(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第６染色体短腕２１．３３領域に存在するＨＬＡ−Ａ遺伝子近傍の一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて抗てんかん薬による薬疹リスクを検査することを特徴とする、抗てんかん薬による薬疹リスクの判定方法であって、
前記一塩基多型が配列番号１の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基の一塩基多型、若しくは該一塩基多型とｒ2＞０．５の連鎖不平衡の関係にある一塩基多型であり、
被験者がマイナーアレルを有する場合に抗てんかん薬による薬疹リスクが高いと判定され、且つ
被検者が、日本人である、方法。
【請求項２】
前記抗てんかん薬がカルバマゼピンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
薬疹が、スティーブンス・ジョンソン症候群、中毒性表皮壊死症、薬剤性過敏症症候群、多形性紅斑、紅斑、紅皮症、播種状紅斑丘疹、および固定薬疹から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
以下の（１）の配列を有する抗てんかん薬による薬疹リスクを検査するためのプローブであって、被検者が日本人である、プローブ。
（１）配列番号１の塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１５〜３５塩基の配列、又はその相補配列。
【請求項５】
以下の（１）の領域を増幅することのできる抗てんかん薬による薬疹リスクを検査するための１５〜３５塩基のプライマーであって、被検者が日本人である、プライマー。
（１）配列番号１の塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗てんかん薬による薬疹リスクを判定するための検査方法及び該検査方法に用いられる試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬疹は、薬物による皮膚障害（cutaneous adverse drug reactions；cADRs）の代表的なものであり、薬物によって引き起こされる皮膚や粘膜の急性炎症反応として特徴付けられる。薬疹は、用量非依存性、予測不可能であり、且つ、しばしば命に関わる。薬疹は症状の軽微なものから重篤なものまで多岐にわたるが、重篤なものとしては、３大重症薬疹として知られるスティーブンス・ジョンソン症候群（Stevens-Johnson syndrome；ＳＪＳ）、中毒性表皮壊死症（toxic epidermal necrolysis；ＴＥＮ）、および薬剤性過敏症症候群（Drug-induced hypersensitivity syndrome；ＤＩＨＳ）が挙げられる。
【０００３】
ほぼ全ての薬物は薬疹を誘発するリスクを有することが報告されているが、中でも、抗てんかん薬であるカルバマゼピン（carbamazepine；ＣＢＺ）はＳＪＳ、ＴＥＮ、およびＤＩＨＳを含む種々の薬疹を誘発しうることが知られている。
【０００４】
これまでの研究により、Ｔ細胞性アレルギー反応が薬疹の発症に関与していると考えられているが、詳細な発症機序は明らかとなっていない。また、ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ−６）の再活性化が発熱や肝炎等のＤＩＨＳの諸症状に関与することが示唆されているが、その発症機序は明らかとなっていない。
【０００５】
ＣＢＺに関しては、台湾人被検者を用いた研究により、ヒト白血球抗原（human leukocyte antigen；ＨＬＡ）−Ｂ*１５０２アレルがＣＢＺにより誘発されるＳＪＳやＴＥＮと極めて強く関連していることが証明されている（非特許文献１）。しかしながら、ＨＬＡ遺伝子座のアレル頻度は人種によって顕著に異なり、例えば、ＨＬＡ−Ｂ*１５０２アレルは東南アジア人では８．６％の頻度で存在するが（非特許文献１）、日本人や白人では０．１％の頻度でしか存在しない（http://www.allelefrequencies.net）。したがって、日本人や白人では、ＨＬＡ−Ｂ*１５０２アレルはＣＢＺにより誘発されるＳＪＳやＴＥＮの予測に有用な遺伝的因子とは言えない。
【０００６】
また、日本人被検者において、ＨＬＡ−Ａ*３１０１アレルとＣＢＺにより誘発される重症薬疹との関連に言及した文献がある（非特許文献２）。関連は有意であり（Ｐ＝０．０００４）、オッズ比は４．３３であると報告されているが、著者らが自ら認めるように、解析に用いたサンプルサイズが小さいことから結果が正しいものであるかは保証の限りではない。実際、同グループの続報によれば、軽微な薬疹および重症薬疹のいずれにおいても、ＨＬＡ−Ａ*３１０１アレルを保有することによる相対リスクは１．３３であり、ＨＬＡ−Ａ*３１０１アレルとＣＢＺにより誘発される薬疹との関連は認められなかった（非特許文献３）。
【０００７】
また、台湾人被検者において、ＨＬＡ−Ａ*３１０１アレルがＣＢＺにより誘発される播種状紅斑丘疹（maculopapular eruption；ＭＰＥ）と関連すると報告されている。しかしながら、ＨＬＡ−Ａ*３１０１アレルとＳＪＳやＴＥＮとの関連は認められなかった（非特許文献４）。
【０００８】
また、白人被検者において、ＣＢＺにより誘発される過敏症症候群の１症例がＨＬＡ−Ａ*３１０１アレルの保有者であったことが報告されている（非特許文献５）。しかしながら、ＨＬＡ−Ａ*３１０１アレルとＣＢＺにより誘発される薬疹との関連を統計的に証明したものではない。
【０００９】
以上の通り、特に日本人や白人においては、ＣＢＺ等の抗てんかん薬による薬疹の発症リスクを予測するために利用可能な臨床検査は知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Chung WH. et al. Nature. 2004 Apr 1;428(6982):486.
