(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)配列番号1と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリシンデカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドの発現による、細胞内リシンデカルボキシラーゼ活性及び
(b)配列番号3と少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリシンエクスポーター活性を有するポリペプチドの欠失又は破壊による、増強されたリシンインポート活性
を含み、かつ
(c)配列番号11と少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつアセチルカダベリン形成活性を有するポリペプチドの欠失又は破壊により、アセチルカダベリン形成活性がない
微生物であって、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である、微生物。
【請求項２】
高いリシン生産能を有する、請求項1に記載の微生物。
【請求項３】
アミノプロピルカダベリン形成活性がない又は低減されている、請求項1又は2に記載の微生物。
【請求項４】
アミノプロピルカダベリン形成活性が、配列番号12と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつアミノプロピルカダベリン形成活性を有するポリペプチドの活性を低下させることにより低減される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の微生物。
【請求項５】
ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性がない又は低減されている、請求項1〜4のいずれか1項に記載の微生物。
【請求項６】
ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性が、配列番号13、14又は15と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドの活性を低下させることにより低減される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の微生物。
【請求項７】
リシン分解活性がない又は低減されている、請求項1〜6のいずれか1項に記載の微生物。
【請求項８】
リシン分解活性が、配列番号16と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリシンヒドロキシラーゼ活性を有する少なくとも1つのポリペプチドの活性を低下させることにより低減される、請求項1〜7のいずれか1項に記載の微生物。
【請求項９】
請求項1〜8のいずれか1項に記載の微生物、及び該微生物の増殖に適した培養培地を含むカダベリン生産系。
【請求項１０】
培養培地がリシンを含む、請求項9に記載のカダベリン生産系。
【請求項１１】
請求項1〜8のいずれか1項に記載の微生物を発酵することを含む、カダベリンの生産方法。
【請求項１２】
培養培地がリシンを含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
培養培地中のカダベリンの濃度（mol/l）が、
（a）アセチルカダベリンの濃度（mol/l）よりも少なくとも1.2倍高い、又は
（b）アミノプロピルカダベリンの濃度（mol/l）よりも少なくとも1.2倍高い、
請求項11又は12に記載の方法。
【請求項１４】
培養培地中のカダベリンの濃度（mol/l）が、アセチルカダベリンの濃度（mol/l）よりも少なくとも1.2倍高い、請求項11〜13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項11〜14のいずれか1項に記載の方法を使用して、カダベリンの濃度（mol/l）が、
（a）アセチルカダベリンの濃度（mol/l）よりも少なくとも1.2倍高い、又は
（b）アミノプロピルカダベリンの濃度（mol/l）よりも少なくとも1.2倍高い
培養培地を製造する方法。
【請求項１６】
カダベリンの濃度（mol/l）がアセチルカダベリンの濃度（mol/l）よりも少なくとも1.2倍高い培養培地を製造する方法である、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
請求項11〜14のいずれか1項に記載の方法を使用して、少なくとも0.25mol/lのカダベリンを含むが、
（a）0.1mol/l以下のアセチルカダベリン、又は
（b）0.1mol/l以下のアミノプロピルカダベリン
を含む培養培地を製造する方法。
【請求項１８】
請求項11〜14のいずれか1項に記載の方法を使用して、少なくとも0.25mol/lのカダベリンを含むが0.1mol/l以下のアセチルカダベリンを含む培養培地を製造する方法。
【請求項１９】
カダベリンの生産のための、請求項1〜8のいずれか1項に記載の微生物又は請求項9〜10のいずれか1項に記載のカダベリン生産系の使用。
【請求項２０】
請求項11〜14のいずれか1項に記載の方法における、請求項1〜8のいずれか1項に記載の微生物又は請求項9〜10のいずれか1項に記載のカダベリン生産系の使用。
【請求項２１】
請求項15〜18のいずれか1項に記載の方法によって培養培地を製造し、培養培地からカダベリンを回収することを含む、カダベリンの回収方法。
【請求項２２】
請求項11〜14のいずれか1項に記載の方法を使用して培養培地を製造し、培養培地からカダベリンを精製することを含む、カダベリンの精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カダベリンの生産を改善する脱調節形態のDNA分子を含む組換え微生物の使用、並びに該微生物の作製に使用される組換えDNA分子及びポリペプチドに関し、該微生物は、細胞内リシンデカルボキシラーゼ活性及び増強されたリシンインポート活性を含むか又は細胞内及び細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性を含むか又は細胞内及び細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性と増強されたリシンインポート活性を含む。本発明はまた、組換え微生物を用いたカダベリンの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
JP 2002223770は、リシン脱炭酸遺伝子及び／又はリシン-カダベリンアンチポーター遺伝子をリシン生産微生物に導入することによるカダベリンの生産方法を開示している。
【０００３】
JP 2004222569は、L-リシンデカルボキシラーゼ活性及びホモセリン要求性を有する組換えコリネ型細菌を培養することによるカダベリンの生産方法を開示している。
【０００４】
WO 2007113127は、L-リシンデカルボキシラーゼ活性が脱調節された組換えコリネ型細菌を培養することによるカダベリンの生産方法、カダベリンアセチルトランスフェラーゼの検出、及びカダベリン生産を改善するためのその欠失を開示している。
【０００５】
WO 2008092720は、細胞内で発現されるデカルボキシラーゼを発現する高リシン生産微生物を発酵することによるカダベリンの生産方法を開示している。それにより、かかる微生物は、リシン／カダベリンアンチポーターの発現が低減又は排除されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】JP 2002223770
【特許文献２】JP 2004222569
【特許文献３】WO 2007113127
【特許文献４】WO 2008092720
【発明の概要】
【０００７】
一態様において、本発明は、細胞内リシンデカルボキシラーゼ活性及び増強されたリシンインポート活性を有するか、又は細胞内及び細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性を有するか、又は細胞内及び細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性と増強されたリシンインポート活性を有する微生物を提供する。
【０００８】
別の態様において、本発明は、上述の微生物、並びに上述の微生物を培養することによりカダベリンを生産する方法を提供し、ここで該微生物の細胞内リシンデカルボキシラーゼ活性又は細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性又は細胞内及び細胞外デカルボキシラーゼ活性は、少なくとも部分的には、cadAリシンデカルボキシラーゼ又はldcCリシンデカルボキシラーゼのホモログである少なくとも1つのポリペプチドの発現によるものである。
【０００９】
さらなる態様において、本発明は、細胞内リシンデカルボキシラーゼ活性及び増強されたリシンインポート活性を有するか、又は細胞内及び細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性を有するか、又は細胞内及び細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性と増強されたリシンインポート活性を有する微生物を提供し、ここで該増強されたリシンインポート活性は、リシンパーミアーゼ活性の増強又はリシン／カダベリンアンチポーター活性の増強によるものである。
【００１０】
さらなる態様において、本発明は、増強されたリシンインポート活性が、リシンエクスポーターポリペプチドの発現を低減若しくは排除することによる、又はリシンパーミアーゼ活性の増強による、又はリシン／カダベリンアンチポーター活性の増強による、あるいはそれらのいずれかの組み合わせによるものである、上述の微生物を提供する。
【００１１】
さらなる態様において、本発明は、lysEポリペプチドの活性が低減されている、又はリシンパーミアーゼポリペプチドの活性が増強されている、又はリシン／カダベリンアンチポーターポリペプチドの活性が増強されている、又はlysEポリペプチド活性の低減、リシンパーミアーゼポリペプチド活性の増強若しくはリシン／カダベリンアンチポーターポリペプチド活性の増強のいずれかの組み合わせを有する、上述の微生物を提供する。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、上述した特徴のいずれかの組み合わせを有し、かつアセチルカダベリン形成活性がない若しくは低減されている、又はアミノプロピルカダベリン形成活性がない若しくは低減されている、又はホモセリンデヒドロゲナーゼ活性がない若しくは低減されている、又はリシン分解活性がない若しくは低減されている、又はこれらの活性の少なくとも2つが存在しない若しくは低減されている微生物を提供する。
【００１３】
別の態様において、本発明は、NP_600742タンパク質の活性、若しくはスペルミジンシンターゼタンパク質の活性、若しくはホモセリンデヒドロゲナーゼタンパク質の活性、若しくはリシンヒドロキシラーゼタンパク質の活性、又はこれらのタンパク質の任意の組み合わせの活性が低減されている微生物を提供する。
【００１４】
別の態様において、本発明は、脱調節されたスペルミジン形成若しくは取り込み活性、又は脱調節されたプトレシン形成若しくは取り込み活性、あるいはそのいずれかの組み合わせを有する微生物を提供する。
【００１５】
別の態様において、本発明は、真正細菌（Eubacteria）のクレード、例えばコリネバクテリウム属（Corynebacterium）又はエッシェリヒア属（Escherichia）、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）又は大腸菌（Escherichia coli）の種に属する、上述した特徴を有する微生物を提供する。
【００１６】
別の態様において、本発明は、上述した特徴を有する微生物及びリシン含有培養培地を含むカダベリン生産系を提供する。
【００１７】
別の態様において、本発明は、上述した微生物のいずれか1つを、リシンを含む又はリシンを含まない培養培地中で発酵することを含む、カダベリンの生産方法を提供する。
【００１８】
別の態様において、本発明は、培養培地が少なくとも0.25mol/lのカダベリンを含むが、0.1mol/l以下のアセチルカダベリン又は0.1mol/l以下のアミノプロピルカダベリンを含む方法、あるいは培養培地中のカダベリンの濃度（mol/l）がアセチルカダベリンの百分率（重量/体積）よりも少なくとも1.2倍高い、又はアミノプロピルカダベリンの百分率（重量/体積）よりも少なくとも1.2倍高い方法を提供する。
【００１９】
別の態様において、本発明は、少なくとも0.25mol/lのカダベリンを含むが、0.1mol/lを超えるアセチルカダベリン又は0.1mol/lを超えるアミノプロピルカダベリンを含まない培養培地、あるいはカダベリンの濃度（mol/l）がアセチルカダベリンの濃度（mol/l）よりも少なくとも1.2倍高い、又はアミノプロピルカダベリンの濃度（mol/l）よりも少なくとも1.2倍高い培養培地を提供する。
【００２０】
別の態様において、本発明は、カダベリンの生産のための上述した微生物のいずれか1つの使用、又はカダベリンを生産する方法における使用を提供する。
【００２１】
別の態様において、本発明は、カダベリンの回収のための、上述した微生物のいずれか1つの発酵により製造される発酵ブロスの使用、又は高濃度のカダベリンを有しかつ低濃度のアセチルカダベリン若しくは低濃度のアミノプロピルカダベリンを有する発酵ブロスの使用を提供する。
【００２２】
別の態様において、本発明は、ヘミセルロース由来ペントースをカダベリン又はリシンなどの精製化学製品（ファインケミカル）に転化する特徴を有する微生物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】カダベリンアセチル化ステップを含む、コリネバクテリウム・グルタミカムにおけるDAP生合成経路の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下の説明では、多数の用語を広く使用する。本発明の理解を容易にするため、ここに定義を提供する。
【００２５】
「カダベリン」という用語は、1,5-ジアミノペンタン（CAS番号：462-94-2）を意味する。
【００２６】
本発明の方法は、好ましくは本明細書中に記載されるベクター又は遺伝子（例えば、野生型遺伝子及び/若しくは変異遺伝子）を含み、並びに/あるいはカダベリンの生産を生じさせる方法で培養される、組換え微生物を特徴とする。
【００２７】
「組換え」微生物という用語は、この微生物が誘導される天然の微生物と比較して、該微生物が、改変された、修飾された又は異なった遺伝子型及び/又は表現型を示す（例えば、遺伝子改変が該微生物のコード核酸配列に影響を及ぼす場合）ように遺伝子が改変、修飾又は組換えされた（例えば、遺伝子組換えされた）微生物（例えば、細菌、酵母細胞、真菌細胞等）を包含する。
【００２８】
プロモーター：mRNAを生成するよう構造遺伝子の転写を指令するDNA配列。通常、プロモーターは遺伝子の5'領域に位置し、構造遺伝子の開始コドンの近位にある。プロモーターが誘導性プロモーターである場合、転写速度は、誘導剤に応答して増大する。対照的に、この転写速度は、プロモーターが構成的プロモーターである場合、誘導剤によっては調節されない。
【００２９】
エンハンサー：プロモーターエレメント。エンハンサーは、転写開始部位に対する該エンハンサーの距離又は配向と関係なく、特定の遺伝子をmRNAに転写する効率を増大させることができる。
【００３０】
クローニングベクター：宿主細胞中で自己複製する能力を有し、遺伝子操作用の細胞を形質転換するために使用されるDNA分子（例えば、プラスミド、コスミド、ファージミド、又はバクテリオファージ）。クローニングベクターは、典型的には、特定可能な方法で、該ベクターの必須の生物学的機能を喪失することなく外来DNA配列を挿入することのできる1つ又は少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、並びに該クローニングベクターで形質転換された細胞の同定及び選択における使用に好適なマーカー遺伝子を含有する。マーカー遺伝子は、典型的には、テトラサイクリン耐性又はアンピシリン耐性を与える遺伝子を含む。
【００３１】
発現ベクター：組換え宿主中で外来タンパク質の発現を生じる、外来タンパク質をコードするクローン化された構造遺伝子を含むDNA分子。通常、クローン化された遺伝子の発現は、プロモーター配列及びエンハンサー配列などの特定の調節配列の制御下に置かれる（すなわち、機能的に連結される）。プロモーター配列は、構成的又は誘導性のいずれであってもよい。
【００３２】
組換え宿主：組換え宿主は、クローニングベクター又は発現ベクターのいずれかを含む任意の原核細胞又は真核細胞であってよい。この用語は、宿主細胞の染色体又はゲノム中にクローン化された遺伝子を含むように遺伝子操作されている原核細胞又は真核細胞を包含することも意味する。好適な宿主の例として、Sambrookら, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) ["Sambrook"]を参照されたい。
【００３３】
