(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における早期急性腎損傷（ＡＫＩ）の指標としてＡＫＩマーカーを使用する方法であって、
（ａ）前記被験体に由来する尿試料を、エキソソーム画分を得るために濃縮するステップであって、前記濃縮するステップは、少なくとも１ステップの免疫精製を含み、前記免疫精製ステップは、近位尿細管、遠位尿細管、集合管およびヘンレループからなる群より選択される腎構造において好ましくかつ示差的に発現されるタンパク質に対する抗体により実施される、ステップと、
（ｂ）前記エキソソーム画分内の前記ＡＫＩマーカーを検出および／または定量化するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記免疫精製が、前記腎構造において発現されるタンパク質のドメインに対する抗体により実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記免疫精製が、前記腎構造において発現されるタンパク質の細胞内ドメインに対する抗体により実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記免疫精製が、前記腎構造において発現されるタンパク質の細胞外ドメインに対する抗体により実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記免疫精製ステップのための前記抗体が、抗アクアポリン１（抗ＡＱＰ１）、抗アクアポリン２（抗ＡＱＰ２）、抗アクアポリン３（抗ＡＱＰ３）、抗ＮＫＣＣ２、抗ＮＨＥ−３、抗ＮａＰｉＩＩ抗体、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体が抗ＡＱＰ１である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記腎構造が、近位尿細管である、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記免疫精製の前に、前記尿をエキソソームについて濃縮するステップをさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記尿試料が、脱細胞化された尿試料である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＡＫＩマーカーが、ＮＧＡＬ、シスタチン−３、ＫＩＭ−１、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１８、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＡＫＩマーカーが、ＮＧＡＬである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出が、前記ＡＫＩマーカーに対する一次抗体との免疫反応により実施される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記一次抗体が標識されており、そして前記標識が、酵素、蛍光化合物、赤外化合物、放射性化合物、または化合物からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＡＫＩマーカーを定量化するステップが、前記ＡＫＩマーカーのレベルを定量化することを含み、そして前記ステップが、前記被験体における処置を決定するために使用される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
早期ＡＫＩを評価するためのキットであって、
（ａ）少なくとも１ステップの免疫精製を用いて、尿試料をエキソソーム画分を得るために濃縮するための抗体と、
（ｂ）前記エキソソーム画分について濃縮された尿試料中の急性腎損傷（ＡＫＩ）マーカーを検出するための抗体と
を含み、前記抗体は、近位尿細管、遠位尿細管、集合管およびヘンレループからなる群より選択される腎構造において好ましくかつ示差的に発現されるタンパク質に対する抗体である、キット。
【請求項１６】
（ｃ）尿試料を得るための手段をさらに含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記免疫精製ステップのための前記抗体が、抗アクアポリン１（抗ＡＱＰ１）、抗アクアポリン２（抗ＡＱＰ２）、抗アクアポリン３（抗ＡＱＰ３）、抗ＮＫＣＣ２、抗ＮＨＥ−３、抗ＮａＰｉＩＩ、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１５または１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記免疫精製の前に、前記尿試料を濃縮するための試薬をさらに含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１９】
前記ＡＫＩマーカーを検出するための前記抗体が、抗ＮＧＡＬ、抗シスタチン−３、抗ＫＩＭ−１、抗ＩＬ−１ベータ、抗ＩＬ−１８、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２０】
前記ＡＫＩマーカーを検出するための前記抗体が標識されている、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
標識された二次抗体をさらに含む、請求項１９に記載のキット。
【請求項２２】
前記標識が、酵素、蛍光化合物、赤外化合物、放射性化合物、および化合物からなる群より選択される、請求項２０または２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記キットを用いるための指示書をさらに含む、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２４】
尿試料からエキソソーム画分を精製するための方法であって、
（ａ）尿試料を、近位尿細管、遠位尿細管、集合管およびヘンレループからなる群より選択される腎構造において好ましくかつ示差的に発現されるタンパク質のドメインに対する抗体と共にインキュベートし、これにより、エキソソーム−抗体複合体を形成するステップと、
（ｂ）（ａ）から得られる前記エキソソーム−抗体複合体を、前記抗体を認識し、不溶性作用物質に結合しているタグと共にインキュベートし、これにより、エキソソーム−抗体−タグ−不溶性作用物質複合体を形成するステップと、
（ｃ）前記エキソソーム−抗体−タグ−不溶性作用物質複合体を上清から分離するステップと、
（ｄ）前記エキソソーム−抗体−タグ−不溶性作用物質複合体を緩衝液で洗浄するステップと
を含み、ここで、前記精製されたエキソソーム画分がＡＫＩマーカーの検出に使用される、方法。
【請求項２５】
前記尿試料が、脱細胞化された尿試料である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記腎構造が、近位尿細管である、請求項２４または２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体が、抗アクアポリン１（抗ＡＱＰ１）、抗アクアポリン２（抗ＡＱＰ２）、抗アクアポリン３（抗ＡＱＰ３）、抗ＮＫＣＣ２、抗ＮＨＥ−３、抗ＮａＰｉＩＩ、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体が抗ＡＱＰ１である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
尿中エキソソーム画分を免疫精製するための方法であって、
近位尿細管、遠位尿細管、集合管およびヘンレループからなる群より選択される腎構造において好ましくかつ示差的に発現されるタンパク質のドメインに対する抗体または抗体の組合せを使用するステップを含み、ここで、前記免疫精製された尿中エキソソーム画分がＡＫＩマーカーの検出に使用される、方法。
【請求項３０】
尿中エキソソーム画分を免疫精製するための方法であって、
抗アクアポリン１（抗ＡＱＰ１）、抗アクアポリン２（抗ＡＱＰ２）、抗アクアポリン３（抗ＡＱＰ３）、抗ＮＫＣＣ２、抗ＮＨＥ−３、抗ＮａＰｉＩＩ、およびこれらの組合せからなる群より選択される抗体または抗体の組合せを使用するステップを含み、ここで、前記免疫精製された尿中エキソソーム画分がＡＫＩマーカーの検出に使用される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、早期における急性腎損傷をモニタリング、診断、および／または予後診断し、それを患う被験体における処置を決定するための方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
腎臓とは、体内の複数の機能を果たす臓器であり、中でも、代謝時に産生される体内の老廃物質の除去、および身体に必要な物質の血液への還流のほか、体液の容量および組成の調節が挙げられる。体内の水電解質バランスは、腎機能により維持される（Ｇｕｙｔｏｎ  Ａ．、Ｈａｌｌ  Ｊ．Ｅ．、２００１年、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｔｒｅａｔｙ、１０版、Ｍｅｘｉｃｏ  ＤＦ、Ｍｅｘｉｃｏ：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｉｎｔｅｒａｍｅｒｉｃａｎａ）。
【０００３】
腎疾患は、多くの国々において、最も重要な死亡原因のうちの１つである。米国では、１９９４年までに、１５００万を超える人々が腎疾患を呈し、これは、患者の生活の質の悪化および死亡の原因となった（Ｇｕｙｔｏｎ  Ａ．、Ｈａｌｌ  Ｊ．Ｅ．、２００１年、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｔｒｅａｔｙ、１０版、Ｍｅｘｉｃｏ  ＤＦ、Ｍｅｘｉｃｏ：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｉｎｔｅｒａｍｅｒｉｃａｎａ）。
【０００４】
腎疾患の臨床症状発現は、十分によく定義された症候群へと群分けすることができる。あるものは、糸球体の疾患に特異的であり、他のものは、腎構造のうちのいずれかに影響を及ぼす疾患の中に存在する。これらの疾患は、多くの国々における罹患および死亡の主要な原因の中にある（Ｇｕｙｔｏｎ  Ａ．、Ｈａｌｌ  Ｊ．Ｅ．、２００１年、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｔｒｅａｔｙ、１０版、Ｍｅｘｉｃｏ  ＤＦ、Ｍｅｘｉｃｏ：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｉｎｔｅｒａｍｅｒｉｃａｎａ）。
【０００５】
重度の腎疾患は、２つの主なカテゴリーへと群分けすることができる。
【０００６】
病態
腎不全とは、腎臓が適正に機能せず、糸球体濾過率が低減される臨床状態である。臨床的に、この欠陥は、２つの群：急性腎損傷（ＡＫＩ）および慢性腎不全（ＣＲＦ）へと分けられる（Ｇｕｙｔｏｎ  Ａ．、Ｈａｌｌ  Ｊ．Ｅ．、２００１年、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｔｒｅａｔｙ、１０版、Ｍｅｘｉｃｏ  ＤＦ、Ｍｅｘｉｃｏ：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｉｎｔｅｒａｍｅｒｉｃａｎａ）。
【０００７】
腎不全
急性腎損傷
急性腎損傷の症状の中には、血中の窒素化生成物の蓄積に対応する高窒素血症を伴う乏尿または無尿（尿排出の減少または非存在）が含まれる。また、体液および塩分の過負荷を決定する水分の滞留に起因して、代謝性老廃生成物も蓄積され、この結果として、浮腫および高血圧症がもたらされる。
【０００８】
症状のうちの最大の脅威の１つが、８ｍＥｑ／Ｌを上回るカリウムの滞留（高カリウム血症）であり、これは、致死性でありうるであろう。腎臓が正常量の水素イオンを排出しない結果として、代謝性アシドーシスの症状発現がもたらされる。
【０００９】
この疾病が、消散することなく持続するなら、完全な無尿に至り、８〜１４日間以内に死亡をもたらしうる（Ｇｕｙｔｏｎ  Ａ．、Ｈａｌｌ  Ｊ．Ｅ．、２００１年、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｔｒｅａｔｙ、１０版、Ｍｅｘｉｃｏ  ＤＦ、Ｍｅｘｉｃｏ：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｉｎｔｅｒａｍｅｒｉｃａｎａ）。
【００１０】
ＡＫＩは、３つの主なカテゴリー：腎前性ＡＫＩ、腎内性ＡＫＩ、および腎後性ＡＫＩへと分けられる。
【００１１】
【表１−１】
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【００１２】
【表１−２】
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先進諸国において、ＡＫＩとは、主に院内で獲得される病理学的状態であって、敗血症、外科的介入、特に、心臓の手術、虚血、腎毒素の投与など、複数の因子によりもたらされる状態であり、したがって、ＡＫＩの影響を防止および減殺するためには、最新の診断技術および処置が必要とされる（Ｖｕｋｕｓｉｃｈ  Ａ．、Ａｌｖｅａｒ  Ｆ．、Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ  Ｐ．、Ｇｏｎｚａｌｅｚ  Ｃ．、Ｏｌｉｖａｒｉ  Ｆ．、Ａｌｖａｒａｄｏ  Ｎ．、Ｚｅｈｎｄｅｒ  Ｃ．、２００４年、Ｒｅｖ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｉｌｅ、１３２巻：１３５５〜１３６１頁）。
【００１３】
