(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を保持するための反応チャンバー（１ａ）および該反応チャンバー（１ａ）の下方に前記試料を加熱するための埋め込まれた金属加熱器（１ｂ）を有するチップ（１）；
前記チップ（１）の上方に配置される、関連するＬＥＤ駆動および光検出増幅器（７）を含む、蛍光を検出するための光ユニット（６）；
前記チップ（１）を囲繞してマウントされ、前記金属加熱器（１ｂ）と誘導的に結合した誘導加熱器（２）；
前記金属加熱器（１ａ）の温度を測定するための、非接触方式の前記チップ（１）の下方にマウントされる赤外温度感知器（３）、ここで該赤外温度感知器（３）は信号調整器（４）と連動する；ならびに
前記信号調整器（４）を介して前記赤外温度感知器（３）から受信されるフィードバックに基づき、前記誘導加熱器（２）への電力を調節するための、該信号調整器（４）および該誘導加熱器（２）と連動した制御器（５）
を含み、前記誘導加熱器はコイルであってチップ（１）の周りに巻かれ、コイル軸方向にみた位置がチップ近傍であり、コイル軸方向長さが、チップ（１）の上方に配置される光ユニット（６）およびチップ（１）の下方にマウントされる赤外温度感知器（３）の加熱を防ぐように、チップ近傍から外れない長さである、非接触リアルタイムマイクロポリメラーゼ連鎖反応［ＰＣＲ］システム（Ａ）。
【請求項２】
チップが、ポリ−ジメチル−シロキサン［ＰＤＭＳ］、アクリル、プロピレンおよびポリカーボネートの少なくとも１つから選択される材料から製造される、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
ＬＥＤ駆動および光検出増幅器（７）ならびに制御器（５）が、ＰＣＲの種々のパラメータをモニターするためのデータ収集および制御システム（８）と連動する、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
制御器（５）が、パルス幅変調器、線形積分微分型（ＰＩＤ）制御器およびオン／オフ切替器の少なくとも１つから選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
ノズル（１ｃ）が、反応チャンバー（１）の側部に設けられている、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
金属加熱器（１ｂ）の底面が黒色で被覆された、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
非接触リアルタイムマイクロポリメラーゼ連鎖反応［ＰＣＲ］システムの操作方法であって、
チップ（１）の反応チャンバー（１ａ）へと試料を充填すること；
埋め込み金属加熱器（１ｂ）を使用して前記試料を加熱すること、ここで該埋め込み金属加熱器（１ｂ）は、誘導加熱器（２）からの加熱エネルギーを受け取るために、該誘導加熱器（２）と誘導的に連結しており、誘導加熱器（２）はその内側にチップ（１）が位置するコイルであり、該コイルは、コイル軸方向にみた位置がチップ近傍であり、コイル軸方向長さが、チップ（１）の上方に配置される光ユニット（６）およびチップ（１）の下方にマウントされる赤外温度感知器（３）の加熱を防ぐように、チップ近傍から上下に延長しない長さであり；
赤外温度感知器（３）を使用して前記金属加熱器（１ｂ）の温度を非接触に測定すること；および
前記赤外温度感知器（３）から受信したフィードバックに基づき、制御器（５）を使用して前記誘導加熱器（２）への電力を調節すること
の行為を含む、前記方法。
【請求項８】
試料を充填する前に、チップ（１）の一端に提供されたノズルを介して、反応チャンバー（１ａ）から、閉じ込められた空気を追い出す、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
関連するＬＥＤ駆動および光検出増幅器（７）を含む光ユニット（６）を使用して蛍光を検出する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
データ獲得および制御システム（８）を使用してポリメラーゼ連鎖反応の異なるパラメータをモニターする、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
電磁誘導工程により誘導加熱器（２）から金属加熱器（１ａ）へ熱を供給する、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
ＤＮＡ増幅、ＤＮＡ抽出、細胞分析および化学分析／合成の少なくとも１つから選択されるＢＩＯ−ＭＥＭＳアプリケーションで使用される、請求項１に記載のシステム（Ａ）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本開示の態様は、非接触リアルタイムマイクロポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システムに関し、より詳細には、態様は、密封された反応チャンバーおよび赤外温度感知を有する誘導的に加熱されたチップを有するＰＣＲシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
