(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系幹細胞、ヒアルロン酸及び医薬上許容される担体を含み、前記間葉系幹細胞が、膝蓋下脂肪パッドストローマ細胞である、医薬組成物。
【請求項２】
関節疾患の治療に用いられる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記関節疾患が、関節軟骨の欠陥、慢性関節リウマチ、変形性関節炎又は癒着性関節包炎である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記間葉系幹細胞が、３回目〜６回目継代までに培養されたものである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記間葉系幹細胞を１.６×１０７〜１×１０９個含む、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記間葉系幹細胞が、誘導されてグリコサミノグリカンを生産する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ヒアルロン酸の濃度範囲が、２５％（v／v）〜７５％（v／v）である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ヒアルロン酸の濃度範囲が、２５％（v／v）〜５０％（v／v）である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記ヒアルロン酸の濃度範囲が、２５％（v／v）である、請求項８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬組成物に関し、特に、間葉系幹細胞、ヒアルロン酸及び医薬上許容される担体を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨関節炎（osteoarthritis）は、高齢者の健康に関する世界的な問題であり、５５〜７０歳の米国人のうちの７０％以上に影響を与えている。その原因は、慢性の外傷又は疾患による漸進的な軟骨損傷である。また、関節軟骨は、血管を備えず、その細胞の有糸分裂の活性が低いため、その細胞の修復には限界がある。
【０００３】
様々な病理のメカニズム、例えば、細胞外マトリックスの酵素的分解（enzymatic degradation of the extracellular matrix。以下、ECMという）、新たなマトリックスの形成の欠乏、細胞死及び軟骨細胞の異常な活性化と肥大型の分化（hypertrophic differentiation）などが骨関節炎の形成に関与している。現在、骨関節炎による疼痛を軽減して影響を受ける機能を改善する治療方法が数多く開発されてきている。しかしながら、現在の治療戦略として、例えば、全体的な関節形成術（total joint arthroplasty）を使用しても、軟骨の自然構造を回復させることができないだけではなく、関節が損傷されるリスクをさらに増やす可能性がある。
【０００４】
現在、骨髄間葉系幹細胞（bone marrow mesenchymal stem cells。以下、BMSCという）で作られた骨と軟骨が既に開発されており、骨関節炎の治療に用いられている。このような技術は訴求力があるものの、骨髄を得るのが辛く、特に、高齢者にとって、生成される幹細胞の量には限界がある。したがって、幹細胞の培養をさらに広げる必要がある。脂肪由来間葉系幹細胞（adipose-derived mesenchymal stem cells。以下はASCという）は、大量のASCが得られてその発病率が低く、かつ、体外でその培養を容易に広げることができるので、今日最も好ましい選択肢であると認められている。また、再生（regeneration）の活性以外、ASCは免疫抑制の特性をも持っている。近年、膝蓋下脂肪パッド（infra-patellar fat pad。以下、IFPという）に幹細胞の特性を持つ細胞が発見された。
【０００５】
ECMは、細胞の微小環境を提供することで恒常性（homeostasis）を維持し、そして特定の組織に分化する。ECMにおいて、ヒアルロン酸（hyaluronan。以下、HAという）は軟骨間質のグリコサミノグリカン（glycosaminoglycan）であり、軟骨組織に自然に存在する。関節軟骨のマトリックスの主要な生理的成分として、HAの量は関節液（synovial fluid）において特に豊富であり、また、このポリマーは軟骨の恒常性に対して機能を発揮して、細胞に関する過程、例えば、細胞の形態形成（morphogenesis）、増殖及び傷口の修復にも関与する。また、HAは関節内の関節炎の治療にも広く使用されている。しかしながら、間葉系幹細胞（Mesenchymal stem cells。以下、MSCという）の分化におけるHAの微小環境の影響に関する研究は少ない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、間葉系幹細胞、ヒアルロン酸及び医薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【０００７】
