(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）２５ｍＭ〜３５ｍＭのボロヒドリド、ナトリウムシアノボロヒドリド、アミンボランおよびピコリンボランよりなる群から選択される還元剤の存在下、１ｍｇ／ｍｌ〜１２ｍｇ／ｍｌのＩＬ１０タンパク質を、スクシンイミジルカルボナート−ＰＥＧ、ＰＥＧ−ブチルアルデヒド、ＰＥＧ−ペンタアルデヒド、ＰＥＧ−アミド−プロピオンアルデヒド、ＰＥＧ−ウレタノ−プロピオアルデヒドおよびＰＥＧ−プロピルアルデヒドよりなる群から選択される活性化ＰＥＧ−リンカーと反応させ、ここで、ＩＬ１０対ＰＥＧ−リンカーの比が１：１〜１：７．７であり、反応は、ｐＨ５．０〜７．４、温度５℃〜３０℃で、３〜２４時間であり、
ｂ）モノ−およびジ−ＰＥＧ化ＩＬ１０の混合物を精製することを含む、少なくとも１つのＰＥＧ分子がＩＬ１０の少なくとも１つのサブユニットの少なくとも１つのアミノ酸残基に共有結合しているモノ−およびジ−ＰＥＧ化ＩＬ１０の混合物の製造方法。
【請求項２】
該ＰＥＧ−リンカーがＰＥＧ−プロピルアルデヒドである、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
該ＰＥＧ−リンカーを構成するＰＥＧの分子量が５，０００ダルトン〜２０，０００ダルトンである、請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
該ＰＥＧ−リンカーを構成するＰＥＧの分子量が５，０００ダルトンである、請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
該還元剤が、ナトリウムシアノボロヒドリドおよびピコリンボランよりなる群から選択される、請求項１記載の製造方法。
【請求項６】
カチオン交換、アニオン交換、サイズ排除および疎水性相互作用よりなる群から選択されるクロマトグラフィーによりモノ−およびジ−ＰＥＧ−ＩＬ１０の混合物を精製する、請求項１記載の製造方法。
【請求項７】
サイズ排除クロマトグラフィーによりモノ−およびジ−ＰＥＧ−ＩＬ１０の混合物を精製する、請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
還元剤がナトリウムシアノボロヒドリドである、請求項１記載の方法。
【請求項９】
ＩＬ１０の量が７．５  ｍｇ／ｍｌである、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
ＩＬ１０対ＰＥＧ−リンカーの比が１：３．５である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
ｐＨ６．３で反応させる、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
１５℃の温度で反応させる、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
１５時間反応させる、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モノＰＥＧ化（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）（ＰＥＧ）およびジＰＥＧ  ＩＬ１０組成物ならびに使用方法を含む。
【背景技術】
【０００２】
サイトカインであるインターロイキン１０（ＩＬ１０）は、その２つの単量体サブユニットを連結する非共有結合性相互作用の破壊に際して生物学的に不活性となる二量体である。ＩＬ１０は最初は２型ヘルパーＴ細胞の産物として特定され、後に、Ｂ細胞およびマクロファージを含む他の細胞型により産生されることが示された。それはまた、γ−インターフェロン、ＩＬ２および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）のような１型ヘルパーＴ細胞から産生される幾つかのサイトカインの合成を抑制する。ＩＬ１０が細胞性免疫応答モジュレーターを抑制し抗原提示細胞依存性Ｔ細胞応答を抑制しうることは、ＩＬ１０が免疫抑制特性を有することを示している。このサイトカインはまた、ＩＬ１、ＩＬ６、ＩＬ８、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）およびＴＮＦ−αのような他のサイトカインの単球／マクロファージ産生を抑制する。その多面的活性の結果として、ＩＬ１０は、多数の臨床用途、例えば、炎症状態、細菌性敗血症、エンテロトキシン誘発性致死性ショックおよび自己免疫疾患、例えば慢性関節リウマチ、同種移植拒絶および糖尿病の治療に関して研究が進められているところである。
【０００３】
癌および腫瘍は免疫系により抑制または根絶されうる。免疫系は、幾つかのタイプのリンパ系細胞および骨髄性細胞、例えば単球、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、好酸球、Ｔ細胞、Ｂ細胞および好中球を含む。これらのリンパ系および骨髄性細胞は、サイトカインとして公知の分泌性シグナリングタンパク質を産生する。サイトカインは、例えば、インターロイキン１０（ＩＬ１０）、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮγ）、ＩＬ１２およびＩＬ２３を含む。免疫応答は、炎症、すなわち、全身または身体の特定の部位における免疫細胞の蓄積を含む。感染因子または外来物質に応答して、免疫細胞はサイトカインを分泌し、そしてこれは免疫細胞の増殖、発生、分化または遊走をモジュレーションする。過剰な免疫応答は自己免疫障害のような病的結果を招きうる一方で、免疫応答の欠損は癌を引き起こしうる。免疫系による抗腫瘍応答は、例えばマクロファージ、ＮＫ細胞および好中球によりもたらされる先天性免疫、ならびに例えば抗原提示細胞（ＡＰＣ）、Ｔ細胞およびＢ細胞によりもたらされる適応免疫を含む（例えば、Ａｂｂａｓら（編）（２０００）Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｎｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ；ＯｐｐｅｎｈｅｉｍおよびＦｅｌｄｍａｎｎ（編）（２００１）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；ｖｏｎ  ＡｎｄｒｉａｎおよびＭａｃｋａｙ（２０００）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１０２０−１０３４；ＤａｖｉｄｓｏｎおよびＤｉａｍｏｎｄ（２００１）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４５：３４０−３５０を参照されたい）。
【０００４】
癌、例えばメラノーマの治療においては、免疫応答をモジュレーションする方法が用いられている。これらの方法は、サイトカイン、例えばＩＬ２、ＩＬ１０、ＩＬ１２、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦアルファ）、ＩＮＦγ、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）での、またはサイトカインアンタゴニスト（例えば、抗体）での治療を含む。インターロイキン１０は最初は、サイトカイン合成抑制因子（ＣＳＩＦ；例えば、Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｏら，（１９８９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７０：２０８１−２０９５を参照されたい）として特徴づけられた。ＩＬ１０は、免疫抑制物質および免疫刺激物質の両方として機能しうる、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球により産生される多面的サイトカインである（例えば、Ｇｒｏｕｘら，（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３１８８−３１９３；およびＨａｇｅｎｂａｕｇｈら，（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：２１０１−２１１０を参照されたい）。
【０００５】
動物モデルは、ＩＬ１０が用量依存的にＮＫ細胞活性化を誘導し標的細胞破壊を促進しうることを示唆している（例えば、Ｚｈｅｎｇら，（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：５７９−５８４；Ｋｕｎｄｕら，（１９９６）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８８：５３６−５４１を参照されたい）。更なる研究は、腫瘍微環境中のＩＬ１０の存在がより良好な患者生存と相関することを示している（例えば、Ｌｕら，（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２：４５７５−４５８３を参照されたい）。
【０００６】
ＩＬ１０は、その比較的短い半減期のため、ポリエチレングリコールを含む種々の相手に対してコンジュゲート化されている。他のサイトカインもＰＥＧ化（ｐｅｇｙｌａｔｅ）されており、一般に、モノＰＥＧ化（例えば、ＰＥＧ分子がサイトカインタンパク質上の単一残基に結合されること）によりＰＥＧ化されている。残念ながら、１つのＩＬ１０サブユニット上のモノＰＥＧ化は、サブユニットシャッフリングのため、ジＰＥＧ化、モノＰＥＧ化および非ＰＥＧ化ＩＬ１０分子の不均一混合物を与える。ＰＥＧ化反応を完了まで進行させることは非特異的および多ＰＥＧ化標的タンパク質をも生成させ、したがってこれらのタンパク質の生物活性を低下させるであろう。このように、適切にＰＥＧ化されたＩＬ１０を、より高い製造収率で、より効率的に製造することが必要とされている。本発明は、モノ−およびジ−ＰＥＧ化ＩＬ１０の混合物の製造方法を提供することにより、この要求を満足させるものである。
【発明の概要】
【０００７】
発明の概括
本発明は、制御された反応が選択的ＰＥＧ化モノ−およびジ−ＰＥＧ−ＩＬ１０の混合物を与え、そしてこれが最終ＰＥＧ化産物の収率を改善し、他のＰＥＧ−ＩＬ１０種に匹敵する効力を有するという知見に基づくものである。
【０００８】
本発明は、ａ）０．７５ｍＭ〜３５ｍＭの還元剤の存在下、約５．０〜７．４のｐＨおよび５℃〜３０℃の温度で１２〜１５時間にわたり、１ｍｇ／ｍｌ〜１２ｍｇ／ｍｌのＩＬ１０タンパク質を活性化ＰＥＧ−リンカーと反応させ、この場合、ＩＬ１０対ＰＥＧ−リンカーの比が１：１〜１：７．７となるようにし、ｂ）モノ−およびジ−ＰＥＧ化ＩＬ１０の混合物を精製することを含む、少なくとも１つのＰＥＧ分子がＩＬ１０の少なくとも１つのサブユニットの少なくとも１つのアミノ酸残基に共有結合しているモノ−およびジ−ＰＥＧ化ＩＬ１０の混合物の製造方法を提供する。ある実施形態においては、該ＰＥＧ−リンカーは、スクシンイミジルカルボナート−ＰＥＧ、ＰＥＧ−ブチルアルデヒド、ＰＥＧ−ペンタアルデヒド、ＰＥＧ−アミド−プロピオンアルデヒド、ＰＥＧ−ウレタノ−プロピオアルデヒドおよびＰＥＧ−プロピルアルデヒドよりなる群から選択され、該ＰＥＧ−リンカーは５，０００ダルトン〜１２，０００ダルトンであり、あるいは該還元剤は、ボロヒドリド、ナトリウムシアノボロヒドリド、アミンボランおよびピコリンボランよりなる群から選択される。さらにもう１つの実施形態においては、カチオン交換、アニオン交換、サイズ排除および疎水性相互作用よりなる群から選択されるクロマトグラフィーによりモノ−およびジ−ＰＥＧの混合物を精製する。この反応方法により製造されたモノ−およびジ−ＰＥＧ−ＩＬ１０と医薬上許容される担体とを含む医薬組成物も含まれる。
【０００９】
