(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルシウムイオンを供給する第１化学物質が溶解した第１液、および接触因子を活性化する第２化学物質が溶解した第２液に血漿を含む検体を混合した混合液を用意する試料作製工程と、
流路の延在方向に直列に配列して隣り合う部分が接触して前記流路を流れる状態に、前記第１液および前記混合液をこの順に一定の圧力で前記流路に導入して前記流路を流れる状態とする試料導入工程と、
前記流路を流れる前記第１液と前記混合液とが接触する接触領域の流速を測定する流速測定工程と、
測定された流速が増加から減少へ切り替わる状態を検出する流速変化検出工程と、
前記流速変化検出工程で検出された切り替わりの前後における流速の変化により前記検体における血液状態を判定する判定工程と
を備え、
前記判定工程では、前記流速変化検出工程で検出された切り替わりの後における流速の減少状態により前記検体における血液凝固能を判定することを特徴とする血液状態測定方法。
【請求項２】
カルシウムイオンを供給する第１化学物質が溶解した第１液、および接触因子を活性化する第２化学物質が溶解した第２液に血漿を含む検体を混合した混合液を用意する試料作製工程と、
流路の延在方向に直列に配列して隣り合う部分が接触して前記流路を流れる状態に、前記第１液および前記混合液をこの順に一定の圧力で前記流路に導入して前記流路を流れる状態とする試料導入工程と、
前記流路を流れる前記第１液と前記混合液とが接触する接触領域の流速を測定する流速測定工程と、
測定された流速が増加から減少へ切り替わる状態を検出する流速変化検出工程と、
前記流速変化検出工程で検出された切り替わりの前後における流速の変化により前記検体における血液状態を判定する判定工程と
を備え、
前記判定工程では、前記流速変化検出工程で検出された切り替わりの前における流速の増加状態により前記検体における粘度を判定することを特徴とする血液状態測定方法。
【請求項３】
請求項１または２記載の血液状態測定方法において、
前記第１化学物質は、塩化カルシウムであることを特徴とする血液状態測定方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の血液状態測定方法において、
前記第２化学物質は、エラグ酸，カオリン，セライトより選択されたものであることを特徴とする血液状態測定方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の血液状態測定方法において、
前記接触領域の流速は、表面プラズモン共鳴に基づく流速測定により測定することを特徴とする血液状態測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液や血漿の凝固能などの状態を測定する血液状態測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血液凝固活性は、外因系の凝固因子の欠損のスクリーニングや肝機能の異常、さらに経口投与による抗凝血薬療法のモニタリングに用いられる指標などを得るための重要な項目である。
【０００３】
このような血液凝固検査には、ＰＴ（プロトロンビン時間：Prothrombin Time）測定法、ＡＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間：Activated Partial Thromboplastin Time）測定法、およびフィブリノゲンテストなどが主に用いられている。これらの測定・テストは、病院内の大型分析装置を用いて実施されている。この中で、ＰＴ測定法およびＡＰＴＴ測定による検査では、凝固反応のトリガーとして、血液が凝固する主にタンパク質（トロンボモジュリンやエラグ酸）およびカルシウムイオンを血漿に混合している。混合開始から凝固完了までの時間（凝固点）を測定し、標準血漿の結果と比較して遅延時間を見積もっている。
【０００４】
