(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＫＤＲ−１１２１抗体の抗原結合ドメイン、ヒトＣＤ８の細胞外ヒンジドメイン、ヒトＣＤ８の膜貫通ドメイン、ヒトＣＤ８の細胞内ヒンジドメイン、ヒトＣＤ２８の細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメイン、ヒト４−１ＢＢの細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメイン及びヒトＣＤ３ζの細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメイン；
（ｉｉ）ＫＤＲ−１１２１抗体の抗原結合ドメイン、ヒトＣＤ２８の細胞外ヒンジドメイン、ヒトＣＤ２８の膜貫通ドメイン、ヒトＣＤ２８の細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメイン及びヒトＣＤ３ζの細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメイン；
（ｉｉｉ）ＤＣ１０１抗体の抗原結合ドメイン、マウスＣＤ８の細胞外ヒンジドメイン、マウスＣＤ８の膜貫通ドメイン、マウスＣＤ２８の細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメイン、マウス４−１ＢＢの細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメイン及びマウスＣＤ３ζの細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメイン；
（ｉｖ）ＤＣ１０１抗体の抗原結合ドメイン、マウスＣＤ８の細胞外ヒンジドメイン、マウスＣＤ８の膜貫通ドメイン、マウスＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメイン及びマウスＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメイン；
（ｖ）ＤＣ１０１抗体の抗原結合ドメイン、ヒトＣＤ８の細胞外ヒンジドメイン、ヒトＣＤ８の膜貫通ドメイン、ヒトＣＤ８の細胞内ヒンジドメイン、ヒトＣＤ２８の細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメイン、ヒト４−１ＢＢの細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメイン及びヒトＣＤ３ζの細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメイン；又は
（ｖｉ）ＤＣ１０１抗体の抗原結合ドメイン、ヒトＣＤ２８の細胞外ヒンジドメイン、ヒトＣＤ２８の膜貫通ドメイン、ヒトＣＤ２８の細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメイン及びヒトＣＤ３ζの細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメイン；
を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、宿主細胞により該ＣＡＲが発現すると、ＶＥＧＦＲ−２ポジティブ細胞を特異的に溶解させる能力を付与する、ＣＡＲ。
【請求項２】
抗原結合ドメインが、配列番号１又は２を含むアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項３】
ヒトＣＤ８の細胞外ヒンジドメイン、ヒトＣＤ８の膜貫通ドメイン及びヒトＣＤ８の細胞内ヒンジドメインが、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載のＣＡＲ。
【請求項４】
マウスＣＤ８の細胞外ヒンジドメイン及びマウスＣＤ８の膜貫通ドメインが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載のＣＡＲ。
【請求項５】
ヒトＣＤ２８の細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメイン、ヒト４−１ＢＢの細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメイン及びヒトＣＤ３ζの細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインが、配列番号５のアミノ酸配列を含み、
マウスＣＤ２８の細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメイン、マウス４−１ＢＢの細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメイン及びマウスＣＤ３ζの細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインが、配列番号６のアミノ酸配列を含む、
請求項１又は２に記載のＣＡＲ。
【請求項６】
ヒトＣＤ２８の細胞外ヒンジドメイン、ヒトＣＤ２８の膜貫通ドメイン及びヒトＣＤ２８の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインが、配列番号７のアミノ酸配列を含み、
ヒトＣＤ３ζの細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載のＣＡＲ。
【請求項７】
マウスＣＤ２８の細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメイン及びマウスＣＤ３ζの細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインが、配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載のＣＡＲ。
【請求項８】
配列番号１０〜１５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
【請求項１０】
配列番号１６〜２１からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項９に記載の核酸。
【請求項１１】
請求項９又は１０の核酸を含む、組換え発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組換え発現ベクターを含む、単離された宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１２に記載の宿主細胞を少なくとも１つ含む、細胞集団。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のＣＡＲ、請求項９若しくは１０に記載の核酸、請求項１１に記載の組換え発現ベクター、請求項１２に記載の宿主細胞、又は請求項１３に記載の細胞集団と、医薬上許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１５】
宿主におけるＶＥＧＦＲ−２の存在を検出する方法であって、
（ａ）宿主由来の１以上の細胞を含むサンプルを、請求項１２に記載の宿主細胞、又は請求項１３に記載の細胞集団と接触させることによって、複合体を形成する工程、及び
（ｂ）複合体を検出する工程であって、該複合体の検出が宿主におけるＶＥＧＦＲ−２の存在を示す、工程、
を含む、方法。
【請求項１６】
癌の治療又は予防のための医薬の製造のための、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＣＡＲ、請求項９若しくは１０に記載の核酸、請求項１１に記載の組換え発現ベクター、請求項１２に記載の宿主細胞、又は請求項１３に記載の細胞集団の使用。
【請求項１７】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のＣＡＲ、請求項９若しくは１０に記載の核酸、請求項１１に記載の組換え発現ベクター、請求項１２に記載の宿主細胞、又は請求項１３に記載の細胞集団を含む、癌の治療又は予防のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、２００９年１０月１日出願の米国仮特許出願第６１／２４７，６２５号（その内容は参照によって組み込まれる）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
固形腫瘍は、癌による死亡率の８５％より多くを占める（Ｊａｉｎ，Ｒ．Ｋ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０７：５８−６２（２００５））。多くの癌（固形腫瘍など）の増殖及び転移は、血管新生としても知られる新規血管の形成によって促進される。従って、腫瘍血管新生を標的とする癌の治療又は予防のための組成物及び方法が、当該分野で必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明の１実施形態は、ＫＤＲ−１１２１抗体若しくはＤＣ１０１抗体の抗原結合ドメイン、細胞外ヒンジドメイン、Ｔ細胞受容体膜貫通ドメイン及び細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。
【０００４】
本発明のさらなる実施形態は、本発明のＣＡＲに関連する、関連の核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、抗体又はその抗原結合部分及び医薬組成物を提供する。
【０００５】
本発明のさらなる実施形態は、宿主における癌の存在を検出する方法及び宿主における癌の治療又は予防方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、抗原が結合していない（なし）又はＢＳＡ、ＶＥＧＦＲ−２若しくは抗ＣＤ３が結合したプレート上で培養した時の増殖の測定としての、空ベクター（斜線縞）、ＳＰ６−ＣＤ８２８ＢＢＺ（ヘリンボーン）、ＤＣ１０１−ＣＤ８（市松模様）、ＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ（灰色）又はＤＣ１０１−ＣＤ８２８Ｚ（黒）で形質導入された細胞による３［Ｈ］−チミジンの取り込み（ＣＰＭ）のグラフである。
【図２】図２は、抗原が結合していない（なし）又はＢＳＡ、ＶＥＧＦＲ−２若しくは抗ＣＤ３が結合したプレート上で培養した時の、空ベクター（斜線縞）、ＳＰ６−ＣＤ８２８ＢＢＺ（ヘリンボーン）、ＤＣ１０１−ＣＤ８（市松模様）、ＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ（灰色）又はＤＣ１０１−ＣＤ８２８Ｚ（黒）で形質導入された細胞によるＩＦＮ−γ分泌（ｐｇ／ｍｌ）のグラフである。
【図３】図３は、単独で培養した又はＳＶＥＣ４−１０ＥＨＲ１、ｂＥｎｄ．３、ＭＳ１、ＳＶＲ、４Ｔ１、ＭＣ３８、ＭＣＡ−２０５、ＭＣ１７−５１、Ｐ８１５、ＥＬ４、Ｃ１４９８、Ｂ１６、ＭＢ４９、ＭＢ４９−ＦＬＫ−１、３Ｔ３若しくは３Ｔ３−ＦＬＫ−１細胞と共培養した場合の、形質導入されていない（右斜線（ｒｉｇｈｔ  ｓｌａｎｔｉｎｇ  ｌｉｎｅ））又は空ベクター（点描）、ＳＰ６−ＣＤ８２８ＢＢＺ（左斜線（ｌｅｆｔ  ｓｌａｎｔｉｎｇ  ｌｉｎｅ））、ＤＣ１０１−ＣＤ８（縞模様）、ＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ（灰色）若しくはＤＣ１０１−ＣＤ８２８Ｚ（黒）で形質導入された細胞によるＩＦＮ−γ分泌（ｐｇ／ｍｌ）のグラフである。
【図４】図４Ａは、未処置（黒丸）、ｒｈＩＬ−２単独で処置（黒菱形）、又はＤＣ１０１  ＣＡＲ（黒三角）若しくは空ベクター（黒四角）を形質導入したＴ細胞で処置したＢ１６−Ｆ１０腫瘍保持マウスの、Ｔ細胞移入後の日数での腫瘍面積（ｍｍ２）のグラフである。図４Ｂは、未処置（黒丸）、ｒｈＩＬ−２単独で処置（黒菱形）、又はＤＣ１０１  ＣＡＲ（黒三角）若しくは空ベクター（黒四角）を形質導入したＴ細胞で処置したＭＣ３８腫瘍保持マウスの、Ｔ細胞移入後の日数での腫瘍面積（ｍｍ２）のグラフである。
【図５】図５Ａは、未処置（黒丸）、ｒｈＩＬ−２単独で処置（黒菱形）、又はＤＣ１０１  ＣＡＲ（黒三角）若しくは空ベクター（黒四角）を形質導入したＴ細胞で処置したＢ１６−Ｆ１０腫瘍保持マウスの、Ｔ細胞移入後の日数でのパーセント生存のグラフである。図５Ｂは、未処置（黒丸）、ｒｈＩＬ−２単独で処置（黒菱形）、又はＤＣ１０１  ＣＡＲ（黒三角）若しくは空ベクター（黒四角）を形質導入したＴ細胞で処置したＭＣ３８腫瘍保持マウスの、Ｔ細胞移入後の日数でのパーセント生存のグラフである。
【図６】図６Ａは、未処置（黒丸）、ｒｈＩＬ−２単独で処置（黒菱形）、ＤＣ１０１抗体で処置（白三角）、ラットＩｇＧ１抗体で処置（白菱形）、又はＤＣ１０１  ＣＡＲ（黒三角）若しくは空ベクター（黒四角）を形質導入したＴ細胞で処置したＢ１６−Ｆ１０腫瘍保持マウスの、Ｔ細胞移入後の日数での腫瘍面積（ｍｍ２）のグラフである。図６Ｂは、未処置（黒丸）、又はＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲベクター（黒三角）、ＳＰ６−ＣＤ８Ｓ８ＢＢＺ  ＣＡＲベクター（白菱形）、ＤＣ１０１−ＣＤ８ベクター（白三角）若しくは空ベクター（黒四角）を形質導入したＴ細胞で処置したＢ１６−Ｆ１０腫瘍保持マウスの、Ｔ細胞移入後の日数での腫瘍面積（ｍｍ２）のグラフである。
【図７】図７は、ＤＣ１０１−ｍＣＤ８２８ＢＢＺ（菱形）、ＤＣ１０１−ＣＤ８２８Ｚ（三角）又は空ベクター（四角）を形質導入したＴ細胞で処置したＢ１６−Ｆ１０腫瘍保持マウスの、Ｔ細胞移入後の日数での腫瘍面積（ｍｍ２）のグラフである。コントロール群は、Ｔ細胞治療を受けなかった（丸）。黒塗り記号は、外因性ｒｈＩＬ−２投与を示し、中抜きの記号はｒｈＩＬ−２投与なしを示す。
【図８】図８は、抗原が結合していない（なし）又はＢＳＡ、ＶＥＧＦＲ−２若しくは抗ＣＤ３が結合したプレート上で培養した時の増殖の測定としての、モック形質導入した（市松模様）、又はＫＤＲ−ＣＤ２８Ｚ（黒）若しくはＫＤＲ−ＣＤ２８ＢＢＺ（灰色）で形質導入した細胞による３［Ｈ］−チミジン取り込み（ＣＰＭ）のグラフである。
【図９】図９は、抗原が結合していない（なし）又はＢＳＡ、ＶＥＧＦＲ−２若しくは抗ＣＤ３が結合したプレート上で培養した時の、モック形質導入した（市松模様）、又はＫＤＲ−ＣＤ２８Ｚ（黒）若しくはＫＤＲ−ＣＤ２８ＢＢＺ（灰色）で形質導入した細胞によるＩＦＮ−γ分泌（ｐｇ／ｍｌ）のグラフである。
【図１０】図１０は、ドナー番号１〜３のそれぞれについて、単独培養（なし）又は２９３細胞若しくは２９３−ＫＤＲ細胞と共培養した時の、形質導入なし（暗灰色）、モック形質導入（白）又はＫＤＲ１１２１−ｈＣＤ２８Ｚ（黒）若しくはＫＤＲ１１２１−ｈＣＤ８２８ＢＢＺ（明灰色）で形質導入した細胞によるＩＦＮ−γ分泌（ｐｇ／ｍｌ）のグラフである。
【図１１】図１１は、単独培養（なし）又は標的細胞２９３Ａ２、２９３Ａ２−ＫＤＲ、ＨＭＶＥＣ−真皮、ＨＭＶＥＣ−肺、ＨＵＶＥＣ、皮膚繊維芽細胞、ＳＡＥＣ、ＨＢＥＣ、ＨＲＥ、ＨＭＥＣ、ＰｒＥＣ若しくはＨＳＭＭ細胞と共培養した時の、形質導入なし（白）、モック形質導入（灰色）又はＫＤＲ−ＣＤ２８Ｚ（黒）で形質導入したＴ細胞によるＩＦＮ−γ分泌（ｐｇ／ｍｌ）のグラフである。
【図１２】図１２は、細胞なし（なし）又は標的細胞（ｂＥｎｄ．３、ＭＢ４９若しくはＭＢ４９−ＦＬＫ−１）を単独で（下線付きのなし）又は１０μｇ／ｍｌのラットＩｇＧ１、抗マウスＶＥＧＦＲ−１抗体若しくは抗マウスＶＥＧＦＲ−２抗体（ＤＣ１０１）と共にインキュベートし、次いで、モック形質導入（白棒）或いは空ベクター（灰色棒）又はＳＰ６−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲ（斜線棒）若しくはＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ（黒棒）をコードするレトロウイルスベクターで形質導入した初代マウスＴ細胞と共に共培養したときの、ＩＦＮ−γ分泌（ｎｇ／ｍｌ）のグラフである。
【図１３】図１３は、モック形質導入（＊）又は空ベクター（四角）、ＳＰ６−ＣＤ８２８ＢＢＺ（丸）、ＤＣ１０１−ＣＤ８（菱形）、ＤＣ１０１−ＣＤ８２８Ｚ（黒三角）若しくはＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ（白三角）で形質導入した初代マウスＴ細胞と共にインキュベートしたＶＥＧＦＲ−２発現標的マウス細胞（ＳＶＥＣ４−１０ＥＨＲ１、４Ｔ１、ＲＥＮＣＡ、ＭＢ４９、ｂＥＮＤ．３、ＭＣ３８、ＭＣ１７−５１、ＭＢ４９−Ｆｌｋ１、ＭＳ１、ＣＴ２６、Ｂ１６−Ｆ１０、３Ｔ３、ＳＶＲ、ＭＣＡ２０５、Ｃ１４９８、３Ｔ３−Ｆｌｋ１）の、種々のエフェクター対標的比（ｘ軸）での、特異的溶解（％）（ｙ軸）のグラフを示す。各データポイントは三連の平均を反映する。
【図１４】図１４Ａは、未処理（黒丸）、ｒｈＩＬ−２単独で処理（黒菱形）、又はＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲ（黒三角）若しくは空ベクター（黒四角）で形質導入したＴ細胞で処理したＭＣＡ２０５腫瘍保持マウスの、Ｔ細胞移入後の日数での腫瘍面積（ｍｍ２）のグラフである。図１４Ｂは、未処理（黒丸）、ｒｈＩＬ−２単独で処理（黒菱形）、又はＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲ（黒三角）若しくは空ベクター（黒四角）で形質導入したＴ細胞で処理したＭＣＡ２０５腫瘍保持マウスの、Ｔ細胞移入後の日数でのパーセント生存のグラフである。図１４Ｃは、未処理（黒丸）、ｒｈＩＬ−２単独で処理（黒菱形）、又はＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲ（黒三角）若しくは空ベクター（黒四角）で形質導入したＴ細胞で処理したＣＴ２６腫瘍保持マウスの、Ｔ細胞移入後の日数での腫瘍面積（ｍｍ２）のグラフである。図１４Ｄは、未処理（黒丸）、ｒｈＩＬ−２単独で処理（黒菱形）、又はＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲ（黒三角）若しくは空ベクター（黒四角）で形質導入したＴ細胞で処理したＣＴ２６腫瘍保持マウスの、Ｔ細胞移入後の日数でのパーセント生存のグラフである。図１４Ｅは、未処理（黒丸）、ｒｈＩＬ−２単独で処理（黒菱形）、又はＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲ（黒三角）若しくは空ベクター（黒四角）で形質導入したＴ細胞で処理したＲＥＮＣＡ腫瘍保持マウスの、Ｔ細胞移入後の日数での腫瘍面積（ｍｍ２）のグラフである。図１４Ｆは、未処理（黒丸）、ｒｈＩＬ−２単独で処理（黒菱形）、又はＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲ（黒三角）若しくは空ベクター（黒四角）で形質導入したＴ細胞で処理したＲＥＮＣＡ腫瘍保持マウスの、Ｔ細胞移入後の日数でのパーセント生存のグラフである。
【図１５】図１５は、ＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ＋ｒｈＩＬ−２で形質導入した２ｘ１０７（実線上の黒三角）、１ｘ１０７（実線上の白三角）、５ｘ１０６（点線上の黒三角）若しくは２ｘ１０６（点線上の白三角）の同系Ｔ細胞で処置した、未処置（黒丸）、ｒｈＩＬ−２単独で処置した（黒菱形）、又は空ベクター＋ｒｈＩＬ−２（黒四角）で形質導入した２ｘ１０７Ｔ細胞で処置した、Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍保持マウスの、Ｔ細胞移入後の日数での腫瘍面積（ｍｍ２）のグラフである。各処置群は、最低５匹のマウスを含んだ。一連の盲検腫瘍測定値を取得し、直交する直径の積を±ＳＥＭでプロットした。
【図１６】図１６Ａは、５Ｇｙ  ＴＢＩで致死未満に照射し、Ｔ細胞もｒｈＩＬ−２も受けていない（黒丸）か、又はＤＣ１０１−ＣＤ２８ＢＢＺ（黒三角）若しくは空ベクター（黒四角）で形質導入した同系マウスＴ細胞２ｘ１０７の単一用量をｒｈＩＬ−２と合わせて注射した；或いは７〜１０日間隔で、ＤＣ１０１−ＣＡＲ（白三角）又は空ベクター（白四角）で形質導入したＴ細胞５ｘ１０６の３連続用量、及びＴ細胞移入の０〜６３日後に、細胞移入と付随して、ｒｈＩＬ−２の１日２回用量を３日間、を注射した、皮下Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍保持マウスの腫瘍面積（ｍｍ２）のグラフである。各処置群は、最低５匹のマウスを含んだ。一連の盲検腫瘍測定値を取得し、直交する直径の積を±ＳＥＭでプロットした。図１６Ｂは、５Ｇｙ  ＴＢＩで致死未満に照射し、Ｔ細胞もｒｈＩＬ−２も受けていない（黒丸）か、又はＤＣ１０１−ＣＤ２８ＢＢＺ（黒三角）若しくは空ベクター（黒四角）で形質導入した同系マウスＴ細胞２ｘ１０７の単一用量をｒｈＩＬ−２と合わせて注射した；或いは７〜１０日間隔で、ＤＣ１０１−ＣＡＲ（白三角）又は空ベクター（白四角）で形質導入したＴ細胞５ｘ１０６の３連続用量、及びＴ細胞移入の０〜６３日後に、細胞移入と付随して、ｒｈＩＬ−２の１日２回用量を３日間、を注射した、皮下ＭＣＡ２０５腫瘍保持マウスの腫瘍面積（ｍｍ２）のグラフである。各処置群は、最低５匹のマウスを含んだ。一連の盲検腫瘍測定値を取得し、直交する直径の積を±ＳＥＭでプロットした。図１６Ｃは、５Ｇｙ  ＴＢＩで致死未満に照射し、Ｔ細胞もｒｈＩＬ−２も受けていない（黒丸）か、又はＤＣ１０１−ＣＤ２８ＢＢＺ（黒三角）若しくは空ベクター（黒四角）で形質導入した同系マウスＴ細胞２ｘ１０７の単一用量をｒｈＩＬ−２と合わせて注射した；或いは７〜１０日間隔で、ＤＣ１０１−ＣＡＲ（白三角）又は空ベクター（白四角）で形質導入したＴ細胞５ｘ１０６の３連続用量、及びＴ細胞移入の０〜１２０日後に、細胞移入と付随して、ｒｈＩＬ−２の１日２回用量を３日間、を注射した、皮下Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍保持マウスの生存（％）のグラフである。各処置群は、最低５匹のマウスを含んだ。一連の盲検腫瘍測定値を取得し、直交する直径の積を±ＳＥＭでプロットした。図１６Ｄは、５Ｇｙ  ＴＢＩで致死未満に照射し、Ｔ細胞もｒｈＩＬ−２も受けていない（黒丸）か、又はＤＣ１０１−ＣＤ２８ＢＢＺ（黒三角）若しくは空ベクター（黒四角）で形質導入した同系マウスＴ細胞２ｘ１０７の単一用量をｒｈＩＬ−２と合わせて注射した；或いは７〜１０日間隔で、ＤＣ１０１−ＣＡＲ（白三角）又は空ベクター（白四角）で形質導入したＴ細胞５ｘ１０６の３連続用量、及びＴ細胞移入の０〜１５０日後に、細胞移入と付随して、ｒｈＩＬ−２の１日２回用量を３日間、を注射した、皮下ＭＣＡ２０５腫瘍保持マウスの生存（％）のグラフである。各処置群は、最低５匹のマウスを含んだ。一連の盲検腫瘍測定値を取得し、直交する直径の積を±ＳＥＭでプロットした。
【図１７】図１７は、ＤＣ１０１−ＣＡＲ（白三角）、ＳＰ６−ＣＡＲ（白菱形）若しくは空ベクター（白四角）＋ｒｈＩＬ−２で形質導入した同系Ｔ細胞２ｘ１０７の移入前に５Ｇｙ  ＴＢＩを受けなかった、又はＴ細胞で処理していない（白丸）、Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍保持マウスの腫瘍面積（ｍｍ２）のグラフである。黒塗り記号で示される群中のマウスは、Ｔ細胞移入前に５Ｇｙ  ＴＢＩを受けた。
【図１８】図１８Ａは、Ｔ細胞移入の０〜５０日後に、ＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ（黒三角）若しくは空ベクター（黒四角）で形質導入した未分離ＣＤ３＋Ｔ細胞５ｘ１０６の単一用量又はＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ（白三角）若しくは空ベクター（白四角）のいずれかで形質導入した精製ＣＤ８＋Ｔ細胞２ｘ１０７の単一用量で処置したＣＴ２６腫瘍保持ＢＡＬＢ／ｃマウスの腫瘍面積（ｍｍ２）のグラフである。全てのＴ細胞処置群は、３日間にわたりｒｈＩＬ−２の１日２回用量を受けた。コントロール群は、ｒｈＩＬ−２単独を受けた（菱形）か処置を受けなかった（丸）。図１８Ｂは、Ｔ細胞移入の０〜３２日後に、ＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ（黒三角）若しくは空ベクター（黒四角）で形質導入した未分離ＣＤ３＋Ｔ細胞５ｘ１０６の単一用量又はＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ（白三角）若しくは空ベクター（白四角）のいずれかで形質導入した精製ＣＤ８＋Ｔ細胞２ｘ１０７の単一用量で処置したＲＥＮＣＡ腫瘍保持ＢＡＬＢ／ｃマウスの腫瘍面積（ｍｍ２）のグラフである。全てのＴ細胞処置群は、３日間にわたりｒｈＩＬ−２の１日２回用量を受けた。コントロール群は、ｒｈＩＬ−２単独を受けた（菱形）か処置を受けなかった（丸）。図１８Ｃは、Ｔ細胞移入の０〜２５日後に、ＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ（実線上の黒三角）若しくは空ベクター（黒四角）で形質導入した未分離ＣＤ３＋Ｔ細胞２ｘ１０７の単一用量又はＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ（実線上の白三角）若しくは空ベクター（白四角）のいずれかで形質導入した精製ＣＤ８＋Ｔ細胞２ｘ１０７の単一用量で処置したＢ１６−Ｆ１０腫瘍保持Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腫瘍面積（ｍｍ２）のグラフである。いくつかの群は、ＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ（点線上の黒三角）若しくは空ベクター（白丸）で形質導入した１ｘ１０７のＣＤ４＋Ｔ細胞及び１ｘ１０７のＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物を受けた。全てのＴ細胞処置群は、３日間にわたりｒｈＩＬ−２の１日２回用量を受けた。コントロール群は、ｒｈＩＬ−２単独を受けた（黒菱形）か処置を受けなかった（黒丸）。
【図１９】図１９は、モック形質導入（＊）又はＳＰ６−ＣＤ８２８ＢＢＺ（四角）、ＫＤＲ１１２１−ＣＤ８２８Ｚ（黒三角）若しくはＫＤＲ１１２１−ＣＤ８２８ＢＢＺ（白三角）で形質導入した初代ヒトＴ細胞と共にインキュベートした標的ヒト細胞（２９３、２９３−ＫＤＲ、ＨＭＶＥＣ−Ｄ、ＨＭＶＥＣ−Ｌ、ＳＡＥＣ、ＮＨＢＥ、ＨＳＭＭ及び繊維芽細胞）の、種々のエフェクター対標的比（ｘ軸）での、特異的溶解（％）（ｙ軸）のグラフを示す。各データポイントは三連の平均を反映する。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明の１実施形態は、ＫＤＲ−１１２１抗体若しくはＤＣ１０１抗体の抗原結合ドメイン、細胞外ヒンジドメイン、Ｔ細胞受容体膜貫通ドメイン及び細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。
