(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(A) Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Ser-Ser-Gly-Trp-Met-Asp-nPhe-Gly-Arg-Arg-Ser-Ala-Glu-Asp-Glu-Asn(配列番号1)；
pGlu-Gly-Pro-Trp-β-isoVal-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys (配列番号2);
pGlu-Gly-Pro-Trp-Ile-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys (配列番号3);
pGlu-Gly-Pro-Trp-Val-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys (配列番号4);
Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly (配列番号5); および
Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-nPhe-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly (配列番号6)
からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つから構成される模倣ペプチドならびに(B)該模倣ペプチドにカップリングされた免疫原性担体を含むポリペプチド免疫原性組成物、ここでProはプロリンのL異性体であり、proはプロリンのD異性体である、前記ポリペプチド免疫原性組成物。
【請求項２】
模倣ペプチドが、アミノ酸配列：Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Ser-Ser-Gly-Trp-Met-Asp-nPhe-Gly-Arg-Arg-Ser-Ala-Glu-Asp-Glu-Asn(配列番号1)を有し、ProはプロリンのL異性体であり、proはプロリンのD異性体である、請求項１に記載のポリペプチド免疫原性組成物。
【請求項３】
免疫原性担体が、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、百日咳トキソイド、およびツベルクリン純粋タンパク質誘導体からなる群より選択される、請求項１に記載のポリペプチド免疫原組成物。
【請求項４】
免疫原性担体が破傷風トキソイドである、請求項３に記載のポリペプチド免疫原性組成物。
【請求項５】
有効量の請求項１に記載のポリペプチド免疫原および該免疫原のための製薬上許容し得るビヒクルを含む免疫原性組成物。
【請求項６】
製薬上許容し得る担体が、前記免疫原が存在する水相、および油相のエマルジョンを含む、請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
油相がスクアレン、スクアラン、モノオレイン酸ソルビタン、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノパルミテートおよびポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエートのうちの少なくとも1種を含む、請求項６に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
油相が乳化剤を含む、請求項６に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
油相または水相のいずれかが少なくとも1種のアジュバントを含有する、請求項６に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
アジュバントが、Nor-MDP、イミキモッド、環状ジグアニル酸、トレオニル-N-アセチル-ムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン、イソプリノシン、トレハロースジミコール酸、QS-21、α-ガラクトシルセラミド、およびα-グルコシルセラミドからなる群より選択される、請求項９に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
アジュバントが、(S)-(-)-6-フェニル-2,3,5,6-テトラヒドロイミダゾ[2,1-b]チアゾール塩酸塩、1-シアノ-2-メチル-3-(2-[[5-メチル-1H-イミダゾール-4-イル)メチル]スルファニル]エチル)グアニジン、Praziquantel、尿酸、マンナン、ならびにビタミンEからなる群より選択される、請求項９に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys (配列番号7);
Ser-Ser-pro-pro-pro-pro-Cys (配列番号8);
Thr-Thr-Pro-Pro-Pro-pro-Cys (配列番号9); および
Thr-Thr-pro-pro-pro-pro-Cys (配列番号10)
からなる群より選択されるスペーサーペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒトプロガストリンペプチドに対する免疫原性組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
胃腸(GI)癌は、世界的にヒトにおける最も一般的な形態の癌であり、多くの国で死亡原因の第一位である。いくつかの増殖因子が、GI悪性腫瘍の増殖を行うことが知られており、特にそれらは一般にプレプロガストリンのプロセッシングから生成されたペプチドホルモンのファミリーである。正常な組織におけるプレプロガストリンの成熟は、中間体プロガストリンの多段階プロセッシングを含み、循環中に認められる主要なアミド化形態のガストリン；それぞれ、「大」および「小」ガストリンとして知られるガストリン-34(G34)およびガストリン-17(G17)を誘導する。これらのホルモンは、粘膜の細胞増殖および特に、食品の摂取後の胃酸の(食後)分泌を調節する。プロガストリンおよびガストリン、特に、G17およびグリシン伸長型のG17(gly-G17)は、in vitroおよびin vivoの双方において、GI悪性腫瘍における栄養的な役割を果たすことが報告されており、いくつかの観察が、治療目的のためのこれらのガストリンの標的化された阻害に関する事例を支持する。
