(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の複数の部位における複数の生物学的標的の存在量もしくは活性またはその両方を決定する方法であって、
担体に固定されたサンプルを提供する工程と、
複数の生物学的標的に対するコード化プローブを前記サンプル中の前記複数の部位に送達する工程であって、各コード化プローブは、（１）生物学的標的と相互作用するプローブ領域と、（２）前記コード化プローブが送達された部位の位置を特定するオリゴヌクレオチドを含むコードタグとを含む、送達工程と、
前記コード化プローブを前記生物学的標的と相互作用させる工程と、
前記生物学的標的と相互作用するコード化プローブを前記生物学的標的と相互作用しないコード化プローブから分離する分離工程と、
前記生物学的標的と相互作用するコード化プローブを配列決定のためにプールする工程と、
前記生物学的標的と相互作用するコード化プローブの配列を決定する決定工程であって、各配列は、前記コードタグのオリゴヌクレオチドの配列の全部または一部を含み、前記コードタグのオリゴヌクレオチドの前記配列は、コード化プローブが送達される前記部位の位置を特定する、決定工程と、
前記複数の生物学的標的の存在量もしくは活性またはその両方を、前記サンプル中の前記部位の位置に関連付ける関連付け工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
サンプル中の複数の部位における複数の生物学的標的の存在量もしくは活性またはその両方を決定する方法であって、
担体に固定されたサンプルを提供する工程と、
複数の生物学的標的に対するプローブを前記サンプル中の前記複数の部位に送達する送達工程と、
前記プローブを前記生物学的標的と結合させる工程と、
結合していないプローブを前記サンプルから分離する分離工程と、
コード化剤を前記サンプル中の前記複数の部位の位置に送達する工程であって、各コード化剤が、該コード化剤が送達される前記部位の位置を特定するオリゴヌクレオチドを含
む、送達工程と、
前記コード化剤と、前記生物学的標的に結合する前記プローブとを結合させてコード化プローブを形成する結合工程と、
前記生物学的標的に結合したコード化プローブを配列決定のためにプールする工程と、
前記コード化プローブの配列を決定する決定工程であって、各配列は、前記コード化剤のオリゴヌクレオチドの配列の全部または一部を含み、前記コード化剤のオリゴヌクレオチドの前記配列は、前記コード化剤が送達された前記部位の位置を特定する、決定工程と、
前記複数の生物学的標的の存在量もしくは活性またはその両方を前記サンプル中の前記複数の部位の位置に関連付ける関連付け工程と、
を含む、方法。
【請求項３】
前記生物学的標的が核酸であり、かつ前記コード化プローブがオリゴヌクレオチドである、
請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記複数の核酸の標的のそれぞれに対して２つのコード化プローブが存在する、
請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記複数の生物学的標的がタンパク質であり、前記コード化プローブのプローブ領域がタンパク質またはアプタマーを含み、かつ前記コードタグまたは前記コード化剤がオリゴヌクレオチドを含む、
請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記複数の生物学的標的が酵素を含む、
請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記コード化プローブの配列の増幅を行う工程をさらに含む、
請求項１および３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記決定工程が、核酸シークエンシング、ハイスループットシークエンシング、またはデジタルシークエンシングにより行われる、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記コード化プローブまたは前記コード化剤は、既知の空間パターンに従い、前記サンプル中の複数の部位に送達される、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ソフトウェアのプログラムされたハードウェアが、前記送達工程、前記分離工程、前記決定工程、および前記関連付け工程のうちの少なくとも２つの工程を行う、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記コード化プローブのプローブ領域がタンパク質であり、かつ前記分離工程が、前記生物学的標的と相互作用する前記コード化プローブを捕獲する親和性捕獲剤を用いることにより達成される、
請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
前記コード化プローブのプローブ領域が核酸であり、かつ前記分離工程が前記サンプルの洗浄により達成される、
請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
サンプル中の複数の部位における複数の核酸標的の存在量もしくは活性またはその両方を決定する方法であって、
担体に固定されたサンプルを提供する工程と、
複数の核酸標的に対するオリゴヌクレオチドプローブを前記サンプル中の前記複数の部位に送達する工程と、
前記オリゴヌクレオチドプローブを前記核酸標的にハイブリダイズさせる工程と、
ハイブリダイズされていないオリゴヌクレオチドプローブを前記サンプルから洗浄除去する工程と、
コード化剤を前記サンプル中の前記複数の部位の位置に送達する工程であって、各コード化剤が、該コード化剤が送達される前記部位の位置を特定するオリゴヌクレオチドを含んでいる、工程と、
前記コード化剤と、前記核酸標的にハイブリダイズする前記オリゴヌクレオチドプローブとを結合させてコード化プローブを形成する結合工程と、
前記核酸標的にハイブリダイズしたコード化プローブを配列決定のためにプールする工程と、
前記核酸標的にハイブリダイズしたコード化プローブの配列を決定する決定工程であって、各配列は、前記コード化剤のオリゴヌクレオチドの配列の全部または一部を含み、前記コード化剤のオリゴヌクレオチドの前記配列は、前記コード化剤が送達される前記部位の位置を特定する、決定工程と、
前記複数の核酸標的の存在量もしくは活性またはその両方を前記サンプル中の前記複数の部位の位置に関連付ける関連付け工程と、
を含む、方法。
【請求項１４】
前記複数の核酸標的のそれぞれに対して２つのオリゴヌクレオチドプローブが送達される、
請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記結合工程がライゲーションにより行われるか、伸長およびそれに続くライゲーションにより行われる、
請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記結合工程と前記決定工程との間に増幅を行う工程をさらに含む、
請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
サンプル中の複数の部位における複数のタンパク質標的の存在量もしくは活性またはその両方を決定する方法であって、
担体に固定されたサンプルを提供する工程と、
複数のタンパク質標的に対するコード化プローブを前記サンプル中の前記複数の部位に送達する工程であって、各コード化プローブは、（１）タンパク質標的と相互作用するタンパク質プローブ領域と、（２）コードタグとを含み、該コードタグは、前記コード化プローブが送達された前記部位の位置を特定するか、該コードタグがその一部をなす前記コード化プローブの前記タンパク質プローブ領域を特定するか、またはそれら両方の特定を行うオリゴヌクレオチドを含む、工程と、
前記コード化プローブを前記タンパク質標的と相互作用させる工程と、
前記タンパク質標的と相互作用するコード化プローブを前記タンパク質標的と相互作用しないコード化プローブから分離する分離工程と、
前記タンパク質標的と相互作用するコード化プローブを配列決定のためにプールする工程と、
前記タンパク質標的と相互作用するコード化プローブの配列を決定する決定工程であっ
て、各配列は、前記コードタグのオリゴヌクレオチドの配列の全部または一部を含み、前記コードタグのオリゴヌクレオチドの前記配列は、前記コード化プローブが送達される前記部位の位置を特定する、決定工程と、
前記複数のタンパク質標的の存在量もしくは活性またはその両方を前記サンプル中の前記複数の部位の位置に関連付ける関連付け工程と、
を含む、方法。
【請求項１８】
前記コード化プローブの配列の増幅を行う工程をさらに含む、
請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記タンパク質標的が酵素であり、かつ前記コード化プローブの前記タンパク質プローブ領域が、前記酵素に対する基質である、
請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記コード化プローブのプローブ領域が親和性捕獲剤、抗体、またはアプタマーである、
請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記タンパク質標的と相互作用するコード化プローブを前記タンパク質標的と相互作用しないコード化プローブから分離することは、前記タンパク質標的と相互作用するコード化プローブと、前記タンパク質標的と相互作用しないコード化プローブとを識別する親和性捕獲剤により達成される、
請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記コードタグがオリゴヌクレオチドである、
請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
サンプル中の複数の部位における複数の生物学的標的の存在量もしくは活性またはその両方を決定する方法であって、
担体に固定されたサンプルを提供する工程と、
複数の生物学的標的に対するコード化プローブを前記サンプル中の前記複数の部位に送達する工程であって、各コード化プローブは、（１）生物学的標的と相互作用するプローブ領域と、（２）コードタグとを含み、該コードタグは、前記コード化プローブが送達された前記部位の位置の特定、または前記生物学的標的の特定、またはそれら両方の特定を行うオリゴヌクレオチドを含む、工程と、
前記コード化プローブを前記生物学的標的と相互作用させる工程と、
前記生物学的標的と相互作用したコード化プローブを配列決定のためにプールする工程と、
前記生物学的標的と相互作用するコード化プローブの配列を決定する工程であって、各配列は、前記コードタグのオリゴヌクレオチドの配列の全部または一部を含み、前記コードタグのオリゴヌクレオチドの前記配列は、前記コード化プローブが送達される前記部位の位置を特定する、工程と、
前記複数の生物学的標的の存在量もしくは活性またはその両方を前記サンプル中の前記部位の位置に関連付ける工程と、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的分子のアッセイ、より特定的には、固体サンプル中の多数の生物学的分子の空間分布を同時に決定するためのアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
以下の解説では、背景および緒言として論文および方法について記述する。ここに含まれるものは、なんら先行技術を「容認」するものとみなされるものではない。しかるべき場合には、出願人は、ここで参照される論文および方法が適用可能な法的規定のもとで先行技術を構成しないものであることを実証する権利を明示的に留保する。
【０００３】
網羅的な遺伝子発現解析およびタンパク質解析は、生物学の機序を理解するうえで有用なツールになってきた。これらのツールの使用により、発生や、癌および自己免疫疾患などの種々の疾患に関与する遺伝子およびタンパク質の同定が可能になってきた。さまざまな転写物についてのインサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーションや他の多重検出などの従来の方法は、遺伝子発現の空間パターンを明らかにし、発生および疾患の分子基盤の解明に役立ってきた。１サンプルあたりのＲＮＡ配列が多い場合の定量分析を可能にしてきた他の技術としては、マイクロアレイ（非特許文献１および非特許文献２参照）、ＳＡＧＥ（ｓｅｒｉａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（非特許文献３参照）、ｑＰＣＲのハイスループット実行（非特許文献４参照）、およびｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ（非特許文献５参照）が挙げられる。これらの方法は有用であるが、サンプル中の多くの空間位置で多くの遺伝子の発現、または多様なタンパク質の存在および／もしくは活性の同時測定を行えるようにするうえではそれほど有用でない。レーザーキャプチャーマイクロダイセクションでは、少数の位置で多くの遺伝子の解析を行うことが可能であるが、それは、非常に高価であり、労力がかかり、しかも倍率調整が十分ではない。２Ｄ方式のある種のＰＣＲアッセイは、空間情報を保持するが（非特許文献６参照）、これらの方法は、ウェル中への組織の物理的移動に基づくので空間分解能が低く、また、このため、組織サンプルへのランダムアクセスおよび高レベルの多重化が妨害される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】シー（Ｓｈｉ）ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２４（９）：１１５１−６１（２００６）