【非特許文献２】Kashiwagi et al., J Dermatol. 2008 Oct;35(10):683-5.
【非特許文献３】Ikeda, et al., Epilepsia. 2010 Feb;51(2):297-300.
【非特許文献４】Hung, et al., Pharmacogenet Genomics. 2006 Apr;16(4):297-306.
【非特許文献５】Calligaris, et al., Int Arch Allergy Immunol. 2009;149(2):173-7.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、抗てんかん薬による薬疹リスクを正確に検査する方法、及び該方法に用いられる検査試薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記課題の解決のために鋭意検討した結果、第６染色体短腕２１．３３領域に存在する一塩基多型（ＳＮＰ）がカルバマゼピン（ＣＢＺ）による薬疹リスクと関連することを同定した。本発明者らは、さらに、第６染色体短腕２１．３３領域に存在するＨＬＡ−Ａアレルの遺伝子型がＣＢＺによる薬疹リスクと関連することを同定した。そして、これらの多型を調べることによりＣＢＺ等の抗てんかん薬による薬疹リスクの予測を正確に実施できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は以下の通りである。
[１]
第６染色体短腕２１．３３領域に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて抗てんかん薬による薬疹リスクを検査することを特徴とする、抗てんかん薬による薬疹リスクの判定方法。
[２]
前記抗てんかん薬がカルバマゼピンである、[１]に記載の方法。
[３]
ＨＬＡ−Ａアレルの遺伝子型を分析することにより前記一塩基多型が分析される、[１]または[２]に記載の方法。
[４]
ＨＬＡ−Ａアレルの遺伝子型が、ＨＬＡ−Ａ*３１０１であることを分析する、[３]に記載の方法。
[５]
前記一塩基多型が、配列番号１〜１２から選択される塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基、若しくは該塩基と連鎖不平衡の関係にある一塩基多型、またはＨＬＡ−Ａ*３１０１と連鎖不平衡の関係にある一塩基多型である、[１]〜[４]のいずれかに記載の方法。
[６]
以下の（１）または（２）の配列を有する抗てんかん薬による薬疹リスクを検査するためのプローブ。
（１）配列番号１〜１２から選択される塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列。
（２）ＨＬＡ−Ａ*３１０１と連鎖不平衡の関係にある一塩基多型を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列。
[７]
以下の（１）または（２）の領域を増幅することのできる抗てんかん薬による薬疹リスクを検査するためのプライマー。
（１）配列番号１〜１２から選択される塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域。
（２）ＨＬＡ−Ａ*３１０１と連鎖不平衡の関係にある一塩基多型を含む領域。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、抗てんかん薬による薬疹リスクを正確かつ簡便に予測することができる。したがって、本発明は、抗てんかん薬の投与の可否を決定するのに有効であり、抗てんかん薬による薬物治療に貢献するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ヒト第６染色体短腕２１．３３領域の連鎖不平衡（ＬＤ）マップを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
＜１＞本発明の方法
本発明の方法は、ヒトの第６染色体短腕２１．３３領域（６ｐ２１．３３領域）に含まれるＳＮＰを分析し、該分析結果に基づいて抗てんかん薬による薬疹リスクを検査することを特徴とする、抗てんかん薬による薬疹リスクの判定方法である。なお、本発明において、「薬疹リスク」とは、抗てんかん薬の投与により薬疹が発生するかどうかを示すリスク、及び抗てんかん薬の投与により薬疹の程度が悪化するかどうかを示すリスクを含む。よって、本発明において、「検査」とは、抗てんかん薬の投与により薬疹が発生するかどうかを予測するための検査、及び抗てんかん薬の投与により薬疹の程度が悪化するかどうかを予測するための検査を含む。本発明の方法においては、ＳＮＰの分析結果を、抗てんかん薬の投与により薬疹が発生するかどうかを示すリスク、および／または、抗てんかん薬の投与により薬疹の程度が悪化するかどうかを示すリスクと関連付ける。
【００１７】
