(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マクロファージコロニー刺激因子受容体及びＳＴＡＴ１タンパク質を同時に発現する細胞であって、該ＳＴＡＴ１タンパク質は検出可能な標識と連結されている上記細胞。
【請求項２】
以下の（１）〜（３）の１つ又は２つ以上を満たす、請求項１に記載の細胞：
（１）前記マクロファージコロニー刺激因子受容体はヒト由来である；
（２）前記検出可能な標識はレポーター遺伝子である；
（３）前記細胞はインビトロで培養される哺乳動物細胞である。
【請求項３】
マクロファージコロニー刺激因子受容体がｃ−Ｆｍｓである、請求項２に記載の細胞。
【請求項４】
レポーター遺伝子がＧＦＰである、請求項２に記載の細胞。
【請求項５】
哺乳動物細胞がヒト骨肉腫細胞である、請求項２に記載の細胞。
【請求項６】
ｃ−Ｆｍｓチロシンキナーゼ阻害剤をスクリーニングするか、或いは、チロシンキナーゼに対する化合物又は組成物の阻害活性を評価するための方法であって、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞を使用するステップを含む、前記方法。
【請求項７】
以下のステップ：
前記化合物又は組成物で前記細胞を少なくとも１時間処理した後、マクロファージコロニー刺激因子を添加し、
ＳＴＡＴ１の核内移行の程度を検出及び分析し、そして
ｃ−Ｆｍｓチロシンキナーゼに対する、前記化合物又は組成物の阻害活性を評価すること
を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
以下のステップ：
１）請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞を播種し、そして培養し；
２）培地を捨て、前記細胞を無血清培地で少なくとも１回洗浄し；
３）試験されるべき化合物又は組成物を添加し、そして無血清培地中で前記細胞を培養し；
４）マクロファージコロニー刺激因子を添加し、そして無血清培地中で培養を継続し；そして
５）ＳＴＡＴ１タンパク質の核内移行の程度を分析し、そして前記化合物又は組成物の活性を評価すること
を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
マクロファージコロニー刺激因子を添加後の培養時間は５〜３５分である、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
マクロファージコロニー刺激因子を添加後の培養時間は２０〜３５分である、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１１】
マクロファージコロニー刺激因子を添加後の培養時間は３０分である、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１２】
マクロファージコロニー刺激因子が、３０ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で添加される、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１３】
マクロファージコロニー刺激因子が、１００〜６００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で添加される、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１４】
マクロファージコロニー刺激因子が、１５０〜２５０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で添加される、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１５】
マクロファージコロニー刺激因子が、２００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で添加される、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１６】
以下の（１）〜（５）の１つ又は２つ以上を満たす、請求項８に記載の方法：
（１）前記ステップ１）で播種される細胞は、６×１０4〜１２×１０4個／ｍｌの細胞密度を有し、培養時間は１２〜４８時間である；
（２）前記ステップ１）、３）又は４）における培養条件は、３７℃、５％ＣＯ2、湿度８０％である；
（３）前記ステップ２）、３）又は４）における無血清培地は、０．２％ＢＳＡ及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含む；
（４）前記ステップ３）において、試験されるべき化合物又は組成物の添加後の培養時間は、０．５〜１．５時間である；
（５）前記ステップ５）におけるＳＴＡＴ１タンパク質の核内移行の程度を分析する前に、以下の前処理が含まれる：前記細胞をＰＢＳで希釈したホルムアルデヒド溶液で固定し；前記細胞を暗所にて室温で２０分間放置し；核染色剤であるヘキスト（ｈｏｅｃｈｓｔ）３３３４２を含むＰＢＳを添加し；そして前記細胞を暗所にて室温で３０分間放置する。
【請求項１７】
ステップ１）における培養時間が２４時間である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ３）における培養時間が１時間である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
ｃ−Ｆｍｓチロシンキナーゼ阻害剤をスクリーニングするための、或いは、ｃ−Ｆｍｓチロシンキナーゼに対する化合物又は組成物の阻害活性を評価するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞の使用。
【請求項２０】
