(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの人工的に導入されたシステインであって、
ａ）前記オレオシンのＮ末端親水性領域内、又は
ｂ）前記オレオシンのＣ末端親水性領域内、
の少なくとも一方に導入されているシステインを含む修飾オレオシンをコードするポリヌクレオチドを含む、宿主細胞、植物細胞又は植物。
【請求項２】
ポリヌクレオチドが、目的タンパク質に融合された修飾オレオシンを含む融合タンパク質をコードする、請求項１の宿主細胞、植物細胞又は植物。
【請求項３】
好適な対照の宿主細胞、植物細胞又は植物より５０％〜４００％多い脂質を蓄積する、請求項１又は２の宿主細胞、植物細胞又は植物。
【請求項４】
更に、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）合成酵素を発現するように遺伝子操作される請求項１〜３のいずれか１項の宿主細胞、植物細胞又は植物。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドによってコードされる修飾オレオシンを発現する、請求項１〜４のいずれか１項の宿主細胞、植物細胞又は植物。
【請求項６】
宿主細胞、植物細胞又は植物において油体を産生する方法であって、前記方法が、宿主細胞、植物細胞又は植物において、
ａ）少なくとも１つの人工的に導入されたシステインであって、
ｉ）前記オレオシンのＮ末端親水性領域内、又は
ｉｉ）前記オレオシンのＣ末端親水性領域内、
の少なくとも一方に導入されているシステインをそれぞれ含む少なくとも２つの修飾オレオシンと、
ｂ）トリアシルグリセロールと
ｃ）リン脂質と
を組み合わせる工程を含む方法。
【請求項７】
以下の少なくとも１つに該当する：
ｉ）修飾オレオシンが宿主細胞、植物細胞又は植物において発現しており、
ｉｉ）宿主細胞が更に、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）合成酵素を発現するように遺伝子操作されており、
ｉｉｉ）宿主細胞内、植物細胞内又は植物内で、好適な対照の宿主細胞、植物細胞又は植物より５０％〜４００％多い脂質を蓄積し、
ｉｖ）前記方法が、任意に、前記細胞又は生物から油体を精製する追加の工程を含み、前記宿主細胞がヒトの一部を形成しない、請求項６の方法。
【請求項８】
好適な対照植物よりも多い油を蓄積する植物を作出する方法であって、少なくとも１つの人工的に導入されたシステインであって、
ａ）前記オレオシンのＮ末端親水性領域内、又は
ｂ）前記オレオシンのＣ末端親水性領域内、
の少なくとも一方に導入されているシステインを含む修飾オレオシンをコードするポリヌクレオチドで形質転換された植物を提供することを含み、
前記植物が前記ポリヌクレオチドによってコードされる修飾オレオシンを発現する、方法。
【請求項９】
前記植物が、更に、ＴＡＧ合成酵素をコードするポリヌクレオチドで形質転換され、ＴＡＧ合成酵素を発現してＴＡＧを合成する請求項８の方法。
【請求項１０】
前記植物が、好適な対照植物よりも５０％〜４００％多い脂質を蓄積する請求項８又は９の方法。
【請求項１１】
前記植物が、
ｉ）動物飼料と、
ｉｉ）バイオ燃料供給原料とに加工される請求項８〜１０のいずれか１項の方法。
【請求項１２】
宿主細胞にて油体を産生する方法であって、
少なくとも１つの人工的に導入されたシステインであって、
ａ）前記オレオシンのＮ末端親水性領域内、又は
ｂ）前記オレオシンのＣ末端親水性領域内、
の少なくとも一方に導入されているシステインを含む修飾オレオシンをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドとＴＡＧ合成酵素をコードする核酸分子を宿主細胞に導入することと、
修飾オレオシンとＴＡＧ合成酵素を発現させるために前記宿主細胞を培養することを含み、
任意に、
ｉ）前記宿主細胞を油分画に加工し、そして
ｉｉ）前記油を、
Ａ）燃料、
Ｂ）オレオケミカル、
Ｃ）栄養用の油、
Ｄ）化粧用の油、
Ｅ）ポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）、又は
Ｆ）Ａ）〜Ｅ）の組み合わせ、
の少なくとも１つに加工する追加の工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種々の宿主細胞種における油体の産生及び修飾のための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
自然界では、花をつける植物は、油、すなわち、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の蓄積を介してその種子にエネルギーを効率的に保存し、油体の周りにリン脂質タンパク質の単層を埋め込むことによって目立たない油体にそれを保存する。これらの種子作物は種々の農業応用で飼料として、さらに最近では、バイオ燃料の原料供給源としても用いられている。重量当たりを基準にして、脂質は、タンパク質又は炭水化物のエネルギー含量のおよそ２倍を有するので、実質的な焦点は、種々の種の、最も明白には植物の油含量を高めることに置かれている。エネルギーの側面を越えて、油体自体は、独特の特性も有し、組換えタンパク質の精製、多量体タンパク質複合体の形成、乳化及び生物活性体の送達を含むが、これらに限定されない多数のバイオテクノロジーの応用の基礎を形成する。
【０００３】
残念ながら、植物種子は植物バイオマス全体のほんのわずかな比率を代表するにすぎず、改善された農業生産性と代替エネルギーへの要求と共に、費やされた多数の種子作物からの現在の油生産は不十分であることが認識されている。研究の尽力は、植物種子の内部での油の生産の生産性を高めることだけでなく、他の細胞の種類及び種における油の生産にも着目している。
【０００４】
従来の育種及び変異誘発は、この領域で漸増の成功を提供してきたが、遺伝子操作は、高いレベルの油を産出するように生物を改変することにおいて最先端の歩みを行っている。あるグループが種子内での油の生産を上方調節する油の合成経路の種々の部分に沿って研究を進めている一方で、ほかのグループはバイオマスのさらに大きな部分を代表する細胞種にて油を増大させることに着目している。
【０００５】
遺伝子操作が特定の標的での油の含量を高めることに若干の進歩を為している一方で、重大な難題が未だ残っている。さらなる生産性の増大は、種子における油体産生でこれから先実現可能であり、他の細胞の種類及び種において植物種子と類似の油体を産生する手段は、まだ達成されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、種々の程度の安定性を持つ油体を産生するための組成物及び方法を提供する。本発明は、人工的にシステイン残基を導入した修飾オレオシンを作出することに関与する。人工的に導入されるシステイン残基は好ましくは、修飾オレオシンのＮ末端及びＣ末端の親水性側鎖に導入される。
【０００７】
修飾オレオシンの発現によって、維管束植物の生殖組織の域を超えて、新しい種類の細胞及び他の種においてさえ安定な油体の創製を可能にする。ＴＡＧ合成酵素と組み合わせた場合、本発明は、安定な油体として真核細胞におけるＴＡＧの蓄積と保存をもたらす。改変されていない細胞又はさらにＴＡＧ合成酵素だけを発現するものと比べて、本発明は、他の手段で達成される過剰レベルのＴＡＧの蓄積を可能にする。たとえば、本発明は、種子の域を越えて維管束植物の成長部分で高いレベルの安定な油体を蓄積できることを示している。
【０００８】
その成長組織で高いレベルのＴＡＧを伴う植物は、動物原料及びバイオ燃料原料の双方の応用に有益なエネルギー源を提供する。
【０００９】
加えて、宿主細胞（たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ，Ｓ．ｃｅｒｉｖｉｓｅａｅ，Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ，Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）から精製された組換えの修飾オレオシンを用いて人工的な油体を生成することができる。人工的な油体における修飾オレオシン又は形質転換した細胞から精製したものを任意で作製して修飾オレオシンにおけるシステイン残基を介して架橋させることができる。酸化還元環境を操作して架橋の程度を制御することもできる。修飾オレオシンでのシステインの数を変えることによって架橋の程度を誂えることもできる。
【００１０】
これらの技法の組み合わせを用いて、修飾オレオシンと共に形成した油体を乳化特性について誂え、熱安定性、化学安定性及びペプチダーゼ耐性を調節することができる。
【００１１】
修飾オレオシンを目的タンパク質に融合して融合タンパク質を形成することもできる。融合タンパク質（修飾オレオシンに目的タンパク質を加えた）は、細胞又は生物にて組換え的に発現させることができる。このように、発現させた融合タンパク質を含有する油体を用いて種々の応用について目的タンパク質を精製し、送達することができる。
【００１２】
加えて、油体は、動物の胃及び／又は内腔の中でＴＡＧの分解及び／又は生体水素化を防ぎ、又は少なくとも遅らせてＴＡＧ由来の無処理の個々の脂質が動物によって腸に吸収されるのを可能にする。従って、本発明はまた、特に植物における修飾オレオシンの発現を介した動物の食事摂取という点でも有用である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
人工的に導入したシステインを持つ修飾オレオシンをコードするポリヌクレオチド
第１の態様では、本発明は、少なくとも１つの人工的に導入したシステインを含む修飾オレオシンをコードするポリヌクレオチドを提供する。用語オレオシンはステロレオシン及びカレオシンも含む。従って、修飾オレオシンは、修飾オレオシン、修飾カレオシン又は修飾ステロレオシンから選択されてもよい。一実施形態では、修飾オレオシンは修飾オレオシンである。別の実施形態では、修飾オレオシンは修飾カレオシンである。別の実施形態では、修飾オレオシンは修飾ステロレオシンである。各種類のオレオシンの例（オレオシン、カレオシン及びステロレオシン）が本明細書に記載される。
【００１４】
一実施形態では、修飾オレオシンは、少なくとも２つのシステインを含み、そのうちの少なくとも１つは人工的に導入される。さらなる実施形態では、修飾オレオシンは少なくとも２〜少なくとも１３（すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４以上）の人工的に導入されたシステインを含む。一実施形態では、システインは、オレオシンのＮ末端親水性領域、又はオレオシンのＣ末端親水性領域に人工的に導入される。さらなる実施形態では、修飾オレオシンは、Ｎ末端親水性領域に少なくとも１つのシステイン、及びＣ末端親水性領域に少なくとも１つのシステインを含む。さらなる実施形態では、システインは、オレオシンのＮ末端親水性領域及びＣ末端親水性領域にわたって実質的に均一に分配される。
【００１５】
さらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、目的タンパク質に融合した修飾オレオシンを含む融合タンパク質をコードする。
構築物
【００１６】
さらなる態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物を提供する。さらなる態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現構築物を提供する。一実施形態では、構築物のポリヌクレオチドはプロモータ配列に操作可能に連結される。一実施形態では、プロモータ配列は植物の成長組織におけるポリヌクレオチドの発現を駆動することが可能である。さらなる実施形態では、プロモータ配列は、植物の種子におけるポリヌクレオチドの発現を駆動することが可能である。さらなる実施形態では、プロモータ配列は、植物の花粉におけるポリヌクレオチドの発現を駆動することが可能である。さらなる実施形態では、プロモータ配列は大腸菌細胞におけるポリヌクレオチドの発現を駆動することが可能である。さらなる実施形態では、プロモータ配列は、酵母細胞におけるポリヌクレオチドの発現を駆動することが可能である。さらなる実施形態では、プロモータ配列は、藻類細胞におけるポリヌクレオチドの発現を駆動することが可能である。
【００１７】
別の態様では、本発明は、修飾された中性脂質タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する構築物を提供する。一実施形態では、構築物は、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）合成酵素をコードする第２のポリヌクレオチドも含有する。種々の実施形態では、構築物は、種々の宿主細胞でその発現を駆動することが可能であるプロモータ配列に操作可能に連結される。従って、本発明はまた、宿主細胞を誘導して修飾オレオシン及び／又はＴＡＧ合成酵素を発現させる構築物の使用を提供する。種々の実施形態では、修飾オレオシンを発現する構築物とＴＡＧ合成酵素を発現する構築物は同一の又は異なったプロモータによって駆動されてもよい。さらに別の実施形態では、構築物の発現が生じるように好適な機能性内因性プロモータの適当な位置及び方向で構築物を位置づける。種々の実施形態では、構築物は細菌、植物、真菌又は藻類の細胞にて発現させることができる。構築物が植物細胞で発現する一実施形態では、細胞は、成長組織、種子、花粉又は果実組織のものであってもよい。
宿主細胞
【００１８】
さらなる態様では、本発明は、本発明の構築物を含む宿主細胞を提供する。さらなる態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むように遺伝子操作された宿主細胞を提供する。さらなる態様では、本発明は本発明のポリヌクレオチドを発現するように遺伝子操作された宿主細胞を提供する。
ＴＡＧ合成酵素も発現する宿主細胞
【００１９】
さらなる実施形態では、宿主細胞はまた、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）合成酵素を発現するように遺伝子操作される。さらなる実施形態では、宿主細胞は、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）合成酵素をコードする核酸配列を含むように遺伝子操作される。さらなる実施形態では、宿主細胞は、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）合成酵素をコードする核酸配列を含む発現構築物を含む。
【００２０】
さらなる実施形態では、核酸は操作可能にプロモータ配列に連結される。さらなる実施形態では、プロモータ配列は植物の成長組織にて核酸配列の発現を駆動することが可能である。一実施形態では、プロモータ配列は植物の種子にて核酸配列の発現を駆動することが可能である。一実施形態では、プロモータ配列は植物の花粉にて核酸配列の発現を駆動することが可能である。
【００２１】
さらなる実施形態では、プロモータ配列は大腸菌細胞にてポリヌクレオチドの発現を駆動することが可能である。さらなる実施形態では、プロモータ配列は酵母細胞にてポリヌクレオチドの発現を駆動することが可能である。さらなる実施形態では、プロモータ配列は藻類細胞にてポリヌクレオチドの発現を駆動することが可能である。
宿主細胞の種類
【００２２】
宿主細胞はどんな種類の細胞であってもよい。一実施形態では、宿主細胞は原核細胞である。さらなる実施形態では、宿主細胞は真核細胞である。一実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、藻類細胞、及び植物細胞から選択される。一実施形態では、宿主細胞は細菌細胞である。さらなる実施形態では、宿主細胞は酵母細胞である。さらなる実施形態では、宿主細胞は真菌細胞である。さらなる実施形態では、宿主細胞は昆虫細胞である。さらなる実施形態では、宿主細胞は藻類細胞である。さらなる実施形態では、宿主細胞は植物細胞である。
植物
【００２３】
さらなる態様では、本発明は、本発明の植物細胞を含む植物を提供する。さらなる態様では、本発明は、本発明の構築物を含む植物を提供する。さらなる態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むように遺伝子操作された植物を提供する。さらなる態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを発現するように遺伝子操作された植物を提供する。さらなる実施形態では、植物は本発明のポリヌクレオチドによってコードされる修飾オレオシンを発現する。
【００２４】
さらなる実施形態では、修飾オレオシンは植物の成長組織で発現される。さらなる実施形態では、修飾オレオシンは植物の種子で発現される。さらなる実施形態では、修飾オレオシンは植物の花粉で発現される。
植物はＴＡＧ酵素も発現する
【００２５】
さらなる実施形態では、植物はまたトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）合成酵素を発現するように遺伝子操作される。さらなる実施形態では、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）合成酵素を修飾オレオシンと同一の組織で発現させる。
【００２６】
さらなる実施形態では、植物はトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）合成酵素をコードする核酸配列を含むように遺伝子操作される。さらなる実施形態では、植物はトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）合成酵素をコードする核酸配列を含む発現構築物を含む。
【００２７】
さらなる実施形態では、核酸はプロモータ配列に操作可能に連結される。
【００２８】
さらなる実施形態では、プロモータ配列は植物の成長組織にて核酸配列の発現を駆動することが可能である。一実施形態では、プロモータ配列は植物の種子にて核酸配列の発現を駆動することが可能である。一実施形態では、プロモータ配列は植物の花粉にて核酸配列の発現を駆動することが可能である。
人工的に導入されたシステインを伴う修飾されたオレオシンポリペプチド
【００２９】
さらなる態様では、本発明は、少なくとも１つの人工的に導入されたシステインを含む修飾オレオシンを提供する。さらなる態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる修飾オレオシンを提供する。一実施形態では、修飾オレオシンは少なくとも２つのシステインを含むが、そのうちの少なくとも１つは人工的に導入される。さらなる実施形態では、修飾オレオシンは少なくとも２〜少なくとも１３（すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４以上）の人工的に導入されたシステインを含む。
【００３０】
さらなる実施形態では、修飾オレオシンは、Ｎ末端親水性領域に少なくとも１つのシステイン、及びＣ末端親水性領域に少なくとも１つのシステインを含む。好まれる実施形態では、システインは、オレオシンのＮ末端親水性領域又はオレオシンのＣ末端親水性領域に人工的に導入される。好ましくは、システインはオレオシンのＮ末端親水性領域とＣ末端親水性領域の間で実質的に均一に分布する。
人工的に導入されたシステインを含む修飾オレオシンとの融合タンパク質
【００３１】
さらなる態様では、本発明は本発明の修飾オレオシンと目的タンパク質を含む融合タンパク質を提供する。こうした融合タンパク質は修飾オレオシン部分と目的タンパク質の部分を含む。
修飾オレオシンを含む油体
【００３２】
さらなる態様では、本発明は、本発明の修飾オレオシンを含む油体を提供する。さらなる態様では、本発明は、本発明の少なくとも２つの修飾オレオシンを含む油体を提供する。一実施形態では、少なくとも２つの修飾オレオシンは、修飾オレオシンにおけるシステイン残基間のジスルフィド結合を介して互いに架橋される。さらなる実施形態では、修飾オレオシンは修飾オレオシンに人工的に導入されたシステイン残基を介して架橋される。
【００３３】
さらなる実施形態では、油体はさらに融合タンパク質を含むが、融合タンパク質は目的タンパク質に融合したオレオシンを含む。この実施形態では、融合タンパク質におけるオレオシンは人工的に導入したシステインを含まなくてもよい。好ましくは、融合タンパク質中のオレオシンは人工的に導入したシステインを含まない。
【００３４】
この実施形態の油体は、Ｒｏｂｅｒｔｓら（２００８）で議論されたように目的タンパク質を精製し、送達するのに有用である。
【００３５】
しかしながら、この実施形態では、油体における修飾オレオシンの存在によって提供される油体の安定性／完全性を変化させる選択肢を活かすことができるのでさらに厳密な精製及び送達の手順を可能にする。
修飾オレオシンとの融合タンパク質を含む油体
【００３６】
さらなる態様では、本発明は、本発明の融合タンパク質を含む油体を提供し、融合タンパク質は本発明の修飾オレオシンと目的タンパク質を含む。こうした融合タンパク質は修飾オレオシンの部分と目的タンパク質の部分を含む。
【００３７】
一実施形態では、油体は本発明の少なくとも２つの融合タンパク質を含む。
【００３８】
一実施形態では、少なくとも２つの融合タンパク質は、融合タンパク質の修飾オレオシン部分におけるシステイン残基間のジスルフィド結合を介して互いに架橋される。一実施形態では、融合タンパク質は、融合タンパク質の修飾オレオシン部分に人工的に導入されたシステイン残基を介して架橋される。
【００３９】
さらなる実施形態では、油体は本発明の少なくとも１つの修飾オレオシンを含む。さらなる実施形態では、少なくとも１つの融合タンパク質は、融合タンパク質の修飾オレオシンにおけるシステインと修飾オレオシンにおけるシステインを介して少なくとも１つの修飾オレオシンに架橋される。
【００４０】
再び、この実施形態の油体は、Ｒｏｂｅｒｔｓら（２００８）で議論されたように目的タンパク質を精製し、送達するのに有用である。
【００４１】
しかしながら、この実施形態では、油体における修飾オレオシンの存在によって提供される油体の安定性／完全性を変化させる選択肢を活かすことができるのでさらに厳密な精製及び送達の手順を可能にする。
エマルション
【００４２】
さらなる態様では、本発明は本発明の修飾オレオシンを含むエマルションを提供する。一実施形態では、エマルションは修飾オレオシンと好適なキャリアを含む。キャリアは適当な酸化還元環境にて緩衝化されてオレオシンの所望の程度の架橋を保持し得る。
【００４３】
キャリアに修飾オレオシンを再懸濁するには、超音波処理又は高圧ホモジネート、次いで適当な酸化条件への暴露を必要とし得る。
組成物
【００４４】
さらなる態様では、本発明は本発明の修飾オレオシンを含む組成物を提供する。一実施形態では、組成物は修飾オレオシンと好適なキャリアを含む。キャリアは適当な酸化還元環境にて緩衝化されてオレオシンの所望の程度の架橋を達成し得る。
【００４５】
キャリアに修飾オレオシンを再懸濁するには、超音波処理又は高圧ホモジネート、次いで適当な酸化条件への暴露を必要とし得る。
【００４６】
さらなる態様では、本発明は本発明の油体を含む組成物を提供する。一実施形態では、組成物は油体と好適なキャリアを含む。キャリアは適当な酸化還元環境にて緩衝化されて修飾オレオシンの所望の程度の架橋を保持し得る。さらなる実施形態では、本発明は本発明の油体を含む皮膚塗布のために製剤化される組成物を提供する。
本発明の油体を含む植物及びその一部
【００４７】
さらなる態様では、本発明は本発明の油体を含む植物及びその一部を提供する。さらなる態様では、本発明は本発明の油体を含む植物の成長組織を提供する。さらなる態様では、本発明は本発明の油体を含む植物の種子を提供する。
本発明の油体を含む動物飼料
【００４８】
さらなる態様では、本発明は本発明の油体を含む動物飼料を提供する。さらなる態様では、本発明は本発明の植物又はその一部を含む動物飼料を提供する。
油体を作出する方法
【００４９】
さらなる態様では、本発明は油体を作出する方法を提供するが、方法は、
ａ）それぞれ少なくとも１つの人工的に導入されたシステインを含む少なくとも２つの修飾オレオシンと
ｂ）トリアシルグリセロールと
ｃ）リン脂質
を混ぜ合わせる工程を含む。
【００５０】
一実施形態では、修飾オレオシンはそれぞれ少なくとも２つのシステインを含み、そのうちの少なくとも１つは人工的に導入される。さらなる実施形態では、修飾オレオシンはそれぞれオレオシンのＮ末端親水性領域に少なくとも１つのシステイン、及びオレオシンのＣ末端親水性領域に少なくとも１つのシステインを含む。
【００５１】
さらなる実施形態では、修飾オレオシンは少なくとも２〜少なくとも１３（すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４以上）の人工的に導入されたシステインを含む。
【００５２】
一実施形態では、システインはオレオシンのＮ末端親水性領域又はオレオシンのＣ末端親水性領域に人工的に導入される。さらなる実施形態では、システインはオレオシンのＮ末端親水性領域及びＣ末端親水性領域の間で実質的に均一に分配される。さらなる実施形態では、修飾オレオシンはオレオシンにおけるシステイン残基間のジスルフィド結合を介して架橋される。さらなる実施形態では、修飾オレオシンはオレオシンに人工的に導入されたシステイン残基間で架橋される。
【００５３】
一実施形態では、修飾オレオシンは、融合タンパク質の一部であり、融合タンパク質は修飾オレオシンと目的タンパク質を含む。
【００５４】
一実施形態では、方法は、作出される油体の酸化還元環境を制御することによって油体における修飾オレオシンの架橋の程度を調節する追加の工程を含む。