本発明の一つの具体的な実施例において、前記組成物は、関節疾患の治療に用いられ、また、前記関節疾患は、関節軟骨の欠陥、慢性関節リウマチ、変形性関節炎又は癒着性関節包炎である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一つの具体的な実施例において、前記間葉系幹細胞は、３回目〜６回目継代までに培養されたものである。また、一つの具体的な例において、前記間葉系幹細胞を、１.６×１０７〜１×１０９個含み、前記間葉系幹細胞は、膝蓋下脂肪パッドストローマ細胞（infra-patellar fat pad stromal cell。以下、IFPSCという）、骨髄間葉系幹細胞、ホウォートンゼリー幹細胞（Wharton’s jelly stem cell。以下、WJSCという）及び脂肪由来幹細胞（adipose derived stem cell。以下、ASCという）からなる群より選ばれる少なくとも一種である。好ましくは、前記の間葉系幹細胞は、膝蓋下脂肪パッドストローマ細胞である。
【０００９】
本発明の一つの具体的な実施例において、前記間葉系幹細胞は、誘導されてグリコサミノグリカンを生産する。
【００１０】
本発明の一つの具体的な実施例において、前記ヒアルロン酸の濃度範囲は、２５％（v／v）〜７５％（v／v）である。好ましくは、前記ヒアルロン酸の濃度範囲は、２５％（v／v）〜５０％（v／v）である。特に好ましくは、前記ヒアルロン酸の濃度範囲は、２５％（v／v）である。
【００１１】
本発明はさらに、間葉系幹細胞、ヒアルロン酸及び医薬上許容される担体を含む有効量の医薬組成物を損傷した関節組織に投与する、関節疾患を治療するための方法を提供する。
【００１２】
本発明の一つの具体的な実施例において、本発明の医薬組成物は、注射によって損傷した関節組織に投与され、また、前記関節疾患は、関節軟骨の欠陥、慢性関節リウマチ、変形性関節炎又は癒着性関節包炎である。
【００１３】
本発明の一つの具体的な実施例において、前記間葉系幹細胞は、３回目〜６回目継代までに培養されたものであり、前記の間葉系幹細胞を、１.６×１０７〜１×１０９個含む。
【００１４】
本発明の一つの具体的な実施例において、前記間葉系幹細胞は、膝蓋下脂肪パッドストローマ細胞、骨髄間葉系幹細胞、ホウォートンゼリー幹細胞及び脂肪由来幹細胞からなる群より選ばれる少なくとも一種である。好ましくは、前記間葉系幹細胞は、膝蓋下脂肪パッドストローマ細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１−１】それぞれ、（A）膝蓋下脂肪パッドストローマ細胞の細胞表面マーカー、（B）骨髄間葉系幹細胞（BMSC）の細胞表面マーカー、（C）ホウォートンゼリー幹細胞（WJSC）の細胞表面マーカー、及び（D）脂肪由来幹細胞（ASC）の細胞表面マーカーを示す図である。
【図１−２】それぞれ、（A）膝蓋下脂肪パッドストローマ細胞の細胞表面マーカー、（B）骨髄間葉系幹細胞（BMSC）の細胞表面マーカー、（C）ホウォートンゼリー幹細胞（WJSC）の細胞表面マーカー、及び（D）脂肪由来幹細胞（ASC）の細胞表面マーカーを示す図である。
【図１−３】それぞれ、（A）膝蓋下脂肪パッドストローマ細胞の細胞表面マーカー、（B）骨髄間葉系幹細胞（BMSC）の細胞表面マーカー、（C）ホウォートンゼリー幹細胞（WJSC）の細胞表面マーカー、及び（D）脂肪由来幹細胞（ASC）の細胞表面マーカーを示す図である。
【図１−４】それぞれ、（A）膝蓋下脂肪パッドストローマ細胞の細胞表面マーカー、（B）骨髄間葉系幹細胞（BMSC）の細胞表面マーカー、（C）ホウォートンゼリー幹細胞（WJSC）の細胞表面マーカー、及び（D）脂肪由来幹細胞（ASC）の細胞表面マーカーを示す図である。
【図１−５】それぞれ、（A）膝蓋下脂肪パッドストローマ細胞の細胞表面マーカー、（B）骨髄間葉系幹細胞（BMSC）の細胞表面マーカー、（C）ホウォートンゼリー幹細胞（WJSC）の細胞表面マーカー、及び（D）脂肪由来幹細胞（ASC）の細胞表面マーカーを示す図である。
【図１−６】それぞれ、（A）膝蓋下脂肪パッドストローマ細胞の細胞表面マーカー、（B）骨髄間葉系幹細胞（BMSC）の細胞表面マーカー、（C）ホウォートンゼリー幹細胞（WJSC）の細胞表面マーカー、及び（D）脂肪由来幹細胞（ASC）の細胞表面マーカーを示す図である。
