(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの総抽出物の重量（１００％）に対して、３０％（ｗ／ｗ）〜６０％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、０．５％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、２％（ｗ／ｗ）〜２０％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および２％（ｗ／ｗ）〜２０％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールを含有する二次分画による精製抽出物（ＡＴＣ２）；またはベルプロシドを含む、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療または予防用医薬組成物。
【請求項２】
シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの総抽出物の重量（１００％）に対して、３０％（ｗ／ｗ）〜６０％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、０．５％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、２．０％（ｗ／ｗ）〜２５％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１．０％（ｗ／ｗ）〜１５％（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１．０％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポールおよび２．０％（ｗ／ｗ）〜２０％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールを含有する二次分画による精製抽出物（ＡＴＣ２）；又はベルプロシドと、薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療または予防用医薬組成物。
【請求項３】
４０％〜９３％のベルプロシド、１．０％〜１０％のベラトルム酸、２．０％〜２５％のカタルポシド、１．０％〜１５％のピクロシドＩＩ、１．０％〜１５％のイソバニロイルカタルポールおよび２．０％〜２５％の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールの混合重量比の混合化合物と薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療または予防用医薬組成物。
【請求項４】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療または予防用医薬組成物の製造のための、請求項１に記載の二次分画による精製抽出物（ＡＣＴ２）、またはベルブロシドと、薬学的に許容可能な単体または賦形剤とを含む組成物の、使用。
【請求項５】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療または予防用医薬組成物の製造のための、４０％〜９３％のベルプロシド、１．０％〜１０％のベラトルム酸、２．０％〜２５％のカタルポシド、１．０％〜１５％のピクロシドＩＩ、１．０％〜１５％のイソバニロイルカタルポールおよび２．０％〜２５％の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールの混合重量比の混合化合物と薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む組成物の、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多量の有効成分を含有するシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルム（pseudolysimachion rotundum var. subintegrum）から単離された精製抽出物または精製抽出物から単離された化合物を有効成分として含む、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療用組成物ならびにその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、気道の閉塞を生じる肺の異常炎症性疾患によって引き起こされる肺疾患の１つである。ＣＯＰＤは、気流排出の障害に起因する呼吸困難を生じ、様々な特徴、例えば喘息の一般的な特徴の、気道制限または気道閉塞の可逆性不良、経時による進行性の発現などを示し、肺気腫および慢性閉塞性気管支炎に分類されることができる（非特許文献１）。
【０００３】
ＣＯＰＤは、心血管系疾患の罹患率および死亡率の危険因子の１つとして、および２００１年の世界規模での死亡原因の第５位として報告されている。慢性閉塞性肺疾患に対するグローバルイニシアチブ（Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease）（ＧＯＬＤ）基準（ＦＥＶ１とＦＶＣとの比が０．７未満）に基づく慢性閉塞性肺疾患の有病率は、４５歳を超える韓国人のうち１７．２％（男性２５．８％、女性９．６％）であった（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。
【０００４】
ほとんどのＣＯＰＤ患者は、３つの病理学的メカニズム（慢性閉塞性気管支炎、気腫および粘液栓）を有し、気腫および閉塞性気管支炎の割合に違いがあるかもしれないが、その全てが喫煙により誘発される。先進諸国において、タバコによる喫煙は、ＣＯＰＤの圧倒的に最も一般的な原因であるが、大気汚染（特に、燃料燃焼による室内大気汚染）、偏った食事および職業上の曝露を含む他のいくつかの危険因子がある。ＣＯＰＤは、加齢に認められる肺機能の正常な低下を加速させる特徴がある。ゆっくりと進行する気流制限が身体障害および早死をまねくが、稀に重症化する可変性気道閉塞および喘息の症状とは全く異なる。
【０００５】
ＣＯＰＤの病態生理学的作用および症候群が基本的に喘息のものと異なることが報告されている。ＣＯＰＤおよび喘息はともに、気道の炎症が関与するが、炎症プロセスの性質が著しく異なり、炎症細胞、メディエーター、炎症反応、解剖学的分布および抗炎症療法に対する反応が異なり、例えば（ａ）炎症細胞において、肥満細胞、好酸球、Ｄ４＋細胞（Ｔｈ２）、マクロファージなどは主に喘息の発症時に作用するが、好中球、ＣＤ８＋（Ｔｃ）などは主にＣＯＰＤの発症時に作用する、（ｂ）炎症性メディエーターにおいて、ロイコトリエンＢ、ヒスタミン、ＩＬ−４、ＩＬ−５、Ｉｌ−１３、エオタキシン、ＲＥＮＴＥＳ、酸化ストレスなどは主に喘息の発症に関与するが、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−８、ＧＲＯ−アルファなどは主にＣＯＰＤの発症に関与する、（ｃ）炎症性症候群において、成人の末梢気道に作用することにより生じ、種々の現象、例えば上皮化生、実質破壊、相対的不可逆性気道閉塞、慢性気管支炎、気腫などを示すＣＯＰＤに比べ、喘息は若年時に肺気道全体に作用することによる様々な炎症性症候群、例えばＡＨＲ（気道過敏性）、上皮細胞の剥落、線維症、実質性病変の非含有、粘液分泌、相対的可逆性気道閉塞、咳、くしゃみ、呼吸困難などを示す（非特許文献５、非特許文献６）。
【０００６】
ＣＯＰＤにおける病理学的研究は、主に末梢気道（細気管支）および肺実質に関与し、喘息は気道全ての炎症に関与するが肺実質に関与しない。細気管支の閉塞があり、線維症およびマクロファージおよびＴリンパ球による浸潤を含む。肺実質が破壊され、マクロファージおよびＣＤ８（細胞毒性）Ｔリンパ球数が増加する（非特許文献７）。重度ＣＯＰＤ患者における気管支生検では、マクロファージおよびＣＤ８細胞の浸潤と好中球数の増加とを伴う同様の変化が示されている（非特許文献８）。
【０００７】
喘息と対照的に、好酸球は憎悪または患者が同時に喘息を併発した時を除いて顕著ではなかった（非特許文献９、非特許文献１０）。
【０００８】
それゆえ、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療アプローチは、喘息のものと異なるはずであるが、現在の治療法は、両疾患を非特異的に治療することに集中している。それゆえ、ＣＯＰＤに特に認可された抗炎症治療法はなく、利用可能な抗炎症治療法は元々喘息用に開発されていた。ＣＯＰＤの研究が直面している課題は多面的であり、この疾患の複雑さおよび異種病因を基礎とする機構の解明が求められ、疾患の進行における炎症の役割を確認する必要がある（非特許文献１１、非特許文献１２）。
【０００９】
長時間作用性ベータアゴニスト、安全なステロイドおよび併用療法の形態での喘息の治療に利用可能な現在の治療法の改善が進められ、ＣＯＰＤでは、抗コリン作動薬が症状を緩和させる。憎悪を治療するためにステロイドが利用されているが、未だにＣＯＰＤの肺機能における進行性の低下に対してまたは喘息の発症に対して顕著な影響を与える治療は示されていない。
【００１０】
それに応じて、これまでにＣＯＰＤの治療に成功し、特化する可能性のある新たな薬剤を開発する研究が多く為されている。
【００１１】
本発明者らは、炎症細胞の再生に対する強力な阻害活性を有する、植物、動物などの天然資源由来の安全かつ有効な強力な治療剤を開発することに注力しており、最終的にシュードリシマキオン・ロンギフォリウム（Pseudolysimachion longifolium：セイヨウトラノオ）の抽出物が強力な抗炎症活性、抗アレルギー活性および抗喘息活性を示し（特許文献１）、更にはベルプロシド（６−Ｏ−３，４−ジヒドロキシベンゾイルカタルポール）、ピクロシドＩＩ（６−Ｏ−４−ヒドロキシ−３−メトキシベンゾイルカタルポール）、ベルミノシド（６−Ｏ−３，４−ジヒドロキシシンナモイルカタルポール）、６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール（６−Ｏ−３，４−ジメトキシベンゾイルカタルポール）、ミネコシド（６−Ｏ−３−ヒドロキシ−４−メトキシシンナモイルカタルポール）、カタルポールなどの上記抽出物から単離された様々な化合物も強力な抗炎症活性、抗アレルギー活性および抗喘息活性を示す（特許文献２）ことを見出している。
【００１２】
シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムは、韓国、中国、日本、サハリン島、およびロシアに分布する多年生草本である。
【００１３】
特許文献１に開示されるシュードリシマキオン・ロンギフォリウムの抽出物の抗炎症、抗アレルギーおよび抗喘息活性に対する以前の研究に基づき、本発明者らは、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物から単離された抗炎症、抗アレルギーおよび抗喘息活性を示すより強力でより豊富な成分を調製するより効率的な方法を開発することを試みた。
【００１４】
しかし、開示が引用することにより本明細書の一部をなす上記の引用文献のものより強力で特異的な抗ＣＯＰＤ活性を示す、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物から単離された、より強力でより豊富な成分またはその化合物を調製する効率的な方法については報告されておらず、または開示されていない。
【００１５】
それに応じて、本発明者らは、より豊富な有効成分、例えばシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物由来のカタルポール誘導体を含有する精製抽出物を調製する新規の工業化された方法を発見し、その精製抽出物または精製抽出物から単離された化合物はＢＡＬＢ／ｃ雄性マウスを用いた種々のインビボ試験、例えばＣＯＰＤ発症時に生じる炎症免疫細胞の増殖および活性ならびに好中球の肺への動員に対する阻害試験；肺胞上皮細胞の破壊に関与するケモカイン、例えばＭＩＰ−２／ＣＸＣＬ−２、ＴＮＦ−アルファ、ＫＣ／ＣＸＣＬ−１（ケモカインＧｒｏ−アルファ）およびＣＸＣＬ−８などの再生に対する阻害試験；ＳＰＦ（特定病原体除去）Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを用いた動物試験においてＮＦ−カッパＢ活性化を低下させることによるＩＬ−１ベータ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−アルファの放出およびＭＭＰ−９発現に対する低減効果を経て、ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験、例えば分子発現プロファイル変化試験などのＴｈ２細胞のＩＬ−４発現に対する作用を誘発するＭＵＣ５ＡＣ（オリゴマー粘液／ゲル形成）の発現に対する阻害試験において、ベータ−２−受容体アゴニストが反応することなく強力な抗ＣＯＰＤ活性を示した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】韓国特許第１０−８６００８０号
【特許文献２】韓国特許出願公開第１０−２００６−１２５４９９号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Barnes P.J.20014, Mediators of chronic obstructive pulmonary disease, Pharmacol. Rev. 56:515-548
【非特許文献２】Dong Soon Kim, Young Sam Kim, Ki-Suck Jung, Jung Hyun Chang, Chae-Man Lim, Jae Ho Lee, Soo-Taek Uh, Jae Jeong Shim, and Woo Jin Lew, on behalf of the Korean Academy of Tuberculosis and Respiratory Diseases, Am J Respir Crit Care Med Vol 172. pp 842-847, 2005
【非特許文献３】Don D.Sin and S.F.Paul Man, Chronic Obstructive Pulmonary Disease as a Risk Factor for Cardiovascular Morbidity and Mortality, Proc Am Thorac Soc Vol2. pp 8-11, 2005
【非特許文献４】A Sonia Buist, Mary Ann McBurnie, William M Vollmer, Suzanne Gillespie, Peter Burney, David M Mannino, Ana M B Menezes, Sean D Sullivan, Todd A Lee, Kevin B Weiss, Robert L Jensen, Guy B Marks, Amund Gulsvik, Ewa Nizankowska-Mogilnicka, International variation in the prevalence of COPD (The BOLD Study): a population-based prevalence study, Vol 370; 741-750, September 1, 2007
【非特許文献５】Barnes PJ (2000b) Mechanisms in COPD: differences from asthma. Chest 117 (Suppl): 10S-14S.
【非特許文献６】Saetta M,Turato G, Maestrelli P, Mapp CE, and Fabbri LM (2001) Cellular and structural bases of chronic obstructive pulmonary disease. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163: 1304-1309
【非特許文献７】Saetta M, Di Stefano A, Turato G, Facchini FM, Corbino L, Mapp CE, Maestrelli P, Ciaccia A, and Fabbri LM (1998) CD8T-lymphocytes in peripheral airways of smokers with chronic obstructive pulmonary disease. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 157:822-826.
【非特許文献８】Di Stefano A, Capelli A, Lusuardi M, Balbo P, Vecchio C, Maestrelli P, Mapp CE, Fabbri LM, Donner CF, and Saetta M (1998) Severity of airflow limitation is associated with severity of airway inflammation in smokers. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 158:1277-1285.
【非特許文献９】Fabbri L, Beghe B, Caramori G, Papi A, and Saetta M (1998) Similarities and discrepancies between exacerbations of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Thorax 53:803-808
【非特許文献１０】Fabbri LM, Romagnoli M, Corbetta L, Casoni G, Busljetic K, Turato G, Ligabue G, Ciaccia A, Saetta M, and Papi A (2003) Differences in airway inflammation in patients with fixed airflow obstruction due to asthma or chronic obstructive pulmonary disease. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167:418-424.
【非特許文献１１】Hele Dj, Belvisi MG, 2003. Novel therapies for the treatment of inflammatory airway disease, Expert. Opino. Invest. Drug, 12:5-18
【非特許文献１２】J Craig Fox and Mary F Fitzgerald; The role of animal models in the pharmacological evaluation of emerging anti-inflammatory agents for the treatment of COPD, Current Opinion in Pharmacology 2009, 9:231-242
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルム由来のカタルポール誘導体などの有効成分を含有する新規の精製抽出物またはベラトルム酸、ベルプロシド、カタルポシド、ピクロシドＩＩ、イソバニロイルカタルポールおよび６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールからなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含む、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療および予防用医薬組成物および健康食品を提供する。
【００１９】
本発明はまた、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルム由来のカタルポール誘導体などの有効成分を含有する新規の精製抽出物またはベラトルム酸、ベルプロシド、カタルポシド、ピクロシドＩＩ、イソバニロイルカタルポールおよび６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールからなる群から選択される少なくとも１つの化合物の、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療および予防への使用を提供する。
【００２０】
本発明はまた、哺乳動物における慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を治療または予防する方法であって、治療的有効量の、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルム由来のカタルポール誘導体などの有効成分を含有する新規の精製抽出物またはベラトルム酸、ベルプロシド、カタルポシド、ピクロシドＩＩ、イソバニロイルカタルポールおよび６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールからなる群から選択される少なくとも１つの化合物を、その薬学的に許容可能な担体と合わせて上記哺乳動物に投与することを含む、方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
したがって、本発明の目的は、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルム由来のカタルポール誘導体などの有効成分を含有する新規の精製抽出物またはベラトルム酸、ベルプロシド、カタルポシド、ピクロシドＩＩ、イソバニロイルカタルポールおよび６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールからなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含む、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療または予防用医薬組成物または健康機能性食品を提供することである。
【００２２】
本明細書で開示される「カタルポール誘導体」の用語は、ベルプロシド、カタルポシド、ピクロシドＩＩ、イソバニロイルカタルポールおよび６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールなどを含む。
【００２３】
本明細書で開示される「シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルム」の用語は、栽培されたまたは天然に生育した植物および商業的に入手可能な植物を含むが、本明細書ではこれらに限定されることを意図するものではない。
【００２４】
本明細書で開示される「新規の精製抽出物」の用語は、（ａ）ブタノールで分画した精製抽出物（以下、「ＡＴＣ１」と示す）および（ｂ）二次分画による精製抽出物（以下、「ＡＴＣ２」と示す）を含む。
【００２５】