本開示の背景
分子生物学において、ＰＣＲは、単一または数コピーのデオキシリボ核酸（DNA）の断片を数オーダーの規模で増幅する技術であり、数百万コピーの特定のＤＮＡ配列を生成する。この方法は、温度サイクリング、すなわち試料の連続的な加熱および冷却に基づく。ＰＣＲが進行するに従い、生成されたＤＮＡ自体が、複製のための鋳型として用いられる。ＰＣＲは、２５〜３０回繰り返される加熱および冷却の３つの主要な段階を含む。各サイクルは、（ｉ）すべての二本鎖が一本鎖ＤＮＡに融解する、〜９４度での変性、（ii）両プライマーが一本鎖の鋳型と対になる、より低い温度である〜５４度でのアニーリング、および（iii）鋳型に相補的な塩基を付加することによりポリメラーゼがプライマーを伸長する、〜７２度での伸長が含まれ、このようにして、各鋳型につき二本鎖ＤＮＡが２コピー生成される。
【０００３】
従来の卓上ＰＣＲシステムでは、ポリプロピレンチューブ内にロードされた試料の温度をサイクルさせる、大きな金属の加熱および冷却ブロックを使用し、反応チャンバーの最小化によって、一体化、速さ、および効率という観点から、利点が得られている。これらの利点のため、ＰＣＲ用の小型システムの開発は、積極的関心のある領域になりつつある。多くの研究グループにより、生体反応に好適な様々な材料を使用する装置が製造されている。ほとんどの研究グループは、その高い熱伝導率と良好に特徴付けられる加工条件のため、その基材としてケイ素を使用していた。そのままのケイ素は光学的に透明ではなく、かつＰＣＲ反応を阻害すると報告されている。酸化ケイ素またはガラスが好ましいが、これらのチップにおける反応チャンバー、加熱器および温度感知器の複雑な多段階製造のため、単回の使い捨てのためには、あまりにも高価となってしまう。加えて、熱蒸発を避けるために、反応チャンバーに、典型的には、融着、陽極接合、可逆的な接合および超音波接合などの種々のタイプの接合のうち１種により行う、密封段階が必要となる。他方、ポリマーは、透明であり、より低い温度で容易に成形できる、生体適合性の低コストな材料である。しかし、その熱伝導率は、ケイ素と比較すると、はるかに小さい。それゆえ、加熱器および温度感知器の設計は重要である。
【０００４】
高速マイクロチップＰＣＲプロトコルの材料選択とともに、加熱方法の選択は重要な役割を果たしている。様々なグループにより共通して使用される加熱方法には、一般的には２つのタイプがある：接触加熱および非接触加熱である。接触加熱法では、PCR溶液を加熱するための抵抗加熱器が利用される。該加熱器は典型的には薄膜金属であり、ほとんどは、その再現性のある抵抗の温度依存性、高温耐熱性、良好な化学安定性および高純度のため、白金（Ｐｔ）である。加えて、後者はその性能を劣化させるであろう、高温での高い拡散率を呈するため、Ｐｔに対する接着層として薄層チタンも時に使用されている。しかし、Ｐｔは極めて高価であり、そして光学的に不透明である。また、他の金属や合金も加熱器に使用されてきた。市販のペルチェブロック熱電ユニットのいくつかも、それらのより大きな熱質量、より遅い温度ランプ速度および不透明さにも関わらず、ＰＣＲチップの温度制御に広く使用されている。最も一般に使用されているＰＣＲ用の非接触加熱スキームは、所望の温度で気流を速やかに切り替えることにより行う熱風サイクリングに基づく。しかし、単一のチップに対して熱風を制御し当てることは容易なことではない。いくつかの報告では、タングステン電球を使用する赤外放射が、３５サイクルに対して１５分未満の非接触の加熱源として利用されていた。しかし、タングステン電球は非コヒーレントかつ非集束の光源であるため、チップが要求される温度に達するために、高電力（５０〜１００Ｗ）を要する。他の報告では、ケイ素のマイクロ反応チャンバーにおける急速な温度ランプに対する低電力放射源として用いる廉価なハロゲン電球が記載されている。
【０００５】
前述の考察を踏まえ、前記問題を克服するために、誘導的に加熱されるポリマー、例証すると、密封された反応チャンバーと赤外温度感知とを有し、ポリ−ジメチル−シロキサン［ＰＤＭＳ］、アクリル、ポリプロピレンおよびポリカーボネートからなるが限定されない群から選択される材料からなるチップを有する非接触リアルタイムマイクロポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システムの開発が必要とされる。
【発明の概要】
【０００６】
本開示の目的
本開示の１つの目的は、誘導加熱器および赤外放射温度感知器を有する非接触リアルタイムマイクロポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システムを提供することである。
本開示の１つの目的は、反応チャンバーおよび埋め込み金属加熱器を有するチップを有する非接触リアルタイムマイクロポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システムを提供することである。
