(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ＧＡＧ化デコリンコアタンパク質の製造方法であって、
非ＧＡＧ化デコリンコアタンパク質をコードするレトロウイルスベクターを発現する宿主細胞を提供する工程であって、前記宿主細胞は、ＣＨＯ細胞であり、前記非ＧＡＧ化デコリンコアタンパク質は、ウシα−ラクトアルブミンシグナル配列に作動可能に連結されている工程と、
前記非ＧＡＧ化デコリンコアタンパク質が培養物中で５ｐｇ／細胞／日を上回る速度で生成されるように前記宿主細胞を培養する工程と、
前記非ＧＡＧ化デコリンコアタンパク質を精製する工程と
を含む方法。
【請求項２】
前記非ＧＡＧ化デコリンコアタンパク質が、前記宿主細胞を培養するために用いられる培地中に分泌される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記精製工程が、
前記培養培地とイオン交換媒体とを接触させる工程、または
前記培養培地とヒドロキシアパタイト媒体とを接触させる工程、または
任意の順序で、前記培養培地と少なくとも１つのイオン交換媒体および少なくとも１つのヒドロキシアパタイト媒体とを接触させる工程
を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記精製工程が、
前記培養培地と陽イオン交換媒体とを接触させる工程と、
前記陽イオン交換媒体を洗浄する工程と、
前記陽イオン交換媒体から第１のデコリン含有溶出液を溶出する工程と、
前記第１のデコリン含有溶出液とヒドロキシアパタイト媒体とを接触させる工程と、
前記ヒドロキシアパタイト媒体を洗浄する工程と、
前記ヒドロキシアパタイト媒体から第２のデコリン含有溶出液を溶出する工程と
を含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）さらに、イオン交換膜またはイオン交換カラムを用いて前記第２のデコリン含有溶出液を精製する工程、および／または
（ｂ）ウイルス不活化ステップ、および／または
（ｃ）ウイルス濾過ステップ、および／または
（ｄ）前記デコリンを濃縮する工程
を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ウシα−ラクトアルブミンシグナル配列に作動可能に連結されている非ＧＡＧ化デコリンコアタンパク質をコードするレトロウイルスベクターを含む宿主細胞であって、前記宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である、宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改良されたデコリン組成物およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１つまたは複数のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖を保有するプロテオグリカンは、コアタンパク質の構造的特性に応じて５つのグループに分類することができる大きな遺伝子ファミリーを形成している。これらのグループの１つは、デコリン（ＤＣＮ）、ビグリカン、フィブロモジュリンおよびルミカンで構成されている小分子のロイシンリッチプロテオグリカンファミリーである。これらは、約１２個のアミノ酸のロイシンリッチリピートを含む４０ｋＤａのコアタンパク質によって特徴づけられる。ＤＣＮは、このグループのプロトタイプであり、ＰＧ−Ｓ２、ＰＧ４０、プロテオデルマタン硫酸およびＤＳ−ＰＧＩＩとも称される。ＤＣＮは、成熟コアタンパク質のセリンに共有結合した１つのデルマタンコンドロイチン硫酸ＧＡＧ鎖を含み、多機能プロテオグリカンであると考えられている。
【０００３】
ＤＣＮの提唱される機能には、コラーゲン繊維形成の調節、フィブロネクチンとトロンボスポンジンとの結合を介した組織の完全性の維持、ならびにトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）の貯蔵所が含まれるが、これらに限定されない。ＤＣＮの後者の機能は、細胞表面上で発現する受容体から細胞外環境中の増殖因子を隔離するＤＣＮコアタンパク質を介して達成される。
【０００４】
実験的なげっ歯類の脊髄損傷へのデコリンの注入は、瘢痕形成を抑制し、軸索成長を促進することが示されている。デコリンは、実験マウス腫瘍モデルにおいて抗腫瘍形成特性を有することも示されており、種々の腫瘍細胞株の増殖を抑制することができる。デコリン遺伝子で知られる複数の選択的スプライシング転写変異体がある。デコリン遺伝子の変異は、先天性の間質角膜ジストロフィーと関連づけられている。
【０００５】
当技術分野で必要とされるものは、特に、治療的使用のための改良されたデコリンの製造方法である。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、改良されたデコリン組成物およびそれらの製造方法に関する。
【０００７】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、デコリンをコードする配列に作動可能に連結した異種シグナルペプチドを含む融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、このシグナル配列は、α−ラクトアルブミンシグナル配列である。いくつかの実施形態では、このα−ラクトアルブミン配列は、ウシα−ラクトアルブミンシグナル配列である。いくつかの実施形態では、デコリンをコードする配列は、デコリンコアタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、このデコリンコアタンパク質は、成熟デコリンコアタンパク質の４位に変異を含む。いくつかの実施形態では、この変異は、セリンからアラニンへの変異である。いくつかの実施形態では、このデコリンコアタンパク質は、実質的に、成熟デコリンコアタンパク質の４位におけるグリコサミノグリカン分子による修飾を欠く。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本発明は、上記の融合タンパク質をコードするベクターを提供する。いくつかの実施形態では、このベクターは、デコリンコアタンパク質をコードする配列に作動可能に連結されたα−ラクトアルブミンシグナル配列をコードする核酸配列を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本発明は、上記のベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本発明は、非ＧＡＧ化（ｎｏｎ−ｇａｇｙｌａｔｅｄ）デコリンコアタンパク質の製造方法であって、非ＧＡＧ化デコリンコアタンパク質を発現する宿主細胞を提供する工程と、前記非ＧＡＧ化デコリンコアタンパク質が生成されるように前記宿主細胞を培養する工程と、前記非ＧＡＧ化デコリンコアタンパク質を精製する工程と、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、非ＧＡＧ化デコリンコアタンパク質は、前記宿主細胞の培養に用いられる培地に分泌される。いくつかの実施形態では、この精製の工程は、前記培養培地とイオン交換媒体とを接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、この精製の工程は、前記培養培地とヒドロキシアパタイト媒体とを接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、この精製の工程は、任意の順序で、前記培養培地と少なくとも１つのイオン交換媒体および少なくとも１つのヒドロキシアパタイト媒体とを接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、この精製の工程は、前記培養培地と陽イオン交換媒体とを接触させる工程と、前記陽イオン交換媒体を洗浄する工程と、前記陽イオン交換媒体から第１のデコリン含有溶出液を溶出する工程と、前記第１のデコリン含有溶出液とヒドロキシアパタイト媒体とを接触させる工程と、前記ヒドロキシアパタイト媒体を洗浄する工程と、前記ヒドロキシアパタイト媒体から第２のデコリン含有溶出液を溶出する工程と、を含む。