生体内（生体内の油体）で組み合わせるすべての成分
【００５５】
一実施形態では、ａ）、ｂ）及びｃ）の成分を宿主細胞内で組み合わせる。この実施形態では、好ましくは宿主細胞で修飾オレオシンを発現させる。
【００５６】
宿主細胞は好ましくは修飾オレオシンを発現するように遺伝子操作される。
【００５７】
宿主細胞は好ましくは本発明の構築物を含む。宿主細胞は好ましくは本発明のポリヌクレオチドを含むように遺伝子操作される。宿主細胞は好ましくは本発明のポリヌクレオチドを発現するように遺伝子操作される。
宿主細胞はＴＡＧ合成酵素も発現する
【００５８】
さらなる実施形態では、宿主細胞はトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）合成酵素を発現するようにも遺伝子操作される。さらなる実施形態では、宿主細胞はトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）合成酵素をコードする核酸配列を含む発現構築物を含む。
【００５９】
さらなる実施形態では、核酸配列はプロモータ配列に操作可能に連結される。一実施形態では、プロモータ配列は植物の成長組織にて核酸配列の発現を駆動することが可能である。一実施形態では、プロモータ配列は植物の種子にて核酸配列の発現を駆動することが可能である。一実施形態では、プロモータ配列は植物の花粉にて核酸配列の発現を駆動することが可能である。
【００６０】
さらなる実施形態では、宿主細胞はトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）合成酵素をコードする核酸配列を含むようにも遺伝子操作される。さらなる実施形態では、宿主細胞はトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）合成酵素をコードする核酸配列を発現するようにも遺伝子操作される。
【００６１】
修飾オレオシンをコードするポリヌクレオチドとトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）合成酵素をコードする核酸配列は、宿主細胞を形質転換する同一の構築物又は別々の構築物に入れられ得ることが当業者によって理解されるであろう。それぞれの発現は同一のプロモータ又は異なったプロモータによって駆動することができ、それは、形質転換する構築物で誘導され得る。或いは、ポリヌクレオチド及び核酸はプロモータなしで細胞を形質転換することができるが、ポリヌクレオチド及び核酸のいずれかの発現は或るプロモータ又は形質転換された細胞の内因性プロモータによって駆動され得ることも当業者によって理解されるであろう。
【００６２】
さらなる実施形態では、宿主細胞は生物の一部を形成する。好まれる実施形態では生物は植物である。
【００６３】
さらなる実施形態では、油は植物の成長組織で産生される。
【００６４】
方法の一実施形態では、植物は、好適な対照植物よりも約５０％〜約４００％多い脂質を蓄積する。方法のさらなる実施形態では、植物は、好適な対照植物よりも約１００％〜約３００％多い脂質を蓄積する。方法のさらなる実施形態では、植物は、好適な対照植物よりも約１５０％〜約２５０％多い脂質を蓄積する。好適な対照植物には、本発明の方法で使用される形質転換された植物と同一の品種及び／又は種の非形質転換型又は野生型が挙げられる。
【００６５】
さらなる実施形態では、植物は動物飼料に加工される。
【００６６】
さらなる実施形態では、植物はバイオ燃料の原料に加工される。
生体内で産生された油体を精製するための追加の方法工程
【００６７】
一実施形態では、方法は細胞又は生物から油体を精製する追加の工程を含む。
生体内で産生され、精製された油体の架橋の程度を変える追加の方法工程
【００６８】
さらなる実施形態では、方法は、精製された油体の酸化還元環境を制御することによって、生体内で産生され、精製された油体における修飾オレオシンの架橋の程度を調節する追加の工程を含む。一実施形態では、酸化環境の使用によって架橋の程度を高める。さらなる実施形態では、還元環境の使用によって架橋の程度を下げる。
試験管内（試験管内／人工的な油体）で組み合わせる成分
【００６９】
特定の実施形態では、成分ａ）、ｂ）及びｃ）を試験管内で組み合わせる。
【００７０】
一実施形態では、ｂ）及びｃ）の成分と組み合わせる前に、ａ）の修飾オレオシンを本発明の宿主細胞で組換え的に発現させ、宿主細胞から精製しておく。
試験管内／人工的な油体の架橋の程度を変化させる追加の方法工程
【００７１】
さらなる実施形態では、方法は、ａ）、ｂ）及びｃ）の成分を組み合わせる酸化還元環境を制御することによって架橋の程度を調節する追加の工程を含む。一実施形態では、酸化環境にてａ）、ｂ）及びｃ）の成分を組み合わせることによって架橋の程度を高める。さらなる実施形態では、還元環境にてａ）、ｂ）及びｃ）の成分を組み合わせることによって架橋の程度を下げる。油体が含有される酸化還元環境を制御することによって、油体が形成された後、架橋の程度も調節され得る。
【００７２】
さらなる態様では、本発明は、好適な対照植物より多くの油を蓄積する植物を作出する方法を提供し、方法は、ポリヌクレオチドによってコードされる修飾オレオシンを発現する本発明のポリヌクレオチドによって形質転換された植物を提供することを含む。
【００７３】
一実施形態では、植物は、ＴＡＧ合成酵素をコードするポリヌクレオチドによっても形質転換され、ＴＡＧ合成酵素を発現するのでＴＡＧを合成する。
【００７４】
一実施形態では、植物は、本発明のいずれかのポリヌクレオチド及びＴＡＧ合成酵素をコードするポリヌクレオチドの双方によって単一植物又は植物細胞を形質転換することによって作出される。
【００７５】
さらなる実施形態では、植物は、本発明のいずれかのポリヌクレオチドで形質転換した第１の植物を、ＴＡＧ合成酵素をコードするポリヌクレオチドで形質転換した第２の植物と交配させることによって作出され、本発明のポリヌクレオチドとＴＡＧ合成酵素をコードするポリヌクレオチドの双方で形質転換された植物を生じる。
【００７６】
さらなる実施形態では、油はＴＡＧである。さらなる実施形態では、油は植物の成長組織で産生される。
【００７７】
方法の一実施形態では、植物は、好適な対照植物よりも約５０％〜約４００％多い脂質を蓄積する。方法のさらなる実施形態では、植物は、好適な対照植物よりも約１００％〜約３００％多い脂質を蓄積する。方法のさらなる実施形態では、植物は、好適な対照植物よりも約１５０％〜約２５０％多い脂質を蓄積する。
【００７８】
さらなる実施形態では、植物は動物飼料に加工される。
【００７９】
さらなる実施形態では、植物はバイオ燃料の原料に加工される。
【００８０】
さらなる態様では、本発明は宿主細胞にて油体を産生する方法を提供し、方法は、
ａ）本発明の修飾オレオシンをコードする少なくとも１つの核酸分子を宿主細胞に導入することと
ｂ）修飾オレオシンを発現させるために宿主細胞を培養することを含む。
【００８１】
さらなる態様では、本発明は宿主細胞にて油体を産生する方法を提供し、方法は、
ａ）本発明の修飾オレオシンをコードする少なくとも１つの核酸分子とＴＡＧ合成酵素をコードする核酸分子を宿主細胞に導入することと
ｂ）修飾オレオシンとＴＡＧ合成酵素を発現させるために宿主細胞を培養することを含む。
【００８２】
宿主細胞は、本明細書に記載されるような宿主細胞である。
油体
【００８３】
さらなる態様では、本発明は本発明の方法によって産生される油体を提供する。
組成物
【００８４】
さらなる態様では、本発明は本発明の油体を含む組成物を提供する。一実施形態では、組成物は油体と好適なキャリアを含む。キャリアを緩衝化して適当な酸化還元環境を提供し、修飾オレオシンの所望の架橋の程度を保持する。さらなる実施形態では、本発明は、本発明の油体を含む皮膚塗布用に製剤化される組成物を提供する。
本発明の油体を含む植物及びその一部
【００８５】
さらなる態様では、本発明は本発明の油体を含む植物又はその一部を提供する。さらなる態様では、本発明は本発明の油体を含む植物の成長組織を提供する。さらなる態様では、本発明は本発明の油体を含む植物の種子を提供する。さらなる態様では、本発明は本発明の油体を含む植物の花粉を提供する。さらなる態様では、本発明は本発明の油体を含む植物の果実、又は子実体を提供する。
本発明の油体を含む動物飼料
【００８６】
さらなる態様では、本発明は本発明の油体を含む動物試料を提供する。さらなる態様では、本発明は本発明の植物又はその一部を含む動物試料を提供する。
【００８７】
一実施形態では、飼料はヒトを含む哺乳類動物に好適である。さらなる実施形態では、飼料は非ヒト哺乳類に好適である。好ましい動物には、ウシ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、ブタ、ニワトリなどの家畜が挙げられるが、これらに限定されない。
植物
【００８８】
修飾オレオシンは、修飾された天然に存在するオレオシンである。非修飾のオレオシン配列が由来する植物はオレオシン及びオレオシンをコードするポリヌクレオチド配列を含有する任意の植物種に由来してもよい。
【００８９】
修飾オレオシンを発現する植物細胞は、任意の植物種に由来してもよい。修飾オレオシンを発現する植物は、任意の植物種に由来してもよい。
【００９０】
一実施形態では、植物細胞又は植物は、裸子植物種に由来してもよい。
【００９１】
さらなる実施形態では、植物細胞又は植物は、被子植物種に由来してもよい。
【００９２】
さらなる実施形態では、植物細胞又は植物は、双子葉植物種に由来してもよい。
【００９３】
さらなる実施形態では、植物細胞又は植物は、単子葉植物種に由来してもよい。
【００９４】
他の好まれる植物は、以下の属：Ｚｅａ、Ｌｏｌｉｕｍ、Ｈｏｒｄｉｕｍ、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｄａｃｔｙｌｉｓ、Ｂｒｏｍｕｓ、Ｔｈｉｎｏｐｙｒｕｍ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ、Ｐｈｅｌｅｕｍ、Ｐｈａｌａｒｉｓ、Ｈｏｌｃｕｓ、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｌｏｔｕｓ、Ｐｌａｎｔａｇｏ及びＣｉｃｈｏｒｉｕｍを含むが、これらに限定されない群から選択される飼料植物種である。
【００９５】
ほかの好まれる植物はマメ科植物である。マメ科の植物又はその一部はＬｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ科植物又はＦａｂａｃｅａｅ科植物における植物を包含してもよい。たとえば、植物は、アルファルファ、クローバを含む飼料マメ科植物；ギンゴウカン；豆、レンズ豆、ルピン、エンドウ豆、落花生、大豆を含む穀類マメ科植物；ルピン、医薬又は産業用のマメ科植物を含む開花マメ科植物；及び休閑又は緑肥のマメ科植物種から選択され得る。
【００９６】
特に好まれる属は、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍである。好まれるＴｒｉｆｏｌｉｕｍ種には、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ  ｒｅｐｅｎｓ；Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ  ａｒｖｅｎｓｅ；Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ  ａｆｆｉｎｅ；及びＴｒｉｆｏｌｉｕｍ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅが挙げられる。特に好まれるＴｒｉｆｏｌｉｕｍ種はＴｒｉｆｏｌｉｕｍ  ｒｅｐｅｎｓである。
【００９７】
別の好まれる属は、Ｍｅｄｉｃａｇｏである。好まれるＭｅｄｉｃａｇｏ種には、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ及びＭｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａが挙げられる。特に好まれるＭｅｄｉｃａｇｏ種はアルファルファとして一般に知られるＭｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａである。
【００９８】
別の好まれる属は、Ｇｌｙｃｉｎｅである。好まれるＧｌｙｃｉｎｅ種には、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ及びＧｌｙｃｉｎｅ  ｗｉｇｈｔｉｉ（Ｎｅｏｎｏｔｏｎｉａ  ｗｉｇｈｔｉｉとしても知られる）が挙げられる。特に好まれるＧｌｙｃｉｎｅ種は大豆として一般に知られるＧｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘである。特に好まれるＧｌｙｃｉｎｅ種は多年生大豆として一般に知られるＧｌｙｃｉｎｅ  ｗｉｇｈｔｉｉである。
【００９９】
別の好まれる属は、Ｖｉｇｎａである。特に好まれるＶｉｇｎａ種は、ササゲとして一般に知られるＶｉｇｎａ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａである。
【０１００】
別の好まれる属は、Ｍｕｃａｎａである。好まれるＭｕｃａｎａ種にはＭｕｃａｎａ  ｐｒｕｎｉｅｎｓが挙げられる。特に好まれるＭｕｃａｎａ種はビロード豆として一般に知られるＭｕｃａｎａ  ｐｒｕｎｉｅｎｓである。
【０１０１】
別の好まれる属は、Ａｒａｃｈｉｓである。特に好まれるＡｒａｃｈｉｓ種は多年生落花生として一般に知られるＡｒａｃｈｉｓ  ｇｌａｂｒａｔａである。
【０１０２】
別の好まれる属は、Ｐｉｓｕｍである。好まれるＰｉｓｕｍ種はエンドウ豆として一般に知られるＰｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍである。
【０１０３】
別の好まれる属は、Ｌｏｔｕｓである。好まれるＬｏｔｕｓ種には、Ｌｏｔｕｓ  ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ、Ｌｏｔｕｓ  ｐｅｄｕｎｃｕｌａｔｕｓ、Ｌｏｔｕｓ  ｇｌａｂａｒ、Ｌｏｔｕｓ  ｔｅｎｕｉｓ及びＬｏｔｕｓ  ｕｌｉｇｉｎｏｓｕｓが挙げられる。好まれるＬｏｔｕｓ種はミヤコグサとして一般に知られるＬｏｔｕｓ  ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓである。別の好まれるＬｏｔｕｓ種は細葉ミヤコグサとして一般に知られるＬｏｔｕｓ  ｇｌａｂａｒである。別の好まれるＬｏｔｕｓ種はネビキミヤコグサとして一般に知られるＬｏｔｕｓ  ｐｅｄｕｎｃｕｌａｔｕｓである。別の好まれるＬｏｔｕｓ種はスレンダーミヤコグサとして一般に知られるＬｏｔｕｓ  ｔｅｎｕｉｓである。
【０１０４】
別の好まれる属は、Ｂｒａｓｓｉｃａである。好まれるＢｒａｓｓｉｃａ種は、飼料ケール及びキャベツとして一般に知られるＢｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａである。
【０１０５】
他の好まれる種は、以下の属：Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ｃａｒｔｈｕｍｕｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ、Ｚｅａ及びＳｅｓａｍｕｍを含むが、これらに限定されない油糧種子作物である。
好まれる油糧種子の属はＢｒａｓｓｉｃａである。好まれる油糧種子の種は、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓである。
好まれる油糧種子の属はＢｒａｓｓｉｃａである。好まれる油糧種子の種は、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａｅである。
好まれる油糧種子の属はＺｅａである。好まれる油糧種子の種は、Ｚｅａ  Ｍａｙｓである。
好まれる油糧種子の属はＣａｒｔｈｕｍｕｓである。好まれる油糧種子の種は、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓである。
好まれる油糧種子の属はＨｅｌｉａｎｔｈｕｓである。好まれる油糧種子の種は、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓである。
好まれる油糧種子の属はＺｅａである。好まれる油糧種子の種は、Ｚｅａ  Ｍａｙｓである。
好まれる油糧種子の属はＳｅｓａｍｕｍである。好まれる油糧種子の種は、Ｓｅｓａｍｕｍ  ｉｎｄｉｃｕｍである。
好まれる貯蔵牧草の属はＺｅａである。好まれる貯蔵牧草の種は、Ｚｅａ  Ｍａｙｓである。
好まれる穀類生産の属は、Ｈｏｒｄｅｕｍである。好まれる穀類生産の種は、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅである。
好まれる牧草の属は、Ｌｏｌｉｕｍである。好まれる牧草の種は、Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅである。
好まれる牧草の属は、Ｌｏｌｉｕｍである。好まれる牧草の種は、Ｌｏｌｉｕｍ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅｕｍである。
好まれる牧草の属は、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍである。好まれる牧草の種は、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ  ｒｅｐｅｎｓである。
好まれる牧草の属は、Ｈｏｒｄｅｕｍである。好まれる牧草の種は、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅである。
【０１０６】
好まれる植物には飼料又は動物飼料用の植物も挙げられる。そのような側物には、以下の属：Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ、Ｐａｎｉｃｕｍが挙げられるが、これらに限定されない。
好まれるバイオ燃料の属はＭｉｓｃａｎｔｈｕｓである。好まれるバイオ燃料の種は、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ  ｇｉｇａｎｔｅｕｓである。
好まれるバイオ燃料の属はＳａｃｃｈａｒｕｍである。好まれるバイオ燃料の種は、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍである。
好まれるバイオ燃料の属はＰａｎｉｃｕｍである。好まれるバイオ燃料の種は、Ｐａｎｉｃｕｍ  ｖｉｒｇａｔｕｍである。
【発明を実施するための形態】
【０１０７】
特許明細書、そのほかの外部の文書又はそのほかの情報源を参照している本明細書では、このことは、本発明の特徴を議論する文脈を提供する目的で一般的なことである。具体的に特に述べられない限り、そのような外部の文書への参照は、そのような文書又はそのような情報源が、いかなる権限においても、従来技術である又は当該技術における共通する一般的な知識を形成すると認めることとして解釈されるべきではない。
【０１０８】
用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」は本明細書で使用されるとき、「少なくとも部分的にｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ」を意味する。用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」を含む本明細書での各言及を解釈する場合、その用語によって前置きされるもの以外の特徴も存在する。「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」のような関連する用語は同様に解釈されるべきである。
【０１０９】
重量基準についての重量では、脂質はタンパク質又は炭水化物いずれかのエネルギー含量のおよそ２倍を有する。世界の脂質の大半は植物によって生産され、脂質の最高密度の形態がトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）としてである。双子葉植物は、種子重量のおよそ６０％をＴＡＧとして蓄積し、それはその後発芽のためのエネルギー源として使用される。というわけで、動物の飼料及びバイオ燃料の原料の双方のための十分な脂質を持続的に生産するために油が豊富な種子を用いることを対象とする多数の尽力があった。
【０１１０】
種子によって産生することができるＴＡＧの限られた量を考えて、成長組織における追加の脂質（優先的にＴＡＧ）を産生する代替のアプローチが行われつつある。これらのアプローチの大半は、ＴＡＧを合成するために植物の葉におけるＫｅｎｎｅｄｙ経路での１又は数個の酵素の上方調節又は過剰発現を追求している。しかしながら、通常、このアプローチによって産生される追加の脂質の大半は、リパーゼとβ−酸化の組み合わせによって植物内で再動員され、その結果、脂質含量の限られた増加しか生じない（普通、ＤＭの２〜４％）。
【０１１１】
発達している種子で産生されるＴＡＧは通常、油体（ＯＢ）と呼ばれる目立たない構造内に含有され、それは、細胞が乾燥する又は凍結条件を経験する場合でさえ、非常に安定性が高く、合体することなく別々のしっかり詰め込まれた小器官として残存する（Siloto et al., 2006; Shimada et al., 2008）。ＯＢは、タンパク質様の乳化剤によって埋め込まれたリン脂質の単層によって取り囲まれるＴＡＧのコアから成る。前者はＯＢの０．５〜３．５％を構成し、この８０〜９０％がオレオシンであり、残りは主としてカルシウム結合（カレオシン）及びステロール結合（ステロレオシン）のタンパク質から成る（Lin and Tzen, 2004）。オレオシンの乳化特性は、両親媒性のＮ末端鎖と、高度に保存された疎水性のコア（約７２残基）とＣ末端の両親媒性鎖から成る３つの機能的ドメインに由来する。同様に、カレオシン及びステロレオシンの双方も親水性のＮ及びＣ末端鎖及びそれら自体の保存された疎水性のコアを持つ。
【０１１２】
葉におけるＴＡＧ合成酵素によるオレオシン又はポリオレオシン（オレオシンの直列頭尾融合）の構成的な発現は、安定な油体の形成を生じ、ＴＡＧの蓄積をもたらすことは以前推測された。しかしながら、その後、我々はオレオシン及びポリオレオシンは植物の葉において有効ではなく、ＤＧＡＴ１と共に同時発現した場合ＴＡＧの蓄積を促進することを見い出した（Roberts et al., 未発表データ）。
【０１１３】
本発明は、１以上の人工的に導入されたシステイン残基を含有する修飾オレオシンを提供する。操作されたシステインを含有するオレオシンによる中性脂肪の被包は、老化するまで待つ必要がなく、過度の表現型を生じることなく葉にかなりの量のＴＡＧを蓄積する代替のメカニズムを提供する。加えて、修飾オレオシンは、組換えタンパク質の生成及び精製と同様にＯＢの安定性、エマルション特性を改変することを含む多数のそのほかの適用を有する。
油体
【０１１４】
ＯＢは一般に、直径０．５〜０．５μｍの範囲で、タンパク質様乳化剤、主としてオレオシンに埋め込まれたリン脂質単層によって取り囲まれたＴＡＧコアから成る（Tzen et al, 1993; Tzen, et al 1997）。ＯＢはたった０．５〜３．５％のタンパク質から成り、この８０〜９０％がオレオシンであり、残りは主としてカルシウム結合（カレオシン）及びステロール結合（ステロレオシン）のタンパク質から成る（Lin and Tzen, 2004）。植物細胞におけるオレオシンとＴＡＧの比は、細胞内での油体の大きさと数に影響する（Sarmiento et al., 1997; Siloto et al., 2006）。
【０１１５】
ＯＢは、多数の植物の種子及び花粉で天然に優勢に産生されるが、幾つかのほかの器官（たとえば、特殊な塊茎）でも見られる。
【０１１６】
オレオシンは、ＯＢの表面に埋め込まれる比較的小さな（１５〜２４ｋＤａ）タンパク質である。
油体の安定性
【０１１７】
上記で議論された適用について油体の好適性及び人工的油体は、とりわけ、少なくとも部分的にその安定性によって限定される。油体の安定性に対処するアプローチの１つは、いわゆるポリオレオシンを含む油体を生成することだった。ポリオレオシンは、２以上のオレオシン単位の頭尾融合体である（Roberts et al., 2008）。オレオシン単位の数を変えることによって油体の特性（熱安定性及び分解速度）を誂えるのが可能になる。植物体でのポリオレオシンの発現は、単一のオレオシン単位のように油体へのポリオレオシンの取り込みをもたらす（Scott et al., 2007）。直列の頭尾配置での複数のオレオシンを用いてポリオレオシンを創る。植物体内及び大腸菌での発現のために別々の構築物（１〜６のオレオシン反復を含有する）が具体的に設計された。組換えポリオレオシンの大半は、トランスジェニック植物の油体及び大腸菌の封入体で蓄積した。精製した原核細胞で作ったポリオレオシンを用いて人工的な油体を生成した。油体及び人工的油体の熱安定性とプロテイナーゼＫにおける構造的統合性は、ポリオレオシンによって上がった。
【０１１８】
しかしながら、ポリオレオシンが提供できる保護／安定性の程度を決定する幾つかの限定要因があり；これらは、翻訳の過程の前に連結されることが可能である直列反復の数に関係しており、油体の標的が限定となり（Scott et al., 2007）；一方で、別の限界は、頭尾の融合配置での転写物を生成することによって達成されるオレオシン融合の性質からもたらされる。これは本質的には、多数の共有結合と個々のオレオシン反復（すなわち、各末端で最大１）当たりの共有結合の位置を有する多量体オレオシン反復の直鎖タンパク質である。加えて、この配置は、Ｎ末端で分解するタンパク質に対する保護を提供するのみで、特定の内部ペプチド配列を認識するほかのタンパク質分解酵素に対する追加的な保護を提供しない。さらに、直列頭尾反復によって形成されるポリオレオシン分子におけるオレオシン単位間の結合はその場で容易に変更されない。油体又は人工油体に埋め込まれた融合ポリオレオシン分子を分解するために部位特異的な特定のプロテアーゼが結合領域で操作され得る一方で、それらは容易に再融合され得ない。
