(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
発光酵素のＮ末端側断片、前記発光酵素のＣ末端側断片、カルシウム結合領域および前記カルシウム結合領域と可逆的に結合または解離できる相互作用領域を含むカルシウムセンサータンパク質であって、前記カルシウム結合領域および前記相互作用領域は前記Ｃ末端側断片と前記Ｎ末端側断片との間に配置されたカルシウムセンサータンパク質を含む細胞を作製する細胞作製工程と、
前記細胞作製工程で作製した前記細胞に当該細胞外から所定の発光基質を添加する添加工程と、
前記添加工程で前記所定の発光基質が与えられた前記細胞の発光画像を撮像する撮像工程と、
前記撮像工程で撮像した前記発光画像に基づいて、前記細胞内における前記カルシウムの濃度を解析する解析工程と
を含み、
前記カルシウムセンサータンパク質が配列番号２１または２２に示されるアミノ酸配列を有する、
細胞内カルシウム解析方法。
【請求項２】
前記撮像工程が前記発光画像を繰り返し撮像することを含む請求項１に記載の細胞内カルシウム解析方法。
【請求項３】
前記撮像工程が複数の異なる細胞に対して同時に行われ、
前記解析工程が前記細胞ごとに行われる、請求項１または２に記載の細胞内カルシウム解析方法。
【請求項４】
発光酵素のＮ末端側断片、前記発光酵素のＣ末端側断片、カルシウム結合領域および前記カルシウム結合領域と可逆的に結合または解離できる相互作用領域を含むカルシウムセンサータンパク質であって、前記カルシウム結合領域および前記相互作用領域は前記Ｃ末端側断片と前記Ｎ末端側断片との間に配置され、前記Ｎ末端断片および前記Ｃ末端断片は前記発光酵素における本来の配置に対して円順列置換されているカルシウムセンサータンパク質であって、  前記発光酵素がホタルルシフェラーゼ及びレニラルシフェラーゼから選択される発光酵素であり、  前記カルシウム結合領域がカルモジュリン由来であり、  相互作用領域がＭ１３ペプチドであり、 配列番号２１または２２に示されるアミノ酸配列を有するカルシウムセンサータンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルシウム解析方法および当該方法に使用されるタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くのホルモンや神経伝達物質はＧタンパク質共役型受容体と相互作用し、細胞内セカンドメッセンジャーを介して様々な細胞活動を引き起こしている。また、細胞活動の多様性は、細胞内のセカンドメッセンジャーの時間的および空間的な濃度分布によって制御されている。したがって、特定の細胞活動に関する細胞内情報伝達を解析するにあたって、セカンドメッセンジャーの時空間的な変化をリアルタイムに捉えることが必要である。
【０００３】
細胞内セカンドメッセンジャーの１つであるカルシウムは、生体内において、各種生化学反応過程のシグナル伝達分子として作用している。これまでに、筋細胞の弛緩、網膜における光受容−伝達、骨の成長、ニューロンの活性化、神経伝達物質やホルモンの受容体からの細胞内情報伝達等の様々な生理的プロセスがカルシウムによって制御されていることが明らかになっている。したがって、生細胞中でのカルシウム局在がリアルタイムにわかれば、細胞および組織レベルでの循環器系、消化器系、網膜、嗅覚、中枢神経等の作用機構が解明されるだけでなく、細胞内のカルシウム濃度を調節する薬剤に関する知見を得ることが期待される。
【０００４】
生細胞内でのカルシウム濃度をリアルタイムで観察するためには、カルシウムを分子イメージングすることが最も効果的であり、従来から、カルシウムに対する多くの分析技術が提案および開発されている。
【０００５】
例えば、非特許文献１には、カルシウム結合タンパク質であるカルモジュリンおよびカルシウムイオンと結合したカルモジュリンと結合するＭ１３ペプチドに対し、シアン色蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）および黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）を融合させた融合タンパク質を使用する、シアン色蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）と黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）との蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づくカルシウム解析方法が開示されている。この方法で使用する融合タンパク質は、中央にカルモジュリンおよびＭ１３ペプチドが、両端にＹＦＰおよびＣＦＰが配置されている。カルシウムが存在しない状態では、ＹＦＰとＣＦＰとが離れておりＦＲＥＴが生じないため、ＣＦＰを励起してもＹＦＰの蛍光は観察されない。このとき細胞内のカルシウムが増加すると、カルモジュリンがカルシウムと結合し、さらにそれらに対してＭ１３が結合することで、融合タンパク質の立体構造が変化する。この状態においてＣＦＰを励起すると、ＦＲＥＴが生じるため、アクセプターであるＹＦＰの蛍光が観察される。このＦＲＥＴシグナルを観察することで、カルシウムの濃度変化を観察できることが明らかにされている。
【０００６】
特許文献１には、カルシウム感受性発光タンパク質およびカルシウム非応答性レニラルシフェラーゼを利用して、細胞内のカルシウム濃度および遺伝子発現量を定量解析する方法が開示されている。この方法では、カルシウム感受性発光タンパク質であるイクオリンおよびカルシウム非応答性レニラルシフェラーゼ由来のレポーターを細胞内に発現させる。
細胞内のカルシウムが増加すると、イクオリンまたはカルシウム感受性発光タンパク質により検出でき、その後に新たな基質を添加することなくレポーターアッセイ法により遺伝子発現の増減を測定できることが明らかにされている。
【０００７】
非特許文献２には、カルモジュリン、Ｍ１３ペプチド、および分割したレニラルシフェラーゼから成る融合タンパク質を利用して観察する方法が開示されている。この方法で使用する融合タンパク質は、中央にカルモジュリンおよびＭ１３ペプチドが、両端にレニラルシフェラーゼの分割した断片が配置されている。カルシウムが存在しない状態では、レニラルシフェラーゼの分割した断片同士が離れており発光活性を有さないため発光を観察することができない。このとき細胞内のカルシウムが増加すると、カルモジュリンがカルシウムと結合し、さらにそれらに対してＭ１３が結合することで、融合タンパク質の立体構造が変化する。この状態では、分割されたレニラルシフェラーゼが再構成されて発光活性が回復し、発光を観察することができる。この発光シグナルを観察することで、カルシウムの濃度変化を観察できることが明らかにされている。
【０００８】
特許文献２には、カルモジュリン、任意にＭ１３ペプチド、および分割したガウシアルシフェラーゼから成る融合タンパク質を利用して観察する方法が開示されている。この方法で使用する融合タンパク質は、中央にカルモジュリンおよび任意にＭ１３ペプチドが、両端にガウシアルシフェラーゼの分割した断片が配置されており、細胞内のカルシウムの増加に伴い、カルモジュリンおよび任意にＭ１３ペプチドがカルシウム依存的に結合して立体構造が変化する。この変化によって、分割されたガウシアルシフェラーゼが解離または再構成されて発光の消失または増強を観察することができる。この発光シグナルを観察することで、カルシウムの濃度変化を観察できることが明らかにされている。
【０００９】
特許文献３には、カルモジュリンと分割したホタルルシフェラーゼとから成る融合タンパク質を利用した細胞内カルシウム濃度の定量解析する方法が開示されている。この方法で使用する融合タンパク質では、分割したホタルルシフェラーゼの断片は、本来のホタルルシフェラーゼにおける配置に対して円順列置換されている。この融合タンパク質を細胞内に発現させ、ルシフェラーゼの基質となるルシフェリンを添加すると細胞からの発光を計測できる。このとき細胞内のカルシウムが増加すると、カルモジュリンの立体構造が変化してルシフェラーゼの発光が消失または増強する。この発光シグナルを検出することで、カルシウムの濃度変化を検出できることが明らかにされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００７／１３９０８０号
【特許文献２】特開２００９−１５３３９９号公報
【特許文献３】特表２００９−５３２０６３号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｍｉｙａｗａｋｉ  Ａ，Ｌｌｏｐｉｓ  Ｊ，Ｈｅｉｍ  Ｒ，ＭｃＣａｆｆｅｒｙ  ＪＭ，Ａｄａｍｓ  ＪＡ，  Ｉｋｕｒａ  Ｍ，Ｔｓｉｅｎ  ＲＹ．  “Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｃａ２＋ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ  ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ．”  Ｎａｔｕｒｅ，  ｖｏｌ．３８８（６６４５），  ｐｐ．８８２−８８７，  １９９７
【非特許文献２】Ｋａｉｈａｒａ  Ａ，Ｕｍｅｚａｗａ  Ｙ，Ｆｕｒｕｋａｗａ  Ｔ．  “Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｃａ２＋  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｓｐｌｉｔ  ｒｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．”  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｖｏｌ．２４，  ｐｐ．１４０５−１４０８，  ２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、蛍光タンパク質を用いる従来技術は、細胞が自己蛍光を発するためシグナル／ノイズ比が低いという問題、ダイナミックレンジが狭いため利用可能な測定対象の範囲が狭いという問題等を有している。
【００１３】
