された免疫グロブリン分子を含んでなるイムノコンジュゲートは、非操作の免疫グロブリン分子を含んでなるイムノコンジュゲートと比較して、Ｆｃ受容体に対し、２０％未満、具体的には１０％未満、より具体的には５％未満の結合親和性を呈する。一実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特異的な実施態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体、より特異的にはＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ受容体である。好ましくは、これらの受容体の各々への結合が低減される。幾つかの実施態様では、補体成分への結合親和性、特異的にはＣ１ｑへの結合親和性も低減される。一実施態様では、新生児Ｆｃ受容体(ＦｃＲｎ)への結合親和性は低減されない。ＦｃＲｎへの実質的に類似な結合、すなわち、前記受容体への免疫グロブリンの結合親和性の保護は、免疫グロブリン(又は前記免疫グロブリンを含んでなるイムノコンジュゲート)が、ＦｃＲｎに対し、非操作の形態の免疫グロブリン(又は前記非操作の形態の免疫グロブリンを含んでなるイムノコンジュゲート)の約７０％より大の結合親和性を呈する場合に達成される。前記免疫グロブリンを含んでなる免疫グロブリン、又はイムノコンジュゲートは、約８０％より大、さらには約９０％より大のこのような親和性を呈しうる。一実施態様では、アミノ酸変異はアミノ酸置換である。一実施態様では、免疫グロブリンは、免疫グロブリン重鎖の位置Ｐ３２９にアミノ酸置換を含む(Ｋａｂａｔ番号付け)。より特異的な実施態様では、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである。一実施態様では、免疫グロブリンは、免疫グロブリン重鎖のＳ２２８、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７及びＰ３３１から選択される位置に更なるアミノ酸置換を含む。より特異的な実施態様では、更なるアミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。特定の実施態様では、免疫グロブリンは、免疫グロブリン重鎖の位置Ｐ３２９、Ｌ２３４及びＬ２３５のにアミノ酸置換を含む。更に特定の実施態様では、免疫グロブリンはアミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ(ＬＡＬＡ Ｐ３２９Ｇ)を含む。アミノ酸置換のこの組合せは、ヒトＩ��Ｇ分子のＦｃγ受容体結合をほぼ完全に無効にし、従って抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)を含むエフェクター機能を低下させる。
【０１０４】
ある実施態様では、イムノコンジュゲートは、ミュータントＩＬ-２ポリペプチド及び抗原結合部分の間に位置する一又は複数のタンパク分解性切断部位を含む。
イムノコンジュゲートの要素(例えば抗原結合部分及び／又はミュータントＩＬ-２ポリペプチド)は、直接的に、又は様々なリンカー、特に、ここに記載されるか又は当分野で知られている一又は複数のアミノ酸、
典型的には約２−２０のアミノ酸を含んでなるペプチドリンカーを介して連結されうる。好適な非免疫原性のリンカーペプチドは、例えば(Ｇ４Ｓ)ｎ、(ＳＧ４)ｎ又はＧ４(ＳＧ４)ｎリンカーペプチド(式中、ｎは一般的には１及び１０の間、典型的には２及び４の数)を含む。
【０１０５】
抗原結合部分
発明のイムノコンジュゲートの抗原結合部分は一般的に、特異的抗原決定基に結合するポリペプチド分子であり、それが結合している実体(例えばミュータントＩＬ-２ポリペプチド又は第二抗原結合部分)を標的部位に、例えば抗原決定基を担持する特異的タイプの腫瘍細胞又は腫瘍間質に向けることができる。イムノコンジュゲートは、例えば、腫瘍細胞の表面上、ウィルス感染細胞の表面上、他の疾患細胞の表面上、血清中に遊離して、及び／又は細胞外マトリックス(ＥＣＭ)中に見られる抗原決定基に結合しうる。
【０１０６】
腫瘍抗原の非限定の例は、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ-１／Ｍｅｌａｎ-Ａ、ｇｐ１００、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ(ＤＰＰＩＶ)、アデノシンデアミナーゼ-結合タンパク質(ＡＤＡｂｐ)、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原(ＣＲＣ)-Ｃ０１７-１Ａ／ＧＡ７３３、癌胎児抗原(ＣＥＡ)及びその免疫原性エピトープＣＡＰ-１及びＣＡＰ-２、ｅｔｖ６、ａｍｌ１、前立腺特異的抗原(ＰＳＡ)及びその免疫原性エピトープＰＳＡ-１、ＰＳＡ-２、及びＰＳＡ-３、前立腺-特異的膜抗原(ＰＳＭＡ)、Ｔ-細胞受容体／ＣＤ３-ゼータ鎖、腫瘍抗原のＭＡＧＥ-ファミリー(例えばＭＡＧＥ-Ａ１、ＭＡＧＥ-Ａ２、ＭＡＧＥ-Ａ３、ＭＡＧＥ-Ａ４、ＭＡＧＥ-Ａ５、ＭＡＧＥ-Ａ６、ＭＡＧＥ-Ａ７、ＭＡＧＥ-Ａ８、ＭＡＧＥ-Ａ９、ＭＡＧＥ-Ａ１０、ＭＡＧＥ-Ａ１１、ＭＡＧＥ-Ａ１２、ＭＡＧＥ-Ｘｐ２(ＭＡＧＥ-Ｂ２)、ＭＡＧＥ-Ｘｐ３(ＭＡＧＥ-Ｂ３)、ＭＡＧＥ-Ｘｐ４(ＭＡＧＥ-Ｂ４)、ＭＡＧＥ-Ｃ１、ＭＡＧＥ-Ｃ２、ＭＡＧＥ-Ｃ３、ＭＡＧＥ-Ｃ４、ＭＡＧＥ-Ｃ５)、腫瘍抗原のＧＡＧＥ-ファミリー(例えばＧＡＧＥ-１、ＧＡＧＥ-２、ＧＡＧＥ-３、ＧＡＧＥ-４、ＧＡＧＥ-５、ＧＡＧＥ-６、ＧＡＧＥ-７、ＧＡＧＥ-８、ＧＡＧＥ-９)、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ-１、ＮＡＧ、ＧｎＴ-Ｖ、ＭＵＭ-１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、ＲＣＡＳ１、α-フェトプロテイン、Ｅ-カドヘリン、α-カテニン、β-カテニン及びγ-カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００ Ｐｍｅｌ１１７、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ-ＥＳＯ-１、ｃｄｃ２７、大腸腺腫症タンパク質(ＡＰＣ)、フォドリン、コネキシン３７、Ｉｇ-イディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２及びＧＤ２ガングリオシド、ウイルス産物、例えばヒトパピローマウイルスタンパク質、腫瘍抗原のＳｍａｄファミリー、ｌｍｐ-１、Ｐ１Ａ、ＥＢＶ-コード核内抗原(ＥＢＮＡ)-１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ-１、ＳＳＸ-２(ＨＯＭ-ＭＥＬ-４０)、ＳＳＸ-１、ＳＳＸ-４、ＳＳＸ-５、ＳＣＰ-１及びＣＴ-７、及びｃ-ｅｒｂＢ-２を含む。
【０１０７】
ウィルス性抗原の非限定例は、インフルエンザウイルス血球凝集素、エプスタイン・バーウイルスＬＭＰ-１、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２糖タンパク質、ＨＩＶ ｇｐ１６０、及びＨＩＶ ｇｐ１２０を含む。
【０１０８】
ＥＣＭ抗原の非限定例は、シンデカン、ヘパラナーゼ、インテグリン、オステオポンチン、リンク、カドヘリン、ラミニン、ラミニンタイプＥＧＦ、レクチン、フィブロネクチン、ノッチ、テネイシン、及びマトリキシン(matrixin)を含む。
【０１０９】
発明のイムノコンジュゲートは、細胞表面抗原の以下の具体的な非限定例に結合できる：ＦＡＰ、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ-１Ｒ、ＣＤ２(Ｔ-細胞表面抗原)、ＣＤ３(ＴＣＲに伴うヘテロ多量体)、ＣＤ２２(Ｂ-細胞受容体)、ＣＤ２３(低親和性 ＩｇＥ受容体)、ＣＤ３０(サイトカイン受容体)、ＣＤ３３(骨髄系細胞表面抗原)、ＣＤ４０(腫瘍壊死因子受容体)、ＩＬ-６Ｒ(ＩＬ６受容体)、ＣＤ２０、ＭＣＳＰ、及びＰＤＧＦβＲ(β血小板由来増殖因子受容体)。
【０１１０】
一実施態様では、発明のイムノコンジュゲートは二以上の抗原結合部分を含み、これらの抗原結合部分の各々は同じ抗原決定基に特異的に結合する。別の実施態様では、発明のイムノコンジュゲートは二以上の抗原結合部分を含み、これらの抗原結合部分の各々は異なる抗原決定基に特異的に結合する。
【０１１１】
抗原結合部分は、抗原決定基への特異的結合を保持した何れかのタイプの抗体又はその断片でありうる。抗体断片は、限定するものではないが、ＶＨ断片、ＶＬ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ(ａｂ’)２断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、及びテトラボディ(例えばHudson and Souriau, Nature Med 9, 129-134 (2003)を参照)を含む。
【０１１２】
特に好適な抗原結合部分は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１／０２０７８３に記載されており、その全体を出典明記によりここに援用する。
【０１１３】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、フィブロネクチンのエクストラドメインＢ(ＥＤＢ)に特異的な少なくとも一、典型的には二以上の抗原結合部分を含む。別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、ＥＤＢのエピトープへの結合についてモノクローナル抗体Ｌ１９と競合しうる少なくとも一、典型的には二以上の抗原結合部分を含む。例えばＰＣＴ公開ＷＯ２００７／１２８５６３(その全体を出典明記によりここに援用する)を参照のこと。更に別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、Ｌ１９モノクローナル抗体由来の第一Ｆａｂ重鎖がカルボキシ-末端ペプチド結合をミュータントＩＬ-２ポリペプチドと共有し、次いでこれがカルボキシ-末端ペプチド結合をＬ１９モノクローナル抗体由来の第二Ｆａｂ重鎖と共有するポリペプチド配列を含む。更に別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、Ｌ１９モノクローナル抗体由来の第一Ｆａｂ軽鎖がカルボキシ-末端ペプチド結合をミュータントＩＬ-２ポリペプチドと共有し、次いでこれがカルボキシ-末端ペプチド結合をＬ１９モノクローナル抗体由来の第二Ｆａｂ軽鎖と共有するポリペプチド配列を含む。更なる実施態様では、イムノコンジュゲートは、Ｌ１９モノクローナル抗体由来の第一ｓｃＦｖがカルボキシ-末端ペプチド結合をミュータントＩＬ-２ポリペプチドと共有し、次いでこれがカルボキシ-末端ペプチド結合をＬ１９モノクローナル抗体由来の第二ｓｃＦｖと共有するポリペプチド配列を含む。
【０１１４】
より特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１９９のポリペプチド配列又は機能性を保ったその変異体を含む。別の実施態様では、イムノコンジュゲートはＬ１９モノクローナル抗体由来のＦａｂ軽鎖を含む。より特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２０１又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列を含む。更に別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１９９及び配列番号：２０１又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な２つのポリペプチド配列を含む。別の特異的な実施態様では、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合によって共有結合される。
【０１１５】
一実施態様では、発明のイムノコンジュゲートは、テネイシンのＡ１ドメイン(ＴＮＣ-Ａ１)に特異的な少なくとも一、典型的には二以上の抗原結合部分を含む。別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、ＴＮＣ-Ａ１のエピトープへの結合についてモノクローナル抗体Ｆ１６と競合しうる少なくとも一、典型的には二以上の抗原結合部分を含む。例えばＰＣＴ公開ＷＯ２００７／１２８５６３Ａ１(その全体を出典明記によりここに援用する)を参照のこと。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、テネイシンのＡ１及び／又はＡ４ドメイン(ＴＮＣ-Ａ１又はＴＮＣ-Ａ４又はＴＮＣ-Ａ１／Ａ４)に特異的な少なくとも一、典型的には二以上の抗原結合部分を含む。別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、テネイシンのＡ１ドメインに特異的な第一Ｆａｂ重鎖がカルボキシ-末端ペプチド結合をミュータントＩＬ-２ポリペプチドと共有し、次いでこれがカルボキシ-末端ペプチド結合をテネイシンのＡ１ドメインに特異的な第二Ｆａｂ重鎖と共有するポリペプチド配列を含む。更に別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、テネイシンのＡ１ドメインに特異的な第一Ｆａｂ軽鎖がカルボキシ-末端ペプチド結合をミュータントＩＬ-２ポリペプチドと共有し、次いでこれがカルボキシ-末端ペプチド結合をテネイシンのＡ１ドメインに特異的な第二Ｆａｂ軽鎖と共有するポリペプチド配列を含む。更なる実施態様では、イムノコンジュゲートは、テネイシンのＡ１ドメインに特異的な第一ｓｃＦｖがカルボキシ-末端ペプチド結合をミュータントＩＬ-２ポリペプチドと共有し、次いでこれがカルボキシ-末端ペプチド結合をテネイシンのＡ１ドメインに特異的な第二ｓｃＦｖと共有するポリペプチド配列を含む。別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、ＴＮＣ-Ａ１に特異的な免疫グロブリン重鎖がカルボキシ-末端ペプチド結合をミュータントＩＬ-２ポリペプチドと共有するポリペプチド配列を含む。
【０１１６】
特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：３３又は配列番号：３５又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な重鎖可変領域配列を含む。別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：２９又は配列番号：３１又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な軽鎖可変領域配列を含む。より特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：３３又は配列番号：３５又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な重鎖可変領域配列、及び配列番号：２９又は配列番号：３１又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な軽鎖可変領域配列を含む。
【０１１７】
別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の重鎖可変領域配列は、配列番号：３４又は配列番号：３６に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一なポリヌクレオチド配列にコードされる。更に別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の重鎖可変領域配列は、配列番号：３４又は配列番号：３６のポリヌクレオチド配列にコードされる。別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の軽鎖可変領域配列は、配列番号：３０又は配列番号：３２に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一なポリヌクレオチド配列にコードされる。更に別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の軽鎖可変領域配列は、配列番号：３０又は配列番号：３２のポリヌクレオチド配列にコードされる。
【０１１８】
特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２０３又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列を含む。別の特異的な実施態様では、発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２０５又は配列番号：２１５又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列を含む。更に別の特異的な実施態様では、発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２０７又は配列番号：２３７又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列を含む。より特異的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２０５及び配列番号：２０７又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な２つのポリペプチド配列を含む。別の特異的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２１５及び配列番号：２３７又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な２つのポリペプチド配列を含む。
【０１１９】
特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２０４に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一なポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド配列を含む。別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２０４のポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド配列を含む。別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２０６又は配列番号：２１６に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一なポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド配列を含む。更に別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２０６又は配列番号：２１６のポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド配列を含む。別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２０８又は配列番号：２３８に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一なポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド配列を含む。更に別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２０８又は配列番号：２３８のポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド配列を含む。
【０１２０】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、テネイシンのＡ２ドメイン(ＴＮＣ-Ａ２)に特異的な少なくとも一、典型的には二以上の抗原結合部分を含む。別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、テネイシンのＡ２ドメインに特異的な第一Ｆａｂ重鎖がカルボキシ-末端ペプチド結合をＩＬミュータントＩＬ-２ポリペプチドと共有し、次いでこれがカルボキシ-末端ペプチド結合をテネイシンのＡ２ドメインに特異的な第二Ｆａｂ重鎖と共有するポリペプチド配列を含む。更に別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、テネイシンのＡ２ドメインに特異的な第一Ｆａｂ軽鎖がカルボキシ-末端ペプチド結合をミュータントＩＬ-２ポリペプチドと共有し、次いでこれがカルボキシ-末端ペプチド結合をテネイシンのＡ２ドメインに特異的な第二Ｆａｂ軽鎖と共有するポリペプチド配列を含む。別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、ＴＮＣ-Ａ２に特異的な免疫グロブリン重鎖がカルボキシ-末端ペプチド結合をミュータントＩＬ-２ポリペプチドと共有するポリペプチド配列を含む。
【０１２１】
特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：２７、配列番号：１５９、配列番号：１６３、配列番号：１６７、配列番号：１７１、配列番号：１７５、配列番号：１７９、配列番号：１８３及び配列番号：１８７又は機能性を保ったその変異体の群から選択される配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な重鎖可変領域配列を含む。別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：２３、配列番号：２５；配列番号：１５７、配列番号：１６１、配列番号：１６５、配列番号：１６９、配列番号：１７３、配列番号：１７７、配列番号：１８１及び配列番号：１８５又は機能性を保ったその変異体の群から選択される配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な軽鎖可変領域配列を含む。より特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：２７、配列番号：１５９、配列番号：１６３、配列番号：１６７、配列番号：１７１、配列番号：１７５、配列番号：１７９、配列番号：１８３及び配列番号：１８７又は機能性を保ったその変異体の群から選択される配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な重鎖可変領域配列、及び配列番号：２３、配列番号：２５；配列番号：１５７、配列番号：１６１、配列番号：１６５、配列番号：１６９、配列番号：１７３、配列番号：１７７、配列番号：１８１及び配列番号：１８５又は機能性を保ったその変異体の群から選択される配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な軽鎖可変領域配列を含む。
【０１２２】
別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の重鎖可変領域配列は、配列番号：２８、配列番号：１６０、配列番号：１６４、配列番号：１６８、配列番号：１７２、配列番号：１７６、配列番号：１８０、配列番号：１８４及び配列番号：１８８の群から選択される配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一なポリヌクレオチド配列にコードされる。更に別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の重鎖可変領域配列は、配列番号：２８、配列番号：１６０、配列番号：１６４、配列番号：１６８、配列番号：１７２、配列番号：１７６、配列番号：１８０、配列番号：１８４及び配列番号：１８８の群から選択されるポリヌクレオチド配列にコードされる。別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の軽鎖可変領域配列は、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：１５８、配列番号：１６２、配列番号：１６６、配列番号：１７０、配列番号：１７４、配列番号：１７８、配列番号：１８２及び配列番号：１８６の群から選択される配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一なポリヌクレオチド配列にコードされる。更に別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の軽鎖可変領域配列は、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：１５８、配列番号：１６２、配列番号：１６６、配列番号：１７０、配列番号：１７４、配列番号：１７８、配列番号：１８２及び配列番号：１８６の群から選択されるポリヌクレオチド配列にコードされる。
【０１２３】
特異的な実施態様では、発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２４１、配列番号：２４３及び配列番号：２４５又は機能性を保ったその変異体の群から選択される配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列を含む。別の特異的な実施態様では、発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２４７、配列番号：２４９及び配列番号：２５１又は機能性を保ったその変異体の群から選択される配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列を含む。より特異的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２４１、配列番号：２４３、及び配列番号：２４５又は機能性を保ったその変異体の群から選択される配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列、及び配列番号：２４７、配列番号：２４９及び配列番号：２５１又は機能性を保ったその変異体の群から選択される配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列を含む。別の特異的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２４１及び配列番号：２４９又は配列番号：２５１又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な２つのポリペプチド配列を含む。更に別の特異的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２４３及び配列番号：２４７又は配列番号：２４９又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な２つのポリペプチド配列を含む。別の特異的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２４５及び配列番号：２４７又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な２つのポリペプチド配列を含む。
【０１２４】
特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２４２、配列番号：２４４及び配列番号：２４６の群から選択される配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一なポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド配列を含む。別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２４２、配列番号：２４４及び配列番号：２４６の群から選択されるポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド配列を含む。別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２４８、配列番号：２５０及び配列番号：２５２の群から選択される配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一なポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド配列を含む。更に別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２４８、配列番号：２５０及び配列番号：２５２の群から選択されるポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド配列を含む。
【０１２５】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、線維芽細胞活性化タンパク質(ＦＡＰ)に特異的な少なくとも一、典型的には二以上の抗原結合部分を含む。別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、ＦＡＰに特異的な第一Ｆａｂ重鎖がカルボキシ-末端ペプチド結合をミュータントＩＬ-２ポリペプチドと共有し、次いでこれがカルボキシ-末端ペプチド結合をＦＡＰに特異的な第二Ｆａｂ重鎖と共有するポリペプチド配列を含む。更に別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、ＦＡＰに特異的な第一Ｆａｂ軽鎖がカルボキシ-末端ペプチド結合をミュータントＩＬ-２ポリペプチドと共有し、次いでこれがカルボキシ-末端ペプチド結合をＦＡＰに特異的な第二Ｆａｂ軽鎖と共有するポリペプチド配列を含む。別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、ＦＡＰに特異的な免疫グロブリン重鎖がカルボキシ-末端ペプチド結合をミュータントＩＬ-２ポリペプチドと共有するポリペプチド配列を含む。
【０１２６】
特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：４１、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：５１、配列番号：５５、配列番号：５９、配列番号：６３、配列番号：６７、配列番号：７１、配列番号：７５、配列番号：７９、配列番号：８３、配列番号：８７、配列番号：９１、配列番号：９５、配列番号：９９、配列番号：１０３、配列番号：１０７、配列番号：１１１、配列番号：１１５、配列番号：１１９、配列番号：１２３、配列番号：１２７、配列番号：１３１、配列番号：１３５、配列番号：１３９、配列番号：１４３、配列番号：１４７、配列番号：１５１及び配列番号：１５５又は機能性を保ったその変異体から成る群から選択される配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な重鎖可変領域配列を含む。別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４３、配列番号：４９、配列番号：５３、配列番号：５７、配列番号：６１、配列番号：６５、配列番号：６９、配列番号：７３、配列番号：７７、配列番号：８１、配列番号：８５、配列番号：８９、配列番号：９３、配列番号：９７、配列番号：１０１、配列番号：１０５、配列番号：１０９、配列番号：１１３、配列番号：１１７、配列番号：１２１、配列番号：１２５、配列番号：１２９、配列番号：１３３、配列番号：１３７、配列番号：１４１、配列番号：１４５、配列番号：１４９及び配列番号：１５３又は機能性を保ったその変異体から成る群から選択される配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な軽鎖可変領域配列を含む。より特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：４１、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：５１、配列番号：５５、配列番号：５９、配列番号：６３、配列番号：６７、配列番号：７１、配列番号：７５、配列番号：７９、配列番号：８３、配列番号：８７、配列番号：９１、配列番号：９５、配列番号：９９、配列番号：１０３、配列番号：１０７、配列番号：１１１、配列番号：１１５、配列番号：１１９、配列番号：１２３、配列番号：１２７、配列番号：１３１、配列番号：１３５、配列番号：１３９、配列番号：１４３、配列番号：１４７、配列番号：１５１及び配列番号：１５５又は機能性を保ったその変異体から成る群から選択される配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な重鎖可変領域配列、及び配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４３、配列番号：４９、配列番号：５３、配列番号：５７、配列番号：６１、配列番号：６５、配列番号：６９、配列番号：７３、配列番号：７７、配列番号：８１、配列番号：８５、配列番号：８９、配列番号：９３、配列番号：９７、配列番号：１０１、配列番号：１０５、配列番号：１０９、配列番号：１１３、配列番号：１１７、配列番号：１２１、配列番号：１２５、配列番号：１２９、配列番号：１３３、配列番号：１３７、配列番号：１４１、配列番号：１４５、配列番号：１４９及び配列番号：１５３又は機能性を保ったその変異体から成る群から選択される配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な軽鎖可変領域配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：４１の重鎖可変領域配列及び配列番号：３９の軽鎖可変領域配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：５１の重鎖可変領域配列及び配列番号：４９の軽鎖可変領域配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：１１１の重鎖可変領域配列及び配列番号：１０９の軽鎖可変領域配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：１４３の重鎖可変領域配列及び配列番号：１４１の軽鎖可変領域配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：１５１の重鎖可変領域配列及び配列番号：１４９の軽鎖可変領域配列を含む。
【０１２７】
別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の重鎖可変領域配列は、配列番号：４２、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５２、配列番号：５６、配列番号：６０、配列番号：６４、配列番号：６８、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：８０、配列番号：８４、配列番号：８８、配列番号：９２、配列番号：９６、配列番号：１００、配列番号：１０４、配列番号：１０８、配列番号：１１２、配列番号：１１６、配列番号：１２０、配列番号：１２４、配列番号：１２８、配列番号：１３２、配列番号：１３６、配列番号：１４０、配列番号：１４４、配列番号：１４８、配列番号：１５２、及び配列番号：１５６から成る群から選択される配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一なポリヌクレオチド配列にコードされる。更に別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の重鎖可変領域配列は、配列番号：４２、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５２、配列番号：５６、配列番号：６０、配列番号：６４、配列番号：６８、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：８０、配列番号：８４、配列番号：８８、配列番号：９２、配列番号：９６、配列番号：１００、配列番号：１０４、配列番号：１０８、配列番号：１１２、配列番号：１１６、配列番号：１２０、配列番号：１２４、配列番号：１２８、配列番号：１３２、配列番号：１３６、配列番号：１４０、配列番号：１４４、配列番号：１４８、配列番号：１５２、及び配列番号：１５６から成る群から選択されるポリヌクレオチド配列にコードされる。別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の軽鎖可変領域配列は、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４４、配列番号：５０、配列番号：５４、配列番号：５８、配列番号：６２、配列番号：６６、配列番号：７０、配列番号：７４、配列番号：７８、配列番号：８２、配列番号：８６、配列番号：９０、配列番号：９４、配列番号：９８、配列番号：１０２、配列番号：１０６、配列番号：１１０、配列番号：１１４、配列番号：１１８、配列番号：１２２、配列番号：１２６、配列番号：１３０、配列番号：１３４、配列番号：１３８、配列番号：１４２、配列番号：１４６、配列番号：１５０、及び配列番号：１５４から成る群から選択される配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一なポリヌクレオチド配列にコードされる。更に別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の軽鎖可変領域配列は、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４４、配列番号：５０、配列番号：５４、配列番号：５８、配列番号：６２、配列番号：６６、配列番号：７０、配列番号：７４、配列番号：７８、配列番号：８２、配列番号：８６、配列番号：９０、配列番号：９４、配列番号：９８、配列番号：１０２、配列番号：１０６、配列番号：１１０、配列番号：１１４、配列番号：１１８、配列番号：１２２、配列番号：１２６、配列番号：１３０、配列番号：１３４、配列番号：１３８、配列番号：１４２、配列番号：１４６、配列番号：１５０、及び配列番号：１５４から成る群から選択されるポリヌクレオチド配列にコードされる。