具体的には、「ブタノールで分画した精製抽出物（ＡＴＣ１）」の用語は、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの総抽出物の重量（１００％）に対して１５％（ｗ／ｗ）〜５０％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、０．３％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、０．５％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、０．３％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、０．３％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および０．３％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール；好ましくはシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの総抽出物の重量（１００％）に対して２０％（ｗ／ｗ）〜２５％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、０．５％（ｗ／ｗ）〜５％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、１％（ｗ／ｗ）〜５％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、０．５％（ｗ／ｗ）〜５％（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、０．５％（ｗ／ｗ）〜５％（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および１％（ｗ／ｗ）〜５％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールを含有することを特徴とし、
および／またはシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの総抽出物（１００％）中に１２．３％（ｗ／ｗ）〜４７％（ｗ／ｗ）のカタルポール誘導体を含有し、１５．０部（ｗ／ｗ）〜１８．０部（ｗ／ｗ）のベルプロシド、２．１０部（ｗ／ｗ）〜２．６０部（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１部（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１．００部（ｗ／ｗ）〜１．３０部（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および２．００部（ｗ／ｗ）〜２．３０部（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール；好ましくは１６．０部（ｗ／ｗ）〜１７．０部（ｗ／ｗ）のベルプロシド、２．２０部（ｗ／ｗ）〜２．５０部（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１部（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１．１０部（ｗ／ｗ）〜１．２０部（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および２．１０部（ｗ／ｗ）〜２．２０部（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール；より好ましくは１６．２０部（ｗ／ｗ）〜１６．９９部（ｗ／ｗ）のベルプロシド、２．４０部（ｗ／ｗ）〜２．４５部（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１部（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１．１０部（ｗ／ｗ）〜１．１９部（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および２．１０部（ｗ／ｗ）〜２．１９部（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールの各カタルポール誘導体の重量間の相対混合比（ｗ／ｗ）を有することを特徴とする。
【００２６】
より具体的には、「ブタノールで分画した精製抽出物（ＡＴＣ１）」の用語は、第１の工程において、水、メタノール、エタノール、ブタノールなどのＣ１〜Ｃ４の低級アルコール、またはそれらの混合物、好ましくは水とエタノールとの混合物、より好ましくは水中３０％（ｗ／ｗ）〜８０％（ｗ／ｗ）のエタノールから選択される少なくとも１つの抽出溶媒を、乾燥したシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムに添加すること、第２の工程において、熱水による還流抽出、冷水抽出、超音波処理または従来の抽出、好ましくは１０℃〜１００℃、好ましくは２０℃〜９０℃の範囲の温度で３０分間〜７２時間、好ましくは６時間〜４８時間の範囲の期間の冷水抽出の後の還流抽出、より好ましくは１０℃〜６０℃、好ましくは２０℃〜５０℃の範囲の温度で３０分間〜７２時間、好ましくは６時間〜４８時間の範囲の期間の冷水抽出の後の４０℃〜１２０℃、好ましくは６０℃〜９０℃の範囲の温度で３０分間〜７２時間、好ましくは６時間〜４８時間の範囲の期間の還流抽出から選択される少なくとも１つの抽出法を繰り返し行い、第１の抽出物を得ること、第３の工程において、第１の抽出物を約０．５倍容量（ｖ／ｖ）〜１０倍容量（ｖ／ｖ）、好ましくは約１倍容量（ｖ／ｖ）〜５倍容量（ｖ／ｖ）の水に懸濁して懸濁した抽出物を得ること、ならびに約０．５倍容量（ｖ／ｖ）〜２０倍容量（ｖ／ｖ）、好ましくは約１倍容量（ｖ／ｖ）〜１０倍容量（ｖ／ｖ）のブタノールを添加し、水層とブタノール層とに分画し、ブタノール層を回収して、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの総抽出物の重量（１００％）に対して１５％（ｗ／ｗ）〜５０％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、０．３％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、０．５％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、０．３％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、０．３％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポールおよび０．３％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールを含有する、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を治療および予防する、ブタノールで分画した精製抽出物（ＡＴＣ１）を得ることのプロセスにより調製されることを特徴とする。
【００２７】
したがって、本発明の別の実施の形態では、本発明は、第１の工程において、水、メタノール、エタノール、ブタノールなどのＣ１〜Ｃ４の低級アルコール、またはそれらの混合物、好ましくは水とエタノールとの混合物、より好ましくは水中３０％（ｗ／ｗ）〜８０％（ｗ／ｗ）のエタノールから選択される少なくとも１つの抽出溶媒を、乾燥したシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムに添加する工程、第２の工程において、熱水による還流抽出、冷水抽出、超音波処理または従来の抽出、好ましくは１０℃〜１００℃、好ましくは２０℃〜９０℃の範囲の温度で３０分間〜７２時間、好ましくは６時間〜４８時間の範囲の期間の冷水抽出の後の還流抽出、より好ましくは１０℃〜６０℃、好ましくは２０℃〜５０℃の範囲の温度で３０分間〜７２時間、好ましくは６時間〜４８時間の範囲の期間の冷水抽出の後の４０℃〜１２０℃、好ましくは６０℃〜９０℃の範囲の温度で３０分間〜７２時間、好ましくは６時間〜４８時間の範囲の期間の還流抽出から選択される少なくとも１つの抽出法を繰り返し行い、第１の抽出物を得る工程、第３の工程において、第１の抽出物を約０．５倍容量（ｖ／ｖ）〜１０倍容量（ｖ／ｖ）、好ましくは約１倍容量（ｖ／ｖ）〜５倍容量（ｖ／ｖ）の水に懸濁して懸濁した抽出物を得る工程、ならびに約０．５倍容量（ｖ／ｖ）〜２０倍容量（ｖ／ｖ）、好ましくは約１倍容量（ｖ／ｖ）〜１０倍容量（ｖ／ｖ）のブタノールを添加し、水層とブタノール層とに分画し、ブタノール層を回収して、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの総抽出物の重量（１００％）に対して１５％（ｗ／ｗ）〜５０％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、０．３％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、０．５％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、０．３％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、０．３％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポールおよび０．３％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールを含有する、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を治療および予防する、ブタノールで分画した精製抽出物（ＡＴＣ１）を得る工程を含む、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムから単離したブタノールで分画した精製抽出物（ＡＴＣ１）を調製する方法も提供する。
【００２８】
具体的には、「二次分画による精製抽出物（ＡＴＣ２）」の用語は、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの総抽出物の重量（１００％）に対して３０％（ｗ／ｗ）〜６０％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、０．５％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、２％（ｗ／ｗ）〜２０％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および２％（ｗ／ｗ）〜２０％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール；好ましくはシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの総抽出物の重量（１００％）に対して４０％（ｗ／ｗ）〜５０％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、１％（ｗ／ｗ）〜５％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、３％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、２％（ｗ／ｗ）〜５％（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、２％（ｗ／ｗ）〜８％（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および３％（ｗ／ｗ）〜８％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールを含有することを特徴とし、
および／またはシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの総抽出物（１００％）中に３６．５％（ｗ／ｗ）〜９１％（ｗ／ｗ）のカタルポール誘導体を含有し、１３．０部（ｗ／ｗ）〜１６．０部（ｗ／ｗ）のベルプロシド、２．２０部（ｗ／ｗ）〜２．５０部（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１部（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１．１０部（ｗ／ｗ）〜１．４０部（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および２．００部（ｗ／ｗ）〜２．２０部（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール；好ましくは１４．０部（ｗ／ｗ）〜１５．０部（ｗ／ｗ）のベルプロシド、２．３０部（ｗ／ｗ）〜２．４５部（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１部（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１．２０部（ｗ／ｗ）〜１．３５部（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および２．００部（ｗ／ｗ）〜２．１０部（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール；より好ましくは１４．５０部（ｗ／ｗ）〜１４．９９部（ｗ／ｗ）のベルプロシド、２．３５部（ｗ／ｗ）〜２．４３部（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１部（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１．２５部（ｗ／ｗ）〜１．３４部（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および２．０１部（ｗ／ｗ）〜２．０９部（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールの各カタルポール誘導体の重量間の相対混合比（ｗ／ｗ）を有することを特徴とする。
【００２９】
より具体的には、「二次分画による精製抽出物（ＡＴＣ２）」の用語は、第１の工程において、水、メタノール、エタノール、ブタノールなどのＣ１〜Ｃ４の低級アルコール、またはそれらの混合物、好ましくは水とエタノールとの混合物、より好ましくは水中３０（ｗ／ｗ）〜８０（ｗ／ｗ）のエタノールから選択される少なくとも１つの抽出溶媒を、乾燥したシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムに添加すること、第２の工程において、熱水による還流抽出、冷水抽出、超音波処理または従来の抽出、好ましくは１０℃〜１００℃、好ましくは２０℃〜９０℃の範囲の温度で３０分間〜７２時間、好ましくは６時間〜４８時間の範囲の期間の冷水抽出の後の還流抽出、より好ましくは１０℃〜６０℃、好ましくは２０℃〜５０℃の範囲の温度で３０分間〜７２時間、好ましくは６時間〜４８時間の範囲の期間の冷水抽出の後の４０℃〜１２０℃、好ましくは６０℃〜９０℃の範囲の温度で３０分間〜７２時間、好ましくは６時間〜４８時間の範囲の期間の還流抽出から選択される少なくとも１つの抽出法を繰り返し行い、第１の抽出物を得ること、第３の工程において、第１の抽出物を約０．５倍容量（ｖ／ｖ）〜１０倍容量（ｖ／ｖ）、好ましくは約１倍容量（ｖ／ｖ）〜５倍容量（ｖ／ｖ）の水に懸濁して懸濁した抽出物を得ること、第３の工程において、約０．５倍容量（ｖ／ｖ）〜２０倍容量（ｖ／ｖ）、好ましくは約１倍容量（ｖ／ｖ）〜１０倍容量（ｖ／ｖ）のブタノールを添加し、水層とブタノール層とに分画し、ブタノール層を回収してブタールで分画した精製抽出物（ＡＴＣ１）を得ること、ならびにブタノールで分画した精製抽出物（ＡＴＣ１）を、逆相分配クロマトグラフィー、順相分配クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーからなる群から選択される少なくとも１つの精製プロセスに供して、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの総抽出物の重量（１００％）に対して３０％（ｗ／ｗ）〜６０％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、０．５％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、２％（ｗ／ｗ）〜２０％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）イソバニロイルカタルポールおよび２％（ｗ／ｗ）〜２０％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールを含有する、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を治療または予防する、二次分画による精製抽出物（ＡＴＣ２）を得ることのプロセスにより調製されることを特徴とする。
【００３０】
したがって、本発明の別の実施の形態では、本発明は、第１の工程において、水、メタノール、エタノール、ブタノールなどのＣ１〜Ｃ４の低級アルコール、またはそれらの混合物、好ましくは水とエタノールとの混合物、より好ましくは水中３０％（ｗ／ｗ）〜８０％（ｗ／ｗ）のエタノールから選択される少なくとも１つの抽出溶媒を、乾燥したシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムに添加する工程、第２の工程において、熱水による還流抽出、冷水抽出、超音波処理または従来の抽出、好ましくは１０℃〜１００℃、好ましくは２０℃〜９０℃の範囲の温度で３０分間〜７２時間、好ましくは６時間〜４８時間の範囲の期間の冷水抽出の後の還流抽出、より好ましくは１０℃〜６０℃、好ましくは２０℃〜５０℃の範囲の温度で３０分間〜７２時間、好ましくは６時間〜４８時間の範囲の期間の冷水抽出の後の４０℃〜１２０℃、好ましくは６０℃〜９０℃の範囲の温度で３０分間〜７２時間、好ましくは６時間〜４８時間の範囲の期間の還流抽出から選択される少なくとも１つの抽出法を繰り返し行い、第１の抽出物を得る工程、第３の工程において、第１の抽出物を約０．５倍容量（ｖ／ｖ）〜１０倍容量（ｖ／ｖ）、好ましくは約１倍容量（ｖ／ｖ）〜５倍容量（ｖ／ｖ）の水に懸濁して懸濁した抽出物を得る工程、第３の工程において、約０．５倍容量（ｖ／ｖ）〜２０倍容量（ｖ／ｖ）、好ましくは約１倍容量（ｖ／ｖ）〜１０倍容量（ｖ／ｖ）のブタノールを添加し、水層とブタノール層とに分画し、ブタノール層を回収してブタールで分画した精製抽出物（ＡＴＣ１）を得る工程、ならびにブタノールで分画した精製抽出物（ＡＴＣ１）を、逆相分配クロマトグラフィー、順相分配クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーからなる群から選択される少なくとも１つの更なる精製プロセスに供して、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの総抽出物の重量（１００％）に対して３０％（ｗ／ｗ）〜６０％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、０．５％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、２％（ｗ／ｗ）〜２０％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポールおよび２％（ｗ／ｗ）〜２０％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールを含有する、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を治療または予防する、二次分画による精製抽出物（ＡＴＣ２）を得る工程を含む、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムから単離された二次分画による精製抽出物（ＡＴＣ２）を調製する方法も提供する。
【００３１】
具体的には、「更なる精製プロセス」の用語は、（ｉ）逆相分配クロマトグラフィー、（ｉｉ）順相分配クロマトグラフィー、（ｉｉｉ）イオン交換クロマトグラフィー、または（ｉｖ）サイズ排除クロマトグラフィー、好ましくは逆相分配クロマトグラフィー、または極性物質を溶出しながら、非極性物質を保持することができる固定相としての任意の樹脂、例えばセファデックス、セファデックスＬＨ２０、セファデックスＧ−２５、セファデックスＧ−１０、セファロース、スーパーデックス、メチルアクリレート樹脂、カルボキシメチルセルロース、スルホプロピルセルロース、カルボキシメチルセファデックス、スルホプロピルセファデックス、カルボキシメチルセファロース、スルホプロピルセファロースなどのセファデックス樹脂；Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｘ、ＨＰ２０、ＰＲＰ−ｈ１ポリマーなどのスチレン−ジビニルベンゼンコポリマーを使用する逆ポリマー樹脂、もしくはメタクリレート支持樹脂など；ＢＰＣ（結合相（クロマトグラフィー）製品、YMC Co. Ltdから入手したシリカ製品、DAISO Co. Ltdから入手したシリカ製品、ASAHI Co. Ltdから入手したシリカ製品、COSMOSYL Co. Ltdから入手したシリカ製品などの通常のシリカゲル；YMC Co. Ltdから入手したＯＤＳ製品、DAISO Co. Ltdから入手したＯＤＳ製品、ASAHI Co. Ltdから入手したＯＤＳ製品、CHEMCO Co. Ltdから入手したＯＤＳ製品、Merck Co. Ltdから入手したＯＤＳ製品、COSMOSYL Co. Ltdから入手したＯＤＳ製品、FUJI Co. Ltdから入手したＯＤＳ製品などのＨＰＬＣフィルターに使用されるＯＤＳ製品を使用する任意のクロマトグラフィーから選択される。
【００３２】
（ｉ）逆相分配クロマトグラフィーを本発明の更なる精製プロセスとして採用する好ましい実施の形態では、「上述の逆相分配クロマトグラフィーにおける固定相」は、極性物質を溶出しながら非極性物質を保持することができる固定相としての逆相物質などの任意の固定相、好ましくは、シリカゲル系固定相、ポリスチレンなどのポリマー系固定相、より好ましくはＣ２、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、１４、Ｃ１６、Ｃ１８などのシリカゲル誘導体であってもよく、またはＰＳ−２、Ｏａｓｉｓ  ＨＬＢなどのポリマー系固定相、更に好ましくは、逆相シリカゲル（Ｃ１８（ＩＶ）−Ｄ）、YMC Co. Ltd.によるＯＤＳ−Ａ／ＯＤＳ−ＡＱ製品、CHEMCO Co. Ltd.によるＳＰ−Ｃ−ＯＤＳ製品、DAISO Co. Ltd.によるＳＰ−ＯＤＳ−ＲＰＳ製品、COSMOSYL Co. Ltd.による５Ｃ１８製品、FUJI Co. Ltd.によるＣｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ製品などであってもよい。
【００３３】
（ｉ）逆相分配クロマトグラフィーを本発明の更なる精製プロセスとして採用する好ましい実施の形態では、「上述の（ｉ）逆相分配クロマトグラフィーにおける移動相」は、水、アセトニトリル、メタノール、エタノール、ブタノールなどの低級アルコール、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）またはそれらの混合物、好ましくは水、メタノール、エタノール、ブタノールなどの低級アルコール、またはそれらの混合物、より好ましくは水とメタノールとの混合溶媒、更に好ましくは極性物質を溶出するため９０：１０（ｖ／ｖ）から開始して６０：４０（ｖ／ｖ）までの水とメタノールとの混合溶媒から選択される少なくとも１つの溶媒であってもよい。
【００３４】
（ｉｉ）順相分配クロマトグラフィーを本発明の更なる精製プロセスとして採用する好ましい実施の形態では、「上述の順相分配クロマトグラフィーにおける固定相」は、非極性物質を溶出しながら、極性物質を保持することができる、固定相としての順相物質、好ましくはシリカゲル、フルオロシル、またはアルミナ系固定相、ＣＮ、ジオール、またはＮＨ２部分ポリマー系固定相など、より好ましくはシリカゲル、フルオロシル、またはアルミナ系固定相などの任意の固定相であってもよい。