スクリーニングがハイコンテントスクリーニングである、請求項１９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞生物学及び薬学分野に属し、そしてｃ−Ｆｍｓキナーゼ阻害剤をスクリーニングするための細胞モデル及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬剤スクリーニングモデルは、薬剤研究及び開発における薬剤活性研究のための不可欠なプラットフォームである。ハイコンテントアナリシス（Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）又はハイコンテントスクリーニング（Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）（ＨＣＳ）は、種々の態様、例えば細胞形態、増殖、分化、遊走、アポトーシス、代謝経路及びシグナル伝達においてスクリーニングされるサンプルによる細胞への影響を同時に検出でき、すなわち細胞構造及び機能的統合を維持しながら、生物学的活性及び潜在的毒性を決定するために、単一の実験において多くの関連情報を得ることができる、オープン試薬及び蛍光標識技術と統合された、ハイスループット蛍光／明視野顕微鏡イメージング及び定量的画像解析を用いての自動プラットフォームである。キナーゼ阻害剤をスクリーニングするための細胞モデルを確立し、そしてハイコンテント技術に基づいて、それとハイスループットスクリーニング技術とを組み合わせることは、創造的な薬剤スクリーニング研究のために避けられない傾向である。
【０００３】
薬剤（例えば、抗腫瘍薬）のための標的としてのキナーゼは、新規薬剤開発のためのホットスポットに国際的になって来た。マクロファージコロニー刺激因子受容体キナーゼ（ｃ−Ｆｍｓ、ＣＳＦ−１Ｒ）は、プロトオンコジーンｃ−ｆｍｓによりコードされる生成物であり、そして細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｋｉｔ）、血小板由来の増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（Ｆｌｔ−３）等として、タイプIIIチロシンキナーゼファミリーに属する。マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１）への結合の後、Ｃ−Ｆｍｓのチロシンキナーゼ活性が活性化され、単核マクロファージ細胞系の生存性及び増殖を促進する（Sherr CJ, Roussel MF, Rettenmier CW. Colony-stimulating factor-1 receptor (c-fms)[J]. J Cell Biochem,1988,38(3):179-187）。因子、例えばＣ−ｆｍｓ遺伝子の反復複製、突然変異、染色体移行、及びＭ−ＣＳＦの過剰発現は、ｃ−Ｆｍｓキナーゼ活性を異常に増強し、単核マクロファージの異常増殖又は関連炎症因子の高発現をもたらし、そして最終的に、疾病、例えば造血系疾患、悪性腫瘍、炎症及びアテローム性動脈硬化症の進行を導く。
【０００４】
受容体キナーゼのリン酸化を阻害し、そして受容体キナーゼにより介在される細胞シグナル経路を阻止することができるＣ−Ｆｍｓ阻害剤は、ｃ−Ｆｍｓ関連疾患を治療するための候補薬剤である（Douglass TG, Driggers L, Zhang JG,et al. Macrophage colony- stimulating factor: not just for macrophages anymore! A gateway into complex biologies [J]. Int Immunopharmacol,2008,8(10): 1354-1376）。ｃ−Ｆｍｓキナーゼの下流の細胞シグナルの重要な分子であるシグナル伝達物質及び転写活性化因子（ＳＴＡＴ１）は、Ｃ−Ｆｍｓによる活性化に基づいて核内に侵入し、そして関連遺伝子の転写を活性化する（Hamilton JA. CSF-1 and cell cycle control in macrophages [J]. Mol Reprod Dev,1997,46(1): 19-23）。ＳＴＡＴ１核内移行の程度は、ｃ−Ｆｍｓのキナーゼ活性に直接的に影響を及ぼす。
【０００５】
これまでの文献において報告されるように、ｃ−Ｆｍｓ阻害剤をスクリーニングするための方法は、分子レベルでキナーゼ活性を決定するための方法、及び分子レベルでキナーゼリン酸化を検出するためのウェスターンブロット法を主に包含するが、しかしながら、それらは欠点、例えば複雑で面倒な操作及び低い定量的範囲を有する。さらに、受容体キナーゼ、例えばｃ−Ｆｍｓのリン酸化は短時間で起きるので、それを正確に検出することは困難である。さらに、インビトロでの容易な二量体化などのために、ハイコンテントアナリシスに基づいてのｃ−Ｆｍｓ阻害剤のハイスループットスクリーニングの細胞モデルに対する報告は存在しない。
【発明の概要】
【０００６】
創造的研究及び多量の実験により、本発明者は、１つの細胞モデルを確立し、そしてｃ−Ｆｍｓキナーゼ阻害剤のスクリーニングが細胞におけるＳＴＡＴ１核内移行の分析により達成され得ることを見出した。従って、本発明は次の通りに提供される：
【０００７】
一つの側面によれば、本発明は、マクロファージコロニー刺激因子受容体及びＳＴＡＴ１タンパク質を同時に発現する細胞に関する。
【０００８】
本発明の細胞は、以下の（１）〜（３）の１つ又は２つ以上を満たす：
（１）前記マクロファージコロニー刺激因子受容体はヒト由来であり、具体的にはｃ−Ｆｍｓである；
（２）前記ＳＴＡＴ１タンパク質は検出可能な標識と連結されており、具体的には、前記検出可能な標識はレポーター因子であり、より具体的には、前記レポーター遺伝子は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である；及び
（３）前記細胞はインビトロで培養される哺乳類細胞であり、より好ましくはヒト骨肉腫細胞（例えば、ヒト骨肉腫細胞Ｕ２ＯＳ）である。
【０００９】
本発明の細胞は、チロシンキナーゼ阻害剤をスクリーニングするか、又はチロシンキナーゼに対する化合物又は組成物の阻害活性を評価するために使用され得、すなわちそれは、チロシンキナーゼ阻害剤をスクリーニングするか、又はチロシンキナーゼに対する化合物又は組成物の阻害活性を評価するための細胞モデルとして使用され得る。具体的には、前記チロシンキナーゼは、マクロファージコロニー刺激因子受容体キナーゼであり、より具体的にはｃ−Ｆｍｓである。本発明の実施例４は、細胞モデルの実施可能性を実証する。
【００１０】
細胞モデルにおいては、ｃ−Ｆｍｓキナーゼの活性は、受容体キナーゼにより介在される下流の細胞シグナルのタンパク質分子の核内移行の程度により影響され得る。細胞モデルがチロシンキナーゼ阻害剤をスクリーニングするために使用される場合、下流のタンパク質分子の核内移行の程度が、ｃ−Ｆｍｓキナーゼに対する化合物の阻害活性を評価するために検出される。