【０１２８】
別の特異的な実施態様では、発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２０９、配列番号：２１１、配列番号：２１３、配列番号：２１７、配列番号：２１９、配列番号：２２１、配列番号：２２３、配列番号：２２５、配列番号：２２７、及び配列番号：２２９又は機能性を保ったその変異体の群から選択される配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列を含む。更に別の特異的な実施態様では、発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２３１、配列番号：２３３、配列番号：２３５及び配列番号：２３９又は機能性を保ったその変異体の群から選択される配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列を含む。より特異的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２１１又は配列番号：２１９又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列、及び配列番号：２３３又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列を含む。別の特異的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２０９、配列番号：２２１、配列番号：２２３、配列番号：２２５、配列番号：２２７及び配列番号：２２９又は機能性を保ったその変異体の群から選択される配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列、及び配列番号：２３１又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列を含む。更に特異的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２１３及び配列番号：２３５又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な２つのポリペプチド配列を含む。更に別の特異的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２１７及び配列番号：２３９又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な２つのポリペプチド配列を含む。更に別の特異的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２１９及び配列番号：２３３又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な２つのポリペプチド配列を含む。更に別の特異的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２２１及び配列番号：２３１又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な２つのポリペプチド配列を含む。更に別の特異的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２２３及び配列番号：２３１又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な２つのポリペプチド配列を含む。更に別の特異的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２２５及び配列番号：２３１又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な２つのポリペプチド配列を含む。更に別の特異的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２２７及び配列番号：２３１又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な２つのポリペプチド配列を含む。更に別の特異的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２２９及び配列番号：２３１又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な２つのポリペプチド配列を含む。更に別の特異的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２１１及び配列番号：２３３又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な２つのポリペプチド配列を含む。
【０１２９】
別の特異的な実施態様では、発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２９７、配列番号：３０１及び配列番号：３１５又は機能性を保ったその変異体の群から選択される配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列を含む。更に別の特異的な実施態様では、発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２９９、配列番号：３０３及び配列番号：３１７又は機能性を保ったその変異体の群から選択される配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列を含む。より特異的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２９７又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列、配列番号：２９９又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列、及び配列番号：２３３又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列を含む。別の特異的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：３０１又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列、配列番号：３０３又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列、及び配列番号：２３１又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列を含む。更に別の特異的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：３１５又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列、配列番号：３１７又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列、及び配列番号：２３３又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列を含む。
【０１３０】
別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２１０、配列番号：２１２、配列番号：２１４、配列番号：２１８、配列番号：２２０、配列番号：２２２、配列番号：２２４、配列番号：２２６、配列番号：２２８、及び配列番号：２３０の群から選択される配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一なポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド配列を含む。更に別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２１０、配列番号：２１２、配列番号：２１４、配列番号：２１８、配列番号：２２０、配列番号：２２２、配列番号：２２４、配列番号：２２６、配列番号：２２８、及び配列番号：２３０の群から選択されるポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド配列を含む。別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２３２、配列番号：２３４、配列番号：２３６、及び配列番号：２４０の群から選択される配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一なポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド配列を含む。更に別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２３２、配列番号：２３４、配列番号：２３６、及び配列番号：２４０の群から選択されるポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド配列を含む。
【０１３１】
別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２９８、配列番号：３０２及び配列番号：３１６の群から選択される配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一なポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド配列を含む。更に別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２９８、配列番号：３０２及び配列番号：３１６の群から選択されるポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド配列を含む。別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：３００、配列番号：３０４及び配列番号：３１８の群から選択される配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一なポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド配列を含む。更に別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：３００、配列番号：３０４及び配列番号：３１８の群から選択されるポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド配列を含む。
【０１３２】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(ＭＣＳＰ)に特異的な少なくとも一、典型的には二以上の抗原結合部分を含む。別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、ＭＣＳＰに特異的な第一Ｆａｂ重鎖がカルボキシ-末端ペプチド結合をミュータントＩＬ-２ポリペプチドと共有し、次いでこれがカルボキシ-末端ペプチド結合をＭＣＳＰに特異的な第二Ｆａｂ重鎖と共有するポリペプチド配列を含む。更に別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、ＭＣＳＰに特異的な第一Ｆａｂ軽鎖がカルボキシ-末端ペプチド結合をＩＬ-２分子と共有し、次いでこれがカルボキシ-末端ペプチド結合をＭＣＳＰに特異的な第二Ｆａｂ軽鎖と共有するポリペプチド配列を含む。別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、ＭＣＳＰに特異的な免疫グロブリン重鎖がカルボキシ-末端ペプチド結合をミュータントＩＬ-２ポリペプチドと共有するポリペプチド配列を含む。
【０１３３】
特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：１８９又は配列番号：１９３又は機能性を保ったその変異体の配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な重鎖可変領域配列を含む。別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：１９１又は配列番号：１９７又は機能性を保ったその変異体の配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な軽鎖可変領域配列を含む。より特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：１８９又は配列番号：１９３又は機能性を保ったその変異体の配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な重鎖可変領域配列、及び配列番号：１９１又は配列番号：１９７又は機能性を保ったその変異体の配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な軽鎖可変領域配列を含む。より特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：１８９の配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な重鎖可変領域配列、及び配列番号：１９１の配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な軽鎖可変領域配列を含む。別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：１９３の配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な重鎖可変領域配列、及び配列番号：１９１の配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な軽鎖可変領域配列を含む。
【０１３４】
別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の重鎖可変領域配列は、配列番号：１９０又は配列番号：１９４の配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一なポリヌクレオチド配列にコードされる。更に別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の重鎖可変領域配列は、配列番号：１９０又は配列番号：１９４のポリヌクレオチド配列にコードされる。別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の軽鎖可変領域配列は、配列番号：１９２又は配列番号：１９８の配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一なポリヌクレオチド配列にコードされる。更に別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の軽鎖可変領域配列は、配列番号：１９２又は配列番号：１９８のポリヌクレオチド配列にコードされる。
【０１３５】
特異的な実施態様では、発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２５３又は配列番号：２５７又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列を含む。別の特異的な実施態様では、発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２５５又は配列番号：２６１又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列を含む。より特異的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２５３又は配列番号：２５７又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列、及び配列番号：２５５又は配列番号：２６１又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列を含む。別の特異的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２５３又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列、及び配列番号：２５５又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列を含む。別の特異的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２５７又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列、及び配列番号：２５５又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列を含む。
【０１３６】
別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５４又は配列番号：２５８の配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一なポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド配列を含む。更に別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５４又は配列番号：２５８のポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド配列を含む。別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５６又は配列番号：２６２の配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一なポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド配列を含む。更に別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５６又は配列番号：２６２のポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド配列を含む。
【０１３７】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、癌胎児抗原(ＣＥＡ)に特異的な少なくとも一、典型的には二以上の抗原結合部分を含む。
別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、ＣＥＡに特異的な第一Ｆａｂ重鎖がカルボキシ-末端ペプチド結合をミュータントＩＬ-２ポリペプチドと共有し、次いでこれがカルボキシ-末端ペプチド結合をＣＥＡに特異的な第二Ｆａｂ重鎖と共有するポリペプチド配列を含む。更に別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、ＣＥＡに特異的な第一Ｆａｂ重鎖がカルボキシ-末端ペプチド結合をミュータントＩＬ-２ポリペプチドと共有し、次いでこれがカルボキシ-末端ペプチド結合をＣＥＡに特異的な第二Ｆａｂ重鎖と共有するポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、ＣＥＡに特異的な免疫グロブリン重鎖がカルボキシ-末端ペプチド結合をミュータントＩＬ-２ポリペプチドと共有するポリペプチド配列を含む。特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：３１３又は機能性を保ったその変異体の配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な重鎖可変領域配列を含む。別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：３１１又は機能性を保ったその変異体の配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な軽鎖可変領域配列を含む。より特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：３１３又は機能性を保ったその変異体の配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な重鎖可変領域配列、及び配列番号：３１１又は機能性を保ったその変異体の配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一な軽鎖可変領域配列を含む。
【０１３８】
別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の重鎖可変領域配列は、配列番号：３１４の配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一なポリヌクレオチド配列にコードされる。更に別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の重鎖可変領域配列は、配列番号：３１４のポリヌクレオチド配列にコードされる。別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の軽鎖可変領域配列は、配列番号：３１２の配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一なポリヌクレオチド配列にコードされる。更に別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の軽鎖可変領域配列は、配列番号：３１２のポリヌクレオチド配列にコードされる。
【０１３９】
別の特異的な実施態様では、発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：３１９又は機能性を保ったその変異体の配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列を含む。更に別の特異的な実施態様では、発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：３２１又は機能性を保ったその変異体の配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列を含む。更に別の特異的な実施態様では、発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：３２３又は機能性を保ったその変異体の配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列を含む。より特異的な実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：３１９又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列、配列番号：３２１又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列、及び配列番号：３２３又は機能性を保ったその変異体に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一なポリペプチド配列を含む。
【０１４０】
別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：３２０の配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一なポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド配列を含む。更に別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：３２０のポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド配列を含む。別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：３２２の配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一なポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド配列を含む。更に別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：３２２のポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド配列を含む。別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：３２４の配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一なポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド配列を含む。更に別の特異的な実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：３２４のポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド配列を含む。
【０１４１】
発明の抗原結合部分は、配列番号２３−２６１(奇数)、２９７−３０３(奇数)、３１１及び３１３に記載のペプチド配列(その機能的断片又は変異体を含む)に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一な配列を有するものを含む。発明はまた、保存的アミノ酸置換を伴う配列番号２３−２６１(奇数)、２９７−３０３(奇数)、３１１及び３１３の配列を含んでなる抗原結合部分を包含する。
【０１４２】
ポリヌクレオチド
発明は、ここに記載のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はミュータントＩＬ-２ポリペプチドを含んでなるイムノコンジュゲートをコードする単離ポリヌクレオチドを更に提供する。
【０１４３】
発明のポリヌクレオチドは、配列番号２、４、５、６、８、９、１０、１２、１３、１４、１６、１７、１８、２０、２１、２２、２４−２６２(偶数)、２９３−２９６、及び２９８−３２４(偶数)に記載の配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なものを含み、その断片又は変異体を含む。
【０１４４】
非ＩＬ-２部分に連結されていないミュータントＩＬ-２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ポリペプチド全体をコードする単一ポリヌクレオチドとして一般的に発現される。
【０１４５】
一実施態様では、本発明はミュータントＩＬ-２ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドであって、配列番号：７、１１、１５  又は１９のミュータントＩＬ-２配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドを指向する。発明はまた、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドであって、保存アミノ酸置換と共に配列番号：７、１１、１５  又は１９のミュータントＩＬ-２ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
【０１４６】
別の実施態様では、発明は、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドであって、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２９３、配列番号：２９４、配列番号：２９５及び配列番号：２９６の群から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一な配列を含むポリヌクレオチドを指向する。別の実施態様では、発明は、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドであって、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２９３、配列番号：２９４、配列番号：２９５及び配列番号：２９６の群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを指向する。別の実施態様では、発明は、イムノコンジュゲートをコードする単離ポリヌクレオチド又はその断片であって、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２９３、配列番号：２９４、配列番号：２９５及び配列番号：２９６の群から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一な核酸配列を含むポリヌクレオチドを指向する。別の実施態様では、発明は、イムノコンジュゲートをコードする単離ポリヌクレオチド又はその断片であって、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２９３、配列番号：２９４、配列番号：２９５及び配列番号：２９６の群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドを指向する。
【０１４７】
発明のイムノコンジュゲートをコードするポリヌクレオチドは、イムノコンジュゲート全体をコードする単一ポリヌクレオチドとして、又は共発現される複数の(例えば、二以上の)ポリヌクレオチドとして発現されうる。共発現されるポリヌクレオチドにコードされたポリペプチドは、機能的イムノコンジュゲートを形成するために、例えばジスルフィド結合又は他の手段を通して会合されうる。例えば、抗原結合部分の重鎖部分は、抗原結合部分の軽鎖部分及びミュータントＩＬ-２ポリペプチドを含んでなるイムノコンジュゲートの部分とは別のポリヌクレオチドにコードされうる。共発現される場合、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと会合し、抗原結合部分を形成するだろう。あるいは別の実施例では、抗原結合部分の軽鎖部分は、抗原結合部分の重鎖部分及びミュータントＩＬ-２ポリペプチドを含んでなるイムノコンジュゲートの部分とは別のポリヌクレオチドにコードされうる。一実施態様では、発明の単離ポリヌクレオチドは、ミュータントＩＬ-２ポリペプチド及び抗原結合部分を含んでなるイムノコンジュゲートの断片をコードする。一実施態様では、発明の単離ポリヌクレオチドは、抗原結合部分の重鎖及びミュータントＩＬ-２ポリペプチドをコードする。別の実施態様では、発明の単離ポリヌクレオチドは、抗原結合部分の軽鎖及びミュータントＩＬ-２ポリペプチドをコードする。
【０１４８】
特異的な実施態様では、発明の単離ポリヌクレオチドは、少なくとも一つのミュータントＩＬ-２ポリペプチド及び少なくとも一、好ましくは二以上の抗原結合部分を含んでなるイムノコンジュゲートの断片をコードし、第一ミュータントＩＬ-２ポリペプチドはアミノ-又はカルボキシ-末端ペプチド結合を第一抗原結合部分と共有し、第二抗原結合部分はアミノ-又はカルボキシ-末端ペプチド結合を第一ミュータントＩＬ-２ポリペプチド又は第一抗原結合部分と共有する。一実施態様では、抗原結合部分は、Ｆｖ分子、特にｓｃＦｖ分子、及びＦａｂ分子から成る群から独立して選択される。別の特異的な実施態様では、ポリヌクレオチドは、２つの抗原結合部分の重鎖及び一つのミュータントＩＬ-２ポリペプチドをコードする。別の特異的な実施態様では、ポリヌクレオチドは、２つの抗原結合部分の軽鎖及び一つのミュータントＩＬ-２ポリペプチドをコードする。別の特異的な実施態様では、ポリヌクレオチドは、一つの抗原結合部分の一つの軽鎖、第二抗原結合部分の一つの重鎖及び一つのミュータントＩＬ-２ポリペプチドをコードする。
【０１４９】
別の特異的な実施態様では、発明の単離ポリヌクレオチドはイムノコンジュゲートの断片をコードし、ポリヌクレオチドは２つのＦａｂ分子の重鎖及びミュータントＩＬ-２ポリペプチドをコードする。別の特異的な実施態様では、発明の単離ポリヌクレオチドはイムノコンジュゲートの断片をコードし、ポリヌクレオチドは２つのＦａｂ分子の軽鎖及びミュータントＩＬ-２ポリペプチドをコードする。別の特異的な実施態様では、発明の単離ポリヌクレオチドはイムノコンジュゲートの断片をコードし、ポリヌクレオチドは一つのＦａｂ分子の重鎖、第二Ｆａｂ分子の軽鎖及びミュータントＩＬ-２ポリペプチドをコードする。
【０１５０】
一実施態様では、発明の単離ポリヌクレオチドは、一又は複数のｓｃＦｖ分子にアミノ-及びカルボキシ-末端アミノ酸で結合される少なくとも１つのミュータントＩＬ-２ポリペプチドを含んでなるイムノコンジュゲートをコードする。
【０１５１】
一実施態様では、発明の単離ポリヌクレオチドはイムノコンジュゲートの断片をコードし、ポリヌクレオチドは、免疫グロブリン分子、具体的にはＩｇＧ分子、より具体的にはＩｇＧ１分子の重鎖、及びミュータントＩＬ-２ポリペプチドをコードする。より特異的な実施態様では、単離ポリヌクレオチドは免疫グロブリン分子の重鎖及びミュータントＩＬ-２ポリペプチドをコードし、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドはアミノ-末端ペプチド結合を免疫グロブリン重鎖と共有する。
【０１５２】
別の実施態様では、本発明はイムノコンジュゲートをコードする単離ポリヌクレオチド又はその断片であって、配列番号：２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、２３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、３１１又は３１３に示される可変領域配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドを指向する。別の実施態様では、本発明は、イムノコンジュゲートをコードする単離ポリヌクレオチド又はその断片であって、配列番号：１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２９７、２９９、３０１、３０３、３１５、３１７、３１９、３２１又は３２３に示されるポリペプチド配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドを指向する。別の実施態様では、発明はイムノコンジュゲートをコードする単離ポリヌクレオチド又はその断片であって、配列番号：２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２９８、３００、３０２、３０４、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２又は３２４に示されるヌクレオチド配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一な配列を含むポリヌクレオチドを更に指向する。別の実施態様では、発明は、イムノコンジュゲートをコードする単離ポリヌクレオチド又はその断片であって、配列番号：２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２９８、３００、３０２、３０４、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２又は３２４に示される核酸配列を含むポリヌクレオチドを指向する。別の実施態様では、発明はイムノコンジュゲートをコードする単離ポリヌクレオチド又はその断片であって、配列番号：２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、２３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、３１１又は３１３のアミノ酸配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一な可変領域配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドを指向する。別の実施態様では、発明は、イムノコンジュゲートをコードする単離ポリヌクレオチド又はその断片であって、配列番号：１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２９７、２９９、３０１、３０３、３１５、３１７、３１９、３２１又は３２３のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一なポリペプチド配列コードする配列を含むポリヌクレオチドを指向する。発明は、イムノコンジュゲートをコードする単離ポリヌクレオチド又はその断片であって、保存アミノ酸置換と共に配列番号：２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、２３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、３１１又は３１３の可変領域配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドを指向する。発明はまた、発明のイムノコンジュゲートをコードする単離ポリヌクレオチド又はその断片であって、保存アミノ酸置換と共に配列番号：１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２９７、２９９、３０１、３０３、３１５、３１７、３１９、３２１又は３２３のポリペプチド配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
