(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体であって、ＣＤ１３のリガンドペプチドと、ジョイニングペプチドと、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドとによって構成された融合蛋白質であり、
ＣＤ１３の前記リガンドペプチドは環状構造を有するＣＮＧＲＣペプチドであり、前記ジョイニングペプチドは分岐側鎖を含まない１〜２５個のアミノ酸残基から構成されることを特徴とする腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体。
【請求項２】
前記腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体を、ポリエチレングリコールと脂肪酸で酸性にして修飾した、または、抗体のＦｃ断片またはアルブミンを加えた組み換えで修飾した腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体である、ことを特徴とする請求項１に記載の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体。
【請求項３】
腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体のコード遺伝子を人工合成または遺伝子クローンによって構成し、一般的な遺伝子操作方法を使用して該コード遺伝子の遺伝子発現及び分離精製を実現する、ことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の作製方法。
【請求項４】
請求項１または請求項２に記載の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の大腸菌組み換え発現菌株を、３５℃〜１０℃の低温下で培養及び誘導発現を行う、ことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の大腸菌における可溶性型発現方法。
【請求項５】
腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の分離精製方法において、請求項１または請求項２に記載の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体をイオン交換クロマトグラフィー及び金属アフィニティークロマトグラフィーによって精製する、ことを特徴とする腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の分離精製方法。
【請求項６】
ＣＤ１３リガンド及びジョイニングペプチドの連続配列をコードするｃＤＮＡであって、前記コードが請求項１または請求項２に記載の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体から選ばれたｃＤＮＡ。
【請求項７】
請求項６のｃＤＮＡを含む遺伝子発現用担体。
【請求項８】
請求項１または請求項２に記載の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体を含有する腫瘍治療薬剤。
【請求項９】
従来の腫瘍治療薬剤及び技術と併用される、請求項８に記載の腫瘍治療薬剤。
【請求項１０】
請求項６または請求項７に記載の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体のｃＤＮＡ及びその遺伝子発現用担体を適用して調製した腫瘍治療薬剤。
【請求項１１】
従来の腫瘍治療薬剤及び技術と併用される、請求項１０に記載の腫瘍治療薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子操作技術分野に属し、腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の調製及び薬学的な応用に係る。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）は腫瘍壊死因子スーパーファミリーの１メンバーである。腫瘍壊死因子スーパーファミリーのその他のメンバーと類似し、可溶性型の腫瘍壊死因子関連リガンドが三量体の形で、ターゲット細胞表面の三量体化受容体分子と結合することによって生物学的に機能する。腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドのアポトーシス誘導作用は、腫瘍細胞における細胞死受容体４（ＤＲ４）及び細胞死受容体５（ＤＲ５）と相互作用して細胞死信号を伝達することによって実現する。腫瘍壊死因子スーパーファミリーのその他のメンバーが全身性の毒性副作用を有するため、その応用が制限されてきたが、他方、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドは比較的安全性が高い上に、種瘍選択性を有する抗腫瘍物質である。前記種瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドはインビボにおいて複数種の腫瘍細胞及び癌化細胞のアポトーシスを誘導でき、且つマウスの、結腸癌、乳癌、多発性骨髄腫、神経膠腫、前立腺癌などを含む複数種の移植異種腫瘍モデルにおいて比較的良好な抗腫瘍活性を有する。特に重要な点は、マウス及び非ヒト霊長類動物に全身投与した場合、ＴＲＡＩＬの毒性が比較的低い、または出ないことが確認されたことである。上記理由から、組み換え腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの、腫瘍治療の臨床研究がすでに進められている。    
但し、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する以外に、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドはさらに自然免疫及び獲得免疫に係り、自身免疫性疾患に関与することが最近報告された。例えば、近年の報告は、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドは胸腺の発育過程において負の選択を調節し、または胸腺細胞をアポトーシスし、且つ自己免疫性疾患、例えばＩ型糖尿病の誘発において重要な役割を果すことを述べている。また、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの受容体は全身において広範に発現し、さらに肝細胞死及び肝炎に関与するため、臨床において腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドを繰り返して、全身に大量に使用することは予想できない免疫機能への影響を招く恐れがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】中国特許文献２００７１０１３３８６２．１
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ Ｒ， Ｋｏｉｖｕｎｅｎ Ｅ， Ｋａｉｎ Ｒ等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２０００，６０：７２２−７２７
【非特許文献２】Ｈａｒａｇｕｃｈｉ Ｎ，Ｉｓｈｉｉ Ｈ，Ｍｉｍｏｒｉ Ｋ等，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． ２０１０，１２０：３３２６−３３３９
【非特許文献３】Ｆｏｎｔｉｊｎ Ｄ，Ｄｕｙｎｄａｍ ＭＣ， ｖａｎ Ｂｅｒｋｅｌ ＭＰ等，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ． ２００６，９４：１６２７−１６３６
【非特許文献４】Ｆｕｊｉｉ Ｈ， Ｎａｋａｊｉｍａ Ｍ， Ｓａｉｋｉ Ｉ等，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ． １９９５，１３：３３７−３４４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
以上の報告は、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの臨床における重複及び持続的な使用による潜在的な毒性副作用を、医者に大いに危惧させるものである。従って、腫瘍の治療時に、癌以外の組織に対する腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの毒性副作用を如何にして防止するかは、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＩＡＬ）の、臨床応用面において技術的課題となっている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
野生型腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの、腫瘍治療面における欠点を克服するため、本発明の目的は、腫瘍組織ターゲティング能を有する腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドを発明し、前記誘導リガンドの治療効果を向上し、その毒性副作用を低減するように、前記誘導リガンドを腫瘍組織に標的搬送することで、腫瘍疾患治療に応用することである。
【０００７】
非特許文献１によれば、アミノペプチダーゼＮ（Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｎ， ＡＰＮ）／ＣＤ１３蛋白は、腫瘍新生血管内皮細胞のみに発現する蛋白質であり、静止状態における正常血管内皮細胞はわずかにＣＤ１３を発現するだけである。また、非特許文献２乃至非特許文献４によれば、最近、アミノペプチダーゼＮ／ＣＤ１３も腫瘍の転移及び予後と関連することが発見された。
【０００８】
本発明は以下の技術的手段により、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの標的搬送を実現し、その抗腫瘍治療効果を向上し、その毒性副作用を低減する目的を達成して実現するものである。      
