(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞懸濁液に含まれる目的細胞を平面状に展開することができる細胞平面展開デバイスであって、
前記細胞平面展開デバイスが、
上面に細胞展開部を有する板状の本体部から構成されており、
前記本体部の細胞展開部には、
前記本体部の一方側から他方側に向かって複数の溝が列状に並設されるとともに、前記複数の溝は、溝幅が異なる複数の溝群からなり、
前記複数の溝群のうちの少なくとも１つの溝群において、
溝の開口部上面の最大幅は、前記目的細胞の直径と等しいか、または前記目的細胞の直径より大きく、かつ、
溝は、その深さ方向の途中で前記目的細胞を保持し得るように、その深さ方向において前記目的細胞の直径よりも小さい幅を有し、
溝の底部に、幅１μｍ以下のスリットもしくは直径１μｍ以下の孔を有するか、または、それらを有さないことを特徴とする細胞平面展開デバイス。
【請求項２】
前記複数の溝群のうちの前記少なくとも１つの溝群において、溝が、その底部に、０．４μｍ以上１μｍ以下の幅のスリットを有することを特徴とする請求項１に記載の細胞平面展開デバイス。
【請求項３】
前記複数の溝群のうちの前記少なくとも１つの溝群において、溝の底部は、閉口であることを特徴とする請求項１に記載の細胞平面展開デバイス。
【請求項４】
前記複数の溝群のうちの前記少なくとも１つの溝群において、溝が傾斜面を有するテーパード型であり、傾斜角度が４５度以下であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞平面展開デバイス。
【請求項５】
前記複数の溝群のうちの前記少なくとも１つの溝群において、溝の深さが目的細胞の直径の２倍より小さいことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の細胞平面展開デバイス。
【請求項６】
前記複数の溝群のうちの前記少なくとも１つの溝群において、溝の表面は、水に対する接触角が、２０度以下であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の細胞平面展開デバイス。
【請求項７】
前記複数の溝群のうちの前記少なくとも１つの溝群において、溝の開口部上面から２０μｍ以上１００μｍ以下の高さに天井構造を有することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の細胞平面展開デバイス。
【請求項８】
前記複数の溝群が、
前記溝群ごとに同じ溝幅の溝が並設されてなることを特徴とする請求項１〜７に記載の細胞平面展開デバイス。
【請求項９】
前記複数の溝群のうちの前記少なくとも１つの溝群以外の他の溝群は、溝の開口部上面の最大幅が、前記目的細胞の直径よりも小さいことを特徴とする請求項１〜８に記載の細胞平面展開デバイス。
【請求項１０】
前記複数の溝群が、
前記本体部の一方側から他方側に向かうにしたがって、前記溝群ごとに溝幅が漸次大きくなるように設定されていることを特徴とする請求項１〜９に記載の細胞平面展開デバイス。
【請求項１１】
前記複数の溝群が、
前記溝幅が大きくなるに従って、漸次溝深さが深くなるよう構成されていることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の細胞平面展開デバイス。
【請求項１２】
前記溝幅が１〜１００μｍの範囲内であるとともに、前記溝深さが１〜１００μｍの範囲内であることを特徴とする請求項１１に記載の細胞平面展開デバイス。
【請求項１３】
前記溝が、断面Ｖ字状であることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の細胞平面展開デバイス。
【請求項１４】
前記本体部が、複数の分割板状体を並設してなることを特徴とする請求項１〜１３のいずれかに記載の細胞平面展開デバイス。
【請求項１５】
前記複数の分割板状体が、
前記分割板状体ごとに、同じ溝幅及び同じ溝深さの複数の溝からなる１種類の溝群が並設されてなることを特徴とする請求項１４に記載の細胞平面展開デバイス。
【請求項１６】
前記細胞懸濁液が、生体試料であることを特徴とする請求項１〜１５のいずれかに記載の細胞平面展開デバイス。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載の細胞平面展開デバイスの溝に、前記細胞懸濁液を接触させる工程を含むことを特徴とする細胞展開方法。
【請求項１８】
前記細胞懸濁液を接触させる工程において、
前記細胞平面展開デバイスの前記本体部の一方側から他方側に向かって前記複数の溝群を横切るように前記細胞懸濁液を前記複数の溝群の溝内に供給し、前記細胞懸濁液中の細胞を小さい細胞から大きい細胞の順に前記複数の溝群の溝内に整列させて展開する工程と、
を少なくとも有することを特徴とする請求項１７に記載の細胞展開方法。
【請求項１９】
前記細胞懸濁液中の細胞を小さい細胞から大きい細胞の順に前記複数の溝群の溝内に整列させて展開する工程の後、
さらに前記平面状に展開された細胞を観察手段で観察する工程と、
を有することを特徴とする請求項１８に記載の細胞展開方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞平面展開デバイスおよびこの細胞平面展開デバイスを用いた細胞展開方法に関する。より詳細には、本発明は、特定の溝がその表面に刻まれた細胞平面展開デバイスであって、溝に沿って細胞を密に整列させることができる細胞平面展開デバイスおよびこの細胞平面展開デバイスを用いた細胞展開方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現代医学において、細胞の形態から得られる多くの情報は、病気の予防・診断・治療等を行う上で極めて重要な役割を担っている。細胞情報を医療に応用する手段の一つである細胞診については、剥離細胞診や擦過細胞診があり、その他より積極的に病巣の細胞を採取する穿刺細胞診等がある。【０００３】
これら細胞診は、採血・擦過・穿刺等により細胞を採取した後、スライドガラス上に主に塗沫法（手技）・オートスミア法（遠心力を利用し、スライドガラス上に検体を付着させる）等によって塗沫面をつくる。【０００４】
そして、この塗沫された検体を染色バット等の容器に収納されたアルコール・染色液・蒸留水等の各溶液中に浸漬し、検体の染色を行った後、封入剤およびカバーガラスを被せる等の一連の操作を行ってプレパラート（標本）を作製し、それを顕微鏡等で鏡検し病変の診断を行うものである。【０００５】
ところで、このような細胞診では、検査対象とする細胞数は極少量に限られており、事象の見逃しも懸念されている。これは、細胞を検査、すなわち観察するには、平面上に単層に展開する必要があり、このため十分な検査細胞数を確保するには、観察範囲が広大になってしまうことが障害の一つとなっている。【０００６】
このため、目的細胞を含んだ細胞懸濁液を細胞の重さの違い，細胞の大きさの違いなどの条件で、ある程度分離して目的細胞を見つけ易くした後、この分離した細胞集団を観察して、目的細胞の有無を調べる方法が試みられている。【０００７】
このような細胞の分離技術について、特許文献１，２には、血液等の細胞分散液に含有される、少なくともがん細胞に対して、物理的・化学的作用および／または生理活性作用を付与できる細胞処理デバイスが開示されている。【０００８】
この細胞処理デバイスは、図１１に示すように、第一面３０１および第二面３０２を有し、第一面３０１から第二面３０２に貫通し一方向に沿って延びるスリット形状を有する貫通孔３１０が形成された、スリット部材３００を有している。【０００９】
また、スリット部材３００の貫通孔３１０は、テーパー部３１２を有し、テーパー部３１２の形成された方向に対して直交する断面における幅は、第一面３０１から第二面３０２側に向かって減少し、第二面３０２側の端（幅Ｗｔｅ）においてがん細胞ｇの平均直径よりも小さくなっている。そして細胞分散液に含有されるがん細胞ｇ以外の細胞は、第一面３０１側から貫通孔３１０を通って第二面３０２側に通過される。【００１０】
