(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物によるヒトまたは動物の体内またはヒトまたは動物の体表での感染症を治療または予防するための、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示されるＢｌａｄ配列またはその活性変異体を含む抗微生物ポリペプチドを含む医薬組成物であって、前記活性異変体は抗菌作用を持ち、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４または少なくとも１００のアミノ酸長さであるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の断片の何れかと少なくとも７０％の同一性を持つ配列を含む、医薬組成物。
【請求項２】
医薬的に許容可能な担体または希釈剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
キレート剤をさらに含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
易感染性免疫系を有する、または重篤である対象中またはその上における感染症の治療または予防のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
ヒトまたは動物の体表ではなく、かつ、ヒトまたは動物の体内でもない場所で、ヒトまたは動物に対して病原性である微生物を殺減する、またはその成長を阻害するための、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示されるＢｌａｄ配列またはその活性変異体を含む抗微生物ポリペプチドを含む組成物であって、前記活性異変体は抗菌作用を持ち、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４または少なくとも１００のアミノ酸長さであるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の断片の何れかと少なくとも７０％の同一性を持つ配列を含む組成物の使用。
【請求項６】
前記組成物が、ヒトまたは動物病原性微生物に関して、ヒトもしくは動物が摂取する物品、ヒトもしくは動物が直接触れるように配置される物品、または、表面を消毒するために用いられる請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記物品が食品または医療装置もしくは器具である、請求項６に記載の使用方法。
【請求項８】
前記表面が、
（ａ）健康診断、診察もしくは治療が行われる；
（ｂ）食品が調理、取扱いもしくは保存される；
（ｃ）個人的な洗浄および／もしくは衛生が行われる；ならびに／または
（ｄ）以下の（ｉ）および／または（ｉｉ）の特定のリスクを有する個人がいる
（ｉ）微生物による感染症に罹患する；および／または
（ｉｉ）医療介入なしに微生物感染症を撃退することができないという環境内にある、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
前記組成物がキレート剤をさらに含む、請求項５〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
前記微生物が細菌または真菌である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記細菌が以下の属：シュードモナス、リステリア、バチルス、スタフィロコッカスおよびサルモネラの１つからの病原性種である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記真菌が以下の属：カンジダ、アスペルギルス、アルテルナリア、フザリウム、クリプトコッカスおよびトリコスポロンの１つからの病原性種である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記真菌、とくにカンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・フミガタスまたはアルテルナリア・アルテルナタが侵襲性真菌感染症を引き起こし得る、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記微生物が細菌または真菌である、請求項５〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
前記細菌が以下の属：シュードモナス、リステリア、バチルス、スタフィロコッカスおよびサルモネラの１つからの病原性種である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記真菌が以下の属：カンジダ、アスペルギルス、アルテルナリア、フザリウム、クリプトコッカスおよびトリコスポロンの１つからの病原性種である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１７】
前記真菌、とくにカンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・フミガタスまたはアルテルナリア・アルテルナタが侵襲性真菌感染症を引き起こし得る、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
ヒトまたは動物の体表ではなく、かつ、ヒトまたは動物の体内でもない場所でのヒトまたは動物に対して病原性を持つ微生物の殺滅、またはその増殖を阻害する方法であって、前記場所に効果的な量の請求項５に記載の組成物を投与するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は抗微生物剤の分野、とくにヒト／動物病原体を標的とするものに関する。
【背景技術】
【０００２】
［序論］
細菌症
細菌はヒト感染症のもっとも一般的な病原体である。世界人口の３分の１超が細菌病原体に感染するおそれがあり、１年当たり２００万人が細菌感染症で死亡する。米国疾病管理センター（ＯＤＣ）および世界保健機関（ＷＨＯ）によると、今日世界中でもっとも一般的な感染症のリストには以下の細菌感染症が含まれる。
【０００３】
コレラ：これは主に汚染された飲料水および不衛生な状態によって広がる疾病である。インド亜大陸、ロシア、およびサブサハラアフリカに特有である。細菌ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）での腸の急性感染症である。主な症状は大量の下痢である。この疾病に感染した人々の５％〜１０％は、嘔吐および下肢痙攣を含む重篤な症状を発症する。重症の場合には、コレラは脱水により死に至らしめうる。毎年約２０万件がＷＨＯに報告されている。
【０００４】
髄膜炎：これは、多くの場合脊髄膜炎として知られる、脊髄の感染症である。通常、ウィルスまたは細菌感染の結果である。細菌性髄膜炎はウィルス性髄膜炎より重篤であり、脳障害、聴力喪失、および学習障害を引き起こし得る。例えば、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型、ナイセリア・メニンギディディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）により引き起こされ得る。毎年約１２０万件の細菌性髄膜炎が発生し、その１０分の１超が死に至る。症状としては、重度の頭痛、発熱、吐気、嘔吐、昏睡、精神錯乱、光恐怖症、および肩こりが挙げられる。
【０００５】
肺炎：これには考えられる原因が多くあるが、通常は連鎖球菌（ストレプトコッカス）またはマイコプラズマ菌の感染症である。これらの細菌は、数年間感染症を引き起こすことなくヒトの体内で生き、別の病気がこの疾病に対する免疫を低下させた場合のみ表面化し得る。ストレプトコッカス・ニューモニエはもっとも一般的な種類である連鎖球菌（ストレプトコッカス）肺炎を引き起こすが、これはマイコプラズマ肺炎より重篤である。Ｓ．ニューモニエは毎年１０万件超の肺炎のための入院、ならびに６００万件の中耳炎および６万件超の髄膜炎のような侵襲性疾患の原因である。
【０００６】
細菌性赤痢：この感染症は毎年世界中で約６０万人を死亡させる。衛生不良な発展途上国でもっとも一般的である。シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）が細菌性赤痢を引き起こす。症状としては、血便の混じった下痢、嘔吐および腹部痙攣が挙げられる。
【０００７】
連鎖球菌性咽頭炎：これは連鎖球菌により引き起こされる。毎年数百万件の連鎖球菌性咽頭炎が発生する。症状としては、咽頭痛、発熱、頭痛、疲労、および吐気が挙げられる。
【０００８】
結核：これは毎年２百万人近くの死者を出し、ＷＨＯは、より効果的な予防手段が講じられなければ、２０００年〜２０２０年の間に１０億人近くが感染するだろうと予測する。ＴＢ菌（例えばマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ））は肺においてもっともよく見られ、胸痛および血痰を吐くひどい咳を引き起こし得る。他の症状としては、疲労、体重減少、食欲減退、寒気、発熱および寝汗が挙げられる。
【０００９】
チフス：腸チフスは細菌サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）により引き起こされ、毎年１２００〜１７００万件のうち、約６０万人を死亡させる。通常は感染した食物または水によって広がる。症状としては、急な発熱および発熱の持続、重度の頭痛、吐気、重度の食欲減退、便秘、および場合によって下痢が挙げられる。
【００１０】
正確な件数は、しかしながら、とくにこれらの疾病のかなり多くが、多くの人々が現代医療へのアクセスを持たない発展途上国に特有であるため、割り出すのが難しい。毎年感染症により引き起こされるすべての死の約半分はたった３つの疾病：結核、マラリア、およびエイズによるものであり得る。これらの疾病は毎年合わせて３億件超の病気を発生させ、５百万人超を死亡させる。
【００１１】
近現代の抗生物質の使用は１９世紀および２０世紀初期に、強力な抗微生物活性を有したペニシリウム・ノタツム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｎｏｔａｔｕｍ）により生成される活性成分ペニシリンの同定で始まった。しかしながら、１９５５年以前はその販売は制御されておらず、過度の制御されない使用は耐性細菌の発現をもたらした。抗生物質耐性は大きな問題となり、耐性ブドウ球菌（スタフィロコッカス）感染症が病院で流行しはじめた。
【００１２】