本発明は、ａ）２５ｍＭの還元剤の存在下、約６．３のｐＨおよび１５℃の温度で１５時間にわたり、７．５ｍｇ／ｍｌのＩＬ１０を活性化ＰＥＧ−リンカーと反応させ、この場合、ＩＬ１０対ＰＥＧ−リンカーの比が１：３．５となるようにし、ｂ）モノ−およびジ−ＰＥＧ化ＩＬ１０の混合物を精製することを含む、少なくとも１つのＰＥＧ分子がＩＬ１０の少なくとも１つのサブユニットの少なくとも１つのアミノ酸残基に共有結合しているモノ−およびジ−ＰＥＧ化ＩＬ１０の混合物の製造方法を含む。ある実施形態においては、該ＰＥＧ−リンカーは、スクシンイミジルカルボナート−ＰＥＧ、ＰＥＧ−ブチルアルデヒド、ＰＥＧ−ペンタアルデヒド、ＰＥＧ−アミド−プロピオンアルデヒド、ＰＥＧ−ウレタノ−プロピオアルデヒドおよびＰＥＧ−プロピルアルデヒドよりなる群から選択される。該ＰＥＧ−リンカーを構成するＰＥＧの分子量は５，０００ダルトン〜２０，０００ダルトンであり、該還元剤は、ボロヒドリド、ナトリウムシアノボロヒドリド、アミンボランおよびピコリンボランよりなる群から選択され、あるいはカチオン交換、アニオン交換、サイズ排除および疎水性相互作用よりなる群から選択されるクロマトグラフィーによりモノ−およびジ−ＰＥＧの混合物を精製する。この反応方法により製造されたモノ−およびジ−ＰＥＧ−ＩＬ１０と医薬上許容される担体とを含む医薬組成物も含まれる。
【００１０】
詳細な説明
添付の特許請求の範囲を含む本明細書において用いる単数形表現は、文脈と明らかに矛盾しない限り、それらの対応複数物を含む。本明細書中で引用されている全ての参考文献を、各個の刊行物、特許出願または特許が参照により組み入れられると具体的かつ個別に示されている場合と同様に、参照により本明細書に組み入れることとする。
【００１１】
Ｉ．定義
「活性化」、「刺激」および「治療（処理）」は、それが細胞または受容体に適用される場合、文脈により又は明示的に特に示されていない限り、同じ意味を有することが可能であり、例えば、リガンドでの細胞または受容体の活性化、刺激または処理（治療）を意味しうる。「リガンド」は、天然および合成リガンド、例えばサイトカイン、サイトカイン変異体、類似体、突然変異タンパク質、および抗体由来の結合性成分を含む。「リガンド」はまた、小分子、例えば、サイトカインのペプチド模倣体、および抗体のペプチド模倣体を含む。「活性化」は、内的メカニズムにより及び外的または環境要因により調節される細胞活性化を意味しうる。「応答」、例えば細胞、組織、器官または生物の「応答」は、生化学的または生理的挙動、例えば濃度、密度、接着、または生物学的区画内の遊走、遺伝子発現の率、または分化の状態の変化を含み、ここで、該変化は、活性化、刺激または処理（治療）に、あるいは内的メカニズム、例えば遺伝的プログラミングに相関される。
【００１２】
分子の「活性」は、リガンドへの又は受容体への該分子の結合、あるいは触媒活性；遺伝子発現または細胞シグナリング、分化もしくは成熟を刺激する能力；抗原活性、他の分子の活性のモジュレーションなどを示しうる又は意味しうる。分子の「活性」は、細胞間相互作用、例えば接着をモジュレーションまたは維持する場合の活性、あるいは細胞の構造、例えば細胞膜または細胞骨格を維持する場合の活性をも意味しうる。「活性」は、比活性、例えば、［触媒活性］／［ｍｇタンパク質］、または［免疫活性］／［ｍｇタンパク質］、生物学的区画内の濃度などをも意味しうる。「増殖活性」は、例えば正常な細胞分裂ならびに癌、腫瘍、異形成、細胞トランスフォーメーション、転移および血管新生を促進する、またはそれらに必要である、またはそれらに特異的に関連している活性を含む。
【００１３】
「投与」および「治療（処理）」は、それが動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、器官または生物学的流体に適用される場合には、該動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官または生物学的流体との外因性医薬、治療用物質、診断剤、化合物または組成物の接触を意味する。「投与」および「治療（処理）」は、例えば、治療方法、プラセボ方法、薬物動態学的方法、診断方法、研究方法および実験方法を意味しうる。「細胞の処理」は、該細胞との試薬の接触、および該細胞に接触している流体との試薬の接触を含む。「投与」および「処理（治療）」は、試薬、診断剤、結合性成分または別の細胞による、例えば細胞の、インビトロおよびエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）処理をも意味する。「治療（処理）」は、それがヒト、獣医学的対象または研究対象に適用される場合には、治療的処理、予防的または防御的手段、研究および診断適用を意味する。「治療（処理）」は、それがヒト、獣医学的もしくは研究対象または細胞、組織もしくは器官に適用される場合には、ヒトもしくは動物対象、細胞、組織、生理学的区画または生理的流体とのＰＥＧ−ＩＬ１０の接触を含む。「細胞の処理」は、ＰＥＧ−ＩＬ１０がＩＬ１０受容体（ＩＬ１０Ｒ１とＩＬ１０Ｒ２とのヘテロ二量体）と接触する場合、例えば、流体相またはコロイド相におけるもの、およびＩＬ１０アゴニストまたはアンタゴニストが流体と接触する場合、例えば、該流体が細胞または受容体と接触しているが該アゴニストまたはアンタゴニストが該細胞または受容体に直接的に接触していることが示されていない場合をも含む。
【００１４】
「悪液質」は、代謝の障害から生じる筋肉喪失（筋肉消耗）および脂肪喪失を含む消耗症候群である。悪液質は種々の癌（「癌悪液質」）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、進行性臓器不全およびエイズにおいて生じる。癌悪液質は、例えば顕著な体重減少、食欲不振、無力症および貧血により特徴づけられる。食欲不振は、食べる意欲の欠如、例えば食物嫌悪感から生じる障害である（例えば、ＭａｃＤｏｎａｌｄら，（２００３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｓｕｒｇ．１９７：１４３−１６１；Ｒｕｂｉｎ（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：５３８４−５３８９；Ｔｉｓｄａｌｅ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ２：８６２−８７１；Ａｒｇｉｌｅｓら，（２００３）Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ８：８３８−８４４；Ｌｅｌｌｉら，（２００３）Ｊ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１５：２２０−２２５；Ａｒｇｉｌｅｓら，（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．Ｍｅｔａｂ．Ｃａｒｅ  ６：４０１−４０６を参照されたい）。
【００１５】
「ＰＥＧ−ＩＬ１０の保存的に修飾された変異体」はアミノ酸および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関しては、保存的に修飾された変異体は、同一または実質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を意味するか、あるいは該核酸がアミノ酸配列をコードしていない場合には、実質的に同一の核酸配列を意味する。遺伝暗号の縮重のため、機能的に同一である多数の核酸がいずれかの与えられたタンパク質をコードしうる。
【００１６】
アミノ酸配列に関しては、コードされている配列内のアミノ酸または小さな割合のアミノ酸を保存的（同類）アミノ酸で置換する、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列に対する個々の置換は、「保存的に修飾された変異（体）」である、と当業者は認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸を示す保存的置換の表は当技術分野においてよく知られている。保存的置換の一例は、以下の群の１つにおけるアミノ酸の、同一群の別のアミノ酸による置換である（Ｌｅｅらに発行された米国特許第５，７６７，０６３号；ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  １５７：１０５−１３２）：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、ＣｙｓまたはＭｅｔ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ；
（７）小さなアミノ酸：Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ。
【００１７】
「有効量」は、医学的状態の症状または徴候を改善または予防するのに十分な量を含む。有効量はまた、診断を可能または容易にするのに十分な量を意味する。個々の患者または獣医学的対象に対する有効量は、例えば治療されている状態、患者の全体的な健康状態、投与の方法、経路および用量ならびに副作用の重症度のような要因に応じて変動しうる（例えば、Ｎｅｔｔｉらに発行された米国特許第５，８８８，５３０号を参照されたい）。有効量は、有意な副作用または毒性作用を回避する最大の用量または投与プロトコールでありうる。該効果は、少なくとも５％、普通は少なくとも１０％、より普通には少なくとも２０％、最も普通には少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも６０％、理想的には少なくとも７０％、より理想的には少なくとも８０％、最も理想的には少なくとも９０％（ここで、１００％は、正常対象により示される診断パラメーターと定義される）の、診断尺度またはパラメーターの改善をもたらすであろう（例えば、Ｍａｙｎａｒｄら，（１９９６）Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ＳＯＰｓ  ｆｏｒ  Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ；Ｄｅｎｔ（２００１）Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｕｒｃｈ  Ｐｕｂｌ．，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫを参照されたい）。ＰＥＧ−ＩＬ１０の有効量は、腫瘍体積を減少させるのに、腫瘍増殖を抑制するのに、転移を予防するのに、または腫瘍部位内へのＣＤ８＋  Ｔ細胞浸潤を増強するのに十分な量であろう。
【００１８】
「外因性」は、文脈に応じて、生物、細胞または人体の外部で産生される物質に関するものである。「内因性」は、文脈に応じて、細胞、生物または人体の内部で産生される物質に関するものである。
【００１９】
「免疫状態」または「免疫障害」は、例えば病的炎症、炎症障害および自己免疫障害または疾患を含む。「免疫状態」は、感染、持続的感染および増殖性状態、例えば癌、腫瘍および血管新生をも意味し、免疫系による照射に対する抵抗性を示す感染、腫瘍および癌をも含む。「癌状態」は、例えば、癌、癌細胞、腫瘍、血管新生および前癌状態、例えば過形成を含む。
【００２０】
「インヒビター」および「アンタゴニスト」、または「アクチベーター」および「アゴニスト」は、例えばリガンド、受容体、補因子、遺伝子、細胞、組織または器官の例えば活性化に関する、それぞれ、抑制分子または活性化分子を意味する。例えば遺伝子、受容体、リガンドまたは細胞のモジュレーターは、該遺伝子、受容体、リガンドまたは細胞の活性を改変する分子であり、この場合、活性はその調節特性において活性化、抑制または改変されうる。該モジュレーターは単独で作用することが可能であり、あるいはそれは補因子、例えばタンパク質、金属イオンまたは小分子を利用することもある。インヒビターは、活性化を低下、遮断、阻止、遅延させる、不活性化する、脱感作する、または例えば遺伝子、タンパク質、リガンド、受容体もしくは細胞をダウンレギュレーションする化合物である。アクチベーターは、活性化を上昇、活性化、促進、増強する、感作する、または例えば遺伝子、タンパク質、リガンド、受容体もしくは細胞をアップレギュレーションする化合物である。インヒビターはまた、構成的活性を軽減、遮断または不活性化する組成物と定義されうる。「アゴニスト」は、標的の活性化における増強を引き起こす又は促進するように、該標的と相互作用する化合物である。「アンタゴニスト」は、アゴニストの作用に対抗する化合物である。アンタゴニストは、アゴニストの活性を妨げ、低下させ、抑制し、または中和する。アンタゴニストはまた、特定されているアゴニストが存在しない場合であっても、標的、例えば標的受容体の構成的活性を妨げ、抑制し、または低下させうる。
