(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｈ１４５Ａの変異を有する変異体ｓｐｒタンパク質をコードする変異体ｓｐｒ遺伝子を含んでいる組換えグラム陰性細菌細胞であって、
非組換えの野生型染色体Ｔｓｐ遺伝子を含み、そして
変異ｓｐｒ遺伝子以外、野生型細菌細胞に対して同質遺伝子である、
組換えグラム陰性細菌細胞。
【請求項２】
Ｈ１４５Ａの変異を有する変異体ｓｐｒタンパク質をコードする変異体ｓｐｒ遺伝子を含んでいる組換えグラム陰性細菌細胞であって、
非組換えの野生型染色体Ｔｓｐ遺伝子を含み、そして
以下の変異遺伝子：
ａ．シャペロン活性及び５０％以下のプロテアーゼ活性を有するＤｅｇＰタンパク質をコードする変異ＤｅｇＰ遺伝子、
ｂ．５０％以下のプロテアーゼ活性を有するＰｒｏｔｅａｓｅ  ＩＩＩタンパク質をコードする、又はノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子である、変異ｐｔｒ遺伝子、
ｃ．５０％以下のプロテアーゼ活性を有するＯｍｐＴタンパク質をコードする、又はノックアウト変異ＯｍｐＴ遺伝子である、変異ＯｍｐＴ遺伝子
の１つ又は複数をさらに含み、
上記変異以外、野生型細菌細胞に対して同質遺伝子である、
組換えグラム陰性細菌細胞。
【請求項３】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項１又は２に記載の細胞。
【請求項４】
ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドを含むベクターをさらに含んでいる、請求項１から３までのいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５】
対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターをさらに含んでいる、請求項１から４までのいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６】
ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチド及び対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを含んでいる、請求項１から３までのいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７】
前記ベクターが、ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチド及び対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の発現を制御するプロモーターを含んでいる、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
対象のタンパク質が、抗体又は抗体の抗原結合性フラグメントである、請求項５から７までのいずれか一項に記載の細胞。
【請求項９】
抗体又は抗体の抗原結合性フラグメントがＴＮＦに特異的である、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
Ｈ１４５Ａの変異を有する変異体ｓｐｒタンパク質をコードする変異体ｓｐｒ遺伝子、野生型Ｔｓｐ遺伝子、及びＴＮＦに特異的な抗体又はその抗原結合性フラグメントである対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含んでいる、組換えグラム陰性細菌細胞。
【請求項１１】
ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドを含んでいる、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
請求項５から１１までのいずれか一項に記載の組換えグラム陰性細菌細胞を、培養培地中、対象のタンパク質を発現させるのに有効な条件下で培養するステップと、組換えグラム陰性細菌細胞のペリプラズム及び／又は培養培地から対象のタンパク質を回収するステップとを含む、対象のタンパク質を生成するための方法。
【請求項１３】
対象のタンパク質がペリプラズム及び／又は上清から回収される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
細胞がＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドを含んでおり、細胞がＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドを発現するのに有効な条件下で培養される、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列及びＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドの発現が、培養培地に誘導因子を加えることによって誘発される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
対象のタンパク質をＤｓｂＣから分離するステップをさらに含む、請求項１４又は請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え細菌宿主系統、特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に関する。本発明は、このような細胞中で対象のタンパク質を生成するための方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸菌などの細菌細胞は、組換えタンパク質を生成するために一般的に用いられる。特に、プラスミドによって遺伝子の挿入を可能にする宿主細胞として細菌細胞が多用途であるという性質のため、組換えタンパク質を生成するのに大腸菌などの細菌細胞を用いると有利な点が多い。大腸菌は、ヒトインスリンを含めた多くの組換えタンパク質を生成するのに用いられている。
【０００３】
組換えタンパク質を生成するのに細菌細胞を用いるのは利点が多いにもかかわらず、対象の組換えタンパク質の発現の間に細菌細胞が溶解する傾向があることを含めた、重大な制限が依然として存在する。この溶解の表現型は野生型の細菌細胞において見られることがあり、細菌のプロテアーゼを欠く細胞など、遺伝子操作された細胞にも見られることがある。プロテアーゼは、大腸菌のペリプラズム及び細胞質における古く、損傷を受け、又はミスフォールディングされたタンパク質を代謝回転する上で重要な役割を果たしている。細菌のプロテアーゼは、対象の組換えタンパク質を分解するように作用し、それによって活性タンパク質の収率を大幅に低減することが多い。それゆえ、プロテアーゼ活性を低減することは、対象のタンパク質のタンパク質分解性を低減するのに望ましい。しかし、Ｔｓｐ（Ｐｒｃとしても知られている）などのプロテアーゼを欠く細菌系統も細胞溶解を示す。
【０００４】
Ｔｓｐ（Ｐｒｃとしても知られている）は、６０ｋＤａのペリプラズムプロテアーゼである。Ｔｓｐ（ｐｒｃ）活性を低減することは、対象のタンパク質のタンパク質分解を低減するのに望ましい。しかし、プロテアーゼｐｒｃを欠く細胞は、低いモル浸透圧濃度で熱感受性の増殖を示すことが見出された。Ｈａｒａらは、遺伝子外サプレッサー（ｓｐｒ）変異を含む熱耐性復帰変異体であったＴｓｐ欠損系統を単離した（Ｈａｒａら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、２巻、６３〜７２頁（１９９６年））。ｓｐｒは、１８ｋＤａの膜結合ペリプラズムプロテアーゼであり、ｓｐｒの基質は細胞分裂の間細胞壁の加水分解に関与する外膜におけるＴｓｐ及びペプチドグリカンである。ｓｐｒ遺伝子は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｐ０ＡＦＶ４（ＳＰＲ＿ＥＣＯＬＩ）と呼ばれている。変異体ｓｐｒ遺伝子を有するプロテアーゼ欠損細菌系統はＣｈｅｎら（Ｃｈｅｎ  Ｃ、Ｓｎｅｄｅｃｏｒ  Ｂ、Ｎｉｓｈｉｈａｒａ  ＪＣ、Ｊｏｌｙ  ＪＣ、ＭｃＦａｒｌａｎｄ  Ｎ、Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ＤＣ、Ｂａｔｔｅｒｓｂｙ  ＪＥ、Ｃｈａｍｐｉｏｎ  ＫＭ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．、２００４年３月５日、８５巻（５）、４６３〜７４頁）に記載されており、ｐｒｃ（Ｔｓｐ）、並びに遺伝子の上流及び下流の領域を増幅し、選択マーカー及びｓｐｒＷ１７４Ｒ変異を含んでいるベクター上でこれらを一緒にライゲートすることによって作り出された別のプロテアーゼであるＤｅｇＰにおける変異の異なる組合せを有する大腸菌系統の構築について記載している。
【０００５】
驚くべきことに、変異体ｓｐｒ遺伝子及び野生型Ｔｓｐ遺伝子を有するグラム陰性細菌細胞は溶解性の低減した細胞を提供することが見出されている。したがって、本発明者らは、対象のタンパク質を生成するための有利な性質を有する新規な系統を提供する。
【０００６】
本発明による細胞は、ｓｐｒ及びＴｓｐが相互のサプレッサーであることが知られているので、有利な増殖及びタンパク質収率の表現型を示し、それゆえ１つが優勢になされる場合、細胞は漏出性になり、又は細胞溶解に対する性向の増大を示すなど、増殖の劣る表現型を示し得ることが予測される。しかし、本発明の細胞は、野生型細胞及びノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる細胞に比べて、細胞溶解の表現型において著しい低減を示した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、変異体ｓｐｒタンパク質をコードする変異体ｓｐｒ遺伝子を含んでいる組換えグラム陰性細菌細胞であって、非組換えの野生型染色体Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる組換えグラム陰性細菌細胞を提供する。
【０００８】
一実施形態において、本発明による細胞のゲノムは、変異ｓｐｒ遺伝子以外、野生型細菌細胞のゲノムに対して同質遺伝子である。
【０００９】
本発明が提供する細胞は、有利な増殖及びタンパク質生成の表現型を示す。
【００１０】
本発明は、上記に規定した組換えグラム陰性細菌細胞において対象の組換えタンパク質を発現することを含む、対象の組換えタンパク質を生成するための方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】野生型Ｗ３１１０及びＭＸＥ００１に比べた、ＭＸＥ０１２及びＭＸＥ０１７の増殖を示す図である。
【図２】野生型Ｗ３１１０及びＭＸＥ００１に比べた、ＭＸＥ０１２及びＭＸＥ０１７における抗ＴＮＦα  Ｆａｂ’の発現を示す図である。
【図３】抗ＴＮＦα  Ｆａｂ’生成性発酵の間のＷ３１１０及びＭＸＥ０１２の増殖プロファイルを示す図である。
【図４】抗ＴＮＦα  Ｆａｂ’生成性発酵の間のＷ３１１０及びＭＸＥ０１２（Ｗ３１１０ｓｐｒＨ１１９Ａ）に対する、ペリプラズムの抗ＴＮＦα  Ｆａｂ’蓄積（実線及び記号）並びに培地のＦａｂ’蓄積（点線及び白記号）を示す図である。
【図５】抗ＴＮＦα  Ｆａｂ’発現性系統Ｗ３１１０及びＭＸＥ０１２、並びに抗ＴＮＦα  Ｆａｂ’及び組換えＤｓｂＣ発現性系統Ｗ３１１０及びＭＸＥ０１２の増殖プロファイルを示す図である。
【図６】抗ＴＮＦα  Ｆａｂ’発現性系統Ｗ３１１０及びＭＸＥ０１２、並びに抗ＴＮＦα  Ｆａｂ’及び組換えＤｓｂＣ発現性系統Ｗ３１１０及びＭＸＥ０１２からのペリプラズム（黒記号）及び上清（白記号）からの抗ＴＮＦα  Ｆａｂ’の収率を示す図である。
【図７】Ｗ３１１０、ＭＸＥ００１、ＭＸＥ００８、及びＭＸＥ０１２系統のｄｓＤＮＡアッセイの結果を示す図である。
【図８】Ｗ３１１０、ＭＸＥ００１、ＭＸＥ００８、及びＭＸＥ０１２系統のタンパク質アッセイの結果を示す図である。
【図９ａ】野生型ｐｔｒ（ＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩ）及びノックアウト変異ｐｔｒ（ＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩ）の５’末端のタンパク質及び遺伝子配列を示す図である。
【図９ｂ】野生型Ｔｓｐ及びノックアウト変異Ｔｓｐの５’末端のタンパク質及び遺伝子配列を示す図である。
【図９ｃ】野生型ＤｅｇＰ及び変異ＤｅｇＰタンパク質のある領域及び遺伝子配列を示す図である。
【図１０】本発明の一実施形態による細胞を生成するのに用いるためのベクターの構築を示す図である。
【図１１】抗ＴＮＦα  Ｆａｂ’及び組換えＤｓｂＣ発現性系統ＭＸＥ０１２の２００Ｌの発酵の増殖プロファイルを示す図である。
【図１２】抗ＴＮＦα  Ｆａｂ’及び組換えＤｓｂＣ発現性系統ＭＸＥ０１２の２００Ｌの発酵の抗ＴＮＦα  Ｆａｂ’力価を示す図である。
【図１３】抗ＴＮＦα  Ｆａｂ’及び組換えＤｓｂＣ発現性系統ＭＸＥ０１２の２００Ｌの発酵の生存性を示す図である。
【図１４】抗ＴＮＦα  Ｆａｂ’及び組換えＤｓｂＣ発現性系統ＭＸＥ０１２の３０００Ｌの発酵の増殖プロファイルを示す図である。
【図１５】抗ＴＮＦα  Ｆａｂ’及び組換えＤｓｂＣ発現性系統ＭＸＥ０１２の３０００Ｌの発酵の抗ＴＮＦα  Ｆａｂ’力価を示す図である。
【００１２】
配列の簡単な説明
配列番号１は、開始コドンの上流の６個のヌクレオチドＡＴＧＡＡＣを含んでいる野生型Ｔｓｐ遺伝子のＤＮＡ配列である。
【００１３】
配列番号２は、野生型Ｔｓｐタンパク質のアミノ酸配列である。
【００１４】
配列番号３は、開始コドンの上流の６個のヌクレオチドＡＴＧＡＡＴを含んでいる変異ノックアウトＴｓｐ遺伝子のＤＮＡ配列である。
【００１５】
配列番号４は、野生型ＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩ遺伝子のＤＮＡ配列である。
【００１６】
配列番号５は、野生型ＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩタンパク質のアミノ酸配列である。
【００１７】
配列番号６は、変異ノックアウトＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩ遺伝子のＤＮＡ配列である。
【００１８】
配列番号７は、野生型ＤｅｇＰ遺伝子のＤＮＡ配列である。
【００１９】
配列番号８は、野生型ＤｅｇＰタンパク質のアミノ酸配列である。
【００２０】
配列番号９は、変異ＤｅｇＰ遺伝子のＤＮＡ配列である。
【００２１】
配列番号１０は、変異ＤｅｇＰタンパク質のアミノ酸配列である。
【００２２】
配列番号１１は、抗ＴＮＦ抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００２３】
配列番号１２は、抗ＴＮＦ抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００２４】
配列番号１３は、抗ＴＮＦ抗体の軽鎖のアミノ酸配列である。
【００２５】
配列番号１４は、抗ＴＮＦ抗体の重鎖のアミノ酸配列である。
【００２６】
配列番号１５は、ＡｓｅＩ制限部位を含んでいる変異Ｔｓｐ遺伝子の領域に対する３’オリゴヌクレオチドプライマーの配列である。
【００２７】
配列番号１６は、ＡｓｅＩ制限部位を含んでいる変異Ｔｓｐ遺伝子の領域に対する５’オリゴヌクレオチドプライマーの配列である。
【００２８】
配列番号１７は、ＡｓｅＩ制限部位を含んでいる変異ＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩ遺伝子の領域に対する３’オリゴヌクレオチドプライマーの配列である。
【００２９】
配列番号１８は、ＡｓｅＩ制限部位を含んでいる変異ＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩ遺伝子の領域に対する５’オリゴヌクレオチドプライマーの配列である。
【００３０】
配列番号１９は、ＡｓｅＩ制限部位を含んでいる変異ＤｅｇＰ遺伝子の領域に対する５’オリゴヌクレオチドプライマーの配列である。
【００３１】
配列番号２０は、ＡｓｅＩ制限部位を含んでいる変異ＤｅｇＰ遺伝子の領域に対する３’オリゴヌクレオチドプライマーの配列である。
【００３２】
配列番号２１は、最初のアミノ酸残基２６個であるシグナル配列を含んでいる非変異ｓｐｒ遺伝子の配列である。
【００３３】
配列番号２２は、シグナル配列のない野生型ｓｐｒ遺伝子の配列である。
【００３４】
配列番号２３は、Ｄ２１０Ａ及びＨ２１２Ａ変異を含んでいる変異ＯｍｐＴ配列のヌクレオチド配列である。
【００３５】
配列番号２４は、Ｄ２１０Ａ及びＨ２１２Ａ変異を含んでいる変異ＯｍｐＴ配列のアミノ酸配列である。
【００３６】
配列番号２５は、変異ノックアウトＯｍｐＴ配列のヌクレオチド配列である。
【００３７】
配列番号２６は、ｈｉｓタグ付けしたＤｓｂＣのヌクレオチド配列である。
【００３８】
配列番号２７は、ｈｉｓタグ付けしたＤｓｂＣのアミノ酸配列である。
【００３９】
配列番号２８は、ｈＴＮＦ４０のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列を示す。
【００４０】
配列番号２９は、ハイブリッドＣＤＲであるｈＴＮＦ４０のＣＤＲＨ２のアミノ酸配列を示し、Ｃ末端の６個のアミノ酸はヒトサブグループ３生殖系列抗体のＨ２  ＣＤＲ配列からであり、このハイブリダイゼーションに起因する配列に対するアミノ酸の変化には以下の通り下線をつける：ＷＩＮＴＹＩＧＥＰＩ  ＹＡＤＳＶＫＧ。
【００４１】
配列番号３０は、ｈＴＮＦ４０のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を示す。
【００４２】
配列番号３１は、ｈＴＮＦ４０のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列を示す。
【００４３】
配列番号３２は、ｈＴＮＦ４０のＣＤＲＬ２のアミノ酸配列を示す。
【００４４】
配列番号３３は、ｈＴＮＦ４０のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を示す。
【００４５】
配列番号３４は、ｈＴＮＦ４０のＣＤＲＨ２のアミノ酸配列を示す。
【００４６】
配列番号３５は、ＯｍｐＡオリゴヌクレオチドアダプターの配列を示す。
【００４７】
配列番号３６は、大腸菌Ｆａｂ発現に対する遺伝子間配列１（ＩＧＳ１）をコードするオリゴヌクレオチドカセットを示す。
【００４８】
配列番号３７は、大腸菌Ｆａｂ発現に対する遺伝子間配列２（ＩＧＳ２）をコードするオリゴヌクレオチドカセットを示す。
【００４９】
配列番号３８は、大腸菌Ｆａｂ発現に対する遺伝子間配列３（ＩＧＳ３）をコードするオリゴヌクレオチドカセットを示す。
【００５０】
配列番号３９は、大腸菌Ｆａｂ発現に対する遺伝子間配列４（ＩＧＳ４）をコードするオリゴヌクレオチドカセットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本発明は、変異ｓｐｒ遺伝子及び非組換えの野生型染色体Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる、対象のタンパク質を発現するのに適する組換えグラム陰性細菌細胞を提供する。
【００５２】
驚くべきことに、変異ｓｐｒ及び非組換えの野生型染色体Ｔｓｐを有する細胞は、改善された細胞の増殖を示し、野生型細胞又は変異Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる細胞に比べて低減した細胞溶解の表現型を示すことが見出されている。
【００５３】
さらに、一実施形態において、変異体のｓｐｒ及び非組換えの野生型染色体Ｔｓｐを有する細胞は、野生型細菌細胞又は変異Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる細胞に比べて、増大した対象の組換えタンパク質の収率を示す。改善されたタンパク質の収率は、ペリプラズマタンパク質の収率でも、及び／又は上清のタンパク質の収率でもよい。一実施形態において、本発明の細胞は、細胞からの漏出の低減により、野生型細胞に比べて改善されたペリプラズマタンパク質の収率を示す。組換え細菌細胞は、低減した細胞溶解により、対象の組換えタンパク質を長期間発現することが可能である。
【００５４】
本発明による細胞が、ペリプラズム及び／又は培地において、対象のタンパク質のおよそ１．０ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、１．８ｇ／Ｌ、２．０ｇ／Ｌ、２．４ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、又は４．０ｇ／Ｌの、最大の収率を発現するのが好ましい。
【００５５】
予め作り出され、組換えタンパク質を発現させるのに用いられるプロテアーゼ欠損細菌系統などの知られている遺伝子操作された系統に付随する欠点は、大腸菌系統において、例えば、ｐｈｏＡ、ｆｈｕＡ、ｌａｃ、ｒｅｃ、ｇａｌ、ａｒａ、ａｒｇ、ｔｈｉ、及びｐｒｏなど、細胞の代謝及びＤＮＡ複製に関与する遺伝子の変異の使用を含むことである。これらの変異は、細胞の増殖、安定性、組換えタンパク質発現収率、及び毒性に対する効果を含めた、宿主細胞に対する多くの有害効果を有し得る。これらのゲノムの変異を１つ又は複数有する系統、特にこれらの変異を多数有する系統は、細菌の増殖速度を、産業的なタンパク質生成に適さないレベルまで低減する適応度の喪失を表し得る。さらに、あらゆる上記のゲノムの変異は、予測不可能な有害な方法で、シス及び／又はトランスにおいて他の遺伝子に影響を及ぼし、それによって系統の表現型、適応度、及びタンパク質のプロファイルを変更し得る。さらに、大幅に変異した細胞を使用することは、商用、特に治療剤に使用するための組換えタンパク質を生成するのに一般に適さない、というのは、このような系統は一般的に欠陥のある代謝経路を有し、そのため最小の培地又は化学的に規定された培地において不十分にしか増殖せず、又は全く増殖しないことがあるからである。
【００５６】
本発明の好ましい一実施形態において、細胞は、ｓｐｒ変異体を導入するのに必要とされるゲノムに対して最小の変異だけを有する。この実施形態において、細菌細胞のゲノムは野生型細菌細胞のゲノムと、ｓｐｒ遺伝子に対する１つ又は複数の変異が異なるにすぎず、細胞の増殖及び／又は対象のタンパク質を発現する能力に対して有害な効果を有し得るいかなる他の変異も有さない。したがって、本発明による１つ又は複数の組換え宿主細胞は、ゲノム配列に対してさらなる遺伝子操作された変異を含んでいる細胞に比べて改善されたタンパク質発現及び／又は改善された増殖の特徴を表し得る。本発明が提供する細胞はまた、細胞のゲノムに対するさらなるかく乱を含んでいる細胞に比べて、治療用タンパク質の生成において用いるのにより適している。
【００５７】
本発明は、変異体ｓｐｒタンパク質をコードする変異体ｓｐｒ遺伝子を含んでいる組換えグラム陰性細菌細胞も提供し、細胞のゲノムは、変異ｓｐｒ遺伝子以外、野生型細菌細胞のゲノムに対して同質遺伝子である。本発明のこの態様において、細胞は野生型Ｔｓｐ遺伝子を有する。野生型染色体Ｔｓｐ遺伝子が非組換えの染色体Ｔｓｐ遺伝子であるのが好ましい。
【００５８】