２０世紀初期には、スルホンアミド、ストレプトマイシン、ネオマイシン、クロラムフェニコール、セファロスポリンおよびテトラシクリンのような抗生物質の開発もあった。これらの化合物の多くは今日まだ用いられているが、すべて耐性の発現の問題に直面し、いくつかは毒性の問題に直面した。例えば、ストレプトマイシンは腎障害および難聴を引き起こし得、クロラムフェニコールは重篤な副作用（例えば貧血症および白血病を含む重篤な血液疾患）を引き起こし得る。
【００１３】
１９６０年代中にさらなる研究が行われ、これは第２世代の抗生物質の開発につながった。これらとしては、メチシリン、とくにペニシリン耐性の問題を克服するように製造されたペニシリンの半合成誘導体があった。メチシリンはペニシリンに対する細菌耐性との戦いにおける大躍進として認められたが、あいにくそうではなく、現在はメチシリンに耐性がある細菌が存在する。アンピシリンもペニシリンの誘導体である。これはペニシリンが治療することができる感染症の範囲を広げるために開発され、現在は大部分のペニシリンにとって代わっている。呼吸器および尿路感染症を含む全範囲の感染症の治療における第１の選択肢であることが多い。アモキシシリンはもう１つの広く用いられるペニシリン誘導体である。アンピシリンと同様に広範囲の活性を有する。ゲンタマイシンはストレプトマイシン（１９４３年に発見された抗ＴＢ薬）と同じファミリーの抗生物質である。耳および腎臓に重篤な毒性副作用を有し得るので、一般的には重篤な感染症のために取ってある。
【００１４】
最近、キノロンと呼ばれ、フルオロキノロンとも称される抗生物質の新規ファミリーが医薬研究所により開発された。広範囲の細菌に対して効果的であることに加え、これらの抗生物質は経口摂取すると血流中で高濃度に達することができる。これは、かつて入院が必要だった多くの感染症を現在では家庭で治療することができることを意味する。フルオロキノロンは重篤な病気の患者に、および／または長期（数週〜数か月）抗生物質が必要である場合にのみ用いられる。
【００１５】
こうした第２世代化合物の開発にかかわらず、耐性の絶え間ない発現は問題であり続ける。一般的には、耐性は薬剤の使用、とくに広範囲にわたる使用または誤用後に発現し、これは結果としてヒトの病気を治療するその効果の損失をもたらす。抗微生物剤の連続使用は耐性菌株の発現、増殖、および蔓延に有利となる選択圧を増加させる。抗微生物剤の不適切で制御されない使用もこれをもたらし、過剰処方、準最適用量の投与、不十分な治療期間、薬剤の不適切な選択をもたらす誤診、および家庭、学校等における抗細菌性家庭用品の使用（とくに濫用）を含む。
【００１６】
いくつかの例では、耐性はすぐに現れる（例えばオキサリンに対するスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の耐性はたった数年で発現した）が、他の例では時間がかかる場合もある（例えばエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）はバンコマイシンに対する耐性が発現するのにほぼ３０年かかった）。期間の差の理由は不明であり、おそらく多因子的である。しかしながら、細菌が抗微生物剤の殺滅作用を回避する能力は、個別の患者を治療する、および感染症の大発生を制御する能力を明らかに妨げる。例えば、ＷＨＯは、１年当たり５０万件近くの新しい多剤耐性結核（ＭＤＲ−ＴＢ）が発生することを予測するが、これは９００万件の新しいＴＢのすべての型の約５％である。
【００１７】
メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡ）のいくつかの菌株は、院内感染を引き起こす特定の能力を有する。米国にあるいくつかの病院では、患者から分離されたＳ．アウレウスの７０％超はＭＲＳＡであり、これらの菌株はバンコマイシン、リネゾリド、ダプトマイシン、およびチゲサイクリンを除くすべての認可薬に耐性であることが多い。最近、米国ではバンコマイシンに対して完全に耐性であるＳ．アウレウスの菌株も患者から分離され、治療をさらに複雑にしている。ＭＲＳＡは多くの病院においてかなり流行し、一度病院内に入ると、この有機体は撲滅するのが非常に困難である。
【００１８】
撲滅の問題は、すべての他の臨床的に認可された薬剤に耐性であることが多い、Ｅ．フェシウムのバンコマイシン耐性菌株（ＶＲＥ）についても同様である。エンテロコッカスにおけるバンコマイシン耐性はプラズミド媒介性であることが多く、いくつかの特異な耐性決定因子からもたらされ得る。Ｅ．フェシウムにおけるペニシリンおよびグリコペプチド耐性の組み合わせは、効果的に治療することができない感染症を引き起こす。幸運なことに、ほとんどのＶＲＥは保菌状態であり、感染症は引き起こさない。感染症が発生する場合、抗生物質では治療できない場合がある。キノロンに対する耐性は、治療中であっても、急速に発現し得る。
【００１９】
現在、いくつかの細菌は、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス、バンコマイシン耐性エンテロコッカス、およびキノロン耐性ストレプトコッカス・ニューモニエのように、「スーパーバグ」の状態に達した。これらの病原体について、治療に使用可能な抗生物質はほとんどまたはまったく存在しない。しかし驚くべきことに、この４０年の間に、すべて１９９９年以降のストレプトグラミン系キヌプリスチン／ダルホプリスチン（Ｓｙｎｅｒｃｉｄ）、オキサゾリジノンリネゾリド、およびリポペプチドダプトマイシンを含む、ほんのわずかのクラスの新規抗生物質しか登場していない。
【００２０】
とくに抗微生物耐性の問題のため、細菌病原体により誘発される疾病を治療するための新規抗生物質の必要性が増大している。前述したように、多くの病原体は治療に用いられる強力な抗生物質に対して耐性を発現させる。驚いたことに、耐性は多くの場合単一の薬剤に制限されず、複数の抗生物質に対して耐性を有し得る。新規のより効果的な薬剤、とくに多剤耐性機構を回避するための有向スペクトルの抗生物質の探索は今日も続いている。この探索のペースは、しかしながら、現在は医薬品会社にとって新規薬剤の認可を得ることがより一層困難であるため、著しく低下している。また、かかる費用、および研究所における新規抗生物質の同定とそれを商業的に製造するための認可との間の時間遅延が大き過ぎ、いくつかの会社は市場を完全に放棄することになった。
【００２１】
真菌感染症
真菌感染症の発生は、一部には免疫系機能不全を有する患者数の増加の結果として、過去３０年の間に増加している。これは、免疫抑制患者の数の増加をもたらす、近年の医学、とくに癌治療における大きな進歩の直接的な結果である。真菌感染症の増加については、非経口栄養、中心静脈カテーテル、広域スペクトルの抗生物質治療、妊娠、制御されない糖尿病を有する患者、臓器移植レシピエント、エイズを有する患者、細胞毒性化学療法を行う癌患者、熱傷または好中球減少症を有する患者、および胃腸病理学を含む、いくつかの他の理由が示されている。
【００２２】
真菌感染症のもっとも重篤なものは、高い死亡率に関連する侵襲性真菌感染症（ＩＦＩ）（例えば血流感染症）である。カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種は３０％の平均死亡率を有するＩＦＩのもっとも一般的な病原体である。カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）は侵襲性カンジダ感染症の発生件数の約５０％の原因であるが、カンジダの非アルビカンス種、すなわちカンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）およびカンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ）の相対頻度は着実に増加している。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種はもっとも一般的に分離される侵襲性糸状菌であり、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｉｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）種が優勢である。カンジダ感染症同様、侵襲性アスペルギルス症は一般に重篤な患者に関連するが、その死亡率は、考慮する特定の個別感染症によって決まるにもかかわらず、はるかに高い：例えば播種性または中枢神経系疾患について８５％以上、びまん性肺疾患について６０％である。
【００２３】
ＩＦＩの有病率および死亡率は過去３０年にかけて増加した。米国のデータは、１９８０年にこの群の疾患が８２８人を死亡させ、死に至る感染症の原因の上位１０番目であったことを示す。同データは、１９９７年には死亡者数が２３７０人、末期感染症の原因の上位７番目まで上昇したことを示した。最近のデータは、カンジダがエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種より一般的になり、現在では米国において４番目にもっとも一般的な死に至る感染症であることを示す。
【００２４】
カンジダＩＦＩも院内環境で増加しており、これらの感染症のリスク因子は増加しつづけるので、さらなる増加が予見される。カンジダ種はすべての院内ＩＦＩの８〜１０％を占め、毎年米国において１０万人に６〜２３人の感染者の割合で発生する。侵襲性カンジダ症の主な懸念はその高い死亡率だけでなく、感染患者の入院が３〜１０日と長く、米国においてカンジダ血症に起因し得る総推定コストが１年当たり約１０億ドルとなることである。ポルトガル人口について最近発表された研究は、入院１０００件当たり２．７件の院内真菌血症が発生し、死亡率が３９．３％であることを示した。欧州におけるＩＦＩの発生について発表された別の最近の研究によると、この数は他の欧州諸国において見出された発生件数により近く、米国人口について見出されたものよりかなり低い。別の最近の報告は、スコットランドにおいてカンジダ血症の発生が１年当たり１０万人の人口について４．８件であることを示した。
【００２５】
１９５０年代後期から、命にかかわる真菌感染症の標準的な治療はアムホテリシンＢである。この化合物は真菌細胞膜中のステロールを標的とし、これに結合し、イオン孔を生成し、膜電位の損失およびその後の崩壊をもたらす。もっとも広域スペクトルの殺真菌剤は使用可能ではあるが、その高い毒性および非経口投与の要件はその使用を限定している。
【００２６】