「発現する」、「発現している」、「発現された」及び「発現」という用語は、遺伝子産物（例えば、本出願において定義及び記載される経路又は反応の遺伝子の生合成酵素）の、それをコードするこのタンパク質の酵素活性が得られる、又はこの遺伝子／経路が発現される生物におけるこの経路若しくは反応を介した代謝フラックスを可能にすることを意味する経路若しくは反応の酵素活性が得られるレベルでの発現を意味する。発現は、出発微生物として用いられる微生物の遺伝子改変によって行うことができる。いくつかの実施形態において、微生物は、出発微生物により産生されるレベル又は改変されていない同等微生物におけるレベルと比較して増加したレベルで遺伝子産物を発現するように遺伝子改変(例えば遺伝子操作）することができる。遺伝子改変には、限定されるものではないが、特定の遺伝子の発現に関係した調節配列又は部位を改変又は修飾すること（例えば強力なプロモーター、誘導性プロモーター若しくは複数のプロモーターの付加により、又は発現が構成的となるように調節配列を除去することによる）、特定の遺伝子の染色体位置を改変すること、特定の遺伝子に隣接する核酸配列（リボソーム結合部位又は転写ターミネーターなど）を改変すること、特定の遺伝子のコピー数を増加させること、特定の遺伝子の転写及び／又は特定の遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質（例えば、調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写アクチベーターなど）を改変すること、あるいは当技術分野における慣用技術を用いた特定の遺伝子の発現を脱調節させる他の慣用的な手段（限定されるものではないが、アンチセンス核酸分子、たとえばリプレッサータンパク質の発現を阻止するためのアンチセンス核酸分子など）が挙げられる。
【００３４】
いくつかの実施形態において、微生物は、出発微生物による遺伝子産物の発現レベルと比較して増加した又は低いレベルで遺伝子産物を発現するように、物理的又は環境的に改変することができる。例えば、微生物を、特定の遺伝子の転写及び／又は特定の遺伝子産物の翻訳を増加させることが知られている又はその疑いがある作用物質で処理する又はその作用物質の存在下で培養して、転写及び／又は翻訳を増強又は増加させうる。あるいは、微生物を、特定の遺伝子の転写及び／又は特定の遺伝子産物の翻訳を増大させるために選択される温度で培養して、 転写及び／又は翻訳を増強又は増加させうる。
【００３５】
「脱調節する」、「脱調節された」及び「脱調節」という用語は、微生物における少なくとも1つの遺伝子の改変又は修飾であって、かかる改変又は修飾のないカダベリン生産と比較して微生物におけるカダベリン生産の効率の増加が生じる改変又は修飾を意味する。いくつかの実施形態において、改変又は修飾される遺伝子は、生合成経路又は輸送タンパク質における酵素をコードし、それにより、微生物における生合成酵素のレベル若しくは活性が改変若しくは修飾されるか、又は輸送特異性若しくは効率が改変若しくは修飾される。いくつかの実施形態において、生合成経路における酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子は、該酵素のレベル又は活性が、非改変型又は野生型遺伝子の存在下におけるレベルと比較して増強又は増大するように、改変又は修飾される。脱調節はまた、例えば、フィードバック抵抗性であるか又は高い若しくは低い比活性を有する酵素をもたらすように、1以上の遺伝子のコード領域を改変することも含む。また脱調節は、酵素又は輸送タンパク質をコードする遺伝子の発現を調節する転写因子（例えば、アクチベーター、リプレッサー）をコードする遺伝子の遺伝子改変をさらに包含する。
【００３６】
「過剰発現する」、「過剰発現している」、「過剰発現された」及び「過剰発現」という用語は、出発微生物の遺伝子改変前に存在するよりも高いレベルにおける遺伝子産物の発現、特に遺伝子産物（例えば、リシン生合成酵素若しくは硫酸還元経路酵素若しくはシステイン生合成酵素、又は本出願において定義及び記載される遺伝子若しくは経路若しくは反応）の発現の増強を意味する。いくつかの実施形態において、微生物は、出発微生物により生産されるレベルと比較して増大したレベルで遺伝子産物を発現するように遺伝的に改変（例えば、遺伝子操作）されていてもよい。遺伝的改変（遺伝子改変）には、限定されるものではないが、特定の遺伝子の発現と関連する調節配列又は部位の改変又は修飾（例えば、強力なプロモーター、誘導性プロモーター若しくは複数のプロモーターの付加により、又は発現が構成的となるように調節配列を除去することにより）、特定の遺伝子の染色体位置の改変、リボソーム結合部位又は転写ターミネーターなどの特定の遺伝子に隣接する核酸配列の改変、特定の遺伝子のコピー数の増大、特定の遺伝子の転写及び／又は特定の遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質（例えば、調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写アクチベーターなど）の修飾、あるいは当技術分野の慣用技術を用いた特定の遺伝子の発現を脱調節する他の任意の慣用的手段（限定されるものではないが、例えばリプレッサータンパク質の発現を阻止するための、アンチセンス核酸分子の使用など）が挙げられる。遺伝子産物を過剰発現させる別の方法は、遺伝子産物の安定性を増強させ、その寿命を増大させることである。C.グルタミカムなどの生物における遺伝子の過剰発現の例は、Eikmannsら（Gene. (1991) 102, 93-8）に見出すことができる。
【００３７】
「脱調節された」という用語は、微生物の操作の前に発現されるか、又は操作されていない同等微生物において発現されるより低い若しくは高いレベルでの遺伝子産物（例えば、リシンデカルボキシラーゼ）の発現を包含する。一実施形態において、微生物を遺伝的に操作して（例えば、遺伝子組換えして）、微生物の操作の前に発現されるレベル又は操作されていない同等微生物において発現されるレベルより低い又は高いレベルで遺伝子産物を発現させることができる。遺伝子操作としては、限定するものではないが、特定の遺伝子の発現に関連する調節配列又は部位を（例えば、強力なプロモーター、誘導性プロモーター又は多重プロモーターを除去することによって）改変又は修飾すること、特定の遺伝子の染色体位置を改変すること、リボソーム結合部位又は転写ターミネーターなどの特定の遺伝子に隣接する核酸配列を改変すること、特定の遺伝子のコピー数を低下させること、特定の遺伝子の転写及び/又は特定の遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質（例えば、調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写アクチベーター等）を改変すること、又は当技術分野においては慣例の、特定の遺伝子の発現を脱調節するための任意の他の従来の手法（例えば、限定するものではないが、アンチセンス核酸分子の使用、又は標的タンパク質の発現をノックアウト若しくは阻止するための他の方法）が挙げられる。
【００３８】
「脱調節された遺伝子活性」、例えば「脱調節されたリシンデカルボキシラーゼ」という用語はまた、各遺伝子活性（例えば、リシンデカルボキシラーゼ活性）が以前には観察されていなかった場合に、好ましくは遺伝子操作により、例えば微生物に異種遺伝子（例えば、リシンデカルボキシラーゼ遺伝子）を1コピー以上導入することによって、遺伝子活性（例えば、リシンデカルボキシラーゼ活性）を微生物に導入することも意味する。
【００３９】
「脱調節された経路又は反応」という表現は、生合成経路又は反応における酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子が、少なくとも1つの生合成酵素のレベル又は活性が改変又は修飾されるように、改変又は修飾されている生合成経路又は反応を意味する。「脱調節された経路」という表現には、2以上の遺伝子が改変又は修飾されて、対応する遺伝子産物／酵素のレベル及び／又は活性が変化している生合成経路が含まれる。いくつかの場合には、微生物における経路を「脱調節」する能力（例えば、所定の生合成経路における2以上の遺伝子を同時に脱調節する能力）は、2以上の酵素（例えば、2又は3種の生合成酵素）が、「オペロン」と呼ばれる遺伝物質の隣接する要素上で互いに隣接して存在する遺伝子によってコードされている微生物の特定の事象から生じる。他の場合には、経路を脱調節するために、一連の連続操作ステップにおいていくつかの遺伝子を脱調節する必要がある。
【００４０】
本発明において脱調節された遺伝子を発現させるには、発現ベクター中で、酵素をコードするDNA配列を、転写発現を制御する調節配列に機能的に連結し、次いで原核宿主細胞又は真核宿主細胞のいずれかに導入しなければならない。プロモーター及びエンハンサーなどの転写調節配列に加えて、発現ベクターは、翻訳調節配列と、発現ベクターを保有する細胞の選択に好適なマーカー遺伝子を含み得る。
【００４１】
原核宿主における発現に好適なプロモーターは、抑制性、構成的、又は誘導性であってよい。好適なプロモーターは当業者に周知であり、T4、T3、Sp6及びT7ポリメラーゼを認識し得るプロモーター、λバクテリオファージのPRプロモーター及びPLプロモーター、大腸菌のtrp、recA、ヒートショック、lacUV5、tac、lpp-lac pr、phoA、gal、trc及びlacZプロモーター、バチルス・ズブチリス（B. subtilis）のα-アミラーゼ及びσ28-特異的プロモーター、バチルス（Bacillus）属のバクテリオファージのプロモーター、ストレプトマイセス（Streptomyces）属のプロモーター、λバクテリオファージのintプロモーター、pBR322のβ-ラクタマーゼ遺伝子のblaプロモーター、及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のCATプロモーター、並びにコリネバクテリウム（Corynebacterium）由来のPGRO、PSOD、PEFTU、PEFTS、並びにこれらのプロモーターの組み合わせ、例えばWO2005059144、WO2007011939、WO2007012078、WO2005059093、WO2008049782、WO2006069711、WO2007020295に記載のものが挙げられる。原核プロモーターは、Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277 (1987)；Watsonら, MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE, 4th Ed., Benjamin Cummins (1987)；Ausubelら（上掲）、及びSambrookら（上掲）に概略されている。
【００４２】
大腸菌リシンデカルボキシラーゼの発現に好適なプロモーターは、WO2005059144、WO2007011939、WO2007012078、WO2005059093、WO2008049782、WO2006069711、WO2007020295に記載されているC.グルタミカムのPsodA、PGRO及びPEFTUプロモーターである。
【００４３】
原核宿主中でタンパク質を発現させる方法は当業者に周知である。例えば、DNA CLONING 2: EXPRESSION SYSTEMS, 第2版, Gloverら(編), 15-58頁（Oxford University Press 1995）中の、Williamsら, "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies,"を参照のこと。同様に、MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, 137-185頁（Wiley-Liss, Inc. 1995）中のWardら, "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies,"；及びPROTEIN ENGINEERING: PRINCIPLES AND PRACTICE, Clelandら(編), 101-127頁（John Wiley & Sons, Inc. 1996）中のGeorgiou, "Expression of Proteins in Bacteria,"も参照されたい。遺伝子発現及びタンパク質産生を増大又は低減させる他の方法はWO2008049782に見出すことができる。
【００４４】
発現ベクターは、多様な技法（例えば、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション等）を用いて細菌宿主細胞中に導入することができる。例えば、Ausubelら(編), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 第3版, 1-1〜1-24頁（John Wiley & Sons, Inc. 1995）を参照のこと。
【００４５】
本明細書において用いられる「実質的に純粋なタンパク質」とは、所望の精製タンパク質が、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）後の単一のバンドによって証明されるとおり、実質的に混入細胞成分を含まないことを意味する。「実質的に純粋な」という用語は、当業者に用いられるように、純度又は均一性に関する1つ以上の特性が均一な分子を表すことをさらに意味する。例えば、実質的に純粋なリシンデカルボキシラーゼは、例えば以下のパラメータ：分子量、クロマトグラフィー泳動、アミノ酸組成、アミノ酸配列、ブロッキングされている又はブロッキングされていないN末端、HPLCの抽出プロファイル、生物学的活性、及び他のこのようなパラメータについて、標準実験偏差内で、一定の、再現性のある特性を示す。しかしこの用語は、他の化合物を含む、リシンデカルボキシラーゼの人工の又は合成の混合物を除外することを意味するものではない。さらにこの用語は、組換え宿主から単離されたリシンデカルボキシラーゼ融合タンパク質を除外することを意味するものでもない。
【００４６】
第1の態様において、本発明は、細胞内リシンデカルボキシラーゼ活性及び増強されたリシンインポート活性を有するか、又は細胞内及び細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性を含むか、又は細胞内及び細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性と増強されたリシンインポート活性を含む微生物を提供する。
【００４７】
微生物は、原核微生物又は真核微生物、特に細菌、古細菌、酵母及び真菌のいずれであってもよい。好ましくは、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、エッシェリヒア属（Escherichia）、特に大腸菌（Escherichia coli）、バチルス属（Bacillus）、特にバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、及びストレプトマイセス属（Streptomyces）から選択される微生物である。
【００４８】
上述したように、本発明の好ましい実施形態は、コリネ型細菌、例えばコリネバクテリウム属の細菌から選択される宿主細胞の使用に関する。特に好ましくは、以下の種：コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Corynebacterium acetoglutamicum）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Corynebacterium acetoacidophilum）、コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）、コリネバクテリウム・メラセコラ（Corynebacterium melassecola）、及びコリネバクテリウム・エフィジエンス（Corynebacterium effiziens）である。本発明の他の好ましい実施形態は、ブレビバクテリア、特にブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、及びブレビバクテリウム・ジバレカタム（Brevibacterium divarecatum）の種の使用に関する。
【００４９】
本発明の他の好ましい実施形態において、宿主細胞は、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032、C.アセトグルタミカムATCC15806、C.アセトアシドフィラムATCC13870、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスFERMBP-1539、コリネバクテリウム・メラセコラATCC17965、コリネバクテリウム・エフィジエンスDSM 44547、コリネバクテリウム・エフィジエンスDSM 44549、ブレビバクテリウム・フラバムATCC14067、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（Brevibacterium lactoformentum）ATCC13869、ブレビバクテリウム・ジバレカタムATCC 14020, コリネバクテリウム・グルタミカムKFCC10065及びコリネバクテリウム・グルタミカムATCC21608、並びに例えば古典的な突然変異誘発及び選択により又は定方向突然変異誘発によりそれらから誘導される株を含む群より選択することができる。
【００５０】