【図１−７】それぞれ、（A）膝蓋下脂肪パッドストローマ細胞の細胞表面マーカー、（B）骨髄間葉系幹細胞（BMSC）の細胞表面マーカー、（C）ホウォートンゼリー幹細胞（WJSC）の細胞表面マーカー、及び（D）脂肪由来幹細胞（ASC）の細胞表面マーカーを示す図である。
【図１−８】それぞれ、（A）膝蓋下脂肪パッドストローマ細胞の細胞表面マーカー、（B）骨髄間葉系幹細胞（BMSC）の細胞表面マーカー、（C）ホウォートンゼリー幹細胞（WJSC）の細胞表面マーカー、及び（D）脂肪由来幹細胞（ASC）の細胞表面マーカーを示す図である。
【図２】図２は、膝蓋下脂肪パッドストローマ細胞（IFPSC）、骨髄間葉系幹細胞（BMSC）、ホウォートンゼリー幹細胞（WJSC）及び腹部皮下脂肪からの脂肪由来幹細胞（ASC）の成長動力学を示す図である。
【図３】図３は、異なるソース由来の間葉系幹細胞を軟骨細胞に走化させた条件培地（conditioned medium。以下、CMという）を示す図である。
【図４】図４は、膝蓋下脂肪パッドストローマ細胞（IFPSC）の多重効果の分化能力を示す図であり、それぞれ（A）オイルレッド（oil red）で染色された脂質形成、（B）アリザリンレッド（alizarin red）で染色された骨形成、（C）及び（D）アルシアンブルー（alcian blue）で染色された軟骨形成を示す。なお、（A）及び（B）における比例尺度は１００ μmであり、（C）及び（D）における比例尺度は１０００ μmである。
【図５】図５は、膝蓋下脂肪パッドストローマ細胞（IFPSC）が、他の幹細胞より軟骨性をことを示す図であり、それぞれ（A）１４日目及び２１日目にアルシアンブルーで染色された様々の間葉系幹細胞、（B）ＯＤ５９５で測定されたアルシアンブルーの染色量、qRT-PCRで測定された異なる誘導日数後の（C）ＳＯＸ９及び（D）ＣＯＬ２Ａ１遺伝子の発現量（*Ｐ＜０.０５）を示す。
【図６】図６は、２５％（v／v）のヒアルロン酸（HA）によってヒト膝蓋下脂肪パッドストローマ細胞（IFPSCs）の脂肪形成、骨形成及び軟骨形成を向上させ、前記IFPSCが、異なる濃度のHAにおけるそれぞれアリザリンレッド、オイルレッド及びアルシアンブルーで染色された脂肪形成、骨形成及び軟骨形成の（A）写真、（B）含有量（*Ｐ＜０.０５、**Ｐ＜０.０１、及び***Ｐ＜０.００１）を示す図である。
【図７】図７は、ヒアルロン酸（HA）が膝蓋下脂肪パッドストローマ細胞（IFPSC）の増殖に影響を及ぼさず、２５％（v／v）、５０％（v／v）、７５％（v／v）及び１００％（v／v）のHAで５日間培養後のIFPSCの（A）写真、（B）異なる濃度のHAがIFPSCの増殖に影響を及ぼさないことを示す図である。なお、比例尺度は１０００μmである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、特定の具体的な実施例により、本発明を実施する形態を説明する。本技術分野に習熟した者は、本明細書に開示された内容によって簡単に本発明の利点や効果を理解することができる。本発明は、他の異なる具体的な実施例によって施行又は応用することもでき、本明細書におけるそれぞれの詳しい内容も、異なる観点と応用に基づいて、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、様々な修正と変更を施すことができる。
【００１７】
特に説明しない限り、本願の明細書と特許請求の範囲において使用された数量用語「一つ」と「前記」は、複数の場合を含む。
【００１８】
特に説明しない限り、本願の明細書と特許請求の範囲において使用された用語「又は」は、「及び／又は」の意味を含む。
【００１９】
本発明は、間葉系幹細胞、ヒアルロン酸及び医薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。本発明の一つの具体的な実施例によれば、前記組成物は関節疾患の治療に用いられ、また、前記関節疾患は、関節軟骨の欠陥、慢性関節リウマチ、変形性関節炎又は癒着性関節包炎である。本発明は、関節疾患の治療に用いられ、特に、関節軟骨の修復に用いられて、様々な軟骨の修復を促進させる。
【００２０】
本発明の一つの具体的な実施例によれば、関節軟骨においては細胞密度の範囲が６８００〜２４０００cells／mm３である軟骨細胞を含むことから、このような細胞密度による軟骨再生では、６００mm３エリアの軟骨を修復させるのに、１.６×１０７個細胞が必要となると推定する。そのため、本発明の一つの具体的な実施例によれば、軟骨組織を修復するためのIFPSCの準備には、膝蓋下脂肪パッドを切除すること及びIFPSCの人工的な処理と分離を含み、約１時間かかる。その後、前記IFPSCを４〜５日培養して半集密的な（sub-confluence）程度に至らしめ、さらに１０日（３回目継代培養（passage））培養して１.６×１０７個の細胞に増殖させるこの製剤は二週間以内で完成させることができると推定する。本発明の一つの具体的な実施例によれば、好ましくは、前記間葉系幹細胞が３回目〜６回目継代までに培養された時、前記間葉系幹細胞の範囲が１.６×１０７〜１×１０９個となっている。最も好ましくは、前記間葉系幹細胞が５回目継代までに培養された時、前記間葉系幹細胞を１×１０８個含む。
