(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
大サブユニットと小サブユニットとを含むキャスパーゼ活性を有するポリペプチドであって、前記キャスパーゼが切断時にキャスパーゼ活性を活性化する神経毒切断部位をさらに含む、前記ポリペプチド。
【請求項２】
前記神経毒切断部位が、大サブユニットのC末端近接領域と、小サブユニットのN末端近接領域との間に位置する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
(i)大サブユニットの前記C末端近接領域が、キャスパーゼ3の大サブユニットのアミノ酸C170からD175、L168からE173、Q161からD175、またはQ161からE173に対応するアミノ酸からなり、小サブユニットの前記N末端近接領域が、キャスパーゼ3の小サブユニットのアミノ酸S176からV190またはS176からC184に対応するアミノ酸からなり、
(ii)大サブユニットの前記C末端近接領域が、キャスパーゼ6の大サブユニットのアミノ酸V174からD179、H172からV177、Q165からD179、またはQ165からV177に対応するアミノ酸からなり、小サブユニットの前記N末端近接領域が、キャスパーゼ6の小サブユニットのアミノ酸S180からA194またはS180からV188に対応するアミノ酸からなり、
(iii)大サブユニットの前記C末端近接領域が、キャスパーゼ7の大サブユニットのアミノ酸D193からD198、L191からQ196、Q184からD198、またはQ184からQ196に対応するアミノ酸からなり、小サブユニットの前記N末端近接領域が、キャスパーゼ7の小サブユニットのアミノ酸S199からV213またはS199からR207に対応するアミノ酸からなり、
(iv)大サブユニットの前記C末端近接領域が、キャスパーゼ8の大サブユニットのアミノ酸K369からD374、Y367からE372、Q360からD374、またはQ360からE372に対応するアミノ酸からなり、小サブユニットの前記N末端近接領域が、キャスパーゼ8の小サブユニットのアミノ酸S375からD389またはS375からT383に対応するアミノ酸からなり、
(v)大サブユニットの前記C末端近接領域が、キャスパーゼ10の大サブユニットのアミノ酸P367からD372、I365からE370、Q358からD372、またはQ358からE370に対応するアミノ酸からなり、小サブユニットの前記N末端近接領域が、キャスパーゼ10の小サブユニットのアミノ酸A373からA386またはA373からQ380に対応するアミノ酸からなり、
(vi)大サブユニットの前記C末端近接領域が、キャスパーゼ9の大サブユニットのアミノ酸H310からD315、K308からE313、Q301からD315、またはQ301からE313に対応するアミノ酸からなり、小サブユニットの前記N末端近接領域が、キャスパーゼ9の小サブユニットのアミノ酸A316からT330またはA316からI324に対応するアミノ酸からなり、または、
(vii)大サブユニットの前記C末端近接領域が、キャスパーゼ2の大サブユニットのアミノ酸R311からD316、T309からQ314、Q302からD316、またはQ302からQ314に対応するアミノ酸からなり、小サブユニットの前記N末端近接領域が、キャスパーゼ2の小サブユニットのアミノ酸G317からT331またはG317からK325に対応するアミノ酸からなる、
請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドがプロドメインをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記神経毒切断部位が、プロドメインのC末端近接領域と、大サブユニットのN末端近接領域との間に位置する、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記神経毒切断部位が、BoNT/Aプロテアーゼにより認識および切断される切断部位である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記切断部位が、配列番号１〜５のいずれか1つに示される、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記神経毒切断部位が、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/GまたはTeNTプロテアーゼにより認識および切断される切断部位である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に定義されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項９に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項９に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１０に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１２】
サンプル中の神経毒活性を決定するための方法であって、
(a)請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドと、神経毒活性を含むことが疑われるサンプルとを接触させるステップ；および
(b)該ポリペプチドのキャスパーゼ活性を測定し、それによってサンプル中の神経毒活性を決定するステップ、
を含む、前記方法。
【請求項１３】
前記キャスパーゼ活性が前記ポリペプチドの少なくとも1種の基質の切断によって測定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記基質が少なくとも1種のエフェクターキャスパーゼである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが宿主細胞により含まれる、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
サンプル中の神経毒活性を決定するための請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項９に記載のポリヌクレオチド、請求項１０に記載のベクターまたは請求項１１に記載の宿主細胞の使用。
【請求項１７】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項９に記載のポリヌクレオチド、請求項１０に記載のベクターまたは請求項１１に記載の宿主細胞を含む、神経毒活性を決定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経毒活性を決定するための手段および方法に関する。具体的には、本発明は、大サブユニットと小サブユニットとを含むキャスパーゼ活性を有するポリペプチドであって、前記キャスパーゼが、切断時にキャスパーゼ活性を活性化する神経毒切断部位をさらに含む前記ポリペプチドに関する。また、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドならびに該ポリヌクレオチドを含むベクターまたは宿主細胞も包含される。本発明はさらに、本発明のポリペプチドに基づくサンプル中の神経毒活性を決定するための方法ならびに一般に、サンプル中の神経毒活性を決定するための前記ポリペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロストリジウム・ボツリナム(Clostridium botulinum)およびクロストリジウム・テタニ(Clostridium tetani)は、非常に強力な神経毒、すなわち、それぞれボツリヌス毒素(BoNT)および破傷風毒素(TeNT)を産生する。これらのクロストリジウム神経毒は、神経細胞に特異的に結合し、神経伝達因子の放出を妨害する。それぞれの毒素は、不活性なプロセッシングされていない約150kDaの一本鎖タンパク質として合成される。翻訳後プロセッシングは、ジスルフィド架橋の形成、および細菌プロテアーゼによる限定的タンパク質分解(ニッキング)を含む。活性な二本鎖神経毒は、ジスルフィド結合により連結された2つの鎖、約50kDaのN末端軽鎖および約100kDaの重鎖からなる。神経毒は構造的に3つのドメイン、すなわち、触媒的軽鎖、転座ドメインを包含する重鎖(N末端の半分)および受容体結合ドメイン(C末端の半分)からなる。Krieglstein 1990, Eur J Biochem 188, 39; Krieglstein 1991, Eur J Biochem 202, 41; Krieglstein 1994, J Protein Chem 13, 49を参照されたい。
【０００３】
クロストリジウム・ボツリナムは、A〜Gと命名された7つの抗原的に異なる血清型のBoNTを分泌する。クロストリジウム・テタニにより分泌される関連するTeNTと共に、全ての血清型が亜鉛(Zn2+)依存的エンドプロテアーゼであり、これはSNAREタンパク質、特に、BoNT/A、CまたはEの場合、SNAP-25を切断することによりシナプス開口放出を遮断する。BoNTは、特に、ボツリヌス中毒症において認められる弛緩性筋麻痺を引き起こす。Fischer 2007, PNAS 104, 10447を参照されたい。
【０００４】
その毒性効果にも拘らず、BoNTは数多くの疾患において治療剤として用いられてきた。BoNT血清型A(BoNT/A)は、斜視、眼瞼痙攣および他の障害の治療のために1989年に米国でヒトでの使用について認可された。それは、例えば、商標名BOTOX(Allergan Inc)および商標名DYSPORT(Ipsen Ltd)の下でタンパク質調製物として市販されている。治療適用のために、治療しようとする筋肉中に複合体を直接注入する。生理的pHでは、この毒素はタンパク質複合体から放出され、所望の薬理学的効果が生じる。複合体化タンパク質を含まない改良型BoNT/A調製物が、商標名XEOMIN(Merz Pharmaceuticals GmbH)の下で入手可能である。
【０００５】
BoNTは、原理的には、随意筋強度を弱め、従って、斜視、頸部ジストニアなどの限局性筋失調症、および特発性眼瞼痙攣または痙攣などの疾患の療法のための有効な治療剤である。それらはさらに、片側顔面痙攣、および限局性痙攣を軽減し、さらに、胃腸障害、多汗症、および皺補正化粧品などの様々な他の適応症において有効であることが示されている。Jost 2007, Drugs 67, 669を参照されたい。