【０００８】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインに連結された抗体の抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖ）を含む、人工的に構築されたハイブリッドタンパク質又はポリペプチドである。ＣＡＲの特徴には、モノクローナル抗体の抗原結合特性を利用して、選択された標的に対し非ＭＨＣ拘束的様式でＴ細胞の特異性及び反応性を再指示（ｒｅｄｉｒｅｃｔ）する能力が挙げられる。非ＭＨＣ拘束的抗原認識は、ＣＡＲを発現するＴ細胞に、抗原プロセシングと無関係に抗原を認識する能力を与え、それにより、腫瘍エスケープの主要な機構を迂回する。さらに、Ｔ細胞中で発現されると、ＣＡＲは、有利なことに、内在性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖及びβ鎖と二量体化しない。
【０００９】
本明細書中で使用する場合、語句「抗原特異性を有する」及び「抗原特異的応答を惹起する」とは、ＣＡＲが、抗原に特異的に結合できかつ抗原を免疫特異的に認識でき、その結果抗原へのＣＡＲの結合が免疫応答を惹起することを意味する。
【００１０】
本発明のＣＡＲは、血管内皮増殖因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ−２）（ヒトではキナーゼドメイン領域（ＫＤＲ）及びマウスでは胎仔肝臓キナーゼ−１（Ｆｌｋ−１）としても公知）に対する抗原特異性を有する。ＶＥＧＦＲ−２は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の受容体であり、７つの細胞外ドメインを有し、血管内皮細胞により選択的に発現される。ＶＥＧＦＲ−２は、腫瘍血管中の腫瘍内皮細胞によって過剰発現される。ＶＥＧＦＲ−２はさらに、正常細胞、非腫瘍細胞又は非癌性細胞によって発現され得る。しかし、かかる状況では、正常細胞、非腫瘍細胞又は非癌性細胞によるＶＥＧＦＲ−２の発現は、腫瘍又は癌細胞による発現ほど強くはない。これに関して、腫瘍又は癌細胞は、正常細胞、非腫瘍細胞又は非癌性細胞によるＶＥＧＦＲ−２の発現と比較して、顕著に高いレベルでＶＥＧＦＲ−２を過剰発現できるかＶＥＧＦＲ−２を発現できる。ＶＥＧＦＲ−２は、腫瘍の血管新生（ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、増殖及び転移を増強する。特定の理論に束縛されないが、ＶＥＧＦＲ−２に対する抗原特異的応答を惹起することによって、本発明のＣＡＲは、腫瘍脈管構造中のＶＥＧＦＲ−２発現内皮細胞を標的化及び破壊し、腫瘍脈管構造を攻撃し、腫瘍を減少又は排除し、腫瘍部位への免疫細胞の浸潤を促進し、かつ抗腫瘍応答を増強／拡大すると考えられる。
【００１１】
血管新生抑制腫瘍療法は、多くの利点を提供する。例えば、内皮細胞は遺伝的に安定なので、薬物耐性の可能性が低いと考えられる。さらに、血流は脈管内皮への容易なアクセスを提供し、正常組織に対する副作用及び毒性が限定的であると考えられる。さらに、腫瘍血管の破壊は、腫瘍細胞死を加速させると考えられる。また、血管新生内皮細胞は、抗原（例えばＶＥＧＦＲ−２）発現を均一に上方制御すると考えられている。さらに、血管新生抑制（ａｎｔｉｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）腫瘍療法は、脈管供給を含む多くの癌（例えば固形腫瘍）に適用可能である。
【００１２】
本発明は、ＫＤＲ−１１２１抗体又はＤＣ１０１抗体の抗原結合ドメインを含むＣＡＲを提供する。ＫＤＲ−１１２１（ＩＭＣ−１１２１Ｂとしても知られる）は、ヒトの抗ＶＥＧＦＲ−２抗体である。ＫＤＲ−１１２１は、ＶＥＧＦＲ−２ドメイン３に結合し、ＶＥＧＦ／ＫＤＲ相互作用を遮断する。ＤＣ１０１は、ラット抗マウスＶＥＧＦＲ−２抗体である。例示的な適切なＫＤＲ−１１２１抗体及びＤＣ１０１抗体は、米国特許第７，４９８，４１４号；同第５，８４０，３０１号；同第５，８６１，４９９号並びにＷＯ２００７／０９５３３７（これらはそれぞれ、本明細書中に参照により組み込まれる）に開示されている。これに関して、本発明の好ましい実施形態は、ＫＤＲ−１１２１（配列番号１）又はＤＣ１０１（配列番号２）の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含むか、これからなるか又は本質的にこれからなる抗原結合ドメインを含むＣＡＲを提供する。
【００１３】
本発明の１実施形態において、ＣＡＲは、細胞外ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、並びに任意選択で、ＣＤ８を含む細胞内ヒンジドメイン並びにＣＤ２８、４−１ＢＢ及びＣＤ３ζを含む細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインを含む。ＣＤ２８は、Ｔ細胞補助刺激（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）に重要なＴ細胞マーカーである。ＣＤ８もＴ細胞マーカーである。４−１ＢＢは、Ｔ細胞に強い補助刺激シグナルを伝達し、Ｔリンパ球の分化を促進し、長期生存を増強する。ＣＤ３ζは、ＴＣＲと会合してシグナルを生じ、免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ；ＩＴＡＭ）を含む。これに関して、本発明の好ましい実施形態は、細胞外ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン及び任意選択の細胞内ヒンジドメインを提供し、この細胞内ヒンジドメインは、配列番号３（ヒトＣＤ８の細胞外ヒンジ配列、膜貫通配列及び細胞内ヒンジ配列）又は配列番号４（マウスＣＤ８の細胞外ヒンジ及び膜貫通配列）を含むか、本質的にこれからなるか、これからなる。細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインは、配列番号５（ヒトＣＤ２８、４−１ＢＢ及びＣＤ３ζの細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達配列）又は配列番号６（マウスＣＤ２８、４−１ＢＢ及びＣＤ３ζの細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達配列）を含むか、本質的にこれからなるか、又はこれからなる。
【００１４】
本発明の別の実施形態において、ＣＡＲは、細胞外ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、並びにＣＤ２８及びＣＤ３ζを含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む。これに関して、本発明の好ましい実施形態は、細胞外ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを提供し、この細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは、配列番号７（ヒトＣＤ２８の細胞外ヒンジ、膜貫通及び細胞内Ｔ細胞シグナル伝達配列）及び配列番号８（ヒトＣＤ３ζの細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達配列）を含むか、本質的にこれらからなるか、又はこれらからなる。
【００１５】
本発明の別の実施形態において、ＣＡＲは、細胞外ヒンジドメインと、ＣＤ８を含む膜貫通ドメインと、ＣＤ２８及びＣＤ３ζを含む細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインとを含む。これに関して、本発明の好ましい実施形態は、配列番号４（マウスＣＤ８細胞外ヒンジ及び膜貫通配列）を含む、本質的に配列番号４からなるか、又は配列番号４からなるか、細胞外ヒンジドメイン及び膜貫通ドメインを提供する。細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインは、配列番号９（マウスＣＤ２８及びＣＤ３ζの配列）を含むか、配列番号９からなるか、又は本質的に配列番号９からなる。
【００１６】
本発明のさらなる実施形態は、表１に示されるアミノ酸配列のいずれかを含むか、それからなるか、又は本質的にそれからなる、ＣＡＲを提供する。
【００１７】
【表１】
0005934099.tif 000002
【００１８】
本発明はまた、本発明のＣＡＲに関する、関連する核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、抗体又はその抗原結合部分、及び医薬組成物を提供する。
【００１９】
本発明の別の実施形態は、宿主における癌の存在を検出する方法を提供し、この方法は以下を含む：（ａ）宿主由来の１以上の細胞を含むサンプルを、本発明のＣＡＲ、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、抗体及び／又はその抗原結合部分と接触させることによって、複合体を形成する工程、及び（ｂ）複合体を検出する工程であって、該複合体の検出が宿主における癌の存在を示す、工程。
【００２０】
本発明の別の実施形態は、本発明のＣＡＲ、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、抗体及び／又はその抗原結合部分を、宿主における癌の治療又は予防に有効な量で宿主に投与することを含む、宿主における疾患の治療又は予防方法を提供する。
【００２１】
本明細書中で言及する宿主は任意の宿主であり得る。宿主は哺乳動物であり得る。本明細書中で使用する場合、用語「哺乳動物」とは、任意の哺乳動物をいい、Ｒｏｄｅｎｔｉａ目の哺乳動物（例えば、マウス及びハムスター）並びにＬｏｇｏｍｏｒｐｈａ目の哺乳動物（例えばウサギ）が挙げられるが、これらに限定されない。哺乳動物は、Ｃａｒｎｉｖｏｒａ目（Ｆｅｌｉｎｅｓ（ネコ）及びＣａｎｉｎｅｓ（イヌ）を含む）由来であり得る。哺乳動物は、Ａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ目（Ｂｏｖｉｎｅｓ（ウシ）及びＳｗｉｎｅｓ（ブタ）を含む）由来又はＰｅｒｓｓｏｄａｃｔｙｌａ目（Ｅｑｕｉｎｅｓ（ウマ）を含む）由来であり得る。哺乳動物は、Ｐｒｉｍａｔｅｓ目、Ｃｅｂｏｉｄｓ目若しくはＳｉｍｏｉｄｓ目（サル）又はＡｎｔｈｒｏｐｏｉｄｓ目（ヒト及び類人猿）のものであり得る。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００２２】
本明細書中で使用する場合、ＣＡＲに関して用語「機能的部分」とは、本発明のＣＡＲの任意の一部又は断片をいい、この一部又は断片は、ＣＡＲ（この一部又は断片はこれの一部である）（親ＣＡＲ）の生物活性を保持する。機能的部分は、例えば、標的細胞を認識する能力又は疾患を検出、治療若しくは予防する能力を、親ＣＡＲと類似の程度まで、同程度まで、又はより高い程度まで保持する、ＣＡＲの一部を包含する。親ＣＡＲを参照すると、機能的部分は、親ＣＡＲの例えば約１０％、２５％、３０％、５０％、６８％、８０％、９０％、９５％又はそれ以上を含み得る。
【００２３】
機能的部分は、当該部分のアミノ末端若しくはカルボキシ末端又は両端にさらなるアミノ酸を含み得、このさらなるアミノ酸は、親ＣＡＲのアミノ酸配列中には見出されないものである。望ましくは、さらなるアミノ酸は、機能的部分の生物機能（例えば、標的細胞の認識、癌の検出、癌の治療若しくは予防など）を妨害しない。より望ましくは、さらなるアミノ酸は、親ＣＡＲの生物活性と比較して、生物活性を増強する。
【００２４】
本発明の範囲内には、本明細書中に記載される本発明のＣＡＲ、ポリペプチド及びタンパク質の機能的変異体が含まれる。本明細書中で使用する場合、用語「機能的変異体」とは、親ＣＡＲ、ポリペプチド又はタンパク質に対して、実質的又は研著な配列同一性又は類似性を有するＣＡＲ、ポリペプチド又はタンパク質をいい、この機能的変異体は、ＣＡＲ、ポリペプチド又はタンパク質（これの変異体である）の生物活性を保持する。機能的変異体は、例えば、親ＣＡＲ、ポリペプチド又はタンパク質と類似の程度まで、同程度まで、又はより高い程度まで、標的細胞を認識する能力を保持した、本明細書中に記載されるＣＡＲ、ポリペプチド又はタンパク質（親ＣＡＲ、ポリペプチド又はタンパク質）の変異体を包含する。親ＣＡＲ、ポリペプチド又はタンパク質を参照すると、機能的変異体は、親ＣＡＲ、ポリペプチド又はタンパク質に対して、例えば、少なくとも約３０％、５０％、７５％、８０％、９０％、９８％又はそれ以上、アミノ酸配列が同一であり得る。
【００２５】
機能的変異体は、例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、親ＣＡＲ、ポリペプチド又はタンパク質を含み得る。或いは又はさらに、機能的変異体は、少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換を有する、親ＣＡＲ、ポリペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列を含み得る。この場合、非保存的アミノ酸置換は、機能的変異体の生物活性を妨害も阻害もしないことが好ましい。非保存的アミノ酸置換は、機能的変異体の生物活性を増強し得、その結果、親ＣＡＲ、ポリペプチド又はタンパク質と比較して機能的変異体の生物活性が増加する。
【００２６】
本発明のＣＡＲのアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換である。保存的アミノ酸置換は当該分野で公知であり、特定の物理的及び／又は化学的特性を有する１つのアミノ酸が、同じ又は類似の化学的又は物理的特性を有する別のアミノ酸と交換されるアミノ酸置換が含まれる。例えば、保存的アミノ酸置換は、酸性アミノ酸の別の酸性アミノ酸での置換（例えば、Ａｓｐ又はＧｌｕ）、非極性側鎖を有するアミノ酸の、非極性側鎖を有する別のアミノ酸での置換（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｖａｌなど）、塩基性アミノ酸の別の塩基性アミノ酸での置換（Ｌｙｓ、Ａｒｇなど）、極性側鎖を有するアミノ酸の、極性側鎖を有する別のアミノ酸での置換（Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒなど）などであり得る。
【００２７】
ＣＡＲ、ポリペプチド又はタンパク質は、特定のアミノ酸配列又は本明細書中に記載される配列から本質的になり得、その結果、他の成分（例えば他のアミノ酸）は、機能的変異体の生物活性を物質的に変化させない。
【００２８】
本発明の実施形態のＣＡＲ、ポリペプチド又はタンパク質（機能的部分及び機能的変異体を含む）は、ＣＡＲ、ポリペプチド又はタンパク質（又はその機能的部分及び機能的変異体）がその生物活性（例えば、抗原に特異的に結合する能力、宿主中の罹患細胞を検出する能力、又は宿主中の疾患を治療若しくは予防する能力など）を保持することを条件として、任意の長さのものであり得る、即ち、任意の数のアミノ酸を含み得る。例えば、ポリペプチドは、約５０〜約５０００アミノ酸長、例えば、５０、７０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００又はそれ以上のアミノ酸長であり得る。これに関して、本発明のポリペプチドには、オリゴペプチドも含まれる。
【００２９】
本発明の実施形態のＣＡＲ、ポリペプチド及びタンパク質（本発明の機能的部分及び機能的変異体を含む）は、１つ以上の天然に存在するアミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含み得る。かかる合成アミノ酸は当該分野で公知であり、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、α−アミノｎ−デカン酸、ホモセリン、Ｓ−アセチルアミノメチル−システイン、トランス−３−及びトランス−４−ヒドロキシプロリン、４−アミノフェニルアラニン、４−ニトロフェニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、４−カルボキシフェニルアラニン、β−フェニルセリン  β−ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α−ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン−２−カルボン酸、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’−ベンジル−Ｎ’−メチル−リジン、Ｎ’，Ｎ’−ジベンジル−リジン、６−ヒドロキシリジン、オルニチン、α−アミノシクロペンタンカルボン酸、α−アミノシクロヘキサンカルボン酸、α−アミノシクロヘプタンカルボン酸、α−（２−アミノ−２−ノルボルナン）−カルボン酸、α，γ−ジアミノ酪酸、α，β−ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン及びα−ｔｅｒｔ−ブチルグリシンが挙げられる。
【００３０】
本発明の実施形態のＣＡＲ、ポリペプチド及びタンパク質（機能的部分及び機能的変異体を含む）は、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、Ｎ−アクリル化、環化（例えばジスルフィド結合を介して）、又は酸付加塩に変換され、かつ／或いは任意選択で二量体化若しくは重合、又はコンジュゲート化され得る。
【００３１】
本発明の実施形態のＣＡＲ、ポリペプチド及び／又はタンパク質（その機能的部分及び機能的変異体を含む）は、当該分野で公知の方法で得ることができる。ポリペプチド及びタンパク質を新規合成する適切な方法は、例えば以下の参考文献に記載されている：Ｃｈａｎら，Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ，２０００；Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｉｄ，Ｒ．編，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，２０００；Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ，Ｗｅｓｔｗｏｏｄら編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ，２００１；及び米国特許第５，４４９，７５２号。また、ポリペプチド及びタンパク質は、標準的な組換え法を使用して、本明細書中に記載される核酸を使用して組換え産生され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  ２００１；及びＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，１９９４を参照。さらに、本発明のＣＡＲ、ポリペプチド及びタンパク質（その機能的部分及び機能的変異体を含む）のあるものは、植物、細菌、昆虫、哺乳動物（例えば、ラット、ヒトなど）などの供給源から、単離及び／又は精製され得る。単離及び精製の方法は当該分野で周知である。或いは、本明細書中に記載されるＣＡＲ、ポリペプチド及び／又はタンパク質（その機能的部分及び機能的変異体を含む）は、Ｓｙｎｐｅｐ（Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡ）、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）及びＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）などの企業によって商業的に合成され得る。これに関して、本発明のＣＡＲ、ポリペプチド及びタンパク質は、合成、組換え、単離及び／又は精製であり得る。
【００３２】
本発明の１実施形態はさらに、本発明のＣＡＲのエピトープに特異的に結合する、抗体又はその抗原結合部分を提供する。抗体は、当該分野で公知の任意の型の免疫グロブリンであり得る。例えば、抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭなど）のものであり得る。抗体は、モノクローナル又はポリクローナルであり得る。抗体は、天然に存在する抗体、例えば、哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、ハムスター、ヒトなど）から単離及び／又は精製された抗体であり得る。或いは、抗体は、遺伝子操作された抗体、例えば、ヒト化抗体又はキメラ抗体であり得る。抗体は、モノマー形態でもポリマー形態でもあり得る。また、抗体は、本発明のＣＡＲの機能的部分に対し、任意のレベルの親和性又は結合活性を有し得る。
【００３３】
本発明のＣＡＲの任意の機能的部分に結合する能力について抗体を試験する方法は、当該分野で公知であり、以下が挙げられる：任意の抗体−抗原結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫沈降及び競合阻害アッセイ（例えば、Ｊａｎｅｗａｙら（下記）及び米国特許出願公開２００２／０１９７２６６Ａ１を参照）。
【００３４】
抗体の製造に適した方法は、当該分野で公知である。例えば、標準的なハイブリドーマ法は、例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５，５１１−５１９（１９７６）、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（編），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）、並びにＣ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙら（編），Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，第５版，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（２００１））に記載されている。或いは、他の方法が当該分野で公知である（例えば、ＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｈａｓｋａｒｄ及びＡｒｃｈｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７４（２），３６１−６７（１９８４）、並びにＲｏｄｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１２１，１４０−６７（１９８６））、及びバクテリオファージベクター発現系（例えば、Ｈｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６，１２７５−８１（１９８９）を参照））。さらに、非ヒト動物において抗体を産生する方法が、例えば、米国特許第５，５４５，８０６号，同第５，５６９，８２５号及び同第５，７１４，３５２号、並びに米国特許出願公開２００２／０１９７２６６Ａ１に記載されている。
【００３５】
さらにファージディスプレイが、抗体を産生するために使用され得る。これに関して、抗体の抗原結合可変（Ｖ）ドメインをコードするファージライブラリーが、標準的な分子生物学技術及び組換えＤＮＡ技術を使用して生成され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）及びＡｕｓｕｂｅｌら（上記）を参照）。所望の特異性を有する可変領域をコードするファージが、所望の抗原への特異的結合について選択され、選択された可変ドメインを含む完全又は部分抗体が再構成される。再構成された抗体をコードする核酸配列は、適切な細胞株（例えば、ハイブリドーマ産生に使用される骨髄腫細胞）中に導入され、その結果、モノクローナル抗体の特徴を有する抗体がこの細胞によって分泌される（例えば、Ｊａｎｅｗａｙら（上記）、Ｈｕｓｅら（上記）及び米国特許第６，２６５，１５０号を参照）。
【００３６】
抗体は、特定の重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックであるトランスジェニックマウスにより産生され得る。かかる方法は当該分野で公知であり、例えば、米国特許第５，５４５，８０６号及び同第５，５６９，８２５号、並びにＪａｎｅｗａｙら（上記）に記載されている。
【００３７】
ヒト化抗体を産生する方法は当該分野で周知であり、例えば、Ｊａｎｅｗａｙら（上記）、米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５８５，０８９号及び同第５，６９３，７６１号、欧州特許０２３９４００Ｂ１、並びに英国特許第２１８８６３８号に詳細に記載されている。ヒト化抗体はまた、米国特許第５，６３９，６４１号及びＰｅｄｅｒｓｅｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３５，９５９−９７３（１９９４）に記載された抗体再浮上（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）技術を使用して生成され得る。
【００３８】
本発明の１実施形態はまた、本明細書中に記載される抗体のいずれかの抗原結合部分を提供する。抗原結合部分は、少なくとも１つの抗原結合部位を有する任意の部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓＦｖ、ｓＦｖ、ディアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）及びトリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ））であり得る。
【００３９】
一本鎖可変領域断片（ｓＦｖ）抗体断片（これは、合成ペプチドを介して抗体軽鎖の可変（Ｖ）ドメインに連結された抗体重鎖のＶドメインを含む、切断型Ｆａｂ断片である）は、慣用的な組換えＤＮＡ技術の技術を使用して生成され得る（例えば、Ｊａｎｅｗａｙら（上記）を参照）。同様に、ジスルフィド安定化可変領域断片（ｄｓＦｖ）は、組換えＤＮＡ技術によって調製され得る（例えば、Ｒｅｉｔｅｒら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７−７０４（１９９４）を参照）。しかし、本発明の抗体断片は、これらの例示的な抗体断片の型に限定されない。
【００４０】
また、抗体又はその抗原結合部分は、検出可能な標識（例えば、放射性同位体、フルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）及び元素粒子（例えば、金粒子）など）を含むように改変され得る。
