(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
均質な間充織幹細胞の培養基を調整するステップ１と、
多種の小型ＲＮＡ分子を組合わせるステップ２と、
核酸とポリペプチドのナノ粒子を組み合わせて移入するステップ３と、
転換された造血幹細胞の培養基を誘導し増殖させるステップ４と、
多種の造血関連遺伝子を活性化するステップ５とを含み、
前記ステップ２における前記多種の小型ＲＮＡ分子は、ｍｉＲ−１３８−１、ｍｉＲ−１３８−２、及びｍｉＲ−４３３であることを特徴とする、間充織幹細胞を誘導して造血幹細胞に転換する方法。
【請求項２】
前記ステップ１における培養基は、無血清の高グルコースＤＭＥＭ／Ｆ１２培養基にＥＧＦ、ＦＧＦ−２、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＩＧＦ及びＴＧＦ−βの５因子を添加する培養基であることを特徴とする請求項１に記載の間充織幹細胞を誘導して造血幹細胞に転換する方法。
【請求項３】
前記ステップ４における培養基は、無血清の高グルコースＤＭＥＭ／Ｆ１２培養基にｓｈｈ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ、デルタ１、ＩＧＦＢＰ、アンジオポエチン、ＢＭＰ４、ＬＩＦ、ＴＧＦ−βの１０因子を添加する培養基であることを特徴とする請求項１に記載の間充織幹細胞を誘導して造血幹細胞に転換する方法。
【請求項４】
前記ステップ２における多種の小型ＲＮＡ分子の組み合わせの比率は、ｍｉＲ−１３８−１、ｍｉＲ−１３８−２、ｍｉＲ−４３３の粉末重量比が１：１：１であることを特徴とする請求項１に記載の間充織幹細胞を誘導して造血幹細胞に転換する方法。
【請求項５】
前記ステップ３における核酸とポリペプチドのナノ粒子のアセンブル方法は、ステップ２における多種の小型ＲＮＡ分子の組み合わせの混合物とポリペプチドトランスフェクション試薬を医学用脱イオン水にそれぞれ溶解した後、撹拌しながら多種の小型ＲＮＡ分子の混合物溶液をポリペプチドトランスフェクション試薬溶液に滴下し、小型ＲＮＡの活性成分とポリペプチドトランスフェクション試薬を混合させるように撹拌を続け、２０分間静置し、ナノ粒子にセルフ−アセンブルさせることを特徴とする請求項１に記載の間充織幹細胞を誘導して造血幹細胞に転換する方法。
【請求項６】
前記核酸とポリペプチドのナノ粒子により間充織幹細胞をトランスフェクションする方法は、１日１回トランスフェクションさせ、全部で２回トランスフェクションさせることを特徴とする請求項５に記載の間充織幹細胞を誘導して造血幹細胞に転換する方法。
【請求項７】
前記転換された造血幹細胞の培養は、造血幹細胞を誘導し増加させる培養基において５×１０5／ｍｌの細胞密度を用いて少なくとも３日間培養することを特徴とする請求項１に記載の間充織幹細胞を誘導して造血幹細胞に転換する方法。
【請求項８】
前記活性化される多種の造血関連遺伝子は、Ｒｕｎｘ１、Ｂｍｉ１、ＨｏｘＢ４、Ｇａｔａ１、Ｇａｔａ２、Ｇｆｉ１、Ｓａｌｌ４、Ｐｕ．１、Ｓｃｌ、Ｍｃｌ、Ｃ−ｍｙｃ、Ｃ−ｍｙｂ、Ｋｃｌ４、Ｃｘｃｒ４及びＣｒｂであることを特徴とする請求項１に記載の間充織幹細胞を誘導して造血幹細胞に転換する方法。
【請求項９】
前記造血幹細胞を誘導し増加させる培養基の処方は、０−１μg／ｍ１  ソニック  ヘッジホッグ、０−１μg／ｍ１  デルタ１、０−１μg／ｍ１  ＦＧＦ２、０−１μg／ｍ１  ＩＧＦＢＰ、０−１μg／ｍ１  ＳＣＦ、０−１μg／ｍ１  アンジオポエチン、０−１μg／ｍ１  ＴＰＯ、０−１μg／ｍ１  ＭＢＰ、０−１μg／ｍ１  ＬＩＦ、０−１μｇ／ｍ１  ＴＧＦ−β、０−１００μＭ  ＴＥＰＡ、及び１−５ｍＭ  ＮＡＣを含むことを特徴とする請求項１に記載の間充織幹細胞を誘導して造血幹細胞に転換する方法。
【請求項１０】