【０００６】
生物活性の決定は、品質管理および定量目的のための安全性尺度として重要である。マウスLD50アッセイは、神経毒の生物活性の定量ならびにその治療能力および／またはその毒性の評価のための現在唯一の信頼できるアッセイである。前記アッセイはまた、神経毒の製造中の品質管理のために受け入れられている。マウスLD50バイオアッセイにおいては、致死濃度および亜致死濃度の神経毒ポリペプチドを含有するサンプルを、少なくとも120匹の動物に注入しなければならない。72時間の観察期間にわたる殺傷された動物の数は、サンプル中の神経毒ポリペプチド濃度を決定することができる。このアッセイの見かけ上の欠点は、多数の動物が犠牲になること、ならびに試験中の前記動物のストレスおよび疼痛が高レベルであることである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
今までのところ提唱されているin vitroアッセイは、無細胞系におけるSNAP-25の切断の決定または初代神経細胞への神経毒曝露に基づくものである。しかしながら、これらのアッセイは信頼性が低く、および／または所望の神経毒機能の全部を考慮するものではない。かくして、現在では、上記のLD50バイオアッセイは、欧州薬局方におけるBoNT/Aに関する研究論文に記載された唯一の信頼できるアッセイである。しかしながら、LD50バイオアッセイの欠点を回避する神経毒活性を測定するための信頼できるアッセイが必要である。
【０００８】
従って、本発明の基礎となる技術的問題は、上記必要性に応じるための手段および方法の提供に見出すことができる。この技術的問題は、特許請求の範囲で特徴付けられ、本明細書の以下に記載される実施形態によって解決される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
かくして、本発明は、大サブユニットと小サブユニットとを含むキャスパーゼ活性を有するポリペプチドであって、前記キャスパーゼが、切断時にキャスパーゼ活性を活性化する神経毒切断部位をさらに含む前記ポリペプチドに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】キャスパーゼは酵素的に不活性なチモーゲンとして構成的に発現される。キャスパーゼ3の場合、プロキャスパーゼ-3は32kDaのタンパク質であり、イニシエータキャスパーゼであるキャスパーゼ8または9による切断ならびにより大きいおよびより小さい断片または17および12kDaのサイズへの自己プロセッシングを受ける。それらは、DEVD配列モチーフの後である程度の選択性で切断する酵素的に活性なヘテロダイマー/テトラマーを形成する。典型的な基質は、PARPであり、これは85kDaの断片および小さい断片に切断され、不活化される。活性なキャスパーゼ-3は多数の基質を切断し、zDEVD-フルオロメチルケトンなどのアルキル化構造に連結されたこの配列選択性を用いる小さいペプチドを用いて阻害することができる。突然変異した配列を有するBoNT/A、CもしくはEまたはBoNTにより認識および切断されるSNAP25配列は、プロドメインと大サブユニットとの間、または大サブユニットと小サブユニットとの間に挿入され、突然変異した配列を有するBoNT/A、CもしくはEまたはBoNTがこの部位での切断によりキャスパーゼ3を活性化することができるようになる。
【図２】異なる大腸菌発現株のSDS-PAGE分析におけるpTZE02/Casp3.1の試験発現を示す。ゲルは12%であり、クマシーブルーで染色した。選択されたマーカーサイズを左側に記載する。クマシー染色されたゲル中のバンドをCasp3.1標的に明確に相関させ、不溶性の標的と比較した可溶性標的の量を見積もるために、抗Strep-Tag抗体を用いるウェスタンブロット分析を実施した。
【図３】異なる大腸菌発現株のウェスタンブロット分析におけるpTZE02/Casp3.1の試験発現を示す。ゲルは12%であり、抗Strep抗体で検出した。選択されたマーカーサイズを左側に記載する。ウェスタンブロット分析は、全ての試験した発現条件の可溶性および不溶性タンパク質画分において25〜35kDaの分子量マーカーバンドの間に泳動するタンパク質の存在を示した。BL21(DE3)ならびにBL21(DE3)/pGroESEL発現のみが、Strep-Tag抗体を用いて可溶性タンパク質画分中で検出された非常に弱いシグナルを示した。翻訳されたCasp3.1タンパク質の予想分子量(30.4kDa)に対応するRosetta(DE3)/pRARE2およびRosetta(DE3)/pLys発現における検出されたタンパク質バンドは、標的の少なくとも20〜30%が可溶性形態で存在することを示した。
【図４】異なる大腸菌発現株のSDS-PAGE分析におけるpTZE44/Casp3.1の試験発現を示す。ゲルは12%であり、クマシーブルーで染色した。選択されたマーカーサイズを左側に記載する。クマシー染色されたゲル中のMBP-Casp3.1融合タンパク質バンドを明確に同定し、不溶性標的と比較して可溶性標的の量を見積もるために、ウェスタンブロット分析を実施した。
【図５】異なる大腸菌発現株のウェスタンブロット分析におけるpTZE44/Casp3.1の試験発現を示す。ゲルは12%であり、抗Strep抗体で検出した。選択されたマーカーサイズを左側に記載する。
【図６】大腸菌Rosetta(DE3)/pRARE2のSDS-PAGE分析におけるpTZE02/Casp3.1の試験発現を示す。ゲルは12%であり、クマシーブルーで染色した。選択されたマーカーサイズを左側に記載する。
【図７】大腸菌Rosetta(DE3)/pRARE2のウェスタンブロット分析におけるpTZE02/Casp3.1の試験発現を示す。ゲルは12%であり、抗Strep抗体で検出した。選択されたマーカーサイズを左側に記載する。
【図８】大腸菌Rosetta(DE3)/pLysのSDS-PAGE分析におけるpTZE02/Casp3.1の試験発現を示す。ゲルは12%であり、クマシーブルーで染色した。選択されたマーカーサイズを左側に記載する。
【図９】大腸菌Rosetta(DE3)/pLysのウェスタンブロット分析におけるpTZE02/Casp3.1の試験発現を示す。ゲルは12%であり、抗Strep抗体で検出した。選択されたマーカーサイズを左側に記載する。
【図１０】P.パストリスX33、KM71およびGS115のSDS-PAGE分析におけるpTZP01/Casp3.1の試験発現を示す。ゲルは12%であり、クマシーブルーで染色した。
【図１１】P.パストリスX33、KM71およびGS115のウェスタンブロット分析におけるpTZP01/Casp3.1の試験発現を示す。ゲルは12%であり、抗Strep抗体で検出した。選択されたマーカーサイズを左側に記載する。
【図１２】P.パストリスKM71およびGS115におけるpHILD2/Casp3.1の試験発現を示す。左パネル：SDS-PAGE分析。ゲルは12%であり、クマシーブルーで染色した。右パネル：ウェスタンブロット分析。ゲルは12%であり、抗Strep抗体で検出した。選択されたマーカーサイズを左側に記載する。
【図１３】BoNT/Aにより誘導された切断反応産物のSDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書で用いられる用語「キャスパーゼ活性を有するポリペプチド」は、システインプロテアーゼ活性、特に、システイン依存的アスパラギン酸特異的プロテアーゼ活性を有するポリペプチドを指す。キャスパーゼ活性を有するポリペプチド(またはいわゆる「キャスパーゼ」）は、細胞中での多くの病理学的プロセスおよび発生などの生理学的プロセスにおいて起こるプログラム細胞死(アポトーシス)に関与する。細胞の文脈では、キャスパーゼはカスケードで働くように配置される。従って、外部または内部刺激により活性化されるカスケードが存在する(いわゆる、イニシエータまたはアピカルキャスパーゼ)。これらのイニシエータキャスパーゼは続いて、タンパク質分解的切断によってさらなるキャスパーゼを活性化する(いわゆるエフェクターまたはエクセキューショナーキャスパーゼ)。エフェクターキャスパーゼは次いで他のポリペプチド基質を切断し、それによって細胞におけるアポトーシス細胞死を誘発する。イニシエータキャスパーゼは、キャスパーゼ2、キャスパーゼ8、キャスパーゼ9およびキャスパーゼ10である。エフェクターキャスパーゼは、キャスパーゼ3、キャスパーゼ6およびキャスパーゼ7である。キャスパーゼ4、キャスパーゼ5およびキャスパーゼ14は、免疫学的プロセスに関与する酵素であり、それぞれイニシエータまたはエフェクターキャスパーゼとしては特徴付けられていない。上記キャスパーゼをコードするアミノ酸配列は、当業界で周知である(Yuan 1992, Development 116(2): 309-320; Ellis 1991, Annu Rev Cell Biol 7: 663-698; Yuan 1993, Cell 75(4): 641-652; Miura 1993, Cell 75(4): 653-660; Fuentes-Prior 2004, Biochem J 384: 201-232)。一態様においては、ヒトキャスパーゼ9は配列番号6に示されるアミノ酸配列を含み、ヒトキャスパーゼ3は配列番号7に示されるアミノ酸配列を含み、ヒトキャスパーゼ8は配列番号8に示されるアミノ酸配列を含み、ヒトキャスパーゼ10は配列番号9に示されるアミノ酸配列を含み、ヒトキャスパーゼ2は配列番号10に示されるアミノ酸配列を含み、ヒトキャスパーゼ7は配列番号11に示されるアミノ酸配列を含み、および／またはヒトキャスパーゼ6は配列番号12に示されるアミノ酸配列を含む。
【００１２】