【００４１】
本発明の１実施形態はさらに、本明細書中に記載されるＣＡＲ、ポリペプチド又はタンパク質（その機能的部分及び機能的変異体を含む）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。これに関して、本発明の１実施形態は、表２のヌクレオチド配列を含むか、これからなるか又は本質的にこれからなる核酸を提供する。
【００４２】
【表２】
0005934099.tif 000003
【００４３】
本明細書中で使用する場合、「核酸」とは、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「核酸分子」を含み、一般にＤＮＡ又はＲＮＡのポリマーを意味し、これは、一本鎖又は二本鎖であり得、合成されても天然供給源から得てもよく（例えば、単離及び／又は精製）、天然、非天然若しくは変更されたヌクレオチドを含み得、未修飾のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間に見出されるホスホジエステル結合の代わりに、天然、非天然若しくは変更されたヌクレオチド間結合（例えば、ホスホロアミダート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ）結合又はホスホロチオエート結合）を含み得る。いくつかの実施形態において、核酸は、挿入、欠失、逆位及び／又は置換を何れも含まない。しかし、本明細書で議論するように、ある場合には、核酸が１以上の挿入、欠失、逆位及び／又は置換を含むことが適切であり得る。
【００４４】
本発明の１実施形態の核酸は組換えであり得る。本明細書中で使用する場合、用語「組換え」とは、（ｉ）天然又は合成の核酸セグメントを、生きた細胞中で複製できる核酸分子に連結することによって、生きた細胞の外側で構築された分子、或いは（ｉｉ）上記（ｉ）に記載した分子の複製から生じる分子、をいう。本明細書の目的のために、複製は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ複製又はｉｎ  ｖｉｖｏ複製であり得る。
【００４５】
組換え核酸は、天然に存在しない配列を有するものであっても、配列の２つの他の分離されたセグメントの人工的な組み合わせによって製造された配列を有するものであってもよい。この人工的な組合わせは、化学合成によって達成される場合が多く、又はより一般的には、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）に記載されたような遺伝子操作技術による、核酸の単離されたセグメントの人工的な操作によって達成される。核酸は、当業者に公知の手順を使用して、化学合成及び／又は酵素ライゲーション反応に基づいて構築され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）及びＡｕｓｕｂｅｌら（上記）を参照。例えば、核酸は、天然に存在するヌクレオチド或いは分子の生物学的安定性を増加させるように、又はハイブリダイゼーションの際に形成される二重鎖の物理的安定性を増加させるように設計された多様な修飾ヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチド）を使用して、化学的に合成され得る。核酸を生成するために使用され得る修飾ヌクレオチドの例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン（β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−置換アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン（β−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル及び２，６−ジアミノプリン。或いは、本発明の核酸の１以上は、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（Ｆｏｒｔ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）及びＳｙｎｔｈｅｇｅｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）などの企業から購入できる。
【００４６】
核酸は、ＣＡＲ、ポリペプチド若しくはタンパク質、又はそれらの機能的部分若しくは機能的変異体のいずれかをコードする、任意の単離又は精製されたヌクレオチド配列を含み得る。或いは、ヌクレオチド配列は、任意の配列へと縮重したヌクレオチド配列、又は縮重配列の組み合わせを含み得る。
【００４７】
本発明の１実施形態は、本明細書中に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列、又は本明細書中に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列に対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、単離又は精製された核酸も提供する。
【００４８】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列は、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得る。「高ストリンジェンシー条件」とは、ヌクレオチド配列が、非特異的ハイブリダイゼーションよりも検出可能に強い量で標的配列（本明細書中に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列）に特異的にハイブリダイズすることを意味する。高ストリンジェンシー条件には、正確に相補的な配列を有するポリヌクレオチド、又はヌクレオチド配列にマッチした数塩基の小領域（例えば３〜１０塩基）を偶然有するランダム配列からの数個の散らばったミスマッチのみを含むポリヌクレオチドを、識別する条件が含まれる。かかる小領域の相補性は、１４〜１７又はそれ以上の塩基の全長相補体よりも容易に融解され、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、それらを容易に識別できるようにする。比較的高ストリンジェンシーの条件には、例えば、低塩及び／又は高温条件（例えば、約０．０２〜０．１ＭのＮａＣｌ又は等価物、約５０〜７０℃の温度により提供される）が含まれる。かかる高ストリンジェンシー条件は、存在したとしても、ヌクレオチド配列とテンプレート鎖若しくは標的鎖との間のミスマッチをほとんど許容せず、本発明のＣＡＲのいずれかの発現を検出するのに特に適している。条件は、漸増量のホルムアミドの添加によって、よりストリンジェントになり得ることが一般に理解される。
【００４９】
１実施形態において、本発明の核酸は、組換え発現ベクター中に組み込まれ得る。これに関して、本発明の１実施形態は、本発明の核酸のいずれかを含む組換え発現ベクターを提供する。本明細書中の目的のために、用語「組換え発現ベクター」とは、宿主細胞によるｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの発現を可能にする遺伝子改変オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンストラクトを意味し、ここで、コンストラクトは、ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ベクターは、細胞内でｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドを発現させるのに十分な条件下で細胞と接触させられる。本発明のベクターは、全体としては天然に存在するものではない。しかし、ベクターの一部は天然に存在するものであり得る。本発明の組換え発現ベクターは、ＤＮＡ及びＲＮＡ（一本鎖又は二本鎖であり得、合成されても一部を天然供給源から得てもよく、天然、非天然若しくは変更されたヌクレオチドを含み得る）が挙げられるがそれらに限定されない任意の型のヌクレオチドを含み得る。組換え発現ベクターは、天然に存在するヌクレオチド間結合若しくは天然に存在しないヌクレオチド間結合、又は両方の型の結合を含み得る。好ましくは、天然に存在しない又は変更されたヌクレオチド又はヌクレオチド間結合は、ベクターの転写も複製も妨害しない。
【００５０】
１実施形態において、本発明の組換え発現ベクターは、任意の適切な組換え発現ベクターであり得、任意の適切な宿主を形質転換又はトランスフェクトするために使用され得る。適切なベクターとしては、増殖（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）及び増大（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）のため、発現のため、又はそれら両方のために設計されたベクター（例えば、プラスミド及びウイルス）が挙げられる。ベクターは、以下からなる群より選択され得る：ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｌｅｎ  Ｂｕｒｎｉｅ，ＭＤ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）及びｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）。バクテリオファージベクター（例えば、λＧＴ１０、λＧＴ１１、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、λＥＭＢＬ４及びλＮＭ１１４９）もまた使用され得る。植物発現ベクターの例としては、ｐＢＩ０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ１２１及びｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。動物発現ベクターの例としては、ｐＥＵＫ−Ｃｌ、ｐＭＡＭ及びｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。組換え発現ベクターは、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター）であり得る。
【００５１】
１実施形態において、本発明の組換え発現ベクターは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（上記）及びＡｕｓｕｂｅｌら（上記）に記載された、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して調製できる。環状又は線状の発現ベクターのコンストラクトは、原核生物又は真核生物の宿主細胞において機能的な複製系を含むように調製され得る。複製系は、例えば、ＣｏｌＥｌ、２μプラスミド、λ、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルスなどに由来し得る。
【００５２】
組換え発現ベクターは、必要に応じてそのベクターがＤＮＡベースであるかＲＮＡベースであるかを考慮して、ベクターが導入される宿主の型（例えば、細菌、真菌、植物又は動物）に特異的な調節配列（例えば、転写及び翻訳の開始及び終止コドン）を含み得る。
【００５３】
組換え発現ベクターは、形質転換又はトランスフェクトされた宿主の選択を可能にする、１以上のマーカー遺伝子を含み得る。マーカー遺伝子には、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質、重金属などに対する耐性）、原栄養性を提供するための栄養要求性宿主における補完などが挙げられる。本発明の発現ベクターに適したマーカー遺伝子には、例えば、ネオマイシン／Ｇ４１８耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子及びアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
【００５４】
組換え発現ベクターは、ＣＡＲ、ポリペプチド又はタンパク質（その機能的部分及び機能的変異体を含む）をコードするヌクレオチド配列或いはＣＡＲ、ポリペプチド又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列と相補的であるか又はそれにハイブリダイズするヌクレオチド配列に作動可能に連結された、天然又は非天然のプロモーターを含み得る。プロモーター（例えば、強い、弱い、誘導性、組織特異的及び発生特異的）の選択は、当業者の技術範囲内である。同様に、ヌクレオチド配列とプロモーターとの組み合わせもまた、当業者の技術範囲内である。プロモーターは、非ウイルスプロモーター若しくはウイルスプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、又はマウス幹細胞ウイルスの末端反復配列中に見出されるプロモーター）であり得る。
【００５５】
本発明の組換え発現ベクターは、一過性の発現のため、安定な発現のため、又はその両方のために設計され得る。また、組換え発現ベクターは、構成的発現又は誘導性発現のために製造され得る。
【００５６】
さらに、組換え発現ベクターは、自殺遺伝子を含むように製造され得る。本明細書中で使用する場合、用語「自殺遺伝子」とは、その自殺遺伝子を発現する細胞を死に至らしめる遺伝子をいう。自殺遺伝子は、その遺伝子が発現される細胞に対し薬剤（例えば薬物）に対する感受性を付与し、細胞がその薬剤と接触したとき又はその薬剤に曝露されたときに細胞を死に至らしめる遺伝子であり得る。自殺遺伝子は当該分野で公知であり（例えば、Ｓｕｉｃｉｄｅ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｃａｒｏｌｉｎｅ  Ｊ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＵＫ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｕｔｔｏｎ，Ｓｕｒｒｅｙ，ＵＫ），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００４を参照）、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及びニトロレダクターゼが挙げられる。
【００５７】
本発明の範囲内には、本発明のＣＡＲ、ポリペプチド又はタンパク質（その機能的部分又は変異体のいずれかを含む）、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、宿主細胞集団、又は抗体若しくはその抗原結合部分のいずれかを含む、コンジュゲート（例えば、バイオコンジュゲート）が含まれる。コンジュゲート並びにコンジュゲートの合成方法は一般に、当該分野で公知である（例えば、Ｈｕｄｅｃｚ，Ｆ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９８：２０９−２２３（２００５）及びＫｉｒｉｎら，Ｉｎｏｒｇ  Ｃｈｅｍ．４４（１５）：５４０５−５４１５（２００５）を参照）。
【００５８】
本発明の１実施形態はさらに、本明細書中に記載される組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を提供する。本明細書中で使用する場合、用語「宿主細胞」とは、本発明の組換え発現ベクターを含み得る任意の型の細胞をいう。宿主細胞は、真核生物細胞（例えば、植物、動物、真菌又は藻類）であってもよく、原核生物細胞（例えば、細菌又は原生生物）であってもよい。宿主細胞は、培養細胞又は初代細胞（即ち、ヒトなどの生物から直接単離された）であり得る。宿主細胞は、接着細胞又は浮遊細胞（即ち、懸濁物中で増殖する細胞）であり得る。適切な宿主細胞は当該分野で公知であり、例えば、ＤＨ５α  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、サルＶＥＲＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などが挙げられる。組換え発現ベクターを増幅又は複製する目的のために、宿主細胞は、ＤＨ５α細胞などの原核生物細胞であり得る。組換えＣＡＲ、ポリペプチド又はタンパク質を産生する目的のために、宿主細胞は哺乳動物細胞であり得る。宿主細胞はヒト細胞であり得る。宿主細胞は任意の細胞型のものであり得、任意の組織型に由来し得、任意の発生段階のものであり得るが、宿主細胞は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）であり得る。宿主細胞はＴ細胞であり得る。
【００５９】
本明細書中の目的のために、Ｔ細胞は、任意のＴ細胞（例えば培養Ｔ細胞（例えば初代Ｔ細胞）、又は培養Ｔ細胞株（例えば、Ｊｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴ１など）由来のＴ細胞、又は哺乳動物から得られたＴ細胞）であり得る。哺乳動物から得られる場合、Ｔ細胞は、多数の供給源（血液、骨髄、リンパ節、胸腺又は他の組織若しくは体液が挙げられるが、これらに限定されない）から得ることができる。Ｔ細胞はまた、富化又は精製され得る。Ｔ細胞はヒトＴ細胞であり得る。Ｔ細胞は、ヒトから単離されたＴ細胞であり得る。Ｔ細胞は、任意の型のＴ細胞であり得、任意の発生段階のものであり得る（ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重ポジティブＴ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（例えば、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、末梢血白血球（ＰＢＬ）、腫瘍浸潤細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞などが含まれるが、これらに限定されない）。Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋Ｔ細胞であり得る。
【００６０】
本発明の１実施形態は、本明細書中に記載される少なくとも１つの宿主細胞を含む細胞集団も提供する。細胞集団は、少なくとも１つの他の細胞（例えば、記載された組換え発現ベクターをいずれも含まない宿主細胞（例えばＴ細胞）又はＴ細胞以外の細胞（例えば、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球、赤血球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋細胞、脳細胞など））に加えて、この組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を含む、不均質な集団であり得る。或いは、細胞集団は、実質的に均質な集団であり得、このとき、集団は、組換え発現ベクターを含む宿主細胞から主に構成される（例えば、組換え発現ベクターを含む宿主細胞から本質的になる）。集団は細胞のクローン集団でもあり得、このとき、集団の全ての細胞は、組換え発現ベクターを含む単一の宿主細胞のクローンであり、その結果、集団の全ての細胞が組換え発現ベクターを含む。本発明の１実施形態において、細胞集団は、本明細書中に記載される組換え発現ベクターを含む宿主細胞を含むクローン集団である。
【００６１】
ＣＡＲ、ポリペプチド、タンパク質（その機能的部分及び変異体を含む）、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞（その集団を含む）及び抗体（その抗原結合部分を含む）（これらは全て、本明細書中以下、集合的に「本発明のＣＡＲ材料」と呼ぶ）は、単離及び／又は精製され得る。本明細書中で使用する場合、用語「単離された」は、その天然の環境から取り出されたことを意味する。用語「精製された」又は「単離された」は、絶対的な純度又は単離を必要としない。むしろ、相対的な用語として意図される。従って、例えば、精製された（又は単離された）宿主細胞調製物は、宿主細胞が、身体内のその天然の環境中の細胞よりも純粋である調製物である。かかる宿主細胞は、例えば、標準的な精製技術によって生成され得る。いくつかの実施形態において、宿主細胞の調製物は、その調製物の総細胞含量の少なくとも約５０％、例えば少なくとも約７０％を宿主細胞が占めるように、精製される。例えば、純度は、少なくとも約５０％であり得、約６０％、約７０％又は約８０％より高くてもよく、或いは約１００％であり得る。
【００６２】
本発明のＣＡＲ材料は、医薬組成物などの組成物へと製剤化され得る。これに関して、本発明の１実施形態は、ＣＡＲ、ポリペプチド、タンパク質、機能的部分、機能的変異体、核酸、発現ベクター、宿主細胞（その集団を含む）及び抗体（その抗原結合部分を含む）のいずれかと、医薬上許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。本発明のＣＡＲ材料のいずれかを含む本発明の医薬組成物は、１種より多い本発明のＣＡＲ材料（例えば、ポリペプチド及び核酸）又は２種以上の異なるＣＡＲを含み得る。或いは、医薬組成物は、他の医薬上活性な薬剤又は薬物（例えば、化学療法剤、例：アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチンなど）と組合わせて、本発明のＣＡＲ材料を含み得る。好ましい実施形態において、医薬組成物は、本発明の宿主細胞又はその集団を含む。
【００６３】
本発明のＣＡＲ材料は、塩（例えば、医薬上許容される塩）の形態で提供され得る。適切な医薬上許容される酸付加塩には、鉱酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸及び硫酸）由来の塩、及び有機酸（例えば、酒石酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、安息香酸、グリコール酸、コハク酸、及びｐ−トルエンスルホン酸などのアリールスルホン酸）由来の塩が含まれる。
【００６４】
医薬組成物に関して、医薬上許容される担体は、従来使用されるいずれの担体であってもよく、化学−物理的考慮事項（例えば、溶解度、及び活性薬剤に対する反応性の欠如）及び投与経路のみによって限定される。本明細書中に記載される医薬上許容される担体（例えば、ビヒクル、アジュバント、賦形剤及び希釈剤）は、当業者に周知であり、公に容易に入手可能である。医薬上許容される担体は、活性薬剤に対し化学的に不活性な担体及び使用条件下で有害な副作用も毒性もない担体であることが好ましい。
【００６５】
担体の選択は、本発明の特定のＣＡＲ材料によって、並びに本発明のＣＡＲ材料を投与するために使用される特定の方法によって、一部決定されよう。従って、本発明の医薬組成物の適切な製剤は多様である。保存剤が使用され得る。適切な保存剤としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム及び塩化ベンザルコニウムが挙げられ得る。２種以上の保存剤の混合物が、任意選択で使用され得る。保存剤又はその混合物は、典型的には、総組成物の約０．０００１重量％〜約２重量％の量で存在する。
【００６６】
適切な緩衝剤としては、例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸カリウム並びに種々の他の酸及び塩が挙げられ得る。２種以上の緩衝剤の混合物が、任意選択で使用され得る。緩衝剤又はその混合物は、典型的には、総組成物の約０．００１重量％〜約４重量％の量で存在する。
【００６７】
医薬製剤中の本発明のＣＡＲ材料の濃度は、例えば、約１重量％未満、通常約１０重量％又は少なくとも約１０重量％から、約２０重量％〜約５０重量％以上まで変動し得、選択される特定の投与様式に従って、流体の体積及び粘度によって主に選択され得る。
【００６８】
投与可能な（例えば、非経口投与可能な）組成物を調製するための方法は、当業者に公知又は明らかであり、例えば以下においてより詳細に記載されている：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ；第２１版（２００５年５月１日）。
【００６９】
経口、エアロゾル、非経口（例えば、皮下、静脈内、動脈内、筋内、皮内、腹腔内（ｉｎｔｅｒｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）及び髄腔内）及び局所投与のための以下の製剤は、単なる例示であり、何ら限定ではない。本発明のＣＡＲ材料を投与するために１より多い経路が使用され得、ある場合には、特定の経路が、別の経路よりも迅速かつ有効な応答を提供し得る。
【００７０】
経口投与に適した製剤は、以下を含むか又は以下からなり得る：（ａ）希釈剤（例えば、水、生理食塩水又はオレンジジュース）中に溶解させた有効量の本発明のＣＡＲ材料などの、液体溶液；（ｂ）カプセル、サシェ剤（ｓａｃｈｅｔ）、錠剤、ロゼンジ及びトローチ（それぞれ、固体又は顆粒として所定量の活性成分を含む）；（ｃ）粉末；（ｄ）適切な液体中の懸濁物；及び（ｅ）適切な乳濁物。液体製剤は、医薬上許容される界面活性剤の添加あり又はなしのいずれかの、水及びアルコール（例えば、エタノール、ベンジルアルコール及びポリエチレンアルコール）などの希釈剤を含み得る。カプセル形態は、例えば、界面活性剤、滑沢剤及び不活性フィラー（例えば、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム及びコーンスターチ）を含む、通常の硬ゼラチン型及び軟ゼラチン型のものであり得る。錠剤形態は、以下の１以上を含み得る：ラクトース、スクロース、マンニトール、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸、結晶セルロース、アラビアゴム、ゼラチン、グアーガム、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、並びに他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、崩壊剤、加湿剤、保存剤、香味料及び他の薬理学的に適合性の賦形剤。ロゼンジ形態は、香料（通常、スクロース及びアラビアゴム又はトラガント）中に本発明のＣＡＲ材料を含み得、アメ（ｐａｓｔｉｌｌｅ）は、当該分野で公知のかかる賦形剤に加えて、不活性基剤（例えば、ゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアラビアゴム）、乳濁物、ゲルなどを含む中に、本発明のＣＡＲ材料を含む。
【００７１】