本発明の一態様では、腫瘍組織ターゲティングを有する腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体であって、配列表における配列１のアミノ酸残基配列を有する蛋白質であり、遺伝子操作方法によって、ＣＤ１３のリガンド、ジョイニングペプチド、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドによって構成した腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体融合蛋白質を構築する。即ち、一般的な遺伝子操作方法を使用して、人工合成またはクローンによって、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体のコード遺伝子を構築し、可溶性型に組み換え・ 発現し、及び容易に分離・精製する。前記ＣＤ１３リガンドはＮＧＲ配列を含有するポリペプチドであってもよく、好ましくは、環状構造を有し、ＮＧＲ配列を含有するポリペプチド、例えばショートペプチドＣＮＧＲＣである。
【０００９】
前記ＣＤ１３のリガンドと腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドとによって構成
した腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体との間に、柔軟性構造を有し、側鎖アミノ酸を含まないショートペプチドを添加してもよい。なお、ショートペプチドは、１〜２５個のアミノ酸残基からなり、主にグリシン、アラニン、セリンなどの、側鎖を含まないアミノ酸によって構成される。
前記ＣＤ１３のリガンドを、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドのＮ端に配置する場合、発現時にＮ端アミノ酸の分解が発生してＣＤ１３リガンドの機能に影響することを防止するために、ＣＤ１３のリガンドの前に側鎖を含まないアミノ酸、主にアラニンまたはグリシンの配列を増加する。
【００１０】
前記ＣＤ１３の合成リガンドと腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドとによって構成した腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体は、腫瘍治療の薬剤調製に良好に応用できる。前記腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドによって調製した腫瘍治療薬剤は、従来の化学治療、放射線治療、中医薬治療、生物治療などの方法と、腫瘍治療において併用療法することができる。
【００１１】
また、本発明の別の態様では、大量の、高純度の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の重合体を、大腸菌において可溶性型に発現し、且つ容易に分離精製する方法を提供する。現在腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドは大腸菌における発現の多くが非生物活性の封入体生成物であるが、本発明における腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の分子構造及び分子量が野生型の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドと比べより複雑で大きいため、大腸菌において発現する時に、その封入体の形成がより多くなり、精製がより複雑となる。本発明では、腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体を低温培養及び誘導発現する発現方法を採用することで、発現生成物に封入体が形成することを有効に防止できる。本発明は同時に、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドが金属イオンとキレート化する生物機能を有することを利用し、イオン交換クロマトグラフィーと金属アフィニティークロマトグラフィーとを連結することによって、腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体を有効に精製し、高純度の蛋白質生成物を得、且つ前記高純度生成物は含有率の高い重合体型を有するため、非常に良好な生物活性を有する。なお、前記低温は３５℃〜１０℃を指す。
【００１２】
また、ＣＤ１３は腫瘍の新生血管内皮細胞にのみ発現するが、他方、静止状態にある正常血管内皮細胞にはわずかにしか発現しない。最近の研究では、ＣＤ１３蛋白が塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の調節によって、１Ｆ６悪性黒色腫などの腫瘍細胞表面に選択的に高発現し、且つ腫瘍の悪性浸潤及び転移と密接に関連することを明らかにしている。本発明者達はフローサイトメトリーを使用して、ＣＤ１３の、様々な種類の細胞における発現レベルを分析した。その結果、ヒト毛細血管内皮細胞がＣＤ１３を高レベルで発現し、ヒト子宮頚癌細胞Ｈｅｌａ腫瘍細胞もＣＤ１３の発現レベルが比較的高く、結腸癌細胞ＨＣＴ−１５は中程度のＣＤ１３分子を発現し、結腸癌細胞ＣＯＬＯ−２０５はＣＤ１３分子を極微量にまたは発現しないことを表らかにした。
前記ＣＤ１３リガンドと腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体とによって構成した腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体は、その腫瘍組織における分布を大幅に向上させ、その腫瘍組織における標的搬送を実現させ、その抗腫瘍効果を大幅に向上させるとともに、同時に、その使用量を顕著に低減することができる。
同時に腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体のｃＤＮＡのコードを公開したが、これによって腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドのｄＤＮＡを介してコードされるＣＤ１３リガンド及びジョイニングペプチドのＤＮＡ配列調製を促進することができる。この結果、前記構成の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体のｃＤＮＡを遺伝子治療に用いることができる。
本発明の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体は、ポリエチレングリコールと脂肪酸で酸性にして修飾する、または、抗体のＦｃ断片またはアルブミンを加えた組み換えで修飾することができ、それによって、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の半減期を延長し、薬物動態学的により良好な効果を達成する。
【発明の効果】
【００１３】
従来の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体と比べ、本発明は以下の有益な効果を有する。
（１）より良好な腫瘍組織ターゲティング能：従来の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドは、腫瘍組織に対する相対的な選択的作用を、主に腫瘍組織が発現する細胞死受容体４及び受容体５を使用して顕著に実現するが、一方、本発明の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体は、腫瘍組織が発現する細胞死受容体４及び受容体５を使用する以外に、さらに腫瘍組織がＣＤ１３を多量に発現する特徴を利用して、腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの、腫瘍組織に対する標的搬送をより有効に実現する。
（２）より高効率の抗腫瘍効果：腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの、腫瘍組織における標的投与を実現するため、本発明の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体は、同様な用量の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドと比べた場合、及び、腫瘍細胞表面のインテグリンαＶβ３、αＶβ５にターゲティングするＴＲＡＩＬ変異体ＲＧＤ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ（特許文献１参照）と比べた場合、単独使用でも、あるいは、従来の化学治療、放射線治療、中医薬治療、生物治療などの方法との併用でも、ともにより強い抗腫瘍効果を示した。
（３）より低い使用量：腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガン
ド変異体が、同様な用量の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドと比べてより強い抗腫瘍効果を有するため、使用時に、同程度な抗腫瘍治療効果を奏したい場合、腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体蛋白質の用量を大幅に低減することができる。腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体蛋白質の投与量の低減は、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの、腫瘍治療における潜在的な副作用を克服することができ、同時に、腫瘍患者の治療費用を削減でき、高い有効性、低毒性副作用、低コストの腫瘍治療効果を達成する。
【００１４】
（４）発現及び生産の容易さ：腫瘍細胞特異性抗体及びその抗体断片によってターゲティングする腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド融合蛋白質と異なって、本発明は腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドをＣＤ１３のショートペプチドと融合しても、分子量の増加が大きくないために、腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の遺伝子クローンの、発現及び生産により有利であり、生産量がより高い。