【００２１】
本発明の一つの具体的な実施例によれば、前記間葉系幹細胞は、膝蓋下脂肪パッドストローマ細胞（IFPSC）、骨髄間葉系幹細胞（BMSC）、ホウォートンゼリー幹細胞（WJSC）及脂肪由来幹細胞（ASC） からなる群より選ばれる少なくとも一種である。好ましくは、前記間葉系幹細胞は膝蓋下脂肪パッドストローマ細胞である。
【００２２】
本発明の一つの具体的な実施例によれば、本発明は、前記IFPSC細胞表面マーカーの輪郭（profile）及び成長動力学（growth kinetics）が腹部皮下脂肪からの脂肪由来幹細胞（ASC）と一致することを示す。ＣＤ３４とＣＤ４５の含有量は、前記IFPSC（９.０％和１１.０％）においてより高く、これに対し、骨髄幹細胞（BMSC）はそれぞれ０.３％と０.５％である。前記IFPSCはASCの表面マーカーをほとんど持っているものの、前記IFPSCにおいてＣＤ４５の含有量はASCより高い（０.４％）。
【００２３】
本発明の一つの具体的な実施例によれば、軟骨培地の存在のもと、間葉系幹細胞（IFPSC、ASC、BMSC及びWJSCを含む）が誘導されてグリコサミノグリカンを生産し、前記グリコサミノグリカンが関節軟骨の細胞外マトリックスの主要な成分であり、アルシアンブルーで染色することができる。他の間葉系幹細胞（ASC、BMSCとWJSCを含む）に比べて、軟骨が誘導された場合、前記IFPSがより顕著なアルシアンブルー染色を示すとともに、その軟骨細胞の遺伝子（例えば、ＳＯＸ９とＣＯＬ２Ａ１）の発現量が高い。
【００２４】
本発明の一つの具体的な実施例によれば、本発明は、間葉系幹細胞が軟骨細胞への走化活性を有することをも示し、これは、前記間葉系幹細胞が損傷した軟骨への潜在的な方向性があることを示唆する。しかし、非関節由来の間質系細胞もよく発見されたため、このような走化作用は組織に対する特異性を有しないことを示す。
【００２５】
本発明の一つの具体的な実施例によれば、提供者の年齢は、間葉系幹細胞の増殖率、倍加時間（doubling time）、テロメアの長さ（telomere length）、又は骨と軟骨への分化能力に影響を及ぼさない。この幹細胞は、３回目〜６回目継代までに培養されたとき、安定性及び前駆細胞（progenitor cells）と比較できるほどの細胞特性を有するが、１０回目継代までに複製された時、細胞老化を引き起こすことが多い。
【００２６】
本発明の一つの具体的な実施例によれば、異なる濃度のヒアルロン酸（HA）は間葉系幹細胞の増殖に対して促進作用を有さない。しかしながら、HAは、間葉系幹細胞の軟骨の形成に対して促進作用を有する可能性がある。HAは、軟骨組織の自然成分とすることができるため、関節内の前駆細胞から軟骨細胞への誘導に使用され、また、細胞集合接着における細胞同士の間の架橋にとっては必要な成分である。さらに、HAはIFPを取り囲む関節液における主要な成分でもあるため、関節液中のHAは微小環境を作ることができ、そして、損傷した組織を修復する期間内に前記間葉系幹細胞から軟骨への分化を誘導させることができる。本発明においては、HAの濃度は体積百分率で表される。本発明に用いられるHAの濃度範囲は、０％（v／v）〜１００％（v／v）であり、好ましくは、２５％（v／v）〜７５％（v／v）である。その濃度が２５％（v／v）であるHAは、軟骨分化に対して、最も良い効果がある。これは、HAが軟骨生長にとって適切な微小環境を提供し得るとともに、間葉系幹細胞から軟骨への分化作用を向上させることを示唆する。
【００２７】
本発明の一つの具体的な実施例によれば、本発明は、間葉系幹細胞（IFPSC、ASC、BMSC及びWJSCを含む）とHAを組み合わせて損傷した関節組織に注射することによって、好ましい軟骨形成の効果が示される。
【００２８】
本発明の一つの具体的な実施例によれば、間葉系幹細胞、ヒアルロン酸及び医薬上許容される担体を含む組成物において、例えば、固形体の組成物に用いられる場合、医薬上許容される担体として、結合剤、潤滑剤、崩壊剤、賦形剤、溶解補助剤、分散剤、安定剤、懸濁剤、着色剤及び香り付けが挙げられ、液体状態の組成物に用いられる場合、医薬上許容される担体として、緩衝剤、保存剤、鎮痛薬、溶解補助剤、等張化剤及び安定剤が挙げられる。
【００２９】
