(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)(i)アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、パラボウイルス科、ピコルノウイルス科及びポックスウイルス科から選択されるウイルス粒子、
(ii)合計の濃度が0.01Mから0.5Mのスクロース、又はスクロース及びラフィノース、又はマンニトール、並びに
(iii) 0.2Mから0.7MのN,N-ジメチルグリシン若しくはN,N,N-トリメチルグリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの水溶液を提供する工程と、
(b)前記溶液を乾燥させて、前記ウイルス粒子を組み入れている組成物を形成する工程と
を含む、ウイルス粒子を保存する方法。
【請求項２】
前記化合物(iii)が、N,N-ジメチルグリシン若しくはN,N,N-トリメチルグリシン又はこの塩酸塩である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記化合物(iii)が、N,N-ジメチルグリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記水溶液が、式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩
【化１】
0005960120.tif 000057
(式中、
-  Xは、-S(O)2-又は-S+(Rc)-を表し;
-  Ra及びRbは、独立して、C1〜6アルキルを表し;
-  Rcは、カルボキシレートアニオンで及びアミン(-NH2)部分で置換されたC1〜6アルキルを表す)
をさらに含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記式(II)の化合物が、式(IIC):
【化２】
0005960120.tif 000058
(式中、Ra及びRbは、独立して、C1〜6アルキルを表す)
のスルホン化合物である、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記式(IIC)のスルホン化合物がメチルスルホニルメタンである、
請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記水溶液中における前記式(IIC)のスルホン化合物の濃度が、0.1Mから1.5Mである、請求項5又は6に記載の方法。
【請求項８】
前記水溶液が、凍結乾燥若しくは噴霧乾燥される、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記水溶液が、凍結乾燥される、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記水溶液が、バイアル若しくはアンプル中で凍結乾燥され、次いで前記バイアル若しくはアンプルが密封される、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記ウイルス粒子が、生ウイルス又は死滅ウイルスから構成される、
請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記生ウイルスが、全ウイルス又は弱毒化生ウイルスである、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記ウイルスが、アデノウイルス、ワクチニアウイルス、インフルエンザウイルス又は麻疹ウイルスから選択される、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ウイルス粒子を組み入れているワクチンを調製する方法であって、
(a)(i)アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、パラボウイルス科、ピコルノウイルス科及びポックスウイルス科から選択されるウイルス粒子、
(ii)合計の濃度が0.01Mから0.5Mのスクロース、又はスクロース及びラフィノース、又はマンニトール、
(iii)0.2Mから0.7MのN,N-ジメチルグリシン若しくはN,N,N-トリメチルグリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、
を提供する工程と;
(b)この混合物に、アジュバント、緩衝剤、抗生物質及び/又は添加物を場合によって添加する工程と;
(c)前記溶液を乾燥させて、前記ウイルス粒子を組み入れている組成物又は固体組成物を形成する工程と
を含む方法。
【請求項１５】
アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、パラボウイルス科、ピコルノウイルス科及びポックスウイルス科から選択されるウイルス粒子又は非感染性ウイルス粒子を含む組成物又は乾燥粉末を製造する方法であって、
(a)(i)アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、パラボウイルス科、ピコルノウイルス科及びポックスウイルス科から選択されるウイルス粒子、
(ii)合計の濃度が0.01Mから0.5Mのスクロース、又はスクロース及びラフィノース、又はマンニトール、並びに
(iii) 0.2Mから0.7MのN,N-ジメチルグリシン若しくはN,N,N-トリメチルグリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの水溶液を提供する工程と、
(b)前記溶液を乾燥させて、前記ウイルス粒子を組み入れている組成物を形成する工程と
を含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス粒子の安定化に関する。
【背景技術】
【０００２】
一部の生物分子は、それらが、単離され、精製され、次いで室温で溶液中にて貯蔵され得るように十分に安定である。しかし、これは、低温での貯蔵を伴う材料及び技術の多くで可能でなく、安定剤又は凍結保護剤の添加、凍結乾燥、真空乾燥及び空気乾燥が、在庫保存を確実にするために試みられてきた。
【０００３】
これらの技術の利用性にもかかわらず、一部の生物材料は、貯蔵の間に不満足な安定性のレベルを依然として示し、一部の技術は、追加の費用及び不都合をもたらす。例えば、冷蔵輸送及び保存は費用がかかり、温度制御の中断はいずれも、生物分子の効力低下をもたらし得る。さらに冷蔵輸送は、発展途上世界の国々で医薬の輸送にしばしば利用できない。
【０００４】
また、凍結乾燥(freeze-drying or lyophilisation)のストレスは、一部の生物材料に非常に損傷を与え得るものとなる。生物学的医薬品の凍結乾燥は、熱感受性バイオマテリアルの溶液又は懸濁液を凍結させ、続いて、一次及び二次乾燥することを含む。この技術は、溶液が融解することなく、真空下サブゼロ温度での水の昇華に基づく。凍結乾燥は、固体タンパク質及びワクチンの医薬品を製造する鍵となる工程に相当する。凍結生物材料からの水蒸気拡散の速度は、非常に低く、したがって、この過程は時間がかかる。さらに、凍結及び乾燥の両方の段階は、タンパク質をアンフォールディング又は変性し得るストレスをもたらす。
【０００５】
国際公開第98/05182号には、乾燥後の変性に対してタンパク質を保護する方法が記載されている。この方法は、タンパク質の水溶液と可溶性カチオン性多価電解質及び環状ポリオールとを混合する工程と、該溶液から水を除去する工程とを含む。ポリエチレンイミンも適切であると述べられているが、ジエチルアミノエチルデキストラン(DEAE-デキストラン)及びキトサンは、好ましいカチオン性多価電解質である。
【０００６】
国際公開第2006/0850082A号には、糖、ヒストンタンパク質などの荷電物質及び乾燥-又は熱-感受性生物学的要素を含む乾燥又は保存生成物が報告されている。この糖は、非晶質固体マトリックスを形成する。しかし、保存された生物学的要素がヒト又は動物に投与される場合、ヒストンは免疫学的結果を有し得る。
【０００７】
国際公開第2008/114021号には、ウイルス粒子を保存する方法が記載されている。この方法は、1種又は複数種の糖、ポリエチレンイミン及びウイルス粒子の水溶液を乾燥して、ウイルス粒子を含む非晶質固体マトリックスを形成する工程を含む。該水溶液は、ポリエチレンイミンをポリエチレンイミンの数平均モル質量(Mn)に基づいて15μM以下の濃度で含有し、糖濃度、又は2種以上の糖が存在する場合、全糖濃度は、0.1Mを超える。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第98/05182号
【特許文献２】国際公開第2006/0850082A号
【特許文献３】国際公開第2008/114021号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、ウイルス製剤が、本明細書で定義されるとおりの式(I)及び/若しくは式(II)の化合物又はこれらの生理学的に許容される塩若しくはエステル並びに場合によって1種又は複数種の糖によって、乾燥の間に安定に保存されることを見出した。ウイルス活性は、熱負荷後にも保護された。ウイルス活性は、長期安定性試験の間も保存された。ウイルス活性は、乾燥前に水溶液中でも保存され得る。ウイルスは、凍結、凍結乾燥及び解凍によって生じた損傷に対して保護された。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって、本発明は、
(a)(i)ウイルス粒子、(ii)場合によって1種又は複数種の糖、並びに(iii)式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル
【化１】
0005960120.tif 000002
【００１１】
(式中、
-  R1は、水素若しくはC1〜6アルキルを表し;
-  R4は、水素を表すか;又は
-  R1及びR4は、これらが結合している原子と一緒になって、ピロリジン環を形成し;
-  R2は、水素、C1〜6アルキル又は-(CH2)2〜5NHC(O)(CH2)5〜15CH3を表し;R3は、C1〜6アルキルである);
及び/或いは
式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル
【化２】
0005960120.tif 000003
【００１２】
(式中、
-  Xは、-S(O)2-又は-S+(Rc)-を表し;
-  Ra及びRbは、独立して、C1〜6アルキルを表し;
-  Rcは、カルボキシレートアニオンで及びアミン(-NH2)部分で置換されたC1〜6アルキルを表す)
の水溶液を提供する工程と、
(b)該溶液を乾燥させて、前記ウイルス粒子を組み入れている組成物を形成する工程と
を含む、ウイルス粒子を保存する方法を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、
-  式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖を含み、且つウイルス粒子を組み入れている組成物;
-  非感染性ウイルス粒子及び場合によってアジュバントを組み入れている、本発明の組成物を含むワクチン;
-  ウイルス粒子を組み入れているワクチンを調製する方法であって、
(a)(i)ウイルス粒子、(ii)式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖の水溶液を提供する工程と;
(b)この混合物にアジュバント、緩衝剤、抗生物質及び/又は添加物を場合によって添加する工程と;
(c)該溶液を乾燥させて、前記ウイルス粒子を組み入れている組成物又は固体組成物を形成する工程とを含む方法;
-  ウイルス粒子又は非感染性ウイルス粒子を含み、且つ本発明の方法によって得られる、組成物又は乾燥粉末;
-  本発明の組成物を含む、密封バイアル又はアンプル;
-  ウイルス粒子を保存するための、式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖の使用;
-  (a)(i)ウイルス粒子、(ii)場合によって1種又は複数種の糖、並びに(iii)本発明の式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは本発明の式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの水溶液を提供する工程と;(b)該溶液を密封容器中最大5年間貯蔵する工程とを含む、乾燥前にウイルス粒子を保存する方法;
-  密封容器で提供され、且つ乾燥前に冷蔵庫又は冷凍庫中で貯蔵される、(i)ウイルス粒子、(ii)場合によって1種又は複数種の糖、並びに(iii)本発明の式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの及び/或いは本発明の式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルのバルク水溶液;
-  乾燥前に、ウイルス粒子を含む水溶液中における前記ウイルス粒子を保存するための、本発明の式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの及び/或いは式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖の使用;及び
-  ウイルス粒子を含む乾燥又は凍結乾燥生成物である組成物のための再懸濁剤としての、式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの及び/或いは式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖の使用
を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図1は、実施例1で得られた結果を示す。アデノウイルスが37℃と-20℃の間のサイクルに耐えるのに役立つ添加剤の能力を評価した。ジメチルスルホン(メチルスルホニルメタン、MSMとも呼ばれる)を添加剤として用いた。p値摘要:**=p<0.01、*=p<0.05。誤差線は、平均の標準誤差(n=4)を示す。
【図２Ａ】図2Aは、様々な実施例に用いたVirTis Advantage凍結乾燥機の棚温度について設定した温度を示す。
【図２Ｂ】図2Bは、様々な実施例に用いたVirTis Advantage凍結乾燥機の凝縮器温度を示す。
【図３】図3は、凍結乾燥の間のアデノウイルスの保存に対する糖及びMSMの効果を調べた実施例2の実験の結果を示す。示される誤差線は、平均の標準誤差(n=3)である。
【図４】図4は、解凍直後に試験したアデノウイルス感染性、及び糖と一緒に又はそれなしでTMG(トリメチルグリシン)との配合後に凍結乾燥させた試料の実施例3で得られた結果を示す。アデノウイルス活性は、GFP発現に対して陽性な細胞を数えることによって評価してpfu/mlで表した。示される誤差線は、平均の標準誤差(n=3)である。
【図５】図5は、実施例4で用いた凍結乾燥条件を実証する。
【図６】図6は、4℃又は37℃で7日間の熱負荷後の、実施例4で用いた再構成試料のウイルス力価を実証する棒グラフを示す。投入ウイルスの開始力価も示す。誤差線は、平均の標準誤差(n=3)を表す。
【図７】図7は、解凍(thawing)(「凍結乾燥前(Pre-Lyophyilisation)」)直後に試験したアデノウイルス試料、及び糖と一緒に又はそれなしでDMG濃度0.00M、0.007M、0.23M及び0.70MでPBS(リン酸緩衝生理食塩水)中配合し、その後に凍結乾燥させた試料について、実施例5で得られた結果を示す。pfu/mlで表したアデノウイルス活性は、GFP(緑色蛍光タンパク質)発現に対して陽性な細胞を数えることによって評価した。示される誤差線は、平均の標準誤差(n=3)である。
【図８】図8は、実施例5及び実施例6で用いた凍結乾燥条件を示す。
【図９Ａ】図9は、解凍(defrosting)直後に試験したアデノウイルス試料、及び糖と一緒に又はそれなしでDMGを配合後に凍結乾燥し、その後に熱負荷をかけた試料について、実施例6で得られた結果を示す。(A)凍結乾燥及び+4℃で7日間の貯蔵後のアデノウイルス活性。誤差線は、平均の標準を示す;特に断らない限り、n=3。
【図９Ｂ】図9は、解凍(defrosting)直後に試験したアデノウイルス試料、及び糖と一緒に又はそれなしでDMGを配合後に凍結乾燥し、その後に熱負荷をかけた試料について、実施例6で得られた結果を示す。(B)凍結乾燥及び+37℃で7日間の熱負荷後のアデノウイルス活性。誤差線は、平均の標準を示す;特に断らない限り、n=3。
【図１０】図10は、実施例7においてVirTis Advantage冷凍乾燥機中で凍結乾燥の間の棚温度、凝縮器温度及び真空の状態を示す。
【図１１】図11は、実施例7で得られた結果を示す。pfu/mlで表したアデノウイルス活性は、GFPに陽性な細胞を数えることによって評価した。誤差線は、平均の標準を示す(n=2)。有意性は、一元配置分散分析(one way ANOVA)、続いてボンフェローニ事後検定を用いて検定した。p値摘要は、*=p<0.05及び**=p<0.01である。
【図１２】図12は、実施例8で得られた凍結乾燥ケーキの外観を示す。
【図１３】図13は、実施例9で得られた結果を報告する。FDは、凍結乾燥を意味する。アデノウイルス及びPBSのみを含むバイアルは、アデノウイルス、マンニトール及びDMGを含むバイアルと比較して、ウイルス力価の非常に大きい損失を示した。示される誤差線は、平均の標準誤差(n=2)である。有意性は、一元配置分散分析(one way ANOVA)、続いてボンフェローニ事後検定を用いて検定した。値はすべて、原液力価と比較した。p値摘要は、*=p<0.01及び**=p<0.001である。
【図１４】図14は、11種の配合物が、凍結乾燥及び熱負荷を通してアデノウイルスを安定化させる能力を評価した実施例10で得られた結果を示す。
【図１５】図15は、11種の配合物が、凍結乾燥及び熱負荷を通してMVAを安定化させる能力を評価した実施例11で得られた結果を示す。
【図１６】図16は、実施例12における設計空間の三次元表示を示す。球は、試験した設計空間内の配合物を表す。この設計は、3因子の完全多元スクリーニング設計である。
【図１７】図17は、実施例12で用いた凍結乾燥プログラム及びそのプログラムの間のセンサーからの温度の読み取り値を示す。
【図１８】図18は、実施例12で用いた凍結乾燥プログラム及びそのプログラムの間のセンサーからの温度の読み取り値を示す。
【図１９】図19は、実施例12におけるDMGを含む配合物由来のデータについての残差の正規確率プロットを示す。
【図２０】図20は、実施例12におけるDMGを含む配合物由来のモデル化データの保持係数(効果)を示す。誤差線は、原点を横切らない場合、有意を示す。
【図２１】図21は、実施例12におけるSMMを含む配合物由来のモデル化データの保持係数(効果)を示す。誤差線は、原点を横切らない場合、有意を示す。
【図２２】図22は、実施例12におけるSMMを含む配合物由来のデータについて残差の正規確率プロットを示す。
【図２３】図23は、非特異的な二次の項の包含後の、実施例12におけるSMMを含む配合物由来のモデル化データの保持係数(効果)を示す。誤差線は、原点を横切らない場合、有意を示す。
【図２４】図24は、実施例12におけるSMMを含む配合物由来のデータについての残差の正規確率プロットを示す。
【図２５】図25は、実施例12におけるTMGを含む配合物由来のモデル化データの保持係数(効果)を示す。誤差線は、原点を横切らない場合、有意を示す。
【図２６】図26は、実施例12におけるTMGを含む配合物由来のデータについての残差の正規確率プロットを示す。
【図２７】図27は、実施例13における設計空間の三次元表示を示す。球は、試験した設計空間内の配合物を示す。この設計は、Doehlert RSM設計である。
【図２８】図28は、実施例13で用いた凍結乾燥プログラムを示す。
【図２９】図29は、実施例13におけるデータ由来のモデルについて様々な統計量を要約する。
【図３０】図30は、微調整後の実施例13におけるモデルで保持された項目を示す。原点を横切らない誤差線は、95%の信頼区間(95%C.I.)で有意な因子を示す。
【図３１】図31は、ラフィノースの異なる3レベル-「低」=0mMでのラフィノース、「中」=150mMでのラフィノース、「高」=300mMでのラフィノースで、実施例13におけるモデルを用いた、DMG及びスクロースの配合物の予測ウイルス力価の表面応答プロットを示す。