【０１５３】
ある実施態様では、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡ、例えばメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは一本鎖又は二本鎖でありうる。
【０１５４】
組換え方法
発明のミュータントＩＬ-２ポリペプチドは、当分野でよく知られている遺伝学的又は化学的方法を使用して欠失、置換、挿入又は修飾によって調整できる。遺伝学的方法は、ＤＮＡ配列をコードする部位特異的突然変異、ＰＣＲ、遺伝子合成等を含みうる。補正ヌクレオチド変化は、例えば配列決定によって検証できる。この点において、天然ＩＬ-２のヌクレオチド配列はTaniguchi等 (Nature 302, 305-10 (1983))に記載されており、ヒトＩＬ-２をコードする核酸はAmerican Type Culture Collection (Rockville MD)などの公的受託所から入手可能である。天然ヒトＩＬ-２の配列を、配列番号:1に示す。置換又は挿入は、天然並びに非天然アミノ酸残基を含みうる。アミノ酸修飾は、糖鎖付加部位の追加又は糖付加などの化学修飾のよく知られた方法を含む。
【０１５５】
発明のミュータントＩＬ-２ポリペプチド及びイムノコンジュゲートは、例えば固体ペプチド合成又は組換え生産によって得られうる。組換え生産では、例えば上記のような前記ミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲート(断片)をコードする一又は複数のポリヌクレオチドは、単離され、宿主細胞における更なるクローニング及び／又は発現のために一又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され配列決定されうる。一実施態様では、発明の一又は複数のポリヌクレオチドを含んでなるベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者によく知られた方法が、適切な転写／翻訳コントロールシグナルと共にミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲート(断片)のコーディング配列を有する発現ベクターを構築するために使用できる。これらの方法は、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術及びインビボ組換え／遺伝学的組換えを含む。例えば、Maniatis等, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); and Ausubel等, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)に記載される技術を参照のこと。発現ベクターはプラスミド、又はウイルスの一部でもよく、核酸断片でありうる。発現ベクターは、ＩＬ-２ミュータント又はイムノコンジュゲート(断片)をコードするポリヌクレオチド(すなわちコーディング領域)がプロモーター及び／又は他の転写又は翻訳コントロール要素と作動可能な関係においてクローン化される発現カセットを含む。ここで使用される場合、「コーディング領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンから成る核酸の一部である。「停止コドン」(ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ)はアミノ酸に翻訳されないが、存在するならばそれはコーディング領域として考えられ、しかし、何れかのフランキング配列、例えばプロモーター、リボソーム、結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域などはコーディング領域の一部ではない。二以上のコーディング領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト中、例えば単一ベクター上に、又は別個のポリヌクレオチドコンストラクト中、例えば別個の(異なる)ベクター上に存在してもよい。更に、何れかのベクターは単一のコーディング領域を有し得、又は二以上のコーディング領域を有し得、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解切断により最終タンパク質へ翻訳後的又は共翻訳的に分けられる一又は複数のポリタンパク質をコードしうる。加えて、発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、発明のポリペプチド、又は変異体又はその誘導体をコードする第一又は第二ポリヌクレオチドに融合又は非融合された異種性コーディング領域をコードしうる。異種性コーディング領域は、限定するものではないが、特殊化要素又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種性機能ドメインを含む。作動的関係とは、遺伝子産物の発現を制御性配列の影響又はコントロール下に置かれるように、遺伝子産物、例えばポリペプチドのコーディング領域が一又は複数の制御性配列と関連する場合である。２つのＤＮＡ断片(例えばポリペプチドコーディング領域及びそれと関連するプロモーター)は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらし、２つのＤＮＡ断片間の連鎖の性質が遺伝子産物の発現を指示する発現制御性配列の能力を干渉しないか又は転写されるＤＮＡ鋳型の能力を干渉しない場合に、「作動的に関連」する。このように、プロモーターがその核酸の転写に影響できる場合に、プロモーター領域はポリペプチドをコードする核酸と作動的に関連するだろう。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を指示する細胞特異的プロモーターでありうる。プロモーターに加えて、他の転写コントロール要素、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を支持するためにポリヌクレオチドと作動的に関連していてもよい。好適なプロモーター及び他の転写コントロール領域がここに開示される。様々な転写コントロール領域が当業者に知られている。これらは、限定するものではないが、脊椎動物細胞において機能する転写コントロール領域、例えば限定するものではないがサイトメガロウイルスからのプロモーター及びエンハンサーセグメント(例えば、イントロン-Ａと併せて前初期プロモーター)、サルウイルス４０(例えば初期プロモーター)、及びレトロウイルス(例えばラウス肉腫ウイルスなど)を含む。他の転写コントロール領域は、脊椎動物遺伝子由来のもの、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギβ-グロビン、並びに真核生物細胞における遺伝子発現をコントロールできる他の配列を含む。更なる好適な転写コントロール領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びに誘導性プロモーター(例えばプロモーター誘導性テトラサイクリン)を含む。同様に、様々な転写コントロール要素が当業者に知られている。これらは、限定するものではないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終止コドン、及びウィルス系由来の要素(特に、内部リボソーム進入部位、又はＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列としても知られる)を含む。発現カセットはまた、他の特性、例えば複製起源、及び／又は染色体組込み要素、例えばレトロウイルス長末端反復(ＬＴＲ)、又はアデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)末端逆位配列(ＩＴＲ)を含みうる。
【０１５６】
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コーディング領域は、本発明のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌又はシグナルペプチドをコードする更なるコーディング領域を伴いうる。例えば、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドの分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするＤＮＡがミュータントＩＬ-２の成熟アミノ酸をコードする核酸の上流に配置されうる。同じことが、発明のイムノコンジュゲート又はその断片に適用される。シグナル仮説によると、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質はシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有し、これは一旦粗面小胞体を横切って成長するタンパク質鎖の排出が開始すると成熟タンパク質から切断される。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドはポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを一般的に有し、それはポリペプチドの分泌又は「成熟」形態を生産するために翻訳ポリペプチドから切断されることを認識しているだろう。例えば、ヒトＩＬ-２はポリペプチドのＮ末端に２０のアミノ酸シグナル配列を伴って翻訳され、それはその後切断され、成熟した１３３アミノ酸ヒトＩＬ-２が生産される。ある実施態様では、天然シグナルペプチド、例えばＩＬ-２シグナルペプチド又は免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチド、又はその配列の機能的誘導体であって、それに作動的に関連したポリペプチドの分泌を指示する能力を保持した機能的誘導体が使用される。あるいは、異種性哺乳類シグナルペプチド、又はその機能性誘導体が使用されうる。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター(ＴＰＡ)又はマウスβ-グルクロニダーゼのリーダー配列と置換されうる。分泌シグナルペプチドの例示的なアミノ酸及びポリヌクレオチド配列を、配列番号２３６−２７３に示す。
【０１５７】
後の精製の促進(例えば、ヒスチジンタグ)又はＩＬ-２ミュータント又はイムノコンジュゲートの標識化における補助のために使用されうる短タンパク質配列をコードするＤＮＡは、ポリヌクレオチドをコードするＩＬ-２ミュータント又はイムノコンジュゲート(断片)の中又は末端に含まれうる。
【０１５８】
更なる実施態様では、発明の一又は複数のポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞が提供される。ある実施態様では、発明の一又は複数のベクターを含んでなる宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、単独で又は組合せにおいて、それぞれポリヌクレオチド及びベクターに関してここに記載されている特徴の何れかを組み込みうる。このような一実施態様では、宿主細胞は、発明のミュータントＩＬ-２ポリペプチドを含んでなるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターを含む(例えば、形質転換又はトランスフェクトされている)。ここで使用される場合、「宿主細胞」なる用語は、発明のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲート又はその断片を生成するよう操作できる何れかの種類の細胞システムを指す。ミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの複製及び発現の補助に好適な宿主細胞は当分野でよく知られている。このような細胞は特定の発現ベクターで適切にトランスフェクト又は形質導入され得、大量のベクター含有細胞が、臨床利用のための十分な量のＩＬ-２ミュータント又はイムノコンジュゲートを得るために、大規模発酵槽での播種のために増殖されうる。好適な宿主細胞は、原核生物微生物、例えば大腸菌、又は様々な真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ)、昆虫細胞などを含む。例えば、ポリペプチドは、特に糖鎖付加が必要でない場合、細菌において生産されうる。発現後、ポリペプチドは可溶性画分において細菌細胞ペーストから単離され得、更に精製されてもよい。原核生物に加え、真核生物微生物、例えば糸状菌又は酵母が、ポリペプチドをコードするベクターのクローニング又は発現宿主に好適であり、部分的又は完全ヒト糖鎖付加パターンを伴うポリペプチドの生産をもたらす、糖鎖付加経路が「ヒト化」された真菌及び酵母株を含む。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004),and Li等, Nat Biotech 24, 210-215 (2006)を参照のこと。(グリコシル化)ポリペプチドの発現に好適な宿主細胞はまた、多細胞生物(無脊椎動物及び脊椎動物)に由来する。無脊椎動物細胞の例は、植物及び昆虫細胞を含む。多くのバキュロウイルス株が同定されており、特にヨトウガ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用されうる。植物細胞培養物がまた、宿主として利用されてもよい。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号(トランスジェニック植物において抗体を生産するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載)を参照のこと。脊椎動物細胞がまた、宿主として使用されうる。例えば、懸濁液において増殖するよう適応された哺乳類細胞株が有用でありうる。有用な哺乳類宿主細胞株の他の例は、Ｖ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株(ＣＯＳ-７)；ヒト胎児由来腎臓株(例えばGraham等, J Gen Virol 36, 59 (1977)に記載の293又は293T細胞)、ベビーハムスター腎臓細胞(ＢＨＫ)、マウスセルトリ細胞(例えばMather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)に記載のＴＭ４細胞)、サル腎臓細胞(ＣＶ１)、アフリカミドリザル腎臓細胞(ＶＥＲＯ-７６)、ヒト子宮頸癌細胞(ＨＥＬＡ)、イヌ腎臓細胞(Ｍ���ＣＫ)、バッファローラット肝臓細胞(ＢＲＬ ３Ａ)、ヒト肺細胞(Ｗ１３８)、ヒト肝臓細胞(Ｈｅｐ Ｇ２)、マウス乳房腫瘍細胞(ＭＭＴ ０６０５６２)、ＴＲＩ細胞(例えばMather等, Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)に記載のもの)、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳類宿主細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞を含み、ｄｈｆｒ−ＣＨO細胞(Urlaub等, Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980))；及び骨髄腫細胞株、例えばＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０を含む。タンパク質生産に好適なある哺乳類宿主細胞株の総説については、例えばYazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照のこと。宿主細胞は、培養細胞、限定するものではないが例えば、哺乳類培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞、また、トランスジェニック生物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織に含まれる細胞を含む。一実施態様では、宿主細胞は真核生物細胞、好ましくは哺乳類細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、ヒト胎児由来腎臓(ＨＥＫ)細胞又はリンパ球系細胞(例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞)である。
【０１５９】
これらのシステムにおいて外来遺伝子を発現させるための標準的な技術は当分野で知られている。抗体等の抗原結合ドメインの重又は軽鎖に融合されたミュータント-ＩＬ-２ポリペプチドを発現する細胞は、抗体鎖の他方をまた発現し、発現されたミュータントＩＬ-２融合タンパク質が重及び軽鎖双方を有するように操作されうる。
【０１６０】
一実施態様では、発明によるミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを生産する方法であって、ミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの発現に適した条件下で、ここに提供されるミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートをコードするポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞を培養すること、及び場合によっては、宿主細胞(又は宿主細胞培養培地)からのミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを回収することを含む方法が提供される。
【０１６１】
発明によるある実施態様では、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドは少なくとも一つの非ＩＬ-２部分に連結される。ミュータントＩＬ-２ポリペプチドセグメントが一又は複数の分子、例えばポリペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、核酸，ポリヌクレオチド又はこれらの分子の組合せである分子(例えば糖タンパク質、糖脂質など)に連結されるように、ＩＬ-２ミュータントは調製されてもよい。ミュータントＩＬ-２ポリペプチドはまた、有機部分、無機部分又は医薬品に連結されうる。ここで使用される場合、医薬品は約５，０００ダルトン以下の化合物を含有する有機物である。ミュータントＩＬ-２ポリペプチドはまた、治療化合物、例えば抗新生物剤、抗微生物剤、ホルモン、免疫調節剤、抗炎症剤等を含む何れかの生物学的薬剤に連結されうる。また含まれるものは放射性同位体、例えばイメージング並びに治療に有用なものを含む。
【０１６２】
ミュータントＩＬ-２ポリペプチドはまた、同タイプの複数分子に、又は二以上のタイプの分子に連結されうる。ある実施態様では、ＩＬ-２に連結される分子は、ＩＬ-２が動物における特異的な組織又は細胞を標的にする能力を与えることが可能であり、以下、「ターゲティング部分」と呼ばれる。これらの実施態様では、ターゲティング部分は標的組織又は細胞におけるリガンド又は受容体に対し親和性を有し得、それによってＩＬ-２を標的組織又は細胞に向かわせる。特定の実施態様では、ターゲティング部分はＩＬ-２を腫瘍に向かわせる。ターゲティング部分は、例えば、細胞表面又は細胞内タンパク質に特異的な抗原結合部分(例えば抗体及びその断片)、生物学的受容体のリガンドなどを含む。このような抗原結合部分は、腫瘍関連抗原、例えばここに記載されるものに特異的でありうる。
【０１６３】
ミュータントＩＬ-２ポリペプチドは、別のポリペプチド、例えば単鎖抗体、又は抗体重又は軽鎖(の一部)に遺伝子学的に融合されるか、又は別の分子に化学的にコンジュゲートされうる。抗体重鎖の一部へのミュータントＩＬ-２ポリペプチドの融合が、実施例に記載されている。ミュータントＩＬ-２ポリペプチド及び別のポリペプチド間の融合であるＩＬ-２ミュータントは、ＩＬ-２配列がポリペプチドに直接的に又はリンカー配列を通して間接的に融合されるように設計されうる。リンカーの組成及び長さは、当分野でよく知られる方法に従って決定され得、効果について試験されうる。ＩＬ-２及び抗体重鎖間のリンカー配列の例は、例えば配列番号２０９、２１１、２１３などに示す配列に見出される。更なる配列がまた、所望されるならば、融合の個々の成分を分けるために切断部位を組み入れるために含まれ得、例えばエンドペプチダーゼ認識配列である。加えて、そのＩＬ-２ミュータント又は融合タンパク質がまた、当分野でよく知られるポリペプチド合成の方法を使用して化学的に合成されうる(例えばメリフィールド固相合成)。ミュータントＩＬ-２ポリペプチドは、よく知られた化学コンジュゲーション方法を使用して、他の分子、例えば別のポリペプチドに化学的にコンジュゲートされうる。当分野でよく知られている二機能性架橋試薬、例えばホモ機能及びヘテロ機能架橋試薬が、この目的のために使用されうる。使用される架橋試薬のタイプは、ＩＬ-２にカップリングされる分子の性質に依存し、当業者によって容易に同定されうる。あるいは、又は加えて、ミュータントＩＬ-２及び／又はそれがコンジュゲートされることが意図される分子は、２つが別々の反応においてコンジュゲートされうるように、化学的に誘導体化され得、当分野で知られている。
【０１６４】
ある実施態様では、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドは、抗原決定基に結合できる抗体可変領域を少なくとも含んでなる一又は複数の抗原結合部分(即ち、イムノコンジュゲートの一部)に連結される。様々な領域が、天然に又は非天然に生じる抗体及びその断片の一部を形成し、またそれに由来しうる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生産する方法は、当分野でよく知られている(例えばHarlow and Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照)。非天然に生じる抗体は、固相-ペプチド合成を使用して構築されるか、組換え的に生産されるか(例えば米国特許第4,186,567号に記載のように)、又は例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含んでなる組合せライブラリーのスクリーニング(例えばMcCaffertyの米国特許第５，９６９，１０８号を参照）によって得られうる。イムノコンジュゲート、抗原結合部分及びその生産方法がまたＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１／０２０７８３に詳細に記載されており、その全体を出典明記によってここに援用する。
【０１６５】
何れかの動物種の抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域が、ミュータントIL-2ポリペプチドに連結されてもよい。本発明において有用な非限定的抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域は、マウス、霊長類、又はヒト起源のものでありうる。ミュータントIL-2/抗体コンジュゲート又は融合物がヒト使用を意図する場合、キメラ形態の抗体が使用され得、抗体の定常領域はヒトからである。ヒト化又は完全ヒト形態の抗体がまた、当分野でよく知られている方法に従って調製されうる(例えばWinterの米国特許第5,565,332号を参照)。ヒト化は、様々な方法によって成され得、限定するものではないが(a)非ヒト(例えばドナー抗体)ＣＤＲの、ヒト(例えば、レシピエント抗体)フレームワーク及び定常領域への、決定的なフレームワーク残基(例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を保つのに重要なもの)の有無におけるグラフティング、(ｂ)非ヒト特異性決定領域(ＳＤＲ又はａ-ＣＤＲ；抗体-抗原相互作用に決定的な残基)のみの、ヒトフレームワーク及び定常領域へのグラフティング、又は(ｃ)全非ヒト可変ドメインの移植(ただし、表面残基の置換によりヒト様セクションでそれらを「覆う」)を含む。ヒト化抗体及びそれらを生成する方法は、例えばAlmagro and Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008), and are further described, e.g., in Riechmann等, Nature 332, 323-329 (1988); Queen等, Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989); US Patent Nos. 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, and 7,087,409; Jones等, Nature 321, 522-525 (1986); Morrison等, Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen等, Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri等, Methods 36, 25-34 (2005) (describing SDR (a-CDR) grafting); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) (describing “resurfacing”); Dall’Acqua等, Methods 36, 43-60 (2005) (describing “FR shuffling”); and Osbourn等, Methods 36, 61-68 (2005) and Klimka等, Br J Cancer 83, 252-260 (2000) (describing the “guided selection” approach to FR shuffling)に総説されている。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当分野で知られている様々な技術を使用して生産できる。ヒト抗体は、van Dijk and van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) and Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008)に一般的に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ方法によって生成されるヒトモノクローナル抗体の部分を形成し、それから得られることができる(例えばMonoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)を参照)。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、抗原チャレンジに応答してインタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を生産するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製されうる(例えばLonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)を参照)。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変領域配列を単離することによって生成されうる(例えば、Hoogenboom等 in Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O’Brien等, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001); and McCafferty等, Nature 348, 552-554; Clackson等, Nature 352, 624-628 (1991)を参照)。ファージは典型的には、抗体断片を短鎖Fv(scFv)断片として又はFab断片としてディスプレイする。ファージディスプレイによるイムノコンジュゲートの抗原結合部分の調製の詳細な説明は��ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１／０２０７８３に添付される実施例に見出される。
【０１６６】
ある実施態様では、本発明に有用な抗原結合部分は、例えばＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１／０２０７８３（親和性成熟に関する実施例を参照）又は米国特許出願公開番号２００４／０１３２０６６（この全内容を出典明記によってここに援用する）に開示される方法に従い、増強された結合親和性を有するように操作される。特異的な抗原決定基に結合する発明のイムノコンジュゲートの能力は、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)又は当業者によく知られた他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術(BIACORE T100 systemにおいて分析される) (Liljeblad等, Glyco J 17, 323-329 (2000))、及び一般的な結合アッセイ(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))によって測定されうる。競合アッセイは、特定の抗原への結合について参照抗体と競合する抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変ドメイン、例えばフィブロネクチンのエクストラドメインＢ(ＥＤＢ)への結合についてＬ１９抗体と競合する抗体を同定するために使用されうる。ある実施態様では、このような競合する抗体は、参照抗体によって結合される同じエピトープ(例えば線状又はコンホメーションエピトープ)に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法が、Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。例示的な競合アッセイでは、固定化された抗原(例えばＥＤＢ)は、抗原に結合する標識された第一標識抗体(例えばＬ１９抗体)、及び抗原への結合について第一抗原と競合するその能力について試験されている第二非標識抗体を含んでなる溶液中においてインキュベートされる。第二抗体は、ハイブリドーマ上澄み中に存在しうる。コントロールとして、固定化された抗原は、第一標識抗体を含んでなるが第二非標識抗体を含まない溶液中においてインキュベートされる。抗原への第一抗体の結合が可能な条件下でのインキュベーションの後、過剰な非結合抗体が除去され、固定された抗原に伴う標識の量を測定が測定される。固定された抗原に伴う標識の量が、コントロールサンプルと比較して試験サンプルにおいて実質的に低減される場合、これは、抗原への結合について第二抗体が第一抗体と競合することを示す。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照のこと。
【０１６７】
発明のミュータントＩＬ-２ミュータント又はイムノコンジュゲートの更なる化学的修飾が所望されうる。例えば、免疫原性及び短い半減期の問題は、実質的に直鎖状のポリマー、例えばポリエチレングリコール(ＰＥＧ)又はポリプロピレングリコール(ＰＰＧ)へのコンジュゲーションによって改善されうる(例えばＷＯ８７／０００５６を参照)。
【０１６８】
ここに記載のように調製されるＩＬ-２ミュータント及びイムノコンジュゲートは、当分野で知られている技術、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等によって精製されうる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には正味荷電、疎水性、親水性等の要因に依存し、当業者に明瞭であろう。アフィニティークロマトグラフィー精製では、ミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートが結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原が使用されうる。例えば、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドに特異的に結合する抗体が使用されうる。発明のイムノコンジュゲートのアフィニティークロマトグラフィー精製では、プロテインＡ又はプロテインＧを伴うマトリックスが使用されうる。例えば、逐次的なプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーが、実施例に基本的に記載されるようにイムノコンジュゲートを単離するために使用されうる。ミュータントＩＬ-２ポリペプチド及びその融合タンパク質の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィー等を含む様々なよく知られた分析方法の何れかによって決定されうる。例えば、実施例に記載されるように発現される重鎖融合タンパク質は、還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥで実証されるようにインタクトで、正確に組み立てられていると示された(例えば図１４を参照)。２つのバンドはおよそＭｒ２５，０００及びＭｒ６０，０００で分解され、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖／ＩＬ-２融合タンパク質の予測された分子量に対応する。
【０１６９】
アッセイ
ここに提供されるミュータントＩＬ-２ポリペプチド及びイムノコンジュゲートは、当分野で知られている様々なアッセイによってそれらの物理的／化学的特性及び生物学的活性について、同定、スクリーニング、又は特徴付けされうる。
【０１７０】
親和性アッセイ
様々な形態のＩＬ-２受容体に対するミュータント又は野生型ＩＬ-２ポリペプチドの親和性は、BIAcore instrument(GE Healthcare)等の標準的な器具及び組換え発現によって得られうる受容体サブユニットを使用して、表面プラズモン共鳴(SPR)によって、実施例に説明する方法に従って決定できる(例えばShanafelt等, Nature Biotechnol 18, 1197-1202 (2000)を参照)。組換えＩＬ-２受容体β／γ-サブユニットヘテロ二量体は、適切な受容体サブユニット／Ｆｃ融合タンパク質(配列番号１０２及び１０３を参照)のヘテロ二量体化を促進するために、ノブ-インツ-ホール技術(例えば米国特許第５，７３１，１６８号を参照)によって修飾された抗体Ｆｃドメイン単量体に、各々のサブユニットを融合することによって生成できる。あるいは、異なる形態のＩＬ-２受容体に対するＩＬ-２ミュータントの結合親和性は、何れかのこのような形態の受容体を発現すると知られている細胞株を使用して評価されうる。結合親和性を測定するための具体的な説明的及び例示的実施態様を、以下に、また下の実施例に記載する。一実施態様によると、ＫＤは、ＣＭ５チップ上に固定されたＩＬ-２受容体を用いて、２５℃で、BIACORE(登録商標)T100 machine(GE Healthcare)を使用して表面プラズモン共鳴によって測定される。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, GE Healthcare)を、供給者の指示に従って、N-エチル-N’-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミドハイドロクロライド(EDC)及びN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)で活性化させる。組換えＩＬ-２受容体を１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５で０．５−３０μｇ／ｍｌに希釈し、１０μｌ／分の流量で注入し、およそ２００−１０００(ＩＬ-２Ｒα-サブユニット)又は５００−３０００(ＩＬ-２Ｒβγノブ-インツ-ホールヘテロ二量体)反応単位(ＲＵ)の共役タンパク質を得る。ＩＬ-２受容体の注入後、１Ｍのエタノールアミンを注入し、非反応基をブロックする。キネティクス測定では、三倍段階希釈のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲート(〜０．３ｎＭ〜３００ｎＭの間の範囲)を、およそ３０μｌ／分の流量で２５℃でＨＢＳ-ＥＰ＋(GE Healthcare, 10 mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% Surfactant P20, pH7.4)に注入した。会合速度(ｋｏｎ)及び解離速度(ｋｏｆｆ)を、単純一対一ラングミュア結合モデル(BIACORE(登録商標)T100 Evaluation Software version 1.1.1)を使用して、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることによって算出する。平衡解離定数(ＫＤ)を、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として算出する。例えばChen等, J Mol Biol 293, 865-881 (1999)を参照のこと。