ＡＫＩエピソードを発症する患者の大半は、許容されるレベルの腎機能を回復するので、彼らは透析に依存しないが、これらの患者のうちの１０〜２０％は、最終的には、恒久的な透析を必要とする（Ｆａｕｃｉ，  Ａ．、２００９年、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｍｅｘｉｃｏ、Ｆ．Ｄ．  Ｉｎｔｅｒａｍｅｒｉｃａｎａ−ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ）。入院患者のうちの５〜７％の間は、ＡＫＩエピソードと関連する合併症を有し、ＩＣＵにおける費用のうちの３０％の原因となっている（Ｆａｕｃｉ，  Ａ．、２００９年、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｍｅｘｉｃｏ、Ｆ．Ｄ．  Ｉｎｔｅｒａｍｅｒｉｃａｎａ−ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ）。ＡＫＩは、重大な問題であり、このため、とりわけ、ＩＣＵ患者など、危険性の高い患者における病態に対する早期の介入を開発するために、多大な努力がなされている（Ｖｕｋｕｓｉｃｈ  Ａ．、Ａｌｖｅａｒ  Ｆ．、Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ  Ｐ．、Ｇｏｎｚａｌｅｚ  Ｃ．、Ｏｌｉｖａｒｉ  Ｆ．、Ａｌｖａｒａｄｏ  Ｎ．、Ｚｅｈｎｄｅｒ  Ｃ．、２００４年、Ｒｅｖ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｉｌｅ、１３２巻：１３５５〜１３６１頁；Ｓｃｈｒｉｅｒ  Ｒ．、２０１０年、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｎｅｐｈｒｏｌ、６巻：５６〜５９頁）。
【００１４】
慢性腎不全
前述の通り、慢性腎不全とは、機能するネフロンのうちの大多数が不可逆的に失われることの帰結である。
【００１５】
機能するネフロンの数が、正常時の２０〜３０％を上回って保持されている限り、腎効率は、我々が大半の電解質の比較的正常な血液濃度および体液の適切な容量を維持することを可能とする。この数字を上回っていれば、重篤な臨床症状が生じることはない（Ｇｕｙｔｏｎ  Ａ．、Ｈａｌｌ  Ｊ．Ｅ．、２００１年、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｔｒｅａｔｙ、１０版、Ｍｅｘｉｃｏ  ＤＦ、Ｍｅｘｉｃｏ：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｉｎｔｅｒａｍｅｒｉｃａｎａ）。
【００１６】
慢性腎不全の最も重要な原因の中には、表２において記載される原因がある。
【００１７】
【表２】
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末期腎疾患（ＥＳＲＤ）
多くの症例において、腎臓の初期病変は、生存するには患者が透析または腎移植のためのプログラムに参加しなければならないところまで、腎機能の進行性の悪化およびネフロンの持続的な喪失をもたらす。この状態を慢性腎不全と称する（Ｋｕｍａｒ  Ｖ．、Ｃｏｔｒａｎ  Ｒ．、２０００年、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｏｂｂｉｎｓ、６版、Ｍａｄｒｉｄ、Ｓｐａｉｎ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）。
【００１８】
【表３】
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腎移植
腎移植は、ＥＳＲＤの最も有効な処置である。移植の成功は、ドナーの種類など、多くの因子に依存する。腎臓の移植片が由来するドナーは、死亡している場合もあり、生存している場合もある。移植される全ての臓器は、移植と関連する虚血および再灌流過程に起因する急性損傷を受ける。
【００１９】
生体ドナー移植は、とりわけ、若齢患者における末期の慢性腎不全を処置するための優れた治療選択肢である。生体ドナー移植は、規定された移植前プロトコールに従い、短い虚血時間（３０分間未満）と併せて、臓器の良好な生存を支援することを可能とする。生存は、１０年間を超え、死体ドナーに由来する臓器による移植と比較して１７〜２０％長い。
【００２０】
死体ドナー移植の場合、患者は待機リストに入り、ＡＢＯおよびＨＬＡによる適合性の程度に関する選択がなされる。選択基準の中には、年齢、ドナーのボディマス指数とレシピエントのボディマス指数との類似性、それが初めての移植に対応するのかどうか、および移植が一方の腎臓であるのか両方の腎臓であるのかがある。この場合、臓器の虚血時間は数時間延長される可能性があり（１または２日間の可能性もあり）、これにより、移植された臓器の劣化が増大する。また、慢性透析患者には、さらなる合併症も見られる。
【００２１】
腎移植患者は、まず集中治療室（ＩＣＵ）または移植ユニットにおいて、後に、入院してまたは外来患者として、注意深いモニタリングを必要とする。モニタリングの間に、複数の外科的または内科的な合併症が生じうる。一部の合併症は早期であり、ＩＣＵまたは移植ユニットになおも限定している間に処置されうるが、移植を施されて長期間の後になお合併症が生じる可能性（遅発型合併症）もあるので、このモニタリングは、患者の全生涯にわたり延長されるべきである。移植片が機能する間は、免疫抑制療法を投与して、移植された臓器の生存、患者の生存を延長し、患者の生活の質を改善することが必要である。この処置は、各患者の臨床状態および血清学的状態に対して調整される。免疫抑制剤と共に、健康な生活様式にしたがうように患者を励ますこと、２４時間尿によるタンパク尿症およびクレアチニンのモニタリング、高脂血症に対する処置の投与、血圧のコントロール、デノボ糖尿病が生じる可能性、移植片の機能異常の場合は慢性腎不全が生じる可能性が含まれる、他の側面も、長期にわたる腎移植のモニタリングの範囲内で考慮に入れるべきである。
【００２２】
腎移植された患者は、ヒトにおけるＡＫＩの良好なモデルである。これらの患者は、被験バイオマーカーを変化させうる他の病態が存在しないという利点を有する。しかし、これらの患者は、免疫抑制薬理下にあるという欠点も有する。
【００２３】
急性腎損傷（ＡＫＩ）の診断法
急性腎損傷（ＡＫＩ）は、腎機能の悪化に対応する病期に応じて、異なるレベルに分類することができる。
【００２４】
ＡＫＩは、多様なパラメータに応じて分類されるが、最も一般的なパラメータは、血清クレアチニン（ＳＣＲ）および利尿（Ｄ）の決定であるが、これらは、疾患の発症の後期において出現し、したがって、早期におけるＡＫＩの診断法を可能とするものではない。
【００２５】
クレアチニン
クレアチニンとは、ホスホクレアチンの分解により筋組織内で形成される代謝性副産物であり、これは、糸球体レベルでの濾過を介して体内から除去される。クレアチニンの総産生速度は、筋肉量（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｍａｓｓ）、筋活動（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）、性別、年齢、およびタンパク質の総消費に依存する。これらの変数はまた、血漿クレアチニンレベルにも影響を及ぼす。これらの限界にもかかわらず、血清クレアチニンレベルが０．６〜１．２ｍｇ／ｄｌを上回る場合のＡＫＩの診断法に最もよく用いられる方法である。
【００２６】
クレアチニンクリアランス
クレアチニンクリアランスとは、ある時間内に血流から除去されるクレアチニンの量である。このパラメータは、糸球体濾過を推定するために決定される。通常のクレアチニンクリアランスレベルは、１２５〜１５０ｍｌ／分の間であり、女性ではわずかに低くなる。
【００２７】
乏尿
乏尿とは、毎日産生される溶質を除去するための正常な代謝状態において放出されるべき尿の最小量を４００ｍｌと考えると、尿産生の値が１日当たり４００ｍｌを下回る尿産生の減少と定義される。
【００２８】
尿毒症
尿毒症は、血中の尿素レベルの上昇に対応する。このパラメータの決定は、血中尿素窒素（ＢＵＮ）の決定を介し、正常値では、８〜１８ｍｇ／ｄｌの間にある。
【００２９】
ＲＩＦＬＥ（Ｒｉｓｋ，Ｉｎｊｕｒｙ，Ｆａｉｌｕｒｅ，Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｋｉｄｎｅｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｎｄ−ｓｔａｇｅ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）分類
ＲＩＦＬＥとは、ＡＫＩの異なる病期：危険性期、損傷期、不全期、腎機能喪失期、末期腎疾患を分類するために提起されているツールである。ＲＩＦＬＥは、患者の血清クレアチニン（ＳＣＲ）レベルおよび利尿（Ｄ）レベルに基づく（Ｃａｒｒｉｌｌｏ  Ｒ．、Ｃａｓｔｒｏ  Ｊ．、ＲＩＦＬＥ  ｓｃａｌｅ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｘｉｃａｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｒｉｔｉｃ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｙ、２３巻（４号）：２４１〜２４４頁）。本発明で用いられる通り、ＡＫＩ１、ＡＫＩ２、およびＡＫＩ３が、ＲＩＦＬＥのＲ、Ｉ、およびＬのそれぞれの病期に対応する。
【００３０】
好中球ゼラチナーゼ会合リポカリン（ＮＧＡＬ）
ゲノミクスおよびプロテオミクスを用いて、ＮＧＡＬ、シスタチン−３、ＫＩＭ−１、ＩＬ−１ベータ、およびＩＬ−１８を含め、急性腎損傷の潜在的なマーカーとしての一連の分子が同定されている。
【００３１】
ＮＧＡＬは通常、低濃度で発現し、上皮傷害に応じて著明に増大する（Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｏｔｔ  Ｋ．Ｍ．、Ｍｏｒｉ  Ｋ．、Ｋａｌａｎｄａｄｚｅ  Ａ．、Ｌｉ  Ｊ．Ｙ．、Ｐａｒａｇａｓ  Ｎ．、Ｎｉｃｈｏｌａｓ  Ｔ．、Ｄｅｖａｒａｊａｎ  Ｐ．、Ｂａｒａｓｃｈ  Ｊ．、２００６年、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ、１５巻：４４２〜４４９頁；Ｃｏｗｌａｎｄ  Ｊ．Ｂ．、Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄ  Ｎ．、１９９７年、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４５巻：１７〜２３頁）。
【００３２】
ＮＧＡＬとは、リポカリンファミリーに属する小型のタンパク質である。ヒトＮＧＡＬは、ジスルフィド架橋を伴い、１７８アミノ酸残基を有する質量２３ＫＤａの、単一のポリペプチド鎖およびその４６ＫＤａの二量体形態である（Ｋｊｅｌｄｓｅｎ  Ｌ．、Ｊｏｈｎｓｅｎ  Ａ．Ｈ．、Ｓｅｎｇｅｌｏｖ  Ｈ．、Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄ  Ｎ．、１９９３年、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２６８巻：１０４２５〜１０４３２頁）。このタンパク質は、腎臓の近位尿細管の上皮を含めた特定の上皮の好中球において発現する。ＮＧＡＬは、分泌タンパク質であり、その構造的に保存されたポケット形態において、高分子複合体を形成するβプリーツシートを介し、小型で疎水性の分子に結合するその能力によって特徴付けられる（Ｕｔｔｅｎｔｈａｌ  Ｌ．Ｏ．、２００５年、Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ、２９巻：３９〜４１頁）。
【００３３】
既に言及した通り、早期における腎傷害を検出することは極めて困難である。ＮＧＡＬは、この問題における一般的な障害を部分的に克服しており、急性腎損傷の診断において有用であることが実証されていることから、この診断を早期において行いうることが示される（Ｚａｐｐｉｔｅｌｌｉ  Ｍ．、Ｗａｓｈｂｕｒｎ  Ｋ．Ｋ．、Ａｒｉｋａｎ  Ａ．Ａ．、Ｌｏｆｔｉｓ  Ｌ．、Ｍａ  Ｑ．、Ｄｅｖａｒａｊａｎ  Ｐ．、Ｐａｒｉｋｈ  Ｃ．Ｒ．、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  Ｓ．Ｌ．、２００７年、Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ、１１巻：Ｒ８４頁）。
【００３４】
多数の研究が、ＮＧＡＬは、急性腎損傷を伴う患者において著明に増大するが、対応する対照ではそれほど増大せず、この増大は最初の２４〜４８時間以内の、クレアチニンが上昇する前にもたらされることを示している。このマーカーは、血漿および尿の両方において用いられるが、異なる臨床領域における全体的な評価をなおも必要とする（Ｍｉｓｈｒａ  Ｊ．、Ｄｅｎｔ  Ｃ．、Ｔａｒａｂｉｓｈｉ  Ｒ．、Ｍｉｔｓｎｅｆｅｓ  Ｍ．Ｍ．、Ｍａ  Ｑ．、Ｋｅｌｌｙ  Ｃ．、Ｒｕｆｆ  Ｓ．Ｍ．、Ｚａｈｅｄｉ  Ｋ．、Ｓｈａｏ  Ｍ．、Ｂｅａｎ  Ｊ．、Ｍｏｒｉ  Ｋ．、Ｂａｒａｓｃｈ  Ｊ．、Ｄｅｖａｒａｊａｎ  Ｐ．、２００５年、Ｌａｎｃｅｔ、３６５巻：１２３１〜１２３８頁；Ｄｅｖａｒａｊａｎ  Ｐ．、２００７年、Ｃｏｎｔｒｉｂ  Ｎｅｐｈｒｏｌ、１５６巻：２０３〜２１２頁）。
【００３５】
また、成人における心肺バイパス（Ｗａｇｅｎｅｒ  Ｇ．、Ｊａｎ  Ｍ．、Ｋｉｍ  Ｍ．、Ｍｏｒｉ  Ｋ．、Ｂａｒａｓｃｈ  Ｊ．Ｍ．、Ｓｌａｄｅｎ  Ｒ．Ｎ．、Ｌｅｅ  Ｈ．Ｔ．、２００６年、Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ、１０５巻：４８５〜４９１頁）、経皮冠動脈介入（Ｂａｃｈｏｒｚｅｗｓｋａ−Ｇａｊｅｗｓｋａ  Ｈ．、Ｍａｌｙｓｚｋｏ  Ｊ．、Ｓｉｔｎｉｅｗｓｋａ  Ｅ．、Ｍａｌｙｓｚｋｏ  Ｊ．Ｓ．、Ｄｏｂｒｚｙｃｋｉ  Ｓ．、２００６年、Ａｍ  Ｊ  Ｎｅｐｈｒｏｌ、２６巻：２８７〜２９２頁）、冠動脈造影（Ｂａｃｈｏｒｚｅｗｓｋａ−Ｇａｊｅｗｓｋａ  Ｈ．、Ｍａｌｙｓｚｋｏ  Ｊ．、Ｓｉｔｎｉｅｗｓｋａ  Ｅ．、Ｍａｌｙｓｚｋｏ  Ｊ．Ｓ．、Ｄｏｂｒｚｙｃｋｉ  Ｓ．、２００７年、Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２２巻：２９５〜２９６頁）などの手術後の尿中では、このマーカーが上昇することも示されており、これはまた、小児における心臓手順（小児における冠動脈バイパス）（Ｍｉｓｈｒａ  Ｊ．、Ｄｅｎｔ  Ｃ．、Ｔａｒａｂｉｓｈｉ  Ｒ．、Ｍｉｔｓｎｅｆｅｓ  Ｍ．Ｍ．、Ｍａ  Ｑ．、Ｋｅｌｌｙ  Ｃ．、Ｒｕｆｆ  Ｓ．Ｍ．、Ｚａｈｅｄｉ  Ｋ．、Ｓｈａｏ  Ｍ．、Ｂｅａｎ  Ｊ．、Ｍｏｒｉ  Ｋ．、Ｂａｒａｓｃｈ  Ｊ．、Ｄｅｖａｒａｊａｎ  Ｐ．、２００５年、Ｌａｎｃｅｔ、３６５巻：１２３１〜１２３８頁）においても示されている。