【００３５】
（ｉｉ）順相分配クロマトグラフィーを本発明の更なる精製プロセスとして採用する好ましい実施の形態では、「上述の（ｉｉ）順相分配クロマトグラフィーにおける移動相」は、非極性物質を溶出するために、ヘキサン、ヘプタン、酢酸エチル、エタノール、ジエチルエーテル、２−プロパノールまたはそれらの混合物、好ましくはヘキサン、ヘプタン、酢酸エチルまたはそれらの混合物から選択される少なくとも１つの溶媒とすることができる。
【００３６】
（ｉｉｉ）イオン交換クロマトグラフィーを本発明の更なる精製プロセスとして採用する好ましい実施の形態では、「上述の（ｉｉｉ）イオン交換クロマトグラフィーにおける固定相」は、荷電した架橋部分を有する固定相としての任意の高分子固定相であってもよく、好ましくは陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂、または合成吸着剤など、より好ましくは、ＡＧ  ５０Ｗ−ｘ８、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲ−１２０、Ｄｏｗｅｘ  ６０Ｗ−ｘ８、ＳＫＩＢなどの強酸性陽イオン交換樹脂；Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−６７、Ｄｏｗｅｘ  ３−ｘ４Ａなどの弱酸性陽イオン交換樹脂；ＤＩＡＩＯＮ  ＳＫＩＢ、ＤＩＡＩＯＮ  ＰＫ２１６、ＤＩＡＩＯＮ  ＣＲ２０、ＤＩＡＩＯＮ  ＵＢＫ５５５（Mitsubishi Chemical Co.）、ＴＲＩＬＩＴＥ  ＳＰＣ  １６０Ｈ、ＴＲＩＬＩＴＥ  ＳＰＣ  １８０Ｈ、ＴＲＩＬＩＴＥ  ＳＰＣ  ４００ＪＨ（Samyang Co. Ltd.）、ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ  ２００Ｃ  Ｎａ、ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ  ＣＧ５０、ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ  ＣＲ１３１０  Ｎａ、ＡＭＢＥＲＪＥＴ  ２００Ｈ、ＡＭＢＥＲＬＹＳＴ  １３１  ＷＥＴ、ＡＬＢＥＲＬＹＳＴ  ２３２  ＷＥＴ（ROHM and HAAS Co. Ltd.）、Ｌｅｗａｔｉｔ  ＶＰ  ＯＣ  １８００、Ｌｅｗａｔｉｔ  ＶＰ  ＯＣ  １８１２、Ｌｅｗａｔｉｔ  ＭＤＳ１３６８  Ｎａ、Ｌｅｗａｉｔｉｔ  Ｋ１２２１（Bayer Co. Ltd.）、ＰＵＲＯＬＩＴＥ  ＰＣＲ８３３ＣＡ、ＰＵＲＯＬＩＴＥ  Ｃ１４５（Purolite Co. Ltd.）、ＭＦＧ２１０、ＭＦＧ  ２５０（Finex Co. Ltd.）などの強塩基性陽イオン交換樹脂；ＳＡ１１Ａ、ＳＡ２０Ａ、ＳＡ２１Ａなどの強塩基性陰イオン交換樹脂；またはＣａｐｔｏＱ（GE Healthcare Co. Ltd.）、またはＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＱＥＡ（Tosoh Co. Ltd.）、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（GE Healthcare Co. Ltd）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＴＭＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＨＩＣＡＰ（Merck KGaA Co. LtdまたはDarmstadt Co. Ltd.）などのそれと同様の特性を有する樹脂、更に好ましくは、ＳＡ２１Ａ；ＳＰ２０７、ＨＰ２０ＳＳ、ＨＰ２０などの吸着剤、より好ましくはＨＰ２０であってもよい。
【００３７】
（ｉｖ）サイズ排除クロマトグラフィーを本発明の更なる精製プロセスとして採用する好ましい実施の形態では、「上述の（ｉｖ）サイズ排除クロマトグラフィーにおける固定相」は、サンプルのサイズにより分離することができる固定相としての任意のゲル型固定相であってもよく、好ましくは、ｓｅｐｈａｄｅｘ（例えば、ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５）などのデキストラン系ゲル、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（例えば、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ−Ｓ４００）などのポリアクリルアミド系ゲル、ＳｕｐｅｒｏｓｅまたはＳｅｐｈａｒｏｓｅ（例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ）などのアガロース系ゲル、またはデキストランと組合せたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標））、もしくは架橋アガロースゲル（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（商標））などのそれらの組合せであってもよいが、本明細書ではそれらに限定されない。「上述の（ｉｖ）サイズ排除クロマトグラフィーにおける移動相」は、酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液、酢酸アンモニウム緩衝液、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ［２−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール］、ＡＤＡ［Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジアセテート）、ＰＩＰＥＳ［ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）］、ＢＥＳ［Ｎ．Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ［３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）］、ＴＥＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸］、ＨＥＰＥＳ［Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）など；好ましくは酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液または酢酸アンモニウム緩衝液からなる群から選択される緩衝溶液とすることができる。
【００３８】
本発明の好ましい実施の形態では、本発明は、（ｉ）逆相分配クロマトグラフィー、（ｉｉ）順相分配クロマトグラフィー、（ｉｉｉ）イオン交換クロマトグラフィー、（ｉｖ）サイズ排除クロマトグラフィー、またはそれらの組合せに加えて、本明細書に開示される更なる精製プロセスとして（ｖ）ゲル浸透クロマトグラフィーまたはゲル濾過クロマトグラフィーを行うこともできる。
【００３９】
また、本発明は、上述の調製方法により調製した（ａ）ブタノールで画分した精製抽出物（以下、「ＡＴＣ１」と示す）または（ｂ）二次分画による精製抽出物（以下、「ＡＴＣ２」と示す）などの新規の精製抽出物を提供する。
【００４０】
本発明は、上記の調製方法により調製された、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物からブタノールで分画した新規の精製抽出物（ＡＴＣ１）であって、該新規の精製抽出物がシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの総抽出物（１００％）中に１２．３％（ｗ／ｗ）〜４７％（ｗ／ｗ）のカタルポール誘導体を含有し、該カタルポール誘導体が、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの総抽出物の重量（１００％）に対して１５％（ｗ／ｗ）〜５０％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、０．３％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、０．５％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、０．３％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、０．３％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および０．３％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール、好ましくは２０％（ｗ／ｗ）〜２５％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、０．５％（ｗ／ｗ）〜５％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、１％（ｗ／ｗ）〜５％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、０．５％（ｗ／ｗ）〜５％（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、０．５％（ｗ／ｗ）〜５％（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および１％（ｗ／ｗ）〜５％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールからなる、新規の精製抽出物も提供する。
【００４１】
本発明は、上記の調製方法により調製された、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物からブタノールで分画した新規の精製抽出物（ＡＴＣ１）であって、１５．０部（ｗ／ｗ）〜１８．０部（ｗ／ｗ）のベルプロシド、２．１０部（ｗ／ｗ）〜２．６０部（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１部（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１．００部（ｗ／ｗ）〜１．３０部（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および２．００部（ｗ／ｗ）〜２．３０部（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール；好ましくは１６．０部（ｗ／ｗ）〜１７．０部（ｗ／ｗ）のベルプロシド、２．２０部（ｗ／ｗ）〜２．５０部（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１部（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１．１０部（ｗ／ｗ）〜１．２０部（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および２．１０部（ｗ／ｗ）〜２．２０部（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール；より好ましくは１６．２０部（ｗ／ｗ）〜１６．９９部（ｗ／ｗ）のベルプロシド、２．４０部（ｗ／ｗ）〜２．４５部（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１部（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１．１０部（ｗ／ｗ）〜１．１９部（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および２．１０部（ｗ／ｗ）〜２．１９部（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールの各カタルポール誘導体の重量間の相対混合比（ｗ／ｗ）を示す、新規の精製抽出物も提供する。
【００４２】
本発明は、上記の調製方法により調製された、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物からの二次分画による新規の精製抽出物（ＡＴＣ２）であって、該新規の精製抽出物がシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの総抽出物（１００％）中に３６．５％（ｗ／ｗ）〜９１％（ｗ／ｗ）のカタルポール誘導体を含有し、該カタルポール誘導体が、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの総抽出物の重量（１００％）に対して３０％（ｗ／ｗ）〜６０％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、０．５％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、２％（ｗ／ｗ）〜２０％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および２％（ｗ／ｗ）〜２０％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール；好ましくはシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの総抽出物の重量（１００％）に対して４０％（ｗ／ｗ）〜５０％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、１％（ｗ／ｗ）〜５％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、３％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、２％（ｗ／ｗ）〜５％（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、２％（ｗ／ｗ）〜８％（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および３％（ｗ／ｗ）〜８％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールからなる、新規の精製抽出物も提供する。
【００４３】
本発明は、上記の調製方法により調製された、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物からの二次分画による新規の精製抽出物（ＡＴＣ２）であって、１３．０部（ｗ／ｗ）〜１６．０部（ｗ／ｗ）のベルプロシド、２．２０部（ｗ／ｗ）〜２．５０部（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１部（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１．１０部（ｗ／ｗ）〜１．４０部（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および２．００部（ｗ／ｗ）〜２．２０部（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール；好ましくは１４．０部（ｗ／ｗ）〜１５．０部（ｗ／ｗ）のベルプロシド、２．３０部（ｗ／ｗ）〜２．４５部（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１部（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１．２０部（ｗ／ｗ）〜１．３５部（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および２．００部（ｗ／ｗ）〜２．１０部（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール；より好ましくは１４．５０部（ｗ／ｗ）〜１４．９９部（ｗ／ｗ）のベルプロシド、２．３５部（ｗ／ｗ）〜２．４３部（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１部（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１．１５部（ｗ／ｗ）〜１．２４部（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および２．０１部（ｗ／ｗ）〜２．０９部（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールの各カタルポール誘導体の重量間の相対混合比（ｗ／ｗ）を示す、新規の精製抽出物も提供する。
【００４４】
本明細書で開示される「精製抽出物」の用語は、真空抽出法、凍結乾燥法、または熱風乾燥法などにより調製される乾燥形態として使用される場合がある。
【００４５】
本明細書で開示される「予防」の用語は、本発明の組成物を投与することによって、本明細書で開示される或る特定の疾患または障害の発症を阻害または遅延する任意の作用を含み、また、本明細書で開示される「治療」の用語は、本発明の組成物を投与することによって、本明細書で開示される或る特定の疾患または障害と関連する症状を緩和または有利に変化させる任意の作用を含む。
【００４６】
本発明者らは、精製抽出物を調製する新規の工業化された方法では、先行技術に開示された従来の方法により調製された粗抽出物、この場合カタルポール誘導体の含量が種々のＨＰＬＣ分析によりわずか８．４９％（ｗ／ｗ）であるのに比べ、より豊富な有効成分、すなわち３６．５％（ｗ／ｗ）〜９１．０％（ｗ／ｗ）の、例えばシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物由来のカタルポール誘導体を提供することができ、例えば、本発明の精製抽出物（ＡＴＣ１）は１７．６０％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、０．７２％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、２．６２％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１．０８％（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１．２６％（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポールおよび２．３６％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールを含有し（実施例２を参照されたい）、本発明の精製抽出物（ＡＴＣ２）は、４３．８３％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、１．８０％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、７．０７％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、２．９３％（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、３．８５％（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポールおよび６．１５％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールを含有するが、先行技術に開示の従来の方法により調製された粗抽出物（ＣＸ）は、粗抽出物であるシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの総抽出物の重量（１００％）に対して僅か５．９％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、０．２１％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、０．８２％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、０．４０％（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、０．４２％（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポールおよび０．７４％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールを含有するに過ぎないことを発見し、また、精製抽出物または精製抽出物から単離された化合物が、ＢＡＬＢ／ｃ雄性マウスを用いた種々のｉｎ  ｖｉｖｏ試験、例えばＣＯＰＤ発症時に生じる炎症免疫細胞の増殖および活性ならびに好中球の肺への動員に対する阻害試験；肺胞上皮細胞の破壊に関与するケモカイン、例えばＭＩＰ−２／ＣＸＣＬ−２、ＴＮＦ−アルファ、ＫＣ／ＣＸＣＬ−１（ケモカインＧｒｏ−アルファ）およびＣＸＣＬ−８などの再生に対する阻害試験；ＳＰＦ（特定病原体除去）Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを用いた動物試験においてＮＦ−カッパＢ活性化を低下させることによるＩＬ−１ベータ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−アルファの放出およびＭＭＰ−９発現に対する低減効果を経て、ならびにインビトロ試験、例えば分子発現プロファイル変化試験などのＴｈ２細胞のＩＬ−４発現に対する作用を誘発するＭＵＣ５ＡＣ（オリゴマー粘液／ゲル形成）の発現に対する阻害試験において、ベータ−２−受容体アゴニストが反応することなく強力な抗ＣＯＰＤ活性を示すことを発見した。
【００４７】
本発明者らはまた、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を治療および予防する、ベラトルム酸、ベルプロシド、カタルポシド、ピクロシドＩＩ、イソバニロイルカタルポールおよび６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール間の最大混合重量比、すなわちベルプロシド（ＡＴＣ１−６８．６％；ＡＴＣ２−６６．８％、化合物の総重量を基準に算出された含量の範囲：４５ｗ／ｗ％〜９０ｗ／ｗ％）、ベラトルム酸（ＡＴＣ１−２．８％；ＡＴＣ２−２．７％、化合物の総重量を基準に算出された含量の範囲：１．５ｗ／ｗ％〜４．０ｗ／ｗ％）、カタルポシド（ＡＴＣ１−１０．２％；ＡＴＣ２−１０．８％、化合物の総重量を基準に算出された含量の範囲：７．０ｗ／ｗ％〜１４．０ｗ／ｗ％）、ピクロシドＩＩ（ＡＴＣ１−４．２％；ＡＴＣ２−４．５％、化合物の総重量を基準に算出された含量の範囲：３．０ｗ／ｗ％〜６．０ｗ／ｗ％）、イソバニロイルカタルポール（ＡＴＣ１−４．９％；ＡＴＣ２−５．８％、化合物の総重量を基準に算出された含量の範囲：３．０ｗ／ｗ％〜８．０ｗ／ｗ％）および６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール（ＡＴＣ１−９．２％；ＡＴＣ２−９．４％、化合物の総重量を基準に算出された含量の範囲：６．０ｗ／ｗ％〜１２．０ｗ／ｗ％）を発見した。
【００４８】