本発明の一つの具体的な実施例において、HAはASCから軟骨への分化作用をも向上させ、また、HAの濃度が２５％（v／v）である場合、IFPSCによる軟骨形成の効果はASCによるものより大きい。
【実施例】
【００３０】
膝蓋下脂肪パッド（IFP）と関節軟骨組織の取得
仏教慈済総合医院の研究倫理委員会に批准され、かつ、参加者からのインフォームド・コンセントを得た後、成人男性から関節鏡で手術を行って初代のヒト関節軟骨断片を分離させ、全膝関節置換術からIFPsを手に入れるとともに、他の由来の幹細胞（BMSC、ASC及びWJSC）を獲得した。IFPsの体積は約２×２×２cm３であった。患者（n=２、全員女性）の年齢は６０歳以上である（それぞれ６５歳と６８歳である）。
【００３１】
統計的分析
本明細書において、結果は平均値±標準偏差で表される。学生のt検定（Student’s t-test）は対照群と実験群間の平均差を評価するのに用いられる。Ｐ＜０.０５の数値は統計学的に有意なものと認められる。多重比較のマンホイットニーのU検定（Mann-Whitney U test）を用いることによってIFPSCの増殖率と他の三種類の異なる由来の幹細胞の増殖率を比較した。
【００３２】
実施例１  ヒトIFPsからのマトリックス細胞の由来
前記得られたIFPsに対してリン酸緩衝生理食塩水（PBS、Biowest、Nuaille、フランス）で連続する洗浄を行って、０.１mg／mlコラゲナーゼIaを用いて３７℃で６０分間分解させた（シグマ-アルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州、米国）。酵素によって消化された後、得られた細胞を集めて、５％ウシ胎児血清（以下、FBSという）（Biological Industry、キブツ、イスラエル）、N-アセチルシステイン（NAC）及びL-アスコルビン酸２-リン酸塩（シグマ-アルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州、米国）を補足するケラチノサイトの無血清培地（KSFM、Ｇｉｂｃｏ、グランドアイランド、NY、米国）に培養した。培養から２日目にペトリ皿の中から上澄み液と破片を除き、そして、得られたIFPSC培養物を０回目とマークした。自発的な分化を抑制するために、前記培養物を半集密的な（８０％集密より低い）程度に維持した。２.５％トリプシン／０.２３mM EDTA （Ｇｉｂｃｏ、グランドアイランド、NY、米国）を使用して継代培養を行った。９６穴プレートの中、細胞密度約２０００cell／cm２で０、３及び７日目にXTT細胞増殖の測定（ロシュ社、マンハイム、ドイツ）を行った。
【００３３】
実施例２  骨髄幹細胞（BMSC）、脂肪由来幹細胞（ASC）及びホウォートンゼリー幹細胞（WJSC）の培養
仏教慈済総合医院の骨髄バンクからBMSC（N=１）を提供して、１０％FBS（Biological Industry社、べイト  ヘメク、イスラエル）を補足するα-MEM培地（Ｇｉｂｃｏ、グランドアイランド、NY、米国）にそのBMSCを培養した。
【００３４】
ASCは、婦人科の手術を受けた患者（N=１、女性、６０歳）の皮下組織由来のものである。ヒト脂肪組織を小さく（１至２ mm３）切って、０.１mgコラゲナーゼIa（シグマ-アルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州、米国）により分解させ、３７℃で６０分間培養した。得られた細胞を集めて、５％FBS、NAC及びL-アスコルビン酸２-リン酸塩を補足するKSFM培地（表皮の成長因子とウシ脳下垂体抽出物である。Ｇｉｂｃｏ、１７００５-０４２、グランドアイランド、NY、米国）に培養した。培養から２日目にペトリ皿中から上澄み液と破片を除き。自発的な分化を抑制するために、この培養物を半集密的な（８０％集密より低い）程度に維持した。
【００３５】
得られたヒト臍帶組織（n=１）をはさみで中心線に沿って機械カッティングを行い、前記臍動脈、臍静脈及びアウトライン膜（outlining membranes）の血管をホウォートンゼリーから分離させ、そして、前記ゼリーを０.５cm３の断片より小さく切った。また、前記ゼリーをコラゲナーゼ１型（シグマ-アルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州、米国）で処理し、９５％の空気／５％CO２の湿った環境において、３７℃で１４〜１８時間培養した。さらに、９５％の空気／５％CO２の湿った環境中おいて、３７℃で前記の外植片（explants）を１０％FBSと抗生物質を補足するDMEM培地（Ｇｉｂｃｏ、グランドアイランド、NY、米国）に培養した。その後、この培養された外植片を５〜７日静置し、WJSCをその外植片から移行した。
【００３６】
実施例３  フローサイトメーターによる幹細胞の表面分子の分析