【００３６】
調査の現況について述べるなら、尿中および血漿中のＮＧＡＬをＡＫＩマーカーとして測定することの限界は、ＮＧＡＬが、適切な腎マーカーとしては今なお評価中なことである。加えて、ＮＧＡＬが、もっぱら腎由来であるなら、このバイオマーカーは、尿細管細胞について構想される最良の腎傷害マーカーのうちの１つとなることも言明されている。より重篤な腎傷害において、尿中ＮＧＡＬの濃度は、正常レベルの１０，０００倍の上昇を示す。血漿中の最大の上昇は、約１００倍である。このために、ＮＧＡＬは、潜在的に異なる程度の腎損傷についての極めて高感度のマーカーとなっている。しかし、この広いダイナミックレンジの下端は、がんおよび他の疾患などの疾患における腎外供給源に起因するＮＧＡＬの上昇により占められている（ｗｗｗ．ｃｌｉｏｎｌｉｎｅ．ｃｏｍ）。本発明者らの革新的な手法は、ＡＫＩの早期かつ非侵襲的な診断を確立するために、腎臓に由来するエキソソーム、特に、特異的な腎構造に由来する特異的なエキソソーム内のＮＧＡＬを解析することによりこの問題に取り組もうと試みる。
【００３７】
アクアポリン１（ＡＱＰ１）
アクアポリン１（ＡＱＰ１）とは、内在性膜タンパク質であり、その種類のタンパク質のうちで最初にヒト赤血球から構造的および機能的に特徴付けられた。このタンパク質は、四量体構造を有し、そのサブユニットの各々は、それ自体で機能性を有する（Ｐｒｅｓｔｏｎ  Ｇ．Ｍ．、Ｊｕｎｇ  Ｊ．Ｓ．、Ｇｕｇｇｉｎｏ  Ｗ．Ｂ．、Ａｇｒｅ  Ｐ．、１９９３年、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２６８巻：１７〜２０頁）。ＡＱＰ１の分子量は、２８ＫＤａであり（Ｆｒｉｅｄｍａｎ  Ｍ．、２００８年、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ、２版、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）、その発現パターンは、年齢および被験組織（腎臓、肺、脳、および眼）に依存する（Ｂｏｎｄｙ  Ｃ．、Ｃｈｉｎ  Ｅ．、Ｓｍｉｔｈ  Ｂ．Ｌ．、Ｐｒｅｓｔｏｎ  Ｇ．Ｍ．、Ａｇｒｅ  Ｐ．、１９９３年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９０巻：４５００〜４５０４頁）。
【００３８】
このチャネルは、腎臓の近位尿細管、その下行部分にあるヘンレループの上皮および直細血管の内皮において強く発現する。下行するヘンレループにおいてこのタンパク質の濃度が高い（全タンパク質のうちの２５％である）ことは、腎臓の濃縮機構において不可欠の役割を示唆する。これは、それらの尿を濃縮できないように、ＡＱＰ１遺伝子の発現をノックアウトする結果として、近位尿細管における水分透過性の減少がもたらされるトランスジェニックマウスを発生させた研究において裏付けられている（Ｍａ  Ｔ．、Ｙａｎｇ  Ｂ．、Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ  Ａ．、Ｃａｒｌｓｏｎ  Ｅ．Ｊ．、Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｃ．Ｊ．、Ｖｅｒｋｍａｎ  Ａ．Ｓ．、１９９８年、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７３巻：４２９６〜４２９９頁）。見かけは正常であるがＡＱＰ１を有さない３例の患者についての報告では、流体の取込みまたは脱水など何らかのストレスに対する生理学的応答についての解析が含まれなかったので、ＡＱＰ１の欠失と関連する異常な表現型は、他の哺乳動物のアクアポリンが重要な生理学的機能を果たす可能性を提起している（Ｐｒｅｓｔｏｎ  Ｇ．Ｍ．、Ｓｍｉｔｈ  Ｂ．Ｌ．、Ｚｅｉｄｅｌ  Ｍ．Ｌ．、Ｍｏｕｌｄｓ  Ｊ．Ｊ．、Ａｇｒｅ  Ｐ．、１９９４年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６５巻：１５８５〜１５８７頁）。
【００３９】
アクアポリン２（ＡＱＰ２）
アクアポリン２（ＡＱＰ２）とは、水分通過のためのチャネルとして働く内在性膜タンパク質である。このチャネルは、バソプレッシンにより調節され、腎臓の連結管および集合管の頂端領域に位置する（Ｆｕｓｈｉｍｉ  Ｋ．、Ｕｃｈｉｄａ  Ｓ．、Ｈａｒａ  Ｙ．、Ｈｉｒａｔａ  Ｙ．、Ｍａｒｕｍｏ  Ｆ．、Ｓａｓａｋｉ  Ｓ．、１９９３年、Ｎａｔｕｒｅ、３６１巻：５４９〜５５２頁）。
【００４０】
このタンパク質の重要性のために、トランスジェニックマウスによる研究が行われている。マウスは、連結管におけるこのアクアポリンは選択的に発現させるが、集合管においては発現させないように改変された。また、このタンパク質が完全に欠失したマウスも開発されている。欠失マウスが、生後（５〜１２日後）に死亡するのに対し、集合管における発現だけが遮断されたマウスは、体重の減少、尿産生の１０倍の増大、および尿容量オスモル濃度の低下を示しながら、成体へと成長することが観察されている。３時間にわたり水分を与えずにおいても、尿容量オスモル濃度に著明な変化が見られないことから、代償機構は存在しないことが裏付けられる（Ｒｏｊｅｋ  Ａ．、Ｆｕｃｈｔｂａｕｅｒ  Ｅ．Ｍ．、Ｋｗｏｎ  Ｔ．Ｈ．、Ｆｒｏｋｉａｅｒ  Ｊ．、Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｓ．、２００６年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０３巻：６０３７〜６０４２頁）。
【００４１】
バソプレッシンの非存在下では、高張性により、１０分間以内に、細胞膜内でＡＱＰ２の蓄積が誘導される。これは、ラット腎集合管の主な細胞において、ｉｎ  ｓｉｔｕで生じ、また、複数の腎上皮系においても生じることから、腎臓に対するストレス時におけるその重要性が裏付けられる（Ｈａｓｌｅｒ  Ｕ．、Ｎｕｎｅｓ  Ｐ．、Ｂｏｕｌｅｙ  Ｒ．、Ｌｕ  Ｈ．Ａ．、Ｍａｔｓｕｚａｋｉ  Ｔ．、Ｂｒｏｗｎ  Ｄ．、２００８年、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２８３巻：２６６４３〜２６６６１頁）。
【００４２】
また、このタンパク質を発現させる遺伝子の劣性突然変異であって、腎性尿崩症をもたらしうる劣性突然変異が多く存在することも公知であり（Ｌｅｄｕｃ−Ｎａｄｅａｕ  Ａ．、Ｌｕｓｓｉｅｒ  Ｙ．、Ａｒｔｈｕｓ  Ｍ．Ｆ．、Ｌｏｎｅｒｇａｎ  Ｍ．、Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ａｇｕａｙｏ  Ａ．、Ｒｉｖｅｉｒａ−Ｍｕｎｏｚ  Ｅ．、Ｄｅｖｕｙｓｔ  Ｏ．、Ｂｉｓｓｏｎｎｅｔｔｅ  Ｐ．、Ｂｉｃｈｅｔ  ＤＧ．、２０１０年、Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、５８８巻：２２０５〜２２１８頁）、また、腎性尿崩症をもたらしうる優性突然変異が存在することも公知である（Ｍｕｌｄｅｒｓ  Ｓ．Ｍ．、Ｂｉｃｈｅｔ  Ｄ．Ｇ．、Ｒｉｊｓｓ  Ｊ．Ｐ．、Ｋａｍｓｔｅｅｇ  Ｅ．Ｊ．、Ａｒｔｈｕｓ、  Ｍ．Ｆ．、Ｌｏｎｅｒｇａｎ  Ｍ．、Ｆｕｊｉｗａｒａ  Ｍ．、Ｍｏｒｇａｎ  Ｋ．、Ｌｅｉｊｅｎｄｅｋｋｅｒ  Ｒ．、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｌｕｉｊｓ  Ｐ．、Ｖａｎ  Ｏｓ  Ｃ．Ｈ．、Ｄｅｅｎ  Ｐ．Ｍ．、１９９８年、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１０２巻：５７〜６６頁）。
【００４３】
アクアポリン３（ＡＱＰ３）
アクアポリン３（ＡＱＰ３）とは、分子量が３０ｋＤａの内在性膜タンパク質であり（Ｗａｋａｙａｍａ  Ｙ．、Ｊｉｍｉ  Ｔ．、Ｉｎｏｕｅ  Ｍ．、Ｋｏｊｉｍａ  Ｈ．、Ｓｈｉｂｕｙａ  Ｓ．、Ｍｕｒａｈａｓｈｉ  Ｍ．、Ｈａｒａ  Ｈ．、Ｏｎｉｋｉ  Ｈ．、２００２年、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｊ、３４巻：３３１〜３３７頁）、腎集合管の上皮細胞の側底膜において発現する。他のアクアポリンとは異なり、このタンパク質はまた、グリセロールも輸送することができる（Ｍａ  Ｔ．、Ｆｒｉｇｅｒｉ  Ａ．、Ｈａｓｅｇａｗａ  Ｈ．、Ｖｅｒｋｍａｎ  Ａ．Ｓ．、１９９４年、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２６９巻：２１８４５〜２１８４９頁）。
【００４４】
マウスにおけるＡＱＰ３遺伝子の発現をノックアウトした実験では、多尿症、特に、腎皮質におけるＡＱＰ２の発現の低下、および尿容量オスモル濃度の低下が観察される。これらの変化におけるＡＱＰ３の易罹病性は、後に他のアクアポリンの発現をノックアウトすることにより実証された（Ｍａ  Ｔ．、Ｓｏｎｇ  Ｙ．、Ｙａｎｇ  Ｂ．、Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ  Ａ．、Ｃａｒｌｓｏｎ  Ｅ．Ｊ．、Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｃ．Ｊ．、Ｖｅｒｋｍａｎ  Ａ．Ｓ．、２０００年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、９７巻：４３８６〜４３９１頁）。
【００４５】
例えば、ヘンレループにおけるＮＫＣＣＣ２、ならびに近位尿細管におけるＮＨＥ−３およびＮａＰｉＩＩなど、腎臓の特異的構造において好ましくかつ示差的に発現する他のタンパク質も同定されている。
【００４６】
尿中エキソソーム
Ｍａｒｋ  Ｋｎｎｅｐｅｒ博士のグループが、健常ヒト尿におけるプロテオーム研究を展開している。これらの研究では、分画遠心分離により得られる尿中細胞画分およびエキソソーム画分が解析されている（Ｋｎｅｐｐｅｒ  Ｍ．Ａ．、Ｐｉｓｉｔｋｕｎ  Ｔ．、Ｓｈｅｎ  Ｒ．Ｆ．、２００４年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０１巻：１３３６８〜１３３７３頁）。エキソソーム画分は、腎上皮の代表的タンパク質の豊富な供給源であると考えられているために、特別の関心を払われている。
【００４７】
エキソソームは、頂端膜タンパク質のエンドサイトーシスにより産生される。この後、エンドソームが多胞体（ＭＶＢ）と融合する。結果として、頂端膜タンパク質が、ＭＶＢ外膜内に分離され、膜の陥入により内部化する。最後に、ＭＶＢの外膜が頂端膜と融合して、エキソソームと称するそれらの内部小胞を尿空間（ｕｒｉｎａｒｙ  ｓｐａｃｅ）内に放出する（Ｋｎｅｐｐｅｒ  Ｍ．Ａ．、Ｐｉｓｉｔｋｕｎ  Ｔ．、Ｓｈｅｎ  Ｒ．Ｆ．、２００４年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０１巻：１３３６８〜１３３７３頁）。尿中エキソソーム内で現在同定されているタンパク質は、細胞膜タンパク質（ＮＫＣＣ２、ＣＤ２４など）、細胞質タンパク質  （ＧＡＰＤＨなど）、および核タンパク質（ＡＦＴ３およびＷＴ−１）に対応する（Ｚｈｏｕ  Ｈ．、Ｃｈｅｒｕｖａｎｋｙ  Ａ．、Ｈｕ  Ｘ．、Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｔ．、Ｈｉｒａｍａｔｓｕ  Ｎ．、Ｃｈｏ  Ｍ．Ｅ．、Ｂｅｒｇｅｒ  Ａ．、Ｌｅｅｌａｈａｖａｎｉｃｈｋｕｌ  Ａ．、Ｄｏｉ  Ｋ．、Ｃｈａｗｌａ  Ｌ．Ｓ．、Ｉｌｌｅｉ  Ｇ．Ｇ．、Ｋｏｐｐ  Ｊ．Ｂ．、Ｂａｌｏｗ  Ｊ．Ｅ．、Ａｕｓｔｉｎ  Ｈ．Ａ．  ３ｒｄ、Ｙｕｅｎ  Ｐ．Ｓ．、Ｓｔａｒ  Ｒ．Ａ．、２００８年、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ、７４巻：６１３〜６２１頁）。
【００４８】
技術水準
特許文献１は、診断法、例えば、疾患の病期または進行におけるバイオマーカーを検出するために用いうるエキソソームについて記載し、また、細胞に由来するバイオマーカーを用いて、疾患のための処置レジメンをさらに決定し、処置の有効性を確立しうることについても記載している。
【００４９】
特許文献２は、エキソソームを体液から単離することによる出産前の診断法であって、特異的なバイオマーカー、特にＣＤ２４によりエキソソームを同定する診断法について記載している。
【００５０】
特許文献３は、表現型を特徴付け、被験体由来の試料中のエキソソームのバイオシグネチャーを決定することにより疾患を診断するための方法について記載している。言及されるマーカーは、ｍｉＲＮＡプロファイルまたはＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ８１、Ｂ７Ｈ３、ＥｐＣａｍ、ＰＳＣＡ、ＴＮＦＲ、ＭＦＧ−Ｅ８、Ｒａｂ、ＳＥＴＡＰ、ＰＣＭＡ、もしくは５Ｔ４を含めた抗原を含む。さらに、方法は、それを用いて、生理学的状態についてのプロファイリングするか、または表現型を決定するために、細胞由来のエキソソームを決定しうることについても言及する。
【００５１】
ＷＯ２００９１１５５６１は、膜小胞またはエキソソームを同定するためのポリペプチドについて記載している。さらに、該発明は、病原体または腫瘍抗原に起因する感染を防止および／または処置するための免疫原性調製物について記載している。
【００５２】
ＫＲ２００７００５８４４１は、免疫抑制反応において用いられる方法および組成物について記載している。組成物は、免疫抑制活性を有するエキソソームであって、異なる細胞型、主に、免疫系に由来しうるエキソソームを含む。さらに、エキソソームを分子へと曝露して、免疫抑制活性を増強することもできる。エキソソームは、免疫系の機能不全と関連する疾患または障害の処置において用いられている。
【００５３】
ＵＳ２００７２５４３５１は、Ｃ型肝炎ウイルスを単離するための方法であって、ウイルスに感染した個体に由来する血漿からのエキソソーム分離を含む方法について記載している。
【００５４】
ＡＵ２００４２０３４８２は、分子（エキソソーム）を含む膜小胞であって、分子が主要組織適合性複合体に由来し、エキソソームが免疫原として用いられるか、または診断目的で用いられる膜小胞について記載している。
【００５５】
ＵＳ２００４１９７３１４は、合成によるエキソソームの作製に主に焦点を絞って、小胞（エキソソーム）膜内のポリペプチドを発現させるための組成物および方法について記載している。