【非特許文献２】スローニム（Ｓｌｏｎｉｍ）およびヤナイ（Ｙａｎａｉ），Ｐｌｏｓ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５（１０）：ｅ１０００５４３（２００９）
【非特許文献３】ヴェルクレスク（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０（５２３５）：４８４−８７（１９９５）
【非特許文献４】スパージオン（Ｓｐｕｒｇｅｏｎ）ら，Ｐｌｏｓ  ＯＮＥ，３（２）：ｅ１６６２（２００８）
【非特許文献５】ヌオーヴォ（Ｎｕｏｖｏ），Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，４：１５１−６７（１９９５）
【非特許文献６】アルマーニ（Ａｒｍａｎｉ）ら，Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ，９（２４）：３５２６−３４（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現時点では、多数の遺伝子、タンパク質、または他の生物学的活性分子の空間的発現パターンを高分解能で同時に解析する実用的方法は存在しない。したがって、組織内の生物学的分子の再現性のある高分解能空間マップの必要性が存在する。本発明は、この必要性に対処する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ここでは、以下の詳細な説明でさらに説明される概念の一部を単純化した形で紹介する。これは、クレームされた要旨の主要なまたは本質的な特徴を明記することを意図したものではなく、クレームされた要旨の範囲を限定すべく使用することを意図したものでもない。クレームされた要旨の他の特徴、詳細、有用性、および利点は、添付の図面に例示されたおよび添付の特許請求の範囲に規定された態様を含む以下に記載の詳細な説明から明らかになる。
【０００７】
本発明は、組織内の生物学的活性の高分解能空間マップを提供するアッセイ系を包含する。アッセイ系は、コード化プローブが規定の空間パターンで生物学的サンプルに提供される高レベルの多重化が可能なアッセイと、空間パターンに従って試薬の制御送達が可能な機器と、本質的にデジタル読取情報を提供するデコード化（解読）スキームとを含む。要するに、本発明は、シークエンシングの高度並列データ解析によりｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの分解能を提供し、多くの位置で多くの生物学的標的を調べる能力を提供する。
【０００８】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、サンプル中の複数の部位において、複数の生物学的標的の存在量もしくは活性またはその両方の空間パターンを決定するアッセイ系を提供する。このアッセイ系は、以下の工程、すなわち、担体に固定されたサンプルを提供する工程と、複数の生物学的標的に対するコード化プローブを既知の空間パターンでサンプル中の複数の部位に送達する工程であって、各コード化プローブは、生物学的標的と相互作用しうるプローブ領域と、コード化プローブが送達された部位の位置を特定するコードタグとを含む送達工程と、コード化プローブを生物学的標的と相互作用させる工程と、生物学的標的と相互作用するコード化プローブを生物学的標的と相互作用しないコード化プローブから分離する分離工程と、コード化プローブの配列の全部または一部を決定する決定工程と、複数の生物学的標的の存在量もしくは活性またはその両方をサンプル中の部位の位置に関連付ける関連付け工程とを行う。
【０００９】
本発明に係る特定の態様では、生物学的標的は核酸を含み、かつコード化プローブはオリゴヌクレオチドであり、いくつかの態様では、複数の核酸標的のそれぞれに対して２つのコード化プローブが存在する。いくつかの態様では、複数の生物学的標的はタンパク質を含み、コード化プローブのプローブ領域はタンパク質であり、かつコードタグはオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、複数の生物学的標的は酵素を含む。いくつかの態様では、コード化プローブのプローブ領域は、抗体、アプタマー、または小分子を含む。
【００１０】
アッセイ系のいくつかの態様は、分離工程と決定工程との間に増幅を行う工程をさらに含む。いくつかの態様では、決定工程は、核酸シークエンシングにより行われ、好ましい態様において、シークエンシングは、ハイスループットデジタル核酸シークエンシングである。
【００１１】
本発明のいくつかの態様では、アッセイされる複数の生物学的標的数とサンプル中の複数の部位数との積は２０超であり、いくつかの態様では、アッセイされる複数の生物学的標的数とサンプル中の複数の部位数との積は５０超であり、いくつかの態様では、アッセイされる複数の生物学的標的数とサンプル中の複数の部位数との積は、７５超、１００超
、１５０超、５００超、７５０超、１，０００超、５，０００超、１０，０００超、２５，０００超、５０，０００超、１００，０００超、５００，０００超、もしくは１，０００，０００超、またはそれ以上である。他の態様では、少なくとも５万個のコード化プローブの配列が並列方式で決定され、他の態様では、少なくとも１０万個のコード化プローブ配列が並列方式で決定され、いくつかの態様では、少なくとも５０万個のコード化プローブの配列が並列方式で決定され、いくつかの態様では、少なくとも１００万個、１０００万個、１億個、１０億個、１００億個、１０００億個、またはそれ以上のコード化プローブの配列が並列方式で決定される。
【００１２】
いくつかの態様では、既知の空間パターンは、サンプルの組織学的特徴により決定される。また、いくつかの態様では、送達工程、分離工程、決定工程、および関連付け工程の少なくとも２つの工程は、ソフトウェアでプログラムされたハードウェアにより行われる。
【００１３】
いくつかの態様では、コード化プローブのプローブ領域はタンパク質であり、かつ分離工程は、生物学的標的と相互作用するコード化プローブを親和性捕獲剤により捕獲することにより達成される。いくつかの態様では、コード化プローブのプローブ領域は核酸であり、かつ分離工程は、サンプルの洗浄により達成される。
【００１４】
他の実施形態では、サンプル中の複数の部位において、複数の核酸標的の存在量もしくは活性またはその両方の空間パターンを決定するアッセイ系を提供する。このアッセイ系は、以下の工程、すなわち、担体に固定されたサンプルを提供する工程と、複数の核酸標的に対するオリゴヌクレオチドプローブを既知の空間パターンでサンプル中の複数の部位に送達する工程と、オリゴヌクレオチドプローブを核酸標的にハイブリダイズさせる工程と、ハイブリダイズされていないコード化オリゴヌクレオチドプローブをサンプルから洗浄除去する工程と、１つ以上のコード化剤を既知の空間パターンに従ってサンプル中の複数の部位の位置に送達する工程であって、各部位に送達されるコード化剤の組合せが異なる工程と、コード化剤とオリゴヌクレオチドプローブとを結合させてコード化プローブを形成する結合工程と、コード化プローブの配列の全部または一部をハイスループットシークエンシングにより決定する決定工程と、複数の生物学的標的の存在量もしくは活性またはその両方をサンプル中の複数の部位の位置に関連付ける関連付け工程とを行う。
【００１５】
本発明の他の実施形態は、サンプル中の複数の部位において、複数のタンパク質標的の存在量もしくは活性またはその両方の空間パターンを決定するアッセイ系を提供する。このアッセイ系は、以下の工程、すなわち、担体に固定されたサンプルを提供する工程と、複数のタンパク質標的に対するコード化プローブを既知の空間パターンでサンプル中の複数の部位に送達する工程であって、各コード化プローブは、タンパク質プローブ領域とコードタグとを含み、前記タンパク質領域は前記タンパク質標的と相互作用しうるものであり、コードタグは、コード化プローブが送達された部位の位置を特定するとともに、該コードタグがその一部をなすコード化プローブのタンパク質プローブ領域を特定するものである工程と、コード化プローブをタンパク質標的と相互作用させる工程と、タンパク質標的と相互作用するコード化プローブをタンパク質標的と相互作用しないコード化プローブから分離する工程と、コード化プローブの配列の全部または一部をハイスループットシークエンシングにより決定する工程と、複数のタンパク質標的の存在量もしくは活性またはその両方をサンプル中の複数の部位の位置に関連付ける工程とを行う。
【００１６】
他の実施形態は、サンプル中の複数の部位において、複数の生物学的標的の存在量もしくは活性またはその両方の空間パターンを決定するアッセイ系を提供する。このアッセイ系は、以下の工程、すなわち、担体に固定されたサンプルを提供する工程と、複数の生物学的標的に対するコード化プローブを既知の空間パターンでサンプル中の複数の部位に送
達する工程であって、各コード化プローブは、生物学的標的と相互作用しうるプローブ領域と、コード化プローブが送達された部位の位置の特定および生物学的標的の特定を行うコードタグとを含む工程と、コード化プローブを生物学的標的と相互作用させる工程と、コード化プローブの配列の全部または一部を決定する工程と、複数の生物学的標的の存在量もしくは活性またはその両方をサンプル中の部位の位置に関連付ける工程とを行う。
【００１７】
本発明に係るアッセイ系は、検出対象の分子とそのような検出系に必要とされる試薬とに基づいて、種々の検出機構を利用可能である。本発明に係るアッセイ系で使用可能な例示的な方法は、以下でより詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明に係るアッセイ系の概略図。
【図２】核酸を検出するための本発明に係るアッセイ系の一実施形態の概略図。
【図３】図２で概観されるアッセイの一実施形態を示す図。
【図４】本発明に係るアッセイ系のコンビナトリアルコード化スキームの一実施形態に対する一般的機構を例示する図。
【図５】図４に示されるコンビナトリアルコード化スキームの実施形態の簡略具体例を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
定義
本明細書で用いられる用語は、当業者により理解される明白な通常の意味を有するものとする。以下の定義は、読者が本発明を理解するのに役立てることを意図したものであり、とくに指定がないかぎり、そのような用語の意味を変更したり、さもなければ限定したりすることを意図したものではない。
【００２０】
本明細書で用いられる「抗体」という用語は、抗原への特異的結合が可能な全体の免疫グロブリンもしくは抗体、または免疫グロブリン分子の任意の機能性フラグメントを意味するものである（抗体および抗原は、本明細書に定義される「結合パートナー」である）。本明細書で用いられる「抗体」は、全体の抗体はもとより、対象の抗原または抗原フラグメントに結合可能な任意の抗体フラグメントを含むものとする。そのようなペプチドの例としては、完全抗体分子や、抗体フラグメント、たとえば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＣＤＲＳ、ＶＬ、ＶＨ、および抗原に特異的に結合可能な抗体の任意の他の部分などが挙げられる。本発明に係るアッセイ用の抗体は、検出されるタンパク質（すなわち、生物学的標的）または本発明に係るアッセイで検出に使用されるタンパク質（すなわち、プローブ）に対して免疫反応性または免疫特異性があり、したがって、それらに特異的かつ選択的に結合する。
【００２１】
本明細書で用いられる「結合剤」という用語は、対象の生物学的分子に特異的に結合する任意の作用剤を意味する。
「相補的」または「実質的に相補的」とは、ヌクレオチド間または核酸間におけるハイブリダイゼーション、塩基対形成、または二重鎖形成を意味する。ヌクレオチド間または核酸間としては、たとえば、二本鎖ＤＮＡ分子の２つの鎖間、またはオリゴヌクレオチドプライマーと一本鎖核酸上のプライマー結合部位との間などがある。相補的ヌクレオチドは、一般的には、ＡとＴ（もしくはＡとＵ）、またはＣとＧである。２つの一本鎖のＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子は、一方の鎖のヌクレオチドが、最適なアライメントおよび比較ならびに適切なヌクレオチド挿入または欠失を行って、他方の鎖の少なくとも約８０％、通常は少なくとも約９０％〜約９５％、さらには約９８％〜約１００％と対合する場合、実質的に相補的であると言われる。