試薬キットは、小型ＲＮＡ分子であるｍｉＲ−１３８−１、ｍｉＲ−１３８−２、及びｍｉＲ−４３３がポリペプチドのナノ粒子と共に間充織幹細胞にトランスフェクションされることで間充織幹細胞から転換される造血幹細胞を誘導し増殖させる培養基を含み、前記造血幹細胞を誘導し増殖させる培養基は、造血幹細胞の増殖に必要な細胞増殖因子及び細胞分化抑制剤を含み、前記造血幹細胞を誘導し増殖させる培養基の処方は、８０−１００％（ｖ/ｖ）のＤＭＥＭ Ｆ１２基本培養基、０−１μg/ｍ１  ソニック  ヘッジホッグ、０−１μg/ｍ１  デルタ１、０−１μg/ｍ１  ＦＧＦ２、０−１μg/ｍ１  ＩＧＦＢＰ、０−１μg/ｍ１  ＳＣＦ、０−１μg/ｍ１  アンジオポエチン、０−１μg/ｍ１  ＴＰＯ、０−１μg/ｍ１  ＭＢＰ、０−１μg/ｍ１  ＬＩＦ、０−１μg/ｍ１  ＴＧＦ−β、０−１００μＭ  ＴＥＰＡ、及び１−５ｍＭ  ＮＡＣであることを特徴とする造血幹細胞を誘導し増殖させる培養基試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物工学分野に属し、特に、間充織幹細胞を大規模で迅速に高純度で誘導して造血幹細胞に転換する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪由来幹細胞（Adipose-derived stem cell、ＡＤ−ＭＳＣｓ）の主なソースである白色脂肪組織(White adipose tissue、ＷＡＴ)は、体内において分布が広く、貯蔵量が豊富である。骨髄由来の間充織幹細胞（Bone-marrow mesenchymal stem cell、ＢＭＳＣｓ）が成人の骨髄の０．２×１０-5―０．１×１０-5だけを占めるが、脂肪組織において得られる幹細胞クローンの生成率がＢＭＳＣｓの１００〜５００倍であることが細胞クローンの実験により分かっている。骨髄におけるＢＭＳＣｓの割合及び増加能力は、いずれも加齢及び骨粗鬆症の発症率により低下するが、脂肪組織におけるＡＤＳＣｓの数は、加齢に伴って減少することがない。ＡＤＳＣの生体外増殖及び自己更新の能力は強く、初代を培養して約５〜７日間経過後、細胞の融合が９０％を超え、１か月に３回の対数増殖期が現れ、２０世代以上を比較的安定して継代培養することができる。生体外培養時、特別に血清を選ぶ必要がなく、添加物がなくても良好に成長することができ、液体窒素による冷凍保存及び長期継代後の細胞成長及び発現型は、いずれも変化しない。
【０００３】
ＡＤＳＣｓは、多向分化能力を有し、異なる誘導培養条件では、ＡＤＳＣｓは、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、内皮細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、膵臓内分泌様細胞、肝臓細胞及び視神経細胞等の多種の組織細胞に定向分化することができる。しかしながら、現在でも造血幹細胞（ＨＳＣｓ）に転化することができるか否かがはっきりと分からない。
【０００４】
造血幹細胞は、白血病のような血液病の治療に最も有効な方法である。白血病は、他の腫瘍病と同様に、近年、中国において顕著に増加する傾向があり、低年齢化の特徴を有する。白血病は、悪性腫瘍の５％を占め、発病者は、子供及び若者が多い。白血病を治療するのに最も有効な方法は、造血幹細胞による治療方法である。しかしながら、現在の治療方法では、マッチングする骨髄又は造血幹細胞を探さなければならないが、患者の家族及び社会の関係部門は、あらゆる要素を動員してマッチング可能な適切な造血幹細胞を探しても、マッチング可能なものは、極めて僅かである。よって、国立の幹細胞バンクを設立しなければならないが、各バンクは、通常、２億元程度がかかるので、経済的なコストが高く、しかも技術的にも、免疫拒否及び腫瘍生成の可能性を完全に排除することができない。また、幹細胞の数に限りがあり、未分化での増加技術が不足しているため、優れた医療結果を最終的に保障することができない。上述した様々な理由により、人々は、造血幹細胞を生成する新たなソースを発見し、造血幹細胞を未分化で増加させる新たな技術及び方法を開発しなければならない。
【０００５】
