(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ape1（Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease 1）の発現が亢進していることを特徴とする血管内皮前駆細胞を含み、血管再生、臓器再生、癌の予防・治療、又は、下肢虚血、心筋梗塞、及び脳梗塞を含む虚血疾患の予防・治療に用いられる細胞製剤。
【請求項２】
Ape1の発現の亢進がApe1発現誘導に基づくものである、請求項１に記載の細胞製剤。
【請求項３】
Ape1発現誘導がApe1遺伝子導入に基づくものである、請求項２に記載の細胞製剤。
【請求項４】
Ape1発現誘導がApe1タンパク質導入に基づくものである、請求項２に記載の細胞製剤。
【請求項５】
Ape1発現誘導がApe1発現誘導剤に基づくものである、請求項２に記載の細胞製剤。
【請求項６】
Ape1発現誘導剤がTNF-α、IL1β、及びIFγから選ばれるいずれか１又は２以上である、請求項５に記載の細胞製剤。
【請求項７】
細胞が前記細胞製剤による治療を必要とする患者由来のものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞製剤。
【請求項８】
静脈投与、筋肉内投与、又は組織に直接適用されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞製剤。
【請求項９】
シート状である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞製剤。
【請求項１０】
血管内皮前駆細胞において、Ape1（Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease 1）の発現を亢進させることを特徴とする、臓器再生能又は新生能が向上した血管内皮前駆細胞のin vitroでの製造方法であって、前記発現の亢進が、Ape1遺伝子導入、Ape1タンパク質導入、又はApe1発現誘導剤によるApe1発現誘導に基づくものである方法。
【請求項１１】
血管内皮前駆細胞において、Ape1（Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease 1）の発現を亢進させることを特徴とする、血管再生能又は新生能が向上した血管内皮前駆細胞のin vitroでの製造方法であって、前記発現の亢進が、Ape1遺伝子導入、Ape1タンパク質導入、又はApe1発現誘導剤によるApe1発現誘導に基づくものである方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は高機能化幹細胞・前駆細胞に関する。より具体的には、Ape1の発現の亢進により血管新生等の機能が向上した血管内皮前駆細胞や間葉系幹細胞等の高機能化幹細胞・前駆細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管内皮前駆細胞（endothelial progenitor cell; EPC）は、末梢血や骨髄などに由来するCD34陽性の細胞群で、最終的に血管内皮細胞への分化能を有することで血管新生を促し、血管再生に貢献する（非特許文献１）。【０００３】
末梢血中の血管内皮前駆細胞の数は、心血管系疾患リスクの程度と逆相関し（非特許文献２）、冠動脈疾患患者の死亡率と逆相関すること（非特許文献３）が報告されている。このことは、虚血部位における血管新生に血管内皮前駆細胞が重要な役割を果たしていることを示唆する。【０００４】
CD34陽性細胞含有率は、末梢血単核球に比べて骨髄単核球のほうが約100倍高い。臨床においては、末梢動脈疾患患者（ASO・バージャー病に伴うヒト虚血肢）に対する自己骨髄細胞を利用した血管再生（新生）療法が実施され、良好な成績が報告されている（非特許文献４）。しかしながら、患者の負担を考慮すると、骨髄細胞よりも末梢血単核球に由来する血管内皮前駆細胞を用いた移植術のほうが好ましい。そのため、VEGF、SDF、G-CSFなどを用いて骨髄から末梢血に血管内皮前駆細胞を強制的に動員する方法も試みられている。【０００５】
一方、発明者らは、血管内皮前駆細胞の移植が癌細胞の増殖を抑制し、腫瘍血管の構築に著しい変化をもたらすことを見出し、血管内皮前駆細胞を用いた抗癌療法について報告している（特許文献１）。【０００６】
自己の細胞を用いた再生医療は、倫理面や安全面でのメリットがある。しかしながら、心血管系疾患リスクの高い糖尿病や慢性腎不全患者、高齢者においては、血管内皮前駆細胞の数及び機能が低下しており（非特許文献５〜７）、移植に必要な量の細胞を調製することができない。こうした問題に対し、血管内皮前駆細胞をin vitroで増殖させる方法（特許文献２）や、未成熟幹細胞からNotchリガンドを作用させて血管内皮前駆細胞に分化誘導する方法（特許文献３）が報告されている。【０００７】
数少ない血管内皮前駆細胞を用いて効果的な再生医療を行うためには、低下した患者由来の血管内皮前駆細胞機能を改善し、高機能化した血管内皮前駆細胞を調製することが望まれる。スタチンやプロスタサイクリンで刺激することで血管内皮前駆細胞の機能を高める方法もあるが、効果が一時的で持続しないという問題がある。VEGFやTERT等の遺伝子を導入することで血管内皮前駆細胞の機能を高める方法も考えられるが、EPCの一部の機能を向上させるにとどまり、EPCとしての全体の機能改善効果は達成されないため、臨床応用に結びつく改善法ではない。【０００８】
Ape1（Apurinic/Apyrimidinic  Endonuclease 1）は、HAP1又はRef-1としても知られ、AP部位のすぐ5'側にあるホスホジエステル・バックボーンを加水分解によって切断し、3'-ヒドロキシル及び5'-デオキシリボースリン酸末端をもつ一本鎖DNA断片を産生するAPエンドヌクレアーゼである。【０００９】
Ape1の生理機能については、その阻害による抗腫瘍効果を示唆する報告が散見される。たとえば、Ape1の低分子阻害剤（E3330）により、HUVECやEPCの増殖と機能が抑制されることが報告されている（非特許文献８）。また、Tatタグ付加型Ape1を内皮細胞に導入すると、TNF-αにより誘導される細胞接着分子VCAM-1の発現が抑制され、単核球の接着が抑制されることが報告されている（非特許文献９）。【００１０】
しかしながら、これらの知見は、いずれも血管内皮前駆細胞に対してApe1が抑制的に作用することを示唆する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】WO2008/142862
【特許文献２】特開2009-189743
【特許文献３】特開2007-89536
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Science, 1997, 275, 964-967
【非特許文献２】New Eng J Med 2003, 348, 593-600
【非特許文献３】New Eng J Med 2005, 353, 999-1007
【非特許文献４】Lancet 2002, 360, 427-435
【非特許文献５】Circulation, 2002, 106, 2781-2786
【非特許文献６】Arterio Throm Vasc Biol, 2006, 2140-2146
【非特許文献７】Diabetes, 2007, 56, 1559-1568,