また、従来のカルシウム感受性発光タンパク質を用いる従来技術は、ルミノメーターまたはフォトンカウンティングでのみ測定を行っているため、一細胞での測定に最適化されておらず、さらに、発光した後速やかに変性および分解されてしまうため、長時間の測定や多数回の刺激に応じた発光を観察することが困難であり、利用可能な測定方法の範囲が狭いという問題を有していた。
【００１４】
また、従来の分割されたレニラルシフェラーゼまたはガウシアルシフェラーゼ、カルシウム結合タンパク質であるカルモジュリンおよびカルシウムイオンと結合したカルモジュリンと結合するＭ１３ペプチドを用いた従来技術は、ルミノメーターまたはフォトンカウンティングでのみ測定を行っているため、一細胞での測定に最適化されておらず、さらに、再構成したルシフェラーゼが解離しづらいため、発光シグナルとカルシウム濃度との相関が悪いという問題を有していた。
【００１５】
また、従来の円順列置換ルシフェラーゼとカルシウム結合タンパク質であるカルモジュリン遺伝子との融合タンパク質を用いる技術は、ルミノメーターまたはフォトンカウンティングでのみ測定を行っているため、一細胞での測定に最適化されておらず、利用可能な測定方法の範囲が狭いという問題を有していた。
【００１６】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、細胞内の情報伝達に影響を及ぼすことなく各細胞からの正確な定量的結果を得ることができ、その結果、個々の細胞においてカルシウム濃度の変化を再現性良く経時的に観察することができるカルシウム解析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の実施形態によれば、発光酵素のＮ末端側断片、前記発光酵素のＣ末端側断片、カルシウム結合領域および前記カルシウム結合領域と可逆的に結合または解離できる相互作用領域を含むカルシウムセンサータンパク質であって、前記カルシウム結合領域および前記相互作用領域は前記Ｃ末端側断片と前記Ｎ末端側断片との間に配置されたカルシウムセンサータンパク質を含む細胞を作製する細胞作製工程と、前記細胞作製工程で作製した前記細胞に当該細胞外から所定の発光基質を添加する添加工程と、前記添加工程で前記所定の発光基質が与えられた前記細胞の発光画像を撮像する撮像工程と、前記撮像工程で撮像した前記発光画像に基づいて、前記細胞内における前記カルシウムの濃度を解析する解析工程とを含む細胞内カルシウム解析方法が提供される。
【００１８】
また、本発明の実施形態によれば、発光酵素のＮ末端側断片、前記発光酵素のＣ末端側断片、カルシウム結合領域および前記カルシウム結合領域と可逆的に結合または解離できる相互作用領域を含むカルシウムセンサータンパク質であって、前記カルシウム結合領域および前記相互作用領域は前記Ｃ末端側断片と前記Ｎ末端側断片との間に配置され、前記Ｎ末端断片および前記Ｃ末端断片は前記発酵酵素における本来の配置に対して円順列置換されているカルシウムセンサータンパク質が提供される。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の実施形態によれば、細胞内のカルシウムに関する個々の細胞からの正確な定量的結果を得ることができ、その結果、個々の細胞において細胞内のカルシウム濃度を再現性良く観察することができるという効果が得られる。
【００２０】
また、本発明のカルシウム結合領域がカルモジュリン由来である実施形態によれば、カルシウム特異的に結合するという効果が得られる。
【００２１】
また、本発明の相互作用領域がＭ１３ペプチドである実施形態によれば、カルシウム依存的にカルモジュリンに結合するという効果が得られる。
【００２２】
また、本発明の発光酵素がホタルルシフェラーゼであり、Ｎ末端側断片がホタルルシフェラーゼのアミノ酸番号１番目から４１６番目のアミノ酸配列を含み、Ｃ末端側断片がホタルルシフェラーゼのアミノ酸番号３９９番目から５５０番目のアミノ酸配列を含む実施形態によれば、発光酵素のＮ末端側断片とＣ末端側断片とが再構成した時にだけ発光するため、シグナル／ノイズ比が大きいという効果が得られる。
【００２３】
また、本発明の発光酵素がレニラルシフェラーゼであり、Ｎ末端側断片がレニラルシフェラーゼのアミノ酸番号１番目から９１番目のアミノ酸配列を含み、Ｃ末端側断片がレニラルシフェラーゼのアミノ酸番号９２番目から３１１番目のアミノ酸配列を含む実施形態によれば、発光酵素のＮ末端側断片とＣ末端側断片とが再構成した時にだけ発光するので、シグナル／ノイズ比が大きいという効果が得られる。
【００２４】
また、本発明のＮ末端断片およびＣ末端断片は、発酵酵素における本来の配置に対して円順列置換されている実施形態によれば、解離したときのバックグランドノイズが低いため、シグナル／ノイズ比が大きいという効果が得られる。
【００２５】
また、本発明の撮像工程が発光画像を繰り返し撮像することを含む実施形態によれば、撮像工程において、発光画像を繰り返し撮像するので、同一細胞における時空間的な測定ができるという効果が得られる。
【００２６】
また、本発明の撮像工程が複数の異なる細胞に対して同時に行われ、解析工程が細胞ごとに行われる実施形態によれば、撮像工程において、複数の異なる細胞について同時に実行し、解析工程において、複数の発光画像を細胞ごとに照合するため、個々の細胞におけるカルシウム濃度変化を時空間的に解析できるという効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】発光観察システム１００の全体構成の一例を示す図である。
【図２】発光観察システム１００の発光画像撮像ユニット１０６の構成の一例を示す図である。
【図３】発光観察システム１００の発光画像撮像ユニット１０６の構成の一例を示す図である。
【図４】発光観察システム１００の画像解析装置１１０の構成の一例を示すブロック図である。
【図５】スプリットルシフェラーゼアッセイ法を用いたカルシウムの検出原理を示す図である。
【図６】５ＨＴ２Ａ受容体およびｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３＿Ｎを導入したＨＥＫ２９３細胞において、５ＨＴ刺激前の発光画像を示す図である。
【図７】５ＨＴ２Ａ受容体およびｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３＿Ｎを導入したＨＥＫ２９３細胞において、５ＨＴ刺激後の発光画像を示す図である。
【図８】選択した細胞での５ＨＴ刺激によるｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３＿Ｎの発光強度の経時変化を示した図である。
【図９】５ＨＴ２Ａ受容体およびｃｐｈＲＬ＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３＿Ｎを導入したＨＥＫ２９３細胞において、５ＨＴ刺激前の発光画像を示す図である。
【図１０】５ＨＴ２Ａ受容体およびｃｐｈＲＬ＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３＿Ｎを導入したＨＥＫ２９３細胞において、５ＨＴ刺激後の発光画像を示す図である。
【図１１】選択した細胞での５ＨＴ刺激によるｃｐｈＲＬ＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３＿Ｎの発光強度の経時変化を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
［方法］
以下に、本発明に係る方法について説明する。
本発明は、発光酵素のＮ末端側断片、前記発光酵素のＣ末端側断片、カルシウム結合領域および前記カルシウム結合領域と可逆的に結合または解離できる相互作用領域を含むカルシウムセンサータンパク質であって、前記カルシウム結合領域および前記相互作用領域は前記Ｃ末端側断片と前記Ｎ末端側断片との間に配置されたカルシウムセンサータンパク質を含む細胞を作製する細胞作製工程と、前記細胞作製工程で作製した前記細胞に当該細胞外から所定の発光基質を添加する添加工程と、前記添加工程で前記所定の発光基質が与えられた前記細胞の発光画像を撮像する撮像工程と、前記撮像工程で撮像した前記発光画像に基づいて、前記細胞内における前記カルシウムの濃度を解析する解析工程とを含む細胞内カルシウム解析方法に関する。
【００２９】
簡潔には、本発明は、対象とする細胞にカルシウムセンサータンパク質を導入し、発光基質を与えて発光を誘導し、その様子を撮像し、撮像した画像に基づいてカルシウム濃度を特定等する方法に関する。
【００３０】
本発明によれば、細胞内のカルシウムの状態を解析することができる。特に、細胞内のカルシウム濃度を定量的に測定することが可能である。また、測定はイメージングによって行うことができるため、細胞ごとに測定が可能であり、さらには細胞内の細胞小器官等の構造に絞って測定することもできる。さらに、一定間隔で同一の測定領域を測定することで、カルシウム濃度の刺激に対する変化および時間的変化を解析することができる。細胞ごとに測定することで、細胞間の差異を解析することもできる。
【００３１】
細胞作製工程では、カルシウムセンサータンパク質を含む細胞が作製される。カルシウムセンサータンパク質とは、発光酵素の２つのポリペプチド断片と、カルシウムに結合できるポリペプチド断片（カルシウム結合領域）と、カルシウム結合領域と可逆的に結合または解離できるポリペプチド断片（相互作用領域）と、任意にその他のポリペプチド断片とが融合したタンパク質であって、カルシウムの存在に応じて当該発光酵素の活性が消失または回復するタンパク質である。カルシウムセンサータンパク質の詳細については後述する。対象となる細胞の種類に限定はなく、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞および動物細胞等を使用できる。動物細胞が使用される場合、特に哺乳細胞が使用され、例えばマウスの細胞、サルの細胞およびヒトの細胞が使用される。細胞は、生体組織の一部として培養された細胞集合体であってもよいし、生体組織が属している臓器等や生命個体の形態でもよい。細胞に対してカルシウムセンサータンパク質を導入する方法に特別な限定はなく、既知の導入方法が使用できる。１つの方法は、当該タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸を細胞に導入し、その後細胞内で当該タンパク質を発現させる方法である。例えば、当該核酸を含む発現ベクターを、リン酸カルシウム法、リポフェクション法またはエレクトロポレーション法等によって細胞内に導入し、発現ベクターから当該タンパク質を発現させることができる。ベクターから発現させるのではなく、当該核酸がゲノムに組み込まれた細胞を作製した後、ゲノムから当該タンパク質を発現させることもできる。別の方法は、細胞外で精製した当該タンパク質を細胞内に直接導入する方法である。例えば、マイクロインジェクション法によって当該タンパク質を細胞内に直接注入することができる。または、当該タンパク質を含む培養液にて細胞をインキュベートさせて、エンドサイトーシスによって当該タンパク質を細胞に取り込ませることができる。