【００２１】
抑制の度合を調べるためには、例えば、与えられた例えばタンパク質、遺伝子、細胞または生物を含むサンプルまたはアッセイを潜在的アクチベーターまたはインヒビターで処理し、該インヒビターの非存在下で対照サンプルと比較する。対照サンプル、すなわち、アンタゴニストで処理されていないサンプルには１００％の相対活性値を割り当てる。該対照に対する活性値が約９０％以下、典型的には８５％以下、より典型的には８０％以下、最も典型的には７５％以下、一般には７０％以下、より一般には６５％以下、最も一般には６０％以下、典型的には５５％以下、普通は５０％以下、より普通には４５％以下、最も普通には４０％以下、好ましくは３５％以下、最も好ましくは３０％以下、より一層好ましくは２５％以下、最も好ましくは２５％未満である場合に、抑制が達成される。該対照に対する活性値が約１１０％、一般には少なくとも１２０％、より一般には少なくとも１４０％、より一般には少なくとも１６０％、頻繁には少なくとも１８０％、より頻繁には少なくとも２倍、最も頻繁には少なくとも２．５倍、普通は少なくとも５倍、より普通には少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも２０倍、より好ましくは少なくとも４０倍、最も好ましくは４０倍以上である場合に、活性化が達成される。
【００２２】
活性化または抑制におけるエンドポイントは以下のとおりにモニターされうる。例えば細胞、生理的流体、組織、器官および動物またはヒト対象の活性化、抑制ならびにそれらの処理（治療）に対する応答はエンドポイントによりモニターされうる。該エンドポイントは、例えば炎症、発癌能または細胞脱顆粒もしくは分泌（例えば、サイトカイン、毒性酸素またはプロテアーゼの放出）の指標の予め決められた量または百分率を含みうる。該エンドポイントは、例えば、イオンフラックスまたは輸送；細胞遊走；細胞接着；細胞増殖；転移能；細胞分化；ならびに表現型の変化、例えば、炎症、アポトーシス、トランスフォーメーション、細胞周期または転移に関する遺伝子の発現の変化の予め決められた量を含みうる（例えば、Ｋｎｉｇｈｔ（２０００）Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．３０：１４５−１５８；ＨｏｏｄおよびＣｈｅｒｅｓｈ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２：９１−１００；Ｔｉｍｍｅら，（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ４：２５１−２６１；ＲｏｂｂｉｎｓおよびＩｔｚｋｏｗｉｔｚ（２００２）Ｍｅｄ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．８６：１４６７−１４９５；ＧｒａｄｙおよびＭａｒｋｏｗｉｔｚ（２００２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．３：１０１−１２８；Ｂａｕｅｒら，（２００１）Ｇｌｉａ  ３６：２３５−２４３；ＳｔａｎｉｍｉｒｏｖｉｃおよびＳａｔｏｈ（２０００）Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．１０：１１３−１２６を参照されたい）。
【００２３】
抑制のエンドポイントは、一般には対照の７５％以下、好ましくは対照の５０％以下、より好ましくは対照の２５％以下、最も好ましくは対照の１０％以下である。一般に、活性化のエンドポイントは、対照の少なくとも１５０％、好ましくは対照の少なくとも２倍、より好ましくは対照の少なくとも４倍、最も好ましくは対照の少なくとも１０倍である。
【００２４】
「標識」された組成物は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、同位体または化学的方法により直接的または間接的に検出可能である。例えば、有用な標識には、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、３Ｈ、１２５Ｉ、安定同位体、蛍光色素、高電子密度試薬、基質、エピトープタグまたは酵素、例えば酵素結合イムノアッセイまたはフルオレット（ｆｌｕｏｒｅｔｔｅ）において使用されるものが含まれる（例えば、ＲｏｚｉｎｏｖおよびＮｏｌａｎ（１９９８）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５：７１３−７２８を参照されたい）。
【００２５】
「リガンド」は、例えば、受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用しうる小分子、ペプチド、ポリペプチドおよび膜会合もしくは膜結合分子またはそれらの複合体を意味する。「リガンド」はまた、アゴニストでもアンタゴニストでもないが受容体の生物学的特性（例えば、シグナリングまたは接着）に有意な影響を及ぼすことなく該受容体に結合しうる物質を含む。さらに、「リガンド」は、例えば化学的または組換え方法により膜結合リガンドの可溶化形態に改変された該膜結合リガンドを含む。通例、リガンドが第１の細胞上で膜結合型である場合、その受容体は通常、第２の細胞上に存在する。その第２の細胞は、その第１の細胞と同じ又は異なる実体でありうる。リガンドまたは受容体は完全に細胞内に存在することが可能である。すなわち、それはシトゾル、核または何らかの他の細胞内区画内に存在することが可能である。リガンドまたは受容体は、例えば細胞内区画から細胞膜の外面へと、その位置を変化させうる。リガンドと受容体との複合体は「リガンド受容体複合体」と称される。リガンドおよび受容体がシグナリング経路に関与する場合、該リガンドは該シグナリング経路の上流位置に存在し、該受容体はその下流位置に存在する。
【００２６】
「小分子」は腫瘍および癌の生理機能および障害の治療（処理）のために与えられる。「小分子」は、１０ｋＤ未満、典型的には２ｋＤ未満、好ましくは１ｋＤ未満の分子量を有する分子と定義される。小分子には、無機分子、有機分子、無機成分を含有する有機分子、放射性原子を含む分子、合成分子、ペプチド模倣体および抗体模倣体が含まれるが、これらに限定されるものではない。治療用物質としての小分子は、大分子と比較して、細胞に対して透過性であり、分解を受けにくく、免疫応答を惹起する傾向が低い可能性がある。抗体およびサイトカインのペプチド模倣体のような小分子ならびに小分子毒素は記載されている（例えば、Ｃａｓｓｅｔら，（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３０７：１９８−２０５；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ（２００Ｉ）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：２７７−３０２；Ｌｉ（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１２５１−１２５６；Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓら，（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．９：４１１−４２０；Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉら，（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．８：２１８５−２１９９；Ｄｏｍｉｎｇｕｅｓら，（１９９９）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６：６５２−６５６；ＳａｔｏおよびＳｏｎｅ（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７１：６０３−６０８；Ｓｔｅｗａｒｔらに発行された米国特許第６，３２６，４８２号を参照されたい）。
【００２７】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の具体例には以下のものが含まれる：アルキル化剤、例えばチオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）およびシクロスホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））；アルキルスルホナート、例えばブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、イムプロスルファン（ｉｍｐｒｏｓｕｌｆａｎ）およびピポスルファン（ｐｉｐｏｓｕｌｆａｎ）；アジリジン、例えばベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン（ｃａｒｂｏｑｕｏｎｅ）、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）およびウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）；エチレンイミンおよびメチルアメルアミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）、例えばアルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリエチレンチオホスルアミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｍｉｄｅ）およびトリメチロロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｍｅ）窒素マスタード、例えばチオラムブシル（ｃｈｉｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、クロルナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、クロロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン（ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ）、イフォスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、メクロルエタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、メクロルエタミンオキシド塩酸塩、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、ノベムビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタード（ｕｒａｃｉｌ  