(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カロテノイド生産性パラコッカス属細菌ＴＳＮ４７Ｒ３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２２０３４）。
【請求項２】
カロテノイド生産性パラコッカス属細菌ＴＳＮ４７Ｒ３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２２０３４）を培養し、菌体からアスタキサンチンを回収することを特徴とする、アスタキサンチンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乾燥菌体重量１ｇあたり１７ｍｇ以上のカロテノイドを生産可能なカロテノイド類生産性パラコッカス属微生物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アスタキサンチンは、マス、マダイ、サケ等の海産物の養殖の際に色揚げに用いられている他、近年では、その抗酸化作用が注目を浴び、化粧品やサプリメント等の健康食品等への応用もなされている。アスタキサンチンは、オキアミ等の甲殻類からの抽出により得ることができるが、供給の安定性に課題があり、加えてその抽出時に細胞壁を破砕する工程を要するため、製法が複雑となり製造コストを低く抑えることが困難である。
【０００３】
一方で、海洋性アグロバクテリウム属（後に、パラコッカス属に属する細菌に再分類された細菌Ｎ‐８１１０６株の培養により、アスタキサンチンを生産する方法が報告されている（例えば特許文献１参照）。この方法によれば、前記微生物を培養した後、アセトンなどの有機溶媒を混和・撹拌するだけで容易にアスタキサンチンを抽出することが可能であり、製法を簡便化して製造コストを低く抑えることが可能になるが、その増殖によって微生物菌体量がほぼ上限に達した状態まで培養したとしても、培地１リットルに含まれる微生物が蓄積するアスタキサンチン量（以下、「培地１リットルあたり微生物が蓄積するアスタキサンチン量」等と表現することがある）は低く、更なる改良が求められていた。その後、本出願人は、Ｎ‐８１１０６株の変異育種株を報告し、更に培地１リットルあたり総カロテノイド量で４００ｍｇ、その中のアスタキサンチンの量で２２０ｍｇを蓄積する微生物ＴＳＮ１８Ｅ７株（特許文献２）、培地１リットルあたり総カロテノイド量で７２０ｍｇ、その中のアスタキサンチンの量で２５０ｍｇを蓄積する微生物ＴＳＴＴ０５２（平成１７年１０月１８日に独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−２０６９０として受託され、平成１９年１月９日に原寄託についてＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７５４として受託されている）（特許文献３）を報告している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平７−１８４６６８号公報
【特許文献２】特開２００５−５８２１６号公報
【特許文献３】特開２００７−１８１４４９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本出願人が報告した、Ｎ‐８１１０６株の変異育種株は、Ｎ−８１１０６株と比較して、培地１リットルあたり高いカロテノイドを蓄積し得る微生物である。しかしながら、カロテノイド又はアスタキサンチンの工業的な製造を考えると、更に大量のカロテノイド等を蓄積できる微生物の創出が課題であった。
【０００６】
そこで本発明の目的は、工業的なカロテノイド又はアスタキサンチンの製造を考慮して、従来報告されている微生物よりも更に大量のカロテノイド又はアスタキサンチンを蓄積し得る微生物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題に関し鋭意検討した結果、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、  乾燥菌体重量１ｇあたり１７ｍｇ以上のカロテノイドを生産可能なカロテノイド類生産性パラコッカス属微生物である。また本発明は、かかる微生物を培養し、菌体又は培養液からアスタキサンチンを回収することを特徴とする、アスタキサンチンの製造方法である。以下本発明を詳細に説明する。
【０００８】