なお、循環がん細胞（ＣＴＣ； Circulating Tumor Cell）は、血液中の通常の細胞よりも平均的な直径が大きいという報告がある。【００１１】
また、その他の細胞の分離技術として、特許文献３に開示された細胞処理デバイス１００では、図１２（ａ），（ｂ）に示したように、底面１０６に同じ大きさの溝１０４が複数並設された流路部材１０２を用意し、この流路部材１０２の複数の溝１０４を横切るように一方側１１０から他方側１１２に向かって細胞懸濁液１５０として血液を流入させることで、この溝１０４内に血液中の赤血球１５０Ａを捕獲し、血液を赤血球１５０Ａとそれ以外の組織由来幹細胞１５０Ｂとに分離するようにしている。【００１２】
また特許文献４に開示された細胞処理デバイス２００は、図１３（ａ），（ｂ）に示したように、複数の柱２０２が列状に整列配置されるとともに、柱２０２と柱２０２の間隔が列ごとに徐々に狭められた上下２つの部材２０４，２０６からなる容器２０８を用い、この容器２０８の柱２０２と柱２０２の間隔が一番広くなる一方側２１０から柱２０２と柱２０２の間隔が一番狭くなる他方側２１２に向かって、細胞懸濁液を流入させることで、柱２０２と柱２０２の間に、柱２０２と柱２０２の間の間隔よりも大きな細胞が捕獲され、大きな細胞２５０Ａから小さな細胞２５０Ｃの順で細胞を分離するようにしている。なお図中の符号２５０Ｂは大きな細胞２５０Ａと小さな細胞２５０Ｃの間の大きさの細胞である。また符号２１４は細胞懸濁液を容器内に供給する際の入口である。【００１３】
このように細胞の分離技術には様々な方法があり、それぞれの分離方法や装置の構成なども異なるため、使用者の目的に合わせて選択したものが用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開２０１０−２２７０１１号公報
【特許文献２】特開２０１０−２２７０８７号公報
【特許文献３】特開２００８−２１２０２２号公報
【特許文献４】米国特許出願公開第２００６／００５１２６５号明細書
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｂ.Ｇ.ｄｅ  Ｇｒｏｏｔｈら,Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ,６巻:２２６〜２３３頁(１９８５年)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
しかしながら、特許文献１，２に記載された細胞処理デバイスは、がん細胞や免疫細胞に物理的作用、化学的作用、および生理的作用の少なくとも一種を付与するためのものであって、細胞懸濁液を平面状に展開してがん細胞等を含めた複数の目的細胞を観察するという用途に最適化されたデバイスではない。【００１７】
例えば、細胞処理デバイスにはがん細胞ｇの「平均直径」よりも小さい幅を有する貫通孔３１０の形成が必須とされているが、細胞診にとって特に重要な稀少なＣＴＣの直径が平均直径よりも小さな場合にそのような貫通孔３１０を通過して失われてしまう虞がある。【００１８】
また、基本的にポンプ等の送液システムを用いて細胞処理デバイス上のテーパー部３１２を細胞懸濁液が通過するようになっており、送液システムを用いずとも細胞懸濁液を細胞処理デバイス上に展開して目的細胞を観察できるようにする態様は記載も示唆もされていない。【００１９】
他方、非特許文献１には、複数の溝が刻まれているアナログレコード盤上で細胞を観察する方法が開示されているが、溝の幅を制御するという概念は一切記載も示唆もない。【００２０】
また、上記した特許文献３に開示された細胞処理デバイス１００は、細胞懸濁液１５０である血液中から、組織由来幹細胞１０５Ｂを分離する装置であるが、不要な赤血球１５０Ａだけを単に溝１０４内で捕獲して、血液を組織由来幹細胞１５０Ｂを含む集団と赤血球１５０Ａの集団とに分離しただけであり、白血球などその他血球細胞も含む組織由来幹細胞１５０Ｂの集団から、組織由来幹細胞１０５Ｂを観察しようとした場合には、まずは組織由来幹細胞１５０Ｂの集団を例えばガラス基板上に展開させ、細胞集団の各細胞を観察する手順を経る必要があり、結局、正確に目的細胞である組織由来幹細胞１０５Ｂを同定するに至るまで煩雑な工程を繰り返す必要があるものであった。【００２１】
また特許文献４に開示された細胞処理デバイス２００では、柱２０２と柱２０２の間で大きな細胞２５０Ａから小さな細胞２５０Ｃの順に細胞を捕獲する構造であるため、大きな細胞２５０Ａが細胞懸濁液中に多く有ると目詰まりを起こして下流側へそれよりも小さな細胞２５０Ｂ，２５０Ｃが流れにくくなってしまい、精度良く細胞を分離することができない場合があった。【００２２】
本発明はこのような現状に鑑み、複数種からなる細胞懸濁液を平面に展開した際に、目的細胞とそれよりも直径の小さな細胞とを分離するとともに、目的細胞およびそれと同程度の直径の細胞を平面状に密に整列させることができる細胞平面展開デバイスおよびこれを用いた細胞展開方法を提供することを目的とする。【００２３】
また、細胞懸濁液中の種々の細胞を大きさごとに平面状に密に整列させることのできる細胞平面展開デバイスおよびこれを用いた細胞展開方法を提供することを目的とする。【００２４】
さらに整列された細胞をこのまま観察することのできる細胞平面展開デバイスおよびこれを用いた細胞展開方法を提供することを目的とする。【００２５】
また、目的細胞だけでなく、目的細胞以外の細胞についても観察することのできる細胞平面展開デバイスおよびこれを用いた細胞展開方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明は、前述したような従来技術における課題および目的を達成するために発明されたものであって、
本発明の細胞平面展開デバイスは、
細胞懸濁液に含まれる目的細胞を平面状に展開することができる細胞平面展開デバイスであって、
前記細胞平面展開デバイスが、
上面に細胞展開部を有する板状の本体部から構成されており、
前記本体部の細胞展開部には、
前記本体部の一方側から他方側に向かって複数の溝が列状に並設されるとともに、前記複数の溝は、溝幅が異なる複数の溝群からなり、
前記複数の溝群のうちの少なくとも１つの溝群において、
溝の開口部上面の最大幅は、前記目的細胞の直径と等しいか、または前記目的細胞の直径より大きく、かつ、
溝は、その深さ方向の途中で前記目的細胞を保持し得るように、その深さ方向において前記目的細胞の直径よりも小さい幅を有し、
溝の底部に、幅１μｍ以下のスリットもしくは直径１μｍ以下の孔を有するか、または、それらを有さないことを特徴とする。
【００２７】
このように構成すれば、目的細胞と、それよりも直径の小さな細胞およびゴミ等とが分離し、目的細胞およびそれと同等の直径の細胞が溝に沿って移動し整列することができる。
さらには、前記本体部の一方側から他方側に向かって複数の前記溝が列状に並設されるとともに、前記複数の溝が溝幅の異なる複数の溝群からなっているので、細胞平面展開デバイスの細胞展開部に細胞懸濁液を流入させた際に、細胞懸濁液中の種々の大きさの細胞を、細胞の大きさに合った大きさの溝内に整列して展開させることができる。
【００２８】
また、本発明の細胞平面展開デバイスは、
前記複数の溝群のうちの前記少なくとも１つの溝群において、溝は、その底部に、０．４μｍ以上１μｍ以下の幅のスリットを有することを特徴とする。
【００２９】
このように構成すれば、細胞観察にとって不要な物質を排出することができる。【００３０】
また、本発明の細胞平面展開デバイスは、
前記複数の溝群のうちの前記少なくとも１つの溝群において、溝の底部は、閉口であることを特徴とする。
【００３１】
このように構成すれば、製造が容易で安価となり好ましい。【００３２】
またスリットを形成する場合と比べて毛細管力を高めることができ、細胞を展開する上で好ましい。【００３３】