【００５６】
ＣＡ２４５３１９８は、がん患者の生体液中の免疫抑制因子の同定および定量化において用いうるエキソソームについて記載している。これらのエキソソームは、単独で用いることもでき、がん患者についての予後診断指標としての他の免疫学的アッセイと組み合わせて用いることもできる。
【００５７】
ＥＰ１５２３９９０は、腫瘍細胞に由来するエキソソームについて記載している。これらのエキソソームは、リンパ球を刺激するための腫瘍特異的抗原および腫瘍特異的分子を有する。
【００５８】
Ｚｈｏｕら（２００６年）は、動物における急性腎損傷モデルに由来する腎機能異常マーカーおよび構造損傷マーカーを保有する尿中エキソソームについて記載している。エキソソームを遠心分離により得たところ、腎損傷マーカーが見出された（Ｅｘｏｓｏｍａｌ  Ｆｅｔｕｉｎ−Ａ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ａｃｕｔｅ  ｋｉｄｎｅｙ  ｉｎｊｕｒｙ、Ｚｈｏｕ  Ｈ．、Ｐｉｔｉｔｋｕｎ  Ｔ．、Ａｐｏｎｔ  Ａ．、Ｙｕｅｎ  Ｐ．  Ｓ．、Ｈｏｆｆｅｒｔ  Ｊ．Ｄ．、Ｙａｓｕｄａ  Ｈ．、Ｈｕ．  Ｘ、Ｃｈａｗｌａ  Ｌ．、Ｓｈｅｎ  Ｒ−Ｆ．、Ｋｎｅｐｐｅｒ  Ｍ．Ａ．、Ｓｔａｒ  Ｒ．、２００６年、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．、７０巻（１０号）：１８４７〜１８５７頁）。
【００５９】
Ｚｈｏｕら（２００８年）は、ネフロンセグメントに由来する尿中エキソソームであって、腎損傷バイオマーカーに富む尿中エキソソームについて記載している。彼らは、分画遠心分離によるこれらのエキソソームの単離およびウェスタンブロット法による転写因子のさらなる検出について記載している。Ｚｈｏｕらは、これらのマーカーが、エキソソーム内では検出可能であるが、腎疾患を伴う被験体の全尿では検出可能でなく、正常な健常個体ではマーカーが見出されないことを見出した（Ｕｒｉｎａｒｙ  ｅｘｏｓｏｍａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ，  ａ  ｎｅｗ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｒｅｎａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ、Ｚｈｏｕ  Ｈ．、Ｃｈｅｒｕｖａｎｋｙ  Ａ．、Ｈｕ  Ｘ．、Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｔ．、Ｈｉｒａｍａｔｓｕ  Ｎ．、Ｃｈｏ  Ｍ．Ｅ．、Ｂｅｒｇｅｒ  Ａ．、Ｌｅｅｌａｈａｖａｎｉｃｈｋｕｌ  Ａ．、Ｄｏｉ  Ｋ．、Ｃｈａｗｌａ  Ｌ．Ｓ．、Ｉｌｌｅｉ  Ｇ．Ｇ．、Ｋｏｐｐ  Ｊ．Ｂ．、Ｂａｌｏｗ  Ｊ．Ｅ．、Ａｕｓｔｉｎ  Ｈ．Ａ．  ３ｒｄ、Ｙｕｅｎ  Ｐ．Ｓ．、Ｓｔａｒ  Ｒ．Ａ．、２００８年、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．、７４巻：６１３〜６２１頁）。
【００６０】
Ｄｅｖａｒａｊａｎ（２００７年）は、患者における損傷の早期の検出のほか、腎損傷の転帰を予測するための急性腎損傷（ＡＫＩ）マーカーのパネルについて提起している（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｋｉｄｎｅｙ  ｉｎｊｕｒｙ、Ｄｅｖａｒａｊａｎ  Ｐ．、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｌ．Ｍ．、２００７年、Ｓｅｍｉｎ．  Ｎｅｐｈｒｏｌ．、２７巻（６号）：６３７〜６５１頁）。
【００６１】
Ｌｏｃｋ（２０１０年）は、腎（ｒｅｎａｌまたはｋｉｄｎｅｙ）損傷の症例において上方制御される遺伝子を検出するためのマイクロアレイ法の使用に焦点を絞って、腎傷害の指標として用いられうる腎マーカーについて総説している（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｅａｒｌｙ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｒｅｎａｌ  ｉｎｊｕｒｙ：  ｗｈｅｒｅ  ａｒｅ  ｗｅ  ａｎｄ  ｗｈａｔ  ｉｓ  ｔｈｅ  ｗａｙ  ｆｏｒｗａｒｄ？、Ｌｏｃｋ  Ｅ．、２０１０年、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１巻（１１６号）：１〜４頁）。
【００６２】
Ａｌｖａｒｅｚら（２０１０年）は、ある学会において、ＮＧＡＬを、腎不全マーカーとして用いることが可能であり、さらにまた、ＮＧＡＬを、腎移植手術後における回復についての予測因子としても用いうることについて記載した（Ｐｉｌｏｔ  ｓｔｕｄｙ  ｆｏｒ  ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｅｘｏｓｏｍａｌ  ｆｒａｃｔｉｏｎ  ａｓ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｉｎ  ｒｅｎａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  Ａｌｖａｒｅｚ  Ｓ．、Ｓｕａｚｏ  Ｃ．、Ｂｏｌｔａｎｓｋｙ  Ａ．、Ｕｒｚｕ  Ｍ．、Ｃａｒｖａｊａｌ  Ｄ．、Ｉｎｎｏｃｅｎｔｉ  Ｇ．、Ｖｕｋｕｓｉｃｈ  Ａ．、Ｈｕｒｔａｄｏ  Ｍ．、Ｃａｍｐｏｓ  Ｄ．、Ｙｅｎ  Ｃ．、Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ  Ｓ．、Ｆｌｏｒｅｓ  Ｍ．、Ｍａｒｑｕｅｚ  Ｊ．、Ｒｏｇｅｌｌｏ  Ａ．、Ｉｒａｒｒａｚａｂａｌ  Ｃ．Ｅ．、２０１０年、ＶＩＩ  Ｌａｔｉｎ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  Ａｃｕｔｅ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｊｕｒｙ：２９頁、Ｃｏｑｕｉｍｂｏ−Ｃｈｉｌｅ）。
【００６３】
Ｂｏｌｔａｎｓｋｙら（２０１０年）は、ＮＧＡＬを、腎移植の症例における臓器回復の予測因子についての潜在的なバイオマーカー指標として記載した（ＮＧＡＬ  ｉｎ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｅｘｏｓｏｍｅｓ  ａｓ  ａ  ｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｉｎ  ｒｅｎａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．  Ｂｏｌｔａｎｓｋｙ  Ａ．、Ａｌｖａｒｅｚ  Ｓ．、Ｖｕｋｕｓｉｃｈ  Ａ．、Ｈｕｒｔａｄｏ  Ｍ．、Ｕｒｓｕ  Ｍ．、Ｉｎｎｏｃｅｎｔｉ  Ｇ．、Ｃａｒｖａｊａｌ  Ｄ．、Ｓｕａｚｏ  Ｃ．、Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ  Ｓ．、Ｃａｒｒｅｎｏ  Ｊ．、Ａｌｔｕｚａｒｒａ  Ｒ．、Ｙｅｎ  Ｃ．、Ｔａｐｉａ  Ｄ．、Ｉｒａｒｒａｚａｂａｌ  Ｃ．Ｅ．、２０１０年、Ｒｅｎａｌ  Ｗｅｅｋ、Ｄｅｎｖｅｒ、ＣＯ、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ、２１巻：９５９頁）。
【００６４】
当技術分野で見出される文献は、近年の試みが、その中では腎損傷を規定する腎細胞が突出する、異なる細胞型からの特異的なエキソソームに由来する転写因子およびバイオマーカー分子の記載および特徴付けに焦点を当てていることを示す。また、バイオマーカーおよび診断手順と併せて、エキソソームの単離について記載する一連の方法への取組みもなされている。前記文献は、本発明と同様の調査について記載することにより、エキソソームの病態マーカーとしての使用（特許文献１、特許文献３、Ｚｈｏｕ  Ｈ．ら、２００６年、Ｄｅｖａｒａｊａｎ、２００７年、およびＬｏｃｋ  ２０１０年）、特に、急性腎損傷についての病態マーカーとしての使用（Ｚｈｏｕ，  Ｈ．ら、２００８年、Ｚｈｏｕ  Ｈ．ら、２００６年、Ｄｅｖａｒａｊａｎ、２００７年、およびＬｏｃｋ  ２０１０年）について示唆し、例えば、ＫＩＭ−１、ＮＧＡＬ、ＩＬ−８、およびシスタチンなど、特異的マーカーの使用について明記している。それにもかかわらず、本発明は、先行技術に対して重要な差違も示す。特に、Ｚｈｏｕ，  Ｈ．ら、２００８年は、アクアポリン−１抗体、アクアポリン−２抗体、アクアポリン−３抗体（ＡＱＰ抗体）、ＮＫＣＣ２抗体、ＮＨＥ−３抗体、およびＮａＰｉＩＩ抗体など、これらの分子（ＡＱＰ、ＮＣＣＫ２、ＮＨＥ−３、ＮａＰｉＩＩ）を含有するエキソソームの免疫精製（ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を可能とすることで、腎損傷についてのより良好でより特異的な同定および診断法を可能とする抗体の使用については記載していない。Ｚｈｏｕ  Ｈ．ら、２００６年は、特異的な免疫沈降についても、本発明で用いられるいくつかのエキソソームマーカーについても記載していない。Ｄｅｖａｒａｊａｎ、２００７年は、抗ＡＱＰ、抗ＮＫＣＣ２、抗ＮＨＥ−３、および／または抗ＮａＰｉＩＩの使用に基づく、特定の腎臓領域に特異的な免疫精製の使用について記載していない。Ｌｏｃｋ  ２０１０年は、特異的な免疫精製について記載していない。
【００６５】
Ａｌｖａｒｅｚら（２０１０年）およびＢｏｌｔａｎｓｋｙら（２０１０年）は、腎損傷の指標としてのＮＧＡＬの使用および腎移植の症例における臓器回復の予測因子としてのＮＧＡＬの使用について提起しているが、本発明とは対照的に、それらのいずれも、腎損傷マーカーをより正確に決定するための、エキソソームを免疫精製する段階については記載していない。
【００６６】
したがって、先行技術は、本発明の新規性にも進歩性にも影響を及ぼすのに十分な背景について記載していない。本発明は、ＡＱＰ−１、ＡＱＰ−２、ＡＱＰ−３（ＡＱＰ）、ＮＫＣＣ２、ＮＨＥ−３、および／またはＮａＰｉＩＩを含有するエキソソームの免疫精製に基づく。
【００６７】
さらに、適用例は、この手順が、患者における腎損傷の決定において正確であることを示す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００６８】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１０／０２０３５２９号明細書
【特許文献２】欧州特許出願公開第２１９１２７６号明細書
【特許文献３】英国特許出願公開第２４６３４０１号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００６９】
本発明は、早期における急性腎損傷をモニタリング、診断、および／または予後診断し、それを患う被験体における処置を決定するための方法であって、ａ）尿試料を提供するステップと、ｂ）少なくとも１つの免疫精製ステップを用いて、尿試料を、尿試料中に存在するエキソソームについて濃縮するステップと、ｃ）エキソソーム内の急性腎損傷（ＡＫＩ）マーカーを検出するステップとを含む方法に関する。
【００７０】
本発明は、被験体におけるＡＫＩの発生を簡便かつ早期に決定するために、特異的な腎損傷マーカーの存在および／またはレベルを決定するための診断用キットであって、少なくとも１つの免疫精製ステップを用いて、尿試料をエキソソームについて濃縮するための手段と、状態についての所定の腎損傷マーカーを検出するための手段とを含むキットをさらに含む。
【００７１】
発明の詳細な説明
本発明は、早期における急性腎損傷をモニタリング、診断、および／または予後診断し、それを患う被験体における処置を決定するための方法であって、ａ）尿試料を提供するステップと、ｂ）少なくとも１つの免疫精製ステップを用いて、尿試料を、尿試料中に存在するエキソソームについて濃縮するステップと、ｃ）エキソソーム内の急性腎損傷（ＡＫＩ）マーカーを検出するステップとを含む方法に関する。
【００７２】
一実施形態では、尿試料を、カテーテルを留置した患者については午前中に１回目の排尿から得、他の患者については２回目の排尿から得、それを解析するまで−８０℃で維持する。
【００７３】
本発明では、少なくとも１つの免疫精製ステップを、尿試料をエキソソームについて濃縮するための手段と考える。特に、腎臓の特異的構造において好ましくかつ示差的に発現する特定のタンパク質の細胞内ドメイン、細胞外ドメイン、または任意のドメインに対する抗体を用いることにより、エキソソームの濃縮が可能となる。したがって、本発明の方法では、腎臓の特異的構造において好ましくかつ示差的に発現されるタンパク質の細胞内ドメイン、細胞外ドメイン、または任意のドメインに対する抗体と、この抗体が、タンパク質のエキソソームの外部表面内に存在するドメインと相互作用することを可能とするのに適する緩衝液とについて検討する。
【００７４】
一実施形態では、本発明の方法は、免疫精製に先立ち、エキソソームについて濃縮するための少なくとも１つのさらなる手段を含みうる。
【００７５】
本発明において検討される、尿試料をエキソソームについて濃縮するための手段はまた、尿試料に由来する大型の要素であって、後の検出相において干渉しうる要素を分離するのに有用な実験法および実験デバイスでもある。例えば、干渉要素は、患者に由来する細胞でありうる。実験室の遠心分離機による処理は、エキソソームについての濃縮、例えば、細胞など、大型粒子の除去を可能とするので、遠心分離管は、濃縮手段と考えることができる。一実施形態では、試料を、５０００〜１００００ｒｐｍで５〜３０分間にわたり遠心分離する。別の実施形態では、試料を、３００００〜４５０００ｒｐｍで３０〜１２０分間にわたり超遠心分離する。
【００７６】
また、微細濾過は、エキソソームがマイクロフィルターを通過することを可能とし、これにより、尿試料をエキソソームについて濃縮することを可能とするので、最大０．２２マイクロメートルのマイクロフィルターカートリッジ、マイクロフィルターカラム、または他のマイクロフィルター媒体も、エキソソームについて濃縮する手段であると考えられる。
【００７７】
本発明の別の実施形態における方法では、所定の腎損傷マーカーに対する一次抗体と、標識とコンジュゲートされた二次抗体であって、一次抗体に対する二次抗体とを、所定の腎損傷マーカーを検出および／または定量化するための手段であると考える。二次抗体の標識は、蛍光マーカー、酵素、放射性マーカー、化合物、赤外化合物でありうる。