【００１１】
前記細胞は、次のステップ：
１）ヒトマクロファージコロニー刺激因子受容体遺伝子を含む真核生物発現ベクターを構築するステップ：
２）ＳＴＡＴ１タンパク質（例えば、ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１融合タンパク質）を安定して発現するヒト骨肉腫細胞を、上記ベクターによりトランスフェクトするステップ；及び
３）ヒトマクロファージコロニー刺激因子受容体及びＳＴＡＴ１タンパク質（例えば、ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１融合タンパク質）を安定して発現する細胞系をスクリーニングするステップにより調製され得る。
【００１２】
本発明の細胞はまた、ヒトマクロファージコロニー刺激因子受容体遺伝子、例えばｃ−Ｆｍｓを含むベクター、及びＳＴＡＴ１遺伝子、例えばＧＦＰ−ＳＴＡＴ１遺伝子を含むベクターにより、ヒト骨肉腫細胞を同時トランスフェクトすることによっても調製され得る。
【００１３】
別の側面によれば、本発明は、寄託日が２０１１年３月２２日である、受入番号ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．４６８８で中国総合微生物保存センター（Ｃｈｉｎａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ）に寄託された、細胞株（ヒト骨肉腫細胞株、Ｕ２０Ｓ−ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１/ＣＳＦ−１Ｒ）に関する。
【００１４】
前記細胞株は、ｃ−Ｆｍｓ及びＧＦＰ−ＳＴＡＴ１融合タンパク質を安定して発現できるヒト骨肉腫細胞Ｕ２ＯＳである。
【００１５】
別の側面によれば、本発明は、本発明の上記のいずれかの項目の細胞、又は本発明の細胞株を用いるステップを含んで成る、ｃ−Ｆｍｓキナーゼ阻害剤をスクリーニングするか、又はチロシンキナーゼに対する化合物又は組成物の阻害活性を評価する方法に関する。
【００１６】
ｃ−Ｆｍｓチロシンキナーゼ阻害剤をスクリーニングするか、又は本発明の前記いずれかの項目のチロシンキナーゼに対する化合物又は組成物の阻害活性を評価するための方法は、次のステップ：
前記化合物又は組成物により少なくとも１時間、前記細胞を処理した後、マクロファージコロニー刺激因子受容体キナーゼを、マクロファージコロニー刺激因子により活性化し、ＳＴＡＴ１の核内移行の程度を検出し、そして分析し、そしてチロシンキナーゼに対する前記化合物又は組成物の阻害活性を評価するステップを含んで成る。
【００１７】
本発明の、前記いずれかの項目に従ってｃ−Ｆｍｓチロシンキナーゼ阻害剤をスクリーニングするための方法は、次のステップ：
１）本発明の前記いずれかの項目の細胞又は本発明の細胞株を播種し、そして培養するステップ；
２）培地を捨て、前記細胞を無血清培地により少なくとも１回洗浄するステップ；
３）試験されるべき化合物又は組成物を添加し、そして無血清培地中で前記細胞を培養するステップ；
４）マクロファージコロニー刺激因子を添加し、そして無血清培地中で培養を継続するステップ；及び
５）ＳＴＡＴ１タンパク質の核内移行の程度を分析し、そして前記化合物又は組成物の活性を評価するステップを含んで成る。
【００１８】
本発明の、前記いずれかの項目に従ってのｃ−Ｆｍｓチロシンキナーゼ阻害剤をスクリーニングする方法において、マクロファージコロニー刺激因子の添加の後の培養時間は、５〜３５分、好ましくは２０〜３５分、例えば２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４又は ３５時間、及びより好ましくは３０分である。
【００１９】
本発明の前記いずれかの項目に従ってのｃ−Ｆｍｓチロシンキナーゼ阻害剤をスクリーニングする方法において、マクロファージコロニー刺激因子が添加される場合、その最終濃度は３０ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１００〜６００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは１５０〜２５０ｎｇ／ｍｌ、及び特に好ましくは２００ｎｇ／ｍｌである。
【００２０】
本発明の前記いずれかの項目に従っての、ｃ−Ｆｍｓチロシンキナーゼ阻害剤をスクリーニングするための方法は、次の（１）〜（５）の１つ又は２つ以上を満たす；
（１）ステップ１）における前記細胞が９６ウェルプレートに基づいて６×１０4〜１２×１０4個／ｍｌの細胞密度で播種され、そして培養時間が１２〜４８時間、好ましくは２４時間であり；
（２）ステップ１）、３）又は４）における培養条件が、３７℃、５％ＣＯ2、８０％湿度である；
（３）ステップ２）、３）又は４）における無血清培地が、０．２％ＢＳＡ及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含む；
（４）ステップ３）において、試験されるべき化合物又は組成物の添加後の培養時間が０．５〜１．５時間、好ましくは１時間である；
（５）前記ステップ５）におけるＳＴＡＴ１タンパク質の核内移行の程度を分析する前に、以下の前処理が含まれる：前記細胞をＰＢＳで希釈したホルムアルデヒド溶液で固定し；前記細胞を暗所にて室温で２０分間放置し；核染色剤であるヘキスト（ｈｏｅｃｈｓｔ）３３３４２を含むＰＢＳを添加し；そして前記細胞を暗所にて室温で３０分間放置する。
【００２１】
ｃ−Ｆｍｓチロシンキナーゼ阻害剤をスクリーニングするための上記方法はまた、チロシンキナーゼに対する化合物又は組成物の阻害活性を評価するための方法としても使用され得る。
【００２２】
さらなる側面によれば、本発明は、ｃ−Ｆｍｓチロシンキナーゼ阻害剤をスクリーニングするか、又はｃ−Ｆｍｓチロシンキナーゼに対する化合物又は組成物の阻害活性を評価するための、本発明の前記いずれかの項目の細胞又は本発明の細胞株の使用に関する。
【００２３】