また、本発明の細胞平面展開デバイスは、
前記複数の溝群のうちの前記少なくとも１つの溝群において、溝が傾斜面を有するテーパード型である場合、傾斜角度は、４５度以下であることを特徴とする。
【００３４】
このように構成すれば、目的細胞および非目的細胞の整列および保持が適切に行われる溝を形成しやすくなる。【００３５】
また、本発明の細胞平面展開デバイスは、
前記複数の溝群のうちの前記少なくとも１つの溝群において、溝の深さは、目的細胞の直径の２倍より小さいことを特徴とする。
【００３６】
このように構成すれば、溝の開口部の最大幅ないし山から山の間の距離が広がり過ぎることなく、一枚の細胞平面展開デバイスで処理できる細胞数を十分に確保できることや毛細管力も働き易くできるなど好ましい。【００３７】
また、本発明の細胞平面展開デバイスは、
前記複数の溝群のうちの前記少なくとも１つの溝群において、溝の表面は、水に対する接触角が、２０度以下であることを特徴とする。
【００３８】
このように構成すれば、細胞懸濁液の展開速度が速く、また必要以上に表面張力によって細胞懸濁液が盛り上がる（厚みを増す）のを抑制することができるなどの観点から好ましい。【００３９】
また、本発明の細胞平面展開デバイスは、
前記複数の溝群のうちの前記少なくとも１つの溝群において、溝の開口部上面から２０μｍ以上１００μｍ以下の高さに天井構造を有することを特徴とする。
【００４０】
このように、溝上部に天井構造を設け、閉鎖的な流路を形成することによって、細胞懸濁液に毛細管力がはたらき、より迅速に細胞懸濁液の展開および目的細胞の整列を行うことができる。【００４３】
また、本発明の細胞平面展開デバイスは、
前記複数の溝群が、
前記溝群ごとに同じ溝幅の溝が並設されてなることを特徴とする。【００４４】
このように構成すれば、溝群ごとに同程度の大きさの細胞を整列して展開させることができる。【００４５】
また、本発明の細胞平面展開デバイスは、
前記複数の溝群のうちの前記少なくとも１つの溝群以外の他の溝群は、溝の開口部上面の最大幅が、前記目的細胞の直径よりも小さいことを特徴とする。
このように構成すれば、目的細胞よりも直径が小さい非目的細胞を、複数の溝群のうちの少なくとも１つの溝群以外の他の溝群に整列して展開できるので、目的細胞と非目的細胞とをより分離しやすくなる。
また、本発明の細胞平面展開デバイスは、
前記複数の溝群が、
前記本体部の一方側から他方側に向かうにしたがって、前記溝群ごとに溝幅が漸次大きくなるように設定されていることを特徴とする。
【００４６】
このように構成すれば、細胞の大きさの順で、溝内に確実に細胞を展開させることができる。【００４７】
また、本発明の細胞平面展開デバイスは、
前記複数の溝群が、
前記溝幅が大きくなるに従って、漸次溝深さが深くなるよう構成されていることを特徴とする。【００４８】
このように構成すれば、溝内に細胞を確実に保持させることができる。【００４９】
また、本発明の細胞平面展開デバイスは、
前記溝幅が１〜１００μｍの範囲内であるとともに、前記溝深さが１〜１００μｍの範囲内であることを特徴とする。【００５０】
このような大きさとすれば、大きな細胞から小さな細胞までを確実に細胞の大きさごとに分別できる。【００５１】
また、本発明の細胞平面展開デバイスは、
前記溝が、断面Ｖ字状であることを特徴とする。【００５２】
このような形状であれば、細胞懸濁液の溝の長さ方向への流動性も確保しつつ、細胞の大きさに応じた細胞の捕獲を確実に行うことができる。【００５３】
また、本発明の細胞平面展開デバイスは、
前記本体部が、複数の分割板状体を並設してなることを特徴とする。【００５４】
このように構成すれば、細胞懸濁液中の細胞の数や大きさに応じて分割板状体を適宜組み合わせて設けることができるため、検出対象となる細胞や展開する細胞に合わせた細胞平面展開デバイスを簡単に得ることができる。【００５５】
また、本発明の細胞平面展開デバイスは、
前記複数の分割板状体が、
前記分割板状体ごとに、同じ溝幅及び同じ溝深さの複数の溝からなる１種類の溝群が並設されてなることを特徴とする。【００５６】
このように構成すれば、分割板状体の規格化を容易に行え、様々な細胞懸濁液に応じた所望の細胞平面展開デバイスを確実に用意することができる。また、このような構造を有するプリズムシートが既に市販されているので、プリズムシートを転用して分割板状体とすることも可能である。【００５７】
また、本発明の細胞平面展開デバイスは、
前記細胞懸濁液が、生体試料であることを特徴とする。【００５８】
このように生体試料であれば、医療における細胞を対象とした検査、例えば血液中の癌細胞などのレア細胞を対象とした検査に用いるのに好適である。【００５９】
また、本発明の細胞展開方法は、
上記のいずれかに記載の細胞平面展開デバイスの溝に、前記細胞懸濁液を添加する工程を含むことを特徴とする。【００６０】
このような細胞平面展開デバイスを用いた細胞展開方法であれば、細胞平面展開デバイスの溝が形成された部位に直接に細胞懸濁液を添加する場合はもちろん、溝と連通した部位に細胞懸濁液を添加した場合であっても、毛細管力により細胞懸濁液を溝に展開させて細胞を整列させることができる。【００６１】
また、本発明の細胞展開方法は、
前記細胞懸濁液を接触させる工程において、
前記細胞平面展開デバイスの前記本体部の一方側から他方側に向かって前記複数の溝群を横切るように前記細胞懸濁液を前記複数の溝群の溝内に供給し、前記細胞懸濁液中の細胞を小さい細胞から大きい細胞の順に前記複数の溝群の溝内に整列させて展開する工程と、
を少なくとも有することを特徴とする。
【００６２】
このような工程を経れば、細胞懸濁液中の細胞を小さい細胞から大きい細胞の順で、順次細胞平面展開デバイスの溝内に整列して展開させることができる。【００６３】
また、本発明の細胞展開方法は、
前記細胞懸濁液中の細胞を小さい細胞から大きい細胞の順に前記複数の溝群の溝内に整列させて展開する工程の後、
さらに前記平面状に展開された細胞を観察手段で観察する工程と、
を有することを特徴とする。
【００６４】
このような工程を有していれば、細胞懸濁液中の細胞は、先の工程で既に小さい細胞から大きい細胞の順に、順次細胞平面展開デバイスの溝内に整列して展開されているため、このままの状態で細胞の観察を行うことができる。【００６５】
したがって、細胞の展開から観察までを迅速に行うことができ、例えば診断に要する時間を従来よりも少なくすることができる。
【発明の効果】
【００６６】
本発明は、複数種からなる細胞懸濁液をその表面に添加すると、目的細胞と、それよりも直径の小さな細胞およびゴミ等とが分離し、目的細胞およびそれと同等の直径の細胞が溝に沿って移動し整列する細胞平面展開デバイスおよびこれを用いた細胞展開方法を提供することができる。【００６７】
さらに本発明によれば、細胞平面展開デバイスの溝上部に、細胞径の２倍程度の高さで天井構造を有するため、複数の溝に跨って細胞に毛細管力がはたらき、ポンプを使用し細胞懸濁液を送液せずとも、前記デバイス表面上に多量の細胞を観察し易く整列させることができる。【００６８】
また、本発明によれば、複数の大きさの溝を列状に並設してなるため、細胞懸濁液中の種々の細胞を大きさごとに溝内に平面状に整列させることができる。【００６９】
さらに本発明によれば、細胞懸濁液中の目的細胞を平面状に整列させることができるため、このままの状態で細胞の観察を行うことができる。【００７０】
また本発明によれば、全ての大きさの細胞を展開することができるため、目的細胞だけでなく、目的細胞以外の細胞についても観察することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１は、本発明の細胞平面展開デバイスの斜視図である。
【図２】図２は、図１に示した本発明の細胞平面展開デバイスのＡ−Ａ線による断面図である。
【図３】図３は、本発明の細胞平面展開デバイスの分割板状体の斜視図である。
【図４】図４は、本発明の細胞平面展開デバイスの変形例を説明するための斜視図である。