１９９０年代には、トリアゾール、フルコナゾールおよびイトラコナゾールとともに、アムホテリシンＢの脂質製剤が導入された。トリアゾールは、ＣＹＰ−４５０依存性ラノステロール１４α−デメチラーゼの阻害によってエルゴステロールの合成に影響を及ぼすことにより作用し、細胞増殖を妨げ、最終的には細胞死をもたらす。これらの薬剤はアムホテリシンＢに対して明らかな利点を示したが、それらは製剤、活性のスペクトルおよび／または耐性の発現により限定されていた。
【００２７】
２０００年から、拡大スペクトルのトリアゾール（ボリコナゾールおよびポサコナゾール）、およびエキノカンジン（カスポファンギン、ミカファンギンおよびアニデュラファンギン）のような既存の薬剤の強い限定を克服するため、新規抗真菌剤が開発された。エキノカンジンはβ−１，３−Ｄ−グルカンの合成を阻害し、真菌細胞壁の不安定化、細胞溶解、および細胞死をもたらす。それらはカンジダおよびアスペルギルス種に対して生体外で活性であるが、幅広い範囲の他の新興病原性真菌に対しては活性でない。これらの新規薬剤のなかでも、依然として薬物副作用（とくにボリコナゾールについて）、トリアゾールに関する薬物間相互作用、および代替製剤の不足（例えば静注用製剤はポサコナゾールについて不足し、経口製剤はエキノカンジンについて不足している）のような限定がある。
【００２８】
現在入手可能な抗真菌剤もカンジダ・アルビカンス保菌の予防撲滅のためには不十分である。実際、この酵母はバイオフィルム成長能力を示し、これはアゾール、ポリエンおよび５−フルオロサイトシンのような抗真菌剤に対する固有の耐性の増加を示す。この理由のため、カンジダ症は、バイオフィルム成長のため基質として作用し得る留置型医療機器（例えば、歯科インプラント、カテーテル、心臓弁、血管バイパスグラフト、接眼レンズ、人工関節、および中枢神経系シャント）に関連することが多い。カンジダ血症を有する４２７人の継続患者の多施設研究では、カテーテル関連カンジダ血症を有する患者の死亡率は４１％であると見出された。従って、新規抗真菌剤の開発にかかわらず、院内真菌感染症の死亡率は容認できないほど高いままである。さらに、一般的には診断および治療するのがより難しく、より高い死亡率の原因となる、カンジダの非アルビカンス種およびアスペルギルスの非フミガタス種を含む、新規および新興真菌病原体のリストも増えている。
【００２９】
本発明の目的は、これらの問題の解決を試みることであり、とくに例えば低い毒性を有しつつ、ヒト／動物病原体に対して強力で広域スペクトルの活性を有する代替抗微生物剤を提供することである。
【発明の概要】
【００３０】
本発明者らは、驚くべきことに、ルピナス（Ｌｕｐｉｎｕｓ、ハウチワマメ）からのＢｌａｄポリペプチドがヒトまたは動物に病原性である多数の多様な細菌および真菌有機体に対して有効な抗微生物活性を示すことを見出した。本発明者らは、Ｂｌａｄポリペプチドが動物に非毒性であり、従ってＢｌａｄがさまざまな背景においてヒトおよび動物病原体に対する抗微生物剤として用いるのに優れた化合物となることも見出した。
【００３１】
従って、本発明者らは、治療または予防によるヒトまたは動物の体の処置方法において用いられる、Ｂｌａｄまたはその活性変異体を含む抗微生物ポリペプチドを含む組成物を提供する。本発明者らは、微生物による対象中またはその上での感染症の治療または予防方法において用いられる前記組成物も提供する。好適な実施形態では、医薬的に許容可能な担体もしくは希釈剤および／またはキレート剤をさらに含む。好適には、組成物は、対象が易感染性免疫系を有する、または重篤である場合、前記方法において用いられる。
【００３２】
本発明者らは、ヒトまたは動物の体上またはその中ではない場所でヒトまたは動物に病原性である微生物を殺滅する、またはその増殖を阻害するための、Ｂｌａｄまたはその活性変異体を含む抗微生物ポリペプチドを含む組成物の使用も提供する。好適には、前記組成物は、ヒトまたは動物病原性微生物に関して、ヒトもしくは動物により摂取される、もしくは直接その上もしくはその中に配置する物品、またはそれを必要とする表面を消毒するために用いられ、好適には該物品は食品または医療装置もしくは器具であり、該表面は：
（ａ）健康診断、診察もしくは治療が行われる；
（ｂ）食品が調理、取扱もしくは保存される；
（ｃ）個人的な洗浄および／もしくは衛生が行われる；ならびに／または
（ｄ）（ｉ）微生物による感染症に罹患する；および／もしくは
（ｉｉ）医療介入なしに微生物感染症を撃退することができない
という特定のリスクを有する個人がいる
環境中にある。
【００３３】
これらの使用の特定の実施形態では、前記組成物はキレート剤をさらに含む。
【００３４】
特定の実施形態では、微生物は細菌または真菌であり、とくに：
―細菌は以下の属：シュードモナス、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカスおよびサルモネラの１つからの病原性種である；または
―真菌は以下の属：カンジダ、アスペルギルス、アルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびトリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）の１つからの病原性種であり、好適には真菌は侵襲性真菌感染症を引き起こし得、好適にはＣ．アルビカンス、Ａ．フミガタスまたはアルテルナリア・アルテルナタ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ）である。
【００３５】
本発明者らは：
―それを必要とする対象に治療効果的な量のＢｌａｄまたはその活性変異体を含む抗微生物ポリペプチドを含む組成物を投与するステップを含む、ヒトまたは動物の治療方法；
―それを必要とする対象に治療効果的な量のＢｌａｄまたはその活性変異体を含む抗微生物ポリペプチドを含む組成物を投与するステップを含む、微生物による感染症の予防または治療方法；ならびに
―ヒトまたは動物の体上またはその中ではない場所でのヒトまたは動物に病原性である微生物の殺滅、またはその増殖の阻害方法であって、該場所に効果的な量のＢｌａｄまたはその活性変異体を含む抗微生物ポリペプチドを含む組成物を投与するステップを含む、方法
も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）およびシュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）についての時間−殺滅曲線を示す。
【図２】スタフィロコッカス・アウレウス、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｂｔｉｌｉｓ）、Ｐ．アエルギノサおよびＬ．モノサイトゲネスの阻害ハロを示す。
【図３Ａ】Ｃ．アルビカンスの時間−殺滅曲線を示す。
【図３Ｂ】Ｃ．アルビカンスの増殖曲線を示す。
【図４】Ｃ．アルビカンスの増殖曲線を示す。
【図５】集合的にＣ．アルビカンス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）およびＡ．フミガタスの阻害ハロを示す。
【図６】集合的にＣ．アルビカンス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）およびＡ．フミガタスの阻害ハロを示す。
【図７】集合的にＣ．アルビカンス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）およびＡ．フミガタスの阻害ハロを示す。
【図８】集合的にＣ．アルビカンス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）およびＡ．フミガタスの阻害ハロを示す。
【図９】Ｌ．モノサイトゲネス、Ｐ．アエルギノサおよびＣ．アルビカンスの時間−殺滅曲線を示す。
【図１０】ルピナス・アルバス（Ｌｕｐｉｎｕｓ  ａｌｂｕｓ、シロバナハウチワマメ）β−コングルチン前駆体をエンコードする配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を示す。
【図１１】Ｂｌａｄに対応するβ−コングルチン前駆体をエンコードする配列の内部断片（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
Ｂｌａｄ
Ｂｌａｄ（「ｂａｎｄａ  ｄｅ  Ｌｕｐｉｎｕｓ  ａｌｂｕｓ  ｄｏｃｅ」―スイートＬ．アルバスからのバンド）は、β−コングルチン、ルピナス属の種中に存在する主要な貯蔵タンパク質の、安定した中間分解生成物に与えられた名称である。１７３個のアミノ酸残基からなり、ルピナスからのβ−コングルチンの前駆体をエンコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号ＡＡＳ９７８６５で公表される、１７９１個のヌクレオチド）の内部断片（ＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号ＡＢＢ１３５２６で登録される、５１９個のヌクレオチド）によりエンコードされる２０ｋＤのポリペプチドとして特徴づけられる。Ｂｌａｄ末端配列をエンコードするプライマーを用いてゲノムルピナスＤＮＡからの配列を増幅する場合、〜６２０ｂｐの生成物が得られ、Ｂｌａｄをエンコードする遺伝子断片中のイントロンの存在を示す。自然発生Ｂｌａｄは、発芽の開始後４〜１２日の間、ルピナス種の子葉のみに（β−コングルチンの集中的かつ限定的なタンパク質分解の後）蓄積する、２１０ｋＤのグリコオリゴマーの主成分である。前記オリゴマーはグリコシル化しているが、自然発生Ｂｌａｄはグルコシル化していない。Ｂｌａｄ含有グリコオリゴマーは、いくつかのポリペプチドを含み、主なものは１４、１７、２０、３２、３６、４８および５０ｋＤの分子量を示す。２０ｋＤのポリペプチド、Ｂｌａｄは、オリゴマー中でもっとも豊富なポリペプチドであり、レクチン活性を有する唯一のものであると考えられる。自然発生Ｂｌａｄは８日齢の植物体中の総子葉タンパク質の約８０％を占める。
【００３８】
Ｌ．アルバスβ−コングルチン前駆体をエンコードする配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を図１０に示す。β−コングルチン親サブユニットをコードする配列は残基７０〜１６６８に位置する。エンコードされた、５３３個のアミノ酸残基のβ−コングルチン親サブユニット（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）は：
0005934225.tif 000002
である。
【００３９】
Ｂｌａｄに対応するβ−コングルチン前駆体をエンコードする配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）の内部断片を図１１に示す。Ｂｌａｄポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）は：
