(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体と、重金属にキレート可能なキレート剤との混合液を調製し、前記混合液中で、前記検体中の重金属と前記キレート剤との錯体を形成させる錯体形成工程、および、
前記錯体の回収により、前記検体中の重金属を回収する重金属回収工程を含み、
前記錯体形成工程において、チオール基のマスキング剤の存在下、前記混合液中で前記錯体を形成し、
前記キレート剤が硫黄含有基を含むキレート剤であり、前記硫黄含有基がチオケトン基であることを特徴とする重金属の回収方法。
【請求項２】
前記錯体形成工程が、前記検体に、前記キレート剤および前記マスキング剤を添加する工程を含む、請求項１記載の回収方法。
【請求項３】
前記錯体形成工程が、前記検体に、前記マスキング剤を添加した後、前記キレート剤を添加する工程を含む、請求項１記載の回収方法。
【請求項４】
前記マスキング剤が、下記構造式（１）〜（３）からなる群から選択された少なくとも一つの構造式で表わされる、請求項１から３のいずれか一項に記載の回収方法。
【化１】
0005899085.tif 000017
前記構造式（１）〜（３）において、Ｒは、水素、アルキル基、フェニル基またはベンジル基を表し、前記構造式（２）および（３）において、Ｘは、ハロゲンを表す。
【請求項５】
前記構造式（１）のマスキング剤が、マレイミド、Ｎ−メチルマレイミドまたはＮ−エチルマレイミドであり、前記構造式（２）のマスキング剤が、ヨードアセトアミドであり、前記構造式（３）のマスキング剤が、ヨード酢酸である、請求項４記載の回収方法。
【請求項６】
前記キレート剤が、１，５−ジフェニル−３−チオカルバゾンである、請求項１から５のいずれか一項に記載の回収方法。
【請求項７】
前記検体が、生体由来の検体である、請求項１から６のいずれか一項に記載の回収方法。
【請求項８】
前記重金属が、Ｂｉ、Ｈｇ、Ｃｄ、Ｐｄ、Ｚｎ、Ｔｌ、ＡｇおよびＰｂからなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１から７のいずれか一項に記載の回収方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載の回収方法により、検体から重金属を回収する重金属回収工程、および、
前記重金属を分析する分析工程を含むことを特徴とする、重金属の分析方法。
【請求項１０】
重金属にキレート可能なキレート剤およびチオール基のマスキング剤を含み、
前記キレート剤が硫黄含有基を含むキレート剤であり、前記硫黄含有基がチオケトン基であることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の回収方法に使用する重金属回収用試薬。
【請求項１１】
前記マスキング剤が、下記構造式（１）〜（３）からなる群から選択された少なくとも一つの構造式で表わされる、請求項１０記載の試薬。
【化２】
0005899085.tif 000018
前記構造式（１）〜（３）において、Ｒは、水素、アルキル基、フェニル基またはベンジル基を表し、前記構造式（２）および（３）において、Ｘは、ハロゲンを表す。
【請求項１２】
前記構造式（１）のマスキング剤が、マレイミド、Ｎ−メチルマレイミドまたはＮ−エチルマレイミドであり、前記構造式（２）のマスキング剤が、ヨードアセトアミドであり、前記構造式（３）のマスキング剤が、ヨード酢酸である、請求項１１記載の試薬。
【請求項１３】
前記キレート剤が、１，５−ジフェニル−３−チオカルバゾンである、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項１４】
請求項１から８のいずれか一項に記載の重金属の回収方法に供する検体の前処理方法であって、
前記検体に、チオール基のマスキング剤を添加することを特徴とする、検体の前処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、重金属の回収方法、およびそれに使用する重金属回収用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
水銀、カドミウム、鉛等の重金属は、人体に蓄積され、健康に悪影響を及ぼすことが知られている。このため、尿等の生体試料、水等の飲食品試料における重金属を分析することが重要である。
【０００３】
重金属の分析は、一般に、前処理として、試料から夾雑物を除去して、重金属を分離し、前記分離した重金属について分析が行われる。前記前処理は、溶媒抽出が汎用されている。前記溶媒抽出は、重金属と結合するキレート剤の極性を利用し、水性媒体および有機媒体に対する分配係数の違いから、試料中の重金属を前記有機媒体中に抽出する方法である。抽出後、前記有機媒体を蒸発させることで、さらに、前記重金属を濃縮できる。具体例として、酸性条件の水性媒体中で不溶性である１，５−ジフェニル−３−チオカルバゾン（以下、「ジチゾン」ともいう）を前記キレート剤として使用するジチゾン法が、例えば、ＪＩＳによって規定されている（非特許文献１、特許文献１参照）。前記ジチゾン法は、まず、酸性条件下で、前記ジチゾンと前記尿等の液体検体とを混合して、前記混合液中で、前記ジチゾンと前記液体検体中の重金属との錯体を形成させる。ついで、前記混合液に、四塩化炭素またはクロロホルム等の有機媒体を添加する。すると、前記錯体は、水性媒体と有機媒体とに対して分配係数が異なるため、前記有機媒体中に抽出される。この有機媒体を回収することで、前記錯体として、前記液体検体から重金属を回収できる。また、前記有機媒体を蒸発させれば、さらに重金属を濃縮できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第２９６９２２６号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】水銀分析マニュアル  環境省  平成１６年３月
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、このような方法で重金属を回収した場合、同じ条件下の処理であるにもかかわらず、検体間で回収率にばらつきがあるという問題が、本発明者によって明らかとなった。検体間で回収率にばらつきがあるということは、回収重金属を定量した場合に、定量結果の信頼性が不十分となるおそれがある。
【０００７】
そこで、本発明は、検体間における重金属回収率のばらつきを抑制する、重金属の回収方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明の重金属の回収方法は、検体と、重金属にキレート可能なキレート剤との混合液を調製し、前記混合液中で、前記検体中の重金属と前記キレート剤との錯体を形成させる錯体形成工程、および、前記錯体の回収により、前記検体中の重金属を回収する重金属回収工程を含み、前記錯体形成工程において、チオール基のマスキング剤の存在下、前記混合液中で前記錯体を形成することを特徴とする。
【０００９】
本発明の重金属の分析方法は、前記本発明の重金属の回収方法により、検体から重金属を回収する重金属回収工程、および、前記重金属を分析する分析工程を含むことを特徴とする。
【００１０】
本発明の重金属回収用試薬は、重金属にキレート可能なキレート剤およびチオール基のマスキング剤を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、前記マスキング剤の存在下、前記検体中の重金属と前記キレート剤との錯体を形成することによって、前述のような、検体間の回収率のばらつきを抑制できる。また、回収率が低い検体に関しては、例えば、回収率を向上させることも可能である。このため、より信頼性に優れた重金属の分析を行うことが可能である。このため、本発明は、例えば、生体由来の検体に対する臨床検査、環境試験等において、極めて有用である。
【００１２】
本発明者は、検体からの重金属の回収について、検体間での回収率のばらつきの原因を解明するため、鋭意研究を行った。その結果、本発明者は、検体の中でも、特に、生体内に蓄積した重金属を排出するデトックス療法をうけている患者由来の検体について、回収率のばらつきが顕著であり、また、低回収率であるとの知見を得た。前記デトックス療法は、一般に、生体の重金属を排出するため、キレート剤を投与する方法であり、前記キレート剤として、例えば、メソ−２，３−ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）等が使用されている。そこで、本発明者は、前記ＤＭＳＡはチオール基を有するため、前記検体由来のＤＭＳＡのチオール基が、検体中の重金属に対して、外部から添加するジチゾンと競合し、その結果、検体中の重金属が十分にジチゾンと錯体を形成することができず、回収率が低下すると推測した。そこで、ジチゾン等のキレート剤と前記重金属との錯体を形成するにあたって、実際に、チオール基のマスキング剤を併用したところ、検体間の回収率のばらつきを抑制し、回収率を向上することを実現するに到った。
【００１３】
本発明は、前述のような前記デトックス療法をうけている患者由来の検体のみならず、健常者由来の検体についても適用できる。生体、食品および環境等に由来する検体には、例えば、アミノ酸であるシステイン等、チオール基含有化合物が多く存在するため、これらによっても、前記ＤＭＳＡと同様の影響が生じると考えられる。このため、前記マスキング剤を使用することによって、ＤＭＳＡと同様の理由から、これらのチオール含有化合物が原因となりうる、検体間の回収率のばらつきも、抑制可能と解される。なお、本発明は、これらの推定には、何ら制限されない。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜重金属の回収方法＞
本発明の重金属の回収方法は、前述のとおり、検体と、重金属にキレート可能なキレート剤との混合液を調製し、前記混合液中で、前記検体中の重金属と前記キレート剤との錯体を形成させる錯体形成工程、および、前記錯体の回収により、前記検体中の重金属を回収する重金属回収工程を含み、前記錯体形成工程において、チオール基のマスキング剤の存在下、前記混合液中で前記錯体を形成することを特徴とする。
【００１５】
本発明は、前記マスキング剤の存在下、前記混合液中で、前記検体中の重金属と前記キレート剤との錯体を形成することが特徴であり、その他の構成および条件は、何ら制限されない。
【００１６】