いくつかの実施形態では、この陽イオン交換媒体は、ＳＰ−セファロースＦＦである。いくつかの実施形態では、このヒドロキシアパタイト媒体は、セラミックヒドロキシアパタイト・タイプＩである。いくつかの実施形態では、これらの方法は、さらに、イオン交換膜またはイオン交換カラムを用いて前記第２のデコリン含有溶出液を精製する工程を含む。いくつかの実施形態では、このイオン交換膜は、Ｑイオン交換膜である。いくつかの実施形態では、これらの方法は、さらに、ウイルス不活化ステップを含む。いくつかの実施形態では、このウイルス不活化ステップは、界面活性剤による処理を含む。いくつかの実施形態では、この界面活性剤は、トリトンＸ−１００である。いくつかの実施形態では、これらの方法は、さらに、ウイルス濾過ステップを含む。いくつかの実施形態では、これらの方法は、さらに、前記デコリンを濃縮する工程を含む。いくつかの実施形態は、この非ＧＡＧ化デコリンコアタンパク質は、約１、５、または１０ｐｇ／細胞／日を上回る速度で前記宿主細胞によって生成される。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本発明は、デコリン含有培地からデコリンを精製するための方法であって、前記デコリン含有培地と陽イオン交換媒体とを接触させる工程と、前記陽イオン交換媒体を洗浄する工程と、前記陽イオン交換媒体から第１のデコリン含有溶出液を溶出する工程と、前記第１のデコリン含有溶出液とヒドロキシアパタイト媒体とを接触させる工程と、前記ヒドロキシアパタイト媒体を洗浄する工程と、前記ヒドロキシアパタイト媒体から第２のデコリン含有溶出液を溶出する工程と、イオン交換膜を用いて前記第２のデコリン含有溶出液を濾過してデコリン含有濾液を提供する工程と、前記濾液を処理してウイルスを除去する工程と、前記濾液からデコリンを濃縮する工程と、を含む方法を提供する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本発明は、成熟デコリンコアタンパク質の４位に変異を含む精製されたデコリンコアタンパク質を含む組成物であって、前記デコリンタンパク質は、実質的にＧＡＧ化されておらず、前記組成物中にデコリンコアタンパク質１ｍｇあたり約１００ｎｇ未満の残留宿主細胞タンパク質およびデコリンコアタンパク質１ｍｇあたり約２０ｐｇ未満の残留宿主細胞ＤＮＡを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、これらの組成物は、前記組成物中にデコリンコアタンパク質１ｍｇあたり約５ｎｇ未満の残留宿主細胞タンパク質およびデコリンコアタンパク質１ｍｇあたり約５ｐｇ未満の残留宿主細胞ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、このデコリンは、水溶液として製剤化される。いくつかの実施形態では、この水溶液は、約６.５〜約７.５のｐＨを有するリン酸緩衝液を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】デコリン発現遺伝子配列（配列番号８）である。
【図２】デコリン発現タンパク質配列（配列番号４）である。
【図３】１５日間のバイオリアクター稼働中に生成されたデコリンに対する生存細胞濃度の積分をプロットしたグラフである。各稼働の回帰直線の傾きは、ピコグラム／細胞／日（ｐ／ｃ／ｄ）での細胞生産性に対応する。これらの２つの稼働は、平均２４.４ｐ／ｃ／ｄであった。最大生産量は、一方の稼働では約１．８ｇ／Ｌに達し、他方の稼働では１．７ｇ／Ｌに達した。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。ただし、本発明はこれに限定さ  定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下に定義する。
【００１５】
本明細書で使用する「デコリン」という用語は、配列番号４と少なくとも８０％同一である成熟タンパク質配列を有するタンパク質分子を指す。
【００１６】
本明細書で使用する「デコリンコアタンパク質」という用語は、成熟デコリンの４番目のアミノ酸に変異を有し、実質的に、４番目のアミノ酸にグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）での修飾を欠く（すなわち非ＧＡＧ化）デコリンタンパク質分子を指す。
【００１７】
本明細書で使用する「宿主細胞」という用語は、インビトロまたはインビボでの存在を問わず、任意の真核細胞（例えば、哺乳類細胞、トリ細胞、両生類細胞、植物細胞、魚細胞、および昆虫細胞）を指す。
【００１８】
本明細書で使用する「細胞培養」という用語は、インビトロでの全ての細胞培養を指す。（例えば、不死の表現型を有する）連続細胞株、初代細胞培養、有限な細胞株（例えば、非形質転換細胞）、ならびにインビトロで維持され、卵母細胞および胚を含む任意の他の細胞集団がこの用語に含まれる。
【００１９】
本明細書で使用する「ベクター」という用語は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなどの任意の遺伝要素を指し、ベクターは、適切な調節エレメントと関係づけられた時に複製可能であり、細胞間で遺伝子配列を転送することができる。したがって、この用語には、クローニング用ビヒクルおよび発現用ビヒクル、ならびにウイルスベクターが含まれる。
【００２０】
本明細書で使用する「相補的」または「相補性」という用語は、塩基対合則によって関係しているポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチド配列）への言及で使用される。例えば、配列「５'−Ａ−Ｇ−Ｔ−３'」は、配列「３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−５’」と相補的である。相補性は、「部分的」であってよく、その際、核酸の塩基の一部のみが、塩基対合則にしたがってマッチしている。あるいは、核酸間で「完全（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）」すなわち「完全（ｔｏｔａｌ）」相補性があってよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に著しく影響を与える。これは、増幅反応、および核酸間の結合に依存する検出法において特に重要である。
【００２１】
核酸に関して使用される「相同性」および「％同一性」という用語は、相補性の程度を指す。部分的相同性（すなわち、部分的同一性）または完全相同性（すなわち、完全同一性）があってよい。部分的相補配列は、完全相補配列が標的核酸配列にハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害する配列であり、「実質的に相同」という機能的用語を使用するために言及される。完全相補配列の標的配列へのハイブリダイゼーションの阻害は、低ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロットまたはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど）を用いて調べることができる。実質的に相同な配列またはプローブ（すなわち、興味のある別のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド）は、競合し、低ストリンジェンシー条件下で完全相同配列の標的配列への結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）を阻害する。これは、低ストリンジェンシー条件が非特異的結合を許すと言っているわけではなく、低ストリンジェンシー条件は、２つの配列の互いへの結合が特異的（すなわち、選択的）相互作用であることを必要とする。非特異的結合が存在しないことは、少しでも部分的な相補性の度合い（例えば、約３０％未満の同一性）を欠く第２の標的の使用によって試験することができ、非特異的結合の非存在下で、プローブは、第２の非相補的標的にハイブリダイズしない。