本発明の乾燥菌体重量１ｇあたり１７ｍｇ以上のカロテノイドを生産可能なカロテノイド類生産性パラコッカス属微生物は、カロテノイド類の生産性を有するパラコッカス属細菌を育種することにより得ることができる。育種に使用するパラコッカス属細菌として好適なのは、本出願人によって見出された、既にあるレベルのカロテノイド及びアスタキサンチンの生産性を有するパラコッカス属細菌ＴＳＴＴ０５２株を例示することができる。その他にも、カロテノイド生産性パラコッカス属細菌ＴＳＮ１８Ｅ７株（特開２００５−５８２１６号）を育種することも例示できる。また更には、海洋性アグロバクテリウム属微生物（後に、パラコッカス属に属する微生物として再分類された）Ｎ−８１１０６株を例示することができる。前記したＴＳＴＴ０５２株はＴＳＮ１８Ｅ７株を育種して得られた株であり、ＴＳＮ１８Ｅ７株はＮ−８１１０６株を育種して得られた株だからである。なお、Ｎ−８１１０６株は細胞中にアスタキサンチン、β−カロテン、β−クリプトキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、カンタキサンチン、３’−ヒドロキシエキネノン、シス−アドニキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチンなどの多様なカロテノイドを蓄積することが知られている。
【０００９】
育種の具体的な内容としては、自然突然変異により派生した優良微生物を選別していく方法などの他に、変異原物質や紫外線で細胞を処理することによって変異を加速させたのちにカロテノイド類又はアスタキサンチンの生産性及び蓄積性が向上した微生物を選別する方法や、以上の様な方法で得られた性質の異なる微生物同士を細胞融合させる方法などを例示することができる。中でも、変異原物質を用いる方法は短期間に有用な微生物を得る方法として好ましく、具体的に変異原物質としてＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、メタンスルホン酸エチル等の化合物を使用する方法が例示できる。より具体的に、ＴＳＴＴ０５２株を用いる育種について一例を述べれば、予め培養して得られたＴＳＴＴ０５２株の菌体を前記のような変異原物質の水溶液に懸濁して一定時間接触した後に、遠心分離などの方法で菌体を回収して変異原物質を除去する。その後平板培地上で培養し、優良微生物のコロニーを選択する。コロニーの選択はアスタキサンチン生産菌に特有の赤色が濃いコロニーを選択・分離し、液体培養を行い、次いで、菌体からカロテノイドを抽出してその蓄積量やアスタキサンチン蓄積量を、組成をＨＰＬＣなどで分析し、生産性の向上した微生物を絞り込むことが例示できる。
【００１０】
カロテノイド類やアスタキサンチンの生産性及び蓄積性は、培地１リットル（Ｌ）当たりから回収できるカロテノイド類等の量や乾燥菌体重量あたり当たりの生産量によって評価することができる。一例を挙げると、固体培地を利用した場合には任意のコロニーをピックアップし、液体培養後、増殖能やカロテノイド類の生産量を定量することにより評価すればよい。本出願人がＴＳＴＴ０５２株を用いる育種により見出したＴＳＮ４７Ｒ３株（平成２２年１２月１５日に独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＡＰ−２２０３４として受託されている）は、乾燥菌体重量１ｇあたり１７ｍｇ以上のカロテノイドを生産可能であり、その６０重量％以上はアスタキサンチンである（培地１リットルあたり１１００ｍｇ以上のアスタキサンチンを蓄積する）カロテノイド類生産性パラコッカス属微生物である。なお、参考までに述べれば、培地１Ｌ当たりの乾燥菌体量は、培養条件等によって異なるが、後述する実施例では１００ｇ以上である。
【００１１】
本発明のカロテノイド類又はアスタキサンチンの生産方法は、上述した育種により得られる微生物を培養することからなる。培養条件は、一般に公知の条件を用いることができる。本発明のカロテノイド類等の生産方法においては、培養は培養液中で行うことが好ましい。例えば培養温度を１０から３５℃に、培地のｐＨを６から９の範囲にそれぞれ設定し、２０から２００時間培養させることが例示できる。培養温度については培養初期、中期、後期に区別してそれぞれの段階で温度を変えてもよい。
【００１２】
培養に用いる栄養培地の培地成分としては、炭素源には廃糖蜜、グルコース、フルクトース、マルトース、ショ糖、デンプン、乳糖、グリセロール、酢酸等が、窒素源にはコーンスティープリカー、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粕等の天然成分や、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩等やグルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン等のアミノ酸類が、無機塩にはリン酸１ナトリウム、リン酸２ナトリウム、リン酸１カリウム、リン酸２カリウム等のリン酸塩や塩化ナトリウム等が、金属イオンには塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸第１鉄、硫酸第２鉄、塩化第１鉄、塩化第２鉄、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、塩化カルシウム・２水和物、硫酸カルシウム、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化銅、硫酸マンガン、塩化マンガン等が、ビタミン類として酵母エキスやビオチン、ニコチン酸、チアミン、リボフラビン、イノシトール、ピリドキシン等が使用できる。
【００１３】