【００７８】
場合によって、一次抗体は、標識と直接コンジュゲートすることができる。この場合、二次抗体は必要とされない。一次抗体はまた、蛍光マーカー、酵素、放射性マーカー、化合物、赤外化合物ともコンジュゲートすることができる。
【００７９】
一実施形態では、特異的な腎構造に由来する特異的なエキソソーム画分の免疫精製を、抗アクアポリン−１（ａｑｕｏｐｏｒｉｎ−１）（抗ＡＱＰ−１）、抗アクアポリン−２（抗ＡＱＰ−２）、抗アクアポリン−３（抗ＡＱＰ−３）、抗ＮＫＣＣ２、抗ＮＨＥ−３、および／もしくは抗ＮａＰｉＩＩ、またはこれらの組合せから選択されるがこれらに限定されない抗体により実行する。
【００８０】
一実施形態では、特異的な腎損傷マーカーは、ＮＧＡＬ、シスタチン−３、ＫＩＭ−１、ＩＬ−１ベータ、および／もしくはＩＬ−１８、またはこれらの組合せから選択されるがこれらに限定されない。
【００８１】
好ましい実施形態では、特異的な腎構造に由来する特異的なエキソソーム画分の免疫精製を、抗ＡＱＰ１、抗ＡＱＰ２、抗ＡＱＰ３、抗ＮＫＣＣ２、抗ＮＨＥ−３、抗ＮａＰｉＩＩ、またはこれらの組合せの任意のドメインに対する抗体であって、尿試料をエキソソームについて濃縮するための手段としての抗体により実行する。
【００８２】
さらなる好ましい実施形態では、特異的な腎損傷マーカーは、ＮＧＡＬ、シスタチン−３、ＫＩＭ−１、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１８、またはこれらの組合せから選択される。
【００８３】
より好ましい実施形態では、抗ＡＱＰ−１を、特異的な腎構造に由来する特異的なエキソソーム画分を免疫精製するのに用いる場合、その存在および／またはレベルが決定される腎損傷マーカーは、ＮＧＡＬおよび／またはシスタチン−３であり、抗ＡＱＰ−２を、特異的な腎構造に由来する特異的なエキソソーム画分を免疫精製するのに用いる場合、その存在および／またはレベルが決定される腎損傷マーカーは、ＮＧＡＬであり、抗ＡＱＰ−３を、特異的な腎構造に由来する特異的なエキソソーム画分を免疫精製するのに用いる場合、その存在および／またはレベルが決定される腎損傷マーカーは、ＫＩＭ−１、ＩＬ−１ベータ、および／またはシスタチン−３である。
【００８４】
一実施形態では、抗ＡＱＰ−１を、特異的な腎構造に由来する特異的な画分を免疫精製するのに用いる場合、エキソソーム画分は、近位尿細管に由来し、特異的なマーカーの存在および／またはレベルは、前記構造における損傷を示す。
【００８５】
一実施形態では、抗ＡＱＰ−２を、特異的な腎構造に由来する特異的な画分を免疫精製するのに用いる場合、エキソソーム画分は、遠位尿細管に由来し、特異的なマーカーの存在および／またはレベルは、前記構造における損傷を示す。
【００８６】
一実施形態では、抗ＡＱＰ−３を、特異的な腎構造に由来する特異的な画分を免疫精製するのに用いる場合、エキソソーム画分は、集合管に由来し、特異的なマーカーの存在および／またはレベルは、前記構造における損傷を示す。
【００８７】
一実施形態では、抗ＮＫＣＣ２を、特異的な腎構造に由来する特異的な画分を免疫精製するのに用いる場合、エキソソーム画分は、ヘンレループに由来し、特異的なマーカーの存在および／またはレベルは、前記構造における損傷を示す。
【００８８】
一実施形態では、抗ＮＨＥ−３を、特異的な腎構造に由来する特異的な画分を免疫精製するのに用いる場合、エキソソーム画分は、近位尿細管に由来し、特異的なマーカーの存在および／またはレベルは、前記構造における損傷を示す。
【００８９】
一実施形態では、抗ＮａＰｉＩＩを、特異的な腎構造に由来する特異的な画分を免疫精製するのに用いる場合、エキソソーム画分は、近位尿細管に由来し、特異的なマーカーの存在および／またはレベルは、前記構造における損傷を示す。
【００９０】
方法は、場合によって、特異的な腎損傷マーカーの存在および／またはレベルに基づき、被験体におけるモニタリング、診断、予後診断、および／または処置の決定のために、被験体における急性腎損傷を評価するためのステップを含む。
【００９１】
本発明は、被験体におけるＡＫＩの発生を簡便かつ早期に決定するために、特異的な腎損傷マーカーの存在および／またはレベルを決定するための診断用キットであって、少なくとも１つの免疫精製ステップを用いて、尿試料をエキソソームについて濃縮するための手段と、状態についての所定の腎損傷マーカーを検出するための手段とを含むキットをさらに含む。
【００９２】
場合によって、診断用キットは、尿試料を患者から得るための手段を含む。特定の実施形態では、尿試料を得るための手段は、尿試料を自分自身で提供することが患者に不可能な場合における尿プローブ、または尿試料を患者から受け取るための容器から選択される。
【００９３】
本発明では、少なくとも１つの免疫精製ステップを、尿試料をエキソソームについて濃縮するための手段と考える。特に、好ましくは、かつ、示差的に、腎臓の特異的構造において発現する特定のタンパク質の細胞内ドメイン、細胞外ドメイン、または任意のドメインに対する抗体を用いることにより、エキソソームについての濃縮が可能となる。したがって、本発明のキットでは、好ましくは、かつ、示差的に、腎臓の特異的構造において発現されるタンパク質の細胞内ドメイン、細胞外ドメイン、または任意のドメインに対する抗体と、この抗体が、タンパク質のエキソソームの外部表面内に存在するドメインと相互作用することを可能とするのに適する反応緩衝液とについて検討する。キットはまた、ブロッキング剤またはブロッキング溶液および特異的な腎損傷マーカーの原液も含む。
【００９４】
一実施形態では、キットは、９６ウェルプレートを含み、そのウェルは、腎臓の特異的構造において好ましくかつ示差的に発現する特定のタンパク質の細胞内ドメイン、細胞外ドメイン、または任意のドメインに対する抗体で覆われ、エキソソームについての濃縮を可能とする。
【００９５】
一実施形態では、本発明のキットは、免疫精製に先立ち、エキソソームについて濃縮するための少なくとも１つのさらなる手段を含みうる。
【００９６】
本発明において検討される、尿試料をエキソソームについて濃縮するための手段は、尿試料に由来する大型の要素であって、後の検出相において干渉しうる要素を分離するのに有用な実験法および実験デバイスである。例えば、干渉要素は、患者に由来する細胞でありうる。実験室の遠心分離機による処理は、エキソソームについての濃縮、例えば、細胞など、大型粒子の除去を可能とするので、遠心分離管は、濃縮手段と考えることができる。また、微細濾過は、エキソソームがマイクロフィルターを通過することを可能とし、これにより、尿試料をエキソソームについて濃縮することを可能とするので、最大０．２２マイクロメートルのマイクロフィルターカートリッジ、マイクロフィルターカラム、または他のマイクロフィルター媒体も、エキソソームについて濃縮する手段であると考えられる。
【００９７】
本発明の別の実施形態におけるキットでは、所定の腎損傷マーカーに対する一次抗体と、標識とコンジュゲートされた二次抗体であって、一次抗体に対する二次抗体とを、所定の腎損傷マーカーを検出および／または定量化するための手段であると考える。二次抗体の標識は、蛍光マーカー、酵素、放射性マーカー、化合物、赤外化合物でありうる。
【００９８】
場合によって、一次抗体は、標識と直接コンジュゲートすることができる。この場合、二次抗体は必要とされない。一次抗体はまた、蛍光マーカー、酵素、放射性マーカー、化合物、赤外化合物ともコンジュゲートすることができる。
【００９９】
一実施形態では、キットは、抗アクアポリン−１（抗ＡＱＰ−１）、抗アクアポリン−２（抗ＡＱＰ−２）、抗アクアポリン−３（抗ＡＱＰ−３）、抗ＮＫＣＣ２、抗ＮＨＥ−３、および／もしくは抗ＮａＰｉＩＩ、またはこれらの組合せから選択されるがこれらに限定されない抗体を含む。
【０１００】
一実施形態では、キットは、ＮＧＡＬ、シスタチン−３、ＫＩＭ−１、ＩＬ−１ベータ、および／もしくはＩＬ−１８、またはこれらの組合せから選択されるがこれらに限定されないマーカーを検出するために標識とコンジュゲートされているかまたはコンジュゲートされていない一次抗体を含む。
【０１０１】
好ましい実施形態では、キットは、抗ＡＱＰ１、抗ＡＱＰ２、抗ＡＱＰ３、抗ＮＫＣＣ２、抗ＮＨＥ−３、抗ＮａＰｉＩＩ、またはこれらの組合せの任意のドメインに対する抗体であって、濃縮するための方法として免疫精製を用いる場合における、尿試料をエキソソームについて濃縮するための手段としての抗体を含む。
【０１０２】
さらなる好ましい実施形態では、キットは、標識とコンジュゲートされているかまたはコンジュゲートされていない一次抗体であって、ＮＧＡＬ、シスタチン−３、ＫＩＭ−１、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１８を検出するための一次抗体を含む。
【０１０３】
より好ましい実施形態では、抗ＡＱＰ−１を、特異的な腎構造に由来する特異的なエキソソーム画分を免疫精製するのに用いる場合、その存在および／またはレベルが決定される腎損傷マーカーは、ＮＧＡＬおよび／またはシスタチン−３であり、抗ＡＱＰ−２を、特異的な腎構造に由来する特異的なエキソソーム画分を免疫精製するのに用いる場合、その存在および／またはレベルが決定される腎損傷マーカーは、ＮＧＡＬであり、抗ＡＱＰ−３を、特異的な腎構造に由来する特異的なエキソソーム画分を免疫精製するのに用いる場合、その存在および／またはレベルが決定される腎損傷マーカーは、ＫＩＭ−１、ＩＬ−１ベータ、および／またはシスタチン−３である。
【０１０４】
一実施形態では、抗ＡＱＰ−１を、特異的な腎構造に由来する特異的な画分を免疫精製するのに用いる場合、エキソソーム画分は、近位尿細管に由来し、特異的なマーカーの存在および／またはレベルは、前記構造における損傷を示す。
【０１０５】
一実施形態では、抗ＡＱＰ−２を、特異的な腎構造に由来する特異的な画分を免疫精製するのに用いる場合、エキソソーム画分は、遠位尿細管に由来し、特異的なマーカーの存在および／またはレベルは、前記構造における損傷を示す。
【０１０６】
一実施形態では、抗ＡＱＰ−３を、特異的な腎構造に由来する特異的な画分を免疫精製するのに用いる場合、エキソソーム画分は、集合管に由来し、特異的なマーカーの存在および／またはレベルは、前記構造における損傷を示す。
【０１０７】
一実施形態では、抗ＮＫＣＣ２を、特異的な腎構造に由来する特異的な画分を免疫精製するのに用いる場合、エキソソーム画分は、ヘンレループに由来し、特異的なマーカーの存在および／またはレベルは、前記構造における損傷を示す。
【０１０８】
一実施形態では、抗ＮＨＥ−３を、特異的な腎構造に由来する特異的な画分を免疫精製するのに用いる場合、エキソソーム画分は、近位尿細管に由来し、特異的なマーカーの存在および／またはレベルは、前記構造における損傷を示す。
【０１０９】
一実施形態では、抗ＮａＰｉＩＩを、特異的な腎構造に由来する特異的な画分を免疫精製するのに用いる場合、エキソソーム画分は、近位尿細管に由来し、特異的なマーカーの存在および／またはレベルは、前記構造における損傷を示す。
【０１１０】
本発明のキットは、場合によって、キットを用いるための指示書を含む。
【０１１１】
本発明の方法およびキットは、尿中エキソソームを免疫精製するステップを含む。したがって、本発明はまた、尿中エキソソームを免疫精製するための方法、および尿中エキソソームを精製するための抗体の使用も記載する。
【０１１２】
本発明は、尿中エキソソームを精製するための方法であって、（ａ）尿試料または場合によって、脱細胞化された（ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ）尿試料を、異なる腎構造の表面において好ましくかつ示差的に発現されるタンパク質の細胞内ドメイン、細胞外ドメイン、または任意のドメインに対する抗体と共にインキュベートし、これにより、エキソソーム−抗体複合体を形成するステップと、（ｂ）（ａ）から得られるエキソソーム−抗体複合体を、抗体の任意の領域を認識し、不溶性作用物質に結合しているタグと共にインキュベートし、これにより、エキソソーム−抗体−タグ−不溶性作用物質複合体を形成するステップと、（ｃ）エキソソーム−抗体−タグ−不溶性作用物質複合体を上清から分離するステップと、（ｄ）エキソソーム−抗体−タグ−不溶性作用物質複合体を適切な緩衝液で洗浄するステップとを含む方法に関する。
【０１１３】
一実施形態では、尿試料または脱細胞化された尿試料を、抗体と共に、適切な緩衝液中、室温で２０〜６０分間インキュベートする。
【０１１４】
一実施形態では、尿中エキソソームのための精製法において用いられる抗体は、抗アクアポリン−１（抗ＡＱＰ−１）、抗アクアポリン−２（抗ＡＱＰ−２）、抗アクアポリン−３（抗ＡＱＰ−３）、抗ＮＫＣＣ２、抗ＮＨＥ−３、および／もしくは抗ＮａＰｉＩＩ、またはこれらの組合せから選択されるがこれらに限定されない。
【０１１５】
好ましい実施形態では、尿中エキソソームのための精製法において用いられる抗体は、抗ＡＱＰ１、抗ＡＱＰ２、抗ＡＱＰ３、抗ＮＫＣＣ２、抗ＮＨＥ−３、抗ＮａＰｉＩＩ、またはこれらの組合せの任意のドメインに対する抗体である。
【０１１６】
一実施形態では、抗ＡＱＰ−１を、特異的な腎構造に由来する特異的な画分を免疫精製するのに用いる場合、エキソソーム画分は、近位尿細管に由来し、特異的なマーカーの存在および／またはレベルは、前記構造における損傷を示す。
【０１１７】
一実施形態では、抗ＡＱＰ−２を、特異的な腎構造に由来する特異的な画分を免疫精製するのに用いる場合、エキソソーム画分は、遠位尿細管に由来し、特異的なマーカーの存在および／またはレベルは、前記構造における損傷を示す。
【０１１８】
一実施形態では、抗ＡＱＰ−３を、特異的な腎構造に由来する特異的な画分を免疫精製するのに用いる場合、エキソソーム画分は、集合管に由来し、特異的なマーカーの存在および／またはレベルは、前記構造における損傷を示す。
【０１１９】
一実施形態では、抗ＮＫＣＣ２を、特異的な腎構造に由来する特異的な画分を免疫精製するのに用いる場合、エキソソーム画分は、ヘンレループに由来し、特異的なマーカーの存在および／またはレベルは、前記構造における損傷を示す。
【０１２０】
一実施形態では、抗ＮＨＥ−３を、特異的な腎構造に由来する特異的な画分を免疫精製するのに用いる場合、エキソソーム画分は、近位尿細管に由来し、特異的なマーカーの存在および／またはレベルは、前記構造における損傷を示す。
【０１２１】