【非特許文献８】Journal of Cellular Physiology. 2008, 209-218
【非特許文献９】Biochemical and Biophysical Communications,2008, 368, 68-73
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の課題は、幹細胞・前駆細胞、特に血管内皮前駆細胞や間葉系幹細胞の機能を向上させることにより、患者由来の限られた幹細胞・前駆細胞を用いて、より効果的な血管再生（新生）療法を実現することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明者らは、血管内皮前駆細胞（Endothelial Progenitor Cell: EPC）の高機能化を目指して種々の検討を行い、血管内皮前駆細胞の機能がApe1遺伝子の発現とリンクしていることを見出した。さらに、Ape1遺伝子の強制発現によって血管内皮前駆細胞の機能が顕著に亢進し、この高機能化した血管内皮前駆細胞を動物実験モデルに投与すると、血管再生効果が増大することを確認した。【００１５】
また発明者らは、間葉系幹細胞株や心筋幹細胞にApe１遺伝子を導入することで、血管内皮前駆細胞の場合と同様に、酸化ストレスによる細胞障害が緩和されることを確認した。【００１６】
これらの結果は、Ape1により高機能化された血管内皮前駆細胞、間葉系幹細胞、心筋幹細胞等の幹細胞・前駆細胞が、組織や臓器の再生療法の向上に有用であることを示す。【００１７】
すなわち、本発明は、Ape1（Apurinic/Apyrimidinic  Endonuclease 1）の発現が亢進していることを特徴とする幹細胞・前駆細胞に関する。【００１８】
後述する実施例では、幹細胞・前駆細胞として、血管内皮前駆細胞、間葉系幹細胞、心筋幹細胞を用いた実施形態を記載したが、本発明の幹細胞・前駆細胞はこれらに限定されない。【００１９】
Ape1の発現は、例えば、Ape1発現誘導、Ape1遺伝子導入、あるいはApe1タンパク質導入によって亢進させることができる。【００２０】
Ape1発現誘導は、例えば、Ape1発現誘導剤の適用によって達成することができる。使用可能なApe1発現誘導剤としては、例えば、TNF-α、IL-1b、IF-γ等を挙げることができる。【００２１】
本発明の幹細胞・前駆細胞では、Ape１発現の亢進により血管新生能が向上している。また、障害血管修復作用（再内皮化作用）や酸化ストレス抵抗性も向上している。
こうした幹細胞・前駆細胞機能の高機能化により、本発明の幹細胞・前駆細胞は、血管新生・血管修復を含む、種々の再生医療において好適に利用することができる。【００２２】
本発明は、上記した幹細胞・前駆細胞を含む細胞製剤も提供する。
本発明の細胞製剤において、用いられる幹細胞・前駆細胞は治療を必要とする患者由来のものであることが好ましい。【００２３】
本発明の細胞製剤は、血管再生、臓器再生、癌の予防・治療、下肢虚血、心筋梗塞、及び脳梗塞を含む虚血疾患の予防・治療などの再生医療において好適に利用される。【００２４】
本発明の細胞製剤の適用方法は特に限定されないが、例えば、静脈投与、筋肉内投与により患部に直接投与されるほか、シート状に加工するなどして組織に直接適用して用いられる。【００２５】
本発明の細胞製剤の形態は特に限定されないが、前述したとおり、組織に直接適用可能なシート状に加工してもよい。【００２６】
本発明は、本発明の細胞製剤を患者に投与することを特徴とする血管再生療法も提供する。【００２７】
さらに本発明は、幹細胞・前駆細胞におけるApe1（Apurinic/Apyrimidinic  Endonuclease 1）又はApe1遺伝子の発現量を指標として、幹細胞・前駆細胞の機能評価を行う方法やそのためのキット（幹細胞・前駆細胞機能評価用キット）も提供する。
前記キット方法は、たとえば、以下の（a）〜（c）の少なくとも１つを含むものとして構成される：
（a）抗Ape1抗体、
（b）Ape1遺伝子に特異的に結合し、該遺伝子を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマー、
（c）Ape1遺伝子に特異的に結合し、該遺伝子を検出するためのポリヌクレオチドプローブ。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、障害血管修復作用（再内皮化）、血管新生作用、酸化ストレス抵抗性、等の幹細胞・前駆細胞の組織や臓器の再生能及び新性能を高め、当該細胞を用いた再生治療効果を向上させることができる。また、本発明によれば、Ape1発現を指標として幹細胞・前駆細胞の機能を簡便に評価することができる。その結果は、血管再生細胞療法の術前評価や血管障害性疾患の診断に応用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、糖尿病マウス（DM）及び加齢マウス（Aged）由来の血管内皮前駆細胞の接着能を示す。
【図２】図２は、加齢マウス（1年6月：Aged-EPC）の血管内皮前駆細胞におけるApe1遺伝子の発現量を若齢マウス（12-14週齢：正常-EPC）と比較した結果を示す。
【図３】図３は、遺伝子導入をしない通常の血管内皮前駆細胞（A：Non-transfected EPCs）と Ape1遺伝子を導入した血管内皮前駆細胞（B:Standard Method、C:Magnet TransfectionMethod）におけるApe1の発現を示す。
【図４】図４は、マウス大腿動脈障害後におけるApe1導入血管内皮前駆細胞による血管リモデリング効果を示す。(A)HE染色像：左から、未処理（None）、コンフルエント状態のEPC(ctEPC)投与、Ape1遺伝子導入EPC投与（Ape-EPC）、(B)I/M比  左から未処理（None）、コンフルエント状態のEPC(ctEPC)投与、Ape1遺伝子導入EPC投与（Ape-EPC）
【図５】図５は、Ape1導入による周細胞由来間葉系幹細胞の酸化ストレスによる細胞障害の緩和を示す（○humanApe1感染細胞、●コントロールとしてのLacZ発現アデノウイルス感染細胞）。
【図６】図６は、ヒト由来心筋幹細胞におけるROS/Superoxide量をフローサイトメトリーにて測定した結果を示す。
【００３０】
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０１０−１７９６０５号の明細書に記載された内容を包含する。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、Ape1発現の亢進により、通常の幹細胞・前駆細胞よりも優れた機能（たとえば、血管新生能など）を有する幹細胞・前駆細胞に関する。以下、本発明の幹細胞・前駆細胞を「高機能化幹細胞・前駆細胞」と記載する。特に、血管内皮前駆細胞の場合を「高機能化血管内皮前駆細胞」、間葉系幹細胞の場合を「高機能化間葉系幹細胞」と記載する。
【００３２】
１．  幹細胞・前駆細胞
本発明の「幹細胞」は、複数系統の細胞に分化できる能力（多分化能）と、細胞分裂を経ても多分化能を維持できる能力（自己複製能）を併せ持つ細胞であって、生体内各組織に存在する種々の幹細胞、例えば、造血幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、皮膚幹細胞、生殖幹細胞、ならびにＥＳ細胞やｉＰＳ及びこれらから誘導された幹細胞を包含する。「前駆細胞」とは、前記幹細胞から特定の体細胞や生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞であって、幹細胞と同様に種々の前駆細胞を包含する。本発明においては、後述する血管内皮前駆細胞及び間葉系幹細胞を好適な例として挙げることができる。