【０００３】
特定の癌促進性の増殖因子およびホルモンに対する免疫化は、特定の癌、特に、乳癌、肺癌、および特定の型のGI癌の治療および予防に有用であることが公知である。さらに、胃-食道および胃-十二指腸潰瘍性疾患の治療および予防に対する免疫学的手法も、これらの慢性症状の治療に有効であり得る。
【０００４】
いくつかの治療手法が成功裏に用いられてきたが、特にその一つは標的化されたヒトまたはヒト化モノクローナル抗体(huMAb)を用いるものである。しかしながら、商業的なhuMAbの製造および送達を設定する費用および困難性を考えると、特に、発展途上国のための、さほど高価ではない代替戦略が必要である。
【０００５】
GI癌および疾患について、これらの免疫学的手法は、疾患を促進する胃腸ペプチドホルモンの生物活性を中和する特異的抗体の生成を必要とする。必要とされる抗体は、特定の増殖因子もしくはホルモン、またはホルモン前駆体に対して特異的でなければならない。1種以上の因子またはホルモンを選択的に標的化して、特定の疾患を治療することができる。
【０００６】
例えば、ヒト胃腸ホルモンガストリン17(「huG17」)は、酸を刺激し、従って胃および十二指腸の潰瘍を引き起こすその能力のため、胃食道逆流疾患などの胃腸疾患プロセスに関与する。さらに、huG17は、いくつかのGI癌の増殖を刺激することが示されている。
【０００７】
従って、huG17の作用を中和することができる特異的抗huG17抗体が、huG17が関与する疾患を治療するための臨床試験において用いられてきた。抗huG17抗体を、例えば、受動免疫によって患者に投与するか、またはそれらを能動免疫により患者中で誘導することができる。
【０００８】
同様に、アミド化ガストリンは循環中で唯一の生物学的に活性な形態のガストリンであると考えられていたが、現在では、ヒトGI癌患者および誘導された癌細胞系を用いる研究に基づいて、プロガストリン形態のプレプロガストリンが増殖能力を有することの相当の証拠が存在する。実際、GI癌細胞は一般に、プレプロガストリンおよびプロガストリンのようなガストリン前駆体をその通常のアミド化形態に十分にプロセッシングすることができない；従って、癌患者における血清レベルは、通常のアミド化形態のレベルよりも非常に高いこれらの前駆体形態のガストリンのレベルを示す。アミド化ガストリンまたはグリシン伸長ガストリンではなく、プロガストリンの血漿レベルは、結腸直腸ポリープを有する患者または対照と比較して、結腸直腸癌を有する患者において有意に上昇することが報告されている(Siddheshwarら、Gut 48: 47-52, 2001)。また、プロガストリン、アミド化ガストリン、総ガストリン、およびグリシン伸長ガストリンは、それぞれ、結腸直腸癌(CRC)患者の100％、69％、56％および44％において検出され(Ciccotostoら、Gastroenterology 109: 1142-53, 1995)、これは癌が実際にはガストリンを完全にプロセッシングできなかったことを示唆している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Siddheshwarら、Gut 48: 47-52, 2001
【非特許文献２】Ciccotostoら、Gastroenterology 109: 1142-53, 1995
【発明の概要】
【００１０】
以下で詳細に考察されるように、従来技術における欠点に対処するため、本発明は、その一態様に従って、(A)(i)プロガストリンまたはN末端および／もしくはC末端プロセッシングされたプロガストリンの種のアミノ酸配列と、それに連結された(ii)7アミノ酸のスペーサーから構成される模倣ペプチドならびに(B)該模倣ペプチドにカップリングした免疫原性担体を含むポリペプチド免疫原を提供する。本発明の一実施形態によれば、前記ポリペプチド免疫原は、アミノ酸配列：Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Ser-Ser-Gly-Trp-Met-Asp-nPhe-Gly-Arg-Arg-Ser-Ala-Glu-Asp-Glu-Asn(配列番号1)を有する模倣ペプチドを含む。別の実施形態によれば、模倣ペプチドは、pGlu-Gly-Pro-Trp-β-イソVal-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys (配列番号2);
pGlu-Gly-Pro-Trp-Ile-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys (配列番号3);
pGlu-Gly-Pro-Trp-Val-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys (配列番号4);
Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly (配列番号5); および
Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-nPhe-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly (配列番号6)
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。本発明に従えば、免疫原性担体を、特に、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、百日咳トキソイド、およびツベルクリン純粋タンパク質誘導体から選択することができる。
【００１１】
本発明の別の態様によれば、有効量の上記ポリペプチド免疫原、および免疫原のための製薬上許容し得るビヒクルを含む免疫原性組成物が提供される。好ましい実施形態においては、製薬上許容し得る担体は、免疫原が存在する水相、および油相のエマルジョンを含む。この油相は、スクアレン、スクアラン、モノオレイン酸ソルビタン、ポリソルベート(登録商標)40および／またはポリソルベート80などの少なくとも1種の生分解性油を含む。油相はまた、個別の乳化剤を含んでもよい。さらに、油相または水相は1種以上のアジュバントを含んでもよい。