【００３２】
添加工程では、細胞作製工程にて作製された細胞に対し発光基質が添加される。本発明に係る方法は発光酵素による発光反応を利用するが、この発光反応を生じさせるためには発光基質が必要となる。発光基質は使用する発光酵素に応じて選択される。発光基質の詳細は後述する。発光基質を添加する方法に特別限定はなく、適宜選択できる。例えば、培養液に添加することで、培養液を介して細胞に発光基質を取り込ませることが出来る。また、マイクロインジェクション法によって、発光基質を細胞内に直接注入することもできる。発光基質の添加のタイミングも適宜選択できる。例えば、細胞へのカルシウムセンサータンパク質の導入の前に、それと同時に、またはその後に発光基質を添加することができる。例えば、一連の操作を通して、細胞を取り扱うための培養液中に発光基質を含めておくことができる。または、マイクロインジェクションにて当該タンパク質および発光基質を同時に細胞に注入することができる。好ましくは、発光基質は測定の直前に添加される。発光基質の添加量に特別な限定はないが、好ましくは、発光酵素が発光反応を生じるために十分な量で添加される。
【００３３】
撮像工程では、発光反応が生じている細胞の画像が取得される。撮像は任意のタイミングで行うことができるが、好ましくは、基質添加から一定時間後に行われる。特に複数の測定を繰り返す場合、測定結果のばらつきを抑えるために、複数の測定を通じて同一のタイミングで撮像することが好ましい。撮像時間は条件に応じて最良の時間が適宜選択される。発光強度が小さい場合、撮像時間（顕微鏡を使用する場合、露出時間）は長くされ、逆に発光強度が大きすぎる場合、撮像時間は短くされる。例えば、５から１０秒間の露出時間とすることができる。撮像は、発光反応に係る波長の光のみを取得して行うこともできるが、それと同時に明視野画像または別の波長の光による画像を取得してもよい。例えば、細胞にカルシウムセンサータンパク質と同時にプローブ（例えば蛍光または発光タンパク質）を融合した特定のタンパク質を導入し、カルシウムセンサータンパク質に由来する光と同時に、当該特定のタンパク質からの光を検出してもよい。なお、撮像に使用される装置については後述する。
【００３４】
解析工程では、取得された画像に基づいて、細胞内のカルシウム濃度等の解析が行われる。解析は、コンピュータにて機能するソフトウェアを使用して、発光量を数値に変換してもよい。当該数値を利用して、スタンダードとの比の算出、試料間の比較等が適宜行われる。このような処理によって、細胞内のカルシウム濃度が特定される。また、濃度の特定とは、詳細な数値の特定でなくとも、カルシウムが試料中に存在するか否かの特定、または設定した濃度範囲にあるかどうか等の大まかな特定であってもよい。なお、解析に使用される装置については後述する。
【００３５】
また、本発明は、撮像工程が発光画像を繰り返し撮像することを含む上記の細胞内カルシウム解析方法に関する。当該方法では、一定の間隔で撮像を繰り返し、または特定の時間に撮像が行われる。このように経時的に撮像されることで、タイムラプスによる観察または動画による観察が可能となる。撮像の都度、発光基質を添加してもよい。当該方法によって、同一細胞における時空間的な測定ができる。すなわち、時間に応じた又は刺激に応じたカルシウム濃度の変化を測定することができる。また、明視野画像を同時に取得することで、カルシウムの濃度変化と細胞の形態変化等との関係を知ることが出来る。また、プローブを付したタンパク質を発現させ、当該プローブの様子を同時に観察することで、当該タンパク質とカルシウムとの関連性を知ることができる。
【００３６】
また、本発明は、撮像工程が複数の異なる細胞に対して同時に行われ、且つ解析工程が細胞ごとに行われる細胞内カルシウム解析方法に関する。当該方法では、一度の撮像において、複数の異なる細胞の画像が取得される。さらに、その後の解析が各々の細胞に対して行われる。撮像した１つの画像に含まれる複数の細胞について細胞ごとの解析を行うことが可能であり、または、撮像した複数の画像にそれぞれ含まれる複数の細胞について細胞ごとの解析を行うことが可能である。また、撮像を上述のような経時的な撮像にすることもできる。これらのような方法によって、個々の細胞におけるカルシウム濃度変化を時空間的に解析できる。例えば、同一条件下におかれた細胞同士のカルシウム濃度の比較に使用することができる。
【００３７】
［カルシウムセンサータンパク質］
次に、本発明に係るカルシウムセンサータンパク質について説明する。本発明は、カルシウムセンサータンパク質を利用する上記方法に関し、またカルシウムセンサータンパク質自体に関する。
【００３８】
本発明に係るカルシウムセンサータンパク質は、発光酵素のＮ末端側断片、発光酵素のＣ末端側断片、カルシウム結合領域およびカルシウム結合領域と可逆的に結合または解離できる相互作用領域を含み、且つ、カルシウム結合領域および相互作用領域はＮ末端側断片とＣ末端側断片との間に配置されている。当該タンパク質は、カルシウムの存在に応じて当該発光酵素の活性が消失または回復する。
【００３９】
カルシウム結合領域とは、細胞内にてカルシウムイオンと可逆的に結合および解離できるペプチドを意味する。カルシウム結合領域の具体例は、例えばカルモジュリン（ＣａＭ）またはその断片である。一方、相互作用領域とは、カルシウム結合領域と相互作用することができるペプチドを意味する。特に、相互作用領域は、カルシウムイオンと結合したカルシウム結合領域と結合することができ、カルシウムイオンが解離したカルシウム結合領域から解離することができる。相互作用領域の具体例は、例えばＭ１３ペプチドである。
【００４０】
カルシウム結合領域および相互作用領域として、カルシウム結合タンパク質であるカルモジュリン（ＣａＭ）およびカルシウムイオンと結合したカルモジュリンと結合するＭ１３とが一連に繋がったペプチドを使用することができる（非特許文献１）。非特許文献１では、この一連に繋がった連結化ペプチドを用いて、ＣａＭおよびＭ１３が２種の蛍光タンパク質に挟まれた構造を有するカルシウムセンサータンパク質を作製しており、この蛍光センサータンパクを「カメレオンタンパク（以下、カメレオンと称す）」と呼んでいる。特に、カルシウム結合領域および相互作用領域として、カメレオンの２３０番目から４０６番目のアミノ酸配列に対応するペプチド、２３０番目から３９６番目に対応するペプチド、２３０番目から４０１番目に対応するペプチド、２３０番目から４１１番目に対応するペプチドまたは２３０番目から４１６番目に対応するペプチドを使用することができる。これらの具体的な配列が示されたペプチドは、それらの機能を失わない限り、例えば感度の改良のための変異を含んだものであっても、本発明に係るカルシウムセンサータンパク質に使用することができる。
【００４１】
発光酵素とは発光を伴う反応を触媒する酵素を意味する。発光酵素は、カルシウムセンサータンパク質において、Ｎ末端側断片およびＣ末端側断片として含まれている。「Ｎ末端側断片」とは、Ｃ末端から複数のアミノ酸が欠失した発光酵素の断片であって、発光酵素活性を失った断片を意味する。「Ｃ末端側断片」とは、Ｎ末端から複数のアミノ酸が欠失した発光酵素の断片であって、発光酵素活性を失った断片を意味する。
【００４２】
発光酵素としては、例えばルシフェラーゼを使用できる。ルシフェラーゼには、ホタル由来のもの、ウミシイタケ由来のものおよびバクテリア由来のもの等が存在するが、特にホタル由来ルシフェラーゼまたはウミシイタケ（レニラ）由来ルシフェラーゼを使用することが好ましい。また、発光基質は発光酵素に応じて選択されるが、ホタルルシフェラーゼを発光酵素として使用する場合、発光基質としてはルシフェリンを使用することができる。また、レニラルシフェラーゼ発光酵素として使用する場合、発光基質としてはセレンテラジンを使用することができる。特に、Ｎ末端側断片としてホタルルシフェラーゼの１番目から４１６番目のアミノ酸配列に対応するペプチド断片を使用し、Ｃ末端側断片としてホタルルシフェラーゼの３９９番目から５５０番目のアミノ酸配列に対応するペプチド断片を使用することができる。あるいは、Ｎ末端側断片としてレニラルシフェラーゼの１番目から９１番目のアミノ酸配列に対応するペプチド断片を使用し、Ｃ末端側断片としてレニラルシフェラーゼの９２番目から３１１番目のアミノ酸配列に対応するペプチド断片を使用することができる。これらの具体的な配列が示されたペプチドは、それらの機能を失わない限り、例えば活性の改良のための変異を含んだものであっても、本発明に係るカルシウムセンサータンパク質に使用することができる。
【００４３】
カルシウムセンサータンパク質において、カルシウム結合領域および相互作用領域は、Ｃ末端側断片とＮ末端側断片との間に配置される。カルシウム結合領域および相互作用領域のどちらがカルシウムセンサータンパク質のＮ末端側に位置してもよいが、上述のカメレオンタンパク質由来のＣａＭ−Ｍ１３を使用する場合、カルシウムセンサータンパク質のＮ末端側にカルシウム結合領域であるＣａＭが位置し、Ｃ末端側に相互作用領域であるＭ１３が位置する。一方、発光酵素のＣ末端側断片およびＮ末端側断片も、どちらがカルシウムセンサータンパク質のＮ末端側に位置してもよい。例えば、カルシウムセンサータンパク質のＮ末端側に発光酵素のＮ末端側断片を配置し、カルシウムセンサータンパク質のＣ末端側に発光酵素のＣ末端側断片を配置してもよい。これに対し、Ｎ末端断片およびＣ末端断片を、発酵酵素における本来の配置に対して円順列置換させてもよい。すなわち、カルシウムセンサータンパク質のＮ末端側に発光酵素のＣ末端側断片を配置し、カルシウムセンサータンパク質のＣ末端側に発光酵素のＮ末端側断片を配置してもよい。
【００４４】
