(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オープンリーディングフレーム５７（ＯＲＦ５７）が欠損していることにより、弱毒化している生の組換えＫＨＶをもたらす、生の組換えコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）。
【請求項２】
病原性に寄与するが複製にとって必須ではない少なくとも一つの追加の遺伝子において欠損していることを特徴とする、請求項１の生の組換えコイヘルペスウイルス。
【請求項３】
前記の少なくとも一つの追加の遺伝子がチミジンキナーゼ遺伝子、ＯＲＦ１２：推定腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体遺伝子、ＯＲＦ１６：推定Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）遺伝子、ＯＲＦ１３４：推定インターロイキン１０ホモログ遺伝子およびＯＲＦ１４０：推定チミジル酸キナーゼ遺伝子から成る群より選択されることを特徴とする、請求項２の生の組換えコイヘルペスウイルス。
【請求項４】
ＢＡＣ（細菌人工染色体）ベクター配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項の生の組換えコイヘルペスウイルス。
【請求項５】
該ＢＡＣベクター配列がヘルペスウイルスから切除され、それによってヘルペスウイルスゲノム内の切除部位または前挿入部位にそれぞれ異種ＤＮＡ断片がとり残されていることを特徴とする、請求項４の生の組換えコイヘルペスウイルス。
【請求項６】
異種ＤＮＡ断片をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項の生の組換えコイヘルペスウイルス。
【請求項７】
該異種遺伝子がコイ春ウイルス血症を引き起こすラブドウイルスの糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子であることを特徴とする、請求項６の生の組換えコイヘルペスウイルス。
【請求項８】
異種ＤＮＡ断片用ベクターとしての使用のための、請求項１〜７のいずれか一項の生の組換えコイヘルペスウイルス。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項の組換えコイヘルペスウイルスを含む細胞。
【請求項１０】
組換えコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）の感染性粒子の作製方法であって、ここで
（ａ）請求項１〜７のいずれか一項の生の組換えＫＨＶまたは請求項１〜７のいずれか一項の組換えコイヘルペスウイルスのゲノムを含む組換えＫＨＶ  ＤＮＡを許容真核細胞に導入する段階；および
（ｂ）組換えコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）を作製するために前記細胞を培養する段階を含む前記方法。
【請求項１１】
コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）によって引き起こされる魚の疾患の予防処置および／または治療処置用のワクチンにおける使用のための、請求項１〜７のいずれか一項の生の組換えコイヘルペスウイルス。
【請求項１２】
コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）によって引き起こされる魚の疾患の予防処置および／または治療処置用のワクチンであって、請求項１〜７のいずれか一項の生の組換えコイヘルペスウイルス、および薬学的に許容可能な担体を含むことを特徴とする前記ワクチン。
【請求項１３】
コイ春ウイルス血症を引き起こすラブドウイルスによって引き起こされる魚の疾患の予防処置および／または治療処置用のワクチンであって、請求項７の生の組換えコイヘルペスウイルス、および薬学的に許容可能な担体を含むことを特徴とする前記ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）、該ＫＨＶの作製方法、該ＫＨＶを含む細胞、ならびにベクターとしての該ＫＨＶの使用およびシプリヌス・カルピオ・カルピオ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｃａｒｐｉｏ）またはシプリヌス・カルピオ・コイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｐｉｏ  ｋｏｉ）等のコイにおいてコイヘルペスウイルスにより引き起こされる魚における疾患の予防処置および／または治療処置のためのワクチンにおける該ＫＨＶの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
マゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｃａｒｐｉｏ）は、主にアジア、ヨーロッパおよび中東において食用として最も広範囲に養殖されている魚である。対照的にニシキゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｋｏｉ）亜種は、個人の娯楽または品評会用の観賞魚として、特に日本においてまた世界中で養殖されている。マゴイおよびニシキゴイの双方に致死的疾患（当初コイヘルペスウイルス病（ＫＨＶＤ）と称された）を引き起こすウイルスは、１９９６年に英国において発見された。その後、該ウイルスは、イスラエル、米国およびドイツにおけるニシキゴイおよびマゴイの大量死の原因として速やかに同定された。マゴイの集約養殖、ニシキゴイの品評会および国際貿易が、この高感染性かつ高病原性の疾患が急速に世界的に拡散するのに寄与した。その出現以来ＫＨＶＤは、ニシキゴイおよびマゴイの双方の養殖業において世界的に重大な財務損失および経済損失を引き起こしてきた。
【０００３】
該ウイルスの初期特性評価は、エンベロープおよびテグメント様構造に囲まれた、１００〜１１０ｎｍの２０面体の電子密度の高いコアを有するヘルペス様構造を明らかにした。該ウイルスのゲノムは、約２９５ｋｂの直鎖状２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を含み、コイ科ヘルペスウイルス１（ＣｙＨＶ‐１）のＤＮＡと同様であるが、一般に１２５ないし２４０ｋｂの範囲の大きさである、ヘルペスウイルス科のウイルスのＤＮＡよりは大きい。ＫＨＶゲノムの配列は、ごく最近発表された（Ａｏｋｉら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、８１、ページ５０５８‐５０６５（２００７））。ＫＨＶゲノムは、どんな他の既知のウイルス塩基配列とも相同性のない相当数のＤＮＡ塩基配列を含有する。さらにそれは、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、イリドウイルスおよび他の巨大ＤＮＡウイルスといった数種のｄｓＤＮＡウイルスのポリペプチドと似たポリペプチドをコードする、非常に多様なＤＮＡ塩基配列を含有する。
【０００４】
このウイルス独自の特性が、異なる三つの学名、すなわち第一に、その形態的発現よりコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）、第二に魚におけるその病原作用よりコイ間質性腎炎・鰓壊死症ウイルス（ＣＮＧＶ）、そして最後にＣｙＨＶ‐１およびＣｙＨＶ‐２との遺伝子内容の類似性よりコイ科ヘルペスウイルス３（Ｃｙｐｒｉｎｉｄ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ３（ＣｙＨＶ‐３））をもたらした。最近のウイルスゲノムの完全長塩基配列決定によって、最後の学名がより支持されている。しかし、以下ではＫＨＶの名称を使用する。
【０００５】
ＫＨＶは、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒａｌｅｓ）の構成メンバーの中でこれまで同定された最大のゲノムに相当する約２９５ｋｂのゲノムを含有する。ＫＨＶの最初の単離が１９９６年に遡るにもかかわらず、ＫＨＶの病原性における個々の遺伝子の役割、および自然宿主の感染の生物学における役割について利用できる情報はほとんど存在しない。
【０００６】
弱毒化ＫＨＶおよびそのワクチン候補としての使用の可能性については、国際特許出願ＷＯ  ２００４／０６１０９３  Ａ１に記載されている。しかし、このワクチン候補には一つの潜在的危険性が隠されている。この弱毒化は、インビトロでのウイルス複製の間に生じたランダム変異の結果である。従って弱毒化の特性は解明されておらず、完全な病原性表現型への復帰変異を排除し得ない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ａｏｋｉ、Ｔ．、Ｈｉｒｏｎｏ、Ｉ．、Ｋｕｒｏｋａｗａ、Ｋ．、Ｆｕｋｕｄａ、Ｈ．、Ｎａｈａｒｙ、Ｒ．、Ｅｌｄａｒ、Ａ．、Ｄａｖｉｓｏｎ、Ａ．Ｊ．、Ｗａｌｔｚｅｋ、Ｔ．Ｂ．、Ｂｅｒｃｏｖｉｅｒ、Ｈ．＆  Ｈｅｄｒｉｃｋ、Ｒ．Ｐ．（２００７）．Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  Ｋｏｉ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｔｈｒｅａｔｅｎｉｎｇ  Ｋｏｉ  ａｎｄ  ｃｏｍｍｏｎ  ｃａｒｐ  ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ（ニシキゴイおよびマゴイを世界的に脅かす新興疾患の拡大する分布を代表する３種類のコイヘルペスウイルス単離株のゲノム配列）．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８１、５０５８‐６５．
【非特許文献２】Ｂａｂｉｃ、Ｎ．、Ｋｌｕｐｐ、Ｂ．Ｇ．、Ｍａｋｏｓｃｈｅｙ、Ｂ．、Ｋａｒｇｅｒ、Ａ．、Ｆｌａｍａｎｄ、Ａ．、Ｍｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒ、Ｔ．Ｃ．、１９９６．Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｇＨ  ｏｆ  ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  ｍｉｃｅ（仮性狂犬病ウイルスの糖タンパク質ｇＨはマウスの細胞培養および神経系における穿通および増殖にとって必須である）．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７７（Ｐｔ９（第９部））、２２７７‐２２８５．
【非特許文献３】Ｂｏｒｓｔ、Ｅ．Ｍ．、Ｈａｈｎ、Ｇ．、Ｋｏｓｚｉｎｏｗｓｋｉ、Ｕ．Ｈ．＆  Ｍｅｓｓｅｒｌｅ、Ｍ．（１９９９）．Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＨＣＭＶ）  ｇｅｎｏｍｅ  ａｓ  ａｎ  ｉｎｆｅｃｉｏｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：ａ  ｎｅｗ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＣＭＶ  ｍｕｔａｎｔｓ（大腸菌（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における感染性細菌人工染色体としてのヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のクローニング：ＨＣＭＶ変異株の構築のための新たな方法）．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３、８３２０‐９．
【非特許文献４】Ｃｏｓｔｅｓ、Ｂ．、Ｆｏｕｒｎｉｅｒ、Ｇ．、Ｍｉｃｈｅｌ、Ｂ．、Ｄｅｌｆｏｒｇｅ、Ｃ．、Ｒａｊ、Ｖ．Ｓ．、Ｄｅｗａｌｓ、Ｂ．、Ｇｉｌｌｅｔ、Ｌ．、Ｄｒｉｏｎ、Ｐ．、Ｂｏｄｙ、Ａ．、Ｓｃｈｙｎｔｓ、Ｆ．、Ｌｉｅｆｆｒｉｇ、Ｆ．、Ｖａｎｄｅｒｐｌａｓｓｃｈｅｎ、Ａ．、２００８．Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｋｏｉ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｓ  ａｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ  ｔｈａｔ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｌｏｃｕｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｐａｒｔｉａｌ  ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｋｏｉ（感染性細菌人工染色体としてのコイヘルペスウイルスゲノムのクローニングはチミジンキナーゼ遺伝子座の破壊がニシキゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｋｏｉ）における部分的な弱毒化を誘発することを示す）．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８２、４９５５‐４９６４．
【非特許文献５】Ｄｅｗａｌｓ、Ｂ．、Ｂｏｕｄｒｙ、Ｃ．、Ｇｉｌｌｅｔ、Ｌ．、Ｍａｒｋｉｎｅ‐Ｇｏｒｉａｙｎｏｆｆ、Ｎ．、ｄｅ  Ｌｅｖａｌ、Ｌ．、Ｈａｉｇ、Ｄ．Ｍ．＆  Ｖａｎｄｅｒｐｌａｓｓｃｈｅｎ、Ａ．（２００６）．Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｏｆ  Ａｌｃｅｌａｐｈｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  １  ａｓ  ａｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｂａｃｔｅｉｒａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ（感染性および病原性の細菌人工染色体としてのアルセラパインヘルペスウイルス１（悪性カタル熱ウイルス）のゲノムのクローニング）．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８７、５０９‐１７．
【非特許文献６】Ｇｉｌｌｅｔ、Ｌ．、Ｄａｉｘ、Ｖ．、Ｄｏｎｏｆｒｉｏ、Ｇ．、Ｗａｇｎｅｒ、Ｍ．、Ｋｏｓｚｉｎｏｗｓｋｉ、Ｕ．Ｈ．、Ｃｈｉｎａ、Ｂ．、Ａｃｋｅｒｍａｎｎ、Ｍ．、Ｍａｒｋｉｎｅ‐Ｇｏｒｉａｙｎｏｆｆ、Ｎ．＆  Ｖａｎｄｅｒｐｌａｓｓｃｈｅｎ、Ａ．（２００５）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ４  ａｓ  ａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ｕｓｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ（細菌人工染色体クローニングを使用する発現ベクターとしての牛ヘルペスウイルス４型の開発）．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８６、９０７‐１７．