【００３３】
１．１  血管内皮前駆細胞
「血管内皮前駆細胞（endothelial progenitor cell; EPC）」とは、骨髄や末梢血、臍帯血などに由来する細胞群で、最終的に血管内皮細胞への分化能を有することで血管新生を促し、血管再生に貢献する細胞群である。
【００３４】
現在、血管内皮前駆細胞については、上記以上の明確な定義は存在しない。厳密に言えば、血管内皮前駆細胞は、血管内皮細胞への分化能を有する細胞と直接血管内皮細胞には分化しないが様々なサイトカイン産生などを介して新生血管の構築・形成を促進する細胞が混在した不均一な(heterogenous)な細胞集団である。
血管内皮前駆細胞は、骨髄のほか末梢血や臍帯血などからも分離・採取することができる。
【００３５】
末梢血中の血管内皮前駆細胞を同定する場合、通常ヒトの場合はCD34/KDR陽性細胞群として、マウスの場合はcKit/Flk陽性細胞（マウス）として同定する。
【００３６】
CD34+細胞（ヒトの場合）や、Lin-/cKit+  or  Sca1+細胞（マウスの場合）は、いわゆる造血幹細胞といった「未分化細胞」全体を意味する。この未分化単核球細胞のなかで、fibronectinをコートした培養皿上で、VEGF入りの培養液で培養すると、培養皿に付着、さらに増殖してコロニーを形成する細胞群（fibronectin-adhesive and Acetyl LDL吸着能をもち、かつLectin結合能をもつ細胞）が血管内皮前駆細胞を多く含む細胞群）であると考えられている。
【００３７】
血管内皮前駆細胞は上記した表面マーカーを利用して磁気ビーズやフローサイトメトリー等によって単核球より分離することも可能であるが、上記のとおり現在血管内皮前駆細胞を正確に同定するマーカーが不明であり、２−３種類のマーカーで、一定の限界があること。発明者らは、Lin陰性、cKit陽性、Flk陽性に基づいてマウス血管内皮前駆細胞を単離している。
【００３８】
このほか、血管内皮前駆細胞の調製方法としては、末梢血や骨髄から分離した単核球をVEGFなどのサイトカインを含む血管内皮分化促進培地を用いて培養することにより付着細胞として血管内皮前駆細胞を回収する方法がある。
【００３９】
また、骨髄未分化細胞とJagged-1又はDelta-4等のNotchリガンドを高発現する細胞とを隣接した状態で共培養し、骨髄来分化細胞から血管内皮前駆組抱様細胞へと分化誘導して取得する方法（特開2007-89536号）、組胞分離フィルターを用いて血管内皮前駆細胞を回収する方法（特開2003-250820）も報告されており、こうした公知の方法を用いて血管内皮前駆細胞を調製することもできる。
【００４０】
現在虚血性疾患や動脈閉塞性疾患を有する患者において、骨髄由来の血管内皮前駆細胞を移植する血管再生治療が行われ、良好な成績を得ている。ここで用いられている血管内皮前駆細胞は、骨髄由来のCD34陽性単核球である。
【００４１】
上述した方法のほか、iPS細胞に代表される人工多能性幹細胞から分化誘導された血管内皮前駆細胞も、本発明にかかる高機能化血管内皮前駆細胞のソースとして好適に用いることができる。
【００４２】
血管内皮前駆細胞は、血管新生作用、障害血管修復作用（再内皮化作用）、酸化ストレス抵抗性、等の機能を有することが知られており、それゆえ、虚血性疾患や動脈閉塞性疾患における血管再生細胞療法に利用される。
【００４３】
また発明者らは、血管内皮前駆細胞の移植が癌細胞の増殖を抑制し、腫瘍血管の構築に著しい変化をもたらすことを見出し、血管内皮前駆細胞を用いた抗癌療法について報告している（WO2008/142862）。すなわち、血管内皮前駆細胞は血管新生の異常を伴う各種疾患の細胞移植療法において、重要な機能を果たす。
【００４４】
しかしながら、患者から取得できる血管内皮前駆細胞は限られており、特に患者の負担なく採取できる末梢血に含まれる血管内皮前駆細胞の数は少ない。さらに、患者から得られる血管内皮前駆細胞の機能は通常より低下していることが多く、移植しても十分な効果が得られないという問題がある。
【００４５】
限られた血管内皮前駆細胞の機能を亢進させることができれば、それは血管内皮前駆細胞を用いた再生医療の向上に寄与する。
【００４６】
１．２  間葉系幹細胞
間葉系幹細胞（mesenchymal  stem  cell）は、間葉に由来する体性幹細胞で、間葉系に属する細胞への分化能を有するため、骨や血管、心筋の再生医療への応用が期待されている。
【００４７】
間葉系幹細胞は間葉系組織のあるすべての組織に存在すると考えられている。骨髄間葉系幹細胞は、骨髄間質細胞の中に含まれている。骨髄間質細胞は骨髄の中で主体となる造血細胞を支える細胞の一種である。骨髄間質細胞は骨髄のなかで造血細胞を支えるために網状の構造をとる。骨髄はからだのなかで血液を造る造血作用の主要臓器である。
【００４８】
間葉系幹細胞は、毛細血管壁を取り巻くように存在する周細胞（pericyte：周皮細胞とも言う）にも存在する。周細胞は、Rouget細胞とも呼ばれる中胚葉性の細胞である。後述する実施例では、この周細胞から調製した間葉系幹細胞株を用いて、Ape1強制発現による効果を実証した。
【００４９】
２．Ape1（Apurinic/Apyrimidinic  Endonuclease 1）
Ape1（Apurinic/Apyrimidinic  Endonuclease 1）は、APEX1（Official Gene Symbol）、HAP1又はRef-1としても知られ、AP部位のすぐ5'側にあるホスホジエステル・バックボーンを加水分解によって切断し、3'-ヒドロキシル及び5'-デオキシリボースリン酸末端をもつ一本鎖DNA断片を産生するAPエンドヌクレアーゼである。
【００５０】
Ape1はAPエンドヌクレアーゼ活性の他に、弱いDNA 3'-ジエステラーゼ活性、3'->5'エキソヌクレアーゼ活性及びRNaseH活性を有することも報告されている。DNA修復活性のほかに、Ape1はin vitroで酸化還元機構によって多くの転写因子DNA結合活性を調整する機能も有している 。すなわち、Ape1は細胞の酸化ストレスに対して細胞を保護する機能を担っている分子の一つでもある。
【００５１】
Ape1遺伝子の塩基配列及びApe1のアミノ酸配列はすでに公知であり、公共のデータベースであるGenBank等に、その配列が公表されている。たとえば、ヒトApe1の塩基配列（mRNA）及びアミノ酸配列は、3つのバリアントについて、それぞれAccession Number NM_001641.2及びNP_001632.2（variant 1）、NM_080648.1 及び NP_542379.1（variant 2）、あるいはNM_080649.1 及びNP_542380.1（variant 3）として公表されている。また、マウスApe1の塩基配列及びアミノ酸配列は、Accession Number NM_009687.1及びNP_033817.1として公表されている。
【００５２】
Ape1遺伝子は、細胞よりRNAを抽出し、上記した配列に基づいて設計したプライマーを用いて目的とする遺伝子を増幅することにより取得することができる。プライマーの一例を下記に記載する。