本発明の回収方法において、回収目的の重金属は、特に制限されない。前記重金属は、例えば、Ｂｉ（ビスマス）、Ｈｇ（水銀）、Ｃｄ（カドミウム）、Ｐｄ（パラジウム）、Ｚｎ（亜鉛）、Ｔｌ（タリウム）、Ａｇ（銀）、Ｐｂ（鉛）等があげられる。検体中の前記重金属の形態は、特に制限されず、例えば、重金属の単体でもよいし、重金属の合金でもよいし、重金属含有化合物でもよい。前記重金属含有化合物は、例えば、重金属を含む有機化合物でもよいし、重金属を含む無機化合物でもよい。前記重金属がＨｇの場合、例えば、有機水銀でもよいし、無機水銀でもよい。本発明の回収方法において、回収目的の重金属は、例えば、一種類でもよいし、二種類以上でもよい。本発明の回収方法は、例えば、前記検体から、一回の回収処理で、二種類以上の重金属を同時に回収することもできる。
【００１７】
本発明の回収方法において、前記検体は、特に制限されない。前記検体は、例えば、生体由来の検体、環境由来の検体、化学物質、医薬品等があげられる。前記化学物質は、例えば、試薬、農薬または化粧品等があげられる。前記生体由来の検体は、特に制限されず、尿、血液、毛髪、臍帯等があげられる。前記血液検体は、例えば、赤血球、全血、血清、血漿等があげられる。これらの中でも、尿検体が好ましい。前記環境由来の検体は、特に制限されず、例えば、生物、食品、水、土壌、大気・空気等があげられる。前記生物検体は、例えば、魚介類等の動物または植物等があげられる。前記食品検体は、例えば、生鮮食品または加工食品等があげられる。前記水検体は、例えば、飲料水、地下水、河川水、海水、生活排水等があげられる。
【００１８】
前記検体は、例えば、取り扱いが容易であることから、液状の検体（液体検体）が好ましい。前記検体は、例えば、未希釈液をそのまま液体検体として使用してもよいし、媒体に、懸濁、分散または溶解した希釈液を液体検体として使用してもよい。前記検体が固体の場合、例えば、前記媒体に懸濁、分散または溶解した希釈液を液体検体として使用してもよい。前記媒体を、以下、希釈媒体という。前記希釈媒体は、特に制限されず、例えば、水、緩衝液等があげられる。前記緩衝液は、特に制限されず、例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、各種のグッド緩衝液等があげられる。前記緩衝液の濃度は、特に制限されず、例えば、１０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００１９】
本発明において、「マスキング」は、ＳＨ基の反応性を不活性にすることを意味し、例えば、ＳＨ基の化学修飾により行うことができる。前記マスキング剤は、特に制限されず、例えば、公知のものが使用でき、いわゆるＳＨ阻害剤も含まれる。前記化学修飾は、特に制限されず、例えば、アルキル化、活性二重結合への付加、アリル化、ジスルフィドとの交換反応、酸化、シアン化、メルカプチド化等があげられる。
【００２０】
前記マスキング剤は、例えば、下記構造式（１）〜（３）からなる群から選択された少なくとも一つの構造式で表わされる化合物が使用できる。下記構造式（１）〜（３）で表わされる化合物は、例えば、いずれか一種類を使用してもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【００２１】
【化１】
0005899085.tif 000002
【００２２】
前記構造式（１）において、Ｒは、水素、アルキル基、フェニル基またはベンジル基を表す。前記構造式（２）において、Ｒは、水素、アルキル基、フェニル基またはベンジル基を表し、Ｘは、ハロゲンを表す。前記構造式（３）において、Ｒは、水素、アルキル基、フェニル基またはベンジル基を表し、Ｘは、ハロゲンを表す。
【００２３】
前記アルキル基は、特に制限されず、例えば、直鎖状もしくは分枝状のアルキル基、または芳香族アルキル基があげられる。前記アルキル基の炭素数は、例えば、１〜７であり、好ましくは、１〜６であり、より好ましくは、１〜２であり、さらに好ましくは、２である。前記直鎖状または分枝状のアルキル基は、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ぺンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル等があげられる。前記アルキル基は、例えば、水素が、置換されてもよいし、未置換でもよい。
【００２４】
前記フェニル基、ベンジル基は、例えば、水素が、置換されてもよいし、未置換でもよい。前記ハロゲンは、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等があげられる。
【００２５】
前記構造式（１）で表わされるマスキング剤は、例えば、マレイミド、Ｎ−メチルマレイミド、Ｎ−エチルマレイミド、Ｎ−フェニルマレイミド、マレイミドプロピオン酸等があげられ、好ましくは、Ｎ−エチルマレイミドである。前記構造式（１）で表わされる化合物は、例えば、いずれか一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【００２６】
前記構造式（２）で表わされるマスキング剤は、例えば、ヨードアセトアミド等のハロゲンアセトアミド等があげられ、好ましくは、ヨードアセトアミドである。前記構造式（２）で表わされる化合物は、例えば、いずれか一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【００２７】
前記構造式（３）で表わされるマスキング剤は、例えば、ハロゲン酢酸等のヨード酢酸等があげられ、好ましくは、ヨード酢酸である。前記構造式（３）で表わされる化合物は、例えば、いずれか一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【００２８】
本発明の回収方法において、前記キレート剤は、例えば、硫黄含有基を含むキレート剤であることが好ましい。前記硫黄含有基は、硫黄原子を含む官能基である。前記硫黄含有基は、例えば、チオケトン基が好ましい。前記チオケトン基は、特に制限されず、例えば、チオカルバゾン基、チオセミカルバゾン基、チオカルバジアゾン基、チオ尿素基、チオセミカルバジド基およびルベアメート基があげられる。
【化２】
0005899085.tif 000003
【００２９】
前記キレート剤は、例えば、下記構造式（４）で表されるキレート剤が好ましい。
【００３０】
【化３】
0005899085.tif 000004
【００３１】
前記構造式（４）において、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ、フェニル基を表す。すなわち、前記構造式（４）で表されるキレート剤は、チオカルバゾン基を含むキレート剤であり、１，５−ジフェニル−３−チオカルバゾン（ジチゾン）である。前記構造式（４）は、例えば、塩でもよい。
【００３２】
前記フェニル基は、例えば、水素が、置換されてもよい。置換される場合、前記水素は、例えば、ハロゲン、ナトリウムおよびカリウム等のアルカリ金属等に置換されてもよい。
【００３３】
本発明の回収方法において、前記キレート剤は、前述のように、硫黄含有基を含むキレート剤が好ましい。前記硫黄含有基は、例えば、チオケトン基があげられ、前記チオケトン基を含むキレート剤は、例えば、チオカルバゾン基、チオセミカルバゾン基、チオカルバジアゾン基、チオ尿素基、チオセミカルバジド基およびルベアメート基からなる群から選択された少なくとも一つの基を含むキレート剤があげられる。前記キレート剤の具体例としては、例えば、以下のようなものが例示できる。本発明において、これらのキレート剤は、例示であって、本発明はこれらの記載に何ら制限されない。
（ａ１）  チオカルバゾン基を含むキレート剤
例えば、１，５−ジ（２−ナフチル）チオカルバゾン
（ａ２）  チオセミカルバゾン基を含むキレート剤
例えば、アセトンチオセミカルバゾン、アセトフェノンチオセミカルバゾン
（ａ３）チオカルバジアゾン基を含むキレート剤
例えば、ジフェニルチオカルバジアゾン
（ａ４）チオ尿素基を含むキレート剤
例えば、１−アセチル−２−チオ尿素、グアニルチオ尿素、１，３−ビス（ジメチルアミノプロピル）−２−チオ尿素、テトラメチルチオ尿素、Ｎ，Ｎ’−ジエチルチオ尿素、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルチオ尿素、Ｎ，Ｎ’−ジブチルチオ尿素、１，３−ビス（ジメチルアミノプロピル）−２−チオ尿素、Ｎ−アリル−Ｎ’−（２−ヒドロキシエチル）チオ尿素、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）チオ尿素、ジアセチルチオ尿素、フェニルチオ尿素、Ｎ，Ｎ’−ジフェニルチオ尿素、モノ−ｏ−トリルチオ尿素、Ｎ，Ｎ’−ジ−ｏ−トリルチオ尿素、ベンゾイルチオ尿素
（ａ５）  チオセミカルバジド基を含むキレート剤
例えば、フェニルチオセミカルバジド、４−フェニルチオセミカルバジド、４−メチルチオセミカルバジド、チオセミカルバジド
（ａ６）  ルベアメート基を含むキレート剤
例えば、ジチオオキサミド（ルベアン酸）
【００３４】
前記錯体形成工程において、前記検体、前記キレート剤および前記マスキング剤の添加順序は、特に制限されない。具体例として、例えば、前記検体に、前記マスキング剤を添加した後、さらに前記キレート剤を添加してもよいし、前記検体に、前記マスキング剤および前記キレート剤を同時に添加してもよい。
【００３５】
前記混合液における前記検体の濃度は、特に制限されず、例えば、０．１〜１００μｇ／Ｌの範囲である。前記混合液において、未希釈の検体の濃度が、前記範囲であることが好ましい。
【００３６】
前記混合液における前記マスキング剤の濃度は、特に制限されず、例えば、５〜３０ｍｇ／ｍＬの範囲であり、好ましくは、１０〜２０ｍｇ／ｍＬの範囲である。
【００３７】
前記混合液において、前記マスキング剤と前記検体との混合割合は、特に制限されず、例えば、前記検体１ｍＬに対して、前記マスキング剤５〜３０ｍｇの範囲が好ましく、より好ましくは、１０〜２０ｍｇの範囲である。
【００３８】
前記混合液における前記キレート剤の濃度は、特に制限されず、例えば、０．１〜０．３ｍｇ／ｍＬの範囲である。
【００３９】
前記混合液において、前記キレート剤と前記検体との混合割合は、特に制限されず、例えば、前記検体１ｍＬに対して、前記キレート剤０．１〜０．３ｍｇの範囲が好ましい。
【００４０】
前記重金属回収工程は、特に制限されず、前記錯体を回収すればよい。前記重金属は、例えば、前記錯体として回収されてもよいし、さらに、回収した前記錯体から遊離させ、単体の重金属として回収してもよい。
【００４１】
以下に、本発明の回収方法について、例をあげて説明するが、本発明は、これらの実施形態には制限されない。
【００４２】
（１）第１実施形態  第１実施形態の回収方法は、前記キレート剤として前記構造式（４）で表わされるキレート剤を使用し、水性溶媒により重金属を回収する例である。
【００４３】