【図５】図５は、本発明の細胞平面展開デバイスの横断面の模式図であって、表面に刻まれている溝がテーパード型（ａ）または平行型（ｂ）であり、目的細胞および目的細胞の直径よりも小さな細胞（非目的細胞）が溝に接触している一態様である。
【図６】図６は、本発明の細胞平面展開デバイスの横断面の模式図であって、表面に刻まれている溝がテーパード型（ａ）もしくは山が平らなテーパード型（ａ’）である場合、または平行型（ｂ）である場合を示したものである。
【図７】図７は、本発明の細胞平面展開デバイスの変形例を説明するための斜視図である。
【図８】図８は、本発明の細胞平面展開デバイスの溝に細胞を展開させた状態を示した状態図である。
【図９】図９は、実施例および比較例で得られた画像を示し、図９（ａ）が実施例１、図９（ｂ）が実施例２、図９（ｃ）が実施例３、図９（ｄ）が比較例１に対応する。
【図１０】図１０は、本発明の実施例による細胞平面展開デバイスの説明図であり、図１０（ａ）は細胞平面展開デバイスの上面図、図１０（ｂ）は各分割板状体の溝の断面図、図１０（ｃ）は各分割板状体の溝に細胞を展開した状態を示した図である。
【図１１】図１１は、特許文献１，２の図５と同様であり、特許文献１，２に開示されている細胞処理デバイスの横断面の模式図である。
【図１２】図１２は、従来の細胞処理デバイスであり、図１２（ａ）は斜視図、図１２（ｂ）は細胞の分離状態を説明する説明図である。
【図１３】図１３は、従来の細胞処理デバイスであり、図１３（ａ）は斜視図、図１３（ｂ）は細胞の分離状態を説明する説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
次に、本発明の細胞平面展開デバイスおよびこれを用いた細胞展開方法について詳細に説明する。
【００７３】
本発明の実施形態に係る細胞平面展開デバイスおよびこれを用いた細胞展開装置は、細胞懸濁液中の種々の細胞を大きさごとに平面状に密に整列させ、この整列された細胞をこのまま観察できるようにしたものである。
【００７４】
また本発明及びその実施形態に係る細胞展開方法は、細胞平面展開デバイスを用いて細胞懸濁液中の種々の細胞を、大きさごとに確実に平面状に整列させる方法である。
なお、本明細書中で「溝群」とは、同じ溝幅の溝の群のことであるが、溝群が１本の溝のみからなる場合も含むものである。
【００７５】
＜細胞展開装置＞
本発明の細胞平面展開デバイスを利用した細胞展開装置としては、図１に示したような細胞平面展開デバイス１０と、この細胞平面展開デバイス１０上に細胞懸濁液３０を供給する液供給手段（図示せず）と、を少なくとも有するものである。
【００７６】
細胞平面展開デバイス１０は、板状の本体部１２からなり、この本体部１２上の細胞展開部１４に複数の溝１６が列状に並設されている。
【００７７】
そして細胞懸濁液３０を、液供給手段（図示せず）で細胞平面展開デバイス１０の複数の溝１６を横切るように本体部１２の一方側２０から他方側２２に向かって供給することで、溝１６内に細胞懸濁液３０中の細胞が密に整列されて展開されるようになっている。
【００７８】
上述した細胞展開装置において、特に細胞平面展開デバイス１０の構造については、同じ寸法の溝、すなわち幅及び深さが同じ寸法の溝が、複数列状に並設されてなるものであれば良いが、溝構造については、以下に記したような特徴的な構造を採っている。
【００７９】
なお、この特徴的な溝構造を備える細胞平面展開デバイス１０の構造については、寸法の異なる溝が複数設けられた構造であれば、より好ましい。
このような細胞平面展開デバイス１０の好ましい構造、および溝の好ましい構造について以下、詳細に説明する。
【００８０】
＜細胞平面展開デバイス１０＞
図１に示した本発明の細胞平面展開デバイス１０は、板状の本体部１２から構成されており、この本体部１２の上面が、細胞懸濁液３０を展開するための細胞展開部１４となっている。
【００８１】
そして細胞展開部１４には、本体部１２の一方側２０から他方側２２に向かって複数の溝１６（１６ａ，１６ｂ，１６ｃ）が列状に並設されている。なお、これらの溝１６ａ，１６ｂ，１６ｃのそれぞれに溝幅及び溝深さが異なっており、同じ寸法の溝の集団が一つの溝群を構成している。図１に示した細胞平面展開デバイス１０においては、溝１６ａの集団が溝群１８Ａを構成し、溝１６ｂの集団が溝群１８Ｂを構成し、溝１６ｃの集団が溝群１８Ｃを構成している。
【００８２】
このような細胞平面展開デバイス１０は、図２に示したように断面が一方側２０から他方側２２（図の右側から左側）に向かって徐々に溝１６の大きさ（溝幅及び溝深さ）が大きくなるように３つの溝群１８Ａ，１８Ｂ，１８Ｃが並設されている。
【００８３】
また、このような細胞平面展開デバイス１０は、図３に示したように、溝の大きさの異なる溝群１８ごとに個別の分割板状体１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃを作成しておき、これを複数並設して設けることで本体部１２を構成することが好ましい。
【００８４】
分割板状体１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃの溝は、公知の微細加工技術で加工可能であるが、例えば市販のプリズムシートを代用することもできる。通常、プリズムシートは、同じ大きさの溝が複数列状に並設されたものであり、本発明の分割板状体とするのに好適である。
【００８５】
また、１枚の分割板状体に同じ大きさの溝だけを備えていれば、例えば目的の大きさの細胞３０Ａが展開された分割板状体１２Ａだけを観察するようにすることもできる。
【００８６】
さらに、細胞懸濁液３０中の細胞３０Ａ，３０Ｂ，３０Ｃについて、細胞ごとに細胞展開部１４に展開される面積がある程度分かっている場合、例えば小さな細胞が大多数であり、大きな細胞が僅かにしか存在しないような場合には、図４に示したように、その割合に合わせて分割板状体１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃの大きさ（面積）を変えることもできる。
【００８７】
なお、本発明の細胞平面展開デバイス１０は、大きさが特に限定されるものではなく、展開する細胞数を加味して大きさを適宜調整することができ、例えば最大で複数の分割板状体１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃを合わせてＡ５（１５０ｍｍ×２１０ｍｍ）程度の大きさとすることもできる。
【００８８】
ここで細胞平面展開デバイス１０をＡ５（１５０ｍｍ×２１０ｍｍ）程度とした場合には、１０ｍｌ程度の血液（細胞懸濁液３０）を、細胞平面展開デバイス１０の細胞展開部１４の複数の溝上に密に整列させることができる。なお細胞懸濁液３０中の細胞の量が多ければ、細胞平面展開デバイス１０をＡ５（１５０ｍｍ×２１０ｍｍ）以上の大きさとする必要がある場合が有ることは当然のことであり、この場合には、分割板状体１２Ａ,１２Ｂ，１２Ｃを分割して、１板状体ずつ観察することも可能である。
【００８９】
なお、このような細胞平面展開デバイス１０の大きさは、従来のスライドガラスの様な細胞観察デバイスに用いられる標準的な大きさ（２５ｍｍ×７５ｍｍ程度）よりもはるかに大きいため、一度に多量の細胞３０Ａ，３０Ｂ，３０Ｃの観察をすることができ、検出対象の細胞数をはるかに多くすることで、検査精度を向上させることができる。
【００９０】
ここで複数の分割板状体１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃを並設する方法としては、分割板状体と分割板状体との間が確実に開かないようにすることができれば如何なる方法であっても良いものである。このような方法の例としては、予め枠部材（図示せず）を用意しておき、この枠部材（図示せず）に各分割板状体１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃを嵌め入れる構成としたり、分割板状体１２Ａと分割板状体１２Ｂとを取り外し可能な接着剤（図示せず）で接着するなどの方法が挙げられる。