【００１２】
さらに別の態様によれば、本発明は、上記の模倣ペプチドとの連結において特に好適である7アミノ酸のスペーサーペプチドを提供する。そのようなスペーサーペプチドの例は、Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys (配列番号7); Ser-Ser-pro-pro-pro-pro-Cys (配列番号8); Thr-Thr-Pro-Pro-Pro-pro-Cys (配列番号9); およびThr-Thr-pro-pro-pro-pro-Cys (配列番号10)からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】コンジュゲートhG18-TT、hG18-DT、hG21-TTおよびhG21-DT(それぞれ、A、B、CおよびD)の各々を含む免疫原を用いる3回の免疫化に応答する、ELISAにより測定されたマウスにおける抗体応答を示す図である。
【図１Ｂ】コンジュゲートhG18-TT、hG18-DT、hG21-TTおよびhG21-DT(それぞれ、A、B、CおよびD)の各々を含む免疫原を用いる3回の免疫化に応答する、ELISAにより測定されたマウスにおける抗体応答を示す図である。
【図１Ｃ】コンジュゲートhG18-TT、hG18-DT、hG21-TTおよびhG21-DT(それぞれ、A、B、CおよびD)の各々を含む免疫原を用いる3回の免疫化に応答する、ELISAにより測定されたマウスにおける抗体応答を示す図である。
【図１Ｄ】コンジュゲートhG18-TT、hG18-DT、hG21-TTおよびhG21-DT(それぞれ、A、B、CおよびD)の各々を含む免疫原を用いる3回の免疫化に応答する、ELISAにより測定されたマウスにおける抗体応答を示す図である。
【図２Ａ】それぞれ、以下の実施例1および実施例2のペプチド1(hG18-TT)およびペプチド2(hG21-TT)を用いて構築されたコンジュゲートの1回の投与に関する、ELISAにより測定されたウサギにおける抗体応答を示す図である。
【図２Ｂ】それぞれ、以下の実施例1および実施例2のペプチド1(hG18-TT)およびペプチド2(hG21-TT)を用いて構築されたコンジュゲートの1回の投与に関する、ELISAにより測定されたウサギにおける抗体応答を示す図である。
【図３】免疫原G18-TTおよびG21-TTで処理されたマウスにおけるヒト胃癌細胞(BCG-823細胞)の阻害を示す図である。42日目の動物に、ヒト胃癌細胞を含有する滅菌、密閉された中空のファイバー管を埋め込んだ。示されるように、いくらかの動物は免疫原に加えて、慣用的な胃癌化学療法剤を受けた。
【図４Ａ】G21免疫原について得られた結果と比較した、本発明の様々な免疫原コンジュゲートを用いてマウスを免疫することにより得られた結果を示す図である。
【図４Ｂ】G21免疫原について得られた結果と比較した、本発明の様々な免疫原コンジュゲートを用いてマウスを免疫することにより得られた結果を示す図である。
【図４Ｃ】G21免疫原について得られた結果と比較した、本発明の様々な免疫原コンジュゲートを用いてマウスを免疫することにより得られた結果を示す図である。
【図４Ｄ】G21免疫原について得られた結果と比較した、本発明の様々な免疫原コンジュゲートを用いてマウスを免疫することにより得られた結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
増殖因子または胃腸ペプチドホルモンに対する能動免疫は、標的化された因子またはホルモンに結合する抗体を誘導する化学構造を含む免疫原を患者に投与することにより達成される。そのような化学構造は、標的化された因子またはホルモンの免疫学的ペプチド模倣体として構築され、それらは標的またはその標的のエピトープと免疫学的に交叉反応する任意の分子から構成させることができる。これらの免疫原は、抗体を誘導する固有の能力を有し得る免疫学的ペプチド模倣体(「免疫模倣体」)であり、例えば、それらは免疫原性であってよい。さらに、免疫模倣体は、本質的に免疫原性ではないことも多く、従って、強力な免疫原性特性を有する担体(「免疫原性担体」)に連結し、それによって、複合体を免疫原性にしなければならない。
【００１５】
本発明に従えば、任意の化学構造が、例えば、Watsonら、Expert Opin. Biol. 1: 309-17 (2001)およびWatsonら、Cancer Res. 56: 880-85 (1996)により例示されたようなhuG17のエピトープと免疫学的に交叉反応する免疫模倣体として働くことができる。本発明の好ましい実施形態においては、ペプチド模倣体は、ヒト小ガストリンならびにグリシン伸長ガストリンに結合する交叉反応性抗体を刺激するように設計された、huG17のアミノ末端エピトープをその中に含むhuG17の一部である。免疫原のスペーサーエレメントは、免疫模倣体(ペプチド模倣体 + スペーサー)が担体に結合する連結点として働く。スペーサーはまた、免疫原のエピトープ部分に対する免疫応答に影響し得る。
【００１６】
スペーサーを介してジフテリアトキソイドにカップリングしたhuG17のN末端ノナペプチド部分を用いる免疫化は、ラットにおける実験的潰瘍および免疫不全マウスにおけるGIヒト癌異種移植片の両方を阻害することが報告されている。GIを有する患者において、「G17DT」として知られるこの免疫原を用いるいくつかの臨床試験が実施され、有意な結果を出しているが(Watsonら(2001)を参照)、この免疫原を用いる最新の米国での第III相臨床試験は、後期段階の膵臓癌の治療において統計的有意性に到達できなかった。
【００１７】
初期の臨床試験においてはいくらかの成功を示しているが、G17DT手法は、特に、GI悪性疾患におけるガストリン遺伝子発現の顕著な不均一性を考慮に入れていなかった。正常な胃の細胞および組織中では、最も豊富な分泌／循環ガストリン種はG17およびG34である。しかしながら、多くの科学的報告書は、これらの後者の種が実際には、循環中に50％未満、特定の事例では、10％〜20％ほどの少なさのガストリン形態を構成することがあることを示している。
【００１８】