当業者であれば、発酵法、ＥＬＩＳＡ、及びタンパク質Ｇ  ＨＰＬＣを含めた当技術分野においてよく知られている方法を用いて、それが望ましい収率の対象のタンパク質を有するか否かを見るために、候補の細胞クローンを試験することが容易にできる。適切な発酵法は、Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ  Ｄ  Ｐら（１９９７年）、「Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｍｅｒｉｃ  Ｆａｂｓ  ｉｎ  Ｅ．  ｃｏｌｉ：ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｈｉｎｇｅ  ｓｉｚｅ  ａｎｄ  ｉｓｏｔｙｐｅ，ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｃｈａｉｎ  ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ  ｂｏｎｄ，Ｆａｂ’  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｌｅｖｅｌｓ，ｔａｉｌ  ｐｉｅｃｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．」、Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．ＭＥＴＨ．、２０９巻、１９３〜２０２頁；Ｂａｃｋｌｕｎｄ  Ｅ．、Ｒｅｅｋｓ  Ｄ．、Ｍａｒｋｌａｎｄ  Ｋ．、Ｗｅｉｒ  Ｎ．、Ｂｏｗｅｒｉｎｇ  Ｌ．、Ｌａｒｓｓｏｎ  Ｇ．、「Ｆｅｄｂａｔｃｈ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」、雑誌記事、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｎｏｎ−Ｕ．Ｓ．  Ｇｏｖ’ｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．、１３５巻（４）、３５８〜６５頁、２００８年７月３１日；  Ｃｈａｍｐｉｏｎ  ＫＭ．、Ｎｉｓｈｉｈａｒａ  ＪＣ．、Ｊｏｌｙ  ＪＣ．、Ａｒｎｏｔｔ  Ｄ．、「Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｕｐｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．」、［雑誌記事］Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．、１巻（９）、１１３３〜４８頁、２００１年９月；及びＨｏｒｎ  Ｕ．、Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ  Ｗ．、Ｋｒｅｂｂｅｒ  Ａ．、Ｋｎｕｐｆｅｒ  Ｕ．、Ｋｕｊａｕ  Ｍ．、Ｗｅｎｄｅｒｏｔｈ  Ｒ．、Ｍｕｌｌｅｒ  Ｋ．、Ｍａｔｚｋｕ  Ｓ．、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ａ．、Ｒｉｅｓｅｎｂｅｒｇ  Ｄ．、「Ｈｉｇｈ  ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ  ｙｉｅｌｄｓ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｉｍｅｒｉｃ  ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ−ｃｅｌｌ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｕｎｄｅｒ  ｎｏｎ−ｌｉｍｉｔｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ」、雑誌記事、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｕｐｐｏｒｔ、Ｎｏｎ−Ｕ．Ｓ．  Ｇｏｖ’ｔ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．、４６巻（５〜６）、５２４〜３２頁、１９９６年１２月に記載されている。当業者であれば、タンパク質Ｇ  ＨＰＬＣ、円偏光二色性、ＮＭＲ、Ｘ線結晶構造解析、及びエピトープ親和性測定方法など、当技術分野においてよく知られている方法を用いて、タンパク質が正確にフォールディングされているか否かを見るために分泌されたタンパク質を試験することも容易にできる。
【００５９】
本発明の好ましい一実施形態において、細胞は、ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる。
【００６０】
本発明を、次に、より詳しく記載する。
【００６１】
「タンパク質」及び「ポリペプチド」の語は、文脈上別段の記載がなければ、本明細書において交換可能に用いられる。「ペプチド」は１０個以下のアミノ酸を意味するものとされる。
【００６２】
「ポリヌクレオチド」の語は、文脈上別段の記載がなければ、遺伝子、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡなどを含む。
【００６３】
本明細書で用いられる「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の語は、本明細書の文脈において「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」と解釈されたい。
【００６４】
非変異細胞又はコントロール細胞は、本発明の文脈において、本発明の組換えグラム陰性細胞と同じ型の細胞を意味し、細胞は変異体ｓｐｒ遺伝子を有するように修飾されていない。例えば、非変異細胞は野生型細胞であってよく、あらゆる変異を導入する修飾の前の本発明の細胞と同じ宿主細胞の集団に由来してよい。
【００６５】
「細胞」、「細胞系」、「細胞培養物」、及び「系統」の表現は交換可能に用いられる。
【００６６】
「変異Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる細胞の表現型」の表現は、本発明の文脈において、変異体のＴｓｐ遺伝子を抱く細胞によって表される表現型を意味する。典型的に、変異体のＴｓｐ遺伝子を含んでいる細胞は、特に高い細胞密度で溶解することができる。これらの細胞の溶解は、あらゆる組換えタンパク質の上清中への漏出をもたらす。変異Ｔｓｐ遺伝子を有する細胞は、低いモル浸透圧濃度では熱感受性の増殖も示すことがある。例えば、４０℃以上などの高温では、細胞は増殖率を示さず、若しくは低減した増殖率を示し、又は細胞は低浸透圧性の培地中で死滅する。
【００６７】
「同質遺伝子の」の語は、本発明の文脈において、本発明の細胞のゲノムが、変異ｓｐｒ遺伝子以外は細胞が由来する野生型の細胞に比べて実質的に同じ、又は同じゲノム配列を有することを意味する。この実施形態において、本発明による細胞のゲノムはさらなる天然に存在しない変異又は遺伝子操作された変異を含んでいない。一実施形態において、本発明による細胞は、起こり得るあらゆる天然に存在する変異を考慮に入れて、変異ｓｐｒ遺伝子以外、野生型細胞に比べて実質的に同じゲノム配列を有し得る。一実施形態において、本発明による細胞は、変異ｓｐｒ遺伝子以外、野生型細胞に比べて正確に同じゲノム配列を有し得る。
【００６８】
細胞がＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドを含んでいる本発明の実施形態において、ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドは、細胞中に形質転換され、及び／又は宿主細胞のゲノム中に組み入れられた適切な発現ベクター上に存在していてよい。ＤｓｂＣをコードするポリヌクレオチドが宿主のゲノム中に挿入される実施形態において、本発明の細胞は、ＤｓｂＣをコードする挿入されたポリヌクレオチド配列のために、野生型細胞とやはり異なる。ＤｓｂＣをコードするポリヌクレオチドが細胞中の発現ベクター中にあり、それによって宿主細胞のゲノムの最小のかく乱をもたらすのが好ましい。
【００６９】
「野生型」の語は、本発明の文脈において、天然に存在することがあり、又は環境から単離され得るグラム陰性細菌細胞の系統を意味し、いかなる遺伝子操作された変異も保有しない。大腸菌の野生型系統の一例にはＷ３１１０−１２系統などのＷ３１１０がある。
【００７０】
あらゆる適切なグラム陰性細菌を、本発明の組換え細胞を生成するための親細胞として用いることができる。適切なグラム陰性細菌には、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、軟腐病菌（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、アシネトバクター・バウマンニイ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、及び大腸菌が含まれる。親細胞が大腸菌であるのが好ましい。本発明において大腸菌のあらゆる適切な系統を用いることができるが、Ｋ−１２  Ｗ３１１０などの野生型Ｗ３１１０系統を用いるのが好ましい。
【００７１】
好ましい一実施形態において、細胞は、変異ｓｐｒ遺伝子以外、Ｗ３１１０系統などの野生型大腸菌細胞に対して同質遺伝子である。
【００７２】
一実施形態において、本発明の細胞は、対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでいる。この実施形態において、対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、細胞中に形質転換され、且つ／又は宿主細胞のゲノム中に組み込まれた適切な発現ベクター内に含まれていてよい。対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが宿主のゲノム中に挿入される実施形態において、本発明のゲノムは、対象のタンパク質をコードする挿入されたポリヌクレオチド配列のために、野生型細胞とやはり異なる。ポリヌクレオチドが細胞における発現ベクター中にあり、それによって宿主細胞のゲノムに対して最小のかく乱を引き起こすのが好ましい。
【００７３】
本発明による細胞は野生型Ｔｓｐ遺伝子を有する。本発明の一態様において、細胞は野生型の非組換え染色体Ｔｓｐ遺伝子を有する。野生型の非組換え染色体Ｔｓｐ遺伝子は、組換えＤＮＡ技術を用いて構築も、生成も、染色体中に挿入もされない染色体Ｔｓｐ遺伝子を意味する。
【００７４】
本明細書で用いられる「Ｔｓｐ遺伝子」は、ペニシリン結合性タンパク質−３（ＰＢＰ３）及びファージテイルタンパク質に対して作用することができるペリプラズムプロテアーゼである、プロテアーゼＴｓｐ（Ｐｒｃとしても知られている）をコードする遺伝子を意味する。野生型Ｔｓｐ遺伝子の配列を配列番号１に示し、野生型Ｔｓｐタンパク質の配列を配列番号２に示す。
【００７５】
ｓｐｒタンパク質は、１８ｋＤａの膜結合ペリプラズムプロテアーゼであり、ｓｐｒの基質は細胞分裂の間細胞壁の加水分解に関与する外膜におけるＴｓｐ及びペプチドグリカンである。
【００７６】
ｓｐｒタンパク質の野生型アミノ酸配列を、Ｎ末端にシグナル配列を有する配列番号２１、及びアミノ酸２６個のシグナル配列のない配列番号２２において示す（ＵｎｉＰｒｏｔ受諾番号Ｐ０ＡＦＶ４による）。本発明におけるｓｐｒタンパク質配列のアミノ酸番号付けはシグナル配列を含んでいる。したがって、ｓｐｒタンパク質のアミノ酸１は、配列番号２１に示す最初のアミノ酸（Ｍｅｔ）である。
【００７７】
変異ｓｐｒ遺伝子が細胞の染色体ｓｐｒ遺伝子であるのが好ましい。
【００７８】
変異ｓｐｒ遺伝子は、変異Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる細胞の表現型を抑制することができるｓｐｒタンパク質をコードしている。変異Ｔｓｐ遺伝子を有する細胞は、良好な細胞増殖速度を有し得るが、これらの細胞の１つの制限は、特に高い細胞濃度で溶解する傾向があることである。したがって、変異Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる細胞の表現型は、特に高い細胞濃度で溶解する傾向がある。変異Ｔｓｐ遺伝子を有する細胞も、低いモル浸透圧濃度で熱感受性の増殖を示す。しかし、本発明の細胞が有するｓｐｒ変異は、変異したＴｓｐ遺伝子を有する細胞中に導入した場合、変異Ｔｓｐ表現型を抑制し、したがって、細胞は、特に高い細胞密度で溶解の低減を表す。細胞の増殖の表現型は、当業者であれば、フラスコ振盪又は高い細胞密度の発酵技術の間に容易に測定することができる。細胞溶解の表現型の抑制は、特にペリプラズムにおいて増殖速度の改善及び／又は組換えタンパク質の生成から見ることができ、Ｔｓｐ変異体及び野生型ｓｐｒを有する細胞に比べて、ｓｐｒ変異体及びＴｓｐ変異体を有する細胞によって示される。
【００７９】
変異Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる細胞の表現型を抑制することができるｓｐｒタンパク質をもたらすあらゆる適切な変異又は複数の変異を、ｓｐｒ遺伝子に対して行うことができる。この活性は、当業者であれば、変異体ｓｐｒ遺伝子及び変異体Ｔｓｐ遺伝子を有する細胞を作り出し、表現型を、変異体Ｔｓｐ遺伝子だけを有する細胞と比較することによって試験することができる。Ｔｓｐ遺伝子に対する適切な変異を以下に詳しく記載する。変異Ｔｓｐ遺伝子、又はＴｓｐをコードする変異Ｔｓｐ遺伝子に対する言及は、別段の指摘がなければ、低減したプロテアーゼ活性を有するＴｓｐタンパク質をコードする変異Ｔｓｐ遺伝子、又はノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子のいずれかを意味する。
【００８０】
「低減したプロテアーゼ活性を有するＴｓｐタンパク質をコードする変異Ｔｓｐ遺伝子」の表現は、変異Ｔｓｐ遺伝子が野生型の非変異Ｔｓｐ遺伝子に比べて完全なプロテアーゼ活性を有さないことを意味する。変異Ｔｓｐ遺伝子は、野生型の非変異Ｔｓｐタンパク質のプロテアーゼ活性の５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、又は５％以下を有するＴｓｐタンパク質をコードしていてよい。変異Ｔｓｐ遺伝子は、プロテアーゼ活性を有さないＴｓｐタンパク質をコードしていてよい。細胞は染色体Ｔｓｐを欠くのではなく、即ち、Ｔｓｐ遺伝子配列はあらゆる形態のＴｓｐタンパク質の発現を防ぐように欠失又は変異されていない。
【００８１】
低減したプロテアーゼ活性を有するタンパク質を生成するために、あらゆる適切な変異をＴｓｐ遺伝子中に導入することができる。グラム陰性細菌から発現されるＴｓｐタンパク質のプロテアーゼ活性は、当業者であれば、Ｔｓｐのプロテアーゼ活性が試験されるＫｅｉｌｅｒら（「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｓｉｔｅ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｓｐ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ＊」、ＴＨＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、２７０巻４８号、１２月１日発行、２８８６４〜２８８６８頁、１９９５年、Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｃ．Ｋｅｉｌｅｒ及びＲｏｂｅｒｔ  Ｔ．Ｓａｕｅｒ）において記載されている方法など、当技術分野におけるあらゆる適切な方法によって容易に試験することができる。
【００８２】
ＴｓｐはＫｅｉｌｅｒら（上述）において、残基Ｓ４３０、Ｄ４４１、及びＫ４５５を含む活性部位を有すると報告されており、残基Ｇ３７５、Ｇ３７６、Ｅ４３３、及びＴ４５２はＴｓｐの構造を維持するのに重要である。Ｋｅｉｌｅｒら（上述）は、変異Ｔｓｐ遺伝子Ｓ４３０Ａ、Ｄ４４１Ａ、Ｋ４５５Ａ、Ｋ４５５Ｈ、Ｋ４５５Ｒ、Ｇ３７５Ａ、Ｇ３７６Ａ、Ｅ４３３Ａ、及びＴ４５２Ａには検出可能なプロテアーゼ活性がなかったという所見を報告している。変異Ｔｓｐ遺伝子Ｓ４３０Ｃは野生型活性の約５〜１０％を示したことがさらに報告されている。したがって、低減したプロテアーゼ活性を有するタンパク質を生成するためのＴｓｐ変異は、Ｓ４３０、Ｄ４４１、Ｋ４５５、Ｇ３７５、Ｇ３７６、Ｅ４３３、及びＴ４５２の１つ又は複数の残基に対するミスセンス変異などの変異を含むことがある。低減したプロテアーゼ活性を有するタンパク質を生成するためのＴｓｐ変異が、活性部位の残基Ｓ４３０、Ｄ４４１、及びＫ４５５の１つ、２つ、又は３つ全てに対するミスセンス変異などの変異を含むことができるのが好ましい。
【００８３】
したがって、変異Ｔｓｐ遺伝子は以下を含むことができる：
Ｓ４３０に対する変異、又は
Ｄ４４１に対する変異、又は
Ｋ４５５に対する変異、又は
Ｓ４３０及びＤ４４１に対する変異、又は
Ｓ４３０及びＫ４５５に対する変異、又は
Ｄ４４１及びＫ４５５に対する変異、又は
Ｓ４３０、Ｄ４４１、及びＫ４５５に対する変異。
【００８４】
Ｓ４３０、Ｄ４４１、Ｋ４５５、Ｇ３７５、Ｇ３７６、Ｅ４３３、及びＴ４５２の１つ又は複数が、低減したプロテアーゼ活性を有するタンパク質をもたらすあらゆる適切なアミノ酸に変異していてよい。適切な変異の例には、Ｓ４３０Ａ、Ｓ４３０Ｃ、Ｄ４４１Ａ、Ｋ４５５Ａ、Ｋ４５５Ｈ、Ｋ４５５Ｒ、Ｇ３７５Ａ、Ｇ３７６Ａ、Ｅ４３３Ａ、及びＴ４５２Ａがある。変異Ｔｓｐ遺伝子は、活性部位残基に対する１つ、２つ、又は３つの変異を含むことができ、例えば、遺伝子は以下を含むことができる：
Ｓ４３０Ａ、若しくはＳ４３０Ｃ、及び／又は
Ｄ４４１Ａ及び／又は
Ｋ４５５Ａ若しくはＫ４５５Ｈ、若しくはＫ４５５Ｒ。
【００８５】
Ｔｓｐ遺伝子が点変異Ｓ４３０Ａ又はＳ４３０Ｃを含んでいるのが好ましい。
【００８６】
「ノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子」の表現は、遺伝子が１つ又は複数の変異を含んでおり、それによってノックアウト変異遺伝子によってコードされるタンパク質を欠く細胞を提供するために、遺伝子によってコードされるタンパク質の発現をもたらさないことを意味する。ノックアウト遺伝子は、部分的又は完全に転写され得るが、コードタンパク質に翻訳されない。ノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子は、タンパク質の発現をもたらさないように、例えば、１つ又は複数の欠失、挿入、点、ミスセンス、ナンセンス、及びフレームシフトの変異によるなど、あらゆる適切な方法において変異され得る。例えば、遺伝子は、遺伝子コード配列中に、抗生物質耐性マーカーなどの外来のＤＮＡ配列を挿入することによってノックアウトされてよい。
【００８７】
変異Ｔｓｐ遺伝子は、遺伝子開始コドン、並びに／或いは遺伝子開始コドンの下流、及び遺伝子終止コドンの上流に位置する１つ又は複数の終止コドンに対する変異を含んでいてよく、それによってＴｓｐタンパク質の発現を防いでいる。開始コドンに対する変異は、開始コドンの１つ、２つ、又は３つ全てのヌクレオチドのミスセンス変異であってよい。或いは、又はさらに、開始コドンは、挿入又は欠失のフレームシフト変異によって変異されてよい。Ｔｓｐ遺伝子は、コード配列の５’末端に２つのＡＴＧコドンを含んでおり、ＡＴＧコドンの１つ又は両方はミスセンス変異によって変異されてよい。Ｔｓｐ遺伝子は、図９ｂに示す通り、第２のＡＴＧコドン（コドン３）からＴＣＧコドンに変異されていてよい。Ｔｓｐ遺伝子は、或いは、又はさらに、遺伝子開始コドンの下流及び遺伝子終止コドンの上流に位置する１つ又は複数の終止コドンを含んでいてよい。ノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子が、開始コドンに対するミスセンス変異、及び１つ又は複数の挿入された終止コドンの両方を含んでいるのが好ましい。Ｔｓｐ遺伝子は第５のコドンから「Ｔ」を欠失するように変異されていてよく、それによって、図９ｂに示す通り、コドン１１及び１６に終止コドンをもたらすフレームシフトを生じている。図９ｂに示す通り、コドン２１に第３のインフレーム終止コドンを作り出すように、Ｔｓｐ遺伝子はＡｓｅＩ制限部位を挿入するように変異されてよい。
【００８８】
ノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子は配列番号３のＤＮＡ配列を有することができ、これは開始コドンの上流にＡＴＧＡＡＴの６個のヌクレオチドを含んでいる。配列番号３のノックアウト変異Ｔｓｐ配列においてなされた変異を図９ｂに示す。一実施形態において、変異Ｔｓｐ遺伝子は、配列番号３のヌクレオチド７から２０４８のＤＮＡ配列を有する。
【００８９】
したがって、適切な変異体Ｔｓｐ遺伝子を有する細胞を同定した後は、変異Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる細胞の表現型を抑制することができるｓｐｒタンパク質をもたらす適切なｓｐｒ遺伝子変異を同定することができる。
【００９０】
本発明の好ましい一実施形態による細胞は、Ｎ３１、Ｒ６２、Ｉ７０、Ｑ７３、Ｃ９４、Ｓ９５、Ｖ９８、Ｑ９９、Ｒ１００、Ｌ１０８、Ｙ１１５、Ｄ１３３、Ｖ１３５、Ｌ１３６、Ｇ１４０、Ｒ１４４、Ｈ１４５、Ｇ１４７、Ｈ１５７、及びＷ１７４から選択される１つ又は複数のアミノ酸、より好ましくはＣ９４、Ｓ９５、Ｖ９８、Ｙ１１５、Ｄ１３３、Ｖ１３５、Ｈ１４５、Ｇ１４７、Ｈ１５７、及びＷ１７４から選択される１つ又は複数のアミノ酸に変異を有するｓｐｒタンパク質をコードする変異体ｓｐｒ遺伝子を含んでいる。この実施形態において、ｓｐｒタンパク質にいかなるさらなる変異もないのが好ましい。好ましくは、変異体ｓｐｒ遺伝子は、Ｎ３１、Ｒ６２、Ｉ７０、Ｑ７３、Ｃ９４、Ｓ９５、Ｖ９８、Ｑ９９、Ｒ１００、Ｌ１０８、Ｙ１１５、Ｄ１３３、Ｖ１３５、Ｌ１３６、Ｇ１４０、Ｒ１４４、Ｈ１４５、Ｇ１４７、及びＨ１５７から選択される１つ又は複数のアミノ酸、より好ましくはＣ９４、Ｓ９５、Ｖ９８、Ｙ１１５、Ｄ１３３、Ｖ１３５、Ｈ１４５、Ｇ１４７、及びＨ１５７から選択される１つ又は複数のアミノ酸に変異を有するｓｐｒタンパク質をコードしている。この実施形態において、ｓｐｒタンパク質にいかなるさらなる変異もないのが好ましい。好ましくは、変異体のｓｐｒ遺伝子は、Ｎ３１、Ｒ６２、Ｉ７０、Ｑ７３、Ｓ９５、Ｖ９８、Ｑ９９、Ｒ１００、Ｌ１０８、Ｙ１１５、Ｄ１３３、Ｖ１３５、Ｌ１３６、Ｇ１４０、Ｒ１４４、及びＧ１４７から選択される１つ又は複数のアミノ酸に、より好ましくはＳ９５、Ｖ９８、Ｙ１１５、Ｄ１３３、Ｖ１３５、及びＧ１４７から選択される１つ又は複数のアミノ酸に変異を有するｓｐｒタンパク質をコードする。この実施形態において、ｓｐｒタンパク質にいかなるさらなる変異もないのが好ましい。
【００９１】
本発明の一態様において、Ｃ９４、Ｓ９５、Ｖ９８、Ｙ１１５、Ｄ１３３、Ｖ１３５、Ｈ１４５、Ｇ１４７、及びＨ１５７から選択される１つ又は複数のアミノ酸、好ましくはＳ９５、Ｖ９８、Ｙ１１５、Ｄ１３３、Ｖ１３５、及びＧ１４７から選択される１つ又は複数のアミノ酸に変異を有するｓｐｒタンパク質をコードする変異体ｓｐｒ遺伝子を含んでおり、細胞が野生型Ｔｓｐ遺伝子を含んでいるグラム陰性細菌細胞を提供する。この実施形態において、ｓｐｒタンパク質にいかなるさらなる変異もないのが好ましい。
