(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程（a）、（b）、および（c）を含む細胞性免疫疾患治療剤のスクリーニング方法であって、
（a）被験物質の存在下で、ニューロピリン−１（Neuropilin-1）及びプレキシン−Ａ１（Plexin-A1）を発現する真核細胞とセマ３Ａ（Sema3A）ポリペプチドとを接触させる工程、
（b）被験物質存在下におけるニューロピリン−１（Neuropilin-1）及びプレキシン−Ａ１（Plexin-A1）を発現する真核細胞とセマ３Ａ（Sema3A）ポリペプチドとの相互作用から生じるシグナルを測定し、被験物質非存在下でのニューロピリン−１（Neuropilin-1）及びプレキシン−Ａ１（Plexin-A1）を発現する真核細胞とセマ３Ａ（Sema3A）ポリペプチドとの相互作用から生じるシグナルと比較する工程、
（c）上記（b）の比較結果に基づいて、対照に比してシグナルを低下させる被験物質を選択する工程、
該細胞性免疫疾患がアトピー性皮膚炎、又は、遅延型アレルギー疾患であり、
該シグナルがミオシン−ＩＩ（myosin-II）のリン酸化である、前記方法。
【請求項２】
該細胞が樹状細胞である請求項１記載の方法。
【請求項３】
該樹状細胞が末梢血から分画されて誘導された細胞である請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
該樹状細胞が細胞株である請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項５】
下記の工程（a）、（b）、および（c）を含む細胞性免疫疾患治療剤のスクリーニング方法であって、
（a）被験物質の存在下で、ニューロピリン−１（Neuropilin-1）及びプレキシン−Ａ１（Plexin-A1）を発現する真核細胞とセマ３Ａ（Sema3A）ポリペプチドとを接触させる工程、
（b）被験物質存在下におけるニューロピリン−１（Neuropilin-1）及びプレキシン−Ａ１（Plexin-A1）を発現する真核細胞とセマ３Ａ（Sema3A）ポリペプチドとの相互作用から生じるシグナルを測定し、被験物質非存在下でのニューロピリン−１（Neuropilin-1）及びプレキシン−Ａ１（Plexin-A1）を発現する真核細胞とセマ３Ａ（Sema3A）ポリペプチドとの相互作用から生じるシグナルと比較する工程、
（c）上記（b）の比較結果に基づいて、対照に比してシグナルを低下させる被験物質を選択する工程、
該細胞性免疫疾患がアトピー性皮膚炎、又は、遅延型アレルギー疾患であり、該シグナルがアクトミオシンの収縮である、前記方法。
【請求項６】
該細胞が樹状細胞である請求項５記載の方法。
【請求項７】
該樹状細胞が末梢血から分画されて誘導された細胞である請求項５又は請求項６記載の方法。
【請求項８】
該樹状細胞が細胞株である請求項５又は請求項６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願
本出願は，日本特許出願２００９−２５４１０８（２００９年１１月５日出願）に基づく優先権を主張しており，この内容は本明細書に参照として取り込まれる。【０００２】
技術分野
本発明は、自己免疫疾患又はアレルギーの治療に有効な、Neuropilin1-Fc（NP-1-Fc）、Neuropilin-1（NP-1）中和抗体、Semaphorin3A（Sema3A）中和抗体等のNP-1とSema3Aとの結合阻害物質を有効成分として含む、自己免疫疾患又はアレルギーを治療または予防するための医薬組成物または当該医薬組成物を用いる治療方法、もしくは当該阻害物質のスクリーニング方法の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
自己免疫疾患は、自己抗原に対する特異的かつ継続的な適応免疫によって生じる。生体内に侵入した抗原を最終的に体外に排出する外来抗原に対する適応免疫や自然免疫と異なり、自己抗原に対する適応免疫反応は自己抗原を自己の生体から除去することができないため、免疫反応が継続する。自己抗体が継続的に供給される結果、反応が更に増幅される。その結果、免疫系は自己組織に対して作用し、組織傷害が生じる。例えば、慢性関節リウマチ、多発性硬化症などでは、自己抗原又は自己MHC複合体に特異的な活性化T細胞が、マクロファージを活性化して局所の炎症を起こすか、あるいは直接組織を傷害する可能性があると考えられている。【０００４】
器官特異的自己免疫疾患としては、例えば甲状腺を傷害するバセドー病や橋本甲状腺炎、膵臓のランゲルハンス島のβ細胞が破壊されることにより生じる若年性糖尿病、副腎皮質の破壊により生じるアジソン病、自己免疫性溶血性貧血、突発性血小板減少症、脱髄性脳炎、多発性硬化症等が知られている。全身性自己免疫疾患としては、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（systemic  lupus  erythematosus、SLE）、シェーグレン病、ベーチェット病等が知られている。これらの疾患には、自己抗体または自己反応性T細胞が関与していると考えられている。【０００５】
適応免疫応答は、ナイーブT細胞および一部のメモリー細胞（以下、「ナイーブT細胞等」という）が存在する末梢リンパ節において、抗原提示細胞による特異的なナイーブT細胞等が活性化されるT細胞応答によって誘導される。ナイーブT細胞等は抗原提示細胞から抗原特異的刺激シグナルと補助刺激シグナルを同時に受け取らなければ活性化されにくい。マクロファージ、B細胞も抗原提示の機能を有するが、T細胞応答において樹状細胞による抗原提示が重要な位置を占めると考えられている。【０００６】
リンパ節に存在する成熟樹状細胞は、ナイーブT細胞等に対する強力な活性化能を有している。リンパ組織中の成熟樹状細胞は貪食により抗原を取り込む能力は低いが、細胞質内で合成されるタンパクに由来するペプチドを結合できるMHC  （major  histocompatibility  complex）クラスI  分子や細胞内膜結合小胞内のタンパク由来のペプチドを結合できるMHC  クラスII  分子を構成的に高レベルで発現している。したがって、成熟樹状細胞はこうした抗原由来のペプチドを提示することができる。リンパ節に存在するナイーブT細胞は、樹状細胞からT細胞受容体（T  cell  receptor、TCR）を通して抗原特異的刺激シグナルを、CD28を通して補助刺激シグナルを受け取る。ナイーブCD8T細胞は、MHCクラスI分子と結合することによって細胞傷害性T細胞に分化し、細胞性免疫を発揮する。一方、ナイーブCD4T細胞は、MHCクラスII分子と結合することによってTh1細胞か、又はTh2細胞、若しくはTh17細胞に分化する。Th17細胞はIL-17を産生することを特徴とし、自己免疫疾患への関与が知られている。Th2細胞（ヘルパーCD4T細胞）は、B細胞の抗体生産を刺激し液性免疫を発揮する。【０００７】
また、外来性抗原に対する炎症により生じるアレルギーの中でも、遅延型とも呼ばれるIV型アレルギーの発症には、活性化T細胞およびマクロファージが関与すると考えられている。ここでは、自己免疫疾患と同様に、樹状細胞やランゲルハンス細胞がナイーブT細胞等に対する抗原の提示機能を主に担っていると考えられている。【０００８】
その一方、通常末梢組織に分布している未成熟樹状細胞はこうした抗原の提示機能もある程度有しているが、成熟樹状細胞と比して抗原取り込み能力が高い。未成熟樹状細胞は貧食により、例えば、外界から進入した抗原や損傷細胞等から遺漏した自己由来の抗原を取り込む。未成熟樹状細胞は抗原を取り込んだ後に刺激を受けて、リンパ流から局所の所属リンパ節（以下、本明細書においては「流入領域リンパ節」ともいうが両用語は同義である）に遊走し成熟樹状細胞となり補助刺激活性を獲得する。したがって、樹状細胞が局所の所属リンパ節においてナイーブT細胞等を活性化するためには、刺激を受けた樹状細胞が末梢組織から抜け出して、所属リンパに向かって遊走し進入する際に、リンパ上皮細胞との相互作用及びトランスマイグレーション（transmigration）能を獲得する必要があるが、樹状細胞が局所の所属リンパ節に遊走する能力を獲得するメカニズムについては明らかではなく、複数の分子が複雑に関与する機構が関与していることが報告されていた。【０００９】
例えば、リンパ節／リンパ上皮細胞由来のCCケモカインリガンド21（CCL21）及びCCL19に結合するCCケモカイン受容体7（CCR7）の発現が、末梢組織から所属リンパ節への樹状細胞の輸送に重要な役割を果すことが示された（非特許文献1）。さらに、リンパ上皮細胞を越えたトランスマイグレーションの間にICAM1が重要な役割を果すことも示された（非特許文献2）。【００１０】
一方で、マウス樹状細胞系リンパ腫細胞においてshRNAによってPleaxin-A1の発現を抑制することによって、in  vivo又はin  vitroにおいて非自己に対するT細胞免疫が減弱されることが報告された（非特許文献3）。また、樹状細胞や破骨細胞におけるPlexin-A1シグナル解析から、これらの細胞においてPlexin-A1はTrem-2及びDAP-12とヘテロ受容体を形成していることが確認された。さらに組換可溶型Sema6Dタンパク質の刺激によって樹状細胞からIL-12等の炎症性サイトカインの発現や、前駆細胞からの破骨細胞分化が促進されること、Sema6Dが野生型の樹状細胞に結合する一方で、Plexin-A1欠損マウスの樹状細胞にはほとんど結合できないことが示された。Plexin-A1欠損マウスでは、T細胞免疫反応が著しく減弱し、破骨細胞分化に異常が起こるため大理石骨病を自然発症することが報告された（非特許文献4）。マウス樹状細胞を用いたshRNAによるPlexin-A1阻害により、Plexin-A1がシグナル伝達因子Rhoの活性化を介して樹状細胞とT細胞の免疫シナプスへのアクチン骨格の局在を制御していることが示された（非特許文献5）。【００１１】
Plexin-A1は、多種類のco-receptorとの結合によって様々な機能を有する受容体として作用することが報告されており、ニワトリの心臓形態発生時にはVEGF受容体やOff-Trackとともに受容体を形成することが報告されているほか、NP-1と共にType3  Semaphorin受容体を形成し神経反発因子として作用するほか、Type6  SemaphorinであるSema6CとSema6Dの受容体として作用し軸索誘導や心臓器官形成に作用することも示されていた。【００１２】
本明細書において引用される参考文献は以下のとおりである。これらの文献に記載される内容はすべて本明細書に参照として取り込まれる。これらの文献のいずれかが、本明細書に対する先行技術を構成すると認めるものではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】L.  Ohl  et  al.,  Immunity  21,  279  (2004).
【非特許文献２】L.  A.  Johnson  et  al.,  J  Exp  Med  203,  2763  (2006).
【非特許文献３】A.  W.  Wong  et  al.,  Nat  Immunol  4,  891  (2003).
【非特許文献４】N.  Takegahara  et  al.,  Nat  Cell  Biol  8,  615  (2006).
【非特許文献５】Eun  SY  et  al.  J  Immunol.  1774271  (2006).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は上記の情況に鑑みてなされたものであり、自己免疫疾患またはアレルギーの症状が観察される患者に対する自己免疫疾患またはアレルギー疾患の治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者は、クラスＩＩＩおよびクラスＶＩセマフォリンの主要な受容体であるPlexin-A1が、樹状細胞のリンパ節への輸送および抗原特異的Ｔ細胞応答に重要な役割を果たしていることを見出した。さらに、Sema6CまたはSema6DではなくSema3Aの発現が、リンパ管内皮細胞を通過する際の樹状細胞移動に必要であり、ここで、Sema3Aはミオシン-II活性を刺激して、アクトミオシン収縮を誘導することを見出した。本発明者は、かかる発見に基づいて、樹状細胞において発現しているNP-1/Plexin-A1ヘテロ受容体とSema3Aとの結合を阻害する阻害剤が、樹状細胞の所属リンパ節への移動を抑制し、所属リンパ節におけるT細胞の活性化を抑制することを明らかにした。また、本発明者は、本発明に係る阻害剤が、自己免疫疾患や接触性皮膚炎等のアレルギー疾患を治療又は予防することを見出した。さらに、本発明者は、樹状細胞において発現しているNP-1/PlexinA1ヘテロ受容体とSema3Aとの結合の阻害を指標にして、自己免疫疾患や接触性皮膚炎等のアレルギー疾患等細胞性免疫疾患の治療剤をスクリーニングすることができることを見出した。【００１６】
すなわち、本発明は以下；
〔１〕Neuropilin-1/Plexin-A1ヘテロ受容体とSema3Aとの結合を阻害する物質を有効成分として含有する細胞性免疫疾患の治療剤、
〔２〕該物質が、Sema3A中和抗体であることを特徴とする〔１〕記載の治療剤、
〔３〕中和抗体が配列番号１に記載の３６３番目から３８１番目のペプチド配列に結合する抗体であることを特徴とする〔１〕記載の治療剤、
〔４〕ペプチド配列がNYQWVPYQGRVPYPRPGTCである〔３〕記載の治療剤、
〔５〕該物質が、Neuropilin-1中和抗体であることを特徴とする〔１〕記載の治療剤、
〔６〕中和抗体が配列番号２に記載の２６５番目から８５７番目のペプチド配列に結合する抗体であることを特徴とする〔５〕記載の治療剤、
〔７〕中和抗体がポリクローナル抗体であることを特徴とする〔２〕から〔６〕のいずれかに記載の治療剤、
〔８〕中和抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする〔２〕から〔６〕のいずれかに記載の治療剤、
〔９〕該物質が、可溶型Neuropilin-1であることを特徴とする〔１〕記載の治療剤、
〔１０〕可溶型Neuropilin-1が以下；
（１）配列番号２に記載の２３番目から５８９番目のアミノ酸を含むポリペプチド、
（２）配列番号２に記載の２３番目から８５７番目のアミノ酸を含むポリペプチド、
（３）（１）又は（２）に記載のポリペプチドを構成するアミノ酸配列のうち、１又はそれ以上のアミノ酸を欠失、付加、又は、置換したアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、Plexin-A1及びSema3Aとの結合活性を保持するポリペプチド、
（４）（１）又は（２）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列にハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、Plexin-A1及びSema3Aとの結合活性を有するポリペプチド、又は
（５）配列番号５に記載のポリヌクレオチド配列にハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、Plexin-A1及びSema3Aとの結合活性を有するポリペプチド、
を含むポリペプチドであることを特徴とする〔９〕記載の治療剤、
〔１１〕該物質が、可溶型Neuropilin-1誘導体であることを特徴とする〔１〕記載の治療剤、
〔１２〕可溶型Neuropilin-1誘導体が〔１０〕に記載された可溶型Neuropilin-1とFcとの融合ポリペプチドである〔１〕記載の治療剤、
〔１３〕Fcが、配列番号７、８、９、又は１０のいずれかに記載されたアミノ酸からなるポリペプチドを含むことを特徴とする〔１２〕に記載の治療剤、
〔１４〕可溶型Neuropilin-1誘導体が〔１０〕に記載された可溶型Neuropillin-1にポリエチレングリコール（PEG）鎖が付加されたポリペプチドである〔１〕記載の治療剤、
〔１５〕細胞性免疫疾患が、自己免疫疾患である〔１〕から〔１４〕に記載の治療剤、
〔１６〕自己免疫疾患が、器官特異的自己免疫疾患である〔１５〕に記載の治療剤、
〔１７〕器官特異的自己免疫疾患が、貧血（再生不良性貧血、溶血性貧血、自己免疫性溶血性貧血、突発性血小板減少症）、自己免疫性肝炎、虹彩毛様体炎、強膜炎、ブドウ膜炎、精巣炎、特発性血小板減少性紫斑病、バセドー病、橋本甲状腺炎、若年性糖尿病、炎症性腸疾患、アジソン病、脱髄性脳炎、又は、多発性硬化症である〔１６〕に記載の治療剤、
〔１８〕自己免疫疾患が、全身性自己免疫疾患である〔１５〕に記載の治療剤、
〔１９〕全身性自己免疫疾患が、アトピー性皮膚炎、慢性関節リウマチ等の関節炎、全身性エリテマトーデス、シェーグレン病、未分化結合組織症候群、抗リン脂質症候群、種々の形態の脈管炎（結節性多発性動脈炎、アレルギー性肉芽腫症及び血管炎）、ウェゲナー肉芽腫症、川崎病、過敏性血管炎、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、ベーチェット症候群、高安動脈炎、巨細胞性動脈炎、閉塞性血栓血管炎、リウマチ性多発性筋痛、本態性（混合型）クリオグロブリン血症、乾癬、尋常性乾癬及び乾癬性関節炎、好酸球増加症を伴う又は伴わない広汎性筋膜炎、再発性皮下脂肪組織炎、再発性多発性軟骨症、リンパ腫様肉芽腫症、結節性紅斑、強直性脊椎炎、ライター症候群、又は、種々の形態の炎症性皮膚炎である〔１８〕に記載の治療剤、
〔２０〕細胞性免疫疾患が、遅延型アレルギー疾患である〔１〕から〔１４〕に記載の治療剤、
〔２１〕遅延型アレルギー疾患が、接触性皮膚炎、金属皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、シェーグレン症候群、感染アレルギー、薬剤性肺炎、又は、ギラン・バレー症候群である〔２０〕に記載の治療剤、
〔２２〕下記の工程（a）、（b）、および（c）を含む細胞性免疫疾患治療剤のスクリーニング方法、
（a）被験物質の存在下で、Neuropilin-1の細胞外ドメインを有するポリペプチドとSema3Aポリペプチドとを接触させる工程、
（b）被験物質存在下におけるNeuropilin-1の細胞外ドメインを有するポリペプチドとSema3Aポリペプチドとの相互作用から生じるシグナルを測定し、被験物質非存在下でのNeuropilin-1の細胞外ドメインを有するポリペプチドとSema3Aポリペプチドとの相互作用から生じるシグナル（対照）と比較する工程、
（c）上記（b）の比較結果に基づいて、対照に比してシグナルを低下させる被験物質を選択する工程、
〔２３〕下記の工程（a）、（b）、および（c）を含む細胞性免疫疾患治療剤のスクリーニング方法、
（a）被験物質の存在下で、Neuropilin-1及びPlexin-A1を発現する真核細胞とSema3Aポリペプチドとを接触させる工程、
（b）被験物質存在下におけるNeuropilin-1及びPlexin-A1を発現する真核細胞とSema3Aポリペプチドとの相互作用から生じるシグナルを測定し、被験物質非存在下でのNeuropilin-1及びPlexin-A1を発現する真核細胞とSema3Aポリペプチドとの相互作用から生じるシグナル（対照）と比較する工程、
（c）上記（b）の比較結果に基づいて、対照に比してシグナルを低下させる被験物質を選択する工程、
〔２４〕該細胞が樹状細胞である〔２３〕記載の方法、
〔２５〕該樹状細胞が末梢血から分画されて誘導された細胞である〔２３〕又は〔２４〕記載の方法、
〔２６〕該樹状細胞が細胞株である〔２３〕又は〔２４〕記載の方法、
〔２７〕該シグナルがRhoキナーゼの活性化であることを特徴とする〔２３〕から〔２６〕に記載の方法、
〔２８〕該シグナルがmyosin-IIのリン酸化であることを特徴とする〔２３〕から〔２６〕に記載の方法、
〔２９〕該シグナルがアクトミオシンの収縮であることを特徴とする〔２３〕から〔２６〕に記載の方法、
〔３０〕該シグナルが該樹状細胞のtransmigrationであることを特徴とする〔２４〕から〔２６〕に記載の方法、
〔３１〕Neuropilin-1及びPlexin-A1を発現する樹状細胞内においてRhoキナーゼの活性化を阻害する方法であって、該方法はヒト樹状細胞表面に発現するNeuropilin-1とSema3Aとの結合を阻害することによる方法、
〔３２〕Neuropilin-1及びPlexin-A1を発現する樹状細胞内においてmyosin-IIのリン酸化を阻害する方法であって、該方法はヒト樹状細胞表面に発現するNeuropilin-1とSema3Aとの結合を阻害することによる方法、
〔３３〕Neuropilin-1及びPlexin-A1を発現する樹状細胞内においてアクトミオシンの収縮を阻害する方法であって、該方法はヒト樹状細胞表面において発現するNeuropilin-1とSema3Aとの結合を阻害することによる方法、
を提供するものである。【００１７】
別の観点においては、本発明は、Neuropilin-1/Plexin-A1ヘテロ受容体とSema3Aとの結合を阻害する物質を投与することにより細胞性免疫疾患を治療する方法を提供する。好ましくは、該物質は、Sema3A中和抗体、Neuropilin-1中和抗体、可溶型Neuropilin-1および可溶型Neuropilin-1誘導体からなる群より選択される。本発明の方法により治療しうる細胞性免疫疾患としては、貧血（再生不良性貧血、溶血性貧血、自己免疫性溶血性貧血、突発性血小板減少症）、自己免疫性肝炎、虹彩毛様体炎、強膜炎、ブドウ膜炎、精巣炎、特発性血小板減少性紫斑病、バセドー病、橋本甲状腺炎、若年性糖尿病、炎症性腸疾患、アジソン病、脱髄性脳炎、多発性硬化症、アトピー性皮膚炎、慢性関節リウマチ等の関節炎、全身性エリテマトーデス、シェーグレン病、未分化結合組織症候群、抗リン脂質症候群、種々の形態の脈管炎（結節性多発性動脈炎、アレルギー性肉芽腫症及び血管炎）、ウェゲナー肉芽腫症、川崎病、過敏性血管炎、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、ベーチェット症候群、高安動脈炎、巨細胞性動脈炎、閉塞性血栓血管炎、リウマチ性多発性筋痛、本態性（混合型）クリオグロブリン血症、乾癬、尋常性乾癬及び乾癬性関節炎、好酸球増加症を伴う又は伴わない広汎性筋膜炎、再発性皮下脂肪組織炎、再発性多発性軟骨症、リンパ腫様肉芽腫症、結節性紅斑、強直性脊椎炎、ライター症候群、又は、種々の形態の炎症性皮膚炎、接触性皮膚炎、金属皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、シェーグレン症候群、感染アレルギー、薬剤性肺炎、ギラン・バレー症候群が挙げられる。【００１８】
本発明のさらに別の観点においては、細胞性免疫疾患の治療剤として使用するための、Neuropilin-1/Plexin-A1ヘテロ受容体とSema3Aとの結合を阻害する物質が提供される。好ましくは、該物質は、Sema3A中和抗体、Neuropilin-1中和抗体、可溶型Neuropilin-1および可溶型Neuropilin-1誘導体からなる群より選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、樹状細胞移動におけるPlexin-A1の関与を示す。
【図２】図２は、Plexin-A1−／−樹状細胞のリンパ管を通過する能力の低下を示す。
【図３】図３は、樹状細胞輸送におけるSema3A−NP-1−Plexin-A1相互作用の関与を示す。
【図４】図４は、Sema3AによるＭＬＣのリン酸化の誘導およびアクトミオシン収縮促進を示す。
【図５】図５は、Plexin-A1−／−マウスにおける抗原特異的Ｔ細胞刺激の低下を示す。
【図６】図６は、Plexin-A1−／−樹状細胞における、ＦＩＴＣ−デキストランの取り込みおよびケモカインに対する応答を示す。
【図７】図７は、Plexin-A1−／−樹状細胞における、内皮細胞単層を通過する樹状細胞の活性低下を示す。
【図８】図８は、樹状細胞およびリンパ管内皮細胞におけるPlexin-A1およびその関連分子の発現プロファイルを示す。
【図９】図９は、Sema6D−／−マウスの作成手順を示す。
【図１０】図１０は、Sema3Aによるミオシン軽鎖のリン酸化の誘導を示す。
【図１１】図１１は、樹状細胞の接着活性およびＴＮＦαおよびｐｒｏ−ＭＭＰ９の分泌を示す。
【図１２】図１２は、Plexin-A1ノックアウトマウス由来の樹状細胞の遊走能を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下の定義は、本明細書において説明する本発明の理解を容易にするために提供される。
【００２１】
「抗体」または「抗体ペプチド」という用語は、完全長抗体（本明細書において「完全長免疫グロブリン」とも指称される）、または特異的結合について完全長抗体と競合するその結合断片を意味し、キメラ抗体、ヒト化抗体、及び、完全ヒト抗体が含まれる。特定の態様において、結合断片は、組換えDNA技術によって作製される。さらなる態様において、結合断片は、完全長抗体の酵素的切断または化学的切断によっても作製される。結合断片には、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、および単鎖抗体が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００２２】
「単離された抗体」という用語は、その天然環境の構成要素から、同定および分離され、かつ/または回収された抗体を意味する。その天然環境の混入物構成要素は、抗体の診断的使用および治療的使用を妨げると思われる材料であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク性溶質または非タンパク性溶質が含まれ得る。好ましい態様において、抗体は、（１）Lowry法によって決定した場合に、抗体の95重量％を上回るまで、および最も好ましくは99重量％を上回るまで、（２）スピニングカップ配列決定装置の使用によってN末端もしくは内部のアミノ酸配列の少なくとも15残基を得るのに十分な程度まで、または、（３）クーマシーブルー染色、もしくは好ましくは銀染色を用いる、還元条件もしくは非還元条件下でのSDS-PAGEによって、均質になるまで、精製される。単離された抗体には、組換え細胞内部のin  situの抗体が含まれ、これは、抗体の天然環境の少なくとも1種の構成要素が存在しないと考えられるためである。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも1つの精製段階によって調製される。
【００２３】
「変種」抗NP-1受容体抗体、又は、「変種」抗Sema3A抗体とは、本明細書において、「親」抗体配列中の1つまたは複数のアミノ酸残基の付加、欠失、および/または置換によって、親抗Neuropilin-1受容体抗体、又は、親抗Sema3A受容体抗体のアミノ酸配列とアミノ酸配列が異なる分子を意味する。好ましい態様において、変種は、親抗体の1つまたは複数の超可変領域中に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。例えば、変種は、親抗体の1つまたは複数の超可変領域中に、少なくとも1個、例えば、約1個〜約10個、および好ましくは、約2個〜約5個の置換を含んでよい。通常、変種は、親抗体の重鎖可変ドメイン配列または軽鎖可変ドメイン配列とのアミノ酸配列同一性が少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、および最も好ましくは少なくとも95％であるアミノ酸配列を有する。この配列に関する同一性または相同性は、本明細書において、配列を整列化し、必要な場合には、最大の配列同一性パーセントを実現するためにギャップを導入した後の、親抗体残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。抗体配列に対するN末端、C末端、または内部の伸長、欠失、または挿入のいずれも、配列の同一性または相同性に影響を及ぼすものとして解釈されない。変種は、Neuropilin-1受容体、又は、Sema3A受容体に結合する能力を保持し、かつ、好ましくは、親抗体の特性より優れた特性を有する。例えば、変種は、より強力な結合親和力を有し、Neuropilin-1受容体、又は、Sema3A受容体によって誘導される免疫細胞の刺激を阻害する能力が増強されている場合がある。本明細書において特に関心の対象とする変種抗体は、親抗体と比べた場合に、その生物活性が少なくとも約10倍、好ましくは少なくとも約20倍、および最も好ましくは少なくとも約50倍の増大を示すものである。
