(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記Ａ．〜Ｃ．からなる群より選択されるヒト抗体コンビナトリアルライブラリー：
Ａ．機能するヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントを複数有し、アドレス可能なように配列されたヒト抗体コンビナトリアルライブラリーであって、前記ライブラリーの各メンバーは、機能するヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントであり、
ａ）各ヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントは、可変軽鎖（ＶＬ鎖）および可変重鎖（ＶＨ鎖）または抗原結合部位を形成するのに十分な軽鎖あるいは重鎖の部分を含み、
ｉ）各ＶＬ鎖は、ＶκおよびＪκヒト生殖系列セグメント、またはＶλおよびＪλヒト生殖系列セグメントを有し、
ｉｉ）各ＶＨ鎖は、ＶＨおよびＪＨヒト生殖系列セグメントを有し、
ｂ）前記ライブラリーは、５０種類以上の異なるヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントを有し、各ヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントのアミノ酸配列は、各ヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントのアドレスから、知ることができる、ことを特徴とするヒト抗体コンビナトリアルライブラリー；
Ｂ．機能するヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントを複数有し、アドレス可能なように配列されたヒト抗体コンビナトリアルライブラリーであって、前記ライブラリーの各メンバーは、機能するヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントであり、
ａ）各ヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントは、改変された可変軽鎖（ＶＬ鎖）および／または改変された可変重鎖（ＶＨ鎖）または抗原結合部位を形成するのに十分な改変された軽鎖あるいは重鎖の部分を含み、
ｉ）各ＶＬ鎖は、ＶκおよびＪκヒト生殖系列セグメント、またはＶλおよびＪλヒト生殖系列セグメントを有し、
ｉｉ）各ＶＨ鎖は、ＶＨ、ＤＨおよびＪＨヒト生殖系列セグメントを有し、
ｂ）前記ＶＬ鎖および／またはＶＨ鎖は、少なくとも１つのアミノ酸の置換または挿入により改変され、
ｃ）前記ライブラリーは、５０種類以上の異なるヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントを有し、各ヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントのアミノ酸配列は、各ヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントのアドレスから、知ることができる、ことを特徴とするヒト抗体コンビナトリアルライブラリー；  および
Ｃ．機能するヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントを複数有し、アドレス可能なように配列されたヒト抗体コンビナトリアルライブラリーであって、前記ライブラリーの各メンバーは、機能するヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントであり、
ａ）各ヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントは、可変軽鎖（ＶＬ鎖）および可変重鎖（ＶＨ鎖）または抗原結合部位を形成するのに十分な軽鎖あるいは重鎖の部分を含み、
ｉ）各ＶＬ鎖は、ＶκおよびＪκヒト生殖系列セグメント、またはＶλおよびＪλヒト生殖系列セグメントを有し、
ｉｉ）各ＶＨ鎖は、ＶＨ、ＤＨおよびＪＨヒト生殖系列セグメントを有し、
ｂ）前記ライブラリーは、５０種類以上の異なるヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントを有し、各ヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントのアミノ酸配列は、各ヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントのアドレスから、知ることができる、ことを特徴とするヒト抗体コンビナトリアルライブラリー。
【請求項２】
前記置換または挿入は、相補性決定領域（ＣＤＲ）内に少なくとも１つのアミノ酸を置換または挿入することによりなされ、ここで当該ＣＤＲはＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３からなる群より選択される、請求項１に記載のヒト抗体コンビナトリアルライブラリー。
【請求項３】
前記置換または挿入される少なくとも１つのアミノ酸は、ペプチド模倣物に対応しており、
当該ペプチド模倣物は、ＴＰＯ、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−５、ヒト脳ナトリウム利尿ペプチド（ｈＢＮＰ−３２）、エキセンディン４、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、グルカゴン、ＰＡＣＡＰ−３８、ＣＤ２０９Ｌ、ＴＮＦ、ＶＥＧＦ、ＭＭＰ阻害剤、およびＣＴＬＡ−４のペプチド模倣物からなる群より選択される、請求項１に記載のヒト抗体コンビナトリアルライブラリー。
【請求項４】
前記置換または挿入される少なくとも１つのアミノ酸は、ペプチド模倣物に対応しており、
当該ペプチド模倣物は、配列番号：８９１、および９８７〜１０１４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のヒト抗体コンビナトリアルライブラリー。
【請求項５】
前記アドレス可能なように配列されたヒト抗体コンビナトリアルライブラリーでは、同じアドレスには同じヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントが配され、当該アドレスと異なる他の全てのアドレスには当該ヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントとは異なるヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントが配されている、請求項１に記載のヒト抗体コンビナトリアルライブラリー。
【請求項６】
ＶＨ生殖系列セグメントの全部またはサブセットがＤＨ生殖系列セグメントの全部またはサブセットと連結され、当該ＤＨ生殖系列セグメントの全部またはサブセットがＪＨ生殖系列セグメントの全部またはサブセットと連結されることによって、ＶＨ鎖をコードする核酸分子が生成され、
Ｖκ生殖系列セグメントの全部またはサブセットがＪκ生殖系列セグメントの全部またはサブセットと連結されるか、Ｖλ生殖系列セグメントの全部またはサブセットがＪλ生殖系列セグメントの全部またはサブセットと連結されることによって、ＶＬ鎖をコードする核酸分子が生成される、請求項１に記載のヒト抗体コンビナトリアルライブラリー。
【請求項７】
下記Ａ．〜Ｍ．の少なくとも１つをさらに有する、請求項１に記載のヒト抗体コンビナトリアルライブラリー：
Ａ．ＶＨ生殖系列セグメントを有するヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメント、  ここで、当該ＶＨ生殖系列セグメントは、ＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、ＩＧＨＶ５、ＩＧＨＶ６、ＩＧＨＶ７、およびこれらいずれかの対立遺伝子変異体からなる群より選択される、あるいは、当該ＶＨ生殖系列セグメントは、配列番号：１０〜２３８のいずれか１つから選択される；
Ｂ．ＤＨ生殖系列セグメントを有するヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメント、  ここで、当該ＤＨ生殖系列セグメントは、ＩＧＨＤ１、ＩＧＨＤ２、ＩＧＨＤ３、ＩＧＨＤ４、ＩＧＨＤ５、ＩＧＨＤ６、ＩＧＨＤ７、およびこれらいずれかの対立遺伝子変異体からなる群より選択される、あるいは、当該ＤＨ生殖系列セグメントは、配列番号：２３９〜２７２のいずれか１つから選択される；
Ｃ．ＪＨ生殖系列セグメントを有するヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメント、  ここで、当該ＪＨ生殖系列セグメントは、ＩＧＨＪ１、ＩＧＨＪ２、ＩＧＨＪ３、ＩＧＨＪ４、ＩＧＨＪ５、ＩＧＨＪ６、およびこれらいずれかの対立遺伝子変異体からなる群より選択される、あるいは、当該ＪＨ生殖系列セグメントは、配列番号：２７３〜２８５のいずれか１つから選択される；
Ｄ．ＤＨ生殖系列セグメントが親水性である、ヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメント；
Ｅ．Ｖκ生殖系列セグメントを有するヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメント、  ここで、当該Ｖκ生殖系列セグメントは、ＩＧＫＶ１、ＩＧＫＶ２、ＩＧＫＶ３、ＩＧＫＶ４、ＩＧＫＶ５、ＩＧＫＶ６、およびこれらいずれかの対立遺伝子変異体からなる群より選択される、あるいは、当該Ｖκ生殖系列セグメントは、配列番号：２８６〜３５５および８６８のいずれか１つから選択される；
Ｆ．Ｊκ生殖系列セグメントを有するヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメント、  ここで、当該Ｊκ生殖系列セグメントは、ＩＧＫＪ１、ＩＧＫＪ２、ＩＧＫＪ３、ＩＧＫＪ４、ＩＧＫＪ５、およびこれらいずれかの対立遺伝子変異体からなる群より選択される、あるいは、当該Ｊκ生殖系列セグメントは、配列番号：３５６〜３６４のいずれか１つから選択される；
Ｇ．Ｖλ生殖系列セグメントを有するヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメント、  ここで、当該Ｖλ生殖系列セグメントは、ＩＧＬＶ１、ＩＧＬＶ２、ＩＧＬＶ３、ＩＧＬＶ４、ＩＧＬＶ５、ＩＧＬＶ６、ＩＧＬＶ７、ＩＧＬＶ８、ＩＧＬＶ９、ＩＧＬＶ１０、ＩＧＬＶ１１、およびこれらいずれかの対立遺伝子変異体からなる群より選択される、あるいは、当該Ｖλ生殖系列セグメントは、配列番号：３６５〜４４１のいずれか１つから選択される；
Ｈ．Ｊλ生殖系列セグメントを有するヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメント、  ここで、当該Ｊλ生殖系列セグメントは、ＩＧＬＪ１、ＩＧＬＪ２、ＩＧＬＪ３、ＩＧＬＪ４、ＩＧＬＪ５、ＩＧＬＪ６、ＩＧＬＪ７、およびこれらいずれかの対立遺伝子変異体からなる群より選択される、あるいは、当該Ｊλ生殖系列セグメントは、配列番号：４４２〜４５１のいずれか１つから選択される；
Ｉ．免疫グロブリン定常領域の全部、または重鎖および軽鎖と相互作用するのに十分な定常領域の部分を有する、ヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメント；
Ｊ．ライブラリ中のヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントは、全長抗体、および抗原結合部位を形成するのに十分な抗体断片あるいは抗体部分からなる群より選択され、ここで、当該抗体断片あるいは抗体部分は、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、単一鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、二重特異性抗体、ＦｄおよびＦｄ'フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆｄフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、およびｓｃＦａｂフラグメントからなる群より選択される；
Ｋ．ヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントは、空間的に配列され、かつアドレス可能である；
Ｌ．ヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントは、溶液の状態または固体担体に担持された状態のいずれかである；  および
Ｍ．ヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントは、識別可能なようにラベルされている。
【請求項８】
ヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントの少なくとも１つのＶＨ鎖および／またはＶＬ鎖の少なくとも１つは、配列の相同性または相違性、遺伝子ファミリー、長さ、組成、ＣＤＲ長または組成、種、機能、特異性、グループ、あるいはサブグループに基づいて選択された生殖系列セグメントのサブセットから生成される、請求項１に記載のヒト抗体コンビナトリアルライブラリー。
【請求項９】
少なくとも１つのＶＨ鎖は、少なくとも下記Ａ．〜Ｃ．の１つに基づいて選択される、請求項１に記載のヒト抗体コンビナトリアルライブラリー：
Ａ．ＣＤＲ組成、ここで、当該ＣＤＲはＣＤＲ３である；
Ｂ．遺伝子ファミリー、ここで、各ＶＨ、ＤＨおよび／またはＪＨ遺伝子ファミリーからの生殖系列セグメントはそれぞれ下記ａ）〜ｃ）から選択される、あるいは、ＶＨ、ＤＨおよび／またはＪＨ遺伝子ファミリーのサブセットからの生殖系列セグメントはそれぞれ下記ａ）〜ｃ）から選択される：
ａ）ＶＨ遺伝子ファミリーは、IGHV1-18、 IGHV1-2、 IGHV1-24、 IGHV1-3、 IGHV1-45、 IGHV1-46、 IGHV1-58、 IGHV1-69、 IGHV1-8、 IGHV2-26、 IGHV2-5、 IGHV2-70、 IGHV3-11、 IGHV3-13、 IGHV3-15、 IGHV3-16、 IGHV3-20、 IGHV3-21、 IGHV3-23、 IGHV3-30、 IGHV3-33、 IGHV3-35、 IGHV3-38、 IGHV3-43、 IGHV3-48、 IGHV3-49、 IGHV3-53、 IGHV3-64、 IGHV3-66、 IGHV3-7、 IGHV3-72、 IGHV3-73、 IGHV3-74、 IGHV3-9、 IGHV4-28、 IGHV4-31、 IGHV4-34、 IGHV4-39、 IGHV4-4、 IGHV4-59、 IGHV4-61、 IGHV5-51、 IGHV6-1および IGHV7-81からなる群より選択される；
ｂ）ＤＨ遺伝子ファミリーは、IGHD1-1、IGHD1-14、IGHD1-20、IGHD1-26、 IGHD1-7、 IGHD2-15、 IGHD2-2、 IGHD2-21、 IGHD2-8、 IGHD3-10、 IGHD3-16、 IGHD3-22、 IGHD3-3、 IGHD3-9、 IGHD4-11、 IGHD4-17、 IGHD4-23、 IGHD4-4、 IGHD5-12、 IGHD5-18、 IGHD5-24、 IGHD5-5、 IGHD6-13、 IGHD6-19、 IGHD6-25、 IGHD6-6および IGHD7-27からなる群より選択される；  および
ｃ）ＪＨ遺伝子ファミリーは、IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5および IGHJ6からなる群より選択される；  および
Ｃ．遺伝子ファミリー、ここで、各Ｖκおよび／またはＪκ遺伝子ファミリーまたは各Ｖλおよび／またはＪλ遺伝子ファミリーからの生殖系列セグメントはそれぞれ下記ａ）〜ｄ）から選択される、あるいは、Ｖκおよび／またはＪκ遺伝子ファミリーまたはＶλおよび／またはＪλ遺伝子ファミリーのサブセットからの生殖系列セグメントの１つはそれぞれ下記ａ）〜ｄ）から選択される：
ａ）Ｖκ遺伝子ファミリーは、IGKV1-12、 IGKV1-12、 IGKV1-16、 IGKV1-17、 IGKV1-27、 IGKV1-33、 IGKV1-37、 IGKV1-39、 IGKV1-5、 IGKV1-6、 IGKV1-8、 IGKV1-9、 IGKV1-NL1、 IGKV1/OR2、 IGKV1D-12、 IGKV1D-13、 IGKV1D-16、 IGKV1-D-17、 IGKV1D-33、 IGKV1D-37、 IGKV1D-39、 IGKV1D-42、 IGKV1D-43、 IGKV1D-8、 IGKV2-24、 IGKV2-28、 IGKV2-29、 IGKV2-30、 IGKV2-30、 IGKV2-40、 IGKV2D-24、 IGKV2D-26、 IGKV2D-28、 IGKV2D-29、 IGKV2-D-30、 IGKV2D-40、 IGKV3-11、 IGKV3-15、 IGKV3-20、 IGKV3-7、 IGKV3-NL1、 IGV3-NL2、 IGKV3-NL3、 IGKV3-NL4、 IGKV3-NL5、 IGKV3/OR2-268、 IGKV3D-11、 IGKV3D-15、 IGKV3D-20、 iGKV3D-7、 IGKV4-1、 IGKV5-2、 IGKV6-21、 IGKV6D-21、 IGKV6D-41、およびIGKV1-39からなる群より選択される；
ｂ）Ｊκ遺伝子ファミリーは、IGKJ1、IGKJ2、IGKJ3、IGKJ4およびIGKJ5からなる群より選択される；
ｃ）Ｖλ遺伝子ファミリーは、IGLV1-36、 IGLV1-40、 IGLV1-41、 IGLV1-44、 IGLV1-47、 IGLV1-50、 IGLV1-51、 IGLV10-54、 IGLV11-55、 IGLV2-11、 IGLV2-14、 IGLV2-18、 IGLV2-23、 IGLV2-33、 IGLV2-8、 IGLV3-1、 IGLV3-10、 IGLV3-12、 IGLV3-16、 IGLV3-19、 IGLV3-21、 IGLV3-22、 IGLV3-25、 IGLV3-27、 IGLV3-32、 IGLV3-9、 IGLV4-3、 IGLV4-60、 IGLV4-69、 IGLV5-37、 IGLV5-39、 IGLV5-45、 IGLV5-8、 IGLV5-52、 IGLV6-57、 IGLV7-43、 IGLV7-46、 IGLV8-61、 IGLV8-61およびIGLV9-49からなる群より選択される；  および
ｄ）Ｊλ遺伝子ファミリーは、IGLJ1、IGLJ2、IGLJ4、IGLJ5、IGLJ6およびIGLJ7からなる群より選択される。
【請求項１０】
ヒト抗体コンビナトリアルライブラリーが、５０、１０２、１０３、１０４、２×１０４、３×１０４、４×１０４、５×１０４、６×１０４、７×１０４、８×１０４、９×１０４、１０５、１０６、１０７、１０８または１０９種類の異なるヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントを有する、請求項１に記載のヒト抗体コンビナトリアルライブラリー。
【請求項１１】
ヒト抗体コンビナトリアルライブラリーが、１０３、２×１０３、３×１０３、４×１０３、５×１０３、６×１０３、７×１０３、８×１０３、９×１０３、１０４、２×１０４、３×１０４、４×１０４、５×１０４、６×１０４、７×１０４、８×１０４、または９×１０４種類の異なるヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントを有し、
ヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントは、空間的に配列される、請求項１に記載のヒト抗体コンビナトリアルライブラリー。
【請求項１２】
配列はマルチウェルプレートに対応する形で構成され、プレートの各場所は異なる抗体と対応する、請求項１１に記載のヒト抗体コンビナトリアルライブラリー。
【請求項１３】
請求項１〜１２いずれか１項に記載のヒト抗体コンビナトリアルライブラリーのヒト生殖系列抗体および／または抗原に結合可能な抗体フラグメントをコードする核酸分子を有する、核酸分子ライブラリー。
【請求項１４】
請求項１〜１２いずれか１項に記載のヒト抗体コンビナトリアルライブラリーを作成する方法であって、
ａ）ライブラリー中の各ヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントごとに、イン・シリコでＶＨおよびＪＨヒト生殖系列セグメントまたはその部分をインフレームでストップコドンなしで組み合わせて、あるいは、イン・シリコでＶＨ、ＤＨおよびＪＨヒト生殖系列セグメントまたはその部分をインフレームでストップコドンなしで組み合わせて、ＶＨ鎖またはその一部分をコードする核酸分子の配列を作成する工程と、
ｂ）ライブラリー中の各ヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントごとに、イン・シリコでＶκおよびＪκヒト生殖系列セグメントまたはその部分をインフレームでストップコドンなしで組み合わせて、あるいは、イン・シリコでＶλおよびＪλヒト生殖系列セグメントまたはその部分をインフレームでストップコドンなしで組み合わせて、ＶＬ鎖またはその一部分をコードする核酸分子の配列を作成する工程と、
ｃ）上記工程ａ）およびｂ）を複数回繰り返して、異なる複数の核酸分子の配列を作成する工程であって、工程ａ）の前記ＶＨ鎖またはその一部分をコードする各核酸分子は、ＶＨ鎖またはその一部分をコードする異なる核酸分子を生成するために、ＶＨおよびＪＨヒト生殖系列セグメントの異なる組合せ、またはＶＨ、ＤＨおよびＪＨヒト生殖系列セグメントの異なる組合せを有し、および／または、工程ｂ）の前記ＶＬ鎖またはその一部分をコードする各核酸分子は、ＶＬ鎖またはその一部分をコードする異なる核酸分子を生成するために、ＶκおよびＪκヒト生殖系列セグメントの異なる組合せ、またはＶλおよびＪλヒト生殖系列セグメントの異なる組合せを有する工程と、
ｄ）前記核酸分子を合成し、当該合成された核酸分子から２つのライブラリーを作成する工程と、  ここで当該ライブラリーは、下記（ｉ）および（ｉｉ）で構成される、
（ｉ）ＶＨ鎖またはその一部分をコードする各核酸分子を有する第一のライブラリー、および
（ｉｉ）ＶＬ鎖またはその一部分をコードする各核酸分子を有する第二のライブラリー、
ｅ）上記工程ｄ）で作成した核酸分子を発現させ、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖またはその断片から構成されるヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントを産生する工程と、を有することを特徴とするヒト抗体コンビナトリアルライブラリーを作成する方法。
【請求項１５】
前記抗体または抗体フラグメントを、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の純度に精製する工程、をさらに有する請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
標的タンパク質に対する結合または活性によるヒト抗体コンビナトリアルライブラリーのスクリーニング方法であって、
ａ）標的タンパク質を、請求項１〜１２いずれか１項に記載のヒト抗体コンビナトリアルライブラリーの一員の少なくとも１つに接触させる工程と、
ｂ）ヒト抗体コンビナトリアルライブラリーの一員のいずれかが前記標的タンパク質に結合するかあるいは機能的活性を調節するかを評価する工程と、を有するヒト抗体コンビナトリアルライブラリーのスクリーニング方法。
【請求項１７】
前記標的タンパク質は、膜結合タンパク質、細胞表面受容体（ＣＳＲ）、ＣＳＲリガンド、サイトカイン受容体、受容体キナーゼ、受容体ホスファターゼ、細胞間相互作用に関与する受容体、または細胞接着分子である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記標的タンパク質は、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、表皮増殖因子受容体(EGFR)、ErbB-2、ErbB-3、IGF-R1、C-Met、TNF-R1、TNF-R2、BTLA、HVEM、LT-βR、CD20、CD3、CD25、NOTCH、DLL4、G-CSF-R、GM-CSF-R、EPO-R、カドヘリン、インテグリン、CD52、CD44、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PIGF、EGF、HGF、TNF-α、LIGHT、リンフォトキシン(LT)、IgE、G-CSF、GM-CSFおよびEPOからなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記機能的活性は、細胞増殖、リンパ種のアポトーシス、走化性、癌細胞の浸潤、マトリゲル、内皮増殖、管形成およびシグナル伝達からなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
標的タンパク質に結合する抗体または抗体フラグメントを同定する工程、をさらに有する請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
標的タンパク質に結合するあるいは機能的活性を調節すると評価されたヒト抗体コンビナトリアルライブラリーの一員の結合または機能的活性の調節を最適化する工程、をさらに有する請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】関連出願
２  ００８年１１月７日に出願された米国仮出願シリアル番号第６１／１９８、７６４号、発明の名称「組合せ抗体ライブラリー及びその使用」、並びに２００９年３月２５日に出願された米国仮出願シリアル番号第６１／２１１、２０４号、発明の名称「組合せ抗体ライブラリー及びその使用」に対し、優先権の利益を主張する。上記出願の主題は、容認されるなら、参照によってそのまま援用される。
本出願はまた、米国仮出願番号第６１／１９８、７６４号及び米国仮出願番号第６１／２１１、２０４号に対する優先権を主張する、本明細書と同日に出願された国際ＰＣＴ出願番号（代理人整理番号３８０００１６−０００８７／７０３ＰＣ）、発明の名称「抗ＤＬＬ４抗体及びその使用」に関する。
本出願は、本明細書と同日に出願された米国仮出願番号（代理人整理番号３８０００１６−００００４／ｐ７０２）、発明の名称「親和性成熟に基づく抗体の最適化の方法」にも関する。
上記に関する各出願の主題は、容認されるなら、参照によってそのまま援用される。
【０００２】電子的に提供される配列表の参照による援用
電子バージョンの配列表は、本明細書で提出されており、その内容は、参照によってそのまま援用される。
電子フィルのサイズは２．９２メガバイトで、タイトルは７０１ｓｅｑ．ＰＣ１．ｔｘｔである。
【技術分野】
【０００３】  ヒト生殖細胞系セグメントから組合わせ抗体ライブラリーを生成する方法を提供する。また、ＶＬ鎖をコードする生殖細胞系セグメントから蓄積された核酸分子のライブラリー及びＶＨ鎖をコードする核酸分子のライブラリー、並びに得られた抗体のライブラリーも提供される。前記ライブラリーは、アドレス可能なライブラリーとして提供される。標的タンパク質抗原に対する抗体ライブラリーをスクリーニングする方法、及び同定される又は選択される抗体を提供する。
【背景技術】
【０００４】  多くの治療用及び診断用モノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）が、癌及び自己免疫疾患などのヒト疾患を治療及び診断するため臨床現場で使用される。例えば、例示的な診断用抗体は、リツキサン（リツキシマブ）、ハーセプチン（トラスツズマブ）、アバスチン（ベバシズマブ）及びレミケード（インフリキシマブ）を含む。抗体治療薬の設計において、例えば、目標物の機能的活性を調節する抗体、並びに／又はより高い特異性及び／又は親和性を伴う抗体といった改良された抗体、並びに／又は特に細胞又は組織環境において、更に生物学的に利用可能で、安定性があり又は可溶性である抗体を生成するのが望ましい。【０００５】  抗体治療薬を生成するため利用可能な方法は限られている。現行の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで望ましい性質を伴う変異体タンパク質を選択するため抗体ライブラリーを使用することを含む。ライブラリーは、標的法及び非標的法（例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９１）  ２２２、５８１−５９７、Ｗｉｎｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−５５、Ｒｏｓｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１：２２６１１−２２６１８、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ  ２０：１７−２９、Ｍｏｎｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１３：１１１７−１１２９、Ｂｅｎｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．、７：７６３−７７９及び  Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２９６：５７−８６）によって変異的多様性を含むよう生成される。これらの各抗体ライブラリーには、その限界がある。従って、本明細書の対照物においては、抗体ライブラリーを作製する方法及び前記方法によって産生される抗体を提供する。
【発明の概要】
【０００６】  本明細書では、ヒト生殖細胞系セグメントの再編成によって生成されるヒト組合せ抗体ライブラリーを提供する。本明細書で提供される組合せ抗体ライブラリーにおいて、ライブラリーの各メンバー抗体は、抗原結合部位を形成するため、可変軽（ＶＬ）鎖及び可変重（ＶＨ）鎖又はその十分な部分を含む、複数の抗体を含有するライブラリーを含む。ライブラリーにおける抗体の各ＶＬ鎖は、Ｖκ及びＪκヒト生殖細胞系セグメント又はその縮重コドン、或いはＶλ及びＪλヒト生殖細胞系セグメント又はその縮重コドンを含む核酸分子によってコードされ、前記セグメントはインフレームで連結される。ライブラリーにおける抗体の各ＶＨ鎖は、ヒトＶＨ及びヒトＪＨ生殖細胞系セグメント並びにＶＨ及びＪＨ生殖細胞系セグメント間のヌクレオチドのあらゆる配列を含む核酸分子によってコードされ、それによって前記セグメントはインフレームで連結される。ヒト組合せ抗体ライブラリーは、少なくとも大体の、或いは５０又は１００又はそれ以上の異なるメンバーを含む。ライブラリーの各メンバーは、抗原結合部位を含み、機能的及び生産的な抗体である。
【０００７】  ヒト組合せ抗体ライブラリーのこうした例で、ＶＨ鎖をコードする核酸分子における、ＶＨ生殖細胞系セグメント、ＶＨとＪＨの間のヌクレオチド配列及びＪＨ生殖細胞系セグメントは、ＶＨセグメントがＶＨとＪＨの間のヌクレオチド配列へ５’で、それはＪＨセグメントへ５’であるよう連結され、並びにＶＬ鎖をコードする核酸分子のＶκ及びＪκ又はＶλ及びＪλ生殖細胞系セグメントは、ＶκセグメントがＪκセグメントへ５’で、或いはＶλセグメントがＪλセグメントへ５’であるよう連結される。ＶＨ及びＪＨ生殖細胞系セグメント間のヌクレオチド配列は、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００のヌクレオチド長において、或いは約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００のヌクレオチド長である。いくつかの例において、ＶＨ及びＪＨ生殖細胞系セグメント間のヌクレオチド配列は、ペプチド模倣物をコードする。
【０００８】  本明細書では、各メンバー抗体が修飾された可変軽（ＶＬ）鎖及び／又は修飾された可変重（ＶＨ）鎖或いはその十分な部分を含み、抗原結合部位を形成する複数の抗体を含有するヒト組合せ抗体ライブラリーも提供する。各ライブラリーのＶＬ鎖は、セグメントがインフレームで連結される、Ｖκ及びＪκヒト生殖細胞系セグメント又はその縮重コドン、或いはＶλ及びＪλヒト生殖細胞系セグメント又はその縮重コドンを含む核酸分子によってコードされる。ライブラリーにおける抗体の各ＶＨ鎖は、セグメントがインフレームで連結される、ＶＨ、ＤＨ及びＪＨヒト生殖細胞系セグメント又は縮重コドンを含む核酸分子によってコードされる。ＶＬ鎖及びＶＨ鎖の得られたタンパク質は、アミノ酸置換又はＣＤＲへのアミノ酸の挿入によって修飾される。前記ＣＤＲは、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２又はＣＤＲＬ３のどれか１つ若しく全ＣＤＲを含むそれ以上のＣＤＲ、例えばＣＤＲＨ３になり得る。挿入又は置換し得るアミノ酸は、ペプチド模倣物に対応する。
【０００９】  上記の全例において、ペプチド模倣物は、ＴＰＯ、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−５、ヒト脳ナトリウム利尿ペプチド（ｈＢＮＰ−３２）、エキセンディン４、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、グルカゴン、ＰＡＣＡＰ−３８、ＣＤ２０９Ｌ、ＴＮＦ、ＶＥＧＦ、ＭＭＰ阻害剤又はＣＴＬＡ−４ペプチド模倣物であり得る。特にＶＬ鎖のリーディングフレームを維持するため、ＶＬをコードする核酸配列のＶ−Ｊ結合部で挿入又は欠失される１つ又はそれ以上のヌクレオチドを有する。例えば、Ｖλヌクレオチド配列の３’末端からヌクレオチドは欠失される。別の例において、ＶλとＪλの間でヌクレオチドを追加するため、ヌクレオチドが、Ｖλヌクレオチド配列の３’末端で挿入される。ヌクレオチドは、特に、グアニン（Ｇ）であるいずれかのヌクレオチドであり得る。ヒトＪλは、ＩＧＬＪ１、ＩＧＬＪ２、ＩＧＬＪ３、ＩＧＬＪ４、ＩＧＬＪ５、ＩＧＬＪ６又はＩＧＬＪ７並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号：４４２−４５１のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供される組合せ抗体ライブラリーの例において、Ｊλは、ＶＬ鎖のリーディングフレームを維持するため、ＶＬ鎖をコードする核酸配列のＶ−Ｊ結合部で挿入又は欠失される１つのヌクレオチドを有する。ヌクレオチドの挿入又は欠失は、Ｊλのリーディングフレームを維持するため選択され得る。例えば、Ｊλの５’末端からのヌクレオチドは欠失される。
【００１５】  ヒト組合せ抗体ライブラリーは、ＶＨ鎖をコードする複数の核酸分子及びＶＬ鎖をコードする複数の核酸分子によって各々コードされる複数メンバーを含む。複数の核酸分子は、全ての組合せ或いは再配列された生殖細胞系セグメント又はその一部の置換に対応することができる。一般的に、本明細書で提供されるライブラリーは、５０、１０２、１０３、１０４、２ｘ１０４、３ｘ１０４、４ｘ１０４、５ｘ１０４、６ｘ１０４、７ｘ１０４、８ｘ１０４、９ｘ１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９又はそれ以上の異なるメンバー、或いは約５０、１０２、１０３、１０４、２ｘ１０４、３ｘ１０４、４ｘ１０４、５ｘ１０４、６ｘ１０４、７ｘ１０４、８ｘ１０４、９ｘ１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９の又はそれ以上の異なるメンバーを含有するライブラリーを含む。例えば、本明細書に提供されるライブラリーは、１０３、２ｘ１０３、３ｘ１０３、４ｘ１０３、５ｘ１０３、６ｘ１０３、４ｘ１０３、７ｘ１０３、８ｘ１０３、９ｘ１０３、１０４、２ｘ１０４、３ｘ１０４、４ｘ１０４、５ｘ１０４、６ｘ１０４、７ｘ１０４、８ｘ１０４、９ｘ１０４又はそれ以上の異なるメンバーを含有するライブラリーを含む。
【００１６】  例えば、ＶＨ鎖をコードする複数の核酸は、配列の類似性又は相違性、遺伝子ファミリー、長さ、構成、ＣＤＲ長さ又は構成、種類、機能性、特異性、群又は亜群に基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成される。１つの例を挙げると、ＶＨ鎖をコードする複数の核酸分子は、ＣＤＲに基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成され、前記ＣＤＲはＣＤＲ３である。別の例を挙げると、ＶＨ鎖をコードする複数の核酸分子は、遺伝子ファミリーに基づいて選択され、それによって各ＶＨ、ＤＨ及び／又はＪＨ遺伝子ファミリーからの生殖細胞系セグメントが選択され、若しくは一部のＶＨ、ＤＨ、及び／又はＪＨ遺伝子ファミリーからの１つの生殖細胞系セグメントが選択される。こうした例において、ＶＨ遺伝子ファミリーは、ＩＧＨＶ１−１８、ＩＧＨＶ１−２  ＩＧＨＶ１−２４、ＩＧＨＶ１−３、ＩＧＨＶ１−４５、ＩＧＨＶ１−４６、ＩＧＨＶ１−５８、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＨＶ１−８、ＩＧＨＶ２−２６、ＩＧＨＶ２−５、ＩＧＨＶ２−７０、ＩＧＨＶ３−１１、ＩＧＨＶ３−１３、ＩＧＨＶ３−１５、ＩＧＨＶ３−１６、ＩＧＨＶ３−２０、ＩＧＨＶ３−２１、ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ３−３０、ＩＧＨＶ３−３３、ＩＧＨＶ３−３５、ＩＧＨＶ３−３８、ＩＧＨＶ３−４３、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＨＶ３−４９、ＩＧＨＶ３−５３、ＩＧＨＶ３−６４、ＩＧＨＶ３−６６、ＩＧＨＶ３−７、ＩＧＨＶ３−７２、ＩＧＨＶ３−７３、ＩＧＨＶ３−７４、ＩＧＨＶ３−９、ＩＧＨＶ４−２８、ＩＧＨＶ４−３１、ＩＧＨＶ４−３４、ＩＧＨＶ４−３９、ＩＧＨＶ４−４、ＩＧＨＶ４−５９、ＩＧＨＶ４−６１、ＩＧＨＶ５−５１、ＩＧＨＶ６−１及びＩＧＨＶ７−８１から選択され、ＤＨ遺伝子ファミリーは、ＩＧＨＤ１−１、ＩＧＨＤ１−１４、ＩＧＨＤ１−２０、ＩＧＨＤ１−２６、ＩＧＨＤ１−７、ＩＧＨＤ２−１５、ＩＧＨＤ２−２、ＩＧＨＤ２−２１、ＩＧＨＤ２−８、ＩＧＨＤ３−１０、ＩＧＨＤ３−１６、ＩＧＨＤ３−２２、ＩＧＨＤ３−３、ＩＧＨＤ３−９、ＩＧＨペプチド模倣物は、その受容体のＥｐｏ活性を模倣する模倣物である。ペプチド模倣物は、更に、アミノ酸などのカルボキシ及び／又はＮ−末端においてフランキング配列を含むことが可能である。例えば、フランキング配列は、グリシン又はプロリンを含み得る。例示的なペプチド模倣物は、配列識別番号：８９１及び９８７−１０１４のいずれかで示されるどれかである。
【００１０】  上記で提供されるライブラリーにおいて、ＶＨ及びＪＨ生殖細胞系セグメント間のヌクレオチドは、ヒト生殖細胞系ＤＨセグメント又はその縮重コドンである。従って、本明細書で提供されるヒト組合せ抗体ライブラリーは、各メンバー抗体が、可変軽（ＶＬ）鎖及び可変重（ＶＨ）鎖又はその十分な部分を含み、抗原結合部位を形成する複数の抗体を含有するライブラリーを含む。ライブラリーにおける抗体の各ＶＬ鎖は、Ｖκ及びＪκヒト生殖細胞系セグメント又はその縮重コドン、或いはＶλ及びＪλヒト生殖細胞系セグメント又はその縮重コドンを含む核酸分子によってコードされ、それによって前記セグメントはインフレームで連結される。ライブラリーにおける抗体の各ＶＨ鎖は、ＶＨ、ＤＨ、ＪＨ生殖細胞系セグメントを含む核酸分子によりコードされ、そによって前記セグメントは、インフレームで連結される。ヒト組合せ抗体ライブラリーは、少なくとも大体の、或いは５０又は１００又はそれ以上の異なるメンバーを含む。ヒト組合せ抗体ライブラリーのこうした例において、ＶＨ鎖をコードする核酸分子のＶＨ、ＤＨ及びＪＨセグメントは、ＶＨセグメントがＤＨセグメントへ５’で、それはＪＨセグメントへ５’であるよう連結され、並びにＶＬ鎖をコードする核酸分子のＶκ及びＪκ並びにＶλ及びＪλ生殖細胞系セグメントは、ＶκセグメントがＪκセグメントへ５’であり、或いはＶλセグメントがＪλセグメントへ５’であるよう連結される。
【００１１】  本明細書で提供されるヒト組合せ抗体ライブラリーの全てにおいて、前記ライブラリーは、アドレス可能なライブラリーとして提供することができる。こうしたアドレス可能なライブラリーにおいて、各アドレス内の抗体は、同じ抗体であり、他の全てのアドレスの抗体とは異なる。例えば、ライブラリーのアドレス可能な抗体は、空間アレイで配列される。空間アレイは、マルチウェルプレートであり得、前記プレートのそれぞれの各位置は様々な抗体メンバーに対応する。抗体メンバーは、プレートのウェルの表面に固定化され得、又は溶液中に存在し得る。別の例において、アドレス可能な抗体は、固体支持体に付着される。こうした例において、固体支持体は、フィルター、チップ、スライド、ビード又はセルロースで、及び様々な抗体メンバーが、その表面に固定化される。いくつかの例において、固体支持体は、Ｂｉａｃｏｒｅチップである。本明細書で提供されるアドレス可能なあらゆるライブラリーをおいて、メンバーは同定可能に標識化される。例えば、標識は、有色、発色性、発光性、化学的、蛍光性又は電子的であり得る。
【００１２】  本明細書で提供されるヒト組合せライブラリーは、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖をコードする複数の核酸分子が、少なくとも大体の、或いは５０又は１００の異なる抗体を生成するのに十分であるよう、複数の核酸分子がＶＨ鎖をコードし、並びに複数の核酸分子がＶＬ鎖をコードするメンバーを含む。従って、本明細書で提供されるライブラリーで、ＶＨ鎖をコードする核酸分子において、全て又は一部の生殖細胞系ＶＨセグメントは、全て又は一部のＤＨセグメントと連結され、それは全て又は一部の生殖細胞系ＪＨセグメントと連結され、ＶＨ鎖をコードする複数の核酸分子を生成し、並びにＶＬ鎖をコードする核酸分子において、全て又は一部の生殖細胞系Ｖκセグメントは、全て又は一部の生殖細胞系Ｊκセグメントと連結され、或いは全て又は一部の生殖細胞系Ｖλセグメントは、全て又は一部の生殖細胞系Ｊλセグメントへ連結され、ＶＬ鎖をコードする複数の核酸分子を生成する。
【００１３】  本明細書で提供されるライブラリーにおいて、ライブラリーのＶＨ鎖は、ヒトＶＨ生殖細胞系セグメント、ＤＨ生殖細胞系セグメント及びＪＨ生殖細胞系セグメントを接合することにより組合わせれた再編成の核酸配列によってコードされる。ヒトＶＨ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、ＩＧＨＶ５、ＩＧＨＶ６又はＩＧＨＶ７並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号：１０−２３８のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供される組合わせ抗体ライブラリーの例において、ＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ鎖のリーディングフレームを維持するため、ＶＨ鎖をコードする核酸分子のＶ−Ｄ結合部で追加又は除去される１つのヌクレオチドを有することができる。例えば、ヌクレオチドは、ＶＨとＤＨの間でヌクレオチドを追加するため、ＶＨヌクレオチド配列の３′末端で挿入される。
ヌクレオチドは、特に、それがグアニン（Ｇ）であるいずれかのヌクレオチドであり得る。ＤＨセグメントは、ＩＧＨＤ１、ＩＧＨＤ２、ＩＧＨＤ３、ＩＧＨＤ４、ＩＧＨＤ５、ＩＧＨＤ６又はＩＧＨＤ７及び遺伝子又はその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号：２３９−２７２のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供される組合わせ抗体ライブラリーの例において、ＤＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ鎖のリーディングフレームを維持するため、ＶＨ鎖をコードする核酸のＶ−Ｄ結合部及び／又はＤ−Ｊ結合部で挿入又は欠失される１つのヌクレオチドを有することができる。ヌクレオチドの挿入又は欠失が、ＤＨの親水性を最大化するため選択される。例えば、ＤＨの５′末端からヌクレオチドが欠失され、及び／又はＤＨの３′末端からヌクレオチドが欠失される。別の例において、ヌクレオチドは、ＤＨとＪＨの間でヌクレオチドを追加するため、ＤＨ配列の３′末端で挿入される。追加されたヌクレオチドは、特にグアニン（Ｇ）といったいずれかのヌクレオチドであり得る。ＪＨ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＨＪ１、ＩＧＨＪ２、ＩＧＨＪ３、ＩＧＨＪ４、ＩＧＨＪ５又はＩＧＨＪ６並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号２７３−２８５のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供されるヒト組合わせ抗体ライブラリーの例において、ＪＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ鎖のリーディングフレームを維持するため、ＶＨ鎖をコードする核酸配列のＤ−Ｊ結合部で挿入又は欠失される１つ又はそれ以上のヌクレオチドを有することができる。例えば、ヌクレオチドの挿入又は欠失は、ＪＨのリーディングフレームを維持するため選択される。１つの例を挙げると、ＪＨの５′末端からヌクレオチドが欠失される。他の例を挙げると、ＪＨの３′末端からヌクレオチドが欠失される。
【００１４】  本明細書で提供されるライブラリーにおいて、ライブラリーにおけるメンバーのＶＬ鎖は、ヒトＶκ生殖細胞系セグメント及びＪκ生殖細胞系セグメントを接合することにより、組合わされたカッパ軽鎖をコードする再編成された核酸によってコードされ、又はヒトＶλ生殖細胞系セグメント及びＪλ生殖細胞系セグメントを接合することにより、組合わされたラムダ軽鎖をコードする再編成された核酸配列によってコードされる。ヒトＶκは、ＩＧＫＶ１、ＩＧＫＶ２、ＩＧＫＶ３、ＩＧＫＶ４、ＩＧＫＶ５及びＩＧＫＶ６並びに遺伝子又はその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号：２８６−３５５及び８６８のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供される組合せ抗体ライブラリーの例において、Ｖκ遺伝子セグメントは、ＶＬ鎖のリーディングフレームを維持するため、ＶＬ鎖をコードする核酸分子のＶ−Ｊ結合部で挿入又は欠失される１つ又はつ又はそれ以上のヌクレオチドを有することができる。例えば、ヌクレオチドはＶκの３’末端で欠失される。
別の例において、ヌクレオチドは、ＶκとＪκの間でヌクレオチドを追加するため、Ｖκヌクレオチド配列の３’末端で挿入される。ヌクレオチドは、特に、それがグアニン（Ｇ）であるいずれかのヌクレオチドであり得る。ヒトＪκは、ＩＧＫＪ１、ＩＧＫＪ２、ＩＧＫＪ３、ＩＧＫＪ４又はＩＧＫＪ５並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号：３５６−３６４のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供される組合せ抗体ライブラリーの例において、Ｊκ遺伝子セグメントは、ＶＬ鎖のリーディングフレームを維持するため、ＶＬ鎖をコードする核酸配列のＶ−Ｊ結合部で挿入又は欠失される１つ又はそれ以上のヌクレオチドを有する。ヌクレオチドの挿入又は欠失は、Ｊκのリーディングフレームを維持するため選択される。いくつかの例を挙げると、Ｊκの５′末端からヌクレオチドが欠失される。ヒトＶλは、ＩＧＬＶ１、ＩＧＬＶ２、ＩＧＬＶ３、ＩＧＬＶ４、ＩＧＬＶ５、ＩＧＬＶ６、ＩＧＬＶ７、ＩＧＬＶ８、ＩＧＬＶ９、ＩＧＬＶ１０又はＩＧＬＶ１１並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号：３６５−４４１のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供される組合せ抗体ライブラリーの例において、Ｖλは、Ｄ４−１１、ＩＧＨＤ４−１７、ＩＧＨＤ４−２３、ＩＧＨＤ４−４、ＩＧＨＤ５−１２、ＩＧＨＤ５−１８、ＩＧＨＤ５−２４、ＩＧＨＤ５−５、ＩＧＨＤ６−１３、ＩＧＨＤ６−１９、ＩＧＨＤ６−２５、ＩＧＨＤ６−６及びＩＧＨＤ７−２７；から選択され、並びにＤＨ遺伝子ファミリーは、ＩＧＨＪ１、ＩＧＨＪ２、ＩＧＨＪ３、ＩＧＨＪ４、ＩＧＨＪ５及びＩＧＨＪ６から選択される。
【００１７】  例えば、ＶＬ鎖をコードする複数の核酸分子は、配列の類似性又は相違性、遺伝子ファミリー、長さ、構成、ＣＤＲ長さ又は構成、種類、機能性、特異性、群又は亜群に基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成される。１つの例を挙げると、ＶＬ鎖をコードする複数の核酸分子は、ＣＤＲに基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成され、前記ＣＤＲはＣＤＲ３である。別の例を挙げると、ＶＨ鎖をコードする複数の核酸分子は、遺伝子ファミリーに基づいて選択され、それによって各Ｖκ及び／又はＪκ或いはＶλ及び／又はＪλ遺伝子ファミリーからの１つの生殖細胞系セグメントが選択され、若しくは一部のＶκ及び／又はＪκ或いはＶλ及び／又はＪλ遺伝子ファミリーからの１つの生殖細胞系セグメントが選択される。こうした例において、Ｖκ遺伝子ファミリーは、ＩＧＫＶ１−１２、ＩＧＫＶ１−１２及びＩＧＫＶ１−３９から選択され、Ｊκ遺伝子ファミリーは、ＩＧＫＪ１、ＩＧＫＪ２、ＩＧＫＪ３、ＩＧＫＪ４、ＩＧＫＶ１−１６、ＩＧＫＶ１−１７、ＩＧＫＶ１−２７、ＩＧＫＶ１−３３、ＩＧＫＶ１−３７、ＩＧＫＶ１−３９、ＩＧＫＶ１−５、ＩＧＫＶ１−６、ＩＧＫＶ１−８、ＩＧＫＶ１−９、ＩＧＫＶ１−ＮＬ１、ＩＧＫＶ１／ＯＲ２、ＩＧＫＶ１Ｄ−１２、ＩＧＫＶ１Ｄ−１３、ＩＧＫＶ１Ｄ−１６、ＩＧＫＶ１−Ｄ−１７、ＩＧＫＶ１Ｄ−３３、ＩＧＫＶ１Ｄ−３７、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９、ＩＧＫＶ１Ｄ−４２、ＩＧＫＶ１Ｄ−４３、ＩＧＫＶ１Ｄ−８、ＩＧＫＶ２−２４、ＩＧＫＶ２−２８、ＩＧＫＶ２−２９、ＩＧＫＶ２−３０、ＩＧＫＶ２−３０、ＩＧＫＶ２−４０、ＩＧＫＶ２Ｄ−２４、ＩＧＫＶ２Ｄ−２６、ＩＧＫＶ２Ｄ−２８、ＩＧＫＶ２Ｄ−２９、ＩＧＫＶ２−Ｄ−３０、ＩＧＫＶ２Ｄ−４０、ＩＧＫＶ３−１１、ＩＧＫＶ３−１５、ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＫＶ３−７、ＩＧＫＶ３−ＮＬ１、ＩＧＶ３−ＮＬ２、ＩＧＫＶ３−ＮＬ３、ＩＧＫＶ３−ＮＬ４、ＩＧＫＶ３−ＮＬ５、ＩＧＫＶ３／ＯＲ２−２６８、ＩＧＫＶ３Ｄ−１１、ＩＧＫＶ３Ｄ−１５、ＩＧＫＶ３Ｄ−２０、ｉＧＫＶ３Ｄ−７、ＩＧＫＶ４−１、ＩＧＫＶ５−２、ＩＧＫＶ６−２１、ＩＧＫＶ６Ｄ−２１、ＩＧＫＶ６Ｄ−４１及びＩＧＫＪ５から選択され、Ｖλ遺伝子ファミリーは、ＩＧＬＶ１−３６、ＩＧＬＶ１−４０、ＩＧＬＶ１−４１、ＩＧＬＶ１−４４、ＩＧＬＶ１−４７、ＩＧＬＶ１−５０、ＩＧＬＶ１−５１、ＩＧＬＶ１０−５４、ＩＧＬＶ１１−５５、ＩＧＬＶ２−１１、ＩＧＬＶ２−１４、ＩＧＬＶ２−１８、ＩＧＬＶ２−２３、ＩＧＬＶ２−３３、ＩＧＬＶ２−８、ＩＧＬＶ３−１、ＩＧＬＶ３−１０、ＩＧＬＶ３−１２、ＩＧＬＶ３−１６、ＩＧＬＶ３−１９、ＩＧＬＶ３−２１、ＩＧＬＶ３−２２、ＩＧＬＶ３−２５、ＩＧＬＶ３−２７、ＩＧＬＶ３−３２、ＩＧＬＶ３−９、ＩＧＬＶ４−３、ＩＧＬＶ４−６０、ＩＧＬＶ４−６９、ＩＧＬＶ５−３７、ＩＧＬＶ５−３９、ＩＧＬＶ５−４５、ＩＧＬＶ５−８、ＩＧＬＶ５−５２、ＩＧＬＶ６−５７、ＩＧＬＶ７−４３、ＩＧＬＶ７−４６、ＩＧＬＶ８−６１、ＩＧＬＶ８−６１及びＩＧＬＶ９−４９から選択され、並びにＪλ遺伝子ファミリーは、ＩＧＬＪ１、ＩＧＬＪ２、ＩＧＬＪ４、ＩＧ���Ｊ５、ＩＧＬＪ６及びＩＧＬＪ７から選択される。
【００１８】  本明細書で提供される組合せ抗体ライブラリーのいずれかにおいて、ライブラリーの各抗体メンバーは、生産的及び機能的である。従って、いくつかの例において、ライブラリーのメンバー抗体は、停止コドン及び／又は制限酵素部位を除去するため修飾される核酸分子によってコードされるＶＨ鎖及び／又はＶＬ鎖を含む。
【００１９】  本明細書で提供される組合せ抗体ライブラリーのいずれかにおいて、ＶＨ鎖は、配列識別番号：１０５９−１４１０又はその一部のいずれかで示されるヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされ、並びにＶＬ鎖は、配列識別番号：１４１１−１４２２、１４２４−１４３９及び１４４１−１４７１又はその一部のいずれかで示されるヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる。本明細書で提供される抗体ライブラリーは、ＶＨ鎖が、配列識別番号：１４７５−１８２６又はその一部のいずれかで示されるアミノ酸配列を有し、並びにＶＬ鎖が、配列識別番号：１８２７−１８３８、１８４０−１８５５及び１８５７−１８８８又はその一部のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するメンバーを含有するライブラリーを含む。
【００２０】  本明細書で提供されるヒト組合せ抗体ライブラリーは、完全長抗体或いは抗体のフラグメント又はその部分であるメンバーを有するものを含み、抗体のフラグメント又は一部は抗原結合部位を形成するのに十分である。こうして、本明細書で提供される組合せ抗体ライブラリーのいずれかは、定常領域の一部が、重鎖及び軽鎖の会合を可能にするのに十分であるよう、全て又は一部の定常領域を更に含むことが可能である。本明細書で提供されるライブラリーの抗体メンバーのフラグメント又は部分で含まれるのは、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ’）２、単一鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、二重特異性抗体、Ｆｄ及びＦｄ’フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆｄフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント及びｓｃＦａｂフラグメントである。例えば、本明細書で提供される組合せ抗体ライブラリーは、ライブラリーの抗体メンバーがＦａｂのＦｄｂライブラリーである。
【００２１】  本明細書では、可変の軽（ＶＬ）鎖をコードする複数のアドレス可能な核酸分子を含有する核酸分子のライブラリーを含む。こうしたライブラリーにおいて、各ＶＬ鎖は、インフレームで連結されるＶκ及びＪκヒト生殖細胞系セグメント又はＶλ及びＪλヒト生殖細胞系セグメントを含有する核酸分子によってコードされ、それによって、各アドレス内の核酸分子は同じで、他の全てのアドレスの核酸分子とは異なる。各核酸メンバーは、ＶκセグメントがＪκセグメントへ５’で、又はＶλセグメントがＪλセグメントへ５’で、ＶＬ鎖をコードする核酸分子のＶκ及びＪκ又はＶλ及びＪλ生殖細胞系セグメントが連結されるよう生殖細胞系セグメントの組合せから形成される。ライブラリーは、生殖細胞系セグメントの全ての組合せの全置換を含み得る複数の核酸メンバーを含む。いくつかの例を挙げると、複数の核酸メンバーは、ＶＨ鎖をコードする複数の核酸分子を生成するため、一部の生殖細胞系Ｖκセグメントが、全て又は一部のＪκセグメントと連結されるよう一部の全生殖細胞系セグメント、或いは全ての又は一部の生殖細胞系Ｖλセグメントが、全て又は一部の生殖細胞系Ｊλセグメントに連結されるよう、一部の全生殖細胞系セグメントを含む。
【００２２】  本明細書で提供されるＶＬ核酸ライブラリーにおいて、ＶＬ鎖をコードされた核酸分子は、ヒトＶκ生殖細胞系セグメント及びＪκ生殖細胞系セグメントを接合することにより組合わされる再編成の核酸配列によって生成される。Ｖκは、ＩＧＫＶ１、ＩＧＫＶ２、ＩＧＫＶ３、ＩＧＫＶ４、ＩＧＫＶ５又はＩＧＫＶ６並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号：２８６−３５５及び８６８のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供されるライブラリーの核酸分子メンバーで含有されるＶκ生殖細胞系セグメントで含まれるのは、Ｖκが、ＶＬ鎖のリーディングフレームを維持するため、ＶＬをコードする核酸分子のＶ−Ｊ結合部で挿入又は欠失される１つ又はそれ以上のヌクレオチドを有するいずれかである。例えば、Ｖκヌクレオチド配列の３’末端で１つ又はそれ以上のヌクレオチドが欠失される。他の例において、１つ又はそれ以上のヌクレオチドは、Ｖκ及びＪκ生殖細胞セグメント間でヌクレオチドを追加するため、Ｖκヌクレオチド配列の３’末端で挿入される。ヌクレオチドは、特に、グアニン（Ｇ）であるいずれかのヌクレオチドであり得る。Ｊκ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＫＪ１、ＩＧＫＪ２、ＩＧＫＪ３、ＩＧＫＪ４及びＩＧＫＪ５並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号：３５６−３６４のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供されるライブラリーの核酸メンバーで含有されるＪκ生殖細胞系セグメントで含まれるのは、Ｊκが、ＶＬ鎖のリーディングフレームを維持するため、Ｖ−Ｊ結合部で挿入又は欠失される１つ又はそれ以上のヌクレオチドを有するいずれかである。挿入又は欠失は、一般的に、Ｊκのリーディングフレームを維持するため選択される。例えば、Ｊκの５’末端からの１つ又はそれ以上のヌクレオチドが欠失される。
【００２３】  いくつかの例において、本明細書で提供されるＶＬ核酸ライブラリーは、ＶＬ鎖をコードする核酸分子が、ヒトＶλ生殖細胞系セグメント及びＪλ生殖細胞系セグメントを結合することによって組合わされる再編成の核酸配列により生成される。Ｖλ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＬＶ１、ＩＧＬＶ２、ＩＧＬＶ３、ＩＧＬＶ４、ＩＧＬＶ５、ＩＧＬＶ６、ＩＧＬＶ７、ＩＧＬＶ８、ＩＧＬＶ９、ＩＧＬＶ１０及びＩＧＬＶ１１並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号：３６５−４４１のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供されるライブラリーの核酸メンバーで含有されるＶλ生殖細胞系セグメントにおいて含まれるのは、Ｖλが、ＶＬ鎖のリーディングフレームを維持するため、ＶＬをコードする核酸分子のＶ−Ｊ結合部で挿入又は欠失される１つ又はそれ以上のヌクレオチドを有するいずれかである。例えば、１つ又はそれ以上のヌクレオチドは、Ｖλヌクレオチド配列の３’末端から欠失される。別の例において、１つ又はそれ以上のヌクレオチドは、ＶλとＪλの間でヌクレオチドを追加するため、Ｖλヌクレオチド配列の３’末端で挿入される。ヌクレオチドは、特に、グアニン（Ｇ）であるいずれかのヌクレオチドであり得る。Ｊλ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＬＪ１、ＩＧＬＪ２、ＩＧＬＪ３、ＩＧＬＪ４、ＩＧＬＪ５、ＩＧＬＪ６及びＩＧＬＪ７並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号：４４２−４５１のいずれかで示されるどれかである。
本明細書で提供されるライブラリーの核酸メンバーで含有されるＪλ生殖細胞系セグメントにおいては、Ｊλが、ＶＬ鎖のリーディングフレームを維持するため、ＶＬをコードする核酸分子のＶ−Ｊ結合部で挿入又は欠失される１つ又はそれ以上のヌクレオチドを有するいずれかである。挿入又は欠失は、一般的に、Ｊλのリーディングフレームを維持するため選択される。例えば、Ｊλの５’末端からヌクレオチドは欠失される。
【００２４】  本明細書で提供されるライブラリーのＶＬ鎖をコードする複数の核酸分子のいずれかは、配列の類似性又は相違性、遺伝子ファミリー、長さ、構成、ＣＤＲ長さ又は構成、種類、機能性、特異性、群又は亜群に基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成される。例えば、ＶＬ鎖をコードする複数の核酸分子は、ＣＤＲに基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成され、前記ＣＤＲはＣＤＲ３である。別の例において、ＶＬ鎖をコードする複数の核酸分子は、遺伝子ファミリーに基づいて選択され、それによって、各々のＶκ及び／又はＪκ或いはＶλ及び／又はＪλ遺伝子ファミリーから１つの生殖細胞系セグメントが選択され、或いは一部のＶκ及び／又はＪκ或いはＶλ及び／又はＪλ遺伝子ファミリーから１つの生殖細胞系セグメントが選択される。こうした例において、Ｖκ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＫＶ１−１２、ＩＧＫＶ１−１２、ＩＧＫＶ１−１６、ＩＧＫＶ１−１７、ＩＧＫＶ１−２７、ＩＧＫＶ１−３３、ＩＧＫＶ１−３７、ＩＧＫＶ１−３９、ＩＧＫＶ１−５、ＩＧＫＶ１−６、ＩＧＫＶ１−８、ＩＧＫＶ１−９、ＩＧＫＶ１−ＮＬ１、ＩＧＫＶ１／ＯＲ２、ＩＧＫＶ１Ｄ−１２、ＩＧＫＶ１Ｄ−１３、ＩＧＫＶ１Ｄ−１６、ＩＧＫＶ１−Ｄ−１７、ＩＧＫＶ１Ｄ−３３、ＩＧＫＶ１Ｄ−３７、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９、ＩＧＫＶ１Ｄ−４２、ＩＧＫＶ１Ｄ−４３、ＩＧＫＶ１Ｄ−８、ＩＧＫＶ２−２４、ＩＧＫＶ２−２８、ＩＧＫＶ２−２９、ＩＧＫＶ２−３０、ＩＧＫＶ２−３０、ＩＧＫＶ２−４０、ＩＧＫＶ２Ｄ−２４、ＩＧＫＶ２Ｄ−２６、ＩＧＫＶ２Ｄ−２８、ＩＧＫＶ２Ｄ−２９、ＩＧＫＶ２−Ｄ−３０、ＩＧＫＶ２Ｄ−４０、ＩＧＫＶ３−１１、ＩＧＫＶ３−１５、ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＫＶ３−７、ＩＧＫＶ３−ＮＬ１、ＩＧＶ３−ＮＬ２、ＩＧＫＶ３−ＮＬ３、ＩＧＫＶ３−ＮＬ４、ＩＧＫＶ３−ＮＬ５、ＩＧＫＶ３／ＯＲ２−２６８、ＩＧＫＶ３Ｄ−１１、ＩＧＫＶ３Ｄ−１５、ＩＧＫＶ３Ｄ−２０、ＩＧＫＶ３Ｄ−７、ＩＧＫＶ４−１、ＩＧＫＶ５−２、ＩＧＫＶ６−２１、ＩＧＫＶ６Ｄ−２１、ＩＧＫＶ６Ｄ−４１、又はＩＧＫＶ１−３９遺伝子ファミリーから１つ又はそれ以上の生殖細胞系セグメントのいずれかを含み得、Ｊκ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＫＪ１、ＩＧＫＪ２、ＩＧＫＪ３、ＩＧＫＪ４及びＩＧＫＪ５遺伝子ファミリーから１つ又はそれ以上の生殖細胞系セグメントのいずれかを含み得、Ｖλ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＬＶ１−３６、ＩＧＬＶ１−４０、ＩＧＬＶ１−４１、ＩＧＬＶ１−４４、ＩＧＬＶ１−４７、ＩＧＬＶ１−５０、ＩＧＬＶ１−５１、ＩＧＬＶ１０−５４、ＩＧＬＶ１１−５５、ＩＧＬＶ２−１１、ＩＧＬＶ２−１４、ＩＧＬＶ２−１８、ＩＧＬＶ２−２３、ＩＧＬＶ２−３３、ＩＧＬＶ２−８、ＩＧＬＶ３−１、ＩＧＬＶ３−１０、ＩＧＬＶ３−１２、ＩＧＬＶ３−１６、ＩＧＬＶ３−１９、ＩＧＬＶ３−２１、ＩＧＬＶ３−２２、ＩＧＬＶ３−２５、ＩＧＬＶ３−２７、ＩＧＬＶ３−３２、ＩＧＬＶ３−９、ＩＧＬＶ４−３、ＩＧＬＶ４−６０、ＩＧＬＶ４−６９、ＩＧＬＶ５−３７、ＩＧＬＶ５−３９、ＩＧＬＶ５−４５、ＩＧＬＶ５−８、ＩＧＬＶ５−５２、ＩＧＬＶ６−５７、ＩＧＬＶ７−４３、ＩＧＬＶ７−４６、ＩＧＬＶ８−６１、ＩＧＬＶ８−６１及びＩＧＬＶ９−４９遺伝子ファミリーから１つ又はそれ以上の生殖細胞系セグメントを含み得、並びに／或いはＪλ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＬＪ１、ＩＧＬＪ２、ＩＧＬＪ４、ＩＧＬＪ５、ＩＧＬＪ６及びＩＧＬＪ７遺伝子ファミリーから１つ又はそれ以上の生殖細胞刑セグメントを含み得る。
【００２５】  本明細書で提供されるＶＬ鎖をコードする全ての核酸ライブラリーにおいて、ＶＬ鎖をコードする核酸分子は、停止コドン及び／又は制限酵素部位を除去するため修飾されることが可能である。本明細書で提供されるライブラリーの核酸分子の例は、配列識別番号：１４１１−１４２２、１４２４−１４３９及び１４４１−１４７１のいずれか或いはその一部を含む。
【００２６】  本明細書では、可変軽（ＶＨ）鎖をコードする複数のアドレス可能な核酸分子を含有する核酸分子のライブラリーを含む。こうしたライブラリーにおいて、各ＶＨ鎖は、インフレームで連結されるＶＨ、ＤＨ及びＪＨヒト生殖細胞系セグメントを含有する核酸分子によってコードされ、それによって、各アドレス内の核酸分子は同じで、他の全てのアドレスの核酸分子とは異なる。各核酸メンバーは、ＶＨ鎖をコードする核酸分子のＶＨ、ＤＨ及びＪＨヒト生殖細胞系セグメントが連結され、ＶＨセグメントがＤＨセグメントへ５’で、それはＪＨセグメントへ５’であるよう生殖細胞系セグメントの組合せから形成される。ライブラリーは、生殖細胞系セグメントの全組合せの全ての置換を含有できる複数の核酸メンバーを含む。いくつかの例において、複数の核酸メンバーは、ＶＨ鎖をコードする複数の核酸分子を生成するため、一部の生殖細胞系ＶＨセグメントが、全て又び一部の生殖細胞系ＤＨセグメントと連結され、それは全て又は一部の生殖細胞系ＪＨセグメントと連結されるよう、全生殖細胞系セグメントの一部を含む。
【００２７】本明細書で提供されるＶＨ核酸ライブラリーにおいて、ＶＨ鎖をコードする核酸分子は、ヒトＶＨ、ＤＨ及びＪＨ生殖細胞系セグメントを結合することによって組合わされる再編成の核酸配列により生成される。ＶＨは、ＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、ＩＧＨＶ５、ＩＧＨＶ６及びＩＧＨＶ７並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号：１０−２３８のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供されるライブラリーの核酸メンバーを含有するＶＨ生殖細胞系セグメントにおいて、ＶＨ鎖のリーディングフレームを維持するため、ＶＨは、ＶＨをコードする核酸分子のＶ−Ｄ結合部で追加又は除去される１つ又はそれ以上のヌクレオチドを有するいずれかを含む。例えば、ＶＨヌクレオチド配列の３’末端で１つ又はそれ以上のヌクレオチドが欠失される。他の例において、１つ又はそれ以上のヌクレオチドは、ＶＨ及びＤＨ生殖細胞系セグメント間でヌクレオチドを追加するため、ＶＨヌクレオチド配列の３’末端で挿入又は追加される。ヌクレオチドは、特にグアニン（Ｇ）であるいずれかのヌクレオチドであり得る。ＤＨ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＨＤ１、ＩＧＨＤ２、ＩＧＨＤ３、ＩＧＨＤ４、ＩＧＨＤ５、ＩＧＨＤ６及びＩＧＨＤ７並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号：２３９−２７２のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供されるライブラリーの核酸メンバーで含有されるＤＨ生殖細胞系セグメントにおいては、ＤＨが、ＶＨ鎖のリーディングフレームを維持するため、Ｖ−Ｄ及び／又はＤ−Ｊ結合部で挿入又は欠失される１つ又はそれ以上のヌクレオチドを有するいずれかを含む。ヌクレオチドの挿入又は欠失は、あらゆるヌクレオチドであり得るが、一般的に、ＤＨの親水性を最大化するため選択される。例えば、ＤＨの５’末端から１つ又はそれ以上のヌクレオチドが欠失される。他の例において、ＤＨの３′末端からヌクレオチドが欠失される。更なる例において、ＤＨとＪＨの間でヌクレオチドを追加するため、ヌクレオチドがＤＨ配列の３′末端で挿入される。ヌクレオチドはあらゆるヌクレオチドであり得るが、一般的に、グアニン（Ｇ）である。生殖細胞系セグメントは、ＩＧＨＪ１、ＩＧＨＪ２、ＩＧＨＪ３、ＩＧＨＪ４、ＩＧＨＪ５及びＩＧＨＪ６並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号：２７３−２８５のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供されるライブラリーの核酸メンバーで含有されるＪＨ生殖細胞系セグメントにおいて、ＪＨは、ＶＨ鎖のリーディングフレームを維持するため、Ｄ−Ｊ結合部に挿入又は欠失される１つ又はそれ以上のヌクレオチドを有するいずれかを含む。通常、ヌクレオチドの挿入又は欠失は、ＪＨのリーディングフレームを維持するため選択される。例えば、ＪＨの５’末端からの１つ又はそれ以上のヌクレオチドが欠失される。別の例において、ＪＨの３’末端からの１つ又はそれ以上のヌクレオチドが欠失される。
【００２８】  本明細書で提供されるライブラリーのＶＨ鎖をコードする複数の核酸分子のいずれかは、配列の類似性又は相違性、遺伝子ファミリー、長さ、構成、ＣＤＲ長さ又は構成、種類、機能性、特異性、群又は亜群に基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成され得る。例えば、ＶＨ鎖をコードする複数の核酸分子は、ＣＤＲに基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成され、前記ＣＤＲはＣＤＲ３である。
別の例を挙げると、ＶＨ鎖をコードする複数の核酸分子は、遺伝子ファミリーに基づいて選択され、それによって各ＶＨ、ＤＨ及び／又はＤＨ遺伝子ファミリーから１つの生殖細胞系セグメントが選択され、若しくは一部のＶＨ、ＤＨ及び／又はＤＨ遺伝子ファミリーから１つの生殖細胞系セグメントが選択される。こうした例において、ＶＨ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＨＶ１−１８、ＩＧＨＶ１−２、ＩＧＨＶ１−２４、ＩＧＨＶ１−３、ＩＧＨＶ１−４５、ＩＧＨＶ１−４６、ＩＧＨＶ１−５８、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＨＶ１−８、ＩＧＨＶ２−２６、ＩＧＨＶ２−５、ＩＧＨＶ２−７０、ＩＧＨＶ３−１１、ＩＧＨＶ３−１３、ＩＧＨＶ３−１５、ＩＧＨＶ３−１６、ＩＧＨＶ３−２０、ＩＧＨＶ３−２１、ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ３−３０、ＩＧＨＶ３−３３、ＩＧＨＶ３−３５、ＩＧＨＶ３−３８、ＩＧＨＶ３−４３、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＨＶ３−４９、ＩＧＨＶ３−５３、ＩＧＨＶ３−６４、ＩＧＨＶ３−６６、ＩＧＨＶ３−７、ＩＧＨＶ３−７２、ＩＧＨＶ３−７３、ＩＧＨＶ３−７４、ＩＧＨＶ３−９、ＩＧＨＶ４−２８、ＩＧＨＶ４−３１、ＩＧＨＶ４−３４、ＩＧＨＶ４−３９、ＩＧＨＶ４−４、ＩＧＨＶ４−５９、ＩＧＨＶ４−６１、ＩＧＨＶ５−５１、ＩＧＨＶ６−１及びＩＧＨＶ７−８１遺伝子ファミリーから１つ又はそれ以上の生殖細胞系セグメントのいずれかを含み得、ＤＨ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＨＤ１−１、ＩＧＨＤ１−１４、ＩＧＨＤ１−２０、ＩＧＨＤ１−２６、ＩＧＨＤ１−７、ＩＧＨＤ２−１５、ＩＧＨＤ２−２、ＩＧＨＤ２−２１、ＩＧＨＤ２−８、ＩＧＨＤ３−１０、ＩＧＨＤ３−１６、ＩＧＨＤ３−２２、ＩＧＨＤ３−３、ＩＧＨＤ３−９、ＩＧＨＤ４−１１、ＩＧＨＤ４−１７、ＩＧＨＤ４−２３、ＩＧＨＤ４−４、ＩＧＨＤ５−１２、ＩＧＨＤ５−１８、ＩＧＨＤ５−２４、ＩＧＨＤ５−５、ＩＧＨＤ６−１３、ＩＧＨＤ６−１９、ＩＧＨＤ６−２５、ＩＧＨＤ６−６及びＩＧＨＤ７−２７遺伝子ファミリーから１つ又はそれ以上の生殖細胞系セグメントのいずれかを含み得、並びに／或いはＪＨ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＨＪ１、ＩＧＨＪ２、ＩＧＨＪ３、ＩＧＨＪ４、ＩＧＨＪ５及びＩＧＨＪ６遺伝子ファミリーから１つ又はそれ以上の生殖細胞系セグメントのいずれかを含み得る。
【００２９】  本明細書で提供されるＶＨ鎖をコードする全ての核酸ライブラリーにおいて、ＶＨ鎖をコードする核酸分子は、停止コドン及び／又は制限酵素部位を除去するため修飾され得る。本明細書で提供されるライブラリーの核酸分子の例は、配列識別番号：１０５９−１４１０のいずれか又はその一部を含む。
【００３０】  本明細書では、可変軽（ＶＬ）鎖又は可変重（ＶＨ）鎖をコードする上記核酸分子のいずれかを含有するアドレス可能なベクターのライブラリーも提供する。また、本明細書では、ライブラリーの各細胞が、上記の異なるベクターのいずれかを含む、アドレス可能な細胞も含む。
【００３１】  本明細書では、可変軽（ＶＬ）鎖をコードする複数のアドレス可能な核酸分子及び可変重（ＶＨ）鎖をコードする複数のアドレス可能な核酸分子を含有する核酸分子のライブラリーを含む（対を成す核酸ライブラリリー）。こうしたライブラリーにおいて、各ＶＬ鎖は、インフレームで連結されるＶκ及びＪκヒト生殖細胞系セグメント或いはＶλ及びＪλ生殖細胞系セグメントを含有する核酸分子によってコードされ、並びに各ＶＨ鎖は、ＶＨ、ＤＨ、及びＪＨヒト生殖細胞系セグメントを含有する核酸分子によってコードされる。ＶＬ鎖をコードする核酸分子の得られた核酸メンバーは、本明細書で提供されるいずれかであり得、ＶＨ鎖をコードする核酸分子は、本明細書で提供されるいずれかであり得る。こうしたアドレス可能なライブラリーにおいて、各位置で対を成す核酸分子が異なるなど、各アドレス内のＶＨ核酸分子及びＶＬ核酸分子の組合せが、他の全てのアドレスにおける核酸分子の組合せと異なるよう、各位置は、ＶＨ鎖をコードする核酸分子及びＶＬ鎖をコードする核酸分子を含む。
【００３２】  本明細書では、ヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法を含む。前記方法は、ａ）ＶＨ鎖又はその部分をコードする核酸分子の配列を生成するため、ＶＨ、ＤＨ及びＪＨヒト生殖細胞系セグメント又はその部分をインフレームで組合わせることと、ｂ）ＶＬ鎖又はその部分をコードする核酸分子の配列を生成するため、Ｖκ及びＪκヒト生殖細胞系セグメント又はその部分、或いはＶλ及びＪλ生殖細胞系セグメント又はその部分をインフレームで組合わせることとの段階を含む。本明細書で提供される方法において、段階ａ）及びｂ）におけるＶＨ、ＤＨ、ＪＨ、Ｖκ、Ｊκ、Ｖλ又はＪλの各部分は、十分な抗原結合部位を形成するＶＨ又はＶＬ或いはその部分を含有する抗体又はその部分を産生するのに十分である。前記方法において、段階ａ）及びｂ）は、複数の異なる核酸分子の配列を生成するために数回繰り返される。核酸分子は、２つのライブラリーを産生するため合成され、それによって、第一のライブラリーは、ＶＨ鎖又はその部分をコードする核酸分子を含み、第二のライブラリーはＶＬ鎖又はその部分をコードする核酸分子を含む。前記方法において、第一のライブラリー及び第二のライブラリーからの核酸分子は、細胞に導入される（例えば、同時形質転換によってなどと共に）。核酸を細胞へ導入する段階は、第一のライブラリー及び第二のライブラリーから対を成す異なる核酸分子で数回繰り返し、結果的に、核酸分子が、他のあらゆる細胞からＶＨ鎖及びＶＬ鎖の様々な組合せをコードするよう、ＶＨ鎖をコードする核酸分子並びにＶＬ鎖をコードする核酸分子を含む。細胞は、各細胞で抗体又はその部分を発現するよう成長させ、それによって複数の抗体又はその部分を産生する。
産生された複数の抗体又はその部分は、ＶＨ又はＶＬ或いはその十分な部分を含有し、抗原結合部位を形成して、抗体又はその部分は、ライブラリーの他の全ての抗体又はその部分のものと異なる。
【００３３】  本明細書で提供される方法によって産生されるヒト組合せライブラリーは、アドレス可能なライブラリーとして提供され得る。こうした方法において、様々な各段階は、前記方法の段階を通して、生殖細胞系セグメントの同一性、組み換えられた核酸配列及び／或いは産生された抗体又はその部分が、それらのアドレスによってわかるよう、アドレス指定された構成で実行することが可能である。例えば、合成された核酸は、個々にアドレス指定され、それによって、第一のアドレス指定された核酸ライブラリー及び第二のアドレス指定された核酸ライブラリーを生成する。核酸分子は、アドレス指定された細胞に導入することが可能で、各位置は、細胞のアドレス指定されたライブラリーの他の全ての細胞からＶＨ及びＶＬの様々な組合せをコードする核酸分子を含む細胞を含有する。抗体の発現において、アドレス指定された抗体が産生され、それによって各位置は、抗原結合部位を形成するのに十分なＶＨ鎖及びＶＬ鎖又はその部分を含有する抗体を含む。各位置の抗体又はその部分は同じで、他の各位置及び他の全ての位置のものとは異なる。こうして、抗体又はその部分の同一性は、そのアドレスによってわかる。
【００３４】  本明細書で提供されるヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法において、段階ａ）で、ＶＨ鎖をコードする核酸分子のＶＨ、ＤＨ及びＪＨ生殖細胞系セグメント又はその部分は、ＶＨセグメントがＤＨセグメントへ５′で、それはＪＨセグメントへ５′であるよう組合わされ、並びに段階ｂ）で、ＶＬ鎖をコードする核酸分子のＶκ、及びＪκ又はＶλ及びＪλ生殖細胞系セグメント又はその部分は、ＶκセグメントがＪκセグメントへ５′で、或いはＶλセグメントがＪλセグメントへ５′であるよう連結される。段階ａ）及び／又はｂ）は、手作業で行うことが可能で、又はヒト生殖細胞系セグメントを組合わせる方法を実行するアルゴリズムに基づいたコンピューター読み込み可能な指示を実行することができる若しくは実行するようプログラムされたコンピュータ又はコンピュータシステムなど、コンピュータによって実行することが可能である。
【００３５】  ヒト組合わせ抗体ライブラリーの生成に対し本明細書で提供される方法において、段階ａ）は、ＶＨ、ＤＨ及びＪＨ生殖細胞系セグメント又はその部分を選択することと、ＤＨ生殖細胞系セグメントの親水性を最大化するため１つ又はそれ以上のヌクレオチドの挿入又は欠失によってＶＨ及び／又はＤＨ生殖細胞系セグメントの生殖細胞系配列を修飾することによりＶ−Ｄ結合部を生成することと、ＪＨのリーディングフレームを維持するため、１つ又はそれ以上のヌクレオチドの挿入又は欠失によりＤＨ及び／又はＪＨ生殖細胞系セグメントの生殖細胞系配列を修飾することによってＤ−Ｊ結合部を生成することと、並びにＶＨ鎖をコードする核酸分子の配列を生成するため、得られたＶＨ、ＤＨ及びＪＨを組合わせることとの段階を含む。こうした方法において、Ｖ−Ｄ結合部は、ＤＨ生殖細胞系セグメントの５′末端から１つ又はそれ以上のヌクレオチド、例えば、１つのヌクレオチドの欠失によって生成され得る。別の例において、Ｖ−Ｄ結合部は、ＶＨ生殖細胞系セグメントの３′末端から１つ又はそれ以上のヌクレオチドを欠失することによって生成され得る。更なる例において、Ｖ−Ｄ結合部は、ＤＨ生殖細胞系セグメントの５′末端で１つ又はそれ以上のヌクレオチドを挿入することによって生成され得る。例えば、挿入又は追加されたヌクレオチド又は複数のヌクレオチドは、あらゆるヌクレオチドであり得、特にグアニン（Ｇ）である。更に、Ｄ−Ｊ結合部は、ＪＨの５′末端から１つ又はそれ以上のヌクレオチドの欠失によって生成され得る。別の例において、Ｄ−Ｊ結合部は、ＤＨ生殖細胞系セグメントの３′末端からヌクレオチドを挿入することにより生成される。挿入又は追加されるヌクレオチド又は複数のヌクレオチドは、あらゆるヌクレオチドであり得、特にグアニン（Ｇ）である。
【００３６】  ヒト組合わせ抗体ライブラリーの生成に対し本明細書で提供される方法において、段階ｂ）は、Ｖκ及びＪκ又はＶλ及びＪλ生殖細胞系セグメント又はその部分を選択することと、Ｊκ、のリーディングフレームを維持するため、１つ又はそれ以上のヌクレオチドの挿入又は欠失によってＶκ又はＪκ生殖細胞系配列を修飾することにより、又はＪλのリーディングフレームを維持するため、１つ又はそれ以上のヌクレオチドの挿入又は欠失によりＶλ又はＪλの生殖細胞系配列を修飾することによりＶ−Ｊ結合部を生成することと、並びにＶＬ鎖をコードする核酸分子の配列を生成するため、得られたＶκ及びＪκ又はＶλ及びＪλを組合わせることとの段階を含む。こうした方法において、Ｖ−Ｊ結合部は、例えば、Ｊκ及びＪλ生殖細胞系セグメントの５′末端から１つ又はそれ以上のヌクレオチド、例えば、１つのヌクレオチドの欠失によって生成され得る。別の例において、Ｖ−Ｊ結合部は、Ｖκ又はＶλ生殖細胞系セグメントの３′末端から１つ又はそれ以上のヌクレオチドを欠失することにより生成され得る。更なる例を挙げると、Ｖ−Ｊ結合部は、Ｊκ又はＪλ生殖細胞系セグメントの５′末端で１つ又はそれ以上のヌクレオチドを挿入することにより生成され得る。例えば、挿入された又は追加されたヌクレオチド又は複数のヌクレオチドは、あらゆるヌクレオチドであり、特にグアニン（Ｇ）である。
【００３７】本明細書で提供される組合わせライブラリーを生成する方法において、段階ａ）及びｂ）を数回繰り返す。段階ａ）を数回繰り返すことは、様々なＶＨ生殖細胞系セグメントのＮ１（第１数など）を選択することと、様々なＤＨ生殖細胞系セグメントのＮ２（第２数など）を選択することと、及び様々なＪＨ配列のＮ３（第３数など）を選択することとを含む。Ｎ１、Ｎ２及びＮ３の数は同じ又は異なり得、全ての個々の生殖細胞系セグメント又はその一部を含み得る。一般的に、Ｎ１、Ｎ２及びＮ３は、それぞれ、ＶＨ、ＤＨ又はＪＨ生殖細胞系セグメントの全て又は一部であり得る生殖細胞系セグメントの数である。段階ａ）を数回繰り返す方法において、ＶＨ、ＤＨ及びＪＨ組合わせの可能な全ての組み合わせは、ＶＨ鎖をコードするＮ１ｘＮ２ｘＮ３の様々な核酸配列を生成するため構成される。
【００３８】例えば、本明細書で提供されるヒト組合わせ抗体ライブラリーを生成する方法において、ＶＨ生殖細胞系セグメント（Ｎ１の異なるＶＨ生殖細胞系セグメントを含む）は、ＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、ＩＧＨＶ５、ＩＧＨＶ６又はＩＧＨＶ７の全て又はその一部並びに遺伝子及びその対立遺伝子、例えば、配列識別番号１０−２３８のいずれかで示されるＶＨ生殖細胞系セグメントから選択され得る。ＤＨ生殖細胞系セグメントは、全て又は一部のＩＧＨＤ１、ＩＧＨＤ２、ＩＧＨＤ３、ＩＧＨＤ４、ＩＧＨＤ５、ＩＧＨＤ６又はＩＧＨＤ７並びに遺伝子及びその対立遺伝子、例えば、配列識別番号：２３９−２７２のいずれかで示されるＤＨ生殖細胞系セグメントから選択され得る。ＪＨ生殖細胞系セグメントは、全て又は一部のＩＧＨＪ１、ＩＧＨＪ２、ＩＧＨＪ３、ＩＧＨＪ４、ＩＧＨＪ５又はＩＧＨＪ６並びに遺伝子及びその対立遺伝子、例えば、配列識別番号：２７３−２８５のいずれかで示されるＪＨ生殖細胞系セグメントから選択され得る。
【００３９】  上記の例のいずれかにおいて、前記方法は、段階ａ）で、配列の類似性又は相異性、遺伝子ファミリー、長さ、構成、ＣＤＲ長さ又は構成、種類、機能性、特異性、群又は亜群に基づいて一部の生殖細胞系セグメントを選択することを含み得る。例えば、一部の生殖細胞系セグメントは、遺伝子ファミリーに基づいて選択し得る。前記方法において、各々のＶＨ、ＤＨ及び／又はＪＨ遺伝子ファミリーから１つの生殖細胞系セグメントが選択され、或いは一部のＶＨ、ＤＨ及び／又はＪＨ遺伝子ファミリーから１つの生殖細胞系セグメントが選択されるよう、生殖細胞系セグメントが選択され得る。ＶＨ遺伝子ファミリーは、遺伝子及びその対立遺伝子を含むＩＧＨＶ１−１８、ＩＧＨＶ１−２、ＩＧＨＶ１−２４、ＩＧＨＶ１−３、ＩＧＨＶ１−４５、ＩＧＨＶ１−４６、ＩＧＨＶ１−５８、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＨＶ１−８、ＩＧＨＶ２−２６、ＩＧＨＶ２−５、ＩＧＨＶ２−７０、ＩＧＨＶ３−１１、ＩＧＨＶ３−１３、ＩＧＨＶ３−１５、ＩＧＨＶ３−１６、ＩＧＨＶ３−２０、ＩＧＨＶ３−２１、ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ３−３０、ＩＧＨＶ３−３３、ＩＧＨＶ３−３５、ＩＧＨＶ３−３８、ＩＧＨＶ３−４３、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＨＶ３−４９、ＩＧＨＶ３−５３、ＩＧＨＶ３−６４、ＩＧＨＶ３−６６、ＩＧＨＶ３−７、ＩＧＨＶ３−７２、ＩＧＨＶ３−７３、ＩＧＨＶ３−７４、ＩＧＨＶ３−９、ＩＧＨＶ４−２８、ＩＧＨＶ４−３１、ＩＧＨＶ４−３４、ＩＧＨＶ４−３９、ＩＧＨＶ４−４、ＩＧＨＶ４−５９、ＩＧＨＶ４−６１、ＩＧＨＶ５−５１、ＩＧＨＶ６−１及びＩＧＨＶ７−８１遺伝子ファミリーを含むが、それらに制限されるものではない。ＤＨ遺伝子ファミリーは、遺伝子及びその対立遺伝子を含むＩＧＨＤ１−１、ＩＧＨＤ１−１４、、ＩＧＨＤ１−２０、ＩＧＨＤ１−２６、ＩＧＨＤ１−７、ＩＧＨＤ２−１５、ＩＧＨＤ２−２、ＩＧＨＤ２−２１、ＩＧＨＤ２−８、ＩＧＨＤ３−１０、ＩＧＨＤ３−１６、ＩＧＨＤ３−２２、ＩＧＨＤ３−３、ＩＧＨＤ３−９、ＩＧＨＤ４−１１、ＩＧＨＤ４−１７、ＩＧＨＤ４−２３、ＩＧＨＤ４−４、ＩＧＨＤ５−１２、ＩＧＨＤ５−１８、ＩＧＨＤ５−２４、ＩＧＨＤ５−５、ＩＧＨＤ６−１３、ＩＧＨＤ６−１９、ＩＧＨＤ６−２５、ＩＧＨＤ６−６及びＩＧＨＤ７−２７遺伝子ファミリーを含むが、それらに制限されるものではない。ＪＨ遺伝子ファミリーは、遺伝子及びその対立遺伝子を含むＩＧＨＪ１、ＩＧＨＪ２、ＩＧＨＪ３、ＩＧＨＪ４、ＩＧＨＪ５及びＩＧＨＪ６遺伝子ファミリーを含むが、それらに制限されるものではない。
【００４０】  本明細書で提供される組合わせライブラリーを生成する方法において、段階ａ）及びｂ）を数回繰り返す。段階ｂ）を数回繰り返すことは、異なるＶλ生殖細胞系セグメントのＮ１（第１数など）を選択すること及び異なるＪλ生殖細胞系セグメントのＮ２（第２数など）を選択し、或いは異なるＶκ生殖細胞系セグメントのＮ３（第３数など）を選択して及び異なるＪκ生殖細胞系セグメントのＮ４（第４数など）を選択することを含む。Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３及びＮ４の数は同じ又は異なり得、並びにそれぞれの全ての生殖細胞系セグメント又はその一部を含み得る。
一般的に、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３及びＮ４は、それぞれ、全て又は一部のＶλ、Ｊλ、Ｖκ、Ｊκ生殖細胞系セグメントであり得る生殖細胞系セグメントの数である。段階ｂ）を数回繰返す方法において、Ｖλ、Ｊλ、Ｖκ、Ｊκの組合わせの可能な全べての組合わせは、ＶＬ鎖をコードするＮ１ｘＮ２又はＮ３ｘＮ４の異なる核酸配列を生成するため構成される。
【００４１】  例えば、本明細書で提供されるヒト組合わせ抗体ライブラリーを生成する方法において、Ｖλ生殖細胞系セグメント（Ｎ１の異なるＶλ生殖細胞系セグメントを含む）は、全て又は一部のＩＧＬＶ１、ＩＧＬＶ２、ＩＧＬＶ３、ＩＧＬＶ４、ＩＧＬＶ５、ＩＧＬＶ６、ＩＧＬＶ７、ＩＧＬＶ８、ＩＧＬＶ９、ＩＧＬＶ１０及びＩＧＬＶ１１並びに遺伝子及びその対立遺伝子、例えば、配列識別番号：３６５−４４１のいずれかで示されるＶλ生殖細胞系セグメントから選択され得る。Ｊλ生殖細胞系セグメントは、全て又は一部のＩＧＬＪ１、ＩＧＬＪ２、ＩＧＬＪ３、ＩＧＬＪ４、ＩＧＬＪ５、ＩＧＬＪ６及びＩＧＬＪ７並びに遺伝子及びその対立遺伝子、例えば、配列識別番号：４４２−４５１のいずれかで示されるＪλ生殖細胞系セグメントから選択され得る。Ｖκ生殖細胞系セグメントは、全て又は一部のＩＧＫＶ１、ＩＧＫＶ２、ＩＧＫＶ３、ＩＧＫＶ４、ＩＧＫＶ５及びＩＧＫＶ６並びに遺伝子及びその対立遺伝子、例えば、配列識別番号：２８６−３５５及び８６８のいずれかで示されるＶκ生殖細胞系セグメントから選択され得る。Ｊκ生殖細胞系セグメントは、全て又は一部のＩＧＫＪ１、ＩＧＫＪ２、ＩＧＫＪ３、ＩＧＫＪ４及びＩＧＫＪ５並びに遺伝子及びその対立遺伝子、例えば、配列識別番号：３５６−３６４のいずれかで示されるＪκ生殖細胞系セグメントから選択され得る。
【００４２】  上記の例のいずれかにおいて、前記方法は、段階ｂ）において、配列の類似性又は相違性、遺伝子ファミリー、長さ、構成、ＣＤＲ長さ又は構成、種類、機能性、特異性、群又は亜群に基づいて一部の生殖細胞系セグメントを選択することを含み得る。例えば、一部の生殖細胞系セグメントは、遺伝子ファミリーに基づいて選択され得る。前記方法において、各々のＶκ及び／又はＪκ或いはＶλえ及び／又はＪλ遺伝子ファミリーから１つの生殖細胞系セグメントが選択され、或いは一部のＶκ及び／又はＪκ或いはＶλ及び／又はＪλ遺伝子ファミリーから１つの生殖細胞系セグメントが選択されるよう、生殖細胞系セグメントは選択され得る。Ｖκ遺伝子ファミリーは、遺伝子及びその対立遺伝子を含むＩＧＫＶ１−１２、ＩＧＫＶ１−１２、ＩＧＫＶ１−１６、ＩＧＫＶ１−１７、ＩＧＫＶ１−２７、ＩＧＫＶ１−３３、ＩＧＫＶ１−３７、ＩＧＫＶ１−３９、ＩＧＫＶ１−５、ＩＧＫＶ１−６、ＩＧＫＶ１−８、ＩＧＫＶ１−９、ＩＧＫＶ１−ＮＬ１、ＩＧＫＶ１／ＯＲ２、ＩＧＫＶ１Ｄ−１２、ＩＧＫＶ１Ｄ−１３、ＩＧＫＶ１Ｄ−１６、ＩＧＫＶ１−Ｄ−１７、ＩＧＫＶ１Ｄ−３３、ＩＧＫＶ１Ｄ−３７、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９、ＩＧＫＶ１Ｄ−４２、ＩＧＫＶ１Ｄ−４３、ＩＧＫＶ１Ｄ−８、ＩＧＫＶ２−２４、ＩＧＫＶ２−２８、ＩＧＫＶ２−２９、ＩＧＫＶ２−３０、ＩＧＫＶ２−３０、ＩＧＫＶ２−４０、ＩＧＫＶ２Ｄ−２４、ＩＧＫＶ２Ｄ−２６、ＩＧＫＶ２Ｄ−２８、ＩＧＫＶ２Ｄ−２９、ＩＧＫＶ２−Ｄ−３０、ＩＧＫＶ２Ｄ−４０、ＩＧＫＶ３−１１、ＩＧＫＶ３−１５、ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＫＶ３−７、ＩＧＫＶ３−ＮＬ１、ＩＧＶ３−ＮＬ２、ＩＧＫＶ３−ＮＬ３、ＩＧＫＶ３−ＮＬ４、ＩＧＫＶ３−ＮＬ５、ＩＧＫＶ３／ＯＲ２−２６８、ＩＧＫＶ３Ｄ−１１、ＩＧＫＶ３Ｄ−１５、ＩＧＫＶ３Ｄ−２０、ＩＧＫＶ３Ｄ−７、ＩＧＫＶ４−１、ＩＧＫＶ５−２、ＩＧＫＶ６−２１、ＩＧＫＶ６Ｄ−２１、ＩＧＫＶ６Ｄ−４１及びＩＧＫＶ１−３９遺伝子ファミリーを含むが、それらに制限されるものではない。Ｖλ遺伝子ファミリーは、遺伝子及びその対立遺伝子を含有するＩＧＬＶ１−３６、ＩＧＬＶ１−４０、ＩＧＬＶ１−４１、ＩＧＬＶ１−４４、ＩＧＬＶ１−４７、ＩＧＬＶ１−５０、ＩＧＬＶ１−５１、ＩＧＬＶ１０−５４、ＩＧＬＶ１１−５５、ＩＧＬＶ２−１１、ＩＧＬＶ２−１４、ＩＧＬＶ２−１８、ＩＧＬＶ２−２３、ＩＧＬＶ２−３３、ＩＧＬＶ２−８、ＩＧＬＶ３−１、ＩＧＬＶ３−１０、ＩＧＬＶ３−１２、ＩＧＬＶ３−１６、ＩＧＬＶ３−１９、ＩＧＬＶ３−２１、ＩＧＬＶ３−２２、ＩＧＬＶ３−２５、ＩＧＬＶ３−２７、ＩＧＬＶ３−３２、ＩＧＬＶ３−９、ＩＧＬＶ４−３、ＩＧＬＶ４−６０、ＩＧＬＶ４−６９、ＩＧＬＶ５−３７、ＩＧＬＶ５−３９、ＩＧＬＶ５−４５、ＩＧＬＶ５−８、ＩＧＬＶ５−５２、ＩＧＬＶ６−５７、ＩＧＬＶ７−４３、ＩＧＬＶ７−４６、ＩＧＬＶ８−６１、ＩＧＬＶ８−６１及びＩＧＬＶ９−４９遺伝子ファミリーを含むが、それらに制限されるものではない。
Ｊλ遺伝子ファミリーは、遺伝子及びその対立遺伝子を含むＩＧＬＪ１、ＩＧＬＪ２、ＩＧＬＪ４、ＩＧＬＪ５、ＩＧＬＪ６及びＩＧＬＪ７遺伝子ファミリーを含むが、それらに制限されるものではない。
【００４３】  ヒト組合わせ抗体ライブラリーを生成する上記の方法のいずれかにおいて、生殖細胞系セグメントは、ユーザ作成のデータベースで含まれ得、例えば、こうした配列に便利にアクセスできる。前記方法の実行において、データベースのＪＨ、Ｊκ及びＪλ生殖細胞系セグメントの配列は、それらの的確なリーディングフレームで示される（例えば、表１３で示されるなど）。
【００４４】  本明細書で提供される方法は、ＶＨ鎖又はその部分をコードする核酸分子を修飾すること及び／又はＶＬ鎖又はその部分をコードする核酸配列を修飾することの段階ａ）及び／又はｂ）後の段階を更に含み得る。例えば、核酸配列は、あらゆる内部停止コドンを除去することにより修飾されることができる。一般的に、停止コドンの修飾は、核酸配列へ１つ又は２つのヌクレオチドのみを変えることにより行う。停止コドンに対するコドントリプレットは、アミノ酸をコードする他の全てのコドントリプレットに変えることが可能である。例えば、停止コドンＴＡＡは、ＴＡＴに修飾することができ、停止コドンＴＡＧは、ＴＡＴに修飾することができ、停止コドンＴＧＡは、ＴＣＡに修飾することが可能である。別の例において、核酸配列は、あらゆる内部制限部位を除去することによって修飾され得る。制限酵素によって識別されるヌクレオチドは、目的の制限酵素によって識別されない配列と同様の長さの他の全てのヌクレオチド配列に修飾され得る（後続のクローニング段階で使用されるものなど）。一般的に、１つ又は２つヌクレオチドのみを変える。通常、制限部位の修飾は、大腸菌におけるコドンの使用を最大化するため行われる。
【００４５】  本明細書で提供されるヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法において、ＶＨ鎖をコードする複数の核酸配列は、配列識別番号：１０５９−１４１０のいずれか又はその一部で示されるどれかを含むが、それらに制限されるわけではない。ＶＬ鎖をコードする複数の核酸配列は、配列識別番号：１４１１−１４２２、１４２４−１４３９及び１４４１−１４７１のいずれか又はその一部で示されるどれかを含むが、それらに制限されるわけではない。
【００４６】  ヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する本明細書で提供される方法のいずれかにおいて、ＶＨ鎖をコードする複数の核酸配列及び／又はＶＬ鎖をコードする複数の核酸配列を位置づけできる。例えば、前記配列は、配列の類似性に基づいて位置づけできる（配列アライメント或いは当業者に周知の及び本明細書に記載の他の方法によって実行など）。ＶＨ鎖をコードする複数の異なる核酸分子の間で及びその中での配列類似性、並びに／或いはＶＬ鎖をコードする複数の異なる核酸分子の間で及びその中での配列類似性を決定できる。ＶＨ鎖及び／又はＶＬ鎖をコードする一部の核酸配列は、選択された配列が、最も類似する配列又は選択された他の配列と最も異なる配列を含むよう選択され得る（例えば、合成及び後続の発現に対し）。
【００４７】  組合せ抗体ライブラリーを生成するため本明細書で提供される方法において、アドレス指定されたライブラリーの合成された核酸配列は、ベクターで含有される。従って、ＶＨ鎖をコードする核酸配列を含む第一のベクターライブラリーからのベクター及びＶＬ鎖をコードする核酸配列を含む第二のベクターライブラリーからのベクターは、ライブラリーの抗体メンバーの生成及び産生に対し、アドレス指定された細胞に導入される。前記ベクターは、重鎖及び軽鎖の会合を可能にするのに十分な定常領域の全て又は部分を更に含むことが可能である。例えば、前記ベクターは、得られたコードされる抗体がＦａｂであるよう、ＣＨ１及びＣＬを含み得る。本明細書で提供される方法において、細胞は、原核生物の細胞又は真核生物の細胞を含む。例えば、細胞は、大腸菌細胞を含む。本明細書で提供される組合せ抗体ライブラリーを生成する方法において、アドレス指定される細胞は、空間アレイで配列することが可能である。空間アレイは、例えば、細胞のアドレス指定されたライブラリーで他の全ての細胞と比較し、前記プレートの各個々の位置が、ＶＨ及びＶＬの異なる組合せをコードする核酸分子を含む細胞に対応するよう、マルチウェルプレートを含む。
【００４８】  本明細書で提供される方法で発現される抗体及びその部分は、抗原結合部位を形成するのに十分な完全長抗体或いはフラグメント又はその部分を含む。例えば、発現される抗体はＦａｂである。本明細書で提供される方法は、更に、抗体又はその部分を精製する段階を含むことができる。ライブラリーの抗体又はその部分は、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の純度のものを含む。従って、アドレス可能なライブラリーは、精製された抗体又はその部分がアドレス指定されるよう、精製される抗体メンバーを含み、各アドレス内の抗体は、同じ抗体で、ライブラリーの他の全てのアドレスの他の全ての抗体とは異なる。
【００４９】  また、本明細書で提供されるのは、組合せ抗体ライブラリーを生成する本明細書で提供される方法により生成されるアドレス可能な組合せ抗体ライブラリーである。こうした抗体ライブラリーは、配列識別番号：１４７５−８３６のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ鎖、及び配列識別番号：１８２７−１８３８、１８４０−１８５５及び１８５７−１８８８のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ鎖を各々含有するメンバーを含む。