次いで細胞平面展開デバイス１０に設けられる溝１６の構造について詳しく説明する。
【００９１】
＜溝１６＞
図５（ａ）に示したように、溝１６は、開口部５０から底部５２全体にかけて、または少なくとも開口部５０近傍において、テーパード型であることが好ましいが、テーパード型でなくても任意の形状にすることができる。
【００９２】
目的細胞６０の直径より小さい幅を有して目的細胞６０が保持される部分よりも深い底部５２側も、テーパード型であってもよいし、また図５（ｂ）に示したように平行型であってもよいし、任意の形状とすることができる。
【００９３】
溝１６の底部５２の形状としては、溝１６を横断面にして見た場合、逆三角形（図６（ａ））であっても、半円（図６（ｂ））ないし弧を描いていても、矩形であってもよく、特に限定されるものではない。
【００９４】
なお、溝１６の底部５２（谷近傍）にはスリットが形成されることもある。また、溝１６の側面は、溝１６を横断面にして見た場合、直線であっても、折れ線であっても、曲線であってもよく、特に限定されるものではない。
【００９５】
＜＜開口部５０の最大幅Ｔ＞＞
溝１６の開口部５０の最大幅Ｔは、通常、目的細胞６０の直径と等しいか、または目的細胞６０の直径より大きい。
【００９６】
溝１６の開口部５０の最大幅Ｔが目的細胞６０の直径と等しければ、テーパード型、平行型どちらの場合も、目的細胞６０はほぼ開口部５０の位置で保持されることになる。
【００９７】
また、開口部５０の最大幅Ｔが目的細胞６０の直径よりも大きければ、目的細胞６０は溝１６に入り込み、目的細胞６０は開口部５０の位置から底部にかけての途中の位置で保持されることになり、目的細胞６０よりも直径が小さい細胞が存在した場合には、目的細胞６０が保持される位置よりも底部側がテーパード型であっても平行型であっても、その細胞は目的細胞６０よりも底部側または底部（溝１６の底面）で保持されることになる。
【００９８】
これらいずれの場合も、溝１６の壁面との間に働く毛細管力によって展開される細胞懸濁液３０とともに、目的細胞６０も溝１６に沿って移動して整列させることができる。
【００９９】
一方、開口部５０の最大幅が目的細胞６０の直径よりも小さければ、目的細胞６０の一部は溝１６に入り込むかもしれないが、全体的に開口部５０から上（底部と反対の方向）の位置に保持されることになる。そうすると、細胞懸濁液３０とともに目的細胞６０は移動しにくくなったり、あるいは溝１６の境界である山５４を越えて隣接する溝１６に移りやすくなったりする虞があるなど、目的細胞６０を溝に整列させる上で好ましくない。
【０１００】
なお、溝１６の幅の基準となる「目的細胞６０の直径」は、あらかじめ目的細胞６０の直径について十分なデータが得られている場合には、必要に応じて、「目的細胞６０の平均直径」、「目的細胞６０の平均直径＋３σ」（σは標準偏差）などに読み替えることができ、それを基準とした幅の溝１６を有する細胞平面展開デバイス１０を作製することができる。後述するスリットの幅や溝１６の深さＨに関する「目的細胞６０の直径」についても同様である。
【０１０１】
さらに、細胞平面展開デバイス１０を、目的細胞６０と、平均直径が目的細胞６０より小さい目的細胞以外の種類の非目的細胞７０を１種以上含む細胞懸濁液３０を対象とすることのできるものとして作製する場合、溝１６の幅は、
目的細胞６０が、溝１６のより開口部５０に近い部位において保持され、かつ、
非目的細胞７０が、溝１６のより底部に近い部位において保持される、または、非目的細胞７０が溝１６の底部（谷）に接する状態で保持されるようにすることが好ましい。
【０１０２】
すなわち、直径のより大きい目的細胞６０が溝１６の最上部近傍の側面に接地し、一方、直径のより小さい非目的細胞７０が目的細胞６０の下から溝１６の最下部近傍に位置し、細胞が二段以上に重なって溝１６の中に存在する状態となる。
このとき、目的細胞６０の下端と非目的細胞７０の上端とが接触しない距離となるような溝形状にすることが好ましい。
【０１０３】
＜＜傾斜角度θ・深さＨ＞＞
溝１６が傾斜面を有するテーパード型（図６（ａ））である場合、その傾斜角度θは４５度以下であることが好ましい。傾斜角度θがこのような範囲にあると、目的細胞６０および非目的細胞７０の整列および保持が適切に行われる溝１６を形成しやすくなる。
【０１０４】
また、例えば溝１６について適切な深さＨを確保しようとした場合に溝１６の開口部５０の最大幅Ｔないし山５４と山５４との間の距離が広がり過ぎることなく、一枚の細胞平面展開デバイス１０で処理できる細胞数を十分に確保できることや毛細管力も働き易くできるなど好ましい。
【０１０５】
なお、溝１６と溝１６との間は、図６（ａ）に示すように水平ないし傾斜のついた頂上面（開口部５０の上面）が形成されていなくてもよいし（この場合、山５４と山５４との間の距離＝開口部５０の最大幅Ｔとなる）、図６（ａ’），（ｂ）に示すように頂上面が形成されていてもよいし（この場合、山５４と山５４との間の距離＞開口部５０の最大幅Ｔとなる）、テーパード型であっても図８（ｂ）に示すような平らな面が形成されていていてもよい。
【０１０６】
水平な平面の頂上面を設ける場合は、その幅は、細胞平面展開デバイス１０上の溝１６の密度（つまり処理できる細胞数）や、隣接する溝同士における目的細胞６０の整列の具合などに応じて、適宜調節することができる。
【０１０７】
また、溝１６がテーパード型（ａ）、平行型（ｂ）どちらの場合も、深さＨは目的細胞６０の直径の２倍より小さいことが好ましい。
【０１０８】
本発明の細胞平面展開デバイス１０の大きさや厚さおよび材質は、顕微鏡下で観察できる大きさや厚さおよび材質であれば、特に限定されるものではない。細胞平面展開デバイス１０の一態様として、例えば、スライドグラス程度の大きさ・厚さを有し、ポリメタクリル酸メチル樹脂（ＰＭＭＡ）からなるプリズムシートなどが挙げられる。
【０１０９】
このようなプリズムシートは市販されており、例えば、有機光学株式会社（株）製の「プリズムシート（先端角度９０度、ピッチ０．０２、幅（ピッチ方向）３００×長さ３００、標準板厚２ミリ）」などが好適である。
【０１１０】
また、本発明の細胞平面展開デバイス１０は、例えば、プリズム形状が形成された金型に紫外線硬化樹脂を配設し、紫外線硬化樹脂上に透明な錘（例えばガラス）または透明基板を配置し、紫外線硬化樹脂の硬化波長を有する光を錘または透明基板の上面から照射し、紫外線硬化樹脂を硬化する方法（特開２００５−３１６５８号公報を参照。）などによって製造することができる。
【０１１１】
＜＜接触角＞＞
本発明の細胞平面展開デバイス１０が有する溝１６の表面は、親水化処理を施すなどして、その水に対する接触角を２０度以下とすることが好ましい。
【０１１２】
細胞平面展開デバイス１０の表面の水に対する接触角をこのような範囲内にするには、例えばＵＶオゾンクリーナー等を用いる処理など、公知の親水化処理により達成することができる。
【０１１３】
細胞平面展開デバイス１０の表面の水に対する接触角がこのような範囲内であると、細胞懸濁液３０の展開速度が速く、また必要以上に表面張力によって細胞懸濁液３０が盛り上がる（厚みを増す）のを抑制することができるなどの観点から好ましい。
【０１１４】
＜＜細胞懸濁液３０・目的細胞６０・非目的細胞７０＞＞
細胞懸濁液３０は、６０を１種含むものであり、目的細胞６０以外の種類の非目的細胞７０をさらに１種以上含むものであってもよい。
【０１１５】
このような細胞懸濁液３０としては、例えば、ヒト等の動物の体液、すなわち、血液，リンパ液，組織液，体腔液などが挙げられる。また、生体由来のものに限定されず、試験・研究等のために人工的に細胞を懸濁させて調製した細胞の分散液であってもよい。
【０１１６】
細胞懸濁液３０は、目的細胞６０として好ましくはがん細胞を含む。そして細胞懸濁液３０は、非目的細胞７０として、がん細胞以外の他の細胞が分散されていてもよい。