【非特許文献７】Ｈｅｄｒｉｃｋ、Ｒ．Ｐ．、Ｇｉｌａｄ、Ｏ．、Ｙｕｎ、Ｓ．Ｃ．、ＭＣｄｏｗｅｌｌ、Ｔ．Ｓ．、Ｗａｌｔｚｅｋ、Ｔ．Ｂ．、Ｋｅｌｌｅｙ、Ｇ．Ｏ．、Ａｄｋｉｓｏｎ、Ｍ．Ａ．（２００５）．Ｉｎｉｔｉａｌ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｅｒｐｅｓ‐ｌｉｋｅ  ｖｉｒｕｓ（ＫＨＶ）  ｆｒｏｍ  Ｋｏｉ  ａｎｄ  ｃｏｍｍｏｎ  ｃａｒｐ（ニシキゴイおよびマゴイからのヘルペス様ウイルス（ＫＨＶ）の最初の単離および特性評価）．Ｂｕｌｌ．Ｆｉｓｈ．Ｒｅｓ．Ａｇｅｎ．Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ２、１‐７．
【非特許文献８】Ｉｌｏｕｚｅ、Ｍ．、Ｄｉｓｈｏｎ、Ａ．＆  Ｋｏｔｌｅｒ、Ｍ．（２００６）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｖｉｒｕｓ  ｃａｕｓｉｎｇ  ａ  ｌｅｔｈａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｃａｒｐ  ａｎｄ  Ｋｏｉ（マゴイおよびニシキゴイにおいて致死的疾患を引き起こす新規ウイルスの特性評価）．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ７０、１４７‐５６．
【非特許文献９】Ｍａｒｋｉｎｅ‐Ｇｏｒｉａｙｎｏｆｆ、Ｎ．、Ｇｉｌｌｅｔ、Ｌ．、Ｋａｒｌｓｅｎ、Ｏ．Ａ．、Ｈａａｒｒ、Ｌ．、Ｍｉｎｎｅｒ、Ｆ．、Ｐａｓｔｏｒｅｔ、Ｐ．Ｐ．、Ｆｕｋｕｄａ、Ｍ．＆  Ｖａｎｄｅｒｐｌａｓｓｃｈｅｎ、Ａ．（２００４）．Ｔｈｅ  ｃｏｒｅ  ２  ｂｅｔａ‐１，６‐Ｎ‐ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ‐Ｍ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ４  ｉｓ  ｎｏｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄｅｓｐｉｔｅ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｎｇ  ｔｏ  ｐｏｓｔ‐ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ（牛ヘルペスウイルス４型によってコードされるコア２ベータ‐１、６‐Ｎ‐アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ‐Ｍは構造タンパク質の翻訳後修飾に寄与するにも関わらずウイルス複製にとって必須ではない）．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８５、３５５‐６７．
【非特許文献１０】Ｍｅｓｓｅｒｌｅ、Ｍ．、Ｃｒｎｋｏｖｉｃ、Ｉ．、Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ、Ｗ．、Ｚｉｅｇｌｅｒ、Ｈ．＆  Ｋｏｓｚｉｎｏｗｓｋｉ、Ｕ．Ｈ．（１９９７）．Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｓ  ａｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｔｉｆｉｃａｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ（感染性細菌人工染色体としてのヘルペスウイルスゲノムのクローニングおよび変異原性）．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４、１４７５９‐６３．
【非特許文献１１】Ｍｏｒｇａｎ、Ｒ．Ｗ．、Ｃａｎｔｅｌｌｏ、Ｊ．Ｌ．＆  ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ、Ｃ．Ｈ．（１９９０）．Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｅｍｂｒｙｏ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｍａｒｅｋ‘ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ（マレック病ウイルスＤＮＡによるニワトリ胚線維芽細胞への遺伝子導入）．Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ  ３４、３４５‐５１．
【非特許文献１２】Ｎｅｕｋｉｒｃｈ、Ｍ．、Ｂｏｅｔｔｃｈｅｒ、Ｋ．、Ｂｕｎｎａｊｒａｋｕｌ、Ｓ．（１９９９）．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  Ｋｏｉ  ｗｉｔｈ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｇｉｌｌｓ（変性鰓を有するコイからのウイルスの単離）．Ｂｕｌｌ．Ｅｕｒ．Ａｓｓ．Ｆｉｓｈ．Ｐａｔｈｏｌ．１９、２２１‐２２４．
【非特許文献１３】Ｒｏｎｅｎ、Ａ．、Ｐｅｒｅｌｂｅｒｇ、Ａ．、Ａｂｒａｍｏｗｉｔｚ、Ｊ．、Ｈｕｔｏｒａｎ、Ｍ．、Ｔｉｎｍａｎ、Ｓ．、Ｂｅｊｅｒａｎｏ、Ｉ．、Ｓｔｅｉｎｉｔｚ、Ｍ．＆  Ｋｏｔｌｅｒ、Ｍ．（２００３）．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓ  ｃａｕｓｉｎｇ  ａ  ｌｅｔｈａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ（養殖コイ（ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ）において致死的疾患を引き起こすウイルスに対して有効なワクチン）．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１、４６７７‐８４．
【非特許文献１４】Ｓｃｈｒｏｄｅｒ、Ｃ．、Ｋｅｉｌ、Ｇ．Ｍ．、１９９９．Ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  １  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｈ  ｆｏｒ  ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｉｒｅｃｔ  ｓｐｒｅａｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｇＨ（Ｗ４５０）  ａｎｄ  ｇＢ  ｆｏｒ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄ‐ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ‐ｔｏ‐ｃｅｌｌ  ｓｐｒｅａｄ（牛ヘルペスウイルス１型は感染性および直接伝播のためには糖タンパク質Ｈを糖タンパク質Ｄ非依存性細胞間伝播のためには糖タンパク質ｇＨ（Ｗ４５０）およびｇＢを要求する）．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８０（Ｐｔ１（第１部））、５７‐６１．
【非特許文献１５】Ｗａｇｎｅｒ、Ｍ．、Ｒｕｚｓｉｃｓ、Ｚ．＆  Ｋｏｓｚｉｎｏｗｓｋｉ、Ｕ．Ｈ．（２００２）．ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｈａｓ  ｃｏｍｅ  ｏｆ  ａｇｅ（ヘルペスウイルス遺伝学は十分な発達段階に達した）．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １０、３１８‐２４．
【非特許文献１６】Ｗａｒｄｅｎ、Ｃ．、Ｔａｎｇ、Ｑ．、Ｚｈｕ、Ｈ．、２０１１．Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ＢＡＣｓ：ｐａｓｔ、ｐｒｅｓｅｎｔ、ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ（ヘルペスウイルスＢＡＣ：過去、現在および未来）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ＆  ｂｉｏｔｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１１、１２４５９５．
【非特許文献１７】Ｗａｒｍｉｎｇ、Ｓ．、Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ、Ｎ．、Ｃｏｕｒｔ、Ｄ．Ｌ．、Ｊｅｎｋｉｎｓ、Ｎ．Ａ．＆  Ｃｏｐｅｌａｎｄ、Ｎ．Ｇ．（２００５）．Ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ＢＡＣ  ｒｅｃｏｍｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｇａｌＫ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ（ｇａｌＫ選択を使用する簡便かつ高い効率の組換え工学）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｅｄｓ  Ｒｅｓ  ３３、ｅ３６．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＫＨＶに関する応用および基礎研究には、組換えウイルスの作製が必要である。最近、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクターの使用により、巨大なヘルペスウイルスゲノムの操作が実行可能となった（Ｍｅｓｓｅｒｌｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９４、１４７５９‐１４７６３（１９９７）；Ｗａｇｎｅｒら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｒｏｂｉｏｌ、１０、３１８‐３２４（２００２）および下記を参照されたい）。これらのベクターは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ））におけるウイルスゲノムの維持および効率的な変異誘発、その後に続く許容真核細胞へのＢＡＣプラスミドの遺伝子導入による子孫ビリオンの再構成を可能とする。ＢＡＣとしてクローニングされた二番目に大きなヘルペスウイルスゲノムに相当するヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）（２３０ｋｂ）を含め、これまでに、数種のヘルペスウイルスのゲノムを、感染性のＢＡＣクローンとして増殖することに成功している（Ｂｏｒｓｔら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７３、８３２０‐８３２９（１９９９））。
【０００９】
最近、ＢＡＣ技術を使用して初めて数種の組換えＫＨＶが構築された；これらの組換え体はＰＣＴの特許出願ＷＯ２００９／０２７４１２にすべて記載されている。この特許出願は、ＯＲＦ５５：チミジンキナーゼ遺伝子；ＯＲＦ１２：推定腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体遺伝子；ＯＲＦ１６：推定Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）遺伝子；ＯＲＦ１３４：推定インターロイキン１０ホモログ遺伝子；ＯＲＦ１４０：推定チミジル酸キナーゼ遺伝子またはそれらの組み合せから成る群より選択される、一または複数の遺伝子において一つの欠損を有する組換えＫＨＶを作製する方法を開示している。このような変異株は、生弱毒化ワクチンウイルスとして使用された。
【００１０】
これらの変異株のいくつかは、一定サイズおよび年齢の特定病原体除去魚（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＳＰＦ  ｆｉｓｈ）において使用されたときに、安全であることが示された。しかし現地の養殖業者は、早期の、換言すれば魚が比較的に若く／小さくてしかも魚のサイズにかなり大きな幅が存在するときのワクチン接種に関心がある。このような条件において、国際特許出願ＷＯ２００９／０２７４１２に開示されたような欠失変異ウイルス株に基づくワクチンは、いくつかの状況において十分には安全ではないかもしれないことが、つまりこのような組換えＫＨＶが若い／小さい魚での使用にとってあまりにも病原性が高いことが分かった。
【００１１】
このことは現在、養魚業等の現地における疾患の制御のための安全かつ有効な弱毒化組換えワクチンが、未だに欠けていることを意味する。
【００１２】
現場においてＫＨＶ感染を制御するための安全かつ有効な弱毒化ワクチンの開発のために使用し得る、新規組換えＫＨＶウイルスを提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
驚くべきことに、オープンリーディングフレーム５７（ＯＲＦ５７）が欠損した組換えＫＨＶは、このヘルペスウイルス組換え体により感染した非常に若く／小さいコイにおいてさえ、非常に減少した死亡率を示すかまたは全く死亡率を示さず、しかも野生株コイヘルペスウイルスに対する免疫を与えることが見出された。このような組換えＫＨＶは、従って若くおよび／または小さいコイにおいて適切に使用し得る安全でかつ有効な弱毒化ワクチンウイルスを提供する。
【００１４】
この発見は、ＯＲＦ５７がいままではそれが無ければ生きたウイルスが存在できない必須遺伝子であると考えられた事実を考慮すると、なお一層驚くべきことである。
【００１５】
従って本発明の第一の実施形態は、ＯＲＦ５７が欠損している組換えコイヘルペスウイルスであって、好ましくはマゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｃａｒｐｉｏ）またはニシキゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｋｏｉ）といったコイに感染させた際に、４０％以下の致死率を誘導する弱毒化ＫＨＶをもたらす、組換えコイヘルペスウイルスに関する。
【００１６】
本明細書で用いる場合、「欠損した（ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）」ＯＲＦ５７とは、もはや機能的でない、すなわちもはや機能的なタンパク質をコードすることのできないＯＲＦ５７である。本明細書で用いる欠損したＯＲＦ５７（ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ＯＲＦ５７）は、コイにおいて４０％以下の致死率を誘発するレベルまで弱毒化されたＫＨＶをもたらす。このような欠損（ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）は、例えばＯＲＦ５７をコードする遺伝子内またはそのプロモーター領域内における一または複数のヌクレオチドの挿入または欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）によって獲得し得る。この様な変異は、例えば遺伝子の５’部位でのフレームシフト変異、またはプロモーター領域（の一部）または遺伝子自身（の一部）の欠失であり得る。