それに応じて、本発明の他の態様において、本発明は、４０％〜９３％のベルプロシド、１．０％〜１０％のベラトルム酸、２．０％〜２５％のカタルポシド、１．０％〜１５％のピクロシドＩＩ、１．０％〜１５％のイソバニロイルカタルポールおよび２．０％〜２５％の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール、好ましくは４５％〜９０％のベルプロシド、１．０％〜７．０％のベラトルム酸、３．０％〜１５％のカタルポシド、２．０％〜１０％のピクロシドＩＩ、２．０％〜１０％のイソバニロイルカタルポールおよび２．０％〜１５％の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールの混合重量比の混合化合物を含む、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療または予防用医薬組成物または健康機能性食品を提供する。
【００４９】
本発明は、４０％〜９３％のベルプロシド、１．０％〜１０％のベラトルム酸、２．０％〜２５％のカタルポシド、１．０％〜１５％のピクロシドＩＩ、１．０％〜１５％のイソバニロイルカタルポールおよび２．０％〜２５％の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール、好ましくは４５％〜９０％のベルプロシド、１．０％〜７．０％のベラトルム酸、３．０％〜１５％のカタルポシド、２．０％〜１０％のピクロシドＩＩ、２．０％〜１０％のイソバニロイルカタルポールおよび２．０％〜１５％の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールの混合重量比の混合化合物と薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療または予防用医薬組成物または健康機能性食品を提供する。
【００５０】
それに応じて、本発明の他の態様において、本発明は、上記の方法により調製された有効成分を含有する新規の精製抽出物またはベラトルム酸、ベルプロシド、カタルポシド、ピクロシドＩＩ、イソバニロイルカタルポールおよび６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールからなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含む、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療または予防用医薬組成物または健康機能性食品を提供する。
【００５１】
本発明は、上記の方法により調製された有効成分を含有する新規の精製抽出物またはベラトルム酸、ベルプロシド、カタルポシド、ピクロシドＩＩ、イソバニロイルカタルポールおよび６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールからなる群から選択される少なくとも１つの化合物と薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療または予防用医薬組成物を提供する。
【００５２】
本発明の別の態様において、上記の方法により調製された新規の精製抽出物またはベラトルム酸、ベルプロシド、カタルポシド、ピクロシドＩＩ、イソバニロイルカタルポールおよび６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールからなる群から選択される少なくとも１つの化合物の、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を治療または予防するために使用される医薬品の製造への使用も提供される。
【００５３】
本明細書で定義される「薬学的に許容可能な担体または賦形剤」の用語は、「薬学的添加物」、すなわち、医薬品を製造するのに使用される不活性な原料を含む。薬学的添加物として、色素、香味料、結合剤、軟化剤、充填剤、滑剤、防腐剤、および他にも多くの分類が挙げられる。一般的な賦形剤として、当該技術分野（食品医薬品局のホームページ：www.fda.govまたは医薬品情報オンラインwww.drugs.comを参照されたい）または以前の文献（例えば、Rowe, Raymond C et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, Pharmaceutical Press, 7th Edition, 2012）でよく知られている、コーンスターチ、乳糖、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ショ糖、ゼラチン、ステアリン酸カルシウム、二酸化ケイ素、シェラックおよびグレーズが挙げられる。
【００５４】
本発明の別の態様において、哺乳動物における慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を治療または予防する方法であって、治療的有効量の、上記の方法により調製される新規の精製抽出物またはベラトルム酸、ベルプロシド、カタルポシド、ピクロシドＩＩ、イソバニロイルカタルポールおよび６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールからなる群から選択される少なくとも１つの化合物を、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）に苦しむ哺乳動物に投与することを含む、方法も提供される。
【００５５】
本発明の別の態様において、哺乳動物における慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を治療または予防する方法であって、治療的有効量の、上記の方法により調製された新規の精製抽出物またはベラトルム酸、ベルプロシド、カタルポシド、ピクロシドＩＩ、イソバニロイルカタルポールおよび６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールからなる群から選択される少なくとも１つの化合物と薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む組成物を、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）に苦しむ哺乳動物に投与することを含む、方法も提供される。
【００５６】
本発明の別の態様において、哺乳動物における慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を治療または予防する方法であって、治療的有効量の、４０％〜９３％のベルプロシド、１．０％〜１０％のベラトルム酸、２．０％〜２５％のカタルポシド、１．０％〜１５％のピクロシドＩＩ、１．０％〜１５％のイソバニロイルカタルポールおよび２．０％〜２５％の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール、好ましくは４５％〜９０％のベルプロシド、１．０％〜７．０％のベラトルム酸、３．０％〜１５％のカタルポシド、２．０％〜１０％のピクロシドＩＩ、２．０％〜１０％のイソバニロイルカタルポールおよび２．０％〜１５％の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールの混合重量比の混合化合物を、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）に苦しむ哺乳動物に投与することを含む、方法も提供される。
【００５７】
本発明の別の態様において、哺乳動物における慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を治療または予防する方法であって、治療的有効量の、４０％〜９３％のベルプロシド、１．０％〜１０％のベラトルム酸、２．０％〜２５％のカタルポシド、１．０％〜１５％のピクロシドＩＩ、１．０％〜１５％のイソバニロイルカタルポールおよび２．０％〜２５％の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール、好ましくは４５％〜９０％のベルプロシド、１．０％〜７．０％のベラトルム酸、３．０％〜１５％のカタルポシド、２．０％〜１０％のピクロシドＩＩ、２．０％〜１０％のイソバニロイルカタルポールおよび２．０％〜１５％の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールの混合重量比の混合化合物と薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む組成物を、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）に苦しむ哺乳動物に投与することを含む、方法も提供される。
【００５８】
本発明の別の態様において、上記の方法により調製された新規の精製抽出物またはベラトルム酸、ベルプロシド、カタルポシド、ピクロシドＩＩ、イソバニロイルカタルポールおよび６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールからなる群から選択される少なくとも１つの化合物と薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む組成物の、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療または予防のために使用される医薬品の製造への使用も提供される。
【００５９】
本発明の別の態様において、４０％〜９３％のベルプロシド、１．０％〜１０％のベラトルム酸、２．０％〜２５％のカタルポシド、１．０％〜１５％のピクロシドＩＩ、１．０％〜１５％のイソバニロイルカタルポールおよび２．０％〜２５％の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール、好ましくは４５％〜９０％のベルプロシド、１．０％〜７．０％のベラトルム酸、３．０％〜１５％のカタルポシド、２．０％〜１０％のピクロシドＩＩ、２．０％〜１０％のイソバニロイルカタルポールおよび２．０％〜１５％の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールの混合重量比の混合化合物と薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む組成物の、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療または予防のために使用される医薬品の製造への使用も提供される。
【００６０】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を治療または予防するための本発明の組成物は、組成物の総重量に対して０．１重量％〜９９重量％、好ましくは０．１重量％〜５０重量％の上記抽出物または化合物を含むことができる。
【００６１】
本発明による組成物を薬学的に許容可能な担体、アジュバントまたは希釈剤、例えば、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱物油を含有する医薬組成物として提供することができる。上記製剤は、追加的に、充填剤、抗凝集剤、滑剤、湿潤剤、香味剤、乳化剤、防腐剤などを含んでもよい。本発明の組成物は、当該技術分野でよく知られている任意の手順を採用することにより、患者に投与した後の上記有効成分の即時放出、持続放出または遅延放出を提供するように製剤化されてもよい。
【００６２】
例えば、本発明の組成物を、油、プロピレングリコールまたは注射剤を製造するのに通常使用される他の溶媒に溶解することができる。担体の好適な例として、生理学的食塩水、ポリエチレングリコール、エタノール、植物油、ミリスチン酸イソプロピルなどが挙げられるが、それらに限定されない。局所投与に対しては、本発明の抽出物を軟膏およびクリームの形態に製剤化することができる。
【００６３】
本組成物を含有する医薬製剤は、経口剤形（粉末、錠剤、カプセル、軟カプセル、水性薬剤、シロップ、エリキシル、丸剤、粉末、サシェ、粒剤）、または局所用調製物（クリーム、軟膏、ローション、ジェル、香膏、パッチ、ペースト、スプレー溶液、エアロゾルなど）、または注射用調製物（溶液、懸濁液、エマルション）などの任意の形態で調製することができる。
【００６４】
医薬剤形の本発明の組成物は、それらの薬学的に許容可能な塩の形態で使用されてもよく、さらに、単独でまたは他の薬学的活性化合物と適当な関連のもと、また同じく、それらと組合せて使用されてもよい。
【００６５】
本発明の抽出物または化合物の望ましい用量は、被験体の状態および体重、重症度、薬剤の形態、投与経路および期間に応じて変化し、当業者により選択され得る。しかしながら、所望の効果を得るため、一般的には、１日当たり体重１ｋｇ当たり本発明の独創的な抽出物を０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲の量で投与することが推奨される。上記用量は、１日１回投与されてもよく、１日に数回に分けて投与されてもよい。
【００６６】
本発明の医薬組成物を、様々な経路で哺乳動物（ラット、マウス、家畜またはヒト）などの被験動物に投与することができる。全ての投与様式を考慮する。例えば、投与は経口で、経直腸で、または静脈内、筋肉内、皮下、皮内、髄腔内、硬膜外もしくは脳室内の注射により行うことができる。
【００６７】
また、様々な機能性健康食品および保健用食品の調製において、本発明の独創的な抽出物を主成分または添加物および補助剤として使用することができる。
【００６８】
それに応じて、本発明の他の目的は、治療的有効量の、上記の方法により調製された有効成分を含有する新規の精製抽出物またはベラトルム酸、ベルプロシド、カタルポシド、ピクロシドＩＩ、イソバニロイルカタルポールおよび６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールからなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含む、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を予防または緩和する健康機能性食品を提供することである。
【００６９】
それに応じて、本発明の他の目的は、４０％〜９３％のベルプロシド、１．０％〜１０％ベラトルム酸、２．０％〜２５％のカタルポシド、１．０％〜１５％のピクロシドＩＩ、１．０％〜１５％のイソバニロイルカタルポールおよび２．０％〜２５％の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール、好ましくは４５％〜９０％のベルプロシド、１．０％〜７．０％のベラトルム酸、３．０％〜１５％のカタルポシド、２．０％〜１０％のピクロシドＩＩ、２．０％〜１０％のイソバニロイルカタルポールおよび２．０％〜１５％の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールの混合重量比の混合化合物を含む、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を予防または緩和する健康機能性食品を提供することである。
【００７０】
「機能性健康食品」の用語は、本明細書では「ヒトまたは哺乳動物において目的とする疾患を予防または改善するため本発明の抽出物を従来の食品に添加することにより物理的機能性または生理学的機能性などの増強された機能性を有する機能性食品」と定義される。
【００７１】
本発明の他の目的は、治療的有効量の、上記の方法により調製された豊富な有効成分を含有する新規の精製抽出物またはベラトルム酸、ベルプロシド、カタルポシド、ピクロシドＩＩ、イソバニロイルカタルポールおよび６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールからなる群から選択される少なくとも１つの化合物と合わせて食品学的に許容可能な添加物を含む、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を予防または緩和する保健用食品を提供することである。
【００７２】
「保健用食品」の用語は、本明細書では「添加物の形態として少量で、または粉末、顆粒、カプセル剤、丸剤、錠剤などの形態として全量で、特定の意図した効果を示さないが、全体的な意図した効果を示す本発明の抽出物または化合物（複数の場合もあり）を含有する食品」と定義される。
【００７３】
本明細書で定義される「食品学的に許容可能な添加物」は、「直接または間接に、任意の食品の成分となる、またはそうでなければ任意の食品の特徴に影響を及ぼす、または合理的にそれが予想される用途の任意の物質」を含み、その起源に応じて３つの群、すなわち、（１）ケトン、グリシン、クエン酸カリウム、ニコチン酸などの化学合成添加物；（２）カキ色素、カンゾウ抽出物、結晶セルロース、グアーガムなどの天然添加物；（３）Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、防腐剤、タール色素などのそれらとの混合添加物など、または当該技術分野もしくは以前の文献（GSFA Online：www.codexalimentarius.net/gsfaonline/index.htmlのホームページの"Codex General Standard for Food Additives"（GSFA, Codex STAN 192-1995）を参照されたい）でよく知られている、食品におけるその機能による様々なカテゴリー、例えば、増粘剤、熟成剤、漂白剤、捕捉剤、湿潤剤、固化防止剤、清澄剤、硬化剤、乳化剤、安定剤、増ちょう剤、塩基および酸、気泡剤、栄養素、着色剤、香味剤、甘味料、保存剤、抗酸化剤などに分類され得る。
【００７４】
或る物質がその食品における特定の目的のために食品に添加される場合、それは直接添加物と呼ばれ、間接食品添加物は、その包装、保存または他の取り扱いによって微量でその食品の一部となるものである。
【００７５】
本明細書に開示される「保健用食品または健康機能性食品」の用語は、食品、健康飲料、栄養補助食品などに含めることができ、目的とする疾患を予防または改善するために、粉末、顆粒、錠剤、懸濁液、エマルション、シロップ、チューイングタブレット、カプセル、飲料などの薬学的な投与形態；または食品形態、例えばパン、餅、ドライフルーツ、キャンディー、チョコレート、チューイングガム、アイスクリーム、低脂肪乳などの牛乳、乳糖加水分解済みの牛乳、山羊乳、加工乳、発酵乳、バター、濃縮乳、ミルククリーム、バターオイル、ナチュラルチーズ、プロセスチーズ、粉ミルク、乳清などの乳製品、ハンバーグ、ハム、ソーセージ、ベーコンなどの加工肉製品、加工卵製品、魚粕などの魚肉製品、即席麺、乾麺、生麺（wet noodles）、フライドヌードル、ノンフライ麺、ゼラチン化乾麺、加熱調理済み麺、凍結乾燥麺、パスタなどの麺製品、ティーバッグ、浸出茶などの茶製品、フルーツ飲料、野菜飲料、炭酸清涼飲料水、豆乳飲料、乳酸飲料配合飲料などの健康飲料、醤油、味噌、唐辛子ペースト、チュンジャン（カラメルで色付けした発酵大豆製品の一種）、チョングッチャン（バチルス・サブチリス：枯草菌）による自然発酵大豆）、混合ペースト、酢、ソース、ケチャップ、カレー粉、ドレッシングなどの調味料、マーガリン、ショートニング、ピザなどへと配合することができるが、本明細書ではこれらに限定されることを意図するものではない。
【００７６】
また、上述の抽出物を目的の障害を予防および改善する食品または飲料に添加することができる。機能性健康食品または保健用食品としての食品または飲料における上述の抽出物または化合物（複数の場合もあり）の量は、一般的には、機能性健康食品組成物用の食品の総重量の約０．０１ｗ／ｗ％〜約１００ｗ／ｗ％の範囲であってもよい。特に、機能性健康食品、保健用食品または特殊な栄養食品における本発明の抽出物の好ましい量は各食品の意図される目的に応じて変化し得るが、一般的に、上記食品組成物１００％に対して麺類などの食品において約０．０１％〜５％、保健用食品において４０％〜１００％の範囲の割合の量で本発明の抽出物または化合物（複数の場合もあり）を添加物としての用途に使用することが好ましい。
【００７７】
本発明の健康飲料組成物が指定される割合で必須の成分として上記抽出物または化合物（複数の場合もあり）を含有する場合、他の液体成分については何らの制限もなく、他の成分は、従来の飲料などの様々な消臭剤（deodorant）または天然の糖質であってもよい。上述の天然の糖質の例は、ブドウ糖、果糖などの単糖、マルトース、ショ糖などの二糖、デキストリン、シクロデキストリンなどの従来の糖、ならびにキシリトールおよびエリスリトールなどの糖アルコールなどである。上述のもの以外の消臭剤として、有利には、タウマチン、レバウジオシドＡ、グリチルリチンなどのステビア抽出物などの天然の消臭剤、およびサッカリン、アスパルテームなどの合成消臭剤などが有用な場合がある。上述の天然の糖質の量は、一般的には、本発明の飲料組成物１００ｍｌ当たり約１ｇ〜２０ｇ、好ましくは５ｇ〜１２ｇの範囲の割合である。
【００７８】
上述の組成以外の成分は、様々な栄養素、ビタミン、ミネラル、または電解質、合成香味剤、着色剤、およびチーズ、チョコレートなどの場合の品質改良剤、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護コロイド接着剤、ｐＨ調整剤、安定剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料などに使用される炭化剤である。上述のもの以外の成分は、天然果汁ジュース、果汁飲料、および野菜飲料を調製するための果汁であってもよく、上記成分は独立してまたは組合せて使用され得る。上記成分の比率はさほど重要ではないが、一般的には、本発明の組成物１００ｗ／ｗ％当たり約０ｗ／ｗ％〜２０ｗ／ｗ％の範囲である。上記抽出物または化合物を含む追加可能な食品の例は、様々な食品、飲料、ガム、ビタミン複合体、健康増進食品などである。
【００７９】
本発明の独創的な抽出物または化合物（複数の場合もあり）は、毒性およびそれに対する副作用がなく、安全に使用することができる。
【００８０】
本発明の組成物、使用および調製物において、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な修飾および変更を行うことができることが当業者に明らかであろう。
【００８１】
本発明は、以下の実施例によってより具体的に説明される。しかしながら、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではないことが理解されるべきである。
【発明の効果】
【００８２】
本発明に記載されるように、豊富な有効成分、例えばシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物由来のカタルポール誘導体を含有する本発明の精製抽出物またはベラトルム酸、ベルプロシド、カタルポシド、ピクロシドＩＩ、イソバニロイルカタルポールおよび６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールからなる群から選択される少なくとも１つの化合物は、ＢＡＬＢ／ｃ雄性マウスを用いた種々のｉｎ  ｖｉｖｏ試験、例えばＣＯＰＤ発症時に生じる炎症免疫細胞の増殖および活性ならびに好中球の肺への動員に対する阻害試験；肺胞上皮細胞の破壊に関与するケモカイン、例えばＭＩＰ−２／ＣＸＣＬ−２、ＴＮＦ−アルファ、ＫＣ／ＣＸＣＬ−１（ケモカインＧｒｏ−アルファ）およびＣＸＣＬ−８などの再生に対する阻害試験；ＳＰＦ（特定病原体除去）Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを用いた動物試験においてＮＦ−カッパＢ活性化を低下させることによるＩＬ−１ベータ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−アルファの放出およびＭＭＰ−９発現に対する低減効果を経て、ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験、例えば分子発現プロファイル変化試験などのＴｈ２細胞のＩＬ−４発現に対する作用を誘発するＭＵＣ５ＡＣ（オリゴマー粘液／ゲル形成）の発現に対する阻害試験において、ベータ−２−受容体アゴニストが反応することなく強力な抗ＣＯＰＤ活性を示した。それゆえ、上記の精製抽出物または化合物を、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療および予防のための治療剤または機能性健康食品として使用することができる。