本発明において、ＳＴＡＴ１及びｃ−Ｆｍｓとは、ＢＣ００２７０４及びＮＭ００５２１１のＧｅｎＢａｎｋ受入番号を有する配列のことであり、そしてそれらのヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１及び配列番号２で示される。しかしながら、本発明においては、ＳＴＡＴ１及びｃ−Ｆｍｓの配列は配列番号１及び配列番号２で示される配列には限定されず、配列番号１及び配列番号２で示される配列の１つ又は２つ以上の置換、交換、欠失に起因し、そしてＳＴＡＴ１又はｃ−Ｆｍｓの機能を有する配列もまた、本発明の範囲内にある。本発明はまた、配列番号１又は配列番号２に対して、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、又は９９％超の相同性を有し、そしてＳＴＡＴ１又はｃ−Ｆｍｓの機能を有する配列も含む。
【００２４】
本発明においては、具体的には、前記チロシンキナーゼは、ｃ−Ｆｍｓチロシンキナーゼであり得る。
【００２５】
本発明の有利な効果
本発明において確立された細胞モデルは、感受性が高く、非常に効果的で、信頼性があり、そしてｃ−Ｆｍｓチロシンキナーゼ阻害剤のハイスループットスクリーニング及び／又はハイコンテントスクリーニングに使用され得る。本発明において確立されたスクリーニング方法は、ウェスターンブロット法よりも高い感度を有し、その操作は単純で且つ早い。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】図１Ａは、ヒトｃ−Ｆｍｓを発現する細胞における、ｈｒＭ−ＣＳＦにより誘導されたＧＦＰ−ＳＴＡＴ１核内移行を示す。
【図１Ｂ】図１Ａは、ヒトｃ−Ｆｍｓを発現する細胞における、ｈｒＭ−ＣＳＦにより誘導されたＧＦＰ−ＳＴＡＴ１核内移行を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ｈｒＭ−ＣＳＦにより誘導されたＧＦＰ−ＳＴＡＴ１核内移行の用量−効果の関係を示す。（ｎ＝６、ＥＣ50は４３．５０±３．６８ｎｇ／ｍｌである）。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ｈｒＭ−ＣＳＦにより誘導されたＧＦＰ−ＳＴＡＴ１核内移行の用量−効果の関係を示す。（ｎ＝６、ＥＣ50は４３．５０±３．６８ｎｇ／ｍｌである）。
【図３】図３は、ｈｒＭ−ＣＳＦにより誘導されたＧＦＰ−ＳＴＡＴ１核内移行に基づく薬剤スクリーニングシステムの信頼性分析を示す。（ｎ＝６、平均Ｚ’値は０．７３４である）。
【図４】図４は、ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１核内移行に対する、ｈｒＭ−ＣＳＦにより細胞を処理するための時間の効果を示す。
【図５】図５は、ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１核内移行に対する、Ｕ２ＯＳ−ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１/ＣＳＦ−１Ｒ細胞の播種密度の効果を示す。
【図６】図６は、細胞モデルにおける核内移行に対するｃ−Ｆｍｓ阻害剤ＧＷ２５８０の阻害効果を示し、ここでＧＦＰ−ＳＴＡＴ１核内移行はｈｒＭ−ＣＳＦにより誘導されている。（ｎ＝３；ＧＷ２５８０のＩＣ50は３０．７４±２．９ｎＭである）。
【図７】図７は、細胞モデルにおける核内移行に対するｃ−Ｆｍｓ阻害剤スーテント（Ｓｕｔｅｎｔ）の阻害効果を示し、ここでＧＦＰ−ＳＴＡＴ１核内移行はｈｒＭ−ＣＳＦにより誘導されている。（ｎ＝３；スーテントのＩＣ50は１４．８５±０．５５ｎＭである）。
【図８】図８は、細胞モデルにおける核内移行に対するｃ−Ｆｍｓ阻害剤イマチニブ（Ｉｍａｔｉｎｉｂ）の阻害効果を示し、ここでＧＦＰ−ＳＴＡＴ１核内移行はｈｒＭ−ＣＳＦにより誘導されている。（ｎ＝３；イマチニブのＩＣ50は１９６．１±２１．７ｎＭである）。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
生物材料の寄託の参照について
本発明は次の生物材料に関する：
寄託日が２０１１年３月２２日である、受入番号ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．４６８８で中国総合微生物保存センター（Ｃｈｉｎａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ）に寄託された、ヒト骨肉腫細胞株（Ｕ２ＯＳ−ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１/ＣＳＦ−１Ｒ）。寄託住所は、北京市朝陽区北辰西路１号院３号、中国科学院微生物研究所１００１０１である。
【００２８】
本発明の実施形態は、次の実施例を通して詳細に示されている。しかしながら、当業者は、次の実施例は、本発明を例示することを単に意図し、本発明の範囲を制限するものではないことを理解している。特定の技術又は条件が実施例に示されていない環境下で、本発明は、技術文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ． J. et al., Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｂｙ Ｈｕａｎｇ Ｐｅｉｔａｎｇ et al., ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓ）に記載されている技術又は条件に従って、又は製品の仕様に従って実施される。製造業者が示していない試薬又は装置は、市販されている従来の製品である。
【００２９】
主要薬剤及び試薬：Ｏｍｅｇａ  Ｂｉｏ−ｔｅｋ  Ｃｏ．から購入されたプラスミドＭｉｎｉＰｒｅｐキット；ＴａｋａＲａ  Ｃｏ．から購入された制限エンドヌクレアーゼ、Ｔ４リガーゼ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏ．から購入されたリポソーム２０００、ヘキスト３３３４２色素；Ｇｉｂｃｏ  Ｃｏ．から購入されたＤＭＥＭ（高グルコース）；Ｔｉａｎｊｉｎ Ｃｈｕａｎｙｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入されたウシ胎児血清；Ｍｅｒｃｋ  Ｃｏ．から購入されたネオマイシン（Ｇ４１８）、ピューロマイシン；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．から購入されたｈｒＭ−ＣＳＦ因子；Ａｍｒｅｓｃｏ  Ｃｏ．から購入されたＢＳＡ、ＨＥＰＥＳ；本発明で仕様されるすべてのキナーゼ阻害剤は本発明者により合成された；残りの試薬は、中国において製造された分析用試薬である。