薬疹としては、特に制限されず、スティーブンス・ジョンソン症候群（Stevens-Johnson syndrome；ＳＪＳ）、中毒性表皮壊死症（toxic epidermal necrolysis；ＴＥＮ）、薬剤性過敏症症候群（Drug-induced hypersensitivity syndrome；ＤＩＨＳ）、多形性紅斑（erythema multiforeme；ＥＭ）、播種状紅斑丘疹（maculopapular eruption；ＭＰＥ）、紅斑（erythema）、紅皮症（erythroderma）、および固定薬疹（fixed drug eruption）等が挙げられる。
【００１８】
抗てんかん薬としては、特に制限されないが、イミノスチルベン系の薬剤であるのが好ましく、カルバマゼピン（ＣＢＺ）であるのがより好ましい。
【００１９】
６ｐ２１．３３領域に存在する具体的なＳＮＰとしては、ヒトrs1633021、rs2571375、rs1116221、rs2844796、rs1736971、rs1611133、rs2074475、rs7760172、rs2517673、rs2524005、rs12665039、およびrs1362088、並びにＨＬＡ−Ａ*３１０１と連鎖不平衡の関係にある一塩基多型を挙げることができる。ここで、rs番号はNational Center for Biotechnology InformationのdbSNPデータベース（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）の登録番号を示す。rs1633021はGenBank Accession No. NT_007592.14の20605120番目の塩基におけるアデニン（Ａ）／グアニン（Ｇ）の多型を意味し、この塩基がＧである場合は抗てんかん薬による薬疹リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、rs1633021がＧＧ＞ＧＡ＞ＡＡの順で抗てんかん薬による薬疹リスクが高い。
【００２０】
rs2571375はGenBank Accession No. NT_007592.14の20803521番目の塩基におけるチミン（Ｔ）／シトシン（Ｃ）の多型を意味し、この塩基がＣである場合は抗てんかん薬による薬疹リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、rs2571375がＣＣ＞ＣＴ＞ＴＴの順で抗てんかん薬による薬疹リスクが高い。
【００２１】
rs1116221はGenBank Accession No. NT_007592.14の20929581番目の塩基におけるチミン（Ｔ）／シトシン（Ｃ）の多型を意味し、この塩基がＴである場合は抗てんかん薬による薬疹リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、rs1116221がＴＴ＞ＴＣ＞ＣＣの順で抗てんかん薬による薬疹リスクが高い。
【００２２】
rs2844796はGenBank Accession No. NT_007592.14の20930762番目の塩基におけるチミン（Ｔ）／シトシン（Ｃ）の多型を意味し、この塩基がＴである場合は抗てんかん薬による薬疹リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、rs2844796がＴＴ＞ＴＣ＞ＣＣの順で抗てんかん薬による薬疹リスクが高い。
【００２３】
rs1736971はGenBank Accession No. NT_007592.14の20634573番目の塩基におけるアデニン（Ａ）／シトシン（Ｃ）の多型を意味し、この塩基がＡである場合は抗てんかん薬による薬疹リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、rs1736971がＡＡ＞ＡＣ＞ＣＣの順で抗てんかん薬による薬疹リスクが高い。
【００２４】
rs1611133はGenBank Accession No. NT_007592.14の20667633番目の塩基におけるチミン（Ｔ）／シトシン（Ｃ）の多型を意味し、この塩基がＴである場合は抗てんかん薬による薬疹リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、rs1611133がＴＴ＞ＴＣ＞ＣＣの順で抗てんかん薬による薬疹リスクが高い。
【００２５】
rs2074475はGenBank Accession No. NT_007592.14の20996141番目の塩基におけるアデニン（Ａ）／グアニン（Ｇ）の多型を意味し、この塩基がＧである場合は抗てんかん薬による薬疹リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、rs2074475がＧＧ＞ＧＡ＞ＡＡの順で抗てんかん薬による薬疹リスクが高い。
【００２６】
rs7760172はGenBank Accession No. NT_007592.14の20688325番目の塩基におけるチミン（Ｔ）／シトシン（Ｃ）の多型を意味し、この塩基がＣである場合は抗てんかん薬による薬疹リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、rs7760172がＣＣ＞ＣＴ＞ＴＴの順で抗てんかん薬による薬疹リスクが高い。