異なる種類の造血細胞の中の小型ＲＮＡ分子の発現が明らかに異なり、しかもこれらの違いは、細胞の発育プロセスにおいてとても重要な調整役割を果たしていることが近年の研究で分かった。例えば、ｍｉＲ−１８１は、Ｂ−リンパ細胞の発育と関係があり、ｍｉＲ−１４２とｍｉＲ−２２３はＴ−リンパ細胞の発育と関係があり、ｍｉＲ−２２１とｍｉＲ−２２２は、人体の赤血球の生成と関係があり、ｍｉＲ−２２３は、マウスの顆粒球細胞の分化と関係があり、ｍｉＲ−１０、ｍｉＲ−１２６及びｍｉＲ−１７は、巨大核細胞の減少と関係がある。また、人々は、ｍｉＲ−１２８及びｍｉＲ−１８１のような小型ＲＮＡが造血幹細胞の分化を阻止する役割を果たしていることを発見した。例えば、ｍｉＲ−１３０ａ及びｍｉＲ−１０ａのようないくつかのｍｉＲＮＡは、ＨＯＸＡ１遺伝子及びＭＡＦＢ遺伝子の転写因子遺伝子が作用することにより細胞の分化を誘導することも発見した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、従来技術において造血幹細胞治療の細胞マッチングの困難、免疫拒否及び造血幹細胞の数に限りがあるという技術ボトルネックの問題を解決する、間充織幹細胞を大規模で迅速に高純度で誘導して造血幹細胞に転換する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の間充織幹細胞を大規模で迅速に高純度で誘導して造血幹細胞に転換する方法は、均質な間充織幹細胞の培養基を調整するステップ１と、多種の小型ＲＮＡ分子を組合わせるステップ２と、核酸とポリペプチドのナノ粒子をアセンブル・トランスフェクションするステップ３と、転換された造血幹細胞の培養基を誘導し増殖させるステップ４と、多種の造血関連遺伝子を活性化するステップ５とを含む。
【０００８】
前記培養基は、無血清の高グルコースＤＭＥＭ／Ｆ１２培養基にＥＧＦ、ＦＧＦ−２、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＩＧＦ及びＴＧＦ−βの５因子を添加する培養基であることが好ましい。
【０００９】
前記培養基は、無血清の高グルコースＤＭＥＭ／Ｆ１２培養基にｓｈｈ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ、デルタ１（Ｄｅｌｔａｌ）、ＩＧＦＢＰ、アンジオポエチン（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）、ＭＢＰ４、ＬＩＦ、ＴＧＦ−βの１０因子を添加する培養基であることが好ましい。
【００１０】
前記多種の小型ＲＮＡ分子は、ｍｉＲ−１３８−１、ｍｉＲ−１３８−２、ｍｉＲ−４３３及びＥＩＤ１ｍＲＮＡの異なる部位をターゲティングするｓｉＲ−ＥＩＤ１分子のシーケンスであることが好ましい。
【００１１】
表２は、前記ＥＩＤ１ｍＲＮＡの異なる部位をターゲティングするｓｉＲ−ＥＩＤ１分子のシーケンスを示している。
【００１２】
前記転換して得られた造血幹細胞の培養は、造血幹細胞を誘導し増加させる培養基において５×１０5／ｍｌの細胞密度を用いて少なくとも３日間培養することが好ましい。
【００１３】
核酸とポリペプチドのナノ粒子のアセンブルは、異なる小型ＲＮＡ分子とポリペプチドトランスフェクション試薬を実例３の処方、手順及び時間に基づいて調整するプロセスを指し、１日１回、全部で２回トランスフェクションさせることにより最も理想な誘導効果を得る。
【００１４】
前記活性化される多種の造血関連遺伝子は、Ｒｕｎｘ１、Ｂｍｉ１、ＨｏｘＢ４、Ｇａｔａ１、Ｇａｔａ２、Ｇｆｉ１、Ｓａｌｌ４、Ｐｕ．１、Ｓｃｌ、Ｍｃｌ、Ｃ−ｍｙｃ、Ｃ−ｍｙｂ、Ｋｃｌ４、Ｃｘｃｒ４及びＣｒｂであることが好ましいが、これらの遺伝子に限らない。
【００１５】
間充織幹細胞培養基の処方は、異なる培養試薬キットにすることが可能であり、異なる間充織幹細胞が増殖するのに必要な細胞増殖因子と、細胞分化抑制剤とを含むことが好ましい。
【００１６】
造血幹細胞誘導増加培養基の処方は、異なる培養試薬キットにすることが可能であり、造血幹細胞が増殖するのに必要な細胞増殖因子と、細胞分化抑制剤とを含むことが好ましい。表３は、具体的な処方を示している。
【００１７】
本発明の方法により得られた誘導造血幹細胞は、例えば、再生不良性貧血及び白血病のような血液病の治療に用いることができる。
【００１８】
具体的な実例を用いて本発明を更に詳しく説明する。
実例１：間充織幹細胞の分離、培養及び増加