【００１７】
ＯＲＦ５７のＤＮＡ塩基配列の一例は、ＯＲＦ開始および終止コドンが９９３８２位および１００８０３位に位置するＧｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＣ＿００９１２７で与えられる、ＯＲＦ５７のＤＮＡ塩基配列である。ＯＲＦ５７の位置が、他のＫＨＶ株において自然変異のために異なり得ることは言うまでもない。また自然変異のために、他のＫＨＶ株と比較したときにあるＫＨＶ株におけるＯＲＦ５７の配列にわずかな差異があり得る。従って本明細書記載のＯＲＦ５７は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＣ＿００９１２７で与えられるＯＲＦ５７のＤＮＡ塩基配列と８０％以上の配列相同性を有するオープンリーディングフレームである。
【００１８】
ヌクレオチド９６６３０‐１０１５５８にわたるＯＲＦ５６、５７および５８を含む領域のヌクレオチド配列を、配列番号１２に示す。図１も参照されたい。
【００１９】
遺伝子を欠損させる最も広範な方法、すなわちＯＲＦ５７全体を欠失させることにより、ＯＲＦ５７タンパク質の産生が完全に失われることは明らかである。
【００２０】
実用上の見地からおよび安全性の観点からこのような全欠失は、取るべき論理的な手段であるだろう。しかしながら図１の通り、隣接したＯＲＦ５８の発現に関与するかもしれない推定プロモーター領域が、１００２１０位‐１００２６１位に位置している。この理由により、ＯＲＦ５７における変異は、好ましくはこの領域に及ぶべきではない。従ってＯＲＦ５７における変異は、１００２１２位の左側または１００２６１位の右側に導入することが好ましい。
【００２１】
また図１より、隣接したＯＲＦ５６の発現に関与するかもしれない二つの推定プロモーター領域が、それぞれ９９４５１位‐９９５００位および９９７９４位‐９９８４３位に位置していることも見て取れる。従って、ＯＲＦ５７内の領域の欠失が、ＯＲＦ５６の発現を妨げることも理論的に可能である。その場合、本発明によりＯＲＦ５７が欠損している組換えＫＨＶが、単にＯＲＦ５６の発現低下の結果として弱毒化された性質を示すということがあり得る。しかしながら実施例のセクションにおいて、１）ＯＲＦ５６は必須遺伝子ではないこと、および２）ＯＲＦ５６の欠損は本発明の組換えＫＨＶの弱毒化の性質に寄与しないことが示されている。これらの実施例において、組換えＫＨＶの生存能力に影響することなく、しかも組換えＫＨＶの弱毒化特性を顕著に変えることなく、ＯＲＦ５６内において広範囲の欠失が成され得ることが示されている。これは、とりわけＯＲＦ５７に位置する推定ＯＲＦ５６プロモーター部位を問題なく除去し得ることを暗示している。
【００２２】
また図１から判断すると、ＯＲＦ５７の二つの推定プロモーターは、ＯＲＦ５６内の９７０７５位‐９７１２４位および９８７１２位‐９８７６１位に位置している。従ってＯＲＦ５７の小部分の欠失、例えばＯＲＦ５７  Ｄｅｌ１等が不完全ながら、なお機能的なＯＲＦ５７にコードされたタンパク質を提供することを排除し得なかった。この可能性を排除するために実施例のセクションにおいて記載する通り、９７００１位‐９９７５０位の領域にわたる広範囲のＯＲＦ５６‐ＯＲＦ５７二重欠失を行った。図７と比較した時に図５に示される通りこの欠失は、本質的に単一のＯＲＦ５７変異株と同等の性質を示す。従ってＯＲＦ５７にコードされたタンパク質は、ウイルスにとって必須でないと結論づけられる。
【００２３】
ＯＲＦ５７の小部分の欠失は可能性があり、上述の理由により好ましい可能性さえあり得るが、しかし生じた不完全なタンパク質が非機能的であることに留意しなければならない。当業者がいかなる理由であれ全ＯＲＦ５７未満を欠失することにするならば、ＯＲＦ５７が欠損されたかどうかを容易に検査することができるだろう。なぜならば、欠損のないＯＲＦ５７は、過度に高レベルの病原性、すなわち過度に低レベルの弱毒化を有するウイルスをもたらすからである。
【００２４】
好ましくは、組換えＫＨＶは、ウイルスの病原性に寄与するが複製に必須でない一または複数のウイルス遺伝子においてさらに欠損している。
【００２５】
従ってこの実施形態の好ましい形態は、ウイルスの病原性に寄与するがしかし複製にとって必須でない少なくとも一つの追加の遺伝子において欠損している、本発明の組換えコイヘルペスウイルスに関する。
【００２６】
この実施形態のより好ましい形態は、病原性に寄与する少なくとも一つの追加の遺伝子において欠損している本発明の組換えコイヘルペスウイルスに関し、ここで前記遺伝子は、チミジンキナーゼ遺伝子；ＯＲＦ１２：推定腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体遺伝子；ＯＲＦ１６：推定Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）遺伝子；ＯＲＦ１３４：推定インターロイキン１０ホモログ遺伝子；ＯＲＦ１４０：推定チミジル酸キナーゼ遺伝子またはそれらの任意の組み合せから成る群より選択される。
【００２７】
この実施形態のさらにより好ましい形態において、組換えＫＨＶは、少なくともチミジンキナーゼ遺伝子または推定チミジル酸キナーゼ遺伝子においてさらに欠損している。
【００２８】
この実施形態の他のさらにより好ましい形態において、本発明の組換えＫＨＶは、チミジンキナーゼ遺伝子が欠損しているとともに、ＯＲＦ１２：推定腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体遺伝子；ＯＲＦ１６：推定Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）遺伝子；ＯＲＦ１３４：推定インターロイキン１０ホモログ遺伝子またはＯＲＦ１４０：推定チミジル酸キナーゼ遺伝子から成る群より選択される、病原性に寄与する少なくとも一つのさらなる遺伝子においてさらに欠損している。
【００２９】
この実施形態の一層さらにより好ましい形態において、組換えＫＨＶは、少なくともチミジンキナーゼ遺伝子および推定チミジル酸キナーゼ遺伝子においてさらに欠損している。
【００３０】
この実施形態の他の好ましい形態において、本発明の組換えコイヘルペスウイルスは生きた形態である。好ましくは、組換えコイヘルペスウイルスは、感染性粒子を再構成する能力を有する。すなわち、許容真核細胞または魚個体、好ましくはコイ、より好ましくはコイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ）、さらにより好ましくはマゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｃａｒｐｉｏ）および／またはニシキゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｋｏｉ）に導入されたときに、複製する能力を有する。
【００３１】
別の実施形態において本発明の組換えＫＨＶは、複製にとって必須である一または複数のウイルス遺伝子においてさらに欠損しており（およびウイルスの病原性に寄与するがしかし複製にとって必須ではない一または複数のウイルス遺伝子において欠損していてもよい）、従って本発明の組換えコイヘルペスウイルスを非複製型で提供する。
【００３２】
従って代わりの実施形態は、前記ヘルペスウイルスが非複製型である本発明の組換えＫＨＶに関する。
【００３３】
「非複製型」とは、組換えコイヘルペスウイルスが、なお細胞または魚個体（例えば、コイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ）、マゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｃａｒｐｉｏ）またはニシキゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｋｏｉ）に感染する能力を有するが、しかし感染性の子孫ウイルスが形成される程度までには複製することができないことを意味する。
【００３４】
非複製型組換え株は、複製にとって必須であるＫＨＶ遺伝子の不活化によって（例えば、ＢＡＣクローニングを使用して、挿入、欠失または変異等の既知の技術によって）作製される。
【００３５】
このような欠失ウイルスは、欠失遺伝子を安定して発現する許容細胞株上で培養される（トランス相補）。
【００３６】
この研究方法は、当該分野において良く知られた研究方法である。それは、とりわけｇＨ欠損ブタヘルペスウイルス１型（Ａｕｊｅｓｚｋｙウイルス）（Ｂａｂｉｃら、１９９６）およびウシヘルペスウイルス１型（ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＫｅｉｌ、１９９９）等の種々のヘルペスウイルスに対して成功裡に使用されてきた。
【００３７】
複製に寄与するいかなる遺伝子も、非複製型組換えコイヘルペスウイルスを得るために欠損させ得る。言い換えれば、不活化させることにより、非複製型組換えコイヘルペスウイルスをもたらすいかなる遺伝子も欠損させ得る。好ましくは、ウイルスの非複製形態を提供するために欠損される本発明の組換えＫＨＶの遺伝子は、ＯＲＦ２５、ＯＲＦ３１、ＯＲＦ３２、ＯＲＦ３４、ＯＲＦ３５、ＯＲＦ４２、ＯＲＦ４３、ＯＲＦ４５、ＯＲＦ５１、ＯＲＦ５９、ＯＲＦ６０、ＯＲＦ６２、ＯＲＦ６５、ＯＲＦ６６、ＯＲＦ６８、ＯＲＦ７０、ＯＲＦ７２、ＯＲＦ７８、ＯＲＦ８１、ＯＲＦ８４、ＯＲＦ８９、ＯＲＦ９０、ＯＲＦ９２、ＯＲＦ９５、ＯＲＦ９７、ＯＲＦ９９、ＯＲＦ１０８、ＯＲＦ１１５、ＯＲＦ１３１、ＯＲＦ１３２、ＯＲＦ１３６、ＯＲＦ１３７、ＯＲＦ１４８およびＯＲＦ１４９から成る群より選択される。
【００３８】
本発明の組換えコイヘルペスウイルスは、好ましくは細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクター配列を含む。
【００３９】
約１５年以前から巨大ヘルペスウイルスのゲノム操作は、このような細菌人工染色体の使用によって促進されてきた。これらのベクターは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）でのウイルスゲノムの維持および変異誘発、その後に続く許容真核細胞へのＢＡＣプラスミドの遺伝子導入による子孫ビリオンの再構成を可能とする。第一段階で、ＢＡＣベクターの配列が従来の相同組換えによって感染細胞中でヘルペスウイルスゲノムに導入される。ヘルペスウイルスの直鎖状２本鎖ＤＮＡゲノムは、複製中に環状化する。それは、ＢＡＣ変異型の環状の複製中間体を単離するために、およびＥ．ｃｏｌｉへのＤＮＡ形質転換によってそれを往復させるために十分である。この往復は、系を確立するために一度だけ必要とされる。ヘルペスウイルスＢＡＣは、それからＥ．ｃｏｌｉ中で増殖されて変異される。同種のクローンヘルペスウイルスＢＡＣ  ＤＮＡは、ウイルス再構成のためだけに真核許容細胞に戻される。ウイルスの機能は要求されないのでウイルスゲノムは、Ｅ．ｃｏｌｉ中では休眠したままであり、クローニングの際に提示していたウイルス機能を保存している。このことは、インビトロでの培養方法によって単離株のもともとの特性が変化してしまうようなウイルスにとって重要である。
【００４０】
本明細書で用いる場合、用語「相同組換え」とは、二つの異なる相同核酸分子が遭遇するときに、交差が起こり新しい核酸の組合せが生じることを表す。本明細書で用いる場合、用語「配列介在性相同組換え」とは、相同組換えにおいて触媒し、実行しまたは補助している特異的組換えタンパク質に依存する相同組換えを引き起こす配列を表す。このような組換えタンパク質は、好ましくは特異的に「配列介在性相同組み換え」に作用し他の配列には作用しない。
【００４１】
ＢＡＣベクター配列は、当該分野においてよく知られており、ヘルペスウイルス等の組換えウイルスの構築におけるその使用がしばしば当該分野において記載されている（Ｂｏｒｓｔ、Ｅ．Ｍ．、Ｈａｈｎ、Ｇ．、Ｋｏｓｚｉｎｏｗｓｋｉ、Ｕ．Ｈ．＆  Ｍｅｓｓｅｒｌｅ、Ｍ．（１９９９）、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３、８３２０‐９．Ｃｏｓｔｅｓ、Ｂ．、Ｆｏｕｒｎｉｅｒ、Ｇ．、Ｍｉｃｈｅｌ、Ｂ．、Ｄｅｌｆｏｒｇｅ、Ｄ．、Ｒａｊ、Ｖ．Ｓ．、Ｄｅｗａｌｓ、Ｂ．、Ｇｉｌｌｅｔ、Ｌ．、Ｄｒｉｏｎ、Ｐ．、Ｂｏｄｙ、Ａ．、Ｓｃｈｙｎｔｓ、Ｆ．、Ｌｉｅｆｆｒｉｇ、Ｆ．、Ｖａｎｄｅｒｐｌａｓｓｃｈｅｎ、Ａ．、２００８．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８２、４９５５‐４９６４．Ｄｅｗａｌｓ、Ｂ．、Ｂｏｕｄｒｙ、Ｃ．、Ｇｉｌｌｅｔ、Ｌ．、Ｍａｒｋｉｎｅ‐Ｇｏｒｉａｙｎｏｆｆ、Ｎ．、ｄｅ  Ｌｅｖａｌ、Ｌ．、Ｈａｉｇ、Ｄ．Ｍ．＆  Ｖａｎｄｅｒｐｌａｓｓｃｈｅｎ、Ａ．（２００６）、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８７、５０９‐１７．Ｇｉｌｌｅｔ、Ｌ．、Ｄａｉｘ、Ｖ．、Ｄｏｎｏｆｒｉｏ、Ｇ．、Ｗａｇｎｅｒ、Ｍ．、Ｋｏｓｚｉｎｏｗｓｋｉ、Ｕ．Ｈ．、Ｃｈｉｎａ、Ｂ．、Ａｃｋｅｒｍａｎｎ、Ｍ．、Ｍａｒｋｉｎｅ‐Ｇｏｒｉａｙｎｏｆｆ、Ｎ．＆  Ｖａｎｄｅｒｐｌａｓｓｃｈｅｎ、Ａ．（２００５）、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８６、９０７‐１７．Ｍｅｓｓｅｒｌｅ、Ｍ．、Ｃｒｎｋｏｖｉｃ、Ｉ．、Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ、Ｗ．、Ｚｉｅｇｌｅｒ、Ｈ．＆  Ｋｏｓｚｉｎｏｗｓｋｉ、Ｕ．Ｈ．（１９９７）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４、１４７５９‐６３．Ｗａｒｍｉｎｇ、Ｓ．、Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ、Ｎ．、Ｃｏｕｒｔ、Ｄ．Ｌ．、Ｊｅｎｋｉｎｓ、Ｎ．Ａ．＆  Ｃｏｐｅｌａｎｄ、Ｎ．Ｇ．（２００５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３、ｅ３６．Ｗａｇｎｅｒ、Ｍ．、Ｒｕｚｓｉｃｓ、Ｚ．＆  Ｋｏｓｚｉｎｏｗｓｋｉ、Ｕ．Ｈ．（２００２）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １０、３１８‐２４）。
【００４２】
ＢＡＣベクター配列は、必ずしもＯＲＦ５７に挿入される必要はない。その代りにそれは、病原性に寄与するいかなる他のウイルス遺伝子、および／またはウイルス複製にとって必須のまたは必須でないいかなる他のウイルス遺伝子、および／またはいかなる遺伝子間領域にも挿入され得る。