【０１７１】
Ｆｃ受容体に対する発明のイムノコンジュゲートの結合は、例えばＥＬＩＳＡによって、又はBIAcore instrument(GE Healthcare)などの標準的な器機を使用して表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)によって容器に決定可能であり、このようなＦｃ受容体は組換え発現によって得られうる。あるいは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメイン又はＦｃドメインを含んでなるイムノコンジュゲートの結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現すると知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するＮＫ細胞を使用して評価されうる。一実施態様によると、ＫＤは、ＣＭ５チップ上に固定されたＦｃ受容体を用いて、２５℃で、BIACORE(登録商標)T100 machine(GE Healthcare)を使用して表面プラズモン共鳴によって測定される。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, GE Healthcare)を、供給者の指示に従って、Ｎ-エチル-Ｎ’-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミドハイドロクロライド(ＥＤＣ)及びＮ-ヒドロキシスクシンイミド(ＮＨＳ)で活性化させる。組換えＦｃ受容体を１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５で０．５−３０μｇ／ｍｌに希釈し、１０μｌ／分の流量で注入し、およそ１００−５０００反応単位(ＲＵ)の共役タンパク質を得る。Ｆｃ受容体の注入後、１Ｍのエタノールアミンを注入し、非反応基をブロックする。キネティクス測定では、３-〜５-倍段階希釈のイムノコンジュゲート(〜０．０１ｎＭ〜３００ｎＭの間の範囲)を、およそ３０−５０μｌ／分の流量で２５℃でＨＢＳ-ＥＰ＋(GE Healthcare, 10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% Surfactant P20, pH7.4)に注入した。会合速度(ｋｏｎ)及び解離速度(ｋｏｆｆ)を、単純一対一ラングミュア結合モデル(BIACORE(登録商標)T100 Evaluation Software version 1.1.1)を使用して、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることによって算出する。平衡解離定数(ＫＤ)を、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として算出する。例えばChen等, J Mol Biol 293, 865-881 (1999)を参照のこと。
【０１７２】
活性アッセイ
ＩＬ-２受容体に結合するＩＬ-２ミュータントの能力は、受容体結合の下流で生じる免疫活性化の効果を評価することで間接的に測定されうる。
【０１７３】
一態様では、アッセイが、生物学的活性を有するミュータントＩＬ-２ポリペプチドを同定するために提供される。生物学的活性は、例えば、ＩＬ-２受容体-担持Ｔ及び／又はＮＫ細胞の増殖を誘導する能力、ＩＬ-２受容体-担持Ｔ及び／又はＮＫ細胞においてＩＬ-２シグナル伝達を誘導する能力、ＮＫ細胞による二次サイトカインとしてインターフェロン(ＩＦＮ)-γを生成する能力、末梢血単核球(ＰＢＭＣ)による二次サイトカイン、特にＩＬ-１０及びＴＮＦ-αの生成を誘導する低減された能力、Ｔ-細胞におけるアポトーシスを誘導する低減された能力、腫瘍縮小を誘導するか及び／又は生存度を改善する能力、及びインビボでの低減された毒性プロファイル、特に低減された血管透過性を含みうる。インビボ及び／又はインビトロでこのような生物学的活性を有するミュータントＩＬ-２ポリペプチドもまた提供される。
【０１７４】
ある実施態様では、発明のミュータントＩＬ-２ポリペプチドは、このような生物学的活性について試験される。様々な方法がＩＬ-２の生物学的活性を決定するために当分野でよく知られており、また多くのこれらの方法の詳細がここに添付の実施例において開示されている。実施例は、ＮＫ細胞によるＩＦＮ-γを生成する能力について、発明のＩＬ-２ミュータントを試験する好適なアッセイを提供する。培養されたＮＫ細胞を、発明のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートでインキュベートし、その後、培養培地におけるＩＦＮ-γ濃度をＥＬＩＳＡによって測定する。
【０１７５】
ＩＬ-２に誘導されるシグナル伝達は、幾つかのシグナル伝達経路を誘導し、ＪＡＫ(Janus kinase)及びＳＴＡＴ（シグナル伝達性転写因子)シグナル伝達分子に関与する。ＩＬ-２と受容体β-及びγ-サブユニットとの相互作用は、受容体及びＪＡＫ１及びＪＡＫ３（それぞれβ-及びγ-サブユニットに付随する）のリン酸化を導く。次いで、ＳＴＡＴ５はリン酸化受容体と会合し、重要なチロシン残基上においてそれ自体でリン酸化する。これは、受容体からのＳＴＡＴ５の解離、ＳＴＡＴ５の二量体化及びＳＴＡＴ５二量体の核へのトランスロケーションをもたらし、そこでそれらは標的遺伝子の転写を促進する。従って、ＩＬ-２受容体を通してシグナル伝達を誘導するミュータントＩＬ-２ポリペプチドの能力は、例えばＳＴＡＴ５のリン酸化を測定することによって評価できる。この方法の詳細は実施例に開示されている。ＰＢＭＣが発明のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートで処理され、リン酸化ＳＴＡＴ５のレベルがフローサイトメトリーによって決定される。
【０１７６】
ＩＬ-２への応答によるＴ細胞又はＮＫ細胞の増殖は、発明のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートによる血液から単離されたＴ細胞又はＮＫ細胞のインキュベートと、その後の、処理細胞の溶解物中のＡＴＰ量の決定によって測定されうる。処理の前に、Ｔ細胞はフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ-Ｍ）でプレ刺激されうる。実施例に記載されるこのアッセイは生細胞の数の高感度な定量を可能にするが、当分野で知られている多くの適切なアッセイが存在する(例えば[３Ｈ]-チミジン組込みアッセイ、Cell Titer Glo ATPアッセイ、Alamar Blueアッセイ、WST-1アッセイ、MTTアッセイ)。
【０１７７】
Ｔ細胞のアポトーシス及びＡＩＣＤの決定のためのアッセイがまた実施例に提供されており、Ｔ細胞は、発明のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートでのインキュベーションの後、アポトーシス-誘導抗体で処理され、アポトーシス細胞がホスファチジルセリン／アネキシン曝露のフローサイトメトリー検出によって定量化される。他のアッセイも当分野で知られている。
【０１７８】
腫瘍増殖及び生存に関するミュータントＩＬ-２の効果は、当分野で知られている様々な動物腫瘍モデルにおいて評価できる。例えば、ヒト癌細胞株の異種移植片が免疫不全マウスに移植され、実施例に記載のように発明のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートで処置されうる。
【０１７９】
インビボでの発明のミュータントＩＬ-２ポリペプチド及びイムノコンジュゲートの毒性は、死亡率、生存中の観察(有害作用の明らかな徴候、例えば行動、体重、体温)及び臨床及び解剖病理学(例えば血液化学値の測定及び／又は組織学的分析)に基づいて決定されうる。
【０１８０】
ＩＬ-２での治療によって誘導される血管透過性は、前処置血管透過性動物モデルにおいて検査されうる。一般的に、発明のＩＬ-２ミュータント又はイムノコンジュゲートは好適な動物、例えばマウスに投与され、後に動物は、血管からの散在が血管透過性の程度を反映する血管漏出レポーター分子を注射される。血管漏出レポーター分子は好ましくは、前処置に使用される野生型形態のＩＬ-２による透過性を明らかにするのに十分な大きさである。血管漏出レポーター分子の例は、アルブミン又は免疫グロブリンなどの血清タンパク質でありうる。血管漏出レポーター分子は好ましくは、分子の組織分布の定量的決定を容易にするために、放射性同位体などで検出可能に標識される。血管透過性は、肝臓、肺などの様々な体内臓器の何れか、並びに異種移植された腫瘍を含む腫瘍に存在する血管について測定されうる。肺が、完全長ＩＬ-２ミュータントの血管透過性を測定するのに好ましい臓器である。
【０１８１】
組成物、製剤、及び投与の経路
更なる態様では、発明は、例えば下記の治療方法の何れかにおける使用のための、ここに提供されるミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの何れかを含んでなる薬学的組成物を提供する。一実施態様では、薬学的組成物は、ここに提供されるミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの何れか及び薬学的に許容可能な担体を含む。別の実施態様では、薬学的組成物は、ここに提供されるミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの何れか及び少なくとも一つの更なる治療剤、例えば下記のものを含む。
【０１８２】
更に提供されるのは、インビボでの投与に適した形態における発明のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを生産する方法であって、(ａ)発明によるミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの獲得、及び(ｂ)少なくとも一つの薬学的に許容可能な担体を伴うミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの製剤化を含んでなり、それによってミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの調整物がインビボでの投与のために製剤化される方法である。
【０１８３】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体中に溶存又は分散された治療的に有効な量の一又は複数のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを含む。「薬学的に又は薬理学的許容可能な」なる表現は、用いられる投与量及び濃度ではレシピエントに一般的に非毒性であり、すなわち、例えばヒトなどの動物に適宜投与された時に、有害な、アレルギー性の又は他の望まない応答をもたらさない分子実体及び組成物を指す。少なくとも一つのミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲート及び場合によっては更なる活性成分を含有する薬学的組成物の調製は、本開示の考慮のもと当業者によく知られており、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990に例示され、出典明記によってここに援用する。更に、動物(例えばヒト)投与では、調製物が、FDA Office of Biological Standards又は他の国における他の権威に要求される無菌性、発熱性、一般的な安全性及び純度標準を満たすべきであることが理解されるだろう。好ましい組成物は凍結乾燥製剤又は水溶液である。例示的なＩＬ-２組成物が、米国特許第４，６０４，３７７及び４，７６６，１０６号に記載されている。ここで使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」は、当業者に知られているありとあらゆる溶剤、バッファー、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤(例えば、抗菌剤、抗真菌剤)、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、抗酸化剤、タンパク質、薬物、薬物安定剤、ポリマー、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、色素、同様な物質及びその組合せを含む(例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329を参照(出典明記によってここに援用する))。
何れかの一般的な担体が活性成分と不適合である場合を除き、治療的又は薬学的組成物におけるその使用が考えられる。
【０１８４】
組成物は、それが固体、液体又はエアロゾル形態で投与されるか、またそれが注射などの投与経路のために無菌である必要があるかに依存して、異なるタイプの担体を含みうる。本発明のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲート(及び何れかの追加の治療剤)は、当業者に知られているように、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、脾臓内に、腎内に、胸膜内に、気管内に、鼻腔内に、硝子体内に、腟内に、直腸内に、腫瘍内に、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、結膜下に、小胞内に、粘膜に、心膜内に、臍内に、眼球内に、経口で、局所的に、局在的に、吸入によって(例えば、エアロゾル吸入)、注射によって、注入によって、持続注入によって、標的細胞を浸す限局灌流によって直接、カテーテルによって、洗浄（lavage）によって、クリームにおいて、液体組成物(例えばリポソーム)において、又は他の方法によって、又は前述の何れかの組合せによって投与されうる(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990を参照(出典明記によってここに援用する))。非経口投与、特に静脈内注射が、発明のミュータントIL-2ポリペプチド及びイムノコンジュゲートなどのポリペプチド分子の投与に最も一般的に使用される。
【０１８５】
非経口組成物は、注射、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、くも膜下腔内又は腹腔内注射による投与のために設計されたものを含む。注射では、発明のミュータントIL-2ポリペプチド及びイムノコンジュゲートは、水溶液中、好ましくは生理学的適合バッファー、例えばHanks液、Ringer液、又は生理学的緩衝生理食塩水中に製剤化されうる。溶液は、懸濁、安定及び／又は分散剤などのフォーミュラトリーを含みうる。あるいは、ミュータントＩＬ-２ポリペプチド及びイムノコンジュゲートは、使用前は、適切なビヒクル、例えば滅菌発熱性物質除去蒸留水との構成のために、粉末形態でありうる。滅菌注射溶液は、必要量の発明のＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを、必要に応じて下に挙げる様々な他の成分を伴う適切な溶媒中に組み入れることによって調製される。滅菌は、例えば滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成されうる。一般的に分散液は、様々な滅菌活性成分を、基礎分散培地及び他の成分を含有する無菌ビヒクルに組み入れることによって調製される。滅菌注射溶液、懸濁液又はエマルションの調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分＋何れかの追加の所望成分の粉末を、その事前の滅菌-濾過液体培地から生産する真空乾燥又は凍結乾燥である。液体培地は、必要であれば適切に緩衝化されるべきであり、液体希釈剤は注射の前に十分な生理食塩水又はグルコースでまず等張にされるべきである。組成物は、製造及び保管の条件下で安定でなければならなく、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。内毒素汚染は安全なレベル、例えば０．５ｎｇ／ｍｇ未満のタンパク質で最小限に保たれるべきであることが理解されるだろう。好適な薬学的に許容可能な担体は、限定するものではないが：リン酸、クエン酸、及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料(例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(約１０残基未満)のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質複合体)；及び／又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。水性注射懸濁液は、カルボキシルメチル・セルロース・ナトリウム、ソルビトール、デキストランなど、懸濁液の粘度を増加させる化合物を含有しうる。場合によっては、懸濁液は、高濃縮液の調製を可能にするために、適切な安定剤又は化合物の溶解度を増加させる薬剤をまた含有しうる。更に、活性化合物���懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製されうる。適切な親油性溶媒又はビヒクルは、脂肪油、例えばゴマ油、又は合成脂肪酸エステル、例えばエチルクリート（ethyl cleats）又はトリグリセリド、又はリポソームを含む。
【０１８６】
活性成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリー系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ-粒子及びナノカプセル)に、あるいはマクロエマルションに捕捉させてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed.Mack Printing Company、1990)に開示されている。徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の適切な例は、ポリペプチドを含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。特定の実施態様では、注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン又はその組合せの組成物における使用によって実施されうる。
【０１８７】
前述の組成物に加えて、イムノコンジュゲートはまた、デポー調製物として製剤化されうる。そのように長く作用する製剤は、インプラント術（例えば皮下又は筋肉内）又は筋肉内注射によって投与されうる。このように、例えば、ミュータントＩＬ−２ポリペプチド及びイムノコンジュゲートは、適切なポリマー又は疎水性材料(例えば許容可能な油中のエマルションとして) 又はイオン交換樹脂と、又は難溶性誘導体として、例えば難溶性塩として製剤化されうる。
【０１８８】
発明のミュータントＩＬ-２ポリペプチド及びイムノコンジュゲートを含んでなる薬学的組成物は、一般的な混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、凍結乾燥プロセスによって製造されうる。薬学的組成物は、薬剤的使用可能な調製物へのタンパク質の加工を容易にする一又は複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤又は補助剤を使用して、一般的な方法において製剤化されうる。適切な製剤は、選択された投与経路に依存する。
【０１８９】
ミュータントＩＬ-２ポリペプチド及びイムノコンジュゲートは、遊離酸又は塩基、中性又は塩形態の組成物に製剤化されうる。薬学的に許容可能な塩は、遊離酸又は塩基の生物学的活性を実質的に保った塩である。これらは酸付加塩、例えばタンパク質組成物の遊離アミノ基で形成されるもの、又は塩酸又はリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸又はマンデル酸などの有機酸で形成されるものを含む。遊離カルボキシル基で形成される塩はまた、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化第二鉄などの無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン又はプロカインなどの有機塩基から得られうる。薬剤塩は、対応する遊離塩基形態よりも水性及び他のプロトン性溶媒中において溶けやすい傾向がある。
【０１９０】
治療方法及び組成物
ここに提供されるミュータントＩＬ-２ポリペプチド及びイムノコンジュゲートの何れかが、治療方法において使用されうる。発明のミュータントＩＬ-２ポリペプチド及びイムノコンジュゲートが、例えば癌の治療において免疫療法剤として使用されうる。
【０１９１】
治療方法における使用では、、発明のミュータントＩＬ-２ポリペプチド及びイムノコンジュゲートは、適正な医療行為に準拠し、製剤化、用量決定、及び投与されるだろう。これに関して考慮される要因は、治療されている特定の障害、治療されている特定の動物、個々の患者の臨床状態、障害の経過、薬剤の送達部位、投与の方法、投与のスケジュール、及び医師に知られている他の要因を含む。
【０１９２】
発明のミュータントIL-2ポリペプチド及びイムノコンジュゲートは、宿主の免疫系の刺激が有益である疾患状態、特に増強された細胞性免疫反応が所望される状態の治療に有用である。これらは、宿主免疫反応が不十分又は不全である疾患状態を含みうる。発明のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートが投与されうる疾患状態は、細胞免疫反応が特定の免疫に決定的なメカニズムである感染又は腫瘍を含む。本発明のIL-2ミュータントが用いられうる特異的な疾患状態は、癌、例えば腎細胞癌又はメラノーマ；HIV陽性患者、免疫抑制患者、慢性感染などに特異的な免疫不全を含む。発明のミュータントIL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートは、それ自体で又は何れかの適切な薬学的組成物中において投与されうる。
【０１９３】
一態様では、医薬としての使用のための発明のミュータントＩＬ-２ポリペプチド及びイムノコンジュゲートが提供される。更なる態様では、疾患の治療における使用のための発明のミュータントＩＬ-２ポリペプチド及びイムノコンジュゲートが提供される。ある実施態様では、治療の方法における使用のための発明のミュータントＩＬ-２ポリペプチド及びイムノコンジュゲートが提供される。一実施態様では、発明は、それを必要とする個体における疾患の治療における使用のための、ここに記載のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを提供する。ある実施態様では、発明は、疾患を有する個体の治療の方法であって、治療的に有効な量のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを個体に投与することを含んでなる方法における使用のためのミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを提供する。ある実施態様では、治療される疾患は増殖性障害である。好ましい実施態様では、疾患は癌である。ある実施態様では、方法は、治療的に有効な量の少なくとも一つの更なる治療剤、例えば治療される疾患が癌ならば抗癌剤を個体に投与することを更に含む。更なる実施態様では、発明は、免疫系の刺激における使用のためのミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを提供する。ある実施態様では、発明は、免疫系を刺激するために有効量のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを個体に投与することを含んでなる、個体における免疫系を刺激する方法における使用のための、ミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを提供する。上記実施態様の何れかによる「個体」は、哺乳類、好ましくはヒトである。上記実施態様の何れかによる「免疫系の刺激」は、免疫機能における何れか一又は複数の一般的な増加、Ｔ細胞機能における増加、Ｂ細胞機能における増加、リンパ球機能の回復、ＩＬ-２受容体の発現における増加、Ｔ細胞応答における増加、ナチュラルキラー細胞活性又はリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞活性における増加等を含みうる。
【０１９４】
更なる態様では、発明は、必要している個体における疾患の治療のための医薬の製造又は調製における、発明のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの使用を提供する。一実施態様では、医薬は、治療的に有効な量の医薬を疾患を有する個体に投与することを含んでなる、疾患を治療する方法における使用のためである。ある実施態様では、治療される疾患は増殖性障害である。好ましい実施態様では、疾患は癌である。このような一実施態様では、方法は、治療的に有効な量の少なくとも一つの更なる治療剤、例えば治療される疾患が癌ならば抗癌剤を個体に投与することを更に含む。更なる実施態様では、医薬は、免疫系の刺激のためである。更なる実施態様では、医薬は、免疫系を刺激するために有効量の医薬を個体に投与することを含んでなる、個体における免疫系を刺激する方法における使用のためである。上記実施態様の何れかによる「個体」は、哺乳類、好ましくはヒトでありうる。上記実施態様の何れかによる「免疫系の刺激」は、免疫機能における何れか一又は複数の一般的な増加、Ｔ-細胞機能における増加、Ｂ細胞機能における増加、リンパ球機能の回復、ＩＬ-２受容体の発現における増加、Ｔ-細胞応答における増加、ナチュラルキラー細胞活性又はリンホカイン活性化キラー(ＬＡＫ)細胞活性における増加等を含みうる。
【０１９５】
更なる態様では、発明は、治療的に有効な量の発明のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを前記個体に投与することを含んでなる、個体における疾患を治療するための方法を提供する。一実施態様では、薬学的に許容可能な形態における発明のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを含んでなる組成物が前記個体に投与される。ある実施態様では、治療される疾患は増殖性障害である。好ましい実施態様では、疾患は癌である。ある実施態様では、方法は、治療的に有効な量の少なくとも一つの更なる治療剤、例えば治療される疾患が癌ならば抗癌剤を個体に投与することを更に含む。更なる態様では、発明は、免疫系を刺激するために有効量のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを個体に投与することを含んでなる、個体における免疫系を刺激するための方法を提供する。上記実施態様の何れかによる「個体」は、哺乳類、好ましくはヒトでありうる。上記実施態様の何れかによる「免疫系の刺激」は、免疫機能における何れか一又は複数の一般的な増加、Ｔ-細胞機能における増加、Ｂ細胞機能における増加、リンパ球機能の回復、ＩＬ-２受容体の発現における増加、Ｔ-細胞応答における増加、ナチュラルキラー細胞活性又はリンホカイン活性化キラー(ＬＡＫ)細胞活性における増加等を含みうる。
【０１９６】
上記治療方法の何れかが、ミュータントＩＬ-２ポリペプチドの代わりに又は加えて、発明のイムノコンジュゲートを使用して実施されてもよいことが理解される。
【０１９７】
ある実施態様では、治療される疾患は増殖性障害、好ましくは癌である。癌の非限定的例は、膀胱癌、脳癌、頭頸部癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、食道癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、胃癌、前立腺癌、血液癌、皮膚癌、扁平上皮癌、骨癌、及び腎臓癌を含む。本発明のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを使用して治療できる他の細胞増殖障害は、限定するものではないが、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺(副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺)、眼、頭頸部、神経系(中枢及び末梢)、リンパ系、骨盤、皮膚、軟部組織、脾臓、胸部、及び泌尿生殖器系の新生物を含む。また含まれるのは、前癌性の状態又は病変及び癌転移を含む。ある実施態様では、癌は、腎細胞癌、皮膚癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、脳癌、頭頸部癌から成る群から選択される。同様に、他の細胞増殖障害もまた、本発明のミュータントＩＬ-２ポリペプチド及びイムノコンジュゲートによって治療されうる。このような細胞増殖性障害の例は、限定するものではにが、高ガンマグロブリン血症、リンパ増殖性障害、異常蛋白血症、紫斑病、サルコイドーシス、セザリー症候群、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ゴーシェ病、組織球増殖症、及び上記臓器における新生物以外の何れかの他の増殖性疾患を含む。別の実施態様では、疾患は、自己免疫、移植拒絶、外傷後免疫反応及び感染性疾患(例えばＨＩＶ)に関連する。より具体的には、ミュータントＩＬ-２ポリペプチド及びイムノコンジュゲートは、細胞媒介性障害、例えばリンパ腫；自己免疫、移植拒絶、グラフト-対-ホスト疾患、虚血及び脳卒中において細胞を除去することに使用されうる。熟練した技術者は、多くの場合において、ミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートが根治ではなく、部分的利益のみをもたらしうることを認識するだろう。幾つかの実施態様では、何らかの利益を有する生理学的変化がまた治療に有益であると考えら得る。従って、幾つかの実施態様では、生理学的変化をもたらすミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの量が、「有効な量」又は「治療的に有効な量」と考えら得る。治療を要する被験体、患者、又は個体は典型的には哺乳類、より具体的にはヒトである。
【０１９８】
発明のイムノコンジュゲートはまた、診断用試薬として有用である。抗原決定基へのイムノコンジュゲートの結合は、ＩＬ-２ポリペプチドに特異的な二次抗体を使用して容易に検出できる。一実施態様では、二次抗体及びイムノコンジュゲートは、細胞又は組織表面上に位置する抗原決定基へのイムノコンジュゲートの結合の検出を容易にする。
【０１９９】
幾つかの実施態様では、有効量の発明のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートが、細胞に投与される。他の実施態様では、治療的に有効な量の発明のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートが、疾患の治療のために個体に投与される。
【０２００】
疾患の防止又は治療では、発明のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの適切な投与量は(単独で、又は一又は複数の他の追加の治療剤との組合せにおいて使用されるとき)、治療される疾患のタイプ、投与の経路、患者の体重、ポリペプチドのタイプ(例えば非コンジュゲートＩＬ-２又はイムノコンジュゲート)、疾患の重症度及び経過、抗体が予防又は治療目的で投与されたか、過去の又は同時的治療介入、ミュータントIL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートに対する患者の臨床歴及び反応、及び主治医の裁量に依存するだろう。何れの場合も、投与に責任のある実践者が、個々の被験体に対し、組成物中の活性成分の濃度及び適切な用量を決定するだろう。限定するものではないが、単回又は様々な時間点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含む様々な投与スケジュールが、ここで考えられる。
【０２０１】
非コンジュゲートＩＬ-２の単回投与は、約５０，０００ＩＵ／ｋｇ〜約１，０００，０００ＩＵ／ｋｇ以上、より典型的には約６００，０００ＩＵ／ｋｇのＩＬ-２の範囲でありうる。これは、一日に数回(例えば２−３ｘ)、数日間(例えば約３−５の連続した日数)繰り替えされてもよく、次いで休息期間(例えば約７−１４日)の後、一又は複数回繰り返されてもよい。従って、治療的に有効な量は、単回投与のみ又は一定に期間わたる多回投与を含みうる(例えば、約１０−２０日間にわたって各々与えられる、ＩＬ-２の約６００，０００ＩＵ／ｋｇの約２０−３０の個々の投与)。イムノコンジュゲートの形態において投与される場合、治療的に有効なミュータントＩＬ-２ポリペプチドは、非コンジュゲートのミュータントＩＬ-２ポリペプチドより低量でありうる。
【０２０２】
同様に、イムノコンジュゲートは、一回で又は一連の治療にわたって患者に好適に投与される。疾患のタイプ及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ(例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ−１０ｍｇ／ｋｇ)のイムノコンジュゲートが患者への投与の最初の候補投与量でありえ、例えば一又は複数の別々の投与で、又は持続注入で為される。一つの典型的な一日の投与量は、上記の要因に依存して、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲でありうる。数日間又はそれ以上にわたる反復投与では、状態に依存して、治療は一般的に疾患症状の所望の抑制が生じるまで持続されるだろう。イムノコンジュゲートの一つの例示的な投与量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲だろう。他の非限定的な例では、用量はまた、投与あたり約１マイクログラム／ｋｇ／体重から、約５マイクログラム／ｋｇ／体重、約１０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約１００マイクログラム／ｋｇ／体重、約２００マイクログラム／ｋｇ／体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５００マイクログラム／ｋｇ／体重、約１ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約２００ミリグラム／ｋｇ／体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５００ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重まで又はそれ以上、及びその中で導きだされる何れかの範囲を含む。ここで挙げた数値から導きだされる範囲の非限定的な例は、約５ｍｇ／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重〜約５００ミリグラム／ｋｇ／体重などの範囲が、上記の数値に基づき投与されうる。このように、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一又は複数(又はその何れかの組合せ)の用量が、患者に投与されうる。このような用量は、間欠的に、例えば毎週又は３週間毎に投与されうる(例えば、患者は約２〜約２０、又は例えば約６用量のイムノコンジュゲートを受ける)。最初の高負荷用量と、その後の一又は複数の低用量が投与されうる。しかしながら、他の投与レジメンが有用でありうる。この療法の進行は、一般的な技術及びアッセイによって容易にモニターされる。
【０２０３】
発明のミュータントＩＬ-２ポリペプチド及びイムノコンジュゲートは一般的に、意図した目的を達成するために有効な量において使用されるだろう。疾患状態を治療又は防止するための使用では、発明のミュータントＩＬ-２ポリペプチド及びイムノコンジュゲート又はその薬学的組成物は、治療的に有効な量において投与又は適用される。治療的に有効な量の決定は、特にここに提供される詳細な開示の考慮のもと、十分に当業者に能力の範囲内である。
【０２０４】
全身性投与では、治療的に有効な用量は最初に、細胞培養アッセイなどのインビトロアッセイから推定されうる。次いで用量は、細胞培養において決定されるＩＣ５０を含む循環濃度範囲を得るために、動物モデルにおいて組み立てられうる。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用されうる。
【０２０５】
最初の投与量はまた、当分野においてよく知られている技術を使用して、インビボデータ、例えば動物モデルから推定されうる。当業者は、動物データに基づいてヒトへの投与を容易に最適化できるだろう。
【０２０６】
投与量及び間隔は、治療効果を維持するのに十分なミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの血漿レベルを提供するために、個々に調整されうる。注射による投与のための通常の患者の投与量は、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５〜１ｍｇ／ｋｇ／日である。治療的に有効な血漿レベルは、毎日の複数回投与によって達成されうる。血漿中のレベルは、例えばＨＰＬＣによって測定されうる。