ここで、血漿中における血液凝固の過程には、外因性血液凝固と内因性血液凝固の２つが存在する。この中で、内因性血液凝固は、血管内皮細胞下組織に接する際に受ける負電荷作用などを凝固活性を上げる因子としている。この過程では、初期にはプレカリクレインと高分子量キニノゲンが第ＸＩＩ因子を活性化することで内因性凝固反応が開始される。この後、血液凝固の過程に従い各種血液凝固因子の情報伝達を経由した後、最終的に可溶化状態であるフィブリノゲンを切断・架橋することで不溶化の重合フィブリンを生成し、血栓が形成される。
【０００５】
ＡＰＴＴ測定法は、内因性凝固因子による血液凝固能を測定する検査方法の１つである。この検査方法では、凝固反応を誘因させる物質としてエラグ酸などの負電荷を帯びた生体物質を血漿サンプルに反応させて第ＸＩＩ因子を十分活性状態にした後、塩化カルシウムを添加し、この結果生成される最終産物である不溶化フィブリンの生成量を物理的に測定する。あるいは、各種血液凝固因子を合成基質法などで測定する。
【０００６】
検査によって得られるＡＰＴＴが標準値よりも延長される場合、例えば、血友病などの血液凝固因子の異常、肝炎・肝硬変などの血液凝固因子を生産する肝機能の障害が主に考えられる。また、ビタミンＫ欠乏症や骨髄腫などによっても血液が固まるまでの時間は長くなる。このように、ＡＰＴＴによって、様々な病態異常を発見することが可能である。
【０００７】
ＡＰＴＴを物理的に測定する方法として、撹拌抵抗式，光散乱方式，熱伝導式，水晶振動子式などが発明されているが、現在一般には、撹拌抵抗および光散乱方式が多く用いられている。撹拌抵抗式の場合、サンプル（検体）を活性化剤と一緒に導入してフィンで撹拌し、フィンの抵抗の上昇から凝固時間を得る方法である。また、光散乱方式は、試験用容器内で、血漿に凝固活性化を促す成分を含む試薬を混合し、容器に対して光を入射し、入射した光の散乱光量変化を測定して凝固時間を得る方法である。散乱光から凝固時間を得るためには、散乱光量をこのまま利用する方法、散乱光量の微分値を利用する方法、あるいは散乱光量がある一定値に達するまでの時間を求める方法がある（特許文献１参照）
【０００８】
また、発明者らは、マイクロ流路を備える測定チップを使った表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定法を用いた流速測定によるＡＰＴＴ測定を提案している（非特許文献１参照）。この測定では、まず、エラグ酸および塩化カルシウムなどの凝固活性化剤を対象となる血漿に混合した血漿サンプルを測定直前に調製する。次に、緩衝液を満たしてあるマイクロ流路に調製した血漿サンプルを導入する。このようにして導入した血漿サンプルが緩衝液と共に移送されるときの流速を測定し、測定された流速より凝固時間を求めている。
【０００９】
非特許文献１のＳＰＲ測定法を用いた流速測定によるＡＰＴＴ測定法では、まず、血漿と凝固活性化剤との不均一な反応を抑制しやすいよう、サンプル管などを用いたバルクでの調製は接触因子（ＸＩ、ＸＩＩ因子）をエラグ酸などの活性化剤（ＡＰＴＴ試薬）で活性化させるまでのプロセスにとどめておく。血漿の完全な活性化は、上記のように一部活性化した血漿と塩化カルシウムをマイクロ流路のような微小空間において接触させることにより実現する。
【００１０】
完全に凝固活性化された接触領域（液−液界面）が流路内に設けられたセンシング領域（測定領域）を通過する速度を利用して凝固活性能を算出する。この算出方法について、図９を用いて説明する。まず、図９の（ａ）に示すように、流路９０４を備える装置を用いる。この装置は、透明な基板９０１と、基板９０１の測定領域に形成された表面プラズモン共鳴測定を行うための金属層９０２と、基板９０１の上に配置された流路基板９０３とを備え、基板９０１と流路基板９０３との間に流路９０４が形成されている。
【００１１】
図９の（ａ）に示すように、流路９０４に、塩化カルシウム溶液９１１を満たし、塩化カルシウム溶液９１１が満たされている流路９０４の一端（導入側）より血漿にＡＰＴＴ試薬を混合して接触因子を完全に活性化した混合血漿９１２を導入し、流路９０４の他端（排出側）より、一定の圧力（負圧）で塩化カルシウム溶液９１１を牽引する。このようにすることで、流路９０４内で排出側に塩化カルシウム溶液９１１が存在し、導入側に混合血漿９１２が存在し、塩化カルシウム溶液９１１の終端と混合血漿９１２の先端とが接触する状態で、これらが流路９０４内を他端の方向に輸送される状態となる。