【００２２】
本明細書で使用する「作動可能な組み合わせ」、「作動可能な順序」および「作動可能に連結される」という用語は、特定の遺伝子の転写および／または所望のタンパク質分子の合成を指示することができる核酸分子が生成されるような方法での核酸配列の結合を指す。この用語は、機能タンパク質が生成されるような方法でのアミノ酸配列の結合も指す。
【００２３】
本明細書で使用する「シグナル配列」という用語は、組み換えＤＮＡ配列に作動可能に連結される場合、組換えポリペプチドの分泌を引き起こすことができるシグナルペプチドをコードする任意のＤＮＡ配列を指す。一般に、シグナルペプチドは、一連の約１５〜３０個の疎水性アミノ酸残基を含む（例えば、Ｚｗｉｚｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ.,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２５５（１６）:７９７３−７７［１９８０］,Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ.,Ｇｅｎｅ ３９（２）:２４７−５４［１９８５］、およびＭａｒｔｉａｌ ｅｔ ａｌ.,Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０５:６０２−６０７［１９７９］参照）。かかる分泌シグナル配列は、好ましくは、組織特異的発現を目標とした細胞型から分泌されるポリペプチド（例えば、乳腺分泌細胞での発現および乳腺分泌細胞からの分泌のための分泌乳タンパク質）をコードする遺伝子に由来する。しかし、分泌ＤＮＡ配列は、かかる配列に限定されるものではない。多くの細胞型および生物から分泌されるタンパク質の分泌ＤＮＡ配列（例えば、ｔ−ＰＡ、血清アルブミン、ラクトフェリン、および成長ホルモンの分泌シグナル、ならびに酵母、糸状菌、および細菌に由来するものなどの、分泌ポリペプチドをコードする微生物遺伝子の分泌シグナル）も用いてもよい。
【００２４】
本明細書で使用する「精製」という用語は、通常の環境から取り除かれるか、単離されるか、または分離される核酸配列またはアミノ酸配列のいずれか一方の分子を指す。したがって、「単離される核酸配列」は、精製された核酸配列である。「実質的に精製された」分子は、それらが正常に関連づけられている他の成分を、少なくとも６０％含まない、好ましくは、少なくとも７５％含まない、より好ましくは少なくとも９０％含まない。
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明は、改良されたデコリン組成物およびそれらの製造方法、ならびに患者の治療のためのデコリンの使用に関する。
【００２６】
デコリン
天然のデコリンは、添付のグリコサミノグリカンおよび９０〜１４０ｋＤの平均分子量を有する糖タンパク質である。本発明は、組換えデコリンの生成を企図する。いくつかの好ましい実施形態では、デコリンは、デコリンコアタンパク質、すなわち、実質的非ＧＡＧ化デコリンである。いくつかの実施形態では、デコリンコアタンパク質は、成熟デコリンコアタンパク質分子の４番目のアミノ酸（すなわち、Ｎ末端から４番目のアミノ酸）に変異を含む。いくつかの実施形態では、この変異は、セリンからアラニンへの変異である。いくつかの実施形態では、このデコリンコアタンパク質は、配列番号１（成熟デコリンコアタンパク質）と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％同一であるが、ただし、このデコリンコアタンパク質は、成熟デコリンコアタンパク質分子の４番目のアミノ酸（すなわち、Ｎ末端から４番目のアミノ酸）に変異を含む。
【００２７】
デコリンは、一般にプレプロタンパク質として発現される。本発明は、デコリンプロペプチドおよび成熟ペプチド配列と作動可能に関連する異種シグナル配列を含むデコリン融合分子を提供する。いくつかの実施形態では、異種シグナルポリペプチドは、α−ラクトアルブミンシグナルポリペプチドである。いくつかの実施形態では、α−ラクトアルブミンシグナルポリペプチドは、ウシα−ラクトアルブミンシグナルポリペプチドである。いくつかの実施形態では、この異種シグナルポリペプチドは、配列番号２と少なくとも８０％、９０％、または１００％同一である。いくつかの実施形態では、このプロペプチド配列は、配列番号３と少なくとも８０％、９０％、または１００％同一である。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドのデコリンコアタンパク部分は、配列番号１（成熟デコリンコアタンパク質）と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％同一であるが、ただし、このデコリンコアタンパク質は、成熟デコリンコアタンパク質分子の４番目のアミノ酸（すなわち、Ｎ末端から４番目のアミノ酸）に変異を含む。いくつかの実施形態では、この融合タンパク質は、配列番号４（シグナルプロペプチドデコリンコアタンパク質）と少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％または１００％同一であるが、ただし、このデコリンコアタンパク質は、成熟デコリンコアタンパク質分子の４番目のアミノ酸（すなわち、Ｎ末端から４番目のアミノ酸）に変異を含む。
【００２８】
本発明は、さらに、この融合タンパク質をコードする核酸配列、およびこの核酸配列を含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、この異種シグナルポリペプチドは、配列番号５と少なくとも８０％、９０％、または１００％同一である。いくつかの実施形態では、このプロペプチド配列は、配列番号６と少なくとも８０％、９０％、または１００％同一である。いくつかの実施形態では、この融合ポリペプチドのデコリンコアタンパク質部分は、配列番号７と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％同一であるが、ただし、デコリンコアタンパク質は、成熟デコリンコアタンパク質分子の４番目のアミノ酸（すなわち、Ｎ末端から４番目のアミノ酸）に変異を含む。いくつかの実施形態では、この融合タンパク質は、配列番号８（シグナルプロペプチドデコリンコアタンパク質）と少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％または１００％同一であるが、ただし、デコリンコアタンパク質は、成熟デコリンコアタンパク質分子の４番目のアミノ酸（すなわち、Ｎ末端から４番目のアミノ酸）に変異を含む。
【００２９】
【表１】
0005965927.tif 000002