【００２７】
rs2517673はGenBank Accession No. NT_007592.14の20795493番目の塩基におけるチミン（Ｔ）／シトシン（Ｃ）の多型を意味し、この塩基がＴである場合は抗てんかん薬による薬疹リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、rs2517673がＴＴ＞ＴＣ＞ＣＣの順で抗てんかん薬による薬疹リスクが高い。
【００２８】
rs2524005はGenBank Accession No. NT_007592.14の20757928番目の塩基におけるチミン（Ｔ）／シトシン（Ｃ）の多型を意味し、この塩基がＴである場合は抗てんかん薬による薬疹リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、rs2524005がＴＴ＞ＴＣ＞ＣＣの順で抗てんかん薬による薬疹リスクが高い。
【００２９】
rs12665039はGenBank Accession No. NT_007592.14の20783030番目の塩基におけるチミン（Ｔ）／シトシン（Ｃ）の多型を意味し、この塩基がＣである場合は抗てんかん薬による薬疹リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、rs12665039がＣＣ＞Ｃ
Ｔ＞ＴＴの順で抗てんかん薬による薬疹リスクが高い。
【００３０】
rs1362088はGenBank Accession No. NT_007592.14の21068087番目の塩基におけるアデニン（Ａ）／グアニン（Ｇ）の多型を意味し、この塩基がＧである場合は抗てんかん薬による薬疹リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、rs1362088がＧＧ＞ＧＡ＞ＡＡの順で抗てんかん薬による薬疹リスクが高い。
【００３１】
なお、rs1633021、rs2571375、rs1116221、rs2844796、rs1736971、rs1611133、rs2074475、rs7760172、rs2517673、rs2524005、rs12665039、およびrs1362088について、ＳＮＰ塩基及びその前後６０ｂｐの領域を含む合計１２１ｂｐの長さの配列を、それぞれ配列番号１〜１２に示した。６１番目の塩基が多型を有する。
【００３２】
本発明においては、上記塩基に相当する塩基を解析する。「上記塩基に相当する塩基」とは、上記領域における該当塩基を意味する。すなわち、「上記塩基に相当する塩基を解析する」ことには、仮に人種の違いなどによって上記配列がＳＮＰ以外の位置で若干変化したとしても、上記領域における該当塩基を解析することが含まれる。
【００３３】
また、本発明において解析する塩基は上記のものに限定されず、上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基の多型を分析してもよい。ここで「上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基」とは、上記の塩基とｒ2＞０．５、好ましくはｒ2＞０．８、さらに好ましくはｒ2＞０．９の関係を満たす塩基をいう。いずれも、リスクアレルのホモ接合体  ＞  リスクアレルと非リスクアレルのへテロ接合体  ＞  非リスクアレルのホモ接合体の順で抗てんかん薬による薬疹リスクが高い。
【００３４】
上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基は、例えば、HapMapデータベース(http://www.hapmap.org/index.html.ja)等を用いて同定することができる。また、複数人（通常は２０−４０人程度）から採取したＤＮＡをシークエンサーにて配列解析し、連鎖不平衡にあるＳＮＰを探索することにより同定することもできる。
【００３５】
上記ＳＮＰの塩基の種類を調べ、得られた結果を上記のような基準に基づいて抗てんかん薬による薬疹リスクと関連付けることにより、抗てんかん薬による薬疹リスクを検査することができる。上記ＳＮＰは単独で解析されてもよいし、上記ＳＮＰの少なくとも１つを含む複数のＳＮＰｓをまとめて解析（ハプロタイプ解析）してもよい。例えば、上記ＳＮＰの複数をまとめて解析してもよいし、上記ＳＮＰの少なくとも１つと、抗てんかん薬による薬疹リスクと関連する他のＳＮＰの少なくとも１つとを組み合わせて解析してもよい。抗てんかん薬による薬疹リスクと関連する複数のＳＮＰｓをまとめて解析すれば、抗てんかん薬による薬疹リスクの検査の精度が向上する。なお、いずれのＳＮＰも、二本鎖ＤＮＡのどちらの鎖を解析してもよい。
【００３６】
また、ヒトの第６染色体短腕２１．３３領域にはＨＬＡ−Ａ遺伝子が含まれる。ＨＬＡ−Ａアレルの遺伝子型はＨＬＡ−Ａ遺伝子座に存在するＳＮＰｓの組み合わせで決定されるため、ＨＬＡ−Ａアレルの遺伝子型を分析することによりヒトの第６染色体短腕２１．３３領域に含まれるＳＮＰｓ、具体的にはＨＬＡ−Ａ遺伝子座に存在するＳＮＰｓを分析することができる。すなわち、本発明の方法の一態様は、ＨＬＡ−Ａアレルの遺伝子型を分析し、該分析結果に基づいて抗てんかん薬による薬疹リスクを検査することを特徴とする、抗てんかん薬による薬疹リスクの判定方法である。