一実施形態では、抗ＮａＰｉＩＩを、特異的な腎構造に由来する特異的な画分を免疫精製するのに用いる場合、エキソソーム画分は、近位尿細管に由来し、特異的なマーカーの存在および／またはレベルは、前記構造における損傷を示す。
【０１２２】
一実施形態では、抗体の任意の領域を認識するタグは、アガロースビーズまたはセファロースビーズに結合させたプロテインＡもしくはプロテインＧまたはこれらの一部である。
【０１２３】
別の実施形態では、タグはビオチンまたはその一部であり、抗体に結合している。こうして、エキソソーム−抗体−ビオチンの複合体が形成される。この実施形態では、不溶性作用物質は、ビオチンまたはその一部に対するアフィニティーを伴う化合物であって、抗体などであるがこれらに限定されない化合物に結合する磁気ビーズである。こうして、磁気ビーズを添加すると、エキソソーム−抗体−ビオチン−（ビオチン−磁気ビーズに対するアフィニティーを伴う）化合物の複合体が形成され、次のステップで分離される。
【０１２４】
一実施形態では、エキソソーム−抗体−タグ−不溶性作用物質の上清からの分離は、遠心分離または沈降により実施される。
【０１２５】
本発明はまた、尿中エキソソームを免疫精製するための、異なる腎構造の表面において好ましくかつ示差的に発現されるタンパク質の細胞内ドメイン、細胞外ドメイン、または任意のドメインに対する抗体または抗体の組合せの使用も開示する。
【０１２６】
一実施形態では、尿中エキソソームを免疫精製するために用いられる抗体は、抗アクアポリン−１（抗ＡＱＰ−１）、抗アクアポリン−２（抗ＡＱＰ−２）、抗アクアポリン−３（抗ＡＱＰ−３）、抗ＮＫＣＣ２、抗ＮＨＥ−３、および／もしくは抗ＮａＰｉＩＩ、またはこれらの組合せから選択されるがこれらに限定されない。
【０１２７】
好ましい実施形態では、尿中エキソソームを免疫精製するために用いられる抗体は、抗ＡＱＰ１、抗ＡＱＰ２、抗ＡＱＰ３、抗ＮＫＣＣ２、抗ＮＨＥ−３、抗ＮａＰｉＩＩ、またはこれらの組合せの任意のドメインに対する抗体である。
【０１２８】
一実施形態では、抗ＡＱＰ−１を、尿中エキソソームを免疫精製するために用いる場合、特異的な腎構造に由来する特異的な画分であるエキソソーム画分は、近位尿細管に由来し、特異的なマーカーの存在および／またはレベルは、前記構造における損傷を示す。
【０１２９】
一実施形態では、抗ＡＱＰ−２を、尿中エキソソームを免疫精製するために用いる場合、特異的な腎構造に由来する特異的な画分であるエキソソーム画分は、遠位尿細管に由来し、特異的なマーカーの存在および／またはレベルは、前記構造における損傷を示す。
【０１３０】
一実施形態では、抗ＡＱＰ−３を、尿中エキソソームを免疫精製するために用いる場合、特異的な腎構造に由来する特異的な画分であるエキソソーム画分は、集合管に由来し、特異的なマーカーの存在および／またはレベルは、前記構造における損傷を示す。
【０１３１】
一実施形態では、抗ＮＫＣＣ２を、尿中エキソソームを免疫精製するために用いる場合、特異的な腎構造に由来する特異的な画分であるエキソソーム画分は、ヘンレループに由来し、特異的なマーカーの存在および／またはレベルは、前記構造における損傷を示す。
【０１３２】
一実施形態では、抗ＮＨＥ−３を、尿中エキソソームを免疫精製するために用いる場合、特異的な腎構造に由来する特異的な画分であるエキソソーム画分は、近位尿細管に由来し、特異的なマーカーの存在および／またはレベルは、前記構造における損傷を示す。
【０１３３】
一実施形態では、抗ＮａＰｉＩＩを、尿中エキソソームを免疫精製するために用いる場合、特異的な腎構造に由来する特異的な画分であるエキソソーム画分は、近位尿細管に由来し、特異的なマーカーの存在および／またはレベルは、前記構造における損傷を示す。
【０１３４】
本発明の方法およびキットは、今日まで適用されている標準的な方法では不可能な、腎損傷マーカーの特異的で簡便かつ早期の検出を提供する利点を有する。本発明の方法およびキットはまた、腎臓の特異的構造に存在する特異的なタンパク質に対して特異的抗体を用いるので、腎臓において損傷している特異的構造を同定する利点も提供する。
【０１３５】
本発明の方法およびキットは、任意の被験体におけるモニタリング、診断、予後診断、および／または処置の決定のために用いることができる。特に、本発明の方法およびキットは、腎移植を受けた患者における、移植と関連する虚血−再灌流過程に起因する腎損傷の発症をモニタリングするのに有用である。本発明の方法およびキットはまた、ＡＫＩを発症し、早期の検出を必要とする可能性のある、集中治療室（ＩＣＵ）の患者におけるモニタリング、診断、予後診断、および／または処置の決定にも有用である。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
早期における急性腎損傷をモニタリング、診断、および／または予後診断し、それを患う被験体における処置を決定するための方法であって、
（ａ）尿試料を提供するステップと、
（ｂ）少なくとも１つの免疫精製ステップを用いて、上記尿試料を、上記尿試料中に存在するエキソソームについて濃縮するステップと、
（ｃ）上記エキソソーム内の急性腎損傷（ＡＫＩ）マーカーを検出および／または定量化するステップと
を含む、方法。
（項目２）
上記免疫精製ステップが、異なる腎構造の表面において好ましくかつ示差的に発現されるタンパク質の細胞内ドメイン、細胞外ドメイン、または任意のドメインに対する抗体により実施される、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記免疫精製ステップのための上記抗体が、抗アクアポリン１（抗ＡＱＰ１）、抗アクアポリン２（抗ＡＱＰ２）、および抗アクアポリン３（抗ＡＱＰ３）、抗ＮＫＣＣ２、抗ＮＨＥ−３、抗ＮａＰｉＩＩ抗体、またはこれらの組合せの中から選択される、項目２に記載の方法。
（項目４）
上記免疫精製ステップのための上記抗体が、アクアポリン１（ＡＱＰ１）、アクアポリン２（ＡＱＰ２）、アクアポリン３（ＡＱＰ３）、ＮＫＣＣ２、ＮＨＥ−３、およびＮａＰｉＩＩの任意のドメインに対する抗体である、項目３に記載の方法。
（項目５）
上記尿試料の、エキソソームについての上記濃縮が、上記免疫精製に先立ち、エキソソームについて濃縮するための少なくとも１つのさらなる手段を含む、項目４に記載の方法。
（項目６）
上記尿試料の、エキソソームについての濃縮のための上記さらなる手段が、遠心分離ステップ、微細濾過ステップ、またはこれらの組合せであり、これにより、脱細胞化された尿試料を生成させる、項目５に記載の方法。
（項目７）
上記遠心分離が、５０００〜１００００ｒｐｍで５〜３０分間にわたり実施される、項目６に記載の方法。
（項目８）
上記遠心分離ステップが、２段階で実施される、項目６または７に記載の方法。
（項目９）
第２の遠心分離ステップが、３００００〜４５０００ｒｐｍで３０〜１２０分間にわたり実施され、これにより、全エキソソーム画分を生成させる超遠心分離ステップである、項目８に記載の方法。
（項目１０）
上記微細濾過ステップが、最大０．２２マイクロメートルのマイクロフィルターを用い、これにより、脱細胞化された尿試料を生成させる、項目６に記載の方法。
（項目１１）
上記急性腎損傷マーカーが、ＮＧＡＬ、シスタチン−３、ＫＩＭ−１、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１８、またはこれらの組合せの中から選択される、項目１に記載の方法。
（項目１２）
検出が、ＮＧＡＬ、シスタチン−３、ＫＩＭ−１、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１８に対する一次抗体との免疫反応により実施される、項目１に記載の方法。
（項目１３）
上記一次抗体が標識されている、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
上記検出が、ＮＧＡＬ、シスタチン−３、ＫＩＭ−１、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１８に対する上記一次抗体に対する標識された二次抗体を検出することにより実施される、項目１に記載の方法。
（項目１５）
上記抗体の標識が、酵素、蛍光化合物、赤外化合物、放射性化合物、化合物の中から選択される、項目１２または１３に記載の方法。
（項目１６）
モニタリング、診断、予後診断、および／または被験体における処置の決定のために、上記特異的腎損傷マーカーの存在および／またはレベルに基づき、上記被験体における上記急性腎損傷を評価するためのステップをさらに含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
早期における急性腎損傷を評価するためのキットであって、
（ａ）少なくとも１つの免疫精製ステップを用いて、尿試料をエキソソームについて濃縮するための手段と、
（ｂ）急性腎損傷（ＡＫＩ）マーカーを検出するための手段と
を含む、キット。
（項目１８）
（ｃ）尿試料を得るための手段をさらに含む、項目１７に記載のキット。
（項目１９）
上記免疫精製ステップのための抗体が、抗アクアポリン１（抗ＡＱＰ１）、抗アクアポリン２（抗ＡＱＰ２）、および抗アクアポリン３（抗ＡＱＰ３）、抗ＮＫＣＣ２、抗ＮＨＥ−３、抗ＮａＰｉＩＩ、またはこれらの組合せの中から選択される、項目１７に記載のキット。
（項目２０）
上記免疫精製ステップのための上記抗体が、アクアポリン１（ＡＱＰ１）、アクアポリン２（ＡＱＰ２）、アクアポリン３（ＡＱＰ３）、ＮＫＣＣ２、ＮＨＥ−３、およびＮａＰｉＩＩの任意のドメインに対する抗体である、項目１９に記載のキット。
（項目２１）
上記尿試料の、エキソソームについての上記濃縮が、上記免疫精製に先立ち、エキソソームについて濃縮するための少なくとも１つのさらなる手段を含む、項目２０に記載のキット。
（項目２２）
上記尿試料をエキソソームについて濃縮するための上記手段が、容器、試験管、遠心分離管、抗体、免疫反応緩衝液、ブロッキング剤もしくはブロッキング溶液、上記特異的腎損傷マーカーの原液、マイクロフィルター、上記抗体で覆われた９６ウェルプレート、またはこれらの組合せの中から選択される、項目２１に記載のキット。
（項目２３）
上記急性腎損傷マーカーを検出するための上記手段が、ＮＧＡＬ、シスタチン−３、ＫＩＭ−１、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１８、またはこれらの組合せに対する抗体の中から選択される抗体である、項目１７に記載のキット。
（項目２４）
上記抗体が標識されている、項目２３に記載のキット。
（項目２５）
ＮＧＡＬ、シスタチン−３、ＫＩＭ−１、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１８、またはこれらの組合せに対する一次抗体に対する標識された二次抗体をさらに含む、項目２３に記載のキット。
（項目２６）
上記抗体中の上記標識が、酵素、蛍光化合物、赤外化合物、放射性化合物、化合物の中から選択される、項目２４または２５に記載のキット。
（項目２７）
上記キットを用いるための指示書をさらに含む、項目２６に記載のキット。
（項目２８）
尿中エキソソームを精製するための方法であって、
（ａ）尿試料または場合によって、脱細胞化された尿試料を、異なる腎構造の表面において好ましくかつ示差的に発現されるタンパク質の細胞内ドメイン、細胞外ドメイン、または任意のドメインに対する抗体と共にインキュベートし、これにより、エキソソーム−抗体複合体を形成するステップと、
（ｂ）（ａ）から得られる上記エキソソーム−抗体複合体を、上記抗体の任意の領域を認識し、不溶性作用物質に結合しているタグと共にインキュベートし、これにより、エキソソーム−抗体−タグ−不溶性作用物質複合体を形成するステップと、
（ｃ）上記エキソソーム−抗体−タグ−不溶性作用物質複合体を上清から分離するステップと、
（ｄ）上記エキソソーム−抗体−タグ−不溶性作用物質複合体を適切な緩衝液で洗浄するステップと
を含む、方法。
（項目２９）
上記抗体が、抗アクアポリン１（抗ＡＱＰ１）、抗アクアポリン２（抗ＡＱＰ２）、および抗アクアポリン３（抗ＡＱＰ３）、抗ＮＫＣＣ２、抗ＮＨＥ−３、抗ＮａＰｉＩＩ、またはこれらの組合せの中から選択される、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
上記抗体が、アクアポリン１（ＡＱＰ１）、アクアポリン２（ＡＱＰ２）、アクアポリン３（ＡＱＰ３）、ＮＫＣＣ２、ＮＨＥ−３、およびＮａＰｉＩＩの任意のドメインに対する抗体である、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
異なる腎構造の表面において好ましくかつ示差的に発現されるタンパク質の細胞内ドメイン、細胞外ドメイン、または任意のドメインに対する抗体または抗体の組合せの使用であって、上記抗体が尿中エキソソームを免疫精製するための抗体である、使用。
（項目３２）
抗アクアポリン１（抗ＡＱＰ１）、抗アクアポリン２（抗ＡＱＰ２）、および抗アクアポリン３（抗ＡＱＰ３）、抗ＮＫＣＣ２、抗ＮＨＥ−３、抗ＮａＰｉＩＩ、またはこれらの組合せの中から選択される抗体または抗体の組合せの使用であって、上記抗体が尿中エキソソームを免疫精製するための抗体である、使用。
（項目３３）
アクアポリン１（ＡＱＰ１）、アクアポリン２（ＡＱＰ２）、アクアポリン３（ＡＱＰ３）、ＮＫＣＣ２、ＮＨＥ−３、およびＮａＰｉＩＩの任意のドメインに対する抗体または抗体の組合せの使用であって、上記抗体が尿中エキソソームを免疫精製するための抗体である、使用。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】図１は、移植の１、２、３、および４日後における腎移植患者の尿試料に由来する細胞画分内のＮＧＡＬの存在度とエキソソーム画分内のＮＧＡＬの存在度とを比較する代表的なウェスタンブロットである。
【図２】図２は、移植の１日後における患者に由来する全尿画分（Ｕ）およびエキソソーム画分（Ｅ）内のＮＧＡＬ−２４およびＮＧＡＬ−４６の存在度を示す代表的なウェスタンブロットである。
【図３】図３は、移植の１日後における患者の尿の全エキソソーム画分内のＮＧＡＬについてのグラフ表示である。ＡＵ＝任意単位である。
【図４】図４は、ＮＧＡＬ−４６とＡＱＰ１、２、および３との間の関係を示す図であり（＊ｐ＜０．０５、ｎ＝５）、ＡＵ＝任意単位である。
【図５】図５は、腎移植片を有する個体におけるＳＣＲレベルとＮＧＡＬレベルとの２つのレベルの比較解析を示す図である。