本明細書で用いられるキャスパーゼはまた、配列番号6〜12のいずれか1つに示される上記の特定の配列に関してアミノ酸配列変異体を有するキャスパーゼ活性を有するポリペプチドも含む。前記変異体配列は、上記の配列番号6〜12のいずれか1つに示される特定の配列に関して1個以上のアミノ酸置換、欠失および／または付加を含む。さらに、そのような変異体ポリペプチドは、別の態様においては、配列番号6〜12のいずれか1つに示される上記の特定のアミノ酸配列と少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含む。本明細書で用いられる用語「同一」とは、最も高い次数の一致が得られるように配列を整列させた場合の配列間の同一のアミノ酸の数を決定することにより特徴付けられる配列同一性を指す。公開された技術、または例えば、BLASTPもしくはFASTA(Altschul 1990, J Mol Biol 215, 403)などのコンピュータプログラムにおいて暗号化された方法を用いて、それを算出することができる。同一性パーセントの値は、一態様においては、アミノ酸配列全体にわたって、または参照配列の少なくとも50%の配列ストレッチにわたって算出される。様々なアルゴリズムに基づく一連のプログラムが、異なる配列を比較するために当業者に利用可能である。これに関連して、NeedlemanおよびWunschまたはSmithおよびWatermanのアルゴリズムが、特に信頼できる結果をもたらす。配列アラインメントを実行するために、PileUPプログラム(Higgins 1989, CABIOS 5, 151)またはGCGソフトウェアパケット(Genetics Computer Group 1991, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)の一部であるGapおよびBestFitプログラム(Needleman 1970, J Mol Biol 48; 443; Smith 1981, Adv Appl Math 2, 482)を用いることができる。パーセント(%)で上記された配列同一性の値は、本発明の別の態様においては、別途特定しない限り、配列アラインメントのための標準設定として常に用いられる以下の設定：Gap Weight:50、Length Weight:3, Average Match: 10.000およびAverage Mismatch: 0.000を用いて配列領域全体にわたってGAPプログラムを用いて決定されるべきである。
【００１３】
キャスパーゼは、N末端からC末端に向かって、(i)プロドメイン、(ii)小サブユニットおよび(iii)大サブユニットからなる不活性プロ酵素(チモーゲン)として発現される。イニシエータキャスパーゼのプロドメインは、キャスパーゼ-2および-9におけるCARDドメインまたはキャスパーゼ-8および-10におけるデスエフェクタードメイン(DED)などの相互作用ドメインを含有する。これらの相互作用ドメインにより、キャスパーゼはその活性化を開始するポリペプチドと相互作用することができる。イニシエータキャスパーゼの活性化を開始するこれらのポリペプチドのいくつかは、例えば、Fasなどの細胞死受容体、TRAIL受容体ならびにキャスパーゼ-8および-10を活性化することができるTNF受容体である。キャスパーゼカスケードの他方の末端上のエフェクターキャスパーゼの基質は、例えば、核ラミナ、ICAD/DFF45(キャスパーゼ活性化DNaseもしくはDNA断片化因子45の阻害因子)、PARP(ポリ-ADPリボースポリメラーゼ)またはPAK2(P21活性化キナーゼ2)である。
【００１４】
従って、一態様においては、エフェクターキャスパーゼ活性を、細胞周期タンパク質、DNA修復タンパク質、シグナリング分子、細胞骨格タンパク質その他などの1種以上の上記基質の切断により測定することができる。一態様においては、エフェクターキャスパーゼ活性を、PARP切断を測定することにより測定する。PARPは、エフェクターキャスパーゼであるキャスパーゼ3によって認識され、切断されるDEVDモチーフを含む。PARP切断を測定するために、いくつかのプロテアーゼ活性アッセイが市販されている。
【００１５】
あるいは、および別の態様においては、エフェクターキャスパーゼのキャスパーゼ活性を、細胞培養液などの細胞集団中で起こる細胞死の量を決定することにより決定することができる。様々な周知の技術により、アポトーシス細胞死を測定することができる。一態様においては、典型的にはいわゆるアポトーシスラダリングとして生じ、アポトーシスを受ける細胞中でのゲノムDNAの規則的切断により引き起こされるDNA断片化を決定する。別の態様においては、Hochst 33258などの特定の染料を用いる画像化方法により、小胞形成を分析することができる。さらに、およびさらなる態様においては、リン脂質分布、および一態様においては、ホスファチジルセリン分布を決定することができる。アネキシンVなどのホスファチジルセリン結合タンパク質により、ホスファチジルセリン分布を決定することができる。アネキシンVに基づいてアポトーシスを測定するための画像化プラットフォームが最近報告され、Tait 2008, J Nuclear Medicine 49(10): 1573-76; Jeppsen 2008, J Biol Chem 283: 6126-35; Tait 2006, J Nuclear Medicine 47: 1546-53に記載されている。アポトーシスを決定するための上記測定法を組合わせることもできることが理解される。
【００１６】
イニシエータキャスパーゼのキャスパーゼ活性を、一態様においては、細胞培養液などのin vivo系またはエフェクターキャスパーゼも含むin vitro(すなわち、無細胞)系におけるエフェクターキャスパーゼ活性について記載されたように決定することができる。さらに、一態様においては、前記イニシエータキャスパーゼの基質としてのエフェクターキャスパーゼの切断に基づいて、イニシエータキャスパーゼ活性を決定することができる。
【００１７】
一態様においては、上記の無細胞in vitro系において、キャスパーゼ活性を決定することができる。そのような無細胞系は、キャスパーゼの基質を含む細胞画分であってもよい。あるいは、前記基質を含み、キャスパーゼが活性となる条件を提供する人工溶液を適用することもできる。別の態様においては、本発明のポリペプチドを発現し、前記ポリペプチドを切断することができる生物学的に活性な神経毒ポリペプチドをさらに含む好適な宿主細胞中、in vivoでキャスパーゼ活性を決定することができる。切断の結果として、本発明のポリペプチドは、活性化され、宿主細胞中でアポトーシスを惹起する。一態様においては、そのような活性アッセイも、本明細書の他の場所に記載される本発明の方法に従って説明される。
【００１８】
本明細書で用いられる用語「神経毒切断部位」は、神経毒ポリペプチドの内因性プロテアーゼによって認識および切断される切断部位を指す。神経毒プロテアーゼにより認識される切断部位は当業界で周知である(例えば、EP 1 926 744 B1を参照されたい)。原則として、神経毒切断部位は、基質中に天然に存在するか、または神経毒ポリペプチドプロテアーゼにより認識および切断される人工的に設計された切断部位である切断部位であってよい。神経毒切断部位の特性は、本発明のポリペプチドを活性化することができる神経毒の種類に影響を与えることが理解される。本明細書に記載の神経毒ポリペプチドは、一態様においては、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/G、BoNT/FまたはTeNTを包含し、これらは全て当業界で周知である。例えば、BoNT/Aによって特異的に認識および切断される神経毒切断部位を用いる場合、BoNT/Aプロテアーゼだけが本発明のポリペプチド、特にそのキャスパーゼ活性を活性化することができるが、BoNT/Eによって特異的に認識および切断される神経毒切断部位を用いる場合、BoNT/Eプロテアーゼだけが本発明のポリペプチド、特に、そのキャスパーゼ活性を活性化することができる。本発明の一態様においては、神経毒切断部位は、成熟BoNTによって切断される。さらに別の態様においては、それはBoNTの突然変異タンパク質、一態様においては、BoNTプロテアーゼ活性を示すBoNT軽鎖を含むか、またはそれからなる突然変異タンパク質によって切断される。
【００１９】
BoNT/Aプロテアーゼにより認識および切断される神経毒切断部位は、本発明の一態様においては、BoNT/Aによる切断に対して感受性であるタンパク質から誘導される。一態様においては、そのようなタンパク質は、ヒトSNAP25AもしくはBまたはラット、マウス、ウシ、ダニオ、フナ、アフリカツメガエル、シビレエイ、ムラサキウニ、ヤリイカ、モノアラガイもしくはアメフラシに由来するそのホモログ、パラログもしくはオルソログである。前記タンパク質から誘導される好適な切断部位は、EP 1 926 744 B1に開示されている。
【００２０】
BoNT/Bプロテアーゼにより認識および切断される神経毒切断部位は、本発明の一態様においては、BoNT/Bによる切断に対して感受性であるタンパク質から誘導される。一態様においては、そのようなタンパク質は、ヒトもしくはマウスVAMP-1、VAMP-2およびVAMP-3/セルブレビン、ウシVAMP-2、ラットVAMP-2もしくはVAMP-3、ニワトリVAMP-1、VAMP-2もしくはVAMP-3、シビレエイVAMP-1、ムラサキウニVAMP、ショウジョウバエsybA、synB、synC、synDもしくはsyn、ヒルVAMP、アフリカツメガエルVAMP-2もしくはVAMP-3、ダニオVAMP-1もしくはVAMP-2、ヤリイカVAMP、モノアラガイVAMP、アメフラシVAMPまたはセンチュウSNB1様またはその任意のオルソログ、パラログもしくはホモログである。前記タンパク質から誘導される好適な切断部位は、EP 1 926 744 B1に開示されている。
【００２１】
BoNT/C1プロテアーゼにより認識および切断される神経毒切断部位は、本発明の一態様においては、BoNT/C1による切断に対して感受性であるタンパク質から誘導される。一態様においては、そのようなタンパク質は、ヒトもしくはマウスSyntaxin 1A、Syntaxin 1B1、Syntaxin 2-1、Syntaxin 2-2、Syntaxin 2-3、Syntaxin 3AもしくはSyntaxin 1B2、ウシもしくはラットSyntaxin 1A、Syntaxin 1B1もしくはSyntaxin 1B2、ラットSyntaxin 2もしくはラットSyntaxin 3、マウスSyntaxin 1A、Syntaxin 1B1、Syntaxin 1B2、Syntaxin 2、Syntaxin 3A、Syntaxin 3BもしくはSyntaxin 3C、ニワトリSyntaxin 1AもしくはSyntaxin 2；アフリカツメガエルSyntaxin 1AもしくはSyntaxin 1B、ダニオSyntaxin 1A、Syntaxin 1BもしくはSyntaxin 3、シビレエイSyntaxin 1AもしくはSyntaxin 1B、ムラサキウニSyntaxin 1AもしくはSyntaxin 1B、ショウジョウバエSyntaxin 1AもしくはSyntaxin 1B、ヒルSyntaxin 1AもしくはSyntaxin 1B、ヤリイカSyntaxin 1AもしくはSyntaxin 1B、モノアラガイSyntaxin 1AもしくはSyntaxin 1Bまたはその任意のオルソログ、パラログもしくはホモログである。前記タンパク質から誘導される好適な切断部位は、EP 1 926 744 B1に開示されている。