【００４３】
しかしながらより好ましい形態において組換えコイヘルペスウイルスは、ＯＲＦ５７に挿入されたＢＡＣベクター配列を含む。このような挿入は、ＢＡＣベクターをＯＲＦ５７に挿入することによって、同時にＯＲＦ５７に欠損が生じ、従って直接的に本発明の組換えＫＨＶを提供するという利点を有する。
【００４４】
本発明の組換えＫＨＶの例は、ＯＲＦ５５への改変ｌｏｘＰ隣接ＢＡＣカセットの挿入によるＫＨＶゲノムのクローニングによって達成された（下記を参照されたい）。この挿入は、許容細胞に遺伝子導入されたときに、そのゲノムが細菌中で安定して維持され、ビリオンを再生できるＢＡＣ組換えウイルスをもたらした（ＢＡＣベクターの詳細については、Ｃｏｓｔｅｓ、Ｂ．、Ｆｏｕｒｎｉｅｒ、Ｇ．、Ｍｉｃｈｅｌ、Ｂ．、Ｄｅｌｆｏｒｇｅ、Ｃ．、Ｒａｊ、Ｖ．Ｓ．、Ｄｅｗａｌｓ、Ｂ．、Ｇｉｌｌｅｔ、Ｌ．、Ｄｒｉｏｎ、Ｐ．、Ｂｏｄｙ、Ａ．、Ｓｃｈｙｎｔｓ、Ｆ．、Ｌｉｅｆｆｒｉｇ、Ｆ．、Ｖａｎｄｅｒｐｌａｓｓｃｈｅｎ、Ａ．、２００８、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８２、４９５５‐４９６４を、および技術的詳細については下記を参照されたい）。このベクターは、ＯＲＦ５７における欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を導入するために使用した。
【００４５】
用語「ＢＡＣベクター」とは、Ｅ．ｃｏｌｉのＦプラスミドを使用して作製されるプラスミドであって、しかもＥ．ｃｏｌｉ等の細菌において約３００ｋｂ以上の巨大サイズのＤＮＡ断片を安定して維持し増殖することのできるベクターを表す。ＢＡＣベクターは、少なくともＢＡＣベクターの複製にとって必須なＢＡＣベクター配列を含有する。このような複製にとって必須な領域の例には、限定されるものではないが、Ｆプラスミドの複製起点およびその変異型が含まれる。
【００４６】
本明細書で用いる場合、用語「ＢＡＣベクター配列」とは、ＢＡＣベクターの機能にとって必須な配列を含む配列を表す。ＢＡＣベクター配列は、「組換えタンパク質依存性組換え配列」および／または「選択マーカー」をさらに含んでいてもよい。
【００４７】
すなわち「組換えタンパク質依存性組換え配列」および／または「選択マーカー」の詳細は、例えば上述の文献、およびＷＯ２２００９／０２７４１２に記載されている。
【００４８】
ＢＡＣベクターがゲノムに挿入される位置に関わらず、好ましくは、ＢＡＣベクター配列は相同組換えを媒介する配列、好ましくはｌｏｘＰによって隣接されている。またＢＡＣベクター配列は、好ましくは選択マーカーを含む（下記を参照されたい）。より好ましい形態において選択マーカーは、薬剤選択マーカーである（下記を参照されたい）。
【００４９】
他の好ましい形態において、前記組換えヘルペスウイルスのゲノムはプラスミド形態で存在する。これは上記のＢＡＣベクター配列を含む組換えコイヘルペスウイルスの環状型を単離することおよび細菌細胞への導入によって達成される。上記の通り、病原性に寄与するまたは複製にとって必要である一または複数の上記の遺伝子が遺伝子工学技術によって欠損されているかぎり、ＢＡＣ（細菌人工染色体）ベクター配列を、病原性に寄与するまたは複製にとって必要である一または複数のウイルス遺伝子に挿入することは、本発明にとって必須ではない。
【００５０】
従って、ＯＲＦ５７および好ましくは病原性に寄与する一または複数のウイルス遺伝子も欠損しているかぎり、ＢＡＣベクター配列はウイルスゲノムのいかなる領域に挿入されてもよい。
【００５１】
もちろん、上記のＢＡＣベクター介在性クローニング技術の利用は、例えば最初はＯＲＦ５７を欠損させるために、そして再度追加の遺伝子を欠損させるために繰り返して使用され得る。
【００５２】
ＢＡＣベクター配列は、原則としてさらなる使用においても、本発明の組換えＫＨＶ中に問題なく存在し得る。しかしながら、例えばワクチンにおける本発明のコイヘルペスウイルスの使用のためには、ＢＡＣ配列の大部分は除去されることが好ましい。これは、例えば選択マーカーをコードする遺伝子およびさらには耐性遺伝子を含むＢＡＣ配列の場合である。ワクチンにおけるこのような遺伝子の存在は、不要であると考えられるだけでなく、望ましくさえない。
【００５３】
従って好ましくはＢＡＣベクター配列の少なくとも一部（例えば、耐性遺伝子または選択マーカーを含む一部）、またはより好ましくは大部分がヘルペスウイルスゲノムから切除され、それによってヘルペスウイルスゲノムにおける切除部位または前挿入部位に異種配列を置き去りにする。より好ましくは、異種配列は２００ヌクレオチド未満のサイズを有する。切除は、ｌｏｘＰ隣接ＢＡＣベクター配列を切除するＣｒｅリコンビナーゼを発現する許容真核細胞への組換えＫＨＶの導入によって達成される。
【００５４】
従ってこの実施形態の好ましい形態は、ＢＡＣベクター配列の一部がヘルペスウイルスゲノムから切除され、それによってヘルペスウイルスゲノムの切除部位または前挿入部位のそれぞれに異種配列を置き去りにすることを特徴とする、本発明の組換えコイヘルペスウイルスに関する。
【００５５】
そしてこの実施形態のより好ましい形態において、ヘルペスウイルスゲノムから切除されるＢＡＣベクター配列の一部は、選択マーカーおよび／または耐性遺伝子をコードする少なくとも一つの遺伝子を含む。
【００５６】
またＢＡＣカセットの挿入部位を含む野生型ウイルスゲノムのＤＮＡ断片（例えば、ＴＫをコードするＯＲＦ５５）を使用する真核細胞中における相同組換えによって、全ＢＡＣカセット配列を除去することも可能である。ＥＧＦＰ（ＢＡＣカセットによりコードされている）を発現しないウイルスプラークを選択することにより、ＢＡＣ挿入サイトが野生型配列に復帰した組換え体を選択することが可能となる。
【００５７】
本発明の組換えコイヘルペスウイルスは、ＫＨＶ  ＢＡＣクローン、およびＢＡＣベクター配列の少なくとも一部がヘルペスウイルスゲノムから切除されている上記のＫＨＶ構築物のどちらの形態でも、さらに特定の遺伝子に欠損のあるゲノムを作製するために、さらなる操作、例えば遺伝子工学技術が関与する操作のために使用し得る。このようなさらなる遺伝子の欠損は、既に上記した通り、同様にＢＡＣ技術を使用して獲得し得る。
【００５８】
本発明の組換えＫＨＶは、魚、より具体的にはコイ、さらにより具体的にはマゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｃａｒｐｉｏ）またはニシキゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｋｏｉ）を単にＫＨＶ疾患から予防するための、ワクチン用途に使用し得るばかりでなく、異種（すなわち非ＫＨＶ）ＤＮＡ断片の担体ウイルス（ｃａｒｒｉｅｒ  ｖｉｒｕｓ）としても効率的に使用され得る。その場合、本発明の組換えＫＨＶの有利な特性が完全に利用し得るであろうし、さらにウイルスは、例えばマーカー特性、さらなる免疫特性またはアジュバント特性等のさらなる特性を獲得するであろう。
【００５９】
この点において「マーカー特性」とは、直接的または間接的に異種ＤＮＡ断片が、野生ウイルス（ｆｉｅｌｄ  ｖｉｒｕｓ）感染とワクチンウイルス感染の違いを識別するのを可能にすることを意味する。
【００６０】
野生ウイルス感染とワクチンウイルス感染の違いを識別する直接的な方法は、例えば、本発明の組換えＫＨＶ中の異種（すなわち非ＫＨＶ）ＤＮＡ断片と特異的に反応し、ＫＨＶ野生ウイルスのＤＮＡとは反応しないプライマーを使用するＰＣＲ法（ＰＣＲ‐ｒｅａｃｔｉｏｎ）を含むであろう。
【００６１】
野生ウイルス感染とワクチンウイルス感染の違いを識別する間接的な方法は、例えば、本発明の組換えＫＨＶ中の異種（すなわち非ＫＨＶ）ＤＮＡ断片によってコードされた免疫原性タンパク質と特異的に反応し、しかもＫＨＶ野生ウイルスのいかなるタンパク質とも反応しない抗体を使用する免疫反応を含むであろう。
【００６２】
従って本発明の他の実施形態は、異種ＤＮＡ断片、例えば異種遺伝子を含む本発明の組換えＫＨＶに関する。
【００６３】
好ましくは、このような異種ＤＮＡ断片は、魚、より具体的にはコイ、さらにより具体的にはマゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｃａｒｐｉｏ）またはニシキゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｋｏｉ）に対して病原性のある、別のウイルスまたは微生物の免疫原性タンパク質をコードする異種遺伝子である。より好ましくは、異種遺伝子は、コイ春ウイルス血症を引き起こすラブドウイルス（ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）の糖タンパク質Ｇ遺伝子である。このような構築物は、ワクチンに使用されたとき、ＫＨＶに対してのみならずコイ春ウイルス血症に対してもコイを保護し得る。
【００６４】
真核細胞における異種遺伝子の発現のために適したプロモーターは、当該技術分野において広範に知られている。異種遺伝子、例えばコイ春ウイルス血症を引き起こすラブドウイルスの糖タンパク質Ｇ遺伝子の発現にとって適したプロモーターの一例は、ＨＣＭＶ（ヒトサイトメガロウイルス）ＩＥプロモーターである。
【００６５】
本発明はさらに、組換えコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）の感染性粒子の作製の方法を提供し、ここで前記方法は、
（ａ）本発明の組換えＫＨＶ、または本発明の組換えＫＨＶのゲノムを含む組換えＫＨＶ  ＤＮＡを、許容真核細胞に導入する段階；および
（ｂ）組換えコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）を作製するために宿主細胞を培養する段階を含む。
【００６６】
上記の本発明の組換えコイヘルペスウイルスおよびそのＤＮＡは弱毒化された特性を有するため、注射または薬浴または経口による魚、好ましくはマゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｃａｒｐｉｏ）またはニシキゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｋｏｉ）個体の免疫化に非常に適している。
【００６７】
従って本発明のさらなる他の実施形態は、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）により引き起こされる魚の疾患の予防処置および／または治療処置における使用のための、本発明の組換えコイヘルペスウイルス、および／または本発明の組換えコイヘルペスウイルスのゲノムを含む、ＫＨＶ  ＤＮＡを提供する。
【００６８】
予防的使用とは、感染または少なくとも疾患の臨床症状を防ぐことを目的とする使用である。
【００６９】
治療的使用とは、ＫＨＶによって引き起こされる疾患に既に罹患している魚における前記ＫＨＶまたはＫＨＶ  ＤＮＡの使用である。
【００７０】
また本発明の他の実施形態は、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）により引き起こされる魚の疾患の予防処置および／または治療処置のためのワクチンにおける使用のための、本発明の組換えコイヘルペスウイルス、および／または本発明の組換えコイヘルペスウイルスのゲノムを含むＫＨＶ  ＤＮＡを提供する。
【００７１】
さらに本発明の他の実施形態は、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）により引き起こされる魚の疾患の予防処理および／または治療処置のためのワクチンであって、本発明の組換えコイヘルペスウイルスおよび／または本発明の組換えコイヘルペスウイルスのゲノムを含むＫＨＶ  ＤＮＡ、並びに薬学的に許容可能な担体を含むことを特徴とするワクチンを提供する。
【００７２】
また本発明の他の実施形態は、コイ春ウイルス血症の原因となるラブドウイルスにより引き起こされる魚の疾患の予防処置および／または治療処置のためのワクチンであって、コイ春ウイルス血症の原因となる前記ラブドウイルスの糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子を保有する本発明の組換えＫＨＶ、または前記ＫＨＶのゲノムを含むＤＮＡ配列、および薬学的に許容可能な担体を含むワクチンを提供する。
【００７３】
本明細書で用いる場合、用語「ワクチン」とは、特定の疾患に対し宿主の予防処置および／または治療処置ができる組成物を表す。このようなワクチンは、予防的免疫または治療的免疫を引き起こし得る。
【００７４】
薬学的に許容可能な担体は、水または緩衝液のように単純であり得る。薬学的に許容可能な担体は、また安定剤を含んでもよい。それは、またアジュバントを含んでもよいし、またはそれ自体がアジュバントでもあり得る。
【００７５】
典型的にワクチンは、注射または水中での魚の浸漬による送達のための液体溶液、エマルジョンまたは懸濁液として調製される。例えば、魚が入った貯水槽または浴槽に添加するために、液体エマルジョンまたは乳剤を調製し得る。また、投与前に、液体ビヒクルへの溶解または懸濁に適した、または固形食との混合に適した固形（例えば、粉体）形態を調製してもよい。ワクチンは、滅菌希釈液による再構成によって即時使用可能となる凍結乾燥培養液であり得る。例えば凍結乾燥細胞は、０．９％生理食塩水（任意に、包装したワクチン製品の一部として提供される）で再構成され得る。注射可能なワクチンの好ましい剤形はエマルジョンである。液体または再構成形態のワクチンは、囲い、水槽または浴槽（ｐｅｎ，ｔａｎｋ  ｏｒ  ｂａｔｈ）への添加の前に少量（例えば、１ないし１００容量）の水で希釈され得る。
【００７６】
この実施形態の好ましい一形態において、組換えＫＨＶ株を含むワクチン製剤は、例えば粉体、凍結乾燥体、圧縮ペレットまたは錠剤等の乾燥形態である。
【００７７】
この実施形態の他の形態において、前記ウイルスは組織培養液の形態であり得る。前記液体は、好ましくは−７０℃の雰囲気下、最も好ましくはグリセリンを含有する液体として保存し得る。一具体例において、該組織培養液は２０％グリセリンを含有する。
【００７８】
本発明において開示する組換えＫＨＶ株は、いくつかの方法によって乾燥形態に変換し得る。特に好ましい乾燥形態は凍結乾燥によるものである。乾燥、例えば凍結乾燥処置に先立って、様々の原料、例えば保存料、抗酸化剤または還元剤、種々の賦形剤等を培養液に添加し得る。このような賦形剤は、乾燥、例えば凍結乾燥した活性弱毒化ウイルスに乾燥段階後にも添加し得る。
【００７９】
本発明の組換えＫＨＶが経口投与（例えば、浸漬または薬浴）のためのワクチン成分として使用されるときは、通常アジュバントの投与の必要はないはずである。
【００８０】
しかしながらもしワクチン製剤が魚に直接注射されるならば、アジュバントを使用してもよい。もし本発明の組換えＫＨＶが非複製型であるならば、免疫賦活剤の添加が好ましいかもしれない。
【００８１】
一般的に製剤は、免疫応答を強化するために、特に注射用の製剤の場合には様々なアジュバント、サイトカインまたは他の免疫賦活剤を含んでよい。
【００８２】