【００１２】
ここで、接触している接触領域９１３では、混合血漿９１２に塩化カルシウム溶液９１１が添加されることになる。この結果、接触領域９１３では、検体，ＡＰＴＴ試薬，および塩化カルシウムが混合した状態となり、凝固反応が起こり得る状態となっている。このため、上述したように、塩化カルシウム溶液９１１と混合血漿９１２が配列して（直列に）流路９０４に流れる状態として接触領域９１３が形成された時点より、接触領域９１３では、凝固反応が開始されることになる。
【００１３】
次に、上述したように混合血漿９１２の先端と塩化カルシウム溶液９１１の終端とが接触して形成した接触領域９１３が、図９の（ｂ），図９の（ｃ）に示すように流路９０４内を輸送されている状態で、流路９０４内の流体（接触領域９１３）の流速を、流路内に設けた測定領域において、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づく流速測定により測定する。
【００１４】
例えば、測定領域を接触領域９１３が通過するときのＳＰＲ屈折率を時系列的に測定領域の全域（全座標）で測定し、図１０の（ａ）に示すように、ｘ軸を時間、ｙ軸を測定位置、ｚ軸をＳＰＲ屈折率変化とするＳＰＲ屈折率分布図を作成する。この分布図の中で、屈折率変化の大きな点が、接触領域９１３に対応する。従って、作成したＳＰＲ屈折率分布図を用い、図１０の（ｂ）に示すように、屈折率変化の大きな点（接触領域９１３）の推移をプロットし、傾きから算出される流速から凝固活性能を求める。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特開平０６−０２７１１５号公報
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】井上鈴代、林勝義、瀬山倫子、岩崎弦、堀内勉、為近恵美、「表面プラズモン共鳴による流速測定法を用いた血液凝固検査(APTT)方法の検討」、第73 回応用物理学会学術講演会  講演予稿集、13a-H3-9、２０１２年。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
しかしながら、図１０の（ｂ）に示すように、流速を求めようとして作成したプロットが直線状とはならず、測定領域の下流側で大きく減速し、プロットが曲がる事象が見られた。
【００１８】
ここで、図１０の（ａ）に示す分布図では、横軸が時間であり縦軸がＳＰＲによる測定領域内の観測点の流路位置を示している。また、この分布図では、濃度によりＳＰＲ屈折率を示し、混合血漿を導入する前は、塩化カルシウム溶液の屈折率が低いため濃い濃度で表示されている。分布図に示されているように、混合血漿が流路内を進行して塩化カルシウム溶液との接触領域がＳＰＲ観測地点を通過すると、ＳＰＲ屈折率が上昇し最終的に混合血漿のＳＰＲ屈折率に置き換わる。
【００１９】
図１０の（ｂ）は、図１０の（ａ）に示す分布図より、接触領域を示す屈折率の切り替わる点を抽出してプロットしたものである。この結果より、単純に流速を求める場合、距離÷時間を示す図１０の（ｂ）に示すプロットによる線の傾きが流速に相当する。なお、傾きが大きいほど速度が速いことを示す。
【００２０】
ところが、図１０の（ｂ）に示すように、実際の結果では、プロット点が曲線を形成し、上述したように単純には流速を求めることができない。全体のプロットに対して、一次近似を行って流速を求めるようにしてもよいが、この一次近似の直線の傾きより求めた流速で凝固活性能を求めると、他の方法で測定した実際により近い値との相関が低くなるという問題があった。このように、流路内における凝固反応が起きる接触領域が移動する流速により血液凝固能などを求める場合、正確な値が得られていないという問題があった。
【００２１】