【００９２】
野生型染色体Ｔｓｐ遺伝子が非組換えの染色体Ｔｓｐ遺伝子であるのが好ましい。細胞が、ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドをさらに含んでいるのが好ましい。
【００９３】
上記のアミノ酸の１つ又は複数の変異は、アミノ酸をコードするヌクレオチドの１個、２個、又は３個に対するあらゆる適切なミスセンス変異であってよい。変異は、アミノ酸残基を、変異Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる細胞の表現型を抑制することができる変異ｓｐｒタンパク質をもたらすあらゆる適切なアミノ酸へ変化させる。ミスセンス変異は、アミノ酸を、野生型アミノ酸に比べて異なるサイズであり、且つ／又は異なる化学性質を有するアミノ酸へ変化させることができる。
【００９４】
一実施形態において、変異は、Ｃ９４、Ｈ１４５、及びＨ１５７のアミノ酸残基の触媒三残基の１つ、２つ、又は３つに対するものである（「Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＮＭＲ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＮｌｐＣ／Ｐ６０  Ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｐｒ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｃｙｓｔｅｉｎｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｔｒｉａｄ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００８年、４７巻、９７１５〜９７１７頁）。
【００９５】
したがって、変異ｓｐｒ遺伝子は、
Ｃ９４に対する変異、又は
Ｈ１４５に対する変異、又は
Ｈ１５７に対する変異、又は
Ｃ９４及びＨ１４５に対する変異、又は
Ｃ９４及びＨ１５７に対する変異、又は
Ｈ１４５及びＨ１５７に対する変異、又は
Ｃ９４、Ｈ１４５、及びＨ１５７に対する変異
を含んでいてよい。
【００９６】
この実施形態において、ｓｐｒタンパク質がいかなるさらなる変異も有さないのが好ましい。
【００９７】
Ｃ９４、Ｈ１４５、及びＨ１５７の１つ、２つ、又は３つが、変異Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる細胞の表現型を抑制することができるｓｐｒタンパク質をもたらすあらゆる適切なアミノ酸に変異されてよい。例えば、Ｃ９４、Ｈ１４５、及びＨ１５７の１つ、２つ、又は３つは、Ｇｌｙ又はＡｌａなどの小型のアミノ酸に変異されてよい。したがって、ｓｐｒタンパク質は、Ｃ９４、Ｈ１４５、及びＨ１５７の１つ、２つ、又は３つの変異を有することができる。ｓｐｒ遺伝子が、変異Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる細胞の表現型を抑制することができるｓｐｒタンパク質を生成することが見出されているミスセンス変異Ｈ１４５Ａを含んでいるのが好ましい。
【００９８】
本明細書の置換変異体に対する呼称は、１つの文字とそれに続く１つの数字とそれに続く１つの文字からなる。最初の文字は野生型タンパク質におけるアミノ酸を指定する。数字はアミノ酸置換が行われるアミノ酸位置を表し、２番目の文字は野生型アミノ酸を置換するのに用いられるアミノ酸を指定する。
【００９９】
好ましい一実施形態において、変異体のｓｐｒタンパク質は、Ｎ３１、Ｒ６２、Ｉ７０、Ｑ７３、Ｓ９５、Ｖ９８、Ｑ９９、Ｒ１００、Ｌ１０８、Ｙ１１５、Ｄ１３３、Ｖ１３５、Ｌ１３６、Ｇ１４０、Ｒ１４４、及びＧ１４７から選択される１つ又は複数のアミノ酸の変異、好ましくはＳ９５、Ｖ９８、Ｙ１１５、Ｄ１３３、Ｖ１３５、及びＧ１４７から選択される１つ又は複数のアミノ酸の変異を含んでいる。この実施形態において、ｓｐｒタンパク質がいかなるさらなる変異を有さないのが好ましい。したがって、変異ｓｐｒ遺伝子は、
Ｎ３１に対する変異、又は
Ｒ６２に対する変異、又は
Ｉ７０に対する変異、又は
Ｑ７３に対する変異、又は
Ｓ９５に対する変異、又は
Ｖ９８に対する変異、又は
Ｑ９９に対する変異、又は
Ｒ１００に対する変異、又は
Ｌ１０８に対する変異、又は
Ｙ１１５に対する変異、又は
Ｄ１３３に対する変異、又は
Ｖ１３５に対する変異、又は
Ｌ１３６に対する変異、又は
Ｇ１４０に対する変異、又は
Ｒ１４４に対する変異、又は
Ｇ１４７に対する変異
を含んでいてよい。
【０１００】
一実施形態において、変異体ｓｐｒタンパク質は、アミノ酸：
Ｓ９５及びＹ１１５、又は
Ｎ３１、Ｑ７３、Ｒ１００及びＧ１４０、又は
Ｑ７３、Ｒ１００及びＧ１４０、又は
Ｒ１００及びＧ１４０、又は
Ｑ７３及びＧ１４０、又は
Ｑ７３及びＲ１００、又は
Ｒ６２、Ｑ９９及びＲ１４４、又は
Ｑ９９及びＲ１４４
に対する複数の変異を含んでいる。
【０１０１】
Ｎ３１、Ｒ６２、Ｉ７０、Ｑ７３、Ｓ９５、Ｖ９８、Ｑ９９、Ｒ１００、Ｌ１０８、Ｙ１１５、Ｄ１３３、Ｖ１３５、Ｌ１３６、Ｇ１４０、Ｒ１４４、及びＧ１４７の１つ又は複数のアミノ酸は、変異Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる細胞の表現型を抑制することができるｓｐｒタンパク質をもたらすあらゆる適切なアミノ酸に変異されてよい。例えば、Ｎ３１、Ｒ６２、Ｉ７０、Ｑ７３、Ｓ９５、Ｖ９８、Ｑ９９、Ｒ１００、Ｌ１０８、Ｙ１１５、Ｄ１３３、Ｖ１３５、Ｌ１３６、Ｇ１４０、及びＲ１４４の１つ又は複数は、Ｇｌｙ又はＡｌａなどの小型のアミノ酸に変異されてよい。
【０１０２】
好ましい一実施形態において、ｓｐｒタンパク質は、１つ又は複数の以下の変異を含んでいる：Ｎ３１Ｙ、Ｒ６２Ｃ、Ｉ７０Ｔ、Ｑ７３Ｒ、Ｓ９５Ｆ、Ｖ９８Ｅ、Ｑ９９Ｐ、Ｒ１００Ｇ、Ｌ１０８Ｓ、Ｙ１１５Ｆ、Ｄ１３３Ａ、Ｖ１３５Ｄ又はＶ１３５Ｇ、Ｌ１３６Ｐ、Ｇ１４０Ｃ、Ｒ１４４Ｃ、及びＧ１４７Ｃ。ｓｐｒタンパク質が１つ又は複数の以下の変異を含んでいるのが好ましい：Ｓ９５Ｆ、Ｖ９８Ｅ、Ｙ１１５Ｆ、Ｄ１３３Ａ、Ｖ１３５Ｄ又はＶ１３５Ｇ、及びＧ１４７Ｃ。この実施形態において、ｓｐｒタンパク質にいかなるさらなる変異もないのが好ましい。
【０１０３】
一実施形態において、ｓｐｒタンパク質は、Ｎ３１Ｙ、Ｒ６２Ｃ、Ｉ７０Ｔ、Ｑ７３Ｒ、Ｓ９５Ｆ、Ｖ９８Ｅ、Ｑ９９Ｐ、Ｒ１００Ｇ、Ｌ１０８Ｓ、Ｙ１１５Ｆ、Ｄ１３３Ａ、Ｖ１３５Ｄ又はＶ１３５Ｇ、Ｌ１３６Ｐ、Ｇ１４０Ｃ、Ｒ１４４Ｃ、及びＧ１４７Ｃから選択される変異を１つ有する。この実施形態において、ｓｐｒタンパク質にいかなるさらなる変異もないのが好ましい。
【０１０４】
さらなる一実施形態において、ｓｐｒタンパク質は、以下から選択される複数の変異を有する：
Ｓ９５Ｆ及びＹ１１５Ｆ
Ｎ３１Ｙ、Ｑ７３Ｒ、Ｒ１００Ｇ、及びＧ１４０Ｃ、
Ｑ７３Ｒ、Ｒ１００Ｇ、及びＧ１４０Ｃ、
Ｒ１００Ｇ及びＧ１４０Ｃ、
Ｑ７３Ｒ及びＧ１４０Ｃ、
Ｑ７３Ｒ及びＲ１００Ｇ、
Ｒ６２Ｃ、Ｑ９９Ｐ及びＲ１４４Ｃ、又は
Ｑ９９Ｐ及びＲ１４４Ｃ。
【０１０５】
一実施形態において、ｓｐｒタンパク質は変異Ｗ１７４Ｒを有する。代替の一実施形態において、ｓｐｒタンパク質は変異Ｗ１７４Ｒを有さない。
【０１０６】
好ましい一実施形態において、本発明による細胞は変異ｓｐｒ遺伝子、及びＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドを含んでいる。
【０１０７】
本発明で用いられる「組換えポリペプチド」は、組換えＤＮＡ技術を用いて構築又は生成されるタンパク質を意味する。ＤｓｂＣをコードするポリヌクレオチド配列は、細菌細胞中に見出されるＤｓｂＣをコードする内在性の配列に同一であってよい。或いは、ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチド配列は、例えば、ＥｃｏＲＩ部位などの制限部位が除去された、及び／又はｈｉｓタグをコードする配列を有するなど、野生型ＤｓｂＣ配列の変異バージョンである。本発明に用いるための一例の修飾ＤｓｂＣヌクレオチド配列を配列番号２６に示すが、これは配列番号２７に示すｈｉｓタグ付けしたＤｓｂＣアミノ酸配列をコードするものである。
【０１０８】
本発明の一態様において、変異体ｓｐｒタンパク質、ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドをコードする変異体ｓｐｒ遺伝子を含んでいるグラム陰性細菌細胞を提供し、細胞は野生型Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる。野生型Ｔｓｐ遺伝子が非組換えの染色体Ｔｓｐ遺伝子であるのが好ましい。
【０１０９】
ＤｓｂＣは、大腸菌におけるジスルフィド結合の形成を触媒する大腸菌のペリプラズムにおいて見出された原核生物のタンパク質である。ＤｓｂＣは、２３６個（シグナルペプチドを含む）の長さのアミノ酸配列、及び分子量２５．６ＫＤａを有する（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．ｐ０ＡＥＧ６）。ＤｓｂＣは、１９９４年に始めて同定された（Ｍｉｓｓｉａｋａｓら、「Ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｄｓｂＣ（ｘｐｒＡ）ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ」、Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１３巻８号、２０１３〜２０２０頁、１９９４年、及びＳｈｅｖｃｈｉｋら、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤｓｂＣ、ａ  ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ  ａｎｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｗｉｔｈ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」、Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｎｒａｌ、１３巻８号、２００７〜２０１２頁、１９９４年）。
【０１１０】
宿主細胞中でタンパク質の発現を改善するジスルフィド結合の形成を触媒するタンパク質が同時発現されることが知られている。ＷＯ９８／５６９３０は細菌細胞中で異種性のジスルフィド結合含有ポリペプチドを生成するための方法を開示しており、ＤｓｂＣ又はＤｓｂＧなどの原核生物のジスルフィドイソメラーゼが真核生物のポリペプチドと同時発現される。ＵＳ６６７３５６９は、外来タンパク質を生成するのに用いるためのＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、及びＤｓｂＤの各々をコードするポリヌクレオチドを含む人工オペロンを開示している。ＥＰ０７８６００９は、細菌において異種性のポリペプチドを生成するためのプロセスを開示しており、ＤｓｂＡ又はＤｓｂＣをコードする核酸の発現は、異種性のポリペプチドをコードする核酸の発現の誘導の前に誘発される。
【０１１１】
本発明者らは、変異ｓｐｒ遺伝子及び野生型Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる細菌細胞におけるＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドの発現の特定の組合せにより、対象のタンパク質を発現するために改善された宿主が提供されることを見出した。驚くべきことに、新しい系統は、野生型細胞又は変異Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる細胞に比べて増大した増殖速度及び増大した細胞生存期間を表すことが見出された。特に、組換えＤｓｂＣ遺伝子、ｓｐｒ変異、及び野生型Ｔｓｐを有する細胞は、変異Ｔｓｐ遺伝子を有する細胞に比べて低減した細胞溶解の表現型を示す。
【０１１２】
一実施形態において、本発明による細胞は、以下の１つ又は複数のさらなるタンパク質も発現する。
タンパク質のフォールディングを促進することができる１つ又は複数のタンパク質、例えば、ＦｋｐＡ、Ｓｋｐ、ＳｉｒＡ、ＰＰｉＡ、及びＰＰｉｄ、並びに／或いは、
タンパク質の分泌又は翻訳を促進することができる１つ又は複数のタンパク質、例えば、ＳｅｃＹ、ＳｅｃＥ、ＳｅｃＧ、ＳｅｃＹＥＧ、ＳｅｃＡ、ＳｅｃＢ、ＦｔｓＹ、及びＬｅｐ、並びに／或いは、
ジスルフィド結合の形成を促進することができる１つ又は複数のタンパク質、例えば、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＤ、ＤｓｂＧ。
【０１１３】
１つ又は複数の上記のタンパク質を、細胞のゲノム中に組み入れてもよく、且つ／又は発現ベクター中に挿入してもよい。
【０１１４】
一実施形態において、本発明による細胞は、１つ又は複数の以下のさらなるタンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドを含んでいない。
タンパク質のフォールディングを促進することができる１つ又は複数のタンパク質、例えば、ＦｋｐＡ、Ｓｋｐ、ＳｕｒＡ、ＰＰｉＡ、及びＰＰｉＤ、
タンパク質の分泌又は翻訳を促進することができる１つ又は複数のタンパク質、例えば、ＳｅｃＹ、ＳｅｃＥ、ＳｅｃＧ、ＳｅｃＹＥＧ、ＳｅｃＡ、ＳｅｃＢ、ＦｔｓＹ、及びＬｅｐ、並びに
ジスルフィド結合の形成を促進することができる１つ又は複数のタンパク質、例えば、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＤ、ＤｓｂＧ。
【０１１５】
本発明の好ましい一実施形態において、組換えグラム陰性細菌細胞は、シャペロン活性及び低減したプロテアーゼ活性を有するＤｅｇＰタンパク質をコードする変異ＤｅｇＰ遺伝子、並びに／或いは変異ｐｔｒ遺伝子をさらに含んでおり、変異ｐｔｒ遺伝子は低減したプロテアーゼ活性を有するＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩタンパク質をコードする、又はノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子及び／又は変異ＯｍｐＴ遺伝子であり、変異ＯｍｐＴ遺伝子は、低減したプロテアーゼ活性を有するＯｍｐＴタンパク質をコードする、又はノックアウト変異ＯｍｐＴ遺伝子である。
【０１１６】
一実施形態において、本発明は、
ａ．変異ｓｐｒ遺伝子、
ｂ．野生型の非組換え染色体Ｔｓｐ遺伝子、
ｃ．シャペロン活性及び低減したプロテアーゼ活性、及び／又は変異ＯｍｐＴを有するＤｅｇＰタンパク質をコードする変異ＤｅｇＰ遺伝子（変異ＯｍｐＴ遺伝子は、低減したプロテアーゼ活性を有するＯｍｐＴタンパク質をコードする、又はノックアウト変異ＯｍｐＴ遺伝子である）、
を含んでいる組換えグラム陰性細菌細胞を提供する。
【０１１７】
この実施形態において、細胞が、上記の変異以外は野生型細菌細胞に対して同質遺伝子であるのが好ましい。
【０１１８】
一実施形態において、本発明は、
ａ．変異ｓｐｒ遺伝子、
ｂ．野生型の非組換え染色体Ｔｓｐ遺伝子、
ｃ．変異ｐｔｒ遺伝子（変異ｐｔｒ遺伝子は、低減したプロテアーゼ活性を有するＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩをコードする、又はノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子であり、且つ／又は変異ＯｍｐＴであり、変異ＯｍｐＴ遺伝子は、低減したプロテアーゼ活性を有するＯｍｐＴタンパク質をコードする、又はノックアウト変異ＯｍｐＴ遺伝子である）、
を含んでいる組換えグラム陰性細菌細胞を提供する。
【０１１９】
この実施形態において、細胞が、上記の変異以外は野生型細菌細胞に対して同質遺伝子であるのが好ましい。
【０１２０】
一実施形態において、本発明は、
ａ．変異ｓｐｒ遺伝子、
ｂ．野生型の非組換え染色体Ｔｓｐ遺伝子、
ｃ．シャペロン活性及び低減したプロテアーゼ活性を有するＤｅｇＰタンパク質をコードする変異ＤｅｇＰ遺伝子、
ｄ．変異ｐｔｒ遺伝子（変異ｐｔｒ遺伝子は、低減したプロテアーゼ活性を有するＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩタンパク質をコードする、又はノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子である）、
ｅ．任意選択によって変異ＯｍｐＴ（変異Ｏｍｐｔ遺伝子は、低減したプロテアーゼ活性を有するＯｍｐＴタンパク質をコードする、又はノックアウト変異ＯｍｐＴ遺伝子である）、
を含んでいる細胞を提供する。
【０１２１】
この実施形態において、細胞が、上記の変異以外は野生型細菌細胞に対して同質遺伝子であるのが好ましい。
【０１２２】
本発明の一実施形態において、細胞は変異ＤｅｇＰ遺伝子を有する。本明細書で用いられる「ＤｅｇＰ」は、ＤｅｇＰタンパク質（ＨｔｒＡとしても知られている）をコードする遺伝子を意味し、ＤｅｇＰタンパク質はシャペロン及びプロテアーゼとしての二重機能を有する（「Ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｏｆ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ」、Ｒａｗｌｉｎｇｓ  ＮＤ、Ｂａｒｒｅｔｔ  ＡＪ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９９４年、２４４巻、１９〜６１頁）。非変異のＤｅｇＰ遺伝子の配列を配列番号７に示し、非変異のＤｅｇＰタンパク質の配列を配列番号８に示す。
【０１２３】
低温でＤｅｇＰはシャペロンとして機能し、高温でＤｅｇＰはプロテアーゼとしての機能を優先する（「Ａ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｓｗｉｔｃｈ  ｆｒｏｍ  Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎ  ａ  Ｗｉｄｅｌｙ  Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ．」Ｃｅｌｌ、９７巻３号、３３９〜３４７頁、Ｓｐｉｅｓｓ  Ｃ、Ｂｅｉｌ  Ａ、Ｅｈｒｍａｎｎ  Ｍ）、及び「Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨｔｒＡ  （ＤｅｇＰ）  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｔ  ｌｏｗ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ」、Ｓｋｏｒｋｏ−Ｇｌｏｎｅｋ  Ｊら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００８年、１５４巻、３６４９〜３６５８頁）。
【０１２４】
細胞がＤｅｇＰ変異を含んでいる実施形態において、細胞におけるＤｅｇＰ変異は、シャペロン活性を有するが完全なプロテアーゼを有さないＤｅｇＰタンパク質をコードする変異ＤｅｇＰ遺伝子を提供する。
【０１２５】
「シャペロン活性を有する」の表現は、本発明の文脈において、変異ＤｅｇＰタンパク質が、野生型の非変異のＤｅｇＰタンパク質に比べて同じ、又は実質的に同じシャペロン活性を有することを意味する。変異ＤｅｇＰ遺伝子が、野生型の非変異のＤｅｇＰタンパク質のシャペロン活性の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上を有するＤｅｇＰタンパク質をコードするのが好ましい。変異ＤｅｇＰ遺伝子が、野生型ＤｅｇＰに比べて同じシャペロン活性を有するＤｅｇＰタンパク質をコードするのがより好ましい。
【０１２６】
「低減したプロテアーゼ活性を有する」の表現は、本発明の文脈において、変異ＤｅｇＰタンパク質が、野生型の非変異のＤｅｇＰタンパク質に比べて完全なプロテアーゼ活性を有さないことを意味する。変異ＤｅｇＰ遺伝子が、野生型の非変異のＤｅｇＰタンパク質のプロテアーゼ活性の５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、又は５％以下を有するＤｅｇＰタンパク質をコードするのが好ましい。変異ＤｅｇＰ遺伝子が、プロテアーゼ活性のないＤｅｇＰタンパク質をコードするのがより好ましい。細胞は、染色体のＤｅｇＰを欠くのではなく、即ち、ＤｅｇＰ遺伝子配列は、あらゆる形態のＤｅｇＰタンパク質の発現を防ぐように欠失又は変異されていない。
【０１２７】
シャペロン活性及び低減したプロテアーゼ活性を有するタンパク質を生成するために、あらゆる適切な変異をＤｅｇＰ遺伝子中に導入することができる。グラム陰性細菌から発現されるＤｅｇＰタンパク質のプロテアーゼ及びシャペロンの活性は、当業者であれば、ＤｅｇＰのプロテアーゼ及びシャペロン活性がＤｅｇＰの天然の基質であるＭａｌＳ上で試験されるＳｐｉｅｓｓらにおいて記載されている方法（「Ａ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｓｗｉｔｃｈ  ｆｒｏｍ  Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎ  ａ  Ｗｉｄｅｌｙ  Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ．」Ｃｅｌｌ、９７巻３号、３３９〜３４７頁、Ｓｐｉｅｓｓ  Ｃ、Ｂｅｉｌ  Ａ、Ｅｈｒｍａｎｎ  Ｍ）、及びまた「Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨｔｒＡ  （ＤｅｇＰ）  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｔ  ｌｏｗ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ」、Ｓｋｏｒｋｏ−Ｇｌｏｎｅｋ  Ｊら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００８年、１５４巻、３６４９〜３６５８頁において記載されている方法などのあらゆる適切な方法によって容易に試験することができる。
【０１２８】
ＤｅｇＰはセリンプロテアーゼであり、アミノ酸残基Ｈｉｓ１０５、Ａｓｐ１３５、及びＳｅｒ２１０の触媒三塩基からなる活性中心を有する（「Ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｏｆ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９９４年、２４４巻、１９〜６１頁、Ｒａｗｌｉｎｇｓ  Ｎ及びＢａｒｒｅｔｔ  Ａ）。シャペロン活性及び低減したプロテアーゼ活性を有するタンパク質を生成するためのＤｅｇＰ変異は、Ｈｉｓ１０５、Ａｓｐ１３５、及びＳｅｒ２１０の１つ、２つ、又は３つに対するミスセンス変異などの変異を含んでいてよい。
【０１２９】
したがって、変異ＤｅｇＰ遺伝子は以下を含んでいてよい：
Ｈｉｓ１０５に対する変異、又は、
Ａｓｐ１３５に対する変異、又は、
Ｓｅｒ２１０に対する変異、又は、
Ｈｉｓ１０５及びＡｓｐ１３５に対する変異、又は、
Ｈｉｓ１０５及びＳｅｒ２１０に対する変異、又は、