【０１１９】
油体に埋め込まれたオレオシンは、たとえば、グルタールアルデヒド又はゲニピンのような架橋剤の添加によって予め共有結合で架橋されているが（Peng et al., 2004 & 2006）、この無作為な架橋は、油体調製物への架橋剤の添加を必要とし、反転しにくい。
人工油体
【０１２０】
原核細胞で発現させた組換えオレオシンを用いて人工油体（ＡＯＢ）を生成することができ、その特性は、植物由来のＯＢによく似ている（Peng et al. 2004; Roux et al. 2004; Chiang et al. 2005; Chiang et al. 2007）。
油体及び人工油体の応用
【０１２１】
油体及びその構成成分オレオシンの独特の特性は、組換えタンパク質の精製、多量体タンパク質複合体の形成、乳化、生体活性成分の送達、多価生体活性成分の生成を含む多数のバイオテクノロジー応用、及び可能性のある風味増強剤としてでさえ、その基礎を形成する（概説については、Capuano et al., 2007 and Roberts et al., 2008を参照）。
エマルション
【０１２２】
エマルションは、普通、異なった極性なので異なった疎水性のために別の液体では非混和性である１以上の液体がその液体で均一に懸濁される場合に作出される。例には、水に均一に分散された油滴、又は油に分散された水滴が挙げられる。相対的に安定なエマルションの生成には、液体間の界面張力を下げる乳化剤の使用が求められる。エマルションの安定性は一般に、均一な分散が特定の条件下で持続する持続時間という点で測定される。乳化剤は食物産業及び化粧品産業で一般に使用されるので、高いエマルション安定性を有し、消費及び局所塗布に安全であることが必要とされる。
【０１２３】
オレオシンを含有する無処理の油体は天然にて界面活性剤を含まない水中油エマルションを形成する。無処理の油体又はＴＡＧの大半が取り除かれた油体は、食物、局所の身の回りのケア（皮膚クリーム）及び医薬製剤にて広範囲の乳化適用を有することが見い出されている（Harada et al., 2002; Deckers et al., 2003; Hou et al., 2003）。
生体水素化
【０１２４】
反芻動物の飼料の脂質特性は肉及び乳製品の脂質特性に影響を及ぼすことが明らかにされている（Demeyer and Doreau, 1999）。異なった植物は異なった脂質特性を有し；所望の脂質特性を持つ植物のみで選択的に動物を飼養することによって、下流にある肉及び乳製品の脂質特性に積極的に影響を与えることが可能である。反芻動物では、肉や乳になる最終的な脂質は食物脂質に影響されるだけでなく、生体水素化に大きく影響される（Jenkins and McGuire 2006; Firkins et al., 2006; Lock and Bauman, 2004）。生体水素化は、反芻胃に存在する生物相による非還元化合物（たとえば、不飽和脂肪）の水素化である。微生物分解に耐性であるタンパク質（単数）又はタンパク質（複数）に脂質を被包することによって生体水素化を防ぐ／遅らせることができる（Jenkins and Bridges 2007）。植物体内におけるポリオレオシン又はオレオシンにトリアシルグリセリドを被包することによる生体水素化の防止はＳｃｏｔｔら（２００７）、Ｃｏｏｋｓｏｎら（２００９）及びＲｏｂｅｒｔｓら（２００８）によって報告された。
オレオシン
【０１２５】
オレオシンは、細胞が乾燥する又は凍結条件を経験する際に合体することなくＯＢがしっかり詰まった別々の小器官になるのを可能にする比較的小さな（１５〜２４ｋＤａ）タンパク質である（Leprince et al., 1998; Siloto et al., 2006; Slack et al., 1980; Shimada et al.2008）。
【０１２６】
オレオシンは、両親媒性のＮ末端鎖と、高度に保存された疎水性のコア（約７２残基）とＣ末端の両親媒性鎖から成る３つの機能的ドメインを有する。受け入れられている位相モデルは、Ｎ及びＣ末端の両親媒性の鎖がＯＢの外側に位置し、中央の疎水性コアがＯＢの内側に位置するものである（Huang, 1992; Loer and Herman, 1993; Murphy 1993）。Ｎ及びＣ末端の両親媒性の鎖の負に荷電した残基が水性外部にさらされ、正に荷電した残基がＯＢ内部にさらされ、負に荷電した脂質に向く。従って、外側に向いた負の電荷を持つ両親媒性の鎖は、生体内及び単離された調製にて立体障害及び静電的な反発力を介して個々の実体としてのＯＢを維持することに関与する（Tzen et al, 1992）。Ｎ末端の両親媒性の鎖は可変性が高いのであらゆる例で特定の二次構造を記載できない。比較してＣ末端鎖は３０〜４０酸基のα−螺旋ドメインを含有する（Tzen et al, 2003）。中央のコアは高度に保存され、天然に存在すると知られる最長の疎水性領域であると考えられ、中央で、３つの間隔を空けたプロリンを含む保存された１２残基のプロリンノットモチーフである（概説についてはFrandsen et al, 2001; Tzen et al, 2003を参照）。中央ドメインの二次、三次及び四次の構造は未だ不明のままである。多数の異なった配置について、モデル化フーリエ変換赤外線（ＦＴ−ＩＲ）及び円二色性での証拠が存在する（概説についはRoberts et al., 2008を参照）。
【０１２７】
主なオレオシンの特性は植物間で相対的に保存されており、以下を特徴とする。
・およそ１４０〜２３０アミノ酸残基に相当する１５〜２５ｋＤａ。
・タンパク質配列は、その全長に沿って４つの部分にほぼ均等に分割することができ、それは、Ｎ末端親水性領域と、２つの中央の疎水性領域（プロリンノブ又はノブによって連結された）と、Ｃ末端親水性領域に相当する。
・オレオシンのトポロジーは、親水性領域が隣接する折り畳まれた疎水性のコアを含むその物理的特性に起因する。この配置は、オレオシンに両親媒性の性質を付与し、リン脂質単層に包埋される疎水性ドメインを結果的に生じる（Tzen et al., 1992）一方で、隣接する親水性ドメインは細胞質の水性環境にさらされる。
・通常、オレオシンはシステインを含有しない。
【０１２８】
本発明で使用するのに好まれるオレオシンは、荷電残基が割り込まない、２つの親水性鎖が隣接する、およそ７０の非極性アミノ酸残基（プロリンノットを含む）の中央ドメインを含有するものである。
【０１２９】
用語「オレオシン」には本明細書で使用されるとき、ステロレオシン及びカレオシンも含まれる
ステロレオシン
ステロレオシンは、１４残基の疎水性アンカー領域によって接続された２つの両親媒性α−螺旋（各螺旋で９１２残基）を含むＮ末端アンカー断片を含む。可溶性のデヒドロゲナーゼドメインはＮＡＤＰ＋結合サブドメインとステロール結合サブドメインを含有する。ステロレオシンＡとＢの明らかな違いは、その多様なステロール結合サブドメインに存在する（Lin and Tzen, 2004）。ステロレオシンは、その疎水性ドメインにプロリンノブを有し、その親水性鎖の一方にステロール結合デヒドロゲナーゼを有する。
カレオシン
【０１３０】
カレオシン（Frandsen et al., 2001）は、基本のオレオシンとはやや異なったプロリンノブを有し、親水性鎖にカルシウム結合モチーフと幾つかのリン酸化部位と思われる部位を含有する。オレオシンに似て、カレオシンは、Ｎ及びＣ末端鎖が親水性である一方で中央のドメインが疎水性であり、油体のアンカーとして作用する３つの構造ドメインを有すると提唱されている。Ｎ末端親水性ドメインは、構造上の転換点としての不変のグリシン残基とカルシウム結合リガンドとしての５つの保存された酸素含有残基を含む２８残基のヘリックスターンヘリックス・カルシウム結合ＥＦハンドモチーフから成る（Chen et al., 1999; Frandsen et al., 2001）。Ｃ末端の親水性ドメインは、幾つかのリン酸化部位を含有し、Ｃ末端近傍はジスルフィド結合内又はジスルフィド結合間に含まれない不変のシステインである（Peng, 2004）。カレオシンの親水性のＮ及びＣ末端は、オレオシンよりもおよそ３倍長い（Lin and Tzen, 2004）。疎水性ドメインは両親媒性のα−ヘリックスとアンカー領域（プロリンノットを含む）から成ると考えられる。
【０１３１】
少なくとも１つの人工的に導入されたシステインの付加によって、本発明での使用のために修飾されるのに好適なオレオシン（オレオシン、ステロレオシン及びカレオシン）の配列の例を以下の表１に示す。配列（ポリヌクレオチド及びポリペプチドの双方は配列表に提供される）。
【表１】
0005934101.tif 000002
【０１３２】
オレオシン、ステロレオシン及びカレオシンは当業者に周知である。当業者に周知の方法によって多数の異なった種からさらなる配列を容易に特定することができる。たとえば、用語、オレオシン、ステロレオシン及びカレオシンのいずれか１つを用いてＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ  Ｃｒｏｓｓ−データベースサーチ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/
gqueryにて利用可能)によってさらなる配列を容易に特定することができる。
植物脂質の生合成
【０１３３】
植物細胞はすべて色素体に局在する一般的な経路によってアセチル−ＣｏＡから脂肪酸を産生する。次いで新しく合成されたアシル鎖の一部を色素体の中で脂質の生合成に使用するが（原核細胞の経路）、大部分は、小胞体（ＥＲ）又はそのほかの部位でのグリセロ脂質の集合のために細胞質ゾルに運び出される（真核細胞の経路）。加えて、色素体外のグリセロ脂質の一部が色素体に戻り、それが色素体とＥＲの脂質のプール間での相当な混合を生じる（Ohlrogge and Jaworski 1997）。
【０１３４】
脂肪酸生合成の色素体経路の最も単純な説明は、２つの酵素系：アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）と脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）から成る。ＡｃＣａｓｅは、アセチル−ＣｏＡからのマロニル−ＣｏＡの形成を触媒し、ＦＡＳはマロニル部分をアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）に移し、マロニルＡＣＰによる成長するアシル鎖の伸長を触媒する。
【０１３５】
最初の脂肪酸合成反応は、３−ケトアシル−ＡＣＰＩＩＩ（ＫＡＳＩＩＩ）によって触媒され、アセチル−ＣｏＡとマロニル−ＡＣＰの縮合を生じる。その後の縮合はＫＡＳＩとＫＡＳＩＩによって触媒される。脂肪酸合成のその後のサイクルが始まる前に、残りのＦＡＳ反応にてケトアシル−ＡＣＰ中間体を飽和アシル−ＡＣＰに還元し、３−ケトアシル−ＡＣＰ還元酵素、３ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラーゼ及びエノイル−ＡＣＰ還元酵素によって順次還元する。
【０１３６】
ＦＡＳの最終生成物は普通、１６：０及び１８：０のＡＣＰであり、植物細胞の最終的な脂肪酸組成は大部分、脂肪酸合成の終了段階でのこれらアシル−ＡＣＰを使用する幾つかの酵素の活性によって決定される。ステアロイル−ＡＣＰ不飽和化酵素はＣ１８：０−ＡＣＰの９位にてシス二重結合を挿入することによってＦＡＳの最終生成物を修飾する。脂肪酸合成の反応は、ＡＣＰからのアシル鎖の加水分解又は転移によって終了する。加水分解はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼによって触媒され、それには２つの主な種類があり、一方のチオエステラーゼは１８：１−ＡＣＰに相対的に特異的であり、第２のものは飽和アシル−ＡＣＰにさらに特異的である。チオエステラーゼによってＡＣＰから放出された脂肪酸は色素体を離れ、真核細胞の脂質経路に入り、そこでＥＲ上にて主としてグリセロ脂質にエステル化される。色素体のアシルトランスフェラーゼは、チオエステラーゼとは対照的に、ＡＣＰからのアシル部分をグリセロールに転移させることによって脂肪酸合成を終了させ、それらは、色素体のグリセロ脂質集合をもたらす原核細胞の脂質経路の必須の部分である。
トリアシルグリセロールの生合成
【０１３７】
ＴＡＧ生合成における唯一の関与工程は、最後の１つ、すなわち、第３の脂肪酸を既存のジアシルグリセロールに付加してＴＡＧを生成することである。植物では、この工程は、アシルＣｏＡ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ１），無関係なアシルＣｏＡ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ２）、ＤＧＡＴ１及びＤＧＡＴ２と１０％未満の同一性を有する可溶性ＤＧＡＴ（ＤＧＡＴ３）（Saha et al., 2006）、ホスファチジルコリン−ステロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ）及びワックスシンターゼ（ＷＳＤ１、Li et al., 2008）を含む５つのＴＡＧ合成酵素（主としてＥＲに局在する）の１つによって優勢に（しかし、排他的ではなく）行われる。ＤＧＡＴ１及びＤＧＡＴ２のタンパク質は、２つの異なった遺伝子ファミリーによってコードされ、ＤＧＡＴ１はおよそ５００のアミノ酸と１０の予測された膜貫通ドメインを含有し、ＤＧＡＴ２はたった３２０のアミノ酸と２つの膜貫通ドメインを有する（Shockey et al., 2006）。
【０１３８】
用語「トリアシルグリセロール合成酵素」又は「ＴＡＧ合成酵素」は本明細書で使用されるとき、既存のジアシルグリセロールに第３の脂肪酸を付加してＴＡＧを生成することを触媒することが可能な酵素を意味する。好まれるＴＡＧ合成酵素には、アシルＣｏＡ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ１）、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ２）、ホスファチジルコリン−ステロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ）及びＤＧＡＴの細胞質可溶性形態（可溶性ＤＧＡＴ又はＤＧＡＴ３）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３９】
内因性のＤＧＡＴ１及びＤＧＡＴ２が成熟した及び老化する葉で役割を担うと思われる（Kaup et al. 2002; Shockey et al. 2006）ことを考えれば、植物はそれらの活性を制御するための多数のフィードバック機構を持つと思われる。実際、Ｚｏｕら（２００８）は、最近、Ｓｅｒがリン酸化のための残基であるＳＮＦ１関連のタンパク質キナーゼ−１（ＳｎＲＫ１）のメンバーに典型的な標的モチーフとしてＴｒｏｐａｅｏｌｕｍ  ｍａｊｕｓ（キンレンカ）のＤＧＡＴ１（ＴｍＤＧＡＴ１）の配列内にコンセンサス配列（Ｘ−Ｌｅｕ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｖａｌ）を特定した。ＳｎＲＫ１タンパク質は、植物における炭素代謝の一般的な調節、たとえば、リン酸化によるスクロースリン酸シンターゼの不活化にますます関与するとみなされているＳｅｒ／Ｔｈｒタンパク質キナーゼの部類である（Halford & Hardie 1998).  Zou et al. (2008）。Ｚｏｕら（２００８）は、単一の点突然変異（ＴｍＤＧＡＴ１のＳｅｒ１９７Ａｌａ）によるＳｎＲＫ１のリン酸化部位と思われる部位の除去が種子におけるＴＡＧの有意に高いレベルの蓄積をもたらすことを明示し続けた。この突然変異は活性を３８〜８０％高め、それは、シロイヌナズナにおける種子ベース当たりの油含量の２０〜５０％の増加をもたらした。
【０１４０】
リン脂質：ＤＧＡアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ）は、リン脂質の分子とジアシルグリセロールの分子からＴＡＧを形成する。ＰＤＡＴは酵母で発現させるとかなり活性があるが、植物種子で発現させるとＴＡＧの収量を感知できるほど高めない。ＰＤＡＴ及びＤＡＧ：ＤＡＧトランスフェラーゼは、ＴＡＧを産生する中性脂質合成酵素ではあるが、Ｋｅｎｎｅｄｙ経路の一部とはみなされない。
【０１４１】
ワックスエステルシンターゼとＤＧＡＴ酵素の組み合わせ（ＷＳ／ＤＧＡＴ）は、調べた限りの中性脂質を産生する原核細胞すべてで見つけられている。ＷＳ／ＤＧＡＴは、種々の独特の脂肪酸、アルコールに及びチオールにさえも桁外れに広い活性を有する。この酵素は推定上の膜貫通領域を有するが、真核細胞からのＤＧＡＴ１及びＤＧＡＴ２のファミリー又はホホバ（ホホバはワックスエステルを蓄積することが見い出されている唯一の真核生物である）由来のＷＥシンターゼに対して配列相同性を示さない。
【０１４２】
レシチン／コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）及びアシル補酵素：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）はＴＡＧではなくステロールエステル（中性脂肪の形態）を産生する酵素であることが言及されるべきである。
【０１４３】
中性脂質の増加を必要とする適用では、証拠は、ＤＧＡＴ２に比べてＤＧＡＴ１の高い活性及び広い特異性が優先的であることを示唆している。たとえば、長鎖ＰＵＦＡのような特定の脂肪酸が好まれる場合、それが最適な脂肪酸を受け入れるならば、ＤＧＡＴ１がやはり適用可能である。植物は一般にｓｎ−２位にて長鎖ＰＵＦＡを取り込む。これが、この基質におけるＬＰＡＴの高い活性によるのか、ＤＧＡＴ１の低い活性によるのかは分かっていない。ＰＵＦＡへの改善された特異性については、これらの脂肪酸を好むＤＧＡＴ２が好ましくてもよいし、又はＤＧＡＴ１の特性が指向進化又は同等の手順を用いて変えられてもよい。
【０１４４】
幾つかの植物種のメンバーに由来する、本発明の方法及び組成物での使用に好適なこれらＴＡＧ合成酵素の例を以下の表２に提供する。配列（ポリヌクレオチド及びポリペプチドの双方は配列表に提供される）
【表２】
0005934101.tif 000003
【０１４５】
本発明はまた、その特異性及び／又は活性を変えるように修飾される（たとえば、置換、挿入又は付加などによりその配列にて）修飾ＴＡＧ合成酵素の使用も企図する。
葉におけるＴＡＧの蓄積
【０１４６】
米国北中央部における３０２種の被子植物の最近のフィールド調査では、普通、葉肉細胞当たり１つの大きな油滴を伴って２４％が葉において明白な細胞質油滴を有することが判った（Lersten et al., 2006 [from Slocombe  et al 2009]）。葉の細胞質ＴＡＧの役割は、炭素貯蔵及び／又は膜の脂質リモデリングに関与することであると考えられる（概説についてはSlocombe et al., 2009を参照）。実際、老化している葉では、色素体脂肪酸は、さらなる動員に先立ってＴＡＧに区分化され、ＤＧＡＴ１がこの過程では役立つと考えられる（Kaup et al., 2002）。
【０１４７】
葉において高レベルのＴＡＧを蓄積するように植物を操作する幾つかの試みがあった。蓄積されたＴＡＧの相対的に低いレベルと場合によっては老化している葉でのみ大半のＴＡＧが蓄積されるために、どの時点においてもＴＡＧを蓄積している作物の収穫と比率が限定されることによって、試みの成功は幾分限定されていた（Bouvier-Nave et al, 2001; Xu et al., 2005; Winichayakul et al., 2008; Andrianov et al., 2010; Slocombe et al., 2009 及びその中の文献）。
【０１４８】
今までのところ、葉においてＴＡＧを蓄積させる試みは、ＤＧＡＴの過剰発現（ＴＡＧの生合成）、ＴＧＤ１又はＣＴＳの成熟（脂質の再動員の防止を生じる）及びＬＥＣ１とＬＥＣ２とＷＲＩＩの過剰発現（発達中の種子における貯蔵油とタンパク質の蓄積に関与する転写因子）を含む３つの特定の遺伝子候補に主として着目している。ＴＡＧ及びそのほかの中性脂質合成酵素の過剰発現は、展開している及び／又は成熟した葉における十分な基質の存在に頼っており、これは、膜のために脂質を合成する色素体（葉の場合葉緑体）によって提供されると想定される。シロイヌナズナの光合成の葉では、膜の脂質の代謝回転は１日当たり全脂肪酸の４％であると概算されている（Bao et al, 2000）。老化している葉では、既存の色素体の膜がさらなる動員に先立ってＴＡＧに区分化するために大半の脂肪酸を提供する。
【０１４９】
タバコの葉におけるシロイヌナズナＤＧＡＴ１遺伝子の過剰発現は、高いＴＡＧの蓄積を生じ（Bouvier-Nave et al., 2001）、これはその後Ａｎｄｒｉａｎｏｖら（２０１０）によって繰り返された。彼らは増加したＴＡＧのレベルを２０倍で、成熟した葉における乾物の約３〜約６％の脂質含量の倍加への優勢を算出した。誘導可能なＡｌｃプロモータを用いて成熟した葉にてＬＥＣ２（種子の成熟と種子油の貯蔵の主な調節因子）を過剰発現させることによって６．８％までのさらなる増加を達成した（Andrianov et al., 2010）。展開している葉における抽出可能なＴＡＧの概算はなかったし、ＴＡＧ蓄積の算出もなかった。
【０１５０】
シロイヌナズナでのパーミアーゼ様タンパク質、ＴＲＩＧＡＬＡＣＴＯＳＹＬＤＩＡＣＹＬＧＬＹＣＥＲＯＬ（ＴＧＤ１）における突然変異は、ＴＡＧ、オリゴガラクト脂質及びホスファチデートの蓄積を引き起こしたが；これには胚珠発育不全の高い発生と相対的に乏しい植物全体の成長が伴った（Xu et al., 2005）。
【０１５１】
Ｗｉｎｉｃｈａｙａｋｕｌら（２００８）は、ライグラス（Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ）の葉においてシロイヌナズナＤＧＡＴ１を過剰発現させ、これが、抽出可能な葉の脂質全体（乾物の約４〜６％）の５０％上昇に至る差であることを見つけた。さらに、上昇した脂質のレベルは、２〜３週間間隔を空けた反復収穫によって生成された新しい葉に存在したことは、新しく出現する葉も追加の脂質を蓄積することが可能であったことを示している。しかしながら、これらの葉における高い脂質レベルは通常、葉が２週齢を超えると野生型のレベルまで低下し始めるということは、脂質が異化作用を介して再動員されることを示している（リパーゼ、次いでβ−酸化によるグリセロール主鎖からの放出）。
【０１５２】
Ｓｌｏｃｏｍｂｅら（２００９）は、ＣＴＳペルオキシソームＡＢＣトランスポータ（ｃｔｓ−２）における突然変異が特に老化の開始の間に葉において１．４％までのＴＡＧの蓄積を招くことを明らかにした。彼らはまた、ｃｔｓ−２の背景のもとで老化の間にＬＥＣ２を異所性に発現させたが；これは、ｃｔｓ−２変異体に対してＴＡＧの全体的な蓄積を高めなかったが、老化組織にてＴＡＧの種子油型の種の蓄積を高めた。ｃｔｓ−２は脂肪酸の分解を阻止するが、難しい表現型ももたらす。Ｓｌｏｃｏｍｂｅら（２００９）は、再利用された膜の脂肪酸は、老化組織の種子プログラムを発現することによって又は脂肪酸の分解を阻止することによってＴＡＧに再指向させられ得ると結論付けた。
【０１５３】
Ｓｃｏｔｔら（２００７）は、トリアシルグリセリド合成酵素とポリオレオシン（直列頭尾配置で融合した２以上のオレオシン）の同時発現が植物細胞にて脂質の貯蔵を可能にすると主張した。同様に、Ｃｏｏｋｓｏｎら（２００９）は、植物の成長組織内で単一のオレオシンとＴＡＧ合成酵素を産生させることが、成長組織における油体とＴＡＧの数の増加に繋がると主張した。これらの技法のいずれかを用いることがおよそ５０％までの脂質含量（必ずしもＴＡＧの形態ではない）の最大増加をもたらす。さらに、このレベルは葉が成熟するにつれて；通常２週齢を超えた葉にて、低下し始める（未発表データ）。
【０１５４】
従って、ＴＡＧが成長組織で蓄積され得る程度は、内因性の固定炭素の回収機構がＴＡＧを異化するという事実によってある程度限定されると思われる。
葉の老化−ＴＡＧ中間体を介した脂質の再利用
【０１５５】
葉の老化は、細胞、組織及び最終的には器官全体の死を結局招く高度に制御された事象の順序である。これは、老化している組織から未だ成長し、発達しているほかの組織への転移と一緒に養分の調節された動員を伴う。葉緑体は、老化の兆候を示す葉肉細胞の第１の小器官であり、葉の老化カスケードにてチラコイド膜の分解が早期に開始されるが、葉緑体のエンベロープは老化の最終段階まで相対的に無傷のままである。ＤＧＡＴ１はシロイヌナズナの葉の老化の間、上方調節され、これは葉緑体のガラクト脂質で一般に見られるＴＡＧ含有の脂肪酸のレベルの上昇と一時的に相関する。老化している葉、特に老化している葉緑体から葉の成長している部分への膜炭素の動員は、葉の老化の鍵となる特徴であり、チラコイド脂質の脱エステル化と得られた脂肪酸の師部移動性スクロースへの変換が関与する。チラコイド脂質の脱エステル化は、１以上の老化誘導のガラクトリパーゼが介在すると思われる。ＴＡＧの形成は、老化の間の膜脂質炭素の師部移動性スクロースへの動員における中間体工程であると思われる（Kaup et al., 2002）。
人工的に導入されたシステインを含むように操作された修飾オレオシン
【０１５６】