【００５０】  本明細書では、標的タンパク質に結合する抗体又はその部分を同定し、及び／又は標的タンパク質の活性を修飾するため、結合又は標的タンパク質に対する活性に対し、ヒト組合せ抗体ライブラリーをスクリーニングする方法を提供している。こうした方法において、ヒト組合せ抗体ライブラリーが提供される。前記ライブラリーは、本明細書で提供されるあらゆるヒト組合せ抗体ライブラリー、又は本明細書で提供される方法で産生されるあらゆるヒト組合せ抗体ライブラリーを含む。こうした方法において、ライブラリーの抗体又はその部分は、標的タンパク質と接触し、抗体又はその部分と標的タンパク質との結合及び／又はライブラリーの抗体又はその部分による機能的活性の修飾を評価する。標的タンパク質に結合し、及び／又は標的タンパク質の活性を修飾する抗体またはその部分を同定し、同定された抗体又はその部分を「ＨＩＴ」として示す。こうした方法において、例えば、ヒト組合せ抗体ライブラリーは、「ＨＩＴ」の同定がそのアドレスによってわかるよう、アドレス可能なライブラリーであり、アドレス可能なアレイで接触を行う。例えば、スクリーニングは、マイクロウェルプレートなどの空間アレイで行う。
【００５１】  本明細書で提供されるスクリーニング法において、標的タンパク質は、膜結合性タンパク質、細胞表面受容体（ＣＳＲ）又はＣＳＲリガンドである。膜結合性タンパク質又はＣＳＲは、サイトカイン受容体、受容体キナーゼ、受容体ホスファターゼ、細胞間相互作用に関与する受容体、又は細胞接着分子を含むが、それらに制限されるものではない。例えば、標的タンパク質は、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、癌細胞表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３、ＩＧＦ−Ｒ１、Ｃ−Ｍｅｔ、ＴＮＦ−Ｒ１、ＴＮＦ−Ｒ２、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＬＴ−βＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＮＯＴＣＨ、ＤＬＬ４、Ｇ−ＣＳＦ−Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦ−Ｒ、ＥＰＯ−Ｒ、カドヘリン、インテグリン、ＣＤ５２及びＣＤ４４、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＩＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＴＮＦ−α、ＬＩＧＨＴ、リンフォトキシン（ＬＴ）、ＩｇＥ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＥＰＯを含むが、それらに制限されるものではない。
【００５２】  いくつかの例において、標的タンパク質への抗体又はその部分の結合を評価する。他の例では、抗体又はその部分により標的タンパク質の機能的活性の調節を評価する。機能的活性は、細胞増殖、リンパ種のアポトーシス、走化性、癌細胞の浸潤、マトリゲル、内皮増殖、管形成及びシグナル伝達を含むが、それらに制限されるものではない。
【００５３】  本明細書で提供されるスクリーニング法において、結合は、細胞で評価することが可能で、及び／又は機能的活性は細胞ベースの活性で評価できる。こうした例において、細胞は、一般的に、膜結合又は細胞外受容体、リガンド若しくは接着タンパク質としてそれらの表面上で、標的タンパク質を発現する。例えば、細胞は、一時的又は安定的に標的タンパク質をコードする核酸分子で発現することができる。
【００５４】  本明細書では、「ＨＩＴ」を同定した後に含むスクリーニング法を提供し、例えば、上記で提供されるスクリーニング法の前回の反復において、第二のライブラリーの組合せ抗体ライブラリーを提供する。こうした例において、第二の組合せ抗体ライブラリーは、同定された「ＨＩＴ」に基づいている。例えば、同定されたＨＩＴの生殖細胞系セグメントとの配列類似性と関連するＶＨ、ＤＨ及びＪＨヒト生殖細胞死セグメントを選択することと、並びに異なるＶＨ鎖又はその部分をそれぞれコードする複数の核酸分子の配列を生成するため、可能な全てのＶＨ、ＤＨ及びＪＨヒト生殖細胞系セグメント又はその部分をインフレームで組合わせることと、及び同定されたＨＩＴの生殖細胞系セグメントとの配列類似性と関連するＶκ及びＪκ又はＶλ及びＪλヒト生殖細胞系セグメントを選択することと、並びに異なるＶＬ鎖又はその部分をそれぞれコードする複数の核酸分子の配列を生成するため、可能な全てのＶκ及びＪκヒト生殖細胞系セグメント又はその部分、或いは可能な全てのＶλ及びＪλ生殖細胞系セグメント又はその部分をインフレームで組合わせることとによって、第二のライブラリーが生成される。ＶＨ、ＤＨ、ＪＨ、Ｖκ、ＪκＶλ又はＪλの一部は、抗原に結合するのに十分なＶＨ又はＶＬ又はその部分を含む抗体を産生するのに十分である。生殖細胞系セグメントの組合わせにおいて、核酸分子は、ＶＨ鎖又はその部分をコードする核酸分子を含む第一のライブラリー、及びＶＬ鎖又はその部分をコードする核酸分子を含む第二のライブラリーを生成するため合成する。第一のライブラリー及び第二のライブラリーからの核酸分子は、細胞に導入し、並びに各細胞が、細胞のライブラリーにおける他の全ての細胞からＶＨ及びＶＬの異なる組合わせをコードする核酸分子を含有するよう、細胞のライブラリーを産生するため前記の段階を数回繰り返す。細胞は、各細胞で抗体を発現するため成長させ、ライブラリーにおける生成された各抗体又はその部分が、ＶＨ及びＶＬ鎖又はその十分な部分の異なる組合わせを含み、ライブラリーにおける他の全ての抗体又はその部分から抗原結合部位を形成するよう、複数の抗体又はその部分を産生する。前記抗体は、第二のヒト組合わせ抗体ライブラリーを生成するため、更に精製される。こうした例において、第二のヒト組合わせ抗体ライブラリーは、関連の生殖細胞系セグメント間及び関連の生殖細胞においての配列類似性が、６０％、６５％７、０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上である、或いは大体そうであるよう生成される。
【００５５】  別の例において、第二の組合せ抗体ライブラリーは、同定されたＨＩＴをコードする核酸分子で含有されるのと同じＶＨ、ＤＨ又はＪＨヒト生殖細胞系セグメントを含むＶＨ鎖をコードする複数の核酸分子を選択することと、並びに同定されたＨＩＴをコードする核酸分子で含有されるのと同じＶκ及びＪκ又はＶλ及びＪλヒト生殖細胞系セグメントを含むＶＬ鎖をコードする複数の核酸分子を選択することとによって生成され、提供される。ＶＬをコードする複数の核酸分子からの核酸分子及びＶＨをコードする複数の核酸分子からの核酸分子を細胞に導入し、細胞を成長させる。これは数回繰り返されて細胞ライブラリーを生成し、各細胞は、ライブラリーの他の全ての細胞と異なる組合せのＶＨ鎖及びＶＬ鎖をコードする核酸分子を含む。各細胞の抗体の発現において、複数の抗体又はその部分が産生される。ライブラリーの各抗体又はその部分は、ＶＨ及びＶＬ鎖又はその十分な部分の異なる組合せを含み、ライブラリーの他の全ての抗体又はその部分から抗原結合部位を形成する。抗体又はその部分は、第二の組合せ抗体ライブラリーを生成するため精製する。
【００５６】  更なる例において、第二の組合せライブラリーは、複数の抗体又はその部分を生成するため、アミノ酸変異を「ＨＩＴ」に導入することによって生成される同定されたＨＩＴに基づいて提供する。第二の組合せ抗体ライブラリーの核抗体メンバー又はその部分は、その一次配列における１つ又はそれ以上のアミノ酸変異により、同定された「ＨＩＴ」とは異なる。こうした例において、アミノ酸変異は、同定されたＨＩＴの相補性決定領域（ＣＤＲ）にある。
【００５７】  上記の各方法において、第二のヒト組合せライブラリーは、標的タンパク質と接触し、抗体及びその部分の標的タンパク質との結合及び／又はライブラリーの抗体又はその部分による機能的活性の調節を評価する。
標的タンパク質に結合し、及び／又は標的タンパク質の活性を調節する抗体又はその部分を調節する抗体又はその部分を同定し、同定された抗体又はその部分を更なる「ＨＩＴ」として表す。いくつかの例において、第二の組合せ抗体ライブラリーは、精製された抗体又はその部分がアドレス指定され、それぞれのアドレス内の精製された各抗体は同じ抗体で、他の全てのアドレスの抗体とは異なる、アドレス可能なライブラリーである。こうした例において、接触は、アドレス可能なアレイで行われ、「ＨＩＴ」の同定は、そのアドレスによってわかる。例えば、スクリーニングは、マイクロウェルプレートといった空間アレイで行われる。
【００５８】  上記で提供されるスクリーニングの例のいずれかにおいて、前記方法は、その方法の以前の反復法における前回の「ＨＩＴ」と比較して、標的タンパク質の最適化された結合親和性を有し、及び／又は標的タンパク質に対し最適化される活性を有し、更なる「ＨＩＴ」を同定するまで、その方法を反復的に繰り返す。
本明細書では、ＶＨ、ＤＨ及びＪＨ生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によってコードされるＶＨ鎖、並びにＶκ及びＪκ又はＶλ及びＪλ生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によってコードされるＶＬ鎖を含む抗ＤＬＬ４抗体を提供する。ＶＨ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＨＶ１及びＩＧＨＶ５又はＩＧＨＶ６或いは遺伝子及びその対立遺伝子で、ＤＨ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＨＤ６及びＩＧＨＤ５又はＩＧＨＤ３或いは遺伝子及びその対立遺伝子で、並びにＪＨ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＨＪ１又はＩＧＨＪ４或いは遺伝子及びその対立遺伝子である。Ｖκ生殖細胞系セグメントはＩＧＫＶ３で、並びにＪκはＩＧＫＪ１又は遺伝子及びその対立遺伝子で、Ｖλ生殖細胞系セグメントはＩＧＬＶ８又はＩＧＬＶ５で、並びにＪλ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＬＪ１又はＩＧＬＪ４或いは遺伝子及びその対立遺伝子である。本明細書で提供される抗ＤＬＬ４抗体は、ＤＬＬ４を結合し、及び／又はＤＬＬ４の活性を調節する。
【００５９】  いくつかの例において、ＶＨ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＨＶ１−４６＊０１、ＩＧＨＶ１−４６＊０２又はＩＧＨＶ１−４６＊０３或いはＩＧＨＶ６−１＊０１又はＩＧＨＶ６−１＊０２である。ＤＨ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＨＤ６−６＊０１、ＩＧＨＤ５−１８＊０１、ＩＧＨＤ３−３＊０１又はＩＧＨＤ３−３＊０２である。ＪＨ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＨＪ１＊０１、ＩＧＨＪ４＊０１、ＩＧＨＪ４＊０２又はＩＧＨＪ４＊０３である。Ｖκ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＫＶ３−１１＊０１又はＩＧＫＶ３−１１＊０２である。Ｊκ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＫＪ１＊０１である。Ｖλ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＬＶ８−６１＊０１、ＩＧＬＶ８−６１＊０２、ＩＧＬＶ８−６１＊０３又はＩＧＬＶ５−４８＊０１である。Ｊλ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＬＪ１＊０１又はＩＧＬＪ４＊０１である。例えば、本明細書で提供される抗ＤＬＬ４抗体は、ＩＧＨＶ１−４６＊０１、ＩＧＨＤ６−６＊０１及びＩＧＨＪ１＊０１から蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるＶＨ鎖並びにＩＧＫＶ３−１１＊０１及びＩＧＫＪ１＊０１生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるＶＬ鎖、ＩＧＨＶ５−５１＊０３、ＩＧＨＤ５−１８＊０１及びＩＧＨＪ４＊０１生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるＶＨ並びにＩＧＬＶ８−６１＊０１及びＩＧＬ１＊０１生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるＶＬ鎖、或いはＩＧＨＶ６−１＊０１及びＩＧＨＤ３−３＊０１及びＩＧＨＪ４＊０１生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるＶＨ鎖並びにＩＧＬＶ５−４８＊０１及びＩＧＬＪ４＊０１生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるＶＬ鎖を含む抗体又はその部分である。本明細書で提供される抗ＤＬＬ４抗体は、配列識別番号：１５１３で示されるアミノ酸配列を有するＶＨ鎖及び配列識別番号：１８５０で示されるアミノ酸を有するＶＬ鎖、配列識別番号：１８０３で示されるアミノ酸配列を有するＶＨ鎖及び配列識別番号：１８８１で示されるアミノ酸配列を有するＶＬ鎖、或いは配列識別番号：１８１２で示されるアミノ酸配列を有するＶＨ鎖及び配列識別番号：１８８４で示されるアミノ酸配列を有するＶＬ鎖を含有する抗体を含むが、それらに限定されるわけではない。例えば、本明細書で提供される抗ＤＬＬ４抗体の例は、配列識別番号：１５１３で示されるアミノ酸配列を有するＶＨ鎖及び配列識別番号：１８５０で示されるアミノ酸配列を有するＶＬ鎖を含む抗体である。抗ＤＬＬ４に結合する十分な抗原結合部位を形成し、及び／又はＤＬＬ４の活性を調節する、上記抗体のどれか一部を含む抗体も提供する。また、本明細書で提供される抗体のいずれかに比べ、配列において保存アミノ酸の変化を含むいずれかの抗体も提供される。
【００６０】  本明細書では、ＶＨ、ＤＨ及びＪＨ生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるＶＨ鎖及びＶκ及びＪκ生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるＶＬ鎖を含有する抗ＥｐｏＲ抗体を提供する。ＶＨ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＨＶ１又は遺伝子及びその対立遺伝子である。ＤＨ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＨＤ６又はＩＧＨＤ３或いは遺伝子及びその対立遺伝子である。ＪＨ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＨＪ１又は遺伝子及びその対立遺伝子である。Ｖκ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＫＶ４である。
Ｊκは、ＩＧＫＪ１である。本明細書で提供される抗ＥｐｏＲ抗体は、ＥｐｏＲを結合し、及び／又はＥｐｏＲの活性を調節する。
【００６１】  いくつかの例において、ＶＨ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＨＶ１−４６＊０１、ＩＧＨＶ１−４６＊０２又はＩＧＨＶ１−４６＊０３である。ＤＨ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＨＤ６−６＊０１、ＩＧＨＤ３−１０＊０１又はＩＧＨＤ３−１０＊０２である。ＪＨ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＨＪ１＊０１、ＩＧＨＪ４＊０１、ＩＧＨＪ４＊０２又はＩＧＨＪ４＊０３である。Ｖκ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＫＶ４−１＊０１である。Ｊκ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＫＪ１＊０１である。例えば、本明細書で提供される抗ＥｐｏＲ抗体は、ＩＧＨＶ１−４６＊０１、ＩＧＨＤ３−１０＊０１及びＩＧＨＪ４＊０１から蓄積されるヌクレオチド配列によってコードされるＶＨ鎖並びにＩＧＫＶ４−１＊０１及びＩＧＫＪ１＊０１生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるＶＬ鎖を含み、或いはＩＧＨＶ１−４６＊０１、ＩＧＨＤ６−６＊０１及びＩＧＨＪ１＊０１生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるＶＨ鎖並びにＩＧＫＶ４−１＊０１及びＩＧＫＪ１＊０１生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるＶＬ鎖を含む。抗本明細書で提供される抗ＥｐｏＲ抗体は、配列識別番号：１５０９で示されるアミノ酸配列を有するＶＬ鎖並びに配列識別番号：１８３８で示されるアミノ酸配列を有するＶＬ鎖、或いは配列識別番号：１５１３で示されるアミノ酸配列を有するＶＨ鎖及び配列識別番号：１８３８で示されるアミノ酸配列を有するＶＬ鎖を含有する抗体を含むが、それらに制限されるわけではない。抗ＥｐｏＲに結合し、及び／又はＥｐｏＲの活性を調節する十分な抗原結合部位を形成する上記抗体のどれか一部を含む抗体も提供する。また、本明細書で提供される抗体のいずれかに比べ、配列において保存アミノ酸の変化を含有するいずれかの抗体も提供する。
【００６２】  本明細書では、ＶＨ、ＤＨ及びＪＨ生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるＶＨ鎖及びＶκ及びＪκ生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるＶＬ鎖を含む抗ＥｒｂＢ２抗体を提供する。ＶＨ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＨＶ４又はＩＧＨＶ１或いは遺伝子及びその対立遺伝子である。ＤＨ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＨＤ６及びＩＧＨＤ１或いは遺伝子及びその対立遺伝子である。
ＪＨ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＨＪ１又はＩＧＨＪ２或いは遺伝子及びその対立遺伝子である。Ｖκ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＫＶ３又はＩＧＫＶ４である。Ｊκは、ＩＧＫＪ１又は遺伝子及びその対立遺伝子である。本明細書で提供される抗ＥｒｂＢ２抗体は、ＥｒｂＢ２を結合し、及び／又はＥｒｂＢ２の活性を調節する。
【００６３】  いくつかの例において、ＶＨ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＨＶ１−４６＊０１、ＩＧＨＶ１−４６＊０２又はＩＧＨＶ１−４６＊０３或いは、ＩＧＨＶ４−３１＊０１、ＩＧＨＶ４−３１＊０２、ＩＧＨＶ４−３１＊０３、ＩＧＨＶ４−３１＊０４、ＩＧＨＶ４−３１＊０５、ＩＧＨＶ４−３１＊０６、ＩＧＨＶ４−３１＊０７、ＩＧＨＶ４−３１＊０８、ＩＧＨＶ４−３１＊０９、ＩＧＨＶ４−３１＊１０である。ＤＨ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＨＤ６−６＊０１又はＩＧＨＤ１−２６＊０１である。ＪＨ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＨＪ１＊０１又はＩＧＨＪ２＊０１である。Ｖκ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＨＶ３−２０＊０１、ＩＧＨＶ３−２０＊０２又はＩＧＫＶ４−１＊０１である。Ｊκ生殖細胞系セグメントは、ＩＧＫＪ１＊０１である。例えば、本明細書で提供される抗ＥｒｂＢ２抗体は、ＩＧＨＶ４−３１＊０２、ＩＧＨＤ１−２６＊０１及びＩＧＨＪ２＊０１から蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるＶＨ鎖並びにＩＧＫＶ３−２０＊０１及びＩＧＫＪ１＊０１生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるＶＬ鎖、或いはＩＧＨＶ１−４６＊０１、ＩＧＨＤ６−６＊０１及びＩＧＨＪ１＊０１生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるＶＨ並びに配列によりコードされるＶＬ鎖を含む。本明細書で提供される抗ＥｒｂＢ２抗体は、配列識別番号：１７６０で示されるアミノ酸配列を有するＶＨ鎖及び配列識別番号：１８３３で示されるアミノ酸配列を有するＶＬ鎖、又は配列識別番号：１５１３で示されるアミノ酸配列を有するＶＨ鎖及び配列識別番号：１８３８で示されるアミノ酸配列を有するＶＬ鎖を含有する抗体を含むが、それらに制限されるものではない。抗ＥｒｂＢ２に結合する及び／又はＥｒｂＢ２の活性を調節する十分な抗原結合部位を形成する上記抗体のどれか一部を含む抗体も提供する。また、本明細書で提供される抗体のいずれかに比べ、配列において保存アミノ酸の変化を含むいずれかの抗体も提供される。
【００６４】  本明細書で提供される抗体のいずれかは、重鎖及び軽鎖の会合を可能にするのに十分な定常領域又は一部の定常領域を更に含むことが可能である。例えば、本明細書で提供される抗体は、Ｆａｂ抗体を含む。更に、本明細書で提供される抗体のいずれかは、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ又は１０−１２Ｍ又はそれ未満である、或いは大体そうである結合親和性を有する抗体を含む。例を挙げると、本明細書で提供される抗体のいずれかは、１ｘ１０−９Ｍ、２ｘ１０−９Ｍ、３ｘ１０−９Ｍ、４ｘ１０−９Ｍ、５ｘ１０−９Ｍ、６ｘ１０−９Ｍ、７ｘ１０−９Ｍ、８ｘ１０−９Ｍ、９ｘ１０−９Ｍ、１ｘ１０−１０Ｍ、２ｘ１０−１０Ｍ、３ｘ１０−１０Ｍ、４ｘ１０−１０Ｍ、５ｘ１０−１０Ｍ、６ｘ１０−１０Ｍ、７ｘ１０−１０Ｍ、８ｘ１０−１０Ｍ、９ｘ１０−１０Ｍ又はそれ未満である、或いは大体そうである結合親和性を有する。
【００６５】  本明細書では、本明細書で提供されるスクリーニング法で同定される抗体のいずれかを含む、本明細書で提供される抗体のいずれかを使用する処理方法を提供する。こうした抗体は、標的タンパク質の発現及び／又は活性と関連する疾患又は障害の治療に用いることができる。一例を挙げると、本明細書では、ＤＬＬ４の発現及び／又は活性と関連する疾患又は障害を治療するため本明細書で提供される抗ＤＬＬ４抗体のいずれかを用いて、治療法或いは薬剤の扱い又は処方の用途を提供する。他の例において、本明細書では、ＥｐｏＲの発現及び／又は活性と関連する疾患又は障害を治療するため本明細書で提供される抗ＥｐｏＲ抗体のいずれかを用いて、治療法或いは薬剤の扱い又は処方の用途を提供する。更なる例において、本明細書では、ＥｒｂＢ２の発現及び又は活性と関連するし疾患又は障害を治療するため本明細書で提供される抗ＥｒｂＢ２抗体を使用する治療法を提供する。
【００６６】  本明細書では、ヒト生殖細胞系セグメントを組合わせる方法を実施するコンピュータデバイスによって実行可能で、コンピューターに読み込み可能な指示を含む、コンピュータシステム又はコンピュータ読み込み可能な媒体を含む。ヒト生殖細胞系セグメントの組合せ方法は、（ａ）利用可能な全ヒト抗体生殖細胞系セグメント（ＶＨ、ＤＨ、ＪＨ、Ｖκ、Ｊκ、Ｖλ及びＪλ）のユーザ作成のコンピュータによるデータベースにアクセスすることと、（ｂ）重鎖をコードする可能な全ての組み換えられた完全長の核酸配列の集より（５’−ＶＨ−ＤＨ−ＪＨ−３’）を生成するためアルゴリズムを適用することと、（ｃ）カッパ軽鎖をコードする可能な全ての組み換えられた完全長の核酸配列（５’−Ｖκ−Ｊκ−３’）及び／又はラムダ軽鎖をコードする可能な全ての組み換えられた完全長の核酸配列（５’−Ｖλ−Ｊλ−３’）の集まりを生成するためアルゴリズムを適用することと、（ｄ）得られた核酸配列がインフレームであるよう（ｂ）の核酸配列のＶ−Ｄ及び／又はＤ−Ｊ結合部並びに（ｃ）の核酸配列のＶ−Ｊ結合部でヌクレオチドを修飾するためアルゴリズムを適用することと、（ｅ）不注意に生成されたあらゆる停止コドンを除去するため、（ｄ）の核酸配列を修飾することと、（ｆ）アドレス可能な構成の固有の位置に組み換えられた各核酸配列を割り当てることと、並びに（ｇ）組み換えられた各核酸配列のアドレスを同定する出力ファイルを生成することとの段階を含む。
コンピュータシステム又はコンピュータ読み込み可能な媒体で実行される方法は、（ｈ）段階（ｅ）の後、制限酵素によって認識される配列を含む組み換えられた核酸配列の５′及び３′末端でヌクレオチドを追加することと、並びに（ｉ）制限酵素によって認識される内部ヌクレオチドを除去するため、ヌクレオチドの置換によって組み換えられた核酸配列を修飾することとを更に含むことができる。前記方法は、細菌発現に対するコドン使用を最適化するため、組み換えられた核酸配列を更に修飾することができる。いくつかの例において、コンピュータシステム又はコンピュータ読み込み可能な媒体により実行される方法は、段階（ｆ）の前に、配列の類似性及び相違性に基づいて、組み換えられた核酸配列のライブラリーから組み換えられた核酸配列を選択すること及び段階（ｆ）のアドレス可能な構成における位置へ選択された配列のみを割り当てることを含み得る。
【００６７】  本明細書では、コンピュータデバイスによってヒト生殖細胞系セグメントを組合わせる方法を実行するため、コンピュータ読み込み可能な指示の実行を含む方法を提供し、前記方法は、（ａ）利用可能な全てのヒト抗体生殖細胞系セグメント（ＶＨ、ＤＨ、ＪＨ、Ｖκ、Ｊκ、Ｖλ及びＪλ）のユーザ作成のコンピュータによるデータベースにアクセスすることと、（ｂ）重鎖をコードする可能な全ての組み換えられた完全長の核酸配列（５’−ＶＨ−ＤＨ−ＪＨ３’）の集まりを生成するため、アルゴリズムを適用することと、（ｃ）カッパ軽鎖をコードする可能な全ての組み換えられた完全長の核酸配列（５’−Ｖκ−Ｊκ３’）及び／又はラムダ経鎖をコードする可能な全ての組み換えられた完全長の核酸配列（５’−Ｖλ−Ｊλ−３’）の集まりを生成するため、アルゴリズムを適用することと、（ｄ）得られた核酸配列がインフレームであるよう、（ｂ）の核酸配列のＶ−Ｄ及び／又はＤ−Ｊ結合部並びに（ｃ）の核酸配列のＶ−Ｊ結合部においてヌクレオチドを修飾するためアルゴリズムを適用することと、（ｅ）不注意に生成されたあらゆる停止コドンを除去するため、（ｄ）の核酸配列を修飾することと、（ｆ）アドレス可能な構成の固有の位置に組み換えられた各核酸配列を割り当てることと、並びに（ｇ）組み換えられた各核酸配列のアドレスを同定する出力ファイルを生成することとの段階を含む。前記方法は、重鎖をコードする、カッパ軽鎖をコードする、及び／又はラムダ経鎖をコードする、組み換えられた核酸配列のＤＮＡ合成、或いは、重鎖をコードする、カッパ軽鎖をコードする、及び／又はラムダ経鎖をコードする、一部の組み換えられた核酸配列のＤＮＡ合成を更に含む。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】抗体の多様性を生成する方法の模式図。図１は、抗体の多様性がどうやって、組み合わせの多様性、様々組み合わせ、接合の多様性を含むんでいます。
【図２】抗体検出の反復法の模式図。図２ａは、様々な可変重鎖および軽鎖をエンコードした拡散の列を生み出す重鎖及び軽鎖セグメントを組み合わせた１）のメソッドの描写です。３）重鎖と軽鎖の表現と関係性によって抗体の多元性を生み出す。抗体を純化する事で（ピッコロとＦＬＰＣ浄化を使用するなど）そして活動の為の（例えば束縛もしくは機能的な活動）抗体のスクリーニングをする事で抗体の精製を生み出します。図２ｂは、最適化されている、または活動の改善ＨＩＴＳアルゴリズムを識別するために識別される”ＨＩＴＳ”に基づいてメソッドを繰り返し含むその他の関連抗体を識別するために反復法の描写です。
【図３】ベクトルマッププラスミド。図３は、プラスミドＡの提供し、ここで詳細に説明するの例示ベクトル地図です。
【図４】プラスミドＤのベクトルマップ。図４は、プラスミド開発、提供し、ここで詳細に説明するの例示ベクトル地図です。
【図５】プラスミドＣのベクトルマップ。図５は、プラスミドのＣ、提供し、ここで詳細に説明するの例示ベクトル地図です。
【図６】プラスミドＥベクターマップ。図６はプラスミドメール、提供し、ここで詳細に説明するの例示ベクトル地図です。
【図７】ＤＮＡ塩基配列編集ソフトウェアの模式図モジュール。図７はＤＮＡ塩基配列編集ソフトウェア内に含まれている１０モジュールを示しています。示すように、ＧＵＩ（グラフィカルユーザーインターフェイス）は、ＧＵＩコントロール、コンパイルルールとＮＣＢＩのツールを含む４つの層があります。加えて、モジュール間の関連が示されている。
【図８】アルゴリズム重鎖および軽鎖の組み合わせ。図８は、生殖細胞のセグメントのエンコーディングから、可変重鎖または可変軽鎖を組換え核酸配列を生成するためのアルゴリズムの模式図である。
【図９】シーケンスをコンパイルするためのアルゴリズム。図９は、組換え核酸配列のエンコード機能可変重鎖または可変軽鎖変更するためのフローチャートである。
【図１０】ランキングシーケンスのためのアルゴリズム。図１０はランク組換え変数の多様性のスコアとクラスタ情報に基づいて、重鎖および軽鎖のためのフローチャートである。
【図１１】シーケンスデータベースのファイル形式の模式図。図１１は、配列データベースファイルの形式を示しています。財経部Ｉ制限部位（配列番号：１９００）は、：図解はＶＨ１−１８（配列番号：１０）、ＶＨ１−２（配列番号：１３）、ＩＧＨＤ１−１＊０１（配列番号：２３９）、ＩＧＨＪ１＊０１（配列番号：２７３）、ＡＩ（配列番号：３３０）、Ａ１０（配列番号：３５４）、ＩＧＫＪ１＊０１（配列番号：３５６）、Ｖ１−１１（配列番号：３６５）、Ｖ１−１３（配列番号：３６６）、ＩＧＬＪ１＊０１（配列番号：４４２）、ＩＧＬＪ２＊０１（配列番号：４４３）、を含む、典型的なシーケンスです。
【図１２】ＤＮＡ塩基配列編集ソフトウェアの初期起動画面。図１２は、ＤＮＡ塩基配列編集ソフトウェアの最初の起動画面を示しています。イラストは、５′末端配列ＣＣＡＴＧＧＣＡ（配列番号：１９０１）、５′端シーケンスＣＣＡＴＧＧＣＧ（配列番号：１９０２）、３′端シーケンスＣＴＡＧＣ（配列番号：１９０３）および３′端シーケンスＧＴＡＣＴ（配列番号番号：１９０４）。
【図１３】ＤＮＡ塩基配列編集ソフトウェアのスプラッシュ画面。図１３は、アプリケーションの起動時に表示されるスプラッシュ画面を示しています。
【図１４】ＤＮＡ塩基配列編集ソフトウェア９６ウェルプレート画面。図１４は、コンパイルされた配列を含むモデルを９６ウェルプレートの画面を示しています。ｇｎｌ・Ｆａｂｒｕｓ・Ｖ３を−４＿ＩＧＬＪ７＊０１（配列番号：１９０６）のシーケンスは、シーケンス情報］ボックスに示されています。
【図１５】ＤＮＡ塩基配列編集ソフトウェア軽鎖マニュアル編集画面。図１５は、ユーザーがいずれかのカッパまたはラムダ軽鎖をコンパイルすることができますモデルマニュアルコンパイル画面を示しています。ＶＬのシーケンスボックスで選択されＶ１が−１１（配列番号：３６５）。ＪＬのシーケンスボックスで選択して、ＩＧＬＪ１＊０１（：４４２配列番号）です。全長配列（配列番号：１９１４）のＤＮＡ配列のボックスに示されています。
【図１６】ＤＮＡ塩基配列編集ソフトウェア重鎖マニュアル編集画面。図１６は、重鎖をコンパイルすることができますモデルマニュアルコンパイル画面を示しています。ＶＨのシーケンスボックスで選択されＶＨ１−１８（配列番号：１０）。ＤＨのシーケンスボックスで選択して、ＩＧＨＤ１−１＊０１（：２３９配列番号）です。公団シーケンス］ボックスで選択して、ＩＧＨＪ１＊０１（：３７３配列番号）です。全長配列（配列番号：１９１５）のＤＮＡ配列のボックスに示されています。
【図１７】ＤＮＡ塩基配列編集ソフトウェア軽鎖自動コンパイル画面。図１７は、モデルの軽鎖の自動コンパイル画面を示しています。イラストは、配列番号：１８８０−１８８１年、１８８３年、１９０５年から１９１３年と１９１６年から１９４０年に記載され可変軽鎖の典型的なシーケンスです。
【図１８】ライトチェーンＢＬＡＳＴのグリッド。図１８は、軽鎖配列のモデルＢＬＡＳＴのグリッドを示しています。イラストは、配列番号：１８８０−１８８１年、１８８３年、１９０５年から１９１３年、１９１６年から１９３９年に記載され可変軽鎖の典型的なシーケンスです。
【図１９】ＤＮＡ塩基配列編集ソフトウェア重鎖の自動コンパイル画面。図１９は、モデルの重鎖の自動コンパイル画面を示しています。１５５６、１７６０、１７６９、１８２１、１９４１年から１９７３年：図解は、配列番号９３３に設定された変数の重鎖の典型的なシーケンスです。
【図２０】重鎖ＢＬＡＳＴのグリッド。図２０は、重鎖配列のＢＬＡＳＴのグリッドのモデルを示しています。図はＳＥＱ  ＩＤＮＯＳ：１５３０、１５３９、１９７４−１９９５の前にある様々な重鎖の典型的な列です。詳細な説明
【００６９】概要【００７０】Ａ  定義
Ｂ．概観【００７１】１  アドレス指定可能な組合せ抗体コレクションを生成する方法
２  結果としてのライブラリー
３  ライブラリの応用
Ｃ．抗体
１  抗体ポリペプチド
２  抗体の構造と機能ドメイン
３  抗体配列と特異
Ｄ  コンビナトリアル抗体ライブラリの生成メンバーのメソッド
１  機能組換え生殖細胞の可変領域の製造方法
Ａ  可変遺伝子セグメント
ｉ．生殖細胞セグメント
ＩＩ  変更された生殖細胞の種類別セグメント
Ｂ  選択生殖細胞の種類別セグメントまたは変更されたセグメント及び
ｃ．シーケンス編集
ｄ．再結合された核酸分子のさらなるシーケンス変更
ｉ．コドン使用
ＩＩ  制限酵素のサイトの追加または削除
ＩＩＩ  リンカー
ＩＶ  タグまたは検出可能な部分
Ｖ  対変異の多様性
ＶＩ  監督ペプチド
ｅ  大腸菌生成可変重鎖および軽鎖配列および核酸分子
ｉ．貯蓄と収集
ＩＩ  収集の決定配列の多様性
核酸アミノ酸配列
ＩＩＩ  核酸分子の生成
ａ）合成
ｂ）組換え技術
ｆ．表現およびその抗体または一部またはライブラリ内のメンバーの結果によるメンバーフラグメント
２  オートメーション
ａ．使用者作成データベース
ｂ．シーケンス編集
ｃ．タンパク質の発現および精製の自動化
Ｅ  ライブラリ
１  ＶＨの核酸ライブラリとベクトルのライブラリ等及び
２  ＶＬの核酸ライブラリとベクトルのライブラリ等及び
３  ペア核酸ライブラリまたはベクトルライブラリ等及び
４  抗体ライブラリ
５  アドレス指定可能なフォーマット
Ａ  マルチウェルプレートプレート
Ｂ  固体サポート
６  その他の表示方法
Ａ  セル表示
Ｂ  ファージディスプレイ
ｃ．ｍＲＮＡの表示とリボソームディスプレイ
ｄ．ＤＮＡの表示
Ｆ  抗体の生産．メソッド
１  ベクトル
２  細胞発現システム
Ａ  原核生物の発現
Ｂ  酵母
ｃ  昆虫
ｄ  哺乳動物細胞
ｅ  植物
３  精製
Ｇ  アプリケーションとライブラリの使用
１  結合分析
２  機能活動
ａ  分化
ｂ  遺伝子表現の交代
ｃ  細胞毒性活性
３  ターゲット
膜結合タンパク質、受容体とリガンドより
ｉ  ノッチとノッチのリガンド
ａ）ノッチタンパク質
ｂ）ＤＬＬ４
ＩＩ  ＥｒｂＢファミリー
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）
ｂ）ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）
ＩＩＩ  ＩＧＦ−Ｒ１が（インスリン様成長因子１受容体）
ＩＶ  ｃ−Ｍｅｔ
Ｖ  ＣＤ２０−Ｂリンバ球抗原
ＶＩＩ  エリスロポエチン受容体（Ｅｐｏ−Ｒ）
ＶＩＩＩ  カドヘリン
ａ）Ｐ−カドヘリン（Ｐ−ｃａｄ／ＣＤＨ３）
ＩＸ  ＣＤ４４
４  反復スクリーニング
５  指向進化
ａ  ランダム突然変異誘発
ｉ  飽和突然変異誘発
ＩＩ  エラーしやすいＰＣＲ
ＩＩＩ  細胞株
ＩＶ  ＤＮＡシャフリング／抗体鎖シャッフリング
Ｖ  ＣＤＲワーキング
ＶＩ  フレームワークの安定化
６  エピトープのマッピング
７  同定された体内での試験
８  製造／キットの記事
９  製剤／主管庁および抗体およびポリペプチドの使用
Ｈ  例【００７２】Ａ  定義
定義されている場合を除き、すべての技術および科学用語は、発明に属す芸術のスキルによって理解されているのと同じ意味を有する。すべての特許、特許出願、公開されたアプリケーションや出版物、遺伝子銀行シーケンス、データベース、ウェブサイトやその他の出版物、全体の開示はここで呼ばれます。イベントではこのセクションでは、これらが優先、ここでの情報開示全体を通じて言及されたその他出版された物、その他はそれら全体に言及により結合された。用語の定義が複数存在するイベントにおいて、このセクションは開示される。参照ＵＲＬまたはそのような他の識別子またはアドレスにあった場合には、そのような識別子は変更することができますしインターネット上の特定の情報の行き来する事ができます、しかし同等の情報はインターネットを検索して見つけることができます。リファレンスはこのような情報の利用可能性をして公開普及を証拠としている。【００７３】ここで使用されるように、”コンビナトリアルライブラリには、”ビルディングブロックの組み合わせに基づいて化合物のコレクションを生成するために交換可能な化学”ビルディングブロック”のさまざまな組み合わせを反応させることにより形成される化合物のコレクションを指します。抗体コンビナトリアルライブラリーについては、ビルディングブロックは、コンポーネントＶ、Ｄ、およびそこから抗体が形成されているＪの領域（または変更されたフォームのもの）から出来ている。目的のためにここでは、”ライブラリ”または”コレクション”は同じ意味で使用されます。【００７４】ここで使用されるように、結合抗体ライブラリーは、抗体のコレクション（またはファブなどその一部）であり、その抗体は、Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子セグメント、特にヒューマンＶ、ＤおよびＪ生殖セグメントの組み合わせによって生成される核酸分子によってコードされています。結合ライブラリーここに典型的に約５０の異なった抗体、（または抗体部分またはフラグメント）のメンバーまたは５０、１００、５００、１０３、２×１０３、３×１０３  ４×１０３  ５×１０３、６×１０３、７×１０３、８×１０３  ９×１０３、１×１０４  ２×１０４  ３×１０４  ４×１０４  ５×１０４、６×１０４  ７×１０４、８×１０４  ９×１０４、１×１０５  ２×１０５、３×１０５倍１０５  ５×１０５、６×１０５  ７×１０５  ８×１０５  ９×１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、またはそれ以上の異なるメンバーを含んでいる。結果のライブラリーまたは抗体もしくはその一部のまたは全部のコレクションは、その標的タンパク質や変調機能活動の調整にバインドするためのスクリーニングされることができる。【００７５】ここで使用されるように、人間の組み合わせ抗体ライブラリーは、抗体もしくはその一部の集まりで、それにより各メンバーがＶＬとＶＨ鎖またはヒト生殖細胞のセグメントを含む核酸によってコードされる抗原結合部位を形成するためにまたはその十分な部分を含んでいます。【００７６】ここで使用されるように、遺伝子のセグメント（Ｉｇ）の可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）と接合部（Ｊ）または定数（Ｃ）の遺伝子を生殖細胞からのエンコード免疫グロブリン重鎖または軽（カッパとラムダ）鎖免疫グロブリンを参照してください。生殖細胞の中には複数のＶ、Ｄ、ＪおよびＣ遺伝子セグメントがあり、しかし遺伝子再構成結果それぞれの機能再編成の遺伝子で発生する唯一の１つのセグメントになる。たとえば、機能的に再編成の重鎖は、１つのＶ、１つのＤと１つのＪと機能的に再構成されたＶとＪを含む軽鎖遺伝子を配置した機能的なＶとＤを含んでいるそして１つのＪそして機能的に配置された軽鎖。ここで、これらの遺伝子のセグメントは、生殖細胞で運ばれるそして機能遺伝子になるまで重鎖と軽鎖に移すことができない。。骨髄のＢ細胞の分化中に、これらの遺伝子のセグメントがランダムに１０１０以上の種類を生み出す事ができる特異遺伝子システムの中からシャッフルされます。ここでの目的として、遺伝子のセグメントは組み合わせ、または個々の生殖細胞のセグメントのコンパイルによって試験管内で再配置されます。【００７７】Ｂ変数生殖セグメントに言及すると、Ｖ、ＤとＪのグループ、サブグループ、遺伝子や対立遺伝子そのに関連付けられています。遺伝子断片配列が知られているデータベースからアクセス可能で（例えば、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）、国際的免疫情報システム▲Ｒ▼（ＩＭＧＴ）、ＫａｂａｔデータベースとトムリンソンのＶＢａｓｅデータベース（Ｌｅｆｒａｎｃ（２００３）核酸解像度、３１：３０７〜３１０；Ｍａｒｔｉｎら、治療用抗体、ワイリーＶＣＨのハンドブックの抗体工学のためのバイオインフォマティクスツール（２００７）、頁１０４から１０７）表３−５リストは典型的な人間の変数生殖セグメントです。典型的な配列ＶＨ、ＤＨ、ＪＨ、Ｖ、Ｊ、ＶおよびまたはＪ、生殖細胞のセグメントは、【００７８】ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１０−４５１と８６８の前にあります。その目的の為にここで、生殖細胞のセグメントは修正された配列を含む生殖細胞、そしてそれは方法の練習をする為に編集の列の法則とともに一致するよう修正された。例えば、生殖細胞の遺伝子セグメントは１つのアミノ酸欠如またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１０−４５１，８６８の前に置かれた核酸のどんな配列と比べても５′または３′への挿入を含んでいる。【００７９】ここで使用されるように、ヌクレオチドの配列に言及される生殖細胞セグメントを参照して変更されたフォームは、例えば、ヒト生殖細胞のセグメントの配列の中にある配列と比べて２，３，４，５，６，７，８，９，または１０核酸と異なっているように、１つもしくはちょっとした核酸の相違を含む核酸の配列を除く（例えばＶＨ、ＤＨ、ＪＨ、Ｖ・、Ｊ・、Ｖ・そしてＪ）ヒューマン生殖細胞セグメントのヌクレオチドの配列と大体同じような核酸の配列に言及されている。いくつかの例では、変更された生殖細胞系列は、終止コドン、制限酵素サイトを削除、リーディング構造を維持する為に追加または削除されたヌクレオチドを移動させる法則を一致させるために修正されている。【００８０】ここで使用されるように、生殖細胞のセグメントのヌクレオチドを参照して反転シーケンスは、遺伝子のセグメントは、逆のヌクレオチドの基準シーケンスの補数であるヌクレオチドの配列を有することを意味します。ここで目的のために、ヌクレオチドの基準シーケ���スは生殖細胞のセグメントは、通常のＤＨ生殖セグメントです。【００８１】ここで、”編集”、”コンパイル”、”結合”、”組み合わせ”、”配置”、”転位”、または他の類似の用語や文法のバリエーションを使用されるように、そのどのによる生殖細胞セグメントは核酸配列表現遺伝子に注文されるか組み立てられる。たとえば、変数の重鎖の生殖細胞のセグメントはＶＨのセグメントが５で、ＤＨセグメントが５で、ＪＨセグメントにつながっている、それをコードする核酸配列ＶＨのチェーンに行き着く。可変軽鎖の生殖細胞のセグメントは、核酸配列をコードするＶＬ鎖の結果、ＶＬのセグメントはＪＬのセグメントに５′である。。一定の遺伝子セグメントまたはセグメントもコードする核酸ＶＨまたはＶＬ鎖の３′末端に組み立てることができます。【００８２】ここで使われたように、”結合した”もしくは”結合”もしくは他の文法上の分類は、それゆえ生殖細胞、そして生殖細胞への参加に言及される。リンケージは、直接または間接的にすることができます。生殖細胞系列のセグメントはセグメントと追加的なヌクリオタイドまたは追加的なヌクリオタイドが枠組み内セグメント全体に影響を与える為加えられたが、ヌクリオタイドが枠組みセグメントの結果を受けて消去されることがありうる。これは、リンカのヌクレオチドの選択は、結果の核酸分子はインフレームになるように、機能と生産性抗体をエンコードしたことが理解される。【００８３】ここで使われたように、”フレーム内”や人間の生殖細胞のセグメントの結合を参照した”リンクされた枠”は、５コドン（ＡＴＧ）ヌクリオタイド酸分子枠とそれにより作られた”生産的な”また機能的な十分な長さのポリペタイドお組み合わせによるヌクリオタイド生殖細胞セグメントの中にあります。ヌクレオチドの選択は、様々なＶＤ、ＤＪやＶＪのセグメントを結合するジョイント特に生殖細胞のセグメント、またＶ（Ｄ）接合にメソッドを与える規則と共に生殖細胞セグメントから挿入または消去される。たとえば、生殖細胞のセグメントはＶＨセグメント５からＤＨ５セグメントへ、そしてそこからＪＨセグメントへ送られる。ＶＨセグメント、例えば接合されたＶＤＪセグメントが５開始コドン（ＡＴＧ）とフレームであるようなＪＨセグメントに挿入または消去される。【００８４】例えば生殖セグメントはＶＨセグメント５からＤＨセグメント５ＤＨへそして、そこからＪＨセグメントのように送られる。
ここでは”機能的な抗体”または”生産性抗体”を使用しているように本明細書中で説明するコードする核酸抗体またはその一部抗体またはその一部はＦａｂなどの方法によって生成される。機能や生産性の抗体では、Ｖ（Ｄ）Ｊ組生殖細胞のセグメント（つまり、並べ替え）のようなエンコードされた抗体またはその部分は切り捨てられていない／又はアミノ酸の配列が出て枠の外にないものはコンパイルされます。これは、核酸分子が内部終始コドンを含んでいない結果、タンパク質の翻訳機構の結果が途中でタンパク質の集合を終了することにつながる。
ここで使用されるように、抗体の一部は、結合部位の抗原を形成するのに十分なアミノ酸が含まれています。
ここで使用されるように、リーディングフレームは、連続と非オーバーラップの三塩基コドンのＤＮＡまたはＲＮＡの重複を指します。三コドンが１つのアミノ酸をエンコードするために、フレーム１、２または３読んで、特定の塩基配列の３つのリーディングフレームが存在しています。たとえば、シーケンスＡＣＴＧＧＴＣＡはフレーム１を読むことでＡＣＴＧＧＴＣＡになる、ＡＣ  ＴＧＧ  ＴＣＡを読み取る事でフレーム２に、そしてＡＣＴ  ＧＧＴＣＡを読む事でフレーム３になります。【００８５】ここで使用されるように、終止コドンは、翻訳中のタンパク質合成の停止を通知する三塩基配列、または黄色の停止を含むシーケンスは（コードするＤＮＡ配列のＲＮＡの終止コドン配列など）は任意のシーケンスのエンコーディングを参照するために使用されるコドン（ＵＡＧを結またはＴＡＧ））、黄土色の終止コドン（ＵＡＡもしくはＴＡＡ））とオパール終止コドン（ＵＧＡまたはＴＧＡ））を含む。それは必要がないことをすべてのセルまたはすべての生物の翻訳の終止コドンの信号が止まるという意味で重要ではない。たとえば、少なくともいくつかの時間の１つ以上の終止コドン（アンバーサプレッサー株のオレンジ色の終止コドンなど）を通じて、オレンジ色抑制系統と部分的なアンバーサプレッサー株、翻訳の進行などの抑制ひずみ宿主細胞インチ【００８６】抗体の可変ドメインを構成するポリペプチド鎖を参照する変数、（ＶＨ）鎖または可変光（ＶＬ）チェーン（ＶＨのドメインまたはＶＬドメインとも呼ばれている）を参照し、様々なドメインの抗体を作ります。ここでの目的は、重鎖生殖セグメントはＶＨ、ＤＨおよびＶＨチェーンをエンコードした核酸の結果作られる。軽鎖の生殖細胞のセグメントは、ＶＬまたはＪＬをとして指定され、カッパ及びラムダ軽鎖を含む（Ｖ・とＪ・；Ｖ・とＪ・）とコンパイル、その結果をコードする核酸のＶＬ鎖により作られる。軽鎖チェーンはいずれかのカッパまたはラムダ軽鎖であることを理解され、しかしＶ・とＪ・のコンパイルの効果により、カッパ、ラムダのを含まない。
ここで使用されるように、”縮重コドン”親の塩基配列のコドンと同じアミノ酸を指定する３塩基のコドンを意味する。当業者の一つは、遺伝コードの縮重に精通しているコドンの縮退識別することができます。【００８７】ここで使用されるように、生殖細胞のセグメントを参照した”グループ”とは、変数（Ｖ）遺伝子、多様性（Ｄ）遺伝子、結合（Ｊ）遺伝子または定数（Ｃ）をコードする遺伝子、すなわち免疫グロブリンからコアコーディング領域を参照にしている。生殖セグメントグループの例としては、ＶＨ、ＤＨ、ＪＨ、Ｖ・、Ｊ・、Ｖ・およびＪ・が含まれています。【００８８】ここで使用されるように、生殖細胞のセグメントを参照した”サブグループ”は、”塩基配列の類似性またはアイデンティティで定義されている列の集合を意味する。一般的に、サブグループは、特定の種で同じグループが［Ｖ、Ｄ、ＪまたはＣ］に属する遺伝子のセット、および共有している塩基配列レベルで少なくとも７５％遺伝子配列です。サブグループは、ＩＭＧＴ命名法に基づいて分類されます（ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ；例えば、ラフランク（２００８）バイオインフォマティクスのブリーフィング、９：２６３−２７５）。一般的に、サブグループは多重遺伝子族を表します。【００８９】ここで使用されるように、遺伝子の対立遺伝子は配列多型をコード領域内の１つまたは複数のヌクレオチドの違いリファレンス遺伝子配列（例えば置換、挿入または削除）と比較してのためにしている配列を生殖細胞を参照してください。したがって、同じサブグループに属しているＩＧの配列は、非常にそのコード配列で同様のことができるにもかかわらず高多型を示す。サブグループの対立は、２つの図の番号が続くアスタリスク（＊）が付いてＩＭＧＴ命名法に基づいて分類されます。例としては対立表３−５に記載されているＶＨ、ＤＨ、ＪＨ、Ｖ・は、Ｊ・、Ｖ・およびＪ・のセグメント生殖細胞の典型的な対立遺伝子。【００９０】ここで使用されるように、生殖細胞のセグメントを参照して”家族”はアミノ酸配列の類似性またはアイデンティティで定義されている生殖セグメント配列のセットを指します。一般的に、生殖細胞の家族は、遺伝子のすべての対立遺伝子が含まれています。【００９１】ここで使用されるように、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００ヌクレオチドの長さのヌクレオチドの任意の配列を意味する”指定されたＤＨセグメント”です。ヌクレオチドの配列は、ＶＨ鎖のＣＤＲ３領域の一部のコードには十分です。【００９２】ここで使用されるように、Ｖ、Ｄまたは”生殖細胞のセグメントに由来する”Ｊ遺伝子セグメントへの参照は、組換えイベントによっては、Ｖ、ＤまたはＪ生殖細胞の遺伝子に由来するＶＨまたはＶＬの核酸配列の対応するヌクレオチドをと一致します。【００９３】ここで使用されるように、抗体またはその一部またはその断片のＶ領域、Ｄ領域またはＪ領域に言及される事で、対応するＶ、ＤまたはＪの生殖細胞の種類別セグメントの遺伝子から派生し組換えのイベントによりヌクリオタイドにエンコードされたアミノ酸に一致する。
ここで使われたように、コレクション内の一意のメンバーの数を指し、ここでコレクション内のメンバーに対して”多様性”を使用している。したがって、多様性は、そのコレクションの類似ポリペプチドメンバーの間で、それぞれ異なるアミノ酸配列または核酸配列、の数を指します。たとえば、１０４の多様性を有するポリヌクレオチドのコレクションは、類似のポリヌクレオチドのメンバーの間で１０４の異なる核酸配列が含まれています。一例では、ポリヌクレオチドのコレクションを提供する／またはポリペプチドは、少なくともまたは１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０以上の多様性を持っています。
ここで使用されるように、”多様性比は、”ライブラリの総数以上のライブラリ内の別のメンバー数の割合を指します。
したがって、他のライブラリよりも多様性比のライブラリには、総数ごとに別のメンバー、全メンバーごとにこのように多くの多様性が含まれています。提供されているライブラリは、ライブラリが約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、または０．９９のような、１に近い多様性比などの高度な多様性比を含みます。【００９４】ここで使用されるように、”配列の多様性”は、核酸配列の類似性の表現を参照して配列アライメント、多様性のスコア、および／またはシーケンスクラスタリングを使用して決定されます。任意の二つの配列は、配列をサイドバイサイドを敷設し、配列の長さに沿ってすべての位置でヌクレオチド以内に違いを解析することにより、整列することができます。配列アライメントは、基本的なローカル配列検索ツール（ブラスト）、核酸を比較するためのＮＣＢＩのツールおよび／またはタンパク質配列使用してインスリコで評価することができる。配列アライメントのブラストの使用は、当業者に知られている。ブラスト検索アルゴリズムは、２つのシーケンスを比較し、それぞれの統計的有意性が一致して計算されます（ブラストによる）。ほとんどお互いに類似しているシーケンスが最も低ブラスコアを持って変化させ配列に対し、高いブラストスコアが高くなります。【００９５】ここで使用されるように、抗体は、自然にまたは部分的または完全に合成、そのような組換えとして、任意の部分は、その抗原を形成するのに十分な免疫グロブリン分子の可変領域の少なくとも一部を含有するものを含む、生産かどうかを、免疫グロブリンおよび免疫グロブリンの部分を指す結合部位。したがって、抗体またはその部分は、免疫グロブリンの抗原結合部位と相同または実質的に結合ドメインを有する任意のタンパク質が含まれています。たとえば、抗体は、（これはＨとＨを示すことができる′）は、２つの重鎖を含む抗体を意味すると２つの軽鎖（示すことができるＬとＬ′）、各重鎖はフルレングスの免疫グロブリンできる場所重鎖またはその部分は、抗原結合部位を形成するのに十分な（しかし、重鎖を含む例えば、ＶＨは、これらに限定されない、チェーン電圧ＶＨ−ＣＨ１の鎖とＶＨ−ＣＨ１の−ＣＨ２の−ＣＨ３の鎖）、および各軽鎖はすることができますフルレングスの軽鎖またはｐｒｏｔｉｏｎその（ただし、軽鎖を含む、例えば、ＶＬの鎖とＶＬ−ＣＬは鎖に限定されない）抗原結合部位を形成するのに十分な。各重鎖（ＨとＨ′）一軽鎖（ＬとＬさんとペアのそれぞれ）。通常、抗体は、最小限の全部又は少なくとも（ＶＨ）が鎖および／または可変光（ＶＬ）の鎖可変重の部分が含まれています。抗体はまた、すべての定数または領域の一部を含めることができます。【００９６】目的のためにここでは、抗体という用語は、完全長抗体およびその一部のような抗体フラグメントを含み、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ＦＤおよびＦｄ、′Ｆａｂフラグメント、ＦｄフラグメントおよびｓｃＦｖフラグメントを断片化します。その他の既知の断片は、ｓｃＦａｂ断片（ハストら、ＢＭＣバイオテクノロジー（２００７）、７：１４）に限定されていないものも含みます。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを含む任意の免疫グロブリンのクラスのメンバーを含んでいます。【００９７】ここで使用されるように、完全長抗体は、２つのフルレングスの軽鎖（例えばＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３のまたＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２の−ＣＨ３−ＣＨ４）そして、２つのフルレングスの重鎖を有する抗体（ＶＬ−Ｃｌ）とＢ細胞と合成生産されて同じドメインを有する抗体を分泌する抗体によって生成されるヒト抗体などのヒンジ領域。【００９８】ここで使用されるように、抗体フラグメントまたは抗体部分は、完全な長さよりも小さいですが、抗体いずれかまたは複数の例えば抗原結合部位を形成するのに十分なの可変領域の少なくとも一部が含まれている完全長抗体の任意の部分を参照して（例えば、１つまたはそれ以上のＣＤＲ）およびこのようにして結合特異性および／または完全長抗体の活性を保持し、抗体フラグメントは、例えば、全長抗体の酵素処理によって生成される抗体誘導体だけでなく、総合的に含まれて組換え誘導体を作り出した。抗体フラグメントの例としては、以下のものだけに限られないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ＦＤとＦｄ′フラグメント（参照、例えば、メソッドの分子生物学、巻２０７：がん治療の方法とプロトコル（２００３）のための組換え抗体、第１章ｐ３−２５、キプリヤノグ）。フラグメントは、このようなジスルフィド結合とペプチドリンカーそして／またはペプチドリンカーとして一緒にリンクされている複数のチェーンを含めることができます。抗体フラグメントは、一般的に含まれている５０アミノ酸および典型的な、少なくとも２００アミノ酸を含んでいます。【００９９】ここで使用されるように、Ｆｖを抗体フラグメントは、１つの変数重いドメイン（ＶＨ）と一つの変数の光非共有結合相互作用によってリンクされている（ＶＬ）のドメインで構成されています。【０１００】ここで使用されるように、ｄｓＦｖは、ＶＨ−ＶＬのペアを安定化させる人工分子間ジスルフィド結合とＦｖを指します。【０１０１】ここで使用されるように、ＦＤのフラグメントは、可変ドメイン（ＶＨ）と抗体の重鎖のいずれかの定常領域ドメイン（ＣＨ１）の含有する抗体の断片である。【０１０２】ここで使用されるように、”Ｆａｂ断片”は完全長抗体の一部を含む抗体フラグメントされていることなど、総合的に生産されている同じ構造を持つパパインとの完全な長さの免疫グロブリン、またはその断片の消化からの結果による組換えによるものです。Ｆａｂ断片は、（ＶＬとＣＬの部分を含む）の軽鎖と様々なドメインの重鎖（ＶＨ）と重鎖（ＣＨ１）のいずれかの定常領域のドメイン部分から可変ドメインを含む別のチェーンが含まれている。；それは組換え製造されることができる。【０１０３】ここで使用されるようには、Ｆ（ａｂ′）２フラグメントは、総合的にｐＨが４．０から４．５、またはでペプシンと免疫グロブリンの消化の結果から、例えば、その抗体フラグメントである組換え、抗体と同じ構造を持って製作。のＦ（ａｂ′）２フラグメントは、２つのＦａｂフラグメントが、ここで、各重鎖部分は、２つのフラグメントを結合ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含む追加のいくつかのアミノ酸が含まれ、それが組換え製造することができる。【０１０４】Ｆａｂ′フラグメントはＦ（ａｂ’）２フラグメントのひとつの重鎖の部分のの含有断片である。【０１０５】ここで使用されるように、ｓｃＦＶフラグメントは、共有結合を任意の順序でポリペプチドリンカによって接続された可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）を含む抗体フラグメントを参照する。リンカーは、長さ２の可変ドメインは、実質的な干渉を受けることなくつながれているようです。典型的なリンカーは（グリシン−セリン）からいくつかのグルタミン酸またはＬｙｓ残基が溶解度を高めるために分散したｎ個の残基である。【０１０６】ここで使用されるように、ダイアボディは二量体ｓｃＦｖです。ダイアボディは、通常、ｓｃＦｖｓより短いペプチドリンカーを持っており、それらは優先的に二量体になります。【０１０７】本書で使用されるように、ｈｓＦｖはヘテオダイメリックコイルドコイルドメイン（（２００１）Ｊモル  バイオル７：３１２：２２１−２２８参照）、に代用されてきた通常Ｆａｂ断片中に存在する抗体断片に言及される。【０１０８】ここで使用されるように、ポリペプチドのドメインは構造的および／または機能的に区別や定義されていること（３つ以上のシーケンス、通常５または７またはそれ以上のアミノ酸）、は構造的に、そして／または機能的に分類、または定義づけできます。典型的なポリペプチドドメインはポリペプチドに一部であり、１つまたは複数の構造モチーフ（αヘリックスの例の組み合わせおよび／またはβ鎖ループ領域で接続）および／から成るポリペプチド内で独立して折返し構造を形成することができるまたはポリペプチドの一部で酵素活性や抗原結合などの特定の機能活動によって認識される。ポリペプチドは、１つ、通常１つ以上持つことができます。例えば、ポリペプチドは、１つまたは複数の構造ドメインと１つまたは複数の機能ドメインを持つことができます。単一のポリペプチドドメインは構造と機能に基づいて区別することができます。ドメインは、アミノ酸の連続した直線配列を包含することができます。また、ドメインは非ポリペプチドのアミノ酸のリニアシーケンスに沿って連続している非連続するアミノ酸の部分は、複数の包含することができます。典型的には、ポリペプチドは、ドメインの複数含まれています。たとえば、各重鎖および抗体分子の軽鎖は、（Ｉｇ）のドメインは、長さ各約１１０個のアミノ酸免疫グロブリンの複数含まれています。【０１０９】ここで使用されるように、免疫グロブリンドメインの構造によって区別されるアートによって認識されているドメイン、それはそれぞれに逆平行βストランド２つのβ−プリーツシートが含まれ、免疫グロブリンは、（Ｉｇ）の折りと呼ばれるアミノ酸のループによって接続されています。イグ倍の２つのβシートは疎水性相互作用と保存内鎖ジスルフィド結合によって一緒に挟まれています。抗体チェーン内の個々の免疫グロブリンドメインは、さらに機能に基づいて区別することができます。重鎖は、１つの変数領域のドメイン（ＶＨ）と３つまたは４つの定常領域ドメイン（ＣＨ）を含んでいますが例えば、軽鎖は、１つの可変領域ドメイン（ＶＬ）および一定常領域ドメイン（ＣＬ）は含まれています。各ＶＬ、ＣＬは、ＶＨの、およびＣＨドメインは免疫グロブリンドメインの例です。
ここで使用されるように、抗体を参照した”変数のドメイン”は別の抗体の間で変化するアミノ酸の配列が含まれている抗体の重鎖または軽鎖の特定の免疫グロブリンのドメインです。各軽鎖と、各重鎖（ＶＬ、ＶＨ）を一つの変数領域のドメインを持っています。可変ドメインは、抗原特異性を提供するため、抗原認識に関与している。各変数の領域は抗原結合部位のドメインとフレームワーク領域（ＦＲＳ）の一部であるＣＤＲを含んでいます。【０１１０】ここで、”可変領域”、”ＨＶ”、”相補性決定領域”と”ＣＤＲ”と”ＣＤＲ抗体が”一緒に抗原が結合形成する各変数の領域内の複数の部分のいずれかを参照するために交換可能に使用される使用されるように抗体のサイトです。各可変領域ドメインがＣＤＲ１、ＣＤＲ２および、ＣＤＲ３という名前の３つのＣＤＲが含まれています。３つのＣＤＲは、ノンリニアのアミノ酸配列に沿って連続しているが、折りたたまれたポリペプチドに近接している。ＣＤＲは可変ドメインのβシートの並列鎖を結合ループ内に位置しています。【０１１１】ここで使用されるように、フレームワーク領域（ＦＲＳ）は、βシート内にある抗体可変領域ドメイン内のドメインです。
ＦＲの領域は超可変領域よりも、そのアミノ酸配列の用語では、比較的多く保存されています。【０１１２】ここで使用されるように、定常領域のドメインは、比較的多くの可変領域ドメインよりも抗体の間で保存されているアミノ酸の配列が含まれている抗体の重鎖または軽鎖のドメインです。各軽鎖は、各重鎖は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３とＣＨ４、１つまたは複数の重鎖定常領域（ＣＨ）のドメインを含む単一の軽鎖定常領域（ＣＬ）をドメインとしています。ＩｇＥおよびＩｇＭ抗体は、ＣＨ１、ＣＨ２のＣＨ３とＣＨ４が含まれている中にフルレングスＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧ抗体のアイソタイプは、ＣＨ１の、ＣＨ２のＣＨ３およびヒンジ領域が含まれています。ＣＨ１とのＣＬのドメインがこのように抗原と回転抗体腕のとの相互作用に貢献し、抗体分子のｆａｂアームを拡張します。抗体の定常領域は、例えば、様々な細胞、生体分子や組織との相互作用を介して特別に結合する抗体である病原体や毒素の抗原の消失のような、とはいうものの、に限ったことではないがに効果的な昨日を持っている。【０１１３】ここで使用されるように、ヒト化抗体は、ヒトへの投与に、免疫応答を引き起こすしないようにアミノ酸の”ヒューマン”シーケンスを含むように変更される抗体を参照にしている。このような抗体の調製方法が知られている。たとえば、抗体は、非可変領域のアミノ酸組成物は、ヒト抗体に基づくことができます。コンピュータプログラムは、そのような領域を識別するために設計されています。
ここで使用されるように、”抗原結合部位”は１つ以上の相補性決定領域（可変領域と呼ばれるＣＤＲ）によって形成されたインターフェイスに関連付けられています。それぞれの抗原結合部位は重鎖可変領域から３つのＣＤＲと軽鎖可変領域から３つのＣＤＲが含まれています。抗体分子は、２つの抗原サイトと、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の部分の各々を含む部分サイトを持っています。結合抗原はＣＤＲに加えて、可変領域ドメインの他の部分を含めることができます。【０１１４】ここで使用されるように、”抗原結合部位を形成するのに十分である抗体または部分”への参照する事は、抗体またはその部分が、少なくとも全６ＣＤＲを含む対応する完全長抗体の結合特異性の少なくとも一部を保持する少なくとも１、２、３、４、５または６ＣＤＲのＶＨとＶＬが含まれていることを意味します。一般的には、少なくとも十分な抗原結合部位は重鎖（ＣＤＲＨ３）のＣＤＲ３が必要です。これは、通常より軽鎖（ＣＤＲＬ３）のＣＤＲ３が必要です。ここで説明するように、当業者の一人はＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａの番号に基づいてＣＤＲを識別することができる事を知っている。（例、Ｋａｂａｔ、ＥＡら等（１９９１）シーケンス免疫インタレスト、第５版、米国保健局との蛋白質のヒューマンサービス、ＮＩＨの公報９１から３２４２、およびＣｈｏｔｈｉａの、Ｃ．ら（１９８７）ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７を参照）。たとえば、Ｋａｂａｔの番号に基づいて、ＣＤＲは−ＬＩは残りＬ２４を−Ｌ３４に対応しています。ＣＤＲは−Ｌ３は、残りＬ８９−Ｌ９７に対応しています；ＣＤＲ−Ｌ２は残りＬ５０と−Ｌ５６に対応しＣＤＲ−Ｈ１は残りＨ３１−Ｈ３５、３５ａや３５ｂ等長さに応じて対応しています；ＣＤＲ−Ｈ２は、残基にＨ５０−Ｈ６５を対応し、ＣＤＲ−Ｈ３が残基Ｈ９５−Ｈ１０２に対応しています。【０１１５】ここで使用されるように、”ペプチド模倣”はポリペプチドの活性を模倣するペプチドである。たとえば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）はペプチド模倣は、このようなＥＰＯの受容体と結合活性化のためにＥＰＯの活性を模倣するペプチドである。【０１１６】ここで使用されるように、最適化された抗体は、抗体、またはその一部、およびリファレンス抗体と比較して／または改善された機能的活性を標的タンパク質のための改良結合親和性を有するに関連付けられています。典型的には、抗体は、１つまたはそれ以上のアミノ酸の変更（アミノ酸の欠失、置換または挿入）は、１つまたは複数のアミノ酸の変更を含むまない親抗体と比較によって最適化されています。一般的に、活動や結合親和性は（例。変更を含んでいないヒット生殖細胞等）親抗体の結合調和と比較され約１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８、９、１０倍倍−、２０倍の倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００、４００倍倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍以上に増加しています。【０１１７】ここで使用されるように、対応した残りに言及した対応、たとえば、”対応するアミノ酸残基”は、（例。対立遺伝子変異体、同じファミリーの遺伝子、種の変異体など）連続した関係である２つのポリペプチド間で比較残基に参考した。ポリペプチドの間で対応する残基を識別することが容易にできる芸術の中にあるスキルです。たとえば、ガイドとして保存された同一のアミノ酸を使用して、対応する残基を識別することができる当業者のいずれかでエンコードされた領域の配列を整列があります。当業者の一つは、手動またはシーケンスを整列させることができる多数の整列プログラムを用意し（例えば、ＢＬＡＳＴ）のいずれかを使用することができます。したがって、アミノ酸残基またはお互いに対応する位置は、指定された基準ポリペプチドと／または構造アラインメントに基づいて対応するように決定されるそれらの残基があります。【０１１８】ここで使用されるように、コンセンサス配列は、（例。対立遺伝子変異体、同じファミリーの遺伝子、種の変異体など）に関連する配列の複雑性が提携したとき、各位置に、最も頻繁に発生する残基である残基を含む統計配列です。したがって、コンセンサス配列は、ほとんどのそれぞれの位置でアライメントの豊富な残基を表しています。目的のためにここでは、例えば、生殖細胞の配列、またはその一部は、コンセンサス生殖細胞系配列を生成するために整列することができます。【０１１９】ここで使用されるように、ライブラリ内の軌跡はメンバーまたはライブラリのメンバーを含めることができる場所や位置に関連付けられています。位置が物理的な位置にする必要はありません。たとえば、コレクションが固体支持体上に配列として提供されている場合、支持体は配列のメンバーを表すことができる場所を含みます。【０１２０】ここで使用されるように、アドレスは、アドレスのメンバーが（例、抗体など）を識別することができる一意のコレクション内の各遺伝子座の識別子に関連付けられています。アドレス部分は、その軌跡や場所のおかげで識別することができるものです。アドレッシングは、このようなウェルのマイクロプレートのように、表面上の位置で行うことができる。たとえば、マイクロウェーブプレートのたんぱく質の為のアドレスはＦ９であり、それはマイクロウェルプレートでの列９に配置されていることを意味します。アドレッシングはバーコードやその他の記号、化学タグ、電子、このようなＲＦタグ、カラータグ、他のそのような識別子を使用してエンコードされたタグなど、他の識別子で行うことができる事にも対応する。【０１２１】ここで使用されるように、配列は３つ以上のメンバを含む抗体などの要素のコレクションを指します。【０１２２】ここで使用されるように、”空間的配列は、”メンバーが区切られている、または配列内の異なる領域を占めている配列です。したがって、空間的配列は、アドレス指定可能な配列の型があります。空間配列の例としては、プレートの各ウェルには、配列内のアドレスでマイクロタイタープレートが含まれています。例えば、空間配列は前記異なる複数の分子を任意の配置が含まれているような異なった分子の複雑性の中に配列された中に含まれます。配列は４８ウェル、９６ウェル、１４４ウェル、１９２ウェル、２４０ウェル、２８８ウェル、３３６ウェル、３８４ウェル、４３２ウェル、４８０ウェル、５７６を含めることができます−また、６７２ウェル、７６８ウェル、８６４ウェル、９６０ウェル、１０５６ウェル、１１５２ウェル、１２４８ウェル、１３４４ウェル、１４４０ウェル、または１５３６ウェルプレート、チューブ、スライド、チップ、フラスコ、または他の適当な実験装置などのマイクロタイタープレートプレートを含みます。【０１２３】ここで使用されるように、アドレス指定可能なライブラリは、コレクションの各メンバは、そのアドレスの美徳によって識別された抗体などの核酸分子または蛋白質剤などの分子の集合です。【０１２４】ここで使用されるように、アドレス指定可能な配列は、配列のメンバの美徳、またはそのようなもマイクロタイタープレート、固相支持体上に自分のアドレス、空間配列内の位置によって識別される色、蛍光、電気信号（すなわち、高周波、実質的に関心のある分子の相互作用を変更しない電子レンジや他の周波数）、バーコードやその他の記号、化学的又は他のそのようなラベルとして識別または検出可能なラベルです。
したがって、一般的には配列のメンバは、固相の表面上に特定の遺伝子座で配置されている直接または間接的にリンクされているもしくは微小粒子又はその他のサポートに貼付されてなど（以下と呼ばれるビーズ）を、溶液中で休止し、又は表面に広がる添付物のような特定のラベルに関連付けられている。【０１２５】ここで使用されるように”アドレスの組み合わせ抗体ライブラリー”は空間配列内の位置などのまたは固体支持体、または化学または識別子、抗体のコレクションを参照するＲＦタグでのような抗体同一で特定されるのと同じと確認できるすべての抗体です。”アドレスアレイの組み合わせ抗体ライブラリー”への参照は、抗体のメンバーは、配列で扱われることを意味します。【０１２６】ここで使用されるように、サポート（行列のサポートマトリックス、不溶性担体または固体支持体ともいう）は任意の固体又は半固体または不溶性のサポートを参照して興味のある分子は、通常生体分子、有機分子や生体特異的リガンドはリンクされているか、結合した。このような材料は、親和性マトリックスとして使用されているか、化学、生体分子の合成などの分析のためにサポートしていますが、これらに限定されない任意の素材が含まれている：ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ナイロン、ガラス、デキストラン、キチン、砂、軽石アガロース、多糖類、デンドリマー、バッキーボール、ポリアクリルアミド、シリコン、ゴム、固相合成、親和性の分離と精製、ハイブリダイゼーション反応、イムノアッセイ等の用途のための担体として使用される他の材料。ここでは母体は、微粒子やマイクロタイタープレート皿・くぼみ、ガラススライド、シリコンチップ、ニトロセルロースシート、ナイロンメッシュ、または他のそのような材料などの連続的な表面の形態にすることができます。ときに、通常の粒子が５から１０ミリメートルの範囲以下の少なくとも１つのディメンションを持っています。このような粒子は、”ビーズ”と言われ、しばしば、必ずではないですが、球形をしていますこのような参照は、しかし、ランダムな形状、針、繊維を含む、任意の形状とすることができる行列のジオメトリを、制約されず、伸長した。特に、大体球状の”ビーズ”は、液相中で使用することができ、注目されている。”ビーズは”磁石を使用して分離するために、追加のコンポーネントとして長いメソッドと分析本と干渉しないように（例。ダイナビーズ▲Ｒ▼（ダイナル、オスロ、ノルウェー）などを参照してください）磁性または常磁性粒子のような追加のコンポーネントを含めることができます。【０１２７】ここで使用されるように、行列やサポート粒子は離散的な粒子の形態であるマトリックス材料を意味する。粒子は、任意の形状と寸法が、通常は１００ミリメートル以下、５０ミリメートル以下、１０ｍｍ以下、１ｍｍ以下、１００μｍ以下、５０μｍ以下、そして典型的なサイズは１００立方ミリメートル以下、５０立方ミリメートル以下、１０立方ミリメートル以下、１立方ミリメートル以下、１００μｍ３以下の大きさであり、立方ミクロンに命令することができます。このような粒子は、総称して”ビーズ”と呼ばれます。【０１２８】ここで使用されているように、研究と実験を参照したシリコは、コンピュータを使用して実行を行った。シリコでの方法は、以下に分子モデリング研究を、生体分子のドッキング実験、分子構造の仮想表現、そして／または、プロセス、分子間相互作用などに限定されない。目的のためにここでは、ライブラリの抗体のメンバーは、コンピュータにそれらの入力の中から成分Ｖ、ＤおよびＪの生殖細胞のセグメントを選択し、合成出力するには、フレームに核酸分子のリストを表示して、それらを結合するコンピュータプログラムを使用して設計することができる。したがって、コレクションまたはここて与えられたライブラリ中の抗体のコンポーネントの再結合がそうするための規則が含まれているソフトウェアと一致して、各ビルディングブロックの塩基配列を組み合わせることにより、シリコ内で行うことができる。プロセスは、コンピュータを使わずに手動で実行されるがコンピュータは速度の利便性を提供しています。【０１２９】ここで使用されるように、データベースはデータ項目のコレクションに関連付けられています。ここでの目的は、データベースの参照は抗体遺伝子配列の配列と構造情報の収集を提供する抗体のデータベースを参照しています。典型的な抗体のデータベースが含まれ、ＩＭＧＴ▲Ｒ▼、国際的な免疫情報システム（ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ例。レフランクその他（２００８）、バイオインフォマティクスのブリーフィング、９：２６３−２７５を参考。）、ナショナルセンターバイオテクノロジー情報（ＮＣＢＩ）、カバットデータベースとトムリンソンのＶベースデータベース（レフランク（２００３）核酸研究所、３１：３０７−３１０；マーティンら、治療用抗体、ワイリー−ＶＣＨ（２００７），ページ１０４−１０７）。データベースは、任意の配列を含むようにユーザーが作成することができます。データベースは、配列は、所望の形式で入力されるように作成することができます。（特にリーディングフレームの例；終止コドンを欠けている。シグナル配列を欠いている。）データベースはまた、抗体の配列に加えて、配列を含むように作成することができます。【０１３０】ここで使用されるように、”コンピュータベースのシステム”とは、ハードウェア、ソフトウェアを参照してデータ記憶媒体とメソッドは、生殖細胞のセグメントを再結合に使用されます。コンピュータベースのシステムの最小ハードウェアは、ここでは、中央処理装置（ＣＰＵ）、入力の平均は、出力手段と記憶手段にデータが含まれて提供されます。熟練の方法およびシステムで使用するために適切なコンピュータベースのシステムを選択することができる職人はここで提供されます。【０１３１】ここで使用されるように、”記録”はコンピュータ読み取り可能な媒体に情報を格納するためのプロセスを参照にします。熟練した当業者は容易に配列の画像データをコンピュータ読み取り可能な媒体に情報を記録するための現在知られているのいずれかの方法を採用することができます。データストレージ構造の選択は、一般的にメディアとプラットフォーム格納されている情報にアクセスするために選択に基づいて作成できます。また、データ処理プログラムや様々なフォーマットは、コンピュータ可読媒体上の羅列イメージ情報を格納するために使用することができます。画像情報は、マイクロソフトワード▲Ｒ▼、グラフィックファイルまたはＡＳＣＩＩファイルの形で表されているもの、ＤＢ２▲Ｒ▼、Ｓｙｂａｓｅ▲Ｒ▼、Ｏｒａｃｌｅ▲Ｒ▼などのデータベースアプリケーションに格納され次のような市販のソフトウェアでフォーマットされたワープロのテキストファイルで表すことができます。熟練した当業者は、情報や指示は、ここに記載記録されたその上を有するコンピュータ可読媒体を得るために、形式（例、テキストファイルまたはデータベース）構造化データプロセッサの任意の数を調整することができます。【０１３２】ここで使用されるように、”スクリーニング”がコレクションまたは抗体のライブラリーおよび／またはその部分で、アクティビティまたはプロパティ抗体またはその一部の決定に基づいています。スクリーニングは、例えばターゲットタンパク質の活性の変調を評価する機能評価試験により抗体からターゲットプロテインの評価に直接結びつく（例。結合親和性）抗体の結合を評価します。【０１３３】ここで使用されるように、標的タンパク質に対する活性は、結合特異性および／または標的タンパク質の機能活性の変調、または標的タンパク質に向かった抗体の活動を反映する他の尺度に関連付けられています。
ここで使用されるように、標的タンパク質に対する活性は、結合特異性および／または標的タンパク質の機能活性の変調、または他の測定標的タンパク質その向かって抗体またはその一部の活動を反映するに関連付けられています。【０１３４】ここで使用されるように、期間評価はここで抗体またはその標的タンパク質の割合のおよび／または変調標的タンパク質の活性の抗体まとの結合の絶対値を取得するという意味での定量的および定性的な判断を含むものとする評価用語を使用されるように、インデックス、比、割合、視覚的またはその他の値を結合または活動のレベルの他の価値評価を量的にまた質的に決めることを含む事を意図しています。評価は、直接または間接的にすることができます。
たとえば、束縛は直接検出可能なラベルとその抗体またはその一部のラベルを貼ることによって、あるいは自分自身にラベルが付いていることが二次抗体を用いて決定することができます。加えて、機能の活動は当業者に知られている評価の種々のいずれかを使用して決定することができ、例えば、増殖、細胞毒性そして、ここで説明され不在対存在下で標的タンパク質の活性の比較があります。【０１３５】ここで使用されるように、”標的タンパク質”は抗体もしくはプローションの理由により調整された活動そして／または特に抗体もしくはその部分の認識されるタンパク質やペプチドに言及されます。標的タンパク質は、任意のペプチドまたはタンパク質抗体の認識エピトープが含まれているものが含まれています。標的タンパク質が病気や障害の発現または活性のおかげでの病因に関与するタンパク質が含まれています。典型的な標的蛋白質はここに記載されています。【０１３６】ここで使用されるように”ヒット”はスクリーニング評価の中で活動しているとして認識または選ばれた抗体またはその一部を参照にします。【０１３７】ここで使用されるように、スクリーニングに続く”繰り返し”がその活動を最適化されるか、もしくは前の繰り返しと比べ改善されると分かるまで、２、３、４、５回以上繰り返されます。【０１３８】ここで使用されるように、”高い情報処理”は大規模な方法、もしくは大きな数の分子を巧みに扱い、一般的に構成の１０、１００、１０００を構成する事を許可する過程に言及されます。
たとえば、精製およびスクリーニングの方法は、高スループットをレンダリングすることができます。ハイスループット法は、手動で実行することができます。しかし、一般に、高スループットの方法は自動化、ロボットやソフトウェアを含みます。【０１３９】ここで使用されるように、”構造／活性関係（ＳＡＲ）”は構造と機能分子の間の関係を指します。目的のためにここで、構造体は、例えば、ヌクレオチドのエンコーディングの配列抗体は、配列を参照しています。ライブラリメンバをアドレスのおかげで、そのアドレスに基づいて知られており、そのシーケンスで各抗体を識別します。したがって、構造が知られている特定のアクティビティに関連付けることができます。したがって、ＳＡＲは活性構造の変化の影響を評価するために使用することができます。【０１４０】ここで使用されるように、”機能的活動が”ポリペプチド（標的タンパク質など）またはその全長（完全）タンパク質に関連付けられている部分の活動を参照します。機能の活動には、以下に具体的には、生物学的活性、触媒や酵素活性、抗原性（抗ポリペプチド抗体に結合するためのポリペプチドと競合するかに結合する能力）、免疫原性、多量体を形成する能力、能力に限定されていない受容体またはリガンドポリペプチドおよびシグナリングと下流のエフェクター機能にバインドします。目的のためにここで、ライブラリ、その中の抗体またはその一部のポリペプチドの機能活性の変調（すなわち、活性化や抑制）本ポリペプチドの機能活性が変更されていること、または抗体の存在下で、変更がない場合と比較して意味抗体またはその部分として、ここでは”調節”や”変調”と、その抗体の効果やその一部、標的タンパク質の機能活性誘導または活性の増強などの活動の増加を意味するのを参照して他の様々な文法形式を使用しても標的タンパク質の１つまたは複数の活動を阻害するとしています。したがって、変調は、アクティビティ（つまり、アップ規制やアゴニスト活性）活性の低下（すなわち、ダウン規制や抑制）や周期、周波数の変化などの活動（任意のその他の変更の増加を含めることができる時間、速度、またはその他のパラメータ）を含んでいます。変調には文脈に依存した、典型的に変調を意味のある文章と比較されることができ、例えば、野生型の蛋白質、構成状態のタンパク質、またはタンパク質が指定されたセルの種類や状態に表される。抗体またはその部分によって標的タンパク質の機能活性の活動に比べて１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上で調整することができます。【０１４１】ここで使用されるように、”アゴニスト”、または誘導するそれ以外の場合は、シグナル伝達活性または受容体の他の機能活性を増強する、抗体またはその部分のシグナル伝達や増強による受容体の他の機能活性を調節ように関連付けられています。アゴニストは、可能な信号伝達又は単独で使用するだけで配位子と比較して受容体によるシグナル伝達を強化する受容体または他の受容体刺激の天然リガンドの存在下でのシグナル伝達やその他の機能活性を変更することができる他の機能活性を調節します。【０１４２】ここで使用されるように、”アンタゴニスト”は、抗体またはその一部をブロックしたり減少しシグナル伝達活性または受容体の他の機能活性することによってシグナル伝達や受容体の他の機能活性を調節するを参照します。【０１４３】ここで使用されるように、ラベルはラベルを添付するか、または分子またはこれに準ずるに直接または間接的にリンクされている検出可能なマーカーです。検出方法は、当技術分野で知られている任意のメソッドを指定できます。【０１４４】ここで使用されるように、結合活性は、例えば、分子の特性を参照にしています。ポリペプチドは、１つまたは複数の結合パートナーをバインドするかどうか、および方法について説明します。バインディングの活動は結合パートナーに結合する能力を含め、（例。高い親和性など）結合パートナーに結合する親和性であり、結合パートナーとの結合の強さ及び拘束力のパートナーと結合する特異性を含んでいます。【０１４５】ここで使用されるように、”親和性”または”結合親和性”とは、抗体分子またはその部分を、標的タンパク質または抗原上のエピトープに結合する強さを指します。親和性は、しばしば定数（ＫＡ）を、または平衡解離（ＫＤ）を一定の平衡協会によって測定されます。低親和性抗体−抗原相互作用が弱く、分子が高親和性抗体−抗原結合を強いている間分子は長い時間にバインドされたまま、急速に解離する傾向があります。高い抗体親和性抗体は、具体的に平衡結合定数を使用してターゲット蛋白質に結合することを意味する（ＫＡ）を大きいか等しい１０６Ｍ−１，大きいか等しい１０７Ｍ−１，大きいか等しい１０８Ｍ−１，ｏｒ大きいか等しい１０９Ｍ−１，１０１０Ｍ−１，１０１１Ｍ−１ｏｒ１０１２Ｍ−１．抗体はまた平衡解離定数（ＫＤ）によって特徴付けられ、例えば１０−４Ｍ，１０−５Ｍ，１０−６Ｍ，１０−７Ｍ，１０−８Ｍ，１０−１０Ｍ，１０−１１Ｍ  ｏｒ  １０−１２Ｍかそれ以下です。一般的に、抗体は、定数が高親和性抗体とみなされるナノモルまたはサブナノモルディソシエーションを有します。このような親和性は容易にこのような平衡透析により、従来の技術を用いて決定することができます。ラジオイムノアッセイ放射性標識を使用して、ターゲット抗原；または当業者に知られている別の方法でメーカーの説明一般的な手順を使用して、ビアコア２０００装置を用いています。親和性のデータがスキャッチャードらの方法により、分析することができます。例。アンニューヨークＡｃａｄ。ＳＣＬ、５１：６６０（１９４９）。【０１４６】ここで使用されるように、”エピトープは”抗原またはタンパク質抗体により認識されるの表面にローカライズされた領域を表します。ペプチドエピトープは、連続エピトープまたは不連続エピトープているものが含まれます。エピトープは、一般的に線形のアミノ酸配列とは対照的にタンパク質の立体構造によって決定されます。【０１４７】ここで使用されるように、”エピトープマッピングは、抗体−抗原認識の分子決定因子の同定のプロセスです。【０１４８】ここで使用されるように、基本的なローカル配列検索ツール（ＢＬＡＳＴ）は、例えばアイデンティティの列の上に基づき、それぞれ検索たんぱく質やＤＮＡデータベースにアルスチュルら（１９９０）によって調��されたものです。例えば、ブラストンは、塩基配列データベース（遺伝子銀行の例）に対して塩基問合せ配列を比較するプログラムです。ブラストピーは、蛋白質配列データベースに対してアミノ酸問合せ配列を比較するプログラムです。【０１４９】ここで使用されるように、ＢＬＡＳＴのビットスコアはギャップと各整列順序に関連付けられている置換数から算出した値です。スコアが高いほど、より重要な位置にあります。【０１５０】ここで使用されるように、人間のタンパク質は、そのすべての対立遺伝子変異と保守的なバリエーションを含むヒトのゲノム中に存在するＤＮＡなどの核酸分子によってコードされる一つです。変更は、野生型や人間のタンパク質の顕著な配列に基づいている場合はバリアントまたは修正は蛋白質のヒトタンパク質です。【０１５１】ここで使用されているように”自然に生じるアミノ酸”はポリペプチドで発生する２０Ｌ−アミノ酸を参照にしています。残基はヒューマンの中のその同族ｍＲＮＡのコドンとｔＲＮＡの分子の特異的認識による蛋白質に組み込まれている自然の中で発見された２０のα−アミノ酸である。【０１５２】ここで使われているように、非天然アミノ酸が遺伝的にエンコードされていないアミノ酸を参照に発生して、使用することはできません。たとえば、非天然アミノ酸は構造を天然アミノ酸に似ている構造と反応性天然アミノ酸を模倣する構造的に変更されている有機化合物です。非天然アミノ酸はこのように、例えば、アミノ酸または２０個の自然発生アミノ酸以外のアナログアミノ酸を含みますが、これだけのアミノ酸は、Ｄ−イソタレノマーに限定されません。含まれて発生する典型的な非天然アミノ酸は、当業者に知られています。【０１５３】ここで使用されるように、核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）とそれらの混合物を含む、そのＤＮＡ、ＲＮＡ、および類似体が含まれています。核酸は、単一の二重鎖することができます。プローブまたはプライマー、必要に応じてラベル付けされて、このような蛍光灯や放射性、単一分子が意図されている本などの検出可能なラベルと同じように参照する場合塾考されます。このような分子は、ターゲットが統計的に一意になるように、またはプローブやライブラリをプライミング用の低コピー数（通常５以下、一般的に３未満）の通常の長さのものです。一般的にプローブまたはプライマーは配列の少なくとも１４、１６または３０の連続ヌクレオチドに相補的な、または関心のある遺伝子と同じが含まれています。
プローブおよびプライマーは、１０、２０、３０、５０、１００以上の核酸の長さになることがあります。【０１５４】ここで使用されるように、ペプチドの長さは２から４０個のアミノ酸からポリペプチドを意味する。【０１５５】ここで使用されるように、アミノ酸の様々なシーケンスで発生するアミノ酸が知られている、３文字または１文字の略語（表１）に基づいて識別される本サービスに提供。様々な核酸断片で発生するヌクレオチドは、当該技術分野で日常的に使用される標準的な単一の文字の名称と指定されています。【０１５６】ここで使用されるように、”アミノ酸”はアミノ基とカルボン酸基を含む有機化合物である。ポリペプチドは、２つまたはそれ以上のアミノ酸が含まれています。目的のためにここで、アミノ酸が２０個の天然アミノ酸、非天然アミノ酸およびアミノ酸アナログ（すなわち、アミノ酸前記α−炭素は、側鎖を持つ）が発生しています。【０１５７】ここで使用されるように、”アミノ酸残基は”そのペプチド結合のポリペプチドの化学的消化（加水分解）に形成されるアミノ酸を指します。アミノ酸残基は、ここでは”Ｌ”の異性体であると推定される説明します。よって、指定されている”Ｄ”の異性体のアミノ酸残基は、所望の機能プロパティがポリペプチドによって保持されている限り、任意のＬ−アミノ酸残基に置換することができます。ＮＨ２のポリペプチドのアミノ末端遊離アミノ基の存在を意味します。ＣＯＯＨ基はポリペプチドのカルボキシル末端遊離カルボキシ基の存在を意味します。ｊの生物に記載された標準ポリペプチド命名規約に準拠して維持します。化学、２４３：３５５７〜３５５９（１９６８）、３７ＣＦＲを採用・§  §１．８２１から１．８２２、アミノ酸残基の略語は、表１に示されています：
【表１】
0005882058.tif 000002
それは、式により本明細書に表されるすべてのアミノ酸残基配列は、カルボキシル末端にアミノ末端の従来の方向に左から右方向を持っていることに留意すべきである。さらに、フレーズ”アミノ酸残基は、”広義など３７ＣＦＲで参照されるものとしての対応の表（表１）に記載されていると修飾アミノ酸及び異常アミノ酸を含むように定義されています§§１．８２１から１．８２２、および参照により本明細書に組み入れられる。さらに、アミノ酸残基配列の先頭または末尾にダッシュなどＮＨ２などのアミノ末端基、またはカルボキシルに、１以上のアミノ酸残基のさらなるシーケンスへのペプチド結合を示すことに注意する必要がありますなどＣＯＯＨなどの端末群。その一般的な使用方法、認識可能な省略形、または生化学命名上ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ委員会にあった、特に断らない限り、任意の保護基は、アミノ酸および他の化合物の略語、されている、、（Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９７２）、を参照してください。１１：１７２６）。それぞれの天然に存在するＬ−アミノ酸はプレフィックス”Ｌ−”には、標準の３文字のコード（または単一文字のコード）または標準の三文字コード（または単一文字のコード）によって識別され、接頭辞”Ｄ−”ことを示しアミノ酸の立体異性体はＤです。【０１５８】本明細書で使用する場合、等速吸引混合物は、アミノ酸のモル比が（例えば、Ｏｓｔｒｅｓｈら、（１９９４）生体高分子３４：１６８１）が報告された反応率に基づいて調整されているものです。【０１５９】本明細書で使用する場合、改変は、ポリペプチドまたは核酸分子のヌクレオチドの配列のアミノ酸の配列の改変への参照内にあり、欠失、挿入、及びアミノ酸とヌクレオチドの置換、それぞれ含まれています。ポリペプチドを変更する方法は、そのような組換えＤＮＡの方法論を使用して、当業者にルーチンです。【０１６０】本明細書中で使用される、アミノ酸の適切な保存的置換は、この当業者に知られており、得られた分子の生物活性を変化させることなく、一般的に行うことができます。この分野の技術者は一般的に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換は、実質的に（例えば、ワトソンらの生物学的活性を変更しない、と認識している。遺伝子の分子生物学、第４版、１９８７、ベンジャミン／カミングスパブ。ＣＯ。、ｐ．２２４）。このような置換は、次のように表２に定めるものに従って行うことができます：
【表２】
0005882058.tif 000003
その他の置換はまた、許容される経験や既知の保存的置換と一致して決定することができます。【０１６１】ここで使用されるように、ＤＮＡを組み合わせは単一の二本鎖の、直鎖状または環状ＤＮＡ分子であり、自然界に存在しない方法の中にＤＮＡ結合と並列したセグメントを含んでいます。【０１６２】ここで使用されるように、ＤＮＡセグメントは、指定された属性を持つ大きなＤＮＡ分子の一部です。たとえば、ＤＮＡセグメントのエンコーディングが指定されたポリペプチド、方向５′から３′読み取りプラスミドやプラスミドの断片など、もはやＤＮＡ分子の一部を、指定されたポリペプチドのアミノ酸配列をコードします。【０１６３】ここで使用されるように、用語”核酸”は、単一および／本鎖または二重デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）とリボ核酸（ＲＮＡ）と同様に、アナログまたはいずれかのＲＮＡやＤＮＡの誘導体などのポリヌクレオチド鎖を意味します。また、用語”核酸”に含まれるペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡ、および他のそのような類似体およびその誘導体またはそれらの組み合わせなどの核酸の類似体が含まれています。核酸はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドを参照することができます。この用語はまた、同等物、誘導体、変異体、そしてヌクレオチド類似体、（センスまたはアンチセンス）から作られたＲＮＡまたはＤＮＡを含んでいます。デオキシリボヌクレオチドはデオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシンおよびデオキシチミジンが含まれています。ＲＮＡの為に、ウラシル塩基はウリジンです。【０１６４】ここで使用されるように、”コードする核酸分子”とは、特定のタンパク質またはペプチドの発現を指示する核酸分子を意味します。核酸配列は、ＲＮＡやタンパク質またはペプチドに翻訳されるＲＮＡ配列に転写される両方のＤＮＡ鎖の配列が含まれています。核酸分子の両方の完全な長さの核酸配列と同様にこのような前駆体の配列を欠いている完全長ポリペプチドの例のように完全な長さの成熟ポリペプチドから派生した非完全な長さの配列が含まれています。