脂肪・骨髄・臍帯の取得は、寄付者の同意のもとで行われている。ヒト脂肪由来幹細胞の採集、分離及び培養は、次の通りである：脂肪吸引物は、低密度の脂質成分と高密度の水性成分との２つの成分に分けられ、水性成分は、液体部分である。液体成分は、脂肪由来幹細胞の原料に用いられている。得られた脂肪組織を、無菌条件で同じ体積のＰＢＳ液を用いて３回〜５回繰り返し洗い、０．１％のＩ型コラゲナーゼを加え、３７℃の水浴で振動し、６０分間消化した後、１０％のウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培養基で消化を終止させる。１０００ｇで１０分間遠心し、上清液及び懸濁液の残存組織を捨て、２倍体積の赤血球分解液（ＮＨ4Ｃ１  １５４ｍｍｏｌ／Ｌ＋ＫＨＣ０3 １０ ｍｍｏｌ／Ｌ＋ＥＤＴＡ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ）を加えて１０分間静置し、遠心し、上清液を捨てる。適量なＰＢＳ液で３回洗い、２００メッシュスクリーンで濾過し、細胞計数板で細胞懸濁液を計数し、１−３×１０5の細胞を１５０ｃｍ2の培養フラスコに接種し、２０ｍLの無血清の高グルコースＤＭＥＭ／f１２の培養基を加え、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ−２、１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢ、５ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ、０．５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−βを添加して均一に混合し、３７℃、５％の二酸化炭素飽和湿度のインキュベーター内に置いて培養する。本発明の培養基は、未分化の間充織幹細胞を迅速に増加させる培養液であり、均一度の高い未分化の間充織幹細胞を培養することができるので、次の造血幹細胞の生成を確実に保障することができる。位相差顕微鏡で細胞の形態的特徴及び増殖状況を観察し、３６〜４８時間の経過後、初めて液を変え、その後、７２時間ごとに液を変える。細胞融合が培養フラスコの底の８０％を超えると、通常のトリプシンで消化して継代培養する。
【００１９】
ヒト脂肪由来幹細胞の鑑定：０．２５％のトリプシンで第３又は第４世代の細胞を消化した後、フローサイトメトリーにより分析した結果、ＡＤＳＣｓは、主にＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ２９、ＣＤ４９ｅ及びＨＬＡ−ＡＢＣを発現するが、ＣＤ３４、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ３１、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ９５Ｌ及びＨＬＡ−ＤＲ（図1参照）を発現しない。この結果は、他のＭＳＣｓとほぼ一致している。しかしながら、ＡＤＳＣｓとＢＭＳＣｓは、多くのＢＭＳＣｓがＣＤ１０とＣＤ１０６を発現し、ＣＤ１０を発現するＡＤＳＣｓがわずか５％〜２０％だけであり、殆どのＡＤＳＣｓがＣＤ４９ｆとＣＤ５４を発現するが、ＢＭＳＣｓは、あまり発現しない。
【００２０】
実例２：ｍｉＲＮＡｓシーケンス、構造及び合成
生物情報学技術及び相関する予測ソフト（ターゲットスキャン；Target  Scan）により、私達は、３種類のｍｉＲＮＡｓ（図２参照）を選別・鑑定した。一番目のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ−１３８−１であり、そのシーケンスが対応する短いヘアピンＤＮＡのシーケンスは、次の通りである：
CCCUGGCAUGGUGUGGUGGGGCAGCUGGUGUUGUGAAUCAGGCCGUUGCCAAUCAGAGAACGGCUACUUCACAACACCAGGGCCACACCACACUACAGG
【００２１】
２番目のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ−１３８−２であり、そのシーケンスが対応する短いヘアピンＤＮＡのシーケンスは、次の通りである：