本実施形態の回収方法は、前記錯体形成工程が、下記（１Ａ）工程を含み、前記重金属回収工程が、下記（１Ｂ）工程および下記（１Ｃ）工程を含む。
（１Ａ）前記キレート剤が水性溶媒に不溶化可能なｐＨ条件下で、前記検体と前記キレート剤との混合液を調製し、前記マスキング剤の存在下、前記混合液中で、前記検体中の重金属と前記キレート剤との錯体を形成する錯体形成工程
（１Ｂ）前記混合液から前記錯体を回収する錯体回収工程
（１Ｃ）アルカリ性条件下で、回収した前記錯体を水性媒体に溶解して、重金属を回収する錯体溶解工程
【００４４】
本実施形態によれば、ｐＨ条件の違いによる、水性媒体に対する前記キレート剤の溶解性の差異を利用することにより、実質的に有機媒体を使用することなく、簡便に重金属を回収できる。また、本実施形態によれば、重金属の回収率および重金属の濃縮率を向上できる。
【００４５】
（１Ａ）錯体形成工程
前記錯体形成工程は、前記キレート剤が水性溶媒に不溶化可能なｐＨ条件下で、前記検体と前記キレート剤との混合液を調製し、前記マスキング剤の存在下、前記混合液中で、前記検体中の重金属と前記キレート剤との錯体を形成する。以下、「前記キレート剤が水性媒体に不溶化可能な前記ｐＨ条件」を、「不溶化ｐＨ条件」ともいう。
【００４６】
前記キレート剤は、前記不溶化ｐＨ条件下において、前記混合液に非溶解の状態を維持できる。このため、前記検体中に重金属が存在する場合、前記混合液において、前記キレート剤と前記検体中の重金属とが錯体を形成する。前記キレート剤は、前記混合液において、例えば、全てが溶解していない状態であることが好ましいが、一部の前記キレート剤が溶解した状態でもよい。後者の場合、例えば、一部のキレート剤が溶解しても、前記重金属と錯体を形成可能な量のキレート剤が、溶解しない状態で前記混合液中に存在していればよい。
【００４７】
前記錯体形成工程において、前記不溶化ｐＨ条件は、特に制限されない。前記不溶化ｐＨ条件は、例えば、酸性条件（ｐＨ５以下）、中性条件（ｐＨ６〜７）、アルカリ性条件（ｐＨ７を超え８以下）があげられる。前記不溶化ｐＨ条件は、その上限が、例えば、ｐＨ８であり、好ましくはｐＨ６．８、より好ましくはｐＨ４、さらに好ましくはｐＨ３、特に好ましくはｐＨ２である。前記不溶化ｐＨ条件の下限は、特に制限されず、例えば、ｐＨ１が好ましい。前記不溶化ｐＨ条件は、例えば、使用する前記キレート剤の種類に応じて適宜設定できる。
【００４８】
前記キレート剤と前記検体とを含む前記混合液は、実質的に水性媒体であればよい。前記水性媒体は、非有機媒体であり、いわゆる水性の液体を意味する。「実質的に水性媒体である」は、例えば、完全な水性媒体の他に、微量の有機媒体（いわゆる、有機溶媒）を含む水性媒体でもよいことを意味する。
【００４９】
前記検体と混合する際、前記キレート剤の形状は、特に制限されず、例えば、乾燥状態（または固体状態ともいう）でもよいし、液体状態でもよい。後者の場合、前記キレート剤は、前記キレート剤が溶解しない非有機媒体に分散されている、前記キレート剤の分散液であることが好ましい。以下、前記キレート剤を分散させる前記非有機媒体を、「分散媒」という。前記分散媒は、例えば、前記不溶化ｐＨ条件の非有機媒体（水性媒体）である。前記不溶化ｐＨ条件が酸性条件の場合、前記分散媒は、例えば、酸およびその水溶液、前記酸性条件の緩衝液があげられる。前記不溶化ｐＨ条件がアルカリ性条件の場合、例えば、アルカリおよびその水溶液、前記アルカリ性条件の緩衝液があげられる。前記不溶化ｐＨ条件が中性条件の場合、前記分散媒は、例えば、水、中性の水溶液、前記中性条件の緩衝液、その他に、前述した、酸およびその水溶液、前記酸性条件の緩衝液、アルカリおよびその水溶液、前記アルカリ性条件の緩衝液等があげられる。
【００５０】
前記酸は、特に制限されず、例えば、塩酸、硫酸、酢酸、ホウ酸、リン酸、クエン酸等があげられる。前記酸の水溶液は、例えば、酸を水または緩衝液で希釈したものがあげられる。酸の希釈に使用する前記緩衝液は、特に制限されず、前述のような一般的な緩衝液が使用できる。前記酸の水溶液において、前記酸の濃度は、特に制限されず、例えば、０を越え１Ｎ以下であり、好ましくは０．０１〜０．１Ｎである。前記酸性条件の緩衝液は、特に制限されず、例えば、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、グッドバッファー等があげられる。前記緩衝液の濃度は、特に制限されず、例えば、１０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００５１】
前記中性の水溶液は、特に制限されず、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等があげられる。前記中性条件の緩衝液は、特に制限されない。前記緩衝液の濃度は、特に制限されず、例えば、１０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００５２】
前記アルカリは、特に制限されず、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等があげられる。前記アルカリ性の水溶液は、例えば、アルカリを水または緩衝液で希釈したものがあげられる。前記アルカリの希釈に使用する前記緩衝液は、特に制限されず、前述の一般的な緩衝液が使用できる。前記アルカリ性の水溶液において、前記アルカリの濃度は、特に制限されず、例えば、０を超え７×１０−３Ｎ以下である。前記アルカリ性条件の緩衝液は、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＮａＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、炭酸バッファー、グッドバッファー等があげられる。前記緩衝液の濃度は、特に制限されず、例えば、１０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００５３】
前記検体と前記キレート剤の混合方法は、特に制限されない。前記検体と前記キレート剤は、例えば、下記（ｘ）〜（ｚ）等の混合方法が例示できる。
（ｘ）予め前記不溶化ｐＨ条件に調節した前記検体と、前記キレート剤とを混合
（ｙ）予め前記不溶化ｐＨ条件に調節した前記キレート剤と、前記検体とを混合
（ｚ）前記不溶化ｐＨ条件の非有機媒体と、前記キレート剤および前記検体とを混合
【００５４】
前記（ｘ）〜（ｚ）において、前記マスキング剤は、例えば、予め前記キレート剤と混合してもよいし、予め前記検体と混合してもよいし、予め前記非有機媒体と混合してもよい。前記マスキング剤は、例えば、前記不溶化ｐＨ条件に調節前の前記検体および前記キレート剤のいずれかに混合してもよいし、前記不溶化ｐＨ条件に調節後の前記検体および前記キレート剤のいずれかに混合してもよい。
【００５５】
前記（ｘ）では、例えば、前記不溶化ｐＨ条件に調節した前記検体と、前記キレート剤とを混合することによって、前記不溶化ｐＨ条件の前記混合液が調製でき、前記混合液において、前記錯体を形成できる。この際、例えば、前記キレート剤との混合により調製される前記混合液が、前記不溶化ｐＨ条件となるように、前記検体のｐＨを調節する。
【００５６】
前記不溶化ｐＨ条件が酸性条件の場合、例えば、前記検体を前記酸性条件に調節する方法は、特に制限されない。前記調節は、例えば、前記検体に、酸性試薬を添加することにより行える。前記酸性試薬は、例えば、酸およびその水溶液、前記酸性条件の緩衝液等があげられる。前記酸は、特に制限されず、例えば、塩酸、硫酸、クエン酸、ホウ酸、リン酸、酢酸等があげられる。前記酸の水溶液は、例えば、酸を水または緩衝液で希釈したものがあげられる。酸の希釈に使用する前記緩衝液は、特に制限されず、前述のような一般的な緩衝液が使用できる。前記酸の水溶液において、前記酸の濃度は、特に制限されず、例えば、０．０１〜５Ｎである。前記酸性条件の緩衝液は、特に制限されず、例えば、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、グッドバッファー等があげられる。前記緩衝液の濃度は、特に制限されず、例えば、１０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００５７】
前記不溶化ｐＨ条件がアルカリ性条件の場合、例えば、前記検体を前記アルカリ性条件に調節する方法は、特に制限されない。前記調節は、例えば、前記検体に、アルカリ性試薬を添加することにより行える。前記アルカリ性試薬は、例えば、前述したような、アルカリおよびその水溶液、前記アルカリ性条件の緩衝液等があげられる。
【００５８】
前記不溶化ｐＨ条件が中性条件の場合、例えば、前記検体を前記中性条件に調節する方法は、特に制限されない。前記検体の本来のｐＨ条件に応じて、例えば、前記酸性試薬、アルカリ性試薬、または、中性試薬を添加することにより行える。前記中性試薬は、例えば、前述したような、水、中性の水溶液、前記中性条件の緩衝液があげられる。
【００５９】
前記（ｙ）では、例えば、前記検体と、前記不溶化ｐＨ条件に調節した前記キレート剤とを混合することによって、前記不溶化ｐＨ条件の前記混合液が調製でき、前記混合液において、前記錯体を形成できる。この際、例えば、前記検体との混合により調製される前記混合液が、前記不溶化ｐＨ条件となるように、前記キレート剤のｐＨを調節する。
【００６０】
前記キレート剤を前記不溶化ｐＨ条件に調節する方法は、特に制限されない。具体例としては、乾燥状態の前記キレート剤を、前記キレート剤が溶解しない非有機媒体に分散することで、前記不溶化ｐＨ条件に調節された、前記キレート剤の分散液が得られる。前記キレート剤を分散させる前記非有機媒体は、例えば、前述した分散媒が使用でき、前記酸性試薬、前記アルカリ性試薬、前記中性試薬等と同様である。
【００６１】
前記乾燥状態の前記キレート剤は、例えば、非有機媒体への分散性に優れることから、凍結乾燥品または減圧乾燥品が好ましい。これらの乾燥品の製造方法は、特に制限されず、例えば、前記キレート剤を有機媒体に混合した後、凍結乾燥または減圧乾燥することによって得られる。前記有機媒体は、特に制限されず、例えば、ｔ−ブチルアルコール、２−プロパノール等が使用できる。
【００６２】
前記（ｚ）では、例えば、前記不溶化ｐＨ条件の非有機媒体と、前記キレート剤および前記検体とを混合することによって、前記不溶化ｐＨ条件の前記混合液が調製でき、前記混合液において、前記錯体を形成できる。この際、例えば、前記キレート剤および前記検体との混合により調製される前記混合液が前記不溶化ｐＨ条件となるように、前記非有機媒体のｐＨを調節する。
【００６３】
前記不溶化ｐＨ条件の非有機媒体は、例えば、前述した前記酸性試薬、前記アルカリ性試薬または前記中性試薬等が使用できる。
【００６４】