0005934225.tif 000003
である。
【００４０】
本発明は、Ｂｌａｄまたはその活性変異体を含む抗微生物ポリペプチドを含む組成物に関する。従って、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のポリペプチド配列またはその活性変異体を含む抗微生物ポリペプチドを含む組成物に関する。代替実施形態では、組成物は本質的にＢｌａｄもしくはその活性変異体を含む抗微生物ポリペプチドからなる、および／または抗微生物ポリペプチドは本質的にＢｌａｄもしくはその活性変異体からなる。さらなる実施形態では、Ｂｌａｄまたはその活性変異体を含む（または本質的にこれらからなる）抗微生物ポリペプチドは分離形態で用いることができる。
【００４１】
Ｂｌａｄの活性変異体は、抗微生物剤として作用する能力を保持する（すなわち、抗微生物活性を有する―こうした活性のレベルおよびどのように測定するかの説明は以下参照）Ｂｌａｄの変異体である。「Ｂｌａｄの活性変異体」は、その範囲内に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の断片を含む。好適な実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の長さの少なくとも１０％、好適には少なくとも２０％、好適には少なくとも３０％、好適には少なくとも４０％、好適には少なくとも５０％、好適には少なくとも６０％、好適には少なくとも７０％、好適には少なくとも８０％、好適には少なくとも９０％、もっとも好適にはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の長さの少なくとも９５％であるものが選択される。Ｂｌａｄまたはその変異体は一般的には、少なくとも１０個のアミノ酸残基、例えば少なくとも２０、２５、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０または１７３個のアミノ酸残基の長さを有する。
【００４２】
「Ｂｌａｄの活性変異体」は、その範囲内に、例えば全配列について、または少なくとも２０個、好適には少なくとも３０個、好適には少なくとも４０個、好適には少なくとも５０個、好適には少なくとも６０個、好適には少なくとも８０個、好適には少なくとも１００個、好適には少なくとも１２０個、好適には少なくとも１４０個、もっとも好適には少なくとも１６０個以上の隣接するアミノ酸残基の領域について、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４との相同性、例えば少なくとも４０％の同一性、好適には少なくとも６０％、好適には少なくとも７０％、好適には少なくとも８０％、好適には少なくとも８５％、好適には少なくとも９０％、好適には少なくとも９５％、好適には少なくとも９７％、もっとも好適には少なくとも９９％同一性を有するポリペプチド配列も含む。タンパク質相同性の測定方法は当技術分野において周知であり、当業者であれば、本文脈では相同性はアミノ酸同一性（「ハード相同性」と称されることもある）に基づいて計算されることを理解するだろう。
【００４３】
相同活性Ｂｌａｄ変異体は一般的には、置換、挿入または削除、例えば１、２、３、４、５〜８個以上の置換、挿入または削除によりＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のポリペプチド配列とは異なる。置換は好適には「保守的」である、すなわちアミノ酸を同様のアミノ酸で置換することができ、それによって同様のアミノ酸は以下の群：芳香族残基（Ｆ／Ｈ／Ｗ／Ｙ）、非極性脂肪族残基（Ｇ／Ａ／Ｐ／Ｉ／Ｌ／Ｖ）、極性非荷電脂肪族（Ｃ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｎ／Ｑ）および極性荷電脂肪族（Ｄ／Ｅ／Ｋ／Ｒ）の１つを共有する。好適な亜群は：Ｇ／Ａ／Ｐ；Ｉ／Ｌ／Ｖ；Ｃ／Ｓ／Ｔ／Ｍ；Ｎ／Ｑ；Ｄ／Ｅ；およびＫ／Ｒを含む。
【００４４】
（上述のような）Ｂｌａｄまたはその活性変異体を含む抗微生物ポリペプチドは、Ｎ末端および／またはＣ末端にいずれかの数のアミノ酸残基を付加したＢｌａｄまたはその活性変異体からなり得るが、ただしポリペプチドは抗微生物活性を保持する（同様に、こうした活性のレベルおよびこれをどのように測定するかの説明は以下参照）。好適には、３００個以下のアミノ酸残基、より好適には２００個以下のアミノ酸残基、好適には１５０個以下のアミノ酸残基、好適には１００個以下のアミノ酸残基、好適には８０個、６０個または４０個以下のアミノ酸残基、もっとも好適には２０個以下のアミノ酸残基をＢｌａｄまたはその活性変異体の一端または両端に付加する。
【００４５】
（上述のような）Ｂｌａｄまたはその活性変異体を含む（または本質的にこれからなる）抗微生物ポリペプチドは、本発明において（例えば植物、動物または微生物供給源から取り出した）精製および／または組換えタンパク質の形態で用いることができる。組換え形態の製造はＢｌａｄの活性変異体の製造を可能にする。
【００４６】
自然発生Ｂｌａｄの精製方法は当技術分野においてすでに説明されている（例えばＲａｍｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔａ  ２０３（１）：２６−３４およびＭｏｎｔｅｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ５（１）：ｅ８５４２）。自然発生Ｂｌａｄの適切な供給源は、好適には発芽の開始後約４〜約１４日の間に採取された、より好適には発芽の開始後約６〜約１２日の間（例えば発芽の開始から８日後）に採取された、ルピナス・アルバスのようなルピナス属の植物、好適には該植物の子葉である。当技術分野では、Ｂｌａｄを含む粗抽出物をもたらす総タンパク質抽出方法、およびこうした抽出物の、例えばＢｌａｄを含むＢｌａｄ含有グリコオリゴマーを含む部分精製抽出物をもたらすタンパク質精製方法が開示されている。Ｂｌａｄそのものを分離するには、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび／または、好適にはＣ−１８カラム上での逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣを用いることができる。
【００４７】
Ｂｌａｄを含むグリコオリゴマーを含む部分精製抽出物を得る代替方法は、Ｂｌａｄのキチン結合活性を用いることである。グリコオリゴマーは、キチン親和性クロマトグラフィー精製の一部として、キチンカラムと非常に強く結合し、０．０５ＮのＨＣｌで溶離される。この精製方法の一例の詳細は以下のとおりである：
【００４８】
８日齢のルピナス属植物から子葉を採取し、１０ｍＭのＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２を含有するＭｉｌｌｉ−Ｑ  ｐｌｕｓ水（ｐＨは８．０に調節）中に均質化する。そのホモジェネートをチーズクロスに通してろ過し、４℃で、１時間３０，０００ｇで遠心分離する。ペレットをその後、１０％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡおよび１０ｍＭのＥＧＴＡを含有するｐＨ７．５の１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝剤中に懸濁させ、４℃で１時間撹拌し、４℃で、１時間３０，０００ｇで遠心分離する。浮遊物に含まれる総グロブリン画分を硫酸アンモニウム（５６１ｇ／ｌ）で沈殿させ、冷却しながら１時間撹拌しつづけ、４℃で、３０分間３０，０００ｇで遠心分離する。得られたペレットを、ｐＨ７．５の５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝剤に溶解し、同じ緩衝剤で平衡化したＰＤ−１０カラム中で脱塩し、同じ緩衝剤で予め平衡化したキチン親和性クロマトグラフィーカラムに通す。カラムをｐＨ７．５の５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝剤で洗浄し、結合タンパク質を０．０５ＮのＨＣｌで溶離する。溶離した画分をすぐに２Ｍのトリスで中和し、ピーク画分を溜め、凍結乾燥させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。
【００４９】
キチンカラムの製造について、粗キチンをＳｉｇｍａから入手し、以下のとおり処理する：キチン試料をＭｉｌｌｉ−Ｑ  ｐｌｕｓ水のみで、その後０．０５ＮのＨＣｌで洗浄する。次に１％（ｗ／ｖ）の炭酸ナトリウムで、次にエタノールで、洗浄剤の吸収度が０．０５未満になるまで洗浄する。キチンを次にピペット先端に充填し、ｐＨ７．５の５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝剤で平衡化する。
【００５０】
組換えタンパク質の製造方法は当技術分野において周知である。ここで適用されるこうした方法は、Ｂｌａｄまたはその活性変異体を含むポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを適切な発現ベクターに挿入するステップ、該ポリヌクレオチドの１つ以上のプロモーター（例えばＴ７ｌａｃのような誘導性プロモーター）との、および対象の他のポリヌクレオチドまたは遺伝子との並置を可能にするステップ、発現ベクターを適切な細胞または有機体（例えばエシェリキア・コリ）中に導入するステップ、形質転換細胞または有機体においてポリペプチドを発現するステップ、ならびに発現した組換えポリペプチドをその細胞または有機体から取り出すステップを含む。こうした精製を補助するため、発現ベクターは、ポリヌクレオチドが、例えば精製を補助することができる末端タグ：例えば、親和性精製のためのヒスチジン残基のタグをさらにエンコードするように構成することができる。組換えポリペプチドを精製した後、精製タグは、例えばタンパク質分解開裂により、ポリペプチドから取り出すことができる。
【００５１】
Ｂｌａｄまたはその活性変異体を含む（または本質的にこれからなる）抗微生物ポリペプチドを含む組成物では、該ポリペプチドは好適には部分精製形態、より好適には精製形態である。前記ポリペプチドは、これに自然と関連する１つ以上の他のポリペプチドを有さない環境中に存在する、および／または存在する総タンパク質の少なくとも約１０％に相当する場合、部分精製である。前記ポリペプチドは、これに自然と関連する他のポリペプチドをすべて、またはほとんどの有さない環境中に存在する場合、精製である。例えば、精製Ｂｌａｄとは、Ｂｌａｄが組成物中の総タンパク質の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％に相当することを意味する。