本発明の又は本発明の方法で使用されるための修飾オレオシンは、少なくとも１つの人工的に導入されたシステイン残基を含有するように修飾される。好ましくは、操作されたオレオシンは少なくとも２つのシステインを含有する。
【０１５７】
操作されたシステインを含有するオレオシンによる中性脂質の被包は、老化するまで待つ必要がなく、極度の表現型を生成することもなく、葉における感知できる量のＴＡＧを蓄積する代替メカニズムを提供する。
【０１５８】
人工的に導入されたシステインを持つ修飾オレオシンの生成に、当業者に周知の種々の方法を用いてもよい。
【０１５９】
そのような方法には、コードされたオレオシンにシステインを導入するようにオレオシンをコードするポリヌクレオチドを修飾する部位特異的変異誘発（米国特許第６，４４８，０４８号）が挙げられる。
【０１６０】
或いは、修飾されたオレオシンをコードするポリヌクレオチドを全体で合成してもよい。
【０１６１】
本発明の及び本発明の方法で使用するための修飾オレオシンを製造するさらなる方法は、実施例の節で提供される。
【０１６２】
導入されるシステインは追加のアミノ酸（すなわち、挿入）であってもよいし、既存のアミノ酸を置き換えて（すなわち、置換）もよい。好ましくは、導入されるシステインは既存のアミノ酸を置き換える。好まれる実施形態では、置き換えられるアミノ酸は荷電した残基である。好ましくは、荷電した残基は親水性ドメインにあることが予測されるので、油体の表面に位置すると思われる。
【０１６３】
標準の方法論（たとえば、Kyte and Doolitle (1982）を用いて、オレオシンの親水性及び疎水性の領域／鎖は当業者によって容易に特定され得る。
【０１６４】
本発明の修飾オレオシンは好ましくは５〜５０ｋＤａ、さらに好ましくは１０〜４０ｋＤａ、さらに好ましくは１５〜２５ｋＤａの分子量の範囲である。
【０１６５】
本発明の修飾オレオシンは好ましくは、１００〜３００アミノ酸、さらに好ましくは１１０〜２６０アミノ酸、さらに好ましくは１２０〜２５０アミノ酸、さらに好ましくは１３０〜２４０アミノ酸、さらに好ましくは１４０〜２３０アミノ酸のサイズ範囲にある。
【０１６６】
好ましくは、修飾オレオシンは、Ｎ末端親水性領域と、２つの中央疎水性領域（プロリンノット又はノブによって連結される）と、Ｃ末端親水性領域を含む。
【０１６７】
好ましくは、修飾オレオシンは、Ｎ末端親水性領域（又は鎖）と、２つの中央疎水性領域（プロリンノット又はノブによって連結される）と、Ｃ末端親水性領域（又は鎖）に相当する４つの部分にその全長をほぼ均等に分割することができる。
【０１６８】
好ましくは、修飾オレオシンのトポロジーは、親水性ドメインが隣接する折り畳まれた疎水性のコアを含むその物理的特性に起因する。
【０１６９】
好ましくは、修飾オレオシンは、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）とリン脂質を組み合わせた場合、油体に形成することができる。
【０１７０】
好ましくは、トポロジーは、隣接する親水性ドメインが、たとえば、細胞質のような油体の外側の水性環境にさらされる一方で油体のリン脂質単層に埋め込まれた疎水性ドメインを生じる修飾オレオシンに両親媒性の性質を付与する。
【０１７１】
一実施形態では、本発明の又は本発明の方法で使用される修飾オレオシンは、上記表１で指されたオレオシンのタンパク質配列のいずれかの疎水性ドメインと少なくとも７０％同一の配列を含む。
【０１７２】
一実施形態では、本発明の又は本発明の方法で使用される修飾オレオシンは、上記表１で指されたタンパク質配列のいずれかと少なくとも７０％の同一性を持つ配列を含む。
【０１７３】
さらなる実施形態では、修飾オレオシンは、追加の人工的に導入されたシステイン（単数）又はシステイン（複数）は別として、上記表１で指されたタンパク質配列のいずれかと本質的に同一である。
【０１７４】
さらなる実施形態では、本発明の又は本発明の方法で使用される修飾オレオシンは、配列番号１６のオレオシン配列と少なくとも７０％の同一性を持つ配列を含む。
【０１７５】
さらなる実施形態では、修飾オレオシンは、追加の人工的に導入されたシステイン（単数）又はシステイン（複数）は別として、配列番号１６と同一のアミノ酸配列を有する。
【０１７６】
さらなる実施形態では、修飾オレオシンは、配列番号１６〜２０のいずれか１つのアミノ酸配列を有する。
修飾オレオシンとの融合タンパク質
【０１７７】
本発明はまた目的タンパク質に融合した本発明の修飾オレオシンを含む融合タンパク質も提供する。
【０１７８】
好ましくは、目的タンパク質は融合タンパク質のＮ末端又はＣ末端である。
【０１７９】
融合タンパク質を組換えで発現させる方法は当業者に周知である（Papapostolou and Howorka, 2009）。本発明の融合タンパク質の製造には目的タンパク質のコーディング配列を修飾オレオシンのコーディング配列に融合することが関与する。
【０１８０】
そのような融合タンパク質は、本発明の油体に含まれてもよく、油体で発現されてもよく、それを使用してＲｏｂｅｒｔら（２００８）で議論されたように種々の適用のために目的タンパク質を精製し、送達してもよい。
【０１８１】
しかしながら、本発明によって、油体における修飾オレオシンの存在により提供される油体の安定性／完全性を変える選択肢を利用することが可能になるので、さらに厳格な精製及び送達の手順が可能になる。
非修飾オレオシンとの融合タンパク質
【０１８２】
本発明はまた、目的タンパク質に融合される非修飾オレオシンを含む融合タンパク質の使用も含む。本発明の融合タンパク質の製造には通常、目的タンパク質のコーディング配列を非修飾オレオシンのコーディング配列に融合することが関与する。
【０１８３】
好ましくは、目的タンパク質は融合タンパク質のＮ末端又はＣ末端である。
【０１８４】
そのような融合タンパク質は、本発明の油体に含まれてもよく、油体で発現されてもよく、それを使用してＲｏｂｅｒｔら（２００８）で議論されたように種々の適用のために目的タンパク質を精製し、送達してもよい。
【０１８５】
しかしながら、本発明は、油体における修飾オレオシンの存在により提供される油体の安定性／完全性を変える選択肢を利用するので、さらに厳格な精製及び送達の手順が可能になる。
【０１８６】
成長組織
成長組織には、芽、葉、根、茎が挙げられる。好まれる成長組織は葉である。
【０１８７】
成長組織に特異的なプロモータ
成長組織に特異的なプロモータの例は、米国特許第６，２２９，０６７号；及び同第７，６２９，４５４；号；及び同第７，１５３，９５３；号；及び同第６，２２８，６４３号に見い出される。
【０１８８】
花粉に特異的なプロモータ
花粉に特異的なプロモータの例は、米国特許第７，１４１，４２４号；及び同第５，５４５，５４６号；及び同第５，４１２，０８５号；及び同第５，０８６，１６９号；及び同第７，６６７，０９７号に見い出される。
【０１８９】
種子に特異的なプロモータ
種子に特異的なプロモータの例は、米国特許第６，３４２，６５７号；及び同第７，０８１，５６５号；及び同第７，４０５，３４５号；及び同第７，６４２，３４６号；及び同第７，３７１，９２８号に見い出される。
【０１９０】
果実に特異的なプロモータ
果実に特異的なプロモータの例は、米国特許第５，５３６，６５３号；及び同第６，１２７，１７９号；及び同第５，６０８，１５０号；及び同第４，９４３，６７４に見い出される。
ポリヌクレオチド及び断片
【０１９１】
用語「ポリヌクレオチド」は本明細書で使用されるとき、任意の長さの、しかし、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドの長さの一本鎖又は二本鎖のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドのポリマーを意味し、非限定例として、遺伝子のコーディング及び非コーディング配列、センス及びアンチセンス配列の相補体、エクソン、イントロン、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボザイム、組換えポリペプチド、単離された及び精製された天然に存在するＤＮＡ又はＲＮＡの配列、合成のＲＮＡ及びＤＮＡの配列、核酸プローブ、プライマー及び断片が挙げられる。
【０１９２】
本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列の断片は、目的の標的に特異的なハイブリッド形成が可能である隣接するヌクレオチドの配列、すなわち、長さ少なくとも１５ヌクレオチドである配列である。本発明の断片は、開示されるポリヌクレオチドの連続ヌクレオチドの１５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１６ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１７ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１８ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１９ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも２１ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも２２ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも２３ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも２４ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも２５ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも２６ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも２７ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも２８ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも２９ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも３０ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも３１ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも３２ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも３３ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも３４ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも３５ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも３６ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも３７ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも３８ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも３９ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも４０ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも４１ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも４２ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも４３ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも４４ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも４５ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも４６ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも４７ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも４８ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも４９ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも５１ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも５２ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも５３ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも５４ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも５５ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも５６ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも５７ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも５８ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも５９ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも６０ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも６１ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも６２ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも６３ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも６４ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも６５ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも６６ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも６７ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも６８ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも６９ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも７０ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも８１ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも８２ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも８３ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも８４ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも８５ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも８６ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも８７ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも８８ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも８９ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも９０ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも９１ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも９２ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも９３ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも９４ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも９５ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも９６ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも９７ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも９８ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも９９ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１５０ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも２００ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも２５０ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも３００ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも３５０ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも４００ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも４５０ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも５００ヌクレオチド含む。ポリヌクレオチドの断片は、アンチセンス、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、遺伝子のスプライシング、三重螺旋若しくはリボザイム技術において、又はマイクロアレイにおけるプライマー、プローブとして使用することができ、又は本発明のポリヌクレオチドに基づいた選抜法で使用することができる。
【０１９３】
用語「プライマー」は、鋳型とハイブリッド形成し、標的と相補的なポリヌクレオチドの重合を誘うのに使用される、普通、遊離の３’−ＯＨを有する短いポリヌクレオチドを指す。
【０１９４】
用語「プローブ」は、ハイブリッド形成に基づくアッセイにてプローブに相補的であるポリヌクレオチド配列を検出するのに使用される短いポリヌクレオチドを指す。プローブは本明細書で定義されるようなポリヌクレオチドの断片から成ってもよい。
ポリペプチド及び断片
【０１９５】
用語「ポリペプチド」は本明細書で使用されるとき、アミノ酸残基が共有ペプチド結合で連結される完全長のタンパク質を含む、任意の長さの、しかし、好ましくは少なくとも５アミノ酸のアミノ酸鎖を包含する。本発明の又は本発明の方法で使用されるポリペプチドは、精製された天然の生成物であってもよいし、組換え法又は合成法を用いて部分的に又は全体的に製造されてもよい。用語は、ポリペプチド、たとえば、二量体若しくはそのほかの多量体のようなポリペプチドの凝集体、融合ポリペプチド、ポリペプチド断片、ポリペプチドの変異体、又はこれらの誘導体を指す。
【０１９６】
ポリペプチドの「断片」は、生物活性に必要とされる機能を実行し、及び／又はポリペプチドの三次構造を提供するポリペプチドの配列である。用語は、上記酵素活性を実行することが可能であるポリペプチド、たとえば、二量体若しくはそのほかの多量体のようなポリペプチドの凝集体、融合ポリペプチド、ポリペプチド断片、ポリペプチドの変異体、又はこれらの誘導体を指す。
【０１９７】
用語「単離される」は、本明細書で開示されるポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列に適用されるとき、その天然の細胞環境から取り出される配列を指すのに使用される。単離された分子は、生化学法、組換え法及び合成法を含む方法又は方法の組み合わせによって得られ得る。
【０１９８】
用語「組換え」は、天然の背景でそれを囲む配列から取り出される及び／又は天然の背景には存在しない配列と再結合させられるポリヌクレオチド配列を指す。
【０１９９】
「組換え」ポリペプチド配列は、「組換え」ポリヌクレオチド配列の翻訳によって生成される。
【０２００】
特定の属又は種に由来する本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチドに関して用語「由来する」は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドが、その属又は種で天然に見い出されるポリヌクレオチド又はポリペプチドと同様の配列を有することを意味する。従って、特定の属又は種に由来するポリヌクレオチド又はポリペプチドは、合成で又は組換えで生成され得る。
変異体
【０２０１】
本明細書で使用されるとき、用語「変異体」は、特別に特定された配列とは異なるポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列を指し、その際、１以上のヌクレオチド又はアミノ酸が欠失する、置換される又は付加される。変異体は、天然に生じる対立遺伝子の変異体であってもよいし、天然には存在しない変異体であってもよい。変異体は、同一の種又は他の種に由来してもよく、ホモログ、パラログ及びオーソログを包含してもよい。特定の実施形態では、本発明のポリペプチド及びポリペプチドの変異体は、本発明のポリペプチド又はポリペプチドのものと同一である又は類似する生物活性を持つ。ポリペプチド及びポリペプチドに関する用語「変異体」は、本明細書で開示されるポリペプチド及びポリペプチドのすべての形態を包含する。
ポリヌクレオチドの変異体
【０２０２】
変異体ポリヌクレオチドの配列は好ましくは、本発明の配列と少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも５１％、さらに好ましくは少なくとも５２％、さらに好ましくは少なくとも５３％、さらに好ましくは少なくとも５４％、さらに好ましくは少なくとも５５％、さらに好ましくは少なくとも５６％、さらに好ましくは少なくとも５７％、さらに好ましくは少なくとも５８％、さらに好ましくは少なくとも５９％、さらに好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも６１％、さらに好ましくは少なくとも６２％、さらに好ましくは少なくとも６３％、さらに好ましくは少なくとも６４％、さらに好ましくは少なくとも６５％、さらに好ましくは少なくとも６６％、さらに好ましくは少なくとも６７％、さらに好ましくは少なくとも６８％、さらに好ましくは少なくとも６９％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも７１％、さらに好ましくは少なくとも７２％、さらに好ましくは少なくとも７３％、さらに好ましくは少なくとも７４％、さらに好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも７６％、さらに好ましくは少なくとも７７％、さらに好ましくは少なくとも７８％、さらに好ましくは少なくとも７９％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８１％、さらに好ましくは少なくとも８２％、さらに好ましくは少なくとも８３％、さらに好ましくは少なくとも８４％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも８６％、さらに好ましくは少なくとも８７％、さらに好ましくは少なくとも８８％、さらに好ましくは少なくとも８９％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９１％、さらに好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは少なくとも９３％、さらに好ましくは少なくとも９４％、さらに好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９６％、さらに好ましくは少なくとも９７％、さらに好ましくは少なくとも９８％、及びさらに好ましくは少なくとも９９％の同一性を示す。同一性は、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも２０ヌクレオチドの位置、好ましくは少なくとも５０ヌクレオチドの位置、さらに好ましくは少なくとも１００ヌクレオチドの位置、及び最も好ましくは全体の長さにわたる比較ウインドウにわたって見つけられる。
【０２０３】