主要な種は、例えば、Rehfeldら、Regulatory Peptides 120: 177-83(2004)に記載された「プロガストリン」として知られるプロセッシングされた中間体である。プロガストリンは、伝統的なガストリン受容体とは無関係である実質的な増殖促進活性を有することが示されている。かくして、上記のG17DT免疫原により生じた抗体は同様に、GI癌患者の循環中に豊富であるプロセッシングされていない／部分的にプロセッシングされた形態のガストリン(プロガストリン)の主要な循環種ではなく、G17およびC末端伸長された形態のみを捕捉する。
【００１９】
本発明の新規免疫原組成物が、癌患者において循環中に認められるガストリンおよびプロガストリンの形態を標的化することにより対処することは、特に従来技術におけるこの欠点である。これに関して、本発明者らは、好適なスペーサーペプチドにカップリングさせた場合、huG17の特定のペプチド模倣体により、従来の免疫原と比較して、予想外に改善された免疫応答をもたらす免疫原が得られることを発見した。
【００２０】
本発明者らはまた、本発明に従えば、改変アミノ酸を用いて、しばしば、天然アミノ酸を含有するペプチドよりも高レベルで交叉反応性抗体の惹起を許容しながらでも、隣接するペプチドの「外来」の固有の特性を増強することができることを発見した。より具体的には、侵入する微生物および「外来」抗原のマクロファージおよび単球によるプロセッシングが、ハロゲン化反応および酸化およびニトロシル化反応をもたらすことが公知である。かくして、得られた化学的改変は、タンパク質およびペプチドの抗原性およびその後の免疫原性を増加させると理解された。従って、本発明は、ペプチド免疫原の免疫原性を増加させるための、パラ-クロロまたはパラ-ニトロ-フェニルアラニン残基などの1個以上のハロゲン化またはニトロシル化アミノ酸残基の含有を包含する。これが、例えば、パラ-NO2-フェニルアラニン(nPhe)が以下に詳述される特定の本発明の免疫原(配列番号1および6)に出現する理由である。
【００２１】
従って、本発明の一態様によれば、改良された免疫原は、それぞれ、プロガストリンならびにプロガストリンのN末端および／またはC末端プロセッシングされた種に対するポリクローナル抗体を生成する。そのような免疫原の例は、(i)アミノ酸残基：Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Ser-Ser-Gly-Trp-Met-Asp-nPhe-Gly-Arg-Arg-Ser-Ala-Glu-Asp-Glu-Asn(配列番号1)のペプチド、それにカップリングした(ii)免疫原性担体を含むものである(本明細書中の配列表において適用された慣例については以下を参照されたい)。従って、この実施形態は、プロガストリン成分(プレプロガストリンの残基88〜101)と、7アミノ酸のスペーサーを包含し、21アミノ酸(G21)のペプチドである免疫模倣体を構成する。
【００２２】
本明細書の意味において、免疫原性担体は、任意の好適な高分子量担体、典型的には、タンパク質またはそれに共有連結されたハプテンもしくはペプチド配列に対する免疫応答を生じることができる十分な分子的複雑性を有する大分子(すなわち、一般に6000 kDを超える)であってよい。好適な免疫原性担体のカテゴリーは、限定されるものではないが、ジフテリアトキソイド(DT)、破傷風トキソイド(TT)、百日咳トキソイド、およびツベルクリン純粋タンパク質誘導体(PPD)により例示される。これらのうち、破傷風トキソイドが好ましい免疫原性担体である。このカテゴリーはまた、Fifisら、J. Immunol. 173: 3148-54 (2004)により記載されたナノビーズなどの粒子状担体ならびに市販のデンドリマー、例えば、PAMAMデンドリマーおよびMAPデンドリマーも包含する。Aguilarら、J. Pept. Sci. 15: 78-88 (2009)を参照されたい。
【００２３】
本明細書の意味において、語句「製薬上許容し得るビヒクル」は、免疫原の免疫原性効果を減じることなく免疫原を運搬する医学的に安全な非毒性物質を指す。好適なビヒクルは、以下でさらに説明されるような液体エマルジョンであってよく、またはそれは安定な粒子状物質、例えば、製薬上安全な凍結乾燥粉末もしくは製薬上許容し得るシリカゲルもしくは合成の非感染性ウイルス様粒子(VLP)であってよい。Fields Virology, Vol. 1, D.M. Knipe & P. Howley (編), Lippincott Williams & Wilkins (2007)を参照されたい。
【００２４】
本発明にとって、好ましい形態の製薬上許容し得るビヒクルは、ポリペプチド免疫原を含有する水相、および油相のエマルジョンである。油相は、意図される投与の用量範囲において非毒性的である、水相と混和しない少なくとも1種の生分解性油を含む。油は天然のものまたは合成のものであってもよく、治療的使用のための国際規制基準を満たすと一般に認識される様々な利用可能なそのような油が存在する。そのような好適な油の例は、スクアレン、スクアラン、モノオレイン酸ソルビタン、ポリソルベート40およびポリソルベート80である。好ましい油相は、これらの5種の油の全部を含む。
【００２５】
さらに、油相は、モノステアリン酸アルミニウムまたはアジュバント活性オレイン酸サッカリドもしくはステアリン酸サッカリドエステルなどの個別の乳化剤を含有してもよい。
【００２６】
本発明の別の態様によれば、上記のエマルジョンの油相または水相は、ポリペプチド免疫原の免疫原性担体成分とは異なる少なくとも1種のアジュバントを含有する。様々な公知のアジュバントが存在し、その任意の1種以上を本発明における使用のために考慮することができる。そのような公知のアジュバントの例は、Nor-MDP、イミキモッド、環状ジグアニル酸、トレオニル-N-アセチル-ムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン、イソプリノシン、トレハロースジミコール酸、QS-21、α-ガラクトシルセラミド(α-GalCer)、およびα-グルコシルセラミド(α-GluCer)である。さらに、このアジュバント規則に関して、本発明は、典型的には、アジュバント自体と見なされない場合に、それにもかかわらず免疫刺激的である材料の使用を包含する。これらの材料の例は、Ergamisol(登録商標)（レバミソール塩酸塩、すなわち(S)-(-)-6-フェニル-2,3,5,6-テトラヒドロイミダゾ[2,1-b]チアゾール塩酸塩）、Cimetidine（1-シアノ-2-メチル-3-(2-[[5-メチル-1H-イミダゾール-4-イル)メチル]スルファニル]エチル)グアニジン）、Praziquantel、尿酸、マンナンおよびマンナンの誘導体、ならびにビタミンEである。