【００２４】
本明細書において使用される「親抗体」という用語は、変種の調製のために使用されるアミノ酸配列をもつ抗体を意味する。好ましくは、親抗体は、ヒトフレームワーク領域を有し、かつ、存在する場合には、ヒト抗体定常領域を有する。例えば、親抗体は、ヒト化抗体または完全ヒト抗体であってよい。
【００２５】
「受容体」という用語は、生物活性分子（「リガンド」）に結合し、かつ細胞上でのリガンドの作用を媒介する、細胞に関連したタンパク質、またはそのようなタンパク質のポリペプチドサブユニットを示すために、本明細書において使用される。「受容体ポリペプチド」という用語は、単離された機能的ドメイン（例えばリガンド結合ドメイン）を含む、完全な受容体ポリペプチド鎖およびその一部分を示すために使用される。
【００２６】
「モジュレーター」という用語は、標的とする分子の活性、活性化、または機能を調節する、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体断片、大分子、または小分子（10kD未満）を含む、任意の化合物を意味する。例えば、NP-1機能モジュレーター、NP-1/Pleaxin-A1ヘテロ二量体受容体機能モジュレーター、又は、Sema3A機能モジュレーターは、それぞれ樹状細胞におけるその発現や樹状細胞に対する接触によってNP-1、NP-1/Pleaxin-A1ヘテロ二量体受容体、又は、Sema3Aが樹状細胞に対して奏する機能を調節する。
【００２７】
「アンタゴニスト」という用語は、標的とする分子の活性、活性化、または機能を低減させる、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体断片、大分子、または小分子（10kD未満）を含む、任意の化合物を意味する。例えば、NP-1アンタゴニスト、NP-1/Pleaxin-A1ヘテロ二量体受容体アンタゴニスト、又は、Sema3Aアンタゴニストは、それぞれ樹状細胞におけるその発現や樹状細胞に対する接触によってNP-1、NP-1/Pleaxin-A1ヘテロ二量体受容体、又は、Sema3Aが樹状細胞に対して奏する機能の低下を引き起こす。該機能の具体的な例としては、樹状細胞中のRhoキナーゼの活性化阻害、樹状細胞中のmyosin-IIのリン酸化阻害、樹状細胞中のactomyosinの伸縮の阻害、樹状細胞のtransmigrationの阻害等が挙げられる。
【００２８】
「アゴニスト」という用語は、標的とする分子の活性、活性化、または機能を増強させる、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体断片、大分子、または小分子（10kD未満）を含む、任意の化合物を意味する。例えば、NP-1アゴニスト、NP-1/Pleaxin-A1ヘテロ二量体受容体アゴニスト、又は、Sema3Aアゴニストは、それぞれ樹状細胞におけるその発現や樹状細胞に対する接触によってNP-1、NP-1/Pleaxin-A1ヘテロ二量体受容体、又は、Sema3Aが樹状細胞に対して奏する機能の上昇を引き起こす。
【００２９】
「キメラ抗体（chimeric  antibody）」または「キメラ抗体（chimeric  antibodies）」という用語は、その軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子が、典型的には遺伝子工学によって、異なる種に属する免疫グロブリン可変領域遺伝子および定常領域遺伝子から構築されている抗体を意味する。例えば、マウスモノクローナル抗体由来の遺伝子の可変セグメントが、γ1およびγ3などのヒト定常セグメントに連結してキメラ抗体を得ることができる。したがって、典型的な治療用キメラ抗体は、マウス抗体由来の可変ドメインまたは抗原結合ドメインおよびヒト抗体由来の定常ドメインから構成されるハイブリッドタンパク質であるが、他の哺乳動物種を使用してもよい。
【００３０】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはT細胞受容体に特異的に結合することができる任意のタンパク質決定基を含む。エピトープの決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、かつ、通常、特定の三次元構造特徴、ならびに特定の電荷特性を有する。より具体的には、本明細書において使用される「NP-1エピトープ」、「NP-1/Pleaxin-A1ヘテロ二量体受容体エピトープ」又は「Sema3Aエピトープ」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、および最も好ましくはマウスまたはヒトにおいて抗原活性または免疫原活性を有するNP-1ポリペプチド、NP-1/Pleaxin-A1ヘテロ二量体受容体、又は、Sema3Aポリペプチドの一部分を意味する。免疫原活性を有するエピトープは、動物における抗体応答を誘発する、NP-1ポリペプチド、NP-1/Pleaxin-A1ヘテロ二量体受容体、又は、Sema3Aポリペプチドの一部分である。抗原活性を有するエピトープは、当技術分野において周知である任意の方法によって、例えばイムノアッセイ法によって決定されるように、抗体が免疫特異的に結合する、NP-1ポリペプチド、NP-1/Pleaxin-A1ヘテロ二量体受容体、又は、Sema3Aポリペプチドの一部分である。抗原エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。
【００３１】
「エピトープタグ付き」という用語は、本明細書において使用される場合、「エピトープタグ」に融合された抗NP-1抗体、抗NP-1/Pleaxin-A1ヘテロ二量体受容体抗体、又は、抗Sema3A抗体を意味する。エピトープタグポリペプチドは、それに対して抗体が産生され得るエピトープを提供するのに十分な残基を有するが、抗NP-1抗体、抗NP-1/Pleaxin-A1ヘテロ二量体受容体抗体、又は、抗Sema3A抗体の活性を妨げない程度に短い。エピトープタグは、好ましくは、十分に特有であり、したがって、それに対する抗体は他のエピトープと実質的に交叉反応しない。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも6個のアミノ酸残基を有し、かつ、通常、約8個〜50個の間のアミノ酸残基（好ましくは約9個〜30個の間の残基）を有する。例には、flu  HAタグポリペプチドおよびその抗体12CA5（Field  et  al.  Mol.  Cell.  Biol.（1988）8,  2159-2165）、c-mycタグならびにそれに対する8F9抗体、3C7抗体、6E10抗体、G4抗体、B7抗体、及び、9E10抗体（Evan  et  al.,  Mol.  Cell.  Biol.（1985）5(12),  3610-3616,  1985)、ならびに単純ヘルペス（Herpes  Simplex）ウイルス糖タンパク質D(gD)タグおよびその抗体（Paborsky  et  al.,  Protein  Engineering（1990）3(6),  547-553）が含まれる。特定の態様において、エピトープタグは、「サルベージ(salvage)受容体結合エピトープ」である。本明細書において使用される場合、「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語は、IgG分子のインビボでの血清半減期の延長に関与している、IgG分子（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4）のFc領域のエピトープを意味する。
【００３２】
本明細書において使用される「断片」という用語は、NP-1又はSema3Aポリペプチド、もしくは、NP-1又はSema3Aポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体のアミノ酸配列の少なくとも5個の連続したアミノ酸残基、少なくとも10個の連続したアミノ酸残基、少なくとも15個の連続したアミノ酸残基、少なくとも20個の連続したアミノ酸残基、少なくとも25個の連続したアミノ酸残基、少なくとも40個の連続したアミノ酸残基、少なくとも50個の連続したアミノ酸残基、少なくとも60個の連続したアミノ酸残基、少なくとも70個の連続したアミノ酸残基、少なくとも80個の連続したアミノ酸残基、少なくとも90個の連続したアミノ酸残基、少なくとも100個の連続したアミノ酸残基、少なくとも125個の連続したアミノ酸残基、少なくとも150個の連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを意味する。
【００３３】
本明細書において使用される場合、「免疫グロブリン」という用語は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされている一つまたは複数のポリペプチドからなるタンパク質を意味する。一つの型の免疫グロブリンは、抗体の基本構造単位を構成する。この型はテトラマーであり、免疫グロブリン鎖の二つの同一なペアからなり、各ペアは一つの軽鎖および一つの重鎖を有する。各ペアにおいて、軽鎖および重鎖の可変領域は、抗原への結合を一緒に担っており、かつ、定常領域は、抗体エフェクター機能を担っている。
【００３４】
完全長免疫グロブリンの「軽鎖」（約25Kdまたは214アミノ酸）は、NH2末端を可変領域遺伝子にコードされ（約110アミノ酸）、かつ、COOH末端をκまたはλ定常領域遺伝子にコードされている。完全長免疫グロブリンの「重鎖」（約50Kdまたは446アミノ酸）は、同様に、可変領域遺伝子（約116アミノ酸）、及び、前述の他の定常領域遺伝子のうち1つ（約330アミノ酸）にコードされている。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεに分類され、それぞれ、抗体のアイソタイプをIgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEと定義される。軽鎖および重鎖内部で、可変領域および定常領域は、約12個またはそれ以上のアミノ酸からなる「J」領域によって連結されており、重鎖は、約10個またはそれ以上のアミノ酸からなる「D」領域も含む（一般に、Fundamental  Immunology（Paul,  W.編,  第2版,  Raven  Press,  N.Y.,  1989）7章を参照せよ）。
【００３５】
免疫グロブリンの軽鎖または重鎖の可変領域は、3つの超可変領域が割り込んだ「フレームワーク」領域からなる。したがって、「超可変領域」という用語は、抗原結合を担っている、抗体のアミノ酸残基の領域を意味する。超可変領域は、「相補性決定領域」ないし「CDR」に由来するアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン中の残基24〜34（CDRL1）、50〜56（CDRL2）、及び、89〜97（CDRL3）、並びに、重鎖可変ドメイン中の残基31〜35（CDRH1）、50〜65（CDRH2）、及び、95〜102（H3））（Kabat  et  al.,  Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest,  第5版,  Public  Health  Service,  National  Institutes  of  Health,  Bethesda,  Md.（1991））、並びに/又は、「超可変ループ」に由来する残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン中の残基26〜32（CDR’L1）、50〜52（CDR’L2）、及び、91〜96（CDR’L3）、並びに、重鎖可変ドメイン中の残基26〜32（CDR’H1）、53〜55（CDR’H2）、及び、96〜101（CDR’H3）、ChothiaおよびLesk,  J.Mol.Biol.（1987）196,  901-917））を含む。「フレームワーク領域」または「FR」残基は、本明細書において定義する超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内では比較的保存されている。したがって、「ヒトフレームワーク領域」は、天然のヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域と実質的に（約85％またはそれ以上、通常90％〜95％またはそれ以上）同一であるフレームワーク領域である。抗体のフレームワーク領域は、免疫グロブリンの構成要素である軽鎖および重鎖の組み合わされたフレームワーク領域であり、CDRを配置し、かつ整列させるのに役立つ。CDRは、主として、抗原のエピトープへの結合を担っている。
【００３６】
「ヒト化」免疫グロブリンという用語は、ヒトフレームワーク領域および非ヒト（通常、マウスまたはラット）免疫グロブリン由来の一つまたは複数のCDRを含む免疫グロブリンを意味する。CDRを提供する非ヒト免疫グロブリンは、「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは、「アクセプター」と呼ばれる。定常領域は存在する必要がないが、存在する場合には、それらは、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、すなわち、少なくとも約85％〜90％、好ましくは約95％またはそれ以上同一でなければならない。したがって、ヒト化免疫グロブリンの部分はすべて、おそらくはCDRを除いて、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。「ヒト化抗体」は、ヒト化軽鎖免疫グロブリンおよびヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体である。例えば、ヒト化抗体は、例えば、キメラ抗体の可変領域全体が非ヒトであるため、上記に定義した典型的なキメラ抗体を包含しないと思われる。
【００３７】
本明細書において使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、かつ、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、または、例えば、米国特許第5,939,598号においてKucherlapatiらによって説明されているように、1種または複数種のヒト免疫グロブリンに関してトランスジェニックであり、かつ、内因性免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体を含む。
【００３８】
「遺伝的に改変された抗体」という用語は、アミノ酸配列がネイティブ抗体の配列から変更されている抗体を意味する。抗体を作製する際に組換えDNA技術が関連するため、天然抗体中に存在するアミノ酸の配列に限定される必要はない。所望の特徴を得るように抗体を再設計することができる。可能な変異は多数あり、例えば、ただ1つのアミノ酸または少数のアミノ酸の変更から、可変領域または定常領域の完全な再設計まで及ぶ。定常領域中の変更は、一般に、補体結合、膜との相互作用、および他のエフェクター機能などの特徴を改善または改変するために行われる。さらに、後述するように、IgG1型抗体のFcγ受容体への結合を低下させる修飾（WO99/58572）、IgG1型抗体の等電点を低下させ血中滞留性を向上させる修飾、その免疫原性を低下させる修飾、及び、そのFcRnへの結合を向上させる修飾（WO2009072604）、若しくは、IgG2型抗体のヘテロジェニティーを低下させる修飾、その免疫原性を低下させる修飾、及び、その酸性条件下での安定性を向上させる修飾、あるいは、IgG4型抗体のヘテロジェニティーを低下させる技術、そのFcγ受容体への結合性を低下させる修飾、及び、その酸性条件下での安定性を向上させる修飾が適宜実施され得る（WO2009041613）。可変領域中の変更は、抗原結合特性を改善するために行われる。
【００３９】
抗体の他に、免疫グロブリンは、例えば、単鎖またはFv、Fab、および(Fab')2、ならびにダイアボディ（diabody）、直鎖状抗体、多価性または多重特異性のハイブリッド抗体（前記およびLanzavecchia  et  al.,  Eur.  J.  Immunol.（1987）17,  105に詳細に説明されている）を含む、様々な他の形態で、かつ、単鎖で（例えば、Huston  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.（1988）85,  5879-5883、及び、Bird  et  al.,  Science（1988）242,  423-426)、存在し得る（Hood  et  al.,  「Immunology」,  Benjamin,  N.Y.,第2版（1984）、並びに、HunkapillerおよびHood,  Nature（1986）,  323,  15-16を参照せよ）。
【００４０】
本明細書において使用される場合、「単鎖Fv」、「単鎖抗体」、「Fv」、または「scFv」という用語は、単一のポリペプチド鎖内に、重鎖および軽鎖の両方に由来する可変領域を含むが、定常領域を欠いている抗体断片を意味する。一般に、単鎖抗体は、抗原結合を可能にすると思われる所望の構造を形成するのを可能にする、VHドメインとVLドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。単鎖抗体は、The  Pharmacology  of  Monoclonal  Antibodies,  113巻,  Rosenburg、及び、Moore編,  Springer-Verlag,  New  York,  269〜315頁（1994）においてPluckthunによって詳細に考察されている。同様に、国際特許出願公開WO88/01649および米国特許第4,946,778号および同第5,260,203号を参照せよ。特定の態様において、単鎖抗体はまた、二重特異性であるか、かつ/またはヒト化されていてよい。
【００４１】
「Fab断片」は、一本の軽鎖、ならびに一本の重鎖のCH1領域および可変領域から構成される。Fab分子の重鎖は、別の重鎖分子とのジスルフィド結合を形成できない。
【００４２】
「Fab''断片」は、一本の軽鎖、ならびに、鎖間のジスルフィド結合が2つの重鎖間で形成されて、F（ab'）2分子を形成できるように、CH1ドメインおよびCH2ドメイン間の定常領域のより多くの部分を含む一本の重鎖を含む。
【００４３】
「F（ab'）2断片」は、二本の軽鎖、ならびに、鎖間のジスルフィド結合が2つの重鎖間で形成されるようにCH1ドメインおよびCH2ドメイン間の定常領域の一部分を含む二本の重鎖を含む。
【００４４】
「ダイアボディ」という用語は、二つの抗原結合部位を有する小型の抗体断片を意味し、この断片は、同じポリペプチド鎖（VH-VL）中に軽鎖可変ドメイン（VL）に連結された重鎖可変ドメイン（VH）を含む。同じ鎖上の二つのドメイン間でのペア形成を起こさせないくらい短いリンカーを用いることによって、これらのドメインは、別の鎖の相補的ドメインとペアになり、かつ、2つの抗原結合部位を作り出すことを余儀なくされる。ダイアボディは、例えば、EP404,097、WO93/11161、およびHollinger  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA（1993）90,  6444-6448において、より十分に説明されている。
【００４５】
「直鎖状抗体」という用語は、Zapata  et  al.  Protein  Eng.（1995）8(10),  1057-1062において説明されている抗体を意味する。手短に言えば、これらの抗体は、一対の抗原結合領域を形成する、一対の直列型Fdセグメント（VH-CH1-VH-CH1）を含む。直鎖状抗体は、二重特異性または単一特異性であってよい。
【００４６】
本明細書において使用される「免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片」という用語は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変ドメインを少なくとも含むポリペプチド断片を意味する。本発明の免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片は、リガンドに結合すること、受容体へのリガンドの結合を防止すること、受容体へのリガンド結合に起因する生物学的応答を妨害すること、またはそれらの任意の組合せを行うことができる。好ましくは、本発明の免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片は、NP-1、NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体、又は、Sema3Aに特異的に結合する。
【００４７】
本明細書において使用される「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって作製される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、任意の真核生物クローン、原核生物クローン、またはファージクローンを含む、単一のクローンに由来する抗体を意味し、それを作製する方法を意味しない。
【００４８】
本発明はまた、前述の抗体に機能的に等価である、遺伝的に改変された抗体も含む。改善された安定性及び／又は治療的有効性を提供する修飾抗体が好ましい。修飾抗体の例には、アミノ酸残基の保存的置換、および、抗原結合の有用性を著しく改悪しない、アミノ酸の一つまたは複数の欠失または付加を含むものが含まれる。置換は、治療的有用性が維持される限り、一つまたは複数のアミノ酸残基の変更または修飾から、ある領域の完全な再設計まで及んでよい。本発明の抗体は、翻訳後に修飾されてよく（例えば、アセチル化およびリン酸化）、または、合成的に修飾されてもよい（例えば、標識基の結合）。
【００４９】
遺伝的に改変された抗体には、抗NP-1抗体、抗NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体抗体、又は、抗Sema3A抗体に由来するキメラ抗体も含まれる。好ましくは、キメラ抗体は、マウスまたはラットに由来する可変領域およびヒトに由来する定常領域を含み、したがって、キメラ抗体は、ヒト対象に投与された場合に、より長い半減期を有し、かつ、免疫原性はより少ない。キメラ抗体を作製する方法は、当技術分野において公知である。これらの抗体の可変領域をヒトIgGの定常領域と結合させて、所望のキメラ抗体を形成させることができる。
【００５０】
好ましくは、本発明において使用される遺伝的に改変された抗NP-1抗体、抗NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体抗体、又は、抗Sema3A抗体には、本明細書において説明する抗体のヒト化型が含まれる。特定の態様において、ヒト化抗体は、マウスドナー免疫グロブリンのCDR、ならびに、ヒトアクセプター免疫グロブリンの重鎖および軽鎖のフレームワークを含む。ヒト化抗体を作製する方法は、米国特許第5,301,101号、同第5,585,089号、同第5,693,762号、及び、同第6,180,370号において開示されている。次いで、これらの抗体のCDRを、当技術分野において公知である任意の選択されたヒトフレームワークにグラフティングして、所望のヒト化抗体を作製することができる。
【００５１】
本発明の抗体は、それらが認識するか、または特異的に結合する本発明のポリペプチドのエピトープまたは部分の観点から説明または特定することができる。エピトープまたはポリペプチド部分は、本明細書において説明されるように、例えば、N末端位置およびC末端位置によって、または、連続したアミノ酸残基のサイズによって、特定することができる。本発明の抗体はまた、交叉反応性の観点から説明または特定することもできる。本発明のポリペプチドの他のいかなる類似体、オルソログ、またはホモログにも結合しない抗体が含まれる。
【００５２】
エピトープビニング（binning）とは、NP-1受容体ポリペプチド、NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体、又は、Sema3Aポリペプチドに同時に結合できるか、又は、結合できない抗体のペアを同定し、それによって、該ポリペプチド又は該受容体上の同じエピトープまたは共通部分のあるエピトープに結合する抗体を同定するための競合的結合アッセイ法の使用を意味する。次いで、同じ結合特異性を有する抗体のファミリー（又はビン）を用いて、NP-1受容体ポリペプチド、NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体、又は、Sema3Aポリペプチド上の特異的なエピトープを定義することができる。エピトープビニング実験により、抗原的に異なるエピトープが存在するという証拠が提供される。しかしながら、それらは、それら自体によっては、NP-1受容体ポリペプチド、NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体、又は、Sema3Aポリペプチド上の特定のアミノ酸配列または位置を確認することも、エピトープをそれらに「位置づける」こともしない。
【００５３】
結合の際の競合は、任意のペアの抗体または断片に関して評価することができる。例えば、適切な検出試薬を用いて、任意の種／供給源に由来する抗体または結合断片の結合特異性を、本明細書において開示するモノクローナル抗体の結合特異性と比較することができる。エピトープビニングは、「単離された抗体」または細胞培養上清を用いて実施することができる。しばしば、ビニングは、その後に開発しようとするクローンの選択を導くために、最初の回のクローン上清を用いて実施される。比較しようとする抗体は、実質的に同種の抗原結合ドメインを有しているべきである。
【００５４】
本発明は、NP-１受容体特異的な抗体およびSema3Aリガンド特異的な抗体の両方を特徴とする。抗体の競合的結合の他に、エピトープビニングはまた、リガンド、及び、その受容体のビニングを競合的に妨げる受容体、又は、リガンドのいずれかに対する抗体、又は、その結合に対する阻害物質を同定するのに使用することもできる。しばしば、抗体のファミリー（又はビン）の有利な特性は、エピトープビンによって定義される特異的エピトープへの結合と関係付けることができる。
【００５５】
競合的結合実験は、結合親和力を直接的に測定しないが、試験される抗体は、競合相手として作用するのに十分に強く結合しなければならない。一般に、実験条件は、結合親和力の差異の影響を最小化するように設計される。
【００５６】
本発明の抗体は、当技術分野において公知である任意の方法によって、特異的結合に関して分析することができる。多くの異なる競合的結合アッセイ形式をエピトープビニングのために使用することができる。使用され得るイムノアッセイ法には、ほんの数例を挙げれば、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ法、ELISA（酵素結合免疫吸着測定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ法、免疫沈降アッセイ法、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ法、凝集アッセイ法、補体結合アッセイ法、イムノラジオメトリックアッセイ法、蛍光イムノアッセイ法、プロテインAイムノアッセイ法などの技術を用いた競合的アッセイ系および非競合的アッセイ系が含まれるが、それらに限定されるわけではない。このようなアッセイ法は日常的であり、かつ、当技術分野において周知である（例えば、Ausubel  et  al.編,  1994,  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  第1巻,  John  Wiley  &  Sons,  Inc.,  New  Yorkを参照せよ）。例示的なイムノアッセイ法は、下記に手短に説明する（ただし、限定するためのものではない）。さらに、Antibodies,  A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory,  Ed  Harlow及びDavid  Lane（1988）に記載されているもののような日常的な交叉ブロッキングアッセイ法も実施することができる。