ｍｕｓｔａｒｄ）；ニトロソウレア、例えばカルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、クロロゾトシン（ｃｈｌｏｒｏｚｏｔｏｃｉｎ）、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ニムスチン（ｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、ラニムスチン（ｒａｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）；抗生物質、例えばアクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎ）、アクノマイシン（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン（ａｚａｓｅｒｉｎｅ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、ミコフェノール酸、ノガラマイシン���ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎ）、ペプロマイシン（ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ）、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン（ｓｔｒｅｐｔｏｎｉｇｒｉｎ）、ストレプトゾシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ）、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメックス（ｕｂｅｎｉｍｅｘ）、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）；代謝拮抗物質、例えばメトトレキセート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えばデノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、メトトレキセート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキセート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）；プリン類似体、例えばフルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、６−メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン（ａｎｃｉｔａｂｉｎｅ）、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、６−アザウリジン、カルモフール（ｃａｒｍｏｆｕｒ、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、ジデオキシウリジン（ｄｉｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、フロクスリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、５−ＦＵ；アンドロゲン、例えばカルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、ドロモスタノロン（ｄｒｏｍｏｓｔａｎｏｌｏｎｅ）プロピオナート、エピチオスタノール（ｅｐｉｔｉｏｓｔａｎｏｌ）、メピチオスタン（ｍｅｐｉｔｉｏｓｔａｎｅ）、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）；抗アドレナール、例えばアミノグルテチミド（ａｍｉｎｏｇｌｕｔｅｔｈｉｍｉｄｅ）、ミトタン（ｍｉｔｏｔａｎｅ）、トリロスタン（ｔｒｉｌｏｓｔａｎｅ）；葉酸補充物、例えばフロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；アセグラトン（ａｃｅｇｌａｔｏｎｅ）；アルドホスファミド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）グリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン（ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）；ジアジクオン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エルフォルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ）；エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン（ｌｅｎｔｉｎａｎ）；ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ）；ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）；ミトザントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；モピダモール（ｍｏｐｉｄａｍｏｌ）；ニトラクリン（ｎｉｔｒａｃｒｉｎｅ）；ペントスタチン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）；ポドフィリ��酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）；シゾフィラン（ｓｉｚｏｆｉｒａｎ）；スピロゲルマニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｒｍａｎｉｕｍ）；テヌアゾン酸（ｔｅｎｕａｚｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）；トリアジクオン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）；ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）；マンノムスチン（ｍａｎｎｏｍｕｓｔｉｎｅ）；ミトブロニトール（ｍｉｔｏｂｒｏｎｉｔｏｌ）；ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）；ピポブロマン（ｐｉｐｏｂｒｏｍａｎ）；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）；チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）；タキソイド、例えばパクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）（ＴＡＸＯＬ（登録商標）Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）およびドキセタキセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（商標），Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）；ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）；６−チオグアニン；メルカプトプリン（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）；メトトレキセート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）；白金類似体、例えばシスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）およびカルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）；ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）；白金；エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）（ＶＰ−１６）；イフォスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）；マイトマイシンＣ；ミトザントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）；ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）；ナベルビン（ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）；ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）；ダウノマイシン（ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ）；アミノプテリン（ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ）；Ｘｅｌｏｄａ（登録商標）Ｒｏｃｈｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；イバンドロネート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）；ＣＰＴ１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）；カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）；ならびに前記のいずれかのものの医薬上許容される塩、酸または誘導体。腫瘍に対するホルモン作用を調節または抑制するよう作用する抗ホルモン剤もこの定義に含まれる。該抗ホルモン剤としては例えば以下のものが挙げられる：抗エストロゲン、例えばタモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、ラロキシフェン（ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ）、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン（ｈｙｄｒｏｘｙｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、トリオキシフェン（ｔｒｉｏｘｉｆｅｎｅ）、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆ��ｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）およびトレミフェン（ｔｏｒｅｍｉｆｅｎｅ）（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）；ならびに抗アンドロゲン、例えばフルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、ニルタミド（ｎｉｌｕｔａｍｉｄｅ）、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、ロイプロリド（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）およびゴセレリン（ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ）；ならびに前記のいずれかのものの医薬上許容される塩、酸または誘導体。
【００２８】
リガンド／受容体、抗体／抗原、または他の結合性ペアに言及する場合の「特異的」または「選択的」に結合は、タンパク質および他の生物学的物質の不均一集団内のタンパク質の存在を決定する結合反応を示す。したがって、示されている条件下、特定されたリガンドは特定の受容体に結合し、サンプル中に存在する他のタンパク質には有意量では結合しない。想定される方法の抗体、または抗体の抗原結合部位由来の結合性組成物は、いずれかの他の抗体またはそれに由来する結合性組成物の場合のアフィニティより少なくとも２倍大きな、好ましくは少なくとも１０倍大きな、より好ましくは少なくとも２０倍大きな、最も好ましくは少なくとも１００倍大きなアフィニティで、その抗原またはその変異体もしくは突然変異タンパク質に結合する。好ましい実施形態においては、該抗体は、例えばスキャッチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）分析（Ｍｕｎｓｅｎら，（１９８０）Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０−２３９）により測定した場合に約１０９  リットル／ｍｏｌより大きなアフィニティを有するであろう。