【００３０】
主要装置：Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ１０００又はＩｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ２０００ＧＥ（Ｈｅａｌｔｈ  ｃａｒｅ  Ｌ：ｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ製）
細胞系：Ｕ２０Ｓ−ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１ヒト骨肉腫細胞Ｔｈｅｒｍｏ（Ｂｉｏ  Ｉｍａｇｅ）。
【実施例】
【００３１】
実施例１：ヒトｃ−Ｆｍｓ及びＳＴＡＴ１を安定して発現する細胞系の確立
ヒトｃ−Ｆｍｓの全長ｃＤＮＡ含む真核細胞発現ベクターｐＣＯＲＯＮ/ｐｕｒｏ−ｃｆｍｓ（米国のSt. Jude Children's Research HospitalのCharles Sherr博士 及びMartine Rousse博士より寄贈された）を構築した。そして、ＧＦＰ及びＳＴＡＴ１が融合され、発現されたヒト骨肉腫細胞系を、リポフェクチンを用いてベクターによりトランスフェクトした。
【００３２】
ヒトｃ−Ｆｍｓを安定して発現する新規細胞系を、抵抗スクリーニング及び限界希釈により得た。４５００ｍｇ／Ｌのグルコース、１０％ウシ胎児血清、４ｍＭのＬ−グルタミン、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８及び２μｇ／ｍｌのヒューロマイシンを含むＤＭＥＭ培地を使用し、そして細胞系を、３７℃、５％ＣＯ2、８０％湿度で、インキュベーター中で培養した。
【００３３】
トランスフェクション前の細胞と比較して、確立された細胞は、細胞形態学において有意な変化は有さず、そして安定した増殖状態を有した。
【００３４】
この実施例において調製された細胞系（すなわち、受入番号ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．４６８８として寄託された本発明のヒト骨肉腫細胞系）は、チロシンキナーゼ阻害剤をクリーニングするための又はチロシンキナーゼに対する化合物の阻害活性を評価するための細胞モデルとして使用できる。
【００３５】
実施例２：新規に確立された細胞系の特徴付け
実施例１で調製された細胞系を、組換え発現されたヒトＭ−ＣＳＦ（ｈｒＭ−ＣＳＦ）により処理し、ｃ−Ｆｍｓを活性化し、そしてＧＦＰ−ＳＴＡＴ１核内移行を誘導した。確立された細胞系においては、ヒトマクロファージコロニー刺激因子受容体が、特異的リガンドＭ−ＣＳＦへの結合に基づいて、二量体化され、そしてその間、立体配座が変更され、そしてキナーゼドメインが活性化された。ｃ−Ｆｍｓの下流シグナル経路を、リン酸転移により活性化した。リン酸化されたＧＦＰ−ＳＴＡＴ１もまた、二量体化され、そして核へ侵入し、すなわち核内移行が生じた。
【００３６】
ｈｒＭ−ＣＳＦにより誘導されたＧＦＰ−ＳＴＡＴ１の核内移行の程度を定量的に検出するために、この実施例においては、Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ１０００ 又はＩｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ２０００を用いて、ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１核内移行の細胞イメージを得た。この得られた細胞イメージを、Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｍｏｄｕｌｅを用いて分析し、ここで核内移行指数（Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ）はＧＦＰ−ＳＴＡＴ１の核内移行の程度を表す。核内移行指数は、１ウェル当たり得られる、細胞中の細胞質の平均蛍光強度に対する核の平均蛍光強度の比に等しい。具体的なステップは次の通りであった：
１）９６ウェル培養プレート（黒く、そして底は透明である）に細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ2、８０％湿度にてインキュベーター中で２４時間、培養するステップ；
２）４５００ｍｇ／Ｌのグルコース、４ｍＭのＬ−グルタミン、０．２％ＢＳＡ及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含む無血清ＤＭＥＭ培地（以下、細胞分析用液体と呼ぶ）により、細胞を２回洗浄し、ここで前記細胞分析用液体を、それぞれ、１ウェル当たり１００μｌで添加し；この後、５０μｌの細胞分析用液体を個々のウェルに添加するステップ；
３）ｈｒＭ−ＣＳＦを含む細胞分析用液体を、５０μｌ／ウェルで添加し、１００ｎｇ／ｍｌの最終ｈｒＭ−ＣＳＥ濃度を得、そして３７℃で３０分間、インキュベーター中で細胞をインキュベートするステップ；
４）１×ＰＢＳ溶液により希釈され、そして３７℃で予備加熱された８％ホルムアルデヒドにより細胞を、１００μｌ／ウェルで固定し、そしてそのプレートを、暗所において室温で２０分間放置するステップ：
５）細胞固定溶液を捨て、２００μｌ／ウェルでヘキスト３３３４２を含む１×ＰＢＳ溶液を添加し、そのプレートを、暗所において室温で３０分間放置するステップ；
６）Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００を用いて細胞イメージを得、ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１の核内移行の程度をＮｕｃｌｅａｒ  Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｍｏｄｕｌｅを用いることにより分析するステップ。
【００３７】
１００ｎｇ／ｍｌの濃度でのｈｒＭ−ＣＳＦの存在下で、有意なＧＦＰ−ＳＴＡＴ１核内移行が、ヒトｃ−Ｆｍｓを発現しないＵ２ＯＳ−ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１細胞と比較して、ヒトｃ−Ｆｍｓを発現するＵ２ＯＳ−ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１/ＣＳＦ−１Ｒ細胞において生じた（図１Ａ及びＢ）。