【図３２】図32は、モンテカルロシミュレーション(Monte-Carlo simulation)を用いて作成した、実施例13におけるデータのモデルに基づく最適予測からの設定及び出力を示す。このモデルで強調表示された予測最適条件は、スクロース=0.5M、DMG=1M、ラフィノース=150mMの濃度である。
【図３３Ａ】図33Aは、実施例13のデータ由来の最適領域プロットを示す。プロットは、固定ラフィノースレベル=0、150、272、300mMでのものである。プロットした変数は、回復力価(pfu/ml)である。図33Aは、十字形が、予測最適条件を印する等高線プロットである。
【図３３Ｂ】図33Bは、実施例13のデータ由来の最適領域プロットを示す。プロットは、固定ラフィノースレベル=0、150、272、300mMでのものである。プロットした変数は、回復力価(pfu/ml)である。図33Bは、予測回復ウイルス活性が初期の活性を超えるか又はそれに等しいモデルの領域を強調表示する同一のグラフ領域である。
【図３４】図34は、実施例14で用いた凍結乾燥プログラムを示す。
【図３５】図35は、凍結乾燥15週後における開始力価のパーセントとしての実施例14での回復ウイルス活性を示す。誤差線は、平均の標準誤差(n=2)である。
【図３６】図36は、実施例14における促進安定性温度(+25℃)での時間経過にわたる回復ウイルス活性を示す。
【図３７】図37は、実施例14におけるストレス試験温度(+37℃)での時間経過にわたる回復ウイルス活性を示す。
【図３８】図38は、実施例15における設計空間の三次元表示を示す。球は、試験する設計空間内の配合物を表す。この設計は、Doehlert RSM設計である。
【図３９】図39は、実施例15において用いた凍結乾燥条件を示す。
【図４０】図40は、データを表すために用いた実施例15におけるモデルの統計量を要約する。
【図４１】図41は、微調整後の実施例15におけるモデルで保持された項目を示す。原点を横切らない誤差線は、95%の信頼区間で有意な因子を示す。
【図４２】図42は、実施例15における様々な配合物による回復ウイルス力価(TCID50/ml)の等高線プロットを示す。
【図４３】図43は、実施例16における設計空間の表示を示す。番号を付けた円は、試験する設計空間内の配合物を表す。
【図４４】図44は、実施例16で用いた凍結乾燥条件を示す。
【図４５】図45は、データを表すために用いた実施例16におけるモデルの統計量を要約する。
【図４６】図46は、微調整後の実施例16におけるモデルで保持された項目を示す。原点を横切らない誤差線は、95%の信頼区間で有意な因子を示す。
【図４７】図47は、実施例16のモデルを用いた、DMG及びマンニトールの配合物の予測回復ウイルス力価の表面応答プロットを示す。
【図４８】図48は、モンテカルロシミュレーションを用いて作成した、実施例16におけるデータのモデルに基づく最適予測からの設定及び出力のスクリーンキャプチャを示す。灰色で強調表示した反復(iteration)48は、最適配合物である(1.0107MのDMG)。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
概要
本発明は、式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種、2種又はそれを超える種類の糖によるウイルス粒子の保存に関する。ウイルス粒子は、水溶液中で式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖に接触させ、次いでウイルス粒子が存在している、得られた溶液は、乾燥させて、ウイルス粒子を組み入れている組成物を形成する。
【００１６】
したがって、ウイルス粒子は、式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖の水溶液(「保存混合物」)と混合され得る。次いで、得られた溶液は、乾燥させて、ウイルス粒子を組み入れている組成物を形成する。乾燥させた組成物は、ケーキ又は粉末の形態を取り得る。必要に応じて、ケーキは粉末に粉砕され得る。
【００１７】
本発明は、ウイルス構造及び機能が乾燥工程の間に保存され得るようにする。したがって、乾燥後のウイルス活性は、維持され得る。したがって、式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル単独の存在は、ウイルス活性の保存を可能にする。ウイルス活性の保存におけるさらなる改善は、式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルと組み合わせて1種又は複数種の糖を用いて達成され得る。
【００１８】
保存されたウイルス粒子は、在庫寿命の延長、貯蔵及び輸送の容易さ、並びに流通用のコールドチェーンを不要にすることを可能にする。したがって、本発明は、凍結保護剤(凍結損傷に対する保護)、リオプロテクタント(lyoprotectant)(凍結乾燥の間の保護)及び/又は熱保護剤(4℃を超える又はそれ未満の温度に対する保護)として保護を与え得る。
【００１９】
さらに、ウイルス粒子は、乾燥工程以前に水溶液に保存される。これによって、調製後、乾燥工程が実施できるようになるまで、ウイルス活性の過度の喪失をもたらさずに、水溶液を貯蔵することが可能となる。
【００２０】
ウイルス粒子
本発明で用いられるウイルス粒子は、生ウイルス、死滅ウイルス、弱毒化生ウイルス、化学的に不活化されたウイルスなどの不活化ウイルス又はビルレント若しくは非ビルレントウイルスなどの全てのウイルスであり得る。生ウイルスは、宿主細胞内で感染及び複製することができる。死滅ウイルスは不活化しており、宿主細胞内で複製することができない。該粒子は、ウイルス様粒子(VLP)又はヌクレオカプシドであってもよい。ウイルスは、原核細胞又は真核細胞に感染性であってもよい。ウイルスは、ヒト又は動物ウイルスであってもよい。
【００２１】
ウイルス粒子は、dsDNAウイルス、ssDNAウイルス、dsRNAウイルス、(+)ssRNAウイルス、(-)ssRNAウイルス、ssRNA-RTウイルス又はdsDNA-RTウイルスであり得るか、又はそれらに由来し得る。限定的であることは意図されないが、一例として、ウイルス粒子は、以下のファミリーのウイルスであり得るか、又はこれらに由来し得る:
-  ヒトアデノウイルス又は非ヒトアデノウイルスなどのアデノウイルス科(Adenoviridae)、例えば、ヒトAd5、Ad2、Ad4、Ad6、Ad7、Ad11、Ad14、Ad24、Ad26、Ad35及びAd36血清型を含むヒトアデノウイルスA、B、C、D、E又はF;
-  カルシウイルス科(Caliciviridae)、例えば、ノーウォークウイルス;
-  コロナウイルス科(Coronaviridae)、例えば、ヒトコロナウイルス299E又はOC43、及びSARS-コロナウイルス;
-  フィロウイルス科(Filoviridae)、例えば、エボラウイルス;
-  フラビウイルス科(Flaviviridae)、例えば、黄熱ウイルス、ウエストナイルウイルス、デング熱ウイルス、C型肝炎ウイルス;
-  ヘパドナウイルス科(Hepadnaviridae)、例えば、B型肝炎ウイルス;
-  ヘルペスウイルス科(Herpesviridae)、例えば、単純ヘルペスウイルス、例えば、HSV1又はHSV2、ヒトヘルペスウイルス1、3、4、5又は6;
-  オルトミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)、例えば、限定されるものではないが、インフルエンザAウイルス血清型H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9H2、H7N2、H7N3及びN10N7を含むインフルエンザA、B、C;
-  パピローマウイルス科(Papillomaviridae)、例えば、ヒトパピローマウイルス;
-  パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)、例えば、ヒトパラインフルエンザウイルス1、麻疹ウイルス及び耳下腺炎ウイルス;
-  パルボウイルス科(Parvoviridae)、例えば、アデノ関連ウイルス;
-  ピコルナウイルス科(Picornaviridae)、例えば、ヒトポリオウイルス、口蹄疫ウイルス(血清型O、A、C、SAT-1、SAT-2、SAT-3及びAsia-1を含む);
-  ポックスウイルス科(Poxviridae)、例えば、ワクチニアウイルス、痘瘡ウイルス及びトリポックスウイルス(鶏痘ウイルス);
-  レオウイルス科(Reoviridae)、例えば、ブルータングウイルス群;
-  レトロウイルス科(Retroviridae)、例えば、ヒト免疫不全ウイルス1及び2を含むレンチウイルス;及び
-  トガウイルス科(Togaviridae)、例えば、風疹ウイルス。
【００２２】
好ましい実施形態において、ウイルス粒子は、アデノウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科又はポックスウイルス科のウイルスであり得るか、又はこれらに由来し得る。特に好ましい実施形態において、ウイルス粒子は、アデノウイルス、ワクチニアウイルス、インフルエンザウイルス、又は麻疹ウイルスであり得るか、又はこれらに由来し得る。ウイルスは、改変ワクチニアウイルスAnkara(MVA)又はMVA由来のウイルス粒子であり得る。
【００２３】
ウイルス様粒子(VLP)は、ウイルスの構造タンパク質由来のウイルスタンパク質を含むが、ウイルス核酸を欠いている。過剰発現される場合、これらのウイルス構造タンパク質は、自然に粒子に自己組織化する。VLPは、複製能力がない。一部の実施形態において、VLPは、脂質二重層内に埋め込まれたウイルスタンパク質である。VLPの例としては、ファージ由来VLP、ヒトパピローマウイルス(HPV)L1主要カプシドタンパク質VLP、ノーウォークウイルスカプシドタンパク質VLP並びにインフルエンザウイルス構造タンパク質、例えば、M1タンパク質、HA赤血球凝集素タンパク質及びN1ノイラミニダーゼタンパク質から組織化したVLPを含む。
【００２４】
ウイルス粒子は、当業者に周知の標準的技術を用いて調製され得る。例えば、ウイルスは、培養宿主細胞を用いられるべきウイルス株に感染させ、ウイルスが培養細胞中で複製するように感染を進行させることによって調製されてもよく、ウイルスを収穫及び精製するために当技術分野で公知の標準的方法によって放出させ得る。
【００２５】
式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩又はエステル、及び式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩又はエステル
式(I)及び式(II)の化合物は、この生理学的に許容される塩又はエステルとして存在し得る。
【００２６】
塩は、典型的には生理学的に許容される酸との塩であり、したがって、無機酸、例えば、塩酸若しくは硫酸、又は有機酸、例えば、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、マレイン酸、マンデル酸、フマル酸若しくはメタンスルホン酸と形成されるものを含む。塩酸塩が好ましい。
【００２７】
エステルは、典型的にはC1〜6アルキルエステル、好ましくはC1〜4アルキルエステルである。したがって、エステルは、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、イソプロピルエステル、ブチルエステル、イソブチルエステル又はtert-ブチルエステルであり得る。エチルエステルが好ましい。
【００２８】
本明細書で使用される場合、C1〜6アルキル基は、好ましくはC1〜4アルキル基である。好ましいアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル及びtert-ブチルから選択される。メチル及びエチルが特に好ましい。
【００２９】
疑いを避けるために、式(I)及び式(II)の化合物の定義は、カルボキシレートアニオンがプロトン化されて、-COOHを与え、アンモニウム又はスルホニウムカチオンが薬学的に許容されるアニオンと結合している化合物も含む。さらに疑いを避けるために、上に定義された化合物は、任意の互変異性又はエナンチオマー形態で使用され得る。
【００３０】
式(I)の化合物
典型的には、R1は、水素又はC1〜6アルキルを表し、R4は水素を表す。典型的には、R2は、水素又はC1〜6アルキルを表す。好ましくは、R1は、水素又はC1〜6アルキルを表し、R4は水素を表し、R2は、水素又はC1〜6アルキルを表す。より好ましくは、R1は、水素又はC1〜6アルキルを表し、R4は水素を表し、R2はC1〜6アルキルを表す。
【００３１】
好ましくは、式(I)の化合物は、N-C1〜6アルキルグリシン、N,N-ジ(C1〜6アルキル)グリシン若しくはN,N,N-トリ(C1〜6アルキル)グリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルであり、より好ましくは、N,N-ジ(C1〜6アルキル)グリシン若しくはN,N,N-トリ(C1〜6アルキル)グリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである。アルキル基は、典型的にはC1〜4アルキル基である。好ましいアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル及びtert-ブチルから選択される。メチル及びエチルが、特に好ましい。
【００３２】
式(I)の好ましい化合物は、N-メチルグリシン、N,N-ジメチルグリシン若しくはN,N,N-トリメチルグリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである。N-メチルグリシンは、サルコシンとも呼ばれる。N,N-ジメチルグリシンは、ジメチルグリシン(DMG)又は2-(ジメチルアミノ)-酢酸とも呼ばれる。N,N,N-トリメチルグリシンは、トリメチルグリシン(TMG)と呼ばれる。
【００３３】
代替として、式(I)の化合物は、典型的には式(IA)のグリシン誘導体又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである:
【化３】
0005960120.tif 000004
【００３４】
(式中、R5及びR6は、独立して、C1〜6アルキル、例えば、メチル又はエチルなどのC1〜4アルキルを表し;R7は、C1〜6アルキル、例えば、メチル若しくはエチルなどのC1〜4アルキル、又は-(CH2)2〜5NHC(O)(CH2)5〜15CH3を表す)。式(IA)の好ましい化合物は、トリメチルグリシン(TMG)及びコカミドプロピルベタイン(CAPB)又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである。トリメチルグリシンが好ましい。
【００３５】
代替として、式(I)の化合物は、典型的には式(IB)のプロリン誘導体又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである:
【化４】
0005960120.tif 000005
【００３６】
(式中、R8及びR9は、独立して、C1〜6アルキル、例えば、メチル又はエチルなどのC1〜4アルキルを表す)。好ましくは、式(IB)の化合物は、S-プロリン誘導体である。好ましくは、R8及びR9は両方とも、メチルを表し;この化合物は、プロリンベタインとして公知である。S-プロリンベタイン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルが、特に好ましい:
【化５】
0005960120.tif 000006
【００３７】
式(IA)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルが好ましい。
【００３８】
好ましくは、式(I)の化合物は、N,N-ジメチルグリシン若しくはN,N,N-トリメチルグリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである。最も好ましくは、式(I)の化合物は、N,N-ジメチルグリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである。
【００３９】
式(II)の化合物
典型的には、Rcのカルボキシレート及びアミン置換基は、Rcアルキル部分の同じ炭素原子に結合している。典型的には、Rcは、C2〜4又はC2〜3アルキル部分である。
【００４０】
式(II)の化合物は、典型的には式(IIA)のスルホン化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである:
【化６】
0005960120.tif 000007
【００４１】
(式中、Rc及びRdは、独立して、C1〜6アルキル、例えば、C1〜4アルキルを表す)。好ましいアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル及びtert-ブチルから選択される。メチル及びエチルが特に好ましい。好ましいスルホン化合物は、メチルスルホニルメタン(MSM)であり、これは、ジメチルスルホン(DMSO2)としても公知である。
【００４２】
式(II)の化合物は、典型的には式(IIB)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである:
【化７】
0005960120.tif 000008
【００４３】
(式中、Rc及びRfは、独立して、C1〜6アルキル、例えば、メチル又はエチルなどのC1〜4アルキルを表し、Rgは、カルボキシレートアニオンで及びアミン(-NH2)部分で置換されたC1〜6アルキル、例えば、メチル又はエチルなどのC1〜4アルキルを表す)。好ましくは、カルボキシレート置換基及びアミン置換基は、同じ炭素原子に結合している。式(IIB)の好ましい化合物は、S-メチル-L-メチオニン(SMM)又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである。
【００４４】
糖
本発明における使用に適切な糖は、還元糖、例えば、グルコース、フルクトース、グリセルアルデヒド、ラクトース、アラビノース及びマルトース;好ましくは非還元糖、例えば、スクロース及びラフィノース、より好ましくはスクロースを含む。糖は、単糖、二糖、三糖、又は他のオリゴ糖であってもよい。「糖」という用語は、糖アルコールを含む。したがって、一つの実施形態において、非還元糖又は糖アルコールの使用が好ましい。
【００４５】
ガラクトース及びマンノースなどの単糖;スクロース、ラクトース及びマルトースなどの二糖;ラフィノースなどの三糖;及びスタキオースなどの四糖が想定される。トレハロース、ウンベリフェロース、ベルバスコース、イソマルトース、セロビオース、マルツロース、ツラノース、メレジトース及びメリビオースも、本発明における使用に適切である。適切な糖アルコールはマンニトールである。マンニトールが用いられる場合、改善された外観のケーキを凍結乾燥後に得ることができる。
【００４６】
糖の存在は、安定を改善するように作用し得る。糖の添加は、凍結乾燥ケーキの改変及びより速い再構成のための溶解度の改善などの他の利点ももたらし得る。凍結乾燥が用いられる場合、一般に1種又は複数種の糖が存在する。1種の糖が用いられる場合、糖は、好ましくはスクロース又はマンニトール、より好ましくはマンニトールである。
【００４７】
ウイルス活性の保存は、2種以上の糖が保存混合物中に用いられる場合、特に有効である。2種、3種、又は4種の糖を用いることもできる。好ましくは、水溶液は、スクロース及びラフィノースの溶液である。スクロースは、グルコース及びフルクトースの二糖である。ラフィノースは、ガラクトース、フルクトース及びグルコースから構成される三糖である。
【００４８】
保存手順
本発明では、ウイルス粒子、場合によって1種又は複数種の糖、並びに式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルを含む水溶液を、乾燥させる。任意の適切な水溶液を用いてもよい。この溶液は緩衝化されてもよい。溶液は、HEPES溶液、リン酸緩衝溶液、トリス緩衝溶液又は純水溶液であってもよい。