上記のような栄養培地を使用した好適な培養条件は、培養温度２０から３０℃、ｐＨが約７．０から７．６、培養時間が６０から１８０時間である。また培地中の糖濃度については、低濃度かつ枯渇しない条件に維持することが好ましく、グルコースなどの高濃度な糖溶液を用いて流加することが好ましい。  本発明の微生物を培養すると、アスタキサンチンを含むカロテノイドが生産され、菌体内又は培養液に蓄積される。カロテノイド類の抽出は、菌体又は培養液からカロテノイドやアスタキサンチンを安定かつ効率良く回収されれば特に限定はなく、例えばメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジクロロメタン、クロロフォルム、ジメチルフォルムアミド、ジメチルスルフォキシド等の抽出溶媒による抽出や、超臨界流体抽出を例示できるが、中でもアセトンを用いた有機溶媒によるが好ましい。抽出されたカロテノイドは、液体クロマトグラフィー等を利用して高純度に分離、精製することも可能である。液体クロマトグラフィーの分離原理としてはイオン交換、疎水性相互作用、分子ふるい等を挙げることができる。好ましくは、逆相クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィーである。また高速液体クロマトグラフィーによれば、抽出したカロテノイドの定量を行うこともできる。
【００１４】
菌体からの抽出に際しては、例えば、培養終了後、菌体を培地から遠心分離操作、デカンテーション又はろ過等の方法を用いて分離し、使用し易い粘度にまで水を加えてスラリーとしておくと良い。後に、調製スラリーを例えばガラスビーズ、ジルコニアビーズを用いた破砕機又は高圧ホモジナイザーを使用して均一化し、好ましくはスプレー乾燥法にて乾燥し、抽出に供するのである。またここで、アスタキサンチンの分解を防ぐために、スラリーにアスコルビン酸等の酸化防止剤を加えてもよい。
【００１５】
なお、本発明の微生物は、例えば、カロテノイドやアスタキサンチンを抽出することなく、そのまま養殖魚等の海産物の飼料へ添加することもできる。また、前述したような抽出操作を実施した後の、カロテノイドやアスタキサンチンをほとんど含まない微生物の残渣もまた、家禽等を飼育するうえで理想的な蛋白質及びビタミン類の供給源として使用することができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の微生物により、化粧品、健康食品又は食用色素として有用なカロテノイド、特にアスタキサンチンを効率よく製造することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＴＳＮ４７Ｒ３株を用いた発酵槽培養におけるアスタキサンチン生産量及び総カロテノイド生産量の経時変化を示した図である。
【図２】培養１７０時間経過時でのカロテノイド生産パターンを示すＨＰＬＣチャートである。
【００１８】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００１９】
実施例１  変異導入及び優良菌株の作製
ＴＳＴＴ０５２株を表１に示す培地３ｍＬに植菌し、試験管中、２５℃、１５０ｒｐｍで１晩振とう培養を行った。この培養液のうち１ｍＬを１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移し、１５０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により菌体を回収した。この菌体をｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（以下緩衝液Ａとする）１ｍＬに懸濁し、次いで３ｍｇ／ｍＬのＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下ＮＴＧとする）水溶液１０μＬを加え、６０分間静置した。その後、遠心分離して上清を除去し、緩衝液Ａに再懸濁する操作を２回繰り返してＮＴＧを除去した。さらに、表１に示す培地１ｍＬにこの菌体を懸濁し、試験管中、２５℃、１５０ｒｐｍで５時間振とう培養した。得られた培養液を適度に希釈し、寒天１５ｇ／Ｌを加えて固化した表１に示す組成の平板培地に塗布して、２５℃で１週間静置培養を行った。生育してきたコロニーのうち赤色の強いものを選別し、フラスコ培養による変異株の評価に供した。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
実施例２  変異株の評価