本発明は、以上のような問題点を解消するためになされたものであり、血漿を含む液と凝固させるための液とを直列的に移送させている流路内で、凝固反応が起きる２つの液の接触領域が移動する流速の測定により、血液凝固能などの血液の状態がより正確に求められるようにすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明に係る血液状態測定方法は、カルシウムイオンを供給する第１化学物質が溶解した第１液、および接触因子を活性化する第２化学物質が溶解した第２液に血漿を含む検体を混合した混合液を用意する試料作製工程と、流路の延在方向に直列に配列して隣り合う部分が接触して流路を流れる状態に、第１液および混合液をこの順に一定の圧力で流路に導入して流路を流れる状態とする試料導入工程と、流路を流れる第１液と混合液とが接触する接触領域の流速を測定する流速測定工程と、測定された流速が増加から減少へ切り替わる状態を検出する流速変化検出工程と、流速変化検出工程で検出された切り替わりの前後における流速の変化により検体における血液状態を判定する判定工程とを備える。
【００２３】
上記血液状態測定方法において、判定工程では、流速変化検出工程で検出された切り替わりの後における流速の減少状態により検体における血液凝固能を判定する。または、判定工程では、流速変化検出工程で検出された切り替わりの前における流速の増加状態により検体における粘度を判定する。
【００２４】
上記血液状態測定方法において、第１化学物質は、塩化カルシウムであればよい。また、第２化学物質は、エラグ酸，カオリン，セライトより選択されたものであればよい。なお、接触領域の流速は、表面プラズモン共鳴に基づく流速測定により測定すればよい。
【発明の効果】
【００２５】
以上説明したことにより、本発明によれば、血漿を含む液と凝固させるための液とを直列的に移送させている流路内で、凝固反応が起きる２つの液の接触領域が移動する流速の測定により、血液凝固能などの血液の状態がより正確に求めることができるようになるという優れた効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、本発明の実施の形態における血液状態測定方法を説明するためのフローチャートである。
【図２】図２は、本発明の実施の形態における血液状態測定方法を説明するための説明図である。
【図３】図３は、本発明の実施の形態における測定で、ＳＰＲ観測領域を単位距離に分割し、接触領域の通過した時間から、各々の部分流速を算出した測定結果を示す特性図である。
【図４】図４は、表面プラズモン共鳴測定における流速の算出について説明する説明図である。
【図５】図５は、本発明の実施の形態におけるＳＰＲ測定により得られたＳＰＲ屈折率分布から、接触領域２１３の推移をプロットした後、測定領域２４２上流から２００μｍ毎に部分流速を算出した結果を示す特性図である。
【図６】図６は、本発明の実施の形態におけるＳＰＲ測定により得られたＳＰＲ屈折率分布から、接触領域２１３の推移をプロットした後、測定領域２４２上流から２００μｍ毎に部分流速を算出した結果を示す特性図である。
【図７】図７は、第１液および混合液による接触領域が、測定領域（長さ５μｍ）を移動しているときの屈折率（ＳＰＲ角度）をＳＰＲ測定により測定した結果を示す特性図である。
【図８】図８は、第１液および混合液による接触領域が、測定領域（長さ５μｍ）を移動しているときの屈折率（ＳＰＲ角度）をＳＰＲ測定により測定した結果を示す特性図である。
【図９】図９は、完全に凝固活性化された接触領域（液−液界面）が流路内に設けられたセンシング領域を通過する速度を利用して凝固活性能を算出する方法について説明する説明図である。
【図１０】図１０は、測定領域を接触領域が通過するときのＳＰＲ屈折率を時系列的に測定領域の全域（全座標）で測定した結果得られる、ｘ軸を時間、ｙ軸を測定位置、ｚ軸をＳＰＲ屈折率変化とするＳＰＲ屈折率分布図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明の実施の形態について図を参照して説明する。図１は、本発明の実施の形態における血液状態測定方法を説明するためのフローチャートである。
【００２８】
まず、ステップＳ１０１で、カルシウムイオンを供給する第１化学物質が溶解した第１液を用意する。また、接触因子を活性化する第２化学物質が溶解した第２液に血漿を含む検体を混合した混合液を作製（用意）する（試料作製工程）。第１化学物質は、例えば、塩化カルシウムである。また、第２化学物質は、エラグ酸，カオリン，セライトなどのＡＰＴＴ試薬であればよい。
【００２９】