FOREWARD PRIMER:5-GGA TTG GGT AAA GGA AGA AGC A-3 (マウス、ラット共用：配列番号１)
5-GTG CCC ACT CAA AGT TTC TTA C-3(ヒト用：配列番号２) 
REVERSE PRIMER：5-CAA GGC GCC AAC CAA CAT TCT T-3(ヒト、マウス、ラット共用：配列番号３)
【００５３】
発明者らは、血管内皮前駆細胞の機能に関わる遺伝子を探索するなかで、Ape1の発現が血管内皮前駆細胞の酸化ストレス維持と、血管新生能に重要な役割を果たしていることを見出した。さらに、発明者らは間葉系幹細胞株及び心筋幹細胞にApe１を導入することで、細胞障害が緩和される可能性を確認した。
【００５４】
すなわち、Ape1の高発現は酸化ストレスに対する抵抗性を高め、障害血管壁での再内皮化促進、血管新生促進作用をもたらす。それゆえ、Ape1の発現を亢進させることにより、酸化ストレス環境下での幹細胞・前駆細胞のviabilityを高めて、虚血部位や障害血管などの局所において、その「再内皮化」「血管新生」作用を十分に発揮させることができる。  
【００５５】
３．高機能化幹細胞・前駆細胞
３．１  Ape1発現の亢進
本発明にかかる幹細胞・前駆細胞は、Ape1の発現が亢進していることを特徴とする高機能化幹細胞・前駆細胞である。ここで、「Ape1の発現が亢進している」とは、Ape1タンパクの発現量の増加による直接的なApe1活性亢進と、関連する抑制系の解除等による間接的なApe1活性亢進の両方を包含する。
【００５６】
たとえば、Ape１発現の亢進は、外的因子によるApe1発現誘導（Ape1遺伝子あるいはApe1タンパクの発現誘導）によってもたらすことができる。Ape1発現の誘導方法としては、たとえば、Ape1遺伝子導入、Ape1タンパク質導入、Ape1発現誘導剤による方法が挙げられる。あるいは、外的因子によらず、ヘテロな幹細胞・前駆細胞集団のなかから、特にApe1高活性の細胞を選択し、単離、増幅させることにより、Ape１発現が亢進した幹細胞・前駆細胞を取得することもできる。
【００５７】
前者の場合、「Ape1の発現が“亢進している”」とは、インタクトな幹細胞・前駆細胞に比較して、Ape1発現誘導後の細胞におけるApe1の発現が高いことを意味する。後者の場合、「Ape1の発現が亢進している」とは、由来する幹細胞・前駆細胞集団の平均的Ape1発現に比較して、選択・増幅された細胞のApe1の発現が高いことを意味する。
【００５８】
Ape1タンパク質の発現レベルは特に限定されないが、基準となる細胞に比べ５倍以上、好ましくは１０倍以上向上していることが望ましい。
【００５９】
ちなみに、後述する実施例では、血管内皮前駆細胞全体あるいは間葉系幹細胞、心筋幹細胞全体にApe−Adenovirusを感染させ、細胞全体のApe発現量は、対照細胞にくらべ、２〜５倍程度の上昇を認めている。感染率は２０％程度と推定されるため、感染している細胞では、１０−２０倍程度の発現と推測される。
【００６０】
３．２  幹細胞・前駆細胞の高機能化
本発明において「高機能化」とは、幹細胞・前駆細胞の有する臓器再生能、新生能（例えば、血管再生能、新生能）、酸化ストレス抵抗性等の機能やviabilityが向上していることを意味する。前述のとおり、本発明において幹細胞・前駆細胞の高機能化は、Ape1発現の亢進によってもたらされる。
【００６１】
たとえば、患者由来の細胞を用いる場合、当該細胞はApe1発現亢進により、当該患者の機能低下している細胞よりも血管新生能、酸化ストレス抵抗性等を向上させて治療に用いる（高機能化している）。好ましくは、健常人、正常対照者（３０歳代の若者、非疾患同年齢など）由来の幹細胞・前駆細胞と同等かそれ以上に高機能化して用いる。
【００６２】
それゆえ、患者から得られる細胞がわずかであっても、高い血管再生（新生）効果を達成することができる。
【００６３】
４．高機能化幹細胞・前駆細胞の調製
本発明の高機能化幹細胞・前駆細胞は、たとえばApe1発現誘導により調製することができる。
４．１  Ape1遺伝子導入
Ape1遺伝子を幹細胞・前駆細胞に導入することにより、Ape1発現誘導を行うことができる。
Ape1遺伝子は、常法に従い、前述した公知の配列を基に調製することができる。たとえば、骨髄や末梢血由来の細胞からRNAを抽出し、公知の配列を元にプライマーを作製し、PCR法でクローニングすることにより目的とするApe1遺伝子のcDNAが調製できる。
【００６４】
本発明において、Ape1遺伝子の細胞への導入は、動物細胞のトランスフェクションに通常用いられる方法、たとえばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、レトロウイルスやバキュロウイルスをベクターとして用いる方法等を用いることができるが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス又はレトロウイルスをベクターとして用いる方法が安全性、導入効率の点から好ましい。
【００６５】
前記ウイルスベクターの調製は、たとえばMiyakeらの方法（Miyake,  S.  et  al,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  93:1320-1324,(1993)）に基づいて行えばよいが、市販のAdenovirus Cre/1oxP Kit(宝酒造社製)を用いることもできる。このキットはP1ファージのCreリコンビナーゼとその認識配列である1oxPを用いた新たな発現制御系（Kanegae Y. et.al., 1995  Nucl. Acids Res. 23,3816）による組換えアデノウイルスベクター作製キットで、Ape1遺伝子を組み込んだ組換えアデノウイルスベクターを簡便に作製することができる。
【００６６】
なお、アデノウイルス感染のMOI（multiplicity  of infection）は、組み込んだ遺伝子及び導入する細胞に依存しているため適宜決定する必要がある。幹細胞・前駆細胞に遺伝子導入する場合、Ape1遺伝子組換えアデノウイルスはMOI＝10〜500（より好ましくは100前後）がよい。
【００６７】
４．２  Ape1タンパク質導入
Ape1タンパク質を幹細胞・前駆細胞に導入することにより、Ape1発現誘導を行うことも可能である。
【００６８】
Ape1タンパク質導入は、公知の方法にしたがい、タンパク質導入試薬とともにApe1を幹細胞・前駆細胞に導入するか、あるいはApe1タンパクのN末端に公知のタンパク質導入ドメイン（特開2005-287418、特開2005-110565等参照）を融合して導入する。ここで、「タンパク質導入ドメイン」とは、タンパク質導入を補助することのできるペプチド等であればよく、たとえば、HIV TAT（Green and Loewnstein,  Cell,  56(6):  1179-88  (1988);  Frankel  and  Pabo,  Cell,  55(6):  1189-93  (1988)）、アンテナペデイア・ホメオドメイン（Antonnapedia homeodomain：Vives  et  al.,  J.  Biol.  Chem,  272(25):  16010-7  (1997)）、HSV  VP22（Elliott  and  O'Hare,  Cell,  88(2):  223-33  (1997)）、cell  penetrating  peptides  （CPP）又はそれらの断片を挙げることができる。あるいは導入する幹細胞・前駆細胞特異的に発現するレセプターと結合する物質を「タンパク質導入ドメイン」として用いることもできる。