ポリヌクレオチド配列の同一性は以下の方法にて判定することができる。ＮＣＢＩ（(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/）から公的に利用可能であるｂｌ２ｓｅｑ(Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden (1999, "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250))におけるＢＬＡＳＴＮ （プログラムバージョン２．２．５［Ｎｏｖ  ２００２］のＢＬＡＳＴパッケージソフト)を用いて、主題のポリヌクレオチド配列を候補ポリヌクレオチドと比較する。低い複雑性部分のフィルタリングをオフにすべきであることを除いてｂｌ２ｓｅｑの初期設定パラメータを利用する。
【０２０４】
以下のユニックスコマンドラインのパラメータを用いてポリヌクレオチド配列の同一性を調べてもよい。
ｂｌ２ｓｅｑ−ｉヌクレオチド１−ｊヌクレオチド２−ＦＦ−ｐｂｌａｓｔｎ    
パラメータ−ＦＦは低い複雑性区分のフィルタリングをオフにする。パラメータ−ｐは、配列の対について適切なアルゴリズムを選択する。ｂｌ２ｓｅｑは、ライン”Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ＝”にて同一ヌクレオチドの数と比率の双方として配列同一性を報告する。
【０２０５】
配列全体の配置構造プログラム（たとえば、Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453）を用いて候補ポリヌクレオチド配列と主題のポリヌクレオチド配列の間で重なり合う長さ全体にわたってポリヌクレオチド配列の同一性を計算することもできる。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバルアライメントアルゴリズムの完全実施は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ(Rice,P. Longden,I. and Bleasby,A. EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Trends in Genetics June 2000, vol 16, No 6. pp.276-277) におけるニードルプログラムに見い出され、それは、http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/から得ることができる。Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのサーバーもオンラインでhttp:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/にて２つの配列間でのＥＭＢＯＳＳニードルグローバルアライメントを実施するような機能も提供する。
【０２０６】
或いは、末端ギャップに不利益をもたらすことなく２つの配列の最適なグローバルアライメントを計算するＧＡＰプログラムを使用してもよい。ＧＡＰは以下の論文Ｈｕａｎｇ，Ｘ．（１９９４）Ｏｎ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１０，２２７−２３５に記載されている。
【０２０７】
ポリヌクレオチドの％配列同一性を計算する好まれる方法は、ＣｌｕｓｔａｌＸ（Jeanmougin et al., 1998, Trends Biochem. Sci. 23, 403-5）を用いて比較されるアライニング配列に基づく。
【０２０８】
本発明のポリヌクレオチド変異体はまた、それらの配列の機能的同等性を保存すると思われる１以上の特別に特定された配列に類似性を示し、無作為な機会によって生じたとは合理的に予想できないものも包含する。ポリペプチドに関するそのような配列類似性は、ＮＣＢＩ（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/）からのプログラム（version 2.2.5 [Nov 2002]）のＢＬＡＳＴスイートからの公的に利用可能なｂｌ２ｓｅｑプログラムを用いて判定されてもよい。
【０２０９】
以下のユニックスコマンドラインのパラメータを用いてポリヌクレオチド配列の同一性を調べてもよい。
ｂｌ２ｓｅｑ−ｉヌクレオチド１−ｊヌクレオチド２−ＦＦ−ｐｔｂｌａｓｔｘ  
パラメータ−ＦＦは低い複雑性区分のフィルタリングをオフにする。パラメータ−ｐは、配列の対について適切なアルゴリズムを選択する。このプログラムは、配列間の類似性の領域を見つけ、無作為配列を含有する固定参照サイズのデータベースにて偶然、そのような一致を見るように期待できる回数の予測数である「Ｅ値」をそのような各領域について報告する。このデータベースのサイズは、Ｂｌ２ｓｅｑプログラムにおける初期設定によって設定される。１よりはるかに小さい、小さなＥ値については、Ｅ値はそのような無作為の一致のおよその確率である。
【０２１０】
特別に特定された配列のいずれか１つと比べると、変異ポリヌクレオチド配列は好ましくは１×１０−６未満の、さらに好ましくは１×１０−９未満の、さらに好ましくは１×１０−１２未満の、さらに好ましくは１×１０−１５未満の、さらに好ましくは１×１０−１８未満の、さらに好ましくは１×１０−２１未満の、さらに好ましくは１×１０−３０未満の、さらに好ましくは１×１０−４０未満の、さらに好ましくは１×１０−５０未満の、さらに好ましくは１×１０−６０未満の、さらに好ましくは１×１０−７０未満の、さらに好ましくは１×１０−８０未満の、さらに好ましくは１×１０−９０未満の、及び最も好ましくは１×１０−１００未満のＥ値を示す。
【０２１１】
或いは、本発明の又は本発明の方法で使用される変異体ポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下にて、特定されたポリヌクレオチド配列又はその相補体とハイブリッド形成する。
【０２１２】
用語「ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する」及びその文法的同等物は、温度及び塩濃度の規定された条件下で標的ポリヌクレオチド分子（たとえば、サザンブロットやノーザンブロットのようなＤＮＡ又はＲＮＡのブロット上に不動化された標的ポリヌクレオチド分子）とハイブリッド形成するポリヌクレオチド分子の能力を指す。ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する能力は、厳密性の低い条件下で先ずハイブリッド形成を行い、次いで所望の厳密性まで厳密性を高めることによって判定することができる。
【０２１３】
長さ約１００塩基より大きいポリヌクレオチド分子に関して、典型的なストリンジェントなハイブリッド形成条件は、天然の二本鎖の融点（Ｔｍ）より２５〜３０℃以下低い温度である（一般にSambrook et al., Eds, 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press; Ausubel et al., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishingを参照）。約１００塩基より大きいポリヌクレオチド分子のＴｍは、式Ｔｍ＝８１．５＋０．４１％（Ｇ＋Ｃ−ｌｏｇ（Ｎａ＋）によって計算することができる（Sambrook et al., Eds, 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press; Bolton and McCarthy, 1962, PNAS 84:1390）。１００塩基より大きいポリヌクレオチドについての典型的なストリンジェントな条件は、たとえば、６×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳの溶液における予備洗浄；６５℃、６×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳにおける一晩のハイブリッド形成；その後の１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃での３０分間の２回の洗浄及び０．２×ＳＳＣ、０．１%ＳＤＳ、６５℃での３０分間の２回の洗浄のようなハイブリッド形成条件である。
【０２１４】
１００塩基未満の長さを有するポリヌクレオチド分子に関して、例となるストリンジェントなハイブリッド形成条件は、Ｔｍより５〜１０℃低い。平均して、１００ｂｐ未満の長さのポリヌクレオチド分子のＴｍは、およそ（５００／オリゴヌクレオチドの長さ）℃低下する。
【０２１５】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）として知られるＤＮＡ模倣体（Nielsen et al., Science. 1991 Dec 6;254(5037):1497-500）に関して、Ｔｍの値は、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッド又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのものより高く、Ｇｉｅｓｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９８、Ｎｏｖ．１；２６（２１）：５００４−６に記載された式を用いて計算することができる。１００塩基未満の長さを有するＤＮＡ／ＰＮＡハイブリッドの例となるストリンジェントなハイブリッド形成条件は、Ｔｍより５〜１０℃低い。
【０２１６】
本発明の、又は本発明の方法で使用される変異体ポリヌクレオチドは、本発明の配列とは異なるが、遺伝子コードの縮重の結果、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに類似した活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも包含する。ポリペプチドのアミノ酸配列を変えない配列の変化は「サイレント変異」である。ＡＴＧ（メチオニン）とＴＧＧ（トリプトファン）を除いて、同一アミノ酸についてのそのほかのコドンを認識された方法によって変更し、特定の宿主生物でのコドン発現を最適化し得る。
【０２１７】
その生物活性を有意に変えることなく、コードされたポリペプチド配列にて１又は数個のアミノ酸の保存的置換を生じるポリヌクレオチドの配列変化も本発明に含まれる。熟練者は表現型上サイレントな置換を作製する方法を認識するであろう（たとえば、Bowie et al., 1990, Science 247, 1306を参照）。
【０２１８】
コードされたポリペプチド配列におけるサイレント変異及び保存的置換による変異体ポリヌクレオチドは、前に記載したｔｂｌａｓｔｘアルゴリズムを介した、ＮＣＢＩ（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/）からのプログラム（version 2.2.5 [Nov 2002]）のＢＬＡＳＴスイートからの公的に利用可能なｂｌ２ｓｅｑプログラムを用いて判定されてもよい。
ポリペプチド変異体
【０２１９】
ポリペプチドに関する用語「変異体」は、天然に存在する、組換え的に及び合成的に作製されるポリペプチドを包含する。変異体ポリペプチド配列は、本発明の配列に対して少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも５２％、さらに好ましくは少なくとも５３％、さらに好ましくは少なくとも５４％、さらに好ましくは少なくとも５５％、さらに好ましくは少なくとも５６％、さらに好ましくは少なくとも５７％、さらに好ましくは少なくとも５８％、さらに好ましくは少なくとも５９％、さらに好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも６１％、さらに好ましくは少なくとも６２％、さらに好ましくは少なくとも６３％、さらに好ましくは少なくとも６４％、さらに好ましくは少なくとも６５％、さらに好ましくは少なくとも６６％、さらに好ましくは少なくとも６７％、さらに好ましくは少なくとも６８％、さらに好ましくは少なくとも６９％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも７１％、さらに好ましくは少なくとも７２％、さらに好ましくは少なくとも７３％、さらに好ましくは少なくとも７４％、さらに好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも７６％、さらに好ましくは少なくとも７７％、さらに好ましくは少なくとも７８％、さらに好ましくは少なくとも７９％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８１％、さらに好ましくは少なくとも８２％、さらに好ましくは少なくとも８３％、さらに好ましくは少なくとも８４％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも８６％、さらに好ましくは少なくとも８７％、さらに好ましくは少なくとも８８％、さらに好ましくは少なくとも８９％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９１％、さらに好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは少なくとも９３％、さらに好ましくは少なくとも９４％、さらに好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９６％、さらに好ましくは少なくとも９７％、さらに好ましくは少なくとも９８％、及びさらに好ましくは少なくとも９９％の同一性を示す。同一性は、本発明のポリペプチドの少なくとも２０アミノ酸の位置、好ましくは少なくとも５０アミノ酸の位置、さらに好ましくは少なくとも１００アミノ酸の位置、及び最も好ましくは本発明のポリペプチドの全体の長さにわたる比較ウインドウにわたって見つけられる。
【０２２０】
ポリペプチド配列の同一性は以下の方法にて判定することができる。ＮＣＢＩ（(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/）から公的に利用可能であるｂｌ２ｓｅｑにおけるＢＬＡＳＴＮ （プログラムバージョン２．２．５［Ｎｏｖ  ２００２］のＢＬＡＳＴパッケージソフト)を用いて、主題のポリペプチド配列を候補ポリペプチド配列と比較する。低い複雑性領域のフィルタリングをオフにすべきであることを除いてｂｌ２ｓｅｑの初期設定パラメータを利用する。
【０２２１】
ポリペプチド配列の同一性は、グローバル配列アライメントプログラムを用いて候補と主題のポリヌクレオチド配列の間での重なり合いの全体の長さにわたって計算することもできる。上記で議論したようなＥＭＢＯＳＳ／ニードル（http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/にて利用可能）及びＧＡＰ（Huang, X. (1994) On Global Sequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10, 227-235.）もポリペプチド配列の同一性を計算するのに好適なグローバル配列アライメントプログラムである。
【０２２２】
ポリペプチドの％配列同一性を計算する好まれる方法は、ＣｌｕｓｔａｌＸ（Jeanmougin et al., 1998, Trends Biochem. Sci. 23, 403-5）を用いて比較されるアライニング配列に基づく。
【０２２３】
本発明の又は本発明の方法で使用されるポリペプチド変異体はまた、それらの配列の機能的同等性を保存すると思われる１以上の特別に特定された配列に類似性を示し、無作為な機会によって生じたとは合理的に予想できないものも包含する。ポリペプチドに関するそのような配列類似性は、ＮＣＢＩ（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/）からのプログラム（version 2.2.5 [Nov 2002]）のＢＬＡＳＴスイートからの公的に利用可能なｂｌ２ｓｅｑプログラムを用いて判定されてもよい。以下のユニックスコマンドラインのパラメータを用いてポリペプチド配列の同一性を調べてもよい。
ｂｌ２ｓｅｑ−ｉヌクレオチド１−ｊヌクレオチド２−ＦＦ−ｐｂｌａｓｔｐ
【０２２４】
特別に特定された配列のいずれか１つと比べると、変異ポリペプチド配列は好ましくは１×１０−６未満の、さらに好ましくは１×１０−９未満の、さらに好ましくは１×１０−１２未満の、さらに好ましくは１×１０−１５未満の、さらに好ましくは１×１０−１８未満の、さらに好ましくは１×１０−２１未満の、さらに好ましくは１×１０−３０未満の、さらに好ましくは１×１０−４０未満の、さらに好ましくは１×１０−５０未満の、さらに好ましくは１×１０−６０未満の、さらに好ましくは１×１０−７０未満の、さらに好ましくは１×１０−８０未満の、さらに好ましくは１×１０−９０未満の、及び最も好ましくは１×１０−１００未満のＥ値を示す。
【０２２５】
パラメータ−ＦＦは低い複雑性区分のフィルタリングをオフにする。パラメータ−ｐは、配列の対について適切なアルゴリズムを選択する。このプログラムは、配列間の類似性の領域を見つけ、無作為配列を含有する固定参照サイズのデータベースにて偶然、そのような一致を見るように期待できる回数の予測数である「Ｅ値」をそのような各領域について報告する。１よりはるかに小さい、小さなＥ値については、これはそのような無作為の一致のおよその確率である。
【０２２６】
その生物活性を有意に変えることのない、記載されたポリペプチド配列の１又は数個のアミノ酸の保存的置換も本発明に含まれる。熟練者は表現型上サイレントな置換を作製する方法を認識するであろう（たとえば、Bowie et al., 1990, Science 247, 1306を参照）。
構築物、ベクター及びその成分
【０２２７】
用語「遺伝子構築物」は、たとえば、ｃＤＮＡ分子のような、しかし、これに限定されない別のポリヌクレオチド分子（挿入ポリヌクレオチド分子）に挿入されていてもよいポリヌクレオチド分子、たとえば、普通、二本鎖ＤＮＡを指す。遺伝子構築物は、挿入ポリヌクレオチド分子を転写すること、及び任意で転写物をポリペプチドに翻訳することを可能にする必要な要素を含有し得る。挿入ポリヌクレオチド分子は、宿主細胞に由来してもよいし、又は異なった細胞若しくは生物に由来してもよいし、及び／又は組換えポリヌクレオチドであってもよい。いったん宿主細胞の中に入ると、遺伝子構築物は宿主の染色体ＤＮＡと一体になり得る。遺伝子構築物はベクターに連結されてもよい。
【０２２８】
用語「ベクター」は、遺伝子構築物を宿主細胞に運ぶのに使用されるポリヌクレオチド分子、普通二本鎖ＤＮＡを指す。ベクターは、大腸菌のような少なくとも１つの追加の宿主系での複製が可能である。
【０２２９】
用語「発現構築物」は、挿入ポリヌクレオチド分子を転写すること、及び任意で転写物をポリペプチドに翻訳することを可能にする必要な要素を含む遺伝子構築物を指す。発現構築物は通常、５’から３’の方向に、
（ａ）構築物が形質転換される宿主細胞にて機能的なプロモータと、
（ｂ）発現されるポリヌクレオチドと、
（ｃ）構築物が形質転換される宿主細胞にて機能的なターミネータ
を含む。
【０２３０】
用語「コーディング領域」又は「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）は、適切な調節配列の制御下で転写産物及び／又はポリペプチドを生成することが可能であるゲノムＤＮＡ配列又はｃＤＮＡ配列のセンス鎖を指す。コーディング配列は、場合によっては、５’翻訳開始コドン及び３’翻訳停止コドンの存在によって特定され得る。遺伝子構築物に挿入されると、「コーディング配列」はそれがプロモータ及びターミネータの配列に操作可能に連結された場合、発現することができる。
【０２３１】
「操作可能に連結される」は、発現させる配列が、プロモータ、組織特異的調節要素、一時的な調節要素、エンハンサ、リプレッサ及びターミネータを含む調節要素の制御下に置かれることを意味する。
【０２３２】
用語「非コーディング領域」は、翻訳開始部位の上流と翻訳停止部位の下流である非翻訳配列を指す。これらの配列もまたそれぞれ、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲと呼ばれる。これらの領域には、転写の開始と停止、ｍＲＮＡの安定性、及び翻訳効率の調節に必要とされる要素が含まれる。
【０２３３】
ターミネータは、転写を終了させ、翻訳された配列の下流の遺伝子の３’非翻訳末端に見い出される配列である。ターミネータは、ｍＲＮＡ安定性の重要な決定基であり、場合によっては空間調節機能を有することが見い出されている。
【０２３４】
用語「プロモータ」は、遺伝子の転写を調節する、コーディング領域の上流の非転写シス調節要素を指す。プロモータは、転写開始位置及びたとえば、ＴＡＴＡボックスのような保存されたボックスを特定するシス開始要素と、転写因子によって結合するモチーフを含む。コーディング配列内のイントロンもまた転写を調節することができ、転写後プロセッシング（スプライシング、キャッピング及びポリアデニル化を含む）に影響を与えることができる。
【０２３５】
プロモータは、発現させるポリヌクレオチドに関して相同であってもよい。このことは、プロモータとポリヌクレオチドが天然で操作可能に連結されて見い出されることを意味する。
【０２３６】
或いは、プロモータは、発現させるポリヌクレオチドに関して非相同であってもよい。このことは、プロモータとポリヌクレオチドが天然で操作可能に連結されて見い出されないことを意味する。
【０２３７】
「導入遺伝子」は、生物の１つから取りされ、形質転換によって別の生物に導入されるポリヌクレオチドである。導入遺伝子は、導入遺伝子が導入される生物の種と同一の種又は異なった種に由来してもよい。
【０２３８】
「逆方向反復」は、反復の後半が、たとえば、
（５’）ＧＡＴＣＴＡ……．ＴＡＧＡＴＣ（３’）
（３’）ＣＴＡＧＡＴ……．ＡＴＣＴＡＧ（５’）のように、
相補鎖である反復する配列である。
【０２３９】
読み過ごし転写は、反復領域間に３〜５ｂｐのスペーサーがあるという条件で相補的塩基の対合を受けてヘアピン構造を形成する転写物を生成する。
宿主細胞
【０２４０】
宿主細胞は、たとえば、細菌、真菌、酵母、昆虫、哺乳類、藻類又は植物の生物に由来してもよい。宿主細胞は合成細胞であってもよい。好まれる宿主細胞は真核細胞である。特に好まれる宿主細胞は植物細胞、特に植物の成長組織の植物細胞である。
【０２４１】
「トランスジェニック植物」は、遺伝子操作又は形質転換の結果、新しい遺伝物質を含有する植物を指す。新しい遺伝物質は、得られるトランスジェニック植物と同一種の植物又は異なった種の植物に由来してもよい。
ポリヌクレオチドを単離する又は作出する方法
【０２４２】
当業者に既知の種々の技法を用いて本発明のポリヌクレオチド分子を単離することができる。例証として、そのようなポリヌクレオチドは、参照によって本明細書に組み入れられるＭｕｌｌｉｓら編、１９９４、Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒに記載されたポリメラーゼ鎖反応の使用を介して単離することができる。本発明のポリヌクレオチドは、本明細書で定義されるような、本発明のポリヌクレオチドに由来するプライマーを用いて増幅することができる。
【０２４３】
本発明のポリヌクレオチドを単離するさらなる方法には、ハイブリッド形成プローブとしての、本明細書で言及される配列を有するポリペプチドのすべて又は一部の使用が含まれる。たとえば、ニトロセルロースフィルター又はナイロン膜のような固形支持体に不動化したポリヌクレオチドに標識したポリヌクレオチドプローブをハイブリッド形成させる技法を用いてゲノムＤＮＡライブラリ又はｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすることができる。例となるハイブリッド形成及び洗浄の条件は：５．０×ＳＳＣ、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔの溶液における６５℃での２０時間のハイブリッド形成；０．１×ＳＳＣ、１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウムにおける洗浄（各５５℃で２０分間の洗浄を３回）、及び任意で０．５×ＳＳＣ、１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウムにおける６０℃での洗浄を１回（２０分間）である。任意のさらなる洗浄（２０分間）は、６０℃にて０．１×ＳＳＣ、１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウムの条件下で実施することができる。
【０２４４】
本発明のポリヌクレオチド断片は、たとえば、制限エンドヌクレアーゼ消化、オリゴヌクレオチド合成及びＰＣＲ増幅のような当該技術で周知の技法によって生成され得る。
【０２４５】
当該技術で周知の方法で部分ポリヌクレオチド配列を用いて相当する完全長のポリヌクレオチド配列を特定してもよい。そのような方法には、ＰＣＲに基づく方法、５’ＲＡＣＥ（Frohman MA, 1993, Methods Enzymol. 218: 340-56）及びハイブリッド形成に基づく方法、コンピュータ／データベースに基づく方法が挙げられる。さらに、例証として、逆ＰＣＲによって、本明細書で開示されるポリヌクレオチド配列に隣接し、既知の領域に基づくプライマーで開始する未知の配列の獲得が可能になる（参照によって本明細書に組み入れられるTriglia et al., 1998, Nucleic Acids Res 16, 8186）。方法は幾つかの制限酵素を用いて遺伝子の既知の領域における好適な断片を生成する。次いで分子内連結によって断片を環化し、ＰＣＲ鋳型として使用する。多様なプライマーが既知の領域から設計される。完全長のクローンを物理的に組み立てるために、標準的な分子生物学のアプローチを利用することができる（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987）。