Ａｓｐ１３５及びＳｅｒ２１０に対する変異、又は、
Ｈｉｓ１０５、Ａｓｐ１３５、及びＳｅｒ２１０に対する変異。
【０１３０】
Ｈｉｓ１０５、Ａｓｐ１３５、及びＳｅｒ２１０の１つ、２つ、又は３つは、シャペロン活性、及び低減したプロテアーゼ活性を有するタンパク質をもたらすあらゆる適切なアミノ酸に変異されていてよい。例えば、Ｈｉｓ１０５、Ａｓｐ１３５、及びＳｅｒ２１０の１つ、２つ、又は３つは、Ｇｌｙ又はＡｌａなどの小型のアミノ酸に変異されてよい。さらなる適する変異は、例えば、Ａｓｐ１３５がＬｙｓ又はＡｒｇに変異され、極性のＨｉｓ１０５がＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、又はＬｅｕなどの非極性のアミノ酸に変異され、小型の親水性のＳｅｒ２１０がＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、又はＴｙｒなどの大型又は疎水性の残基に変異されるなど、Ｈｉｓ１０５、Ａｓｐ１３５、及びＳｅｒ２１０の１つ、２つ、又は３つの、反対の性質を有するアミノ酸への変化である。ＤｅｇＰ遺伝子が、図９ｃに示す通り、シャペロン活性を有するがプロテアーゼを有さないタンパク質を生成することが見出されている点変異Ｓ２１０Ａを含んでいるのが好ましい（「Ａ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｓｗｉｔｃｈ  ｆｒｏｍ  Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎ  ａ  Ｗｉｄｅｌｙ  Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ．」Ｃｅｌｌ、９７巻３号、３３９〜３４７頁、Ｓｐｉｅｓｓ  Ｃ、Ｂｅｉｌ  Ａ、Ｅｈｒｍａｎｎ  Ｍ）。
【０１３１】
ＤｅｇＰは、タンパク質−タンパク質相互作用を媒介する、ＰＤＺ１（残基２６０〜３５８）及びＰＤＺ２（残基３５９〜４４８）の２つのＰＤＺドメインを有する（「Ａ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｓｗｉｔｃｈ  ｆｒｏｍ  Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎ  ａ  Ｗｉｄｅｌｙ  Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ．」、Ｃｅｌｌ、９７巻３号、３３９〜３４７頁、Ｓｐｉｅｓｓ  Ｃ、Ｂｅｉｌ  Ａ、Ｅｈｒｍａｎｎ  Ｍ）。本発明の一実施形態において、ｄｅｇＰ遺伝子は、ＰＤＺ１ドメイン及び／又はＰＤＺ２ドメインを欠失するように変異される。ＰＤＺ１及びＰＤＺ２の欠失は、ＤｅｇＰタンパク質のプロテアーゼ活性の完全な喪失及び野生型ＤｅｇＰタンパク質に比べて低下したシャペロン活性をもたらし、ＰＤＺ１又はＰＤＺ２いずれかの欠失は、野生型ＤｅｇＰタンパク質に比べて５％のプロテアーゼ活性及び同様のシャペロン活性をもたらす（「Ａ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｓｗｉｔｃｈ  ｆｒｏｍ  Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎ  ａ  Ｗｉｄｅｌｙ  Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ．）」、Ｃｅｌｌ、９７巻３号、３３９〜３４７頁、Ｓｐｉｅｓｓ  Ｃ、Ｂｅｉｌ  Ａ、Ｅｈｒｍａｎｎ  Ｍ）。
【０１３２】
変異ＤｅｇＰ遺伝子は、例えば、図９ｃに示す通り、同定及びスクリーニング方法において助けとなるためにＡｓｅＩなど、サイレントの天然に存在しない制限部位も含んでいてよい。
【０１３３】
点変異Ｓ２１０Ａ及びＡｓｅＩ制限マーカー部位を含んでいる変異ＤｅｇＰ遺伝子の好ましい配列を配列番号９に提供し、コードされるタンパク質配列を配列番号１０に示す。配列番号９の変異ＤｅｇＰ配列になされた変異を図９ｃに示す。
【０１３４】
細胞が、シャペロン活性及び低減したプロテアーゼ活性を有するＤｅｇＰタンパク質をコードする変異ＤｅｇＰ遺伝子を含んでいる本発明の実施形態において、本発明が提供する１つ又は複数の細胞は、変異細胞に比べて細胞からの正確にフォールディングされたタンパク質の収率の改善を提供することができ、ＤｅｇＰ遺伝子は、染色体欠損ＤｅｇＰなど、ＤｅｇＰ発現を防ぐノックアウトＤｅｇＰに対して変異されている。ＤｅｇＰの発現を防ぐノックアウト変異ＤｅｇＰ遺伝子を含んでいる細胞においてＤｅｇＰのシャペロン活性は完全に失われるが、本発明による細胞においてＤｅｇＰのシャペロン活性は保持され、完全なプロテアーゼ活性は失われる。これらの実施形態において、本発明による１つ又は複数の細胞は、タンパク質のタンパク質分解性を防ぐようにプロテアーゼ活性は低減されており、宿主細胞におけるタンパク質において正確なフォールディング及び輸送を可能にするようにシャペロン活性は維持されている。
【０１３５】
当業者であれば、タンパク質Ｇ  ＨＰＬＣ、円偏光二色性、ＮＭＲ、Ｘ線結晶構造解析、及びエピトープ親和性測定方法など、当技術分野においてよく知られている方法を用いて、タンパク質が正確にフォールディングされているか否かを見るために分泌されたタンパク質を試験することが容易にできる。
【０１３６】
これらの実施形態において、本発明による１つ又は複数の細胞は、ＤｅｇＰ発現を防ぐ変異ノックアウトＤｅｇＰ遺伝子を有する細胞に比べて細胞の増殖が改善されていてよい。理論によって拘泥しようとするものではないが、シャペロン活性を必要とする全てのタンパク質をプロセシングする細胞の能力を増大し得るシャペロン活性をＤｅｇＰプロテアーゼが保持するため、細胞増殖の改善が示され得る。したがって、細胞の増殖及び再生に必要な正確にフォールディングされたタンパク質の生成は、ＤｅｇＰノックアウト変異を有する細胞に比べて本発明の１つ又は複数の細胞において増大し、それによって増殖を制御する細胞の経路を改善し得る。さらに、知られているＤｅｇＰプロテアーゼ欠損系統は一般に温度感受性であり、約２８℃を超える温度では通常増殖しない。しかし、本発明による細胞は温度感受性ではなく、細菌からタンパク質を生成する工業規模に通常用いられる、およそ３０℃からおよそ３７℃の温度を含めた２８℃以上の温度で増殖することができる。
【０１３７】
本発明の一実施形態において、細胞は変異ｐｔｒ遺伝子を有する。本明細書で用いられる「ｐｔｒ遺伝子」は、高分子量のタンパク質を分解するプロテアーゼであるＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩをコードする遺伝子を意味する。非変異のｐｔｒ遺伝子の配列を配列番号４に示し、非変異のＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩタンパク質の配列を配列番号５に示す。
【０１３８】
変異ｐｔｒ遺伝子、又はＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩをコードする変異ｐｔｒ遺伝子に対する言及は、別段の指摘がなければ、低減したプロテアーゼ活性を有するＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩタンパク質をコードする変異ｐｔｒ遺伝子、又はノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子のいずれかを意味する。
【０１３９】
「低減したプロテアーゼ活性を有するＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩタンパク質をコードする変異ｐｔｒ遺伝子」の表現は、本発明の文脈において、変異ｐｔｒ遺伝子が、野生型の非変異のｐｔｒ遺伝子に比べて完全なプロテアーゼ活性を有さないことを意味する。
【０１４０】
変異ｐｔｒ遺伝子が、野生型の非変異のＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩタンパク質のプロテアーゼ活性の５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、又は５％以下を有するＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩをコードするのが好ましい。変異ｐｔｒ遺伝子がプロテアーゼ活性を有さないＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩタンパク質をコードするのがより好ましい。この実施形態において、細胞は染色体ｐｔｒを欠いておらず、即ち、ｐｔｒ遺伝子配列は、あらゆる形態のＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩタンパク質の発現を防止するように欠失又は変異されていない。
【０１４１】
低減したプロテアーゼ活性を有するＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩタンパク質を生成するために、あらゆる適切な変異がｐｔｒ遺伝子中に導入されてよい。グラム陰性細菌から発現されたＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩタンパク質のプロテアーゼ活性は、当業者であれば、当技術分野におけるあらゆる適切な方法によって容易に試験することができる。
【０１４２】
「ノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子」の表現は、本発明の文脈において、遺伝子が１つ又は複数の変異を含んでおり、それによって、ノックアウト変異遺伝子によってコードされるタンパク質を欠く細胞を提供するように、遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を引き起こさないことを意味する。ノックアウト遺伝子は、部分的又は完全に転写され得るが、コードタンパク質に翻訳され得ない。ノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子は、タンパク質の発現を引き起こさないように、例えば、１つ又は複数の欠失、挿入、点、ミスセンス、ナンセンス、及びフレームシフトの変異によるなど、あらゆる適切な方法において変異されてよい。例えば、遺伝子は、遺伝子コード配列中に、抗生物質耐性マーカーなどの外来のＤＮＡ配列を挿入することによってノックアウトされてよい。
【０１４３】
好ましい一実施形態において、遺伝子は、遺伝子コード配列中に、抗生物質耐性マーカーなどの外来のＤＮＡ配列を挿入することによって変異されない。ＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩ遺伝子は、遺伝子開始コドン、並びに／或いは遺伝子開始コドンの下流及び遺伝子終止コドンの上流に位置する１つ又は複数の終止コドンに対する変異を含んでおり、それによってＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩタンパク質の発現を防いでいる。
【０１４４】
標的のノックアウト遺伝子開始コドンに対する変異は開始コドンの機能の喪失を引き起こし、それによって標的の遺伝子は確実に、コード配列の開始に適切な開始コドンを含んでいない。開始コドンに対する変異は開始コドンの１つ、２つ、又は３つ全てのヌクレオチドのミスセンス変異であってよい。或いは、又はさらに、開始コドンは挿入又は欠失のフレームシフト変異によって変異されてよい。
【０１４５】
好ましい一実施形態において、ｐｔｒ遺伝子は、図９ａに示す通り、ＡＴＧ開始コドンがＡＴＴに変化するように変異されている。
【０１４６】
ノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子は、或いは、又はさらに、遺伝子開始コドンの下流及び遺伝子終止コドンの上流に位置する１つ又は複数の終止コドンを含んでいてよい。ノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子が、開始コドンに対するミスセンス変異、及び１つ又は複数の挿入された終止コドンの両方を含んでいるのが好ましい。
【０１４７】
１つ又は複数の挿入された終止コドンがインフレーム終止コドンであるのが好ましい。しかし、１つ又は複数の挿入された終止コドンは、或いは、又はさらに、フレーム外（ｏｕｔ−ｏｆ−ｆｒａｍｅ）終止コドンであってよい。１つ又は複数のフレーム外終止コドンは、フレーム外開始コドンが挿入又は欠失のフレームシフト変異によってインフレーム開始コドンに変化される場合に翻訳を停止するのに必要とされ得る。１つ又は複数の終止コドンが、ナンセンス点変異及びフレームシフト変異を含めたあらゆる適切な変異によって導入されてよい。１つ又は複数の終止コドンがフレームシフト変異及び／又は挿入変異によって、好ましくは遺伝子配列のセグメントを、終止コドンを含んでいる配列で置換することによって導入されるのが好ましい。例えば、終止コドンＴＡＡを含んでいるＡｓｅＩ制限部位を挿入してもよい。
【０１４８】
好ましい一実施形態において、ｐｔｒ遺伝子は、図９ａに示す通り、ＡｓｅＩ制限部位の挿入によって、インフレーム終止コドンを挿入するように変異される。好ましい一実施形態において、ノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子は配列番号６のＤＮＡ配列を有する。配列番号６のノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子配列においてなされた変異を図９ａに示す。
【０１４９】
上記に記載したノックアウト変異は、標的のノックアウト遺伝子部位の上流又は下流の染色体ＤＮＡに対して最小のかく乱を引き起こし、又はかく乱を引き起こさず、外来のＤＮＡ（例えば、対象のタンパク質、特に治療用タンパク質の発現に対する細胞の適合性に影響を及ぼし得る、抗生物質耐性マーカー）の挿入及び保持を必要としないので有利である。したがって、本発明による１つ又は複数の細胞は、増殖の特徴の改善及び／又は外来ＤＮＡの遺伝子コード配列中への挿入によってプロテアーゼ遺伝子がノックアウトされた細胞に比べてタンパク質発現の改善を示すことがある。
【０１５０】
一実施形態において、本発明による細胞は変異ＯｍｐＴ遺伝子を有する。本明細書で用いられる「ＯｍｐＴ遺伝子」は、外膜プロテアーゼであるプロテアーゼＯｍｐＴ（外膜プロテアーゼＴ）をコードする遺伝子を意味する。野生型の非変異ＯｍｐＴ遺伝子の配列は、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ  Ｐ０９１６９である。
【０１５１】
変異ＯｍｐＴ遺伝子、又はＯｍｐＴをコードする変異ＯｍｐＴ遺伝子に対する言及は、別段の指摘がなければ、低減したプロテアーゼ活性を有するＯｍｐＴタンパク質をコードする変異ＯｍｐＴ遺伝子、又はノックアウト変異ＯｍｐＴ遺伝子のいずれかを意味する。
【０１５２】
「低減したプロテアーゼ活性を有するＯｍｐＴタンパク質をコードする変異ＯｍｐＴ遺伝子」の表現は、本発明の文脈において、変異ＯｍｐＴ遺伝子が野生型の非変異ＯｍｐＴ遺伝子に比べて完全なプロテアーゼ活性を有さないことを意味する。変異ＯｍｐＴ遺伝子は、野生型の非変異ＯｍｐＴタンパク質のプロテアーゼ活性の５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、又は５％以下を有するＯｍｐＴタンパク質をコードしていてよい。変異ＯｍｐＴ遺伝子は、プロテアーゼ活性を有さないＯｍｐＴタンパク質をコードしていてよい。この実施形態において、細胞は染色体ＯｍｐＴを欠くのではなく、即ち、ＯｍｐＴ遺伝子配列はあらゆる形態のＯｍｐＴタンパク質の発現を防ぐように欠失又は変異されていない。
【０１５３】
低減したプロテアーゼ活性を有するタンパク質を生成するために、あらゆる適切な変異をＯｍｐＴ遺伝子中に導入することができる。グラム陰性細菌から発現されるＯｍｐＴタンパク質のプロテアーゼ活性は、当業者であれば、Ｋｒａｍｅｒら（「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｃｉｄｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｏｆ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ＯｍｐＴ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ」、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、５０５巻（２００１年）  ４２６〜４３０頁）及びＤｅｋｋｅｒら（「Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｐｅｃｉｔｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｇｒａｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ＯｍｐＴ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｂｙ  Ｓｐａｔｉａｌｌｙ  Ａｄｄｒｅｓｓｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００１年、４０巻、１６９４〜１７０１頁）において記載されている方法など、当技術分野におけるあらゆる適切な方法によって容易に試験することができる。
【０１５４】
ＯｍｐＴは、Ｋｒａｍｅｒら（「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｓｅｒｉｎｅ  ａｎｄ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ＯｍｐＴ」、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２０００年、４６８巻、２２０〜２２４頁）において報告されており、これは、セリン、ヒスチジン、及び酸性残基をアラニンによって置換すると、Ｇｌｕ２７、Ａｓｐ９７、Ａｓｐ２０８、又はＨｉｓ１０１ではおよそ１０倍活性が低減し、Ｓｅｒ９９ではおよそ５００倍活性が低減し、Ａｓｐ８３、Ａｓｐ８５、Ａｓｐ２１０、又はＨｉｓ２１２ではおよそ１００００倍活性が低減すると開示している。Ｖａｎｄｅｐｕｔｔｅ−Ｒｕｔｔｅｎら（「Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏｕｔｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ＯｍｐＴ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｕｇｇｅｓｔｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｉｔｅ」、Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２００１年、２０巻１８号、５０３３〜５０３９頁）は、Ａｓｐ８３−Ａｓｐ８５対及びＨｉｓ２１２−Ａｓｐ２１０対を含む活性部位を有すると開示している。さらに、Ｋｒａｍｅｒら（「Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ＯｍｐＴ」、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、ＦＥＢＳ、２００２年、２６９巻、１７４６〜１７５２頁）は、ループＬ４における変異Ｄ２０８Ａ、Ｄ２１０Ａ、Ｈ２１２Ａ、Ｈ２１２Ｎ、Ｈ２１２Ｑ、Ｇ２１６Ｋ／Ｋ２１７Ｇ、Ｋ２１７Ｔ、及びＲ２１８Ｌは全て、酵素活性の部分的又はほぼ完全な喪失をもたらすことを開示している。
【０１５５】
したがって、低減したプロテアーゼ活性を有するタンパク質を生成するためのＯｍｐＴ変異は、Ｅ２７、Ｄ４３、Ｄ８３、Ｄ８５、Ｄ９７、Ｓ９９、Ｈ１０１、Ｅ１１１、Ｅ１３６、Ｅ１９３、Ｄ２０６、Ｄ２０８、Ｄ２１０、Ｈ２１２、Ｇ２１６、Ｋ２１７、Ｒ２１８、及びＥ２５０の残基の１つ又は複数に対するミスセンス変異などの変異を含んでいてよい。
【０１５６】
Ｅ２７、Ｄ４３、Ｄ８３、Ｄ８５、Ｄ９７、Ｓ９９、Ｈ１０１、Ｅ１１１、Ｅ１３６、Ｅ１９３、Ｄ２０６、Ｄ２０８、Ｄ２１０、Ｈ２１２、Ｇ２１６、Ｋ２１７、Ｒ２１８、及びＥ２５０の１つ又は複数は、低減したプロテアーゼ活性を有するタンパク質をもたらすあらゆる適切なアミノ酸に変異していてよい。例えば、Ｅ２７、Ｄ４３、Ｄ８３、Ｄ８５、Ｄ９７、Ｓ９９、Ｈ１０１、Ｅ１１１、Ｅ１３６、Ｅ１９３、Ｄ２０６、Ｄ２０８、Ｄ２１０、Ｈ２１２、Ｇ２１６、Ｋ２１７、Ｒ２１８、及びＥ２５０の１つ又は複数は、アラニンに変異していてよい。適切な変異の例には、Ｅ２７Ａ、Ｄ４３Ａ、Ｄ８３Ａ、Ｄ８５Ａ、Ｄ９７Ａ、Ｓ９９Ａ、Ｈ１０１Ａ、Ｅ１１１Ａ、Ｅ１３６Ａ、Ｅ１９３Ａ、Ｄ２０６Ａ、Ｄ２０８Ａ、Ｄ２１０Ａ、Ｈ２１２Ａ、Ｈ２１２Ｎ、Ｈ２１２Ｑ、Ｇ２１６Ｋ、Ｋ２１７Ｇ、Ｋ２１７Ｔ、Ｒ２１８Ｌ、及びＥ２５０Ａがある。一実施形態において、変異ＯｍｐＴ遺伝子は、Ｄ２１０Ａ及びＨ２１２Ａ変異を含んでいる。Ｄ２１０Ａ及びＨ２１２Ａ変異を含んでいる適切な変異ＯｍｐＴ配列を配列番号２３に示す。
【０１５７】
「ノックアウト変異ＯｍｐＴ遺伝子」の表現は、本発明の文脈において、遺伝子が１つ又は複数の変異を含んでおり、それによって、ノックアウト変異遺伝子によってコードされるタンパク質を欠く細胞を提供するように、遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を引き起こさないことを意味する。ノックアウト遺伝子は、部分的又は完全に転写され得るが、コードタンパク質に翻訳され得ない。ノックアウト変異ＯｍｐＴ遺伝子は、タンパク質の発現を引き起こさないように、例えば、１つ又は複数の欠失、挿入、点、ミスセンス、ナンセンス、及びフレームシフトの変異によるなど、あらゆる適切な方法において変異されてよい。例えば、遺伝子は、遺伝子コード配列中に、抗生物質耐性マーカーなどの外来のＤＮＡ配列を挿入することによってノックアウトされてよい。
【０１５８】
一実施形態において、ＯｍｐＴ遺伝子は、遺伝子開始コドン、並びに／或いは遺伝子開始コドンの下流及び遺伝子終止コドンの上流に位置する１つ又は複数の終止コドンに対する変異を含んでおり、それによってＯｍｐＴタンパク質の発現を防いでいる。開始コドンに対する変異は開始コドンの１つ、２つ、又は３つ全てのヌクレオチドのミスセンス変異であってよい。或いは、又はさらに、開始コドンは挿入又は欠失のフレームシフト変異によって変異されてよい。
【０１５９】
適切な変異ノックアウトＯｍｐＴ配列を、配列番号２４に示す。
【０１６０】
一実施形態において、本発明によるグラム陰性細菌細胞は、染色体ｏｍｐＴを欠くなど、ノックアウト変異ｏｍｐＴ遺伝子を有さない。
【０１６１】
一実施形態において、本発明によるグラム陰性細菌細胞は、染色体ｄｅｇＰを欠くなど、ノックアウト変異ｄｅｇＰ遺伝子を有さない。一実施形態において、本発明によるグラム陰性細菌細胞は、変異ｄｅｇＰ遺伝子を有さない。
【０１６２】
一実施形態において、本発明によるグラム陰性細菌細胞は、染色体ｐｔｒを欠くなど、ノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子を有さない。
【０１６３】