（５）可溶性型の発現及び容易な分離精製：現在、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドを大腸菌において発現する時に非生物活性の封入体生成物を形成しやすい。一方で、本発明の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の分子構造及び分子量は野生型の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドと比べより複雑で大きい。従って、本発明は腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体を低温下で培養及び誘導発現する発現方法を開発することにより、発現生成物に封入体が形成することを有効に防止可能とした。本発明は同時に、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドが金属イオンをキレート化する生物機能を有することを利用し、金属アフィニティークロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィーとを連結することによって、腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体を有効に精製し、高純度の蛋白質生成物を得た。本発明は可溶性型の発現及び容易な分離精製方法を最適化することによって精製した生成物に、含有率の高い重合体型を最終的に得た。それによって、得られた生成物が非常に良好な生物活性を有することを証明した。含有率の高い重合体型の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体を生産することは、本発明と同類の研究に対して顕著な相違点となる。本発明によって、高い重合体含有率の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体を有効に発現し及び高効率に得る発現方法及び精製プロセスを提供できる。
（６）ＣＤ１３リガンドのＮ端に側鎖を含まない１個のアミノ酸を結合することで、発現時にＮ端アミノ酸の分解を抑制し、ＣＤ１３リガンドの機能に影響することを有効に防止する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】精製した組み換えヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及び変異体の分析結果を示す。１Ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示し：１はＣＤ１３にターゲティングする腫瘍ターゲティングヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体（ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ）を、２はヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドを、３はインテグリンαＶβ３、αＶβ５にターゲティングするヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体（ＲＧＤ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ）を、それぞれ示す。１Ｂは、非還元、非変性ＰＡＧＡ分析結果を示し：１はＣＤ１３にターゲティングする腫瘍ターゲティングヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体（ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ）を、２はヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）を、３はインテグリンαＶβ３、αＶβ５にターゲティングするヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体（ＲＧＤ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ）を、それぞれ示す。
【図２】フローサイトメトリーで、緑色フルオレセイン標識のヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）及びその腫瘍ターゲティング変異体（ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ）とヒト毛細血管内皮細胞との結合を示す。ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ及びＴＲＡＩＬ、ＲＧＤ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）対照蛋白はＦＩＴＣフルオレセイン用いて標識される。ヒト毛細血管内皮細胞（ＨＤＭＶＥＣ）は１μｇの標識蛋白質を用いて１時間標識した。
【図３】ＣＯＬＯ−２０５細胞表面ＣＤ１３とインテグリンαＶβ３、αＶβ５との発現分析を示す。（ａ）は、ＣＤ１３の発現分析を、（ｂ）はインテグリンαＶβ３の発現分析を、（ｃ）はインテグリンαＶβ５の発現分析を、それぞれ示す。
【図４】ヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）及びその腫瘍ターゲティング変異体（ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ）の、各種腫瘍細胞アポトーシスを誘導する線量効果との関係の分析を示す。（ａ）は、Ｈｅｌａ細胞を、（ｂ）は、ＣＯＬＯ−２０５細胞を、（ｃ）は、ＨＣＴ−１５細胞カスパーゼを示す。
【図５】分光光度法で、ヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）及びその腫瘍ターゲティング変異体（ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ）の、ＣＤ１３陽性Ｈｅｌａ細胞カスパーゼ−８及びカスパーゼ−３の酵素活性に対する影響を示す。（ａ）は、カスパーゼ−８、（ｂ）はカスパーゼ−３の結果を、それぞれ示す。細胞はそれぞれ１０〜２７０ｎｇ／ｍｌ濃度分布の腫瘍ターゲティング変異体ＮＧＲＬ−ＴＲＡＩＬ及びＲＧＤ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ蛋白を用いてＨｅｌａ細胞をそれぞれ８時間処理し、誘導後細胞は氷上分裂分解し、蛍光基質を加えて１時間反応し、その後マイクロプレートリーダーを用いて測定分析を行った（励起波長４００ｎｍ、発振波長５０５ｎｍ）。
【図６】ヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）及びその腫瘍ターゲティング変異体（ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ）の、ＣＯＬＯ−２０５腫瘍モデルにおける単独治療及びＣＰＴ−１１との併用治療の抗腫瘍効果を示す。（ａ）はヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）及びその腫瘍ターゲティング変異体（ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ）、並びにＲＧＤ−Ｌ−ＴＲＡＩＬの単独治療を示す。（ｂ）はヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体とＣＰＴ−１１との併用治療を示す。データ統計分析結果は平均値で表示され、分散は標準誤差で、アスタリスク＊はｐ＜０．０５を表し、２つのアスタリスク＊＊はｐ＜０．０１を表す。
【図７】ヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）及びその腫瘍ターゲティング変異体（ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ）の、ＨＴ−１５結腸癌腫瘍モデルにおける単独治療及びＣＰＴ−１１との併用治療の抗腫瘍効果を示す。（ａ）はヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）及びその腫瘍ターゲティング変異体（ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ）の単独治療を示す。（ｂ）はヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）及びその腫瘍ターゲティング変異体（ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ）とＣＰＴ−１１との併用治療を示す。データ統計分析結果は平均値で表示され、分散は標準誤差で、アスタリスク＊はｐ＜０．０５を表し、２つのアスタリスク＊＊はｐ＜０．０１を表す。
【図８】ヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）及びその腫瘍ターゲティング変異体（ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ）の、ＴＲＡＩＬが感受性ではないＨＴ−２９結腸癌腫瘍モデルにおける単独治療及びＣＰＴ−１１との併用治療の抗腫瘍効果を示す。
【図９】ヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）とその変異体（ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ）、及びＲＧＤ−Ｌ−ＴＲＡＩＬの、ＣＯＬＯ−２０５腫瘍動物モデル内の腫瘍組織におけるターゲティング集積効果の比較分析を示す。ＣＯＬＯ−２０５腫瘍を含有するヌードマウスに、それぞれ１００ｍｌ／５μＣｉ．標識のヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその腫瘍ターゲティング変異体蛋白を尾静脈注射する。静注後、５、３０、６０、１２０及び２４０分後に、それぞれ腫瘍組織を剥離して且つ重量を測り、サーマルサイクラーを用いて腫瘍組織同位体の放射量を測定した。腫瘍組織の放射量単位がグラムごとの組織測定放射量と注射放射量との百分率（％  ＩＤ／ｇ）であり、全ての結果は３回の独立した実験の平均値である。