【００５２】
Ｂｌａｄまたはその活性変異体を含む（または本質的にこれからなる）抗微生物ポリペプチドを含む組成物では、ルピナスタンパク質分は本質的にＢｌａｄまたはその活性変異体を含む（または本質的にこれからなる）ポリペプチドを含むＢｌａｄ含有グリコオリゴマーからなり得る。
【００５３】
Ｂｌａｄを含む（または本質的にこれからなる）抗微生物ポリペプチドを含む組成物は、当業者により組成物に添加された別の化合物を含む製剤とすることもできる。好適な実施形態では、こうした製剤は、Ｂｌａｄおよび医薬的に許容可能な担体または希釈剤を含む（または本質的にこれらからなる）抗微生物ポリペプチドを含む医薬品製剤である。
【００５４】
微生物標的
本発明は、抗微生物化合物としての、すなわちヒトまたは動物に病原性である微生物の増殖を阻害する、またはこれを殺滅するための、Ｂｌａｄの使用に関する。こうした微生物としては、とくに細菌および真菌が挙げられる。こうした病原性微生物は、ヒトおよび／または動物において感染症またはその他の健康障害（例えば食中毒、アレルギー）を引き起こし得、例えば、目、皮膚、熱傷、創傷、上気道管、肺、胃腸管、尿生殖器管、腎臓、肝臓、神経系および／または心血管系（例えば血流）に影響を及ぼし、またはこれらを感染させ得る。こうした病原性微生物は本来病原性であり得、または日和見性であり得る（すなわち健康な宿主では疾患を引き起こさないが、易感染性免疫系を有する宿主では疾患を引き起こし得る）。こうした病原性微生物は、ヒトまたは動物に毒性である化合物を放出することにより、追加で、または代わりに健康障害を引き起こし得る。
【００５５】
Ｂｌａｄは、グラム陽性およびグラム陰性細菌病原体の両方に対する抗微生物剤として用いることができる。とくに好適な細菌標的としては、病原性シュードモナス種、例えばＰ．アエルギノサ、シュードモナス・オリジハビタンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓ）およびシュードモナス・プレコグロシシダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｌｅｃｏｇｌｏｓｓｉｃｉｄａ）（もっとも好適にはＰ．アエルギノサ）、病原性リステリア種、例えばＬ．モノサイトゲネスおよびリステリア・イバノビ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ）（もっとも好適にはＬ．モノサイトゲネス）、病原性バチルス種、例えばＢ．サブチリス、バチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）およびバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）（もっとも好適にはＢ．サブチリス）、病原性スタフィロコッカス種、例えばＳ．アウレウス（メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス［ＭＲＳＡ］を含む）、スタフィロコッカス・シュードインテルメジウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、スタフィロコッカス・シュライフェリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ）およびスタフィロコッカス・カプラエ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｒａｅ）（もっとも好適にはＳ．アウレウス）、病原性サルモネラ種、例えばサルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）亜種、例えばサルモネラ・アリゾナエ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ａｒｉｚｏｎａｅ）サルモネラ・コレラスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、サルモネラ・パラチフィＡ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ）、サルモネラ・パラチフィＢ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ｂ）、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・ダブリン（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｄｕｂｌｉｎ）、サルモネラ・チフフィスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｓｕｉｓ）およびサルモネラ・ブランデンブルグ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｂｒａｎｄｅｎｂｕｒｇ）（もっとも好適にはＳ．エンテリティディスまたはＳ．チフィスイス）、ならびに病原性カンピロバクター種、例えばカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）およびカンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉ）（もっとも好適にはＣ．ジェジュニ）が挙げられる。好適な実施形態では、Ｂｌａｄは、全身性炎症および敗血症（例えばＰ．アエルギノサ）、コレラ（例えばＶ．コレラエ）、髄膜炎（例えばＬ．モノサイトゲネス、ヘモフィルス・インフルエンザ��ｂ型、ナイセリア・メニンギティディス、またはストレプトコッカス・ニューモニエ）、肺炎（例えばＳ．ニューモニエ、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）またはＳ．アウレウス）、細菌性赤痢（例えばシゲラ・ボイディ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ）、シゲラ・ディセンテリエ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、シゲラ・フレクスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、シゲラ・ソネイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ））、連鎖球菌性咽頭炎（例えばストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、結核（例えばマイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、マイコバクテリウム・アフリカヌム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、マイコバクテリウム・カネッティ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｎｅｔｔｉ）およびマイコバクテリウム・ミクロティ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｃｒｏｔｉ））、チフス（Ｓ．チフィ）、または食中毒（例えば以下の属：リステリア、スタフィロコッカスおよびサルモネラの１つからの病原性種）を引き起こし得る病原体に対して用いられる。
【００５６】
Ｂｌａｄは、単細胞（酵母）および多細胞（糸状）真菌病原体の両方に対する抗微生物剤として用いることができる。とくに好適な真菌標的としては、病原性カンジダ種、例えばＣ．アルビカンス、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・ルシタニエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｕｓｉｔａｎｅａｅ）、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・クルセイおよびカンジダ・ドゥブリニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ）、病原性アルテルナリア種、例えばＡ．アルテルナタおよびアルテルナリア・モレスタ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｍｏｌｅｓｔａ）、病原性アスペルギルス種、例えばＡ．フミガタス、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）およびアスペルギルス・クラバタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｌａｖａｔｕｓ）、病原性フザリウム種、例えばフザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ベルチシリオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ）、およびフザリウム・プロリフェラツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ）、病原性クリプトコッカス種、例えばクリプトコッカス・ネオフォルマンス、クリプトコッカス・ラウレンティ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｕｒｅｎｔｉｉ）、クリプトコッカス・アルビダス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｉｄｕｓ）およびクリプトコッカス・ガッティ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｔｔｉｉ）、ならびに病原性トリコスポロン種、例えばトリコスポロン・オボイデス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｏｖｏｉｄｅｓ）、トリコスポロン・インキン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｉｎｋｉｎ）、トリコスポロン・アサヒ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓａｈｉｉ）、トリコスポロン・ムコイデス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｍｕｃｏｉｄｅｓ）、トリコスポロン・アステロイデス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、およびトリコスポロン・クタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｃｕｔａｎｅｕｍ）（すべて以前はトリコスポロン・ベイゲリ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｂｅｉｇｅｌｉｉ）の一般名で認識されていた）、トリコスポロン・デルマチス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｄｅｒｍａｔｉｓ）、トリコスポロン・ドハエンセ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｄｏｈａｅｎｓｅ）およびトリコスポロン・ロウビエリ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｌｏｕｂｉｅｒｉ）が挙げられる。