【００４９】
溶液は、2から約12のpHを有してもよく、緩衝化されてもよい。溶液は、HEPES緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリス緩衝剤、クエン酸ナトリウム緩衝剤、ビシン緩衝剤(すなわち、N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン緩衝剤)又はMOPS緩衝剤(すなわち、3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸緩衝剤)で緩衝化されてもよい。溶液は、NaClを含んでも、含まなくてもよい。したがって、溶液は、生理食塩水クエン酸ナトリウム(SSC)緩衝溶液であってもよい。
【００５０】
一般に、ウイルス粒子の調製物は、保存混合物と、すなわち、式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種、2種又はそれを超える種類の糖と混合される。保存混合物はそれ自体緩衝化されてもよい。それは、HEPES溶液、リン酸緩衝溶液、トリス緩衝溶液又は純水溶液であってもよい。
【００５１】
代替として、この水溶液は、典型的にはウイルス粒子、式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖からなっても、又は本質的になってもよい。
【００５２】
式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度、並びにそれぞれの場合による糖の濃度は、通常の実験によって決定され得る。したがって、最良の安定性をもたらす最適化濃度が、選択され得る。式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、化合物は、安定性を改善するために相乗的に作用し得る。
【００５３】
乾燥のために水溶液中に存在する場合、糖の濃度は、少なくとも0.01M、典型的には飽和までである。一般に、存在する場合、糖の濃度は、少なくとも0.1M、少なくとも0.2M又は少なくとも0.5Mで飽和、例えば、室温での飽和まで、又は3M、2.5M若しくは2Mまでである。したがって、糖の濃度は、例えば、0.1Mから3M又は0.2Mから2Mの範囲であり得る。好ましくは、糖は存在する。代替として、糖の濃度、又は2種以上の糖が存在する場合、合計の糖の濃度は、0.08Mから3M、0.15Mから2M又は0.2Mから1Mの範囲であってもよい。適切な範囲は、0.05Mから1Mである。
【００５４】
2種以上の糖が存在する場合、好ましくはそれらの糖の1種は、スクロースである。スクロースは、0.05M、0.1M、0.25M又は0.5Mから飽和、例えば、室温での飽和又は3M、2.5M若しくは2Mまでの濃度で存在してもよい。
【００５５】
スクロースのモル濃度とその他の糖(複数可)のモル濃度との比は、典型的には1:1から20:1、例えば、5:1から15:1である。したがって、2種の糖が存在する場合で、特にスクロース及びラフィノースが存在する場合、スクロースのモル濃度の比は、典型的には1:1から20:1、例えば、5:1から15:1、好ましくは約10:1である。
【００５６】
乾燥のための水溶液中におけるそれぞれの式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル或いは式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度は、一般に0.001Mから2.5M、より特には0.01Mから2.5Mの範囲である。例えば、濃度範囲は、0.1Mから2.5Mであってもよい。
【００５７】
代替として、例えば、式(I)の化合物がDMG又は塩若しくはエステルである場合、乾燥のための水溶液中におけるそれぞれの式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル或いは式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度は、一般に0.1mMから3M又は1mMから2Mの範囲である。濃度は、1mMから1.5M又は5mMから1M又は0.07Mから0.7Mであってもよい。好ましい濃度は、7mMから1.5M又は0.07Mから1.2Mである。特に、式(I)の化合物が、DMGなどのN-アルキル化グリシン誘導体である場合、別のさらなる好ましい範囲は、0.5Mから1.5Mである。
【００５８】
用いられる式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル或いは式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの特定の濃度は、保存されるべきウイルス粒子の種類;用いられる特定の化合物;1種、2種又はそれを超える種類の糖が存在するかどうか及び糖(複数可)の同一性;並びに乾燥手順及び条件を含むいくつかの因子に依存する。したがって:
-  Xが-S(O)2-を表す式(II)の化合物若しくは式(IIA)の化合物、例えば、MSM、又はこれらの生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度は、好ましくは0.2mMから1M、例えば、0.35mMから1M、3.5mMから0.5M、0.035Mから0.5M又は0.035Mから0.25Mである。
【００５９】
-  式(I)の化合物又は式(IA)若しくは式(IB)の化合物、例えば、TMG、或いはこの生理学的に許容される塩又はエステルの濃度は、好ましくは0.01Mから2M、例えば、0.07Mから2M、0.2Mから1.5M、0.23Mから1.5M又は0.07Mから0.7Mの濃度で用いられる。
【００６０】
-  Xが-S+(Rc)-を表す式(II)の化合物若しくは式(IIB)の化合物、例えば、S-メチル-L-メチオニン、又はこれらの生理学的に許容される塩又はエステルの濃度は、好ましくは0.005Mから2M、例えば、0.007Mから2M、0.02Mから2M、0.023Mから1.5M又は0.07Mから1Mである。
【００６１】
-  糖が存在しない場合、式(I)の化合物、例えば、N,N-ジメチルグリシン(DMG)又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度は、5mMから1.5M又は70mMから1.5M若しくは1.2M又は7mMから1Mである。より好ましい濃度は、0.023Mから0.7M若しくは1M、又は0.07Mから0.7M若しくは1M、例えば、約0.7Mである。
【００６２】
-  1種又は複数種の糖が存在する場合、式(I)の化合物、例えば、N,N-ジメチルグリシン(DMG)又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度は、一般により低く、1
mMから1M若しくは1.5M又は5mMから1Mの範囲である。より好ましい濃度は、0.007Mから0.7M又は1M、例えば、約0.007Mである。特に好ましい範囲は、0.5Mから1.5Mである。
【００６３】
式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルが存在する場合、好ましくはN-アルキル化グリシン誘導体又はこの塩若しくはエステル及び式(IIA)又は式(IIC)のスルホン化合物が存在する場合、化合物は、相乗作用をもたらす量で存在し得る。例えば:
-  乾燥のための水溶液中におけるN-アルキル化グリシン誘導体又はこの塩若しくはエステルの濃度は、一般に0.1mMから3M又は1mMから2Mの範囲である。濃度は、1mMから1.5M又は5mMから1Mであってもよい。好ましい濃度は、0.1Mから1.5M又は0.5Mから1.25Mである。
【００６４】
-  乾燥のための水溶液中における式(IIA)又は式(IIC)のスルホン化合物の濃度は、一般に0.1mMから3M、1mMから2M又は0.2mMから1Mである。濃度は、0.1Mから1.5M又は0.5Mから1.25Mであってもよい。
【００６５】
典型的には、乾燥は、凍結乾燥、真空乾燥、流動床乾燥又は噴霧乾燥によって達成される。凍結乾燥が好ましい。材料中の水を減少させ、材料をバイアル中に密封することによって、材料は、容易に保存、出荷され、その後にその元の形態に再構成され得る。乾燥条件は、通常の実験によって適切に最適化され得る。
【００６６】
乾燥後、ウイルス粒子を組み入れている組成物が形成される。ウイルス粒子を組み入れているマトリックスが作製される。組成物は、典型的には非晶質固体である。したがって、一般に非晶質固体マトリックスである固体マトリックスが、一般に形成される。「非晶質の」によって、非構造化された、及び分子の観測可能な規則正しい又は繰り返された組織を持たない(すなわち、非結晶質の)が意味される。
【００６７】
存在する場合、糖又は糖(複数)は、乾燥された組成物中で非晶質マトリックスを与える。式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルは、糖マトリックス中に分散される。したがって、式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルは、糖マトリックス内に組み入れられる。ウイルス粒子も、糖マトリックス内に組み入れられる。したがって、乾燥手順は、例えば、ウイルス粒子が組み入れられている非晶質ケーキを形成する凍結乾燥によって実施され得る。
【００６８】
乾燥工程は、一般に水溶液が調製されるとすぐに、又はその後間もなく行われる。代替として、水溶液は、典型的には乾燥工程前に貯蔵される。水溶液中のウイルス粒子は、貯蔵の間に、式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖によって保存される。
【００６９】
水溶液、又はバルク中間溶液は、一般に最大5年、例えば、最大4年、3年、2年又は1年貯蔵される。好ましくは、溶液は、最大6ヶ月、より好ましくは最大3ヶ月又は最大2ヶ月、例えば、1日から1ヶ月又は1日から1週間貯蔵される。乾燥前に、溶液は典型的には、冷蔵庫又は冷凍庫で貯蔵される。冷蔵庫の温度は、通常は2から8℃、好ましくは4から6℃、又は例えば、約4℃である。冷凍庫の温度は、通常は-10から-80℃、好ましくは-10から-30℃、例えば、約-20℃である。
【００７０】
溶液は、典型的には、密封容器、好ましくは密封不活性プラスチック製容器、例えば、袋又は瓶に貯蔵される。容器は典型的には滅菌である。バルク中間溶液の容量は、典型的には0.1から100リットル、好ましくは0.5から100リットル、例えば、0.5から50リットル、1から20リットル又は5から10リットルである。容器は、典型的には0.1から100リットル、好ましくは0.5から100リットル、例えば、0.5から50リットル、1から20リットル又は5から10リットルの容量を有する。
【００７１】
貯蔵されたバルク中間溶液が、凍結乾燥される場合、それは典型的には、乾燥工程前に凍結乾燥用トレイ中に注ぎこまれる。
【００７２】
溶液の安定な貯蔵は、製造工程の柔軟性を増加させる。したがって、溶液は、容易に貯蔵、出荷され、その後に乾燥させ得る。
【００７３】
凍結乾燥
凍結乾燥は、典型的には傷みやすい材料を保存するために又はその材料を輸送にとってより都合よくさせるために使用される脱水工程である。凍結乾燥は、固体タンパク質及びワクチン医薬品を製造するための鍵となる工程に相当する。しかし、生物材料は、操作の間に凍結及び乾燥のストレスの両方を受け、これは、タンパク質をアンフォールディング又は変性し得る。さらに、凍結生物材料からの水蒸気拡散の速度は非常に低く、したがって、この過程は、時間がかかる。本発明の保存技術は、生物材料が、凍結乾燥操作の乾燥及び/又は熱ストレスに対して保護されることを可能にする。
【００７４】
この技術には、主な3段階、すなわち、凍結、一次乾燥及び二次乾燥がある。凍結は、典型的には凍結乾燥機を使用して行われる。この工程では、生物材料を、単純な結晶生成物の場合は、その共融点(Teu)未満に、又は非晶質生成物の場合は、ガラス転移温度(Tg')未満に、すなわち、材料の固相及び液相が共存し得る最低温度未満に冷却することが重要である。これにより、融解よりもむしろ昇華が、次の一次乾燥段階で起こることが確実にされる。
【００７５】
一次乾燥の間に、圧力は、適当なレベルの真空をかけることによって制御される一方、水が昇華し得るように十分な熱が供給される。材料中の水の少なくとも50%、典型的には60〜70%が、この段階で昇華する。過剰な熱は生物材料の構造を劣化又は変化させ得るので、一次乾燥はゆっくりでよい。冷凝縮器チャンバー及び/又は冷凝縮器プレートは、水蒸気が再固化によって捕捉される面を与える。
【００７６】
二次乾燥プロセスにおいて、水和の水は、さらに熱をかけることによって除去される。典型的には、圧力も、さらなる乾燥を促進させるために低くされる。凍結乾燥プロセスの終了後、真空は、密封前に窒素などの不活性ガスで解除され得るか、又は材料は真空下で密封され得る。
【００７７】
真空乾燥
ある種の実施形態において、乾燥は、1300Pa付近での真空乾燥を用いて行われる。しかし、真空乾燥は、本発明にとって必須ではなく、他の実施形態において、ウイルス粒子と接触した保存混合物は、回転させられる(すなわち、回転乾燥)か、又は凍結乾燥される(以下にさらに記載されるとおりに)。有利には、本発明の方法は、ウイルス粒子を含む保存混合物を真空にかける工程をさらに含む。都合良くは、真空は、20,000Pa以下、好ましくは10,000Pa以下の圧力でかけられる。有利には、真空は、少なくとも10時間、好ましくは16時間以上の期間かけられる。当業者に公知であるように、真空適用期間は、試料の大きさ、使用される機械及び他のパラメータに依存する。
【００７８】
噴霧乾燥及び噴霧凍結乾燥
別の実施形態において、乾燥は、本発明の保存混合物と混合されたウイルス粒子を噴霧乾燥又は噴霧凍結乾燥させることによって達成される。これらの技術は、当業者に周知であり、気体、例えば、空気、酸素を含まない気体若しくは窒素、又は噴霧凍結乾燥の場合には、液体窒素によって液体原料を乾燥させる方法を含む。液体原料は、液滴の噴霧中に霧化される。次いで、液滴は、乾燥チャンバー中で気体との又は液体窒素との接触によって乾燥させる。
【００７９】
流動床乾燥
さらなる実施形態において、乾燥は、本発明の保存混合物と混合されたウイルス粒子を流動床乾燥させることによって達成される。この技術は、当業者に周知であり、典型的には、制御された速度条件下で気体(例えば、空気)を生成物層に通して、流動化状態を生じさせる工程を含む。この技術は、粒子状生成物物質の乾燥、冷却、凝集、粒状化及びコーティングの段階を含み得る。熱は、流動気体、及び/又は流動層に埋没された他の加熱面(例えば、パネル又は管)によって供給され得る。冷却は、冷たい気体を用いて及び/又は流動層中に埋没された面を冷却して達成され得る。凝集及び粒状化の工程は、当業者に周知であり、達成されるべき生成物の特性に応じて多様な方法で行われ得る。粉末、顆粒又は板状小片などの粒子状生成物のコーティングは、制御条件下で流動粒子上に液体を噴霧することによって達成され得る。
【００８０】
乾燥組成物
低い残留含水率を有する組成物を得ることができる。冷蔵温度を超える温度、例えば、4℃から56℃若しくはそれを超える範囲内で、又は冷蔵温度より低い温度、例えば、0から-70℃若しくはそれ未満の範囲内で長期の保存を可能にする残留含水率のレベルが達成される。したがって、乾燥組成物は、重量で10%以下、5%以下、2%以下又は1%以下の残留含水率を有し得る。好ましくは、残留含水率は、0.5%以上又は1%以上である。典型的には、乾燥組成物は、重量で0.5から10%、好ましくは重量で1から5%の残留含水率を有する。
【００８１】
組成物は、乾燥粉末形態で得ることができる。例えば、凍結乾燥から得られるケーキは、粉末形態に粉砕され得る。したがって、本発明による固体組成物は、自由に流動する流動する粒子の形態を取り得る。固体組成物は、典型的には密封されたバイアル、アンプル又は注射器中の粉末として提供される。吸入のためである場合、粉末は乾燥粉末吸入器で提供され得る。固体マトリックスは、代替としてパッチとして提供され得る。粉末は、錠剤形態に加圧されてもよい。
【００８２】
組成物は、典型的にはウイルス粒子、式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖からなっても、又はこれらから本質的になってもよい。
【００８３】
固体担体上への乾燥
しかし、本発明の方法のさらなる実施形態において、ウイルス粒子を含む混合物は、固体担体上に乾燥させる。固体担体は、ビーズ、試験管、マトリックス、プラスチック製担体、マイクロタイター皿、マイクロチップ(例えば、シリコン、シリコン-ガラス又は金チップ)、又は膜を含み得る。別の実施形態において、本発明の方法によって保存されるウイルス粒子がその上に乾燥又は結合される固体担体が提供される。
【００８４】
ウイルス粒子の保存性の測定
ウイルス粒子に関連した保存は、乾燥、凍結、0℃未満又は-25℃未満の温度、凍結乾燥、室温、0℃を超える温度、25℃又は30℃を超える温度の条件への曝露下での、核酸又はタンパク質の劣化、トランスフェクション効率の損失、細胞性又は体液性免疫応答を刺激する能力の損失、ウイルス感染性の損失、免疫原性の損失、ウイルス力価の損失、宿主細胞応答の損失又はワクチン効力の損失などの物理的若しくは化学的劣化及び/又は生物活性の損失に対するウイルス粒子の耐性を指す。好ましくは、本発明による保存は、凍結保護(凍結損傷に対する保護)、溶解保護(凍結乾燥の間の保護)及び/又は熱保護(4℃より高い又は低い温度に対する保護)を含む。
【００８５】
感染性及び/又は免疫原性などのウイルス活性をアッセイする方法は、当業者に周知であり、限定されるものではないが、細胞培養中のウイルスの増殖、血液中のウイルス特異的抗体の検出、T細胞及び/若しくはB細胞応答を誘発する能力、ウイルス抗原の検出、ウイルスがコードされたDNA若しくはRNAの検出、又は顕微鏡を用いたウイルス粒子の観察を含む。
【００８６】
さらに、ウイルスの存在は、宿主細胞の形態学的変化を生じさせ、これを測定して、ウイルス活性の指標を得ることができる。検出可能な変化、例えば、ウイルス感染による宿主細胞における変化は、細胞変性効果として公知である。細胞変性効果は、細胞の円形化、方向性喪失(disorientation)、膨張又は収縮、死滅及び表面からの剥離からなり得る。多くのウイルスは、TUNEL(ターミナルウリジンデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニック末端標識)(Terminal uridine deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labelling)アッセイなどの技術及び当業者に周知の他の技術によって測定可能な、感染細胞におけるアポトーシス(プログラム細胞死)を誘導する。
【００８７】
ウイルスは、宿主細胞遺伝子の発現の制御に影響を与えることもでき、これらの遺伝子は、分析され、ウイルス活性が存在するか否かの指標を与えることができる。このような技術は、ウイルス発現産物との酵素反応又は化学反応を完了させるための、細胞培養への試薬の添加を含み得る。さらに、ウイルスゲノムは、ウイルス感染性の検出を高めるために修飾され得る。例えば、位相差顕微鏡検査、蛍光顕微鏡検査又は放射線イメージングによって容易に検出され得るマーカーを発現させるために、ウイルスゲノムは遺伝的に修飾され得る。マーカーは、GFP(緑色蛍光タンパク質)などの発現された蛍光タンパク質又は比色反応又は放射性標識化反応に関与し得る発現された酵素であってもよい。マーカーはまた、試験される細胞の特定の機能を妨げる又は阻害する遺伝子産物であり得る。
【００８８】