【００２２】
BoNT/Dプロテアーゼにより認識および切断される神経毒切断部位は、本発明の一態様においては、BoNT/Dによる切断に対して感受性であるタンパク質から誘導される。一態様においては、そのようなタンパク質は、ヒトもしくはマウスVAMP-1、VAMP-2およびVAMP-3/セルブレビン、ウシVAMP-2、ラットVAMP-2もしくはVAMP-3、ニワトリVAMP-1、VAMP-2もしくはVAMP-3、シビレエイVAMP-1、ムラサキウニVAMP、ショウジョウバエsybA、synB、synC、synDもしくはsyn、ヒルVAMP、アフリカツメガエルVAMP-2もしくはVAMP-3、ダニオVAMP-1もしくはVAMP-2、ヤリイカVAMP、モノアラガイVAMP、アメフラシVAMPまたはセンチュウSNB1様またはその任意のオルソログ、パラログもしくはホモログである。前記タンパク質から誘導される好適な切断部位は、EP 1 926 744 B1に開示されている。
【００２３】
BoNT/Eプロテアーゼにより認識および切断される神経毒切断部位は、本発明の一態様においては、BoNT/Eによる切断に対して感受性であるタンパク質から誘導される。一態様においては、そのようなタンパク質は、ヒトSNAP-25AもしくはBまたはラット、マウス、ウシ、ダニオ、フナ、アフリカツメガエル、シビレエイ、ムラサキウニ、ヤリイカ、モノアラガイもしくはアメフラシに由来するそのホモログ、パラログもしくはオルソログである。前記タンパク質から誘導される好適な切断部位は、EP 1 926 744 B1に開示されている。
【００２４】
BoNT/Fプロテアーゼにより認識および切断される神経毒切断部位は、本発明の一態様においては、BoNT/Fによる切断に対して感受性であるタンパク質から誘導される。一態様においては、そのようなタンパク質は、ヒトもしくはマウスVAMP-1、VAMP-2およびVAMP-3/セルブレビン、ウシVAMP-2、ラットVAMP-2もしくはVAMP-3、ニワトリVAMP-1、VAMP-2もしくはVAMP-3、シビレエイVAMP-1、ムラサキウニVAMP、ショウジョウバエsybA、synB、synC、synDもしくはsyn、ヒルVAMP、アフリカツメガエルVAMP-2もしくはVAMP-3、ダニオVAMP-1もしくはVAMP-2、ヤリイカVAMP、モノアラガイVAMP、アメフラシVAMPまたはセンチュウSNB1様またはその任意のオルソログ、パラログもしくはホモログである。前記タンパク質から誘導される好適な切断部位は、EP 1 926 744 B1に開示されている。
【００２５】
BoNT/Gプロテアーゼにより認識および切断される神経毒切断部位は、本発明の一態様においては、BoNT/Gによる切断に対して感受性であるタンパク質から誘導される。一態様においては、そのようなタンパク質は、ヒトもしくはマウスVAMP-1、VAMP-2およびVAMP-3/セルブレビン、ウシVAMP-2、ラットVAMP-2もしくはVAMP-3、ニワトリVAMP-1、VAMP-2もしくはVAMP-3、シビレエイVAMP-1、ムラサキウニVAMP、ショウジョウバエsybA、synB、synC、synDもしくはsyn、ヒルVAMP、アフリカツメガエルVAMP-2もしくはVAMP-3、ダニオVAMP-1もしくはVAMP-2、ヤリイカVAMP、モノアラガイVAMP、アメフラシVAMPまたはセンチュウSNB1様またはその任意のオルソログ、パラログもしくはホモログである。前記タンパク質から誘導される好適な切断部位は、EP 1 926 744 B1に開示されている。
【００２６】
TeNTプロテアーゼにより認識および切断される神経毒切断部位は、本発明の一態様においては、TeNTによる切断に対して感受性であるタンパク質から誘導される。一態様においては、そのようなタンパク質は、ヒトもしくはマウスVAMP-1、VAMP-2およびVAMP-3/セルブレビン、ウシVAMP-2、ラットVAMP-2もしくはVAMP-3、ニワトリVAMP-1、VAMP-2もしくはVAMP-3、シビレエイVAMP-1、ムラサキウニVAMP、ショウジョウバエsybA、synB、synC、synDもしくはsyn、ヒルVAMP、アフリカツメガエルVAMP-2もしくはVAMP-3、ダニオVAMP-1もしくはVAMP-2、ヤリイカVAMP、モノアラガイVAMP、アメフラシVAMPまたはセンチュウSNB1様またはその任意のオルソログ、パラログもしくはホモログである。前記タンパク質から誘導される好適な切断部位は、EP 1 926 744 B1に開示されている。
【００２７】
BoNTにより認識および切断される神経毒切断部位は、本発明の一態様のおいては、BoNTタンパク質中に見出される自己触媒的切断部位から誘導される。複数の態様において、本発明に従って用いられ、所与のBoNTまたはTeNTの自己触媒的切断部位から誘導される神経毒切断部位は、BoNT/A残基250Tyr-251Tyr、BoNT/B残基256Phe-257Phe、BoNT/C1残基257Phe-258Tyr、BoNT/D残基257Phe-258Phe、BoNT/E残基239Pro-240Leu、BoNT/F残基254Pro-255Leu、BoNT/G残基256Phe-257Phe、TeNT残基259Ile-260Tyr、BoNT/A残基Phe266-Gly267、BoNT/B残基Phe272-Gly273、BoNT/C1残基Phe273-Gly274、BoNT/D残基Phe273-Gly274、BoNT/E残基Phe255-Gly256、BoNT/F残基Phe270-Gly271、BoNT/G残基Phe272-Gly273またはTeNT残基Phe275-Gly276などの少なくとも6個、少なくとも8個、少なくとも10個または少なくとも15個の連続する残基を含む。前記BoNTおよびTeNTから誘導される好適な切断部位は、EP 1 926 744 B1に開示されている。
【００２８】
本発明のポリペプチドの一態様においては、前記神経毒切断部位は、BoNT/Aプロテアーゼにより認識および切断される切断部位である。一態様においては、前記切断部位は配列番号1〜5のいずれか1つに示される。
【００２９】
本発明のポリペプチドのさらなる態様においては、前記神経毒切断部位は、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/GまたはTeNTプロテアーゼにより認識および切断される切断部位である。
【００３０】
本発明のポリペプチドの一態様においては、前記神経毒切断部位は、大サブユニットのC末端近接領域と、小サブユニットのN末端近接領域との間に位置する。さらなる態様においては、大サブユニットの前記C末端近接領域は、キャスパーゼ3の大サブユニットのアミノ酸C170からD175、L168からE173、Q161からD175、またはQ161からE173に対応するアミノ酸からなり、小サブユニットの前記N末端近接領域は、キャスパーゼ3の小サブユニットのアミノ酸S176からV190またはS176からC184に対応するアミノ酸からなる。さらなる態様においては、大サブユニットの前記C末端近接領域は、キャスパーゼ6の大サブユニットのアミノ酸V174からD179、H172からV177、Q165からD179、またはQ165からV177に対応するアミノ酸からなり、小サブユニットの前記N末端近接領域は、キャスパーゼ6の小サブユニットのアミノ酸S180からA194またはS180からV188に対応するアミノ酸からなる。さらなる態様においては、大サブユニットの前記C末端近接領域は、キャスパーゼ7の大サブユニットのアミノ酸D193からD198、L191からQ196、Q184からD198、またはQ184からQ196に対応するアミノ酸からなり、小サブユニットの前記N末端近接領域は、キャスパーゼ7の小サブユニットのアミノ酸S199からV213またはS199からR207に対応するアミノ酸からなる。さらなる態様においては、大サブユニットの前記C末端近接領域は、キャスパーゼ8の大サブユニットのアミノ酸K369からD374、Y367からE372、Q360からD374、またはQ360からE372に対応するアミノ酸からなり、小サブユニットの前記N末端近接領域は、キャスパーゼ8の小サブユニットのアミノ酸S375からD389またはS375からT383に対応するアミノ酸からなる。さらなる態様においては、大サブユニットの前記C末端近接領域は、キャスパーゼ10の大サブユニットのアミノ酸P367からD372、I365からE370、Q358からD372、またはQ358からE370に対応するアミノ酸からなり、小サブユニットの前記N末端近接領域は、キャスパーゼ10の小サブユニットのアミノ酸A373からA386またはA373からQ380に対応するアミノ酸からなる。さらなる態様においては、大サブユニットの前記C末端近接領域は、キャスパーゼ9の大サブユニットのアミノ酸H310からD315、K308からE313、Q301からD315、またはQ301からE313に対応するアミノ酸からなり、小サブユニットの前記N末端近接領域は、キャスパーゼ9の小サブユニットのアミノ酸A316からT330またはA316からI324に対応するアミノ酸からなる。さらなる態様においては、大サブユニットの前記C末端近接領域は、キャスパーゼ2の大サブユニットのアミノ酸R311からD316、T309からQ314、Q302からD316、またはQ302からQ314に対応するアミノ酸からなり、小サブユニットの前記N末端近接領域は、キャスパーゼ2の小サブユニットのアミノ酸G317からT331またはG317からK325に対応するアミノ酸からなる。
【００３１】