【００３７】
ＨＬＡ−Ａ遺伝子は、ＨＬＡクラスＩ分子の重鎖をコードする遺伝子である。ＨＬＡ−Ａ遺伝子座として、具体的には、GenBank Accession No. NC_000006.11の29910309〜29913661の領域が挙げられる。被験者がＨＬＡ−Ａ*３１０１を有する場合に抗てんかん薬による薬疹リスクが高い。
【００３８】
ＨＬＡ−Ａアレルの遺伝子型を調べ、得られた結果を上記のような基準に基づいて抗てんかん薬による薬疹リスクと関連付けることにより、抗てんかん薬による薬疹リスクを検査することができる。なお、ＨＬＡ−Ａ遺伝子は、二本鎖ＤＮＡのどちらの鎖を解析してもよい。また、抗てんかん薬による薬疹リスクと関連するＳＮＰの少なくとも１つと、ＨＬＡ−Ａアレルの遺伝子型とをまとめて解析してもよい。
【００３９】
ＳＮＰの解析またはＨＬＡ−Ａアレルの解析（以下、総称して多型の解析ともいう）に用いる試料としては、染色体ＤＮＡを含む試料であれば特に制限されないが、例えば、血液、尿等の体液サンプル、口腔粘膜などの細胞、毛髪等の体毛などが挙げられる。多型の解析にはこれらの試料を直接使用することもできるが、これらの試料から染色体ＤＮＡを常法により単離し、これを用いて解析することが好ましい。
【００４０】
多型の解析は、通常の遺伝子多型解析方法によって行うことができる。例えば、シークエンス解析、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、インベーダー法などが挙げられるが、これらに限定されない。なお、ＨＬＡ−Ａアレルを解析する場合には、ＨＬＡ−Ａ*３１０１とそれ以外のＨＬＡ−Ａアレルとを区別できる限り、ＨＬＡ−Ａ遺伝子配列の全体を解析してもよく、ＨＬＡ−Ａ遺伝子配列の一部のみを解析してもよい。
【００４１】
シークエンス解析は通常の方法により行うことができる。具体的には、多型を示す塩基の５’側  数十塩基の位置に設定したプライマーを使用してシークエンス反応を行い、その解析結果から、該当する位置がどの種類の塩基であるかを決定することができる。なお、「多型を示す塩基」とは、例えば、上記ＳＮＰｓ塩基や、ＨＬＡ−Ａアレルの遺伝子型を決定するために用いることのできるＨＬＡ−Ａ遺伝子座中の多型塩基を意味する。ＨＬＡ−Ａアレルの遺伝子型を決定するために用いることのできる多型塩基としては、具体的には、ＨＬＡ−Ａ*３１０１とそれ以外のＨＬＡ−Ａアレルとを区別するために用いることのできる多型塩基が挙げられる。そのような多型塩基としては、より具体的には、ＨＬＡ−Ａ*３１０１と連鎖不平衡の関係にある一塩基多型が挙げられる。ＨＬＡ−Ａ*３１０１と連鎖不平衡の関係にある一塩基多型とは、ＨＬＡ−Ａ*３１０１とｒ2＞０．５、好ましくはｒ2＞０．８、さらに好ましくはｒ2＞０．９の関係を満たす塩基をいう。また、「多型を示す塩基」が存在する部位を「多型部位」ともいう。なお、シークエンス反応の前に、あらかじめ多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲなどによって増幅しておくことが好ましい。
【００４２】
また、多型の解析は、ＰＣＲによる増幅の有無を調べることによって行うことができる。例えば、多型を示す塩基を含む領域に対応する配列を有し、かつ、３’末端が各多型に対応するプライマーをそれぞれ用意する。それぞれのプライマーを使用してＰＣＲを行い、増幅産物の有無によってＳＮＰやＨＬＡ−Ａアレルがどのタイプの多型であるかを決定することができる。また、ＬＡＭＰ法（特許第３３１３３５８号明細書）、ＮＡＳＢＡ法（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification；特許２８４３５８６号明細書）、ＩＣＡＮ法（特開２００２−２３３３７９号公報）などによって増幅の有無を調べることもできる。その他、単鎖増幅法を用いてもよい。
【００４３】
また、多型部位を含むＤＮＡ断片を増幅し、増幅産物の電気泳動における移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することもできる。このような方法としては、例えば、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（single-strand conformation polymorphism）法（Genomics.
1992 Jan 1; 12(1): 139-146.）が挙げられる。具体的には、まず、目的の多型部位を含むＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離し、分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度の違いによってＳＮＰやＨＬＡ−Ａアレルがどのタイプの多型であるかを決定することができる。
【００４４】