本発明のデコリンポリヌクレオチドは、組換え技術によってデコリンポリペプチドを生成させるために使用することができる。したがって、例えば、このポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現するための様々な発現ベクターのいずれか１つに含まれていてもよい。本発明のいくつかの実施形態では、ベクターには、レトロウイルスベクター、染色体配列、非染色体配列および合成ＤＮＡ配列（例えば、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡの組合せに由来するベクター、ならびにワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、ならびに仮性狂犬病などのウイルスＤＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。どのベクターも、宿主内で複製可能であり、生存可能である限り、用いることができると企図される。いくつかの好ましい実施形態では、これらのベクターは、米国特許第６，８５２，５１０号および同第７，３３２，３３３号ならびに米国特許公開第２００４０２３３５１７３号および同第２００３０２２４４１５号に記載されているようなレトロウイルスベクターであり、これらの全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの特に好ましい実施形態では、これらのベクターは、偽型のレトロウイルスベクターである。
【００３０】
特に、本発明のいくつかの実施形態は、上記で大まかに説明した配列（例えば、配列番号８）の１つまたは複数を含む組換え構築物を提供する。本発明のいくつかの実施形態では、これらの構築物は、本発明の配列が順方向または逆方向に挿入されたプラスミドベクターまたはウイルスベクターなどのベクターを含む。さらに他の実施形態では、異種構造配列（例えば、配列番号８）は、適切な段階で翻訳の開始配列および終結配列と共に組み立てられる。本発明の好ましい実施形態では、適切なＤＮＡ配列は、様々な手順のいずれかを用いてベクターに挿入される。一般に、このＤＮＡ配列は、当技術分野で公知の手順によって、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（複数可）に挿入される。
【００３１】
多数の適切なベクターが、当業者に公知であり、市販されている。かかるベクターには、以下のベクターが含まれるが、これらに限定されない：１）細菌ベクター−ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（キアゲン社）、ｐＢＳ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＢＳＫＳ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（ストラタジーン社）、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（ファルマシア社）、２）真核ベクター−ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ＰＸＴ１、ｐＳＧ（ストラタジーン社）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（ファルマシア社）、および３）バキュロウイルスベクター−ｐＰｂａｃおよびｐＭｂａｃ（ストラタジーン社）。宿主内で複製可能であり、生存可能である限り、任意の他のプラスミドまたはベクターを用いてもよい。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、任意の必須のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位、転写終結配列、ならびに５'隣接非転写配列を含む。他の実施形態では、ＳＶ４０スプライス部位、およびポリアデニル化部位由来のＤＮＡ配列を用いて、必要な非転写遺伝要素を提供してもよい。
【００３２】
本発明の特定の実施形態では、発現ベクター中のＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を指示するための適切な発現制御配列（複数可）（プロモーター）に作動可能に連結されている。本発明において有用なプロモーターには、ＬＴＲプロモーターまたはＳＶ４０プロモーター、大腸菌のｌａｃプロモーターまたはｔｒｐプロモーター、ラムダファージのＰＬプロモーターおよびＰＲプロモーター、Ｔ３プロモーターおよびＴ７プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）極初期プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼプロモーター、およびマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターならびに原核細胞もしくは真核細胞またはウイルス内で遺伝子発現を制御することが知られている他のプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。本発明の他の実施形態では、組換え発現ベクターには、複製起点および宿主細胞の形質転換を可能にする選択マーカー（例えば、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸還元酵素もしくはネオマイシン耐性、または大腸菌におけるテトラサイクリン耐性もしくはアンピシリン耐性）を含む。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態では、高等真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増加する。エンハンサーは、通常約１０〜３００塩基対であり、プロモーターに作用し、その転写を増加させるＤＮＡのシス作用性エレメントである。本発明において有用なエンハンサーには、複製起点の１００〜２７０塩基後期側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれるが、これらに限定されない。
【００３４】
他の実施形態では、発現ベクターは、翻訳開始のリボソーム結合部位および転写ターミネーターも含む。本発明のさらに他の実施形態では、このベクターは、発現を増幅するための適切な配列も含んでいてよい。
【００３５】
さらなる実施形態では、本発明は、上記の構築物を含む宿主細胞を提供する。本発明のいくつかの実施形態では、この宿主細胞は、高等真核細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞）である。本発明の他の実施形態では、この宿主細胞は、下等真核細胞（例えば、酵母細胞）である。本発明のさらに他の実施形態では、この宿主細胞は、原核細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。宿主細胞の具体例としては、大腸菌、ネズミチフス菌、枯草菌、ならびにシュードモナス属、ストレプトミセス属、およびブドウ球菌の中の様々な種、ならびに出芽酵母、分裂酵母、ショウジョウバエＳ２細胞、スポドプテラＳｆ９細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、サル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７株（Ｇｌｕｚｍａｎ,Ｃｅｌｌ ２３:１７５［１９８１］）、Ｃ１２７、３Ｔ３、２９３、２９３Ｔ、ＨｅＬａおよびＢＨＫの細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
宿主細胞でこれらの構築物を従来の方法で使用し、組換え配列によってコードされる遺伝子産物を生成させることができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞へのこの構築物の導入は、レトロウイルス形質導入、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーションによって達成することができる（例えば、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ.［１９８６］Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ参照）。あるいは、本発明のいくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド合成機により合成によって生成させることができる。