C.グルタミカムの他の特に好ましい菌株は、ATCC13058、ATCC13059、ATCC13060、ATCC21492、ATCC21513、ATCC21526、ATCC21543、ATCC13287、ATCC21851、ATCC21253、ATCC21514、ATCC21516、ATCC21299、ATCC21300、ATCC39684、ATCC21488、ATCC21649、ATCC21650、ATCC19223、ATCC13869、ATCC21157、ATCC21158、ATCC21159、ATCC21355、ATCC31808、ATCC21674、ATCC21562、ATCC21563、ATCC21564、ATCC21565、ATCC21566、ATCC21567、ATCC21568、ATCC21569、ATCC21570、ATCC21571、ATCC21572、ATCC21573、ATCC21579、ATCC19049、ATCC19050、ATCC19051、ATCC19052、ATCC19053、ATCC19054、ATCC19055、ATCC19056、ATCC19057、ATCC19058、ATCC19059、ATCC19060、ATCC19185、ATCC13286、ATCC21515、ATCC21527、ATCC21544、ATCC21492、NRRL B8183、NRRL W8182、B12NRRLB12416、NRRLB12417、NRRLB12418及びNRRLB11476を含む群から選択することができる。
【００５１】
略称KFCCはKorean Federation of Culture Collectionを表し、ATCCはAmerican-Type Strain Culture Collectionを表し、略称DSMはDeutsche Sammlung von Mikroorganismenを表す。略称NRRLは、ARS cultures collection Northern Regional Research Laboratory（Peorea, IL, USA）を表す。
【００５２】
特定の実施形態において、本発明の微生物は、「キャンベルイン（Campbell in）」又は「キャンベルアウト（Campbell out）」微生物（又は細胞若しくは形質転換体）である。本明細書において用いられる「キャンベルイン」形質転換体という表現は、環状二本鎖DNA分子（例えばプラスミド）全体が単一の相同組換え事象（事象中1回の交差）により細胞の染色体に組み込まれ、環状DNA分子の直鎖形態の、該環状DNA分子の第1のDNA配列に相同な染色体の第1のDNA配列への挿入を効率的に生じる、元の宿主細胞の形質転換体を意味する。「キャンベルインされた（Campbelled in）」という表現は、「キャンベルイン」形質転換体の染色体に組み込まれた直鎖状DNA配列を意味する。「キャンベルイン」形質転換体は、相同組換え交差点を含みかつそれの周囲の第1相同DNA配列の重複を含む。
【００５３】
「キャンベルアウト」とは、「キャンベルイン」形質転換体の子孫である細胞を意味し、該細胞では、「キャンベルインされた」DNAの直鎖状の挿入されたDNAに含まれる第2のDNA配列と、該直鎖状挿入物の第2のDNA配列に相同的な染色体起源の第2のDNA配列との間で第2の相同組換え事象（切り出し（cross out）事象）が起こり、その第2の組換え事象が組み込まれたDNA配列の一部の欠失（放出）を生じるが、重要な点では組み込まれたDNA配列の一部（一塩基ほど小さくともよい）が染色体中に残ることとなり、結果として、元の宿主細胞と比較して、「キャンベルアウト」細胞は染色体中に1以上の意図的な変化を含む（例えば、一塩基置換、複数塩基置換、異種遺伝子若しくはDNA配列の挿入、相同遺伝子若しくは改変型相同遺伝子の1若しくは複数の追加コピーの挿入、又は上記列挙した例の2以上を含むDNA配列の挿入）。
【００５４】
「キャンベルアウト」細胞又は菌株は通常、必ずしもそうでなくてもよいが、「キャンベルインされた」DNA配列の一部（放出することが望まれる部分）に含まれる遺伝子（例えば、約5％〜10％スクロースの存在下で増殖させた細胞において発現された場合に致死性となるバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）sacB遺伝子）に対するカウンターセレクションによって得ることができる。カウンターセレクションを行う場合又は行わない場合のいずれでも、所望の「キャンベルアウト」細胞は、任意のスクリーニング可能な表現型、例えば限定されるものではないが、コロニーの形態、コロニーの色、抗生物質耐性の有無、ポリメラーゼ連鎖反応による所与のDNA配列の有無、栄養要求性の有無、酵素の有無、コロニー核酸ハイブリダイゼーションなど、を用いて、所望の細胞についてスクリーニングすることにより取得又は同定することができる。
【００５５】
「キャンベルイン」又は「キャンベルアウト」に至る相同組換え事象は、相同DNA配列内である範囲のDNA塩基において起きる可能性があり、相同配列はこの範囲の少なくとも一部について互いに同一であるため、交差事象が正確にどこで起こるかを特定することは通常不可能である。言い換えると、どの配列が挿入されたDNAに由来するのか、どの配列が染色体DNAに由来するのかを正確に特定することは不可能である。さらに、第1の相同DNA配列及び第2の相同DNA配列は通常、部分的に非相同性の領域で隔てられ、これが「キャンベルアウト」細胞の染色体に残る非相同性のこの領域である。
【００５６】
実用性のため、C.グルタミカムでは、典型的な第1及び第2相同DNA配列は、少なくとも約200塩基対長であり、数千塩基対長までとなることもあるが、より短い又はより長い配列を用いて実施する手順も可能である。第1及び第2相同配列の好ましい長さは約500〜2000塩基であり、「キャンベルイン」から「キャンベルアウト」の取得は、第1及び第2相同配列をおよそ同じ長さに、好ましくは200塩基対未満の差で、最も好ましくは2つのうち短いものが塩基対長の長いものの少なくとも70％の長さとなるように設計することにより容易に実施できる。
【００５７】
リシンデカルボキシラーゼ活性とは、リシンデカルボキシラーゼにより触媒される、L-リシンのカダベリンへの脱炭酸を意味する。この酵素は、E.C. 4.1.1.18として分類されている。例えば、大腸菌（Escherichia coli）から単離される、リシンデカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、cadA遺伝子産物（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, Entry b4131）とldcC遺伝子産物（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, Entry JW0181）である。
【００５８】
酵素活性を測定し比較する方法は当技術分野で公知であり、例えばHandbook of Corynebacetrium glutamicum 2005 Eggeling, Borth(編) CRC Press Boca Raton USA及びその参照文献、又はMethods in Enzymology Volume 17, Part 1 pp. 3-1098 (1970)、Volume 17, Part 2, pp.3-961 (1971)、Volume 41, pp.3-564 (1975)、Volume 42 pp.3-537 (1975)、Volume 63, pp.3-547 (1979)、Volume 64, pp.3-418 (1980)、Volume 89, pp.3-656 (1982)、Volume 90 pp.3-602 (1982)、Volume 142, pp.3-732 (1987)、Volume 143 pp.3-582 (1987)及びその参照文献に記載されている。コリネバクテリウム・グルタミカムの菌株の比較に使用される標準株はATCC13032（Handbook of Corynebacetrium glutamicum 2005 Eggeling, Borth(編) CRC Press Boca Raton USA）である。
【００５９】
大腸菌ldcCのアミノ酸配列は配列番号1に開示されており、大腸菌cadAのアミノ酸配列は配列番号2に開示されている。
【００６０】
大腸菌リシンデカルボキシラーゼ遺伝子をコードするDNA分子は、配列番号1又は2のアミノ酸配列から逆翻訳されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドプローブを用いて、cDNA又はゲノムライブラリをスクリーニングすることによって得ることができる。
【００６１】
別法として、相互にプライミングする長いオリゴヌクレオチドを用いてDNA分子を合成することにより、大腸菌リシンデカルボキシラーゼ遺伝子又は本明細書に開示する遺伝子を得ることができる。例えば、Ausubelら(編), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,8.2.8〜8.2.13頁 (1990) ["Ausubel"]を参照されたい。Wosnickら, Gene 60:115 (1987)；及びAusubelら(編), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 第3版, 8-8〜8-9頁（John Wiley & Sons, Inc. 1995）も参照のこと。ポリメラーゼ連鎖反応を用いる確立された技法は、少なくとも2キロベース長のDNA分子を合成する能力を提供する。Adangら, Plant Molec. Biol. 21:1131 (1993)；Bambotら, PCR Methods and Applications 2:266 (1993)；Dillonら, "Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes," METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol.15: PCR PROTOCOLS: CURRENT METHODS AND APPLICATIONS, White(編), 263-268頁, （Humana Press, Inc. 1993）に記載；Holowachukら, PCR Methods Appl. 4:299 (1995)。
【００６２】
親酵素と比較して保存的アミノ酸変化を含む大腸菌リシンデカルボキシラーゼの変異体又は本明細書に記載する遺伝子の変異体を作製することができる。すなわち、例えば配列番号1又は2の1つ以上のアミノ酸置換を含む変異体であって、アルキルアミノ酸は該リシンデカルボキシラーゼアミノ酸配列中でアルキルアミノ酸に置換されており、芳香族アミノ酸は大腸菌リシンデカルボキシラーゼアミノ酸配列中で芳香族アミノ酸に置換されており、硫黄含有アミノ酸は大腸菌リシンデカルボキシラーゼアミノ酸配列中で硫黄含有アミノ酸に置換されており、水酸基含有アミノ酸は大腸菌リシンデカルボキシラーゼアミノ酸配列中で水酸基含有アミノ酸に置換されており、酸性アミノ酸は大腸菌リシンデカルボキシラーゼアミノ酸配列中で酸性アミノ酸に置換されており、塩基性アミノ酸は大腸菌リシンデカルボキシラーゼアミノ酸配列中で塩基性アミノ酸と置換されている、上記変異体を得ることができる。
【００６３】
共通アミノ酸のうち、例えば、「保存的アミノ酸置換」は、以下の各グループ内のアミノ酸間の置換によって説明される。（1）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン、（2）フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン、（3）システイン及びメチオニン、（4）セリン及びトレオニン、（5）アスパラギン酸及びグルタミン酸、（6）グルタミン及びアスパラギン、並びに（7）リシン、アルギニン及びヒスチジン。
【００６４】
大腸菌リシンデカルボキシラーゼ中の保存的アミノ酸変化は、ヌクレオチドを配列番号1又は2に示されるヌクレオチドと置換することによって導入することができる。このような「保存的アミノ酸」変異体は、例えば、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発、リンカースキャニング突然変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応を用いた突然変異誘発等によって得ることができる。Ausubelら, 上掲, 8.0.3-8.5.9頁；Ausubelら(編), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 第3版, 8-10〜8-22頁（John Wiley & Sons, Inc. 1995）。また、一般にMcPherson(編), DIRECTED MUTAGENESIS：A PRACTICAL APPROACH, IRL Press (1991)も参照のこと。L-リシンをカダベリンへと変換するこのような変異体の能力は、標準的な酵素活性アッセイ（例えば本明細書中に記載されるアッセイ）を用いて測定することができる。
【００６５】
本発明において好適なリシンデカルボキシラーゼは、大腸菌由来のリシンデカルボキシラーゼ、並びに対応する「元の」遺伝子産物と80％、好ましくは90％また最も好ましくは95％及び98％以下の（アミノ酸配列に基づく）配列同一性を有し、且つ依然としてリシンデカルボキシラーゼの生物学的活性を有する同等の遺伝子である。これらの同等の遺伝子は、当技術分野で公知の方法によってヌクレオチドの置換、欠失、又は挿入を導入することにより容易に構築することができるし、あるいは、当技術分野で周知の方法（例えばデータベース検索、ライブラリスクリーニング、相補性アッセイ又は酵素活性試験）により同定及びクローニングすることができる他の微生物のホモログ遺伝子をクローニングすることにより容易に構築することができる。好ましくは、クローニングされたホモログ遺伝子のヌクレオチド配列を、例えばコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）又は大腸菌のコドン使用頻度に適合化させることにより、目的の宿主微生物における発現のために最適化する。
【００６６】
本発明の他の好適な実施形態は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）のコドン使用頻度を適用することによってDNAに再翻訳された大腸菌のリシンデカルボキシラーゼ（配列番号1又は2）を使用する。これらのリシンデカルボキシラーゼポリヌクレオチド配列は、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属の微生物、特にコリネバクテリウム・グルタミカム中でのリシンデカルボキシラーゼの発現に有用である。
【００６７】
細胞内リシンデカルボキシラーゼ活性は、微生物の細胞膜の細胞質側に位置するリシンデカルボキシラーゼによってもたらされる。真核微生物の場合、リシンデカルボキシラーゼは細胞の1以上の区画内に位置しうる。好ましくは、微生物の細胞質内に位置するか、細胞膜に挿入又は結合されている。
【００６８】
細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性は、細胞膜の外側に位置するリシンデカルボキシラーゼによってもたらされる。リシンデカルボキシラーゼは、ペリプラズム腔内、細胞壁内、細胞壁の表面上に位置するか、培地中に分泌されるか、又はそれらの任意の組み合わせでありうる。
【００６９】
本発明の微生物は、細胞内リシンデカルボキシラーゼ活性、好ましくは高い細胞内デカルボキシラーゼ活性を含む。細胞内リシンデカルボキシラーゼ活性は、微生物によって発現させようとする1以上のリシンデカルボキシラーゼ遺伝子で微生物を形質転換することによって創出又は増強することができる。さらに又はあるいは、リシンデカルボキシラーゼ遺伝子を、コードされるリシンデカルボキシラーゼの発現又は酵素活性が増強されるように変異してもよい。
【００７０】
別の実施形態において、細胞内リシンデカルボキシラーゼ活性は、細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性と組み合わせる。細胞内又は細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性のいずれかを欠損する微生物は、細胞内又は細胞外のいずれかでリシンデカルボキシラーゼを発現するように形質転換しうる。細胞外発現は、形質転換対象の微生物において機能的な、細胞外発現のためのシグナル配列、例えば分泌シグナル又は分子アンカーのためのシグナルを含むように、リシンデカルボキシラーゼ遺伝子を変異させることによって達成することができる。細胞外発現の例は、Choi and Lee Appl Microbiol Biotechnol 2004 64: 625-635、Current Opinion in Biotechnology 2005, 16:538-545、Trends in Biotechnology 2007 16 73-79に見出すことができる。
【００７１】
細胞内又は細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性がリシンデカルボキシラーゼ活性を有する異なるポリペプチドをコードする2以上のリシンデカルボキシラーゼ遺伝子の発現に起因する場合には、細胞内又は細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性の総活性は、これらの異なるリシンデカルボキシラーゼ活性の結果となる。総リシンデカルボキシラーゼ活性に対する特定のリシンデカルボキシラーゼ遺伝子の寄与は、特定の微生物における異なるリシンデカルボキシラーゼ遺伝子の発現レベルを比較し、これらの遺伝子から発現されたリシンデカルボキシラーゼの酵素比活性を比較することによって測定することができる。異なる遺伝子の発現レベルは、当技術分野で周知の方法により測定することができ、好ましくは、タンパク質レベルで、例えばウエスタンブロット又はELISAアッセイにより、発現レベルを測定しうる。リシンデカルボキシラーゼの酵素比活性を測定する方法もまた当技術分野で周知である。好ましい方法はWO2007113127に開示されている。
【００７２】