【００２２】
「ハイブリダイゼーション」とは、２つの一本鎖ポリヌクレオチドが非共有結合で安定な二本鎖ポリヌクレオチドを形成する過程を意味する。得られる（通常は）二本鎖のポリヌクレオチドは、「ハイブリッド」または「二重鎖」である。「ハイブリダイゼーション条件」は、典型的には約１Ｍ未満、多くの場合約５００ｍＭ未満の塩濃度を含み、約２００ｍＭ未満のこともある。「ハイブリダイゼーション緩衝液」は、５％ＳＳＰＥなどの緩衝化塩溶液または当技術分野で公知の他のそのような緩衝液である。ハイブリダイゼーション温度は、５℃程度に低くすることが可能であるが、典型的には２２℃超、より典型的には約３０℃超であり、典型的には３７℃を超える。ハイブリダイゼーションは、多くの場合、ストリンジェント条件下で、すなわち、プライマーがその標的部分配列にはハイブリダイズするが他の非相補的配列にはハイブリダイズしない条件下で、行われる。ストリンジェント条件は、配列依存性であり、異なる環境では異なる。たとえば、より長いフラグメントは、特異的ハイブリダイゼーションを行うには短いフラグメントよりも高いハイブリダイゼーション温度を必要としうる。相補鎖の塩基組成および長さ、有機溶媒の存在、ならびに塩基ミスマッチの程度をはじめとする他の因子がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する可能性があるので、パラメーターの組合せは、いずれか１つのパラメーターのみの絶対的測定よりも重要である。一般的には、ストリンジェント条件は、規定のイオン強度およびｐＨで特定の配列のＴｍよりも約５℃低くなるように選択される。例示的なストリンジェント条件は、約７．０〜約８．３のｐＨおよび少なくとも２５℃の温度で少なくとも０．０１Ｍから多くとも１Ｍを超えないナトリウムイオン濃度の塩濃度（または他の塩）を含む。たとえば、５ｘＳＳＰＥ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）および約３０℃の温度の条件は、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションに好適であるが、好適な温度は、ハイブリダイズされる領域の長さおよび／またはＧＣ含有率に依存する。
【００２３】
「ライゲーション」とは、２つ以上の核酸（たとえば、オリゴヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチド）の末端間の共有結合または共有連結を鋳型駆動反応で形成することを意味する。結合または連結の性質は、さまざまでありうる。また、ライゲーションは、酵素的または化学的に行いうる。本明細書で用いられる場合、ライゲーションは、通常、一方のオリゴヌクレオチドの５’炭素末端ヌクレオチドと他方のヌクレオチドの３’炭素との間にホスホジエステル連結を形成するように酵素的に行われる。
【００２４】
本明細書で用いられる「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、「オリゴ」、または文法的等価表現は、一般的には、共有連結で一体化された少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。核酸は、一般的には、ホスホジエステル結合を含有するが、いくつかの場合には、ホスホルアミダイト連結、ホスホロジチオエート連結、もしくはメチルホホロアミダイト（ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｐｈｏｒｏａｍｉｄｉｔｅ）連結、またはペプチド核酸主鎖および連結などの他の選択肢の主鎖を有する核酸類似体が含まれていてもよい。他の類似体核酸としては、ロックド核酸、陽性主鎖、非イオン性主鎖、および非リボース主鎖を含む二環式構造を有するものが挙げられる。分子の安定性を増大させるためにリボースリン酸主鎖の修飾を行ってもよく、たとえば、ＰＮＡ：ＤＮＡハイブリッドは、いくつかの環境でより高い安定性を呈しうる。
【００２５】
「プライマー」とは、ポリヌクレオチド鋳型との二重鎖の形成時、核酸合成の開始点として作用し、伸長二重鎖が形成されるように鋳型に沿ってその３’末端から伸長されうる天然または合成のオリゴヌクレオチドを意味する。伸長過程時に追加されるヌクレオチドの配列は、鋳型ポリヌクレオチドの配列により決定される。プライマーは、通常、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長される。
【００２６】
「ＳＮＰ」または「単一ヌクレオチド多型」という用語は、個体間の遺伝的変異を意味し、たとえば、生物のＤＮＡ中の単一の窒素塩基位置が変異しうるものであり、ＳＮＰは
、ゲノム全体にわたり見いだされ、個体間の遺伝的変異の多くは、ＳＮＰ遺伝子座での変異に起因し、多くの場合、この遺伝的変異は、個体間の表現型変異をもたらす。本発明で使用するためのＳＮＰおよびそのそれぞれの対立遺伝子は、公共のデータベース（Ｕ．Ｃ．サンタクルーズ・ヒトゲノム・ブラウザ・ゲートウェイ（Ｕ．Ｃ．Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ  Ｇａｔｅｗａｙ）（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｇＧａｔｅｗａｙ）またはＮＣＢＩ
ｄｂＳＮＰウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／）などの多くの情報源に由来しうるか、または米国特許第６，９６９，５８９号明細書および「ヒトゲノム多型」という名称の米国特許出願公開第２００６／０１８８８７５号明細書に記載されるように実験的に決定しうる。ＳＮＰの使用は、本明細書に提示された実施形態のいくつかで説明されているが、他の両対立遺伝子マーカーまたは複対立遺伝子マーカーも使用しうることは理解されよう。両対立遺伝子マーカーは、２つの多型体または対立遺伝子を有するマーカーである。上述したように、形質に関連する両対立遺伝子マーカーでは、対照群と比較して症例群の遺伝的組成物中に豊富に存在する対立遺伝子は、「関連対立遺伝子」と称され、他の対立遺伝子は「非関連対立遺伝子」と呼ばれうる。したがって、所与の形質（たとえば、疾患または薬剤応答）に関連する両対立遺伝子多型では、対応する関連対立遺伝子が存在する。本明細書に提示された方法で使用しうる他の両対立遺伝子多型としては、多重ヌクレオチド変化、挿入、欠失、および転座が挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらに、本明細書でのＤＮＡへの言及は、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、エピソームＤＮＡ、および／またはＤＮＡの誘導体、たとえば、アンプリコン、ＲＮＡ転写物、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ類似体などを包含しうることも理解される。関連解析（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ）でスクリーニングされる多型遺伝子座は、二倍体または一倍体の状態で存在可能であり、理論上、ゲノム全体にわたる部位に由来する。
【００２７】
本明細書で用いられる「選択的に結合する」、「選択的結合」などという用語は、結合パートナー（たとえば、タンパク質、核酸、抗体、または他の親和性捕獲剤など）を指す場合、指定のアッセイ条件下で選択的ハイブリダイゼーションを保証する高い親和性および／または相補性を有する２つ以上の結合パートナーの結合反応を意味する。典型的には、特異的結合は、バックグラウンドシグナルの標準偏差の少なくとも３倍である。したがって、指定の条件下で、結合パートナーは、その特定の「標的」分子には結合し、サンプル中に存在する他の分子には有意量で結合しない。
【００２８】
「シークエンシング」、「配列決定」などは、核酸のヌクレオチド塩基配列に関する情報を決定することを意味する。そのような情報は、核酸の部分配列情報さらには全配列情報の同定または決定を含みうる。配列情報は、さまざまな程度の統計的な信頼性または信頼度を用いて決定されうる。一態様では、この用語は、核酸中の複数のコンティグ（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ）ヌクレオチドの同一性および順序の決定を含む。「ハイスループットデジタルシークエンシング」または「次世代シークエンシング」とは、本質的に並列方式で核酸配列の多く（典型的には、数千〜数十億）を決定する方法を用いた配列決定を意味し、この場合、１度に１つではなくバルクプロセスで配列決定すべくＤＮＡ鋳型を作製し、好ましくは並列方式で、または他の選択肢としてそれ自体並列方式化しうるウルトラハイスループット連続プロセスを用いて、多くの配列を読み取る。そのような方法としては、パイロシークエンシング（たとえば、４５４ライフサイエンス社（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．），ブランフォード，コネチカット州（Ｂｒａｎｆｏｒｄ，ＣＴ）により製品化されているもの）、ライゲーションによるシークエンシング（たとえば、ＳＯＬｉＤ（商標）技術であって、ライフテクノロジー社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．），カールスバッド，カリフォルニア州（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）により製品化されているもの）、修飾ヌクレオチドを用いた合成によるシークエンシング（たとえば、ＴｒｕＳｅｑ（商標）およびＨｉＳｅｑ（商標）技術であって、イルミナ社（Ｉｌｌ
ｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．），サンディエゴ，カリフォルニア州（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により製品化されているもの、ＨｅｌｉＳｃｏｐｅ（商標）であって、ヘリコスバイオサイエンス社（Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ），ケンブリッジ，マサチューセッツ州（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）により製品化されているもの、およびＰａｃＢｉｏ  ＲＳであって、パシフィックバイオサイエンス・カリフォルニア社（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｉｎｃ．），メンロパーク，カリフォルニア州（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）により製品化されているもの）、イオン検出技術によるシークエンシング（イオントレント社（Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ，Ｉｎｃ．），サウスサンフランシスコ，カリフォルニア州（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ））、ＤＮＡナノボールのシークエンシング（コンプリートゲノミクス社（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．），マウンテンビュー，カリフォルニア州（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ））、ナノ細孔に基づくシークエンシング技術（たとえば、オックスフォードナノポアテクノロジーズ社（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＬＴＤ），オックスフォード，英国（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ））により開発されたもの）、および高度並列シークエンシング法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２９】