【００３７】
タンパク質は、適切なプロモーターの制御下で、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞において発現させることができる。無細胞翻訳系も、本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用いてかかるタンパク質を生成させるために使用することができる。原核生物宿主および真核生物宿主での使用に適切なクローニングベクターおよび発現ベクターについては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ,ｅｔ ａｌ.（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ,Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ,Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ,Ｎ.Ｙ.によって記載されている。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態では、適切な宿主株の形質転換および培地中で適切な細胞密度になるまでの宿主株の増殖の後に、タンパク質が分泌され、細胞はさらなる期間培養される。本発明の他の実施形態では、細胞は、典型的には、遠心分離によって収集され、物理的または化学的手段によって破壊され、得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持される。本発明のさらに他の実施形態では、タンパク質発現に用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊または細胞溶解剤の使用を含む任意の便利な方法によって破壊することができる。
【００３９】
本発明は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない組換え細胞培養物からデコリンを収集し、精製するための方法も提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、デコリン、特に、デコリンコアタンパク質の精製のための改良された方法を提供する。いくつかの実施形態では、これらのプロセスには、２つのカラムクロマトグラフィーステップおよび研磨ステップが含まれる。
【００４０】
いくつかの好ましい実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、デコリン含有培地、好ましくは、清澄化培地からデコリンを捕捉する。いくつかの実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィー媒体は、ＳＰ−セファロースＦＦである。いくつかの実施形態では、陽イオン交換媒体を、中性ｐＨの約５ｍＭ〜１５ｍＭのリン酸ナトリウム、好ましくは、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、および２０〜７０ｍＭのＮａＣｌ、好ましくは、約５０ｍＭのＮａＣｌで平衡化する。いくつかの実施形態では、陽イオン交換媒体にデコリン含有培地を添加後、陽イオン交換媒体を洗浄する。いくつかの実施形態では、洗浄緩衝液は、約５ｍＭ〜１５ｍＭのリン酸ナトリウム、好ましくは、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、および２０〜７０ｍＭのＮａＣｌ、好ましくは、約５０ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態では、デコリンを、その後、陽イオン交換媒体から溶出する。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、約５ｍＭ〜１５ｍＭのリン酸ナトリウム、好ましくは、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、および１５０〜２５０ｍＭのＮａＣｌ、好ましくは、約２００ｍＭのＮａＣｌを含む。
【００４１】
いくつかの実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィーステップのデコリン含有溶出液を、ヒドロキシアパタイト媒体に添加する。いくつかの実施形態では、このヒドロキシアパタイト媒体は、ＣＨＴタイプ１である。いくつかの実施形態では、ヒドロキシアパタイト媒体を、約５ｍＭ〜１５ｍＭのリン酸ナトリウム、好ましくは、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、および１５０〜２５０ｍＭのＮａＣｌ、好ましくは、約２００ｍＭのＮａＣｌで平衡化する。いくつかの実施形態では、ヒドロキシアパタイト媒体へのデコリン含有培地の添加後、ヒドロキシアパタイト媒体を洗浄する。いくつかの実施形態では、洗浄緩衝液は、約５ｍＭ〜１５ｍＭのリン酸ナトリウム、好ましくは、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、および１５０〜２５０ｍＭのＮａＣｌ、好ましくは、約２００ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態では、デコリンを、その後、ヒドロキシアパタイト媒体から溶出する。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、約０．２Ｍ〜０．４Ｍのリン酸ナトリウム、好ましくは、０．３Ｍのリン酸ナトリウム、および１５０〜２５０ｍＭのＮａＣｌ、好ましくは、約２００ｍＭのＮａＣｌを含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーステップのデコリン含有溶出液の緩衝液を交換し、イオン交換膜に添加する。いくつかの実施形態では、このイオン交換膜は、Ｑイオン交換媒膜、例えば、ムスタングＱイオン交換媒体である。いくつかの実施形態では、この膜を、約３０ｍＭ〜７０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、好ましくは約５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌで平衡化する。いくつかの実施形態では、膜へのデコリン含有溶液の添加後、膜を洗浄し、デコリンは、この膜を通過する。いくつかの実施形態では、洗浄緩衝液は、約３０ｍＭ〜７０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、好ましくは、約５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌを含む。精製後、デコリンを、好ましくは、例えば、フロー濾過により、所望の濃度まで濃縮する。
【００４３】
本発明の他の実施形態では、デコリン含有溶液を処理して、ウイルスを不活化または除去する。いくつかの実施形態では、デコリン含有溶液を界面活性剤で処理して、ウイルスを不活化する。いくつかの実施形態では、この界面活性剤は、トリトンＸ−１００である。いくつかの実施形態では、この界面活性剤で処理するステップを、陽イオン交換クロマトグラフィーのステップ後に行う。いくつかの実施形態では、デコリン含有溶液を濾過し、ウイルスを除去する。いくつかの実施形態では、これらの溶液を、ウイルスフィルター（例えば、Ｖｉｒｏｓａｒｔウイルスフィルター）に通して濾過する。いくつかの実施形態では、濾過ステップを、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーステップ後に行う。