【図１０】１２５Ｉ同位体標識測定したヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）及びその変異体（ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ）の、動物器官組織における分布である。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００１６】
腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の調製
コンピュータ支援構造を使用してシミュレーション及び分子設計を行い、ＳＧＩコンピュータワークステーションにおいて、ＭＳＩ社の分子設計ソフト（ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ、Ｄｉｓｃｏｖｅｒなどモジュール）を使用して、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの結晶構造を元に、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドのＮ端に対してＣＤ１３リガンドショートペプチドを付加して分子モデル構築及び分子設計を行い、ジョイニングペプチドのアミノ酸の長さを確定した。
前記分子設計に基づいて、まずジョイニングペプチドが５個のグリシンを選択して設計案とした。その理由は、コンピュータシミュレーションから、前記案のジョイニングペプチドが比較的短いので、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの蛋白質の構造、及びＣＤ１３との結合に対して共に大きい影響を与える可能性があったためである。その他の設計案のジョイニングペプチドの多くはＣＤ１３リガンドと腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの分子表面とがある程度の距離を有するため、この相互作用及び影響が小さくなる。
また、ジョイニングペプチドがアラニンまたはグリシン、アラニン−グリシン−グリシン−セリン−セリン−グリシン−グリシン−グリシンであるショートペプチドの腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体、及び３回以上重複するグリシン−（アラニン−グリシン−グリシン−セリン−セリン−グリシン−グリシン−グリシン）３の２５個のアミノ酸残基の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の発現を試してみたが、共に類似な結果を得た。以上の結果から、コンピュータ分子設計の正確性が証明された。 更に、上記結果を比較した場合、５個のシステインをもつ腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の発現レベルが最も高く（１００ ｍｇ／Ｌ）、その他の変異体の発現レベルがやや低いが、共に約５０−１００ ｍｇ／Ｌのレベルであった。
【００１７】
腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体のコンピュータ支援分子設計において、腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体に対して構造シミュレーション及び分子設計を行ったことを利用して、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド結晶構造に基づき、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドとＣＤ１３リガンドとの間のジョイニングペプチドのアミノ酸配列及び長さに対して分子モデル構築及び分子設計を行い、ジョイニングペプチドのアミノ酸長さを確定した。その結果、コンピュータ分子設計時に計算された１〜２５個のアミノ酸ショートペプチド長以内に、ショートペプチドが側鎖を含まず、柔軟性の比較的大きいアミノ酸残基、例えばグリシン、アラニン、セリンなどから構成されたものであれば、共に腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの構造に対していずれの影響もなく、ＣＤ１３リガンドの機能にも影響しないことを発見した。且つ分子動力学により計算した側鎖を含まず、柔軟性の比較的大きい２５個のアミノ酸ショートペプチド長範囲内において、ショートペプチド長がより長いほど、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの構造に対する相互作用がより小さくなり、定性的に言えば、長さが短かすぎれば、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド蛋白質の構造に対してある程度の影響を与える可能性があり、及び、ＣＤ１３リガンドとＣＤ１３との結合に影響を与える可能性もあることが分かった。
【００１８】
野生型ヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド遺伝子は、ヒト胎盤から得た伝令ＲＮＡを逆転写することによって得た。ＣＮＧＲＣショートペプチドが融合した腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体遺伝子のＰＣＲプライマーのヌクレオチドの配列は以下の通りである。
プライマー１：５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＴＧＣＡＡＴＧＧＴＣＧＴＴＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴ ＧＧＴＧＴＧＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＴＣＣＴＣＡＧ−３’；
プライマー２：５’−ＡＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＣＡ ＡＣＴＡＡＡＡＡＧＧＣＣＣ−３’。
【００１９】
ＰＣＲ反応を通じて、コードＣＮＧＲＣショートペプチドと５個のグリシンとから構成したジョイニングペプチドの腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体（ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ）遺伝子を得た。腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体（ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ）遺伝子をＮｏｖａｇｅｎ社のｐＥＴ−２３ａ発現担体にクローニングした。得た組み換え発現プラスミドはＥ．
ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）において発現した。腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬの可溶性型発現を行うため、発現条件を以下の通りにした。一夜成長させた組み換え発現菌をＬＢ培地に１００倍希釈し、３７℃で２．５時間培養し、その後さらに２４℃で１〜２時間培養し、２４℃下で０．５ｍＭまでＩＰＴＧを加えて、その後細菌を２４℃下で一夜誘導発現した。細菌を遠心した後、分裂分解液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭジチオトレイトール、ｐＨ７．６）に懸濁して超音波粉砕を行った。
【００２０】
組み換え腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ蛋白質の含有液をＳＰ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカチオン性樹脂を通して精製し、３００ｍＭ ＮａＣｌ溶出精製物を収集した。溶出蛋白をＮｉ−ＮＴＡアガロースゲル（Ｑｉａｇｅｎ社）アフィニティークロマトグラフィーによってさらに精製し、２５０ｍＭイミダゾールを用いて溶出を行い、その後ＳｅｐｈｄｅｘＧ−２５で脱塩した。実験に使用した全ての水は共にエンドトキシンを除去した超精製水であり、蛋白質の定量を南京建成生物工程研究所により提供されたＢＣＡ蛋白質測定試薬キットを使用して測定した。腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその腫瘍ターゲティング変異体蛋白質の純度及び分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動銀染色法によって測定し、分子量は質量スペクトル分析によって確認した（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、 ４７００ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ）。
【００２１】
インテグリンαＶβ３、αＶβ５にターゲティングするＴＲＡＩＬ変異体ＲＧＤ−ＬＴＲＡＩＬの構築、発現及び精製は特許文献１に従って行った。
従来の報告によれば、野生型腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体が大腸菌において発現するときに、常に非生物活性の封入体生成物の形で存在する。本発明の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体は４個のシステイン（即ち２対のジスルフィド結合を形成した）が増加しており、該変異体が大腸菌において発現するときに野生型腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドと比べ非生物活性の封入体生成物をより形成しやすくなるので、精製もより難しくなる。しかし、本発明は発現条件及び分離精製過程を最適化することによって、腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体を、可溶性型で発現させることに成功し、且つカチオン性樹脂層析及びニッケル金属アフィニティークロマトグラフィーによって、生物活性を有し、純度の高い腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体蛋白質を得ることができた。収量は１００ｍｇ／Ｌであった。変性還元条件下の１５％ポリアクリルアミゲル電気泳動銀染色法の分析（図１の１Ａ）及び質量スペクトルで配列を測定した分析結果は共に発現生成物が間違いないことを証明した。