プラーク形成単位のアッセイを用いて、ウイルス感染性を測定し、ウイルス力価を示すことができる。このアッセイでは、適切な宿主細胞は、それらがプラスチック製瓶又は皿を覆う細胞の単層を形成するまで、平らな表面で増殖させる。特定の宿主細胞の選択は、ウイルスの型に依存する。適切な宿主細胞の例としては、限定されるものではないが、CHO、BHK、MDCK、10T1/2、WEHI細胞、COS、BSC1、BSC40、BMT10、VERO、W138、MRC5、A549、HT1080、293、B-50、3T3、NIH3T3、HepG2、Saos-2、Huh7、HEK293及びHeLa細胞が挙げられる。次いで、宿主細胞の単層を、ウイルス粒子に感染させる。感染の結果として、産生された任意のウイルス粒子が、それらの産生部位から遠くに移動することができないように、液体培地は、半固体培地と置き換えられる。ウイルス粒子が細胞に感染し、複製し、次いで、その細胞を死滅させるときに、プラークは形成される。プラークは、例えば、顕微鏡下で他の細胞より丸く、より濃く見える、又は目により視覚化される場合に白色の点として見える細胞変性効果を示す、単層内の細胞の領域を指す;プラーク中心は、ウイルスに誘導される溶解のために細胞を欠くことがあり得る。新たに複製したウイルスは、周囲の細胞に感染し、それらも死滅させる。この過程は、数回繰り返され得る。次いで、細胞は、生細胞だけを染色するメチレンブルーなどの色素で染色される。プラーク内の死細胞は、染まらず、着色背景上で非染色領域として見える。
【００８９】
各プラークは、1個のウイルスによる1個の細胞の感染性、続いて、そのウイルスの複製及び蔓延の結果である。しかし、細胞を死滅させないウイルスは、プラークを形成し得ない。プラークは、例えば、顕微鏡下で他の細胞より丸く、より濃く見える、又は目により視覚化される場合に白色の点として見える細胞変性効果を示す、単層内の細胞の領域を指す;プラーク中心は、ウイルスに誘導される溶解のために細胞を欠くことがあり得る。ウイルス力価の指標は、「プラーク形成単位」(PFU)を測定することによって与えられる。ウイルス感染性のレベルは、本発明によって保存される生物材料の試料で測定して、本発明の保存混合物を添加することなく乾燥及び/又は熱変化に供した新たに収穫されたウイルス又は試料などの対照試料と比較し得る。
【００９０】
本発明のウイルス粒子の一部の型、例えば、ウイルスタンパク質、VLP、又は一部の不活化ウイルスは、プラークアッセイでプラークを形成する能力をもたない。この場合、保存性は、当業者に周知である免疫原性を決定する方法などの他の方法によって測定され得る。例えば、抗体又は細胞媒介性宿主免疫応答を測定するインビボ及びインビトロでのアッセイが、当技術分野で公知であり、本発明における使用に適切である。例えば、抗体に基づく免疫応答は、本発明の保存ウイルス粒子を用いた免疫の前後に、動物モデルにおける血清抗体の量、アビディティ及びアイソタイプ分布を比較することによって測定され得る。
【００９１】
本発明の保存ウイルス粒子の用途
ワクチン
本発明の保存ウイルス粒子は、ワクチンとして使用し得る。例えば、死滅全ウイルス、弱毒化生ウイルス、化学的不活化ウイルス、VLP又は生ウイルスベクターなどの保存ウイルス粒子は、ワクチンとしての使用に適する。ワクチンとして、本発明の保存ウイルス粒子は、ウイルス感染、ウイルス誘発の毒性を含むがこれに限定されないウイルス感染の続発症、癌及びアレルギーを含むがこれらに限定されない多くの状態の治療又は予防のために、抗原として又はウイルスタンパク質などの抗原をコードするために使用され得る。このような抗原は、宿主の免疫系を刺激して、体液性及び/又は細胞性抗原特異的応答を生じる一つ又は複数のエピトープを含む。
【００９２】
本発明の保存ワクチンは、ウイルス、例えば、ヒトパピローマウイルス(HPV)、HIV、HSV2/HSV1、インフルエンザウイルス(A型、B型及びC型)、パラインフルエンザウイルス、ポリオウイルス、RSVウイルス、ライノウイルス、ロタウイルス、A型肝炎ウイルス、ノーウォークウイルス、エンテロウイルス、アストロウイルス、麻疹ウイルス、耳下腺炎ウイルス、水痘-帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン-バーウイルス、アデノウイルス、風疹ウイルス、ヒトT細胞リンパ腫I型ウイルス(HTLV-I)、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、D型肝炎ウイルス、ポックスウイルス及びワクチニアウイルスによる感染を予防又は治療するために使用され得る。ワクチンはさらに、多数の獣医学的疾患、例えば、口蹄疫(血清型O、A、C、SAT-1、SAT-2、SAT-3及びAsia-1を含む)、コロナウイルス、ブルータングウイルス、ネコ白血病ウイルス、トリインフルエンザ、ヘンドラ及びニパーウイルス、ペスチウイルス、イヌパルボウイルス及びウシウイルス性下痢ウイルスに対する適切な免疫応答を与えるために使用され得る。一つの実施形態において、ワクチンは、サブユニット、結合型又は多価ワクチンである。例えば、本発明の保存ワクチンは、2種以上の異なる型のウイルス、例えば、麻疹、耳下腺炎及び風疹ウイルスによる感染を治療するために使用され得る(例えば、MMRワクチン)。
【００９３】
本発明のワクチン組成物は、1種又は複数種の糖、及びスルホキシド、スルホン、スルホニウム、テチン又はベタイン化合物を含有する本発明の保存用混合物と混合されたウイルス粒子を含む。ワクチン組成物は、適切な緩衝剤、及び添加物、例えば、抗生物質、アジュバント、又は免疫系の特定の細胞に対するワクチン抗原の提示を強める他の分子をさらに含み得る。
【００９４】
当技術分野で周知の種々のアジュバントを、ワクチンの効力を増加させるために、並びに/又は体液性及び細胞性免疫応答を調節するために用いることができる。適切なアジュバントとしては、限定されるものではないが、鉱塩(例えば、水酸化アルミニウム(「ミョウバン」)、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム)、粒子状アジュバント(例えば、ビロソーム、ISCOMS(サポニン及び脂質の構造化複合体))、微生物誘導体(例えば、MPL(モノホスホリル脂質A)、CpGモチーフ、フラジェリンなどのTLRアジュバントを含む修飾毒素)、植物誘導体(例えば、サポニン(QS-21))及び内因性免疫刺激性アジュバント(例えば、サイトカイン、及びワクチンの有効性を増強するために免疫刺激剤として作用する任意の他の物質)が挙げられる。
【００９５】
本発明のワクチン組成物は、適切な貯蔵を与え、及び調製物の保存寿命を最大化するために、凍結乾燥(free-dried(lyophilised))形態であり得る。これは、長期間のワクチンの備蓄を可能にし、免疫原性、効力及び有効性を維持するのに役立つ。本発明の保存用混合物は、凍結乾燥プロトコルの間に遭遇する乾燥及び熱のストレスに対してウイルス物質を保存するのに特に適している。したがって、保存用混合物は、収穫のすぐ後及び試料を凍結乾燥操作に供するすぐ前の、ウイルス又はウイルス粒子への添加に適する。
【００９６】
本発明によって調製したワクチンの保存性を測定するために、当業者に周知の技術を用いてワクチンの効力は測定され得る。例えば、細胞性又は体液性免疫応答の生成は、ワクチンに対する抗体又は免疫細胞応答の生成をモニターすることにより適当な動物モデルで試験され得る。免疫応答を誘発する、本発明の方法に従って調製されたワクチン試料の能力は、同じ保存技術に供さなかったワクチンと比較され得る。
【００９７】
ウイルスベクター
本発明の方法に従って保存されたウイルス又はウイルスベクターは、標的細胞に異種遺伝子又は他の核酸配列を移入するために使用され得る。適切には、異種配列(すなわち、導入遺伝子)は、標的細胞で発現され得るタンパク質又は遺伝子産物をコードする。適切な導入遺伝子は、望ましいレポーター遺伝子、治療用遺伝子及び免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子(ワクチンとして使用するために)を含む。遺伝子発現不全に関連する疾患の治療又は予防のための手法である遺伝子治療は、細胞内への治療用遺伝子の挿入、続いて必要なタンパク質の発現及び産生を含む。この手法により、損傷遺伝子の置換え又は望ましくない遺伝子の発現の阻止が可能になる。特に、保存ウイルス又はウイルスベクターは、治療用導入遺伝子又は免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子を患者に移入するために、遺伝子治療に使用され得る。
【００９８】
好ましい実施形態において、保存ウイルス粒子は、生ウイルスベクターである。「生ウイルスベクター」によって、標的種に対して非病原性又は低病原性であり、且つ他のウイルス又は微生物に対して保護的な免疫応答を刺激する抗原をコードする1種又は複数種の遺伝子、レポーター遺伝子又は治療用タンパク質が挿入されている生ウイルスベクターが意味される。特に、ウイルスベクターが依然として複製することができ、それにより、挿入核酸配列によってコードされたポリペプチドを発現し、及びワクチンの場合には、感染宿主動物における免疫応答を誘発するように、核酸は、ウイルスベクター中に導入される。一つの実施形態において、生ウイルスベクターは、弱毒化生ウイルスベクターであり、すなわち、野性型ウイルスよりもビルレントでない(疾患を引き起こさない)ように改変されている。
【００９９】
組換えウイルスを潜在性ワクチンとして使用する基盤には、病原性生物からの特定の遺伝子の、非病原性又は弱毒化ウイルスのゲノム中への組込みが含まれる。次いで、組換えウイルスは、インビボ又はインビトロでのいずれかで特定の真核細胞に感染して、それらに組換えタンパク質を発現させ得る。
【０１００】
疾患生物由来の配列をコードする遺伝子の挿入によって誘導される生ウイルスベクターワクチンは、弱毒化生ウイルス、不活化ワクチン、サブユニット又はDNA手法に比べて好ましくあり得る。生ウイルスベクターの最も重要な安全性特徴の一つは、受容者が、病因物質それ自体に曝露されることなく病原性生物からの特定の抗原に対して免疫され得ることである。安全性は、宿主に対して弱毒化されるか、又は対象の異種抗原をまだ発現することができるが宿主内で複製することができないウイルスベクターを選択することによってさらに調節される。標的種における安全性の履歴を有するワクチン株は、さらなる安全性特徴を与える。ベクターが必須遺伝子を欠失しているいくつかの系が開発されており、ワクチンの調製は、欠けている機能を与える細胞系で行われる。
【０１０１】
様々なベクター、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルスベクターが、標的細胞への異種遺伝子の送達のために使用され得る。対象の異種遺伝子は、ウイルスベクターに挿入され得る。本発明のウイルスベクターは、例えば、複製起点、場合によって異種遺伝子の発現のためのプロモーター、及び場合によってプロモーターの調節因子を備えたウイルスベクターを含み得る。例えば、本発明の実施に有用なアデノウイルスは、E1及び/若しくはE3及び/若しくはE4領域に欠失を有し得るか、又はそうでなければ異種DNAを受け入れるために最大化され得る。
【０１０２】
ウイルスベクターは、対象の異種遺伝子に作動可能に連結された他のウイルス核酸配列と一緒に、構成的プロモーター、例えば、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、SV40ラージT抗原プロモーター、マウス乳癌ウイルスLTRプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター(MLP)、マウス乳癌ウイルスLTRプロモーター、SV40初期プロモーター、アデノウイルスプロモーター、例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター(Ad MLP)、HSVプロモーター(HSV IEプロモーターなど)、HPVプロモーター、例えば、HPV上流調節領域(URR)又はラウス肉腫ウイルスプロモーターを含み得る。組織特異的又は誘導的プロモーターも、対象の異種遺伝子の発現を調節するために使用され得る。プロモーターはまた、発現が設計される宿主細胞と適合性であるように選択され得る。
【０１０３】
ウイルスベクターはまた、エンハンサーなどの他の転写調節エレメントを含み得る。エンハンサーは、プロモーター/遺伝子配列に作動可能に連結される場合、その遺伝子配列の転写を増加させる、シス作用因子として広義に定義される。エンハンサーは、他の発現調節エレメント(例えば、プロモーター)よりも対象の配列からさらに非常に離れた位置から機能することができ、対象の配列に対していずれの方向で位置する場合も作動し得る。
【０１０４】
エンハンサーは、ポリオーマウイルス、BKウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)、アデノウイルス、シミアンウイルス40(SV40)、モロニー肉腫ウイルス、ウシパピローマウイルス及びラウス肉腫ウイルスを含む、多くのウイルス源から同定されてきた。適切なエンハンサーの例としては、SV40初期遺伝子エンハンサー、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復(LTR)由来のエンハンサー/プロモーター、及びヒト又はマウスCMV由来のエレメント、例えば、CMVイントロンA配列に含まれるエレメントが挙げられる。
【０１０５】
次いで、対象の異種遺伝子を含むウイルスベクターは、貯蔵、凍結乾燥などのさらなる保存技術に供すること、又は患者若しくは宿主細胞への投与の前に、本発明の方法によって保存され得る。
【０１０６】
抗ウイルス活性を示すことが公知であるポリペプチドをコードする核酸、免疫調節分子、例えば、サイトカイン(例えば、TNF-アルファ、IL-6及びIL-2などのインターロイキン、インターフェロン、GM-CSFなどのコロニー刺激因子)、アジュバント並びに共刺激分子及び補助分子は、本発明のウイルスベクターに含め得る。代替として、このようなポリペプチドは、例えば、本発明の保存混合物中で、別個に提供され得るか、又は本発明のウイルスベクターと同時に、連続的に又は別個に投与され得る。
【０１０７】
好ましくは、本発明の保存されたウイルスベクターは、当業者に公知である様々なウイルス技術、例えば、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス及びアデノウイルスなどの組換えウイルスベクターによる感染を用いて、適切な宿主細胞に導入され得る。好ましくは、対象の遺伝子を含む本発明の保存されたウイルスベクターの投与は、標的細胞のウイルス感染によって媒介される。
【０１０８】
多数のウイルスに基づく系が、哺乳動物細胞をトランスフェクトするために開発された。
【０１０９】
例えば、選択された組換え核酸分子は、当技術分野で公知の技術を用いて、ベクターに挿入し、レトロウイルス粒子としてパッケージングすることができる。次いで、組換えウイルスは、単離され、インビボ又はエクスビボのいずれかで被験者の細胞に送達され得る。レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス(Mo-MLV)に基づき得る。レトロウイルスベクターでは、ウイルス遺伝子(gag、pol及びenv)の1種又は複数種は、一般に対象の遺伝子と置き換えられる。
【０１１０】
多くのアデノウイルスベクターが公知である。アデノウイルスサブグループC血清型2及び5が、ベクターとして一般に使用される。野性型アデノウイルスゲノムは、約35kbであり、その30kbまでを外来性DNAで置き換えることができる。
【０１１１】
調節機能を有する四つの初期転写単位(E1、E2、E3及びE4)、及び構造タンパク質をコードする後期転写物がある。アデノウイルスベクターは、不活化されたE1及び/又はE3遺伝子を有し得る。次いで、ミッシング遺伝子(missing gene)(複数可)は、ヘルパーウイルス、プラスミドによってイントランスで供給され得るか、又はヘルパー細胞ゲノムに組み込まれ得る。アデノウイルスベクターは、E2a温度感受性突然変異体又はE4欠失を利用し得る。最小アデノウイルスベクターは、逆方向末端反復配列(ITR)及び導入遺伝子の周囲のパッケージング配列だけを含むことができ、必要なウイルス遺伝子のすべては、ヘルパーウイルスによってイントランスで提供される。したがって、適切なアデノウイルスベクターとしては、Ad5ベクター並びにシミアンアデノウイルスベクターが挙げられる。
【０１１２】
ウイルスベクターは、ワクチニアウイルス及びトリポックスウイルス、例えば、鶏痘ワクチンを含む、ウイルスのポックスファミリー由来であってもよい。例えば、改変ワクチニアウイルスAnkara(MVA)は、正常のヒト組織を含む、大部分の細胞型で複製しないワクチニアウイルスの株である。したがって、組換えMVAベクターは、本発明のポリペプチドを送達するために使用され得る。
【０１１３】
付加型のウイルス、例えば、アデノ関連ウイルス(AAV)及び単純ヘルペスウイルス(HSV)も、適切なベクター系を開発するために使用され得る。
【０１１４】
添加剤
本発明では、ウイルス粒子の保存のための添加剤も提供される。添加剤は、(a)場合によって1種若しくは複数種の糖(スクロース、ラフィノース、スタキオース、トレハロース、若しくは糖アルコール、又はこれらの任意の組合せなど);並びに(b)式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルを含む。好ましくは1種又は複数種の糖が存在する。好ましくは、添加剤は、これらの成分からなるか、又は本質的になる。
【０１１５】
「添加剤」によって、本発明のウイルス粒子のための担体として用いられる不活性物質が意味される(例えば、ウイルス粒子がワクチンとして用いられる場合)。典型的には、ウイルス粒子(例えば、ワクチンとしての使用のための)は、添加剤中に溶解され、又はそれと混合され、これは、ウイルス粒子の保存剤として作用し、並びに/又は一部の文脈では身体の中への投与及び吸収を助ける。本発明の保存用混合物と同様に、添加剤も、当技術分野で周知の酸化防止剤などの他の保存剤、潤沢剤及び結合剤を、それらの成分が本発明の保存用混合物の有効性を著しく低下させない限り、含み得る。
【０１１６】
固体担体上でのアッセイ
固体担体上に貯蔵された保存ウイルス粒子は、診断目的に、又はワクチン接種計画をモニターするために使用され得る。例えば、体液(血液、尿、唾液、痰、胃液など)などの患者試料は、患者試料及び本発明の保存用混合物を含む混合物を固体担体上に乾燥させることによって、本明細書で記載される方法によって保存され得る。次いで、保存された患者試料は、抗ウイルス抗体を用いて(例えば、ELISAを用いて)試料中のウイルス抗原/エピトープの存在について試験され得る。代替として、対象のウイルス粒子は、ウイルス粒子及び本発明の保存用混合物を含む混合物を固体担体上に乾燥させることによって、本明細書で記載される方法によって保存され得る。患者試料は、患者試料と、対象のウイルス粒子がその上に結合している固体担体とを接触させることによって、抗ウイルス抗体の存在について試験され得る。抗原-抗体複合体の形成は、測定可能なシグナルを誘発させ得る。試料中のウイルス粒子抗原-抗体複合体の存在及び/又は量は、ウイルス感染の存在又は患者におけるワクチン接種計画の進行を示すために用いることができる。
【０１１７】
投与
本発明による保存ワクチン又はウイルス粒子は、様々な公知の経路及び技術を用いてインビボで被験者に、一部の場合に乾燥又は凍結乾燥生成物の再構成後に、投与され得る。例えば、保存ワクチンは、注射剤、懸濁製剤又はエマルション製剤として提供され、従来の針及び注射器を用いて非経口的、皮下、経口、表皮、皮内、筋内、動脈内、腹腔内、静脈内注射によって、又は液体噴流注入システムを用いて投与され得る。保存ワクチンは、皮膚若しくは粘膜組織に局所的に、例えば、経鼻、髄腔内、腸内、舌下、経直腸若しくは経膣的に投与され、又は呼吸器若しくは肺投与に適した微粉化噴霧として提供され得る。
【０１１８】
一つの実施形態において、本発明の方法は、該混合物を、液体注入としての投与に適した配合物に処理する工程をさらに含む。好ましくは、該方法は、該混合物を、消化を介する又は肺経路を介する投与に適した配合物に処理する工程をさらに含む。
【０１１９】
保存生成物は、投与製剤と適合しており、予防的に及び/又は治療的に有効である量で被験者に投与される。本発明の保存生成物又はワクチンの投与は、「予防的」又は「治療的」のいずれかのためであり得る。本明細書で使用される場合、「治療的」又は「治療」の用語は、以下、すなわち、感染又は再感染の予防;症状の低減又は除去;及び病原体の低減又は完全な除去のいずれも含む。治療は、予防的に(感染前に)又は治療的に(感染後に)行うことができる。
【０１２０】
式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖は、典型的にはウイルス粒子を含む乾燥又は凍結乾燥生成物、好ましくは本発明の生成物のための、例えば、それが、患者への投与前に液体形態(水溶液)に変えられる場合に、再懸濁剤として作用する。