本発明のポリペプチドの別の態様においては、前記ポリペプチドはプロドメインをさらに含む。一態様においては、プロドメインは、キャスパーゼ3のアミノ酸1〜29、キャスパーゼ7のアミノ酸1〜24、キャスパーゼ6のアミノ酸1〜24、キャスパーゼ8のアミノ酸1〜217、キャスパーゼ10のアミノ酸1〜226、キャスパーゼ9のアミノ酸1〜139またはキャスパーゼ2のアミノ酸1〜153を含む。一態様においては、前記神経毒切断部位は、プロドメインのC末端近接領域と、大サブユニットのN末端近接領域との間に位置する。さらなる態様においては、プロドメインの前記C末端近接領域は、キャスパーゼ3の大サブユニットのアミノ酸S29からD34に対応するアミノ酸からなり、大ドメインの前記N末端近接領域は、キャスパーゼ3の大サブユニットのアミノ酸N35からD40に対応するアミノ酸からなる。一態様においては、キャスパーゼ3のプロドメインのC末端近接領域は、かくして、アミノ酸29〜34を包含し、大ドメインのN末端近接領域は、アミノ酸35〜40からなり、キャスパーゼ6のプロドメインのC末端近接領域は、アミノ酸24〜29を包含し、大ドメインのN末端近接領域はアミノ酸30〜35からなり、キャスパーゼ7のプロドメインのC末端近接領域はアミノ酸24〜29を包含し、大ドメインのN末端近接領域はアミノ酸30〜35からなり、キャスパーゼ8のプロドメインのC末端近接領域はアミノ酸217〜222を包含し、大ドメインのN末端近接領域はアミノ酸223〜228からなり、キャスパーゼ9のプロドメインのC末端近接領域はアミノ酸153〜158を包含し、大ドメインのN末端近接領域はアミノ酸159〜164からなり、キャスパーゼ10のプロドメインのC末端近接領域はアミノ酸231〜236を包含し、大ドメインのN末端近接領域はアミノ酸237〜242からなる。
【００３２】
本明細書の他の場所で考察される通り、本発明のポリペプチドの別の態様においては、前記ポリペプチドはエフェクターキャスパーゼである。一態様においては、前記エフェクターキャスパーゼは、キャスパーゼ3、キャスパーゼ6およびキャスパーゼ7からなる群より選択される。
【００３３】
別の態様においては、本発明のポリペプチドが神経毒切断部位を導入することにより誘導されるキャスパーゼは、キャスパーゼ3である。
【００３４】
さらなる態様においては、本発明のポリペプチドは、配列番号6〜10のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含むか、またはキャスパーゼ活性および切断時にキャスパーゼ活性を活性化する神経毒切断部位を保持する本明細書の他の場所に記載されるその変異体である。
【００３５】
本明細書の他の場所でも考察される通り、本発明のポリペプチドのさらなる態様においては、前記ポリペプチドはイニシエータキャスパーゼである。一態様においては、前記イニシエータキャスパーゼは、キャスパーゼ2、キャスパーゼ8、キャスパーゼ9およびキャスパーゼ10からなる群より選択される。
【００３６】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに意図する。
【００３７】
本明細書で用いられる用語「ポリヌクレオチド」とは、一本鎖または二本鎖DNA分子ならびにRNA分子を指す。前記用語に包含されるものは、ゲノムDNA、cDNA、hnDNA、mRNAならびにそのような分子種の全ての天然の誘導体または人工的に改変された誘導体である。ポリヌクレオチドは、一態様においては、線状または環状分子であってよい。さらに、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列に加えて、本発明のポリヌクレオチドは、5'または3'-UTR配列などの適切な転写および／または翻訳に必要とされるさらなる配列を含んでもよい。本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、当業者であればさらに苦労することなくポリペプチド配列から誘導することができる。遺伝子コードの縮重性を考慮して、ポリヌクレオチド中の本発明のポリペプチドをコードする核酸配列中で最適化されたコドンを用いることができる。それによって、例えば、本発明の宿主細胞中での最適な発現を達成することができる。
【００３８】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００３９】
用語「ベクター」は、好ましくは、ファージ、プラスミド、ウイルスまたはレトロウイルスベクターならびに人工染色体、例えば、細菌もしくは酵母人工染色体を包含する。さらに、この用語はまた、ゲノムDNA中への標的構築物の無作為のまたは部位特異的な組込みを可能にする標的構築物にも関する。そのような標的構築物は、好ましくは、以下で詳細に説明される相同または非相同組換えのいずれかにとって十分な長さのDNAを含む。本発明のポリヌクレオチドを包含するベクターは、一態様においては、宿主細胞中での増殖および／または選択のための選択マーカーをさらに含む。ベクターは、当業界で周知の様々な技術によって宿主細胞中に組込むことができる。例えば、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿もしくは塩化ルビジウム沈殿などの沈殿中、または荷電した脂質との複合体中もしくはフラーレンなどの炭素に基づくクラスター中に導入することができる。あるいは、熱ショックまたはエレクトロポレーション技術により、プラスミドベクターを導入することができる。ベクターがウイルスである場合、それを好適なパッケージング細胞系を用いてin vitroでパッケージした後、宿主細胞に適用することができる。レトロウイルスベクターは、複製能力を有するか、または複製欠損であってもよい。後者の場合、ウイルスの増殖は一般に、宿主/細胞を補充する際にのみ起こる。さらに、本発明の一態様においては、ポリヌクレオチドを、原核もしくは真核宿主細胞または前記ベクター中のその単離された画分中での発現を可能にする発現制御配列に機能し得る形で連結する。ポリヌクレオチドの発現は、翻訳可能なmRNAへのポリヌクレオチドの転写を含む。宿主細胞中での発現を確保する調節エレメントは、当業界で周知である。一態様においては、それらは、転写の開始を確保する調節配列ならびに/または転写の終結および転写物の安定化を確保するポリAシグナルを含む。さらなる調節エレメントとしては、転写ならびに翻訳エンハンサーが挙げられる。原核宿主細胞中での発現を許容する可能な調節エレメントは、例えば、大腸菌におけるlac-、trp-またはtac-プロモーターを含み、真核宿主細胞中での発現を許容する調節エレメントの例は、酵母におけるAOX1-もしくはCAL1-プロモーターまたは哺乳動物および他の動物細胞におけるCMV-、SV40-、RSV-プロモーター(ラウス肉腫ウイルス)、CMV-エンハンサー、SV40-エンハンサーもしくはグロビンイントロンである。さらに、本発明により包含される発現ベクター中で誘導性発現制御配列を用いることができる。そのような誘導性ベクターは、tetもしくはlacオペレーター配列または熱ショックもしくは他の環境因子により誘導される配列を含んでもよい。好適な発現制御配列は当業界で周知である。転写の開始を担うエレメントの他に、そのような調節エレメントは、ポリヌクレオチドの下流にある転写終結シグナル、例えば、SV40-ポリA部位またはtk-ポリA部位も含んでもよい。これに関連して、Okayama-Berg cDNA発現ベクターpcDV1(Pharmacia)、pBluescript(Stratagene)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogen)またはpSPORT1(Invitrogen)などの好適な発現ベクターが公知である。好ましくは、前記ベクターは、発現ベクターおよび遺伝子導入または標的化ベクターである。レトロウイルス、ワクシニ���ウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはウシパピローマウイルスなどのウイルスから誘導された発現ベクターを、標的細胞集団中への本発明のポリヌクレオチドまたはベクターの送達のために用いることができる。そのような手法を、遺伝子療法のために用いることもできる。当業者には周知である方法を用いて、組換えウイルスベクターを構築することができる；例えば、Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.およびAusubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)に記載の技術を参照されたい。
【００４０】
さらに、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞も本発明により包含される。
【００４１】
本明細書で用いられる用語「宿主細胞」は、原核および真核宿主細胞を包含する。一態様においては、宿主細胞は細菌細胞である。一態様においては、前記細菌宿主細胞は、大腸菌宿主細胞またはクロストリジウム宿主細胞であり、一態様においては、クロストリジウム・ボツリナム宿主細胞である。そのような細菌宿主細胞を、例えば、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターの複製のために用いることができる。真核宿主細胞は、一態様においては、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドまたはベクターのいずれかを含む細胞であり、前記ポリヌクレオチドまたはベクターは前記ポリペプチドを作製するために宿主細胞中で発現される。一態様においては、真核宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドを安定に発現する真核宿主細胞系の細胞であってよい。別の態様においては、宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターで一過的にトランスフェクトされた、本発明のポリヌクレオチドを発現する真核宿主細胞である。本発明による宿主細胞は、一態様においては、本発明のポリペプチドのキャスパーゼ活性のための基質をさらに含む。さらに、別の態様においては、宿主細胞は、細胞の生理的変化により、一態様においては、アポトーシス細胞死により、またはアポトーシスを誘導することができるカスケードの少なくとも活性化により、本発明の切断されたポリペプチドによって付与されたキャスパーゼ活性に応答することができる。一態様においては、前記の細胞の生理的変化は、細胞形態の変化により、DNA分解、一態様においては、アポトーシスラダリングにより、および/または核ラミナ、ICAD/DEF45(キャスパーゼ活性化DNaseもしくはDNA断片化因子45の阻害因子)、PARP(ポリ-ADPリボースポリメラーゼ)またはPAK2(P21-活性化キナーゼ2)などのアポトーシスキャスパーゼカスケードの基質の切断により検出することができる。一態様においては、宿主細胞は、真核宿主細胞であり、別の態様においては、哺乳動物宿主細胞であり、さらに別の態様においては、神経毒ポリペプチドを取り込むことができる細胞である。一態様においては、神経毒ポリペプチドを取り込むことができる細胞は、神経毒ポリペプチドの取込みのための全ての必須成分を内因的に産生する細胞であってよい。一態様においては、細胞は神経細胞である。別の態様においては、神経毒ポリペプチドを取り込むことができる細胞は、神経毒ポリペプチドの取込みにとって必須である成分を産生するように遺伝子操作された細胞である。そのような細胞をどのように分子生物学的技術により遺伝子操作することができるかは、当業者には周知である。