【００８３】
本発明の上記および他の目的、特徴および他の利点は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明によって更に明確に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】比較例１で調製されたシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの粗抽出物のＨＰＬＣ分析を示す図である。
【図２】実施例１で調製されたシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの本発明の精製抽出物（ＡＴＣ１）のＨＰＬＣ分析を示す図である。
【図３】実施例２で調製されたシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの本発明の精製抽出物（ＡＴＣ２）のＨＰＬＣ分析を示す図である。
【図４】ＡＤＲＢ２  ＧＰＣＲ発現細胞株モデルを樹立する概略的手法を示す図である。
【図５】既知のＡＤＲＢアゴニストで処理したＵ２ＯＳ細胞のスポット形成を示す図である。
【図６】本発明の精製抽出物および化合物で処理したＵ２ＯＳ細胞のスポット形成を示す図である。
【図７】ＨＳＣを用いてＭＵＣ５ＡＣの発現をデジタル化した結果を示す図である。
【図８】ＴＧＦｂ１で処理したＡ５４９細胞におけるＭＵＣ５ＡＣ発現の変化を表す図である。
【図９】本発明の精製抽出物または化合物で前処理した後、ＴＮＦ−αで処理したＡ５４９細胞におけるＭＵＣ５ＡＣ発現の変化を表す図である。
【図１０】アクロレイン、本発明の精製抽出物または化合物で処理したＡ５４９細胞におけるＭＵＣ５ＡＣ発現の変化を表す図である。
【図１１】ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋）からのＴｈ２分化の誘導に対する本発明の精製抽出物または化合物の影響を示す図である。
【図１２】マウスＴｈ２の分化に対する本発明の精製抽出物または化合物の影響を示す図である。
【図１３】マウスＴｈ２細胞の分化マーカーであるＩＬ−４発現に対する本発明の精製抽出物または化合物の影響を示す図である。
【図１４】Ｂａｌｂ／ｃマウスへのＬＰＳ吸入（気管内投与（ｉ．ｔ））後およびタバコの煙を投与された後の総免疫細胞、好中球の数およびＴリンパ球の濃度に対する本発明の精製抽出物または化合物の影響を示す図である。
【図１５】気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞数に対する本発明の精製抽出物または化合物の影響を示す図である（Ａ：総細胞数（×１０５）／ＢＡＬＦ（ｍＬ）；Ｂ：好中球数（×１０４）／ＢＡＬＦ（ｍＬ）；Ｃ：ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数（×１０４）／ＢＡＬＦ（ｍＬ）、データは平均細胞数±ＳＥＭ（Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．００１対ＬＰＳ＋ＣＳ；ｎ＝１０を表す）。
【図１６】Ｂａｌｂ／ｃマウスへのＬＰＳ吸入（ｉ．ｔ）後およびタバコの煙を投与された後のＣＸＣＬ−１、ＴＮＦ−αおよびＭＩＰ−２の濃度に対する本発明の精製抽出物または化合物の影響を示す図である。
【図１７】炎症細胞数に対する本発明の精製抽出物または化合物の影響を示す図である。
【図１８】ＢＡＬＦの総細胞数に対する本発明の精製抽出物または化合物の影響を示す図である。
【図１９】肺組織のＭＭＰ−９活性に対する本発明の精製抽出物または化合物の影響を示す図である。
【図２０】肺組織の炎症誘発性タンパク質の発現に対する本発明の精製抽出物または化合物の影響を示す図である。
【図２１】気管支肺胞洗浄液の組織学的検査を使用する肺組織細胞での炎症反応に対する本発明の精製抽出物の阻害効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００８５】
本発明の組成物、使用および調製物において、本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、様々な修飾および変更を行うことができることが当業者に明らかであろう。
【００８６】
本発明を、以下の実施例においてより具体的に説明する。しかしながら、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではないと理解されるべきである。
【実施例】
【００８７】
以下の参照例、実施例および実験例は、その範囲を限定することなく本発明を更に説明することを意図するものである。
【００８８】
比較例１．シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの粗抽出物の調製
１−１．粗抽出物（ＡＴＥ）の調製
１ｋｇの乾燥シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルム（ＧＡＰに従い、大韓民国忠清北道陰城郡蘇伊面２４４で栽培した）を小片に切断し、１０Ｌの４０％エタノールと混合した。混合物を室温で２４時間撹拌し、３回に亘って７８℃で１２時間の還流抽出により抽出して濾過物を回収した。抽出物を濾紙で濾過して細片を除去した。回収した濾過物を減圧下で５５℃〜６５℃にてロータリーエバポレーター（EYELA、Ｎ−２１００、日本）で濃縮し、凍結乾燥機で乾燥して、比較例として使用する２０２ｇの乾燥粗抽出物（以下、「ＡＣＥ」と示す）を得た。
【００８９】
１−２．成分分析
表１の条件に従ってＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １２６０モデル、米国）を使用して成分分析を行い、結果を図１に示す。
【００９０】
図１からわかるように、各成分を、それぞれ、９．５４８分（ベルプロシド）、１０．８１７分（ベラトルム酸）、１６．７２８分（カタルポシド）、２０．３４６分（ピクロシドＩＩ）、２１．８５３分（イソバニロイルカタルポール）、および３０．４６２分（６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール）に検出したことを確認した。
【００９１】
数式１に従って、サンプル中の各成分の含有量（％）をＨＰＬＣパターン（保持時間）に基づいて算出した。
【００９２】
［数式１］
各成分の含有量＝標準の濃度（ｍｇ／ｍｌ）／試験サンプルの濃度（ｍｇ／ｍｌ）×Ａｔ／Ａｓ×標準の純度（％）
式中、「Ａｔ」は試験サンプル中の成分面積を示し、「Ａｓ」は試験サンプルのサンプリングした容量と標準とが互いに同一である場合の標準における成分面積を示す。
【００９３】
【表１】
0005982077.tif 000002
【００９４】
結果として、表２に見られるように、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの粗抽出物には、僅か８．４９％（ｗ／ｗ）のカタルポール誘導体、すなわち５．９％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、０．２１％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、０．８２％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、０．４０％（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、０．４２％（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および０．７４％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールがそれぞれ含まれていることが確認された。
【００９５】
【表２】
0005982077.tif 000003
【００９６】
実施例１．シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの精製抽出物（ＡＴＣ１）の調製
比較例１に従って従来の方法により調製したシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの粗抽出物（ＡＣＥ）を２Ｌの蒸留水に懸濁し、懸濁物を２Ｌのブタノールに添加して、ブタノール可溶性画分と水溶性画分とに分画した。ブタノール可溶性画分を回収し、減圧下で濃縮し、乾燥して、試験例として使用する８２ｇの本発明のブタノールで分画した精製抽出物（ＡＴＣ１）を得た。
【００９７】
表１の条件に従ってＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １２６０モデル、米国）を使用して成分分析を行い、結果を図２に示す。
【００９８】
図２からわかるように、各成分を、それぞれ、９．５４５分（ベルプロシド）、１０．８２１分（ベラトルム酸）、１６．７２７分（カタルポシド）、２０．３４５分（ピクロシドＩＩ）、２１．８５３分（イソバニロイルカタルポール）、および３０．４６２分（６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール）に検出したことを確認した。
【００９９】
数式１に従って、サンプル中の各成分の含有量（％）をＨＰＬＣパターン（保持時間）に基づいて算出した。
【０１００】
結果として、表３に見られるように、本発明のシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムのブタノールで分画した精製抽出物（ＡＴＣ１）には、２５．６４％（ｗ／ｗ）のカタルポール誘導体、すなわち１７．６０％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、０．７２％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、２．６２％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、１．０８％（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、１．２６％（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および２．３６％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールがそれぞれ含まれていることが確認された。
【０１０１】
【表３】
0005982077.tif 000004
【０１０２】
実施例２．シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの精製抽出物（ＡＴＣ２）の調製
実施例１による本発明のシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムのブタノールで分画した精製抽出物（ＡＴＣ１）を、７５ｍＬの混合溶媒（蒸留水：メタノール＝１：０．００３）に溶解し、溶出溶媒（蒸留水：メタノール＝９０：１０→６０：４０）を使用して懸濁物を溶出しながら、逆相カラムクロマトグラフィー（Ｃ１８（ＩＶ）−Ｄ−７５−１２０ｎｍ、AGC Si-Tech Co. Ltd.、日本、４５０ｇ）に７５ｇの上記溶液を充填した。最初の溶出溶媒系（蒸留水：メタノール＝９０：１０）による８．４Ｌの溶出液を回収し、減圧下で濃縮した。後の溶出溶媒系（蒸留水：メタノール＝６０：４０）による５．６Ｌの溶出液を回収し、減圧下で濃縮し、乾燥して、試験例として使用する３３ｇの本発明の二次分画による精製抽出物（ＡＴＣ２）を得た。
【０１０３】
表１の条件に従ってＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １２６０モデル、米国）を使用して成分分析を行い、結果を図３に示す。
【０１０４】
図３からわかるように、各成分を、それぞれ、９．５２５分（ベルプロシド）、１０．８１８分（ベラトルム酸）、１６．７２１分（カタルポシド）、２０．３４６分（ピクロシドＩＩ）、２１．８５７分（イソバニロイルカタルポール）、および３０．４６２分（６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール）に検出したことを確認した。
【０１０５】
数式１に従って、サンプル中の各成分の含有量（％）をＨＰＬＣパターン（保持時間）に基づいて算出した。
【０１０６】
結果として、表４に見られるように、本発明のシュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの二次分画による精製抽出物（ＡＴＣ２）には、６５．６３％（ｗ／ｗ）のカタルポール誘導体、すなわち４３．８３％（ｗ／ｗ）のベルプロシド、１．８０％（ｗ／ｗ）のベラトルム酸、７．０７％（ｗ／ｗ）のカタルポシド、２．９３％（ｗ／ｗ）のピクロシドＩＩ、３．８５％（ｗ／ｗ）のイソバニロイルカタルポール、および６．１５％（ｗ／ｗ）の６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールがそれぞれ含まれていることが確認された。
【０１０７】
【表４】
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【０１０８】
実施例３．シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルム由来の本発明の化合物の調製
【０１０９】
以下の物理化学特性を有する本発明の化合物、すなわちベルプロシド、ベラトルム酸、カタルポシド、ピクロシドＩＩ、イソバニロイルカタルポールおよび６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールを韓国特許出願公開第１０−２００６−１２５４９９号に開示の単離方法に従い、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物から精製し、各化合物の物理化学特性を、各化学構造の特定において既に公開された参照文献のものと比較した。
【０１１０】
１．ベルプロシド（＝６−Ｏ−（３，４−ジヒドロキシベンゾイル）カタルポール）
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：２．４７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．０，９．２Ｈｚ，Ｈ−９）、２．５９（１Ｈ，ｄｄｄｄ，Ｊ＝１．６，４．０，８．０，８．０，Ｈ−５）、３．００（１Ｈ，ｍ，Ｈ−Ｇ４）、３．０５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−Ｇ２）、３．１４（１Ｈ，ｍ，Ｈ−Ｇ５）、３．１８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−Ｇ３）、３．４２、３．７１（２Ｈ，ｍ，Ｈ−Ｇ６）、３．６７（１Ｈ，ｓ，Ｈ−７）、３．７１、３．９１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ，ｅａｃｈ，Ｈ−１０）、４．６１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｈ−Ｇ１）、４．９４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．０，６．０Ｈｚ，Ｈ−４）、５．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｈ−６）、５．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，Ｈ−１）、６．４１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．６，６．０Ｈｚ，Ｈ−３）、６．８２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｈ−５’）、７．３５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．０Ｈｚ，Ｈ−６’）、７．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，Ｈ−２’）。
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：９３．０（Ｃ−１）、１４１．１（Ｃ−３）、１０１．８（Ｃ−４）、３５．２（Ｃ−５）、７９．５（Ｃ−６）、５８．２（Ｃ−７）、６５．８（Ｃ−８）、４１．８（Ｃ−９）、１２０．０（Ｃ−１’）、１１６．４（Ｃ−２’）、１４５．１（Ｃ−３’）、１５０．８（Ｃ−４’）、１１５．４（Ｃ−５’）、１２２．６（Ｃ−６’）、１６５．６（Ｃ−７’）、９７．９（Ｃ−Ｇ１）、７３．４（Ｃ−Ｇ２）、７６．４（Ｃ−Ｇ３）、７０．３（Ｃ−Ｇ４）、７７．５（Ｃ−Ｇ５）、６１．４（Ｃ−Ｇ６）。
【０１１１】
２．ピクロシドＩＩ（＝６−Ｏ−（４−ヒドロキシ−３−メトキシベンゾイルカタルポール）
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：２．４７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．０，９．６Ｈｚ，Ｈ−９）、２．５８（１Ｈ，ｄｄｄｄ，Ｊ＝１．２，６．０，８．０，８．４Ｈｚ，Ｈ−５）、３．００（１Ｈ，ｍ，Ｈ−Ｇ４）、３．０５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−Ｇ２）、３．１４（１Ｈ，ｍ，Ｈ−Ｇ５）、３．１８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−Ｇ３）、３．４２、３．７１（２Ｈ，ｍ，Ｈ−Ｇ６）、３．６７（１Ｈ，ｂｒ  ｓ，Ｈ−７）、３．７２、３．９２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．２，ｅａｃｈ，Ｈ−１０）、４．６２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｈ−Ｇ１）、４．９９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．４，６．０Ｈｚ，Ｈ−４）、５．０６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ｈ−６）、５．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，Ｈ−１）、６．４２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．２，６．０Ｈｚ，Ｈ−３）、６．８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ｈ−５’）、７．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，Ｈ−２’）、７．５２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．４Ｈｚ，Ｈ−６’）、３．８３（３Ｈ，ｓ，３’−Ｏ−ＣＨ３）。
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：９３．０（Ｃ−１）、１４１．１（Ｃ−３）、１０１．８（Ｃ−４）、３５．２（Ｃ−５）、７９．７（Ｃ−６）、５８．２（Ｃ−７）、６５．８（Ｃ−８）、４１．８（Ｃ−９）、５８．５（Ｃ−１０）、１２０．０（Ｃ−１’）、１１２．７（Ｃ−２’）、１４７．５（Ｃ−３’）、１５２．０（Ｃ−４’）、１１５．３（Ｃ−５’）、１２３．８（Ｃ−６’）、１６５．６（Ｃ−７’）、９７．９（Ｃ−Ｇ１）、７３．４（Ｃ−Ｇ２）、７６．４（Ｃ−Ｇ３）、７０．３（Ｃ−Ｇ４）、７７．５（Ｃ−Ｇ５）、６１．４（Ｃ−Ｇ６）、５５．７（３’−ＯＣＨ３）。
【０１１２】
３．カタルポシド（＝６−Ｏ−（４−ヒドロキシベンゾイルカタルポール）
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：２．４７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．０，９．６Ｈｚ，Ｈ−９）、２．５６（１Ｈ，ｄｄｄｄ，Ｊ＝１．２，４．０，８．０，８．０Ｈｚ，Ｈ−５）、３．００（１Ｈ，ｍ，Ｈ−Ｇ４）、３．０５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−Ｇ２）、３．１４（１Ｈ，ｍ，Ｈ−Ｇ５）、３．１８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−Ｇ３）、３．４３、３．７２（２Ｈ，ｍ，Ｈ−Ｇ６）、３．６９（１Ｈ，ｂｒ  ｓ，Ｈ−７）、３．７２、３．９２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ，ｅａｃｈ，Ｈ−１０）、４．６２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｈ−Ｇ１）、４．９６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．０，６．０Ｈｚ，Ｈ−４）、５．０５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．２，８．０Ｈｚ，Ｈ−６）、５．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，Ｈ−１）、６．４２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．２，６．０Ｈｚ，Ｈ−３）、６．８６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｈ−３’，−５’）、７．８５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，Ｈ−２’，−６’）。
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：９２．９（Ｃ−１）、１４１．１（Ｃ−３）、１０１．８（Ｃ−４）、３５．１（Ｃ−５）、７９．６（Ｃ−６）、５８．２（Ｃ−７）、６５．８（Ｃ−８）、４１．８（Ｃ−９）、１１９．６（Ｃ−１’）、１３１．７（Ｃ−２’，６’）、１１５．５（Ｃ−３’，５’）、１６２．６（Ｃ−４’）、１６５．５（Ｃ−７’）、９７．８（Ｃ−Ｇ１）、７３．４（Ｃ−Ｇ２）、７６．４（Ｃ−Ｇ３）、７０．３（Ｃ−Ｇ４）、７７．５（Ｃ−Ｇ５）、６１．４（Ｃ−Ｇ６）。
【０１１３】
４．イソバニロイルカタルポール（＝６−Ｏ−（３−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾイル）カタルポール）
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：２．４７（１Ｈ，ｍ，Ｈ−９）、２．５５（１Ｈ，ｍ  Ｈ−５）、３．００（１Ｈ，ｍ，Ｈ−Ｇ４）、３．０５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−Ｇ２）、３．１４（１Ｈ，ｍ，Ｈ−Ｇ５）、３．１８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−Ｇ３）、３．４３、３．７０（２Ｈ，ｍ，Ｈ−Ｇ６）、３．７０（１Ｈ，ｂｒ  ｓ，Ｈ−７）、３．７２、３．９２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．２，ｅａｃｈ，Ｈ−１０）、４．６２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｈ−Ｇ１）、４．９５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．４，６．０Ｈｚ，Ｈ−４）、５．０６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｈ−６）、５．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，Ｈ−１）、６．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，Ｈ−３）、７．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ｈ−５’）、７．４２（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−２’）、７．４８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ｈ−６’）、３．８４（３Ｈ，ｓ，４’−Ｏ−ＣＨ３）。