【実施例】
【０１２１】
以下の実施例により、本発明は例証される。以下の材料、装置及び技術は、特に断りのない限り、実施例において用いた:
材料
HEK-293細胞(ECACC 85120602)
ジメチルグリシンDMG(Sigma D1156、ロット077K1856)
ジメチルスルホン(MSM)(Sigma M81705、ロット0001452516)
スクロース(Sigma 16104、ロット70040)
ラフィノース(Sigma R0250、ロット039K0016)
PBS(Sigma D8662、ロット118K2339)
水(Sigma W3500、ロット8M0411及びRNBB1139)
Hydranalメタノール(Fluka、37817、ロット8331D)
Hydranal Composite(Fluka、34805、ロット8287A)
5ml  ガラスバイアル(Adelphi Tubes VCD005)
14ml  凍結乾燥栓(Adelphi Tubes FDIA14WG/B)
14mm  キャップ(Adelphi Tubes CWPP14)
アデノウイルスGFP(Vector Biolabs  カタログ1060)
麻疹ウイルス株3A及び1A(NIBSCにてP.Christianによって提供される好意)
ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)(Sigma D5796、ロットRNBB1139)
ウシ胎仔血清(FBS)(Sigma F7524、ロット109K3395)
ペニシリン  ストレプトマイシン(PS)(Sigma P4458、ロット0409M00393)
生理食塩水クエン酸ナトリウム(SSC)(Sigma S6639、ロット020M8404)
BHK-21細胞系(ECCAC CB2857)
HEK 293(ECACC 85120602)
MVA(ATCC-VR-1508)
2ml  ガラスバイアル(Adelphi Tubes VCDIN2R)
13mm  凍結乾燥用栓(Adelphi Tubes FDW13)
クリンプ(Adelphi Tubes COTW13)
装置
Advantage凍結乾燥機(VirTis)
HERA安全クラスIIキャビネット(Thermofisher)
VirTis Advantage凍結乾燥機(Biopharma Process Systems)
Binder CO2インキュベータ(Binder)
Binder APT line TM MK熱サイクル試験チャンバー(Binder)
Thermo Scientific MaxQ 4450インキュベータ(Thermofiser)
KERN EW220-3NM天秤(VWR)
Elcold -45℃冷凍庫(VWR)
Forma 900シリーズ  -80℃冷凍庫(Thermofisher)
カールフィッシャー容量滴定器(Mettler Toldeo)
DMIL LEDインバータ顕微鏡(Leica、EQP#062)
ATL-84-1 Atlion天秤(Acculab、EQP#088)
IP250 37℃インキュベータ(LTE、EQP#016)
凍結乾燥プロトコル
約3日間継続する事前にプログラム化されたプロトコルを用いて、試料をVirTis Advantage凍結乾燥機により凍結乾燥した。試料を-40℃で1時間凍結させ、その後、Themo Savant VLPポンプ(Thermofisher、英国)によって、最初に200ミリトールで真空をかけた。棚温度及び真空は、この処理を通して調整し、凝縮器は-80℃に維持した。工程8は、真空を開放する前に試料に栓をするまで、延長した。用いた乾燥サイクルを以下に示す:
【表１】
0005960120.tif 000009
【０１２２】
一次乾燥期において、棚温度は、-45℃から-32℃に上昇させる。二次乾燥期は、乾燥が終了するまで20℃への傾斜を含んだ。凝縮器温度は、一定の-80℃でとどめるように設定した。プローブにより、棚温度及び凝縮器温度を記録した(図2A及び図2B参照)。
【０１２３】
統計分析
PRISM Graphpadソフトウェア  バージョン4.00を用いて、異なる添加剤間の有意性を分析するために、一元配置分散分析(ANOVA)検定、続いてテューキー対比較(turkey pair wise comparison)を行った。p値摘要は、*=p<0.10;**=P<0.05;***=P<0.005である。
【０１２４】
一部の実施例において、以下の値を計算した:
-  R2=決定係数。あてはまりの良さの尺度。R2<0.5=低いモデル有意性。
【０１２５】
-  Q2=予測精度の推定。予測の良さの尺度。Q2は、有意なモデルについて>0.1でなければならない。Q2は、良いモデルについて>0.5でなければならない。R2-Q2<0.2〜0.3。
【０１２６】
-  モデル妥当性(MV)=「多様なモデル問題の検定」。モデル妥当性<0.25=統計的に有意なモデル問題の指標、例えば、外れ値、不正確なモデル/変換。
【０１２７】
-  再現性(Rep)=全体的変動と比較した、反復実験間の変動の尺度。再現性>0.5は、有意を意味する。
【０１２８】
［実施例１］
凍結乾燥
添加剤のそれぞれの種類(以下の表1参照)を原液として作製し、250μlを適切に標識した5mlガラスバイアルに添加した。次いで、50μlのアデノウイルスをそれぞれのバイアルに添加した。ボルテックスした後、バイアルをVirTis Advantage凍結乾燥機に積載し、上記一般実験技術の項で示したプロトコルに従って凍結乾燥させた。
【表２】
0005960120.tif 000010
【０１２９】
熱負荷
凍結乾燥に続いて、試料を、Binder APTラインTMMK温度試験チャンバーにおいてインキュベートした。37℃の温度で12時間、-20℃に1時間の傾斜、-20℃で10時間、続いて37℃に1時間の傾斜によってサイクルさせた。それぞれのサイクルは合計で24時間になり、2週間の期間繰り返し、その後、以下に記載するとおりにアデノウイルスアッセイを行った。
【０１３０】
アデノウイルスアッセイ(GFP)
96平底細胞培養皿(Jencons、英国)に、HEK293細胞(ECACC 85120602)を1ml当たり105細胞(ウェル当たり100μl)で播種し、37℃、5%CO2で維持した。90%の集密度に達した後、アデノウイルスに加えて添加剤を含むバイアルを300μlPBSで再構成した。次いで、再構成したバイアルから20μlを取って、180μlのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に添加することによって、10分の1希釈工程を行った。この10分の1希釈液20μlを取って、それを180μlのDMEMに添加することによって、さらに100分の1希釈(元の試料の)を行った。次いで、得られた希釈液(10分の1及び100分の1)のそれぞれ100μlを、HEK293細胞を含むプレートのウェルに添加した。さらに、添加剤処理液で用いた同じ供給源由来で、同じ力価(-80℃で貯蔵後)を有する、アデノウイルスのさらなる試料を解凍し、10分の1希釈シリーズ(DMEM中)を作製するために用いた。10分の1から106分の1の範囲の希釈液も、HEK293を含む個々のウェルに添加した。接種48時間後に、蛍光顕微鏡を用いて、ウェル当たりGFP(緑色蛍光タンパク質)細胞の数を数え、その後に、これを適用した容量及び接種材料の希釈を考慮に入れて、処理試料のpfu/mlに換算した。
【０１３１】
結果及び検討
この実験は、貯蔵の間に添加剤の存在下でウイルス回復に対する冷却及び加熱の影響を評価するために設計した。結果は、糖のみ又はPBSを含む添加剤において回復不良を示す(図1)。糖に加えてジメチルスルホンを含む添加剤において、回復は有意により高かった。
【０１３２】
さらに、ジメチルスルホンを含む添加剤は、対照試料と比較して熱及び凍結負荷後の劣化が少ないことを示した。結果は、糖単独又はPBSなどの不適当な添加剤は、FD後に有意なウイルス力価をまったくもたらすことができないので、FDプロセスの間に熱保護が、欠かせないことを示す。しかし、ジメチルスルホンを含む添加剤が、糖とともに用いられる場合、ウイルス力価は、凍結解凍サイクルの間でさえも元の力価のものに近いままである。
【０１３３】
［実施例２］
ウイルスを加えた添加剤のそれぞれの種類(表2参照)を、PBS中原液として作製し、適切に標識した5mlガラスバイアルに250μlを添加した。バイアルすべてを3連で調製した。50μlのアデノウイルスをそれぞれのバイアルに添加した。ボルテックスした後、ゴム栓を部分的に挿入し、バイアルをVirTis advantageに積載し、上記一般実験技術の項に示した凍結乾燥プロトコルに従って凍結乾燥させた(FD)。凍結乾燥に続いて、試料をウイルス力価について、実施例1に記載したアデノウイルスアッセイを用いて評価した。
【表３】
0005960120.tif 000011
【０１３４】
結果を図3に示す。PBS、糖のみ及びMSMのみの添加剤は、回復不良を示した。添加剤が糖に加えてMSMを含む場合、ウイルスの回復は有意に増加した。結果は、MSMと糖の間の相乗作用を示した一方、分離して用いたMSMは、不良な安定性添加剤であることを示した。
【０１３５】
残留水分プロトコル
残留水分測定のために一部のバイアルを取った(以下の表3参照)。容量カールフィッシャー滴定器を用いて、残留水分の評価を行った。滴定器(Mettler Toledo)は、1モルのI2が、それぞれのモルのH2Oに対して消費される原理で作動する。滴定器は、10mg/mlの水標準(Sigma、英国)を用いて検証した。
【０１３６】
天秤(Kern、独国)を用いて、乾燥した添加剤混合物を含むバイアルの重さを量ることによって、滴定を行った。チャンバーからの1mlの液体(hydranal methanol rapid及びhydranol methanol composite、Fluka)を、5mlの注射器及び針を用いて滴定チャンバーからガラスバイアルに移す。添加剤が溶解するとすぐに、液体を注射器中に上方へ引き取り、液体を滴定チャンバー中に注入する。バイアルの重さを再度量り、重量(添加剤の重量)の差を滴定器中に投入した。次いで、滴定器により、残留水分が計算された。
【０１３７】
測定は、MSMの存在が、二次乾燥の間のケーキの乾燥を補助し得ることを示す。
【表４】
0005960120.tif 000012
【０１３８】
［実施例３］
添加剤にウイルスを加えた混合物を調製し、実施例2で記載したとおりに処理した。添加剤は、TMG及び場合によって糖を含んだ。乾燥前の添加剤中それぞれの成分の最終濃度を以下の表4に示す。バイアルはすべて3連で調製した。
【表５】
0005960120.tif 000013
【０１３９】
添加剤中TMG(トリメチルグリシン)の使用の結果を、図4に示す。TMGは、凍結乾燥試料からのアデノウイルス感染性の回復を高めるように見える。しかし、最低濃度(0.07M)は、最大の保護を与え、この濃度を超えてTMG濃度を増加させることは、与えられる保護を減少させる。0.07MのTMG処理液は、糖単独よりも大きい保護を与えた。
【０１４０】
［実施例４］
実施例4は、アデノウイルスの凍結乾燥配合物中添加剤としてのS-メチル-L-メチオニン(SMM)、スクロース及びラフィノース間の相互作用を明らかにするための実験を記載する。
【０１４１】
ウイルスの調製及び凍結乾燥
2×106pfu/mlの力価(凍結前)を有する、CMVプロモーター下で強化GFPを発現する組換えアデノウイルス(Vector Biolabs)を、-80℃での貯蔵から取り出し、解凍させた。このウイルスの50μlアリコートを、可変濃度のそれぞれの添加剤を含むPBS中で300μlに希釈した。試験した添加剤配合物の完全一覧は、表5に見ることができる。
【表６】
0005960120.tif 000014
【０１４２】
それぞれの処理液は、6連のバイアルで作製した。これらの試料を、5mlガラスバイアル中で調製し、ゴム栓を部分的に挿入し、ボルテックスした後、VirTis advantageに積載し、図5に示す条件下で凍結乾燥した。
【０１４３】
凍結乾燥アデノウイルスの熱負荷
凍結乾燥後、試料を直ちに取り出し、それぞれの処理液の3連を熱負荷のために37℃で置く一方、他の3連を凍結乾燥後対照として4℃で貯蔵した。熱負荷は7日間であり、その後、バイアルのすべてを対照バイアルに戻し、それらを実際にアッセイするまで、すべてを4℃で維持した。
【０１４４】
水で戻したケーキ由来の回復した感染性ウイルスのアッセイ
96平底細胞培養皿(VWR、英国)に、HEK293(ECACC 85120602)細胞を1ml当たり105細胞(ウェル当たり100μl)で播種し、37℃、5%CO2で維持した。90%の集密度に達した後、アデノウイルスに加えて添加剤を含むバイアルを300μlのPBSで再構成した。再構成した試料を、DMEMに加えて5%FBS中1:10及び1:100に連続的に希釈した。次いで、得られた希釈ウイルス試料のそれぞれ100μlを、プレートの個々のウェルに添加した。さらに48時間後、蛍光顕微鏡を用いて、ウェル当たりGFP細胞の数を数えた。
【０１４５】
凍結乾燥の間のアデノウイルス感染性の保護(図6)
試料を凍結33日後に、及び熱負荷をかけた試料の場合、37℃で7日、続いて4℃でさらに26日貯蔵後にアッセイした。結果を図6Aに示す。
【０１４６】
S-メチル-L-メチオニン単独は、凍結乾燥の間にアデノウイルスの濃度依存性の保護を示す。この濃度範囲で、配合物中S-メチル-L-メチオニンの増加は、再構成した試料からの回復ウイルス感染性の増加を示した。S-メチル-L-メチオニンと糖の低濃度処理液(0.1Mスクロース、10mMラフィノース)との共配合は、この関係を有意に変えなかった。しかし、S-メチル-L-メチオニンと高濃度糖処理液(1.0Mスクロース、100mMラフィノース)との共配合は実に、低いS-メチル-L-メチオニン濃度でウイルス感染性の回復を有意に高めた。
【０１４７】
この証拠の上に、凍結乾燥の間のウイルス感染性の保護のための最適配合は、糖を含まないS-メチル-L-メチオニンの高濃度(>0.07M)、又は高濃度の糖(1.0Mスクロース、100mMラフィノース)との共配合物中の0.23M未満のS-メチル-L-メチオニンの濃度のいずれかであるように見える。
【０１４８】
凍結乾燥及び37℃での熱負荷の間のアデノウイルス感染性の保護(図6)
配合物中いずれの糖も非存在下で、S-メチル-L-メチオニンは、凍結乾燥及びその後の熱負荷の間のウイルス感染性の非常に限られた保持を与えただけであった(図6B)。この限定された保護でさえも、0.07M及びそれを超える濃度で見られるだけである。低濃度の糖(0.1Mスクロース、10mMラフィノース)との共配合は、同様にあまり保護を示さないが、有効性は、低いS-メチル-L-メチオニン濃度で増強させ得る。
【０１４９】
S-メチル-L-メチオニンと高濃度の糖(1Mスクロース、100mMラフィノース)との共配合は、0.00Mと0.23Mとの間のS-メチル-L-メチオニンで明らかな保護の増強を示し、この増強は、相加効果を十分に超えており、したがって、恐らくは、0.07M及び0.23Mの両方での真の相乗作用と考えることができた。高濃度の糖(1Mスクロース、100mMラフィノース)が配合された0.05Mと0.1Mとの間のS-メチル-L-メチオニンが、最適濃度であるように見える。しかし、この範囲でさえも、回復は、ほぼ2〜3×105pfu/mlであり、これは、投入ウイルスのアッセイした力価に関してほとんど対数減少値を示す。
【０１５０】
［実施例５］
凍結乾燥後に、感染性アデノウイルスの回復レベルを容易にアッセイすることができるように、CMVプロモーター下で強化GFP(緑色蛍光タンパク質)を発現する組換えアデノウイルス(Vector Biolabs)を、添加剤混合物と配合した。ウイルスを加えた添加剤のそれぞれの種類(以下の表6参照)をPBS中原液として作製し、300μlを適切に標識した5mlガラスバイアルに添加した。ボルテックスした後、ゴム栓を部分的に挿入し、上に示した凍結乾燥プロトコルに従って、バイアルをVirTis Advantage凍結乾燥機に積載し、凍結乾燥した(FD)。凍結乾燥後、試料のウイルス力価を以下に記載されるとおりのアデノウイルスアッセイで評価した。
【表７】
0005960120.tif 000015
【０１５１】
上記一般実験技術の項に示したプロトコルに従って、試料をVirTis Advantage凍結乾燥機で凍結乾燥させた。凍結乾燥に続いて、試料を、実施例1で記載したとおりのアデノウイルスアッセイでアッセイした。
【０１５２】
結果を図7に示す。PBS中凍結乾燥したアデノウイルスの回復は、典型的には低く、これは、この実験で再現された。
【０１５３】
DMG単独は、凍結乾燥の間にアデノウイルス感染性の保護を与え、これは、糖単独と比べて勝る。糖及びDMGの配合は、用量依存性の保護を示した。最高濃度のDMGは、凍結乾燥前のアデノウイルスに匹敵するように見える。
【０１５４】
［実施例６］
この実施例における実験は、熱負荷の間にアデノウイルスを保護するDMGの能力を調査することによって、ラフィノース及びスクロースとともに凍結乾燥の間にアデノウイルスを保護するDMGの能力についてさらに詳しく説明する。互いに固定比率の糖のそれぞれの2種類の濃度を試験した(高い糖=1Mスクロースと100mMラフィノース、低い糖=0.1Mスクロースと10mMラフィノース)一方、DMGの5種類の濃度を調べた(0.007M、0.023M、0.070M、0.230M、0.700M)。
【０１５５】
凍結乾燥及び熱処理後に、感染性アデノウイルスの回復のレベルを容易にアッセイすることができるように、GFPを発現するアデノウイルス株に添加剤混合物を配合した。アデノウイルスに添加剤を配合し、凍結乾燥し、その後、+4℃及び+37℃で1週間貯蔵した。その後、試料をHEK293細胞に接種し、接種48時間後にGFP発現細胞の数を数えることによって、回復ウイルスを評価した。
【０１５６】
材料及び方法
配合ウイルスの調製及び凍結乾燥
2×106pfu/mlの力価(凍結前)を有して、CMVプロモーター下で強化GFPを発現する組換えアデノウイルス(Vector Biolabs)を、-80℃での貯蔵から取り出し、解凍させた。このウイルスの50μlアリコートを、可変濃度のそれぞれの添加剤を含むPBS中300μlに希釈した。試験した添加剤配合の完全一覧は、以下の表7に見ることができる。それぞれの処理液は、6連の5mlバイアルで作製した。ゴム栓を部分的に挿入し、ボルテックスした後に、VirTis Advantage凍結乾燥機に積載し、プログラム10で凍結乾燥させた(図8参照)。
【表８】
0005960120.tif 000016
【０１５７】
凍結乾燥アデノウイルスの熱負荷
凍結乾燥後、試料を直ちに取り出し、3連のそれぞれの処理液を熱負荷のために+37℃で置いた一方、他の3連は、凍結乾燥後の対照として+4℃で貯蔵した。熱負荷は7日間であり、その後、バイアルすべてを対照バイアルまで戻し、それらを実際にアッセイするまで+4℃で保持した。
【０１５８】
水で戻したケーキ由来の回復感染性ウイルスのアッセイ
96平底細胞培養皿(VWR、英国)に、1ml当たり105細胞(ウェル当たり100μl)でHEK 293(ECACC 85120602)細胞を播種し、37℃、5%CO2で維持した。90%の集密度に達した後、アデノウイルスに加えて添加剤を含むバイアルを300mlのPBSで再構成した。再構成した試料を、5%FBSを加えたDMEM中1:10及び1:100に連続的に希釈した。次いで、得られた希釈ウイルス試料のそれぞれ100mlを、プレートの個々のウェルに添加した。さらに48時間後、蛍光顕微鏡を用いてウェル当たりGFP細胞の数を数えた。結果を図9A及び図9Bに示す。
【０１５９】
結果及び検討
凍結乾燥の間のアデノウイルス感染性の保護(図9A参照)
凍結乾燥後の試験期間の継続の間に4℃で貯蔵した試料を、凍結乾燥後の対照の代わりとして及びまた熱負荷の負の対照としてアッセイした。いずれの添加剤も非存在下で、この実験の間のアデノウイルスの凍結乾燥は、試料の感染性を1.5×106pfu/mlから1.0×104pfu/ml未満に低下させた。
【０１６０】
アデノウイルスと一緒の添加剤としてのDMGの使用は、凍結乾燥ケーキの再構成後にウイルス感染性の回復を高めた。この実験で凍結乾燥の間のアデノウイルスの保護のためのDMGの最適濃度は、0.07M以上であるように見える。添加剤を用いると、7.5〜8.5×105pfu/mlの回復力価は、容易に達成できる(1.5×106pfu/mlの投入力価と比べて)。