前記キレート剤および前記検体の混合方法は、特に制限されず、例えば、転倒混和、振動、超音波等の従来の方法があげられる。
【００６５】
前記混合液には、前記キレート剤、前記検体および前記マスキング剤の他に、その他の成分が含まれてもよい。前記他の成分は、特に制限されず、例えば、酸化剤、還元剤等があげられる。前記酸化剤は、例えば、前記キレート剤と前記重金属との錯体形成反応の反応性の向上に使用できる。前記還元剤は、例えば、前記混合液中に過剰量の酸化剤が含まれている場合に、前記過剰量の酸化剤の消去に使用できる。
【００６６】
前記錯体形成の処理条件は、特に制限されず、処理温度は、例えば、室温であり、処理時間は、例えば、３０秒〜１０分である。
【００６７】
（１Ｂ）錯体回収工程
前記錯体回収工程は、前記錯体形成工程において形成された錯体を、前記混合液から回収する。
【００６８】
前述のように、前記不溶化ｐＨ条件下において、前記キレート剤は、非溶解の状態を維持できる。このため、前記キレート剤と前記重金属との錯体も、非溶解の状態で、前記混合液に存在する。そこで、この錯体回収工程において、前記混合液に存在する非溶解の前記錯体を回収する。なお、前記マスキング剤は、前記混合液の液体画分に存在するため、この錯体回収工程において除去できる。
【００６９】
前記錯体の回収方法は、特に制限されず、例えば、固体と液体とを分離する公知の方法が採用できる。前記回収方法は、例えば、遠心分離処理、ろ過処理、沈殿処理、膜分離処理、吸着処理、凍結乾燥処理等の処理方法があげられる。前記回収の処理条件は、特に制限されず、例えば、錯体の種類や量に応じて適宜設定できる。前記遠心分離処理によって前記錯体の回収を行う場合、例えば、遠心加速度：１９，６００〜２９，４００ｍ／ｓ２（２，０００〜３，０００×ｇ）の範囲、温度：４℃〜室温の範囲、時間：１〜１０分の範囲の条件があげられる。前記遠心分離後、例えば、上清を除去することで、前記錯体を回収できる。前記ろ過処理によって前記錯体の回収を行う場合、例えば、使用するフィルターは、特に制限されず、ろ紙、粉末ろ紙、メンブレンフィルター等があげられる。前記ろ過処理後、前記フィルターを通過しない画分を、前記錯体として回収できる。
【００７０】
（１Ｃ）錯体溶解工程
前記錯体溶解工程は、アルカリ性条件下で、前記回収した錯体を水性媒体に溶解して、重金属を回収する。
【００７１】
前記キレート剤は、前記アルカリ性条件下において溶解する。このため、アルカリ性条件下で、前記回収した錯体を水性媒体に混合することによって、前記キレート剤を、前記錯体の状態で前記水性媒体に溶解できる。前記錯体が溶解された前記水性媒体を、錯体水溶液ともいう。前記錯体は、前記水性媒体において、例えば、全てが溶解していることが好ましいが、一部の前記錯体が非溶解の状態で残存してもよい。前記非溶解の錯体は、例えば、検出限界以下であることが好ましい。
【００７２】
前記錯体溶解工程において、前記アルカリ性条件は、特に制限されない。前記アルカリ性条件の下限は、例えば、ｐＨ９が好ましく、より好ましくはｐＨ１１である。前記アルカリ性条件の上限は、特に制限されず、例えば、ｐＨ１２が好ましい。前記アルカリ性条件は、例えば、使用する前記キレート剤の種類によって適宜設定できる。なお、前記錯体形成工程の不溶化ｐＨ条件がアルカリ性条件の場合、前記錯体溶解工程における前記アルカリ性条件は、前者よりも高いｐＨであることが好ましい。
【００７３】
前記錯体の溶解方法は、特に制限されない。例えば、予め前記アルカリ性条件に調節した前記水性媒体を前記錯体に添加して、前記錯体を溶解させてもよいし、前記水性媒体に前記錯体を添加した後、前記混合液を前記アルカリ性条件に調節して、前記錯体を溶解させてもよい。
【００７４】
前記アルカリ性条件の調節方法は、特に制限されない。前記調節は、例えば、アルカリ性試薬が使用できる。前記アルカリ性試薬は、例えば、アルカリおよびその水溶液、前記アルカリ性条件の緩衝液等があげられる。前記アルカリは、特に制限されず、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等があげられる。前記アルカリの水溶液は、例えば、アルカリを水または緩衝液で希釈したものがあげられる。前記アルカリの希釈に使用する前記緩衝液は、特に制限されず、前述の一般的な緩衝液が使用できる。前記アルカリの水溶液において、前記アルカリの濃度は、特に制限されず、例えば、０．１〜１Ｎである。前記アルカリ性条件の緩衝液は、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＮａＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、炭酸バッファー、グッドバッファー等があげられる。前記緩衝液の濃度は、特に制限されず、例えば、１０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００７５】
前記錯体および前記水性媒体の混合方法は、特に制限されず、例えば、転倒混和、振動、超音波等の従来の方法があげられる。
【００７６】
前記錯体に対する前記水性媒体の添加量は、特に制限されない。前記水性媒体の添加量は、例えば、回収された前記錯体を溶解できる量を添加することが好ましい。また、前記水性媒体の添加量は、例えば、前記検体の液量より少量であることが好ましい。これによって、例えば、使用した前記検体よりも高い濃度の重金属含有液を得ることができる。すなわち、前記検体よりも重金属が濃縮された重金属含有液を得ることができる。前記水性媒体の添加量は、前記検体の液量に対して、例えば、１／２〜１／１００の範囲であり、好ましくは１／１０〜１／５０の範囲であり、より好ましくは１／５０である。
【００７７】
本実施形態において、前記重金属回収工程は、前記錯体を水性媒体に溶解した後、さらに、前記錯体における前記キレート剤を分解する工程を含んでもよい。このように前記キレート剤を分解することにより、前記錯体から前記重金属を単体で回収できる。前記キレート剤の分解方法は、特に制限されず、例えば、灰化等の公知の方法があげられる。前記灰化は、例えば、湿式灰化または乾式灰化があげられる。前記湿式灰化は、例えば、水銀分析マニュアル（環境省、平成１６年３月）に従って行える。
【００７８】
以下に、本実施形態について、前記不溶化ｐＨ条件を酸性条件とし、前記キレート剤として前記ジチゾンを使用し、前記検体として尿検体を使用し、重金属である水銀を回収する方法を、例にあげて説明する。これらは一例であり、本発明を制限するものではない。
【００７９】
まず、前記尿検体に前記マスキング剤を添加して、検体混合液を調製する。
【００８０】
前記尿検体の量は、特に制限されず、例えば、１〜１００ｍＬの範囲であり、好ましくは１〜２０ｍＬの範囲であり、より好ましくは５〜１０ｍＬの範囲である。前記マスキング剤は、前記尿検体１ｍＬあたり、例えば、前述の濃度となるように添加する。
【００８１】
前記検体混合液は、例えば、所定時間放置してもよい。前記処理温度は、例えば、室温であり、処理時間は、例えば、３０秒〜１０分である。
【００８２】
つぎに、前記検体混合液のｐＨを、前記酸性試薬の添加により、前記酸性条件に調節する。前記酸性試薬の添加量は、特に制限されず、前記尿検体１ｍＬあたり、例えば、１〜１０μＬの範囲である。前記酸性試薬は、例えば、塩酸水溶液が好ましく、その規定は、例えば、１〜８Ｎの範囲である。
【００８３】
チューブに、凍結乾燥品のジチゾンを入れ、さらに、前記ｐＨ調節後の前記検体混合液を添加する。前記ジチゾンは、前記尿検体１ｍＬあたり、例えば、０．１〜０．３ｍｇであり、好ましくは０．３ｍｇである。この際、前記ジチゾンを添加した前記混合液のｐＨは、例えば、１〜４であり、好ましくは１〜２である。
【００８４】
調製した前記混合液を所定時間放置して、前記ジチゾンと前記尿検体中の水銀との錯体を形成させる。前記処理温度は、例えば、室温であり、処理時間は、例えば、３０秒〜１０分である。
【００８５】
つぎに、前記混合液を遠心分離に供し、錯体を含む沈殿物と上清とに分離する。前記上清を除去し、前記チューブ内の前記錯体に、アルカリ性試薬を添加する。そして、前記錯体を前記アルカリ性試薬に溶解させる。
【００８６】
前記アルカリ性試薬の添加量は、特に制限されず、前記尿検体１ｍＬあたり、例えば、１０〜２００μＬの範囲であり、好ましくは２０〜１００μＬの範囲であり、より好ましくは２０μＬである。前記アルカリ性試薬のｐＨは、例えば、９〜１２であり、好ましくは１１〜１２である。前記アルカリ性試薬は、例えば、水酸化ナトリウム水溶液が好ましく、その規定は、例えば、０．１〜１Ｎの範囲であり、好ましくは０．４Ｎである。
【００８７】
このようにして、錯体の状態で水性媒体に溶解した水銀を回収できる。また、前記錯体に、例えば、湿式灰化等を施すことによって、前記錯体における前記ジチゾンを分解させ、水銀のみを回収することもできる。なお、一例として、水銀の回収を記載したが、本発明は、これには限定されない。
【００８８】
（２）第２実施形態
第２実施形態の回収方法は、前記キレート剤として前記構造式（４）で表わされるキレート剤および下記構造式（５）で表わされるキレート剤を使用し、水性媒体により重金属を回収する例である。本実施形態は、特に示さない限り、前記第１実施形態の記載を援用できる。
【００８９】
本実施形態において、前記構造式（４）で表わされるキレート剤を、第１キレート剤、下記構造式（５）で表わされるキレート剤を、第２キレート剤という。
【００９０】
【化４】
0005899085.tif 000005
【００９１】
前記構造式（５）で表わされる第２キレート剤は、メソ−２，３−ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）である。以下、前記第２キレート剤を、ＤＭＳＡともいう。
【００９２】
本実施形態の回収方法は、前記錯体形成工程が、下記（２Ａ）工程を含み、前記重金属回収工程が、下記（２Ｂ）〜（２Ｄ）工程を含む。
（２Ａ）前記検体と前記第１キレート剤との混合液を調製し、前記マスキング剤の存在下、前記混合液中で、前記第１キレート剤と前記検体中の重金属との第１錯体を形成させる第１錯体形成工程であり、前記第１キレート剤が水性媒体に不溶化可能なｐＨ条件下で、前記混合液を調製する工程
（２Ｂ）前記混合液から前記第１錯体を回収する第１錯体回収工程
（２Ｃ）前記第１錯体と、前記第２キレート剤の水溶液との混合液を調製し、前記混合液中で、前記第１錯体由来の重金属と前記第２キレート剤との第２錯体を形成させる第２錯体形成工程であり、前記第２キレート剤の水溶液が、前記第１キレート剤が不溶化可能なｐＨ条件である工程
（２Ｄ）前記混合液から、前記第２錯体が溶解した液体画分を回収することで、重金属を回収する第２錯体回収工程