且つ本発明の発現条件及び精製プロセス下で、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体は共に非常に高い含有率の重合体（図１の１Ｂ）を有したが、これはその他の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの発現及び精製における同種の操作ではほとんど見られなかった。
【００２２】
腫瘍壊死因子スーパーファミリー蛋白は共に単量体、二量体及び三量体を形成する特性を有し、且つそれらの生物学活性は二量体及び三量体の形に依存し、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドも例外ではない。そこで、ＣＮＧＲＣ分域構造を融合した後、本発明の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体が、重合体を形成する能力に影響するか否かを測定するため、非変性非還元ポリアクリルアミゲル電気泳動の分析を行った。その結果、前記組み換え腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその腫瘍ターゲティング変異体蛋白が重合体を形成する能力を有することを示した。以上から、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドと腫瘍ターゲティング変異体蛋白、及びＲＧＤ−ＴＲＡＩＬが共に分子量が約２０，０００、４０，０００、６０，０００ダルトンである３つのバンドを有し、この３つの分子量のバンドは単量体、二量体及び三量体（図１の１Ｂ）と対応することが示された。これらの結果から、本発明が発現、精製する腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその腫瘍ターゲティング変異体蛋白が確かに正確な３次元構造を有し、従来報告された大腸菌に発現したＴＲＡＩＬと比べより良好な生物活性を有することが証明された。
【実施例２】
【００２３】
腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその腫瘍ターゲティング変異体と内皮細胞との結合実験
腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドとその腫瘍ターゲティング変異体ＮＧＲＬ−ＴＲＡＩＬ、及びＲＧＤ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ変異体をそれぞれフルオレセイン（Ｓｉｇｍａ社）で標識を行い、標識した蛋白はＳｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ２５分子篩によって遊離フルオレセインを除去した。ヒト皮膚微小血管細胞はトリプシンによって消化された後、２％のウシ胎児血清を含有する氷冷リン酸緩衝液を用いて２回洗い、その後改めて懸濁し、１μｇの標識蛋白を加え、４℃下で１時間育成した。実験はフルオレセインで標識したウシ血清アルブミンを対照とした。染色した細胞を３回洗浄した後フローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を使用して結合能力を分析した。
さらに、フルオレセイン標識の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドとその腫瘍ターゲティング変異体ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ、及びインテグリンαＶβ３、αＶβ５にターゲティングするＴＲＡＩＬ変異体ＲＧＤ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ（特許文献１参照）の、ヒト皮膚微小血管内皮細胞と直接結合する能力を評価した。フローサイトメトリーの測定結果は、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬの、ヒト皮膚微小血管内皮細胞と結合する能力が、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びインテグリンαＶβ３、αＶβ５受容体にターゲティングする変異体ＲＧＤ−Ｌ−ＴＲＡＩＬよりも遥かに高いことを示した。
【００２４】
これらの結果から、ＣＤ１３リガンドショートペプチドは、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体と血管内皮細胞との特異的結合能力を顕著に向上し、該腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬと血管内皮細胞との特異的結合能力が、インテグリンαＶβ３、αＶβ５リガンドショートペプチドが向上した腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体ＲＧＤ−ＬＴＲＡＩＬと血管内皮細胞との特異的結合能力よりも大幅に向上したことを明らかにした（図２）。ヒト微小血管内皮細胞表面での蛋白質の発現は、ＣＤ１３及びインテグリンαＶβ３、αＶβ５を有することが別々の研究者らによってそれぞれ発見されたものである。本発明者らは、初めに同一の実験システムにおいてヒト微小血管内皮細胞表面のＣＤ１３及びインテグリンαＶβ３、αＶβ５の存在比を比較し、ＣＤ１３の発現存在比がインテグリンαＶβ３、αＶβ５の存在比と比べ顕著に高いことを発見し、それによって、ＣＤ１３がインテグリンαＶβ３、αＶβ５と比べて、よりよいヒト微小血管内皮細胞の定方向ターゲット分子であることを発見した。インテグリンαＶβ３、αＶβ５が国際上最も認められた新生血管のマーカーであり、ＲＤＧ配列を含有するリガンドは現在すでに腫瘍の前期成長及び腫瘍の早期転移を診断するプローブとして汎用されている。本発明はＣＤ１３が、インテグリンαＶβ３、αＶβ５よりも優れた腫瘍ターゲット分子であり、ＣＤ１３を腫瘍ターゲティングとすると、インテグリンαＶβ３、αＶβ５より遥かに優れた効果を得ることができることを国際的に初めて証明した。これは当業の科学者を驚かせる結果であり、予想外の発明成果である。よって、上記発見は本発明の最も重要な新規知見の１つであるといえる。
【実施例３】
【００２５】
ＣＤ１３及びインテグリンαＶβ３、αＶβ５の発現分析
細胞表面のＣＤ１３またはインテグリンの発現存在度は間接標識法でフローサイトメトリーを用いて分析測定した。消化後の細胞は２％ウシ胎児血清を含有する氷冷リン酸緩衝液で２回洗浄し、細胞を改めて懸濁した後氷上Ａｎｔｉ−ＣＤ１３モノクロナル抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、Ａｎｔｉ−αＶβ３インテグリン抗体ＭＡＢ ２３Ｃ６（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、またはＡｎｔｉ−αＶβ５インテグリン抗体ＭＡＢ １９６１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社)で１時間抗体コーティングし、陰性対照として、精製同型ラット免疫グロブリンＧ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を採用した。１次抗体コーティング細胞を２回洗浄した後、緑色フルオレセイン結合のヒツジ抗ラット免疫グロブリンＧ１ （γ）（Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を加えて、３０分間２次抗体遮光標識した。その後、３回洗浄し、さらに４％ホルマリンを含有するリン酸緩衝液で固定し、最後にフローサイトメトリーにおいてＣＤ１３またはインテグリンαＶβ３、αＶβ５発現の存在比を測定分析した。なお、全ての染色実験は３回繰り返した。
【００２６】
ＣＮＧＲＣは、２対のジスルフィド結合を形成でき、環状構造を有し、ＮＧＲ配列を含有するＣＤ１３のリガンドであるので、良好なＣＤ１３への親和性及び選択性を有する。本発明ではＣＤ１３に対するターゲット設計を行なうので、まず内皮細胞及び腫瘍細胞表面のＣＤ１３発現状況を分析した。フローサイトメトリー分析結果は、ヒト皮膚微小血管内皮細胞表面は高レベルのＣＤ１３を発現し、ヒト皮膚微小血管内皮細胞表面のＣＤ１３発現レベルはインテグリンαＶβ３、αＶβ５の発現レベルよりも高いことを示した。また、注目すべき点として、複数種の腫瘍細胞も、様々なレベルでＣＤ１３を発現し、ＨＤＭＶＥＣ及びＨｅｌａは高レベルのＣＤ１３を発現し、結腸癌ＨＣＴ−１５は中等レベルの存在比のＣＤ１３を発現し、結腸癌ＣＯＬＯ−２０５のＣＤ１３発現量は極微弱か、または発現しなかった。
【００２７】
腫瘍新生血管及び腫瘍細胞表面はＣＤ１３、及びインテグリンαＶβ３、αＶβ５を発現するが、ＣＤ１３とインテグリンαＶβ３、αＶβ５と比較して、どちらが腫瘍ターゲ
ティングのよりよいターゲットであるかは、誰も詳細に研究及び対比してこなかった。本発明は、腫瘍新生血管及び腫瘍細胞表面ＣＤ１３、及びインテグリンαＶβ３、αＶβ５の発現レベルを丁寧に比較し、且つ細胞及び動物モデルレベルにおいて、それぞれＣＤ１３にターゲティングするＴＲＡＩＬ変異体ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ及びインテグリンαＶβ３、αＶβ５にターゲティングするＴＲＡＩＬ変異体ＲＧＤ−Ｌ−ＴＲＡＩＬの抗腫瘍
活性を評価したところ、驚くべき、且つ予想と反する結果を得た。本発明はＣＯＬＯ−２０５表面のＣＤ１３及びインテグリンαＶβ３、αＶβ５の発現状況を比較し、ＣＯＬＯ−２０５表面ではほとんどＣＤ１３分子を発現せずに、但し低レベルのインテグリンαＶβ３及び高レベルのインテグリンαＶβ５を発現することを発見した（図３）。これを裏付けるデータとして、ＣＤ１３にターゲティングするＴＲＡＩＬ変異体ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬの、ＣＯＬＯ２０５細胞のアポトーシス誘導活性がやや増加し（図４）、一方、インテグリンαＶβ３、αＶβ５にターゲティングするＴＲＡＩＬ変異体ＲＧＤ−Ｌ−ＴＲＡＩＬの、ＣＯＬＯ−２０５細胞のアポトーシス誘導活性が１０倍も向上した（ＣＯＬＯ−２０５細胞に対して、ＴＲＡＩＬの半数致死量が３．５ｎｇ／ｍＬで、ＲＧＤ−Ｌ−ＴＲＡＩＬの半数致死量が０．３７ｎｇ／ｍＬである）。そのため、ＣＯＬＯ−２０５細胞表面のターゲティング発現レベルからも、ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ及びＲＧＤ−Ｌ−ＴＲＡＩＬの、ＣＯＬＯ−２０５細胞半数致死量に対する増加レベルからも、ＲＧＤ−Ｌ−ＴＲＡＩＬは共にＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬより優れていた。