次に、ステップＳ１０２で、流路の延在方向に直列に配列して隣り合う部分が接触して流路を流れる状態に、第１液および混合液をこの順に一定の圧力で流路に導入して流路を流れる状態とする（試料導入工程）。
【００３０】
例えば、図２の（ａ）に示すような、流路２０４を備えるフローセル（測定チップ）２００を用いればよい。このフローセル２００は、透明な基板２０１と、基板２０１の測定領域に形成された表面プラズモン共鳴測定を行うための金属層２０２と、基板２０１の上に配置された流路基板２０３とを備え、基板２０１と流路基板２０３との間に流路２０４が形成されている。
【００３１】
図２の（ａ）に示すように、流路２０４に、第１液２１１を満たし、図２の（ｂ）に示すように、第１液２１１が満たされている流路２０４の一端の導入口２０５より混合液２１２を導入し、流路２０４の他端の排出口２０６より、一定の圧力（負圧）で第１液２１１を牽引すればよい。排出口２０６に負圧機構２４１を接続し、第１液２１１を吸引すればよい。このようにすることで、流路２０４内で他端側（導入口２０５側）に第１液２１１が存在し、一端側（排出口２０６側）に混合液２１２が存在し、第１液２１１の終端と混合液２１２の先端とが接触する状態で、これらが流路２０４内を他端の方向に輸送される（流れる）状態となる。
【００３２】
ここで、接触している接触領域２１３では、混合液２１２に第１液２１１が添加されることになり、接触領域２１３では、検体，第１化学物質，および第２化学物質が混合した状態となり、凝固反応が起こり得る状態となっている。このため、上述したように、第１液２１１と混合液２１２が配列して流路２０４に流れる状態として接触領域２１３が形成された時点より、接触領域２１３では、凝固反応が開始されることになる。
【００３３】
次に、ステップＳ１０３で、図２の（ｂ）に例示するように、接触領域２１３を形成した状態の混合液２１２および第１液２１１が流路２０４内を輸送されている状態で、接触領域２１３の流速を測定する（流速測定工程）。図２の（ｃ）に示す流路２０４内の所定の測定領域２４２において、接触領域２１３の流速を測定する。この流速の測定においては、接触領域２１３が測定領域２４２を通過しているときの速度（流速）を、よく知られた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づく流速測定により測定する。
【００３４】
この流速測定では、測定領域２４２を接触領域２１３が通過するときのＳＰＲ屈折率を時系列的に測定領域２４２の全域で測定し、時間および測定位置に対するＳＰＲ屈折率変化の分布図を作成する。この分布図の中で、屈折率変化の大きな点が、接触領域２１３に対応する。従って、作成したＳＰＲ屈折率分布図を用い、屈折率変化の大きな点（接触領域２１３）の推移をプロットして測定領域２４２内の測定箇所毎に変化する流速の状態を示すグラフを得る。屈折率変化の大きな点の測定箇所が下流に行くほど、時系列的に後の測定となる。
【００３５】
次に、ステップＳ１０４で、測定領域２４２内で測定された接触領域２１３の流速（移動速度）が増加から減少へ切り替わる状態を検出する（流速変化検出工程）。言い換えると、時系列的に得られている接触領域２１３の流速が、増加から減少へと切り替わる状態を、上述したプロットのグラフより求める。
【００３６】
次に、ステップＳ１０５で、ステップＳ１０４（流速変化検出工程）で検出された切り替わりの前後における流速の変化により、検体における血液状態を判定する（判定工程）。例えば、検出された切り替わりの後における流速の減少状態により、検体における血液凝固能を判定する。また、検出された切り替わりの前における流速の増加状態により、検体における粘度を判定する。
【００３７】
図１０を用いて説明したように、上述した接触領域の流速測定の結果より得られる流速は、図１０の（ｂ）に示すように、測定領域２４２内の測定箇所が下流へと移動する中で一様とならずに変化している。言い換えると、時系列的に変化している。この変化は、測定領域２４２を接触領域２１３が通過する過程で血液凝固反応が進行し、接触領域２１３の粘度が上昇し、送液抵抗が徐々に大きくなり減速し、一様の流速とならないためと考えられる。
【００３８】