【０２４６】
特定の種からトランスジェニック植物を作製する場合、その種に由来する配列（単数）又は配列（複数）でそのような植物を形質転換することが有益であり得る。利益は、トランスジェニック生物を生成することにおける種間形質転換に関する一般の懸念を軽くするかもしれない。さらに、遺伝子の下方調節が所望の結果である場合、低下した発現が所望である植物におけるそれと同一の（少なくとも高度に類似した）配列を利用することが必要なのかも知れない。とりわけこれらの理由で、幾つかの異なった植物種において特定の遺伝子のオーソログを特定し、単離することができることが望ましい。
【０２４７】
記載される方法によって変異体（オーソログを含む）が特定されてもよい。
変異体を特定する方法
物理的方法
【０２４８】
ＰＣＲに基づく方法（Mullis et al., Eds. 1994 The Polymerase Chain Reaction, Birkhauser）を用いて変異体ポリヌクレオチドが特定されてもよい。通常、ＰＣＲによって本発明のポリヌクレオチド分子の変異体を増幅するのに有用なプライマーのポリヌクレオチド配列は、相当するアミノ酸配列の保存された領域をコードする配列に基づいてもよい。
【０２４９】
或いは、当業者に周知のライブラリスクリーニング法を採用してもよい（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987）。プローブ配列の変異体を特定する場合、正確な配列の一致を求める場合に比べてハイブリッド形成及び／又は洗浄の厳密性を通常軽減する。
【０２５０】
たとえば、本発明のポリペプチドに対して産生させた抗体を用いて発現ライブラリをスクリーニングすることによって（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987）、又はそのような抗体の助けを借りて天然の供給源からポリペプチドを特定することによって、物理的方法によりポリペプチド変異体も特定されてもよい。
コンピュータに基づく方法
【０２５１】
ポリヌクレオチド及びポリペプチド双方の変異体を含む本発明の変異体の配列は、パブリックドメイン配列アライメントアルゴリズム及び配列データベースを検索する配列類似性検索ツールを用いた、当業者に周知のコンピュータに基づく方法によって特定されてもよい（パブリックドメインデータベースには、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、ＰＩＲなどが挙げられる）。オンライン情報源については、たとえば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：１−１０及び１１−１６，２００１を参照のこと。類似性検索は、解析される配列（すなわち、問い合わせ配列）との比較のために標的配列を見つけ、並べる。配列比較アルゴリズムは、スコア化マトリクスを用いて配置構造のそれぞれに全体のスコアを割り振る。
【０２５２】
配列データベースにて変異体を特定するのに有用なプログラムの例となるファミリーは、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ｔＢＬＡＳＴＮ及びｔＢＬＡＳＴＸを含むプログラム（バージョン２．２．５［Ｎｏｖ２００２］）のＢＬＡＳＴスイートであり、それは、（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）から、又は米国２０８９４、ＭＤ、ベセスダ、３８Ａビル、８Ｎ８０５号室、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の国立医学図書館から公的に利用可能である。ＮＣＢＩのサーバーはまた、多数の公的に利用可能な配列データベースをスクリーニングするプログラムを使用するための施設も提供する。ＢＬＡＳＴＮはヌクレオチド配列データベースに対してヌクレオチド問い合わせ配列を比較する。ＢＬＡＳＴＰはタンパク質配列データベースに対してアミノ酸問い合わせ配列を比較する。ＢＬＡＳＴＸはタンパク質配列データベースに対して読み取りフレームすべてで翻訳されたヌクレオチド問い合わせ配列を比較する。ｔＢＬＡＳＴＮは読み取りフレームすべてで動的に翻訳されたヌクレオチド配列データベースに対してタンパク質問い合わせ配列を比較する。ｔＢＬＡＳＴＸはヌクレオチド配列データベースの６フレーム翻訳に対してヌクレオチド問い合わせ配列の６フレーム翻訳を比較する。ＢＬＡＳＴプログラムは初期設定パラメータと共に使用してもよく、又はスクリーニングを純化するのに必要とされるようにパラメータを変更してもよい。
【０２５３】
ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＸを含む、アルゴリズムのＢＬＡＳＴファミリーの使用は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７の出版物にて記載されている。
【０２５４】
ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ｔＢＬＡＳＴＮ、ｔＢＬＡＳＴＸ又は類似のアルゴリズムにより生成された問い合わせ配列による１以上のデータベース配列への「ヒット」は、配列の類似した部分を並べ、特定する。類似性の程度と配列の重なり合いの長さの順にヒットが配置される。データベースの配列へのヒットは一般に問い合わせ配列の配列長さの画分にわたってのみ重なり合いを表す。
【０２５５】
ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ｔＢＬＡＳＴＮ及びｔＢＬＡＳＴＸのアルゴリズムはアライメントについての「期待」値も生成する。期待値（Ｅ）は、無作為の連続する配列を含有する同一サイズのデータベースを検索する際、偶然見るのを期待することが出来るヒットの数を示す。期待値は、データベースへのヒットが真の類似性を示すかどうかを判定するための有意な閾値として使用される。たとえば、ポリヌクレオチドのヒットに割り振られた０．１のＥ値は、スクリーニングされるデータベースのサイズのデータベースにて単に偶然、類似のスコアで並べた配列の部分にわたって０．１の一致を見ることを期待できることを意味すると解釈される。並べられ、一致した部分にわたって０．０１以下のＥ値を有する配列については、データベースで偶然、一致を見つける確率は、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ｔＢＬＡＳＴＮ、又はｔＢＬＡＳＴＸのアルゴリズムを用いて１％以下である。
【０２５６】
関連する配列の一群の複数の配列アライメントは、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J. (1994) CLUSTALW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22:4673-4680, http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalW/Top.html）又はＴ−ＣＯＦＦＥＥ（Cedric Notredame, Desmond G. Higgins, Jaap Heringa, T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment, J. Mol. Biol. (2000) 302: 205-217)）、又はＰＩＬＥＵＰによって実施することができ、それは、進行性の対合アライメント（Feng and Doolittle, 1987, J. Mol. Evol. 25, 351）を使用する。
【０２５７】
モチーフ又は特徴的配列を見つけるのにパターン認識ソフトウエアの適用が利用可能である。たとえば、ＭＥＭＥ（モチーフ誘出用の複数のＥｍ）は、一連の配列でモチーフ及び特徴的配列を見つけ出し、ＭＡＳＴ（モチーフアライメント及び検索ツール）はこれらのモチーフを用いて問い合わせ配列にて類似の又は同一のモチーフを特定する。ＭＡＳＴの結果は、適切な統計データと見つけたモチーフの視覚的概観と共に一連のアライメントとして提供される。ＭＥＭＥ及びＭＡＳＴはサンディエゴのカリフォルニア大学で開発された。
【０２５８】
ＰＲＯＳＩＴＥ（Bairoch and Bucher, 1994, Nucleic Acids Res. 22, 3583; Hofmann et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27, 215）は、ゲノムＤＮＡ配列又はｃＤＮＡ配列から翻訳された未同定のタンパク質の機能を特定する方法である。ＰＲＯＳＩＴＥデータベース（www.expasy.org/prosite）は、生物学的に有意なパターンと特性を含有し、適当なコンピュータツールと共に用いてタンパク質の既知のファミリーに新しい配列を割り振ることができ、又はどの既知のドメインが配列に存在するかを判定できるように設計される（Falquet et al., 2002, Nucleic Acids Res. 30, 235）。プロサーチは、所与の配列のパターン又は特徴によってＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ及びＥＭＢＬのデータベースを検索することができるツールである。
ポリペプチドを単離する方法
【０２５９】
変異体ポリペプチドを含む、本発明の、又は本発明の方法で使用されるポリペプチドは、たとえば、固相法を用いた直接ペプチド合成（たとえば、Stewart et al., 1969, in Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co, San Francisco California, or automated synthesis, for example using an Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Foster City, California)）のような当該技術で周知のペプチド合成法を用いて調製され得る。ポリペプチドの変異のある形態も合成の間に生成され得る。
【０２６０】
本発明の、又は本発明の方法で使用されるポリペプチド及び変異体ポリペプチドはまた、当該技術で周知の種々の技法（たとえば、Deutscher, 1990, Ed, Methods in Enzymology, Vol. 182, Guide to Protein Purification）を用いて天然の供給源から精製され得る。
【０２６１】
或いは、本発明の、又は本発明の方法で使用されるポリペプチド及び変異体ポリペプチドは、好適な宿主細胞で組換え的に発現させ、以下で議論するように細胞から分離され得る。
構築物及びベクターを作製する方法
【０２６２】
本発明の遺伝子構築物は、１以上の本発明のポリヌクレオチド配列及び／又は本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、たとえば、細菌、真菌、昆虫、哺乳類、又は植物の生物を形質転換するのに有用である。本発明の遺伝子構築物は、本明細書で定義されるような発現構築物を含むように意図される。
【０２６３】
遺伝子構築物及びベクターを作製し、使用する方法は当該技術で周知であり、一般にＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９８７に記載されている。
ポリヌクレオチド、構築物又はベクターを含む宿主細胞を作製する方法
【０２６４】
本発明は、本発明の遺伝子構築物又はベクターを含む宿主細胞を提供する。
【０２６５】
本発明の発現構築物のような遺伝子構築物を含む宿主細胞は、本発明のポリペプチドの組換え作製のための当該技術で周知の方法（たとえば、Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987 ; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 1987）で有用である。そのような方法には、本発明のポリペプチドの発現に好適な又はその誘導性である条件にて適当な培地における宿主細胞の培養が関与し得る。任意で培養物に分泌されてもよい発現された組換えポリペプチドは当該技術で周知の方法（たとえば、Deutscher, Ed, 1990, Methods in Enzymology, Vol 182, Guide to Protein Purification）によって培地、宿主細胞、又は培養培地から分離され得る。
構築物又及びベクターを含む植物細胞及び植物を作製する方法
【０２６６】
本発明はさらに、本発明の遺伝子構築物を含む植物細胞、及び本発明の、又は本発明の方法で使用されるポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現を変更するように改変された植物細胞を提供する。そのような細胞を含む植物も本発明の態様を形成する。
【０２６７】
植物細胞、植物及びその一部をポリペプチドで形質転換する方法は、Ｄｒａｐｅｒら、１９８８，Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉ．Ｐｕｂ．Ｏｘｆｏｒｄ，ｐ．３６５；Ｐｏｔｒｙｋｕｓ及びＳｐａｎｇｅｎｂｕｒｇ，１９９５，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ．；及びＧｅｌｖｉｎら、１９９３，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌ．Ｍａｎｕａｌ．Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄ．Ｐｕｂ．Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ．に記載されている。形質転換法を含むトランスジェニック植物の概説は、Ｇａｌｕｎ及びＢｒｅｉｍａｎ，１９９７，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｐｌａｎｔｓ．Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎに提供されている。
植物の遺伝子操作の方法
【０２６８】
多数の植物形質転換の戦略が利用可能である（たとえば、Birch, 1997, Ann Rev Plant Phys Plant Mol Biol, 48, 297, Hellens RP, et al (2000) Plant Mol Biol 42: 819-32, Hellens R et al Plant Meth 1: 13）。たとえば、戦略は、その際／その時、それが正常に発現される場合、植物細胞、器官にて及び／又は特定の発達段階にてポリヌクレオチド／ポリペプチドの発現を高めるように設計されてもよく、又はその際／その時、それが正常に発現されない場合、細胞、組織、器官における、及び／又は特定の発達段階におけるポリヌクレオチド／ポリペプチドを異所性に発現するように設計されてもよい。発現されたポリヌクレオチド／ポリペプチドは、形質転換される植物種に由来してもよいし、又は異なった植物種に由来してもよい。
【０２６９】
形質転換戦略は、正常に発現される場合、細胞、組織、器官における、及び／又は特定の発達段階でのポリヌクレオチド／ポリペプチドの発現を低下させるように設計され得る。そのような戦略は遺伝子サイレンシング戦略として知られる。
【０２７０】
トランスジェニック植物における遺伝子の発現のための遺伝子構築物は通常、１以上のクローン化ポリヌクレオチドの発現を駆動するためのプロモータと、ターミネータと、形質転換された植物における遺伝子構築物の存在を検出するための選択可能なマーカー配列を含む。
【０２７１】
本発明の構築物での使用に好適なプロモータは、単子葉又は双子葉の植物の細胞、組織又は器官にて機能的であり、細胞−、組織−及び器官−に特異的なプロモータ、細胞周期特異的プロモータ、一過性プロモータ、誘導性プロモータ、ほとんどの植物組織で活性がある構成的プロモータ及び組換えプロモータが挙げられる。プロモータの選択は、そのように所望したクローン化したポリヌクレオチドの一時的な発現及び空間的な発現に左右される。プロモータは、当該導入遺伝子に正常に関連したもの、又はそのほかの植物、ウイルス、並びに植物の病原性細菌及び真菌の遺伝子に由来するプロモータであってもよい。当業者は、過度の実験を行わずに、本発明のポリヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を用いて植物の形質を改変し、調節するのに好適であるプロモータを選択することができるであろう。構成的な植物プロモータの例には、ＣａＭＶ３５Ｓプロモータ、ノパリンシンターゼプロモータ及びオクトピンシンターゼプロモータ、及びトウモロコシのＵｂｉプロモータが挙げられる。特定の組織で活性があり、内部の発生シグナル又は外部の非生物若しくは生物のストレスに応答する植物プロモータは科学文献に記載されている。例となるプロモータは、たとえば、ＷＯ０２／００８９４に記載されており、それは参照によって本明細書に組み入れられる。
【０２７２】
植物の形質転換用遺伝子構築物で一般に使用される例となるターミネータには、たとえば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓターミネータ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのノパリンシンターゼ若しくはオクトピンシンターゼのターミネータ、Ｚｅａ  ｍａｙｓのゼイン遺伝子のターミネータ、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａのＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼのターミネータ及びＳｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍのＰＩ−ＩＩターミネータが挙げられる。
【０２７３】
植物の形質転換で一般に使用される選抜可能なマーカーには、カナマイシン耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ遺伝子（ＮＰＴＩＩ）、スペクチノマイシンとストレプトマイシンの耐性を付与するａａｄＡ遺伝子、Ｉｇｎｉｔｅ（ＡｇｒＥｖｏ）及びＢａｓｔａ（Ｈｏｅｃｈｓｔ）の耐性のためのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒ遺伝子）、及びハイグロマイシン耐性のためのハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）遺伝子が挙げられる。
【０２７４】
植物及び植物組織でのプロモータ発現解析に使用され得るレポーター遺伝子（宿主に対して外来性である活性、普通、酵素活性及び/又は視覚シグナル（たとえば、ルシフェラーゼ、ＧＵＳ、ＧＦＰ）を発現するコーディング配列）を含む遺伝子構築物の使用も企図される。レポーター遺伝子の文献は、Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら、１９９３，Ｎａｔｕｒｅ、３０３，２０９，及びＳｃｈｒｏｔｔ，１９９５，Ｉｎ：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｔ．，Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ．Ｅｄｓ）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ．Ｂｅｒｌｉｎｅ，ｐｐ．３２５−３３６で概説されている。
【０２７５】
以下は、以下の植物種を遺伝的に形質転換するのに使用することができる遺伝情報プロトコールを開示する代表的な出版物である：コメ（Alam et al., 1999,  Plant Cell Rep. 18, 572）；リンゴ（Yao et al., 1995, Plant Cell Reports 14, 407-412）；トウモロコシ（米国特許第５，１７７，０１０号及び同第５，９８１，８４０号）；コムギ（Ortiz et al., 1996, Plant Cell Rep. 15, 1996, 877）；トマト（米国特許第５，１５９，１３５号）；ジャガイモ（Kumar et al., 1996 Plant J. 9, : 821）；キャッサバ（Li et al., 1996 Nat. Biotechnology 14, 736）；レタス（Michelmore et al., 1987, Plant Cell Rep. 6, 439）；タバコ（Horsch et al., 1985, Science 227, 1229）；綿（米国特許第５，８４６，７９７号及び同第５，００４，８６３号）；イネ（米国特許第５，１８７，０７３号及び同第６．０２０，５３９号）；ペパーミント（Niu et al., 1998, Plant Cell Rep. 17, 165）；柑橘植物（Pena et al., 1995, Plant Sci.104, 183）；キャラウェイ（Krens et al., 1997, Plant Cell Rep, 17, 39）；バナナ（米国特許第５，７９２，９３５号）；大豆（米国特許第５，４１６，０１１号；同第５，５６９，８３４号；同第５，８２４，８７７号；同第５，５６３，０４４５５号及び同第５，９６８，８３０号）；パイナップル（米国特許第５，９５２，５４３号）；ポプラ（米国特許第４，７９５，８５５号）；一般の単子葉植物（米国特許第５，５９１，６１６号及び同第６，０３７，５２２号）；アブラナ（米国特許第５，１８８，９５８号；同第５，４６３，１７４号及び同第５，７５０，８７１号）；シリアル（米国特許第６，０７４，８７７号）；西洋ナシ（Matsuda et al., 2005, Plant Cell Rep. 24(1):45-51）；サクラ属（Ramesh et al., 2006 Plant Cell Rep. 25(8):821-8; Song and Sink 2005 Plant Cell Rep. 2006 ;25(2):117-23; Gonzalez Padilla et al., 2003 Plant Cell Rep.22(1):38-45）；イチゴ（Oosumi et al., 2006 Planta. 223(6):1219-30; Folta et al., 2006 Planta Apr 14; PMID: 16614818）；バラ（Li et al., 2003）；キイチゴ（Graham et al., 1995 Methods Mol Biol. 1995;44:129-33）；トマト（Dan et al., 2006, Plant Cell Reports V25:432-441）；リンゴ（Yao et al., 1995, Plant Cell Rep. 14, 407−412）；キャノーラ（Brassica napus L.).(Cardoza and Stewart, 2006 Methods Mol Biol. 343:257-66）；ベニバナ（Orlikowska et al, 1995, Plant Cell Tissue and Organ Culture 40:85-91）；ライグラス（Altpeter et al, 2004 Developments in Plant Breeding 11(7):255-250）；コメ（Christou et al, 1991 Nature Biotech. 9:957-962）；トウモロコシ（Wang et al 2009 In: Handbook of Maize pp. 609-639）；及びＡｃｔｉｎｉｄｉａ  ｅｒｉａｎｔｈａ(Wang et al., 2006, Plant Cell Rep. 25,5: 425-31)。そのほかの種の形質転換も本発明によって企図される。好適な方法及びプロトコールは科学文献にて入手可能である。
植物
【０２７６】
用語「植物」は、植物全体、植物の一部、植物の種子、果実、珠芽、及び子孫を含めることが意図される。
【０２７７】
用語「珠芽」は、種子及び挿し木を含めて有性又は無性のいずれかで生殖又は伝搬に使用され得る植物の一部を意味する。
【０２７８】
本発明の植物は、自分自身で成長してもよいし、成長して異なった植物株と交配してもよく、所望の表現型の特徴を持つ、得られる交配種が特定されてもよい。２以上の世代を成長させて、主題の表現型の特徴が安定して維持され、遺伝することを確保してもよい。そのような標準的な育種法で生じる植物も本発明の態様を形成する。
【０２７９】
略記
オレオシン（又はＯｌｅ）＿０−０は操作されたシステインを含まないオレオシンを意味する。
オレオシン（又はＯｌｅ）＿１−１は各親水性鎖に操作されたシステインを１つ持つオレオシンを意味する。
オレオシン（又はＯｌｅ）＿１−３はＮ末端の親水性鎖に操作されたシステインを１つとＣ末端の親水性鎖に操作されたシステインを３つ持つオレオシンを意味する。
オレオシン（又はＯｌｅ）＿３−１は、Ｎ末端の親水性鎖に操作されたシステインを３つとＣ末端の親水性鎖に操作されたシステインを１つ持つオレオシンを意味する。
オレオシン（又はＯｌｅ）＿３−３はＮ末端の親水性鎖に操作されたシステインを３つとＣ末端の親水性鎖に操作されたシステインを３つ持つオレオシンを意味する。
オレオシン（又はＯｌｅ）＿５−６はＮ末端の親水性鎖に操作されたシステインを５つとＣ末端の親水性鎖に操作されたシステインを６つ持つオレオシンを意味する。