内因性リシンデカルボキシラーゼ活性をリシンデカルボキシラーゼ活性を有する少なくとも1つの追加ポリペプチドのトランスジェニック発現により増強する場合には、この又はこれらの追加ポリペプチドの寄与は、形質転換微生物と非形質転換微生物の総リシンデカルボキシラーゼ活性を比較することにより測定することができる。
【００７３】
好ましい実施形態において、細胞内若しくは細胞外デカルボキシラーゼ活性、又は両方の活性は、少なくとも部分的には、好ましくは30％を超えて又は50％を超えて又は60％を超えて又は70％を超えて又は75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％を超えて、配列番号1又は2に対して少なくとも80％又は少なくとも85％又は少なくとも90％又は少なくとも95％又は少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリシンデカルボキシラーゼ活性を有する、好ましくは高いリシンデカルボキシラーゼ活性を有する1以上のポリペプチドに起因する。
【００７４】
一実施形態において、細胞内若しくは細胞外デカルボキシラーゼ活性、又は両方の活性は、98％を超えて又は99％を超えて、配列番号1又は2に対して少なくとも80％又は少なくとも85％又は少なくとも90％又は少なくとも95％又は少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリシンデカルボキシラーゼ活性を有する、好ましくは高いリシンデカルボキシラーゼ活性を有する1以上のポリペプチドに起因する。
【００７５】
一実施形態において、細胞内若しくは細胞外デカルボキシラーゼ活性、又は両方の活性は、少なくとも部分的には、好ましくは30％を超えて又は50％を超えて又は60％を超えて又は70％を超えて又は75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％を超えて、配列番号1に対して少なくとも80％又は少なくとも85％又は少なくとも90％又は少なくとも95％又は少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリシンデカルボキシラーゼ活性を有する、好ましくは高いリシンデカルボキシラーゼ活性を有する1以上のポリペプチドに起因する。
【００７６】
一実施形態において、細胞内若しくは細胞外デカルボキシラーゼ活性、又は両方の活性は、少なくとも部分的には、好ましくは30％を超えて又は50％を超えて又は60％を超えて又は70％を超えて又は75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％を超えて、配列番号2に対して少なくとも80％又は少なくとも85％又は少なくとも90％又は少なくとも95％又は少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリシンデカルボキシラーゼ活性を有する、好ましくは高いリシンデカルボキシラーゼ活性を有する1以上のポリペプチドに起因する。
【００７７】
一実施形態において、細胞内リシンデカルボキシラーゼ活性又は細胞内及び細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性を含む微生物はまた、増強されたリシンインポート能力をも含む。
【００７８】
改善されたリシンインポート能力は、発酵培地から微生物へのリシンの流入を増強する任意の手段により、又は微生物から発酵培地へのリシンの流入を低減することにより達成することができる。
【００７９】
リシンエクスポート及びインポート活性を測定する方法は、Bellmann, A, Vrljic, M, Patek, Mら MICROBIOLOGY-SGM 147 pp.1765-1774, 2001、及びBurkovski, A, Kramer, R. APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY 58 pp.265-274. 2002と、それらで引用された参照文献に見出すことができる。
【００８０】
例えば、リシンインポート能力は、リシンエクスポーター活性を減少若しくは排除することにより、又はリシンパーミアーゼ活性を増強することにより、又はリシン／カダベリンアンチポーター活性を増強することにより、あるいはこれらの任意の組み合わせにより、改善することができる。
【００８１】
リシンエクスポーター活性は、培地から細胞へとリシンを輸送することができる任意のポリペプチド、例えばリシンエクスポーター、リシンシンポーター（symporter）、又はリシンアンチポーターポリペプチドに起因することができる。
【００８２】
微生物が細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性及び高いリシン生産能を有する場合、リシンインポート能力を増強するための上述した手段とは対照的な手段を採用することにより、例えば特定の遺伝子の発現を低減する代わりに特定の遺伝子発現を増強することにより、リシンエクスポート能を増強させることが有利である。高いリシン生産能を有し、かつリシンエクスポーターポリペプチドの低減又は排除された発現を有するが、細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性を欠損している微生物の例は、WO 97/23597及びWO2005073390（これは、アミノ酸エクスポートタンパク質の増強された発現若しくは活性を有する微生物を培養することによりアミノ酸を増強して生産する方法を開示する）、並びにUS 7,435,584（これは、lysE（リシンエクスポートキャリア）遺伝子を高発現するコリネバクテリウムを培養することによりL-リシンを増強して生産する方法を開示する）に見出すことができる。
【００８３】
本発明の一実施形態において、少なくとも1つのリシンエクスポーターポリペプチドの活性を低減させるが、ここでリシンエクスポーターポリペプチドは、配列番号3と少なくとも80％若しくは少なくとも85％若しくは少なくとも90％若しくは少なくとも95％若しくは少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリシンエクスポート活性を有するか、又はリシンエクスポーターポリペプチドは、配列番号4と少なくとも80％若しくは少なくとも85％若しくは少なくとも90％若しくは少なくとも95％若しくは少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリシンエクスポート活性を有するものであり、あるいは少なくとも2つのリシンエクスポーターポリペプチドの活性を低減させるが、ここで少なくとも1つは、配列番号3と少なくとも80％若しくは少なくとも85％若しくは少なくとも90％若しくは少なくとも95％若しくは少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリシンエクスポート活性を有し、また少なくとも1つは、配列番号4と少なくとも80％若しくは少なくとも85％若しくは少なくとも90％若しくは少なくとも95％若しくは少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリシンエクスポート活性を有するものである。
【００８４】
lysE遺伝子は、文献Eggeling, L, Sahm, H JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING 92, 3 201-213、Eggeling, L, Sahm, H ARCHIVES OF MICROBIOLOGY 180, 3 155-160 2003に記載されており、またドイツ特許出願DE 95-01048222も参照されたい。
【００８５】
YbjE遺伝子産物（配列番号4）及びその変異体は、例えばWO2005073390に記載されている。
【００８６】
「低減された活性（活性の低減・低下）」という用語は、微生物の操作前に発現されたレベル又は操作していない同等微生物におけるレベルよりも低いレベルにおける、遺伝子産物、例えばリシンエクスポーター分子、スペルミジンシンターゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼなどの発現を含み、好ましくは、遺伝子産物の発現は、同じ条件下で増殖させた特定の微生物種の周知株と比較される。例えばコリネバクテリウムの場合には、遺伝子の発現は、好ましくはATCC13032株における発現レベルと比較され、大腸菌の場合には、遺伝子の発現は、好ましくは菌株コレクションATCCに寄託されたMG1665株における発現レベルと比較され、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の場合には、発現レベルは菌株コレクションATCCに寄託されたW303株と比較される。一実施形態において、微生物は、微生物の操作前に発現されるレベル又は操作されていない同等微生物におけるレベルよりも低いレベルで遺伝子産物を発現するように遺伝的に改変(例えば遺伝子組換え）することができる。遺伝的改変（遺伝子操作）には、限定されるものではないが、特定の遺伝子の発現に関係した調節配列又は部位を改変又は修飾すること（例えば強力なプロモーター、誘導性プロモーター又は複数のプロモーターを除去することによる）、特定の遺伝子の染色体位置を改変すること、特定の遺伝子に隣接する核酸配列（リボソーム結合部位又は転写ターミネーターなど）を改変すること、特定の遺伝子のコピー数を低下させること、特定の遺伝子の転写及び／又は特定の遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質（例えば、調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写アクチベーターなど）を改変すること、あるいは当技術分野における慣用技術を用いた特定の遺伝子の発現を低減させる他の慣用的な手段（限定されるものではないが、アンチセンス核酸分子の使用、又は標的タンパク質の発現をノックアウト若しくは阻止するための他の方法など）が挙げられる。特に、宿主生物の染色体から1以上のヌクレオチドが欠失される遺伝子操作を行うことができる。遺伝子産物の活性、例えばリシンエクスポーター分子の活性の低減はまた、遺伝子産物の活性の低減を導く1以上の遺伝子変異を導入することによって得ることができる。さらに、遺伝子産物の活性は、該遺伝子産物の発現又は活性を調節する調節タンパク質に影響を及ぼすことにより、例えば該遺伝子の転写に影響を及ぼすことにより、低減させることも可能である。その例は転写リプレッサー及び転写アクチベーターである。例えば、lysE遺伝子の発現には、lysG遺伝子産物によって負の影響が及ぶ。lysG遺伝子の配列（本明細書中、配列番号5として開示）及びLysG 遺伝子産物の配列（本明細書中、配列番号6として開示）はまた、以下のアクセッション番号P94632、X96471として見出すこともできる。
【００８７】
別の実施形態において、リシンインポート能力は、リシンパーミアーゼ活性の増強により、又はリシン／カダベリンアンチポーター活性の増強により、あるいは両方の組み合わせにより増強される。
【００８８】
所定の微生物のリシンパーミアーゼ活性は、例えば微生物のランダム突然変異誘発により若しくは1以上のリシンパーミアーゼ遺伝子による微生物の形質転換により又はそれらの任意の組み合わせにより、例えば1以上の内因性リシンパーミアーゼ遺伝子（例えば配列番号7に開示されているもの）の発現を増加させることにより、又はリシンパーミアーゼポリペプチド（例えば配列番号8に開示されているもの）のパーミアーゼ活性を増大させることにより、増強することができる。
【００８９】
一実施形態において、微生物のリシンパーミアーゼ活性は、配列番号8に対して少なくとも80％又は少なくとも85％又は少なくとも90％又は少なくとも95％又は少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリシンパーミアーゼ活性を有する1以上のリシンパーミアーゼポリペプチド（例えばリシンパーミアーゼ活性を有するホモログ又は変異体）の組換え発現により、増強する。リシンパーミアーゼ活性を測定する方法は、Bellmann, A, Vrljic, M , Patek, Mら MICROBIOLOGY-SGM 147 pp.1765-1774 2001、及びBurkovski, A, Kramer, R APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY 58 pp.265-274 2002、並びにFujii, Tら、BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY 66, pp.1981-1984, 2002、及びこれらで引用された参照文献中に見出すことができる。
【００９０】
組換え発現は、例えば1以上のリシンパーミアーゼ遺伝子の形質転換により、より高い発現活性を有する脱調節されたプロモーターを用いて内因性リシンパーミアーゼ遺伝子を提供することにより、又はリシンパーミアーゼ遺伝子発現若しくは遺伝子産物活性の負の調節因子を低減することにより、達成することができる。
【００９１】
別の実施形態において、リシンインポート能力は、リシン／カダベリンアンチポーター活性の増強によって増強される。リシン／カダベリンアンチポーターは、細胞の膜を横切って異なる方向へ同時にリシン及びカダベリンを輸送するタンパク質である。リシン／カダベリンアンチポーター活性の増強は、1以上の内因性リシン／カダベリンアンチポーター遺伝子の発現を増大させることにより、微生物のランダム突然変異誘発により、1以上のリシン／カダベリンアンチポーター遺伝子による微生物の形質転換により、又はリシン／カダベリンアンチポーターポリペプチドのリシン／カダベリンアンチポーター活性の最適化によって（例えばリシンインポート及びカダベリンエクスポートの選択性について）、あるいはそれらの任意の組み合わせによって、達成することができる。
【００９２】
一実施形態において、微生物のリシン／カダベリンアンチポーター活性は、配列番号9に対して少なくとも80％又は少なくとも85％又は少なくとも90％又は少なくとも95％又は少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリシン／カダベリンアンチポーター活性を有する1以上のリシン／カダベリンアンチポーターポリペプチド（例えばリシン／カダベリンアンチポーター活性を有するホモログ又は変異体）の組換え発現により、増強される。
【００９３】
組換え発現は、例えば、1以上のリシン／カダベリンアンチポーター遺伝子の形質転換により、より高い発現活性を有する脱調節されたプロモーターを用いてリシン／カダベリンアンチポーター遺伝子を提供することにより、又はリシン／カダベリンアンチポーター遺伝子発現若しくは遺伝子産物活性の負の調節因子を低減することにより、達成することができる。
【００９４】
cadB遺伝子産物（本明細書中、配列番号9として開示される）のインポート又はエクスポート活性は、細胞及び発酵培地中のリシン及びカダベリン濃度に依存することが知られている。従って、機能性cadB遺伝子産物を発現する特定の微生物のリシンインポート能力は、発酵培地中のリシン濃度を増加させることにより、発酵培地の低いpH値を防止することにより、又は発酵培地中の所定のリシン濃度若しくはpH値におけるリシンインポートを促進する変異を挿入することにより、あるいはそれらの組み合わせにより、改善することができる（Soksawatmaekhin W.ら; Excretion and uptake of cadaverine by CadB and its physiological functions in Escherichia coli; Molecular Microbiology; 2004, volume 51,5; pp.1401-1412）。
【００９５】
発酵培地中の所定のリシン濃度又はpH値において大腸菌cadB遺伝子産物のリシンインポートを促進するいくつかの変異が記載されている（Soksawatmaekhin W.ら; Identification of the Cadaverine Recognition Site on the Cadaverine-Lysine Antiporter CadB; The Journal of Biological Chemistry; 2006; volume 281, 39; pp.29213-29220）。当業者であれば、他のcadBタンパク質（例えばcadBのホモログ又は変異体）における同様の変異を同定することが可能である。
【００９６】
従って、一実施形態において、リシン／カダベリンアンチポーターポリペプチドは、配列番号9に対して少なくとも80％又は少なくとも85％又は少なくとも90％又は少なくとも95％又は少なくとも98％の同一性を有し、かつ以下の変異：C12S、W41L、W43L、Y55L、Y57L、Y73L、Y73F、Y73W、Y89L、Y89F、Y89W、Y90L、Y90F、Y90W、Y107L、Y174L、C125S、D185N、E204Q、E204D、Y235L、Y235F、Y235W、W289L、D303N、D303E、Y310L、Y366L、Y368L、D372N、E377Q、E408Q、Y423L、Y423F及びY423Wの1以上を含むアミノ酸配列を含む。上述した変異は、cadB遺伝子産物のアミノ酸配列に基づいて命名されている。当業者であれば、これらの変異を、配列比較ツールを用いて、例えば配列アライメントを用いて、他の遺伝子産物、例えばcadB遺伝子産物と相同である遺伝子産物に移すことができる。
【００９７】