【０１１７】
例えば、細胞懸濁液３０は、免疫細胞を含んでいてもよい。また、例えば、血液のように、がん細胞（目的細胞６０）の他に、白血球（免疫細胞），赤血球，血小板等の細胞（非目的細胞７０）が分散していてもよい。
【０１１８】
本明細書において、がん細胞とは、がん（悪性腫瘍）を構成する細胞をいう。がんは、転移する性質を有し、がん細胞は、がんが転移する際に、上述した血液等の体液に混入する。血液に混入して生体内を循環できる状態になったがん細胞は、循環がん細胞〔ＣＴＣ〕（または循環腫瘍細胞）と呼ばれている。
【０１１９】
したがって、細胞懸濁液３０は、循環がん細胞を含む血液であってもよい。本明細書において、免疫細胞とは、白血球、すなわち、顆粒球，リンパ球，単球などの細胞をいう。
【０１２０】
ＣＴＣの直径（本明細書において「平均直径」を意味する。）について、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．１５６， Ｎｏ．１， ５７−６３， Ｊａｎｕａｒｙ ２０００には、以下のように報告されている。
【０１２１】
複数種の循環がん細胞について光学顕微鏡写真を撮影し、各種の循環がん細胞の平均的な投影面積を３９６μｍ2〜７９６μｍ2であると測定した。よって、各種の循環がん細胞の形状を球と仮定すると、循環がん細胞の直径は２２〜３２μｍであると算出されるとした。
【０１２２】
また、血球細胞の直径を下表に示す。
【０１２３】
【表１】
0005929915.tif 000002
【０１２４】
＜＜スリット・孔＞＞
スリットとは、溝１６の長手方向に沿って底部５２（谷近傍）に長く延びている孔をいい、細胞観察にとって不要な物質を排出することのできるものをいう。
【０１２５】
本発明の細胞平面展開デバイス１０は、必要に応じて、このようなスリットや孔を有していてもよい。なお、溝１６にスリットや孔が形成される場合は、毛細管力がやや弱まる可能性があるが、細胞懸濁液３０を展開する上で支障がないようにすればよい。
【０１２６】
このようなスリットとしてはその幅（溝１６の長手方向に対する垂直方向の長さ）が１μｍ以下、孔であれば直径１μｍ以下であることが実験により確認された。逆にいうと、溝１６にスリットを形成しない場合は、形成する場合に比べて毛細管力を高めることができ、細胞を展開する上でより好ましい。
【０１２７】
スリットは、谷（最深部）を含む部位に形成されていることが好ましいが、不要物の排出に支障が生じない範囲であれば、谷を含まない部位に形成されていてもよい。また、スリットは、溝１６の長手方向に沿って底部５２全体にわたって形成されていてもよいし、部分的、または断続的に形成されていてもよい。スリットの溝１６の長手方向の長さは特に限定されるものではない。
【０１２８】
なおスリットの幅はその機能上、細胞懸濁液３０の溶媒（水など）が通常は自重の働きのみにより表面張力に打ち勝って落ちることのできる幅を有することが好ましい。そのような幅は、溶媒の種類や細胞平面展開デバイス１０の材質、表面処理（親水化処理）によって変動する可能性があるが、例えば０．４μｍを下限とすることが好ましい。ただし、吸収部材等により自重以外の力を働かせてスリットから細胞懸濁液３０の溶媒等を排出するような場合には、スリットの幅の下限値をより小さくすることも可能である。
【０１２９】
スリットの幅が０．４μｍ以上１μｍ以下であると、細胞を一切ロスすることなく、細胞懸濁液３０の溶媒とともに細胞のデブリ等のゴミが細胞平面展開デバイス１０から除去されるため、細胞を展開した後の観察に好適である。
【０１３０】
また、細胞を展開途中または展開後に蛍光物質等を用いて染色する場合に、染色液を容易に除去できる点からも好ましい。細胞懸濁液３０の溶媒や染色液を除去すると、目的細胞６０の移動は止まり、静止した状態で目的細胞６０を観察することができるようになる。
【０１３１】
＜＜天井構造＞＞
本発明の細胞平面展開デバイス１０において、溝１６の上部に天井構造がなく開放された状態であっても、溝１６の壁面との間に働く力により、細胞懸濁液３０はポンプ等を使用して送液することなく溝１６の中に展開し、細胞平面展開デバイス１０の表面上に目的細胞６０を整列させることができる。
【０１３２】
しかしながら、溝１６の上部に天井構造を設け、閉鎖的な流路を形成することによって、細胞懸濁液３０に毛細管力がはたらき、より迅速に細胞懸濁液３０の展開および目的細胞６０の整列を行うことができるようになる。
【０１３３】
この天井構造は、開口部５０の上面（頂上面）から２０μｍ以上１００μｍ以下の高さに設けることが好ましく、目的細胞６０の直径の２倍程度の高さに設けることがより好ましい。
【０１３４】
このような天井構造は、例えば、２０μｍ以上１００μｍ以下の厚さのスペーサを介したカバーグラス等で形成することができる。
上記した細胞平面展開デバイス１０を用いた細胞展開方法について下記に説明する。
【０１３５】
＜細胞展開方法＞
本発明の細胞展開方法は、本発明の細胞平面展開デバイス１０の溝１６に、細胞懸濁液３０を接触させる工程を含むことを特徴とする。
【０１３６】
細胞平面展開デバイス１０の溝１６が形成された部位に直接に細胞懸濁液３０を添加する場合はもちろん、溝１６と連通した部位に細胞懸濁液３０を添加した場合であっても、毛細管力により細胞懸濁液３０を溝に展開させて細胞を整列させることができる。
【０１３７】
特に複数種からなる細胞懸濁液３０を細胞平面展開デバイス１０の溝１６に接触させると、目的細胞６０と、非目的細胞７０およびゴミ等とを分離し、目的細胞６０のみを平面状に密に整列させることができる。
【０１３８】
さらに、本発明の細胞平面展開デバイス１０の溝１６の上部に、細胞径の２倍程度の高さで天井構造を有すると、細胞に毛細管力がはたらき、より迅速に、細胞平面展開デバイス１０の表面上に目的細胞６０のみを整列させることができるため好ましい。
【０１３９】
また、たとえば細胞懸濁液３０の展開速度をさらに速めたり、より均一に細胞を展開させたりしたい場合には、スピンコーターなどの展開手段を併用することも可能である。
【０１４０】
上記のようにして目的細胞６０を整列させたのち、溝１６の中で目的細胞６０が保持されている位置（高さ）に顕微鏡の焦点を合わせることにより、目的細胞６０を観察することができる。その際、細胞懸濁液３０中に非目的細胞７０が存在していたとしても、目的細胞６０よりも底部５２側に保持されているので、目的細胞６０の観察を妨げない。
【０１４１】
このような、細胞平面展開デバイス１０の溝１６に、細胞懸濁液３０を接触させる工程について詳しく説明する。
【０１４２】
まず始めに、図１に示したような上記説明した本発明の細胞平面展開デバイス１０を準備する。細胞平面展開デバイス１０は、本体部１２の一方側２０から他方側２２に向かって、各溝１６の大きさが漸次大きくなるように構成されたものである。
【０１４３】
そして、この細胞平面展開デバイス１０の複数の溝群１８を横切るように、好ましくは複数の溝群１８を直交するように本体部１２の一方側２０から他方側２２に向かって、細胞懸濁液３０を供給する。すなわち、小さな溝１６ａが設けられた側から各溝群を横切るように、細胞懸濁液３０を細胞展開部１４に供給する。図１中の棒線矢印は、細胞懸濁液３０の流れ方向である。
【０１４４】
細胞懸濁液３０の液供給手段（図示せず）としては、特に限定されるものではなく、例えば細胞平面展開デバイス１０を平らな面に載置させた後、シリンジを用いて一方側２０から他方側２２に向かって細胞懸濁液３０を供給したりすることができる。
【０１４５】
また、細胞平面展開デバイス１０を傾斜させ、ここに本体部１２の一方側２０から細胞懸濁液３０を流すことで細胞展開部１４に細胞懸濁液３０中の細胞３０Ａ，３０Ｂ,３０Ｃを展開させるようにしても良い。
【０１４６】
細胞平面展開デバイス１０の傾斜の際には、細胞平面展開デバイス１０自体を傾斜させる他、図７に示したように細胞平面展開デバイス１０を載置させた際に上面の細胞展開部１４が傾斜面４０となるような形態としても良いものである。