【０１６１】
凍結乾燥、続いて+37℃での熱負荷の間のアデノウイルス感染性の保護(図9B参照)
ウイルス感染性の検出可能な回復は、+37℃での熱負荷後に、添加剤を含まないバイアル(PBS中アデノウイルス)から観察されなかった。これは、+4℃で保持された同等の配合物の試料を上回るウイルス感染性の非常に有意な損失を示す。
【０１６２】
糖単独(例えば、1.0Mスクロース、100mMラフィノース)を配合した試料から熱負荷後にウイルス感染性を回復させることが可能である。残念なことに、回復ウイルス力価は、試験期間に4℃で保持された試料の1.9×105pfu/mlに比べてわずか4.3×104pfu/mlでしかない。
【０１６３】
DMGが唯一の添加剤として用いられる場合、DMGの最適濃度は、ほぼ7.5×105pfu/mlの回復とともに、0.07M以上であるように見えた。最大0.07M(0.007〜0.07M)のDMG濃度で、DMG濃度と回復ウイルスの間の正の相関がある。0.07MのDMGを超えると、その効果は飽和するように見える。
【０１６４】
アデノウイルスと、同じ低い濃度の糖及び0.07M以上のDMGとの共配合は、いずれの糖も非存在下での等しいDMG濃度と少なくとも同程度であり、おそらくは保護効果のわずかな増強を示した。
【０１６５】
0.023M以下でのDMGと、高い糖濃度(1.0Mスクロース、100mMラフィノース)との共配合は、DMG効果が飽和したと考えられる処理に匹敵するレベルまで回復を高めた。しかし、0.07M以上のDMG濃度で、高い糖濃度の添加は、明らかな利点をまったく有しない。これらの所見は、高い濃度(1.0Mスクロース、100mMラフィノース)での糖のDMG配合物への添加は、その効果を飽和させるのに必要なDMGの量を減少させることを示唆する。
【０１６６】
［実施例７］
凍結乾燥後に、感染性アデノウイルス回復のレベルを容易にアッセイし得るように、CMVプロモーター下で強化GFPを発現する組換えアデノウイルス(Vector Biolabs)に、添加剤混合物を配合した。添加剤のそれぞれの種類(以下の表8参照)は、原液として作製し、250μlを適切に標識した2mlガラスバイアルに添加した。原液から50μlのアデノウイルスをそれぞれのバイアルに添加した。ボルテックスした後、バイアルをVirTis Advantage凍結乾燥機に積載し、凍結乾燥した。
【表９】
0005960120.tif 000017
【０１６７】
凍結乾燥プロトコル
約3日間継続する予めプログラム化したプロトコルを用いて、VirTis Advantage凍結乾燥機によって、試料を凍結乾燥させた。試料を-40℃で1時間凍結し、その後、Thermo Savant VLPポンプ(Thermofisher、英国)を用いて最初は300ミリトールで真空をかけた。棚温度及び真空は、この処理を通して調整し、凝縮器は-80℃で維持した。工程9は、真空の開放前に試料に栓をするまで延長した。用いた乾燥サイクルは、以下の表9に示す。
【表１０】
0005960120.tif 000018
【０１６８】
一次乾燥期において、棚温度は-34℃に保持する。二次乾燥期は、乾燥が終了するまで、+20℃への傾斜を含んだ。凝縮器温度は一定の-80℃でとどまるように設定した。プローブにより、棚温度及び凝縮器温度を記録した(図10参照)。
【０１６９】
アデノウイルスアッセイ
96平底細胞培養皿(Jencons、英国)に、1ml当たり105細胞(ウェル当たり100μl)でHEK293細胞(ECACC 85120602)を播種し、37℃、5%CO2に維持した。90%の集密度に達した後、アデノウイルスに加えて添加剤を含むバイアルを、5%ウシ胎仔血清(FBS)を加えたダルベッコ最小必須培地(DMEM)1mlで再構成した。再構成したバイアルから100μlを取り、900μlのDMEMに添加することによって、1:10希釈工程を行った。次いで、得られた希釈ウイルス100μlを、プレート上の第一列に添加し、1:2希釈をプレートで実行した。この過程を次の添加剤で繰り返した。さらに48時間後、蛍光顕微鏡を用いて、ウェル当たりGFP細胞の数を数えた。
【０１７０】
統計分析
PRISM Graphpadソフトウェアバーション4.00を用いて種々の添加剤間の有意性を分析するために、一元配置分散分析検定、続いてボンフェローニ事後検定を行った。p値摘要は、*=p<0.05;**=p<0.01;***=p<0.001である。
【０１７１】
結果及び検討
図11は、凍結乾燥後のアデノウイルス力価の保存についてのマンニトールとDMGとの組合せの利点を示す。凍結乾燥後、DMGをそのままで添加剤として用いた場合、ウイルス力価のほぼ対数の半分の降下(half a log drop)があった。マンニトールが唯一の添加剤であった場合、力価の損失は、DMGより著しく、ウイルス力価は、2対数桁(2 logs)だけ低下した。しかしマンニトールとDMG両方を使用すると、力価に有意な損失は無く、凍結乾燥ケーキの外観は改善された。
【０１７２】
［実施例８］
この実施例における実験の目的は、ケーキ形成を評価することであった。より広範なパネルの添加剤ミックスを用いた以外は実施例7と同様に、実施例8を行った。添加剤のそれぞれの種類(下記の表10参照)を原液として作製し、300μlを適切に標識した2mlガラスバイアルに添加した。ボルテックスした後、バイアルをVirTis Advantage凍結乾燥機に積載し、これを表9に示した凍結乾燥プロトコルに従って運転した。凍結乾燥後に、試料を写真に撮り、ケーキ形成を評価した。
【表１１】
0005960120.tif 000019
【０１７３】
凍結乾燥後の凍結乾燥ケーキの外観を調べた。結果は図12に示す。0.7MのDMGの存在下で、様々な濃度のマンニトールを用いた。最も高いマンニトール濃度は0.58Mであり、最も低いものは0.018Mであった。マンニトールの最高濃度(0.58M)で、白色不透明なケーキが形成された。濃度が低下するにつれて、あまり望ましくない透明で澄んだ泡が形成された。
【０１７４】
［実施例９］
2種類の添加剤だけを調製したことを除いて実施例7と同様に、実施例9を行った。第1の添加剤は、最終容量300μlに作製したPBS中アデノウイルスであった。第2の添加剤は、2mlガラスバイアル中アデノウイルスと一緒のマンニトール(0.58M)及びDMG(0.7M)であった。ボルテックスした後、バイアルをVirTis Advantage凍結乾燥機に積載し、表9に示した凍結乾燥プロトコルに従って凍結乾燥させた。凍結乾燥後、試料は、ウイルス力価をアッセイしたか、又は+37℃で1週間熱処理し、次いでアッセイした。
【０１７５】
結果は、図13に示す。凍結乾燥後、PBS対照中対数の半分を超えるウイルス力価の低下があった。元のウイルス原液と比較して、DMG及びマンニトールを含む試料では、ウイルス力価の有意な損失は見られなかった。+37℃での熱処理後、PBS対照中対数の半分を超えるウイルス力価の降下が再度あった。DMG及びマンニトールを含む試料のウイルス力価は、元の原液力価と比較して、約0.3対数桁だけ低下した。
【０１７６】
［実施例１０］
アデノウイルスの安定化
ウイルスの調製及び凍結乾燥
CMVプロモーター下で増強GFP(緑色蛍光タンパク質)を発現し、SSC中6.7×105pfu/mlの力価(凍結前)を有する組換えヒトアデノウイルスAd5(Vector Biolabs)を、-80℃での貯蔵から取り出し、解凍させた。50μlのアリコートを2mlの凍結乾燥バイアルに添加した。これらの50μlのウイルス試料に、DMG、MSM及び場合によってスクロースから構成される配合物混合物250μlを添加した。それぞれの配合物混合物をSSC中で作製した。ウイルス試料に添加後のそれぞれの配合物中のDMG、MSM及びスクロースの濃度を、表11に示す:
【表１２】
0005960120.tif 000020
【０１７７】
ゴム栓を部分的に挿入した。ボルテックスした後、バイアルをVirTis Advantage Plus EL85凍結乾燥機に積載し、プログラム4で凍結乾燥させた。したがって、以下の表12に示す乾燥サイクルを用いて、試料を凍結乾燥させた。試料を-45℃で1時間凍結し、その後、Themo Savant VLPポンプ(Thermofisher、英国)によって、最初に300ミリトールで真空をかけた。棚温度及び真空は、この処理を通して調整し、凝縮器は-42℃に維持した。工程11は、真空を開放する前に試料に栓をするまで、延長した。
【表１３】
0005960120.tif 000021
【０１７８】
熱処理において、棚温度は、-40℃に降下させた。
【０１７９】
凍結乾燥ウイルスの熱負荷
凍結乾燥後、バイアルに直ちにキャップをし、取り出し、クリンプさせ、次いで、熱負荷のために37℃で置いた。熱負荷は7日間であって、その後、バイアルすべてを、それらを実際にアッセイするまで4℃に戻した。
【０１８０】
水で戻したケーキ由来の回復感染性ウイルスのアッセイ
96平底細胞培養皿(VWR、英国)に、1ml当たり105細胞(1ウェル当たり100μl)でHEK293(E
CACC 85120602)細胞を播種し、37℃、5%CO2で維持した。90%の集密度に達した後、細胞を接種した。
【０１８１】
アデノウイルスに加えて添加剤を含むバイアルを、300μlのSSC中再構成した。次いで、再構成したバイアルから20μlを取り、180μlのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に添加することによって、10分の1希釈工程を行った。10分の1希釈液20μlを取って、それを180μlのDMEMに添加することによって、さらに100分の1希釈(当初の試料の)を行った。次いで、得られた希釈液(10分の1及び100分の1)のそれぞれ100μlを、HEK293細胞を含むプレートのウェルに添加した。
【０１８２】
さらに、添加剤処理で用いた同じ供給源からで、同じ力価を有する(-80℃で貯蔵後)アデノウイルスのさらなる試料を解凍し、10分の1の希釈シリーズ(DMEM+10%FBS中)を作製するために用いた。10分の1から106分の1の範囲の希釈液も、HEK293を含む個々のウェルに添加した。接種48時間後に、蛍光顕微鏡を用いて1ウェル当たりGFP(緑色蛍光タンパク質)細胞の数を数えて、その後に、これを、接種材料の適用された容量及び希釈を考慮に入れて、処理試料のpfu/mlに換算した。
【０１８３】
結果
結果を図14に示す。MODDE9.0プログラム(Umetrics、Sweden)を用いて重回帰(MLR)分析によってデータを分析したときに、MSM及びDMGを組み合わせて用いた場合並びにDMG及びスクロースを組み合わせて用いた場合、相乗作用が見られた。
【０１８４】
［実施例１１］
MVAの安定化
ウイルスの調製及び凍結乾燥
MVAを-80℃での貯蔵から取り出し、解凍した。50μlのアリコートを2mlの凍結乾燥バイアルに添加した。これらのバイアル試料に、上の表11に記載した配合物混合物250μlを添加した。ゴム栓を部分的に挿入した。ボルテックスした後、バイアルをVirTis Advantage Plus EL85冷凍乾燥機に積載し、実施例10で記載したとおりにプログラム4で凍結乾燥させた。
【０１８５】
凍結乾燥ウイルスの熱負荷
凍結乾燥後、バイアルに直ちにキャップし、取り出し、クリンプさせ、次いで、熱負荷のために+37℃で置いた。熱負荷は7日間であり、その後、バイアルのすべてを、それらを実際にアッセイするまで4℃に戻した。
【０１８６】
水で戻したケーキから回復した感染性MVAのアッセイ
添加剤を加えたMVAを300mlのSSC中で再構成した。再構成した試料を希釈し、アッセイした。
【０１８７】
アッセイプレート(96ウェル)に、BHK-21細胞(1ウェル当たり100μl、105細胞/ml)を播種した。10%FBS及び1%PSを補給したDMEM中に細胞を希釈した。プレートを+37℃、+5%CO2で1から2時間置いた。
【０１８８】
その間に、配合したMVA試料の希釈シリーズを(同じ増殖培地において) 10-1から10-4の範囲で調製した。それぞれの希釈シリーズを4回調製した。BHK-21細胞を含む個々のウェルにそれぞれの希釈液35μlを適用し、ウェルにさらに65μlの培地を継ぎ足した。
【０１８９】
接種後6日目に、細胞変性効果(CPE)の存在又は非存在について記録し、TCID50を計算した。次いで、これらを用いて、熱負荷バイアルにおける1ml当たり感染性MVAの濃度を推定した。
【０１９０】
結果
結果を図15に示す。このスクリーニング試験での応答の範囲は、開始力価の0.6〜60.5%であった(図15参照)。これを、アッセイまで-80℃で保持したウイルスの第2のアリコートに対して評価した。図15は、正の対照のパーセントとしてのそれぞれの配合処理液の応答を示す。最良の実行性配合物は、0.15Mのスクロース、1MのDMG、1MのMSMを含んだ。全体として、結果は、添加剤のこの組合せが、凍結乾燥環境におけるウイルスの安定化にかなりの可能性を有することを強く示唆する。
【０１９１】
［実施例１２］
材料
化学薬剤
【表１４】
0005960120.tif 000022
【０１９２】
生物学的薬剤
【表１５】
0005960120.tif 000023
【０１９３】
その他
【表１６】
0005960120.tif 000024
【０１９４】
装置
【表１７】
0005960120.tif 000025
【０１９５】
方法
実験設計
MODDE 9.0を用いて、3因子、2レベルの完全多元スクリーニング設計を作成した(コード化された値を示す図16、及び適用された実濃度を示す表13参照)。この設計は、試験した範囲の高及び低レベルでの添加剤の組合せ、並びに反復中心点を検定することを含む。反復中心点は、実験における誤差の指標を与える。
【０１９６】
設計は、それぞれの試験因子(添加剤)及びこれらの間の相互作用の一次効果をモデル化し得る、すなわち、配合物への添加剤の存在の影響を決定し得る。それは、二次のより高い効果をモデル化し得ないが、それらが存在するかどうかの指標(データにおける曲率)を与え得る。二次効果は、データ内の共分散から生じる、すなわち、二つ以上の変数は、互いに依存している。二次効果が予想されるが、この目的は、添加剤のいずれかの効果を検出し、次いで、効果を有するいずれかの添加剤を、その効果をより正確にモデル化し得るより精緻な試験に進めるために、この単純なスクリーニング試験を最少処理で用いることである。
【０１９７】
凍結乾燥環境におけるアデノウイルスの安定性
凍結乾燥環境における配合されたアデノウイルスの調製及び熱負荷
生理食塩水クエン酸ナトリウム(SSC)中6.7×105pfu/mlの力価(凍結前)を有して、CMVプロモーター下で増強GFPを発現する組換えアデノウイルスを、-80℃での貯蔵から取り出し、室温で解凍させた。その後、ウイルスの50μlアリコートを15本の個々の2mlガラス凍結乾燥バイアルに添加した。それぞれのバイアルに、250μlの添加剤ブレンドを混合した。ウイルスと一度混合した添加剤ブレンド配合物を表13に記載し、SSC中で作製した。
【表１８】
0005960120.tif 000026
【０１９８】
ゴム栓を部分的に挿入し、ボルテックスした後、VirTis Advantage凍結乾燥機に積載し、プログラム4で凍結乾燥させた(図17参照)。凍結乾燥後、試料に真空下で直ちにキャップをし、取り出し、クリンプさせて、熱負荷のために37℃で置いた。熱負荷は7日間であり、その後、バイアルすべてを、それらを実際にアッセイするまで、4℃で保持した。凍結乾燥試料は、アッセイ直前に、300μlのSSC中で再構成した。
【０１９９】
アデノウイルスのアッセイ
1ml当たり105細胞(1ウェル当たり100μl)で播種することによって、HEK293を接種のために96ウェル平底細胞培養皿に調製し、37℃、5%CO2で維持した。2時間後、細胞を以下のとおりに接種した。
【０２００】
熱負荷をかけたウイルス試料を、DMEM+10%FBS中10分の1及び100分の1に希釈した。次いで、得られた希釈ウイルス試料のそれぞれ100μlを、アッセイプレートの個々のウェルに添加した。さらに、元のSSC中アデノウイルスの第2のアリコートを-80℃から解凍し、10倍の希釈シリーズ(10分の1から100,000分の1)も、DMEM+10%FBS中で調製した。この正の対照希釈液シリーズの2反復を、用いたそれぞれの96ウェルプレートに接種した。さらに48時間後、蛍光顕微鏡を用いて、1ウェル当たりGFPの数を数えた。
【０２０１】
結果
全般
応答の良好な範囲をそれぞれの実験で観察した。わずか数パーセントと32〜46%との間の回復ウイルス活性の範囲が最も多く生じた(表14参照)。
【表１９】
0005960120.tif 000027
【０２０２】
この応答の分散は、適切なモデルが適用可能となるのに十分であった。それはまた、配合物の保護効果を示す。
【０２０３】
いくつかのモデルにおいて、最低の応答は、アッセイの検出閾値未満であった。データセットの変換(対数変換)を容易にするために、これらの事例の応答に検出閾値のレベル(これはこの場合、(その可算レベルを考慮に入れ、次いで希釈係数などを見込むと)6×102pfu/mlである)を割り当てた。
【０２０４】
さらなるモデル化分析を表15から表17に示す。
【表２０】
0005960120.tif 000028
【表２１】
0005960120.tif 000029
【０２０５】
以下の略語/列が、表16にある。
【０２０６】
NE=新規な添加剤、Suc=スクロース、Raff=ラフィノース(すべて一次効果)。
【０２０７】
NExS=NEとスクロースの間の相互作用。
【０２０８】
NExR=NEとラフィノースの間の相互作用。
【０２０９】
SxR=スクロースとラフィノースの間の相互作用。
【０２１０】
曲率=二次効果を示す。
【０２１１】
*=モデル安定性のためにモデルで保持される非有意な項。
【表２２】
0005960120.tif 000030
【０２１２】
以下の略語/列が、表17にある。
【０２１３】
NE=新規な添加剤、Suc=スクロース、Raff=ラフィノース(すべて一次効果)。
【０２１４】
NExS=NEとスクロースの間の相互作用。
【０２１５】
NExR=NEとラフィノースの間の相互作用。
【０２１６】
SxR=スクロースとラフィノースの間の相互作用。
【０２１７】
曲率=二次効果を示す。
【０２１８】
二次の項=データ中の曲率によって予測される二次効果、これはモデルを強化する。この実験設計は、特定の二次効果を特定することができない。
【０２１９】
DMG
このデータセットで、応答の良好な分散(0.36〜32.84%回復)が見られ、特に最も低い応答は、検出限界を超えている(表14参照)。データ点の一つ(試料ID11)(表13参照)は、モデルの微調整の間に明らかな外れ値として印を付したのち、分析から削除した。この外れ値の理由は知られていないが、オペレータエラーであると推定される。モデル強度の四つの指標すべてが高く(表14参照)、データ中に曲率は見られなかった(図19参照)。このモデルで、重要因子二つのみが特定され、DMG及びスクロースは、それぞれ有意な正の一次効果であることがわかった(表16及び図20参照)。その他の効果又は相互作用は見られなかった。ラフィノースは、モデルに、したがって、試験した範囲でのウイルス回復に影響を与えないと示された。
【０２２０】
SMM
このデータセットで、応答の良好な範囲(0.09〜40.30%回復)が見られたが(表14参照)、この範囲での最低値は、検出閾値未満であった。モデル微調整の間に、データ点の一つ(試料ID7)を、明らかな外れ値として分析から削除した(表13参照)。作成した一次モデルは、重要因子としてスクロースのみを特定したが(図21参照)、何らかの意味ある有意性を得るために、このモデル内で非有意な因子(SMM、ラフィノース、及びSMM*スクロース)を保持することが必要であった。
【０２２１】
そうであっても、このモデルは、R2及びQ2に対して比較的弱く記録する(それぞれ、0.5及び0.4)。図22は、モデルにおける曲率の証拠を示す。これを認めた後に、二次効果を入れて、新たなモデルを展開した。前の実施例におけるように、特定の二次効果は、この実験設計で特定できない。新たなモデルは、四つのモデル評価パラメータすべてでより高く記録した。このモデルは、スクロース、及びラフィノースを一次効果として、並びにSMMとスクロースの間の相互作用及び一つの添加剤の推定二次効果を特定した(図23参照)。この新しいモデルは、モデル内の曲率の証拠を示さなかった(図24参照)。
【０２２２】
TMG