したがって、カルシウムセンタータンパク質は、例えば、そのＮ末端側から、発光酵素のＣ末端側断片、カルシウム結合領域、相互作用領域および発光酵素のＮ末端側断片が順に並んだ構造を有する。この具体例として、カルシウムセンサータンパク質は配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有してよい。このタンパク質は、そのＮ末端側から、ホタルルシフェラーゼのＣ末端側断片（３９９番目から５５０番目）、カメレオンタンパク質のＣａＭ−Ｍ１３断片（２３０番目から４０６番目）およびホタルルシフェラーゼのＮ末端側断片（１番目から４１６番目）が配置された構造を有し、本願では「ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３＿Ｎ」と称される（図５ａ参照）。また、カルシウムセンサータンパク質は、配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有してよい。このタンパク質は、そのＮ末端側から、レニラルシフェラーゼのＣ末端側断片（９２番目から３１１番目）、カメレオンタンパク質のＣａＭ−Ｍ１３断片（２３０番目から４０６番目）およびレニラルシフェラーゼのＮ末端側断片（１番目から９１番目）が配置された構造を有し、本願では「ｃｐｈＲＬ＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３＿Ｎ」と称される（図５ｂ参照）。
【００４５】
カルシウムセンサータンパク質は、カルシウムの存在に応じて、発光酵素としての活性を取得または喪失することができる。カルシウムセンサータンパク質に含まれる発光酵素のＣ末端側断片およびＮ末端側断片は、それぞれ発光酵素としての活性を失っているものの、カルシウムセンサータンパク質の構造に応じてＣ末端側断片とＮ末端側断片とが接近して結合することで、発光活性を回復することができる。カルシウムセンサータンパク質の構造は、カルシウム結合領域と相互作用領域とによって調節される。例えば、図５ａに示されるように、ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３＿Ｎでは、カルシウムイオンが存在していない場合、Ｃ末端側断片とＮ末端側断片とは適度に接近して結合し発光酵素としての活性を示すが、カルシウムイオンが存在すると、ＣａＭにカルシウムイオンが結合し、さらにそこへＭ１３が結合することで、センサータンパク質全体としての構造が変化し、発光酵素としての活性を失う。一方、図５ｂに示されるｃｐｈＲＬ＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３＿Ｎでは、カルシウムイオンが存在していない場合には、Ｃ末端側断片とＮ末端側断片とが結合できず発光酵素としての活性を示さないが、カルシウムイオンが存在するとＣａＭおよびＭ１３との作用によりセンサータンパク質の構造が変化し、Ｃ末端側断片とＮ末端側断片とが適度に接近して結合するため発光酵素としての活性を示す。このような機構に基づいて、カルシウムセンサータンパク質を用いることで、カルシウムイオンの存在または非存在を、発光酵素による発光の有無として検出することができる。
【００４６】
なお、発光酵素のＣ末端側断片とＮ末端側断片との間の「結合」の態様に特別な限定はなく、共有結合または非共有結合等の化学的結合であってもよい。特に、Ｎ末端側断片とＣ末端側断片とが発光酵素の本来の機能を果たしうる程度に「接近」または「接触」している状態であることが好ましい。あるいは、Ｎ末端側断片とＣ末端側断片とが「会合」する状態であってもよい。すなわち、当該表現において使用される「結合」という用語は、「接近」、「接触」または「会合」という意味を含む。
【００４７】
上述のとおり、本発明に係るカルシウムセンサータンパク質は、カルシウムの存在に応じて、発光酵素の活性が消失または回復する。また、本発明に係る方法は、当該タンパク質のこのような特徴を利用する。従来の分子間のエネルギー共鳴（ＦＲＥＴ、ＢＲＥＴ等）を利用する技術では、エネルギー共鳴の効率の低さに起因してダイナミックレンジが狭く、また、検出される波長の違いによってカルシウムの存在／非存在が解析される。これに対し、本発明では、ルシフェラーゼといった発光酵素による単純な反応を利用するためダイナミックレンジが広く、イメージングも可能となり、また、カルシウムの存在／非存在は発光の発生／非発生に対応するため、シグナル／ノイズ比の高い検出結果が得られる。
【００４８】
［核酸］
次に、本発明に係るカルシウムセンサータンパク質をコードする遺伝子を含む核酸に関して説明する。
【００４９】
当該核酸は、本発明に係るカルシウムセンサータンパク質をコードする遺伝子を含む。特に、そのような遺伝子のＯＲＦ領域を含む。この遺伝子のコドンは、対象とする細胞における発現に最適化されていてよい。また、Ｋｏｚａｋ配列等、発現量を上昇させるための配列を含んでよく、または付与されていてよい。
【００５０】
また、本発明は上記核酸を含むベクターに関する。当該ベクターは、対象とする細胞における発現のための発現ベクターであってよい。発現ベクターである場合、カルシウムセンサータンパク質をコードする遺伝子の配列のほかに、発現を制御するための配列、マーカー遺伝子の配列等、一般的な発現ベクターに含まれる配列を含んでよい。本発明に係る細胞内カルシウム解析方法の細胞作製工程において、当該発現ベクターを使用することができる。すなわち、当該発現ベクターを細胞に導入し、カルシウムセンサータンパク質を発現させて、カルシウムの検出に使用できる。
【００５１】
［装置］
次に、本発明に係るカルシウム解析方法（特に撮像工程および解析工程）にて使用される発光観察システム１００について、図１から３を用いて説明する。図１は、発光観察システム１００の全体構成の一例を示す図である。図２は、発光観察システム１００の発光画像撮像ユニット１０６の構成の一例を示す図である。図３は、発光観察システム１００の発光画像撮像ユニット１０６の構成の一例を示す図である。
【００５２】
まず、図１に示すように、発光観察システム１００は、細胞１０２を収納した容器１０３（具体的にはシャーレ、スライドガラス、マイクロプレート、ゲル支持体、微粒子担体など）と、容器１０３を配置するステージ１０４と、発光画像撮像ユニット１０６と、画像解析装置１１０と、で構成されている。微弱な発光を測定するための発光画像撮像ユニット１０６をステージ１０４の下側に配置してもよい。これにより、カバー開閉によるサンプル上方からの外乱光を完全に遮断できて発光画像のシグナル／ノイズ比を増すことができる。発光画像撮像ユニット１０６は、レーザー走査式の光学系であってもよい。
【００５３】
ここで、細胞１０２は、例えば、カルシウム濃度に依存して発光するよう発光標識された生きた細胞である。また、カルシウム濃度に依存して発光するタンパク質として、発光酵素のＣ末端側断片とＮ末端側断片との間にカルシウム結合領域（カルモジュリン）およびカルシウム結合領域と可逆的に結合または解離できる相互作用領域（Ｍ１３）を挿入した融合タンパク質の他に、例えば、特許文献２または特許文献３に開示されている融合タンパク質を用いてもよい。また、ここで、細胞１０２に、上記融合タンパク質が発現されるよう構成した、当該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入することにより、融合タンパク質が細胞１０２内で発現されるよう構成してもよい。なお、細胞１０２には、添加工程において、当該細胞外から所定の発光基質（例えばルシフェリンなど）および所定の刺激（例えば薬物刺激など）が与えられる。
【００５４】
また、発光画像撮像ユニット１０６は、具体的には、正立型の発光顕微鏡であり、細胞１０２の発光画像を撮像する。発光画像撮像ユニット１０６は、図示の如く、対物レンズ１０６ａと、ダイクロイックミラー１０６ｂと、ＣＣＤカメラ１０６ｃと、結像レンズ１０６ｆと、で構成されている。対物レンズ１０６ａは、具体的には、（開口数／倍率）２の値が０．０１以上のものである。ダイクロイックミラー１０６ｂは、細胞１０２から発せられた発光を色別に分離し、２色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合に用いる。ＣＣＤカメラ１０６ｃは、対物レンズ１０６ａ、ダイクロイックミラー１０６ｂおよび結像レンズ１０６ｆを介して当該ＣＣＤカメラ１０６ｃのチップ面に投影された細胞１０２の発光画像および明視野画像を撮る。また、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、画像解析装置１１０と有線または無線で通信可能に接続される。ここで、細胞１０２が撮像範囲中に複数存在する場合、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、当該撮像範囲中に含まれる複数の細胞１０２の発光画像および明視野画像を撮像してもよい。結像レンズ１０６ｆは、対物レンズ１０６ａおよびダイクロイックミラー１０６ｂを介して当該結像レンズ１０６ｆに入射した像（具体的には細胞１０２を含む像）を結像する。なお、図１では、ダイクロイックミラー１０６ｂで分離した２つの発光に対応する発光画像を２台のＣＣＤカメラ１０６ｃで別々に撮像する場合の一例を示しており、１つの発光を用いる場合には、発光画像撮像ユニット１０６は、対物レンズ１０６ａ、１台のＣＣＤカメラ１０６ｃおよび結像レンズ１０６ｆで構成されてもよい。
【００５５】
ここで、２色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合、発光画像撮像ユニット１０６は、図２に示すように、対物レンズ１０６ａと、ＣＣＤカメラ１０６ｃと、スプリットイメージユニット１０６ｄと、結像レンズ１０６ｆと、で構成されてもよい。そして、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、スプリットイメージユニット１０６ｄおよび結像レンズ１０６ｆを介して当該ＣＣＤカメラ１０６ｃのチップ面に投影された細胞１０２の発光画像（スプリットイメージ）および明視野画像を撮像してもよい。スプリットイメージユニット１０６ｄは、細胞１０２から発せられた発光を色別に分離し、ダイクロイックミラー１０６ｂと同様、２色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合に用いる。