【０２０７】
局所投与又は選択的取込みの場合、イムノコンジュゲートの有効な局所濃度は血漿濃度と関連しない場合がある。当業者は、過度な実験をすることなく、治療的に有効な局所投与量を最適化できるだろう。
【０２０８】
治療的に有効な用量のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートは一般的に、実質的な毒性をもたらすことなく治療効果を提供するだろう。ＩＬ-２ミュータント又はイムノコンジュゲートの毒性及び治療効果は、細胞培養又は実験動物において標準的な手順によって決定できる(例えば実施例８及び９を参照)。細胞培養アッセイ及び動物研究は、ＬＤ５０(集団の５０％に致死性である用量)及びＥＤ５０(集団の５０％に治療的に有効である用量)を決定するために使用できる。毒性及び治療効果間の用量比が、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表現される治療指数である。大きい治療指数を示すＩＬ-２ミュータント及びイムノコンジュゲートが好ましい。一実施態様では、本発明によるミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートは、高い治療指数を示す。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用に好適な投与量の範囲を組み立てるのに使用されうる。投与量は好ましくは、ほとんどあるいは全く毒性の無いＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。投与量は、様々な要因、例えば採用される剤形、利用される投与経路、被験体の状態などに応じて、この範囲内において様々でありうる。正確な製剤化、投与の経路及び投与量は、患者の状態を考慮してそれぞれの医師によって選択されうる。(例えばFingl等, 1975, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1(出典明記によってその全体をここに援用する)を参照)。
【０２０９】
主治医又は発明のＩＬ−２ミュータント又はイムノコンジュゲートで治療される患者は、毒性、臓器不全などに対し、どのように及びいつ投与を終了、中断、調整するかを知っているだろう。逆に、主治医はまた、臨床反応が十分でない場合、治療を高レベルに調整することを知っているだろう（毒性を除く）。興味の障害の管理における投与量の大きさは、治療される状態の重症度、投与の経路などによって様々だろう。状態の重症度は、例えば標準的な予後評価方法によって一部には評価されうる。さらに、用量及びおそらくは投与頻度はまた、個々の患者の年齢、体重及び反応によって様々だろう。
【０２１０】
前記ポリペプチドを含んでなるミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの最大投与量は、それぞれ野生型ＩＬ-２又は野生型ＩＬ-２を含んでなるイムノコンジュゲートに使用されるものから増加されうる。
【０２１１】
他の薬剤及び治療
発明によるミュータントＩＬ-２ポリペプチド及びイムノコンジュゲートは、治療において一又は複数の他の薬剤との組合せにおいて投与されうる。例えば、発明のミュータントＩＬ-２ポリペプチド又はイムノコンジュゲートは、少なくとも一つの追加の治療剤と共投与されうる。「治療剤」なる用語は、治療を必要としている個体における症状又は疾患を治療するために投与される何れかの薬剤を包含する。このような追加の治療剤は、治療されている特定の徴候に好適な何れかの活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補活性を伴うものを含みうる。ある実施態様では、追加の治療剤は、免疫調節剤、細胞分裂阻害剤、細胞接着の阻害剤、細胞傷害剤、細胞アポトーシスの活性化剤、又はアポトーシス誘導物質に対する細胞の感受性を増加させる薬剤である。特定の実施態様では、追加の薬剤は、抗癌剤、例えば微小管撹乱物質、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、DNAインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化剤、又は抗血管新生剤である。
【０２１２】
このような他の薬剤は、意図した目的に有効な量において、組合せにおいて好適に存在する。このような他の薬剤の有効な量は、使用されるミュータントIL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの量、障害又は治療のタイプ、及び上記で検討した他の要因に依存する。ミュータントIL-2ポリペプチド及びイムノコンジュゲートは一般的に、ここに記載されるものと同じ用量及び投与経路で、又はここに記載される用量の約１〜９９％で、或いは経験的／臨床的に適切と判断される任意の用量及任意の投与経路で、用いられる。
【０２１３】
上述のかかる併用療法には、併用投与(二以上の薬剤が同一又は別個の組成物中に含まれる)、及び発明のミュータントIL-2ポリペプチド又はイムノコンジュゲートの投与が、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与より前に、同時に、及び／又は後になされうる別個の投与が含まれる。発明のミュータントIL-2ポリペプチド及びイムノコンジュゲートはまた、放射線療法との組合せにおいて使用されてもよい。
【０２１４】
製造品
本発明の他の態様では、上記の疾患の治療、予防及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。該製造品は容器と該容器上又は該容器に付随するラベル又はパッケージ挿入物を具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、IV液バッグ等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。容器は、症状を治療、予防及び／又は診断するために有効な組成物単独又は他の組成物と組み合わせる組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる(例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる)。組成物中の少なくとも一つの活性剤は発明のミュータントIL-2ポリペプチドである。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が選択された症状の治療に使用されることを示す。更に、製造品は、(a)本発明のミュータントIL-2ポリペプチドを含有する組成物を中に収容する第一の容器；と(b)更なる細胞障害剤又はそれ以外の治療薬を含有する組成物を中に収容する第二の容器とを含みうる。本発明のこの実施態様における製造品は、組成物を特定の症状の治療に使用することができることを示しているパッケージ挿入物を更に含む。あるいは、もしくは付加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二の(又は第三の)容器を更に具備してもよい。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
【０２１５】
上記の製造品の何れかは、ミュータントIL-2ポリペプチドの代わりに又は加えて、発明のイムノコンジュゲートを含みうることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０２１６】
【図１】ミュータントIL-2ポリペプチドを含んでなるFab-IL-2-Fab(A)及びIgG-IL-2(B)イムノコンジュゲートフォーマットの略図。
【図２】ネイキッドIL-2野生型コンストラクトの精製。(A)野生型ネイキッドIL-2のHisタグ精製のクロマトグラム;(B)精製タンパク質のSDS PAGE(8-12% Bis-Tris (NuPage, Invitrogen), MES running buffer)。
【図３】ネイキッドIL-2野生型コンストラクトの精製。(A)野生型IL-2のサイズ排除クロマトグラフィーのクロマトグラム;(B)精製タンパク質のSDS PAGE(8-12% Bis-Tris (NuPage, Invitrogen), MES running buffer)。
【図４】Superdex 75, 10/300 GLにおいて決定される野生型IL-2の分析サイズ排除クロマトグラフィー。プール1は74%の23kDa種及び26%の20kDa種を含み、プール2は40%の22kDa種及び60%の20kDa種を含む。
【図５】ネイキッドIL-2四重ミュータントコンストラクトの精製。(A)IL-2四重ミュータントのHisタグ精製のクロマトグラム;(B)精製タンパク質のSDS PAGE(8-12% Bis-Tris (NuPage, Invitrogen), MES running buffer)。
【図６】ネイキッドIL-2四重ミュータントコンストラクトの精製。(A)IL-2四重ミュータントのサイズ排除クロマトグラフィーのクロマトグラム;(B)精製タンパク質のSDS PAGE(8-12% Bis-Tris (NuPage, Invitrogen), MES running buffer)。
【図７】Superdex 75, 10/300GLにおいて決定されるIL-2四重ミュータントの分析サイズ排除クロマトグラフィー(プール2, 20 kDa)。
【図８】野生型又は四重ミュータントIL-2を含んでなるFAP-標的化29B11ベースFab-IL-2-FabによるIL-2R及びヒトFAPへの同時結合。(A)SPRアッセイのセットアップ;(B) SPRセンサーグラム。
【図９】溶液中における、Proleukinと比較した、野生型又はミュータントIL-2を含んでなるFAP-標的化4G8ベースFab-IL-2-FabによるNK92細胞によるIFN-γ放出の誘導。
【図１０】溶液中における、Proleukinと比較した、野生型又はミュータントIL-2を含んでなるFAP-標的化4G8ベースFab-IL-2-Fabによる単離NK細胞(下)の増殖の誘導。
【図１１】溶液中における、Proleukinと比較した、野生型又はミュータントIL-2を含んでなるFAP-標的化4G8ベースFab-IL-2-Fabによる活性化CD3+T細胞の増殖の誘導。
【図１２】溶液中における、Proleukinと比較した、野生型又はミュータントIL-2を含んでなるFAP-標的化4G8ベースFab-IL-2-Fabによる過剰刺激T細胞の活性化誘導細胞死(AICD)の誘導。
【図１３】溶液中における、Proleukinと比較した、野生型又は四重ミュータントIL-2を含んでなるFAP-標的化4G8ベースFab-IL-2-Fabを伴う溶液中におけるリン酸-STAT5 FACSアッセイ。(A)制御性T細胞(CD4+CD25+FOXP3+);(B)CD8+ T細胞(CD3+CD8+);(C)CD4+T細胞(CD4+CD25-CD127+);(D)NK細胞(CD3-CD56+)。
【図１４】FAP-標的化28H1ベースFab-IL-2 qm-Fabイムノコンジュゲートの精製。(A)プロテインGカラムの溶出プロファイル。(B)Superdex 200サイズ排除カラムの溶出プロファイル。(C)非還元及び還元サンプルによる最終産物のNovex Tris-Glycine 4-20% SDS-PAGE。
【図１５】4G8ベースFAP-標的化Fab-IL-2 qm-Fabイムノコンジュゲートの精製。(A)プロテインAカラムの溶出プロファイル。(B)Superdex 200サイズ排除カラムの溶出プロファイル。(C)非還元及び還元サンプルによる最終産物の NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel (Invitrogen), MOPS running buffer。
【図１６】MHLG1 KV9 MCSP-標的化Fab-IL2QM-Fabイムノコンジュゲートの精製。(A)プロテインAカラムの溶出プロファイル、B)Superdex 200サイズ排除カラムの溶出プロファイル。C)非還元及び還元サンプルによる最終産物のNuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel, Invitrogen, MOPS running buffer。
【図１７】HEK293-ヒトFAP細胞におけるFab-IL-2-Fabコンストラクトの標的結合。
【図１８】HEK293-ヒトFAP細胞におけるFab-IL-2-Fabコンストラクトの標的結合。
【図１９】HEK293-ヒトDPPIV及びHEK293 mock-トランスフェクト細胞において決定されるFab-IL-2-Fabコンストラクトの結合特異性。特異的DPPIV(CD26)抗体の結合を右に示す。
【図２０】GM05389線維芽細胞におけるFAPへのFab-IL-2-Fabコンストラクトの結合によるFAP内部移行の分析。
【図２１】溶液中におけるNK92細胞によるIL-2誘導IFN-γ放出。
【図２２】溶液中におけるNK92細胞によるIL-2誘導IFN-γ放出。
【図２３】溶液中におけるNK92細胞のIL-2誘導増殖。
【図２４】溶液中におけるPBMCによるSTAT5リン酸化アッセイにおけるFab-IL-2-Fabクローン28H1対29B11対4G8の評価。(A)NK細胞(CD3-CD56+);(B)CD8+T細胞(CD3+CD8+);(C)CD4+T細胞(CD3+CD4+CD25-CD127+);(D)制御性T細胞(CD4+CD25+FOXP3+)。
【図２５】ヒト腎細胞腺癌細胞株ACHNにおけるFAP-標的化4G8 Fab-IL-2 wt-Fab及び4G8 Fab-IL-2 qm-Fabイムノコンジュゲートの効果。
【図２６】マウスルイス肺癌細胞株LLC1におけるFAP-標的化4G8 FAP-IL-2 qm-Fab及び28H1 Fab-IL-2 qm-Fabイムノコンジュゲートの効果。
【図２７】マウスルイス肺癌細胞株LLC1におけるFAP-標的化28H1 Fab-IL-2 wt-Fab及び28H1 Fab-IL-2 qm-Fabイムノコンジュゲートの効果。
【図２８】ビヒクルコントロール(A)又は9μg/gのwt IL-2(B)又はqm IL-2(C)で処置されたマウスの肺の低倍率(100x)。9μg/gのwt IL-2で処置されたマウスの肺は、肺胞腔に移動したバソセントリック単核浸潤を示す。浮腫及び出血も存在する。qm IL-2で処置されたマウスにおいてわずかな浸潤を幾つかの血管の周りに観察される。
【図２９】図28に示す肺の高倍率(200x)。血管中及び周辺における単核細胞の辺縁趨向及び浸潤は、qm IL-2で処置されたマウス(B及びC)よりもwt IL-2で処置されたマウスにおいて(A)より重篤である。
【図３０】ビヒクルコントロール(A)又は9μg/gのwt IL-2(B)又はqm IL-2(C)で処置されたマウスの肝臓の低倍率(100x)。バソセントリック浸潤がwt IL-2で処置されたマウスに見られる。
【図３１】異なるIL-2野生型(wt)及び四重ミュータント(qm)調製物を用いた24(A)又は48時間(B)のインキュベーションによるNK92細胞によるIFN-γ分泌。
【図３２】異なるIL-2野生型(wt)及び四重ミュータント(qm)調製物を用いた48時間のインキュベーションによるNK92細胞の増殖。
【図３３】異なるIL-2野生型(wt)及び四重ミュータント(qm)調製物を用いた48時間のインキュベーションによるNK92細胞の増殖。
【図３４】異なるFAP-標的化28H1 IL-2イムノコンジュゲート又はProleukinを用いた4(A)、5(B)又は6(C)日間のインキュベーションによるNK細胞の増殖。
【図３５】異なるFAP-標的化28H1 IL-2イムノコンジュゲート又はProleukinを用いた4(A)、5(B)又は6(C)日間のインキュベーションによるCD4 T-細胞の増殖。
【図３６】異なるFAP-標的化28H1 IL-2イムノコンジュゲート又はProleukinを用いた4(A)、5(B)又は6(C)日間のインキュベーションによるCD8 T-細胞の増殖。
【図３７】異なるIL-2イムノコンジュゲート又はProleukinを用いた6日間のインキュベーションによるNK細胞(A)、CD4 T-細胞(B)及びCD8 T-細胞(C)の増殖。
【図３８】Proleukin、インハウス生産の野生型IL-2及び四重ミュータントIL-2を用いた30分インキュベーションの後のNK細胞(A)、CD8 T-細胞(B)、CD4 T-細胞(C)及び制御性T-細胞(D)におけるSTATリン酸化。
【図３９】Proleukin、野生型IL-2を含んでなるIgG-IL-2又は四重ミュータントIL-2を含んでなるIgG-IL-2を用いた30分インキュベーションの後のNK細胞(A)、CD8 T-細胞(B)、CD4 T-細胞(C)及び制御性T-細胞(D)におけるSTATリン酸化。
【図４０】野生型又は四重ミュータントIL-2を含んでなる異なる用量のIL-2イムノコンジュゲートの投与後(1日1回を７日間)のBlack 6マウスの生存。
【図４１】野生型(wt)又は四重ミュータント(qm)IL-2を含んでなるFAP-標的化(A)及び非標的化(B)IgG-IL-2コンストラクトの単一静脈内投与後のIL-2イムノコンジュゲートの血清濃度。
【図４２】野生型(wt)又は四重ミュータント(qm)IL-2.を含んでなる非標的化Fab-IL-2-Fabコンストラクトの単一静脈内投与後のIL-2イムノコンジュゲートの血清濃度。
【図４３】四重ミュータントIL-2の精製。(A)固定化金属イオンクロマトグラフィー;(B)サイズ排除クロマトグラフィー;(C)非還元条件下のSDS PAGE(NuPAGE Novex Bis-Tris gel (Invitrogen), MES running buffer);(D)分析サイズ排除クロマトグラフィー(Superdex 75 10/300 GL)。
【図４４】異なるIL-2イムノコンジュゲートを用いた６日のインキュベーション後のプレ活性化CD8(A)及びCD4(B)T細胞の増殖。
【図４５】異なるIL-2イムノコンジュゲートを用いた６日のインキュベーション及び抗Fas抗体を用いた一晩の処置の後のCD3+T細胞の活性化誘導細胞死。
【図４６】FAP-標的化4G8ベースIgG-IL-2四重ミュータント(qm)イムノコンジュゲートの精製。A)プロテインAアフィニティークロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。B)サイズ排除クロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。C)最終産物の分析SDS-PAGE(NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel, Invitrogen, MOPS running buffer)。D)Superdex200カラムにおける最終産物の分析サイズ排除クロマトグラフィー(97%単量体内容物)。
【図４７】FAP-標的化28H1ベースIgG-IL-2 qmイムノコンジュゲートの精製。A)プロテインAアフィニティークロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。B)サイズ排除クロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。C)最終産物の分析SDS-PAGE(還元: NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel, Invitrogen, MOPS running buffer;非還元: NuPAGE Tris-Acetate, Invitrogen, Tris-Acetate running buffer)。D)Superdex200カラムにおける最終産物の分析サイズ排除クロマトグラフィー(100%単量体内容物)。
【図４８】対応するFab-IL-2 qm-Fabコンストラクトと比較した、FACSによって測定される安定的にトランスフェクトされたHEK293細胞において発現されるヒトFAPへのFAP-標的化4G8ベースIgG-IL-2 qmイムノコンジュゲートの結合。
【図４９】28H1ベースFab-IL-2 qm-Fabコンストラクトと比較した、溶液中におけるFAP-標的化4G8ベースIgG-IL-2 qmイムノコンジュゲートに誘導されたNK92細胞におけるインターフェロン(IFN)-γ放出。
【図５０】28H1ベースFab-IL-2-Fab及びFab-IL-2 qm-Fabコンストラクト並びにProleukinと比較した、溶液中におけるFAP-標的化4G8ベースIgG-IL-2 qmイムノコンジュゲートを用いた20分間の刺激後の、異なる細胞タイプにおけるFACSによるリン酸化STAT5の検出。A)NK細胞(CD3-CD56+);B)CD8+T細胞(CD3+CD8+);C)CD4+T細胞(CD3+CD4+CD25-CD127+);D)制御性T細胞(CD4+CD25+FOXP3+)。
【０２１７】
実施例
以下は、発明の方法及び組成物の実施例である。上記の一般的な説明のもと、様々な他の実施態様が実施されうることが理解される。
【０２１８】
実施例1
一般的方法
組換えＤＮＡ技術
標準的方法を使用し、Sambrook等, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されるようにDNAを操作した。分子生物学試薬を、製造者の指示に従って使用した。ヒト免疫グロブリン軽及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat, E.A.等, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242に記載される。
【０２１９】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列を二本鎖配列決定によって決定した。
【０２２０】
遺伝子合成
必要な場合、所望の遺伝子を、適切な鋳型を使用してＰＣＲによって生成するか、又は自動化遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物からGeneart AG(Regensburg, Germany)によって合成した。正確な遺伝子配列が入手可能でない場合、オリゴヌクレオチドプライマーを最も近いホモログからの配列に基づいて設計し、遺伝子を適切な組織に由来するＲＮＡからＲＴ-ＰＣＲによって単離した。特異制限エンドヌクレアーゼ切断部位にはさまれる遺伝子セグメントを標準のクローニング／シークエンシングベクターにクローン化した。プラスミドＤＮＡを形質転換細菌から精製し、濃度を紫外分光法によって決定した。サブクローン化遺伝子断片のＤＮＡ配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。それぞれの発現ベクターへのサブクローニングを可能にするために、遺伝子セグメントを適切な制限部位で設計した。全てのコンストラクトは、真核生物細胞における分泌のためのタンパク質を標的にするリーダーペプチドをコードする５’-末端ＤＮＡ配列と共に設計した。配列番号２６３−２７３は、それらをコードする例示的なリーダーペプチド及びポリヌクレオチド配列である。
【０２２１】
ＩＬ-２Ｒβγ-サブユニット-Ｆｃ融合物及びＩＬ-２Ｒα-サブユニットＦｃ融合物の調製
ＩＬ-２受容体結合親和性を研究するために、ヘテロ二量体ＩＬ-２受容体の発現を可能にするツールを生成した;「ノブ-インツ-ホール」技術(Merchant等, Nat Biotech.16, 677-681 (1998))を使用してヘテロ二量体化するよう操作されたＦｃ分子(Ｆｃ(ホール))(配列番号２７４及び２７５を参照)にＩＬ-２受容体のβ-サブユニットを融合させた。次いで、ＩＬ-２受容体のγ-サブユニットをＦｃ(ノブ)変異体(配列番号２７６及び２７７を参照)に融合させ、これをＦｃ(ホール)とヘテロ二量体化させた。次いで、このヘテロ二量体Ｆｃ-融合タンパク質を、ＩＬ-２／ＩＬ-２受容体相互作用を分析するために基質として使用した。ＩＬ-２Ｒα-サブユニットをＡｃＴｅｖ切断部位及びＡｖｉ Ｈｉｓタグ(配列番号２７８及び２７９)を伴う単量体鎖として発現させた。それぞれのＩＬ-２Ｒサブユニットを、ＩＬ-２Ｒβγ  サブユニットコンストラクトについては血清と共に、α-サブユニットコンストラクトについては血清なしでＨＥＫ ＥＢＮＡ２９３において一過性に発現させた。ＩＬ-２Ｒβγ サブユニットコンストラクトをプロテインＡ(GE Healthcare)において、その後サイズ排除クロマトグラフィー(GE Healthcare, Superdex 200)によって精製した。ＩＬ-２Ｒα-サブユニットをＮｉＮＴＡカラム(Qiagen)においてＨｉｓタグによって、その後サイズ排除クロマトグラフィー(GE Healthcare, Superdex 75)によって精製した。
【０２２２】
イムノコンジュゲートの調製
抗原結合部分の生成及び親和性成熟を含むＦａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートの調製及び精製についての詳細は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１／０２０７８３に添付される実施例に見出され、これを出典明記によってここにその全体を援用する。そこに記載されるようにＦＡＰに対する様々な抗原結合ドメインがファージディスプレイによって生成されており、以下の実施例において使用される４Ｇ８、３Ｆ２、２８Ｈ１、２９Ｂ１１、１４Ｂ３、及び４Ｂ９と命名されるものを含む。クローン２８Ｈ１は親クローン４Ｇ８に基づく親和性成熟抗体であり、クローン２９Ｂ１１、１４Ｂ３及び４Ｂ９はクローン３Ｆ２に基づく親和性成熟抗体である。ここで使用されるＭＨＬＧ１ＫＶ９と命名される抗原結合ドメインは、MCSPを指向する。
【０２２３】
以下の実施例において使用された野生型ＩＬ-２を含んでなるイムノコンジュゲートの配列も、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１／０２０７８３に見出される。以下の実施例において使用された四重ミュータントＩＬ-２を含んでなるイムノコンジュゲートに対応する配列は：４Ｇ８：配列番号２１１及び２３３；３Ｆ２：配列番号２０９及び２３１；２８Ｈ１：配列番号２１９及び２３３；２９Ｂ１１：配列番号２２１及び２３１；１４Ｂ３：配列番号２２９及び２３１；４Ｂ９：配列番号２２７及び２３１；ＭＨＬＧ１-ＫＶ９：配列番号２５３及び２５５である。ＤＮＡ配列を遺伝子合成及び／又は古典的分子生物学技術によって生成し、ＭＰＳＶプロモーター及び上流の合成ポリＡ部位のコントロール下で哺乳類発現ベクター(軽鎖に一つそして重鎖に一つ／ＩＬ-２融合タンパク質)にサブクローン化し、各ベクターはＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を保有した。下記の実施例において使用されるイムノコンジュゲートを、指数関数的に増殖しているＨＥＫ２９３-ＥＢＮＡをリン酸カルシウムトランスフェクションを使用して哺乳類発現ベクターで共トランスフェクトすることによって生産した。あるいは、懸濁液において増殖しているＨＥＫ２９３細胞を、それぞれの発現ベクターでポリエチレンイミン(ＰＥＩ)によってトランスフェクトした。あるいは、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞プール又はＣＨＯ細胞クローンを無血清培地における生産のために使用した。野生型又は(四重)ミュータントＩＬ-２を含んでなる４Ｇ８-ベースＦＡＰ-標的化Ｆａｂ-ＩＬ-２-ＦａｂコンストラクトはプロテインＡマトリックスを使用してアフィニティークロマトグラフィーによって精製され得、親和性成熟２８Ｈ１-ベースＦＡＰ-標的化Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂコンストラクトは小規模においてプロテインＧマトリックスにおいてアフィニティークロマトグラフィーで精製した。
【０２２４】
簡潔には、野生型又は(四重)ミュータントＩＬ-２を含んでなるＦＡＰ-標的化２８Ｈ１Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂを、細胞上澄みから、一親和性工程(プロテインＧ)とその後のサイズ排除クロマトグラフィー(Superdex 200, GE Healthcare)によって精製した。プロテインＧカラムを２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム(ｐＨ７．５)において平衡化し、上澄みをロードし、カラムを２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム(ｐＨ７．５)で洗浄した。Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂを８．８ｍＭギ酸(ｐＨ３)で溶出した。溶出された画分をプールし、最終製剤バッファー：２５ｍＭリン酸カリウム、１２５ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン(ｐＨ６．７)においてサイズ排除クロマトグラフィーによってポリッシュした。精製からの例示的な結果及び分析を下記する。
【０２２５】
野生型又は(四重)ミュータントＩＬ-２を含んでなるＦＡＰ-標的化３Ｆ２Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂ又は４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂを、プロテインＡを使用する一親和性工程から成る類似な方法と、その後のサイズ排除クロマトグラフィー(Superdex 200, GE Healthcare)によって精製した。プロテインＡカラムを２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム(ｐＨ７．５)において平衡化し、上澄みをロードし、カラムを２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム(ｐＨ７．５)で洗浄し、その後１３．３ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム(ｐＨ５．４５)で洗浄した。１０ｍＭＭＥＳ、５０ｍＭ塩化ナトリウム(ｐＨ５)での第三洗浄を場合によって実施した。Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂを、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン(ｐＨ３)で溶出した。溶出された画分をプールし、最終製剤バッファー：２５ｍＭリン酸カリウム、１２５ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン(ｐＨ６．７)においてサイズ排除クロマトグラフィーによってポリッシュした。例示的な詳細精製手順及び結果を、選択コンストラクトについて下記する。
【０２２６】
一つの単一ＩＬ-２四重ミュータント(ｑｍ)を図１Ｂに示すように一つのヘテロ二量体重鎖のＣ末端に融合し、ＦＡＰ-標的化ＩｇＧ-ＩＬ-２ｑｍ融合タンパク質をＦＡＰ-抗体４Ｇ８、４Ｂ９及び２８Ｈ１に基づいて生成した。ＦＡＰが選択的に発現されている腫瘍間質へのターゲティングは、二価抗体Ｆａｂ領域を介して達成される(アビディティー効果)。単一ＩＬ-２四重ミュータントの存在をもたらすヘテロ二量体化は、ノブ-インツ-ホール技術の適用によって達成される。ホモ二量体ＩｇＧ-サイトカイン融合の生成を最小化にするために、サイトカインをノブを有するＩｇＧ重鎖のＣ-末端(Ｃ-末端Ｌｙｓ残基の欠失を伴う)にＧ４-(ＳＧ４)２-又は(Ｇ４Ｓ)３-リンカーを介して融合した。抗体-サイトカイン融合物はＩｇＧ様特性を有する。ＦｃγＲ結合／エフェクター機能を低減させ、ＦｃＲ共活性化を防ぐために、Ｐ３２９Ｇ Ｌ２３４Ａ Ｌ２３５Ａ(ＬＡＬＡ)変異をＦｃドメインに導入した。これらのイムノコンジュゲートの配列を、配列番号２９７、２９９及び２３３(２８Ｈ１)、配列番号３０１、３０３及び２３１(４Ｂ９)、及び配列番号３１５、３１７及び２３３(４Ｇ８))に示す。加えて、ＣＥＡ-標的化ＩｇＧ-ＩＬ-２ｑｍ融合タンパク質及びコントロールＤＰ４７ＧＳ非標的化ＩｇＧ-ＩＬ-２ｑｍ融合タンパク質(ＩｇＧが特定の標的に結合しない)を生成した。これらのイムノコンジュゲートの配列を、配列番号３０５、３０７及び３０９(ＤＰ４７ＧＳ)、及び配列番号３１９、３２１及び３２３(ＣＨ１Ａ１Ａ)に示す。
【０２２７】
ＩｇＧ-ＩＬ-２コンストラクトをＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞における一過性発現によって生成し、基本的にはＦａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂコンストラクトについて上記したように精製した。簡潔には、ＩｇＧ-ＩＬ-２融合タンパク質を、２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム(ｐＨ７．５)において平衡化したプロテインＡ(HiTrap ProtA, GE Healthcare)を用いて一親和性工程によって精製した。上澄みのローディング後、カラムをまず２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で洗浄し、その後、１３．３ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．４５で洗浄した。ＩｇＧ-サイトカイン融合タンパク質を２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３で溶出した。画分を中和し、プールし、最終製剤バッファー：２５ｍＭリン酸カリウム、１２５ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン、ｐＨ６．７においてサイズ排除クロマトグラフィー(HiLoad 16/60 Superdex 200, GE Healthcare)によって精製した。例示的な詳細精製手順及び結果を、選択コンストラクトについて下記する。精製されたタンパク質サンプルのタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて算出されたモル消衰係数を使用して、２８０ｎｍで光学密度(ＯＤ)を測定することによって決定した。イムノコンジュゲートの純度及び分子量を、還元剤(5mM1,4-ジチオトレイトール)の有無においてＳＤＳ-ＰＡＧＥで分析し、クマシーブルー(SimpleBlueTMSafeStain, Invitrogen)で染色した。NuPAGE(登録商標)Pre-Castゲルシステム(Invitrogen)を製造者の指示に従って使用した(4-20% Tris-glycine gels又は3-12% Bis-Tris)。イムノコンジュゲートサンプルの凝集内容物を、２５℃で２ｍＭＭＯＰＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．０２％ＮａＮ３、ｐＨ７．３においてSuperdex 200 10/300GL分析サイズ排除カラム(GE Healthcare)を使用して分析した。
【０２２８】
ＦＡＰ結合親和性
抗原結合部分としてこれらの実施例において使用される切断Ｆａｂ断片のＦＡＰ結合活性を、Biacore装置において表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)によって決定した。簡潔には、抗His抗体(Penta-His, Qiagen 34660)をＣＭ５チップ上に固定し、１０ｎＭのヒト、マウス又はカニクイザルＦＡＰ-Ｈｉｓ(２０ｓ)を捕獲した。温度は２５°Ｃであり、ＨＢＳ-ＥＰをバッファーとして使用した。Ｆａｂ分析物濃度は１００ｎＭ〜０．４１ｎＭ(二つ組)であり、流量は５０μｌ／分(会合：３００ｓ，解離：６００ｓ(４Ｂ９，１４Ｂ３，２９Ｂ１１，３Ｆ２)又は１２００ｓ(２８Ｈ１，４Ｇ８)，再生：６０ｓ１０ｍＭグリシンｐＨ２)だった。フィッティングを1:1結合モデル、RI=0、Rmax=local(捕獲フォーマットのため)に基づいて実施した。表2は、SPRによって決定される一価の親和性を示す。
0005878182.tif 000003
【０２２９】
標的化ＩＬ-２イムノコンジュゲートによる生物学的活性アッセイ
野生型又は(四重)ミュータントＩＬ-２を含んでなる、ＦＡＰ-又はＭＣＳＰ-標的化Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲート及びＦＡＰ-標的化ＩｇＧ-ＩＬ-２イムノコンジュゲートの生物学的活性を、市販のＩＬ-２(Proleukin, Novartis, Chiron)と比較して、幾つかの細胞アッセイにおいて調査した。
【０２３０】
ＮＫ細胞に放出されるＩＦＮ-γ(溶液中)
ＩＬ-２飢餓ＮＫ９２細胞(９６-Ｕ-ウェルプレートに１０００００細胞／ウェル)を、ＮＫ培地(１０％ＦＣＳ、１０％ウマ血清、０．１ｍＭ２-メルカプトエタノール、０．２ｍＭイノシトール及び０．０２ｍＭ葉酸で補充されたInvitrogenからのMEMalpha(#22561-021))において２４時間、野生型又は(四重)ミュータントＩＬ-２を含んでなる異なる濃度のＩＬ-２イムノコンジュゲートでインキュベートした。上澄みを収集し、ＩＦＮ-γ放出をＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎからの抗ヒトＩＦＮ-γＥＬＩＳＡキットＩＩ(＃５５０６１２)を使用して分析した。Proleukin(Novartis)を細胞のＩＬ-２-媒介活性化のポジティブコントロールとして使用した。
【０２３１】
ＮＫ細胞増殖