【００５７】
Biacoreは、モノクローナル抗体のパネルをエピトープビニングするのに日常的に使用される様々なアッセイ形式のうちの1つにすぎない。多くの参考文献（例えば、The  Epitope  Mapping  Protocols,  Methods  in  Molecular  Biology,  第6.6巻  Glenn  E.Morris編）では、抗体をビニングするのに使用できると考えられ、かつ、NP-1受容体、NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体、又は、Sema3Aポリペプチドに対する抗体の結合特異性に関する同一の情報を提供すると予想される代替の方法を説明している。Biacoreシステムを使用する場合、エピトープビニング実験は、ネイティブな抗原を用いて実施される。エピトープビニング研究は、Biacore  1000（登録商標）システム（Biacore,  Uppsalla  Sweden）を用いて実施され得る。BIAlogue（登録商標）バージョン1.2ソフトウェアを、試験方法をプログラムするために好適に使用され得る。例えば、NP-1に対して産生させたマウスモノクローナル抗体をビニングするためにBiacoreを使用する例の場合、ポリクローナルヤギ抗マウスIgG  Fc抗体（Jackson  ImmunoResearch  Laboratories,  West  Grove,  PA）がBiacore（登録商標）CM5センサーチップに共有結合的に固定化され、かつ、試験系列のモノクローナル一次抗体をそのチップに結合（捕捉）するのに使用され得る。次いで、ポリクローナルIgG  Fc断片（Jackson  ImmunoResearch  Laboratories,  West  Grove,  PA）を用いて、チップ上の空いているFc結合部位がブロックされる。続いて、NP-1受容体が注入され、捕捉されたモノクローナル一次抗体に特異的に結合される。Biacore機器は、センサーチップに結合されたタンパク質の質量を測定し、かつ、一次抗体およびNP-1受容体抗原の両方の結合を各サイクルに関して確認することができる。一次抗体および抗原がチップに結合した後、可溶性の二次抗体が注入され、予め結合された抗原に結合される。モノクローナル二次抗体がモノクローナル一次抗体と同時にNP-1受容体抗原に結合できる場合、その結合は、Biacoreによって検出される。しかしながら、モノクローナル二次抗体がモノクローナル一次抗体と同時にNP-1受容体抗原に結合できない場合、さらなる結合は検出されない。各モノクローナル抗体を、陰性対照としてそれ自身に対して試験して、バックグラウンド（結合無し）シグナルのレベルが確かめられる。
【００５８】
非標識競合ELISA形式（LFC-ELISA）もまた、抗体をビニングするのに好適に使用され得る。この方法は、Nagata  et  al.,  J.  Immuno  Methods（2004）292,  141-155によって説明される。エピトープビニングのためのこの方法では、ビオチン標識したNP-1受容体、NP-1/Plaxin-A1ヘテロ二量体受容体、又は、Sema3Aポリペプチドが好適に使用され得る。NP-1受容体、NP-1/Plaxin-A1ヘテロ二量体受容体、又は、Sema3Aポリペプチドに対して産生させたマウスモノクローナル抗体をビニングする例の場合、ELISA  B（PBS,  0.1％  Tween  20,  1％  BSA）中で希釈した1μg/mLヤギ抗マウスIgG  Fc-γ特異的抗体（Jackson  ImmunoResearch）で、100μL/ウェルでマイクロタイタープレートがコーティングされる。周囲温度で3時間、このコーティング抗体が結合された後、モノクローナル抗体を含む各馴化培地をELISAバッファー中で希釈して抗体濃度が約0.5μg/mLに調製され、かつ、4℃で一晩、ヤギ抗マウスIgGでコーティングしたプレートに結合される（一次抗体）。平行して、馴化培地の第二のセット（二次抗体）がポリスチレン試験管中でELISAバッファー中約0.5μg/mLの抗体として希釈され、50ng/mLのビオチン標識された、と混合され、かつ、4℃で一晩インキュベートされる。一次抗体がコーティング抗体と共にインキュベーションされた後、無関係の抗体でプレートがブロックされ、プレート上の空いている結合部位が占有される。二次抗体−ビオチン−NP-1受容体、二次抗体−ビオチン−NP-1/Plaxin-A1ヘテロ二量体受容体、又は、二次抗体−ビオチン−Sema3Aポリペプチド混合物がプレートに添加され、結合される。アッセイ法における（非競合）の対照として、50ng/mLのビオチン標識された、NP-1受容体、NP-1/Plaxin-A1ヘテロ二量体受容体、又は、Sema3Aポリペプチド抗原が、（二次抗体とのプレインキュベーションを実施せずに）直接、固定化した一次抗体を含むウェルに添加される。ビオチン標識された、NP-1受容体、NP-1/Plaxin-A1ヘテロ二量体受容体、又は、Sema3Aポリペプチドの二次抗体複合体と共にインキュベーションされた後、ストレプトアビジン-HRP（Pierce,  Rockford,  IL）が0.5μg/mLでプレートに添加される。TMB基質（BioFX  Laboratories,  Owings  Mills,  MD）を用いてこれらのプレートが発色され、かつ、個々のウェルの450nmでの吸光度が、プレートリーダー（Molecular  Devices  SpectraMax（登録商標）340,  Sunnyvale,  CA）を用いて測定される。一次抗体が二次抗体とは異なるエピトープに結合する場合、ビオチン標識された、NP-1受容体、NP-1/Plaxin-A1ヘテロ二量体受容体、又は、Sema3Aポリペプチドの二次抗体複合体はプレートに結合して、吸光度の測定値は高くなると考えられる。一次抗体が二次抗体と同じエピトープに結合する場合、ビオチン標識されたNP-1受容体、NP-1/Plaxin-A1ヘテロ二量体受容体、又は、Sema3Aポリペプチドの二次抗体複合体はプレートに結合せず、吸光度の測定値は低くなると考えられる。
【００５９】
本発明の抗体は、NP-1受容体、又は、NP-1/Plaxin-A1ヘテロ二量体受容体のアンタゴニストとして作用する。例えば、本発明は、NP-1受容体、又は、NP-1/Plaxin-A1ヘテロ二量体受容体のSema3Aとの受容体／リガンド相互作用を部分的または完全に混乱させる抗体を含む。本発明は、受容体特異的な抗体を特徴とし、かつ本発明は、リガンド結合を防がないが、受容体の活性化を防ぐ受容体特異的な抗体をさらに特徴とする。受容体活性化（すなわち、シグナル伝達）は、本明細書において説明されるか、またはそうでなければ、当技術分野において公知の技術によって決定され得る。例えば、受容体活性化は、免疫沈降法とそれに続くウェスタンブロット解析により、受容体またはmyosin-II等のその基質のリン酸化（例えば、チロシンまたはセリン/スレオニン）を検出することによって好適に決定され得る。特定の態様において、抗体の不在下での活性の少なくとも90％、少なくとも80％、少なくとも70％、少なくとも60％、または少なくとも50％、リガンドまたは受容体活性を阻害する抗体が提供される。
【００６０】
本発明はまた、リガンド結合および受容体活性化の両方を妨げる受容体特異的抗体、ならびに受容体−リガンド複合体を認識する抗体も特徴とする。同様に、リガンドに結合し、かつ受容体へのリガンドの結合を妨げる中和抗体、ならびに、リガンドに結合し、それによって受容体の活性化を妨げるが、リガンドが受容体に結合するのを妨げはしない抗体も、本発明に含まれる。これらの抗体は、本明細書において開示する本発明のペプチドの特異的生物活性を含む生物活性に対するアンタゴニストとして指定され得る。
【００６１】
本発明はまた、NP-1/Plexin-A1ヘテロ受容体とSema3Aとの結合を調節するSema3Aの「機能モジュレーター」のスクリーニング方法を提供する。該スクリーニング方法により試験に供される被検物質は、前記のような抗NP-1抗体、抗NP-1/Plaxin-A1ヘテロ二量体受容体抗体、又は、抗Sema3A抗体のほか、有機又は無機化学物質、若しくは、生物学的分子、或いは、組成物が、適宜使用され得る。
【００６２】
さらに本発明は、NP-1/Plexin-A1ヘテロ受容体とSema3Aとの結合を調節するSema3Aの「機能モジュレーター」の設計方法、及び、当該モジュレーターを提供する。好適には、NP-1の細胞外ドメインのうちSema3Aとの結合に必要なドメインを含むポリペプチドを構成成分として含むSema3Aの機能モジュレーターが適宜設計され得る。NP-1の細胞外ドメインのうちSema3Aとの結合に必要なドメインを有するポリペプチドが該機能モジュレーターとして使用され得るが、該ポリペプチドから作成される誘導体も含まれる。
【００６３】
本発明の「誘導体」は、NP-1/Plexin-A1ヘテロ受容体とSema3Aとの結合を調節する機能を有する限り、生体内安定化のために後述する公知の修飾を施したものであってもよく、本明細書及び特許請求の範囲における「誘導体」という語は、文脈上そうでないことが明らかな場合を除き、生体内安定化のための修飾を施したものも包含する意味で用いられている。
【００６４】
本発明において記載される「ハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、ハイブリダイズする対象の特定のポリヌクレオチド配列の均等物をコードするポリヌクレオチドを意味し、当該均等物によってコードされるポリペプチドは、ハイブリダイズする対象の特定のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの均等物であることを意味する。よって、「ハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」が、中程度のストリンジェント条件下でハイブリダイズしないポリヌクレオチドであり得る。上記ハイブリダイゼーションの条件は、既報の条件を参考に設定することができる（Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  John  Wiley＆Sons,  6.3.1-6.3.6,  1999）。例えば、ハイストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションの条件としては、6×SSC（sodium  chloride/sodium  citrate）/45℃の後、0.2×SSC/0.1％SDS/50〜65℃での一回以上の洗浄が挙げられる。また、中程度のストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、2×SSC/30℃の後、1×SSC/0.1％SDS/30〜50℃での一回以上洗浄が挙げられる。
【００６５】
抗Neuropilin-1抗体、抗NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体抗体、及び抗Sema3A抗体の作製
NP-1（本明細書においては「NP-1受容体」とも指称され、これらの用語は同義である）、NP-1/Plexin-A1ポリペプチドのようなNP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体、又は、Sema3Aは、抗原内に含まれるエピトープ、ペプチド、またはポリペプチドに結合する抗体を調製するのに使用され得る。特に有用な抗NP-1抗体は、NP-1と「特異的に結合する」。また、特に有用な抗NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体抗体は、NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体と「特異的に結合する」。特に有用な抗Sema3A抗体は、Sema3Aと「特異的に結合する」。以下の2つの特性のうち少なくとも1つを示す場合、特異的に結合するとみなされる：（１）それらが、閾値レベルの結合活性を示す、および（２）それらが、関連するポリペプチド分子と有意に交叉反応しない。
【００６６】
前記の第一の特徴に関しては、結合の閾値レベルは、抗NP-1抗体、抗NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体抗体、又は、抗Sema3A抗体が、NP-1ポリペプチド、ペプチド、またはエピトープ、NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体ポリペプチド、ペプチド、またはエピトープ、又は、Sema3Aポリペプチド、ペプチド、またはエピトープと、対照ペプチドに対する結合親和力より少なくとも10倍大きな親和力でそれぞれ結合する場合に、決定される。これらの抗体が、106M-1またはそれ以上、好ましくは、107M-1またはそれ以上、より好ましくは108M-1またはそれ以上、および最も好ましくは109M-1またはそれ以上の結合親和力（Ka）を示すことが好ましい。抗体の結合親和力は、例えば、スキャッチャード解析（Scatchard,  G.,  Ann.NY  Acad.  Sci.（1949）51,  660-672）によって、当業者によって容易に決定され得る。
【００６７】
第二の特徴に関して、例えば、標準的なウェスタンブロット解析によって、抗体が、NP-1ポリペプチド、又は、Sema3Aポリペプチドのようなポリペプチドを検出できるが、他に現在のところ公知である関連ポリペプチドを検出できない場合、抗体は、関連ポリペプチド分子と有意に交叉反応しない。公知である関連ポリペプチドの例としては、公知のオルソログおよびパラログ、ならびにタンパク質ファミリーの類似した公知のメンバーなど、先行技術において開示されているものが含まれ得る。
【００６８】
スクリーニングは、非ヒトNP-1、又は、非ヒトNP-1/非ヒトPlexin-A1ヘテロ二量体受容体、若しくは、非ヒトSema3A、及び、ヒトNP-1、又は、ヒトNP-1/ヒトPlexin-A1ヘテロ二量体受容体、若しくは、ヒトSema3Aを用いて実施され得る。
【００６９】
さらに、抗体は、公知である関連ポリペプチドに対してスクリーニングすることによって、NP-1、又はSema3Aに特異的に結合する集団を単離することができる。例えば、NP-1、又はSema3Aに対して産生させた抗体は、不溶性マトリックスに接着された関連ポリペプチドに吸着される。NP-1、又は、Sema3Aに特異的な抗体は、適切な緩衝液条件下でマトリックスを通過すると考えられる。スクリーニングにより、公知である密接に関連したポリペプチドに交叉反応しないポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の単離が可能になる（Antibodies：A  Laboratory  Manual,  Harlow及びLane（編）,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  1988、Current  Protocols  in  Immunology,  Cooligan,  et  al.（編）,  National  Institutes  of  Health,  John  Wiley  and  Sons,  Inc.,  1995）。特異的抗体のスクリーニングおよび単離は、当技術分野において周知である。Fundamental  Immunology,  Paul（編）,  Raven  Press,  1993、Getzoff  et  al.,  Adv.  in  Immunol.（1988）43,  1-98、Monoclonal  Antibodies：Principles  and  Practice,  Goding,  J.W.（編）,  Academic  Press  Ltd.,  1996、Benjamin  et  al.,  Ann.  Rev.  Immunol.（1984）2,  67-101を参照せよ。特異的に結合する抗NP-1抗体、又は、抗Sema3A抗体は、当技術分野のものでありかつ下記に開示するいくつかの方法によって検出され得る。
【００７０】
NP-1、又は、NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体、若しくは、Sema3Aに類似した抗原性のNP-1、又は、NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体、若しくは、Sema3Aを含む抗原に対する抗体は、NP-1、又は、NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体、若しくは、Sema3Aに類似した抗原性のNP-1、又は、NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体、若しくは、Sema3Aを用いて作製することができる。これは、NP-1、又は、NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体、若しくは、Sema3Aに類似した抗原性のNP-1、又はNP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体、若しくは、Sema3Aを抗原（免疫原）として使用して、動物に接種し、かつ、その動物から免疫応答を誘発することによって実施され得る。当業者は、抗原性のエピトープを有するポリペプチドが、NP-1、又は、NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体、若しくは、Sema3A（例えば、SEQ  ID  NO：1、SEQ  ID  NO：2、SEQ  ID  NO：3）の少なくとも6個、好ましくは少なくとも9個、およびより好ましくは少なくとも15個〜約30個の連続したアミノ酸残基の配列を含むことを認識すると考えられる。NP-1、又は、NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体、若しくは、Sema3Aのより多くの部分を含むポリペプチド、すなわち、30〜100残基から最大でアミノ酸配列の全長を含むポリペプチドが含まれ得る。抗原または免疫原性エピトープは、本明細書において説明するように、結合されたタグ、アジュバント、および担体も好適に含まれ得る。適切な抗原は、NP-1を例として挙げれば、SEQ  ID  NO：2によってコードされるNP-1ポリペプチドのアミノ酸番号265（Leu）〜アミノ酸番号857（Ile）（SEQ  ID  NO：2）、またはその連続した9〜592アミノ酸長のアミノ酸断片を含む。抗原として使用するのに好ましいペプチドは、本明細書において開示する凝固因子V/VIIドメイン、MAMドメイン、及び、疎水性プロットから当業者が予測するもののようなNP-1親水性ペプチドであり、これは、例えば、6残基のスライディングウィンドウに基づくHopp/Woods親水性プロフィールから、埋もれたG残基、S残基、およびT残基ならびに露出したH残基、Y残基、およびW残基は無視して、決定され得る。例えば、DNASTAR  Proteanプログラム（DNASTAR,  Inc.,  Madison,  WI）を用いてJameson-Wolfプロットによって予測される抗原性エピトープを有するポリペプチドは、適切な抗原である。Sema3Aを例として挙げるならば、SEQ  ID  NO：1によってコードされるSema3Aポリペプチドのアミノ酸番号363（Asn）〜アミノ酸番号381（Cys）、又はその連続した9〜19アミノ酸長のアミノ酸断片を含む。このようなペプチドとしては、例えば、以下の配列：NYQWVPYQGRVPYPRPGTC（SEQ  ID  NO：12）を有するペプチドが好適に使用され得る。さらに、保存されているモチーフ、及び、NP-1又はSema3aの保存されているモチーフ間の可変領域は、適切な抗原である。適切な抗原には、Plexin-A1とは別の細胞外ドメイン、例えばVEGF受容体と組み合わせた、上記に開示したNP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体に類似するNP-1/VEGF受容体ヘテロ二量体受容体等のポリペプチドも含まれる。さらに、マウスNP-1ポリペプチドの対応する領域（265番残基（Leu）〜857番残基（Ile）（SEQ  ID  NO：11）を用いて、マウスNP-1に対する抗体が好適に作製され得る。さらに、この免疫応答から生成させた抗体は、本明細書において説明するように単離され、かつ精製され得る。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を調製および単離するた��の方法は、当技術分野において周知である。例えば、Current  Protocols  in  Immunology,  Cooligan,  et  al.（編）：National  Institutes  of  Health,  John  Wiley  and  Sons,  Inc.,  1995、Sambrook  et  al.,  Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual,  第2版,  Cold  Spring  Harbor,  NY,  1989、及びHurrell,  J.  G.  R.編、Monoclonal  Hybridoma  Antibodies：Techniques  and  Applications,  CRC  Press,  Inc.,  Boca  Raton,  FL,  1982.を参照せよ。
【００７１】
組換えNP-1を含むポリペプチド又は天然供給源から単離されたNP-1ポリペプチドに対するポリクローナル抗体、もしくは、組換えNP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体又は天然供給源から単離されたNP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体に対するポリクローナル抗体は、当業者に周知の方法を用いて調製され得る。組換えSema3Aを含むポリペプチド又は天然供給源から単離されたSema3Aポリペプチドに対するポリクローナル抗体も同様に、当業者に周知の方法を用いて調製され得る。例えば、Green  et  al.：「Production  of  Polyclonal  Antisera」,  Immunochemical  Protocols（Manson編）,  1〜5頁（Humana  Press  1992）、及びWilliams  et  al.：「Expression  of  foreign  proteins  in  E.  coli  using  plasmid  vectors  and  purification  of  specific  polyclonal  antibodies」,  DNA  Cloning  2：Expression  Systems,  第2版,  Glover  et  al.（編）,  15頁（Oxford  University  Press,  1995）を参照せよ。NP-1ポリペプチド、NP-１/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体、又は、Sema3Aポリペプチドの免疫原性は、ミョウバン（水酸化アルミニウム）またはフロイント完全アジュバントもしくはフロイント不完全アジュバントのようなアジュバントを用いて増大させ得る。免疫化のために有用なポリペプチドには、NP-1又はその一部分、若しくは、Sema3A又はその一部分と、免疫グロブリンポリペプチド又はマルトース結合タンパク質との融合物のような融合ポリペプチドも含まれる。ポリペプチド免疫原は、完全長分子またはその一部分でもあり得る。ポリペプチド部分が「ハプテン様」である場合、そのような部分は、免疫化のために、巨大分子担体（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）、ウシ血清アルブミン（BSA）、または破傷風トキソイドなど）に結合または連結させることが有利な場合がある。
【００７２】
ポリクローナル抗体は、典型的には、ウマ、雌ウシ、イヌ、ニワトリ、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ヤギ、またはヒツジなどの動物において産生させるが、本発明の抗NP-1抗体、抗NP-１/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体抗体、又は、抗体Sema3A抗体は、類人霊長類抗体に由来してもよい。診断的および治療的に有用な抗体をヒヒにおいて産生させるための一般的な技術は、例えば、Goldenbergらによる国際特許公報WO  91/11465およびLosman  et  al.,  Int.  J.  Cancer（1990）46,  310において見出し得る。
【００７３】
あるいは、抗NP-1モノクローナル抗体、抗NP-１/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体モノクローナル抗体、又は、抗Sema3Aモノクローナル抗体が作製され得る。特定の抗原に対するげっ歯動物モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法によって取得され得る（例えば、Kohler  et  al.,  Nature（1975）256,  495、Coligan  et  al.（編）,  Current  Protocols  in  Immunology,  第1巻,  2.5.1〜2.6.7頁（John  Wiley&Sons  1991）[“Coligan”]、Picksley  et  al.：「Production  of  monoclonal  antibodies  against  proteins  expressed  in  E.  coli.」,  DNA  Cloning  2：Expression  Systems,  第2版,  Glover  et  al.（編）,  93頁（Oxford  University  Press、1995）を参照せよ）。
【００７４】
手短にいえば、NP-1モノクローナル抗体、又は、Sema3Aモノクローナル抗体は、NP-1受容体、又は、Sema3Aを含む組成物がマウスに注射され、血清試料を採取することによって抗体産生の存在が確認され、脾臓を摘出してBリンパ球が得られ、Bリンパ球を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマが作製され、それらのハイブリドーマがクローン化され、抗原に対する抗体を産生する陽性クローンが選択され、抗原に対する抗体を産生するクローンが培養され、かつ、ハイブリドーマ培養物から抗体が単離されることによって、取得され得る。
【００７５】