非経口投与に適した製剤には、水性又は非水性の等張無菌注射溶液（抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、及び製剤を意図したレシピエントの血液と等張にする溶質を含み得る）並びに水性及び非水性の無菌懸濁物（懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤及び保存剤を含み得る）が挙げられる。本発明のＣＡＲ材料は、医薬上許容される界面活性剤（例えば、石鹸又は洗剤）、懸濁剤（例えば、ペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はカルボキシメチルセルロース）又は乳化剤及び他の医薬的アジュバントの添加あり又はなしの、医薬的担体（例えば、無菌の液体又は液体混合物（水、生理食塩水、水性デキストロース及び関連の等溶液、アルコール（例えば、エタノール又はヘキサデシルアルコール）、グリコール（例えば、プロピレングリコール又はポリエチレングリコール）、ジメチルスルホキシド、グリセロール、ケタール（例えば、２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノール）、エーテル、ポリ（エチレングリコール）４００、油、脂肪酸、脂肪酸エステル若しくはグリセリド、又はアセチル化脂肪酸グリセリドを含む））中の生理学的に許容される希釈剤中で投与され得る。
【００７２】
非経口製剤で使用され得る油には、石油、動物油、植物油又は合成油が挙げられる。油の具体的例としては、落花生油、大豆油、ゴマ油、綿実油、コーン油、オリーブ油、ペトロラタム及び鉱油が挙げられる。非経口製剤での使用に適切な脂肪酸には、オレイン酸、ステアリン酸及びイソステアリン酸が挙げられる。オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルが、適切な脂肪酸エステルの例である。
【００７３】
非経口製剤での使用に適した石鹸には、脂肪酸のアルカリ金属、アンモニウム及びトリエタノールアミン塩が挙げられ、適切な洗剤には以下が挙げられる：（ａ）カチオン性洗剤（例えば、ジメチルジアルキルアンモニウムハライド及びアルキルピリジニウムハライド）、（ｂ）アニオン性洗剤（例えば、アルキル、アリール及びオレフィンスルホン酸塩、アルキル、オレフィン、エーテル及びモノグリセリド硫酸塩及びスルホコハク酸塩）、（ｃ）非イオン性洗剤（例えば、脂肪アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド及びポリオキシエチレンポリプロピレンコポリマー）、（ｄ）両性洗剤（例えば、アルキル−β−アミノプロピオン酸塩及び２−アルキル−イミダゾリン第４級アンモニウム塩）、並びに（ｅ）それらの混合物。
【００７４】
非経口製剤は典型的に、例えば、溶液中に約０．５重量％〜約２５重量％の本発明のＣＡＲ材料を含むであろう。保存剤及び緩衝液が使用され得る。注射部位での刺激を最小化又は排除するために、かかる組成物は、例えば、約１２〜約１７の親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）を有する１種以上の非イオン性界面活性剤を含み得る。かかる製剤中の界面活性剤の量は、典型的には、例えば、約５重量％〜約１５重量％の範囲であろう。適切な界面活性剤としては、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ソルビタンモノオレエート）、及びプロピレンオキシドとプロピレングリコールとの縮合によって形成される、疎水性塩基とエチレンオキシドとの高分子量付加物が挙げられる。非経口製剤は、単一用量又は複数用量の密封容器（例えば、アンプル及びバイアル）中に提示され得、使用直前の無菌液体賦形剤（例えば注射用水）の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存され得る。即時注射溶液及び懸濁物は、以前に記載された種類の無菌の粉末、顆粒及び錠剤から調製できる。
【００７５】
注射可能な製剤は、本発明の１実施形態に従う。注射可能な組成物のための有効な医薬的担体の要件は、当業者に周知である（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，Ｂａｎｋｅｒ及びＣｈａｌｍｅｒｓ編，頁２３８−２５０（１９８２）、及びＡＳＨＰ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｄｒｕｇｓ，Ｔｏｉｓｓｅｌ，第４版，頁６２２−６３０（１９８６）を参照）。
【００７６】
局所製剤（経皮薬物放出に有用なものを含む）は、当業者に周知であり、本発明の実施形態の皮膚への適用に関して適切である。本発明のＣＡＲ材料は、単独で又は他の適切な成分と組み合わせて、吸入を介して投与されるエアロゾル製剤にされ得る。これらのエアロゾル製剤は、加圧された許容可能な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など）中に入れられ得る。これらはまた、例えばネブライザー又はアトマイザー中の非加圧製剤のための医薬として製剤化され得る。かかるスプレー製剤は、粘膜にスプレーするためにも使用され得る。
【００７７】
「有効量」又は「治療に有効な量」とは、個体における癌を予防又は治療するのに適切な用量をいう。治療的使用又は予防的使用に有効な量は、例えば、治療される疾患又は障害の病期及び重篤度、患者の年齢、体重及び全般的健康状態、並びに処方医師の判断に依存するであろう。用量のサイズもまた、選択された活性剤、投与方法、投与のタイミング及び頻度、特定の活性剤の投与に伴い得る任意の有害な副作用の存在、性質及び程度、並びに所望の生理学的効果によって決定されよう。種々の疾患又は障害が、おそらく各投与経路又は種々の投与経路で本発明のＣＡＲ材料を使用する、複数の投与を含む長期治療を必要とし得ることが、当業者に理解されよう。本発明の限定を意図しない例として、本発明のＣＡＲ材料の用量は、約０．００１〜約１０００ｍｇ／治療される対象の体重ｋｇ／日、約０．０１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約０．０１ｍｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重／日であり得る。
【００７８】
本発明の目的のために、投与される本発明のＣＡＲ材料の量又は用量は、合理的な時間枠にわたって対象又は動物において治療応答又は予防応答をもたらすのに十分でなければならない。例えば、本発明のＣＡＲ材料の用量は、投与時点から約２時間以上の期間（例えば、約１２時間〜約２４時間又はそれ以上）において、抗原に結合するため、又は疾患を検出、治療若しくは予防するために、十分でなければならない。特定の実施形態において、この期間はさらに長くてもよい。用量は、本発明の特定のＣＡＲ材料の効力及び動物（例えば、ヒト）の状態、並びに治療する動物（例えば、ヒト）の体重によって決定されるであろう。
【００７９】
本発明の目的のために、例えば、本発明のＣＡＲ、ポリペプチド又はタンパク質を発現するＴ細胞の所与の用量を哺乳動物に投与した際に、かかるＴ細胞によって標的細胞が溶解される又はＩＦＮ−γが分泌される程度を、種々の用量のＴ細胞をそれぞれ与えた哺乳動物のセット間で比較することを含むアッセイが、哺乳動物に投与される出発用量を決定するために使用され得る。特定の用量の投与の際に標的細胞が溶解される又はＩＦＮ−γが分泌される程度は、当該分野で公知の方法によってアッセイできる。
【００８０】
本発明のＣＡＲ材料を１種以上のさらなる治療剤と共に投与する場合、１種以上のさらなる治療剤は、哺乳動物に共投与され得る。「共投与（ｃｏａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」とは、本発明のＣＡＲ材料が１種以上のさらなる治療剤の効果を増強でき、また１種以上のさらなる治療剤が本発明のＣＡＲ材料の効果を増強できるように十分に近接した時間で、１種以上のさらなる治療剤及び本発明のＣＡＲ材料を投与することを意味する。これに関して、本発明のＣＡＲ材料が最初に投与されかつ１種以上のさらなる治療剤が２番目に投与され得、１種以上のさらなる治療剤が最初に投与されかつ本発明のＣＡＲ材料が２番目に投与され得る。或いは、本発明のＣＡＲ材料及び１種以上のさらなる治療剤は、同時に投与され得る。ＣＡＲ材料と共投与され得る例示的な治療剤は、ＩＬ−２である。ＩＬ−２は、本発明のＣＡＲ材料の治療効果を増強すると考えられる。宿主細胞又は細胞集団が宿主に投与される本発明の方法の目的のために、細胞は、宿主に対して同種又は自己の細胞であり得る。
【００８１】
本発明の医薬組成物、ＣＡＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞又は細胞集団は、宿主における疾患を治療又は予防する方法で使用され得ることが企図される。特定の理論に束縛されないが、細胞によって発現された場合に、ＣＡＲ（又は関連の本発明のポリペプチド若しくはタンパク質）が、ＣＡＲが特異的な抗原（例えばＶＥＧＦＲ−２）を発現する細胞に対する免疫応答を媒介できるように、本発明のＣＡＲは、生物活性（例えば、抗原（例えばＶＥＧＦＲ−２）を認識する能力）を有する。これに関して、本発明の１実施形態は、宿主における疾患を治療又は予防するのに有効な量で、本発明のＣＡＲ材料のいずれかを宿主に投与することを含む、宿主における疾患の治療又は予防方法を提供する。
【００８２】
本発明の１実施形態は、本発明のＣＡＲ材料を投与する前に宿主をリンパ枯渇させる（ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｅ）ことをさらに含む。
【００８３】
本発明の方法に関して、癌は、以下のいずれかを含む任意の癌であり得る：急性リンパ球性癌、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、膀胱癌、骨癌、脳癌、乳癌、肛門、肛門管若しくは肛門直腸（ａｎｏｒｅｃｔｕｍ）の癌、眼の癌、肝内胆管の癌、関節の癌、頸部、胆嚢若しくは胸膜の癌、鼻、鼻腔若しくは中耳の癌、口腔の癌、外陰部の癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性癌、結腸癌、食道癌、子宮頸癌、線維肉腫、消化管カルチノイド腫瘍、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、腎臓癌、喉頭癌、白血病、液性腫瘍、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、悪性中皮腫、肥満細胞腫、黒色腫、多発性骨髄腫、上咽頭癌、非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、膵臓癌、腹膜、網及び腸間膜の癌、咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、腎癌、皮膚癌、小腸癌、軟組織癌、固形腫瘍、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、尿管癌、並びに膀胱癌。好ましくは、癌は、血管新生表現型によって特徴付けられる癌、例えば、固形腫瘍又は血液悪性腫瘍である。
【００８４】
用語「治療」及び「予防」並びにそれらの派生語は、本明細書中で使用する場合、１００％又は完全な治療又は予防を必ずしも意味しない。むしろ、当業者が潜在的な有益効果又は治療効果を有すると認識する、変動する程度の治療又は予防が存在する。これに関して、本発明の方法は、哺乳動物中の癌の任意のレベルの治療又は予防の任意の量を提供し得る。さらに、本発明の方法が提供する治療又は予防は、治療又は予防される疾患（例えば癌）の１以上の状態又は症状の治療又は予防を含み得る。また、本明細書の目的のために、「予防」は、疾患又はその症状若しくは状態の発症を遅延させることを包含し得る。
【００８５】
標的細胞を認識する能力及び抗原特異性についてＣＡＲを試験する方法は、当該分野で公知である。例えば、Ｃｌａｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６３：５０７−５１３（１９９９）は、サイトカイン（例えば、インターフェロン−γ、顆粒球／単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子ａ（ＴＮＦ−α）又はインターロイキン２（ＩＬ−２））の放出を測定する方法を教示している。さらに、ＣＡＲ機能は、Ｚｈａｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７４：４４１５−４４２３（２００５）に記載されるように、細胞毒性（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ）の測定によって評価できる。標的細胞を認識する能力及び抗原特異性についてＣＡＲを試験する方法は、実施例の項目で本明細書中に記載される。
【００８６】
生検は、個体からの組織及び／又は細胞の取り出しである。かかる取り出しは、取り出された組織及び／又は細胞に対して実験法を行なうために、個体から組織及び／又は細胞を収集するためのものであり得る。この実験法は、個体が特定の状態又は疾患状態（ｄｉｓｅａｓｅ−ｓｔａｔｅ）を有する及び／又はそれらに罹患しているか否かを決定するための実験を含み得る。状態又は疾患は、例えば癌であり得る。
【００８７】
宿主における癌の存在を検出する本発明の方法の１実施形態に関して、宿主の細胞を含有するサンプルは、全細胞、その溶解物、又は全細胞溶解物の画分（例えば、核画分若しくは細胞質画分、全タンパク質画分、又は核酸画分）を含むサンプルであり得る。サンプルが全細胞を含む場合、細胞は、宿主の任意の細胞、例えば、任意の臓器又は組織の細胞（血球又は内皮細胞を含む）であり得る。
【００８８】
上記医薬組成物に加えて、本発明のＣＡＲ材料は、包接錯体（例えば、シクロデキストリン包接錯体）又はリポソームとして製剤化され得る。リポソームは、特定の組織に本発明のＣＡＲ材料を標的化するために機能し得る。リポソームは、本発明のＣＡＲ材料の半減期を増加させるためにも使用され得る。例えば、Ｓｚｏｋａら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９，４６７（１９８０）並びに米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号及び同第５，０１９，３６９号に記載されるように、リポソームを調製するための多くの方法が利用可能である。
【００８９】
本発明の実施形態に関連して有用な送達系には、本発明の組成物の送達が、治療される部位の感作の前に、及び感作を引き起こすのに十分な時間で生じるような、時限放出（ｔｉｍｅ−ｒｅｌｅａｓｅｄ）、遅延放出（ｄｅｌａｙｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）及び徐放（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）送達系が挙げられ得る。本発明の組成物は、他の治療剤又は療法と合わせて使用され得る。かかる系は、本発明の組成物の反復投与を回避することにより、対象及び医師の利便性を向上させることができ、本発明の特定の組成物実施形態に特に適したものであり得る。
【００９０】
多くの型の放出送達系が利用可能であり、当業者に公知である。これらには、ポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキサラート（ｃｏｐｏｌｙｏｘａｌａｔｅ）、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸及びポリ無水物などの、ポリマーベースの系が挙げられる。上記ポリマーの薬物含有マイクロカプセルは、例えば米国特許第５，０７５，１０９号に記載されている。送達系には、ステロール（例えば、コレステロール、コレステロールエステル）及び脂肪酸又は中性脂肪（例えば、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリド）を含む脂質；ヒドロゲル放出系；シラスティック（ｓｙｌａｓｔｉｃ）系；ペプチドベースの系；ワックスコーティング；従来の結合剤及び賦形剤を使用した圧縮錠剤；部分融合移植物（ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｆｕｓｅｄ  ｉｍｐｌａｎｔ）などの、非ポリマー系も含まれる。具体例としては以下が挙げられるがこれらに限定されない：（ａ）米国特許第４，４５２，７７５号、同第４，６６７，０１４号、同第４，７４８，０３４号及び同第５，２３９，６６０号に記載されるような、活性組成物がマトリックス内にある形態で含まれる、侵食性（ｅｒｏｓｉｏｎａｌ）の系、及び（ｂ）米国特許第３，８３２，２５３号及び同第３，８５４，４８０号に記載されるような、活性成分が制御された速度でポリマーから浸透する拡散系。さらに、ポンプベースのハードウェア送達系も使用され得、そのうちいくつかは、移植のために適合している。
【００９１】
多数のトランスフェクション技術が、当該分野で一般に公知である（例えば、Ｇｒａｈａｍら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６−４６７（１９７３）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）；Ｄａｖｉｓら，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８６）；及びＣｈｕら，Ｇｅｎｅ，１３：９７（１９８１）を参照）。トランスフェクション法には、リン酸カルシウム共沈殿（例えば、Ｇｒａｈａｍら（上記）を参照）、培養細胞への直接的マイクロインジェクション（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ，２２：４７９−４８８（１９８０）を参照）、エレクトロポレーション（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：７４２−７５１（１９８８）を参照）、リポソーム媒介性の遺伝子移入（例えば、Ｍａｎｎｉｎｏら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６８２−６９０（１９８８）を参照）、脂質媒介性の形質導入（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：７４１３−７４１７（１９８７）を参照）及び高速微粒子（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）を使用する核酸送達（例えば、Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３２７：７０−７３（１９８７）を参照）が挙げられる。
【００９２】
当業者は、本発明の本発明のＣＡＲ材料が、本発明のＣＡＲ材料の治療効力又は予防効力を改変によって増加させるために、多数の方法で改変され得ることを容易に理解するであろう。例えば、本発明のＣＡＲ材料は、直接的又はリンカーを介して間接的に、標的化部分にコンジュゲート化され得る。化合物（例えば、本発明のＣＡＲ材料）を標的化部分にンジュゲート化する実務は、当該分野で公知である。例えば、Ｗａｄｗａら，Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ３：１１１（１９９５）及び米国特許第５，０８７，６１６号を参照。
【００９３】
或いは、本発明のＣＡＲ材料は、デポー（ｄｅｐｏｔ）形態に改変され得、その結果、投与される身体中に本発明のＣＡＲ材料が放出される様式は、時間及び身体内の位置に関して制御される（例えば、米国特許第４，４５０，１５０号を参照）。本発明のＣＡＲ材料のデポー形態は、例えば、本発明のＣＡＲ材料及び多孔性又は非多孔性の材料（例えばポリマー）を含む移植可能な組成物であり得、ここで本発明のＣＡＲ材料は、材料に封入されるか又は材料を通して拡散され、及び／又は非多孔性材料の分解によって拡散される。次いでデポーは、身体内の所望の位置に移植され、本発明のＣＡＲ材料は、所定の速度で移植物から放出される。
【００９４】
以下の実施例は、本発明をさらに説明するが、その範囲を限定するものであると決して解釈すべきではないことは当然である。
【実施例】
【００９５】
マウス
純系メスＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）から購入した。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入した。全ての動物は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈの動物施設，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤにおいて、病原体なしの特定の条件で収容した。７〜９週齢のマウスを全ての実験で使用し、それらの実験は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤの動物実験倫理委員会の指針に従って実施した。
【００９６】
細胞培養
これらの実施例で使用したマウス腫瘍株は、Ｂ１６−Ｆ１０（黒色腫）、ＭＣＡ−２０５（肉腫）、ＭＣ３８（結腸腺癌）、ＭＢ４９（膀胱癌腫）、ＭＣ１７−５１（肉腫）、ＣＴ−２６（結腸癌腫）、Ｒｅｎｃａ（腎癌腫）、４Ｔ１（乳腺腺癌）、Ｃ−１４９８（骨髄性白血病）、Ｐ８１５（肥満細胞腫）、ＥＬ−４（リンパ腫）及びＮＩＨ−３Ｔ３（マウス胚繊維芽細胞）であった。Ｂ１６−Ｆ１０、ＭＣＡ−２０５、ＭＣ３８及びＮＩＨ−３Ｔ３細胞は、Ｓｕｒｇｅｒｙ  Ｂｒａｎｃｈ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）の細胞培養物寄託機関から得た。ＣＴ２６及びＲｅｎｃａ細胞は、Ｗｅｉｓｓ博士（ＮＣＩ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）から得た。ＳＶＥＣ４−１０ＥＨＲ１、ＭＳ１及びＳＶＲは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した、形質転換されたマウス内皮細胞株であった。ｅＢＥＮＤ．３も、形質転換されたマウス内皮細胞株である（Ｆｒａｎｋ  Ｃｕｔｔｉｔａ博士，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ  ａｔ  ＮＣＩ，ＮＩＨ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤのご厚意による提供）。マウスＶＥＧＦ−２タンパク質を安定して発現するＭＢ４９−Ｆｌｋ１及びＮＩＨ３Ｔ３−Ｆｌｋ１細胞は、全長マウスＶＥＧＦＲ−２をコードするＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルスベクターで、ＭＢ４９及びＮＩＨ−３Ｔ３細胞株を形質導入することによって作製された（Ｘ．Ｌｉら，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２５：２９８７（２００７））（Ｌｅｎａ  Ｃｌａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈ教授，Ｕｐｐｓａｌａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｗｅｄｅｎのご厚意による提供）。
【００９７】
これらの実施例で使用した末梢血リンパ球（ＰＢＬ）は、Ｓｕｒｇｅｒｙ  Ｂｒａｎｃｈ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤにおいて治療された転移性黒色腫患者の白血球アフェレーシスによって得られた凍結保存ＰＢＭＣであった。これらの実施例で使用した以下の正常初代ヒト細胞は、ＬＯＮＺＡ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から調達した：微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）（肺由来（ＨＭＶＥＣ−Ｌ）又は真皮由来（ＨＭＶＥＣ−Ｄ））、臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）、気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）、腎上皮細胞（ＨＲＥ）、乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）、前立腺上皮細胞（ＰｒＥＣ）、平滑筋筋芽細胞（ＨＳＭＭ）、ヒト初代皮膚繊維芽細胞。使用した他の細胞株は、ヒト胎児胚腎臓繊維芽細胞細胞株２９３及びＫＤＲを発現する安定な形質転換体である２９３−ＫＤＲであった（Ｍａｒｉａ  Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ博士，Ｓｕｒｇｅｒｙ  Ｂｒａｎｃｈ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤのご厚意による提供）。レトロウイルスパッケージング細胞株２９３ＧＰ及びＰＧ１３は、ＣＴＡＡから得た。ヒトエコトロピックパッケージング細胞株ＰｈｏｅｎｉｘＴＭ  Ｅｃｏは、Ｇａｒｙ  Ｎｏｌａｎ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ，ＣＡの厚意により提供された（Ｏｒｂｉｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡからも入手可能）。
【００９８】
上記全てのマウス腫瘍株は、Ｒ１０（１０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌｅ，ＮＹから）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地）中で維持した。マウス内皮細胞株、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、２９３、２９３−ＫＤＲ、２９３ＧＰ、ＰＧ１３及びＰｈｏｅｎｉｘＴＭＥｃｏ細胞は全て、Ｄ１０（１０％熱不活化ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））中で維持した。全ての初代ヒト細胞は、その製造業者（Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．）から購入したそれぞれの培養培地中で維持した。マウスＴ細胞は、１０％熱不活化ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．０５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸塩、２ｎＭ  Ｌ−グルタミン（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから）を含み、３０ＩＵ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン（ｒｈＩＬ）−２（Ｃｈｉｒｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（本明細書中以下ＣＭ−Ｍと呼ぶ）中で培養した。初代ヒトリンパ球は、５０％ＲＰＭＩ１６４０、５０％ＡＩＭ−Ｖ培地、０．０５ｍＭメルカプトエタノール（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから）、３００ＩＵ／ｍｌ  ｒｈＩＬ−２及び１０％熱不活化ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＷｅｓｔＳａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）を含む培養培地（ＣＭ−Ｈ）中で培養した。全ての細胞は、５％ＣＯ２及び９５％湿度下、３７℃で培養した。