オレオシン（又はＯｌｅ）＿６−７はＮ末端の親水性鎖に操作されたシステインを６つとＣ末端の親水性鎖に操作されたシステインを７つ持つオレオシンを意味する。
【図面の簡単な説明】
【０２８０】
【図１】オレオシン＿０−０とＤＧＡＴ１（Ｓ２０５Ａ）の構築物の構造を示す図である。ＣａＭＶ３５はカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモータである。ａｔｔＢ１はＧＡＴＥＷＡＹ（商標）組換え部位である。ＵＢＱ１０はシロイヌナズナのＵＢＱ１０遺伝子からのイントロンである。ＯＣＳターミネータはオクトピンシンターゼのターミネータである。
【図２】シロイヌナズナで形質転換する場合のオレオシン＿１−１とＤＧＡＴ１（Ｓ２０５Ａ）の構築物の配置を示す図である。
【図３】オレオシン＿１−３とＤＧＡＴ１（Ｓ２０５Ａ）の構築物の配列を示す図である。ＣａＭＶ３５はカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモータである。ａｔｔＢ１はＧＡＴＥＷＡＹ（商標）組換え部位である。ＵＢＱ１０はシロイヌナズナのＵＢＱ１０遺伝子からのイントロンである。ＯＣＳターミネータはオクトピンシンターゼのターミネータである。
【図４】オレオシン＿３−１とＤＧＡＴ１（Ｓ２０５Ａ）の構築物を示す図である。ＣａＭＶ３５はカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモータである。ａｔｔＢ１はＧＡＴＥＷＡＹ（商標）組換え部位である。ＵＢＱ１０はシロイヌナズナのＵＢＱ１０遺伝子からのイントロンである。ＯＣＳターミネータはオクトピンシンターゼのターミネータである。
【図５】オレオシン＿３−３とＤＧＡＴ１（Ｓ２０５Ａ）の構築物を示す図である。ＣａＭＶ３５はカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモータである。ａｔｔＢ１はＧＡＴＥＷＡＹ（商標）組換え部位である。ＵＢＱ１０はシロイヌナズナのＵＢＱ１０遺伝子からのイントロンである。ＯＣＳターミネータはオクトピンシンターゼのターミネータである。
【図６】植物を形質転換するのに使用される構築物ｐＲＳｈ１のマップを示す図である。マップは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモータの制御下にあるシロイヌナズナＤＧＡＴ１（Ｓ２０５Ａ）と同様にＣａＭＶ３５Ｓプロモータの制御下にある人工的に導入されたシステイン（この場合、Ｏｌｅｏ＿３−３）を持つオレオシンの配置を示す。そのほかのオレオシン配列及びＴＡＧ合成酵素の配列は当然それぞれＯｌｅｏ＿３−３及びＤＧＡＴ１について置換され得る。
【図７】操作されたシステイン残基を伴った及び伴わない精製組換えゴマ種子オレオシンに結合する抗ゴマ種子オレオシン抗体のドットブロットの比較を示す図である。
【図８】大腸菌で発現させたＡＯＢでのオレオシンのシステインタンパク質を検出する免疫ブロット解析を示す図である。等容量のＡＯＢ（還元剤なしでの２×ＳＤＳ負荷色素を含む７．５μｌ）をレーン当たり負荷した。ｍＭでのＧＳＳＧの濃度を各レーンの上に示す。
【図９】大腸菌で発現させたＯｌｅ＿０−０、Ｏｌｅ＿１−１及びＯｌｅ＿３−３のＳＤＳ及びＳＤＳ−尿素ＰＡＧＥ／免疫ブロット解析を示す図である。試料は、還元剤（ＤＴＴ及びβ−ＭＥ）又は酸化剤（ＧＳＳＧ）の存在下又は非存在下で封入体（ＩＢ）及び人工油体（ＡＯＢ）から調製し、その際、等量のタンパク質を隣接するレーンに負荷した。
【図１０】ＣａＭＶ３５Ｓプロモータの制御下でＤＧＡＴ１（Ｓ２０５Ａ）とゴマのオレオシンの双方を発現しているトランスジェニックシロイヌナズナの種子に蓄積されたオレオシン（Ｏｌｅ＿０−０、Ｏｌｅ＿１−３、Ｏｌｅ＿３−１及びＯｌｅ＿３−３、配列番号１１〜２０）の免疫ブロット解析を示す図である。
【図１１】ＣａＭＶ３５Ｓプロモータの制御下でＤＧＡＴ１（Ｓ２０５Ａ）とゴマのオレオシンの双方を発現しているトランスジェニックシロイヌナズナの油体に蓄積されたオレオシン（Ｏｌｅ＿０−０、Ｏｌｅ＿１−３、Ｏｌｅ＿３−１及びＯｌｅ＿３−３、配列番号１１〜２０）の免疫ブロット解析を示す図である。酸化剤（＋）の存在下でのオリゴマーのオレオシンのバンド（二量体及び三量体）の出現はジスルフィド結合が天然の油体の外側で形成し得ることを示す。
【図１２】ＣａＭＶ３５Ｓプロモータの制御下でＤＧＡＴ１（Ｓ２０５Ａ）とゴマのオレオシンの双方を発現しているトランスジェニックシロイヌナズナの葉に蓄積されたオレオシン（Ｏｌｅ＿０−０、Ｏｌｅ＿１−３、Ｏｌｅ＿３−１及びＯｌｅ＿３−３、配列番号１１〜２０）の免疫ブロット解析を示す図である。
【図１３】トランスジェニックシロイヌナズナの葉における組換えオレオシンの蓄積（黒い矢印）の免疫ブロットを示す図である。
【図１４】ＤＧＡＴ１（Ｓ２０５Ａ）とＯｌｅ＿３−３を過剰発現しているシロイヌナズナの葉における追加の脂質（黒い矢印）の蓄積をしめすＦＡＭＥＳ  ＧＣ／ＭＳの結果を示す図である。
【図１５】ＤＧＡＴ１（Ｓ２０５Ａ）とＯｌｅ＿３−３を含有するトランスジェニックシロイヌナズナの野生型株と独立株の葉の総脂質の特徴についてのＧＣ／ＭＳの結果を示す図である。灰色の矢印は内部標準を示す。黒色の矢印は追加の中性脂質（ワックスエステル、ステロールエステル及びＴＡＧ）を示す。白抜きの矢印は野生型（及び５０Ａ株）に比べて葉に相当量の中性脂質を蓄積する３つの株（４１Ｓ、１８Ａ及び４７Ｃ）を示す。
【図１６】発芽後２、３、４及び５週間目の野生型及びトランスジェニックシロイヌナズナ（ＤＧＡＴ１（Ｓ２０５Ａ）とＯｌｅ＿３−３を含有する）の総ＴＡＧの特徴を示すＧＣ／ＭＳの結果を示す図である。
【図１７】野生型及びトランスジェニックシロツメクサ（ＤＧＡＴ１（Ｓ２０５Ａ）とＯｌｅ＿３−３を含有する）の葉の総脂質の特徴を示すＧＣ／ＭＳの結果を示す図である。
【図１８】野生型及びトランスジェニックシロツメクサ（ＤＧＡＴ１（Ｓ２０５Ａ）とＯｌｅ＿３−３を含有する）の葉のＣ１８：１及びＣ１８：２の脂質の特徴を示すＦＡＭＥＳ  ＧＣ／ＭＳの結果を示す図である。
【実施例】
【０２８１】
以下の非限定例を参照して本発明を説明する。
実施例１：ウサギ抗ゴマ種子オレオシン抗体の創製
【０２８２】
ウサギ抗ゴマ種子オレオシン抗体の生成
Ｃ末端のＨｉｓタグを含有する完全長のゴマ種子オレオシン（ヌクレオチド配列は配列番号１に示す）を大腸菌で発現させ、常法によって封入体を調製した。封入体を結合緩衝液（１００ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、８Ｍの尿素、及び１０ｍＭのイミダゾール）にて可溶化し、平衡化したイオン金属アフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）Ｎｉアガロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するカラムに負荷した。６容の洗浄緩衝液（１００ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、６Ｍの尿素、及び５０ｍＭのイミダゾール）で洗浄することによって結合しなかったタンパク質をカラムから取り除いた。溶出緩衝液（１００ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、６Ｍの尿素、及び２５０ｍＭのイミダゾール）の１容アリコートでタンパク質を溶出した。溶出した分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クマシー染色によって分析し、Ｂｒａｄｆｏｒｄのアッセイを用いてタンパク質濃度を測定した。２６５μｇのＩＭＡＣ精製した組み換えオレオシンタンパク質を等量のフロインド完全アジュバントと混合して最終容量０．５ｍｌとした。採血前の採血に続いて、１回目の注射をウサギの首の後ろ及び肩にて複数部位に投与した。７７μｇの精製オレオシンを含有する追加免疫注射を感作の後３週間と７週間で行い、９週目に予備解析のために約３ｍｌの試験採血を行った。０．２５％ｖ／ｖのフェノールと０．０１％ｖ／ｖのメルチオレートの添加によって血清を保護し、２００μｌのアリコートにて−２０℃で保存した。
【０２８３】
免疫ブロットによってウサギ抗ゴマ種子オレオシン抗体の感度を評価し、それは、抗体の１／２，０００の希釈によって０．２５ｎｇのゴマ種子オレオシンを恒常的に検出できることを示した（図７）。
実施例２：１以上の人工的に導入したシステイン残基を含有する修飾オレオシンの設計及び大腸菌での発現
【０２８４】
大腸菌での発現のための構築物の設計
大腸菌での発現のための多数の修飾オレオシン構築物を設計した。これらは、Ｎ末端及びＣ末端の親水性の鎖に１又は３のシステイン残基を含有した。構築物は、システイン残基を含有しないＧｅｎＢａｎｋクローンＡＦ０９１８４０であるゴマ種子オレオシン（配列番号１６）のヌクレオチド配列及び翻訳されたポリペプチド配列に基づいた。
【０２８５】
操作したＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位を用いてクローンすべてをｐＥＴ２９ｂにてサブクローニングした。加えて、Ｃ末端の親水性鎖の３’末端のコーディング領域にＰｒｏＴｒｐコーディング配列を付加して、Ｐｅｎｇら（２００６）Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｏｉｌ  ｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｇｅｎｉｐｉｎ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋ．台湾特許Ｉ  ２５０４６６によって以前操作されたＮｃｏＩ部位によってコードされるアミノ酸残基を模倣した。
【０２８６】
ここで記載されるＮ末端及びＣ末端双方の親水性領域にシステイン残基を含むように変異させたオレオシン／システインタンパク質は、Ｏｌｅ−１−１、Ｏｌｅ−１−３、Ｏｌｅ−３−１及びＯｌｅ−３−３（それぞれ配列番号２、３、４及び５）と命名されるが、最初と２番目の数字はそれぞれＮ末端及びＣ末端におけるジスルフィド結合の数に相当する。システイン残基を持たない標準のオレオシンを対照として用い、Ｏｌｅ−０−０（配列番号１）と名付けた。
【０２８７】
油体の表面にあると予測された荷電残基についてシステインを置換したが、それを以下に列記する。
Ｎ末端の単一システイン（Ｏｌｅ−１−ｘ）  Ｇｌｕ３Ｃｙｓ
Ｎ末端の３個のシステイン（Ｏｌｅ−３−ｘ）  Ｇｌｕ３Ｃｙｓ、Ａｒｇ１２Ｃｙｓ、Ｇｌｎ２３Ｃｙｓ
Ｃ末端の単一システイン（Ｏｌｅ−ｘ−１）  Ｇｌｎ１３７Ｃｙｓ
Ｃ末端の３個のシステイン（Ｏｌｅ−ｘ−３）  Ｇｌｎ１１２Ｃｙｓ、Ｌｙｓ１２３Ｃｙｓ、Ｇｌｎ１３７Ｃｙｓ
【０２８８】
構築物は、ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ消化と連結を介してＧＥＮＥＡＲＴが提供した主鎖（ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ）からｐＥＴ２９ｂ（Ｎｏｖｏｇｅｎ）に相対的に単純にサブクローニングできるように設計した。これによってオレオシンのコーディング配列をｐＥＴ２９のＮ末端Ｓ・タグ融合の下流でＣ末端Ｈｉｓタグの上流に置いた（図１〜５、及び配列番号１〜１０）。使用したオレオシン及び修飾オレオシンの配列は、配列表の要約に要約される。
少なくとも１つの人工的に導入したシステインを含有する修飾オレオシンの大腸菌における発現と精製
【０２８９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クマシーブリリアントブルー染色及びゴマ種子オレオシンに対して産生させた抗体（実施例１に記載した）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ／免疫ブロット解析によって、大腸菌発現系における組換えゴマ種子オレオシン（操作したシステインを伴った及び伴わない）の発現を評価した。
【０２９０】
ｐＥＴ２９発現ベクターにオレオシン（操作したシステイン残基を伴った及び伴わない）コーディング配列を含有する大腸菌（ＢＬ２１  Ｒｏｓｅｔｔａ-Ｇａｍｉ）を新鮮に播種した１０ｍｌの培養物にて組換え修飾オレオシンの発現を誘導した。３７℃、２２０ｒｐｍにて中間対数期（ＯＤ６００＝０．５〜０．７）まで培養物を増殖させ、１ｍＭの最終濃度でＩＰＴＧを添加することによって発現を誘導した。誘導した培養物を３７℃、２２０ｒｐｍにてさらに２〜３時間インキュベートした。修飾オレオシンの特性を考えて、本出願者らは、可溶性形態で発現させることを試みず、むしろ封入体から抽出するように選択した。培養物のアリコート（１ｍｌ）を１．５ｍｌの微量遠心管に移し、遠心（２６５５×ｇで４℃にて５分間）によって細胞を沈殿させた。
【０２９１】
４０μｇ／ｍｌでのＤＮＡ分解酵素の添加と共に５ｍｌ／ｇ湿潤細胞沈殿物にて沈殿した細胞をＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）試薬（Ｍｅｒｃｋ）に再浮遊し、回転装置上で３０分間穏やかに混合し、その後、８０００ｇにて４℃で１０分間遠心した。得られた細胞沈殿物を上記のようにＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）とＤＮＡ分解酵素で再処理した。８０００ｇにて４℃で１０分間遠心することによって、残りの可溶性タンパク質と浮遊した細胞残渣を不溶性の封入体から分離した。
【０２９２】
Ｄ’Ａｎｄｒeａら（２００７）から適合させた手順を用いて組換えオレオシンを封入体からさらに精製した。手短には、２００ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ１１（元々の細胞沈殿物のｇ当たり５ｍｌ）における再浮遊によって封入体調製物を洗浄し、８０００ｇにて４℃で１０分間遠心することによって再沈殿させた。洗浄した封入体の沈殿物を再び、沈殿物のグラム当たり５ｍｌの２００ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝液に再浮遊させ、９容量の新鮮に調製したクロロホルム：メタノールの混合物（５：４、ｖ／ｖ）に加え、５：４：１（クロロホルム：メタノール：緩衝液）の最終比を得た。浮遊液を穏やかに５分間混合し、乳白色の単相の混合物を形成したが、これを１０，０００×ｇにて４℃で１０分間遠心し、修飾オレオシンを含有する上清を沈殿物から慎重に分離し、新しいチューブに移した。上清のアリコートを窒素気流のもとで乾燥させ、タンパク質を８Ｍの尿素に再可溶化し、Ｑｕｂｉｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって定量した。
【０２９３】
実施例３：人工的に導入されたシステインを伴ったゴマ種子オレオシンに結合させるための抗ゴマ種子オレオシン抗体の使用
ドットブロットを用いて、システインを伴わないオレオシンに結合する実施例１に記載した抗ゴマ種子オレオシン抗体（Ａｂ）の能力を、システインを含有するオレオシン（実施例２に記載）に対して比較した。事前に平衡化したＨｙｂｏｎｄ−ＰＰＶＤＦ転移膜上で１２〜０．２５ｎｇに連続希釈したＯｌｅ−０−０とＯｌｅ−１−３とＯｌｅ−３−１のスポットを作った。これを一次抗体としての１：２０００の抗ゴマ種子オレオシン抗体と共にインキュベートした。次いでブロットを適当な二次抗体と共にインキュベートし、化学発光によって発色させた（図７）。結果は、免疫ブロットでは、抗ゴマ種子オレオシン抗体は、システイン残基を伴ったオレオシンよりもシステイン残基を伴わないオレオシンに対して一桁感度が高いことを示す。異なった感度の結果として、免疫ブロットによる解析のためのゲルには異なった量の組換えタンパク質を負荷することが必要だった。均一ではないレーンの負荷にもかかわらず、単量体とオリゴマーの形態の間での相対的な分布という点でレーン間にて異なったオレオシンを比較することは未だ可能である。
実施例４：少なくとも１つの人工的に導入されたシステインを含有し、架橋の程度を変えている大腸菌で発現させた修飾オレオシンを伴った人工的な油体の創製
【０２９４】
人工的な油体の調製
次いで１５０μｇ又は１ｍｇの組換えオレオシンを含有するように計算した実施例３に記載された上清のアリコートを乾燥させることによって人工的な油体（ＡＯＢ）を調製した。
【０２９５】
ＡＯＢを生成する方法には、ＰＬとＴＡＧと組換えオレオシン／修飾オレオシンを組み合わせることが関与した。強力なカオトロピック剤の非存在下では、精製した分画から個々の組換えオレオシンを解離するのに必要とされる崩壊力には、超音波処理と冷却の数回のサイクルが関与した。１５０μｇのＰＬ（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ＃Ｐ３６４４）を含有する２０μｌのクロロホルムに１５０μｇ及び１ｍｇのオレオシン／修飾オレオシン試料を可溶化することによってこれを達成し、６０μｌの精製ゴマ種子油（Tzen and Huang 1992）及び９４０μｌのＡＯＢ緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ）と混合した。次いで完全な混合物を３０秒間で３回超音波処理した（Ｓｏｎｉｃｓ  ＆  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｖｉｂｒａ〜Ｃｅｌｌ  ＶＣ６００，６００Ｗ，２０ｋＨｚ；１／８”先細りのマイクロチッププローブ、出力設定＃３）。
【０２９６】
本出願者らはまた、精製手順は上手く規模拡大でき、５０ｇの細胞沈殿物を出発材料として使用した場合、クロロホルムと大半のメタノールを取り除くのに窒素気流を回転真空エバポレータに置き換えることが必要であることを見い出した。この時点で、オレオシン／修飾オレオシンの大半は共沸溶媒の外で沈殿し、１２，０００ｒｐｍにて１０分間の遠心により分離された。
【０２９７】
封入体を１ｍｌのＡＯＢ緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１０ｍＭのＤＴＴ及び５％［ｖ／ｖ］のゴマ油）に浮遊させ、次いで４回超音波処理した。１２，０００ｒｐｍにて１０分間の遠心によりＡＯＢを濃縮し、これによって水性分画を覆うＡＯＢ浮遊の形成を生じた。下にある水性分画をピペットで取り除き、残ったＡＯＢを、１ｍｌのＡＯＢ緩衝液ＩＩＩ（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ）での穏やかな撹拌によって洗浄した（可溶性タンパク質及び還元剤を取り除くために）。洗浄の後、遠心によってＡＯＢを再構築し、下にある水性分画を取り除き、次いでＡＯＢ緩衝液ＩＶ（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＧＳＳＧ）にてボルテックスすることによって再浮遊させ、さらなる解析のためにＡＯＢを４℃で保存した。
【０２９８】
組換えのＯｌｅ＿０−０及びオレオシン／システインの変異体すべては、大腸菌の封入体で上手く発現し、局在した（図９）。Ｏｌｅ＿０−０は主として単量体で存在し（ＡＯＢと同様に双方の封入体で）；これは、２０ｋＤａの分子量マーカーよりも速く分画として移動した（還元型及び非還元型のＳＤＳ及びＳＤＳ−尿素−ＰＡＧＥにて）。二量体オレオシンの２つの形態に相当すると思われるおよそ３５と３６ｋＤａの２本のゆっくり移動する免疫反応性のバンドも存在した。Ｏｌｅ＿０−０はシステイン残基を含有するとは予測されないが、２つの見かけの二量体の全体の強度及び比率は、還元剤（β−ＭＷ＠試料負荷緩衝液の５％、及び１０ｍＭのＤＴＴ）の存在によって影響を受けた。
【０２９９】
封入体では、Ｏｌｅ＿１−１の優勢な形態は単量体である。たった１つの二量体形態が存在すると思われたが、これは還元剤又は尿素によって影響を受けなかった。ＡＯＢからのＯｌｅ＿１−１（還元剤の存在下、ついで酸化剤の存在下で生成された）は、三量体、四量体及びたぶん五量体のオリゴマー（これらのオリゴマーの電気泳動上の焦点はＳＤＳ−ＵＲＥＡゲルでかなり改善された）の形成と同様に二量体と単量体の比で大きな増大を示した。ＧＳＳＧの除去とＡＯＢへの還元剤の再導入によって、封入体で見られる類似の比率での単量体と二量体のみの存在を生じた。Ｏｌｅ＿１−１で生成したＡＯＢ（還元剤とＧＳＳＧ双方の非存在下で）は、ほとんど同等の部分の単量体と二量体及び少量の三量体の存在を示したということは、ＡＯＢが形成される条件は幾分還元能を有することを示している。その後のＧＳＳＧの添加は、四量体の出現と同様にオリゴマー部分の増加を生じた。
【０３００】
単量体は封入体におけるＯｌｅ＿３−３の優勢な形態であったが、複数のオリゴマー形態にて比較的高い比率も存在した。オリゴマーの比率は、還元剤の添加によってわずかに低下したが、還元剤とカオトロピック剤双方の添加によってやや増えた。組換えタンパク質をＡＯＢから抽出した場合、三量体より大きいＯｌｅ＿３−３のオリゴマー形態はあまり分解されなかった。ＧＳＳＧの添加及び還元剤やカオトロピック剤の非存在によって大きなオリゴマー形態の創製は促進されるが、これらオリゴマー形態の一部は濃縮用ゲルに入ることができなかった。合わせて、これらの結果は、ＡＯＢではＯｌｅ＿３−３は高度の架橋されており、架橋の一部は、封入体から回収されたＯｌｅ＿３−３に比べてさらに変わりやすかったことを示している。このことは、相当な既存の架橋（封入体内での）にもかかわらず、ＡＯＢでは、Ｏｌｅ＿３−３は架橋に対する多数の相方と思われるものへのアクセスを有することを示唆している。同様に、Ｏｌｅ＿１−３及びＯｌｅ＿３−１については、親水性領域の一方又は双方に１を超えるシステインかあった場合、架橋される種の数は増加した（図８及び９）。
【０３０１】
非還元型のＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、同一数のオレオシンを含有するが、異なった位置でジスルフィド結合を持つオリゴマーは互いに異なって移動することが十分に理解されればよい。実際、これは図８で見ることができ、その際、データは互いに対するオレオシン鎖の位置が油体にて異なった位置であることを示している。たとえば、Ｏｌｅ＿１−１は鎖当たりジスルフィド結合を１つしか形成できず、これは同一位置で形成しなければならないが、３つのシステインの存在によって１を超えるジスルフィド結合を形成するのが可能になるので、それはまた、異なった程度の親水性鎖の重なり合いを持つジスルフィド結合を形成することも可能にするとともに、同じ鎖に結合する複数のオレオシンを有することを可能にする（図８及び９）。
【０３０２】
ＳＤＳ及び還元剤（ＤＴＴ及びβ−ＭＥ）の添加はオリゴマー複合体の数を減らした（図９）。ＳＤＳ及び尿素の添加は、予め分解された複数の二量体形態が１つとして移動したことと、三量体及び四量体の形態も対応して強度を高める単一バンドとして移動しているのでおそらくさらに豊富であると思われることを除いて、ＳＤＳのみのパターンと類似するパターンを生じる（図９）。それに対して、ＳＤＳと還元剤と尿素の存在は、Ｏｌｅ＿１−１とＯｌｅ＿１−３のわずかなオリゴマー形態を生じたが、Ｏｌｅ＿３−１又はＯｌｅ＿３−３のオリゴマーは生じなかった（図９）。Ｏｌｅ＿３−１及びＯｌｅ＿３−３については、尿素はジスルフィドオレオシンを完全に変性させるわけではなく、実際、ジスルフィド結合の完全な還元を抑え得ると思われる。これらの結合が封入体の生成の間に形成されることはあり得ることである（還元された及び非還元の封入体の沈殿物を見る必要がある）。さらに、操作されたシステインの非存在下で形成された二量体オレオシンの存在（図８及び９）は、オリゴマー形成の一部が、他の種類の引き付ける力、たとえば、ＳＤＳによっては完全には壊れないが、ＳＤＳと尿素双方の組み合わせによってほぼ完全に壊される強力な疎水性結合によることを示している（図８及び９）。
【０３０３】
ＡＯＢの完全性とエマルションの安定性に対するオレオシンペプチドにおける架橋と思われる部位の数の増加の影響は以下で評価することができる。
ＡＯＢの完全性の定量的判定
【０３０４】
吸収（ＯＤ６００）、血球計算盤を用いたＡＯＢの直接計数、又は顕微鏡を用いた合体の視覚評価を用いたＡＯＢの安定性及び完全性の評価は、高度に可変性であることが判明し、とりわけ、予備試料採取の撹拌の程度、取り出した試料の質、顕微鏡下に置かれた時間に影響を受けた。これを回避するために、本出願者らは、完全性を比較する手段として、種々の処理の間、ＡＯＢから周辺の媒体に放出されるＴＡＧの量を定量する単純な方法を考案した。ＡＯＢ緩衝液（２５０μｌのＧＣガラス挿入チューブにてＯＢ又はＡＯＢの試料中プロテイナーゼＫ［ＰＮＫ］と総タンパク質の比が１：１で使用するときＰＮＫを含有する）を用いて、本質的に等量の（ＴＡＧとタンパク質のＢｒａｄｆｏｒｄｓ測定のＦＡＭＥＳ−ＧＣ／ＭＳ概算に基づく）ＡＯＢ調製物を総容量２００μｌで作製し、プラスチックの蓋で覆った。処理（温度の上昇又はＰＮＫへの暴露）に続いて、１５μｌの魚油（Ｖｉｔａｍａｘ（登録商標）、オーストラリア）を試料に加え、ボルテックスで混合し、その後、５，２００ｇにて１分間遠心した。魚油の添加とその後のボルテックスによって、ＡＯＢから漏れ出したＴＡＧが添加された魚油と混合するのが可能になり、短い遠心により浮かばせることができる。４μｌの油相を採取し、脂肪酸メチルエステル化（ＦＡＭＥ）に供し、次いで、Ｂｒｏｗｓｅら（１９８６）によって記載されたように、ＧＣ−ＭＳ（島津、モデル番号、５０ｍＱＣ２／ＢＰＸ７０−０．２５ＧＣキャピラリーカラム（ＳＧＥ）を装着した）によって解析する。添加した魚油の非存在下では、ＡＯＢから漏れ出したＴＡＧの量が少なすぎて遠心の後でさえ、採取可能な眼に見える層を形成できなかったが；そのような場合、最大容量は６μｌだった。魚油とゴマ油の非常に異なった液体特性によって我々は、添加したＴＡＧから漏れ出したＴＡＧを容易に区別することができた。
【０３０５】