目的のためにここで、核酸配列はまた、ネイティブのシーケンスまたはシーケンスの特定のホストのコドンの好みを提供するために導入することができるのコドンの縮退が含まれています。【０１６５】ここで使用されるように、用語”ポリヌクレオチド”はＤＮＡまたはＲＮＡ誘導体たとえば、オリゴマーまたはポリマーデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）を含む少なくとも２つのリンクされているヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を含むを参照して、ヌクレオチドのアナログまたはホスホジエステル結合よりも”バックボーン”債券その他の、例えば、ホスホトリエステル結合、ジアルキルホスホルアミダート結合、フォフォロシエイト結合、チオエステル結合、またはペプチド結合（核酸ペプチド）。用語”オリゴヌクレオチド”はまた、”ポリヌクレオチド”とここで本質的に同義語として使用されています。しかしながらアートの中のそれらはオリゴヌクレオチドを認識し、例えば、ＰＣＲプライマーは、一般的に以下の長さ約百ヌクレオチドのために５０から１００以下です。【０１６６】ポリヌクレオチドを含むヌクレオチド類似体は、例えば、質量ポリヌクレオチドの質量の差別化を可能なヌクレオチドを、変更されたポリヌクレオチドの検出を可能に蛍光、放射性、蛍光または化学発光ラベルなどの検出可能なラベルを含むヌクレオチド、またはヌクレオチドビオチンまたは固体支持体にポリヌクレオチドの固定化を容易にチオール基などの反応性基を含みます。ポリヌクレオチドはまた、酵素的または光分解化学的には、例えば、選択的に切断される１つ以上のバックボーン債を含めることができます。例えば、ポリヌクレオチドは、１つ以上のデオキシリボヌクレオチドを続けることができる１つまたは複数のリボヌクレオチドに続く１つ以上のデオキシリボヌクレオチドを含めることができ、このような配列は基本的な加水分解によるヌクレオチド配列による配列です。ポリヌクレオチドはまた、比較的切断に耐性を１つまたは複数の結合を含めることができ、例えば、ペプチド核酸結合によってリンクされているヌクレオチドによってリンクされている３′末端に、少なくとも１つのヌクレオチドを含めることができるキメラオリゴヌクレオチドプライマー、ホスホジエステル結合、または他の適当な結合、およびポリメラーゼによって拡張されることができます。
ペプチド核酸配列は、周知の方法を使用して調製することができる（例えば、ウェイラーら。核酸研究所２５：２７９２〜２７９９（１９９７）を参照）。【０１６７】ここで使用されるように、２つのタンパク質や核酸の間の”類似性”はタンパク質や核酸の塩基配列のアミノ酸の配列の間の関連性を指します。類似性は、アイデンティティおよび／または残基の配列の相同性の程度に基づくことができる残基がそこに含まれています。タンパク質や核酸との間の類似度を評価するための方法は人工的な能力として知られています。たとえば、配列類似性を評価する一つの方法では、２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列は、配列間の同一性の最大レベルが得られるように並んでいます。“アイデンティティ”は、アミノ酸やヌクレオチドは、配列不変される範囲を指します。アミノ酸配列のアラインメント、ある程度の塩基配列も、アミノ酸（またはヌクレオチド）に頻繁に置換および／または保守的な違いを考慮することができます。保守的な違いは関与する残基の物理化学的特性を保持するものです。調整は国際的にも（すべての残基を含む配列の全長にわたって比較された配列の調整）、現場でも（唯一の最も類似した領域または領域を含む配列の部分の位置）にも対応します。【０１６８】“同一性”はそれ自体が芸術と意味を認識され技術を用いて計算することができます。（例。計算分子生物，レスク，Ａ．Ｍ．，教育．，オックスフォード大学雑誌，ニューヨーク、１９８８；生物コンピューター：情報科学と遺伝子のプロジェクトＤ．Ｗ．，教育  教育雑誌，ニューヨーク、１９９３；配列データのコンピュータ分析、パート１、グリフィン，Ａ．Ｍ．，ａｎｄグリフィン，Ｈ．Ｇ．，教育．，フマナ新聞、ニュージャージー、１９９４；分子生物学の配列データのコンピューター分析、ボン  ヘインジェ、Ｇ．，学術新聞，１９８７；そして配列科学分析入門書、ブリブスコヴ，Ｍ．とデエレックス，Ｊ．，教育．，Ｍストックン新聞，ニューヨーク，１９９１）。一方メソッドの数は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の用語”アイデンティティ”のアイデンティティを測定するために存在しており、熟練した職人（キャリロＨ．＆リプトンＤ．、ＳＩＡＭＪ応用数学４８：１０７３（１９８８））がよく知られている。
ここで使用されるにおいて、ホモログ（核酸およびアミノ酸配列を基準にして）、は２５％の配列相同性よりも大きく、２５％以上の連続した同属以上に典型的には同等以上または２５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％または９５％の配列の相同性より大きい。；必要に応じて正確な割合を指定することができます。この場合、本利用規約”相同性”と”アイデンティティ”は、間¬変更¬ためによく使用されます。一般的には、パーセント相同性またはＩＤを決定するため、配列は配列の相同性では、保存アミノ酸の数は、標準的な配置アルゴリズムプログラムによって決定されている各業者によって確立されたデフォルトのギャップペナルティーを使用することができます。実質的に相同の核酸分子は、興味のある核酸の長さに沿ってすべて中等度の厳しさ、または高ストリンジェンシーで一般的にハイブリダイズする。また、企図して、ハイブリダイズ核酸分子のコドンの代わりに、コドンの縮退含まれている核酸分子である。
任意の２つの分子は、塩基配列、または少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％”同一”または”であるアミノ酸配列を持っているかどうかを同たとえば、使用して、ＦＡＳＴＡの”プログラム”のような既知のコンピュータアルゴリズムを使用して決定することができる”、ピアソンらと同様に、デフォルトのパラメータを設定します。（１９８８）文集。Ｎａｔｌ。Ａｃａｄ。科学。。アメリカ８５：２４４４（他のプログラムは、ＧＣＧプログラムパッケージ（デブルー、Ｊ．ら、核酸研究１２（Ｉ）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（アチュール、ＳＦら。ＪＭｏｌｅｃ  Ｂｉｏｌ２１５：４０３（１９９０））；巨大なコンピュータへのガイド、マーティンＪ．ビショップ、エド、アカデミックプレス、サンディエゴ、１９９４年とキャリロら（１９８８）シャム、ｊ応用数学４８：１０７３）。【０１６９】たとえば、バイオテクノロジー情報データベースのナショナルセンターのＢＬＡＳＴ機能は、ＩＤを決定するために使用することができます。他の市販または公開プログラムでは、ＤＮＡＳｔａｒ”ＭｅｇＡｌｉｇｎ”プログラム（マディソン、ＷＩ）、ウィスコンシン州ジェネティクスコンピューターグループ大学（ＵＷＧ）”ギャップ”プログラム（マディソンＷＩ）を含まれています。
パーセンテージの相同性やタンパク質とのアイデンティティそして／または核酸分子は、ＧＡＰのコンピュータプログラム（例えば、ニードルら（１９７０）ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ。４８：４４３スミスとウォーターマンにより改訂（（１９８１）前売応。数学２：４８２）。
簡潔に、ＧＡＰプログラムは、ｓｉｍｉ−ｌａｒ−ｉｔｙに分かれて類似している配置シンボルの数（例えば、ヌクレオチド又はアミノ酸）、同様に２つの配列のうち短い方のシンボルの合計数字によって分けられます。ＧＡＰプログラムはデフォルトパラメータを含む事ができます。：（１）単項演算子比較行列と重みｃｏｍ−ｐａｒｉｓｏｎグリブクソンらのマトリックス（１９８６）ニュークル酸解像度１４：６７４５、シュワルツとダイホフによる、
タンパク質配列および構造、国立医学研究財団のアトラス頁３５３３５８（１９７９）；（２）各ギャップ３０のペナルティと各ギャップ中の各シンボルの追加０．１０ペナルティ、（３）最後のギャップにはペナルティなし。【０１７０】したがって、、用語”同一性”または”相同性”を使用してテストと基準ポリペプチドまたはポリヌクレオチドとの比較を表しています。、ここで用語を使用されるように”９０％と同じ”を参照％のアイデンティティへの参照核酸またはポリペプチドのアミノ酸配列〜９９．９９相対９０には、少なくとも。９０％以上のレベルでのアイデンティティは、比較される例示の目的でテストおよび１００アミノ酸の基準ポリペプチドの長さと仮定して、という事実を示している。テストポリペプチド中にアミノ酸のない１０％以上（すなわち、１００のうち１０）は、基準ポリペプチドとは異なります。同様の比較は、テストと基準ポリヌクレオチドとの間行うことができます。点突然変異は、ランダムまたはポリペプチドの全長にわたって配布され、それらは、例えば、最大許容最大長さを変えることの１つまたは複数の場所に集合させることができるような違いを表現することができます。ポリペプチドテストの中のアミノ酸の１０％以下（例。１００分の１０）は言及されているポリペプチドとは違います。同様の比較は、テストと基準ポリヌクレオチドとの間行うことができます。点突然変異は、ランダムまたはポリペプチドの全長にわたって配布され、それらは、例えば、最大許容最大長さを変えることの１つまたは複数の場所に集合させることができるような違いを表現することができます。例。１００分の１０アミノ酸の差（約９０％の同一性）。違いは、核酸またはアミノ酸置換、挿入または削除される定義されています。約８５から９０パーセント以上の相同性やアイデンティティのレベルでは、結果セットをプログラムとのギャップのパラメータの独立していなければならない。アイデンティティのような高レベルのマニュアル調整で多くの場合、容易に評価することができるソフトウェアに依存することがない。
ここで使用されるように、参照ポリペプチドに記載されアミノ酸の指定された割合を含むポリペプチドは、ポリペプチドと基準ポリペプチド間で共有される連続した同一のアミノ酸の割合を指します。たとえば、配列番号を記載設定のアミノ酸配列を有するポリペプチド基準に記載されアミノ酸の７０％が含まれていますアイソフォームはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：ＸＸを持っています、そしてそれは１４７個のアミノ酸を列挙します、それは基準ポリペプチドが含まれていることを意味し、少なくとも１０３の連続アミノ酸は配列番号のアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：ＸＸの前に置かれます。【０１７１】ここで使用されるように、整列順序がヌクレオチド又はアミノ酸の配列の対応する位置を揃えるとの相同性（類似性および／またはＩＤ）を使用することを指します。通常、５０％以上のＩＤで関連している２つ以上の配列が整列されます。
配列の整列セットは、対応する位置に配置されゲノムＤＮＡ配列と整列のＥＳＴおよびその他のｃＤＮＡなどのＲＮＡから由来する配列を、合わせて含めることができます２つ以上の配列を指します。【０１７２】ここで使用されるように、”プライマー”はＤＮＡポリメラーゼなどつの異なるヌクレオシド三リン酸の存在下、重合剤、（例えば、４つの異なったヌクレオタイド隣酸塩の存在、例えばＤＮＡポリメナーゼ、また逆転写酵素）適切なバッファーと適切な温度の中で適切な条件の下テンプレート指向性ＤＮＡの開始点として機能することができます。これは、特定の核酸分子が、”プローブ”としてできることとして理解されるであろう”プライマー”プライマー”として保存される。
しかし、３′ている拡張機能の水酸基を持っています。プライマーは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素（ＲＴ）が−ＰＣＲ法は、ＲＮＡ  ＰＣＲ法、ＬＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、パンハンドルＰＣＲ法、キャプチャーＰＣＲ、発現ＰＣＲ法、ＰＣＲの中の３′、５′ＲＡＣＥ、連結媒介ＰＣＲおよびその他の増幅プロトコルを含んでいます。
ここで使用されるように、”プライマーのペアは”（ＰＣＲによるなど）および３′（下流）プライマーが増幅されるシーケンスの最後の５′５ハイブリダイズ（上流）プライマーを′が含まれているプライマーのセットを参照してハイブリダイズは、増幅される配列の３′末端の補数を含んでいます。【０１７３】ここで使用されるように、”特異的なハイブリダイズ”はアニールを参照して相補的塩基対合、標的核酸分子の核酸分子（オリゴヌクレオチドなど）に言及します。当業者は、試験管内で、長さと特定の分子の組成などの特定のハイブリダイゼーションに影響を与える生体内のパラメータに精通している。ヴィボでのハイブリダイゼーションのパラメータは、特に関連します。さらにアニーリング温度、バッファー組成と塩濃度も含まれています。典型的な非具体的に高ストリンジェンシーで核酸分子を結合削除するための条件は洗浄０．１×脳炎、０．１％のＳＤＳ、６５℃、中ストリンジェンシーでは０．２×脳炎、０．１％ＳＤＳ、５０℃。同等のストリンジェンシー条件は、当該技術分野において知られている。
当業者が容易に標的核酸分子、特定のアプリケーションに適切な核酸分子の特異的なハイブリダイゼーションを達成するためにこれらのパラメータを調整することができます。
ここで使用されるように、実質的に製品と同じ関心のあるプロパティは、十分に実質的に同一の製品は、製品の代わりに使用することができるように変更されていないように十分に類似したことを意味します。【０１７４】ここで使用されるように、それはまた、関連する当業者によって理解される用語は、”実質的に同一”または”類似”コンテキストを使用して変化することが理解されている。【０１７５】ここで使用されるように、対立遺伝子変異体または対立遺伝子変異を参照遺伝子と同じ染色体遺伝子座を占めるの２つ以上の代替形式のいずれかです。対立遺伝子変異は、突然変異で自然に発生する集団内表現型多型をもたらすことができます。遺伝子の突然変異、または（エンコードされたポリペプチドの変更なし）サイレントすることができるポリペプチドは、アミノ酸配列を変更したエンコードすることができます。この法律において”対立遺伝子変異体”も遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされるタンパク質を表すためにここで使用されています。一般的に遺伝子を参照の形では、野生型形式および／または集団や種の単一のリファレンスメンバーからのポリペプチドの主要な形式をエンコードします。典型的には、間に種亜種が含まれて対立遺伝子変異体は、通常、野生型および／または優勢な形態と同じ種の少なくとも８０％、９０％以上のアミノ酸同一性があります。アイデンティティの程度は、遺伝子に比較かどうかに依存種間または種内です。一般的には、種内の対立遺伝子変異体がある野生型および／または野生型と９６％、９７％、９８％、９９％以上のＩＤを含め優勢な形態で約８０％、８５％、９０％または９５％の同一またはそれ以上、少なくともおよび／またはポリペプチドの優勢な形態です。対立遺伝子変異体への参照は、ここで一般的に同じ種のメンバーの間でタンパク質をｎ個のバリエーションに関連付けられています。【０１７６】ここで使用されるように、”対立遺伝子変異体”と同じ意味でここで使用される”対立遺伝子は、”遺伝子またはその一部の代替形式に関連付けられています。対立遺伝子は相同染色体上の同じ遺伝子座や位置を占めています。主題は遺伝子の２つの同一の遺伝子を持っている場合、件名は、その遺伝子や遺伝子のホモ接合体と言われています。
対象は、遺伝子の異なる２つの対立遺伝子を持っている場合は、件名は遺伝子のヘテロ接合体と言われています。
特定の遺伝子の対立遺伝子は、それぞれの単一のヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドの他とは異なる場合置換、欠失、ヌクレオチドの挿入を含めることができます。遺伝子の対立遺伝子はまた、変異を含む遺伝子の形式することができます。【０１７７】ここで使用されるように、種の変異体は、マウスやヒトなど、さまざまな動物種を含む、さまざまな種間ポリペプチドの変種を参照してください。【０１７８】ここで使用されるように、スプライス変異体は、ゲノムＤＮＡの一次転写産物の差分処理によって生成されるバリアントを参照しているｍＲＮＡの複数のタイプの結果です。【０１７９】ここで使用されるように、用語のプロモーターは、ＲＮＡの結合ポリメラーゼと転写の開始を提供するＤＮＡ配列を含む遺伝子の一部を意味します。プロモーター配列は、常にではありませんが、一般的にされている遺伝子の５′非コード領域にあります。【０１８０】ここで使用されるように分離またはポリペプチドまたはタンパク質を精製または生物学的活性部分は、その実質的に細胞材料や、そこからタンパク質が化学的前駆体または他の化学物質から実質的に、あるいは派生した細胞または組織から他の汚染タンパク質の無料です化学的に合成します。準備はもし薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ゲル電気泳動の技術者によって使用される高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの分析の標準的な方法で決定された容易に見つけられた不純を見つける十分に自由になると決定づけられることができます。このような純度を評価したり、十分に純粋なようにさらに精製することは、化合物の精製を生産するための方法は、当事者のスキルとして知られています。実質的に化学的に純粋な化合物は、しかしながら異性体の混合物である。このような場合には、さらに精製することは、化合物の特定の活性を増加させる可能性があります。
任期は実質的に細胞物質の自由タンパク質が、そこから、または隔離され組換え的に生成細胞の細胞成分から分離されている蛋白質の準備が含まれています。一実施形態では、この期間は、実質的に細胞物質の自由を有するプロテアーゼ蛋白質の準備が含まれています。以下、非プロテアーゼタンパク質の約３０％（乾燥重量）非プロテアーゼタンパク質（また混入タンパク質と称する）、一般的に以下の約２０％以上の非プロテアーゼタンパク質または非プロテアーゼタンパク質の１０％以下、非プロテアーゼ蛋白質の約５％。プロテアーゼタンパク質またはアクティブな部分は、その組換え生産されている場合、それはまた、実質的に培養液、すなわち、培養培地は、以下を表す無料ですより約または２０％、１０％またはプロテアーゼ蛋白製剤の体積の５％。【０１８１】ここで使用されるように、その期間は、実質的に化学的前駆体または他の化学物質の自由なタンパク質がタンパク質の合成に関与している化学前駆体又は他の化学物質から分離されているプロテアーゼ蛋白質の準備が含まれています。その期間は約３０％（乾燥重量）２０％、１０％、５％以下の有するプロテアーゼの蛋白質化学的前駆体または非プロテアーゼの化学物質やプロテアーゼの蛋白質の準備が含まれています。
ここで使用されるように、たとえば、合成核酸分子または合成遺伝子または合成ペプチドのような合成体に言及されることは組換え方法および／または化学合成法によって生成される核酸分子またはポリペプチド分子を意味する。【０１８２】ここで使用されるように、組換えＤＮＡの方法を使用して組換えによって生産がクローニングされたＤＮＡがコードするタンパク質を表現するための分子生物学のよく知られているメソッドの使用を意味します。【０１８３】ここで使用されるように、個別の要素に言及されるベクトル（または、プラスミド）いずれかの式または複製物の細胞の中にある異種核酸を導入するために使用される個別の要素を指します。ベクターは、一般的には、エピソームままゲノムの染色体、そのへの遺伝子またはその一部の統合に影響を与えるように設計することができます。また、意図酵母人工染色体と哺乳動物人工染色体などの人工染色体はベクトルは考慮されます。選択とそのような車の使用は、当業者に知られている。【０１８４】ここで使用されるように、発現ベクターはベクトルを作動このようなＤＮＡ断片の発現をすることができるプロモーター領域などの調節配列、とリンクされているＤＮＡを発現することができる事が含まれています。このような追加のセグメントは、プロモーターおよびターミネーター配列を含めることができる任意の複製の１つまたは複数の起源を、１つまたは複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどを含めることができます。発現ベクターは一般的に、またはプラスミドまたはウイルスＤＮＡから誘導される両方の要素を含めることができます。したがって、発現ベクターは、組換えＤＮＡまたはＲＮＡ、プラスミド、ファージ、組換えウイルスまたはその他のベクトルなどの構築を参照していることは、適切な宿主細胞導入時に、クローニングされたＤＮＡの発現の結果です。適切な発現ベクターは、当技術分野で当業者に知られており、その真核細胞および／または原核細胞、それらの宿主細胞ゲノムに統合し、又はエピソームままで複製的なものが挙げられます。【０１８５】ここで使用されるように、ベクターはまた、”ウイルスベクター”または含まれている”ウイルスベクター”をウイルスベクター作動細胞（車やシャトルなど）に転送するために外来性遺伝子を外来性遺伝子をリンクされている設計のウイルスがあります。【０１８６】ここで使用されるように作動または作動ＤＮＡセグメントを参照するときにリンクされているセグメントが、彼らは終端にコーディングセグメントを介して、例えば、自分の利用目的のためのコンサートのプロモーター、収益の転写開始を機能するように配置されていることを意味します。【０１８７】ここで使用されるように、生物学的サンプルでは、生きているか、またはウイルスのソースから得られた任意のサンプルを参照して、任意のセル型や組織を、そこから核酸やタンパク質、または他の高分子を得ることができる対象の含まれています。生物学的サンプルは、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿や汗、組織や動物や植物からの臓器サンプルなどの体液、も含まれますが、（ただしこれらに限定されない）、その土壌と水のサンプルやその他の環境試料、ウイルス、細菌、真菌、藻類、原生動物およびコンポーネントです。食品と環境のため細菌やウイルスやその他の汚染を評価することができます。方法はここで、生物試料を用いて実施されているようなプロファイリングのためのいくつかの実施形態では、また、任意のサンプルをテストするために使用することができます。【０１８８】ここで使用されるように、巨大分子が数百から数百万から最大分子量を有する任意の分子をに言及されます。高分子は、ペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、核酸、一般的に生物学的生物によって合成される他のそのような分子を含む組換えの分子生物学の方法を使用して合成または調製することができます。【０１８９】ここで使用されるように、用語”生体高分子”は、２つ以上の単量体サブユニット、またはその誘導体、結合または高分子で結ばれている構成分子を含む生体分子です。生体高分子は、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、炭水化物、または脂質、またはその誘導体またはそれらの組み合わせ、例えば、それぞれペプチド核酸部や糖を含む核酸分子です。生体高分子は、核酸、タンパク質、糖、脂質、およびその他の高分子を含むがこれらに限定されない。核酸は、そのＤＮＡ、ＲＮＡ、およびフラグメントが含まれています。核酸は、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ミトコンドリアの核酸、葉緑体の核酸、別の遺伝物質を持つ他の細胞小器官に由来することができます。【０１９０】ここで使用されるように、生体分子の性質はその誘導体で発見された化合物である。生体分子は、これらに限定されない：オリゴヌクレオチド、オリゴニュークリアサイド、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ペプチド核酸（ＰＮＡは）、オリゴ糖と糖を含みます。【０１９１】ここで使用されるように、生物学的粒子は、使用の有無を含むカプセル化された核酸、単一のセルなしファージベクターまたはファージキャプシドを含む、パッケージ化された核酸、ファージ、なしウイルスベクターまたはウイルスキャプシドなど、ウイルスを参照して真核生物および原核細胞またはそのフラグメント、リポソームまたはミセルエージェントまたはその他の包装粒子、および他のそのような生物材料に言及されます。【０１９２】ここで使用されるように、組成物は、任意の混合物を意味する。これは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水、非またはそれらの任意の組み合わせ水性することができます。【０１９３】ここで使用されるように、組み合わせの間または２つ以上の項目間の任意の関連付けを指します。組み合わせは、２つ以上のアイテムを１つの混合物、またはそれらの任意の変化など、その混合物であることができる２つの組成物または２つのコレクションなど、２つ以上の個別の項目に言及することができます。【０１９４】ここで使用されるように、キットには、それらの使用のためのパッケージの組み合わせに応じて含む命令および／または試薬を指します。【０１９５】ここで使用されるように、流体は流れることができる任意の組成を意味する。流体はこのように半固体、ペースト、ソリューション、水性混合物、ジェル、ローション、クリームなどのような組成物の形態である組成物を包含する。【０１９６】ここで使用されるように、抗原手段は、ポリペプチドが、免疫応答を誘導することを確認します。高抗原性ポリペプチドは、免疫応答を誘発するこれらのことは再現性と予想されます。【０１９７】ここで使用されるように、医薬効果や治療効果は効果を指し、病気や障害の治療やその症状の改善のために意図剤の投与時に観察します。【０１９８】ここで使用されるように、”病気や障害”は、原因や条件も含めてから得られた生物の病理学的条件を参照して、感染症、これらに限定されない条件を、遺伝的条件、取得し、特定の症状を特徴としています。病気や関心のある障害ここでこれらの者の標的タンパク質とそれらとは、ターゲットタンパク質が病因や病理学の役割を果たしているの仲介など、特定の標的タンパク質を関与しています。典型的な標的蛋白質と関連疾患や障害は、他の場所でここに記載されています。【０１９９】ここで、病気や条件で対象を”治療”を使用しているように対象者の症状は、部分的または完全に緩和されていること、または静的次の処理のままを意味します。したがって、治療は予防、治療および／または治療法を網羅しています。予防は／潜在的な病気の予防や症状や病気の進行の悪化の防止に関連付けられています。治療は、変更インターフェロンのいずれかの医薬用途を網羅し、組成物は、ここで提供されます。【０２００】ここで使用されるように、治療薬、治療法、保護剤、または当業者に知られているワクチンを含む、化学療法の平均、従来の薬と薬物療法は放射線治療剤は当技術分野でよく知られている。【０２０１】ここで使用されるように、治療は、条件は、障害や病気やその他の表示の症状、または改善されるそれ以外の場合は有利に変更どのような方法を意味します。【０２０２】ここで用いられる治療効果は変化させるには、典型的に向上することや病気または状態の症状を改善するか、その治療法を疾患または状態の対象の治療に起因する効果を意味するように。治療に有効な量は、組成物、分子または化合物対象に投与後の治療効果をもたらすの量を意味します。【０２０３】ここで使用されるように、用語”テーマは”人間のような、哺乳動物など、動物を指します。
ここで使用されるように、患者が被験者に関連付けられています。【０２０４】ここで使用されるように、処理することにより、特定の疾病または障害の症状は、このような医薬組成物または治療他の投与によりとしての改善は、任意の軽減を意味するかどうかを永続的または一時的、永続的または一時的なことができる症状に起因する、または組成物または治療薬の投与に関連付けられています。【０２０５】ここで使用されるように、予防や予防は、発展途上の疾患または状態のリスクが低減されるメソッドを参照します。【０２０６】ここで使用されるように、有効量は治療剤、予防硬化改善、逮捕または部分的に疾病または障害の症状を逮捕するために必要な量です。【０２０７】ここで使用されるように、管理は、抗体またはプローションは、その、その標的タンパク質に接触している任意のメソッドに関連付けられています。管理は、ヴィボの中またはヴィボの外あるいはヴィトロの中で行うことができる。たとえば、ヴィボの外での管理のための体液は、血液など、対象から削除され、抗体またはその一部と本体の外側で接触します。ヴィボの中での投与のためには、抗体またはその一部などの導入、局所、全身ローカルおよび／または他の経路によるとして、体内に導入することができます。ヴィトロの中での管理は、細胞培養法などの方法を網羅しています。【０２０８】ここで使用されるように、単位用量形態は、物理的に分離ユニット人間と動物の対象に適しており、個別に当該技術分野において知られているパッケージに関連付けられています。【０２０９】ここで使用されるように、単一の投与製剤は、直接投与用の製剤を指します。【０２１０】ここで使用されるように、”製造の資料では、”作られ、販売されている製品です。このアプリケーションで使用されるように、用語がコンパイル生殖細胞抗体または抗体そこ包装の記事に含まれて得られた包含することを意図しています。【０２１１】ここで使用されるように、流体が流れることができる任意の組成を意味します。流体はこのように半固体、ペースト、ソリューション、水性混合物、ジェル、ローション、クリームなどのような組成物の形態である組成物を包含します。【０２１２】ここで使用されるように、人間を含む霊長類の全ての動物は、ゴリラやサルなどの霊長類に限定されていません。げっ歯類、マウス、ラットなど、家禽、鶏などの、反芻動物、ヤギ、牛、ヒツジ、鹿などの羊；、ブタなどの動物です。ヒト以外の動物が企図する動物としての人間を除外します。ここに記載して生殖細胞のセグメントは、その結果抗体、任意のソース、動物、植物、原核生物および真菌からです。ほとんどの生殖細胞のセグメントは、その結果抗体は、哺乳動物の起源など、動物由来のものです。【０２１３】ここで使用されるように、コントロールが実質的にすることを除いては、テストパラメータで処理されていない、または、それには、サンプルの血漿サンプルされている場合、テストサンプルと同じですが、サンプルを参照するには、罹患していない、通常のボランティアからすることができます関心のある状態です。コントロールは、内部統制することができます。【０２１４】ここで使用されるように、文脈が明らかに特記する場合を除いた複数形を含む単数形”ａ”、”ａｎ”と”ｔｈｅ”指示が含まれています。したがって、”細胞外ドメイン”を含む、例えば、化合物を参照して、１つを有する化合物または細胞外ドメインが複数含まれています。【０２１５】ここで使用されるように、範囲と金額は”約”特定の値または範囲として表現することができます。についても正確な金額が含まれています。したがって、”約５塩基”は”約５拠点”また”５拠点”も意味します。
ここで使用されているように、簡略化した保護基、アミノ酸および他の化合物の略語は、その一般的な使用方法と一致して、特に断らない限り、認識された省略形、または生化学命名に関するＩＵＰＡＣ命名−Ｉｕｂインタフェース委員会を使用することはできません。（バイオ生物学（１９７２）１１：１７２６参照）。
Ｂ  概略
与えられたものは機能抗体のライブラリ（例。コレクション）、と結果としてのライブラリを生成するためのメソッドです。
コレクション、またはライブラリは、先験的に知られているが、ここで、各アドレス内の抗体は、同じシーケンスを持っているアドレスの中で、コレクション内の各他のアドレスで抗体とは異なります。コレクションは、分類されることができる修正された物理的な配列またはメンバーとして提供することができる。抗体の配列のコレクションはその組み合わせ生殖部の完全なレパートリー、その選択した部分、またはコレクションの変更フォームの表すことができます。ライブラリのメンバーは個別に設計されており並べられている。このため、図書館は、他のライブラリよりもはるかに少ないメンバーとライブラリの作成を許可するが、より多様性を有し、非常に多岐にわたっています。ライブラリは、本文書に記載された１０２メンバーとしていくつか含まれており、一般的に含まれているのが、１０３、１０４、２×１０４  ３×１０４  ４×１０４  ５×１０４、６×１０４  ７×１０４、８×１０４  ９×１０４または約１０６、１０７、１０８、１０９以上のユニークなメンバーを含む１０５以上のユニークなメンバーです。【０２１６】抗体のコレクションは、このような配列やその他のアドレス形式のように、アドレスされるように、各メンバが識別されていることを各遺伝子座が同じであるか、各遺伝子座での同じ結合特異性を有する抗体を持っています。座、または物理的な軌跡をすることができますそれ以外の場合は特定のソート、化学ライブラリの記述方法でバーコード、化学タグに添付ファイルとラベルをＲＦタグ、添付ファイルのようなことができます。【０２１７】対照的に、他の抗体ライブラリーは、遺伝子座での抗体の混合物が含まれているように、またはライブラリの正体不明のメンバが含まれて生産されています。そのようなライブラリの例としては、次のいずれかに記載されている：欧州特許出願第ＥＰ０３６８６８４およびＥＰ８９３１１７３１、国際公開特許出願ＷＯ９２／００１０４７、ＷＯ  ０２／３８７５６、ＷＯ  ９７／０８３２０、ＷＯ  ２００５／０２３９９３、ＷＯ  ０７／１３７６１６及びＷＯ  ２００７／０５４８１６；米国特許第６５９３０８１、６９８９２５０号；米特許出願公開番号米２００２／０１０２６１３、米２００３／１５３０３８、米２００３／００２２２４０、米２００５／０１１９４５５、米、２００５／００７９５７４および米２００６／０２３４３０２およびオルランディらにより出版されます。（１９８９）学会国際、教育、科学。
Ｕ．Ｓ．Ａ．、８６：３８３３−３８３７；ワードら。（１９８９）自然、３４１：５４４−５４６、ヒューズら。（１９８９）科学、２４６：１２７５−１２８１、バートンら。（１９９１）文集。国立、教育。科学、Ｕ．Ｓ．Ａ．、８８：１０１３４−１０１３７；マークら。（１９９１）ｊモル、ボル、２２２：５８１−５９１。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら。（１９９１）Ｊ，モルボル、２２７：３８１−３８８。ニシンら。（１９９４）エンボＪ１３：６９２−６９８。Ｂａｒｂａｓら。（１９９２）文集。国立。科学。科学、Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９：４４５７−４４６１；赤松ら。
（１９９３）ｊイミュノル、１５１：４６５１−１６５９；グリフィンら。（１９９４）エンボＪ１３：３２４５−３２６０。フェロウス（２００４）ＰＮＡ、１０１：１２４６７−１２４７２。パーソンら。（２００６）ｊモルボル。３５７：６０７−６２０。キナピックら。
（２０００）ｊモルボル。２９６：５７−８６；ロザら。（２００８）ｊモルボル。３７６：１１８２−１２００。モンドンら。バイオサイエンス（２００８）フロンティア、１３：１１１７−１１２９、そしてベアール、アイ（２００７）エキスパートオピン。生物。、７；７６３−７７９。【０２１８】これらのライブラリの多くは（１０８−１０１０メンバーなど）のメンバーの多数が含まれていますが、また、すべてのメンバーが機能していることを確認することも、多様性を最大化するために、その生殖細胞系列の完全なレパートリーまたは選択された部分を表すためにメカニズムはありません。したがって、組成物は、多様なライブラリの最適化されていません。たとえば、多くの既存のライブラリは、生殖細胞系列のＰＣＲ増幅によって開発されています。ＰＣＲ増幅は、結果の増幅産物にエラーが導入されています。加えて、いくつかのメソッドのハイブリッドプライマーは、個々のＶの（Ｄ）Ｊ組セグメントの組換えを容易にするために使用されています。これは、組換えイベントが発生することができる”アウトフレームの”非機能メンバーの結果。また、このような方法を実施する上で、メンバーのいずれか（例えば、チューブ内やファージディスプレイを介して）プールされ、ターゲットへの結合一緒にスクリーンや基板個別に取得され、成長し混合し、植民地として宿主細胞に導入されます。肯定的な相互作用やその他の選択されたイベントの識別時に、任意の”ヒット”は、さらに注文識別することが特徴である必要があります。【０２１９】抗体の組み合わせアドレスのライブラリは、これらの問題を共有していない本サービスを提供します。コレクションの各メンバは、アドレス指定される各メンバが占めるようにユニークな軌跡は、例えば、空間的配列または他の配列やその他の個人アドレス（例えば、ウェルプレートでのプレゼンテーション用に、サポートやチップ、バーコーディングにバインドされている、色は、ラベル付きのＲＦタグをコード化されたサポートやその他のようなアドレス形式）。各メンバーを個別に生成されるため、アドレスを表示していますメンバーは、容易であるため、各メンバーの配列が知られている。メンバーの表示は、関数だけでなく、バインディングものメンバーのスクリーニングが可能任意の形式で達成することができます。”ヒット”は迅速に審査結果と一致して識別することができます。したがって、コレクションのメンバ間の構造／活性関係（ＳＡＲ）は特性の間、または特定された”ヒット”の中の配列の類似性を識別するために行うことができます。薬物動態、用量反応はまた、スクリーニングまたはすぐに”ヒット”の識別以下が利用可能です。“ヒット”のさらなる最適化がこのような変異と反復スクリーニングとして実行することができます。したがって、メソッドは、アドレス指定可能な組合せ抗体のコレクションを生成するためにここに記載して結果のコレクションは、抗体医薬として使用するために、例えば、所望の特異性抗体および／または活動の同定に強力な代替手段を提供しています。
アドレス指定可能な組合せ抗体コレクションを生成する方法【０２２０】のいずれかの方法の例では、本サービスに提供では、ライブラリの変数（ＶＨ）が重いと可変光（ＶＬ）のチェーンのメンバーが生殖細胞抗体配列を知られているので、またはその配列変更は、ＤＮＡ合成により組換えまたは合成、生成されます。したがって、メンバーは、ナイーブな生殖細胞の全体のレパートリーを表すことができる”自己”タンパク質に対する選択に基づいて制限されていません。コレクション内の組合せの多様性は可変重鎖および個々のときＶ（Ｖ・またはＶ・）とＪを構成する個々のＶ、ＤおよびＪセグメントの組換え（例。ここに記載されたコンピュータソフトウェアによってシリコで実行）から存在している可変軽鎖（図１を参照）を構成するＶ（Ｄ）Ｊ・セグメント。配列は最大組合せの多様性を生成するＶ（Ｄ）Ｊセグメントのすべての組み合わせのランダムな組換えによって結合することができます。
別の方法としては、Ｖ（Ｄ）Ｊセグメントは、このような特定のシーケンスまたは配列のサブセットは、ライブラリのメンバーを生成するために使用されていること、または半合理的な合理的なアプローチを使用して再結合することができます。たとえば、生殖細胞のセグメントが配列の類似性や相違点に基づいて選択するか、または共有の特性に基づいて（例えば、Ｖ領域の家族、およびＣＤＲ３の長さや組成物または他の生化学的属性）。【０２２１】本手法では、結果のメンバーの組み合わせの多様性は、完全な長さのポリペプチドをコードする配列に機能するために最適化されています。Ｖのすべての組み合わせが、（Ｄ）Ｊ組セグメントが再結合することができ、異なるＶ（Ｄ）Ｊ組配列の間のコンパイルされたシーケンス内の関節は、結果の配列がインフレームになるように選択されています。各機能を備えたメンバーは、コレクションのアドレス（もやチップの位置など）を占めている。ヴィボの中では、しかし、接合部の多様性はヌクレオチドは、しばしば接合で新しいアミノ酸をもたらすことができます接合領域で挿入されているようですＶ（Ｄ）Ｊ組換え時に存在しています。したがって、ここでのメソッドのいくつかの例では、結果のフレームメンバーが突然変異を受けることができ、例えば、接合領域（例えば、接合部の多様性）の多様性を紹介しています。このような例では、各遺伝子座は（挿入、削除またはアミノ酸の置換など）を１つまたは複数の突然変異によって同じＶ（Ｄ）Ｊセグメントを持つ抗体のプールが、異なる互いに含めることができます。【０２２２】ナイーブ抗体ライブラリを生成するに加えて、これらのメソッドはここでは、結果のメンバーが知られているターゲットに対して最適化されていることにより抗体ライブラリを生成するために使用することができます提供されます。例えば、重鎖および軽鎖の個々のＶ（Ｄ）Ｊセグメントの開始シーケンスがターゲットに対して既知の結合ペプチドを含むように生成することができます。そのようなライブラリ形式の目標は、たとえば、成長因子、サイトカイン、ホルモンや他の細胞活性化を治療標的を模倣するアゴニストまたはアンタゴニスト抗体の検出を可能にするプラットフォームを生成することです。【０２２３】一般的に、コレクションのメンバは、ここの全部又は可変光（ＶＬ）および可変重（ＶＨ）がチェーンの部分を含んで提供されるので、得られた抗体に限り、結合部位の抗原を形成するのに十分です。したがって、組み合わせの多様性に加えて、コレクション内の多様性がここに重鎖および軽鎖（図１）を組み合わせることにより、多様性を組み合わせることによって達成が提供される。したがって、個別に再結合ＶＬとＶＨ鎖は、それ自体がそのＶＬとＶＨ鎖、またはサブセットのすべての可能な組み合わせのスケーラブルなコレクションを生成するために様々な組み合わせで組み合わせることができる上記について討論しました。たとえば、ライブラリは、すべてのメンバは、同じＶＨのチェーンを持って全部又は個別に再結合ＶＬのメンバーのサブセットと対になっています生成することができます。重鎖および軽鎖のメンバーは、直接的または間接的な結合により組み合わせることができます。重鎖および軽鎖の結果のペアは、完全な抗体は、Ｆａｂフォーム、一本鎖（ｓｃ）のＦｖをフォーム、またはそれらの任意の多量フォームなど、任意のライブラリ形式で提示することができます。【０２２４】２  結果の書庫【０２２５】本発明はここで核酸分子のエンコーディングのＶＬ鎖の核酸分子のエンコーディングのＶＨ鎖のライブラリのライブラリです。また、ここで最小まったく含有する抗体ライブラリまたはＶＬおよびＶＨ鎖の部分は、ペアになっているコンビナトリアル抗体ライブラリです提供など、ライブラリ内の各結果のメンバーは、結合部位の抗原を形成するのに十分であることを確認します。ライブラリ、またはすべて、またはすべての可能な生殖細胞の抗体の一部を表すナイーブなライブラリをすることができ、そのフォームを変更することができます。ペア抗体コレクションの結果メンバーは、以下には、Ｆａｂ、一本鎖（ｓｃ）のＦｖを、ジスルフィド、ビス−ｓｃＦｖ、ディサボディ、トライアボディ、テトラボディ、ミニボディなど多量のフォーマットおよびＦｖ安定化に限定されません。コードする核酸分子は、そのことができる終止コドンを欠いているため、コレクションの個々のメンバーは、ライブラリはここで、既存の抗体のコレクションとは異なり、抗体ライブラリーの場合、各メンバーが”生産”や”機能”が、それ以外完全な長さのポリペプチドを製造することができる前に、得られたタンパク質を切り捨てます。通常、すべてのライブラリは、ライブラリの各メンバーのアイデンティティは、そのローカスまたは”アドレス”に基づいて知られているように、アドレス可能な形式で、ここで提供される。抗体のコレクションの例としてはここでアドレス指定可能な組合せのＦａｂライブラリなどの組み合わせのＦａｂライブラリが提供されます。上記のライブラリのいずれかが１０２、１０３、１０４または１０５、またはそれ以上の異なるメンバを含めることができます。
３  ライブラリの応用【０２２６】結果としてのライブラリは、任意のアプリケーションや目的、必要に応じて使用することができます。彼らの多様性、特異性とエフェクター機能のため、抗体は、タンパク質ベースの治療のために魅力的な候補となります。様々な活動は、このような抗体医薬として使用するためのユニークな機能を有する抗体を識別するために、このように、ライブラリは、スクリーニングの方法で使用することができます。たとえば、抗体ライブラリーは、ここで関数に基づいて、または未知の、または、既知のターゲットに対して結合アッセイのスクリーニングに使用することができます。特に、それは結果のライブラリが選択したターゲットに対する新たなモノクローナル抗体（例えば、ファブ）を発見するには、セルベースのアッセイなどの機能アッセイに使用することができることがここで企図されています。したがって、ライブラリはここでは、彼らは、おそらく低親和性結合される抗体の識別を可能にするためのライブラリが、既存の利点を提供して提供される機能の理想的な抗体医薬の候補となります。したがって、両方のアゴニストとアンタゴニスト抗体を容易に発見することができます。【０２２７】結果の識別”ヒット”は、さらに抗体の検出（図２）の反復スクリーニング方法によって所望のターゲットに対して最適化することができます。たとえば、アクティビティベースのバインディングのスクリーニング法から同定抗体”ヒット”は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組生殖細胞のＶ（Ｄ）Ｊは（配列同一または類似の例）、生殖細胞のセグメント関連を含み、さらにライブラリを生成するために使用することができるセグメント、ヒット識別されます。コレクションには知られているコレクション内の個々のメンバーのアイデンティティは、反復のアプローチが改善された治療への応用抗体”ヒット”を識別するために”ヒット”の急速な拡大に使用することができるように、配列されているという事実のおかげです。また、抗体”ヒット”は、重鎖および軽鎖を変更生成し、変更のＶＬ鎖の核酸分子のエンコーディングのライブラリの歴代の突然変異誘発のための足場として使用することができ、コードする核酸分子のライブラリはＶＨ鎖抗体ライブラリーを変更最小限のＶＬおよびＶＨ鎖を変更を含みます。【０２２８】最後に、本書および／またはさらなるライブラリから特定された抗体”ヒット”が１つまたは複数のターゲットタンパク質の特異性のおかげで、ビトロ内での様々なおよびビトロ内のアプリケーションで使用することができ、反復スクリーニングおよび／または他の突然変異誘発法により最適化されます。たとえば、抗体は、診断方法で使用することができます。別の例では、抗体は、疾患または障害の発現や活性化、特定のターゲットタンパク質のに関連付けられている治療の治療や他の用途の方法で使用することができる抗体が調節することができます。【０２２９】以下のセクションでは、メソッドとライブラリの典型的なコンポーネントが、配列されたライブラリー、結果のライブラリおよびライブラリのアプリケーションを含む組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法について説明します。【０２３０】Ｃ．抗体【０２３１】本発明はアドレス指定可能な組合せ���抗体の生成ライブラリ、および結果のライブラリと抗体のメソッドです。ライブラリ中の抗体は、最小限の全部又は可変重鎖（ＶＨ）との一部および／または可変軽を含む（ＶＬ）のチェーンはとても抗体限り十分な抗体結合部位が含まれています。たとえば、抗体のＶＨ及びＶＬ鎖ここに典型的に抗原結合部位を構成する三つのＣＤＲのすべてに一般的に２つ以上、最大、１つまたは複数含まれて提供されます。いくつかの例では、抗体（フレデリックソンらなどを参照してください。結合および活性化ターゲットの監督に影響することにより既知のターゲットに対してペプチドは可変領域のＣＤＲ領域にグラフトされる合成ＣＤＲを含むように生成することができます。（２００６）ＰＮＡＳ１０３：１４３０７−１４３１２））
必要に応じて、抗体は、すべて、または（ＣＨ１の、ＣＨ２のＣＨ３とＣＨ４および／または一定の重鎖（ＣＬ）のような１つまたは複数のＣＨドメインなど）を一定の重鎖の一部を含めることができます。したがって、抗体は、ライブラリに含まれてここでは、全長抗体であるまた、フラグメントまたはその一部を含む、例えば、例えばＦａｂ、Ｆａｂ′を、のＦ（ａｂ′）２、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）を含むものが挙げられる将来価値、ｄｓＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ＦＤおよびＦｄは′Ｆａｂフラグメント、Ｆｄフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、およびｓｃＦａｂの断片を断片化します。たとえば、ライブラリ内の抗体は、ここでＦａｂを含んで提供される。【０２３２】構造、シーケンス、抗体の機能の説明は、当業者の一つであり、当業者のいずれかの生殖細胞の多様性を生じさせるメカニズムに精通していることが知られている。これは、コンビナトリアル抗体のライブラリーは、Ｂ細胞分化に伴う生殖細胞組換えの過程を模倣する生殖細胞のＤＮＡ配列の組換えによって行うことができることはここで企図されている。またはここで説明したように、分子生物学の技術を使用して手動で実行することができるような組換え（コンピュータなど）シリコ内で行うことができます。組換え配列を個別に可変重鎖および軽鎖配列のすべての順列を生成するには、このようなＤＮＡ合成により、または組換えＤＮＡ技術により、生成することができます。抗体は、任意の形式で表現することができるいくつかのインスタンスでは、変数と定数の領域の組み合わせが達成することができます。その結果、組み合わせ抗体のライブラリ全体をナイーブ抗体レパートリーまたはそのサブセットを表すことができる本サービスに提供するということです。【０２３３】１  抗体ポリペプチド【０２３４】抗体は、膜結合型と分泌形でＢ細胞によって自然に生成されます。抗体は、具体的に同種の相互作用を介して結合する抗原エピトープと認識しています。抗体中和や毒素、病原体やその他の感染症のクリアランスを引き起こす複数のエフェクター機能を開始することができる抗原を同族に結合します。抗体特異性の多様性は、Ｂ細胞の開発中に組換えのイベントのために自然に発生します。これらのイベントを通じて、複数の抗体Ｖ、Ｄおよび抗体分子の可変領域をエンコードするＪ遺伝子セグメント、様々な組み合わせが多様な抗体の多数の天然の抗体のレパートリーを生成するために一定の領域の遺伝子と結合されています。ヒト抗体のレパートリーは、１０１０以上の異なる抗原特異性が含まれているため、理論的に具体的に異物抗原を認識することができます。抗体は、すなわち、組換え、抗体フラグメントなどの抗体を生産などの自然に産生される抗体を、同様に総合的に含まれています。【０２３５】折り返し抗体ポリペプチドでは、結合特異性はスキップして、および／または軽鎖可変領域ドメイン重いの部分を含む抗原結合部位のドメインにより付与されます。抗体分子の他のドメインはシグナル伝達との相互作用他の細胞、ポリペプチド、生体分子となどのイベントに参加することでエフェクター機能を提供しています。これらのエフェクター機能は、中和および／または抗体によって認識される感染剤のクリ���ランスが発生します。【０２３６】２  抗体の構造と機能ドメイン【０２３７】フルレングスの抗体は、４つのポリペプチド鎖、２つの同一の重（Ｈ）が鎖（それぞれは、通常、約４４０個のアミノ酸を含む）と２つの同一の光（Ｌ）鎖（各約２２０個のアミノ酸を含む）が含まれています。軽鎖はκ（・）とラムダ（・）と呼ばれる２つの別個の形で存在しています。各チェーンは、変数（Ｖ）と定常（Ｃ）領域のドメインを含む免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインとして編成ドメインのシリーズで構成されています。軽鎖は、２つのドメインを、Ｃの領域（ＣＬ）とＶ領域（ＶＬ）に対応しています。重鎖は、Ｃ領域（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３とＣＨ４）の４つのドメインは、Ｖ領域（ＶＨ）と、３つまたは４つのドメインを持っており、いくつかのケースでは、ヒンジ領域です。四鎖は（２つの重りと２つの光）と非共有結合共有結合（ジスルフィド）結合の組み合わせによって一緒に保持されます。【０２３８】抗体は、フルの長さであるものと、すなわち、そのファブは、Ｆａｂ′、のＦ（ａｂ′）２、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖを、ｄｓＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙのＦＤとＦｄ′断片を断片的なものが挙げられる。フラグメントは、単一の鎖または二量体のものが挙げられます。唯一のＶＨおよびＶＬドメインを含むＦｖ断片、（例。全体の抗原結合部位を保持する最小の免疫グロブリンの断片、分子生物学、巻２０７のメソッド：組換え抗体癌治療方法およびプロトコルのための抗体（２００３）；第１章ｐ３−２５、キプリヤノグ）。ＦＶの安定化は、ペプチドとの連携によりＶＨおよびそのような例としてのＶＬ鎖の直接リンクによって達成され、ジスルフィド結合やノブに穴変異（単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）を生成します。Ｆａｂフラグメントは、対照的に、一緒に変数のチェーンを保持ＣＨ１とのＣＬのドメインの存在のために安定している。のみＶＨのドメインが含まれているＦＤの抗体は、完全な抗原結合部位を欠いている不溶性することができます。【０２３９】３  抗体配列と特異
重鎖および軽鎖の可変領域は、−領域、またはイントロンをコーディング以外で区切られた複数の生殖細胞の遺伝子セグメントによってコードされている多くの場合、異なる染色体上に存在しています。遺伝子、２７の多様性（ＤＨ）の遺伝子、および６への参加（ＪＨ）の遺伝子、たとえば、免疫グロブリン重鎖領域の遺伝子は約６５変数（ＶＨ）が含まれています。カッパ（・）とラムダ（・）軽鎖はまた、各ＶＬとＪＬ遺伝子セグメント、同様の数によってコードされている任意のＤ遺伝子セグメントが含まれていません。典型的なＶＨ、ＤＨは、ＪＨとＶＬ（Ｖ・またはＶ・）とＪＬ（Ｊ・またはＪ・）遺伝子セグメントは表３−５に記載されている生殖細胞です。【０２４０】Ｂ細胞の分化生殖細胞のＤＮＡは、１つのＤＨと重鎖遺伝子座のいずれかのＪＨ遺伝子セグメントが再結合することにより再配置され、ＶＨの鎖をエンコードに替えＶＤＪ遺伝子を形成する１のＶＨ遺伝子セグメントの結合が続いています。転位は、対立遺伝子排除のプロセスによって、単一の重鎖遺伝子でのみ発生します。対立遺伝子排除は、インフレームまたは約１変数重鎖のＶＤＪ再結合の３分の１で発生しＶＤＪセグメントの”生産”組換えによって規制されています。このような生産性の組換えイベントが最初のセルに発生すると、ｐｒｅ−Ｂ細胞の表面に発現して取得し、さらに重鎖の再結合を遮断する信号を送信することにより、対立遺伝子の発現を防止するμ重鎖の生産の結果重鎖遺伝子座が生まれます。表面は−μ重鎖もして、転位のカッパ（・）遺伝子座を有効に機能表明します。・組換えは、両方の座に非生産的である場合、ラムダ（・）遺伝子座にのみ再アクティブになります。軽鎖転位のイベントは、ＶＬとＪＬのセグメントが再結合されていることを除いて、重鎖と類似しています。それぞれの一次転写する前に、対応する定数鎖遺伝子が追加されます。後続の転写とＲＮＡスプライシングはそのまま軽鎖または重鎖に翻訳されてｍＲＮＡになります。【０２４１】抗体の可変領域は抗原結合および特異性と、それによって得られた組換えをコードする核酸配列の可変領域ドメイン、抗体の間で異なっており、特定の抗体と抗原特異性を付与する個々の生殖細胞Ｖ、ＤおよびＪセグメントの組換えのイベントのために付与します。しかし、バリエーション領域を決定する３つの相補（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に限定されます（Ｈ）と（Ｌ）重鎖可変領域のＮ末端ドメイン内にあります。ＣＤＲは、より保存されている地域が点在している”フレームワーク領域”（ＦＲ）と呼ばれます。フレームワーク領域およびＣＤＲの程度は正確に確認、（カバット、ＥＡらを参照。（１９９１）免疫学的興味の、たんぱく質の配列、第５版、保健社会福祉省、米国エネルギー省、ＮＩＨ公報９１−３２４２、およびチョシア、Ｃ．ら（１９８７）Ｊモルボル。１９６：９０１−９１７）。ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２および、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４：各ＶＨおよびＶＬは、一般的に３つのＣＤＲと、次の順序でカルボキシ末端にアミノ末端から配置した４つのＦＲＳで構成されています。ＶＬおよびＶＨドメイン間でシーケンスの変動は、一般的に抗原結合部位を形成する領域であるＣＤＲは、��限されています。例えば、重鎖は、一般的には、ＶＨ遺伝子はＮ末端３つのフレームワーク領域は、最初の２つの完全なＣＤＲおよび第三ＣＤＲの最初の部分をエンコード、ＤＨの遺伝子は第三ＣＤＲの中央部とＪＨをエンコード遺伝子は第三のＣＤＲと４番目のフレームワーク領域の最後の部分をエンコードします。軽鎖については、ＶＬ遺伝子は第一のＣＤＲおよび第２のＣＤＲをエンコードします。第三ＣＤＲは（ＣＤＲＬ３）ＶＬとＪＬの遺伝子セグメントの結合することにより形成されている。したがって、ＣＤＲの１と２は、排他的に生殖細胞Ｖ遺伝子セグメントシーケンスでエンコードされます。ＶＨおよびＶＬ鎖ＣＤＲ３ｓはＣＤＲ１と２の定形外の境界と銀の結合部位の中心を形成し、ＦＲＳは、ＨとＬのＣＤＲを配向で足場をサポートしています。平均では、抗原結合部位は、通常、ＣＤＲの少なくとも４人が（例、ジャニス  キュービィ、免疫学の変数をされると抗原結合するための特異性に貢献し、重鎖および軽鎖のＣＤＲ３と、抗原のエピトープと接触する必要があります。免疫学、第３版、ニューヨーク、ＷＨのフリーマンアンドカンパニー、１９９８年、頁１１５から１１８）。Ｄ遺伝子セグメントのすべて含まれているＣＤＲＨ３は、ＡＢ−結合部位の中で最も多様なコンポーネントであり、通常、Ａｂの特異性を定義する上で重要な役割を果たします。配列変異に加えて、（例１２表２６を参照）重鎖および軽鎖の間のＣＤＲの長さのばらつきがあります。【０２４２】一方、一定の領域は、複数の抗体の間で保存されている配列によりエンコードされます。これらのドメインは、抗体の機能特性を付与します、例えば、能力は注文感染性病原体のクリアランスを引き起こすために免疫系の細胞および血清タンパク質と相互作用します。例えばＩｇＭは、ＩＧＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥとＩｇＡのための抗体の別のクラスが、それらは、異なるエフェクター機能を扱うことができるように、別の定常領域を持っています。【０２４３】Ｖ、Ｄ、およびＪのこれらの自然組換えのイベントは、両方の高い親和性と特異性とほぼ２ｘ１０７異なる抗体を提供することができます。その他の多様性は、Ｖ領域の体細胞高頻度変異でも、塩基の挿入や削除を接合セグメント内で導入されています。その結果、約１０１０抗体個々の抗原特異性が異なる存在であるということです。【０２４４】メソッドは、ここでのメカニズムにより、様々な機能や他のプロパティをテストすることができる抗体のコレクションの生成を可能にして、間に生殖細胞抗体の多様性を生成するための責任を利用して提供します。
Ｄ．形容詞抗体ライブラリーの生成会員の身元方法【０２４５】本発明はここで組み合わせた抗体ライブラリーの製造方法、結果のライブラリです。典型的には、ライブラリ内の各メンバは、可変重鎖および可変軽鎖、またはその一部を抗原結合部位を形成するのに十分含まれています。メソッドは、本サービスに提供では、ライブラリの各抗体のメンバーは、（生殖細胞系列の公開データベースからなど）知られています（Ｄ）のＪ遺伝子セグメントのシーケンスを組み合わせることにより、自然結合イベントを模倣することによって生成されるか、さまざまな組み合わせで、そのフォームの変更フレームでは、核酸配列をエンコード機能ＶＨとＶＬ鎖を複数生成します。たとえば、メソッドコードする核酸分子可変重のステップで（ＶＨ）チェーンが再結合する個々のＶ、ＤおよびＪセグメントによって生成されます。核酸分子のエンコーディングは、可変光（ＶＬ）チェーンは、個々のときＶ（Ｖ・またはＶ・）とＪ（Ｊ・、またはＪ・）を可変軽鎖を構成するセグメント再結合によって生成されます。セグメントは、生殖細胞のセグメントすることができるか、その配列を縮退しました。そのような例では、このメソッドによって生成される結果の抗体はナイーブ抗体です。これは、メソッドは、既知の生殖細胞系列のセグメントの変更されたフォームを使用して実行することができますただし、ここで意図されている、例えば、ライブラリに、さらに多様性を紹介しています。たとえば、このメソッドは、逆（反転ＩＥ）の補数のＤＨ生殖セグメントの配列を使用して実行することができます。生殖細胞のセグメントを再結合のプロセスは、フレームの分子生物学の技術やシリコ内で（アルゴリズムを実行するようにプログラムされたコンピュータを使用するなど）を使用して手動で実行することができます。【０２４６】方法では、組換えは、各遺伝子のセグメントは、組換え核酸分子を得られた機能ＶＨまたはＶＬポリペプチドをコードするように、インフレームされるように行われます。また、メソッドでは、各核酸分子は、個別に生成され、合成した方法では、ライブラリの結果のメンバーが表現すると、組み合わせ抗体メンバーは最低限そのＶＨとＶＬのチェーン、または一部を含む生成されるように組換え可変領域遺伝子を一緒にコードする核酸分子の共発現によって生産されています。メソッドは、ＶＨおよびＶＬ鎖をコードする遺伝子は、重鎖および軽鎖、リンカによって結合されていることにより、単一の核酸分子として表すことができるコードする核酸分子のいくつかの例です。メソッドは、コードする核酸分子の別の例ではＶＨとＶＬ鎖が別々に一緒に発現のために提供することができることです。したがって、組換え核酸分子からの発現により、ライブラリの各別のメンバーは、多様性は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組セグメントの組み合わせの多様性と重鎖および軽鎖の組み合わせの多様性によって達成されることにより、生殖細胞エンコードされた抗体を表しています。
方法では、追加の多様性は、当技術分野で知られているアプローチの数のいずれかを使用して、ライブラリに導入することができる限定されないために、ランダムな突然変異誘発、半や合理的突然変異誘発合理的として紹介されます。【０２４７】うち１つ以上の方法のすべてのステップは、プロセス内の各メンバのＩＤがアドレス遺伝子座で、その場所で知られているように、アドレス指定可能な形式で行うことができます。したがって、ここでコードする核酸配列のＶＨ鎖、核酸配列のエンコーディングのＶＬ鎖を再結合生殖細胞のアドレス指定可能なライブラリを再結合生殖細胞のアドレスライブラリ、およびの核酸分子のエンコーディングのＶＬ鎖の組み合わせとコードする核酸分子ＶＨの鎖によって形成されたアドレスライブラリである提供各遺伝子座です。また、提供されるアドレス細胞は、組換え核酸分子のエンコーディングのさまざまな組み合わせを含む遺伝子座の各セルＶＬと再結合する核酸ＶＨが与えられています。結果の抗体ライブラリーは、アドレス指定することができます。このようなアドレス抗体ライブラリーは、”ヒット”などの活動の様々なスクリーニングすることができるとの間の中で”ヒット”抗体の結果のライブラリ構造／活性関係の評価の迅速な同定をも可能に結合、増殖、細胞に限定されない低親和性が自己抗原、イオンチャネル、Ｇタンパク質共役型受容体、新規エピトープ、非タンパク質抗原およびアゴニスト抗体の発見などの困難な抗原に対してリードします。【０２４８】１  機能組換え生殖細胞の可変領域遺伝子の製造方法【０２４９】本発明はここでの生殖細胞系セグメントまたは変更されたフォームその、各コードする核酸分子重鎖または軽鎖のさまざまな機能可変領域の再結合によって生成された核酸分子を生成するためのメソッドです。可変遺伝子セグメントはＶＨ、ＤＨが、ＪＨ、Ｖ・、Ｊ・、Ｖ・およびＪ・が含まれています。生殖細胞系列のセグメントはから選択することができるヒト、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ馬、ウサギや犬の生殖細胞のセグメントに限定されません。典型的な生殖細胞のセグメントは、ヒト由来のものです。【０２５０】Ａの可変遺伝子セグメント
ｉ．生殖細胞セグメント
本方法を実施するには、セグメントのシーケンスは、抗体生殖細胞系遺伝子セグメントを提供する任意のソースから得られる生殖細胞です。これらは、任意のデータベースや生殖細胞の遺伝子セグメントの記載の配列を設定公表されている文献が含まれています。典型的な抗体の生殖細胞のソースは含まれて国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の、国際的な免疫情報システムのデータベースに限定されていない▲Ｒ▼（ＩＭＧＴ）、カバットのデータベースとトムリンソンのＶＢａｓｅデータベース（Ｌｅｆｒａｎｃ（２００３）核酸研究所、３１：３０７−３１０；マーティンら、治療用抗体、ワイリー−ＶＣＨ（２００７）、頁１０４から１０７）のハンドブックの抗体工学のためのバイオインフォマティクスツール。必要に応じて、非ヒト生殖細胞系列のセグメントのための核酸配列はまた、公表されている文献や公開データベースから取得することができます。たとえば、例示的なマウスの生殖細胞のデータベースがｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／ｖ＿ｍｉｃｅ．ｈｔｍｌデータベースを利用可能なクローラ式です。配列リストは、ここＩＭＧＴデータベースやその他の公共データベースから収集された配列の例示的なヒト生殖細胞のセグメントのシーケンス（例えば、参照配列番号：１０−４５１および８６８）を提供できます。【０２５１】たとえば、例示的なヒト重鎖生殖セグメントは、（配列番号１０から２８５）を表３に記載されています。典型的な人間の軽鎖カッパ生殖セグメントは、（配列番号２８６から３６４および配列番号８６８）を表４に記載されています。典型的な人間の軽鎖ラムダ生殖セグメントは、（配列番号３６５から４５１）の表５に記載されています。生殖細胞系列のセグメントは、ＩＭＧＴ遺伝子名と、以前はヒトゲノム機構（ヒューゴ）命名法委員会によって承認された定義を使用して記載されています。セグメントは、これにより最初の３文字の軌跡を（ＩｇＨ、ＩＧＫまたはＩＧＬ）を示すＩＭＧＴ命名法を使用して名前が付けられ、４文字目は、遺伝子（ＶはＶ遺伝子を、ＤはＤ遺伝子を、ＪはＪ遺伝子を表す）、５番目の位置は、遺伝子数の分類を示すハイフンの後にサブグループの数を示しています。対立遺伝子については、ＩＭＧＴ名には、アスタリスクと２つの図番号が続いています。【０２５２】ヒトの重鎖Ｖ遺伝子、ヒト軽鎖カッパＶの遺伝子、それぞれヒト軽鎖ラムダＶの遺伝子（例。レフランク、Ｍ．−Ｐ．経験Ｃｌｉｎの免疫遺伝学、１８：１００−１１６（２００１）、ツァッハウとＨＧ免疫、４：４９−５４（１９９６）、Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｍ．−Ｐ．経験Ｃｌｉｎの免疫遺伝学、１８：１６１−１７４（２０００）、川崎ら、ゲノム研究所、７：２５０−２６１（１９９７）、Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｍ．−Ｐ．経験Ｃｌｉｎの免疫遺伝学、１８：２４２−２５４（２００１）。
任意の名前付け規則は、抗体の生殖細胞のセグメントを識別するために使用することができます。任意の名前付け規則を使用している核酸配列を識別することができる当業者の一つ（例。表２２、参照）、組換え核酸配列を記述するここで目的のために、ＶＨの生殖細胞のセグメントが識別されるすべての対立せずにＩＭＧＴ命名法を使用して名前が付けられます。表６に、それぞれの対立遺伝子を有するＩＭＧＴの命名法とそれに対応するＩＭＧＴ命名法を記載してあります。ＶＫの生殖細胞のセグメントはツァッハウ命名法を使用して名前が付けられます。表７にツァッハウの命名法とそれに対応するＩＭＧＴの名称を示しています。ＶＬの生殖細胞のセグメントは、川崎市の名称を使用して識別されます。表８は、川崎市の命名法とそれに対応するＩＭＧＴの名称を示しています。のＤＨ、公団、ＪＫとＪＬの生殖細胞のセグメントはＩＭＧＴ命名法を使用して名前が付けられます。【０２５３】
【表３】
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【０２５４】
【表４】
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【０２５５】
【表５】
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【０２５６】
【表６】
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【０２５７】
【表７】
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【０２５８】
【表８】
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【０２５９】ｉｉ．組み換え生殖細胞系セグメント
本書で、方法の応用は生殖細胞系の配列セグメントに限定されていないことが認められています。従って、組み換えＶＨ，ＤＨ，ＪＨ，Ｖκ，Ｊκ，Ｖλおよび／またはＪλの配列セグメント、またはそれに類似した配列は方法の適用に使われます。配列セグメントを組み換え、その種類を増加することによって、ライブラリー、およびコンパイルされたセグメントの並べ替えの多様性を増加することもできます。生殖細胞系のセグメントは不規則または経験的に変更することができます。生殖細胞系のセグメントは不規則または経験によって変更することができます。または／加えて、生殖細胞系セグメントは、リンカー、制限酵素部位、あるいはこの方法の応用に必要な他のヌクレオチド配列（ここで指定された）の使用によって変更され、組み換え完全長核酸分子の生成を容易にすることができます。【０２６０】一般的に、変更された生殖細胞セグメントは、生殖細胞系配列に由来するものを含みます。生殖細胞セグメントは、不規則または経験的に生殖細胞系配列に変異を挿入することによって変更することができるが、また生殖細胞系のコンセンサス配列を生成するために変更することができます。たとえば、変更されたＪＨ生殖細胞系セグメントは配列ＩＤ番号３４５０−３４５５にあります。【０２６１】別の例では、生殖細胞セグメントの追加的な変更には、制限部位を提供する個々の生殖細胞系セグメントの５’または３’のいずれかまたは両方の端末にフランキング配列の追加の例があります。そういった変更は、ＤＮＡ合成、またはＰＣＲによって生殖細胞系列に組み込むことができます。例えば、制限酵素部位を組み込むことができるプライマーを利用します。後述の一例では、そういった制限部位を組み込むことによって生殖細胞系セグメントの接合を促すことができます。ただし、場合によっては、生殖細胞セグメントの組み換えは制限部位の除去を含みます。制限部位は、当技術分野で知られているあらゆる制限部位を含めます。典型的な制限部位の配列は表１５に記載されています。一般的に、選択される制限部位は、後の生殖細胞セグメントの統合と適合性があり、また平滑末端ライゲーション、あるいは付着末端ライゲーションを容易にするために選択されることがあります。制限酵素の選択は普通であり、当業者のいずれかのレベルの範囲内にあります。【０２６２】いくつかの例では、モノクローナル抗体を含み、また特に治療抗体など、既知の抗体を、ここで指定される方法に利用できます。
モノクローナル抗体の抗原特異性がすでに承認されていることを踏まえ、由来の配列をこの方法に取り入れることによって、抗原に対して向上した特異性と機能性をもって抗体の識別が可能なります。生殖細胞系配列から由来するヌクレオチド配列、例えばＶＨ，ＤＨ，ＪＨ，Ｖκ，Ｊκ，Ｖλおよび／あるいはＪλ．の１つあるいはそれ以上に相当する物は、自らで生殖細胞系配列と組み込むことができます。当業者は、生殖細胞系配列から由来する特定の抗体をコードする核酸分子で相当する配列を識別することができます。以下の表９は、由来の生殖細胞系配列に関連するＶ、ＤおよびＪの局部を特定します。【０２６３】
【表９】
0005882058.tif 000019
0005882058.tif 000020
【０２６４】例によって、組み換えられた生殖細胞系配列は、生殖細胞系配列の一部あるいは全てのヌクレオチドに取って代わるヌクレオチドの配列を含む場合もあります。例えば、ここで、ＤＨと指定された組み替えの生殖細胞系配列は、ヌクレオチドのいかなる配列であると認められています。核酸分子のＤＨのセグメントはＣＤＲＨ３部の中部をエンコードし、抗原の特異性と変異性に大きな働きをしています。この局部は、抗体の中で最も変異性の高いだけに、さらに多くの組み換えを耐えることができます。また、抗原特異性を効かせる最も重要な局部です。一般的にはＤＨと指定されたセグメントは５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、あるいはそれ以上のヌクレオチドを含みます。ヌクレオチドの配列は、後述で説明される通り、インフレームでＶＨおよびＪＨと統合されると、抗原結合部位を十分に含む抗体分子あるいはその一部が生成されるように選択されます。ヌクレオチドは不規則または経験的に選択されます。場合によって、ＤＨと指定されたヌクレオチドのセグメントは、ヌクレオチドの不規則配列を含む例もあります。別例で、ヌクレオチドのセグメントは、特定の抗原を対象するように選択されることもあります。例えば、ヌクレオチドのセグメントは、特定のペプチド模倣物をエンコードすることがあります（表１６に参照）。他の例で、ＤＨと指定されたヌクレオチドのセグメントは、既知のＤＨ生殖細胞系配列に比べると逆の補完物であるヌクレオチドを含むかもしれません。これは、例１４に説明されています。【０２６５】他の例で、生殖細胞系セグメントは、生殖細胞系セグメントの間のコンセンサス配列を生成するために組み替えられることがあります。一般的に、ＣＤＲ局部間の変異性のため、コンセンサス配列は、フレームワーク局部で生成されます。そういった変更は、例えば組み合わせた抗体ライブラリーを手動で作っている場合、共通配列の操作を容易にすることによって、この方法の実行に貢献できます。これは、各ＪＨが共通のフレームワーク局部Ｆ４を含むとして例１に例示されています。【０２６６】
【０２６７】ｂ．【０２６８】生殖細胞系セグメント、あるいはそれに由来する組み換え配列の選択【０２６９】上記で説明された通り、それぞれのＶＨ鎖およびＶＬ鎖は、遺伝子セグメント、一般生殖細胞系セグメント、あるいはそれに由来する物の組み合わせによって生成された核酸分子にエンコードされています。得られたライブラリーに属するものは、再び組み換えられる遺伝子を不規則または経験的に選ぶことによって、選択できます。当業者は、組み替え用のＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子セグメントまたはそれによるサブセットを選択し、ＶＨあるいはＶＬをエンコードしながらインフレーム核酸分子を生成することができます。【０２７０】一例では、Ｖ（Ｄ）Ｊ配列セグメントは不規則で組み換えられ、あらゆる既知の生殖細胞系配列（例えば、本書の配列一覧に記載された、あるいは公開データベースで利用可能な、あるいは当業者に知られている物、およびそれに由来する物）は全ての可能な並べ替えで組み換えられます。そういった例で、各ＶＨ遺伝子セグメントは各ＤＨと組み換えられ、そしてこれは再び各ＪＨと組み換えられます。同様に、各ＶＬ（κまたはλ）は各ＪＬ（κまたはλ）と組み替えられます。そういった例で、組み換えで得られた生殖細胞系核酸分子は単純なＶＨおよびＶＬの全ての種類を代表します。例えば、生殖細胞系セグメントは３〜５表に記載された既知の生殖細胞系セグメントと組み換えられる場合は、ＶＨをエンコードする組み換え核酸分子の約１０万種類あるいはそれ以上、ＶＬκをエンコードする組み換え核酸の約６００種類あるいはそれ以上、およびＶＬλをエンコードする組み換え核酸分子の約７００種類あるいはそれ以上が発生されます。したがって、可変重鎖、および軽鎖をエンコードする核酸のライブラリーは、あらゆる組み換え抗体可変領域をエンコードすることができます。加えて、変更、例えば上記に説明された突然変異生成、逆位ＤＨ配列の組み入れ、あるいは指向性ペプチドを利用することによって、多様性をさらに増加することができます。【０２７１】別の方法としては、Ｖ（Ｄ）Ｊセグメントは、使用される特定の生殖細胞系のセグメントの配列、あるいはサブセットがライブラリーの種類の生成に限られるように、合理的または半合理的なアプローチで組み換えられることは可能です。例えば、例１４に説明された通り、ライブラリーのあらゆるメンバーはＩＧＨＶ３−２３＊０１のＶＨ生殖細胞系セグメントを含みます。他の例では、変更された生殖細胞系セグメント、例えば不規則に生成された（例えば特定のＣＤＲへの部位特異的突然変異生成によって）または試験的に生成された（例えば指向性ペプチド模倣物を含むように組み換えることによって）特定の局部の突然変異を含む物を選択できます。生殖細胞系セグメントの選択を可能にするおかげで、ここで提供されるライブラリーは多目的であり、ライブラリーのアプリケーションに基づいて合理的に設計できます。【０２７２】例えば、得られた核酸配列は配列の類似点、あるいは相違点、あるいはその他の共通点に基づいて制限されている場合は、抗体生殖細胞系セグメントを選択することができます。例えば、生殖細胞系セグメント配列は、セグメントの配列は、配列の類似点、あるいは相違点、あるいはその他の共通点に基づいて選択されることは可能です（例えばＶ領域族、長さ、ＣＤＲ３の長さや組成、種類、機能性、特異性、グループ、サブグループ、ＣＤＲ内のパターン、特定のアミノ酸やその他の生化学的属性）。抗体組成データベース（例えばＣＡＴＨデータベースはｃａｔｈｗｗｗ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／で、ＳＡＣＳデータベースはｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／ｓａｃｓ／で、ＩＭＧＴ  ３Ｄ組成データベースはｉｍｇｔ３ｄ．ｉｇｈ．ｃｎｒｓ．ｆｒ／でアクセス可能）、あるいはその他のデータベースは、選択可能な基準によって生殖細胞系セグメントを分類することができるように公開されています。あるいは、その選択を、配列アライメントを利用してなど、手動で分類することができます。【０２７３】別の例では、生殖細胞系セグメントはその配列における類似点または相違点に基づいて選択されます。当業者は、生殖細胞系配列の間の類似性、または配列において特有の類似性を共有する生殖細胞系セグメントを知っているあるいは識別することができます。一例では、ＶＨ，ＤＨ，ＪＨ，Ｖκ，Ｊκ，Ｖλおよび／またはＪλ．のグループに属する生殖細胞系セグメント配列は、配列相同性に基づいて選択することができます。選択されたセグメント間の配列類似性は、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいはそれ以上を含むことができるが、それに限りません。例えば、同サブグループあるいは同族である生殖細胞系セグメントのサブセットは選択できるが、一般的にこれらはより高い類似性（すなわち７０％以上、通常は７５％あるいはそれ以上）を共有します。上記の表３〜５表は、同サブグループまたは同遺伝子族に属する生殖細胞系セグメントを特定します。例えば、表３で、ＩＧＨＶ７、ＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、ＩＧＨＶ５、ＩＧＨＶ６、およびＩＧＨＶ７は、それぞれＶＨセグメントのサブグループを代表するが、グループ内の生殖細胞系セグメントは少なくとも７５％の配列類似性を共有します。したがって、ＩＧＨＶ１内のすべての生殖細胞系セグメントが選択可能、ＩＧＨＶ２内のすべての生殖細胞系セグメントが選択可能、ＩＧＨＶ３内のすべての生殖細胞系セグメントが選択可能などになります。別例では、表３でＩＧＨＶ１−１８＊０１およびＩＧＨＶ１−１８＊０２は、対立遺伝子である生殖細胞系セグメントを有する遺伝子族を表します。したがって、同族である生殖細胞系セグメントは生殖細胞系配列のサブセットとして選択することができます。【０２７４】別の例で、生殖細胞系セグメントは、得られるサブセットが多様な種類の配列を表すように、配列の相違点に基づいて選択されます。当業者は、配列において特有の類似性を共有する生殖細胞系セグメントを知っているあるいは識別することができます。選択されたセグメント間の相違性は、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいはそれ以下の類似性を示す例を含みます。例えば、それぞれ異なったサブグループからの生殖細��系セグメントのサブセットを選択できます。したがって、例えば、ＶＨセグメントは、ＩＧＨＶ１，ＩＧＨＶ２，ＩＧＨＶ３，ＩＧＨＶ４，ＩＧＨＶ５，ＩＧＨＶ６およびＩＧＨＶ７のそれぞれのサブグループから選択できます。そして、一つのサブグループはＩＧＨＶ１−１８＊０１，ＩＧＨＶ１−２６＊０１，ＩＧＨＶ３−１１＊０１，ＩＧＨＶ４−２８＊０１，ＩＧＨＶ６−１＊０１，ＩＧＨＶ７−４−１＊０３を含むことが可能です。別例で、ＶＨセグメントは各遺伝子族から選択できます。例えば、サブセットはＩＧＨＶ１−１８＊０１，ＩＧＨＶ１−２＊０１，ＩＧＨＶ１−３＊０１，ＩＧＨＶ１−４５＊０１，ＩＧＨＶ１−４６＊０１，ＩＧＨＶ１−５８＊０１，ＩＧＨＶ１−６９＊０１，ＩＧＨＶ１−８＊０１，ＩＧＨＶ１−ｃ＊０１，ＩＧＨＶ１−ｆ＊０１，ＩＧＨＶ２−２６＊０１，ＩＧＨＶ２−５＊０１，ＩＧＨＶ２−７０＊０１，ＩＧＨＶ３−１１＊０１，ＩＧＨＶ３−１３＊０１，ＩＧＨＶ３−１５＊０１，ＩＧＨＶ３−１６＊０１，ＩＧＨＶ３−２０＊０１，ＩＧＨＶ３−２１＊０１，ＩＧＨＶ３−２３＊０１，ＩＧＨＶ３−３０＊０１，ＩＧＨＶ３−３３＊０１，ＩＧＨＶ３−３８＊０１，ＩＧＨＶ３−４３＊０１，ＩＧＨＶ３−４８＊０１，ＩＧＨＶ３−４９＊０１，ＩＧＨＶ３−５３＊０１，ＩＧＨＶ３−６４＊０１，ＩＧＨＶ３−６６＊０１，ＩＧＨＶ３−７＊０１，ＩＧＨＶ３−７２＊０１，ＩＧＨＶ３−７３＊０１，ＩＧＨＶ３−７４＊０１，ＩＧＨＶ３−９＊０１；ＩＧＨＶ４−２８＊０１，ＩＧＨＶ４−３０−２＊０１，ＩＧＨＶ４−３１＊０１，ＩＧＨＶ４−３４＊０１，ＩＧＨＶ４−３９＊０１，ＩＧＨＶ４−５９＊０１，ＩＧＨＶ４−６１＊０１，ＩＧＨＶ５−５１＊０１，ＩＧＨＶ６−１＊０１およびＩＧＨＶ７−４−１＊０１を含むことが可能です。当業者は、生殖細胞系の配列における相違点に基づいて、希望の配列のサブセットを選択することができます。他の生殖細胞系セグメントのサブセットも配列における相違点に基づいて選択することができます。表１０〜１２は、各遺伝子族につき少なくとも一つの生殖細胞系セグメントを代表するＶＨ，ＤＨ，ＪＨ，Ｖκ，Ｊκ，Ｖλおよび／またはＪλ．の典型的な生殖細胞系セグメントの選択を示しています。【０２７５】
【表１０】
0005882058.tif 000021
0005882058.tif 000022
【０２７６】
【表１１】
0005882058.tif 000023
0005882058.tif 000024
【０２７８】
【表１２】
0005882058.tif 000025
0005882058.tif 000026
【０２８０】以上の全ての例では、類似性、相違性、あるいはその他の特徴による生殖細胞系セグメントの選択は、生殖細胞系セグメントの一つのグループだけに限定されることがあるが、（ＶＨ，ＤＨ，ＪＨ，Ｖκ，Ｊκ，Ｖλおよび／またはＪλ．の中から）、２グループ、３グループ、４グループ、５グループ、６グループ、あるいは全ての７グループを含む場合もあります。従って、例えば、複数の鎖ＶＨをエンコードするために遺伝子セグメントを組み換えるにあたって、ＶＨ生殖細胞系セグメントだけは類似性、相違性、あるいはその他の特徴に基づいて限定され、また、ＤＨおよびＪＨセグメントは既知されている全てのＤＨとＪＨの生殖細胞系のセグメントを代表します。別の例で、それぞれのＶＨ，ＤＨおよびＪＨの配列セグメントは、配列の類似性、相違性、あるいはその他の特徴に基づいて選択され、ここでコンパイルするための限定された生殖細胞系セグメント配列のサブセットという結果になります。また別の例で、複数のＶＨ鎖をエンコードするための遺伝子セグメントを組み換えるにあたって、ＤＨセグメントは、特定の対象に対するペプチド模倣物をエンコードするヌクレオチドの含有における変更に基づいて限定されます。そういった例で、ＶＨおよびＪＨのセグメント配列は、限定されたＤＨの（例えば組み換えられた）サブセットと組み換えられる、知られている全ての生殖細胞系セグメント配列を代表します。ここで拳げられるコンパイル方法に使用される生殖細胞系セグメントの選択は、様々な要因によるが、例えばコンパイル結果のライブラリー、ライブラリー作成の初期的段階で特定の対象に対する生殖細胞系セグメント配列に関して持っている知識（以下のＧ．４で説明される通り）、およびライブラリーのサイズなどです。【０２８１】
【０２８２】
【０２８３】ｃ．【０２８４】配列編集【０２８５】ここで挙げられるコンパイル方法では、可変遺伝子セグメントの配列は、重鎖可変領域（５’−ＶＨＤＨＪＨ−３’）、カッパ軽鎖可変領域（５’−ＶκＪκ−３’）、およびラムダ軽鎖可変領域（５’−ＶλＪλ−３’）を生成するために組み換えられます。遺伝子セグメントは、完全長の可変領域、あるいは完全長以下の可変領域（すなわち完全長の一部）を生成するために組み換えることができるが、その長さは発言すると抗原結合部位を形成するのに十分であることは前提です。核酸配列は、結果の核酸分子がインフレームで機能性ＶＨまたはＶＬポリペプチド（例えば抗原結合部位を形成するポリペプチド、あるいはそのための十分な部分）をエンコードするように、組み換えられます。【０２８６】
【０２８７】ここで提供される編集方法は当業者に知られているいかなる処置によって行うことができます。例えば、手動で、シルコ（すなわちコンピューターソフトウェアー）で、あるいはこれらを組み合わせた方法によって行うことができます。以下で説明された他の例で、この編集方法は配列編集ソフトウェアによって行うこともできます。また、生殖細胞系セグメント配列、あるいはその他の公共バイオインフォマティクスツールを提供する公開データベースもこの方法の執行に使用することができます。【０２８８】一般的に、完全長の可変領域（５’−ＶＨＤＨＪＨ−３’）、あるいはその一部は、ＶＨセグメントがＤＨセグメントと、そしてそれがＪＨセグメントと組み換えられるように、組み換えられます。重鎖セグメントは常に、ＶＨセグメントがＤＨセグメントの５’で、そしてそれがＪＨセグメントの５’になるように、組み合わせられます。正確なＶＨＤＨＪＨは、不規則または経験的に選択可能で、上記に述べられた通りに生殖細胞系セグメントまたはそれに由来する物を代表できます。この方法は分子生物学の技術を利用し手動で行う場合、生殖細胞系セグメントの両端に制限酵素を追加しセグメントの結合を容易にすることができると知られています。したがって、例によって、結果のＶＨ鎖では生殖細胞のセグメントの間でより多くのアミノ酸が見られる場合があります。例えば、本書の例で説明された通りに、ＶＨ鎖をエンコードし核酸分子ライブラリーに属する物は、ＪＨ領域の５’末端で結合されたＤＨ領域の間でアミノ酸ＳＹを含む配列もエンコードする場合があります。【０２８９】この方法の一例では、ＶＨＤＨＪＨ遺伝子セグメントの全ての置換配列は可変重鎖をエンコードする核酸分子を生成するために組み換えることができます。したがって、各ＶＨセグメント（例えば配列ＩＤ番号１０−２３８に記載されたいずれもの項目）はそれぞれのＤＨセグメント（例えば配列ＩＤ番号２３９−２７２に記載されたいずれもの項目）と、そしてそれが再びそれぞれのＪＨセグメント（例えば配列ＩＤ番号２７３−２８５に記載されたいずれもの項目）と組み合わせられます。そういった例で、表３にある典型的な重鎖の生殖細胞系セグメントに基づいて、可変重（ＶＨ）鎖をエンコードする約１０万あるいはそれ以上の核酸分子が生成されます。別の例で、ＶＨＤＨＪＨ遺伝子セグメントは試験的に（例えば、以下に説明される通り、合理的または半合理的なアプローチによって）組み換えられることが可能です。例えば、以下に説明される通りＶＨ．ＤＨおよび／またはＪＨのいかなるサブセットは、組み換え核酸分子を生成するために選択可能です。いくつかの例で、個々の遺伝子セグメントは、多様性、同じＶ領域族、ＣＤＲ３の長さ、組成、あるいはその他の生化学的属性の共通特徴に基づいて選択されます。【０２９０】完全長のカッパ軽鎖可変領域（５’−ＶκＪκ−３’）、あるいはその一部は、ＶκセグメントがＪκセグメントと組み合わせられるように、組み換えられます。完全長のラムダ軽鎖可変領域（５’−ＶλＪλ−３’）は、特定のＶλセグメントがＪλセグメントと組み合わせられるように、組み換えられます。軽鎖セグメントは常に、ＶＬセグメントがＪＬ��グメントの５’になるように組み合わせられます。正確なＶκＪκあるいはＶλＪλは、不規則または経験的に選択可能で、上記に述べられた通りに生殖細胞系セグメントまたはそれに由来する物を代表できます。この方法は分子生物学の技術を利用し手動で行う場合、生殖細胞系セグメントの両端に制限酵素を追加しセグメントの結合を容易にすることができると知られています。したがって、例によって、結果のＶＬ鎖では生殖細胞のセグメントの間でより多くのアミノ酸が見られる場合があります。【０２９１】この方法の一例では、ＶκＪκの全ての置換配列は可変カッパ軽鎖をエンコードする核酸分子を生成するために組み換えることができます。したがって、各Ｖκ（例えば配列ＩＤ番号２８６−３５５、８６８に記載されたいずれもの項目）は、それぞれのＪκ（例えば配列ＩＤ番号３５６−３６４に記載されたいずれもの項目）と組み合わせられます。そういった例で、表４にある典型的なカッパ軽鎖に基づいて、可変カッパ軽鎖をエンコードする約６００あるいはそれ以上の核酸分子が生成されます。別の例では、ＶλＪλの全ての置換配列は可変ラムダ軽鎖をエンコードする核酸分子を生成するために組み換えられます。したがって、各Ｖλ（例えば配列ＩＤ番号３６５−４４１に記載されたいずれもの項目）は、それぞれのＪλ（例えば配列ＩＤ番号４４２−４５１に記載されたいずれもの項目）と組み合わせられます。そういった例で、表５にある典型的なラムダ軽鎖生殖細胞系セグメントに基づいて、可変ラムダ軽鎖をエンコードする約７００あるいはそれ以上の核酸分子が生成されます。別の例で、ＶκＪκあるいはＶλＪλの遺伝子セグメントは本書の以下の説明の通りに試験的に組み換えられます。【０２９２】上記のすべての例で、組み換えセグメントは、組み換え完全長核酸が５’の開始コドン（ＡＴＧ）とフレーム内にあるように結合され、完全長ポリペプチドの発現を可能にします。Ｖ（Ｄ）Ｊのいかなるコンビネーション、およびそれに伴う結合の変更は可能で、各配列のリーディングフレームを維持しながらインフレームのコンパイルされたＶ（Ｄ）Ｊ配列を生成します。接合部の変更の選択は、結合されるＶ（Ｄ）Ｊのコンビネーションと各遺伝子セグメントのリーディングフレームの正確さの機能です。たとえば、可変遺伝子セグメントのいずれかが、コンパイルの時にリーディングフレーム１、２、あるいは３に存在可能です。しかし、一般的に、本書の方法の応用にあたって、Ｖ配列（ＶＨ，ＶκあるいはＶλ）はいつもリーディングフレーム１に当たります。また、Ｊ配列のリーディングフレームは、結果の遺伝子セグメントが適切なアミノ酸を含むように、リーディングフレーム１，２、あるいは３に設定されています。以下の【０２９３】
【表１３】
0005882058.tif 000027
【０２９４】重鎖に関しては、選択されたＤ可変遺伝子セグメント配列のリーディングフレームはＶあるいはＪ生殖細胞系セグメントの場合より柔軟です。これは、Ｄ遺伝子配列が抗原特異性に重要な役割を果たすＣＤＲＨ３の中央部をエンコードしているおかげです。
したがって、Ｄ遺伝子セグメント配列においてアミノ酸の変動が見込まれています。したがって、たとえば、ＤＨ遺伝子セグメントは、いかなるリーディングフレームに属するいかなるＤＨ遺伝子セグメント、あるいはそれに由来する逆位補完、あるいはＤＨと指定されるいかなるヌクレオチド配列であるかもしれません。しかし、いくつかの例で、Ｄ生殖細胞系配列のリーディングフレームは、結果のエンコードされたアミノ酸は主に親水性であるように選択されます。ＣＤＲ３が抗原結合部位なので、表面が露出した親水性の残基に富んでいます（参照は、Ｚａｎｅｔｔｉ  ａｎｄ  Ｂｉｌｌｅｔｔａ、Ａｎｔｉｇｅｎｉｚｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｔｏ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９６年）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｖｏｌｕｍｅ  ２（７５〜１２２ページ）、ハーウッドアカデミック出版社、またはＰｏｍｍｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００４年）Ｊ  Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  １７：１７〜３２）。当業者は、配列における疎水性もしくは親水性を測定する技術に精通しています。たとえば、親水性はタンパク質の水治療法総平均（ＧＲＡＶＹ）を利用することによって測定できるが、これは各残基の疎水性値を加えそして配列の長さで割り算を行うことによって疎水性値を測定できます（参照は、Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２年）、またはｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｏｒｇ／ｓｍｓ２／ｐｒｏｔｅｉｎ＿ｇｒａｖｙ．ｈｔｍｌ）。ＧＲＡＶＹ値は低ければ低いほど、配列の下の親水性は高いです。【０２９５】いくつかの例で、リーディングフレームを維持しながらインフレームの可変遺伝子セグメントのコンパイルは、組み換えやセグメントの結合などの変更の必要がありません。しかし他の例で、ただＶ（Ｄ）Ｊをコンパイルすることだけではリーディングフレームを維持することができません。したがって、遺伝子セグメント間の接合部が望ましいフレームにない場合、変更はセグメント間の接合部内のヌクレオチドに行われ、その結果は各遺伝子が望ましいセグメントにあり、完全長配列がインフレームにあります。核酸の変更は、ヌクレオチドあるいはそれに由来する合成の交換や置換、挿入、または削除を伴います。たとえば、ＶＤ接合部では、１つまたは複数のヌクレオチドがＤの５’末端から除去、Ｖの３’末端から除去、あるいはＶとＤの間に１つまたは複数のヌクレオチドが挿入することができます（例えば、Ｖ３’末端にヌクレオチドを追加することは可能です）。他の例で、Ｄ−Ｊ接合部では、１つまたは複数のヌクレオチドがＪの５’末端から除去、Ｄの３’末端から除去、あるいはＤとＪの間に１つまたは複数のヌクレオチドが挿入することができます（例えば、Ｄの３’末端にヌクレオチドを追加することは可能です）。さらに他の例で、Ｖ−Ｊ接合部では、軽鎖の生成で見られるように、１つまたは複数のヌクレオチドがＪの５’末端から除去、Ｖの３’末端から除去、あるいはＶとＪの間に１つまたは複数のヌクレオチドが挿入することができます（例えば、Ｖの３’末端にヌクレオチドを追加することは可能です）。ヌクレオチドが挿入される例では、１つ以上のグアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）��およびチミン（Ｔ）の中からのいかなるヌクレオチド挿入が見られます。いくつかの例で、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）のグアニン残基への微妙な優先傾向のため、グアニン（Ｇ）は挿入に選ばれることがあります（Ａｌｔ  ｅｔ  ａｌ．１９８２年）。【０２９６】この方法においては、重鎖セグメントが軽鎖遺伝子セグメント配列と別に組み換えられます。したがって、いずれかの核酸分子は重鎖（ＶＨ）、または軽鎖（ＶＬ）可変領域をエンコードします。この方法では、ＶＨ鎖をエンコードする複数の核酸分子、およびＶＬ鎖をエンコードする複数の核酸分子が生成されます。その配列の数は、組み合わせ可能なＶ、Ｄ、あるいはＪ遺伝子セグメントによるいかなる可能な並べ替えの数と同じです。たとえば、既知の全ての生殖細胞がこの方法に使用される場合、完全に単純な抗体のライブラリーが作成されます。他の例で、組み換え遺伝子セグメントもこの方法に使用できます。あるいは、順列の数は、選択されたＶ、Ｄ、およびＪの機能だが、これは全ての生殖細胞系セグメント、あるいはそれに由来する物のサブセットかもしれません。【０２９７】核酸配列は、一度コンパイルされら、コドンを削除するためにさらに変更され、出来上がる分子が機能分子（例えば、切断されていないポリペプチドをエンコードする）であることを確保します。たとえば、終止コドンを除去するための変更はヌクレオチドの置換を伴います。そのような変更の典型的な例としては、終止コドンＴＡＡをコドンＴＡＴへ、終止コドンＴＧＡをコドンＴＡＴへ、および終止コドンＴＧＡをコドンＴＣＡへの置き換えなどを含みます。【０２９８】ｄ．組み換え核酸配列の追加的な変更
上述のように、生殖細胞系セグメント配列は、本書のコンパイルを行う前に変更することができます。または、変更は直接に組換え核酸配列に行うことができます。したがって、コンパイルの前に後述の変更は個々の生殖細胞系セグメント配列に行うことができるが、リーディングフレームが維持されること、およびインフレームの組み換え核酸配列を生成するにあたって本書で説明されたコンパイルに当てはまるルールが遵守されることは前提です。
したがって、ＶＨ鎖あるいはＶＬ鎖をエンコードする複数の組換え核酸のいずれもがさらに変更されることは可能です。