CGUUGCUGCAGCUGGUGUUGUGAAUCAGGCCGACGAGCAGCGCAUCCUCUUACCCGGCUAUUUCACGACACCAGGGUUGCAUCA
【００２２】
３番目のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ−４３３であり、そのシーケンスが対応する短いヘアピンＤＮＡのシーケンスは、次の通りである：
CCGGGGAGAAGUACGGUGAGCCUGUGAUUAUUCAGAGAGGCUAGAUCCUCUGUGUUGAGAAGGAUCAUGAUGGGCUCCUCGGUGUUCUCCAGG
【００２３】
これらのｍｉＲＮＡｓは、すべて化学合成の方法により得ることができる。安定性を強化するために、これらの小型ＲＮＡの組成モノマーは、全部又は部分的に異なる化学修飾を行うことができ、例えば、メトキシ又はエトキシ修飾である。本発明のｍｉＲＮＡｓの活性成分の調整方法は、次の通りである：
ＲＮＡ／ＤＮＡシンセサイザーにより４種類の異なるヌクレオチドモノマーを所定の設計シーケンスで３種類の異なる小型ＲＮＡ一本鎖に合成し、これらの小型ＲＮＡ一本鎖のシーケンスは、上述に説明した通りである。合成後の小型ＲＮＡ一本鎖は、分離・純化により他の成分を除去し、アニールして３つの特徴を有するｍｉＲＮＡｓを形成する。これらの３種類のｍｉＲＮＡ分子を冷凍し乾燥粉末に濃縮して処方の小核酸活性成分とし、低温で保存する。乾燥粉末は、ｍｉＲＮＡ−１３８−１、ｍｉＲＮＡ−１３８−２及びｍｉＲＮＡ−４３３を含み、これらのｍｉＲＮＡは、いずれも１つのＥＩＤ１遺伝子のシードフラグメントを含む。これらをそれぞれＥＩＤ１の３‘ＵＴＲシーケンスを含むルシフェラーゼプラスミド（ｐＲＬ−ＴＫ）と共に脂肪間充織幹細胞をトランスフェクションし、その後３６時間ルシフェラーゼ活性の結果を分析したところ、これらの小型ＲＮＡ分子（ｓｉＲ−ＥＩＤ１、ｓｈＲ−ＥＩＤ１及びｓＲＮＡ−Ｍを含む）がいずれもターゲット遺伝子ＥＩＤ１ (図３参照)を効果的に減少させて、異なるヒストン及び多種の転写因子をアセチル化するので、結果として間充織幹細胞を活性化させ他の幹細胞に容易に形質転換させやすいことが示された。小型ＲＮＡの干渉効果を強化するために、私達は、ｍｉＲＮＡ−１３８−１、ｍｉＲＮＡ−１３８−２及びｍｉＲＮＡ−４３３を合成した後、この３種類の小型ＲＮＡ（ｓＲＮＡ−Ｍ）の組み合わせ戦略を用い、最終的な小核酸活性成分は、ドライパウダー重量が１：１：１の比率で混合して調整することを採択した。
【００２４】
実例３．小核酸とポリペプチドのナノ粒子の調整及び細胞トランスフェクション
前記小核酸成分の混合物及び細胞透過性ペプチド（北京吉利奥生物技術発展有限会社より購入する）を医学用脱イオン水に溶解し、１０分間まんべんなくかき混ぜ、核酸及びポリペプチドの重量パーセントが１：１０〜１：１００の割合になるよう、撹拌しながら小核酸活性成分の溶液をゆっくりと細胞透過性ペプチドの溶液に滴下する。撹拌を続け、小核酸活性成分及び細胞透過性ペプチドを十分に混合することができるようにし、２０分間静置して、ナノ粒子に十分にセルフ―アセンブル(self−assemble)させ、すぐに使用できるようにする。
【００２５】
小型ＲＮＡがヒト間充織幹細胞を誘導して造血幹細胞へ転換させる効率を高めるために、本発明は、具体的な誘導スキームを更に向上し、表１は、ここで公開した８種類の誘導処方を示している。表から分かるように、スキーム３の第２の誘導処方の効率が最も高く、即ち、１日１回で合わせて２回のトランスフェクションにより、８０％の間充織幹細胞を造血幹細胞へ転換することができる。従来の誘導方法に比べて大幅に改良し、当該技術により臨床レベルの造血幹細胞を得ることができる。再生不良性貧血及び白血病のような血液病の治療に更に用いることができる。
表１：間充織幹細胞から造血幹細胞へ転換する誘導スキーム
0005878650.tif 000002
表２：ＥＩＤ１ｍＲＮＡの異なる部位をターゲティングするｓｉＲ−ＥＩＤ１分子のシーケンス
シーケンス番号              シーケンス（プラス鎖）
１                          GGAGGACGACTACGACTATTT