さらに、本発明の抗NP-1抗体、抗NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体抗体、又は、Sema3A抗体は、ヒトモノクローナル抗体に由来され得る。ヒトモノクローナル抗体は、抗原の接種に応答して特異的なヒト抗体を産生するように操作されたトランスジェニックマウスから取得される。この技術にしたがえば、ヒト重鎖およびヒト軽鎖の遺伝子座のエレメントが、内因性の重鎖および軽鎖の遺伝子座の標的化された破壊を含む胚性幹細胞株に由来するマウスの系統に導入される。トランスジェニックマウスは、ヒト抗原に対して特異的なヒト抗体を合成することができ、かつ、これらのマウスを用いて、ヒト抗体を分泌するハイブリドーマが作製される。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、例えば、Green  et  al.,  Nature  Genet.（1994）7,  13、Lonberg  et  al.,  Nature（1994）368，856、及び、Taylor  et  al.,  Int.  Immun.（1994）6,  579によって説明されている。
【００７６】
モノクローナル抗体は、十分に確立された様々な技術によってハイブリドーマ培養物から単離および精製され得る。このような単離技術には、プロテイン-Aセファロースを用いたアフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが含まれる（例えば、前出Coligan,  2.7.1〜2.7.12頁及び2.9.1〜2.9.3頁、Baines  et  al.：「Purification  of  Immunoglobulin  G（IgG）」,  Methods  in  Molecular  Biology,  第10巻,  79〜104頁（The  Humana  Press,  Inc.  1992）を参照せよ）。
【００７７】
特定の用途の場合、抗NP-1抗体、抗NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体抗体、又は、Sema3A抗体の断片を調製することが望ましいことがときとして生じ得る。このような抗体断片は、例えば、抗体のタンパク分解性の加水分解によって取得され得る。抗体断片は、従来の方法による完全長抗体のペプシン消化またはパパイン消化によって取得され得る。例として、抗体断片は、F(ab')2と表される5S断片を提供するように、ペプシンで抗体を酵素的に切断することによって作製され得る。この断片をチオール還元剤によってさらに切断して、一価の3.5S  Fab'断片が作製され得る。任意で、ジスルフィド結合の切断に起因するスルフヒドリル基に対するブロック基を用いて、切断反応が実施され得る。代替の方法として、ペプシンを用いた酵素的切断では、一価のFab断片2つおよびFc断片1つが直接生じる。これらの方法は、例えば、Goldenbergの米国特許第4,331,647号、Nisonoff  et  al.,  Arch  Biochem.  Biophys.（1960）89,  230、  Porter,  Biochem.  J.（1959）73,  119、Edelman  et  al.,  Methods  in  Enzymology第1巻、422頁（Academic  Press  1967）及び前出Coligan、2.8.1〜2.8.10頁及び2.10〜2.10.4頁に記載されている。
【００７８】
一価の軽鎖−重鎖断片を形成するための重鎖の分離、断片のさらなる切断、または他の酵素的、化学的、もしくは遺伝的技術など抗体を切断する他の方法も、それらの断片が、完全な抗体によって認識される抗原に結合する限りにおいて、好適に使用され得る。
【００７９】
前記の例として、例えば、Fv断片は、VH鎖およびVL鎖の結合が含まれ得る。この結合は、Inbar  et  al.,  Proc.  Nat'l  Acad.  Sci.  USA（1972）69,  2659によって説明されているように、非共有結合性でもあり得る。あるいは、これらの可変鎖は、分子間のジスルフィド結合によって連結され得るか、またはグルタルアルデヒドなどの化学物質によって架橋され得る（例えば、Sandhu,  Crit.  Rev.  Biotech.（1992）12,  437を参照せよ）。
【００８０】
Fv断片は、ペプチドリンカーによって連結されたVH鎖およびVL鎖が含まれ得る。これら単鎖の抗原結合タンパク質（scFv）は、オリゴヌクレオチドによって連結されたVHドメインおよびVLドメインをコードするDNAを含む構造遺伝子を構築することによって調製される。構造遺伝子は、発現ベクター中に挿入され、続いて、このベクターは、大腸菌のような宿主細胞中に導入される。組換え宿主細胞は、2つのVドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単一のポリペプチド鎖を合成する。scFvを作製するための方法は、例えば、Whitlow  et  al.,  Methods：  A  Companion  to  Methods  in  Enzymology  2,  97（1991）によって説明されている（同様に、Bird  et  al.,  Science（1988）242,  423、Ladner  et  al.,  米国特許第4,946,778号、Pack  et  al.,  Bio/Technology（1993）11,  1271、及び、前出Sandhuも参照せよ）。
【００８１】
例として、scFVは、リンパ球がNP-1ポリペプチド、NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体、Sema3Aポリペプチドにインビトロで曝露され、かつ、（例えば、固定化または標識したNP-1ポリペプチド、NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体、Sema3Aポリペプチドの使用によって）ファージベクターまたは同様のベクター中の抗体ディスプレイライブラリーを選択することによって取得され得る。潜在的なNP-1結合性ポリペプチド、NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体結合性ポリペプチド、Sema3A結合性ポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージ上（ファージディスプレイ）または大腸菌のような細菌上にディスプレイされたランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって取得され得る。これらのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ランダム変異誘発およびランダムポリヌクレオチド合成によるなど、いくつかの方法で取得され得る。このようなランダムペプチドディスプレイライブラリーを作製及びスクリーニングするための技術は、当技術分野において公知であり（Ladner  et  al.,  米国特許第5,223,409号、Ladner  et  al.,  米国特許第4,946,778号、Ladner  et  al.,  米国特許第5,403,484号、Ladner  et  al.,  米国特許第5,571,698号、及び、Kay  et  al.,  Phage  Display  of  Peptides  and  Proteins（Academic  Press,  Inc.  1996））、かつ、このようなライブラリーをスクリーニングするためのランダムペプチドディスプレイライブラリーおよびキットは、例えば、CLONTECH  Laboratories,  Inc.（Palo  Alto,  CA）、Invitrogen  Inc.（San  Diego,  CA）、New  England  Biolabs,  Inc.（Beverly,  MA）、およびPharmacia  LKB  Biotechnology  Inc.（Piscataway,  NJ）から市販されている。本明細書において開示するNP-1ポリペプチドを含む配列を用いてランダムペプチドディスプレイライブラリーをスクリーニングして、NP-1ポリペプチド、NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体、Sema3Aポリペプチドに結合するポリペプチドが同定され得る。
【００８２】
抗体断片の別の形態は、1つの相補性決定領域（CDR）をコードするペプチドである。CDRペプチド（「最小認識単位」）は、関心対象の抗体のCDRをコードする遺伝子を構築することによって取得され得る。このような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法を用いて、抗体産生細胞のRNAから可変領域を合成することによって、調製され得る（例えば、Larrick  et  al.,  Methods：A  Companion  to  Methods  in  Enzymology（1991）2,  106、Courtenay-Luck,「Genetic  Manipulation  of  Monoclonal  Antibodies」,  Monoclonal  Antibodies：Production,  Engineering  and  Clinical  Application,  Ritter  et  al.（編）,  166頁（Cambridge  University  Press  1995）、及びWard  et  al.,  「Genetic  Manipulation  and  Expression  of  Antibodies」,  Monoclonal  Antibodies：Principles  and  Applications,  Birch  et  al.（編）,  137頁（Wiley-Liss,  Inc.  1995）を参照せよ）。
【００８３】
あるいは、抗NP-1抗体、抗NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体抗体、又は、抗Sema3A抗体は、「ヒト化」モノクローナル抗体が適宜使用され得る。ヒト化モノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変鎖に由来するマウスの相補性決定領域をヒト可変ドメイン中に導入することによって作製される。次いで、ヒト抗体の典型的な残基でマウス対応物のフレームワーク領域が置換される。ヒト化モノクローナル抗体に由来する抗体構成要素を使用することにより、マウスの定常領域の免疫原性に関連する潜在的な問題が回避される。マウスの免疫グロブリン可変ドメインをクローニングするための一般的技術は、例えば、Orlandi  et  al.,  Proc.  Nat'l  Acad.  Sci.  USA（1989）86,  3833によって説明されている。ヒト化モノクローナル抗体を作製するための技術は、例えば、Jones  et  al.,  Nature（1986）321,  522、Carter  et  al.,  Proc.  Nat'l  Acad.  Sci.  USA（1992）89,  4285、  Sandhu,  Crit.  Rev.  Biotech.（1992）12,  437、Singer  et  al.,  J.Immun.（1993）150,  2844、Sudhir（編）,  Antibody  Engineering  Protocols（Humana  Press,  Inc.  1995）、Kelley,「Engineering  Therapeutic  Antibodies」,  Protein  Engineering：Principles  and  Practice,  Cleland  et  al.（編）,  399〜434頁（John  Wiley  &  Sons,  Inc.  1996）及びQueen  et  al.,  米国特許第5,693,762号（1997）によって説明されている。
【００８４】
さらに、本発明の抗NP-1抗体、抗NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体抗体、又は、抗Sema3A抗体、若しくは、それらの抗体断片は、当技術分野のものであり、かつ本明細書において説明する方法を用いて、好適にPEG化され得る。
【００８５】
本発明の抗体には、修飾された、すなわち、抗体がNP-1ポリペプチド、NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体、又は、Sema3Aポリペプチドへの結合や受容体活性化の抑制を妨げないように、任意のタイプの分子が抗体に共有結合された誘導体が含まれる。例えば、限定されるわけではないが、前記の抗体誘導体には、例えば、公知の保護基/ブロック基、タンパク質分解切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質への連結などによるグリコシル化、アセチル化、ペグ化、ホスフィル化（phosphylation）、アミド化、誘導体化によって修飾された抗体が含まれる。限定されるわけではないが、特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などを含む公知の技術によって、多数の化学修飾のいずれかが実施され得る。さらに、誘導体は、一つまたは複数の非古典的なアミノ酸が含まれ得る。
【００８６】
Sema3A機能モジュレーターの機能スクリーニング
本発明者は、樹状細胞の所属リンパ節への移動に関与するPlexin-A1のヘテロ受容体の一方がNP-1であり、そのリガンドがSema3Aであること、そして、Sema3AリガンドとNP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体のリガンド受容体間複合体が形成されることにより、樹状細胞中においてRhoキナーゼによるmyosin-IIのリン酸化を介したアクトミオシン収縮が生じ、樹状細胞の移動が誘導されることを明らかにした。このように樹状細胞の移動に関与するPlexin-A1を含むヘテロ二量体受容体の他方の受容体がNP-1であること、及び、リガンドがSema3Aであることを明らかにしたことに伴い、NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体とSema3Aリガンドを利用して、所属リンパ節において樹状細胞により抗原を提示されて刺激された細胞傷害性T細胞やマクロファージ等をその素因とする細胞性免疫疾患の治療剤として使用され得るモジュレーターをスクリーニングすることが可能となった。
【００８７】
すなわち、本発明は、候補薬剤の存在下および不存在下において、Sema3Aポリペプチドを含む組成物および樹状細胞を接触させ；当該薬剤の存在および不存在下で樹状細胞のtransmigration、細胞内シグナルの変動を測定し；および、候補薬剤の存在対不存在下で、異なる測定結果に基づいて、樹状細胞に対するSema3A機能のモジュレーターとして候補薬剤を同定することを含む、樹状細胞のtransmigration、分化または活性化のSema3A機能のモジュレーターに関してスクリーニングする方法を提供する。
【００８８】
本発明が関連する実施態様において、本願発明は、NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体とSema3Aリガンドに関連するこれまでの説明において実質的に記載された、Sema3A機能のモジュレーターに関してスクリーニングする方法を提供する。実際にSema3A機能のモジュレーターに関するスクリーニングを行う方法は、Sema3Aポリペプチド又はその誘導体と被験物質とをin  vitroで接触させる方法と、当該被験物質をin  vivoで非ヒト動物に投与する方法とに大別できる。このうち、Sema3Aポリペプチド又はその誘導体と被験物質とをin  vitroで接触させることを特徴とする、本発明のSema3A機能のモジュレーターのスクリーニング方法として、以下の三つの方法が具体的に例示され得る。
【００８９】
１）NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体を発現する細胞を用いる方法
NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体を発現する細胞を用いて本発明のスクリーニングを行う手法としては、具体的には以下に例示される方法が挙げられる。すなわち、Sema3A機能のモジュレーターのうちアンタゴニストをスクリーニングする際には、まず前記の記載に従い、Sema3Aとアルカリフォスファターゼ（AP）との融合ポリペプチドSema3A-APを作製する。他方、NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体を細胞表面に発現した形質転換体を作製する。次にこの細胞に対して、（i）Sema3A-APを添加した場合、及び（ii）Sema3A-AP及び被験物質を添加した場合の当該Sema3A-APの細胞への結合性を、アルカリフォスファターゼ活性により検出する。（i）の場合と比較して（ii）の場合の方が、AP活性が低い、又は、検出されない場合は、その被験物質がSema3Aのアンタゴニストであることが示唆される。
【００９０】
さらに、本発明の他の実施態様によれば、NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体を発現する細胞として末梢血から分画して誘導された樹状細胞や、樹状細胞株が好適に用いられ得る。こうした樹状細胞としては、末梢血より分画した単核球をGM-CSFやIL-4と共に培養してin  vitroで調製された樹状細胞が使用され得る。末梢血からの樹状細胞のin  vitroでの調製方法は公知である（例えば、Eur  Cytokine  Netw.（1995）6(4),  245-52を参照せよ）。さらに本発明の他の実施態様によれば、JAWSII等（ATCC,  CRL-11904）のマウス由来の樹状細胞株も好適に使用され得る。
【００９１】
上記で、NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体に結合したSema3A-APのアルカリフォスファターゼ活性を検出する例のようにSema3AのNP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体発現細胞への結合性を検出する代わりに、NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体を発現する樹状細胞を用いた場合には、上記と同様の実験を行ない、NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体を発現する細胞にSema3Aを加えたときに観察される細胞の変化を被験物質が阻害することを指標にすることも可能である。ここで「細胞の変化」とは、Rhoキナーゼの活性化や細胞内のmyosin-IIのリン酸化、細胞の収縮やtransmigration機能等を指す。
【００９２】
またSema3Aのアゴニストをスクリーニングする際には、例えば、前記NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体を細胞表面に発現した形質転換体に対して、（i）Sema3A-APを添加した場合、及び（ii）被験物質を添加した場合や、Sema3A-APと被験物質とを添加した場合のNP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体発現細胞の変化、例えばRhoキナーゼの活性化や細胞内のmyosin-IIのリン酸化、細胞の収縮やtransmigration機能を比較する。（i）の場合と被験物質のみを添加した（ii）の場合で同じあるいは類似の細胞の変化が認められた場合、その被験物質がSema3Aのアゴニストであることが示される。また、被験物質の添加によってSema3A-APを添加した場合に見られるSema3Aの作用が増強された場合も、アゴニストであると考えられる。
【００９３】
上記のアゴニストをスクリーニングする際にも、NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体を細胞表面に発現した形質転換体のほか、前記の末梢血から分画して誘導された樹状細胞や、樹状細胞株が好適に用いられ得る。
【００９４】
具体的な検出方法としては、NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体の細胞外ドメインとSema3Aとの相互作用から生じるシグナルの有無を検出できる方法であれば特に制限されないが、前記のようにNP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体に対するSema3Aの結合性を指標とした場合の他、細胞のtransmigration機能の測定（後述の実施例も参照）や、細胞内のRhoキナーゼの活性化の検出、又は、細胞内のmyosin-IIのリン酸化の検出によっても、本発明のスクリーニングを行うことができる。
【００９５】
細胞内のRhoキナーゼの活性化の検出を指標にするスクリーニング方法としては、例えば、Cytoskelton社（Denver,  CO,  USA）が販売するキット（RhoA  G-LISA  Activation  Assay  colorimetric  format又はluminescence  format、若しくは、G-LISA  activation  assay  Biochem  Kit）が好適に使用され得る。また、myosin-IIのリン酸化を指標とするスクリーニング方法としては、NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体を発現する細胞を、二色の互いに異なる色素でラベルした抗MLC（myosin  light  chain）抗体と抗phospho-MLC抗体で染色しその画像をイメージアナライザーで取得し解析することによって実施され得る。こうした方法は、Biochem.Biophys.Res.Commun.（2008）374(2),  356-60に記載されている。
【００９６】
前記のアッセイは、高速大量処理スクリーニング（HTS）法として行われてもよい。HTSは、多数の化合物を連続的に試験する実験構成に関する。好ましくは、前記HTS構成が、マイクロプレート上で行われてもよく、部分的又は完全に自動化されていてもよく、またデータ保存、解析、及びバイオインフォマティクスを用いる解釈のために、コンピュータのような電子装置に接続されていてもよい。好ましくは、前記自動化が、多数のマイクロプレートを操作することができて１日あたり何千もの試験を行い得るロボットを含み得る。好ましくは、所望の調節機能又は阻害機能を示すことが知られている試験化合物も、ポジティブコントロールとしてアッセイに含まれるであろう。HTSという用語は、超高速大量処理スクリーニング形式（UHTS）も含む。好ましくは、前記UHTS形式が、384ウェル又は1536ウェルのマイクロプレート、マイクロリットル以下又はナノリットル以下のピペッター、改良型プレートリーダー及びエバポレーション処理の手段を用いて行われてもよい。HTS法は、例えば米国特許第5,876,946号及び第5,902,732号明細書に記載されている。本技術分野の専門家であれば、過度の試行錯誤を要することなく、上述の方法をHTS形式又はUHTS形式に適応させることができる。
【００９７】
２）NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体を発現させた細胞膜を用いる方法
前記のNP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体を細胞表面に発現する細胞の代わりにその細胞より調製された細胞膜を用いても、前記１）と同様の手法により、本発明のスクリーニングを行うことができる。この場合は、NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体に対する結合性が測定される。
【００９８】
３）単離精製されたNP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体の細胞外ドメインを有するタンパク質を用いる方法
先述の記載に基づき単離精製されたNP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体を用いても、本発明のスクリーニングを行うことができる。この場合も、NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体に対する結合性が測定される。
【００９９】
前記のようなスクリーニング方法によって、Sema3Aの機能モジュレーターがスクリーニングされ得るが、スクリーニングに供される被検物質としては、前記に既に述べた抗Neuropilin-1抗体、抗NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体抗体、及び抗Sema3A抗体が挙げられる。
【０１００】
神経軸索誘導に関与するSema3AとNP-1との相互作用試験において、Sema3AとNP-1との結合に重要なドメインがこれまでに明らかとされている。SEQ  ID  NO：2によってコードされるNP-1ポリペプチドのアミノ酸番号265（Leu）〜アミノ酸番号857（Ile）のポリペプチド断片を免疫源として得られたポリクローナル抗体が中和活性を示した（He  Z  et  al.,  Cell（1997）90,  739-51）ことから、NP-1ポリペプチドのアミノ酸番号265（Leu）〜アミノ酸番号857（Ile）からなるポリペプチドに結合する抗NP-1抗体から、Sema3Aの機能アンタゴニストが好適に取得され得る。
【０１０１】
また、SEQ  ID  NO：1によってコードされるSema3Aポリペプチドのアミノ酸番号363（Asn）〜アミノ酸番号381（Cys）のポリペプチドを免疫源として得られたポリクローナル抗体が中和活性を示した（Luo  Y  et  al.,Cell（1993）75,  217-27）ことから、Sema3Aポリペプチドのアミノ酸番号363（Asn）〜アミノ酸番号381（Cys）からなるポリペプチドに結合する抗Sema3A抗体から、Sema3Aの機能アンタゴニストが好適に取得され得る。
【０１０２】
前記のような抗Neuropilin-1抗体、抗NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体抗体、及び抗Sema3A抗体のほかに、スクリーニングに供される被検物質としては、有機又は無機化学物質、若しくは、生物学的分子、或いは、組成物である。最も好ましいモジュレーターは、治療剤として投与することができるものが求められるので、限定された毒性を持つ分子が好ましい。しかしながら、毒性は、引き続き行われる他のアッセイでスクリーニングすることができ、医薬化学者によって化合物から「設計排除」され得る。製薬会社にて伝統的に維持されている天然抽出物ライブラリー、化学ライブラリー、またはコンビナトーリアルライブラリー、ペプチドライブラリーなどを利用したスクリーニングが具体的に考えられる。
【０１０３】
Sema3A機能モジュレーターの設計
上記のスクリーニング方法のほか、可溶型Neuropilin-1（NP-1）、すなわち、NP-1の細胞外ドメインのうちSema3Aとの結合に必要なドメインを含むポリペプチドを構成成分として含むSema3Aの機能モジュレーターが適宜設計され得る。NP-1の細胞外ドメインのうちSema3Aとの結合に必要なドメインを有するポリペプチドが該機能モジュレーターとして使用され得るが、該ポリペプチドから作成される誘導体も含まれる。
【０１０４】