【０００７】
本開示の概要
本開示において請求されるシステムを提供することにより、先行技術の欠点が克服され、そしてさらなる利点が提供される。
本開示の技術を介して、さらなる特徴および利点が理解される。本開示に係る他の態様および側面は本明細書に詳細に記載されており、これらは請求される開示の一部であると考えられる。
【０００８】
本開示の主要な態様は、非接触リアルタイムマイクロポリメラーゼ連鎖反応［ＰＣＲ］システムを提供する。このシステムは、試料を保持するための反応チャンバーおよび反応チャンバーの下方に試料を加熱するための埋め込み金属加熱器を有するチップを含む。チップの上方に配置される関連するＬＥＤ駆動および光検出増幅器を含む、蛍光を検出するための光ユニット。チップの周囲にマウントされ、かつ金属加熱器と誘導的に連結した誘導加熱器。チップの下方にマウントされた、金属加熱器の温度を測定するための赤外温度感知器、ここで該赤外温度感知器は信号調整器と連動する。ならびに、信号調整器を介して赤外温度感知器から受信したフィードバックに基づき誘導加熱器への電力を調節するための、信号調整器および誘導加熱器と連動した制御器。
【０００９】
本開示の一態様において、チップは、ポリ−ジメチル−シロキサン［ＰＤＭＳ］、アクリル、ポリカーボネート、ポリプロピレンの非限定の群から選択される材料から製造される。
本開示の一態様において、ＬＥＤ駆動および光検出増幅器およびパルス幅変調制御器は、ＰＣＲの種々のパラメータを観測するためのデータ獲得および制御システムと連動する。
【００１０】
本開示の一態様において、誘導加熱器はコイルであり、該コイルは金属加熱器を誘導的に加熱するためにチップの近傍に配置される。そして、チップおよびコイルの間の距離は、０〜１０ｍｍの間で変動する。
本開示の一態様において、制御器（５）は、パルス幅変調器、線形積分微分型（ＰＩＤ）制御器およびオン／オフ切替器の少なくとも１つから選択される。
本開示の一態様において、反応チャンバーは、一側にノズルを有し、試料を充填する間に閉じ込められた空気を漏らさない。
【００１１】
本開示の他の態様は、非接触リアルタイムマイクロポリメラーゼ連鎖反応［ＰＣＲ］システムの操作方法を提供する。この方法は、試料をチップの反応チャンバーへと充填させる行為が含まれる。試料は、誘導加熱機からの熱エネルギーを受け取るために、誘導加熱機へと誘導的に連結された、埋め込まれた加熱機により加熱する。その後、赤外温度感知器を使用して金属加熱器の温度を測定する。そして、赤外温度感知器から受信されるフィードバックに基づき、制御器を使用して誘導加熱器への電力を調節する。
【００１２】
本開示の一態様において、試料を充填する前に、チップの一端に備えられたノズルを介して、反応チャンバーから閉じ込められた空気を放出する。
本開示の一態様において、ＬＥＤ駆動と光検出とが関連した増幅器を含む光ユニットを使用して、蛍光を検出する。
本開示の一態様において、データ獲得および制御システムを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応の異なるパラメータをモニターする。
【００１３】
本開示の一態様において、電磁誘導工程により、誘導加熱器から金属加熱器へと熱が供給される。
前述の概要は単に説明するためのものであって、いかなる限定をも意図しない。前記の説明的な側面、態様、および特徴に加えて、さらなる側面、態様、および特徴は、以下の図面および詳細な説明を参照することにより明らかとなるであろう。
【００１４】
添付の図面の簡単な説明
本開示の新規な特徴および特性は、添付の請求の範囲に記載されている。しかし、本開示自体、ならびに使用の好ましい様式、そのさらなる目的および利点は、添付の図と併せて読むと、説明的な態様に係る以下の詳細な記載を参照することにより最も良く理解されるだろう。同じ参照番号は同じ構成要素を示す添付の図を参照して、例示のみの目的で、１または２以上の態様が今、記載され、そしてそこにおいて：
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は非接触マイクロＰＣＲシステムを説明するブロック図である。
【図２Ａ−Ｅ】図２ａ〜２ｃは埋め込み加熱器および反応チャンバーを有するＰＤＭＳチップの３段階の製造工程を示す図である。図２ｄおよび２ｅはＰＤＭＳチップの上面図および斜視図を示す図である。
【００１６】
【図３Ａ−Ｃ】図３ａ〜３ｃはチップ、対物レンズおよびＩＲ感知器に対するコイルの位置を示す図である。
【図４】図４は、５０ｋＨｚの周波数で１０Ａの電流を伝導する、線径１ｍｍの針金を２回巻いた直径１０ｍｍの銅コイルを使用して誘導的に加熱した、厚さ０．４ｍｍの直径８ｍｍのニッケルリング周囲の磁力線に係る２Ｄ数値シミュレーションを示す図である。
【図５】図５は異なる加熱器の材料：ステンレス鋼（ＳＳ）、アルミニウム（Ａｌ）および銅（Ｃｕ）において消散した電力に係る、周波数の関数としての数値シミュレーションを示すグラフである。銅コイル自体（Coil）において消散した電力も示す。