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：９３．０（Ｃ−１）、１４１．０（Ｃ−３）、１０１．６（Ｃ−４）、３５．２（Ｃ−５）、７９．７（Ｃ−６）、５８．２（Ｃ−７）、６５．８（Ｃ−８）、４１．８（Ｃ−９）、５８．４（Ｃ−１０）、１２１．７（Ｃ−１’）、１１５．７（Ｃ−２’）、１４６．３（Ｃ−３’）、１５２．１（Ｃ−４’）、１１１．４（Ｃ−５’）、１２１．３（Ｃ−６’）、１６５．３（Ｃ−７’）、９７．８（Ｃ−Ｇ１）、７３．４（Ｃ−Ｇ２）、７６．４（Ｃ−Ｇ３）、７０．３（Ｃ−Ｇ４）、７７．４（Ｃ−Ｇ５）、６１．４（Ｃ−Ｇ６）、５５．７（４’−ＯＣＨ３）。
【０１１４】
５．６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール（＝６−Ｏ−（３，４−ジメトキシベンゾイル）カタルポール）
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：２．４７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．０，９．６Ｈｚ，Ｈ−９）、２．５９（１Ｈ，ｄｄｄｄ，Ｊ＝１．６，４．８，８．０，８．０Ｈｚ，Ｈ−５）、３．００（１Ｈ，ｍ，Ｈ−Ｇ４）、３．０５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−Ｇ２）、３．１４（１Ｈ，ｍ，Ｈ−Ｇ５）、３．１８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−Ｇ３）、３．４２、３．７１（２Ｈ，ｍ，Ｈ−Ｇ６）、３．７０（１Ｈ，ｂｒ  ｓ，Ｈ−７）、３．７２、３．９０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ，ｅａｃｈ，Ｈ−１０）、４．６１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｈ−Ｇ１）、４．９７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．８，６．０Ｈｚ，Ｈ−４）、５．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，Ｈ−６）、５．１０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，Ｈ−１）、６．４２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．６，６．０Ｈｚ，Ｈ−３）、７．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ｈ−５’）、７．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，Ｈ−２’）、７．６４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．４Ｈｚ，Ｈ−６’）、３．８１、３．８４（６Ｈ，ｓ  ｅａｃｈ，３’，４’−ＯＣＨ３）。
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：９２．９（Ｃ−１）、１４１．１（Ｃ−３）、１０１．８（Ｃ−４）、３５．２（Ｃ−５）、７９．９（Ｃ−６）、５８．２（Ｃ−７）、６５．９（Ｃ−８）、４１．８（Ｃ−９）、５８．４（Ｃ−１０）、１２１．３（Ｃ−１’）、１１１．８（Ｃ−２’）、１４８．５（Ｃ−３’）、１５３．２（Ｃ−４’）、１１１．２（Ｃ−５’）、１２３．５（Ｃ−６’）、１６５．５（Ｃ−７’）、９７．８（Ｃ−Ｇ１）、７３．４（Ｃ−Ｇ２）、７６．４（Ｃ−Ｇ３）、７０．３（Ｃ−Ｇ４）、７７．５（Ｃ−Ｇ５）、６１．４（Ｃ−Ｇ６）、５５．６、５５．７（３’，４’−ＯＣＨ３）。
【０１１５】
実験例１．ＡＤＢＲ２  ＧＰＣＲ−標的細胞系アッセイシステムの確立
ＡＤＢＲ２  ＧＰＣＲ−標的細胞系アッセイシステムを開発するために、以下の試験を行った。
【０１１６】
１−１．ＡＤＢＲ２  ＧＰＣＲ発現型細胞株の開発
ＡＤＢＲ２（ベータ−２アドレナリン受容体）ＧＰＣＲ（Ｇ−タンパク質共役受容体、Sinco Biological Inc.、ＨＦ１０３７８−Ｍ）をｐＩＲＥＳｐｕｒｏベクター（Clontech、カリフォルニア州マウンテンビュー）にクローニングし、Ｕ２ＯＳ（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−９６、ヒト骨肉腫細胞株）に形質転換させ、ＤＥＭＥ（HyClone）、１０％ＦＢＳ（HyClone、ＳＨ３００７１．０３）および１％抗生物質（Gibco、１５１４０）を補充した成長培地で処理し、シングルコロニーを選択した。
【０１１７】
選択された安定しているコロニーを９６ウェルプレートに植菌し、試験サンプル、すなわちインダカテロール（陽性対照、Zhiyu biotechnology、中国）をプレートに入れ処理し、植菌２４時間後に実施例で調製されたＡＴＣ２抽出物をプレートに入れ処理した。細胞をホルマリン溶液で５分間固定し、滅菌水で洗浄し、図４に示すスポット検出ソフトウェア（ThermoFisher、米国）を用いてスポット形成を確認した。
【０１１８】
１−２．陽性対照の有効性に対する評価
１０マイクロモルの、既知のＡＤＢＲ２アゴニスト、すなわちイソプロテレノール、サルメテロール、ホルモテロール、サルブタモールおよびインダカテロール（Zhiyu biotechnology、中国）を、選択されたＵ２ＯＳ細胞安定発現型ＡＤＢＲ２  ＧＰＣＲに入れ処理し、処理によるスポット形成をＣｅｌｌｏｍｉｃｓ装置（ThermoFisher、米国）のスポット検出ソフトウェアを用いて決定した。
【０１１９】
図５に示すことができるように、既知のＡＤＢＲ２アゴニスト（イソプロテレノール、サルメテロール、ホルモテロール、サルブタモールおよびインダカテロール）、特にインダカテロールで処理した群は全て明らかなスポット形成を示し、ベータ２−アゴニスト、例えばインダカテロールはＡＤＲＢ２アゴニスト（ベータ２−受容体）として作用することにより明らかなスポットを形成するが、４０ｍｇ／ｍｌのＡＴＣ２ではスポット形成されなかったことを確認した。
【０１２０】
１−３．試験サンプルの有効性に対する評価
４０μｇ／ｍｌのＡＴＣ２および本発明の化合物、すなわち２０マイクロモルのベルプロシド、ベラトルム酸、カタルポシド、ピクロシドＩＩ、イソバニロイルカタルポールおよび６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールそれぞれを、選択されたＵ２ＯＳ細胞安定発現型ＡＤＢＲ２  ＧＰＣＲに入れて処理し、処置によるスポット形成をＣｅｌｌｏｍｉｃｓ装置（ThermoFisher、米国）のスポット検出ソフトウェアを用いて決定した。
【０１２１】
図６に示すことができるように、ＡＴＣ２および本発明の化合物、すなわち２０マイクロモルのベルプロシド、ベラトルム酸、カタルポシド、ピクロシドＩＩ、イソバニロイルカタルポールおよび６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールで処置した群は全てスポット形成を示さなかったことを確認しており、これは、受容体上にＡＤＲＢ２−ＧＦＰが存在することを意味する。結果に従い、ＡＴＣ抽出物および本発明の化合物は、ＡＤＢＲ２アゴニストとして作用しなかったことを確認した。
【０１２２】
それに応じて、主要な治療標的物質であるＭＵＣ５ＡＣを直接標的とし、ＭＵＣ５ＡＣ発現を予防する、本発明の抽出物および本発明の化合物は、従来の治療、例えばベータ２アゴニストによる治療に存在する問題、例えばベータ２受容体に対するアドレナリン応答、例えば低カリウム血症、筋痙攣、不安、頻脈、心室期外収縮などおよび経口投与の場合における有害反応、例えば血中薬物濃度の不規則な変化により生じる不整脈、てんかんなどを解決することができることを確認した。
【０１２３】
実験例２．ムチン５ＡＣ−標的型細胞系アッセイシステムの確立
ムチン５Ａ／ＣがＣＯＰＤ治療剤を開発するための重要な標的物質であることが報告されている（Busse PJ, Zhang TF, Srivastava K, Schofield B, Li XM.2007. Effect of ageing on pulmonary inflammation, airway hyperresponsiveness and T and B cell responses in antigen-sensitized and -challenged mice. Clinical & Experimental Allergy. 37(9): 1392403., Smirnova MG, Birchall JP, Pearson JP. 2000. TNF-alpha in the regulation of MUC5AC secretion: some aspects of cytokine-induced mucin hypersecretion on the in vitro model. Cytokine, 12:17326）。
【０１２４】
それに応じて、本発明者らは動物細胞レベルの標的タンパク質の発現を定量的に決定することができるハイコンテンツスクリーニングシステムを導入した新規のハイスループットスクリーニング試験を開発し、ムチン５ＡＣ発現の阻害剤をスクリーニングするために、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  ＢｉｏＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎに公開されている標的活性化因子法を改変して以下の試験を行った。
【０１２５】
２−１．ＨＳＣを用いたムチン５Ａ／Ｃ発現のデジタル化
ヒト肺癌組織から単離された上皮細胞株であるＡ５４９細胞株（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−１８５）を９６ウェルプレート（５０００細胞／ウェル）に播種し、播種の２４時間後に、２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、２０マイクロモルのＩＧＦ、５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−ベータ１、３０ナノモルのアクロレイン、５ナノモルのＰＭＡ、１マイクログラム／ｍｌのＬＰＳおよび２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１ベータをプレートで処理した。ムチン５Ａ／Ｃの発現をＣｅｌｌｏｍｉｃｓ装置の標的活性化因子プログラムによりデジタル化した。
【０１２６】
図７に示すことができるように、ＴＧＦ−ベータ１を除く試験した物質全てにおいてＭＵＣ５Ａ／Ｃの発現が増加したことを確認した。
【０１２７】
２−２．ムチン５Ａ／Ｃ発現に対するＴＧＦ−ベータ１の阻害効果のデジタル化
種々の濃度のＴＧＦ−ベータ１（PeproTech、＃１００−２１）、すなわち１、５および１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−ベータ１を、Ａ５４９細胞株（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−１８５）を用いて処理し（treated with）、ムチン５Ａ／Ｃの発現をＣｅｌｌｏｍｉｃｓ装置の標的活性化因子プログラムによりデジタル化した。
【０１２８】
図８に示すことができるように、ＴＧＦ―ベータ１が対照培地（ＧＭ、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％抗生物質）よりＭＵＣ５Ａ／Ｃの発現を更に阻害したことを確認した。
【０１２９】
２−３．ムチン５Ａ／Ｃ発現に対するＴＮＦ−アルファの阻害効果のデジタル化
種々の濃度のＡＴＣ２抽出物を、Ａ５４９細胞株を用いて２時間処理した後、２０ｇ／ｍｌのＴＮＦ−アルファ（Sigma、Ｈ８９１６）を用いて２４時間処理した。ムチン５Ａ／Ｃの発現をＣｅｌｌｏｍｉｃｓ装置の標的活性化因子プログラムによりデジタル化した。
【０１３０】
図９に示すことができるように、ＡＴＣ２を前処理した場合に用量依存的にＭＵＣ５ＡＣ発現を増加させるＴＮＦ−アルファの処理を用いてＭＵＣ５Ａ／Ｃの発現を効果的に阻害したことを確認した。
【０１３１】
２−４．ムチン５Ａ／Ｃ発現に対する本発明の試験サンプルの阻害効果
５％フェノールレッドおよびＦＢＳ（ウシ胎児血清）を補充したＤＭＥＭ培地で希釈したＡ５４９細胞株（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−１８５）を６ウェルプレート（４×１０５細胞／ウェル）に藩種し、一晩付着させ、２０および４０マイクログラム／ｍｌのＡＴＣ２抽出物を、Ａ５４９細胞株を用いて１時間処理した。３０ｎＭのアクロレインで処理し、ムチン５Ａ／Ｃ発現を誘導した。培地を細胞とともに取り出し、ＰＢＳ溶液で洗浄して、細胞からリボ核酸を単離するためトリゾール（Invitrogen、米国カリフォルニア州）で５分間ホモジナイズした。細胞を回収し、遠心分離器に移し、１５秒間クロロホルムと完全に混合させ、３分間静置し、１４０００ｒｐｍの速度にて１５分間遠心分離した。リボ核酸を含有する上清を新しいチューブに移し、１０分間イソプロピルアルコールと混合させた。溶液を遠心分離し、上清を廃棄し、７５％エタノールを沈殿物に添加した。沈殿物を１００００ｒｐｍの速度にて５分間遠心分離し、上清を廃棄した。沈殿したリボ核酸を室温で２０分間乾燥させた。乾燥したリボ核酸をＤＥＰＣ（ジエチルピロカーボネート、Ｗ２００４、www.biosesang.com、韓国）で処理した蒸留水に懸濁させた。リボ核酸を定量化後、相補的ＤＮＡを、１マイクログラムのＲＮＡおよびＲＴキット（Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｋｉｔ、Qiagen、米国）を用いて合成し、合成したｃＤＮＡを鋳型として使用した。ムチン５Ａ／Ｃプライマー（フォワード；５−ＣＧＡ  ＣＡＡ  ＣＴＡ  ＣＴＴ  ＣＴＧ  ＣＧＧ  ＴＧＣ−３、リバース：５−ＧＣＡ  ＣＴＣ  ＡＴＣ  ＣＴＴ  ＣＣＴ  ＧＴＣ  ＧＴＴ−３）と混合し、ＰＣＲミックス（ＤｒｅａｍＴａｑ（商標）ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、Fermentas、米国）を用いて９４℃にて５分間変性させ、４０サイクル、すなわち９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で４５秒間で反応させ、酵素不活性化させるために７２℃にて５分間ＰＣＲを行った。ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、Bioneer Corporation, www.bioneer.co.kr、韓国）を内部標準物質として使用した。
【０１３２】
図１０に示すことができるように、ＭＵＣ５Ａ／Ｃの発現はアクロレイン処理により増加したが、本発明の抽出物（ＡＲＣ２）または本発明の化合物、例えばベルプロシドまたは６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールの処置では用量依存的に阻害された。
【０１３３】
実験例３．マウスＴｈ２細胞分化に対する阻害効果
３−１．マウスＴｈ２細胞分化の樹立
ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋）をＭＡＣＳ（Miltenyi Biotec、注文番号１３０−０９０−９７６）を用いてＣ５７ＢＬ６マウスのリンパ節および脾臓から単離し、回収したＣＤ４＋Ｔ細胞を抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ、BD pharmingen）および抗ＣＤ２８（０．５μｇ／ｍＬ、BD pharmingen）で被覆したプレートで培養した。
【０１３４】
ＴＨ２細胞の分化を抗ＩＦＮ−ガンマおよびｒｍＩＬ−４（Hyclone）を補充したＲＰＭＩ培地で誘導し、分化度をＦＡＣＳ（フローサイトメトリー、Becton-Dickinson、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）により決定した。
【０１３５】
図１１に示すことができるように、この確立した試験条件を利用することを確認したが、それはこの条件の分化度が２９．６％と測定され、ＴＨ２細胞（３８％、Merck Milipore、ＦＣＩＭ０２５１６２）の分化を誘導するための市販の培地を用いた従来的に利用可能な条件のものと類似しており、また、ｍＲＮＡ発現を決定するため、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｓ１０００  Ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ、Bio-Rad）実験によりマーカー発現の誘導を再確認したところ、分化を誘導後３日目にＴＨ２細胞の分化が誘導されていたためであった。
【０１３６】
３−２．マウスＴｈ２細胞分化に対する影響
ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋、Miltenyi Biotec、１３０−０９３−２２７）をＭＡＣＳ（Miltenyi Biotec、注文番号１３０−０９０−９７６）を用いてＣ５７ＢＬ６マウスのリンパ節および脾臓から単離し、細胞をＴｈ２細胞に分化させるよう誘導するときに５、１０、２０および４０マイクログラム／ｍｌのＡＴＣ２で処理した。Ｔｈ２分化度をＩＬ−４分化マーカーの発現により決定した。
【０１３７】
図１２に示すことができるように、種々の濃度のＡＴＣ２で処理した試験群のＴｈ２分化度が用量依存的に減少しており、５マイクログラム／ｍｌのＡＴＣ２の場合１９．２％である一方対照群では２９．６％であった。また、細胞の総数は２０および４０マイクログラム／ｍｌのＡＴＣ２で処理した試験群で減少し、それゆえ、実際には１０マイクログラム／ｍｌ未満のＡＴＣ２が細胞の総数に影響することなくＴｈ２分化の有効な阻害濃度を示すことを確認した。
【０１３８】
それに応じて、１０マイクログラム／ｍｌ未満のＡＴＣ２が試験に適切な濃度であると確認した。
【０１３９】
３−３．Ｔｈ２細胞分化に関与する分子発現のスペクトル変化に対する影響
ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋、Miltenyi Biotec、１３０−０９３−２２７）をＭＡＣＳ（Miltenyi Biotec、注文番号１３０−０９０−９７６）を用いてＣ５７ＢＬ６マウスのリンパ節および脾臓から単離し、細胞をＴｈ２細胞に分化させるよう誘導するときに２．５、５および１０マイクログラム／ｍｌのＡＴＣ２で処理した。Ｔｈ２分化度をＩＬ−４分化マーカーの発現により決定した。
【０１４０】
図１３に示すことができるように、Ｉｌ−４発現がナイーブ細胞と比較しＴｈ２細胞にのみ誘導され、ＩＬ−４分化マーカーの発現が２．５マイクログラム／ｍｌのＡＴＣ２で処理した群では約６０％、５マイクログラム／ｍｌのＡＴＣ２で処理した群では約３０％および１０マイクログラム／ｍｌのＡＴＣ２で処理した群では約５％に急激に減少したことを確認した。
【０１４１】
タバコの喫煙または空気汚染により生じた酸化ストレスは、肺胞の維持を破壊し、アポトーシスおよび炎症反応を増大させ、プロテアーゼ／アンチプロテアーゼの不均衡を誘発し、加齢および自己免疫応答による炎症を増強し、それにより３０年〜５０年経過後にＣＯＰＤ疾患の発症を生じる。ＣＯＰＤは、具体的な特徴、例えば空気捉え込みの障害、気腫または肺の特異的な炎症、例えばマクロファージ、好中球、Ｔリンパ球、ＣＤ８細胞、ケモカインなどの濃度増加を示した。
【０１４２】
本試験は、ＬＰＳおよびＣＳの気管内投与（ｉ．ｔ．）によるＣＯＰＤ誘発型マウスの試験サンプル（ＡＴＣ２、ベルプロシド、ロフルミラスト）の有効な濃度を分析した。
【０１４３】
結果では、１５ｍｇ／ｋｇを超えるＡＴＣ２、１５ｍｇ／ｋｇのベルプロシドおよび１５ｍｇ／ｋｇのロフルミラストがＢＡＬＦ中の総免疫細胞、好中球およびＴリンパ球などの数に対する同様の阻害を示したことを確認した。１５ｍｇ／ｋｇを超えるＡＴＣ２、１５ｍｇ／ｋｇのベルプロシドおよび１５ｍｇ／ｋｇのロフルミラストが、肺胞を破壊するメディエーターであるＴＮＦ−α、ＫＣ／ＣＸＣＬ−１およびＭＩＰ−２の再生濃度に対する同様の阻害を示した。
【０１４４】
これらの結果より、１５ｍｇ／ｋｇを超えるＡＴＣ２、１５ｍｇ／ｋｇのベルプロシドおよび１５ｍｇ／ｋｇのロフルミラストがＣＯＰＤの発症により生じる好中球の肺への動員の拡大および活性化を阻害することにより強力な抗ＣＯＰＤ活性を示すことを確認した。 
【０１４５】
実験例４．動物モデル試験（マウス）
ＢＡＬＦの総免疫細胞、好中球およびＴリンパ球などの数ならびにＴＮＦ−α、ＫＣ／ＣＸＣＬ−１およびＭＩＰ−２の再生濃度に対する本発明の抽出物および化合物の抗ＣＯＰＤ効果を決定するために、ＣＯＰＤ誘発型マウスを用いて以下の試験を行った。
【０１４６】
４−１．実験動物
定期的に関連する呼吸器病原体を血清学的にスクリーングした、８週齢の特定病原体除去雄性ＢＡＬＢ／ｃマウス（約１８ｇ〜２０ｇ）を、ORIENT Co.（www.orient.co.kr、韓国ソウル）から購入し、２２±２℃、湿度５５±１５％、１２時間の明暗サイクルで制御された飼育室にて飼料および水を自由摂取にて飼育し、１週間に亘って実験環境に馴化させた。
【０１４７】
４−２．薬剤および投与
（１）試験サンプル
４種類のサンプル、すなわちＡＴＣ２（３０ｍｇ／ｋｇ）、ベルプロシド（３０ｍｇ／ｋｇ）、インダカテロール（３０ｍｇ／ｋｇ）、ロフルミラスト（３０ｍｇ／ｋｇ）を０．５％ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロースナトリウム）に溶解し、試験サンプルとして使用した。
【０１４８】
（２）投与
３０ｍｇ／ｋｇのＡＴＣ２、ベルプロシド、インダカテロールおよびロフルミラストのそれぞれをＬＰＳ＋ＣＳ混合物｛ＬＰＳ（１００μｇ／ｍｌ）＋標準的なタバコ抽出物（タバコ喫煙（ＣＳ）、４ｍｇ／ｍｌ）＝１：１｝１００μｌと混合し、気管内投与（ｉ．ｔ．）の１時間前にマウスに経口投与した。
【０１４９】
（３）標準的なタバコ抽出物の調製（タバコ喫煙；ＣＳ）
試験材料：標準的なタバコＣＭ７（Ｃｏｒｅｓｔａ  Ｍｏｎｉｔｅｒｉｎｇ  Ｃｉｇａｒｅｔｔｅ７、Heinr Borgwaldt、ドイツ）６０本およびイソプロパノール、エタノール（Merck、ドイツ）、ｎ−ヘプタデカン（Sigma-Aldrich、米国）を試験材料として使用し、自動喫煙機（ＩＳＯ３３０８標準化製品、自動喫煙機、モデル番号ＲＭ２０、Heinr Borgwaldt）を実験で使用した。
【０１５０】
４−３．主流煙の回収
（１）主流煙の回収