可溶型Neuropilin-1（NP-1）、すなわち、NP-1の細胞外ドメインのうちSema3Aとの結合に必要なドメインとしては、配列番号２に記載されるNP-1ポリペプチドのアミノ酸番号23（Arg）〜アミノ酸番号589（Thr）からなるポリペプチド、又は配列番号２に記載されるNP-1ポリペプチドのアミノ酸番号23（Arg）〜アミノ酸番号857（Ile）からなるポリペプチドが好適に挙げられる。また、上記のポリペプチドを構成するアミノ酸配列のうち、１又はそれ以上のアミノ酸を欠失、付加、又は、置換したアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、Plexin-A1及びSema3Aとの結合活性を保持するポリペプチドも本発明の目的に好適に使用され得る。Sema3Aとの結合活性を保持するために必要なアミノ酸残基、及び、そのような残基の特定方法は、例えば、Gu  C  et  al.,（2002）277(20),  18069-76等の引例に記載されており、該引例の情報に基づいて適宜設計され得る。
【０１０５】
そのほか、ポリペプチドの機能及び免疫学的同一性の置換は、（ａ）置換されるアミノ酸が隣接する領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖のサイズを維持しながら、それらの効果において実質的に異なる置換基を選択することにより達成される。天然発生残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（i）疎水性：ノルロイシン,  met,  ala,  val,  leu,  ile;
（ii）中性の親水性：cys,  ser,  thr;
（iii）酸性：asp,  glu;
（iv）塩基性：asn,  gln,  his,  lys,  arg;
（v）鎖配向に影響する残基：gly,  pro;  及び
（vi）芳香族：trp,  tyr,  phe。
【０１０６】
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とする。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、好ましくは残された（非保存）部位に導入され得る。変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びPCR突然変異誘発（Carter  et  al.,  Nucl.  Acids  Res.（1986）13,  4331、Zoller  et  al.,  Nucl.  Acids  Res.（1987）10,  6487、カセット突然変異誘発（Wells  et  al.,  Gene（1985）,  34,  315）、制限的選択突然変異誘発（Wells  et  al.,  Philos.  Trans.R.  Soc.  London  SerA（1986）317,  415）等のこの分野で周知の方法を用いて作成され、或いはクローニングしたDNAに対して他の知られた技術を実施して変異体DNAが作成され得る。
【０１０７】
また、本発明は、配列番号２に記載されるNP-1ポリペプチドのアミノ酸番号23（Arg）〜アミノ酸番号589（Thr）からなるポリペプチド、又は配列番号２に記載されるNP-1ポリペプチドのアミノ酸番号23（Arg）〜アミノ酸番号857（Ile）からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列にハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、Plexin-A1及びSema3Aとの結合活性を有するポリペプチドを提供する。
【０１０８】
該誘導体としては、生体内でのポリペプチドの安定性を高めるために、ポリペプチドに糖鎖やポリエチレングリコール（PEG）鎖が付加されたもの、ポリペプチドを構成するアミノ酸の少なくとも一部としてD体アミノ酸が用いられたもの、NP-1の細胞外ドメインのうちSema3Aとの結合に必要なドメインのアミノ末端、又は、カルボキシ末端に抗体の定常領域のうちFc配列がインフレームで融合された融合ポリペプチド等が好適に挙げられる。
【０１０９】
糖鎖やPEG鎖の付加により、又は、Fcとの融合ポリペプチドとすることにより、若しくは、ポリペプチドを構成するアミノ酸の少なくとも一部としてD体アミノ酸を用いることにより、NP-1の細胞外ドメインのうちSema3Aとの結合に必要なドメインを有するポリペプチドは生体内でのペプチダーゼによる分解を受けにくくなり、生体内におけるその半減期が長くなる。本発明の「誘導体」は、細胞性免疫疾患の治療又は予防活性を有する限り、生体内安定化のためのこれらの公知の修飾を施したものであってもよく、本明細書及び特許請求の範囲における「誘導体」という語は、文脈上そうでないことが明らかな場合を除き、生体内安定化のための修飾を施したものも包含する意味で用いられている。
【０１１０】
ポリペプチドに対する糖鎖付加は公知であり、例えば、Sato  M.  et  al.,  J  Am  Chem  Soc.（2004）,  126(43),  14013-22やSato  M.,  Angew  Chem  Int  Ed  Engl.（2004）,  43(12),  1516-20等に記載されている。糖鎖は、N末端、C末端、又は、それらの間のアミノ酸に結合可能であるが、ポリペプチドの活性を阻害しないためにN末端、又は、C末端に結合することが好ましい。また、付加する糖鎖の個数は、一個又は二個が好ましく、一個が好ましい。糖鎖は、単糖から四糖が好ましく、さらには二糖又は三糖が好ましい。糖鎖は、ポリペプチドの遊離のアミノ基又はカルボキシル基に直接又は例えば炭素数1〜10程度のメチレン鎖等のスペーサー構造を介して結合され得る。
【０１１１】
ポリペプチドに対するPEG鎖の付加も周知であり、例えば、Ulbricht  K  et  al.,  Clin  Nephrol.（2006）65(3),  180-90やDharap  SS  et  al.,  Proc  Natl  Acad  Sci  USA.（2005）,  102(36),  12962-7等に記載されている。PEG鎖は、N末端、C末端又はそれらの間のアミノ酸に結合可能であり、通常、一個又は二個のPEG鎖が、ポリペプチド上の遊離のアミノ基やカルボキシル基に結合される。PEG鎖の分子量は、特に限定されないが、通常3000〜7000程度、好ましくは5000程度のものが好適に用いられる。
【０１１２】
NP-1の細胞外ドメインのうちSema3Aとの結合に必要なドメインを含むポリペプチドと融合されるFcは、抗体の定常領域のうちトリプシン酵素による消化によって生じる重鎖部分を意味する。より具体的にはヒトに由来する抗体のFcの場合、配列番号７、８、９及び１０で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられるが、該アミノ酸配列に限定されるものではない。
【０１１３】
例えば、IgG1型抗体のFc配列のうち、EUナンバリングに基づくアミノ酸番号233、234、235、236、327、330及び／又は331のアミノ酸をIgG2型又はIgG4型の配列に置換することによって、該IgG1型抗体の特性をFcγ受容体に結合しないように修飾する技術が公知である（WO99/58572）。また、IgG1型抗体のFc配列中のアミノ酸残基を改変することによって、該抗体の等電点を低下させ血中滞留性を向上させる技術、その免疫原性を低下させる技術、及び、そのFcRnへの結合を向上させる技術もまた公知である（WO2009072604）。さらに、IgG2型抗体のFc配列中のアミノ酸残基を改変することによって、該IgG2抗体のヘテロジェニティーを低下させる技術、その免疫原性を低下させる技術、及び、その酸性条件下での安定性を向上させる技術や、IgG4型抗体のFc配列中のアミノ酸残基を改変することによって、該IgG4抗体のヘテロジェニティーを低下させる技術、そのFcγ受容体への結合性を低下させる技術、及び、その酸性条件下での安定性を向上させる技術が公知である（WO2009041613）。本発明において、可溶型Neuropilin-1誘導体には、可溶型Neuropilin-1と前記のような配列番号７、８、９及び１０で記載されるアミノ酸配列に前記のようなFcγ受容体への非結合、血中滞留性、免疫原性の低下、FcRnへの結合活性の向上、酸性条件下での安定性の向上等の特性を付与する改変が加えられた改変Fcとの融合ポリペプチドも含まれる。
【０１１４】
薬学的組成物
本発明はさらに、薬学的に許容される担体、および本明細書において説明するポリペプチドまたは抗体を含む薬学的組成物も含まれ得る。例えば、薬学的組成物は、所望の生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドが含まれ得る。このようなタンパク質には、例えば、アブリン、リシンA、シュードモナスエキソトキシン、もしくはジフテリア毒素などの毒素;腫瘍壊死因子、α-インターフェロン、β-インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、血栓性物質、もしくは抗血管新生物質、例えば、アンギオスタチンもしくはエンドスタチンなどのタンパク質、または、例えば、リンフォカイン、インターロイキン-1（「IL-1」）、インターロイキン-2（「IL-2」）、インターロイキン-4（「IL-4」）、インターロイキン-6（「IL-6」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「GM-CSF」）、顆粒球コロニー刺激因子（「G-CSF」）、もしくは他の増殖因子などの生体応答調節物質が含まれ得る。
【０１１５】
治療を目的として、本発明のポリペプチドまたは抗体および薬学的に許容される担体は、治療的有効量で患者に投与される。本発明の治療的分子と薬学的に許容される担体との組合せは、投与される量が生理学的に有意である場合、「治療的有効量」で投与されるといわれる。作用物質は、その存在により、受容者である患者の生理機能に検出可能な変化がもたらされる場合、生理学的に有意である。例えば、細胞性免疫疾患を治療するのに使用される作用物質は、その存在により、細胞性免疫疾患応答が軽減される場合、生理学的に有意である。
【０１１６】
本発明のポリペプチドまたは抗体を含む薬学的組成物は、液状形態で、エアロゾルで、または固形形態で提供され得る。液状形態の例は、注射液剤および経口懸濁剤である。例示的な固形形態には、カプセル剤、錠剤、および制御放出形態が含まれる。後者の形態の例は、ミニ浸透圧ポンプおよび埋め込み剤である（Bremer  et  al.,  Pharm.  Biotechnol.  （1997）10,  239,  Ranade：「Implants  in  Drug  Delivery」,  Drug  Delivery  Systems,  RanadeおよびHollinger（編），95〜123頁（CRC  Press  1995）、Bremer  et  al.：「Protein  Delivery  with  Infusion  Pumps」,  Protein  Delivery：Physical  Systems,  SandersおよびHendren（編），239〜254頁（Plenum  Press  1997）、Yewey  et  al.：「Delivery  of  Proteins  from  a  Controlled  Release  Injectable  Implant」,  Protein  Delivery：Physical  Systems,  SandersおよびHendren（編），93〜117頁（Plenum  Press  1997））。
【０１１７】
リポソームは、静脈内に、腹腔内に、くも膜下腔内に、筋肉内に、皮下に、または、経口投与、吸入、もしくは鼻腔内投与を介して、対象に治療的ポリペプチドを送達するための1つの手段を提供する。リポソームは、水溶性の区画を取り囲む1つまたは複数の脂質二重層からなる顕微鏡的小胞である（一般に、Bakker-Woudenberg  et  al.,  Eur.  J.  Clin.  Microbiol.  Infect.  Dis.  12（1993）（補遺1）：S61、Kim,  Drugs  （1993）46：618、およびRanade,  「Site-Specific  Drug  Delivery  Using  Liposomes  as  Carriers」,  Drug  Delivery  Systems,  RanadeおよびHollinger（編）,  3〜24頁（CRC  Press  1995）を参照されたい）。リポソームは、組成が細胞膜に類似しており、結果として、リポソームは安全に投与することができ、かつ生分解性である。調製方法によって、リポソームは、単層または多重層でよく、かつ、リポソームのサイズは様々でよく、直径は0.02μm〜10μm超の範囲である。様々な作用物質をリポソーム中に封入することができる。疎水性作用物質は二重層に分配し、親水性作用物質は内側の水溶性空間内に分配する（例えば、Machy  et  al.,  Liposomes  In  Cell  Biology  And  Pharmacology  （John  Libbey  1987）、およびOstro  et  al.,  American  J.  Hosp.  Pharm.  （1989）46：1576を参照されたい）。さらに、リポソームサイズ、二重層の数、脂質組成、ならびにリポソームの電荷および表面の特徴を変更することによって、封入された作用物質の治療的有効性を制御することも可能である。
【０１１８】
あるいは、抗体、抗体断片、炭水化物、ビタミン、および輸送タンパク質など様々なターゲティングリガンドをリポソームの表面に結合させることもできる。例えば、リポソームを分枝型のガラクトシル脂質誘導体で修飾して、肝臓細胞表面で専ら発現される、アシアロ糖タンパク質（ガラクトース）受容体を標的にさせることができる（Kato及びSugiyama,  Crit.  Rev.  Ther.  Drug  Carrier  Syst.（1997）14,  287、Murahashi  et  al.,  Biol.  Pharm.  Bull.（1997）20,  259）。同様に、Wu  et  al.,  Hepatology（1998）27,  772では、アシアロフェツインでリポソームを標識すると、リポソームの血漿半減期が短縮され、かつ、アシアロフェツイン標識リポソームの肝細胞による取込みが大幅に増強されたことが示された。一方で、分枝型ガラクトシル脂質誘導体を含むリポソームの肝臓蓄積は、アシアロフェツインを前もって注射することにより阻害され得る（Murahashi  et  al.,  Biol.  Pharm.  Bull.（1997）20,  259）。ポリアコニチル化ヒト血清アルブミンリポソームは、肝臓細胞にリポソームをターゲティングするための別のアプローチを提供する（Kamps  et  al.,  Proc.  Nat’l  Acad.  Sci.  USA（1997）94,  11681）。さらに、Gehoらの米国特許第4,603,044号では、肝臓の特殊な代謝細胞に関連した肝胆道受容体に対する特異性を有する、肝細胞を対象とするリポソーム小胞送達系を記載している。
【０１１９】
ポリペプチドおよび抗体は、タンパク質マイクロカプセル化の標準的技術を用いて、リポソーム内に封入され得る（例えば、Anderson  et  al.,  Infect.  Immun.（1981）31,  1099、Anderson  et  al.,  Cancer  Res.（1990）50,  1853、及びCohen  et  al.,  Biochim.  Biophys.  Acta（1991）1063,  95、Alving  et  al.：「Preparation  and  Use  of  Liposomes  in  Immunological  Studies」,  Liposome  Technology,  第2版,  第3巻,  Gregoriadis（編）,  317頁（CRC  Press  1993）、Wassef  et  al.,  Meth.  Enzymol.（1987）149,  124を参照されたい）。上記のように、治療的に有用なリポソームは、様々な構成要素を含んでよい。例えば、リポソームは、ポリ（エチレングリコール）の脂質誘導体を含んでよい（Allen  et  al.,  Biochim.  Biophys.  Acta（1993）1150,  9）。
【０１２０】
分解性ポリマーマイクロスフェアは、治療タンパク質の高い全身レベルを維持するために設計された。マイクロスフェアは、ポリ（ラクチド-co-グリコリド）（PLG）、ポリ無水物、ポリ（オルトエステル）、非生分解性酢酸エチルビニルポリマーなどの分解性ポリマーから調製され、その際、タンパク質はポリマー中に閉じ込められる（Gombotz及びPettit,  Bioconjugate  Chem.（1995）6,  332、Ranade：「Role  of  Polymers  in  Drug  Delivery」,  Drug  Delivery  Systems,  Ranade及びHollinger（編）,  51〜93頁（CRC  Press  1995）、Roskos及びMaskiewicz：「Degradable  Controlled  Release  Systems  Useful  for  Protein  Delivery」,  Protein  Delivery：Physical  Systems,  Sanders及びHendren（編）,  45〜92  頁（Plenum  Press  1997）、Bartus  et  al.,  Science（1998）  281,  1161、Putney及びBurke、Nature  Biotechnology（1998）16,  153、Putney,  Curr.  Opin.  Chem.  Biol.（1998）2,  548）。ポリエチレングリコール（PEG）でコーティングされたナノスフェアもまた、治療用タンパク質の静脈内投与のための担体を提供し得る（例えば、Gref  et  al.,  Pharm.  Biotechnol.（1997）10,  167を参照せよ）。
【０１２１】
他の剤形は、例えば、Ansel及びPopovich,  Pharmaceutical  Dosage  Forms  and  Drug  Delivery  Systems,  第5版（Lea&Febiger  1990）,  Gennaro（編）,  Remington's  Pharmaceutical  Sciences,  第19版（Mack  Publishing  Company  1995）により、かつ、Ranade及びHollinger,  Drug  Delivery  Systems（CRC  Press  1996）により示されているように、当業者によって考案され得る。
【０１２２】
薬学的組成物は、抗NP-1抗体、抗NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体抗体、及び抗Sema3A抗体、並びに、NP-1誘導体を含む容器を含むキットして供給され得る。治療的ポリペプチドは、単回投与もしくは複数回投与用の注射液剤の形態で、または、注射前に溶解される滅菌粉末として、提供され得る。あるいは、このようなキットは、治療的ポリペプチドを投与するための乾燥粉末分散装置、液体エアロゾル発生装置、またはネブライザーも含んでよい。このようなキットは、薬学的組成物の適応症および使用法に関する書面情報をさらに含んでよい。
【０１２３】
抗NP-1抗体、抗NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体抗体、及び抗Sema3A抗体、並びに、NP-1誘導体を含む薬学的組成物は、液状形態で、エアロゾルで、または固形形態で提供され得る。液状形態の例は、注射液剤、エアロゾル、液滴、トポロジー（topological）液剤、および経口懸濁剤である。例示的な固形形態には、カプセル剤、錠剤、および制御放出形態が含まれる。後者の形態の例は、ミニ浸透圧ポンプおよび埋め込み剤である（Bremer  et  al.,  Pharm.Biotechnol.（1997）10,  239、Ranade：「Implants  in  Drug  Delivery」,  Drug  Delivery  Systems、Ranade及びHollinger（編）,  95〜123頁（CRC  Press  1995）、Bremer  et  al.,「Protein  Delivery  with  Infusion  Pumps」,  Protein  Delivery：Physical  Systems、Sanders及びHendren（編）,  239〜254頁（Plenum  Press  1997）、Yewey  et  al.,「Delivery  of  Proteins  from  a  Controlled  Release  Injectable  Implant」,  Protein  Delivery：Physical  Systems、Sanders及びHendren（編）,  93〜117頁（Plenum  Press  1997））。他の固形形態には、クリーム剤、ペースト剤、および他のトポロジー適用などが含まれる。
【０１２４】
抗NP-1抗体、抗NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体抗体、及び抗Sema3A抗体、並びに、NP-1誘導体の治療的用途
抗NP-1抗体、抗NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体抗体、及び抗Sema3A抗体、並びに、NP-1誘導体は、NP-1、又は、NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体とSema3Aとの結合を阻害し、自己免疫疾患又はアレルギー疾患等の細胞性免疫疾患を治療、予防するのに有用であると考えられる。さらに、本発明の抗NP-1抗体、抗NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体抗体、及び抗Sema3A抗体、並びに、NP-1誘導体のアンタゴニスト活性および結合活性は、樹状細胞中におけるRhoキナーゼ活性測定法、Myosin-IIリン酸化測定法、アクトミオシンの収縮測定法、及び、樹状細胞のtransmigration測定法、並びに、本明細書において説明する他の生物学的アッセイ法において分析することもできる。
【０１２５】
抗NP-1抗体、抗NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体抗体、及び抗Sema3A抗体、並びに、NP-1誘導体の治療的有効量とは、対象に投与された場合に、疾患または障害に関連した症状または生物活性を予防、遅延、軽減、または阻害するのに有効である抗体の量を意味する。投与は、単回投与または複数回投与からなってよく、かつ、他の薬学的組成物と組み合わせて与えてもよい。
【０１２６】
自己免疫疾患
より詳細に述べるならば、器官特異自己免疫疾患には、いくつかの形態の貧血（再生不良性貧血、溶血性貧血、自己免疫性溶血性貧血、突発性血小板減少症）、自己免疫性肝炎、虹彩毛様体炎、強膜炎、ブドウ膜炎、精巣炎、特発性血小板減少性紫斑病、バセドー病、橋本甲状腺炎、膵臓のランゲルハンス島のβ細胞が破壊されることにより生じる若年性糖尿病、炎症性腸疾患、副腎皮質の破壊により生じるアジソン病、脱髄性脳炎、多発性硬化症等が含まれる。
【０１２７】
また、全身性自己免疫疾患には、アトピー性皮膚炎、慢性関節リウマチ等の関節炎、全身性エリテマトーデス（systemic  lupus  erythematosus、SLE）、シェーグレン病、未分化結合組織症候群、抗リン脂質症候群、種々の形態の脈管炎（結節性多発性動脈炎、アレルギー性肉芽腫症及び血管炎）、ウェゲナー肉芽腫症、川崎病、過敏性血管炎、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、ベーチェット症候群、高安動脈炎、巨細胞性動脈炎、閉塞性血栓血管炎、リウマチ性多発性筋痛、本態性（混合型）クリオグロブリン血症、乾癬、尋常性乾癬及び乾癬性関節炎、好酸球増加症を伴う又は伴わない広汎性筋膜炎、再発性皮下脂肪組織炎、再発性多発性軟骨症、リンパ腫様肉芽腫症、結節性紅斑、強直性脊椎炎、ライター症候群、種々の形態の炎症性皮膚炎が含まれる。
【０１２８】
より広範な障害の一覧には、望ましくない免疫応答及び炎症、肝線維症、肝硬変又は他の肝疾患、甲状腺炎又は他の腺疾患、糸球体腎炎又は他の腎臓及び泌尿器疾患、耳炎又は他の耳鼻咽頭疾患、皮膚炎又は他の皮膚疾患、歯周病又は他の歯性疾患、精巣炎又は精巣・精巣上体炎、不妊症、精巣外傷又は他の免疫関連精巣疾患、胎盤機能不全、胎盤不全、習慣性流産、子癇、子癇前症及び他の免疫及び／又は炎症関連婦人科疾患、後部ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、結膜炎、脈絡網膜炎、ブドウ膜網膜炎、視神経炎、眼内炎症、たとえば網膜炎又は類嚢胞黄斑水腫、交感性眼炎、強膜炎、色素性網膜炎、変性眼底疾患の免疫及び炎症性成分、中枢神経系（ＣＮＳ）又は他の器官における免疫及び／又は炎症抑制が有益である自己免疫疾患又は症状又は障害に伴う炎症、パーキンソン病、パーキンソン病治療の合併症及び／又は副作用、ＡＩＤＳ関連痴呆複合型ＨＩＶ関連脳症、デビック病、シドナム舞踏病、アルツハイマー病及び他のＣＮＳの変性疾患、症状、又は障害、脳梗塞の炎症性成分、ポリオ後症候群、精神障害の免疫及び炎症性成分、脊髄炎、脳炎、亜急性硬化性汎脳炎、脳脊髄炎、急性神経障害、亜急性神経障害、慢性神経障害、ギランバレー症候群、偽脳腫瘍、ダウン症候群、ハンティングトン病、筋萎縮性側索硬化症、ＣＮＳ圧迫症又はＣＮＳ外傷又はＣＮＳ感染の炎症性成分、筋萎縮又は筋ジストロフィーの炎症性成分、並びに中枢神経系及び末梢神経系の免疫及び炎症関連疾患、症状及び障害が含まれる。
【０１２９】
アレルギー疾患
本発明が提供するNeuropilin-1-Fc、NP-1中和抗体、Sema3A中和抗体等のNP-1とSema3Aとの結合阻害物質を使用するための組成物および方法が使用され得るアレルギー疾患として、遅延型（IV型ともいわれる）アレルギー疾患が挙げられる。遅延型（IV型ともいわれる）アレルギー疾患には、金属皮膚炎、接触性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、シェーグレン症候群、感染アレルギー、薬剤性肺炎、又は、ギラン・バレー症候群等が含まれる。
【０１３０】
接触性皮膚炎
アレルギー性接触性皮膚炎は、皮膚と接触する抗原に対するT細胞性免疫反応と定義される。アレルゲン依存性のT細胞応答が、CLA+細胞集団にほとんど限局されているため、CLA+T細胞集団は、皮膚炎の開始に関与していると考えられている（Santamaria-Babi,  L.F.,  et  al.,  J  Exp  Med（1995）181,  1935を参照せよ）。最近のデータでは、一般的な接触過敏症アレルゲンであるニッケルに応答して増殖し、かつ1型（IFN-γ）サイトカインおよび2型（IL-5）サイトカインの両者を産生するのは、メモリー（CD45RO+）CD4+CLA+T細胞のみであり、CD8+T細胞は該当しないことが判明した。さらに、CD4、CD45RO（メモリー）、またはCD69と組み合わせてCLAを発現する細胞は、ニッケル特異的な刺激の後に増加し、かつ、ケモカイン受容体CXCR3、CCR4、CCR10を発現するが、CCR6は発現しない。Moed  H.,  et  al.,  Br  J  Dermatol（2004）51,  32を参照せよ。
【０１３１】
動物モデルにおいて、アレルギー性接触性皮膚炎がT細胞依存性であること、およびアレルギー応答性T細胞が、アレルゲン適用部位に遊走することが実証された。一般に、Engeman  T.M.,  et  al.,  J  Immunol（2000）164,  5207、Feguson  T.A.及びKupper  T.S.  J  Immunol（1993）150,  1172並びにGorbachev  A.V.及びFairchild  R.L.  Crit  Rev  Immunol.（2001）21,  451を参照せよ。
【０１３２】
アトピー性皮膚炎