好適な実施形態では、Ｂｌａｄは、（表層、局所、良性、自己限定性真菌性疾患とは対照的に）重篤である、および／または命にかかわる場合の多い全身性および内臓真菌感染症と通常定義される、侵襲性真菌感染症（ＩＦＩ）を引き起こし得る病原体に対して用いられる。とくに好適なＩＦＩを引き起こす真菌としては、上記で定義したような病原性カンジダ、アスペルギルスまたはアルテルナリア種、好適にはＣ．アルビカンス、Ａ．フミガタスまたはＡ．アルテルナタ、もっとも好適にはＣ．アルビカンスまたはＡ．フミガタスが挙げられる。
【００５７】
当業者であれば、日常的な方法によって、いずれかの特定の背景において抗微生物剤としてＢｌａｄ（またはその活性変異体）を含む（または本質的にこれからなる）抗微生物ポリペプチドを用いるのに適した濃度を識別することができるだろう。好適には、例えば、Ｂｌａｄは少なくとも１μｇ／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも２０μｇ／ｍｌ、少なくとも５０μｇ／ｍｌ、または少なくとも１００μｇ／ｍｌ、および５００μｇ／ｍｌまで、６００μｇ／ｍｌまで、１ｍｇ／ｍｌまで、２．５ｍｇ／ｍｌまで、５ｍｇ／ｍｌまでまたは１０ｍｇ／ｍｌまでの濃度で用いられる。好適には、選択されるＢｌａｄの濃度は１０μｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ、より好適には５０μｇ／ｍｌ〜２．５ｍｇ／ｍｌ、より好適には１００μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ、さらにより好適には１００μｇ／ｍｌ〜６００μｇ／ｍｌ（例えば約２５０μｇ／ｍｌ）である。本発明者らは、Ｂｌａｄが少なくとも４００μｇ／ｍｌまでは宿主に非毒性である証拠（実施例４および５を参照）を提供した。
【００５８】
本発明者らは、驚くべきことに、Ｂｌａｄのキレート剤（例えばＥＤＴＡ）との組み合わせが相乗的な抗微生物効果を生むことを見出した。従って、好適には、キレート剤はＢｌａｄ（またはその活性変異体）を含む（または本質的にこれからなる）ポリペプチドの抗微生物活性を向上させるのに用いられ、こうしたキレート剤の使用は特定のレベルの抗微生物活性を達成するのに必要な前記抗微生物ポリペプチドの濃度を低下させることができる。キレート剤（別名、金属イオン封鎖剤）は、金属イオンと結合し、非共有複合体を形成し、イオンの活性を低減するいずれかの化合物である。適切なキレート剤としては、ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）およびＥＧＴＡ（エチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸）のようなポリアミノカルボキシレートが挙げられる。好適には、ＥＤＴＡはキレート剤として、好適には少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも５０μｇ／ｍｌ、または少なくとも１００μｇ／ｍｌ、および５００μｇ／ｍｌまで、１ｍｇ／ｍｌまで、５ｍｇ／ｍｌまで、１０ｍｇ／ｍｌまで、または２０ｍｇ／ｍｌまでの濃度で用いられる。好適には、ＥＤＴＡは０．１ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの濃度で用いられる。
【００５９】
成果
Ｂｌａｄ（またはその活性変異体）を含む（または本質的にこれからなる）抗微生物ポリペプチドを用い、ヒト／動物病原性微生物の増殖を阻害する（静微生物活性を有することを意味する）、および／または該微生物を殺滅する（殺微生物活性を有することを意味する）ことができる。当業者であれば、微生物のとくに所望の増殖阻害または殺滅を達成するのに適した用量および／または濃度を識別することができる。
【００６０】
好適には、静微生物剤として用いる場合、抗微生物ポリペプチドは、抗微生物ポリペプチドが存在しない同等の条件と比べて、増殖率を１０％、より好適には５０％、より好適には７５％、より好適には９０％、より好適には９５％、より好適には９８％、より好適には９９％、さらにより好適には９９．９％低減する。もっとも好適には、抗微生物ポリペプチドは微生物のいかなる増殖も予防する。
【００６１】
好適には、殺微生物剤として用いる場合、抗微生物ポリペプチドは、抗微生物ポリペプチドが存在しない同等の条件と比べて、微生物の集団の１０％、より好適には該集団の５０％、より好適には該集団の７５％、より好適には該集団の９０％、より好適には該集団の９５％、より好適には該集団の９８％、より好適には該集団の９９％、さらにより好適には該集団の９９．９％を殺滅する。もっとも好適には、抗微生物ポリペプチドは微生物の集団のすべてを殺滅する。
【００６２】
ヒトまたは動物中またはその上で感染症を予防または治療するのに用いる場合、抗微生物ポリペプチドは好適には治療効果的な量、すなわち、臨床的に検出可能なレベルの感染症予防または撲滅が達成されるようなレベルの増殖阻害および／または殺滅をもたらす量で用いられる。好適には、治療効果的な量の抗微生物ポリペプチドはヒトまたは動物の対象に非毒性である。前記治療効果的な量の抗微生物ポリペプチドは、抗微生物ポリペプチドを含む組成物の一部として投与される場合に治療効果的であることを意図している。
【００６３】
本発明者らは、驚くべきことに、同様の濃度（質量による）で、Ｂｌａｄが（殺真菌および静真菌活性に関して）Ｃ．アルビカンスおよびＡ．フミガタスに対してほぼアムホテリシンＢと同様に強力であり、フルコナゾールより強力であることを見出した。これは、（ｉ）ＢｌａｄがアムホテリシンＢおよびフルコナゾールの比較的小さい有機分子と比べてかなり大きな分子量を有すること、ならびに（ｉｉ）Ｂｌａｄの性質がヒトおよび他の動物に非毒性であり、食用であることを考えると、顕著な結果である。
【００６４】
医療使用および方法
本発明者らは、治療または予防によるヒトまたは動物の体の処置方法において用いられる、Ｂｌａｄまたはその活性変異体を含む抗微生物ポリペプチドを含む組成物を提供する。この目的のため、彼らは、それを必要とする対象に治療効果的な量のＢｌａｄまたはその活性変異体を含む抗微生物ポリペプチドを含む組成物を投与するステップを含む、ヒトまたは動物の治療方法も提供する。
【００６５】
本発明者らは、微生物によるヒトまたは動物の対象中またはその上での感染症の予防または治療方法において用いられる、Ｂｌａｄまたはその活性変異体を含む抗微生物ポリペプチドを含む組成物も提供する。この目的のため、彼らは；
―それを必要とする対象に治療効果的な量のＢｌａｄまたはその活性変異体を含む抗微生物ポリペプチドを含む組成物を投与するステップを含む、微生物による感染症の予防または治療方法；ならびに
―Ｂｌａｄまたはその活性変異体を含む抗微生物ポリペプチドを含む組成物の、微生物によるヒトまたは動物の対象中またはその上での感染症の予防または治療のための薬剤の製造における使用
も提供する。
【００６６】
前記組成物は、注射（例えば皮内、皮下、筋肉内、静脈内、骨内、および腹腔内）、経皮粒子送達、吸引、局所、経口、または経粘膜（例えば鼻、舌、膣または腸）投与することができる。
【００６７】
好適には、前記組成物は医薬的に許容可能な担体または希釈剤を含む。こうした医薬組成物は従来の医薬製剤として製剤することができる。これは、当業者に利用可能な標準的な医薬製剤化学および方法を用いて行うことができる。例えば、Ｂｌａｄ（またはその活性変異体）を含む抗微生物ポリペプチドを１つ以上の医薬的に許容可能な担体または希釈剤と組み合わせ、液体製剤をもたらすことができる。湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質等のような、補助物質も存在し得る。
【００６８】
担体、希釈剤および補助物質は一般的には、過度の毒性なしに投与することができ、そのものとしては組成物を受け入れる個体において免疫応答を誘発しない医薬品である。医薬的に許容可能な担体としては、これらに限定されないが、水、食塩水、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、グリセロールおよびエタノールのような液体が挙げられる。医薬的に許容可能な塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、等のような鉱酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩、等のような有機酸の塩もその中に含むことができる。必要ではないが、製剤は、安定剤として作用し、とくにＢｌａｄのようなポリペプチドを含む組成物について有利な、医薬的に許容可能な担体を含有することも好ましい。ポリペプチドの安定剤としても作用する適切な担体の例としては、限定なしに、医薬品グレードのデキストロース、スクロース、ラクトース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストラン、等が挙げられる。他の適切な担体としては、同様に限定なしに、デンプン、セルロース、リン酸ナトリウムまたはカルシウム、クエン酸、酒石酸、グリシン、高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００６９】