ノックアウト変異を含めた多くの遺伝子操作された変異は、上首尾に変異させた細胞の選択及び同定を可能にする抗生物質耐性マーカーの使用を伴う。しかし、抗生物質耐性マーカーの使用には数々の不都合がある。
【０１６４】
本発明の一実施形態において、変異遺伝子は１つ又は複数の制限マーカー部位を有してよい。したがって、ｓｐｒ遺伝子、及び／又はＤｅｇＰタンパク質をコードする変異ＤｅｇＰ遺伝子はシャペロン活性を有するがプロテアーゼ活性を有さず、並びに／或いは変異ｐｔｒ遺伝子及び／又は変異ＯｍｐＴ遺伝子は、１つ又は複数の制限マーカー部位を含んでいるように変異されてよい。制限部位は遺伝子中に遺伝子操作され、天然に存在しない。制限マーカー部位が有利であるのは、制限マーカー部位により、必要とされる染色体の変異を含んでいる正確に修飾されている細胞のスクリーニング及び同定が可能になるからである。１つ又は複数の変異遺伝子を有するように修飾された細胞は、天然に存在しない制限マーカー部位を含むゲノムＤＮＡの領域を増幅するようにデザインされたオリゴヌクレオチド対を用いて、細胞溶解物からゲノムＤＮＡのＰＣＲによって分析することができる。増幅されたＤＮＡを、次いで、天然に存在しない制限マーカー部位でＤＮＡを消化することができる適切な制限酵素とインキュベートする前及び後にアガロースゲル電気泳動によって分析してもよい。制限酵素とインキュベートした後にＤＮＡフラグメントが存在すれば、細胞が、１つ又は複数の変異遺伝子を有するように上首尾に修飾されたことを確認している。
【０１６５】
細胞が配列番号６のＤＮＡ配列を有するノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子を含む実施形態において、配列番号１７及び配列番号１８に示すオリゴヌクレオチドプライマー配列を用いて、形質転換した細胞のゲノムＤＮＡから天然に存在しないＡｓｅＩ制限部位を含むＤＮＡの領域を増幅してもよい。次いで、増幅したゲノムＤＮＡを、ＡｓｅＩ制限酵素とインキュベートし、ゲル電気泳動によって分析して、ゲノムＤＮＡ中の変異ｐｔｒ遺伝子の存在を確認してもよい。
【０１６６】
細胞が、配列番号９のＤＮＡ配列を有する変異ＤｅｇＰ遺伝子を含んでいる実施形態において、配列番号１９及び配列番号２０に示すオリゴヌクレオチドプライマー配列を用いて、形質転換した細胞のゲノムＤＮＡから天然に存在しないＡｓｅＩ制限部位を含んでいるＤＮＡの領域を増幅してもよい。次いで、増幅したゲノムＤＮＡを、ＡｓｅＩ制限酵素とインキュベートし、ゲル電気泳動によって分析して、ゲノムＤＮＡ中の変異ＤｅｇＰ遺伝子の存在を確認してもよい。
【０１６７】
１つ又は複数の制限部位を、１つ又は複数の欠失、挿入、点、ミスセンス、ナンセンス、及びフレームシフトの変異を含むあらゆる適切な変異によって導入することができる。制限部位を、上記に記載した通り、開始コドンの変異、及び／又は１つ若しくは複数の終止コドンを導入するような変異によって導入することができる。この実施形態が有利であるのは、制限マーカー部位が、導入されるノックアウト変異の直接的且つ独特なマーカーであるからである。
【０１６８】
ＡｓｅＩ制限部位など、インフレームの終止コドンを含む制限マーカー部位を挿入してもよい。挿入される制限部位が制限マーカー部位及び終止コドンの両方として作用して遺伝子コード配列の完全な転写を防ぐので、これは特に有利である。例えば、終止コドンがＡｓｅＩ部位の導入によってｐｔｒ遺伝子に導入される実施形態において、これは、図９ａに示すように制限部位をまた作り出す。
【０１６９】
制限マーカー部位を、開始コドンに対する変異、及び任意選択によって１つ又は複数のさらなる点変異によって挿入してもよい。この実施形態において、制限マーカー部位がＥｃｏＲＩ制限部位であるのが好ましい。開始コドンに対する変異は制限マーカー部位も作り出すので、これは特に有利である。例えば、ｐｔｒ遺伝子の開始コドンがＡＴＴに変更される実施形態において、これは、図９ａに示すようにＥｃｏＲＩマーカー部位をまた作り出す。
【０１７０】
細胞が変異ＯｍｐＴ遺伝子を有する本発明の実施形態において、１つ又は複数の制限部位を、１つ又は複数の欠失、挿入、点、ミスセンス、ナンセンス、及びフレームシフトの変異を含むあらゆる適切な変異によって導入してもよい。例えば、ＯｍｐＴ遺伝子が変異Ｄ２１０Ａ及びＨ２１２Ａを含んでいる実施形態において、これらの変異は、選択マーカーとして用いることができるサイレントのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を導入する。
【０１７１】
変異ｓｐｒ遺伝子及び変異ＤｅｇＰ遺伝子において、マーカー制限部位を、サイレントコドン変化を用いて導入してもよい。例えば、ＡｓｅＩ部位をサイレントの制限マーカー部位として用いてもよく、ＤｅｇＰに対して図９ｃに示すように、ＴＡＡ終止コドンはフレーム外である。
【０１７２】
ｐｔｒ遺伝子が低減したプロテアーゼ活性を有するＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩをコードするように変異されている本発明の実施形態において、１つ又は複数のマーカー制限部位を、サイレントのコドン変化を用いて導入してもよい。
【０１７３】
本発明による組換えグラム陰性細菌細胞はあらゆる適切な手段によって生成され得る。
【０１７４】
当業者であれば、ｓｐｒ変異体遺伝子を導入するために、染色体の遺伝子配列を、変異遺伝子配列で置換するのに用いることができる適切な技術を知っている。相同的組換えによって宿主の染色体中に組み込むのを可能にする適切なベクターを用いることができる。
【０１７５】
適切な遺伝子置換方法は、例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎら（「Ｎｅｗ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃ．Ｍ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１９８９年９月、１７１巻９号、４６１７〜４６２２頁）、Ｓｋｏｒｕｐｓｋｉら（「Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ａｌｌｅｌｉｃ  ｅｘｃｈａｎｇｅ」、Ｓｋｏｒｕｐｓｋｉ  Ｋ及びＴａｙｌｏｒ  Ｒ．Ｋ．、Ｇｅｎｅ、１９９６年、１６９巻、４７〜５２頁）、Ｋｉｅｌら（「Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｂｙ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ」、Ｋｉｅｌ  Ｊ．Ａ．Ｋ．Ｗ．ら、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ、１９８７年、２０７巻、２９４〜３０１頁）、Ｂｌｏｍｆｉｅｌｄら（「Ａｌｌｅｌｉｃ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｓａｃＢ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ａ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｐＳＣ１０１  ｒｅｐｌｉｃｏｎ」、Ｂｌｏｍｆｉｅｌｄ  Ｉ．Ｃ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９１年、５巻（６）、１４４７〜１４５７頁）、並びにＲｉｅｄら（「Ａｎ  ｎｐｔＩ−ｓａｃＢ−ｓａｃＲ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ，  ｕｎｍａｒｋｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｂｙ  ｍａｒｋｅｒ  ｅｘｃｈａｎｇｅ−ｅｖｉｃｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｒｉｅｄ  Ｊ．Ｌ．  及びＣｏｌｌｍｅｒ  Ａ．、Ｇｅｎｅ、５７巻（１９８７年）、２３９〜２４６頁）に記載されている。相同組換え／置換を可能にする適切なプラスミドはｐＫＯ３プラスミドである（Ｌｉｎｋら、１９９７年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１７９巻、６２２８〜６２３７頁）。
【０１７６】
細胞が、ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドを含んでいる実施形態において、当業者であれば、ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドを挿入するのに用いることができる適切な技術を知っている。ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドを、ｐＫＯ３プラスミドなどの適切なベクターを用いて細胞のゲノム中に組み込むことができる。
【０１７７】
細胞が、対象のタンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドを含んでいる実施形態において、当業者であれば、対象のタンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドを挿入するのに用いることができる適切な技術をやはり知っている。対象のタンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドを、ｐＫＯ３プラスミドなどの適切なベクターを用いて細胞のゲノム中に組み込むことができる。
【０１７８】
或いは、又はさらに、ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチド及び／又は対象のタンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドは、組換え発現カセット中に非組入れであってもよい。一実施形態において、ＤｓｂＣ及び／又は対象のタンパク質、及び１つ若しくは複数の制御発現配列をコードするポリヌクレオチドを有するために、本発明において発現カセットが用いられる。１つ又は複数の制御発現配列はプロモーターを含んでいてよい。１つ又は複数の制御発現配列は、終止配列などの３’非翻訳領域も含んでいてよい。適切なプロモーターを以下により詳しく論じる。
【０１７９】
一実施形態において、対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド及び／又はＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドを有するために、本発明において発現カセットが用いられる。発現カセットは、１つ若しくは複数の制御発現配列、１つ若しくは複数の対象のタンパク質をコードする１つ若しくは複数のコード配列、及び／又はＤｓｂＣをコードするコード配列を含んでいるのが典型的である。１つ又は複数の制御発現配列はプロモーターを含んでいてよい。１つ又は複数の制御発現配列は、終止配列などの３’非翻訳領域も含んでいてよい。適切なプロモーターを以下により詳しく論じる。
【０１８０】
一実施形態において、本発明による細胞は、プラスミドなどの１つ又は複数のベクターを含んでいる。ベクターが上記に規定した１つ又は複数の発現カセットを含んでいるのが好ましい。一実施形態において、対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、及びＤｓｂＣをコードするポリヌクレオチドを１つのベクター中に挿入する。或いは、対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、及びＤｓｂＣをコードするポリヌクレオチドを別々のベクター中に挿入する。
【０１８１】
対象のタンパク質が重鎖及び軽鎖の両方を含む抗体である実施形態において、第１のベクターが軽鎖ポリペプチドをコードし、第２のベクターが重鎖ポリペプチドをコードする、２つのベクターを細胞系にトランスフェクトしてもよい。或いは、ベクターが軽鎖及び重鎖のポリペプチドをコードする配列を含んでいる、単一のベクターを用いてもよい。或いは、抗体をコードするポリヌクレオチド配列及びＤｓｂＣをコードするポリヌクレオチドを１つのベクター中に挿入する。ベクターが、抗体の軽鎖及び重鎖のポリペプチドをコードする配列を含んでいるのが好ましい。
【０１８２】
細胞が以下の１つ又は複数のさらなるタンパク質：
タンパク質のフォールディングを促進することができる１つ又は複数のタンパク質、例えば、ＦｋｐＡ、Ｓｋｐ、ＳｕｒＡ、ＰＰｉＡ、及びＰＰｉＤ、並びに／又は
タンパク質の分泌又は転位置を促進することができる１つ又は複数のタンパク質、例えば、ＳｅｃＹ、ＳｅｃＥ、ＳｅｃＧ、ＳｅｃＹＥＧ、ＳｅｃＡ、ＳｅｃＢ、ＦｔｓＹ、及びＬｅｐ、並びに／又は
ジスルフィド結合形成を促進することができる１つ又は複数のタンパク質、例えば、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＤ、ＤｓｂＧ
も発現する実施形態において、１つ又は複数のさらなるタンパク質を、ＤｓｂＣをコードするポリヌクレオチド及び／又は対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列として同じベクター中に挿入された１つ又は複数のポリヌクレオチドから発現させてもよい。或いは、１つ又は複数のポリヌクレオチドを別々のベクター中に挿入してもよい。
【０１８３】
本発明において用いるためのベクターは、上記で定義した１つ又は複数の発現カセットを挿入することによって、適切なベクター中に生成することができる。或いは、ポリヌクレオチド配列の発現を指示するための制御発現配列がベクターに含まれていてよく、したがってポリヌクレオチドのコード領域だけがベクターを完成するのに必要とされ得る。
【０１８４】
ＤｓｂＣをコードするポリヌクレオチド及び／又は対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、細胞中で細胞に適するプロモーターの制御下で発現させるために、複製可能なベクター、典型的には自律的複製ベクター中に挿入するのが適切である。多くのベクターがこの目的で当技術分野において知られており、好適なベクターの選択は核酸のサイズ及び特定の細胞型に依存し得る。
【０１８５】
本発明によるポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換するのに用いることができるベクターの例には：
プラスミド、例えば、ｐＢＲ３２２若しくはｐＡＣＹＣ１８４、及び／又は
ウイルスのベクター、例えば、細菌のファージ
転位性遺伝要素、例えば、トランスポゾン
が含まれる。
【０１８６】
このようなベクターは、通常、プラスミドのＤＮＡ複製開始点、抗生物質の選択マーカー、プロモーター、及びマルチクローニング部位によって分離されている転写ターミネーター（発現カセット）、及びリボソーム結合部位をコードするＤＮＡ配列を含んでいる。
【０１８７】
本発明において用いられるプロモーターは、関連のポリヌクレオチドに直接連結していてよく、又は代替として好適な位置に、例えば、関連のポリペプチドが関連のプロモーターに挿入された場合に関連のプロモーターに対して作用することができるようなベクター中に位置していてよい。一実施形態において、プロモーターは、それに対してプロモーターが作用するポリヌクレオチドのコード部分の前に、例えば、ポリヌクレオチドの各コード部分の前の関連のプロモーターに位置している。本明細書で用いられる「前」はプロモーターが、コードするポリヌクレオチド部分に関して５プライムエンドに位置することを意味するものとされる。
【０１８８】
プロモーターは、宿主細胞に対して内在性でも、又は外因性でもよい。適切なプロモーターには、Ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ＰｈｏＡ、Ｉｐｐ、Ａｒａｂ、Ｔｅｔ、及びＴ７が含まれる。
【０１８９】
用いられる１つ又は複数のプロモーターは誘導プロモーターであってよい。
【０１９０】
ＤｓｂＣをコードするポリヌクレオチド、及び対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが１つのベクター中に挿入されている実施形態において、ＤｓｂＣ及び対象のタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、単一のプロモーター又は別々のプロモーターの制御下にあってよい。ＤｓｂＣ及び対象のタンパク質をコードするヌクレオチド配列が別々のプロモーターの制御下にある実施形態において、プロモーターは独立に誘導プロモーターであってよい。
【０１９１】
細菌系において用いるための発現ユニットは、対象のポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能にリンクしているシャインダルガノ（Ｓ．Ｄ．）配列も一般に含んでいる。プロモーターは、制限酵素の消化によって細菌の供給源のＤＮＡから除去し、所望のＤＮＡを含んでいるベクター中に挿入することができる。
【０１９２】
ポリヌクレオチド配列が、例えば、抗体軽鎖及び抗体重鎖など、２つ以上の対象のタンパク質に対するコード配列を２つ以上含んでいる本発明の実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡの中央における翻訳開始を可能にする１つ又は複数の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を含んでいてよい。ＩＲＥＳ配列は、コードされたポリペプチド配列を生成するためのｍＲＮＡの別々の翻訳を増強するためにコードするポリヌクレオチド配列間に位置していてよい。
【０１９３】
発現ベクターが、ＷＯ０３／０４８２０８又はＷＯ２００７／０３９７１４（これらの内容は参照によって本明細書に組み入れられる）に記載されている抗体又はその抗原結合性フラグメントを生成するためのジシストロン性のメッセージも含んでいるのが好ましい。好ましくは、抗体の軽鎖をコードするＤＮＡを含んでいる上流のシストロン、及び対応する重鎖をコードするＤＮＡを含んでいる下流のシストロン、並びにジシストロン性の遺伝子間配列（ＩＧＳ）が、ＩＧＳ１（配列番号３６）、ＩＧＳ２（配列番号３７）、ＩＧＳ３（配列番号３８)、及びＩＧＳ４（配列番号３９）から選択される配列を含んでいるのが好ましい。
【０１９４】
ターミネーターは宿主細胞に対して内在性でも、又は外因性でもよい。適切なターミネーターはｒｒｎＢである。
【０１９５】
プロモーター及びターミネーター並びにタンパク質ターゲティング方法を含んでいるさらなる適切な転写レギュレーターは、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｃｈｉｅｖｉｎｇ  Ｈｉｇｈ−Ｌｅｖｅｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」、Ｓａｖｖａｓ  Ｃ．Ｍａｋｒｉｄｅｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、１９９６年９月、５１２〜５３８頁に見ることができる。
【０１９６】
発現ベクター中に挿入されたＤｓｂＣポリヌクレオチドが、ＤｓｂＣシグナル配列及びＤｓｂＣコード配列をコードする核酸を含んでいるのが好ましい。ベクターは、好ましくは宿主の染色体を独立に複製するために、ベクターの１つ又は複数の選択された宿主細胞における複製を可能にする核酸配列を含んでいるのが好ましい。このような配列は様々な細菌ではよく知られている。
【０１９７】
一実施形態において、ＤｓｂＣ及び／又は対象のタンパク質は、Ｎ末端及び／又はＣ末端にヒスチジンタグを含んでいる。
【０１９８】
抗体分子は、細胞から分泌されることもあり、又は適切なシグナル配列によってペリプラズムに対して標的化することもある。或いは、抗体分子は細胞の原形質内に蓄積することもある。抗体分子がペリプラズムに対して標的化するのが好ましい。
【０１９９】
対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、別のポリペプチド、好ましくは、成熟ポリペプチドのＮ末端に特異的な切断部位を有するシグナル配列又は他のポリペプチドとの融合物として発現されてよい。選択される異種性のシグナル配列は、宿主細胞によって認識され、プロセシングされるものでなければならない。天然又は真核生物のポリペプチドシグナル配列を認識せず、プロセシングしない原核生物の宿主細胞では、シグナル配列は原核生物のシグナル配列によって置換されている。適切なシグナル配列には、ＯｍｐＡ、ＰｈｏＡ、ＬａｍＢ、ＰｅｌＢ、ＤｓｂＡ、及びＤｓｂＣが含まれる。
【０２００】
上記に列挙した成分の１つ又は複数を含んでいる適切なベクターの構築は、標準のライゲーション技術を用いるものである。単離したプラスミド又はＤＮＡフラグメントを、必要とするプラスミドを生成するのに望ましい形態において、切断し、誂え、再ライゲーション（ｒｅ−ｌｉｇａｔｅｄ）する。
【０２０１】
本発明の好ましい一実施形態において、本発明は、ＤｓｂＣをコードするポリヌクレオチド配列及び対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含んでいる多シストロン性の（ｍｕｌｔｉ−ｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）ベクターを提供する。多シストロン性のベクターは、ポリヌクレオチド配列のベクター中への繰返し連続クローニングを可能にする有利なクローニング方法によって生成することができる。方法は、ＡｓｅＩ及びＮｄｅＩ制限部位の「ＡＴ」末端などの１対の制限部位の適合性の付着末端を用いるものである。コード配列を含んでおり、ＡｓｅＩ−ＮｄｅＩフラグメントなどの適合性の付着末端を有するポリヌクレオチド配列を、ＮｄｅＩなどのベクターにおける制限部位中にクローニングしてもよい。ポリヌクレオチド配列の挿入は５’制限部位を破壊するが、ＮｄｅＩなどの新たな３’制限部位を作り出し、次いでこの新たな制限部位を用いて、適合性の付着末端を含んでいるさらなるポリヌクレオチド配列を挿入してもよい。次いでこのプロセスを繰り返してさらなる配列を挿入する。ベクター中に挿入された各ポリヌクレオチド配列は、終止コドンに対して３’の非コード配列を含んでおり、終止コドンはスクリーニング用のＳｓｐＩ部位、シャインダルガノリボソーム結合性配列、Ａリッチスペーサー、及び開始コドンをコードするＮｄｅＩ部位を含んでいてよい。
【０２０２】
ある抗体の軽鎖（ＬＣ）、ある抗体の重鎖（ＨＣ）をコードするポリヌクレオチド配列、ＤｓｂＣポリヌクレオチド配列、及びさらなるポリヌクレオチド配列を含んでいるベクターの創製を示す図を図１０に示す。
【０２０３】
上首尾に変異させた系統を、コロニーＰＣＲ  ＤＮＡ配列決定及びコロニーＰＣＲ制限酵素マッピングを含めた当技術分野においてよく知られている方法を用いて同定してもよい。
【０２０４】
細胞が２つ以上の変異遺伝子を含んでいる実施形態において、変異されたプロテアーゼを、グラム陰性細菌中の同じ又は異なるベクター上に導入してもよい。
【０２０５】
一実施形態において、本発明によるグラム陰性細菌細胞は、染色体ｏｍｐＴを欠くなど、ノックアウト変異ｏｍｐＴ遺伝子を有さない。
【０２０６】