【００４２】
本発明の宿主細胞の一態様においては、前記宿主細胞は、初代神経細胞、細胞系N1E-11、細胞系Neuro2a、細胞系PC12、および細胞系SH-SY5Yからなる群より選択される。
【００４３】
本発明は、サンプル中の神経毒活性を決定するための方法であって、
(a)本発明のポリペプチドと、神経毒活性を含むことが疑われるサンプルとを接触させるステップ；および
(b)該ポリペプチドのキャスパーゼ活性を測定し、それによって、サンプル中の神経毒活性を決定するステップ
を含む前記方法に関する。
【００４４】
本発明の方法を、自動化によって支援することができる。具体的には、一態様において、ステップa)および/またはb)を、キャスパーゼ活性を測定するためのロボット装置および自動化システムによって支援することができる。好適なシステムは当業界で公知であり、決定しようとする応答の種類に依存する。さらに、前記方法は、サンプル調製または本発明のポリペプチドの作製に関する追加のステップを含んでもよい。
【００４５】
本明細書で用いられる用語「接触させること」とは、少なくとも2つの異なる化合物を物理的に近いところに持っていき、前記化合物の物理的および/または化学的相互作用を可能にすることを指す。上記方法においては、本発明によるポリペプチドを、生物学的に活性な神経毒ポリペプチドを含むことが疑われるサンプルと接触させる。前記ポリペプチドを、サンプルにより含まれる神経毒ポリペプチドによる本発明のポリペプチド中の神経毒切断部位の切断を可能にするのに十分な時間にわたって、および条件下で接触させるべきである。本明細書で用いられる接触は、一態様においては、本発明のポリペプチドを含有する本発明の宿主細胞中で行う。かくして、一態様においては、前記ポリペプチドは宿主細胞、一態様においては、本発明の宿主細胞により含まれる。前記時間および条件は、サンプルにより含まれる神経毒ポリペプチドの量ならびに宿主細胞による神経毒ポリペプチドの取込みに依存する。当業者は、宿主細胞、サンプルの種類、および決定すべき神経毒の種類に応じて、適用する必要がある条件を十分承知している。別の態様においては、接触は、本発明のポリペプチドならびに本発明のポリペプチドの基質および/または他のキャスパーゼを含む無細胞系中で行う。無細胞系は、その系とサンプルとの接触の際に本発明のポリペプチドの活性を測定するのを可能にし、かくして、前記サンプル中の神経毒活性を決定するのを可能にするべきである。
【００４６】
用語「サンプル」とは、神経毒ポリペプチドを含むことが疑われるサンプルを指す。サンプルは、一態様においては、水性溶液である。そのようなサンプルは、生物学的サンプルであってもよいし、または人工的に作製された水性溶液のサンプルであってもよい。そのような溶液は、一態様においては、品質管理および/もしくは活性の決定/特定目的で、または安全性管理のために、神経毒製造中の様々な段階で得られる。前記サンプル中に存在する神経毒は、少なくとも神経毒プロテアーゼ活性を示すべきであると想定される。別の態様においては、神経毒は完全に生物学的に活性である。一態様においては、前記完全に生物学的に活性な神経毒は、本発明のキャスパーゼポリペプチドに基づいて、細胞に進入するため、およびリードアウトを活性化するために必要とされる。従って、そのような完全に生物学的に活性な神経毒は、宿主細胞を、本発明の方法により分析しようとするサンプルと接触させる場合に適用される。別の態様においては、本発明の方法のために適用されるサンプルは、神経毒プロテアーゼ活性だけを示す神経毒ポリペプチドまたはその断片を含む。そのような神経毒ポリペプチドまたは断片は、一態様においては、タンパク質分解的に活性な軽鎖を含むか、または本質的にそれからなる神経毒ポリペプチドの突然変異タンパク質である。神経毒プロテアーゼ活性だけを示す神経毒ポリペプチドまたはその断片を含むサンプルは、そのサンプルを本明細書の他の場所で詳細に特定される無細胞系に接触させる場合に用いるべきであることが理解される。
【００４７】
キャスパーゼ活性は、本発明のポリペプチドにより付与されるキャスパーゼ活性の基質の切断を決定することにより測定される。基質の切断は、一態様においては、切断された基質を直接的に決定することにより測定することができる。さらなる態様においては、基質の切断は、PAGEに基づく技術により、FRETもしくはフローサイトメトリーなどの免疫蛍光に基づく技術により、ウェスタンブロッティングもしくはELISAなどの抗体に基づく技術により、サイズ排除クロマトグラフィー、好適な検出器を備えたHPLCにより、または質量分析もしくはNMR分光法などの分光技術により決定される。別の態様においては、キャスパーゼ活性は、間接的に、すなわち、基質の切断の下流のプロセスを決定することにより決定される。宿主細胞中で本発明のポリペプチドにより活性化されたキャスパーゼカスケードは、一態様においては、アポトーシスをもたらすため、その活性は細胞生理の検出可能な変化、最終的には、アポトーシス細胞死をもたらす。細胞生理の変化は、細胞形態の変化により、DNA断片化、一態様においては、アポトーシスラダリングにより、および/または細胞周期タンパク質、DNA修復タンパク質、シグナリング分子、細胞骨格タンパク質その他などのアポトーシスキャスパーゼカスケードの基質の切断により検出することができる。一態様においては、基質は、以下の基質：核ラミナ、ICAD/DFF45(キャスパーゼ活性化DNaseもしくはDNA断片化因子45の阻害剤)、PARP(ポリ-ADPリボースポリメラーゼ)またはPAK2(P21活性化キナーゼ2)のうちの1種以上である。
【００４８】
サンプル中の神経毒ポリペプチドの量を、定量的または定性的に決定することができる。定量的検出のためには、一態様においては、測定された量を、本発明の方法において決定しようとする神経毒ポリペプチドの所定量を有するサンプルを較正にかけることにより確立される較正曲線と比較することができる。
【００４９】
本発明の方法の一態様においては、前記キャスパーゼ活性は、前記ポリペプチドの少なくとも1種の基質の切断をin vivoまたはin vitroで決定することにより測定される。基質としてのエフェクターキャスパーゼの切断を、本発明のポリペプチドにおいてイニシエータキャスパーゼ活性を用いることにより達成することができる。本発明のポリペプチドによる基質としてのエフェクターキャスパーゼの切断は、一態様においては、元のキャスパーゼ活性の増幅をもたらす。従って、そのような本発明のポリペプチドは、少量の神経毒ポリペプチドに対しても高い感受性を有する。
【００５０】
具体的には、キャスパーゼ活性を有する本発明のポリペプチドを発現する宿主細胞を含む宿主細胞培養液中でのアポトーシスを決定することにより、キャスパーゼ活性を測定することが本発明の方法において想定される。これに関連して用いられる宿主細胞培養液は、神経毒ポリペプチドを適切に取り込むことができる神経細胞を含む神経宿主細胞培養液であってよい。この目的のために、本発明のポリペプチドのキャスパーゼ活性は、宿主細胞培養液中の宿主細胞を神経毒ポリペプチドを含有するサンプルと接触させた後に活性化される。神経毒を含有するサンプルは、神経毒ポリペプチドを含む薬剤またはボツリヌス細菌もしくは神経毒ポリペプチドを発現するように遺伝子操作され、そのような薬剤の製造に用いられる宿主細胞からの細胞抽出物から誘導することができる。サンプルの生物学的に活性な神経毒は、前記宿主細胞に進入し、続いて、神経毒プロテアーゼのそれぞれの切断部位を含む本発明のポリペプチドを活性化する。キャスパーゼ活性を有する本発明の活性化されたポリペプチドは次いで、キャスパーゼカスケードを活性化し、かくして、宿主細胞におけるアポトーシスを誘導する。次いで、宿主細胞のアポトーシスを、本明細書の他の場所で詳細に説明されるように測定することができる。具体的には、アポトーシスは、Hochst 33258染料を用いる小胞形成の決定などの画像化技術により、細胞の細胞形態および細胞内形態を決定することにより測定される。
【００５１】
上記から理解されるように、本発明は、サンプル中の神経毒活性を決定するための本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞の使用に一般的に関する。
【００５２】
さらに、神経毒活性を決定するためのキットが本発明に従って提供される。前記キットは、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞を含む。
【００５３】
本明細書で用いられる用語「キット」とは、本発明の方法を実行するためにすぐに使用できる様式で個別のまたは共通のバイアル中で提供される本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターおよび/または宿主細胞を含む手段の集合体を指す。一態様においては、キットは、本発明の方法を実行するためのさらなる手段、一態様においては、神経毒ポリペプチドを含む較正標準溶液および/またはキャスパーゼ基質の切断を決定するための検出剤もしくは細胞におけるアポトーシスを決定するための薬剤などのキャスパーゼ活性を測定するための手段を含む。さらに、一態様においては、キットは、本発明の方法を実行するための説明書を含む。これらの説明書は、マニュアルとして提供することができるか、または実行の際に本発明の1以上のステップを管理することができるデータ保存媒体上のコンピュータにより実行可能なアルゴリズムの形態にあってもよい。
【００５４】
以下、本発明の実施形態を示す。
（１）大サブユニットと小サブユニットとを含むキャスパーゼ活性を有するポリペプチドであって、前記キャスパーゼが切断時にキャスパーゼ活性を活性化する神経毒切断部位をさらに含む、前記ポリペプチド。