さらに、多型を示す塩基が制限酵素認識配列に含まれる場合は、制限酵素による切断の有無によって解析することもできる（ＲＦＬＰ法）。この場合、まず、ＤＮＡ試料を制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片を分離し、検出されたＤＮＡ断片の大きさによってＳＮＰやＨＬＡ−Ａアレルがどのタイプの多型であるかを決定することができる。
【００４５】
また、ハイブリダイゼーションの有無を調べることによって多型の種類を解析することも可能である。すなわち、各塩基に対応するプローブを用意し、いずれのプローブにハイブリダイズするかを調べることによってＳＮＰやＨＬＡ−Ａアレルがどのタイプの多型であるかを調べることもできる。
【００４６】
このようにしてＳＮＰやＨＬＡ−Ａアレルがどのタイプの多型であるかを決定することで、抗てんかん薬による薬疹リスクを検査するためのデータを得ることができる。
【００４７】
＜２＞本発明の検査用試薬
本発明はまた、抗てんかん薬による薬疹リスクを検査するためのプライマーやプローブなどの検査試薬を提供する。このようなプローブとしては、上記多型部位を含み、ハイブリダイズの有無によって多型部位の塩基の種類を判定できるプローブが挙げられる。具体的には、配列番号１〜１２のいずれかにおいて塩基配列の６１番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有する１０塩基以上の長さのプローブや、ＨＬＡ−Ａ遺伝子座中の多型塩基を含む配列を有する１０塩基以上の長さのプローブが挙げられる。プローブの長さは好ましくは、１５〜３５塩基であり、より好ましくは２０〜３５塩基である。なお、ＨＬＡ−Ａ遺伝子座中の多型塩基は、ＨＬＡ−Ａ*３１０１と連鎖不平衡の関係にある一塩基多型が好ましい。
【００４８】
また、プライマーとしては、上記多型部位を増幅するためのＰＣＲに用いることのできるプライマー、又は上記多型部位を配列解析（シークエンシング）するために用いることのできるプライマーが挙げられる。具体的には、配列番号１〜１２のいずれかにおいて塩基配列の６１番目の塩基を含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーや、ＨＬＡ−Ａ遺伝子座中の多型塩基を含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーが挙げられる。このようなプライマーの長さは１０〜５０塩基が好ましく、１５〜３５塩基がより好ましく、２０〜３５塩基がさらに好ましい。なお、ＨＬＡ−Ａ遺伝子座中の多型塩基は、ＨＬＡ−Ａ*３１０１と連鎖不平衡の関係にある一塩基多型が好ましい。
【００４９】
上記多型部位をシークエンシングするためのプライマーとしては、上記塩基の５’側領域、好ましくは３０〜１００塩基上流の配列を有するプライマーや、上記塩基の３’側領域、好ましくは３０〜１００塩基下流の領域に相補的な配列を有するプライマーが例示される。ＰＣＲによる増幅の有無で多型を判定するために用いるプライマーとしては、上記塩基を含む配列を有し、上記塩基を３’側に含むプライマーや、上記塩基を含む配列の相補配列を有し、上記塩基の相補塩基を３’側に含むプライマーなどが例示される。
【００５０】
なお、本発明の検査用試薬はこれらのプライマーやプローブに加えて、ＰＣＲ用のポリメラーゼやバッファー、ハイブリダイゼーション用試薬などを含むものであってもよい。
【実施例】
【００５１】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００５２】
（１）カルバマゼピン（ＣＢＺ）による薬疹リスクと関連するＳＮＰｓの同定
ＣＢＺによる薬疹リスクを決定する遺伝子多型を同定するために、日本人被検者を用いてゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）を行い、得られた結果をもとにＨＬＡ−Ａアレルの遺伝子型解析および追試（replication study）を行った。ＧＷＡＳとは、疾患等の表現型に関わる遺伝子多型を探索する遺伝統計学的手法である。例えば、ヒトゲノム全体を網羅するような数十万〜１００万箇所のＳＮＰｓを用いて、ある疾患の患者（ケース）とその疾患にかかっていない被検者（コントロール）との間で、多型の頻度に差があるかどうかを統計的に検定することで、疾患と関連する遺伝子多型を見出すことができる。
【００５３】
＜被検者＞
ＧＷＡＳおよびＨＬＡ−Ａアレルの遺伝子型解析では、ＣＢＺにより薬疹が誘発される被検者（薬疹被検者（Case））６２名を用いた。６２名中、ＣＢＺによりＤＩＨＳ以外の薬疹が誘発された被検者３３名を、東京大学医科学研究所のBioBank Japan (BBJ) (Nakamura, Y. The BioBank Japan Project. Clin Adv Hematol Oncol 5, 696-7 (2007)) に登録された患者から選択した。３３名の内訳は、スティーブンス・ジョンソン症候群（ＳＪＳ）または中毒性表皮壊死症（ＴＥＮ）が４名、多型性紅斑（ＥＭ）が１６名、播種状紅斑丘疹（ＭＰＥ）が４名、紅斑が２名、紅皮症が１名、固定薬疹が１名、および未分類の薬疹が５名であった。なお、ＳＪＳは体表面の１０％未満の皮膚の剥離により定義され、ＴＥＮは１０％を超える皮膚の剥離により定義される（いずれもブドウ球菌性熱傷様皮膚症候群を除く）。また、６２名中、ＣＢＺによりＤＩＨＳが誘発された被検者２９名を、横浜市立大学附属病院、昭和大学病院、杏林大学医学部附属病院、および愛媛大学医学部附属病院から得た。