【００２７】
本発明のさらなる態様によれば、改良された免疫原は、huG17およびgly-huG17のアミノ末端エピトープに対するポリクローナル抗体を生成する。これらの免疫原の例は、(i)配列：pGlu-Gly-Pro-Trp-isoVal-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys(配列番号2)のペプチド、それにカップリングした(ii)上記の免疫原性担体を含むものである。ここで、本明細書中の他の場所と同様、「イソVal」は、Leuのβアミノ酸模倣体を指し、一般にLeuに置換することができ、「pGlu」は、huG17ホルモンの生物活性N末端に見出されるアミノ酸誘導体であるピログルタミン酸である。再び、破傷風トキソイドは、この実施形態のための好ましい免疫原性担体であり、そこでN末端huG17の改変物(プレプロガストリンの残基76〜86) + 7アミノ酸のスペーサーがG-18ペプチドである免疫模倣体を構成する。
【００２８】
本発明のさらなる実施形態は、(i)配列pGlu-Gly-Pro-Trp-Val-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Thr-Thr-Pro-Pro-Pro-pro-Cys(配列番号3)のペプチド、それにカップリングした(ii)上記の免疫原性担体を含む免疫模倣体である。同様に、破傷風トキソイドが、この実施形態において好ましい免疫原性担体であり、そこでN末端huG17の改変物(プレプロガストリンの改変された残基76〜86) + 7アミノ酸のスペーサーがG-18 LVペプチド、huG17の免疫模倣体を構成する。代替として、この実施形態によれば、「G18 LI」と命名された配列pGlu-Gly-Pro-Trp-Ile-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cysのペプチドが、huG17の相同的免疫模倣体を構成するペプチド(i)として用いられる。
【００２９】
本発明のさらに別の実施形態は、(i)配列：Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly(配列番号5)のペプチド、それにカップリングした(ii)上記の免疫原性担体を含む免疫模倣体である。かくして、この実施形態は、プレプロガストリンの残基79〜93 + 7アミノ酸のスペーサーがG-20ペプチドを構成する、huG17のグリシン伸長免疫模倣体である。
【００３０】
また、本発明の一実施形態は、(i)配列：Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-nPhe-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly(配列番号6)のペプチド、それにカップリングした(ii)上記の免疫原性担体を含む免疫模倣体である。従って、この実施形態は、プレプロガストリンの残基79〜93 + 7アミノ酸のスペーサーがG-20 YFペプチドを構成する、huG17の改変グリシン伸長免疫模倣体である。
【００３１】
以下に列挙される残りのペプチド配列(配列番号7〜10)は、1個以上のD異性体プロリルアミノ酸を含むスペーサーであり、本発明者らが発見した特徴は、担体上への隣接する免疫原ペプチドの適切な位置的提示にとって重要である。この意味において、Dアミノ酸異性体は好適な配置を可能にし、ならびにAPC提示のための免疫原の持続性を増強し、より高力価の抗体が得られる。
【００３２】
以下の一覧において、配列番号7として同定されたペプチドは、スペーサーペプチド：Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cysである。さらに、配列番号8は、スペーサーペプチド：Ser-Ser-pro-pro-pro-pro-Cysであり、配列番号9は、スペーサーペプチド：Thr-Thr-Pro-Pro-Pro-pro-Cysであり、および配列番号10は、スペーサーペプチド：Thr-Thr-pro-pro-pro-pro-Cysである。
【００３３】
従来技術においては、免疫模倣体-担体複合体を用いる免疫化による有効な抗体応答の誘導には、典型的には免疫原の2回以上の投与を必要とし、抗体力価が所望のレベルまで上昇するには数週間または数ヶ月かかる。対照的に、本発明の改良された免疫原は、免疫原の初期過程の投与の直後に有効なレベルの抗体を誘導する。かくして、惹起された抗体のレベルは数ヶ月間にわたって上昇したままであり、免疫原の単回注射によるその後の追加免疫の際により高レベルまで容易に上昇する。
【００３４】
本発明を以下の実施例を参照することによりさらに説明するが、これは例示に過ぎず、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００３５】
標準的な固体状態の合成方法により、ペプチドを調製した。それぞれのペプチドを、アミノ酸含量および純度に関して特性評価した。
【００３６】
かくして、以下に列挙されるアミノ酸配列を有するペプチドを合成した。これらの配列において、本明細書の他の箇所におけると同様、大文字で始まるアミノ酸はL異性体アミノ酸であるが、小文字で始まるものはD異性体である。
【００３７】
(1)Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Ser-Ser-Gly-Trp-Met-Asp-nPhe-Gly-Arg-Arg-Ser-Ala-Glu-Asp-Glu-Asn (配列番号1)、「G-21」と命名、
(2)pGlu-Gly-Pro-Trp-イソVal-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys (配列番号2)、「G-18」と命名、
(3)pGlu-Gly-Pro-Trp-イソVal-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys (配列番号3)、「G-18 LV」と命名(ヒトG17相同体)、