「Ｔｍ」という用語は、「融解温度」を参照する際に用いられる。融解温度とは、二本鎖核酸分子の集団が半分に解離されて一本鎖になる温度のことである。核酸のＴｍを計算するためのいくつかの式は、当技術分野で周知である。標準的参考文献により示されるように、Ｔｍ値の単純な推定値は、核酸が１Ｍ  ＮａＣｌの水性溶液中に存在する場合、式Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％  Ｇ＋Ｃ）により計算可能である（たとえば、アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）およびヤング（Ｙｏｕｎｇ），量的フィルターハイブリダイゼーション（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ），核酸ハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（１９８５）参照）。他の参考文献（たとえば、アラウィ（Ａｌｌａｗｉ）およびサンタルシア・ジュニア（ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｊｒ．），バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），３６：１０５８１−９４（１９９７））は、構造、環境、さらには配列の特性をＴｍの計算で考慮した代替計算法を含む。
【００３０】
本明細書に記載の技術の実施では、とくに指定がないかぎり、有機化学、高分子技術、分子生物学（組換え技術を含む）、細胞生物学、生化学、およびシークエンシング技術の従来技術および説明を利用可能であり、これらは、当業者の技能の範囲内である。そのような従来技術としては、ポリマーアレイ合成、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよびライゲーション、ならびに標識を用いたハイブリダイゼーションの検出が挙げられる。本明細書の実施例を参照することにより、好適な技術の具体例を得ることが可能である。しかしながら、もちろん、他の等価な従来手順を使用することも可能である。そのような従来技術および説明は、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら編，ゲノム解析（Ｇｅｎｏｍｅ
Ａｎａｌｙｓｉｓ）：実験マニュアルシリーズ（Ｖｏｌ．Ｉ−ＩＶ）（１９９９）；ワイナー（Ｗｅｉｎｅｒ），ガブリエル（Ｇａｂｒｉｅｌ），ステフェンス（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ）編，遺伝的変異（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ）：実験マニュアル（２００７）；ディーフェンバハ（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ），ドベクスラー（Ｄｖｅｋｓｌｅｒ）編，ＰＣＲプライマー（ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ）：実験マニュアル（２００３）；ボウテル（Ｂｏｗｔｅｌｌ）およびサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ）：モレキュラークローニングマニュアル（２００３）；マウント（Ｍｏｕｎｔ），バイオインフォマティクス（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）：シークエンスおよびゲノム解析（２００４）；サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）およびラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ），モレキュラー・クローニング  プロトコル要約集（Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）：実験マニュアル（２００６）；サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）およびラ
ッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ），モレキュラー・クローニング：実験マニュアル（２００２）（すべて、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版社（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）刊）；ストライヤー（Ｓｔｒｙｅｒ），生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第４版（１９９５）；Ｗ．Ｈ．フリーマン（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ），ニューヨーク，ニューヨーク州；ゲイト（Ｇａｉｔ），「オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」：実用手法（２００２），ＩＦＬプレス（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ），ロンドン、ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ）；コックス（Ｃｏｘ），レーニンジャーの新生化学（２０００）第３版，Ｗ．Ｈ．フリーマン出版社，ニューヨーク，ニューヨーク州；ならびにバーグ（Ｂｅｒｇ）ら，生化学（２００２）第５版，Ｗ．Ｈ．フリーマン出版社，ニューヨーク，ニューヨーク州（それらはすべて、それらの全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み入れられるものとする）などの標準的実験マニュアルに見いだしうる。
【００３１】
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる場合、単数表現の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「それの（ｔｈｅ）」は、文脈上明らかに異なる場合を除いて、複数表現の参照語を包含することに留意されたい。したがって、たとえば、「核酸（ａ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」への参照は、１つ以上の核酸を意味し、「アッセイ（ｔｈｅ  ａｓｓａｙ）」への参照は、当業者に公知の等価な工程および方法への参照を包含し、他も同様である。
【００３２】
とくに定義されていないかぎり、本明細書で用いられる科学技術用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されているものと同一の意味を有する。本明細書に挙げられた出版物はすべて、本明細書に記載の本発明と組み合わせて使用可能な装置、製剤、および方法を説明および開示することを目的として、引用により組み入れられるものとする。
【００３３】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限値および下限値の間の各介在値ならびにその指定範囲内の任意の他の指定値または介在値は、本発明の範囲内に包含されるものとみなされる。これらのより小さい範囲の上限値および下限値は、独立して、そのより小さい範囲内に含まれうるものであり、また、指定範囲内の任意の特定的に除外された限界値の制約を受けて、本発明の範囲内に包含される。指定範囲が限界値の一方または両方を含む場合、それらの含まれる両限界値のいずれか一方を除外した範囲もまた、本発明の範囲内に包含される。
【００３４】
以下の説明では、本発明のより十分な理解を提供すべく、多数の詳細な具体的内容が示される。しかしながら、これらの詳細な具体的内容の１つ以上を用いることなく本発明を実施しうることは、当業者には明らかである。他の例では、本発明が曖昧にならないように、当業者に周知の特徴および周知の手順は、説明されていない。
【００３５】
本発明の一般的事項
本発明に係るアッセイ系は、１）効率的な空間コード化スキームを用いて高レベルの多重化が可能なアッセイと、２）空間パターンに従って試薬を送達しうる機器と、３）本質的にデジタル読取情報により決定されるデコード化とを含む、空間コード化多重化アッセイを提供する。本発明に係るアッセイ系では、生物学的標的の存在もしくは不在および相対量または生物学的標的の指標となる生物学的活性、さらには生物学的サンプル（たとえば、顕微鏡用スライドや培養ディッシュなどの担体上に配置された組織切片または他の生物学的構造物）中の生物学的標的の位置または活性を検出する。
【００３６】
アッセイ系はさらに、空間規定パターンで試薬を送達する能力を備えた機器を提供する。この機器は、ソフトウェア、試薬、およびプロトコルと一緒になって、本発明に係るき
わめて革新的なアッセイ系の主要要素を提供し、遺伝子発現およびペプチド局在化を含めて、意味のある空間環境中の多数の生物学的標的または活性の測定を可能する。このアッセイ系で使用されるコード化スキームでは、多重化アッセイの生成物を生物学的サンプルから取り出して分析に供すべくプールした後、生物学的サンプル中の生物学的標的または活性（またはその欠如）の位置を決定することが可能である。コード化スキームのデコード化は、たとえば、低コストで数百万〜数兆のデータ点を容易に提供する次世代シークエンシングにより、実施可能である。次いで、生物学的標的の量または活性などのアッセイ結果を生物学的サンプル中の特定の位置に対しマッピングすることが可能である。アッセイ系は、生物学的サンプル中の細胞機能および調節の複雑な空間パターンを知る新しい解析の機会を与える。
【００３７】
本発明に係るアッセイ系１００の概略図は、図１で提供される。工程１１０では、担体に固定された生物学的サンプルが提供される。生物学的サンプルは、対象の生物学的標的を含有する。生物学的標的は、核酸（たとえば、ＲＮＡ転写物、ゲノムＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ、アンプリコン、または他の核酸配列を含む）およびタンパク質、酵素などの任意の対象分子を含みうる。工程１２０では、コード化プローブは、既知の空間パターンに従って生物学的サンプルに送達される。コード化プローブは、対象の生物学的標的と相互作用可能なプローブと、アッセイされる生物学的標的のサンプル中の位置を特定することにより、アッセイ結果をサンプル中の位置に関連付けるために使用可能なコードタグとを含む。ほとんどの実施形態では、コードタグはオリゴヌクレオチドである。しかしながら、コードタグはまた、質量タグ、蛍光標識、または他の部分を含みうる。
【００３８】
いくつかの実施形態では、コード化プローブのプローブおよびコードタグの部分は、生物学的サンプルに送達される前にあらかじめ結合される。たとえば、コード化プローブがオリゴヌクレオチドである場合、プローブおよびコードタグ配列の両方を単一のオリゴヌクレオチドとして合成することが可能である。他の選択肢として、コード化プローブのプローブおよびコードタグの部分を、独立して、合成または取得し、生物学的サンプルへの送達前に組み合わせることが可能である（たとえば、２つの個別のオリゴヌクレオチドを合成し、たとえば、ライゲーションにより結合させることが可能であり、または抗体およびオリゴヌクレオチドを独立して調製し、生物学的サンプルへの送達前にコンジュゲートすることが可能である）。また、図２〜５に記載されているように、プローブおよびコードタグ（コード化オリゴヌクレオチド中）を独立して合成し、アッセイにおいて異なる工程で生物学的サンプルに送達する（たとえば、最初にプローブ、その後コードタグ、またはその逆）。
【００３９】
工程１３０では、コード化プローブを生物学的標的と反応または相互作用させる。すなわち、たとえば、オリゴヌクレオチドを核酸標的にハイブリダイズさせたり、酵素にタンパク質標的との反応を触媒させたり、抗体をエピトープに結合させたりするなどする条件を提供する。生物学的標的が核酸である場合、コード化プローブは、典型的には、オリゴヌクレオチドであり、標的核酸にハイブリダイズする。生物学的標的がタンパク質である場合、コード化プローブは、典型的には、標的タンパク質に結合することによりまたはそれと反応することにより（すなわち、タンパク質の一方は、他方の基質である）標的タンパク質と相互作用するアプタマー、小分子、またはオリゴヌクレオチドコンジュゲートタンパク質である。コード化オリゴヌクレオチドは、コンジュゲーション、好適な基を介する化学架橋または光架橋などによりプローブ（タンパク質）に結合しうる。
【００４０】
コード化プローブが生物学的標的と相互作用した後、工程１４０では、生物学的標的と相互作用したコード化プローブを、生物学的標的と相互作用しなかったコード化プローブから分離しなければならない。生物学的標的が核酸でありかつコード化プローブがオリゴヌクレオチドである場合、分離は、たとえば、ハイブリダイズされていないコード化プロ
ーブをサンプルから洗浄除去することにより、達成可能である。同様に、アプタマー、小分子、およびタンパク質のプローブを使用するアッセイを含めて、アフィニティー結合に基づく他のアッセイでは、親和性の低い結合剤を、洗浄工程を用いて除去することが可能である。プローブが標的との相互作用を介して変換される場合（たとえば、ペプチドの場合、たとえば、プロテアーゼによる切断またはキナーゼによるリン酸化を介して）、すべてのコード化プローブ、すなわち、生物学的標的と相互作用して変換されたコード化プローブおよび変換されなかったコード化プローブの両方を捕集することが便利である。捕集後またはプール後、抗体または他の親和性捕獲剤を用いて、一部分（たとえば、リン酸基）の付加により変換されたプローブを捕獲することが可能である。プローブが切断を介して変換された場合、たとえば、変換（たとえば、切断による）時に変換されたプローブから除去されるタグを介して変換されなかったプローブを捕獲することにより、または切断の部位に新しいタグを付加することにより、変換されたプローブを分離することが可能である。