フローサイトメーターによって、３回目又は４回目継代までに培養を行ったIFPSC和BMSCの表面分子を定性した。２mM EDTAを補足するPBSで細胞を分離させ、２％ウシアルブミン及び０.１％窒化ナトリウム（シグマ-アルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州、米国）を補足するPBSで洗浄して、それぞれフルオレセインイソチオシアネート（fluorescein isothiocyanate）又は藻紅素（phycoerythrin）を接合された抗体（ＣＤ２９、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、HLA-ABC及びHLA-DR （BD、PharMingen）を含む）とを培養した。その後、ベクトン・ディッキンソン社のフローサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン社、サンノゼ、CA、米国）によってこの細胞を分析した。
【００３７】
実施例１〜３の結果は、前記IFPSCが脂肪由来幹細胞と似ている発現タイプを有することを示している。図１に示すように、３回目継代までに培養するまでに、前記衍生されたIFPSCは、高度な同質の繊維細胞様細胞の外観を有し、１４日間の培養に経って容易に細胞の集密に至って、前記IFPSCは、MSCsと似ており、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びHLA-ABCの表面マーカーを発現した。しかしながら、図１に示すように、前記IFPSCは、BMSCと異なって、より高い含有量のＣＤ３４及ＣＤ４５を発現した。図１及び表１に示すように、BMSC、WJSC及びASCに比べて、前記IFPSCは、ASCと似ているものの、BMSCと異なる細胞の表面マーカーを持っている。図２に示すように、０、３及び７日目にIFPSC、BMSC、WJSC及びASCの細胞数を観察すると、７日目のとき、前記IFPSCの成長動力学は、明らかにASC、BMSC及びWJSCの成長動力学よりも優れている（Ｐ＜０.０５）。
【００３８】
【表１】
0005960777.tif 000002
【００３９】
実施例４  走化移行試験
軟骨破片をチョップして１mm３とし、コラゲナーゼ２型（０.１％、Worthington、Lakewood、NJ、米国）の溶液を用いて３７℃で一晩加水分解を行った。その後、加水分解された内容物を１００μmフィルターでろ過してPBSで洗浄し、この分離された軟骨細胞を５０００cells／cm２で播種して、その細胞を２ mM L-グルタミン、１０％FBS （Ｇｉｂｃｏ）、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、５０μg／mLアスコルビン酸及び０.１M非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ、インビトロゲン、グランドアイランド、NY、米国）を補足するDMEM／F１２（Ｇｉｂｃｏ）に生長させて集密に至らしめた。１０％FBS及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補足する高いグルコースのDMEM（Ｇｉｂｃｏ）に軟骨細胞をさらに培養することにより軟骨細胞の条件培地（chondrocyte-conditioned medium）を４８時間で集めた。
【００４０】
前記IFPSC、BMSC、ASC、及びWJSCを２４穴の透過性ボイデンチャンバーの上層の穴（細孔径は８μmである。Costar、コーニング社、コーニング、NY、米国）に播種して、そして、底層の穴に置いた軟骨細胞由来の細胞無し培地に移行させた。４８時間移行の試験を行った後、この移行した細胞をクリスタル紫で染色（シグマ-アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州、米国）し、明視野顕微鏡によって（bright field microscopy）細胞を数えた。
【００４１】
実施例４の結果は、前記IFPSCが軟骨細胞へ走化したことを示している。図３に示すように、対照群培地では、前記IFPSCの基本な移行活性がASC及びWJSCと似ているが、BMSCより小さい。つまり、IFPSCを含む全ての細胞は高度な軟骨細胞に走化する条件培地である。それでも、前記IFPSCは、対照群培地よりも２.９５倍高い移行率を有する。
【００４２】
実施例５ 脂肪形成（adipogenesis）、骨形成（osteogenesis）及び軟骨形成（chondrogenesis）の誘導