本発明による細胞は、対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含んでいてよい。対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、外来性でも、又は内在性でもよい。対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、宿主の染色体中に組み込まれてもよく、又は通常はプラスミドであるベクター中に非組入れ（ｎｏｎ−ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）であってもよい。
【０２０７】
一実施形態において、本発明による細胞は対象のタンパク質を発現する。「対象のタンパク質」は、本明細書の文脈において、通常は組換えポリペプチドである、発現用のポリペプチドを意味するものとされる。しかし、対象のタンパク質は、宿主細胞において内在性の遺伝子から発現される内在性タンパク質であってもよい。
【０２０８】
本明細書で用いられる、「組換えポリペプチド」は、組換えＤＮＡ技術を用いて構築又は生成されるタンパク質を意味する。対象のタンパク質は、外来性のベクターから発現された、内在性のタンパク質若しくはその変異バージョン（例えば、減弱された生物学的活性を有するもの）に同一の外来性の配列であってよく、又はそのフラグメントであってよい。或いは、対象のタンパク質は、宿主細胞によって通常発現されない、異種性のタンパク質であってよい。
【０２０９】
対象のタンパク質は、治療用、予防用、又は診断用のタンパク質を含めたあらゆる適切なタンパク質であってよい。
【０２１０】
一実施形態において、対象のタンパク質は、炎症性疾患及び障害、免疫疾患及び障害、線維性障害、並びに癌を含めた疾患又は障害の処置において有用である。
【０２１１】
「炎症性疾患」又は「障害」、及び「免疫疾患又は障害」の語は、関節リウマチ、乾癬性関節炎、スティル病、マックルウェルズ病、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、ＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、血管炎、Ｉ型糖尿病、移植、及び移植片対宿主病を含む。
【０２１２】
「線維性障害」の語は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、全身性硬化症（又は強皮症）、腎臓線維症、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎症、高血圧、末期腎不全、腹膜線維症（連続の外来腹膜透析）、肝硬変、加齢黄斑変性（ＡＲＭＤ）、網膜症、反応性心臓線維症（ｃａｒｄｉａｃ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、瘢痕、ケロイド、火傷、皮膚潰瘍、血管形成、冠状動脈バイパス手術、関節形成術、及び白内障手術を含む。
【０２１３】
「癌」の語は、上皮から生じ、皮膚中又はより一般的には身体器官（例えば、乳房、卵巣、前立腺、肺、腎臓、膵臓、胃、膀胱、又は腸）の内膜に見出される悪性の新たな増殖を含む。癌は、隣接の組織中に浸潤し、例えば、骨、肝臓、肺、又は脳などの遠位の器官に広がる（転移）傾向がある。
【０２１４】
タンパク質は、タンパク質分解感受性のポリペプチド、即ち、自然状態又は分泌の間のいずれかにおいて、大腸菌などの１つ又は複数のグラム陰性細菌、プロテアーゼによって切断を受けやすく、切断に感受性であり、又は切断されるタンパク質であってよい。一実施形態において、対象のタンパク質は、ＤｅｇＰ、ＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩ、及びＴｓｐから選択されるプロテアーゼに対してタンパク質分解感受性である。一実施形態において、対象のタンパク質は、プロテアーゼＴｓｐに対してタンパク質分解感受性である。一実施形態において、対象のタンパク質は、プロテアーゼであるＤｅｇＰ及びＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩに対してタンパク質分解感受性である。一実施形態において、対象のタンパク質は、プロテアーゼであるＤｅｇＰ及びＴｓｐに対してタンパク質分解感受性である。一実施形態において、対象のタンパク質は、プロテアーゼであるＴｓＰ及びＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩに対してタンパク質分解感受性である。一実施形態において、対象のタンパク質は、ＤｅｇＰ、ＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩ、及びＴｓＰに対してタンパク質分解感受性である。
【０２１５】
タンパク質が真核生物のポリペプチドであるのが好ましい。
【０２１６】
本発明による細胞によって発現される対象のタンパク質は、例えば免疫原、２つの異種性のタンパク質を含む融合タンパク質、又は抗体であってよい。対象のタンパク質として用いるための抗体には、モノクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、又はキメラ抗体が含まれる。抗体はあらゆる種からのものであってよいが、モノクローナル抗体、ヒト抗体、又はヒト化フラグメントに由来しているのが好ましい。抗体は、免疫グロブリン分子のあらゆるクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、若しくはＩｇＡ）又はサブクラスに由来していてよく、例えば、マウス、ラット、サメ、ウサギ、ブタ、ハムスター、ラクダ、ラマ、ヤギ、若しくはヒトを含めたあらゆる種から得ることができる。抗体フラグメントの部分は、１つを超える種から得ることができ、例えば、抗体フラグメントはキメラであってよい。一例において、定常領域はある種からであり、可変領域は別の種からである。
【０２１７】
抗体は、全長の重鎖及び軽鎖を有する完全な抗体分子であってよく、又はそのフラグメント、例えば、ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００３３３１に記載されている通り、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、Ｆａｂ、修飾Ｆａｂ’、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆａｂ−Ｆｖ、又は二重特異性抗体、例えば、Ｆａｂ−ｄＡｂであってよい。
【０２１８】
抗体はあらゆる標的の抗原に特異的であってよい。抗原は、細胞に付随するタンパク質、例えば、細菌細胞、酵母菌細胞、Ｔ細胞、内皮細胞、若しくは腫瘍細胞などの細胞状の細胞表面タンパク質であってよく、又は可溶性タンパク質であってよい。対象の抗原はまた、疾患若しくは感染の間に上方制御されるタンパク質などのあらゆる医学的に関連のあるタンパク質、例えば、受容体であってよく、且つ／又はこれらの対応するリガンドであってもよい。細胞表面タンパク質の特定の例には、接着分子、例えば、β１インテグリンなどのインテグリン、例えば、ＶＬＡ−４、Ｅ−セレクチン、Ｐセレクチン、若しくはＬ−セレクチン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤＷ５２、ＣＤ６９、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＩＣＯＳ、ＢＣＭＰ７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤＣＰ１、ＣＳＦ１、若しくはＣＳＦ１受容体、ＤＰＣＲ１、ＤＰＣＲ１、ヅヅリン（ｄｕｄｕｌｉｎ）２、ＦＬＪ２０５８４、ＦＬＪ４０７８７、ＨＥＫ２、ＫＩＡＡ０６３４、ＫＩＡＡ０６５９、ＫＩＡＡ１２４６、ＫＩＡＡ１４５５、ＬＴＢＰ２、ＬＴＫ、ＭＡＬ２、ＭＲＰ２、ネクチン様２、ＮＫＣＣ１、ＰＴＫ７、ＲＡＩＧ１、ＴＣＡＭ１、ＳＣ６、ＢＣＭＰ１０１、ＢＣＭＰ８４、ＢＣＭＰ１１、ＤＴＤ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ヒト乳脂肪グロブリン（ＨＭＦＧ１及び２）、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ抗原、ＫＤＲ及びＶＥＧＦ、及び好適な場合にはこれらの受容体が含まれる。
【０２１９】
可溶性抗原には、インターロイキン、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１６、又はＩＬ−１７、例えば、ＩＬ１７Ａ及び／又はＩＬ１７Ｆ、ウイルス抗原、例えば、呼吸器合胞体ウイルス抗原又はサイトメガロウイルス抗原、免疫グロブリン、例えば、ＩｇＥ、インターフェロン、例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、又はインターフェロンγ、腫瘍壊死因子ＴＮＦ（以前は腫瘍壊死因子−αとして知られていた）、腫瘍壊死因子−β、コロニー刺激因子、例えば、Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦ、及び血小板由来増殖因子、例えば、ＰＤＧＦ−α及びＰＤＧＦ−β、並びに好適な場合にはこれらの受容体が含まれる。他の抗原には、細菌の細胞表面抗原、細菌の毒素、ウイルス、例えば、インフルエンザ、ＥＢＶ、ＨｅｐＡ、Ｂ、及びＣ、生物テロ薬剤、放射性核種及び重金属、並びにヘビ毒及びクモ毒、及び毒素が含まれる。
【０２２０】
一実施形態において、対象の抗原の活性を機能的に変更するのに抗体を用いることができる。例えば、抗体は、前記抗原の活性を、直接的又は間接的に、中和し、拮抗する（antagonize）、又は作用し（アゴナイズ：agonise）得る。
【０２２１】
本発明の一態様では、変異体ｓｐｒタンパク質、野生型Ｔｓｐ遺伝子をコードする変異体ｓｐｒ遺伝子、及びＴＮＦに特異的な抗体又はその抗原結合性フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を含んでいる組換えグラム陰性細菌細胞が提供される。野生型染色体Ｔｓｐ遺伝子が非組換えの染色体Ｔｓｐ遺伝子であるのが好ましい。細胞が、ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドをさらに含んでいるのが好ましい。
【０２２２】
好ましい一実施形態において、ＷＯ０１／０９４５８５（この内容は参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されている通り、本発明による細胞によって発現される対象のタンパク質は、抗ＴＮＦ抗体、より好ましくは抗ＴＮＦ  Ｆａｂ’である。
【０２２３】
一実施形態において、ヒトＴＮＦαに対する特異性を有する抗体は重鎖を含んでおり、可変ドメインは、ＣＤＲＨ１に対して配列番号２８に示す配列、ＣＤＲＨ２に対して配列番号２９若しくは配列番号３４に示す配列、又はＣＤＲＨ３に対して配列番号３０に示す配列を有するＣＤＲを含んでいる。
【０２２４】
一実施形態において、抗体は軽鎖を含んでおり、可変ドメインは、ＣＤＲＬ１に対して配列番号３１に示す配列、ＣＤＲＬ２に対して配列番号３２に示す配列、又はＣＤＲＬ３に対して配列番号３３に示す配列を有するＣＤＲを含んでいる。
【０２２５】
上記に言及した配列番号２８、及び配列番号３０から配列番号３４に示したＣＤＲは、マウスモノクローナル抗体ｈＴＮＦ４０に由来する。しかし、配列番号２９はハイブリッドＣＤＲからなる。ハイブリッドＣＤＲは、マウスモノクローナル抗体ｈＴＮＦ４０（配列番号４０）からの重鎖ＣＤＲ２の部分、及びヒトグループ３生殖系列Ｖ領域配列からの重鎖ＣＤＲ２の部分を含んでいる。
【０２２６】
一実施形態において、抗体は重鎖（可変ドメインは、ＣＤＲＨ１に対して配列番号２８に示す配列、ＣＤＲＨ２に対して配列番号２９若しくは配列番号３４に示す配列、又はＣＤＲＨ３に対して配列番号３０に示す配列を有するＣＤＲを含んでいる）、及び軽鎖（可変ドメインは、ＣＤＲＬ１に対して配列番号３１に示す配列、ＣＤＲＬ２に対して配列番号３２に示す配列、又はＣＤＲＬ３に対して配列番号３３に示す配列を有するＣＤＲを含んでいる）を含んでいる。
【０２２７】
一実施形態において、抗体は、ＣＤＲＨ１に対して配列番号２８、ＣＤＲＨ２に対して配列番号２９又は配列番号３４、ＣＤＲＨ３に対して配列番号３０、ＣＤＲＬ１に対して配列番号３１、ＣＤＲＬ２に対して配列番号３２、及びＣＤＲＬ３に対して配列番号３３を含んでいる。抗体がＣＤＲＨ２に対して配列番号２９を含んでいるのが好ましい。
【０２２８】
抗ＴＮＦ抗体がＣＤＲグラフト化抗体分子であるのが好ましい。好ましい一実施形態において、可変ドメインは、ヒトアクセプターフレームワーク領域及び非ヒトドナーＣＤＲを含んでいる。
【０２２９】
抗体分子がヒトＴＮＦ（以前はＴＮＦαとして知られていた）に対して特異性を有するのが好ましく、軽鎖は配列番号１１の軽鎖可変領域を含んでおり、重鎖は配列番号１２の重鎖可変領域を含んでいる。
【０２３０】
抗ＴＮＦ抗体がＦａｂ又はＦａｂ’のフラグメントであるのが好ましい。
【０２３１】
ヒトＴＮＦに対して特異性を有する抗体分子がＦａｂ’であり、配列番号１３を含んでいる、又はそれからなる軽鎖配列、及び配列番号１４を含んでいる、又はそれからなる重鎖配列を有するのが好ましい。
【０２３２】
発現後、抗体フラグメントを、例えば、エフェクター分子などの別の実体に対してコンジュゲートすることによってさらにプロセシングしてもよい。
【０２３３】
本明細書で用いられるエフェクター分子の語には、例えば、抗悪性腫瘍薬、薬物、毒素（例えば、細菌若しくは植物起源の酵素的に活性な毒素及びこれらのフラグメント、例えば、リシン（ｒｉｃｉｎ）及びそのフラグメント）生物学的に活性なタンパク質、例えば、酵素、他の抗体又は抗体フラグメント、合成の、又は天然に存在するポリマー、核酸及びこれらのフラグメント、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びこれらのフラグメント、放射性核種、特に放射性ヨウ化物、放射性同位元素、キレート化金属、ナノ粒子及びレポーターグループ、例えば、蛍光化合物又はＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光法によって検出され得る化合物が含まれる。エフェクター分子は、あらゆる適切な方法によって抗体又はそのフラグメントに付着していてよく、例えば、抗体フラグメントは、ＷＯ０５／００３１７３１又はＷＯ０５／００３１７０（これらの内容は参照によって本明細書に組み入れられる）に記載されている通り、少なくとも１つのエフェクター分子で付着するように修飾されていてよい。ＷＯ０５／００３１７１又はＷＯ０５／００３１７０も適切なエフェクター分子も記載している。
【０２３４】
一実施形態において、所望により、抗体又はそのフラグメント、例えばＦａｂをＰＥＧ化して必要とされる性質、例えば、抗体全体に類似の性質を有する生成物を生成する。例えば、抗体は、ＷＯ０１／０９４５８５に記載されている通り、ＰＥＧ化した抗ＴＮＦα−Ｆａｂ’であってよく、好ましくは、重鎖のＣ末端終端でリシル−マレイミド由来の基（ｌｙｓｙｌ−ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｕｐ）でシステイン残基の１つに付着しており、リシル残基の２つのアミノ基の各々はこれを、分子量約２００００Ｄａを有するメトキシポリ（エチレングリコール）残基に共有結合させており、その結果メトキシポリ（エチレングリコール）残基の合計平均分子量は約４００００Ｄａであり、より好ましくはリシル−マレイミド由来の基は、［１−［［［２−［［３−（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）−１−オキソプロピル］アミノ］エチル］アミノ］−カルボニル］−１，５−ペンタンジイル］ビス（イミノカルボニル）である。
【０２３５】
細胞はまた、１つ又は複数のさらなる対象のタンパク質をコードするさらなるポリヌクレオチド配列を含んでいてよい。
【０２３６】
一実施形態において、野生型が精製の間に対象の組換えタンパク質と同時精製することが知られている１つ又は複数の大腸菌宿主タンパク質は、Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓら、「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｔｈｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ  Ｆａｂ’  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ：ｃｈａｎｇｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐＩ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ＰｈｏＳ／ＰｓｔＳ  ｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、３７巻（２００４年）、１０９〜１１８頁及びＷＯ０４／０３５７９２（これらの内容は参照によって本明細書に組み入れられる）において記載されている通り、遺伝子修飾用に選択される。このような修飾された宿主タンパク質の使用により、これらが組換え抗体と最早同時精製されないように、選択された大腸菌タンパク質の物理的性質を変更することによって、大腸菌において生成された対象のタンパク質、特に抗体に対する精製プロセスが改善される。変更される大腸菌タンパク質が、リン酸結合性タンパク質（ＰｈｏＳ／ＰｓｔＳ）、ジペプチド結合性タンパク質（ＤｐｐＡ）、マルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）、及びチオレドキシンの１つ又は複数から選択されるのが好ましい。
【０２３７】
一実施形態において、汚染性の宿主タンパク質の物理的性質は、アミノ酸タグをＣ末端又はＮ末端に添加することによって変更される。好ましい一実施形態において、変更される物理的性質は等電点であり、アミノ酸タグはＣ末端に付着するポリアスパラギン酸タグである。一実施形態において、前記タグの添加によって変更される大腸菌タンパク質は、ジペプチド結合性タンパク質（ＤｐｐＡ）、マルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン、及びリン酸結合性タンパク質（ＰｈｏＳ／ＰｓｔＳ）である。詳しい一実施形態において、大腸菌のリン酸結合性タンパク質（ＰｈｏＳ／ＰｓｔＳ）のｐＩは、アスパラギン酸残基を６個含んでいるポリアスパラギン酸タグ（ＰｏｌｙＤ）をＣ末端に加えることよって７．２から５．１に低減される。
【０２３８】
単独で、又はＮ末端若しくはＣ末端にタグを加えることとの組合せのいずれかで、その物理的性質を変更するための、汚染性の大腸菌タンパク質の特定の残基の修飾も好ましい。このような変更は、ｐＩ又は疎水性を変更するためのタンパク質又はアミノ酸置換基のサイズを変更するための挿入又は欠失を含むことができる。一実施形態において、これらの残基はタンパク質の表面上に位置する。好ましい一実施形態において、タンパク質のｐＩを低減するために、ＰｈｏＳタンパク質の表面残基が変更される。機能的なＰｈｏＳタンパク質を維持するために、リン酸塩の結合において重要であると関係付けられている残基（Ｂａｓｓ、ＵＳ５，３０４，４７２）を回避するのが好ましい。タンパク質の表面から遠くはなれて突出している、又は塩基性残基の大型の基である、若しくは塩基性残基の大型の基の近くにあるリシン残基を標的にするのが好ましい。一実施形態において、ＰｈｏＳタンパク質はＣ末端に付着しているヘキサポリアスパラギン酸タグを有し、分子の反対の終端にある表面残基が置換用に標的にされる。選択されたリシン残基が、中性残基から酸性残基に変わる場合よりも大きな潜在的なｐＩ変化を付与するようにグルタミン酸又はアスパラギン酸を置換するのが好ましい。本明細書における置換変異体に対する呼称は、文字とその後に続く数字、その後に続く文字からなる。最初の文字は野生型タンパク質におけるアミノ酸を指定する。数字はアミノ酸置換が行われるアミノ酸位置を意味し、２番目の文字は野生型アミノ酸を置換するのに用いられるアミノ酸を指定する。本発明におけるＰｈｏＳの好ましい変異において、リシン残基（Ｋ）２７５、１０７、１０９、１１０、２６２、２６５、２６６、３０９、３１３は、単一変異又は複合変異としてグルタミン酸（Ｅ）又はグルタミン（Ｑ）に対して置換され、さらにリシン（Ｋ）３１８は、単一変異又は複合変異としてアスパラギン酸（Ｄ）に対して置換されてよい。単独の変異がＫ２６２Ｅ、Ｋ２６５Ｅ、及びＫ２６６Ｅであるのが好ましい。複合変異がＫ２６５／２６６Ｅ及びＫ１１０／２６５／２６６Ｅであるのが好ましい。全ての変異が、Ｃ末端で付着しているポリアスパラギン酸（ＰｏｌｙＤ）タグと、任意選択によってＫ３１８Ｄ置換とも組み合わされるのがより好ましい。好ましい一実施形態において、変異は少なくとも２単位のｐＩにおける低減をもたらす。本発明の変異がＰｈｏＳのｐＩを７．２から約４と約５．５との間に低減するのが好ましい。本発明の一実施形態において、大腸菌のＰｈｏＳタンパク質のｐＩは、ｐｏｌｙＤ  Ｋ３１８Ｄ、ｐｏｌｙＤ  Ｋ２６５／２６６Ｅ、及びｐｏｌｙＤ  Ｋ１１０／２６５／２６６の変異を用いて、７．２からそれぞれ約４．９、約４．８、及び約４．５に低減される。
【０２３９】
対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、別のポリペプチド、好ましくは、成熟ポリペプチドのＮ末端に特異的な切断部位を有するシグナル配列又は他のポリペプチドとの融合物として発現されてよい。選択される異種性のシグナル配列は、宿主細胞によって認識され、プロセシングされるものでなければならない。天然又は真核生物のポリペプチドシグナル配列を認識せず、プロセシングしない原核生物の宿主細胞では、シグナル配列は原核生物のシグナル配列によって置換されている。適切なシグナル配列には、ＯｍｐＡ、ＰｈｏＡ、ＬａｍＢ、ＰｅｌＢ、ＤｓｂＡ、及びＤｓｂＣが含まれる。
【０２４０】
ポリヌクレオチドに関して本明細書に記載する本発明の実施形態は、ベクター、発現カセット、及び／又はこれらに用いられる成分を含む宿主など、関連する態様をこれらに適用することができる限り、本発明の代替の実施形態に等しく適用されるものである。
【０２４１】
本発明は、培養培地中で、対象の組換えタンパク質を発現させ、対象の組換えタンパク質を組換えグラム陰性細菌細胞のペリプラズム及び／又は培養培地から回収するのに有効な条件下で、上記に記載した組換えグラム異性細菌細胞を培養することを含む、対象の組換えタンパク質を生成するための方法も提供する。細胞が、ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドを含んでいる一実施形態において、細胞を、ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドを発現させるのに有効な条件下で培養する。
【０２４２】
本発明の方法において用いるのが好ましいグラム陰性細菌細胞及び対象のタンパク質は、上記に詳しく記載したものである。
【０２４３】