２                          GCATCTGTCTTGCTGGAAGCT 
３                          GGTTGAGCGGTTTGCACAATG
４                          GGTTTGCACAATGTCGGAAAT
５                          GGCGAGGAATTTGATGACTGG
６                          GCGAGGAATTTGATGACTGGG
７                          GCTCTTGAAGAAGCCGACAAG
８                          GACAAGATGTTTCTGAGAACA
９                          GGCGGGTTTCAGATGCATTAT
１０                        GCGGGTTTCAGATGCATTATG
１１                        GGTTTCAGATGCATTATGATT
１２                        GGACCCAACTTTCCGCTATCT
１３                        GCCACAGTTATCAAAGGCTAC
１４                        GACACTAAATGTGTGTGAATG
１５                        GCCCAGAAATTACCTTGGTAT
１６                        GCTTGTTATTTGTCATGCACC
１７                        GCTTCAGCTATCTAATTCACA
１８                        GCCCTATCAATGAGTATGTTG
１９                        GCCGTGGTTACCTTACTAAGA
２０                        GCTGAAGTTCTAGGAGAGTAA
２１                        GCTCCATTATAGCAGTAAAGA
２２                        GAACGAATATCCAATGCAACA
２３                        CAAATACTCACCATTGTGTTA
実例４：間充織幹細胞を誘導して造血幹細胞に転換する小核酸−ポリペプチドのナノ粒子。
ｍｉＲＮＡ−４３３及びｍｉＲ−１３８をヒト間充織幹細胞にトランスフェクションして１〜２日間後、付着した紡錘状間充織幹細胞を浮遊する円形の幹細胞に形質転換する。造血幹細胞を誘導し増加させる培養基（表３は、処方を示している）において５×１０5／ｍｌの細胞密度で少なくとも３日間培養し、これらの幹細胞は、徐々に間充織幹細胞の特異的抗原（例えば、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ２９、Ｆ１ｋ−１）を失うと同時に、造血幹細胞の表面抗原（例えば、ＣＤ３４、ＣＤ１３３、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４１及びＣＤ９０）（図４参照）を得る。また、迅速に増加することができる。
【００２６】
これらの形質転換後の幹細胞に対してＦＡＣＳダブル抗原標識による分析を行った結果、次のことが分かった：これらの幹細胞の中の９０％の細胞は、長期造血幹細胞（ＬＴ−ＨＳＣｓ）及び短期造血幹細胞（ＳＴ−ＨＳＣｓ）の表面マーカー抗原（例えば、ＣＤ３４、ＣＤ１３３、ＣＤ１５０、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ４５、ＣＤ４１及びＣＤ９０等）を発現し、１０％の細胞だけは、造血前駆細胞の表面マーカー抗原（例えば、ＣＤ３８及びＦＬＫ２）を発現する（図５参照）。
【００２７】
ＲＴ−ＰＣＲ方法を用いてこれらの形質転換後の幹細胞を検出した結果、次のことが分かった：これらの幹細胞は、例えば、Ｒｕｎｘ１、Ｂｍｉ１、ＨｏｘＢ４、Ｇａｔａ１、Ｇａｔａ２、Ｇｆｉ１、Ｓａｌｌ４、Ｐｕ．１、Ｓｃ１などの多くの重要な造血関連遺伝子を高く発現することができるので、遺伝子発現においては、自然生成した造血幹細胞により似ており、原料である間充織幹細胞と異なる（図６参照）。これらの造血を制御する重要な遺伝子を活性化することにより、間充織幹細胞を造血幹細胞に転換することが可能となる。