核酸配列の変更は、ヌクレオチドあるいはそれに由来する合成の交換や置換、挿入、または削除を伴います。核酸分子の変更がこの方法のおかげでできたＶ（Ｄ）Ｊセグメントのリーディングフレームを維持するための接合部に影響を及ぼさない限り、当業者は適切と見なすいかなる核酸分子の変更を行うことができます。結果の完全長核酸が５’開始コドン（ＡＴＧ）とフレーム内にあり、完全長のＶＨもしくはＶＬの発現、またはそこから抗原結合部位を生成するための十分な部分の発現は可能であることを確保するために、いかなる変更をチェックし、リーディングフレームに影響がないかを確認する必要があります。【０２９９】得られた組換え生殖細胞可変重鎖および軽鎖の核酸配列は、ＤＮＡ合成によって（例えば、核酸分子の合成によって行われた変更）、または標準分子生物学技術によって、さらに変更できます。したがって、一例で、希望のいかなる変更は、組換え可変重または可変軽鎖をエンコードする核酸分子に行うことができ、そして結果は、核酸分子が下記ｅ．のｉｉｉで説明されるように行われた変更の通りに合成されます。遺伝子コードの退化のために、核酸配列は、不要な制限部位、スプライスドナー部位もしくはスプライス受容部位、あるいは潜在的に悪影響を及ぼすその他のヌクレオチドの有害な配列を含み、不要なヌクレオチド配列を避けるように設計できます。また、生物は場合によって、特定のコドンの使用あるいはＧＣからＡＴへの特定の半径をサポートする生物もあります。したがって、遺伝子コードの退化によって、特定の生物あるいは生物のグループ向けの発現の核酸配列の設計は可能になりました。また、核酸分子は、配列の最適化（または非最適化）によってさまざまな発現のレベルに設計することができます。別の例で、ｅ．ｉｉｉで説明された通り、組み換えられた生殖細胞系ＶＨとＶＬ核酸分子は、ＰＣＲ、部位特異的突然変異誘発法、制限酵素消化、連結反応、クローニングなどの標準分子生物学技術、あるいはその技術の組み合わせによってさらに組み換えることができます。そういった変更をＤＮＡ合成中に行うかあるいは分子生物学技術を使用して行うかの決定は、最終使用者によるが、またその変更の目的、程度、およびタイミングなどの要因も影響を及ぼすかもしれません。【０３００】ＶＨもしくはＶＬをエンコードする組換え生殖細胞核酸分子の変更は、不規則または経験的に行うことができます。たとえば、抗体の特異性および親和性に貢献するいかなるＣＤＲループ領域の変更を代表例として、１つあるいはそれ以上の領域のランダム突然変異はライブラリーの多様性を向上させます。そして、多様性が増加したこのライブラリーは抗体、それに由来する物、あるいはその部分もしくは断片の生成を可能にし、そしてそういった生成物は親和性の高い抗原と束縛される可能性があります。別の例で、変更は合理的または半合理的なアプローチで試験的に行うことができます。本書で見られる鎖とＶＬ鎖をエンコードする核酸分子の試験的な変更のうち、定方向ライブラリーの作成のためのＣＤＲ領域の変更、コドン使用を最適化するための変更、および／または例制限部位もしくは探知可能な分子部分を挿入するための変更なども含まれます。変更は、さらに不規則および経験的な変更の組み合わせも含むことがあります。【０３０１】ｉ．コドンの使用
たとえば、核酸配列は、コドン使用を細菌発現などのような発現に適用させるように変更することができます。複数のコドンが同一のアミノ酸をエンコードすることで退化します。このように単一のアミノ酸が複数のコドンにエンコードされるが、特定の生物内でコドンの使用はアミノ酸によって異なります。ここで取り上げられる完全長核酸は、稀なコドンを特定の発現系で使用されるより豊富なコドンに換えるために変更されています。一般的に、変更はサイレント突然変異を含むおかげで、置換はコドンの特異性に影響を及ぼしません。コドン使用表は、特に一般的な発現系に関するものが当業者に知られています。例えば、細菌発現に関しては、コドン使用表が知られています（例えば、Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，８：１８９２−１９１２（１９８０年）、Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，９：ｒ４３−ｒ７４（１９８１年）、および表１４を参考）。コドン使用表は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ向けの３ヌクレオチドの全ての６４可能なコドン、およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２細菌におけるその使用率を記載します。表は、単一のアミノ酸が複数のコドンにエンコードされる（冗張）にもかかわらず、このコドンは特定のアミノ酸において同じ使用率で使用されていないことを示します。たとえば、アミノ酸のアルギニンが６つのコドンにエンコードされています：ＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、およびＡＧＧ。コドンＣＧＣの使用率は２２％である一方、コドンＡＧＡは％２．０％に過ぎません。【０３０２】
【表１４】
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【０３０３】ｉｉ．【０３０４】制限酵素部位の追加または除去
別の例で、核酸の追加的な変更は、制限部位を提供する個々の組み換えＶＨまたはＶＬ核酸配列の５’または３’のいずれかまたは両方の端末にフランキング配列の追加を含みます。そういった変更は、ＤＮＡ合成中に、またはＰＣＲによって生殖細胞系組み換え核酸分子に組み込むことができます。例えば、制限酵素部位を組み込むことができるプライマーを利用します。いくつかの例で、このような制限部位の追加は、選択されたベクターの方向で核酸のクローニングを容易にします。例えば、制限部位は、当技術分野で知られているあらゆる制限部位を含めます。典型的な制限部位の配列は表１５に記載されています。一般的に、選択される制限部位は、発現ベクターと適合性があり、また平滑末端ライゲーション、あるいは付着末端ライゲーションを容易にするために選択されることがあります。制限酵素の選択は普通であり、当業者のいずれかのレベルの範囲内にあります。【０３０５】
【表１５】
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【０３０６】いくつかの例で、そういった核酸は、核酸配列内における制限部位を除去するように変更されることがあります。特に、制限部位の除去は、後の消化、ライゲーション、およびクローニングの工程に影響を及ぼさないように行われます。例えば、前述に説明された通り、組み換え核酸分子の変更によって、フランキング制限部位の末端を持たせ、発現ベクターの方向でクローニングを容易にします。一般に、そういった制限部位が特別に選ばれ、フランキング末端にしか存在できないようにします。制限部位が特殊ではなければ、核酸分子配列を変更し、相対する制限部位を除去します。当業者は、制限部位に精通しており、その部位を含む核酸配列を特定できます。表１５は除去可能な典型的な制限部位を記載します。【０３０７】いくつかの例では、単一のヌクレオチドの変更だけで、制限部位の変更が可能です。他の例では、２つまたは３つのヌクレオチドを変更して初めて制限部位を除去することができます。前述に説明された通り、組み換え核酸分子に存在する制限部位の変更は、一般的に、コドンの使用を考えて行われます。たとえば、Ｓａｌ  Ｉ制限部位（ＧＴＣＧＡＣ、配列ＩＤ番号：１８９６）の一つが、核酸内に存在するなら、バリン（Ｖ）をコードするＧＴＣコドンは、ＧＴＡ、ＧＴＧ、ＧＴＴ、あるいはＧＴＣに変更することが可能です。
単に最後のＣをＧに変更するだけで、コドンＧＴＣ（使用率１５．３％）をＧＴＧ（使用率２６．３％）に変えることができ、これはコドンの使用率の１１％の増加を示します。あるいは、最後のＣをＴに変更することで、アスパラギン（Ｄ）をコードするＧＡＣコドン（使用率１９．２％）をＧＡＴ（使用率３２．２％）に変更し、コドンの使用率の１３％の増加を示します。この例で、上記のいずれの変更を行うことができます。一般的に、変更の目的はコドンの使用率の最も高くかつ有益な増加を達成することです。【０３０８】ｉｉｉ．リンカー
追加的な例で、核酸分子はリンカー配列によって変更することができます。例えば、単鎖抗体（例えばｓｃＦｖ抗体）が望ましい場合は、可変重鎖および軽鎖を最初にリンカによって結合することができます。そのつながりは直接またはリンカーを介して行うことができます。たとえば、ペプチドリンカーをエンコードする核酸は、ＤＮＡ合成中に、あるいは子生物学技術によって、第１配列（例えば可変重鎖）の５’末端、あるいは第２核酸配列（例えば、可変軽鎖）の３’末端に追加することができます。通常に、リンカーは結果のポリペプチドが可溶性があるように十分に長いです。リンカーとして使用される核酸配列は、約２あるいは２〜６０、あるいは約６０のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーをエンコードすることができます。例えば、約５〜４０、あるいは約１０〜３０、２〜６、７、あるいは８アミノ酸残基。リンカー部分の例には、（ＧｌｙｍＳｅｒ）ｎ、および（ＳｅｒｍＧｌｙ）ｎなどのペプチドも含まれるが、ここで、ｎは１〜６（１〜４、２〜４も含まれる）であり、ｍは１〜６（１〜４、２〜４も含まれる）です。そういったリンカーの典型的な例は、グリシン−セリン−ポリペプチドなどのペプチドリンカーをエンコードするいかなる物だが、例えば、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−，ＧＧＧＧＧ（配列ＩＤ番号：９８１），ＧＧＧＧＳ（配列ＩＤ番号：９８２）あるいは（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列ＩＤ番号：９８５），ＳＳＳＳＧ（配列ＩＤ番号：９８３）あるいは（ＳＳＳＳＧ）ｎ（配列ＩＤ番号：１９９６）。リンク一部分は例えばＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８８年）ＰＮＡＳ  ８５：５８７９−５８８３、Ｗｈｉｔｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６：９８９−９９５、およびＮｅｗｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：５４５−５５３で見られます。他の適当なリンカーにはペプチドリンカーを含むいかなるものだが、例えば米国特許４７５１１８０号、あるいは４９３５２３３号などだが、参考として本書に記載しました。希望のペプチドリンカーをエンコードするポリヌクレオチドの挿入に関しては、適切で在来の技術を利用し、可変重鎖もしくは可変軽鎖の配列のどこでも、またはインフレームで末端５’もしくは３’でできます。たとえば、制限部位が重鎖配列の末端５’、および軽鎖配列の末端３’に追加される一方、リンカーセグメントをエンコードする核酸（例えば（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３、配列ＩＤ番号：９８４）が重鎖配列の末端３’に追加され、軽鎖配列の末端５’との接続ができます。発現の上で、そういった核酸分子はｓｃＦｖ抗体をエンコードし、重鎖の可変領域が軽鎖の可変領域に機能的にリンクされています。【０３０９】ｉｖ．【０３１０】タグまたは探知可能な部分
加えて、小さなエピトープタグ、例えばｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグなど、その他の小さなエピトープタグ、および／またはその他の追加的なＤＮＡ配列は、結合のために、可変重鎖、あるいは可変軽鎖をエンコードする核酸配列に追加されます（Ａｒｎａｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００６年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，４８：１−１３）。場合によって、例えば、ＬＰＥＴＧタグなど、定着を許すタグは追加され、リガーゼやソルターゼのタンパク質を利用し、領域指定変更を可能にします（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７年）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，２：ｅ１１６４）。したがって、そういったタグの挿入では、定着が可能（例えば、ビアコアチップで）、および／またはソルターゼの存在で選択的な分類が可能になります。一般的に、追加的なＤＮＡ配列が核酸分子の３’または５’の末端に追加され、組み換え可変配列が直接的または間接的にリンカーによってエンコードされます。あるいは、追加のＤＮＡ配列を希望の発現ベクターに組み込むことによって、発現の時に得られた抗体は、追加の配列を含むようになります。例えば、配列ＩＤ番号：１に記載されたプラスミドは３２６５−３３０６のヌクレオチドに属するＨｉｓ−Ｆｌａｇタグを含みます（Ｆｌａｇは３２６５−３２８８のヌクレオチドに、Ｈｉｓは３２８９−３３０６のヌクレオチドに当たります）。別の例で、配列ＩＤ番号：２に記載されているプラスミドＤは３２６５−３２８８のヌクレオチドに属するＦｌａｇタグ、また３２８９−３３０３のヌクレオチドに属するＬＰＥＴＧタグを含みます。このように、重鎖が単独であるいは軽鎖と一緒に発現する際に、得られる抗体はＦｌａｇタグ反対あるいはＨｉｓタグ反対の試薬によって検出することができます。これは、例１０に例示されています。当業者は、検出可能な配列あるいは分子部分を、組み換え可変重軽鎖配列をエンコードする核酸分子に追加し、得られる抗体の検出、および／または除去を容易にします。【０３１１】ｖ．【０３１２】突然変異多様性
他の例で、変更は得られる核酸分子の突然変異多様性を促すためにも行われます。アミノ酸の置換、除去、あるいは追加などによって、不規則もしくは試験的にいかなる変更が可能です（例えば、組み換え核酸分子のいかなる領域もしくはセグメントの場合）。変更は、ＤＮＡ合成中にあるいは分子生物学の通常技術、例えば部位特異的突然変異誘発法、制限酵素消化、および／またはクローニングなどを使用して行うことができます。【０３１３】例えば、変更は、ＶＨ鎖をエンコードする核酸分子、およびＶＬ鎖をエンコードする核酸分子に組み込むことができます。また、変更はＣＤＲ１，ＣＤＲ２，ＣＤＲ３，ＦＲ１，ＦＲ２，ＦＲ３あるいはＦＲ４の一つあるいは複数の領域に組み込むことができます。たとえば、変更は特定の可変領域の１つ、２つ、あるいは３つの全てのＣＤＲに組み込むことができます。一例で、変更はＣＤＲ１およびＣＤＲ２に組み込まれます（例えば重鎖の可変領域の場合）。一般的に、変更は重鎖（ＣＤＲＨ３）のＣＤＲ３に組み込まれます。
いかなる組み合わせが考えられます。当業者は、ＶＨもしくはＶＬをエンコードする核酸分子のＣＤＲ１，ＣＤＲ２，ＣＤＲ３，ＦＲ１，ＦＲ２，ＦＲ３およびＦＲ４の領域を知っており、識別することができます（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７年）Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７３：９２７−９４８、ＷＯ／２００７／１３７６１６、ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／、ｂｉｏｃ．ｕｎｉｚｈ．ｃｈ／ａｎｔｉｂｏｄｙ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／ＮｕｍＦｒａｍｅ．ｈｔｍｌ、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ（２００７年），９６−１０３ページを参考）。たとえば、ＣＤＲは、配列アライメントに基づいてＫａｂａｔ番号付けを、または構造トポロジーに基づいてＣｈｏｔｈｉａ番号付けを利用するＶＨ鎖およびＶＬ鎖に見られます。Ｋａｂａｔ番号付け方式が配列アライメントから考案されて以来、番号付け方式に関連する配列への挿入は文字で（例えば、２７、２７Ａ、２７Ｂ、２７Ｃ、など）、そして除去は相当する省略された数字に示されるようになりました。Ｋａｂａｔ番号付けに基づく軽鎖と重鎖の６つのＣＤＲに相当する残基はＣＤＲ−Ｌ１：Ｌ２４−Ｌ３４、ＣＤＲ−Ｌ２：Ｌ５０−Ｌ５６、ＣＤＲ−Ｌ３：Ｌ８９−Ｌ９７、ＣＤＲ−Ｈ１：Ｈ３１−Ｈ３５Ｂ、ＣＤＲ−Ｈ２：Ｈ５０−Ｈ６５、ＣＤＲ−Ｈ３：Ｈ９５−Ｈ１０２です。当業者は、ＣＤＲの長さが変動するものだと了知し、アライメントとＫａｂａｔの番号付け方式によって、相当する残基を識別することができます。【０３１４】ｖｉ．【０３１５】指向性ペプチド
いくつかの例で、変更は抗体、あるいはその部分もしくは断片の意図的な変更を含むが、その結果は、抗体、あるいはその部分もしくは断片は生物学的に活性なペプチドの対抗性を模倣します（例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ＰＣＴ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＷＯ  ２００４／０５００１７を参考）。受容体結合、活性化、および酵素活性などの重要な生物学的な機能は、アミノ酸残基、一定期間ペプチド、エピトープ、およびミモトープの限られた量を含む大きなタンパク分子の不連続部位に起因しています。ペプチドのこのエピトープとミモトープは、治療薬として使用することができるが、サイズが小さく劣化が早いため、生体内で不安定です。しかし、ペプチドエピトープは、抗体の可変領域に組み込まれ、抗体は生物学的活性ペプチドの活動を模倣することができます。そういった抗体は、より安定で、より長い半減期を見せます。したがって、抗体あるいはその一部は、特定の対象のポリヌクレオチドに属する抗体の可変領域に配列を組み込むことによって、その対象あるいは機能に従って活動するように設定できます。多くの場合は、既知の対象の構造や機能に関する情報は入手可能です。これらのライブラリーは、将来の抗体ライブラリーのためのリード抗体を提供するので重要です。【０３１６】したがって、本書の変更は生殖細胞系組み換えＶＨおよびＶＬをエンコードする核酸配列を含むが、そこで１つあるいはそれ以上のＣＤＲに相当するヌクレオチドは１つあるいはそれ以上のアミノ酸残基をエンコードするヌクレオチドに置き換えられます。一例で、生殖細胞系組み換えＶＨおよび／またはＶＬをエンコードする核酸分子の変更は、ＤＮＡ合成中に起こる可能性があります。あるいは、変更は、生殖細胞系組み換えＶＨおよび／またはＶＬをエンコードする核酸分子に、制限酵素消化とその後に次ぐ希望のペプチドとのライゲーションによって組み込むことができます。必要に応じて、制限部位は、部位特異的突然変異誘発法あるいはＰＣＲによって、ＣＤＲに生成され、ペプチドのライゲーションを容易にします。後者は本書の例１２に例示されています。【０３１７】ヌクレオチドは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１６、２０、２５、またはそれ以上のアミノ酸を含むペプチドをエンコードすることができます。有用な特性を表すペプチドは抗体足場への組み込みに適切です。一般的に、ペプチドは具体的に対象の分子に結合されるものです。ペプチドはまた、例えば結合の後でアゴニストまたはアンタゴニストの作用など、特定の活動を表す物を含みます。ペプチドの活動と作用は、受容体、膜結合表面分子、配位子、酵素もしくは構造タンパク質の結合、または受容体、対象の薬物送達、酵素活性の活性化もしくは制限なども含みます。ペプチドの例としては、サイトカイン、成長因子もしくは成長抑止剤の受容体など、細胞表面の受容体に結合する物が挙げられます。組み換え生殖細胞ＶＨまたはＶＬに組み込むペプチド模倣物は、米国特許７１６９９０５号、米国特許７３９６９１７号、米国特許７２７２５０８号、米国特許７０１９０１７号、Ｕ．Ｓ．ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｐａｔｅｎｔ出願番号ＵＳ２００７０１３４４、ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ出願番号ＷＯ２００５０６０６４２、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００年）Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１５：１２７４−１２７７．に記載されたいかなる物を含みます。そういったペプチドの典型的な例は表１６にあります。組み換え生殖細胞系核酸にエンコードされるＶＨとＶＬに組み込むためのその他のペプチドは分野で既に知られており（例は上記のいかなるの参考へ）、および／または対象によって特定できます。【０３１８】
【表１６】
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【０３１９】組み換え生殖細胞系ＶＨもしくはＶＬをエンコードする核酸分子は、ペプチドをエンコードするヌクレオチドの置換、またはＣＤＲ１，ＣＤＲ２，ＣＤＲ３，ＦＲ１，ＦＲ２，ＦＲ３あるいはＦＲ４の１つあるいはそれ以上への挿入によって変更されます。たとえば、組み換え生殖細胞系ＶＨもしくはＶＬをエンコードする核酸分子は、完全なＣＤＲを、ペプチドをエンコードするヌクレオチドに置き換えることによって変更されます。ペプチドによって置き換えられるＣＤＲはＣＤＲＨ１，ＣＤＲＨ２，ＣＤＲＨ３，ＣＤＲＬ１，ＣＤＲＬ２，および／またはＣＤＲＬ３です。たとえば、結果のＶＨ鎖もしくはＶＬ鎖では１つあるいは複数のＣＤＲがペプチドによって置き換えられます。そして、共同のペプチドの可能性もあります。他の例で、組み換えヒト生殖細胞系ＶＨもしくはＶＬをエンコードする核酸分子は、ＣＤＲの一部を、ペプチドをエンコードするヌクレオチドに置き換えることによって変更されます。ペプチドによって置き換えられるＣＤＲの一部はＣＤＲＨ１，ＣＤＲＨ２，ＣＤＲＨ３，ＣＤＲＬ１，ＣＤＲＬ２，および／またはＣＤＲＬ３の一部です。ヌクレオチドによって置き換えられたＣＤＲの一部は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１６、２０、２５、またはそれ以上のアミノ酸を含むペプチドをエンコードすることができます。他の例で、１つあるいは複数のＣＤＲの１つあるいは複数の部分がペプチドをエンコードするヌクレオチドによって置き換えられます。そして、得られるペプチドは共同、または別々の可能性があります。さらに他の例で、組み換えヒト生殖細胞系ＶＨもしくはＶＬをエンコードする核酸分子は、抗体のＣＤＲの２つのヌクレオチドの真ん中にペプチドをエンコードするヌクレオチドの挿入によって変更されます。ペプチドを挿入されたＣＤＲはＣＤＲＨ１，ＣＤＲＨ２，ＣＤＲＨ３，ＣＤＲＬ１，ＣＤＲＬ２，および／またはＣＤＲＬ３です。いくつかの例で、結果のＶＨ鎖もしくはＶＬ鎖は１つあるいは複数のＣＤＲに挿入された１つあるいは複数のペプチドを含みます。
そして、ＣＤＲに挿入されたペプチドは共同、または別々の可能性があります。【０３２０】ペプチドのカルボキシ、あるいはＮ末端にフランキング配列を追加することで、足場抗体内のペプチドの存在を変え、生物学的活性を増加できることは証明されています。したがって、核酸分子は、カルボキシあるいはＮ末端にフランキング配列を追加されたペプチドをエンコードするように変更することができます。フランキング配列は１、２、３、４、５、またはそれ以上のアミノ酸をエンコードすることができます。フランキング配列はいかなるアミノ酸またはアミノ酸のいかなる組み合わせをエンコードすることができます。
グリシンは、最も小さく単純なアミノ酸で、側鎖にただ１つの水素原子を含みます。グリシンはサイズが小さいので限られた空間に入り込んだり、他のアミノ酸ができない特定の構造ができます。プロリンは立体的に拘束されているアミノ酸で、ペプチド配列（ＲＥＦ）を隣接するとペプチドの活性を高める効果を表します。一般的に、フランキング配列はグリシンまたはプロリンをエンコードします。普通は、フランキング配列はプロリンをエンコードします。例えば、核酸分子は、配列ＩＤ番号：８９１に記載されたＥＰＯペプチドのＮ−あるいはＣ−末端に追加されたプロリンおよび／またはグリシンを含むペプチドを、エンコードすることができます。フランキング配列を含む核酸分子の典型的な例は配列ＩＤ番号８７４−８９５に記載されたＥＰＯペプチドのいずれもをエンコードします。【０３２１】ｅ．【０３２２】可変重鎖・軽鎖配列、および核酸分子の生成
本書の方法によってコンパイルされたＶＨ鎖およびＶＬ鎖をエンコードする組み換え核酸分子配列は収集、保管されています。
収集された配列は、例えば他の組み換え配列との類似性などによって、特定のいかなる特性で分析することができます。そして配列はその多様性に基づいて並べられます。組換え配列の全て、またはそのサブセットは、ＤＮＡ合成および／または組み換えＤＮＡ技術によって、組み換え核酸分子に仕上げることができます。例えば、配列のサブセットは、抗体ライブラリー作成における配列の類似点または相違点に基づいて選択されます。【０３２３】ｉ．【０３２４】収集および保存
この方法によって組み換えられた配列は、収集、保存されます。一般的に、収集と保存はアドレス可能な形式で行われ、各配列がそれぞれの遺伝子座によって確認されます。たとえば、配列はデータベースやリストなどで保存できます。さらに、各核酸配列の遺伝子セグメントの個々のコンポーネントが知られており、組換え核酸配列がコンポネントのセグメントによって特定されています。たとえば、ＶＨ１−１８＿ＩＧＨＤ１−２６＊０１＿ＩＧＨＪ２＊０１と呼ばれる核酸配列は、ＤＨ生殖細胞系セグメントＩＧＨＤ１−２６＊０１、ＪＨ生殖細胞系セグメントＩＧＨＪ２＊０１、およびＶＨ生殖細胞系セグメントＶＨ１−１８（命名法によってＶＨ１−１８＊０１とも呼ばれる）を含む可変重鎖をエンコードする核酸配列を特定できます。当業者は、希望の命名法によって核酸配列を特定できるが、コンポネントのセグメントの特定は容易であることを前提とします。【０３２５】一般的に、ＶＨ鎖をエンコードする配列は、ＶＬ鎖と別に組み換え、収集、保存されます。さらに、ＶＬ鎖の中で、Ｖカッパ軽鎖をエンコードする配列は、Ｖラムダ鎖をエンコードする配列と別に組み換え、収集、保存されます。各遺伝子座の核酸配列のＩＤは知られており、アドレス可能な形式内の全ての核酸分子の配列を含むアウトプットファイルにマッピングすることは可能です。【０３２６】本書の目的において、配列はアドレスできるように保存され、配列あるいはそのコンポネントを容易に特定することができます。
上記の方法を執行することで、ＶＨ鎖をエンコードする複数で多様の核酸分子が生成され、これらは組み換えセグメントあるいはそのコンポネントのいかなる可能な置換配列を表します。例えば、１０，１００，５００，１０００（１０３），２ｘ１０３，４ｘ１０３，６ｘ１０３，８ｘ１０３，１０４，２ｘ１０４，３ｘ１０４，４ｘ１０４，５ｘ１０４，６ｘ１０４，７ｘ１０４，８ｘ１０４，９ｘ１０４，１０５，２ｘ１０５，３ｘ１０５，４ｘ１０５，５ｘ１０５，６ｘ１０５，７ｘ１０５，８ｘ１０５，９ｘ１０５，１０６，１０７あるいはそれ以上のＶＨ核酸配列の生成が可能です。上記の方法を執行することで、ＶＬ鎖をエンコードする複数で多様の核酸分子が生成され、これらは組み換えセグメントあるいはそのコンポネントのいかなる可能な置換配列を表します。例えば、１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００，２００，３００，４００，５００，６００，７００，８００，９００，１０００（１０３），２ｘ１０３，３ｘ１０３，４ｘ１０３，５ｘ１０３，６ｘ１０３，７ｘ１０３，８ｘ１０３，９ｘ１０３，１０４，５ｘ１０４，１０５あるいはそれ以上のＶＬ核酸配列の生成が可能です。【０３２７】これらの例は、本書の方法によってコンパイルされた配列を、ＳｅｑｕｅｎｃｅＨｉｓｔｏｒｙ．ｔｘｔファイルに収集、保存する例です。そのようなファイルは、例で、例示ソフトウェアによって生成され、ＤＮＡ合成に指令された配列を表しています。配列はまた、スプレッドシートやリストなど、手動で保存することもできます。【０３２８】ｉｉ．【０３２９】収集された核酸配列の多様性の確定
いくつか例で、組み換え核酸分子は配列の多様性によって収集、保存されます。ライブラリーメンバーの配列の多様性に関する知識は、以下に説明される通り、合成および発現のために、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖をエンコードする核酸配列の制限されたサブセットの選択に用いることができます。したがって、得られる抗体ライブラリーはメンバーの間の配列相違点によって、その配列多様性を増加することができます。あるいは、得られる抗体ライブラリーはメンバーの間の配列相同性によって、その配列多様性を減少することができます。したがって、たとえば、選択された組み換え核酸の配列がライブラリー内のその他の全ての配列と比較し、異なる物（例えば、１０％，２０％，３０％，４０％，５０％，６０％，６５％など７０％以下の相同生の物）は選択されます。別の例で、初期的検索で”ヒット”が見つかったら、全てのメンバーがより高い配列相同性（例えば、７０％，７５％，８０％，８５％，９０％，９５％あるいはそれ以上）を共有する別のライブラリーを作成することができます。上記の割合はただの例だけです。当業者は、特定のライブラリーに記載する配列を選択するにあたって、配列相同性に希望に従って限度を付けることができます。【０３３０】組み換え核酸配列の間で配列相同性あるいは相違性を確定するにあたって、収集された全ての核酸配列に基づいて配列の多様性は判断されます。一般的に、遺伝コードの縮退のため、まず組み換え核酸配列がアミノ酸配列に移動され、アミノ酸に配列を持たせ、そして得られたアミノ酸の配列相同性が確定されます。その移動は遺伝子コードに基づいて行われ、６４のコドンが２０のアミノ酸、また３つの終止コドンをエンコードする場合に行われます。各配列の移動は、手動で、あるいはコンピューターやその他の自動化法によって行うことができます。当業者は、タンパク質を移動する方法に精通しています。複数の配列はその配列多様性に基づいて分類や保存されます。【０３３１】一般的に、配列多様性は、２つあるいはそれ以上の配列の配列相同性をすることによって行われるが、例えばアライメントによって確定することができます。当業者は、配列の間で配列相同性（いわゆるアイデンティティ）を確定するために様々な技術に精通しています。たとえば、配列相同性は、配列の間でヌクレオチドの相違点を確定することなど、手動で確定することができます。ヌクレオチドあるいはアミノ酸配列の配列類似性や配列相同性は、通常のソフトウェアやコンピュータプログラムを使用し決定することもできます。このようなアルゴリズムは当業者によく知られています。たとえば、最良のセグメントまたは配列の類似性を確定するには、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０），ＦＡＳＴＡ（Ｌｉｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７：１４３５−１４４１），あるいはＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７）ホモロジー検索プログラムを利用���ることができます。グローバルアライメントを行うには、利用できるのは、配列アライメントプログラムのＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２：４６７３−４６８０）です。【０３３２】例えば、核酸またはアミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴを使用し、その配列類似性を確定することができます。関係性を決定する十分な類似性のパラメータは、統計的類似度を計算する、よく知られている方法に基づいて計算されます。ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用し２つ以上の配列の関連性を決定する典型的なパラメータの例は、以下の通りです。簡単に言えば、アミノ酸の配列アライメントはＢＬＡＳＴＰ２．０．８バージョン（１９９９年１月５日）と次のパラメータを使用し行うことができます：Ｍａｔｒｉｘ：０
ＢＬＯＳＵＭ６２、ｇａｐ  ｏｐｅｎ：１１、ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：１、ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ：５０、ｅｘｐｅｃｔ：１０．０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ：３、ｆｉｌｔｅｒ：ｏｎ．核酸の配列アライメントはＢＬＡＳＴＮ２．０．６バージョン（１９９８年９月１６日）と次のパラメータを使用し行うことができます：Ｍａｔｃｈ：１、ｍｉｓｍａｔｃｈ：−２、ｇａｐ  ｏｐｅｎ：５、ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：２、ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ：５０、ｅｘｐｅｃｔ：１０．０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ：Ｉ１、ｆｉｌｔｅｒ：ｏｆｆ．当業者は、上記のパラメータにおいて、例えば比較の厳格さを増強したり緩和したりなど、どの変更を行い、２つ以上の配列の関係性を決定できるかを知っています。ＢＬＡＳＴプログラムは、ＢＬＡＳＴビットスコア−というアウトプット指標を提供するが、これは整列された各配列に関連するギャップや置換の数で計算される指数です。スコアが高いほど、整列の重要性が高まります。ビットスコアは、他の選択された各配列に対して最少の配列多様性、あるいは最多の配列多様性を表す配列を選択するに利用されます。【０３３３】別の例で、配列多様性は、アライメント方法（例えばＣＬＵＳＴＡＬ方法）で２つ以上のアミノ酸、または核酸配列を比較することによって確定できます。（例えば、Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ａｎｄ  Ｐ．Ｍ．Ｓｈａｒｐ（１９８８年）Ｇｅｎｅ  ７３：２３７−２４４を参考）。ＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズムは、すべてのペアの間の距離を調べることによって、配列をクラスターに分類します。クラスターをペアで整列され、そしてグループに分類されます。例えば、配列Ａと配列Ｂなど、２つのアミノ酸配列との間の類似性の割合は、配列Ａの長さ引く配列Ａのギャップ残基の数引く配列Ｂのギャップ残基の数、割る配列ＡとＢの共同の残基の数、その１００回で計算されます。類似性が低い、あるいは類似性がないアミノ酸配列のペアのギャップは類似性の割合決定に計算されません。核酸配列の間の配列類似性（例えば配列相同性）は、例えばＪｏｔｕｎ  Ｈｅｉｎ方法など、当分野で知られている他の方法でも計算されます。
（例えば、Ｈｅｉｎ．Ｊ．（１９９０年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６２６−６４５を参考。）核酸配列の間の相同性は、例えばハイブリダイゼーションの条件を変更することなど、当分野で知られている他の方法でも確定されます。ＢＬＡＳＴｃｌｕｓｔはクラスタ分析に使用できるその他のプログラムです。ＢＬＡＳＴｃｌｕｓｔは、例で説明されたソフトウェアコンパイルプログラムで使用されます。【０３３４】多様性とクラスター情報だけでなく、ＢＬＡＳＴビットスコア情報も、配列の選択にあたってユーザーに様々なオプションを提供します。たとえば、選択された配列ができる限り多様性がある場合、ユーザーは抗体ライブラリーを作成することができます。こうするために、ユーザーは多様性スコアおよびクラスター情報を使用し、最高の多様性を示す別のクラスターから配列を選択することができます。あるいは、ユーザーは、例えば、選択される配列が既定された配列にできるだけ類似するなど、そういった抗体ライブラリーを作成することもできます。これはＢＬＡＳＴ機能を利用することによって行います。ユーザーは、選択された最初の配列をＢＬＡＳＴし、ライブラリー用のその他の配列をＢＬＡＳＴビットスコアによって、最高のスコアおよび最も高い配列類似性を示す配列を選択できます。たとえば、例５はソフトウェアコンパイルプログラムを使用し組み換え配列の間の配列多様性を確定する方法を説明します。例は、ＢＬＡＳＴがすべての配列に適用し、ＢＬＡＳＴビットスコアが配列の間に配列類似性あるいは相違性を確定するように計算されることを例示します。【０３３５】ｉｉｉ．【０３３６】組み換え配列から核酸分子を生成する【０３３７】
【０３３８】
【０３３９】ａ）合成【０３４０】必要に応じて、配列は個別に核酸分子に合成されます。収集されたすべての配列あるいはそのサブセットは合成する可能です。ＶＨ鎖あるいはＶＬ鎖をエンコードする核酸分子は、合成遺伝子法を利用し、当業者に知られている方法で合成されます（例えば、米国特許４，６５２，６３９号、５，１３２，２１５号、５，０９３，２５１号、６，１１０，６６８号、６，４７２，１８４号、公開された米国出願ＵＳ２００６０２８１１１３号、ＵＳ２００７０００４０４１号、ＵＳ２００７０１２２８１７号、および国際ＰＣＴ公開された出願ＷＯ９８／１５５６７号、ＷＯ９９／４７５３６号、ＷＯ００／７５３６４号、ＷＯ２００４０３５７８１号、ＷＯ２００５０７１０７７号を参考）。これらは連結されている一本鎖オリゴの合成を含む標準的な固相ポリペプチド合成法を包括します。方法はまた、配列の全ての可能な組み合わせを代表する普遍的なビルディングブロックとして使用される標準的なトリプレットを使用する方法もあり、反応段階で組み合わせることができます（Ｓｌｏｎｏｍｉｃｓ  ▲Ｒ▼）。【０３４１】核酸が合成され２０，５０，１００，２００，３００，４００，５００，６００，７００，８００，９００，１０００あるいはそれ以上の塩基対を含むようになれます。遺伝子合成は自動化法で行うことができます。核酸分子を生成するには既知のいかなる合成法を利用することができます。たとえば、オリゴヌクレオチドや遺伝子の合成を目的とする企業があります。例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（ＩＤＴ）（コーラルビル、アイオワ州）、ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（サンディエゴ、カリフォルニア州）、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ社（ボセル、ワシントン州）、およびＳｌｏｎｉｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（プッフハイム、ドイツ）。【０３４２】合成で使用されるヌクレオチドモノマーは、プリンおよびピリミジンのデオキシリボヌクレオチド（アデノシン（Ａ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）、およびチミジン（Ｔ））、またはリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＵ（ウリジン））、またはこのヌクレオチドの類似体もしくはその派生物、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡ、およびそのような類似体および生物またはその組み合わせかもしれません。他のヌクレオチド類似体は、当分野で知られており、ここで記載されるオリゴヌクレオチドの合成に使用することができます。【０３４３】ヌクレオチドを変更することによって、核酸分子は合成されます。一例で、各オリゴヌクレオチドは、例えば５’リン酸基など、末端リン酸基を含みます。例えば本書の方法によって、２つのオリゴヌクレオチドを共同で反対のポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの後で、隣接する２つのオリゴヌクレオチドのギャップを消えるために、特定のオリゴヌクレオチドの３’末端と結合されるオリゴヌクレオチドの末端５’にリン酸基が追加されます。一例で、５’リン酸基（ＰＯ４）は、オリゴヌクレオチド合成中に追加されます。
別の例で、５’リン酸基の追加のために、Ｔ４ポリヌクレオチド・キナーゼ（Ｔ４ＰＫ）などのキナーゼはオリゴヌクレオチドに追加されます。他のオリゴヌクレオチドの変更は、よく知られており、本書で提供される方法と利用できます。【０３４４】合成オリゴヌクレオチドは化学的に合成することができます。オリゴヌクレオチドの化学合成の方法はよく知られており、オリゴヌクレオチドの成長鎖へのヌクレオチド単量体もしくは三量体の添加を含みます。一般的に、合成オリゴヌクレオチドは、保護基を含むヌクレオチド単量体もしくは三量体を化学的に結合することによって生成されます。たとえば、保護基を含む単一ヌクレオチド、つまりホスホルアミダイトは、一度に１つずつ追加することができます。合成は、普通にオリゴヌクレオチドの３’末端から始まります。ホスホルアミダイトを最も含む３’が固体に付着され、合成は５’末端に各ホスホロアミダイトを追加することによって進行します。追加した度に、保護基が５’リン酸基の最後に追加された塩基から除去され、別のホスホロアミダイトの追加が可能になります。例えば、Ｂｅｈｌｋｅ  ｅｔ  ａｌ．“Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（２００５年）．１−１２、Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．“ＵｌｔｒａｍｅｒｓＴＭ−Ｔｈｅ  Ｌｏｎｇｅｓｔ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｗｉｔｈ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ”Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社  技術報告書（２００７年）、およびＭｃＢｒｉｄｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２４：２４５−２４８を参考できるが、これらは標準シアノエチル化学（ホスホラミダイトモノマーおよびテトラゾール触媒を使用するもの）を使用し、オリゴヌクレオチドの合成を説明します。このような方法は、普通に１００〜２００の塩基を含むオリゴヌクレオチドの生成につながります。【０３４５】したがって、より大きな遺伝子を合成するには、より微細なオリゴヌクレオチド一連をアニーリングする方法もあります。この方法では、特定のアニーリングによって接続、浄化され、標準的なライゲーションやポリメラーゼ反応を利用する自動ＤＮＡ合成装置などによって、個別に指定されたオリゴヌクレオチドが生成されます。一般的に、オリゴは、アニーリングを可能にする共通配列の重複ストレッチを有するように設計されます。遺伝子合成の様々な方法が説明されたが、例えば、重複するリン酸化オリゴヌクレオチドのライゲーション（Ｇｕｐｔａ，Ｎ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９６８年）Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，８８．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｊｏｉｎｉｎｇ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ａｌａｎｉｎｅ−ｔＲＮＡ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０，１３３８−１３４４；Ｆｕｈｒｍａｎｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）ｉｓ  ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｉｎ  Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１９９９年８月；１９（３）：３５３−６１）、ウルトラマーを利用したデノボ遺伝子構成（Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．“ＵｌｔｒａｍｅｒｓＴＭ−Ｔｈｅ  Ｌｏｎｇｅｓｔ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ＡｖｉａｌａｂＩｅ  ｗｉｔｈ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ”Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ（２００７）、Ｆｏｋ  Ｉ法（Ｍａｎｄｅｃｋｉ，Ｗ．ａｎｄ  Ｂｏｌｌｉｎｇ，Ｔ．Ｊ．（１９８８年）ＦｏｋＩ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｇｅｎｅ，６８，１０１−１０７）、遺伝子合成向けの変更系リガーゼ連鎖反応、完全長分子が重複する累進的な伸長によって生成されるＰＣＲ組み立て（Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｗ．Ｐ．，Ｃｒａｍｅｒｉ，Ａ．，Ｈａ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｔ．Ｍ．ａｎｄ  Ｈｅｙｎｅｋｅｒ，Ｈ．Ｌ．（１９９５年）Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｅｎｔｉｒｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｆｒｏｍ  ｌａｒｇｅ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｇｅｎｅ，１６４，４９−５３）、熱力学的平衡インサイドアウト（Ｇａｏ  Ｘ，Ｙｏ  Ｐ，Ｋｅｉｔｈ  Ａ，Ｒａｇａｎ  ＴＪ，Ｈａｒｒｙｓ  ＴＫ．Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃａｌｌｙ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ（ＴＢＩＯ）ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｐｒｉｍｅｒ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｌｏｎｇｅｒ  ｇｅｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００３年１１月１５日；３１（２２）ｅ１４３）、あるいは組み合わせたアプローチ（Ｙｏｕｎｇ  Ｌ，Ｄｏｎｇ  Ｑ．Ｔｗｏ−ｓｔｅｐ  ｔｏｔａｌ  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｍｅｔｈｏｄ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００４年４月１５日；３２（７）：ｅ５９）なども含むがこれらに限りません。オリゴヌクレオチドが長いほどエラーの頻度が高くなるため、より短いオリゴヌクレオチド（２００以下の塩基対）の組み合わせを利用する方法は普通です。【０３４６】合成された分子は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、および脱塩など、よく知られている多くの方法によって浄化することができます。【０３４７】一実施形態で、合成された核酸は、マルチウェルプレートに配列され、そこで各プレートはそれぞれの核酸に相当します。具体的には、プレートの各遺伝子座は、重鎖か軽鎖かを問わず抗体可変領域をエンコードする核酸を含みます。マルチウェルプレートの各ウェルに含まれている核酸のアイデンティティは知られているものであり、プレート内の全ての核酸の配列を含むアウトプットファイルにマッピングされます。マルチウェルプレートプレートは、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、および１５３６ウェルプレートを含むことができるがそれだけに限��ません。実施例で、核酸は空間的に９６ウェルプレートに配列されています。【０３４８】合成時に、結果として得られる核酸分子は、個別に遺伝子座（ウェル、チップ、タグ、およびその他のアドレス可能な形式など）に記載されます。プレートの各遺伝子座は、合成されたおよび組み換えられた別々の核酸分子を含むことができるが、その核酸分子は重鎖可変領域または軽鎖可変領域またはアドレスに対応するその一部をエンコードします。各遺伝子座の核酸分子のＩＤは知られており、アドレス可能な形式内の全ての核酸分子の配列を含むアウトプットファイルにマッピングすることは可能です。例えば、核酸分子は空間的配列によってマルチウェルプレートプレートにアドレスされ、プレートの個々遺伝子座は個別で１つの核酸分子を含みます。マルチウェルプレートプレートは、１２ウェルプレート、２４ウェルプレート、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、および１５３６ウェルプレートを含むことができるがそれだけに限りません。【０３４９】ｂ）組換え生成
いくつかの例で、組み換えＶＨ配列および／またはＶＬ配列またはそのサブセットは、組み換えＤＮＡ技術を利用し組み換え核酸分子に仕上げることができます。当業者は、例えば、ＰＣＲ、クローニング、および制限酵素消化などをも含み、ＤＮＡ組み換え技術に精通しています。このような技術は、上記に説明された通り、生殖細胞系セグメントを組み合わせ、インフレームで組み換え核酸分子を生成するために利用できます。一般的に、各ベクトルが個別で生み出され、各ベクトルはクローニングプロセスによって配列のＩＤを表します。したがって、組み合わせ抗体ライブラリーの組換え生成はアドレス可能です。【０３５０】ＤＮＡ組み換え技術を使用し組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法では、生殖細胞系セグメントは、リンカーによって直接または間接的につながっており、得られる核酸分子はインフレームで機能的であり、生産性抗体という結果になります。リンカーは、ペプチド、ポリペプチド、またはアミノ酸です。たとえば、制限酵素などの組み換えＤＮＡ技術を利用することによって、アミノ酸はＶ−Ｄ、Ｄ−Ｊ、およびＶ−Ｊの接合部に挿入され、生殖細胞系セグメントの結合を容易にすることができると知られています。
本書の例１４にあるいうに、リンカーの典型的な例として、ＤＨ生殖細胞系セグメントの３’末端とＪＨ生殖細胞系セグメントの５’末端の間にＳＹをエンコードするヌクレオチド配列が挙げられます。【０３５１】組換えＤＮＡ技術によって組み合わせ抗体ライブラリーを作成する方法では、ライブラリーメンバーの間で共同の核酸配列を含む親ベクトルの一つまたは複数が生成されるかもしれません。例えば、ベクトルはライブラリーのメンバーの間で共同であるＶＨ、ＤＨおよび／またはＪＨ生殖細胞系セグメントの核酸配列、その派生物、あるいはその一部、および／またはＶＬおよび／またはＪＬを含むように生成できます。セグメントの挿入は、本書で説明されるように、リーディングフレームに関して行われ、結果として得られるコンパイル核酸分子はインフレームであることは知られています。以下の説明は、組換えＤＮＡ技術を使用し組み合わせ抗体ライブラリーを作成する方法の総括的な要約です。参照は例示のためであると知られています。本書の説明を使用することによって、当業者は生殖細胞系セグメントからコンパイルされた核酸、あるいはその派生物を含む類似したベクトルを生成し、インフレームで組み換えのＶＨ鎖またはＶＬ鎖を生成することができます。例えば、ＶＨ／ＤＨ／ＪＨあるいはＶＬ／ＪＬセグメントを組み換えベクトルに添加する順番は不規則であることは知られているが、最終的なヌクレオチド配列のクローンはインフレームで組み換えＶＨ鎖もしくはＶＬ鎖をエンコードすることは前提とします。【０３５２】したがって、普通に親ベクトルは、ライブラリーの全てのメンバーに共有される配列を含むように生成されます。たとえば、全てのベクトルが共通の生殖細胞系ＶＨを共有する場合、適切なリーディングフレームにＶＨを含むベクトルが生成され、これは他の生殖細胞系セグメントの組み込みのために操作できます。例えば、ＶＨ生殖細胞系配列は、ＤＨ生殖細胞系配列との結合のために、３’末端で制限酵素部位を含むように変更されます。別の例で、ベクトルはＶＨ，ＤＨあるいはＪＨの生殖細胞系配列の一部を含むように生成されます。たとえば、ベクトルは本書で規定されるように共通フレームワーク配列を含むように生成されます。これは例１４で例示されているが、そこで組み換えプラスミドベクトルは、ＪＨ生殖細胞系セグメントの共通フレームワーク４領域を含むように生成されました。本書の方法によって組み合わせ抗体ライブラリーを作成するに使用される親ベクトルの典型的な例は配列ＩＤ番号：２０５１に取り上げられるが、そのベクトルは、共通のＶＨ生殖細胞系セグメント（ＶＨ３−２３（ＩＧＨＶ３−２３＊０１）内部の制限部位を除去し３’末端に追加的な制限部位を加えるように変更できる）、およびＪＨ生殖細胞系セグメントの共通フレームワーク４領域を含みます。【０３５３】そこで親ベクトルはさらに残りの生殖細胞系セグメント、その派生物、あるいはその一部を挿入するために使用され、最終的で複数のベクトルはそれぞれ組み換えＶＨ鎖および／またはＶＬ鎖をエンコードする核酸配列を含むように生成されます。親ベクトルから最終的なベクトルまでの生成は段階的に起こることもあるので、したがって、少なくとも１つの中間ベクトルが生み出されます。
一般的に、後続の生殖細胞系セグメント、その派生物、あるいはその一部のための核酸配列は、親ベクトルもしくは中間ベクトルへの後続のクローニングに向けて、オリゴヌクレオチドとして生成されます。終止コドンがいかなる段階で挿入される場合、その終止コドンは本書で説明された方法で除去されるか終止コドンを含む特定のセグメントがクローンされないかという結果になると知られています。隣接する核酸配列の結合を容易にするために、オリゴヌクレオチドは３’および／または５’末端で補完的な制限酵素部位を含むように生成されます。【０３５４】たとえば、親ベクトルに含まれるコンポーネントによって、中間ベクトルは生殖細胞系セグメント、その派生物、あるいはその一部を含むように生成されます。例えば、中間ベクトルは上記の親ベクトル（配列ＩＤ番号：２０５１に記載された）から生成されるが、そこで各ベクトルは適切なリーディングフレームで別々のＪＨセグメントを含みます。ＪＨセグメントは、生殖細胞系セグメント、あるいはそれによる派生物です。変更されたＪＨセグメントの典型的な例は配列ＩＤ番号：３４５０−３４５５、およびＪＨ領域をエンコードする例は配列ＩＤ番号：３４５６−３４６１に記載されています。．ＪＨセグメントの全体、あるいは一部は既存の親ベクトル、あるいは中間ベクトルに追加されます。例えば、上記に説明された通り、親ベクトルは共通フレームワーク４領域を含むように生成された場合、ＪＨセグメントのＣＤＲ３の最終部分に相当するヌクレオチドを含むＪＨセグメントの一部を挿入することができます。例えば、別々のＪＨセグメントなど、様々なセグメントを追加することで、ライブラリーの多様性を増加することができます。したがって、複数の中間ベクトルが生成されます。たとえば、例１４で６つの中間ベクトルが生成されます（配列ＩＤ番号：２０６４−２０６９のいかなる配列）。【０３５５】コンパイル生殖細胞系配列のすべてのコンポーネントを含む複数の最終ベクトルが生成されます。上記の通り、ベクトルに挿入される残りのヌクレオチドはオリゴヌクレオチドとして生成され、また普通に３’末端および／または５’末端で補完的な制限酵素部位を含みます。上記に述べられた通り、オリゴヌクレオチドは挿入されたセグメントのための適切なリーディングフレームを提供し、終止コドンを含みません。加えて、オリゴヌクレオチドは親ベクトルもしくは中間ベクトルに含まれるセグメントの既存のリーディングフレームを維持するために生成されます。例えば、説明された通り、ＤＨ領域のリーディングフレームは重要ではないと知られています。したがって、ＤＨ生殖細胞系セグメントを含むＤＨセグメントは、いかなるリーディングフレームに挿入したり、不規則なヌクレオチド配列だったりします。例１４はＤＨ生殖細胞系セグメント（例えば、配列ＩＤ番号：２３９−２４５，２４８，２５０，２５２，２５４，２５６，２５８−２７２に記載されているもの）、またはそれによる逆位セグメント（例えば、配列ＩＤ番号：３４６２−３４８８に記載されているもの）を全ての３つのセグメントに挿入することによって複数の最終ベクトルが生成されるプロセスを例示します。しかし、オリゴヌクレオチドを生成するにあたって、１つまたは複数のヌクレオチドは３’または５’末端から除去され、隣接するＪＨセグメントのリーディングフレームを維持します。これは例１４で見られるように、リーディングフレームを維持するためにヌクレオチドを追加もしくは除去する条件があります。【０３５６】得られた最終ベクトルは、ＶＨ鎖もしくはＶＬ鎖をエンコードするコンパイル済みＶＨ／ＤＨ／ＪＨあるいはＶＬ／ＪＬ生殖細胞系セグメント、あるいはそれに派生する物を含みます。各最終ベクトルは個別であり、個別の組み換えＶＨ鎖もしくはＶＬ鎖をエンコードする個別の核酸配列を含みます。核酸分子はすでに発現ベクターにクローン化されているので、上記に説明された通り、直接に発現系に変換することができます。【０３５７】ｆ．【０３５８】抗体あるいはその一部あるいはその断片の発現および生成
本書の方法では、合成組換え核酸分子、または組み換え生成による組み換え核酸分子などの核酸分子は、発現ベクターにクローン化されます。ポリヌクレオチドは、普通に制限酵素消化およびライゲーションによって、ベクトルに挿入されます。当業者に知られている従来のいかなるベクトルは、真核生物や原核細胞での発現に使用することができます。典型的なベクトルには、以下に記載されている通り、プラスミドＡ、Ｃ、およびＤがあります。ベクターは、適合性のある発現系が、核酸の増幅および／またはエンコードされた可変重・可変軽鎖ポリペプチドの発現に利用できるように変更できます。【０３５９】一般的に、ベクターへのライゲーションは、そこで発現される組み換えポリペプチドのアイデンティティを確認できるように、アドレス可能な形式で行われます。例えば、核酸を含むベクトルは空間的にマルチウェルプレートプレートに配列にされ、プレートの個々遺伝子座は個別で１つの核酸を挿入されたベクトルを含みます。具体的には、プレートの各遺伝子座は、重鎖または軽鎖をエンコードするベクトルを含みます。マルチウェルプレートの各ウェルに含まれている核酸のアイデンティティは、例えば上記の合成や編集で収集され保存された配列にマッピングすることによって知られています。たとえば、ベクトルへのライゲーションは、既に上記の核酸分子を含むマルチウェルプレートに直接に行うことができます。マルチウェルプレートプレートは、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、および１５３６ウェルプレートを含むことができるがそれだけに限りません。実施例で、核酸は空間的に９６ウェルプレートに配列されています。【０３６０】一般的に、本書の方法を利用するにあたって、可変重鎖をエンコードする核酸分子は最初のベクトルに連結されます。可変軽鎖をエンコードする核酸分子は２番目のベクトルに連結されます。最初のベクトルと２番目のベクトルは、可変重鎖および可変軽鎖の共発現のために、同じ発現宿主に変換することができます。ポリペプチドは、発現時に、可変重鎖と可変軽鎖のポリペプチドの相互作用のおかげで、機能するようになります。いくつかの例で、核酸分子は、発現の前に、リンカーの利用などによって直接に結合することが可能です。そのような例で、単一の核酸分子は、可変重鎖および可変軽鎖をコードし、単一のベクトルに連結し発現することができます。【０３６１】ここで挙げられる全ての方法では、発現した抗体は、最小限に、抗原結合部位を形成するためのＶＨ鎖およびＶＬ鎖、またはその一部を含みます。加えて、必要に応じて、発現のために一定鎖は、可変鎖との効果的なつながりで挿入されます。方法に関する全ての例では、組換え核酸は抗体やその断片をエンコードするが、例えば、ＩｇＧを１つ、Ｆａｂ断片を１つ、Ｆ（ａｂ’）２断片を１つ、あるいはＦｖ断片（例えば、ジスフィドで結合されたＦｖあるいはＦｖ単一鎖）を１つなども含まれるがこれらに限りません。典型的な抗体の例は、Ｆａｂ断片です。このような抗体またはその断片は、当業者に知られているいかなる方法で浄化されます。【０３６２】セクションＦは、抗体またはその断片を発現、浄化させる方法について説明します。
２．オートメーション【０３６３】上記の方法におけるいかなる段階は、自動化および／または高生産性および／またはいかなる方法で合理化されることは可能です。当業者は、インシリコデータベースの設置、コンピュータープログラムのアプリケーション、ロボット工学技術、および／またはその他の高生産性化を含み、システムやプロセスの自動化に精通しています。本書の方法におけるプロセスの全体、または特定のステップが自動化できると考えられます。オートメーションの程度はユーザーによります。以下の説明と例は、方法の様々なプロセスの自動化を例示しています。【０３６４】ａ．ユーザーによるデータベース
本書の方法を応用するにあたって、生殖細胞系セグメントまたはそれによる派生物が必要です。そういったセグメントは当業者に知られている物で、上記に挙げられた市販のデータベースで入手できます。そういった生殖細胞系セグメントは上記の表３〜５の配列リストに記載されています。変更されたＪＨ生殖細胞系セグメントの例は配列ＩＤ番号３４５０−３４５５にあります。手軽なアクセスのために、配列はユーザーが作成したデータベースにコンパイルすることもできます。配列の全ての情報を含むファイルまたはデータベースの作成によって、この配列への即時アクセスが可能になります。加えて、配列ファイルは他のシステムやプロセスに接続し、方法の応用を容易にすることができます。例えば、図９、例４で見られるように、データベースは、入力ファイルとして配列コンパイルアルゴリズムにリンクされ、配列コンパイルのためのＶ（Ｄ）Ｊの重鎖および軽鎖配列を特定しています。【０３６５】データベースは生殖細胞系ＶＨ，ＤＨ，ＪＨ，Ｖκ，Ｊκ，ＶλおよびＪλセグメントのための配列を記載しています。特に、データベースファイルは、配列ＩＤ番号：１０−４５１、８６８、に記載されている核酸、あるいはそのサブセットの配列を含みます。配列は、ＦＡＳＴＡ形式で指定され、全ての配列はその間に空白を含むとさらに便利です。本書の方法の応用に当たって、ＪＨ，ＪκおよびＪλセグメント配列は、それぞれの最適なリーディングフレーム（表１３に記載）に対応するフレームトリプレットをエンコードしながら、データベースファイルに記載されています。配列は、特定のためにデータベースファイル内で名前を与えられます。例えば、生殖細胞系セグメントは［ＶＨ］，［ＤＨ］，［ＪＨ］，［ＶＫ］，［ＪＫ］，［ＶＬ］，および［ＪＬ］のセクションヘッディングで特定されています。そのデータベースファイルは例で（例えば例３で）ＳｅｑｕｅｎｃｅＤａｔａｂａｓｅ．ｔｘｔ．ｆｉｌｅと記載されている。図１１は、配列テータベースのファイル形式の概略図を示しています。【０３６６】加えて、データベースは、方法を応用する際に使用される配列を含むこともあります。たとえば、データベースは、制限部位向けの核酸配列を含む場合に、［制限部位］のセクションヘディングによって示すことができます。これらの配列は、以下に説明されている通り、特定のプログラムプロセスによってアクセスし、また、組み換え核酸分子内に存在する制限部位に対応する核酸配列を特定することができます。データベースに記載されている制限部位配列は配列ＩＤ番号：９７７−９８０，１８８９−１９００にあるいかなる物を含みます。当業者に知られている従来のいかなる制限部位配列は、データベースファイルに記載することができます。
たとえば、図１１にあるようにデータベースファイルの略図は制限酵素Ｍｆｅ  Ｉ向けの配列を含みます。【０３６７】データベースファイルは定期的にアップデートされ、内容の配列が増えると見なされています。加えて、データベースファイルは、方法の応用に使用できると見なされる配列を含むように、さらにアップロードできます。たとえば、抗体生殖セグメント以外のタンパク質をエンコードする核酸配列は、ＦＡＳＴＡ形式を使用して、適切なヘッディングでデータベースに入力することができます。それで、この配列は生殖細胞抗体配列に組み換えられることが可能です。たとえば、セクションタイトル［ＤＨ］の下にペプチドをエンコードする核酸配列を追加することによって、抗体のＤＨにペプチド配列を挿入することは可能です。【０３６８】ｂ．
配列編集【０３６９】配列の編集方法は、例えば以下のソフトウェアを使用し行うことができます。本書の方法に従って生殖細胞系セグメントを編集する可能なアルゴリズムもしくはプロセスを行うように設定されたいかなるソフトウェア、またはいかなる適切な方法を利用することができます。ソフトウェアープログラミングに精通している当業者は、そういったアルゴリズムもしくはプロセスを行うプログラムを作ることができます。一般的に、そのソフトウェアは、次のいずれかのプロセスを実行するように設計されています：
（ａ）ユーザーがインシリコで作成した全ての利用可能な生殖細胞系セグメント（ＶＨ，ＤＨ，ＪＨ，Ｖκ，Ｊκ，ＶλおよびＪλ）のデータベースへアクセスできます。
（ｂ）アルゴリズムを利用し、重鎖向けの組み換え完全長核酸配列の全ての組み合わせ（５’−ＶＨ−ＤＨ−ＪＨ−３’の組み含わせ）を生成、カッパ軽鎖向けの組み換え完全長核酸配列の全ての組み合わせ（５’−Ｖκ−Ｊκ−３’の組み合わせ）を生成、およびラムダ軽鎖向けの組み換え完全長核酸配列の全ての組み合わせ（５’−Ｖλ−Ｊλ−３’の組み合わせ）を生成できます。
（ｃ）アルゴリズムを利用することによって、接合部の核酸配列を変更し、核酸配列がインフレームにある結果を生み出します。
（ｄ）結合によって得られた核酸配列を変更し、偶然に生成された終止コドンを除去します。
（ｅ）結果として得られる完全長核酸を変更し、細菌発現に対するコドンの作用を最適化します。
（ｄ）得られた核酸配列を変更し、不要な制限部位を除去します。
（ｇ）最適化された完全長核酸配列の５’および３’末端でクローニングを行うために、制限部位を含むフランキング核酸を挿入します。
（ｈ）配列多様性に基づいて組み換え核酸配列に順番を付けます。
（ｇ）組み換え核酸配列のライブラリーから組み換え核酸配列（重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含む物）を選択します。
（ｈ）選択された核酸配列を、アドレス可能な形式の特有の遺伝子座に移動します。
（ｉ）個別の重鎖または軽鎖の配列を記載するアドレス形式に基づいて、全ての組み換え核酸配列を含むアウトプットファイルを生成し、各遺伝子座がアドレス可能、またアドレスされた形式の遺伝子座であることを確保します。【０３７０】本書の方法を本書の説明に従って利用するために、ここで、ソフトウェア、コンピューター可読媒体、およびコンピューターシステムを提案しました。例は、典型的なソフトウェア、コンピューター可読媒体、およびコンピューターシステムを表します。当業者はそのソフトウェアー、コンピューター可読媒体、およびコンピューターシステムの公開後、それぞれを変更することができると認められているが、またその変更の内容をここに記入されると見なされます。【０３７１】たとえば、本書に取り上げられる方法の各プロセスは、本書の例に登場する模範的なコンピューターソフトウェアによって実行されます。たとえば、例２、図８、図９は、生殖細胞系セグメント編集の模範的なプロセスを例示します。図９の流れ図は、上記の（ａ）−（ｄ）および（ｆ）の各ステップのプロセスを例示します。たとえば、例２、および図１０は、配列多様性に基づいて配列に順番を付ける模範的なプロセスを例示します。図１０の流れ図は、配列多様性スコア確定に次ぐ配列順番づけプロセスを例示します。
また、図１７はその順番の例を挙げています。【０３７２】ｃ．タンパク質の発現および浄化のオートメーション
タンパク質の発現および浄化を自動化する方法は当業者に知られています（例えば、Ｌｅｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００１年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．２２：１５９−１６４、Ａｃｔｏｎ  ＴＢ  ｅｔ  ａｌ．（２００５年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３９４：２１０−４３、Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４年）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，５：２３−２７を参考）。このようなプロセスは、普通に機械的な方法で行われます。【０３７３】タンパク質の発現および浄化の高生産性自動化の典型的な例はＰｉｃｃｏｌｏＴＭ（Ｗｏｌｌｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６年）ＪＡＬＡ，１１：２９１−３０３）です。ＰｉｃｃｏｌｏＴＭシステムは、Ｅ．ｃｏｌｉ、およびバキュロウイルスによる細胞昆虫発現系からのタンパク質の発現と浄化を自動化します。Ｐｉｃｃｏｌｏは複数で異なるタンパク質の発現と浄化を同時に行うことができます。Ｐｉｃｃｏｌｏシステムは、複数のサンプルの発現、浄化を同時にサポートする曝気アセンブリによる２４位の培養容器ブロック（ＣＶＢ）を使用します。Ｐｉｃｃｏｌｏシステムは以下の機能を行う４つのモジュールで構成されています。液体ハンドリングモジュール、ＣＶＢインキュベーター、遠心分離機、およびストレージカルーセル。レール取り付け６−軸ＲＸ６０ＬＳｐｉｎａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒロボット（ＳＴ  Ｒｏｂｏｔ；Ｓｔａｕｂｌｉ，Ｈｏｒｇｅｎ，スイス）は液体ハンドリングモジュール、ＣＶＢインキュベーター、遠心分離機、およびストレージカルーセルの間に実験器具を移動させます。システムは、ユーザーが発現と浄化プロセスの条件を制御できるようにするソフトウェアによって動作します。【０３７４】発現プロセスは細菌培養物などの入力接種材料を伴う適切な増殖培地を含むＣＶＢプレートの接種からはじめることができます。２４培養容器ブロックに対して合計で、５７６培養物のユニットが同時に生殖することができます。プレートはユーザーが指定した期間内と条件に従って培養されます。典型的な成長および誘導温度は１６℃〜３７℃の範囲で変動し、成長および誘導に最適な温度の選択は当業者の基本的な技術です。細菌増殖は監視する可能です。必要に応じて、ＣＶＢプレートの組み立てに誘導物質の適切な量を添加し、そして適切な条件の下で増殖することによって、タンパク質の発現を誘導することができます。タンパク質の発現は、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）など、発現ベクターとの適合性のある誘導物質を添加することによって、誘導することができます。発現時間は２〜４８時間です。最適な発現時間の選択は当業者の基本的な技術です。引き続きの発現プレートは冷却条件で保管されます。例えば、例９に説明されている通り、空間的に整列された形質転換細胞は、細胞増殖やタンパク質の発現向けの２４−ウェル培養容器ブロックに位置付られます。形質転換細胞の９６−ウェルプレートにつき、培養容器の４つが生成され、それぞれの９６−ウェルプレートに対する複数のＦａｂが増殖します。【０３７５】希望のタンパク質の発現の後、ＰｉｃｃｏｌｏＴＭシステムは得られたタンパク質の残りを浄化するのに精製するために使用できます。
Ｐｉｃｃｏｌｏ機は溶解および浄化のプロセスを行うために設定されています。細胞は採取され、浄化技術との適合性のある適切な溶解バッファーを使用し溶解されます。溶解バッファーの選択は当業者の基本的な技術です。そして、得られる浮遊物は、カラムクロマトグラフィーによって、ａｎｔｉ−ｆｌａｇ樹脂あるいはＮｉ−ｃｈａｒｇｅｄ樹脂などの適切な改質樹脂で浄化されます。当業者は、本書で説明された通り、タンパク質浄化に適切な樹脂を特定することができます。樹脂は、実行を開始する前に、適切な洗浄バッファーで手動で平衡化する必要があります。結合タンパク質は、適切な溶出バッファーによって溶離され、そしてその溶出液は出力プレートで収集されます。出力プレートは、オペレータに回収されるまで、冷温（例えば、６℃）で保管されます。【０３７６】純度はゲル電気泳動、染色法、および分光技術など、分野で知られているいかなる方法で判定されます。本書で説明されたように、他の浄化方法はＰｉｃｃｏｌｏと組み合わせることができます。たとえば、タンパク質はタンパク質浄化の直交二次高生産性方法を利用し、さらに浄化できます（例えば、例１０を参考）。また、適合性のある樹脂、Ａｋｔａ浄化装置（ＧＥヘルスケア社）、およびオートサンプラを使用することによってカラムクロマトグラフィーをさらに行うことができます。浄化抗体の典型的な例として、タンパクＧ樹脂を利用することができます。【０３７７】Ｅ．ライブラリー
ここでライブラリーを紹介します。ライブラリーにはＶＨ鎖およびＶＬ鎖をエンコードする核酸ライブラリー、組み換え核酸分子によって変性したベクトルライブラリー、および抗体ライブラリーがあります。いくつかの例では、各ライブラリーに属するメンバーは、例えばセクションＥ．２．に取り上げられたいかなるアドレス可能な形式で処理されています。ライブラリーに属するメンバー、そして結果として出来上がるライブラリは上記で挙げられた方法によって作成されます。【０３７８】１．ＶＨ核酸ライブラリー、およびそれによるベクトルライブラリー
ここで、ＶＨ鎖をエンコードする組み換え核酸ライブラリーを紹介します。ここで取り上げられるライブラリーは完全にＶＨ，ＤＨおよびＪＨ生殖細胞系セグメントあるいはそれに由来する物で構成されている核酸分子を含みます。ＶＨ，ＤＨおよびＪＨ生殖細胞系セグメントは、上記の表３ｖに記載されているいかなるセグメント、あるいはそれに由来する物を含みます。いかなる置換配列は可能です。ライブラリーの核酸分子は、配列があるが、ＶＨセグメントはＤＨセグメントの５’で、そしてＤＨセグメントはＪＨセグメントの５’です。セグメントは直接的または間接的にペプチドリンカーによって、リンクされています。【０３７９】ライブラリー内の核酸分子が生殖細胞系セグメントの派生物なので、そういった核酸ライブラリーに属するメンバーは、ＶＬ鎖をエンコードする核酸との共同発現の時に、ナイーブ抗体をエンコードすることができる。ライブラリーはナイーブで、生殖細胞から由来すると見なされるにもかかわらず、本書の方法を利用するにあたって、結合セグメントの接合領域は変更され、核酸分子をエンコードする生成物はインフレームで生み出されます。しかし、このような変更は軽微なものであり、一般的に生殖細胞系セグメントの１つだけの単一ヌクレオチドの様々な挿入、あるいは除去を伴います。加えて、終止コドンや制限酵素部位の除去など、本書で取り上げられる方法によって組み換え核酸配列を変更することも、ナイーブ抗体の生成につながります。【０３８０】ライブラリーは、生殖細胞系セグメントを含む配列からコンパイルされ作成されることも可能です。場合によって、ライブラリーには、ＶＨおよびＪＨ生殖細胞系セグメントの間のヌクレオチド配列、また完全にＶＨおよびＪＨ生殖細胞系セグメントで構成されている組み換え核酸分子を含むライブラリーもあります。その領域はＣＤＲＨ３の中部を含むが、ＣＤＲＨ３は結果として得られる抗体の抗原特異性の決定に重要な役を果たしています。ヌクレオチド配列は不規則のいかなるヌクレオチド配列が可能です。いくつかの例で、ヌクレオチド配列は、特定の対象に対するペプチド模倣物をエンコードする配列、例えば細胞表面の受容体などが可能です。典型的なペプチド模倣物は表１６に記載されています。一般的に、ヌクレオチド配列は約５，１０，１５，２０，２５，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０あるいはそれ以上の長さのヌクレオチドで構成されています。結果として得られる核酸分子は、ライブラリーで、ＶＨセグメントは不規則ヌクレオチド配列の５’で、そして不規則ヌクレオチド配列はＪＨセグメントの５’という配列を示しています。場合によって、不規則ヌクレオチド配列はＤＨ生殖細胞系セグメントです。【０３８１】別の例では、ここで取り上げられるライブラリーは組み換え核酸分子を含むが、そこで含まれるＶＨ，ＤＨおよびＪＨ生殖細胞系セグメントの１つあるいは２つあるいは全ては、例えば、アミノ酸の添加あるいは除去、挿入などによって変更されました。たとえば、ライブラリーは指向性ペプチドをエンコードする配列を含有する核酸分子を含みます。ライブラリーはまた、アミノ酸置換（例えば、ＣＤＲの１つあるいはそれ以上のアミノ酸）をエンコードするヌクレオチド突然変異を含む組み換え核酸分子も包括します。
さらに他の例で、ここで取り上げられるライブラリーは組み換え核酸分子を含むが、そこで、ＶＨ鎖をエンコードする核酸分子の部分あるいは全部、または少なくとも１つあるいはそれ以上のＶＨ，ＤＨおよびＪＨは既存のモノクローナル抗体（例えば、表９に記載されているいかなる物も含む）から派生します。ここで取り上げられるライブラリーの典型的な例は、例えば、配列ＩＤ番号：１０４３もしくは配列ＩＤ番号：１０５８（末端制限部位配列を含む配列ＩＤ番号：４５３）に記載されているａｎｔｉ−ＣＤ２０抗体のＶＨ鎖、または配列ＩＤ番号：１０５７（末端制限部位配列を含む配列ＩＤ番号：４５２）に記載されているハーセプチンをエンコードする核酸分子を含むことは可能です。【０３８２】ここで取り上げられる組み換え核酸分子のライブラリーは、上記の例の１つ、複数、あるいは全てを代表するメンバーを含むことは可能です。また、ここで取り上げられるいかなるライブラリーは、異種配列のメンバーを含むことも可能です。例えば、制限部位配列、リンカー配列、タッグやその他の探知可能な部分を含む配列、あるいはそれ以外の配列などです。【０３８３】ここで取り上げられるＶＨ核酸ライブラリーでは、組み換え核酸分子の各メンバーは生産性があり、ＶＨ鎖をエンコードする核酸分子と共同で発現すると、抗原結合部位を形成するために十分な機能性のある抗体あるいはその一部を生成します。加えて、ここで取り上げられるＶＨ核酸ライブラリーでは、ライブラリーに属する核酸はそれぞれ異なります。ここで取り上げられるＶＨ核酸ライブラリーは１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００，２００，３００，４００，５００，６００，７００，８００，９００，１０００，２０００，３０００，４０００，５０００，６０００，７０００，８０００，９０００，１０，０００（１０４），２ｘ１０４，３ｘ１０４，４ｘ１０４，５ｘ１０４，６ｘ１０４，７ｘ１０４，８ｘ１０４，９ｘ１０４，１０５，２ｘ１０５，３ｘ１０５，４ｘ１０５，５ｘ１０５，６ｘ１０５，７ｘ１０５，８ｘ１０５，９ｘ１０５，１０６あるいはそれ以上のメンバーを含むことができます。ここで取り上げられる核酸メンバーはアドレス可能な形式で提供され、アドレスされると、配列内の位置によってそのアイデンティティが確認できます。【０３８４】たとえば、模範的なＶＨ核酸ライブラリーは、配列ＩＤ番号：４５４−８０５に記載されているメンバーを含み、各メンバーはＶＨ，ＤＨおよびＪＨ生殖細胞系セグメントの別々の組み換え核酸分子を代表します。このようなライブラリーは３’および５’末端で制限部位向けの異種配列を含みます。ライブラリーに属するメンバーは、配列ＩＤ番号：１０５９−１４１０に記載されている物のように、異種配列を含まない配列を有するものも含むことができます。【０３８５】他の例で、模範的なＶＨ核酸ライブラリーは、配列ＩＤ番号：２０７０−２７５９に記載されているメンバーを含み、各メンバーはＶＨ，ＤＨおよびＪＨ生殖細胞系セグメント、あるいはそれに由来するものの別々の組み換え核酸分子を代表します。このようなライブラリーは制限部位向けの異種配列を含むメンバーを包括するが、そのメンバーは異種配列の位置によって、ＣＴＡＧＣに相当する３’末端に含むメンバー（配列ＩＤ番号：１９０３に記載された）、およびＣＣＡＴＧＧＣＡに相当する５’末端に含むメンバー（配列ＩＤ番号：１９０１に記載された）です。ライブラリーに属するメンバーには、配列ＩＤ番号：２０７０−２７５９に記載されている物のように、３’および５’または両方の末端で異種配列を含まない配列を有するものも含まれると知られています。【０３８６】ＶＨ核酸ライブラリーはここで取り上げられる他のいかなるライブラリーあるいはそのサブセットに属するいずれものメンバーを含むこともできます。例えば、ＶＨ核酸ライブラリーは配列ＩＤ番号：４５４−８０５および２０７０−２７５９、あるいはそのサブセットに記載されているメンバーをも含みます。ライブラリーに属するメンバーには、３’あるいは５’末端で異種配列を含むメンバー、および／’または異種配列を含まないメンバーも含まれます。【０３８７】いくつかの例では、ここで取り上げられるライブラリーのいかなる核酸配列はベクトルライブラリーを作成するためにベクトルに組み込むことができます。ベクトルライブラリーの例としては、重要なプラスミドＡもしくはプラスミドＢに含まれているＶＨ鎖をエンコードする組み換え核酸分子のライブラリーが挙げられます。【０３８８】  ２、ＶＬの核酸ライブラリとベクトルライブラリ
本発明は再結合されたＶＬチェーンを含む核酸ライブラリです。ライブラリは、ラムダ或いはガンマライトチェーン、またはその組み合わせが含まれています。したがって、ここでいうライブラリは完全にＶκとＪκ生殖細胞と・またはＶλとＪλ生殖細胞のセグメントから再結合された核酸分子です。
ＶκとＪκと・或いはＶλとＪλの生殖細胞セグメントは上記表４−５のすべてまたはそのひとつのサブセットが含まれています。任意の置換が可能です。【０３８９】  ライブラリ内で形成した核酸分子には、ＶＬセグメント（Ｖκ或いはＶλ）が５’対ＪＬセグメント（Ｊκ或いはＪλ）という配列があります。
ライブラリ内の核酸分子は生殖細胞セグメントから得たもので、ＶＨチェーンをエンコードする核酸と共同に表現された場合、この核酸ライブラリはナイーブ抗体をエンコードすることができます。
このライブラリは単純で、かつ生殖細胞から由来すると考えられています。それにもかかわらず、この方法を実施した上で、セグメントの共同領域は、結局にフレーム内にて核酸分子がエンコードされることになります。【０３９０】  しかし、このような変化は、軽微なものであり、かつ、普通はさまざまな単一の生殖細胞セグメントのヌクレオチドの挿入または削除が含まれています。また、他の組替核酸配列に対する変更も、前記する方法を採用すれば、たとえば、終止コドンと制限酵素部位配列の削除すれば、やはりナイーブ抗体になれます。【０３９１】  いくつかの例では、ここでいうライブラリは、再結合された核酸分子を含みます。かつ、核酸分子に含まれている最低ひとつ或いは二つのＶκ，とＪκ生殖セグメントまたはＶλとＪλ生殖セグメントは変更されたものです。アミノ酸の挿入、削除または添加による変更とか挙げられます。
たとえば、ライブラリは主導ペプチド配列がある核酸分子を含みます。ライブラリはまた、再結合されたアミノ酸置換をエンコードする塩基変異がある核酸分子を含みます。ＣＤＲの１つまたは複数のアミノ酸とか挙げられます。【０３９２】  もう一つの例では、ここで言うライブラリは再結合された核酸分子を含みます。当該核酸分子のうちに、少なくとも一部の核酸分子、たとえば、ＶＨチェーン付きの核酸分子全体、或いは少なくとも一つ或いは一つ以上のＶκ，とＪκ或いはＶλａとＪλは既存のモノクローナル抗体に由来するもので、表９に掲げるモノクローナル抗体を含むが、これに限りません。【０３９３】  たとえば、配列番号１４２３（配列番号：８１８、端末制限部位配列を含む）に記載されているように、例示的なライブラリはハーセプチンのＶＬチェーンつきの核酸分子を含めることができます。でなければ、質問番号：１０５０或いは配列番号：１４４０（配列番号：８３５端末制限部位配列を含む）に記載されているように、ライブラリは反ＣＤ２０抗体のＶＬチェーンつきの核酸分子を含めることができます。ここでいう組替核酸分子のライブラリは、上記の例の中の一つか一部、あるいはそのすべてを含めることができます。ここでいうライブラリのいずれも、異種配列つきの配列を含むメンバーを含めることができます。たとえば、制限部位の配列、リンカー配列、タグ或いはその他の検出可能な部分をエンコードする配列、またはその他の配列とか挙げられます。【０３９４】  ここでいうＶＬ核酸ライブラリは、その各組替核酸分子メンバーが生産性あり、また、共同でＶＨチェーンつきの核酸分子で表す場合は、機能的な抗体またはその一部を生成し、かつ、十分な抗原結合部位が含まれています。【０３９５】  また、ここにていうＶＬ核酸ライブラリがお互いに異なっています。ＶＬ核酸ライブラリは１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００，２００，３００，４００，５００，６００，７００，８００，９００，１０００，２０００，３０００，４０００，５０００，６０００，７０００，８０００，９０００，１０，０００（１０４），２ｘ１０４，３ｘ１０４，４ｘ１０４，５ｘ１０４，６ｘ１０４，７ｘ１０４，８ｘ１０４，９ｘ１０４，１０５，２ｘ１０５，３ｘ１０５，４ｘ１０５，５ｘ１０５，６ｘ１０５，７ｘ１０５，８ｘ１０５，９ｘ１０５，１０６或いはこれ以上の異なるメンバーを含めることができます。核酸メンバーは、アドレスが指定されたので、配列内でのロケーションは各核酸のアイデンティティを識別できます。【０３９６】  たとえば、例示的なＶＬ核酸ライブラリには、配列番号８０６−８１５，８１７，８１９−８３４，８３６−８６７のメンバーが含まれています。それぞれはＶκ，とＪκ生殖セグメントの異なっている組替核酸分子を表します。【０３９７】  このようなライブラリには、３’末端と５末端に位置する制限部位に対する異種配列メンバーが含まれています。配列番号１４１１−１４２２，１４２４−１４３９，１４４１−１４７２のいずれかに記載されているように、ライブラリのメンバーは異種配列がない配列を含めることができると理解されています。【０３９８】  いくつかの例では、ライブラ���内の核酸配列のいずれかはベクトルに含まれているし、ライブラリを生成することができます。典型的なベクトルライブラリは、再結合されたバックボーンプラスミドＣ或いはプラスミドＥに含まれるＶＬチェーンつきの組替核酸分子のライブラリです。
３、核酸ライブラリ対或いはベクターライブラリ【０３９９】  また、ここでいうライブラリは再結合されたＶＬチェーン付きの組替核酸分子とＶＨチェーン付きの核酸分子、及びｉ．ｅ．核酸ライブラリ対です。このライブラリ対はセクションＥにおけるＶＨ核酸ライブラリーのいずれかの核酸メンバーの最初の核酸分子を含めることができます。【０４００】  一つ以上と第二核酸分子は、第Ｅ．２セクションにおけるＶＬ核酸ライブラリーのいずれかの核酸メンバーです。ライブラリ対における核酸メンバーには、異種配列ありの方も異種配列がない方も含まれています。
いくつかの例では、核酸分子対の一つは、異種配列（タグやその他の検出可能な部分など）を含めることができます。その他のライブラリ内の核酸分子対は異種配列を含みません。
相補的核酸対ライブラリは対処ライブラリとして提供することができます。これらのライブラリには、対応フォマットの各遺伝子座は、あるＶＨチェーンをエンコードする一本の核酸分子及びあるＶＬチェーンをエンコードする一本の核酸分子を含みます。他に対応したすべての遺伝子座の核酸対と比較すると、核酸対（すなわちＶＨチェーンをエンコードする核酸分子とＶＬチェーンをエンコードする核酸分子の組合）はそれぞれ異なります。【０４０１】  いくつかの例では、核酸分子はペアベクトルライブラリを生産するベクトルを含めることができます。これらのライブラリには、対応ライブラリの各遺伝子座はＶＬチェーンをエンコードする核酸分子のベクトルとＶＨチェーンをエンコードする核酸分子のベクトルを含みます。【０４０２】  いくつかの例では、核酸対ライブラリは共通のＶＬチェーンをエンコードする（対処ライブラリには、各遺伝子座は同じ核酸分子がある）核酸分子を含めることができます。その他の例では、核酸対ライブラリは共通のＶＨチェーンをエンコードする（対処ライブラリには、各遺伝子座は同じ核酸分子がある）核酸分子を含めることができます。一般的に、対処ライブラリには１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，１００，２００，３００，４００，５００，６００，７００，８００，９００，１０００，５，０００，１０，０００あるいはさらに多い、ＶＬチェーンをエンコードする核酸分子及び、１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，１００，２００，３００，４００，５００，６００，７００，８００，９００，１０００，５，０００，１０，０００或いはさらに多い、ＶＬチェーンをエンコードする核酸分子が含まれています。その結果、組み合わせたライブラリ対は１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００，２００，３００，４００，５００，６００，７００，８００，９００，１０００，２０００，３０００，４０００，５０００，６０００，７０００，８０００，９０００，１０，０００（１０４），２ｘ１０４，３ｘ１０４，４ｘ１０４，５ｘ１０４，６ｘ１０４，７ｘ１０４，８ｘ１０４，９ｘ１０４，１０５，２ｘ１０５，３ｘ１０５，４ｘ１０５，５ｘ１０５，６ｘ１０５，７ｘ１０５，８ｘ１０５，９ｘ１０５，１０６，１０７，１０８，１０９，１０１０或いはさらに多い、異なる分子対が含まれています。【０４０３】  ここで記述したように、第一核酸分子及び第二核酸分子（例えば、ＶＨチェーンをエンコードする核酸分子とライトチェーンをエンコードする核酸分子）の共同表現を通じて、抗体ライブラリを生成することができます。さらに、核酸分子にはＣＨをエンコードする配列が含まれる場合、ファブライブラリを生成することもできます。すなわち、ライブラリ内のすべての分子は一つのＣＨを通じてつながったＶＨチェーン及びＶＬチェーンを含有します。【０４０４】  例えば、典型的な核酸対ライブラリが含んだ第一核酸分子はいずれかの一つ或いは複数の核酸分子の配列番号の表示が４５４−８０５或いは２０７０−２７５９（ＶＨチェーンをエンコ���ドするもの）です。また、第二核酸分子について、配列番号の表示が８０６−８１５，８１７，８１９−８３４，及び８３６−８６７（ＶＬチェーンをエンコードするもの）です。上記の配列は制限部位の３’及び５’の末端にある異種配列を含めます。また、核酸ライブラリには異種配列なしでも配列を生成できると知られています。したがって、いくつかの例では、ライブラリのメンバーはそれら異種配列なしの配列を含めることもできます。例えば、典型的な核酸対ライブラリが含んだ核酸分子配列は、配列番号の表示が１０５９−１４１０或いは２０７０−２７５９（３’及び５’の制限部位を除く）（ＶＨチェーンをエンコードするもの）である第一核酸分子、及び配列番号の表示が１４１１−１４２２，１４２４−１４３９と１４４１−１４７１である第二核酸分子の制限部位の３’及び５’の末端において、異種配列が含まれていません。このようなライブラリは上記の核酸対の配列のいかなる配列を含めます。したがって、対ライブラリは概ね１．５ｘ１０５，２．１ｘ１０５，２．５ｘ１０５，３．５ｘ１０５，４ｘ１０５，４．２ｘ１０５，４．４ｘ１０５，４．６ｘ１０５，４．８ｘ１０５，５ｘ１０５，５．２ｘ１０５，５．４ｘ１０５，５．６ｘ１０５，５．８ｘ１０５，６ｘ１０５あるいはさらに大きい分子、若しくは５００，６００，７００，８００，９００，１０３，５ｘ１０３，１０４，５ｘ１０４，１０５或いはさらに大きいサブライブラリを含めることができます。【０４０５】  テーブル１７は典型的な対ライブラリの例を示しています。各行はライブラリの異なる遺伝子座を表示します。テーブルには、核酸分子の配列番号は「ＲＳ」（異種制限部位の配列を含む）と、「ＮＯ  ＲＳ」（異種制限部位の配列を含んでいない）と表示されます。【０４０６】
【表１７】
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【０４０７】４抗体ライブラリ
ここで述べている抗体ライブラリはその部分が少なくともＶＨチェーンとＶＬチェーンを含み、あるいは、その一部が十分な抗原結合部位を含みます。ＶＨチェーンあるいは抗体ライブラリの一部の抗体全体は上記Ｅ１段落で表示した核酸ライブラリの任意核酸分子にエンコードされます。したがって、抗体ライブラリ内の抗体は生殖セグメント配列の全部或いは一部から派生され、及び／或いは変更された配列から派生されます。いくつかの例では、これらのライブラリは対応ライブラリとして提供されています。【０４０８】  また、抗体ライブラリにおいて、機能多様である十分な抗原結合部位を含んだ抗体の種類は複雑多様です。抗体ライブラリの遺伝子座は他の遺伝子座と異なる抗体を含みます。したがって、本段落で述べている抗体ライブラリは高い抗体の多様性を展示しています。これらの抗体ライブラリは一般的には、概ね１０３，１０４，２ｘ１０４，３ｘ１０４，４ｘ１０４，５ｘ１０４，６ｘ１０４，７ｘ１０４，８ｘ１０４，９ｘ１０４，１０５及びさらにユニークな、その中には、概ね１０６，１０７，１０８，１０９及びさらにユニークな、１０２異なる抗体を含みます。自然再結合過程及び抗体レパートリーの自然構造の多様性を模倣する方法を通じて、ここでのべている抗体ライブラリを生成することができます。【０４０９】ＶＨチェーン及びＶＬチェーン或いは十分な抗原結合部位の一部を除けば、ここで述べているライブラリ内の結果抗体は一部の定常領域を含めることができます。例えば、抗体は一つ或いはいくつかのＣＨ１，ＣＨ２，ＣＨ３或いはＣＬ部分を含めることができます。一般的に、抗体或いはその部分は一つのＣＨ１領域を含みます。結果抗体或いはその部分は、完全長抗体に限定しないＦａｂ，Ｆａｂ’，Ｆ（ａｂ’）２、シングルチェーンＦｖｓ（ｓｃＦｖ），Ｆｖ，ｄｓＦｖ，ｄｉａｂｏｄｙ，Ｆｄ  ａｎｄ  Ｆｄ’の断片を含みます。ここで述べている典型的な対応抗体ライブラリはＦａｂライブラリです。【０４１０】  当抗体ライブラリ内の抗体の数は限りがあります。配列の類似性或いは相違点或いは共有の特性（例えば、Ｖ領域のファミリ、ＣＤＲ３の長さ或いはその他の生化学の属性）に基づいて抗体ライブラリの数を選択します。例えば、抗体ライブラリ内の抗体の選択を通じて、結果抗体におけるＶＬチェーン或いはＶＨチェーンをエンコードする個々の生殖セグメントは属性（例は同じサブグループ或いは遺伝子ファミリである）を共有し、または、それ以外の場合は類似或いは異なる配列の配列番号を有します。したがって、その他の例では、抗体ライブラリ内の抗体は、ＶＨチェーン或いはＶＬチェーンの配列の多様性によって、選択されます。抗体ライブラリ内の抗体はその配列の多様性あるいは類似性を代表し選択されます。したがって、いくつかのインスタンスでは、抗体ライブラリ内の抗体は高い多様性の抗体グループを代表するが、その他のインスタンスでは、抗体ライブラリ内の抗体は類似性があり、多様性がない抗体グループを代表します。例えば抗体ライブラリ内の抗体は他の抗体と比べると、ＶＨチェーン或いはＶＬチェーンにおいて、４０％，５０％，６０％，７０％，８０％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，���５％，９６％，９７％，９８％ｏｒ９９％の配列が類似します。抗体ライブラリの選択はアプリケーションの機能によって、技術レベルの範囲内にて行われます。【０４１１】  いくつかの例では、当対応ライブラリは人間ナイーブライブラリです。抗体ライブラリ内の抗体全体は人間の生殖セグメントの配列からである、と意味します。例えば、すべての抗体のＶＨチェーンはＶＨ，ＤＨ及びＪＨ生殖セグメントの組み合わせた核酸分子でエンコードされます。例えば、上記のテーブル３或いはあるサブテーブルの表示によると、このようにできた核酸分子はＶＨチェーンの５’からＤＨ領域の５’までの配列を有します。すべての抗体のＶＬチェーンはＶκとＪκ生殖セグメント及び／或いはＶλとＪλ生殖セグメントが組み合わせてエンコードするものです。例えば、上記のテーブル３−４或いはその中のサブテーブルの表示によると、このようにできた核酸分子はＶＬチェーンの５’（Ｖλ及びＪλ）からＪＬ領域（Ｊκ或いはＪλ）までの配列を有します。【０４１２】  当ライブラリはナイーブで生殖セグメントから派生されると考えられます。にもかかわらず、実践の方法によると、セグメントの共同領域はフレーム内のコーディングの結果分子を表示するために変更されている。しかし、このような変更は、一般的に軽微またさまざまな生殖セグメントの単一塩基の挿入或いは削除を含みます。また、当方法の実践によると、例えば、終始コドンと酵素制約部位の削除による組換え核酸分子配列のその他の変更は、抗体を生成する原因にもなります。当ナイーブ抗体ライブラリ内のナイーブ抗体の全部或いはその一つのサブ配列を有することができます。例えば、当ナイーブ抗体ライブラリは１０３，１０４，２ｘ１０４，３ｘ１０４  ４ｘ１０４，５ｘ１０４，６ｘ１０４，４ｘ１０４，７ｘ１０４，８ｘ１０４，９ｘ１０４，１０５及びさらにユニークな抗体、その中に１０６あるいは１０７あるいは、さらに多い抗体を含みます。【０４１３】  特定の例では、抗体ライブラリ内の抗体のＶＨチェーンはＶＨとＪＨの生殖セグメントのみが組み合わせたヌクレオチドの配列で構成され、ＶＨとＪＨの生殖セグメントのヌクレオチドの配列でエンコードされます。コーディング核酸分子におけるＶＨセグメントは５’からＪＨまでのヌクレオチドのランダムな配列です。したがって、できた抗体ライブラリ内の抗体は当領域のアミノ酸のランダムな配列を含みます。また、当領域はＣＤＲＨ３の中心部分を含む。それは最大限に抗体の抗原特異性の生成を担当します。当ヌクレオチドの配列はヌクレオチドのランダムな配列である可能性がある。いくつかのインスタントでは、ヌクレオチドの配列は任意のターゲットがペプチド類似物の抑制をエンコードする配列です。例えば、細胞表面の受容体は典型的なペプチド類似物はテーブル１６のようです。その他の例では、ランダムなヌクレオチド配列はＤＨ生殖セグメント或いはその中の変更部分です。一般的には、ヌクレオチド配列は概ね５，１０，１５，２０，２５，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０或いはさらに多いヌクレオチドです。【０４１４】  また、抗体ライブラリ内の抗体は少なくともその一部が変更された生殖セグメントの配列から派生さ��ます。いくつかの例では、すべてのコーディング生殖セグメントが変更されました。例えば、ランダムな突然変異。その他の例では、特に生殖セグメントは変更されるターゲットです。例えば、変更された生殖セグメントの配列は変更された、一つ或いは複数のＣＤＲのアミノ酸の突然変異を含めることができます。特に、抗体ライブラリの抗体は変更されたＣＤＲ、例えばＣＤＲＨ３を含めることができます。