【００６９】
４．３  Ape1発現誘導剤
Ape1発現を外的に誘導することのできる「Ape1発現誘導剤」を目的とする幹細胞・前駆細胞に導入することにより、Ape1発現誘導を行うことができる。
【００７０】
「Ape1発現誘導剤」としては、たとえば、TNF-α、IL1β、IFNγ等を挙げることができる。これらの「Ape1発現誘導剤」を後述する幹細胞・前駆細胞培養用の培地に添加し、幹細胞・前駆細胞を通常の方法により培養する。培養時間は、少なくとも6時間、好ましくは24〜48時間であるが、これに限定されない。培地へのApe1発現誘導剤の添加量は適宜設定され、たとえばTNF-αであれば、1〜100 ng/ml、好ましくは5  ng/ml程度である。
【００７１】
５．高機能化幹細胞・前駆細胞の培養方法
本発明の高機能化幹細胞・前駆細胞は、通常の幹細胞・前駆細胞と同様の方法で培養・増殖させることができる。
【００７２】
培地は単核球の培養に適した培地であれば特に限定されず、基本培地として、MEM培地、BME培地、DME培地、α-MEM培地、IMEM培地、ES培地、DM-160培地、Fisher培地、F12培地、WE培地、RPMI培地、StemSpan培地、StemPro培地及びこれらの混合物を用いることができる。あるいは市販のリンパ球培養用培地：たとえばGT-T培地（タカラバイオ）、AIM V培地（インビトロジェン）、Tリンパ球培養用培養液（コスモバイオ）、X-VIVO培地（Lonza社製）、ECM培地、ECM-MV2培地、市販の血管内皮細胞用培地：たとえばEGM-2培地やEBM-2培地等を用いてもよい。基本培地には、VEGF、ヘパリンを添加することが必要である。
【００７３】
その他、培地には、細胞の維持増殖に必要な各種栄養源や分化誘導に必要な各成分を適宜添加してもよい。たとえば、栄養源としては、グリセロール、グルコース、果糖、ショ糖、乳糖、ハチミツ、デンプン、デキストリン等の炭素源、また、脂肪酸、油脂、レシチン、アルコール類等の炭化水素類、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、硝酸ナトリウム等の窒素源、食塩、カリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等の無機塩類、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、モリブデン酸ナトリウム、タングステン酸ナトリウム及び硫酸マンガン、各種ビタミン類、アミノ酸類等を含むことができる。
【００７４】
なお、培地は、FBS、FCS等の動物血清を含まない「無血清培地」であることが好ましいが、血清代替物、KSR（Knockout Serum Replacement）等は添加してもよい。
これらの成分を配合して得られる培地のpHは5.5〜9.0、好ましくは6.0〜8.0、より好ましくは6.5〜7.5の範囲である。
【００７５】
血管内皮前駆細胞や間葉系幹細胞は細胞外マトリックスに付着して増殖する特性を有する付着細胞である。本発明の高機能化血管内皮前駆細胞もまた同様の性質を有する。それゆえ、培養においては適当な足場を用いることが好ましい。足場は細胞が付着して分裂・増殖し得るマトリックスや基質や担体であれば特に制限されず、たとえば、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、プロテオグリカン、ラミニン、テネイシン、エンタクチン、エラスチン、フィブリリン、ヒアルロン酸、ゼラチン、ポリ-L-リジン(poly-L-lysine)、ポリ-D-リジン(poly-D-lysine)等を挙げることができる。とくに、ファイブロネクチンをマトリックスとして用いることが望ましい。
【００７６】
培養は、36℃〜38℃、好ましくは36.5℃〜37.5℃で、1％〜25％ O2、1％〜15％ CO2の条件下で適宜培地を交換しながら行う。
【００７７】
６．高機能化幹細胞・前駆細胞を用いた細胞製剤
本発明の高機能化幹細胞・前駆細胞は、優れた血管新生作用、障害血管修復作用（再内皮化作用）、酸化ストレス耐性を有し、虚血性疾患や動脈閉塞性疾患等の血管再生医療に好適に利用できる。すなわち、本発明は高機能化幹細胞・前駆細胞を含む細胞製剤を提供する。
【００７８】
本発明の細胞製剤の投与方法は特に限定されず、適用部位に応じて、外科的手段による局所移植、静脈内投与、腰椎穿刺投与、局所注入投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、脳内投与、脳室内投与、又は静脈投与などが考えられる。
【００７９】
血液中の血管内皮前駆細胞は、障害血管部位には自らの特性で集積する。すなわち、血管内皮前駆細胞には、患部から離れた部位に静脈投与した場合でも、虚血部位特異的に集まり、損傷部位の血管再生を促すという特徴がある。それゆえ、患者の負担なく、簡便な静脈投与によっても投与部位から離れた虚血部位の血管再生治療が可能となる。但し、末梢虚血臓器への血管新生作用に関して、血管内皮前駆細胞が運ばれるための血流が不十分な場合には、局所に筋肉注射することもある。
【００８０】
本発明の製剤は、シート状にして、患部に直接適用してもよい。シートは細胞のみならず適当な支持体を含んでいてもよい。
【００８１】
本発明の細胞製剤は、細胞の維持・増殖、患部への投与を補助する足場材料や成分、他の医薬的に許容しうる担体を含んでいてもよい。細胞の維持・増殖に必要な成分としては、炭素源、窒素源、ビタミン、ミネラル、塩類、各種サイトカイン等の培地成分、あるいはマトリゲルTM等の細胞外マトリックス調製品、が挙げられる。
【００８２】
患部への投与を補助する足場材料や成分としては、生分解性ポリマー；たとえば、コラーゲン、ポリ乳酸、ヒアルロン酸、セルロース、及びこれらの誘導体、ならびにその２種以上からなる複合体、注射用水溶液；たとえば生理食塩水、培地、PBSなどの生理緩衝液、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液（たとえばD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム）等が挙げられ、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、たとえばポリソルベート80、HCO-50等と併用してもよい。
【００８３】
その他、必要に応じて、医薬的に許容される有機溶剤、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤等を含んでいてもよい。
【００８４】
実際の添加物は、本発明の治療剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれるが、これらに限定するものではない。たとえば、注射用製剤として使用する場合、精製された抗体を溶剤、たとえば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに吸着防止剤、たとえばTween80、Tween20、ゼラチン等を加えたものを使用することができる。
【００８５】
本発明の細胞製剤の対象となりうる疾患としては、たとえば、心筋梗塞や脳梗塞等の虚血性疾患や末梢動脈閉塞性疾患、が挙げられる。
【００８６】