対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが外来性である場合、ポリヌクレオチドを当技術分野において知られているあらゆる適切な手段を用いて宿主細胞中に組み入れることができる。ＤｓｂＣをコードするポリヌクレオチド配列を、当技術分野において知られているあらゆる適切な手段を用いて宿主細胞中に組み入れることもできる。ポリヌクレオチドが、細胞中に形質転換される発現ベクターの部分として組み入れられるのが典型的である。したがって、本発明による細胞の一態様は、対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、及びＤｓｂＣをコードするポリヌクレオチドを含んでいる発現カセットを含む。
【０２４４】
対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、及びＤｓｂＣをコードするポリヌクレオチド配列を、塩化ルビジウム、ＰＥＧ、又は電気穿孔を用いるなど、標準の技術を用いて細胞中に形質転換してもよい。
【０２４５】
本発明による方法は、対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドで上首尾に形質転換されている安定な細胞の選択を促進する選択系も用いることができる。選択系は通常、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド配列の同時形質転換を使用する。一実施形態において、細胞中に形質転換された各ポリヌクレオチドは、１つ又は複数の選択マーカーをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含んでいる。したがって、対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド及び任意選択によってＤｓｂＣをコードするポリヌクレオチドの形質転換、並びにマーカーをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドの形質転換は一緒に生じ、選択系を用いて所望のタンパク質を生成するこれらの細胞を選択することができる。
【０２４６】
１つ又は複数のマーカーを発現することができる細胞は、細胞中に組み入れられる選択系のポリペプチド／遺伝子又はポリペプチド成分によって付与される性質（例えば、抗生物質耐性）のために、例えば、毒素又は抗生物質の添加など、ある種の人工的に課せられた条件下で生存／増殖／繁殖することができる。１つ又は複数のマーカーを発現することができない細胞は、人工的に課せられた条件下で生存／増殖／繁殖することができない。人工的に課せられる条件は、所望により幾分強力であるように選択され得る。
【０２４７】
本発明においてあらゆる適切な選択系を用いることができる。典型的に、選択系は、例えば、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、又はアンピリシン耐性の遺伝子など、既知の抗生物質に対して耐性をもたらすベクターの１つ又は複数の遺伝子中に含まれていることに基づいていてよい。関連の抗生物質の存在下で増殖する細胞は、これらが抗生物質に対する耐性をもたらす遺伝子及び所望のタンパク質の両方を発現するように選択されてよい。
【０２４８】
対象のタンパク質及び／又はＤｓｂＣを発現させるために、誘導可能な発現系、又は構成的なプロモーターを本発明において用いることができる。一実施形態において、対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、及びＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドの発現は、培養培地に誘導因子を加えることによって誘導される。適切な誘導可能な発現系及び構成的なプロモーターは、当技術分野においてよく知られている。
【０２４９】
形質転換細胞を培養するのにあらゆる適切な培地を用いることができる。例えば、培地中で増殖するように上首尾に形質転換されている細胞だけを可能にするように、培地は抗生物質を含み得るなど、培地を特定の選択系に適応させてもよい。
【０２５０】
培地から得た細胞を、所望により、さらにスクリーニング及び／又は精製にかけてもよい。方法は、所望により対象のタンパク質を抽出及び精製する１つ又は複数のステップをさらに含むことができる。
【０２５１】
ポリペプチドを、原形質、ペリプラズム、及び／又は上清からを含む、系統から回収することができる。
【０２５２】
タンパク質を精製するために用いる特定の方法（単数又は複数）はタンパク質のタイプに依存する。適切な方法には、イムノ−アフィニティカラム、又はイオン交換カラム上での分画化、エタノール沈澱、逆相ＨＰＬＣ、疎水性−相互作用クロマトグラフィー、シリカ上クロマトグラフィー、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ及びＤＥＡＥなどのイオン交換樹脂上のクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、硫酸アンモニウム沈澱、及びゲルろ過が含まれる。
【０２５３】
一実施形態において、方法は、ＤｓｂＣから対象の組換えタンパク質を分離することをさらに含む。
【０２５４】
抗体を、培養培地及び／又は原形質抽出物及び／又はペリプラズム抽出物から、従来の抗体精製手順、例えば、タンパク質Ａ−セファロース、タンパク質Ｇクロマトグラフィー、タンパク質Ｌクロマトグラフィー、チオフィリック（ｔｈｉｏｐｈｉｌｉｃ）、混合モード樹脂（ｍｉｘｅｄ  ｍｏｄｅ  ｒｅｓｉｎｓ）、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、アフィニティクロマトグラフィー、硫酸アンモニウム、エタノール、又はＰＥＧ分画／沈澱、イオン交換膜、膨張床吸着クロマトグラフィー（ＥＢＡ）、又は擬似移動床クロマトグラフィーなどによって適切に分離することができる。
【０２５５】
方法は、対象のタンパク質の発現量を測定し、高発現レベルの対象のタンパク質を有する細胞を選択するさらなるステップも含むことができる。
【０２５６】
方法は、抗体又は抗体フラグメントなどの対象のタンパク質のペグ化などの１つ又は複数のさらなる下流のプロセシングのステップも含むことができる。
【０２５７】
本明細書に記載する１つ又は複数の方法のステップを、バイオリアクターなどの適切な容器において組み合わせて行ってもよい。
【実施例】
【０２５８】
（例１）
細胞系統ＭＸＥ００１（ΔＴｓｐ）の生成
ＭＸＲ００１系統を以下の通り生成した：
Ｔｓｐカセットを、ＳａｌＩ、ＮｏｔＩ制限フラグメントとして、同様に制限したｐＫＯ３プラスミド中に移動させた。ｐＫＯ３プラスミドは、温度感受性変異体のｐＳＣ１０１複製開始点（ＲｅｐＡ）を、染色体の組入れ事象に対して強化及び選択するためのクロラムフェニコールマーカーと一緒に用いる。レバンスクラーゼをコードするｓａｃＢ遺伝子は、ショ糖上で増殖させた大腸菌に致死的であり、したがって（クロラムフェニコールマーカー及びｐＳＣ１０１開始点と一緒に）用いて脱組込み（ｄｅ−ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）及びプラスミドキュアリング事象に対して強化及び選択するのに用いられる。この方法は以前に記載されている（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、１９８９年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１７１巻、４６１７〜４６２２頁、及びＢｌｏｍｆｉｅｌｄら、１９９１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、５巻、１４４７〜１４５７頁）。ｐＫＯ３系は全ての選択マーカーを、挿入された遺伝子以外の宿主ゲノムから除去する。
【０２５９】
以下のプラスミドを構築した。
ＥｃｏＲＩ及びＡｓｅＩ制限マーカーを含んでいる、配列番号３に示すノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子を含んでいるｐＭＸＥ１９１。
【０２６０】
次いで、プラスミドを、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｅ．Ｍ．及びＮｉｃｋｏｌｏｆｆ，Ｊ．Ａ．における「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、４７巻、Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ，Ｊ．Ａ．（編集）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、１０５巻（１９９５年）に見られる方法を用いて調製した、電気的コンピテント大腸菌Ｗ３１１０細胞中に形質転換した。
【０２６１】
１日目  大腸菌細胞４０μｌを、冷却したＢｉｏＲａｄ０．２ｃｍ電気穿孔キュベット中、ｐＫＯ３  ＤＮＡ（１０ｐｇ）１μｇと混合し、その後２５００Ｖ、２５μＦ、及び２００Ωで電気穿孔した。２×ＰＹ１０００μｌを直ちに加え、３０℃のインキュベーター中で１時間、２５０ｒｐｍで振盪することによって細胞を回収した。細胞を２×ＰＹ中１／１０に段階希釈し、その後１００μｌのアリコートを、クロラムフェニコール２０μｇを含み３０℃及び４３℃に予め温めた２×ＰＹ寒天平板上に塗抹した。平板を３０℃及び４３℃で一夜インキュベートした。
【０２６２】
２日目  ３０℃で増殖させたコロニーの数により電気穿孔の効果が推定されたが、４３℃の増殖を生存したコロニーは潜在的な組入れ事象を表している。４３℃の平板から単一のコロニーを拾い、２×ＰＹ１０ｍｌ中に再懸濁した。この１００μｌを、ショ糖５％（ｗ／ｖ）を含み３０℃に予め温めた２×ＰＹ寒天平板上に塗抹して単一のコロニーを生成させた。平板を３０℃で一夜インキュベートした。
【０２６３】
３日目  ここでコロニーは、潜在的な同時の脱組込み及びプラスミドキュアリング事象を表す。脱組込み及びキュアリング事象が増殖における初期に生じた場合、大部分のコロニー塊はクローンとなる。単一のコロニーを拾い、クロラムフェニコール２０μｇ／ｍｌ又は５％（ｗ／ｖ）ショ糖のいずれかを含む２×ＰＹ寒天上にレプリカプレーティングした。平板を３０℃で一夜インキュベートした。
【０２６４】
４日目  ショ糖上で増殖し、且つクロラムフェニコール上で死滅した両方のコロニーは、潜在的な染色体の置換及びプラスミドキュアリング事象を表している。これらを拾い、変異特異的なオリゴヌクレオチドでＰＣＲによってスクリーニングした。正確なサイズのＰＣＲ陽性のバンドを生じたコロニーを削除して、ショ糖５％（ｗ／ｖ）を含む２×ＰＹ寒天上で単一のコロニーを生成し、平板を３０℃で一夜インキュベートした。
【０２６５】
５日目  ＰＣＲ陽性、クロラムフェニコール感受性、及びショ糖耐性の大腸菌の単一のコロニーを用いてグリセロール株、化学的コンピテント細胞を作製し、５’及び３’に隣接するオリゴとのＰＣＲ反応用のＰＣＲ鋳型として作用させて、Ｔａｑポリメラーゼを用いた直接ＤＮＡ配列決定用のＰＣＲ生成物を生成した。
【０２６６】
オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、図１ａ、１ｂ、及び１ｃに示す通り、天然に存在しないＡｓｅＩ制限部位を含んでいるＴｓｐ遺伝子の領域をＰＣＲ増幅することによって、変異Ｔｓｐ遺伝子を有するゲノムＤＮＡの上首尾な修飾を確認するために細胞系統ＭＸＥ００１を試験した。次いで、変異遺伝子における天然に存在しないＡｓｅＩ制限部位の存在を確認するために、ＡｓｅＩ制限酵素でのインキュベートの前及び後に、ＤＮＡの増幅した領域をゲル電気泳動によって分析した。この方法を以下の通り行った。
【０２６７】
以下のオリゴを用いて、ＰＣＲを用い、ＭＸＥ００１及びＷ３１１０から調製した大腸菌細胞可溶化物からゲノムＤＮＡを増幅した。
【化１】
0005960607.tif 000002
【０２６８】
細胞のコロニー１個を、１×ＰＣＲバッファー２０μｌ中９５℃で１０分間加熱することによって、可溶化物を調製した。混合物を室温に放冷し、次いで１３２００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を除去し、「細胞可溶化物」のラベルを付けた。
【０２６９】
Ｔｓｐオリゴ対を用いて各系統を増幅した。
【０２７０】
ＤＮＡを標準のＰＣＲ手順を用いて増幅した。
５μｌ      バッファー×１  （Ｒｏｃｈｅ）
１μｌ      ｄＮＴＰ混合物（Ｒｏｃｈｅ、１０ｍＭ混合物）
１．５μｌ  ５’オリゴ（５ｐｍｏｌ）
１．５μｌ  ３’オリゴ（５ｐｍｏｌ）
２μｌ      細胞可溶化物
０．５μｌ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  ５Ｕ／μｌ）
３８．５μｌ  Ｈ２Ｏ
ＰＣＲサイクル
９４℃    １分
９４℃    １分）
５５℃    １分）３０サイクル繰返し
７２℃    １分）
７２℃    １０分
【０２７１】
反応が完了したら２５μｌをＡｓｅＩでの消化用に新たな微量遠心管に移した。ＰＣＲ反応２５μｌに、Ｈ２Ｏ１９μｌ、バッファー３（ＮＥＢ）５μｌ、ＡｓｅＩ（ＮＥＢ）１μｌを加え、混合し、３７℃で２時間インキュベートした。
【０２７２】
残りのＰＣＲ反応に、ローディングバッファー（×６）５μｌを加え、２０μｌを０．８％ＴＡＥ２００ｍｌアガロースゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上にローディングし、エチジウムブロマイド（貯蔵液１０ｍｌ／ｍｌを５μｌ）を加え、１００ボルトで１時間泳動させた。サイズマーカー（ＰｅｒｆｅｃｔＤＮＡマーカー０．１〜１２ｋｂ、Ｎｏｖａｇｅｎ）１０μｌを最終レーンにローディングした。
【０２７３】
ＡｓｅＩ消化が完了したら、ローディングバッファー（×６）１０μｌを加え、２０μｌを０．８％ＴＡＥアガロースゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上にローディングし、エチジウムブロマイド（１０ｍｌ／ｍｌ貯蔵液を５μｌ）を加え、１００ボルトで１時間泳動した。サイズマーカー（ＰｅｒｆｅｃｔＤＮＡマーカー０．１〜１２ｋｂ、Ｎｏｖａｇｅｎ）１０μｌを最終レーンにローディングした。ゲルを両方ともＵＶトランスイルミネーターを用いて可視化した。
【０２７４】
増幅したゲノムフラグメントは、Ｔｓｐに対して２．８ｋｂの正確なサイズバンドを示した。引き続きＡｓｅＩで消化させると、Ｔｓｐ欠損系統ＭＸＥ００１に導入されたＡｓｅＩ部位の存在が確認されたが、Ｗ３１１０コントロールでは確認されなかった。
【０２７５】
ＭＸＥ００１：Ｔｓｐプライマーセットを用いてゲノムＤＮＡを増幅し、得られたＤＮＡをＡｓｅＩで消化して２．２ｋｂｐｓ及び０．６ｋｂｐｓのバンドを生成した。
【０２７６】
Ｗ３１１０のＰＣＲ増幅したＤＮＡは、ＡｓｅＩ制限酵素によって消化されなかった。
【０２７７】
（例２）
ｓｐｒ変異体の生成
ｓｐｒ変異を、相補性アッセイを用いて生成し選択した。
【０２７８】
ｓｐｒ遺伝子を、１０００ｂｐあたり１つから２つの変異を導入するＣｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標）ランダム変異ダイバーシティＰＣＲキットを用いて変異させた。変異ｓｐｒＰＣＲ  ＤＮＡを、ｓｐｒ変異体と一緒にＣＤＰ８７０Ｆａｂ’を発現する誘導発現ベクター［ｐＴＴＯ  ＣＤＰ８７０］中にクローニングした。次いで、このライゲーションを、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｅ．Ｍ．及びＮｉｃｋｏｌｏｆｆ，  Ｊ．Ａ．、「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、４７巻、Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ，Ｊ．Ａ．（編集）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、１０５巻（１９９５年）において見られる方法を用いて、大腸菌系統ＭＸＥ００１（ΔＴｓｐ）中に電気的形質転換した。以下のプロトコールを用いた。電気的コンピテントＭＸＥ００１  ４０μｌ、ライゲーション２．５μｌ（ＤＮＡ１００ｐｇ）を０．２ｃｍ電気穿孔キュベット中に加え、以下の条件、２５００Ｖ、２５μＦ、及び２００ΩでＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌを用いて電気的形質転換を行った。電気的形質転換後、ＳＯＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１ｍｌ（３７℃に予め加温）を加え、穏やかに振盪して細胞を３７℃１時間回復させた。
【０２７９】
細胞をＨｙｐｏｔｏｎｉｃ寒天（酵母菌抽出物５ｇ／Ｌ、トリプトン２．５ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ（全てＤｉｆｃｏ））上に塗抹し、４０℃でインキュベートした。コロニーを形成した細胞をＨＬＢ上に４３℃で再塗抹し、ＭＸＥ００１系統に対して低浸透圧条件下高温で増殖する能力の回復を確認した。選択したクローンからプラスミドＤＮＡを調製し、配列決定してｓｐｒ変異を同定した。
【０２８０】
この方法を用いて、ｓｐｒタンパク質における、以下の通りΔＴｓｐ表現型を補足する８つの単一の変異、１つのダブル変異、及び２つの複数の変異を単離した：
１．Ｖ９８Ｅ
２．Ｄ１３３Ａ
３．Ｖ１３５Ｄ
４．Ｖ１３５Ｇ
５．Ｇ１４７Ｃ
６．Ｓ９５Ｆ及びＹ１１５Ｆ
７．Ｉ７０Ｔ
８．Ｎ３１Ｔ、Ｑ７３Ｒ、Ｒ１００Ｇ、Ｇ１４０Ｃ
９．Ｒ６２Ｃ、Ｑ９９Ｐ、Ｒ１４４Ｃ
１０．Ｌ１０８Ｓ
１１．Ｌ１３６Ｐ
【０２８１】
（例３）
ｓｐｒ変異を有する変異体大腸菌細胞系統の生成
例２で同定した１から５の個々の変異、並びにｓｐｒ（Ｃ９４Ａ、Ｈ１４５Ａ、Ｈ１５７Ａ）及びＷ１７４Ｒの３つの触媒三残基の変異を用いて、複合のΔＴｓｐ／変異体ｓｐｒ系統を作製するための例１からの野生型の非組換え染色体Ｔｓｐ遺伝子を有するｓｐｒ変異系統又はＭＸＥ００１（ΔＴｓｐ）系統を作り出すために、いずれかの野生型Ｗ３１１０大腸菌系統（遺伝子型：Ｆ−ＬＡＭ−ＩＮ（ｒｒｎＤ−ＲＲｎＥ）１ｒｐｈ１（ＡＴＣＣ  ｎｏ．２７３２５））を用いて新たな系統を生成した。
【０２８２】
ＭＸＥ００１を作製するための例１に記載した通り、遺伝子置換ベクター系を用いて、ｐＫＯ３相同組換え／置換プラスミドを用いて、以下の変異体の大腸菌細胞系統を作製した（Ｌｉｎｋら、１９９７年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１７９巻、６２２８〜６２３７頁）。
【表１】
0005960607.tif 000003
【０２８３】
変異体ｓｐｒ組入れカセットを、ＳａｌＩ、ＮｏｔＩ制限フラグメントとして、同様に制限したｐＫＯ３プラスミド中に移動した。
【０２８４】
プラスミドは、温度感受性変異体のｐＳＣ１０１複製開始点（ＲｅｐＡ）を、染色体の組入れ事象に対して強化及び選択するためのクロラムフェニコールマーカーと一緒に用いている。レバンスクラーゼをコードするｓａｃＢ遺伝子は、ショ糖上で増殖させた大腸菌に対して致死的であり、したがって（クロラムフェニコールマーカー及びｐＳＣ１０１開始点と一緒に）脱組込み及びプラスミドのキュアリングの事象に対して強化及び選択するのに用いられる。この方法は以前に記載されている（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、１９８９年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１７１巻、４６１７〜４６２２頁、及びＢｌｏｍｆｉｅｌｄら、１９９１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、５巻、１４４７〜１４５７頁）。ｐＫＯ３系は全ての選択マーカーを、挿入された遺伝子以外の宿主のゲノムから除去する。
【０２８５】
ＳａｌＩ制限部位をクローン同定用に除去するｓｐｒ配列内にサイレント変異を含んでいる変異ｓｐｒ遺伝子を含んでいる、以下のｐＫ０３ベクターを構築した。
ｐＭＸＥ３３６、ｐＫ０３  ｓｐｒ  Ｓ９５Ｆ  （−ＳａｌＩ）
ｐＭＸＥ３３７、ｐＫ０３  ｓｐｒ  Ｙ１１５Ｆ  （−ＳａｌＩ）
ｐＭＸＥ３３８、ｐＫ０３  ｓｐｒ  Ｇ１４７Ｃ  （−ＳａｌＩ）
ｐＭＸＥ３３９、ｐＫ０３  ｓｐｒ  Ｄ１３３Ａ  （−ＳａｌＩ）
ｐＭＸＥ３４０、ｐＫ０３  ｓｐｒ  Ｖ１３５Ｄ  （−ＳａｌＩ）
ｐＭＸＥ３４１、ｐＫ０３  ｓｐｒ  Ｖ１３５Ｇ  （−ＳａｌＩ）
ｐＭＸＥ３４２、ｐＫ０３  ｓｐｒ  Ｖ９８Ｅ  （−ＳａｌＩ）
ｐＭＸＥ３４３、ｐＫ０３  ｓｐｒ  Ｃ９４Ａ  （−ＳａｌＩ）
ｐＭＸＥ３４４、ｐＫ０３  ｓｐｒ  Ｈ１４５Ａ  （−ＳａｌＩ）
ｐＭＸＥ３４５、ｐＫ０３  ｓｐｒ  Ｈ１５７Ａ  （−ＳａｌＩ）
ｐＭＸＥ３４６、ｐＫ０３  ｓｐｒ  Ｗ１７４Ｒ  （−ＳａｌＩ）
【０２８６】
次いで、これらのプラスミドを、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｅ．Ｍ．及びＮｉｃｋｏｌｏｆｆ，Ｊ．Ａ．、「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、４７巻、Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ，Ｊ．Ａ．（編集）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、１０５巻（１９９５年）に見られる方法を用いて調製した、化学的コンピテント大腸菌Ｗ３１１０細胞中に、又は例１からのＭＸＥ００１系統中に形質転換して、表１に示す通り、複合のΔＴｓｐ／変異体ｓｐｒ系統を作製した。
【０２８７】
１日目  電気的コンピテント大腸菌細胞又はＭＸＥ００１細胞を、冷却したＢｉｏＲａｄ０．２ｃｍ電気穿孔キュベット中、ｐＫＯ３  ＤＮＡ（１０ｐｇ）１μｇと混合し、その後２５００Ｖ、２５μＦ、及び２００Ωで電気穿孔した。２×ＰＹ１０００μｌを直ちに加え、３０℃のインキュベーター中で１時間、２５０ｒｐｍで振盪することによって細胞を回収した。細胞を２×ＰＹ中１／１０に段階希釈し、その後１００μｌのアリコートを、クロラムフェニコール２０μｇを含み３０℃及び４３℃に予め温めた２×ＰＹ寒天平板上に塗抹した。平板を３０℃及び４３℃で一夜インキュベートした。
【０２８８】
２日目  ３０℃で増殖させたコロニーの数により電気穿孔の効果が推定されたが、４３℃の増殖を生存したコロニーは潜在的な組入れ事象を表している。４３℃の平板から単一のコロニーを拾い、２×ＰＹ１０ｍｌ中に再懸濁した。この１００μｌを、ショ糖５％（ｗ／ｖ）を含み３０℃に予め温めた２×ＰＹ寒天平板上に塗抹して単一のコロニーを生成させた。平板を３０℃で一夜インキュベートした。
【０２８９】
３日目  ここでコロニーは、潜在的な同時の脱組込み及びプラスミドキュアリング事象を表す。脱組込み及びキュアリング事象が増殖における初期に生じた場合、大部分のコロニー塊はクローンとなる。単一のコロニーを拾い、クロラムフェニコール２０μｇ／ｍｌ又は５％（ｗ／ｖ）ショ糖のいずれかを含む２×ＰＹ寒天上にレプリカプレーティングした。平板を３０℃で一夜インキュベートした。
【０２９０】
４日目  ショ糖上で増殖し、且つクロラムフェニコール上で死滅した両方のコロニーは潜在的な染色体の置換及びプラスミドキュアリング事象を表している。これらを拾い、ＳａｌＩ部位の喪失に対してＰＣＲプラス制限消化によってスクリーニングした。正確なサイズのＰＣＲ陽性のバンド及びＳａｌＩによる消化に対する耐性を生じたコロニーを削除して、ショ糖５％（ｗ／ｖ）を含む２×ＰＹ寒天上で単一のコロニーを生成し、平板を３０℃で一夜インキュベートした。