【００１７】
【図６】図６は温度の関数としてのリアルタイム蛍光信号の導関数を示す融解曲線を示すグラフである（チップに対しては、較正していないＩＲ感知器の示数、およびＭＪＲサーモサイクラー内のチューブに対しては、較正された熱電対）。
【図７】図７はサイクリングしている間の温度プロフィールを示すグラフである。黒線がコンピュータにより即座に切り替えられる設定値を示すのに対し、赤色曲線はＩＲ感知器からの温度（更正済み）を示す。左図が全サイクルの完全なプロフィールを示すのに対し、右パネルは最初の数サイクルを示す。
【図８】図８は市販のサーモサイクラーを使用してポリプロピレンチューブで行った類似の実験と同様にして、ＰＤＭＳチップでの３００ｂｐのラムダＤＮＡの増幅からのリアルタイム蛍光信号を示す図である。
【図９】図９はチューブおよびＰＤＭＳチップで増幅した３００ｂｐのＤＮＡの融解曲線分析を示すグラフである。ＩＲ感知器で融解曲線を記録するために、両方の試料をチップ上にロードした。
【００１８】
図面は、説明の目的のみで本開示の態様を図示する。当業者は以下の記載から、本明細書に説明される構造および方法の別の態様を、本明細書に記載される開示の原理から逸脱せずに採用してもよいことを容易に理解するであろう。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
詳細な説明
以下の本開示の詳細な記載がより良く理解されることを目的として、前述のものにより、本開示の特徴および技術的利点の要点を広く概説した。本開示の請求の範囲の主旨を形成する本開示のさらなる特徴および利点が、本明細書において記載されるであろう。本開示と同じ目的を実行するために、他の構造を修飾または設計するための基礎として、開示される概念および具体的な態様を容易に利用してもよいことが、当業者に理解されるべきである。このような均等の構造が、添付の請求の範囲に記載された本開示の精神および範囲から逸脱していないこともまた、当業者に理解されるべきである。さらなる目的および利点とともに、その機構および操作方法の両者に関して、本開示の特性であると考えられる新規な特徴は、添付の図面と関連して考慮すると、以下の記載から、より良く理解されるだろう。しかし、各図が単に説明および記載のみの目的で提供されていること、および本開示の限定の定義として意図させることがないことが、明確に理解されるべきである。
【００２０】
上で議論される問題を克服するために、本開示は、非接触リアルタイムマイクロポリメラーゼ連鎖反応システム（Ａ）を提供する。該システムは、単純であり、そしていかなる光放射ならびに追加のレンズおよびフィルターをも必要としない誘導加熱器（２）を含む。誘導的な加熱によって、信頼性が向上し、はるかに単純になったチップ（１）製造段階がもたらされる。さらに、チップ温度をモニターおよび制御するために、該システムでは赤外温度感知器（３）が使用される。これによって、複雑な製造段階を使用してチップ内に埋め込まれなければならない熱電対や抵抗器などの接触型の温度計の必要性がなくなる。温度計がチップ（１）それ自体の一部ではないから、チップのコストおよび廃棄可能性が大幅に改善される。さらに、温度計の較正は、チップ毎ではなく、チップ読取り器ユニットの一部として一度するのを要するのみである。加熱に加えての非接触温度感知の使用は、完全な非接触ＰＣＲチップシステム一式の利点を十分に理解するためには不可欠である。
【００２１】
本開示は、ＰＤＭＳチップ（１）を使用する、完全に非接触なＰＣＲシステム（Ａ）の設計を提供する。非接触な加熱が電磁誘導を使用するものと認識されるのに対して、非接触な温度感知が赤外熱電対（４）により達成される。本開示は、より特別には、埋め込み加熱器（１ｂ）を有するチップ（１）の設計、加熱器の金属およびその形状の選択の最適化、温度をモニターするための赤外温度感知（３）の使用、最良の赤外発光および蛍光のための加熱器表面被覆の最適化、赤外温度計を較正するためのＤＮＡ融解曲線の使用、蒸発の障壁としての鉱油または他の添加剤の必要性をなくすマイクロシリンジを使用して試料を注入できるＰＤＭＳチップ（１）内の密封された反応チャンバー（１ａ）、加熱器（１ｂ）および反応チャンバー（１ａ）部分の製造工程ならびに空気中でのプラズマ接合を使用するそれら互いの接合、最適な電力を埋め込み加熱器（１ｂ）に伝達するためにその周波数を合わせた、共鳴励起した誘導コイル、ならびに最後に、赤外温度感知器（３）からのフィードバックに基づき誘導加熱器（２）への電力を調節するための低電力パルス幅変調（ＰＷＭ）制御器（５）に関する。
【００２２】
蛍光検出ユニットを含む非接触ＰＣＲシステム（Ａ）の原型を組み立て、ラムダＤＮＡの増幅および融解について試験した。本開示に係るＰＣＲ機器は、ＰＣＲの最中に０．５秒毎に蛍光を測定する。本開示では、６００、８００および１０００ｂｐの大きさを含むが限定されないラムダＤＮＡの増幅を実証し、市販のＰＣＲ機械と比較して融解曲線が産物に特異的か検証した。リアルタイムマイクロチップＰＣＲアプリケーションにおいて、電気的な接触がなく、使い捨てで透明な生体適合性のあるポリマーチップを使用することによって、様々なアプリケーションに係る分野において低コストなシステムの急速な展開に道が開かれ得る。