【００５６】
また、複数色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合（つまり、多色の発光を用いる場合）、発光画像撮像ユニット１０６は、図３に示すように、対物レンズ１０６ａと、ＣＣＤカメラ１０６ｃと、フィルターホイール１０６ｅと、結像レンズ１０６ｆと、で構成されてもよい。そして、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、フィルターホイール１０６ｅおよび結像レンズ１０６ｆを介して当該ＣＣＤカメラ１０６ｃのチップ面に投影された細胞１０２の発光画像および明視野画像を撮像してもよい。フィルターホイール１０６ｅは、細胞１０２から発せられた発光をフィルタ交換によって色別に分離し、複数色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合に用いる。
【００５７】
図１に戻り、画像解析装置１１０は、具体的にはパーソナルコンピュータである。そして、画像解析装置１１０は、図４に示すように、大別して、制御部１１２と、システムの時刻を計時するクロック発生部１１４と、記憶部１１６と、通信インターフェース部１１８と、入出力インターフェース部１２０と、入力装置１２２と、出力装置１２４と、で構成されており、これら各部はバスを介して接続されている。
【００５８】
記憶部１１６は、ストレージ手段であり、具体的には、ＲＡＭやＲＯＭ等のメモリ装置、ハードディスクのような固定ディスク装置、フレキシブルディスク、光ディスク等を用いることができる。そして、記憶部１１６は制御部１１２の各部の処理により得られたデータなどを記憶する。通信インターフェース部１１８は、画像解析装置１１０と、ＣＣＤカメラ１０６ｃと、の間における通信を媒介する。すなわち、通信インターフェース部１１８は他の端末と有線または無線の通信回線を介してデータを通信する機能を有する。入出力インターフェース部１２０は、入力装置１２２や出力装置１２４に接続する。ここで、出力装置１２４には、モニタ（家庭用テレビを含む）の他、スピーカやプリンタを用いることができる（なお、以下で、出力装置１２４をモニターとして記載する場合がある）。また、入力装置１２２には、キーボードやマウスやマイクの他、マウスと協働してポインティングデバイス機能を実現するモニターを用いることができる。
【００５９】
また、制御部１１２は、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）等の制御プログラムや各種の処理手順等を規定したプログラムや所要データを格納するための内部メモリを有し、これらのプログラムに基づいて種々の処理を実行する。そして、制御部１１２は、大別して、発光画像撮像指示部１１２ａと、発光画像取得部１１２ｂと、画像解析部１１２ｃと、解析結果出力部１１２ｄと、で構成されている。
【００６０】
また、発光画像撮像指示部１１２ａは、通信インターフェース部１１８を介して、ＣＣＤカメラ１０６ｃへ発光画像および明視野画像の撮像を指示する。発光画像取得部１１２ｂは、ＣＣＤカメラ１０６ｃで撮像した発光画像および明視野画像を、通信インターフェース部１１８を介して取得する。ここで、発光画像撮像指示部１１２ａは、発光画像および明視野画像を繰り返し撮像する指示を行ってもよく、複数の異なる細胞１０２について同時に撮像を実行してもよい。なお、発光画像取得部１１２ｂは、撮像した発光画像および明視野画像を、クロック発生部１１４による時間情報とともに記憶部１１６に格納してもよい。
【００６１】
また、画像解析部１１２ｃは、発光画像取得部１１２ｂで取得した発光画像に基づいて、細胞１０２から発せられる発光の発光強度に基づいてカルシウムの濃度を解析する。ここで、画像解析部１１２ｃは、発光画像取得部１１２ｂにより繰り返し撮像された複数の発光画像に基づいて、経時的なカルシウム濃度の変動を測定してもよく、複数の異なる細胞１０２について同時に発光画像が撮像された場合に、複数の発光画像を細胞１０２ごとに照合してカルシウムの濃度を解析してもよい。
【００６２】
解析結果出力部１１２ｄは、画像解析部１１２ｃでの解析結果を出力装置１２４に出力する。より具体的には、解析結果出力部１１２ｄは、画像解析部１１２ｃで得られた、細胞１０２から発せられる発光の発光強度に基づくカルシウム濃度の時系列データを、グラフ化して出力装置１２４に表示する。
【実施例１】
【００６３】
ホタルルシフェラーゼを用いたカルシウムセンサータンパク質を作製し、その機能を調べた。
【００６４】
［前準備１］
前準備として、ホタルルシフェラーゼのＮ末端側断片遺伝子およびＣ末端側断片遺伝子のクローニング、ＣａＭおよびＭ１３遺伝子のクローニング並びにカルシウムセンサータンパク質発現プラスミドの作製を行った。
【００６５】
（手順１）
ホタルルシフェラーゼの各断片のクローニングのための、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）に用いる合成オリゴＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）を以下に示す配列で調製した。調製したオリゴＤＮＡは、本来の順序でセンサータンパク質内に配置するためのＮ末側断片（ＮＬｕｃ）遺伝子およびＣ末側断片（ＣＬｕｃ）遺伝子、並びに円順列置換してセンサータンパク質内に配置するためのＮ末側断片（ｃｐＮＬｕｃ）遺伝子およびＣ末側断片（ｃｐＣＬｕｃ）遺伝子である。
［ＮＬｕｃ遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列］
ＮＬｕｃ＿Ｆｗ（配列番号１）：５’−ＴＧＴＧＧＡＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＴＧＣＣＡＡ−３’
ＮＬｕｃ＿Ｒｖ（配列番号２）：５’−ＣＡＧＣＴＣＧＡＧＧＴＣＣＴＴＧＴＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＧＴＴ−３’
［ＣＬｕｃ遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列］
ＣＬｕｃ＿Ｆｗ（配列番号３）：５’−ＡＴＣＡＧＡＴＣＴＧＧＣＴＡＣＧＴＴＡＡＣＡＡＣＣＣＣＧＡＧ−３’
ＣＬｕｃ＿Ｒｖ（配列番号４）：５’−ＣＴＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＣＧＧＣＧＡＴＣＴＴＧＣＣＧＣＣ−３’
［ｃｐＮＬｕｃ遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列］
ｃｐＮＬｕｃ＿Ｆｗ（配列番号５）：５’−ＡＴＣＡＧＡＴＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＣＡＡＡＡＡＣＡＴＴＡＡＧ−３’
ｃｐＮＬｕｃ＿Ｒｖ（配列番号６）：５’−ＣＴＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＴＣＣＴＴＧＴＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣ−３’
［ｃｐＣＬｕｃ遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列］
ｃｐＣＬｕｃ＿Ｆｗ（配列番号７）：５’−ＴＧＴＧＧＡＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＧＧＣＴＡＣＧＴＴＡＡＣＡＡＣＣＣＣ−３’
ｃｐＣＬｕｃ＿Ｒｖ（配列番号８）：５’−ＣＡＧＣＴＣＧＡＧＣＡＣＧＧＣＧＡＴＣＴＴＧＣＣＧＣＣＣＴＴ−３’
【００６６】
また、カルモジュリンおよびＭ１３のクローニングのための、ＰＣＲに用いる合成オリゴＤＮＡを以下に示す配列で調製した。
［ＣａＭ−Ｍ１３遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列］
ＣａＭ−Ｍ１３＿Ｆｗ（配列番号９）：５’−ＧＣＣＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧＡＣＣＡＡＣＴＧＡＣＡＧＡＡＧＡＧ−３’
ＣａＭ−Ｍ１３＿Ｒｖ（配列番号１０）：５’−ＣＡＴＧＧＡＴＣＣＣＡＧＴＧＣＣＣＣＧＧＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴ−３’
ＣａＭ−Ｍ１３ｄ１０＿Ｒｖ（配列番号１１）：５’−ＣＡＴＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＴＴＧＧＣＡＧＣＧＣＴＧＡＣＧＧＣ −３’
ＣａＭ−Ｍ１３ｄ０５＿Ｒｖ（配列番号１２）：５’−ＣＡＴＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＡＴＣＴＴＣＴＴＧＡＡＣＣＧＧＴＴ −３’
ＣａＭ−Ｍ１３ａ０５＿Ｒｖ（配列番号１３）：５’−ＣＡＴＧＧＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＴＣＣＡＧＴＧＣ −３’
ＣａＭ−Ｍ１３ａ１０＿Ｒｖ（配列番号１４）：５’−ＣＡＴＧＧＡＴＣＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＧＣＣＣＴＴＧＣＴＣＡＣ −３’
【００６７】
（手順２）
上記のオリゴＤＮＡを用いて、ホタルルシフェラーゼの各断片をＰＣＲによりクローニングした。鋳型としてｐＧＬ４．１０（プロメガ（株）製）を用いた。配列番号１および２のオリゴＤＮＡをプライマーとして用いてＮ末端側断片遺伝子（ＮＬｕｃ：ＧＬ４．１０遺伝子の１番目から４１６番目のアミノ酸を含む）を増幅し、配列番号３および４のオリゴＤＮＡを用いてＣ末端側断片遺伝子（ＣＬｕｃ：ＧＬ４．１０遺伝子の３９９番目から５５０番目のアミノ酸を含む）を増幅し、配列番号５および６のオリゴＤＮＡを用いて円順列置換センサータンパク質用のＮ末端側断片遺伝子（ｃｐＮＬｕｃ：ＧＬ４．１０遺伝子の１番目から４１６番目のアミノ酸を含む）を増幅し、配列番号７および８のオリゴＤＮＡを用いて円順列置換センサータンパク質用のＣ末端側断片遺伝子（ｃｐＣＬｕｃ：ＧＬ４．１０遺伝子の３９９番目から５５０番目のアミノ酸を含む）を増幅した。
【００６８】
（手順３）