【００３８】
実施例３：ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１核内移行を誘導するためのｈｒＭ−ＣＳＦの半有効濃度の決定
ステップは次の通りであった：
１）実施例１において調製された細胞を用いて、１×１０5個の細胞／ｍｌの細胞懸濁液を調製し、９６ウェル培養プレート（黒色であり、そして底が透明である）に細胞を、１００μ／ウェルで播種するステップ；
２）３７℃、５％ＣＯ2、８０％の湿度でインキュベーターにいて細胞を２４時間、培養するステップ；
３）それぞれ、１００μｌ／ウェルで、細胞分析用液体により細胞を２回洗浄し、前記溶液を捨て、そして細胞分析用液体を５０μｌ／ウェルで添加するステップ；
４）細胞分析用液体により希釈されたｈｒＭ−ＣＳＦを添加し、それぞれ、１、３、１０、３０、１００、３００、６００、１０００ｎｇ／ｍｌの最終濃度を得るステップ；
５）３７℃、５％ＣＯ2、８０％湿度でインキュベーターにおいて細胞を３０分間インキュベートした後、３７℃で予備加熱された細胞固定溶液を１００μｌ／ウェルで添加し、培養物プレートを軽くに振盪し、混合物を均等に混合し、そしてプレートを暗所にて室温で２０分間放置するステップ；
６）前記溶液を捨て、ｈｏｅｃｈｓ３３３４２を含む１×ＰＢＳ溶液を２００μｌ／ウェルで添加し、そしてプレートを室温で暗所にて３０分間放置するステップ；及び
７）Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２０００を用いることにより細胞イメージを得、そしてＮｕｃｌｅａｒ  Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｍｏｄｕｌｅを用いて、ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１の核内移行の程度を分析するステップ。
【００３９】
図２Ａ及びＢに示されるように、ｈｒＭ−ＣＳＦの濃度が１０ｎｇ／ｍｌである場合、ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１融合タンパク質の核内移行が開始し；ｈｒＭ−ＣＳＦの濃度が６００ｎｇ／ｍｌである場合、ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１の核内移行の程度が最大に達する。「Ｓ」型曲線を、Ｏｒｉｇｉｎ７．５ソフトウェアシグモイドフィットにより適合させ、ｈｒＭ−ＣＳＦの半有効濃度（ＥＣ50）を得、この濃度で、Ｕ２ＯＳ−ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１/ＣＳＦ−１Ｒ細胞におけるｃ−Ｆｍｓキナーゼを活性化し、ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１核内移行を誘導し、そしてその濃度は４３．５０±３．６８ｎｇ／ｍｌであった。
【００４０】
実施例４：Ｕ２ＯＳ−ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１/ＣＳＦ−１Ｒ細胞モデルの信頼性の評価
この実施例においては、実施例１において確立された新規細胞モデルの信頼性を、Ｚ’因子により評価した。実験システムの信頼性を評価するための重要パラメーターとしてのＺ’因子は、ハイ−スループットスクリーニング、ハイコンテントアナリシス実験システムの安定性及び信頼性を評価する場合、広く適用できる。Ｚ’因子は、下記式に従って計算される：
【００４１】
【数１】
0005960794.tif 000002
【００４２】
［式中、σは標準偏差を表し、μは平均シグナルを表し、Ｃ＋は正の対照を表し、Ｃ−は負の対照を表す。］
【００４３】
Ｚ’因子は０〜１以内である。Ｚ’が０である場合、それは、実験システムが支持できないことを示唆する。０．５＞Ｚ’＞０である場合、それは、実験システムが不良な安定性を有し、そして信頼できないことを示唆する。１＞Ｚ’≧０．５である場合、それは、実験システムが良好な安定性及び信頼性を有することを示唆する。Ｚ’因子が１である場合、正の対照と負の対照との間の標準偏差が０であり、このことは、理想的実験システムを示唆する（Ｊｉ−Ｈｕ Ｚｈａｎｇ， Ｔｈｏｍａｓ Ｄ． Ｙ． Ｃｈｕｎｇ ａｎｄ Ｋｅｖｉｎ Ｒ． Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ． Ａ Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ａｓｓａｙｓ [Ｊ]． Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ． １９９９．４：６7）。
【００４４】
本発明において確立された実験システムの信頼性を評価するためのステップは、次の通りであった：
１）１×１０5個の細胞／ｍｌの細胞懸濁液を調製し、９６ウェル培養プレート（黒色であり、そして底が透明である）に細胞を、１００μｌ／ウェルで播種し、そして３７℃、５％ＣＯ2、８０％湿度で、インキュベーター中で２４時間、細胞を培養するステップ；
２）細胞分析用液体により、細胞をそれぞれ、１００μｌ／ウェルで２回洗浄し、溶液を捨て、そして細胞分析用液体を５０μｌ／ウェルで添加するステップ；
３）細胞分析用液体により希釈されたｈｒＭ−ＣＳＦを添加し、２００ｎｇ／ｍｌの最終濃度を得、対照として、ｈｒＭ−ＣＳＦを含まない細胞分析用液体を設定し、そして３７℃、５％ＣＯ2、８０％湿度で、インキュベーター中で細胞を３０分間インキュベートするステップ；
４）３７℃で予備加熱された細胞固定溶液を１００μｌ／ウェルで添加し、培養物プレートを軽く振盪し、混合物を均等に混合し、そしてプレートを暗所において室温で２０分間放置するステップ；
５）溶液を捨て、２００μｌ／ウェルでヘキスト３３３４２を含む１×ＰＢＳ溶液を添加し、プレートを暗所において室温で３０分間放置するステップ；