【００９９】
実施例１
この実施例は、ＤＣ１０１抗体の抗原結合ドメイン、細胞外ヒンジドメイン、Ｔ細胞受容体膜貫通ドメイン及び細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を作製する方法を実証する。
【０１００】
全てのコンストラクトは、以前に記載された（Ｈｕｇｈｅｓ，ＭＳ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１６：４５７−４７２（２００５））ベクターのＭＦＧ設計のスプライシング及び最適化開始コドンを組み込む、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）末端反復配列（ＬＴＲ）（ｉｎ  ｖｉｖｏサイレンシングに対し比較的抵抗性であることが知られる）を含むレトロウイルスベクター（ＭＳＧＶ）中にクローニングした。
【０１０１】
ＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲは、マウスＶＥＧＦＲ−２に対する一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）（以下、ＤＣ１０１  ＳｃＦｖと呼ぶ）を含む。ＤＣ１０１  ＳｃＦｖは、２１８ｂｐリンカーによって融合された、マウスＶＥＧＦＲ−２に特異的なラットＩｇＧ（ＤＣ１０１；Ｉｍｃｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。ＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲは、マウスＣＤ８α鎖のヒンジ及び膜貫通（ＴＭ）領域（Ｇｅｎｂａｎｋ識別子ＮＭ００１０８１１１０のヌクレオチド５８０〜７９５に対応）にインフレームで連結させ、次いでこれを、ＣＤ２８（Ｇｅｎｂａｎｋ識別子ＮＭ００７６４２のヌクレオチド６１８〜７４０に対応）、４−１ＢＢ（Ｇｅｎｂａｎｋ識別子Ｊ０４４９２のヌクレオチド７７９〜９１３に対応）及びＣＤ３ζ（Ｇｅｎｂａｎｋ識別子ＮＭ００１１１３３９１のヌクレオチド３１３〜６３５に対応）分子由来のマウス細胞内シグナル伝達配列に融合させる。
【０１０２】
ＤＣ１０１−ＣＤ８２８Ｚコンストラクトは、４−１ＢＢシグナル伝達ドメインを欠くことを除き、類似の配置及び順序で、ＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲと同じ成分を有する。
【０１０３】
全長の８０６ｂｐ  ｓｃＦｖ  ｃＤＮＡ（ＤＣ１０１  ＳｃＦｖと称する）を、以下のようなポリメラーゼ連鎖（ＰＣＲ）増幅及びアセンブリ技術を使用して構築した。重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）のコード配列を、別々に増幅し、続くＰＣＲ反応によってリンカーを用いて組換えた。第一セットのＰＣＲ反応を実施して、リーダー配列（ＬＳ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）、並びにまた軽鎖可変領域（ＶＬ）を増幅した。プラスミドＤＣ１０１  ＨＣ（クローン８．６）ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ及びＤＣ１０１  ＬＣ（クローン３．２）ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（それぞれ、ＤＣ１０１抗体（Ｄａｌｅ  Ｌｕｄｗｉｇ，Ｉｍｃｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．の厚意による提供）の重鎖コード配列及び軽鎖コード配列を含む）をテンプレートとして第一のＰＣＲ反応で使用して、ＤＣ１０１  ＳｃＦｖのＬＳ＋ＶＨ、及びＶＬ成分を作製した。重鎖フォワードプライマーＨｅａｖｙ−Ｆ（配列番号２２）を、重鎖リーダー配列の５’末端に及ぶように設計した。これは、その５’末端にＸｈｏＩ部位を含む。軽鎖リバースプライマーＶＬ−Ｒ（配列番号２３）は、その３’末端にＮｏｔＩ部位を含む。軽鎖フォワードプライマーＶＬ−Ｆ（配列番号２４）は、２１８ｂｐのリンカー配列の一部を含むように設計した。これは、重鎖リバースプライマーＶＨ−Ｒ（配列番号２５）と対応する。
【０１０４】
第二のＰＣＲ反応において、第一のＰＣＲ産物（即ち、重鎖ＬＳ＋ＶＨ断片及びＶＬ断片）を、最終ＤＣ１０１  ＳｃＦｖ断片を生じるＨｅａｖｙ−Ｆ及びＶＬ−Ｒプライマーセットを使用してアセンブル及び増幅した。合成したＤＣ１０１  ＳｃＦｖ  ＤＮＡ断片を配列確認した。
【０１０５】
以前に記載したマウスＣＤ８αヒンジのヌクレオチド配列並びにマウスＣＤ２８、４−１ＢＢ及びＣＤ３ζの膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを、２つの異なる配置（即ち、ＣＤ８２８ＢＢＺ又はＣＤ８２８Ｚ）の順に、インフレームでアセンブルした。これらの断片両方を、５’末端にＮｏｔＩ部位並びに３’末端にＳａｌＩ及びＢａｍＨ１部位を有するように設計し、ＧｅｎｅＡｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で合成した。これらの配列をコードするプラスミドを、ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標），Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）で消化し、同様に消化したＭＳＧＶベクタープラスミド（Ｚｈａｏら  ２００９（近刊）により記載）中に個々にライゲーションした。このサブクローニング工程により、２つの暫定レトロウイルスコンストラクト：即ち、ＭＳＧＶ−４Ｄ５−ＣＤ８２８ＢＢＺ及びＭＳＧＶ−４Ｄ５−ＣＤ８２８Ｚが作製された。ＤＣ１０１  ＣＡＲをコードするレトロウイルスベクターＭＳＧＶ−ＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ（ＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺとも呼ぶ）及びＭＳＧＶ−ＤＣ１０１−ＣＤ８２８Ｚ（ＤＣ１０１−ＣＤ８２８Ｚとも呼ぶ）を作製するために、ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ消化したＤＣ１０１  ＳｃＦｖ断片を、ＭＳＧＶ−４Ｄ５−ＣＤ８２８ＢＢＺ及びＭＳＧＶ−４Ｄ５−ＣＤ８２８Ｚプラスミド中に直接ライゲーションして、４Ｄ５断片を置換した。
【０１０６】
この実施例は、ＤＣ１０１  ＳｃＦｖセグメント、マウスＣＤ８αヒンジ及び膜貫通セグメント、並びに細胞内マウスＴ細胞シグナル伝達ＣＤ２８、４−１ＢＢ及びＣＤ３ζセグメントを含むＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を作製する方法を実証した。この実施例は、ＤＣ１０１  ＳｃＦｖセグメント、マウスＣＤ８αヒンジ及び膜貫通セグメント、並びに細胞内マウスＴ細胞シグナル伝達ＣＤ２８及びＣＤ３ζセグメントを含むＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を作製する方法も実証した。
【０１０７】
実施例２
この実施例は、ＫＤＲ−１１２１抗体の抗原結合ドメイン、細胞外ヒンジドメイン、Ｔ細胞受容体膜貫通ドメイン及び細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を作製する方法を実証する。
【０１０８】
ヒトＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ）特異的ｓｃＦｖは、ＫＤＲ−１１２１抗体（ヒトＫＤＲタンパク質に対する完全にヒトのＩｇＧ）に由来した（本明細書中、以下ＫＤＲ１１２１−ＳｃＦｖと呼ぶ）。ＫＤＲ−１１２１  ＶＬ及びＶＨのアミノ酸配列は、刊行された報告に由来した（Ｄ．Ｌｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：４３４９６（２００３））。２１８ｂｐリンカーによって連結されたＶＬ配列及びＶＨ配列を含むコドン最適化ＫＤＲ  ＳｃＦｖを設計し、ｗｅｂベースのＤＮＡコドン最適化アルゴリズム（Ｇａｏ，Ｗ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０，４４３−４４８（２００４））を使用し、ソフトウェアによって生成されたプライマー（配列番号２９〜７２）を使用して合成した。合成されたＫＤＲ１１２１  ＳｃＦｖ  ＤＮＡ断片を配列確認し、以前に記載されたヒトＣＤ２８及びＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達部分（Ｊ．Ｍａｈｅｒら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：７０（２００２））に連結されたヒトＣＤ２８ヒンジ及び膜貫通配列を含むＭＳＧＶベースのベクター中にインフレームでサブクローニングして、ＭＳＧＶ−ＫＤＲ１１２１ＣＤ２８Ｚベクターを得た。
【０１０９】
ＭＳＧＶ−ＫＤＲ１１２１ＣＤ２８ＢＢＺベクターを得るために、ＫＤＲ１１２１  ＳｃＦｖを、標準的な分子生物学的技術を使用して、ヒトＣＤ２８、４−１ＢＢ及びＣＤ３ζ分子の細胞質シグナル伝達ドメインに連結されたヒトＣＤ８α鎖のヒンジ及び膜貫通配列を含む類似のＭＳＧＶベクター（Ｚｈａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９近刊）中にインフレームでクローニングした。本書に記載した全てのベクターの配列の完全性は、ＤＮＡシークエンシングで確認した。
【０１１０】
この実施例は、ＫＤＲ−１１２１  ＳｃＦｖセグメント、ヒトＣＤ８αヒンジ及び膜貫通セグメント、並びに細胞内ヒトＴ細胞シグナル伝達ＣＤ２８、４−１ＢＢ及びＣＤ３ζセグメントを含むＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を作製する方法を実証した。この実施例は、ＫＤＲ−１１２１  ＳｃＦｖセグメント、ヒトＣＤ８αヒンジ及び膜貫通セグメント、並びに細胞内ヒトＴ細胞シグナル伝達ＣＤ２８及びＣＤ３ζセグメントを含むＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を作製する方法も実証した。
【０１１１】
実施例３
この実施例は、ＤＣ１０１抗体の抗原結合ドメイン、細胞外ヒンジドメイン、Ｔ細胞受容体膜貫通ドメイン及び細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードする組換え発現ベクターを含むウイルスを作製する方法を実証する。
【０１１２】
ＰＧ１３細胞に、９ｍｇのプラスミドＤＮＡ（実施例１に記載したように調製したＭＳＧＶ−ＤＣ１０１ＣＤ８２８ＢＢＺ又はＭＳＧＶ−ＤＣ１０１ＣＤ８２８Ｚ）を、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００トランスフェクション試薬（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）を使用してトランスフェクトした。これらのトランスフェクト細胞からの上清を、２４時間後に回収し、０．４５mｍ孔サイズのマイクロフィルタ（ＭｉＵｅｘ−Ｈａ；ＭｉＵｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）で濾過し、８mｇ／ｍｌ硫酸プロタミン（Ｓｉｇｍａ）の存在下でＰｈｏｅｎｉｘＴＭ  Ｅｃｏ細胞の形質導入に使用した。形質導入を次の日に繰り返した。１６時間後、ＭＳＧＶ−ＤＣ１０１ＣＤ８２８ＢＢＺ又はＭＳＧＶ−ＤＣ１０１ＣＤ８２８Ｚ  ＣＡＲを形質導入したＰｈｏｅｎｉｘＴＭ  Ｅｃｏ細胞を回収し、限界希釈クローニングに供した。クローンを増殖させ、高力価のクローンを、以前に記載されたようなドットブロット力価決定法（Ｍ．Ｏｎｏｄｅｒａら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：１１８９（１９９７））によって選択した。６つの最も高い力価のクローンからレトロウイルス上清を作製した。簡潔に述べると、１０ｃｍ２の組織培養プレート（Ｎｕｎｃ（登録商標），Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ（登録商標），ＶｅｒｎｏｎＨｉｌｌｓ，ＩＬ）に、１０ｍｌのＤ１０中５ｘ１０６細胞を播種した。次の日に培地交換（１０ｍｌ）を行った。各クローンから２４時間後に上清を回収し、以下の実施例５に記載するようにマウスＴ細胞を形質導入し、以下の実施例６に記載されるように、形質導入されたＴ細胞の表面上のＣＡＲ発現を測定することによって評価した。高頻度でマウスＴ細胞を形質導入しかつ高レベルでＣＡＲを発現する能力を有する２つのコンストラクトのそれぞれについて、ＰｈｏｅｎｉｘＴＭ  Ｅｃｏプロデューサークローンを、続く実験でマウスＴ細胞を形質導入するためのレトロウイルス上清の産生のために選択した。
【０１１３】
この実施例は、ＤＣ１０１  ＳｃＦｖセグメント、マウスＣＤ８αヒンジ及び膜貫通セグメント、並びに細胞内マウスＴ細胞シグナル伝達ＣＤ２８、４−１ＢＢ及びＣＤ３ζセグメントを含むＣＡＲをコードする組換え発現ベクターを含むウイルスを作製する方法を実証した。この実施例は、ＤＣ１０１  ＳｃＦｖセグメント、マウスＣＤ８αヒンジ及び膜貫通セグメント、並びに細胞内マウスＴ細胞シグナル伝達ＣＤ２８及びＣＤ３ζセグメントを含むＣＡＲをコードする組換え発現ベクターを含むウイルスを作製する方法も実証した。
【０１１４】
実施例４
この実施例は、ＫＤＲ−１１２１抗体の抗原結合ドメイン、細胞外ヒンジドメイン、Ｔ細胞受容体膜貫通ドメイン及び細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードする組換え発現ベクターを含むウイルスを作製する方法を実証する。
【０１１５】
ヒトＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ）に特異的なＣＡＲを発現する組換えレトロウイルスベクターのセットを構築した。ＫＤＲ１１２１−ｈＣＤ８２８ＢＢＺと称するＫＤＲ  ＣＡＲベクターは、完全にヒトの抗体ＫＤＲ１１２１（Ｄ．Ｌｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：４３４９６（２００３））（これは、ヒトＫＤＲ抗原に対して特異的である）由来のＳｃＦｖを含んだ。ＫＤＲ１１２１  ＳｃＦｖを、ヒトＣＤ８α由来のヒンジ及び膜貫通配列に連結し、次いでこれを、ＴＣＲのヒトＣＤ２８、４−１ＢＢ及びＣＤ３ζドメイン由来の細胞内配列に融合させた。
【０１１６】
ＫＤＲ１１２１−ｈＣＤ２８Ｚと称する第二のベクターは、ヒトＣＤ２８分子のヒンジ及び膜貫通配列並びに細胞内シグナル伝達ドメインに連結され、次いでＴＣＲのＣＤ３ζドメインの細胞質配列に連結されたＫＤＲ１１２１  ＳｃＦｖを含んだ。
【０１１７】
ＭＳＧＶ−ＫＤＲ１１２１−ＣＤ８２８ＢＢＺ及びＭＳＧＶ−ＫＤＲ１１２１−ＣＤ８２８Ｚレトロウイルスベクターを産生する安定なＰＧ１３プロデューサー細胞クローンを、以下の変更を伴い、実質的には実施例３に記載したとおりに作製した。ＰｈｏｅｎｉｘＴＭ  Ｅｃｏ細胞に、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００トランスフェクション試薬（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）を使用して、９ｍｇのプラスミドＤＮＡ（ＭＳＧＶ−ＫＤＲ１１２１−ＣＤ８２８ＢＢＺ又はＭＳＧＶ−ＫＤＲ１１２１−ＣＤ８２８Ｚ）をトランスフェクトした。これらのトランスフェクト細胞から上清を２４時間後に回収し、ＰＧ１３細胞の形質導入に使用した。形質導入を次の日に繰り返した。１６時間後、形質導入したＰＧ１３細胞を限界希釈クローニングに供した。２つのコンストラクトのそれぞれについて６つの高力価ウイルス産生ＰＧ１３クローンを、ドットブロット力価決定法によって同定した（Ｍ．Ｏｎｏｄｅｒａら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：１１８９（１９９７））。これらのクローンのそれぞれから実施例３に記載したように上清を取得し、以下の実施例５に記載されるようにヒトＴ細胞を形質導入し、以下の実施例１５に記載されるように形質導入されたＴ細胞の表面上のＣＡＲ発現を測定することによって評価した。高頻度でマウスＴ細胞を形質導入しかつ高レベルでＫＤＲ  ＣＡＲを発現する能力を有するコンストラクトのそれぞれについて、ＰＧ１３プロデューサークローンを、続く実験でヒトＴ細胞を形質導入するためのレトロウイルス上清の産生のために選択した。
【０１１８】
この実施例は、ＫＤＲ−１１２１  ＳｃＦｖセグメント、ヒトＣＤ８αヒンジ及び膜貫通セグメント、並びに細胞内ヒトＴ細胞シグナル伝達ＣＤ２８、４−１ＢＢ及びＣＤ３ζセグメントを含むＣＡＲをコードする組換え発現ベクターを含むウイルスを作製する方法を実証した。この実施例は、ＫＤＲ−１１２１  ＳｃＦｖセグメント、ヒトＣＤ８αヒンジ及び膜貫通セグメント、並びに細胞内ヒトＴ細胞シグナル伝達ＣＤ２８及びＣＤ３ζセグメントを含むＣＡＲをコードする組換え発現ベクターを含むウイルスを作製する方法も実証した。
【０１１９】
比較例１
この例は、ＤＣ１０１抗体の抗原結合ドメイン、細胞外ヒンジドメイン及びＴ細胞受容体膜貫通ドメインをコードするが細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインを欠く組換え発現ベクターを含むウイルスを作製する方法を実証する。この例は、ＳＰ６抗体の抗原結合ドメイン、細胞外ヒンジドメイン、Ｔ細胞受容体膜貫通ドメイン及び細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードする組換え発現ベクターを含むウイルスを作製する方法も実証する。
【０１２０】
ＭＳＧＶ−ＤＣ１０１−ＣＤ８（ＤＣ１０１−ＣＤ８とも呼ぶ）を作製するために、ＤＣ１０１−ＣＤ８ヌクレオチド配列を、プライマーセットＨｅａｖｙ  Ｆ（配列番号２２）及びリバースプライマー（配列番号２６）（これらは、ＴＡＡ終止コドンとその後のＳａｌＩ制限部位を含む）を使用するＰＣＲ反応によってＭＳＧＶ−ＤＣ１０１−ＣＤ８２８Ｚプラスミドから増幅した。ＰＣＲ産物をＸｈｏＩ及びＳａｌＩで消化し、同様に消化したＭＳＧＶ−ＤＣ１０１−ＣＤ８２８Ｚプラスミド中にライゲーションして、ＤＣ１０１−ＣＤ８２８Ｚ断片を置換した。ＤＣ１０１−ＣＤ８コンストラクトは、細胞内Ｔ細胞シグナル伝達配列を欠き、ＤＣ１０１  ＳｃＦｖ、マウスＣＤ８αヒンジ及びマウスＣＤ８αＴＭ配列のみを含む。
【０１２１】
ＭＳＧＶ−ＳＰ６−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲ（ＳＰ６−ＣＤ８２８ＢＢＺ又はＳＰ６  ＣＡＲと称する）を以下のように作製した。ＳＰ６  ＳｃＦｖ断片を、プライマー：ＳＰ６フォワード（配列番号２７）（ＸｈｏＩ部位を含む）及びＳＰ６リバース（配列番号２８）（ＮｏｔＩ部位を含む）を使用して、ＳＰ６−ＳｃＦｖをコードするプラスミド（Ｇ．Ｇｒｏｓｓ，Ｔ．Ｗａｋｓ，Ｚ．Ｅｓｈｈａｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ８６：１００２４（１９８９））からＰＣＲにより増幅した。ＳＰ６  ＳｃＦｖをコードするプラスミドは、Ｚ．Ｅｓｈｈａｒ教授（Ｔｈｅ  Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｓｒａｅｌ）のご厚意により提供された。次いで、ＰＣＲ産物をＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ酵素で消化し、同様に消化したＭＳＧＶ−ＤＣ１０１ＣＤ８２８ＢＢＺプラスミド中にクローニングして、ＤＣ１０１  ＳｃＦｖを置換した。ＳＰ６  ＳｃＦｖは、ハプテン２，４，６−トリニトロフェニル（ＴＮＰ）を認識する。ＳＰ６−ＣＤ８２８ＢＢＺ（ＳＰ６  ＣＡＲ）コンストラクトは、ＳＰ６  ＳｃＦｖ並びにマウスＣＤ８αヒンジ及び膜貫通セグメント、並びに細胞内マウスＴ細胞シグナル伝達ＣＤ２８、４−１ＢＢ及びＣＤ３ζセグメントを含む。
【０１２２】
ＤＣ１０１−ＣＤ８及びＳＰ６−２８Ｚ  ＣＡＲをコードするレトロウイルスを、一過的に産生させた。簡潔に述べると、２９３ＧＰ細胞を、ポリ−Ｄ−リジン被覆ディッシュ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）に、１０ｍｌのＤ１０中５ｘ１０６細胞の密度でプレートした。次の日、培養培地を、抗生物質なしの１０ｍｌのＤ１０で置換し、細胞に、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ  Ｃｏｒｐ．）を使用して、ＲＤ１１４エンベロープタンパク質をコードするプラスミド（Ｃ．Ｄ．Ｐｏｒｔｅｒら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：９１３（１９９６））と共に、ＭＳＧＶ−ＤＣ１０１−ＣＤ８又はＭＳＧＶ−ＳＰ６−ＣＤ８２８ＢＢＺプラスミドのいずれかをトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を３７℃でインキュベートし、６〜８時間後、培養培地をＤ１０で置換した。細胞を、さらに３６〜４８時間３７℃でインキュベートした。レトロウイルスを含む上清をディッシュから回収し、遠心分離して細胞デブリを除去し、マウスＴ細胞を形質導入するために使用した。
【０１２３】
この例は、ＤＣ１０１  ＳｃＦｖセグメント並びにヒトＣＤ８αヒンジ及び膜貫通セグメントをコードするが細胞内ヒトＴ細胞シグナル伝達ＣＤ２８、４−１ＢＢ及びＣＤ３ζセグメントを欠く組換え発現ベクターを含むウイルスを作製する方法を実証した。この例は、ＳＰ６  ＳｃＦｖセグメント、ヒトＣＤ８αヒンジ及び膜貫通セグメント、並びに細胞内ヒトＴ細胞シグナル伝達ＣＤ２８、４−１ＢＢ及びＣＤ３ζセグメントを含むＣＡＲをコードする組換え発現ベクターを含むウイルスを作製する方法も実証した。
【０１２４】
実施例５
この実施例は、ＤＣ１０１抗体又はＫＤＲ−１１２１抗体の抗原結合ドメイン、細胞外ヒンジドメイン、Ｔ細胞受容体膜貫通ドメイン及び細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードする組換え発現ベクターを含む宿主細胞を作製する方法を実証する。
【０１２５】
脾臓を回収し、４０μｍナイロンフィルターを通して破砕した。赤血球溶解後、ＣＤ３＋脾細胞を、マウスＴ細胞ネガティブ単離キット（Ｄｙｎａｌ（登録商標），ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）を使用して精製し、２μｇ／ｍｌ  ＣｏｎＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標），Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及び１ｎｇ／ｍｌ組換えマウス（ｒｍ）ＩＬ−７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標），Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）の存在下ＣＭ−Ｍ中で培養した。２４時間後、細胞を回収し、１２００ｒｐｍで５分間室温で遠心分離し、新たなＣＭ−Ｍ中に１ｘ１０６細胞／ｍｌで再縣濁した。凍結保存ヒトＰＢＬをＣＭ−Ｈ中３７℃で解凍し、洗浄し、５０ｎｇ／ｍｌマウス抗ヒトＣＤ３抗体（Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ  ＯＫＴ（登録商標）３，Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｈｏｒｓｈａｍ，ＰＡ）を補充したＣＭ−Ｈ中１ｘ１０６／ｍｌの濃度で再縣濁した。２日間の培養後、細胞を回収し、ＯＫＴ３なしの新たなＴ細胞培養培地中に１ｘ１０６細胞／ｍｌで再縣濁した。
【０１２６】
マウス及びヒトのリンパ球を、以前に記載されたように（Ｈ．Ｈａｎｅｎｂｅｒｇら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：８７６（１９９６））レトロウイルスベクターで予め被覆した培養ディッシュ上で、同様の形質導入プロトコルを用いて実施例３又は実施例４に記載したように産生されたレトロウイルスを使用して形質導入した。培養プレートをベクターで被覆するために、組織培養物処理なしの６ウェルプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、２５μｇ／ｍｌ組換えフィブロネクチン断片（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）；Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ．Ｉｎｃ，Ｊａｐａｎ）でまず処理した。次いで、４〜５ｍｌのレトロウイルスベクター上清をこれらのプレートに添加し、プレートを３２℃で２０００ｇで２時間スピンした。次いで、上清を除去し、刺激したマウスＴ細胞又はヒトリンパ球を各ウェルに１ｘ１０６細胞／ｍｌ（２〜３ｍｌ／ウェル）で添加し、プレートを室温で１５００ｒｐｍで１０分間スピンした。次いで、細胞を３７℃で一晩インキュベートし、この手順を次の日に繰り返し（合計２回の形質導入）、その後、細胞を５％ＣＯ２インキュベータ中３７℃で増殖させ、必要に応じて分割して、０．５ｘ１０６細胞／ｍｌと２ｘ１０６細胞／ｍｌとの間の細胞密度を維持した。形質導入の４日後又は５日後、リンパ球を、導入遺伝子産物の存在についてフローサイトメトリーでアッセイし、活性について抗原特異的増殖及びサイトカイン放出アッセイでアッセイした。
【０１２７】