上記のオリゴＤＮＡを用いて、ＣａＭおよびＭ１３をＰＣＲによりクローニングした。鋳型としてカメレオン遺伝子（ＹＣ２．１）のｃＤＮＡを用いた（非特許文献１）。配列番号９および１０のオリゴＤＮＡをプライマーとして用いてＣａＭ−Ｍ１３遺伝子（カメレオン遺伝子の２３０番目から４０６番目のアミノ酸配列に対応する領域を含む）、配列番号９および１１のオリゴＤＮＡをプライマーとして用いてＣａＭ−Ｍ１３ｄ１０遺伝子（カメレオン遺伝子の２３０番目から３９６番目のアミノ酸配列に対応する領域を含む）、配列番号９および１２のオリゴＤＮＡをプライマーとして用いてＣａＭ−Ｍ１３ｄ０５遺伝子（カメレオン遺伝子の２３０番目から４０１番目のアミノ酸配列に対応する領域を含む）、配列番号９および１３のオリゴＤＮＡをプライマーとして用いてＣａＭ−Ｍ１３ａ０５遺伝子（カメレオン遺伝子の２３０番目から４１１番目のアミノ酸配列に対応する領域を含む）並びに配列番号９および１４のオリゴＤＮＡをプライマーとして用いてＣａＭ−Ｍ１３ａ１０遺伝子（カメレオン遺伝子の２３０番目から４１６番目のアミノ酸配列に対応する領域を含む）をそれぞれ増幅した。
【００６９】
（手順４）
上記の通り増幅した各遺伝子を発現用プラスミドに挿入することで、カルシウムセンサータンパク質発現用プラスミドを作製した。具体的には、動物細胞発現用プラスミドであるｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）のＢａｍＨＩ部位とＥｃｏＲＩ部位の間に、発光酵素の断片としてＮＬｕｃ遺伝子およびＣＬｕｃ遺伝子を、カルシウム結合領域および相互作用領域としてＣａＭ−Ｍ１３遺伝子、ＣａＭ−Ｍ１３ｄ１０遺伝子、ＣａＭ−Ｍ１３ｄ０５遺伝子、ＣａＭ−Ｍ１３ａ０５遺伝子またはＣａＭ−Ｍ１３ａ１０遺伝子をそれぞれ挿入し、プラスミドｐｃＤＮＡ／ＧＬ４＿Ｎ＿ＣａＭ−Ｍ１３＿Ｃ、ｐｃＤＮＡ／ＧＬ４＿Ｎ＿ＣａＭ−Ｍ１３ｄ１０＿Ｃ、ｐｃＤＮＡ／ＧＬ４＿Ｎ＿ＣａＭ−Ｍ１３ｄ０５＿Ｃ、ｐｃＤＮＡ／ＧＬ４＿Ｎ＿ＣａＭ−Ｍ１３ａ０５＿ＣおよびｐｃＤＮＡ／ＧＬ４＿Ｎ＿ＣａＭ−Ｍ１３ａ１０＿Ｃを作製した。また、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）のＢａｍＨＩ部位とＥｃｏＲＩ部位の間に、発光酵素の断片としてｃｐＮＬｕｃ遺伝子およびｃｐＣＬｕｃ遺伝子を、カルシウム結合領域および相互作用領域としてＣａＭ−Ｍ１３遺伝子、ＣａＭ−Ｍ１３ｄ１０遺伝子、ＣａＭ−Ｍ１３ｄ０５遺伝子、ＣａＭ−Ｍ１３ａ０５遺伝子またはＣａＭ−Ｍ１３ａ１０遺伝子をそれぞれ挿入し、プラスミドｐｃＤＮＡ／ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３＿Ｎ、ｐｃＤＮＡ／ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３ｄ１０＿Ｎ、ｐｃＤＮＡ／ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３ｄ０５＿Ｎ、ｐｃＤＮＡ／ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３ａ０５＿ＮおよびｐｃＤＮＡ／ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３ａ１０＿Ｎを作製した。
【００７０】
［前準備２］
カルシウムセンサータンパク質の機能の測定のために、細胞をセロトニン刺激することでカルシウムイオンを流入させる実験系を使用する。そのためにセロトニン受容体である５ＨＴ２Ａ受容体（配列番号２３）の遺伝子をクローニングした。
【００７１】
（手順１）
ＰＣＲに用いる合成オリゴＤＮＡを以下に示す配列で調製した。
［ヒト５ＨＴ２Ａ受容体遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列］
ＨＵ＿５ＨＴ２ＡＲ＿Ｆｗ（配列番号１５）：５’−ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＡＴＴＣＴＴＴＧＴＧＡＡＧＡＡＡＡＴ−３’
ＨＵ＿５ＨＴ２ＡＲ＿Ｒｖ（配列番号１６）：５’−ＴＣＡＣＡＣＡＣＡＧＣＴＣＡＣＣＴＴＴＴＣＡＴＴＣＡＣＴＣＣ−３’
【００７２】
（手順２）
プライマーとして上記オリゴＤＮＡを用い、鋳型としてヒト脳ｃＤＮＡライブラリ（タカラバイオ（株）製）を用いて、５ＨＴ２Ａ受容体遺伝子（ヒトの５ＨＴ２Ａ受容体遺伝子の全長に対応する領域を含む）をＰＣＲにより増幅した。
【００７３】
（手順３）
ＰＣＲで増幅させた５ＨＴ２Ａ受容体遺伝子をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクターにサブクローニングした後、作製したＤＮＡの配列をＤＮＡシーケンシングにより確認した。
【００７４】
（手順４）
手順２の通り増幅した５ＨＴ２Ａ受容体遺伝子を、哺乳類細胞の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン（株）製）に挿入し、ヒト５ＨＴ２Ａ受容体発現用プラスミドｐｃＤＮＡ／５ＨＴ２ＡＲを作製した。
【００７５】
［実験］
上記の通り作製したカルシウムセンサータンパク質発現用プラスミドおよびヒト５ＨＴ２Ａ受容体発現用プラスミドを用いて、ＨＥＫ２９３細胞におけるカルシウム濃度変動の発光イメージングを行った。
【００７６】
（手順１）
ＡＴＣＣ社より入手したＨＥＫ２９３細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター内にて、１０％  Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍおよび１×Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓを添加したＥａｒｌｅ’ｓ  ＭＥＭ／培地（ＧＩＢＣＯ社製）中で培養した。
【００７７】
（手順２）
次の通り、細胞に各発現用プラスミドを導入した。細胞を、直径３５ｍｍガラスボトムディッシュに２ｘ１０５／ｄｉｓｈの細胞密度で播種し、５％ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した後、ヒト５ＨＴ２Ａ受容体発現用プラスミドｐｃＤＮＡ／５ＨＴ２ＡＲおよびカルシウムセンサータンパク質発現用プラスミドｐｃＤＮＡ／ＧＬ４＿Ｎ＿ＣａＭ−Ｍ１３＿Ｃ、ｐｃＤＮＡ／ＧＬ４＿Ｎ＿ＣａＭ−Ｍ１３ｄ１０＿Ｃ、ｐｃＤＮＡ／ＧＬ４＿Ｎ＿ＣａＭ−Ｍ１３ｄ０５＿Ｃ、ｐｃＤＮＡ／ＧＬ４＿Ｎ＿ＣａＭ−Ｍ１３ａ０５＿Ｃ、ｐｃＤＮＡ／ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３＿Ｎ、ｐｃＤＮＡ／ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３ｄ１０＿Ｎ、ｐｃＤＮＡ／ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３ｄ０５＿ＮまたはｐｃＤＮＡ／ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３ａ０５＿Ｎを、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ（ロシュ社製）を用いてトランスフェクションを行い、５％ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。
【００７８】
（手順３）
次の通り、発光画像の撮像を行った。培地中にルシフェリン２ｍＭ（プロメガ社製）を加えて１時間静置し、発光顕微鏡ＬＶ（ＬＵＭＩＮＯＶＩＥＷ）−２００（オリンパス社製）にセットし、１２秒間隔で発光画像のタイムラプス撮影を行った。発光観察の条件として、対物レンズの倍率を４０倍、露出時間を５〜１０秒間、ビニングを１ｘ１とし、ＥＭ−ＣＣＤカメラｉＸｏｎ（アンドール社製）を用いて、画像解析装置１１０として構成したパーソナルコンピュータに取り込んだ。
【００７９】
（手順４）
タイムラプス撮影開始から２分後、セロトニン５ＨＴ（最終濃度１０μＭ）で刺激を行い、引き続き発光画像のタイムラプス撮影を行った。この刺激によって、細胞内にカルシウムイオンが流入する。
【００８０】
（手順５）
手順３で撮影した各々の発光画像に対して複数のＲＯＩ（Ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ：関心領域）を指定し（図６）、手順４で撮影した各々の発光画像に対して複数のＲＯＩを指定した（図７）。さらに、指定した各ＲＯＩの発光強度を各々の発光画像に基づいて測定し、その発光強度の経時変化をグラフで表示した（図８）。なお、図６から８は、細胞内にｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３ｄ１０＿Ｎを発現させた場合の結果を示す。発光画像の解析は、画像解析部１１２ｃとして機能するＭｅｔａMｏｒｐｈソフトウェア（ユニバーサルイメージング社製）を用いて行った。
【００８１】
［結果］
図６−８に示されるように、円順列置換型のホタルルシフェラーゼ遺伝子を用いたカルシウムセンサータンパク質ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３＿Ｎ（配列番号２１）を用いた場合、セロトニン５ＨＴ刺激の前後で発光強度の変化を検出することができた。すなわち、刺激前において観察された発光強度（図６）は、刺激後において低下した（図７）。グラフを見ると、５ＨＴ刺激直後（横軸２−３分）に蛍光強度が大きく下がることがわかる（図８）。なお、５分後以降、発光強度が上下する様子が観察されたが、これは細胞によるカルシウム濃度の調節を反映していると考えられる。このように、ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３＿Ｎを用いることによって、刺激に対するカルシウム応答を発光強度の減少としてシングルセル（単一細胞）レベルで検出できることがわかった。
【００８２】