【００２９】
本明細書中で用いる「インターロイキン１０」または「ＩＬ１０」は、ポリエチレングリコールにコンジュゲート化されている場合であっても非コンジュゲート化形態の場合であっても、ホモ二量体を形成するよう非共有結合した２つのサブユニットを含むタンパク質である。特に示さない限り、本明細書中で用いる「インターロイキン１０」および「ＩＬ１０」はヒトまたはマウスＩＬ１０（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ ０００５６３；Ｍ３７８９７；またはＵＳ６，２１７，８５７）（それらは「ｈＩＬ１０」または「ｍＩＬ１０」とも称される）を意味しうる。
【００３０】
「ＰＥＧ化ＩＬ１０」または「ＰＥＧ−ＩＬ１０」は、結合が安定するようリンカーを介してＩＬ１０タンパク質の１以上のアミノ酸残基に共有結合した１以上のポリエチレングリコール分子を有するＩＬ１０分子である。「モノＰＥＧ化ＩＬ１０」および「モノＰＥＧ−ＩＬ１０」は、少なくとも１つのポリエチレングリコール分子がリンカーを介してＩＬ１０二量体の１つのサブユニット上の単一アミノ酸残基に共有結合していることを意味する。「ジＰＥＧ化ＩＬ１０」および「ジＰＥＧ−ＩＬ１０」は、少なくとも１つのＰＥＧ分子がリンカーを介してＩＬ１０二量体の各サブユニット上の単一残基に共有結合していることを意味する。該ＰＥＧ部分の平均分子量は、好ましくは、約５，０００〜約５０，０００ダルトンである。ＩＬ１０へのＰＥＧ結合の方法または部位は決定的なものではないが、好ましくは、該ＰＥＧ化は生物活性分子の活性を改変しないか、または最小限度に改変するに過ぎない。好ましくは、半減期の増加は生物活性におけるいずれの減少よりも大きい。ＰＥＧ−ＩＬ１０の場合、生物活性は、典型的には、ＵＳ  ７，０５２，６８６に記載されているとおり、細菌性抗原（リポ多糖、ＬＰＳ）でチャレンジされＰＥＧ−ＩＬ１０で処理された被験者の血清中の炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦα、ＩＦＮγ）のレベルを評価することにより測定される。
【００３１】
本明細書中で用いる「血清半減期」（「ｔ１／２」と略称される）は、消失半減期、すなわち、物質の血清濃度がその初期または最大値の半分に達する時間を意味する。合成物質に関して本明細書中で用いる「血清半減期の増加」なる語は、該合成物質が、その非合成内因性物質または組換え製造物より遅い速度で消失することを意味する。
【００３２】
ＩＩ．総論
本発明はモノ−およびジ−ＰＥＧの混合物の製造方法を提供する。ＰＥＧ化ＩＬ１０は、腫瘍状態において、より有効であることが示されている。例えば、ＵＳ２００８００８１０３１を参照されたい。本発明は、モノＰＥＧ化（ＩＬ１０ホモ二量体の１つのサブユニット上に少なくとも１つのＰＥＧ分子）およびジＰＥＧ化（ＩＬ１０ホモ二量体の各サブユニット上に少なくとも１つのＰＥＧ分子）ＩＬ１０の両方を精製することによる、ＰＥＧ化ＩＬ１０の収率を増加させるための方法を提供する。
【００３３】
ＩＩＩ．ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）
ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）は、治療用タンパク質製品の製造において使用されている化学的部分である。「ＰＥＧ化する」なる動詞は、少なくとも１つのＰＥＧ分子を別の分子、例えば治療用タンパク質に結合させることを意味する。例えば、アデノシンデアミナーゼのＰＥＧ化製剤であるアダジェン（Ａｄａｇｅｎ）が重度の複合免疫不全疾患の治療に関して承認されており、ＰＥＧ化スーパーオキシドジスムターゼが頭部損傷の治療に関して臨床治験中であり、ＰＥＧ化アルファインターフェロンが肝炎の治療に関して第Ｉ相臨床治験において試験されており、ＰＥＧ化グルコセレブロシダーゼおよびＰＥＧ化ヘモグロビンが前臨床試験中であると報告されている。ポリエチレングリコールの結合はタンパク質分解を防ぐことが示されている（例えば、Ｓａｄａら，（１９９１）Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７１：１３７−１３９を参照されたい）。
【００３４】
ＰＥＧは、その最も一般的な形態においては、一般構造：
ＨＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
を有する、ヒドロキシル基で終わる直鎖状または分枝状ポリエーテルである。
【００３５】
ＰＥＧを分子（ポリペプチド、多糖、ポリヌクレオチドおよび小有機分子）に結合させるためには、一方または両方の末端に官能基を有する該ＰＥＧの誘導体を調製することにより該ＰＥＧを活性化させることが必要である。タンパク質のＰＥＧ結合のための最も一般的な経路は、リシンおよびＮ末端アミノ基との反応に適した官能基でＰＥＧを活性化することである。特に、ポリペプチドへのＰＥＧの結合に関与する最も一般的な反応性基はリシンのアルファまたはイプシロンアミノ基である。
【００３６】
タンパク質とのＰＥＧ化リンカーの反応は、主に以下の部位におけるＰＥＧ部分の結合を招く：タンパク質のＮ末端におけるアルファアミノ基、リシン残基の側鎖上のイプシロンアミノ基、およびヒスチジン残基の側鎖上のイミダゾール基。ほとんどの組換えタンパク質は単一のアルファならびに多数のイプシロンアミノおよびイミダゾール基を有するため、リンカーの化学に応じて多数の位置異性体が生成されうる。
【００３７】
広く使用されている２つの第１世代の活性化モノメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）はスクシンイミジルカルボナートＰＥＧ（ＳＣ−ＰＥＧ；例えば、Ｚａｌｉｐｓｋｙら，（１９９２）Ｂｉｏｔｅｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １５：１００−１１４；ならびにＭｉｒｏｎおよびＷｉｌｃｈｅｃｋ（１９９３）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．４：５６８−５６９）およびベンゾトリアゾールカルボナートＰＥＧ（ＢＴＣ−ＰＥＧ；例えば、Ｄｏｌｅｎｃｅら，米国特許第５，６５０，２３４号を参照されたい）であった。それらは主としてリシン残基と反応してカルバマート結合を形成するが、ヒスチジンおよびチロシン残基と反応することも公知である。ＩＦＮα上のヒスチジン残基への結合は、加水分解的に不安定なイミダゾールカルバマート結合であることが示されている（例えば、ＬｅｅおよびＭｃＮｅｍａｒ，米国特許第５，９８５，２６３号を参照されたい）。
【００３８】
第２世代のＰＥＧ化技術は、これらの不安定な結合および残基反応性における選択性の欠如を回避するように設計されている。ＰＥＧ−アルデヒドリンカーの使用は、還元的アミノ化により、ポリペプチドおよび／またはタンパク質サブユニットのＮ末端上の単一部位を標的化する。ＩＬ１０は、種々の形態のＰＥＧ化分子を得るために種々のタイプのリンカーおよびｐＨを使用してＰＥＧ化されうる（例えば、ＵＳ５，２５２，７１４、ＵＳ５，６４３，５７５、ＵＳ５，９１９，４５５、ＵＳ５，９３２，４６２、ＵＳ５，９８５，２６３、ＵＳ７，０５２，６８６を参照されたい）。
【００３９】
ＩＶ．ＰＥＧ−ＩＬ１０の生物活性
ヒトＩＬ１０は、免疫適格性マウスに投与されると、中和抗体の急速な発生を誘導する。このタイプの中和を回避するために、Ｂ細胞欠損マウス（すなわち、抗体応答を惹起し得ないマウス）においてＰＥＧ−ｈＩＬ１０の皮下投与を行った。これらの免疫欠損マウスにおける十分に樹立された同系腫瘍はＰＥＧ−ｈＩＬ１０により有意に成長遅延したか又は完全に拒絶された。該腫瘍成長制限または抑制はＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞に依存的であった。ＣＤ８細胞が欠乏すると、ＰＥＧ−ｈＩＬ１０の抑制効果は完全に妨げられた。したがって、ＰＥＧ−ｈＩＬ１０はＣＤ８媒介性細胞傷害性応答を誘導する。
【００４０】
腫瘍組織の更なる分析は、ＰＥＧ−ＩＬ１０が、非ＰＥＧ化ＩＬ１０の場合より大きなレベルで、腫瘍内へのＣＤ８＋  Ｔ細胞の浸潤を増強することを示した。該浸潤性ＣＤ８細胞による炎症性サイトカイン発現のレベルも、ＰＥＧ−ＩＬ１０処理では、非ＰＥＧ化ＩＬ１０処理と比較して高かった。ＰＥＧ−ＩＬ１０での腫瘍患者の治療（処理）は有意な抗腫瘍応答を誘導し、有意な治療利益をもたらすはずである（例えばを参照されたい）。
【００４１】
本発明において使用されるＩＬ１０タンパク質は、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％またはそれ以上、例えば少なくとも９５％の観測相同性を、成熟ＩＬ１０タンパク質（すなわち、いずれのリーダー配列をも欠くもの）の配列と共有するアミノ酸配列を含有する。例えば、米国特許第６，２１７，８５７号を参照されたい。アミノ酸配列相同性または配列同一性は、残基のマッチ（一致）を最適化することにより、そして必要に応じて、必要なギャップを導入することにより決定される。相同アミノ酸配列は、典型的には、それぞれの各配列において天然対立遺伝子変異、多形変異および種間変異を含むと意図される。典型的な相同タンパク質またはペプチドは、ＩＬ１０ポリペプチドのアミノ酸配列に対して２５〜１００％の相同性（ギャップが導入されうる場合）ないし５０〜１００％の相同性（保存的置換が含まれる場合）を有するであろう。Ｎｅｅｄｌｅｈａｍら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）；Ｓａｎｋｏｆｆら．ｉｎ  Ｔｉｍｅ  Ｗａｒｐｓ，Ｓｔｒｉｎｇ  Ｅｄｉｔｓ，ａｎｄ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：Ｔｈｅ  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，１９８３，Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ，Ｒｅａｄｉｎｇ，Ｍａｓｓ．；ならびにＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣａｌｉｆおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のソフトウェアパッケージを参照されたい。
【００４２】
該ＰＥＧ−ＩＬ１０コンジュゲートにおけるＩＬ１０部分はグリコシル化されていることが可能であり、非グリコシル化突然変異タンパク質または他の類似体、例えばＢＣＲＦ１（エプスタインバーウイルスのウイルス性ＩＬ１０）タンパク質で修飾されていてもよい。ＩＬ１０をコードする配列の修飾は、種々の技術、例えば部位特異的突然変異誘発［Ｇｉｌｌｍａｎら，Ｇｅｎｅ  ８：８１−９７（１９７９）；Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：７３１−７３４（１９８７）］を用いて実施可能であり、ＩＬ１０活性に関する適当なアッセイにおける通常のスクリーニングにより評価されうる。修飾ＩＬ１０タンパク質、例えば変異体は、天然に存在する配列から一次構造レベルで変化していることが可能である。そのような修飾はアミノ酸の挿入、置換、欠失および融合により行われうる。ＩＬ１０変異体は、血清半減期の増加、ＩＬ１０に対する免疫応答の軽減、精製または製造の促進、ＩＬ１０からその単量体サブユニットへの変換の軽減、治療効力の改善および治療用に使用中の副作用の重症度または頻度の低減を含む種々の目的を意図して製造されうる。アミノ酸配列変異体は、翻訳後変異体、例えばグリコシル化変異体であることもあるが、通常は、天然で見いだされない予め決められた変異体である。本発明においてはＩＬ１０の任意の変異体が使用されうる。ただし、それは適当なレベルのＩＬ１０活性を保有している必要がある。腫瘍の場合、適当なＩＬ１０活性は、例えば、腫瘍部位内へのＣＤ８＋  Ｔ細胞浸潤、これらの浸潤性細胞からの炎症性サイトカイン、例えばＩＦＮγ、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ１０およびＲＡＮＫ−Ｌの発現、生物学的サンプルにおけるＴＮＦαまたはＩＦＮγのレベルの増加であろう。