【００９３】
（２Ａ）第１錯体形成工程
前記第１錯体形成工程は、前記第１キレート剤と検体との混合液を調製し、前記マスキング剤の存在下、前記混合液中で、前記第１キレート剤と前記検体中の重金属との第１錯体を形成する工程である。前記第１錯体形成工程において、前記混合液は、前記第１キレート剤が水性媒体に不溶化可能なｐＨ条件下で調製する。以下、「前記第１キレート剤が水性媒体に不溶化可能な前記ｐＨ条件」を、「第１ｐＨ条件」ともいう。前記第１ｐＨ条件は、前記第１実施形態における「不溶化ｐＨ条件」であり、本実施形態において、前記第１実施形態の記載を援用できる。
【００９４】
前記第１錯体形成工程（２Ａ）は、前記第１実施形態における前記（１Ａ）工程であり、本実施形態において、前記第１実施形態の記載を援用できる。
【００９５】
（２Ｂ）第１錯体回収工程
前記第１錯体回収工程は、前記第１錯体形成工程において形成された第１錯体を、前記混合液から回収する。
【００９６】
前記第１錯体回収工程（２Ｂ）は、前記第１実施形態における前記（１Ｂ）工程であり、本実施形態において、前記第１実施形態の記載を援用できる。
【００９７】
（２Ｃ）第２錯体形成工程
前記第２錯体形成工程は、前記第１錯体と、前記第２キレート剤の水溶液との混合液を調製し、前記混合液中で、前記第１錯体由来の重金属と前記第２キレート剤との第２錯体を形成する工程である。前記第２錯体形成工程において、前記第２キレート剤の水溶液は、前記第１キレート剤が不溶化可能なｐＨ条件である。以下、「前記第１キレート剤が不溶化可能なｐＨ条件」を、「第２ｐＨ条件」ともいう。
【００９８】
前記混合液において、前記第２キレート剤は、溶解した状態であり、前記第１錯体は、非溶解の状態を維持できる。そして、前記混合液において、前記第１錯体と前記第２キレート剤とが存在すると、メカニズムは不明であるが、前記第１錯体を形成する前記重金属の全部または一部が、前記第１錯体から解離して、前記第２キレート剤と結合し、前記第２キレート剤と前記重金属との前記第２錯体が形成される。
【００９９】
前記第２ｐＨ条件は、例えば、水性媒体に対して、前記第２キレート剤が可溶化可能であり、且つ、前記第１キレート剤が不溶化可能なｐＨ条件である。前記第２錯体形成工程において、前記第２キレート剤水溶液のｐＨ条件と、前記水溶液と前記第１錯体との混合液のｐＨ条件は、ともに、前記第２ｐＨ条件であることが好ましい。
【０１００】
前記第２ｐＨ条件は、例えば、非アルカリ性条件があげられ、具体的には、酸性条件（ｐＨ２〜３）、弱酸性条件（ｐＨ４〜５）、中性条件（ｐＨ６〜７）があげられる。前記第２ｐＨ条件の上限は、特に制限されず、例えば、ｐＨ６．８であり、好ましくはｐＨ６であり、より好ましくはｐＨ４である。前記第２ｐＨ条件の下限は、特に制限されず、例えば、ｐＨ２であり、好ましくはｐＨ３であり、より好ましくはｐＨ４である。前記第２ｐＨ条件は、例えば、前記第１キレート剤および前記第２キレート剤の種類等により適宜設定できる。
【０１０１】
前記第２キレート剤水溶液は、例えば、水性媒体に前記第２キレート剤が溶解していればよい。前記第２キレート剤は、前記水溶液において、例えば、全てが溶解している状態であることが好ましいが、一部が溶解した状態でもよい。後者の場合、前記第２キレート剤は、例えば、前記第１錯体由来の前記金属と錯体を形成可能な量が、前記水溶液に存在していればよい。
【０１０２】
前記第２キレート剤水溶液は、例えば、水性媒体を前記第２ｐＨ条件に調整した後、前記第２キレート剤を溶解して調製してもよいし、水性媒体に前記第２ｐＨを添加した後、この混合液のｐＨを前記第２ｐＨ条件に調整して、前記第２キレート剤を溶解して調製してもよい。
【０１０３】
前者の場合、前記第２キレート剤であるＤＭＳＡは、強酸性であることから、前記第２キレート剤を溶解する前記水性媒体は、例えば、前記アルカリ性試薬が好ましい。前記アルカリ性試薬に前記第２キレート剤を溶解することで、前記第２ｐＨ条件、好ましくは前記非アルカリ性条件の前記水溶液を調製できる。前記アルカリ性試薬のｐＨは、特に制限されず、下限が、例えば、８であり、好ましくは９であり、より好ましくは１０であり、上限が、例えば、１２であり、好ましくは１１である。前記アルカリ性試薬は、特に制限されず、例えば、前記アルカリ性水溶液が好ましく、より好ましくはアルカリ性緩衝液である。前記アルカリ性水溶液は、例えば、リン酸３ナトリウム水溶液等があげられる。前記アルカリ性緩衝液は、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッドバッファー等があげられる。前記水溶液および前記緩衝液の濃度は、特に制限されず、例えば、１０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは１００ｍｍｏｌ／Ｌである。
【０１０４】
後者の場合、前記水性媒体は、特に制限されず、例えば、水、水溶液、緩衝液等が使用できる。そして、例えば、前記水性媒体と前記第２キレート剤とを混合した後、前記第２ｐＨ条件に調整すればよい。前記調整方法は、特に制限されず、例えば、前記酸性試薬、前記アルカリ性試薬、前記中性試薬等を適宜使用できる。
【０１０５】
前記第２キレート剤水溶液における前記第２キレート剤の濃度は、特に制限されず、例えば、５〜２０ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは１０〜２０ｍｇ／ｍＬである。
【０１０６】
前記第１錯体および前記第２キレート剤水溶液の混合方法は、特に制限されず、例えば、転倒混和、振動、超音波等の従来の方法があげられる。
【０１０７】
前記混合液において、前記第２キレート剤水溶液の添加量は、特に制限されない。前記第１錯体形成工程で使用した前記検体１ｍＬあたり、例えば、１０〜２００μＬが好ましく、より好ましくは２０〜１００μＬであり、より好ましくは２０μＬである。また、前記混合液において、前記第１錯体と前記第２キレート剤との添加割合は、特に制限されない。前記第１錯体形成工程で使用する前記第１キレート剤と、前記第２錯体形成工程で使用する前記第２キレート剤との割合（重量比）が、例えば、１：０．３〜1：４０であり、好ましくは１：７〜1：４０であり、より好ましくは１：１０〜1：４０である。
【０１０８】
前記第１錯体に対する前記第２キレート剤水溶液の添加量は、特に制限されない。前記第２キレート剤水溶液の添加量は、例えば、使用した前記検体の液量より少量であることが好ましい。これによって、例えば、使用した前記検体よりも高い濃度の重金属含有液を得ることができる。すなわち、前記検体よりも重金属が濃縮された重金属含有液を得ることができる。前記第２キレート剤水溶液の添加量は、前記検体の液量に対して、例えば、１／２〜１／１００の範囲であり、好ましくは１／１０〜１／５０の範囲であり、より好ましくは１／５０である。
【０１０９】
前記混合液には、前記第１錯体および前記第２キレート剤水溶液の他に、その他の成分が含まれてもよい。前記他の成分は、特に制限されず、例えば、前述のような、酸化剤、還元剤等があげられる。
【０１１０】
前記第２錯体形成の処理条件は、特に制限されず、処理温度は、例えば、室温であり、処理時間は、例えば、３０秒〜１０分である。
【０１１１】
（２Ｄ）第２錯体回収工程
前記第２錯体回収工程は、前記混合液から、前記第２錯体形成工程において形成された第２錯体が溶解した液体画分を回収することで、重金属を回収する。
【０１１２】
前述のように、前記第２ｐＨ条件下において、前記第２キレート剤は、前記混合液に溶解した状態であるため、前記第２キレート剤と前記重金属との第２錯体も、溶解した状態で前記混合液に存在する。他方、前記第１キレート剤は、前記混合液に不溶化可能な状態であるため、非溶解状態で前記混合液に存在する。そこで、この第２錯体回収工程において、前記第２錯体が溶解した液体画分を回収することで、前記重金属を回収する。前記第２錯体は、前記混合液において、全てが溶解していることが好ましいが、一部の前記第２錯体が非溶解の状態でもよい。前記非溶解の第２錯体は、例えば、検出限界以下であることが好ましい。
【０１１３】
前記液体画分の回収方法は、特に制限されず、例えば、固体と液体とを分離する公知の方法が採用できる。前記回収方法は、例えば、前記第１実施形態の（１Ｂ）工程における回収方法の例示を援用できる。例えば、前記フィルターを用いたろ過処理の場合、前記ろ過処理後、前記フィルターを通過した画分を、前記液体画分として回収できる。
【０１１４】
本実施形態において、前記重金属回収工程が、前記液体画分を回収した後、さらに、前記第２錯体における前記第２キレート剤を分解する工程を含んでもよい。このように前記第２キレート剤を分解することにより、前記第２錯体から前記重金属を単体で回収できる。前記第２キレート剤の分解方法は、特に制限されず、例えば、灰化等の公知の方法があげられ、前記第１実施形態の記載を援用できる。
【０１１５】
以下に、本実施形態について、前記第１ｐＨ条件を酸性条件とし、前記第２ｐＨ条件を弱酸性〜中性条件とし、前記第１キレート剤として前記ジチゾン、前記第２キレート剤として前記ＤＭＳＡ、前記検体として尿検体を使用し、重金属である水銀を回収する方法を、例にあげて説明する。これらは一例であり、本発明を制限するものではない。
【０１１６】
前記第１実施形態と同様にして、前記尿検体へのマスキング剤の添加、得られた検体混合液のｐＨ調節、前記ｐＨ調節後の検体混合液へのジチゾンの添加、ジチゾンと検体中の水銀との錯体の形成を行う。
【０１１７】
そして、前記第１実施形態と同様にして、前記混合液を遠心分離に供し、第１錯体を含む沈殿物と上清とに分離する。前記上清を除去し、前記チューブ内の前記第１錯体に、前記ＤＭＳＡ水溶液を添加する。これによって、前記第１錯体と前記ＤＭＳＡ水溶液の混合液において、前記第２錯体を形成させる。
【０１１８】
前記ＤＭＳＡ水溶液は、例えば、前記ＤＭＳＡを、アルカリ性水溶液に溶解して調製できる。前記アルカリ性水溶液は、例えば、リン酸３ナトリウム水溶液が好ましく、濃度は、例えば、１０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌであり、ｐＨは、例えば、９〜１２である。前記ＤＭＳＡ水溶液において、前記ＤＭＳＡ濃度は、例えば、５〜２０ｍｇ／ｍＬである。前記ＤＭＳＡ溶液のｐＨは、例えば、２〜６の範囲であり、好ましくは４〜６の範囲であり、より好ましくは４である。
【０１１９】
前記第１錯体に対する前記ＤＭＳＡ水溶液の添加量は、特に制限されず、前記尿検体１ｍＬあたり、例えば、１０〜２００μＬの範囲であり、好ましくは２０〜１００μＬの範囲であり、より好ましくは２０μＬである。前記第１錯体と前記ＤＭＳＡ溶液との混合液のｐＨは、例えば、２〜６の範囲であり、好ましくは４〜６の範囲であり、より好ましくは４である。