【００５４】
また、ＧＷＡＳおよびＨＬＡ−Ａアレルの遺伝子型解析では、対照被検者として以下の２グループを用いた。
【００５５】
第１の対照被検者としては、日本人の一般集団（General population）として、御堂筋ロータリークラブおよびその関連ロータリークラブで募集した８９８名のボランティアを用いた。当該８９８名のボランティアは、てんかん、脳神経障害、癌、およびＣＢＺによる治療のいずれの病歴も有さない。
【００５６】
第２の対照被検者としては、ＣＢＺ耐性対照（CBZ-tolerant control）として、ＣＢＺを投与しても薬疹が誘発されなかった３７６名の被検者をＢＢＪより得た。
【００５７】
追試では、ＣＢＺにより薬疹の誘発された被検者（薬疹被検者）１６名と、ＣＢＺにより薬疹が誘発されなかった被検者（ＣＢＺ耐性被検者）４４名を、横浜市立大学附属病院、昭和大学病院、杏林大学医学部附属病院、および愛媛大学医学部附属病院から得て用いた。
【００５８】
本研究は東京大学医科学研究所のヒトゲノム倫理審査委員会および理化学研究所横浜研究所研究倫理委員会によって承認され、全ての被検者からインフォームドコンセントを得た。
【００５９】
＜統計解析＞
各ＳＮＰまたは各ＨＬＡアレルとＣＢＺにより誘発される薬疹（ＣＢＺ誘発性薬疹）との関連は、フィッシャーの正確確率検定（Fisher's exact test）により評価した。ＧＷＡＳにおいては、関連解析は、allele frequency model、dominant-inheritance model、およびrecessive-inheritance modelを用いて行った。各ＳＮＰｓとＣＢＺ誘発性薬疹との関連は、これら３モデルにおいて算出された最も低いＰ値に基づき評価した。
【００６０】
＜ＧＷＡＳ＞
薬疹被検者５５名、および一般集団被検者８９８名の遺伝子型は、HumanHap550v3 Genotyping BeadChip（Illumina社）を用いて解析した。関連解析には、上記被検者の内、主成分分析（ＰＣＡ）により外れ値であると判断された薬疹被検者１名および一般集団被検者１６名を除外し、さらにクオリティコントロールにより薬疹被検者１名を除外し、残る薬疹被検者５３名および一般集団被検者８８２名のデータを採用した。遺伝子型を解析した５５４４９６個のＳＮＰｓ中、常染色体に存在し、且つクオリティコントロールを通過した４４４８２３個のＳＮＰｓについて関連解析を行った。
【００６１】
ＧＷＡＳの結果、多重検定におけるボンフェローニ補正後のＰ＜１．１２×１０-7（＝０．０５／４４４８２３）を満たしてＣＢＺ誘発性薬疹と有意に関連する１２個のＳＮＰｓが同定された（表１）。これらＳＮＰｓの内、rs1633021が最も低いＰ値を示し、ＣＢＺ誘発性薬疹と最も強く関連することが明らかとなった（Ｐ＝１．１８×１０-13）。なお、この結果の検証のため、rs1633021についてmultiplex-PCR invader assay（Third Wave Technologies）（Ohnishi, Y. et al. J Hum Genet 46, 471-7 (2001)）を行い、ＧＷＡＳの結果と１００％一致することを確認した。
【００６２】
【表１】
0005899527.tif 000002
薬疹被検者５３名および一般集団被検者８８２名による関連解析の結果
ＭＡＦ：マイナーアレル頻度
Ｃｈｒ：染色体
【００６３】
これら１２個のＳＮＰｓは、いずれも第６染色体短腕２１．３３領域（６ｐ２１．３３領域）上の約４６３ｋｂの領域に位置していた。そこで、一般集団被検者８８２名を用いて、当該領域の連鎖不平衡（linkage disequilibrium；ＬＤ）マップを作成した（図１）。その結果、１２個のＳＮＰｓの内、１１個のＳＮＰｓが２９．８４〜３０．２７Ｍｂの単一のＬＤブロック上に位置することが明らかとなった。また、残る１つのＳＮＰ（rs1362088）も、当該ＬＤブロックの近傍に位置していた。当該領域は、ＨＬＡ−Ａ遺伝子座を含むＭＨＣ  Ｉ領域に相当する。
【００６４】
＜ＨＬＡ−Ａアレルの遺伝子型解析＞
ＨＬＡ−Ａ遺伝子座近傍に位置するＳＮＰｓにＣＢＺ誘発性薬疹との関連が認められたことから、次に、ＨＬＡ−Ａアレルの遺伝子型解析を行った。薬疹被検者としては、主成分分析（ＰＣＡ）により外れ値であると判断された薬疹被検者１名を除いた上記５４名に７名を追加した６１名を用いた。対照被検者としては、３７６名のＣＢＺ耐性被検者を用いた。
【００６５】
結果を表２に示す。表２中、「＊」は多重検定におけるボンフェローニ補正後のＰ＜２．６３×１０-3（＝０．０５／１９）を満たしてＣＢＺ誘発性薬疹と有意に関連することを示す。
【００６６】
【表２】
0005899527.tif 000003
【００６７】