【００４４】
本発明のプロセスは、好ましくは、ヒト患者の臨床使用に適するデコリン組成物を提供する。いくつかの実施形態では、これらの組成物は、デコリンタンパク質が実質的にＧＡＧ化されないように、成熟デコリンコアタンパク質の４位に変異を含む精製されたデコリンコアタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、これらの組成物は、精製されたデコリンコアタンパク質を提供し、これらの組成物は、組成物中、デコリンコアタンパク質１ｍｇあたり約１００、５０、２０、１０、５もしくは２ｎｇ未満の残留宿主細胞タンパク質および／またはデコリンコアタンパク質１ｍｇあたり約２０、１０、５、または２ｐｇ未満の残留宿主細胞ＤＮＡを含むことを特徴とする。いくつかの実施形態では、デコリンを水溶液で提供する。いくつかの実施形態では、この水溶液は、ｐＨが約６.５〜７.５、好ましくは、約７．０であるリン酸緩衝生理食塩水（例えば、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム）である。
（１）非ＧＡＧ化デコリンコアタンパク質の製造方法であって、
非ＧＡＧ化デコリンコアタンパク質を発現する宿主細胞を提供する工程と、
前記非ＧＡＧ化デコリンコアタンパク質が生成されるように前記宿主細胞を培養する工程と、
前記非ＧＡＧ化デコリンコアタンパク質を精製する工程と
を含む方法。
（２）前記非ＧＡＧ化デコリンコアタンパク質が、前記宿主細胞を培養するために用いられる培地中に分泌される、（１）に記載の方法。
（３）前記精製工程が、前記培養培地とイオン交換媒体とを接触させる工程を含む、（２）に記載の方法。
（４）前記精製工程が、前記培養培地とヒドロキシアパタイト媒体とを接触させる工程を含む、（２）に記載の方法。
（５）前記精製工程が、任意の順序で、前記培養培地と少なくとも１つのイオン交換媒体および少なくとも１つのヒドロキシアパタイト媒体とを接触させる工程を含む、（２）に記載の方法。
（６）前記精製工程が、
前記培養培地と陽イオン交換媒体とを接触させる工程と、
前記陽イオン交換媒体を洗浄する工程と、
前記陽イオン交換媒体から第１のデコリン含有溶出液を溶出する工程と、
前記第１のデコリン含有溶出液とヒドロキシアパタイト媒体とを接触させる工程と、
前記ヒドロキシアパタイト媒体を洗浄する工程と、
前記ヒドロキシアパタイト媒体から第２のデコリン含有溶出液を溶出する工程と
を含む、（２）に記載の方法。
（７）前記陽イオン交換媒体がＳＰ−セファロースＦＦである、（６）に記載の方法。
（８）前記ヒドロキシアパタイト媒体がセラミックヒドロキシアパタイトタイプＩである、（６）に記載の方法。
（９）さらに、イオン交換膜またはイオン交換カラムを用いて前記第２のデコリン含有溶出液を精製する工程を含む、（６）に記載の方法。
（１０）前記イオン交換膜が、Ｑイオン交換膜である、（９）に記載の方法。
（１１）さらに、ウイルス不活化ステップを含む、（６）に記載の方法。
（１２）前記ウイルス不活化ステップが、界面活性剤による処理を含む、（１）に記載の方法。
（１３）前記界面活性剤がトリトンＸ−１００である、（２）に記載の方法。
（１４）さらに、ウイルス濾過ステップを含む、（６）に記載の方法。
（１５）さらに、前記デコリンを濃縮する工程を含む、（６）に記載の方法。
（１６）前記非ＧＡＧ化デコリンコアタンパク質が、約１、５、または１０ｐｇ／細胞／日を上回る速度で前記宿主細胞によって生成される、（１）に記載の方法。
（１７）デコリン含有培地からデコリンを精製するための方法であって、
前記デコリン含有培地と陽イオン交換媒体とを接触させる工程と、
前記陽イオン交換媒体を洗浄する工程と、
前記陽イオン交換媒体から第１のデコリン含有溶出液を溶出する工程と、
前記第１のデコリン含有溶出液とヒドロキシアパタイト媒体とを接触させる工程と、
前記ヒドロキシアパタイト媒体を洗浄する工程と、
前記ヒドロキシアパタイト媒体から第２のデコリン含有溶出液を溶出する工程と、
イオン交換膜を用いて前記第２のデコリン含有溶出液を濾過して、デコリン含有濾液を提供する工程と、
前記濾液を処理してウイルスを除去する工程と、
前記濾液からデコリンを濃縮する工程と
を含む方法。
（１８）前記成熟デコリンコアタンパク質の４位に変異を含む精製されたデコリンコアタンパク質を含む組成物であって、
前記デコリンタンパク質が実質的にＧＡＧ化されておらず、前記組成物中にデコリンコアタンパク質１ｍｇあたり約１００ｎｇ未満の残留宿主細胞タンパク質およびデコリンコアタンパク質１ｍｇあたり約２０ｐｇ未満の残留宿主細胞ＤＮＡを含む組成物。
（１９）前記組成物が、前記組成物中にデコリンコアタンパク質１ｍｇあたり約５ｎｇ未満の残留宿主細胞タンパク質およびデコリンコアタンパク質１ｍｇあたり約５ｐｇ未満の残留宿主細胞ＤＮＡを含む、（１８）に記載の組成物。
（２０）前記デコリンが水溶液として製剤化される、（１８）に記載の組成物。
（２１）前記水溶液が、約６.５〜約７.５のｐＨを有するリン酸緩衝液を含む、（２０）に記載の組成物。
（２２）デコリンをコードする配列に作動可能に連結した異種シグナルペプチドを含む融合タンパク質。
（２３）前記シグナル配列が、α−ラクトアルブミンシグナル配列である、（２２）に記載の融合タンパク質。
（２４）前記α−ラクトアルブミン配列が、ウシα−ラクトアルブミンシグナル配列である、（２３）に記載の融合タンパク質。
（２５）前記デコリンをコードする配列が、デコリンコアタンパク質をコードする、（２２）に記載の融合タンパク質。
（２６）前記デコリンコアタンパク質が、成熟デコリンコアタンパク質の４位に変異を含む、（２５）に記載の融合タンパク質。
（２７）前記変異がセリンからアラニンへの変異である、（２６）に記載の融合タンパク質。
（２８）前記デコリンコアタンパク質が、実質的に、成熟デコリンコアタンパク質の４位におけるグリコサミノグリカン分子による修飾を欠く、（２５）に記載の融合タンパク質。
（２９）（２２）に記載の融合タンパク質をコードするベクター。
（３０）前記ベクターが、デコリンコアタンパク質をコードする配列に作動可能に連結されたα−ラクトアルブミンシグナル配列をコードする核酸配列を含む、（２９）に記載のベクター。
（３１）（２９）に記載のベクターを含む宿主細胞。
【００４５】
実験
実施例１
ヒトデコリンの変異型の発現および生成の最適化
デコリンの変異型用の発現コンストラクトを製造した。セリンからアラニンへの変更を、成熟デコリンの４番目のアミノ酸の位置で行った。この変異は、ＧＡＧがデコリン分子に結合するのを防ぐ。この発現コンストラクトは、タンパク質生成および分泌のための内因性シグナルペプチドの代わりに、ウシα−ラクトアルブミンシグナルペプチドを使用する。この構築物を、図７および図８に示す。
【００４６】
この発現構築物が、正しいタンパク質の形成をもたらすことを確認するために、ＣＨＯ細胞株を、ＧＰＥｘ（登録商標）プロセスおよび上記の遺伝子構築物を用いて作製した。デコリンを生成させ、精製した。Ｎ末端アミノ酸配列決定を、精製タンパク質にて行った。得られた配列を以下に示す。
Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ（配列番号９）
この配列は、成熟タンパク質の予想される配列に対応している。アラニン変異を、期待どおりに組み込み、シグナルペプチドおよびプロタンパク質を切断して、正しい成熟デコリンＮ−末端配列を得た。
【００４７】
変異型デコリンを生成するクローン細胞株を、ＧＰＥｘ（登録商標）を用いて作製した。トップ（ｔｏｐ）発現細胞株を、異なる培養条件および預けられているマスター細胞をスクリーニングすることによって選択した。この細胞株の生成を、流加条件を用いて、２つの１０Ｌバイオリアクター稼働で検討した。この稼働の結果を図９に示す。
【００４８】
実施例２
デコリンコアタンパク質の精製