アジュバントは、宿主の免疫応答を非特異的な方法で強化する免疫賦活物質である。アジュバントは、親水性アジュバント、例えば水酸化アルミニウムもしくはリン酸アルミニウム、または疎水性アジュバント、例えばミネラルオイルを含むアジュバントであり得る。ムラミルジペプチド、アビジン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、オイル、オイルエマルジョン、サポニン、デキストラン硫酸、グルカン、サイトカイン、ブロック共重合体、免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび当該分野で知られたその他のアジュバントは、本発明の組換えＫＨＶと混合し得る。養殖業において頻繁に使用されるアジュバントの例は、ムラミルジペプチド、リポ多糖類、数種のグルカンおよびグルカンおよびＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）（ホモポリマー）である。適したアジュバントは、例えば油中水（ｗ／ｏ）エマルジョン、ｏ／ｗエマルジョンおよびｗ／ｏ／ｗ二重エマルジョンである。ｗ／ｏエマルジョンにおける使用に適したオイルアジュバントは、例えばミネラルオイルまたは代謝可能なオイルである。ミネラルオイルは、例えばＢａｙｏｌ（登録商標）、Ｍａｒｃｏｌ（登録商標）およびＤｒａｋｅｏｌ（登録商標）であり；代謝可能なオイルは、例えばピーナッツ油および大豆油等の植物油、または魚油スクアランおよびスクアレン等の動物油である。あるいは、ＥＰ３８２，２７１に記載の通り、ビタミンＥ（トコフェロール）可溶化物も有利に使用し得る。非常に適したｏ／ｗエマルジョンは、例えば、５〜５０％ｗ／ｗ水相と９５〜５０％ｗ／ｗオイルアジュバントから出発して得られるが、より好ましくは２０〜５０％ｗ／ｗ水相と８０〜５０％ｗ／ｗオイルアジュバントが使用される。アジュバントの添加量は、アジュバントそれ自体の性質、および製造者によって提供される当該量に関する情報に依存する。
【００８３】
好ましい実施形態において本発明のワクチンは、安定剤をさらに含む。安定剤は、例えば分解から保護するため、保存性を高めるため、または凍結乾燥効率を改善するために本発明のワクチンに添加され得る。有用な安定剤は、とりわけＳＰＧＡ（Ｂｏｖａｒｎｉｋら、１９５０、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．５９、ｐ．５０９）、脱脂乳、ゼラチン、ウシ血清アルブミン、例えばソルビトール、マンニトール、トレハロース、デンプン、ショ糖、デキストランまたはグルコース、乳糖等の炭水化物、アルブミンもしくはカゼインまたはその分解物等のタンパク質、およびアルカリ金属リン酸塩等の緩衝液である。
【００８４】
ネオマイシンおよびストレプトマイシン等の抗生物質を、潜在的な細菌増殖を防ぐために添加し得る。
【００８５】
さらにワクチンは、一または複数の適した界面活性化合物または乳化剤、例えばＳｐａｎ（登録商標）またはＴｗｅｅｎ（登録商標）を含み得る。ワクチンは、またいわゆる「ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）」も含み得る。ビヒクルとは、本発明のＫＨＶウイルス（ウイルス粒子形態かそれともＤＮＡ形態）が、それに共有結合することなくそれに付着する化合物である。このようなビヒクルは、とりわけバイオ‐マイクロカプセル、マイクロ‐アルギン酸、リポソームおよびｍａｃｒｏｓｏｌｓであり、当該技術分野においてすべて知られている。このようなビヒクルの特別の形態がイスコムである。言うまでもないことであるが、本発明のワクチンに他の安定剤、担体、希釈剤、エマルジョン、その他を混合することもまた本発明の範囲内である。このような添加物は、例えば「レミントン薬学の科学と実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｙ）」（２０００、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ、ＵＳＡ、ＩＳＢＮ：６８３３０６４７２）、および「獣医ワクチン学（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ）」（Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｅｔら、編、１９９７、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、ＩＳＢＮ：０４４４８１９６８１）等の良く知られた参考書に記載されている。
【００８６】
組換えＫＨＶは、ワクチンにおいてその乾燥形態で使用されるとき、さらに再構成液体、好ましくは滅菌水、生理食塩水または生理溶液を含み得る。それは、また細胞のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の製造工程由来の少量の残留物も含有し得る。これらの物質はそれ自体添加物ではないものの、それにもかかわらずワクチン製剤に存在し得る。
【００８７】
ワクチンは、経口的に、例えば飼料によりまたは強制経口投与により、または注射により（例えば、筋肉内または腹腔内経路により）魚に対し個別に投与し得る。
【００８８】
あるいはワクチンは、水中に入れられた魚全体の個体群にスプレーし、溶解しおよび／または浸漬することによって一斉に投与し得る。これらの方法は、全ての種類の魚、例えば食用魚および鑑賞用魚等のワクチン接種にとって、および様々な環境、例えば池、水族館、自生地および淡水貯留池等におけるワクチン接種にとって有用である。
【００８９】
本発明のさらなる態様は、本発明の組換えＫＨＶを含むＤＮＡワクチンに関する。
【００９０】
本発明のＤＮＡワクチンは、どちらも本発明の組換えＫＨＶのゲノムを含むという意味で、本発明の組換えＫＨＶを含むワクチンと基本的に異ならない。
【００９１】
それらは、例えばＧｅｎｅＧｕｎ（登録商標）等の無針注射器を使用する皮内施用により容易に投与し得る。この投与方法は、ＤＮＡをワクチン接種される動物の細胞に直接送達する。本発明の医薬組成物（以下に概説）における本発明の組換えＫＨＶ  ＤＮＡの好ましい量は、１０ｐｇと１０００μｇの範囲内にある。好ましくは、０．１と１００μｇの範囲内の量が使用される。あるいは魚は、例えば１０ｐｇと１０００μｇ／ｍｌの範囲内の投与されるべきＤＮＡを含む溶液に浸漬され得る。すべてのこれらの投与技術および投与経路は、当該技術分野で良く知られている。
【００９２】
好ましくは、本発明のワクチンは、例えば懸濁液、溶液、分散液、エマルジョン、その他の、注射または浸漬ワクチン接種に適した形態に製剤化される。
【００９３】
標的生物に対する本発明ワクチン施用のための投与計画は、単回投与または複数回投与の施用が可能であり、投与量および製剤に適合する仕方で、および免疫学的に有効であろう量で、同時にまたは逐次的に投与され得る。処置が「免疫学的に有効」であるか否かを決定することは、当業者の能力で十分可能であり、例えばワクチン接種された動物に実験的な攻撃感染を投与し、そして次に標的動物の臨床症状、血清パラメータを検討することによって、または病原体の再分離を評価する。
【００９４】
本発明の組換えＫＨＶまたは組換えＫＨＶ  ＤＮＡに基づく本発明のワクチンに対して、何が、「医薬的有効量」を構成するかは、所望の効果および標的生物に依存する。有効量の決定は、専門家の通常の技術で十分可能である。本発明の医薬組成物中に含まれる、本発明の組換えＫＨＶ  ＤＮＡの好ましい量については、上述した。
【００９５】
本発明の組換えＫＨＶウイルス株を含む生ワクチンの好ましい量は、例えばプラーク形成単位（ｐｆｕ）として表される。例えば生ウイルスベクターにとって、動物当たり１ないし１０１０プラーク形成単位（ｐｆｕ）内の用量範囲が有利に使用し得る；好ましくは１０２ないし１０６ｐｆｕ／用量である。
【００９６】
多数の投与方法が施用できて、すべてが当該技術分野で知られている。本発明のワクチンは、好ましくは注射（筋肉内または腹腔内経由）、浸漬、薬浴または経口によって魚に投与される。投与のためのプロトコールは、標準的ワクチン接種技法に従って最適化し得る。
【００９７】
もしワクチンが本発明の組換えＫＨＶの非複製型を含むならば、用量は投与される非複製型ウイルス粒子の数として表されるであろう。さらに生ウイルス粒子の投与と比較したとき、該用量は通常いくぶん高めであるだろうが、それは、生ウイルス粒子は、免疫系によって除去される前に標的動物において一定範囲まで複製するからである。非複製型ウイルス粒子に基づくワクチンにとって、約１０４ないし１０９粒子の範囲のウイルス粒子量が通常は適しているであろう。
【００９８】
ワクチンは、特に本発明の生組換えＫＨＶが使用されるとき、好ましくは浸漬によって投与される。これは、このようなワクチンを商業的養殖業において使用する場合に特に効果的である。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】ＯＲＦ５７を含むＣｙＨＶ‐３ゲノム領域の概要図。各ＯＲＦ（Ｇｅｎｂａｎｋ受付番号ＮＣ＿００９１２７に準拠）のＡＴＧ（開始）コドンおよび終止コドンの座標を示す。コンピュータ解析（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  ａｎａｌｙｓｅｓ）により同定された、ＯＲＦ５６およびＯＲＦ５７の内側または近くの、推定プロモーター（Ｐ）の座標を示す。文字Ｐに続く数字は、同定されたプロモーター配列の制御下にあるＯＲＦを特定する。ＯＲＦ５６および／またはＯＲＦ５７を無効にするために欠失される選択配列を、上部に示す。欠失部位の座標を示す。
【図２】ＯＲＦ５７（図２）またはＯＲＦ５６（図３）を欠失したＦＬ  ＢＡＣ  ｇａｌＫ組換えプラスミドを作製するために実施した段階、ならびに作製した該プラスミドからの感染性ウイルスの再構成を証明するために実施した段階のフローチャート。ＯＲＦ５７またはＯＲＦ５６領域を、図１に特定する通り、Ｅ．ｃｏｌｉにおける相同組換えを使用してｇａｌＫ発現カセットによって置換した。野生型チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子座を有する感染性ウイルス（ＦＬ  ＢＡＣ復帰変異株）を再構成するために、組換えプラスミドをｐＧＥＭＴ‐ＴＫプラスミドと一緒に許容ＣＣＢ細胞に同時遺伝子導入した。不完全なＴＫの形態を有する感染性ウイルス（ＦＬ  ＢＡＣ切除株）を再構成するために、組換えプラスミドを、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するＣＣＢ細胞に遺伝子導入した。
【図３】ＯＲＦ５７（図２）またはＯＲＦ５６（図３）を欠失したＦＬ  ＢＡＣ  ｇａｌＫ組換えプラスミドを作製するために実施した段階、ならびに作製した該プラスミドからの感染性ウイルスの再構成を証明するために実施した段階のフローチャート。ＯＲＦ５７またはＯＲＦ５６領域を、図１に特定する通り、Ｅ．ｃｏｌｉにおける相同組換えを使用してｇａｌＫ発現カセットによって置換した。野生型チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子座を有する感染性ウイルス（ＦＬ  ＢＡＣ復帰変異株）を再構成するために、組換えプラスミドをｐＧＥＭＴ‐ＴＫプラスミドと一緒に許容ＣＣＢ細胞に同時遺伝子導入した。不完全なＴＫの形態を有する感染性ウイルス（ＦＬ  ＢＡＣ切除株）を再構成するために、組換えプラスミドを、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するＣＣＢ細胞に遺伝子導入した。
【図４】ＯＲＦ５７およびＯＲＦ５６（ＯＲＦ５６‐５７）を欠失したＦＬ  ＢＡＣ組換えプラスミドを作製するために実施した段階、ならびに作製した該プラスミドからの感染性ウイルスの再構成を証明するために実施した段階のフローチャート。ＯＲＦ５６‐５７領域を、図１に特定する通り、Ｅ．ｃｏｌｉにおける相同組換えを使用してｇａｌＫ発現カセットによって置換した。次に、ｇａｌＫ発現カセットを、ｇａｌＫ発現カセット（ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌカセット）に隣接するＫＨＶゲノム領域に相当する合成ＤＮＡ配列による相同組換えによって除去した。野生型チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子座を有する感染性ウイルス（ＦＬ  ＢＡＣ復帰変異株）を再構成するために、組換えプラスミドをｐＧＥＭＴ‐ＴＫプラスミドと一緒に許容ＣＣＢ細胞に同時遺伝子導入した。不完全なＴＫの形態を有する感染性ウイルス（ＦＬ  ＢＡＣ切除株）を再構成するために、組換えプラスミドを、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するＣＣＢ細胞に遺伝子導入した。
【図５Ａ】ＯＲＦ５７単一欠損組換え体の安全性（Ａ〜Ｄ）およびワクチン接種／攻撃感染（Ｅ〜Ｇ）試験。ＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５７  Ｄｅｌ  １  ｇａｌＫ（Ａ）株およびＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５７  Ｄｅｌ  ２  ｇａｌＫ（Ｂ）株を、実施例（安全性試験）に記載した通りマゴイ（７月齢、平均体重３．７４ｇ、ｎ＝２０）に対し試験した。ＦＬ  ＢＡＣ切除株（Ｃ）およびモック感染（Ｄ）は、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。生き残ったコイの割合を、第０日を基準として感染後の日数に従って表す。ＯＲＦ５７単一欠損組換え体による感染後第６週に（ＥおよびＦ）、魚を実施例（ワクチン接種／攻撃感染）に記載の通り攻撃感染した。モック感染した魚は、対照（Ｇ）として使用した。生き残ったコイの割合を、第４２日を基準として感染後の日数に従って表した。
【図５Ｂ】ＯＲＦ５７単一欠損組換え体の安全性（Ａ〜Ｄ）およびワクチン接種／攻撃感染（Ｅ〜Ｇ）試験。ＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５７  Ｄｅｌ  １  ｇａｌＫ（Ａ）株およびＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５７  Ｄｅｌ  ２  ｇａｌＫ（Ｂ）株を、実施例（安全性試験）に記載した通りマゴイ（７月齢、平均体重３．７４ｇ、ｎ＝２０）に対し試験した。ＦＬ  ＢＡＣ切除株（Ｃ）およびモック感染（Ｄ）は、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。生き残ったコイの割合を、第０日を基準として感染後の日数に従って表す。ＯＲＦ５７単一欠損組換え体による感染後第６週に（ＥおよびＦ）、魚を実施例（ワクチン接種／攻撃感染）に記載の通り攻撃感染した。モック感染した魚は、対照（Ｇ）として使用した。生き残ったコイの割合を、第４２日を基準として感染後の日数に従って表した。