【００２８】
培養によりこれらの形質転換後の単一細胞が自己再生することができることを確実に証明するために、トランスフェクション後の単一幹細胞を分離してメチルセルロースを塗布している２４穴培養板に接種し（コーニング会社から購入する）、造血幹細胞の増加を誘導するサイトカイン及び他の必要な成分を培養基に加え（表３は、処方を示している）、培養条件は、３７℃、５％のＣＯ2とした。表３は、本発明の造血幹細胞を増加させる培養基の処方を示している。第１５日目に顕微鏡により細胞コロニーの形成を観察することができる（図７参照）。当該方法は、いままで幅広く用いられている造血幹細胞のコロニー培養方法より有効且つ迅速である。現在、よく使われている培養方法は、造血幹細胞及び造血前駆細胞の分化や比較的低い増加倍数を招きやすい。
【００２９】
表３：造血幹細胞増加用の培養基の処方
0005878650.tif 000003
【００３０】
実施例５：これらの形質転換された造血幹細胞が造血機能を再構成できることが２度の移植実験により分かった。
小型ＲＮＡ分子がトランスフェクションされた間充織幹細胞を、臨界致死量の放射処理を経たマウスの体内に移植する。１０週間後、ヒト脂肪間充織幹細胞から分化した造血細胞を検出することができる。その後、マウスの骨髄から、移植されたヒト間充織幹細胞から分化した造血幹細胞を分離し、臨界致死量の放射処理を経た他のマウスの体内に再度移植する。１０週間後、抗ヒトモノクローナル抗体を用いてマウスの骨髄に対してＦＡＣＳ分析を行った結果、臨界致死量の放射処理を経たマウスの骨髄から造血幹細胞及び造血前駆細胞のマーカー遺伝子の発現を検出した。これらの造血前駆細胞（Ｍ−ＨＳＣｓ）は、ＣＤ３３、ＣＤ１３、ＣＤ１９、ＣＤ３、ＣＤ２３５、ＣＤ６１及びＣＤ５６のような分子マーカーを特に発現させる血球細胞にさらに分化することができる（図８参照）。明らかに、この種類の誘導造血幹細胞は、再生不良性貧血及び白血病のような血液病の治療に更に用いることができる。
【００３１】
間充織幹細胞を大規模で迅速に高純度で誘導して造血幹細胞に転換する方法は、均質な間充織幹細胞の培養基を調整するステップ１と、多種の小型ＲＮＡ分子を組合わせるステップ２と、核酸とポリペプチドのナノ粒子をアセンブル・トランスフェクションするステップ３と、転換された造血幹細胞の培養基を誘導し増殖させるステップ４と、多種の造血関連遺伝子を活性化させるステップ５とを含む。上述した技術案を用いたので、従来技術において造血幹細胞治療の細胞マッチングの困難、免疫拒否及び造血幹細胞の数に限りがあるという技術ボトルネックの問題を解決することができ、この誘導された造血幹細胞は、再生不良性貧血及び白血病のような血液病の治療に更に用いることができる。
【００３２】
本発明の方法は、いくつかの内因性ｍｉＲＮＡs及びその派生物を提供し、私達の先願において全体に補足的に記載されたｓｈＲＮＡのステム及びループのフラグメントと異なり、斬新な造血幹細胞の源泉であり、高い転換効率を有し、先願に記載された方法より８〜１０倍の効率であり、臨床への適用が可能になり、小型ＲＮＡを最初の間充織幹細胞にトランスフェクションするボトルネック問題を効果的に解決することができる。よって、造血幹細胞の増幅の過程において下流の血球細胞に分化する事態の発生を効果的に防止し、造血幹細胞の発生と関係する多種の遺伝子を効果的に活性化することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
本発明の実施例又は従来技術の技術案を更に詳しく説明するために、以下に、実施例又は従来技術を説明する際に用いられた図を簡単に紹介する。これらの図は、本発明のいくつかの実施例にすぎず、当業者は、当然、これらの図から他の図を得ることができる。
【図１】ヒト脂肪間充織幹細胞の表面の特異的抗原である。脂肪間充織幹細胞は、ＣＤ２９、ＣＤ４４、Ｆ１ｋ１、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ７１及びＣＤ１６６が陽性であり、ＣＤ１３３、ＣＤ３８、ＣＤ３３及びＣＤ４５が陰性であることが、フローサイトメトリーの分析により分かった。