この実施例は、ＫＤＲ−１１２１又はＤＣ１０１のＳｃＦｖセグメント、ＣＤ８αヒンジ及び膜貫通セグメント、並びに細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ＣＤ２８、４−１ＢＢ及びＣＤ３ζセグメントを含むＣＡＲをコードする組換え発現ベクターを含む宿主細胞を作製する方法を実証した。この実施例は、ＫＤＲ−１１２１又はＤＣ１０１のＳｃＦｖセグメント、ＣＤ８αヒンジ及び膜貫通セグメント、並びに細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ＣＤ２８及びＣＤ３ζセグメントを含むＣＡＲをコードする組換え発現ベクターを含むウイルスを作製する方法も実証した。
【０１２８】
実施例６
この実施例は、実施例１の核酸で形質導入した宿主細胞が、ＤＣ１０１  ＳｃＦｖセグメント、ヒンジ及び膜貫通セグメント、並びに細胞内Ｔ細胞シグナル伝達セグメントを含むＣＡＲを発現したことを実証する。
【０１２９】
マウスＴ細胞を、実施例５に記載したように、レトロウイルスベクターＤＣ１０１−ＣＤ８２８Ｚ又はＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲを用いてレトロウイルスにより形質導入したか、或いは、比較例１に記載したようにＤＣ１０１−ＣＤ８又はＳＰ６−ＣＤ８２８ＢＢＺベクターで形質導入したか、又は空のＭＳＧＶベクター（ＣＡＲ配列をいずれも欠く）で形質導入した。形質導入されたＣＤ３＋初代マウスＴ細胞上のレトロウイルスによりコードされる導入遺伝子産物の表面発現を、可溶性マウスＶＥＧＦＲ−２−ヒトＩｇＧ−ＦＣ融合タンパク質及びＰＥコンジュゲート化抗ヒトＩｇＧ−ＦＣを使用してフローサイトメトリーにより決定した。
【０１３０】
形質導入の４日後に、細胞を、抗マウスＣＤ８抗体及びＣＡＲ特異的試薬で共染色し、ＦＡＣＳ分析して、ＣＤ８＋及びＣＤ８−Ｔ細胞サブセット中の導入遺伝子産物の発現を決定した。形質導入の４日後の、レトロウイルスにより形質導入されたマウスＴ細胞上のＤＣ１０１  ＣＡＲの検出は、可溶性マウス（ｍ）ＶＥＧＦＲ２−ｈＩｇＧ．ＦＣ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標），Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＤ）による間接的免疫蛍光法と、その後のフィコエリトリン（ＰＥ）標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＦＣ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＴＭ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）での染色とによって達成した。簡潔に述べると、５ｘ１０５細胞を、２μｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））又は種特異的可溶性ｍＶＥＧＦＲ２−ｈＩｇＧ．ＦＣタンパク質と共に、４℃で４５分間インキュベートした。次いで、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（リン酸緩衝化生理食塩水、１％ＦＢＳ含有）で洗浄し、ＰＥコンジュゲート化抗ヒトＩｇＧ−ＦＣ（αｈＩｇＧ．ＦＣ）で染色した。この工程で、マウスＴ細胞を、製造業者が推奨する適切な濃度でペリジニンクロロフィル（ＰｅｒＣＰ）標識した抗マウスＣＤ８（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で４℃で２０〜３０分間共染色し、次いでＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄し再縣濁した。２μｇウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と共にインキュベートし、次いでＰＥコンジュゲート化抗ヒトＩｇＧ−ＦＣ（αｈＩｇＧ−ＦＣ）及びＰｅｒＣＰ標識抗マウスＣＤ８で染色した細胞は、コントロールとして機能した。
【０１３１】
ＳＰ６  ＣＡＲの発現を決定するために、形質導入したマウスＴ細胞をＦＡＣｓ緩衝液中で洗浄し再縣濁した。５ｘ１０５細胞のアリコートを、ビオチン標識ポリクローナルヤギ抗マウスＦ（ａｂ）２抗体（抗Ｆａｂ，Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）又はビオチン標識正常ポリクローナルヤギＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）と共に４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、再縣濁して、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｏｃｙａｎａｔｅ）（ＦＩＴＣ）標識ストレプトアビジン（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及びＡＰＣ標識抗マウスＣＤ８（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で４℃で２５分間共染色し、次いでＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中に再縣濁した。ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞は共に、同様のＣＡＲ発現プロフィールを示した。
【０１３２】
結果を表３及び表４Ａ〜４Ｂに示す。
【０１３３】
【表３】
0005934099.tif 000004
【０１３４】
表３において、形質導入されたマウスＴ細胞中の形質導入効率及びＣＡＲ発現レベルは、パーセント導入遺伝子ポジティブ細胞（％形質導入）及び発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によってそれぞれ示される。データは、５つの異なる実験由来の平均±ＳＥＭで示される。表３に示すように、ＤＣ１０１  ＣＡＲ発現ベクターは、ＣｏｎＡ／ＩＬ−７活性化マウスＴ細胞を、効率的にかつ一貫して形質導入し（約７９〜約８６％の範囲）、この細胞は、形質導入の５日後にほぼ（約９０％）ＣＤ８＋であった。
【０１３５】
【表４−１】
0005934099.tif 000005
【０１３６】
【表４−２】
0005934099.tif 000006
【０１３７】
表４Ａに示されるように、４−１ＢＢシグナル伝達部分を含むＤＣ１０１  ＣＡＲ由来のＣＡＲ発現の強度は、全ての形質導入実験（ｎ＝５）において、４−１ＢＢ配列を欠くベクター由来の発現強度よりも一貫して低かった。
【０１３８】
この実施例は、ＤＣ１０１  ＳｃＦｖセグメント、細胞外ヒンジ及び膜貫通セグメント、並びに細胞内Ｔ細胞シグナル伝達セグメントを含むＣＡＲを発現する実施例１の核酸で宿主細胞を形質導入する際の形質導入効率を実証した。
【０１３９】
実施例７
この実施例は、ＤＣ１０１−ＣＤ８２８Ｚ及びＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲで改変されたＴ細胞が、増殖によって測定されるｉｎ  ｖｉｔｒｏの抗原特異的応答を生じるのに有効であることを実証する。
【０１４０】
固定化されたＶＥＧＦＲ−２タンパク質に応答して増殖するＤＣ１０１−ＣＡＲ操作されたＴ細胞の能力を測定した。未処理のマイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中に希釈した５μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））、５μｇ／ｍｌ可溶性マウスＶＥＧＦＲ２−ｈＩｇＧ．ＦＣ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標））、５μｇ／ｍｌ可溶性マウスＶＥＧＦＲ２−ｈＩｇＧ．ＦＣ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標））、２μｇ／ｍｌの精製抗マウスＣＤ３抗体（クローン１４５−２Ｃ１１，ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、又は２μｇ／ｍｌ精製マウス抗ヒトＣＤ３抗体（Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ  ＯＫＴ（登録商標）３）を用いて、３７℃で３時間個々に被覆した。マウスＴ細胞を、実施例５に記載したように、以下のレトロウイルスベクターで形質導入した：ＳＰ６−ＣＤ８２８ＢＢＺ、ＤＣ１０１−ＣＤ８、ＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ、ＤＣ１０１−ＣＤ８２８Ｚ又は空ベクター。
【０１４１】
形質導入の４日後、細胞を洗浄し、そのそれぞれのＣＭ中に再縣濁し、抗原被覆したマイクロタイタープレート上２００μｌＣＭ中にウェル当たり１０５細胞でプレートした。細胞を３日間培養し、１μＣｉ（０．０３７ＭＢｑ）［メチル−３Ｈ］チミジン／ウェル（（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（登録商標）Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で、培養の最後の１８時間にわたりパルスした。細胞をＴｏｍｔｅｃ（登録商標）細胞ハーベスター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（登録商標），Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）で回収し、Ｗａｌｌａｃ  ＭｉｃｒｏＢｅｔａ（登録商標）液体シンチレーションカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（登録商標），Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で分析して、取り込まれた放射性チミジンの量を決定した。このアッセイを３連のウェルで実施した。結果を図１に示す（値は平均±ＳＥＭで示す）。
【０１４２】
図１に示されるように、種々のベクターで形質導入されたＴ細胞間では、固定化された抗マウスＣＤ３抗体に対する応答に差異はなかったが、インタクトな細胞内シグナル伝達配列を含むＤＣ１０１−ＣＡＲ（ＤＣ１０１−ＣＤ８２８Ｚ及びＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ）で操作されたＴ細胞だけが、増殖によって測定されるように、プレート結合標的ＶＥＧＦＲ−２タンパク質に特異的に応答した。さらに、ＤＣ１０１−ＣＡＲで形質導入された細胞は、４−１ＢＢシグナル伝達配列あり又はなしの両方で、プレート結合標的ＶＥＧＦＲ−２に応答して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖した。
【０１４３】
この実施例は、ＤＣ１０１−ＣＤ８２８Ｚ及びＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲ改変されたＴ細胞が、ＶＥＧＦＲ−２タンパク質による刺激に応答してｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖することを実証した。
【０１４４】
実施例８
この実施例は、ＤＣ１０１−ＣＤ８２８Ｚ及びＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲ改変されたＴ細胞が、ＩＦＮ−γ分泌によって測定される抗原特異的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ応答を生じるのに有効であることを実証する。
【０１４５】
形質導入されたマウス細胞を、ＩＦＮ−γ放出アッセイにおいて、プレート結合ＶＥＧＦＲ−２タンパク質に対する特異的反応性について試験した。ヒトＰＢＬを、実施例５に記載したように、以下のレトロウイルスベクターで形質導入した：ＳＰ６−ＣＤ８２８ＢＢＺ、ＤＣ１０１−ＣＤ８、ＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ、ＤＣ１０１−ＣＤ８２８Ｚ又は空ベクター。形質導入された細胞を、実施例７に記載されたように、２００μｌＣＭ中で、抗原被覆したマイクロタイタープレート上で培養した。細胞培養物上清を、１日後又は２日後に回収し、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して、ＩＦＮ−γについて酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）で分析した。アッセイは三連のウェルで実施した。結果を図２に示す（値は平均±ＳＥＭで示す）。
【０１４６】
図２に示されるように、種々のベクターで形質導入されたＴ細胞間では、固定化された抗マウスＣＤ３抗体に対する応答に差異はなかったが、インタクトな細胞内シグナル伝達配列を含むＤＣ１０１−ＣＡＲ（ＤＣ１０１−ＣＤ８２８Ｚ及びＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ）で操作されたＴ細胞だけが、ＩＦＮ−γ分泌によって測定されるように、プレート結合標的ＶＥＧＦＲ−２タンパク質に特異的に応答した。さらに、ＤＣ１０１−ＣＡＲは、４−１ＢＢシグナル伝達配列あり又はなしの両方で、プレート結合標的ＶＥＧＦＲ−２に応答してＩＦＮ−γを分泌した。
【０１４７】
この実施例は、ＤＣ１０１−ＣＤ８２８Ｚ及びＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲ改変されたＴ細胞が、ＶＥＧＦＲ−２タンパク質による刺激に応答してｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＦＮ−γを分泌することを実証した。
【０１４８】
実施例９
【０１４９】
この実施例は、ＤＣ１０１−ＣＤ８２８Ｚ及びＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲ改変されたＴ細胞が、ＶＥＧＦＲ−２を発現するマウス細胞株をｉｎ  ｖｉｔｒｏで特異的に認識することを実証する。
【０１５０】
マウス内皮細胞株及び種々の組織起源の腫瘍株を、フローサイトメトリーによってＶＥＧＦＲ−２の細胞表面発現について試験した。簡潔に述べると、細胞を回収し（接着細胞を、細胞スクレイパー（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を使用して回収した）、ＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中に再縣濁した。５ｘ１０５細胞のアリコートを、２μｇの組換えＤＣ１０１抗体と共に４℃で４５分間インキュベートした。次いで、細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で２回洗浄し、２μｇの可溶性ｍＶＥＧＦＲ２−ｈＩｇＧ．ＦＣタンパク質及びＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ．ＦＣ抗体と共に、４℃でそれぞれ３０分間連続してインキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。前記プロトコルの第一インキュベーション工程においてＤＣ１０１抗体の代わりにラットＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体を用いたこと以外同様に染色した細胞は、コントロールとして機能した。フローサイトメトリー取得を、ＦＡＣＳ  ＣａｌｉｂｕｒＴＭフローサイトメータ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて実施した。データを取得し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔＴＭソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｓｏｎ）を使用して分析した。前方小角度光散乱（ｆｏｒｗａｒｄ  ａｎｇｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒ）及びヨウ化プロピジウム染色の組み合わせを使用して、死細胞を除外した（ｇａｔｅ  ｏｕｔ）。種々の細胞型におけるＶＥＧＦＲ−２染色の特異性及び発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、アイソタイプコントロール抗体で染色したそれぞれの細胞型を使用して決定した。
【０１５１】
ＶＥＧＦＲ−２レベルは試験した細胞株間で異なっていた。形質転換された全てのマウス内皮細胞株（ＳＶＥＣ４−１０ＥＨＲ１、ｂＥＮＤ．３、ＳＶＲ及びＭＳ１）は、高レベルのＶＥＧＦＲ−２発現を示したが、細胞株のほとんどは、低レベル（ＭＣ３８、ＣＴ２６、４Ｔ１及びＭＣＡ２０５）、又は検出不能なレベル（ＭＣ１７−５１、Ｂ１６−Ｆ１０、ＲＥＮＣＡ、Ｃ４１９８、ＭＢ４９及びＮＩＨ−３Ｔ３）の細胞表面ＶＥＧＦＲ−２タンパク質のいずれかを示した。２つのＶＥＧＦＲ−２ネガティブ細胞株ＭＢ４９及びＮＩＨ−３Ｔ３に、ＶＥＧＦＲ−２を発現するレンチウイルスベクターを安定に形質導入し（ＭＢ４９−Ｆｌｋ１及び３Ｔ３−Ｆｌｋ１）、次のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔ細胞機能アッセイにおいてポジティブコントロールとして使用した。
【０１５２】
初代マウスＴ細胞を、形質導入しなかったか、又は実施例５に記載されたように以下のレトロウイルスベクターで形質導入した：ＳＰ６−ＣＤ８２８ＢＢＺ、ＤＣ１０１−ＣＤ８、ＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ、ＤＣ１０１−ＣＤ８２８Ｚ又は空ベクター。４日後、細胞を、単独で培養したか、又は２００μｌＣＭ中の以下のマウス細胞のうち１つと共に共培養した：ＳＶＥＣ４−１０ＥＨＲ１、ｂＥＮＤ−３、ＳＶＲ、ＭＳ１、ＭＣ３８、４Ｔ１、Ｐ８１５、ＭＣＡ２０５、ＭＣ１７−５１、ＥＬ−４、Ｃ１４９８、Ｂ１６−Ｆ１０、ＭＢ４９、ＮＩＨ−３Ｔ３、並びにＦＬＫ−１を発現するように形質導入した細胞株：ＭＢ４９−ＦＬＫ−１及び３Ｔ３−ＦＬＫ−１。ＩＦＮ−γ分泌を、実施例８に記載のようにアッセイした。結果を図３に示す（三連のウェルの平均値±ＳＥＭで示す）。
【０１５３】
図３に示されるように、ＩＦＮ−γ応答は、ＶＥＧＦＲ−２ポジティブ細胞株３Ｔ３−Ｆｌｋ１、ＭＢ４９−Ｆｌｋ１、ＳＶＥＣ４−１０ＥＨＲ１、ｂＥＮＤ−３、ＳＶＲ、ＭＳ１、４Ｔ１及びＭＣ３８に応答して特異的に検出された。ＩＦＮ−γ分泌の量は、標的細胞上に発現されたＶＥＧＦＲ−２のレベルと高度に相関した（ＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺについてＲ２＝０．９６５２；ＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＺについてＲ２＝０．９５８４）。反応性は、インタクトなＴ細胞シグナル伝達ドメインを含むＤＣ１０１−ＣＡＲを発現するＴ細胞に限定された。４−１ＢＢシグナル伝達配列あり又はなしで、ＤＣ１０１−ＣＡＲの性能に有意な差はなかった。
【０１５４】
さらに、標的抗原認識の特異性を、抗体遮断実験によって確認した。標的細胞（ｂＥｎｄ．３、ＭＢ４９又はＭＢ４９−ＦＬＫ−１）を、１０μｇ／ｍｌのラットＩｇＧ１、抗マウスＶＥＧＦＲ−１抗体又は抗マウスＶＥＧＦＲ−２抗体（ＤＣ１０１）のいずれかと共に、３７℃で１時間インキュベートし、次いで、モック形質導入したか或いは空ベクター又はＳＰ６−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲ若しくはＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺをコードするレトロウイルスベクターで形質導入した初代マウスＴ細胞と共に共培養した。上清を２４時間後に回収し、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮ−γを評価した。図１２に示されるように、抗ＶＥＧＦＲ−２抗体ＤＣ１０１は、ＶＥＧＦＲ−２＋内皮ｂＥＮＤ．３及びＭＢ４９−Ｆｌｋ−１腫瘍細胞株に対するＤＣ１０１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の認識を遮断したが、抗マウスＶＥＧＦＲ−１又はアイソタイプコントロール抗体のいずれでも、遮断は観察されなかった。
【０１５５】
この実施例は、ＤＣ１０１−ＣＤ８２８Ｚ及びＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲ改変されたＴ細胞が、ＶＥＧＦＲ−２発現細胞によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激に応答してｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＦＮ−γを分泌すること、及びＩＦＮ−γの分泌量が、標的細胞により発現されるＶＥＧＦＲ−２のレベルと高度に相関することを実証した。
【０１５６】
実施例１０
この実施例は、養子移入されたＤＣ１０１  ＣＡＲ発現Ｔ細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏで樹立された腫瘍の増殖を阻害できることを実証する。
【０１５７】
治療の効力を決定するために、ＤＣ１０１  ＣＡＲ形質導入した細胞を使用して、樹立された血管新生化した皮下（ｓ．ｃ．）腫瘍を保持するマウスを処置した。
【０１５８】
５０００００の腫瘍（Ｂ１６−Ｆ１０、ＭＣ３８、ＭＣＡ２０５、ＣＴ２６又はＲｅｎｃａ）細胞を、５匹のマウス（６〜７週齢）の群にｓ．ｃ．注射した。１０日目と１２日目との間に、腫瘍面積が約５０ｍｍ２の平均サイズに達した時点で、マウスに５Ｇｙ  ＴＢＩを致死未満で照射し、ＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲ又は空ベクターで形質導入した２０ｘ１０７の同系マウスＴ細胞を、ｒｈＩＬ−２と合わせて注射した。コントロール群は、ｒｈＩＬ−２単独を受けたか処置を受けなかった。
【０１５９】
腫瘍の開始量は４０〜８０ｍｍ２の範囲であった。特記しないかぎり、養子移入の当日に、腫瘍保持マウスの骨髄非破壊的な（５Ｇｙ）全身放射線照射（ＴＢＩ）によって、リンパ球減少症を誘導した。付随して、マウスを、特記しない限り３日間にわたり少なくとも６〜８時間の間隔で、１日２回、６用量のｒｈＩＬ−２（１００，０００ＣＵ／０．５ｍＬ／用量／マウス）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって、静脈内（ｉ．ｖ．）処置した。必要な場合、５匹のＢ１６−Ｆ１０腫瘍保持マウスに、単一用量の組換えＤＣ１０１抗体又はラットＩｇＧ１（両方とも、５００mｌＰＢＳ中８００mｇ／用量／マウス）をｉ．ｐ．注射した。全ての実験は二重盲検無作為化様式で実施し、独立して少なくとも２回、類似の結果を有した。各処置群は５匹のマウスを含んだ。一連の盲検腫瘍測定値を得、直交する直径の積を、±ＳＥＭでプロットした。腫瘍治療に関する統計を、各データポイントにおける腫瘍増殖曲線の線形の傾きに基づくＷｉｌｃｏｘｏｎ  Ｒａｎｋ  Ｓｕｍ  Ｔｅｓｔを使用して計算した。累積生存時間は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法によって計算し、ログランク検定によって分析した。０．０５未満のＰ値を、統計的に有意とみなした。
【０１６０】
結果を図４Ａ〜４Ｂ、５Ａ〜５Ｂ及び１４Ａ〜１４Ｆに示す。ＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲを発現するＴ細胞（黒三角）は、同系マウス中の免疫原性の低いいくつかの腫瘍（Ｂ１６−Ｆ１０（図４Ａ；Ｐ＝０．００９）、ＭＣ３８（図４Ｂ；Ｐ＝０．００９）、ＭＣＡ２０５（図１４Ａ、Ｐ＝０．０２５）、ＣＴ２６（図１４Ｃ、Ｐ＝０．００９）及びＲＥＮＣＡ（図１４Ｅ、Ｐ＝０．００８）腫瘍が含まれる）に対する顕著な増殖阻害効果を媒介できた。ＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲを発現するＴ細胞はまた、Ｂ１６−Ｆ１０（図５Ａ）、ＭＣ３８（図５Ｂ）、ＭＣＡ２０５（図１４Ｂ）、ＣＴ２６（図１４Ｄ）及びＲＥＮＣＡ（図１４Ｆ）腫瘍保持マウスの生存率を増加させた。未処置のマウス（黒丸）、空ベクターを形質導入したＴ細胞で処置したマウス（黒四角）、又はＩＬ−２単独で処置したマウス（黒菱形）において、抗腫瘍効果は見られなかった。
【０１６１】
この実施例は、養子移入されたＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏでＢ１６−Ｆ１０及びＭＣ３８腫瘍の増殖を阻害し、腫瘍保持マウスの生存を改善することを実証した。
【０１６２】
実施例１１
この実施例は、ＤＣ１０１  ＣＡＲを形質導入したＴ細胞の抗腫瘍効果が、細胞媒介性であることを実証する。
【０１６３】
樹立されたＢ１６−Ｆ１０腫瘍を保持するマウスを、５Ｇｙ  ＴＢＩで致死未満に照射し、実施例１０に記載したのと類似の処置を受けさせた：ＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲ（黒三角）又は空ベクター（黒四角）を形質導入した細胞（図６Ａ）。この実験で示される５匹のマウスのさらなる群に、ｒｈＩＬ−２と合わせて、単一用量の８００μｇ／マウス組換えＤＣ１０１抗体（白三角）又はラットＩｇＧ１コントロール抗体（白菱形）を受けさせた（図６Ａ）。コントロール群は、図６Ａに示すように、ｒｈＩＬ−２単独（黒菱形）を受けたか、未処置のままにした（黒丸）。
【０１６４】
図６Ａに示されるように、ＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲを発現するＴ細胞（黒三角）は、腫瘍増殖を阻害できた。しかし、他の処置群（組換えＤＣ１０１抗体での処置を含む）は、樹立されたＢ１６腫瘍の増殖の制御に対し影響を有さなかった。
【０１６５】
Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍保持マウスを、ＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺを形質導入した同系Ｔ細胞２ｘ１０７、１ｘ１０７、５ｘ１０６若しくは２ｘ１０６＋ｒｈＩＬ−２で処置し、未処置にし、ｒｈＩＬ−２単独で処置し、又は空ベクターを形質導入したＴ細胞２ｘ１０７＋ｒｈＩＬ−２で処置した。Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫に対するＤＣ１０１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の治療効果は、投与した細胞数の一次関数であった（図１５）。腫瘍増殖の遅延は、２ｘ１０６の低さのＤＣ１０１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞で達成された（Ｐ＝０．００８）。