【００２８】
この結果より、ＣＯＬＯ−２０５インビボ腫瘍モデルにおいて、ＲＧＤ−Ｌ−ＴＲＡＩＬの抗腫瘍効果が、ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬより顕著に優れているはずであると推考した。しかし、ＣＯＬＯ−２０５インビボ腫瘍モデル実験において、ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬの抗腫瘍効果は、同用量（１００μｇ）のＲＧＤ−Ｌ−ＴＲＡＩＬより顕著に優れ、ひいては、１／５（２０μｇ）のＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬの抗腫瘍効果は、ほぼ５倍の用量（１００μｇ）のＲＧＤ−Ｌ−ＴＲＡＩＬの抗腫瘍効果と同等であった。前記結果は、抗腫瘍薬剤のインビボ抗腫瘍生物活性というものは、そのインビボ実験活性及び人々の一般的な論理及び理解に基づいて推測及び演繹することが不可能であり、着実な科学実験を通じてステップごとに検証しなければ発見不可能であり、どの様なレベルの実験でも欠かすことができないものであることを、明確に教示した。本発明において、インビトロの複数の実験は共にＲＧＤ−Ｌ−ＴＲＡＩＬの抗腫瘍活性がＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬより顕著に優れることを示したが、インビボ腫瘍動物モデルの抗腫瘍実験は全く異なる結果を示した。
【実施例４】
【００２９】
アネキシン（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ）及びピリジニウムヨージド（ＰＩ）双染色法による細胞アポトーシスの測定
腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドとその腫瘍ターゲティング変異体ＮＧＲＴＲＡＩＬ、及びＲＧＤ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ変異体に処理された細胞をトリプシンで消化した後、培養プレートから吸出し、リン酸緩衝液で２回洗浄し、３００ｇ遠心力下で５分間遠心し、上澄み液を除去し、その後１００μＬ結合緩衝液を用いて改めて懸濁し、最終濃度が２μｇ／ｍＬのＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｇｅｎ社）を加えて室温で育成し、１０分間後４００μＬの結合緩衝液を補充し、細胞をフロー分析管内に転移し、管ごとに１μｇのピリジニウムヨージド（Ｓｉｇｍａ社）を加えた。細胞を３０分以内にフローサイトメトリーで分析した。各々の細胞系は少なくとも３回繰り返して実験した。
【００３０】
次に、ＣＯＬＯ−２０５、ＨＣＴ−１５及びＨＴ−２９腫瘍細胞を用いてそれぞれ腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体ＮＧＲ−ＴＲＡＩＬの、
腫瘍細胞アポトーシス誘導活性を評価した（図４）。腫瘍細胞を一連の濃度分布のＴＲＡＩＬ変異体またはＴＲＡＩＬで誘導処理した後、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣとＰＩ双染色の方法を使用して、フローサイトメトリーで測定分析を行った。その結果、腫瘍細胞が異なると、ＴＲＡＩＬに対して感受性が異なることが明示された。ＣＯＬＯ−２０５細胞が最も感受性を有し、ＨＣＴ−１５細胞はその次であり、Ｈｅｌａ細胞では、比較的感受性がなかった。但し、Ｈｅｌａ腫瘍細胞において、腫瘍細胞アポトーシスを誘導するＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬの活性は、顕著に向上し、ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ対Ｈｅｌａの細胞半数致死量（ＥＣ５０）は約１８．５ｎｇ／ｍＬであり、ＴＲＡＩＬ対Ｈｅｌａの細胞半数致死量（ＥＣ５０）は、約１４５ｎｇ／ｍＬであったことから、ＮＧＲショートペプチドの追加は、Ｈｅｌａ細胞対ＴＲＡＩＬの感受性を８倍も向上した。ＣＯＬＯ−２０５及びＨＣＴ−１５腫瘍細胞に対して、腫瘍細胞アポトーシスを誘導するＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬの活性は、ＴＲＡＩＬよりやや高かった。ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ及びＴＲＡＩＬが、これらの腫瘍細胞に対してアポトーシスを誘導する程度の差が、腫瘍細胞表面のＣＤ１３分子の発現及び存在比と、正に相関した。
【００３１】
ＣＤ１３高発現のＨｅｌａ腫瘍細胞において、ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬでの、腫瘍細胞アポトーシス誘導活性の顕著な向上は、ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬにおけるＮＧＲ分域構造がＴＲＡＩＬ変異体蛋白を、標的細胞表面に誘導し、細胞表面に多量に分布させたからであろう。それによって、標的細胞表面腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の局所濃度を増加し、変異体分子における腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド部分を、ＴＲＡＩＬ受容体により容易に、頻繁に及び有効に接近させ、細胞アポトーシス経路を活性化する信号を増強し、それによって、ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬの活性を増強する原因になったと推考する。且つ、このような細胞アポトーシス活性の増強程度が腫瘍細胞表面ＣＤ１３発現の存在比によって決まり、存在比が高ければ活性増強程度も高く、その逆も同様となった。例えば、ＣＤ１３高発現のＨｅｌａ腫瘍細胞において、高いＣＤ１３発現量によって、ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬの活性が８倍も向上した（図４）。一方、ＣＤ１３低発現のＣＯＬＯ−２０５結腸癌細胞に対しては、ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬの活性向上は低かった。以上の結果は、腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬの活性向上は、ＣＮＧＲＣのターゲティング能によって得られたことをはっきり明示した。
【実施例５】
【００３２】
カスパーゼ−８及びカスパーゼ−３の酵素活性測定
カスパーゼ−８及びカスパーゼ−３の酵素活性は蛍光検出試薬キット（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ社）を使用して測定した。実験はメーカ提供の方法を使用した。蛍光値は酵素標識固相免疫測定装置で測定し、蛍光パラメータは、励起波長４００ｎｍ、発光波長５０５ｎｍで行った。
【００３３】
腫瘍細胞と異なり、正常なヒト皮膚微小血管内皮細胞、２９３Ｔ腎細胞及び初代の肝細胞を、３００ｎｇ／ｍＬの腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体により２４時間処理しても、顕著な細胞毒性が認められなかった。これによって、腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体が、正常細胞と腫瘍細胞とを区分できたため、腫瘍細胞アポトーシスは誘導できたが、正常細胞に対しては比較的安全性が高いことを示した。
【００３４】
腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその腫瘍ターゲティングヒト変異体により処理した後、Ｈｅｌａ細胞におけるカスパーゼ−８及びカスパーゼ−３の活性を蛍光法で測定した。この結果、ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬにおけるＮＧＲ分域構造が、ＴＲＡＩＬ変異体蛋白を標的細胞の表面に誘導できて、細胞表面に多量に分布させ、それによって、標的細胞表面腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の局所濃度を高め、変異体分子における腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド部分を、ＴＲＡＩＬ受容体により容易に、頻繁に及び有効に接近させ、細胞アポトーシス経路を活性化する信号を増強したことを明らかにした。更に、ＦＡＤＤ−／−及びカスパーゼ−８−／−突然変異のＪｕｒｋａｔ細胞において、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体は、共に細胞アポトーシスを誘導することが検出できなかった。以上の実験結果から、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体が、同様に、共に受容体−ＦＡＤＤ-カスパーゼ−８ルートを経由して細胞アポトーシスを誘導する作用を奏することが明らかになった。
【実施例６】
【００３５】
腫瘍動物モデルの抗腫瘍治療効果実験
５〜６週齢のメスヌードマウスは上海実験動物センターから購入した。ヌードマウス
に対してまず尾静脈へ１００μｇの、自然殺傷性細胞を阻害する特異抗体−精製Ａｓｉａｌｏ ＧＭ−１抗体（和光純薬工業株式会社、日本）を静注した。２４時間後、ヌードマウス背部の右上側に１０万個のＣＯＬＯ−２０５、ＨＴ−１５またはＨＴ−２９結腸癌細胞を皮下接種した。腫瘍サイズが７０ｍｍ３に達した時点で、ランダムに群を分け、治療を開始した。組み換え腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドとその腫瘍ターゲティング変異体ＮＧＲ−ＴＲＡＩＬ、及びＲＧＤ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ変異体蛋白を、腹腔を経由して投与し、１日１回投与で、連続で１０〜１４日間投与した。水溶性のカンプトテシンＣＰ