好ましくは、配列番号9に対して少なくとも80％又は少なくとも85％又は少なくとも90％又は少なくとも95％又は少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含むリシン／カダベリンアンチポーターポリペプチドは、以下の変異：W41L、W43L、Y57L、Y89L、Y107L、Y174L、D185N、E204Q、Y235L、W289L、D303N、Y366L、Y368L、D372N及びE408Qの1以上を含む。
【００９８】
配列番号9に対して少なくとも80％又は少なくとも85％又は少なくとも90％又は少なくとも95％又は少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含むより好ましいリシン／カダベリンアンチポーターポリペプチドは、以下の変異：W41L、W43L、Y57L、Y107L、Y174L、D185N、Y366L、Y368L及びE408Qの1以上を含む。
【００９９】
別の実施形態において、本発明は、細胞内リシンデカルボキシラーゼ活性及び増強されたリシンインポート活性を含むか、又は細胞内及び細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性を含むか、又は細胞内及び細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性と増強されたリシンインポート活性を含み、かつ高いリシン生産能を有する微生物を提供する。高いリシン生産能を有する微生物は、リシンがさらに代謝されて例えばカダベリンとならない場合に、例えば細胞内又は周囲の培地中で、リシンを富化することができる。
【０１００】
高いリシン産生能を有する微生物は、グループ（i）から選択される少なくとも1つの脱調節された遺伝子を有していることが好ましい。このグループ（i）は、リシンの生合成において重要な役割を果たす遺伝子のグループであり、アスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、スクシニル-アミノ-ケトピメレートトランスアミナーゼ、スクシニル-ジアミノ-ピメレートデスクシニラーゼ、ジアミノピメレートエピメラーゼ、ジアミノピメレートデヒドロゲナーゼ、アルギニル-tRNAシンテターゼ、ジアミノピメレートデカルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、6-ホスホグルコノラクトナーゼ、フルクトース1,6-ビホスファターゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、スクシニル-CoAシンテターゼ、メチルマロニルCoAムターゼ、ジアミンアセチルトランスフェラーゼの遺伝子からなる。
【０１０１】
少なくとも1種のグループ（i）の遺伝子は、本発明の方法に従って脱調節されていなければならない。好ましくは、2種以上のグループ（i）の遺伝子、例えば、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種の遺伝子は、本発明に係る微生物中で脱調節されている。
【０１０２】
脱調節するグループ（i）の好ましい遺伝子は、アスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメレートデヒドロゲナーゼ、ジアミノピメレートデカルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、6-ホスホグルコノラクトナーゼ、フルクトース1,6-ビホスファターゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、スクシニル-CoAシンテターゼ、ジアミンアセチルトランスフェラーゼである。
【０１０３】
グループ（i）の遺伝子及び遺伝子産物は、当技術分野において公知である。EP 1108790は、ホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝子及びピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子中の変異を開示しており、この変異はリシンの生産における組換えコリネ型細菌の生産性に有利な効果を有する。WO 00/63388は、アスパルトキナーゼ遺伝子中の変異を開示しており、この変異はリシンの生産における組換えコリネ型細菌の生産性に有利な効果を有する。EP 1108790及びWO 00/63388は、これらの上記遺伝子中の変異に関して参照により本明細書中に組み入れられる。
【０１０４】
遺伝子/遺伝子産物毎の以下の表において、各遺伝子の脱調節の可能な方法について記載する。この表の「脱調節」の列において引用される文献及び刊行物は、遺伝子の脱調節に関して参照により本明細書に組み入れられる。表に記載される方法は、各遺伝子の脱調節の好適な実施形態である。
【表１】
0005960604.tif 000002
【０１０５】
アスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、スクシニル-アミノ-ケトピメレートトランスアミナーゼ、スクシニル-ジアミノ-ピメレートデスクシニラーゼ、ジアミノピメレートエピメラーゼ、ジアミノピメレートデヒドロゲナーゼ、アルギニル-tRNAシンテターゼ、ジアミノピメレートデカルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、6-ホスホグルコノラクトナーゼ、フルクトース1,6-ビホスファターゼの遺伝子の脱調節の好適な方法は、例えば、強力な発現シグナルを用いた遺伝子増幅によって遺伝子活性を増大させる「上方」変異、及び／又は酵素活性を増強する点変異である。
【０１０６】
ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、スクシニルCoAシンテターゼ、メチルマロニルCoAムターゼ、アセチルトランスフェラーゼの遺伝子の脱調節の好適な方法は、例えば、弱い発現シグナルを用いた遺伝子欠失若しくは遺伝子破壊によって遺伝子活性を低下させる「下方」変異、及び／又は上記の酵素活性を破壊し若しくは低下させる点変異である。
【０１０７】
アスパルトキナーゼが遺伝子グループ（i）の1メンバーとして脱調節されている場合、少なくとも1つの第2の遺伝子（i）のメンバー（アスパルトキナーゼ以外）も脱調節されていなければならない。
【０１０８】
本発明の方法により微生物中で生産されるカダベリンのかなりの部分が後にアセチル化されることが観察されている（WO 2007/113127）。アセチルカダベリン形成ポリペプチド（アセチルカダベリンを生産することができる酵素活性ポリペプチドとして定義される）に起因するアセチル化反応を阻害するため、またカダベリンの収量を増大させるため、本発明の好適な実施形態では、生産微生物のジアミンアセチルトランスフェラーゼを脱調節し、特に、例えば該遺伝子の欠失又は破壊によってその活性を低下させる。
【０１０９】
アセチルカダベリン形成ポリペプチドの一例は、コリネバクテリウム・グルタミカムのアセチル-CoA依存性ジアミンアセチルトランスフェラーゼ（NP_600742タンパク質）、例えば配列番号10及び配列番号11に開示されるものである。
【０１１０】
本発明の一実施形態において、アセチルカダベリン形成活性は、配列番号11に対して少なくとも80％又は少なくとも85％又は少なくとも90％又は少なくとも95％又は少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつアセチルカダベリン形成活性を有する少なくとも1つのアセチルカダベリン形成ポリペプチドの活性を低下させることにより低減されている。アセチルカダベリン形成活性は、WO 2007/113127に記載されているように試験することができる。
【０１１１】
本発明の方法に従って微生物において産生されるカダベリンのかなりの部分が、アミノプロピルカダベリン形成ポリペプチドによりアミノプロピルカダベリンに変換されうることが観察されている。この反応を阻止し、カダベリンの収量を高めるために、本発明の好ましい実施形態は、産生微生物のアミノプロピルカダベリン形成ポリペプチドを脱調節する、特にその活性を、例えば該遺伝子の欠失又は破壊により低減させる。
【０１１２】
アミノプロピルカダベリン形成ポリペプチドの一例は、Soksawatmaekhin W.ら; Molecular Microbiology; (2004) Vol.51,5; p.1401-1412に記載されているような大腸菌のスペルミジンシンターゼである）。
【０１１３】
従って、本発明の一実施形態において、アミノプロピルカダベリン形成活性は、配列番号12に対して少なくとも80％又は少なくとも85％又は少なくとも90％又は少なくとも95％又は少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも1つのアミノプロピルカダベリン形成ポリペプチドの活性を低下させることにより低減されている。
【０１１４】
リシンについての微生物の生産能は、JP2004222569に記載されているようにカダベリン産生微生物のホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドの活性を脱調節することによって、好ましくはその活性をホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする遺伝子の欠失又は破壊により低減することによって改善することができることが観察されている。
【０１１５】
ホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドの例は、コリネバクテリウム・グルタミカムのホモセリンデヒドロゲナーゼ、本明細書において配列番号13として開示されるもの、又は大腸菌のホモセリンデヒドロゲナーゼ、本明細書において配列番号14及び配列番号15として開示されるものである。
【０１１６】
従って、本発明の一実施形態において、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性は、配列番号13、14又は15に対して少なくとも80％又は少なくとも85％又は少なくとも90％又は少なくとも95％又は少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含むホモセリンデヒドロゲナーゼポリペプチドの活性を低下させることにより低減されている。ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性の測定方法は、M. B. Jenkins, V.W. Woodward, Biochimica et Biophysica Acta, 1970, 212, 21-32に見出すことができる。
【０１１７】
本発明の別の実施形態において、微生物は、脱炭酸以外により、例えばリシンヒドロキシラーゼ活性の低減により、低下されたリシン分解能を有する。 
リシンヒドロキシラーゼポリペプチドは、リシンN6-ヒドロキシラーゼ［EC:1.14.13.59］としても記載されているリシンヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドである。リシンヒドロキシラーゼ活性を有するかの試験は、Meneely KM, and Lamb AL BIOCHEMISTRY 46 p.11930-11937 2007、及びIJ, Hsueh LC, Baldwin JEら EUROPEAN JOURNAL OF BIOCHEMISTRY 268 p.6625-6636に見出される。
【０１１８】
一例は、大腸菌CFT073のリシンヒドロキシラーゼ iucD（配列番号 16）である。
【０１１９】
本発明の別の実施形態において、リシン分解活性は、配列番号16のリシンヒドロキシラーゼに対して少なくとも80％又は少なくとも85％又は少なくとも90％又は少なくとも95％又は少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、リシンヒドロキシラーゼ活性を有する少なくとも1つのポリペプチドの活性を低下させることにより低減されている。
【０１２０】
本発明の別の実施形態において、微生物は、脱調節されたスペルミジン形成若しくは取り込み活性又はプトレシン形成若しくは取り込み活性、あるいはそれらの組み合わせを有する。
【０１２１】
スペルミジン形成活性は、スペルミジンを合成可能なポリペプチドによってもたらされる。スペルミジン形成ポリペプチドの一例は、配列番号12のスペルミジンシンターゼである。
【０１２２】
プトレシン形成活性は、プトレシンを合成可能なポリペプチドによってもたらされる。プトレシン形成ポリペプチドの一例は、大腸菌のプトレシンシンターゼspeE （例えば配列番号17に開示されるもの）、又は大腸菌のオルニチンデカルボキシラーゼspeF （例えば配列番号18に開示されるもの）である。
【０１２３】
スペルミジン又はプトレシン取り込み活性を有するポリペプチドは、スペルミジン若しくはプトレシン又はその両方を細胞に輸送（transport）可能なポリペプチドである。スペルミジン及び／又はプトレシン取り込みポリペプチドの一例は、プトレシン/オルニチンアンチポーターとして機能する、大腸菌のpotE（例えば配列番号19に開示されるもの）である。
【０１２４】
本発明の一実施形態において、微生物は、低減されたスペルミジン形成若しくは取り込み活性又はプトレシン形成若しくは取り込み活性を有し、
（a）スペルミジン形成活性が、配列番号12に対して少なくとも80％又は少なくとも85％又は少なくとも90％又は少なくとも95％又は少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含むスペルミジン形成ポリペプチドの活性を低下させることにより脱調節されている、あるいは
（b）プトレシン形成活性が、配列番号17に対して少なくとも80％又は少なくとも85％又は少なくとも90％又は少なくとも95％又は少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含むプトレシン形成ポリペプチドの活性を低下させることにより脱調節されている、あるいは
（c）プトレシン形成活性が、配列番号18に対して少なくとも80％又は少なくとも85％又は少なくとも90％又は少なくとも95％又は少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含むオルニチンデカルボキシラーゼポリペプチドの活性を低下させることにより脱調節されている、あるいは
（d）スペルミジン取り込み活性又はプトレシン取り込み活性又はスペルミジン及びプトレシン取り込み活性が、配列番号19に対して少なくとも80％又は少なくとも85％又は少なくとも90％又は少なくとも95％又は少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を含むスペルミジン取り込みポリペプチド又はプトレシン取り込みポリペプチド又はスペルミジン及びプトレシン取り込みポリペプチドの活性を低下させることにより脱調節されている、あるいは
（e）スペルミジン形成若しくは取り込み活性又はプトレシン形成若しくは取り込み活性あるいはその組み合わせが、（a）、（b）、（c）又は（d）の組み合わせの活性を低下させることにより低減されている。
【０１２５】
本発明の重要な態様は、所望の化合物であるカダベリンが生産されるように本明細書に記載の組換え微生物を育成又は培養することを含む。
【０１２６】
従って、本発明の一実施形態は、細胞内リシンデカルボキシラーゼ活性及び増強されたリシンインポート活性を含むか、又は細胞内及び細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性を含むか、又は細胞内及び細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性と増強されたリシンインポート活性を含む微生物と、この微生物の培養に適した発酵培地（好ましくは発酵培地はリシンを含む）とを含むカダベリン生産系である。
【０１２７】
カダベリン生産系は、カダベリンの生産のための技術システム、例えばカダベリン産生微生物を含む培養培地、又はリシン含有溶液若しくは培養培地とリシンデカルボキシラーゼ産生微生物である。通常、カダベリン生産系は、カダベリンの生産を支持する技術システム、例えば発酵槽を備える。
【０１２８】
「培養（育成）する」という用語は、本発明の生きている微生物を保持し及び/又は増殖させる（例えば、培養液又は株を保持し及び/又は増殖させる）ことを包含する。一実施形態において、本発明の微生物は、液体培地中で培養する。別の実施形態において、本発明の微生物は、固形培地又は半固形培地中で培養する。好適な実施形態において、本発明の微生物は、該微生物を保持し及び/又は増殖させるために不可欠な又は有益な栄養物を含有する培地（例えば滅菌液体培地）中で培養する。
【０１２９】
使用し得る炭素源としては、糖類及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン及びセルロースなど）、油脂（例えば、大豆油、ひまわり油、ピーナッツ油、ヤシ油など）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸など）、アルコール（例えば、グリセロール及びエタノールなど）、並びに有機酸（例えば、酢酸など）が挙げられる。好適な実施形態において、グルコース、フルクトース又はスクロースが、炭素源として使用される。これらの物質は、個別にあるいは混合物として使用し得る。
【０１３０】