【０１２０】
つぎに、前記混合液を遠心分離に供し、前記第２錯体が溶解した上清と沈殿とに分離し、前記上清を回収する。
【０１２１】
このようにして、前記第２錯体の状態で液体画分に溶解した水銀を回収できる。また、前記第２錯体に、例えば、湿式灰化等を施すことによって、前記第２錯体における前記ＤＭＳＡを分解させ、水銀のみを回収することもできる。なお、一例として、水銀の回収を記載したが、本発明は、これには限定されない。
【０１２２】
（３）第３実施形態
第３実施形態は、第２キレート剤として、下記構造式（６）で表わされるキレート剤を使用し、水性媒体により重金属を回収する例である。本実施形態は、特に示さない限り、前記第２実施形態の記載を援用できる。
【化５】
0005899085.tif 000006
【０１２３】
前記構造式（６）において、
Ｒ３は、炭素数１または２のアルキル基またはアミノアルキル基を表し、または、Ｒ３を有さず、
Ｙは、
【化６】
0005899085.tif 000007
を表わす。
【０１２４】
前記第２キレート剤は、例えば、下記構造式（６−１）で表わされるチオプロニン（Ｎ−（２−メルカプトプロピオニル)グリシン）、下記構造式（６−２）で表わされるＤＭＰＳ（１，２−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸ナトリウム）、下記構造式（６−３）で表わされるシステイン（２−アミノ−３−スルファニルプロピオン酸）等があげられる。前記第２キレート剤は、例えば、前記構造式（６）を有する化合物の水和物でもよい。また、前記第２キレート剤は、その互変異性体または立体異性体でもよい。前記異性体は、例えば、幾何異性体、配座異性体等があげられる。前記第２キレート剤は、例えば、市販品を用いてもよい。前記チオプロニンは、例えば、関東化学（株）、東京化成工業（株）、和光純薬工業（株）等、前記ＤＭＰＳは、例えば、和光純薬工業（株）等、前記システインは、例えば、ナカライテスク（株）をはじめ複数社から入手できる。前記第２キレート剤は、一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【０１２５】
【化７】
0005899085.tif 000008
【０１２６】
本実施形態の回収方法は、前記構造式（６）で表わす第２キレート剤を使用する以外、特に示さない限り、前記第２実施形態の記載を援用でき、具体的には、前記（２Ａ）〜（２Ｄ）工程と同様にして行うことができる。
【０１２７】
前記（２Ｃ）工程の第２錯体形成工程において、前記第１錯体と、前記第２キレート剤の水溶液との混合液を調製し、前記混合液中で、前記第１錯体由来の重金属と前記第２キレート剤との第２錯体を形成する。
【０１２８】
前記（２Ｃ）工程において、第２ｐＨ条件は、例えば、水性媒体に対して、前記第２キレート剤が可溶化可能であり、且つ、前記第１錯体が不溶化可能なｐＨ条件である。前記第２錯体形成工程において、前記第２キレート剤水溶液のｐＨ条件と、前記水溶液と前記第１錯体との混合液のｐＨ条件は、ともに、前記第２ｐＨ条件であることが好ましい。前記混合液は、前記第１キレート剤が溶解しなければ、いかなるｐＨであってもよい。
【０１２９】
前記第２ｐＨ条件は、例えば、非アルカリ性条件があげられ、具体的には、酸性条件（ｐＨ１〜３）、弱酸性条件（ｐＨ４〜５）、中性条件（ｐＨ６〜７）があげられる。前記第２ｐＨ条件の上限は、特に制限されず、例えば、ｐＨ６．８であり、好ましくはｐＨ６であり、より好ましくはｐＨ４である。前記第２ｐＨ条件の下限は、特に制限されず、例えば、ｐＨ４であり、好ましくはｐＨ３であり、より好ましくはｐＨ２であり、さらに好ましくはｐＨ１である。前記第２ｐＨ条件は、例えば、前記第１キレート剤および前記第２キレート剤の種類等により適宜設定できる。
【０１３０】
前記第２キレート剤水溶液は、例えば、水性媒体に前記第２キレート剤が溶解していればよい。前記第２キレート剤は、前記水溶液において、例えば、全てが溶解している状態であることが好ましいが、一部が溶解した状態でもよい。後者の場合、前記第２キレート剤は、例えば、前記第１錯体由来の前記金属と錯体を形成可能な量が、前記水溶液に存在していればよい。
【０１３１】
前記第２キレート剤水溶液は、例えば、水性媒体を前記第２ｐＨ条件に調整した後、前記第２キレート剤を溶解して調製してもよいし、水性媒体に前記第２キレート剤を添加した後、この混合液のｐＨを前記第２ｐＨ条件に調整して、前記第２キレート剤を溶解して調製してもよい。
【０１３２】
前者の場合、前記第２キレート剤を溶解する前記水性媒体は、特に制限されず、例えば、水、水溶液、緩衝液等が使用できる。そして、例えば、前記水性媒体を前記第２ｐＨ条件に調整した後、前記第２キレート剤を溶解すればよい。前記調整方法は、特に制限されず、例えば、前記酸性試薬、前記アルカリ性試薬、前記中性試薬等を適宜使用できる。
【０１３３】
後者の場合、前記水性媒体は、特に制限されず、例えば、水、水溶液、緩衝液等が使用できる。そして、例えば、前記水性媒体と前記第２キレート剤とを混合した後、前記第２ｐＨ条件に調整すればよい。前記調整方法は、特に制限されず、例えば、前記酸性試薬、前記アルカリ性試薬、前記中性試薬等を適宜使用できる。
【０１３４】
前記第２キレート剤水溶液における前記第２キレート剤の濃度は、特に制限されず、例えば、１５〜３００ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは７５〜１５０ｍｇ／ｍＬである。本実施形態において、前記第２キレート剤は、特に溶解性に優れることから、前記チオプロニン、前記ＤＭＰＳ、前記システインが好ましい。例えば、前記第２キレート剤水溶液における前記第２キレート剤の濃度が高い程、前記第１錯体由来の重金属と前記第２キレート剤とでより多くの第２錯体を形成でき、重金属の回収率を向上できる。
【０１３５】
以下に、本実施形態について、前記第１ｐＨ条件を酸性条件とし、前記第２ｐＨ条件を弱酸性〜中性条件とし、前記第１キレート剤として前記ジチゾン、前記第２キレート剤として前記ＤＭＰＳ、前記検体として尿検体を使用し、重金属である水銀を回収する方法を、例にあげて説明する。これらは一例であり、本発明を制限するものではない。
【０１３６】
前記第１実施形態と同様にして、前記尿検体へのマスキング剤の添加、得られた検体混合液のｐＨ調節、前記ｐＨ調節後の検体混合液へのジチゾンの添加、ジチゾンと検体中の水銀との錯体の形成を行う。
【０１３７】
そして、前記第１実施形態と同様にして、前記混合液を遠心分離に供し、第１錯体を含む沈殿物と上清とに分離する。前記上清を除去し、前記チューブ内の前記第１錯体に、前記ＤＭＰＳ水溶液を添加する。これによって、前記第１錯体と前記ＤＭＰＳ水溶液の混合液において、前記第２錯体を形成させる。
【０１３８】
前記ＤＭＰＳ水溶液は、例えば、前記ＤＭＰＳを、媒体に溶解して調製できる。前記媒体は、例えば、リン酸３ナトリウム水溶液、硝酸、酢酸、リン酸、クエン酸、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等があげられ、濃度は、例えば、１０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである。前記媒体のｐＨは、特に制限されず、ジチゾンが溶解しない範囲であればよい。前記ＤＭＰＳ水溶液において、前記ＤＭＰＳ濃度は、例えば、５〜２０ｍｇ／ｍＬである。前記ＤＭＰＳ溶液のｐＨは、例えば、２〜６の範囲であり、好ましくは４〜６の範囲であり、より好ましくは４である。
【０１３９】
前記第１錯体に対する前記ＤＭＰＳ水溶液の添加量は、特に制限されず、前記尿検体１ｍＬあたり、例えば、１０〜２００μＬの範囲であり、好ましくは２０〜１００μＬの範囲であり、より好ましくは２０μＬである。前記第１錯体と前記ＤＭＰＳ水溶液との混合液のｐＨは、例えば、２〜６の範囲であり、好ましくは１〜３の範囲であり、より好ましくは１である。
【０１４０】
つぎに、前記混合液を遠心分離に供し、前記第２錯体が溶解した上清と沈殿とに分離し、前記上清を回収する。
【０１４１】
このようにして、前記第２錯体の状態で液体画分に溶解した水銀を回収できる。また、前記第２錯体に、例えば、湿式灰化等を施すことによって、前記第２錯体における前記ＤＭＰＳを分解させ、水銀のみを回収することもできる。なお、一例として、水銀の回収を記載したが、本発明は、これには限定されない。また、本例では、前記第２キレート剤として前記ＤＭＰＳを用いた場合を例にとったが、例えば、前記第２キレート剤として前記チオプロニン、システイン等を用いた場合にも、本例と同様にして重金属を回収できる。
【０１４２】
（４）その他の実施形態
本発明の回収方法において、前記重金属回収工程は、例えば、前記各実施形態における水性媒体を用いた回収の他、前記錯体を、有機媒体で抽出する方法であってもよい。この場合、例えば、前記重金属回収工程は、日本工業規格（ＪＩＳ）Ｋ０１０１およびＫ０１０２等で指定されているジチゾン法（比色法）および原子吸光法に準じて行ってもよい。
【０１４３】
＜重金属の分析方法＞
本発明の重金属の分析方法は、前述のように、前記本発明の回収方法により、検体から重金属を回収する重金属回収工程、および、前記重金属を分析する分析工程を含むことを特徴とする。前記重金属回収工程は、前記本発明の回収方法を引用できる。
【０１４４】
前記分析工程は、特に制限されず、例えば、分析目的の重金属の種類等に応じて、適宜選択できる。前記重金属の分析は、例えば、光学的測定、ＧＣ−ＥＣＤ（ガスクロマトグラフ−電子捕獲型検出器）、電気化学的測定（例えば、ストリッピングボルタンメトリ等）等により行える。前記光学的測定による分析は、例えば、光学分析機器等を用いて、吸光度、透過率、反射率等を測定することにより行える。前記光学分析機器は、例えば、原子吸光光度計、可視光吸光度計等があげられる。前記重金属の分析は、例えば、定性でもよいし、定量でもよい。
【０１４５】
本発明の分析方法は、例えば、さらに、測定値の補正工程を含んでもよい。前記補正工程は、例えば、分析結果の測定値を、測定値と検体中の重金属濃度との相関関係により、補正できる。前記相関関係は、例えば、重金属濃度が既知である標準検体について、前記本発明の回収方法によりサンプルを回収し、前記サンプルの測定値と、前記標準検体の重金属濃度とをプロットすることにより求めることができる。前記標準検体は、重金属の希釈系列が好ましい。このように補正を行うことによって、より信頼性の高い定量が可能となる。
【０１４６】
前記重金属の分析は、例えば、前述のような錯体として分析してもよいし、前記錯体から前記重金属を単離して、前記重金属単体として分析してもよい。後者の場合、前記重金属回収工程は、前述のように、前記錯体における前記キレート剤を分解する工程、すなわち、前記錯体から前記重金属を単離する工程を含むことが好ましい。