（２）前記神経毒切断部位が、大サブユニットのC末端近接領域と、小サブユニットのN末端近接領域との間に位置する、（１）に記載のポリペプチド。
（３）(i)大サブユニットの前記C末端近接領域が、キャスパーゼ3の大サブユニットのアミノ酸C170からD175、L168からE173、Q161からD175、またはQ161からE173に対応するアミノ酸からなり、小サブユニットの前記N末端近接領域が、キャスパーゼ3の小サブユニットのアミノ酸S176からV190またはS176からC184に対応するアミノ酸からなり、
(ii)大サブユニットの前記C末端近接領域が、キャスパーゼ6の大サブユニットのアミノ酸V174からD179、H172からV177、Q165からD179、またはQ165からV177に対応するアミノ酸からなり、小サブユニットの前記N末端近接領域が、キャスパーゼ6の小サブユニットのアミノ酸S180からA194またはS180からV188に対応するアミノ酸からなり、
(iii)大サブユニットの前記C末端近接領域が、キャスパーゼ7の大サブユニットのアミノ酸D193からD198、L191からQ196、Q184からD198、またはQ184からQ196に対応するアミノ酸からなり、小サブユニットの前記N末端近接領域が、キャスパーゼ7の小サブユニットのアミノ酸S199からV213またはS199からR207に対応するアミノ酸からなり、
(iv)大サブユニットの前記C末端近接領域が、キャスパーゼ8の大サブユニットのアミノ酸K369からD374、Y367からE372、Q360からD374、またはQ360からE372に対応するアミノ酸からなり、小サブユニットの前記N末端近接領域が、キャスパーゼ8の小サブユニットのアミノ酸S375からD389またはS375からT383に対応するアミノ酸からなり、
(v)大サブユニットの前記C末端近接領域が、キャスパーゼ10の大サブユニットのアミノ酸P367からD372、I365からE370、Q358からD372、またはQ358からE370に対応するアミノ酸からなり、小サブユニットの前記N末端近接領域が、キャスパーゼ10の小サブユニットのアミノ酸A373からA386またはA373からQ380に対応するアミノ酸からなり、
(vi)大サブユニットの前記C末端近接領域が、キャスパーゼ9の大サブユニットのアミノ酸H310からD315、K308からE313、Q301からD315、またはQ301からE313に対応するアミノ酸からなり、小サブユニットの前記N末端近接領域が、キャスパーゼ9の小サブユニットのアミノ酸A316からT330またはA316からI324に対応するアミノ酸からなり、または、
(vii)大サブユニットの前記C末端近接領域が、キャスパーゼ2の大サブユニットのアミノ酸R311からD316、T309からQ314、Q302からD316、またはQ302からQ314に対応するアミノ酸からなり、小サブユニットの前記N末端近接領域が、キャスパーゼ2の小サブユニットのアミノ酸G317からT331またはG317からK325に対応するアミノ酸からなる、
（２）に記載のポリペプチド。
（４）前記ポリペプチドがプロドメインをさらに含む、（１）〜（３）のいずれか１に記載のポリペプチド。
（５）前記神経毒切断部位が、プロドメインのC末端近接領域と、大サブユニットのN末端近接領域との間に位置する、（４）に記載のポリペプチド。
（６）前記神経毒切断部位が、BoNT/Aプロテアーゼにより認識および切断される切断部位である、（１）〜（５）のいずれか１に記載のポリペプチド。
（７）前記切断部位が、配列番号１〜５のいずれか1つに示される、（６）に記載のポリペプチド。
（８）前記神経毒切断部位が、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/GまたはTeNTプロテアーゼにより認識および切断される切断部位である、（１）〜（７）のいずれか１に記載のポリペプチド。
（９）（１）〜（８）のいずれか１に定義されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（１０）（９）に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
（１１）（１）〜（８）のいずれか１に記載のポリペプチド、（９）に記載のポリヌクレオチドまたは（１０）に記載のベクターを含む宿主細胞。
（１２）サンプル中の神経毒活性を決定するための方法であって、
(a)（１）〜（８）のいずれか１に記載のポリペプチドと、神経毒活性を含むことが疑われるサンプルとを接触させるステップ；および
(b)該ポリペプチドのキャスパーゼ活性を測定し、それによってサンプル中の神経毒活性を決定するステップ、
を含む、前記方法。
（１３）前記キャスパーゼ活性が前記ポリペプチドの少なくとも1種の基質の切断によって測定される、（１２）に記載の方法。
（１４）前記基質が少なくとも1種のエフェクターキャスパーゼである、（１３）に記載の方法。
（１５）前記ポリペプチドが宿主細胞により含まれる、（１２）〜（１４）のいずれか１に記載の方法。
（１６）サンプル中の神経毒活性を決定するための（１）〜（８）のいずれか１に記載のポリペプチド、（９）に記載のポリヌクレオチド、（１０）に記載のベクターまたは（１１）に記載の宿主細胞の使用。
（１７）（１）〜（８）のいずれか１に記載のポリペプチド、（９）に記載のポリヌクレオチド、（１０）に記載のベクターまたは（１１）に記載の宿主細胞を含む、神経毒活性を決定するためのキット。
本明細書で引用される全ての参考文献は、その全体の開示内容および本明細書に具体的に記載される開示内容に関して、参照により本明細書に組込まれるものとする。
【００５５】
(実施例)
【実施例１】
【００５６】
大腸菌構築物(pTZ_E02_Casp3.1およびpTZ_E44_Casp3.1)のクローニング
この構築物は、pET24dに基づくベクター誘導体であり、最終構築物はC末端Streptag IIを含むプロキャスパーゼ(Procaspase) 3.1をコードする。以下のクローニング戦略を適用した：Procaspase 3.1を、以下のプライマー：
1369_Casp3.1_BsmBI_fp AACGTCTCTGATGAACAGCTACAAGATGGACTACCC (配列番号13)
1369_Casp3.1_2Stop_AscI_rp AAGGCGCGCCTATTATTTTTCGAACTGCGGGTGGCTC (配列番号14)
を用いて、プラスミドMRZ_Casp3.1からPCR増幅した。
【００５７】
Procaspase 3.1を、制限部位AscI/BsmBIを用いてpTZE02中にサブクローニングした。陽性クローンをPCRによりスクリーニングし、プラスミドDNAを単離した。最終構築物のクローニングされた標的配列を、配列決定により検証した。pTZ_E44_Casp3.1構築物は、Procaspase 3.1に融合されたssMBP(ペリプラズム発現のためのシグナル配列を含むマルトース結合タンパク質)からなる。最終構築物は、C末端Streptag IIを含むペリプラズム発現されるMBP-Procaspase 3.1融合タンパク質をコードする。MBP融合パートナーを、セリンプロテアーゼ第Xa因子を用いてProcaspase 3.1から切断して、天然のStrepタグ付Procaspase 3.1を得ることができる。以下のクローニング戦略を適用した：Procaspase 3.1を、以下のプライマー：1369_Casp3.1_BsmBI_fpおよび1369_Casp3.1_2Stop_AscI_rpを用いてプラスミドMRZ_Casp3.1からPCR増幅させた。Procaspase 3.1を、制限部位AscI/BsmBIを用いてpTZE44中にサブクローニングした。陽性クローンをPCRによりスクリーニングし、プラスミドDNAを単離した。最終構築物のクローニングされた標的配列を、配列決定により検証した。
【実施例２】
【００５８】
P.パストリス構築物pTZ_P01_Casp3.1およびpHIL-D2_Casp3.1のクローニング
pTZ_P01_Casp3.1構築物は、分泌シグナル(α因子)を担持するpPICZalphaAに基づくベクター誘導体である。最終構築物は、C末端Streptag IIを含むProcaspase 3.1として分泌される。以下のクローニング戦略を適用した：Procaspase 3.1を、以下のプライマー：1369_Casp3.1_BsmBI_fpおよび1369_Casp3.1_2Stop_AscI_rpを用いて、プラスミドMRZ_Casp3.1からPCR増幅した。Procaspase 3.1を、制限部位AscI/BsmBIを用いてpTZP01中にサブクローニングした。陽性クローンをPCRによりスクリーニングし、プラスミドDNAを単離した。最終構築物のクローニングされた標的配列を、配列決定により検証した。pHIL-D2_Casp3.1構築物は、N末端6xHisタグを含むProcaspase 3.1として細胞内で発現される。以下のクローニング戦略を適用した：Procaspase 3.1を、以下のプライマー：
1369_Casp3.1_pHILD2_fp AACAATTGTCTGCCATCATGCATCATCATCATCATCATAACAGCTACAAGATGGACTACC (配列番号15)
1369_Casp3.1_pHILD2_rp AACAATTGTTATTAGAGACCGTGGTAGAAGTACAGCTC (配列番号16)
を用いて、プラスミドMRZ_Casp3.1からPCR増幅した。
【００５９】
Procaspase 3.1を、制限部位MfeI/EcoRIを用いてpHILD2中にサブクローニングした。挿入は2つの異なる方向(cwおよびccw)で起こり得る。制限分析および配列決定により、所望の方向(1369_pHILD2_Casp3.1_cw)を同定する。陽性クローンをPCRによりスクリーニングし、プラスミドDNAを単離した。最終構築物のクローニングされた標的配列を、配列決定により検証した。
【実施例３】
【００６０】
pTZE02/Casp3.1の大腸菌中での発現
この構築物は、C末端Streptag IIを含むProcaspase 3.1をコードする、pET24dに基づくベクター誘導体である。Casp3.1の予想分子量は30.4kDaであり、見積もられるpIは8.5である。発現を分析するために、pTZE02/Casp3.1(KanR)を、以下の大腸菌株：
BL21 (DE3)