６）Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２０００を用いることにより細胞イメージを得、そしてＮｕｃｌｅａｒ  Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｍｏｄｕｌｅを用いて、ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１の核内移行の程度を分析し、そしてＺ′因子を計算するステップ。
【００４５】
２００ｎｇ／ｍｌのｈｒＭ−ＣＳＦの存在下で、本発明において確立されたスクリーニングシステムは、０．７３４の平均Ｚ′因子を有した（図３）。
結果は、本発明の細胞が、チロシンキナーゼ阻害剤をスクリーニングするための、又はチロシンキナーゼに対する化合物の阻害活性を評価するための細胞モデルとして、非常に信頼でき、且つ実行可能であることを示す。
【００４６】
実施例５：ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１核内移行に対する、ｈｒＭ−ＣＳＦにより細胞を処理するための時間の効果
ステップは次の通りであった：
１）実施例１において調製された細胞を用いて、１×１０5個の細胞／ｍｌの細胞懸濁液を調製し、９６ウェル培養プレート（黒色であり、そして底が透明である）に細胞を、１００μ／ウェルで播種し；そして３７℃、５％ＣＯ2、８０％の湿度でインキュベーターにいて細胞を２４時間、培養するステップ；
２）それぞれ、１００μｌ／ウェルで、細胞分析用液体により細胞を２回洗浄し、前記溶液を捨て、そして細胞分析用液体を５０μｌ／ウェルで添加するステップ；
３）５分ごとに細胞分析用液体により希釈されたｈｒＭ−ＣＳＦを添加し、２００ｎｇ／ｍｌの最終濃度を得、ｈｒＭ−ＣＳＦを含まない細胞分析油液体を対照として設定し、３７℃で、インキュベーター中で細胞をインキュベートし、そしてサイトカインにより細胞を、それぞれ０、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０分間、処理するステップ；
４）３７℃で予備加熱された細胞固定溶液を１００μｌ／ウェルで添加し、培養物プレートを軽く振盪し、混合物を均等に混合し、そしてプレートを暗所において室温で２０分間放置するステップ；
５）溶液を捨て、２００μｌ／ウェルでヘキスト３３３４２を含む１×ＰＢＳ溶液を添加し、プレートを暗所において室温で３０分間放置するステップ；及び
６）Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２０００を用いることにより細胞イメージを得、そしてＮｕｃｌｅａｒ  Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｍｏｄｕｌｅを用いて、ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１の核内移行の程度を分析するステップ。
【００４７】
ｈｒＭ−ＣＳＦ因子が添加されると、ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１核内移行が速やかに起こった。細胞が前記因子により５〜３０分間処理される期間中、ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１核内移行の程度は断続的に上昇した。３０分の時点で、ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１核内移行の程度は最大に達した。３０分後、因子により細胞を処理するための時間が上昇するにつれて、ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１核内移行の程度は代わりに、徐々に低下した（図４）。
【００４８】
実施例６：ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１核内移行に対する細胞播種密度の効果
ステップは次の通りであった：
１）９６ウェル培養プレート（黒色であり、そして底は透明である）に、実施例１において調製された細胞を、それぞれ、１０００、２０００、４０００、６０００、８０００、１００００、１２０００、１４０００個の細胞／ｍｌで播種し、そして３７℃、５％ＣＯ2、８０％湿度で、インキュベーター中で、細胞を２４時間培養するステップ；
２）それぞれ、１００μｌ／ウェルで、細胞分析用液体により細胞を２回洗浄し、前記溶液を捨て、そして細胞分析用液体を５０μｌ／ウェルで添加するステップ；
３）細胞分析用液体により希釈されたｈｒＭ−ＣＳＦを、５０μｌ/ウェルで添加し、２００ｎｇ／ｍｌの最終濃度を得、ｈｒＭ−ＣＳＦを含まない細胞分析油液体を対照として設定し、そして３７℃で３０分間、インキュベーター中で細胞をインキュベートするステップ；
４）３７℃で予備加熱された細胞固定溶液を１００μｌ／ウェルで添加し、培養物プレートを軽く振盪し、混合物を均等に混合し、そしてプレートを暗所において室温で２０分間放置するステップ；
５）溶液を捨て、２００μｌ／ウェルでヘキスト３３３４２を含む１×ＰＢＳ溶液を添加し、プレートを暗所において室温で３０分間放置するステップ；及び
６）Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２０００を用いることにより細胞イメージを得、そしてＮｕｃｌｅａｒ  Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｍｏｄｕｌｅを用いて、ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１の核内移行の程度を分析するステップ。
【００４９】
図５に示されるように、細胞播種密度が２０００個の細胞／ウェルから１２０００個の細胞／ウェルに上昇し、そして細胞が２００ｎｇ／ｍｌのｈｒＭ−ＣＳＦにより３０分間処理される場合、ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１核内移行の誘導される程度が徐々に低下した。しかしながら、その低下は有意ではなかった。ブランク対照細胞における細胞質の平均蛍光強度に対する核の平均蛍光強度の比は、細胞播種密度が上昇するにつれて、低下した。
【００５０】
実施例７：細胞モデルにおけるＧＦＰ−ＳＴＡＴ１核内移行に対するＧＷ２５８０の阻害効果