【図６】図６は、ＡＫＩ１（５例の患者）、ＡＫＩ２（３例の患者）、およびＡＫＩ３（５例の患者）として分類されたＩＣＵ患者における、エキソソームを含まない尿画分（白色バー、ＥＦ−Ｕ）および全エキソソーム画分（黒色バー、ＴＥ）についてのＮＧＡＬの相対存在度（任意単位）を示す図である。
【図７】図７は、ＡＫＩ１（５例の患者）、ＡＫＩ２（３例の患者）、およびＡＫＩ３（５例の患者）として分類されたＩＣＵからの患者における、任意単位によるＮＧＡＬの存在度についてのＴＥ／ＥＦ−Ｕ比を示す図である。
【図８】図８は、ＡＫＩ１（５例の患者）として分類されたＩＣＵ患者における、エキソソームを含まない尿（ＥＦ−Ｕ）、全エキソソーム（ＴＥ）、および免疫精製されたエキソソーム（ＩＰ−Ｅ）についてのＮＧＡＬの相対存在度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１３７】
本節では、例示的な例を指針として提示するものであり、したがって、これらの例は、限定的なものとしてみなされるべきではない。
【０１３８】
適用例
以下では、腎移植を受けた１２例のヒト患者群における腎（ｒｅｎａｌまたはｋｉｄｎｅｙ）損傷を決定する研究に基づき、本発明の実施形態の一部が記載される。研究は、ＩＣＵに収容された２８例の個体であって、４６％（２８例中１３例）がＲＩＦＬＥ分類に従うＡＫＩを発症した個体を含んだ。
【０１３９】
（実施例１）
研究対象群についての記載
１２例のヒト患者群に加えて、対照群としての役割を果たす健常個体を解析することにより、本発明の方法および生成物について調べた。健常対照のために用いられた組入れ基準は、腎臓の総体的症状が存在しないことであり、患者のための組入れ基準は、本研究の持続期間中に腎移植を受けた全ての個体であった。患者は、説明同意文書の承認を考慮の上で登録された。
【０１４０】
（実施例２）
尿サンプリング
５０ｍｌの尿検体を、研究対象の各個体から、カテーテルの挿入により得た。試料は、熟練の看護師により、午前中の１回目の排尿から採取された。移植を受けた個体の場合、移植の前日に試料を得、手術後、後続する３日間にわたり毎日１回ずつ３つの試料を得、これらのうち、手術後における第１の試料を解析用に選択した。ウェスタンブロット解析を待機する間、試料は−８０℃で維持した。
【０１４１】
（実施例３）
尿中エキソソームの調製
エキソソームは、２つの異なる手法を考慮して得た。第１の手法は、遠心分離を用いる第１のステップと超遠心分離を用いる第２のステップとの２ステップの遠心分離による分離に対応した。本発明の主な特色である第２の方法では、第１段階の遠心分離と、第２ステップの免疫精製とについて検討した。
【０１４２】
２つの遠心分離ステップを伴う第１の方法では、１０ｍｌの尿試料を採取し、これに、プロテアーゼ阻害剤錠（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ  ｔａｂｌｅｔｓ、Ｒｏｃｈｅ）を添加した。第１の遠心分離は、細胞内容物を分離するために、４℃、１７，０００ｇで１５分間にわたり実施し、これを−８０℃で保存し、第１の上清画分（Ｓ１）を得た。第１の画分であるＳ１を３８，０００ｒｐｍで１時間にわたりさらに超遠心分離し、これにより、第２の上清画分（Ｓ２）および沈殿物（全エキソソーム）を生成させた。
【０１４３】
第２のステップで免疫精製を考慮する、遠心分離の第１のステップの場合、２つの遠心分離ステップを伴う方法の第１のステップにおいて記載される通りに得られたＳ１の画分を、腎臓の異なる領域からエキソソームを得るための、ＡＱＰ１抗体、ＡＱＰ２抗体、またはＡＱＰ３抗体を用いるエキソソームの免疫精製のために用いた。試料は、ゲル中に各試料の全タンパク質１００マイクログラムずつがロードされるように、ロードバッファー（１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、２００ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、４％のＳＤＳ、０．２％のブロモフェノールブルー、２０％のグリセリン）中に再懸濁させた。
【０１４４】
（実施例４）
ウェスタンブロット解析
ウェスタンブロットにより、特異的抗体を用いるタンパク質の存在の同定が可能となった。タンパク質は、１００Ｖで９０分間にわたる、７．５％および１２％のアクリルアミドゲル中の電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて、それらのサイズに従い分離した。分離したら、全てのタンパク質を、３００ｍＡで９０分間にわたり、ニトロセルロース膜へと転写した。この過程の後、膜を、一定の撹拌下で１時間にわたり、５％のスキムミルクを用いてブロッキングし、その後、４℃で撹拌しながら、抗ＡＱＰ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）一次抗体、抗ＡＱＰ２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）一次抗体、抗ＡＱＰ３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）一次抗体、または抗ＮＧＡＬ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）一次抗体との一晩にわたるインキュベーションを行った。インキュベーションが終わったら、膜を、１％のＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（Ｗｉｎｋｌｅｒ）で３回洗浄して、室温で２時間にわたり撹拌を伴い、二次抗体と共に継続した。最後に、さらなる処理のために、膜をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０  １％で３回洗浄した。
【０１４５】
タンパク質の存在度は、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ４ソフトウェアを用いて、ウェスタンブロットにより得られたバンドの濃度測定を使用する半定量解析により決定し、決定を標準化するように、各バンドについて２つずつの測定値（全ての試料について全バンドおよび固定サイズのバンド）を得た。
【０１４６】
タンパク質の決定
全タンパク質濃度は、市販されるキット（ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、両方の細胞画分において決定した。
【０１４７】
統計学的解析
ＡＮＯＶＡの統計学的モデルを用いて記述関連研究を行った。解析は、ｐ値≦０．０５を有意差と考えて、ＷＩＮＫＳ  ＳＤＡ  ６．０ソフトウェアを用いて実施した。
【０１４８】
（実施例５）
本発明の方法に従う解析の結果
群研究の特徴
本研究では、腎移植を施された１２例の患者について検討した。
【０１４９】
患者の年齢は、１５〜６０歳の範囲にわたったが、患者の大半（１２例中７例）は、４０〜６０歳の間であった。患者の大半は、男性（９１．６％）であった。２５％が、死体ドナーに由来する臓器を施され、７５％が生体ドナーに由来する臓器を施された（表４）。
【０１５０】
血清クレアチニンは、移植された臓器の生存率について調べるのに重要なパラメータである。移植の１日後、全ての患者の血清クレアチニン値は、正常より高く（０．８〜１．４ｍｇ／ｄｌ）、死体ドナーに由来する臓器を施された患者の値がより高いことが示された（表４）。
【０１５１】
検討された他のパラメータは、移植に先立ち臓器が虚血に供された虚血時間であった。虚血時間は、２７〜１１８２分間の範囲にわたる。死体ドナーに由来する臓器を施された患者では、時間が３００〜１１８２分間の範囲にわたり、生体ドナーに由来する臓器を施される患者による２７〜３６０分間の時間と比較して、一般に長時間であった（表４）。
【０１５２】
【表４】
0005893742.tif 000006
腎不全バイオマーカーの解析
本発明者らの調査チームにより得られたかつての結果、および本研究による結果は、健常個体の尿の細胞画分またはエキソソーム画分内には、検出可能なレベルのバイオマーカーが見られないことを示す（Ｆｌｏｒｅｓ  Ｍ．、Ｍａｒｑｕｅｚ  Ｓ．、２００９年、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｕｎｉｔ：  Ｎｅｗ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｋｉｄｎｅｙ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ  ｄｅ  ｌｏｓ  Ａｎｄｅｓ、Ｓａｎｔｉａｇｏ、Ｃｈｉｌｅ）。また、エキソソーム画分内のバイオマーカーの発現レベルも、細胞画分内で発現するバイオマーカーの発現レベルより高い（図１）。さらに、研究対象であるバイオマーカーの高レベルの発現は、移植の１日後に生じる（図１）。最後に、ウェスタンブロットを用いると、ＮＧＡＬの２つのアイソフォームである、２３ｋＤａのＮＧＡＬ−２３および４６ｋＤａのＮＧＡＬ−４６を検出することが可能である（図１）。これにより、本研究は、移植の１日後に回収される尿試料のエキソソーム画分に由来するバイオマーカーのプロファイルを決定することに焦点を絞る。
【０１５３】
ＮＧＡＬ
ウェスタンブロット法を用いて、研究に含めた１２例の患者の移植の１日後における全尿中エキソソームに由来する全てのＮＧＡＬアイソフォームの存在度を解析する（ＮＧＡＬ−２３およびＮＧＡＬ−４６）ことから、これら１２例中１１例についての情報を得た。これらの結果は、ＮＧＡＬが症例のうちのほとんど全例において発現したことを示す。発現の範囲は、７．３〜１７０．３ＡＵの間であった、すなわち、極端な場合の間の差違は約２０倍であった（図３）。
【０１５４】
ウェスタンブロットを用いてＮＧＡＬ−４６およびＮＧＡＬ−２４を同定したところ、両方のマーカーが発現するのは尿中エキソソーム画分内だけであり、上清は、非特異的なバンドのみを示す（図２）。
【０１５５】
１１例の患者のうちで、ＮＧＡＬ値が高い患者は患者５および７であり、それぞれの値は１７０．３および８３．８ＡＵであった。
【０１５６】
最低レベルは、値１２．６ＡＵの患者１０および７．９ＡＵの患者２で見出された。
【０１５７】
免疫精製されたエキソソーム内のバイオマーカーの発現
Ｐｉｓｉｔｋｕｎは、２００４年（Ｐｉｓｉｔｋｕｎ  Ｔ．、Ｓｈｅｎ  Ｒ．Ｆ．、Ｋｎｅｐｐｅｒ  Ｍ．Ａ．、２００４年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０１巻：１３３６８〜１３３７３頁）において、正常患者に由来する尿中エキソソーム内のアクアポリン（ＡＱＰ）の存在について記載した。そこで、本研究では、腎移植を受けた患者に由来する免疫精製エキソソーム内のＡＱＰ（ＡＱＰ１、ＡＱＰ２、ＡＱＰ３）の発現について探索した。これらの成分の各々を選択したのは、その発現がネフロン内の特定の帯域と関連するためである。ＡＱＰ１は通常、近位尿細管と関連し（Ｋｎｅｐｐｅｒ  Ｍ．Ａ．、１９９７年、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７２巻：Ｆ３〜Ｆ１２頁）、ＡＱＰ２は、遠位尿細管および集合管と関連し（Ｍａ  Ｔ．、Ｙａｎｇ  Ｂ．、Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ  Ａ．、Ｃａｒｌｓｏｎ  Ｅ．Ｊ．、Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｃ．Ｊ．、Ｖｅｒｋｍａｎ  Ａ．Ｓ．、１９９８年、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７３巻：４２９６〜４２９９頁）、ＡＱＰ３は、ネフロン由来の集合管と関連する（Ｓａｓａｋｉ  Ｓ．、Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ  Ｋ．、Ｍａｒｕｍｏ  Ｆ．、１９９８年、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、６０巻：１９９〜２２０頁）。
【０１５８】
この解析は、特定の種類のエキソソーム内に存在する各バイオマーカーの存在度を決定することを可能とする。したがって、手法は、解析される腎損傷についてのバイオマーカーの潜在的な起源の間の関係を確立する手法である。
【０１５９】
ＮＧＡＬ−４６
図４は、陽性情報を伴う患者の尿中エキソソーム内のＡＱＰレベルによる、ＮＧＡＬ−４６アイソフォームの正常化を示す。ＮＧＡＬ−４６は、ＮＧＡＬ−４６の発現が、ＮＧＡＬ−２３より高いので選択した（図１）。
【０１６０】
結果は、ＡＱＰ１の存在度と関係するＮＧＡＬの存在度が、他のＡＱＰより統計学的に高いことを示す（図４、ｐ＜０．０５）。これらの結果は、ＡＱＰ１を含有するエキソソームが、ＮＧＡＬの存在度がより高いことを示唆する（図４）。これらの結果に基づくと、ＮＧＡＬ−４６は、ＡＱＰ１が優先的に発現する腎領域、すなわち、集合管の近位帯域と主に関連することが示される。
【０１６１】
血清クレアチニンレベルのＮＧＡＬレベルとの比較
ＮＧＡＬのレベルと血清クレアチニン（ＳＣＲ）のレベルとを比較する結果として、ＳＣＲレベルが３ｍｇ／ｄｌより低い個体（患者５、８、および１１）またはＳＣＲレベルが６ｍｇ／ｄｌより高い個体（患者１、２、３、７、９、および１２）は、ＮＧＡＬとの相関を有さないことが示される。（図５）。
【０１６２】
データは、糸球体濾過のマーカー（ＳＣＲ）が、腎損傷マーカー（ＮＧＡＬ）と相関しないことを示唆する。
【０１６３】
考察
腎損傷バイオマーカーの解析
ＮＧＡＬ
ＦｌｏｒｅｓおよびＭａｒｑｕｅｚ（２００９年）（Ｆｌｏｒｅｓ  Ｍ．、Ｍａｒｑｕｅｚ  Ｓ．、２００９年、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｕｎｉｔ：  Ｎｅｗ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｋｉｄｎｅｙ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ  ｄｅ  ｌｏｓ  Ａｎｄｅｓ、Ｓａｎｔｉａｇｏ、Ｃｈｉｌｅ）は、健常個体に由来する尿のエキソソーム画分内には、検出可能なレベルのＮＧＡＬが見られないことを示した。情報が入手可能であった本研究の１１例の患者は、腎移植を受けた患者の尿中エキソソームの１００％ではＮＧＡＬが検出されるが、尿の細胞画分を含まない上清では、ＮＧＡＬが検出されないことを示した。発現レベルは、７．９〜１７０．３ＡＵの間であり、極端な個体の間の差違は２２倍超であった。したがって、解析された画分は、全尿より代表的な画分であったので、データは、尿中エキソソーム内のＮＧＡＬの検出が、腎損傷についての優れたバイオマーカーを構成することを示唆する。