健常人からの血液をヘパリン収容シリンジにとり、ＰＢＭＣを単離した。未処置のヒトＮＫ細胞をMiltenyi BiotecからのヒトNK Cell IsolationキットII(#130-091-152)を使用してＰＢＭＣから単離した。細胞のＣＤ２５発現をフローサイトメトリーで検査した。増殖アッセイでは、２００００の単離ヒトＮＫ細胞を、野生型又は(四重)ミュータントＩＬ-２を含んでなる異なるＩＬ-２イムノコンジュゲートの存在中において、３７℃、５％ＣＯ２で、加湿インキュベーターにおいて２日間インキュベートした。Proleukin(Novartis)をコントロールとして使用した。２日後、細胞溶解物のＡＴＰ量を、PromegaからCellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(#G7571/2/3)を使用して測定した。最も高いＰｒｏｌｅｕｋｉｎ濃度を１００％増殖に、ＩＬ-２刺激無しの未処理細胞を０％増殖に設定し、増殖のパーセンテージを算出した。
【０２３２】
ＳＴＡＴ５リン酸化アッセイ
健常人からの血液をヘパリン収容シリンジにとり、ＰＢＭＣを単離した。ＰＢＭＣを、記載の濃度で野生型又は(四重)ミュータントＩＬ-２を含んでなるＩＬ-２イムノコンジュゲートで、又はコントロールとしてＰｒｏｌｅｕｋｉｎ(Novartis)で処理した。３７℃で２０分のインキュベーションの後、ＰＢＭＣを３７℃で１０分間プレ加温Cytofixバッファー(Becton Dickinson #554655)で固定化し、その後、４℃で３０分間Phosflow Perm Buffer III(Becton Dickinson #558050)で透過処理した。異なる細胞集団及びＳＴＡＴ５のリン酸化の検出のためにフローサイトメトリー抗体の混合物を使用してＦＡＣＳ染色を実施する前に、細胞を０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで２回洗浄した。サンプルを、Becton DickinsonからHTSと共にFACSCantoIIを使用して分析した。
【０２３３】
ＮＫ細胞をＣＤ３−ＣＤ５６＋として定義し、ＣＤ８陽性Ｔ-細胞をＣＤ３＋ＣＤ８＋として定義し、ＣＤ４陽性Ｔ-細胞をＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ１２７＋として定義し、Ｔｒｅｇ細胞をＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋として定義した。
【０２３４】
Ｔ-細胞の増殖及びＡＩＣＤ
健常人からの血液をヘパリン収容シリンジにとり、ＰＢＭＣを単離した。未処置のＴ-細胞を、Miltenyi BiotecのPan T Cell Isolation Kit II(#130-091-156)を使用して単離した。Ｔ-細胞を１６時間１μｇ／ｍｌのＰＨＡ-Ｍ(Sigma Aldrich #L8902)でプレ刺激した後、Proleukin又は野生型又は(四重)ミュータントＩＬ-２を含んでなるＦａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートを、洗浄した細胞に更に５日間加えた。５日後、細胞溶解物のＡＴＰ量を、PromegaからCellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(#G7571/2/3)を使用して測定した。相対増殖を、最も高いＰｒｏｌｅｕｋｉｎ濃度を１００％増殖に設定して算出した。
【０２３５】
Ｔ-細胞のホスファチジルセリン(ＰＳ)露出及び細胞死を、アネキシンＶ(Annexin-V-FLUOS Staining Kit, Roche Applied Science)及びヨウ化プロピジウム(ＰＩ)-染色細胞のフローサイトメトリー分析(FACSCantoII, BD Biosciences)によってアッセイした。活性化誘導細胞死(ＡＩＣＤ)を誘導するために、１６時間のＰＨＡ-Ｍ及び５日のＦａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートでの処理の後、Ｔ-細胞を１６時間、アポトーシス誘導抗Ｆａｓ抗体(Millipore clone Ch11)で処理した。アネキシンＶ染色を製造者の指示に従って実施した。簡潔には、細胞をＡｎｎ-Ｖ結合バッファー(1x stock:0.01Mのヘペス/NaOH pH7.4, 0.14 MのNaCl, 2.5mMのCaCl2)で洗浄し、アネキシンVFITC(Roche)で暗所において室温で１５分間染色した。ＰＩ(０．３μｇ／ｍｌ)を含有する２００μｌ／ウェルのＡｎｎ-Ｖ-結合バッファーの添加の前に、細胞をＡｎｎ-Ｖ-結合バッファーにおいて再度洗浄した。細胞をフローサイトメトリーによって直ちに分析した。
【０２３６】
ＦＡＰ発現細胞の結合
安定してトランスフェトされたＨＥＫ２９３細胞上に発現されたヒトＦＡＰへのＦＡＰ-標的化ＩｇＧ-ＩＬ-２ｑｍ及びＦａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂイムノコンジュゲートの結合をＦＡＣＳで測定した。簡潔には、２５００００細胞／ウェルを丸底９６-ウェルプレートにおいて記載の濃度のイムノコンジュゲートでインキュベートし、３０分間４℃でインキュベートし、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで１回洗浄した。結合イムノコンジュゲートを、FITC-conjugated AffiniPure F(ab’)2 Fragment goat anti-human F(ab’)2 Specific(Jackson Immuno Research Lab #109-096-097、ワーキング溶液：ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中に１：２０希釈、新鮮に調製)で４℃で３０分間のインキュベーション後、FACS CantoII(Software FACS Diva)を使用して検出した。
【０２３７】
ＦＡＣＳによる結合によるＦＡＰの内部移行の分析
当分野で知られている幾つかのＦＡＰ抗体について、それらが結合によりＦＡＰ内部移行を誘導することが記載されている(described e.g. in Baum等, J Drug Target 15, 399-406 (2007); Bauer等, Journal of Clinical Oncology, 2010 ASCO Annual Meeting Proceedings (Post-Meeting Edition), vol. 28 (May 20 Supplement), abstract no. 13062 (2010); Ostermann等, Clin Cancer Res 14, 4584-4592 (2008))。従って、我々は、我々のＦａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートの内部移行特性を分析した。簡潔には、１５％ＦＣＳのＥＭＥＭ培地において培養されたＧＭ０５３８９細胞(ヒト肺線維芽細胞)を分離し、洗浄し、カウントし、生存について検査し、１２-ウェルプレートに２ｘ１０５細胞／ウェルの密度で播種した。次の日、ＦＡＰ-標的化Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートを冷却培地に希釈し、氷上で３０分間、細胞表面へ結合させた。過剰な非結合抗体を冷却ＰＢＳを使用して洗浄し、細胞を記載の時間３７℃で０．５ｍｌのｃｏｍｐｌｅｔｅプレ加温培地において更にインキュベートした。異なる時間点に達した時、細胞を氷上に移し、冷却ＰＢＳで１回洗浄し、二次抗体(FITC-conjugated AffiniPure F(ab’)2 Fragment goat anti-human F(ab’)2 specific, Jackson Immuno Research Lab # 109-096-097, 1:20希釈)で３０分間４℃でインキュベートした。次いで細胞をＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで２回洗浄し、９６-ウェルプレートに移し、４分間４℃、４００ｘｇで遠心分離し、細胞プレートをボルテックスで再懸濁させた。細胞を１００μｌの２％ＰＦＡを使用して固定化した。ＦＡＣＳ測定では、細胞を２００μｌ／サンプルのＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中に再懸濁させ、FACS CantoII(Software FACS Diva)においてプレートプロトコルにより測定した。
【０２３８】
実施例２
我々は、一又は複数の以下の変異(配列番号：１に示す野生型ＩＬ-２配列と比較)を含む変異バージョンのＩＬ-２を設計した：
１．Ｔ３Ａ−予測Ｏ-糖鎖付加部位のノックアウト
２．Ｆ４２Ａ−ＩＬ-２／ＩＬ-２Ｒα相互作用のノックアウト
３．Ｙ４５Ａ−ＩＬ-２／ＩＬ-２Ｒα相互作用のノックアウト
４．Ｌ７２Ｇ−ＩＬ-２／ＩＬ-２Ｒα相互作用のノックアウト
５．Ｃ１２５Ａ−ジスルフィド架橋ＩＬ-２二量体を避けるための前述の変異
【０２３９】
変異１−４の全てを含んでなるミュータントＩＬ-２ポリペプチドを、ここではＩＬ-２四重ミュータント(ｑｍ)と記載する。変異５を更に含みうる(配列番号：１９を参照)。
【０２４０】
ＣＤ２５への結合を干渉するために設計された３つの変異Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇに加えて、Ｏ-糖鎖付加部位を除去し、ＩＬ-２ｑｍポリペプチド又はイムノコンジュゲートがＣＨＯ又はＨＥＫ２９３細胞等の真核生物細胞において発現される時に高い均一性及び純度でタンパク質産物を得るためにＴ３Ａ変異を選択した。
【０２４１】
精製目的のために、Ｈｉｓ６タグをＣ末端にＶＤ配列を介して導入した。比較のために、非変異類似体バージョンのＩＬ-２を生成し、所望しない分子間ジスルフィド架橋を避けるためにＣ１４５Ａ変異のみを有した(配列番号：３)。シグナル配列なしのそれぞれの分子量は、ネイキッドＩＬ-２については１６４２３Ｄであり、ネイキッドＩＬ-２ｑｍについては１６１６９Ｄだった。野生型及び四重ミュータントＩＬ-２をＨｉｓタグと共に、無血清培地(Ｆ１７培地)においてＨＥＫ ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクトした。濾過した上澄みを、それをNiNTA Superflow Cartridge(5ml, Qiagen)にロードする前に、クロスフローにおいてバッファー交換した。カラムを洗浄バッファー：２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４で洗浄し、溶出バッファー：２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍイミダゾール、ｐＨ７．４で溶出した。ローディング後、カラムを８カラム体積(ＣＶ)の洗浄バッファー、１０ＣＶの５％溶出バッファー(２５ｍＭイミダゾールに相応)で洗浄し、次いで０．５Ｍイミダゾールまでの勾配で溶出した。プールした溶出物を、２ｍＭＭＯＰＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２％アジ化ナトリウム、ｐＨ７．３においてHiLoad 16/60 Superdex75(GE Healthcare)カラムにおいてサイズ排除クロマトグラフィーでポリッシュした。図２は、野生型ネイキッドＩＬ-２のＨｉｓタグ精製のクロマトグラムを示す。プール１を画分７８−８５から、プール２を画分８６−１１１からつくった。図３は野生型ＩＬ-２のサイズ排除クロマトグラフィーのクロマトグラムを示し、各プールについては画分１２〜１４をプールした。図４は、２ｍＭＭＯＰＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２％アジ化ナトリウム、ｐＨ７．３においてSuperdex 75, 10/300 GL(GE Healthcare)カラムにおいて決定される野生型ＩＬ-２の分析サイズ排除クロマトグラフィーを示す。プール１及び２はおよそ２２及び２０ｋＤａの２タンパク質を含んだ。プール１はより多くの大タンパク質を有し、プール２はより多くの小タンパク質を有し、推定ではこの差異はＯ-糖鎖付加の差異による。収量はプール１についてはおよそ０．５ｍｇ／Ｌ上澄み、プール２についてはおよそ１．６ｍｇ／Ｌ上澄みだった。図５は四重ミュータントＩＬ-２のＨｉｓタグ精製のクロマトグラムを示す。プール１を画分５９−９１から、プール２を画分９２−１１１からつくった。図６は四重ミュータントＩＬ-２のサイズ排除クロマトグラフィーのクロマトグラムを示し、ここではプール２画分１２〜１４のみ記録した。図７は、２ｍＭＭＯＰＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２％アジ化ナトリウム、ｐＨ７．３におけるSuperdex 75, 10/300 GL(GE Healthcare)カラムにおいて決定される四重ミュータントＩＬ-２の分析サイズ排除クロマトグラフィーを示す。ネイキッド四重ミュータントＩＬ-２の調製物は、２０ｋＤの一タンパク質のみを有した。このタンパク質はＯ-糖鎖付加部位ノックアウトを有した。アリコートのネイキッドＩＬ-２野生型及び四重ミュータントを−８０℃で冷凍保存した。収量はおよそ０．９ｍｇ／Ｌ上澄みだった。
【０２４２】
第二バッチのＨｉｓ-タグ四重ミュータントＩＬ-２を、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー(ＩＭＡＣ)と、その後のサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)によって上記のように精製した。ＩＭＡＣに使用したバッファーは、カラム平衡化及び洗浄については５０ｍＭＴｒｉｓ、２０ｍＭイミダゾール、０．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ８、溶出については５０ｍＭＴｒｉｓ、０．５Ｍイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８だった。ＳＥＣ及び最終製剤バッファーに使用したバッファーは、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６だった。図４３は精製の結果を示す。収量は２．３ｍｌ／Ｌ上澄みだった。
【０２４３】
その後、ＩＬ-２Ｒβγヘテロ二量体及びＩＬ-２Ｒα-サブユニットの親和性を表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)で決定した。簡潔には、リガンド−ヒトＩＬ-２Ｒα-サブユニット(Ｆｃ２)又はヒトＩＬ-２Ｒβノブγホールヘテロ二量体(Ｆｃ３)−をＣＭ５チップ上に固定した。その後、ネイキッド野生型(プール１及び２)又は四重ミュータントＩＬ-２、及びＰｒｏｌｅｕｋｉｎ(Novartis/Chiron)を３００ｎＭ〜１．２ｎＭ(１：３希釈)の範囲の濃度においてＨＢＳ-ＥＰバッファーにおいて２５℃で分析物としてチップに適用した。流量は３０μｌ／分であり、以下の条件を適用した：会合：１８０ｓ、解離：３００ｓ、及び再生：２ｘ３０ｓ ３Ｍ ＭｇＣｌ２(ＩＬ-２Ｒβノブγホールヘテロ二量体)、１０ｓ ５０ｍＭＮａＯＨ(ＩＬ-２Ｒα-サブユニット)。１：１結合をフィッティングに適用した(１：１結合ＲＩ≠０、Ｒｍａｘ＝ｌｏｃａｌ(ＩＬ-２Ｒβγ)、見かけのＫＤ、１：１結合ＲＩ＝０、Ｒｍａｘ＝ｌｏｃａｌ(ＩＬ-２Ｒα))。表３はＩＬ-２Ｒβγ及びＩＬ-２Ｒα-サブユニットへのヒト野生型及び四重ミュータントＩＬ-２並びにＰｒｏｌｅｕｋｉｎの結合のそれぞれのＫＤ値を示す。
0005878182.tif 000004
【０２４４】
データは、ネイキッドＩＬ-２四重ミュータントが所望のふるまいを示し、ＩＬ-２Ｒα-サブユニットについて結合を失ったが、ＩＬ-２Ｒβγへの結合は保たれ、それぞれの野生型ＩＬ-２コンストラクト及びＰｒｏｌｅｕｋｉｎに匹敵することを示す。野生型ＩＬ-２のプール１及び２間の差異はおそらく、Ｏ-糖鎖付加における差異に起因しうる。この可変性及び不均一性は、Ｔ２３Ａ変異の導入によりＩＬ-２四重ミュータントにおいて克服された。
【０２４５】
実施例３
３つの変異Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇ及び変異Ｔ３Ａは、モデルターゲティングドメインとして抗ＦＡＰ抗体４Ｇ８を使用して、単一ミュータント：１)４Ｇ８ＩＬ-２Ｔ３Ａ、２)４Ｇ８ＩＬ-２ Ｆ４２Ａ、３)４Ｇ８ＩＬ-２ Ｙ４５Ａ、４)４Ｇ８ＩＬ-２ Ｌ７２Ｇとして、Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂフォーマット(図１Ａ)に導入するか、又はさらにＯ-糖鎖付加部位を不活性にするために、５)三重ミュータントＦ４２Ａ／Ｙ４５Ａ／Ｌ７２Ｇとして、又は６)四重ミュータントＴ３Ａ／Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ／Ｌ７２ＧとしてＦａｂ-ＩＬ-２ｍｔ-Ｆａｂコンストラクトに組合せられた。４Ｇ８-ベースＦａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂを比較に使用した。全コンストラクトは、ジスルフィド架橋ＩＬ-２二量体を避けるためにＣ１４５Ａ変異を有した。異なるＦａｂ-ＩＬ-２-ＦａｂコンストラクトをＨＥＫ２９３において発現させ、上記のプロテインＡ及びサイズ排除クロマトグラフィーによって上記のように精製した。その後、ヒト及びマウスＩＬ-２Ｒβγヘテロ二量体及びヒト及びマウスＩＬ-２Ｒα-サブユニットの選択ＩＬ-２変異体の親和性を、以下の条件下で組換えＩＬ-２Ｒβγヘテロ二量体及び単量体ＩＬ-２Ｒα-サブユニットを使用して表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)(Biacore)により決定した：ＩＬ-２Ｒα-サブユニットを二密度において固定化し、高固定化のフローセルをＣＤ２５結合を失ったミュータントに使用した。以下の条件を使用した：化学固定：ヒトＩＬ-２Ｒβγヘテロ二量体１６７５ＲＵ；マウスＩＬ-２Ｒβγヘテロ二量体５０９４ＲＵ；ヒトＩＬ-２Ｒα-サブユニット１０１９ＲＵ；ヒトＩＬ-２Ｒα-サブユニット３８５ＲＵ、マウスＩＬ-２Ｒα-サブユニット１１８２ＲＵ；マウスＩＬ-２Ｒα-サブユニット３７８ＲＵ、温度：２５℃、分析物：４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２変異体-Ｆａｂコンストラクト３．１ｎＭ〜２００ｎＭ、流量４０μｌ／分、会合：１８０ｓ、解離：１８０ｓ、再生：１０ｍＭグリシンｐＨ１．５、６０ｓ、４０μｌ／分。フィッティング：二状態反応モデル(コンホメーション変化)、ＲＩ＝０ Ｒｍａｘ＝ｌｏｃａｌ。キネティック分析の結果を表４に示す。
0005878182.tif 000005
【０２４６】
ＩＬ-２Ｒβγヘテロ二量体及びＦＡＰに対する同時結合をＳＰＲによって示した。簡潔には、ヒトＩＬ-２Ｒβγノブ-インツ-ホールコンストラクトをＣＭ５チップ上に化学的に固定し、１０ｎＭのＦａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂコンストラクトを９０秒間捕獲した。ヒトＦＡＰを２００ｎＭ〜０．２ｎＭの濃度で分析物として使用した。条件は：温度：２５℃、バッファー：ＨＢＳ-ＥＰ、流量：３０μｌ／分、会合：９０ｓ、解離：１２０ｓだった。再生を６０秒間、１０ｍＭグリシン、ｐＨ２で実施した。フィッティングを１：１結合、ＲＩ≠０、Ｒｍａｘ＝ｇｌｏｂａｌのモデルで実施した。ＳＰＲ結合アッセイは、Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂコンストラクトが(野生型及び四重ミュータント双方として、並びに親和性成熟ＦＡＰバインダー２８Ｈ１又は親３Ｆ２又は４Ｇ８抗体に基づく)、１０ｎＭの濃度で、チップ上に固定されたＩＬ-２Ｒβγヘテロ二量体並びに分析物として使用されるヒトＦＡＰに同時に結合できることを示した(図８)。決定された親和性を表５に示す。
0005878182.tif 000006
【０２４７】
まとめると、ＳＰＲデータは、ｉ)Ｔ３Ａ変異はＣＤ２５への結合に影響しない、ｉｉ)３つの変異Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２ＧはＩＬ-２Ｒβγヘテロ二量体に対する親和性に影響しないが、それらはこのオーダー：ｗｔ＝Ｔ３Ａ＞Ｙ４５Ａ(およそ５ｘ低い)＞Ｌ７２Ｇ(およそ１０ｘ低い)＞Ｆ４２Ａ(およそ３３ｘ低い)でＣＤ２５に対する親和性を低減する；ｉｉｉ)Ｏ-糖鎖付加部位ミュータントＴ３Ａの有無にかかわらず３つの変異Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇの組合せはＳＰＲ条件下で決定されるようにＣＤ２５結合の完全な消失をもたらす、ｉｖ)マウスＩＬ-２Ｒβγヘテロ二量体及びＩＬ-２Ｒα-サブユニットに対するヒトＩＬ-２の親和性はヒトＩＬ-２受容体と比較しておよそ１０のファクターで低減されるが、選択した変異はマウスＩＬ-２Ｒβγヘテロ二量体に対する親和性に影響しないがマウスＩＬ-２Ｒα-サブユニットへの結合をしかるべく無効にする、ことを示した。これは、全体ＩＬ-２はヒトにおいてより齧歯類において少ない毒性を呈するが、マウスがＩＬ-２ミュータントの薬理学的及び毒物学的効果の研究の妥当なモデルであることを示す。
【０２４８】
Ｏ-糖鎖付加の消失とは別に、四変異Ｔ３Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｌ７２Ｇの組合せのもう一つの利点は、アラニンによるフェニルアラニン、チロシン又はロイシン等の表面に露出した疎水性残基の交換によるＩＬ-２四重ミュータントの低表面疎水性である。動的光散乱による凝集温度の分析は、野生型又は四重ミュータントＩＬ-２を含んでなるＦＡＰ-標的化Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートの凝集温度は、３Ｆ２親Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂ及び親和性成熟２９Ｂ１１ ３Ｆ２-誘導体についてはおよそ５７−５８°Ｃの同じ範囲であり；４Ｇ８親Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂ及び親和性成熟２８Ｈ１，４Ｂ９及び１４Ｂ３ ４Ｇ８-誘導体については６２−６３°Ｃの範囲であることを示し、四変異の組合せはタンパク質安定性に負の影響をもたないことを示す。選択されたＩＬ-２四重ミュータントの好ましい特性として、一過性発現収量は、Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂフォーマットにおける四重ミュータントが、それぞれのＦａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂコンストラクトについて観察されるより高い発現収量をもたらしうることを示した。最後に、薬物動態解析は、４Ｇ８-ベースＦａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂ及びＦａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂ双方が同等なＰＫ特性を有することを示す(下の実施例９を参照)。これらのデータ及び下の実施例４に記載される細胞データに基づき、四重ミュータントＴ３Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｌ７２Ｇが、標的化Ｆａｂ-ＩＬ-２-ＦａｂイムノコンジュゲートにおけるＩＬ-２のＣＤ２５結合の無効化に理想的な組合せの変異として選択された。
【０２４９】
実施例４
野生型ＩＬ-２又は単一ミュータント４Ｇ８ＩＬ-２ Ｔ３Ａ、４Ｇ８ＩＬ-２ Ｆ４２Ａ、４Ｇ８ＩＬ-２ Ｙ４５Ａ、４Ｇ８ＩＬ-２ Ｌ７２Ｇ又はそれぞれの三重(Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ／Ｌ７２Ｇ)又は四重ミュータント(Ｔ３Ａ／Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ／Ｌ７２Ｇ)ＩＬ-２を含んでなる４Ｇ８-ベースＦＡＰ-標的化Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートをその後、上記のようにＰｒｏｌｅｕｋｉｎと比較して細胞アッセイにおいて検査した。
【０２５０】
ＩＬ-２誘導ＩＦＮ-γ放出を、コンストラクトでのＮＫ細胞株ＮＫ９２のインキュベーション後に測定した(図９)。ＮＫ９２細胞はそれらの表面上にＣＤ２５を発現する。結果は、ＩＬ-２Ｒβγヘテロ二量体に対するＦａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂのおよそ１０-倍低い親和性から予測されるように、野生型ＩＬ-２を含んでなるＦａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートが、ＩＦＮ-γ放出の誘導においてＰｒｏｌｅｕｋｉｎより弱いことを示す。ＣＤ２５結合を干渉する単一変異並びにＩＬ-２三重ミュータントにおけるＣＤ２５結合を干渉する３つの変異の組合せの導入は、方法のエラー内で、ＩＦＮ-γ放出の絶対的誘導及び効力に関して野生型ＩＬ-２コンストラクトに匹敵するＦａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂコンストラクトをもたらした。
0005878182.tif 000007
【０２５１】
その後、Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートによる単離ヒトＮＫ細胞の増殖の誘導を、増殖アッセイ(Cell Titer Glo, Promega)において評価した(図１０)。ＮＫ９２細胞と対照的に、新鮮に単離されたＮＫ細胞はＣＤ２５を発現しない(又は非常に少量のみ)。結果は、ＩＬ-２Ｒβγヘテロ二量体に対するＦａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂイムノコンジュゲートのおよそ１０-倍低い親和性から予測されるように、野生型ＩＬ-２を含んでなるＦａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートが、ＮＫ細胞増殖の誘導においてＰｒｏｌｅｕｋｉｎより弱いことを示す。ＣＤ２５結合を干渉する単一変異並びにＩＬ-２三重ミュータントにおけるＣＤ２５を干渉する３つの変異の組合せの導入は、増殖の絶対的誘導及び効果に関して野生型ＩＬ-２コンストラクトに匹敵するＦａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂコンストラクトをもたらした；Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂ三重ミュータントに観察される効力において非常に小さいシフトのみがあった。第二の実験では、異なる量のＰｒｏｌｅｕｋｉｎ及びＦａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートでのインキュベーション後に、ＰＨＡ-活性化Ｔ-細胞の増殖の誘導を評価した(図１１)。活性化Ｔ-細胞はＣＤ２５を発現するので、Ｔ-細胞増殖における明瞭な低減が、ＩＬ-２単一ミュータントＦ４２Ａ、Ｌ７２Ｇ又はＹ４５Ａを含んでなるイムノコンジュゲートでのインキュベーションにより観察できた；Ｆ４２Ａが最も強い低減を示し、続いてＬ７２Ｇ及びＹ４５Ａであったが、Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂ又はＦａｂ-ＩＬ-２(Ｔ３Ａ)-Ｆａｂを使用した場合、活性はＰｒｏｌｅｕｋｉｎと比較してほぼ保たれた。これらのデータは、ＳＰＲによって決定されるＣＤ２５に対する親和性における低減を反映する(上記の実施例)。ＩＬ-２三重ミュータントにおけるＣＤ２５結合を干渉する３つの変異の組合せは、溶液中におけるＴ-細胞の有意に低減された誘導を媒介するイムノコンジュゲートをもたらした。これらの発見に沿って、１μｇ／ｍｌ ＰＨＡでの１６時間の第一刺激、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ又はそれぞれのＦａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートでの５日間の第二刺激、その後の１μｇ／ｍｌ ＰＨＡでの第三刺激による過剰刺激の後、我々はアネキシンＶ／ＰＩ染色によって決定されるＴ-細胞の細胞死を測定した。この設定において我々は、過剰刺激Ｔ-細胞における活性化誘導細胞死(ＡＩＣＤ)が、ＣＤ２５結合を干渉するＩＬ-２単一ミュータントＦ４２Ａ、Ｌ７２Ｇ及びＹ４５Ａを含んでなるＦａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートにより強く低減されることを観察し、Ｆ４２Ａ及びＬ７２Ｇが最も強い低減を示し、これはＩＬ-２三重ミュータントを含んでなるイムノコンジュゲートにおける３つの変異の組合せによって達成される低減と類似した(図１２)。最後のセットの実験では、我々は、ヒトＰＢＭＣからのヒトＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔ-細胞、ＣＤ８＋Ｔ-細胞及びＴｒｅｇ細胞における、Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂ及びＰｒｏｌｅｕｋｉｎと比較した、ＳＴＡＴ５リン酸化の誘導に対するＦａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂの効果を研究した(図１３)。無か又は非常に低いＣＤ２５発現を示すＮＫ細胞及びＣＤ８＋Ｔ-細胞(ＩＬ-２Ｒシグナル伝達がＩＬ-２Ｒβγヘテロ二量体によって媒介されることを意味する)では、結果は、野生型ＩＬ-２を含んでなるＦａｂ-ＩＬ-２-ＦａｂフォーマットがＳＴＡＴ５リン酸化の誘導においてＰｒｏｌｅｕｋｉｎよりおよそ１０-倍弱く、Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-ＦａｂがＦａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂコンストラクトに匹敵したことを示す。刺激によりＣＤ２５の急速な上方制御を示すＣＤ４＋Ｔ-細胞では、Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-ＦａｂはＦａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂイムノコンジュゲートより弱かったが、飽和濃度ではＩＬ-２Ｒシグナル伝達の匹敵する誘導を示した。これはＴｒｅｇ細胞と対照的であり、そこでは、Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂの効力は、Ｔｒｅｇ細胞における高ＣＤ２５発現と、Ｔｒｅｇ細胞におけるＣＤ２５に対するＦａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂイムノコンジュゲートの高結合親和性により、Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂイムノコンジュゲートと比較して有意に低減された。Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-ＦａｂイムノコンジュゲートにおけるＣＤ２５結合の無効化の結果として、Ｔｒｅｇ細胞におけるＩＬ-２シグナル伝達は、ＩＬ-２Ｒシグナル伝達がＩＬ-２Ｒβγヘテロ二量体を通してＣＤ２５-陰性エフェクター細胞において活性化される濃度でＩＬ-２Ｒβγヘテロ二量体を介してのみ活性化させる。まとめると、ここに記載のＩＬ-２四重ミュータントは、ＩＬ-２Ｒβγヘテロ二量体を通してＩＬ-２Ｒシグナル伝達を活性化できるが、ＡＩＣＤをも、他のエフェクター細胞に対するＴｒｅｇ細胞の優先的刺激も生じない。
【０２５２】
実施例５
実施例２及び３に記載のデータに基づき、クローン２８Ｈ１又は２９Ｂ１１に基づく親和性成熟ＦＡＰ-標的化Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂイムノコンジュゲートを、一般的な方法セクションに上記するように生成し、精製した。より詳細には、ＦＡＰ-標的化２８Ｈ１標的化Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂを、一親和性工程(プロテインＧ)と、その後のサイズ排除クロマトグラフィー(Superdex 200)で精製した。カラム平衡化をＰＢＳにおいて実施し、安定ＣＨＯプール(ＣＤＣＨＯ培地)からの上澄みをプロテインＧカラム(GE Healthcare)にロードし、カラムをＰＢＳで洗浄し、その後サンプルを２．５ｍＭのＨＣｌで溶出し、画分を直ちに１０ｘＰＢＳで中和した。サイズ排除クロマトグラフィーを、Superdex 200カラムにおいて、最終製剤バッファー：２５ｍＭリン酸ナトリウム、１２５ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン、ｐＨ６．７において実施した。図１４は精製からの溶出プロファイル、及びＳＤＳ-ＰＡＧＥ(NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel 4-20%, Invitrogen, MOPS running buffer、還元及び非還元)による産物の分析評価からの結果を示す。プロテインＧ及びプロテインＡに対する２８Ｈ１Ｆａｂ断片の低結合能により、更なる捕獲工程がより高い収率をもたらしうる。
【０２５３】
ＦＡＰ-標的化４Ｇ８、３Ｆ２及び２９Ｂ１１Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂ及びＭＣＳＰ-標的化ＭＨＬＧ１ ＫＶ９ Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂイムノコンジュゲートを、一親和性工程(プロテインＡ)と、その後のサイズ排除クロマトグラフィー(Superdex 200)によって精製した。カラム平衡化を２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５において実施し、上澄みをプロテインＡカラムにロードした。第一洗浄を２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５において実施し、その後、第二洗浄：１３．３ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．４５を行った。Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂイムノコンジュゲートを、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３において溶出した。サイズ排除クロマトグラフィーを、最終製剤バッファー：２５ｍＭリン酸カリウム、１２５ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン、ｐＨ６．７において実施した。図１５は、４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂについての、精製からの溶出プロファイル及びＳＤＳ-ＰＡＧＥ(NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel 4-20%, Invitrogen, MOPS running buffer、還元及び非還元)による産物の分析特徴づけからの結果を示し、図１６はＭＨＬＧ１ ＫＶ９ Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂイムノコンジュゲートについてである。
【０２５４】
ＦＡＰ-抗体４Ｇ８、４Ｂ９及び２８Ｈ１に基づくＦＡＰ-標的化ＩｇＧ-ＩＬ-２ｑｍ融合タンパク質、及びコントロールＤＰ４７ＧＳ非標的化ＩｇＧ-ＩＬ-２ｑｍ融合タンパク質を、一般的な方法セクションに上記するように生成した。図４６及び４７は、４Ｇ８-及び２８Ｈ１-ベースコンストラクトについてのそれぞれの精製のクロマトグラム及び溶出プロファイル(Ａ，Ｂ)並びに最終精製コンストラクトの分析ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及びサイズ排除クロマトグラフィー(Ｃ，Ｄ)を示す。一過性発現収量は、４Ｇ８-ベースについては４２ｍｇ／Ｌ、２８Ｈ１-ベースＩｇＧ-ＩＬ-２ｑｍイムノコンジュゲートについては２０ｍｇ／Ｌだった。
【０２５５】
４Ｇ８及び２８Ｈ１抗ＦＡＰ抗体に基づくＩｇＧ-ＩＬ-２ｑｍイムノコンジュゲートのＦＡＰ結合活性を、対応する非修飾ＩｇＧ抗体と比較して、Biacore machineにおいて表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)によって決定した。簡潔には、抗Ｈｉｓ抗体(Penta-His, Qiagen 34660)をＣＭ５チップ上に固定し、１０ｎＭのＨｉｓ-タグヒトＦＡＰを捕獲した(２０ｓ)。温度は２５°Ｃであり、ＨＢＳ-ＥＰをバッファーとして使用した。分析物濃度は５０ｎＭ〜０．０５ｎＭであり５０μｌ／分の流量だった(会合：３００ｓ、解離：９００ｓ、再生：６０ｓ(１０ｍＭグリシン、ｐＨ２))。フィッティングを１：１結合モデル、ＲＩ＝０、Ｒｍａｘ＝ｌｏｃａｌ(捕獲フォーマットのため)に基づいて実施した。表７は１：１結合 ＲＩ＝０、Ｒｍａｘ＝ｌｏｃａｌのＳＰＲフィッティングにより決定される推定見かけ二価親和性を示す(ｐＭアビディティー)。
0005878182.tif 000008
【０２５６】