ＧＷ２５８０は、受容体キナーゼのリン酸化を効果的に阻害できる、選択的マクロファージコロニー刺激因子受容体キナーゼ阻害剤である。実施例１において確立されたｃ−Ｆｍｓ阻害剤スクリーニングモデルを用いて、ＧＷ２５８０の阻害活性を評価した。それらのステップは、次の通りであった：
１）９６ウェル培養プレート（黒色であり、そして底は透明である）に、Ｕ２ＯＳ−ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１/ＣＳＦ−１Ｒ細胞を、１．０×１０4個の細胞／ｍｌで播種し、そして前記細胞を、３７℃、５％ＣＯ2、８０％湿度でインキュベーターにおいて、２４時間、培養するステップ；
２）培地を捨て、そして細胞を、細胞分析用液体により、それぞれ１００μｌ／ウェルで２回洗浄するステップ；
３）細胞分析用液体を５０μｌ／ウェルで添加し；細胞分析用液体により希釈された、ＤＭＳＯに溶解されたＧＷ２５８０を、５０μｌ／ウェルで添加し、そして細胞を、３７℃、５％ＣＯ2、８０％湿度で、インキュベーター中で１時間インキュベートするステップ；
４）ｈｒＭ−ＣＳＦを含む細胞分析用液体を、３５μｌ／ウェルで添加し、２００ｎｇ／ｍｌの最終ｈｒＭ−ＣＳＦ濃度を得、そして細胞を、３７℃、５％ＣＯ2、８０％湿度で、インキュベーター中で３０分間インキュベートするステップ；
５）１×ＰＢＳ溶液により希釈された、予備加熱されたホルムアルデヒド（８％）を１２５μｌ／ウェルで添加し、そしてプレートを暗所において室温で２０分間放置するステップ；
６）溶液を捨て、ヘキスト３３３４２を含む１×ＰＢＳ溶液を２００μｌ／ウェルで添加し、そしてプレートを、暗所において室温で３０分間放置し；Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２０００を用いて、細胞イメージを得、Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｍｏｄｕｌｅを用いて、ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１の核内移行の程度を分析し；そしてＯｒｉｇｉｎ７．５ソフトウェアシグモイドフィットにより「Ｓ」型曲線を当てはめ、そしてＩＣ５０値を計算するステップ。
【００５１】
結果を図６に示す。ｈｒＭ−ＣＳＦがヒトｃ−Ｆｍｓを活性化し、そしてＧＦＰ−ＳＴＡＴ１核内移行を誘導する、ｃ−Ｆｍｓ阻害剤をスクリーニングするための細胞モデルにおいては、ＧＷ２５８０はＧＦＰ−ＳＴＡＴ１核内移行を有意に阻害できた（ｎ＝３；ＩＣ50＝３０．７４±２．９ｎＭ）。
【００５２】
実施例８：細胞モデルにおけるＧＦＰ−ＳＴＡＴ１核内移行に対するスーテント（Ｓｕｔｅｎｔ）の阻害効果
スニチニブ（Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）（Ｓｕ１１２４８、Ｓｕｔｅｎｔ）は、多重標的チロシン受容体キナーゼ阻害剤であり、そしてその主要標的は、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、ＰＤＧＦＲ、ｃ−Ｋｉｔである。臨床実施においては、スニチニブは主に、癌、例えば悪性腎細胞癌、及びイマチニブ（Ｉｍａｔｉｎｉｂ）に対して耐性の消化管間質腫瘍を処理するために使用される。スニチニブはまた、ｃ−Ｆｍｓのリン酸化を効果的に阻害することが文献に報告されている（Ｇｕｏ Ｊ， Ｍａｒｃｏｔｔｅ ＰＡ， ＭｃＣａｌｌ ＪＯ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ−１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ｃ−Ｆｍｓ）ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＡＢＴ−８６９ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ[Ｊ]． Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ． ２００６．５(４)：１００７−１０１３）。従って、スーテントの阻害活性が、実施例１において確立されたようなｃ−Ｆｍｓをスクリーニングするための細胞モデルを用いることにより評価された。スーテントの活性は、実施例７における方法に類似する方法を用いることにより評価された。結果は、スーテントがまた、ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１核内移行を効果的に阻害したことを示した（図７に示されるように、ｎ＝３；ＩＣ50＝１４．８５±０．５５ｎＭ）。
【００５３】
実施例９：細胞モデルにおけるＧＦＰ−ＳＴＡＴ１核内移行に対するイマチニブの阻害効果
イマチニブは、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＧにより開発されたチロシンキナーゼ阻害剤であり、そして主に、Ｂｃｒ−ａｂｌを異常発現する骨髄性白血病及び異常ｃ−Ｋｉｔ活性を有する消化管間質腫瘍を処理するために臨床実施において使用される。イマチニブの活性は、実施例７における方法に類似する方法を用いることにより評価された。結果は、イマチニブがＧＦＰ−ＳＴＡＴ１核内移行を効果的に阻害できたことを示した（図８に示されるように、ｎ＝３；ＩＣ50＝１９６．１±２１．７ｎＭ）。
【００５４】
本発明を実施するために具体的形態が詳細に記載されているが、当業者は、種々の補正及び置換が、開示される教示に基づいて詳細に行われ得、そしてその変更は本発明の範囲内であることを理解すべきである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲及びその等価物により定義される。
【図１Ａ】
0005960794.tif 000003
【図１Ｂ】
0005960794.tif 000004
【図２Ａ】
0005960794.tif 000005
【図２Ｂ】
0005960794.tif 000006
【図３】
0005960794.tif 000007
【図４】
0005960794.tif 000008
【図５】
0005960794.tif 000009
【図６】
0005960794.tif 000010
【図７】
0005960794.tif 000011
【図８】
0005960794.tif 000012
【配列表】
0005960794000001.app