BL21 (DE3) / pGroEL ES (CamR)
Rosetta (DE3) / pRARE2 (CamR)
Rosetta (DE3) / pLys (CamR)
中に形質転換した。
【００６１】
0.4のOD600に達するまで、50μg/mlのカナマイシン(およびそれぞれの株について30μg/mlのクロラムフェニコール)を添加したLB培地中、37℃で細胞を増殖させた。それぞれの培養を30℃に変更し、0.5のOD600に達するまで増殖させた。培養液を0.2mMのIPTGで誘導し、30℃でさらに22時間増殖させた。誘導の0、1、4および22時間後、サンプルを採取し、BugバスターHT溶液(Novagen)で処理して、細胞を破壊し、可溶性および不溶性タンパク質画分を分離した。サンプルを12%ゲル上でのSDS-PAGEにより分析した(図2および3)。
【実施例４】
【００６２】
pTZE44/Casp3.1の大腸菌中での発現
この構築物は、Procaspase 3.1に融合したssMBP(ペリプラズム発現のためのシグナル配列を含むマルトース結合タンパク質)からなる。最終構築物は、C末端Streptag IIを含むペリプラズム発現されるMBP-Procaspase 3.1融合タンパク質をコードする。MBP融合パートナーを、セリンプロテアーゼ第Xa因子を用いてProcaspase 3.1部分から切断して、天然のStrepタグ付Procaspase 3.1を得ることができる。MBP-Casp3融合タンパク質の予想分子量(MBP-シグナル配列が切断除去されている)は74kDaであり、見積もられるpIは6.9である。発現を分析するために、pTZE44/Casp3.1(AmpR)を、以下の大腸菌株：
BL21 (DE3)
BL21 (DE3) / pGroEL ES (CamR)
Rosetta (DE3) / pRARE2 (CamR)
Rosetta (DE3) / pLys (CamR)
中に形質転換した。
【００６３】
0.4のOD600に達するまで、200μg/mlのアンピシリン(およびそれぞれの株について30μg/mlのクロラムフェニコール)を添加したLB培地中、37℃で細胞を増殖させた。それぞれの培養を30℃に変更し、0.5のOD600に達するまで増殖させた。培養液を0.2mMのIPTGで誘導し、30℃でさらに22時間増殖させた。誘導の0、1、4および22時間後、サンプルを採取し、BugバスターHT溶液(Novagen)で処理して、細胞を破壊し、可溶性および不溶性タンパク質画分を分離した。サンプルを12%ゲル上でのSDS-PAGE(および抗Strep-tag抗体を用いるウェスタンブロット)により分析した；図4および5を参照されたい。ウェスタンブロット分析は、誘導の4〜22時間後にRosetta(DE3)/pRARE2およびRosetta(DE3)/pLys発現の不溶性タンパク質画分中に70kDa分子量マーカーバンドのわずかに下に泳動するタンパク質の存在を示した。Strep-Tag抗体で検出された弱いタンパク質バンドもまた、誘導の4〜22時間後にBL21(DE3)/pGroESEL発現の不溶性タンパク質画分中に見える。このバンドがMBP-Casp3.融合タンパク質に一致するかどうかは解明することができなかった。
【００６４】
pTZE02/Casp 3.1構築物の以前に試験した発現条件を最適化するために、4つのさらなる試験発現を実施した。pTZE02/Casp3.1(KanR)を、以下の大腸菌株：
Rosetta (DE3) / pRARE2 (CamR)
Rosetta (DE3) / pLys (CamR)
中に形質転換した。
【００６５】
0.4のOD600に達するまで、50μg/mlのカナマイシンおよび30μg/mlのクロラムフェニコールを添加したLB培地中、37℃で細胞を増殖させた。それぞれの培養液を2つの等量部分に分割した。それぞれの培養液の半分を30℃に変更し、他の半分を20℃に変更し、0.5のOD600に達するまで増殖させた。培養液を0.2mMのIPTGで誘導し、それぞれの温度でさらに24時間増殖させた。誘導の0、1、4、6、8および24時間後、サンプルを採取し、BugバスターHT溶液(Novagen)で処理して、細胞を破壊し、可溶性および不溶性タンパク質画分を分離した。サンプルを12%ゲル上でのSDS-PAGE(および抗Strep-tag抗体を用いるウェスタンブロット)により分析した；図6〜9を参照されたい。ウェスタンブロット分析を実施して、クマシー染色されたゲル中のバンドを、Casp 3.1標的とを明確に相関させ、不溶性標的と比較した可溶性標的の量を見積もった。クマシー染色されたゲル中のバンドを、Casp 3.1標的とを明確に相関させ、不溶性標的と比較した可溶性標的の量を見積もるために、ウェスタンブロット分析を実施した。ウェスタンブロット分析は、全ての試験した発現条件の可溶性および不溶性タンパク質画分中で25と35kDaの分子量マーカーバンドの間に泳動するタンパク質の存在を示した。20℃でのRosetta(DE3)/pRARE2発現(6〜8時間の誘導)における検出されたタンパク質バンドは、翻訳されるCasp3.1タンパク質の予想分子量(30.4kDa)と一致し、標的の少なくとも50%が可溶性形態で存在することを示していた。再度、ウェスタンブロット分析は、全ての試験した発現条件の可溶性および不溶性タンパク質画分中で25と35kDaの分子量マーカーバンドの間に泳動するタンパク質の存在を示した。20℃でのRosetta(DE3)/pLys発現(6〜8時間の誘導)における検出されたタンパク質バンドは、翻訳されたCasp3.1タンパク質の予想分子量(30.4kDa)と一致し、標的の少なくとも50%が可溶性形態で存在することを示していた。最良の発現結果は、20℃および8時間の誘導時間でのRosetta(DE3)/pRARE2において達成された。
【実施例５】
【００６６】
pTZP01/Casp3.1およびpHil-D2/Casp3.1のP.パストリス中での発現
この構築物は、分泌シグナル(α因子)を担持するpPICZalphaAに基づくベクター誘導体である。最終構築物は、C末端Streptag IIを含むProcaspase 3.1として分泌される。分泌さるCasp3.1タンパク質(以下の認識部位：Glu-Lys-Arg切断部位-Glu-Ala-Glu-Ala-Caspase3.1のアルギニンとグルタミンの間のKEX2およびSTE13にコードされる切断部位)の予想分子量は30.4kDaであり、見積もられるpIは8.48である。発現を分析するために、pTZP01/Casp3.1(ZeocinR)をSalIを用いて線状化し、以下のP.パストリス株：
X33
KM71
GS115
中に形質転換した。
【００６７】
AOX遺伝子座への組換えを、スクリーンPCRによって検証した。組換え細胞を、YPD培地中で3日間、28℃で増殖させた(前培養液、KM71およびGS115の場合、16の最終OD600に達し、X33の場合、18のOD600に達した)。それぞれの前培養液を、MGY培地中に接種し(KM71およびGS115については0.04%のヒスチジンを添加した、提供されたInvitrogenのマニュアルを参照されたい)、5のOD600に達するまで増殖させた。培養液を0.5%(最終濃度)メタノールを用いて誘導し、28℃でさらに72時間増殖させた。誘導の0、24、48および72時間後、サンプルを採取した。ガラスビーズ溶解を実施して、細胞を破壊し、可溶性および不溶性タンパク質画分を分離した。サンプルを12%ゲル上でのSDS-PAGE分析により分析した(図10および11)。クマシー染色されたゲル中のCasp3.1タンパク質バンドを明確に同定し、不溶性標的と比較した可溶性標的の量を見積もるために、抗Strep-タグ抗体を用いるウェスタンブロット分析を実施した。ウェスタンブロット分析において、メタノールで誘導した後に30.4kDaの予想分子量に泳動するタンパク質バンドは検出されなかった。ゲル上に10のOD600の1/6をロードした場合でも、分泌(可溶性)画分中でシグナルはほぼ検出されなかった。これが標的の少ないか、もしくは全くない分泌に起因するか、または一般的な少量の発現に起因するものであるかは、不明なままであった。
【００６８】
最終構築物pHil-D2/Casp3.1は、N末端6xHis-tagを含むProcaspase 3.1として細胞内で発現される。His-Casp3.1タンパク質の予想分子量は30kDaであり、見積もられるpIは8.9である。発現を分析するために、pHIL-D2/Casp3.1(AmpR)をSalIを用いて線状化し、以下のP.パストリス株：
KM71
GS115
中に形質転換した。
【００６９】
HIS4遺伝子座中への組換えを、スクリーンPCRによって検証した。組換え細胞を、ヒスチジンを含まないSDC培地中で3日間、28℃で増殖させた(前培養液、KM71の場合、4.52の最終OD600に達し、GS115の場合、3.29のOD600に達した)。それぞれの前培養液を、SDC培地中に接種し(ヒスチジンを含まない)、2.5のOD600に達するまで増殖させた。培養液を0.5%(最終濃度)メタノールを用いて誘導し、28℃でさらに72時間増殖させた。誘導の0、24、48および72時間後、サンプルを採取し、ガラスビーズで処理して、細胞を破壊した。サンプルを12%ゲル上でのSDS-PAGE分析(および抗Strep-tag抗体を用いるウェスタンブロット)により分析した；図12を参照されたい。ウェスタンブロット分析において、30kDaの予想分子量に泳動するタンパク質バンドが、メタノールを用いる誘導後に検出された。検出されたタンパク質バンドの強度は、誘導がより長く続くほど、低下するようである。これは、時間に対する産生された標的の安定性の低下に起因するか、または時間に対する発現の減少に起因することもあり得る。
【実施例６】
【００７０】
BoNT/AによるCasp3.1の活性化
精製されたCasp3.1を、37℃で2時間、活性なBoNT/Aと共にインキュベートした。その反応により得られた切断産物を、SDS-PAGEにより分離し、ウェスタンブロッティングによりさらに分析した。その結果を図13に示す。Casp3.1のいくらかの自己触媒的活性化も存在するが、Casp3.1の用量依存的BoNT/A誘導活性化も観察された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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