アトピー性皮膚炎（AD）は、この10年間の間に、発病率が劇的に増加した、慢性的に再発する炎症性皮膚疾患である。臨床的に、ADは、慢性的な再発性経過を示す、著しくそう痒性でしばしば擦りむけた斑および丘疹を特徴とする。ADの診断は、主として、主要な臨床所見および軽微な臨床所見に基づく。Hanifin  J.M.,  Arch  Dermatol（1999）135,  1551を参照せよ。組織病理学により、急性病変における海綿状態、過錯角化、および限局的な錯角化が明らかになるのに対し、過錯角化および錯角化、アカントシス/顆粒層肥厚、ならびにリンパ球および大量の肥満細胞による真皮の血管周囲浸潤を伴う著しい表皮過形成は、慢性病変の特徴である。
【０１３３】
T細胞は、組織における局所的免疫応答開始の中心的役割を果たし、かつ、証拠により、特に、皮膚浸潤性のT細胞が、皮膚における調節されていない免疫応答の開始および維持において重要な役割を果たし得ることが示唆されている。皮膚炎症部位中の浸潤性T細胞の約90％は、Eセレクチン、すなわち内皮上の誘導性接着分子に結合する、皮膚リンパ球関連Agを発現する（CLA+）（Santamaria-Babi  L.F.,  et  al.,  Eur  J  Dermatol（2004）14,  13を参照せよ）。対照個体と比較して有意な、AD患者における循環血中CLA+  T細胞の増加が実証されているのに対し（Teraki  Y.,  et  al.,  Br  J  Dermatol（2000）143,  373を参照せよ）、他の研究者らは、AD患者由来のCLA+メモリーT細胞が、CLA-集団と比較してアレルゲン抽出物に優先的に応答することを実証した（Santamaria-Babi,  L.F.,  et  al.,  J  Exp  Med.（1995）181,  1935を参照せよ）。ヒトにおいて、皮膚のアトピー性障害の病因は、IL-5  およびIL-13に類似したTh-2型サイトカインを高いレベルで発現するCLA+  T細胞の増加に関連付けられている。Akdis  M.,  et  al.,  Eur  J  Immunol（2000）30,  3533及びHamid  Q.,  et  al.,  J  Allergy  Clin  Immunol（1996）98,  225を参照せよ。
【０１３４】
NC/Ngaマウスは、約6週齢〜8週齢で、指定された病原体を有する（非SPF）条件で飼育した場合、臨床経過および臨床徴候、組織病理学および免疫病理学を含む多くの局面でヒトADに類似しているAD様病変を自然発症的に発症する。一方、SPF条件下で飼育されたNC/Ngaマウスは、皮膚病変を発症しない。しかしながら、自然発症的皮膚病変の発症および引っ掻き行動は、天然のままのチリダニ抗原を毎週皮内注射することによって、SPF施設で飼育されたNC/Ngaマウスにおいて同時発生させることができる。Matsuoka  H.,  et  al.,  Allergy（2003）58,  139を参照されたい。したがって、NC/NgaにおけるADの発症は、AD治療用の新規な治療物質を評価するための有用なモデルである。
【０１３５】
自然発症的ADのNC/Ngaモデルの他に、OVAを用いたマウス皮膚感作もまた、感作マウスの皮膚における単核浸潤物による抗原依存性の表皮肥厚および真皮肥厚を誘導するモデルとして使用することができる。これは、通常、全IgEおよび特定のIgEの血清レベルの上昇と同時に発生するが、皮膚バリアの機能不全もそう痒症も、このモデルにおいて普通は発生しない。Spergel  J.M.,  et  al.,  J  Clin  Invest（1998）101,  1614,を参照せよ。DO  11.10  OVA  TCRトランスジェニックマウスをOVAで感作することにより、皮膚バリアの調節不全およびそう痒症を誘導するために、このプロトコールを改良することができる。感作抗原を認識できる抗原特異的T細胞の数を増加させると、皮膚の炎症レベルが上昇して、可視的な引っ掻き行動および皮膚の苔癬化/落屑が誘導され得る。
【０１３６】
関節炎
変形関節炎、関節リウマチ、および傷害が原因で関節炎を起こした関節などを含む関節炎は、抗炎症性の抗体および結合ポリペプチドの治療的使用から利益を受けると思われる一般的な炎症性状態である。例えば、関節リウマチ（RA）は、身体全体に影響を及ぼす全身性疾患であり、関節炎の最も一般的な形態の一つである。これは、疼痛、こわばり、熱感、発赤、および腫脹を引き起こす、関節の内側を覆う膜の炎症を特徴とする。炎症細胞は、硬骨および軟骨を消化し得る酵素を放出する。関節リウマチの結果として、炎症を起こした関節の内層、すなわち滑膜は、硬骨および軟骨に侵入し、かつそれらを損傷して、他の生理的作用に混じって関節の劣化および重度の疼痛をもたらし得る。巻き込まれた関節は、その形状および配列を失って、疼痛および動作低下をもたらし得る。
【０１３７】
関節リウマチ（RA）は、重度の障害および死亡率の上昇を招く、炎症およびそれに続く組織損傷を特に特徴とする免疫介在性疾患である。様々なサイトカインが、リウマチ関節において局所的に産生される。多数の研究により、二種のプロトタイプの炎症誘発性サイトカインであるIL-1およびTNF-αが、滑膜炎症および進行性の関節破壊に関与するメカニズムにおいて重要な役割を果たしていることが実証された。実際、TNF-αおよびIL-1の阻害物質をRA患者に投与すると、炎症の臨床徴候および生物学的徴候が劇的に改善し、かつ、骨びらんおよび軟骨破壊の放射線医学的徴候が減少した。しかしながら、これらの有望な結果にもかかわらず、大きな比率の患者がこれらの作用物質に応答しないことから、他のメディエーターも関節炎の病態生理に関与していることが示唆されている（Gabay,  Expert.  Opin.  Biol.  Ther.（2002）2,  2,  135-149）。
【０１３８】
当技術分野において公知である、いくつかの関節リウマチ動物モデルがある。例えば、コラーゲン誘発関節炎（CIA）モデルでは、マウスは、ヒト関節リウマチによく似ている慢性の炎症性関節炎を発症する。CIAは、RAと同様の免疫学的特徴および病理学的特徴を有するため、これは、潜在的なヒト抗炎症性化合物をスクリーニングするための理想的なモデルになる。CIAモデルは、免疫応答および炎症応答の両方に依存する、周知のマウスモデルである。免疫応答は、抗原として与えられるコラーゲンに応答したB細胞およびCD4+T細胞の相互作用を含み、かつ、抗コラーゲン抗体の産生をもたらす。炎症期は、これらの抗体の一部がマウス固有のコラーゲンに交叉反応し、かつ補体カスケードを活性化した結果としての、炎症メディエーターに由来する組織応答の結果である。CIAモデルを使用する利点は、病因の基本的メカニズムが公知であるということである。II型コラーゲン上のT細胞およびB細胞関連エピトープが同定されており、かつ、免疫介在性関節炎に関係する様々な免疫学的パラメータ（例えば、遅延型過敏症および抗コラーゲン抗体）ならびに炎症性パラメータ（例えば、サイトカイン、ケモカイン、およびマトリックス分解酵素）が決定されており、したがって、CIAモデルにおける試験化合物の有効性を評価するのに使用することができる（Wooley,  Curr.  Opin.  Rheum.（1999）3,  407-20、Williams  et  al.,  Immunol.（1992）89,  9784-8、Myers  et  al.,  Life  Sci.（1997）61,  1861-78、及び、Wang  et  al.,  Immunol.（1995）92,  8955-9）。
【０１３９】
炎症性腸疾患  IBD
アメリカ合衆国では、約500,000人の人々が炎症性腸疾患（IBD）に罹患しており、この疾患は、結腸および直腸（潰瘍性結腸炎）、または小腸および大腸の両方（クローン病）のいずれかを冒し得る。これらの疾患の病因は不明であるが、これらは罹患組織の慢性的な炎症を伴う。潰瘍性結腸炎（UC）は、一般に結腸と呼ばれる大腸の炎症性疾患であり、結腸の粘膜または最も内側の壁の炎症および潰瘍を特徴とする。この炎症は、結腸の頻繁な排便を引き起こし、結果として下痢を生じる。症状には、ゆるい大便、ならびに付随する腹部の有痛性痙攣、発熱、および体重減少が含まれる。UCの正確な原因は不明であるが、最近の研究により、身体の天然の防御が、身体が異物であると考える身体中のタンパク質に対抗して作用すると示唆されている（「自己免疫反応」）。おそらく、これらのタンパク質が腸中の細菌タンパク質に似ているため、それらは、結腸の内壁を破壊し始める炎症プロセスを扇動または刺激する可能性がある。結腸の内壁が破壊される間に、潰瘍が形成して、粘液、膿、および血液を放出する。この疾患は、通常、直腸領域で始まり、最終的には大腸全体に拡大し得る。炎症のエピソードが繰り返されると、瘢痕組織によって腸および直腸の壁が肥厚する。結腸組織の死滅または敗血症が、重度の疾患と共に発生し得る。潰瘍性結腸炎の症状の重症度は様々であり、かつ、それらの発症は漸進的または急激であり得る。呼吸器感染症またはストレスを含む多くの因子によって、発病が引き起こされ得る。
【０１４０】
UCの有効な治療法は現在は無いが、治療は、結腸内壁における異常な炎症プロセスを抑制することに焦点を合わせられている。コルチコステロイド免疫抑制薬（例えば、アザチオプリン、メルカプトプリン、およびメトトレキサート）ならびにアミノサリチル酸を含む治療薬が、この疾患を治療するために利用可能である。しかしながら、コルチコステロイドおよびアザチオプリンなどの免疫抑制薬を長期間使用すると、骨の菲薄化、白内障、感染症、ならびに肝臓および骨髄に対する作用を含む、深刻な副作用をもたらし得る。現在の療法が成功していない患者においては、外科手術が選択肢である。外科手術は、結腸全体および直腸の除去を含む。
【０１４１】
慢性の潰瘍性結腸炎を部分的に再現することができるいくつかの動物モデルがある。最も広く使用されているモデルは、結腸中に慢性の炎症および潰瘍を誘発する2,4,6-トリニトロベンスルホン酸（trinitrobenesulfonic  acid）／エタノール（TNBS）誘発性結腸炎モデルである。直腸内への点滴注入によって感受性の高いマウスの結腸中にTNBSを導入すると、結腸の粘膜においてT細胞性免疫応答が誘導され、この場合、大腸壁全体にわたるT細胞およびマクロファージの密な浸潤を特徴とする広範囲の粘膜炎症が生じる。さらに、この組織病理学的な病像は、進行性の体重減少（衰弱）、血性下痢、直腸脱、および大腸壁肥厚の臨床像を伴う（Neurath  et  al.  Intern.  Rev.  Immunol.（2000）19,  51-62）。
【０１４２】
別の結腸炎モデルは、血性下痢、体重減少、結腸の短縮、および好中球浸潤を伴う粘膜潰瘍を発症する急性結腸炎を誘導するデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）を使用する。DSS誘発性結腸炎は、組織学的には、リンパ様過形成、限局的な陰窩損傷、および上皮潰瘍と共に、固有層中への炎症細胞の浸潤を特徴とする。これらの変化は、上皮に対するDSSの毒性作用に起因し、かつ、固有層細胞の食作用ならびにTNF-αおよびIFN-γの産生によって起こると考えられている。一般的に使用されているものの、ヒト疾患との関連性に関するDSSのメカニズムについてのいくつかの問題は、依然として解明されていない。SCIDマウスのようなT細胞欠損動物において観察されるため、DSSは、T細胞に依存しないモデルとみなされている。
【０１４３】
これらのTNBSモデル、DSSモデル、またはCD4導入モデルに対するNP-1とSema3Aとの結合阻害物質の投与はNP-1とSema3Aとの結合阻害物質の使用により、胃腸疾患の症状が改善され、かつそれらの経過が変化するかを評価するために使用することができる。
【０１４４】
乾癬
乾癬は、700万人を超えるアメリカ人に発症する慢性皮膚病態である。乾癬は、新しい皮膚細胞が異常に増殖した結果、古い皮膚が十分な速さで剥がれ落ちていない、炎症を起こし、隆起し、かつ鱗屑を有する皮膚部分を生じる場合に発生する。最も一般的な型である尋常性乾癬は、銀白の鱗屑で覆われた、皮膚の炎症部分（「病変」）を特徴とする。乾癬は、少数のプラークに限定されるか、または中程度から広範囲の皮膚領域を含む場合があり、頭皮、膝、肘、および胴に最も一般的に現れる。極めて目立つが、乾癬は、接触感染性疾患ではない。これらの疾患の病因は、罹患組織の慢性的な炎症に関係する。本発明のNP-1とSema3Aとの結合阻害物質は、乾癬、他の炎症性皮膚疾患、皮膚アレルギーおよび粘膜アレルギー、ならびに関連した疾患における炎症および病理学的作用を減少させる有益な治療物質としての機能を果たす可能性がある。
【０１４５】
乾癬は、多大な不快感を引き起こし得る、皮膚のT細胞性炎症性障害である。これは、治療法が無く、かつあらゆる年齢の人々に発症する疾患である。乾癬は、ヨーロッパ人および北米人の人口の約2％に発症する。軽度の乾癬に罹患している個体は、しばしば、局所剤を用いて疾患を制御することができるが、世界中の100万人を超える患者は、紫外線療法または全身的免疫抑制療法を必要とする。残念ながら、紫外線放射は不便でリスクがあり、かつ、多くの治療法は毒性があるため、長期の使用には制限がある。さらに、患者は、通常、乾癬を再発し、症例によっては、免疫抑制療法の中止後すぐに、元に戻る。NP-1とSema3Aとの結合阻害物質は、最近開発された、CD4+CD45RB導入モデルに基づく乾癬モデルを用いて試験することができる（Davenport  et  al.,  Internat.  Immunopharmacol.（2002）2,  653-672）。
【０１４６】
本明細書において説明する他の疾患モデルに加えて、ヒト乾癬病変に由来する炎症組織に対するNP-1とSema3Aとの結合阻害物質の活性は、重症複合免疫不全（SCID）マウスモデルを用いてインビボで測定することができる。ヒト細胞が免疫不全マウスに移植された、いくつかのマウスモデルが開発されている（まとめて、異種移植モデルと呼ばれる）。例えば、Cattan  AR,  Douglas  E,  Leuk.  Res.（1994）18,  513-22、及びFlavell,  DJ,  Hematological  Oncology（1996）14,  67-82を参照されたい。乾癬のインビボ異種移植モデルとして、ヒト乾癬皮膚組織をSCID  マウスモデルに移植し、かつ、適切なアンタゴニストを攻撃接種する。さらに、当技術分野における他の乾癬動物モデルも、NP-1とSema3Aとの結合阻害物質を評価するのに使用することができ、例えば、AGR129マウスモデルにヒト乾癬皮膚移植片を移植し、かつ、適切なアンタゴニストを攻撃接種する（例えば、Boyman,  O.  et  al.,  J.  Exp.  Med.（2004）199,  5,  731-736を参照せよ）。同様に、ヒト結腸炎、IBD、関節炎、または他の炎症性病変由来の組織または細胞をSCIDモデルにおいて使用して、本明細書において説明するNP-1とSema3Aとの結合阻害物質の抗炎症特性を評価することができる。
【０１４７】
治療の有効性は、当技術分野において周知の方法を用いて、処置集団における抗炎症作用の経時的な増大として測定され、かつ統計学的に評価される。いくつかの例示的な方法には、例えば、乾癬モデルにおいて、表皮の厚さ、真皮上層中の炎症細胞の数、および錯角化のグレードを測定することが含まれるが、それに限定されるわけではない。このような方法は当技術分野において公知であり、かつ本明細書において説明する。例えば、Zeigler,  M.  et  al.  Lab  Invest（2001）81,  1253、Zollner,  T.M.  et  al.  J.  Clin.  Invest.（2002）109,  671、Yamanaka,  N.  et  al.  Microbio.l  Immunol.（2001）45,  507、Raychaudhuri,  S.P.  et  al.  Br.  J.  Dermatol.（2001）144,  931、Boehncke,  W.  H  et  al.  Arch.  Dermatol.  Res.（1999）291,  104、Boehncke,  W.  H  et  al.,  J.  Invest.  Dermatol.（2001）116,  596、Nickoloff,  B.  J.  et  al.  Am.J.Pathol.（1995）146,  580、Boehncke,  W.H  et  al.（1997）J.Cutan.  Pathol.  24,  1、Sugai,  J.,  M.  et  al.  J.  Dermatol.  Sci.  （1998）17,  85、及び、Villadsen  L.S.  et  al.  J.  Clin.  Invest.（2003）112,  1571を参照せよ。また、フローサイトメトリー（又はPCR）のような周知の方法を用いて経時的に炎症をモニターして、試料中に存在する炎症細胞または損傷細胞の数、IBDに関するスコア（体重減少、下痢、直腸出血、結腸の長さ）、CIA  RAモデルの足疾患スコアおよび炎症スコアを定量することもできる。
【０１４８】
全身性エリテマトーデス
全身性エリテマトーデス（SLE）は、遍在する自己抗原を対象とする慢性的なIgG抗体（例えば抗dsDNA）産生を特徴とする、免疫複合体に関連した障害である。SLEの作用は、特定の器官に限局されるのではなく、全身性である。多数の染色体座位がこの疾患に関係付けられており、かつ、抗dsDNA抗体および糸球体腎炎など、疾患の様々な局面をもたらしている可能性がある。CD4+T細胞は、SLEのマウスモデルにおいて活動的な役割を果たすことが示されている（Horwitz,  Lupus（2001）10,  319-20、Yellin及びThienel,  Curr.  Rheumatol.  Rep.（2000）2,  24-37）。CD8+T細胞の役割は、明瞭に定義されていないが、狼瘡患者において「サプレッサー」CD8+T細胞機能が障害されていることを示唆する証拠がある（Filaci  et  al.,  J.  Immunol.（2001）  166,  6452-7、Sakane  et  al,  J.  Immunol.（1986）137,  3809-13）。
【０１４９】
本明細書において用いる場合、「・・・を含む（comprising）」との表現により表される態様は、「本質的に・・・からなる（essentially  consisting  of）」との表現により表される態様、ならびに「・・・からなる（consisting  of）」との表現により表される態様を包含する。
【０１５０】
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書に参照として取り込まれる。
【０１５１】
本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、下記の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１５２】
＜実施例１＞
方法
マウス
Ｃ５７ＢＬ／６をバックグラウンドとするＰｌｅｘｉｎ−Ａ１−／−，Ｓｅｍａ３Ｋ−／−，Ｓｅｍａ６ｃ−／−およびNP-1ノックインマウスは、先に樹立されたものである。ＯＴ−ＩＩＴｇマウスはＷ．Ｒ．Ｈｅａｔｈ氏より提供された。【０１５３】
Sema6D−／−に関しては，開始コドンをもつ第２エクソンおよび第３エクソンを含む０．６ｋｂｐのフラグメントをｎｅｏ耐性カセットで置き換え，ランダムインテグレーションからターゲティングベクターを選択するためにヘルペス単純ウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＹ−ＴＫ）遺伝子を挿入した。直鎖状にしたターゲティングプラスミドＤＮＡをエレクトロポレーションにより胚性幹（ＥＳ）細胞にトランスフェクションした。Ｇ４１８とガンシクロビルで二重選択した後、３２０個の耐性クローンをＰＣＲおよびサザンブロット分析によりSema6Dアレルの相同組換えについてスクリーニングした。サザンブロット分析のためには、野生型およびSema6D−標的ＥＳ細胞からゲノムＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行った。ＤＮＡは、製造元のプロトコルにしたがって、ナイロンブロッティング膜（ＨｙｂｏｎｄＮ）に移した。フィルターを放射性標識プローブで一晩ハイブリダイズさせた。次にフィルターを０．１％ＳＤＳを含む０．１ｘＳＳＣで６５℃で１時間洗浄した後、オートラジオグラフィーを行った。相同組換えをもつ３個のクローンを同定し、単離した。３つの独立したSema6D変異体クローンからのＥＳ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの胚盤胞に別々に注入した。胚盤胞を偽妊娠ＩＣＲ代理母に移し、次にキメラ雄をＣ５７ＢＬ／６またはＢＡＬＢ／ｃ雌と戻し交配させた。ヘテロ接合体マウスを交尾させてホモ接合体を生成した。免疫学的分析のためには、ホモ接合体マウスをＣ５７ＢＬ／６またはＢＡＬＢ／ｃマウスと８世代以上戻し交配させた。Sema6D標的アレルの生殖細胞系伝達およびジェノタイプは、サザンブロッティングおよびＰＣＲ分析によりさらに評価した。ＰＣＲは、プライマー（５’−ａｃａａａｃｇａｇａａａｃｃａｇｔｔｔｃａｃｃ−３’）（SEQ  ID  NO:13）および（５’−ｃｃａｇｃａａｔａｔａａａｇｔｇｔｇｔｃｔｃｇ−３’）（SEQ  ID  NO:14）を用いて、９４℃で６０秒間、６０℃で６０秒間、７２℃で６０秒間を３５サイクルで行った。【０１５４】
ＲＴ−ＰＣＲ分析用には、ＲＮｅａｓｙｋｉｔｓ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて脾臓からＲＮＡを単離し、ＤＮａｓｅＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理して、ゲノムＤＮＡを除いた。ｃＤＮＡｓはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて合成し、ＲＴ−ＰＣＲは、プライマー（５’−ｃａａｔａｔｃｃｇｇｔｔｔｔｔａｇａｇｇａｃｇｃｃ−３’）（SEQ  ID  NO:15）および（５’−ｃｃｔｇｃｔｇｔｃｔｇｇａｃｃｔｃｃａｃｇｔｃａｇ−３’）（SEQ  ID  NO:16）を用いて、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を３５サイクルで行った。マウスは特別の無菌環境下で維持し、８−１２週齢で使用した。すべての実験手順は我々の組織のガイドラインにしたがった。【０１５５】
細胞培養
骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）は、先に記載したようにして、骨髄細胞をＧＭ−ＣＳＦとともに６から８日間培養することにより生成した。ＳＶＥＣ４−１０（マウスリンパ管内皮細胞株、ＡＴＣＣより）を１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で培養した。ヒトリンパ管微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ−ｄＬｙ，Ｌｏｎｚａ）は、ＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＣｅｌｌＭｅｄｉｕｍＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（Ｌｏｎｚａ）中で培養した。【０１５６】
抗体、試薬および蛍光染料
以下の試薬を用いた：ＬＰＳ，オキサゾロン（Ｏｘａｚｏｌｏｎｅ）（４−エトキシメチレン−２フェニル−２−オキサゾリン−５−オン），ＦＩＴＣ−アイソマー，ブレビスタチン（Ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ），ＭＬ−７（Ｓｉｇｍａ），Ｙ−２７６３２（Ｃａｒｂｉｏｃｈｅｍ），コラゲナーゼ−Ｄ（Ｒｏｃｈｅ），カルセイン−ＡＭ，ＣＦＳＥ（５−（および−６）−カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル），ＣＭＦＤＡ（５−クロロメチルフルオレセインジアセテート），ＣＭＴＭＲ（５−（および−６）−（（（４−クロロメチル）ベンゾイル）アミノ）テトラメチルローダミン），ファロイジン−４８８，ファロイジン−５４６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），組換えヒトSema3A−Ｆｃ，マウスＧＭ−ＣＳＦ，マウスＣＣＬ１９，マウスＣＣＬ２１（Ｒ＆Ｄ），マウスＣＸＣＬ１２，マウスＴＮＦα（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）およびマウスＣＤ４０（ＨＭ４０−３）（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。免疫組織化学実験には以下の抗体を用いた：ウサギ抗−ＭＬＣ，ウサギ抗リン酸化ＭＬＣ（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），マウス抗−Ｂ−アクチン（Ｓｉｇｍａ），ウサギ抗Plexin-A1（ＹｏｓｈｉｄａＹより譲渡），ビオチン化抗マウスＬＹＶＥ−１（Ｒ＆Ｄ），Ｃｙ３−抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ），ＥＣＬ−抗ウサギＩｇＧ−ＰＯＤ，ＥＣＬ−抗マウスＩｇＧ−ＰＯＤ，ストレプトアビジン−ＰＯＤ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）。フローサイトメトリ用には、ＦＩＴＣ／ＡＰＣ−抗−ＣＤ４（ＧＫ１．５）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ），ＡＰＣ−Ｃｙ７−抗−ＣＤ８ａ（５３−６．７），ＰＥ−抗−Ｂ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２），ＦＩＴＣ／ＡＰＣ−抗−ＣＤ１１ｃ（ＨＬ３），ＦＩＴＣ／ＰＥ−抗−Ｉ−Ａｂ（２５−９−１７），（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ），Ａｌｅｘａ６４７−抗−ＣＣＲ７（４ＢＩ２）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ），Ａｌｅｘａ６４７−抗ＣＸＣＲ４，抗−マウスＣＤ４９ａ（ＨＡ３１／８），抗−マウスＣＤ４９ｅ（５Ｈ１０−２７）（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ），抗−マウスＣＤ１１ａ（Ｍ１７／４），抗−マウスＣＤ５１（ＲＭＶ−７）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ），抗−マウスＶＬＡ−ｌ（ＭＡＢ１９９７）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ），抗−マウスＣＤ１８（Ｍ１８／２）および抗−マウスＣＤ６１（２Ｃ９，Ｇ２）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を細胞染色に用いた。抗Sema6DｍＡｂ（ｎａｔｓｕｃｌｏｎｅ）は、Sema6D欠損マウスを組換えSema6D−Ｆｃ蛋白質で免疫することにより樹立した。【０１５７】
抗原特異的Ｔ細胞の増殖性応答のインビボでのモニタリング
ＣＦＳＥ−希釈アッセイ用には、ＯＴ−ＩＩマウスから単離したＣＤ４＋Ｔ細胞をＣＦＳＥで標識した（ＬｙｏｎｓａｎｄＰａｒｉｃｈ，Ｊ．ＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ１９９４）。簡単には、１０７個／ｍｌの細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中１μＭのＣＦＳＥとともに１０分間インキュベーションした。２ｘ１０６個の細胞をレシピエントマウスの静脈内に移入した。２時間後、完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）中のＯＶＡ（ＧｒａｄｅＶＩ，Ｓｉｇｍａ）を後足蹠の皮下に注射してマウスを免疫した。マウスは７２時間後に犠牲死させた。流入領域リンパ節における抗原特異的Ｔ細胞の増殖性応答は、フローサイトメトリにより分析し、これはＣＦＳＥ蛍光強度の希釈により示した。【０１５８】