このデータセットで、応答の良好な分散(0.72〜46.27%)が見られ、データ点のすべては、検出可能閾値を超えていた(表13参照)。四つのモデル評価パラメータのすべてについて、許容できるスコアを生成した(表14参照)。このモデルは、TMGの一次効果、並びにTMGとスクロースの間の相互作用を特定する(表16参照)。ラフィノース及びスクロースは、非有意な因子と特定されるが、スクロースは、階層モデルを保存するためにモデル中に保持される(図25参照)。図26は、モデル中の曲率を示唆する;しかし、モデルは、二次相互作用を含めることによって改善されず、曲率の他の何らかの原因を示唆した。
【０２２３】
［実施例１３］
材料
化学薬剤
【表２３】
0005960120.tif 000031
【０２２４】
生物学的薬剤
【表２４】
0005960120.tif 000032
【０２２５】
その他
【表２５】
0005960120.tif 000033
【０２２６】
装置
【表２６】
0005960120.tif 000034
【０２２７】
方法
実験の設計
MODDE 9.0(Umetrics)を用いて、Doehlert実験設計を作成した(図27参照)。Doehlert設計は、通常のシンプレックスから構築した応答面モデリング設計である。それらは、異なる方向に容易に拡張でき、新たな因子を既存の設計に加えることができる。通常の配合設計とは異なって、非有意な因子は、分析から削除することができ、したがって、交絡因子にならない。さらに、設計内の異なる因子は、異なる数のレベルで検定され、したがって、より重要であると疑われる因子に対してより多くの検定レベルを割り当てることが可能である。したがって、添加剤は7レベルで検定したが一方、スクロースは5レベル、及びラフィノースは3レベルで検定した。このモデルは、二次効果及び相互作用についてモデル化する能力を保有する。この設計は、3因子及び3反復中心点を含み、15の検定試料を生じさせた。
【０２２８】
スクロースは、0Mと1Mの間で検定した。スクロースの上限レベルは1Mに設定したが、許容できる凍結乾燥の限度に近いことがわかったからである。それは、前の試験における高度に首尾よいレベルであることもわかり、一般に、スクロース濃度が高いほど、非経口で望ましくない。スクロースの最低レベルは、0Mに設定した。ラフィノースは、0mMから300mMの範囲にわたって検定したが、Doehlert設計の性質が、検定レベルが0mMを含まないことを意味したからであり、代わりに、以下の濃度を検定した:27.5mM、150.0mM、及び272.5mM。
【０２２９】
DMGは、0Mから2Mの線形範囲にわたって検定した。最適濃度が凍結乾燥環境でしばしば0.5Mと1.5Mの間であった前の実験に基づいて、この範囲を限定することが可能であった。
【０２３０】
凍結乾燥環境におけるアデノウイルスの安定性
凍結乾燥環境における配合アデノウイルスの調製及び熱負荷
SSC中6.7×105pfu/mlの力価(凍結前)を有し、CMVプロモーター下で強化GFPを発現する組換えアデノウイルスを、-80℃での貯蔵から取り出し、解凍させた。その後、ウイルスの50μlアリコートを15の2mlガラス凍結乾燥用バイアルに添加した。それぞれのバイアルに、250μlの添加剤ブレンドを混合した。ウイルスと混合した後の添加剤ブレンド配合物を表18に記載し、SSC中で作製した。
【表２７】
0005960120.tif 000035
【０２３１】
ゴム栓を部分的に挿入し、ボルテックスした後、Virtis advantage凍結乾燥機に積載し、プログラム4で凍結乾燥させた(図28参照)。凍結乾燥後、試料に真空下で直ちにキャップをし、取り出し、クリンプさせ、熱負荷のために37℃で置いた。熱負荷は7日間であり、その後、バイアルすべてを、それらを実際にアッセイするまで、4℃で保持した。アッセイ直前に、凍結乾燥試料を300μlのSSC中で再構成した。
【０２３２】
アデノウイルスのアッセイ
1ml当たり105細胞(ウェル当たり100μl)で播種することによって、接種のためにHEK293細胞を96ウェル平底細胞培養皿中で調製し、37℃、5%CO2で維持した。2時間後、細胞を以下のとおりに接種した。
【０２３３】
熱負荷をかけたウイルス試料を、DEME+10%FBS中10分の1、及び100分の1に希釈した。次いで、得られた希釈ウイルス試料のそれぞれ100μlをアッセイプレートの個々のウェルに添加した。さらに、元のSSC中アデノウイルスの第2のアリコートを-80℃から解凍し、10倍希釈シリーズ(10分の1から100,000分の1)もDMEM+10%FBS中で調製した。この正の対照希釈シリーズの2反復を、用いたそれぞれの96ウェルプレートに接種した。さらに48時間後、蛍光顕微鏡を用いて、ウェル当たりGFP細胞の数を数えた。
【０２３４】
結果
四つの指標すべてが、良好な有意性を示唆する強いモデルが生じた(R2=0.93、Q2=0.79、モデル妥当性=0.98、再現性=0.68)(図29参照)。これらの中で、再現性の図は、唯一わずかに低いが、0.5を十分超えている。通例よりもわずかに低いこの値についての理由は、反復中心点間のわずかに高い変動である得るか、又はむしろ、これらの間の変動のレベルが、アッセイにおける全体の変動と比較して比例的により大きいからである。
【０２３５】
モデルは、スクロース及びDMG両方の一次効果、並びにDMGの二次効果を特定した(図30参照)。ラフィノースの一次又は二次効果は認められなかった。しかし、ラフィノースは、DMGと相互作用を実に有し、したがって、一次のラフィノースの係数は、モデル階層構造を保つために保持しなければならない。さらに、二次のラフィノースの効果は、(図29に示す及び上で検討した指標によって評価して)それがより強いモデルをもたらすので保持した。いずれの場合も、二次のラフィノースの効果は、90%の信頼区間で有意に近く、試験した範囲にわたって単に決定的に検出できないだけの真の効果であり得る。
【０２３６】
図31は、変化させたスクロース(X軸)及びDMG(Z軸)濃度に対する回復ウイルス活性(Y軸)の一連の三次元プロットを示す。「低」は、0mMのラフィノース濃度を意味し、「中」は、150mMのラフィノース濃度を意味し、及び「高」は、300mMのラフィノース濃度を意味する。
【０２３７】
それぞれのプロットは、異なり且つ固定のラフィノース濃度でのモデルを示す。アデノウイルスの保存改善は、スクロース濃度を増加させることによって達成される。この傾向は、試験範囲を超えて続き、実験は、真のスクロース最適条件を特定することができない。対照的に、最適のDMG濃度は、明らかに試験範囲内である。ラフィノース濃度を増加させると、最適DMG濃度を低下させるように見える。
【０２３８】
モンテカルロシミュレーションを用いて、最適配合物を予測した(図32参照)。0.5Mのスクロース、1MのDMG、150mMのラフィノースの最適条件が、4.2×105pfu/mlの回復ウイルス力価又は熱負荷前のその投入の98%(4.3×105pfu/mlの力価を有した正の対照に基づいて)をもたらすと予測された。
【０２３９】
予測最適条件は、最適条件を文脈中に導入する等高線プロット(図33a)で示される。モデルは、配合物が100%以上の回復ウイルス活性をもたらす設計空間の全領域を予測する。この領域は、ウイルス活性のゼロに近い損失が予想されるデータ中の平坦域と見ることが必要である。図33bは、この領域を強調表示する。この図は、ラフィノース濃度が増加すると、領域がY軸(DMG濃度)を下方に及びX軸(スクロース濃度)を上方に動くことを示す。
【０２４０】
結論
DMG、スクロース及びラフィノースの配合物は、凍結乾燥及び熱負荷を通してアデノウイルスの保存に有意な可能性を有すると特定された。データに基づくモデルは、ウイルス活性の100%の回復が可能であることを予測する。このモデルにより、0.5と1.5Mの間の最適DMG濃度が特定された。最適スクロース濃度は、試験範囲を超えており、スクロース濃度の他の制約も超えているように思われる。ラフィノースは、このモデルにおける重要因子ではないと思われる。
【０２４１】
［実施例１４］
材料
化学薬剤
【表２８】
0005960120.tif 000036
【０２４２】
生物学的薬剤
【表２９】
0005960120.tif 000037
【０２４３】
その他
【表３０】
0005960120.tif 000038
【０２４４】
装置
【表３１】
0005960120.tif 000039
【０２４５】
実験設計
凍結乾燥環境におけるアデノウイルスのためのDMG、スクロース及びラフィノースの推定最適配合を検定するために、長期安定性試験を計画した。3種類の配合物を検定した:
-  SSC緩衝剤単独中アデノウイルス;
-  SSC中0.5Mのスクロース及び150mMのラフィノースにおけるアデノウイルス;及び
-  SSC中0.5Mのスクロース、150mMのラフィノース及び1MのDMGにおけるアデノウイルス。
【０２４６】
+4℃±3の長期安定性試験温度を選択した。これは、冷蔵貯蔵(+5℃±3)を目的とした生成物の長期試験のための標準工業ガイドラインと大まかに一致する。ストレス試験温度、又はさらに高温の促進熱安定性温度に相当させるために、+25℃の促進安定性温度を採用し、+37℃の熱負荷を採用した。
【０２４７】
25℃及び37℃での試料を、凍結乾燥1週間後、2週間後、5週間後及び15週間後に試験した。+4℃での試料を凍結乾燥15週間後に試験した。
【０２４８】
凍結乾燥環境における配合アデノウイルスの調製及び熱負荷
SSC中6.7×105pfu/mlの力価(凍結前)を有し、CMVプロモーター下で強化GFPを発現する組換えアデノウイルスを、-80℃での貯蔵から取り出し、解凍させた。その後、ウイルスの50μlアリコートを2ml凍結乾燥用ガラスバイアルに添加した。それぞれのバイアルに、250μlの添加剤ブレンドを混合した。用いた添加剤ブレンド配合物は、上に記載したとおり、すなわち、(i)緩衝剤単独(SSC)、(ii)糖(SSC中0.5Mのスクロース、150mMのラフィノース)、及び(iii)推定最適配合物(やはりSSC中0.5Mのスクロース、150mMのラフィノース、1MのDMG)であった。
【０２４９】
ゴム栓を部分的に挿入し、ボルテックスした後、VirTis Advantage凍結乾燥機に積載し、プログラム1で凍結乾燥させた(図34参照)。凍結乾燥後、試料を真空下で直ちにキャップし、取り出し、クリンプさせ、三つの熱処理間に分配した。その後、それぞれの時点で、それぞれの配合物の二つのバイアルを上記日程に従って回復し、アッセイ直前に300μlのSSC中で再構成した。
【０２５０】
アデノウイルスのアッセイ
1ml当たり105細胞(ウェル当たり100μl)で播種することによって、接種のためにHEK293細胞を96ウェル平底細胞培養皿中で調製し、37℃、5%CO2で維持した。2時間後、細胞を以下のとおりに接種した。
【０２５１】
熱負荷をかけたウイルス試料を、上記のとおりに熱負荷から取り出し、DMEM+10%FBS中1
0分の1、及び100分の1に希釈した。次いで、得られた希釈ウイルス試料のそれぞれ100μlを、アッセイプレートの個々のウェルに添加した。
【０２５２】
さらに、SSC中、元のアデノウイルスの第2のアリコートを-80℃から解凍させ、10倍希釈シリーズ(10分の1から100,000分の1)もDMEM+10%FBS中で調製した。この正の対照希釈シリーズの2反復を、用いたそれぞれの96ウェルプレートに接種した。さらに48時間後、蛍光顕微鏡を用いて、ウェル当たりGFP細胞の数を数えた。
【０２５３】
結果
15週目で、(図35参照)緩衝剤単独(SSC)中で配合した試料から、ウイルス活性はまったく回復されなかった。糖との配合は、この損失の一部を防止する。しかし、+4℃で貯蔵された試料においてのみ、損失は、完全な対数降下未満の損失、すなわち、開始力価の10%を超える回復活性である。この処理では、この時点で、損失は、温度の増加とともに漸進的に悪化する。高温は、比較的長い熱安定性試験(促進安定性)をシミュレートする標準モードであるので、糖での損失は、+4℃で終点に達していないこと、及び時間経過とともにさらなる損失が予想され得ることが示唆される。
【０２５４】
推定最適配合物を用いると、損失はさらに減少する。実際、三つの貯蔵温度すべてで、損失は、ほぼ半分の対数損失(33%の回復活性)である。三つの温度すべてにおける応答は、27.84%と30.00%の回復の間であり、これは、0.52〜0.54対数の損失に相当する。この配合物に関して、三つの温度(+4℃、25℃及び+37℃)間の有意な差がないように見える。これは、(a)劣化が終点に達しており、時間経過とともにさらなる劣化を予想できないこと、又は(b)低下の速度が非常に遅くなってしまっているので、促進温度試験における差を検出することができないことのいずれかを意味する。
【０２５５】
図36及び図37は、これらの所見をさらに支持する。+25℃及び+37℃の両方で、いずれの時点でも緩衝剤単独中に貯蔵された試料からウイルス活性は、回復されない。糖単独で配合されたものは、終始いくらかの活性を保持する。それらの活性は、わずかにより大きい程度だけ、及びより高い温度(+37℃)でわずかにより急速に低下する。推定最適配合では、+37℃でウイルス活性のより急な低下があるが、両方ともの温度で、時間経過とともに同様のレベルに低下する。
【０２５６】
試験した配合物のすべてに関して+25℃及び+37℃の両方ともで、ウイルス活性の低下の大部分は、t=0週とt=5週の間に生じる。実際、緩衝剤単独及び糖の配合物の場合、劣化の圧倒的大部分は、t=0週とt=1週の間に生じる。t=0として用いた応答の値は、凍結乾燥及び熱負荷前のウイルスの力価であったが、時点は、熱負荷後の週としてプロットする。したがって、t=0週とt=1週との間の認められた差は、凍結乾燥の間及び熱負荷の最初の週の間の劣化の合計である。
【０２５７】
［実施例１５］
材料
化学薬剤
【表３２】
0005960120.tif 000040
【０２５８】
生物学的薬剤
【表３３】
0005960120.tif 000041
【０２５９】
その他
【表３４】
0005960120.tif 000042
【０２６０】
装置
【表３５】
0005960120.tif 000043
【０２６１】
方法
実験設計
実施例13に記載したとおりに、MODDE9.0(Umetics)を用いて、Doehlert実験設計を作成した(図38参照)。したがって、TMGを7レベルで検定したが一方、スクロースは5レベル、ラフィノースは3レベルで検定した。このモデルは、二次効果及び相互作用についてモデル化する能力を保有する。この設計は、3因子及び3反復中心点を含み、15の検定試料を生じさせた。
【０２６２】
スクロースは、0と1Mの間で検定した。Doehlert設計の性質は、検定レベルが0mMを含まなかったことを意味したが、ラフィノースは、0から300mMの範囲にわたって検定した。代わりに、以下の範囲を検定した:27.5、150.0、及び272.5mM。TMGは、0から2Mの線形範囲にわたって検定した。
【０２６３】
凍結乾燥環境における配合MVAの調製及び熱負荷
MVAを-80℃の貯蔵から取り出し、解凍させた。MVAの50μlアリコートを、凍結乾燥用2mlガラスバイアルに添加し、その後、250μlの添加剤ブレンドをそれぞれのバイアルに添加した。ウイルスと混合した後の添加剤ブレンド配合物を表19に記載し、SSC中で作製した。
【表３６】
0005960120.tif 000044
【０２６４】
ゴム栓を部分的に挿入し、ボルテックスした後、Virtis advantage凍結乾燥機に積載し、図39に記載するとおりに凍結乾燥させた。凍結乾燥後、試料を、直ちに真空下でキャップし、取り出し、クリンプさせ、熱負荷のために37℃で置いた。熱負荷は7日間であり、その後、バイアルすべてを対照バイアルに戻し、それらを実際にアッセイするまで4℃で保持した。凍結乾燥試料を、アッセイ直前に300μlのSSC中再構成した。
【０２６５】
MVAのアッセイ
アッセイプレート(96ウェル)に、BHK-21細胞(1ウェル当たり100μl、105細胞/ml)を播種した。10%FBS及び1%PSを補給したDMEMに細胞を希釈した。プレートを+37℃、5%CO2で1から2時間置いた。
【０２６６】
その間に、配合MVA試料の10倍希釈シリーズを(同じ増殖培地において) 10分の1から10,000分の1の範囲で調製した。それぞれの希釈シリーズを5回調製した。(上記の)BHK-21細胞を含む個々のウェルにそれぞれの希釈液100μlを適用した。
【０２６７】
接種後6日目に、ウェルは細胞変性効果(CPE)の存在又は非存在について記録し、TCID50を計算した。次いで、これらを用いて、熱負荷バイアルにおける1ml当たり感染性MVAの濃度を推定した。
【０２６８】
結果
この試験からのデータを表19に示す。応答は、開始力価の6%から92%に変化した。分析の間に、配合番号14は、明らかな外れ値として特定し、この分析から排除した。これは、モデル評価パラメータを強めた。
【０２６９】
ここで報告されるモデル(図40及び図41参照)は、スクロースの一次効果を実証する。ラフィノースは、一次効果は持たないことがわかったが、二次相互作用を実に実証した。TMGは、この試験で一次効果を持たないことがわかったが、二次効果は特定された。最終的に、スクロースとTMGの間の相互作用が特定された。
【０２７０】
図42は、モデルの等高線プロットを示す。最適TMG濃度は、モデルの中心に近いが(ほぼ1M)、これは、他の添加剤を変化させるとわずかにドリフトする。ラフィノースも最適条件を示す。最終的に、一般に、スクロース濃度が高くなればなるほど、MVAの保存はより良好である。
【０２７１】
モンテカルロシミュレーションは、1Mのスクロース、1.14MのTMG及び141.76mMのラフィノースの最適条件を特定し、1.14×106pfu/ml、すなわち、開始力価の87.7%の予測回復を示した。
【０２７２】
［実施例１６］
材料
化学薬剤
【表３７】
0005960120.tif 000045
【０２７３】
生物学的薬剤
【表３８】
0005960120.tif 000046
【０２７４】
その他
【表３９】
0005960120.tif 000047
【０２７５】
装置
【表４０】
0005960120.tif 000048
【０２７６】
方法
MODDE 9.0を用いて、中心複合面心(Central Composite Face-centred)(CCF)設計を作成した(図43参照)。CCF設計は、それぞれの因子の3レベルのみを検定する応答面モデリング(RSM)設計の方式であるが、二次のモデルを依然として支持する。通常の配合設計とは異なって、非有意な因子は分析から削除することができ、したがって、交絡因子にならない。
【０２７７】
凍結乾燥環境における配合MVAの調製及び熱負荷
MVAを-80℃での貯蔵から取り出し、解凍させた。MVAの50μlアリコートを凍結乾燥用2mlガラスバイアルに添加した。その後、250μlの添加剤ブレンドをそれぞれのバイアルに添加した。ウイルスと混合された後の添加剤ブレンド配合物は、表20に記載し、SSC中で作製した。
【表４１】
0005960120.tif 000049
【０２７８】
ゴム栓を部分的に挿入し、ボルテックスした後、Virtis advantage凍結乾燥機に積載し、図44に記載するとおりに凍結乾燥させた。凍結乾燥後、試料を直ちに真空下でキャップをし、取り出し、クリンプさせ、熱負荷のために37℃で置いた。熱負荷は7日間であり、その後、バイアルすべてを対照バイアルに戻し、それらを実際にアッセイするまで4℃で保持した。凍結乾燥試料は、アッセイ直前に300μlのSSC中で再構成した。
【０２７９】
MVAのアッセイ
アッセイプレート(96ウェル)にBHK-21細胞(ウェル当たり100μl、105細胞/ml)を播種した。10%FBS、及び1%PSで補給したDMEM中で細胞を希釈した。プレートを、+37℃、+5%CO2で1〜2時間置いた。
【０２８０】
その間に、配合MVA試料の10倍希釈シリーズを、10分の1から10,000分の1の範囲の同じ増殖培地で調製した。それぞれの希釈シリーズを5回調製した。BHK-21細胞(上記)を含む個々のウェルに、それぞれの希釈液100μlを適用した。
【０２８１】
接種6日後に、CPEの存在又は不存在についてウェルを記録し、TCID50を計算した。次いで、これらを用いて、熱負荷をかけたバイアル中1ml当たり感染性MVAの濃度を推定した。
【０２８２】
その後、配合MVA試料の2倍希釈シリーズを2000分の1から32,000分の1の範囲で調製した。これらの希釈液を別個に、しかし前述同様にアッセイした。