【００４３】
本発明において使用されるＩＬ１０は、哺乳動物、例えばヒトまたはマウスに由来しうる。ヒトＩＬ１０（ｈＩＬ１０）は、ＩＬ１０治療を要するヒトの治療に好ましい。本発明において使用されるＩＬ１０は、好ましくは、組換えＩＬ１０である。ヒトおよびマウスＩＬ１０の製造を示す方法は米国特許第５，２３１，０１２号に見出されうる。ヒトおよびマウスＩＬ１０の天然に存在する又は保存的に置換された変異体も含まれる。本発明のもう１つの実施形態においては、ＩＬ１０はウイルス由来でありうる。エプスタインバーウイルスからのウイルス性ＩＬ１０（ＢＣＲＦ１タンパク質）のクローニングおよび発現はＭｏｏｒｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：１２３０（１９９０）に開示されている。
【００４４】
ＩＬ１０は、当技術分野で公知の標準的な技術［例えば、該タンパク質を分泌しうる活性化細胞（例えば、Ｔ細胞）の培地からの単離および精製、化学合成または組換え技術］を用いる多数の方法により得られうる［例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：３４１−４７（１９８６）；Ａｔｈｅｒｔｏｎら，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，１９８９，Ｉ．Ｒ．Ｌ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ；米国特許第５，２３１，０１２号（これは、組換え技術および他の合成技術を含む、ＩＬ１０活性を有するタンパク質の製造方法を教示している）を参照されたい］。好ましくは、ＩＬ１０タンパク質は、組換え技術を用いて、ＩＬ１０ポリペプチドをコードする核酸から得られる。また、組換えヒトＩＬ１０は例えばＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｊ．から商業的に入手可能である。
【００４５】
ＰＥＧ−ＩＬ１０は、当技術分野でよく知られた技術を用いて製造されうる。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、例えばＬｕｎｄｂｌａｄ，Ｒ．Ｌ．ら（１９８８）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ｖｏｌ．１，ｐｐ．１０５−１２５に記載されているとおりに合成されうる。ＰＥＧは、前記のとおりにリンカーを使用してＩＬ１０にコンジュゲート化されうる。ある実施形態においては、本発明において使用されるＰＥＧ−ＩＬ１０はモノＰＥＧ−ＩＬ１０であり、これにおいては、１〜９個のＰＥＧ分子が、リンカーを介して、ＩＬ１０二量体の１つのサブユニットのＮ末端におけるアミノ酸残基のアルファアミノ基に共有結合している。
【００４６】
ＩＶ．治療用組成物、方法
ＰＥＧ−ＩＬ１０は、治療的有効量のＩＬ１０と医薬担体とを含む医薬組成物として製剤化されうる。「治療的有効量」は、所望の治療結果を得るのに十分な量である。好ましくは、そのような量は最小の負の副作用を有する。ＩＬ１０で治療可能な状態を治療するために投与されるＰＥＧ−ＩＬ１０の量は該コンジュゲート化タンパク質のＩＬ１０活性に基づき、これは、当技術分野で公知のＩＬ１０活性アッセイにより決定されうる。そのような治療を要する個々の患者に対する治療的有効量は、例えば、治療される状態、患者の全体的な健康状態、投与方法、副作用の重症度などのような種々の要因を考慮して決定されうる。腫瘍の場合、適当なＩＬ１０活性は、例えば、腫瘍部位内へのＣＤ８＋  Ｔ細胞浸潤、これらの浸潤性細胞からの炎症性サイトカイン、例えばＩＦＮγ、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ１０およびＲＡＮＫ−Ｌの発現、生物学的サンプルにおけるＴＮＦαまたはＩＦＮγのレベルの増加であろう。
【００４７】
ＰＥＧ化ＩＬ１０の治療的有効量はタンパク質約０．０１〜約１００μｇ／ｋｇ体重／日（１日当たり体重１ｋｇ当たり）の範囲でありうる。好ましくは、ＰＥＧ化ＩＬ１０の量はタンパク質約０．１〜２０μｇ／ｋｇ体重／日、より好ましくはタンパク質約０．５〜１０μｇ／ｋｇ体重／日、最も好ましくはタンパク質約１〜４μｇ／ｋｇ体重／日の範囲である。本発明のＰＥＧ−ＩＬ１０を使用して、より低頻度の投与計画が用いられうる。なぜなら、このコンジュゲート化形態はＩＬ１０より長時間作用性だからである。該ＰＥＧ化ＩＬ１０は、凝集物および他のタンパク質を実質的に含有しない精製形態で製剤化される。好ましくは、ＰＥＧ−ＩＬ１０は、１日当たりタンパク質約５０〜８００μｇの範囲の量（すなわち、タンパク質約１〜１６μｇ／ｋｇ体重／日のＰＥＧ−ＩＬ１０）が運搬されるよう、連続的注入により投与される。１日注入量は副作用および血球数のモニターに基づいて変動しうる。
【００４８】
モノＰＥＧ−ＩＬ１０を含有する医薬組成物を製造するためには、ＰＥＧ−ＩＬ１０の治療的有効量を医薬上許容される担体または賦形剤と混合する。好ましくは、該担体または賦形剤は不活性である。医薬担体は、本発明のＩＬ１０組成物を患者へ運搬するのに適したいずれかの適合性無毒性物質でありうる。適当な担体の具体例には、正常食塩水、リンガー液、デキストロース溶液およびハンクス液が含まれる。非水性担体、例えば不揮発性油およびオレイン酸エチルも使用されうる。好ましい担体は５％デキストロース／食塩水である。該担体は少量の添加物、例えば、等張性および化学的安定性を増強する物質、例えばバッファーおよび保存剤を含有しうる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ＳｃｉｅｎｃｅｓおよびＵ．Ｓ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８４）を参照されたい。治療用物質および診断用物質の製剤は、生理的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することにより、例えば凍結乾燥粉末、スラリー、水性溶液（水溶液）または懸濁液の形態で製造されうる（例えば、Ｈａｒｄｍａｎら，（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ａｖｉｓら，（編）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら，（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら，（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；ＷｅｉｎｅｒおよびＫｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照されたい）。
【００４９】
本発明の組成物は経口投与されることが可能であり、あるいは体内に注射されることが可能である。経口用製剤は、胃腸管内のプロテアーゼから該ＩＬ１０を更に保護するための化合物をも含みうる。注射は、通常、筋肉内、皮下、皮内または静脈内である。あるいは適当な状況において、関節内注射または他の経路が用いられうる。
【００５０】
非経口投与の場合には、ＰＥＧ化ＩＬ１０は、好ましくは、医薬担体を伴う注射可能な単位投与形（溶液、懸濁液、エマルション）として製剤化される。例えば、Ａｖｉｓら編，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら編，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）；およびＬｉｅｂｅｒｍａｎら編，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）を参照されたい。あるいは本発明の組成物は移植可能または注射可能な薬物運搬系（ドラッグデリバリーシステム）により患者の体内に導入されうる（例えば、Ｕｒｑｕｈａｒｔら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２４：１９９−２３６，（１９８４）；Ｌｅｗｉｓ編，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８１）；米国特許第３，７７３，９１９号、第３，２７０，９６０号など）。該ＰＥＧ化ＩＬ１０は、種々の添加剤および／または希釈剤の存在下または非存在下、例えば水、食塩水（塩類液）または緩衝化ビヒクルのような水性ビヒクル中で投与されうる。
【００５１】
個々の患者に対する有効量は、例えば、治療されている状態、患者の全体的な健康状態、投与の方法、経路および用量ならびに副作用の重症度のような要因に応じて変動しうる（例えば、Ｍａｙｎａｒｄら，（１９９６）Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ＳＯＰｓ  ｆｏｒ  Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ；Ｄｅｎｔ（２００１）Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｕｒｃｈ  Ｐｕｂｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫを参照されたい）。
【００５２】
典型的な獣医学的対象、実験対象または研究対象には、サル、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ウマおよびヒトが含まれる。
【００５３】
適当な用量の決定は、例えば、治療に影響を及ぼすことが当技術分野において知られている若しくはその疑いがある又は治療に影響を及ぼすと予想されるパラメーターまたは因子を用いて、実施者により行われる。一般に、投与は、最適用量より幾分少ない量で開始し、ついで、いずれかの負の副作用との比較において所望の又は最適な効果が達成されるまで、それを少しずつ増加させる。重要な診断尺度には、例えば炎症の症状の尺度、または産生された炎症性サイトカインのレベルが含まれる。好ましくは、使用される生物学的物質は治療標的動物と同じ種に由来し、それにより該試薬に対する体液性応答が最小限度に抑えられる。第２の治療用物質、例えばサイトカイン、ステロイド、化学療法剤、抗生物質または放射線との共投与または治療のための方法は当技術分野においてよく知られている（例えば、Ｈａｒｄｍａｎら，（編）（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；ＰｏｏｌｅおよびＰｅｔｅｒｓｏｎ（編）（２００１）Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ．，ＰＡ；ＣｈａｂｎｅｒおよびＬｏｎｇｏ（編）（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ．，ＰＡを参照されたい）。治療用物質の有効量は、典型的には少なくとも１０％、通常は少なくとも２０％、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約４０％、最も好ましくは少なくとも５０％、症状、例えば腫瘍サイズの減少または腫瘍成長の抑制をもたらす。
【００５４】
ＶＩ．用途