実施例１で選別した変異株を、表１に示す培地３ｍＬに植菌し、試験管中、２５℃、１５０ｒｐｍで１晩振とう培養した。次いでこの培養液０．５ｍＬを、１００ｍＬ容バッフル付三角フラスコに入れた表１に示す培地６０ｍＬへ植菌し、２５℃、１２０ｒｐｍで６日間振とう培養を行った。培養中は培養液を適宜抜き取り、濁度（ＯＤ６６０ｎｍ）、残存グルコース濃度、培地ｐＨ、及びカロテノイド生産量を経時的に分析した。カロテノイド生産量の定量は以下のように行った。まず培養液１ｍＬを１．５ｍＬ容エッペンドルフチューブに移し、１５０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により菌体を回収した。この菌体を２０μＬの純水に懸濁し、次いで４８０μＬのジメチルホルムアミド、及び５００μＬのアセトンを順次加え振とうすることでカロテノイドを抽出した。抽出残渣を１５，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により除去した後、市販の液体クロマトグラフィー用カラム（ＴＳＫｇｅｌ−ＯＤＳ８０ＴＭカラム、東ソー株式会社製）を用いた高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣとする）で各種カロテノイドを定量した。
【００２２】
なお、カロテノイドの分離はＡ液として純水とメタノールの５：９５の混合溶媒、Ｂ液としてメタノールとテトラヒドロフランの７：３の混合溶媒を用い、１ｍＬ／ｍｉｎの流速で、Ａ液を５分間カラムに通液させた後、同じ流速においてＡ液からＢ液へ５分間の直線濃度勾配溶出を行い、さらにＢ液を５分間通過させることにより行った。アスタキサンチン濃度は４７０ｎｍの吸光度をモニターし、既知濃度のアスタキサンチン試薬（アレクシス社／コスモバイオ社製）で作成した検量線より濃度を算出した。
【００２３】
上記の方法に従って変異株のカロテノイド生産性を評価し、親株であるＴＳＴＴ０５２株よりも生産性が向上した株の中から、新規変異株ＴＳＮ４７Ｒ３株を取得した。表２にＴＳＮ４７Ｒ３株、及び変異導入前の株であるＴＳＴＴ０５２株の培養終了時におけるカロテノイド生産量を示す。表２のとおり、ＴＳＮ４７Ｒ３株は親株であるＴＳＴＴ０５２株よりカロテノイド及びアスタキサンチンの生産が向上していることが分かる。
【００２４】
【表２】
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【００２５】
実施例３  発酵槽での新規微生物の培養及びカロテノイドの定量
表１に示す培地６０ｍＬにＴＳＮ４７Ｒ３株を植菌し、１００ｍＬバッフル付三角フラスコ中、２５℃、１２０ｒｐｍで１晩振とう培養を行い前々培養とした。次いでこの培養液３ｍＬを、５００ｍＬ容バッフル付三角フラスコに入れた表３に示す培地１００ｍＬへ植菌し、２５℃、１２０ｒｐｍで１晩振とう培養を行い前培養とした。次いで、表４に示す培地１．８Ｌを全容３．０Ｌ発酵槽（サクラ精機社製、ＴＦＬＣ−３）に入れ、１２１℃、２０分間で滅菌後、得られた前培養液を９０ｍＬ植菌し、約１７０時間培養した。発酵槽の操作は次のようにした。まず、発酵槽の培養温度は２２℃、ｐＨは７．０から７．２とし、ｐＨの調整は１０％のアンモニア水溶液を用いた。また発酵槽の攪拌速度は、培養開始時には５１６ｒｐｍとし、培養が進むにつれて徐々に攪拌速度を上げ、培養１１７時間において５９４ｒｐｍまで上昇させた。培養過程に発生する炭素源不足は、７０％グルコースを適宜添加することにより補った。グルコース濃度は、１０ｇ／Ｌで培養を開始し、培養１８時間後にグルコースの添加を開始して、０．５ｇ／Ｌ〜３３ｇ／Ｌとなるように調節した。培養開始から１１７時間経過した時点でグルコースの添加を終了し、０．２Ｍ硫酸第１鉄７水和物の水溶液２５ｍＬを培養液に追加した。
【００２６】
【表３】
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【００２７】
【表４】
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【００２８】
図１にＯＤ６６０ｎｍ、アスタキサンチン生産量及び総カロテノイド生産量の経時変化を示す。図１のように、培養時間の経過と共にアスタキサンチン、総カロテノイドの生産量が増加し、培養１７０時間の時点での各カロテノイドの量を定量すると、表５のようになる。また、その際のＨＰＬＣチャートを図２に示す。図１のように、培養時間の経過と共にカロテノイド及びアスタキサンチンの生産量が増加し、培養開始後約１４０時間でＯＤ６６０の値は４９０を超える。この時の菌体乾燥重量は培地１リットルあたり約１２３ｇであり、カロテノイド生産量は培地１リットルあたり約１６６５ｍｇ、うちアスタキサンチンの生産量は培地１リットルあたり約６９４ｍｇであった。培養開始後約１６８時間でアスタキサンチンの生産量は最大となる。この時のＯＤ６６０の値は約４４０で、菌体乾燥重量は培地１リットルあたり約１０９ｇであり、カロテノイド生産量は培地１リットルあたり約１８６４ｍｇ、うちアスタキサンチンの生産量は培地１リットルあたり約１１１８ｍｇ（菌体乾燥重量１ｇあたり約１０ｍｇ）であった。本実験操作により、培地１Ｌあたりアスタキサンチン約１１００ｍｇ、カロテノイド約１８５０ｍｇを生産することがわかる。
【００２９】
【表５】
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【図１】
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【図２】
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