前記IFPSCを１ウェルあたり５×１０４個細胞の密度で１２穴プレートの脂質培地（１０％FBS、１μmol／Lデキサメサゾン（dexamethasone）（シグマ-アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州、米国）、５μg／mLインスリン（シグマ-アルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州、米国）、０.５mmol／Lイソブチルメチルキサンチン（シグマ-アルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州、米国）及び６０μmol／Lインドメサシン（indomethacin）（シグマ-アルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州、米国）を補足するDMEM）に播種した。そして、前記IFPSCを７日間成長させて、３日間毎に培地を取り替えた。さらに、オイルレッド（シグマ-アルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州、米国）で染色し、PBSで２回洗浄した後、１ml １００％イソプロピルアルコール（シグマ-アルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州、米国）で試料から脂質を抽出して、５分間軽く振った。５１０nmでの吸光度により脂質濃度を測定した。各試料中の脂質含有量を３回繰り返して測定した。
【００４３】
前記IFPSCを１ウェルあたり１×１０４個の細胞密度で１２穴プレートに播種し、骨形成培地（１０％FBS、０.１μmol／Lデキサメサゾン、１０mmol／L β-グリセロリン酸塩（シグマ-アルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州、米国）及び５０μmol／Lのアスコルビン酸（シグマ-アルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州、米国）を補足するDMEM）に培養して、３日間毎に培地を取り替えた。細胞を２１日間成長させて、アリザリンレッド（シグマ-アルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州、米国）で染色した。染色の定量については、１ウェルあたり１０％（V／V）酢酸（ベーカー社、フィリップスバーグ、NJ、米国）を８００μL添加して、前記プレートを室温で３０分間振盪し、培養した。そして、セルスクレーパー（コーニング社、コーニング、NY、米国）で前記プレートから単層の細胞（前記プレートに緩く付着している）を削り取って、１０％（V／V）酢酸によって前記細胞を１.５mLの口が広いピペット付エッペンドルフに移した。
【００４４】
渦巻き（vortex）を３０秒行った後、細胞の懸濁液を５００μL鉱油（シグマ-アルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州、米国）で覆って、８５℃ちょうどに加熱して１０分間維持し、氷上に移して５分間置いた。そして、その細胞の懸濁液を２０,０００gで１５分間遠心し、５００μLの上澄み液を新たな１.５mLのエッペンドルフ（Scientific Specialties Inc.、Lodi、CA、米国）に移した。さらに、２００ μLの１０％（V／V）水酸化アンモニウム（ベーカー社、フィリップスバーグ、 NJ、米国）を添加して、酸を中和させた。等分された上澄み液（１５０μL）を、壁が不透明であって底盤が透明である９６穴プレート（Costar、コーニング Inc.、コーニング、NY、米国）に４０５nmでの吸光度を３回繰り返して測定した。
【００４５】
前記IFPSC、ASC、BMSC及びWJSCを１ウェルあたり１×１０５個の細胞密度で１２穴プレートに播種し、骨形成培地に培養した。前記成骨培地は、DMEM、１０％FBS、１０ ng／mL TGF-β１（Pepro Tech Inc.、ロッキー・ヒル、 NJ、米国）、５０ μg／mLアスコルビン酸-２-リン酸塩（シグマ-アルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州、米国）、及び６.２５ μg／mLインスリン（シグマ-アルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州、米国）を補足し、また、３日間毎に培地を取り替えた。前記細胞を軟骨細胞培地に３７℃で５％CO２で３週間培養した。培養された細胞をパラホルムアルデヒド（para-formaldehyde）（Bionovas社、トロント、カナダ）に固定させた後、スライドガラスに固定させて、標準のアルシアンブルー（Fluka、Sigma-Aldrich Chemie GmbH、Buchs、スイス）の方式に従って染色した。アルシアンブルーに豊かなプロテオグリカンを有する細胞外マトリックスを混ぜることによる定量分析については、具体的に、培養物を６M塩酸グアニジン（シグマ-アルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州、米国）に一晩培養して，５９５ nmでの吸光度を測定した。