発明者らは血管内皮前駆細胞の移植が癌細胞の増殖を抑制し、腫瘍血管の構築に著しい変化をもたらすことを見出し、血管内皮前駆細胞を用いた抗癌療法について報告している（前掲）。それゆえ、本発明の細胞製剤はこうした癌の予防・治療にも好適に用いることができる。
【００８７】
上記に限定されず、本発明の細胞製剤は血管新生の異常を伴う各種疾患の細胞医療に利用することができる。
【００８８】
７．幹細胞・前駆細胞の機能評価
従来、血管内皮前駆細胞の機能を評価する方法としては、培養系での増殖能や遊走能など、in vivoでは、障害血管修復能（再内皮化）や末梢組織血流改善度（血管新生）などがある。しかし、これらの方法は非常に煩雑であるため、簡易的に血管内皮前駆細胞の機能と密接に関連している遺伝子群の発現量を測定することにより、血管内皮前駆細胞機能を「推測」する方法が試行されている。
【００８９】
本発明では、対象遺伝子のひとつとしてApe1を用いることにより、簡便かつ正確に幹細胞・前駆細胞（血管内皮前駆細胞、間葉系幹細胞、心筋幹細胞等）の機能を評価する方法を提供する。具体的には、幹細胞・前駆細胞中のApe1遺伝子発現量あるいはApe1タンパク質発現量を測定し、これを平均的な同種細胞におけるApe1遺伝子又はApe1タンパク質発現量と比較し、当該幹細胞・前駆細胞の機能を評価する。
【００９０】
７．１  Ape1遺伝子発現量の測定
Ape1遺伝子の発現量は、回収した細胞からまず全RNAを抽出し、この全RNA中におけるApe1遺伝子（mRNA）の発現量を後述するいずれかの方法を用いて測定する。
【００９１】
全RNAの抽出方法は特に限定されず、たとえば、チオシアン酸グアニジン・塩化セシウム超遠心法、チオシアン酸グアニジン・ホットフェノール法、グアニジン塩酸法、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法（Chomczynski, P. and Sacchi, N., (1987) Anal. Biochem., 162, 156-159）等を採用することができる。抽出された全RNAは、必要に応じてさらにmRNAのみに精製して用いてもよい。
【００９２】
遺伝子の発現量は、遺伝子チップ、アレイ等の固相化試料を用いた核酸ハイブリダイゼーション法、RT-PCR法、リアルタイムPCR法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、ならびにクロスハイブリダイゼーション法など公知の方法を用いて測定することができる。
【００９３】
７．２  Ape1タンパク発現量の測定
Ape1タンパク発現量は、たとえば抗原抗体反応を利用した免疫学的方法を用いて測定することができる。
【００９４】
免疫学的方法としては、たとえば、免疫沈降法や、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ELISA法、及びRIA法を含む固相免疫法あるいはこれらに改変を加えた公知の変法（サンドイッチELISA、US Patent No.4202875記載の方法、Meagerらの方法（Meager A., Clin Exp Immunol. 2003 Apr, 132(1), p128-36）等）を挙げることができる。すなわち、これらの方法に基づき、Ape1タンパクと特異的に結合する抗体を用いてApe1タンパク発現量を測定する。
【００９５】
抗Ape1抗体は、必要に応じて標識してもよい。標識は、抗Ape1抗体を直接標識するか、又は該抗体を一次抗体とし、該一次抗体を特異的に認識する（抗体を作製した動物由来の抗体を認識する）標識二次抗体と協同で用いてもよい。前記標識の種類として好ましいものは、酵素（アルカリホスファターゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼ）又はビオチン（ただし二次抗体のビオチンにさらに酵素標識ストレプトアビジンを結合させる操作が加わる）であるが、これらに限定されない。標識二次抗体（又は標識ストレプトアビジン）としては、予め標識された抗体（又はストレプトアビジン）が、各種市販されている。なお、RIAの場合は125Ｉ等の放射性同位元素で標識された抗体を用い、測定は液体シンチレーションカウンター等を用いて行う。
【００９６】
これら標識された酵素の活性を検出することにより、抗原の発現量が測定される。アルカリホスファターゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼで標識する場合、これら酵素の触媒により発色する基質や発光する基質が市販されている。
【００９７】
発色する基質を用いた場合、ウエスタンブロット法やドット／スロットブロット法を利用すれば、目視で検出できる。ELISA法では、市販のマイクロプレートリーダーを用いて各ウェルの吸光度（測定波長は基質により異なる）を測定し、定量することが好ましい。また上述の抗体作製に使用した抗原の希釈系列を調製し、これを標準抗原試料として他の試料と同時に検出操作を行い、標準抗原濃度と測定値をプロットした標準曲線を作成することにより、他の試料中の抗原濃度を定量することも可能である。
【００９８】
一方、発光する基質を使用した場合は、ウエスタンブロット法やドット／スロットブロット法においては、Ｘ線フィルム又はイメージングプレートを用いたオートラジオグラフィーや、インスタントカメラを用いた写真撮影により検出することができる。また、デンシトメトリーやモレキュラー・イメージャーＦｘシステム（バイオラッド社製）等を利用した定量も可能である。さらに、ELISA法で発光基質を用いる場合は、発光マイクロプレートリーダー（たとえば、バイオラッド社製等）を用いて酵素活性を測定する。
【００９９】
なお、本発明において、指標とするApe1遺伝子やKIAAタンパクの「発現量」は、その物理的な量に限定されず、これを間接的に示す活性、力価（抗体価等）も含む。
【０１００】
７．３  評価
評価は、たとえば、正常幹細胞・前駆細胞における平均的Ape1遺伝子又はApe1タンパク発現量を基準値として、その基準値と被験細胞におけるApe1遺伝子又はApe1タンパク発現量を比較することにより行うことができる。Ape1遺伝子又はApe1タンパク発現量の測定は、前述したApe1発現誘導剤であらかじめ細胞を刺激してから行ってもよい。この場合、「Ape1発現誘導能」として幹細胞・前駆細胞の機能を評価できる。
【０１０１】
被験細胞におけるApe1遺伝子又はApe1タンパク発現量が前記した基準値に比較して低い場合、被験細胞は幹細胞・前駆細胞の機能が低下していると評価できる。
【０１０２】
こうした幹細胞・前駆細胞の機能評価結果は、たとえば血管内皮前駆細胞、間葉系幹細胞、心筋幹細胞等の幹細胞・前駆細胞を用いた再生医療の術前評価や、これらの細胞の機能低下を伴う各種疾患、例えば心筋梗塞などの発症リスクや疾患程度の評価としても利用できる。
【０１０３】
８．幹細胞・前駆細胞機能評価用キット
本発明は、前記した幹細胞・前駆細胞機能評価のための試薬・キットも提供する。キットは、必須の構成要素として、以下の（a）〜（c）の少なくとも１つを含む：
（a）抗Ape1抗体、
（b）Ape1遺伝子に特異的に結合し、該遺伝子を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマー
（c）Ape1遺伝子に特異的に結合し、該遺伝子を検出するためのポリヌクレオチドプローブ。
【０１０４】
各構成要素は、それぞれ単独で、幹細胞・前駆細胞機能評価用試薬として用いられてもよい。
【０１０５】