【０１６６】
２ｘ１０７のＤＣ１０１−ＣＡＲ改変Ｔ細胞の単一用量による腫瘍治療研究のほとんどにおいて、２〜３週間にわたって腫瘍増殖の迅速な阻害が存在し、この寛解期間の間に、親腫瘍は壊死して繊維状になったが、生存腫瘍の小さい小結節が、親腫瘍の周辺で再出現し、多くのマウスにおいて最終的に再生した。
【０１６７】
しかし、有効な腫瘍治療及び腫瘍なし生存が、ＤＣ１０１−ＣＡＲを形質導入したＴ細胞５ｘ１０６及びｒｈＩＬ−２による３回連続の毎週用量で処置した、樹立されたＢ１６−Ｆ１０又はＭＣＡ２０５腫瘍を保持するマウスで達成された（図１６Ａ〜１６Ｄ）。樹立された皮下Ｂ１６又はＭＣＡ２０５腫瘍を保持するマウスに、５Ｇｙ  ＴＢＩを致死未満で照射し、ｒｈＩＬ−２と共に、ＤＣ１０１−ＣＤ２８ＢＢＺ又は空ベクターで形質導入した同系マウスＴ細胞２ｘ１０７の単一用量を注射した。いくつかの群には、７〜１０日間間隔で、ＤＣ１０１−ＣＡＲ又は空ベクターを形質導入したＴ細胞５ｘ１０６の３連続用量を受けさせ、細胞移入と付随して、ｒｈＩＬ−２の１日２回用量を３日間受けさせた。処置なしの群は、Ｔ細胞もｒｈＩＬ−２も受けなかった。腫瘍面積に関する結果を図１６Ａ（Ｂ１６−Ｆ１０）及び図１６Ｂ（ＭＣＡ２０５）に示し、生存に関する結果を図１６Ｃ（Ｂ１６−Ｆ１０）及び図１６Ｄ（ＭＣＡ２０５）に示す。
【０１６８】
この実施例は、ＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞の養子移入は腫瘍増殖を阻害できたが、組換え抗体による処置が腫瘍増殖を阻害できなかったことを実証した。
【０１６９】
実施例１２
この実施例は、細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを欠くＤＣ１０１コンストラクトで形質導入したＴ細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍治療効果を誘導できないことを実証する。
【０１７０】
実施例１０に記載したように、樹立された皮下Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍を保持するマウスを、５Ｇｙ  ＴＢＩで致死未満で照射し、以下で形質導入した同系マウスＴ細胞２０ｘ１０６で処置した：ＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲベクター、ＳＰ６−ＣＤ８Ｓ８ＢＢＺ  ＣＡＲベクター、ＤＣ１０１−ＣＤ８ベクター（これはＴ細胞シグナル伝達ドメインを欠く）又は空ベクター。Ｔ細胞で処置した全てのマウス群は、実施例１０に記載されるようにｒｈＩＬ−２投与を受けた。コントロール群の動物は、Ｔ細胞でもｒｈＩＬ−２でも処置しなかった。
【０１７１】
図６Ｂに示されるように、ＤＣ１０１  ＳｃＦｖを発現するが細胞内Ｔ細胞シグナル伝達分子を欠くＴ細胞（白三角）は、樹立されたＢ１６腫瘍の増殖制御に対し影響を有さなかった。さらに、未処置マウス（黒丸）及び無関係のＣＡＲ（ＳＰ６ＣＡＲ）（白菱形）又は空ベクター（黒四角）で操作されたＴ細胞で処置したマウスは、腫瘍阻害を誘導できなかった（図６Ｂ）。しかし、ＤＣ１０１  ＣＡＲ発現Ｔ細胞（黒三角）は、腫瘍増殖を阻害できた。
【０１７２】
この実施例は、ＤＣ１０１  ＣＡＲ発現Ｔ細胞の養子移入は腫瘍増殖を阻害できたが、ＤＣ１０１を発現するが細胞内Ｔ細胞シグナル伝達分子を欠くＴ細胞及び無関係のＣＡＲを発現するＴ細胞での処置は、それぞれ腫瘍増殖を阻害できなかったことを実証した。
【０１７３】
実施例１３
この実施例は、ＤＣ１０１  ＣＡＲを形質導入した細胞が、４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインあり及びなしの両方で、ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍増殖を阻害したことを実証する。
【０１７４】
図７に示されるように、実施例１０に記載するように、樹立された皮下Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍を保持する５匹のマウスの群を、５Ｇｙ  ＴＢＩで致死未満で照射し、４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインを含む（ＤＣ１０１−ｍＣＤ８２８ＢＢＺ、菱形）若しくは４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインなし（ＤＣ１０１−ＣＤ８２８Ｚ；三角）のＤＣ１０１  ＣＡＲ又は空ベクター（四角）を形質導入した同系Ｔ細胞２０ｘ１０６をｉ．ｖ．注射した。コントロール群はＴ細胞治療を受けなかった（丸）（図７）。黒塗りの記号で示される全てのＴ細胞処置群は、外因性ｒｈＩＬ−２投与を受け、白抜きの記号で示されるＴ細胞処置群は、ｒｈＩＬ−２を受けなかった（図７）。全てのｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍処置研究において、マウスを無作為化し、腫瘍サイズを盲検様式で測定した。腫瘍の直交する直径の積を平均±ＳＥＭで示す。実験は少なくとも２回独立して実施し、類似の結果であった。
【０１７５】
図７に示されるように、４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達配列を含むＤＣ１０１  ＣＡＲベクター（ＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ）及び４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達配列を欠くＤＣ１０１  ＣＡＲベクター（ＤＣ１０１−ＣＤ２８Ｚ）を形質導入したＴ細胞は、同様に良好な性能を示し、樹立された嵩高い腫瘍の増殖遅延において、統計的に区別不能であった（Ｐ＝０．１）。
【０１７６】
この実施例は、ＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺを発現するＴ細胞及びＤＣ１０１−ＣＤ２８Ｚを発現するＴ細胞の養子移入が、それぞれｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍増殖を阻害できたことを実証した。
【０１７７】
実施例１４
この実施例は、４−１ＢＢシグナル伝達セグメントがＤＣ１０１  ＣＡＲ改変Ｔ細胞の持続をｉｎ  ｖｉｖｏで増強することを実証する。
【０１７８】
実施例１０に記載したようにＤＣ１０１  ＣＡＲ（ＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ又はＤＣ１０１−ＣＤ８２８Ｚ）を形質導入したＴ細胞及び外因性ｒｈＩＬ−２を受けた処置群のそれぞれ由来の２匹のマウス由来の腫瘍サンプルのＦＡＣＳ分析を、Ｔ細胞移入の３０日後に回収し、実施例６に記載したように、フローサイトメトリーによってＤＣ１０１  ＣＡＲ発現Ｔ細胞の存在について個々に分析した。腫瘍サンプルを機械的に壊して単細胞懸濁物にし、Ｆｉｃｏｌｌでの勾配遠心分離によって低密度細胞画分を調製した。ＤＣ１０１  ＣＡＲの細胞表面発現を、ＢＳＡ又は可溶性マウスＶＥＧＦＲ−２−ヒトＩｇＧ．ＦＣ融合タンパク質と、その後のＰＥコンジュゲート化ヤギ抗ヒトＩｇＧ．ＦＣ抗体と共に、細胞を連続的にインキュベートすることによって検出した。細胞は、ＡＰＣコンジュゲート化ラット抗マウスＣＤ３で共染色した。前方及び側方散乱プロフィールのリンパ球ゲート領域中のＤＣ１０１  ＣＡＲ発現ＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセントを、表５に示す。
【０１７９】
【表５】
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【０１８０】
表５に示されるように、ＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲベクター操作したＴ細胞で処置したマウスは、ＤＣ１０１  ＣＡＲを保有するが４−１ＢＢを欠くＴ細胞で処置したマウスと比較して、腫瘍腫瘍中のＤＣ１０１  ＣＡＲ発現ＣＤ３＋細胞が４〜５倍多かった。
【０１８１】
この実施例は、４−１ＢＢが、腫瘍部位での養子移入された抗原特異的Ｔ細胞の持続を増強することを実証した。
【０１８２】
実施例１５
この実施例は、ＤＣ１０１−ＣＡＲを形質導入したＴ細胞が、腫瘍部位に効率的に移動する（ｔｒａｆｆｉｃ）ことを実証する。
【０１８３】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、２×１０５のＢ１６−Ｆ１０腫瘍細胞を皮下注射した。実施例１０に記載したように、１０日目及び１２日目に、マウスを５Ｇｙで照射し、ｒｈＩＬ−２と合わせて、ＤＣ１０１  ＣＡＲ（ＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ）又は空ベクターを形質導入したＴｈｙ１．１＋同系Ｔ細胞２０×１０６で静脈内処置した。
【０１８４】
表６Ａに示した時点で、各群由来の個々のマウス由来の腫瘍及び脾臓を切り出し、単細胞懸濁物を得るために処理し、実施例６に記載したように、フローサイトメトリーで分析した。脾臓は、４０μｍナイロンフィルターを通して破砕した。赤血球溶解後、脾細胞を単離した。腫瘍の単細胞懸濁物を４０μｍナイロン細胞ストレイナー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して作製し、Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ（登録商標）−Ｍ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｃａｎａｄａ）を使用した密度勾配遠心分離によってリンパ球をさらに分離した。脾臓及び腫瘍サンプルから単離したマウスＴ細胞の表現型を、製造業者の推奨に従ってアロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲート化ラット抗マウスＣＤ３及びＰＥ標識マウス抗ラットＴｈｙ１．１抗体（共にＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから）を用いて細胞を直接染色することにより、決定した。細胞アリコートを、それぞれの蛍光色素標識したアイソタイプコントロール抗体で染色して、染色の特異性を決定した。リンパ球ゲートされた集団中のＣＤ３＋Ｔｈｙ１．１＋細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーで決定した。細胞を取得し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。腫瘍細胞調製物及び脾細胞の全細胞集団中のリンパ球ゲートされた領域中の細胞を、分析に含めた。四分円を、アイソタイプコントロール抗体染色に基づいて樹立した。代表的なＦＡＣＳデータを表６Ａに示し（ＣＤ３＋Ｔｈｙ１．１＋細胞のパーセンテージ）、独立した実験からの３匹の異なるマウスから得たプールしたデータを、表６Ｂに示す（ＣＤ３＋Ｔｈｙ１．１＋細胞のパーセンテージ）。
【０１８５】
【表６−１】
0005934099.tif 000008
【０１８６】
【表６−２】
0005934099.tif 000009
【０１８７】
３日目までに、養子移入したＴ細胞は、それらの遺伝的改変にかかわらず、脾臓及び腫瘍に同様に輸送された。しかし、６日目及び９日目には、腫瘍への輸送は、ＤＣ１０１  ＣＡＲを付与したＴ細胞でかなり大きかった。ＶＥＧＦＲ−２特異的Ｔ細胞の腫瘍部位への輸送及び腫瘍部位におけるホーミングの増加は、複数の実験で再現性よく観察された。これらの知見を、Ｔｈｙ１．１特異的抗体を用いて腫瘍切片を染色した後、共焦点顕微鏡を使用して、養子移入したＴｈｙ１．１＋Ｔ細胞を直接可視化することによってさらに確認した。
【０１８８】
腫瘍サンプルを、ＡＣＴの４日後にＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲ又は空ベクターを形質導入したＴ細胞及びｒｈＩＬ−２で処置したＢ１６−Ｆ１０腫瘍保持Ｃ５７ＢＬ／６マウスから得た。腫瘍切片を、核を示すための４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）と共に、移入されたＴ細胞上で発現されたＴｈｙ１．１抗原又は内皮細胞マーカーＣＤ３１について染色し、蛍光顕微鏡を用いて分析した。細胞移入の４日後に、ＤＣ１０１−ＣＡＲを形質導入したＴｈｙ１．１＋Ｔ細胞で処置したマウスから採取した腫瘍サンプルは、空ベクターを形質導入した細胞で処置したものよりもたくさんのＴｈｙ１．１＋Ｔ細胞を含んだ。この時点で、腫瘍血管は、腫瘍血管中の内皮細胞と密接に関連した、ＤＣ１０１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を含んだ。さらに、内皮細胞マーカーＣＤ３１で染色した腫瘍切片は、空ベクターを形質導入したＴ細胞で処置したマウスと比較して、ＤＣ１０１−ＣＡＲを形質導入したＴ細胞で処置したマウスの腫瘍において、血管数の減少を示した。
【０１８９】
輸送の増強及び腫瘍中のＤＣ１０１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞数の増加が、ＣＡＲを形質導入したＴ細胞と空ベクターを形質導入したＴ細胞との間のケモカイン受容体の発現における何らかの固有の差異の結果であるかどうか決定するため、富化した脾臓ＣＤ３＋Ｔ細胞を、空ベクター又はＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ、ＤＣ１０１−ＣＤ８２８Ｚ若しくはＳＰ６−ＣＤ８２８ＢＢＺをコードするベクターで形質導入した。形質導入の５日後、細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏのＴ細胞のホーミング及び／又は効率的な輸送に関与することが知られているＣＤ６２Ｌ分子及びケモカイン受容体（ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ９及びＣＣＲ７）の細胞表面発現について、ＦＡＣＳ分析した。
【０１９０】
Ｔ細胞の輸送に関与することが知られているケモカイン受容体ＣＣＲ７、ＣＣＲ９、ＣＸＣＲ−３及びＣＸＣＲ−４、並びにホーミング分子Ｌ−セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）の発現レベルにおいて、ＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ、ＤＣ１０１−ＣＤ８２８Ｚ、ＳＰ６−ＣＤ８２８ＢＢＺを発現するレトロウイルスベクター又は空ベクターで形質導入したＴ細胞間には差異はなかった。従って、輸送の増強及び腫瘍中のＤＣ１０１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞数の増加は、抗原非依存的機構における何らかの固有の差異（例えば、ＣＡＲを形質導入したＴ細胞と空ベクターを形質導入したＴ細胞との間のケモカイン受容体の発現増加）の結果ではなく、ｉｎ  ｖｉｖｏの標的抗原結合の結果であると思われる。
【０１９１】
この実施例は、腫瘍への輸送が、養子移入の６日後及び９日後の時点で、空ベクターを形質導入した細胞よりも、ＤＣ１０１  ＣＡＲ付与Ｔ細胞でかなり大きいことを実証した。
【０１９２】
実施例１６
この実施例は、実施例２の核酸を形質導入した宿主細胞が、ＫＤＲ１１２１  ＳｃＦｖセグメント、細胞外ヒンジ及び膜貫通セグメント、並びに細胞内Ｔ細胞シグナル伝達セグメントを含むＣＡＲを発現することを実証する。
【０１９３】
形質導入されたヒトＴ細胞上のＫＤＲ  ＣＡＲの検出を、実施例６に記載したように、形質導入の５日後に実施した（ただし、可溶性ヒト（ｈ）ＶＥＧＦＲ２−ｈＩｇＧ．ＦＣ融合タンパク質を染色プロトコルで使用し、細胞はＰｅｒＣＰ標識マウス抗ヒトＣＤ３抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で共染色した）。フローサイトメトリー取得は、ＦＡＣＳ  ＣａｌｉｂｕｒＴＭフローサイトメータ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて実施した。データを取得し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔＴＭソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｓｏｎ）を使用して分析した。前方小角度光散乱及びヨウ化プロピジウム染色の組み合わせを使用して、死細胞を排除した。形質導入したＴ細胞上のＣＡＲ特異的染色及びその発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、アイソタイプコントロール抗体で染色したそれぞれの細胞型を使用して決定した。四分円を、関連するアイソタイプコントロールに基づいて樹立した。結果を表７に示す。
【０１９４】
【表７】
0005934099.tif 000010
【０１９５】
表７に示されるように、実施例２のＫＤＲ  ＣＡＲコードレトロウイルスベクターを形質導入したヒトＰＢＬは、高頻度で、細胞表面上にＣＡＲを発現するＣＤ３＋Ｔ細胞を約７９〜約８５％で生じる。
【０１９６】
両方のベクターがヒトＰＢＬを同程度に形質導入できるものの、ＫＤＲ−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲベクター（４−１ＢＢ配列を有する）から指示されるＣＡＲ発現のＭＦＩは、表８に示されるように、僅かに損なわれた。
【０１９７】
【表８】
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【０１９８】
この実施例は、ＫＤＲ１１２１  ＳｃＦｖセグメント、細胞外ヒンジ及び膜貫通セグメント、並びに細胞内Ｔ細胞シグナル伝達セグメントを含むＣＡＲを発現する実施例２の核酸配列で宿主細胞を形質導入する際の形質導入効率を実証した。
【０１９９】
実施例１７
この実施例は、ＫＤＲ１１２１−ＣＤ２８Ｚ及びＫＤＲ１１２１−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲ改変Ｔ細胞が、増殖によって測定されるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗原特異的応答を生じるのに有効であることを実証する。
【０２００】
実施例７に記載したように、マイクロタイタープレートを、ＢＳＡ、可溶性ＫＤＲ−ｈＩｇＧ．ＦＣ融合タンパク質又は抗ヒトＣＤ３  ｍＡｂで被覆した。ＯＫＴ３刺激したヒトＰＢＬを、実施例５に記載したように、レトロウイルスベクター：ＫＤＲ−ＣＤ２８Ｚ若しくはＫＤＲ−ＣＤ２８ＢＢＺで形質導入したか、又はモック形質導入した。７日後、細胞を、抗原被覆したマイクロタイタープレート上で３日間培養し、３［Ｈ］−チミジンを１８時間パルスし、実施例７に記載したように、増殖の測定としてチミジン取り込みについて分析した。アッセイは三連で実施し、値は平均±ＳＥＭで示す。結果を図８に示す。
【０２０１】
図８に示されるように、種々のベクターで形質導入されたＴ細胞間では、固定化された抗マウスＣＤ３抗体に対する応答に差異はなかったが、ＫＤＲ１１２１−ＣＡＲで操作されたＴ細胞のみが、増殖によって測定されるように、プレート結合標的ＶＥＧＦＲ−２タンパク質に特異的に応答した。さらに、ＫＤＲ１１２１  ＣＡＲを形質導入した細胞は、４−１ＢＢシグナル伝達配列あり又はなしの両方で、プレート結合標的ＶＥＧＦＲ−２に応答して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖した。
【０２０２】
この実施例は、ＫＤＲ１１２１−ＣＤ２８Ｚ及びＫＤＲ１１２１−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲ改変Ｔ細胞が、ＶＥＧＦＲ−２タンパク質による刺激に応答してｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖することを実証した。
【０２０３】
実施例１８
この実施例は、ＫＤＲ１１２１−ＣＤ２８Ｚ及びＫＤＲ１１２１−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲ改変Ｔ細胞が、ＩＦＮ−γ分泌によって測定される抗原特異的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ応答を生じるのに有効であることを実証する。
【０２０４】
形質導入したヒトＰＢＬを、ＩＦＮ−γ放出アッセイにおいて、プレート結合ＶＥＧＦＲ−２タンパク質並びにＶＥＧＦＲ−２発現標的細胞に対する特異的反応性について試験した。ヒトＰＢＬを、実施例５に記載したように、レトロウイルスベクター：ＫＤＲ１１２１−ＣＤ８２８ＢＢＺ若しくはＫＤＲ１１２１−ＣＤ２８Ｚで形質導入し、又はモック形質導入した。形質導入された細胞を、実施例７に記載されたように、２００μｌＣＭ中で、抗原被覆したマイクロタイタープレート上で培養した。細胞培養物上清を、１日後若しくは２日後（マウスＴ細胞）又は１日後（ヒトＴ細胞）に回収し、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して、ＩＦＮ−γについて酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）で分析した。アッセイは三連のウェルで実施した。結果を図９に示す（値は平均±ＳＥＭで示す）。
【０２０５】
図９に示されるように、種々のベクターで形質導入されたＴ細胞間では、固定化された抗マウスＣＤ３抗体に対する応答に差異はなかったが、ＫＤＲ１１２１−ＣＡＲで操作されたＴ細胞のみが、ＩＦＮ−γ分泌によって測定されるように、プレート結合標的ＶＥＧＦＲ−２タンパク質に特異的に応答した。さらに、ＫＤＲ１１２１  ＣＡＲを形質導入した細胞は、４−１ＢＢシグナル伝達配列あり又はなしの両方で、プレート結合標的ＶＥＧＦＲ−２に応答して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＦＮ−γを分泌した。
【０２０６】
この実施例は、ＫＤＲ１１２１−ＣＤ２８Ｚ及びＫＤＲ１１２１−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲ改変Ｔ細胞が、ＶＥＧＦＲ−２タンパク質による刺激に応答して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＦＮ−γを分泌することを実証した。
【０２０７】
実施例１９
この実施例は、ＫＤＲ１１２１−ＣＤ８２８ＢＢＺ及びＫＤＲ１１２１−ＣＤ２８Ｚを形質導入したヒトＰＢＬが、ＩＦＮ−γ分泌によって測定されるように、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ）発現標的細胞と共培養したときに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの抗原特異的応答を生じることを実証する。
【０２０８】
ＫＤＲタンパク質発現細胞の認識におけるＫＤＲ  ＣＡＲ改変Ｔ細胞の能力を試験した。３つの異なるドナー由来のＰＢＬに、実施例５に記載したように、ＫＤＲ１１２１−ＣＤ８２８ＢＢＺ及びＫＤＲ１１２１−ＣＤ２８Ｚ  ＣＡＲを形質導入したか、又はモック形質導入した。形質導入の８日後に、実施例９に記載したように、形質導入細胞を単独で培養したか、又はＫＤＲネガティブ２９３細胞若しくは２９３−ＫＤＲ細胞（高レベルのＫＤＲタンパク質を発現する安定な形質転換体）と共に２４時間共培養した。培養物上清を、実施例８に記載したように、ＩＦＮ−γ分泌について分析した。結果を図１０に示す。
【０２０９】
図１０に示されるように、ＫＤＲ１１２１−ＣＤ８２８ＢＢＺベクター及びＫＤＲ１１２１−ＣＤ２８Ｚベクターは共に、ＫＤＲ発現２９３−ＫＤＲ細胞のみを特異的に認識し、２９３細胞を認識しないそれらの能力から明らかなように、同様のレベルの特異性及び機能性を形質導入ヒトＴ細胞に付与した。
【０２１０】
この実施例は、ＫＤＲ１１２１−ＣＤ２８Ｚ及びＫＤＲ１１２１−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲ改変Ｔ細胞が、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ）発現細胞による刺激に応答して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＦＮ−γを分泌することを実証した。
【０２１１】
実施例２０
この実施例は、ＫＤＲ−１１２１  ＣＡＲ改変Ｔ細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＶＥＧＦＲ−２発現細胞による刺激に応答して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＦＮ−γを分泌することを実証する。
【０２１２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで短期間培養した種々の組織起源の正常初代ヒト内皮細胞及び上皮細胞並びに筋肉筋芽細胞のパネル（２９３Ａ２、ＨＭＶＥＣ−真皮、ＨＭＶＥＣ−肺、ＨＵＶＥＣ、皮膚繊維芽細胞、ＳＡＥＣ、ＨＢＥＣ、ＨＲＥ、ＨＭＥＣ、ＰｒＥＣ、ＨＳＭＭ）を、フローサイトメトリーによってＫＤＲ発現について試験した。ＫＤＲタンパク質は、形質導入細胞（２９３Ａ２−ＫＤＲ）及び培養初代内皮細胞（即ち、ＨＭＶＥＣ−Ｄ、ＨＭＶＥＣ−Ｌ及びＨＵＶＥＣ）でのみ容易に検出可能であり、試験した初代上皮細胞及び筋芽細胞のいずれでも検出不能であった。ＫＤＲ発現の強度は、肺由来ＨＭＶＥＣ（ＨＭＶＥＣ−Ｌ）又はＨＵＶＥＣと比較して、皮膚由来ヒト真皮微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ−Ｄ）でより高かった。
【０２１３】
ヒトＰＢＬを、実施例５に記載したようにＫＤＲ１１２１−ＣＤ８２８ＢＢＺで形質導入したか、又はモック形質導入した。４日後に、標的細胞を単独で培養し、形質導入細胞を単独で培養し、又は形質導入細胞を２００μｌＣＭ中以下の細胞株のうち１つと共に共培養した：２９３Ａ２、ＨＭＶＥＣ−真皮、ＨＭＶＥＣ−肺、ＨＵＶＥＣ、皮膚繊維芽細胞、ＳＡＥＣ、ＨＢＥＣ、ＨＲＥ、ＨＭＥＣ、ＰｒＥＣ、ＨＳＭＭ又は２９３Ａ２−ＫＤＲ。ＩＦＮ−γ分泌を、実施例８に記載したようにアッセイした。結果を図１１に示す（三連のウェルの平均値±ＳＥＭとして示す）。
【０２１４】
図１１に示されるように、ＫＤＲ  ＣＡＲを形質導入した細胞は、その組織起源にかかわらずＫＤＲポジティブ細胞（ＨＭＶＥＣ−Ｄ、２９３−ＫＤＲ細胞、ＨＭＶＥＣ−Ｌ及びＨＵＶＥＣ）に応答してのみＩＦＮ−γを分泌し、試験した他の初代細胞の何れも認識できなかった。