【００４６】
実施例５の結果は、前記IFPSCが脂肪、骨和軟骨細胞に分化できることを示している。培地における分化誘導によって、前記IFPSCが容易に脂肪系、骨系、軟骨系に分化された。図４Aと図４Bに示すように、脂肪形成及び骨形成の条件培地に培養して１４日後に誘導することによって、前記分離されたIFPSCは、その細胞質に、大きく且つオイルレッドでの陽性反応を呈する脂質小滴を有し、アリザリンレッドで染色後の細胞形態が直方体である変化を示す。図４Cと図４Dに示すように、２１日間の軟骨形成の誘導によって、前記IFPSCは、アルシアンブルーで染色した後の細胞集合現象を示す。
【００４７】
実施例６  RNAの抽出と定量
メーカーの説明に基づいて、RNeasy（登録商標）（Qiagen）を用いて全てのRNAを抽出した。ＳＯＸ９とＣＯＬ２A１の遺伝子（プライマーとアニーリングの温度が表２に示される）のリアルタイムPCRの分析を行った。SuperScript III One-Step RT-PCRキット（Invitrogen社, Grand Island, NY、米国）を用いて相補的DNAを合成し、AmpliTaq金キット（Applied Biosystems社, Foster City, CA、米国）によってその相補的DNAを増殖させ、ファストスタートユニバーサル SYBR Green マスター（ROX、ロシュ社、インディアナポリス、IN、米国）と定量リアルタイムPCRの検出システム（ABI Step One Plus system、 Applied Biosystems社、Foster City、CA、米国）を用いてリアルタイムPCRを行ってモニタリングした。また、GAPDH遺伝子を参考の遺伝子として前記遺伝子産物を分析して、２ΔΔCtにより各標的遺伝子の発現量を計算した。なお、各標的遺伝子に対して各試料の４つの値を得て、前記実験を少なくとも３回繰り返して測定を行った。
【００４８】
【表２】
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【００４９】
実施例６の結果は、前記IFPSCが他の位置由来の間葉系幹細胞（例えば、BMSC、ASC及びWJSC）より軟骨性を持っていることを示している。図５Aと図５Bに示すように、軟骨への分化の誘導によって、２１日目のとき、誘導されたBMSC、ASC及びWJSCに比べて、前記誘導されたIFPSCはより大量のグリコサミノグリカンを発現した。図５Cと図５Dに示すように、前記IFPSCは、軟骨性に関する遺伝子、例えば、ＳＯＸ９とＣＯＬ２A１を徐々に発現するが、それに反して、この２つの遺伝子はASC及びWJSCにおける発現が少なく、又は、BMSCの異なる誘導期間には、異なる発現がある。
【００５０】
実施例７  ヒアルロン酸の微小環境における細胞の培養
異なる含量のヒアルロン酸を培地に溶解した後、用意されたヒアルロン酸溶液（分子量が５０００〜１００００ kDa、２０ mg／２mL、Suplasyn、BIONICHE、Galway、アイルランド）を１２穴プレートに添加し、最終の濃度（V／V）を２５％、５０％、７５％及び１００％とし、そして、室内の空気に固化させた。前記IFPSCを５０００個の細胞密度で５％FBS、NAC及びL-アスコルビン酸-２-リン酸塩を補足する１００ μLのKSFMに播種して、２日間毎に培地を取り替えて１４日間維持した。異なる時点での分化と増殖をさらに分析するために、前記細胞を集めた。
【００５１】
実施例７の結果は、HAの微小環境はIFPSCの分化を向上させるが、その生長に対して全く影響を及ぼさないことを示している。異なる濃度のHAをペトリ皿に塗布して、HAがIFPSCの分化と生長に与える影響を調べた。７５％（v／v）のHA塗布の培養群は低い分化能力を示し、それ以外、２５％（v／v）のHA塗布の培養群または５０％（v／v）のHA塗布の培養群に培養したIFPSCは、骨、脂肪、及び軟骨への分化を向上させることを示した。図６Aと図６Bに示すように、軟骨形成について、HA無しの培養群に比べて、２５％（v／v）のHAに培養されたIFPSCは２〜３倍向上した分化能力を示した。また、図７Aと図７Bに示すように、２５％（v／v）〜７５％（v／v）の濃度範囲にあるHA塗布の培養はIFPSCの増殖に影響を及ぼさない。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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