別の好ましい実施形態において、本明細書に記載する微生物は、キシロース、アラビノース、セロビオース又はそれらの混合物を含む液体培地、固形培地又は半固形培地中又は上で培養するが、かかる培地は、上述したもののような他の炭素源を含んでもよいし又は含まなくてもよい。本発明の微生物を培養するための培地は、限定された数の異なる炭素源、例えば1、2、3、4、5若しくはそれ以上の炭素源のみを含むものであってもよいし、又は炭素源の非常に複雑な混合物、リグノセルロース基質若しくは農業残渣の加水分解物、例えば限定されるものではないが、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オオムギ、コメ、キャッサバなどの供与源に由来するデンプンの加水分解物、又は麦わら、木材、紙若しくは植物起源の他の材料の加水分解物を含んでもよい。
【０１３１】
炭素源の好ましい組み合わせは、高含量のグルコース及びキシロース、フルクトース及びキシロース、スクロース及びキシロース、又はスクロース及びグルコース、又はスクロース及びフルクトース、又はスクロース、グルコース及びフルクトース、又はスクロース、グルコース、フルクトース及びキシロース、又はグルコース、フルクトース及びキシロース、又はグルコース、フルクトース、キシロース及びアラビノース、又はスクロース、キシロース及びアラビノース、又はグルコース、キシロース及びアラビノース、並びに上述した糖の他の組み合わせを含む培地である。
【０１３２】
培地がキシロースを含む場合には、キシロース代謝の遺伝子を発現する又は過剰発現する本発明の微生物を使用することが有利である。キシロース代謝の遺伝子は、例えば、キシロース輸送系の遺伝子（xylE、xylT及びxylFGH遺伝子）、キシロース利用の遺伝子（xylA及びxylB遺伝子）、並びにキシロース転写活性化因子の遺伝子（xylR遺伝子）を含む、大腸菌のxylABFGHR遺伝子座の遺伝子である。xylABFGHR遺伝子座の遺伝子を過剰発現する微生物は、EP1577396及びEP1577369に記載されている。キシロースイソメラーゼをコードする大腸菌のxylA遺伝子単独又は一緒にキシルロキナーゼをコードするxylB遺伝子を過剰発現するコリネバクテリウムは、例えばKawaguchiら（Engineering of a xylose metabolic pathway in Corynebacterium gutamicum, Applied and Environmental Microbiology, 2006, Vol.72, 5, p.3418-3428）に記載されている。好ましい実施形態において、本発明の微生物は、少なくともxylA若しくはxylB遺伝子、又はよりさらに好ましくはxylA及びxylB遺伝子を発現又は過剰発現する。
【０１３３】
培地がアラビノースを含む場合には、アラビノース代謝の遺伝子を発現する又は過剰発現する本発明の微生物を使用することが有利である。アラビノース代謝の遺伝子は、例えば、大腸菌のaraBADオペロンの遺伝子（例として、L-アラビノースイソメラーゼ（araA）、L-リボロキナーゼ（araB）及びL-リブロース-5-リン酸-4-エピメラーゼ（araD）をコードするaraA、araB、araD及びareE遺伝子を含む）、又はコリネバクテリウム・グルタミカムのaraBDAオペロンの遺伝子（araA、araB及びaraD遺伝子のホモログを含む）、L-アラビノースイソメラーゼをコードするaraE、転写調節因子をコードするaraR遺伝子、並びに推定アルドース1-エピメラーゼをコードするgalM遺伝子である。本発明の微生物は、好ましくは少なくともaraA、araB及びaraD遺伝子、より好ましくは少なくともaraA、araB、araD及びaraE遺伝子を発現又は過剰発現する（Kawaguchiら Identification and Functional Analysis of the Gene Cluster for L-Arabinose Utilization in Corynebacterium glutamicum, Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75, Vol.11, p.3419-3429）。アラビノース代謝の遺伝子の大腸菌ホモログは、異種微生物、例えばコリネバクテリウム・グルタミカムにおいても使用することができる（Kawaguchiら Engineering of an L-arabinose metabolic pathway in Corynebacterium glutamicum, Applied Microbiology and Biotechnology, 2008, 77, Vol,5, p.1053-1062）。
【０１３４】
培地がセロビオースを含む場合には、セロビオース代謝の遺伝子を発現する又は過剰発現する本発明の微生物を使用することが有利である。セロビオース代謝の遺伝子は、例えば、ホスホエノールピルビン酸（phosphenolpyruvate）：炭水化物ホスホトランスフェラーゼ系（PTS）ベータ-グルコシド特異的酵素IIBCA成分及びホスホル-ベータ-グルコシダーゼをコードするコリネバクテリウム・グルタミカムのbglA遺伝子である。コリネバクテリウムR株由来のこれらの遺伝子及び各タンパク質の例は、アクセッション番号AF508972に見出すことができる。
【０１３５】
培地がキシロース、アラビノース、セロビオース又は他の炭素源を含む場合には、キシロース代謝、アラビノース代謝又はセロビオース代謝の遺伝子を発現する又は過剰発現する本発明の微生物を使用することが有利である。例えば、培地が高含量のキシロース及びアラビノースを有する場合には、キシロース代謝及びアラビノース代謝の遺伝子を発現又は過剰発現する、例えばxylA及びxylB遺伝子とaraA、araB、araD遺伝子、好ましくはxylA及びxylB、araA、araB、araD及びaraE遺伝子を発現する微生物を使用することが有利である。培地が高含量のキシロース及びセロビオース（cellubiose）を有する場合には、キシロース代謝及びセロビオース代謝の遺伝子を発現する又は過剰発現する、例えばxylA及びxylBとbglA遺伝子を発現する微生物を使用することが有利である（Sasakiら Simultaneous utilization of D-cellobiose, D-glucose, and D-xylose by recombinant Corynebacterium glutamicum under oxygen-deprived conditions, Applied Microbiology and Biotechnology, 2008, Vol.81, 4, p.691-699）。
【０１３６】
使用し得る窒素源には、含窒素有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、コーンスティープリカー、大豆粉及び尿素）、又は無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム）が包含される。これらの窒素源は、個別にあるいは混合物として使用し得る。使用し得るリン源は、リン酸、リン酸二水素カリウム若しくはリン酸水素二カリウム、又はこれに相当するナトリウム含有塩である。培地は、増殖に必要な金属塩（例えば、硫酸マグネシウム又は硫酸鉄）をさらに含むものでなければならない。最後に、上記の物質に加えて、アミノ酸及びビタミンなどの必須の増殖促進物質も使用してよい。本発明の培地には、好適な前駆物質をさらに添加し得る。上記の供給物質（feed substance）は、単一バッチとして培地に添加してもよいし、あるいは培養中に培地に適切に供給してもよい。
【０１３７】
好ましくは、本発明の微生物は、制御されたpH下で培養する。「制御されたpH」という用語は、所望のファインケミカル（例えばカダベリン）の生産を生じさせる任意のpHを包含する。一実施形態において、微生物は、pH約7で培養する。別の実施形態において、微生物は、pH6.0〜8.5で培養する。所望のpHは、任意の数の当業者に公知の方法で維持することができる。例えば、培地のpHを適切に制御するために、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、若しくはアンモニア水）、又は酸性化合物（例えば、リン酸若しくは硫酸）を用いる。
【０１３８】
また好ましくは、本発明の微生物は、制御された通気下で培養する。「制御された通気」という用語は、所望のファインケミカル（例えば、カダベリン）の生産を生じさせるのに十分な通気（例えば、酸素）を包含する。一実施形態において、通気は、培地中の酸素レベルを調節することによって（例えば、培地中に溶解している酸素量を調節することにより）制御される。好ましくは、培地の通気は、培地を攪拌することによって制御する。攪拌は、プロペラ又は同様の機械式攪拌装置によって、増殖容器（例えば発酵槽）を回転又は振とうさせることによって、あるいは多様なポンプ装置によって提供し得る。通気は、無菌空気又は酸素を培地に通す（例えば、発酵混合物に通す）ことによってさらに制御することができる。また好ましくは、本発明の微生物は、（例えば、ポリグリコール脂肪酸ルエステルなどの消泡剤を添加することによって）過剰な発泡を起こすことなく培養する。
【０１３９】
さらに、本発明の微生物は、制御された温度下で培養することができる。「制御された温度」という用語は、所望のファインケミカル（例えば、カダベリン）の生産を生じさせる任意の温度を包含する。一実施形態において、制御された温度は、15℃〜95℃の温度を包含する。別の実施形態において、制御された温度は、15℃〜70℃の温度を包含する。好適な温度は20℃〜55℃、さらに好ましくは30℃〜45℃、又は30℃〜50℃である。
【０１４０】
微生物は、液体培地中で培養する（例えば、保持し及び/又は増殖させる）ことが可能であり、好ましくは、静置培養、試験管培養、振盪培養（例えば、回転振盪培養、振盪フラスコ培養等）、通気攪拌培養、又は発酵などの従来の培養法で連続的又は断続的に培養する。好適な実施形態において、微生物は、振盪フラスコで培養する。さらに好適な実施形態において、微生物は、発酵槽中で培養する（例えば、発酵法）。本発明の発酵法としては、限定するものではないが、バッチ法、フェドバッチ法及び連続発酵法が挙げられる。「バッチ法」又は「バッチ発酵」という表現は、培地、栄養素、補助添加剤等の組成が発酵開始時に設定されていて、発酵中には変更されないが、pH及び酸素濃度などの因子を制御して培地の過剰な酸性化及び/又は微生物の死滅を防ぐ試みをなし得る閉鎖系を指す。「フェドバッチ法」又は「フェドバッチ」発酵という表現は、発酵の進行に伴って1種以上の基質又は栄養補助剤を添加する（例えば、徐々に又は連続的に添加する）点を除いて、バッチ発酵を指す。「連続法」又は「連続発酵」という表現は、好ましくは所望のカダベリンの回収のために、規定の発酵培地を発酵槽に連続的に添加し、同量の使用済み又は「調整」培地を同時に除去する系を指す。このような多様な発酵法が開発されており、当技術分野において周知である。
【０１４１】
本発明の方法は、カダベリンを回収するステップをさらに含み得る。カダベリンを「回収する」という用語は、該化合物を培地から抽出し、採取し、単離し、又は精製することを包含する。上記の化合物の回収は、当技術分野において公知の従来の単離法又は精製法のいずれかに従って実施することが可能であり、このような方法としては、例えば、限定するものではないが、慣用の樹脂（例えば、アニオン又はカチオン交換樹脂、非イオン吸着樹脂等）を用いた処理、慣用の吸着剤（例えば、活性炭、ケイ酸、シリカゲル、セルロース、アルミナ等）を用いた処理、pHの変更、溶媒抽出（例えば、アルコール、酢酸エチル、へキサン等の慣用の溶媒を用いた抽出）、蒸留、透析、濾過、濃縮、結晶化、再結晶化、pH調整、凍結乾燥等が挙げられる。例えば、カダベリンは、まず培地から微生物を除去することによって回収することができる。次いで、バイオマスを除去したブロスをカチオン交換樹脂に通液させて不要なカチオンを除去し、その後、アニオン交換樹脂に通液させて不要な無機アニオン及びカダベリンより酸性度の強い有機酸を除去する。さらに、ブロスを苛性薬剤（caustic agent）で処理して、相分離によりアルコールなどの有機溶媒を用いてカダベリンを抽出することができる。カダベリンは、蒸留によって抽出された相から種々の用途に十分な純度で回収することができる。可能性ある用途としては、有機ジカルボン酸を用いた重縮合によるポリアミドの生産が挙げられる。
【０１４２】
従って、別の態様において、本発明は、カダベリン生産のための上記ステップを含む、ポリアミド（例えばナイロン(登録商標))の生産方法を提供する。カダベリンを、公知の方法で、ジカルボン酸、トリカルボン酸、ポリカルボン酸と反応させてポリアミドを得る。好ましくは、カダベリンは、4〜10個の炭素を含むジカルボン酸（例えば、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸など）と反応させる。上記のジカルボン酸は、好ましくは遊離酸である。
【０１４３】
本発明の微生物は、これらの微生物を発酵することによりカダベリンを生産するために有用であり、ここでは培養で微生物を増殖させる、好ましくは上述したような培養条件下で微生物を増殖させる。
【０１４４】
従って本発明は、細胞内リシンデカルボキシラーゼ活性及び増強されたリシンインポート活性を含むか、又は細胞内及び細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性を含むか、又は細胞内及び細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性と増強されたリシンインポート活性を含む微生物を発酵することを含むカダベリンの生産方法を含む。好ましくは、本方法は、培養培地からカダベリンを回収することを含む。
【０１４５】
一実施形態において、微生物は、増強されたリシン／カダベリンアンチポーター活性を含む、例えば微生物は、配列番号9に対して少なくとも80％又は少なくとも85％又は少なくとも90％又は少なくとも95％又は少なくとも98％の同一性を有し、かつリシン／カダベリンアンチポーター活性を有するポリペプチド（例えば、リシン／カダベリンアンチポーター活性を有するホモログ又は変異体）を過剰発現するものであり、方法は、リシンを含む培地中で上記微生物を発酵することを含む。好ましくは、培養培地は、0.1mMを超える、又は0.5mMを超える、又は1mMを超える、又は3mMを超える、又は5mMを超える、又は7mMを超える、又は8mMを超える、又は9mMを超える、又は10mMを超えるリシンを含む。より好ましくは、培養培地は15mMを超えるリシンを含む。よりさらに好ましくは、培養培地は20mMを超えるリシンを含む。最も好ましくは、培養培地は30mMを超えるリシンを含む。
【０１４６】
別の実施形態において、微生物は、細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性を含むか、又は細胞外リシンデカルボキシラーゼ活性と増強されたリシン／カダベリンアンチポーター活性を含む。
【０１４７】
本発明の別の実施形態は、カダベリンの生産方法であって、培養培地中のカダベリンの濃度（mol/l）が、アセチルカダベリン若しくはアミノプロピルカダベリン又はその両方の濃度（mol/l）よりも少なくとも1.2倍高い、又は1.3倍を超えて高い、又は1.4倍を超えて、又は1.5倍を超えて、又は1.6倍を超えて、又は1.7倍を超えて、又は1.8倍を超えて、又は1.9倍を超えて、又は2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍を超えて高い方法である。本発明の別の実施形態は、上記方法において製造される培養培地である。
【０１４８】
好ましくは、培養培地は、カダベリンと、非常に低濃度のアセチルカダベリン又はアミノプロピルカダベリンを含む。より好ましくは、アセチルカダベリン若しくはアミノプロピルカダベリン又はその両方の濃度は、0.2、又は0.1、又は0.05、又は0.03、又は0.01mol/lより低い、又は0.005mol/l又は0.001mol/lより低い。好ましくは、カダベリン、アセチルカダベリン又はアミノプロピルカダベリンの濃度は、生産方法を停止した後に、例えばカダベリンを生産する微生物を培養培地から分離した後に、測定する。
【０１４９】
本発明の別の実施形態は、カダベリンの生産方法であって、培養培地中のカダベリンの濃度（mol/l）が、アセチルカダベリンの濃度（mol/l）よりも少なくとも1.2倍高い、又は1.3倍を超えて高い、又は1.4倍を超えて、又は1.5倍を超えて、又は1.6倍を超えて、又は1.7倍を超えて、又は1.8倍を超えて、又は1.9倍を超えて、又は2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍を超えて高い方法である。別の実施形態は、上記方法において製造される培養培地である。
【０１５０】
本発明のさらなる実施形態は、カダベリンの生産方法であって、培養培地中のカダベリンの濃度（mol/l）が、アミノプロピルカダベリンの濃度（mol/l）よりも少なくとも1.2倍高い、又は1.3倍を超えて高い、又は1.4倍を超えて、又は1.5倍を超えて、又は1.6倍を超えて、又は1.7倍を超えて、又は1.8倍を超えて、又は1.9倍を超えて、又は2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍を超えて高い方法である。別の実施形態は、上記方法において製造される培養培地である。
【０１５１】
本発明の別の実施形態は、少なくとも0.25mol/l、又は少なくとも0.3、又は少なくとも0.35、又は少なくとも0.4、又は少なくとも0.45、又は少なくとも0.5、又は少なくとも0.6、又は少なくとも0.7、又は少なくとも0.8、又は少なくとも0.9mol/lのカダベリンを含み、かつ、0.2mol/l以下、又は0.15mol/l以下、又は0.1mol/l以下、又は0.05以下、又は0.045以下、又は0.04以下、又は0.03mol/l以下のアセチルカダベリン、あるいは0.05以下、又は0.045以下、又は0.04以下、又は0.03mol/l以下のアミノプロピルカダベリン、あるいは0.05以下、又は0.045以下、又は0.04以下、又は0.03mol/l以下の各アセチルカダベリン及びアミノプロピルカダベリンを含む培養培地である。