この状態は、２つの事象を同時に観測していることが要因として挙げられる。第１は、塩化カルシウム溶液（第１液２１１）と血漿混合溶液（混合液２１２）とが接触した直後の事象である。この第１事象では、血漿の凝固活性が十分に活性化できていないため、定圧牽引によって接触領域２１３が単に動かされる状態になっているものと考えられる。第２は、接触領域２１３が形成されてから一定時間が経過した後の事象である。この第２事象では、接触領域２１３において、血漿の凝固活性が完全に活性化されて不溶化物質である凝固産物が産生され、粘度が上昇する。しかしながら、流れを発生させている牽引の力（圧力）は一定として変化させていないため、第２事象では、接触領域２１３の移動速度（流速）は減少する。
【００３９】
以上の知見の元に、発明者らは、測定感度の精度を向上させるためには、上述した２つの事象を切り離して判定を行えばよいものと考察し、本発明に至った。
【００４０】
前述したように、ＳＰＲ屈折率分布図から得られる屈折率変化の大きな点(接触領域)の時間推移プロットを元データとし、このデータからＳＰＲ観測領域の単位距離（２００μｍ，４００μｍなど）毎の部分流速を算出し、加速している領域と減速している領域を判別し、加速する領域から粘度、減速する領域から凝固活性度を判定する。
【００４１】
ＳＰＲ観測領域を単位距離に分割し、接触領域の通過した時間から、各々の部分流速を算出した測定結果例を図３に示す。図３に示すように、初期には部分流速が上昇するが、ある地点を境に部分流速は減少の傾向を示す。
【００４２】
初期の部分流速が増加する領域では、接触領域において血漿中の凝固因子が塩化カルシウムと接触した直後であり、凝固産物である不溶化フィブリンも定圧による液体牽引力を抑制する程は産生されない。このため、初期において、部分流速は、液体牽引力によって血漿溶液が牽引されるある一定値まで流速は上昇する。
【００４３】
ここで、流路を流れている液体の牽引力は、粘性に左右される。粘性の高い液体では、ずり応力による抵抗が大きくなり牽引力は低下して速度（部分速度）が低下する。
【００４４】
接触領域が形成されてからの時間が長くなり、接触領域が流路内の測定領域中盤を通過する頃には、血漿中の凝固因子の十分な活性化が促進され、不溶化フィブリンが多量に産生される。このため、定圧による液体牽引力に対して拮抗する力が生じ、部分流速は徐々に低下する。
【００４５】
図３に示すような、部分流速をプロットしたグラフより、上述した部分流速が上昇から減少に転じる切り替わりの状態を検出し、切り替わる前の流速上昇状態より粘度が求められ、切り替わった後の流速下降状態より血液凝固能が求められる。
【００４６】
以下、実施例を用いてより詳細に説明する。まず、フローセル２００の作製について説明する。フローセルは、図２に示す構造とする。まず、例えば、化薬マイクロケム株式会社製の「ＳＵ−８」などのネガ型のフォトレジストを用い、基板の上に流路型などを備える鋳型を形成する。この鋳型を用い、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）による流路基板２０３を作製する。流路基板２０３は、流路長さ１０ｍｍで、幅０．５ｍｍ，高さ７５μｍの断面矩形の流路２０４となる溝部を備える。また、溝部の一端には、導入口２０５となる穴径０．８ｍｍの流路基板２０３を貫通する貫通穴が接続し、溝部の他端には、排出口２０６となる穴径０．８ｍｍの流路基板２０３を貫通する貫通穴が接続している。
【００４７】
一方、測定に用いるＳＰＲ装置でフローセルを載置する測定面を備えるプリズムと同じ屈折率を持つ透明なプラスチック基板を用意し、この基板表面に層厚５０ｎｍ程度の金膜を形成し、金属層２０２を備える基板２０１を作製する。この基板２０１の金属層２０２の面に、上述した流路基板２０３を貼り付け、フローセル２００とする。
【００４８】
次に、測定について説明する。まず、図２の（ａ）に示すように、導入口２０５より０．０２Ｍの塩化カルシウム水溶液である第１液２１１を供給し、流路２０４の内部を第１液２１１で充填する。この状態で、ＳＰＲ装置（Smart SPR,NTT-AT）のＳＰＲ測定プリズム上の測定面にフローセル２００を載置する。このとき、フローセル２００の測定領域２４２が、ＳＰＲ装置の光軸に重なる状態とする。測定領域２４２は、流路方向に５μｍの長さとされている。この初期の状態におけるＳＰＲ角度を、フローセル２００の初期状態とした。