本発明は、増殖状態または障害、例えば、子宮、子宮頸、乳房、前立腺、精巣、陰茎、胃腸管、例えば食道、中咽頭、胃、小腸、大腸、結腸または直腸、腎臓、腎細胞、膀胱、骨、骨髄、皮膚、頭部または頚部、皮膚、肝臓、胆嚢、心臓、肺、膵臓、唾液腺、副腎、甲状腺、脳（例えば、神経膠腫）、神経節、中枢神経系（ＣＮＳ）および末梢神経系（ＰＮＳ）ならびに免疫系（例えば、脾臓または胸腺）の癌の治療方法を提供する。本発明は、例えば、免疫原性腫瘍、非免疫原性腫瘍、休眠腫瘍、ウイルス誘発性癌、例えば上皮細胞癌、内皮細胞癌、扁平上皮癌、パピローマウイルス、腺癌、リンパ腫、癌腫、メラノーマ、白血病、骨髄腫、肉腫、奇形癌腫、化学誘発性癌、転移および血管新生の治療方法を提供する。本発明はまた、例えば、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）および／またはＣＤ８  Ｔ細胞の活性をモジュレーションすることによる、腫瘍細胞または癌細胞抗原に対する寛容の軽減を想定している（例えば、Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｍｏｎｔａｇｕｔら，（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：３１８０−３１８７；Ｓａｗａｙａら，（２００３）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９：１５０１−１５０９；Ｆａｒｒａｒら，（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：２８４２−２８４９；Ｌｅら，（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：６７６５−６７７２；ＣａｎｎｉｓｔｒａおよびＮｉｌｏｆｆ（１９９６）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３４：１０３０−１０３８；Ｏｓｂｏｒｎｅ（１９９８）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３９：１６０９−１６１８；ＬｙｎｃｈおよびＣｈａｐｅｌｌｅ（２００３）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：９１９−９３２；ＥｎｚｉｎｇｅｒおよびＭａｙｅｒ（２００３）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９：２２４１−２２５２；Ｆｏｒａｓｔｉｅｒｅら，（２００１）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４５：１８９０−１９００；Ｉｚｂｉｃｋｉら，（１９９７）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３７：１１８８−１１９４；Ｈｏｌｌａｎｄら（編）（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，４ｔｈｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡを参照されたい）。
【００５５】
幾つかの実施形態においては、本発明は、ＰＥＧ−ＩＬ１０および少なくとも１つの追加的な治療用または診断用因子を使用する、増殖状態、癌、腫瘍または前癌状態、例えば過形成の治療方法を提供する。該追加的治療用因子は例えば以下のものでありうる：サイトカインまたはサイトカインアンタゴニスト、例えばＩＬ１２、インターフェロン−アルファ、または抗上皮増殖因子受容体、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、葉酸代謝拮抗物質、例えばメトトレキセート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）またはフルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｕｒａｃｉｌ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、放射線療法、ホルモンまたは抗ホルモン療法、例えばアンドロゲン、エストロゲン、抗エストロゲン、フルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）またはジエチルスチルベストロール（ｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｌｂｅｓｔｒｏｌ）、手術、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、イフォスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）、アルキル化剤、例えばメルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）またはシスプラチン（ｃｉｓ−ｐｌａｔｉｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）、グルココルチコイド、ヒスタミン受容体アンタゴニスト、血管新生インヒビター、放射線、放射線増感剤、アントラサイクリン（ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、ビンカアルカロイド、タキサン、例えばパクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）およびドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、細胞周期インヒビター、例えばサイクリン依存性キナーゼインヒビター、別の腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体、モノクローナル抗体と毒素との複合体、Ｔ細胞アジュバント、骨髄移植、または抗原提示細胞、例えば樹状細胞療法。ワクチンは、例えば可溶性タンパク質として、または該タンパク質をコードする核酸として提供されうる（例えば、Ｌｅら，前掲；ＧｒｅｃｏおよびＺｅｌｌｅｆｓｋｙ（編）（２０００）Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ；ＳｈａｐｉｒｏおよびＲｅｃｈｔ（２００１）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：１９９７−２００８；Ｈｏｒｔｏｂａｇｙｉ（１９９８）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３９：９７４−９８４；Ｃａｔａｌｏｎａ（１９９４）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３１：９９６−１００４；ＮａｙｌｏｒおよびＨａｄｄｅｎ（２００３）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．３：１２０５−１２１５；Ｔｈｅ  Ｉｎｔ．Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｉａｌ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐ（２００４）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０：３５１−３６０；Ｓｌａｍｏｎら（２００１）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：７８３−７９２；Ｋｕｄｅｌｋａら（１９９８）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３８：９９１−９９２；ｖａｎ  Ｎｅｔｔｅｎら（１９９６）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３４：９２０−９２１を参照されたい）。
【００５６】
癌の髄外造血（ＥＭＨ）の治療方法も提供する。ＥＭＨは記載されている（例えば、Ｒａｏら（２００３）Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ４４：７１５−７１８；Ｌａｎｅら（２００２）Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ．２９：６０８−６１２を参照されたい）。
【００５７】
本発明の広範な範囲は、以下の実施例を参照して最も良く理解されるが、それらの実施例は本発明を特定の実施形態に限定することを意図したものではない。
【００５８】
本明細書における全ての引用文献を、各個の刊行物または特許出願が参照により組み入れられると具体的かつ個別に示されている場合と同様に、参照により本明細書に組み入れることとする。
【００５９】
当業者に明らかなとおり、本発明の多数の修飾および変更が、その精神および範囲から逸脱することなく施されうる。本明細書に記載されている特定の実施形態は単なる例示として記載されているに過ぎず、本発明は、添付の特許請求の範囲の条項およびそのような特許請求の範囲に含まれる均等物の全範囲により限定されるべきであり、本発明は、本明細書に例示として記載されている特定の実施形態により限定されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１はモノ−およびジ−ＰＥＧ−ＩＬ１０の製造の反応速度論を示す。
【図２】図２は、移植されたＰＤＶ６扁平上皮癌に対する種々のモノ−およびジＰＥＧ−ＩＬ１０（マウス）プロトタイプの効力を示す。
【００６１】
実施例
Ｉ．一般的方法
分子生物学における標準的な方法は記載されている（Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｗｕ（１９９３）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｖｏｌ．２１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。標準的な方法はＡｕｓｕｂｅｌら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＶｏＩｓ．１−４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹにも記載されており、これは細菌細胞におけるクローニングおよびＤＮＡ突然変異誘発（Ｖｏｌ．１）、哺乳類細胞および酵母におけるクローニング（Ｖｏｌ．２）、複合糖質およびタンパク質発現（Ｖｏｌ．３）、ならびにバイオインフォマティクス（Ｖｏｌ．４）を記載している。
【００６２】
免疫沈降、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離および結晶化を含むタンパク質精製のための方法が記載されている（Ｃｏｌｉｇａｎら（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａａｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。化学分析、化学修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の製造、タンパク質のグリコシル化が記載されている（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ，ｐｐ．１６．０．５−１６．２２．１７；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃｏ．（２００１）Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；ｐｐ．４５−８９；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００１）ＢｉｏＤｉｒｅｃｔｏｒｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，ｐｐ．３８４−３９１を参照されたい）。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の製造、精製および断片化が記載されている（Ｃｏｌｉｇａｎら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，前掲）。リガンド／受容体相互作用を特徴づけるための標準的な技術が利用可能である（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい）。ＰＥＧ−ＩＬ１０の製造方法は、例えば米国特許第７，０５２，６８６号に記載されている。