１．０概要
精製の工程を小規模で行い、精製物を２００Ｌの１バッチに添加し、流加供給方式を用いてＧＭＰスイートで生成した。このバッチを、１４日目に約５０％の生存率レベルで収集した。バイオリアクターの１４日目（収集日）のタンパク質濃度のレベルは、１．２４０ｇ／Ｌであった。
【００４９】
１．１  ＤＣＰの合成で使用される成分
全培養ステップのために用いられる細胞培養培地は、Ｌ−グルタミンおよび０.１％プルロニックＦ６８を有するハイクローン（ＨｙＣｌｏｎｅ）（ローガン、ユタ州、米国）ＨＹＱ ＰＦ−ＣＨＯ液体大豆（Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｏｙ）（ＬＳ）であった。この培地を、完全無菌の液体として受け取った。ＨｙＱ ＰＦ−ＣＨＯ ＬＳは、専売のタンパク質を含まないハイクローンの培養培地製剤である。正確な成分は知られていないが、ハイクローンは、ＨｙＱ ＰＦ−ＣＨＯ ＬＳ（参照番号ＢＢＭＦ８３０２）についてのＦＤＡと共に、無血清培地用のタイプＩＩデバイスファイル（Ｔｙｐｅ ＩＩ Ｄｅｖｉｃｅ Ｆｉｌｅ）を保持する。ＨｙＱ ＣｅｌｌＢｏｏｓｔ Ｒ１５．４は、生産培養で使用されるハイクローンの専売培地補充製剤である。
【００５０】
１．２  ＤＣＰの生成
【００５１】
【表２】
0005965927.tif 000003
１．２．１  ２００Ｌ生産培養接種のスケールアップ
各継代培養ステップの詳細を、以下の接種培養スケールアップの処理ステップの表に示す。製造ロット０９０１８は、ロット番号０６００５（バイアル＃１８２）のＭＣＢバイアルを３７℃の水浴で解凍することによって開始した。ＭＣＢ凍結バイアルを解凍した後、これらの細胞を、ＨＹＱ ＰＦ−ＣＨＯ ＬＳ細胞培養培地３５ｍＬを含む単一振とうフラスコ（２５０ｍＬ）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に添加した。血球計を用いて決定した初期細胞数は２．２５×１０５細胞／ｍＬであり、生存率は９０.４％であった。次いで、培養物を、加湿、５％ＣＯ２環境中３７℃に維持したインキュベーター内のオービタルシェーカー（９０ｒｐｍ）上に置いた。継代培養ステップは、約２.０×１０５細胞／ｍｌの接種密度を目標とした。フラスコ中の３日目の細胞数および生存率（％）は、１４.２４×１０５細胞／ｍＬ、９５.８％生存率であり、このフラスコを１Ｌフラスコに継代した。１Ｌフラスコの３日目の平均生存細胞数は２３.４３×１０５細胞／ｍＬであり、生存率は９８.１％であった。この１Ｌフラスコを、初期培養液量および初期標的細胞密度がそれぞれ１０００ｍＬおよび２.０×１０５細胞／ｍＬで、１０Ｌの使い捨てウェーブバッグを有するウェーブバイオリアクターシステム２０ＥＨ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンスバイオプロセス社、サマセット、ニュージャージー州）に継代培養した。ウェーブバイオリアクターの動作設定は、インキュベーション温度が３７.０℃、ロッカー速度が１５.０ｃｐｍ、ロッキング角度が１１.０°、および通気ガス中のＣＯ２濃度が５.０％、ガス流速は０.２５Ｌ／分であった。２日後、ウェーブバッグ中の生存細胞密度は１０.２８×１０５細胞／ｍｌであり、新鮮なＨＹＱ ＰＦ−ＣＨＯ ＬＳを、培養液量が４９９２ｍＬになるまで添加した。３日後、生存細胞密度は１８.３７×１０５細胞／ｍＬであり、ウェーブバッグ中の内容物を、３０Ｌのバイオリアクターに移した。温度、ｐＨ、溶存酸素、圧力および撹拌速度についてのこの３０Ｌのバイオリアクターの動作設定点は、それぞれ３７℃、空気飽和４０％、圧力１ｐｓｉｇ、および５０ｒｐｍ攪拌速度であった。ｐＨ調節器を稼働せず、細胞がｐＨ７に向かって自然に漂うのを可能にさせた。
【００５２】
【表３】
0005965927.tif 000004
１．２．２  ２００Ｌ生成用バイオリアクター内での培養
最初に、ＨｙＱ ＰＦ−ＣＨＯ ＬＳ細胞培養培地１３７ＫｇおよびＨｙＱ Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ Ｒ１５．４の１２％（ｗ／ｖ）溶液４．３Ｋｇを、２００Ｌのバイオリアクターに添加した。生産培養の「０日目」は、２００Ｌのバイオリアクターに接種した日と考えた。
【００５３】
３０Ｌのバイオリアクター内の生存細胞密度は、培養の２日目に１４．８７×１０５細胞／ｍＬであり、これは、最初の目標密度２．００×１０５細胞／ｍＬで２００Ｌのバイオリアクターに接種するのに十分であった。３０Ｌの全内容物を移し、接種後の重量、細胞密度および生存率は、それぞれ１７１.９Ｋｇ、２.９０×１０５細胞／ｍＬおよび９３.９％であった。温度、ｐＨ、溶存酸素、圧力および撹拌速度についてのこの２００Ｌのバイオリアクターの動作設定点は、それぞれ３７℃、ｐＨ７．０、空気飽和４０％、圧力１ｐｓｉｇ、および３５ｒｐｍ攪拌速度であった。
【００５４】
ｐＨのデッドゾーンを、最初に、接種前に、実際のｐＨ値マイナス７.０に設定した。これを行うことによって、ＣＯ２の添加を防ぎ、細胞がｐＨ７に向かって自然に漂うのを可能にさせた。最初のデッドゾーン設定は０.３２であった。接種後、このｐＨを毎日チェックし、このデッドゾーンを、実際のｐＨ値マイナス７.０に調整した。１日目に、このｐＨのデッドゾーンを０.２２まで減少させ、３日目、このデッドゾーンを０.０５に設定し、この稼働の残りについてはこの設定を維持した。
【００５５】
第１のフィードを、グルコース値が５ｇ／Ｌ以下に低下した２日目もしくは３日目、またはデフォルトまで低下した３日目に行った。２日目に、グルコース値が５ｇ／Ｌを下回ったので、１２％ｗ／ｖのＨｙＱ Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ Ｒ１５．４＋１２０ｍＭのＬ−グルタミン溶液４．４ｋｇ（Ｌ）をこのバイオリアクターに添加した。次のフィードを、グルコース値が５ｇ／Ｌ以下に低下した４日目または５日目に行った。４日目に、グルコース値は５ｇ／Ｌを下回り、これにより、１２％ｗ／ｖのＨｙＱ Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ Ｒ１５．４溶液９ｇ／Ｌ（１４.２Ｌ）のフィードを追加した。５日目に、温度を３７℃から３１℃に下げた。収集までの６日間、グルコース値を毎日チェックし、グルコース値が５ｇ／Ｌ以下に低下した任意の日に、グルコースを３ｇ／Ｌ増加させるために、２０％グルコース溶液を添加した。８日目および１２日目に、グルコース値は、それぞれ４.８４ｇ／Ｌおよび４.９８ｇ／Ｌに低下した。８日目および１２日目に、２０％グルコース溶液２．９ｋｇ（Ｌ）および３．０ｋｇ（Ｌ）をこのバイオリアクターに添加した。
【００５６】
生存細胞密度は、６１.００×１０５細胞／ｍＬで５日目にピークに達し、生存率は９５.７％であった。細胞生存率が５０．２％であり、バイオリアクターの最終重量が１９１．８Ｋｇであった２００９年１１月３日（１４日目）にこのバイオリアクターを収集した。
【００５７】
積分した細胞数（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｎｕｍｂｅｒ）（ＩＣＮ）を得て、タンパク質結果に対してプロットし、傾斜が１４日間の稼働のｐｃｄ（２７.３１６）を与える曲線を得た。
【００５８】
１．４  開始時の生産の概要
このロットを１４日目に収集し、生存率は５０．２％、力価は１．２４０ｇ／Ｌであった。このバッチを下流に移し、終了時点のバッチ処理レコード（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｂａｔｃｈ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｒｅｃｏｒｄ）ごとに精製した。
【００５９】
ＤＣＰ  ２００Ｌの終了時点の精製
１．３  概要