８．１  抗Ape1抗体
抗Ape1抗体は、公知の方法にしたがって調製することができる。すなわち、常法により、抗原となるApe1タンパク質、あるいはその任意の部分ポリペプチドを用いて動物を免疫し、該動物生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。
【０１０６】
抗体は、ポリクローナルであってもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。モノクローナル抗体は、公知の方法（たとえば、Kohler and Milstein, Nature 256, 495-497, 1975、Kennet, R. ed., Monoclonal Antibody p.365-367, 1980, Prenum Press,  N.Y.）にしたがって、特異的抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、これより得ることができる。
【０１０７】
抗体作製用の抗原としては、抗原であるApe1タンパク又はその少なくとも6個の連続した部分アミノ酸配列からなる部分ポリペプチド（エピトープペプチド）、あるいはこれらに任意のアミノ酸配列や担体（たとえば、Ｎ末端付加するキーホールリンペットヘモシアニン）が付加された誘導体を挙げることができる。
【０１０８】
前記抗原ポリペプチドは、Ape1タンパク又はその部分ポリペプチド（エピトープペプチド）を遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。具体的には、Ape1遺伝子又はその一部を発現可能なベクターを作製し、これを宿主細胞に導入して該遺伝子を発現させればよい。
【０１０９】
抗Ape1抗体は、適当な標識によりラベル（たとえば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよいし、ビオチン等により適当に修飾されていてもよい。また、適当な支持体に固相化されていてもよいし、あるいは固相化可能なように別個に支持体がキットに含まれていてもよい。そのような支持体としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド等の蛋白を付着可能な合成樹脂、ガラス、ニトロセルロース、セルロース、及びアガロース製の支持体、あるいはゲル型支持体を使用することができる。支持体の形態は特に限定されないが、極小球あるいはビーズ（たとえば"ラテックス"ビーズ）などの微粒子、微量遠心チューブなどのチューブ（内壁）、マイクロタイタープレート（ウェル）等の形態で提供される。
【０１１０】
８．２  Ape1遺伝子増幅用プライマー
Ape1遺伝子増幅用プライマー、Ape1遺伝子の少なくとも一部に相補的な配列を有する5〜30塩基長の連続したオリゴヌクレオチドである。プライマーはApe1遺伝子増幅用の塩基配列（配列番号１）に基づき、市販のプライマー設計ソフトを用いるなど、常法にしたがい容易に設計し、増幅させて調製することができる。このようなプライマーの例としては、たとえば配列番号１〜５に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを挙げることができる。
【０１１１】
Ape1遺伝子増幅用プライマーは、適当な標識によりラベル（たとえば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよく、またビオチン、リン酸、アミン等により修飾されていてもよい。
【０１１２】
８．３  Ape1遺伝子検出用プローブ
Ape1遺伝子検出用プローブは、Ape1遺伝子に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、20〜1500塩基長程度のものが好ましい。具体的には、ノーザンハイブリダイゼーション法であれば、20塩基長程度の1本鎖オリゴヌクレオチドか2本鎖DNAが好適に用いられる。また、マイクロアレイであれば、100〜1500塩基長程度の2本鎖DNA、又は20〜100塩基長程度の１本鎖オリゴヌクレオチドが好適に用いられる。Affimetrix社のGene Chipシステムの場合は、25塩基長程度の１本鎖オリゴがよい。これらは、特にApe1遺伝子の3’非翻訳領域に存在する配列特異性が高い部分に特異的にハイブリダイズするプローブとして設計することが好ましい。
【０１１３】
Ape1遺伝子検出用プローブは、適当な標識によりラベル（たとえば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよく、ビオチン、リン酸、アミン等により修飾されていてもよい。
【０１１４】
Ape1遺伝子増幅用プライマー及びApe1遺伝子検出用プローブは、適当な標識によりラベル（たとえば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよく、またビオチン、リン酸、アミン等により修飾されていてもよい。また、Ape1遺伝子検出用プローブは、ガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ等の適当な固定されていてもよい。
【０１１５】
本発明のキットは、上記した構成要素のみならず、抗Ape1抗体に特異的な（標識）二次抗体や、ラベル体の検出のための試薬、反応用緩衝液、酵素、基質等、Ape1の検出に必要な他の要素を含んでいてもよい。
【実施例】
【０１１６】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【０１１７】
実施例１：血管内皮前駆細胞（EPC）
１．糖尿病、加齢マウスにおける血管内皮前駆細胞（EPC）機能の低下
糖尿病（DM)マウス及び加齢（aged：１年６月）マウス骨髄から単核球細胞を単離した後、マグネットソーティングシステム(MACS)により、Lin-, cKit+, Flk+ の細胞を精製した。精製したEPCは、α-MEM (GIBCO)(あるいはEndothelial cell basal medium EBM (clontech))(10% FCS, VEGF)を含むfibronectinコーティングした培地で、48時間培養した。接着している細胞のうち、Acetyl-LDL吸着かつLectin結合陽性細胞を接着EPCとして、培養EPC機能の一つであるFibronectinへの接着能を評価した（全培養細胞数の中の割合で算出）。【０１１８】
図１に示すように、糖尿病（DM)マウス及び加齢（aged）マウス由来のEPCは正常マウス（12〜14週齢）に比べて、接着能が低く、さらにコロニー形成能）が低下していることが示唆された。すなわち、接着した細胞は増殖してコロニーを形成するが、そのコロニー形成度（コロニーごとの細胞数）が小さい。これは、増殖能の低下としても評価できる。【０１１９】
２．加齢マウス由来EPCにおける炎症性サイトカイン誘導Ape1発現能
12〜14週齢のマウス及び加齢マウス（１年６月)から、前項と同様にしてEPCを調製した。調製した細胞は、前項と同様の方法で培養するが、培養期間をさらに1週間延ばしてコンフルエントにしたのち、炎症性サイトカインTNFα 5-10 ng/mlを含む培地に交換して、16時間後に細胞を回収した。回収した細胞よりRNAを精製し、RT-PCR法によりmRNA量を測定した。使用したプライマー配列を下記に示す。
Forward; atg ccg aag cgt ggg aaa aag（配列番号４）