【０１４７】
要は、細胞懸濁液３０中の各細胞３０Ａ，３０Ｂ，３０Ｃが緩やかな流れや自重を利用して溝を横切って移動されるような液供給手段（図示せず）であれば、如何なる手段であっても構わないものである。なおこの時、細胞懸濁液３０の好ましい流速としては１０〜３００μｌ／ｓｅｃである。
【０１４８】
細胞懸濁液３０を液供給手段（図示せず）で細胞展開部１４に展開させると、図８に示したように、溝１６ａ，１６ｂ，１６ｃ内に細胞懸濁液３０中の細胞３０Ａ，３０Ｂ，３０Ｃが平面状に展開されることとなる。
【０１４９】
細胞懸濁液３０の供給は、細胞平面展開デバイス１０の溝１６の大きさが、小さい溝１６ａから大きい溝１６ｃに向かって供給しているので、小さい溝１６ａから大きな溝１６ｃの順に小さい細胞３０Ａから大きな細胞３０Ｃが展開されることになる。このため、大きな溝１６ｃ内に小さな細胞３０Ａと大きな細胞３０Ｃとが両方入ってしまうようなことがなく、細胞を確実に大きさごとに分別しながら密に展開することができる。
【０１５０】
このようにして種々の細胞を展開した後、今度はこの平面状に細胞が展開された細胞平面展開デバイス１０を観察手段（図示せず）で観察する。
【０１５１】
観察手段（図示せず）としては、例えばＣＣＤカメラ，顕微鏡など通常用いる手段が利用できる。
【０１５２】
従来の細胞の分離技術では、分離した後、新たに分離後の細胞を平面状に展開させ、これを観察するといった手順が再度必要であったり、分離により目的細胞６０を損失してしまうといったことがあったが、本発明の細胞平面展開デバイス１０を用いた場合には、細胞の展開後、このままの状態で細胞観察が直ぐにできるため、細胞懸濁液３０中から目的細胞６０を見つけ出し、これを観察するまでの一連の作業を従来より早めることができるとともに、多数の細胞を漏れなく展開できるため、簡易に目的細胞６０の検出精度を高めることができる。
【０１５３】
すなわち、目的細胞６０が例えば血液中のがん細胞などであった場合には、これを早くに精度良く見つけ出すことで早期に臨床学的診断ができ、結果的に適切な治療方針を導き、患者への身体的および精神的な負担が軽減されることにもつながる。
【０１５４】
以上、本発明の細胞平面展開デバイス１０およびこれを用いた細胞展開方法について説明したが、本発明は上記の形態および方法に限定されるものではないものである。
【０１５５】
例えば、上記した細胞展開方法の説明では、細胞懸濁液３０を溝１６の大きさが小さい方から大きい方に向かって供給しているが、場合によってはこの逆であっても構わないものである。
【０１５６】
このような場合は、例えば大きな細胞だけを整列展開させたい場合であり、この場合には、細胞懸濁液３０の供給を、細胞平面展開デバイス１０の溝１６の大きさが小さい方から大きい方に向かって供給しても、大きい方から小さい方へ供給しても、いずれにしても大きな細胞を細胞展開部の上方（上面側）に整列展開した分別ができる。
【０１５７】
したがって、細胞懸濁液３０を供給する方向については、細胞懸濁液３０中のどのような大きさの細胞を観察したいのか、あるいは細胞懸濁液３０中の種々の細胞のうち、どの細胞を展開させたいかなどに応じて適宜決定すれば良いものである。
【０１５８】
さらに、上記細胞平面展開デバイス１０では、溝１６が本体部１２の両側面に至るまで溝１６が形成されているため、細胞懸濁液３０が溝１６外に流れ出す可能性を有する構造であるが、これを防止するために別途両側面に壁（図示せず）を設け、細胞懸濁液３０が溝１６の両端部から外に流れ出ないようにしても良いものである。
【０１５９】
また、上記細胞平面展開デバイス１０は、３つの分割板状体からなり、それぞれに１種類の溝が形成されているが、これに限定されるものではなく、何枚の分割板状体を用いても良く、また１枚の分割板状体に大きさが異なる複数種の溝が形成されていても構わないものであり、分割板状体の枚数と溝の大きさの種類数とが一致しなくても良いものである。
【実施例】
【０１６０】
次に、本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。【０１６１】
［実施例１］
山５４と山５４との間の幅（ピッチ＝開口部５０の最大幅Ｔ）２４μｍかつ傾斜角度θが４５度のプリズムシート（有機光学株式会社（株）製の「プリズムシート（先端角度９０度、ピッチ０．０２、幅（ピッチ方向）３００×長さ３００、標準板厚２ミリ）」；テーパード型）の表面を、ＵＶオゾンクリーナーを用いて親水化処理を施した。シート表面の水に対する接触角は２０度であった。【０１６２】
次に、Hoechst試薬にて（Invtrogen社）染色済みＪｕｒｋａｔ細胞（直径約１０〜１５μｍ）を含む細胞懸濁液（１０7個／ｍＬ）２０μＬをその表面に滴下し、細胞を展開した。蛍光顕微鏡下で取得した細胞展開画像を図９（ａ）に示す。【０１６３】
［実施例２］
実施例１で用いたプリズムシート表面を、実施例１と同様にして表面処理を行った。【０１６４】
その後、厚さ５０μｍのフィルムをスペーサとして介してカバーガラスをプリズムシートの表面上に配置した。【０１６５】
次に、Hoechst試薬にて（Invtrogen社）染色済みＪｕｒｋａｔ細胞を含む細胞懸濁液（１０7個／ｍＬ）２０μＬを、プリズムシートとカバーガラスとの間隙に添加し、細胞を展開した。蛍光顕微鏡下で取得した細胞展開画像を図９（ｂ）に示す。【０１６６】
［実施例３］
実施例１において、プリズムシートとして山５４と山５４との間の幅（ピッチ）１５μｍかつ傾斜角度θが７０度のプリズムシート（有機光学株式会社（株）製の「プリズムシート  先端角度１４０度、ピッチ０．０１５、幅（ピッチ方向）３００×長さ３００、標準板厚２ミリ」；テーパード型）を用いた以外は実施例１と同様にして細胞を展開した。顕微鏡下で取得した細胞展開画像を図９（ｃ）に示す。【０１６７】
［比較例１］
実施例１において、プリズムシートの代わりに、溝のないスライドガラス（松浪硝子（株）製の「大型スライド白縁磨  Ｎｏ．１」）を用いた以外は実施例１と同様にして細胞を展開した。顕微鏡下で取得した細胞展開画像を図９（ｄ）に示す。【０１６８】
実施例１〜３に相当する図９（ａ）〜図９（ｃ）から明らかなように、本実施形態の溝構造を有する細胞平面展開デバイス１０を用いれば、細胞が重なることなく、均一で平面状に展開されていることが確認できた。
これに対して比較例１に相当する図９（ｄ）では、細胞が一部に偏っており、また細胞同士が密になってしまっていることが確認された。【０１６９】
［実施例４］
がん患者から採血された末梢血を用い、これを本発明の細胞平面展開デバイス１０上に展開し、末梢血中の種々の細胞の検出、特には血液循環がん細胞（ＣＴＣ）の検出を行った。【０１７０】
なお、ここでの細胞懸濁液３０は、末梢血そのものでも適切な緩衝液、例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）等で希釈し細胞平面展開デバイス１０上に展開され易いようにしたものであっても良いものであるが、ここではリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で希釈したものを用いた。【０１７１】
また細胞懸濁液３０は、細胞平面展開デバイス１０上に展開した後、光学検出にて細胞を同定するために、あらかじめ血液循環がん細胞（ＣＴＣ）および白血球を蛍光標識した。【０１７２】
上記細胞懸濁液３０の調整方法は以下の通りである。【０１７３】
まず細胞懸濁液１ｍｌに、白血球標識用にＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８（インビトロジェン社製）で標識した抗ＣＤ４５抗体（Santa Cruz Biotechnology, Inc.）溶液１０μｌを添加し、室温暗所にて３０分反応させた後、さらにパラホルムアルデヒド（和光純薬社製）を４％になるように加えて、緩やかに混和し、室温暗所にて１５分間反応させた。【０１７４】