【図２】ｍｉＲＮＡ−１３８−１、ｍｉＲＮＡ−１３８−２及びｍｉＲＮＡ−４３３分子の２次構造を示している。
【図３】異なる小型ＲＮＡ分子によって効果的に識別されるターゲット遺伝子ＥＩＤ１を示している。
【図４】ヒト間充織幹細胞から造血幹細胞へ転換される際の、細胞表面の特異的抗原の変化を示している。
【図５】転換後の造血幹細胞及び造血前駆細胞の分類及び割合を示している。
【図６】ヒト間充織幹細胞、造血幹細胞及び異なる小型ＲＮＡをトランスフェクションした幹細胞における造血関連遺伝子の発現差異を、ＰＣＲ電気泳動により比較して分析することを示している。
【図７】転換後の造血幹細胞のコロニー形成及び細胞形態を示している。
【図８】転換後の造血幹細胞と造血前駆細胞をマウスに２回目の移植を行い、各種の血液細胞に分化している状態を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下に、本発明の実施例の図を参考しながら、本発明の実施例の技術案を詳しく説明する。説明する実施例は、本発明の一部の実施例にすぎず、全部の実施例ではない。本発明の実施例に基づき、当業者は、創造性のある労動をせずに得られたすべての他の実施例も本発明の保護範囲に属する。
【００３５】
間充織幹細胞を大規模で迅速に高純度で誘導して造血幹細胞に転換する方法は、均質な間充織幹細胞の培養基を調整するステップ１と、多種の小型ＲＮＡ分子を組合わせるステップ２と、核酸とポリペプチドのナノ粒子をアセンブル・トランスフェクションするステップ３と、転換された造血幹細胞の培養基を誘導し増殖させるステップ４と、多種の造血関連遺伝子を活性化するステップ５とを含む。
【００３６】
前記培養基は、無血清の高グルコースＤＭＥＭ／Ｆ１２培養基にＥＧＦ、ＦＧＦ−２、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＩＧＦ及びＴＧＦ−βの５因子を添加する培養基である。
【００３７】
前記培養基は、無血清の高グルコースＤＭＥＭ／Ｆ１２培養基にｓｈｈ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ、Ｄｅｌｔａｌ、ＩＧＦＢＰ、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ、ＭＢＰ４、ＬＩＦ、ＴＧＦ−βの１０因子を添加する培養基である。
【００３８】
前記多種の小型ＲＮＡ分子は、ｍｉＲ−１３８−１、ｍｉＲ−１３８−２、ｍｉＲ−４３３及びＥＩＤ１ｍＲＮＡの異なる部位をターゲティングするｓｉＲ−ＥＩＤ１分子のシーケンスである。
【００３９】
図２は、前記ＥＩＤ１ｍＲＮＡの異なる部位をターゲティングするｓｉＲ−ＥＩＤ１分子のシーケンスを示している。
【００４０】
前記転換して得られた造血幹細胞の培養は、造血幹細胞を誘導し増加させる培養基において５×１０5／ｍｌの細胞密度を用いて少なくとも３日間培養することにより、最終的に間充織幹細胞を造血幹細胞に形質転換させる。
【００４１】
核酸とポリペプチドのナノ粒子のアセンブルは、異なる小型ＲＮＡ分子とポリペプチドトランスフェクション試薬を一定の調和比率、手順及び時間で調整し（実例３参照）、１日１回、合わせて２回のトランスフェクションにより最も理想な誘導効率を得ることを指す。
【００４２】
前記活性化される多種の造血関連遺伝子は、Ｒｕｎｘ１、Ｂｍｉ１、ＨｏｘＢ４、Ｇａｔａ１、Ｇａｔａ２、Ｇｆｉ１、Ｓａｌｌ４、Ｐｕ．１、Ｓｃｌ、Ｍｃｌ、Ｃ−ｍｙｃ、Ｃ−ｍｙｂ、Ｋｃｌ４、Ｃｘｃｒ４及びＣｒｂであることが好ましいが、これらの遺伝子に限らない。
【００４３】
上述した内容は、本発明の好ましい実施例にすぎず、本発明は、これらの実施例に限るものではない。本発明の主旨から逸脱しない限り、様々な変形や置換えは、全て本発明の請求の範囲内に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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