【０１５２】
上述した方法により生産されるカダベリンは、カダベリン（DAP）を含む発酵ブロス（すなわち、カダベリンの生産方法を完了又は停止した後の状態の培養培地）の仕上げ（work up）により回収又は精製することができる。
【０１５３】
以下に記載する発酵ブロスからカダベリンを回収又は精製する方法は、単に例示理由のためである。当業者であれば、以下に記載する方法の、同様にうまく適用可能な別の方法又は変法を理解している。
【０１５４】
生産されたカダベリンを回収するために、発酵ブロスを濃厚化又は濃縮することが有利である。発酵ブロスは、公知の方法、例えばロータリーエバポレーター、薄膜式エバポレーター、流下膜式エバポレーターを用いて、逆浸透により、又はナノ濾過により、濃厚化又は濃縮することができる。必要に応じて、濃縮手順によって沈殿することもある塩を、例えば濾過又は遠心分離により除去してもよい。この濃縮発酵ブロスは続いて、本発明の方法では、カダベリンを得るために仕上げ処理を行う（work up）。本発明における仕上げ処理のために、上記のような濃縮手順を実行可能であるが、必ず必要なものではない。
【０１５５】
本発明において、カダベリンは、有機抽出剤を用いて発酵ブロスから抽出する。より具体的には、できる限り極性が高く、アルカリpHにおいて安定な、水との混和性の差（miscibility gap）がある有機溶媒、例えば特に極性、双極性のプロトン性有機溶媒をここで使用する。好適な溶媒は、特に3〜8個の炭素原子を有する、環状又は開環状の、場合により分枝状のアルカノール、特にn-及びイソプロパノール、n-、sec-及びイソブタノール、又はシクロヘキサノール、並びにn-ペンタノール、n-ヘキサノール、n-ヘプタノール、n-オクタノール、2-オクタノール、及びこれらの一分枝状若しくは多分枝状異性体である。ここで、特にn-ブタノールを言及する。
【０１５６】
好ましい実施形態において、抽出及び／又は続く相分離は、水及び抽出剤又は可能な場合には形成する共沸化合物の沸点により制限される高温においてバッチ式で行う。抽出剤としてn-ブタノールを使用する場合には、抽出及び相分離を、例えば約25〜90℃、又は好ましくは40〜70℃で、行うことができる。抽出のため、分配平衡が確立されるまで、例えば10秒から2時間の期間にわたって、好ましくは5〜15分間にわたって、2つの相を撹拌する。続いて、相が完全に分離するまで相を放置し、これは好ましくは10秒から5時間、例えば15〜120分、又は30〜90分、特にn-ブタノールの場合には、約25〜90℃又は40〜70℃の範囲の温度で行う。
【０１５７】
別の好ましい実施形態において、カダベリンを、多段階プロセス（例えば混合槽-沈殿槽の組み合わせ）において連続的に、又は抽出カラム中で連続的に、発酵ブロスから抽出する。
【０１５８】
当業者であれば、慣用の最適化技法の一部として、各場合に分離しようとする相のために本発明において使用可能な抽出カラムの構成を確立することができる。好適な抽出カラムは、原理的には、電源出力を有しないもの、又は電源出力を有するもの、例えばパルスカラム又は回転内部構造物を有するカラムである。当業者であれば、また慣用の技法の一部として、最適な方法で、相分離を最適化するための内部構造物の種類及び材料、例えばふるいトレイ及びカラムトレイを選択することができる。小分子の液液抽出の基本的な理論は周知である（例えばH.-J. Rehm and G. Reed(編) (1993), Biotechology, Volume 3 Bioprocessing, Chapter 21, VCH, Weinheim参照）。工業的に適用可能な抽出カラムの構成は、例えばLoら編, (1983) Handbook of Solvent Extraction, JohnWiley& Sons, New Yorkに記載されている。上記テキストブックの開示内容に関して明示的に参照する。
【０１５９】
相分離後、カダベリンを、自体公知の方法によりカダベリンを含む抽出相から単離及び精製する。カダベリンを回収する可能な手段は、特に、限定されるものではないが、蒸留、好適な有機若しくは無機酸を用いた塩としての沈殿、又はこれらの好適な手段の組み合わせである。
【０１６０】
蒸留は、連続的に又はバッチ式で行うことができる。単一の蒸留カラム又は互いに連結された複数の蒸留カラムを用いることができる。蒸留カラム装置の構成及び実行パラメータの設定は、当業者の責任である。各場合に用いる蒸留カラムは、自体公知の方法により設計することができる（例えば、Sattler, Thermische Trennverfahren [Thermal separation methods], 2nd Edition 1995, Weinheim, p.135ff；Perry’s Chemical Engineers Handbook, 7th Edition 1997, New York, Section 13参照）。従って、使用する蒸留カラムは、分離に有用な内部構造物、例えば分離トレイ（例として有孔トレイ、バブルキャップトレイ又はバルブトレイ）、配列されたパッキング材（例として板金若しくは織物パッキング、又はランダムベッドのパッキング）を備えうる。使用するカラムに必要なプレートの数、及び還流比は、必要な純度、分離しようとする液体の相対沸騰位置によって本質的に決まり、これは当業者であれば公知の方法により具体的な設計及び実行データを確定することができる。
【０１６１】
塩としての沈殿は、好適な有機又は無機酸、例えば硫酸、塩酸、リン酸、酢酸、ギ酸、炭酸、シュウ酸などを添加することにより行うことができる。別の好ましい実施形態において、有機ジカルボン酸を用いて、塩を形成し、これを直接に又は例えば再結晶による精製後に、続く重縮合に使用して、ポリアミドを得ることができる。より具体的には、そのようなジカルボン酸はC4-C12-ジカルボン酸である。
【０１６２】
抽出手順において生成された有機カダベリン相はまた、クロマトグラフィーにより仕上げ処理することも可能である。クロマトグラフィーのため、カダベリン相を適当な樹脂、例えば強い又は弱い酸性イオン交換体（Lewatit 1468 S、Dowex Marathon C、Amberlyst 119 Wetなど）にアプライし、所望の生成物又は混入物を部分的に又は完全にクロマトグラフィー樹脂に保持させる。これらのクロマトグラフィーステップは、必要に応じて、同じ又は他のクロマトグラフィー樹脂を用いて反復して行ってもよい。当業者であれば、適当なクロマトグラフィー樹脂の選択及びそれらの最も効率的な適用に精通している。精製された生成物は、濾過又は限外濾過により濃縮し、適当な温度で保存することができる。
【０１６３】
単離された化合物（複数でもよい）の内容（identity）及び純度は、従来の技術により決定することができる。これには、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、ガスクロマトグラフィー（GC）、分光法、染色法、薄層クロマトグラフィー、NIRS、酵素アッセイ又は微生物学的アッセイが含まれる。これらの分析法は、Patekら(1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140；Malakhovaら(1996) Biotekhnologiya 11 27-32；及びSchmidtら(1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Vol.A27, VCH: Weinheim, pp.89-90, pp.521-540, pp.540-547, pp.559-566, 575-581及びpp.581-587；Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons；Fallon, A.ら(1987) Applications of HPLC in Biochemistry: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol.17にまとめられている。
【０１６４】
上述した方法により生産し回収又は精製されたカダベリンは既知の技術によりポリアミドを生成するために使用することができるため、これらのポリアミドは本発明の別の実施形態を構成する。
【実施例】
【０１６５】
以下の非限定的な実施形態に基づき、添付の図面を参照しながら本発明をより詳細に説明する。
【０１６６】
実施例１
LU11697の株構築
C.グルタミカムATCC 13032株を、DNA A（pInt sacB delta PEPCKとも呼ばれる）（配列番号20）で形質転換し、また「キャンベルイン」を行って、「キャンベルイン」株を得た。続いて、「キャンベルイン」株を「キャンベルアウト」して、「キャンベルアウト」株であるLU11031を得たが、これは、欠陥ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ酵素（Delta PEPCK）をコードする改変型ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子（pepck）を含有する。
【０１６７】
続いて11301株をDNA B（pInt sacB 2x ddhとも呼ばれる）（配列番号21）で形質転換し、「キャンベルイン」株を得た。続いて、「キャンベルイン」株を「キャンベルアウト」して、「キャンベルアウト」株であるLU11100を得たが、これは重複ddh遺伝子をコードする遺伝子をその天然プロモーターと共に含有する（2*ddh）。
【０１６８】
LU11100株をDNA C（pInt sacB LysC T311Iとも呼ばれる）（配列番号22）で形質転換し、「キャンベルイン」株を得、続いてこれを「キャンベルアウト」して、「キャンベルアウト」株であるLU11271を得た。LU11271株は、フィードバック抵抗性アスパラギン酸キナーゼ酵素（Askfbr）（lysCによりコードされる）をコードする遺伝子を含有する。得られたアスパラギン酸キナーゼタンパク質において、T311がI311に変化していた（LysC T311Iと呼ばれる）。さらに、PSODプロモーターをask lysC遺伝子の発現を駆動するために付加する。
【０１６９】
LU11271株をDNA D（pK19 PSOD dapB rxb2957とも呼ばれる）（配列番号23）で形質転換し、「キャンベルイン」株を得、続いてこれを「キャンベルアウト」して、「キャンベルアウト」株であるLU11269を得た。LU11269株は、dapB遺伝子の上流にdapBの発現を駆動するためにPSODプロモーターを含有する。
【０１７０】
LU11269株をDNA E（pK19 sacB 2x argS lysAとも呼ばれる）（配列番号24）で形質転換し、「キャンベルイン」株を得、続いてこれを「キャンベルアウト」して、「キャンベルアウト」株であるLU11275を得た。LU11275株は、lysA遺伝子及びargSを含む重複遺伝子座を含有する。
【０１７１】
LU11275株をDNA F（pInt sacB delta homとも呼ばれる）（配列番号25）で形質転換し、「キャンベルイン」株を得、続いてこれを「キャンベルアウト」して、「キャンベルアウト」株であるLU11328を得た。LU11368株はhsdh/hom遺伝子の欠失を含有する。
【０１７２】
LU11368株をDNA G（pK19 delta pycAとも呼ばれる）（配列番号26）で形質転換し、「キャンベルイン」株を得、続いてこれを「キャンベルアウト」して、「キャンベルアウト」株であるLU11374を得た。LU11374株はピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子 pycA遺伝子の欠失を含有する。
【０１７３】
LU11374株をDNA H（pCLIk Int sacB hsdh置換とも呼ばれる）（配列番号27）で形質転換し、「キャンベルイン」株を得、続いてこれを「キャンベルアウト」して、「キャンベルアウト」株であるLU11401を得た。この株は、V59からAへの変異を有する変異型hom遺伝子を含有する。
【０１７４】
LU11401株をDNA I（pInt sacB pycA*とも呼ばれる）（配列番号28）で形質転換し、「キャンベルイン」株を得、続いてこれを「キャンベルアウト」して、「キャンベルアウト」株であるLU11414を得た。この株は、P458からSへの変異を有する変異型ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を含有する。
【０１７５】
LU11414株をDNA J（pInt sacB PSOD pycAとも呼ばれる）（配列番号28）で形質転換し、「キャンベルイン」株を得、続いてこれを「キャンベルアウト」して、「キャンベルアウト」株である11424を得た。この株は、pycA遺伝子の上流にPSODプロモーターを含有する。
【０１７６】
LU11424株をDNA K（pInt sacB delta G6PDHとも呼ばれる）（配列番号28）で形質転換し、「キャンベルイン」株を得、続いてこれを「キャンベルアウト」して、「キャンベルアウト」株である11436を得た。この株は、グルコース-6-P-デヒドロゲナーゼ遺伝子（G6PDH）の欠失を含有する。
【０１７７】
LU11436株をDNA L（pInt sacB G6PDH*とも呼ばれる）（配列番号29）で形質転換し、「キャンベルイン」株を得、続いてこれを「キャンベルアウト」して、「キャンベルアウト」株であるLU11443を得た。この株は、変異型グルコース-6-P-デヒドロゲナーゼ遺伝子（G6PDH）を含有する。この遺伝子では、配列が変異を含み、アミノ酸234が、野生型タンパク質ではアラニンであるところ、スレオニンに変異している。
【０１７８】
LU11443株をDNA M（pK19 sacBデルタスクシニル-CoA-シンテターゼとも呼ばれる）（配列番号30）で形質転換し、「キャンベルイン」株を得、続いてこれを「キャンベルアウト」して、「キャンベルアウト」株であるLU11600を得た。この株は、スクシニル-CoA-シンターゼベータ鎖の欠失を含有する。
【０１７９】
LU11600株をDNA N（pK19 sacBスクシニル-CoA-シンテターゼ置換とも呼ばれる）（配列番号31）で形質転換し、「キャンベルイン」株を得、続いてこれを「キャンベルアウト」して、「キャンベルアウト」株であるLU11601を得た。この株は、変異型スクシニルCoAシンターゼベータ鎖遺伝子を含有する。この遺伝子では、配列が変異を含み、野生型タンパク質と比較して、P17からSへの変異、G39からEへの変異、A165からTへの変異を有する。
【０１８０】
LU11601株をDNA O（pCLIK Int sacB delta MMCMとも呼ばれる）（配列番号32）で形質転換し、「キャンベルイン」株を得、続いてこれを「キャンベルアウト」して、「キャンベルアウト」株であるLU11606を得た。この株は、メチルマロニルCoAムターゼ遺伝子の欠失を含有する。
【０１８１】
LU11606株をDNA P（pCLIK Int sacB MMCM置換とも呼ばれる）（配列番号33）で形質転換し、「キャンベルイン」株を得、続いてこれを「キャンベルアウト」して、「キャンベルアウト」株であるLU11696を得た。この株は、P75からSへの変異、G413からEへの変異、A417からVへの変異を含む変異型メチルマロニルCoAムターゼ遺伝子を含有している。
【０１８２】
LU11696株をDNA Q（pInt sacB PSOD G6PDHとも呼ばれる）（配列番号34）で形質転換し、「キャンベルイン」株を得、続いてこれを「キャンベルアウト」して、「キャンベルアウト」株であるLU11697を得た。この株は、G6PDH遺伝子の前にPSODプロモーターを含有する。
【０１８３】
実施例２
LU14105の株構築
LU11697株をDNA R（pInt sacB ldc bioDとも呼ばれる）（配列番号35）で形質転換し、「キャンベルイン」株を得、続いてこれを「キャンベルアウト」して、「キャンベルアウト」株であるLU14105を得た。この株は、C.グルタミカムのbioD遺伝子座に組み込まれた、その天然プロモーター（ldc）の転写制御下に大腸菌由来のリシンデカルボキシラーゼ遺伝子を含有する。
【０１８４】
実施例３
LU14635の株構築
LU14105株をDNA S（pInt sacB delta RXA02214とも呼ばれる）（配列番号36）で形質転換し、「キャンベルイン」株を得、続いてこれを「キャンベルアウト」して、「キャンベルアウト」株であるLU14635を得た。この株は、アセチルトランスフェラーゼ遺伝子の欠失を含有する。
【０１８５】
実施例４
LU14646及びLU14646デルタアセチルトランスフェラーゼの株構築
LU 14105株をDNA T（pInt sacB delta lysEとも呼ばれる）（配列番号37）で形質転換し、「キャンベルイン」株を得、続いてこれを「キャンベルアウト」して、「キャンベルアウト」株であるLU14646を得た。この株は、リシンエクスポーターlysE遺伝子の欠失を含有する。
【０１８６】
LU 14646株をDNA R（pInt sacB delta RXA02214とも呼ばれる）（配列番号38）で形質転換し、「キャンベルイン」株を得、続いてこれを「キャンベルアウト」して、「キャンベルアウト」株であるLU14646デルタアセチルトランスフェラーゼを得た。この株は、同定されたアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の欠失を含有する。