Ｔ−１１（１１−ヒドロキシ−カンプトテシン、商品名：カンプト、Ｐｈａｒｍａｃｉａ／Ｕｐｊｏｈｎ社製品）は週ごとに１回、合計２回投与した。組み換え蛋白及びカンプトテシンは共にリン酸緩衝液によって希釈した。腫瘍サイズをノギスで計測し、次式で求めた。計算式：（長×幅）２／２、とした。
【００３６】
また、胸腺を持っていないヌードマウスにおいて、ＣＯＬＯ−２０５及びＨＴ−１５、２種の結腸癌モデルを用いて、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその腫瘍ターゲティング変異体ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬの抗腫瘍活性を測定及び比較した。ＣＯＬＯ−２０５及びＨＴ−１５結腸癌が共にＴＲＡＩＬに対して感受性があった（そのうちＣＯＬＯ−２０５が最も感受性があった）ため、単独のＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ対ＴＲＡＩＬの治療効果を、この２つのモデルにおいて評価した。実験結果は図４、６に示されるように、ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬは極めて顕著に腫瘍の増殖を抑制し、腫瘍増殖抑制効果は野生型ＴＲＡＩＬ及びＲＧＤ−Ｌ−ＴＲＡＩＬより顕著に強かった。
【００３７】
また、ＣＯＬＯ−２０５モデルにおいて、１００μｇ／日用量のＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬが、腫瘍の成長を抑制する効果は、１００μｇ／日の野生型ＴＲＡＩＬより大幅に強く（ｐ＜０．０１）、１００μｇ／ｄ用量のＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬが、腫瘍の成長を抑制する効果は、１００μｇ／日のＲＧＤ−Ｌ−ＴＲＡＩＬよりも強かった（ｐ＜０．０１）。仮に、ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬの用量を野生型の１／５（２０μｇ／日）まで下げた場合でも、腫瘍の成長を抑制する効果は、野生型ＴＲＡＩＬ（１００μｇ／日）より優れており（ｐ＜０．０１）、要するに、２０μｇ／日用量のＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬの腫瘍成長抑制効果は、すでに１００μｇ／日用量のＲＧＤ−Ｌ−ＴＲＡＩＬの腫瘍成長抑制効果と近い効果であった（図６）。
ＨＣＴ−１５モデルにおいて、同様な用量の処理下（４００μｇ／日）で、ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬは、野生型ＴＲＡＩＬより腫瘍抑制効果が良好であり（ｐ＜０．０５）、ＲＧＤ−ＬＴＲＡＩＬよりも強く（ｐ＜０．０５）、ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ（８０μｇ／日）の投与量を、野生型ＴＲＡＩＬの１／５までに下げた場合、その腫瘍抑制効果は野生型ＴＲＡＩＬ（４００μｇ／日）に相当した（両者の間に有意差はなかった）（図７）。８０μｇ／日投与量のＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬの腫瘍抑制効果は、すでに４００μｇ／日のＲＧＤ−Ｌ−ＴＲＡＩＬの腫瘍抑制効果と近い効果であった。治療過程において、ＮＧＲ−ＬＴＲＡＩＬが、腫瘍の成長を抑制することは用量依存的であった。
以上の結果は、ＣＮＧＲＣペプチドをＴＲＡＩＬと融合した後ＴＲＡＩＬのインビボ抗腫瘍活性を顕著に向上させ、さらに、ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬの抗腫瘍効果がＲＧＤ−Ｌ−ＴＲＡＩＬより顕著に強いことを明確に示した。
【００３８】
本発明では、さらに腫瘍ターゲティングTRAIL 変異体と化学治療薬剤ＣＰＴ−１１とを併用する抗腫瘍効果を検討した。胸腺を持っていないヌードマウスのＣＯＬＯ−２０５ 、ＨＣＴ−１５及びＨＴ−２９結腸癌モデルを用いて、ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬと化学治療薬剤ＣＰＴ−１１との併用後のインビボにおける抗腫瘍効果を評価した。ＣＯＬＯ−２０５、ＨＣＴ−１５がＴＲＡＩＬ感受性型であり、且つＣＯＬＯ−２０５が最も感受性が高いが、一方、ＨＴ−２９は、ＴＲＡＩＬ不感受性型である。ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬまたはＴＲＡＩＬは毎日腹腔内に一回、蛋白質を注射し、合計２週間注射し、ＣＰＴ−１１は２日ごとに尾静脈に１回注射して、合計７回注射した。併用投与群中、ＴＲＡＩＬに対して感受性であるＣＯＬＯ−２０５腫瘍モデルにおいて、１回、比較的低いＣＰＴ−１１用量（６．２５ｍｇ／ｋｇ／回）を選択し、異なる用量のＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ（３０または８０μｇ／日／個）、またはＴＲＡＩＬ（２７０μｇ／日／個または９０μｇ／日／個）と併用し、ＴＲＡＩＬに対して抵抗性のあるＨＴ−２９結腸癌モデルにおいて、比較的高い用量のＣＰＴ（２５ｍｇ／ｋｇ／回）を選択してＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬまたはＴＲＡＩＬ（４００μｇ／日／個）と併用した。
【００３９】
ＣＯＬＯ−２０５モデルにおいて、３０μｇ／日 ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬと６．２５ｍｇ／ｋｇ／回ＣＰＴ−１１とを併用する群の、腫瘍成長を抑制する効果が、単独の６．２５ｍｇ／ｋｇ／回ＣＰＴ−１１群より大幅に強く（ｐ＜０．０１）、単独の３０μｇ／日 ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ群より強かった（ｐ＜０．０５）。つまり、２７０μｇ／日 ＴＲＡＩＬと６．２５ｍｇ／ｋｇ／回ＣＰＴ−１１とを併用する群の効果に相当し、９０μｇ／日 ＴＲＡＩＬと６．２５ｍｇ／ｋｇ／回ＣＰＴ−１１とを併用する群より優れていた（ｐ＜０．０５）（図６）。
【００４０】
また、ＨＣＴ−１５腫瘍モデルにおいて、８０μｇ／日 ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬと６．２５ｍｇ／ｋｇ／回ＣＰＴ−１１とを併用する群において、腫瘍増殖を抑制する効果が、単独の６．２５ｍｇ／ｋｇ／回ＣＰＴ−１１または８０μｇ／日 ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬより強く、且つ４００μｇ／日 ＴＲＡＩＬ群及び４００μｇ／日 ＴＲＡＩＬと６．２５ｍｇ／ｋｇ／回ＣＰＴ−１１とを併用する群より良好であった（図７）。ここで注目するべき点は、４００μｇ／日／個の用量のＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ＋ＣＰＴ−１１の併用治療群において、２８日目後１０匹の投与マウスのうち、８匹のマウスの腫瘍が消滅し、４００μｇ／日／個のＴＲＡＩＬ＋ＣＰＴ−１１の併用治療群において１０匹の動物のうち、７匹のマウスの腫瘍が消滅したことである（図７（ｂ））。
【００４１】
ＴＲＡＩＬが耐性をもつＨＴ−２９結腸癌モデルにおいて、ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬを単独に使用する場合、毎日腹腔内に４００μｇ／個ヌードマウスまで高用量を注射しても、弱い抗腫瘍効果のみしか観察されなかった。他方、ＮＧＲ−ＴＲＡＩＬ＋ＣＰＴ−１１併用で治療した場合、腫瘍成長を顕著に抑制でき、且つＴＲＡＩＬ＋ＣＰＴ−１１の併用より治療効果がより良好であり、且つＴＲＡＩＬ＋ＣＰＴ−１１の併用と比べ治療効果がより良好であった。４００μｇ／日のＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬと２５ｍｇ／ｋｇ／日のＣＰＴ−１１との併用群の治療効果が最も良好で、４００μｇ／日のＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ群よりも非常に優れており（ｐ＜０．０１）、２５ｍｇ／ｋｇ／日のＣＰＴ−１１群より強く（ｐ＜０．０５）、４００μｇ／日のＴＲＡＩＬと２５ｍｇ／ｋｇ／日のＣＰＴ−１１との併用群よりも強かった（ｐ＜０．０５）。
【００４２】
以上をまとめると、前記３種の腫瘍モデルにおいて、化学治療薬剤ＣＰＴ−１１と併用した後、ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬの抗腫瘍活性が共にＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬまたはＣＰＴ−１１を単独に使用する治療効果より強く、且つＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬとＣＰＴ−１１との併用効果がＴＲＡＩＬとＣＰＴ−１１との併用効果より優れていた。ＴＲＡＩＬ感受性のＣＯＬＯ−２０５及びＨＣＴ−１５に対して、ＴＲＡＩＬに相当する腫瘍増殖抑制効果を達成し、ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬの使用量がそれぞれＴＲＡＩＬの１／９〜１／３及び１／５だけで、ＴＲＡＩＬ不感受性のＨＴ−２９腫瘍に対して、同様な用量のＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬとＣＰＴ−１１との併用群は、抗腫瘍効果がＴＲＡＩＬとＣＰＴ−１１との併用群より優れていた。この結果、腫瘍ターゲティング変異体蛋白ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬが化学治療薬剤ＣＰＴ−１１との併用時、抗腫瘍活性が単独使用時より顕著に増強され、且つ腫瘍増殖抑制効果が野生型のＴＲＩＡＬと化学治療薬剤との併用より優れていた。これのみならず、併用によって、さらにＴＲＡＩＬの応用範囲を拡大し、腫瘍ターゲティング変異体蛋白は、ＴＲＡＩＬに対して不感受性である腫瘍（例えばＨＴ−２９結腸癌）に対してより有効に増殖を抑制できた。