【００２３】
方法および材料：
図１は、非接触マイクロＰＣＲシステム（Ａ）を説明する例示的な態様である。このシステムは、誘導加熱器（２）と誘導的に連結された埋め込み金属加熱器（１ｂ）を有するＰＤＭＳチップ（１）を含む。赤外放射温度感知器（３）は、チップ（１）の底部から、加熱器（１ａ）温度を測定する。温度信号を設定値と比較して、ＰＷＭオン−オフ制御回路（５）により誘導加熱器（２）への電力を調節する。関連するＬＥＤ駆動および光検出が増幅器（７）を有する光ピックアップユニット（６）は、チップ（１ａ）の上方に配置され、蛍光を検出する。光検出の増幅器（７）およびＰＷＭオン−オフ制御回路（５）は、データ獲得および制御システム（８）と連動している。データ獲得および制御システム（８）は、ポリメラーゼ連鎖反応のパラメータをモニターする内臓プログラムを有する。個々のサブシステムのさらなる詳細については以下のとおりである。
【００２４】
ＰＤＭＳチップの製造
図２ａ〜２ｃは、ＰＤＭＳチップ（１）の製造に含まれる段階を説明する例示的な態様である。チップ（１）の上半分は、レプリカ成形技術を使用して製造された反応チャンバー（１ａ）からなる。まず原版を設計し、ＳＵ−８とフォトリソグラフィとを使用して製造した。２インチのシリコンウェハ上にネガ型のフォトレジスト［ＳＵ８  ２１５０］を、１０００ｒｐｍで３０秒間スピンコートした。ソフトベーク後、２分間のＵＶ露光によって、フォトマスク上のパターンを、ＳＵ８で被覆したシリコンウェハに転写した。露光したパターンをポストベークし、３０分間現像した後、ハードベークした。チップ（１）の上半分を得るために、１０：１のＰＤＭＳを原版に注ぎ、ベークし、剥がした。反応チャンバー（１ａ）の容積は約５μＬ［直径３ｍｍおよび高さ６００μｍ］である。、円形チャンバーは、一側にノズル（１ｃ）を有し、充填の間に、捕捉した空気を閉じ込める。薄い円形金属シートからなるチップ（１）の下半分は、ＰＤＭＳに埋め込まれた。金属ディスクを疎水性のスライドガラス上に注がれたＰＤＭＳの薄層へと浸すだけで、これを製造した。セ氏９０度での２時間のハードベークののち、断片を切断し、スライドから剥がした。最後に、ＰＤＭＳの上半分および下半分を空気プラズマに２分間曝露し、軽く圧迫しながら接触させて、セ氏９０度で３０分間オーブンで加熱することにより、不可逆的に接合した、埋め込み反応チャンバー（１ａ）および加熱器（１ｂ）を有するＰＣＲチップ（１）が得られた。
【００２５】
チップ（１）を使用するために、まず、マイクロシリンジを使用してノズル（１ｃ）の位置で反応チャンバー（１ａ）に穿刺した。続いて、反対側からマイクロシリンジを使用して、このチャンバー（１ａ）に溶液を満たした。ノズル（１ｃ）の方向に空気のほとんどを移動させ、穿たれた穴から退避させた。残存する捕捉されたいかなる気泡はノズル（１ｃ）内に閉じ込められ、そしてＰＣＲまたは蛍光信号に干渉しない。
【００２６】
図２ｄおよび２ｅはそれぞれ、ＰＤＭＳチップ（１）の上面図および斜視図を示す。チップ（１）は、試料を保持するための反応チャンバー（１ａ）および反応チャンバー（１ａ）の下方に埋め込まれた試料を加熱するための金属加熱器（１ｂ）を含む。チップ（１）は、捉えられた空気を反応チャンバー（１ａ）から追い出すための、反応チャンバー（１ａ）の側にあるノズル（１ｃ）をさらに含む。
【００２７】
埋め込み加熱器の設計
所定の一次コイルに関し、二次のものへと結合される電力は、周波数、金属の抵抗率および幾何学的寸法（直径および厚さ）に依存する。寸法が大きいほど、結合する電力は向上するであろうが、増大した熱質量のため受動的冷却速度が低下する。周波数が高くなるほど、良好な加熱効率がもたらされるが、これにより電力トランジスタにおけるスイッチング損失が代償とならなければならない。様々な厚さの異なる商業的に入手可能な鋼鉄、銅およびアルミニウムの金属シートを試し、シミュレーションを行い最も良好なスイッチング周波数を決定した。蛍光信号の集光を改善するためにシートの上面を研磨する一方で、赤外放射温度感知器（３）による最も良好な温度検出のために底面を黒く被覆することが重要である。
【００２８】
誘導加熱コイルおよびＩＲ検出器
赤外検出器（３）は、直径〜７ｍｍの放出表面の温度を正確に感知するために、〜２ｍｍ以内に配置しなければならない。よって、チップ（１）の直下にそれを配置する。
【００２９】
前記感知器の本体は金属であるため、誘導加熱器（２）の一次コイルの位置は重要である。図３ａに示すように１０回巻きのコイルをチップ（１）の下方で使用すると、赤外温度感知器（３）本体もまた加熱され、温度信号を妨げる。他方、図３ｂに示すようにコイルをチップ（１）上方に配置すると、金属本体を有する対物レンズ（６）が加熱され、電力が過剰に消散されてしまう。さらに、チップ（１）の取り扱いが不便となり、そして加熱効率が減少する。したがって、図３ｃに示されるように、最終的に最適化された設計は、チップ（１）のすぐ周囲に、かつ光ユニット（６）およびＩＲ感知器（３）から離して配置された３回巻きのコイルからなる。誘導加熱コイルはチップ（１）の近傍に配置され、誘導コイルおよびチップ（１）の間の距離は０〜１０ｍｍで変動する。