【０１４７】
＜重金属回収用試薬＞
本発明の重金属回収用試薬は、前述のように、前記本発明の回収方法に使用する試薬であって、前述のように、重金属にキレート可能なキレート剤およびチオール基のマスキング剤を含むことを特徴とする。本発明の重金属回収用試薬は、前記キレート剤と前記マスキング剤を含むことが特徴であって、その他の構成および条件は、特に制限されない。前記キレート剤および前記マスキング剤は、例えば、前記本発明の回収方法を援用できる。
【０１４８】
＜重金属回収用キット＞
本発明の重金属回収用キットは、前記本発明の回収方法に使用するキットであって、重金属にキレート可能なキレート剤およびチオール基のマスキング剤を含むことを特徴とする。本発明の重金属回収用キットは、前記キレート剤と前記マスキング剤を含むことが特徴であって、その他の構成および条件は、特に制限されない。前記キレート剤および前記マスキング剤は、例えば、前記本発明の回収方法を援用できる。前記キレート剤および前記マスキング剤は、例えば、それぞれ別個の容器に収容されてもよいし、同一の容器に混合または未混同で収容されてもよい。
【０１４９】
前記重金属回収用キットは、前記キレート剤および前記マスキング剤の他に、例えば、その他の試薬を含んでもよい。前記その他の試薬は、特に制限されず、例えば、前述した酸化剤、還元剤等があげられる。
【０１５０】
＜検体の前処理方法＞
本発明の検体の前処理方法は、前記本発明の回収方法に供する検体の前処理方法であって、検体中の重金属と、重金属にキレート可能なキレート剤との錯体形成に先立って、前記検体に、チオール基のマスキング剤を添加することを特徴とする。本発明の前処理方法は、前記本発明の回収方法における前記錯体形成工程の記載を援用できる。
【０１５１】
本発明の重金属の分析方法は、前述の態様の他に、以下に示す第２の方法があげられる。本発明の第２の分析方法は、検体と、重金属にキレート可能なキレート剤との混合液を調製し、前記混合液中で、前記検体中の重金属と前記キレート剤との錯体を形成させる錯体形成工程、および、前記錯体の検出により前記重金属を分析する分析工程を含み、前記錯体形成工程において、チオール基のマスキング剤の存在下、前記混合液中で前記錯体を形成することを特徴とする。
【０１５２】
前記キレート剤は、例えば、前記重金属と錯体を形成した状態で検出可能であり、前記重金属と錯体を形成していない状態で検出不可なキレート剤が使用できる。このキレート剤によれば、例えば、前記錯体の回収の有無に関わらず、前記錯体の検出によって、間接的に、前記錯体を構成する重金属を検出できる。本発明の第２の分析方法は、例えば、前記錯体の回収による前記重金属回収工程が不要である。
【０１５３】
本発明の第２の分析方法において、前記キレート剤は、例えば、前述のジチゾンがあげられる。前記ジチゾンと重金属の錯体の検出方法は、特に制限されず、公知の方法が採用でき、吸光度等の光学的シグナルの測定により検出できる。本発明の第２の分析方法において、前記錯体形成工程は、前述の内容を全て援用できる。
【０１５４】
本発明の第２の検体の前処理方法は、前記本発明の第２の分析方法に供する検体の前処理方法であって、検体中の重金属と、重金属にキレート可能なキレート剤との錯体形成に先立って、前記検体に、チオール基のマスキング剤を添加することを特徴とする。
【実施例】
【０１５５】
つぎに、本発明の実施例について説明する。なお、本発明は、下記の実施例により制限されない。
【０１５６】
［実施例１］
（１）検体の調製
健常者から採取した尿検体（ｎ＝３）に、塩化水銀（ＩＩ）を１０μｇ／Ｌとなるよう添加し、検体Ａとした。また、体内の重金属の排出療法としてメソ−２，３−ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）を単回投与した患者から採取した尿検体（ｎ＝３）を、検体Ｂ、Ｃ、Ｄとして使用した。
【０１５７】
（２）キレート剤の調製
ジチゾン１．５ｍｇ（Ｆｌｕｋａ社製）をｔ−ブチルアルコール１ｍＬ（ナカライテスク社）に溶解し、この溶液を全て、ポリプロピレン（ＰＰ）製１５ｍＬコニカルチューブ（Ｎｕｎｃ社製）に注入した。前記溶液を凍結乾燥した。
【０１５８】
（３）検体からの水銀の回収
５ｍＬの前記検体Ａ〜Ｄに、それぞれ、マスキング剤としてＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を、０、１２．５、２５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように溶解した後、室温で１５分静置した。これにより、前記検体中に含まれるチオール基含有化合物を前記ＮＥＭでマスキングした。前記ＮＥＭ添加後の検体Ａ〜Ｄに、それぞれ、５Ｎ  塩酸（ナカライテスク社製）を添加し、ｐＨを、約１〜２に調整した。
【０１５９】
前記ｐＨ調整後の検体全量を、前記キレート剤である前記ジチゾンを含むチューブに添加し、室温で５分間、振とうすることによって、前記検体と前記ジチゾンとを混合し、前記ジチゾンと水銀との錯体を形成させた。その後、前記チューブを、遠心分離（１９，６００ｍ／ｓ２（２０００×ｇ）、２０℃、１０分間）して、前記錯体を含む沈殿と上清とに分離した。
【０１６０】
前記上清を湿式灰化し、有機物を分解した。前記湿式灰化は、水銀分析マニュアル（環境省、平成１６年３月）に従って行った。そして、前記灰化後の水銀回収サンプルについて、原子吸光光度計（商品名ＭＥＲＣＵＲＹ  ＡＮＡＬＹＺＥＲ、日本インスツルメンツ（株）製）により、前記上清中に含まれる水銀量を定量した。前記上清中に含まれる水銀量をジチゾン添加前の検体中の水銀量（Ｘ）から差し引き、ジチゾン添加後の検体中の水銀量（Ｙ）を算出した。なお、前記ジチゾン添加前の検体中の水銀量（Ｘ）とは、前述と同様に調製したｐＨ調整後の各検体について、ジチゾンを混合することなく、同様に湿式灰化して定量した水銀量である。
Ｙ＝Ｘ−上清中に含まれる水銀量（ｎｇ）
Ｘ：ジチゾン添加前の検体中の水銀量（ｎｇ）
Ｙ：ジチゾン添加後の検体中の水銀量（ｎｇ）
【０１６１】
そして、ジチゾン添加前（吸着前）の検体中の水銀量と、ジチゾン添加後（吸着後）の検体中の水銀量とを、下記式（１）に代入して、水銀の回収率（％）を求めた。
回収率（％）＝１００×Ｙ／Ｘ    （１）
Ｘ：ジチゾン添加前の検体中の水銀量（ｎｇ）
Ｙ：ジチゾン添加後の検体中の水銀量（ｎｇ）
【０１６２】
下記表１に、各検体について、ＮＥＭ濃度と回収率との関係を示す。下記表１において、「吸着前」とは、ジチゾン添加前の検体における既知水銀量であり、「吸着後」とは、ジチゾン添加により回収した水銀回収サンプルの回収水銀量である。下記表１に示すように、ＮＥＭ濃度が０ｍｍｏｌ／Ｌの場合、健常者の検体Ａは、回収率が８３．５３％であったのに対して、ＤＭＳＡ投与患者の検体Ｂ〜Ｄは、回収率が、それぞれ、８７．８３％、３７．５４％、６９．５０％であり、排出療法としてＤＭＳＡを投与された患者から採取した検体間で、回収率にばらつきが生じていた。これに対して、前記検体Ｂ〜Ｄにマスキング剤としてＮＥＭを添加し、マスキング処理を施すことによって、ＮＥＭの濃度依存的に回収率が向上し、検体間での回収率のばらつきが著しく解消され、健常者の検体Ａと同程度の回収率が実現できた。
【０１６３】
【表１】
0005899085.tif 000009
【０１６４】
このように、例えば、検体中にＤＭＳＡ等のチオール基含有化合物が含まれる場合、ジチゾンとの錯体形成により水銀を回収する際、検体間に回収率にばらつきが生じるが、本発明によれば、マスキング剤での処理によって、検体間の回収率にばらつきを軽減し、水銀の回収率を向上できることがわかった。
【０１６５】
［実施例２］
（１）検体の調製
健常者から採取した尿検体（ｎ＝１）を、検体ａとした。また、前記検体ａに、ＤＭＳＡを０．２ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加したものを、検体ｂ（ｎ＝１）とした。ＤＭＳＡを単回投与した患者から採取した尿検体（ｎ＝１）を、検体ｃとした。他方、前記各検体ａ〜ｃに、それぞれ、塩化水銀（ＩＩ）（和光純薬工業社製）を１ｐｐｍとなるよう混合し、検体ａ１、ｂ１およびｃ１とした。以下、検体ａ〜ｃを、水銀未添加検体といい、検体ａ１〜ｃ１を、水銀添加検体ともいう。
【０１６６】
（２）マスキング試薬の調製
精製水に、終濃度が５０ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＮＥＭを添加して、ＮＥＭ溶液を調製し、これをマスキング試薬１とした。
【０１６７】
（３）比色試薬
精製水に、硝酸およびラウリル硫酸ナトリウムを添加して、混合液を調製し、これを比色試薬２とした。前記比色試薬２において、硝酸の終濃度は０．１３Ｎ、ラウリル硫酸ナトリウムの終濃度は０．９％とした。また、エタノールに、終濃度が０．０２４ｍｍｏｌ／Ｌとなるようにジチゾンを溶解し、ジチゾン溶液を調製し、これを比色試薬３とした。
【０１６８】
（４）検体からの水銀の回収
前記検体ａ〜ｃおよびａ１〜ｃ１の６検体を、それぞれ０．４９ｍＬ、別の容器に分取した。そして、前記容器に、前記マスキング試薬１を０．０１ｍＬ混合した後、室温で１５分静置することで、ＮＥＭによる前処理を行った。つぎに、前記容器に、前記比色試薬２を０．０３ｍＬ混合した。さらに、前記容器に、前記比色試薬３を０．０２ｍＬ添加し、添加時（０秒）および添加から３０秒後に、波長４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。そして、３０秒後の吸光度から、０秒の吸光度を差し引き、この値を各検体ａ〜ｃ、ａ１〜ｃ１のシグナル値とした。
【０１６９】
前記水銀添加検体（ａ１、ｂ１、ｃ１）と、前記水銀未添加検体（ａ、ｂ、ｃ）とのシグナル値の差（Δ）を求めた。そして、前記シグナル値の差（Δ）について、水銀添加検体ａ１と水銀未添加検体ａとのシグナル値の差（Δａ１−ａ）を１００％として、相対値（％）を回収率として算出した。
【０１７０】
また、比較例として、前記ＮＥＭのマスキング試薬１に代えて、精製水０．０１ｍＬを使用した以外は、同様にして、シグナル値、シグナル値の差（Δ）および回収率を求めた。
【０１７１】
下記表２に、その結果を示す。下記表２に示すように、前処理に精製水を使用した比較例では、ＤＭＳＡ未添加の健常者由来検体ａおよびａ１と比較して、ＤＭＳＡを添加した検体ｂおよびｂ１、ならびにＤＭＳＡを投与した患者由来の検体ｃおよびｃ１について、回収率が著しく低下した。これに対して、前処理にＮＥＭを使用した実施例では、ＤＭＳＡを添加した検体ｂおよびｂ１、ならびにＤＭＳＡを投与した患者由来の検体ｃおよびｃ１についても、７５％以上という優れた回収率を示した。