【００４３】
インビボの動物モデル実験から、腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬが、野生型腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド、及びインテグリンαＶβ３、αＶβ５にターゲティングするＴＲＡＩＬ変異体ＲＧＤ−ＬＴＲＡＩＬと比べて、より優れた治療効果を有することをさらに証明した。これにより、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドをＣＤ１３にターゲティングする腫瘍ターゲティングペプチドと融合した後、動物腫瘍モデル体内レベルにおいて確かにその抗腫瘍生物活性を向上できることを明らかにした。同様に、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体は単独使用時に薬効を向上できるだけでなく、化学治療薬剤ＣＰＴ−１１と併用する場合にも、顕著な相乗効果を有し、治療効果がより顕著に現れた。腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体をＣＰＴ−１１と併用して治療を行うことは、各患者の使用量を下げ、潜在的全身性毒性を最低限に抑制できるだけでなく、もともと腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドに対して感受性がない腫瘍治療にも適用拡大することが可能となる（図８）。
インビボ動物実験は、腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の治療効果が、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド、ひいては、インテグリンαＶβ３、αＶβ５ターゲティングＴＲＡＩＬ変異体ＲＧＤ−Ｌ−ＴＲＡＩＬの治療効果よりも優れることを十分に証明した。
【実施例７】
【００４４】
腫瘍組織における組み換え蛋白質の薬剤分布測定
組み換え腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドと腫瘍ターゲティング変異体ＮＧＲ−ＴＲＡＩＬ、及びＲＧＤ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ変異体をそれぞれ放射性同位体１２５ヨウ素標識試薬キット（Ｐｉｅｒｃｅ社）で標識した。標識結果：１２５Ｉ−腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの比放射能が７．８６μＣｉ／μｇ蛋白、１２５Ｉ−腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の比放射能が７．４９μＣｉ／μｇ蛋白であった。ヌードマウスにＣＯＬＯ−２０５結腸癌を接種した後、腫瘍サイズが４００〜５００ｍｍ３に到達した後ランダムに群を分け、野生型群と２種の変異体群とに分け、各群に５回の測定時間点を設け、それぞれ５、３０、６０、１２０、２４０分とし、各時間点で３匹の動物を用いた。各担腫瘍ヌードマウスに、１００μＬの、５μＣｉ含有の標識蛋白質を注射した。各時間点で、マウスの腫瘍を剥離して且つ重量を測り、液体シンチレーション計数器において放射剤量を測定した。腫瘍組織における蛋白質の分布量の標識は、グラムごとの組織の測定放射量と注射放射量との百分率（％ＩＤ／ｇ）で表示した。
【００４５】
腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の、動物モデルにおける抗腫瘍活性の増強は、腫瘍組織にターゲティングして多量に分布させることができることをさらに証明した。同時に、さらにＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬとＲＧＤ−Ｌ−ＴＲＡＩＬとの体内腫瘍動物モデルにおけるターゲティング能力を比較するため、ヨウ素１２５同位体で標識した腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬとＲＧＤ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ、及び野生型ＴＲＡＩＬの、腫瘍組織における分布を測定した。同様な放射量のヨウ素１２５標識の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体を、それぞれＣＯＬＯ−２０５担腫瘍ヌードマウスに注射し、注射後、５、３０、６０、１２０及び２４０分時間点で、マウス腫瘍組織を手術して剥離し且つ重量を測り、それぞれ液体シンチレーション計数器におい同位体量を測定した。
【００４６】
この結果、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドＴＲＡＩＬは、ＣＤ１３のショートペプチドリガンドＣＮＧＲＣ、及びαＶβ３、αＶβ５インテグリンのショートペプチドリガンドＡＣＤＣＲＧＤＣＦＣペプチドを融合した後、ＴＲＡＩＬ蛋白の、ＣＯＬＯ−２０５腫瘍組織分域にターゲティングして多量に分布させる能力を顕著に増強し、ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬが腫瘍組織に存在させ及び特異的に分布させ得ることを示した。注射の初期、腫瘍組織における１２５ＩＲＧＤ−Ｌ−ＴＲＡＩＬの分布は１２５Ｉ−ＴＲＡＩＬの約２倍で、腫瘍組織における１２５Ｉ−ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬの分布は１２５Ｉ−ＴＲＡＩＬの約２．5 倍であり、ＣＯＬＯ−２０５腫瘍組織におけるＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬの分布程度がＲＧＤ−Ｌ−ＴＲＡＩＬと比べ顕著に高かった（図９）。腫瘍組織に対するＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ及びＲＧＤ−Ｌ−ＴＲＡＩＬの親和力が増強され、腫瘍組織における分布が増加され、循環血液中におけるその消失速度を大幅に遅くするため、腫瘍組織における分布時間を延長した結果である。注射後２４０分時点では、腫瘍組織におけるＴＲＡＩＬの分布は、全個体では測定できなかったが、依然相当多くのＲＧＤ−Ｌ−ＴＲＡＩＬが腫瘍区域に持続的に分布しており（図９）、且つその時腫瘍組織におけるＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬの含有量がＲＧＤ−Ｌ−ＴＲＡＩＬの２倍であった。前記結果は、ＣＮＧＲＣペプチドがＴＲＡＩＬと融合した後ＣＮＧＲＣペプチドが腫瘍領域の血管内皮細胞と結合し且つその増殖を抑制し及びアポトーシスを誘導する生物学機能を維持した事実をよく説明していた。
【００４７】
そのため、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の、動物体内腫瘍組織区域における分布の増加と、動物モデルにおいて観察されたその抗腫瘍活性の増強と、の２つ事実は、共に、本発明の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬは、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドに非常に優れた、変異体ＲＧＤ−Ｌ−ＴＲＡＩＬより強い腫瘍ターゲティング能を与え、且つ投与量を下げ、最終的に抗腫瘍効果を向上できることを証明した。ＣＤ１３リガンドを、現在腫瘍早期診断において汎用されているインテグリン（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ）のリガンドＲＧＤと比べた場合、ターゲティング能がより優れた腫瘍プローブであることが、本発明によって初めて証明された。
【実施例８】
【００４８】
体内における、組み換え蛋白質と腫瘍組織との結合
腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその腫瘍ターゲティング変異体ＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ、ＲＧＤ−Ｌ−ＴＲＡＩＬ変異体、ウシ血清アルブミンを、緑色フルオレセインによって標識した。標識した蛋白を、ゲル分子篩Ｓｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ２５を用い、遊離のフルオレセインを除去した。腫瘍が４００〜５００ｍｍ３の大きさに成長した担腫瘍マウスに対して５００μｇフルオレセインで標識した蛋白を尾静脈へ静注し、静注
後３０分時点で、マウス腫瘍を手術して剥離し、腫瘍細胞単細胞懸濁液を調製し、生理食塩水で複数回洗浄し、癌細胞を６万個採取してフローサイトメトリー測定を行い、組み換え蛋白質の、腫瘍細胞表面における結合状況を分析した。
【００４９】
データ統計は社会科学データ・パケット・ソフトウェアを使用して分析した。全ての実
験は少なくとも３回繰り返し、細胞アポトーシス及び付着実験の結果は平均値及び標準偏差によって表示し、腫瘍サイズを平均値及び標準偏差で表示した。ｐ＜０．０５は有意差があり、ｐ＜０．０１は極めて有意差がある、それぞれ１つの及び２つの「＊」でマークした。
なお、他器官におけるＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬの分布がＴＲＡＩＬと類似し、その他の臓器において特異的に分布することはなかった（図１０（ａ）、１０（ｂ））。体内におけるＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬの代謝は、主に腎臓を経由して体外に排出された（図１０（ｂ））。そのため、動物体内腫瘍組織区域分布の増加及び動物モデルにおいて観察された抗腫瘍活性の増強は、設計した分子におけるＮＧＲ−Ｌ−ＴＲＡＩＬがＲＧＤ−ＴＲＡＩＬと比べより優れており、ＴＲＡＩＬ蛋白により優れたターゲティング能を与え、最終的に抗腫瘍効果を向上できることを十分に証明した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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