【００３０】
蛍光検出ユニット
インターカレート染料Sybr Greenに対して最適化された蛍光検出システムは、４７０ｎｍ青色ＬＥＤ励起源からなり、ダイクロックミラーを使用して投影され、２０×顕微鏡対物を使用してＰＤＭＳチップ（１）に焦点を合わせた。同じレンズを介して５２０ｎｍの発光を集光し、バンドパスフィルターを使用してフィルターを掛け、シリコンフォトダイオードに焦点を合わせた。ＬＥＤ強度を１９０Ｈｚに変調し、増幅器のロックを使用して光電流を同調的に検出した。時間に対してプロットする場合において毎秒ごとに獲得される信号により、ＰＣＲの間の連続的な蛍光がもたらされた。
【００３１】
温度較正
市販のＩＲ感知器は、黒く塗られた埋め込み加熱器の放射率に対し較正する必要がある。加えて、反応チャンバー（１ａ）は、加熱器（１ｂ）から〜０．５ｍｍ離して配置され、より低い温度であるだろう。したがって、ＤＮＡ自体を、較正用の温度標準として反応チャンバー（１ａ）内で使用した。蛍光を使用してチップ（１）内のＤＮＡの融点を同定し、この融解が発生した時点のＩＲ感知器（３）の信号を記録し、それを市販のＰＣＲサーモサイクラーで得られた実際の融点と比較することにより、これを行う。異なる融点を有するＤＮＡを使用することにより、感知器の示数を実際のチャンバー温度に対して較正することができる。所定のシステム（Ａ）では、これを一度しか行う必要がない。なぜなら、後続反応も、前記感知器に対して同じ場所に配置された同様のチップ（１）内で起こるからである。
【００３２】
信号加工および電力制御エレクトロニクス
赤外放射温度感知器（３）のＤＣ信号を、精密オペアンプ(op-amp)を使用して緩和し、Analog Devicesからの冷接点補償を有する熱電対増幅ＩＣを使用して増幅した。ＰＷＭ波形もまた生成するマイクロ制御器の内蔵比較器にその信号を送った。ＰＣからの設定温度もまた、ＵＳＢ  ＤＡＣ／ＡＤＣシステムを使用して比較器に送った。比較器の出力をＭＯＳＦＥＴドライバーにより制御し、該出力をＰＷＭ信号の形式で、パワーＭＯＳＦＥＴに送る。その後、該トランジスタをオンに切り替え、５ボルトＤＣからの電力を、誘導加熱器一次コイルと１０μＦ低損失コンデンサとにより形成された共振回路に供給した。ＵＳＢ−ＤＡＱシステムは、ＰＣ上にＩＲ温度ならびに光ユニットからの蛍光信号を記録する。
【００３３】
試料の調製
２×DyNAmo Sybr green Masterミックス、Ｔａｑポリメラーゼ、ラムダＤＮＡ、ＰＣＲ水およびプライマーを使用して、ＰＣＲ試料の調製を行った。１マイクロリットルのラムダＤＮＡ鋳型、２．５マイクロリットルのＰ１［５−ＡＧＴ  ＧＴＣＧＡＡ  ＴＴＣ  ＴＧＡ  ＴＣＧ  ＴＧＧ  ＴＧＡ  ＴＡＴ  ＣＣＧ−３］、２．５マイクロリットルのＰ２［５−ＡＧＴ  ＧＴＣ  ＡＡＧ  ＣＣＴ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＣＡＧ  ＴＴＣ  ＴＣＴ-３］、１マイクロリットルのＴａｑポリメラーゼ、２５マイクロリットルのMasterミックス、および１８マイクロリットルのＰＣＲ水を用いて、５０マイクロリットルのミックスを調製し、３１１ｂｐの増幅ＤＮＡを産生した。異なるプライマーを使用し、〜６００ｂｐおよび〜１０００ｂｐの増幅ラムダＤＮＡを産生した。
【００３４】
非接触ＰＣＲの段階的実行
非接触リアルタイムＰＣＲシステム（Ａ）においては、埋め込み金属加熱器（１ｂ）を有する、密封の使い捨てのＰＤＭＳチップ（１）を使用してＰＣＲ反応を実行するところ、以下の工程を実行する必要がある：
ａ．標準的な卓上の市販サーモサイクラープロトコルに従い、ＰＣＲ試料を調製する。試料には、ＰＣＲ水に鋳型ＤＮＡ、プライマー、ｄＮＴＰ、Ｔａｑポリメラーゼまたは均等物、適切な塩および緩衝剤が含まれる。また、試料には、Sybr GreenまたはTaqman蛍光プローブも含まれる。DyNAmoキットなどの市販のマスターミックスおよびその均等物を使用することができる。
ｂ．細針付きのクリーンでありかつ滅菌されたシリンジを使用して、ノズル（１ｃ）の位置で反応チャンバー（１ａ）に穴を開け、閉じ込められた空気を放出する。場合によっては、気泡は反応に干渉しないため、この段階は任意である。
【００３５】
ｃ．試料約５〜１０マイクロリットルを、ＰＤＭＳチップ（１）の反応チャンバー（１ａ）に、その上部封入を介して穴を開けることにより注入する。この工程の間、段階２からの開けられた穴から逃すためのノズル（１ｃ）の方向に、閉じ込められた空気を追いやる。残留している閉じ込められた空気は、いずれもノッチで小さい気泡を形成し、そしてその後のＰＣＲ反応に干渉しない。
ｄ．ＰＣＲ試料を有するＰＤＭＳチップ（１）を、誘導加熱器（２）のコイル内の小さな保持器に配置する。保持器の位置は最適な加熱および蛍光のために予め調整され、そしていかなる反応に対しても妨げられる必要がない。