【０２１５】
これらの結果と一致して、細胞毒性アッセイにおいて、ＫＤＲ１１２１−ｈＣＤ８２８ＢＢＺ及びＫＤＲ１１２１−ｈＣＤ２８Ｚ  ＣＡＲ改変Ｔ細胞は、ＫＤＲポジティブ標的細胞を特異的に溶解させたがＫＤＲネガティブ細胞型は溶解させず、一方でモック又はＳＰ６−ＣＡＲを形質導入したＴ細胞は、試験した標的細胞のいずれも溶解できなかった（図１９）。
【０２１６】
この実施例は、ＫＤＲ１１２１−ＣＤ２８Ｚ及びＫＤＲ１１２１−ＣＤ８２８ＢＢＺ  ＣＡＲ改変Ｔ細胞が、組織の起源にかかわらず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ）発現細胞による刺激に応答して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＦＮ−γを分泌することを実証した。
【０２１７】
実施例２１
この実施例は、ＶＥＧＦＲ−２  ＣＡＲを発現するように改変された初代マウスＴ細胞が、ＶＥＧＦＲ−２発現マウス細胞を特異的に溶解させることを実証する。
【０２１８】
モック形質導入或いは空ベクター又はＳＰ６−ＣＤ８２８ＢＢＺ、ＤＣ１０１−ＣＤ８、ＤＣ１０１−ＣＤ８２８Ｚ若しくはＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ発現レトロウイルスベクターを形質導入した初代マウスＴ細胞を、変動するエフェクター対標的比（５０、１７、５．６、１．９）で、標的細胞（ＳＶＥＣ４−１０ＥＨＲ１、４Ｔ１、ＲＥＮＣＡ、ＭＢ４９、ｂＥＮＤ．３、ＭＣ３８、ＭＣ１７−５１、ＭＢ４９−Ｆｌｋ１、ＭＳ１、ＣＴ２６、Ｂ１６−Ｆ１０、３Ｔ３、ＳＶＲ、ＭＣＡ２０５、Ｃ１４９８、３Ｔ３−Ｆｌｋ１）と共にインキュベートし、細胞溶解を、標準的なＣｒ５１放出アッセイを使用して決定した。
【０２１９】
実施例９で得た結果及び図１３に示した結果と一致して、細胞毒性アッセイにおいて、ＤＣ１０１−ＣＡＲ改変Ｔ細胞は、ＶＥＧＦＲ−２ポジティブ標的細胞を特異的に溶解させたが、ＶＥＧＦＲ−２ネガティブ細胞型は溶解させなかった。対照的に、モック、空ベクター又はＳＰ６−ＣＡＲを形質導入したＴ細胞は、試験した標的細胞のいずれも溶解させられなかった（図１３）。
【０２２０】
実施例２２
この実施例は、ＤＣ１０１−ＣＡＲ発現Ｔ細胞が、照射による宿主のプレコンディショニングの存在下又は非存在下で、抗腫瘍応答を生じることを実証する。
【０２２１】
養子細胞移入（ＡＣＴ）前の宿主免疫細胞の枯渇は、免疫抑制細胞並びに恒常性維持サイトカインに関して移入細胞と競合するリンパ球を排除することによって、移入された抗原特異的Ｔ細胞の抗腫瘍効力を増強できる。従って、以前の養子Ｔ細胞治療実験において、マウスは細胞移入前に５Ｇｙの全身放射線照射法（ＴＢＩ）を受けた。しかし照射は、腫瘍脈管構造を有害に変更し又は損傷し、及び／又は標的抗原ＶＥＧＦＲ−２の発現を歪める可能性がある。
【０２２２】
従って、ＤＣ１０１−ＣＡＲ操作されたＴ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を、養子Ｔ細胞移入前に、宿主リンパ枯渇（ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）あり又はなしでマウスにおいて試験した。皮下Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍を保持するＣ５７ＢＬ／６マウスに、Ｔ細胞移入前の５Ｇｙ  ＴＢＩあり又はなしで、ＤＣ１０１−ＣＡＲ、ＳＰ６−ＣＡＲ又は空ベクターを形質導入した同系Ｔ細胞２ｘ１０７＋ｒｈＩＬ−２を受けさせたか、又はＴ細胞で処置しなかった。
【０２２３】
以前の実験からの知見と一致して、ＤＣ１０１−ＣＡＲ発現Ｔ細胞は再び、ＳＰ６−ＣＡＲ又は空ベクターで操作したものと比較して、リンパ枯渇マウスにおいて抗腫瘍応答を再現性よく生じさせた（図１７、Ｐ＝０．００９）。腫瘍阻害効果は、照射による宿主プレコンディショニングの存在下又は非存在下のいずれかでＤＣ１０１−ＣＡＲ  Ｔ細胞を受けた処置群間で統計的に区別できなかった（Ｐ＝０．２５１）。
【０２２４】
この実施例は、ＤＣ１０１−ＣＡＲ発現Ｔ細胞が、宿主リンパ枯渇あり又はなしで抗腫瘍応答を生じることを実証した。
【０２２５】
実施例２３
この実施例は、養子移入したＶＥＧＦＲ−２  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞で観察された毒性が、減少した数のＴ細胞又はＤＣ１０１−ＣＡＲを形質導入した精製ＣＤ８＋Ｔ細胞を投与することによって低減され得ることを実証する。
【０２２６】
異なる組織学の樹立された皮下腫瘍を保持する合計１３５匹のＣ５７ＢＬ／６マウスで実施した腫瘍治療研究において、養子移入した同系Ｔ細胞は、９０％より多くのＣＤ８＋Ｔ細胞を含んだ。処置に関連した罹患及び死亡は、５Ｇｙの全身放射線照射法、ＤＣ１０１−ＣＤ８２８ＢＢＺ若しくはＤＣ１０１−ＣＤ８２８Ｚ  ＣＡＲを形質導入した２ｘ１０７までのＴ細胞、及び高用量のＩＬ−２を受けたマウスにおいて報告されなかった。血管新生化した組織（例えば、腎臓、網膜及び膵臓）における低レベルのＶＥＧＦＲ−２発現の報告にもかかわらず、最大数（２ｘ１０７）のＶＥＧＦＲ−２  ＣＡＲ改変Ｔ細胞で処置したＣ５７ＢＬ／６マウス中の種々の臓器の組織病理学的分析は、処置関連の毒性の証拠を示さなかった。
【０２２７】
対照的に、重篤な毒性が、ＤＣ１０１−ＣＡＲを形質導入した同系Ｔ細胞２ｘ１０７で同様に処置した腫瘍保持ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて観察された。しかし、樹立されたＣＴ２６又はＲＥＮＣＡ腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスでは、投与したＴ細胞数を５ｘ１０６まで減らした場合、又はＤＣ１０１−ＣＡＲを形質導入した精製同系ＣＤ８＋Ｔ細胞２ｘ１０７を投与することによって、治療関連のいずれの毒性もなしに、匹敵する抗腫瘍効果が達成された（図１８Ａ及び１８Ｂ）。２ｘ１０７のＤＣ１０１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞及びＩＬ−２で処置したＢＡＬＢ／ｃマウスの組織病理学的分析により、肝臓における多巣性の軽度の凝固壊死及び軽度の肝胆管周囲炎並びに肺血管周囲炎（ｐｅｒｉｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）、小腸及び結腸の絨毛萎縮、絨毛鈍麻（ｂｌｕｎｔｉｎｇ）及び陰窩上皮過形成を含むサイトカイン誘導性の低血圧に特徴的な知見が明らかとなった。心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、子宮、卵巣又は脳の巨視的外観には、異常は見られなかった。
【０２２８】
ＢＡＬＢ／ｃマウスと比較してＣ５７ＢＬ／６で見られた毒性の差異は、養子移入に使用した最終細胞産物中に存在するＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加に起因したように見えた。ＢＡＬＢ／ｃ脾臓から得たＣＤ３＋Ｔ細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓から得たＣＤ３＋Ｔ細胞と同様に培養したが、最終ＢＡＬＢ／ｃ細胞産物（５〜６日間培養した）は、養子移入の時点で、約６０％のＣＤ８＋Ｔ細胞及び４０％のＣＤ４＋Ｔ細胞を含んでいた。減少した数（５ｘ１０６）の未分離Ｔ細胞又はＤＣ１０１−ＣＡＲを形質導入した精製ＣＤ８＋Ｔ細胞２ｘ１０７で処置したＢＡＬＢ／ｃマウス（１５匹の腫瘍保持マウスを含む３つの独立した実験における）では毒性は見られなかったが、ＣＤ８＋Ｔ細胞（約６０％）及びＣＤ４＋（約４０％）Ｔ細胞の両方を含むＤＣ１０１−ＣＡＲ改変Ｔ細胞２ｘ１０７を受けたマウスは、図１８Ａ及び１８Ｂに示される同じ実験において、罹患及び死亡を示した。これらの知見をＢ１６腫瘍保持Ｃ５７ＢＬ／６マウスでさらに評価し、ここで、ＶＥＧＦＲ−２  ＣＡＲを形質導入した精製ＣＤ４＋Ｔ細胞、又は１ｘ１０７の精製ＣＤ８＋及び１ｘ１０７のＣＤ４＋Ｔ細胞（共にＣＡＲを形質導入した）の１：１混合物を含む２ｘ１０７のＴ細胞でマウスを処置した場合に、罹患及び死亡が証明された。その一方、有効な腫瘍治療は、２ｘ１０７の未分離ＣＤ３＋Ｔ細胞（＞９０％がＣＤ８＋Ｔ細胞）又はＶＥＧＦＲ−２ＣＡＲを形質導入した精製ＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかで処置したマウスにおいて、有害な影響なしに達成された（図１８Ｃ）。
【０２２９】
複数の実験において、等しい数のＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を含む２ｘ１０７のＣＡＲ形質導入Ｔ細胞での非腫瘍保持ＢＡＬＢ／ｃ又はＣ５７ＢＬ／６マウスの処置は、有害な影響も毒性もなしに十分に許容された。従って、養子移入されたＶＥＧＦＲ−２  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞で観察された毒性の原因は、正常な血管又は組織に対する的外れの細胞媒介性の細胞毒性ではなく、腫瘍血管網における標的抗原ＶＥＧＦＲ−２のＣＤ４＋Ｔ細胞認識及び引き続く下流の分子事象に限定されるようである。
【０２３０】
この実施例は、減少した数のＴ細胞又はＤＣ１０１−ＣＡＲで形質導入した精製ＣＤ８＋Ｔ細胞を投与することは、養子移入したＶＥＧＦＲ−２  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞で観察される毒性を低減し得ることを実証した。
【０２３１】
実施例２４
この実施例は、転移性癌を有するヒト患者に抗ＶＥＧＦＲ２  ＣＡＲ発現細胞集団を投与する方法を実証する。
【０２３２】
細胞調製
【０２３３】
ＰＢＭＣを、白血球アフェレーシス（約１Ｘ１０１０細胞）によって得る。全ＰＢＭＣを、Ｔ細胞増殖を刺激するために抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）及びアルデスロイキンの存在下で培養する。形質導入は、抗ＶＥＧＦＲ２  ＣＡＲレトロウイルスベクター（ＫＤＲ１１２１−ｈＣＤ８２８ＢＢＺヌクレオチド配列（配列番号１６）を含む）を含む上清に、約１Ｘ１０７〜５Ｘ１０８の細胞を曝露することによって開始する。これらの形質導入細胞を増殖させ、その抗腫瘍活性について試験する。首尾よいＣＡＲ遺伝子移入は、ＣＡＲタンパク質に対するＦＡＣＳ分析で決定し、抗ＶＥＧＦＲ２反応性は、トランスフェクト細胞で測定されるサイトカイン放出によって試験する。それぞれの形質導入したＰＢＬ集団についての首尾よいＣＡＲ遺伝子移入は、＞１０％のＣＡＲポジティブ細胞として規定し、生物活性については、γ−インターフェロン分泌は少なくとも２００ｐｇ／ｍｌである。
【０２３４】
第１相−用量漸増：
【０２３５】
このプロトコルの最初の部分は、１コホート当たり最少３人の患者の３つのコホートを用い、第１相用量漸増設計で進行する。各コホートについて移入した抗ＶＥＧＦＲ２操作細胞の総数は以下のようにする：コホート１：１０８細胞；コホート２：１０９細胞；コホート３：１０１０細胞；及びコホート４：５ｘ１０１０細胞。
【０２３６】
操作されたＰＢＬ細胞を受ける前に、患者は、シクロホスファミド及びフルダラビンの骨髄非破壊的なリンパ球枯渇前処置（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）レジメンを受け、その後、１〜４日間、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ腫瘍反応性の、ＣＡＲ遺伝子を形質導入したＰＢＬ＋ＩＶアルデスロイキンの静脈内注入（７２０，０００ＩＵ／ｋｇｑ８ｈで最大１５用量）を受ける。
【０２３７】
第２相部分
【０２３８】
第１相部分と同様に、操作されたＰＢＬ細胞を受ける前に、第２相部分の患者は、シクロホスファミド及びフルダラビンの骨髄非破壊的なリンパ球枯渇前処置レジメンを受け、その後、１〜４日間、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ腫瘍反応性の、ＣＡＲ遺伝子を形質導入したＰＢＬ＋ＩＶアルデスロイキンの静脈内注入（７２０，０００ＩＵ／ｋｇｑ８ｈで最大１５用量）を受ける。
【０２３９】
このプロトコルの第２相部分は、第１相部分で決定される抗ＶＥＧＦＲ２操作された細胞の最大耐用量（ＭＴＤ）を利用して進行する。患者は、組織像に基づいて２つのコホートに入れられる：コホート１は、転移性の黒色腫及び腎癌を有する患者を含み、コホート２は他の全ての癌の型を含む。
【０２４０】
薬物投与
表９に示すように薬物を投与する。０日目は細胞注入の当日である。
【０２４１】
【表９】
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【０２４２】
細胞注入及びアルデスロイキン投与
【０２４３】
細胞は、Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙの職員により、患者集中治療室へ届けられる。血液貯蔵プロトコルで行われるのと同様に、注入前に、細胞産物同定ラベルを、２人の権限のある職員（医師又は正看護師）によって二重に確認し、産物の正体及び投与の証拠書類を患者のカルテに書き込む。細胞は、細胞の凝集を防ぐために注入の間バッグを穏やかに撹拌しながら、非濾過チュービングを介して２０〜３０分間にわたり静脈内注入される。
【０２４４】
血液製剤のサポート
【０２４５】
指針として１日ＣＢＣを用いて、患者は、血小板及び濃厚赤血球（ＰＲＢＣ）を必要に応じて受ける。ヘモグロビンを＞８．０ｇｍ／ｄｌに維持し、血小板を＞２０，０００／ｍｍ３に維持する試みが行われる。幹細胞産物（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ）を除く全ての血液製剤に照射する。全血及び血小板輸血のために白血球フィルターを使用して、輸血されるＷＢＣに対する感作を減少させ、ＣＭＶ感染の危険性を低下させる。
【０２４６】
試験中の評価
細胞注入後の評価（４５０ｍＬ／６週間以下）：
【０２４７】
総リンパ球数が２００／ｍｍ３より多くなったところで、以下のサンプルを月曜、水曜及び金曜に引き抜き、ＴＩＬラボに送る（患者は入院したまま）：５つのＣＰＴチューブ（各１０ｍｌ）及び１つのＳＳＴチューブ（１０ｍｌ）。
【０２４８】
他の時点において、Ｆｉｃｏｌｌクッション上での遠心分離を使用した精製によって、全血から患者の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を得る。これらのＰＢＭＣのアリコートを、１）細胞機能の免疫学的モニタリングのために凍結保存する、及び２）ＣＡＲのＰＣＲ分析及びベクターコピー数評価のために、ＤＮＡ及びＲＮＡ抽出に供する。
【０２４９】
生検
腫瘍組織又はリンパ節の生検を実施してもよいが、治療の過程の間には必要とされない。これらの生検は、実施された手順並びに顆粒球及び血小板数に基づいて最小の罹患率が予測される場合にのみ実施される。生検組織は、Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙの病理学者の立会いのもとでＳｕｒｇｅｒｙ  Ｂｒａｎｃｈ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｆａｃｉｌｉｔｙで処理し、全ての生検組織はＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙに送られる。腫瘍による抗原発現を評価するため及びこれらの生検から増殖したリンパ球の反応性を評価するために、研究を実施する。さらに、形質導入細胞の存在を、ベクター配列に対するＲＴ−ＰＣＲを使用して定量する。
【０２５０】
免疫学的試験：
アフェレーシスを、処置前及び処置の４〜６週間後に実施する。他の時点において、患者末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、Ｆｉｃｏｌｌクッションでの遠心分離を使用する精製によって、全血から取得する。これらのＰＢＭＣのアリコートを、細胞機能の免疫学的モニタリングのために凍結保存し、ＣＡＲのＰＣＲ分析及びベクターコピー数評価のためにＤＮＡ及びＲＮＡ抽出に供する。
【０２５１】
リンパ球を直接試験し、その後ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養で試験する。直接的免疫学的モニタリングにより、テトラマー染色を使用するＥＡＣＳ分析によって、Ｈｅｒ−２と反応性のＴ細胞を定量する。Ｅｘ  ｖｉｖｏ免疫学的アッセイには、十分なＴ細胞が入手可能な場合には、バルクＰＢＬ（＋／−ペプチド刺激）によるサイトカイン放出及び他の実験的研究（例えば細胞溶解）が含まれる。細胞数が限定されている場合、免疫学的活性の直接的分析が好ましい。免疫学的アッセイは、１）予め注入したＰＢＭＣ、及び２）注入の時点で凍結保存された、操作されたＰＢＬのアリコートを含めることによって、標準化される。一般に、これらのアッセイにおける２〜３倍の差異は、真の生物学的差異を示す。Ｆｏｘｐ３レベルを半定量的ＰＣＲによって分析し、細胞注入の前及び追跡の時点で取得したＰＢＬサンプルにつきｍＲＮＡを評価する。
【０２５２】
遺伝子治療試験のモニタリング：持続性及び増殖性（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）レトロウイルス（ＲＣＲ）：
操作された細胞の生存：ＣＡＲ及びベクターの存在を、樹立されたＰＣＲ技術を使用して、ＰＢＭＣサンプル中で定量する。テトラマー分析及びＣＡＲ染色の両方を使用する免疫学的モニタリングを使用して、ＰＣＲベースの分析を補強する。これは、注入した細胞由来のリンパ球のｉｎ  ｖｉｖｏ生存を推定するためのデータを提供する。さらに、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞の測定を実施し、循環におけるこれらのＴ細胞サブセットの研究を、レトロウイルスベクター操作されたＴ細胞のそれぞれについて独自のＤＮＡ配列を検出できる特異的ＰＣＲアッセイを使用して決定する。
【０２５３】
患者の血液サンプルを取得し、細胞注入の前にＰＣＲによるＲＣＲの検出のための分析を行い、ＲＣＲ  ＰＣＲを、細胞投与の３ヶ月後及び６ヵ月後、並びに１年後の時点で実施する。全ての以前の試験が短期間の臨床歴でネガティブであった場合には、その後血液サンプルを毎年アーカイブに保存する。患者がこの試験の間に死ぬか又は新生物を発症した場合、生検サンプルでＲＣＲにつきアッセイする試みを行う。処置後サンプルのいずれかがポジティブであった場合、ＦＤＡと協議の上、ＲＣＲのさらなる分析及びより詳細な患者の追跡を行う。ＲＣＲ  ＰＣＲアッセイは、ＧａＬＶエンベロープ遺伝子を検出する。これは、Ｉｎｄｉａｎａ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによる契約のもとで行う。これらの試験の結果は、ＲＣＲ試験を実施する請負人及びＳｕｒｇｅｒｙ  Ｂｒａｎｃｈ研究チームが保持する。
【０２５４】
これらの試験の性質に起因して、特異的Ｔ細胞クローンの増殖を、腫瘍抗原に応答して増殖する腫瘍反応性Ｔ細胞として観察することが可能である。従って、免疫学的かつ分子的にＴ細胞の持続性を追跡する配慮をする。ＣＡＲ形質導入細胞の持続性についての血液サンプル（５〜１０ｍＬ）を、細胞注入の１ヵ月後、次いで３ヵ月後、６ヵ月後、１２ヵ月後に取得し、次いでその後年１回取得する。（ベクター配列に特異的なプライマーを使用する半定量的ＤＮＡ−ＰＣＲにより）６ヶ月の時点でＣＡＲ遺伝子形質導入細胞の高レベルの持続性をいずれかの患者が示した場合、以前にアーカイブ化したサンプルを、生き残ったＣＡＲ遺伝子形質導入細胞のクローン性の同定を可能にする技術に供する。かかる技術には、Ｔ細胞クローニング又はＬＡＭ−ＰＣＲ  ３０が含まれ得る。ＣＡＲ遺伝子形質導入細胞由来の優勢な又はモノクローナルのＴ細胞クローンが追跡の間に同定された場合、組込み部位及び配列を同定し、続いて、ヒトゲノムデータベースに対して分析し、配列が任意の既知のヒト癌に関連するか否かを決定する。優勢な組込み部位が観察された場合、最初の観察の後３ヶ月以下の間隔で、Ｔ細胞クローニング又はＬＡＭ−ＰＣＲ試験を使用して、クローンが持続性であるか一過性であるかを確認する。モノクローナル性が持続する全ての例において、及び特に、クローンの増殖が存在する例において、配列が既知のヒト癌と関連していることが既知であるか否かにかかわらず、対象は、利用可能であれば治療が早期に開始できるように、悪性度の兆候について綿密にモニタリングすべきである。
【０２５５】
研究後評価（追跡）：
患者を、表１０に従って、最初の治療レジメン（最後のアルデスロイキン用量の終了として規定する）の４〜６週間後に評価する。
【０２５６】
【表１０】
0005934099.tif 000013
【０２５７】
データを収集し、以下に詳述するように評価する。標的病変の評価は以下のとおりである：ベースラインにおいて、全ての関連臓器を代表する最大１０病変までの全ての測定可能な病変を、標的病変として同定し、記録し、測定すべきである。標的病変は、それらのサイズ（最長の直径を有する病変）及び正確な反復測定（画像化技術による又は臨床的にのいずれか）へのそれらの適格性に基づいて選択すべきである。全ての標的病変に対する最長径（ＬＤ）の合計を計算し、ベースライン合計ＬＤとして報告する。ベースライン合計ＬＤを基準として使用して、疾患の測定可能な寸法の客観的腫瘍応答をさらに特徴付ける。標的病変評価の応答基準は表１１に示すとおりである。
【０２５８】
【表１１】
0005934099.tif 000014
【０２５９】
非標的病変の評価は以下のとおりである：ベースラインにおいて、全ての他の病変（又は疾患部位）を非標的病変として同定すべきであり、また記録すべきである。測定値は必要なく、これらの病変は「存在」又は「非存在」として示すべきである。標的病変評価の応答基準は表１２に示すとおりである。
【０２６０】
【表１２】
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【０２６１】
最良の全体応答の評価
最良の全体応答（表１３）は、治療開始から疾患の進行／再発までに記録された最良の応答である（進行性の疾患について、治療開始以降記録された最小の測定値を基準とする）。患者の最良の応答割り当ては、測定値及び確証基準の両方の達成に依存する。
【０２６２】
【表１３】
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【０２６３】
確証的な測定値／応答の持続期間
確証：ＰＲ又はＣＲのステータスを割り当てるために、腫瘍測定値における変化を、応答基準が最初に満たされた少なくとも４週間後に実施すべき反復研究によって確証する。ＳＤの場合、追跡測定値は、６〜８週間の最小間隔で、研究に入ったあと少なくとも１回、ＳＤ基準を満たしたものであろう。
【０２６４】
全体応答の持続期間：全体応答の持続期間は、測定値基準がＣＲ／ＰＲ（いずれか最初に記録された方）を満たす時点から、再発性又は進行性の疾患が客観的に記録される最初の日付まで、測定される（進行性の疾患について、治療開始以降記録された最小の測定値を基準とする）。全完全奏功の持続期間は、測定基準がＣＲを最初に満たす時点から、再発性の疾患が客観的に記録される最初の日付まで、測定される。
【０２６５】
安定（Ｓｔａｂｌｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ）の持続期間：安定は、処置の開始から、進行の基準が満たされるまで、治療開始以降記録された最小の測定値を基準として、測定される。
【０２６６】
この実施例は、ヒト癌患者に対する抗ＶＥＧＦＲ２  ＣＡＲ発現細胞集団の投与方法を実証した。
【０２６７】
刊行物、特許出願及び特許を含む、本明細書中に引用した全ての参考文献は、それぞれの参考文献が参照によって組み込まれることが個々にかつ具体的に示されているのと同程度又はその全体が本明細書中に記載されているのと同程度まで、参照によって本明細書中に組み込まれる。
【０２６８】
本発明の説明に関して（特に、以下の特許請求の範囲に関して）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」並びに同様の指示対象の使用は、本明細書中に特記しないか文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方をカバーすると解釈すべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特記しない限り、オープンエンドの用語（即ち、「〜を含むがそれらに限定されない」を意味する）と解釈すべきである。本明細書中の値の範囲の記述は、本明細書中に特記しない限り、その範囲内に入る各個別の値に個々に言及する省略方法として働くことのみを意図しており、各個別の値は、それが本明細書中に個々に記述されているかのように本明細書中に組み込まれる。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中に特記しない又は文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施できる。本明細書中に提供される任意の及び全ての例又は例示的語句（例えば、「など（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）の使用は、本発明をよりよく説明することのみを意図しており、特段特許請求されない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中の全ての語句は、特許請求されていない任意の要素を本発明の実施に必須のものとして示していると解釈すべきではない。
【０２６９】
発明を実施するための発明者が知る最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が本明細書中に記載されている。これらの好ましい実施形態のバリエーションは、上述の説明を読めば当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者がかかるバリエーションを適宜使用することを予期しており、本発明者らは、本明細書中に具体的に記載されたのとは異なる方法で本発明が実施されることを意図している。従って、本発明は、適用法によって許容されるとおり、本明細書中に添付した特許請求の範囲に記載される対象の全ての改変及び等価物を含む。さらに、その全ての可能なバリエーションでの上記要素の任意の組合わせが、本明細書中に特記しない又は文脈と明らかに矛盾しない限り、本発明によって包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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