Ｔ細胞刺激（ｐｒｉｍｉｎｇ）用には、ＣＦＡ中の１００ｕｇのキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を後足蹠に注射することによりマウスを免疫した。免疫の５日後、流入領域リンパ節から単離したＣＤ４＋Ｔ−細胞を種々の濃度のＫＬＨで７２時間刺激した。増殖アッセイ用には、最後の１４時間、細胞を２μＣｉの３Ｈ−チミジンで刺激した。ＩＬ−２，ＩＦＮγおよびＩＬ−１７の分泌は、ＣｙｔｏｋｉｎｅＰｌｅｘ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて測定した。【０１５９】
養子導入実験
ＢＭＤＣをＰＢＳ中５μＭのＣＦＳＥで室温で１０分間標識しし、ＰＢＳでよく洗浄した。５０μｌのＰＢＳ中の１ｘ１０６個のＤＣをレシピエントマウスの後足蹠の皮下に注射した。注射の２４から４８時間後に膝窩リンパ節を採取し、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＤで３７℃で３０分間処理し、細胞を計数し、フローサイトメトリにより分析した。移動した樹状細胞のパーセンテージは、総リンパ節細胞に対する蛍光樹状細胞の比率に対応する。【０１６０】
二光子顕微鏡
ＢＭＤＣ（１ｘ１０６）をＯＴ−ＩＩペプチドでパルスし，５μＭのＣＭＴＭＲで標識し、野生型レシピエントマウスの後足蹠に注射した。樹状細胞の移入の１８時間後、５μＭのＣＭＦＤＡで標識した２ｘ１０７個のＯＴ−ＩＩＴｇマウス由来ＣＤ４＋Ｔ−細胞を静脈内に移入した。１時間において、抗ＣＤ６２Ｌ抗体を投与して、新たなＴ細胞がＨＥＶを通ってリンパ節に流入することをブロックした。１０時間後、膝窩リンパ節を切除し９５％Ｏ２／５％ＣＯ２でバブリングした洗浄培地（ｓｕｐｅｒｆｕｓｅｄｍｅｄｉｕｍ）中で３７℃で維持した。ＣＭＦＤＡおよびＣＭＴＭＲの二光子励起および第二高調波発生用には、ＭａｉＴａｉＴｉ：ｓａｐｐｈｉｒｅレーザー（Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ，ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，ＣＡ）を８７５ｎｍに調整した。細胞移動の四次元分析のためには、５μｍのｚをもつ７個のｘ−ｙ切片のスペーディングを３０秒ごとに取得して、３０分間で深さ３０μｍの体積のイメージを生成した。３つの蛍光チャネルは、４４０，５１０および５６０ｎｍの二色ミラーを、４００／４０（第二高調波シグナル），５３５／２６（ＣＭＦＤＡ）または６００／１００（ＣＭＴＭＲ）ｎｍの帯域通過フィルターと組み合わせて用いて分離し、０．８ＮＡ４０ｘの浸水対物レンズを用いてノンデスキャン検出器で検出した。【０１６１】
ＦＩＴＣ皮膚ペインティング
担体溶液（１：１ｖ／ｖアセトン：ジブチルフタレート）中の５０μｌの２ｍｇ／ｍｌＦＩＴＣを剃った肩の上に適用することにより、インビボで表皮樹状細胞の移出を誘導した。対照動物には、同じ量のＦＩＴＣなしの担体溶液を与えた。２４および４８時間後にマウスを犠牲死させ、上腕リンパ節を切除し、ＣＤ１１ｃ＋ＦＩＴＣ＋樹状細胞の頻度をフローサイトメトリにより評価した。上腕リンパ節に移動した内因性のＤＣの数は次の計算により分析した：（内因性樹状細胞の数）＝（合計細胞数）ｘ（ＣＤ１１ｃ＋ＦＩＴＣ＋細胞の％）。【０１６２】
トランスウエル実験
未コーティングトランスウエル（孔径，５．０μｍ；Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、のＣＣＬ２１またはＣＸＣＬ１２を含むＲＰＭｌ中０．１％ＢＳＡ０．６ｍｌの入った２４ウエルプレートに入れた。０．１ｍｌ溶液中１ｘ１０５個の樹状細胞をトランスウエルの上部ウエルに加え、３７℃で３時間インキュベーションした。下部チャンバ中の細胞を５ｍＭＰＢＳ−ＥＤＴＡで５分間で剥離し、Ｇｕａｖａにより計数した。インビトロ移動アッセイのためには、フィブロネクチン（１０ｍｇ／ｍｌ），タイプ１コラーゲン（３．０ｍｇ／ｍｌ）またはリンパ管内皮細胞を、上部チャンバの膜上に重層した。簡単には、２ｘ１０４個のＳＶＥＣ４−１０またはＨＭＶＥＣ−ｄＬｙの細胞を、２μｇ／ｍｌのフィブロネクチンでコーティングしたトランスウエル挿入物の上部または下部表面に播種した。２日間培養した後、コンフルエントの層の一体性をファロイジン染色により調べた。移動アッセイは６時間行った。樹状細胞におけるミオシンＩＩおよびＲｈｏの活性の阻害は、５０μＭのブレビスタチン（Ｓｉｇｍａ）および３０μＭのＹ−２７６３２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で３７℃で３０分間処理することにより行った。【０１６３】
樹状細胞のインビボ移動
末梢からの樹状細胞の流出を観察するために、腹部にオキサゾロンを適用することにより接触過敏性を誘導した。感作の６日後，オキサゾロンを耳に適用した。チャレンジの８時間後、１０６個のＣＭＦＤＡ標識ＢＭＤＣを皮膚から注射した。２４時間後、動物を犠牲死させ、耳の組織をパラホルムアルデヒドで固定した。ビオチン化抗ＬＹＶＥ−１＋ストレプトアビジン−Ｃｙ３を用いてホールマウント染色を行ってリンパ管を検出し、画像は共焦点ｚ−スタックイメージングにより取得し、末梢に保持された細胞の数を計数した。【０１６４】
２次元移動アッセイ
Ｚｉｇｍｏｎｄチャンバにおける樹状細胞の走化性を分析するため，ＬＰＳで処理した樹状細胞をフィブロネクチンコーティング（２ｕｇ／ｍｌ）カバースリップに３０分間接着させた。次に、これをＺｉｇｍｏｎｄチャンバに入れ、溶液（０．１％ＢＳＡ含有ＲＰＭＩ）のアリコート（０．１ｍｌ）をチャンバの片側に加え、ＣＣＬ２１（５ｕｇ／ｍｌ）を含む同じ溶液を反対側に加えた。画像は、温度，湿度およびＣＯ２についての環境チャンバを備えた倒立共焦点顕微鏡（ＬＳＭ５エキサイタ、ＨＡＬ１００，Ｚｅｉｓｓ）により、３０秒ごとに記録した。イメージングには、ＺｅｉｓｓＥＣ−ｐｌａｎＮｅｏｆｌｕａｒ２０ｘ対物レンズ（０．５ＮＡ）を用いた。【０１６５】
樹状細胞−移動に及ぼすSema3Aの影響を分析するため、ＥＺ−Ｔａｘｉｓｃａｎチャンバにおいて、製造元のプロトコル（ＥｆｆｅｃｔｏｒＣｅｌｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）にしたがって走化性実験を行った。ＥＺ−Ｔａｘｉｓｃａｎは、可視的にアクセス可能な走化性チャンバである。１つのコンパートメントがＣＣＬ２１（５μｇ／ｍｌ）を含み、別のコンパートメントが細胞および組換えSema3A−Ｆｃ（５ｕｇ／ｍｌ）またはＩｇＧを含むチャンバをマイクロチャネルにより接続した。移動する細胞の位相コントラスト画像は３０秒間隔で取得した。【０１６６】
３Ｄコラーゲンマトリクスにおける二次元移動アッセイ
ＬＰＳ（５００ｎｇ／ｍｌ）で１２時間処理した骨髄由来樹状細胞を、２％ＦＣＳおよび対照ＩｇＧ（５ｕｇ／ｍｌ）またはSema3A−Ｆｃ（５ｕｇ／ｍｌ）を含むタイプＩコラーゲン（３ｍｇ／ｍｌ）（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に懸濁し、Ｚｙｇｍｏｎｄチャンバの片側にキャスティングして、ステージをゲルで覆い、３７℃で３０分間インキュベーションして重合させた。次に、０．５％ＢＳＡおよびＣＣＬ２１（５ｕｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩを反対側に加えた。２０分間インキュベーションした後、上述したようにして、共焦点低速度撮影ビデオ顕微鏡記録計を用いて樹状細胞の運動を１分間隔で取得した。【０１６７】
走化性アッセイの分析
コラーゲンマトリクス中における樹状細胞の速度を比較するため、ＭｅｔａｍｏｒｐｈオフラインソフトウエアであるＴｒａｃｋ−ｐｏｉｎｔまたはＩｍａｇｅＪＭａｎｕａｌＴｒａｃｋｉｎｇＰｌｕｇｉｎを用いて、ランダムサンプルの単一細胞の手動追跡を行った。細胞は２時間追跡した。速度および方向のパラメータを計算し、得られたデータを走化性について分析することによりプロットして可視化した。休止部分を除くことにより、移動の平均速度および瞬間速度を計算した。【０１６８】
樹状細胞−内皮細胞相互作用
１ｘ１０４個のＢＭＤＣを正常ヒト皮膚リンパ管微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ−ｄＬｙ）に由来する内皮細胞単層に加えた。３０分間インキュベーションした後、温度，湿度およびＣＯ２用の環境チャンバを備えた倒立共焦点顕微鏡（ＬＳＭ５エキサイタ、ＨＡＬ１００，Ｚｅｉｓｓ）で、３０秒ごとに画像を記録した。イメージングにはＺｅｉｓｓＥＣ−ｐｌａｎＮｅｏｆｌｕａｒ２０ｘ対物レンズ（０．５ＮＡ）を用いた。３Ｄ立体イメージング用には、１ｘ１０４個のＣＦＳＥ標識ＢＭＤＣをＨＭＶＥＣ−ｄＬｙの内皮細胞単層に加えた。４５分間インキュベーションした後、細胞を４％ＰＦＡで固定し、ファロイジン−Ａｌｅｘａ５４６で染色した。【０１６９】
共焦点顕微鏡画像は、倒立顕微鏡（ＬＳＭ５ｅｘｃｉｔｅｒ，Ｚｅｉｓｓ）で、ＺｅｉｓｓＰｌａｎ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ６３ｘｏｉｌＤＩＣ対物レンズ（１．４ＮＡ）を用いて、０．２２μｍの光学切片分離（ｚ−インターバル）で取得した。Ｉｍａｒｉｓ３Ｄソフトウエアを用いて１２個のＺ−スタック画像を再構築して、３Ｄ立体像とした。統計学的分析を評価するために、樹状細胞を次の２群に分類した：共焦点顕微鏡を用いて内皮細胞の先端部に限定して検出しうるＤＣ、または内皮細胞の先端部から基底部までの全体で検出しうる樹状細胞。内皮細胞の全体で検出しうる樹状細胞の、総樹状細胞に対するパーセンテージを計算した。【０１７０】
ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＴ−ＰＣＲ分析用には、未成熟骨髄由来樹状細胞，成熟樹状細胞（ＣＤ４０；１ｕｇ／ｍｌ，ＴＮＦａ；５０ｎｇ／ｍｌ），ＳＶＥＣ４−１０およびＨＭＶＥＣ−ｄＬｙから、ＲＮｅａｓｙｋｉｔｓ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡを単離し、ＤＮａｓｅＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理してゲノムＤＮＡを除去した。ｃＤＮＡｓはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩｃＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて合成した。【０１７１】
接着アッセイ
フィブロネクチン，ラミニン，Ｉ型コラーゲン，ＩＶ型コラーゲン，ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）でコーティングした９６ウエルディッシュ（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）をＲＰＭＩ中０．５％ＢＳＡで３０分間ブロッキングした。１μＭのＣａＩｃｅｉｎ−ＡＭで標識した５ｘ１０４個のＢＭＤＣを各ウエルに入れた。３７℃で３０分間インキュベーションした後、プレートを１１００ｒｐｍで１５秒間振盪しＰＢＳで３回洗浄した。細胞をＰＢＳ中０．２％ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで可溶化し、Ａｒｖｏ（ＰｅｒｋｉｎＥＩｍｅｒ）を用いて４６０ｎｍの蛍光強度を測定した。加えた細胞の総量の細胞溶解物の吸光度を１００％とした。樹状細胞の内皮細胞への接着活性については、１μＭのＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭで標識した１ｘ１０５個のＢＭＤＣを２４ウエルプレート中の内皮細胞単層に加えた。３７℃で３０分間インキュベーションした後、細胞を４％ＰＦＡで固定し、よく洗浄した。画像は、蛍光顕微鏡（ＮｉｋｏｎｅｃｌｉｐｓｅＴＥ２０００−Ｅ）により、ＮｉｋｏｎＰｌａｎＦｌｕｏｒ１０ｘＤＩＣ対物レンズ（ＮＡ０．３）を用いて取得し、ＮＩＳ−ｅｌｅｍｅｎｔｓＡＲ３．０ソフトウエアにより接着した細胞の数を計数した。【０１７２】
免疫組織学
ＬＰＳ処理ＢＭＤＣ（２ｘ１０４）をフィブロネクチンでコーティングしたガラス（１０ｕｇ／ｍｌ）に３７℃で３０分間接着させた。非接着細胞を除去した後、樹状細胞をSema3A−Ｆｃ（５ｕｇ／ｍｌ）または対照ＩｇＧ（５ｕｇ／ｍｌ）とともに１０分間インキュベーションし、４％ＰＦＡで４℃で３０分間固定し、ブロッキング溶液（３０％正常ヤギ血清、ＰＢＳ中、２％ＢＳＡを含有）とともに１時間インキュベーションし、ウサギ抗Plexin-A1またはウサギ抗ｐＭＬＣと、抗ウサギＣｙ３，ファロイジン−Ａｌｅｘａ４８８で一晩染色した。画像は共焦点Ｚ−スタックイメージング（０．５μｍ間隔）により、ＺｅｉｓｓＰｌａｎ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ６３ｘｏｉｌＤＩＣ対物レンズ（１．４ＮＡ）を用いて、倒立顕微鏡（ＬＳＭ５ｅｘｃｉｔｅｒ，Ｚｅｉｓｓ）で取得した。【０１７３】
ＥＬＩＳＡアッセイ
ＢＭＤＣは、Sema6D−Ｆｃ（５μｇ／ｍｌ）および対照ＩｇＧ（５μｇ／ｍｌ）でコーティングしたプレートで、ＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍｌ）ありまたはなしで、培養した。４８時間インキュベーションした後、培養上清を単離し、ＥＬＩＳＡによりＴＮＦαおよびｐｒｏ−ＭＭＰ９（Ｒ＆Ｄ）をアッセイした。【０１７４】
リンパ節中の樹状細胞サブセットの分析
８週齢の炎症を生じていないマウスから、頸部、上腕部，中心部，鼡径部および膝窩部のリンパ節を単離し、４００μ／ｍｌのコラゲナーゼＤを含むＨＡＮＫＳで３７℃で３０分間消化し、消化した組織から単一細胞懸濁物を調整し，ＣＤ１１ｃ，Ｂ２２０，ＣＤ４，ＣＤ８ａ，Ｉ−Ａｂに対する抗体で染色し、次にＣＤ１１ｃ＋Ｂ２２０−の集団についてゲート設定した後にフローサイトメトリで分析した。【０１７５】
統計学的分析
データが基準を満たすことを確認した後に、スチューデントｔ検定および一元ＡＮＯＶＡを実施した。他の場合にはマンホィットニーＵ検定を行った。ＡＮＯＶＡが有意である場合には、事後分析としてＴｕｋｅｙ検定を用いた。分析はＳｔａｔｃｅ１２を用いて行った。【０１７６】
結果
Plexin-A1−／−マウスにおける流入領域リンパ節への樹状細胞移動の低下
我々は先に、Plexin-A1−／−マウスが非常に低下した抗原特異的Ｔ細胞生成を示すことを報告した。しかし、Plexin-A1がどのようにして抗原特異的Ｔ細胞プライミングに関与しているかは不明であった。このメカニズムをさらに詳細に調べるため、野生型およびPlexin-A1−／−マウスにおいてＯＴ−ｌｌ細胞を活性化した。野生型レシピエントマウスにおいては、ＯＶＡペプチドをＣＦＡとともに皮下に適用した後、ＣＦＳＥで標識したＯＴ−ｌｌ細胞はよく増殖した（図１Ａ）。これに対し，ＯＴ−ｌｌＴ−細胞をPlexin-A1−／−レシピエントマウスに移入した場合には、抗原特異的増殖応答が著しく低下した（図１Ａ）。このことから、抗原特異的Ｔ細胞応答におけるPlexin-A1の重要性が確認された。【０１７７】
抗原特異的Ｔ細胞は、流入領域リンパ節において抗原をパルスした樹状細胞と接触することにより刺激される。このため、ｐＩｅｘｉｎ−Ａ１−欠損樹状細胞が流入領域リンパ節における樹状細胞−Ｔ細胞相互作用に及ぼす影響を調べた。【０１７８】
リンパ節における抗原をパルスした樹状細胞と抗原特異的Ｔ細胞との細胞−細胞接触を観察するため、ＣＭＴＭＲ−標識ＯＶＡでパルスした、野生型またはPlexin-A1−／−マウスに由来する樹状細胞を、野生型レシピエントマウスの足蹠に注射し、二光子顕微鏡により膝窩リンパ節を分析した。野生型樹状細胞を足蹠に注射した場合には，ＣＭＴＭＲ標識樹状細胞は流入領域リンパ節のＴ細胞領域に豊富に分布しており、その全体に存在していた（図１Ｂ，上）。これに対し、Plexin-A1−／−樹状細胞を注射した場合には、レシピエントマウスの流入領域リンパ節では樹状細胞がほとんど認められなかった（図１Ｂ，下）。このことは、移動能力が低下していることを示す。【０１７９】
野生型とPlexin-A1−／−樹状細胞とについてインビボの移動活性を定量的に比較するために、ＣＦＳＥ標識樹状細胞を野生型マウスの足蹠に注射した後の流入領域リンパ節への到達を調べた。Plexin-A1−／−樹状細胞は、野生型樹状細胞と比較して移動活性が低下していることがわかった。【０１８０】
次に、内因性樹状細胞の移動能力を分析した。定常状態において、皮膚流入領域リンパ節中のＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩｈｉおよびＣＤ１１ｃ＋ＣＤ４−ＣＤ８−の移動性樹状細胞サブセットの数は、Plexin-A1−／−マウスにおいて低下していた（図５Ｃ）。【０１８１】
樹状細胞の成熟の間にPlexin-A1の発現は増加するため、ＦＩＴＣ−皮膚ペインティング実験を行って、炎症条件下で、Plexin-A1欠損が樹状細胞輸送に及ぼす影響を調べた。図１Ｄに示されるように，Plexin-A1−／−マウスは、野生型マウスと比較して、移動したＦＩＴＣ陽性樹状細胞が有意に低下していた。【０１８２】
これらの結果を合わせると、Plexin-A1は樹状細胞移動に決定的に関与していることが示され、樹状細胞移動の低下がPlexin-A1−／−マウスにおけるＴ細胞刺激の欠損の主な理由であることが示唆される。【０１８３】
Plexin-A1−／−樹状細胞における樹状細胞輸送の間の移動能力の低下
末梢組織からリンパ管への樹状細胞輸送に関しては、いくつかの順番の段階があり、これには、抗原取り込み、ケモカインに応答したリンパ管への間質性移動、およびリンパ管を通過する過程が含まれる。いずれの段階でPlexin-A1が必要であるかを決定するために、それぞれの移動段階を詳細に調べた。抗原取り込みに関しては、野生型とPlexin-A1−／−樹状細胞との間で有意な相違は認められなかった（図６Ａ）。さらに、トランスウエルアッセイにおいては、樹状細胞がＣＣＬ１９，ＣＣＬ２１またはＣＸＣＬ１２のいずれかに応答して移動する能力（図６Ｂ）、およびＺｙｇｍｏｎｄチャンバを用いる二次元アッセイにおいて、ケモカイン勾配における樹状細胞の感受性の方向（図６Ｃ）には相違がなかった。これらの知見と一致して、野生型とPlexin-A1−／−樹状細胞との間ではＣＣＲ７およびＣＸＣＲ４の発現レベルは同程度であった（図６Ｄ）。【０１８４】
これらの結果は、Plexin-A1は抗原取り込みおよび移動の間のケモカインに対する応答性には必要ではないことを示す。【０１８５】
我々の観察は、Plexin-A1が、これらの細胞がいったん最初のリンパ管に到達したときの移動において決定的な役割を果たすことを示唆する。インビボでの移動プロセスにおけるPlexin-A1の役割を調べるため、野生型またはPlexin-A1−／−のＣＦＳＥ標識樹状細胞をオキサゾロン処理マウスに養子導入し、移植された樹状細胞の運命を調べた。【０１８６】
図２Ａに示されるように，養子導入の２４時間後、生理学的リンパ流の存在下では、ほとんどの野生型樹状細胞は最初のリンパ管の周りには認められなかった。これに対し、多数のPlexin-A1−／−樹状細胞がレシピエントマウスの皮膚のリンパ管に沿って保持されており，これはＬＹＶＥ−１陽性リンパ管を伴っていた（図２Ａ）。このことは、Plexin-A1−／−樹状細胞においてはリンパ管を通過する能力が低下していることを示す。【０１８７】
次に、樹状細胞におけるPlexin-A1欠損が樹状細胞とリンパ管内皮細胞との間の最初の接触に影響を与えるか否かを低速度イメージングにより調べた。野生型樹状細胞はリンパ管内皮細胞の細胞−細胞接合部で内皮細胞と相互作用し、内皮細胞を越える移動を示した（図２Ｂ上）。しかし、Plexin-A1−／−樹状細胞は、野生型樹状細胞において見られたものと同様に、活発に動き、その樹状突起を伸張させ、リンパ管内皮細胞と接触したが、リンパ管内皮細胞を通過することができなかった（図２Ｂ下）。【０１８８】
この知見をさらに確認するために、ＣＦＳＥ標識樹状細胞をリンパ管内皮細胞の単層に適用し、Ｆアクチンマーカーであるファロジンで染色して、共焦点Ｚ−スタックイメージングにより観察した。野生型樹状細胞は、内皮細胞の上から下まで全体に観察された。これに対し、Plexin-A1−／−樹状細胞はリンパ管内皮細胞に接着することはできたが、これを越えて移動することはできなかった（図２Ｃ，図７）。さらに，トランスウエル実験において、Plexin-A1−／−樹状細胞は内皮細胞単層を通過する能力が有意に低下していた（図２Ｄ）。【０１８９】
これらの結果を総合すると、樹状細胞がリンパ管を通過する過程におけるPlexin-A1の重要性が強く示唆される。【０１９０】
Sema6CまたはSema6DではなくSema3Aがplexin-A1媒介性樹状細胞移動を担う
Plexin-A1は、２つのタイプのセマフォリン、すなわち、分泌性クラスＩＩＩセマフォリンであるSema3AおよびクラスＶＩ貫膜セマフォリンであるSema6CおよびSema6Dに対する受容体成分である。したがって、Plexin-A1−／−樹状細胞における欠損はいずれの相互作用が原因であるかを判定することとした。最初に、これらの分子の樹状細胞およびリンパ管における発現プロファイルを調べた。Sema3A受容体成分であるNP-1およびPlexin-A1、ならびにSema6Dは樹状細胞で発現されていたが、Sema3AおよびSema6Cはリンパ管で発現されていた（図８）。発現プロファイルに基づいて、樹状細胞の移動にはいずれのモードが不可欠であるかを明らかにするために、養子導入アッセイを行った。Sema3A結合部位が欠損しているNP-1ｓｅｍａ−ノックインマウスからの樹状細胞を野生型レシピエントマウスに移入した場合には、流入領域リンパ節への移動が低下していた（図３Ａ）。これに対し、Sema6D−／−マウス（図９）からの樹状細胞は、野生型マウスからのものと同程度の移動活性を示した（図３Ａ）。これらの結果は、樹状細胞輸送には樹状細胞におけるNP-1−発現が必要であることを示唆する。【０１９１】
リンパ管においていずれのセマフォリンが必要であるかをさらに確認するために、，野生型マウスからの樹状細胞をSema3A−／−レシピエントマウスに移入し、樹状細胞の流入領域リンパ節への移動が低下していることを見いだした（図３Ｂ）。しかし、野生型マウスからの樹状細胞をSema6C−／−またはSema6D−／−レシピエントマウスに移入した場合には，樹状細胞移動の異常は認められなかった（図３Ｂ）。これらの知見をインビトロで確認するために、リンパ管内皮細胞単層の存在下で移動アッセイを行った。【０１９２】
図３Ｃに示されるように，NP-1ｓｅｍａ−ノックインマウスからの樹状細胞は移動能力の低下を示し、これは，Plexin-A1−／−マウスからの樹状細胞と類似していた（図２Ｄ）。さらに、Sema6D−１−マウスからの樹状細胞は何ら異常を示さなかった（図３Ｄ）。次に、以下のPlexin-A1関連変異マウス：Sema3A−／−．Sema6C−／−，Sema6D−／−−，およびNP-1ｓｅｍａ−ノックインマウスを用いて、Ｔ細胞刺激（ｐｒｉｍｉｎｇ）実験を行った。これらの結果と一致して、Sema3A−／−およびNP-1ｓｅｍａ−ノックインマウスはPlexin-A1−／−マウスと同様にＴ細胞刺激に欠陥があったが、Sema6C−／−もSema6D−／−も抗原特異的Ｔ細胞刺激には何ら異常がなかった（図３Ｄ）。これらの結果を合わせると、Sema6CまたはSema6DではなくSema3Aがリンパ節への樹状細胞移動過程のPlexin-A1の機能的リガンドであることが示された。【０１９３】
Sema3Aは、ミオシンＩＩ活性を刺激することによりアクトミオシン収縮を誘導する。神経系では、Sema3Aはニューロン軸索誘導因子の方向および移動を決定している。したがって、我々は、Sema3Aは樹状細胞移動にも関連しているとの仮説をたてた。このことを明らかにするために、まず、移動している樹状細胞におけるPlexin-A1の局在を調べた。Plexin-A1の発現は後端部に局在しており、活発なアクチン重合が観察される先端部ではなかった（図４Ａ）。このことと一致して、トランスウエルアッセイにおいて、ケモカインに応答した樹状細胞の移動は、Sema3Aを上方チャンバに加えることにより増強されたが、下方チャンバに加えても増強されなかった（図４Ｂ左）。【０１９４】
さらに、ＥＺ−ｔａｘｉｓｃａｎにより評価した二次元指向性移動アッセイにおいては、Sema3Aは運動性樹状細胞の割合を増加させ、ケモカイン勾配に対抗してSema3Aを適用したときに、樹状細胞の速度を加速した（図４Ｂ右）。このことから、移動する樹状細胞の極性に対するSema3Aの重要性が示唆される。【０１９５】
最近、Ｒｈｏファミリーの小ＤＴＰａｓｅｓおよびミオシンＩＩが樹状細胞輸送において役割を果たすことが方向された。これらの分子の局在は，Plexin-A1と似ており、狭いギャップまたは狭窄領域を通る間に細胞体を絞りアクトミオシン収縮を生ずるのに必要であると考えられる。さらに，ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）のリン酸化はミオシンＩＩ活性に重要であり、Sema3A媒介性軸索退縮における関与が示唆されている。これらの先に知見、およびリンパ管におけるSema3Aの大量の発現に鑑みて、Sema3Aが樹状細胞の運動の間にミオシンＩＩの活性に影響を及ぼすか否かを調べた。予測されたように、組換えSema3Aにより刺激された樹状細胞ではＭＬＣリン酸化の増加が認められた（図４Ｃ，図１０）。さらに，Sema3Aは運動性樹状細胞の割合、およびコラーゲンマトリクス（これはインビトロで狭窄領域を通る通過のモデルとして用いられている）における樹状細胞の速度を増加させた（図４Ｄ）。【０１９６】
さらに、Sema3Aが樹状細胞の移動に及ぼす影響がミオシンＩＩ活性に依存するか否かを判定するために、ミオシンＩＩまたはその上流のアクチベータであるＲｈｏキナーゼを薬物で阻害した。図４Ｅに示されるように，Sema3Aを上部チャンバに適用したときに樹状細胞移動は有意に増強され、ＤＣをミオシンＩＩ阻害剤であるブレビスタチンまたはＲｈｏキナーゼ阻害剤であるＹ−２７６３２のいずれかで処理すると、この効果はなくなった。【０１９７】
これらの結果を合わせると、Sema3Aが樹状細胞の移動の間にアクトミオシン収縮を誘導することが示唆される。【０１９８】
図１．Ｐｌｅｘｉｎ−Ａ１−／−マウスは、樹状細胞のリンパ節への移動の欠損のため、低下したＴ細胞応答を示す
（Ａ）Plexin-A1−／−マウスにおける抗原特異的Ｔ細胞の生成の低下
ＣＦＳＥで標識したＯＴ−ＩＩＣＤ４＋Ｔ−細胞を野生型（＋／＋）またはPlexin-A1−／−（−／−）マウスの静脈内に移入し、次にＣＦＡ中のＯＶＡ−ペプチドを足蹠の皮下に注射した。７２時間後、ＣＦＳＥの希釈によって抗原特異的Ｔ細胞応答を測定した。各実験について示されるデータは、３回の独立した実験の代表例である。
（Ｂ）Plexin-A1−／−樹状細胞における、流入領域リンパ節への樹状細胞輸送の低下
ＣＭＴＭＲで標識した野生型（＋／＋）またはPlexin-A1−／−（−／−）マウス由来のＢＭＤＣを野生型レシピエントマウスの足蹠に注射し、このマウスにＣＭＦＤＡ−標識ＣＤ４＋ＯＴ−ＩＩＴ−細胞（緑）を移入した。注射の２４時間後、二光子顕微鏡で膝窩リンパ節への樹状細胞輸送を観察した。
（Ｃ）Plexin-A1−／−マウスにおける、移動した樹状細胞の数の低下
野生型（白棒）またはPlexin-A1−／−（黒棒）マウスからのＣＦＳＥ標識ＢＭＤＣを野生型レシピエントマウスの足蹠に注射した。膝窩リンパ節への樹状細胞輸送の数は、下記の式により分析した：（流入細胞の％）＝（総細胞数）ｘ（ＣＦＳＥ＋細胞の％）／（流入細胞数）
平均＋／−ＳＤ，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１，マンホイットニーＵ検定