データは、方法のエラー内では、ヒトＦＡＰの親和性は、対応する非修飾抗体と比較して、２８Ｈ１-ベースイムノコンジュゲートについては保たれ、４Ｇ８-ベースイムノコンジュゲートについてはわずかのみ低下したことを示す。
【０２５７】
実施例６
ＦＡＰ-標的化，親和性成熟２８Ｈ１及び２９Ｂ１１ベースＦａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲート(各々野生型又は四重ミュータントＩＬ-２を含んでなる)、及び３Ｆ２ベースＦａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂの親和性を以下の条件下で、組換えＩＬ-２Ｒβγヘテロ二量体を使用して、ヒト、マウス及びカニクイザルＩＬ-２Ｒβγヘテロ二量体について表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)によって決定した：リガンド：ＣＭ５上に固定されたヒト、マウス及びカニクイザルＩＬ-２Ｒβノブγホールヘテロ二量体、分析物：２８Ｈ１又は２９Ｂ１１Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂ(野生型又は四重ミュータントＩＬ-２を含んでなる)、３Ｆ２Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂ(野生型ＩＬ-２を含んでなる)、温度：２５℃又は３７℃、バッファー：ＨＢＳ-ＥＰ、分析物濃度：２００ｎＭ〜２．５ｎＭ、流量：３０μｌ／分、会合：３００ｓ、解離：３００ｓ、再生：６０ｓ ３Ｍ ＭｇＣｌ２、フィッティング：１：１結合、ＲＩ≠０、Ｒｍａｘ＝ｇｌｏｂａｌ。ＦＡＰ-標的化親和性成熟２８Ｈ１及び２９Ｂ１１ベースＦａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲート(各々野生型又は四重ミュータントＩＬ-２を含む)、及び３Ｆ２ベースＦａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂの親和性を、以下の条件下で、組換え単量体ＩＬ-２Ｒα-サブユニットを使用して、ヒト、マウス及びカニクイザルＩＬ-２Ｒα-サブユニットについて表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)によって決定した：リガンド：ＣＭ５チップ上に固定されたヒト、マウス及びカニクイザルＩＬ-２Ｒα-サブユニット、分析物：２８Ｈ１又は２９Ｂ１１Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂ(野生型又はミュータントＩＬ-２を含んでなる)、３Ｆ２Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂ(野生型ＩＬ-２を含んでなる)、温度：２５℃又は３７℃、バッファー：ＨＢＳ-ＥＰ、分析物濃度２５ｎＭ〜０．３ｎＭ、流量：３０μｌ／分、会合：１２０ｓ、解離：６００ｓ、再生：無し、フィッティング：１：１結合、ＲＩ＝０、Ｒｍａｘ＝ｇｌｏｂａｌ。
【０２５８】
ＩＬ-２Ｒβγヘテロ二量体によるキネティック分析の結果を表８に示す。
0005878182.tif 000009
【０２５９】
ヒトＩＬ-２Ｒβγヘテロ二量体に対するヒトＩＬ-２の親和性は約１ｎＭと記載されるが、Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲート(野生型又は四重ミュータントＩＬ-２を含んでなる)双方とも、６及び１０ｎＭの間の低減された親和性有し、上記でネイキッドＩＬ-２について記載するように、マウスＩＬ-２Ｒに対する親和性はヒト及びカニクイザルＩＬ-２Ｒに対するより約１０倍弱い。
【０２６０】
ＩＬ-２Ｒα-サブユニットによるキネティック分析の結果を表９に示す。選択した条件下では、ヒト、マウス又はカニクイザルＩＬ-２Ｒα-サブユニットに対するＩＬ-２四重ミュータントを含んでなるイムノコンジュゲートの検出可能な結合はない。
0005878182.tif 000010
【０２６１】
野生型又は四重ミュータントＩＬ-２を含んでなるＭＣＳＰ-標的化ＭＨＬＧ１-ＫＶ９  Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートの親和性を、以下の条件下で、組換えＩＬ-２Ｒβγヘテロ二量体を使用してヒトＩＬ-２Ｒβγヘテロ二量体について表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)によって決定した：ヒトＩＬ-２Ｒβノブγホールヘテロ二量体をＣＭ５チップ上に固定した(１６００ＲＵ)。ＭＨＬＧ１-ＫＶ９Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂ及びＦａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂを、ＨＢＳ-Ｐバッファーにおいて２５℃で分析物として使用した。分析物濃度はＩＬ-２Ｒβγについて３００ｎＭ〜０．４ｎＭ(１：３希釈)であり、流量は３０μｌ／分(会合時間１８０ｓ、解離時間３００ｓ)だった。再生をＩＬ-２Ｒβγについて３Ｍ ＭｇＣｌ２で２ｘ３０ｓ実施した。データをＩＬ-２Ｒβγについて１：１結合、ＲＩ≠０、Ｒｍａｘ＝ｌｏｃａｌを使用してフィッティングした。
【０２６２】
野生型又は四重ミュータントＩＬ-２を含んでなるＭＣＳＰ-標的化ＭＨＬＧ１-ＫＶ９  Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートの親和性を以下の条件下で、組換え単量体ＩＬ-２Ｒα-サブユニットを使用して、ヒトＩＬ-２Ｒα-サブユニットについて表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)によって決定した：ヒトＩＬ-２Ｒα-サブユニットをＣＭ５チップ上の固定した(１９０ＲＵ)。ＭＨＬＧ１-ＫＶ９Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂ及びＦａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂを、ＨＢＳ-Ｐバッファーにおいて２５℃で分析物として使用した。分析物濃度はＩＬ-２Ｒαについて３３．３ｎＭ〜０．４ｎＭ(１：３希釈)であり、流量は３０μｌ／分(会合時間１８０ｓ、解離時間３００ｓ)だった。再生をＩＬ-２Ｒαについて５０ｍＭＮａＯＨで１０ｓ実施した。データをＩＬ-２Ｒαについて１：１結合、ＲＩ＝０、Ｒｍａｘ＝ｇｌｏｂａｌを使用してフィッティングした。
【０２６３】
ＩＬ-２Ｒβγヘテロ二量体によるキネティック分析の結果を表１０に示す。
0005878182.tif 000011
【０２６４】
データは、ＭＣＳＰ-標的化ＭＨＬＧ１-ＫＶ９Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-ＦａｂイムノコンジュゲートはＩＬ-２Ｒβγ受容体に対する親和性を保つが、ＣＤ２５に対する親和性は野生型ＩＬ-２を含んでなるイムノコンジュゲートと比較して無効化されることを示す。
【０２６５】
その後、ＩＬ-２Ｒβγヘテロ二量体及びＩＬ-２Ｒα-サブユニットに対する４Ｇ８-及び２８Ｈ１-ベースＩｇＧ-ＩＬ-２ｑｍイムノコンジュゲートの親和性を、Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂイムノコンジュゲートフォーマットとの直接比較において表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)で決定した。簡潔には、リガンド−ヒトＩＬ-２Ｒα-サブユニット又はヒトＩＬ-２Ｒβγヘテロ二量体−をＣＭ５チップ上に固定した。その後、４Ｇ８-及び２８Ｈ１-ベースＩｇＧ-ＩＬ-２ｑｍイムノコンジュゲート又は４Ｇ８-及び２８Ｈ１-ベースＦａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂイムノコンジュゲートを、３００ｎＭ〜１．２ｎＭ(１：３希釈)の範囲の濃度でＨＢＳ-ＥＰバッファー中に２５°Ｃで分析物としてチップに適用した。流量は３０μｌ／分であり、以下の条件を適用した：会合：１８０ｓ、解離：３００ｓ、及び再生：２ｘ３０ｓ ３Ｍ ＭｇＣｌ２(ＩＬ-２Ｒβγヘテロ二量体)、１０ｓ ５０ｍＭＮａＯＨ(ＩＬ-２Ｒα-サブユニット)。１：１結合をフィッティングに適用した(１：１結合ＲＩ≠０、Ｒｍａｘ＝ｌｏｃａｌ(ＩＬ-２Ｒβγ)、見かけのＫＤ、１：１結合ＲＩ＝０、Ｒｍａｘ＝ｌｏｃａｌ(ＩＬ-２Ｒα))。それぞれのＫＤ値を表１１に示す。
0005878182.tif 000012
【０２６６】
データは、４Ｇ８-及び２８Ｈ１-ベースＩｇＧ-ＩＬ-２ｑｍイムノコンジュゲートは、Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂイムノコンジュゲートと同程度の親和性でＩＬ-２Ｒβγヘテロ二量体に結合するが、それらはＣＤ２５結合を干渉する変異の導入によってＩＬ-２Ｒα-サブユニットに結合しないことを示す。対応するＦａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂイムノコンジュゲートと比較すると、ＩｇＧ-ＩＬ-２ｑｍ融合タンパク質の親和性は、方法のエラーの範囲内で若干増強されるように見える。
【０２６７】
実施例７
第一セットの実験では、我々はＦＡＣＳによって、野生型又はミュータントＩＬ-２を含んでなるＦＡＰ-標的化Ｆａｂ-ＩＬ-２-ＦａｂイムノコンジュゲートがヒトＦＡＰ-発現ＨＥＫ２９３-ＦＡＰに結合できることを(図１７)、ＩＬ-２四重変異がＦＡＰ-発現細胞への結合に影響しなかったことを確認した(図１８)。
0005878182.tif 000013
【０２６８】
特に、これらの結合実験は、Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂとしての親和性成熟ＦＡＰバインダー２８Ｈ１、２９Ｂ１１、１４Ｂ３及び４Ｂ９が、親ＦＡＰバインダー３Ｆ２(２９Ｂ１１、１４Ｂ３、４Ｂ９)及び４Ｇ８(２８Ｈ１)に基づくＦａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートと比較して、ＨＥＫ２９３-ＦＡＰ標的細胞に対して優れた絶対結合を示し(図１７)、一方、高い特異性及びＦＡＰの近いホモログであるＤＰＰＩＶでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３ｍｏｃｋ-トランスフェクト細胞への非結合を維持することを示した。比較のために、マウス抗ヒトＣＤ２６-ＰＥ ＤＰＰＩＶ抗体クローンＭ-Ａ２６１(BD Biosciences, #555437)をポジティブコントロールとして使用した(図１９)。内部移行特性の分析は、Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートの結合がＦＡＰ内部移行の誘導をもたらさないことを示した(図２０)。
【０２６９】
更なる実験では、安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞上に発現されるヒトＦＡＰへのＦＡＰ-標的化４Ｇ８-ベースＩｇＧ-ＩＬ-２ｑｍ及びＦａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂイムノコンジュゲートの結合をＦＡＣＳで測定した。結果を図４８に示す。データは、ＩｇＧ-ＩＬ-２ｑｍイムノコンジュゲートが０．９ｎＭのＥＣ５０値でＦＡＰ-発現細胞に結合し、対応する４Ｇ８-ベースＦａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂコンストラクトのものに匹敵することを示す(０．７ｎＭ)。
【０２７０】
野生型ＩＬ-２又は四重ミュータントを含んでなる親和性成熟抗ＦＡＰＦａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートをその後、上の実施例において記載するようにＰｒｏｌｅｕｋｉｎと比較して細胞アッセイにおいて試験した。
【０２７１】
ＩＬ-２誘導によるＩＦＮ-γ放出を、２４時間のこれらのイムノコンジュゲートによるＮＫ細胞株ＮＫ９２のインキュベーション後、ＥＬＩＳＡによって上澄みにおいて測定した(図２１)。ＮＫ９２細胞はそれらの表面上にＣＤ２５を発現する。結果は、ＩＬ-２Ｒβγヘテロ二量体に対するＦａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂイムノコンジュゲートのおよそ１０-倍低い親和性から予測されるように、野生型ＩＬ-２を含んでなるＦａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートが、ＩＦＮ-γ放出の誘導においてＰｒｏｌｅｕｋｉｎより弱いことを示す。Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂイムノコンジュゲートは、ＮＫ９２細胞が幾らかのＣＤ２５を発現する事実に関わらず、効力及びＩＦＮ-γ放出の絶対誘導の観点から、選択されたクローンについてそれぞれの野生型コンストラクトにかなり匹敵した。しかしながら、２９Ｂ１１Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂは２９Ｂ１１Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂ並びに２８Ｈ１及び４Ｇ８コンストラクトと比較して少ないサイトカイン放出を誘導することが観察され、Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂに対するＦａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂについては効力において小さな変化のみあった。
【０２７２】
加えて、ＭＣＳＰ-標的化ＭＨＬＧ１-ＫＶ９-ベースＦａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂイムノコンジュゲートを、ＮＫ９２細胞に関してＩＦＮ-γ放出アッセイにおいて、２８Ｈ１及び２９Ｂ１１ベースＦａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂイムノコンジュゲートと比較した。図２２は、ＭＣＳＰ-標的化ＭＨＬＧ１-ＫＶ９-ベースＦａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂが、ＩＦＮ-γ放出誘導において、ＦＡＰ-標的化Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂイムノコンジュゲートにかなり匹敵することを示す。
【０２７３】
その後、３日にわたるＩＬ-２によるＮＫ９２細胞の増殖の誘導を、CellTiter Glo(Promega)を使用してＡＴＰ測定によって増殖アッセイにおいて評価した(図２３)。ＮＫ９２細胞が少量のＣＤ２５を発現するとすると、四重ミュータントＩＬ-２を含んでなる野生型ＩＬ-２及びイムノコンジュゲートを含んでなるＦａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲート間の差異は増殖アッセイにおいて検出されるが、飽和条件下では双方とも類似な増殖の絶対誘導を達成した。
【０２７４】
更なる実験では、我々は、ヒトＰＢＭＣからのヒトＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＴｒｅｇ細胞における、２８Ｈ１Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂ及びＰｒｏｌｅｕｋｉｎと比較した、ＳＴＡＴ５リン酸化の誘導に関する２８Ｈ１親和性成熟ＦＡＰ-標的化Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂイムノコンジュゲートの効果を研究した（図２４）。無か又は非常に低いＣＤ２５発現を示すＮＫ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞では（ＩＬ-２Ｒシグナル伝達がＩＬ-２Ｒβγヘテロ二量体を介して伝えられることを意味する）、結果は、野生型ＩＬ-２を含んでなるＦａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートが、ＰｒｏｌｅｕｋｉｎよりＩＦＮ-γ放出の誘導においておよそ＞１０-倍低い効力であり、Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-ＦａｂイムノコンジュゲートがＦａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂコンストラクトより非常にわずかのみ効力が少ないことを示した。刺激によってＣＤ２５の急速な上方制御を示すＣＤ４＋Ｔ細胞では、Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-ＦａｂはＦａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂイムノコンジュゲートより有意に効果が少ないが、飽和濃度では同等のＩＬ-２Ｒシグナル伝達の誘導を示した。これはＴｒｅｇ細胞と対照的であり、そこでは、Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂの効力は、Ｔｒｅｇ細胞における高ＣＤ２５発現と、Ｔｒｅｇ細胞におけるＣＤ２５に対するＦａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂコンストラクトの高結合親和性により、Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂコンストラクトと比較して有意に低減された。Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-ＦａｂイムノコンジュゲートにおけるＣＤ２５結合の無効化の結果として、Ｔｒｅｇ細胞におけるＩＬ-２シグナル伝達は、ＩＬ-２Ｒシグナル伝達がＩＬ-２Ｒβγヘテロ二量体を通してＣＤ２５-陰性エフェクター細胞において活性化される濃度でＩＬ-２Ｒβγヘテロ二量体を介してのみ活性化される。それぞれのｐＭ ＥＣ５０値を表１３に示す。
0005878182.tif 000014
【０２７５】
別のセットの実験では、ＦＡＰ-標的化４Ｇ８-ベースＩｇＧ-ＩＬ-２ｑｍ及びＦａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂイムノコンジュゲートの生物学的活性を、幾つかの細胞アッセイにおいて調査した。
【０２７６】
ＦＡＰ-標的化４Ｇ８-ベースＩｇＧ-ＩＬ-２ｑｍ及び２８Ｈ１-ベースＦａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂイムノコンジュゲートを、ＩＬ-２Ｒβγシグナル伝達の活性化によって誘導されるＮＫ９２細胞によるＩＦＮ-γ放出の誘導について研究した。図４９は、ＦＡＰ-標的化４Ｇ８-ベースＩｇＧ-ＩＬ-２ｑｍイムノコンジュゲートが、ＩＦＮ-γ放出の誘導において、親和性成熟２８Ｈ１-ベースＦａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂイムノコンジュゲートと等しく有効であったことを示す。
【０２７７】
我々はまた、ヒトＰＢＭＣからのヒトＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔ-細胞、ＣＤ８＋Ｔ-細胞及びＴｒｅｇ細胞における、２８Ｈ１-ベースＦａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂ及びＦａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂイムノコンジュゲート並びにＰｒｏｌｅｕｋｉｎと比較した、ＳＴＡＴ５リン酸化の誘導に対するＦＡＰ-標的化４Ｇ８-ベースＩｇＧ-ＩＬ-２ｑｍイムノコンジュゲートの効果を研究した。これらの実験の結果を図５０に示す。ＮＫ細胞及びＣＤ８＋Ｔ-細胞では、４Ｇ８-ベースＩｇＧ-ＩＬ-２ｑｍイムノコンジュゲートはＰｒｏｌｅｕｋｉｎよりＳＴＡＴ５リン酸化の誘導において＜１０-倍効果が弱いが、２８Ｈ１-ベースＦａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂ及びＦａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂイムノコンジュゲートよりわずかに効果があった。ＣＤ４＋Ｔ-細胞では、４Ｇ８-ベースＩｇＧ-ＩＬ-２ｑｍイムノコンジュゲートは２８Ｈ１Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂイムノコンジュゲートより効果が弱いが、２８Ｈ１Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂイムノコンジュゲートよりわずかに効果があり、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ及び２８Ｈ１Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂと比較して飽和濃度でＩＬ-２Ｒシグナル伝達の誘導を未だ示した。これは、４Ｇ８-ベースＩｇＧ-ＩＬ-２ｑｍ及び２８Ｈ１Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂイムノコンジュゲートの効果がＦａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂイムノコンジュゲートと比較して有意に低減されるＴｒｅｇ細胞と対照的である。
【０２７８】
まとめると、ここに記載されるＩＬ-２四重ミュータントは、野生型ＩＬ-２と類似して、ＩＬ-２Ｒβγヘテロ二量体を通してＩＬ-２Ｒシグナル伝達を活性化できるが、他のエフェクター細胞細胞に対するＴｒｅｇ細胞の優先的刺激を生じない。
【０２７９】
実施例８
ＦＡＰ-標的化Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂイムノコンジュゲートの抗腫瘍効果を、インビボにおいて、ＡＣＨＮ異種移植片及びＬＬＣ１同系モデルにおいて、ＦＡＰ-標的化Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂイムノコンジュゲートと比較して評価した。全ＦＡＰ-標的化Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲート(野生型又は四重ミュータントＩＬ-２を含んでなる)は、マウスＦＡＰ並びにマウスＩＬ-２Ｒを認識する。ＳＣＩＤ-ヒトＦｃγＲＩＩＩトランスジェニックマウスにおけるＡＣＨＮ異種移植モデルはＩＨＣにおいてＦＡＰについて強く陽性である一方、それは免疫不全モデルであり、ＮＫ細胞及び／又はマクロファージ／単球によって媒介される免疫エフェクターメカニズムのみ反映可能であり、しかしＴ-細胞媒介免疫を欠き、従ってＡＩＣＤ又はＴｒｅｇ細胞を通して媒介される効果を反映できない。完全免疫応答性マウスにおいて対照的に同系ＬＬＣ１モデルは、適応性Ｔ-細胞媒介免疫エフェクターメカニズムも反映できるが、マウス間質においてＦＡＰのかなり低い発現を示す。これらのモデルの各々は従って、ヒト腫瘍において遭遇する状況を部分的に反映する。
【０２８０】
ＡＣＨＮ腎細胞癌異種移植モデル
ＦＡＰ-標的化４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂ及び４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂイムノコンジュゲートを、ＳＣＩＤ-ヒトＦｃγＲＩＩＩトランスジェニックマウスに腎内に注射されたヒト腎細胞腺癌細胞株ＡＣＨＮを使用して試験した。ＡＣＨＮ細胞はもともとＡＴＣＣ(American Type Culture Collection)から得られ、増殖後にGlycart internal cell bankに預けた。ＡＣＨＮ細胞を、５％ＣＯ２で水飽和雰囲気中において３７℃で、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭにおいて培養した。インビトロ継代１８を９８．４％の生存率で腎臓内注射に使用した。麻酔されたＳＣＩＤマウスの右側腹部及び腹膜壁に小切開(２ｃｍ)を作った。５０μｌ細胞懸濁液(ＡｉｍＶ培地中に１ｘ１０６ＡＣＨＮ細胞)を、腎臓において被膜下２ｍｍに注射した。皮膚創傷及び腹膜壁をクランプを使用して閉じた。実験の開始時に年齢が８−９週(RCC, Switzerlandで繁殖)の雌ＳＣＩＤ-ＦｃγＲＩＩＩマウス(GLYCART-RCC)を、専用のガイドライン(GV-Solas; Felasa; TierschG)に従い、１２時間明／１２時間暗の一日のサイクルと共に、特定病原体除去条件下に維持した。実験研究プロトコルは、地方自治体に審査及び承認された(Ｐ２００８０１６)。到着後、動物を、新しい環境に慣れさせるため、また観察のために一週間維持した。連続的な健康モニタリングを定期的に実施した。マウスに０日目に１ｘ１０６のＡＣＨＮ細胞を腎内に注射し、ランダム化し、重さを量った。腫瘍細胞注射の一週間後、マウスに三週間、週に３回４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂ及び４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂを静脈内注射した。全てのマウスに、２００μｌの適切な溶液を静脈内注射した。ビヒクルグループにおけるマウスにＰＢＳを、処置グループに４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂ又は４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂイムノコンジュゲートを注射した。２００μｌあたりの適当な量のイムノコンジュゲートを得るために、保存液を必要に応じてＰＢＳで希釈した。図２５は、４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂ及び４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂイムノコンジュゲート双方がビヒクルグループと比較して増強された生存中央値の観点から優れた効果を媒介することを示し、効果の観点から４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂイムノコンジュゲートに対して４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂは有利である。
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【０２８１】
ＬＬＣ１ルイス肺癌同系モデル
ＦＡＰ-標的化４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂ及び２８Ｈ１Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-ＦａｂイムノコンジュゲートをＢｌａｃｋ６マウスに静脈内注射されたマウスルイス肺癌細胞株ＬＬＣ１を使用して試験した。ＬＬＣ１ルイス肺癌細胞はもともとＡＴＣＣから得られ、増殖後、Glycart internal cell bankに預けた。腫瘍細胞株を、５％ＣＯ２で水飽和雰囲気中において３７℃で、１０％ＦＣＳ(Ｇｉｂｃｏ)を含有するＤＭＥＭにおいてルーチン的に培養した。継代１０を９７．９％の生存率で移植に使用した。動物あたり２ｘ１０５細胞を、２００μｌのＡｉｍＶ細胞培養培地(Ｇｉｂｃｏ)中において尾静脈に静脈内注射した。実験の開始時に年齢が８−９週のＢｌａｃｋ６マウス(Charles River, Germany)を、専用のガイドライン(GV-Solas; Felasa; TierschG)に従い、１２時間明／１２時間暗の一日のサイクルと共に、特定病原体除去条件下に維持した。実験研究プロトコルは、地方自治体に審査及び承認された(Ｐ２００８０１６)。到着後、動物を、新しい環境に慣れさせるため、また観察のために一週間維持した。連続的な健康モニタリングを定期的に実施した。マウスに０日目に２ｘ１０５のＬＬＣ１細胞を静脈内注射し、ランダム化し、重さを量った。腫瘍細胞注射の一週間後、マウスに三週間、週に３回４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂ又は２８Ｈ１Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂを静脈内注射した。全てのマウスに、２００μｌの適切な溶液を静脈内注射した。ビヒクルグループにおけるマウスにＰＢＳを、処置グループに４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂ又は２８Ｈ１Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂコンストラクトを注射した。２００μｌあたりの適当な量のイムノコンジュゲートを得るために、保存液を必要に応じてＰＢＳで希釈した。図２６は、４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂ又は親和性成熟２８Ｈ１Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂコンストラクトがビヒクルグループと比較して、増強された生存中央値の観点から優れた効果を媒介することを示す。
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【０２８２】
別の実験では、ＦＡＰ-標的化２８Ｈ１Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂ及び２８Ｈ１Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂイムノコンジュゲートを、Ｂｌａｃｋ６マウスに静脈内注射された同じマウスルイス肺癌細胞株ＬＬＣ１において試験した。継代９を９４．５％の生存率で移植に使用した。動物あたり２ｘ１０５細胞を、２００μｌのＡｉｍＶ細胞培養培地(Gibco)中において尾静脈に静脈内注射した。マウスに０日目に２ｘ１０５のＬＬＣ１細胞を静脈内注射し、ランダム化し、重さを量った。腫瘍細胞注射の一週間後、マウスに三週間、週に３回２８Ｈ１Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂ又は２８Ｈ１Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂを静脈内注射した。全てのマウスに、２００μｌの適切な溶液を静脈内注射した。ビヒクルグループにおけるマウスにＰＢＳを、処置グループに２８Ｈ１Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂ又は２８Ｈ１Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂコンストラクトを注射した。２００μｌあたりの適当な量のイムノコンジュゲートを得るために、保存液を必要に応じてＰＢＳで希釈した。図２７は、２８Ｈ１Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂ及び２８Ｈ１Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂイムノコンジュゲートがビヒクルグループと比較して増強された生存中央値の観点から優れた効果を媒介することを示し、効果の観点から２８Ｈ１Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂイムノコンジュゲートに対して２８Ｈ１Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂは有利である。
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【０２８３】
実施例９
４Ｇ８-ベースＦＡＰ-標的化Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂをその後、４Ｇ８-ベースＦＡＰ-標的化Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂイムノコンジュゲートと、Ｂｌａｃｋ６マウスにおいて７日静脈内投与毒性及び毒物動態学研究において比較した。表１５は、毒性及び毒物動態学研究の研究デザインを示す。
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【０２８４】
この研究の目的は、７日間の非腫瘍保有雄マウスへの一日一回の静脈内投与後、ＦＡＰ-標的化４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂ野生型(ｗｔ)インターロイキン-２(ＩＬ-２)及びＦＡＰ-標的化Ｇ４８Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂ四重ミュータントＩＬ-２(ｑｍ)の毒性及び毒物動態学プロファイルを特徴付け、また比較することであった。この研究では、５雄マウス／グループの５グループに、０(ビヒクルコントロール)、４．５又は９μｇ／ｇ／日ｗｔＩＬ-２、又は４．５又は９μｇ／ｇ／日ｑｍＩＬ-２を静脈内投与した。更なる６雄マウス／グループの４グループに、毒物動態学を評価するために、４．５又は９μｇ／ｇ／日ｗｔＩＬ-２、又は４．５又は９μｇ／ｇ／日ｑｍＩＬ-２を投与した。研究期間は、４．５及び９μｇ／ｇ／日ｗｔＩＬ-２を与えられた動物において観察される臨床徴候により、７日〜５日まで変化した。毒性の評価は、死亡率、生存中の観察、体重、及び臨床及び解剖病理学に基づいた。血液を、毒物動態学分析のために、毒物動態学グループにおける動物から様々な時点で採取した。毒物動態学データは、ｗｔＩＬ-２又はｑｍＩＬ-２で処置されたマウスが最後の出血時間まで測定可能な血漿レベルを有したことを示し、治療の期間中、マウスがそれぞれの化合物に曝露されたことを示す。１日目のＡＵＣ０-ｉｎｆ値は、双方の用量レベルで、ｗｔＩＬ-２及びｑｍＩＬ-２の同等な曝露を示す。スパースサンプルを５日目がとられ、１日目と同等な血漿濃度を示し、５日間のどちらかの化合物の投与後に蓄積が生じなかったことを示唆する。更に詳細に、以下の発見を観察した。
【０２８５】
毒物動態学
表１６は、WinNonLin Version 5.2.1及び市販のカッパ特異的ＥＬＩＳＡ(Human Kappa ELISA Quantitation Set, Bethyl Laboratories)によって決定されるＦＡＰ-標的化４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂ及びＦＡＰ-標的化４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂの平均血漿毒物動態学パラメーターをまとめる。
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【０２８６】
個々の血清濃度を以下に示す：
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【０２８７】
これらのデータは、４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂ及び４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂ双方が同等な薬物動態特性を示すことを示し、４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂが若干高い曝露であった。
【０２８８】
死亡
９μｇ／ｇのＦＡＰ-標的化４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂグループにおいて、治療関連死亡が一動物において５日目の剖検より前に生じた。活動性低下、皮膚冷却、及び猫背姿勢が死より前に観察された。この動物は、浮腫及び出血を伴う肺における細胞浸潤及び顕著な骨髄壊死の組合せによって死亡したと思われる。死亡を表１７にまとめる。
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【０２８９】
臨床観察
活動性低下、皮膚冷却、及び猫背姿勢の観察が、４．５及び９μｇ／ｇ／日のｗｔＩＬ-２を与えられた動物において観察された。臨床観察を表１８にまとめる。
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【０２９０】
体重
体重の緩やかな減少が、４．５及び９(それぞれ９％及び１１％)μｇ／ｇ／日のｗｔＩＬ-２を与えられた動物において、５日間の治療後に観察された。体重のわずかな減少が、４．５又は９(それぞれ２％及び１％)μｇ／ｇ／日のｑｍＩＬ-２を与えられた動物において、５日間の治療後に観察された。体重の緩やかな(９％)減少がまた、５日間の治療後にビヒクルコントロールにおいて観察された。しかしながら、潜在異常値(動物＃３)を除外した場合、パーセント減少は５％だっただろう。ビヒクルグループにおける体重損失はストレスに起因したかもしれない。
【０２９１】
血液学
低減された血小板数を、４．５（〜４．５倍）及び９μｇ／ｇ／日（〜１１倍）４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂを与えられた動物において観察し、これは、骨髄における低減された巨核球並びにこれらの動物の脾臓及び肺における全身性消費効果（フィブリン）と相関した（下の病理組織学を参照）。これらの発見は、低減された血小板が、消費及び生産の低下／リンパ球の増加による骨髄系細胞密集／ＩＬ-２の直接的又は間接的効果としての骨髄系細胞生産の組合せ効果によりそうであることを示した。