【００３６】
ｅ．蛍光を集光するために、光ヘッドの位置を下げる。該ヘッドの位置を最大限の蛍光のために予め調整し、そしていかなる反応に対しても妨げられる必要がない。
ｆ．いくつかの設計において、光ヘッドは固定されるが、チップ（１）を配置および取り外すために、試料保持器を移動することができる。最終位置において、光学レンズはＰＤＭＳ表面から数ミリメートル離れている。
【００３７】
ｇ．赤外放射温度感知器（３）は、試料保持器の下方の予め調整した位置に置き、そしていかなる反応に対しても妨げられる必要がない。試料保持器はセンタ穴を有し、この穴を介して感知器により赤外放射が集光される。
ｈ．ＰＤＭＳチップ（１）および光ヘッド（６）を適切な位置に置いた後、マイクロコンピュータにソフトウェア制御器を実行するための指令を与える。また、反応のパラメータ、すなわち最初のインキュベーション温度および時間、変性、アニーリングおよび伸長の段階のためのそれぞれの温度でのサイクル数および時間ならびに最後の伸長温度および時間も、ソフトウェアに入力する。その後、ソフトウェアから、各段階の温度および時間を制御するハードウェアへと指令が送られる。蛍光は、連続的に、または各サイクル間におけるユーザーが決定した時間においてのいずれかで記録する。
【００３８】
ｉ．反応後、試料を室温まで冷却する。直ちに保持器からＰＤＭＳチップ（１）を取り外すことができる。
ｊ．時間の関数としての蛍光および温度のデータをソフトウェアから回収し、分析することができる。
【００３９】
結果
QuickField 2-D電磁シミュレータにより決定される、金属薄板周囲の小さいコイルにより生成された磁束密度を図４に示す。
このシミュレーションに関し、このコイルは、伝導率５．８８×１０７Ｓ/ｍの直径１ｍｍの銅針金での２線の直径１０ｍｍのループからなる。加熱器は、伝導率１×１０７Ｓ/ｍの８ｍｍ直径、０．４ｍｍ厚さのニッケルディスクであり、周波数は５０ＫＨｚであった。磁場とは別に、銅コイル（一次）では電力が消散し、そして加熱ディスク（二次）についても、図５に示されるように、周波数の関数として異なる加熱材料、すなわち、ステンレス鋼（ＳＳ）、アルミニウム（Ａｌ）および銅（Ｃｕ）に対し算出された。
【００４０】
一次（コイル）中で消散された電力は、材料とは相対的に無関係であると観察され、周波数とともに増大する。他方、この加熱器中で消散した電力は、Ａｌでは低周波数で、ステンレス鋼（ＳＳ）ではより高い周波数で、最も大きい。しかし、このスイッチングトランジスタ中で消散した電力はより高い周波数で増大し、したがって、ＰＣＲ実験のために、アルミニウム加熱器（銅と同様の伝導率を有するが、その研磨表面から良好な蛍光反射を有する）において〜１３０ＫＨｚの最適な周波数を選択した。最適化した加熱器の形状は、厚さ０．３８ｍｍ、直径７．１４ｍｍであり、そして最高赤外放射率のためにその底部側を黒く塗られたＡｌシートからなるものであった。
【００４１】
市販のMJ Research USAのサーモサイクラーにロードしたチップ（１）およびポリプロピレンチューブにおける３つの異なるＤＮＡ、すなわちラムダ３００ｂｐ、６００ｂｐおよび１０００ｂｐの融解曲線を比較することにより、温度較正を行った。約５マイクロリットルをロードし、アニーリング（５４度）から変性（９０度）まで温度に傾斜をつけた。
図６は得られた融解曲線を示し、そして表１はＰＤＭＳチップ（１）内のＤＮＡの融点でのＩＲ感知器（３）の示数を、市販のサーモサイクラーからの読み取りとしての実際の融点と比較するものである。
【００４２】
表１：異なるラムダＤＮＡ試料におけるチューブ（較正された熱電対）およびチップ（非較正のＩＲ感知器）の融点
【表１】
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【００４３】
２つの得られた較正曲線およびＩＲ感知器（３）示数の間の線形適合を較正して、その後のＰＣＲ実験に対し反応チャンバー（１ａ）内の試料の真の温度を表示した。チップにロードした５μＬ用のＰＣＲプロトコルは、９６度で６０ｓｅｃの最初の変性段階、それに続く変性（９５度で１５ｓｅｃ）、アニーリング（４８度で１５ｓｅｃ）、および伸長（７２度で１００ｓｅｃ）の段階の１８サイクル、ならびに７２度で３００ｓｅｃの最後の伸長からなる。図７は、非接触ＩＲ感知器（３）からのフィードバックを有するオン−オフ加熱器制御により維持される温度プロフィールを示す。変性およびアニーリングの段階の間で切り替えるときに冷却速度を改善するため、小さい〜５Ｗの扇風機を使用したことに留意されたい。
【００４４】
図８は、ＰＤＭＳチップにおける３００ｂｐラムダＤＮＡの増幅のリアルタイム蛍光信号を、市販のサーモサイクラーを使用しポリプロピレンチューブで実施した同様の実験とともに示す。
すべてのＤＮＡ試料（３００ｂｐ、６００ｂｐおよび１０００ｂｐ）に関して、増幅を再現的に獲得できた。増幅後に、融解曲線分析を、図９で示すように同じチップ内で実施した。もう１つのＰＤＭＳチップにロードしたが、市販のサーモサイクラーを使用してチューブで増幅した同様のＤＮＡ試料から得られた融解曲線もまた示す。ＰＤＭＳ装置での２つの融解実行は、サイクル回数の違いによる小さな差異を有するものの、ほとんど同一であった。