【０１８７】
振盪フラスコ培養でのカダベリン生産
組換え株について振盪フラスコ実験を行い、カダベリン生産を試験した。WO2005059139に記載のとおり、リシン生産と同じ培養培地及び同じ条件を用いた。対照のため、宿主株と、pClik5aMCSを含む組換え株とを並行して試験した。これらの株を、CM寒天上で、30℃で一晩前培養した。培養した細胞を、1.5mlの0.9％NaClを含むマイクロチューブに回収し、ボルテックス後、610nmでの吸光度によって細胞密度を測定した。本培養として、オートクレーブした100ml三角フラスコに入った、0.5gのCaCO3を含む10mlの生産培地に、初期OD値の1.5倍に達するまで懸濁細胞を播種した。本培養は、回転式振盪培養機（Infors AJ118, Bottmingen, Switzerland）上で、200rpmにおいて、30℃で48〜78時間行った。カダベリン及びリシンの濃度は、HPLC（Agilent 1100 Series LC system）を用いて測定した。
【０１８８】
リシンデカルボキシラーゼ遺伝子を含む全ての組換え株を用いて培養したブロス中には、相当量のカダベリンが蓄積されていた。一方、リシン生産性に著しい低下が見られた。リシンがカダベリンへと完全に変換されたと考えると、リシンと同数のカダベリン分子が生産されなければならない。しかし、蓄積されたカダベリンの量は、宿主株によって生産されたリシンの量より少なく、他方、相当量の副生成物であるアセチルカダベリンが同時に蓄積され、糖収量の低下をもたらした。
【０１８９】
HPLC分析に加えて、カダベリンとアセチルカダベリンを質量分光法で同定した。
【０１９０】
プラスミド構築及びlysE遺伝子の破壊
リシンエクスポーターをコードする遺伝子の染色体破壊のため、2回の連続的相同組換え事象によってマーカーを用いない操作を可能とする組換えプラスミドを構築した。上流用及び下流用のPCRプライマーのセット（WJK199、WJK200、WJK201及びWJK202）を用いて、野性型ATCC13032コリネバクテリウム・グルタミカム染色体DNAからlysE遺伝子の上流領域及び下流領域を含むDNA断片を増幅し、PCRプライマーと共に融合PCR用のテンプレートとして使用して、上記遺伝子の中間領域が除去されている融合断片を作製した。1039塩基対のサイズの融合PCR産物を精製し、SpeIとXbaIで消化して、同じ制限酵素で消化したpInt sacBベクター（C.グルタミカムのゲノム遺伝子座において配列を統合する（Beckerら(2005), Applied and Environmental Microbiology, 71 (12), 8587-8596頁））中に挿入した。
【０１９１】
lysEの増幅用オリゴヌクレオチド：
WJK199 
5’-TCTCACTAGTGCAGCAAGGATAATGTGTGC-3’
WJK200 
5’-GTTGTCTAGAGCTGCCAACAATGGTCTTGG-3’
WJK201
5’-CACGACGACGTTGATCCAGCGGTCCGATGGACAGTAAAAG-3’
WJK 202
5’-CTTTTACTGTCCATCGGACCGCTGGATCAACGTCGTCGTG-3’
【０１９２】
その後、上記のプラスミドを使用して、lysE遺伝子の天然のコード領域を破壊した。使用した株は、ldcC遺伝子が染色体のbioD遺伝子座に組み込まれていてカダベリンとリシンの両方を生産する、LU14105であった。2回の連続組換え事象（上流領域と下流領域で各1回）は、それぞれ、遺伝子の中間配列を破壊するために必要とされる。遺伝子破壊した変異体は、プライマーを用いたPCRとサザンハイブリダイゼーション解析で確認した。
【０１９３】
実施例５
振盪フラスコ培養でのカダベリン生産
上述した菌株の振盪フラスコ培養でのカダベリン生産：
LU1105株、LU14635株、LU14646株、及びLU14646デルタアセチルトランスフェラーゼ株をカダベリン生産について分析した。lysE遺伝子及びアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の欠失を有する上記組換え株について振盪フラスコ実験を行い、カダベリン生産を試験した。WO2005059139に記載のとおり、リシン生産と同じ培養培地及び同じ条件を用いた。対照のため、宿主株と、欠失/破壊lysE遺伝子を有する組換え株とを並行して試験した。これらの株を、CM寒天上で、30℃で一晩前培養した。培養した細胞を、1.5mlの0.9％NaClを含むマイクロチューブに回収し、ボルテックス後、610nmでの吸光度によって細胞密度を測定した。本培養として、オートクレーブした100ml三角フラスコに入った、0.5gのCaCO3を含む10mlの生産培地に、初期OD値の1.5倍に達するまで懸濁細胞を播種した。本培養は、回転式振盪培養機（Infors AJ118, Bottmingen, Switzerland）上で、200rpmにおいて、30℃で48〜78時間行った。カダベリン及びリシンの濃度は、HPLC（Agilent 1100 Series LC system）を用いて測定した。
【０１９４】
欠失／破壊lysE遺伝子を有する組換えLU14646株で培養したブロス中では、野生型lysE遺伝子を有する同系LU14105株よりも、カダベリンの量が6.6g/lから9.9g/lに増大したことがわかった。さらに、リシン生産性は、8.3g/lから0.3g/lに低下した。またアセチルトランスフェラーゼの欠失により、カダベリン生産が6.6g/lから10.2g/lにまで増大したが、11.8g/lのリシンが上清中に蓄積した。上述したアセチルトランスフェラーゼがL14635株及びLU14646デルタアセチルトランスフェラーゼ株で欠失している場合には、アセチルカダベリンは検出されなかった。lysE遺伝子とアセチルトランスフェラーゼの欠失の組み合わせでは、カダベリン濃度が14.9g/lにまで増大し、このことは、lysE遺伝子の欠失とアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の欠失との間の相乗効果を示している。
【表２】
0005960604.tif 000003
【０１９５】
別の実施形態において、リシンデカルボキシラーゼを、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいて活性を有する強力なプロモーター、及びC.グルタミカムにおいて活性を有する移行及び分泌を構成する配列と融合してクローニングする。移行及び分泌のための配列は、ゲル電気泳動分離及びエドマン分解によるN末端配列決定によって、放線菌（Actinobacteria）、例えばストレプトマイセス及びコリネバクテリアにおける分泌タンパク質を同定することにより見出すことができる。分泌タンパク質をコードするDNA配列は、分泌タンパク質に見出される最初のアミノ酸をコードする最初のコドンの前に1〜100bpの追加の配列を有する5'末端を示す。この開始コドンの後の追加の配列は、移行及び分泌についてタンパク質を標的化するペプチドシグナル配列をコードする。このシグナル配列は、リシンデカルボキシラーゼldC又はcadAなどの遺伝子の前に融合して、mRNAに発現されて、シグナル配列及びタンパク質配列の融合タンパク質が産生されるようにする。融合タンパク質は、シグナル配列が切除されてタンパク質が分泌される際に、細胞壁マトリックス中及び細胞培養上清中に移行及び分泌される。活性なリシンデカルボキシラーゼ（LDC及びCADAなど）としての分泌タンパク質は、細胞上清中で活性を有し、ここで脱炭酸反応によってリシンからカダベリンへと変換することができる。これにより、細胞代謝により生成されるリシンの量は、カダベリンへと変換され、炭素源は、副生成物の同時生成を伴うことなくカダベリンへと変換されうる。
【０１９６】
最も可能性が高いのは、分泌されるリシンデカルボキシラーゼの発現を、細胞内リシンデカルボキシラーゼをも発現する菌株において、並びにカダベリンアセチルトランスフェラーゼの欠失を有する菌株において実施する。
【０１９７】
実施例６
リシンデカルボキシラーゼ分泌生物の株構築
機能性リシンデカルボキシラーゼを分泌可能な株を構築するために、上述したPSODプロモーター、ストレプトマイセス・コエリコロル（Streptomyces coelicolor）由来のアルファアミラーゼのシグナル配列、及びLDC遺伝子を、PCRプライマー伸長により融合し、クローニングして、ベクターpCLIK5A PSOD ldc sigseqアルファアミラーゼ（配列番号41）を得た。得られたベクターをLU14635株に形質転換する。上述したように振盪フラスコにおいて増殖及びインキュベーションした後、培養上清中のリシンの量が、移行／分泌シグナル配列を有しないldCを発現する対照と比較して低減していることが見出される。
【０１９８】
実施例７
DAPの生産のためのC5糖の利用のための株構築
キシロースの利用に関する大腸菌遺伝子（キシロースイソメラーゼ及びキシルロースキナーゼxylAB）をPCR融合法によりC.グルタミカム由来のPgroプロモーターに融合し、PCRにより増幅し、ベクターpGの制限部位XhoI及びMluIに挿入して、ベクターpG Pgro xylAB（配列番号39）を得た。プラスミドをLU14635株に形質転換すると共に、キシロース利用遺伝子を含まない空の対照プラスミドpGを形質転換して、LU14635 pG株及びLU14635 pG Pgro xylAB株を得た。
【０１９９】
振盪フラスコ培養でのカダベリン生産
振盪フラスコ実験を以下のように実施した：
上述した株の振盪フラスコ培養でのカダベリン生産。LU14635 pG株及びpG Pgro Xyl AB株をカダベリン生産について分析した。キシロースオペロン遺伝子を過剰発現するためにプラスミドによる組換え株について振盪フラスコ実験を行い、カダベリン生産を試験した。これらの株を、25μg/mlカナマイシンを含むCM寒天上で、30℃で一晩前培養した。培養した細胞を、1.5mlの0.9％NaClを含むマイクロチューブに回収し、ボルテックス後、610nmでの吸光度によって細胞密度を測定した。本培養として、オートクレーブした100ml三角フラスコに入った、25μg/mlの濃度のカナマイシンを添加した10mlのMDAP培地に、初期OD値の1.5倍に達するまで懸濁細胞を播種した。本培養は、回転式振盪培養機（Infors AJ118, Bottmingen, Switzerland）上で、200rpmにおいて、30℃で48〜78時間行った。カダベリン及びリシン並びに残留糖の濃度は、HPLC（Agilent 1100 Series LC system）を用いて測定した。
【０２００】
MDAPバッチ培地処方
MDAP培地は以下の成分から構成される：
硫酸アンモニウム 25g/L
酵母エキス Difco 15g/L
ビタミンストック 15ml/L
塩溶液MDAP 100ml/L
微量元素溶液: 15ml/L
ピリドキシン 1mg/ml 1ml/L
糖（グルコース又はキシロース） 60〜50g/L
ACES 78g/L
MOPS 21g/L
CaCO3 15g/L
【０２０１】
ビタミンストック
ビオチン 300mg/l
チアミン 500mg/l
ニコチンアミド 600mg/l
パントテン酸 2000mg/l
ビタミン溶液の添加 15ml/l
【０２０２】
塩溶液MDAP  
クエン酸  2g/L
硫酸カルシウム 1.5g/L
リン酸カリウム 25g/L
硫酸マグネシウム 12.5g/L
硫酸鉄（II） 700mg/L
硫酸亜鉛 300mg/L
硫酸マンガン 150mg/L
【０２０３】
微量元素溶液
クエン酸  2.1g/L
ホウ酸 300mg/L
硫酸コバルト 240mg/L
硫酸銅 300mg/L
硫酸ニッケル 200mg/L
モリブデン酸ナトリウム 50mg/L
【０２０４】
【表３】
0005960604.tif 000004
【０２０５】
この実験は、キシロース利用遺伝子の発現が、キシロース上での良好な増殖を導くことを示すが、50g/Lキシロースの添加時にグルコース上で良好に増殖しカダベリンを生産する対照株LU14635 pGは、ほとんど増殖又はカダベリン生産しなかった。このことは、異種遺伝子の不在下では、キシロースが C.グルタミカム株によって変換可能ではないことを示している。細胞増殖の尺度であるODは、キシロースを培地に添加した場合に最高値を示し、培地へのグルコース添加と比較して、より高い値に、従って細胞数に達した。カダベリン濃度はまた、プラスミドpG キシロースオペロン上にキシロース利用遺伝子を有する実験において最高値であった。この実験から得られた収量値（利用された糖1g当たりのカダベリンg）はまた、グルコースを添加した場合の収量よりも増大していた。このデータは、カダベリン生産の収量並びに増殖が、キシロース利用の遺伝子をカダベリン生産株において発現させた場合に改善されうることを示している。このデータはまた、C.グルタミカムをカダベリンなどのファインケミカルを生産するためにペントースを変換するための株としてうまく使用可能であることを示す。
【０２０６】
実施例８
バチルス・ズブチリス由来のキシロース利用遺伝子を用いたDAPの生産のためのC5糖（ペントース）の利用のための株構築
キシロースの利用についてのバチルス・ズブチリス遺伝子（すなわちキシロースイソメラーゼ及びキシルロースキナーゼ）を、PCR反応によりC.グルタミカム由来のPSODプロモーターと融合し、PCRにより増幅し、ベクターpGの制限部位XhoI及びMluIに挿入して、ベクターpG PSOD xyl AB B.ズブチリスを得た。このベクターの配列は配列番号40である。このプラスミドをLU14635株に形質転換し、並びにキシロース利用遺伝子を含まない空の対照プラスミドpGを形質転換して、LU14635 pG株及びLU14635 pG Pgro xylAB B.ズブチリス株を得た。
【０２０７】
振盪フラスコ培養でのカダベリン生産
振盪フラスコ実験を以下のように実施した：
上述した菌株の振盪フラスコ培養でのカダベリン生産。LU14635 pG株及びpG Pgro xylAB B.ズブチリス株をカダベリン生産について分析した。キシロースオペロン遺伝子を過剰発現するプラスミドによる組換え株について振盪フラスコ実験を行い、カダベリン生産を試験した。これらの株を、25μg/mlカナマイシンを含むCM寒天上で、30℃で一晩前培養した。培養した細胞を、1.5mlの0.9％NaClを含むマイクロチューブに回収し、ボルテックス後、610nmでの吸光度によって細胞密度を測定した。本培養として、オートクレーブした100ml三角フラスコに入った、25μg/mlの濃度のカナマイシンを添加した10mlのMDAP培地に、初期OD値の1.5倍に達するまで懸濁細胞を播種した。本培養は、回転式振盪培養機（Infors AJ118, Bottmingen, Switzerland）上で、200rpmにおいて、30℃で48〜78時間行った。カダベリン及びリシン並びに残留糖の濃度は、HPLC（Agilent 1100 Series LC system）を用いて測定した。
【０２０８】
LU14635 pG Pgro xylAB B.ズブチリス株は、単一炭素源としてキシロース上で良好に増殖するのに対し、LU14635 pG株はそうではないことがわかった。LU14635 pG Pgro xylAB B.ズブチリス株は、単一炭素源としてのキシロース上での増殖時に、相当量のカダベリンを生産するが、対照LU14635 pGは相当量ではカダベリンを生産しなかった。
【０２０９】
実施例９
リシンデカルボキシラーゼの分泌のための株構築。脱炭酸についての大腸菌ldc遺伝子を、PCR融合によりC.グルタミカム由来のPSODプロモーター、及びストレプトマイセス・コエリコロル（Streptomyces coelicolor）のアルファアミラーゼのシグナル配列と融合する。この融合した遺伝子を、次にpCLIKベクターにクローニングして、pCLIK PSOD ldc alpha-amylase sigseq（配列番号41）を得る。このプラスミドを形質転換してLU14635 pCLIK PSOD ldc alpha amy sigseq株を得る。上述した株の振盪フラスコ培養でのカダベリン生産を行う。LU14635 pCLIK株及びpCLIK PSOD ldc alpha amy sigseq株をカダベリン生産について分析する。振盪フラスコ実験を、C.グルタミカムにより分泌されるldcを過剰発現するプラスミドによる組換え株で実施して、カダベリン生産を試験する。これらの株を、25μg/mlカナマイシンを含むCM寒天上で、30℃で一晩前培養する。培養した細胞を、1.5mlの0.9％NaClを含むマイクロチューブに回収し、ボルテックス後、610nmでの吸光度によって細胞密度を測定する。本培養として、オートクレーブした100ml三角フラスコに入った、25μg/mlの濃度のカナマイシンを添加した10mlのMDAP培地に、初期OD値の1.5倍に達するまで懸濁細胞を播種する。本培養は、回転式振盪培養機（Infors AJ118, Bottmingen, Switzerland）上で、200rpmにおいて、30℃で48〜78時間行う。カダベリン及びリシン並びに残留糖の濃度は、HPLC（Agilent 1100 Series LC system）を用いて測定する。LU14635 pCLIK PSOD ldc alpha amy sigseq株は、細胞上清中にリシンを生産しないのに対し、LU14635 pCLIK株はそうではなく、またLU14635 pCLIK PSOD ldc alpha amy sigseq株はLU14635 pCLIK株よりも多くのカダベリンを生産することがわかる。
【表４】
0005960604.tif 000005
【０２１０】
【表５】
0005960604.tif 000006
【図１】
0005960604.tif 000007
【配列表】
0005960604000001.app