したがって、ナイーブ抗体と比べると、抗体ライブラリ内の抗体は一つ或いはアルミ酸のＣＤＲ置換を含めることができます。【０４１５】  いくつかの例では、抗体ライブラリ内の抗体は、ナイーブ抗体の可変領域に気になるヌクレオチドターゲットに対する配列の取り込みによって、目的のターゲット或いは機能に向かって導かれることができます。したがって、組換え或いは挿入による結合した配列を除けば、その多の抗体は生殖セグメントの配列を代表します。これらの整合された配列はペプチドのみでなく、モノクローナル抗体の部分も含まれます。【０４１６】  例えば、抗体は特定ターゲットの模倣として機能するダイレクトペプチドを含めることができます。一般的に、このような抗体は、目標に向かってアゴニストとして機能するいくつかのインスタントでは、拮抗することができます。ペプチドは抗体のいかなる部位に含まれる可能性がある。しかし、一般的には可変部位に含まれます。また、一つ或いは複数のＣＤＲの部位に広く含まれます。特に、ダイレクトペプチドは抗体のＣＤＲ３部位に含まれます。抗体ライブラリの抗体は同じダイレクトペプチド及び／或いは異なるダイレクトペプチドに変更されます。【０４１７】  関連の例では、このような抗体は既知のモノクローナル抗体の配列部分を含めることができます。当部分は既知のモノクローナル抗体に対応する一つ或いは複数のＣＤＲ部分も含めることができます。その他のインスタントでは、抗体ライブラリの抗体はモノクローナル抗体可変領域全体（例えばライトチェーン領域或いは重鎖領域）を含めることができます。例えば、抗体ライブラリの抗体は知られているモノクローナル抗体を含めることができます。当抗体は叙述のように、生殖セグメントの派生によってライトチェーン可変領域或いは重鎖可変領域とつながります。上記のテーブル９のように、これは典型的な抗体ライブラリです。
当抗体ライブラリ内の一つ或いは複数の抗体は既知の任意のモノクローナル抗体のライトチェーン可変領域或いは重鎖可変領域を有します。【０４１８】  ここで述べている抗体ライブラリは上記の例の一つ、一部或いは全部を代表する抗体を含みます。ここで述べている抗体ライブラリでは、単一のＶＬチェーン或いはＶＨチェーン或いはその一部は当抗体ライブラリの異なる抗体のＶＬチェーンとＶＨチェーンと同じである可能性があります。これはＶＨチェーンとＶＬチェーンの組み合わせです。この組み合わせは抗体ライブラリの抗体がそれぞれ異なる原因です。例えば、各遺伝子座に対応された抗体。したがって、ライブラリは共通のＶＨチェーン、及び異なるＶＬチェーンを含めることができます。そのため、できたライブラリ内の抗体はそれぞれＶＨチェーンとＶＬチェーンのコンビネーションを含みます。【０４１９】  ここで述べている抗体ライブラリは配列番号がいずれか４５４−８０５（ＶＨチェーンをエンコードするもの）である核酸にエンコードされる重鎖、及び配列番号がいずれか８０６−８１５，８１７，８１９−８３４，及び８３６−８６７（ＶＬチェーンをエンコードするもの）である核酸分子にエンコードされるライトチェーン、或いは制限部位の３’及び５’の末端に異種配列なしの配列、及びサブライブラリを含みます。当抗体ライブラリは配列番号がいずれか２０７０−２７５９（ＶＨチェーンをエンコードするもの）である核酸にエンコードされる重鎖、及び配列番号がいずれか８０６−８１５，８１７，８１９−８３４，及び８３６−８６７（ＶＬチェーンをエンコードするもの）である核酸分子にエンコードされるライトチェーン、或いは制限部位の３’及び５’の末端に異種配列なしの配列、及びサブライブラリも含めることもできます。上記の再組換えの任意のＶＨチェーン或いはＶＬチェーンの組み含わせによって、抗体ライブラリを生成できます。当抗体ライブラリのコンビネーション、規模、種類（例えば抗原結合の断片、フルレングス抗体など）も変更される可能性があります。【０４２０】  テーブル１７は核酸分子の配列をエンコードするＶＨチェーン及びＶＬチェーンを含める抗体ライブラリを表示します。また、典型的な抗体ライブラリはテーブル１７が表示するサブライブラリを含みます。そのサブライブラリにはテーブル２２が表示する核酸配列をエンコードするＶＨチェーンとＶＬチェーンが含まれます。例えば、配列番号のいずれかが１４７５−１８２６を表示するＶＨチェーンは配列番号のいずれかが１８２７−１８３８，１８４０−１８５５，１８５７−１８８８を表示するＶＬチェーンと、ペアになります。このようにできた抗体ライブラリは、例９のようにＣＨを表示する場合、抗原結合断片のライブラリです。ＶＨチェーンとＶＬチェーンのコンビネーションによって、できた抗体ライブラリは概ね２．１．０ｘ１０５或いはさらに多い抗体、或いはサブライブラリがあります。生殖セグメントにエンエンコードされる一つの抗体は、一つのナイーブ抗体を代表します。【０４２１】  ここで述べている典型的な抗体ライブラリは上記のテーブル１７のように、核酸分子の配列にエンエンコードされるＶＨチェーンとＶＬチェーンを含みます���【０４２２】５  アドレス指定可能なフォーマット
これらの抗体ライブラリは対応ライブラリを含みます。その対応ライブラリはそれぞれ唯一のアドレスを有し、当ライブラリの他の遺伝子座と比べると、他のアドレスを通じて識別される異なる抗体を含みます。例えば、ある遺伝子座での抗体は改めてその唯一をコピーすること、或いは、唯一のマークから認識されます。対応ライブラリは核酸ライブラリの一種であり、遺伝子座ごとに一つの核酸分子を有します。その分子はその他のすべての遺伝子座の核酸分子と異なります。遺伝子座は一つの抗体ライブラリがあります。遺伝子座ごとには一つの抗体或いはその他と異なる抗体の一部、或いは、抗体ライブラリ内のその他の遺伝子座と異なる抗体を含みます。【０４２３】  当抗体ライブラリはアドレス指定可能な機能を表示できます。アドレス指定は表面、或いは物理的な奇跡などの影響を受け、或いは、その他の方式及び／或いは並べ替え可能なマーク、例えばバーコード付のラベル或いはその他のラベル、化学品タグ、電子、ＲＦタグ、カラーコード或いはその他の類似な標識。さまざまなアドレス指定機能が精通されています。これらの模範は、一つのアレーとされます。当ライブラリ内の抗体或いは固定或いは付属の陳列を通して、ソリューションを提供することができます。【０４２４】  任意の核酸分子或いは抗体は重複或いはマルチウェルプレートのような配列をランダムに提供できます。また、抗体ライブラリは空間アレーで現れます。そのため、すべての核酸分子或いは抗体は異なる区域に設けられた、その他のいかなる抗体或いは核酸分子の区域と重複することになりません。当抗体はアドレス指定の機能は既知の抗体に読み取れられます。【０４２５】ａ．マルチウェルプレート
核酸分子或いは抗体はマルチウェルプレートにおいて空間的な配列を行います。このため、軌跡プレートあたりに一つの抗体を対応します。マルチウェルプレートは１２、２４、４８、９６、３８４、及び１４３６マルチウェルプレートを含みますが、しかし、これらに限りません。こんなインスタントでは、マルチウェルプレートでの抗体のＩＤは既知です。当抗体はソリューションを解決する、或いは、ソリューションの解決に役立っています。例えば、当技術の長所の一つは抗体がソリューションの解決を提出するので、当ソリューションは完全に折りたたむとともに、機能化させます。タンパク質は濾過器、ベーンの表面、あるいはベーンに置かれる場合に、その活性の損失が消えたことが認知します。また、抗体である場合、当抗体は任意の目標活動をスクリーニングできます。
抗体はバイディング、細胞の毒性、分化或いは細胞の増殖、遺伝子表示の変化を含めます。しかしながら、これらを限定しません。すべての抗体のＩＤが既知であるので、構造活性相関（ＳＡＲ）の情報はすぐ利用されます。最後、スクリーニングを行う、或いは、「インパクト」を認識または導いて合成する過程に、薬物動態及び／用量反応実験を行います。
ほかの例では、核酸分子と抗体はマルチウェルプレートに空間的に配列できます。このため、すべての奇跡プレートは抗体対を対応します。こんなインスタントで、任意の特定のマルチウェルプレートにある抗体対のＩＤは既知です。抗体対は２，３，４，５，６，７，８，９，１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１０あるいはさらに多い抗体、或いはさらに多い核酸分子を含めることができます。例えば、抗体或いは核酸分子はランダム或いはニーズに応えて分けられます。例えば、同じＶファミリは同じ長さのＣＤＲ３のアルミ酸、長さ、或いはその他のすべての生化学属性を有します。抗体である場合、対処した抗体対は目標活動によって、スクリーニングできます。バイディング、細胞の毒性、分化或いは細胞の増殖、遺伝子表示の変化を含めますが、これらを限定しません。抗体ライブラリのスクリーニングにおいて、指定の時間内に、もっと多い抗体をスクリーニングできます。そのため、大部分の抗体の多様性をカバーしてしまいます。また、「インパクト」認識或いはコンビネーション引導を行います。コンビネーション内のすべての抗体のＩＤは既知であるので、現有の抗体は単一、個体の抗体はすぐコンビネーション内に認識され、その「活性」を確認できます。【０４２６】ｉｉ．ソリッドサポート
核酸と抗体アレーは硬い支持体に固定されたそれらの抗体を含みます。例えばベーンに固定された抗体。例えば、付属物或いは硬い支持体に固定された（この限りでなく）濾過機、ベーン表面或いはセルロースの捺印及び親和性タグベーンの使用。いくつかの例では、変異細胞の表現ペブチドは自然にビーズを吸着することができます。これらのビーズあたりに一つのシングル細胞を有します（フリーマンｅｔａｌ．生物工学。Ｂｉｏｅｎｇ（２００４）８６：１９６−２００）。固定ガラスの支持によると、シングル細胞のクローンを培養できます。色または蛍光気質でスクリーニングすることができます。米国特権番号６３７２４８３，６３５２８４２，６３４６４１６及び６２４２２６６を参照ください。【０４２７】  例えば、抗体ライブラリ内の抗体はベーンに固定されると仮定します。ベーンモールドＢＩＡｃｏｒｅ用のベーンを含めます。タンパク質は目標分子を指定する能力を確定します。例えば、リアルタイムな生体分子の相互作用の分析（ＢＩＡ）技術の使用。
Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．及びＵｒｂａｎｉｃｚｋｙは（１９９１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５  ａｎｄ  Ｓｚａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．結構と訳されます。生物学。５：６９９−７０５。Ｂｉａｃｏｒｅはタンパク質の相互作用及び親和力を測る方法です。当技術は光学現象のプラズモン共鳴（ＳＰＲ）の表面によって、リアルタイムに標識なしのタンパク質の相互作用を監視できます。（Ｗｅｌｆｏｒｄ  Ｋ．１９９１，Ｏｐｔ．Ｑｕａｎｔ．Ｅｌｅｃｔ．２３：１；Ｍｏｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｍｙｓｚｋａ，１９９８，酵素方法２９５：２６８）。性能比生物センサーは生物分子の相互作用をリアルタイムに観測する用であり、両方の親和力と動力学によって、集中、スクリーニング及び認識の積極性を確定します。
ＢＩＡｃｏｒｅ分析は結合速度定数、解離速度定数、親和定数を便利に得られます。【０４２８】  方法論は、共有カルボキシメチルデキストランの薄層を接続されている長いヒドロキシアルキルチオールの単分子膜で覆われて金膜を有するガラス基板で構成されるセンサーチップの表面に配位子の固定に依存しています。固定手順において、センサーチップと同時に操作し、性能比によって、継続的に観測を行います。未知のサンプルまたはライゲーション溶液を固定されたリガンドで利用して装置に導入されています。リガンドとライゲーションとの間の相互作用は、表面プラズモン共鳴技術とＢｉａｌｏｇｕｅ［ファルマシア］などのプログラムを介してコンピュータに記録された測定によって直接観察されます。【０４２９】６．その他の表示方法
他の表示方法他の非アドレス可能な形式にライブラリも提供できます。そのようなもので模範的他の非アドレス可能な形式が表示で、特に、いずれもスクリーンするのを容易にする活動か活動のためのライブラリのメンバーの書式を含みます。一般に、抗体ライブラリーにそのような形式を使用しますが、望んでいるなら、また、核酸かベクトルライブラリに提供できます。ライブラリ（表現型）とそれらをコード化する遺伝情報（遺伝子型）の個別分子の間の物理的なリンクがあるように、通常、ライブラリは、ディスプレー技術を使用することでスクリーンされます。これらの方法は、セル表示、ファージ提示法、ｍＲＮＡ表示、リボゾーム表示、およびＤＮＡが表示するということを包含しますが、制限されない。【０４３０】ａ．セル表示
バクテリアＥ．ｃｏｌｉ、イーストＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、および哺乳類細胞を含むセルの表面に細胞表面で急送されるタンパク質でそれらを溶断することによって選別のための抗体ライブラリーを表すことができます。セル表示は、目標抗原の固定が不要である抗体ライブラリーをスクリーンするのに使用される技術です。代わりに、希望の抗体を特定するのに、蛍光活性化細胞分類などのテクニック（ＦＡＣＳ）を使用できます。レーザー光線を通り抜けるとき、ＦＡＣＳは彼らの光散乱の特性に基づいてセルの分集団の分離を可能にします。米国が公開した特許出願番号の例を参照してください。Ｅ．ｃｏｌｉ外部の表面で以前に細菌表面に異種タンパク質を向けるために見せられたタンパク質にそれらを溶断することによって、単一のチェーン抗体を表現できます。
（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９０：１０４４４−１０４４８）．イースト菌の表面に単一のチェーンとＦａｂ抗体を表示できます、そして、形質転換細胞のライブラリを発生させるのにイーストの相同組換えを利用できます。ｅ３６）．（ｓｅｅｅ．ｇ．Ｋｉｅｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．，１０：１３０３−１３１０；Ｗｅａｖｅｒ−Ｆｅｌｄｈａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，５６４：２４−３４；ａｎｄ  Ｓｗｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３２：ｅ３６）．哺乳類細胞表示は、免疫グロブリンと同様にｓｃＦｖライブラリをスクリーンるのに利用されました。（Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：０７−６１７）．【０４３１】ｂ．ファージ提示法
ファージ提示法は選別抗体ライブラリーへの特定の抗原に付く彼らの能力に関する広く使用された方法です。ファージ提示法はタンパク質かペプチドが融合としてファージの表面で個別にコートタンパク質に急送されるセルベースの方法です；同じファージ粒子がファージのタンパク質かペプチドをコード化するＤＮＡを運ぶ間（スミスＧ．Ｐ．（１９８５）科学２２８：１３１５−１３１７）．ファージ選択は、タンパク質かペプチドためのＤＮＡが回復されて、伝播されるか、または表現されるために特定のファージが隔離されて、クローンを作られるのを可能にして、タンパク質かペプチドの認識にかかわる特定の結合反応とを通して達成されます。ファージ提示法の使用は増幅と伝播のためのＥ．ｃｏｌｉへの依頼ので急速であって、軽快です。典型的な使用法は、固定された抗原に対してファージライブラリーを撮影することを伴います。【０４３２】ｃ．ｍＲＮＡ表示とリボゾーム表示
ｍＲＮＡ表示とリボゾーム表示の使用は抗体ライブラリーの完全に生体外の建設を許可します。ｍＲＮＡ表示は新生タンパク質がプロマイシンリンクを通してｍＲＮＡに電子対を共有して付くことが引き起こされる、タンパク質かペプチドを表示する方法です（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．６４：１２２９７−１２３０２）．プロマイシンは、ａｍｉｎａｃｙｌ  ｔＲＮＡの物真似として機能して、リボゾームＡサイトに入ります、そして、新生タンパク質はリボゾームのペプチジルトランスフェラーゼ活動でそれに電子対を共有して制限されています。選択がリボゾームの解離の後にこれらのタンパク質−ｍＲＮＡ融合に行われます。あるいはまた、リボゾーム表示はリボゾームの表面に初期のフォームにタンパク質かペプチドを表示する方法です、コード化するｍＲＮＡのある安定の複合体が形成されるように；複合体がタンパク質かペプチドのために配位子と共に選択されて、遺伝情報が孤立しているｍＲＮＡの逆転写によって得られる（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．ＵＳ  ５，６４３，７６８  ａｎｄ  ＵＳ  ５，６５８，７５４をみてください）．選択のテクニックは固定された抗原に対してリボゾーム表示ライブラリが撮影されるファージ提示法のものと同様です。【０４３３】ｄ．ＤＮＡ表示
ＤＮＡ表示では、ペプチドをコード化するＤＮＡは、ペプチドにリンクされます。非共有原子価のＤＮＡ表示では、それ自身のテンプレートのＤＮＡと統合された複製配列の起源と同様にバクテリアのＲｅｐＡタンパク質の認識でＤＮＡタンパク質リンケージを促進します（Ｏｄｅｇｒｉｐ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：２８０６−２８１０）．あるいはまた、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用を利用できます。．共有原子価のＤＮＡ表示では、抗体フラグメントに遺伝学的に溶かされたバクテリオファージＰ２タンパク質は、それ自身のＤＮＡ配列に固まります（Ｒｅｉｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎｕｃｌ．酸Ｒｅｓ。３３：ｅ１０）．あるいはまた、ＤＮＡとペプチドを分類できます、水中油型乳剤などのように。選択のテクニックは固定された抗原に対してリボゾｕ１２５４０ーム表ｕ３１０３４示ライブラリが撮影されるファージ提示法のものと同様です。例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＷＯ９８／０３７１８６．Ｆ．を参考してください。抗体の生成の方法【０４３４】当業者に知られているどんな方法でもここに提供されたライブラリの核酸分子と抗体メンバーを作ることができます。そのような手順は、日常的であり、技能職人にとって、よく知られています。
彼らは遺伝子合成、ＰＣＲ、血管結紮、クローニング、移入、および浄化のテクニックを含む通常の分子生物学のテクニックを含んでいます。そのような手順の記述を以下に提供します。【０４３５】例えば、上でここに議論するように、遺伝子合成手法を使用することで核酸配列を構成できます。ヌワレオチドの効果挿入、削除、添加または交換に遺伝子合成か通常の分子生物学のテクニックも使用できます。例えば、付加的ヌクレオチド系列を核酸配列に接合できます。１つの例ので、リンカー配列加えることができます、合成の遺伝子のベクトルにクローンを作る目的のための制限酵素サイトを含む系列などのように、例えば、抗体定常領域コード化ＤＮＡ配列の増幅のために設計されたタンパク質の発現ベクトルまたはベクトル。その上、作動的に機能的なＤＮＡ要素を指定する付加的ヌクレオチド系列は核酸分子をコード化する再結合している生殖細胞にリンクできます。そのような系列の例は、タンパク質分泌を容易にするように設計したプロモーター系列、および細胞内タンパク質の発現を容易にするのを設計したリーダー・ペプチド系列を包含しますが、有限であることではありません。また、タンパク質結合領域を指定する系列などの付加的ヌクレオチド系列を核酸配列にリンクできます。そのような領域はが特定の標的細胞の中へ再結合させた抗体かそれの断片を理解力容易にするか、またはそうでなければ、合成の遺伝子の薬物動力学を機能アップする系列を包含しますが、制限されない。【０４３６】変異体抗体を発生させるように変異誘発などのようにここに説明されるように、さらに核酸配列を設計できます。遺伝子合成で変異誘発は完全に作用できます。例えば、統合が変異体抗体をコード化するように、核酸分子は手動かシリコで設計される場合があります。遺伝子合成法を使用するメリットは変異が作用できるということであるので、得られた核酸分子は上でここに議論するように組み立てになるか「生産的」です。統合の他の方法は遺伝子合成の間に無作為化を達成できるところに存在しています。例えば、オリゴヌクレオチドのどの統合が非ネイティブのｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓで「ドーピングされるか」によってプロトコルは開発されました、ランダム変異導入法のために狙う遺伝子部のシリコセクションのランダム化をもたらして（ワングとフーバー（１９９７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９：５８１２−９）．この方法はランダム置換率を保有している間、位置の選択のコントロールを許します。あるいはまた、他の分子生物学のテクニックで変異誘発は作用できます。一般に、部位特異的変異処理戦略は使うことができます。【０４３７】テンプレート核酸分子か分子から変異体抗体ライブラリーを創設するのに他の現行手法を使用できます、ナイーブ抗体をコードする生殖細胞系列再結合させた核酸分子ように。そのような方法が、変異性ポリメラーゼ連鎖反応を含んでいますが制限されない（コールドウェルとジョイス（１９９２）；グラムｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８９：３５７６−８０）。その内の特定の領域を最適化するカセット突然変異誘発は、総合的突然変異誘発オリゴヌクレオチドと置き換えられます。���Ｓｔｅｍｍｅｒ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．１３：２１４−２０）；Ａｒｋｉｎ  ａｎｄ  Ｙｏｕｖａｎ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８９：７８１１−７８１５；Ｏｌｉｐｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ。（１９８６）Ｇｅｎｅ，４４：１７７−８３；Ｈｅｒｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，８７：６９６−７００）；突然変異頻度を追加するためのホスト細胞のミューテータ緊張の使用（Ｇｒｅｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７：１８９−９５）；ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ（Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ，３９１：２８８−２９１；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，１７７，２６３；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，９６５，４０８；Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７：１２０５−１２０９）；そして、他のランダム変異導入法方法。【０４３８】１．ベクトル
ここに提供しているのは、再結合している抗体をコード化する核酸を含むベクトルかそれの部分です。抗体ポリペプチドをコード化する核酸は、原核生物のか真核セルの中への変化の前に通常中間的ベクトルにクローンされます。ベクトルのこの選択は希望のアプリケーション次第であることができます。例えば、核酸の挿入の後に、ベクトルは、例えば、レプリケーション、そして／または、それの表現のための再結合している抗体の遺伝子を拡張するために宿主細胞を変えるのに通常使用されます。
そのような例では、高い平らな表現に適したベクトルは使用されています。他の場合では、細胞表面における表現されたポリペプチドの表示と互換性があるベクトルは選ばれています。【０４３９】再結合している抗体かそれの部分の式のために、多くの発現ベクターが利用できるか、そして、当業者に知られてます。ホスト発現系の選択で発現ベクターの選択は影響を及ぼされます。熟練した職人の技能のレベルのかなり中にそのような選択はあります。
一般的には、発現ベクターは、転写プロモーターおよび必要に応じエンハンサー、翻訳シグナル、転写および翻訳終止シグナルを含めることができます。安定な形質転換に便用される発現ベクターは、形質転換細胞の選択と維持を許す選択可能なマーカーを持ってます。いくつかのケースでは、レプリケーションの起源は、細胞内のベクトルのコピー数を増幅するために使用することができます。一般に、ベクトルも連結核酸分子（例えば、彼のタグ、フラグタグ）に手術可能にリンクされた付加的ヌクレオチド系列を含むことができます。一般に、目的のために、ここに、ベクトルは定常領域をコード化する系列を含んでいます。
したがって、タンパク質融合として再結合している抗体かそれの部分も表現できます。例えば、溶融は、ポリペプチドに追加機能性を加えるために発生できます。例えば融合タンパク質は、タンパク質分泌、そして／または、膜結合性を指示するための信号の系列の融合と、ローカライズ、例えば、ｈｉｓ６タグ、ｍｙｃタグ、または浄化のためのタグ、例えば、ＧＳＴ溶融、およびタンパク質分泌、そして／または、膜結合性を指示するための系列を包含しますが、制限されない。【０４４０】例えば、当技術分野で知られているどんなプロモーター／エンハンサもタンパク質の表現を制御できます。適当なバクテリアのプロモーターは、当技術分野でよく知られて、以下でここに説明されます。哺乳類細胞、イースト菌、および昆虫細胞のための他の適当なプロモーターは芸術でよく知られて、そして、或るものは以下で例示されます。異種核酸の表現を指示するのに使用されるプロモーターの選択は特定用途によります。使用できるプロモーターは’ＳＶ４０早期プロモーター含む真核細胞発現ベクター（３０４−３１０  Ｂｅｒｎｏｉｓｔとシャンボン、ネイチャー２９０：（１９８１））、ラウス肉腫ウイルスの３の’長い末端反復に含まれたプロモーターを含んでいますが、制限されません。（山本  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−７９７（１９８０））、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１４４１−１４４５（１９８１））、メタロチオネイン遺伝子（（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２（１９８２））；・−ラクタマーゼプロモーターのような原核生物発現ベクター（Ｊａｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：５５４３）またはＴＡＣプロモーターは、（（ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１−２５（１９８３））；また、”組換え細菌の有用なタンパク質”を参照してください：サイエンティフィックアメリカン２４２：７９−９４（１９８０））で、ノパリン合成プロモーターを含む植物発現ベクター（Ｈｅｒｒａｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａｅｔ  ａｌ、自然３０３：２０９−２１３（１９８４））またはカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ  ＲＮＡプロモータ−（Ｇａｒｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ。９：２８７１（１９８１））、および光合成酵素リブロース二リン酸カルボキシラーゼのプロモーター）（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：１１５−１２０（１９８４）；酵母ＧＡＬ４のプロモーターのような他の真菌のプロモーター要素、アルコール脱水素酵素のプロモーター、ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒｏｌキナーゼプロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、そして、組織特異性を示す、遺伝形質転換動物で使用されました以下の動物転写支配領域：膵臓腺房細胞でアクティブになっているエラスターゼＩ遺伝子の制御領域（スウィフトら、Ｃｅｌｌ３８：６３９−６４６（１９８４）；。Ｏｒｎｉｔｚｅｔ  ａｌ、コールドスプリングハーバーシンポジウムクアント生��５０：３９９−４０９（１９８６）；マクドナルド、消化７：４２５−５１５（１９８７））；膵β細胞（ハナハンら、Ｎａｔｕｒｅ３１５：１１５−１２２（１９８５）リンパ球系細胞でアクティブになっている）、奐疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、セル３８：６４７でアクティブになっているインスリン遺伝子制御領域−６５８（１９８４）；アダムスｅｔ  ａｌ、自然３１８：５３３−５３８（１９８５）；アレキサンダーら、モル。．細胞生物７：１４３６−１４４４（１９８７））精巣がん、乳がん、リンパ球とマスト細胞でアクティブになっているマウス乳腺腫瘍ウイルスの制御領域、（レダー  ｅｔ  ａｌ、細胞４５：４８５−４９５（１９８６））、肝臓でアクティブになっているアルブミン遺伝子制御領域、（Ｐｉｎｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ，遺伝子および開発  １：２６８−２７６（１９８７））肝臓でアクティブになっているα−フェトプロテインの遺伝子の制御領域、（Ｋｒｕｍｌａｕｆｅｔ  ａｌ、分子細胞生物５：１６３９−１６４８（１９８５年）；ハンマーｅｔ  ａｌ、科学２３５：５３−５８  １９８７））、肝臓でアクティブになっているα−１アンチトリプシン遺伝子の制御領域（Ｋｅｌｓｅｙさんｅｔ  ａｌ、遺伝子および開発。１：１６１−１７１（１９８７））骨髄細胞でアクティブになっているβグロビン遺伝子の制御領域（Ｍａｇｒａｍｅｔ  ａｌ、自然３１５：３３８−３４０（１９８５）；コリアスｅｔ  ａｌ、Ｃｅｌｌ４６：８９−９４（１９８６。））、脳のオリゴデンドロサイト細胞でアクティブになっているミエリン塩基性タンパク質遺伝子の制御領域（リードヘッドら、細胞４８：７０３−７１２（１９８７））、骨格筋でアクティブになっているミオシン軽鎖−２遺伝子の制御領域（Ｓｈａｎｉ、自然３１４：２８３−２８６（１９８５））、および視床下部のｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｓでアクティブになっている性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子の制御領域（メイソンら、科学２３４：１３７２−１３７８（１９８６））。【０４４１】プロモーターに加えて、発現ベクターは、通常、宿主細胞内では、抗体がその一部の発現のために必要なすべての追加要素が含む転写単位または発現カセットを含まれています。典型的な発現カセットは生殖細胞系列抗体チェーンをコード化する核酸配列に手術可能にリンクされたプロモーターを含みます、そして、信号が転写、リボゾーム結合部位、および翻訳終結の効率的なポリアデニル化に必要です。カセットの追加要素はエンハンサを含むことができます。また、カセットは、通常、転写終結領域を効率的に終端を提供するために構造遺伝子の下流に含まれています。終端領域をプロモーター配列と同じ遺伝子から得ることができるか、または異なった遺伝子から得ることができます。【０４４２】いくつかの発現系には、チミジンキナーゼやジヒドロ葉酸還元酵素などの遺伝子増幅を提供するマーカーがあります。あるいはまた、また、遺伝子増幅にかかわらない高い利回り発現系も適当です、昆虫細胞の中でバキュロ・ウイルスベクトルを使用するのなどように、核酸配列が多面体プロモーターか他の強いバキュロ・ウイルスプロモーターの指示に基づき生殖細胞系列抗体チェーンをコード化していて。【０４４３】目的のために、がここに提供したベクトルは、抗体の再結合している可変部をコード化する核酸配列に操作可能にリンクされた抗体の定常領域をコード化するヌクレオチド配列を含んでいます。ベクトルはＣＨ１かＣＨ２かＣＨ３かＣＨ４、そして／または、ＣＬの１かすべてのための系列を含むことができます。一般にＦａｂｓの表現などのようなベクトルはＣＨ１かＣＬのための系列を含んでいます。そのようなベクトルが重鎖定常領域の遺伝子（例えば、ＣＨ１）を含むのにおいて模範的であるのは、ここに説明された、核外遺伝子ＡとＤでナ。そのようなベクトルが軽いチェーン定常領域の遺伝子を含むのにおいて模範的であるのは、ここに説明された、核外遺伝子ＣとＥです。【０４４４】模範的発現ベクターは例えば、ｐＣＭＶなどのどんな哺乳類発現ベクトルも含んでいます。細菌発現のために、そのようなベクトルはＭＢＰや、ＧＳＴやＬａｃＺなどのｐＢＲ３２２、ｐＵＣ、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄ、および溶融ベクトルを含んでいます。そのようなベクトルが模範的であるのは、例、核外遺伝子Ａ、核外遺伝子Ｃ、核外遺伝子Ｄ、および核外遺伝子Ｅのためにここに説明されるように、細菌発現ベクトルです。例えば真核細胞発現ベクターとして真核生物ウイルスからの調節要素を含むいくらの他の真核ベクトルは、使用できます。これらは、例えば、ＳＶ４０ベクトル、乳頭腫ウイルスベクトル、およびがエプスタイン−バーウイルスに由来したベクトルを包含します。他の模範的真核ベクトルがｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９Ａ＋、ｐＭＴ０１０Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロ・ウイルスｐＤＳＣＥ、そして、真核生物に有効表現するＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０早期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、金属結合性蛋白質プロモーター、ネズミ科の乳房の腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、多面体プロモーター、または見せられた他のプロモーターの指示に基づき、タンパク質の表現を許容するいかなるの他のベクトルを含んでいます。【０４４５】Ｅ．ｃｏｌｉセルの変換のための模範的核外遺伝子ベクトルは、例えばここに説明されたＣｏｌＥ１模写ベクトルを含みます。これらのすべてのベクトルに共通のいくつかの特徴が（ａ）ｐＢＡＤ誘導プロモータ。（ｂ）ＡｒａＣの遺伝子（それは、ｐＢＡＤプロモーターをコントロールします）。（ｃ）効率的な翻訳のための合成のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）。（ｄ）高いコピー表現を許容する模写のＣｏｌＥ１の起源。（ｅ）表現されたタンパク質がペリプラズムに転位されるのを許容するＳＴＩＩリーダー・シーケンス。（ｆ）模写のｆ１の起源。（ｇ）そして、抗生物質耐性を与えるための遺伝子。そのような核外遺伝子は核外遺伝子Ａ（図３）、核外遺伝子Ｃ（図５）、核外遺伝子Ｄ（図４）、および核外遺伝子Ｅ（図６）を含んでいます。重鎖可変部のための挿入遺伝子に操作可能にリンクされた重鎖定常領域（ＣＨ１）のための遺伝子を含んでいて、核外遺伝子ＡとプラスミドＤは重鎖抗体の遺伝子の表現に利用されます。ベクトルはＮｈｅＩとここに説明された再結合している抗体の遺伝子のクローニングのために許容するＮｃｏＩ制限サイトを含んでいます。両方のベクトルはレプリケーションのｐＵＣの起源、レプリケーションのＣｏｌＥ１タイプの起源、およびアミノグルコシドのホスホトランスフェラーゼ遺伝子の協議しているカナマイシン耐性を含んでいます。プラスミドＡは、（彼の）６タグタンパク質精製用にフラグを設定するタグが含まれています。プラスミドＤは（彼）の６ＴａｇとＦｌａｇ  Ｔａｇの両方とｓｏｒｔａｓｅを使用することで得られたタンパク質の共有結合を許容する追加ＬＰＥＴＧタグを含んでいます。軽いチェーン可変部のための挿入遺伝子に操作可能にリンクされた軽いチェーン定常領域（ＣＬ）のための遺伝子を含んでいて、核外遺伝子ＣとプラスミドＥは中で軽いチェーン抗体の遺伝子の表現に利用されます。プラスミドＣは、カッパの軽いチェーンに特定であり、とここに説明された再結合している抗体の遺伝子のクローニング許容するためにＮｃｏＩ制限サイトとＢｓｅＷＩを含んでいます。
プラスミドＥは、カッパの軽いチェーンに特定であり、とここに説明された再結合している抗体の遺伝子のクローニング許容するためにＮｃｏＩ制限サイトとＡｃｒＩＩ  Ｉを含んでいます。両方のベクトルはレプリケーションの３．３の起源、レプリケーションのＣｏｌＥ１タイプの起源、および遺伝子の協議しているクロラムフェニコール耐性を含んでいます。上で説明されたベクトルは、軽いチェーンベクトルに重いチェーンベクトルに共同変成するデュアルなベクター系で利用されるように設計されています。したがって、それらは二つ異なってコンパチブル、利用したレプリケーションのＣｏｌＥ１の起源をを含んでいます、重いチェーンと軽いチェーンのためにの２、１。ベクトルが共同変えられて、表されるとき、これは、抗体の両方のチェーンの効率的な発現を許容します。【０４４６】抗体チェーンをコード化する核酸を含む発現ベクターを構成するのに芸術における技能がベクトルへのＤＮＡ断片の挿入でそれらに知られているどんな方法も使用できます。これらの方法は生体外の組み換えＤＮＡ、合成的技法、および生体内の組換え型（遺伝的組換え）を含むことができます。例えば、補足的な粘着末端を持っているクローニングベクトルにＤＮＡ断片を結紮することによって、クローニングベクトルへの挿入を実行できます。【０４４７】ＤＮＡ断片に使用する相補的な制限部位は、クローニングベクター内に存在しない場合は、ＤＮＡ分子の両端が酵素変更することができます。あるいはまた、ヌクレオチド系列（リンカ）をＤＮＡ末端に結紮することによって、望まれていたどんなサイトも製作できます。これらの結紮リンカは制限酵素認識配列をコード化する特定の化学的に統合された核酸を含むことができます。【０４４８】２．セルと発現系
ベクトルを含むセルも供給します。一般に異種のＤＮＡを表現するために設計できて、分泌経路を持っているどんな細胞種類も、適当です。表現ホストは細菌性細胞（例えば、大腸菌）や、イースト菌や、真菌細胞や、古細菌や、植物細胞や、昆虫細胞やヒト細胞を含む動物細胞などの原核生物のと真核有機体を含みます。表現ホストは表現されたタンパク質に存在している翻訳後修飾のタイプとしてまた、彼らのタンパク質産生レベルにおいて異なることができます。さらに、表現ホストの選択は、ベクトル、転写、および使用した翻訳要素の選択にしばしば関連します。例えば、表現ホストの選択はしばしば、しかし、いつもでない系列が利用した先駆の選択に依存しています。例えば、同じ種の宿主細胞の中に多くの異種のシグナル配列を表すことができるだけです（すなわち、昆虫細胞シグナル配列は昆虫細胞の中に最適に表されます）。対照的に、他のシグナル配列は、次のような異種のホストで使用することができます、例えば、酵母、昆虫、または哺乳動物宿主細胞とした組織プラスミノーゲン活性化因子プリ／プロのシーケンスだけで動作するヒト血清アルブミン（ｈＨＳＡ）シグナル配列昆虫および哺乳動物細胞内で機能することが実証され（Ｔａｎｅｔ  ａ（２００２）タンパク質工学。１５：３３７）。これらと他の要素に基づいて表現ホストの選択をすることができます、浄化のための規定と安全問題や、生産費や、必要性や方法などのように；したがって、ベクター系は使用される宿主細胞と互換性があるに違いありません。【０４４９】真核生物宿主での発現は、酵母とピキア酵母、ショウジョウバエの細胞と鱗翅目細胞、植物、タバコ、トウモロコシ、コメ、藻類などの植物細胞などの昆虫細胞、ウキクサなどの酵母の式を含めることができます。真核生物の細胞はまた、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞やベビーハムスター腎臓（牌）細胞などの哺乳動物細胞株が含まれています。また、例えば、血清、ミルク、および卵にの生産を含んでいて、真核生物発現ホストは遺伝形質転換動物での生産を含みます。【０４５０】遺伝子系列の多くのコピーが発生するように、例えば、変化、移入、感染、電気穿孔法、および微小気泡を通して組み換え分子を宿主細胞に挿入できます。一般に、標準の移入方法は、バクテリアの、そして、哺乳類のイースト、または大量の抗体チェーンを急送する昆虫細胞株を作り出すのに使用されます、次に標準的方法を使用することで浄化されるもの。（例えば、Ｃｏｌｌ（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ参照してください。．，２６４：１７６１９−１７６２２；酵素学の方法でタンパク質精製ガイド、Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８２（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，ｅｄ．），１９９０）。真核および原核細胞の形質転換は標準的な手法に応じて実行されます（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９７７）Ｊ．Ｂａｃｔ．１３２：３４９−３５１；参照してください。；Ｃｌａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓ  ａｎｄ  Ｃｕｒｔｉｓｓ（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１０１，３４７−３６２）。例えば、外国ヌクレオチド系列を宿主細胞の中に紹介するための周知の手順のどれかを用いることができます。これらはリン酸カルシウム移��、ポリブレン、原形質融合、電気穿孔法、バイオリスティクス、リポソーム、顕微注入法、プラズマベクトル、ウイルス・ベクターの使用、またいかなる他のもクローンのゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成のＤＮＡまたは他の外国産の遺伝子の資料をホストセルに紹介するための他のよく知られている方法を含んでいます。一般に、宿主細胞は、目的のための、ここに、最初のベクトルが少なくともＶＨチェーンをコード化している状態でトランスフェクトされていて少なくともＶＬチェーンをコード化する２番目のベクトルです。【０４５１】したがって、それだけで、特定の遺伝子工学的手法が正常に宿主細胞生殖細胞、またはそれらの変更されたフォームを、抗体のポリペプチド発現することができるには少なくとも、両方の遺伝子を導入することができなければ使用されている必要があります。【０４５２】分離された組換え可変領域遺伝子、ｃＤＮＡ、または合成ＤＮＡ配列を組み込む組換えＤＮＡ分子で宿主細胞の形質転換は、遺伝子の複数のコピーを生成することができます。したがって、遺伝子は形質転換体を成長させ、形質転換体から組換えＤＮＡ分子を分離し、必要な場合、単離された組換えＤＮＡから挿入された遺伝子を取得するによって大量に得ることができます。一般的に、発現ベクターを細胞に導入された後、トランスフェクトした細胞は、以下に示す標準的な精製技術を用いて培養物から回収される生殖鎖の発現を支持する条件下で培養されます。【０４５３】Ａ生体内外の方法を含むタンパク質産生で芸術で知られているどんな方法でも高処理量アプローチを使用することで抗体とそれの部分を生産できます。例えば、再結合している抗体かそれの部分を宿主細胞かホスト動物にコード化する核酸分子の導入そして、生体外に再結合している抗体をコード化する核酸分子からの表現のように。原始核細胞（特に大腸菌）は、それの多量の再結合している抗体か部分を生産するシステムを提供して、高処理量式のアプリケーションとタンパク質の浄化で特に希望しています。大腸菌の変化は当業者によく知られている簡単で急速なテクニックです。高処理量表現のための大腸菌宿主株が制限されないｃｏｌｉ、ＢＬ２１（ＥＭＤ  生命科学）、およびＬＭＧ１９４（ＡＴＣＣ）含んでいます。そのような大腸菌宿主株で模範的であるのは、ＢＬ２１です。ハイスループット発現ベクターは、ｐＢＲ３２２のとｐＵＣ系ベクターを含まれますが限定されていません。
そのような模範的ベクトルは、プラスミドＡを、表現と浄化のプラスミドＣ、プラスミドＤ、およびプラスミドＥ含む、ここに説明されたベクトルです。表現と浄化のオートメーションは高処理量式を容易にすることができます。例えば、自動収穫か溶解させるのと浄化ユニットか、他の同様のロボットシステムかまた全自動のシステムに細胞培養を合併するピッコロ・システムの使用は使うことができます。【０４５４】ａ．原核生物の表現原始核細胞（特に大腸菌）はそれの多量の再結合している抗体か部分を生産するシステムを提供します。
大腸菌の変化は当業者によく知られている簡単で急速なテクニックです。大腸菌のための発現ベクターは高いレベルのタンパク質の発現を引き起こして、何らかの毒性を宿主細胞に示すタンパク質を急送することの役に立つ誘導プロモータを含むことができます。誘導性プロモーターの例は、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ハイブリッドｔａｃプロモーター、Ｔ７およびＳＰ６のＲＮＡのプロモーターとλＰＬプロモーター調節温度が含まれています。【０４５５】大腸菌の細胞質環境で再結合している抗体かそれの部分を表現できます。細胞質は還元環境です、いくつかの分子のために、これは不溶性の封入体の形成をもたらすことができます。タンパク質を再可溶するのに、ジチオスレイトールやβメルカプトエタノールなどの還元剤と変性剤（例えば、グアニジン−ＨＣｌや尿素などの）を使用できます。模範的代替的アプローチは酸化環境と可溶性タンパクの生産につながる分子シャペロンのよう、そして、二硫化異性化元素を供給するバクテリアのペリプラズムスペースの再結合している抗体かそれの断片の表現です。通常、リーダー・シーケンスはペリプラズムにタンパク質を向ける、表現されるべきタンパク質に溶断されます。そして、リーダーはペリプラズムにおけるシグナル・ペプチダーゼによって除去されます。ＴＡＴ経路に発現したタンパク質を移すに３つの主要な経路があります、すなわちペリプラズム、すなわち秒経路、ＳＲＰの経路。ペリプラズムを狙うリーダー・シーケンスの例はペクチン酸塩リアーゼ遺伝子、ＳｔＩＩリーダー・シーケンス、およびＤｓｂＡリーダー・シーケンスからのｐｅｌＢリーダーを含んでいます。模範的リーダー・シーケンスはＤｓｂＡリーダー・シーケンスです。
いくつかの場合、ペリプラズム表現は表現されたタンパク質の漏出を培地の中に許容します。タンパク質の分泌は培養上清から迅速で簡単な浄化を許します。浸透性の病勢減退はペリプラズムから分泌されないタンパク質を入手できます。細胞表現と同様です、いくつかの場合、タンパク質が解決不能になることができて、変性剤と還元剤は、可溶化を容易にするのに使用されて、リフォールディングすることができます。誘導の温度と成長も表現レベルと溶解度に影響を及ぼすことができます。
２５℃と３７℃Ｃの間の温度は通常、使用されています。表現されたタンパク質の溶解度を増加させるのに突然変異も使用できます。通常、バクテリアはａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄタンパク質を生産します。したがって、タンパク質が機能のために糖鎖付加を必要とするなら、浄化の後に宿主細胞から糖鎖付加を生体外に加えることができます。【０４５６】ｂ．酵母
出芽酵母、分裂酵母、解脂耶氏酵母、マルシアヌスダニ、およびピキア酵母などの酵母は、組換え抗体またはその一部のための便利な表現のホストです。エピソーム複製ベクターか相同組換えによる安定した染色体の統合で酵母を変えることができます。通常、誘導プロモータは、遺伝子発現を規制するのに使用されます。そのようなプロモーターの例はＣＵＰ１などのＡＯＸ１、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７、ＧＡＬ５、および金属結合性蛋白質プロモーターを含んでいます。表現ベクターはしばしば変成しているＤＮＡの選択とメンテナンスのためのＬＥＵ２や、ＴＲＰ１や、ＨＩＳ３や、ＵＲＡ３などの選択可能なマーカーを含んでいます。
イーストで表現されたタンパク質は、しばしば可溶性です。Ｂｉｐやタンパク質ジスルフィドイソメラーゼなどの分子シャペロンがある共同表現は表現レベルと溶解度を改良できます。さらに、サッカロミセス酵母から酵母の接合型α−因子分泌シグナルなどの分泌シグナルペプチド融合とＡｇａ２ｐ嵌合接着受容体などの酵母細胞表面タンパク質またはＡｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓグルコアミラーゼとの融合を使用することで酵母で表現されたタンパク質は指示できます。Ｋｅｘ−２蛋白酵素などの蛋白酵素切断部位、分泌経路を出るとき、表現されたポリペプチドから溶断された系列を取り除くために設計できます。酵母もＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒモチーフにグリコシル化することができます。【０４５７】ｃ  昆虫
昆虫特にバキュロウイルス表現を使用して、昆虫細胞は抗体かそれの部分を表現することの役に立ちます。昆虫細胞は、
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スには、安全を改良して、真核生物発現の規定の関心を減少させる制限している宿主域があります。典型的な発現ベクターはポリヘドリンプロモーターやバキュロ・ウイルスのｐ１０プロモーターなどの高い平らな表現にプロモーターを使用します。一般的に使用されたバキュロウイルス系はタマナギンウワバ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａの核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）や、カイコガ属のｍｏｒｉの核多角体病ウイルス（ＢｍＮＰＶ）などのバキュロ・ウイルスとＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａから得られたＳｆ９やＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  Ｎｉから得られたＴＮなどの昆虫細胞株を含んでいます。高レベルの発現において、表現されるべき分子のヌクレオチド系列はすぐに、ウイルスのポリヘドリン開始コドンの下流に溶断されます。人間の抗体を表現できるバキュロ・ウイルス組換え型、ｐＡｃＵＷ５１などの二重表現転送（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を発生させるのは、利用されています。哺乳類の分泌シグナルを昆虫細胞の中で正確に処理して、培地の中に表現されたタンパク貿を分泌するのに使用できます。【０４５８】昆虫細胞の代替表現系は安定して形質転換細胞を使用することです。．Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａからのＳｆ９派生したセルなどの細胞株か、そして、表現にＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ＮｉからのＴＮの派生した細胞株は使用できます。一貫したレベルの表現を引き起こすのにバキュロ・ウイルス前初期遺伝子プロモーターＩＥ１を使用できます。典型的な発現ベクターはｐＩＥ１−３とｐＩ３１−４転送ベクトル（Ｎｏｖａｇｅｎ）を含んでいます。現ベクターはネオマイシンやハイグロマイシンなどの選択可能なマーカーの使用で通常維持されます。【０４５９】ｄ  哺乳類細胞抗体かそれの部分を表現するのに哺乳類発現システムを使用できます。アデノウィルスなどのウイルス感染かダイレクトＤＮＡ転送によるリポソームなどの哺乳類細胞、ＤＥＡＥ−デキストランと電気穿孔法や顕微注入法などの物理的な手段によるリン酸カルシウムに表現構造物を移すことができます。哺乳類細胞のための発現ベクターはｍＲＮＡキャップ部位、ＴＡＴＡボックス、翻訳開始系列（コーザックコンセンサス配列）、およびポリアデニル化要素を通常含んでいます。そのようなベクトルはしばしば多量発現のための転写プロモーターエンハンサを含んでいます、例えば、ＳＶ４０のプロモーターエンハンサ、ヒトサイトメガロ・ウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の長い末端反復など。これらのプロモーターエンハンサは多くの細胞種類でアクティブです。表現に組織と細胞種類プロモーターとエンハンサー領域も使用できます。模範的プロモーター／エンハンサー領域は、エラスターゼＩ、インスリン、免疫グロブリン、マウス乳腺腫瘍ウイルス、アルブミン、アルファフェトプロテイン、α１アンチトリプシン、βグロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖２、性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御エラスターゼなどの遺伝子からのそれらを含んでいますが制限されない。表現構造物でセルを選択して、維持するのに選択可能なマーカーを使用できます。選択可能なマーカーの遺伝子の例は、ハイグロマイシ��Ｂリン酸、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシド系リン酸、ジヒドロ葉酸還元酵素およびチミジンキナーゼを包含しますが制限されない。抗体は、ＮＥＯＲ／Ｇ４１８システム、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）システムまたはグルタミン合成酵素（ＧＳ）システムを使用することで通常生産されます。ＧＳシステムは、重鎖と軽いチェーンの両方を表現するのにｐＥＥ１２／ｐＥＥ６などの共同表現ベクターを使用します。細胞表面がＴＣＲ−ζやＦｃεＲＩ−γなどの分子に合図している溶融は細胞表面で活動的な状態のタンパク質の表現を指示できます。【０４６０】多くの細胞株がマウス、ネズミ人間、猿、鶏肉、およびハムスター細胞を含む哺乳類発現に利用可能です。模範的細胞株はＣＨＯ、Ｂａｌｂ／３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＭＴ２、マウスＮＳＯ（非分泌）、他の骨髄腫細胞株、雑種細胞、ｈｅｔｅｒｏｈｙｂｒｉｄｏｍａ細胞株、リンパ球、線維芽細胞、Ｓｐ２／０、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、２９３、２Ｂ８、およびＨＫＢセルを含んでいますが、限られていません。
細胞株もセル培地から分泌タンパク質の浄化を容易にする無血清培地に適合していた状態で利用可能です。その一例は血清の無料のＥＢＮＡ−１細胞株（ファム他、（２００３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ．Ｂｉｏｅｎｇ８４：３３２−４２）です。【０４６１】ｅ  植物ここにそれについて説明されたどんな抗体や部分などのタンパク質も表現するのにトランスジェニック植物細胞と植物を使用できます。プロトプラストにマイクロプロジェクタ衝撃とＰＥＧ−仲介転送などの直接的なＤＮＡの転送を使用するか、およびアグロバクテリウム媒介形質転換で表現構造物を植物に通常移します。表現ベクターはプロモーター、エンハンサー配列、転写終結要素、および翻訳調節要素を含むことができます。通常、発現ベクターおよび変換技術は、シロイヌナズナ、タバコなどの双子葉植物ホストとトウモロコシや米などの単子葉植物のホスト間で、分割されます。表現に使用される植物プロモーターの例はカリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ３５年代のプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、リボース二リン酸カルボキシラーゼプロモーター、およびトウモロコシユビキチン−１（ｕｂｉ−１）プロモータープロモーターを含んでいます。ハイグロマイシンや、ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｓｅ異性化元素やネオマイシンホスホトランスフェラーゼなどの選択可能なマーカーは、形質転換細胞の選択と維持を容易にするのにしばしば使用されます。形質転換植物細胞をセル、集合（組織をたこにならせる）として培養で維持するか、または全植物体に作り直すことができます。遺伝子導入植物セルも蛋白酵素か変更された蛋白酵素を生産するために設計された藻を含むことができます（例えば、メイフィールドｅｔ  ａｌ．（２００３）ＰＮＡＳ  １００：４３８−４４２）を見てください）。．植物には哺乳類細胞と異なった糖鎖付加パターンがあるので、これはこれらのホストで作り出されたタンパク質の選択に影響を及ぼすことができます。【０４６２】３．浄化抗体とそれの部分は当業者に知られているどんな手順でも浄化されます。芸術で知られている標準タンパク質浄化のテクニックを使用することで再結合している生殖細胞系列抗体をかなりの純粋さに浄化できます、ＳＤＳ−ページか粒群とサイズ排除クロマトグラフィーか、硫酸アンモニウム降水量か、はさみ状のクロマトグラフィーか、イオン交換クロマトグラフィーかカラムクロマトグラフィーを含んでいますが限なれない。例えば、カラムクロマトグラフィーで抗体を浄化できます。抗体を浄化するための模範的方法は、カラムクロマトグラフィーを使用することです、この中に、高親和性免疫グロブリンを結合するプロテインＧ、連鎖球菌から細胞表面結合蛋白質にリンクされています。６０％か７０％か８０％の純度と通常少なくとも９０％か、９１％か、９２％か、９３％か、９４％か、９５％か、９６％か、９７％か、９８％か９９％の純度に抗体を浄化できます。純度は、このようなＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー染色により標準的な方法で評価することができます。【０４６３】宿主細胞からの再結合している抗体かそれの部分の浄化のための方法は選ばれた宿主細胞と発現系によります。一般に、分泌された分子に関しては、セルを取り除いた後に、タンパク質は培地から精製されます。細胞内発現において、セルを溶解させることができました、そして、タンパク質は抽出から浄化しました。遺伝子導入植物や動物などのトランスジェニック生物が表現に使用されるとき、溶解させている細胞抽出物をするように材料を始動するとして組織か器官を使用できます。さらに、トランスジェニック動物生産がミルクか卵におけるポリペプチドの生産を含むことができます、卵を集めることができで芸術の標準方法を使用することでタンパク質を必要ならさらに、抽出して、さらに精製できます。【０４６４】抗体が多量で変成しているバクテリアによって表現されるとき、表現は構成している場合がありますが、通常プロモーター誘導の後に、ポリペプチドは不溶性凝集体を形成することができる。芸術には技能が１つに知られているポリペプチド封入体の浄化に適したいくつかのプロトコルがあります。多数の変化は当業者に明らかになるでしょう。【０４６５】例えば、一般に、１つのメソッドで、セルサスペンションは遠心分離されます，そして、封入体を含むペレットは、溶けませんが、封入体を洗うバッファで再懸濁します。例えば２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ペーハー７．２）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  Ｎａｃｌ、および２％でトリトン−Ｘ１００、非イオン性洗剤。できるだけ多量の細胞残屑を取り除くために洗濯ステップを繰り返すのが、必要である場合があります。封入体の残っているペレットは適切なバッファ（例えば、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ペーハー６．８、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で再懸濁することができます。他の適切なバッファは当業者に明らかです。【０４６６】あるいはまた、バクテリアペリプラズムから抗体を浄化できます。ポリペプチドがバクテリアのペリプラズムに輸出されるところに当業者それらに知られている他の方法に加えて、冷たい浸透圧衝撃でバクテリアのペリプラズム部分を遊離させられることができます。例えば、ペリプラズムからの孤立している組換え型のポリペプチドへの１つの方法で、細菌性細胞は、ペレットを形成するために遠心分離されます。ペレットは２０％の蔗糖を含むバッファで再懸濁します。ペレットは、セルを溶解させるために、バクテリアが遠心分離されて、氷のように冷たい５ｍＭ  ＭｇＳＯ４で再懸濁して約１０分間氷浴に保たれます。セルサスペンションは遠心分離されます、そして、表面に浮かぶのは、注いで、保存されます。宿主タンパク質と芸術における技能のものによく知られている標準の分離のテクニックで表面に浮かぶところの現在の組換え型のポリペプチドを切り離すことができます。これらのメソッドは、含まれて、次の手順、これらに限定されない：
溶解分、サイズの差動濾過、カラムクロマトグラフィー。【０４６７】Ｇ．ライブラリのアプリケーションと用途
ここに提供しているのは、目標の活動を変更するか、または調節する（増減します）抗体か抗体を特定するか、または選択するためのここに提供されたスクリーニングするための抗体ライブラリーを使用する方法です。上で議論するように、ここに提供された抗体ライブラリーは、ライブラリーに他のすべてのメンバーとそれぞれ異なったメンバー１）そして、それぞれ生産的で機能的な２）を含みます。これらの特性によって、ライブラリは、スクリーニング機能に多様かつ堅牢です。例えば、提供されたライブラリを使用して、機能か活動を望んでいて、ここに、小ライブラリー（例えば、１０００人以下のメンバーを含む）をスクリーニンして、抗体を特定するのは、可能です。これは９６０人のメンバーだけのライブラリが様々な目標に付くのにスクリーニング検定に使用された例１３で例示されます、いくつかの高の親近感（ナノモルの親近感）抗体の識別をもたらして。
選別の方法で、ここに、含みますが限られないセルの他の結合、細胞毒性、分化または増殖を含んでいる細胞移動、アポトーシス、新脈管形成、および遺伝子発現変化のためにどんな希望の活動についても検査できます。例えば、治療標的に対してアゴニストか敵対者抗体の発見のために結果として起こるライブラリをスクリーニンできます、例えば細胞増殖と分化にかかわる目標や、細胞移動や、アポトーシスやａｎｇｉｏｇｅｎｅｉｓなどのように。このような目標は、成長因子、サイトカイン、リンパ球抗原、他の細胞活性化と受容体をふくみますが限定されない。【０４６８】他の例では、あらかじめ目標に関する特定の知識を必要とせずに興味がある観察可能な生物学的過程を測定するのに“ブラインド”の機能的なスクリーンを使用することでライブラリをスクリーンできます。例えば、強い機能的活動によって、特定の目標を特定するためにさらに分析評価をスクリーンしながらそのようなもので特定されるどんなヒットも分析できます。“ブラインド”分析的なアプローチは、任意の観測生物学的結果に適用することができます。例えば、容易にＢ細胞のアポトーシスについて検査できます、そして、増加するＢ細胞アポトーシスのためのスクリーンはＢ細胞殺害を促進する抗体ヒットをもたらすことができます。そのような抗体は、ＣＤ−２０のような知られているＢ細胞表面タンパクを縛るか、または目新しい目標を縛ることができます。．別の例では、酵素結合免疫吸着検定法で、骨髄細胞などのセルの人口から特定のサイトカインの増加する（または、減少する）分泌（例えば、インターフェロン・アルファ）について検査できます、これらのタンパク質の分泌を変更する抗体のためにスクリーンするのを許容して。スクリーンされた結果を獲得するメカニズムに関する先験的などんな知識も必要ではありません、そして、効果が強いなら、後で特定の抗体目標は追求できます。また、確信している細胞種類で形態変化を引き起こす、または先祖細胞集団で細胞分化を促進しても、抗体がそれであることがわかるためにブラインドの機能分析をハイコンテントスクリーニングアプローチに合併できます。【０４６９】ここに提供された選別の方法は、ターゲットプロテイン、ペプチドまたは抗原を表現するターゲットプロテインがここに提供された抗体ライブラリー、ペプチド、抗原またはセルの各器官か単に細胞集団に接触すること、そして、ターゲットプロテインかセルの活動を調節する（増減します）抗体メンバーを特定することを含みます。例えば、ターゲットプロテインに固まる抗体を特定するためにライブラリのメンバーに接触できます。別の例では、目標の機能的活動の変調のために抗体をスクリーンできます。機能分析はアゴニストと敵対者抗体の識別を可能にします。ここに熟考されて、そのこれほどスクリーンしている分析評価が特に受容体目標や他のシグナリング分子などの膜結合タンパクに対して役に立つということです。【０４７０】スクリーンすることを許可する形式でここに提供された抗体ライブラリーは提示できます、例えば空間的なアレイを含むアドレス可能なライブラリ、そして、イースト表示、哺乳類の表示、ファージ提示法、リボゾーム表示を含むｍＲＮＡ表示、およびＤＮＡ表示を含むセル表示ライブラリとして。例えば、選別はアドレス可能な抗体ライブラリーに実行されます、例えば空間的な整列させられたライブラリのように、場所（例えば、井戸）におけるそれぞれの抗体メンバーは、ターゲットプロテインがタンパク質に対してライブラリの他のすべてのメンバーから別々に接触されて、検査されます。したがって、“ヒット”の識別のときに、抗体メンバーのアイデンティティはすぐに、アレイの位置から更なる充実、増幅またはそれの配列のための少しも要件なしで知られています。
ライブラリ・スクリーニングは、選別数百から数千に関する高処理量か同じスクリーニング検定で、より多くの抗体であるかもしれません。ここに抗体スクリーニングが希望の活動を持っている抗体メンバーを特定するのに当業者に知られているどんなテクニックも使用できます。典型的な高処理量スクリーンに関しては、マイクロタイタープレートのセットは発生されます、それによってマイクロプレートにおける各ウェルは異なったライブラリメンバーを含みます。例えば、プレートのあらゆるウェルが同じ抗体重鎖を含む抗体を含むところでプレートを作成できますが、各ウェルが異なった軽いチェーンを含むので、各ウェルの対にされた抗体（重くて軽いチェーン）はプレートの他のすべてのウェルの抗体と異なっています。すべてのウェルに次に、スクリーニング検定（例えば、標的タンパク質かセル、バッファ、分析評価試薬を表現するターゲットプロテイン、）を実行するのに必要な一定の要素に積んで、適切な時期のためにかえされて、選択の読み取りのために検査されます。シングルの浄化した標的分子またはセルを含む反応が、読み取りを与えるために十分であるところで結合があるか他の機能分析などの活動のための選別にこの方法を使用できます。【０４７１】例えば、そのような方法で、目標（例えばその配位子の存在下で）の効果活性化にセルベースの分析評価を実行できます、そして、活性化（例えばシグナリング、分化、増殖、走化性、アポトーシスまたは他の後続加工を評価などなど）は抗体の存在下で評価されます。【０４７２】一般に、このような機能アッセイの性能は、水溶性タンパク質の存在を必要とする。したがって、それは、彼らが可溶性の形式でスクリーンすることを許可する、ここに提供された抗体ライブラリーの利点です。例えば、抗体は例えば、多層のプレートのウェルにを対処できます。各場所におけるそれぞれの抗体は異なっています。したがって、活動を評価するとき”ヒット”のアイデンティティはすぐに、決定できます。【０４７３】スクリーンの初期のラウンドに続いて、繰り返しの選別指示された発生法で特定された”ヒット”をさらに最適化できます。例えば、”ヒット”の識別に続いて、第一のスクリーンライブラリから獲得された情報を使用することで‘集中している’ライブラリを創設できます。それらが”ヒット”のものに関連する生殖細胞系列セグメントの部品から作成されるので、集中しているライブラリはオリジナルの第一のライブラリの基礎を表します。彼らは１つに選択された”ヒット”の特性を洗練させることができます、結合があるか関連している機能的活動の親近感を増加させるのなどように。．【０４７４】抗体のアイデンティティはアドレスによって知られています。一度特定されていて、抗体Ｈｉｔｓはフルの長さのＩｇＧとしてまたはＦａｂ、Ｆａｂ’を、Ｆａｂ’の−ＳＨおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントとして発生できます。組換え型のテクニックと酵素の消化を使用などなどの伝統的な手段でそれの抗体か断片を作成できます。抗体かそれの断片が、キメラであるか人間化できます。以下に詳しく説明されるように、診断していて治療法の目的にそれの抗体か断片を使用できます。【０４７５】１．結合アッセイ
当業者に知られているどんな方法でも選択された目標を縛る彼らの能力のために、ここに提供された抗体ライブラリーはスクリーンできます。模範的目標抗原は以下で説明されます。結合アッセイは、溶液、懸濁液または固体支持体上で実行することができます。例えば、目標抗原を固定票（例えば、炭素、プラスチック表面またはチップ）に固定して、抗体で接触できます。
非結合抗体また標的タンパク質は、洗い流すことができる、結合複合体は、次に検出することができます。非特異的結合を抑える条件のもとで結合分析を実行できます、非イオン系洗剤（例えば、０．１％のトリトンＸ−１００かトゥイーン２０）がある高イオン強度バッファ（例えば、０．３−０．４Ｍ  ＮａＣｌ）を使用する、そして／または、タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンかゼラチン）ををブロックするのなどように。ネガティブコントロールは、背景の尺度の結合などのアッセイを含むことができます。．結合親和力は、スキャッチャードの分析を使用することで決定している場合があります。（マンソンｅｔ  ａｌ、アナル．生物化学、１０７：２２０（１９８０））、ビアコアまたは当業者に知られている他の方法。【０４７６】ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ法（免疫測定法をリンクされている酵素）、”サンドイッチ”免疫、メソスケールディスカバリー（ＭＳＤは、ゲイサーズバーグ、メリーランド州）、免疫アッセイ、ＥＬＩＳＰＯＴアッ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫アッセイ、などの技術を用いた凝集反応アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射アッセイ、蛍光イムノアッセイ、タンパク質イムノアッセイなどの技術を使用する模範的結合合アッセイは、競争力か非競争のアッセイシステムなどの免疫学的検定法含みますが限られない。そのような分析評価は、技術分野（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ、編、１９９４年、分子生物学の現在のプロトコル、第１巻、ジョンワイリー＆サンズを、Ｉｎｃ。、ニューヨーク、その全体がここで参考として援用される）で通常であってよく知られています。他のアッセイ形式は、バインドする特定の分子（例えば、抗体）するように設計さリポソームを使用して、カプセル化された試薬やマーカーを解放するリポソームイムノアッセイ（ＬＩＡ）を含まれています。次に、標準的方法によると、リリースされた化学物質は検出されます（Ｍｏｎｒｏｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ａｍｅｒ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｖ．５：３４−４１を見てください）。【０４７７】一般に、結合は通常目標にまたは、望まれているなら直接ライブラリの抗体メンバーに付く検出可能な半分かラベル（例えば、酵素、放射性核種、蛍光プローブ、「電気−化学発光」ラベル、またはカラー染料）を使用して検出されます。あるいはまた、結合はラベルされているか、または検出可能の一層の３番目の試薬によって検出されます。たとえば、ターゲットタンパク質に結合した抗体の検出は、サンドイッチ法の形式でラベルキャプチャ分子を用いて達成することができます。ラベルエージェントとして明確にタンパク質Ａかタンパク質Ｇなどの免疫グロブリン定常領域を結合することができる他のタンパク質も使用できます。これらのタンパク質が免疫グロブリン定常領域でさまざまな種から強い非免疫原性の反応性を示します（ｓｅｅ，ｅ．ｇ．，Ｋｒｏｎｖａｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１１：１４０１−１４０６；Ａｋｅｒｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：２５８９−２５４２）。ビオチンなどの検出可能な半分で検出エージェントを変更できます、これに���トレプトアビジンなどの別の分子が明確に結合することができます。さまざまな検出可能な半分が当業者によく知られています。【０４７８】分析評価に使用されるラベルか検出可能なグループの選択は重要ではありません、分析評価に使用される抗体の特異結合をかなり妨げない限り。一般に、この選択は必要である感度、化合物がある活用の容易さ、安定性要件、利用可能な計装、および処分条項次第です。当業者の一つ技能は、ラベルに精通して、使われる分析評価との適当でコンパチブル検出可能なラベルを特定できます。【０４７９】検出可能なグループは検出可能な物理的であるか化学の性質があるどんな材料であってもよいです。そのような検出可能なラベルは免疫学的検定法の分野でよく開発しています、そして、一般に、いずれもそのような方法で役に立つとラベルする大部分を本発明に適用できます。したがって、ラベルが分光器、そして、光化学、そして、生化学、免疫、電気、光学、または、化学の手段で検出可能な構成のいずれかです。本発明における役に立つラベルは電磁ビーズ（例えば、ダイナビーズ）、蛍光染料（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサス赤、ローダミン、および同様のもの）、放射（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）；酵素（例えば酵素結合免疫吸着検定法に一般的に使用される、山葵ペルオキシダーゼ類、アルカリ・ホスファターゼ、および他のもの）か、化学発光ラベル（ルシフェリンと２、３−ｄｉｈｙｄｒｏｐｈｔａｈｌａｚｉｎｅｄｉｏｎｅｓ、例えば、ルミノール）と、コロイド金か色ガラスなどの比色分析のラベルかプラスチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）を含んでいます。使用できる様々なラベリングか信号生産システムのレビューに関しては、例えば。合衆国はＮｏ．４，３９１，９０４の特許を見てください。【０４８０】ラベルを検出する手段は、当業者にによく知られています。したがって、例えば、ラベルが放射性標識であるところでは、検出のための手段は放射線写真法のようにシンチレーション・カウンタか写真用フィルムを含んでいます。ラベルが蛍光標識であるところでは、光の適切な波長がある蛍光色素を励起して、結果として起こる蛍光を検出することによって、それを検出できます。
電荷撮像素子（ＣＣＤｓ）か光電子増培管やおよび同様のものなどの電子感知器の使用で目視により蛍光を検出できます。
同様に、適切な基板を酵素に提供して、得られた反応生成物を検出することによって、酵素のラベルは検出できます。単にラベルに関連している色を観測することによって、最終的に簡単な比色分析のラベルを検出できます。【０４８１】いくつかの分析評価形式はラベルされたコンポーネントの使用を必要としません。例えば、目標抗体の存在を検出するのに接着分析評価を使用できます。この場合、抗原でコーティングされた粒子は目標抗体を含むサンプルによって膠着させられています。この形式では、コンポーネントのどれかはラベルされる必要はありません、そして、目標抗体の存在は簡単な目視検査によって検出されます。【０４８２】あるいはまた、セルに付く彼らの能力のためにここに提供された抗体ライブラリーはスクリーンできます、全細胞撮影を使用して、減算の撮影のあるなしにかかわらず。スクリーニングは生きている細胞に対して、またはそのまま、軽度固定標的細胞に対して行うことができます。全細胞撮影のための方法は以前に、説明されます（例えばＳｉｅｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．はここに参照で盛込まれた（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．方法２０６：７３−８５を見てください）。適用できる選別のための他のテクニックは蛍光活性セルソーティング（ＦＡＣｓ）を含んでいます；。【０４８３】ハイスループットスクリーニングのために、アッセイは、多重化することができます。その結果、多くの異なったターゲットプロテインへの抗体の結合親和力はすぐに、決定できます。１つの例では、異なるターゲットタンパク質が別々に異なる検出部分ラベルを付けることができます。例えば、色分けされたビーズと異なった抗原を結合できる、（シュベンクｅｔ  ａｌ（２００７）Ｍｏｌ．セル．Ｐｒｏｔ．，６：１２５−１３２）．別の例では、マルチスポットプレートを使用できます、それは最大１００個のタンパク質についてプレートの場所で吸収を多重送信する分析評価を許容します（例えば、メソスケールディスカバリーから多アレイか多スポットプレートを使用します；ＭＳＤ、ゲイザースバーグ（ＭＤ）。．そのような例では、マルチスポットプレートの各ウェルへの異なった抗体メンバーの追加でここに提供された処抗体ライブラリーはスクリーンできます。アッセイは、容易に多数の標的タンパク質に対する一度に抗体の何千ものスクリーニングを可能にします。これは例１３でここに例示されます。【０４８４】スクリーンの方法で、ここに、抗体の結合親和力は、ターゲットプロテインのために高い親近感を持っている抗体を特定するか、または選択するのために決定しています。１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍに関してある、または低い結合親和力がある抗体は、通常、選択されるか、または特定されます。一般に、抗体がナノモルかサブナノモル結合親和力を持ちながら特定されるまで、抗体はスクリーンされます。希望の結合親和力を持っていない選別の最初のラウンドで特定された”ヒット”は、繰り返しの選別、そして／または、指示された発生法で最適化して、高い結合親和力を持っている抗体を特定するために目標抗原に付くようにさらにスクリーンできます。【０４８５】当業者に知られている任意のメソッドは、抗体の結合親和性を測定するために使用することができます。例えば、飽和結合分析評価、例えば飽和酵素結合免疫吸着検定法を実行することによって、抗体の結合特性を評価できます、例えばターゲットプロテインに付くのは酵素結合免疫吸着検定法によって増加する量の抗体で評価されます。そのような実験では、結合が線量依存性そして／または、可飽和であるかどうか評価する可能です。さらに、５０％の結合がある信号から結合親和力を推定できます。その結合定数（ｋａ）か解離定数（Ｋｄ）で通常、見かけの結合親和力は測定されます、そしてスキャッチャードの分析を使用することで決定されます（ムンソンｅｔ  ａｌ、Ａｎａｌ生物化学、１０７：、２２０（１９８０）。例えば、ラベルされていないタンパク質の増加する濃縮が加えられるところでの競争結合分析でターゲットプロテインへの結合親和力を評価できます、放射線検定法（ＲＩＡ）やＥＬＩＳＡなどのように。ビアコア動態解析を使用することで結合親和力も分析できます。これは、それらの表面で固定されたターゲットプロテインを含むチップから抗体メンバーの結合と解離を分析することを含まれます。ビアコア評価ソフトウェアは、データを相互作用モデルに合わせることによって、ＫａとＫｄの値を発生させます。結合親和性のすべてのアッセイは、大まかな近似をを提供しますが、使われた分析評価と条件によって、抗体の結合親和力が異なることができるのが理解されます。様々な条件のもとで様々な分析評価を実行することによって、抗体の結合親和力を見積もるのは、可能です。【０４８６】さらに、抗体の構造によって、結合親和力は異なることができます。一般に二価抗体、例えば、二価のＦ（ａｂ’）２フラグメントまたは完全な長さのＩｇＧは一価のＦａｂ抗体より良い結合親和力を持っています。したがって、Ｆａｂには特定の目標のための指定された結合親和力があるところで結合親和力が二価である完全な長さ免疫グロブリンがさらに大きいのが、除外されているのが理解されます。【０４８７】２．機能的活動当業者が１つに知られているどんな方法による目標の機能的活動も調節する彼らの能力のために、抗体ライブラリーがここに提供した機能的な活動をスクリーンできます。分析評価は、細胞の表面にある受容体を結合する、そして／または、調節できる抗体を特定するように設計される場合があります。そのような抗体は、受容体結合の正常な効果をまねるアゴニストか、または受容体結合の正常な効果を抑制する敵対者のどちらかであるかもしれません。特定関心は受容体に結合して、細胞内合図を調節するエージェントの識別です。【０４８８】何らかの例では、そのような分析評価はセルベースの分析評価です。一般に、分析評価は、興味がある目標を表現するのが知られている細胞株を使用することで実行されます。．このような細胞は、当業者のいずれかに知られてます。たとえば、いずれかの細胞を識別するためにＡＴＣＣ受託カタログ（ａｔｃｃ．ｏｒｇ）相談することができます。．また、そのようなセル、そして／または、彼らの即座に手があいているソースを得るための手段は、特定の細胞種類が望まれているなら当業者に知られています。
科学的文学の分析は容易にセルがどんな希望の目標も表現するのが適当な選択を明らかにすることができます。表１８はここに提供された抗体ライブラリーに対してここに機能的活動でスクリーンできる興味がある目標を表現する模範的セル線を記載します。【０４８９】
【表１８】
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0005882058.tif 000159
0005882058.tif 000160
【０４９０】さらに、興味がある目標を急送するセル線は発現ベクターが興味がある目標を表現している一時的であるが安定した移入で発生できます。【０４９１】カウフマンら、トランスフェクションと表現の方法は、当業者が知られている（カウフマンのＲＪ（１９９０）酵素学のメソッド１８５：５３７−５６６カウフマンｅｔ  ａｌ．（１９９０）酵素学メソッド１８５：５３７−５６６の）。さらに、特定の目標（例えば、セルの表面マーカー）の表現のためにどんなプライマリセルや細胞株も評価できます。抗体とＦＡＣＳとラベルされた蛍光を使用することでセルの表面マーカーについて検査できます。適当な細胞株はＡ５４９（肺）、ＨｅＬａ、Ｊｕｒｋａｔ、ＢＪＡＢ、Ｃｏｌｏ２０５、Ｈ１２９９、ＭＣＦ７、ＭＤＡ  ＭＢ２３１、ＰＣ３、ＨＵＭＥＣ、ＨＵＶＥＣ、およびＰｒＥＣを含んでいます。【０４９２】ここに説明されるように、どんな適当な機能的効果も測定できます。例えば細胞形態学（例えば、細胞体積、核体積、セル周辺、および核周辺）、リガンド結合、基質結合、ヌクレアーゼ活性、アポトーシス、走化性か細胞移動と、細胞表面マーカー式と、細胞増殖と、ＧＦＰの陽性と色素希釈分析評価（例えば、細胞膜に固まる染料によるセル追跡者分析評価）、ＤＮＡ合成アッセイ（ＦＡＣＳ分析とＢｒｄＵのかＨｏｅｃｈｓｔ色素など例えば、３Ｈ−チミジン、蛍光ＤＮＡ結合染料）と核巣アッセイなどのすべての適当な分析評価が、セルベースのシステムを使用することで潜在的変調器を特定することになっています。測定できる他の機能的活動は、リガンド結合、基質結合、エンドヌクレアーゼ、そして／または、エキソヌクレアーゼ活性、両方の知られていると未同定の遺伝的マーカー（例えば、ノーザンブロット）への転写の変更、遺伝子マーカー（例えば、北しみ）を非特殊化しました、細胞の代謝における変化、と変化はヌードネズミ、および他のものにおける細胞増殖とセル表面マーカー表現とＤＮＡ統合とマーカーと色素希釈分析評価（例えば、ＧＦＰとセル追跡者分析評価）、コンタクトインヒビション、腫瘍の成長ヌードマウス、およびその他を包含します。【０４９３】例えば、彼らのターゲットプロテインを表現するのが知られているセルの１つ以上の表現型の変調のためにここに提供されたライブラリの抗体かそれの部分を評価できます。彼らの使用のための表現型分析、キット、および試薬は、当業者によく知られて、抗体ライブラリーをスクリーンするのにここに使用されます。いくつかの商業業者のどれかから購入できる代表的な表現型アッセイは細胞の生存を決定するためのそれら、細胞毒性、増殖または細胞生存（分子プローブ、ユージン、オレゴン；パーキンエルマー、ボストン、マサチューセッツ州）（酵素の分析評価（Ｐａｎｖｅｒａ、ＬＬＣ、マディソン、ウィスコンシン州；ＢＤ生命科学、フランクリン・レイクス、Ｎ．Ｊ．；がん遺伝子リサーチ商品、サンディエゴ、カリフォルニア）、細胞調節を含むタンパク質ベースの分析評価）がトランスダクションを示します、炎症；酸化過程、アポトーシス（分析評価デザインＩｎｃ．、アナーバー、ミシガン州）、トリグリセリド蓄積（σ−オルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州）、新脈管形成分析評価、管形成分析評価、サイトカイン、ホルモン分析評価、および新陳代謝の分析評価（ケミコンの国際Ｉｎｃ．、テメキュラ、カリフォルニア；アマーシャム生命科学、ピスキャタウェイ（ニュージャージー州）を含みます。【０４９４】特定の表現型分析（すなわち、Ａ５４９細胞、ＨｅＬａ細胞、ジャー、ＢＪＡＢ、Ｃｏｌｏ２０５、Ｈ１２９９、ＭＣＦ７、したＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＰＣ３のＨＵＭＥＣ、ＨＵＶＥＣの、とｐｒｅｃと関心の対象を表現するために知られている任意の他）に適切であると決心しているセルは抗体、またコントロール化合物と処理されます。必要なら、受容体目標のための配位子が含まれているので、受容体の起動は作用しています。処理の期間の終わりに、扱われて未処置のセルは分析評価が表現型の結果、終点を決定するように特定の１つ以上の方法で分析されます。【０４９５】表現型のエンドポイントはタンパク質、脂質、核酸、ホルモン、糖類や金属などの細胞成分の濃度の変化か時間や処理量以上の細胞形態の変化を含んでいます。細胞周期は、吸気または細胞による生物学的指標の排泄の段階をｐＨが含くむ細胞状態の測定はた、興味のあるエンドポイントです。【０４９６】ターゲットプロテインの上に抗体の直接効果を評価するために分析評価を実行できます。例えば、ターゲットプロテインが細胞の表面にある受容体であれば、ターゲットプロテインが直接変調するかどうか評価するために抗体を加えることができます、受容体の刺激、活動または機能などのように。そういった場合には、抗体はアゴニスト抗体であると考えられます。他の例では、配位子か他の刺激剤の面前でターゲットプロテインが細胞の表面にある受容体であれば、抗体が抗体の作用を調節するかどうか（例えば、禁止します）決定するために抗体の存在か不在で受容体の活動を刺激できます。例えば、抗体は、配位子が受容体と対話する、そして／または、そうでなければ否定的刺激性シグナルを引き起こす能力を妨げることによって、行動できます。このような場合では、抗体が受容体拮抗薬と考えられます。したがって、選別の方法はここに機能的活動でアゴニストと敵対者抗体の識別を可能にします。【０４９７】ａ．分化
物理的であるか、化学的であるか表現型な変化の検出を許すどんな分析評価も使用することで細胞分化を分析できます。
様々な分析評価は、量的に外部刺激に対応して細胞増殖と起動を決定するのに使用されます。セル増殖分析は、細胞分裂で新たに統合されたセルのＤＮＡに試薬を組み入れることによって量的に細胞増殖を決定するのに使用されます。そのような試薬は３Ｈ−チミジン、ブロモ−２分の５デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）、および蛍光ヘキスト染料に含んでいますが、限られていません。染料でセルに染色して、染料がいくつのセル理解力を基礎づけたかを測定することによって細胞生存率アッセイは、細胞が染料を除くという事実でサンプルの正常細胞の数を測定するのに使用されます。そのような染料が３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ臭化（ＭＴＴ）、２，３−ビス（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈの−テトラゾリウム−５−ｃａｒｂｏｘａｎｉｌｉｄｅ内部塩（ｘｔｔ）、４−［３−（４−ヨードフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−２Ｈの−５−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｏ］−１，３−ベンゼンジスルホン（ＷＳＴ−１）を含みますが限らない。試薬の取り込みは、いずれかの測色分光光度計を使用するか、またはシンチレーションカウンターで放射を測定することによって測定されます。これらのメソッドの詳細はよく、当業者に知られています。たとえば、例１２は、細胞の増殖を評価するためにＭＴＴの増殖アッセイを例証します。【０４９８】蛍光染料はさまざまなセルベースの分析評価における生細胞と主要な機能的活動の検出に一般的に使用されます。細胞代謝に依存していないいくつかの非放射性、蛍光ベースのアッセイがあります。蛍光染料は核酸を結合します、そして、次に、量的または質的に蛍光は測定できます。このような染料は、ヨウヨウ化とＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を含みますが限定されない。セル番号が蛍光に基づいて定量することができます。また、イメージ器具で利用可能なツールを使用することでＤＮＡ含量を定量されることができます。これらのメソッドの詳細については、よく、当業者に知られています。【０４９９】異常な細胞増殖と腫瘍成長を抑制できる抗体を特定するのに分析評価としてマトリゲルへの生体内侵入性の度合いかある他の細胞外液母材成分を使用できます。腫瘍細胞はセルの悪性と生体内侵入性との良い相関関係をマトリゲルｌかある他の細胞外液母材成分に示します。この分析評価では、発癌性細胞は宿主細胞として通常使用されます。したがって、宿主細胞の間の生体内侵入性のレベルにおける測定変化は潜在的変調器の導入の前後に抗体を特定できます。【０５００】簡潔に、マトリゲルと共にコーティングされたフィルタかある他の細胞外液母材成分を使用することによって、宿主細胞の侵入のレベルを測定できます。フィルタの遠位側か皿の下部で細胞数と動かされた距離、１２５Ｉと共にセルを前ラベルして、または放射能を数えることによってゲル、フィルタの遠位側に突き抜けることへの浸透は、生体内侵入性として評定されて、組織学的であると評定されます。動物細胞の基本法のマニュアルの、フレッシュニー、文化などを参照してください第３版、ワイリーリスは、ニューヨーク（１９９４）、ここに引用して援用）。【０５０１】ｂ．遺伝子発現変化
生物反応を検出することによって、抗体による結合の検出、そして／または、目標の変調を実行できます、レポーター遺伝子の例えば、測定するＣａ２＋イオン流出、ｃＡＭＰ、ＩＰ３、ＰＩＰ３または転写などのように。また、処理の後のセル（レポーター遺伝子分析評価を使用するセルの遺伝子の１つ以上の表現の測定）の遺伝子型の分析は効力のインディケータか抗体の力として使用されます。ホールマークの遺伝子か、信号変換経路に関連しているように疑われたそれらの遺伝子は、扱われたものと同様に未処置のセルの中で測定されます。【０５０２】レポーター遺伝子の起動を測定する分析評価は実行できます。適当なレポーター遺伝子は熟練した職人にとって、身近な標準方法のいずれでもセルに挿入される外来遺伝子と同様に内在性遺伝子を含んでいます、移入や、電気穿孔法や、リポフェクションやウイルス感染などのように。例えば、組換え受容体を発現する細胞は（例えば、クロラムフェニコールアセチル転移酵素、蛍ルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、およびアルカリ・ホスファターゼ）がレポーター遺伝子をトランスフェクトすることができで作動応答要素にリンクされている。次に、セルは抗体でかえされます、そして、レポーター遺伝子の表現は表現していませんが、組み換え受容体が本質的にはその他の点では同じ対照細胞の中で表現にたとえられます。受容体発現細胞におけるレポーター遺伝子発現における統計的に重要な変化は受容体と対話するテスト化合物を暗示しています。また、目的のタンパク質は、赤や緑色蛍光タンパク質などの第２のレポーターに添付ファイルを介して間接的にレポーターとして使用することができます（例えば、Ｍｉｓｔｉｌｉ  ＆  Ｓｐｅｃｔｏｒ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：９６１−９６４参照してください。）【０５０３】構築レポーターは、通常、細胞にトランスフェクトされます。潜在的な変調器で処理した後、レポーター遺伝子の転写、翻訳、または活動の量は当業者に知られている標準技術に準拠して測定されます。ルシフェラーゼを用いたレポーター遺伝子アッセイを使用すると、ＳＴＡＴ５が直接、または実施例１２で実証されているサイクリン−Ｄのプロモーターの誘導活性化を測定します。【０５０４】ｃ．細胞毒性活動
直接アポトーシスかプログラム細胞死を引き起こすか、または増殖因子受容体、その結果事実上人目についている増殖を妨げることによって間接的にアポトーシスを引き起こす彼らの能力のために抗体をスクリーンできます。また、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）として知られている、ダイレクト細胞毒性に通じて、抗体は補数を結合します。したがって、補体依存性細胞傷害を評価するために分析評価を実行できます。【０５０５】アッセイの様々な評価する。アポトーシスは、当業者のいずれかに知られている。たとえば、アポトーシスアッセイは、アポトーシスに関与する酵素であるカスパーゼの活性化をアッセイするこれらを含まれています。カスパーゼアッセイは、活性酵素、タンパク分解活性にチモーゲン処理の測定に基づいています。市販のキットおよび試薬の数は、カスパーゼ関数に基づいて、アポトーシスを評価するために利用可能です、ＰｈｉＰｈｉＬｕｘ（ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｉｎ、Ｉｎｃ。）は、カスパーゼ３活性アッセイ（ロシュアプライドサイエンス）、均質カスパーゼ法（ロシュダイアグノスティックス）、カスパーゼグロアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、アポ−ＯＮＥの均一カスパーゼ−３／７アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、ＣａｓｐＡＣＥアッセイシステム比色またはＦｌｕｏｒｍｅｔｒｉｃ（メガ）、ＥｎｚＣｈｅｋカスパーゼ３アッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＩｍａｇのＩＴライブ緑色のＣａｓｐａｓｅ−３および７の検出キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、Ａｃｔｉｖｅカスパーゼ３の検出キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カスパーゼによるアポトーシス製品（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）とカスパーゼのアポトーシス測定キット（Ｇｅｎｏｔｅｃｈ）を含みますが限らない。例１１は、カスパーゼ分析評価を使用することでアポトーシスのための含有を例示します。【０５０６】アポトーシスのための分析評価はＴＵＮＥＬとヌクレアーゼの起動とＤＮＡのその後の分裂を１８０−２００塩基対の増分に測定するＤＮＡ断片化分析評価を含んでいます。そのような分析評価とキットが商業的に利用可能であり、アポトーシスのＤＮＡラダーキット（科学応ロシュ）、細胞ＤＮＡの断片化酵素免疫測定法（応用科学ロシュ）、細胞死検出ＥＬＩＳＡＰＬＵＳ（ロシュダイアグノスティックス）、その場細胞死検出キット（科学応用ロシュ）、デッドエンドＦｌｕｏｒｏｍｅｔｉｒｃや色彩ＴＵＮＥＬのシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＡＰＯ−ＢｒｄＵのＴＵＮＥＬのアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＴＵＮＥＬアポトーシス検出キット（州北部）包含しますが、限らない。【０５０７】アポトーシスを評価する他の分析評価は例えば膜の保全の損失を評価するセル透過性測定を含んでいます。例えば、抗体が細胞死を引き起こすことができるかどうか決定するために、未処置のセルに比例してプロピジウムヨウ化物（ＰＩ）、トリパンブルー、または７−ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄの摂取によって評価される膜の保全（７ＡＡＤ）の損失を評価できます。さらに、アポトーシスを測定するのにＡＰＯＰｅｒｃｅｎｔａｇｅアッセイ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒアッセイ）などの市販キットを使用できます。アネキシンＶ分析評価も使うことができます。ア���キシンＶはホスファチジルセリンに結合します、通常、それは、細胞膜の木裏で見つけられます。アポトーシスの間、ホスファチジルセリンを外表面に転位して、アネキシンＶ．Ｆｏｒの例で検出できて、蛍光ラベルされたアネキシンＶを使用する標準の結合分析は使用できます（例えば、インビトロジェンからの、アネキシンＶ、アレックスＦｌｕｏｒ３５０Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）。タンパク質切断を評価して、アポトーシスの他のマーカーの存在を評価するミトコンドリアとＡＴＰ／ＡＤＰ分析評価でアポトーシスも測定できます。このようなアッセイは、ルーチンと当業者に知られています。例えば、ＲＫＯ、ＨＣＴ１１６、または興味があるターゲットプロテインを急送する他のセルなどのようの細胞株を使用することで機能的抗体を特定するのに分析評価としてアポトーシス分析を使用できます。細胞が共同緑色蛍光タンパク質、またはセルのトラッカー色素をコードする遺伝子などのマーカー遺伝子を含む構築物とトランスフェクトすることができます。アポトーシス変化は、当技術分野で知られている方法を使用することで決定できます、蛍光顕微鏡を使用する、ＤＡＰＩ汚損やＴＵＮＥＬ分析評価のように。そして、ＴＵＮＥＬ分析評価に、商業的に利用可能なキットを使用できる（例えば、フルオレセインＦｒａｇＥＬのＤＮＡ断片化検出キット（癌遺伝子研究製品、猫＃ＱＩＡ３９）とテトラメチル−ローダミン−５−ｄＵＴＰを（ロシュ、猫、（Ｃａｔ＃１５３４  ３７８）。＃１５３４  ３７８））．抗体で接触されたセルは、例えば、対照群に比べ増加したアポトーシスを展示します。