【００４１】
反応（変換）または相互作用したコード化プローブを、反応または相互作用しなかったコード化プローブから分離した後、反応および／または相互作用したコード化プローブの配列は、好ましくはシークエンシングにより、決定される。コード化プローブの配列は、アッセイ結果を生物学的サンプル中の元の位置に対しマッピングすることを可能にする。
【００４２】
図２は、空間情報のコード化のためのコンビナトリアルコード化スキームの効率的な実行を具現化する本発明に係るアッセイ系の概略図を提供する。この概観の目的では、プローブはオリゴヌクレオチドであるが、他の箇所で説明されるように、他のタイプのプローブを使用することも可能である。工程２１０では、担体に固定された生物学的サンプル、たとえば、組織サンプルまたは他の生物学的構造が提供される。工程２２０では、１種以上のオリゴヌクレオチドプローブが生物学的サンプルに送達され、そこで、オリゴヌクレオチドプローブは、生物学的サンプル中の生物学的標的にハイブリダイズ可能である。工程２３０では、オリゴヌクレオチドプローブを核酸標的と相互作用させる（ハイブリダイズさせる）。すなわち、オリゴヌクレオチドプローブが標的核酸にハイブリダイズすることが可能である適切な条件が提供される。
【００４３】
工程２４０では、標的核酸にハイブリダイズしなかったオリゴヌクレオチドプローブは、除去され、それにより、標的核酸にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブから分離される。この実施形態では、分離は、たとえば、サンプルを洗浄してハイブリダイズされなかったオリゴヌクレオチドプローブを除去することにより、達成可能である。次いで、工程２５０では、コード化オリゴヌクレオチド（コード化剤）は、選択された空間パターンに従って生物学的サンプルに送達される。この場合、コード化オリゴヌクレオチドは、生物学的サンプル中の生物学的標的の位置をコード化するために使用されるコードタグを含む。図１に示されるアッセイ系とは対照的に、ここでは、プローブおよびコード化剤（コード化オリゴヌクレオチド）は、別々の工程で送達されることに留意されたい。工程２６０では、コード化オリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチドプローブに結合させてコード化プローブを形成する。プローブがオリゴヌクレオチドであるこの場合、コード化オリゴヌクレオチドは、たとえばライゲーションにより、オリゴヌクレオチドプローブに結合させることが可能である。他の選択肢として、プライマーとして作用するプローブオリゴヌクレオチドを伸長させるＤＮＡポリメラーゼを用いることによりコード化オリゴヌクレオチド中の情報が転写され、これにより、プローブオリゴヌクレオチドはコード化オリゴヌクレオチドの配列をコピーして組み込むことが可能である。
【００４４】
工程２７０では、コード化プローブ中のコードタグの配列さらにはプローブ自体の配列または配列の一部分を決定し、工程２８０では、標的核酸を生物学的サンプルにマッピングする。いくつかの実施形態では、配列の存在量は、その位置での生物学的標的の相対量
を明らかにする。本発明をよりよく説明するために、この実施形態は特定の順序での個々の工程を示しているが、工程の厳密な順序は変更することが可能である。たとえば、工程２２０と２５０とを組み合わせることが可能であって、プローブとコード化オリゴヌクレオチドとの混合物を、選択された空間パターンに従って送達するようにすることができる。次いで、組み合わされた工程２２０および２５０の直後にまたはそれらと同時に、結合工程２６０を行うことが可能である。次いで、この場合、工程２６０の後、工程２４０が行われる。したがって、この一連の工程の２つの主要な結果（すなわち、プローブ分子の位置特異的コード化、および対応する標的分子と相互作用するその能力に基づくプローブ分子の分離）は、特定の工程の実行時、いくらかの柔軟性をもたせて達成可能であることを認識しうる。同様に、コード化スキームのデザインにもかなりの柔軟性が存在する。以下で述べるように、本発明に係るアッセイは、コンビナトリアル法にとくに適合する。
【００４５】
したがって、本発明は、シークエンシングの高度並列データ解析によりｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの分解能を提供し、多くの位置で多種多様な生物学的標的を調べる能力を提供する。いくつかの実施形態では、アッセイされる複数の生物学的標的数と生物学的サンプル中の部位数との和は２０超であり、他の実施形態では、アッセイされる複数の生物学的標的数と生物学的サンプル中の部位数との和は５０超であり、他の実施形態では、アッセイされる複数の生物学的標的数と生物学的サンプル中の部位数との和は、１００超、５００超、１，０００超、１０，０００超、２５，０００超、１００，０００超、５００，０００超、１，０００，０００超である。本発明に係る空間コード化範囲に基づき、さらに多数が意図されうることが理解される。たとえば、各位置につき１０，０００個の標的×１０，０００個の位置のアッセイは、１０８個の異なるアッセイを生じさせる。また、とくに、単一細胞程度の分解能を有する空間位置が利用される場合、これらよりも多数でさえも利用されることが容易に意図されうる。さらに、ハイスループットデジタルシークエンシングが利用される実施形態では、典型的には、少なくとも１，０００個のコード化プローブの配列が並列方式で決定される。より典型的には、デジタル読取情報を用いて、各アッセイに対して複数の配列読み値（プローブおよび空間位置コードにより規定される）を取得することが望ましい。実験のデザインおよびアッセイの要件にもよるが、１個のアッセイあたり平均で少なくとも３個のコピー、より典型的には１個のアッセイあたり少なくとも１０個または少なくとも３０個のコピーを得ることが望ましい。好適なダイナミックレンジを有する定量的読取情報では、１個のアッセイあたり１，０００個の読み値を取得することが望ましいこともある。したがって、１，０００，０００個のアッセイが行われる場合、配列読み値の数は１０億以上になる可能性がある。ハイスループットデジタルシークエンシングを使用しかつ重複（ｒｅｄｕｎｄｎａｃｙ）を許した場合、少なくとも１０，０００個のコード化プローブの配列が並列方式で決定されるか、または少なくとも１００，０００個、５００，０００個、１，０００，０００個、１０，０００，０００個、１００，０００，０００個、１，０００，０００，０００個、またはそれ以上のコード化プローブの配列が並列方式で決定される。
【００４６】
アッセイ
本発明に係るアッセイ系のアッセイ部分は、次の一般的工程、すなわち、コード化剤（いくつかの実施形態では、プローブにあらかじめ結合されている）が既知の空間パターンに従ってサンプルに送達されるようにプローブおよびコード化剤を送達する工程と、プローブをサンプル中の生物学的標的と相互作用または反応させる工程と、プローブおよびコード化剤があらかじめ結合されていない場合、コード化剤をプローブに結合させる工程とを含む。
【００４７】
本発明に係るサンプルは、担体に固定可能であるかまたは本質的に二次元で提供可能である実質上任意の１種または複数種の生物学的サンプルを含む。この場合、アッセイされる生物学的標的に結合する能力または生物学的サンプル内の元の位置を知る機能は重要で
ある。例示的な生物学的サンプルは、組織切片（たとえば、全動物切除切片および組織生検試料を含む）、スライド上または培養ディッシュ上の細胞集団などを含む。本発明に係るアッセイ系は、新しいサンプル（一次組織切片など）および保存したサンプル（限定されるものではないが、凍結サンプル、パラホルマリン固定サンプル、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプル）を含めて、多数の生物学的サンプルタイプに適合可能であるという点でとくに有利である。本発明に係るアッセイ系の重要な態様は、生物学的サンプルが個別の独立して測定可能な領域を有する基材表面上に固定されることである。
【００４８】
検出対象の生物学的標的は、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物類、イオン、または以上のいずれかを含有する多成分複合体（ただし、これらに限定されるものではない）をはじめとする任意の生物学的分子でありうる。細胞レベル下の標的の例としては、オルガネラ、たとえば、ミトコンドリア、ゴルジ体、小胞体、葉緑体、エンドサイト小胞、エキソサイト小胞、空胞、リソソームなどが挙げられる。
【００４９】
いくつかの特定の実施形態では、アッセイ系は、核酸解析（たとえば、遺伝子型解析により）、ＤＮＡコピー数またはＲＮＡ転写物の定量分析、サンプル内の特定の転写物の局在化解析などに使用される。図３は、たとえば、本発明に係るアッセイ系で使用可能な単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を検出するための、例示的なアッセイの全体的スキームを例示する。図３では、２つのオリゴヌクレオチドプローブが提供される。各オリゴヌクレオチドプローブは、３０５および３０７に見られる標的特異的領域（分析対象のＳＮＰのいずれかの側に位置する）と３０１および３０３に見られるライゲーション領域とを含む。オリゴヌクレオチドプローブは、生物学的サンプル中の標的核酸（図示せず）にハイブリダイズされる。工程３０２では、一方のオリゴヌクレオチドプローブを伸長させてＳＮＰ配列を組み込み、かつ他方のプローブにライゲートして、標的核酸領域３０９とライゲーション領域３０１および３０３とを含む伸長されたプローブを形成する。
【００５０】
２つのコード化剤（両方とも、コードタグ（３１５および３１７で示される）とライゲーション領域（３１１および３１３で示される）とプライマー領域（３１９および３２１で示される）とを含む）を組み合わせ、伸長されたプローブにライゲートし、コード化標的特異的オリゴヌクレオチドを形成する。この場合も、図１とは対照的に、プローブおよびコード化剤は、別々の工程で送達される。そうすることにより、以下に記載のコンビナトリアル実施形態の使用が可能になる。好ましい実施形態では、１対のコード化オリゴヌクレオチド内のコード化オリゴヌクレオチドは、標的配列の一方の側または他方の側（すなわち、標的配列の５’側または３’側）に特異的にライゲートする。また、典型的には、コード化オリゴヌクレオチドおよびプローブのライゲーション領域およびプライマー領域は、共通（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）である。すなわち、プローブおよびコード化オリゴヌクレオチドの構築に使用される１組のライゲーション領域およびプライマー領域は、一定であり、プローブの標的特異的領域およびコード化オリゴヌクレオチドのコードタグのみが異なる。しかしながら、この場合も、他の選択肢の実施形態では、ライゲーション領域およびプライマー領域は、共通でなく、プローブおよびコード化剤ごとに異なる。
【００５１】
ライゲーションに続いて、コード化プローブを溶出させ、プールし、場合により、ＰＣＲを介してシークエンシングアダプターをコード化プローブに付加する。他の選択肢の実施形態では、シークエンシングプライマーをコード化オリゴヌクレオチドにライゲートしうるか、またはシークエンシングプライマー配列をコード化オリゴヌクレオチドの一部として付加しうる。図３に見られるように、各シークエンシングアダプターは、コード化プローブ上のプライマー領域３１９および３２１に適合可能なプライマー領域３１９または３２１を含む。第１のアダプター３２７、第１のプライマー領域３１９、第１のコードタグ３１５、ライゲーション領域３１１および３０１、標的領域３０９、ライゲーション領域３１３および３０３、第２のコードタグ３１７、第２のプライマー領域、３２５および
第２のアダプター３２９を含む最終構築物は、この時点で、デジタルハイスループットシークエンシングプロセスに投入可能な状態にある。
【００５２】
伸長反応およびライゲーション反応の組合せが図３に例示されているが、ライゲーションのみ（たとえば、標的核酸配列の連続部分にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに対して）を含めて、コード化オリゴヌクレオチドを標的特異的オリゴヌクレオチドに連結するために様々な反応が用いられうることを認識すべきである。他の選択肢として、ＧＯＬＤＥＮＧＡＴＥ（登録商標）アッセイ（ファン（Ｆａｎ）ら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ
Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，６８：６９−７８（２００３）；（イルミナ社（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．），サンディエゴ，カリフォルニア州（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）参照）などの場合、追加のオリゴヌクレオチドを利用するアッセイを利用しうる。
【００５３】
他の実施形態では、本発明に係るアッセイ系はまた、ペプチドまたはタンパク質、抗体の存在、酵素および他のタンパク質の活性、翻訳後修飾、ペプチドの活性型および非活性型、さらには生物学的サンプル中のペプチドアイソフォームを分析するために使用可能である。したがって、プローブは、酵素の活性領域、免疫グロブリンの結合ドメイン、タンパク質の規定ドメイン、全タンパク質、合成ペプチド、導入された突然変異を有するペプチド、アプタマーなどを含みうる。
【００５４】
特定の態様では、プローブは、酵素またはプロ酵素（たとえば、キナーゼ、ホスファターゼ、チモーゲン、プロテアーゼ、またはそれらの断片）に対する基質である。特定の態様では、プローブは、１つ以上のシグナル伝達経路に関与するタンパク質（たとえば、キナーゼまたはホスファターゼ）を検出するために使用されるリン酸化基質である。本発明に係る他の特定の態様では、プローブは、特定のプロテアーゼまたはプロテアーゼのクラスにのみ会合する特定のプロテアーゼ基質である。他の態様では、プローブは、酵素のさまざまなプロセス体、アイソフォーム、および／またはドメインである。タンパク質系プローブは、典型的には、オリゴヌクレオチドコード化剤にコンジュゲートされるかまたは他の形で連結される。この場合、オリゴヌクレオチドコード化剤はまた、タンパク質プローブの同定を可能にするヌクレオチド配列成分を含むであろう。
【００５５】
特定の態様では、本発明は、サンプル中の異なる位置間および／またはサンプル間の生物学的標的の量および／または活性の差を評価するためのアッセイを提供する。この方法は、生物学的サンプルから複数のコード化結果を決定することと、生物学的サンプル中の各位置の生物学的標的の量の差を評価することとを含む。
【００５６】
コンビナトリアル実施形態
コード化の効率を最大化するために、コード化オリゴヌクレオチドでコードタグ対を使用するコンビナトリアル手法を使用することが可能である。標的特異的情報とコードタグとを切り離すことにより、所要のオリゴヌクレオチドの数は、劇的に低減され、それに付随してコストが削減される。
【００５７】
図４は、本発明に係るアッセイ系のコンビナトリアルコード化スキームの一実施形態に対する一般的機構を例示する。ここでは、代表的組織切片（４１６で示される）中の核酸がアッセイされる。図４のＡでは、対象の標的核酸４０２に特異的に結合される２つの標的特異的／コード化オリゴヌクレオチド構築物４２０および４２２が示される（たとえば、図３の工程３０２および３０４間で形成される）。第１のコード化プローブ４２０は、たとえば、アッセイ生成物の増幅用の共通プライミング部位に会合するコードタグ４０８、またはシークエンシング技術を用いてコード識別子の同定を可能にするアダプター４０４を含む。第２のコード化プローブ４２２は、たとえば、アッセイ生成物の増幅用の共通
プライミング部位に会合するコードタグ４０６、またはシークエンシング技術を用いてコード識別子の同定を可能にするアダプター４１０を含む。
【００５８】
図４のＢでは、２０個の異なるコードタグ、すなわち、ａ１〜ａ１０（コードタグ４０６、コード化プローブ４２０上）およびｂ１〜ｂ１０（コードタグ４０８、コード化プローブ４２２）に使用可能な空間パターンが示される。たとえば、コードタグａ１は、１０個の離散した領域またはスポット（４１２では第１の水平線（行）のスポットとして示される）として生物学的サンプル上に堆積される。コードタグａ２は、４１２では第２の行上の１０個のスポットとして生物学的サンプルに堆積される。コードタグａ３は、４１２では第３の行上の１０個のスポットとして生物学的サンプル上に堆積され、以下も同様である。「ａ」タグは１０個の横の行で堆積されるが、「ｂ」タグは４１４に示されるように１０個の縦の列で堆積される。たとえば、コードタグｂ１は、４１４の第１の列の１０個の離散したスポットとして生物学的サンプル上に堆積され、コードタグｂ２は、４１４の第２の列の１０個の離散したスポットとして生物学的サンプル上に堆積される。そのような構成を用いることにより、２０個のコードタグで生物学的サンプル上の１００個の異なる位置を一意的に規定することが可能である。
【００５９】
図４のＣでは、コードタググリッド４１８に合致する代表的組織切片４１６が示される。矢印は、組織切片４１６に合致するグリッド４１８上に「ａ」コードタグおよび「ｂ」コードタグがどのように堆積されるかを示す。順序付け後、たとえば、コードタグａ１およびｂ４が標的核酸配列に会合した場合、標的核酸配列（すなわち、生物学的標的）は、組織切片の位置ａ１、ｂ４に存在したことになる。
【００６０】
図５は、本発明に係るアッセイ系のコード化スキームの簡略具体例を提供する。図５は、ａ１、ａ２、ａ３、ａ４、およびｂ１、ｂ３、ｂ３およびｂ４を含む、コード化オリゴヌクレオチド５１０を示す。標的特異的オリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）（プローブ）１および２は、５２０に示される。堆積または分配のスキームは、５３０に示される。図４では例示されたグリッドと同様に、コード化オリゴヌクレオチドａ１〜ａ４は、パターン状（ここでは縦パターン状）に堆積され、コード化オリゴヌクレオチドｂ１〜ｂ４には、パターン状（ここでは横パターン状）に堆積される。しかしながら、スポットを有する正方形として示されるグリッドは、実際には図４に示される組織切片４１６などの生物学的サンプル（図示せず）上の堆積パターンである。
【００６１】
標的特異的オリゴヌクレオチドは、生物学的サンプルに送達され、標的核酸が存在する場合、標的特異的オリゴヌクレオチドは、生物学的サンプル中の標的核酸にハイブリダイズする。次いで、ハイブリダイズされなかった標的特異的オリゴヌクレオチドは、たとえば洗浄により、除去される。次いで、コード化オリゴヌクレオチドは、５３０に示された空間パターンに従って生物学的サンプルに送達される。コード化オリゴヌクレオチドは、生物学的サンプル中の標的核酸にハイブリダイズした任意の標的特異的オリゴヌクレオチドにライゲートされ（またはたとえば、伸長およびライゲートされ）、次いで、ライゲートされた構築物は、生物学的サンプルから溶出され、プールされる。そしてシークエンシングアダプターが、この配列がコード化オリゴヌクレオチド中にあらかじめ含まれていない場合に付加される。ライゲートされた構築物は、たとえば、ハイスループットシークエンシングまたは「次世代」シークエンシングにより、配列決定される。
【００６２】
得られる配列のプールは、５４０に示される。ａ４ｂ１、ａ４ｂ２、ａ１ｂ３、ａ２ｂ３、ａ３ｂ３、ａ４ｂ３、およびａ４ｂ４（横線で示された位置）では標的特異的オリゴヌクレオチド１のみで配列読取情報が得られた。ａ１ｂ１（縦線で示された位置）では標的特異的オリゴヌクレオチド２のみで配列読取情報が得られた。位置ａ２ｂ１、ａ３ｂ１、ａ１ｂ２、ａ２ｂ２、およびａ３ｂ２（クロスハッチで示された位置）では両方の標的
特異的オリゴヌクレオチド１および２で配列読取情報が得られた。ａ１ｂ４、ａ２ｂ４、またはａ３ｂ４（陰影無しで示された位置）ではいずれの標的特異的オリゴヌクレオチドでも配列読取情報が得られなかった。したがって、アッセイが行われた生物学的サンプルにおいて、第１の標的核酸は、生物学的サンプルの左側の大部分および下側で検出され、第２の標的核酸は、生物学的サンプルの左上部分でのみ検出され、いずれの標的核酸も、生物学的サンプルの右上部分では検出されなかった。この時点で、２つの標的核酸の示差発現を生物学的サンプルに戻して生物学的サンプル中のこれらの位置の生物学的構造または細胞型に対しマッピングすることが可能である。
【００６３】
位置情報に加えて、コードタグの相対存在量に関する情報を得ることが可能である。たとえば、ａ４Ｔ１ｂ２配列と比較してデータセット中にａ４Ｔ１ｂ１配列が１０倍存在することが判明した場合、これは、標的核酸配列１がａ４Ｔ１ｂ１位置にａ４Ｔ１ｂ２位置の１０倍存在することを示唆する。
【００６４】
図３に示されるヌクレオチド解析の場合、コードタグを標的特異的オリゴヌクレオチドに直接ライゲートすることにより、ｎ個の標的に対して２ｎ個の標的特異的オリゴヌクレオチドが必要とされるにすぎない。たとえば、図２で概説されたコンビナトリアル手法を用いて、１０，０００個の空間位置で１００個の異なる標的をアッセイするには、２×１００個の標的特異的オリゴヌクレオチドおよび２×１００個のコード化オリゴヌクレオチドが必要である。アッセイオリゴヌクレオチドの合計カウント数は、共通プライマーをカウントしないで、わずか４００個（標的特異的なもの２００個およびコード化されたもの２００個）である。これとは対照的に、コード化オリゴヌクレオチドを標的特異的オリゴヌクレオチドから切り離さなかった場合、（ｎ×Ｘ位置コード）＋（ｎ×Ｙ位置コード）が必要となり、上記の例では、共通プライマー配列をカウントしないで２０，０００個のオリゴヌクレオチドが必要になる。さらに、図２〜５に示される実施形態は、２つのコード化剤（コードタグ）を用いたコンビナトリアルスキームを示しているが、３つ、４つ、またはそれ以上のコード化剤およびコードタグを使用して、さまざまな手段によりおよび工程のさまざまな組合せで、プローブにまたは互いに結合させることが可能である。
【００６５】
本発明に係るアッセイ系の空間コード化態様に基づいて、それほど多くないアッセイ数であっても、多量の情報を発生させることが可能である。たとえば、５個以上の生物学的標的をサンプル中の５個以上の位置でアッセイすると、２５個以上の組合せが発生する。読取にデジタルシークエンシングを用いた場合、１つの組合せあたりの配列読み値の最適数は、必要とされた感度およびダイナミックレンジに依存し、調整可能である。たとえば、各組合せに対して平均で１００個の読み値をサンプリングする場合、２５個の組合せに対する全数は、２５，０００個の読み値である。平均サンプリング深さを１，０００として１，０００個の標的を１，０００個の位置でアッセイする場合、１０９個の読み値が必要とされる。これらの数は大きいが並列デジタルシークエンシング法の本来の能力の範囲内にあり、この方法では、適度の時間でかつ１個の読み値あたり非常に低コストで数十億個さらには数兆個の読み値のデータ集合を発生することが可能である。したがって、識別される位置数もしくはアッセイされる生物学的標的数またはその両方を変化させることにより、かつデジタルシークエンシングを用いることにより、多量の情報を得ることが可能である。特定の態様では、２つ以上の生物学的分子に対して複数の位置を識別することが可能である。
【００６６】
試薬送達系
本発明に係る試薬送達系は、生物学的サンプルの離散部分への試薬の送達およびコード化スキームの空間パターンの整合性の維持を可能にする機器を含む。本発明に係るアッセイ系の試薬送達系は、任意選択のイメージング手段と試薬送達ハードウェアと制御ソフトウェアとを含む。試薬送達は、いくつかの異なる方法で達成可能である。試薬送達は、一
度に多くの異なる生物学的サンプルに対して行われることに留意されたい。単一の組織切片を本明細書に例示してきたが、複数の生物学的サンプルを固定して同時に分析することが可能である。たとえば、組織サンプルの連続切片を並列方式で解析し、データを合わせて３Ｄマップを構築することが可能である。
【００６７】
本発明に係るアッセイ系に不可欠なのは、生物学的サンプル上への試薬の空間パターン化を可能にする機器である。生物学的分子（たとえば、オリゴヌクレオチドまたは抗体）および化学試薬（たとえば、小分子またはｄＮＴＰ）の両方の調製および送達の技術は、当技術分野で公知であり、かつこれらの機器系の使用は、当業者に公知であり、本発明に係るアッセイ系に容易に適合可能である。好適な試薬送達系の一例は、生物学的分子を含有するナノリットルスケールの小滴を高精度かつ高再現性で送達すべく使用可能なＬａｂｃｙｔｅ（商標）エコー音響液体ハンドラーである。当業者であれば、試薬が送達されるべき位置を特定するソフトウェアを用いて、この試薬送達装置を全系内に組み込むことが可能であった。
【００６８】
生物学的サンプル上への作用剤および／またはコード識別子の堆積に使用可能な他の機器には、インクジェットスポッティング、ピン、ペン、またはキャピラリーを利用した機械的スポッティング、マイクロコンタクトプリンティング、光化学法、またはフォトリソグラフィー法などが含まれるが、これらに限定されるものではない。いくつかの適用では、異なる試薬分布および／または生物学的標的定量に対して生物学的サンプルの特定の領域を１つ以上のアッセイ領域に分割または分離することが好ましいこともある。アッセイ領域は、バリヤーまたはチャネルを用いて物理的に分離可能である。
【００６９】