(4)pGlu-Gly-Pro-Trp-Ile- Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys (配列番号4)、「G18 LI」と命名、
(5)Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly (配列番号5)、「G-20」と命名、
(6)Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-nPhe-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly (配列番号6)、「G-20」と命名、
(7)Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys (配列番号7)、7アミノ酸のペプチドであるセリル-プロリルスペーサー、
(8)Ser-Ser-pro-pro-pro-pro-Cys (配列番号8)、7アミノ酸のペプチドであるセリル-全部D-プロリルのスペーサー、
(9)Thr-Thr-Pro-Pro-Pro-pro-Cys (配列番号9)、7アミノ酸のペプチドであるトレオニル-プロリルスペーサー、
(10)Thr-Thr-pro-pro-pro-pro-Cys (配列番号10)、7アミノ酸のペプチドであるトレオニル-全部D-プロリルのスペーサー。
【００３８】
ペプチド1(配列番号1)は、プレプロガストリンのN末端側の残基88〜101に結合したカルボキシ末端スペーサー-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys(配列番号7)が先行するプロガストリンのパラ-ニトロフェニルアラニン改変アミノ末端免疫模倣体(-Gly-Trp-Met-Asp-nPhe-Gly-Arg-Arg-Ser-Ala-Glu-Asp-Glu-Asn)を含む。ペプチド2(配列番号2)は、イソValがLeuに置換されたhuG17の相同体であるhuG17の11アミノ酸の免疫模倣体(pGlu-Gly-Pro-Trp-Leu-isoVal-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-)、次いで、huG17免疫模倣体のプレプロガストリン残基のアミノ酸番号86に結合したスペーサー-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-D-Pro-Cys(配列番号7)を含む。ペプチド3(配列番号3)は、上記のプレプロガストリンのアミノ酸番号86に結合した、ValがイソValに置換されている以外はペプチド2と同じである、11アミノ酸の免疫模倣相同体、-Ser-Ser-pro-pro-pro-pro-Cys(配列番号8)を含む。ペプチド4(配列番号4)は、IleがイソValに置換されている以外はペプチド2と同様に、huG17の11アミノ酸の免疫模倣体、pGlu-Gly-Pro-Trp-Ile-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly、次いで、huG17の免疫模倣体のプレプロガストリンのC末端の残基番号79に結合したスペーサー-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys(配列番号7)を含む。ペプチド5(配列番号5)は、huG17のグリシン伸長免疫模倣体のプレプロガストリンN末端の残基番号79に結合したスペーサー-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys(配列番号7)が先行する、gly-huG17の15アミノ酸の免疫模倣体、Trp-Ile-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Glyを含む。ペプチド6(配列番号6)は、huG17のグリシン伸長免疫模倣体のプレプロガストリンN末端の残基番号79に結合したスペーサー-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys(配列番号7)が先行する、gly-huG17のパラ-ニトロフェニルアラニン改変された15アミノ酸の免疫模倣体、Trp-Ile-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-nPhe-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Glyを含む。ペプチド9(配列番号1)は、プレプロガストリンのN末端の残基88〜101のペプチドに結合した、カルボキシ末端スペーサー-Ser-Ser-pro-pro-pro-pro-Cys(配列番号8)が先行する、プロガストリンのアミノ末端免疫模倣体、-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly-Arg-Arg-Ser-Ala-Glu-Asp-Glu-Asnを含み、プロガストリンのヒトペプチド模倣体を形成する。
【００３９】
本発明の好ましい態様によれば、これらのペプチドはそれぞれ、破傷風トキソイド(TT)免疫原性担体上に存在するアミノ基にコンジュゲートされた。この連結は、連結剤の一方の末端にスクシンイミジルエステルを含有し、他方の末端にマレイミドを含有するヘテロ二官能性連結剤を用いる、末端ペプチドのシステイン残基を介するものであった。上記のペプチド1および2のいずれかと、担体との連結を達成するために、ペプチドのシステインを最初に還元した。乾燥ペプチドを0.1Mのリン酸ナトリウムバッファー、pH 7〜9に、5〜50モル過剰量のジチオトレイトールと共に溶解した。このペプチドを凍結乾燥し、用いるまで減圧下で保存した。
【００４０】
105分子量のTTあたり約25の遊離アミノ基の活性化を達成するのに十分な比率で、ヘテロ二官能性連結剤ε-マレイミドカプロン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(EMCS)で処理することにより、TTを活性化した。
【００４１】