生体外に、補数と免疫がある効果細胞がないとき抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）か補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）によって引き起こされた細胞死を区別することを決定できます。したがって、細胞死のアッセイは、不活化血清（補体の存在下で、すなわち）と免疫エフェクター細胞の非存在下で熱を使用して実行することができます。【０５０８】３．目標
ここに提供された選別法で、抗体はどんな活動のためにもスクリーンされます、結合か他の機能的活動などのように、目標に対して。活動は、目標のアゴニストかアンタゴニスト活性であるかもしれません。スクリーニング法は、任意の企図目標に基づいて設計することができます。このようなターゲットの例は膜結合タンパク質、受容体とリガンド物；イオンチャネル、Ｇタンパク質共役型受容体、新規なエピトープ、および非タンパク質抗原を含みます。どんな活動も、評価できて、目標の興味がある機能です。当業者は、様々な目標の活動になじみ深く、そのような知られている活動に基づくスクリーニング検定を選ぶことができます。模範的目標のためのこれらの活動の多くが以下でここに例示されます。すべての目標のために結合活性を評価できます。【０５０９】膜結合タンパク質、受容体とそのリガンド
模範的目標は、特に多細胞生物の構成、分化、および維持における重要な役割を果たすことができる、膜結合タンパクと、受容体とそれの配位子です。これらの機能を妨げる抗体を特定するのは熟考されます。例えば、多くの個別細胞の運命（例えば、他のセルとの増殖、移動、分化、または相互作用）は、他のセルから受け取られた情報、そして／または、じかに接する環境によって通常決定されます。さまざまのセル受容体か膜結合タンパクによって順番に受け取られて、解釈される分泌されたポリペプチド（例えば、マイトジェン因子、生存因子、細胞傷害性因子、分化因子、神経ペプチド、およびホルモン）によってこの情報はしばしば伝えられます。これらの分泌されたポリペプチド、または、シグナリング分子は、通常それらの細胞外環境における動作の場所に達するようにセル分泌経路を通り抜けます。したがって、そのような目標（受容体か配位子）のいずれか以上に対する抗体の識別は重要な経路疾患を調節できます、その結果、病気を変調して、症状を改善します。【０５１０】このような膜結合タンパク質および細胞受容体はサイトカイン受容体、受容体キナーゼ、受容体の脱リン酸化、細胞間相互作用に関与する受容体、カドヘリン、インテグリンのような細胞接着因子の分子、およびそのような受容体のリガンドを含みます限られない。このようなターゲットの例としては、細胞表面の受容体などの膜結合型受容体が含まれてＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３（血管内皮細胞増殖因子受容体１、２、４）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−ｂ３、ＩＧＦ−Ｒ１、Ｃ−Ｍｅｔ（また、肝細胞増殖因子受容体として知られている。ＨＧＦＲ）、ＤＬＬ４、ＤＤＲ１（ディスコイジンドメイン受容体）、キット（ｃ−キットのためｒｅｃｅｔｐｒ）、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ４（線維芽細胞増殖因子受容体１、２、４）、ロン（（ｒｅｃｅｐｔｅｕｒ原産地ｎａｎｔａｉｓ；また、マクロファージ刺激する１受容体として知られている）、ＴＥＫ（内皮特異的受容体チロシンキナーゼ）、ＴＩＥ（免疫グロブリンがあるチロシン・キナーゼとｅｐｉｍｅｒｍａｌ増殖因子相同ドメイン受容体）、ＣＳＦ１Ｒ（刺激因子１つのｃｏｌｎｇｌｙ受容体）、ＰＤＧＦＲＢ（血小板由来増殖因子受容体Ｂ）、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ１（エリスロポエチン産生細胞受容体Ａ１、Ａ２およびＢ１）、ＴＮＦ−Ｒ１、ＴＮＦ−Ｒ２、ＨＶＥＭ、ＬＴ−βＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３、ＣＤ２５、ノッチ、Ｇ−ＣＳＦ−Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦの−ＲおよびＥＰＯ−Ｒを含みますが、これらに限定されない。他のターゲットは、カドヘリン、インテグリン、ＣＤ５２またはＣＤ４４の中から選択のような膜結合タンパク質が含まれています。ここに選別法の目標であることができる模範的配位子は、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＩＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＴＮＦ−α、ＬＩＧＨＴ、ＢＴＬＡ、リンホトキシン（ＬＴ）、ＩｇＥ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＥ、およびＥＰＯを包含していますが、限られない。【０５１１】当業者は、活動や様々な標的タンパク質の機能に精通しています。したがって、スクリーニング検定（例えば、結合が��るか機能的な分析評価）は上で説明した結合、増殖またはアポトーシス分析評価のいずれも例のように、ここに抗体ライブラリーをスクリーンするためにそのようなものを選ぶことができます。表１８Ａはそのようなターゲットプロテインをスクリーンするのに使うことができる模範的ターゲットプロテインの活動と知られている機能、模範的分析評価の概要および模範的分析評価を提供します。別の例では、ターゲットプロテインのための結合親和力のために抗体かそれの断片をスクリーニングできます。ターゲットプロテインの既知のエピトープ、または、目新しいエピトープに結合があることができます、以下でここに説明されるように、特定できます。表１８Ｂは治療抗体によって認識された模範的ターゲットプロテインに知られているエピトープの例を供給します。
さらにも従うセクションは、ターゲットプロテインの活動と機能を例示します、模範的スクリーニング検定とその結果特定された抗体を含んでいます。ターゲットプロテインへの高い親近感を示す、そして／または、そうでなければターゲットプロテインの活動を調節する抗体を特定するために興味があるどんなターゲットプロテインに対して同様の分析評価を使うことができるのが理解されます。【０５１２】
【表１８Ａ】
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【０５１３】
【表１８Ｂ】
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【０５１４】ｉ．ノッチとノッチリガンド
ａ）ノッチ蛋白質
ノッチ蛋白質（ノッチ１はＳＥＱ  ＩＤ番号：２００２により；ノッチ２はＳＥＱ  ＩＤ番号：２００３により；ノッチ３はＳＥＱ  ＩＤ番号：２００４により；ノッチ４はＳＥＱ  ＩＤ番号：２００５により）は細胞間交流に決定的な役割を果している一方通行の膜貫通レセプター蛋白質であります。ノッチ族の細胞表面レセプターは各種の幹細胞と無差別前駆細胞など多種の細胞の上に、胎芽にせよ、出生後の自己更新組織にせよ、発見されます。Ａｒｔａｖａｎは−Ｔｓａｋｏｎａｓなどの（１９９５）科学２６８：２２５−３２をご参照に。例えば、人初代マクロファージは全てのノッチレセプターを搾り出し、マクロファージ差異化の間にノッチ３を選択的に増やします（Ｆｕｎｇなどの（２００７）循環、１１５：２９４８−２９５６をご参考に）。特に内皮細胞にも発見されたノッチ４は血管新生に役立ちます。ノッチはリンパ細胞の上にも存在します。ここでノッチシグナリングはリンパ細胞の成長や、成熟や、活性化や、転換などに参与します。【０５１５】五種類のノッチリガンドがあり、それぞれはデルタ様１、デルタ様３、デルタ様４、ジャグド１、ジャグド２と命名されます。ノッチがリガンドに活性化されるとき、その細胞内ドメインは蛋白分解性に切り裂かれて細胞核に運ばれ、ＣＳＬ（ＣＢＦ−１／Ｓｕ（Ｈ）／Ｌａｇ−１／ＲＢＰ−ＪＫ）転写因子と一緒に下流エフェクターの転移を活性化します。生じたエフェクターは他のジーンエンコーディング転移因子が末端差異化に入るために取る転移活性を抑制します。【０５１６】ノッチシグナリング通路（ＮＳＰ）は各種の細胞の成長と組織内バランスの期間に、差異化や、細胞運命決定や、幹細胞維持や、細胞活性性や、増殖や、細胞死亡など多数の細胞過程に存在します。ノッチシグナリングは多種の癌の場合に調節不全になるります。間違ったシグナリングは多数の疾患に関わります。例えば、Ｔ−ＡＬＬ（Ｔ細胞性急性リンパ性白血病）や、ＣＡＤＡＳＩＬ（皮質下梗塞および白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症）や、多発性硬化症（ＭＳ）や、ファロー四徴症や、アラジール症候群や、多発性骨髄腫や、他の症状などであります。それでノッチは蛋白質治療学の主な目標になります（アメリカパテント番号６０８３９０４をご参考に）。【０５１７】ここで提供された抗体ライブラリーは、ノッチレセプターとの結合及び／または功能活性を測定することより、活性調節用にえり分けられます。功能活性は増殖、細胞活性性、細胞死亡などノッチレセプターを発見する活性であります。例１３はここでノッチ１と結合する抗体を選択し、または確認するように提供された抗体ライブラリーについての結合測定を例示します。測定はＲＢＰ−Ｊκ／ＣＢＦ−１蛍光素酵素レポーター測定などを利用するシグナル転換測定をも含みます（Ｆｕｎｇなどの（２００７）循環、１１５：２９４８−２９５６をご参考に）。ノッチリガンドがあるにせよ、ないにせよ、測定を行えます。例えば、ＤＬＬ４をあらわす各細胞のコインキュベーションにより（Ｆｕｎｇなどの（２００７）循環、１１５：２９４８−２９５６をご参考に）、またはリガンドの固定化により（Ｌｅｆｏｒｔなどの（２００３）実験血液学、３４：１７２０−１７２９をご参��に）測定を行います。例えば、Ｆｕｎｇなどの記述によると、細胞は安定的にＤＬＬ４を発見した構造により形質移入されることも、ノッチを発見した人初期マクロファージを覆うことも、抗体ライブラリーメンバーがある場合に測定を受けることもできます。【０５１８】ノッチレセプター（ノッチ、ノッチ２、ノッチ３及び／またはノッチ４）の活性を調節するここで提供されたライブラリーから確認されたその抗体または部分はノッチの発見及び／または活性に関する病気の治療または予防に使用されます。これらの抗体はこの治療に反対抗体または反反対抗体として使われます。例えば、ノッチの反対抗体は癌細胞の成長または増殖を抑制したり減少したりするように使われます。例えば、前立腺癌と白血病などのさまざまの癌の治療に使われます（ＵＳ６６８９７４４をご参考に）。【０５１９】ここで提供された反対抗体はＴ細胞急性リンパ性白血病、リンパ腫、異常血管分布に関わる肝臓病、糖尿病、卵巣癌、血管細胞運命に関わる病気、関節リウマチ、膵臓癌、非小細胞肺癌、多発性骨髄腫やプラズマ細胞白血病や髄外性形質細胞腫などのプラズマ細胞腫瘍、神経芽腫などへの治療にも使われます。多発性骨髄腫などのプラズマ細胞不調、血管新生、乳癌や結腸直腸癌や肺癌や膵臓癌や前立腺癌肝癌や卵巣癌や頭頚部腫瘍や、皮膚腫瘍や脳腫や血液腫瘍などの肉腫や癌への治療にも使われます（ＵＳ２００８０２２６６２１、ＷＯ２００８／０９１６４１、ＷＯ２００５／０５４４３４をご参考に）。ノッチシグナリングは皮膚と血管と脂肪の発育に関わりますが、活性化されたレセプターは乳腺上皮を変質させます。そのゆえ、ノッチの反対抗体は乳腫瘍の治療に使用されます（ＵＳ２００８０２０６７５３をご参考に）。
ここで提供されたのはノッチ１の活性を調節する抗体であるから、ノッチ１の発見や活性に関わる病気または状況の治療に使用されます。この抗体は、生殖細胞系セグメントからなる塩基配列によりコード化されたＶＨチェーンとＶＬチェーンを有する抗体、またはそれから最適化された抗体を含みます。その一例はＦａｂ抗体であります。この抗体はさらに定常域を含みます。この抗体はノッチ１と結合親和力を持つ抗体を含みます。そのノッチ１は１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍまたはその以下であり、特にナノモルまたはサブナノモルと結合親和力を持っています。
ここで提供されたアンチノッチ１抗体はせめて一つのＣＤＲを有する抗体を含み、ＣＤＲはＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及び／またはＣＤＲＬ３であります。例えば、ＣＤＲＨ１はＧＹＴＦＴＳＹＹＭＨ（アミノ酸２６−３５、配列同一性番号は１５１２）であります；ＣＤＲＨ２はＩＩＮＰＳＧＧＳＴＳＹＡＱＫＦＱＧ（アミノ酸５０−６６、配列同一性番号は１５１２）であります；ＣＤＲＨ３はＥＧＹＳＳＳＷＹＤＹＦＤＹ（アミノ酸９９−１１１、配列同一性番号は１５１２）であります；ＣＤＲＨ３はｅｙｙｙｇｓｇｓｙｙｎｄｙｆｄｙ（アミノ酸９９−１１４、配列同一性番号は１５０９）であります；ＣＤＲＬ１はＲＡＳＱＳＶＳＳＮＬＡ（アミノ酸２４−３４、配列同一性番号は１８４３）であります；ＣＤＲＬ１はＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（アミノ酸２４−３５、配列同一性番号は１８３３）であります；ＣＤＲＬ１はＲＡＳＱＳはＳＷＬＡ（アミノ酸２４−３４、配列同一性番号は１８４１）であります；ＣＤＲＬ２はＧＡＳＴＲＡＴ（アミノ酸５０−５６、配列同一性番号は１８４３）であります；ＣＤＲＬ２はＧＡＳＳＲＡＴ（アミノ酸５１−５７、配列同一性番号１８３３）であります；ＣＤＲＬ２はＤＡＳＳＬＥＳ（アミノ酸５０−５６、配列同一性番号は１８４１）であります；ＣＤＲＬ３はＱＱＹＮＮＷＰＰＷＴ（アミノ酸８−９８、配列同一性番号は１８４３）であります；ＣＤＲＬ３はＱＱＹＧＳＳＰＰＷＴ（アミノ酸９０−９９、配列同一性番号は１８３３）であります；ＣＤＲＬ３はＱＱＹんＳＹＳＰＷＴ（アミノ酸８９−９８、配列同一性番号は１８４１）であります。ここで提供されたもう一つのＣＤＲは以上の各ＣＤＲと比べて６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはその以上の配列同一性を発見します。
例えば、ノッチ１の活性を調節する抗体はＩＧＨＶ１（たとえば、配列同一性番号１−４３に規定されたもの）であるＶＨ生殖細胞セグメントからなる生殖細胞成分を含む延期配列によりコード化されたＶＨチェーンを含む抗体を含みます。またはＩＧＨＶ１（例えば、配列同一性番号２６８−２７１に規定されたもの）であるＤＨ生殖細胞セグメント、あるいはＩＧＨＪ４（例えば、配列同一性番号２７８または２７９に規定されたもの）であるＪＨ生殖細胞セグメントであります。このような抗体はＩＧＫＶ１（配列同一性番号２８６−３１６により規定されたもの）またはＩＧＫＶ３（配列同一性番号３３２−３５０により規定されたもの）であるＶκ生殖細胞セグメントからなる生殖細胞成分を含む塩基配列によりコード化されたＶＬチェーンを含む抗体をも含みます。またはＩＧＫＪ１であるＪκ塩基セグメント（配列同一性番号３５６により規定されたもの）であります。このような抗体は上述の生殖セグメントの異形である生殖セグメントを含む塩基配列によりコード化された抗体をも含みます。異形の原因は、保守突然変異または他の突然変異であります。ただし、条件は生じられた抗体は機能性または生産性の抗体である上にノッチ１と結合することであり、それに／または機能性活性を調節することであります。
ノッチ１に反する抗体の例はＶＨチェーンがＩＧＨＶ１−４６（例えば、ＩＧＨＶ１−４６＊０１、ＩＧＨＶ１−４６＊０２またはＩＧＨＶ１−４６＊０３）であるＶＨ生殖細胞セグメントからなる塩基配列によりコード化される場所である抗体であります。またはＩＧＨＤ３−１０（例えば、ＩＧＨＤ３−１０＊０１、ＩＧＨＤ３−１０＊０２）であるＤＨ生殖細胞セグメントであり、ＩＧＨＪ４（例えば、ＩＧＨＪ４＊０１、ＩＧＨＪ４＊０２、ＩＧＨＪ４＊０３）であるＪＨ生殖セグメントであります。ＶＬチェーンはＩＧＫＶ３−１５（例えば、ＩＧＫＶ３−１５＊０１）や、ＩＧＫＶ３−２０（例えば、ＩＧＫＶ３−２０＊０１、ＩＧＫＶ３−２０＊０２）や、またはＩＧＫＶ１−５（例えば、ＩＧＫＶ１−５＊０１、ＩＧＫＶ１−５＊０２、ＩＧＫＶ１−５＊０３）であるＶκ生殖細胞セグメントからなる塩基配列によりコード化されます。またはＩＧＫＪ１＊０１であるＪκ生殖細胞セグメントであります。ノッチ１の活性を調節するここで提供された抗体の例は表１８Ｃにより規定されます。【０５２０】
【表１８Ｃ】
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ｂ）【０５２１】ＤＬＬ４
ＤＬＬ４（配列同一性番号２０１０により規定され）はノッチ膜貫通レセプター用の膜貫通蛋白質リガンドであります。それは各種の組織内に幅広く発見されますが、その発見は圧倒的に血管系統に位置しています。ＤＬＬ４はノッチ１とノッチ４レセプターを活性化します。それは正常の血管発育に対して必要であり、腫瘍血管の上に発見されます。それは腫瘍血管新生の間に血管内に上向き調節され、その発見はＶＥＧＦシグナリングを頼りにします。血管新生内皮細胞の上のＤＬＬ４発見は血管新生を生産的に進ませることにより血管発育の消極的な調節器のように働きます（Ｒｉｄｇｗａｙなどの（２００６）自然、４４４：１０８３；Ｎｏｇｕｅｒａ−Ｔｒｏはｅなどの（２００６）自然、４４４：１０３２をご参考に）。それは内皮細胞の増殖を抑制するように働きます。しかしながら、ＤＬＬ４の妨害は血管の伸ばしや別れを特徴にする血管新生の増加と、血管機能の減少と、その結果としての腫瘍成長の低滅に関わります（Ｒｉｄｇｗａｙなどの（２００６）自然、４４４：１０８３；Ｎｏｇｕｅｒａ−Ｔｒｏはｅなどの（２００６）自然、４４４：１０３２を参考に）。
これで、ＤＬＬ４機能は腫瘍成長と腫瘍血管密度の切離しに関わります。ＤＬＬ４は炎症誘発刺激物に暴露された活性化マクロファージの上にも発見されます。刺激物はリポ多糖や、インターロイキン−１βや、Ｔｏｌｌ様レセプター４リガンドや、他の炎症誘発刺激物を含みます。ノッチ通路を通過するＤＬＬ４のシグナリングはマクロファージ活性化を特徴としての炎症状況に加担します（Ｆｕｎｇなどの（２００７）循環、１１５：２９４８−２９５６をご参考に）。【０５２２】ここで提供された抗体ライブラリーはＤＬＬ４との結合を測定すること及び／または機能活性を測定することにより活性の調節のためにえり分けられます。例１３はＤＬＬ４と結合する抗体を選択しまたは確認するためにここで提供された抗体ライブラリーをえり分けるような結合測定を例示します。各測定は抗ＤＬＬ４抗体が存在する場合にＤＬＬ４−ノッチの相互作用への抑制を評価する結合測定をも含みます。このような測定は反対抗体を確認するように使用されます。例１７はこれを例示します。機能活性の測定は上述のようなシグナル転換及び／または下流機能活性の測定によりＤＬＬ４によるノッチシグナリングの活性化を評価する測定を含みます。ノッチの活性化は、例を挙げれば、ＤＬＬ４を発見する細胞とのコインキュベーションによりも、ＤＬＬ４の固定化によりも、抗体成分が存在する場合に行われる測定によりも実現されます。このような測定には、例を挙げれば、ＤＬＬ４により引き起こされた内皮細胞増殖の抗体の効果が測定できます（Ｒｉｄｇｗａｙなどの（２００６）自然、４４４：１０８３をご参考に）。一部の例には、抗体はノッチを発見する細胞の差異化に対する影響を測定するように使用されます。これらの細胞はＤＬＬ４またはＪａｇ１などリガンドを表現する細胞と一緒に培養されます。差異化を促進する抗体を確認するためには（例えば、ノッチの活性化を干渉する）、抗体はこの測定に添えられることができます。例示的な測定は例１８をご参考になさい。【０５２３】それで、ここで提供されたライブラリーから確認された抗体、またはここで提供された抗体はＤＬＬ４と結合し（例えば特別に結合する）、一部の場合にはＤＬＬ４関連の効果の一つまたはその以上の方面を調製することができます。これらの方面はノッチレセプター活性化の任意の一つまたはその以上の減少または閉塞や、ノッチレセプター下流分子シグナリングの減少または閉塞や、ＤＬＬ４と結合するノッチレセプターの中断または閉塞や、内皮細胞増殖の促進や、内皮細胞差異化の抑制や、動脈差異化の抑制や、腫瘍血管注入や、腫瘍の治療と予防や、細胞増殖異常または癌や、ＤＬＬ４発見関連の障害の治療と予防や、ノッチレセプター発見及び／または活性関連障害の治療と予防などを含みます。一部の場合には、抗体は特別にＤＬＬ４と結合します。一部の場合には、抗体は特別にＤＬＬ４細胞外ドメイン（ＥＣＤ）と結合します。一部の場合には、生体内及び／または生体外のＤＬＬ４活性を減少し、抑制し、閉塞します。一部の場合には、抗体はＤＬＬ４リガンドと結合するために競争します（ＤＬＬ４と結合するノッチレセプターを減少し、閉塞します）。【０５２４】ここで提供されたライブラリーか���確認された、ＤＬＬ４の活性を調節するこの抗体またはその部分は、ＤＬＬ４の発見及び／または活性と関連する疾患の治療と予防のために使用されます。例えば、増えた発見及び／または活性や、望まれない発見及び／または活性であります（アメリカ発表された応用序列番号ＵＳ２００８０１７５８４７と国際発表されたＰＣＴ応用番号ＷＯ２００８０６０７０５、ＷＯ２００８０９１２２２をご参考に）。治療は腫瘍及び非腫瘍異常を含みます。例えば、これらの抗体またはその部分は腫瘍や癌（例えば、結腸癌や肺がんや乳癌や）や、細胞増殖異常や、血管新生（例えば、眼内血管新生疾患）に関連する症状の治療のために使用されます。特別に、これらの抗体またはその部分は抗ＶＥＧＦ治療法との協力及び／または抗ＶＥＧＦ治療に抵抗する治療に使用されます。【０５２５】血管新生は多種の障害の病因にかかわります。これらの不調には、固形腫瘍と腫瘍転移や、動脈硬化や、後水晶体線維形成や、血管腫や、慢性炎症や、増殖網膜症（例えば糖尿病網膜症）など眼内血管新生疾患や、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）や、血管新生緑内障や、移植された角膜組織及びほかの組織の免疫拒絶や、関節リウマチや、乾癬などがあります。
ＦｏｌｋｍａｎなどのＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１０９３１−３４（１９９２）；ＫｌａｇｓｂｒｕｎなどのＡｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５３：２１７−３９（１９９１）；Ｇａｒｎｅｒ  Ａ．、眼疾病理生物学における「血管疾患」、動態方法、Ｇａｒｎｅｒ  Ａ．、Ｋｌｉｎｔｗｏｒｔｈ  ＧＫ、ｅｄｓ．、第二版（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ、１９９４）、ページ１６２５−１７１０。【０５２６】腫瘍成長の場合、血管新生は増生から新生物までの推移にも、腫瘍の生長と転移に栄養を提供することにも肝心みたいであります。Ｆｏｌｋｍａｎなどの自然３３９：５８（１９８９）。血管新生は腫瘍細胞が正常細胞と比べて生長優勢と増殖自主性を獲得することを許します。腫瘍は普通単一の異常細胞から始まります。毛細血管床から遠く離れているから、この異常細胞は幾つ立方ミリメートルのサイズまでしか増殖できなく、生長も散布もなく「睡眠状態」に長い間に渡って留まっています。後で一部の腫瘍細胞は血管新生表現型に変わって内皮細胞を活性化します。これらの内皮細胞は新しい毛細血管まで増殖し成熟します。新しく形成されたこれらの血管は初期腫瘍の引き続ける生長をも、転移性腫瘍細胞の散布と再繁殖をも許します。従って、腫瘍薄片における微小血管の密度と乳癌及びいくつかのほかの腫瘍に掛かる患者の生き残りとの相互関係が分かりました。ＷｅｉｄｎｅｒなどのＮ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２４：１−６（１９９１）；Ｈｏｒａｋなどのランセット３４０：１１２０−２４（１９９２）；Ｍａｃｃｈｉａｒｉｎｉなどのランセット３４０：１４５−４６（１９９２）。血管新生のスイッチをコントロールするメカニズムはまだ判明していませんが、多数の血管新生刺激物と抑制物とのネットバランスから腫瘍塊の血管新生が生じると信じられます（Ｆｏｌｋｍａｎ、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１（１）：２７−３１（１９９５））。
それに加えて、これらの抗体またはその部分は非腫瘍異常の治療に使用されます。非腫瘍異常は望まれないまたは異常肥大や、関節炎や、リウマチ関節炎（ＲＡ）や、乾癬や、乾癬性歯垢や、類肉腫症や、動脈硬化や、動脈硬化性歯垢や、心筋梗塞による浮腫や、糖尿病と増殖網膜症（早期網膜症）や、後水晶体線維形成や、血管新生緑内症や、加齢黄斑変性や、糖尿病黄斑浮腫や、角膜血管新生や、角膜移植血管新生や、角膜移植拒絶や、網膜／脈絡血管新生や、隅角血管新生（虹彩）や、眼血管新生疾患や、血管再狭窄や、脳動静脈畸形（ＡＶＭ）や、髄膜腫や、血管腫や、血管線維腫や、甲状腺肥大や（グレーブス病を含み）や、角膜及びほかの組織移植や、慢性炎症や、肺炎や、急性肺損傷／ＡＲＤＳや、敗血症や、初期肺高血圧や、悪性肺液浸出や、脳浮腫（例えば、急性発作／閉塞性頭部損傷／創傷に関わる場合）や、滑膜性炎症や、ＲＡ内のパンヌス形成や、骨化性筋炎や、肥大骨形成や、変形性関節症（ＯＡ）や、難治性腹水や、多嚢胞性卵巣症候群や、子宮内膜症や、液体病の第三間隔（膵炎や、隔壁腔症候群や、火傷や、大腸疾患や）や、子宮筋腫や、早産や、ＩＢＤ（クローン病と潰瘍性大腸炎）などの慢性炎症や、同種移植腎拒絶や、炎症性大腸疾患や、ネフローゼ症候群や、望まれないまたは異常組織塊生長（非癌）や、肥満や、脂肪組織塊生長や、血友病関節や、肥大傷跡や、髪成長抑制や、オースラ−ウェバー症候群や、化膿性肉芽腫後水晶体線維形成や、強皮症や、トラコーマや、血管癒着や、滑膜炎や、皮膚炎や、子癇前症や、腹水や、心膜液浸出（例えば、芯膜炎に関わり）や、肋膜液浸出などを含みます。
ここで提供された抗体はＤＬＬ４活性を調節しますので、ＤＬＬ４の発見または活性に関連する疾患や症状やの治療にも使われることができます。このような抗体は、生殖細胞セグメントからなる塩基配列によりコード化されたＶＨチェーンとＶＬチェーンを持っている抗体、またはそれから最適化された抗体を含みます。その一例はＦａｂ抗体であります。この抗体はさらに定常域を含みます。この抗体はＤＤＬ４と結合親和力を持つ抗体を含みます。このＤＤＬ４は１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍまたはその以下であり、特にナノモルまたはサブナノモルと合親和力を持っています。【０５２７】ここで提供された抗ＤＬＬ４はＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２および／またはＣＤＲＬ３．例えば、ＣＤＲＨ１はＧＹＴＦＴＳＹＹＭＨ（アミノ酸２６−３５配列同一性番号：１５１３）；ＣＤＲＨ１はＧＹＳＦＴＳＹＷＩＧ（アミノ酸２６−３５配列同一性番号：１８０３）；ＣＤＲＨ１はＧＤＳＶＳＳＮＳＡＡＷＮ（アミノ酸２６−３７配列同一性番号：１８１２）；ＣＤＲＨ１はＧＧＳＦＳＧＹＹＷＳ（アミノ酸２６−３５配列同一性番号：１７７９）；ＣＤＲＨ１はＧＹＴＦＴＳＹＡＭＨ（アミノ酸２６−３５配列同一性番号：１４９４）；ＣＤＲＨ１はＧＹＴＦＴＳＹＤＩＮ（アミノ酸２６−３５配列同一性番号：１５３７）；ＣＤＲＨ１はＧＧＳはＳＧＧＹＹＷＳ（アミノ酸２６−３７配列同一性番号：１７６１）；ＣＤＲＨ２はＩＩＮＰＳＧＧＳＴＳＹＡＱＫＦＱＧ（アミノ酸５０−６６配列同一性番号：１５１３）；ＣＤＲｈ２はＩＩＹＰＧＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧ（アミノ酸５０−６６配列同一性番号：１８０３）；ＣＤＲＨ２はＲＴＹＹＲＳＫＷＹＮＤＹＡＶＳＶＫＳ（アミノ酸５２−６９配列同一性番号：１８１２）；ＣＤＲＨ２はＥＩＮＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（アミノ酸５０−６５配列同一性番号：１７７９）；ＣＤＲＨ２はＷＳＮＡＧＮＧＮＴＫＹＳＱＥＦＱＧ（アミノ酸５０−６６配列同一性番号：１４９４）；ＣＤＲＨ２はＷＭＮＰＮＳＧＮＴＧＹＡＱＫＦＱＧ（アミノ酸５０−６６配列同一性番号：１５３７）；ＣＤＲＨ２は（アミノ酸５２−６７配列同一性番号：１７６１）；ＣＤＲＨ３はＥＥＹＳＳＳＳＡＥＹＫＱＨ（アミノ酸９９−１１１配列同一性番号：１５１３）；ＣＤＲＨ３はＲＧＹＳＹＧＹＤＹＦＤＹ（アミノ酸９９−１１０配列同一性番号：１８０３）；ＣＤＲＨ３はＥＹＹＤＦＷＳＧＹＹＴＤＹＦＤ（アミノ酸１０２−１１７配列同一性番号：１８１２）；ＣＤＲＨ３はＥＧＹＳＳＳＷＹＤＹＦＤＹ（アミノ酸９９−１１１配列同一性番号：１５１２）；ａ  ＣＤＲＨ３はＡＮＷＧＤＹＦＤＹ（アミノ酸８９−１０６配列同一性番号１７７９）；ＣＤＲＨ３はＡＮＷＧＹＷＹＦＤＬ（アミノ酸９９−１０８配列同一性番号：１５１４）；ＣＤＲＨ３はＤＤＹＧＧＮＳＤＹＦＤＹ（アミノ酸９９−１１０配列同一性番号：１４９４）；ＣＤＲＨ３はＥＧＹＣＳＧＧＳＣＹＳＹＷＹＦＤＬ（アミノ酸９９−１１５配列同一性番号：１５０８）；ＣＤＲＨ３はＥＹＹＹＧＳＧＳＹＹＮＤＹＦＤＹ（アミノ酸９９−１１４配列同一性番号：１５０９）；ＣＤＲＨ３はＧＧＹＣＳＳ���ＳＣＹＡＤＹＹＹＹＹＧＭＤＶ（アミノ酸９９−１１９配列同一性番号：１５３７）；ＣＤＲＨ３はＥＧＹＣＳＧＧＳＣＹＳＹＷＹＦＤＬ（アミノ酸１００−１１６配列同一性番号：１７６１）；ＣＤＲＬ１はＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡ（アミノ酸２４−３４配列同一性番号：１８５０）；ＣＤＲＬ１はＧＬＳＳＧＳＶＳＴＳＹＹＰＳ（アミノ酸２３−３６配列同一性番号：１８８１）；ＣＤＲＬ１はＴＬＲＳＧＩＮＬＧＳＹＲＩＦ（アミノ酸２３−３６配列同一性番号：１８８４）；ＣＤＲＬ１はＲＡＳＱＳＶＳＳＮＬＡ（アミノ酸２４−３４配列同一性番号：１８４３）；ＣＤＲＬ１はＲＡＳＱＧはＳＷＬＡ（アミノ酸２４−３４配列同一性番号：１８４９）；ＣＤＲＬ１はＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（アミノ酸２４−３５配列同一性番号：１８３３）；ＣＤＲＬ１はＲＡＳＱＳはＳＷＬＡ（アミノ酸２４−３４配列同一性番号：１８４１）；ＣＤＲＬ１はＲＳＳＱＳＬＬＤＳＤＤＧＮＴＹＬＤ（アミノ酸２４−４０配列同一性番号：１８５３）；ＣＤＲＬ１はＴＧＴＳＳＤＶＧＧＹＮＹＶＳ（アミノ酸２３−３６配列同一性番号：１８６４）；ＣＤＲＬ１はＴＬＳＳＤＬＳＶＧＧＫＮＭＦ（アミノ酸２３−３６配列同一性番号：１８８６）；ＣＤＲＬ２はＤＡＳＮＲＡＴ（アミノ酸５０−５６配列同一性番号：１８５０）；ＣＤＲＬ２はＳＴＮＴＲＳＳ（アミノ酸５２−５８配列同一性番号：１８８１）；ＣＤＲＬ２はＹＹＳＤＳＳＫ（アミノ酸５２−５８配列同一性番号：１８８４）；ＣＤＲＬ２はＧＡＳＴＲＡＴ（アミノ酸５０−５６配列同一性番号：１８４３）；ＣＤＲＬ２はＡＡＳＳＬＱＳ（アミノ酸５０−５６配列同一性番号：１８４９）；ＣＤＲＬ２はＧＡＳＳＲＡＴ（アミノ酸５１−５７配列同一性番号：１８３３）；ＣＤＲＬ２はＤＡＳＳＬＥＳ（アミノ酸５０−５６配列同一性番号：１８４１）；ＣＤＲＬ２はＴＬＳＹＲＡＳ（アミノ酸５６−６２配列同一性番号：１８５３）；ＣＤＲＬ２はＥＶＳＮＲＰＳ（アミノ酸５２−５８配列同一性番号：１８６４）；ＣＤＲＬ２はＨＹＳＤＳＤＫ（アミノ酸５２−５８配列同一性番号：１８８６）；ＣＤＲＬ３はＱＱＲＳＮＷＰＰＷＴ（アミノ酸８９−９８配列同一性番号：１８５０）；ＣＤＲＬ３はＶＬＹＭＧＳＧはＹＶ（アミノ酸９１−１０１配列同一性番号：１８８１）；ＣＤＲＬ３はＭＩＷＨＳＳＡＳＦＶ（アミノ酸９７−１０６配列同一性番号：１８８４）；ＣＤＲＬ３はＱＱＹＮＮＷＰＰＷＴ（アミノ酸８９−９８配列同一性番号：１８４３）；ＣＤＲＬ３はＱＱＡＮＳＦＰＰＷＴ（アミノ酸８９−９８配列同一性番号：１８４９）；ＣＯＲＬ３はＱＱＹＧＳＳＰＰＷＴ（アミノ酸９０−９９配列同一性番号：１８３３）；ＣＤＲＬ３はＱＱＹＮＳＹＳＰＷＴ（アミノ酸８９−９８配列同一性番号：１８４１）；ＣＤＲＬ３はＭＱＲＩＥＦＰＳＷＴ（アミノ酸９５−１０４配列同一性番号：１８５３）；ＣＤＲＬ３はＳＳＹＴＳＳＳＴＬＦＶ（アミノ酸９１−１０１配列同一性番号：１８６４）；ＣＤＲＬ３はＱＶＹＥＳＳＡＮＦＶ（アミノ酸８９−９８配列同一性番号：１８８６）であるＣＤＲをせめて一つ持っている抗体を含みます。以上の各ＣＤＲに対して６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％���９６％、９７％、９８％、９９％又はその以上の配列同一性を示したＣＤＲもここで提供されます。【０５２８】例えば、ＤＬＬ４の活性を調節する抗体は、ＶＨ生殖細胞セグメントやＤＨ生殖セグメントやＪＨ生殖セグメントなどからなる生殖細胞成分を含めた塩基配列によりコード化されたＶＨチェーンを含めた抗体を含みます。ＶＨ生殖細胞セグメントは以下のものを含みます。ＩＧＨＶ１（例えば、配列同一性番号１０−４３により規定されたもの）；ＩＧＨＶ４（例えば、配列同一性番号１５３−２２４により規定されたもの）；ＩＧＨＶ５（例えば、配列同一性番号２２５−２３２により規定されたもの）またはＩＧＨＶ６（例えば、配列同一性番号２３３または２３４により規定されたもの）。ＤＨ生殖細胞セグメントは以下の物を含みます。ＩＧＨＤ６（例えば、配列同一性番号２６８−２７１により規定されたもの）；ＩＧＨＤ５（例えば、配列同一性番号２６４−２６７に規定されたもの）；ＩＧＨＤ４（配列同一性番号２６０−２６３により規定されたもの）；ＩＧＨＤ２（配列同一性番号２４４−２５１により規定されたもの）；ＩＧＨＤ３（例えば配列同一性番号２５２−２５９により規定されたもの）；ＩＧＨＤ６（配列同一性番号２６８−２７１により規定されたもの）；ＩＧＨＤ７（配列同一性番号２７２により規定されたもの）；ＪＨ生殖細胞セグメントは以下のものを含みます。ＩＧＨＪ１（配列同一性番号２７３により規定されたもの）；ＩＧＨＪ２（配列同一性番号２７４により規定されたもの）；ＩＧＨＪ４（配列同一性番号２７７−２７９により規定されたもの）；ＩＧＨＪ６（配列同一性番号２８２−２８５により規定されたもの）。これらの抗体はＶκ生殖細胞セグメントや、Ｊκ生殖細胞セグメントや、Ｖλ生殖細胞セグメントや、Ｊλ生殖細胞セグメントからなる生殖細胞成分を含めた塩基配列によりコード化されたＶＬチェーンを含めた抗体を含みます。Ｖκ生殖細胞セグメントは以下のものを含みます。ＩＧＫＶ１（例えば、配列同一性番号２８６−３１６により規定されたもの）；ＩＧＫＶ２（例えば、配列同一性番号３１７−３３１により規定されたもの）；ＩＧＫＶ３（例えば、配列同一性番号３３２−３５０により規定されたもの）。Ｊκ生殖細胞セグメントはＩＧＫＪ１（例えば、３５６により規定されたもの）であります。Ｖλ生殖細胞セグメントは以下のものを含みます。ＩＧＬＶ２（例えば、配列同一性番号３８０−３９９により規定されたもの）；ＩＧＬＶ８（例えば、配列同一性番号４３６−４３８により規定されたもの）；ＩＧＬＶ１１（例えば、配列同一性番号３７９により規定されたもの）；ＩＧＬＶ５（例えば、配列同一性番号４２４−４３１により規定されたもの）。【０５２９】Ｊλ生殖細胞セグメントはＩＧＬＪ１（例えば、配列同一性番号４４２により規定されたもの）またはＩＧＬＪ４（例えば、配列同一性番号４４６により規定されたもの）であります。このような抗体は上述の生殖セグメントの異形である生殖セグメントを含む塩基配列によりコード化された抗体をも含みます。異形の原因は、保守突然変異または他の塩基突然変異であります。ただし、条件は生じられた抗体は機能性または生産性の抗体である上にＤＬＬ４と結合することであり、それに／または機能活性を調節することであります。【０５３０】ＤＬＬ４に反する典型的な抗体はＶＨチェーンが以下のＶＨ生殖細胞セグメントからなる塩基配列によりコード化された場所である抗体を含みます。ＩＧＨＶ１−３（例えばＩＧＨＶ１−３＊０１、ＩＧＨＶ１−３＊０２）、ＩＧＨＶ１−８＊０１、ＩＧＨＶ１−４６（例えばＩＧＨＶ１−４６＊０１、ＩＧＨＶ１−４６＊０２やＩＧＨＶ１−４６＊０３）、ＩＧＨＶ４−３１（例えばＩＧＨＶ４−３１＊０１、ＩＧＨＶ４−３１＊０２、ＩＧＨＶ４−３１＊０３、ＩＧＨＶ４−３１＊０４、ＩＧＨＶ４−３１＊０５、ＩＧＨＶ４−３１＊０６、ＩＧＨＶ４−３１＊０７、ＩＧＨＶ４−３１＊０８、ＩＧＨＶ４−３１＊０９、ＩＧＨＶ４−３１＊１０）、ＩＧＨＶ４−３４（例えばＩＧＨＶ４−３４＊０１、ＩＧＨＶ４−３４＊０２、ＩＧＨＶ４−３４＊０３、ＩＧＨＶ４−３４＊０４、ＩＧＨＶ４−３４＊０５、ＩＧＨＶ４−３４＊０６、ＩＧＨＶ４−３４＊０７、ＩＧＨＶ４−３４＊０８、ＩＧＨＶ４−３４＊０９、ＩＧＨＶ４−３４＊１０、ＩＧＨＶ４−３４＊１１、ＩＧＨＶ４−３４＊１２、ＩＧＨＶ４−３４＊１３）、ＩＧＨＶ５−５１（例えば、ＩＧＨＶ１−５−５１＊０１、ＩＧＨＶ１−５−５１＊０２、ＩＧＨＶ１−５−５１＊０３、ＩＧＨＶ１−５−５１＊０４やＩＧＨＶ１−５−５１＊０５）やはＩＧＨＶ６−１（例えばＩＧＨＶ６−１＊０１やＩＧＨＶ６−１＊０２）；であるＶＨ生殖細胞セグメントや、ＩＧＨＤ２−２、（例えばＩＧＨＤ２−２＊０１、ＩＧＨＤ２−２＊０２）、ＩＧＨＤ２−１５＊０１、ＩＧＨＤ４−２３＊０１、ＩＧＨＤ６−６（例えばＩＧＨＤ６−６＊０１）、ＩＧＨＤ６−１３＊０１、ＩＧＨＤ５−１８（例えばＩＧＨＤ５−１８＊０１）、ＩＧＨＤ３−３（例えばＩＧＨＤ３−３＊０１やＩＧＨＤ３−３＊０２）、ＩＧＨＤ３−１０（例えばＩＧＨＤ３−１０＊０１、ＩＧＨＤ３−１０＊０２）、やＩＧＨＤ７−２７＊０１；とＪＨ生殖細胞系列のセグメントそのはＩＧＨＪ１＊０１、ＩＧＨＪ２＊０１、ＩＧＨＪ４＊０１、ＩＧＨＪ４＊０２、ＩＧＨＪ４＊０３、やＩＧＨＪ６（例えばＩＧＨＪ６＊０１、ＩＧＨＪ６＊０２、ＩＧＨＪ６＊０３、ＩＧＨＪ６＊０４）。であるＤＨ生殖細胞セグメントや、ＩＧＨＪ１＊０１であるＪＨ生殖細胞セグメントであります。ＶＬチェーンは以下の生殖細胞セグメントからなる塩基配列によりコード化されます。ＩＧＫＶ１−５（例えばＩＧＫＶ１−５＊０１、ＩＧＫＶ１−５＊０２、ＩＧＫＶ１−５＊０３）、ＩＧＫＶ１−１２（例えばＩＧＫＶ１−１２＊０１、ＩＧＫＶ１−１２＊０２）、ＩＧＫＶ２−Ｄ−４０＊０１、ＩＧＫＶ３−１１（例えばＩＧＫＶ３−１１＊０１やＩＧＫＶ３−１１＊０２）、ＩＧＫＶ３−１５＊０１、ＩＧＫＶ３−２０（例えばＩＧＫＶ３−２０＊０１、ＩＧＫＶ３−２０＊０２）であるＶκ生殖細胞セグメントや、ＩＧＫＪ１＊０１であるＪκ生殖細胞セグメントや、ＩＧＬＶ２−１４（例えばＩＧＬＶ２−１４＊０１、ＩＧＬＶ２−１４＊０２、ＩＧＬＶ２−１４＊０３、ＩＧＬＶ２−１４＊０４）、ＩＧＬＶ８−６１（例えばＩＧＬＶ８−６１＊０１、ＩＧＬＶ８−６１＊０２やＩＧＬＶ８−６１＊０３）、ａ��  ＩＧＬＶ５（例えばＩＧＬＶ５−４８＊０１）、やＩＧＬＶ１１−５５＊０１であるＶλ、生殖細胞セグメントや、ＩＧＬＪ１＊０１又はＩＧＬＪ４＊０１であるＪλ生殖細胞セグメントであります。ＤＬＬ４活性を調節する、ここで提供された典型的な抗体は表１８Ｄにより規定されます。【０５３１】
【表１８Ｄ】
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0005882058.tif 000168
【０５３２】ここで提供された抗ＤＬＬ４抗体は確認された抗ＤＤＬ４生殖細胞ヒットと比べて最適化されました。これらの抗体は確認された生殖細胞ヒットと比べて、ＶＨにおける一つまたはその以上の突然変異、及び／またはＶＬにおける一つまたはその以上の突然変異を含みます。例えば、対応する抗体生殖細胞ヒットと比べて、これらの抗体は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはその以上のアミノ酸置換を含めることができます。突然変異はＶＨチェーンにおいて起こる可能性があります。例えば、ＶＨ、ＤＨまたはＪＨ域の一つまたはその以上のアミノ酸残留分において。その代わりに、あるいはそれに加えて、突然変異はＶＬチェーンにおいて起こる可能性があります。例えば、ＶＬまたはＪＬ域のひとつまたはその以上のアミノ酸残留物において。一つ又はその以上の突然変異を含めた最適化された抗体は母抗体（例えば、変形を含めない生殖細胞ヒット）と比べて改良された活性を展示します。これらの最適化された抗体はＤＬＬ４標的蛋白質に対して改良された作動的なまたは拮抗的な機能活性を展示します。他の例において、最適化された抗体はＤＬＬ４との改良された結合親和力を示しました。一般的には、母抗体（例えば、変形を含まない生殖細胞ヒット）と比べて、活性または結合親和力は１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８−倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００−ｆｏｌｄ倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍まで、またはその以上まで増えます。【０５３３】例えば、これらの例に見るように、ここで提供された最適化された抗ＤＬＬ４抗体は、母抗体と比べて、１００倍以上まで向上した結合親和力を示しました。このような抗体はナノモルの親和力を示します。【０５３４】例えば、ここで提供された最適化された抗ＤＬＬ４抗体は抗ＤＬＬ４ヒットのＶＨチェーンにおいて一つ又はその以上の変形を含みます。例に挙げれば、配列同一性番号１４９４、１５０８−１５０９、１５１２−１５１３、１５３７、１７６１、１７７９、１８０３、１８１２により規定されたものであります。一つの例において、一つ又はその以上の変形はＤＨ域の変形を含みます。例えば、ここで提供された抗ＤＬＬ４抗体は、配列同一性番号３７３６に規定されたアミノ酸残留物に対応する（配列同一性番号１８０３に規定された抗ＤＬＬ４ヒットのＶＨチェーンにより規定されたアミノ酸残留物Ｇ１００及び／又はＧ１０４にも対応する）Ｇ１及び／又はＧ５の位置における変形を含むＤＨ域をコード化するＩＧＨＤ５−１８＊０１の変形体からなる生殖細胞セグメントを含むＶＨチェーンを含むことができます。変形は他の任意のアミノ酸残留物に対するものであり、特にリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、トレオニン（Ｔ）であります。
典型的な変形は配列同一性番号３７３６により規定されたＤＨ域におけるアミノ酸置換に対応するＧ１Ｋ、Ｇ１Ｒ及び／又はＧ５Ｔであります（配列同一性番号１８０３により規定された抗ＤＬＬ４ヒットのＶＨチェーンにおけるアミノ酸置換Ｇ１００Ｋ、Ｇ１００Ｒ及び／又はＧ１０４Ｔにも対応します）。例えば、ここで提供された抗ＤＬＬ４抗体は、配列同一性番号３７３７に規定されたアミノ酸残留物に対応する（配列同一性番号１５１３に規定された抗ＤＬＬ４ヒットのＶＨチェーンにより規定されたアミノ酸残留物Ｓ１０２、Ｓ１０３及び／またはＳ１０４にも対応します）Ｓ３、Ｓ４及び／またはＳ５の位置における変形を含むＤＨ域をコード化するＩＧＨＤ６−６＊０１の変形体からなる生殖細胞セグメントを含むＶＨチェーンを含むことができます。変形は他の任意のアミノ酸残留物に対するものであり、特にアラニン（Ａ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）であります。このような変形の例は配列同一性番号３７３７により規定されたＤＨ域におけるアミノ酸置換に対応するＳ３Ａ、Ｓ４Ｐ、Ｓ５Ｆ及び／又はＳ５Ａであります（配列同一性番号１５１３により規定された抗ＤＬＬ４ヒットのＶＨチェーンにおけるアミノ酸置換Ｓ１０２Ａ、Ｓ１０３Ｐ、Ｓ１０４Ｆ及びＳ１０４Ａにも対応します）。【０５３５】それに加えて、ここで提供された最適化された抗ＤＬＬ４抗体は抗ＤＬＬ４ヒットのＶＨチェーンのＪＨ域における一つ又はその以上の変形を含みます。例えば、ここで提供された抗ＤＬＬ４抗体は、配列同一性番号３７３８に規定されたアミノ酸残留物に対応するＨ６の位置における変形を含むＪＨ域をコード化するＩＧＨＪ＊０１の変形体からなる生殖細胞セグメントを含むＶＨチェーンを含むことができます（配列同一性番号１５１３に規定された抗ＤＬＬ４ヒットのＶＨチェーンにおけるアミノ酸残留物Ｈ１１１にも対応します）。変形は他の任意のアミノ酸残留物に対するものであり、特にフェニルアラニン（Ｆ）又はチロシン（Ｙ）であります。
典型的な変形は配列同一性番号３７３８により規定されたＪＨ域におけるアミノ酸置換に対応するＨ６Ｆ及びＨ６Ｙであります（配列同一性番号１５１３により規定された抗ＤＬＬ４ヒットのＶＨチェーンのＪＨ域におけるアミノ酸置換Ｈ１１１Ｆ及びＨ１１１Ｙにも対応します）。表１８Ｅにリストされたのは抗ＤＬＬ４ヒットのＶＨチェーンのＪＨ域における一つ又はその以上の変形を含む典型的な抗ＤＬＬ４抗体の変形体であります。【０５３６】ここで提供された最適化された抗ＤＬＬ４抗体はＶＬチェーンにおける一つ又はその以上のアミノ酸変形をも含みます。例えば、ここで提供された最適化された抗ＤＬＬ４抗体は、抗ＤＬＬ４ヒットのＶＨチェーンのＶκ域における一つ又はその以上の変形を含みます。例えば、ここで提供された抗ＤＬＬ４抗体は、配列同一性番号３７３９に規定されたアミノ酸残留物に対応するＳ２８、Ｓ３０及び／又はＳ３の位置における変形を含むＶκ域をコード化するＩＧＫＶ３−１１の変形体（例えば、ＩＧＫＶ３−１１＊０１又はＩＧＫＶ３−１１＊０２）からなる生殖細胞セグメントを含むＶＬチェーンを含むことができます（配列同一性番号１８５０に規定された抗ＤＬＬ４ヒットのＶＬチェーンにおけるアミノ酸残留物Ｓ２８、Ｓ３０及び／又はＳ３１にも対応します）。変形は他の任意のアミノ酸残留物に対するものであり、特にプロリン（Ｐ）、アスパラギン（Ｎ）、リシン（Ｋ）であります。典型的な変形は配列同一性番号３７３９により規定されたＶκ域におけるアミノ酸置換に対応するＳ２８Ｐ、Ｓ３０Ｎ及び／又はＳ３１Ｋであります（配列同一性番号１８５０により規定された抗ＤＬＬ４ヒットのＶＬチェーンのＶκ域におけるアミノ酸置換Ｓ２８Ｐ、Ｓ３０Ｎ及び／又はＳ３１Ｋにも対応します）。表１８Ｅにリストされたのは抗ＤＬＬ４ヒットのＶＬチェーンのＶκ域における一つ又はその以上の変形を含む典型的な抗ＤＬＬ４抗体の変形体であります。【０５３７】
【表１８Ｅ】
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0005882058.tif 000170
【０５３８】ｉｉ．ＥｒｂＢ族
ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、ＨＥＲ２／ｃ−ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ−３）及びＨｅｒ４（ＥｒｂＢ−４）を含むグループＩレセプターチロシン・キナーゼは、上皮細胞の、間葉細胞の及び神経細胞の組織において広く発見され、増殖と差異化において根本的な役割をします。彼らは様々にレセプターと結合する一族のリガンドにより活性化されます。例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子アルファー（ＴＧＦ−ａｌｐｈａ）、アンフィレグリンはＥｒｂＢ１と結合しますが、他のレセプターとは結合しません。ニューレグリンはＥｒｂＢ３及びＥｒｂＢ４に結合します。最後に、ｂ−セルリン（ＢＴＣ）、ヘパリン結合ＥＧＦ、エピレグリンはＥｒｂＢ１及びＥｒｂＢ４に結合します。ＥｒｂＢ２は特徴付けのリガンドを持っていませんが、他のＥｒｂＢ族のメンバーと一緒にヘテロ二量体化により転送される間にホモ二量体化により活性化されることができます。【０５３９】ａ）上皮成長因子レセプター
（ＥＧＦＲ）
上皮成長因子レセプター（配列同一性番号２０００により規定されたＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−１、人体におけるＨＥＲ１）は、細胞外蛋白質リガンドの上皮成長因子族（ＥＧＦ族）の成員を受け入れる細胞表面レセプターであります。リガンド上皮成長因子（ＥＧＦ）と結合したら、ＥＧＦＲは二量体化し、その固有細胞内蛋白質チロシン・キナーゼ活性を刺激します。この自己リン酸化は幾つかのほかの蛋白質による下流活性化とシグナリングを誘発します。これらの蛋白質は自分のホスホチロシン結合ＳＨ２ドメインを通じてリン酸化チロシンに関連します。これらの下流シグナリング蛋白質はＭＡＰＫやＡｋｔやＪＮＫ経路など幾つかのシグナル転換カスケードを始め、ＤＮＡ合成及び細胞増殖を引き起こします。これらの蛋白質は細胞変形、癒着、増殖など表現型を調節します。そのゆえ、ＥＧＦＲ発見または活性に影響を及ぼした変形は癌を引き起こします。
ＥＧＦＲの向上調節は間違った癌予知に関連します。ＥＲＢＩＴＵＸ▲Ｒ▼（セツキシマブ）は大腸直腸及び／又は頭頚部腫瘍の治療に対して認可されたキメラ型モノクローナル抗体であります。ＥＲＢＩＴＵＸ▲Ｒ▼はＥＧＦＲに結合し、ＤＮＡ合成及び細胞増殖に関連する細胞内シグナリングを防止します。ＶＥＣＴＩＢＩＸ▲Ｒ▼（パニツムマブ）はＥＧＦＲ発見の転移性結腸直腸癌の治療に対して認可された完全人モノクローナル抗体であります。ＥＲＢＩＴＵＸ▲Ｒ▼もＶＥＣＴＩＢＩＸ▲Ｒ▼も、単独にせよ、化学療法薬と共同にせよ、使用されます。【０５４０】ここで提供された抗体ライブラリーはえり分けられ、ＥＧＦＲとの結合及び／又は機能活性の測定により活性を調節することができます。機能活性はシグナル転換や細胞変形や癒着や増殖などを含みます。ＥＧＦリガンドが存在してもしなくても、機能測定が行われることができます。例１３はＥＧＦＲと結合する抗体を選択しまたは確認するためにここで提供された抗体ライブラリーをえり分けるような結合分析を例示します。【０５４１】ここで提供されたライブラリーから確認された、ＥＧＦＲ活性を調節する抗体又はその部分は、ＥＧＦＲの発見及び／又は活性に関連する疾患症状の治療又は予防のために使用されることができます。例えば、これらの抗体又はその部分は、各種類の癌の治療のために使用されることができます。神経膠芽腫や、頭頚部腫瘍や、膵臓癌や、大腸直腸癌や、肺癌や、神経系統癌や、胃腸癌や、前立腺癌や、卵巣癌や、乳癌や、悪性腎臓腫瘍や、網膜癌や、皮膚癌や、肝癌や、泌尿生殖器癌や、膀胱癌や、肺腺癌や肺扁平上皮癌や非小細胞肺癌などの肺癌を含みますがそれらに限りません。【０５４２】ここで提供された抗体はＥＧＦＲ活性を調節しますので、ＥＧＦＲの発見または活性に関連する疾患や症状やの治療にも使われることができます。このような抗体は、生殖細胞セグメントからなる塩基配列によりコード化されたＶＨチェーンとＶＬチェーンを持っている抗体、またはそれから最適化された抗体を含みます。その一例はＦａｂ抗体であります。この抗体はさらに定常域を含みます。この抗体はＥＧＦＲと結合親和力を持つ抗体を含みます。このＥＧＦＲは１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍまたはその以下であり、ナノモルまたはサブナノモルと結合親和力を持っています。【０５４３】ここで提供された抗ＥＧＦＲ抗体はＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及び／又はＣＤＲＬ３であるＣＤＲをせめて一つ持っている抗体を含みます。例えば、ＣＤＲＨ１はＧＹＴＦＴＳＹＹＭＨ（配列同一性番号１５０８によるアミノ酸２６−３５）であります、ＣＤＲＨ２はＩＩＮＰＳＧＧＳＴＳＹＡＱＫＦＱＧ（アミノ酸５０−６６配列同一性番号：１５０８）、ＣＤＲＨ３はＥＧＹＣＳＧＧＳＣＹＳＹＷＹＦＤＬ（アミノ酸９９−１１５配列同一性番号：１５０８）、ＣＤＲＨ３はＥＧＹＳＳＳＷＹＤＹＦＤＹ（アミノ酸９９−１１１配列同一性番号：１５１２）、ＣＤＲＬ１はＲＡＳＱＳＶＳＳＮＬＡ（アミノ酸２４−３４配列同一性番号：１８４３）、ＣＤＲＬ１はＲＡＳＱＳはＳＷＬＡ（アミノ酸２４−３４配列同一性番号：１８４１）、ＣＤＲＬ２はＧＡＳＴＲＡＴ（アミノ酸５０−５６配列同一性番号：１８４３）、ＣＤＲＬ２はＤＡＳＳＬＥＳ（アミノ酸５０−５６配列同一性番号：１８４１）、ＣＤＲＬ３はＱＱＹＮＮＷＰＰＷＴ（アミノ酸８９−９８配列同一性番号：１８４３）、やＣＤＲＬ３はＱＱＹＮＳＹＳＰＷＴ（アミノ酸８９−９８配列同一性番号：１８４１）。以上の各ＣＤＲに対して６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はその以上の配列同一性を示したＣＤＲもここで提供されます。【０５４４】例えば、ＥＧＦＲ活性を調節する抗体はＩＧＨＶ１（たとえば、配列同一性番号１−４３に規定されたもの）であるＶＨ生殖細胞セグメントからなる生殖細胞成分を含む延期配列によりコード化されたＶＨチェーンを含む抗体を含みます。またはＩＧＨＤ６（例えば、配列同一性番号２６８−２７１に規定されたもの）であるＤＨ生殖細胞セグメント、ＩＧＨＤ２（例えば、配列同一性番号２４４−２５１に規定されたもの）であるＪＨ生殖細胞セグメント、ＩＧＨＪ２（例えば、配列同一性番号２７４により規定されたもの）であるＪＨ生殖セグメント、ＩＧＨＪ４（例えば、配列同一性番号２７８または２７９により規定されたもの）である生殖セグメントであります。このような抗体はＩＧＫＶ１（配列同一性番号２８６−３１６により規定されたもの）またはＩＧＫＶ３（配列同一性番号３３２−３５０により規定されたもの）であるＶκ生殖細胞セグメントからなる生殖細胞成分を含む塩基配列によりコード化されたＶＬチェーンを含む抗体をも含みます。またはＩＧＫＪ１であるＪκ塩基セグメント（配列同一性番号３５６により規定されたもの）であります。このような抗体は上述の生殖セグメントの異形である生殖セグメントを含む塩基配列によりコード化された抗体をも含みます。【０５４５】異形の原因は、保守突然変異または他の突然変異であります。ただし、条件は生じられた抗体は機能性または生産性の抗体である上にＥＧＦＲと結合することであり、それに／または機能活性を調節することであります。
ＥＧＦＲに反する抗体の例はＶＨチェーンがＩＧＨＶ１−４６（例えば、ＩＧＨＶ１−４６＊０１、ＩＧＨＶ１−４６＊０２またはＩＧＨＶ１−４６＊０３）であるＶＨ生殖細胞セグメントからなる塩基配列によりコード化される場所である抗体であります。またはＩＧＨＤ２−１５（例えば、ＩＧＨＤ２−１５＊０１）であるＤＨ生殖細胞セグメント、ＩＧＨＪ２＊０１またはＩＧＨＪ４（例えば、ＩＧＨＪ４＊０１、ＩＧＨＪ４＊０２、ＩＧＨＪ４＊０３）であるＪＨ生殖セグメントであります。ＶＬチェーンはＩＧＫＶ１−５（例えばＩＧＫＶ１−５＊０１、ＩＧＫＶ１−５＊０２、ＩＧＫＶ１−５＊０３）又はＩＧＫＶ３−１５（例えば、ＩＧＨＶ３−１５＊０１）であるＶκ生殖細胞セグメントからなる塩基配列によりコード化されます。またはＩＧＫＪ１＊０１であるＪκ生殖細胞セグメントであります。ＥＧＦＲ活性を調節する、ここで提供された典型的な抗体は表１８Ｃにより規定されます。【０５４６】
【表１８Ｆ】
0005882058.tif 000171
【０５４７】ｂ）人間上皮成長因子レセプター２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）
ＨＥＲ２／ｎｅｕ（配列同一性番号１９９９により規定されたＥｒｂＢ−２）は、細胞成長及び差異化を引き起こすシグナル転換経路に通常に関わる細胞薄膜表面結合のレセプターチロシンキナーゼであります。ＥｒｂＢ−２はＥＧＦ族の何のものにも活性化されませんので、オーファン・レセプターだと思われています。しかしながら、ＥｒｂＢレセプターはリガンド結合の上に二量体化しますが、ＥｒｂＢ−２はＥｒｂＢ族のほかのメンバーに対して優先の二量体化パートナーであります。ＥｒｂＢ２はキナーゼ活性化及び細胞増殖を引き起こします。Ｅｒｂ８−２は乳癌の発病に関わりますから、治療の標的として注意すべきであります。実は、２５−３０％の初期乳癌にＥｒｂＢ−２蛋白質の過剰発現が見つかりました。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ▲Ｒ▼（トラスツズマブ）は組み合えＤＮＡから得る人モノクローナル抗体であり、選択的にＥｒｂＢ−２の細胞内ドメインに結合する乳癌の治療に使用されます。なので、ＥｒｂＢ−２はもう一つの蛋白質治療法における注目すべき標的であります。Ｃａｒｔｅｒなど、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４２８５−４２８９；アメリカパテント番号５、７２５、８５６をご参考に。【０５４８】ここで提供された抗体ライブラリーはえり分けられ、ＥｒｂＢ−２との結合及び／又は機能活性の測定により活性を調節することができます。機能活性はシグナル転換や細胞変形や癒着や増殖などを含みます。例えば、ＥｒｂＢ−２を発見する細胞は、抗体又はその部分がある場合又はない場合における増殖のために、測定されることができます。その代わりに、レポーターシステム測定は構築されることができます。それにより、蛍光素酵素のようなリポーター蛋白質の発見はＥｒｂＢ２の活性化を頼りにします（例えば、Ｕｅｄａなど、（２００４）Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７９：２４５０５−２４５１３をご参考に）。測定は、ＥｒｂＢ−２結合パートナーのリガンドであるＥＧＦ、ＴＧＦ又は他のＥｒｂＢリガンドがある場合に行われることができます。例１３はＥｒｂＢ−２と結合する抗体を選択しまたは確認するためにここで提供された抗体ライブラリーをえり分けるような結合分析を例示します。【０５４９】ここで提供されたライブラリーから確認された、ＥｒｂＢ−２活性を調整する抗体又はその部分は、ＥｒｂＢ−２の発見及び／又は活性に関連する疾患症状の治療又は予防のために使用されることができます。例えば、これらの抗体又はその部分は乳癌や卵巣癌や結腸癌や肺癌や前立腺癌など各種の癌のような増殖疾患の治療に使用されることができます。
ここで提供されたのはＥｒｂＢ−２の行動を調整する抗体であるから、ＥｒｂＢ−２の発見や行動に関わる病気または状況の治療に使用されます。この抗体は、生殖細胞系セグメントからなる塩基順列によりコード化されたＶＨチェーンとＶＬチェーンを有する抗体、またはそれから最適化された抗体を含みます。その一例はＦａｂ抗体であります。この抗体はさらに定常域を含みます。
この抗体はＥｒｂＢ−２と結合親和力を持つ抗体を含み、または１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍまたはその以下で、ナノモルまたはサブナノモルの結合親和力を持っています。
ここで提供された抗ＥｒｂＢ−２抗体はＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及び／またはＣＤＲＬ３であるＣＤＲをせめて一つ持っている抗体を含みます。例えば、ＣＤＲＨ１はＧＧＳはＳＧＧＹＹＷＳ（配列同一性番号１７６０によるアミノ酸２６−３７）であります、ＣＤＲＨ１はＧＹＴＦＴＳＹＹＭＨ（によるアミノ酸２６−３５配列同一性番号：１５１２）；ＣＤＲＨ１はＧＦＳＬＳＴＳＧＶＧＶＧ（によるアミノ酸２６−３７配列同一性番号：１５５９）；ＣＤＲＨ１はＧＧＴＦＳＳＹＡは（によるアミノ酸２６−３５配列同一性番号：１５２２）；ＣＤＲＨ２はＹＩＹＹＳＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳ（によるアミノ酸５２−６７配列同一性番号：１７６０）；ＣＤＲＨ２はＩＩＮＰＳＧＧＳＴＳＹＡＱＫＦＱＧ（によるアミノ酸５０−６６配列同一性番号：１５１２）；ＣＤＲＨ２はＬＩＹＷＮＤＤＫＲＹＳＰＳＬＫＳ（によるアミノ酸５２−６７配列同一性番号：１５５９）；ＣＤＲＨ２はＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧ（によるアミノ酸５０−６６配列同一性番号：１５２２）；ＣＤＲＨ３はＥＧＹＳＳＳＷＹＤＹＦＤＹ（によるアミノ酸１００−１１２配列同一性番号：１７６０）；ＣＤＲＨ３はＧＹＳＧＳＹＹＹＷＹＦＤＬ（によるアミノ酸９９−１１１配列同一性番号：１５１２）；ＣＤＲＨ３はＥＥＹＳＳＳＳＡＥＹＫＱＨ（によるアミノ酸９９−１１１配列同一性番号：１５１３）；ＣＤＲＨ３はＲＰＮＷＧＹＷＹＦＤＬ（によるアミノ酸１００−１１０配列同一性番号：１５５９）；ＣＤＲＨ３はＧＹＮＷＮＤＤＹＹＹＹＹＧＭＤＶ（によるアミノ酸９９−１１４配列同一性番号：１５２２）；ＣＤＲＬ１はＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（によるアミノ酸２４−３５配列同一性番号：１８３３）；ＣＤＲＬ１はＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＡ（によるアミノ酸２４−４０配列同一性番号：１８３８）；ＣＤＲＬ１はＲＡＳＱＳＶＳＳＮＬＡ（によるアミノ酸２４−３４配列同一性番号：１８４３）；ＣＤＲＬ１はＲＳＳＱＳＬＶＹＳＤＧＮＴＹＬＮ（によるアミノ酸２４−３９配列同一性番号：１８２８）；ＣＤＲＬ２はＧＡＳＳＲＡＴ（によるアミノ酸５１−５７配列同一性番号：１８３３）；ＣＤＲＬ２はＷＡＳＴＲＥＳ（によるアミノ酸５６−６２配列同一性番号：１８３８）；ＣＤＲＬ２はＧＡＳＴＲＡＴ（によるアミノ酸５０−５６配列同一性番号：１８４３）；ＣＤＲＬ２はＫＶＳＮＤＲＳ（によるアミノ酸５５−６１配列同一性番号：１８２８）；ＣＤＲＬ３はＱＱＹＧＳＳＰＰＷＴ（によるアミノ酸９０−９９配列同一性番号：１８３３）；ＣＤＲＬ３はＱＱＹＹＳＴＰＰＷＴ（によるアミノ酸９５−１０４配列同一性番号：１８３８）；ＣＤＲＬ３はＱＱＹＮＮＷＰＰＷＴ（によるアミノ酸８９−９８配列同一性番号：１８４３）；やＣＤＲＬ３はＭＱＧＴＨＷＰＰＷＴ（によるアミノ酸９４−１０３配列同一性番号：１８２８）。以上の各ＣＤＲに対して６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はその以上の配列同一性を示したＣＤＲもここで提供されます。【０５５０】例えば、ＥｒｂＢ−２活性を調節する抗体はＩＧＨＶ４（例えば、配列同一性番号１５３−２２４により規定されたもの）やＩＧＨＶ１（例えば、配列同一性番号１０−４３により規定されたもの）であるＶＨ生殖細胞セグメントからなる生殖細胞成分を含む塩基配列によりコード化されたＶＨチェーンを含む抗体を含みます。又はＩＧＨＤ６（例えば、配列同一性番号２６８−２７１により規定されたもの）やＩＧＨＤ１（例えば、配列同一性番号２３９−２４３によりきていされたもの）やＩＧＨＤ７（例えば、配列同一性番号２７２により規定されたもの）であるＤＨ生殖細胞セグメントや、ＩＧＨＪ１（例えば、配列同一性番号２７３により規定されたもの）や、ＩＧＨＪ２（例えば、配列同一性番号２７４により規定されたもの）や、ＩＧＨＪ４（例えば、配列同一性番号２７７−２７９により規定されたもの）や、ＩＧＨＪ６（例えば、配列同一性番号２８２−２８５により規定されたもの）であります。これらの抗体は、ＩＧＫＶ３（例えば、配列同一性番号３３２−３５０により規定されたもの）や、ＩＧＫＶ４（例えば、配列同一性番号３５１により規定されたもの）や、ＩＧＫＶ２（例えば、配列同一性番号３１７−３３１により規定されたもの）であるＶκ生殖細胞セグメントからなる生殖細胞成分を含む塩基配列によりコード化されたＶＬチェーンを含む抗体を含みます。又は、ＩＧＫＪ１（例えば、配列同一性番号３５６により規定されたもの）であるＪκ生殖細胞セグメントであります。このような抗体は上述の生殖セグメントの異形である生殖セグメントを含む塩基配列によりコード化された抗体をも含みます。異形の原因は、保守突然変異または他の突然変異であります。ただし、条件は生じられた抗体は機能性または生産性の抗体である上にＥｒｂＢ−２と結合することであり、それに／または機能活性を調整することであります。【０５５１】ＥｒｂＢ−２に対する典型的な抗体はＶＨチェーンが以下の生殖細胞系セグメントからなる塩基配列によりコード化される場所である抗体を含みます。ＩＧＨＶ４−３１（例えばＩＧＨＶ４−３１＊０１、ＩＧＨＶ４−３１＊０２、ＩＧＨＶ４−３１＊０３、ＩＧＨＶ４−３１＊０４、ＩＧＨＶ４−３１＊０５、ＩＧＨＶ４−３１＊０６、ＩＧＨＶ４−３１＊０７、ＩＧＨＶ４−３１＊０８、ＩＧＨＶ４−３１＊０９、ＩＧＨＶ４−３１＊１０）、ＩＧＨＶ１−４６（例えば、ＩＧＨＶ１−４６＊０１、ＩＧＨＶ１−４６＊０２、ＩＧＨＶ１−４６＊０３）、ＩＧＨＶ２−５（例えばＩＧＨＶ２−５＊０１、ＩＧＨＶ２−５＊０２；ＩＧＨＶ２−５＊０３、ＩＧＨＶ２−５＊０４、ＩＧＨＶ２−５＊０５、ＩＧＨＶ２−５＊０６、ＩＧＨＶ２−５＊０７、ＩＧＨＶ２−５＊０８、ＩＧＨＶ２−５＊０９、ＩＧＨＶ２−５＊１０）ＩＧＨＶ１−６９（例えばＩＧＨＶ１−６９＊０１、ＩＧＨＶ１−６９＊０２、ＩＧＨＶ１−６９＊０３、ＩＧＨＶ１−６９＊０４、ＩＧＨＶ１−６９＊０５、ＩＧＨＶ１−６９＊０６、ＩＧＨＶ１−６９＊０７、ＩＧＨＶ１−６９＊０８、ＩＧＨＶ１−６９＊０９、ＩＧＨＶ１−６９＊１０、ＩＧＨＶ１−６９＊１１、ＩＧＨＶ１−６９＊１２、ＩＧＨＶ１−６９＊１３）；であるＶＨ生殖細胞系セグメントや、ＩＧＨＤ６−６（例えばＩＧＨＤ６−６＊０１）、ＩＧＨＤ６−１３（例えばＩＧＨＤ６−１３＊��１）、ＩＧＨＤ１−２６（例えばＩＧＨＤ１−２６＊０１）、ＩＧＨＤ７−２７＊０１、やＩＧＨＤ１−１＊０１；であるＤＨ生殖細胞セグメントや、ＩＧＨＪ１＊０１、ＩＧＨＪ２＊０１、ＩＧＨＪ４（例えばＩＧＨＪ４＊０１、ＩＧＨＪ４＊０２、ＩＧＨＪ４＊０３）やＩＧＨＪ６（例えばＩＧＨＪ６＊０１、ＩＧＨＪ６＊０２、ＩＧＨＪ６＊０３、ＩＧＨＪ６＊０４）又はＩＧＨＪ６であるＪＨ生殖細胞系セグメントであります。ＶＬチェーンは以下の生殖細胞系セグメントからなる塩基配列によりコード化されます。ＩＧＫＶ３−２０（例えばＩＧＨＶ３−２０＊０１やＩＧＨＶ３−２０＊０２）、、ＩＧＫＶ４−１（例えば、ＩＧＫＶ４−１＊０１）、ＩＧＫＶ３−１５＊０１、又はＩＧＫＶ２−３０＊０１であるＶκ生殖細胞系セグメントや、ＩＧＫＪ１＊０１であるＪκ生殖細胞系セグメントであります。ＥｒｂＢ−２活性を調節する、ここで提供された典型的な抗体は表１８Ｇにより規定されます。【０５５２】
【表１８Ｇ】
0005882058.tif 000172
0005882058.tif 000173
【０５５３】ｉｉｉ．
ＩＧＦ−Ｒ１（インスリン様成長因子１レセプター）
インスリン様成長因子１レセプター（配列同一性番号２００７により規定されたＩＧＦ−Ｒ１）は、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）及びインスリン様成長因子２（ＩＧＦ−２）により活性化された膜組織貫通レセプターであります。インスリン様成長因子レセプター１の過剰発見は幾つかの癌細胞系及び腫瘍組織に見つかりました。ＩＧＦＲ１の過剰発見は４０％の乳癌細胞系に（Ｐａｎｄｉｎｉなど、（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５：１９３５をご参考に）、１５％の肺癌細胞系に見つかりました。乳癌腫瘍組織において、ＩＧＦＲ１は６−１４倍まで過剰発見され、正常の組織より２−４倍高いキナーゼ活性を示します（Ｗｅｂｓｔｅｒなど、（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：２７８１及びＰｅｋｏｎｅｎなど、（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：１３４３をご参考に）。それに、報告によりますと、大腸直腸癌組織は強く高まったＩＧＦＲ１レベルを示します（Ｗｅｂｅｒなど、Ｃａｎｃｅｒ９５（１０）：２０８６−９５（２００２）をご参考に）。正常の子宮膣部細胞と比べて、初期頚部癌細胞培養及び頚部癌細胞系に対する分析はそれぞれ３倍及び５倍のＩＧＦＲ１過剰発見を示します（Ｓｔｅｌｌｅｒなど、（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：１７６２をご参考に）。滑膜肉腫細胞におけるＩＧＦＲ１の発見は攻撃表現型と関連します（つまり、腫瘍移転及び増殖の高い比率；Ｘｉｅなど、（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：３５８８をご参考に）【０５５４】ＩＧＦ−Ｒ１の活性化は有糸分裂細胞の残存と増殖、それに骨格筋や心筋などの組織の成長を引き起こします。ＩＧＦ−１レセプターは幾つかの癌に関わります。一番注目すべきのは乳癌であります。ＩＧＦ−Ｒ１は、腫瘍の血管新生促進能力を推測することにより、腫瘍転移の可能性を高めます。それに加えて、ＩＧＦ−Ｒ１の抗細胞死亡の特性の御蔭で、癌細胞は化学療法薬又は放射療法の細胞毒素特性を避けます。ＩＧＦ−Ｒ１とＥＧＦＲとの間に行った相互干渉は、ＥＧＦＲ抑制物がある場合にもＥＧＦＲシグナリングを回復させます。ＩＧＦ−１Ｒにより伝えられたシグナリングの抑制は、化学療法と他の分子標的療法により、腫瘍成長の速度を減らし、細胞死亡を増やし、腫瘍殺しを増やすことを示します。【０５５５】腫瘍のＩＧＦ−１Ｒ機能を抑制することを目的に取る実験方法は励みとなりましたが、成功は限られます。その癌治療に対する効果はまだ臨床の確認が必要であります。ＩＧＦ−Ｒ１機能を抑制するという抗体の能力は、ＩＧＦ−１Ｒのαサブユニットにおける未知の抗原分子を対象にする鼠のモノクローナル抗体（α−ＩＲ３）において初めて見つかりました（Ｋｕｌｌなど、（１９８３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：６５６１−６６をご参考に）。後には、ＩＧＦ−１Ｒのαサブユニットまで発展した他の抗体は、さまざまの実験性癌モデルにおいて様々の程度までＩＧＦ−Ｒ１機能を抑制することが分かりました。癌及び癌転移など各種の腫瘍疾患の治療には、違う、又は改良された結合や効果や安全の特性を持っているＩＧＦ−１Ｒ抗体が必要であります。【０５５６】ここで提供された抗体ライブラリーはＩＧＦ−Ｒ１との結合を分析すること及び／または��能運動を分析することにより運動の調整のためにえり分けられます。例えば、細胞増殖であります。ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２がある場合に測定が行われることができます。例１３は、ＩＧＦ−Ｒ１と結合する抗体を選択し又は確認するためにここで提供する抗体ライブラリーをえり分ける結合測定を例示します。【０５５７】ここで提供されたライブラリーから確認された、ＩＧＦ−Ｒ１活性を調整する抗体又はその部分は、ＩＧＦ−Ｒ１の発見及び／又は活性に関連する疾患症状の治療又は予防のために使用されることができます。例えば、これらの抗体又はその部分は、リウマチ関節炎や、グレーブス病や、多発性硬化症や、全身性紅斑性狼瘡や、橋本甲状腺疾患や、重症筋無力症や、自己免疫性甲状腺疾患や、ベーチェット病や、先端巨大症や、膀胱癌や、ウィルムス腫瘍や、卵巣癌や、膵臓癌や、良性の前立腺過形成や、乳癌、前立腺癌や、骨癌や、肺癌や、結腸直腸癌や、子宮頚癌や、滑膜肉腫や、転移性癌に関連する下痢や、血管作動性腸管分泌腫瘍や、巨大症や、乾癬や、動脈硬化や、血管の平滑筋再狭窄又は不適当な微小血管増殖などの治療に使われることができます。【０５５８】ｉｖ．Ｃ−Ｍｅｔ
Ｃ−Ｍｅｔ（又は配列同一性番号２００１により規定された肝細胞成長因子レセプターＨＧＦＲ）上皮由来の細胞（幹細胞及び前駆細胞を含み）において見つかった薄膜レセプターであります。ｃ−Ｍｅｔはそのリガンドである肝細胞成長因子（ＨＧＦ）により刺激される時、幾つかの生物学反応を引き起こし、それは又有糸分裂形成や運動形成や器官形成など侵入成長を誘発します。【０５５９】Ｃ−Ｍｅｔは腫瘍細胞系にも、それぞれの人固形腫瘍にも発見されました。癌細胞における異常のｃ−Ｍｅｔ活性は間違った予知に関連し、腫瘍成長や血管新生や転移を誘発します。Ｃ−Ｍｅｔは以下のような多数の発癌シグナル転換経路を引き起こします。器官形成を引き起こすＲＡＳや、細胞運動性に関連するＰＩ３Ｋや、分枝形態形成を引き起こすＳＴＡＴや、複数のジーンの転写制御に参与するベタ・カテニンなどであります。ＨＧＦは、ｃ−Ｍｅｔを通じて、特定な細胞種類の分裂促進因子であることが見つかりました。これらの細胞種類は黒色素胞や、尿細管性細胞や、ケラチノサイトや、特定な内皮細胞と上皮細胞を含みます（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏなど、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７６：４５−５１（１９９１）；Ｉｇａｗａなど、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７４：８３１−８３８（１９９１）；Ｈａｎなど、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３０：９７６８−９７８０（１９９１）；Ｒｕｂｉｎなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：４１５−４１９（１９９１）をご参考に）。【０５６０】幾つかの癌治療法はｃ−Ｍｅｔシグナリングへの干渉を必要としています。これらの治療法は以下のものを含みます。キナーゼ抑制物はＡＴＰがリン酸基転移防止のｃ−Ｍｅｔと結合することを防ぎます。ＨＧＦ抑制物はｃ−ＭｅｔのＨＧＦ活性を防ぎます。デコイＭＥＴ抑制物はリガンド結合及びホモ二量体化を防ぎます。免疫療法は受動免疫療法と主動免疫療法を含みます。前者はＣＤＣ又はＡＤＣＣを活性化します。後者は細胞因子を利用して免疫細胞の非特定刺激を誘発します。しかしながら、この経路が様々な病理症状の重要な病因になると見れば、治療剤の開発に最適な臨床特性を持つ薬剤が引き続けて必要であることが明らかになります。【０５６１】ここで提供された抗体ライブラリーはｃ−Ｍｅｔとの結合を分析すること及び／または機能運動を分析することにより運動の調整のためにえり分けられます。例えば、細胞増殖又は細胞シグナリングであります。ＨＧＦがある場合に、測定が行われることができます。例１３はｃ−Ｍｅｔと結合する抗体を選択しまたは確認するためにここで提供された抗体ライブラリーをえり分けるような結合分析を例示します。【０５６２】ここで提供されたライブラリーから確認された、ｃ−Ｍｅｔ活性を調整する抗体又はその部分は、ｃ−Ｍｅｔの発見及び／又は活性に関連する疾患症状の治療又は予防のために使用されることができます。例えば、これらの抗体又はその部分は以下の疾患の治療に使われることができます。肺癌や、骨癌や、膵臓癌や、皮膚癌や、頭頚部癌や、皮膚又は眼内黒色腫や、子宮癌や、直腸癌や、肛門部癌や、胃癌や、結腸癌や、乳癌や、婦人科腫瘍（例えば、子宮肉腫や、卵管癌や、子宮内膜癌や、子宮頚部癌や、膣癌や、外陰癌）や、ホジキン病や、食道癌や、小腸癌や、内分泌系癌（例えば、甲状腺や副甲状腺や副腎などの癌）や、軟組織肉腫や、尿道癌や、陰茎癌や、前立腺癌や、慢性又は急性白血病や、小児固形腫瘍や、リンパ性リンパ腫や、膀胱がんや、腎臓又は尿管癌（例えば、腎細胞癌や腎盂癌）や、中枢神経系統新生物（例えば、初期ＣＮＳリンパ腫や、脊椎軸腫瘍や、脳幹膠腫や、下垂体腺腫や）などであります。
ここで提供された抗ｃ−Ｍｅｔ抗体はＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及び／又はＣＤＲＬ３であるＣＤＲをせめて一つ持っている抗体を含みます。例えば、ＣＤＲＨ１はＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳ（配列同一性番号によるアミノ酸２６−３５）であります、ＣＤＲＨ２はＳはＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（によるアミノ酸５０−６６配列同一性番号：３３５３）、ＣＤＲＨ３はＥＨＩＶＶＶＩＡはＹＹＹＹＹＹＧＭＤＶ（によるアミノ酸９９−１１８配列同一性番号：３３５３）、ＣＤＲＨ３はＥＤＩＶＶＶＰＡＡＭＳＹＹＹＹＹＹＧＭＤＶ（によるアミノ酸９９−１１９配列同一性番号：３３４７）、ＣＤＲＨ３はＥＤＩＶＬＭＶＹＡはＹＹＹＹＹＹＧＭＤＶ（によるアミノ酸９９−１１９配列同一性番号：３３４９）、ＣＤＲＨ３はＥＤＩＶＶＶＶＡＡＴＳＹＹＹＹＹＹＧＭＤＶ（によるアミノ酸９９−１１９配列同一性番号：３３５１）、ＣＤＲＬ１はＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳ（によるアミノ酸２２−３３配列同一性番号：１８７０）、ＣＤＲＬ２はＧＫＮＮＲＰＳ（によるアミノ酸４９−５５配列同一性番号：１８７０）、やＣＤＲＬ３はＮＳＲＤＳＳＧＮＨＬＶＶ（によるアミノ酸８８−９９配列同一性番号：１８７０）。以上の各ＣＤＲに対して６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はその以上の配列同一性を示したＣＤＲもここで提供されます。【０５６３】例えば、ｃ−Ｍｅｔ活性を調整する抗体はＩＧＨＶ３（たとえば、配列同一性番号６８−１５２により規定されたもの）であるＶＨ生殖細胞セグメントからなる生殖細胞成分を含む延期配列によりコード化されたＶＨチェーンを含む抗体を含みます。またはＩＧＨＶ２（例えば、配列同一性番号２４４−２５１により規定されたもの）であるＤＨ生殖細胞セグメンや、ＩＧＨＪ６（例えば、配列同一性番号２８２−２８５により規定されたもの）であるＪＨ生殖細胞セグメントや、又はＪＨ生殖細胞セグメントの組み換え形式（例えば、配列同一性番号３４５５により規定されたもの）であります。これらの抗体は以下の生殖細胞セグメントからなる生殖細胞成分を含む塩基配列によりコード化されたＶＬチェーンを含む抗体をも含みます。ＩＧＬＶ３（例えば、配列同一性番号４００−４１７により規定されたもの）であるＶλ生殖細胞セグメント及びＩＧＬＪ２（例えば、配列同一性番号４４３により規定されたもの）であるＪλ生殖細胞セグメントであります。このような抗体は上述の生殖セグメントの異形である生殖セグメントを含む塩基配列によりコード化された抗体をも含みます。異形の原因は、保守突然変異または他の塩基突然変異であります。ただし、条件は生じられた抗体は機能性または生産性の抗体である上にｃ−Ｍｅｔと結合することであり、それに／または機能活性を調整することであります。【０５６４】ｃ−Ｍｅｔに反する典型的な抗体はＶＨチェーンが以下の生殖細胞セグメントからなる塩基配列によりコード化される場所としての抗体を含みます。ＩＧＨＶ３−２３（例えば、ＩＧＨＶ３−２３＊０１、ＩＧＨＶ３−２３＊０２、ＩＧＨＶ３−２３＊０３、ＩＧＨＶ３−２３＊０４、又はＩＧＨＶ３−２３＊��５）であるＶＨ生殖細胞セグメントや、ＩＧＨＤ２−１５＊０１、ＩＧＨＤ２−２（例えば、ＩＧＨＤ２−２＊０１、ＩＧＨＤ２−２＊０２又はＩＧＨＤ２−２＊０３）、ＩＧＨＤ２−８（例えば、ＩＧＨＤ２−８＊０１又はＩＧＨＤ２−８＊０２）、又はＩＧＨＤ２−２１（例えば、ＩＧＨＤ２−２１＊０１又はＩＧＨＤ２−２１＊０２）であるＤＨ生殖細胞セグメントや、ＩＧＨＪ６（例えば、ＩＧＨＪ６＊０１、ＧＨＪ６＊０２、ＧＨＪ６＊０３、ＧＨＪ６＊０４）又はその組み換え形式（例えば、配列同一性番号３４５５により規定されたもの）であるＪＨ生殖細胞セグメントなどであります。ＶＬチェーンはＩＧＬＶ３−１９＊０１であるＶλ生殖セグメント及びＩＬＧＪ２＊０１であるＪλ生殖細胞セグメントからなる塩基配列によりコード化されます。Ｅｐや活性を調節する、ここで提供された典型的な抗体は表１８Ｈにより規定されます。【０５６５】
【表１８Ｈ】
0005882058.tif 000174
【０５６６】ｖ．ＣＤ２０−Ｂ−リンパ性抗原
ＣＤ２０（配列同一性番号２０１１により規定された人Ｂリンパ球限定差異化抗原であるＢｐ３５）はプレＢ及び成熟Ｂリンパ球に位置する恐水病膜組織貫通蛋白質であります。ＣＤ２０は周辺血液又はリンパ系器官からの９０％以上のＢ細胞の表面に見つかり、早期プレＢ細胞形成の間に発見され、形質細胞差異化まで止まります。ＣＤ２０は正常のＢ細胞にも悪性Ｂ細胞にも存在します。特に、ＣＤ２０は９０％以上のＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）に発見されますが（Ａｎｄｅｒｓｏｎなど（１９８４）Ｂｌｏｏｄ６３（６）：１４２４−１４３３）、造血幹細胞や、ブプレＢ細胞や、正常の形質細胞や、または他の正常の組織には見つかりません（Ｔｅｄｄｅｒなど（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５（２）：９７３−９７９）。ＣＤ２０はＮＨＬなどの腫瘍細胞にも発見されます。【０５６７】ＣＤ２０は細胞周期開始及び差異化の活性過程における早期ステップを制御します。ＣＤ２０はイオン・チャンネルとして働き、ＢＣＲにより引き起こされた細胞内貯蔵所の空虚化に従って細胞内カルシウムの進出を促進するカルシウム貯蔵所として営みます。幹細胞ではなくて、殆ど全てのＢ細胞において発見されたＣＤ２０の原因で、これはｍＡｂにより引き起こした抗体依存性細胞毒性及び補足依存性細胞毒性を通じて抗原調節の標的であります。それに加えて、抗体により引き起こされたら、ＣＤ２０は成長を制御し腫瘍細胞死亡を誘発するシグナリングを始めます（Ｔｅｅｌｉｎｇなど（２００６）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７７：３６２−３７１）。【０５６８】ＣＤ２０はＲＩＴＵＸＡＮ▲Ｒ▼（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）により癌細胞標的として証明されました。ＲＩＴＵＸＡＮ▲Ｒ▼（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）は、正常及び悪性のＢリンパ球の表面において発見されたＣＤ２０抗原に対するジーン組換えのキメラ型鼠／人モノクローナル抗体であります（例えば、アメリカ・パテント番号５、７３６、１３７をご参考に）。ＲＩＴＵＸＡＮ▲Ｒ▼は細胞死亡や、補足依存性の細胞毒性（ＣＤＣ）や、ＡＤＣＣを通じてＢ細胞溶解を引き起こすことが見つかりました。【０５６９】ここで提供された抗体ライブラリーは、ＣＤ２０との結合及び／又は機能活性の測定による活性調節のためにえり分けられることができます。例えば、補足依存性細胞媒介毒性や、細胞殺しや、ＣＤ２０発見細胞の細胞死亡測定であります。例１３はＣＤ２０と結合する抗体を選択しまたは確認するためにここで提供された抗体ライブラリーをえり分けるような結合分析を例示します。例１１は、架橋Ｆａｂ抗体機能の評価のためのリンパ球細胞死亡測定を例示します。【０５７０】ここで提供されたライブラリーから確認された、ＣＤ２０活性を調整する抗体又はその部分は、ＣＤ２０の発見及び／又は活性に関連する疾患症状の治療又は予防のために使用されることができます。例えば、これらの抗体またはその部分はリンパ球や、自己免疫疾患や、移植拒絶などの治療に使われることができます（例えば、自己免疫反応を抑制することにより器官や組織移植の拒絶を防ぐために）。リンパ球は、非ホジキン・リンパ球（高級リンパ球や、中級リンパ球や、低級リンパ球や）や、ホジキン病や、急性リンパ性白血病や、骨���腫や、慢性リンパ性白血病や、骨髄芽球性白血病などを含みますが、それらに限りません。自己免疫疾患は、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）や、リウマチ関節炎や、クローン病や、乾癬や、自己免疫血小板減少性紫斑病や、多発性硬化症や、強直性脊椎炎や、重症筋無力症や、尋常性天疱瘡などを含みますが、それらに限りません。【０５７１】ｖｉｉ．エリスロポエチン・レセプター（Ｅｐｏ−Ｒ）
エリスロポエチン（配列同一性番号２００９により規定されたＥｐｏ）は赤血球系前駆細胞の増殖及び差異化を引き起こす糖蛋白質ホルモンであります。Ｅｐｏは成熟赤血球細胞を形成させる赤血球系前駆細胞の成長や差異化や残存を促進するという責任を負います。血液及び組織における酸素レベルの変化に対して反応する時、エリスロポエチンは未熟赤芽球の増殖と差異化を刺激しそうであります。それは、成長因子としても働き、赤血球系前駆細胞の有糸分裂活性（例えば、赤血球激発及び群落を形成させるユニット）を刺激します。これは差異化因子としても働き、赤血球群落を形成させるユニットから前赤芽球への転換を誘発します（Ｅｒｓｌｅｖ、Ａ．、Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３１６：１０１−１０３（１９８７）をご参考に）。
Ｅｐｏ活性はエリスロポエチン・レセプター（Ｅｐや）と呼ぶ細胞表面レセプターの結合と活性化を通じて調節されます。リガンドがない場合に、Ｅｐｏレセプターは行われた二量体に存在します。Ｅｐｏがそのレセプターとの結合は構造変化を引き起こします。例えば、細胞質ドメインが互いに近く置かれます。「二量化」がレセプターの活性化に役立つという考えは不十分な理解であります。
Ｅｐｏレセプターの活性化は複数の生物学効果を引き起こします。これらの活性の一部は増殖の刺激や、差異化の刺激や、細胞死亡の抑制やを含みます（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６、３１９、４９９、Ｌｉｂｏｉなど、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、９０：１１３５１（１９９３）、Ｋｏｕｒｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４８：３７８（１９９０）をご参考に）。エリスロポエチン・レセプターの欠陥は赤白血病と一族性赤血球増加を引き起こすことができます。【０５７２】エリスロポエチンは、赤血球細胞増殖（ＲＢＣ）の刺激が望まれた各治療法に使われる重要な薬品であります。Ｅｐｏｇｅｎ・（エポエチン−アルフア）は組換え糖蛋白質であり、赤血球細胞増殖を刺激し、それにより貧血症を治療するように使われます（例えば、アメリカ・パテント番号４、７０３、００８及び５、９５５、４２２をご参考に）。【０５７３】ここで提供された抗体ライブラリーはＥｐやとの結合を分析すること及び／または機能運動を分析することにより運動の調整のためにえり分けられます。例えば、細胞増殖、細胞死亡又は細胞シグナリングであります。例１３はＥｐやと結合する抗体を選択しまたは確認するためにここで提供された抗体ライブラリーをえり分けるような結合分析を例示します。例１２と例１８はＥｐやにより引き起こされた細胞増殖又は細胞死亡の調節を評価する測定を例示します。その故に、このような分析は主動抗体を確認するように使用されます。【０５７４】ここで提供されたライブラリーから確認された、Ｅｐや活性を調整する抗体又はその部分は、Ｅｐやの発見及び／又は活性に関連する疾患症状の治療又は予防のために使用されることができます。例えば、これらの抗体又はその部分は低い赤血球のレベル及び／又は減少された血色素レベル（例えば、貧血症）を特徴にする不調の治療に使われることができます。それに加えて、これらの抗体又はその部分は、血液又は組織における低下の又は正常以下の酸素レベルを特徴にする不調の治療に使われることができます。例えば、低酸素血症又は慢性組織低酸素症であります。又は不十分な血液循環又は低下の血流量を特徴にする疾患であります。これらの抗体又は抗原結合部分は、創傷治癒を促進するように、又は脳髄／脊髄損傷や卒中などにより引き起こされた神経細胞及び／又は組織損害を保護するように使われることができます。抗体により治療される症状は、貧血（例えば、化学療法による貧血）や、貧血に関連する癌や、慢性疾患の貧血や、ＨＩＶ関連貧血や、骨髄移植関連貧血などや、心不全や、虚（乏）血性心臓病や、腎不全などを含みますが、それに限りません。
ここで提供された抗体はＥｐや活性を調整しますので、Ｅｐやの発見または活性に関連する疾患や症状やの治療にも使われることができます。このような抗体は、生殖細胞セグメントからなる塩基配列によりコード化されたＶＨチェーンとＶＬチェーンを持っている抗体、またはそれから最適化された抗体を含みます。その一例はＦａｂ抗体であります。この抗体はさらに定常域を含みます。この抗体はＥＧＦＲと結合親和力を持つ抗体を含みます。このＥｐやは１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１Ｍ、１０−１２またはその以下であり、ナノモルまたはサブナノモルと結合親和力を持っています。【０５７５】ここで提供された抗Ｅｐや抗体はＣＤＲＨ１及び／又はＣＤＲＬ３であるＣＤＲをせめて一つ持っている抗体を含みます。例えば、ＣＤＲＨ１はＧＹＴＦＴＳＹＹＭＨ（配列同一性番号１５０９によるアミノ酸２６−３５）であります．ＣＤＲＨ１はＳＧＹＳはＳＳＮＷＷＧ（によるアミノ酸＄２６−３７配列同一性番号：１７５９）、ＣＤＲＨ１はＧＧＳはＳＧＧＹＹＷＳ（によるアミノ酸２６−３７配列同一性番号：１７６９）、ＣＤＲＨ１はＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳ（によるアミノ酸２６−３５配列同一性番号：３３５９）、ＣＤＲＨ２はＩＩＮＰＳＧＧＳＴＳＹＡＱＫＦＱＧ（によるアミノ酸５０−６６配列同一性番号：１５０９）、ＣＤＲＨ２はＹＩＹＹＳＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳ（によるアミノ酸５１−６６配列同一性番号：１７５９）、ＣＤＲＨ２はＹＩＹＹＳＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳ（によるアミノ酸５２−６７配列同一性番号：１７６９）、ＣＤＲＨ２はＳはＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（によるアミノ酸５０−６６配列同一性番号：３３５９）、ＣＤＲＨ３はＥＹＹＹＧＳＧＳＹＹＮＤＹＦＤＹ（によるアミノ酸９９−１１４配列同一性番号：１５０９）、ＣＤＲＨ３はＥＧＹＳＳＳＷＹＤＹＦＤＹ（によるアミノ酸９９−１１１配列同一性番号：１５１２）、ＣＤＲＨ３はＴＮＷＧＡＥＹＦＱＨ（によるアミノ酸９９−１０８配列同一性番号：１７５９）、ＣＤＲＨ３はＡＮＷＧＤＮＷＦＤＳ（によるアミノ酸１００−１０９配列同一性番号：１７６９）、ＣＤＲＨ３はＡＮＷＧＹＷＹＦＤＬ（によるアミノ酸９９−１０８配列同一性番号：１５１４）、ＣＤＲＨ３はＥＧＹＣＳＧＧＳＣＹＳＹＷＹＦＤＬ（によるアミノ酸９９−１１５配列同一性番号：１５０８）、ＣＤＲＨ３はＧＩＴＭＶＲＧＶＩはＹＹＹＹＹＹＧＭＤＶ（によるアミノ酸９９−１１９配列同一性番号：３３５９）、ＣＤＲＬ１はＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（によるアミノ酸２４−３５配列同一性番号：１８３３）、ＣＤＲＬ１はＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＡ（によるアミノ酸２４−４０配列同一性番号：１８３８）、ＣＤＲＬ１はＲＡＳＱＳＶＳＳＮＬＡ（によるアミノ酸２４−３４配列同一性番号：１８４３）、ＣＤＲＬ１はＲＡＳＱＳはＳＷＬＡ（によるアミノ酸２４−３４配列同一性番号：１８４１）、ＣＤＲＬ１はＲＳＳＱＳＬＬＤＳＤＤＧＮＴＹＬＤ（によるアミノ酸２４−４０配列同一性番号：１８５３）、ＣＤＲＬ１はＲＡＳＱＳはＳＹＬＮ（によるアミノ酸２４−３４配列同一性番号：１８５４）、ＣＤＲＬ１はＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳ（によるアミノ酸２３−３３配列同一性番号：１８７０）、ＣＤＲＬ２はＧＡＳＳＲＡＴ（によるアミノ酸５１−５７配列同一性番号：１８３３）、ＣＤＲＬ２はＷＡＳＴＲＥＳ（によるアミノ酸５６−６２配列同一性番号：１８３８）、ＣＤＲＬ２はＧＡＳＴＲＡＴ（によるアミノ酸５０−５６配列同一性番号：１８４３）、ＣＤＲＬ２はＤＡＳＳＬＥＳ（によるアミノ酸５０−５６配列同一性番号：１８４１）、ＣＤＲＬ２はＴＬＳＹＲＡＳ（によるアミノ酸５６−６２配列同一性番号：１８５３）、ＣＤＲＬ２はＡＡＳＳＬＱＳ（によるアミノ酸５０−５６配列同一性番号：１８５４）、ＣＤＲＬ２はＧＫＮＮＲＰＳ（によるアミノ酸４９−５５配列同一性番号：１８７０）、ＣＤＲＬ３はＱＱＹＧＳＳＰＰＷＴ（によるアミノ酸９０−９９配列同一性番号：１８３３）、ＣＤＲＬ３はＱＱＹＹＳＴＰＰＷＴ（によるアミノ酸９５−１０４配列同一性番号：１８３８）、ＣＤＲＬ３はＱＱＹＮＮＷＰＰＷＴ（によるアミノ酸８９−９８配列同一性番号：１８４３）、ＣＤＲＬ３はＱＱＹＮＳＹＳＰＷＴ（によるアミノ酸８９−９８配列同一性番号：１８４１）、ＣＤＲＬ３はＭＱＲＩＥＦＰＳＷＴ（によるアミノ酸９５−１０４配列同一性番号：１８５３）、ＣＤＲＬ３はＱＱＳＹＳＴＰＰＷＴ（によるアミノ酸８９−９８配列同一性番号：１８５４）、やＣＤＲＬ３はＮＳＲＤＳＳＧＮＨＬＶＶ（によるアミノ酸８８−９９配列同一性番号：１８７０）。以上の各ＣＤＲに対して６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はその以上の配列同一性を示したＣＤＲもここで提供されます。【０５７６】例えば、Ｅｐや活性を調節する抗体は以下の生殖細胞セグメントからなる生殖細胞成分を含む塩基配列によりコード化されたＶＨチェーンを含む抗体を含みます。ＩＧＨＶ１（例えば、配列同一性番号１０−４３により規定されたもの）や、ＩＣＨＶ３（例えば、配列同一性番号６８−１５２により規定されたもの）や、ＩＧＨＶ４（例えば、配列同一性番号１５３−２２４により規定されたもの）であるＶＨ生殖細胞セグメントや、ＩＧＨＤ６（例えば、配列同一性番号２０８−２７１により規定されたもの）や、ＩＧＨＤ３（例えば、配列同一性番号２５２−２５９により規定されたもの）や、ＩＧＨＤ７（例えば、配列同一性番号２７２により規定されたもの）や、ＩＧＨＤ２（例えば、配列同一性番号２４４−２５１により規定されたもの）であるＤＨ生殖細胞セグメントや、ＩＧＨＪ１（例えば、配列同一性番号２７３により規定されたもの）や、ＩＧＨＪ４（例えば、配列同一性番号２７７−２７９により規定されたもの）や、ＩＧＨＪ５（例えば、配列同一性番号２８０又は２８１により規定されたもの）や、ＩＧＨＪ２（例えば、配列同一性番号２７４により規定されたもの）や、ＩＧＨＪ６（例えば、配列同一性番号２８２−２８５により規定されたもの）であるＪＨ生殖細胞セグメントや、又はＪＨ生殖細胞セグメントの組み換え形式（例えば、配列同一性番号３４５０−３４５５により規定されたもの）であります。【０５７７】このような抗体は以下の生殖細胞セグメントからなる生殖細胞成分を含む塩基配列により規定されたＶＬチェーンを含む抗体をも含みます。ＩＧＫＶ４（例えば、配列同一性番号３５１により規定されたもの）や、ＩＧＫＶ３（例えば、配列同一性番号３３２−３５０により規定されたもの）や、ＩＧＫＶ１（例えば、配列同一性番号２８６−３１６及び８６８により規定されたもの）や、ＩＧＫＶ２（例えば、配列同一性番号３１７−３３１により規定されたもの）であるＶκ生殖細胞セグメントや、ＩＧＫＪ１（例えば、配列同一性番号３５６により規定されたもの）であるＪκ生殖細胞セグメントや、ＩＧＬＶ３（例えば、配列同一性番号４００−４１７により規定されたもの）であるＶλ生殖細胞セグメントや、ＩＧＬＪ２（例えば、配列同一性番号４４３により規定されたもの）であるＶλ生殖細胞セグメントであります。【０５７８】このような抗体は上述の生殖セグメントの異形である生殖セグメントを含む塩基配列によりコード化された抗体をも含みます。