製剤後、組成物は、さまざまな既知の経路および技術を用いて対象に生体内で送達させることができる。例えば、液体製剤は注射溶液、懸濁液またはエマルジョンとして提供し、従来の針および注射器を用いる、または液体ジェット注射システムを用いる、非経口、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、骨内または腹腔内注射によって投与することができる。液体製剤は、目、皮膚、毛髪もしくは粘膜組織（例えば鼻、舌、膣もしくは腸）に局所投与する、または経呼吸器もしくは経肺投与に適した微細噴霧として提供することもできる。他の投与形態としては、経口投与、坐剤、および活性または不活性経皮送達技術が挙げられる。好適な実施形態では、抗微生物ポリペプチドは局所ローション、ハンドクリーム、目薬、シャンプーまたはコンディショナーとして適した組成物に製剤される。
【００７０】
抗微生物ポリペプチドを必要とする対象は、いずれかのヒトまたは動物の個体とすることができる。好適な実施形態では、抗微生物ポリペプチドを用い、若者（例えば年齢が５歳、３歳、２歳、１歳、６か月または１か月未満の個人のような、年齢が１６歳未満の個人）、高齢者（例えば年齢が８０歳または９０歳超の個人のような、年齢が７０歳超の個人）、易感染性免疫系を有する人々（先天性免疫不全を有する人々、後天性免疫不全を有する人々（例えばエイズを有する人々）および化学療法または免疫抑制薬剤の投与のような治療の結果として抑制された免疫系を有する人々）、重篤な人々、または病原性微生物への曝露の可能性がとくに高い人々（例えば医療専門家）のような、微生物による感染症に罹患するという特定のリスクを有する対象における感染症を予防すること、および／または医療介入なしに微生物感染症を撃退することができないという特定のリスクを有する対象における感染症を治療することができる。
【００７１】
他の抗微生物剤の使用および方法
本発明者らは、ヒトまたは動物の体上またはその中ではない場所でヒトまたは動物に病原性である微生物を殺滅する、またはその増殖を阻害するための、Ｂｌａｄまたはその活性変異体を含む抗微生物ポリペプチドを含む組成物の使用も提供する。この目的のため、彼らは、ヒトまたは動物の体上またはその中ではない場所でのヒトまたは動物に病原性である微生物の殺滅、またはその増殖の阻害方法も提供するが、該方法は該場所に効果的な量のＢｌａｄまたはその活性変異体を含む抗微生物ポリペプチドを含む組成物を投与するステップを含む。前記効果的な量は、検出可能なレベルの微生物の保菌の予防または撲滅が達成されるようなレベルの微生物の増殖阻害および／または殺滅をもたらす量である。好適には、効果的な量の抗微生物ポリペプチドはヒトまたは動物の対象に非毒性である。前記効果的な量の抗微生物ポリペプチドは抗微生物ポリペプチドを含む組成物の一部として投与される場合に効果的であることを意図している。
【００７２】
これらの実施形態では、ヒトもしくは動物が摂取する、もしくはその上もしくはその中に直接配置する物品上、またはそれを必要とする表面（例えばヒトまたは動物と直接または間接的に接触し得る表面）上での病原性微生物の増殖を予防する、および／またはこれを殺滅するため、
（ｉ）ヒトもしくは動物が該病原性微生物に感染する；または
（ｉｉ）ヒトまたは動物が病原性微生物により放出される毒素と接触する
リスクを低減するように、抗微生物ポリペプチドを消毒剤として用いることを意図している。
【００７３】
好適な実施形態では、抗微生物ポリペプチドは、食品上もしくはその中のヒト／動物病原性微生物の増殖を予防する、または食品上もしくはその中にすでに存在するヒト／動物病原性微生物を殺滅するため、食品中またはその上で用いられる。この場合、抗微生物ポリペプチドを用い、ヒトもしくは動物が病原性微生物に感染する、またはヒトもしくは動物が食品を摂取した結果として病原性微生物から放出される毒素を摂取するリスクを低減することができる。これらの実施形態では、前記病原性微生物が（例えば直接または放出毒素によって）食中毒を引き起こし得ることがとくに好適である。食品の語により、栄養または楽しみを理由に消費されるいずれかの液体または固体物質を意味することを意図している。抗微生物ポリペプチドを含む組成物は、例えば、食品の調理中に食品の他の成分と混合することができ、または例えば、食品の表面に（例えば液体膜または噴霧として）用いてもよい。これらの実施形態において考慮される特定の食品としては、水、フルーツジュースのようなソフトドリンク、アルコールドリンク、生肉、調理鳥肉、卵、ミルク、クリーム、アイスクリーム、チーズ、生野菜および果物、加工食品（とくに例えばＬ．モノサイトゲネス、Ｖ．コレラエ、病原性スタフィロコッカス種、病原性サルモネラ種および病原性カンピロバクター種に関する）、ナッツ、ならびにパン、米および芋のようなデンプン質食品（とくに病原性アスペルギルス種に関する）が挙げられる。
【００７４】
代替の好適な実施形態では、抗微生物ポリペプチドは医療装置または器具―診断、治療または手術機能を行うために体の上またはその中に配置するいずれかの装置―例えば人工生体組織、ペースメーカー、ステント、スカフォード、弁、温度計、注射器、皮下注射針、モニター装置、人工呼吸器、除細動器、人工心肺、ＥＥＧおよびＥＣＧユニット、超音波装置、ドリル、ノコギリ、ナイフ、外科用メス、トング、ハサミ、クリップ、ステッチ等内またはその上に用いられる。こうした方法では、抗微生物ポリペプチドを用い、医療手順中に装置または器具と接触する体の感染症を予防することができる。
【００７５】
代替の好適な実施形態では、抗微生物ポリペプチドはそれを必要とする表面（例えばヒトまたは動物と直接または間接的に接触し得る表面）上に用いられる。抗微生物ポリペプチドを用いることができる表面は：
（ａ）健康診断、診察もしくは治療が行われる；
（ｂ）食品が調理、取扱もしくは保存される；
（ｃ）個人的な洗浄および／もしくは衛生が行われる；ならびに／または
（ｄ）（ｉ）微生物による感染症に罹患する；および／もしくは
（ｉｉ）医療介入なしに微生物感染症を撃退することができない
という特定のリスクを有する個人（こうした人々の例は上述した）がいる環境中にあり得る。
こうした表面の例としては、食品工場内のいずれかおよび食品スーパーマーケット内の棚／ベンチが挙げられる。
【００７６】
抗微生物ポリペプチドを用いることができる表面は、建物（またはその部屋）の床もしくは壁または該部屋または建物内の物品の表面とすることができる。想定される特定の建物としては、病院および他の医療施設、学校および他の保育施設、介護施設、レストランおよび他の飲食店、食品調理、加工および／または保存場所（例えば市場、食品店、スーパーマーケット、および食品工場）、ならびに個人の住所が挙げられる。想定される特定の部屋としては、医療現場内のものすべて、とくに手術室、事故および救急部、集中治療および患者病棟、ならびに台所、浴室、トイレ、レストランおよび食品調理／加工ホールが挙げられる。
【実施例】
【００７７】
以下の実施例では、ＢＬＡＤは、Ｒａｍｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔａ  ２０３（１）：２６−３４：文献のＭａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓセクションの“Ｐｌａｎｔ  ｍａｔｅｒｉａｌ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ”および“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ”部分参照、に従って精製した２０ｋＤのＢｌａｄポリペプチドを含む自然発生Ｂｌａｄ含有グリコオリゴマーを示す。
【００７８】
定義：
ＭＩＣ―最小阻害濃度：微生物の目に見える増殖を阻害するもっとも低い抗微生物剤の濃度
ＭＦＣ／ＭＢＣ―最小殺真菌／殺細菌濃度（または最小致死濃度）：標準の条件下、２４時間後に初期接種の９９．９％を殺滅するのに必要なもっとも低い抗微生物剤の濃度
時間−殺滅曲線：制御された条件下での一定の時間にわたる１つ以上の抗微生物剤による分離株の「殺滅」の測定は、時間−殺滅方法として知られる。これは、固定接種の殺滅の速度を、特定の時間間隔で、対照（有機体、薬剤なし）および抗微生物剤含有チューブまたはフラスコをサンプリングし、各サンプルを寒天板上に分散させ、生存コロニー数（ｃｆｕ／ｍｌ）を測定することにより測定する、ブイヨン培地の方法である。
【実施例１】
【００７９】
ＢＬＡＤの殺細菌活性
［各種細菌種についてのＢＬＡＤのＭＩＣおよびＭＢＣ（ミューラー・ヒントン培地を用いる）］
【表１】
0005934225.tif 000004
【００８０】
（Ａ）リステリア・モノサイトゲネスおよび（Ｂ）シュードモナス・アエルギノサでのＢＬＡＤの時間−殺滅曲線：図１を参照されたい。
【００８１】
Ｌ．モノサイトゲネスおよびＰ．アエルギノサに対して、ＢＬＡＤは１００μｇ／ｍｌで静細菌性であり、２５０μｇ／ｍｌで殺細菌性である。
【００８２】
（Ａ）スタフィロコッカス・アウレウス、（Ｂ）バチルス・サブチリス、（Ｃ）シュードモナス・アエルギノサ、および（Ｄ）リステリア・モノサイトゲネスに対するＢＬＡＤの阻害ハロデータ：図２を参照されたい。
【００８３】
ＰＣＡ上でのすべての試験した細菌種の増殖は、処理ディスク上のＢＬＡＤ量を２０μｇ（右下のディスク）から１００μｇ（左下のディスク）まで、および２００μｇ（上のディスク）まで増加させることによりますます阻害された（２４時間培養―効果は数日間見られた）。
【実施例２】
【００８４】
ＢＬＡＤの殺真菌活性
［カンジダ種についてのＢＬＡＤのＭＩＣおよびＭＦＣ（ＲＰＭＩ培地を用いる）］
【表２】
0005934225.tif 000005
【００８５】
［カンジダ種についてのＢＬＡＤのＭＩＣおよびＭＦＣ（ｐＨ７．５のＰＤＢ培地を用いる）］
【表３】
0005934225.tif 000006
【００８６】
［各種糸状菌についてのＢＬＡＤのＭＩＣおよびＭＦＣ（ＲＰＭＩ培地を用いる）］
【表４】
0005934225.tif 000007
備考―クリプトコッカス・ネオフォルマンスのＭＩＣは０．２５〜１．０μｇ／ｍｌと測定された。
【００８７】
ＰＤＢ培地におけるカンジダ・アルビカンスでのＢＬＡＤの時間−殺滅曲線（Ａ）および増殖曲線（Ｂ）：図３を参照されたい。
【００８８】
Ｃ．アルビカンスに対して、ＢＬＡＤは１０μｇ／ｍｌで静真菌性であり、１００μｇ／ｍｌで殺真菌性である。
【００８９】
ｐＨ７のＰＤＢ培地におけるカンジダ・アルビカンスでのＢＬＡＤの増殖曲線：図４を参照されたい。
【００９０】
Ｃ．アルビカンスに対して、ＢＬＡＤおよびアムホテリシンＢは１０μｇ／ｍｌで静真菌性である。１００μｇ／ｍｌではフルコナゾールはほとんど増殖を遅延しない。
【００９１】
カンジダ・アルビカンスに対する（ＡおよびＢ）ＢＬＡＤならびに（Ｃ）アムホテリシンＢまたはフルコナゾールの阻害ハロデータ：図５を参照されたい。
【００９２】