精製破傷風トキソイドの調製：TTを限外濾過により精製した。回収された精製TTの最終濃度は、5〜40 mg/mlであると予想された。クロマトグラフィー(SEC HPLC)、タンパク質濃度(Lowry)、および遊離アミノ基(ニンヒドリン)により、純度を決定した。
【００４２】
ペプチドを商業的に入手し(Biosyn Corp, USA)、既知の純度および含量を有する還元ペプチドをコンジュゲーションに用いた。ペプチドをトリス(2-カルボキシエチル)-ホスフィン-HCl(TCEP)を用いて還元し、混合物をコンジュゲーションにおいて用いた。Ellmansアッセイを用いて、遊離スルフヒドラル(sulfhydral)基を決定した。
【００４３】
破傷風トキソイドの活性化：精製TTを活性化バッファー中に5〜50 mg/mlに希釈した。所望の量のTTを、テフロン(登録商標)コートされた撹拌棒を含むガラスバイアルに移し、EMCS(50〜90 mg/mlのDMF)をTT溶液に添加した。EMCS/DTのモル比は活性化レベルを決定する。最後の濃縮工程において、総量を減少させて5〜50 mg TT/mlを得た。SEC HPLC、Lowryによるタンパク質濃度、Ellman'sによる活性化レベルにより、TT溶液を決定した。
【００４４】
ペプチド-TTのコンジュゲーション：マレイミド-TTと反応するペプチドの量を算出した後、ペプチドをM-TT溶液に添加した。ペプチド-TTコンジュゲートを限外濾過により精製した。
【００４５】
ペプチドG18およびG21のコンジュゲートをEMCSによりTTに連結し、0.1〜0.5M重炭酸アンモニウムで平衡化させたG50 Sephadexカラム上、4℃での低圧クロマトグラフィーにより混合物の他の成分から分離した。それぞれの場合、コンジュゲートをカラム空隙容量中で溶出し、凍結乾燥および保存し、使用するまで4〜0℃で乾燥した。
【００４６】
重量増加、アミノ酸分析などの当業者には公知のいくつかの方法により、免疫模倣ペプチド含量に関してコンジュゲートを特性評価することができる。これらの方法により作製されたペプチドG18およびG21のTTとのコンジュゲートを、アミノ酸分析により決定したところ、104〜106 MWのTTあたり10〜30モルのペプチドを有し、全てが試験動物の免疫化にとって免疫原として好適であると考えられた。同様に、G18およびG21のDTコンジュゲートを同じ様式で調製して、抗体結合のアッセイのための基質としてhuG17を用いてELISA力価を決定した。
【実施例２】
【００４７】
実施例1のペプチド-TTコンジュゲートを、以下のように調製された水相および油相成分のエマルジョン中で投与した。コンジュゲートおよびアジュバントをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に溶解して、水相を作製した。コンジュゲートの濃度が、これらの成分が最終的なエマルジョン中に有する濃度の2倍となるように水相を調製する。以下の実施例4で用いられる免疫原を調製するために、コンジュゲートをPBS、pH 6.5〜8.0中に、5〜12 mg/mlの濃度で溶解した(勿論この広い範囲を超えてもよく、本発明者らはコンジュゲートを欲する場合、担体の程度を制御するためにそれを用いる)。
【００４８】
水相を1:1(vol:vol)で油性ビヒクル相と混合して、最終免疫原製剤を含むエマルジョンを作製した。一つのそのようなビヒクルは、20〜60部のスクアレン、70〜30部のスクアラン、2〜12部のモノオレイン酸ソルビタン、0.6〜2.0部のモノステアリン酸アルミニウム、0.1〜1部のポリソルベート80および0.2〜1.2部のポリソルベート40の混合物である。水相および油相ビヒクルは、安定化乳化混合物を形成させるために任意の公知の方法により混合してもよい。エマルジョンは保存時に安定でなければならない、すなわち、それは数週間から数ヶ月の最少保存時間にわたって水相およびビヒクル相への有意な程度の分離を受けるべきではない。エマルジョンはまた、許容可能なサイズの皮下注射針により容易に注入することができる稠度のものでなければならない。
【００４９】
免疫原を含有する水相を、2つのガラスシリンジ間の18ゲージの二本連結した針により、1:1(vol:vol)で2つの溶液の油性ビヒクル混合物を用いて乳化した。混合物を針を介して50回押した。次いで、乳化した混合物を動物への注射のために使い捨てシリンジ中に取り出した。実施例4中のための、エマルジョン中の最終免疫原濃度は、約1〜約5 mg/mlの濃度範囲のコンジュゲート：hG18TTであった。
【実施例３】
【００５０】
本発明者らは、実施例1および2に記載のように、TTおよびDTに連結された実施例1に記載のG18およびG21ペプチドの各々を含むコンジュゲートを構築した。次いで、ペプチドG18免疫原(図1A、B)を用いて6匹のマウスを免疫し、ペプチドG21免疫原(図1C、D)を用いて6匹のマウスを免疫した。
【実施例４】
【００５１】
本発明者らは、実施例1および2に記載のように、TTおよびDTに連結された、上記のG18およびG21ペプチドの各々を含むコンジュゲートを構築した。次いで、G18免疫原(図2A)を用いて4匹のウサギを免疫し、G21免疫原(図2B)を用いて4匹のウサギを免疫した。
【００５２】
図1および2に提示されるように、これらのELISA試験の結果は、免疫原1および2(実施例1および2の)が、いくつかの動物種において、ならびに誘導された抗体応答の期間において、その効力および抗体の惹起の両方に関して有効であったことを示している。
【実施例５】
【００５３】
本発明者らは、上記に記載のように、TTおよびDTに連結されたG18およびG21ペプチドの各々を含むコンジュゲートを構築した。次いで、G18TT免疫原およびG21TT免疫原を用いて6匹のマウスを免疫した。ピーク力価(42日目)において、全てのマウスは、50,000個のヒト胃癌細胞／1〜2 cmのチューブ(BCG-823)を含有する滅菌された腹腔内中空ファイバーインプラントを5日間受けた。中空ファイバー管はCTLまたはNK細胞ではなく500 KD未満の分子の浸透を許容し、免疫応答性マウス中でのヒト癌細胞の生存を可能にする。5日間の終わりに、それぞれのマウスのインプラントを除去し、生細胞をMTTアッセイにより計数し、それらを非免疫マウス中の対照インプラントと比較した。示されるように、いくらかの動物は10 mg/kgのシスプラチン(CP)または20 mg/kgの5-フルオロウラシル(5-FU)または10 mg/kgのCP + 5-FUの各々の組合せ(FUP)の単回投与でも処理した。