ここに、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を充分量加えて混和し、遠心分離にて洗浄を行い、次に細胞膜透過処理用として０．１％Ｔｗｅｅｎを含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を１ｍｌ、およびＣＴＣ標識用にＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７で標識した抗ＣＫ抗体（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ社製）溶液１０μｌを添加し、緩やかに混和しながら、室温暗所にて３０分反応させ、最後の５分間、細胞核染色用にＤＡＰＩ（同仁化学社製）溶液１０μｌを添加して反応させた。【０１７５】
この後、遠心分離により細胞に結合していない抗体試薬を除去し、新たにリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を添加して再懸濁させ、これにて本実施例で用いる細胞懸濁液とした。【０１７６】
本実施例においては、図１０（ａ）に示したように、１種類の大きさの溝からなる溝群がそれぞれに形成された４枚の分割板状体（１２Ａ〜１２Ｄ）を用意し、この４枚の分割板状体（１２Ａ〜１２Ｄ）を溝１６の大きさの順に並べ合わせてなる細胞平面展開デバイス１０を用いた。【０１７７】
なお、図１０（ｂ）に示したように、１枚目の分割板状体１２Ａには、溝幅Ｔが５μｍ，溝深さＨが５μｍの溝１６ａが複数列状に並設され、同様に２枚目の分割板状体１２Ｂには、溝幅Ｔが１０μｍ，溝深さＨが１０μｍの溝１６ｂが複数列状に並設され、３枚目の分割板状体１２Ｃには、溝幅Ｔが１５μｍ，溝深さＨが１５μｍの溝１６ｃが複数列状に並設され、４枚目の分割板状体１２Ｄには、溝幅Ｔが２０μｍ，溝深さＨが２０μｍの溝１６ｄが複数列状に並設されている。【０１７８】
溝幅Ｔが５μｍ，溝深さＨが５μｍの溝１６ａを有する分割板状体１２Ａの溝内には、直径２〜４μｍ程度の血小板，数μｍ程度にまで小さくなったＣＴＣ細胞残骸，厚み２μｍ程度の一部の赤血球が捕獲されるものと考えられる。通常の細胞が球状であるのに対し、赤血球は、直径が７〜８μｍで厚みが２μｍ程度の偏平形状であるから、この大きさの溝１６ａにも捕獲されると考えられる。【０１７９】
次いで溝幅Ｔが１０μｍ，溝深さＨが１０μｍの溝１６ｂを有する分割板状体１２Ｂの溝内には、直径７〜８μｍで厚み２μｍ程度の赤血球の一部，６〜９μｍ程度の小リンパ球が捕獲されるものと考えられる。【０１８０】
さらに溝幅Ｔが１５μｍ，溝深さＨが１５μｍの溝１６ｃを有する分割板状体１２Ｃの溝内には、直径９〜１５μｍ程度の大リンパ球，直径１０〜１７μｍ程度の顆粒球が捕獲されるものと考えられる。【０１８１】
最後に最下流側の溝幅Ｔが２０μｍ，溝深さＨが２０μｍの溝１６ｄを有する分割板状体１２Ｄの溝内には、直径２０μｍ程度の血液循環がん細胞（ＣＴＣ）が捕獲されるものと考えられる。【０１８２】
このような４枚の分割板状体１２Ａ〜１２Ｄからなる細胞平面展開デバイス１０を傾斜させ、細胞平面展開デバイス１０の溝１６の大きさが小さい溝１６ａから大きい溝１６ｄとなる一方側２０から他方側２２に溝１６を直交するようにして、細胞展開部１４上に細胞懸濁液３０を供給し、溝内に各細胞を展開させた。【０１８３】
このとき、細胞平面展開デバイス１０の傾斜具合は、細胞懸濁液の流速が１０〜３００μｌ／ｓｅｃ程度となるよう調整した。【０１８４】
細胞展開後の細胞平面展開デバイス１０のうち、最下流側に位置する溝幅Ｔが２０μｍ，溝深さＨが２０μｍの溝１６ｄを有する分割板状体１２Ｄに、Ｈｅ−Ｎｅレーザ（励起波長６３３ｎｍ）を照射し、これをＣＣＤカメラで撮像したところ、血液循環がん細胞（ＣＴＣ）に特異的に発現するＣＫに結合したＡｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ６４７の蛍光が検出され、血液循環がん細胞（ＣＴＣ）を同定できた。【０１８５】
ここで偽陽性を避けるため、白血球検出用に標識したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８を励起するＡｒレーザ（励起波長４８８ｎｍ）で、シグナルが検出されないことも確認した。【０１８６】
次に細胞核を検出するため、水銀ランプを用いてＤＡＰＩをＵＶ励起させたところ、細胞核も検出された。【０１８７】
また、ＣＴＣ細胞残骸を検出するため、最上流側に位置する溝幅Ｔが５μｍ，溝深さＨが５μｍの溝１６ａを有する分割板状体１２Ａに上記したのと同様のＨｅ−Ｎｅレーザ（励起波長６３３ｎｍ）を照射したところ、ＣＴＣ細胞残骸も検出された。【０１８８】
本発明の細胞平面展開デバイス１０を用いて行った血液中の種々の細胞展開の結果としては、図１０（ｃ）に示したように予想していた大きさの細胞が、その大きさに合った大きさの溝１６内に確実に整列されて展開され、特に重要な血液循環がん細胞（ＣＴＣ）についても、先に展開予想されていた分割板状体１２Ｄから検出できた。【０１８９】
したがって、本発明の細胞平面展開デバイス１０を用いて細胞懸濁液３０の展開を行えば、確実に大きさの違う細胞をこれに合った大きさの溝内に整列して分別できるとともに、このまま観察することができることが確認された。【０１９０】
なお、本実施例では行っていないが、末梢血液中に存在する非血球細胞としては、循環血管内皮細胞（ＣＥＣ）や循環内皮前駆細胞（ＣＥＰ）などもあり、これらは一般に直径１０〜１５μｍ程度の大きさを有する。【０１９１】
このため、２番目に位置する溝幅Ｔが１０μｍ，溝深さＨが１０μｍの溝１６ｂを有する分割板状体１２Ｂと、３番目に位置する溝幅Ｔが１５μｍ，溝深さＨが１５μｍの溝１６ｃを有する分割板状体１２Ｃを観察すれば、これらの細胞検出が可能と考えられる。【０１９２】
上記の実施例においては主に末梢血中の血液循環がん細胞（ＣＴＣ）の検出を行ったが、他にも同様にして末梢血中の胎児有核赤血球、末梢血，骨髄液，組織中の幹細胞などのレア細胞、また体液（腹水，唾液，汗，尿，糞，髄液，乳汁など）中に剥離した細胞の検出などにも利用され得ると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１９３】
本発明の細胞平面展開デバイスを用いて細胞を観察した場合、細胞懸濁液が、例えば、被験者から採血した血液（１０ｍＬ）である場合、顕微鏡の狭い視野内に多数の細胞を高密度で整列させ展開することができるため、例えばがん細胞などの数が少ない細胞を効率良く発見することができる。
【符号の説明】
【０１９４】
１０・・・細胞平面展開デバイス
１２・・・本体部
１２Ａ〜１２Ｄ・・・分割板状体
１４・・・細胞展開部
１６・・・溝
１６ａ〜１６ｄ・・・溝
１８・・・溝群
１８Ａ〜１８Ｄ・・・溝群
２０・・・一方側
２２・・・他方側
３０・・・細胞懸濁液
３０Ａ〜３０Ｃ・・・細胞
４０・・・傾斜面
５０・・・開口部
５２・・・底部
５４・・・山
６０・・・目的細胞
７０・・・非目的細胞
Ｔ・・・溝の最大幅
Ｈ・・・溝深さ
１００・・・細胞処理デバイス
１０２・・・流路部材
１０４・・・溝
１０６・・・底面
１１０・・・一方側
１１２・・・他方側
１５０・・・細胞懸濁液
１５０Ａ・・赤血球
１５０Ｂ・・組織由来幹細胞
２００・・・細胞処理デバイス
２０２・・・柱
２０４・・・部材
２０６・・・部材
２０８・・・容器
２１０・・・一方側
２１２・・・他方側
２１４・・・入口
２５０Ａ〜２５０Ｃ・・・細胞
３００・・・スリット部材
３０１・・・第１面
３０２・・・第２面
３１０・・・貫通孔
３１２・・・テーパー部
ｇ・・・がん細胞
ｔ・・・厚み
ｄｔ・・・深さ
Ｗｔｅ・・・幅
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図９】
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