一例示的態様では、試薬送達系は流動系でありうる。本発明に係る試薬送達用流動系は、１つ以上のポンプ、バルブ、流体貯蔵器、チャネル、および／または試薬貯蔵器などの機器を含みうる。試薬送達系は、流体を移動させて生物学的サンプルの離散した部分と接触するように構成される。試薬の移動は、流体試薬の下流などに配置されたポンプにより駆動可能である。ポンプは、各流体試薬を反応室まで（およびそれを通り抜けるように）駆動可能である。他の選択肢として、流体を貫通するように重力により試薬を駆動してもよい。米国特許出願公開第２００７０１６６７２５号明細書および同第２００５０２３９１９２号明細書には、本発明に係るアッセイ系で使用可能な汎用流体ツールが開示されている。このツールは、比較的単純なハードウェアを用いて非常に複雑な分析操作を達成すべくガス、液体、および固体の精密操作が可能である。
【００７０】
より具体的な例では、基材に固定された生物学的サンプルに１つ以上のフローセルを上から装着することが可能である。フローセルは、それに接続された入口チューブおよび出口チューブを含みうる。また、場合により、試薬をフローセルにおよび生物学的サンプル全体にわたり送達するために、外部ポンプが使用される。フローセルは、生物学的サンプルの特定部分にのみ試薬を送達し、生物学的サンプルの任意の特定部分に送達される試薬の量およびタイプを制限するように構成される。
【００７１】
他の態様では、マイクロ流体系を生物学的サンプルが配置される基材に一体化させたり、または基材の上に外側から装着したりすることが可能である。基材に当接した流体層により、平面状基材上および／またはその上方に、流体を保持および移送するためのマイクロ流体流路を形成してもよい。試薬貯蔵器間に配置されたバルブの選択的開閉により、流体試薬を選択および送達することが可能である。
【００７２】
ポンプは、一般的には、流体および／または流体中に配置された試薬を移動させるためのなんらかの機構を含む。いくつかの例では、ポンプは、小容積の流路（すなわち、マイクロ流体構造）を介して流体および／または試薬を移動させるように構成可能である。ポ
ンプは、いくつかある手段の中でとくに、流体および／もしくは流体移送構造体に正圧または負圧を機械的に加えることにより、電気的に電界の適切な印加を行うことにより、またはその両方により、駆動することが可能である。例示的な機械式ポンプは、シリンジポンプ、蠕動ポンプ、ロータリーポンプ、加圧ガス、ピペッターなどを含みうる。機械式ポンプは、微細加工されたり、成型されたりすることが可能である。例示的な電気式ポンプは、電極を含みうる。また、電気泳動、電気浸透、電気毛管現象、誘電泳動（進行波形態を含む）などにより駆動しうる。
【００７３】
バルブは、一般的には、チャネルを介して流体の流路の制御するためのなんらかの機構を含む。バルブは、たとえば、チャネルを部分的にまたは完全に閉鎖するように選択的に変形可能な可変形部材、チャネルを部分的にまたは完全に閉塞するようにチャネル内に選択的に伸長可能な可動突起、電気毛管構造体などを含みうる。
【００７４】
開口ガスケットを生物学的サンプルの上に装着することが可能であり、そしてサンプルおよび試薬をガスケット中に注入することが可能である。好適なガスケット材料としては、ネオプレン、ニトリル、およびシリコーンゴムが挙げられるが、これらに限定されるものではない。他の選択肢として、基材上の生物学的サンプルと化学的不活性耐水性材料との間に挟設されたガスケットにより、水密反応室を形成することが可能である。化学的不活性耐水性材料としては、たとえば、黒色陽極酸化アルミニウム、熱可塑性物質（たとえば、ポリスチレン、ポリカーボネートなど）、ガラスなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７５】
任意選択の実施形態では、アッセイ系は、関心のある生物学的サンプルの特徴および組織を決定するためのイメージング手段を含む。得られる画像は、たとえば、試薬の堆積パターンをデザインするために使用しうる。各人は、その代わりに、たとえば、顕微鏡を用いて、生物学的サンプルを観察したり、生物学的サンプルの組織を解析したり、送達アッセイ試薬に対する空間パターンを特定したりすることが可能であるので、イメージング手段は、任意選択である。含めるのであれば、送達系は、ＣＣＤ型またはＩＧＦＥＴ型（たとえば、ＣＭＯＳ型）撮像装置などの撮像装置や、米国特許出願公開第２００９０１９７３２６号明細書（引用により本明細書に組み入れられるものとする）に記載されるような試薬送達用の超音波スプレー装置を含むマイクロ回路構成を備えることができる。また、図４および５は、ｘ，ｙグリッド構成を用いて例示しているが、たとえば、組織サンプルのトポロジーを追跡したり、組織中の特定のグループの細胞、細胞層、および／または細胞型にターゲティングしたりするなど、他の構成を使用することが可能であることに留意されたい。
【００７６】
さらに他の選択肢では、試薬送達系は、マスク処理やスプレー処理などの半導体技術を用いて、生物学的サンプル表面上の特定のパターンに合わせた試薬の送達を制御する。特定の領域を曝露から保護するマスクを用いることにより、生物学的サンプルの特定の領域を試薬への曝露から保護することが可能である。スプレー処理や流体流動などの従来技術を用いて、試薬を生物学的サンプルに導入してもよい。マスク化送達を用いることにより、基材表面上へのパターン化された送達スキームが得られる。
【００７７】
本発明の好ましい態様では、試薬送達機器は、インクジェットプリント技術に基づく。多種多様なインクジェット機構（たとえば、熱方式、圧電方式）が存在し、適合性は、水性および有機性のインク配合物を用いて示されてきた。独立作動ノズルセットを用いて複数の試薬を同時に送達することが可能であり、非常に高い分解能が得られる。
【００７８】
関心のある特定部位にターゲティングするため、試薬送達方法および関連するコード化スキームを支援すべく、アッセイされる生物学的サンプルの情報画像を用いてもよい。ア
ッセイ系の他の特徴と統合された画像処理（たとえば、免疫組織化学または他の染色化学により識別された細胞型の画像）を用いて、生物学的サンプルのサンプル領域を特定することが可能である。いくつかの態様では、ソフトウェアを用いて、画像情報を試薬送達パターンに自動変換する。したがって、試薬送達のために生物学的サンプルを非常に正確に位置合せし整合させる機構は、本発明に係るアッセイ系の重要な要素である。スライド上での基準マーカーの使用および／または他の非常に正確な物理的位置決めシステムなどの機構は、この目的に適合しうる。
【００７９】
本発明は、好ましくは、アッセイ系に合わせて作製された完全なソフトウェア一式を含む。場合により、実施される特定のアッセイに合ったコード化ヌクレオチド（核酸がアッセイされるいくつかの実施形態では、標的特異的オリゴヌクレオチド）をデザインするためにオリゴヌクレオチドデザインソフトウェアを使用し、系の一部として組み込んでもよい。また、場合により、アッセイ結果を決定するために、試薬送達およびデータ解析（すなわち、配列解析）のためのアルゴリズムおよびソフトウェアを組み込んでもよい。生成されるデータセットのタイプが測定尺度の結果として大規模なものになる可能性があるので、統合データ解析はとくに有用である。アッセイ系により生成される空間関連データの解析のためにとくにデザインされたアルゴリズムおよびソフトウェアツールは、パターン解析ソフトウェアおよび可視化ツールを含めて、アッセイ系により生成されるデータの価値を高める。
【００８０】
ある態様では、アッセイ系は、試薬の調製および試薬の品質管理（たとえば、オリゴヌクレオチドプールの完全性および配列忠実性）を行うプロセスを含む。特に、揮発性、主要温度での安定性、および試薬送達機器に適合させるための化学的適合性などの因子に従って試薬を配合し、アッセイ系内に組み込まれた機器により分析してもよい。
【００８１】
シークエンシング
本発明に係るアッセイ系のコード化プローブ中のコードタグおよびプローブ配列を同定するために、多くの方法を使用することが可能である。質量分析（たとえば、Ｍａｌｄｉ−Ｔｏｆ，ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）、核磁気共鳴イメージング、または好ましくは核酸シークエンシングなどの技術を用いてコードタグを検出することが可能である。本発明に係るコードタグをデコード化するための技術の例は、たとえば、米国特許出願公開第２００８０２２０４３４号明細書（引用により本明細書に組み入れられるものとする）に見いだしうる。たとえば、コードタグは、オリゴヌクレオチド質量タグ（ＯＭＴまたはｍａｓｓＴａｇ）でありうる。そのようなタグは、たとえば、米国特許出願公開第２００９０３０５２３７号明細書（その全体が引用により組み入れられるものとする）に記載されている。さらに他の選択肢では、コード化プローブを増幅してマイクロアレイにハイブリダイズさせることが可能である。このためには、コード特異的プライマーの使用により達成される個別の増幅反応を行う必要がある。この場合、各増幅は、特定の空間コードまたはコードのサブセットに特有なものである。各増幅はまた、異なる解像可能標識（たとえば、発蛍光団）を含む。ハイブリダイゼーションに続いて、サンプル中の異なる空間位置にマッピングされた特定の標的の相対量を、解像可能標識の相対存在量により決定することが可能である。
【００８２】
とくに好ましい一態様では、アッセイ系により得られるコードタグは、ハイスループットシークエンシング法、次世代シークエンシング法、および高度並列次世代シークエンシング法に供される基質であり、たとえば、ＳＯＬｉＤ（商標）技術（ライフテクノロジーズ社）またはゲノム・アナライザー（Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｎｌｙｚｅｒ）（イルミナ社）を用いてコードタグの配列を確認するために使用される。そのような次世代シークエンシング法は、たとえば、ワンパスのシークエンシング法を用いて、または両末端シークエンシングを用いて、実施可能である。次世代シークエンシング法としては、ハイブリダイ
ゼーションに基づく方法、たとえば、ドルマナック（Ｄｒｍａｎａｃ）の米国特許第６，８６４，０５２号明細書、同第６，３０９，８２４号明細書、および同第６，４０１，２６７号明細書、ならびにドルマナック（Ｄｒｍａｎａｃ）らの米国特許出願公開第２００５／０１９１６５６号明細書に開示されるもの、シークエンシング・バイ・シンセシス方法、たとえば、米国特許第６，２１０，８９１号明細書、同第６，８２８，１００号明細書、同第６，９６９，４８８号明細書、同第６，８９７，０２３号明細書、同第６，８３３，２４６号明細書、同第６，９１１，３４５号明細書、同第６，７８７，３０８号明細書、同第７，２９７，５１８号明細書、同第７，４６２，４４９号明細書、および同第７，５０１，２４５号明細書、米国特許出願公開第２０１１００５９４３６号明細書、同第２００４０１０６１１０号明細書、同第２００３００６４３９８号明細書、および同第２００３００２２２０７号明細書、ロナギ（Ｒｏｎａｇｈｉ）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１：３６３−３６５（１９９８）、およびリー（Ｌｉ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１００：４１４−４１９（２００３）、ライゲーションに基づく方法、たとえば、米国特許第５，９１２，１４８号明細書および同第６，１３０，０７３号明細書、および米国特許出願第２０１００１０５０５２号明細書、同第２００７０２０７４８２号明細書、および同第２００９００１８０２４号明細書、ナノ細孔シークエンシング、たとえば、米国特許出願第２００７００３６５１１号明細書、同第２００８００３２３０１号明細書、同第２００８０１２８６２７号明細書、同第２００９００８２２１２号明細書、およびソニ（Ｓｏｎｉ）およびメラー（Ｍｅｌｌｅｒ），Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ５３：１９９６−２００１（２００７）、さらには他の方法、たとえば、米国特許出願第２０１１００３３８５４号明細書、同第２００９０２６４２９９号明細書、同第２００９０１５５７８１号明細書、および同第２００９０００５２５２号明細書が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、マッカーナン（ＭｃＫｅｒｎａｎ）ら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１９：１５２７−４１（２００９）、およびベントレー（Ｂｅｎｔｌｅｙ）ら，Ｎａｔｕｒｅ  ４５６：５３−５９（２００８）をも参照されたい。それらはすべて、それらの全体があらゆる目的で本明細書に組み入れられるものとする。
【００８３】
アッセイ系の適用