【図５Ｃ】ＯＲＦ５７単一欠損組換え体の安全性（Ａ〜Ｄ）およびワクチン接種／攻撃感染（Ｅ〜Ｇ）試験。ＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５７  Ｄｅｌ  １  ｇａｌＫ（Ａ）株およびＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５７  Ｄｅｌ  ２  ｇａｌＫ（Ｂ）株を、実施例（安全性試験）に記載した通りマゴイ（７月齢、平均体重３．７４ｇ、ｎ＝２０）に対し試験した。ＦＬ  ＢＡＣ切除株（Ｃ）およびモック感染（Ｄ）は、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。生き残ったコイの割合を、第０日を基準として感染後の日数に従って表す。ＯＲＦ５７単一欠損組換え体による感染後第６週に（ＥおよびＦ）、魚を実施例（ワクチン接種／攻撃感染）に記載の通り攻撃感染した。モック感染した魚は、対照（Ｇ）として使用した。生き残ったコイの割合を、第４２日を基準として感染後の日数に従って表した。
【図５Ｄ】ＯＲＦ５７単一欠損組換え体の安全性（Ａ〜Ｄ）およびワクチン接種／攻撃感染（Ｅ〜Ｇ）試験。ＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５７  Ｄｅｌ  １  ｇａｌＫ（Ａ）株およびＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５７  Ｄｅｌ  ２  ｇａｌＫ（Ｂ）株を、実施例（安全性試験）に記載した通りマゴイ（７月齢、平均体重３．７４ｇ、ｎ＝２０）に対し試験した。ＦＬ  ＢＡＣ切除株（Ｃ）およびモック感染（Ｄ）は、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。生き残ったコイの割合を、第０日を基準として感染後の日数に従って表す。ＯＲＦ５７単一欠損組換え体による感染後第６週に（ＥおよびＦ）、魚を実施例（ワクチン接種／攻撃感染）に記載の通り攻撃感染した。モック感染した魚は、対照（Ｇ）として使用した。生き残ったコイの割合を、第４２日を基準として感染後の日数に従って表した。
【図５Ｅ】ＯＲＦ５７単一欠損組換え体の安全性（Ａ〜Ｄ）およびワクチン接種／攻撃感染（Ｅ〜Ｇ）試験。ＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５７  Ｄｅｌ  １  ｇａｌＫ（Ａ）株およびＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５７  Ｄｅｌ  ２  ｇａｌＫ（Ｂ）株を、実施例（安全性試験）に記載した通りマゴイ（７月齢、平均体重３．７４ｇ、ｎ＝２０）に対し試験した。ＦＬ  ＢＡＣ切除株（Ｃ）およびモック感染（Ｄ）は、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。生き残ったコイの割合を、第０日を基準として感染後の日数に従って表す。ＯＲＦ５７単一欠損組換え体による感染後第６週に（ＥおよびＦ）、魚を実施例（ワクチン接種／攻撃感染）に記載の通り攻撃感染した。モック感染した魚は、対照（Ｇ）として使用した。生き残ったコイの割合を、第４２日を基準として感染後の日数に従って表した。
【図５Ｆ】ＯＲＦ５７単一欠損組換え体の安全性（Ａ〜Ｄ）およびワクチン接種／攻撃感染（Ｅ〜Ｇ）試験。ＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５７  Ｄｅｌ  １  ｇａｌＫ（Ａ）株およびＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５７  Ｄｅｌ  ２  ｇａｌＫ（Ｂ）株を、実施例（安全性試験）に記載した通りマゴイ（７月齢、平均体重３．７４ｇ、ｎ＝２０）に対し試験した。ＦＬ  ＢＡＣ切除株（Ｃ）およびモック感染（Ｄ）は、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。生き残ったコイの割合を、第０日を基準として感染後の日数に従って表す。ＯＲＦ５７単一欠損組換え体による感染後第６週に（ＥおよびＦ）、魚を実施例（ワクチン接種／攻撃感染）に記載の通り攻撃感染した。モック感染した魚は、対照（Ｇ）として使用した。生き残ったコイの割合を、第４２日を基準として感染後の日数に従って表した。
【図５Ｇ】ＯＲＦ５７単一欠損組換え体の安全性（Ａ〜Ｄ）およびワクチン接種／攻撃感染（Ｅ〜Ｇ）試験。ＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５７  Ｄｅｌ  １  ｇａｌＫ（Ａ）株およびＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５７  Ｄｅｌ  ２  ｇａｌＫ（Ｂ）株を、実施例（安全性試験）に記載した通りマゴイ（７月齢、平均体重３．７４ｇ、ｎ＝２０）に対し試験した。ＦＬ  ＢＡＣ切除株（Ｃ）およびモック感染（Ｄ）は、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。生き残ったコイの割合を、第０日を基準として感染後の日数に従って表す。ＯＲＦ５７単一欠損組換え体による感染後第６週に（ＥおよびＦ）、魚を実施例（ワクチン接種／攻撃感染）に記載の通り攻撃感染した。モック感染した魚は、対照（Ｇ）として使用した。生き残ったコイの割合を、第４２日を基準として感染後の日数に従って表した。
【図６Ａ】ＯＲＦ５６単一欠損組換え体の安全性。
【０１００】
ＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５６  Ｄｅｌ  １  ｇａｌＫ（Ａ）株およびＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５６  Ｄｅｌ  ２  ｇａｌＫ（Ｂ）株を、実施例（安全性試験）に記載した通りマゴイ（７月齢、平均体重３．７４ｇ、ｎ＝２０）に対し試験した。ＦＬ  ＢＡＣ切除株（Ｃ）およびモック感染（Ｄ）は、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。生き残ったコイの割合を、第０日を基準として感染後の日数に従って表す。
【図６Ｂ】ＯＲＦ５６単一欠損組換え体の安全性。
【０１０１】
ＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５６  Ｄｅｌ  １  ｇａｌＫ（Ａ）株およびＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５６  Ｄｅｌ  ２  ｇａｌＫ（Ｂ）株を、実施例（安全性試験）に記載した通りマゴイ（７月齢、平均体重３．７４ｇ、ｎ＝２０）に対し試験した。ＦＬ  ＢＡＣ切除株（Ｃ）およびモック感染（Ｄ）は、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。生き残ったコイの割合を、第０日を基準として感染後の日数に従って表す。
【図６Ｃ】ＯＲＦ５６単一欠損組換え体の安全性。
【０１０２】
ＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５６  Ｄｅｌ  １  ｇａｌＫ（Ａ）株およびＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５６  Ｄｅｌ  ２  ｇａｌＫ（Ｂ）株を、実施例（安全性試験）に記載した通りマゴイ（７月齢、平均体重３．７４ｇ、ｎ＝２０）に対し試験した。ＦＬ  ＢＡＣ切除株（Ｃ）およびモック感染（Ｄ）は、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。生き残ったコイの割合を、第０日を基準として感染後の日数に従って表す。
【図６Ｄ】ＯＲＦ５６単一欠損組換え体の安全性。
【０１０３】
ＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５６  Ｄｅｌ  １  ｇａｌＫ（Ａ）株およびＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５６  Ｄｅｌ  ２  ｇａｌＫ（Ｂ）株を、実施例（安全性試験）に記載した通りマゴイ（７月齢、平均体重３．７４ｇ、ｎ＝２０）に対し試験した。ＦＬ  ＢＡＣ切除株（Ｃ）およびモック感染（Ｄ）は、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。生き残ったコイの割合を、第０日を基準として感染後の日数に従って表す。
【図７Ａ】ＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株の安全性（Ａ〜Ｃ）およびワクチン接種／攻撃感染（Ｄ〜Ｇ）試験。ＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株（Ｂ）の安全性を、実施例（安全性試験）に記載した通りマゴイ（７月齢、平均体重４．４１ｇ、ｎ＝３０）に対し実施した。ＦＬ  ＢＡＣ切除株（Ａ）およびモック感染（Ｃ）は、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。モック感染は、二重の群に対し実施した。生き残ったコイの割合は、第０日を基準として感染後の日数に従って表す。
【０１０４】
ワクチン接種／攻撃感染（Ｄ〜Ｇ）試験。ＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株によりワクチン接種した魚（ｎ＝１５）を、実施例（ワクチン接種／攻撃感染）に記載した通りワクチン接種後第３週（Ｄ）または第６週（Ｆ）にＫＨＶ  ＦＬ株により攻撃感染した。モック感染魚の二重の群を対照（ＥおよびＧ）として使用した。生き残ったコイの割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
【図７Ｂ】ＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株の安全性（Ａ〜Ｃ）およびワクチン接種／攻撃感染（Ｄ〜Ｇ）試験。ＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株（Ｂ）の安全性を、実施例（安全性試験）に記載した通りマゴイ（７月齢、平均体重４．４１ｇ、ｎ＝３０）に対し実施した。ＦＬ  ＢＡＣ切除株（Ａ）およびモック感染（Ｃ）は、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。モック感染は、二重の群に対し実施した。生き残ったコイの割合は、第０日を基準として感染後の日数に従って表す。
【０１０５】
ワクチン接種／攻撃感染（Ｄ〜Ｇ）試験。ＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株によりワクチン接種した魚（ｎ＝１５）を、実施例（ワクチン接種／攻撃感染）に記載した通りワクチン接種後第３週（Ｄ）または第６週（Ｆ）にＫＨＶ  ＦＬ株により攻撃感染した。モック感染魚の二重の群を対照（ＥおよびＧ）として使用した。生き残ったコイの割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
【図７Ｃ】ＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株の安全性（Ａ〜Ｃ）およびワクチン接種／攻撃感染（Ｄ〜Ｇ）試験。ＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株（Ｂ）の安全性を、実施例（安全性試験）に記載した通りマゴイ（７月齢、平均体重４．４１ｇ、ｎ＝３０）に対し実施した。ＦＬ  ＢＡＣ切除株（Ａ）およびモック感染（Ｃ）は、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。モック感染は、二重の群に対し実施した。生き残ったコイの割合は、第０日を基準として感染後の日数に従って表す。
【０１０６】
ワクチン接種／攻撃感染（Ｄ〜Ｇ）試験。ＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株によりワクチン接種した魚（ｎ＝１５）を、実施例（ワクチン接種／攻撃感染）に記載した通りワクチン接種後第３週（Ｄ）または第６週（Ｆ）にＫＨＶ  ＦＬ株により攻撃感染した。モック感染魚の二重の群を対照（ＥおよびＧ）として使用した。生き残ったコイの割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
【図７Ｄ】ＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株の安全性（Ａ〜Ｃ）およびワクチン接種／攻撃感染（Ｄ〜Ｇ）試験。ＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株（Ｂ）の安全性を、実施例（安全性試験）に記載した通りマゴイ（７月齢、平均体重４．４１ｇ、ｎ＝３０）に対し実施した。ＦＬ  ＢＡＣ切除株（Ａ）およびモック感染（Ｃ）は、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。モック感染は、二重の群に対し実施した。生き残ったコイの割合は、第０日を基準として感染後の日数に従って表す。
【０１０７】
ワクチン接種／攻撃感染（Ｄ〜Ｇ）試験。ＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株によりワクチン接種した魚（ｎ＝１５）を、実施例（ワクチン接種／攻撃感染）に記載した通りワクチン接種後第３週（Ｄ）または第６週（Ｆ）にＫＨＶ  ＦＬ株により攻撃感染した。モック感染魚の二重の群を対照（ＥおよびＧ）として使用した。生き残ったコイの割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
【図７Ｅ】ＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株の安全性（Ａ〜Ｃ）およびワクチン接種／攻撃感染（Ｄ〜Ｇ）試験。ＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株（Ｂ）の安全性を、実施例（安全性試験）に記載した通りマゴイ（７月齢、平均体重４．４１ｇ、ｎ＝３０）に対し実施した。ＦＬ  ＢＡＣ切除株（Ａ）およびモック感染（Ｃ）は、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。モック感染は、二重の群に対し実施した。生き残ったコイの割合は、第０日を基準として感染後の日数に従って表す。
【０１０８】
ワクチン接種／攻撃感染（Ｄ〜Ｇ）試験。ＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株によりワクチン接種した魚（ｎ＝１５）を、実施例（ワクチン接種／攻撃感染）に記載した通りワクチン接種後第３週（Ｄ）または第６週（Ｆ）にＫＨＶ  ＦＬ株により攻撃感染した。モック感染魚の二重の群を対照（ＥおよびＧ）として使用した。生き残ったコイの割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