【０１７２】
【表２】
0005899085.tif 000010
【０１７３】
このように、例えば、検体中にＤＭＳＡ等のチオール基含有化合物が含まれる場合、ジチゾンとの錯体として水銀を回収する際、検体間に回収率にばらつきが生じるが、本発明によれば、マスキング剤での処理によって、検体間の回収率のばらつきを軽減できた。
【０１７４】
［実施例３］
（１）検体の調製
健常者から採取した尿検体に、ＤＭＳＡを０．２ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加した。
【０１７５】
（２）キレート剤の調製
前記実施例１と同様にして、ジチゾンのキレート剤を調製した。
【０１７６】
（３）検体からの水銀の回収
５ｍＬの前記検体に、マスキング剤としてヨード酢酸またはヨードアセトアミドを、それぞれ、１２．５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように溶解した以外は、前記実施例１と同様にして、キレート剤を用いて水銀の回収を行い、回収率を求めた。また、比較例として、前記検体を、前記マスキング剤を溶解することなく、室温で１５分静置した以外は、前記実施例１と同様にして、キレート剤を用いて水銀の回収を行い、回収率を求めた。
【０１７７】
下記表３に、その結果を示す。下記表３に示すように、検体にマスキング剤としてヨード酢酸またはヨードアセトアミドを溶解させた場合、マスキング剤不使用の比較例と比較して、回収率が向上した。
【０１７８】
【表３】
0005899085.tif 000011
【０１７９】
［実施例４］
（１）検体の調製
体内の重金属の排出療法としてメソ−２，３−ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）を単回投与した患者から尿検体を採取した。
【０１８０】
（２）キレート剤の調製
前記実施例１と同様にして、ジチゾンのキレート剤を調製した。
【０１８１】
（３）検体からの水銀の回収
５ｍＬの前記検体に、マスキング剤としてＮＥＭを、１２．５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように溶解した以外は、前記実施例１と同様にして、キレート剤を用いて水銀の回収を行い、回収率を求めた。また、比較例として、前記検体を、前記マスキング剤を溶解することなく、室温で１５分静置した以外は、前記実施例１と同様にして、キレート剤を用いて水銀の回収を行い、回収率を求めた。
【０１８２】
下記表４に、その結果を示す。下記表４に示すように、検体にマスキング剤としてＮＥＭを溶解させた場合、マスキング剤不使用の比較例と比較して、回収率が向上した。
【０１８３】
【表４】
0005899085.tif 000012
【０１８４】
［実施例５］
（１）検体およびキレート剤の調製
前記実施例４と同様にして、検体およびジチゾンのキレート剤を調製した。
【０１８５】
（２）第２キレート剤の調製
第２キレート剤としてチオプロニン（関東化学（株）製）を、０．１ｍｏｌ／Ｌ硝酸水溶液に５００ｍｍｏｌ／Ｌとなるように溶解し、チオプロニン水溶液を調製した。
【０１８６】
（３）検体からの水銀の回収
前記実施例４と同様にして、前記錯体を形成させ、上清を除去した。そして、前記チューブ内の前記沈殿全量に、前記第２キレート剤であるチオプロニン水溶液を添加し、室温で５分間、振とうすることによって、前記錯体と前記第２キレート剤水溶液とを混合し、前記混合液において、前記水銀と前記チオプロニンとの錯体（第２錯体）を形成させた。前記チューブを、遠心分離（１９，６００ｍ／ｓ２（２０００×ｇ）、２０℃、１０分間）して、前記第２錯体が溶解した上清と沈殿とに分離した。前記上清を回収し、これを、水銀濃縮サンプルとした。
【０１８７】
前記水銀濃縮サンプルを湿式灰化し、有機物を分解した。前記湿式灰化は、水銀分析マニュアル（環境省、平成１６年３月）に従って行った。そして、前記灰化後の水銀濃縮サンプルについて、原子吸光光度計（商品名ＭＥＲＣＵＲＹ  ＡＮＡＬＹＺＥＲ、日本インスツルメンツ（株）製）により、水銀濃度を定量した。また、ジチゾンのキレート剤、マスキング剤および第２キレート剤非添加の前記検体についても、同様にして、前記原子吸光光度計により、水銀濃度を定量した。そして、比較例として、前記検体を、前記マスキング剤を溶解することなく、室温で１５分静置した以外は同様にして、ジチゾンのキレート剤および第２キレート剤を用いて、水銀濃度を定量した。
【０１８８】
前記水銀濃縮サンプルの水銀濃度（ＸＣ）および溶液量（ＸＶ）、ならびに、前記検体の水銀濃度（ＹＣ）および溶液量（ＹＶ）を、下記式（２）に代入して、水銀の回収率（％）を求めた。
回収率（％）＝１００×（ＸＣ×ＸＶ）／（ＹＣ×Ｙｖ）    （２）
【０１８９】
下記表５に、その結果を示す。下記表５に示すように、検体にマスキング剤を溶解させた場合、マスキング剤不使用の比較例と比較して、回収率が向上した。
【０１９０】
【表５】
0005899085.tif 000013
【０１９１】
［実施例６］
（１）検体の調製
前記実施例４と同様にして、検体を調製した。
【０１９２】
（２）キレート剤の調製
ジチゾン０．１５ｍｇ（Ｆｌｕｋａ社製）を、乳鉢中で粉砕し、使用した。
【０１９３】
（３）第２キレート剤の調製
前記実施例５と同様にして、第２キレート剤を調製した。
【０１９４】
（４）検体からの水銀の回収
４ｍＬの前記検体に、マスキング剤としてＮＥＭ、マレイミドまたはＮ−メチルマレイミド（ＮＭＭ）を、それぞれ、１２．５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように溶解した後、室温で１５分静置した。これにより、前記検体中に含まれるチオール基含有化合物を前記マスキング剤でマスキングした。
【０１９５】
前記検体に、前記キレート剤である前記ジチゾンを添加し、クエン酸（無水）（キシダ化学社製）／クエン酸３ナトリウム・２水和物（和光純薬工業社製）緩衝剤を、最終濃度が１００ｍＭとなるように添加し、室温で２０分間、振とうすることによって、前記検体と前記ジチゾンとを混合し、前記ジチゾンと水銀との錯体を形成させた。その後、前記検体と前記ジチゾンとの混合物全量を、ガラス繊維ろ紙のついたろ過容器に入れた後、遠心ろ過し、前記錯体を含む沈殿とろ液とに分離した。
【０１９６】
前記沈殿に、前記第２キレート剤であるチオプロニン水溶液を添加し、室温で１５分間静置することによって、前記錯体と前記第２キレート剤水溶液とを混合し、前記混合液において、前記水銀と前記チオプロニンとの錯体（第２錯体）を形成させた。前記ろ過容器を前記と同様の条件で遠心ろ過して、前記第２錯体が溶解したろ液を分取した。前記ろ液を回収し、これを、水銀濃縮サンプルとした。
【０１９７】
前記水銀濃縮サンプルを湿式灰化した以外は、前記実施例１と同様にして、水銀の回収率を求めた。また、前記水銀濃縮サンプルについて、実施例５と同様にして、前記原子吸光光度計により、水銀濃度を定量した。そして、比較例として、前記検体を、前記マスキング剤を溶解することなく、室温で１５分静置した以外は同様にして、ジチゾンのキレート剤および第２キレート剤を用いて、水銀の回収率を求め、また、水銀濃度を定量した。
【０１９８】
下記表６および表７に、その結果を示す。下記表６および表７に示すように、検体にマスキング剤を溶解させた場合、マスキング剤不使用の比較例と比較して、回収率が向上した。
【０１９９】
【表６】
0005899085.tif 000014
【０２００】
【表７】
0005899085.tif 000015
【０２０１】
［実施例７］
（１）検体の調製
健常者から採取した尿検体（６検体、各ｎ＝１）に、塩化水銀（ＩＩ）を１０μｇ／Ｌとなるよう添加し、検体Ａ〜Ｆとした。
【０２０２】
（２）キレート剤の調製
ジチゾン０．０４ｍｇ（Ｆｌｕｋａ社製）を乳鉢中で粉砕し使用した。
【０２０３】
（３）検体からの水銀の回収
１ｍＬの前記検体Ａ〜Ｆに、それぞれ、マスキング剤としてＮ−メチルマレイミド（ＮＭＭ）を、０、１２．５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように溶解し、この溶液を全て、ポリプロピレン（ＰＰ）製１５ｍＬコニカルチューブ（Ｎｕｎｃ社製）に注入した後、室温で１５分静置した。これにより、前記検体中に含まれるチオール基含有化合物を前記ＮＭＭでマスキングした。前記ＮＭＭ添加後の検体Ａ〜Ｆに、それぞれクエン酸・クエン酸３ナトリウム緩衝液を１００ｍｍｏｌ／Ｌとなるよう添加し、ｐＨを、約２〜３に調整した。
【０２０４】
前記ｐＨ調整後の検体にジチゾンを添加し、室温で２０分間、振とうすることによって、前記検体と前記ジチゾンとを混合し、前記ジチゾンと水銀との錯体を形成させた。その後、前記チューブを、遠心分離（１８６，２００ｍ／ｓ２（１９０００×ｇ）、２０℃、５分間）して、前記錯体を含む沈殿と上清とに分離した。
【０２０５】
前記上清を、実施例１と同様にして、湿式灰化し、前記上清中に含まれる水銀量を定量し、水銀の回収率（％）を求めた。
【０２０６】
下記表８に、ＮＭＭ濃度と水銀の回収率との関係を示す。下記表８において、「吸着前」とは、ジチゾン添加前の検体における既知水銀量であり、「吸着後」とは、ジチゾン添加により回収した水銀回収サンプルの回収水銀量である。下記表８に示すように、ＮＭＭ濃度が０ｍｍｏｌ／Ｌの場合、検体Ａ〜Ｆは、回収率が、それぞれ、８５．０５％、７２．３７％、８３．３５％、６７．９４％、８７．０５％、７４．１８％であり、検体間で回収率にばらつきが生じていた。これに対して、前記検体Ａ〜Ｆにマスキング剤としてＮＭＭを添加し、マスキング処理を施すことによって回収率が向上し、検体間での回収率のばらつきが改善した。
【０２０７】
【表８】
0005899085.tif 000016
【０２０８】
このように、例えば、検体中にＤＭＳＡ等のチオール基含有化合物が含まれる場合、ジチゾンとの錯体形成により水銀を回収する際、検体間に回収率にばらつきが生じるが、本発明によれば、マスキング剤での処理によって、検体間の回収率にばらつきを軽減し、水銀の回収率を向上できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０２０９】
以上のように、本発明によれば、前記マスキング剤の存在下で、前記検体中の重金属と前記キレート剤との錯体を形成することによって、前述のような、検体間の回収率のばらつきを抑制できる。また、回収率が低い検体に関しては、例えば、回収率を向上させることも可能である。このため、より信頼性に優れた重金属の分析を行うことが可能である。このため、本発明は、例えば、生体由来の検体に対する臨床検査、環境試験等において、極めて有用である。