ＨＬＡ−Ａ*３１０１アレルの頻度は、ＣＢＺ耐性被検者と比較して薬疹被検者において有意に高く（Ｐ＝３．６４×１０-15）、ＣＢＺ薬疹被検者では６０．７％であったが、ＣＢＺ耐性被検者ではわずか１２．５％であった。これは、ＨＬＡ−Ａ*３１０１アレルが、日本人におけるＣＢＺ誘発性薬疹の予測因子として６０．７％の感度と８７．５％の特異性を有することを示す。ここで、ＣＢＺ誘発性薬疹の発症率が２．９％とすると、陽性的中率は１２．７％、陰性的中率は９８．７％と算出される。すなわち、ＨＬＡ−Ａ*３１０１陽性と判定された患者をＣＢＺ治療から除外することで、ＣＢＺ誘発性薬疹の頻度を２．９％から１．１％に低減することができる。
【００６８】
てんかんや三叉神経痛に対するＣＢＺの代替薬としては、例えばフェニトインやバルプロ酸等の薬疹発症率の低い薬剤が利用できる。これら代替薬は、治療効果ではＣＢＺに劣るが、しばしば命にかかわる薬疹の発症を防げるという点では、患者にとってＣＢＺよりも好ましい選択となりうる。よって、ＨＬＡ−Ａ*３１０１のタイピングによりＣＢＺによる薬疹リスクを予測することは、てんかんや三叉神経痛等の疾病に対する個々の治療方針を決定する上で極めて有用である。
【００６９】
また、ＨＬＡ−Ａ*０２０６アレルの頻度も、ＣＢＺ耐性被検者と比較して薬疹被検者において有意に高かった（Ｐ＝２．４６×１０-4）。
【００７０】
＜追試＞
ＨＬＡ−Ａ*３１０１アレルおよびＨＬＡ−Ａ*０２０６アレルと、ＣＢＺ誘発性薬疹との有意な関連を検証するため、独立した集団を用いて追試（replication study）を行った。被検者としては、薬疹被検者１６名およびＣＢＺ耐性被検者４４名を用いた。
【００７１】
結果を表３に示す。表３中、「＊」は多重検定におけるボンフェローニ補正後のＰ＜２．５０×１０-2（＝０．０５／２）を満たしてＣＢＺ誘発性薬疹と有意に関連することを示す。
【００７２】
【表３】
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ＣＩ：信頼区間（Confidence Interval）
【００７３】
ＨＬＡ−Ａ*３１０１アレルは、Ｐ＝１．５３×１０-2（１次試験と追試を組み合わせた解析ではＰ＝１．０９×１０-16）を示し、ＣＢＺ誘発性薬疹との関連が再現された。一方、ＨＬＡ−Ａ*０２０６アレルとＣＢＺ誘発性薬疹との関連は再現されなかった。
【００７４】
＜ＨＬＡ−Ａ*３１０１アレルと各種薬疹との関連解析＞
さらに、これまでの試験に用いた被検者を合わせて、ＨＬＡ−Ａ*３１０１アレルと各種薬疹との関連を解析した。その結果、ＨＬＡ−Ａ*３１０１アレルは、ＤＩＨＳ（Ｐ＝２．０６×１０-9）、ＳＪＳ／ＴＥＮ（Ｐ＝２．３５×１０-4）、およびその他の薬疹（Ｐ＝４．７４×１０-8）とそれぞれ有意に関連した（表４）。
【００７５】
【表４】
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「＊」は多重検定におけるボンフェローニ補正後の有意性の閾値を満たしてＣＢＺ誘発性薬疹と有意に関連することを示す。
ｃＡＤＲｓ：薬物による皮膚障害（cutaneous adverse drug reactions）
ＳＩＳ／ＴＥＮ：スティーブンス・ジョンソン症候群（Stevens-Johnson syndrome）／中毒性表皮壊死症（toxic epidermal necrolysis）
ＤＩＨＳ：薬剤性過敏症症候群（Drug-induced hypersensitivity syndrome）
ＣＩ：信頼区間（Confidence Interval）
【００７６】
ＨＬＡ−Ａ遺伝子はＨＬＡクラスＩの重鎖をコードし、ＨＬＡクラスＩ分子は抗原ペプチドを提示することで免疫系の中心的役割を担う。したがって、ＣＢＺ誘発性薬疹と関連するＳＮＰｓは、ＨＬＡ−Ａの抗原に対する結合親和性の差異を反映しており、薬疹発症の際の免疫応答に影響していると考えられる。
【００７７】
なお、本実施例のＧＷＡＳではＨＬＡ−Ｂ遺伝子座とＣＢＺ誘発性薬疹との関連は見出されなかったが、ＨＬＡ−Ｂ*１５０２アレルは台湾人でＣＢＺにより誘発されるＳＪＳ／ＴＥＮと強く関連することが知られている。そこで、薬疹被検者６１名およびＣＢＺ耐性被検者３７６名を用いてＨＬＡ−Ｂアレルの遺伝子型を解析したが、ＨＬＡ−Ｂ*１５０２アレルは薬疹被検者のいずれにも見出されず、また、いずれのＨＬＡ−ＢアレルもＣＢＺ誘発性薬疹との関連は認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
以上の通り、ＣＢＺ誘発性薬疹と関連する１２個のＳＮＰｓが見出され、また、ＨＬＡ−Ａ*３１０１アレルがＣＢＺ誘発性薬疹と関連することが明らかとなった。よって、ＨＬＡ−Ａ*３１０１アレルおよびこれらＳＮＰｓは、ＣＢＺ等の抗てんかん薬による薬疹リスクの検査に有用である。したがって、本発明は、抗てんかん薬の投与の可否を決定するのに有効であり、抗てんかん薬による薬物治療に貢献するものである。
【図１】
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【配列表】
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