Reverse; cag tgc tag gta tag ggt g（配列番号５）【０１２０】
その結果、加齢マウス由来EPCでは12〜14週齢のマウス由来EPCに比べて、Ape1遺伝子発現量が顕著に低下していた(図2)。おり、TNFαによる発現誘導に対する応答も低いことが確認された。通常培養下のEPCにおいてApe1の発現量は、加齢マウスと若年マウスの間に大きな差はない。したがって、TNFαによる発現誘導に対する応答が、正常EPCに比較して、老化EPCでは著明に低下していることが確認された。【０１２１】
３．EPCへのApe1遺伝子導入
Adenovirusを用いてマウス血管内皮前駆細胞にヒトApe1遺伝子を導入した。導入後のEPCにおけるApe1発現量（赤）を測定した。Adenovirusへの導入は、マグネット感染キット（MagnetofectionTM-AdenoMag）を利用したMagnet Transfection Methodと通常の方法（Standard  Method）の２種類で行った。すなわち、Ape１導入ウイルス（AdenoApe）20μlとAdenoMag2μlを混合し、20分間室温でインキュベートした後、サブコンフルエント状態のEPCが入っている培養プレートに添加した。このプレートを、magnetic plateにのせ、60分間静置した後、通常の37℃で培養して感染させた。感染細胞は、抗Ape1抗体で免疫反応させ、TRITC二次抗体で可視化（赤色）した。【０１２２】
結果を図３に示す。Magnet Transfection MethodによりApe１遺伝子が効率よく導入されることが確認された。【０１２３】
４．Ape1導入EPCによる血管障害治癒
12〜14週齢のマウス大腿動脈障害モデルに、前項で作製したApe1導入EPCを経静脈より導入し、４週間後に血管リモデリング（新生内膜肥厚度＝I/M比）を評価した。【０１２４】
大腿動脈内側をwire (COOK社）挿入により障害させた後、調製したEPC(1x104/mouse)を尾静脈から導入した。血管障害4週後に、大腿動脈を摘出、固定し、血管の短軸切片をHE染色して観察した（図4(A)）。中膜（M）、および肥厚内膜（I)の面積を測定し、新生内膜肥厚度（I/M比）を算出した（図4(B)）。【０１２５】
非細胞導入群（none）に比べ、通常のEPC群(ct EPC)群でも、新生内膜肥厚度の低下を認めたが、Ape1導入EPC(Ape-EPC)群において、著明な新生内膜費高度改善効果が確認された。【０１２６】
実施例２：間葉系幹細胞（MSC）
１．間葉系幹細胞株の樹立、調製
間葉系幹細胞株は、温度感受性SV40T抗原発現トランスジェニックマウス（株式会社ファクトより購入）の末梢毛細血管組織由来より、抗NG2抗体を用いてNG2陽性細胞としてマグネットソーティング法にて単離して細胞株を樹立した。【０１２７】
樹立した細胞株は、周細胞および間葉系幹細胞に特徴的なNG2、CD146、PDGFR、CD90などの遺伝子群を発現するとともに、血管細胞や脂肪細胞（特異的FABP4発現、脂肪滴の同定(oil red 染色)）や骨芽細胞(Osteopontin発現、Ca沈着（Alizarin Red 染色））への分化能を保持しており、コラーゲンコーティング培養皿に、DMEM(10% FCS)で33℃で継代培養することで、細胞の不老不死状態を維持可能であった。アッセイ時には37℃で培養することにより、細胞内に発現しているSV40T抗原を不活性化させ、以下の実験に用いた。【０１２８】
２．細胞活性度（酸化ストレスによる細胞障害）の評価
コラーゲンコーティング培養皿に培養した上記間葉系幹細胞にヒトApe1(hApe1)発現用組み換えアデノウイルスを感染させることにより、間葉系幹細胞内にhuman Ape1 (hApe1)を強制発現させた。コントロール(Ct) として、LacZ発現アデノウイルス感染細胞を用いた。【０１２９】
前述の培養条件でサブコンフルエントまで細胞を培養した後、様々な濃度の過酸化水素（H2O2）を含む培地に培地を交換して、24時間培養することにより、酸化ストレスによる細胞障害を誘起させ、その障害程度をWSTアッセイ法で評価した。WSTアッセイは、WST-1（Roche  Applied  Science）を用いて、その使用説明書に基づいて行った。H2O2未処置群を100％、SDSにより死細胞化した群を0％として、その生存性の割合を算出した。【０１３０】
図5に示すように、コントロールにおいては、H2O2  500μMレベルから細胞障害が認められ、700μMで30%程度の細胞障害を示した。一方、Ape1発現間葉系幹細胞においては、同じ両のH2O2では、有意な細胞障害を認めなかった。なお非生理的な1000μM H2O2存在下では、両者ともに50%以上の細胞障害がもたらされ、両者の差異は認められなかった。【０１３１】
実施例３：心筋幹細胞
ヒト心臓由来心筋幹細胞株(CSC03)は慢性心筋梗塞患者右室より採取した微小心筋組織から酵素分解法及びbFGF添加による継代培養にて樹立した。【０１３２】
レトロウイルスベクターpRetro-IRES-DsRedにヒトApe1-cDNAを組み込み、IRESによってApe1と共に蛍光蛋白DsRedを発現するpRetro-Ape-IRES-DsRedをCSC03へ導入した。DsRed陽性細胞をFACSにより精製することによりApe1遺伝子導入細胞を選択的に精製した。pRetro-IRES-DsRedを導入し、DsRed陽性細胞を対照コントロールとして準備した。【０１３３】
Ape1-DsRed-CSC03及びDsRed-CSC03細胞内における活性酸素（reactive oxygen species; total ROS）及び代表的ROSであるsuperoxideの細胞内発現は、FACSを用いて解析した。【０１３４】
図6に示すように、CSCO3の活性に影響するROSおよびsuperoxide量は、コントロール細胞（DsRed-CSC03)ではROS（H2O2,ONOO-，HO・，NO,ROO・）及びsuperoxide（O2・）の発現（産生）を11.3%認めた。これに対し、Ape1遺伝子導入CSC（Ape1: Ape1-DsRed-CSC03）ではROS及びsuperoxideの産生が5.1%に抑制されていた。
【産業上の利用可能性】
【０１３５】
本発明によれば、血管新生作用、障害血管修復作用（再内皮化作用）、酸化ストレス抵抗性等の幹細胞・前駆細胞の機能を高め、より効果的な血管再生治療を行うことが可能になる。さらに、Ape1発現を指標として、幹細胞・前駆細胞の簡便な機能評価が可能となり、これにより血管再生細胞療法の術前評価や血管障害性疾患の診断が可能となる。【０１３６】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【配列表フリーテキスト】
【０１３７】
配列番号１：Ape1増幅用プライマー（フォワード：マウス、ラット用）
配列番号２：Ape1増幅用プライマー（フォワード：ヒト用）
配列番号３：Ape1増幅用プライマー（リバース：ヒト、マウス、ラット用）
配列番号４：Ape1 RT-PCR用プライマー（フォワード：マウス用）
配列番号５：Ape1 RT-PCR用プライマー（リバース：マウス用）
【図１】
0005880867.tif 000002
【図２】
0005880867.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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