【００５４】
この試験の結果を図3に提示する。免疫原1および2(実施例1および2の)は、いずれかの抗ガストリン／プロガストリン(G18およびG21免疫原)を用いる場合、ヒト胃癌細胞の増殖の阻害、ならびに従来の胃癌化学療法剤の存在下で有効であった十分な抗体応答の誘導に関して有効であることを見てとることができる。
【実施例６】
【００５５】
本発明者らは、上記のG18-a、G-18-b、G20およびG20-aペプチド(それぞれ、配列番号3〜6)の各々を含むコンジュゲートを構築し、それらをG21(配列番号1)と比較した。それらは、実施例1および2に記載のように、TTに全て連結された。次いで、本発明者らは、これらの免疫原(図4A、B、CおよびDを参照)を用いて6匹のマウスを免疫し、比較のために、G21免疫原を用いて6匹のマウスを免疫した。
【００５６】
かくして示された改良は、本発明による免疫原ペプチドの免疫模倣体およびユニークなスペーサー領域中で具体化された改変物から生じる。本発明のペプチド免疫原を、上記の免疫原性模倣体およびスペーサーをいずれも含まない免疫原と比較して試験したところ、後者はさほど有効でないことがわかった。従って、従来の免疫原は、本発明者らが本発明に従ってその免疫模倣体および／またはそのスペーサーを改変することにより改良された。
[１]  (A)(i)プロガストリンのアミノ酸配列またはプロガストリンのN末端および／もしくはC末端プロセッシングされた種、それに連結された(ii)7アミノ酸のスペーサーから構成される模倣ペプチドならびに(B)該模倣ペプチドにカップリングされた免疫原性担体を含むポリペプチド免疫原。    
[２]  模倣ペプチドが、アミノ酸配列：Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Ser-Ser-Gly-Trp-Met-Asp-nPhe-Gly-Arg-Arg-Ser-Ala-Glu-Asp-Glu-Asn(配列番号1)を有する、１に記載のポリペプチド免疫原。    
[３]  模倣ペプチドが、
pGlu-Gly-Pro-Trp-β-isoVal-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys (配列番号2);
pGlu-Gly-Pro-Trp-Ile-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys (配列番号3);
pGlu-Gly-Pro-Trp-Val-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys (配列番号4);
Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly (配列番号5); および
Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-nPhe-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly (配列番号6)
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、１に記載のポリペプチド免疫原。    
[４]  免疫原性担体が、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、百日咳トキソイド、およびツベルクリン純粋タンパク質誘導体からなる群より選択される、１に記載のポリペプチド免疫原組成物。    
[５]  免疫原性担体が破傷風トキソイドである、４に記載のポリペプチド免疫原性組成物。    
[６]  有効量の１に記載のポリペプチド免疫原および該免疫原のための製薬上許容し得るビヒクルを含む免疫原性組成物。    
[７]  製薬上許容し得る担体が、前記免疫原が存在する水相、および油相のエマルジョンを含む、６に記載の免疫原性組成物。    
[８]  油相がスクアレン、スクアラン、モノオレイン酸ソルビタン、ポリソルベート40およびポリソルベート80のうちの少なくとも1種を含む、７に記載の免疫原性組成物。    
[９]  油相が乳化剤を含む、７に記載の免疫原性組成物。    
[１０]  油相または水相のいずれかが少なくとも1種のアジュバントを含有する、７に記載の免疫原性組成物。    
[１１]  アジュバントが、Nor-MDP、イミキモッド、環状ジグアニル酸、トレオニル-N-アセチル-ムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン、イソプリノシン、トレハロースジミコール酸、QS-21、α-ガラクトシルセラミド、およびα-グルコシルセラミドからなる群より選択される、１０に記載の免疫原性組成物。    
[１２]  アジュバントが、Ergamisol(登録商標)、Cimetidine、Praziquantel、尿酸、マンナンおよびマンナンの誘導体、ならびにビタミンEからなる群より選択される、１０に記載の免疫原性組成物。    
[１３]  Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys (配列番号7);
Ser-Ser-pro-pro-pro-pro-Cys (配列番号8);
Thr-Thr-Pro-Pro-Pro-pro-Cys (配列番号9); および
Thr-Thr-pro-pro-pro-pro-Cys (配列番号10)
からなる群より選択されるスペーサーペプチド。
【図１Ａ】
0005960064.tif 000002
【図１Ｂ】
0005960064.tif 000003
【図１Ｃ】
0005960064.tif 000004
【図１Ｄ】
0005960064.tif 000005
【図２Ａ】
0005960064.tif 000006
【図２Ｂ】
0005960064.tif 000007
【図３】
0005960064.tif 000008
【図４Ａ】
0005960064.tif 000009
【図４Ｂ】
0005960064.tif 000010
【図４Ｃ】
0005960064.tif 000011
【図４Ｄ】
0005960064.tif 000012
【配列表】
0005960064000001.app