【００４９】
次に、接触因子を活性化する第２化学物質が溶解した第２液および血漿を用意する。血漿として、血液凝固用標準血漿を用いる。血液凝固用標準血漿を３７℃・１分の加熱条件で加熱処理した後、同量のＡＰＴＴ試薬（コアグピアＡＰＴＴ、積水化学）を加えて再度３７℃で４分加熱し、混合液２１２とする。ＡＰＴＴ試薬が、接触因子を活性化する第２化学物質が溶解した第２液である。ここで、試料（検体）となる血漿の活性調整は、オーレンベロナール緩衝液（シスメックス）による希釈で行うことができる。例えば、１００％活性の血液凝固用標準血漿に対して緩衝液で２倍に希釈した場合、検体の凝固活性は５０％となる。
【００５０】
次に、ベースライン取得のため前述した初期状態でのＳＰＲ角度分布を３０秒間測定した後、設置してあるフローセル２００の導入口２０５より、上述したように調整した混合液２１２を３μリットル導入する。このようにして、第１液２１１が満たされている流路２０４の一端の導入口２０５より混合液２１２を導入し、流路２０４の他端の排出口２０６より、一定の圧力（負圧）で第１液２１１を牽引する。このことにより、流路２０４内で導入口２０５側に第１液２１１が存在し、排出口２０６側に混合液２１２が存在し、第１液２１１の終端と混合液２１２の先端とが接触して接触領域２１３を形成し、これらが流路２０４内を他端の方向に流れる状態となる。このようにして一定の圧力で牽引することで流れている接触領域２１３の移動速度（流速）を、測定領域２４２において測定する。
【００５１】
ここで、流速の測定について説明する。ＳＰＲ測定においては、例えば、ＣＣＤなどによるイメージセンサのｘ方向の１ライン毎に屈折率を反映したデータが観測されている。このため、測定領域２４２を、接触領域２１３が進行していくと、屈折率変化が起こり、イメージセンサのライン毎にどのタイミングで接触領域２１３の進行による屈折率変化が起こったかが記録される。このように、測定領域２４３を流れる接触領域２１３の時系列的な屈折率変化の測定の中で、屈折率変化の起こった時点（時刻）を読み取るようにすればよい。
【００５２】
例えば、図４の（ａ）に示すように、イメージセンサのＹライン毎に記録されている屈折率変化の時間変化から、屈折率のステップ変化が起こった時刻を読み取る。図４の（ｂ）に示すように、表面プラズモン共鳴角度に相当する最も光が吸収されたピクセル強度をカラープロファイルで表示することで、上述した読み取りの状態をより視覚的に表す。また、図４の（ｃ）に示すように、上述した読み取りにおけるｘライン毎の時間変化をカラープロファイルの変化で表すようにしてもよい。図４の（ｃ）に示す矢印で示される傾きが、流速（部分流速）となる。Ｙラインのピクセルに対応する測定領域２４２上の実距離（約１０μｍ）を代入して計算し、傾きである流速はμｍ／ｓｅｃの単位で記述される。なお、図６では、カラープロファイルをグレースケールで簡略化して示している。
【００５３】
次に、測定結果について説明する。上述したＳＰＲ測定により得られたＳＰＲ屈折率分布から、接触領域２１３の推移をプロットした後、測定領域２４２上流（導入口２０５側）から２００μｍ毎に部分流速を算出した結果を図５および図６に示す。図５は、血漿活性度５０％の検体を用いて混合液２１２を作製した場合の結果を示している。また、図６は、血漿活性度１００％の検体を用いて混合液２１２を作製した場合の結果を示している。
【００５４】
いずれの結果においても、測定領域２４２の導入口２０５側の開始端に近い領域（流路最上流部）では、流速が増加する傾向にあり、測定領域２４２の中盤からは流速が減少する傾向となっていることがわかる。測定領域２４２の中盤からの減速傾向を血漿活性度と比較して観察すると、血漿の活性状態が高い方（図６）が、流速の減少が大きい。
【００５５】
また、これらの結果より、測定された流速が増加から減少へ切り替わる箇所の後の流速が減少する領域の減少の傾きは、全ての測定領域２４２のデータを単に一次近似して求める結果より、活性度の違いに対してより高い相関を示している。
【００５６】