生物学的サンプル中の生物学的標的の量および空間位置を同時に測定可能なハイスループット多重化アッセイ系が有益と思われる生物学的研究、診断法、および薬剤開発の重要な領域が多数存在することは、本開示を読めば当業者には明らかである。たとえば、さまざまなＲＮＡ転写物（ｔｒａｎｃｒｉｐｔｓ）の相対存在量を推定する能力と、組織中の多くの位置（個別細胞程度の大きさであってもよいし、さらにはそれよりも小さくてもよい）にわたり存在量の空間パターンの画像を再構築する能力とを組み合わせることにより、多種多様な領域の基礎研究が可能になる。以下のものは、例示的な使用であり、なんら範囲を限定するものでないない。
【００８４】
一例では、ＣＴ走査での画像再構成と類似した方法で一連の組織切片を解析することにより、遺伝子発現の三次元パターンが決定される。そのような方法は、疾患病理において遺伝子発現の変化の測定に使用されうる。疾患病理としては、たとえば、癌組織および／または傷害、炎症、もしくは感染を受けた組織などがある。本発明に係るアッセイ系を用いれば、複合組織中の遺伝子発現およびタンパク質局在化に関するより詳細な情報が得られ、正常状態および疾患状態の両方で機能および調節に関する新しい知見がもたらされ、試験しうる新しい仮説が提供される。たとえば、本発明に係るアッセイ系を用いれば、多くの個体研究およびＥＮＣＯＤＥ（バーニー（Ｂｉｒｎｅｙ）ら，Ｎａｔｕｒｅ，４４７：７９９−８１６（２００７））やｍｏｄＥＮＣＯＤＥのような、より大きいプログラムから得られる知見のいくつかを組織レベルで統合しうる。アッセイ系はまた、システム生物学の分野で遺伝子発現の相互作用ネットワークをモデリングするコンピューター的取組みを支援する。
【００８５】
アッセイ系はまた、体細胞変異（たとえば、癌における体細胞突然変異）または感染性生物に対する応答変動を解析する新規な手法を提供する。たとえば、腫瘍は、典型的には、きわめて不均一であり、異常局所環境において遺伝的正常細胞とともに癌細胞を含有する。癌細胞は、突然変異および選択を受け、この過程において局所クローンが発生することは、珍しくない。腫瘍との関連で比較的稀な体細胞突然変異を同定することにより、クローン変異体の選択における主要突然変異の役割に関する研究が可能になる。癌細胞および遺伝的正常細胞の両方における血管新生、炎症、または他の癌関連過程に関連する転写パターンは、癌生物学に関する知見を得るべく解析可能であり、癌を治療するための新しい療法剤の開発を支援可能である。他の例では、各人は、感染性生物に対するさまざまな感受性を有しており、本発明に係るアッセイ系は、微生物と組織との相互作用または微生物と組織内の種々の細胞型との相互作用を研究すべく使用可能である。
【００８６】
重要なこととして、空間関連情報の提供に加えて、本発明では、稀な突然変異の検出感度が増大される。これは、どの所与の反応においても小さな位置のみがアッセイされるので、ＳＮ比（信号対雑音比）を劇的に増大させることが可能であるからである。混合サンプル中の稀な突然変異の典型的なアッセイでは、サンプルは、バルクで処理される。すなわち、核酸は、多くのセルから抽出されて単一のプールにされる。したがって、突然変異が１０，０００個の細胞のうち１個に存在する場合、約１０，０００個までの細胞に由来する正常ＤＮＡのバックグラウンドに対して検出しなければならない。これとは対照的に、本発明に係るアッセイ系では、多くの細胞が解析されるものの、空間コード化システムにより個々の細胞または小さな細胞群が同定される。したがって、本発明に係るアッセイ系では、バックグラウンドは何桁も低減され、感度は大幅に増大される。さらに、突然変異細胞の空間組織を観測することが可能であり、これは、癌の組織切片中の主要突然変異の検出にとくに重要なものとなりうる。すでに、分子組織学的分析は、癌生物学に関する知見をもたらしており、診断法での使用可能性を有しうる。本発明に係る技術は、そのような方法の能力を大幅に増大させることを約束する。
【００８７】
以下の実施例は、本発明をいかに実施および使用するかについての完全な開示および説明を当業者に提供すべく提示されたものであり、本発明者が自身の発明に対して意図した範囲を限定しようとするものでもなければ、以下の実験が実施される実験のすべてであることまたはそれだけに限られることを表現または暗示しようとするものでもない。当業者であればわかるであろうが、広義に記述された本発明の精神または範囲から逸脱することなく、特定の実施形態に示された本発明に、多数の変更および／または修正を加えることが可能である。したがって、本発明の実施形態は、いかなる点においても、例示的なものであって限定的なものではないとみなされる。
【００８８】
使用される数に関して正確を期すべく努力してきたが（たとえば、量、温度など）、いくらかの実験誤差および偏差を考慮しなければならない。とくに指定がないかぎり、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度単位であり、圧力は大気またはその近傍である。
【００８９】
実施例１：コード化スキームの初期概念実証
初期概念実証として、実用的単一アッセイを実証すべくマイクロアレイを用いてモデル系を開発する。より複雑な生物学的サンプルの解析に関する問題に対処する前に、基本デザインによりアッセイの概念を検証し、実用的アッセイを確立する。この概念実証のための読取として従来のシークエンシングを使用する。
【００９０】
組織切片の代用物してマイクロアレイを使用する。標的の組成が既知でありかつ系統的に変化させることができるように、マイクロアレイの標的配列は完全に特定される。５’アミノ修飾を介して合成オリゴヌクレオチド鋳型をガラススライドに結合させる。各スラ
イドは、単一のオリゴヌクレオチド鋳型配列を有し、行われるアッセイは、ライゲーション、または伸長およびそれに続くライゲーション（これは特定の多型の決定に有用でありうるため）のいずれかを利用しうる。
【００９１】
アッセイのｉｎ  ｓｉｔｕ部分が終了した後、反応生成物は溶出され、生成物の存在または不在を決定し収量を推定するためにｑＰＣＲにより解析されるとともに、そのアッセイ生成物の構造を決定するために従来のシークエンシングにより解析される。試験される単一のアッセイは、適切なポジティブコントロールならびにネガティブコントロール、および単一塩基変異体を識別する能力をチェックするための一つのヌクレオチド変異体（ＳＮＶ）を含む。
【００９２】
実施例２：拡張性（Ｓｃａｌａｂｉｌｉｔｙ）
ハイスループット試験で使用するためのアッセイの拡張性を確証するために、アッセイ系の複雑度を増大させる。マイクロアレイモデル系を用いて２４プレックス（ｐｌｅｘ）×２４部位アッセイを行うことにより、空間コード化およびアッセイ系の両方の拡張性を実証する。
【００９３】
各アッセイ位置の生物学的標的（ここではＤＮＡ標的配列の量）をマイクロアレイ基材上で系統的に変化させる。たとえば、スポットサイズが５０μｍ（ミクロン）（中心間）であるマイクロアレイでは、１ｍｍ２の領域は４００個以下のスポットを含有する。標的配列の個々の解像を可能にするために、任意で、各部位の周りの領域は、これらのスポットを有しない領域により占められる。あるいは、２以上の直接隣接するスポットは、標的配列を有しない領域に取り囲まれて、またはその領域に隣接してクラスター化されてもよい。
【００９４】
空間コード化が正確であることを実証するために、部位は、アッセイ読取情報が各部位の予想組成物と一致することを示すさまざまな標的組成物を含む。２４個の標的配列を用いて、存在する１２個の標的と不在の１２個の標的とのさまざまな組合せを持つ各部位で、単純デジタルパターンが作製される。すなわち二進コード（０＝不在、１＝存在）が作製される。次いで、アッセイ読取情報を決定し、検出された領域が空間デコード化後の予想シグナルと一致することを示す。この特定例では、コード空間は、多少の誤りがあっても異なるコードの混合を生じない程度に十分大きい（２２４）。さらに、このデザインでは、誤りの同定が可能であり、空間コード化の正確度の推定だけでなく、標的配列の存在または不在を判定する正確度の推定もまた可能である。
【００９５】
定量差の検出能力は、２４部位アッセイの各部位で行われる２４個のアッセイのそれぞれについて用量−応答曲線を作成することにより評価される。これにより、検出限界、ダイナミックレンジ、およびそのレンジにわたり所与の倍率変化を検出する能力の評価が可能になる。
【００９６】
一態様では、各標的に対して特徴数を変化させることにより異なる比で個別の標的を表すべく、ラテン方格法が使用される。言い換えれば、一部位で複数のスポットを用いて、２４個の標的配列のそれぞれに割り付けられたスポットの数を変化させることが可能であり、２４部位のそれぞれは、異なる組成物を有しうる。１×３インチのマイクロアレイは、多重反復試験を可能にするのに十分な程度に大きい。こうした２４配列のより大きいセットは、デコンボルーションを必要とする。また、これは、次世代シークエンシング技術（たとえば、ＳＯＬｉＤ（商標）技術（ライフテクノロジーズ社，カールスバッド，カリフォルニア州）またはゲノム・アナライザー（イルミナ社，サンディエゴ，カリフォルニア州））などのハイスループット技術を用いて達成される。２４プレックスアッセイの使用は、空間コード化およびデコード化の正確度とアッセイ系の定量的応答との両方を実証
する。
【００９７】
実施例３：保存サンプルへのアッセイの適合化
ゲノムＤＮＡがＲＮＡアッセイの概念実証としてアッセイされる。これは、単一コピーの参照シグナルを確証する方法を提供するためである。ＦＦＰＥサンプル用に実用的アッセイを開発した後、それをＲＮＡアッセイに適合化する。この目的のために、高多重化で適合性を確保すべくアッセイオリゴヌクレオチド濃度をアッセイする。細胞直径が１０ミクロンの細胞直径であって、各細胞に対して直径１０ミクロンの試薬小滴を送達すると仮定すると、小滴の容積は、５００μｌ以下であり、１μΜの濃度で３×１０１１個以下の分子を含有しうる。１０，０００個の細胞で１，０００個の標的配列をアッセイするためには、一小滴中に２，０００個以下のターゲティングオリゴヌクレオチドが必要とされる。したがって、各小滴は、各アッセイオリゴの１．６億以下のコピー数（細胞内の数千個の標的配列よりもはるかに過剰）を含有しうる。
【００９８】
低回収効率の問題に対処するために、非常に小数のまたは損なわれたサンプルから得られる絶対数の少ない生成物分子の取扱いが強化される。すなわち、溶出が効率的で、表面への分子の吸着から生じる減少が防止される。後者の問題に対処する方法は、グリコーゲンや担体核酸などの担体材料を組み込むことである。
【００９９】
実施例４：生物学的サンプルへのアッセイの適合化
人為的系を形成するために対照ＲＮＡ鋳型を固体担体に固定する。ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド中のニックを修復可能なＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いてアッセイを行う。対応付けられたスライド上または同一のスライドの異なる部分上でアッセイを行い、一方ではｇＤＮＡをアッセイし、他方ではＲＮＡをアッセイする。ｇＤＮＡをアッセイする場合、スライドをＲＮアーゼで前処理することが可能であり、ＲＮＡをアッセイする場合、スライドをＤＮアーゼで前処理する。ｇＤＮＡまたはＲＮＡを抽出してそれぞれｑＰＣＲまたはＲＴ−ｑＰＣＲで相対量を定量することにより、アッセイの結果を確認する。
【０１００】
組織切片ＲＮＡアッセイを可能なかぎり情報量の多いものとするため、存在量の範囲にわたり転写物を標的とする特定の組織での発現レベルに関する既存の情報がアッセイデザインで使用される。アッセイの定量性能特性の初期評価を可能にするために、高存在量の転写物といくつかの中〜低存在量の転写物の両方が標的とされる。
【０１０１】
以上では、本発明の原理を単に例示しているにすぎない。本明細書に明示的に説明も提示もされていないが、本発明の原理を具現化し、その趣旨および範囲に包含される種々の構成を、当業者であれば、考案できるであろうことはわかるであろう。さらに、本明細書に挙げられた実施例および条件表現はすべて、本発明の原理およびその技術の促進に本発明者らが寄与する概念を読者が理解するのに役立つように主に意図されたものであり、そのような特定的に挙げられた実施例および条件に限定されないとみなされるものとする。さらに、本発明の原理、態様、および実施形態、さらにはその特定の実施例を述べた本明細書の記載はすべて、それらの構造的および機能的な等価物の両方を包含するものとする。そのほかに、そのような等価物は、現在知られている等価物および今後開発される等価物（すなわち、構造にかかわらず同一の機能を発揮する任意の開発される要素）の両方を包含するものとする。したがって、本発明の範囲は、本明細書に提示および説明された例示的実施形態に制限されるものではない。もっと正確に言えば、本発明の範囲および趣旨は、添付の特許請求の範囲により具現化される。以下の特許請求の範囲では、「手段」という用語が用いられていないかぎり、そこに挙げられた特徴または要素はいずれも、米国特許法第条１１２第６項に準ずる手段＋機能の制限を受けるとみなされるべきものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図４】
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