【０１６４】
ＮＧＡＬのドナーの種類との関係
ドナーが生存している場合に移植される臓器の質は、死体ドナーの場合と比較して良好であり、これは、腎損傷マーカーの発現の低さとして反映されるはずであることが公知である。この種の挙動は、ＮＧＡＬレベルが低く、移植された臓器も生体ドナーから施された患者２、６、９、および１０において示された。同じ文脈では、患者１が高レベルのＮＧＡＬを示すが、これは、この患者が、死体ドナーに由来する移植片を施されたことにより説明することができる。それにもかかわらず、このＮＧＡＬの発現パターンは、死体ドナーに由来する移植片を施され、中程度のＮＧＡＬレベルを示す患者３によって示されず、したがって、臓器の質として解釈されうるであろう。
【０１６５】
患者５および７は、生体ドナーに由来する腎臓を施されたが、高レベルのＮＧＡＬを示す。患者７は、移植された腎臓の機能に遅延を示し、移植後第１週に血液透析を必要とした。したがって、ＮＧＡＬは、腎損傷についての優れたマーカーである。
【０１６６】
ＮＧＡＬの虚血時間との関係
虚血時間が長いほど、その臓器が有する機能は低くなるので、臓器の虚血時間は、移植前に臓器が受けている傷害の決定因子である。これは、３６０〜１１８２分間の虚血時間値と関連してＮＧＡＬの発現が高度である患者１および７において観察される。虚血時間値が２７〜９０分間であった患者２および６では、逆のことが観察される。この関係は、虚血時間値が低く、ＮＧＡＬレベルが高い、患者１１を例外とする大半の症例において確立することができる（表４、図３）。患者５は、群のうちで高レベルのＮＧＡＬを示すが、虚血時間データは入手可能でない。
【０１６７】
ＮＧＡＬの年齢および性別との関係
例えば、患者５は、研究における最若齢者であるが、最高レベルのＮＧＡＬを示すので、本研究で得られる結果に従うと、年齢は、各患者のＮＧＡＬレベルとの関係を有さないと考えられる（図３）。研究に含めた女性は１例だけであったので、患者の性別とマーカーとの間の関係を確立することは不可能である。
【０１６８】
免疫精製されたエキソソーム内のバイオマーカーの発現
ＡＱＰ１、ＡＱＰ２、およびＡＱＰ３
異なる種類のＡＱＰにより免疫精製されたエキソソームについて、バイオマーカーの存在度を解析した。
【０１６９】
Ｋｎｅｐｐｅｒ、１９９７年（Ｋｎｅｐｐｅｒ  Ｍ．Ａ．、１９９７年、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７２巻：Ｆ３〜Ｆ１２頁）は、ＡＱＰ１が、近位尿細管と優先的に関連することを示したが、ＡＱＰ２は、遠位尿細管および集合管と関連し（Ｍａ  Ｔ．、Ｙａｎｇ  Ｂ．、Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ  Ａ．、Ｃａｒｌｓｏｎ  Ｅ．Ｊ．、Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｃ．Ｊ．、Ｖｅｒｋｍａｎ  Ａ．Ｓ．、１９９８年、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７３巻：４２９６〜４２９９頁）、ＡＱＰ３は、ネフロン由来の集合管と関連する（Ｓａｓａｋｉ  Ｓ．、Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ  Ｋ．、Ｍａｒｕｍｏ  Ｆ．、１９９８年、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、６０巻：１９９〜２２０頁）。
【０１７０】
Ｐｉｓｉｔｋｕｎは、２００４年（Ｐｉｓｉｔｋｕｎ  Ｔ．、Ｓｈｅｎ  Ｒ．Ｆ．、Ｋｎｅｐｐｅｒ  Ｍ．Ａ．、２００４年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０１巻：１３３６８〜１３３７３頁）において、ＡＱＰが、正常患者の尿中エキソソーム内に存在することを示した。
【０１７１】
本研究は、ＡＱＰが正常患者に由来する尿中エキソソーム内に存在するほか、また、移植時における臓器またはドナーの状態とは無関係に、腎移植に供された全ての患者においても存在すること示す（表４）。
【０１７２】
膜成分とバイオマーカーの間の関係
ＡＱＰ１が、ネフロン内の近位尿細管と関連し（Ｋｎｅｐｐｅｒ  Ｍ．Ａ．、１９９７年、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、２７２巻：Ｆ３〜Ｆ１２頁）、ＡＱＰ２が、遠位尿細管と関連し、ＡＱＰ３が、集合管と関連することを考慮して、ＡＱＰ１、ＡＱＰ２、およびＡＱＰ３により免疫精製されたエキソソームについて、ＮＧＡＬの存在度を解析した。
【０１７３】
ＮＧＡＬ
免疫精製されたエキソソームの各々におけるＮＧＡＬの発現は、それらの膜内にＡＱＰ１を伴うエキソソームについては、ＮＧＡＬの存在度が著明に高く（ｐ＜０．０５、図４）、ＡＱＰ２を伴うエキソソームおよびＡＱＰ３を伴うエキソソームがこれに続き、後二者の間では有意差が見られないことを示唆する。データは、腎臓の近位尿細管に由来するエキソソームは、腎損傷マーカーであるＮＧＡＬの存在度が高いことを示唆する。
【０１７４】
結論
移植の１日後の腎損傷におけるバイオマーカーの解析は、全尿ではなく、尿のエキソソーム画分に対してウェスタンブロット法を用いるバイオマーカーの検出を可能とした。これらのバイオマーカーは、この技法を健常患者において用いては検出不能である。
【０１７５】
ＮＧＡＬは、解析される全ての患者において、腎移植の１日後に採取される尿試料のエキソソーム画分内に存在することから、エキソソーム内の分子的因子の発現が、移植手順と関連する移植片内の腎損傷の発症に起因することが示唆される。興味深いことに、患者１、４、および７は共に、高レベルのＮＧＡＬを示した。これらの患者のうちで、患者１および７は、移植後第１週の間に、透析療法を必要とする移植片の機能に遅延を示した。これらの予備的結果は、尿中エキソソーム内のＮＧＡＬレベルの上昇が、腎移植における腎機能異常の確立において臨床的役割を果たすことを示す。
【０１７６】
これらのマーカーの存在度を決定するための定量的方法を用いると、例えば、ＥＬＩＳＡを用いて、腎移植と関連する腎損傷の程度を決定するための限界、ならびに移植片の機能および生存率におけるそれらの関与を確立することが可能となる。
【０１７７】
解析に基づくと、ＮＧＡＬは、近位尿細管から得られる尿中エキソソーム内で主に発現される。
【０１７８】
（実施例６）
研究対象群についての記載
統計学的解析、試料の調製、ウェスタンブロット法のプロトコール、全尿、全エキソソーム、免疫精製されたエキソソームに関しては、前出の実施例で用いられた同じ手順を用いた。
【０１７９】
本実施例では、３０ｍｌの尿試料を、集中治療室（ＩＣＵ）に収容された患者の２回目の排尿から得、滅菌容器内に保管した。試料は、さらなる処理およびウェスタンブロット解析まで−８０℃で保管した。
【０１８０】
研究群
研究群は、ＩＣＵに収容された２８例の個体であって、年齢が２１〜９５歳の範囲にわたり、１９例の男性および９例の女性を伴う個体を含んだ。４６％（２８例中１３例）が、ＲＩＦＬＥ分類に従うＡＫＩを発症した。
【０１８１】
以下の表５に、年齢、性別、および通常の方法に従い決定されるＡＫＩ病期を示す。
【０１８２】
【表５−１】
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【０１８３】
【表５−２】
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これら２８例の患者のうちの４６％が、ＡＫＩを伴うと診断され、９例は女性（３２％）であり、１９例は男性（６８％）であった。ＡＫＩ病期に従う分類は、この群の主な構成員には、男性の数が多いことを示す。
【０１８４】
ＡＫＩ病期および年齢に関する関係は観察されていないが、５７％（１６例の患者）は、４５歳より年長であった。
【０１８５】
（実施例７）
全エキソソーム、エキソソームを含まない尿、および免疫精製されたエキソソームにおける腎損傷のバイオマーカーについての解析
ウェスタンブロット法により、ＡＫＩバイオマーカーであるＮＧＡＬを、エキソソームを含まない尿（ＥＦ−Ｕ）、全エキソソーム画分（ＴＥ）、および免疫精製されたエキソソーム（ＩＰ−Ｅ）について解析した。ウェスタンブロット法を用いたところ、研究における２８例の患者のうち、患者１７は、検出可能なレベルのＮＧＡＬを示した。以下の表６は、研究対象である患者におけるバイオマーカーの検出についての結果を示す。
【０１８６】
【表６−１】
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【０１８７】
【表６−２】
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ＡＫＩを伴うと診断された患者（２８例中１３例）のうちの１００％（１３例中１３例）は、被験画分のうちの少なくとも１つにおいてＮＧＡＬが検出可能であった。ＡＫＩについての診断が陰性の患者の場合は、３３％がＮＧＡＬの陽性を示す。
【０１８８】
さらに、ＡＫＩを伴うと分類された患者では、症例のうちの８５％において、エキソソーム画分内のＮＧＡＬの存在度が、ＥＦ−Ｕ画分と比較して高かった。ＡＫＩの診断を伴う５例の患者が、エキソソーム画分内のＮＧＡＬの優先的な発現を示した（患者５、８、９、１２、および１６）のに対し、ＥＦ−Ｕ画分内のそれらのＮＧＡＬレベルは極めて低かった。ＡＫＩの診断およびＮＧＡＬが陽性である２例の患者だけが、いずれの画分においても同等なＮＧＡＬの存在度を示した（患者２および７）。
【０１８９】
ＡＫＩの診断が陰性の群では、６０％が検出不能なＮＧＡＬレベルを示す。ＡＫＩの診断が陰性であり、ＮＧＡＬが陽性であると分類された全ての患者は、エキソソーム画分内に高レベルのＮＧＡＬを示した。
【０１９０】
【表７−１】
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【０１９１】
【表７−２】
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患者は、ＡＫＩ３を最も重篤とするＡＫＩの３つの病期に分類された。ＡＫＩを伴うと診断された１３例の患者のうち、５例が、ＡＫＩ１と分類され、５例（１００％）が、エキソソーム画分内に高存在度のＮＧＡＬを示した。ＡＫＩ２を伴うと診断された３例の患者のうち、３例が、エキソソーム画分内に高存在度のＮＧＡＬを示した。ＡＫＩ３を伴うと診断された５例の患者のうち、３例（６０％）が、エキソソーム画分内に高存在度のＮＧＡＬを示した（表７）。
【０１９２】
さらに、エキソソームを含まない尿（ＥＦ−Ｕ）画分と全エキソソーム（ＴＥ）画分とにおけるＮＧＡＬの相対存在度も解析した。
【０１９３】
ＩＣＵに収容され、ＡＫＩ１、ＡＫＩ２、およびＡＫＩ３を伴うと診断された患者の尿中ＮＧＡＬレベルを個別に決定した。結果は、ＡＫＩ１およびＡＫＩ２の場合、ＴＥ内のＮＧＡＬの存在度がＥＦ−Ｕ中と比較して高いが、損傷レベルが上昇すると共に、ＮＧＡＬの存在度もまた上昇することを明らかに示す（図６）。
【０１９４】
ＡＫＩの診断が陰性の患者群では、３３％（１５例中５例）が、ＴＥ画分内に検出可能なレベルのＮＧＡＬを示した。この画分内のＮＧＡＬの存在度レベルは、平均で１３．５±９．８ＡＵであった。これらのレベルは、ＡＫＩ１を伴う患者のＴＥ内で見出されるレベルより著明に低かった（７９．６±２２ＡＵ、図６）。これは、血清クレアチニンレベルによっては検出されなかった初期の腎損傷として解釈されうるであろう。
【０１９５】
かつてのデータは、ＴＥ内のＮＧＡＬの測定が、血清クレアチニンを用いるＡＫＩの診断の２４時間前におけるＡＫＩの診断について感度の高い方法であることを示す。
【０１９６】
ＮＧＡＬの相対存在度をＴＥ画分内とＥＦ−Ｕ画分内とで比較するために、ＴＥ／ＥＦ−Ｕ比を計算した。結果（図７）は、ＡＫＩ１の場合、ＴＥ内のＮＧＡＬの存在度が、ＥＦ−Ｕ内と比較して４５倍高く、ＡＫＩ２の場合、１３倍高いことを示す。それにもかかわらず、ＡＫＩ３を伴うと診断された患者は、有意差を示さなかった。データは、血清クレアチニン法を用いてＡＫＩの診断を確立する前の２４時間において、尿中エキソソーム内のＮＧＡＬは、ＡＫＩ（ＡＫＩ１、およびＡＫＩ２）の早期検出において高い感度を有することを示す。
【０１９７】
かつての結果は、ＡＫＩ１を伴う患者における全エキソソーム（ＴＥ）内のＮＧＡＬの存在度が高いことを示したので免疫精製されたエキソソーム（ＩＰ−Ｅ）内のＮＧＡＬの存在度についてさらに解析した。ＡＫＩ１を伴うと診断された患者におけるエキソソームを免疫精製するには、ＡＱＰ１を用いた。ＩＰ−Ｅ画分内のＮＧＡＬの存在度を、ＴＥ画分内およびＥＦ−Ｕ画分内と比較した。結果は、ＩＰ−Ｅ内のＮＧＡＬの存在度がＴＥ画分内より高く、ＥＦ−Ｕ画分内よりなお高いことを示す（図８）。
【０１９８】
データは、エキソソームをネフロンの近位尿細管部分から免疫精製することにより、ＮＧＡＬの存在度が高まり、したがって、危機的な患者におけるＡＫＩの早期検出の感度も高まることを示す。
【０１９９】
尿中ＮＧＡＬの決定を確立することを可能とする、本実施例の２８例の患者による群についての解析は、血清中のクレアチニンレベルについての通常の方法が可能となる前の２４時間においてＡＫＩの診断についての良好な方法である。
【０２００】
エキソソーム画分内のＮＧＡＬの存在度は、エキソソームを含まない尿画分内より高く、したがって、特に、病期ＡＫＩ１およびＡＫＩ２については、早期ＡＫＩの診断のための感度の高い方法であることが示される。
【０２０１】
エキソソームの免疫精製は、ＡＱＰ１により免疫精製されたエキソソーム内のＮＧＡＬの存在度が高いことに起因して、ＡＫＩの検出感度の上昇を可能とする。
【０２０２】
他の病態も、尿中ＮＧＡＬレベルを上昇させうることを踏まえると、免疫精製されたエキソソームの解析は、測定されたＮＧＡＬが、腎臓に由来することを確立させ、早期ＡＫＩを検出するためのエキソソームバイオマーカーの決定における特異性が増大する。
【図２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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