これらのことから分かるように、活性化状態が各々異なる血漿を用いた複数の検体を用いた測定の結果より、測定された流速が増加から減少へ切り替わる箇所の後の流速が減少する領域の減少の傾き（流速減少率）を活性化状態と対応付けた検量データ（検量線）を作成すれば、活性の不明な血漿の活性能を測定することが可能となる。
【００５７】
次に、上述した測定の中で流速が増加から減少へ切り替わるときの、切り替わりの前における流速の増加状態により、検体における粘度が判定できることについて説明する。まず、検体として、標準血漿（１００％）を用いた第１検体、標準血漿をオーレンベロナール溶液により１．３倍に希釈した第２検体、標準血漿をオーレンベロナール溶液により２倍希釈した第３検体を用意する。
【００５８】
これら各検体を用い、前述同様に、第１液および混合液による接触領域が測定領域（長さ５μｍ）を移動しているときの屈折率（ＳＰＲ角度）をＳＰＲ測定により測定する。測定結果を図７，図８に示す。図７，図８において、横軸は、測定領域の開始端からの位置（距離）、縦軸は、測定された接触領域の屈折率の値が、横軸の各位置を通過するまでに要した時間を示す。
【００５９】
また、図７において、（ａ）が第１検体を測定した結果を示し、（ｂ）が第２検体を測定した結果を示し、（ｃ）が第３検体を測定した結果を示している。また、図８において、「×」が第１検体を測定した結果を示し、黒三角が第２検体を測定した結果を示し、黒四角が第３検体を測定した結果を示している。また、図７は、測定領域全域の測定結果を示し、図８は、測定領域の開始端より６００μｍまでの箇所の測定結果を示している。
【００６０】
図７に示すように、測定領域の全体を見ると、第１検体と第２検体との測定結果（接触領域の移動）は、測定領域の中盤から最下流にかけてほぼ重なっていた。これは、凝固のための試薬による凝固活性が頭打ちしていて、産生されるフィブリン量が両者で同量になっているためと考えられる。
【００６１】
しかしながら、測定領域の最上流部、つまり、接触領域の移動速度が増加傾向を示す領域で、凝固因子の活性化がなされていない部分（例えば６００μｍまでの領域）では、図８に示すように、第１検体より第２検体の方が、接触領域の移動に時間を要し、地２検体より第３検体の方が、接触領域の移動に時間を要している。
【００６２】
これは、接触領域の移動速度が増加傾向を示す領域では、検体の活性度が高いほど、移動により多くの時間を要していることを示し、速度の増加が小さいことを示している。血漿の粘性はオーレンベロナール溶液よりも高いので、上述した結果は、検体における粘度の状態を反映した結果であると考えられる。このように、第１液と第２液との接触領域の流速測定により、流速が増加から減少へ切り替わる中で、検出された切り替わりの前における流速の増加状態により、検体における粘度の判定ができることが分かる。
【００６３】
以上に説明したように、本発明では、カルシウムイオンを供給する第１化学物質が溶解した第１液、および接触因子を活性化する第２化学物質が溶解した第２液に血漿を含む検体を混合した混合液を、これらの順に、流路の延在方向に直列に配列して隣り合う部分が接触して流れる状態とし、この中で測定される両者の接触領域の流速が、増加から減少へ切り替わる中で、切り替わりの前後における流速の変化により検体における血液状態を判定するようにした。これにより、本発明によれば、血漿を含む液と凝固させるための液とを直列的に移送させている流路内で、凝固反応が起きる２つの液の接触領域が移動する流速の測定により、血液凝固能などの血液の状態がより正確に求められるようになる。
【００６４】
なお、本発明は以上に説明した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想内で、当分野において通常の知識を有する者により、多くの変形および組み合わせが実施可能であることは明白である。
【符号の説明】
【００６５】
２０１…基板、２０２…金属層、２０３…流路基板、２０４…流路、２０５…導入口、２０６…排出口、２１１…第１液、２１２…混合液、２１３…接触領域。
【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図１０】
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