ｐＨ７．５のポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）（３日培養）上でのＣ．アルビカンスの増殖は、処理ディスク上のＢＬＡＤ量を２０μｇ（Ａ、下のディスク）から５０μｇ（Ｂ、下のディスク）まで、１００μｇ（Ｂ、上のディスク）までおよび２００μｇ（Ａ、上のディスク）まで増加させることにより阻害された。これは２０μｇのアムホテリシンＢ（Ｃ、上のディスク）および２５μｇのフルコナゾール（Ｃ、下のディスク）で達成される阻害よりも非常に好ましい。
【００９３】
（Ａ）ＰＤＡおよび（Ｂ）ｐＨ７．５のＰＤＡ（３日培養）上のクリプトコッカス・ネオフォルマンスに対するＢＬＡＤの阻害ハロデータ：図６を参照されたい。
【００９４】
Ｃ．ネオフォルマンスの増殖は、ＰＤＡ上ではより効果が大きいが、両方の培地上で処理ディスク上のＢＬＡＤ量を増加させることにより阻害された。Ｉ―上のディスク２００μｇ、下のディスク１０μｇ；ＩＩ―左上のディスク５０μｇ、右上のディスク２０μｇ、下のディスク１００μｇ。
【００９５】
（Ａ）ミューラー・ヒントン培地（ｒｕｌｅ  Ｍ４４−Ａ）、（Ｂ）ＰＤＡまたは（Ｃ）ｐＨ７．５のＰＤＡ（３日培養）上でのアスペルギルス・フミガタスに対するＢＬＡＤの阻害ハロデータ：図７を参照されたい。左のパネルは上から見たプレートを示し；右のパネルは下から見たプレートを示す。
【００９６】
Ａ．フミガタスの増殖は、ｐＨ７．５のＰＤＡ上ではより効果が大きいが、処理ディスク上のＢＬＡＤ量を増加させることにより、すべての培地上で阻害された。Ｉ―上のディスク２００μｇ、下のディスク１０μｇ；ＩＩ―左上のディスク５０μｇ、右上のディスク２０μｇ、下のディスク１００μｇ。
【００９７】
ｐＨ７．５のＰＤＡ（６日培養）上でのアスペルギルス・フミガタスに対する（ＡおよびＢ）ＢＬＡＤならびに（Ｃ）アムホテリシンＢまたはフルコナゾールの阻害ハロデータ：図８を参照されたい。
【００９８】
ｐＨ７．５のＰＤＡ上でのＡ．フミガタスの増殖は、処理ディスク上のＢＬＡＤ量を２０μｇ（Ａ、下のディスク）から５０μｇ（Ｂ、下のディスク）まで、１００μｇ（Ｂ、上のディスク）まで、および２００μｇ（Ａ、上のディスク）まで増加させることにより阻害された。これは１０ｍｇのアムホテリシンＢ（Ｃ、上のディスク）および１００ｍｇのフルコナゾール（Ｃ、下のディスク）で達成される阻害よりも非常に好ましい。非常に似た結果がトリコスポロン・クタネウムについて見られた（データは図示せず）。
【実施例３】
【００９９】
ヒト病原体に対する殺細菌／殺真菌活性に関するＥＤＴＡのＢＬＡＤとの相同効果
（Ａ）リステリア・モノサイトゲネス、（Ｂ）シュードモナス・アエルギノサおよび（Ｃ）カンジダ・アルビカンスでのＢＬＡＤおよび／またはＥＤＴＡの時間−殺滅曲線：図９を参照されたい。
【０１００】
Ｌ・モノサイトゲネスに対して、１０μｇ／ｍｌのＢＬＡＤも０．１ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡのいずれも増殖を阻害しないが、２つの組み合わせは静細菌性である。Ｐ．アエルギノサに対して、５０μｇ／ｍｌのＢＬＡＤまたは１ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡは増殖を阻害する（すなわち両方とも静細菌性である）が、２つの組み合わせは殺細菌性である。Ｃ．アルビカンスに対して、１０μｇ／ｍｌのＢＬＡＤまたは０．１ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡは増殖を阻害する（すなわち両方とも静真菌性である）が、２つの組み合わせは殺真菌性である。
【実施例４】
【０１０１】
モルモットにおけるＢＬＡＤの経皮毒性実験
化学物質の試験のためのＯＥＣＤガイドライン、Ｎｏ．４０２、急性経皮毒性を用いて、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ  Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｄｅ  Ａｇｒｏｎｏｍｉａによりリスボン工科大学獣医学部で行われた機密実験（２００６年７月１８日〜２００６年８月１日）。実験は優良実験室規範および動物福祉に従って行われた。
【０１０２】
ＢＬＡＤの急性経皮毒性は、経皮毒性実験に適した動物として広く受け入れられている、モルモットへの単回投与後に評価された。ＢＬＡＤを、各１０匹の２群の無毛皮膚に、それぞれ２００μｇ／ｍｌおよび４００μｇ／ｍｌ投与した。投与後、動物を１５日間観察し続け、その間の体重、罹患率および死亡率を記録した。
【０１０３】
材料および方法
１．材料
試験項目：ＢＬＡＤを５ｍｇ／ｍｌで用意し（黄色がかった不透明な液体、０〜４℃）、−８０℃で保存した。
動物：アルビノモルモット；系統：バルセロナのＨａｒｌａｎ  Ｉｂｅｒｉｃａによるダンキン・ハートレイ（ＨｓｄＰｏｃ：ＤＨ）
用いた動物の数：３０；体重：４００〜４４９ｇ；齢：６週
ハウス：動物を消毒した木粉（リグノセル）が入ったポリエチレンの箱に個別に入れた。
周囲条件：
ａ）光周期：１２時間毎の明／暗のサイクル
ｂ）制御環境：１９／２２℃の平均温度および６０％の平均湿度
適応：動物は試験の開始前の７日間、試験の環境条件下に置いた。
食糧：バルセロナのＨａｒｌａｎ  Ｉｂｅｒｉｃａにより供給されるＧｌｏｂａｌ  Ｄｉｅｔ２０１４、Ｒｏｄｅｎｔ  Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  Ｄｉｅｔ；水、適宜
【０１０４】
２．方法
投与：動物を試験の４８時間前に剃毛し、病変のない皮膚を持つ動物のみに実験を行った。１ｍｌのアリコート（２００μｇ／ｍｌまたは４００μｇ／ｍｌ）を各動物の剃毛した皮膚に投与した。
実験デザイン：実験の３０匹の動物を４つの群、各１０匹の２群および各５匹の２群に分けた。１つの群の１０匹には２００μｇ／ｍｌでＢＬＡＤを投与し（試験群１）、もう１つの群の１０匹にはＢＬＡＤを４００μｇ／ｍｌで投与した（試験群２）。５匹の２群は対照とした：１つの群には水（１ｍｌアリコート）を投与し、もう１つの群はすべての他の群と同様に扱ったが、いずれの投与も行わなかった。
成果：投与後、動物を１５日間毎日観察し、罹患のいずれかの兆候、または死亡を記録した。罹患に関して、投与部位での皮膚病変の発症および正常な行動パターンの変化のような一般的な毒性の兆候にとくに注意を払った。体重は投与前および試験期間の終わりに個別に測定した。
【０１０５】
結果
どちらの濃度のＢＬＡＤでも、経皮投与領域におけるいずれかの物理的な変化または飲水／摂食もしくは一般行動の変化の兆候は見られなかった。ＢＬＡＤ投与後、副作用も死亡も起こらなかった。体重の増加はすべての群において同様だった（こうした幼齢の動物の成長から予想される増加と一致していた）。
【０１０６】
結論
４００μｇ／ｍｌまでの（あるいはこれより高い）濃度のＢＬＡＤは経皮毒性を示さない。
【実施例５】
【０１０７】
アルビノラットにおけるＢＬＡＤの経口毒性実験
化学物質の試験のためのＯＥＣＤガイドライン、Ｎｏ．４０１、急性経口毒性を用いて、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ  Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｄｅ  Ａｇｒｏｎｏｍｉａによりリスボン工科大学獣医学部で行われた機密実験。実験は優良実験室規範および動物福祉に従って行われた。
【０１０８】
ＢＬＡＤの急性経口毒性は、経口毒性実験に適した動物として広く受け入れられている、ラットへの単回投与後に評価された。ＢＬＡＤは強制給餌により、各１０匹の２群に、それぞれ２００μｇ／ｍｌおよび４００μｇ／ｍｌで投与した。投与後、動物を１５日間観察し続け、その間の体重、罹患率および死亡率を記録した。観察期間後、動物は安楽死させ、剖検を行った。
【０１０９】
材料および方法
１．材料
試験項目：ＢＬＡＤを５ｍｇ／ｍｌで用意し（黄色がかった不透明な液体、０〜４℃）、−８０℃で保存した。
動物：ラタス・ノルベジカス（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）；系統：バルセロナのＨａｒｌａｎ  Ｉｂｅｒｉｃａからリスボンの獣医学部の動物飼育場が入手したウィスター・ハノーバー
用いた動物の数：３０；体重：２５０〜３００ｇ；齢：１０週
ハウス：動物は消毒した木粉（リグノセル）が入ったポリエチレンの箱に個別に入れた。
周囲条件：
ａ）光周期：１２時間毎の明／暗のサイクル
ｂ）制御環境：１９／２２℃の平均温度および６０％の平均湿度
適応：動物は試験の開始前の７日間、試験の環境条件下に置いた。
食糧：バルセロナのＨａｒｌａｎ  Ｉｂｅｒｉｃａより供給されるＧｌｏｂａｌ  Ｄｉｅｔ２０１４、Ｒｏｄｅｎｔ  Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  Ｄｉｅｔ；水、適宜
【０１１０】
２．方法
投与：１ｍｌのアリコート（２００μｇ／ｍｌまたは４００μｇ／ｍｌ）を各動物に、胃一般的には強制給餌として知られる経口（経口腔食道）挿管法により投与した。投与は用いた動物の種に適した金属プローブで行った。動物は投与前の１８時間は絶食させ、投与の３時間後に給餌した。
実験デザイン：実験の３０匹の動物を４つの群、各１０匹の２群および各５匹の２群に分けた。１つの群の１０匹には２００μｇ／ｍｌでＢＬＡＤを投与し（試験群１）、もう１つの群の１０匹にはＢＬＡＤを４００μｇ／ｍｌで投与した（試験群２）。５匹の２群は対照とした：１つの群には水（１ｍｌアリコート）を投与し、もう１つの群はすべての他の群と同様に扱ったが、いずれの投与も行わなかった。
成果：投与後、動物を１５日間毎日観察し、罹患の兆候、または死亡を記録した。体重は投与前および試験期間の終わりに個別に測定した。観察期間後、動物は、その後の剖検のため、（二酸化炭素で飽和した雰囲気下での窒息により）安楽死させた。
【０１１１】
結果
どちらの濃度のＢＬＡＤでも、いずれかの物理的な変化または飲水／摂食もしくは一般行動の変化の兆候も見られなかった。ＢＬＡＤ投与後、副作用も死亡も起こらなかった。体重の増加はすべての群において同様だった（こうした幼齢の動物の成長から予想される増加と一致していた）。剖検／胸腔および腹腔の器官の肉眼観察でそれに変化がないことがわかった。
【０１１２】
結論
４００μｇ／ｍｌまでの（あるいはこれより高い）濃度のＢＬＡＤは経口毒性を示さない。
【図１】
0005934225.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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