一方、ｐｃＤＮＡ／ＧＬ４＿Ｎ＿ＣａＭ−Ｍ１３＿Ｃ、ｐｃＤＮＡ／ＧＬ４＿Ｎ＿ＣａＭ−Ｍ１３ｄ１０＿Ｃ、ｐｃＤＮＡ／ＧＬ４＿Ｎ＿ＣａＭ−Ｍ１３ｄ０５＿ＣまたはｐｃＤＮＡ／ＧＬ４＿Ｎ＿ＣａＭ−Ｍ１３ａ０５＿Ｃを用いた場合は、５ＨＴで細胞を刺激したときに発光強度に変化が見られず、ｐｃＤＮＡ／ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３ｄ１０＿Ｎ、ｐｃＤＮＡ／ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３ｄ０５＿Ｎ、ｐｃＤＮＡ／ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３ａ０５＿Ｎを用いた場合は、発光が弱く画像取得ができなかった。
【００８３】
また、個々の細胞における発光強度の変化を見ると、５ＨＴ刺激において細胞間の応答に大きなばらつきのあることがわかった（図８）。これまでのカルシウムを介する細胞内情報伝達機構の研究から、カルシウム濃度変化の細胞内分布あるいは時間経過が異なると、シグナルの意味が異なることが明らかにされている。従来のルミノメーターを用いた発光量変化の解析では、細胞集団全体の観測に留まり、個々の細胞の応答までは解析できなかった。しかし、本発明に係るカルシウムセンサータンパク質を用いた方法の場合、生体内の変化を１細胞毎にリアルタイムに観察することができ、細胞内シグナルの働きを詳細に研究できることがわかった。
【実施例２】
【００８４】
レニラルシフェラーゼを用いたカルシウムセンサータンパク質を作製し、その機能を調べた。
【００８５】
［前準備１］
前準備として、レニラルシフェラーゼのＮ末端側断片遺伝子およびＣ末端側断片遺伝子のクローニング、ＣａＭおよびＭ１３遺伝子のクローニング並びにカルシウムセンサータンパク質発現プラスミドの作製を行った。
【００８６】
（手順１）
円順列置換されたレニラルシフェラーゼのＮ末側断片（ｃｐＲＮＬｕｃ）遺伝子およびＣ末側断片（ｃｐＲＣＬｕｃ）遺伝子の作製のための、ＰＣＲに用いる合成オリゴＤＮＡを以下に示す配列で調製した。
［ｃｐＲＮＬｕｃ遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列］
ｃｐＲＮＬｕｃ＿Ｆｗ（配列番号１７）：５’−ＡＴＣＡＧＡＴＣＴＧＣＴＴＣＣＡＡＧＧＴＧＴＡＣＧＡＣＣＣＣ−３’
ｃｐＲＮＬｕｃ＿Ｒｖ（配列番号１８）：５’−ＣＴＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＧＡＧＣＣＡＴＴＣＣＣＧＣＴＣＴＴ−３’
［ｃｐＲＣＬｕｃ遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列］
ｃｐＲＣＬｕｃ＿Ｆｗ（配列番号１９）：５’−ＴＧＴＧＧＡＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＡＴＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＡＴＣＡＣＴＡＣ−３’
ｃｐＲＣＬｕｃ＿Ｒｖ（配列番号２０）：５’−ＣＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴＧＣＴＣＧＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＣＧＣＧ−３’
【００８７】
なお、ＣａＭおよびＭ１３遺伝子のクローニングには、実施例１と同様のオリゴＤＮＡ（配列番号９−１４）を用いる。
【００８８】
（手順２）
上記のオリゴＤＮＡを用いて、レニラルシフェラーゼの各断片をＰＣＲによりクローニングした。鋳型としてｈＲｌｕｃ（プロメガ（株）製）を用いた。プライマーとして
配列番号１７および１８のオリゴＤＮＡを用いて、円順列置換センサータンパク質用のＮ末端側断片遺伝子（ｃｐＲＮＬｕｃ：ｈＲｌｕｃ遺伝子の１番目から９１番目のアミノ酸を含む）を増幅し、配列番号１９および２０のオリゴＤＮＡを用いて、末端側断片遺伝子（ｃｐＲＣＬｕｃ：ｈＲｌｕｃ遺伝子の９２番目から３１１番目のアミノ酸を含む）を増幅した。
【００８９】
また、ＣａＭおよびＭ１３を、実施例１と同様に、カメレオン遺伝子（ＹＣ２．１）からクローニングすることで、ＣａＭ−Ｍ１３遺伝子、ＣａＭ−Ｍ１３ｄ１０遺伝子、ＣａＭ−Ｍ１３ｄ０５遺伝子、ＣａＭ−Ｍ１３ａ０５遺伝子およびＣａＭ−Ｍ１３ａ１０遺伝子を増幅した。
【００９０】
（手順３）
上記の通り増幅した各遺伝子を発現用プラスミドに挿入することで、カルシウムセンサータンパク質発現用プラスミドを作製した。具体的には、動物細胞発現用プラスミドであるｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）のＢａｍＨＩ部位とＥｃｏＲＩ部位の間に、発光酵素の断片としてｃｐＲＮＬｕｃ遺伝子およびｃｐＲＣＬｕｃ遺伝子を、カルシウム結合領域および相互作用領域としてＣａＭ−Ｍ１３遺伝子、ＣａＭ−Ｍ１３ｄ１０遺伝子、ＣａＭ−Ｍ１３ｄ０５遺伝子、ＣａＭ−Ｍ１３ａ０５遺伝子またはＣａＭ−Ｍ１３ａ１０遺伝子をそれぞれ挿入し、プラスミドｐｃＤＮＡ／ｃｐｈＲＬ＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３＿Ｎ、ｐｃＤＮＡ／ｃｐｈＲＬ＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３ｄ１０＿Ｎ、ｐｃＤＮＡ／ｃｐｈＲＬ＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３ｄ０５＿Ｎ、ｐｃＤＮＡ／ｃｐｈＲＬ＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３ａ０５＿ＮおよびｐｃＤＮＡ／ｃｐｈＲＬ＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３ａ１０＿Ｎを作製した。
【００９１】
［前準備２］
カルシウムセンサータンパク質の機能の測定のために、細胞をセロトニン刺激することでカルシウムイオンを流入させる実験系を使用する。そのためにセロトニン受容体である５ＨＴ２Ａ受容体の遺伝子を、実施例１と同様にクローニングした。
【００９２】
［実験］
上記の通り作製したカルシウムセンサータンパク質発現用プラスミドおよびヒト５ＨＴ２Ａ受容体発現用プラスミドを用いて、ＨＥＫ２９３細胞におけるカルシウム濃度変動の発光イメージングを行った。
【００９３】
（手順１）
ＡＴＣＣ社より入手したＨＥＫ２９３細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター内にて、１０％  Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍおよび１×Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓを添加したＥａｒｌｅ’ｓ  ＭＥＭ／培地（ＧＩＢＣＯ社製）中で培養した。
【００９４】
（手順２）
次の通り、細胞に各発現用プラスミドを導入した。細胞を、直径３５ｍｍガラスボトムディッシュに２ｘ１０５／ｄｉｓｈの細胞密度で播種し、５％ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した後、ヒト５ＨＴ２Ａ受容体発現用プラスミドｐｃＤＮＡ／５ＨＴ２ＡＲおよびカルシウムセンサータンパク質発現用プラスミドｐｃＤＮＡ／ｃｐｈＲＬ＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３＿Ｎ、ｐｃＤＮＡ／ｃｐｈＲＬ＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３ｄ１０＿Ｎ、ｐｃＤＮＡ／ｃｐｈＲＬ＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３ｄ０５＿Ｎ、ｐｃＤＮＡ／ｃｐｈＲＬ＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３ａ０５＿ＮおよびｐｃＤＮＡ／ｃｐｈＲＬ＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３ａ１０＿Ｎを、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ（ロシュ社製）を用いてトランスフェクションを行い、５％ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。
【００９５】
（手順３）
次の通り、発光画像の撮像を行った。培地中にセレンテラジン５０μＭ（プロメガ社製）を加えて１時間静置し、発光顕微鏡ＬＶ（ＬＵＭＩＮＯＶＩＥＷ）−２００（オリンパス社製）にセットし、５秒間隔で発光画像のタイムラプス撮影を行った。発光観察の条件として、対物レンズの倍率を４０倍、露出時間を５〜１０秒間、ビニングを１ｘ１とし、ＥＭ−ＣＣＤカメラｉＸｏｎ（アンドール社製）を用いて、画像解析装置１１０として構成したパーソナルコンピュータに取り込んだ。
【００９６】
（手順４）
タイムラプス撮影開始から２分後、セロトニン５ＨＴ（最終濃度１０μＭ）で刺激を行い、引き続き発光画像のタイムラプス撮影を行った。この刺激によって、細胞内にカルシウムイオンが流入する。
【００９７】
（手順５）
手順３で撮影した各々の発光画像に対して複数のＲＯＩ（Ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ：関心領域）を指定し（図９）、手順４で撮影した各々の発光画像に対して複数のＲＯＩを指定した（図１０）。さらに、指定した各ＲＯＩの発光強度を各々の発光画像に基づいて測定し、その発光強度の経時変化をグラフで表示した（図１１）。なお、図９から１１は、細胞内にｃｐｈＲＬ＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３＿Ｎを発現させた場合の結果を示す。発光画像の解析は、画像解析部１１２ｃとして機能するＭｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（ユニバーサルイメージング社製）を用いて行った。
【００９８】
［結果］
図９−１１に示されるように、円順列置換型のレニラルシフェラーゼ遺伝子を用いたカルシウムセンサータンパク質ｃｐｈＲＬ＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３＿Ｎ（配列番号２２）を用いた場合、セロトニン５ＨＴ刺激の前後で発光強度の変化を検出することができた。すなわち、刺激前において観察された発光強度（図９）は、刺激後において増大した（図１０）。グラフを見ると、５ＨＴ刺激直後（横軸２−３分および１７−１８分）に発光強度が大きく上がることがわかる（図１１）。このように、ｃｐｈＲＬ＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３＿Ｎを用いることによって、刺激に対するカルシウム応答を発光強度の増強としてシングルセル（単一細胞）レベルで検出できることがわかった。