標準的なタバコＣＭ７（Ｃｏｒｅｓｔａ  Ｍｏｎｉｔｅｒｉｎｇ  Ｃｉｇａｒｅｔｔｅ７、Heinr Borgwaldt、ドイツ）の主流煙を、ＫＳ  Ｈ  ＩＳＯ（国際標準化機構）３４０２基準（タバコおよびタバコ製品−条件および試験の環境（Tobacco and tobacco products - Atmosphere for conditioning and testing））および韓国ガイドライン（タバコ型喫煙の有害成分において抑制因子を必要とする決定ガイドライン（Determination guideline for the harmful component in Cigarette type smoking desire suppressor）、２０１２年１０月、ＫＦＤＡ）に開示の手法に従い回収し、喫煙室で行った（温度２２±２℃、相対湿度６０±５％）。
【０１５１】
タバコをＩＳＯ基準の喫煙手法、すなわち喫煙量（３５．０±０．３ｍＬ）、喫煙間隔（６０±０．５秒）、喫煙時間（２．００±０．０２秒）および吸い殻の長さ（チップペーパー＋３ｍｍ、巻取紙＋３ｍｍ）に従い、ＩＳＯ３３０８基準（ルーチン分析用タバコ喫煙機−定義および標準条件（Routine analytical cigarette - Smoking machine - Definition and standard conditions）に従い自動喫煙機（ＩＳＯ３３０８基準化製品、自動喫煙機、モデル番号ＲＭ２０／ＣＳ、Heinr Borgwaldt、ドイツ）を用いて燃焼させ、タバコのＴＰＭ（総粒子状物質）をＩＳＯ３３０８基準（ＫＳ  Ｈ  ＩＳＯ３３０８、２０００）に従い９２ｍｍのケンブリッジフィルター（ＩＳＯ３３０８標準化製品、ＲＭ２０、Heinr Borgwaldt、ドイツ）を用いて回収した。
【０１５２】
（２）総粒子状物質（ＴＰＭ）の重量
予め燃焼させたケンブリッジフィルターを含有するタバコホルダーの重量をＩＳＯ４３８７基準に従い決定した後、燃焼後のケンブリッジフィルター（ＲＭ２０、Heinr Borgwaldt、ドイツ）により回収されたタバコの煙を含有するタバコホルダー（ＲＭ２０／ＣＳ、Heinr Borgwaldt、ドイツ）の重量を決定し、ＴＰＭ含量（ＫＳ  Ｈ  ＩＳＯ４３８７、２０００；タバコ−ルーチン分析用喫煙機を用いたニコチン非含有の総乾燥粒子状物質の決定（Cigarettes-Determination of total and nicotine-free dry particulate matter using a routine analytical smoking machine）および韓国ガイドライン（タバコ型喫煙の有害成分において抑制因子を必要とする決定ガイドライン、２０１２年１０月、ＫＦＤＡ）を算出した。
【０１５３】
その結果、標準的タバコを３回燃焼させた場合のＴＰＭ含量をそれぞれ１６．０６２１ｍｇ（１９本）、１５．９１３５ｍｇ（２０本）、１５．５３８０ｍｇ／タバコ（２０本）であることを確認した。標準的なタバコの試験総数は５９本であり、ＴＰＭは４７．５１３６ｍｇであった。
【０１５４】
（３）タバコのＴＰＭの抽出
ＲＰＭを含有するケンブリッジフィルターをタバコホルダーから分離し、１００ｍＬ容の三角フラスコに注いだ。イソプロパノール５０ｍｌを三角フラスコに添加し、完全に混合させ、室温にて８時間に亘り静置し、抽出した。抽出後、溶液をろ過し、真空下において濃縮し、シンチレーション用バイアル（ＷＨＥＡＴＯＮ、０３−３４０−２５Ｎ、米国）に移し、窒素ガス下において濃縮した。
【０１５５】
主流煙中のタバコＴＰＭの含量を以下の実験式１に従い算出した。
【０１５６】
［実験式１］
＜ＴＰＭ含量の算出＞    
TPM(mg/cig)=(WFHA-WFHB)/N
式中、ＴＰＭは総粒子状物質を表し、
ＷＦＨＡは喫煙後のフィルターホルダーの重量を表し、
ＷＦＨＢは喫煙前のフィルターホルダーの重量を表し、
Ｎは喫煙したタバコ（ｖｉｇ．）の数／捉え込みを表す。
【０１５７】
４−４．試験方法
（１）ＣＯＰＤ動物モデル
８週齢のＢＡＬＢ／ｃ雄性マウスを７％抱水クロラールで麻酔し、ＬＰＳ＋ＣＳ混合物｛ＬＰＳ（１００μｇ／ｍｌ）＋標準的タバコ抽出物（タバコの喫煙（ＣＳ）、４ｍｇ／ｍｌ）＝１：１｝１００μｌを１週間に１回を３週間マウスに吸入（ｉ．ｔ．）させ、ＣＯＰＤ動物モデルを調製した。つまり、ＬＰＳ＋ＣＳ混合物１００μｌを絶食マウスの鼻および口に一様に吸入させた（ｉ．ｔ）。試験群を６群、すなわち（ｉ）処置なしの正常群（インタクト）、（ｉｉ）ＬＰＳ＋ＣＳ混合物で処理した対照群（ＣＯＰＤ−対照）、（ｉｉｉ）ＬＰＳ＋ＣＳ処理１時間前にＡＴＣ２（３０ｍｇ／ｋｇ、経口）処理した試験サンプル群（ＣＯＰＤ−ＡＴＣ２）、（ｉｖ）ＬＰＳ＋ＣＳ処理１時間前にベルプロシド（３０ｍｇ／ｋｇ、経口）で処理した試験サンプル群（ＣＯＰＤ−ベルプロシド）、（ｖ）ＬＰＳ＋ＣＳ処理１時間前にインダカテロール（３０ｍｇ／ｋｇ、経口）で処理した試験サンプル群（ＣＯＰＤ−インダカテロール）および（ｖｉ）ＬＰＳ＋ＣＳ処理１時間前にロフルミラスト（３０ｍｇ／ｋｇ、経口）で処理した試験サンプル群（ＣＯＰＤ−ロフルミラスト）に分けた。実験の終わりに、各マウスの血液、ＢＡＬＦおよび肺胞上皮細胞を単離し、試験に回収した。
【０１５８】
（２）血液からのＰＢＭＣの単離および細胞数の決定
実験の終わりに、血液８００μｌ〜１０００μｌを、３０Ｉ．Ｕヘパリン（ＡＰＵ８ＡＦ、JW Pharmaceutical、韓国）４０μｌを注射されたマウスから採取した後、心穿刺法に従いエチルエーテルで麻酔した。回収した血液５００μｌをＡＣＫ溶液（Ａ１０４９２０１、Invitrogen、米国）９．５ｍＬに添加し、５分間静置し、赤血球を溶解させた。血液を１２００ｒｐｍの速度にて５分間遠心分離し、ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を単離し、０．０４％トリパンブルー（１５２５００６１、Invitrogen、米国）で染色し、総細胞数／ｍｌを計数した。
【０１５９】
（３）ＢＡＬＦ（ＢＡＬ液）の単離および総細胞数の決定
採血後、注射器に含んだＦＢＳ非含有／ＤＭＥＭ培地１ｍｌを剖検したマウスの気管に注入し、マウスをひもで固定し、血液を三回循環させ、ＢＡＬＦから細胞を単離した。血液を単離し、ＡＫ溶液で３７℃、５分間処理し、赤血球を溶解させ、ＦＢＳ非含有／ＤＭＥＭ培地で洗浄し、０．０４％トリパンブルーで染色し、総細胞数を計数した。
【０１６０】
（４）肺細胞（肺胞上皮細胞）の単離および総細胞数の決定
ＢＡＬＦを単離せずにマウスから肺を摘出し、肺組織を薄片にスライスした。薄片を、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含まないＤＭＥＭ培地（ＬＭ００１−０５、Welgene、韓国）３ｍｌに添加し、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩＶ（Ｃ５１３８、Sigma-Aldrich、米国）を培地に添加した。培地を３７℃にて３０分間、振盪インキュベータ（ＫＭＣ４８０Ｓ、VISION SCI、韓国）でインキュベートし、組織を５回以上消化させ、肺胞上皮細胞を単離した。単離した肺胞上皮細胞を培地で洗浄し、細胞染色器（３５２３５０、FALCON、米国）に通し、細胞以外の未消化の組織または不純物質を除去した。細胞をＡＣＫ溶液で３７℃にて５分間処理し、赤血球を溶解させ、培地で再度洗浄し、０．０４％トリパンブルー（１５２５００６１、Invitrogen、米国）で染色し、総細胞数を計数した。
【０１６１】
（５）ＦＡＣＳ分析
単離したＰＢＭＣ、ＢＡＬ（気管支肺胞洗浄液）および肺胞上皮細胞を５×１０５細胞に調節し、４℃にて免疫蛍光染色を行った。ＰＥ−抗ＣＤ３ｅ（５５３０６４、BD Pharmingen、米国）、ＦＩＴＣ−抗ＣＤ８（５５３０３１、BD Pharmingen、米国）、ＰＥ−抗ＣＤ４（５５３０４７、BD Pharmingen、米国）、ＰＥ−抗Ｇｒ−１（５５３１２８、BD Pharmingen、米国）およびＦＩＴＣ−抗好中球（ａｂ５５４５３、Abcam、イギリス）をそれぞれ、それらに添加し、氷中で、３０分間反応させた。反応後、細胞をリン酸緩衝生理学的食塩溶液で４回以上洗浄し、ＣＤ３＋ＣＤ４＋およびＣＤ３＋ＣＤ８＋、ならびにＧｒ−１＋好中球＋の細胞の割合（％）を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、Becton、Dickinson、米国）のＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  ｐｒｏｇｒａｍ（６４３２７４、BD Biosciences、米国）を用いて決定し、各組織の総絶対数を総細胞に対して適用することにより算出した。
【０１６２】
（６）ＥＬＩＳＡ分析
マウスから単離したＢＡＬＦのＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−ａ、ＩＬ−１７、ＭＣＰ−１およびＧＲＯ−ａ（BioSource、米国）の濃度を酵素結合免疫吸着測定法により決定した。Ｌ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−ａ、ＩＬ−１７、ＭＣＰ−１およびＧＲＯ−ａに対する各抗体を被覆緩衝液（２９１１９５、R&D System、米国）で希釈し、マイクロウェルに被覆し、４℃にて一晩静置した。各ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄し、１０倍希釈した血清１００μｌをウェルに添加した。溶液を室温にて１時間静置し、洗浄緩衝液（Ｔｗｅｅｎ−２０、Sigma-Aldrich、米国）で２回洗浄し、抗体アビジン−ＨＲＰ抱合型抗体（ＤＹ９９８、R&D System、米国）１００μｌを添加し、室温にて１時間静置させ、再度洗浄した。ＴＭＢ基質（５５５２１４、BD、米国）１００μｌをウェルに添加した。溶液を暗所に３０分間静置させ、停止溶液（ＤＹ９９４、R&D system、米国）５０μｌを添加し、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４５０ｎｍでの吸光度を決定した（３４０ＰＣ３８４、Molecular Devices、米国）。
【０１６３】
（７）肺組織のｍＲＮＡ遺伝子発現の決定
（７−１）肺組織からのＲＮＡ単離
マウスの肺組織を摘出し、断片に細粉し、溶解させ、ＲＮＡｚｏｌＢ（ＣＳ−１０５Ｂ、Tel-Test、米国）５００ｍｌを添加することにより溶解させた。クロロホルム（ＣＨＣｌ３）５０ｍＬを混合浮遊液に添加し、再度１５秒間混合した。溶液を氷中に１５分間静置させ、１３０００ｒｐｍにて遠心分離し、その上清約２００ｍＬを採集し、２−プロパノール２００ｍＬを添加し、上清と等しい容量にした。混合物を氷中に１５分間静置させ、１３０００ｒｐｍで再度遠心分離し、８０％ＥｔＯＨで洗浄し、真空ポンプ（ULVAC、米国）で３分間乾燥させ、ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡをピロ炭酸ジエチル（ＤＥＰＣ、ＩＢＳ−ＢＷ１００４、Intron、韓国）で処理した蒸留水２０ｍＬに溶解させ、加熱ブロック（２０５０、Lab-Line、インド）を用いて７５℃で不活性化し、１本鎖ｃＤＮＡの合成に使用した。
【０１６４】
（７−２）逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
逆転写反応を、以下のような手法で行った：加熱ブロックで調製した総ＲＮＡ２μｇを、ＤＮａｓｅ  Ｉ（１０Ｕ／ｍＬ）２Ｕ／チューブを添加することにより３７℃にて３０分間反応させ、７５℃にて１０分間変性させ、１０ｍＭのｄＮＴＰミックス（４０２６、４０２７、４０２８、４０２９、TaKaRA、日本）を２．５ｍＬ添加し、ランダムシークエンスヘキサヌクレオチド（２５ピコモル／２５ｍＬ（１１０３４７３１００１、Roche、ドイツ）を１ｍＬ、ＲＮＡ阻害剤としてＲＮａｓｅ阻害剤（２３１３Ａ、TaKaRa、日本、２０Ｕ／ｍＬ）を１ｍＬ、１００ｍＭのＤＴＴ（Ｐ１１７１、Progmega、米国）を１ｍＬ、５×ＲＴ緩衝液（Ｍ５３１Ａ、Promega、米国）を４．５ｍＬおよび２５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３、３７５ｍＭ  ＫＣｌ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を添加し、再度Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴ（２００Ｕ／ｍＬ、Ｍ１７０５、Promega、米国）を１ｍＬ添加し、溶液の最終容量をＤＥＰＣ（ピロ炭酸ジエチル）で処理した蒸留水を添加することにより２０ｍＬに調節した。反応混合物２０ｍＬを完全に混合し、２０００ｒｐｍにて５秒間遠心分離し、加熱ブロックで３７℃、６０分間反応させ、１本鎖ｃＤＮＡを合成し、９５℃にて５分間静置させ、Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴを不活性化し、合成したｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に使用した。
【０１６５】
（７−３）リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ
合成したｃＤＮＡをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Applied Biosystems、米国）を用いたリアルタイム定量的ＰＣＲに使用した（Galli SJ. Allergy, Curr. Biol., 10:R93-95, 2006）。ＣＡＴＧＴＴＣＣＡＧＴＡＴＧＡＣＴＣＣＡＣＴＣＡＣＧ（ＶＩＣ、Applied Biosystems Co. Ltd.により提供された製品）を、ＴＧＦ−β１、ＭＵＣ５ＡＣおよびマウスグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）のプローブとして使用し、Ｓｐｅｒ−Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（４３６９０１６、ABI）を実験に使用し、最終濃度が２００ｎＭに達する程度まで反応させた。リアルタイム定量的ＰＣＲを以下のようにして行った：初期変性：５０℃で２分間、９４℃で１０分間でおよび９５℃で０．１５分間を４０サイクル、６０℃で１分間。Ｇ３ＰＤＨ（４３５１３０９、ABI、米国）をＲＭＥ処理群および対照群の内部標準物質として使用し、ＲＱ（相対定量）を以下の実験式２に従い算出した（表５を参照されたい）。
【０１６６】
［実験式２］    
対象群の定量PCR  ｙ＝x(1＋e)n
x=初期量、y=収量、n=サイクル数、e=効率
【０１６７】
【表５】
0005982077.tif 000006
【０１６８】
（８）病理組織学的検査
摘出した肺を１０％ホルムアルデヒド溶液（Ｆ０１６１、SAMCHUN、韓国）で素早く固定し、薄片にスライスした。薄片を流水で８時間洗浄し、エポキシで包埋し、ミクロトーム（ＳＭ２０００Ｒ、LEICA、ドイツ）を用いて薄片にスライスし、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色し、コラーゲン沈着染色としてマッソントリクローム染色を行った。盃細胞を観察するため、細胞をＰＡＳ（過ヨウ素酸シッフ）染色を用いて染色し、４００倍の光学顕微鏡により観察した（３３３２４６、NIKON、日本）。
【０１６９】
４−５．統計
種々の実験から得られた結果は全て、平均±標準誤差として記録され、有意性の検証はスチューデントのＴ検定を使用して決定した。上記のデータを一元配置ＡＮＯＶＡ検定に従い分析し、決定された各最終点におけるそれぞれの群間の統計的有意分散値を決定し、各群間の統計的有意性をノンパラメトリックなマン・ホイットニー検定およびダネットの多重比較検定（ＩＢＭ  ＳＰＳＳ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  バージョン１９．０統計ソフトウェア、Inc, IBM、米国）に従い決定した。各対照間（ＣＯＰＤ対照）の差は明らかであるため、図および表に示さなかった。結果（平均±平均の標準誤差として示す）はＰ値、統計学的有意性として＜０．０５（＊）、＜０．０１（＊＊）または＜０．００１（＊＊＊）として表した。
【０１７０】
４−６．試験結果
（１）ＢＡＬＦの総免疫細胞、好中球およびＴリンパ球の数に対する影響
対照群（ＣＯＰＤ対照）の総免疫細胞の細胞数、好中球＋Ｇｒ−１＋細胞の総絶対細胞数およびＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の総絶対細胞数は、正常群（Ｂａｌｂ／ｃ正常群）のものと比較し急激に増加した。ＡＴＣ２（５、１０、１５、３０ｍｇ／ｋｇ）の１５ｍｇ／ｋｇ超で処置した試験群の総免疫細胞数は、対照群と比較して減少し、ベルプロシド（１５ｍｇ／ｋｇ）およびロフルミラスト（１５ｍｇ／ｋｇ）（ｐ＜０．０５）で処理した試験群のものは、対照群と比較して急激に減少した（図１４）。ＡＴＣ２（５、１０、１５、３０ｍｇ／ｋｇ）の１５ｍｇ／ｋｇ超（ｐ＜０．００１）および３０ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．００１）で処理した試験群の好中球＋Ｇｒ−１＋細胞の総絶対細胞数（総絶対数）は、対照群とそれぞれ比較して７３．２％超および８１．９％超減少し、ベルプロシド（１５ｍｇ／ｋｇ）（ｐ＜０．００１）およびロフルミラスト（１５ｍｇ／ｋｇ）（ｐ＜０．００１）で処理した試験群のものは、対照群とそれぞれ比較して９３．９％超および９７．５％超減少した（図１４）。ＡＴＣ２（５、１０、１５、３０ｍｇ／ｋｇ）の１５ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０１）および３０ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．００１）で処理した試験群のＣＤ４＋Ｔ細胞の総絶対細胞数（総絶対数）は、対照群とそれぞれ比較して４７．７％超および１９．７％超減少し、ベルプロシド（１５ｍｇ／ｋｇ）およびロフルミラスト（１５ｍｇ／ｋｇ）（ｐ＜０．００１）で処理した試験群のものは、対照群とそれぞれ比較して３２．９％超および７３．２％超減少した（図１４ｃ）。ＡＴＣ２（５、１０、１５、３０ｍｇ／ｋｇ）およびベルプロシド（１５ｍｇ／ｋｇ）で処置した試験群のＣＤ８＋Ｔ細胞の総絶対細胞数（総絶対数）は、対照群のものと比較すると顕著な違いはなく、一方ロフルミラスト（１５ｍｇ／ｋｇ）（ｐ＜０．００１）で処理した試験群は対照群のものと比較すると６７．２％超減少した（図１４）。
【０１７１】
その結果、ＡＴＣ２（５、１０、１５、３０ｍｇ／ｋｇ）の１５ｍｇ／ｋｇ超、ベルプロシド（１５ｍｇ／ｋｇ）およびロフルミラスト（１５ｍｇ／ｋｇ）で処理した群が炎症免疫細胞の増殖および活性化ならびに好中球の肺への動員に対する強力な阻害効果を示し、強力な抗ＣＯＰＤ活性を生じることが確認された。
【０１７２】
（２）ＢＡＬＦの好中球数に対する影響
マウスＢＡＬＦの対照群（ＣＯＰＤ対照）において、サイトスピンを用いてディフクイック染色した好中球の数は、正常群（Ｂａｌｂ／ｃ正常群）のものと比較して約１８４倍急激に増加した（図１５）。図１５に示すことができるように、ＡＴＣ２（５、１０、１５、３０ｍｇ／ｋｇ）の１５ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．００１）および３０ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．００１）で処理した群の好中球数は、対照群とそれぞれ比較して８９．１％超および７２．４％超減少し、ベルプロシド（１５ｍｇ／ｋｇ）（ｐ＜０．００１）およびロフルミラスト（１５ｍｇ／ｋｇ）（ｐ＜０．００１）で処理した群のものは、対照群とそれぞれ比較して９４．２％超および９９．０％超減少した。
【０１７３】
その結果、ＡＴＣ２（５、１０、１５、３０ｍｇ／ｋｇ）の１５ｍｇ／ｋｇ超、ベルプロシド（１５ｍｇ／ｋｇ）およびロフルミラスト（１５ｍｇ／ｋｇ）で処理した群が好中球の肺への動員の拡大に対する強力な阻害効果を示し、強力な抗ＣＯＰＤ活性を生じることが確認された。
【０１７４】
（３）ＢＡＬＦのＣＸＣＬ−１、ＴＮＦ−αおよびＭＩＰ−２の再生に対する影響
肺組織の炎症性マクロファージから産生されたものから放出された種々のケモカインＭＩＰ−２／ＣＸＣＬ−２、ＴＮＦ−αおよびプロテアーゼなどは、肺胞層を破壊し、ＫＣ／ＣＸＣＬ−１（ケモカインＧｒｏ−α）およびＣＸＣＬ−８は好中球を刺激し、プロテアーゼを放出し、それにより再度肺胞を破壊し、ＣＯＰＤを生じる（Blidberg K, Palmberg L, Dahlen B,Lantz AS, Larsson K.2012. Chemokine release by neutrophils in chronic obstructive pulmonary disease. Innate Immun. 18: 503-510）。
【０１７５】
図１６Ａに示すことができるように、ＥＬＩＳＡ法により決定された、マウスのＢＡＬＦのケモカインＫＣ／ＣＸＣＬ−１（ケモカインＧｒｏ−α）の再生を示すとき、対照群のケモカインＫＣ／ＣＸＣＬ−１（ケモカインＧｒｏ−α）の再生は、対照群（Ｂａｌｂ／ｃ正常群）のものと比較して約５．９倍急激に増加した。ＡＴＣ２（５、１０、１５、３０ｍｇ／ｋｇ）の１５ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０１）で処理した群のケモカインＫＣ／ＣＸＣＬ−１（ケモカインＧｒｏ−α）の再生は対照群とそれぞれ比較して４６．８％超および８３．９％超減少した。ベルプロシド（１５ｍｇ／ｋｇ）（ｐ＜０．０５）およびロフルミラスト（１５ｍｇ／ｋｇ）（ｐ＜０．０１）で処理した群のものは、対照群とそれぞれ比較して５７．４％超および８２．７％超減少した。図１６Ｂに示すことができるように、ＥＬＩＳＡ法により決定した、マウスのＢＡＬＦのＴＮＦ−αの再生を示すとき、対照群のＴＮＦ−αの再生は対照群（Ｂａｌｂ／ｃ正常群）のものと比較して約２．８倍急激に増加した。ＡＴＣ２（５、１０、１５、３０ｍｇ／ｋｇ）の１５ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０５）および３０ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０１）で処理した群のＴＮＦ−αの再生は対照群とそれぞれ比較して４５．５％超および６３．４％超減少し、ベルプロシド（１５ｍｇ／ｋｇ）（ｐ＜０．０５）およびロフルミラスト（１５ｍｇ／ｋｇ）（ｐ＜０．０１）で処理した群のものは、対照群とそれぞれ比較して４２．２％超および６５．０％超減少した。図１６Ｃに示すことができるように、ＥＬＩＳＡ法により決定した、マウスのＢＡＬＦのケモカインＭＩＰ−２／ＣＸＣＬ−２の再生を示すとき、対照群のケモカインＭＩＰ−２／ＣＸＣＬ−２の再生は、対照群（Ｂａｌｂ／ｃ正常群）のものと比較して約５．２倍急激増加した。ＡＴＣ２（５、１０、１５、３０ｍｇ／ｋｇ）の１５ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０５）および３０ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．００１）で処理した群のケモカインＭＩＰ−２／ＣＸＣＬ−２の再生は対照群とそれぞれ比較して４８．４％超および８６．４％超減少し、ベルプロシド（１５ｍｇ／ｋｇ）（ｐ＜０．０１）およびロフルミラスト（１５ｍｇ／ｋｇ）（ｐ＜０．００１）で処理した群のものは、対照群とそれぞれ比較して６３．０％超および８１．９％超減少した。
【０１７６】
その結果、ＡＴＣ２（５、１０、１５、３０ｍｇ／ｋｇ）の１５ｍｇ／ｋｇ超、ベルプロシド（１５ｍｇ／ｋｇ）およびロフルミラスト（１５ｍｇ／ｋｇ）で処理した群は、肺細胞の破壊に関与するケモカインＭＩＰ−２／ＣＸＣＬ−２、ＴＮＦ−α、ＫＣ／ＣＸＣＬ−１（ケモカインＧｒｏ−α）およびＣＸＣＬ−８などの再生に対して強力な阻害効果を示し、強力な抗ＣＯＰＤ活性を生じることが確認された。
【０１７７】
実験例５．動物モデル試験（ラット）