【０２９２】
化合物投与に不確かな関連の血液学発見は、ビヒクルコントロールグループの平均値と比較した、４．５（〜５-倍）及び９μｇ／ｇ（〜３-倍）での４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂによる絶対リンパ球数の低下から成る。これらの発見は、明瞭な用量異存性を欠くが、生存中観察に観察されるストレス又は化合物の過剰な薬理作用（組織へのリンパ球遊走）に伴う作用であると二次的に考えられる。４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂの投与に起因する治療に関連する血液学変化はなかった。幾つかの孤立した血液学発見は、それらのそれぞれのコントロールと統計的に異なった。しかし、これらの発見は、病理学的関連を示唆するには不十分な程度のものだった。
【０２９３】
肉眼病理学及び組織病理学
治療関連肉眼発見は、４．５及び９μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂグループそれぞれの５／５及び４／５のマウス、及び４．５及び９μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂ治療グループ双方の１／５において見られた脾腫を含んだ。
【０２９４】
治療関連組織病理学発見は、肺、骨髄、肝臓、脾臓、及び胸腺において、４．５及び９μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂ及び４．５及び９μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂを与えられたグループに存在し、下に報告するように、変化の発生、重症度又は性質において異なった。
【０２９５】
肺における治療関連組織病理学発見は、４．５及び９μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂグループの５／５マウスにおいて軽度から顕著であり、４．５及び９μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂグループの５／５マウスにおいてわずかであった単核細胞浸潤から成った。単核細胞浸潤は、リンパ球(その内の幾つかは細胞質顆粒を有すると観察された)並びに反応性マクロファージから成った。これらの細胞はバソセントリックパターンを有することが最もよく観察され、しばしば肺の血管内に観察される辺縁趨向を伴った。これらの細胞はまた血管の周囲に観察されたが、より重症な場合では、パターンはびまん性であった。出血は、４．５及び９μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂグループの５／５マウスにおいてわずかに〜軽度、９μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂグループの２／５マウスにおいてわずかに見られた。出血は血管周囲に最もよく観察されたが、より重症な場合では、それは肺胞腔に観察された。浮腫は、４．５及び９μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂグループの５／５マウスにおいて軽度〜中程度、９μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂグループの５／５マウスにおいてわずかに観察された。浮腫は血管周囲にしばしば見られたが、より重症な場合では、それは肺胞腔にも観察された。周辺細胞変性及び核崩壊が、それぞれ４．５及び９μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂグループの２／５及び５／５マウスにおいて観察され、浸潤性又は反応性白血球の変性から成る。ＭＳＢ染色を実施した選択動物は、４．５及び９μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂグループ双方における動物の肺に見られるフィブリンについて陽性であり、これらの動物において観察された低減された血小板と一部相関した。
【０２９６】
骨髄における治療関連変化は、それぞれ９μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂ及び４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂグループ双方の５／５マウス及び２／５マウス、及び４．５双方の５／５マウス及び２／５マウスにおけるわずか〜軽度に増加した全体骨髄細胞性を含んだ。これは、髄及び洞内のＣＤ３陽性Ｔ-細胞の数の増加によって一部裏付けられる(特にＴリンパ球であり、選択動物に実施されるｐａｎ-Ｔ-細胞マーカーＣＤ３を用いた免疫組織化学で確認される)、これらのグループにおける増加したわずか〜中程度のリンパ球-骨髄球過形成によって特徴付けられた。ＣＤ３陽性Ｔ-細胞の増加は、双方の４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂグループにおいて中程度であり、双方の４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂグループにおいて軽度だった。巨核球のわずか〜軽度の減少が９μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂグループの５／５マウス及び４．５の２／５マウスに観察され、赤血球前駆体のわずか〜中程度の減少が９μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂグループの５／５マウス及び４．５の３／５マウスに観察された。骨髄壊死が、９(軽度〜顕著)μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂグループの５／５マウス及び４．５(最小限)の１／５マウスに観察された。骨髄における巨核球の低減された数は、増加したリンパ球／骨髄系前駆体による骨髄の直接的密集によりうる低下血小板、及び／又は様々な組織(脾臓及び肺を参照)における炎症による血小板の消費と相関した。骨髄において観察される低下した赤血球前駆体は、一時的作用によると思われる末梢血血液学（末梢血の前に骨髄において見られる）及び末梢赤血球の長い半減期（血小板と比較）と相関しなかった。骨髄における骨髄壊死のメカニズムは、髄腔の明らかな過剰密集(リンパ球／骨髄系細胞の生産及び増殖による)、増殖細胞タイプからのサイトカインの全身性又は局所放出に、二次性に起因し得、低酸素の局所的作用又は化合物の他の薬理作用に関連しうる。
【０２９７】
肝臓における治療関連発見は、４．５及び９μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂグループの５／５マウスにおける、軽度〜中程度のバソセントリック単核細胞浸潤及びわずか〜軽度の単細胞壊死から成った。わずかな単細胞壊死は、それぞれ４．５及び９μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂグループの２／５及び４／５マウスにおいて見られた。単核球浸潤は主にリンパ球(特にＴ-リンパ球、選択された動物に実施されるｐａｎ-Ｔ細胞マーカーＣＤ３を用いた免疫組織化学によって確認)から成り、バソセントリックに並びに中心及び門脈内の境界（marginating）にもっともよく観察された。Ｆ４／８０の免疫組織化学染色に対する選択動物は、９μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂ及び４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂグループにおいて、肝類洞中の増加した数及びサイズ（活性化）のマクロファージ／クッパー細胞を示した。
【０２９８】
脾臓における治療関連発見は、４．５及び９μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂグループの５／５マウスにおける中程度〜顕著なリンパ過形成／浸潤及び軽度〜中程度のマクロファージ過形成／浸潤、及び４．５及び９μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂグループの５／５マウスにおける軽度〜中程度のリンパ過形成／浸潤及びわずか〜軽度のマクロファージ過形成／浸潤から成る。９μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂ及び４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂについての免疫組織化学は、ｐａｎ-Ｔ-細胞マーカーＣＤ３並びにマクロファージマーカーＦ４／８０の使用により異なるパターンを示した。９μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂでは、Ｔ-細胞及びマクロファージ免疫反応のパターンは主に赤脾髄領域内にとどまり、一次濾胞の構造はリンパ球溶解及び壊死によって変化した（下記）。９μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂでは、特殊染色はビヒクルコントロールのものと類似なパターンを示したが、Ｔ-細胞集合による細動脈周囲リンパ鞘（ＰＡＬＳ）白脾髄肥大及び大きく肥大した赤脾髄領域を伴った。Ｔ-細胞及びマクロファージ陽性はまた赤脾髄内において明らかであり、ビヒクルコントロールと類似したパターンであったが、肥大していた。これらの発見は、脾腫の肉眼発見と相関する。壊死が、それぞれ４．５及び９μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂグループの３／５マウスにおいてわずかに、５／５マウスにおいてわずか〜軽度に観察された。壊死は通常、一次濾胞の領域の周りに生じ、ＭＳＢ染色を使用した選択動物は４．５及び９μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂグループ双方においてフィブリンに陽性であり、これらの動物において観察された低減された血小板と一部相関した。リンパ球溶解が４．５μｇ／ｇ（最小限〜軽度）及び９μｇ／ｇ（中程度〜顕著）４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂグループにおいて見られた。
【０２９９】
胸腺における治療関連発見は、４．５及び９μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂ双方、及び４．５ｕｇ／ｇ４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂグループにおけるリンパ球の最小〜軽度の増加を含んだ。皮質及び髄質は４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂグループにおいては個々に明らかではなかったが、９μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂ及び９μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂグループにおける選択された動物に関するｐａｎＴ細胞マーカー（ＣＤ３）についての免疫組織化学は、胸腺内の大部分の細胞について強い陽性を示した。胸腺における増加リンパ球は、双方の化合物の直接の薬理学的効果であると考えられ、そこでは、ＩＬ-２が、更なる分化及びクローン性増殖のために骨髄から胸腺（Ｔ細胞）へ移動するリンパ球の増殖を誘導する。これは９μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂを除く全てのグループで生じたが、これは一時的作用のようである。リンパ球溶解は４．５μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂグループにおいて軽度であり、９μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂグループにおいて中程度〜顕著だった。中程度のリンパ球欠乏が、４．５及び９μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂグループ粗放において観察された。これらの発見は４．５及び９μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂグループにおいてより頑強であるように見える一方、これらの動物は５日目に瀕死とされ、軽度〜顕著のリンパ球溶解並びに中程度のリンパ球欠乏がこの生存中観察に関連しうる（不良な身体条件によるストレス関連作用）。
【０３００】
肝臓における化合物投与に不確かな関連の組織病理学発見は、４．５及び９μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂグループ双方の５／５マウスの肝臓中にランダムに散乱する小病巣／小肉芽腫として観察されるわずかな混合細胞(リンパ球及びマクロファージ)浸潤／活性化から成った。このわずかな変化はビヒクルコントロールグループにも見られたが、少ない発生と重症度だった。９μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂグループにおいて、胃腺拡張及び萎縮が５／５マウスにおいてわずか〜軽度に見られ、回腸絨毛萎縮が３／５マウスにわずかに見られた。この発見は、生存中観察に観察される、特に９μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂグループにおける低減された体重など、これらのマウスに見られる不良な健康状態にほとんど起因すると思われる。
【０３０１】
注射部位発見は、混合型細胞浸潤、血管周囲浮腫、及び筋変性を含み、ビヒクルコントロール、９μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂ及び９μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂグループにおいて等しく観察された。一動物は表皮壊死を有した。これらの発見は、治療自体に起因せず、毎日の静脈内注射及び尾の取扱いに起因する。別の動物は、治療に起因するものではなく慢性病変によると思われる筋変性及び筋再生を伴う骨格筋のマクロファージ浸潤を有した（肺組織組織学切片に観察された）。辺縁リンパ欠乏（Marginal lymphoid depletion）が４．５及び９μｇ／ｇの４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂグループそれぞれにおいて３／５及び４／５マウスに観察され、マウスの加齢に従い胸腺に見られる正常な生理学的変化にほぼ起因すると思われた(also seen in similar incidence, 4/5 mice, and severity in vehicle control animals)。
【０３０２】
結論として、雄マウスにおける最高で５日間の４．５又は９μｇ／ｇ／日の用量での４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂ又は４Ｇ８Ｆａｂ−ＩＬ-２ｑｍ−Ｆａｂの連日の静脈内投与は、双方の化合物で類似な治療関連組織学的発見をもたらした。しかしながら、発見は一般的にＦＡＰ-標的化４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂではより蔓延であり、より重症だった：肺（図２８及び２９）（リンパ球及び反応性マクロファージから成る単核細胞浸潤、出血、及び浮腫）、骨髄（リンパ-骨髄過形成及び増加細胞充実性)、肝臓(図３０） (単細胞壊死、数及び活性化におけるクッパー細胞／マクロファージ増加)、脾臓(肉眼的に肥大したマクロファージ及びリンパ球浸潤／過形成)及び胸腺(増加リンパ球)。加えて、死亡、リンパ球溶解、壊死又は細胞変性（肺、脾臓、骨髄、及び胸腺）、並びに低減された巨核球及び赤血球（骨髄）及び低減された血小板（末梢血）は、ｗｔＩＬ-２を与えられた動物にのみ見られた。臨床及び解剖病理学的発見、並びに臨床観察、及び双方の化合物の同等な全身性曝露に基づくと、ｑｍＩＬ-２はこの研究の条件下で、ｗｔＩＬ-２より、５投与後に、顕著に少ない全身性の毒性を呈した。
【０３０３】
実施例１０
野生型及び四重ミュータントＩＬ-２によるＮＫ細胞 ＩＦＮ-γ分泌の誘導
ＮＫ-９２細胞を、９６ウェル-Ｆ-底プレートに１０００００細胞／ウェル播種する前に２時間飢餓にした。ＩＬ-２コンストラクトを、播種ＮＫ-９２細胞上に滴定した。２４時間又は４８時間後、プレートを遠心分離した後、上澄みを集め、市販のＩＦＮ-γＥＬＩＳＡ(ＢＤ＃５５０６１２)を使用してヒトＩＦＮ-γの量を決定した。
【０３０４】
野生型ＩＬ-２の２つの異なるインハウス調製物(それらのＯ-グリコシル化プロファイルがおそらく若干ことなる、実施例２を参照)、市販の野生型ＩＬ-２(Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ)及びインハウス調製四重ミュータントＩＬ-２(第一バッチ)を試験した。
【０３０５】
図３１は、２４(Ａ)又は４８時間(Ｂ)のＮＫ細胞によるＩＦＮ-γ分泌の誘導において、四重ミュータントＩＬ-２が市販(Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ)又はインハウス生産野生型ＩＬ-２と等しく効果があることを示す。
【０３０６】
実施例１１
野生型及び四重ミュータントＩＬ-２によるＮＫ細胞増殖の誘導
ＮＫ-９２細胞を、９６-ウェル-ブラック-Ｆ-透明底プレートに１００００細胞／ウェルを播種する前に２時間飢餓にした。ＩＬ-２コンストラクトを、播種ＮＫ-９２細胞上に滴定した。４８時間後、製造者の指示に従ってPromegaの“CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay”キットを使用してＡＴＰ量を測定し、生細胞の数を決定した。
【０３０７】
実施例１０と同じＩＬ-２調製物を試験した。
図３２は、全ての試験した分子がＮＫ細胞の増殖を誘導できたことを示す。低濃度(＜０．０１ｎＭ)では、四重ミュータントＩＬ-２はインハウス生産の野生型ＩＬ-２よりわずかに活性が低く、全てのインハウス調製物は市販の野生型ＩＬ-２(Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ)より活性が低かった。
【０３０８】
第二実験では、次のＩＬ-２調製物を試験した：野生型ＩＬ-２(プール２)、四重ミュータントＩＬ-２(第一及び第二バッチ)。
図３３は、全ての試験した分子がＮＫ細胞の増殖の誘導においておよそ類似して活性であり、低濃度では、２つのミュータントＩＬ-２調製物は野生型ＩＬ-２調製物より最小限でのみ活性が低かった。
【０３０９】
実施例１２
野生型又は四重ミュータントＩＬ-２を含んでなるイムノコンジュゲートによるヒトＰＢＭＣ増殖の誘導
末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を、Histopaque-1077(Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, MO, USA)を使用して調製した。簡潔には、健康な志願者からの静脈血をヘパリン処置されたシリンジに採った。血液をカルシウム-及びマグネシウム-フリーＰＢＳで２：１に希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ-１０７７上に層にした。勾配を、中断することなく室温で３０分間４５０ｘｇで遠心分離した。ＰＢＭＣを有する相間を集め、ＰＢＳで３回洗浄した(室温で１０分間、３５０ｘｇと、その後に３００ｘｇ)。
その後、ＰＢＭＣを３７℃で１５分間、４０ｎＭのＣＦＳＥ(カルボキシフルオセインサクシニミジルエステル)で標識化した。細胞を３７℃で３０分間、標識化ＰＢＭＣを回収する前に、２０ｍｌの培地で洗浄した。細胞を洗浄し、数え、１０００００の細胞を９６-ウェル-Ｕ-底プレートに播種した。事前に希釈したＰｒｏｌｅｕｋｉｎ(市販の野生型ＩＬ-２)又はＩＬ-２-イムノコンジュゲートを、播種した細胞上に滴定し、これを指定の時間インキュベートした。４−６日後、細胞を洗浄し、適切な細胞表面マーカーで染色し、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩを使用してＦＡＣＳで分析した。ＮＫ細胞をＣＤ３−／ＣＤ５６＋として、ＣＤ４Ｔ-細胞をＣＤ３＋／ＣＤ８−として、ＣＤ８Ｔ-細胞をＣＤ３＋／ＣＤ８＋として定めた。
【０３１０】
図３４は、４(Ａ)、５(Ｂ)又は６(Ｃ)日間の、異なるＦＡＰ-標的化２８Ｈ１ ＩＬ-２イムノコンジュゲートでのインキュベーション後のＮＫ細胞の増殖を示す。全ての試験したコンストラクトは、濃度依存性にＮＫ細胞増殖を誘導した。Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎは低濃度でイムノコンジュゲートより効果的であったが、高濃度ではこの差異はもはや存在しなかった。早い時点では(４日目)、ＩｇＧ-ＩＬ-２コンストラクトはＦａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂコンストラクトよりわずかに強力のようだった。後の時点では(６日目)、全てのコンストラクトが同程度の効果を有し、Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂコンストラクトが低濃度では最も効力が弱かった。
【０３１１】
図３５は、４(Ａ)、５(Ｂ)又は６(Ｃ)日間の、異なるＦＡＰ-標的化２８Ｈ１ ＩＬ-２イムノコンジュゲートでのインキュベーション後のＣＤ４Ｔ-細胞の増殖を示す。全ての試験したコンストラクトは、濃度依存性にＣＤ４Ｔ-細胞増殖を誘導した。Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎはイムノコンジュゲートより高い活性を有し、野生型ＩＬ-２を含んでなるイムノコンジュゲートは四重ミュータントＩＬ-２を含んでなるものよりわずかに強力だった。ＮＫ細胞については、Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂコンストラクトは最も低い活性を有した。少なくとも野生型ＩＬ-２コンストについては、増殖するＣＤ４Ｔ細胞は一部は制御性Ｔ細胞のようである。
図３６は、４(Ａ)、５(Ｂ)又は６(Ｃ)日間の、異なるＦＡＰ-標的化２８Ｈ１ ＩＬ-２イムノコンジュゲートでのインキュベーション後のＣＤ８Ｔ-細胞の増殖を示す。全ての試験したコンストラクトは、濃度依存性にＣＤ８Ｔ-細胞増殖を誘導した。Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎはイムノコンジュゲートより高い活性を有し、野生型ＩＬ-２を含んでなるイムノコンジュゲートは四重ミュータントＩＬ-２を含んでなるものよりわずかに強力だった。ＮＫ及びＣＤ４Ｔ-細胞については、Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂコンストラクトは最も低い活性を有した。
【０３１２】
図３７は別の実験の結果を示し、野生型又は四重ミュータントＩＬ-２を含んでなるＦＡＰ-標的化２８Ｈ１ ＩｇＧ-ＩＬ-２、及びＰｒｏｌｅｕｋｉｎを比較した。インキュベーション時間は６日間だった。図に示すように、全ての３つのＩＬ-２コンストラクトは、類似な効力で、用量異存性に、ＮＫ(Ａ)及びＣＤ８Ｔ-細胞(Ｃ)増殖を誘導する。ＣＤ４  Ｔ-細胞(Ｂ)については、特に中間濃度では、ＩｇＧ-ＩＬ-２ｑｍイムノコンジュゲートは低い活性を有し、これは、ＣＤ４Ｔ-細胞のサブセットであるＣＤ２５-陽性(制御性を含む)Ｔ-細胞に関するその活性の欠如によりうる。
【０３１３】
実施例１３
野生型及び四重ミュータントＩＬ-２によるエフェクター細胞活性化(ｐＳＴＡＴ５アッセイ)
ＰＢＭＣを上記のように調製した。５０００００ＰＢＭＣ／ウェルを９６-ウェル-Ｕ-底プレートに播種し、１０％ＦＣＳ及び１％Glutamax (Gibco)を含有するＲＰＭＩ培地中に３７℃で４５分間置いた。その後、ＰＢＭＣを３７℃で２０分間、指定の濃度でＰｒｏｌｅｕｋｉｎ、インハウス生産の野生型ＩＬ-２又は四重ミュータントＩＬ-２でインキュベートし、ＳＴＡＴ５のリン酸化を誘導した。その後、細胞を直ちに３７℃で１０分間固定し(BD Cytofix Buffer)、１回洗浄し、その後、４℃で３０分間、透過処理工程を行った(BD Phosflow Perm Buffer III)。その後、細胞をＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで洗浄し、暗所において室温で３０分間、ＮＫ細胞(ＣＤ３−／ＣＤ５６＋)、ＣＤ８＋Ｔ-細胞(ＣＤ３＋／ＣＤ８＋)、ＣＤ４＋Ｔ-細胞(ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ２５−／ＣＤ１２７＋)又はＴｒｅｇ細胞(ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＣＤ１２７−／ＦｏｘＰ３＋)、並びにｐＳＴＡＴ５の検出について、ＦＡＣＳ抗体の混合で染色した。細胞をＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで２回洗浄し、２％ＰＦＡ中に再懸濁させ、フローサイトメトリー分析を行った(BD FACSCantoII)。
図３８は、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、インハウス生産の野生型ＩＬ-２(プール２)及び四重ミュータントＩＬ-２(バッチ１)での３０分間のインキュベーション後の、ＮＫ細胞(Ａ)、ＣＤ８Ｔ-細胞(Ｂ)、ＣＤ４Ｔ-細胞(Ｃ)及び制御性Ｔ-細胞(Ｄ)におけるＳＴＡＴリン酸化を示す。全３つのＩＬ-２調製物は、ＮＫ並びにＣＤ８Ｔ-細胞におけるＳＴＡＴリン酸化の誘導において等しく効果的だった。ＣＤ４Ｔ-細胞及び特に制御性Ｔ-細胞においては、四重ミュータントＩＬ-２は野生型ＩＬ-２調製物より低い活性を有した。
【０３１４】
実施例１４
野生型及び四重ミュータントＩｇＧ-ＩＬ-２によるエフェクター細胞活性化(ｐＳＴＡＴ５アッセイ)
実験条件は上記の通りである(実施例１３を参照)。
図３９は、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、野生型ＩＬ-２を含んでなるＩｇＧ-ＩＬ-２又は四重ミュータントＩＬ-２を含んでなるＩｇＧ-ＩＬ-２での３０分間のインキュベーション後の、ＮＫ細胞(Ａ)、ＣＤ８Ｔ-細胞(Ｂ)、ＣＤ４Ｔ-細胞(Ｃ)及び制御性Ｔ-細胞(Ｄ)におけるＳＴＡＴリン酸化を示す。全ての細胞タイプに関して、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎは、ＩｇＧ-ＩＬ-２イムノコンジュゲートよりＳＴＡＴリン酸化の誘導において強力だった。ＩｇＧ-ＩＬ-２野生型及び四重ミュータントコンストラクトはＮＫ並びにＣＤ８Ｔ-細胞において等しく効果的だった。ＣＤ４Ｔ-細胞、特に制御性Ｔ-細胞では、ＩｇＧ-ＩＬ-２四重ミュータントは、ＩｇＧ-ＩＬ-２野生型イムノコンジュゲートより低い活性を有した。
【０３１５】
実施例１５
ＦＡＰ-標的化Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂ及びＦａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂイムノコンジュゲートの最大耐量(ＭＴＤ)
野生型(ｗｔ)又は四重ミュータント(ｑｍ)ＩＬ-２を含んでなるＦＡＰ-標的化Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートの漸増用量を、腫瘍のない免疫適格性Ｂｌａｃｋ６マウスにおいて試験した。
実験の開始時に年齢が８−９週の雌のＢｌａｃｋ６マウス(Charles River, Germany)を、専用のガイドライン(GV-Solas; Felasa; TierschG)に従い、１２時間明／１２時間暗の一日のサイクルと共に、特定病原体除去条件下に維持した。実験研究プロトコルは、地方自治体に審査及び承認された(Ｐ２００８０１６)。到着後、動物を、新しい環境に慣れさせるため、また観察のために一週間維持した。連続的な健康モニタリングを定期的に実施した。
マウスに、６０、８０及び１００μｇ／マウスの用量で４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂを、１００、２００、４００、６００及び１０００μｇ／マウスの用量で４Ｇ８Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂを７日間、週に一回、静脈内注射した。全てのマウスに、２００μｌの適切な溶液を静脈内注射した。２００μｌあたりの適当な量のイムノコンジュゲートを得るために、保存液を必要に応じてＰＢＳで希釈した。
図４０は、Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-ＦａｂのＭＴＤ（最大耐量）がＦａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂより１０-倍高いことを示し、すなわちＦａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂでは７日間で毎日６００μｇ／マウスに対し、Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂでは７日間で毎日６０μｇ／マウスだった。
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【０３１６】
実施例１６
単一用量のＦＡＰ-標的化及び非標的化ＩｇＧ-ＩＬ-２ｗｔ及びｑｍの薬物動態
単一用量薬物動態(ＰＫ)研究を、野生型又は四重ミュータントＩＬ-２を含んでなるＦＡＰ-標的化ＩｇＧ-ＩＬ-２イムノコンジュゲート、及び野生型又は四重ミュータントＩＬ-２を含んでなる非標的化ＩｇＧ-ＩＬ-２イムノコンジュゲートについて、腫瘍のない免疫適格性１２９マウスにおいて実施した。
【０３１７】
実験の開始時に年齢が８−９週の雌の１２９マウス(Harlan, United Kingdom)を、専用のガイドライン(GV-Solas; Felasa; TierschG)に従い、１２時間明／１２時間暗の一日のサイクルと共に、特定病原体除去条件下に維持した。実験研究プロトコルは、地方自治体に審査及び承認された(Ｐ２００８０１６)。到着後、動物を、新しい環境に慣れさせるため、また観察のために一週間維持した。連続的な健康モニタリングを定期的に実施した。
マウスに、ＦＡＰ-標的化２８Ｈ１ ＩｇＧ-ＩＬ-２ｗｔ(２．５ｍｇ／ｋｇ)又は２８Ｈ１  ＩｇＧ-ＩＬ-２ｑｍ(５ｍｇ／ｋｇ)、又は非標的化ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ-ＩＬ-２ｗｔ(５ｍｇ／ｋｇ)又はＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ-ＩＬ-２ｑｍ(５ｍｇ／ｋｇ)を静脈内注射した。全てのマウスに、２００μｌの適切な溶液を静脈内注射した。２００μｌあたりの適当な量のイムノコンジュゲートを得るために、保存液を必要に応じてＰＢＳで希釈した。
マウスを１、８、２４、４８、７２、９６時間で、その後は３週間、２日毎に採血した。血清を抽出し、ＥＬＩＳＡ分析まで−２０℃で保管した。血清中におけるイムノコンジュゲート濃度を、ＩＬ-２-イムノコンジュゲート抗体(Roche-Penzberg)の定量化のために、ＥＬＩＳＡを使用して決定した。吸収を、４０５ｎｍの測定波長及び４９２ｎｍの参照波長を使用して測定した(VersaMax tunable microplate reader, Molecular Devices)。
図４１は、これらのＩＬ-２イムノコンジュゲートの薬物動態を示す。ＦＡＰ-標的化（Ａ）及び非標的化（Ｂ）ＩｇＧ-ＩＬ-２ｑｍコンストラクト双方とも、対応するＩｇＧ-ＩＬ-２ｗｔコンストラクト（およそ１５時間）より長い血清半減期（およそ３０時間）を有した。
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【０３１８】
実施例１７
単一用量の非標的化Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂ及びＦａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂの薬物動態
単一用量薬物動態(ＰＫ)研究を、野生型又は四重ミュータントＩＬ-２を含んでなる非標的化Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂイムノコンジュゲートについて、腫瘍のない免疫適格性１２９マウスにおいて実施した。
【０３１９】
実験の開始時に年齢が８−９週の雌の１２９マウス(Harlan, United Kingdom)を、専用のガイドライン(GV-Solas; Felasa; TierschG)に従い、１２時間明／１２時間暗の一日のサイクルと共に、特定病原体除去条件下に維持した。実験研究プロトコルは、地方自治体に審査及び承認された(Ｐ２００８０１６)。到着後、動物を、新しい環境に慣れさせるため、また観察のために一週間維持した。連続的な健康モニタリングを定期的に実施した。
マウスに、６５ｎｍｏｌ／ｋｇの用量でＤＰ４７ＧＳ Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂを、又は６５ｎＭ／ｋｇの用量でＤＰ４７ＧＳ Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂを一回、静脈内注射した。全てのマウスに、２００μｌの適切な溶液を静脈内注射した。２００μｌあたりの適当な量のイムノコンジュゲートを得るために、保存液を必要に応じてＰＢＳで希釈した。
【０３２０】
マウスを０．５、１、３、８、２４、４８、７２、９６時間で、その後は３週間、２日毎に採血した。血清を抽出し、ＥＬＩＳＡ分析まで−２０℃で保管した。血清中におけるイムノコンジュゲート濃度を、ＩＬ-２-イムノコンジュゲート抗体(Roche-Penzberg)の定量化のために、ＥＬＩＳＡを使用して決定した。吸収を４０５ｎｍの測定波長及び４９２ｎｍの参照波長を使用して測定した(VersaMax tunable microplate reader, Molecular Devices)。
図４２は、これらのＩＬ-２イムノコンジュゲートの薬物動態を示す。Ｆａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂｗｔ及びｑｍコンストラクトは、およそ３−４時間の血清半減期を有する。野生型又は四重ミュータントＩＬ-２を含んでなるコンストラクト間の血清半減期の差異は、それ自体が長い半減期を有するＩｇＧ-様イムノコンジュゲートよりＦａｂ-ＩＬ-２-Ｆａｂコンストラクトであまりはっきりせず、
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【０３２１】
実施例１８
ＩＬ-２活性化ＰＢＭＣの活性化誘導細胞死
健康なドナーからの新鮮に単離されたＰＢＭＣを、１０％ＦＣＳ及び１％グルタミンを伴うＲＰＭＩ１６４０中において、１μｇ／ｍｌのＰＨＡ-Ｍで一晩プレ活性化した。プレ活性化ＰＢＭＣを収集した後、ＰＢＳ中において４０ｎＭのＣＦＳＥで標識化し、１０００００細胞／ウェルで９６-ウェルプレートに播種した。プレ活性化ＰＢＭＣを異なる濃度のＩＬ-２イムノコンジュゲート(４Ｂ９ ＩｇＧ-ＩＬ-２ｗｔ、４Ｂ９ ＩｇＧ-ＩＬ-２ｑｍ、４Ｂ９ Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂ、及び４Ｂ９Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-Ｆａｂ)で刺激した。６日間のＩＬ-２処理の後、ＰＢＭＣを０．５μｇ／ｍｌの活性化抗Ｆａｓ抗体で一晩処理した。ＣＤ４(ＣＤ３＋ＣＤ８−)及びＣＤ８(ＣＤ３＋ＣＤ８＋)Ｔ-細胞の増殖を、ＣＦＳＥ希釈によって６日後に分析した。抗Ｆａｓ処理後の生Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ３＋アネキシンＶ陰性生細胞におけるゲーティングによって決定した。
【０３２２】
図４４に示すように、全てのコンストラクトはプレ活性化Ｔ-細胞の増殖を誘導した。低濃度では、野生型ＩＬ-２を含んでなるコンストラクトは、ＩＬ-２ｑｍを含んでなるコンストラクトより活性だった。ＩｇＧ-ＩＬ-２ｗｔ、Ｆａｂ-ＩＬ-２ｗｔ-Ｆａｂ及びＰｒｏｌｅｕｋｉｎは類似な活性を有した。Ｆａｂ-ＩＬ-２ｑｍ-ＦａｂはＩｇＧ-ＩＬ-２ｑｍよりわずかに活性が低かった。野生型ＩＬ-２を含んでなるコンストラクトはＣＤ８Ｔ細胞よりＣＤ４Ｔ細胞においてより活性であり、おそらく制御性Ｔ細胞の活性化のためである。四重ミュータントＩＬ-２を含んでなるコンストラクトは、ＣＤ８及びＣＤ４Ｔ細胞において類似な活性であった。
【０３２３】
図４５に示すように、高濃度の野生型ＩＬ-２で刺激されたＴ細胞は、四重ミュータントＩＬ-２で処理されたＴ細胞より抗Ｆａｓ誘導のアポトーシスに感受性だった。
【０３２４】
前述の発明は、明瞭な理解のために説明及び例として幾らか詳細に記載したが、説明及び実施例は、発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。ここに引用した全ての特許及び科学文献の開示は、出典明記によってその全体を明瞭に引用する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【配列表】
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