【００９９】
一方、ｐｃＤＮＡ／ｃｐｈＲＬ＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３ｄ１０＿Ｎ、ｐｃＤＮＡ／ｃｐｈＲＬ＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３ｄ０５＿Ｎ、ｐｃＤＮＡ／ｃｐｈＲＬ＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３ａ０５＿ＮおよびｐｃＤＮＡ／ｃｐｈＲＬ＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３ａ１０＿Ｎを用いた場合は、発光強度が弱く発光画像を取得できなかった。
【０１００】
また、個々の細胞における発光強度の変化を見ると、５ＨＴ刺激において細胞間の応答に大きなばらつきのあることがわかった（図１１）。これまでのカルシウムを介する細胞内情報伝達機構の研究から、カルシウム濃度変化の細胞内分布あるいは時間経過が異なると、シグナルの意味が異なることが明らかにされている。従来のルミノメーターを用いた発光量変化の解析では、細胞集団全体の観測に留まり、個々の細胞の応答までは解析できなかった。ところが、本発明に係るカルシウムセンサータンパク質を用いた方法の場合、生体内の変化を１細胞毎にリアルタイムに観察することができ、細胞内シグナルの働きを詳細に研究できることがわかった。
【０１０１】
以上、実施例１および２の実験によれば、本発明に係るカルシウムセンサータンパク質を用いた方法によって、細胞内の情報伝達に影響を及ぼすことなく、各細胞からの正確な定量的結果を得ることができ、その結果、個々の細胞においてカルシウム濃度の変化を再現性良く経時的に観察できることがわかる。
【０１０２】
［その他の実施形態］
本発明は、上述した実施形態以外にも、特許請求の範囲に記載した技術的思想の範囲内において種々の異なる実施の形態にて実施されてもよい。
【０１０３】
例えば、上述した実施形態においては、主に、互いに結合することにより発光酵素活性が回復するよう分割させた発光酵素のＮ末端側断片およびＣ末端側断片、カルシウム結合タンパク質であるカルモジュリン並びにカルシウム依存的にカルモジュリンと結合するペプチド（Ｍ１３）からなる融合タンパク質をカルシウムセンサータンパク質として説明を行ったが、本発明はこれに限らず、発光酵素のＮ末端側断片およびＣ末端側断片、カルシウム結合タンパク質であるカルモジュリン並びにカルシウム依存的にカルモジュリンと結合するペプチド（Ｍ１３）からなる融合タンパク質に替えて、特許文献２、特許文献３、非特許文献２等に開示されているカルシウムセンサータンパク質を用いてもよい。
【０１０４】
また、上述した記載によれば、次の要旨に表現されるポリペプチドの態様も本発明に包含される。
［ポリペプチド態様１］（機能：スプリットルシフェラーゼの相互作用）
前記発光酵素のＮ末端側断片およびＣ末端側断片、カルシウム結合タンパク質であるカルモジュリン並びにカルシウム依存的にカルモジュリンと結合するペプチド（Ｍ１３）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記発光酵素のＮ末端側断片およびＣ末端側断片は非共有結合的に相互作用し、前記非共有結合的相互作用は調整可能であることを特徴とするポリペプチド。
［ポリペプチド態様２］（機能：ＣａＭ−Ｍ１３の作用）
前記カルシウム結合タンパク質であるカルモジュリンおよびカルシウム依存的にカルモジュリンと結合するペプチド（Ｍ１３）が、前記非共有結合的相互作用を検出可能に変化させることを特徴とする前記態様１に記載のポリペプチド。
［ポリペプチド態様３］（機能：外因性因子の作用）
前記非共有結合的相互作用は外因性因子の存在下で強化されることを特徴とする前記態様１に記載のポリペプチド。
［ポリペプチド態様４］（機能：カルシウムの作用）
前記外因性因子はカルシウムであることを特徴とする前記態様２に記載のポリペプチド。
［ポリペプチド態様５］（機能：発光）
前記態様３に記載のポリペプチドであって、前記非共有的相互作用により発光することを特徴とするポリペプチド。
【産業上の利用可能性】
【０１０５】
以上詳述に説明したように、本発明にかかるカルシウム解析方法は、バイオ、製薬、医療など様々な分野で好適に用いることができる。
[付記]以下に、出願当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［項１］  発光酵素のＮ末端側断片、前記発光酵素のＣ末端側断片、カルシウム結合領域および前記カルシウム結合領域と可逆的に結合または解離できる相互作用領域を含むカルシウムセンサータンパク質であって、前記カルシウム結合領域および前記相互作用領域は前記Ｃ末端側断片と前記Ｎ末端側断片との間に配置されたカルシウムセンサータンパク質を含む細胞を作製する細胞作製工程と、
前記細胞作製工程で作製した前記細胞に当該細胞外から所定の発光基質を添加する添加工程と、
前記添加工程で前記所定の発光基質が与えられた前記細胞の発光画像を撮像する撮像工程と、
前記撮像工程で撮像した前記発光画像に基づいて、前記細胞内における前記カルシウムの濃度を解析する解析工程と
を含む細胞内カルシウム解析方法。
［項２］  前記カルシウム結合領域がカルモジュリン由来である項１に記載の細胞内カルシウム解析方法。
［項３］  前記相互作用領域がＭ１３ペプチドである項１または２に記載の細胞内カルシウム解析方法。
［項４］  前記発光酵素がホタルルシフェラーゼであり、
前記Ｎ末端側断片がホタルルシフェラーゼのアミノ酸番号１番目から４１６番目のアミノ酸配列を含み、
前記Ｃ末端側断片がホタルルシフェラーゼのアミノ酸番号３９９番目から５５０番目のアミノ酸配列を含む
項１から３の何れか１項に記載の細胞内カルシウム解析方法。
［項５］  前記発光酵素がレニラルシフェラーゼであり、
前記Ｎ末端側断片がレニラルシフェラーゼのアミノ酸番号１番目から９１番目のアミノ酸配列を含み、
前記Ｃ末端側断片がレニラルシフェラーゼのアミノ酸番号９２番目から３１１番目のアミノ酸配列を含む
項１から３の何れか１項に記載の細胞内カルシウム解析方法。
［項６］  前記Ｎ末端断片および前記Ｃ末端断片は、前記発酵酵素における本来の配置に対して円順列置換されている項１から５の何れか１項に記載の細胞内カルシウム解析方法。
［項７］  前記撮像工程が前記発光画像を繰り返し撮像することを含む項１から６の何れか１項に記載の細胞内カルシウム解析方法。
［項８］  前記撮像工程が複数の異なる細胞に対して同時に行われ、
前記解析工程が前記細胞ごとに行われる、
項１から７の何れか１項に記載の細胞内カルシウム解析方法。
［項９］  前記カルシウムセンサータンパク質が配列番号２１または２２に示されるアミノ酸配列を有する項１から８の何れか１項に記載の細胞内カルシウム解析方法。
［項１０］  発光酵素のＮ末端側断片、前記発光酵素のＣ末端側断片、カルシウム結合領域および前記カルシウム結合領域と可逆的に結合または解離できる相互作用領域を含むカルシウムセンサータンパク質であって、前記カルシウム結合領域および前記相互作用領域は前記Ｃ末端側断片と前記Ｎ末端側断片との間に配置され、前記Ｎ末端断片および前記Ｃ末端断片は前記発酵酵素における本来の配置に対して円順列置換されているカルシウムセンサータンパク質。
［項１１］  前記前記カルシウム結合領域がカルモジュリン由来である項１０に記載のカルシウムセンサータンパク質。
［項１２］  前記相互作用領域がＭ１３ペプチドである項１０または１１に記載のカルシウムセンサータンパク質。
［項１３］  前記発光酵素がホタルルシフェラーゼであり、
前記Ｎ末端側断片がホタルルシフェラーゼのアミノ酸番号１番目から４１６番目のアミノ酸配列を含み、
前記Ｃ末端側断片がホタルルシフェラーゼのアミノ酸番号３９９番目から５５０番目のアミノ酸配列を含む
項１０から１２の何れか１項に記載のカルシウムセンサータンパク質。
［項１４］  前記発光酵素がレニラルシフェラーゼであり、
前記Ｎ末端側断片がレニラルシフェラーゼのアミノ酸番号１番目から９１番目のアミノ酸配列を含み、
前記Ｃ末端側断片がレニラルシフェラーゼのアミノ酸番号９２番目から３１１番目のアミノ酸配列を含む
項１０から１２の何れか１項に記載のカルシウムセンサータンパク質。
［項１５］  配列番号２１または２２に示されるアミノ酸配列を有する項１０から１４の何れか１項に記載のカルシウムセンサータンパク質。
【符号の説明】
【０１０６】
１００  発光観察システム
１０２  細胞
１０３  容器（シャーレ）
１０４  ステージ
１０６  発光画像撮像ユニット
１０６ａ  対物レンズ（発光観察用）
１０６ｂ  ダイクロイックミラー
１０６ｃ  ＣＣＤカメラ
１０６ｄ  スプリットイメージユニット
１０６ｅ  フィルターホイール
１０６ｆ  結像レンズ
１１０  画像解析装置
１１２  制御部
１１２ａ  発光画像撮像指示部
１１２ｂ  発光画像取得部
１１２ｃ  画像解析部
１１２ｄ  解析結果出力部
１１４  クロック発生部
１１６  記憶部
１１８  通信インターフェース部
１２０  入出力インターフェース部
１２２  入力装置
１２４  出力装置
【図１】
0005893241.tif 000002
【図２】
0005893241.tif 000003
【図３】
0005893241.tif 000004
【図４】
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【図５】
0005893241.tif 000006
【図６】
0005893241.tif 000007
【図７】
0005893241.tif 000008
【図８】
0005893241.tif 000009
【図９】
0005893241.tif 000010
【図１０】
0005893241.tif 000011
【図１１】
0005893241.tif 000012
【配列表】
0005893241000001.app