ＢＡＬＦの総免疫細胞、好中球などの数、サイトカイン、例えばＩＬ−１ベータ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−ａの再生されたレベル、ＭＭＰ−９の活性化、炎症誘発性タンパク質、例えばＭＭＰ−９、ＮＦ−ｋＢの発現および肺組織の炎症反応に対する本発明の抽出物または化合物の抗ＣＯＰＤ作用を決定するために、ＣＯＰＤ誘発型マウスを用いて以下の試験を行った。
【０１７８】
５−１．実験動物
定期的に関連する呼吸器病原体を血清学的にスクリーングした、６週齢の特定病原体除去雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（約１８０ｇ〜２００ｇ）を、ORIENT Co.（www.orient.co.kr、韓国ソウル）から購入し、温度２２±２℃、湿度５５±１５％、１２時間の明暗サイクルで制御された飼育室にて飼料（抗生物質非含有、Samyang Oil & Feed Corp.、韓国）および水を自由摂取にて飼育し、１週間に亘って実験環境に馴化させた。
【０１７９】
５−２．薬剤および投与
（１）試験サンプル
３種類の試験サンプル、すなわちＡＴＣ２（３０ｍｇ／ｋｇ）、ベルプロシド（３０ｍｇ／ｋｇ）、ダクサス（主成分：ロフルミラスト、１ｍｇ／ｋｇ）をＰＢＳに溶解し、試験サンプルとして使用する。
【０１８０】
（２）投与
ＡＴＣ２、ベルプロシド、ダクサスを気管支内投与（ｉ．ｔ．）の１時間前に４ｍｇ／ｋｇの用量にてマウスに経口投与した。
【０１８１】
５−３．ＣＯＰＤラットモデルの調製
（１）標準的なタバコ
３Ｒ４Ｆケンタッキー標準タバコ（カルフォルニア大学、米国）をタバコの煙を生成するための標準的なタバコとして使用した。１本当たりタール９．４ｍｇ、ＴＰＭ（総粒子状物質）１１ｍｇおよび１２ｍｇの一酸化炭素を含有するタバコを、温度２２±１℃および湿度６０±２％、開封後４８時間〜７２時間で調整した後に使用した。
【０１８２】
（２）手法
タバコ煙生成器（CH Technology Corp.米国）を用いてタバコの煙に曝露させた。詳細には、ノーズオンリー法に従い、ヘッド／ノーズオンリー曝露装置（TSE System、ドイツ）を用いて試験サンプルを経口後１時間で、タバコの煙に毎時間、３日間の吸入により曝露させた。実験において標準的なタバコの１本当たり８回の吐き出し（容量３５ｍＬ、期間２秒間、間隔１回／分）を行った。試験された群は５群、すなわち（ｉ）処置なしの正常群（正常対照、ＮＣ）、（ｉｉ）タバコの煙に曝露された対照群（ＣＯＰＤ）、（ｉｉｉ）タバコの煙に曝露する１時間前にダクサス（１ｍｇ／ｋｇ、経口）で処理した試験サンプル群（ＤＡ）、（ｉｖ）タバコの煙に曝露する１時間前にＡＴＣ２（３０ｍｇ／ｋｇ、経口）で処理した試験サンプル群（ＹＰＬ）および（ｖ）タバコの煙に曝露する１時間前にベルプロシド（３０ｍｇ／ｋｇ、経口）で処理した試験サンプル群（Ｖｅｒ）に分けられた。実験終了後、各ラットの血液、ＢＡＬＦおよび肺胞上皮細胞を単離し、試験用に回収した。
【０１８３】
５−４．ＢＡＬＦの単離および免疫細胞数の決定
実験を終了した後、ラットをＺｏｌｅｔｉｌ５０（３ＶＸ９、Virbac、フランス、経口）で麻酔し、尾静脈より採血した。肺からＢＡＬＦを単離するため、右肺の気管支を縫合糸で結紮した後、気管切開を行った。静脈用カテーテル（１６ＧＡ、３Ｓ−Ｃａｔｈ、Dukwoo、韓国）を気管支に入れ、気管支とカテーテル（１６ＧＡ、３Ｓ−Ｃａｔｈ、Dukwoo、韓国）との両方を縫合糸で固定した。ＤＰＢＳ（ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、１４１９０−２５０、Invitrogen、米国）を５ｍＬ含有する注射器をカテーテルにつなげ、ＤＰＢＳを強制的に３回循環させ、ＢＡＬＦを単離した。縫合糸で結紮した右肺を単離し、１０％中性ホルマリン溶液で固定し、残りの肺組織を−７０℃で冷凍庫に保存した。単離したＢＡＬＦを１５００ｒｐｍにて１５分間遠心分離し、細胞ペレットを調製し、上清をサイトカイン分析用に−７０℃で冷凍庫に保存した。細胞ペレットをＤＰＢＳに懸濁させ、細胞をサイトスピン遠心分離器（ＣＳ０３２７００４７、Hanil、韓国）を用いてスライドガラスに付着させた。ディフクイック染色（ＺＳ１００３、Sysmex、日本）を行い、細胞を光学顕微鏡検査（ＤＭ１０００、Leica、ドイツ）で観察し、各試験サンプルの免疫細胞数を計数した。
【０１８４】
５−５．ＢＡＬＦのサイトカイン分析
ラットから単離されたＢＡＬＦのＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＴＮＦ−α（R&D System、米国）のレベルを酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により決定した。各サイトカインの分析を製造者のマニュアルに従って行い、４５０ｎｍの吸光度をＥＬＩＳＡリーダー（３４０ＰＣ３８４、Molecular Devices、米国）により決定した。
【０１８５】
５−６．免疫細胞発現の決定
（１）ゼラチン酵素電気泳動
ラットの肺組織をプロテアーゼ阻害剤（１１８３６１５３００１、Roche、ドイツ）で処理した組織溶解緩衝液（Ｃ３２２８、Sigma-Aldrich、米国）を用いてホモジナイズし、ホモジナイズした肺組織を１２０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離し、上清を単離した。タンパク質アッセイ試薬（５００−０００６、Bio-Rad、米国）を使用し、定量化した。ＭＭＰ−９の活性を決定するため、１％ゼラチン（Ｇ９３８２、Sigma-Aldrich、米国）を含有するドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を実験に使用した。タンパク質に６０μｇ／レーンの用量で電気泳動を行った。酵素電気泳動ゲルを２．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（０６９４、Amresco、米国）で洗浄し、展開緩衝液（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５およびＣａＣｌ２、Ｔ１５０３、Sigma-Aldrich、米国）を用いて３７℃にて１６時間反応させた。反応が終了後、酵素電気泳動ゲルをクマシーブリリアントブルー（０４７２、Amresco、米国）を用いて染色し、脱染色緩衝液｛メタノール（Ｍ１４４７、Samchun、韓国）５００ｍＬ＋Ｄ．Ｗ１４００ｍＬ＋酢酸１６０ｍＬ（９１５１、J.T.Baker）｝を用いて洗浄した。ＭＭＰ−９バンドの密度をＣｈｅｍｉ−ｄｏｃ（１７０−８０７０、Bio-Rad、米国）を用いて決定し、ＭＭＰ−９の活性を決定した。
【０１８６】
（２）ウェスタンブロット
ホモジナイズから得られたタンパク質に、３０μｇ／レーンの用量で電気泳動を行い、二フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（ＩＰＶＨ０００１０、Millipore、米国）を用いて移した。膜（ＩＰＶＨ０００１０、Millipore、米国）を５％スキムミルクでブロックした後、抗ＭＭＰ−９（ａｂ３８８９８、Abcam、イギリス）、抗ｐ６５（ｓｃ−３７２、Santa Cruz、米国）および抗ｐ−ｐ６５（ｓｃ−３３０３９、Santa Cruz、米国）抗体と反応させた。反応が終了後、膜をＴＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＴｒｉｓ−緩衝生理食塩水、ＨＴ２００８、Biosesang、韓国）で洗浄し、室温にて１時間、適切な２次抗体（ｓｃ−３５８９１４、Santa Cruz、米国）と反応させた。膜をＴＢＳＴで再度洗浄し、バンドを化学発光キット（３４０９５、Thermo、米国）を用いて確認した。
【０１８７】
５−７．病理組織学的検査
摘出した肺を１０％ホルムアルデヒド溶液（Ｆ０１６１、SAMCHUN、韓国）で素早く固定し、薄片にスライスした。薄片を流水で８時間洗浄し、エポキシで包埋し、ミクロトーム（ＣＵＴ４０５０、MicroTec、ドイツ）で薄片にスライスし、ヘマトキシリン（ＭＨＳ−１６、Sigma-Aldrich、米国）およびエオジン（ＨＴ１１０−１−３２、Sigma-Aldrich、米国）で染色した。肺組織の病理組織学的変化を観察するため、細胞を４００倍の光学顕微鏡（ＤＭ１０００、Leica、ドイツ）で観察した。
【０１８８】
５−８．統計
種々の実験から得られた結果全てを、一元配置ＡＮＯＶＡ検定を用いて決定し、それぞれの群間の統計的有意性の事後比較結果をダネットの多重比較検定に従い検証した。
【０１８９】
５−９．試験結果
（１）ＢＡＬＦの総免疫細胞数に対する影響
特徴的な好中球濃度の増加がＣＯＰＤ誘発型群に観察された。ダクサスで処理した薬剤対照群は好中球濃度が低下したが、ＣＯＰＤ誘発型群と比較し著しいものではなかった。一方、ＡＴＣ２およびベルプロシドで処理した群はＣＯＰＤ誘発型群と比較し、好中球および総免疫細胞の濃度の著しい低下を示した（図１７Ａ）。低下を好中球の濃度と総免疫細胞の濃度との比で観察した。ダクサスで処理した陽性対照群は、ＣＯＰＤ誘発型群に対して３００個の免疫細胞を計数した場合、免疫細胞数に対する好中球数の比と同様の比を示したが、ＡＴＣ２およびベルプロシドで処置された群は、好中球数の比の著しい低下を示した（図１７Ｂ）。
【０１９０】
（２）ＢＡＬＦのサイトカイン放出に対する影響
ＣＯＰＤ誘発型群において、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＴＮＦ−α濃度がＢＡＬＦにおいて急激に増加した。ダクサスで処理した薬剤対照群は、ＣＯＰＤ誘発型群と比較してサイトカイン濃度の顕著な低下を示さなかった。一方、ＡＴＣ２およびベルプロシドで処理した群はＣＯＰＤ誘発型群と比較してサイトカイン濃度が顕著に低下し、この低下のレベルはダクサスで処理した薬剤対照群と比較して急激な減少であった（図１８）。
【０１９１】
（３）肺組織のＭＭＰ−９活性に対する影響
ＣＯＰＤ誘発型群において、炎症および細胞外マトリクスの分解に関与する重要なメディエーターであるＭＭＰ−９の活性は著しく増加した。一方、ＡＴＣ２およびベルプロシドで処理した群は、ＭＭＰ−９の活性が著しく低下し、この低下のレベルはダクサスで処理した薬剤対照群と同様であった（図１９）。
【０１９２】
（４）肺組織の炎症誘発性タンパク質の発現に対する影響
ＣＯＰＤ誘発型群において、炎症誘発性タンパク質、例えばＭＭＰ−９およびＮＦ−κＢの活性が著しく増加した。しかし、ＣＯＰＤ誘発型群の炎症誘発性タンパク質の発現のこのような増加は、ＡＴＣ２およびベルプロシドで処理した群において顕著に低下し、ダクサスで処理した薬剤対照群と同様であった（図２０）。
【０１９３】
（５）肺組織の炎症に対する影響
ＣＯＰＤ誘発型群において、気管支、血管周囲組織、および間質組織などに多くの炎症細胞の浸潤が示された。また、ＣＯＰＤ誘発型群におけるこのような炎症の増大は、ＡＴＣ２およびベルプロシドで処理した群およびダクサスで処理した薬剤対照群において顕著に低下した。ＡＴＣ２およびベルプロシドで処理した群の炎症に対する阻害効果はダクサスで処理した薬剤対照群のものより強力であった（図２１）。
【０１９４】
その結果、ＡＴＣ２およびＡＴＣ２から単離された化合物、ベルプロシドなどは、ＣＯＰＤの主な原因である、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、またはＴＮＦ−αの放出、ＮＦ−κＢの活性化およびＭＭＰ−９の発現を阻害することによりＣＯＰＤの対する強力な治療効果を有することが確認された。本発明の抽出物または化合物のこのような治療活性は、従来から入手可能なＣＯＰＤ治療剤（ダクサス）と同様またはより強力なものであると確認する。
【０１９５】
実験例６．ラットにおける経口投与による急性毒性試験
６週齢のＳＰＦ  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに本発明の抽出物および化合物を投与することにより、急性毒性試験を行った。
【０１９６】
２５０ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ、５０００ｍｇ／ｋｇの本発明の抽出物および化合物を、２匹のラットからなる各群に経口投与し、ラットの症状を１４日間に亘り観察した。抽出物または化合物の投与の後、全ての臨床上の変化、すなわち、死亡率、臨床兆候、体重の変化を観察し、血液学検査および血液生化学検査などの血液検査を行った。検視により腹部臓器および胸部臓器の異常な変化を観察した。
【０１９７】
いずれの群またはいずれの性別においても、死亡率の変化、臨床兆候、体重変化および重大な知見を全く示さなかった。さらに、５０００ｍｇ／ｋｇの本発明の抽出物または化合物で処理した試験群において何らの毒性も示さなかった。
【０１９８】
したがって、本発明で調製した本発明の抽出物および化合物が経口投与においてＬＤ５０（５０００ｍｇ／ｋｇ超）を示す強力で安全な物質であったことが確認された。
【０１９９】
［発明の形態］
以下に製剤化方法および賦形剤の種類を記載するが、本発明はそれらに限定されない。代表的な調製例を以下に記載する。
【０２００】
注射用調製物
ＡＴＣ１抽出物．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１００ｍｇ
メタ重亜硫酸ナトリウム．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．３．０ｍｇ
メチルパラベン．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０．８ｍｇ
プロピルパラベン．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０．１ｍｇ
注射用蒸留水．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．適量
【０２０１】
有効成分を溶解し、ｐＨを約７．５に制御し、その後、全ての成分を２ｍｌアンプルに充填して、従来の注射用調製物の方法により滅菌することにより注射用調製物を調製した。
【０２０２】
粉末調製物
ＡＴＣ２抽出物．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．５００ｍｇ
コーンスターチ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１００ｍｇ
乳糖．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１００ｍｇ
タルク．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１０ｍｇ
【０２０３】
上記成分を混合し、密封パッケージに充填することにより粉末調製物を調製した。
【０２０４】
錠剤調製物
ベルプロシド．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．２００ｍｇ
コーンスターチ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１００ｍｇ
乳糖．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．適量
【０２０５】
上記成分を混合し、打錠することにより錠剤調製物を調製した。
【０２０６】
カプセル調製物
ベラトルム酸．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１００ｍｇ
乳糖．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．５０ｍｇ
コーンスターチ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．５０ｍｇ
タルク．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．２ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．適量
【０２０７】
上記成分を混合し、従来のゼラチン調製物の方法によりゼラチンカプセルに充填することにより錠剤調製物を調製した。
【０２０８】
液体調製物
カタルポシド．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１０００ｍｇ
糖．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．２０ｇ
多糖類．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．２０ｇ
レモンフレバー．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．２０ｇ
【０２０９】
有効成分を溶解した後、全ての成分を１０００ｍｌのアンプルに充填し、従来の液体調製物の方法により滅菌することによって液体調製物を調製した。
【０２１０】
健康食品調製物
ＡＴＣ２抽出物．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１０００ｍｇ
混合ビタミン．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．適量
ビタミンＡアセテート．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．７０ｇ
ビタミンＥ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１．０ｍｇ
ビタミンＢ１．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０．１３ｍｇ
ビタミンＢ２．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０．１５ｍｇ
ビタミンＢ６．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０．５ｍｇ
ビタミンＢ１２．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０．２ｇ
ビタミンＣ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１０ｍｇ
ビオチン．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１０ｇ
ニコチン酸アミド．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１．７ｍｇ
葉酸．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．５０ｇ
パントテン酸カルシウム．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０．５ｍｇ
混合ミネラル．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．適量
硫酸第一鉄．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１．７５ｍｇ
酸化亜鉛．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０．８２ｍｇ
炭酸マグネシウム．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．２５．３ｍｇ
リン酸一カリウム．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１５ｍｇ
リン酸二カルシウム．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．５５ｍｇ
クエン酸カリウム．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．９０ｍｇ
炭酸カルシウム．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１００ｍｇ
塩化マグネシウム．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．２４．８ｍｇ
【０２１１】
上述のビタミンおよびミネラルの混合物は、様々に変化し得る。かかる変化は、本発明の趣旨および範囲から逸脱するものではないものとする。
【０２１２】
健康飲料調製物
６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール．．．．．．．．．．．．．．．．．．１０００ｍｇ
クエン酸．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１０００ｍｇ
オリゴ糖．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１００ｇ
濃縮アンズ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．２ｇ
タウリン．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１ｇ
蒸留水．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．９００ｍｌ
【０２１３】
有効成分を溶解し、混合し、８５℃で１時間撹拌し、濾過した後、全ての成分を１０００ｍｌのアンプルに充填し、従来の健康飲料調製物の方法により滅菌することによって健康飲料調製物を調製した。
【０２１４】
上述の本発明について、該発明が様々に変化し得ることが明らかであろう。かかる変化は本発明の趣旨および範囲から逸脱するものとされず、当業者に自明であろう全てのかかる修飾が添付の特許請求の範囲内に包含されることが意図される。
【産業上の利用可能性】
【０２１５】
本発明の記載されるように、シュードリシマキオン・ロツンダム変種スブインテグルムの抽出物由来のカタルポール誘導体などの豊富な有効成分を含有する本発明の精製抽出物またはベラトルム酸、ベルプロシド、カタルポシド、ピクロシドＩＩ、イソバニロイルカタルポールおよび６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールからなる群から選択される少なくとも１つの化合物は、ＢＡＬＢ／ｃ雄性マウスを用いた種々のｉｎ  ｖｉｖｏ試験、例えばＣＯＰＤ発症時に生じる炎症免疫細胞の増殖および活性ならびに好中球の肺への動員に対する阻害試験；肺胞上皮細胞の破壊に関与するケモカイン、例えばＭＩＰ−２／ＣＸＣＬ−２、ＴＮＦ−アルファ、ＫＣ／ＣＸＣＬ−１（ケモカインＧｒｏ−アルファ）およびＣＸＣＬ−８などの再生に対する阻害試験；ＳＰＦ（特定病原体除去）Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを用いた動物試験においてＮＦ−カッパＢ活性化を低下させることによるＩＬ−１ベータ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−アルファの放出およびＭＭＰ−９発現に対する低減効果を経て、ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験、例えば分子発現プロファイル変化試験などのＴｈ２細胞のＩＬ−４発現に対する作用を誘発するＭＵＣ５ＡＣ（オリゴマー粘液／ゲル形成）の発現に対する阻害試験において、ベータ−２−受容体アゴニストが反応することなく強力な抗ＣＯＰＤ活性を示した。それゆえ、上記の精製抽出物または化合物を、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を治療および予防する治療剤または機能性健康食品として使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図６】
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