【図７Ｆ】ＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株の安全性（Ａ〜Ｃ）およびワクチン接種／攻撃感染（Ｄ〜Ｇ）試験。ＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株（Ｂ）の安全性を、実施例（安全性試験）に記載した通りマゴイ（７月齢、平均体重４．４１ｇ、ｎ＝３０）に対し実施した。ＦＬ  ＢＡＣ切除株（Ａ）およびモック感染（Ｃ）は、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。モック感染は、二重の群に対し実施した。生き残ったコイの割合は、第０日を基準として感染後の日数に従って表す。
【０１０９】
ワクチン接種／攻撃感染（Ｄ〜Ｇ）試験。ＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株によりワクチン接種した魚（ｎ＝１５）を、実施例（ワクチン接種／攻撃感染）に記載した通りワクチン接種後第３週（Ｄ）または第６週（Ｆ）にＫＨＶ  ＦＬ株により攻撃感染した。モック感染魚の二重の群を対照（ＥおよびＧ）として使用した。生き残ったコイの割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
【図７Ｇ】ＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株の安全性（Ａ〜Ｃ）およびワクチン接種／攻撃感染（Ｄ〜Ｇ）試験。ＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株（Ｂ）の安全性を、実施例（安全性試験）に記載した通りマゴイ（７月齢、平均体重４．４１ｇ、ｎ＝３０）に対し実施した。ＦＬ  ＢＡＣ切除株（Ａ）およびモック感染（Ｃ）は、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。モック感染は、二重の群に対し実施した。生き残ったコイの割合は、第０日を基準として感染後の日数に従って表す。
【０１１０】
ワクチン接種／攻撃感染（Ｄ〜Ｇ）試験。ＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株によりワクチン接種した魚（ｎ＝１５）を、実施例（ワクチン接種／攻撃感染）に記載した通りワクチン接種後第３週（Ｄ）または第６週（Ｆ）にＫＨＶ  ＦＬ株により攻撃感染した。モック感染魚の二重の群を対照（ＥおよびＧ）として使用した。生き残ったコイの割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
【図８Ａ】ＦＬ  ＢＡＣ復帰変異ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株の安全性（Ａ〜Ｃ）およびワクチン接種／攻撃感染（Ｄ〜Ｇ）試験。ＦＬ  ＢＡＣ復帰変異ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株（Ｂ）の安全性を、実施例（安全性試験）に記載した通りマゴイ（７月齢、平均体重３．７４ｇ、ｎ＝３０）に対し試験した。ＦＬ  ＢＡＣ復帰変異株（Ａ）およびモック感染（Ｃ）を、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。モック感染は二重の群に対し実施した。生き残ったコイの割合は、第０日を基準として感染後の日数に従って表す。
【０１１１】
ワクチン接種／攻撃感染（Ｄ〜Ｇ）試験。ＦＬ  ＢＡＣ復帰変異ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株によりワクチン接種した魚（ｎ＝１５）を、実施例（ワクチン接種／攻撃感染）に記載した通りワクチン接種後第３週（Ｄ）または第６週（Ｆ）にＫＨＶ  ＦＬ株により攻撃感染した。モック感染魚の二重の群を対照（ＥおよびＧ）として使用した。生き残ったコイの割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
【図８Ｂ】ＦＬ  ＢＡＣ復帰変異ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株の安全性（Ａ〜Ｃ）およびワクチン接種／攻撃感染（Ｄ〜Ｇ）試験。ＦＬ  ＢＡＣ復帰変異ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株（Ｂ）の安全性を、実施例（安全性試験）に記載した通りマゴイ（７月齢、平均体重３．７４ｇ、ｎ＝３０）に対し試験した。ＦＬ  ＢＡＣ復帰変異株（Ａ）およびモック感染（Ｃ）を、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。モック感染は二重の群に対し実施した。生き残ったコイの割合は、第０日を基準として感染後の日数に従って表す。
【０１１２】
ワクチン接種／攻撃感染（Ｄ〜Ｇ）試験。ＦＬ  ＢＡＣ復帰変異ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株によりワクチン接種した魚（ｎ＝１５）を、実施例（ワクチン接種／攻撃感染）に記載した通りワクチン接種後第３週（Ｄ）または第６週（Ｆ）にＫＨＶ  ＦＬ株により攻撃感染した。モック感染魚の二重の群を対照（ＥおよびＧ）として使用した。生き残ったコイの割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
【図８Ｃ】ＦＬ  ＢＡＣ復帰変異ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株の安全性（Ａ〜Ｃ）およびワクチン接種／攻撃感染（Ｄ〜Ｇ）試験。ＦＬ  ＢＡＣ復帰変異ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株（Ｂ）の安全性を、実施例（安全性試験）に記載した通りマゴイ（７月齢、平均体重３．７４ｇ、ｎ＝３０）に対し試験した。ＦＬ  ＢＡＣ復帰変異株（Ａ）およびモック感染（Ｃ）を、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。モック感染は二重の群に対し実施した。生き残ったコイの割合は、第０日を基準として感染後の日数に従って表す。
【０１１３】
ワクチン接種／攻撃感染（Ｄ〜Ｇ）試験。ＦＬ  ＢＡＣ復帰変異ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株によりワクチン接種した魚（ｎ＝１５）を、実施例（ワクチン接種／攻撃感染）に記載した通りワクチン接種後第３週（Ｄ）または第６週（Ｆ）にＫＨＶ  ＦＬ株により攻撃感染した。モック感染魚の二重の群を対照（ＥおよびＧ）として使用した。生き残ったコイの割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
【図８Ｄ】ＦＬ  ＢＡＣ復帰変異ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株の安全性（Ａ〜Ｃ）およびワクチン接種／攻撃感染（Ｄ〜Ｇ）試験。ＦＬ  ＢＡＣ復帰変異ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株（Ｂ）の安全性を、実施例（安全性試験）に記載した通りマゴイ（７月齢、平均体重３．７４ｇ、ｎ＝３０）に対し試験した。ＦＬ  ＢＡＣ復帰変異株（Ａ）およびモック感染（Ｃ）を、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。モック感染は二重の群に対し実施した。生き残ったコイの割合は、第０日を基準として感染後の日数に従って表す。
【０１１４】
ワクチン接種／攻撃感染（Ｄ〜Ｇ）試験。ＦＬ  ＢＡＣ復帰変異ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株によりワクチン接種した魚（ｎ＝１５）を、実施例（ワクチン接種／攻撃感染）に記載した通りワクチン接種後第３週（Ｄ）または第６週（Ｆ）にＫＨＶ  ＦＬ株により攻撃感染した。モック感染魚の二重の群を対照（ＥおよびＧ）として使用した。生き残ったコイの割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
【図８Ｅ】ＦＬ  ＢＡＣ復帰変異ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株の安全性（Ａ〜Ｃ）およびワクチン接種／攻撃感染（Ｄ〜Ｇ）試験。ＦＬ  ＢＡＣ復帰変異ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株（Ｂ）の安全性を、実施例（安全性試験）に記載した通りマゴイ（７月齢、平均体重３．７４ｇ、ｎ＝３０）に対し試験した。ＦＬ  ＢＡＣ復帰変異株（Ａ）およびモック感染（Ｃ）を、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。モック感染は二重の群に対し実施した。生き残ったコイの割合は、第０日を基準として感染後の日数に従って表す。
【０１１５】
ワクチン接種／攻撃感染（Ｄ〜Ｇ）試験。ＦＬ  ＢＡＣ復帰変異ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株によりワクチン接種した魚（ｎ＝１５）を、実施例（ワクチン接種／攻撃感染）に記載した通りワクチン接種後第３週（Ｄ）または第６週（Ｆ）にＫＨＶ  ＦＬ株により攻撃感染した。モック感染魚の二重の群を対照（ＥおよびＧ）として使用した。生き残ったコイの割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
【図８Ｆ】ＦＬ  ＢＡＣ復帰変異ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株の安全性（Ａ〜Ｃ）およびワクチン接種／攻撃感染（Ｄ〜Ｇ）試験。ＦＬ  ＢＡＣ復帰変異ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株（Ｂ）の安全性を、実施例（安全性試験）に記載した通りマゴイ（７月齢、平均体重３．７４ｇ、ｎ＝３０）に対し試験した。ＦＬ  ＢＡＣ復帰変異株（Ａ）およびモック感染（Ｃ）を、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。モック感染は二重の群に対し実施した。生き残ったコイの割合は、第０日を基準として感染後の日数に従って表す。
【０１１６】
ワクチン接種／攻撃感染（Ｄ〜Ｇ）試験。ＦＬ  ＢＡＣ復帰変異ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株によりワクチン接種した魚（ｎ＝１５）を、実施例（ワクチン接種／攻撃感染）に記載した通りワクチン接種後第３週（Ｄ）または第６週（Ｆ）にＫＨＶ  ＦＬ株により攻撃感染した。モック感染魚の二重の群を対照（ＥおよびＧ）として使用した。生き残ったコイの割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
【図８Ｇ】ＦＬ  ＢＡＣ復帰変異ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株の安全性（Ａ〜Ｃ）およびワクチン接種／攻撃感染（Ｄ〜Ｇ）試験。ＦＬ  ＢＡＣ復帰変異ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株（Ｂ）の安全性を、実施例（安全性試験）に記載した通りマゴイ（７月齢、平均体重３．７４ｇ、ｎ＝３０）に対し試験した。ＦＬ  ＢＡＣ復帰変異株（Ａ）およびモック感染（Ｃ）を、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。モック感染は二重の群に対し実施した。生き残ったコイの割合は、第０日を基準として感染後の日数に従って表す。
【０１１７】
ワクチン接種／攻撃感染（Ｄ〜Ｇ）試験。ＦＬ  ＢＡＣ復帰変異ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ株によりワクチン接種した魚（ｎ＝１５）を、実施例（ワクチン接種／攻撃感染）に記載した通りワクチン接種後第３週（Ｄ）または第６週（Ｆ）にＫＨＶ  ＦＬ株により攻撃感染した。モック感染魚の二重の群を対照（ＥおよびＧ）として使用した。生き残ったコイの割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
【発明を実施するための形態】
【０１１８】
［実施例］
ａ）細胞およびウイルス
コイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ）脳細胞（ＣＣＢ）（Ｎｅｕｋｉｒｃｈ  ら、１９９９）を、グルコース（Ｄ‐グルコース一水和、Ｍｅｒｃｋ）４．５ｇ／ｌおよび１０％ウシ胎児血清を含有する最小必須培地（ＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。細胞は５％ＣＯ２を含有する多湿雰囲気中２５℃で培養した。ＣｙＨＶ‐３  ＦＬ株は、ＫＨＶで死亡した魚の腎臓から単離された（ＣＥＲ  Ｍａｒｌｏｉｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）。
【０１１９】
ｂ）ＣｙＨＶ‐３  ＢＡＣプラスミド
ＣｙＨＶ‐３組換え体を作製するために親プラスミドとしてＣｙＨＶ‐３  ＦＬ  ＢＡＣプラスミドを使用した。このプラスミドは、Ｃｏｓｔｅｓら（２００８）および国際特許出願ＷＯ  ２００９／０２７４１２において広範に記載されている。ＣｙＨＶ‐３  ＦＬ  ＢＡＣプラスミドは、ＣｙＨＶ‐３  ＦＬ株ゲノムの感染性細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンである。このプラスミドにおいて、ｌｏｘＰ‐隣接ＢＡＣカセットがＣｙＨＶ‐３  ＴＫ遺伝子座（ＯＲＦ５５）に挿入される。
【０１２０】
ｃ）細菌におけるｇａｌＫポジティブ選択を使用するＯＲＦ５７  ＣｙＨＶ‐３  ＦＬ  ＢＡＣ組換えプラスミドの作製
ＯＲＦ５７遺伝子座（図１のＯＲＦ５７  Ｄｅｌ  １およびＯＲＦ５７  Ｄｅｌ  ２を参照されたい）に欠失を有する二つのＣｙＨＶ‐３  ＦＬ  ＢＡＣ組換えプラスミドを、以前に記載された通り（Ｗａｒｍｉｎｇら、２００５）細菌においてｇａｌＫポジティブ選択を使用して作製した（図２）。組換え断片は、欠失される配列に隣接するＣｙＨＶ‐３ゲノム領域と相同な５０ｂｐの隣接配列を有するガラクトキナーゼ（ｇａｌＫ）遺伝子（１２３１ｂｐ）から構成されていた（図１）。
【０１２１】