異形の原因は、保守突然変異または他の塩基突然変異であります。ただし、条件は生じられた抗体は機能性または生産性の抗体である上にＥｐやと結合することであり、それに／または機能活性を調整することであります。【０５７９】Ｅｐやに対する典型的な抗体はＶＨチェーンが以下の生殖細胞セグメントからなる塩基配列によりコード化されます。ＩＧＨＶ１−４６（例えばＩＧＨＶ１−４６＊０１、ＩＧＨＶ１−４６＊０２、ＩＧＨＶ１−４６＊０３）、ＩＧＨＶ３−２３（例えばＩＧＨＶ３−２３＊０１、ＩＧＨＶ３−２３＊０２、ＩＧＨＶ３−２３＊０３、ＩＧＨＶ３−２３＊０４、ＩＧＨＶ３−２３＊０５）、ＩＧＨＶ４−２８（例えばＩＧＨＶ４−２８＊０１、ＩＧＨＶ４−２８＊０２、ＩＧＨＶ４−２８＊０３、ＩＧＨＶ４−２８＊０４、ＩＧＨＶ４−２８＊０５）、やＩＧＨＶ４−３１（例えばＩＧＨＶ４−３１＊０１、ＩＧＨＶ４−３１＊０２、ＩＧＨＶ４−３１＊０３；ＩＧＨＶ４−３１＊０４、ＩＧＨＶ４−３１＊０５、ＩＧＨＶ４−３１＊０６、ＩＧＨＶ４−３１＊０７、ＩＧＨＶ４−３１＊０８、ＩＧＨＶ４−３１＊０９、ＩＧＨＶ４−３１＊１０）；であるＶＨ生殖細胞系セグメントや、ＩＧＨＤ６−６（例えばＩＧＨＤ６−６＊０１）、ＩＧＨＤ６−１３（例えばＩＧＨＤ６−１３＊０１）、ＩＧＨＤ３−１０（例えばＩＧＨＤ３−１０＊０１  ｏｒ  ＩＧＨＤ３−１０＊０２）、ＩＧＨＤ７−２７＊０１、ＩＧＨＤ２−１５＊０１、ｏｒ  ＩＧＨＤ６−１３＊０１であるＤＨ生殖細胞系セグメントや、ＩＧＨＪ１＊０１、ＩＧＨＪ４（例えばＩＧＨＪ４＊０１、ＩＧＨＪ４＊０２  ｏｒ  ＩＧＨＪ４＊０３）、ＩＧＨＪ５（例えばＩＧＨＪ５＊０１、ＩＧＨＪ５＊０２）、ＩＧＨＪ６（例えばＩＧＨＪ６＊０１、ＩＧＨＪ６＊０２、ＩＧＨＪ６＊０３、ＩＧＨＪ６＊０４）、であるＪＨ生殖細胞系セグメントや、又はこれらの組替え形式（例えば、配列同一性番号３４５５により規定されたもの）であります。ＶＬチェーンは以下の生殖細胞系セグメントからなる塩基配列によりコード化されます。ＩＧＫＶ４−１（例えばＩＧＫＶ４−１＊０１）、ＩＧＫＶ３−１５＊０１、ＩＧＫＶ３−２０（例えばＩＧＫＶ３＊０１、ＩＧＫＶ３＊０２）、ＩＧＫＶ１−５（例えばＩＧＫＶ１−５＊０１、ＩＧＫＶ１−５＊０２、ＩＧＫＶ１−５＊０３）、ＩＧＫＶ１−３９＊０１、ｏｒ  ＩＧＫＶ２Ｄ−４０＊０１；であるＶκ生殖細胞系セグメントや、ＩＧＫＪ１＊０１であるＪκ生殖細胞系セグメントや、ＩＧＬＶ３−１９＊０１であるＶλ生殖細胞セグメントや、ＩＬＧＪ２＊０１であるＪλ生殖細胞セグメントなどであります。Ｅｐや活性を調節する、ここで提供された典型的な抗体は表１８Ｉにより規定されます。【０５８０】
【表１８Ｉ】
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0005882058.tif 000176
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【０５８１】ｖｉｉｉ．カドヘリン
カドヘリンは一群のカルシウムによるタイプ１の膜組織貫通の糖蛋白質であり、細胞癒着にかかわり、組織内細胞の相互結合を確保します。多数の群のカドヘリン分子があり、Ｎカドヘリンや、Ｅカドヘリンや、Ｐカドヘリンを含みますが、それらに限りません。この一族のメンバーはカルシウムによる同種親和性相互作用を示し、選択性の細胞間認識及び癒着に責任があります。
それは器官形成の間に様々の細胞タイプを適切な位置に配置します。カドヘリンは多細胞構造の統合を維持することに重要な役割をもします。胎芽形態形成の間に、カドヘリン一族の多様なメンバーの発見は空間的に臨時的に制御され、様々の細胞タイプを機能構造へ順序に組み立てることを促進します。カドヘリンは癌の細胞連結及び転移細胞において重大な役割をすると思われます。【０５８２】ａ）Ｐ−カドヘリン（Ｐ−ｃａｄ／ＣＤＨ３）
Ｐ−カドヘリン（配列同一性番号２００８により規定されたＰ−ｃａｄ）は胎盤において見つかった単スパンタイプ１膜組織貫通糖蛋白質であり、Ｅ−カドヘリン（上皮カドヘリン、Ｅ−ｃａｄ）と異形同源であります。Ｐ−ｃａｄもＥ−ｃａｄもアルファ−カテニンによる細胞骨格と相互に作用します。他のカドヘリンのように、Ｐ−カドヘリンは上皮細胞間癒着に役割をします。他の主な役割は細胞表現型の決定及び細胞動態との関連を含みます。細胞動態は腫瘍細胞の移転及び散布を含みます。上皮組織におけるＰ−ｃａｄの発見は細胞群を増殖活性に参与させそうであり、細胞差異化に従って減少します。【０５８３】Ｐ−カドヘリン発見は、カルシウムによる細胞癒着蛋白質として、不完全に差異化する侵略膀胱癌細胞に見つかりました。このような膀胱癌細胞は減少したＥカドヘリン発見を示します。（Ｍｉａｌｈｅ  Ａ．など、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１６４：８２６（２０００））。Ｅカドヘリン及びＰカドヘリンの下向き調節は培養された腫瘍前立腺細胞にも関連します。（Ｗａｎｇ  Ｊ．など、Ｕｒｏｌ．Ｒｅｓ．５：３０８（２０００））。人大腸直腸癌の形成は、Ｅカドヘリン／カテニン複合体の細胞レベルの低下を、せめて部分的に、引き起こします。（Ｄｅｂｒｕｙｎｅ  Ｐ．など、Ａｃｔａ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｂｅｌｇ．６２（４）：３９３（１９９９））。最近の報告によりますと、Ｐカドヘリンの異常上向き調節は増殖細胞表現型に関連します。増殖細胞表現型は胃腸管組織の腫瘍変形に関わり、特に異形成及び腺腫性ポリープに関わります。（Ｓａｎｄｅｒｓ  Ｄ．Ｓ．など／．、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９０（５）：５２６（２０００））。その故、特定の癌タイプ、特に一部の消化系統癌タイプ（例えば、結腸癌）は、正常細胞と比べて、Ｐカドヘリンの上向き調節や過剰発見を特徴にします。Ｐカドヘリンは癌の診断、予防又は治療の有効標的であります（アメリカ発表のパテント申請番号２００３／０１９４４０６と国際発表のパテント申請番号ＷＯ０２／０９７３９５をご参考に）。【０５８４】ここで提供された抗体ライブラリーはｐＣａｄとの結合を分析すること及び／または機能運動を分析することにより運動の調整のためにえり分けられます。機能活性の測定は、増殖や、腫瘍細胞癒着や、ＡＤＣＣ又はＣＤＣ活性を評価する測定や、抗細胞死亡測定や、細胞周期チェックポイント測定などを含みます。例１３はｐＣａｄと結合する抗体を選択しまたは確認するためにここで提供された抗体ライブラリーをえり分けるような結合分析を例示します。例２０はＰカドヘリンに引き起こされた細胞間癒着に与えた抗体効果を評価する測定であります。例えば、Ｐカドヘリン機能を抑制する抗体は、自分がある場合に細胞群生が失敗することにより、確認されます。【０５８５】ここで提供されたライブラリーから確認された、ｐＣａｄ活性を調整する抗体又はその部分は、ｐＣａｄの発見及び／又は活性に関連する疾患症状の治療又は予防のために使用されることができます。例えば、これらの抗体又はその部分は結腸癌や胃癌や肝癌などの消化系癌及び肺癌や乳癌など他の癌の治療に使われることができます。
ここで提供された抗体はＰカドヘリン活性を調整しますので、Ｐカドヘリンの発見または活性に関連する疾患や症状やの治療にも使われることができます。このような抗体は、生殖細胞セグメントからなる塩基配列によりコード化されたＶＨチェーンとＶＬチェーンを持っている抗体、またはそれから最適化された抗体を含みます。その一例はＦａｂ抗体であります。この抗体はさらに定常域を含みます。この抗体はＰカドヘリンと結合親和力を持つ抗体を含みます。このＰカドヘリンは１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１Ｍ、１０−１２Ｍまたはその以下であり、ナノモルまたはサブナノモルと結合親和力を持っています。【０５８６】ここで提供さ抗Ｐカドヘリン抗体や抗体はＣＤＲＨ１，ＣＤＲＨ２，ＣＤＲＨ３，ＣＤＲＬ１，ＣＤＲＬ２及び／又はＣＤＲＬ３であるＣＤＲをせめて一つ持っている抗体を含みます。例えば、ＣＤＲＨ１はＧＹＴＦＴＳＹＹＭＨ（配列同一性番号１５１２によるアミノ酸２６−３５）であります、ａＣＤＲＨ１はＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳ（によるアミノ酸２６−３５配列同一性番号：３５５９）、ＣＤＲＨ２はＩＩＮＰＳＧＧＳＴＳＹＡＱＫＦＱＧ（によるアミノ酸５０−６６配列同一性番号：１５１２）、ＣＤＲＨ２はＳはＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（によるアミノ酸５０−６６配列同一性番号：３３５９）、ＣＤＲＨ３はＥＧＹＳＳＳＷＹＤＹＦＤＹ（によるアミノ酸９９−１１１配列同一性番号：１５１２）、ＣＤＲＨ３はＡＮＷＧＹＷＹＦＤＬ（によるアミノ酸９９−１０８配列同一性番号：１５１４）、ＣＤＲＨ３はＥＹＹＹＧＳＧＳＹＹＮＤＹＦＤＹ（によるアミノ酸９９−１１４ｏｆ１５０９）、ＣＤＲＨ３はＧＩＴＭＶＲＧＶＩはＹＹＹＹＹＹＧＭＤＶ（によるアミノ酸９９−１１９配列同一性番号：３３５９）、ＣＤＲＨ３はＶＩＩＴＰＲＴＩＶはＹＡＦＤＶ（によるアミノ酸９９−１１４配列同一性番号：３０７１、ＣＤＲＬ１はＲＡＳＱＳＶＳＳＮＬＡ（によるアミノ酸２４−３５配列同一性番号：１８４３）、ＣＤＲＬ１はＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（によるアミノ酸２４−３５配列同一性番号：１８３３）、ＣＤＲＬ１はＲＡＳＱＳはＳＷＬＡ（によるアミノ酸２４−３４配列同一性番号：１８４１）、ＣＤＲＬ１はＲＡＳＱＳはＳＹＬＮ（によるアミノ酸２４−３４配列同一性番号：１８５４）、ＣＤＲＬ１はＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳ（によるアミノ酸２３−３３配列同一性番号：１８７０、ＣＤＲＬ２はＧＡＳＴＲＡＴ（によるアミノ酸５０−５６配列同一性番号：１８４３）、ＣＤＲＬ２はＧＡＳＳＲＡＴ（によるアミノ酸５１−５７配列同一性番号：１８３３）、ＣＤＲＬ２はＤＡＳＳＬＥＳ（によるアミノ酸５０−５６配列同一性番号：１８４１）、ＣＤＲＬ２はＡＡＳＳＬＱＳ（によるアミノ酸５０−５６配列同一性番号：１８５４）、ＣＤＲＬ２はＧＫＮＮＲＰＳ（によるアミノ酸４９−５５配列同一性番号：１８７０）、ＣＤＲＬ３はＱＱＹＮＮＷＰＰＷＴ（によるアミノ酸８９−９８配列同一性番号：１８４３）、ＣＤＲＬ３はＱＱＹＧＳＳＰＰＷＴ（によるアミノ酸９０−９９配列同一性番号：１８３３）、ＣＤＲＬ３はＱＱＹＮＳＹＳＰＷＴ（によるアミノ酸８９−９８配列同一性番号：１８４１）、ＣＤＲＬ３はＱＱＳＹＳＴＰＰＷＴ（によるアミノ酸８９−９８配列同一性番号：１８５４）、やＣＤＲＬ３はＮＳＲＤＳＳＧＮＨＬＶＶ（によるアミノ酸８８−９９配列同一性番号：１８７０）。
以上の各ＣＤＲに対して６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はその以上の配列同一性を示したＣＤＲもここで提供されます。【０５８７】例えば、Ｐカドヘリン活性を調整する抗体は以下の生殖細胞セグメントを含む塩基配列によりコード化されたＶＨチェーンを含む抗体を含みます。ＩＧＨＶ１（たとえば、配列同一性番号１−４３に規定されたもの）又はＩＧＨＶ３（例えば、配列同一性番号６８−１５２により規定されたもの）であるＶＨ生殖細胞セグメントや、ＩＧＨＤ３（例えば、配列同一性番号２５２−２５９に規定されたもの）や、ＩＧＨＤ６（例えば、配列同一性番号２６８−２７１により規定されたもの）や、ＩＧＨＤ７（例えば、配列同一性番号２７２により規定されたもの）であるＤＨ生殖細胞セグメントや、ＩＧＨＪ２（例えば、配列同一性番号２７４により規定されたもの）や、ＩＧＨＪ３（例えば、配列同一性番号２７５又は２７６により規定されたもの）や、ＩＧＨＪ４（例えば、配列同一性番号２７８又は２７９により規定されたもの）や、ＩＧＨＪ６（例えば、配列同一性番号２８２−２８５により規定されたもの）であるＪＨ生殖細胞セグメントや、又はＪＨ生殖細胞セグメントの組換え形式（例えば、配列同一性番号３４５０−３４５５により規定されたもの）であります。【０５８８】このような抗体は以下の生殖細胞セグメントからなる生殖細胞成分を含む塩基配列により規定されたＶＬチェーンを含む抗体をも含みます。ＩＧＫＶ１（例えば、配列同一性番号２８６−３１６により規定されたもの）や、ＩＧＫＶ３（例えば、配列同一性番号３３２−３５０により規定されたもの）であるＶκ生殖細胞セグメントや、ＩＧＫＪ１（例えば、配列同一性番号３５６により規定されたもの）であるＪκ生殖細胞セグメントや、ＩＧＬＶ３（例えば、配列同一性番号４００−４１７により規定されたもの）であるＶλ生殖細胞セグメントや、ＩＧＬＪ２（例えば、配列同一性番号４４３により規定されたもの）であるＶλ生殖細胞セグメントであります。このような抗体は上述の生殖セグメントの異形である生殖セグメントを含む塩基配列によりコード化された抗体をも含みます。異形の原因は、保守突然変異または他の突然変異であります。ただし、条件は生じられた抗体は機能性または生産性の抗体である上にＰカドヘリンと結合することであり、それに／または機能活性を調整することであります。
Ｐカドヘリンに対する典型的な抗体は、ＶＨチェーンが以下の生殖セグメントからなる塩基配列によりコード化される場所である抗体を含みます。ＩＧＨＶ１−４６（例えば、ＩＧＨＶ１−４６＊０１、ＩＧＨＶ１−４６＊０１、又はＩＧＨＶ１−４６＊０３）又はＩＧＨＶ３−２３（例えば、ＩＧＨＶ３−２３＊０１、ＩＧＨＶ３−２３＊０２、ＩＧＨＶ３−３＊０３、ＩＧＨＶ３−２３＊０４、ＩＧＨＶ３−２３＊０５）であるＶＨ生殖細胞セグメントや、ＩＧＨＤ３−１０（例えばＩＧＨＤ３−１０＊０１、ＩＧＨＤ３−１０＊０２）又はＩＧＨＤ６−１３（例えば、ＩＧＨＤ６−１３＊０１）又はＩＧＨＤ７−２７＊０１であるＤＨ生殖細胞セグメントや、ＩＧＨＪ３（例えば、ＩＧＨＪ３＊０１、ＩＧＨＪ３＊０２）や、ＩＧＨＪ４（例えば、ＩＧＨＪ４＊０１、ＩＧＨＪ４＊０２、ＩＧＨＪ４＊０３）や、ＩＧＨＪ６（例えば、ＩＧＨＪ６＊０１、ＩＧＨＪ６＊２、ＩＧＨＪ６＊０３、ＩＧＨＪ６＊０４）や、ＩＧＨＪ２＊０１であるＪＨ生殖細胞セグメントや、又は配列同一性番号３４５８及び３４６１によりそれぞれに規定されたＪＨ域をコード化するこれらの組換え形式（例えば、配列同一性番号３４５２及び３４５５により規定されたもの）であります。ＶＬチェーンは以下の生殖細胞セグメントからなる塩基配列によりコード化されます。ＩＧＫＶ１−５（例えば、ＩＧＫＶ１−５＊０１、ＩＧＫＶ１−５＊０２、ＩＧＫＶ１−５＊０３）、ＩＧＫＶ１−３９＊０１、ＩＧＫＶ３−１５（例えば、ＩＧＫＶ３−１５＊０１）、ＩＧＫＶ３−２０（例えば、ＩＧＫＶ３−２０＊０１、ＩＧＫＶ３−２０＊０２）又はＩＧＫＶ３−１１（例えば、ＩＧＫＶ３−１１＊０１、ＩＧＫＶ３−１１＊０２）であるＶκ生殖細胞セグメントや、ＩＧＫＪ１＊０１であるＪκ生殖細胞セグメントや、ＩＧＬＶ３−１９＊０１であるＶλ生殖細胞セグメントや、ＩＬＧＪ２＊０であるＪλ生殖細胞セグメントであります。Ｐカドヘリン活性を調節する、ここで提供された典型的な抗体は表１８Ｊにより規定されます。【０５８９】
【表１８Ｊ】
0005882058.tif 000178
【０５９０】ｉｘ．ＣＤ４４
配列ＩＤ番号：２００６に記載されているＣＤ４４は、細胞間作用、細胞接着、および細胞移動に関与している細胞表面内在性膜糖タンパク質です。ＣＤ４４遺伝子の転写物は、選択的かつ複雑なスプライシングを経て、様々な機能性アイソフォーム変異を生み出します。ＣＤ４４は様々なアイソフォームで多種多様な細胞種類の表面で発現されるタンパク質です。最小のアイソフォームである標準ＣＤ４４（ＣＤ４４ｓ）は、様々な細胞で発現されるほか、細胞外基質成分への細胞接着を仲介したり、リンパ球や単球の活性化に共同刺激を与えたりすると見なされます。一方、細胞外領域でｖ６ドメイン（ＣＤ４４ｖ６）を含むＣＤ４４のスプライス変異の発現は上皮のサブセットに限ります。【０５９１】ＣＤ４４はリンパ球の活性化、再循環、ホーミング、造血、および腫瘍転移を含み、多種多様な細胞機能に関わっています。
ＣＤ４４は、ヒアルロン酸の受容体で、Ｅ−セレクチンおよびＬ−セレクチンなどの他のリガンドと、またオステオポンチン、コラーゲン、およびマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）などの他のリガンドと相互作用することができます。ＭＭＰは、血管壁の強度を維持するタンパク質を分解させ、内皮細胞が間質マトリックスに漏れ出、血管形成の発生につながります。ＭＭＰを抑制することによって、新生毛細血管の形成が防止されます。ＣＤ４４はヒアルロン酸と相互作用し、細胞接着を仲介します。この相互作用を混乱させる治療はいくつかの病状の治療に採用できます。【０５９２】ＣＤ４４のいくつかの変異体は乳癌、前立腺癌細胞の細胞表面マーカーの役を果たします。ＣＤ４４の過剰発現は、特にリンパ腫をはじめ、多様な悪性腫瘍の発生や拡大に関連していると見なされます。ＣＤ４４ｖ６は、変異エクソン（ＣＤ４４ｖ３，ＣＤ４４ｖ５，ＣＤ４４ｖ７／ｖ８，ＣＤ４４ｖ１０）と同様に、腫瘍関連抗原と見なされ、ヒト腫瘍および正常組織においての良好な発現パターンを示しています（Ｈｅｉｄｅｒ  Ｋ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ３１Ａ：２３８５−２３９１，１９９５年、Ｈｅｉｄｅｒ  Ｋ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ４３：２４５−２５３，１９９６年、Ｄａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６年、Ｂｅｈａｍ−Ｓｃｈｍｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８年、Ｔｅｍｐｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８年、Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８年）。また、特に腫瘍の放射免疫治療（ＲＩＴ）をはじめ、抗原に基づいた診断および治療法の対象となりました（Ｓｔｒｏｏｍｅｒ  Ｊ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６（８）：３０４６−５５，２０００，ＷＯ  ９５／３３７７１，ＷＯ  ９７／２１１０４）。ＣＤ４４は抗癌治療開発の対象となりました（米国特許５，９９０，２９９号を参考）。【０５９３】本書で取り上げられる抗体ライブラリーでは、ＣＤ４４との結合や機能の活性化を分析することによって、活動の調整を検索することができます。１３例は、結合の分析によって、ここで取り上げられる抗体ライバリーを分析し、ｐＣａｄと結合する抗体を特定または選択する例を示します。【０５９４】ここで取り上げられたライブラリーで特定された、ＣＤ４４の活性を調整する抗体またはその一部は、ＣＤ４４あるいはそれによる変異体の発現および／または活性に関連している病状の治療あるいは予防に利用することができます。たとえば、抗体またはその一部は、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣ）、食堂ＳＣＣ、肺ＳＣＣ、皮膚ＳＣＣ、乳腺腺癌（ＡＣ）、肺ＡＣ、頸部ＳＣＣ、膵臓ＡＣ、コロンＡＣ、あるいは胃ＡＣなどの癌の治療に採用することができます。抗体あるいはその一部はまた、関節リウマチの治療にも採用することができます。【０５９５】４．反復検索
“ヒット”が取得された後、セクションＣで記述された方法で、本書で取り上げられる分析方法を適用するための新規ライブラリーを作成することができます。抗体がアドレス可能な形式で記載されているおかげで、”ヒット”を取得するだけで活性と構成の関係性をすぐに特定、測定することができます。たとえば、”ヒット”が取得される直後に、エンコードされた抗体のコンポーネント生殖細胞系セグメントが特定されます。その後に、特定された”ヒット”に関連する生殖細胞系セグメントから派生した核酸分子によってエンコードされた抗体を含む新規作成のライブラリーを作ることができます。生殖細胞系セグメントは普通に、配列類似性で関連しているが、その他に、ＣＤＲ、指向性ペプチド、あるいはそれ以外の生化学的性質によって関連していることもあります。【０５９６】一般的に、反復検索で抗体の新規ライブラリーを生成するにあたって、”ヒット”に含まれる生殖細胞系セグメントの遺伝子族が特定されます。ＶＨ，ＤＨおよびＪＨ遺伝子族セグメントは、あらゆる可能な並べ替え、あるいは希望のサブセット内で組み合わせられ、ＶＨ鎖をエンコードする核酸分子を生成します。ＶκおよびＪκ、またはＶλおよびＪλ遺伝子族セグメントは、あらゆる可能な並べ替え、あるいは希望のサブセット内で組み合わせられ、ＶＬ鎖をエンコードする核酸分子を生成します。様々なペアに組まれたＶＨをおよびＶＬを表すベクターは、抗体ライブラリー作成のために生成された発現タンパク質、および純化された抗体メンバーです。以降の抗体ライブラリーはアドレス形式で作成されます。以降のライブラリーは上記に説明された通りに、検索を最適化するためにスクリーニング検定に利用することができます。【０５９７】加えてライブラリーの各メンバーのアイデンティティが知られている場合に作成されるので、既に特定の関係のあるメンバーが記載されているライブラリーがあることは可と見なされます。したがって、そういったメンバーが、関係のある”ヒット”のサブライブラリに編集され、本書の方法を再びに行わず検索することが可能になります。【０５９８】また、指向進化などによって、”ヒット”や後続のライブラリーのメンバーに突然変異を起こさせ、”ヒット”を最適化することができます。【０５９９】５．指向進化
本書のスクリーニング方法によって特定された抗体の”ヒット”が突然変異生成などによって変更され、変更された抗体のライブラリーを作成することができます。そして、機能性が高まった（例えば向上した結合性や安定性、延長したインビボ安定性、および／また向上した機能的活性の調節性）１つあるいはそれ以上の例を特定するために、変更された抗体を測定します。特定のタンパク質に対する向上した機能性を検索、選択するために、新たに変更された”ヒット”のライブラリーを作成することができます。ライブラリーはアドレス可能な形式、または上記に説明された他の表示形式で検索することができます。たとえば、より厳格かつより高度な結合や洗浄の条件を採択することなどによって、２番目のライブラリーでより高親和性結合タンパク質を特定することができます。その他のスクリーニング技術を利用することもできます。【０６００】突然変異ライブラリーを作るためには様々なアプローチが採択されたが、例えば、チェーンシャフリング（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９およびＣｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４）、変異性ＰＣＲ（Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９およびＬｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９年）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  １：１１−１５）、Ｅ．ｃｏｌｉ突然変異誘発株の利用（Ｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６０，３５９）、組換え（例えば、米国出版２００４−０００５７０９号を参考）、ランダム開裂を利用したＤＮＡシャフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ  ３８９−３９１、ｔｅｒｍｅｄ  ”ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ”）、ＲＡＣＨＩＴＴ▲Ｒ▼（Ｃｏｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：３５４）、あるいは、抗体分子の相補性決定領域（ＣＤＲ）への特定のアプローチ、例えばＣＤＲウォーキング（Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３８０９  ａｎｄ  Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４：３９２）、部位特異的突然変異誘発（Ｚｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７年）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １０：６４８７−６５０４）、カセット式変異誘発（Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ（１９９１年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０８：５６４−５８６）および縮重オリゴヌクレオチドの取り込み（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４年）ＥＭＢＯ  Ｊ  １３：３２４５）。【０６０１】取り込みによって、突然変異誘発は既知の領域、あるいは結合界面にある可能性の高い領域を対象とする突然変異生成があります。例えば、突然変異誘発は本書で説明される通り、重鎖または軽鎖のＣＤＲ領域に起こさせることができます。また、突然変異誘発はＣＤＲに隣接する、あるいは近くのフレームワーク領域、特にＣＤＲの接合部の１０、５つ、あるいは３つのアミノ酸の間のＣＤＲフレームワーク領域に起こさせます。加えて、突然変異誘発はＣＤＲの１つあるいは限られたＣＤＲに起こさせることが���きます。【０６０２】ａ．ランダム変異導入法
抗体と抗原がＣＤＲの残基によって結合されます。ですから、ＣＤＲ突然変異誘発は広く、抗体のＦａｂおよびＦｖ断片の親和性を向上させるのに利用されます。ランダム変異導入法には例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１ｒｅｄ、ＵＶ放射、または脱アミノ化、アルキル化、あるいは塩基類似突然変異原などによる化学修飾、またはＤＮＡシャフリング、カセット式変異誘発、部位特異的なランダム変異導入法、変異性ＰＣＲなどのＰＣＲ法（例えば、米国出願２００６−０１１５８７４号を参考）、あるいはＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  ＰＣＲによるランダム変異導入キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、あるいは多様化ランダム変異導入キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）など、市販のランダム突然変異誘発キットを利用する方法があります。多様化ランダム変異導入キットでは、反応混合物のｄＧＴＰ、およびマンガン（Ｍｎ２＋）の量を変更することによって、特定のＤＮＡ配列の変異率を調整することができます。増加するマンガンの量は当初、突然変異率を引き上げます。これは増加したｄＧＴＰの濃度がもたらしたより高い突然変異率によります。ＰＣＲを再び行うことによって突然変異率をさらに高めることができます。以上の全てのアプローチはＣＤＲ突然変異の抗体の発現ライブラリーの作成、およびよりいいバインダーの選択が必要です。突然変異生成による指向タンパク進化への様々なアプローチのいずれも採択することができます。このアプローチのいずれも、あるいは組み合わせたアプローチでリード抗原を変更させ、希望の特性を持たせることができます。当分野で知られているいかなる方法でリード抗体を変更、修飾することができます。【０６０３】飽和突然変異誘発
典型的な例で、飽和突然変異誘発法はＣＤＲの残基が可能なアミノ酸の全ての２０個に突然変異を起こさせる場合に利用されます（例えば、ｔｈｅ  Ｋｕｎｋｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｄｉａ  Ｐａ．および米国特許６，５６２，５９４号を参考）。この方法では、選択されたアミノ酸をエンコードする希望のコドンでヌクレオチドがランダム化された縮重変異原性オリゴヌクレオチドプライマーが合成されます。典型的な無作為化方式には、ＮＮＳ−あるいはＮＮＫＮランダム化があるが、ここで、Ｎはいかなるヌクレオチドを、Ｓはグアニン、あるいはシトシン、およびＫはグアニン、あるいはチミンを表しています。縮重変異原性プライマーは一本鎖ＤＮＡテンプレートにアニールされ、そしてテンプレートの相補鎖を合成するためにＤＮＡポリメラーゼが添加されます。ライゲーション後、二本鎖ＤＮＡテンプレートを増幅するためにＥ．ｃｏｌｉに変化されます。また、単一アミノ酸の変更は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）など、市販の部位特異的突然変異誘発キットを利用し行われます。他の実施形態では、当分野で一般に知られている部位特異的アミノ酸変異の方法を利用することができます。【０６０４】ｉｉ．変異性ＰＣＲ
変異性ＰＣＲによって、特定の核酸配列にランダム突然変異を導入することができます（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６（３）：８８９−９６を参考）。簡単に言えば、変異性ＰＣＲは複製の正確さに悪影響を与える条件の下で行われるので、当業者の能力をもってランダム突然変異が導入されます。生成後、このランダムな変異体を遺伝子表示形式に配置、パンに置かれ、そして評価されます。【０６０５】ｉｉｉ．細胞株
Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＤ５  またはＥｐｉｃｕｒｉａｎ  Ｃｏｌｉ▲Ｒ▼  ＸＬ１−Ｒｅｄ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）などの突然変異誘発株は、プラスミド複製中に、単一ヌクレオチド点変異を含む抗体ライブラリーを作成するのに利用されます。そして、遺伝子表示形式を利用し、生物学的活性に基づいてランダム変異体ライブラリーを分析します。【０６０６】ｉｖ．ＤＮＡシャフリング／抗体鎖シャッフリング
ＤＮＡシャフリングリードによってリード抗体の活性を調節することができます。ＤＮＡシャッフルで、変異ＤＮＡ分子が生成される方法には、インウィトロ相同的組み換え、あるいは親ＤＮＡの不規則分解があり、そしてその後に次ぐＰＣＲを利用した再組み立てによって、不規則点変異の導入という結果につながります（例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９−３９１、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１０７４７−１０７５１、米国特許５，６０５，７９３号と５，８１１，２３８号と５，８３０，７２１号、および国際出版ＷＯ９５／０２２６２５号とＷＯ９７／２００７８号を参考）。対立遺伝子多型、あるいは多種のＤＮＡ分子などの親ＤＮＡ分子のファミリーを利用することによって、プロセスの機能性を増やすようにこの方法を変更することができます。希望の活性の選択あるいはスクリーニング、またそれに次ぐ突然変異生成の追加的な繰り返しおよび分析では、希望の突然変異誘発を決めながら、有害な変化を裂けて選択することが可能なので、配列の急速な”進化”を促します。【０６０７】抗体鎖シャッフルでは、選択された特定のＶＨが、複数のＶＬ配列と組み合わせられ、新たなＶＨ／ＶＬのペアを生み出します（例えば、Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１１１２０−１１１２３、Ｃｏｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１００２６−１００３０、およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９を参考）。【０６０８】ｖ．ＣＤＲウォーキング
別の例では、より高い親和性抗体の生成、あるいは選択は、第三免疫選択プロセスを模倣するＣＤＲウォーキング突然変異によって行われます。たとえば、抗体のＣＤＲの飽和突然変異を介して繊維状バクテリオファージの表面上に表示される１つあるいは複数の抗体断片のライブラリーを作成し、そして固定した抗原を利用して重要な抗体を選択します。そして、逐次および並列最適化戦略によって最も高い親和性の抗体を選択できます（例えば、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３８０９−３８１３、およびＹａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ２５４（３）：３９２−４０３を参考）。【０６０９】ｖｉ．フレームワークの安定化
フレームワーク領域または定常領域で変異を起こさせ、抗体の半減期を延ばすことができます。フレームワーク領域あるいは定常領域で変異を起こすことはまた、抗体の免疫原性を変更するため、特定の分子への共有結合あるいは非共有結合サイトを提供するため、あるいは補体結合やＦｃＲ結合や抗体依存性細胞毒性の特性（ＡＤＣＣ）を変更するために行われます。単一抗体は、１つあるいは複数のＣＤＲ、あるいは可変領域のフレームワーク領域、あるいは定常領域で変異を持つことが可能です。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ００／０９５６０号、Ｅｗｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００３年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２（６）：１５１７−１５２８、Ｅｗｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００４年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３（２）：１８４−９９、およびＫｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ８：８１−８９を参考。【０６１０】６．エピトープマッピング
“ヒット”が出たら、その結合エピトープを決定することができる。したがって、ここで提供される抗体ライブラリーによって、既知抗原内の未知のエピトープ、あるいは未知抗体内の新たなエピトープ（例えば癌細胞株）など新たなエピトープを特定することができます。エピトープマッピングの方法は当業者に知られています（例えば、Ｏｌｗｙｎ  Ｍ．Ｒ．Ｗｅｓｔｗｏｏｄ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｋ  Ｃ．Ｈａｙ．Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ．オックスフォード大学出版局２００１年、Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔａｌｏｇ  ＃  Ｚ３７３９９０  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６を参考）。抗体によって特定されるエピトープのマッピング方法には、ＢＩＡｃｏｒｅあるいはＥＬＩＳＡを利用した結合分析（Ｒｅｉｎｅｋｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９９年）、ＥＬＩＳＰＯＴ、予測ソフトウェア、表面台（例えばタンパク質チップ）でのペプチドライブラリーのコンビナトリアル合成そしてその後に抗体表面への露出、タンパク抗原配列から由来するペプチドライブラリーのファージ提示法、質量分析法、ＭＡＬＤＩを利用した方法、水素重水交換（ｓｅｅ  ｅ．ｇ．Ｂａｅｒｇａ−Ｏｒｔｉｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００２年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１１：１３００−１３０８）、および表面プラズマ共鳴などの方法があります。【０６１１】７．該当ヒットのインビボ分析
特定の対象の”ヒット”が特定されたら、対象の異常な活性との関係をインビボ分析で判定できます。一般的に、この方法では、非ヒト動物モデルにある疾患や症状に対して抗原を投与し、そしてその生体モデルで抗体の効果を評価します。インビボ分析は適切な制御対策としては、抗体の欠乏に備えてサンプルを用意しておく方法も含まれます。一般的には、様々な抗体の濃度で様々な分析を組み合わせ、並列に実行することによって、抗体の各濃度に対してそれぞれの反応が得られます。通常、この濃度から適切なものを負の制御として採択されます（例えば、濃度ゼロあるいは検出レベル以下）。望ましい抗体とは、抗体がない場合と比較すると、動物生態モデルの疾患あるいは症状を、約１０％以上、約２０％以上、約２５％以上、約３０％以上、約４５％以上、約５０％以上、約５５％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、またはそれ以上で調節（軽減や増加）できる抗体です。一般的には、望ましい抗体は、疾患や症状にかかった動物生態が健康な動物生態になるように貢献します。【０６１２】非ヒト動物モデルには、疾患の進行を監視するために抗体を投与する前に、疾患および／または表現型誘導の物質を注射された非ヒト動物モデルも含まれます。遺伝モデルも利用できます。ネズミなどの動物は、１つあるいはそれ以上の遺伝子の過剰発現、低発現、あるいは無力化によって疾患または状態を模倣するように生成されます。そのような動物は、当分野でよく知られているトランスジェニック動物生成技術、または天然あるいは誘導変異株によって生成されます。当業者は、特定の対象に関する様々な動物モデルに馴染みがあります。【０６１３】このような動物モデルには、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、豚、およびヒト以外の霊長類、例えば、ヒヒ、チンパンジー、サルなども含まれます。当分野でよく知られているいかなる動物生体を使用することができます。プロセスのいくつかの側面は異なる場合があるが、例えば、抗体投与の期間制度（例えば、予防薬および／または治療剤）、抗体が個別投与か併用投与かの投与の様式、および抗体の投与頻度なども含まれます。【０６１４】組み換え（トランスジェニック）動物モデルは、トランスジェニック動物を生成する標準的な技術を利用して、ここで特定された遺伝子のコーディング部分を希望の動物ゲノムに導入することによって生成されます。こトランスジェニック操作の対象になれる動物モデルには、ネズミ、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、豚、およびヒト以外の霊長類、例えば、ヒヒ、チンパンジー、およびサルを例外なし含まれます。このような動物にトランス遺伝子を導入する技術には、前核マイクロインジェクション（米国特許４，８７３，１９１号）、生殖細胞系へのレトロウイルス媒介遺伝子移入（例えば、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：６１４８−６１５）、胚幹細胞における遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９年）Ｃｅｌｌ  ５６：３１３−３２１）、胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ，（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏ��．３：１８０３−１８１４）、精子媒介遺伝子移入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９年）Ｃｅｌｌ  ５７：７１７−７３）。例えば、米国特許４，７３６，８６６号を参考。【０６１５】動物モデルによって、ここで取り上げられる抗体、組成物、あるいは併用療法の効力を評価することができます。肺癌向けの動物モデルには、肺癌動物モデル（例えば、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４年）Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  ８（５）：７５５−６９を参考）、およびｐ５３機能障害を持ったトランスジェニックマウスモデル（例えば、Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８年）Ｊ  Ｌａ  Ｓｔａｔｅ  Ｍｅｄ  Ｓｏｃ  １５０（４）：１７９−８５を参考）などのモデルも含まれます。乳癌向けの動物モデルには、サイクリンＤ１を過剰発現するトランスジェニックマウス（例えば、Ｈｏｓｏｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１年）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ  １０（５）：４７１−８を参考）などのモデルもあります。結腸癌向けの動物モデルには、ＴＣＲ  ｂ  およびｐ５３のダブルノックアウトマウス（例えば、Ｋａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１年），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６１（６）：２３９５−８を参考）などのモデルもあります。膵癌向けの動物モデルには、Ｐａｎｃ０２マウス膵臓腺癌の転移モデル（例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１年）皮下膵臓腫瘍で発生したヌーヌーマウス（例えば、Ｇｈａｎｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１年）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ８（３）：１９９−２０８を参考）などのモデルもあります。非ホジキンリンパ腫向けの動物モデルには、重症複合免疫不全症（“ＳＣＩＤ”）マウス（例えば、Ｂｒｙａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００年）Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  ８０（４）：５５３−７３参考）、およびＩｇＨｍｕ−ＨＯＸ１１トランスジェニックネズ（例えば、Ｈｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５（２３）：１３８５３−８を参考）などのモデルも含まれます。食道癌向けの動物モデルには、ヒトパピローマウイルス１６Ｅ７型癌遺伝子向けのマウストランスジェニック（例えば、Ｈｅｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６年）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７０（３）：１８７３−８１を参考）などのモデルもあります。結腸直腸癌向けの動物モデルには、Ａｐｃマウスモデル（例えば、Ｆｏｄｄｅ  ＆  Ｓｍｉｔｓ，（２００１年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ７（８）：３６９−７３およびＫｕｒａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００年）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９（５０）：５７５５−６３を参考）などのモデルもあります。【０６１６】関節炎向けの動物モデルには、関節リウマチラット（例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ，（１９５６年）Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，９１：９５−１０１を参考）、およびマウスやラット生体内におけるコラーゲン誘導関節炎（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｏｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．ＳｈｅｖａｃｈおよびＷ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９４年を参考）などのモデルもあります。喘息向け���動物モデルには、肺過敏性のマウスモデル（例えば、Ｒｉｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：２３５１−２３６３  ａｎｄ  Ｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９年）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０：１９７−２０６を参考）などのモデルもあります。同種免疫拒絶反応向けの動物モデルには、ラット同種心臓移植モデル（例えば、Ｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４年）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５８：２３−２７およびＴｉｎｕｂｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：４３３０−４３３８を参考）、また、拒絶反応１５３：４３３０−４３３８）とラット異種心臓同種移植の拒絶反応（例えば、Ｊａｅ−Ｈｙｕｃｋ  Ｓｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００２年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９９（１６）：１０６１７−１０６２２を参考）などのモデルもあります。ヒト再生不良性貧血のモデルには、鋼マウスが利用されています（例えば、Ｊｏｎｅｓ，（１９８３年）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１１：５７１−５８０を参考）。貧血向けの動物モデルには、溶血性貧血モルモット肺過敏性のマウスモデル（例えば、Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９７２年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．５１：５７５を参考）などのモデルもあります。好中球減少症向けの動物モデルには、好中球減少症の好中球減少性ＣＤラット（例えば、Ｎｏｈｙｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３９：２５９−２６６を参考）などのモデルもあります。【０６１７】８．製造品／キット
選択された抗体あるいは選択された抗体をエンコードする核酸を含む医薬品、またはそれによる派生物あるいは生物学的に活性のある部分は、製造品として包装され、包装材、および疾患や障害の治療に効果がある医薬組成物、および選択された抗体あるいは核酸分子が該当する疾患あるいは障害の治療に使用できることを表示するラベルを含むべきです。【０６１８】本書で取り上げられる製造品は包装材を含みます。医薬品に使用される包装材は当業者によく知られているものです。たとえば、米国特許５３２３９０７号、５０５２５５８号および５０３３２５２号を参考。それぞれは本書で全体的に取り上げています。医薬品包装材の例としては、ブリスターパック、ボトル、チューブ、吸入器、ポンプ、バッグ、小瓶、容器、注射器、ボトル、および選択された処方、投与と治療方法に適切な包装材なども挙げられます。本書で取り上げられる医学品や組成物の多様な処方は、いかなるＥＰＯ媒介性疾患あるいは障害、または治療ポリペプチド媒介性疾患あるいは障害の選択的な治療法として認められています。【０６１９】抗体および抗体をエンコードする核酸分子はキットとして提供されます。キットにはここで説明された医薬組成物、および投与物を１つ含むキットもあります。たとえば、選択された抗体は、注射、吸入器、投与カップ、点滴器、または塗布器などの投与器具と一緒にキットとして提供される場合もあります。また、選択の上、キットは、用量、投与方式・方法に関する使用方法などの説明書を含む場合もあります。キットにはここで説明された医薬組成物、および診断道具を含むキットもあります。たとえば、キットは生体内の抗体の濃度、量、あるいは活性を測定する道具と一緒に提供される場合もあります。【０６２０】９．抗体およびポリペプチドの調合／投与および用法
ここで取り上げられる抗体は投与のために調合される場合があります。活性成分は単独で投与できるにもかかわらず、調合は医薬製剤として提示する方が好ましいです。製剤は少なくとも１つの活性成分、また１つあるいは複数の適切な担体を含みます。各担体は、他の成分と適合性があり患者に薬学的にも生理学的にも害を与えない物でなければなりません。
製剤には、経口投与、経鼻投与、直腸投与、または非経口投与（皮下投与、筋内投与、静脈内投与、および皮内投与を含む）に相応しい物があります。製剤は状況によって単位剤形で提示され薬学分野で知られている方法調製されます。例えば、Ｇｉｌｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．１９９０年）Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄ．（１９９０年）．マック出版社．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．、Ａｖｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．１９９３年）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．１９９０年）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ、およびＬｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．１９９０年）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ．を参考。【０６２１】抗体の投与の経路は、当分野で知られている方法に従うが、例えば静脈内、腹腔内、脳内、筋肉、皮下、眼内、動脈内、髄腔内、吸入、または病巣内経路、局部または下記の持続放出性システムなどの投与方法があります。抗体は、なるべく注入またはボーラス注射によって継続的に投与されます。抗体は局部投与または全身投与で投与できます。【０６２２】ここで取り上げられる抗体は薬剤分野で認められる担体との混合物で調合される場合があります。この製剤の調合、投与の方法に関しては”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”、マック出版社、Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．最新版を参照。この治療組成物はなるべく液体あるいは粉体エアゾール（凍結乾燥）の形で、静脈内経路、経鼻、あるいは経肺で投与できます。そして、この組成物は非経口、または皮下など、希望の経路で投与できます。体系的に投与される場合、治療組成物は消毒された状態、ピロゲンなし、または非経口で投与できる、ｐＨや等張性や安定性に適した水薬でなければなりません。これらの条件は当業者に知られているものです。【０６２３】治療製剤は多くの従来の投与量処方で投与できます。簡単に言えば、ここで取り上げられる抗体の製剤は、生理学的に認められる担体、賦形剤、あるいは安定剤と混合し希望の精度を持たせ、投与あるいは保管するために調合されます。このような材料は、指定された投与量および濃度で被投与者にいかなる害を与えることなく、また次の要素を含めます：トリス塩酸、リン酸塩、クエン酸、酢酸塩、およびその他の有機酸塩などの緩衝剤、および／またはアスコルビン酸などの抗酸化剤、および／またはポリアルギニンなどの低分子量（約１０残基未満）ペプチド、および／または血清アルブミン、ゼラチン、あるいは免疫グロブリンなどのタンパク質、および／またはポリビニルピロリドン；などの親水性ポリマー、および／またはグリシン、グルタミン酸、アスパラギン���、あるいはアルギニンなどのアミノ酸、および／または単糖類、二糖類、およびセルロースあるいはそれに由来する派生物を含む他の炭水化物、グルコース、マンノース、あるいはデキストリン、および／またはＥＤＴＡなどのキレート剤、および／またはマンニトールあるいはソルビトールなどの糖アルコール、および／またはナトリウムなどの対イオン、および／またはＴＷＥＥＮ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ、あるいはポリエチレングリコールなどの非イオン性表面活性剤など。【０６２４】インビボで投与される場合、抗体製剤は消毒するべきで、従来の方法で調合することができます。これは、消毒された濾過膜の濾過作用のおかげで、凍結乾燥の前後を問わず、容易に行うことができます。抗体は通常、凍結乾燥状態あるいは液剤として保管されます。ゴマ、ピーナツなどのような自然発生油、または綿実油あるいはオレイン酸エチルなどのような合成脂肪酸賦形剤、あるいはそれに類似する物が望ましいです。緩衝剤、防腐剤、酸化防止剤などの添加剤は医薬分野で認められる方法で添加できます。【０６２５】医薬組成物は、合理的に設計され目的達成のために適切な量で添加された抗体を含んで初めて利用可能になります。当業者は特に本書で公開された詳細を踏まえて、治療に有効な量を測定能力があります。治療的に有効な用量は、インビボやインビトロを利用することによって測定できます。【０６２６】治療的に効果のある抗体の量は、例えば、治療目的、投与経路、患者の状態などによります。また、主治医は、疾患の種類や深刻度、体重、性別、食事習慣、投与の経路や時間、併用の薬剤、およびその他の関連する臨床的因子など、様々な要因を考慮しながら薬の作用を変更するができます。したがって、セラピストは最適な治療効果を得るために、投与量を調整し、必要に応じて投与経路を変更する場合もあります。臨床医は通常、希望の効果を生み出す投与量が決まるまで抗体の投与を続けます。この治療の進行は従来の分析によって監視されます。【０６２７】ペプチドを含むいかなる抗体に関しては、治療に有効な投与量は細胞培養分析によって事前に推定できます。たとえば、動物モデルでは用量は、細胞培養で指定されるＥＣ５０値を含む血中濃度領域を生みさすように処方されます（例えば、細胞の増殖や分化を促進または阻害する試験分子の濃度）。このような情報を踏まえて、人体に効果的な用量をより正確に決定することができます。【０６２８】ここで取り上げられる抗体分子の毒性および治療効果性は、細胞培養あるいは実験動物において医学の標準的な方式によって決定されるが、例えば、ＬＤ５０値（人口５０％に対する致死量）やＥＤ５０値（人口５０％に治療効果のある用量）を測定する場合。毒性と治療効果性の比率は治療指数と言い、ＬＤ５０値とＥＤ５０値の比率として説明することもできます。より高い治療指数を表す分子の方が望ましいです。この細胞培養分析および動物実験から得られたデータはヒト用量の範囲を測定するために利用されます。このような分子の投与量は、ＥＤ５０値と小量あるいはゼロ毒性を含む血中濃度の範囲内にあります。
投与量は範囲内で投与の方法や経路によって変動します。医師は患者の状態に基づいて正確な製剤、投与経路、および投与量を決定することができます。（例えば、Ｆｉｎｇｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５年，“Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”，Ｃｈ．１，ｐ．１を参考）。【０６２９】投与の量と間隔は、細胞の増殖、分化、あるいは最小有効濃度（ＭＥＣ）を促進あるいは抑制する十分な抗体の血漿中濃度を生み出すために個別に調整することができます。ＭＥＣは各抗体によって異なりますが、説明された分析によってインビトロデータから推定できます。ＭＥＣを生み出すに必要な投与量は個別の特徴および投与経路によります。しかし、ＨＰＬＣアッセイまたはバイオアッセイによって血漿中濃度を測定することができます。【０６３０】投与間隔もＭＥＣ値によって測定できます。抗体分子を投与する制度では血漿中濃度が期間の１０〜９０％の間にＭＥＣ値を上回るが、これは普通３０〜９０％の間、また最も一般的に５０〜９０％の間です。【０６３１】局部投与または選択的取り込みの場合、抗体の効果的な局部濃度は血漿中濃度に関連していないものとします。
１日投与量は以上の条件によって一般的に、１μ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ以上です。臨床医は通常、希望の効果を生み出す投与量が決まるまで分子の投与を続けます。この治療の進行は従来の分析によって監視されます。【０６３２】定期的で複数の投与、あるいは継続的な注入によって患者に投与する可能な投与量に関しては、疾患の種類や深刻度によって、例えば、拮抗薬、あるいはアゴニスト抗体の約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇまで、もっと一般的に約０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまで、もっと一般的に約０．０１０〜２０ｍｇ／ｋｇまでの用量は初期的な投与に勧められます。数日間あるいは長い期間かけて投与する場合、病状によって、治療は症状が抑制されるまで、あるいは患者が望ましく改善するまで繰り返されます。
しかし、他の投薬計画も認められます。【０６３３】Ｈ．例示
次の例は、例示だけで、本発明の範囲を限定するものではありません。【０６３４】例１
材料と方法
１．プラスミドＡおよびＣ【０６３５】図３〜６に挙げられるプラスミドＡ（配列番号：１）、プラスミドＣ（配列番号：３）、プラスミドＤ（配列番号：２）、およびプラスミドＥ（配列番号：４）は、組換えＦａｂ抗体を生成するのに使用されます。このプラスミドはＥ．ｃｏｌｉと適合性のある高コピー、ＣｏｌＥ１複製起点を含みます。また、プラスミドＡとＤのＣｏｌＥ１複製起点はプラスミドＣとＥのＣｏｌＥ１複製起点と適合性があります。
さらに、同じＥ．ｃｏｌｉ細胞で培養されると同様のコピー数で複製されます。プラスミドは、Ｆａｂをペリプラズムに移動させ、より優れた折りたたみ機能を生み出すＳＴＩＩリーダー配列、並びにアラビノース誘導性遺伝子発現向けのアラ・プロモーターを含みます。プラスミドＡはＦａｂ重鎖の生成向けの重鎖定常領域、およびタンパク質の純化に向けたＦｌａｇとＨｉｓタグを含みます。プラスミドＤはＦａｂ重鎖の生成向けの重鎖定常領域、並びにタンパク質の純化およびタンパク質のリガーゼやソルターゼを利用する部位特異的修飾に向けたＦｌａｇ、ＬＰＥＴＧ、およびＨｉｓタグを含みます。プラスミドＣはカッパＦａｂ軽鎖の生成に向けたカッパ軽鎖定常領域を、プラスミドＥはラムダＦａｂ軽鎖の生成に向けたラムダ軽鎖定常領域を含みます。したがって、プラスミドＡとＤはＦａｂ重鎖を、プラスミドＣとＥはＦａｂ軽鎖をエンコードします。Ｆａｂは、Ｅ．ｃｏｌｉが重鎖をエンコードするプラスミドおよび軽鎖をエンコードするプラスミドとの同時形質転換、および重鎖や軽鎖の遺伝子発現のプロモーターの誘導の上で生成されます。【０６３６】２．細胞株
Ｅ．ｃｏｌｉのＢＬ２１株（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＬＭＧ１９４株（ＡＴＣＣ）はＦａｂの発現に使用されました。ＲａｍｏｓＢリンパ球細胞（ＡＴＣＣ）およびＪｕｒｋａｔ  Ｔリンパ球細胞（ＡＴＣＣ）はアポ−ＯＮＥ相同性カスパーゼ−３／７アッセイに使用されました。ＢａＦ３マウス末梢血細胞株（Ｈａｒｖｅｙ  Ｌｏｄｉｓｈ、マサチューセッツ工科大学）はＥＰＯ  Ｆａｂライブラリー細胞に基づいたアッセイに使用されました。【０６３７】３．ＤＮＡ配列編集ソフトウェア
ＤＮＡ配列編集ソフトウェアここで挙げられます。抗体の生殖細胞系の活性を維持しながら、重鎖Ｖ，Ｄ，およびＪセグメント配列、また軽鎖ＶおよびＪセグメントを組み換えるインシリコの方法を導入ソフトウェアです。本ソフトウェアは、組織的にＶＨ，ＤＨおよびＪＨおよびＶＬおよびＪＬ生殖細胞系セグメントをエンコードするＤＮＡ、あるいはＶＨ，ＤＨおよびＪＨおよびＶＬおよびＪＬ生殖細胞系セグメントのサブセット組み合わせ、Ｆａｂライブラリー作成向けの核酸分子の生成のために、組み換え重鎖や軽鎖の可変領域の配列を生み出します。生殖細胞系セグメントはデータベースから入力されます。例２はソフトウェアの説明です。例３は、ソフトウェアの使用方法、例４は、組み換え生殖細胞系配列を編集しＤＮＡ合成に使われる配列を出力する説明です。【０６３８】４．ＰｉｃｃｏｌｏＴＭ自動化システム
ＰｉｃｃｏｌｏＴＭシステムは完全に自動化されたシステムで、”Ｔｈｅ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐ”（ＴＡＰ）によって販売されています（例えば、システムを説明するＷｏｌｌｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６年）ＪＡＬＡ，１１：２９１−３０３を参考）。本システムは細胞培養、自動化収穫、溶解、および純化機を組み合わせるシステムです。例９は、ＰｉｃｃｏｌｏＴＭのシステム運用を詳しく説明します。【０６３９】例２
ＤＮＡ配列編集ソフトウェアデザイン
この例ではＤＮＡ配列編集ソフトウェアについて説明します。【０６４０】Ａ．概要
ＶＨ，ＤＨおよびＪＨおよびＶＬおよびＪＬ生殖細胞系セグメントに関しては、配列は例えばＳｅｑｕｅｎｃｅＤａｔａｂａｓｅ．ｔｘｔなどのデータベースファイルを利用して入力されます。ソフトウェアの機能は、１）ＶＨ，ＤＨおよびＪＨおよびＶＬおよびＪＬのいかなる可能な組み換えを生成し、可変重（ＶＨ）鎖、および可変軽（ＶＬ）鎖をエンコードする配列を生成すること、２）配列を翻訳、フレームチェックを行うこと、３）配列をＳｅｑｕｅｎｃｅＨｉｓｔｏｒｙ．ｔｘｔファイルに保存し、ヌクレオチドフォーマットによる配列追跡を可能にすること、および、４）ＤＮＡ合成に向けて整列された９６ウェルのプレートを代表するファイルとして配列を出力することです。出力は様々な重鎖や軽鎖配列を整列として表示する９６ウェルプレートファイルの形で出され、また、整列の各遺伝子座に相当する９６ウェルプの各レートが指定されます。この出力に基づいてＤＮＡ分子は９６ウェルプレートで合成されます。加えて、ソフトウェアは配列に順序を付け、多様のスコアを出すことができます。ソフトウェアは自動的にＶＨ鎖とＶＬ鎖（カッパ及びラムダ）をエンコードする組換え核酸配列のいかなる順列を生成します。ユーザーは必要に応じて、ソフトウェアが組み換える生殖細胞系セグメントを予めに選択すること、あるいは順序付け機能を利用して十分に異なる配列を選択することによって、出力ファイルを手動で制限することができます。【０６４１】Ｂ．ソフトウェアの説明【０６４２】  ＤＮＡ配列編集ソフトウェアは、ビジュアルスタディオ（Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｔｕｄｉｏ）２００５年Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ版開発ツールを使用してＣ＃プログラミング言語で作られています。ＤＮＡ配列コンパイルソフトウェアは、Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＸＰおよびＶｉｓｔａの３２ビット版のオペレーティングシステムでＭｉｃｒｏｓｏｆｔ．ＮＥＴ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋを実行する必要があります。ソフトウェアは、１０モジュールで構成されています（図７を参考）。このモジュールには、本書で挙げられる（ａ）多様性コンバーターへのＢＬＡＳＴ、（ｂ）ＤＮＡ配列編集ＧＵＩ、（ｃ）ＤＮＡ配列編集コントロール、（ｄ）ＤＮＡ配列編集ルール、および（ｅ）ＤＮＡ配列編集テストなどがあります。他の５モジュールはパブリックドメインソフトウェアから入手できます。それらは（ｆ）Ｎユニット、（ｇ）フォフォーマットｄｂ、（ｈ）ＢＬＡＳＴ、（ｉ）ＢＬＡＳＴＣｌｕｓｔ、および（ｊ）ＸＰエクスプローラーバーです。【０６４３】  モジュールにはクラスがあります。クラスはオブジェクトの正式的な定義です。クラスは、実行時にオブジェクトの実例が作成されるテンプレートとして機能します。クラスはオブジェクトのプロパティ、およびその動作を制御する方法を特定します。シングルトンクラスは、グローバルに、他のすべてのクラスによってアクセスできるクラスです。この場合、シングルトンクラスは、配列編集に関するあらゆるルールを持つ配列編集モジュルです。静的クラスは、クラスの実例を作成しなくてもアクセスできる機能およびデータを含みます。静的なクラスメンバーは特定のオブジェクトに特有のデータや動作の分類に使用することができます。オブジ��クトに変更があっても、このデータや機能は変更しません。【０６４４】また、ソフトウェアは４層に分類されます：１）グラフィカルユーザーインターフェイス（ＧＵＩ）、２）ＧＵＩコントロール、３）編集のルール、４）ＮＣＢＩツールです。４層は、
ＧＵＩ−ＧＵＩは、コンピューターオペレータへの情報提示、あるいはコンピューターオペレータとの相互作用です。ＧＵＩは多様のコンバーターへのＢＬＡＳＴ、ＤＮＡ配列編集ＧＵＩ、およびＮユニットで構成されています。
ＧＵＩコントロール−ＧＵＩに再使用されるＧＵＩカスタム表示Ｗｉｎｄｏｗｓコントロール。ＧＵＩコントロールはＸＰエクスプローラーバー、およびＤＮＡ配列編集コントロールで構成されています。
編集ルール−ＤＮＡ配列編集ルールの導入。編集ルールはＤＮＡ配列編集ルール、およびＤＮＡ配列編集ルールテストで構成されています。
ＮＣＢＩツール−ＮＣＢＩで入手可能、ローカルコンピュータでの検索を可能にするツールのセットです。【０６４５】１．モジュール
ａ．ＤＮＡ配列編集ＧＵＩ
ＤＮＡ配列編集ＧＵＩは主なアプリケーションです。ユーザーと相互作用し、機能性を完全に利用可能にします。ＤＮＡ配列編集ＧＵＩは全体的に、配列編集に使われる生殖細胞系セグメントを選択し制限すること、全ての配列を自動的に編集すること、配列多様性、クラスタ、あるいは類似性に基づいて全ての配列に順序を付けること、および９６ウェルプレートに配置する編集ＤＮＡ配列を選択することを可能にします。
ＤＮＡ配列編集ＧＵＩは次のクラスに分けられます：
Ｐｒｏｇｒａｍ（プログラム）−アプリケーション実行のエントリポイントを含む、自動的に生成された静的クラスです。
ＳｐｌａｓｈＳｃｒｅｅｎ（スプラッシュ画面）−アプリケーションの起動時、終了時にスプラッシュ画面を表示するユーザーコントロールです。
ＭａｉｎＦｏｒｍ（メインフォーム）−ユーザーに利用可能な機能を全て包括する形態です。ＭａｉｎＦｏｒｍはまた、ＤＮＡ配列編集コントロールモジュルに導入されたユーザーコントロールを表示したり、ＤＮＡ配列編集規則モジュールで定義された配列編集シングルトンを初期化します。【０６４６】Ｒｅｌｅａｓｅ（リソース）−スプラッシュ画面の画像を表示するリソースファイル。
設定−自動的に生成されたクラスで、５’制限部位および３’制限部位に関するユーザー設定を含むが、この制限部位はＩＤＴ整列を完成するために配列と配置されます。
ＡｂｏｕｔＢｏｘ（オートボックス）−アプリケーションの情報をユーザーに表示する形態です。ユーザーと相互作用し、機能性を完全に利用可能にします。
ａ．ＤＮＡ配列編集コントロール【０６４７】ＤＮＡ配列編集コントロールモジュールは、ＧｕＩで使用されるウィンドウカスタムコントロールを含みます。次のクラスが含まれます：
ＦａｂｒｕｓＤａｔａＧｒｉｄＶｉｅｗ−．ＮＥＴフレームワークＤａｔａＧｒｉｄＶｉｅｗの導出クラスで、列のヘッダーに列号を表示します。．ＮＥＴフレームワークはＷｉｎｄｏｗｓオペレーティングシステムの一部で、一般的なプログラミング問題に対する既定のソリューションの大規模なライブラリーを提供するほか、フレームワーク専用のプログラム実行を管理します。ＤａｔａＧｒｉｄＶｉｅｗコントロールは、カスタマイズ可能なデータ表示テーブルを提供します。【０６４８】  ＷｅｌｌＰｌａｔｅＣｏｎｔｒｏｌ（ウェルプレートコントロール）−９６ウェルプレートの情報を表示するカスタムコントロールです。
ＡｕｔｏＨｅａｖｙＳｅｑｕｅｎｃｅＣｏｎｔｒｏｌ（自動重配列コントロール）−自動的に編集されたＤＮＡ配列をデータグリッドで表示し、ユーザーが９６ウェルプレートに選択できるようにするカスタムコントロールです。また、表示順位、多様性、スコア、クラスタ、Ｖ（Ｄ）Ｊ配列の識別子、およびＤＮＡ配列タンパク質配列も表示できます。
ＡｕｔｏＬｉｇｈｔＳｅｑｕｅｎｃｅＣｏｎｔｒｏｌ（自動軽配列コントロール）−自動的に編集されたＤＮＡ配列をデータグリッドで表示し、ユーザーが９６ウェルプレートに選択できるようにするカスタムコントロールです。また、表示順位、多様性、スコア、クラスタ、Ｖ（Ｄ）Ｊ配列の識別子、およびＤＮＡ配列タンパク質配列も表示できます。
ＭａｎｕａｌＨｅａｖｙＳｅｑｕｅｎｃｅＣｏｎｔｒｏｌ（手動重配列コントロール）−重鎖ＤＮＡ配列を編集するためにＶＨ，ＤＨおよびＪＨ配列を手動で選択できるようにするカスタムコントロールです。
ＭａｎｕａｌＨｅａｖｙＳｅｑｕｅｎｃｅＣｏｎｔｒｏｌ（手動軽配列コントロール）−重鎖ＤＮＡ配列を編集するためにＶＨ，ＤＨおよびＪＨの配列を手動で選択できるようにするカスタムコントロールです。
ＬｉｇｈｔＳｅｑｕｅｎｃｅＢｌａｓｔＦｏｒｍ（軽配列ＢＬＡＳＴ形態）−他の軽鎖に対して軽配列のＢＬＡＳＴ結果をグリッド形式で表示するカストムコントロールです。
ＨｅａｖｙＳｅｑｕｅｎｃｅＢｌａｓｔＦｏｒｍ（重配列ＢＬＡＳＴ形態）−他の重鎖に対して重配列のＢＬＡＳＴ結果をグリッド形式で表示するカストムコントロールです。【０６４９】ｃ．ＤＮＡ配列編集規則モジュール
ＤＮＡ配列編集規則モジュールは、ＤＮＡ配列編集向けのビジネスロジックを包括します。このモジュールは、編集、接合部の生成、終止コドン除去、および配列順位付けを含み、機能的かつ組み換えＶＤＪおよびＶＪ抗体配列編集の規則を包括します。【０６５０】ＤＮＡ配列コンパイルモジュールでは、主に６つのクラスがあります：
ＳｅｑｕｅｎｃｅＣｏｍｐｉｌｅｒはＤＮＡ配列の機能性を全て提供するシングルトンクラスです。このクラスでは、Ｖ（Ｄ）Ｊ配列、およびその関連情報から、紐み合わせＤＮＡ配列を自動的にまたは手動で生成することは可能になります。
ＢｌａｓｔＴａｂｌｅは多様性スコア、クラスター番号に関する情報を提供し、特定の配列のＢＬＡＳＴ検索を行います。
ＳｅｑｕｅｎｃｅＨｉｓｔｏｒｉａｎはＤＮＡ合成会社が注文したＤＮＡ配列をヌクレオチドフォーマットで追跡するクラスです（例えば、ＩＤＴ，Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，およびそれに類似するものです）。ＳｅｑｕｅｎｃｅＨｉｓｔｏｒｙ．ｔｘｔというファイルで持続が可能だが、このファイルはＤＮＡ合成会社が注文したＤＮＡの全ての配列をヌクレオチドフォーマットで追跡を続けます。
ＳｅｑｕｅｎｃｅＣｏｎｔａｉｎｅｒは全てのＶ（Ｄ）Ｊ配列情報と制限部位をＳｅｑｕｅｎｃｅｓＤａｔａｂａｓｅ．ｔｘｔテキストファイルで記載された通りに保存するクラスです。
ＤｎａＳｅｑｕｅｎｃｅはＨｅａｖｙＣｈａｉｎＤｎａＳｅｑｕｅｎｃｅおよびＬｉｇｈｔＣｈａｉｎＤｎａＳｅｑｕｅｎｃｅクラスによって、それぞれ重鎖および軽鎖配列を模倣する親クラスです。
ＷｅｌｌＰｌａｔｅ＿８ｘ１２は９６ウェルプレートを模倣するクラスです。ＤＮＡ配列の例への参考を含み、また注文ファイルに保存されるようにします。
加えて、ＤＮＡ配列編集規則には３つの補充クラスがあります：
ＣｏｄｏｎＵｓａｇｅＴａｂｌｅはＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２向けのコドン使用表を包括するクラスです。
Ｔｒａｎｓｌａｔｏｒは６４のコドンを、遺伝子コードに基づいて相当するアミノ酸に翻訳する静的クラスです。【０６５１】ＰｒｏｔｏＰａｒａｍはＧＲＡＶＹ値を計算する静的クラスです。
次はＤＮＡ配列編集規則モジュールの主要な６つのクラス（ｉ−ｖｉ）、および補充の３つのクラス（ｖｉｉ−ｉｘ）をそれぞれ分析したものです。【０６５２】ｉ．ＳｅｑｕｅｎｃｅＣｏｍｐｉｌｅｒ（配列編集機能）
ＳｅｑｕｅｎｃｅＣｏｍｐｉｌｅｒはＤＮＡ配列の機能性を全て提供するシングルトンクラスです。このクラスでは、Ｖ（Ｄ）Ｊ配列、およびその関連情報から、組み合わせＤＮＡ配列を自動的にまたは手動で生成することは可能になります。
ＳｅｑｕｅｎｃｅＣｏｍｐｉｌｅｒには次の機能があります。【０６５３】１）自動的ＤＮＡ配列編集向けのアルゴリズム
ＳｅｑｕｅｎｃｅＣｏｍｐｉｌｅｒは図８に示されるアルゴリズムを使用し、軽鎖および重鎖の全ての可能なＶ（Ｄ）Ｊ配列の組み合わせを計算することによって、編集された配列を生み出します。アルゴリズムはただ、軽鎖および重鎖の全ての可能なＶ（Ｄ）Ｊ配列の組み合わせを計算することに同等です。
たとえば、ＶＨが３つ、ＤＨが３つ、およびＪＨが３つの配列がある場合、アルゴリズムは３＊３＊３のコンビを計算し、可能な２７コンビを生み出します。同様に、Ｖκが４つ、およびＪκが４つの配列がある場合、アルゴリズムは４＊４のコンビを計算し、可能な１６コンビを生み出します。加えて、アルゴリズムはラムダ軽鎖、およびカッパ軽鎖を別々で計算します。【０６５４】２）配列編集【０６５５】実際の配列編集にあたってはまず、ＳｅｑｕｅｎｃｅＤａｔａｂａｓｅ．ｔｘｔファイルから、重鎖および軽鎖向けのＶＨ、ＤＨ、およびＪＨ配列、またはＶＬおよびＪＬ配列をそれぞれ特定することは第一歩です。個々のセグメントは例４に説明された通りに特定されます。
個々のセグメントが特定された後で、Ｖ（Ｄ）Ｊ接合部が生成され、ヌクレオチドの部分（セグメントと結合部）が結合され、配列は編集されます（図９を参考）。接合部の生成、終止コドンの除去、および制限部位に関する規則は、”Ｖ（Ｄ）Ｊ接合部生成”、”終止コドンの除去”、および”コドン使用テーブル”セクションのヘッディングの下に記載されています。【０６５６】３）Ｖ（Ｄ）Ｊ接合部の生成
個々のＶ（Ｄ）Ｊ配列の間の組み換え配列の接合部は、結果の配列がインフレームになるように選択されます。
ＳｅｑｕｅｎｃｅＣｏｍｐｉｌｅｒは以下の３つの規則によってリーディングフレームを特定します。【０６５７】１．Ｖ配列は常にリーディングフレーム１です。
２．Ｄ配列は最も負のＧＲＡＶＹ（疎水性総平均）を生み出すフレームを持っています。
３．Ｊ配列はＳｅｑｕｅｎｃｅＤａｔａｂａｓｅ．ｔｘｔで指定されたようなリーディングフレームを持っています（例４．１”Ｖ（Ｄ）Ｊ配列データベースファイル作成”で説明されるように、Ｊ配列はリーディングフレームの特定のために３つのコドンで表示されます。表１３も参考）。【０６５８】以上の規則に基づいて、いずれもの配列の塩基を組み換えるだけでコドンが配列の間の接合部で自動的に生成されるわけではありません。ＳｅｑｕｅｎｃｅＣｏｍｐｉｌｅｒは新しいコドンを生成するために、表１９に記載されている規則に従います。たとえば、Ｖ配列がリーディングフレーム１、およびＪ配列がリーディングフレーム２にあるという軽鎖Ｖ−Ｊ接合部を作成する時に、”Ｇ”ヌクレオチドがＶ−Ｊ接合部の真ん中に挿入され、セグメント全体のリーディングフレームを保ちます。【０６５９】
【表１９】
0005882058.tif 000179
0005882058.tif 000180
【０６６０】４）終止コドンの除去
場合によって、Ｖ（Ｄ）Ｊ接合部の生成は終止コドン（ＴＡＡ，ＴＡＧあるいはＴＧＡ）を生み出す場合があります。
ＳｅｑｕｅｎｃｅＣｏｍｐｉｌｅｒは次の規則に従って、有害な終止コドンを除去し、終止コドンをエンコードするヌクレオチドは指定された新しいコドンに置き換えられます：
0005882058.tif 000181
ＳｅｑｕｅｎｃｅＣｏｍｐｉｌｅｒはＶ（Ｄ）Ｊ接合部生成、および終止コドン除去の完了した後で、タンパク質配列は完成で機能的です。【０６６１】５）配列に順位を付けるアルゴリズム
一度配列が編集された後で、各配列が順位づけられ、最高多様性から最低多様性の順番でユーザーに例示されます（表２０、図１７、図１９を参考）。このような配列のランキング表示のおかげで、ユーザーは色々な選択肢から９６ウェルプレートの注文書ファイルに配列を選ぶことができます。ユーザーは最も多様な配列、または最も類似性のある配列を選択することができます。【０６６２】ソフトウェアは配列の多様性のスコアとクラスタ番号情報によって、編集された配列に順位をつけます。多様性のスコアは、セクションＢ．１．ｅに記載された通りに多様性コンバーターへのＢＬＡＳＴによって、また、クラスタ情報は、Ｂ．１．ｉ．に記載された通りにＢＬＡＳＴＣｌｕｓｔによって生成されます。配列順位のアルゴリズムの流れ図は図１０にあります。アルゴリズムは、各クラスターから最も低い多様性のスコアの配列を選び出し、その配列を多様性に基づいて最も低いから最も高い多様性（低い多様性スコアは低い類似性ということで、最も高い多様性を表している）の順番で並べ、その順番に従って配列に順位を付け、その配列をそれぞれのクラスターから削除し、そして全ての配列が順位付けられるまでこのプロセスを繰り返します。【０６６３】アルゴリズムによる順位付けの例は表２０にあります。表の配列は最も高いから最も低い多様性の順番で並べてあります。最も多様性の低いスコアの配列は最も高い多様性を表し１位にあります。２番目の配列は同じクラスターに属しているが、６４位にあります。配列００１および配列００２は両方３９クラスターにあり、多様性スコアで連続しているので、ユーザーはこのデータを踏まえて特定されたクラスタが合計で６３があると分かります。【０６６４】
【表２０】
0005882058.tif 000182
【０６６５】ｉｉ．ＢｌａｓｔＴａｂｌｅ（ＢＬＡＳＴ表）
ＢｌａｓｔＴａｂｌｅは多様性スコア、クラスター番号に関する情報を提供し、特定の配列のＢＬＡＳＴ検索を行います。【０６６６】ｉｉｉ．ＳｅｑｕｅｎｃｅＨｉｓｔｏｒｉａｎ（配列歴史）
ＳｅｑｕｅｎｃｅＨｉｓｔｏｒｉａｎはＤＮＡ合成会社が注文したＤＮＡ配列をヌクレオチドフォーマットで追跡するクラスです。ＳｅｑｕｅｎｃｅＨｉｓｔｏｒｙ．ｔｘｔというファイルで持続が可能です。【０６６７】ｉｖ．ＳｅｑｕｅｎｃｅＣｏｎｔａｉｎｅｒ（配列コンテナ）
ＳｅｑｕｅｎｃｅＣｏｎｔａｉｎｅｒはテキストファイルからＶ（Ｄ）Ｊ配列、および制限部位を読み込み、そして、手動でまたは自動的な編集のための将来の検索に向けてメモリーに保存します。【０６６８】ｖ．ＤｎａＳｅｑｕｅｎｃｅ（ＤＮＡ配列）
ＤｎａＳｅｑｕｅｎｃｅはＨｅａｖｙＣｈａｉｎＤｎａＳｅｑｕｅｎｃｅおよびＬｉｇｈｔＣｈａｉｎＤｎａＳｅｑｕｅｎｃｅクラスによって、それぞれ重鎖および軽鎖配列を模倣する親クラスです。ＨｅａｖｙＣｈａｉｎＤｎａＳｅｑｕｅｎｃｅとＬｉｇｈｔＣｈａｉｎＤｎａＳｅｑｕｅｎｃｅクラスの唯一相違点は、配列を編集する方式にあるが、これは各クラスのコンストラクターに実装されています。
各クラスには、フィールド、プロパティ、およびメソッドがあります。加えて、親ＤｎａＳｅｑｕｅｎｃｅクラスはイベントやネストタイプを含みます。したがって、ＤｎａＳｅｑｕｅｎｃｅは重鎖および軽鎖配列に共通されるすべての機能を実装しています。これには、アミノ酸、クラスター、ＤｉｖｅｒｓｉｔｙＳｃｏｒｅ（多様性スコア）、＿ＳＥＱ＿ＩＤ（配列ＩＤ）、名前、注意項目、ヌクレオチド、順位、およびＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎＳｉｔｅｓ（制御部位）などのフィールド、並びに制限部位の除去、終止コドンの除去、および制限部位のサイレンシングなどののメソッドがあります。ＨｅａｖｙＣｈａｉｎＤｎａＳｅｑｕｅｎｃｅクラスは、ＶＨ，ＪＨとＤＨ配列、ＶＨ−ＪＨとＪＨ−ＤＨの接合部、およびＶＨ−ＪＨとＪＨ−ＤＨ接合部を生成するメソッドを含みます。ＬｉｇｈｔＣｈａｉｎＤｎａＳｅｑｕｅｎｃｅクラスは、ＶＬとＪＬ配列、ＶＬ−ＪＬ接合部、およびＶＬ−ＪＬ接合部を生成するメソッドのフィールドを含みます。【０６６９】ｖｉ．ＷｅｌｌＰｌａｔｅ＿８ｘ１２（ウェルプレート＿８ｘ１２）
ＷｅｌｌＰｌａｔｅ＿８ｘ１２は９６ウェルプレートを模倣するクラスです。ＤＮＡ配列の例への参考を含み、また注文ファイルに保存されるようにします。【０６７０】Ｖｉｉ  ＣｏｄｏｎＵｓａｇｅＴａｂｌｅ（コドン使用表）
ＣｏｄｏｎＵｓａｇｅＴａｂｌｅはＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２向けのコドン使用表を包括するクラスです。ソフトウェアはＣｏｄｏｎＵｓａｇｅＴａｂｌｅを利用し、リーディングフレームの問題を解決したり、制限部位サイレンシングを解除したりできます。ソフトウェアは希望のプラスミドにＤＮＡを挿入するのに使用される制限部位を特定するように設定されています。ＤＮＡ配列で制限部位が特定されると、ソフトウェアは適切なアミノ酸配列を維持しながら、不要な制限部位を修正するためにヌクレオチド配列を変更します。上記のコドン重複性はコドンを変更するためです。コドンの変更によって、新しく使用された可能なコドンの使用頻度を有利に増加させることができます。また、コドンの１番、２番目の塩基を変更するより、コドンの最後の塩基を変更する方が望ましいです。【０６７１】ｖｉｉｉ．Ｔｒａｎｓｌａｔｏｒ（翻訳機能）
Ｔｒａｎｓｌａｔｏｒは６４のコドンを、遺伝子コードに基づいて相当するアミノ酸に翻訳する静的クラスです。【０６７２】
【表２０】
0005882058.tif 000183
0005882058.tif 000184
【０６７３】ｉｘ．ＰｒｏｔｏＰａｒａｍ
ＰｒｏｔｏＰａｒａｍはＧＲＡＶＹ値を計算する静的クラスです。特定のペプチドあるいはタンパクに対するＧＲＡＶＹ（疎水性総平均）値は、全てのアミノ酸の疎水性を足し配列内の塩基数で割って計算されます。基本的には、ＧＲＡＶＹ値はタンパク質の疎水性残基の相対的な値です。Ｖ（Ｄ）Ｊ接合部生成ソフトウェアは、Ｄ配列のリーディングフレームを計算する時にこの情報を使用します。このリーディングフレームは最も負のＧＲＡＶＹ値で決定されます。【０６７４】
【表２１】
0005882058.tif 000185
0005882058.tif 000186
【０６７５】ｄ．ＤＮＡ配列編集規則テストモジュール
ＤＮＡ配列編集規則テストモジュールは、自動化されたＮ単体の複数のテストで、各クラスの単体テストを実行します。このテストによって、個々のモジュールとクラスが正常に動作していることを確認できます。９つのクラスは：
ＢｌａｓｔＴａｂｌｅＴｅｓｔ；
ＣｏｄｏｎＵｓａｇｅＴａｂｌｅＴｅｓｔ；
ＨｅａｖｙＣｈａｉｎＤｎａＳｅｑｕｅｎｃｅＴｅｓｔｅｒ；
ＬｉｇｈｔＣｈａｉｎＤｎａＳｅｑｕｅｎｃｅＴｅｓｔｅｒ；
ＰｒｏｔｏＰａｒａｍＴｅｓｔ；
ＳｅｑｕｅｎｃｅＣｏｍｐｉｌｅｒＴｅｓｔ，
ＳｅｑｕｅｎｃｅＣｏｎｔａｉｎｅｒＴｅｓｔ；
ＴｒａｎｓｌａｔｏｒＴｅｓｔ；ａｎｄ
ＴｒａｎｓｌａｔｏｒＷｒａｐｐｅｒ．【０６７６】ｅ．多様性コンバーターへのＢＬＡＳＴモジュール
多様性コンバーターへのＢＬＡＳＴは、ＢＬＡＳＴの出力ファイルによって多様性のスコアを出力できるプログラムです。５つクラスを含みます：
Ｐｒｏｇｒａｍ（プログラム）−アプリケーション実行のエントリポイントを含む、自動的に生成された静的クラスです。
Ｍａｉｎ  Ｆｏｒｍ（メインフォーム）−オペレーターが変更するファイルを選択する時に押すボタンです。
リソース−デフォルトで作成される空のファイルリソースです。
設定−ユーザの設定を記録する、自動的に生成されたクラスです。【０６７７】ＢｌａｓｔＣｏｎｖｅｒｔｅｒ（ＢＬＡＳＴコンバーター）−ＢＬＡＳＴ出力ファイルを多様性スコアファイルへの変換実装を含むクラスです。【０６７８】ｉ．ＢＬＡＳＴコンバーターアルゴリズム
ＢＬＡＳＴコンバーターアルゴリズムはＢＬＡＳＴ出力ファイルで次の方程式を行い配列多様性スコアを計算します。【０６７９】
【数１】
0005882058.tif 000187
このアルゴリズムは、個々のＢＬＡＳＴ数を、２乗し、その２乗を足し、サンプル（Ｎ）の数で規格化し、そして平方根を求めることによって、ＢＬＡＳＴスコアの標準偏差を計算します。【０６８０】たとえば、配列多様性スコアは次のＢＬＡＳＴ出力ファイルでアルゴリズムを行うことによって計算されました（−ｍ９ＢＬＡＳＴスウィッチ、例えば、コメントライン付き表、配列ビューオプション、Ｂ．１．ｈを参考）。
0005882058.tif 000188
【０６８１】それぞれの可変鎖配列の多様性スコアを出す次の出力ファイルは生成されます。最も低い多様性スコアは配列と次の最も類似性のある配列との間の類似性を表し、また最も高い多様性を持っています。
0005882058.tif 000189
【０６８２】ｆ．Ｎ単体
Ｎ単体はすべての．Ｎｅｔ言語向けの単体テストフレームワークです。Ｎ単体テストツールは、オブジェクトモデルをテストする手段の１つで、そのアプリケーションとロジックが正常に動作する限り、有用なツールです。当初はＪ単体から移植されたが、現在の２．４．２バージョンの発売はＭｉｃｒｏｓｏｆｔ．ＮＥＴ向けのｘ単体ベーステストツールの５番目重要です。完全にＣ＃で書き込まれました。また、例えば、カスタム属性、およびその他に関連する機能など、様々な．ＮＥＴ言語特徴を取り入れるように再設計されました。Ｎ単体はｘ単体をすべての．Ｎｅｔ言語に取り入れます。Ｎ単体はＮ単体機関から公衆に無料で公開されています。【０６８３】ｇ．Ｆｏｒｍａｔｄｂ
Ｆｏｒｍａｔｄｂは、タンパク質あるいはヌクレオチドのデータベースがｂｌａｓｔａｌｌ，ｂｌａｓｔｐｇｐあるいはＭｅｇａＢＬＡＳＴに検索される前に、そのソースデータベースをフォーマットするために利用されます。ソースデータベースは、ＦＡＳＴＡあるいはＡＳＮ．１形式です。ソースデータベースがｆｏｒｍａｔｄｂによってフォーマットされたら、ＢＬＡＳＴに必要ではなくなります。
次のコマンドラインオプションはｆｏｒｍａｔｄｂで出力ファイルを生成する時に利用されます。
−ｉフォーマットのファイルを入力
−ｐファイルの種類（Ｔ−タンパク質、Ｆ−ヌクレオチド、デフォルト＝Ｔ）
−ｏ構文解析オプション
Ｔ−正しい：構文解析配列ＩＤおよびインデックス作成
Ｆ−正しくない：ＩＤの構文解析を行わないインデックスを作成しない
現在、ｗｉｎ３２−ｉａ３２（２．２．１７）バージョンが使われています。Ｆｏｒｍａｔｄｂは、国立情報バイオテクノロジーセンターからダウンロードすることができます。
ｈ．基本的局所配列検索ツール（ＢＬＡＳＴ）
基本的局所配列検索ツール（ＢＬＡＳＴ）は、なローカル配列検索ツールは、配列間の局所類似の領域を検索します。このプログラムは、ヌクレオチドあるいはタンパク質の配列を配列データベースと対比し、一致件数の統計的有意性を計ります。ＢＬＡＳＴは配列の間で機能的または進化的関係を推測するだけでなく、遺伝子族メンバーの特定にも貢献します。
次のコマンドラインオプションはｂｌａｓｔａｌｌで出力ファイルを生成する時に利用されます。
−ｐプログラム名（“ｂｌａｓｔｐ”，“ｂｌａｓｔｎ”，“ｂｌａｓｔｘ”，“ｔｂｌａｓｔｎ”，あるいは“ｔｂｌａｓｔｘ”）
−ｄデータベース
−Ｉクエリ―ファイル
−ｏＢＬＡＳＴ  レポート出力ファイル
−ｍ配列ビューオポション（０＝デフォルト、９＝コメントライン付き表）
−ｂ（Ｂ）［Ｉｎｔｅｇｅｒ］の配列を表示するデータベース配列番号。
現在、ｗｉｎ３２−ｉａ３２（２．２．１７）バージョンが使われています。ＢＬＡＳＴは、国立情報バイオテクノロジーセンターからダウンロードすることができます。【０６８４】ｉ．ＢＬＡＳＴＣｌｕｓｔ
ＢＬＡＳＴＣｌｕｓｔは、タンパク質またはヌクレオチドの配列をクラスターにするためのスタンドアローンＢＬＡＳＴパッケージ内のプログラムの１つです。このプログラムは対マッチで始まり、特定の配列はクラスター内の少なくとも１つの配列と一致する場合、クラスタ内に取り入れられます。ヌクレオチド配列の場合は、Ｍｅｇａｂｌａｓｔアルゴリズム、タンパク質の場合は、ｂｌａｓｔｐアルゴリズムを利用し、対マッチを計算します。
最も簡単な例ではＢＬＡＳＴＣｌｕｓｔは入力として、連結ＦＡＳＴＡ形式の配列を含むファイルを利用し、各配列は定義線の先頭に特有の識別子を持っています。ＢＬＡＳＴＣｌｕｓｔは入力配列をフォーマットし、一時的ＢＬＡＳＴデータベースを作成し、クラスタリングを実行し、そして完了時にデータベースを削除します。したがって、ＢＬＡＳＴＣｌｕｓｔを使用する前に予めにｆｏｒｍａｔｄｂを実行する必要はありません。ＢＬＡＳＴＣｌｕｓｔ出力は、１本線当たりに１つのクラスターが付いた、スペースで区切られた配列識別子のファイルです。クラスターは最大から最小への順番で分別されています。
次のコマンドラインオブションはｂｌａｓｔｃｌｕｓｔで出力ファイルを生成する時に利用されます。
−ｄ配列データベース名
−ｏクラスターリストを保存する出力ファイル
−Ｓ類似性境界
もし＜３の場合は、境界はＢＬＡＳＴスコア濃度（０．０〜０．３、デフォルト＝１．７５）に設定されます。
もし＞３の場合は、境界は同一の残基のパーセンテージ（３〜１００）で設定されます。
現在、ｗｉｎ３２−ｉａ３２（２．２．１７）バージョンが使われています。ＢＬＡＳＴＣｌｕｓｔは、国立情報バイオテクノロジーセンターからダウンロードすることができます。【０６８５】ｊ．ＸＰＥｘｐｌｏｒｅｒＢａｒ
ＸＰＥｘｐｌｏｒｅｒＢａｒは完全にカストム可能なＷｉｎｄｏｗｓ  ＸＰ式エキスプローラーバーで、Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＸＰテーマや動画を使った拡大／縮小機能をサポートします。ＸＰエクスプローラバーはパブリックドメインソフトウェアとして無料で入手可能です。【０６８６】例３
配列データペース
ＤＮＡ配列編集ソフトウェアは、配列情報が記録されたファイルが必要で、このファイルを利用して配列編集規則に従って配列編集を実行することができます。このファイルはＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔａｂａｓｅ．ｔｘｔです。全ての組み換え配列はファイル内のは例つデータから生み出されます。したがってファイルは、ソフトウェアが配列編集の実行に使用するすべての配列を含みます。
たとえば、ファイルは希望の生殖細胞系セグメント向けのヌクレオチド配列、および制限酵素向けのヌクレオチド認識配列を含みます。データベース内の配列にはあらゆる既知配列が含まれ、また、配列は随時手動で更新することができます。ヒト由来のＶ、Ｄ、およびＪ抗体生殖細胞系配列は、ＮＣＢＩ  ＩｇＢＬＡＳＴデータベース（国立バイオテクノロジー情報センターから入手可能）、および国際免疫遺伝情報システム（ＩＭＧＴ）から得られたもので、配列データベースファイルに入力されました。データベースファイルは配列編集ソフトウェアに入力ファイルとして提供されます。
ＳｅｑｕｅｎｃｅＤａｔａｂａｓｔ．ｔｘｔファイルのフォーマットは図１１で例示されています．ＳｅｑｕｅｎｃｅｓＤａｔａｂａｓｅ．ｔｘｔファイルは次の規則に従って手動で新しい配列を追加するだけで更新できます：
●  すべての配列はＦＡＳＴＡ形式で指定するべきです。
●  Ｊの配列に３文字コドンを指定するべきです。
●  すべての配列の間に”空線”を引くべきです。
●  ／／は無関係なコメントのある線の先頭に記すべきです。
●  セクションのタイトルは次の通りに示すべきです：
○  ［ＶＨ］−続きのＶＨ配列リスト：
○  ［ＤＨ］−続きのＤＨ配列リスト：
○  ［ＪＨ］−続きのＪＨ配列リスト：
○  ［ＶＫ］−続きのＶＫ配列リスト：
○  ［ＪＫ］−続きのＪＫ配列リスト：
○  ［ＶＬ］−続きのＶＬ配列リスト：
○  ［ＪＬ］−続きのＪＬ配列リスト：
○  ［Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｓｉｔｅｓ］−続きの制限部位リスト：【０６８７】例４
重鎖と軽鎖ＤＮＡファイル作成、および順位分析【０６８８】この例では、ＤＮＡ配列編集ソフトウェアで使用される組み換え重鎖および軽鎖配列ファイルを作成する方法について説明します。ファイルはソフトウェアがインストールされた直後に作成されました。ファイルは、データベース内の配列の多様性やクラスターに関する情報を計算するために、ＳｅｑｕｅｎｃｅＤａｔａｂａｓｅ．ｔｘｔファイルから作成され、ＮＣＢＩのｆｏｒｍａｔｄｂ、ＢＬＡＳＴ、およびＢＬＡＳＴｃｌｕｓｔなどのパブリックドメインソフトウェアによって分析されています。ソフトウェアの順位付け機能は自動的だが、ユーザーはこの機能を任意に利用し、ＤＮＡ合成に使われる配列に順位を付け、選択や並べることができるようにします。【０６８９】配列ファイルを作成する前に、希望の全てのＶ．（Ｄ）．およびＪ可変領域配列のためのＤＮＡ配列を含むデータベースが作成されました（例３を参考）。ＤＮＡ配列編集ソフトウェアは機械的に、全ての重鎖可変生殖細胞系セグメント、および軽鎖可変生殖細胞系セグメント配列を、データベースに、機能性アミノ酸配列をエンコードする核酸分子に組み換えました。ソフトウェアは核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、配列ファイルを生成しました。組み換えアミノ酸配列は、各編集配列と他のそれぞれの編集配列の間の類似性を計るために比較され、その類似性は測定されたが、後で多様性スコアの測定にも利用されました。
最後に、編集配列は配列類似性によってクラスター化されました。ソフトウェアの様々なステップはソフトウェアを初期化した直後に行われたのだが、そのステーブは以下のとおりです。【０６９０】１．重鎖と軽鎖の編集
データベースファイルが更新され、全ての必要なＶ（Ｄ）Ｊ配列を含んだ後、ＤＮＡ配列編集ソフトウェアは、例２、セクションＢ．１．ｃに説明されている通りにＤＮＡ配列編集規則に従って、データベースファイルを入力ファイルとして使用し完全長の重鎖あるいは軽鎖配列を機械的に編集しました。ソフトウェアは、編集された可変重鎖および軽鎖の生殖細胞系セグメントにエンコードされた完全長のアミノ酸配列を含むファイルを作成しました。次のファイルに含まれています：
●  ＴｅｍｐＬｉｇｈｔＣｈａｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅｓ．ｔｘｔ−このファイルはアミノ酸フォーマットのカッパおよびラムダの全ての軽鎖配列の組み合わせを含みます。
●  ＴｅｍｐＬｉｇｈｔＣｈａｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅｓ．ｔｘｔ−このファイルはアミノ酸フォーマットの全ての重鎖配列の組み合わせを含みます。
編集された軽鎖および重鎖アミノ酸配列は特有のＩＤによって示されています（ｇｎｌ｜Ｆａｂｒｕｓ｜Ｖ＿（Ｄ）＿Ｊ）。その例は以下にあります。
0005882058.tif 000190
【０６９１】２．組み換え可変重鎖と軽鎖の順位付け
ソフトウェアによって、組み換え可変重鎖および軽鎖は、配列類似性で、全ての組み換え配列と比較されました。これは、ＮＣＢＩユーティリティＢＬＡＳＴで実行されます。Ｂｌａｓｔビットスコアで多様性スコアを計算します。組み換え可変重鎖および軽鎖はまた、クラスター分析ツール（例えばＢＬＡＳＴｃｌｕｓｔ）によって、配列類似性が分析されました。【０６９２】例２、”配列に順位を付けるアルゴリズム”のヘッディングの下で説明された通り、編集された配列は、多様性スコアとクラスタ番号情報に基づいてソフトウェアによって順位付けられました。順位付けは、プログラムの起動後に自動的に行われ、以下の例５で説明されるように、ユーザーが自動編集機能で観察することができます。たとえば、図１７、図１９、自動配列後のスクリーンショットを例示し、クラスタ、多様性スコア、模範的な重鎖と軽鎖配列の順位を表示するコラムを示します。【０６９３】以下のセクションでは、例２で説明されたアルゴリズムを利用し、多様性スコアやクラスターを特定し配列に順位を付けるための様々なステップを説明します。【０６９４】ａ．編集された配列の類似性および多様性スコアを計算
編集された配列は、配列の間の類似性を測定するために比較されました。この情報に基づいて多様性スコアが測定されたのです。最初は、ＴｅｍｐＬｉｇｈｔＣｈａｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅｓ．ｔｘｔとＴｅｍｐＨｅａｖｙＣｈａｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅｓ．ｔｘｔのファイルがフォルダ（ユーザーが作成したもの）にコピーされ、ＤＯＳコマンドプロンプトウィンドウが開かれました。ＮＣＢＩ  ＤＮＡユーティリティｆｏｒｍａｔｄｂによって、まず軽鎖や重鎖にそれぞれ相当する次のコマンドプロンプトを使用し、ＢＬＡＳＴ用のファイルを準備しました。
Ｒｕｎ  ｆｏｒｍａｔｄｂ−ｉ  ＴｅｍｐＬｉｇｈｔＣｈａｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅｓ．ｔｘｔ−ｐＴ−ｏＦ
Ｒｕｎ  ｆｏｒｍａｔｄｂ−ｉ  ＴｅｍｐＨｅａｖｙＣｈａｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅｓ．ｔｘｔ−ｐＴ−ｏＦ
ＤＯＳコマンドプロンプトウィンドウを開いたフォルダにＦｏｒｍａｔｄｂがインストールされていることは必須条件です。そうでなければ、ユーティリティは見つかりません。また、パスによってＤＯＳコマンドに、ｆｏｒｍａｔｄｂが以前にインストールされたフォルダから直接に利用するように指示できます。例えば、すべてのＮＣＢＩユーティリティは”ＮＣＢＩＵｔｉｌｉｔｉｅｓ”というフォルダにダウンロードされた場合、コマンドプロンプトは次の通りです：
Ｒｕｎ  ＮＣＢＩＵｔｉｌｉｔｉｅｓ￥ｂｉｎ￥ｆｏｒｍａｔｄｂ−ｉ  ＴｅｍｐＬｉｇｈｔＣｈａｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅｓ．ｔｘｔ−ｐＴ−ｏＦ
Ｒｕｎ  ＮＣＢＩＵｔｉｌｉｔｉｅｓ￥ｂｉｎ￥ｆｏｒｍａｔｄｂ−ｉ  ＴｅｍｐＨｅａｖｙＣｈａｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅｓ．ｔｘｔ−ｐＴ−ｏＦ
そして、ＢＬＡＳＴコマンドプロンプトによって、ＨｅａｖｙＣｈａｉｎＢｌａｓｔＲｅｓｕｌｔｓ．ｔｘｔとＬｉｇｈｔＣｈａｉｎＢｌａｓｔＲｅｓｕｌｔｓ．ｔｘｔの出力ファイルが生成されました。コマンドプロンプトは以下の通りです：
●  Ｒｕｎ  ｂｌａｓｔａｌｌ−ｐ  ｂｌａｓｔｐ−ｄ  ＴｅｍｐＬｉｇｈｔＣｈａｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅｓ．ｔｘｔ−Ｉ  ＴｅｍｐＬｉｇｈｔＣｈａｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅｓ．ｔｘｔ−ｏ  ＬｉｇｈｔＣｈａｉｎＢｌａｓｔＲｅｓｕｌｔｓ．ｔｘｔ−ｍ  ９−ｂ  ５００
（−ｂ値はＢＬＡＳＴの配列数より大きくなければなりません）、