【００４５】
産業上の利用可能性：
本開示はＢｉｏ−ＭＥＭＳ分野において、すなわちポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用するＤＮＡ増幅において、広範な適用を有する。ＤＮＡ増幅は、病原体検出、法医学捜査、生体防御、食糧および水の管理、環境モニタリング、ＤＮＡ配列決定などの様々な形態で使用される。
【００４６】
均等物
本明細書中の複数形および／または単数形の用語の実質的にいずれの使用に関して、当業者は、文脈および／または用途に適切であるように、複数形から単数形へとおよび／または単数形から複数形へと置き換えることができる。さまざまな単数形／複数形の置換が、明確さのために、本明細書中に明示的に記載されてもよい。
【００４７】
一般的に、本明細書において、特に添付の請求の範囲（例えば添付の請求の範囲の主文）において使用されている用語が、「オープン」な用語（例えば、用語「含む(including)」は「含むが限定されない」として解されるべきであり、用語「有する（having）」は「少なくとも有する」として解されるべきであり、用語「含む(includes)」は「含むが限定されない」と解釈されるべきである、など）を通常意図されることを、当業者は理解するであろう。導入されるクレーム列挙の特定の番号を意図する場合、かかる意図としてクレームに明確に列挙されるであろうし、かかる列挙がない場合はかかる意図が存在しないものと当業者は理解するであろう。例えば、理解の助けとして、以下の添付される請求の範囲は、クレーム列挙を導入するために、「少なくとも１項」および「１項または２項以上」という前置きの句の使用を含んでもよい。しかし、かかる句の使用は、同じクレームが、「１項または２項以上」または「少なくとも１項」という前置きの句および「a」または「an」などの不定冠詞（例えば「a」および／または「an」は典型的には「少なくとも１項」または「１項または２項以上」を意味するものと解釈されるべきである）を含む場合であっても、不定冠詞「a」または「an」によるクレーム列挙を導入することによって、かかる導入されたクレーム列挙を含む任意の特定のクレームが、たった１つのかかる列挙を含む発明に限定されることを暗示するものと解釈されるべきではない；同じことがクレーム列挙を導入するために使用される不定冠詞の使用にも当てはまる。さらに、導入されたクレーム列挙の特定の番号が明示的に列挙されたとしても、当業者はかかる列挙が典型的には少なくとも列挙された番号を意味するものと解釈されるべきであると理解するであろう（例えば、他の修飾がなく、「２つの列挙」という最低限の列挙は、典型的には、少なくとも２つの列挙、または２つもしくは３つ以上の列挙を意味する）。
【００４８】
さらに、「Ａ、Ｂ、およびＣ、などの少なくとも１つ」に類似した慣例を使用する場合において、一般に、当業者が慣例（例えば「Ａ、Ｂ、およびＣの少なくとも１つを有するシステム」が、Ａ単独で、Ｂ単独で、Ｃ単独で、ＡおよびＢ一緒に、ＡおよびＣ一緒に、ＢおよびＣ一緒に、ならびに／あるいはＡ、ＢおよびＣ一緒に有する、などを含むが限定されない）を理解するだろうという意味で、かかる構文を意図する。「Ａ、Ｂ、またはＣ、などの少なくとも１つ」に類似する慣例を使用する場合において、一般に、当業者が慣例（例えば「Ａ、Ｂ、またはＣの少なくとも１つを有するシステム」が、Ａ単独で、Ｂ単独で、Ｃ単独で、ＡおよびＢ一緒に、ＡおよびＣ一緒に、ＢおよびＣ一緒に、ならびに／あるいはＡ、ＢおよびＣ一緒に有する、などを含むが限定されない）を理解するだろうという意味で、かかる構文を意図する。２つまたは３つ以上の代替用語を表す実際上任意の離接語および／または句は、明細書、請求の範囲または図面のいずれかであっても、用語の１つ、用語のいずれか、または両方の用語を含む可能性を熟考するものと理解されるべきであることを、当業者はさらに理解するであろう。例えば、「ＡまたはＢ」という句は、「Ａ」または「Ｂ」または「ＡおよびＢ」の可能性を含むものと解されるであろう。
【００４９】
様々な側面および態様が本明細書に開示されているが、他の側面および態様は当業者には明らかであろう。本明細書に開示される様々な側面および態様は説明のためであり、限定することを意図するものではなく、真の範囲および精神は以下の請求の範囲により示される。
【００５０】
数字の参照：
【表２】
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【図１】
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【図２Ａ−Ｅ】
0006026996.tif 000005
【図３Ａ−Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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