【０２９１】
５日目  ＰＣＲ陽性、クロラムフェニコール感受性、及びショ糖耐性の大腸菌の単一のコロニーを用いてグリセロール株、化学的コンピテント細胞を作製し、５’及び３’に隣接するオリゴとのＰＣＲ反応用のＰＣＲテンプレートとして作用させて、Ｔａｑポリメラーゼを用いた直接ＤＮＡ配列決定用のＰＣＲ生成物を生成して正確な変異を確認した。
【０２９２】
（例４）
Ｆａｂ’及びＤｓｂＣ共発現用のプラスミドの生成
抗ＴＮＦ  Ｆａｂ’の重鎖及び軽鎖配列の両方（配列番号１３に示す軽鎖配列及び配列番号１４に示す重鎖配列を有する抗ＴＮＦ  Ｆａｂ’）、並びにＤｓｂＣをコードする配列を含んでいるプラスミドを構築した。
【０２９３】
ＷＯ０１／９４５８５に記載されている抗ＴＮＦαＦａｂ’フラグメント（ＣＤＰ８７０と呼ぶ）のジシストロン性のメッセージを作成した。上流のシストロンは抗体の軽鎖（配列番号１３）をコードし、下流のシストロンは抗体の重鎖（配列番号１４）をコードしている。ＯｍｐＡシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列は、軽鎖及び重鎖の各々をコードするＤＮＡの５’末端に融合してペリプラズムへの効果的な分泌を可能にした。遺伝子間配列（ＩＧＳ）２を、配列番号３７に示す通りに用いた。
【０２９４】
ＣＤＰ８７０Ｆａｂ’（抗ＴＮＦ  Ｆａｂ’）及びＤｓｂＣ（ペリプラズムポリペプチド）に対する発現ベクターであるプラスミドｐＤＰＧ３５８（ｐＴＴＯ４０．４  ＣＤＰ８７０  ＩＧＳ２）を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ  ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙにおいて見ることができる従来の制限クローニング法を用いて構築した。プラスミドｐＤＰＨ３５８は以下の特徴：強力なｔａｃプロモーター及びｌａｃオペレーター配列を含んでいた。図１０に示す通り、プラスミドは独特のＥｃｏＲＩ制限部位をＦａｂ’重鎖のコード領域の後に含んでおり、その後に非コード配列、次いで独特のＮｄｅＩ制限部位が続いた。ＤｓｂＣ遺伝子を、Ｗ３１１０粗製染色体ＤＮＡを鋳型として用いて、５’ＥｃｏＲＩ部位をコードするＰＣＲ生成物の後に強力なリボソーム結合が続き、その後に天然の開始コドン、シグナル配列、及びＤｓｂＣの成熟配列、Ｃ末端Ｈｉｓタグにおける終結、及び最後に非コードＮｄｅＩ部位が続くようにＰＣＲクローニングした。ＥｃｏＲＩ−ＮｄｅｌＩ  ＰＣＲフラグメントを制限し、３個全てのポリペプチド：Ｆａｂ’軽鎖、Ｆａｂ’重鎖、及びＤｓｂＣが単一のポリシストロン性のｍＲＮＡ上にコードされるように発現ベクター中にライゲートした。
【０２９５】
Ｆａｂ軽鎖、重鎖遺伝子、及びＤｃｂＣ遺伝子を、単一のポリシストロン性メッセージとして転写した。大腸菌のペリプラズムに対するポリペプチドの転移を指示する大腸菌ＯｍｐＡタンパク質からのシグナルペプチドをコードするＤＮＡを軽鎖及び重鎖の遺伝子配列両方の５’末端に融合した。転写を二重転写ターミネーターｒｒｎＢ  ｔ１ｔ２を用いて終結させた。ｌａｃＩｑ遺伝子は構成的に発現されるＬａｃＩリプレッサータンパク質をコードしていた。これは、アロラクトース又はＩＰＴＧの存在によって抑制解除が誘導されるまで、ｔａｃプロモーターからの転写を抑制した。用いた複製開始点はｐ１５Ａであり、これは低コピー数を維持した。プラスミドは、抗生物質選択用にテトラサイクリン耐性遺伝子を含んでいた。
【０２９６】
（例５）
大腸菌系統における抗ＴＮＦ  Ｆａｂ’又は抗ＴＮＦ  Ｆａｂ’及びＤｓｂＣの発現
抗ＴＮＦ  Ｆａｂ’及びＤｓｂＣの発現
野生型Ｗ３１１０細胞系、例１において提供したＭＸＥ００１系統、及び例３において提供した変異体系統ＭＸＥ０１２（Ｈ１４５Ａｓｐｒ変異体系統）を、例４において生成したプラスミドで形質転換した。
【０２９７】
系統の形質転換を、Ｃｈｕｎｇ  Ｃ．Ｔら、「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ．」ＰＮＡＳ、８６巻、２１７２〜２１７５頁（１９８９年）に見られる方法を用いて行った。
【０２９８】
抗ＴＮＦ  Ｆａｂ’の発現
例３において提供した野生型Ｗ３１１０細胞系、ｓｐｒ変異体系統ＭＸＥ００８、ＭＸＥ０１２、ＭＸＥ０１７及びＭＸＥ０１２（Ｈ１４５Ａ  ｓｐｒ変異体系統）及び例１において提供したＭＸＥ００１の系統を、ＣＤＰ８７０Ｆａｂ’に対する発現ベクター（配列番号１３に示す軽鎖配列及び配列番号１４に示す重鎖配列を有する抗ＴＮＦ  Ｆａｂ’）であるプラスミドｐＭＸＥ１１７（ｐＴＴＯ  ＣＤＰ８７０又は４０．４  ＩＧＳ１７）で形質転換したが、この発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．」、ＣＳＨＬ  ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．に見ることができる従来の制限クローニング法を用いて構築されたものである。プラスミドｐＭＸＥ１１７（ｐＴＴＯ  ＣＤＰ８７０又は４０．４  ＩＧＳ１７）は以下の特徴：強力なｔａｃプロモーター及びｌａｃオペレーター配列を含んでいた。Ｆａｂ軽鎖及び重鎖遺伝子を、単一のジシストロン性メッセージとして転写した。大腸菌ＯｍｐＡタンパク質からのシグナルペプチドをコードするＤＮＡを、ポリペプチドの大腸菌ペリプラズムへの移動を指示する軽鎖及び重鎖両方の遺伝子配列５’末端に融合させた。転写を二重転写ターミネーターｒｒｎＢ  ｔ１ｔ２を用いて終結させた。ｌａｃＩｑ遺伝子は構成的に発現されるＬａｃＩリプレッサータンパク質をコードしていた。これは、アロラクトース又はＩＰＴＧの存在によって抑制解除が誘導されるまで、ｔａｃプロモーターからの転写を抑制した。用いた複製開始点はｐ１５Ａであり、低コピー数を維持した。プラスミドは、抗生物質選択用にテトラサイクリン耐性遺伝子を含んでいた。
【０２９９】
系統の形質転換を、Ｃｈｕｎｇ  Ｃ．Ｔら、「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ．」、ＰＮＡＳ、８６巻、２１７２〜２１７５頁（１９８９年）に見られる方法を用いて行った。
【０３００】
（例６）
フラスコ振盪培養物を用いた変異大腸菌系統における抗ＴＮＦ  Ｆａｂ’の発現
抗ＴＮＦ  Ｆａｂ’を発現する、例５によって生成された以下の系統：Ｗ３１１０、ＭＸＥ００１、ＭＸＥ０１２、及びＭＸＥ０１７を、Ｆａｂ’の増殖及び発現を比較するフラスコ振盪実験において試験した。
【０３０１】
用いたフラスコ振盪実験のプロトコールは以下の通りに行った：
５ｍｌフラスコ振盪実験
単一のコロニーを拾って、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを加えた５ｍｌＬＢ中に入れ、２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一夜増殖させた。
一夜の培養物を用いて、１００ｍｌプラステトラサイクリンに接種して０．１ＯＤ６００（即ち、４のＯＤに対して１００／４×０．１＝１００ｍｌ中に２．５ｍｌ）とした。
このマスター培養物を用いて、各時間点に対して培養試験管３×５ｍｌを準備した。基準培養物１本をＯＤ測定用の試料に準備した。
最初は増殖を肉眼でモニタリングしながら培養物を３０℃、２５０ｒｐｍで振盪し、次いで対照の培養物をサンプリングすることによって、０．５ＯＤ６００の培養物を捕らえた（通常約２時間）。培養物が０．５を超えるＯＤを達成したら、ＩＰＴＧを各培養試験管に加えて濃度２００μＭ（０．０４Ｍを２５μｌ）とした。
誘導後必要とされる時間点（例えば、１時間、２時間）に培養試験管を取り除き、氷上に維持した。
１３２００ｒｐｍで５分間遠心分離後、細胞ペレットをペリプラズマ抽出バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ．Ｃｌ／１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．４）２００μｌ中に再懸濁した。ペリプラズマ抽出物を２５０ｒｐｍ、３０℃で一夜撹拌した。翌日、抽出物を１３２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清をデカントして捨て、「ペリプラズマ抽出物」として−２０℃で貯蔵した。使用済みの細胞ペレットは廃棄した。
【０３０２】
ＥＬＩＳＡ定量
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ中２μｇ／ｍｌのＡＢ１４１（ウサギ抗ヒトＣＨ１、ＵＣＢ）で４℃一夜コーティングした。試料／コンジュゲートバッファー（ＰＢＳ、ＢＳＡ  ０．２％（ｗ／ｖ）、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．１％（ｖ／ｖ））３００μｇで３回洗浄後、プレート上で試料／コンジュゲートバッファー１００μｌ中試料及び標準の１／２段階希釈を行い、プレートを室温で１時間、２５０ｒｐｍで撹拌した。洗浄バッファー（ＰＢＳ、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．１％（ｖ／ｖ））３００μｌで３回洗浄後、試料／コンジュゲートバッファー中１／１０００希釈後、リビーリング（ｒｅｖｅａｌｉｎｇ）抗体６０６２（ウサギ抗ヒトκＨＲＰコンジュゲートしたもの、Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、英国）１００μｌを加えた。次いで、プレートを室温で１時間、２５０ｒｐｍで撹拌した。洗浄バッファー３×３００μｌで洗浄後、ＴＭＢ基質１００μｌを加え（ＴＭＢ溶液の５０：５０混合物（Ｃａｌｂｉｏｃｈｍ）：ｄＨ２Ｏ）、自動プレートリーダーを用いてＡ６３０を記録した。好適なアイソタイプの精製Ｆａｂ’標準と比較することによって、ペリプラズマ抽出物中のＦａｂ’の濃度を算出した。
【０３０３】
図１は、野生型Ｗ３１１０及びＭＸＥ００１と比べたＭＸＥ０１２及びＭＸＥ０１７の改善された増殖を示す。
【０３０４】
図２は、野生型Ｗ３１１０及びＭＸＥ００１と比べたＭＸＥ０１２及びＭＸＥ０１７におけるＦａｂ’の改善された発現を示す。
【０３０５】
（例７）
高密度発酵を用いた抗ＴＮＦ  Ｆａｂ’又は抗ＴＮＦ  Ｆａｂ’及びＤｓｂＣを発現する大腸菌系統の増殖
例５によって生成した以下の系統を、抗ＴＮＦα  Ｆａｂ’の増殖及び発現を比較する発酵実験において試験した。
例５において生成した抗ＴＮＦ  Ｆａｂ’を発現する系統：
Ｗ３１００
ＭＸＥ０１２（Ｈ１４５Ａ  ｓｐｒ変異体系統）
例５において生成した抗ＴＮＦ  Ｆａｂ’及びＤｓｂＣを発現する系統：
Ｗ３１００
ＭＸＥ０１２（Ｈ１４５Ａ  ｓｐｒ変異体系統）
【０３０６】
増殖培地
発酵増殖培地は、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ  ３．８６ｇ／ｌ及びグリセロール１１２ｇ／ｌを有するＳＭ６Ｅ培地（Ｈｕｍｐｈｒｅｙら、２００２年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、２６巻、３０９〜３２０頁に記載）をベースとした。
【０３０７】
接種
接種培養物を、テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌを補った同じ培地中で増殖させた。培養物をおよそ２２時間、撹拌しながら３０℃でインキュベートした。
【０３０８】
発酵
発酵槽（総容積２．５リットル）に、接種培養物を０．３〜０．５ＯＤ６００に接種した。温度は増殖相の間は３０℃に維持し、誘導前に２５℃に下げた。溶存酸素濃度を、可変性の撹拌及びエアフローによって空気飽和を３０％上回って維持した。１５％（ｖ／ｖ）ＮＨ４ＯＨ及び１０％（ｖ／ｖ）濃Ｈ２ＳＯ４で自動滴定することによって、培養物のｐＨを７．０で制御した。１０％（ｖ／ｖ）Ｓｔｒｕｋｔｏｌ  Ｊ６７３溶液（Ｓｃｈｉｌｌ  ａｎｄ  Ｓｅｉｌａｃｈｅｒ）を加えることによって泡立ちを制御した。発酵の様々な段階で数々の添加を行った。バイオマス濃度がおよそ４０ＯＤ６００に到達したらマグネシウム塩及びＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏを加えた。誘導相の前及び間にＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏのさらなる添加を行って、確実にリン酸塩が過剰に維持されるようにした。発酵の初期に存在したグリセロールが枯渇したら（およそ７５ＯＤ６００）、８０％（ｗ／ｗ）の継続的なグリセロールの供給を適用した。発酵における同じ時点に１７０μＭのＩＰＴＧの供給を適用した。ＩＰＴＧ供給の開始を誘導の開始と理解した。発酵は、典型的に、グリセロール供給速度（０．５から２．５ｍｌ／ｈの間の範囲）で６４〜１２０時間行った。
【０３０９】
バイオマス濃度及び増殖速度の測定
６００ｎｍでの培養物の光学密度を測定することによってバイオマス濃度を決定した。
【０３１０】
ペリプラズム抽出
細胞を、遠心分離によって培養物試料から回収した。さらなる分析用に上清の分画を（−２０℃で）保持した。細胞ペレット分画を、抽出バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中、元の培養体積に再懸濁した。およそ１６時間、６０℃でインキュベートした後、遠心分離によって抽出物を澄明にし、上清分画を分析用に（−２０℃で）保持した。
【０３１１】
Ｆａｂ’定量
ペリプラズム抽出物及び培養物上清中のＦａｂ’濃度を、Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓら、２００２年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、２６巻、３０９〜３２０に記載されている通り、Ｆａｂ’アセンブリーＥＬＩＳＡによって、タンパク質Ｇ  ＨＰＬＣを用いて決定した。ＨｉＴｒａｐ  タンパク質Ｇ  ＨＰ１ｍｌカラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ又は同等物）に分析物（およそ中性のｐＨ、３０℃、０．２μｍろ過）を２ｍｌ／分でローディングし、カラムを２０ｍＭリン酸塩、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で洗浄し、次いで５０ｍＭグリシン／ＨＣｌ  ｐＨ２．７の注入を用いてＦａｂ’を溶出した。溶出されたＦａｂ’をＡｇｉｌｉｅｎｔ１１００又は１２００ＨＰＬＣシステム上Ａ２８０によって測定し、既知濃度の精製Ｆａｂ’タンパク質の検量線を参照することによって定量した。
【０３１２】
図３は、実行時間を延長した発酵の間の、抗ＴＮＦ  Ｆａｂ’を発現するＷ３１１０及びＭＸＥ０１２の増殖プロファイルを示す。データは、バイオマス蓄積の間、野生型に比べたｓｐｒ系統の最初の増殖速度における小規模の増大、及び発酵の最後およそ２０時間における野生型系統Ｗ３１１０に比べて増大したｓｐｒ変異体系統ＭＸＥ０１２の生存期間を図示するものである。
【０３１３】
図４は、実行時間を延長した発酵の間の、抗ＴＮＦ  Ｆａｂ’を発現するＷ３１１０及びＭＸＥ０１２（Ｗ３１１０ｓｐｒＨ１４５Ａ）に対するペリプラズマのＦａｂ’蓄積（実線及び記号）並びに培地のＦａｂ’蓄積（点線及び白記号）を示す。データは、ペリプラズマのＦａｂ’蓄積の最初の速度は２つの系統では非常に類似しているが、野生型Ｗ３１１０細胞は、ＭＸＥ０１２に比べて発酵の後期にペリプラズマのＦａｂ’を漏出することを示している。
【０３１４】
図５は、抗ＴＮＦα  Ｆａｂ’発現性系統Ｗ３１１０及びＭＸＥ０１２、並びに抗ＴＮＦα  Ｆａｂ’及び組換えＤｓｂＣ発現性系統Ｗ３１１０及びＭＸＥ０１２の増殖プロファイルを示す。ＤｓｂＣを発現する系統は、組換えＤｓｂＣを発現しない対応する細胞系統に比べて改善した増殖を示すことが分かる。系統におけるｓｐｒ変異の存在は細胞の増殖を改善することも分かる。
【０３１５】
図６は、抗ＴＮＦα  Ｆａｂ’発現性大腸菌系統Ｗ３１１０及びＭＸＥ０１２、並びに抗ＴＮＦα  ＦＡｂ’及び組換えＤｓｂＣ発現性大腸菌系統Ｗ３１１０及びＭＸＥ０１２からのペリプラズム（黒記号）及び上清（白記号）からのＦａｂ合計収率を示す。このグラフから、組換えＤｓｂｃを発現する系統が高収率の抗ＴＮＦα  Ｆａｂ’を生成し、ＭＸＥ０１２系統は３．０ｇ／Ｌを超える抗ＴＮＦα  Ｆａｂ’を約９２時間で生成したことが分かる。変異体ｓｐｒ遺伝子を有するＭＸＥ０１２系統はＷ３１１０系統（上清の抗ＴＮＦαＦａｂ’が少ないと分かる）に比べて低減した溶解を示したことも分かる（白記号）。
【０３１６】
（例８）
系統におけるＤＮＡ漏出及び総タンパク質量の決定
ｄｓＤＮＡアッセイ
Ｗ３１１０、ＭＸＥ００１、ＭＸＥ００８、及びＭＸＥ０１２系統の上清中への二本鎖ＤＮＡの漏出を、Ｑｕａｎｔ−ＩＴ  Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｒｅｆ：Ｐ１１４９６）を用いて決定した。１〜１０００μｇ／ｍＬの範囲に提供されたＤＮＡ標準を希釈することによって、検量線を調製した。蛍光の読みが方法の直線範囲に入るように（５００から１０００倍）、試料をＴＥバッファー中希釈した。９６ウェルプレートにおいて、希釈試料又は標準１００μＬを、Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ試薬１００μＬと混合し、プレートを光線から保護して室温で５分間インキュベートした。蛍光の計数値を、励起フィルタ４８５ｎｍ、及び発光フィルタ５３５ｎｍを用いて０．１秒間測定した。結果を図７に示す。
【０３１７】
タンパク質アッセイ
Ｗ３１１０、ＭＸＥ００１、ＭＸＥ００８、及びＭＸＥ０１２系統の総タンパク質濃度を、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ  Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｅｆ：２３２３６）を用いて決定した。ウシ血清アルブミン標準を２５〜１０００μｇ／ｍＬの範囲にわたって希釈することによって、検量線を作成した。光学密度が方法の直線範囲内に入るように試料を水で希釈し（５から１０倍）、試料又は標準の３３μＬをクーマシー試薬１ｍＬと混合した。室温で１０分間インキュベートした後、クーマシー試薬をブランクとして分光光度計上でＯＤ５９５ｎｍを読んだ。総タンパク質濃度を検量線に基づいて算出した。結果を図８に示す。
【０３１８】
（例９）
大規模発酵を用いた抗ＴＮＦ  Ｆａｂ’及びＤｓｂＣを発現する大腸菌系統の増殖
例５によって生成した以下の系統を、抗ＴＮＦα  Ｆａｂ’の系統の増殖及び生存性並びに発現を比べる発酵実験において試験した：
例５において生成される抗ＴＮＦ  Ｆａｂ’及びＤｓｂＣを発現するＭＸＥ０１２（ｓｐｒ  Ｈ１４５Ａ変異体）
【０３１９】
発酵を以下の通りに行った：
抗ＴＮＦ  Ｆａｂ’及びＤｓｂＣ細胞を発現するＭＸＥ０１２を、最初に、フラスコ振盪培養物中酵母菌抽出物及びペプトンの複合培地を用いて増殖させた。次いで、細胞を、化学的に規定された培地を用いて接種段階の発酵槽に移した。細胞を、規定された移行点まで栄養非制限の条件下で増殖させた。次いで、細胞を、同様の化学的に規定された培地を用いて、およそ２３０Ｌの最終体積で２５０Ｌ生成発酵槽に移した。培養物を最初に、炭素源が枯渇するまで、バッチモード中で増殖させた。炭素源が枯渇した後、炭素源を限定する供給を、指数関数的に増大する速度で供給した。規定された量の炭素源を加えた後、フィード溶液を添加する速度を下げ、ＩＰＴＧを加えてＦａｂ’の発現を誘導した。次いで、発酵を続け、Ｆａｂ’をペリプラズム中に蓄積させた。誘導後の規定された時点で、遠心分離によって培養物を回収し、回収した細胞をＴｒｉｓ及びＥＤＴＡバッファー中に再懸濁し、５９℃に加熱することによって、Ｆａｂ’を細胞から抽出した。
【０３２０】
発酵の増殖プロファイルを、６００ｎｍの培養物の光学密度を測定することによって決定した。
【０３２１】
Ｆａｂ’の力価を、上記例７に記載した通りタンパク質Ｇ  ＨＰＬＣによって決定したが、ペリプラズム抽出の間新鮮な細胞を用い、抽出バッファー１ｍＬを細胞培養液に加える点が異なった。上清及びペリプラズムのＦａｂ’を、例７に記載した通りに測定した。図１２はペリプラズムのＦａｂ’の力価を示す。
【０３２２】
細胞培養物の生存性を、蛍光活性化セルソーティングを用いてフローサイトメトリーによって測定した。
【０３２３】
図１１は、抗ＴＮＦα  Ｆａｂ’及び組換えＤｓｂＣ発現性系統ＭＸＥ０１２の２００Ｌ発酵の増殖プロファイルを示す。
【０３２４】
図１２は、抗ＴＮＦα  Ｆａｂ’及び組換えＤｓｂＣ発現性系統ＭＸＥ０１２の２００Ｌ発酵のペリプラズムの抗ＴＮＦα  Ｆａｂ’力価を示す。
【０３２５】
図１３は、抗ＴＮＦα  Ｆａｂ’及び組換えＤｓｂＣ発現性系統ＭＸＥ０１２の２００Ｌ発酵の生存性を示す。
【０３２６】
（例１０）
大規模発酵を用いた抗ＴＮＦ  Ｆａｂ’及びＤｓｂＣを発現する大腸菌系統の増殖
【０３２７】
例５によって生成した以下の系統を、抗ＴＮＦα  Ｆａｂ’の系統の増殖及び発現を比べる発酵実験において試験した。
例５において生成した抗ＴＮＦ  Ｆａｂ’及びＤｓｂＣを発現するＭＸＥ０１２
【０３２８】
発酵を、最終容積およそ２６５０Ｌを含む３０００Ｌ生成発酵槽で、例９に記載した通りに行った。
【０３２９】
発酵の増殖プロファイルを、６００ｎｍの培養物の光学密度を測定することによって決定した。
【０３３０】
Ｆａｂ’の力価を、上記例９に記載した通り、タンパク質Ｇ  ＨＰＬＣによって決定した。
【０３３１】
図１４は、抗ＴＮＦα  Ｆａｂ’及び組換えＤｓｂＣ発現性系統ＭＸＥ０１２の３０００Ｌ発酵の増殖プロファイルを示す。
【０３３２】
図１５は、抗ＴＮＦα  Ｆａｂ’及び組換えＤｓｂＣ発現性系統ＭＸＥ０１２の３０００Ｌ発酵のペリプラズムの抗ＴＮＦα  Ｆａｂ’力価を示す。
【０３３３】
本発明を、好ましい実施形態を参照にして特に示し、記載してきたが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲によって規定される通り、本発明の範囲から逸脱することなしに形態及び詳細において様々な変更を行うことができることが理解されよう。
【図１】
0005960607.tif 000004
【図２】
0005960607.tif 000005
【図３】
0005960607.tif 000006
【図４】
0005960607.tif 000007
【図５】
0005960607.tif 000008
【図６】
0005960607.tif 000009
【図７】
0005960607.tif 000010
【図８】
0005960607.tif 000011
【図９ａ】
0005960607.tif 000012
【図９ｂ】
0005960607.tif 000013
【図９ｃ】
0005960607.tif 000014
【図１０】
0005960607.tif 000015
【図１１】
0005960607.tif 000016
【図１２】
0005960607.tif 000017
【図１３】
0005960607.tif 000018
【図１４】
0005960607.tif 000019
【図１５】
0005960607.tif 000020
【配列表】
0005960607000001.app