【００６３】
蛍光標示式細胞分取検出系（ＦＡＣＳ）を含むフローサイトメトリーのための方法が利用可能である（例えば、Ｏｗｅｎｓら（１９９４）Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ；Ｇｉｖａｎ（２００１）Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２ｎｄｅｄ．；Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ：Ｓｈａｐｉｒｏ（２００３）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪを参照されたい）。核酸プライマーおよびプローブを含む核酸、ポリペプチドならびに抗体を修飾するのに適した、例えば診断試薬として使用される蛍光試薬が入手可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。
【００６４】
免疫系の組織学の標準的方法が記載されている（例えば、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈａｒｍｅｌｉｎｋ（編）（１９８６）Ｈｕｍａｎ  Ｔｈｙｍｕｓ：Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｈｉａｔｔら（２０００）Ｃｏｌｏｒ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ，ＰＡ；Ｌｏｕｉｓら（２００２）Ｂａｓｉｃ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ：Ｔｅｘｔ  ａｎｄ  Ａｔｌａｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照されたい）。
【００６５】
癌の治療および診断のための方法が記載されている（例えば、Ａｌｉｓｏｎ（編）（２００１）Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｇｒｏｖｅ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；Ｏｌｄｈａｍ（編）（１９９８）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，３ｒｄ．ｅｄ．，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌ，Ｈｉｎｇｈａｍ，ＭＡ；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（編）（２００１）Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｅｌａｎｏｍａ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｄｕｎｉｔｚ，Ｌｔｄ．，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ；Ｄｅｖｉｔａら（編）（２００１）Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，６ｔｈｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｐｈｉｌａ，ＰＡ；Ｈｏｌｌａｎｄら（編）（２０００）Ｈｏｌｌａｎｄ−Ｆｒｅｉ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＢＣ  Ｄｅｃｋｅｒ，Ｐｈｉｌａ．，ＰＡ；ＧａｒｒｅｔｔおよびＳｅｌｌ（編）（１９９５）Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍａｒｋｅｒｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ；ＭａｃＫｉｅ（１９９６）Ｓｋｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ，２ｎｄｅｄ．，Ｍｏｓｂｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ；Ｍｏｅｒｔｅｌ（１９９４）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３０：１１３６−１１４２；Ｅｎｇｌｅｍａｎ（２００３）Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３０（３  Ｓｕｐｐｌ．８）：２３−２９；Ｍｏｈｒら（２００３）Ｏｎｋｏｌｏｇｉｅ  ２６：２２７−２３３を参照されたい）。
【００６６】
例えば抗原断片、リーダー配列、タンパク質フォールディング、機能性ドメイン、グリコシル化部位および配列アライメントを決定するためのソフトウェアパッケージおよびデータベースが入手可能である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ，Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（登録商標）Ｓｕｉｔｅ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）；ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；ＤｅＣｙｐｈｅｒ（登録商標）（ＴｉｍｅＬｏｇｉｃ  Ｃｏｒｐ．，Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｂａｙ，Ｎｅｖａｄａ）；Ｍｅｎｎｅら（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １６：７４１−７４２；Ｍｅｎｎｅら（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｎｏｔｅ  １６：７４１−７４２；Ｗｒｅｎら（２００２）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｐｒｏｇｒａｍｓ  Ｂｉｏｍｅｄ．６８：１７７−１８１；ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ（１９８３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３：１７−２１；ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：４６８３−４６９０を参照されたい）。
【００６７】
ＩＩ．ＰＥＧ化ＩＬ１０
ＩＬ１０（例えば、げっ歯類または霊長類）を５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１００ｍＭ  塩化ナトリウム（ｐＨ範囲５〜７．４）に対して透析した。１：１〜１：７モル比の５Ｋ  ＰＥＧ−プロピルアルデヒドを、０．７５〜３０ｍＭ  ナトリウムシアノボロヒドリドの存在下、１〜１２ｍｇ／ｍｌのＩＬ１０と反応させた。あるいは同様にして、該反応をピコリンボランで活性化することが可能である。該反応を５〜３０℃で３〜２４時間インキュベートした。
【００６８】
特に、ＰＥＧ化反応のｐＨを６．３に調節し、７．５ｍｇ／ｍｌのｈＩＬ１０をＰＥＧと反応させて、ＩＬ１０対ＰＥＧリンカーの比を１：３．５とした。シアノボロヒドリドの最終濃度は２５ｍＭであり、該反応を１５℃で１２〜１５時間行った。図１はモノ−およびジ−ＰＥＧ−ＩＬ１０の反応速度論を示す。該モノ−およびジ−ＰＥＧ  ＩＬ１０は該反応の最大産物であり、終了時にそれぞれの濃度は５０％である。
【００６９】
該反応を、アミノ酸、例えばグリシンおよびリシン、またはＴｒｉｓバッファーを使用してクエンチした。所望のＰＥＧ化プロトタイプを単離するためには、例えばゲル濾過、アニオンおよびカチオン交換クロマトグラフィーならびにサイズ排除のような複数の精製方法が用いられている。
【００７０】
あるいは、ＩＬ１０を１０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌに対して透析する。該透析バッファーを使用して、該透析ＩＬ１０を約０．５〜１２ｍｇ／ｍｌの濃度へと３．２倍希釈した。リンカーであるＳＣ−ＰＥＧ−１２Ｋ（Ｄｅｌｍａｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍａｙｗｏｏｄ，ＩＬ）の添加の前に、１容量の１００ｍＭ  Ｎａ−テトラボラート（ｐＨ９．１）を９容量の該希釈ＩＬ１０に加えて、該ＩＬ１０溶液のｐＨを８．６に上昇させる。該ＳＣ−ＰＥＧ−１２Ｋリンカーを該透析バッファーに溶解し、適当な容量の該リンカー溶液（ＩＬ１０の１ｍｏｌ当たりリンカー１．８〜３．６ｍｏｌ）を該希釈ＩＬ１０溶液中に加えて該ＰＥＧ化反応を開始させる。該反応の速度を制御するために、該反応を５℃で行う。該ＰＥＧ化反応中、該反応溶液を穏やかに攪拌する。サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）による測定で該モノＰＥＧ−ＩＬ１０の収率が４０％近くになれば、１Ｍ  グリシン溶液を３０ｍＭの最終濃度まで加えることにより該反応を停止させた。ＨＣｌ溶液を使用して該反応溶液のｐＨをゆっくりと７．０に調節し、該反応を０．２ミクロンフィルターで濾過し、−８０℃で保存する。
【００７１】
ＩＩＩ．効力比較
ＰＥＧ−ＩＬ１０の種々のプロトタイプを比較するために、治療群当たり１０匹のマウスにマトリゲル内の１０６  ＰＤＶ６扁平上皮癌を１００μＬの体積内の右脇腹に皮下移植した。平均腫瘍サイズが１００ｍｍ３に達したら（移植から約２〜３週間）、以下のマウスＰＥＧ−ＩＬ１０プロトタイプまたは対照での処理を１日１回開始した（特に示されていない限り、リンカーはＰＰＡであった）。
【００７２】
対照              ＨＥＰＥＳバッファー
０．２ｍｐｋ      ２×５Ｋ  ジＰＥＧ−ＩＬ１０
０．０２ｍｐｋ    ２×５Ｋ  ジＰＥＧ−ＩＬ１０
０．２ｍｐｋ      １×５Ｋ  モノＰＥＧ−ＩＬ１０
０．０２ｍｐｋ    １×５Ｋ  モノＰＥＧ−ＩＬ１０
０．２ｍｐｋ      １×５Ｋ  モノＰＥＧ−ＩＬ１０＋２×５Ｋ  ジＰＥＧ−ＩＬ１０
０．０２ｍｐｋ    １×５Ｋ  モノＰＥＧ−ＩＬ１０＋２×５Ｋ  ジＰＥＧ−ＩＬ１０
０．２ｍｐｋ      １×１２Ｋ  モノＰＥＧ−ＩＬ１０（ＳＣリンカー）
０．０２ｍｐｋ    １×１２Ｋ  モノＰＥＧ−ＩＬ１０（ＳＣリンカー）
測定したエンドポイントには、腫瘍サイズ（週２回測定）、体重（週１回測定）および血清濃度（処理の開始時、中間点および終了時）が含まれた。図２は前記の種々のプロトタイプの効力を示す。
【００７３】
本明細書における全ての引用文献を、各個の刊行物または特許出願が参照により組み入れられると具体的かつ個別に示されている場合と同様に、参照により本明細書に組み入れることとする。
【００７４】
当業者に明らかなとおり、本発明の多数の修飾および変更が、その精神および範囲から逸脱することなく施されうる。本明細書に記載されている特定の実施形態は単なる例示として記載されているに過ぎず、本発明は、添付の特許請求の範囲の条項およびそのような特許請求の範囲に含まれる均等物の全範囲により限定されるべきであり、本発明は、本明細書に例示として記載されている特定の実施形態により限定されるべきではない。
【図１】
0005888980.tif 000002
【図２】
0005888980.tif 000003