これらの断片は、ｐｇａｌＫベクターを鋳型として使用してＰＣＲによって作製した。増幅のために次のプライマーを使用した（プライマー配列に対しては表１を参照されたい）：ＯＲＦ５７  Ｄｅｌ  １欠損の作製用：ＯＲＦ５７  Ｄｅｌ  １‐ｇａｌＫアンプリコンをもたらす、プライマーＯＲＦ５７  Ｄｅｌ１  ｆｗおよびＯＲＦ５７  Ｄｅｌ１  ｒｅｖ；ＯＲＦ５７  Ｄｅｌ  ２欠損の作製用：ＯＲＦ５７  Ｄｅｌ  ２‐ｇａｌＫアンプリコンをもたらすプライマーＯＲＦ５７  Ｄｅｌ２  ｆｗおよびＯＲＦ５７  Ｄｅｌ２  ｒｅｖ。増幅産物は精製した（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）。次にＣｙＨＶ‐３  ＦＬ  ＢＡＣプラスミドを含有するエレクトロコンピテントＳＷ１０２セルを上記ＰＣＲ産物５０ｎｇにより電気穿孔した。相同組換えが起きた細菌を選択するために、電気穿孔した細胞を２０％ガラクトースおよびクロラムフェニコール（１７μｇ／ｍｌ）を添加した固形Ｍ６３最小培地に播種した。最後に、得られたコロニーを、ｇａｌＫ陽性クローンの作製を確認するために他に記載した通りマッコンキー指標寒天培地に画線した。組換えＢＡＣ分子は、増幅し精製し（ＱＩＡＧＥＮ  Ｌａｒｇｅ‐Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ  Ｋｉｔ）、その分子構造は制限酵素‐サザンブロットの複合法、ＰＣＲおよび配列決定を使用して管理した。
【表１】
0005982009.tif 000002
【０１２２】
ｄ）ＯＲＦ  ５７  ＣｙＨＶ‐３  ＦＬ  ＢＡＣ組換えプラスミドからの感染性ウイルスの再構成
ＣｙＨＶ‐３  ＢＡＣプラスミドを許容ＣＣＢに遺伝子導入した（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。野生型ＴＫ遺伝子座を有する菌株に由来するＢＡＣプラスミドを作製するために、ＣｙＨＶ‐３  ＢＡＣプラスミドをｐＧＥＭＴ‐ＴＫベクターと共にＣＣＢ細胞に同時遺伝子導入した（分子比１：７５）。遺伝子導入後第７日に、ＥＧＦＰ発現（ＢＡＣカセットはＥＧＦＰ発現カセットをコードする）陰性のウイルスプラークを釣菌し、３回連続のプラーク精製によって濃縮した。同様に、ウイルスゲノムからＢＡＣカセットを切除したビリオンを再構成するために、ＢＡＣプラスミドを、核局在シグナルに融合したＣｒｅリコンビナーゼをコードするｐＥＦＩＮ３‐ＮＬＳ‐Ｃｒｅベクターと一緒にＣＣＢ細胞に同時遺伝子導入した（Ｃｏｓｔｅｓら；２００８  ＪＶＩ）（分子比：１：７０）。
【０１２３】
ｅ）細菌におけるｇａｌＫポジティブ選択を使用するＯＲＦ  ５６  ＣｙＨＶ‐３  ＦＬ  ＢＡＣ組換えプラスミドの作製
以前に記載された通り（Ｗａｒｍｉｎｇら、２００５）（図３）、細菌におけるｇａｌＫポジティブ選択を使用して、ＯＲＦ５６遺伝子座に欠失を有する二つのＣｙＨＶ‐３  ＦＬ  ＢＡＣ組換えプラスミド（図１のＯＲＦ５６  Ｄｅｌ  １およびＯＲＦ５６Ｄｅｌ  ２を参照されたい）を作製した。組換え断片は、欠失される配列に隣接するＣｙＨＶ‐３領域に相同な５０ｂｐの隣接配列を有するガラクトキナーゼ（ｇａｌＫ）遺伝子（１２３１ｂｐ）から構成されていた（図１）。これらの断片は、ｐｇａｌＫベクターを鋳型として使用するＰＣＲによって作製した。増幅のために次のプライマーを使用した（プライマー配列に対しては表２を参照されたい）：ＯＲＦ５６Ｄｅｌ  １欠損の作製用：ＯＲＦ５６  Ｄｅ１  １‐ｇａｌＫアンプリコンをもたらすプライマーＯＲＦ５６  Ｄｅｌ１  ｆｗおよびＯＲＦ５６  Ｄｅｌ１  ｒｅｖ；ＯＲＦ５６Ｄｅｌ  ２欠損の作製用：ＯＲＦ５６    Ｄｅｌ  ２‐ｇａｌＫアンプリコンをもたらすプライマーＯＲＦ５６  Ｄｅｌ２  ｆｗおよびＯＲＦ５６  Ｄｅｌ２  ｒｅｖ。増幅産物は精製した（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）。次にＣｙＨＶ‐３  ＦＬ  ＢＡＣプラスミドを含有するエレクトロコンピテントＳＷ１０２セルを、上記ＰＣＲ産物５０ｎｇにより電気穿孔した。相同組換えが起きた細菌を選択するために、電気穿孔した細胞を２０％ガラクトースおよびクロラムフェニコール（１７μｇ／ｍｌ）を添加した固形Ｍ６３最小培地に播種した。最後に、得られたコロニーを、ｇａｌＫ陽性クローンの作製を確認するために他に記載した通りマッコンキー指標寒天培地に画線した。組換えＢＡＣ分子は増幅し精製して（ＱＩＡＧＥＮ  Ｌａｒｇｅ‐Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ  Ｋｉｔ）、その分子構造は制限酵素‐サザンブロットの複合法、ＰＣＲおよび配列決定を使用して管理した。
【表２】
0005982009.tif 000003
【０１２４】
ｆ）ＯＲＦ  ５６  ＣｙＨＶ‐３  ＦＬ  ＢＡＣ組換えプラスミドからの感染性ウイルスの再構成
ＣｙＨＶ‐３  ＢＡＣプラスミドを許容ＣＣＢに遺伝子導入した（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。野生型ＴＫ遺伝子座を有する菌株由来のＢＡＣプラスミド作成するために、ＣｙＨＶ‐３  ＢＡＣプラスミドをｐＧＥＭＴ‐ＴＫベクターと一緒にＣＣＢ細胞に同時遺伝子導入した（分子比１：７５）。遺伝子導入後第７日に、ＥＧＦＰ発現（ＢＡＣカセットはＥＧＦＰ発現カセットをコードする）陰性のウイルスプラークを釣菌し、３回連続するプラーク精製によって濃縮した。同様に、ウイルスゲノムからＢＡＣカセットを切除したビリオンを再構成するために、ＢＡＣプラスミドを核局在シグナルに融合したＣｒｅリコンビナーゼをコードするｐＥＦＩＮ３‐ＮＬＳ‐Ｃｒｅベクターと一緒にＣＣＢ細胞に同時遺伝子導入した（Ｃｏｓｔｅｓら；２００８  ＪＶＩ）（分子比：１：７０）。
【０１２５】
ｇ）細菌におけるｇａｌＫポジティブおよびネガティブ選択を使用するＯＲＦ５６‐５７  ＣｙＨＶ‐３  ＦＬ  ＢＡＣ組換えプラスミドの作製
ＯＲＦ５６およびＯＲＦ５７遺伝子座に欠失を有するＣｙＨＶ‐３  ＦＬ  ＢＡＣ組換えプラスミドは（図１）、以前に記載された通り（Ｗａｒｍｉｎｇら、２００５）（図４）細菌におけるｇａｌＫポジティブおよびネガティブ選択を使用して作製した。第一の組換え過程（ｇａｌＫポジティブ選択）は、ＯＲＦ５６およびＯＲＦ５７の特定された配列をガラクトキナーゼ（ｇａｌＫ）遺伝子（１２３１ｂｐ）によって置換することであった。組換え断片は、欠失される配列に隣接するＣｙＨＶ‐３ゲノム領域に相同な５０ｂｐの隣接配列を有するｇａｌＫ遺伝子から構成されていた（図１）（ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ  ｇａｌＫ、図４）。この断片は、プライマーＯＲＦ５６‐ＯＲＦ５７  Ｄｅｌ  ｆｗおよびＯＲＦ５６‐ＯＲＦ５７  Ｄｅｌ  ｒｅｖ（表３）および鋳型としてｐｇａｌＫベクターを使用してＰＣＲによって作製した。増幅産物は精製した（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）。次にＣｙＨＶ‐３  ＦＬ  ＢＡＣプラスミドを含有するエレクトロコンピテントＳＷ１０２セルを、上記ＰＣＲ産物５０ｎｇにより電気穿孔した。相同組換えが起きた細菌を選択するために、電気穿孔した細胞を２０％ガラクトースおよびクロラムフェニコール（１７μｇ／ｍｌ）を添加した固形Ｍ６３最小培地に播種した。最後に、得られたコロニーを、ｇａｌＫ陽性クローンの作製を確認するために、他に記載した通りマッコンキー指標寒天培地に画線した。組換えＢＡＣ分子は増幅し精製して（ＱＩＡＧＥＮ  Ｌａｒｇｅ‐Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ  Ｋｉｔ）、その分子構造は制限酵素‐サザンブロットの複合法、ＰＣＲおよび配列決定を使用して管理した。第二の組換え過程（ｇａｌＫネガティブ選択）は、ＦＬ  ＢＡＣ  ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ  ｇａｌＫプラスミドからｇａｌＫカセットを除去することであった。この目的を達成するために、４９９ｂｐの合成ＤＮＡ断片（ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ  カセット、下記を参照されたい）を使用した。それは、欠失される配列に隣接するＣｙＨＶ‐３ゲノム領域に相同な配列：ｇａｌＫ遺伝子の上流の２５０ｂｐ（Ｇｅｎｂａｎｋ受付番号ＮＣ＿００９１２７の座標９６７５１位から９７００位）およびｇａｌＫ遺伝子の下流の２４９ｂｐ（Ｇｅｎｂａｎｋ受付番号ＮＣ＿００９１２７の９９７６０位の塩基が欠失した座標９９７５１位から１００００００位）から構成される。ＦＬ  ＢＡＣ  ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌ  ｇａｌＫプラスミドを含有するエレクトロコンピテントＳＷ１０２セルを上記ＰＣＲ産物５０ｎｇにより電気穿孔した。相同組換えが起きた細菌を選択するために、電気穿孔した細胞を２‐デオキシガラクトースを添加した固形最小培地に播種した（ｇａｌＫによる２‐デオキシガラクトースの消化により毒性物質が生じる）。組換えＢＡＣ分子は増幅し精製して（ＱＩＡＧＥＮ  Ｌａｒｇｅ‐Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ  Ｋｉｔ）、その分子構造は制限酵素‐サザンブロットの複合法、ＰＣＲおよび配列決定を使用して管理した。
【０１２６】
ＯＲＦ５６‐５７  Ｄｅｌカセット：
５‘‐
ｔｔｔｇｔｃａａｃｃａｇｔｃｃｔｃｃａｇｇｇｔｃｇｇｔｔｔｇｇｃｇｃｔｇｇｃｃｔｃｃｔｔｇｃｃｃｔｔｇｇｔｃａｃｇｇｃｇａｔｇｇｃａｇａｃｇｃｃａｃａａｔｃｃｔｃｇｃｇａｃｇｇｇｔｔｃｃｇｔｃａｇａｇｃａｇａｇｔｔｃｔｔａａａｃａｔｔｔｃｇａｃｇｃｃｔｃｃｔｃｃｇａｃｇｇｔｇａａｃｃａｃｔｃｔｇａｃｃａａｔｔｃａｇｇｔｃｇｇａｇｇｇｃｃａｃｇｔｃｔｇｃｃｔｇｔｇｃａｔｃａｔｃｇｔｃｔｇｃａｃａｇｃｇｔｃｃｃｔｃｇａｃａｇｃｃｃｃａｇｃｃｃｇｃａｃａｇｃａｇｔｃｇｃｃａｃｔｃｔｔｃｃｃｔｇｔｔｇａｇｔｇｃａｃｇａｃｔｃｇｔｃａａｇａｔｃａａｇｃｔｇｃｔｔｇａｇｃｇｃｇｔｃｇｔｇｔａｃｇｇｇｔｔｃａｔｇａｔｇｇｃｃｃｔｇｃａｇａａｇｇｃｇｃｔｇｃｇｃａｔｔｃａｇａａｇｃａｇｇｇｃｔｇｃａｇｇａｔｇｇｔｇｇｇｇｃｔｃｇａｇｇａｃｃｃｇｇａｇａａｇｇｔｇｇａｇｇａｔａｔｇａａｇａａｃｔｔｔｇｔｇｃｔｇｃａｃａａｇｇｇｃｔｔｃａａｃｃａｃｃａｃｔａｃｇｃｃｔｔｃｔｇｃｇａｔｃａｃｃａｃｔｇｇｃａｇｃａｃｔｇｇｇｃｃｃｔｇｇｇｃｃｇｃｔｃｃｔｔｃｇａｇｇｇｃｇａｇｃｔｇｃｃｃｇａｃｇｔｇｇｔｇｇ‐３‘
【表３】
0005982009.tif 000004
【０１２７】
ｈ）ＯＲＦ５６‐５７  ＣｙＨＶ‐３  ＦＬ  ＢＡＣ組換えプラスミドからの感染性ウイルスの再構成
ＣｙＨＶ‐３  ＢＡＣプラスミドを許容ＣＣＢに遺伝子導入した（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。野生型ＴＫ遺伝子座を有する菌株に由来するＢＡＣプラスミドを作製するために、ＣｙＨＶ‐３  ＢＡＣプラスミドをｐＧＥＭＴ‐ＴＫベクターと一緒にＣＣＢ細胞に同時遺伝子導入した（分子比１：７５）。遺伝子導入後第７日に、ＥＧＦＰ発現（ＢＡＣカセットはＥＧＦＰ発現カセットをコードする）陰性のウイルスプラークを釣菌し、３回連続のプラーク精製によって濃縮した。同様に、ウイルスゲノムからＢＡＣカセットを切除したビリオンを再構成するために、ＢＡＣプラスミドを核局在シグナルと融合したＣｒｅリコンビナーゼをコードするｐＥＦＩＮ３‐ＮＬＳ‐Ｃｒｅベクターと一緒にＣＣＢ細胞に同時遺伝子導入した（Ｃｏｓｔｅｓら；２００８  ＪＶＩ）（分子比：１：７０）。
【０１２８】
ｉ）安全性試験
マゴイを、６０リットルの水槽中、２４℃で１０日間順化させた。コイ（リットル当たりコイ５０ｇの生物体量）を、試験するＫＨＶ株の４、４０または４００ＰＦＵ／ｍｌを含有する水に２時間浸漬した。対照群（モック感染）は、等量の培地を添加した水に浸漬した。インキュベーション期間の終わりに、魚を大きな水槽に戻した。ウイルス接種菌液は、投与量が群間で同等であることを保証するために、接種前に滴定し接種後に逆滴定した。ＫＨＶ疾患の臨床症状について、魚を毎日検査し死亡した魚は除去した。
【０１２９】
ｊ）ワクチン接種／攻撃感染
マゴイを、６０リットルの水槽中、２４℃で１０日間順化させた。ワクチン接種のためにコイ（リットル当たり魚５０ｇの生物体量）を、試験するＫＨＶ株の４、４０または４００ＰＦＵ／ｍｌを含有する水に２時間浸漬した。インキュベーション期間の終わりに、魚を大きな水槽に戻した。ワクチン接種後の第３週または第６週に、ワクチン接種した魚の入った水槽に放流する直前に感染させた無感作の魚と共棲させることによって、これらの魚を病原性ＫＨＶにより攻撃感染した。追加された魚は、病原性の親ＦＬ株の３００ＰＦＵ／ｍｌを含有する水中に２時間浸漬して接種された。二匹の感染魚を、ワクチン接種した魚を含有する各水槽に添加した。
【０１３０】
ｋ）安全性および攻撃感染の結果
ＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５７  Ｄｅｌ  １  ｇａｌＫ（図５Ａ）およびＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５７  Ｄｅｌ  ２  ｇａｌＫ（図５Ｂ）株の安全性を、実施例（安全性試験）に記載した通りマゴイ（７月齢、平均体重３．７４ｇ、ｎ＝２０）に対し試験した。ＦＬ  ＢＡＣ切除株（図５Ｃ）およびモック感染（図５Ｄ）は、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。生き残ったコイの割合を、第０日を基準として感染後の日数に従って表す。ＯＲＦ５７単一欠損組換え体（図５ＥおよびＦ）による感染後第６週に、魚を実施例（ワクチン接種／攻撃感染）に記載した通り攻撃感染した。モック感染した魚は、対照（図５Ｇ）として使用した。生き残ったコイの割合は、第４２日を基準として感染後の日数に従って表した。
【０１３１】
図５ＡおよびＢから本発明のＯＲＦ５７欠損変異株は、小さい魚に使用されたときでさえ安全であることが明らかである。
【０１３２】
また図５ＥおよびＦから、本発明のＫＨＶ  ＯＲＦ５７欠損変異株は、特に４０ｐｆｕ／ｍｌ以上の用量で投与されたときに、効果的なワクチンとして非常に適していることも明らかとなる。
【０１３３】
ＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５６  Ｄｅｌ  １  ｇａｌＫ（図６Ａ）およびＦＬ  ＢＡＣ切除ＯＲＦ５６  Ｄｅｌ  ２  ｇａｌＫ（図６Ｂ）株の安全性を、実施例（安全性試験）に記載した通りマゴイ（７月齢、平均体重３．７４ｇ、ｎ＝２０）に対し試験した。ＦＬ  ＢＡＣ切除株（図６Ｃ）およびモック感染（図６Ｄ）を、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。生き残ったコイの割合を、第０日を基準として感染後の日数に従って表す。図６ＡおよびＢから明らかな通り、ＯＲＦ５６欠損変異株は、対照の野生型ウイルスにほぼ匹敵する病原性を示す（パネルＡおよびＢをパネルＣと比較されたい）。
【０１３４】
図７および８から分かる通り、ＯＲＦ５７およびＯＲＦ５６の双方に欠失を保有するＫＨＶは、単一のＯＲＦ５７欠失を保有するＫＨＶのそれと匹敵する安全性および効力特性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【配列表】
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