●  Ｒｕｎ  ｂｌａｓｔａｌｌ−ｐ  ｂｌａｓｔｐ−ｄ  ＴｅｍｐＨｅａｖｙＣｈａｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅｓ．ｔｘｔ−Ｉ  ＴｅｍｐＨｅａｖｙＣｈａｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅｓ．ｔｘｔ−ｏ  ＨｅａｖｙＣｈａｉｎＢｌａｓｔＲｅｓｕｌｔｓ．ｔｘｔ  −ｍ  ９  −ｂ  ８０００
（−ｂ値はＢＬＡＳＴの配列数より大きくなければなりません）。
ＢＬＡＳＴの出力ファイルが生成された後、例２、”ＢＬＡＳＴコンバーターアルゴリズム”のサブセクションで示されたアルゴリズム、およびＢＬＡＳＴのビットスコアによって、以下のコマンドに従って、各配列の多様性スコアが計算されました。
（ａ）  Ｒｕｎ  ＢｌａｓｔＴｏＤｉｖｅｒｓｉｔｙＣｏｎｖｅｒｔｅｒ．ｅｘｅ（ソフトウェアが起動されるとこのファイルは自動的に実行します）。
（ｂ）  ＬｉｇｈｔＣｈａｉｎＢｌａｓｔＲｅｓｕｌｔｓ．ｔｘｔファイルを開きます。
（ｃ）  ファイルをＡｌｌＬｉｇｈｔＣｈａｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅｓＤｉｖｅｒｓｉｔｙＳｃｏｒｅｓ．ｔｘｔとして保存します。
（ｄ）  ＨｅａｖｙＣｈａｉｎＢｌａｓｔＲｅｓｕｌｔｓ．ｔｘｔファイルを開きます。
（ｅ）  このファイルをＡｌｌＨｅａｖｙＣｈａｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅｓＤｉｖｅｒｓｉｔｙＳｃｏｒｅｓ．ｔｘｔとして保存します。【０６９５】ｂ．配列類似性によって編集された配列をクラスターにする
最後に、ＮＣＢＩユーティリティＢＬＡＳＴＣｌｕｓｔを使用して対マッチを作り、配列類似性に基づいて配列はクラスタ化されます。ＢＬＡＳＴＣｌｕｓｔによってＡｌｌＬｉｇｈｔＣｈａｉｎｓＢＬａｓｔＣｌｕｓｔ．ｔｘｔとＡｌｌＨｅａｖｙＣｈａｉｎｓＢｌａｓｔＣｌｕｓｔ．ｔｘｔ．の２つの出力ファイルが生成されます。この例では、２つの配列は類似性が９５％あるいは９６％に達して初めて対マッチとして見なされます。コマンドプロンプトは以下の通りです：
●  Ｒｕｎ  ｂｌａｓｔｃｌｕｓｔ−ｄ  ＴｅｍｐＬｉｇｈｔＣｈａｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅｓ．ｔｘｔ  −ｏ  ＡｌｌＬｉｇｈｔＣｈａｉｎｓＢｌａｓｔＣｌｕｓｔ．ｔｘｔ−Ｓ  ９５
●  Ｒｕｎ  ｂｌａｓｔｃｌｕｓｔ−ｄ  ＴｅｍｐＨｅａｖｙＣｈａｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅｓ．ｔｘｔ−ｏ  ＡｌｌＨｅａｖｙＣｈａｉｎｓＢｌａｓｔＣｌｕｓｔ．ｔｘｔ−Ｓ  ９６
ＢｌａｓｔＣｌｕｓｔ設定（−Ｓ）は必要に応じて変更することができます。
すべてのファイルが（上記の通りに）生成された後、次のファイルはＤＮＡ配列編集ツールのインストールフォルダに手動でコピーされます：
（ａ）  ＡｌｌＨｅａｖｙＣｈａｉｎｓＢｌａｓｔＣｌｕｓｔ．ｔｘｔ
（ｂ）  ＡｌｌＬｉｇｈｔＣｈａｉｎｓＢｌａｓｔＣｌｕｓｔ．ｔｘｔ
（ｃ）  ＡｌｌＬｉｇｈｔＣｈａｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅｓＤｉｖｅｒｓｉｔｙＳｃｏｒｅｓ．ｔｘｔ
（ｄ）  ＡｌｌＨｅａｖｙＣｈａｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅｓＤｉｖｅｒｓｉｔｙＳｃｏｒｅｓ．ｔｘｔ
例５
ＤＮＡ配列編集ツールソフトウェアのインストールとグラフィカルユーザーインタフェース【０６９６】ＤＮＡ配列編集ソフトウェアによって、重鎖および軽鎖抗体配列を組み換え、そして９６ウェルプレート出力ファイルに記載する希望の配列を選択するが、このファイルはＤＮＡ合成会社からヌクレオチドフォーマットでＤＮＡ配列を購入する際に注文ファイルとして使用されます。この例はまた、ＤＮＡ配列編集ソフトウェアを利用する時に、メインメニュー、オプション、エクスプローラバーを含んで、ユーザーが接触するソフトウェアの要件や制御を例示します。【０６９７】Ａ．ソフトウェアの概要
ソフトウェアは、オペレーティング・システムとしてＷｉｎｄｏｗｓ  ＸＰ又はＷｉｎｄｏｗｓ  Ｖｉｓｔａを使用するコンピュータで実行するよう設計されている。ソフトウェアは、実行ファイルｓｅｔｕｐ．ｅｘｅを実行し、ユーザ選択のフォルダーにおけるプログラムを設定することによりインストールされる。インストールすると、ユーザは、メイン・メニュー・オプション及びエクスプローラ・バー・オプションが目に入る。詳細については下記で説明する。【０６９８】１  システムの必要条件
ＤＮＡ配列編集ソフトウェアは、スタンドアロン・アプリケーションとしてローカル・マシンで実行するよう設計されている。【０６９９】オペレーティング・システム：Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＸＰ／Ｖｉｓｔａ３２ビット版
インターネット接続：必要なし
データベース・サーバ：なし【０７００】２  ＤＮＡ配列編集ツールプログラムのインストール
該プログラムをインストールするため、実行ファイルｓｅｔｕｐ．ｅｘｅを実行し、各自で選択するフォルダーのプログラムをインストールする。【０７０１】３  メイン・メニュー・オプション（図１２を参照）
３つのメイン・メニュー・オプションがある。
ファイル−ファイル・メニューを使用して、アプリケーションを終了させる。
ウェルプレート−ウェルプレート・メニューを使用して、注文を作成し、全プレート又は選択するウェルを消去し、又はウェルプレートの注文作成に対して制限部位を設定する。
ヘルプ−ヘルプ・メニューを使用して、実行中のソフトウェアのバージョンを確認する。【０７０２】４  エクスプローラ・バー・オプション
３つのエクスプローラ・バー・オプションがある（図１２、左欄を参照）：
手動編集−手動編集は、生殖細胞系セグメントのユーザ選択を可能にする軽鎖又は重鎖の手動編集形式を表示するのに使用される項目を含む。
自動編集−自動編集は、軽鎖又は重鎖の自動編集形式を表示するのに使用される項目を含む。
ウェルプレート−ウェルプレートは、ウェルプレート形式を表示するのに使用される項目を含む。【０７０３】Ｃ．アプリケーションの起動
すべてのプログラムのＷｉｎｄｏｗｓメニューでＦａｂｒｕｓＤＮＡ編集ツールをクリック、又はデスクトップでＦａｂｒｕｓＤＮＡ編集ツールのショートカットをダブルクリックすることのいずれかにより、ソフトウェアを起動させる。
スプラッシュ画面（図１３）が、アプリケーションの起動時に現われ、その後目立たなくなる。【０７０４】Ｄ．ＤＮＡ配列編集ソフトウェアを使用して出力プレートを生成
ＤＮＡ配列編集ソフトウェアを使用し、重鎖及び軽鎖抗体配列を組換え、続いて目的の配列を選択して、ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｃｏｍｐａｎｙからヌクレオチド形式でＤＮＡ配列を入手するための注文ファイルとして役割りを果たす９６ウェルプレートの出力ファイルを生成する。プレートファイルに加え、ＳｅｑｕｅｎｃｅＨｉｓｔｏｒｙ．ｔｘｔファイルを作成し、注文される全配列を把握する。ユーザは、配列を生成し、続いて下記のセクションＣ．２−４に記載のとおり、９６ウェルプレートのグリッドへの含有物に対する個々の配列を選択するため、手動編集又は自動編集のいずれかを選択できる。また、ソフトウェアプログラムは、全配列の多様性スコアも算出する。以下のセクションは、ＤＮＡ合成の注文に対して可変重鎖及び軽鎖をコードする生殖細胞系配列の選択及び編集するユーザオプションについて説明する。【０７０５】１．９６  ウェルプレート画面
アプリケーションの起動時、９６ウェルプレート画面が表示される。図１２で示すとおり、９６ウェルプレートは、アプリケーションの起動時は空である。メイン・メニューは、ＤＮＡ配列編集のタイトルの下で、画面上部に沿って横長である。エクスプローラ・バーは、画面の左側で縦長である。ユーザは、手動編集機能又は自動編集機能のいずれかを使用し、本明細書の以下で説明されるとおり、製作用に選択されるだろうＤＮＡ配列を空の９６ウェルプレートに追加する必要がある。９６ウェルプレート画面の追加を可能にする前記プレート内のオペレーティング機能は、以下を含む：【０７０６】ａ．ウェルプレートの制限部位を選択【０７０７】ユーザにより、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｄａｔａｂａｓｅ．ｔｘｔファイルから制限酵素配列が選択され、クローニング目的で、５’末端及び３’末端において編集されたＤＮＡ配列に追加する。以下のコマンドを使用し、抗体の鎖タイプによってプレートの注文に追加される５’及び３’制限部位を特定する。
重鎖：
●  ウェルプレート＞設定＞重鎖＞５’末端→選択、及びウェルプレート＞設定＞重鎖＞３’末端→選択
カッパ軽鎖：
●  ウェルプレート＞設定＞カッパ軽鎖＞５’末端→選択、及びウェルプレート＞設定＞カッパ軽鎖＞３’末端→選択
ラムダ軽鎖：
●  ウェルプレート＞設定＞ラムダ軽鎖＞５’末端→選択、及びウェルプレート＞設定＞ラムダ軽鎖＞３’末端→選択【０７０８】これは、注文ファイルの各配列の鎖タイプに前置及び後置される制限部位を定義し、ＩＤＴ注文ウェルプレート開始／終了制限部位ボックスで見ることができる（図１２及び図１４を参照）。編集ソフトウェアは、選択される制限部位に対し編集された配列を内部で検索し、クローニング目的に対して非適合であり得る内部のあらゆる制限部位を削除するためコドン使用を踏まえてヌクレオチド配列を修飾する機能を含む。これは、「抑制された制限部位を伴う」こうした配列のみが注文される、注文用のウェルプレートで配列を置く前に完了する。これは、セクションのタイトルが「コドン使用表」の実施例２、及び以下のセクション２で説明される。【０７０９】ｂ．ウェルプレートで配列を位置付け【０７１０】配列の選択は、以下のセクションＣ．２及びＣ．３で説明されるとおり、手動編集又は自動編集のいずれかの画面から実行する。下記のとおり、手動編集又は自動編集画面において、編集後、「選択する」の縦列にチェックマークを付け（自動編集）又は「ウェルプレートに追加する」ボタンをクリック（手動編集）することで、配列を選択する。
ｃ．ウェル配列情報の表示
ウェルで置かれ、編集された配列は、ウェルをクリックして表示する。選択する配列のウェルはハイライトされる。例えば、図１４は、ユーザが注文するため選択した編集配列を含む単一の９６ウェルプレートに対するモデル画面を示す。前記図の横列Ａにおいて、縦列１−３（中間グレーの影）は、編集された重鎖配列のセルを示し、縦列３−６（薄いグレーの影）は、編集された軽鎖配列のセルを示す。ハイライトされたセルは（横列Ａ、縦列５、濃い影で示す）、個々のデータが画面底部の配列情報ボックスのセルを示す。【０７１１】次いで、配列情報テキストボックスは、そのウェルに関する配列情報で更新される。配列情報ボックスは、名称を含む特定の配列、ヌクレオチド配列、アミノ酸配列、多様性スコア及びＶ（Ｄ）Ｊ組換えの個々の構成要素のタイトルに関する全ての関連情報を列挙する。例えば、図１４において、ハイライトされた配列は、ＶＬ生殖細胞系セグメントＶ３−４及びＪＬ生殖細胞系セグメントＩＧＬＪ７＊０１から編集された可変軽鎖である。【０７１２】ｄ．注文の生成
９６ウェルプレートから注文され得る１から９６個の配列など、プレートに入れる試料の数がいくつであっても、注文は９６ウェルプレートに対し生成される。注文を生成するためには、ウェルプレート＞注文の生成オプションを選択し、ファイル名を必要に応じて入力する。注文ファイルは、カンマ区切り変数（．ｃｓｖ）形式で保存される。実施例４は、ソフトウェア編集のソフトウェアを使用して編集される例示的配列の編集、出力及び注文を説明する。【０７１３】ｅ．ウェルプレートにおいて選択するウェルを消去
プレートにおける特定のウェルを消去するため、選択するウェルをクリックし、次いでウェルプレート＞消去＞選択するウェルを選択し、或いは目的のウェルを右クリックして「選択するウェルの消去」を選ぶ。【０７１４】ｆ．全ウェルプレートから全ての配列を消去
ウェルプレートは、注文が生成されると自動的に消去されるわけではない。全ウェルプレートを消去するためには、ウェルプレート＞消去＞全プレートを選択する。【０７１５】２．配列の手動編集
手動編集オプションを使用するユーザの選択により、編集された配列を手動で生成することができる。【０７１６】ａ．軽鎖の手動編集
軽鎖を手動で編集するため、エクスプローラ・バーから手動編集＞軽鎖オプションを選択する。手動編集画面は、図１５で示す。手動編集経鎖の画面は、ユーザがラムダ又はカッパ配列のいずれかを編集することを可能にする。このオプションは、ヘディングタイプにおいて利用可能で、画面上部のラムダ又はカッパのいずれかの前にある丸を選択することで選ぶ。該ソフトウェアは、Ｖλ及びＪκ配列の組合せ又はその逆も認めない。【０７１７】ｉ．ラムダ軽鎖の編集
ラムダ経鎖の編集方法を以下の段階で示す。
●  タイプ＞ラムダを選択する
●  ＶＬ配列コンボ・ボックスから目的のＶλ配列を選択する。ＳｅｑｕｅｎｃｅＤａｔａｂａｓｅ．ｔｘｔファイルで入力される利用可能な全てのＶλヌクレオチド配列が、下のドロップダウン・メニュー・ボックスに現れる。
●  ＪＬ配列コンボ・ボックスから目的のＪλ配列を選択する。ＳｅｑｕｅｎｃｅＤａｔａｂａｓｅ．ｔｘｔファイルで入力される利用可能な全てのＪλヌクレオチド配列が、下のドロップダウン・メニュー・ボックスに現れる。
●  「ウェルプレートへ追加する」ボタンをクリックし、ウェルプレートに編集された配列を追加する。【０７１８】ＤＮＡ配列ヘディングにおいて、２つのボックスが見られる。「制限部位の抑制なし」ボックスは、個々のＶλ及びＪλヌクレオチド配列に加え、配列編集規則を踏まえて生成されたあらゆるＶ−Ｊ結合部を表示する。対応のコードされたアミノ酸配列も表示される。例えば、図１５において、「制限部位の抑制なし」ボックスで表示される最初の配列は、選択されるＶλ配列に対応する（この場合はＶ１−１１）。これに続くのは、プロリン（Ｐ）をコードする３つのヌクレオチド「ｃｃｔ」の記述で、それは機能的な核酸分子を生成するため、編集法の実行により作成される連結領域に対応する。表示される最後の配列は、選択されるＪλ配列（この場合はＩＧＬＪ１＊０１）に対応する。「抑制される制限部位を伴う」ボックスは、制限部位を抑制する配列に対して必要なあらゆるヌクレオチド修飾を含む編集配列を表示するが、一方でコドン使用を維持する。ソフトウェアによって抑制される全ての制限部位は、「注記」ボックスで表示される。抑制される制限部位を伴う配列は、注文ファイルに入れられる配列である。【０７１９】（ｉｉ）カッパ軽鎖の編集
カッパ軽鎖の編集方法を以下の段階で示す。
●  タイプ＞カッパを選択する。
●  ＶＫ配列コンボ・ボックスから目的のＶＫ配列を選択する。ＳｅｑｕｅｎｃｅＤａｔａｂａｓｅ．ｔｘｔファイルで入力される利用可能な全てのＶＫヌクレオチド配列が、下のボックスに現れる。
●  ＪＫ配列コンボ・ボックスから目的のＪＫ配列を選択する。ＳｅｑｕｅｎｃｅＤａｔａｂａｓｅ．ｔｘｔファイルで入力される利用可能な全てのＪＫヌクレオチド配列が、下のボックスに現れる。
●  「ウェルプレートへ追加する」ボタンをクリックし、ウェルプレートに編集された配列を追加する。編集される全配列は、ＤＮＡ合成の注文のためウェルプレートに追加される。
上記のラムダ軽鎖配列の編集のとおり、ＤＮＡ配列ヘディングにおいて、２つのボックスが見られる。
「制限部位の抑制なし」ボックスが、個々のＶκ及びＪκ配列に加え、生成されるあらゆるＶ−Ｊ結合部を表示する。「抑制される制限部位を伴う」ボックスは、選択する制限部位を抑制するあらゆる配列の修飾を伴い編集された配列を表示する。ソフトウェアによって抑制される全ての制限部位は、「注記」ボックスに表示される。抑制される制限部位を伴う配列は、注文ファイルに入れる配列である。【０７２０】ｂ．重鎖の手動編集
重鎖を手動で編集するため、エクスプローラ・バーで手動編集＞重鎖オプションを選択する。手動編集画面は、図１６で示す。手動編集重鎖画面は、ユーザがＶＨ、ＤＨ及びＪＨ配列を連結することを可能にする。以下の段階は、重鎖を編集する方法を示す。
●  ＶＨ配列コンボ・ボックスから目的のＶＨ配列を選択する。ＳｃｑｕｅｎｃｅＤａｔａｂａｓｅ．ｔｘｔファイルに入れられる利用可能な全ＶＨヌクレオチド配列が、下のドロップダウン・メニュー・ボックスに現れる。
●  ＤＨ配列コンボ・ボックスから目的のＤＨ配列を選択する。ＳｅｑｕｅｎｃｅＤａｔａｂａｓｅ．ｔｘｔファイルに入れる利用可能な全ＤＨヌクレオチド配列が、下のドロップダウン・メニュー・ボックスに現れる。
●  ＤＨリーディング・フレーム・ボックスから目的のＤＨリーディング・フレームを選択する。ＧＲＡＶＹ値は、リーディング・フレームの選択によって更新される。ユーザは、最低のＧＲＡＶＹ値に対応するリーディング・フレームを選択すべきである。
●  ＪＨ配列コンボ・ボックスから目的のＪＨ配列を選択する。ＳｅｑｕｅｎｃｅＤａｔａｂａｓｅ．ｔｘｔファイルに入れる利用可能な全ＪＨヌクレオチド配列が、下のボックスに現れる。
●  「ウェルプレートへ追加する」ボタンをクリックし、ウェルプレートに編集配列を追加する。編集される全配列は、ＤＮＡ合成の注文のためウェルプレートに追加される。【０７２１】ＤＮＡ配列ヘディングにおいて、２つのボックスがある。「制限部位の抑制なし」ボックスは、個々のＶＨ、ＤＨ及びＪＨ配列に加え、配列編集規則を踏まえて生成されたあらゆるＶ−Ｄ結合部を表示する。
対応のコードされたアミノ酸配列も表示される。例えば、図１６において、「制限部位の抑制なし」ボックスで表示される最初の配列は、選択するＶＨ配列に対応する（この場合はＶ１−１８）。これに続くのは、グルタミン酸（Ｅ）をコードする３つのヌクレオチド「ｇａｇ」の記述で、それは機能的な核酸分子を生成するため、編集法の実行により作成されるＶ−Ｄ連結領域に対応する。表示される次の配列は、選択されるＤＨ配列（この場合はＩＧＬＪ１＊０１）に対応する。その配列は、トレオニン（Ｔ）をコードする３つのヌクレオチド「ａｃｇ」の記述に続き、それは機能的な核酸分子を生成するため、編集法の実行により作成されるＤ−Ｊ連結領域に対応する。表示される最後の配列は、選択されるＪＨ配列（この場合はＩＧＨＪ１＊０１）に対応する。「抑制される制限部位を伴う」ボックスは、現在抑制されるあらゆる制限部位を伴う編集配列を表示する。抑制される全ての制限部位は、「注記」ボックスで表示される。抑制される制限部位を伴う配列は、注文ファイルに入れる配列である。【０７２２】３  配列の自動編集
編集される鎖は、自動編集オプションを使用することで自動的に生成される。実施例４で説明されるとおり、全配列の編集は、初期化においてコンピュータにより機械的に実行され、ファイルに保存される。自動編集機能は、ユーザがこれらの配列を見ることを可能にする。【０７２３】ａ．軽鎖の自動編集
軽鎖を自動的に編集するため、エクスプローラ・バーで自動編集＞軽鎖オプションを選択する。自動編集画面は、図１７で表示される。自動編集軽鎖の画面は、ＶＫ及びＪＫ並びにＶλ及びＪλ配列の可能な全ての組合せを表示する。
自動編集画面は、以下の縦列でグリッドを表示する：
●  選択する−この縦列は、チェックマークを付ける又はチェックマークを外して、ウェルプレートへ配列を追加又はウェルプレートから配列を排除するボックスを含む。
●  順位−この縦列は、多様性の観点から順位を示す。値１は、最も多様な配列を示す。
●  集団−この縦列は、配列が分けられる集団を列挙する。集団番号は、単に識別子で、その数値は、いずれの順位付けにも関連しない。
●  多様性スコア−この縦列は、リストの他の全ての配列に対し、本配列のＢＬＡＳＴビットスコア結果の二乗平均に基づいたスコアを列挙する。低値は、より多様な配列を示す。
●  Ｖ配列−この縦列は、本配列に対して使用されるＶ配列識別子を列挙する。
●  Ｊ配列−この縦列は、本配列に対して使用されるＪ配列識別子を列挙する。
●  アミノ酸配列−この縦列は、タンパク質構成において編集される配列を列挙する。【０７２４】ｂ．重鎖の自動編集
重鎖を自動的に編集するため、エクスプローラ・バーで自動編集＞重鎖オプションを選択する。自動編集画面は、図１９で表示される。自動編集重鎖の画面は、ＶＨ、ＤＨ及びＪＨ配列の可能な全ての組合せを表示する。
自動編集画面は、以下の縦列でグリッドを表示する：
●  選択する−この縦列は、チェックマークを付ける又はチェックマークを外して、ウェルプレートへ配列を追加又はウェルプレートから配列を排除するボックスを含む。
●  順位−この縦列は、多様性の観点から順位を示す。値１は、最も多様な配列を示す。
●  集団−この縦列は、配列が分けられる集団を列挙する。集団番号は、単に識別子で、その数値は、いずれの順位付けにも関連しない。
●  多様性スコア−この縦列は、リストの他の全ての配列に対し、本配列のＢＬＡＳＴビットスコア結果の二乗平均に基づいたスコアを列挙する。低値は、より多様な配列を示す。
●  Ｖ配列−この縦列は、本配列に対して使用されるＶ配列識別子を列挙する。
●  Ｄ配列−この縦列は、本配列に対して使用されるＤ配列識別子を列挙する。
●  Ｊ配列−この縦列は、本配列に対して使用されるＪ配列識別子を列挙する。
●  アミノ酸配列−この縦列は、タンパク質構成において編集される配列を列挙する。【０７２５】４  軽鎖及び重鎖配列の編集と関連する他の機能性
ａ．自動編集画面のソート・オプションを変更
自動編集画面で列挙される配列の一覧は、所望の縦列ヘッダをクリックすることで再編成され得る。例えば、多様性スコアに基ういて配列を表示するため、縦列ヘッダの「多様性スコア」をクリックし、配列は、最低から最高の多様性スコアの観点から再注文される。
ｂ．状態指標
自動編集画面は、編集される配列の状態を識別するため色彩規則を使用する。例えば、灰色は、配列がすでに注文されていることを示し、青色は、配列が注文されておらず、９６ウェルプレートに入れられていないことを示し、及び濃い青色は、配列が９６ウェルプレートに入れられたことを示す。例えば、図１７の横列０２２、０２３及び０２４においてホールドの項目は、編集された配列が、注文のため９６ウェルプレートに入れられたことを示し、また「選択する」の縦列にチェックマークを付けることによっても示される。例えば、図１９の横列０１０３−０１０７においてボールドの項目は、編集された配列が、注文のため９６ウェルプレートに入れられたことを示し、また「選択する」の縦列にチェックマークを付けることによっても示される。
ｃ．９６ウェルプレートに複数の配列を入れること
複数の選択する配列のボックスをクリックすることで、複数の配列を９６ウェルプレートに入れることが可能である。これは、マウスで最初の配列を選択し、次いでシフト・キーを押さえ、最後に選択された配列のボックスをクリックして行うことができる。或いは、Ｃｔｒｌキーを押さえ、選択する全ての配列のそれぞれのボックスをクリックすることで、Ｃｔｒｌキーを使用して個々の配列を選択することができる。一旦ＶＬ配列を選択して９６ウェルプレートに加えると、列ヘッダを右クリックして「ウェルプレートにコピーする」を選択する。選択する全ての配列は、ＤＮＡ合成の注文のため、ウェルプレートへ加えられる
ｄ．９６ウェルプレートに単一配列を入れること
単一配列を９６ウェルプレートに入れるため、「選択する」の縦列にあるボックスをクリックし、或いは、配列の列ヘッダを右クリックして「ウェルプレートにコピーする」をクリックする。選択される配列のみが、ＤＮＡ合成の注文のため、ウェルプレートへ加えられる。
ｅ．編集における他の全ての配列に対し、選択する配列でＢＬＡＳＴ
配列が自動編集で編集されると、ソフトウェアは、ユーザがリストの他の全ての配列に対し、単一配列のＢＬＡＳＴ検索を実行するオプションを可能にする。この機能は、出力インジケータ、ＢＬＡＳＴビットスコアを提供し、それは整列された各配列と関連するギャップ及び置換の数から算出される値である。スコアが高くなればなるほど、アライメントが重要である。このデータは、ユーザが、他の全ての選択する配列に対し、最も高い多様性、或いは最も低い多様性のいずれかを有する配列を選択しようと試みる場合に有用である。選択するＶＬ配列に対し生成されるデータの例は、図１８で説明しており、選択するＶＨ配列に対し生成されるデータの例は、図２０で説明している。
次いで、編集配列は、編集される各配列と他の全ての編集される配列との類似性を決定するため比較し、この情報を使用して、多様性スコアを生成する。例えば、ＮＣＢＩユーティリティのＢＬＡＳＴを使用して、ヌクレオチド又はタンパク質の配列を比較し、一致配列の統計的有意性を算出することにより、配列間の局所類似性の領域を見つけることが可能である。
ＢＬＡＳＴを実行するため、比較する配列は、配列上でクリックすることで選択される。ユーザは、配列を右クリックしてＢＬＡＳＴオプションを選択できる。例えば、ＶＬ配列に対し、図１８は、手動編集又は自動編集の画面上のＶ４−２＿ＩＧＬＪ２＊０１配列で選択することにより、続いて配列を右クリックしてＢＬＡＳＴを選択することにより、生成されるＢＬＡＳＴグリッド形式を例示する。図１８で例示される新しいグリッド形式が生成され、選択する配列と整列する他の編集配列のＢＬＡＳＴビットスコアを提供する。例えば、ＶＨ配列に対し、図２０では、手動編集又は自動編集の画面のＶＨ４−３９＿ＩＧＨＤ５−２４＊０１＿ＩＧＨＪ６＊０１配列で選択することにより、次いで配列を右クリックしてＢＬＡＳＴを選択することにより、生成されるＢＬＡＳＴグリッド形式を例示する。図２０で例示する新しいグリッドを生成し、選択する配列と整列する他の編集配列のＢＬＡＳＴビットスコアを提供する。配列は、「選択する」の縦列のボックスにチェックマークを付けることにより、ＤＮＡ合成を注文するため、９６ウェルプレート・ファイルへの挿入に対し、この新しいグリッド形式から選択できる。
ＢＬＡＳＴ形式は、縦列でのグリッドである：
●  選択する−この縦列は、チェックマークを付ける又はチェックマークを外して、ウェルプレートへ配列を追加又はウェルプレートから配列を排除するボックスを含む。
●  順位−この縦列は、多様性の観点から順位を示す。値１は、最も多様な配列を示す。
●  ＢＬＡＳＴビットスコア−この縦列は、選択する配列に対し、特にこの配列のＢＬＡＳＴビットスコアを示す。
●  Ｖ配列−この縦列は、本配列に対して使用されるＶ配列識別子を列挙する。
●  Ｊ配列−この縦列は、本配列に対して使用されるＪ配列識別子を列挙する。
●  アミノ酸配列−この縦列は、タンパク質構成において編集される配列を列挙する。【０７２６】  実施例６
重鎖及び軽鎖生殖細胞系組換えＤＮＡ配列の生成
この実施例では、ＤＮＡ配列編集ソフトウェアによって、重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列を生成する方法を説明する。編集の第一段階は、上記の実施例５に記載のとおり、配列の手動編集又は自動編集のいずれかを選択することである。手動編集は、選択する配列においてユーザが完全に制御できるため有用である。これは、全ての配列が、同じ特定のセグメント含むライブラリーを産生し、又は異なる配列を選択することによって多様性をコントロールすることで、ユーザが、希望するあらゆる状況にライブラリーを提供することを可能にする（異なる遺伝子ファミリーなど）。【０７２７】手動編集を使用し、生殖細胞系セグメントは、ＶＨ、ＤＨ、ＪＨ、Ｖκ、Ｊκ、Ｖλ又はＪλ生殖細胞系セグメントの各遺伝子ファミリーから生殖細胞系セグメントを選ぶことにより、選択された。可変重鎖の編集は、軽鎖とは別に実行された。また、可変カッパ軽鎖の編集は、可変ラムダ鎖とは別に実行された。こうして、別の９６ウェルプレート・ファイルは、可変重鎖、可変カッパ軽鎖及び可変ラムダ軽鎖に対し作成された。【０７２８】例えば、可変重鎖に対し、例えばＩＧＨＶ１−１８＊０１などのＩＧＨＶ１−１８遺伝子ファミリーから１つのＶＨ生殖細胞系セグメントが選択され、例えば、ＩＧＨＶ１−２＊０１などのＩＧＨＶ１−２遺伝子ファミリーから１つのＶＨ生殖細胞系セグメントが選択される。ＤＨ生殖細胞系セグメント及びＪＨ生殖細胞系セグメントに対し、同様の選択を行った。ＤＨ生殖細胞系セグメントをリーディングフレームで選択し、可能であれば最も低いＧＲＡＶＹスコアを提供した。手動編集画面において、ＶＨＤＨＪＨ生殖細胞系セグメントの組合せを１つずつ産生した。更に、制限酵素部位ＮｃｏＩ及びＮｈｅＩは、適切なベクターにサブクローニングすることを可能にするため、組換えられたセグメントの５′末端及び３′末端における含有物に対し、各々のＶＨＤＨＪＨの組合せに対する「ウェルプレート」メニューから選択された（実施例８を参照）。これは、ソフトウェアが自動的にＤＮＡ配列ウィンドウで、「制限部位の抑制なし」及び「抑制される制限部位を伴う」の選択する配列を表示する（この場合は、配列において内部に存在するあらゆるＮｃｏＩ又はＮｈｅＩ制限部位が、コドン使用表を用いた修飾により抑制された）。生成されるＶ−Ｄ結合部及びＤ−Ｊ結合部もまた、配列編集規則に従って、ソフトウェアによって生成され、ＤＮＡ配列ウィンドウで示された（例示的配列を図１６で示す）。再編成された配列に対する生殖細胞系セグメントの構成要素を選択すると、それは「ウェルプレートへ追加する」であった。全ての可変重鎖生殖細胞系セグメントの全組合せに対し、これを繰り返した。【０７２９】Ｖκ及びＪκ生殖細胞系セグメントの組合せを選択することにより、同様の選択もＶκ及びＪκ軽鎖生殖細胞系に対し行われ（各生殖細胞系セグメントから１つの遺伝子ファミリーのメンバーのみがこれまでに選択された）、手動編集画面において１つずつである。更に、制限酵素部位ＮｃｏＩ及びＢｓｉＷＩは、適切なベクターにサブクローニングすることを可能にするため、組換えられたセグメントの５’末端及び３’末端における含有物に対し、各々のＶκ及びＪκの���合せに対する「ウェルプレート」メニューから選択された（実施例８を参照）。これは、ソフトウェアが自動的にＤＮＡ配列ウィンドウで、「制限部位の抑制なし」及び「抑制される制限部位を伴う」の選択する配列を表示する（この場合は、配列において内部に存在するあらゆるＮｃｏＩ又はＢｓｉＷＩ制限部位が、コドン使用表を用いたヌクレオチド修飾により抑制された）。生成されるＶ−Ｊ結合部もまた、配列編集規則に従って、ソフトウェアによって生成され、ＤＮＡ配列ウィンドウで示された。再編成された配列に対する生殖細胞系セグメントの構成要素を選択すると、それは「ウェルプレートへ追加する」であった。全ての可変カッパ軽鎖生殖細胞系セグメントの全組合せに対し、これを繰り返した。【０７３０】Ｖλ又はＪλ生殖細胞系セグメントの組合せを選択することにより、同様の選択もＶλ又はＪλ軽鎖生殖細胞系セグメントに対し行われ（各生殖細胞系セグメントから１つの遺伝子ファミリーのメンバーのみが、これまでに選択された）、手動編集画面において１つずつであった。更に、制限酵素部位ＮｃｏＩ及びＡｖｒＩＩは、適切なベクターにサブクローニングすることを可能にするため、組換えられたセグメントの５′末端及び３′末端における含有物に対し、各々のＶλ及びＪλの組合せに対する「ウェルプレート」メニューから選択された（実施例８を参照）。これは、ソフトウェアが自動的にＤＮＡ配列ウィンドウで、「制限部位の抑制なし」及び「抑制される制限部位を伴う」の選択する配列を表示する（この場合は、配列において内部に存在するあらゆるＮｃｏＩ又はＡｖｒＩＩ制限部位が、コドン使用表を用いたヌクレオチド修飾により抑制された）。生成されるＶ−Ｊ結合部もまた、配列編集規則に従って、ソフトウェアによって生成され、ＤＮＡ配列ウィンドウで示された（例示的選択は、図１５で示す）。再編成された配列に対する生殖細胞系セグメントの構成要素を選択すると、それは「ウェルプレートへ追加する」であった。可変ラムダ軽鎖生殖細胞系セグメントの全組合せに対し、これを繰り返した。【０７３１】ＮｈｅＩ、ＢｓｉＷＩ及びＡｖｒＩＩ部位の選択は、それぞれの重鎖及び軽鎖に対する完全なアミノ酸保存を可能にし、天然ヒトＶ及びＣ領域を維持する。【０７３２】全配列が選択されると、選択された配列は、９６ウェルプレート表示で見れる（図１２及び図１４を参照）。
ＤＮＡ合成の注文は、注文作成機能を用いて作成した。ＤＮＡ編集ソフトウェアは、９６ウェルフォーマットにマップされるアレイで選択する配列を出力した。このフォーマットでの配列は、合成抗体の可変重鎖及び軽鎖配列を生成するため、ＤＮＡ合成のベンダー（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐ．）に送られた。合成された核酸分子が戻り、９６ウェル・フォーマットによって同定された。表２２は、配列編集ソフトウェアによって作成され、注文されて、合成される配列を列挙している。【０７３３】
【表２２】
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【０７３４】実施例７
異なるリーダー配列によるＦａｂ分泌の比較【０７３５】この例において、コードされるＦａｂの発現において異なるリーダー配列の影響を評価した。適切に折り畳まれたタンパク質を確実にするため、ジスルフィド結合は、酸化的環境で形成する必要があり、従って、Ｓｅｃ、ＳＲＰ及びＴＡＴなどの経路を用いることにより、Ｆａｂタンパク質をペリプラズムに移動する必要がある。ＳＲＰ経路は、あらゆるタンパク質の折り畳み不全を必要としない。ＳＲＰリーダー配列を表２３で示す。【０７３６】
【表２３】
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【０７３７】プラスミドＡ（配列識別番号：１）及びプラスミドＣ（配列識別番号：３）を修飾し、ＤｓｂＡリーダー配列（配列識別番号：５）又は変異ＤｓｂＡリーダー配列（配列識別番号：９６５）のいずれか、及びリボソーム結合部位（ＲＢＳ）変異を含有した。ＲＢＳ変異を含む３つの順方向のプライマー及びＤｓｂＡ（配列識別番号：９６６−９６８で示す）のＮ−末端に対応する配列並びにＤｓｂＡ又は変異ＤｓｂＡ（配列識別番号：９６９−９７０で示す）のいずれかのＣ−末端に対応する２つの逆方向プライマーを使用し、オーバーラップＰＣＲを行った。前記ＰＣＲは、６つの異なるリーダー配列をもたらした（表２４）。次いで、これらのリーダー配列は、開始コドンでＡＴＧの上流ＥｃｏＲＩ部位とＮｃｏＩ部位の間でプラスミドＡ及びプラスミドＣに挿入された。ＲＢＳ変異を伴うＤｓｂＡリーダー配列を含むプラスミドＡ及びプラスミドＣは、配列識別番号：１０１５−１０１７及び１０２１−１０２３でそれぞれ示される。ＲＢＳ変異を伴う変異ＤｓｂＡリーダー配列を含むプラスミドＡ及びＣは、配列識別番号：１０１８−１０２０及び１０２４−１０２６でそれぞれ示される。【０７３８】
【表２４】
0005882058.tif 000203
【０７３９】Ｆａｂ抗体の発現における異なるリーダー配列の影響を評価するため、リツキサンの発現を評価した。リツキサン重鎖（配列識別番号：４５３）は、それぞれのプラスミドＡベクターで存在するＣＨ配列にインフレームでクローン化され、リツキサン軽鎖（配列識別番号：８３５）は、それぞれのプラスミドＣベクターで存在するＣκ配列にインフレームでクローン化された。つまり、ＶＨ及びＶκ鎖は、ＮｈｅＩ及びＮｃｏＩで（重鎖ＤＮＡに対し）又はＮｃｏＩ及びＢｓｉＷＩ（軽鎖ＤＮＡに対し）とのプラスミドの消化、続いてライゲーションにより、プラスミドＡ及びＣベクターにクローン化された（ＳＴＩＩリーダー配列、ＤｓｂＡリーダー配列又は変異ＤｓｂＡリーダー配列を含む）。重鎖及び軽鎖をコードするプラスミドは、以下の実施例８に記載どおり、ＬＭＧ１９４細胞に同時形質転換し、０．４％グルコース及び０．００８％アラビノースの存在下で、ＴＢ培地（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ）において、２０℃で３６時間成長させた。発現されたＦａｂをＢｕｇｂｕｓｔｅｒ▲Ｒ▼（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して全細胞から抽出し、Ｎｉ２＋親和性カラム（ＥＭＤ）を使用して精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、続いてウェスタンブロットで行った。結果は、誘導物質の不在下で、皆無かされに近いタンパク質の発現示す。誘導において、ＤｓｂＡリーダー配列の支配下で、Ｆａｂの発現は（３つの各ＲＢＳ変異に対し）、ＳＴＩＩリーダー配列の支配下の発現と同等であった。変異ＤｓｂＡは、より低い発現をもたらした。ＤｓｂＡリーダー配列の様々なＲＢＳ変異において、発現に著しい相違はなかった。【０７４０】実施例８
合成された可変重鎖及び軽鎖のクローニング及び同時形質転換【０７４１】  この例では、重鎖又は軽鎖ＤＮＡをそれら各々のプラスミドにクローニングし、続いて同時形質転換及びタンパク質の成長／精製により、Ｆａｂライブラリーを生成した。実施例６に記載どおり、配列編集ソフトウェアから生成されるＤＮＡ分子の合成後、ＤＮＡ分子は、同時形質転換及び組合わせＦａｂの発現に対し、必要に応じて、定常重鎖又は軽鎖を含むプラスミドへクローン化された。プラスミドＡ（配列識別番号：１）及びプラスミドＤ（配列識別番号：２）は、重鎖定常領域配列を含む。プラスミドＣ（配列識別番号：３）は、カッパ軽鎖定常領域配列を含み、プラスミドＥ（配列識別番号：４）は、ラムダ軽鎖定常領域配列を含む。【０７４２】  可変重鎖をコードする合成の組換え核酸は、ＨｈｅＩ及びＮｃｏＩで消化され、標準分子技術を用いてＳｔＩＩリーダー配列のプラスミドＡに結合された。可変カッパ軽鎖をコードする合成の組換え核酸は、ＮｃｏＩ及びＢｓｉＷＩで消化され、可変ラムダ鎖をコードする合成の組換え核酸は、ＮｃｏＩ及びＡｖｒＩＩで消化され、標準分子生物学技術を用いるＳｔＩＩリーダー配列で、プラスミドＣ又はプラスミドＥにそれぞれ結合された。【０７４３】  可変重鎖及び軽鎖の様々な組合せを各々含む、プラスミドＡ及びプラスミドＣ又はプラスミドＥのいずれか１つを大腸菌に同時形質転換した。重鎖及び軽鎖の全組合せに対し、その過程を繰り返した。つまり、プラスミドＡ（Ｆａｂ重鎖をコードする）及びプラスミドＣ又はプラスミドＥ（Ｆａｂ軽鎖をコードする）は、最終濃度１ｎｇ／μｌまでのＴＥ緩衝液中で別々に再懸濁された。１μＬの重鎖プラスミド及び１μＬの軽鎖プラスミドをＰＣＲ管又はＰＣＲプレートで混合し、２０μＬの氷冷ＬＭＧ１９４コンピテント細胞と混合した。形質転換反応は、水上にて１０分間インキュベートし、続いて４２℃で４５秒間、予熱されたＰＣＲブロックで熱ショックを行った。次いで、前記の管は、氷上で更に２分間静置し、続いて２００μＬのＳＯＣ培地を添加した。細胞は、３７℃で１．５時間、回復させた。１００μＬアリコートの形質転換培養物を使用して、０．４％（ｗ／ｖ）グリコース、１７μｇ／ｍＬカナマイシン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）及び３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む０．９ｍＬのＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地）に植菌した。培養物は、３０℃にて、２０時間激しく振盪して成長させた。形質転換培養物が成長し、実施例９に記載どおり、ＰｉｃｃｏｌｏＴＭシステムを用いて精製した【０７４４】実施例９
Ｆａｂライブラリーのハイスループット成長及び精製【０７４５】この例において、Ｆａｂライブラリーは、ハイスループット技術を使用して生成及び精製される。実施例８に記載どおり、対を成す重鎖（プラスミドＡ）及び軽鎖（プラスミドＣ又はＥ）のハイスループット形質転換を実行するが、９６ウェルＰＣＲプレートを個々のＰＣＲ管の代わりに使用したことは除く。転換後、細胞は、通気性のあるテープで覆った深底２ｍｌウエルの９６ウェル（ＶＷＲ）ブロックで一晩成長させた。一晩経過した培養物は、ＰｉｃｃｏｌｏＴＭで植菌するため直接的に使用した（Ｗｏｌｌｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）ＪＡＬＡ、１１：２９１−３０３）。【０７４６】抗体Ｆａｂフラグメントのハイスループットで、並行の発現及び精製は、ＰｉｃｃｏｌｏＴＭ（Ｔｈｅ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐ（ＴＡＰ））を使用して行われ、それはタンパク質の発現及び精製を自動化する。ＰｉｃｃｏｌｏＴＭに対する発現及び生成パラメータは、Ｒｕｎ  Ｃｏｍｐｏｓｅｒソフトウェア（ＴＡＰ）を使用して準備した。「変形ファイル」は、種培養プレートの各クローンの位置をマッピングして作成した。これは、Ｒｕｎ  Ｃｏｍｐｏｓｅｒソフトウェアに提出され、基本的な機械設定は以下のとおりに行われた：誘導前のインキュベータを３０℃で設定、発現インキュベータ１を１６℃で設定、遠心分離機を６℃及び５０００ｘｇで設定、ＴＢ（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ、１リットルにつき１２ｇトリプトン、２４ｇ酵母エキス、９．４ｇリン酸カリウム（二塩基）、及び２．２ｇリン酸カリウム（一塩基））、５０μｇ／ｍＬカナマイシン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、３５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．４％（ｗ／ｖ）グルコース（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）及び０．０１５％（ｖ／ｖ）消泡剤２０４（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で準備された培地ポンプ１（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号７１７５４）、０．２％（ｗ／ｖ）アラビノース（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で準備されたインデューサポンプ１、インキュベータのガス発生速度を５１％酸素、０．１ｍＬ植菌容量を２秒に設定、誘導統計平均を異常値なしで設定（３つの最高及び３つの最低の値を排除した後決定されるブロック平均ＯＤ６００など）、培養槽ブロック（ＣＶＢ）の誘導前遅延を１時間２０分に設定し、及び発現インキュベータ順化を３０分に設定する。【０７４７】種培養物を準備し、製造業者が定めるとおり、必要な実験機器とともにＰｉｃｃｏｌｏＴＭ中に装填した：２４ウェル培養槽ブロック（ＣＶＢ、Ｔｈｅ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐ）、２４ウェルフィルタ・プレート（Ｔｈｅ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐ）、２４ウェル出力プレート（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びピペットチップボックス（ＭＢＰ）。上記で説明されるとおり補充されたＴＢ培地、アラビノース誘発物質及び関連ポンプを無菌状態下で準備し、機械に取り付けられた。遠心分離機の釣り合いおもりを設定し、遠心分離機内に入れた。最後に、精製試薬を調製し、システムポンプに取り付けた（以下に記載ど��り、溶解緩衝液、レジン、洗浄緩衝液及び溶出緩衝液）。これが完成すると、機械を始動させ、工程を開始した。【０７４８】植菌をする前に、接種菌を２４ウェルＣＶＢの特定のウェルにマップし、以下の表２５で説明されるとおり、発現及び誘導条件を設定した。ＣＶＢの各ウェルは、播種プレートから植菌する前に、上記で説明されるとおり補充される１０ｍＬのＴＢ培地で充填した。各ＣＶＢのそれぞれのウェルを０．１ｍＬ種培養物で植菌し、次いで保管カルーセルに戻し、予定される誘導前のインキュベーションが可能になるのを待つ。誘導前のインキュベーションを開始するため、一旦ＣＶＢを待ち行列に入れると、それは保管カルーセルから移動させ、通気アセンブリに結合して（攪拌、しっかりと密封、及び酸素／空気の制御された管理方法を提供する）、次いで誘導前のインキュベータに入れた。インキュベーションの開始時にＯＤ６００を読み取り、その後、約３０分ごとに読み取る。ピッコロ操作制御ソフトウェアが、ＯＤ６００の測定値を監視し、各ＣＶＢが１．０のＯＤ６００設定点に達するときを予測する。ＣＶＢがＯＤ６００設定点に達する約３０分前、アセンブリを発現インキュベータに移動して、望ましい発現温度に釣り合わせ、次いでＣＶＢの培養物は、表２５で示される既定容量のアラビノースを添加することで誘導された。細胞の成長は、誘導後３０分ごとにＯＤ６００を測定し、インキュベーションの合計時間に対して吸光度の測定値を示すデータをプロットすることによって監視された。表２５からの６つのＣＶＢ発現／精製スキームを分析した。ＣＶＢ０１からＣＶＢ０４は、約１７００分後に最大約２０となったＯＤ６００と同様のパターンを示した。これらのプレートにおいて、プレートの個々の各ウェルにおけるＦａｂ培養物の成長は、ＣＶＢ０３及びＣＶＢ０４の条件で観察される成長速度／ウェルの若干大きな変動性と同様である。ＣＶＢ０５及びＣＶＢ０６は、ＯＤ６００が前回の分析時点において依然と上昇しており、すなわち誘導後の合計インキュベーション時間は２３００分で、より遅い成長を見せた。Ｆａｂ培養物の成長は、各プレートのウェル間で変わり、ウェル間の最大ＯＤ６００は、ＯＤ６００＝１０からＯＤ６００＝１６−１８まで変化した。【０７４９】
【表２５】
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【０７５０】  培養物のインキュベーション及び培養物の増殖誘導に続いて、細胞を回収し、Ｆａｂの精製に対し溶解した。自動化された発現及び全溶媒精製の「ライフサイクル」精製を使用し、発現されたＦａｂタンパク質の精製に対してＰｉｃｃｏｌｏＴＭを用いた。調節された発現の後、溶解前に、保管カルーセルにおいて、ＣＶＢを６℃で３０分間冷却した。ＣＶＢは、液体処理ベッドに移動させ、溶解緩衝液（１：１０００Ｌｙｓｏｎａｓｅ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と２．５ｍＬのＰｏｐＣｕｌｔｕｒｅ）を混合しながら各ウェルに添加した。溶解は、１０分間継続し、次いでＣＶＢを５０００ｘｇで１０分間、細胞残屑のペレットに速心分離した。遠心分離の間、フィルタ・プレートをフィルタ・ベッドに置き、レジン（２ｍＬのＮｉ充填されたＨｉｓ−Ｂｉｎｄレジン（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の５０％スラリー）を各ウェルへ添加した。可溶性の溶解物が、レジンを含むフィルタ・プレートにおける対応のウェルへ添加し、流し捨てる前に１０分間結合させた。洗浄緩衝液（１２ｍＬの洗浄緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０））を二段階で各ウェルに加え、流して捨てた。最後に、出力プレートをフィルタベッドのフィルタプレート下に置き、ＩＭＡＣ溶出緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール）を二段階で出力プレート中に流して添加した。前記出力プレートを他の全ての実験器具と管理カルーセルに戻した。この過程が消化工程で各ＣＶＢに対し完了すると、機械を取り外した【０７５１】同様のＰｉｃｃｏｌｏＴＭを使用して、同じクローンとの工程が発現のインキュベーション温度、アラビノースの誘発物質の濃度及び発現の時間の最適化を可能にさせた。誘導前の試料が３０℃でインキュベートされる二段階温度のインキュベーションを用いることで、広範囲で最適の結果が得られた。誘導に続いて、タンパク質の発現を２０℃で行った。最適な発現収率は、０．０３２％アラビノース誘発物質の使用、続いて４５時間の発現で得られた。【０７５２】例１０
Ｆａｂ抗体の直交二次純化
ＰｉｃｃｏｌｏＴＭプロセス後生じられた部分的に純粋なＦａｂを快速にもっと純化させるために、純化の直交方法が開発されました。Ｆａｂは前の例９に説明されたようにＰｉｃｃｏｌｏＴＭ機械により発見し、純化されました。ＰｉｃｃｏｌｏＴＭ純化から取得されたＦａｂサンプルごとに約１．８ｍＬのＩＭＡＣ溶出物は、製造者プロトコールに従って、Ａｋｔａ純化装置（ＧＥヘルスケア）及びＡ−９０５オートサンプラー（ＧＥヘルスケア）により４°Ｃで１ｍＬのＨｉ−Ｔｒａｐ蛋白質Ｇカラムの上にもっと純化されました。この蛋白質サンプルは深型ウェルの９６ウェル・ブロック（ＶＷＲ）に移転されました。後者は、蒸発防止のために、アルミニウム・ホイル・テープで覆われました。
オートサンプラーは多段注入（典型として、サンプルごとに４５０μＬの注入四回）のためにＨｉ−Ｔｒａｐ蛋白質Ｇカラムの上に設置されました。それから、このカラムは２カラム容積の５０ｍＭのリン酸ソーダｐＨ７．２及び１５０ｍＭのＮａＣｌで洗われました。Ｆａｂは六カラム容積の１００ｍＭグリシンｐＨ２．８で溶出されました。溶出ピーク部分（約０．８ｍＬ）は深型ウェルの９６ウェル・プレート・ブロックの中に収集されました。溶出された蛋白質は直ちに飽和二塩基性リン酸ソーダｐＨ９．０により中和されました。蛋白質濃度は、分子動力プレートリーダーの上のＡ２８０における吸収率の測量により測定され、対応するＦａｂの消散係数から計算されました。消散係数は、Ｆａｂ重鎖と軽鎖におけるチロシン＋トリプトファン＋フェニルアラニンの総数に基づいて計算されました。ＰｉｃｃｏｌｏＴＭシステムを利用する以下の純化において発見された蛋白質は一般に２０％以下の純度であります。蛋白質Ｇによる直交純化の後、Ｆａｂ純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥが示したように９５％以上の純度であります。【０７５３】  表１７は、Ｐｉｃｃｏｌｏにより生じられてから二次純化によりもっと純化されたＦａｂ抗体を表示します。
Ｆａｂ抗体のアミノ酸配列は、配列同一性番号１４７５−１８２６のいずれかにおいて表示された可変重鎖配列、及び配列同一性番号１８２７−１８３８、１８４０−１８５５、１８５７−１８８において表示された可変軽鎖配列を含む配列に対応します。重鎖及び軽鎖Ｆａｂライブラリーメンバーの配列はプラスミドＡ、Ｃ、Ｅに包括された不変地域をも含みます。【０７５４】例１１
リンパ球細胞死亡測定
抗体ライブラリーからの独特なＦａｂを確認するために、測定を通して希望の機能、特性又は活性を評価することができます。蛋白質機能測定の例として、架橋抗ＣＤ２０Ｆａｂ（配列同一性番号４５３において表示された重鎖及び配列同一性番号８３５において表示された軽鎖）は、細胞を基礎にした測定を通して、リンパ腫の細胞死亡を引き起こす能力をテストされました。抗ＣＤ２０Ｆａｂは  抗ＣＤ２０カッパ軽鎖のさまざまの部分を識別する等しいモル濃度の多クローン性抗人カッパ軽鎖抗体を添加することにより、架橋されました。【０７５５】  細胞死亡はＡｐｏ−ＯＮＥ同質カスパーゼ−３／７測定（プロメガ）を通して確定されました。ラモスＢリンパ球細胞は、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）及びＰ−Ｓ（ペニシリン−ストレプトマイシン）を含むＲＰＭＩ１６４０媒介において育てられ、クリアな９６−ウェル・プレート（ウェルごとにコスター３５９５、コーニング、２．５ｘ１０４細胞）の中に配置されました。ジャーカットＴリンパ球細胞、１０％ＦＢＳ及びＰ−Ｓを含むＲＰＭＩ１６４０において育てられ、クリアな９６−ウェル・プレート（ウェルごとにコスター３５９５、コーニング、２．５ｘ１０４細胞）の中に配置されました。架橋抗ＣＤ２０Ｆａｂは、０、２５、５０、１００及び２００ｎＭの濃度で、人カッパ軽鎖に反する同じ濃度の多クローン性抗体（シグマ）と一緒に、それぞれのウェルに添加されました。抗Ｆａｓ単クローン性抗体（２０−１００ｎｇ／ｍｌ）又はスタウロスポリン（１．０μＭ）は、正の制御のために添加されましたが、Ｆａｂは負の制御として使用されました。同じ容積のＡｐｏ−ＯＮＥカスパーセ３／７試薬（ローダミン１１０、ｂｉｓ−（Ｎ−ＣＢＺ−Ｌ−アスパーチル−Ｌ−グルタミ−Ｌ−バリル−Ｌ−アスパラギン酸アミド、Ｚ−ＤＥＶＤ−Ｒ１１０）は添加されましたが、プレートは室温で一時間培養されました。ローダミン１１０の存在は４８５ｎｍ励起／５２１ｎｍ放出で蛍光プレートリーダーにおける蛍光性を測量することにより検出されました。細胞死亡率の向上は以下の方程式により計算されました。
１００ｘ［（Ｆａｂ用蛍光性）−（背景用蛍光性）］／（背景用蛍光性）【０７５６】例１２
エリスロポエチン結合Ｆａｂライブラリー【０７５７】「幼稚な」ライブラリのかわりに、指図されたＦａｂライブラリーは既知の標的に構築されました。この例において、指図されたＦａｂライブラリーは構築されました。その中に、１６アミノ酸エリスロポエチン・ペプチド（ＥＰＯ）は抗体のさまざまなＣＤＲに挿入されて、組み合えＥＰＯ（ＥＰＯＲ）の活性化を引き起こしたＦａｂを確定します。ＣＤＲにおいて発生したアミノ酸残留分の数量に変化がある（表２６をご参考に）ので、大きめな挿入物はＥＰＯペプチドの挿入のために選ばれました。これらのＣＤＲはＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１及びＣＤＲ−Ｌ３を包括します。【０７５８】
【表２６】
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ペプチド挿入物の配向を無作為に抽出してペプチドの活性表面を暴露するために、ほかの二つのアミノ酸残留分（プロリン又はグリシン）はＥＰＯペプチドのＮ終点及びＣ終点に加えられ、それぞれのペプチドを十六産出しました（配列同一性番号８７４−８８９）。重鎖ＶＨ３−２３（配列同一性番号８６９）及び軽鎖  Ａ１７（配列同一性番号８７１）を含むＦａｂはＥＰＯペプチド・ライブラリーの母抗体として働きました。ＢｓａＩ制限部位はＥＰＯペプチドの核酸配列及び重鎖と軽鎖可変地域の核酸配列へ導入されて、ＥＰＯペプチドをそれぞれのＣＤＲにコード化するＤＮＡのクローニングを可能にしました。重鎖ＶＨ３−２３ＤＮＡは組替えられて、ＣＤＲ２でＢｓａＩ部位を含むＶＨ３−２３Ｂ（配列同一性番号：８９６）及びＣＤＲ３でＢｓａＩ部位を含むＶＨ３−２３Ｒ（配列同一性番号：９１３）を作りました。軽鎖Ａ１７ＤＮＡは組替えられて、ＣＤＲ１でＢｓａＩ部位を含むＡ１７Ｐ（配列同一性番号：８７２）及びＣＤＲ３でＢｓａＩ部位を含むＡ１７Ｑ（配列同一性番号：８７３）を作りました。ＥＰＯペプチドをコード化する十六のさまざまのジーンは、それぞれの重鎖（ＣＤＲ２とＣＤＲ３）又は軽鎖（ＣＤＲ１とＣＤＲ３）配列へクローンされましたが、結果として生じられたＦａｂは例９に説明されたように発見し、純化されました。表２７はＦａｂを含む結果の６４ＥＰＯをリストします。【０７５９】
【表２７】
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【０７６０】ＥＰＯレセプター（ＥＰＯＲ配列同一性番号９６２）の活性化を調節するＦａｂを確定する選り分けはＥＰＯＲをコード化したＣｄｎａで安定に形質移入されたＢａＦ３細胞において行われました。【０７６１】ａ．ＭＴＴ細胞増殖測定【０７６２】ＭＴＴ（３−［４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ］２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）のテトラゾリウム環は生細胞のミトコンドリア酸脱水素酵素により切り裂かれて、水溶液に不溶解の紫ＭＴＴホルマザン結晶を生じますが、酸化イソプロパノールに溶解されることができます。ＢａＦ３／ＥｐｏＲ細胞（５ｘ１０３−５ｘ１０５）はＥｐｏ  Ｆａｂがある場合及びない場合に一、二日か培養されました。ＭＴＴ溶液（培養容積の１０％）は細胞に加えられ、ＣＯ２培養器に３７°Ｃ３−４時間培養されました。イソプロパノールにおける０．１Ｎ  ＨＣｌと等しい容積は加えられました。吸収率は５７０ｎｍで測量されましたが、細胞数は標準曲線に基づいて計算されました。【０７６３】ｂ．ルシフェラーゼレポータ−測定【０７６４】ＥＰＯＲの活性化はＳＴＡＴ５転写因子の活性化を引き起こしましたが、後者は引き続いてｃ−ｍｙｃ、ｂｃｌ−２、ｐｉｍ−１及びｃｙｃｌｉｎ−Ｄを包括するジーン転写を引き起こしました。転写は、上述のジーンのいずれのプロモーターをレポータージーンとリンクすることにより検出されることができますが、これによりレポーター・プラスミドを作ります。二つのレポータープラスミドは作り出され、ＥＰＯＲの活性化を評価します。初めのレポーター・プラスミドは、鼠サイクリン−Ｄプロモーター（配列同一性番号９６３）をｐＧＬ４．７０におけるルシフェラーゼ・ジーンの５’端に置くことにより構造されました。簡単に言えば、ｐＧＬ４．７０は制限酔素ｐＧＬ４．７０及びＨｉｎｄＩＩＩと消化されましたが、サイクリンＤプロモーターは標準分子生物プロトコールによりプラスミドの塩基２８−６６の間に挿入されました。【０７６５】ＥＰＯＲを活性化することができるＥＰＯ  ＦａｂはＳＴＡＴ５の活性化を引き起こし、それでサイクリン−Ｄプロモーターを活性化し、ルシフェラーゼ・ジーンの誘導と発見を引き起こしました。その故、第二レポーター・プラスミドはｐＧＬ４．２３ベクター（プロメガ、配列同一性番号１９９８）を通してＳＴＡＴ５のために作られました。このベクターは、プロモーターなき反応要素の活性化が発見を駆動することを許すルシフェラーゼのために翻訳開始部位の５’端で最小プロモーターを含みます。ＳＴＡＴ５結合（配列同一性番号９６４）のためのＤＮＡ元素の六回の繰り返しは最小プロモーターの上流に直接にクローン去れました。簡単に言えば、ｐＧＬ４．２３は制限酵素ＮｈｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩと消化されましたが、ＳＴＡＴ５のＤＮＡ元素繰り返しは標準分子生物プロトコールによりプラスミドの塩基２８−６６の間に挿入されました。【０７６６】ＥＰＯＲを活性化することができるＥＰＯ  ＦａｂはＳＴＡＴ５の活性化及びルシフェラーゼ・ジーンの直接発見を引き起こします。前にＥＰＯＲをコード化するＣｄｎａにより形質移入されたＢａＦ３細胞は以上のレポーター・プラスミ���の一つにより一時的に形質移入されました。結果の細胞はＥＰＯ  Ｆａｂがある場合及びない場合に培養されます。ルシフェラーゼ基質を含む等しい容積の溶解緩衝液は細胞培養に加えられます。相対ルミネッセンスは基質と５分間培養した後、ルミノメーターにより１０秒間測量されました。【０７６７】例１３
電子化学ルミネッセンス結合測定【０７６８】この例には、電子化学ルミネッセンス（ＥＣＬ）結合測定は九つの違う抗体（人上皮成長因子２レセプター（ＥｒｂＢ２）、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦ  Ｒ）、肝細胞成長因子レセプター（ＨＧＦ  Ｒ／ｃ−Ｍｅｔ）、ノッチ−１、ＣＤ４４、インスリン様成長因子−１溶解可レセプター（ＩＧＦ−１  ｓＲ）、Ｐ−カドヘリン、糖蛋白質レセプター（Ｅｐｏ  Ｒ）及びデルタ様蛋白質４（ＤＬＬ）を包括します）の一つと結合することができる抗体のために９６０メンバーＦａｂライブラリーをえり分けます。ＥＣＬ測定において、抗原−抗体の相互作用は、ルテニウムｔｒｉ−ｂｉｓｐｙｒｉｄｉｎｅ−（４−ｍｅｔｈｙｓｕｌｆｏｎｅ）（Ｒｕ（ｂｐｙ）２２＋と標識された検出抗体の添加により検出されます。電流を使用する時、Ｒｕ（ｂｐｙ）２２＋標識は共反應劑がある場合に酸化還元循環を受けますが、光が放出されます。シグナルはＲｕ（ｂｐｙ）２２＋標識が電極の近くにある時にしか生じられなく、洗浄のニーズを除きます。検出された光強度は獲得された蛋白質の量と比例します。【０７６９】組み換え人蛋白質はＲ＆Ｄシステムから取得され、以下のものを包括します。ｒ人ＥｒｂＢ２／Ｆｃキメラ、ＣＦ（Ｃａｔ＃  １１２９−ＥＲ）；ｒ人ＥＧＦ  Ｒ／Ｆｃキメラ、ＣＦ（Ｃａｔ＃  ３４４−ＥＲ）；ｒ人ＨＧＦ  Ｒ／ｃ−ＭＥＴ／Ｆｃキメラ、ＣＦ（Ｃａｔ＃  ３５８−ＭＴ／ＣＦ）；ｒ人ノッチ−１／Ｆｃキメラ、ＣＦ（Ｃａｔ＃  ３６４７−ＴＫ）；ｒ人ＣＤ４４／Ｆｃキメラ、ＣＦ（Ｃａｔ＃  ３６６０−ＣＤ）；ｒ人ＩＧＦ−１  ｓＲ，（ＩＧＦ−１  ｓＲ）、ＣＦ（Ｃａｔ＃  ３９１−ＧＲ）；ｒ人Ｐ−カドヘリン／Ｆｃキメラ、ＣＦ（Ｃａｔ＃  ８６１−ＰＣ）；ｒ人エリスロポエチンＲ／Ｆｃキメラ、ＣＦ（Ｃａｔ＃  ９６３−ＥＲ）；組替え人ＤＬＬ４（Ｃａｔ＃  １５０６−Ｄ４／ＣＦ）。これらの蛋白質は各蛋白質（６０μｇ／ｍＬ抗原）の５０ナノリトルを９６ウェル・マルチスポット１０ハイバインド・プレートの表面に配置することにより、１０プレートの各ウェルの上に固定されました。スポット１０は制御子として空白の状態で残れました。【０７７０】トリス緩衝塩水Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ）における１％ウシ血清アルブミンの１５０μｌ等分は各ウェルに加えられ、２０°Ｃで３０分間培養されることができました。あとで、洗浄とタップ乾燥化により残留溶液を徹底に取り除きました。それでは、１％ＢＳＡ  ＴＢＳＴの１２．５μｌ等分は各ウェルに加えられたあと、純化されたＦａｂの１２．５μｌ等分を加えました。このプレートは封じられ、２０°Ｃで一時間振られながら培養されました。【０７７１】検出抗体は、製造者指示に従って個々に山羊抗人カッパ軽鎖ポリクローン抗体（Ｋ３５０２−１ＭＧ，シグマ・アルドリッチ）及び山羊抗人ラムダ軽鎖ポリクローン抗体（Ｌ１６４５−１ＭＬ、シグマ・アルドリッチ）をルテニウム（ＩＩ）トリス・ビピリジン−（４−ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｅ）−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ  ＮＨＳ−エステル、中尺度発見）と接合することにより、準備されました。２５でのＴＡＧ検出抗体は各ウェルに加えられ、２０°Ｃで一時間��られながら培養されることができました。最後には、１５μｌのリード緩衝溶液Ｐと界面活性剤（Ｃａｔ＃  Ｒ９２ＰＣ−１、中尺度発見）は各ウェルに加えられました。電子化学ルミネッセンスはセクターＳｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ２４００（中尺度発見）により測られました。データは各ウェルの空白に対する抗原用の各ＥＣＬシグナルを比べることにより分析されました。空白比率が４又はその以上であるシグナルは「ヒット」Ｆａｂだと思われました。【０７７２】それぞれ９６の違うＦａｂを含む十個のプレートはＥＣＬ測定によりえり分けられました。初期選り分けの結果は以下の表２８−２８Ｂにおいて表示されました。以下の表２８は初期ＥＣＬ選り分けにおいて「ヒット」だと確認された６のＦａｂ（重鎖及び軽鎖）をリストします。「ヒット」はシグナル対空白比率が４以上であるＦａｂ抗体でありました。組換え人デルタ様蛋白質４（ＤＬＬ４）と結合する三つのＦａｂは確認されました。一つのＦａｂは組換え人上皮成長因子２（ＥｒｂＢ２）と結合すると確認され、もう一つのＦａｂは組換え人エリスロポエチン・レセプター（ＥｐｏＲ）と結合すると確認されました。残った一つのＦａｂはＥｒｂＢ２及びＥｐｏＲと結合すると確認されました。単一Ｆａｂ濃度での初期ＭＳＤ測定の結果は以下の表２８Ｂにおいて表示されます。表２８Ｂは６Ｆａｂ（Ｆａｂ番号は表２８において確認された各Ｆａｂと対応します）、Ｆａｂ濃度、９組買え人標的／蛋白質抗原、及び既知のＦａｂ濃度での初期ＭＳＤ測定選り分けからのＥＣＬシグナルをリストします。【０７７３】初期ＥＣＬ選り分けからの「ヒット」を確認するために、Ｆａｂ濃度による滴定は行われて、Ｆａｂ抗原の結合親和性を確定しました。測定過程は上述と同じであります。ただし、Ｆａｂ抗体の濃度はウェルにより０．１ｎＭから２．４μＭまで変化します。データは以下の表２９−３４において表示されます。データはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌにより図式で表示されましたが、結合親和性は５０％結合シグナルから推定されました。表示された通り、結合親和性は測定による可能であります（例１６をご参考に）。【０７７４】結果によれば、Ｆａｂ  ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１  ＆  Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１は低めなナノモル範囲に１０ｎＭ又はその以下で特に高い親和性を持つ人ＤＬＬ４と結合しますが、Ｆａｂ  ＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１  ＆  Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１及びＶＨ６−１＿ＩＧＨＤ３−３＊０１＿ＩＧＨＪ４＊０１  ＆  Ｖ４−３＿ＩＧＬＪ４＊０１はマイクロモルの範囲に人ＤＬＬ４と結合します。．これらの三つのＦａｂが違う重鎖及び軽鎖を含みますから、結果によれば、抗体により識別されたＤＬ４４の上における結合エピトープは違うようになる可能性があります。【０７７５】それに加えて、結果によれば、Ｆａｂ  ＶＨ４−３１＿ＩＧＨＤ１−２６＊０１＿ＩＧＨＪ２＊０１  ＆  Ａ２７＿ＩＧＫＪ１＊０１は約１００Ｎｍの濃度で人ＥｒｂＢ２／Ｆｃキメラと結合しますが、Ｆａｂ  ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ３−１０＊０１＿ＩＧＨＪ４＊０１  ＆  Ｂ３＿ＩＧＫＪ１＊０１は約１００ｎＭで人エリスロポエチンＲ／Ｆｃキメラと結合します。一つのＦａｂのＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−１３＊０１＿ＩＧＨ４１＊０１  ＆  Ｂ３＿ＩＧＫＪ１＊０１は人ＥｒｂＢ２／Ｆｃ及び人【０７７６】エリスロポエチンＲ／Ｆｃキメラとの親和性を表します。このＦａｂがキメラ蛋白質のＦｃ地域と結合する可能性が低いであります。理由はＦｃ核融合蛋白質である他の五つの抗原との結合は見つからなかったことにあります。【０７７７】
【表２８】
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【０７７８】
【表２９】
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【０７７９】
【表３０】
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【０７８０】
【表３１】
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【０７８１】
【表３２】
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【０７８２】
【表３３】
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【０７８３】
【表３４】
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【０７８４】例１４
ＶＨ３−２３  重鎖ライブラリー
この例において、重鎖を含む６９０の違うＶＨ３−２３は標準分子生物プロトコールにより生じられました。ライブラリ多様性が生じられた原因は以下のポイントにあります。（１）６の違うＪＨセグメントを使用します；（２）各ＤＨセグメントの直接配列及び逆配列（又は逆補足）を包括します；（３）全ての３の読み枠における各直接の及び逆のＤＨセグメントを翻訳します。これは六つのｐＦ−ＶＨ３−２３−ＩＧＨＪプラスミド及び１１５の違うＤＨセグメントの初期生成を引き起こしました。各単独ＤＨセグメントを各ｐＦ−ＶＨ３−２３−ＩＧＨＪプラスミドに同時にクローンするのは６９０メンバー重鎖ライブラリーを引き起こしました。それで、このライブラリーは、前に生じられた様々な軽鎖（例８をご参考に）により変質され、３０１２メンバーＦａｂライブラリーを生じました。【０７８５】Ａ．ｐＦ−ＶＨ３−２３−ＩＧＨＪ１  ｔｏ  ｐＦ−ＶＨ３−２３−ＩＧＨＪ６プラスミドの生成
この例において、それぞれＶＨ３−２３ＶＨセグメント及び六つのＪＨセグメントをコード化する６のプラスミドは生じられました。これらのプラスミドが組み替えられることにより、ＢｓａＩ部位は以下のために融合されました。（１）単独ＪＨセグメント（表３５をご参考に）を可能にします；（２）それから、単独ＤＨセグメントの何れも（表３７をご参考に）のクローニングを可能にします。このために、プラスミドＡ（配列同一性番号１）及びＶＨセグメントＶＨ３−２３Ｒ（配列同一性番号２０５０）は始めに組み替えられ、内部ＢｓａＩ部位（配列同一性番号３７１９）を取り除きました。それから、ＶＨ３−２３Ｒはさらに組み替えられ、以下のように二つのＢｓａＩ部位を加えました。（１）ＶＨ３−２３ＶＨセグメントの３’端において；（２）ＪＨセグメントの枠組み地域４（アミノ酸ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳ、配列同一性番号３４５６−３４６１、以下の表３５をご参考に）を高度化する塩基の５’端において。
それから、ＶＨ３−２３Ｒ（配列同一性番号２０５０）は標準ＤＮＡ合成プロトコールにより合成されました。ＶＨ３−２３ＲはＮｃｏＩ（配列同一性番号９７７）及びＮｈｅＩ（配列同一性番号９７８）により消化され、組換えられたプラスミドＡへ縛られ、プラスミドｐＦ−ＶＨ３−２３Ｒ（配列同一性番号２０５１）を作りました。【０７８６】セグメントＩＧＨＪ１−ＩＧＨＪ６（表３５、配列同一性番号３４５０−３４５５及び配列同一性番号３４５６−３４６１をご参考に）をコード化するシリーズの前進の及び後退のオリゴ（以下の表３６をご参考に）は標準ＤＮＡ合成プロトコールにより生じられました。ペアになるオリゴ（特定のＩＧＨＪセグメントをコード化します）はＢｓａＩにより消化され、同じように消化されたプラスミドｐＦ−ＶＨ３−２３Ｒ（配列同一性番号２０５１）へ縛られ、それにより６の新しいプラスミドを生じました：ｐＦ−ＶＨ３−２３−ＩＧＨＪ１（配列同一性番号：２０６４），ｐＦ−ＶＨ３−２３−ＩＧＨＪ２（配列同一性番号：２０６５），ｐＦ−ＶＨ３−２３−ＩＧＨＪ３（配列同一性番号：２０６６），ｐＦ−ＶＨ３−２３−ＩＧＨＪ４（配列同一性番号：２０６７），ｐＦ−ＶＨ３−２３−ＩＧＨＪ５（配列同一性番号：２０６８），やｐＦ−ＶＨ３−２３−ＩＧＨＪ６（配列同一性番号：２０６９）。それぞれの新しいプラスミドに対して、これは以下のような結果を引き起こしました。ＢｓａＩ部位が枠組み地域４をコード化する塩基の５’端で取り除かれました。新しいＢｓａＩ部位はＪＨセグメントの５’端で生じられました。これらにより、単独ＤＨセグメントが全ての六つのヴェクターに同時にクローンされて、ＤＨセグメントごとに六つの違うジーンを作りました。【０７８７】
【表３５】
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【０７８８】
【表３６】
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【０７８９】Ｂ．ＤＨオリゴの生成及びｐＦ−ＶＨ３−２３−ＩＧＨＪプラスミドへのクローニング
この例において、ペアになったＤＨオリゴは生じられ、ｐＦ−ＶＨ３−２３−ＩＧＨＪプラスミドへクローンされ、以下のように６９０新しいＶＨ３−２３重鎖を生じました。二十七（２７）のＤＨセグメント（以下の表３７をご参考に）は組み替えられた各ｐＦ−ＶＨ３−２３−ＩＧＨＪプラスミドへクローニングするために選ばれました。ＣＤＲ３地域におけるライブラリ多様性が生じられた原因は以下のポイントにあります。（１）各ＤＨセグメントの直接配列及び逆配列（又は逆補足）を包括します；（３）全ての３の読み枠における各直接の及び逆のＤＨセグメントを翻訳します。若し既知のＤＨセグメント用読み枠の翻訳はストップ・コドンを引き起こせば、その特定な配列及び読み枠はライブラリーから排除されました。以下の表３７は各特定なＤＨセグメントの開けた読み枠を示します。
これらのＤＨセグメントはライブラリーに包括され、１１５の違うＤＨセグメントを引き起こしました。【０７９０】
【表３７】
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以下のルール（表３８をご参考に）は以下のように使用されました。六つの違うベクターへクローンするためにペアになったＤオリゴをデザインし、結果の重鎖配列が枠におけることを確保します。これらのルールは直接の及び逆のＤＨセグメントに応用されました。ｐＦ−ＶＨ３−２３−ＩＧＨＪプラスミドをＢｓａＩ部位にクローンすることを容易にするために、以下の塩基はＤＨセグメントオリゴ塩基に加えられました。
直接の５’端：ＣＧＡＡＡ；
直接の３’端：Ｔ；
間接の５’端：ＣＧＡＡＡ；
間接の３’端：Ｔ【０７９１】それぞれの特定なＤＨセグメント用結果のオリゴは以下の表３９−４０においてリストされます。クローニングを容易にするために加えられた塩基は小文字で表示されます。ＤＨセグメントをコード化する塩基は大文字で表示されます。これらのオリゴは標準ＤＮＡ合成技術により合成されました。ペアになったオリゴ（特定なＤＨセグメントをコード化します）はＢｓａＩにより消化され、同じように消化されたｐＦ−ＶＨ３−２３−ＩＧＨＪ１からｐＦ−ＶＨ３−２３−ＩＧＨＪ６までのプラスミドへ縛られ、以下の表４１にリストされた６９０メンバーのＶＨ３−２３ライブラリーを生じました。ＶＨ３−２３重鎖ライブラリーは様々な軽鎖と共に変質され（例８において説明されたように）、３０１２メンバーのＦａｂライブラリーを作りました。【０７９２】
【表３８】
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【０７９３】
【表３９】
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【０７９４】
【表４０】
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【０７９５】
【表４１】
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【０７９６】例１５
電子化学ルミネッセンス結合測定【０７９７】例１３において説明された電子化学ルミネッセンス（ＥＣＬ）結合測定はさらに以下のように使用されました。
九つの違う抗体の一つと結合することができる抗体のために、以下の表７７の２２−３６行において表示された５３７６メンバーのＦａｂライブラリー及び１５の組換えＦａｂ抗体を選り分けました。例１３に説明されたように、データは各ウェルの空白に対する抗原用の各ＥＣＬシグナルを比べることにより分析されました。空白比率が４又はその以上であるシグナルは「ヒット」Ｆａｂだと思われました。【０７９８】それぞれ９６の違うＦａｂを含む五十六（５６）のプレートはＥＣＬ測定によりえり分けられました。三十六（３６）のＦａｂには、表４２−４４に示されたような一つ又はその以上の蛋白質抗原との特定な結合親和性が見つかりました。以下の表４２はＥＣＬ測定の結果を纏めます。組換え人標的／蛋白質抗原、標的ごとの抗体ヒット数、及び標的ごとのヒットパーセント（ヒットの数／選り分けられた５３７６抗体）を包括します。十一のＦａｂは組換え人デルタ様蛋白質４（ＤＤＬ４）と結合すると確認されましたが、２だけのヒットは組換え人上皮成長因子２（ＥｒｂＢ２）と結合すると確認されました。十のＦａｂは組換え人エリスロポエチン・レセプター（Ｅｐｏ  Ｒ）と結合すると確認されましたが、６のＦａｂは組換え人Ｐ−カドヘリンと結合すると確認されました。それに加えて、３のＦａｂは組換え人上皮成長因子２（ＥｒｂＢ２）と結合すると確認されましたが、３のＦａｂは組換え人ノッチ１と結合すると確認されました。以下の表４３は、初期ＥＣＬ選り分けにおいて「ヒット」として確認された２１のＦａｂ（重鎖及び軽鎖を包括します）をリストします。「ヒット」はシグナル対空白の比率が４以上であるＦａｂ抗体であります。単一Ｆａｂ濃度での初期ＭＳＤ測定選り分けの結果は以下の表４４においてリストされます。
表４４は２１Ｆａｂ（Ｆａｂ番号は表４３において確認された各Ｆａｂと対応します）、Ｆａｂ濃度、９組買え人標的／蛋白質抗原、及び既知のＦａｂ濃度での初期ＭＳＤ測定選り分けからのＥＣＬシグナルをリストします。【０７９９】
【表４２】
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【０８００】
【表４３】
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【０８０１】
【表４４】
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【０８０２】初期ＥＣＬ選り分け（表４２−４４をご参考に）において確認された「ヒット」を確認するために、Ｆａｂ濃度による滴定は行われて、Ｆａｂ抗原の結合親和性を確定しました。測定過程は上述の例１３に説明されたようであります。ただし、Ｆａｂ抗体の濃度はウェルにより０．０６２８ｎＭから１．５７μＭまで変化します。用量反応測定の結果は以下の表４５−６１において表示されます。以下の表６２−７６は１５の組み替えられた抗−ＤＬＬ４抗体（以下の表７７の行２２−３６において表示されます）のための用量反応測定の結果をリストします。組み替えられた抗−ＤＬＬ４抗体は、前に確認された生殖細胞系抗体と比べて、重鎖又は軽鎖においてせめて一つの変形を持っています。【０８０３】
【表４５】
0005882058.tif 000248
【０８０４】
【表４６】
0005882058.tif 000249
【０８０５】
【表４７】
0005882058.tif 000250
【０８０６】
【表４８】
0005882058.tif 000251
【０８０７】
【表４９】
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【０８０８】
【表５０】
0005882058.tif 000253
【０８０９】
【表５１】
0005882058.tif 000254
【０８１０】
【表５２】
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0005882058.tif 000256
【０８１１】
【表５３】
0005882058.tif 000257
【０８１２】
【表５４】
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【０８１３】
【表５５】
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0005882058.tif 000260
【０８１４】
【表５６】
0005882058.tif 000261
【０８１５】
【表５７】
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【０８１６】
【表５８】
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【０８１７】
【表５９】
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【０８１８】
【表６０】
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【０８１９】
【表６１】
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【０８２０】
【表６２】
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【０８２１】
【表６３】
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【０８２２】
【表６４】
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【０８２３】
【表６５】
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【０８２４】
【表６６】
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【０８２５】
【表６７】
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【０８２６】
【表６８】
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【０８２７】
【表６９】
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【０８２８】
【表７０】
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【０８２９】
【表７１】
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0005882058.tif 000278
【０８３０】
【表７２】
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【０８３１】
【表７３】
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【０８３２】
【表７４】
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【０８３３】
【表７５】
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【０８３４】
【表７６】
0005882058.tif 000284
【０８３５】まとめ
以下の表７７はＭＳＤ測定の結果を纏めます。表７７は、組換え人標的／蛋白質抗原及びこれらのＦａｂを、それぞれの重鎖及び軽鎖（配列同一性番号を包括します）により指定されたように、リストします。以下の表７７に示されたように、幾つかのＦａｂは多標的と結合すると確認されました。例えば、Ｆａｂ  ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ２−１５＊０１＿ＩＧＨＪ２＊０１  ＆  Ｌ１２＿ＩＧＫＪ１＊０１はＥＧＦ  Ｒ、Ｅｐｏ  Ｒ及びＤＬＬ４と結合しますが、Ｆａｂ  ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ３−１０＊０１＿ＩＧＨＪ４＊０１  ＆  Ｌ１２＿ＩＧＫＪ１＊０１はノッチ−１、Ｐ−カドヘリン及びＤＬＬ４と結合します。以下の表７７は、ＤＬＬ４と結合する１５の他の組み替えられたＦａｂ（行２２−３６に表示されます）をリストします。【０８３６】
【表７７】
0005882058.tif 000285
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【０８３７】例１６
表面プラスモン共鳴
この例において、選ばれたＦａｂ（表７８−７９をご参考に）が組み替えられた人ＤＬＬ４（Ｒ＆Ｄシステム）との結合親和性は、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）（バイオセンサー・ツール、ソルトレイクシティ、ユタ州）により分析されました。これらのＦａｂ（表７８をご参考に）は、初期ＥＣＬ選り分けにおいてＤＬＬ４と結合すると確認された生殖細胞系抗体、及び初期確認された抗−ＤＬＬ４Ｆａｂと比べて重鎖又は軽鎖において一つ又はその以上の変形を含む組み替えられたＦａｂを包括します。【０８３８】結果は以下の表７９に表示されました。表７９はＦａｂ（Ｆａｂ番号により）、ｋａ（Ｍ−１ｓ−１）、ｋｄ（ｓ−１）、ＫＤ（ｎＭ）及び標準偏差（括弧で表示）をリストします。結果によれば、ＦａｂがＤＬＬ４との結合親和性は４８．５Ｎｍから３８ｕＭまでの範囲におります。清祥細胞系Ｆａｂ  ＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１  ＆  Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１は４．８ｕＭの平均ＫＤを持っていますが、変形Ｆａｂ  ＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１＿Ｇ１００Ｋ＿Ｇ１０４Ｔ  ＆  Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１は改良された３５５ｎＭのＫＤを持っています。生殖系細胞Ｆａｂ  ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１  ＆  Ｌ６＿ＧＫＪ１＊０１は、７３０ｎＭの平均ＫＤを持っているＤＬＬ４と結合しますが、変形Ｆａｂｓ（以下の表７８及び７９の行５−６及び８−１０）は７０．６ｎＭから３８８ｎＭまでわたる改良されたＫＤｓを持っているＤＬＬ４と結合します。生殖系細胞Ｆａｂ  ＶＨ６−１＿ＩＧＨＤ３−３＊０１＿ＩＧＨＪ４＊０１  ＆  Ｖ４−３＿ＩＧＬＪ４＊０１は平均結合親和性が３８Ｕｍでありますが、生殖系細胞Ｆａｂ  ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ３−１０＊０１＿ＩＧＨＪ４＊０１  ＆  Ｌ１２＿ＩＧＫＪ１＊０１は平均ＫＤが５００ｎＭであります。【０８３９】
【表７８】
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【０８４０】
【表７９】
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【０８４１】例１７
ＤＬＬ４−ノッチ相互作用の抑制【０８４２】この例において、前にＤＬＬ４と結合すると確認された四つのＦａｂは、ノッチ−ＦｃとＤＬＬ４との結合を閉鎖する能力のために機能的に選り分けられました。
このＥＬＬＳＡ測定において、組み替えられた人ＤＬＬ４がプレートと結合した後、Ｆａｂ及びノッチ−Ｆｃが加えられました。抗人ＦＣ−ＨＲＰと接合した抗体は、検出分子として使用されましたので、ノッチ−ＦｃがＤＬＬ４と結合すれば、強いシグナルがＡ４５０で観測されます。代わりに、Ｆａｂがノッチ−ＦｃとＤＬＬ４との結合を閉鎖することができれば、シグナルが観測されません。測定されたＦａｂは、Ｆａｂ  ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＿Ｓ１０２Ａ＿Ｓ１０３Ｐ＿Ｓ１０４Ｆ  ＆  Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１、Ｆａｂ  ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＿Ｓ１０２Ａ＿Ｓ１０３Ｐ＿Ｓ１０４Ｆ＿Ｈ１１１Ｆ  ＆  Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１、Ｆａｂ  ＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１＿Ｇ１００Ｋ＿Ｇ１０４Ｔ  ＆  Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１、及びＦａｂ  ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ３−１０＊０１＿ＩＧＨＪ４＊０１  ＆  Ｌ１２＿ＩＧＫＪ１＊０１を包括します。【０８４３】要約すると、Ｍａｘｉｓｏｒｐ  Ｎｕｎｃ  ９６−ウェル・プレートは、０．５μｇ／ｍｌの組み替えられた人ＤＬＬ４細胞外ドメーン（Ｒ＆Ｄシステム）により最小２時間塗られていました。ウェルは洗われてから、４％のＢＳＡにより閉鎖されました。閉鎖の後、濃度が０．００４から５μＭまでのＦａｂｓ  ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＿Ｓ１０２Ａ＿Ｓ１０３Ｐ＿Ｓ１０４Ｆ  ＆  Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１、ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＿Ｓ１０２Ａ＿Ｓ１０３Ｐ＿Ｓ１０４Ｆ＿Ｈ１１１Ｆ  ＆  Ｌ６＿ＧＫＪ１＊０１、ＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１＿Ｇ１００Ｋ＿Ｇ１０４Ｔ  ＆  Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１、及びＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ３−１０＊０１＿ＩＧＨＪ４＊０１  ＆  Ｌ１２＿ＩＧＫＪ１＊０１は、濃度が１０Ｎｍである組み替えられた人Ｆｃ−ノッチ細胞外度メーン（Ｒ＆Ｄシステム）と一緒に加えられました。一、二時間の培養の後、ウェルは洗われましたが、ノッチ結合は１：１０００希釈度で鼠抗人ＦＣ−ＨＲＰと接合した抗体により測られました。ＨＲＰ活性はＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）により検出された後、酸中和が発生しました。Ａ４５０はＳｐｅｃｔｒａＭａｘプラス３８４の上に測られました。【０８４４】結果によると、Ｆａｂｓ  ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＿Ｓ１０２Ａ＿Ｓ１０３Ｐ＿Ｓ１０４Ｆ  ＆  Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１、ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＪ１＊０１＿Ｓ１０２Ａ＿Ｓ１０３Ｐ＿Ｓ１０４Ｆ＿Ｈ１１１Ｆ  ＆  Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１、又はＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１＿Ｇ１００Ｋ＿Ｇ１０４Ｔ  ＆  Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１の添加は、低減したシグナルを引き起こし、ノッチ−ＦｃとＤＬＬ４との結合を閉鎖するそれらの能力を示しました。Ｆａｂ  ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ３−１０＊０１＿ＩＧＨＪ４＊０１  ＆  Ｌ１２＿ＩＧＫＪ１＊０１の添加は、活性の損失を引き起こさなく、Ｆａｂ  ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ３−１０＊０１＿ＩＧＨＪ４＊０１  ＆  Ｌ１２＿ＩＧＫＪ１＊０１がノッチ−ＤＬＬ４の相互作��を閉鎖しないことを示しました。この結果によると、Ｆａｂｓ  ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＿Ｓ１０２Ａ＿Ｓ１０３Ｐ＿Ｓ１０４Ｆ  ＆  Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１、ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−６＊０１＿ＩＧＨＪ１＊０１＿Ｓ１０２Ａ＿Ｓ１０３Ｐ＿Ｓ１０４Ｆ＿Ｈ１１１Ｆ  ＆  Ｌ６＿ＩＧＫＪ１＊０１又はＶＨ５−５１＿ＩＧＨＤ５−１８＊０１＞３＿ＩＧＨＪ４＊０１＿Ｇ１００Ｋ＿Ｇ１０４Ｔ  ＆  Ｖ３−４＿ＩＧＬＪ１＊０１は、Ｆａｂ  ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ３−１０＊０１＿ＩＧＨＪ４＊０１  ＆  Ｌ１２＿ＩＧＫＪ１＊０１と比べて、ＤＬＬ４のそれぞれの抗原分子と結合します。【０８４５】例１８
レセプター刺激のためのＥｐｏＲ細胞を基にする測定【０８４６】この例において、各Ｆａｂは、細胞を基にする測定により、エリスロポエチン・レセプターを刺激するそれらの能力のために分析されました。使用された細胞系は、人エリスロポエチン・レセプター（ＥｐｏＲ）により形質移入されたＢａ／Ｆ３細胞、及びＥｐｏＲを欠けた母Ｂａ／Ｆ３細胞を包括しました。母Ｂａ／Ｆ３細胞はレセプターアゴニストに反応しませんでしたが、二つの細胞系は成長するにはＩＬ−３を必要としていました。【０８４７】要するに、Ｂａ／Ｆ３細胞（ＥｐｏＲ付き及び付きなし）はＲＰＭＩ  １６４０媒介において１０％ＦＢＳ、抗生物質、及び５ｎｇ／Ｌの組み替えられた鼠ＩＬ−３により増殖され、ＩＬＬ−３を欠けた同量の媒介を洗い、５０μｌで５０００細胞／ウェルで９６のウェル・プレートへめっきされました。めっきの後、細胞は１０μｌのＦａｂ、アゴニスト制御子ＥＭＰ１６（ＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱ、配列同一性番号３７３５）、又は媒介により処理されてから、３７°Ｃで湿度５％のＣＯ２環境において四日間成長しました。細胞の生育性及び増殖性を測るために、レサズリンを基にする生育性測定試薬がテストウェルに加えられ、２４時間続けました。代謝活性細胞による試薬の減少は容易に定量化できる蛍光分子レゾルフィンを生じました。各処理の平均蛍光性は、媒介制御の平均蛍光性により分けられ、倍増増殖を齎しました。【０８４８】結果によると、４０  ｎＭ  Ｆａｂ  ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ２−１５＊０１＿ＩＧＨＪ２＊０１  ＆  Ｌ２＿ＩＧＫＪ１＊０１はレセプターによる増殖を示しましたが、５４  ｎＭ  Ｆａｂ  ＶＨ１−４６＿ＩＧＨＤ６−１３＊０１＿ＩＧＨＪ４＊０１  ＆  ０１＿ＩＧＫＪ１＊０１はレセプター発見の細胞にも母細胞にも媒介の上における増殖を殆ど示しませんでした。２．５μＭの濃度で加えられた既知のレセプター・アゴニスト・ペプチドＥＭＰ１６（ＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱ、配列同一性番号３７３５）は強い細胞増殖を示しました。【０８４９】例１９
ＤＬＬ４／Ｊａｇ１の抑制【０８５０】この例は、ノッチ通路の活性化がＣ２Ｃ１２筋芽細胞差異化を防ぐという細胞測定を説明します（Ｊａｒｒｉａｕｌｔなど、１９９８  分子及び細胞生物学、１８：７４２３−７４３１をご参考に）。ノッチ通路を活性化するために、ノッチリガンド（例えば、ＤＬＬ４又はＪａｇ１）は細胞表面の上に全長さ蛋白質として発見されなければなりません。このノッチ活性化を実現するために、ノッチリガンドＤＬＬ４又はＪａｇ１を自然的にまたは異常的に発見する非粘着性細胞は、Ｃ２Ｃ１２細胞及び選ばれたＦａｂと共同に培養されます。ＤＬＬ４又はＪａｇ１の機能抑制は差異化を促進するというＦａｂの能力により評価され、ノッチ通路の不活性化を示しました。チューブ様構造への差異化は形態上から簡単に識別されますが、トロポニンＴ（シグマ・アルドリッチ）に反する抗体により検出されることができます。【０８５１】要するに、Ｃ２Ｃ１２鼠筋芽細胞は、ＩＭ９細胞（人リンパ球細胞系）及びＦａｂを発見するＪａｇ１がある場合及びない場合に培養されます。これらの細胞は、１０％のＦＢＳ（ウシ胎児血清）における１２のウェル皿におけるカバーガラスの上にめっきされます。翌日、附着したＣ２Ｃ１２細胞は１％のＦＢＳを含むＤＭＥＭの中に移転され、差異化を引き起こします。培養の後、これらの細胞は視覚化されるので、筋管への差異化が発生かどうか観測することができます。低い血清状態は筋管の差異化を引き起こしますが、Ｊａｇ１を発見するＩＭ９細胞は低い血清状態でＣ２Ｃ１２細胞の無差異化状態を維持します。【０８５２】例２０
ｐ−カドヘリンの抑制【０８５３】この例は、Ｐ−カドヘリンを抑制する抗体の能力が細胞群生の失敗により観測されたという細胞測定を説明します。Ｐ−カドヘリンは細胞間粘着に関わるので、Ｐ−カドヘリンの抑制は細胞分散を引き起こします。【０８５４】要するに、Ａ４３１表皮腫瘍細胞は１０％ＦＢＳのＤＭＥＭにおいて１００００細胞／ウェル（９６−ウェル）で９６−ウェル皿へめっきされます。翌日、Ｆａｂは１００・ｇ／ｍｌでウェルに加えられます。ｐ−カドヘリン抗体（Ａｂｃａｍ）を閉鎖する機能は正の制御として使用されますが、１０％ＦＢＳのＤＭＥＭ自身は負の制御として使用されます（Ｓｈｉｍｏｙａｍａ、Ｙ．など、１９８９癌研究、４９：２１２８−２１３３をご参考に）。三時間後細胞は「分散」のために検査され、写真を撮られます。
媒介により培養された細胞は重要な「群生」だけを展示しますが、抗−Ｐ−カドヘリンＦａｂ又は抗体により培養された細胞は分散されます。【０８５５】修正必要の所々が専門家から見れば明らかですから、この発明は付録要求の範囲内に限定する希望です。
【図１】
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【図２−Ａ】
0005882058.tif 000290
【図２−Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0005882058.tif 000297
【図９】
0005882058.tif 000298
【図１０】
0005882058.tif 000299
【図１１】
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【図１２】
0005882058.tif 000301
【図１３】
0005882058.tif 000302
【図１４】
0005882058.tif 000303
【図１５】
0005882058.tif 000304
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
0005882058.tif 000307
【図１９】
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【図２０】
0005882058.tif 000309
【配列表】
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