（Ｄ）Plexin-A1−／−マウスにおける内因性樹状細胞の移動活性の低下
野生型（白棒）およびPlexin-A1−／−（黒棒）マウスの剃った肩にＦＩＴＣアイソマーをペイントした。示される時点で、上腕リンパ節から細胞を単離し、ＣＤ１１ｃ＋ＦＩＴＣ＋細胞を数えた。【０１９９】
図２．Plexin-A1−／−樹状細胞におけるリンパ管を越える通過能の低下
（Ａ）Plexin-A1−／−マウスにおける、リンパ管に沿った樹状細胞の保持
予めオキサゾロンを注射して感作したマウスの耳組織に、野生型（＋／＋）またはPlexin-A1−／−（−／−）マウスからのＣＦＳＥ標識骨髄樹状細胞（緑）を皮内注射した。２４時間後、耳を切除し、ストレプトアビジン−Ｃｙ３（赤）をもつビオチン化抗ＬＹＶＥ−１抗体を用いてホールマウント染色を行い（上）、視野中の残留樹状細胞を計数した（下）。＊＊＊ｐ＜０．００１、マンホイットニーＵ検定
（Ｂ）Plexin-A1−／−樹状細胞における樹状細胞のリンパ管内皮細胞単層を通過する能力の低下
野生型（＋／＋）またはPlexin-A1−／−（−／−）マウスに由来するＢＭＤＣをリンパ管内皮細胞単層に適用し、樹状細胞とリンパ管内皮細胞との間の相互作用を、低速度ビデオ顕微鏡記録器により３０秒ごとに記録した。黄色の点線は内皮細胞の細胞結合部を示す。白色はリンパ管内皮細胞と接触している樹状細胞を示す。赤色は野生型樹状細胞において観察された移動プロセスを示す。
（Ｃ）Plexin-A1−／−樹状細胞における移動能力の低下
ＣＦＳＥ標識樹状細胞を内皮細胞単層に適用し、４５分間インキュベーションし、固定し、Ａｌｅｘａ−５４６コンジュゲート化ファロイジンで染色した。共焦点顕微鏡画像は、０．２２μｍの光学切片距離（ｚ−間隔）で取得した。野生型樹状細胞は先端から基底レベルに侵入したが、Plexin-A1−／−樹状細胞は基底レベルに到達できなかった（左）。樹状細胞移動の定量（右）。リンパ管内皮細胞単層に付着した樹状細胞の数（白棒）、およびリンパ管内皮細胞単層を越えて移動した樹状細胞の数（黒棒）を、共焦点顕微鏡により測定した。総樹状細胞に対する移動した樹状細胞のパーセンテージを計算した。平均＋／−ＳＤ、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定
（Ｄ）Plexin-A1−／−樹状細胞における、リンパ管内皮細胞単層を通過する際のケモカイン誘導性移動能力の低下
野生型（白棒）またはPlexin-A1−／−（黒棒）マウスからの樹状細胞を、リンパ管内皮細胞を重層したトランスウエル（孔径：５μｍ）の上部チャンバに適用し、ＣＣＬ２１に応答した走化性を測定した。平均＋／−ＳＤ、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定【０２００】
図３．Sema3A−NP-1−Plexin-A1相互作用は、Plexin-A1／NP-1を介して樹状細胞移動を担う
（Ａ）樹状細胞中で発現されたNP-1は樹状細胞移動を担う
野生型（白棒）およびNP-1−ノックイン（Sema3A結合部位が破壊されている）またはSema6D−／−（黒棒）マウスからの樹状細胞を、野生型レシピエントマウスに養子導入した。NP-1−／−ノックインマウスからの樹状細胞のみが樹状細胞移動の低下を示した。平均＋／−ＳＥ，＊ｐ＜０．０５，マンホイットニーＵ検定
（Ｂ）リンパ管で発現したSema3Aは、樹状細胞移動を担う
野生型マウスからの樹状細胞を、野生型（＋／＋）およびSema3A−／−，Sema6C−／−またはＳｅｉｈａ６Ｄ−／−（−／−）マウスに養子導入した。Sema3A−／−レシピエントマウスのみが樹状細胞移動の低下を示した。データは３回の独立した実験から得た。標準誤差＋／−９５％信頼区間，＊＊ｐ＜０．０１，マンホイットニーＵ検定
（Ｃ）Plexin-A1−／−樹状細胞の場合と同様に、樹状細胞におけるNP-1の異常は移動の低下を示したがSema6Dは示さなかった
上述したように、野生型（白棒）およびNP-1ノックインまたはSema6D−／−（黒棒）マウスに由来する樹状細胞を、リンパ管内皮細胞を重層したトランスウエル（孔径５μｍ）の上部チャンバに適用し、ＣＣＬ２１に応答した走化性を測定した。平均＋／−ＳＤ，＊＊ｐ＜０．０１，スチューデントｔ検定
（Ｄ）Sema3A−／−およびNP-1−ノックインマウスではＴ細胞刺激の低下が認められたが、Sema6C−／−およびSema6D−／−マウスでは見られなかった
抗原特異的Ｔ細胞刺激を調べるために，Sema3A−／−，NP-1−ノックイン，Sema6C−／−，Sema6D−／−（黒丸）および野生型（白丸）マウスをＣＦＡ中ＫＬＨで免疫し、ＫＬＨに対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答をインビトロで調べた。平均＋／−ＳＤ．＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１，スチューデントｔ検定【０２０１】
図４．Sema3AはＭＬＣのリン酸化を誘導し，樹状細胞が狭窄領域を通って移動するために必要なアクトミオシン収縮を促進する
（Ａ）Plexin-A1は樹状細胞の後端に局在している
樹状細胞を固定し、Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート化ファロイジン（緑）および抗Plexin-A1ポリクローナル抗体＋抗ウサギＩｇＧ−Ｃｙ３（赤）で染色した。スケールバー，１０μｍ（上パネル）。Plexin-A1およびＦ−アクチンの局在は上パネルに示される細胞の蛍光強度を測定することにより定量した（下パネル）。共局在していない細胞のパーセンテージを示す（右パネル）。データは３回の独立した実験の代表例である。
（Ｂ）Sema3Aはケモカインに応答した樹状細胞の移動を増強する（左および中）
樹状細胞移動アッセイを行った。下部チャンバのＣＣＬ２１の存在下で、組換えSema3A蛋白質を下部（左）または上部（中）チャンバに適用した。平均＋／−ＳＤ．＊＊ｐ＜０．０１，両側スチューデントｔ検定
（右）組換えSema3A（黒棒、黒丸）または対照ＩｇＧ（白棒、白丸）をＣＣＬ２１の反対側に適用して、ＥＺ−ｔａｘｉｓｃａｎを用いた二次元樹状細胞走化性アッセイを行った。移動性画分の樹状細胞の瞬間速度はＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウエアにより分析した（右パネル）。＊＊＊ｐ＜０．００１，マンホイットニーＵ検定。データは３回の独立した実験の代表例である。
（Ｃ）Sema3AはＭＬＣのリン酸化を誘導する。フィブロネクチンでコーティングしたガラス上の樹状細胞を５μｇ／ｍｌのｈＩｇＧ（左パネル）またはSema3A−Ｆｃ（右パネル）で処理した。１０分後，細胞を固定し、抗ｐＭＬＣ抗体＋抗ウサギＩｇＧ−Ｃｙ３（下）で染色した。共焦点顕微鏡による画像は０．２μｍの光学切片距離（ｚ−間隔）での８個のｚ−スタック画像からなり、ｚ−スタック画像を１つの画像に投影した。スケールバー，１０μｍ
（Ｄ）Sema3Aは３Ｄ−コラーゲンマトリクス中の樹状細胞移動の速度を促進する
Sema3Aの存在下または非存在下でケモカインに応答した単一の樹状細胞のタイプＩコラーゲンマトリクスにおける速度を低速度顕微鏡イメージングにより分析し、単一の樹状細胞の速度をＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウエアにより決定した。細胞の平均速度（左パネル）（ｎ＝６４）および瞬間速度の分布（右パネル）。＊＊＊ｐ＜０．００１、マンホイットニーＵ検定。データは、３回の独立した実験の代表例である。
（Ｅ）組換えSema3Aは樹状細胞移動を促進し，これはミオシンＩＩ活性をブロックすることにより消失する
５０μＭのブレビスタチンまたは３０μＭのＹ−２７６３２で３７℃で３０分間処理したＢＭＤＣを、３ｍｇ／ｍｌのタイプ１コラーゲン（左パネル）およびＨＭＶＥＣ−ｄＬｙ単層（右パネル）を重層したトランスウエル（孔径：５μｍ）の上部チャンバに適用し、上部チャンバにおいて、Sema3Aの存在下または非存在下におけるＣＣＬ２１に応答した走化性を測定した。群間の全体的な相違は一元ＡＮＯＶＡにより判定した。事後的多重比較は、Ｔｕｋｅｙ検定を用いて行った。＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１【０２０２】
図５．Plexin-A1−／−マウスにおける抗原特異的Ｔ細胞刺激の低下
（Ａ）野生型（＋／＋）およびPlexin-A1−／−（−／−）マウスの後足蹠にＣＦＡ中１００μｇのキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を注射することによりマウスを免疫した。免疫の５日後、流入領域リンパ節から単離したＣＤ４＋Ｔ−細胞を、種々の濃度のＫＬＨおよび照射したＡＰＣで７２時間刺激した。増殖アッセイ用に、最後の１４時間に、２μＣｉの３Ｈ−チミジンで細胞をパルスした。ＩＬ−２，ＩＦＮγおよびＩＬ−１７の分泌は、ＣｙｔｏｋｉｎｅＰｌｅｘ（ＢｉｏＲａｄ）で測定した。平均＋／−ＳＤ、＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１、両側スチューデントｔ検定
（Ｂ）Ｔ細胞領域では移動した樹状細胞はほとんど見られなかった
野生型（＋／＋）またはPlexin-A1−／−（−／−）マウスからのＣＦＳＥ標識樹状細胞を移入した２４時間後に、膝窩リンパ節を単離し、フィコエリスリン（ＰＥ）−コンジュゲート化抗Ｂ２２０で染色した。移動した樹状細胞の局在は、蛍光顕微鏡により観察した。スケールバーは１００μｍを示す。
（Ｃ）Plexin-A1−／−マウスにおける、定常状態皮膚流入領域リンパ節における移動性樹状細胞サブセット数の低下
８週齢の非炎症性野生型マウス（白棒）またはPlexin-A1−／−マウス（黒棒）（ｎ＝４）から皮膚流入領域リンパ節を単離した。単一細胞懸濁物をＣＤ１１ｃ，Ｂ２２０，ＣＤ４，ＣＤ８ａ，Ｉ−Ａｂ，に対する抗体で染色し、ＣＤ１１ｃ＋Ｂ２２０−集団についてゲート設定した後、フローサイトメトリで分析した。平均＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．＊ｐ＜０．０５、両側スチューデントｔ検定【０２０３】
図６．Plexin-A1−／−樹状細胞において、ＦＩＴＣ−デキストランの取り込みおよびケモカインに対する応答は影響を受けなかった
（Ａ）Ｐｌｅｘｉｎ−Ａ１−／−樹状細胞は、野生型樹状細胞と同じ程度に抗原を取り込んだ。野生型マウス（白丸）またはPlexin-A1−／−マウス（黒丸）からのＢＭＤＣをＡＰＣ抗ＣＤ１１ｃで染色し、ＦＩＴＣ−デキストランとともにｔ３７℃で示される時間培養した（太線）。ＣＤ１１ｃ＋細胞に対するＦＬ１蛍光陽性細胞の割合をフローサイトメトリにより分析した。氷上でＦＩＴＣデキストランとともに培養した細胞を対照として用いた。
（Ｂ）トランスウエルアッセイにおけるケモカインに対する正常な応答
野生型（白棒）またはPlexin-A1−／−（黒棒）マウスに由来する樹状細胞をＢｏｙｄｅｎチャンバ（孔径５μｍ）の上部チャンバに加え、ＣＣＬ２１，ＣＣＬ１９またはＣＸＣＬ１２に応答して下部チャンバに移動した樹状細胞の数を計数した。
（Ｃ）ケモカインに応答した樹状細胞の正常な方向のセンシング
野生型（＋／＋）またはPlexin-A1（−／−）（−／−）マウスからの樹状細胞を、フィブロネクチンでコーティングしたカバースリップに接着させ、ＺｉｇｍｏｎｄチャンバのＣＣＬ２１勾配中に置いた。樹状細胞輸送は、共焦点低速度ビデオ顕微鏡記録計により３０秒ごとに記録した。画像はＮＩＢＩｍａｇｅＪソフトウエアにより分析した。スキャッタープロットは、ＣＣＬ２１勾配中で６０分間移動の後の、野生型（＋／＋）およびPlexin-A1−／−（−／−）樹状細胞の位置を元の位置に対して示す。ＣＣＬ２１起源に向かって３０度の円弧の内部で止まった細胞のパーセンテージを示す。
（Ｄ）ＣＣＲ７およびＣＸＣＲ４の発現レベルの比較
野生型（＋／＋，黒線）またはPlexin-A1−／−（−／−，赤線）マウス、およびアイソタイプ対照（灰色領域）からの樹状細胞におけるＣＣＲ７およびＣＸＣＲ４の発現をフローサイトメトリにより測定した。【０２０４】
図７．Plexin-A1−／−樹状細胞における、内皮細胞単層を通過する能力の低下
野生型（＋／＋）およびPlexin-A1−／−（−／−）マウスに由来するＢＭＤＣをＣＦＳＥ（緑）で標識し、ＨＭＶＥＣ−ｄＬｙ単層に適用した。４５分間インキュベーションした後、パラホルムアルデヒドで固定し、Ａｌｅｘａ−５４６コンジュゲート化ファロイジン（赤）で染色した。共焦点顕微鏡画像は０．２μｍの光学切片距離（ｚ−間隔）で取得した。スケールバーは１０μｍを示す。【０２０５】
図８．樹状細胞およびリンパ管内皮細胞におけるPlexin-A1およびその関連分子の発現プロファイル
樹状細胞およびリンパ管におけるPlexin-A1関連遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲにより測定した。Ｇ３ＰＤＨの発現を測定して対照とした。【０２０６】
図９．Sema6D−／−マウスの作成
（Ａ）Sema6D遺伝子の破壊
野生型Sema6Dアレル（上），Sema6D標的化コンストラクト（中）および得られたSema6D標的化アレル（下）の遺伝子構造を示す。黒ボックスはエクソンを示す。開始コドンを含む０．６−ｋｂのフラグメントをＮｅｏで置き換えた。ランダム・インテグレーションに対する選択を可能とするため、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を付加した。Ｅ，ＥｃｏＲｌ．
（Ｂ）ゲノムＰＣＲ分析
野生型（＋／＋），ヘテロ接合体（＋／−）およびホモ接合体（−／−）変異体マウスの尾部から単離したゲノムＤＮＡを、示されるプライマー（矢印）を用いてＰＣＲにより評価した。０．７ｋｂｐのフラグメントは野生型アレルを表し、１．３ｋｂｐのフラグメントは標的化アレルを表す。
（Ｃ）ＲＴ−ＰＣＲ分析
脾臓から単離したｃＤＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、Sema6D遺伝子の発現を測定した。
（Ｄ）野生型（＋／＋）およびホモ接合体（−／−）マウスからのＢＭＤＣを、フィコエリスリンとコンジュゲート化した抗ＣＤ１１ｃおよびビオチン化抗Sema6DｍＡｂ（実線）またはアイソタイプのマッチした対照（点線）＋アロフィコシアニンとコンジュゲート化したストレプトアビジンで染色した。フローサイトメトリにより、ＣＤ１１ｃ陽性細胞にゲート設定してSema6D発現を調べた。【０２０７】
図１０．Sema3Aはミオシン軽鎖のリン酸化を誘導した
（Ａ）強度の値の範囲を示す３次元表面グラフの二次元描写の等高線画像
フィブロネクチンでコーティングしたガラス上のＢＭＤＣを５μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ（下パネル）または組換えSema3A−Ｆｃ蛋白質（上パネル）で３７℃で１０分間刺激した。細胞を固定した後、ウサギ抗ｐＭＬＣ＋抗ウサギＣｙ３で染色した。画像は、共焦点顕微鏡により、０．２μｍの光学切片距離（ｚ−間隔）の８個のｚ−スタックイメージから取得し、ｚ−スタック画像を１つの画像に投影し、これは３Ｄ表面のグラフを単一の値の範囲が示される２Ｄグラフィックで描写したものである。
（Ｂ）ｈＩｇＧ（白棒，白丸）またはSema3A−Ｆｃ（黒棒，黒丸）で刺激した樹状細胞の樹状突起の領域における、平均強度の頻度の分布（左軸）または蓄積された割合のパーセンテージ（右軸）。（ｎ＝８０）、ｐ＜０．００１，マンホイットニーＵ検定。データは３回の独立した実験の代表例である。【０２０８】
図１１．野生型とPlexin-A1−／−樹状細胞との間では、接着活性およびＴＮＦαおよびｐｒｏ−ＭＭＰ９の分泌は有意に相違しない
（Ａ，Ｂ）細胞外マトリクス（Ａ）および内皮細胞（Ｂ）に対する接着活性は、野生型とPlexin-A1−／−の樹状細胞で同程度であった。
（Ａ）野生型（白棒）およびPlexin-A1−／−（黒棒）マウスに由来するＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ標識ＢＭＤＣを、示されるように、細胞外マトリクスをコーティングしたプレート（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に適用した。３０分間インキュベーションした後、非接着細胞を十分に除去し、接着細胞を１００μｌの０．２％ＴｒｉｔｏｎＸを含む溶解バッファで可溶化し、吸光度計を用いて吸光度４６０ｎｍの蛍光吸収を定量した。値は総入力細胞抽出物の蛍光吸収に対するパーセンテージとして示す。
（Ｂ）野生型（白棒）およびPlexin-A1−／−（黒棒）マウスに由来する１ｘ１０５個のＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ標識ＢＭＤＣをリンパ管内皮細胞（ＳＶＥＣ４−１０）の単層に適用した。３０分間インキュベーションした後、細胞を４％ＰＦＡで２０分間固定し、十分に洗浄した。値は、蛍光顕微鏡の観察視野において内皮細胞に接着した細胞の数として示す。細胞は、ＮＩＳ−ｅｌｅｍｅｎｔｓＡＲ３．０ソフトウエアにより計数した。
（Ｃ）インテグリンの発現レベルは、野生型とPlexin-A1−／−の樹状細胞との間で相違しなかった。野生型（黒線）およびPlexin-A1−／−（赤線）マウスに由来するＢＭＤＣを、ＣＤ１１ｃ−ＦＩＴＣおよびビオチン化抗インテグリン抗体＋ＡＰＣとコンジュゲート化したストレプトアビジンで染色した。発現レベルはフローサイトメトリにより測定した。
（Ｄ，Ｅ）ＴＮＦαおよびｐｒｏ−ＭＭＰ９の分泌レベルは野生型とPlexin-A1−／−の樹状細胞で相違しなかった。野生型（白棒）およびPlexin-A1−／−（黒棒）マウスに由来するＢＭＤＣをＬＰＳおよび５μｇ／ｍｌのプレートにコーティングしたｈＩｇＧまたは組換えSema6D−Ｆｃとともに４８時間培養した。ｐｒｏ−ＭＭＰ９（Ｄ）およびＴＮＦα（Ｅ）の濃度はＥＬＩＳＡにより測定した。【０２０９】
接触性皮膚炎マウスモデル
接触性皮膚炎は、ジニトロフルオロベンゼン（DNFB）およびオキサゾロンを含む様々な接触アレルゲンを用いて、マウスにおいて誘発することができる。アセトンおよびオリーブ油からなるビヒクル中のアレルゲンでマウスを局所的に感作し、次いで、オリーブ油のみに溶かしたアレルゲンを耳に攻撃接種する。耳の厚さの変化は、アレルゲンに対する免疫応答の尺度である。感作期（0日目〜5日目）に、または攻撃接種期（5日目〜6日目）の間にNeuropilin-1-Fcを投与する。Neuropilin-1-Fcによって耳の厚さの抑制を観察することにより、接触性皮膚炎を抑制する際のNeuropilin-1-Fcの役割が認められ得るだろう。【０２１０】
0日目に、アセトン：オリーブ油（4：1）中0.5％DNFBまたはアセトン：オリーブ油のみをC57B1/6マウスの背中に塗る。5日目に、カリパスを用いてマウスの耳の厚さを測定し、かつ、溶液25μlを耳に滴下することによって、オリーブ油のみ（対照）またはオリーブ油中0.25％DNFBをマウスの耳に攻撃接種する。耳の厚さの変化を6日目に測定し、かつ、5日目と6日目の耳の厚さの差として、炎症を算出する。0日目〜5日目または5日目〜6日目のいずれかに、PBSまたはNeuropilin-1-Fcを適量マウス群に局所、腹腔内または静脈内に注射する。【０２１１】
Neuropilin-1-Fcによって耳の厚さが抑制されることから、Neuropilin-1-Fcが、接触性皮膚炎を抑制する際に有用であり得ることが実証されるであろう。【０２１２】
＜実施例２＞
生体内での細胞遊走におけるPlexin-A1の役割を評価するために、オキサゾロンによって処置されたマウスの真皮内に野生型、又は、Plexin-A1のノックアウトマウスから採取して、CFSEによって標識された樹状細胞が養子移入された。その後、移入された樹状細胞の動態が観察された。【０２１３】
養子移入は以下の方法によって実施された。すなわち、骨髄由来の樹状細胞が5μMのCFSE（carboxyfluorescein  diacetate  succinimidyl  ester）で22℃において10分間標識された。その後、当該細胞がPBSで洗浄された。PBSで懸濁された1ｘ106細胞数の樹状細胞が受容マウスの下肢足蹠の皮下に移入された。移入後24時間及び48時間において膝窩リンパ節が採集された。当該リンパ節は1mg/mlのコラゲナーゼDによって37℃において30分間処理された。細胞数がフローサイトメトリーによって計測され解析された。Cavanaghら（Nat.  Immunol.  (2005)  6,  1029−1037）によって記載されるように、移動した樹状細胞の割合は、総リンパ節細胞中の蛍光標識された樹状細胞の割合に相当する。【０２１４】
オキサゾロンによる処置は接触性過敏反応のモデルを提供するものである。樹状細胞の末梢部位からの移行を解析するために、接触性過敏反応がJohnsonら（J.  Exp.  Med.  (2006)  203,  2763−2777）によって記載されているように、腹部でのオキサゾロンの処置によって誘導された。感作後6日でオキサゾロンが耳に処置された。処置後8時間に1ｘ106細胞数のCFSE標識された骨髄由来の樹状細胞が経皮により移入された。24時間後にマウスが絶命され、その耳の組織がパラフォルムアルデヒド中で固定化された。リンパ管の検出のために、全載標本をビオチン化抗LYVE-1抗体（R&Dシステムズ）及びストレプトアビジン−インドカルボシアニンで染色した。画像は共焦点Zスタック画像分析によって取得され、末梢に留まっている細胞の数が測定された。【０２１５】
著量のPlexin-A1ノックアウトマウス由来の樹状細胞は、適合移植後24時間受容マウスの皮膚におけるリンパ節の内皮細胞マーカーであるLYVE-1がポジティブであるリンパ管に沿って留まっていた（図１２ａ）。こうした動態は野生型の樹状細胞では観察されなかった。こうした結果は、Plexin-A1ノックアウトマウス由来の樹状細胞はリンパ節を通過する遊走能が欠失していることを示唆するものである。【０２１６】
時間差画像分析（time-lapse  imaging）によって、樹状細胞におけるPlexin-A1の欠損が樹状細胞とリンパ節の上皮細胞との最初の接触に影響を及ぼしているか否かが検討された。野生型の樹状細胞はリンパ管内皮細胞の細胞間接合部で内皮細胞と相互作用して、内皮細胞を通過した（図１２ｂ）。Plexin-A1が欠損された由来の樹状細胞は野生型樹状細胞と同程度に活発に動き、樹状突起を伸ばし、リンパ管内皮細胞と接触したが、リンパ管内皮細胞を通過することはできなかった（図１２ｂ）。【０２１７】
上記の観察を確認するため、Fアクチンマーカーであるファロイジン（phalloidin）で染色されたリンパ管内皮細胞の単層細胞上にCFSE標識された樹上細胞が加えられた後に、これらの細胞が共焦点Zスタック画像分析（confocal  z-stack  imaging）によってモニターされた。その結果、内皮細胞の上面からでも下面からでも野生型樹状細胞の存在が観察された。対照的に、Plexin-A1が欠損された樹状細胞はリンパ管内皮細胞に接触することはできたが、これらの細胞層を通過することはできなかった（図１２ｃ）。【０２１８】
トランスウエル実験は以下の方法によって実施された。すなわち、0.1％のBSAを含有したCCL19、CCL21又はCXCL12を含むRPMI培地中0.6mlが各ウエルに充填された24ウエルプレートに、コート処理されていないトランスウエルインサート（孔径の大きさは5μm、コーニング）が設置された。トランスウエルの上部ウエルに樹状細胞の懸濁液（0.1ml中に1ｘ105細胞）が添加された後に、37℃において3時間インキュベートされた。5分間、5mMPBS-EDTAで処理することにより下部チャンバー内の細胞を剥離し、GuavaPCAシステム上のGuava  ViaCountアッセイによって細胞数を計測した。in  vitroの細胞遊走アッセイのために、フィブロネクチン（10μg/ml）、Ｉ型コラーゲン（3.0mg/ml）又はリンパ管内皮細胞が上部チャンバー膜上にコートされた。（2ｘ104細胞数の）SVEC4-10マウスリンパ管内皮細胞又はヒトの皮膚リンパ管微小血管内皮細胞がフィブロネクチン（2μg/ml）によって被覆されたトランスウエルインサートの上部又は下部の表面に播種された。二日の培養後コンフレントな細胞の層の完全性（integrity）がファロイジン染色で確認された。細胞遊走アッセイはLedgerwoodら（Nat.  Immunol.  (2008)  9,  42−53）によって記載された方法によって6時間実施された。Lammermannら（Nature  (2008)  453,  51−55）によって記載されるように、ミオシンＩＩ又はROCKは50μMのブレビスタチン又は30μMのY-27632を用いて37℃において30分間樹状細胞を処理することによってミオシンＩＩ又はRhoキナーゼであるROCKが阻害された。【０２１９】
さらに、Plexin-A1が欠損された樹状細胞はトランスウエルシステムにおいて、ケモカインによって誘導される、内皮細胞の単層細胞層を通過した遊走能が顕著に衰えていたことが示された（図１２ｄ）。【０２２０】
これらの結果を併せるとPlexin-A1はリンパ管を通過する移動に重要な役割を演じていることが示唆された。【０２２１】
図１２ａ−１
感作されたマウスの耳組織中の皮内に移入されたCFSE標識された野生型及びPlexin-A1が欠損された骨髄由来の樹状細胞の共焦点Zスタック画像分析を示す。樹状細胞を移入してから24時間後に、ビオチン化抗LYVE-1抗体とストレプトアビジン−インドカルボシアニン（赤）を用いて全載標本が染色され評価された。計測バーは50μmを表す。【０２２２】
図１２ａ−２
図１２ａ−１で示される視野中に留まる樹状細胞の定量化を表すグラフである。個々の記号は個々の視野を表し、赤い丸は平均値を表す。*Ｐ値は0.001より小さい（Mann-Whitney  Uテスト）。【０２２３】
図１２ｂ
野生型及びPlexin-A1が欠損された骨髄由来の樹状細胞のリンパ管内皮細胞の単一層を超えた遊走を、低速度撮影のビデオ顕微鏡によって相互作用として30秒毎に記録し評価した図である。黄色の破線は内皮細胞の接合部を示し、白色の矢印はリンパ管内皮細胞と接触している樹状細胞を表す。赤色の矢印は野生型樹状細胞の遊走経過を示す。計測バーは50μmを表す。【０２２４】
図１２ｃ−１
野生型及びPlexin-A1が欠損された骨髄由来の樹状細胞が、内皮細胞単一層に添加され45分間インキュベートされ、固定化された後にAlexa  Fluor  546結合ファロイジン（phalloidin）を用いて染色された共焦点顕微像を示す。画像は0.22μmの光学切片分離（z間隔）を用いて得られた。【０２２５】
図１２ｃ−２
総樹状細胞数に対する移動した樹状細胞数の割合によって示される樹状細胞の移動の定量化（平均値及び標準偏差値）。*Ｐ値は0.001より小さい（Student'sテスト）。【０２２６】
図１２ｄ
リンパ管内皮細胞が単層化された（孔径の大きさが5μmの）トランスウエルインサートを超えての、CCL21濃度勾配（gradient）に応答した野生型及びPlexin-A1が欠損された樹状細胞の遊走能を表すグラフである。*Ｐ値は0.001より小さい（Student'sテスト）。データは三回の試験の代表値である（平均値及び標準偏差値）。
【図１】
0005888728.tif 000002
【図２】
0005888728.tif 000003
【図３】
0005888728.tif 000004
【図４】
0005888728.tif 000005
【図５】
0005888728.tif 000006
【図６】
0005888728.tif 000007
【図７】
0005888728.tif 000008
【図８】
0005888728.tif 000009
【図９】
0005888728.tif 000010
【図１０】
0005888728.tif 000011
【図１１】
0005888728.tif 000012
【図１２】
0005888728.tif 000013
【配列表】
0005888728000001.app