以下で概説するとおり、２００Ｌバッチからの収集物を精製し、最終体積４２Ｌ中２１１ｇ（５ｍｇ／ｍＬ時）が得られた。最終バルク製剤原料は、このバッチについて以前に承認された仕様を満たした。特に明記しない限り、全ての濃度を吸光度によって測定した。
【００６０】
１．４  清澄化（２００９年１１月３日）
収集物（１８９Ｌ）を、体積／面積が５．９Ｌ／ｆｔ２であり、初期流速３Ｌ／分で、Ｃｕｎｏ ６０Ｍ０２マキシマイザーフィルター（Ｍａｘｉｍｉｚｅｒ ｆｉｌｔｅｒ）（２×１６ｆｔ２）を通して濾過し、かつ０．２２μｍ １０”ミリポア社のオプティキャップフィルター（Ｏｐｔｉｃａｐ ｆｉｌｔｅｒ）を通して濾過した。フィルターハウジングに圧縮窒素を吹きつけて、生成物の回収を最大限にした。
【００６１】
【表４】
0005965927.tif 000005
１．５  捕捉−陽イオン交換クロマトグラフィー
清澄化培地からタンパク質を捕捉するためにＳＰ−セファロースＦＦ（ＧＥヘルスケア社）を用いた。カラム上で捕捉する前に、この清澄化培地を希釈して、伝導率を下げた。この稼働条件を、様々な画分の分析と共に以下に示す。この清澄化培地を、２つのサブバッチとして処理した。
【００６２】
【表５】
0005965927.tif 000006
捕捉−ＳＰ−セファロースサブバッチＡ
【００６３】
【表６】
0005965927.tif 000007
【００６４】
【表７】
0005965927.tif 000008
１．５．１  捕捉−ＳＰ−セファロースサブバッチＢ
【００６５】
【表８】
0005965927.tif 000009
【００６６】
【表９】
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１．６  ウイルスの不活化
２つのＳＰ−セファロースサブロットを、それぞれ、１％の濃度まで希釈した１１％（ｗ／ｖ）のトリトンＸ−１００を用いてウイルスを不活化した。これらのロットを、ＣＨＴクロマトグラフィーの前に６０〜９０分間、穏やかに混合しながら室温でインキュベートした。ウイルスの不活化物質のその後の処理を、ＩＳＯ７スイートで行った。
【００６７】
【表１０】
0005965927.tif 000011
１．７  中間体−セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）クロマトグラフィー
ＣＨＴタイプI（バイオラッド社）を用いて、ＳＰセファロースプール中の残留ＣＨＯタンパク質からＤＣＰをさらに精製し、不活化ステップからのトリトンを除去した。この稼働条件を、種々の画分の分析と共に以下に示す。ＳＰ−セファロースプールを、上記のとおり２つのサブバッチとして処理した。
【００６８】
【表１１】
0005965927.tif 000012
１．７．１  ＣＨＴサブバッチＡ
【００６９】
【表１２】
0005965927.tif 000013
【００７０】
【表１３】
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１．７．２  中間体−ＣＨＴサブバッチＢ
【００７１】
【表１４】
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【００７２】
【表１５】
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１．８  ＣＨＴプールの中間体の緩衝液交換
２つのＣＨＴプール（４７.８Ｌ）を合わせ、等量の水で希釈し、総体積９５.６Ｌを得た。これを、０．６ｍ２ Ｐｒｅｐ／スケールＴＦＦカートリッジ（ミリポア社）、１０ＫＭＷＣＯを用いて、約４５Ｌおよび約６．５７ｍｇ／ｍＬまで約２倍濃縮した。再循環流速は５Ｌ／分であり、約２０ｐｓｉの背圧を維持した。
【００７３】
次いで、この濃縮物を、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５（５５．５Ｌ）の７．９倍の体積に対して連続的に透析濾過し、緩衝液交換の終了時の透過伝導率（ｐｅｒｍｅａｔｅ ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）が５ｍＳ／ｃｍ（４．４０ｍＳ／ｃｍ）未満であることを確認した。このフィルターを洗浄し、この濃縮物を合わせて、２〜８℃での貯蔵前に０.２μｍで濾過した。
【００７４】
【表１６】
0005965927.tif 000017
１．９  研磨−ムスタングＱろ過
ムスタングＱ（Ｐａｌｌ社）ステップをフロースルーモードで行い、全ての結合物質を塩化ナトリウムストリップで溶出した。緩衝液交換をしたプールを、調整済みのムスタングＱ膜上に直接添加した。
【００７５】
【表１７】
0005965927.tif 000018
【００７６】
【表１８】
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【００７７】
【表１９】
0005965927.tif 000020
１．１０  ウイルス濾過
ムスタングＱプールを、Ｖｉｒｏｓａｒｔフィルターを用いてウイルス濾過した。
【００７８】
【表２０】
0005965927.tif 000021
このフィルターを、３０ｐｓｉの窒素で、注入用の水（ＷＦＩ）３Ｌで湿らせた。
【００７９】
ムスタングＱプールを、３０ｐｓｉの窒素下で、このフィルターに通過させた。次いで、このフィルターをＷＦＩ５Ｌで洗い流した。
【００８０】
【表２１】
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１．１１  濃度および製剤
ウイルス濾液（４８．０Ｌ）を、２×０．６ｍ２ Ｐｒｅｐ／Ｓｃａｌｅ ＴＦＦカートリッジ（ミリポア社）、１０ＫＭＷＣＯを用いて濃縮し、緩衝液交換をした。再循環流速は５Ｌ／分であり、２０ｐｓｉの供給圧力を維持した。
【００８１】
ウイルスのろ液を、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７.０の６.９倍の容積に対して、４８.５Ｌの最終容積まで連続的に透析濾過した。次いで、このバルクを約４０Ｌまで濃縮し、次いで、このカートリッジを、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７.０の２.４Ｌで洗い流し、全ての残留タンパク質を除去した。これを濃縮物と共にプールし、濃度を５.０ｇ／Ｌ（４２.２Ｌ総体積）であると決定した。次いで、最終バルクを、０.２μｍフィルターを用いてバッグに濾過して入れた。
【００８２】
【表２２】
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２  ステップの回収率の表
以下の表は、このバッチの精製に用いたステップのそれぞれのステップ回収率を示す。注釈：これらの値は、ウイルスバリデーションサンプリングを考慮しない。
【００８３】
【表２３】
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上記明細書で言及した全ての刊行物および特許は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の範囲および趣旨から逸脱することのない、本発明に記載の方法およびシステムの様々な変更および変形は、当業者には明らかであろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して説明してきたが、特許請求される本発明は、かかる特定の実施形態に不当に限定されるものではないことを理解すべきである。実際に、本発明の分野の当業者に明らかである本発明を実施するための記載された態様の種々の変更は、添付の特許請求の範囲内にあると意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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