【０２８３】
結果
これらの試料のアッセイ(LOG間隔=1)の最初の通過(pass)は、五つだけの応答レベルを生じさせたが、これらの一つは、検出閾値未満であった。より重要なことに、十一の処理の六つが、最大検出閾値を超えていた。これらの試料を再アッセイした(LOG間隔=0.3)。試料は、これらの二つのアッセイ間で+4℃で液体として保持した。一部の試料は、両方のアッセイで意味ある値(最大閾値と最少閾値の間)を示した。これは、二つのアッセイ間の損失の決定を可能にした。
【０２８４】
第2の通過アッセイ後、検出閾値未満の力価を生じさせた処理はなかった。変換を容易にするために、この処理を最少検出閾値に等しい応答に割り当てた。
【０２８５】
このデータから作成されたモデルは比較的強い。モデル妥当性の四つのパラメータの三つが0.9を超えて記録する(R2=0.82、Q2=0.70、モデル妥当性=0.91、再現性=0.70)(図45参照)。
【０２８６】
モデルは、有意な因子を一つだけ特定した。DMGは、二次(非線形/二次の)効果を有することがわかった(図46参照)。
【０２８７】
図47は、作成したRSMモデルを示す。それは、効果的には試験濃度範囲内でマンニトールによって変わらない単純なDMG用量応答曲線である。モンテカルロシミュレーションがするのと同様に、用量応答曲線は明らかな最適DMG濃度を特定する(図48参照)。予測された最適DMG濃度は、1.00Mであり、予測されたウイルス活性の回復は、開始力価の117%である。
本発明は、以下の実施形態を包含する。
（１）  (a)(i)ウイルス粒子、(ii)場合によって1種又は複数種の糖、並びに(iii)式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル
【化８】
0005960120.tif 000050
(式中、
-  R1は、水素若しくはC1〜6アルキルを表し;
-  R4は、水素を表すか;又は
-  R1及びR4は、これらが結合している原子と一緒になって、ピロリジン環を形成し;
-  R2は、水素、C1〜6アルキル又は-(CH2)2〜5NHC(O)(CH2)5〜15CH3を表し;
-  R3は、C1〜6アルキルである);
及び/或いは
式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル
【化９】
0005960120.tif 000051
(式中、
-  Xは、-S(O)2-又は-S+(Rc)-を表し;
-  Ra及びRbは、独立して、C1〜6アルキルを表し;
-  Rcは、カルボキシレートアニオンで及びアミン(-NH2)部分で置換されたC1〜6アルキルを表す)
の水溶液を提供する工程と、
(b)前記溶液を乾燥させて、前記ウイルス粒子を組み入れている組成物を形成する工程と
を含む、ウイルス粒子を保存する方法。
（２）  前記水溶液が、式(I)の化合物若しくはこの生理学的に許容される塩、又は式(II)の化合物若しくはこの生理学的に許容される塩を含む、実施形態（1）に記載の方法。
（３）  前記式(I)の化合物が、N,N-ジ(C1〜6アルキル)グリシン、N,N,N-トリ(C1〜6アルキル)グリシン若しくはN-C1〜6アルキルグリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである、実施形態（1）又は（2）に記載の方法。
（４）  前記式(I)の化合物が、(a)N,N-ジメチルグリシン、N,N,N-トリメチルグリシン、若しくはN-メチルグリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、或いは(b)N-メチルグリシン、N,N-ジメチルグリシン若しくはN,N,N-トリメチルグリシン又はこの塩酸塩である、実施形態（3）に記載の方法。
（５）  前記式(I)の化合物が、N,N-ジメチルグリシン又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである、実施形態（4）に記載の方法。
（６）  前記式(I)の化合物が、
-  式(IA)
【化１０】
0005960120.tif 000052
(式中、R5及びR6は、独立して、C1〜4アルキルを表し、R7は、C1〜4アルキル又は-(CH2)2〜5NHC(O)(CH2)5〜15CH3を表す)
の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルであり;
-  前記式(I)の化合物が、式(IB)
【化１１】
0005960120.tif 000053
(式中、R8及びR9は、独立して、C1〜4アルキルを表す)
の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルであり;
-  前記式(II)の化合物が、式(IIA)
【化１２】
0005960120.tif 000054
(式中、Rc及びRdは、独立して、C1〜4アルキルを表す)
の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルであり;又は
-  前記式(II)の化合物が、式(IIB)
【化１３】
0005960120.tif 000055
(式中、Re及びRfは、独立して、C1〜4を表し;Rgは、カルボキシレートアニオンで及びアミン部分で置換されたC1〜4アルキルを表す)
の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルである、実施形態（1）又は（2）に記載の方法。
（７）  前記式(I)又は式(II)の化合物が、ジメチルスルホン、トリメチルグリシン、コカミドプロピルベタイン、プロリンベタイン若しくはS-メチル-L-メチオニン、又はこれらの生理学的に許容される塩若しくはエステルである、実施形態（1）、（2）又は（6）のいずれかに記載の方法。
（８）  (a)前記水溶液が、1種又は複数種の糖を含み、前記式(I)若しくは式(II)の化合物又はこれらの生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度が0.1mMから2.5Mであり、糖濃度、又は2種以上の糖が存在する場合の合計糖濃度が少なくとも0.01Mであるか、或いは(b)前記式(I)若しくは式(II)の化合物又はこれらの生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度が、0.1mMから3Mである、実施形態（2）から（7）のいずれかに記載の方法。
（９）  式(I)若しくは式(II)の化合物又は生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度が、(a)0.001Mから2.5M、0.01Mから2.5M若しくは0.1Mから2M、又は(b)7mMから1.5M若しくは0.07Mから0.7M、又は(c)7mMから1.5M若しくは0.07Mから1M、又は(d)0.05Mから2M、0.02Mから2M若しくは0.07Mから1Mである、実施形態（2）から（7）のいずれかに記載の方法。
（１０）  前記水溶液が、式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩、及び式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩を含む、実施形態（1）に記載の方法。
（１１）  前記水溶液が、実施形態（3）から（5）のいずれかに記載の式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩、及び式(IIC):
【化１４】
0005960120.tif 000056
(式中、Ra及びRbは、独立して、C1〜6アルキルを表す)
のスルホン化合物である式(II)の化合物を含む、実施形態（10）に記載の方法。
（１２）  前記水溶液中における前記式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩の濃度が、0.1Mから1.5Mである、実施形態（11）に記載の方法。
（１３）  前記式(IIC)のスルホン化合物が、メチルスルホニルメタンである、実施形態（11）又は（12）に記載の方法。
（１４）  前記水溶液中における前記式(IIC)のスルホン化合物の濃度が、0.1Mから1.5Mである、実施形態（11）から（13）のいずれかに記載の方法。
（１５）  (a)前記糖濃度、又は合計糖濃度が、0.1Mから3M又は0.2Mから2Mであり、(b)前記乾燥のための溶液が、1種又は複数種の糖を、少なくとも0.1Mの濃度、又は2種以上の糖が存在する場合は合計糖濃度で含み、或いは(c)前記水溶液の糖濃度が、0.05Mから1Mである、実施形態（1）から（14）のいずれかに記載の方法。
（１６）  前記水溶液が、非還元糖又は糖アルコールを含む、実施形態（1）から（15）のいずれかに記載の方法。
（１７）  2種以上の糖が用いられ、且つ前記糖の1種がスクロースである、実施形態（1）から（16）のいずれかに記載の方法。
（１８）  スクロースとその他の糖(複数可)との濃度の比が、1:1から20:1である、実施形態（17）に記載の方法。
（１９）  前記他の糖が、ラフィノースである、実施形態（17）又は（18）に記載の方法。
（２０）  前記乾燥のための溶液が、マンニトールを含む、実施形態（1）から（18）のいずれかに記載の方法。
（２１）  マンニトールである1種の糖が存在するか、又はスクロース及びラフィノースである2種の糖が存在する、実施形態（1）から（16）のいずれかに記載の方法。
（２２）  前記水溶液が、スクロース又はマンニトールを含む、実施形態（16）に記載の方法。
（２３）  (a)前記水溶液が、凍結乾燥されるか、又は(b)前記水溶液が、凍結乾燥若しくは噴霧乾燥されるか、又は(c)前記水溶液が、バイアル若しくはアンプル中で凍結乾燥され、次いで前記バイアル若しくはアンプルが密封される、実施形態（1）から（22）のいずれかに記載の方法。
（２４）  前記ウイルス粒子が、生ウイルス又は死滅ウイルスから構成される、実施形態（1）から（23）のいずれかに記載の方法。
（２５）  前記生ウイルスが、全ウイルス又は弱毒化生ウイルスである、実施形態（24）に記載の方法。
（２６）  前記水溶液が、アデノウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、パラボウイルス科、ピコルノウイルス科及びポックスウイルス科から選択されるウイルスを含む、実施形態（1）から（25）のいずれかに記載の方法。
（２７）  前記ウイルスが、アデノウイルス、ワクチニアウイルス、インフルエンザウイルス又は麻疹ウイルスから選択されるウイルスである、実施形態（26）に記載の方法。
（２８）  実施形態（1）又は（3）から（7）のいずれかに記載の式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、及び/或いは実施形態（1）、（3）から（7）、（11）又は（13）のいずれかに記載の式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖を含み、且つウイルス粒子を組み入れている組成物。
（２９）  (a)固体であり、及び/又は(b)1種若しくは複数種の糖を含み、及び/又は(c)凍結乾燥されており、及び/又は(d)非還元糖若しくは糖アルコールを含む、実施形態（28）に記載の組成物。
（３０）  スクロース若しくはマンニトールである1種の糖が存在し、又はスクロース及びラフィノースである2種の糖が存在する、実施形態（28）又は（29）に記載の組成物。
（３１）  ウイルス誘発の毒性、ウイルス感染、ウイルス感染の続発症、癌若しくはアレルギーの予防若しくは治療における;又は遺伝子治療若しくは自己免疫疾患の治療における、ワクチンとしての使用のための、実施形態（28）から（30）のいずれかに記載の組成物。
（３２）  非感染性ウイルス粒子及び場合によってアジュバントを組み入れている、実施形態（28）から（30）のいずれかに記載の組成物を含むワクチン。
（３３）  ウイルス粒子を組み入れているワクチンを調製する方法であって、
(a)(i)ウイルス粒子、(ii)実施形態（1）又は（3）から（7）のいずれかに記載の式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、及び/或いは実施形態（1）、（3）から（7）、（11）又は（13）のいずれかに記載の式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに(iii)場合によって1種又は複数種の糖の水溶液を提供する工程と;
(b)この混合物に、アジュバント、緩衝剤、抗生物質及び/又は添加物を場合によって添加する工程と;
(c)前記溶液を乾燥させて、前記ウイルス粒子を組み入れている組成物又は固体組成物を形成する工程と
を含む方法。
（３４）  (a)1種又は複数種の糖を含み、前記式(I)若しくは式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度が0.1mMから2.5Mであり、前記糖濃度、又は2種以上の糖が存在する場合は合計糖濃度が、少なくとも0.01Mであるか、或いは(b)前記式(I)若しくは式(II)の化合物又はこれらの生理学的に許容される塩若しくはエステルの濃度が、0.1mMから3Mである、実施形態（33）に記載の方法。
（３５）  前記ワクチンが、多価ワクチンである、実施形態（28）から（31）のいずれかに記載の組成物、実施形態（32）に記載のワクチン、又は実施形態（33）若しくは（34）に記載の方法。
（３６）  ウイルス粒子又は非感染性ウイルス粒子を含み、実施形態（1）から（27）、（33）又は（34）のいずれかに記載の方法によって得られる、組成物又は乾燥粉末。
（３７）  実施形態（28）から（31）及び（36）のいずれかに記載の組成物を含有する密封されたバイアル又はアンプル。
（３８）  ウイルス粒子を保存するための、実施形態（1）又は（3）から（7）のいずれかに記載の式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、及び/或いは実施形態（1）、（3）から（7）、（11）又は（13）のいずれかに記載の式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖の使用。
（３９）  (a)(i)ウイルス粒子、(ii)場合によって1種又は複数種の糖、並びに(iii)実施形態（1）又は（3）から（7）のいずれかに記載の式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは実施形態（1）、（3）から（7）、（11）又は（13）のいずれかに記載の式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルの水溶液を提供する工程と;
(b)前記溶液を最大5年間密封容器に貯蔵する工程と
を含む、乾燥前にウイルス粒子を保存する方法。
（４０）  (c)前記溶液を乾燥させて、前記ウイルス粒子を含む非晶質固体マトリックスを形成する工程をさらに含む、実施形態（39）に記載の方法。
（４１）  (a)前記溶液が、冷蔵庫に貯蔵されるか、又は(b)前記溶液が、冷凍庫に貯蔵される、実施形態（39）又は（40）に記載の方法。
（４２）  密封容器で提供され、乾燥前に冷蔵庫又は冷凍庫で貯蔵される、(i)ウイルス粒子、(ii)場合によって1種又は複数種の糖、並びに(iii)実施形態（1）又は（3）から（7）のいずれかに記載の式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル及び/或いは実施形態（1）、（3）から（7）、（11）又は（13）のいずれかに記載の式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステルのバルク水溶液。
（４３）  前記バルク水溶液が、0.1から100リットルの容量を有する、実施形態（42）に記載の溶液。
（４４）  ウイルス粒子を含む水溶液中における前記ウイルス粒子を乾燥前に保存するための、実施形態（1）又は（3）から（7）のいずれか一項に記載の式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、及び/或いは実施形態（1）、（3）から（7）、（11）又は（13）のいずれかに記載の式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖の使用。
（４５）  ウイルス粒子を含む乾燥又は凍結乾燥生成物である組成物のための再懸濁剤としての、
実施形態（1）又は（3）から（7）のいずれかに記載の式(I)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、及び/或いは実施形態（1）、（3）から（7）、（11）又は（13）のいずれかに記載の式(II)の化合物又はこの生理学的に許容される塩若しくはエステル、並びに場合によって1種又は複数種の糖の使用。
（４６）  前記組成物が、実施形態（28）から（31）、及び（36）のいずれかに記載されるとおりである、実施形態（45）に記載の使用。
【図１】
0005960120.tif 000059
【図２Ａ】
0005960120.tif 000060
【図２Ｂ】
0005960120.tif 000061
【図３】
0005960120.tif 000062
【図４】
0005960120.tif 000063
【図５】
0005960120.tif 000064
【図６】
0005960120.tif 000065
【図７】
0005960120.tif 000066
【図８】
0005960120.tif 000067
【図９Ａ】
0005960120.tif 000068
【図９Ｂ】
0005960120.tif 000069
【図１０】
0005960120.tif 000070
【図１１】
0005960120.tif 000071
【図１２】
0005960120.tif 000072
【図１３】
0005960120.tif 000073
【図１４】
0005960120.tif 000074
【図１５】
0005960120.tif 000075
【図１６】
0005960120.tif 000076
【図１７】
0005960120.tif 000077
【図１８】
0005960120.tif 000078
【図１９】
0005960120.tif 000079
【図２０】
0005960120.tif 000080
【図２１】
0005960120.tif 000081
【図２２】
0005960120.tif 000082
【図２３】
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【図２４】
0005960120.tif 000084
【図２５】
0005960120.tif 000085
【図２６】
0005960120.tif 000086
【図２７】
0005960120.tif 000087
【図２８】
0005960120.tif 000088
【図２９】
0005960120.tif 000089
【図３０】
0005960120.tif 000090
【図３１】
0005960120.tif 000091
【図３２】
0005960120.tif 000092
【図３３Ａ】
0005960120.tif 000093
【図３３Ｂ】
0005960120.tif 000094
【図３４】
0005960120.tif 000095
【図３５】
0005960120.tif 000096
【図３６】
0005960120.tif 000097
【図３７】
0005960120.tif 000098
【図３８】
0005960120.tif 000099
【図３９】
0005960120.tif 000100
【図４０】
0005960120.tif 000101
【図４１】
0005960120.tif 000102
【図４２】
0005960120.tif 000103
【図４３】
0005960120.tif 000104
【図４４】
0005960120.tif 000105
【図４５】
0005960120.tif 000106
【図４６】
0005960120.tif 000107
【図４７】
0005960120.tif 000108
【図４８】
0005960120.tif 000109