内部Ｃ１５：０及びＣ１７：０の標準を用いて、本出願者らは処理の後回収されたＣ１８：２（ゴマ種子油の主な液体）の絶対量を算出することができる。
【０３０６】
高温でのＡＯＢ完全性とエマルション安定性の判定
水中油エマルションは高温ではあまり安定ではない；従って、種々の数の導入システインを持つ修飾オレオシンが高温でのＡＯＢの完全性に影響するかどうかを検討するのは興味深い。これを達成するために、本出願者らは９５℃のリン酸緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８、１００ｍＭのＮａＣｌ）にてＯＢ及びＡＯＢ（異なったオレオシンを含有する）の完全性を判定する（上記方法を用いて）。ＡＯＢを２時間加熱する。完全性は上記のように判定する。
【０３０７】
第一胃液におけるＡＯＢの安定性に対する架橋オレオシン：ＴＡＧの高い比率の効果は以下のように対処することができる。
【０３０８】
第一胃液におけるＡＯＢ完全性の判定
ジスルフィドの狙いの１つは、第一胃の微生物叢による生体水素化からのある程度の保護を提供することである。第一胃液によるＡＯＢ安定性の評価は以下のように評価することができる。ＡＯＢを等量の第一胃液（２５μｌ）に加える。３９℃にて試料を０、１５、３０、６０、１２０及び２４０分間インキュベートし、インキュベートの終了時に等量の負荷緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、混合し、７０℃にて１時間加熱する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／免疫ブロットによって１５μｌの各試料／負荷緩衝液混合物を比較する。完全性は上記のように判定する。
【０３０９】
プロテイナーゼＫにおけるＡＯＢ完全性の解析
制御可能で反復可能な高度に分解性の環境にて修飾オレオシンの影響を検討するために、１：１（ｇ／ｇタンパク質）のプロテイナーゼＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するリン酸緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ８、１００ｍＭのＮａＣｌ）にて３７℃で４時間インキュベートした後、ＡＯＢ（異なった修飾オレオシンを含有する）の完全性を判定する（上記の方法を用いて）。プロテイナーゼＫの最大活性は６５℃未満で達成されるが、ＡＯＢの不安定性に対する温度の影響を減らすためにさらに低い温度を用いる。完全性は上記のように判定する。
実施例５：１以上の人工的に導入されたシステインを含有する修飾オレオシンの設計及び植物体内での発現
【０３１０】
植物体内での発現のための構築物の設計
本出願者らは、Ｎ及びＣの末端鎖で異なった数のシステインを持つゴマ種子オレオシンの個々のコーディング配列（ＧｅｎＢａｎｋクローンＡＦ０９１８４０に基づく）を合成した。コーディング配列には５’ＮｏｔＩ部位と３’ＮｄｅＩ部位が隣接した。ａｔｔＬ１部位、ＮｏｔＩ部位及びＮｄｅＩ部位に続くｎｏｓ停止配列、前向きＣａＭＶ３５Ｓプロモータ、シロイヌナズナのＤＧＡＴ１（Ｓ２０５Ａ）（配列番号１１〜２０及び図１〜５）に加えてそれ自体のＵＢＱ１０イントロン、ａｔｔＬ２部位を含有する別個のアクセプターカセットを合成した。異なった数のシステインを持つゴマ種子オレオシンはＮｏｔＩ部位とＮｄｅＩ部位を介して個々にアクセプターカセットに移した。次いでＬＲ組換え反応を介して、これら完成したカセットのそれぞれを植物バイナリーベクターｐＲＳｈ１、図６に移した（Winichayakul et al., 2008）。これによってオレオシンをＣａＭＶ３５Ｓプロモータ（ｐＲＳｈ１の中にすでに含有された）の下流に置き、ｎｏｓターミネータ（ｐＲＳｈ１の中にすでに含有された）をシロイヌナズナのＤＧＡＴ１（Ｓ２０５Ａ）（図１〜５）の下流に置いた。ゴマ種子オレオシン（システインを伴った）とＤＧＡＴ１をコードするヌクレオチド配列をシロイヌナズナでの発現について最適化し、これには、コドン頻度、ＧＣ含量の最適化、隠れたスプライス部位の除去、ｍＲＮＡ不安定配列の除去、ポリアデニル化部位と思われる部位の除去、及び３ヌクレオチド停止コドンの付加が含まれた（Brown et al, 1990; Beelman and Parker, 1995; Rose, 2004; Rose and Beliakoff, 2000; Norris et al., 1993）。
【０３１１】
使用されるオレオシン配列は例示のためのみであることが留意されるべきである。オレオシン又はステロレオシン又はカレオシンの配列はいずれも架橋領域を含有するように操作されてもよい。元々のオレオシン翻訳配列の反復に対して完全なＯＲＦ（スプライシング後）のコーディング配列を点検してオレオシンのコーディング領域にわたって同一であることを見い出した。
システインを含有するゴマ種子オレオシンによるシロイヌナズナの形質転換
【０３１２】
シロイヌナズナの野生系統Ｃｏｌｕｍｂｉａの（上記の構築物による）形質転換、修飾オレオシンについてのＴ２種子の解析、異なった数のシステインを持つゴマ種子オレオシンを含有するシロイヌナズナ油体の免疫ブロット解析は以前記載された（Scott et al., 2007）ように実施した。
【０３１３】
バイナリー構築物を含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＧＶ３１０１によるシロイヌナズナの形質転換には、フローラル・ディップ法（Clough, 1998）及びフローラル・ドロップ法（Martinez-Trujillo, 2004）の双方を用いた。Ｔ１種子は、発芽後１４及び２１日目にＢａｓｔａ（登録商標）を噴霧することによって処理した発芽し、選抜した植物から回収した。Ｂａｓｔａ（登録商標）耐性のＴ１植物（それぞれ単一のゴマ種子オレオシン及び修飾オレオシン構築物を含有する７１、６２及び２３形質転換体）を移植し、自家繁殖し、種を播くようにし、Ｔ２種子を回収した。Ｂａｓｔａ（登録商標）耐性のシロイヌナズナからの等量の種子抽出物を抗ゴマ種子オレオシン抗体によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ／免疫ブロットで解析し；試料の大半にて、適切なサイズの組換えゴマ種子オレオシンと修飾オレオシンを認めた（図１０）。選抜したＴ２株にてサザンブロット解析を行い、挿入部位の数を決定した。
実施例６：少なくとも１つの人工的に導入されたシステインを含有する修飾オレオシンを持つ油体のシロイヌナズナ種子からの抽出及び精製
【０３１４】
シロイヌナズナ種子からの粗精製油体の調製
砂のヘラ先と７５０μｌの抽出緩衝液（６００ｍＭのスクロースを含有する１０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．５）を含有する乳鉢と乳棒により２００ｍｇの種子を粉砕することによって、又はＷｉｇｇｅｎｈａｕｓｅｒＤ-１３０ホモゲナイザーを用いて３００μｌの抽出緩衝液中で２５ｍｇの種子をホモジネートすることによって、実施例５に記載されたように作出された植物の種子から粗精製のＯＢ調製物を調製した。さらなる７５０μｌの抽出緩衝液を加え、乳鉢中のスラリーを２ｍｌの微量遠心管に移し、ホモゲナイザー先端を抽出緩衝液ですすぎ、この容量をホモジネートした種子に加えた。次いで試料を２０，０００×ｇで５分間遠心し、これによって、沈殿物と、遊離のＴＡＧと同様に無傷の及び崩壊した双方の油体を含有する非混和性の油層が重層した水性上清が残った。上部の油層を穏やかにチューブの横に寄せ、水性層と沈殿物を捨てた。次いで抽出緩衝液にてボルテックスすることによって油層をチューブの側面から再び再懸濁し、新しい２ｍｌの微量遠心管に入れた。最終容量を抽出緩衝液で０．５ｍｌに合わせた。
【０３１５】
シロイヌナズナ種子からの精製油体調製物及び操作したオレオシン間の架橋システイン残基
ＷｉｇｇｅｎｈａｕｓｅｒＤ-１３０ホモゲナイザーを用い、３００μｌの抽出緩衝液（６００ｍＭのスクロースを含有する１０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．５）にて２５ｍｇのシロイヌナズナ種子（実施例５に記載されたように形質転換した植物の）を粉砕した。種子が粉々になるまで粉砕し、試料は種子からデンプンが放出されるにつれて「クリーム状」で泡だって見えた。ホモゲナイザー先端を１ｍｌの緩衝液ですすぎ、この容量を砕いた種子に加えた。ここまでで試料を４つのロットで調製し、１４，０００ｒｐｍにて５分間遠心した。細いゲル負荷用の先端を用いて油層をチューブの側面に穏やかに寄せ、水性層を新しいチューブに取り移した。抽出緩衝液を用いて油層をチューブの側面から再び懸濁し、新しい２ｍｌのチューブに入れた。最終容量を抽出緩衝液で０．５ｍｌ（チューブの側面で読み取って）に合わせ、試料を２つに分け、酸化剤（３ｍＭのＧＳＳＧ）を一方のチューブに加え、室温にて１０分間インキュベートした。次いで油体調製物を等量の２×ゲル負荷緩衝液に加え、５分間煮沸した後、ゲルに負荷した。
【０３１６】
Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎゲルリグ方式（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上の事前作製されたＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ、４−１２％、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｍｉｄｉゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、又はＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ  ＳＤＳ泳動緩衝液（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルのみ用）（２０Ｘ），カタログ番号ＮＰ０００２−０２を伴ったＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ勾配ゲル、１．０ｍｍ，１５ウェル、カタログ番号ＮＰ０３４３ＢＯＸ、又はその場で作製したＴｒｉｓ−ＨＣｌゲルのいずれかにて試料を泳動した。ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でゲルを染色し、負荷した全タンパク質を示すか、又はｉＢｌｏｔ方式（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてゲルをニトロセルロース膜上にブロットした。各場合、陰性対照は野生型Ｃｏｌｕｍｂｉａ株の種子から抽出した試料であり、陽性対照は、野生型ゴマ種子で実施した同一抽出法（粉砕は乳鉢と乳棒によったが）だった。１０μｌの各試料と陰性対照をゲルに負荷し、５μｌは陽性対照に使用した。
【０３１７】
ブロットに続いて、ＴＢＳＴ（５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．２％のＴｗｅｅｎ）中１２．５％の脱脂粉乳の溶液にて少なくとも１．５時間、膜をブロックした。次いでＴＢＳＴにて５分間、膜を３回洗浄し、その後、ＴＢＳＴ中１／１０００の一次抗体（抗ゴマ）と共に室温で１時間インキュベートした。３回のＴＢＳＴによる洗浄の後、１／５０００での二次抗体（抗ウサギ）と共に室温にて１時間インキュベートした。次いで膜をさらに３回洗浄し、標準の化学発光プロトコールを用いてシグナルを発生させた。
【０３１８】
図１１はＣａＭＶ３５Ｓプロモータの制御のもとでの油体におけるゴマ種子オレオシン単位の蓄積を示す。組換えオレオシンとポリオレオシンがシロイヌナズナの種子で蓄積するのが見られ、正確に油体を標的としたことが理解され得る（図１１）。加えて、野生型や非酸化トランスジェニック油体ではなく、これらの試料におけるオリゴマーの出現と単量体形態の相当する消失によって証拠付けられるように、１０分間の酸化剤の存在下で、システインを含有する組換えオレオシンは架橋を形成することも理解され得る。
【０３１９】
植物体内でのＯＢの完全性とエマルションの安定性に対するオレオシンペプチドにおける架橋と思われる部位の数の増加の影響は以下のように評価することができる。
【０３２０】
ＯＢ完全性の定量的判定
吸収（ＯＤ６００）、血球計算盤を用いたＡＯＢの直接的計数、又は顕微鏡による合体の視覚的評価のいずれかを用いたＯＢの安定性と完全性の評価は、高度に変化しやすいことを示し、とりわけ、試料採取前の撹拌の程度、取り出した試料の量、顕微鏡下に置かれた時間によって影響を受けた。これを回避するために、本出願者らは、完全性を比較する手段として、種々の処理の間、ＯＢから周辺媒体に放出されるＴＡＧの量を定量するための試料採取法を考案した。ＡＯＢ緩衝液（２５０μｌのＧＣガラス挿入チューブにてＯＢの試料中プロテイナーゼＫ［ＰＮＫ］と総タンパク質の比が１：１で使用するときＰＮＫを含有する）を用いて、本質的に等量の（ＴＡＧとタンパク質のＢｒａｄｆｏｒｄｓ測定のＦＡＭＥＳ−ＧＣ／ＭＳ概算に基づく）ＯＢ調製物を総容量２００μｌで作製し、プラスチックの蓋で覆った。処理（温度の上昇又はＰＮＫへの暴露）に続いて、１５μｌの魚油（Ｖｉｔａｍａｘ（登録商標）、オーストラリア）を試料に加え、ボルテックスで混合し、その後、５，２００ｇにて１分間遠心した。魚油の添加とその後のボルテックスによって、ＯＢから漏れ出したＴＡＧが添加された魚油と混合するのが可能になり、短い遠心により浮かばせることができる。４μｌの油相を採取し、脂肪酸メチルエステル化（ＦＡＭＥ）に供し、次いで、Ｂｒｏｗｓｅら（１９８６）によって記載されたように、ＧＣ−ＭＳ（島津、モデル番号、５０ｍＱＣ２／ＢＰＸ７０−０．２５ＧＣキャピラリーカラム（ＳＧＥ）を装着した）によって解析する。添加した魚油の非存在下では、ＯＢから漏れ出したＴＡＧの量が少なすぎて遠心の後でさえ、採取可能な眼に見える層を形成できなかったが；そのような場合、最大容量は６μｌだった。魚油とゴマ油の非常に異なった液体特性によって我々は、添加したＴＡＧから漏れ出したＴＡＧを容易に区別することができた。
【０３２１】
内部Ｃ１５：０及びＣ１７：０の標準を用いて、本出願者らは処理後に回収したＣ１８：２（ゴマ種子油における主な液体）の絶対量を算出することができる。
【０３２２】
高温でのＯＢの完全性とエマルションの安定性の判定
水中油エマルションは高温ではあまり安定ではない；従って、種々の数の導入システインを持つ修飾オレオシンが高温でのＯＢ及びＡＯＢの完全性に影響するかどうかを検討するのは興味深い。これを達成するために、本出願者らは９５℃のリン酸緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８、１００ｍＭのＮａＣｌ）にてＯＢ（異なったオレオシンを含有する）の完全性を判定する（上記方法を用いて）。ＡＯＢを２時間加熱する。完全性は上記のように判定する。
【０３２３】
架橋オレオシン：ＴＡＧの高い比率の効果が第一胃液中のＯＢの安定性を高めることは以下のように評価することができる。
【０３２４】
第一胃におけるＯＢ完全性の判定
ジスルフィドの狙いの1つは、第一胃の微生物叢による生体水素化からのある程度の保護を提供することである。第一胃液によるＯＢ安定性の評価は以下のように評価することができる。ＯＢを等量の第一胃液（２５μｌ）に加える。３９℃にて試料を０、１５、３０、６０、１２０及び２４０分間インキュベートし、インキュベートの終了時に等量の負荷緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、混合し、７０℃にて１０分間加熱する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／免疫ブロットによって１５μｌの各試料／負荷緩衝液混合物を比較する。完全性は上記のように判定する。
【０３２５】
プロテイナーゼＫにおけるＯＢ完全性の解析
制御可能で反復可能な高度に分解性の環境にて修飾オレオシンの影響を検討するために、１：１（ｇ／ｇタンパク質）のプロテイナーゼＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するリン酸緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ８、１００ｍＭのＮａＣｌ）にて３７℃で４時間インキュベートした後、ＯＢ（異なった修飾オレオシンを含有する）の完全性を判定する（上記の方法を用いて）。プロテイナーゼＫの最大活性は６５℃未満で達成されるが、ＯＢの不安定性に対する温度の影響を減らすためにさらに低い温度を用いる。完全性は上記のように判定する。
実施例７：シロイヌナズナの葉における油体の産生
【０３２６】
成長組織で油体を産生するために、そのような組織（たとえば、葉）ではトリアシルグリセロールを産生することが必要である。
【０３２７】
植物の成長部分におけるトリアシルグリセロールの産生
ほとんどの植物（Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅを含む）では、葉の脂質の大半はグリセロールに結合し、ジアシルグリセロールとして存在する。それらは脂質二重層に取り込まれ、そこで複数の細胞内小器官の膜として又は細胞自体の膜として機能する。葉における脂質二重層の大半は葉緑体チラコイド膜である。少量の葉脂質はクチクラ外層ワックスとして存在し、さらに小さな比率がトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の形態で存在する。
【０３２８】
ほとんどの植物は、発達している胚及び花粉細胞でＴＡＧを合成し、貯蔵し、そこで、その後それは、発芽及び花粉管成長の間に異化可能なエネルギーを提供するのに利用される。双子葉植物は種子重量のおよそ６０％までをＴＡＧとして蓄積することができる。通常、このレベルは、エネルギー貯蔵の主な形態が炭水化物（たとえば、デンプン）である単子葉植物の種子では相当に低い。ＴＡＧ生合成の唯一の関与段階は最後の１つ、すなわち、既存のジアシルグリセロールへの第３の脂肪酸の付加、従ってＴＡＧの生成である。植物では、この工程は、アシルＣｏＡジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ１）、無関係のアシルＣｏＡジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ２）、及びリン脂質ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（Zou et al., 1999; Bouvier-Nave et al., 2000; Dahlqvist et al., 2000; Lardizabal et al., 2001）を含む３つの酵素のうち１つのよって実行される。植物の成長部分におけるこれら遺伝子のいずれかの転写領域の過剰発現は、Ｂｏｕｖｉｅｒ−Ｎａｖeら（２０００）によるタバコにおけるシロイヌナズナＤＧＡＴ１；Ｓｈｏｃｋｅｙら（２００６）による酵母及びタバコにおける油桐ＤＧＡＴ２；Ｓｔａｈｌら（２００４）によるシロイヌナズナにおけるシロイヌナズナＰＤＡＴの過剰発現によって実証されたように、葉細胞の細胞質におけるＴＡＧ液滴の形成をもたらす。シロイヌナズナのＤＧＡＴ１は場合によっては総脂質レベルを高めることが実証されたが、たとえば、Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ  ｈａｉｒｙの根 (Bryan et al., 2004)及びＬｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅの葉 (Cookson et al., 2009)におけるＴＡＧの蓄積によって必ずしもそうではない。
【０３２９】
これらの葉におけるＴＡＧの蓄積を明らかにするために、これらの植物の葉から抽出した脂質の総量を形質転換しなかった植物又は空のバイナリーベクターで形質転換した植物と比較することができる。植物が同一の環境条件下で生長すること及び採取される葉が生理的に同等であることを保証すること。適切な内部標準と共に、脂質の総抽出物の定量は、ＦＡＭＥＳ  ＧＣ／ＭＳ解析（Winichayakul et al, 2008 Delivery of grasses with high levels of unsaturated, protected fatty acids.  Proceedings of the New Zealand Grassland Association, 70:211-216によって記載されたように）を用いて達成することができる。或いは、総脂質は、Ｆｏｌｓｃｈ法（Folsch et al., 1957 J. Folsch, M. Lees and G.A. Slone-Stanley, A simple method for the determination of total lipid extraction and purification, Journal of Biological Chemistry 226 (1957), pp. 497−507）を用いて抽出し、Ｒｅｓｔｅｋ（Restek Corp., Bellefonte, PA）ＲＴＸ６５ＴＧカラムを装着したＧＣ／ＭＳと共に適切な内部標準を用いて定量することができる。
【０３３０】
シロイヌナズナのＤＧＡＴ１（Ｓ２０５Ａ）とゴマ種子オレオシン構築物（Ｏｌｅｏ＿０−０又はＯｌｅｏ＿１−１又はＯｌｅｏ＿１−３又はＯｌｅｏ＿３−１又はＯｌｅｏ＿３−３のいずれか、配列番号１１〜２０、図１〜５）を過剰発現している植物から葉を採取し、ポリクローナル抗ゴマ種子オレオシン抗体を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ／免疫ブロットによって解析した。組換えオレオシンがシロイヌナズナの葉に蓄積するのが見られたことが理解され得る（図１２）。
【０３３１】
同一細胞（たとえば、葉細胞）におけるオレオシン／修飾オレオシンタンパク質の同時の発現と蓄積は、オレオシンに埋め込まれたリン脂質単層によって被包されたトリグリセリド油体の産生を生じるが；これは、酵母（Ting et al., 1997）及び種子（Abell et al., 2004)）における非修飾のオレオシンで明らかにされている。
【０３３２】
トランスジェニックシロイヌナズナの葉からの油体の調製
ＤＧＡＴ１（Ｓ２０５Ａ）とゴマ種子オレオシン構築物（Ｏｌｅｏ＿０−０又はＯｌｅｏ＿１−１又はＯｌｅｏ＿１−３又はＯｌｅｏ＿３−１又はＯｌｅｏ＿３−３のいずれか、配列番号１１〜２０、図１〜５）を過剰発現しているトランスジェニックシロイヌナズナの葉から油体を抽出することができる。
【０３３３】
そのような植物のＯＢに対するオレオシンペプチドにおける架橋と思われる部位の数の増加の効果は、ＯＢ完全性を測定することによって評価することができ、エマルションの安定性は実施例６に記載されたとおりに評価することができる。
【０３３４】
各親水性鎖に３を超えるシステイン残基を含有するオレオシンの設計及び構築
Ｏｌｅ＿３−３株は、ＤＧＡＴ１（Ｓ２０５Ａ）と同時発現させた場合、ＴＡＧの形態で高い脂質レベルの相当なレベルを有したが、Ｏｌｅ＿０−０を含有する株はＤＧＡＴ１過剰発現対照を超える高い脂質レベルを有さなかった。Ｏｌｅ＿１−１、Ｏｌｅ＿１−３及びＯｌｅ＿３−１は、葉における脂質蓄積のレベルと各鎖で操作されたシステインの数の増加との間に相関があることを示した（表３）。
【０３３５】
【表３】
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【０３３６】
総脂質（ＴＡＧであると示された）の増加と親水性ドメインで操作されたシステインの数との間の相関は、システインの数が所望のＴＡＧのレベルに影響を及ぼす手段であり得ることを示した。その結果、親水性鎖当たり３を超えるシステインを含有する新しい構築物を設計した。システイン／親水性鎖の無限の数を記入するのは可能ではないが、限定には以下が含まれる：
・鎖の長さ−追加の残基が付加してシステインのための空間を作ると、ＯＢを移動する自由度によって接触する能力が限定されるので、結局のところ、疎水性ドメインの相互作用の程度は低下する。
・＋、−、及び両親媒性の残基の比率を維持すること−これら残基の均衡とこれら残基の分布が劇的に変化すると、親水性鎖がＯＢの表面と実際には相互作用しなくなるので、リパーゼや合体に対する保護を提供しなくなる。
・イオウの利用性−オレオシン分子当たりのシステインの数を増やすことは、イオウが限定されていれば、植物を栄養的ストレス下に置くことになる。
【０３３７】
アミノ酸と、主として中性である又は荷電しているが、疎水性ではないと予測されるものを置き換えることによって元々のシステイン／オレオシンは相対的に均一な間隔を空けた対ではない３つのシステインを各鎖に持つように操作された。
【０３３８】
オレオシンは多分、特定のレベルの負の電荷を有することを必要とし、Ｃ末端ではこれはＫ（Ｌｙｓ）によって達成されると思われるので、荷電した又は中性の残基を追加のシステインと交換する戦略を継続することは、合体を防ぐという点で乏しい安定性を生じ得る。さらに、Ｎ末端の親水性領域では、正及び負に荷電したアミノ酸の間の空間と振動を維持する一方でさらなる残基の置換を可能にする、操作されたシステイン間に残る残基が少なすぎると思われる。従って、Ｎ及びＣ末端について、既存の残基をシステインで置換するのではなく、追加の残基（システイン）が付加される。或いは、さらに長い親水性鎖を持つオレオシンが使用され得る。
【０３３９】
２つの追加の構築物（Ｏｌｅ＿５−６及びＯｌｅ＿６−７）も設計した。これらは鎖当たりのシステイン残基という点で意図的に不均衡なのではないが、各システイン間に通常４〜５の残基を付与しようとして構成される。実際、Ｎ末端鎖でシステインを６つに増やすために（既存のシステインの置換とは対照的に）追加の残基を生成する必要があったが；これは、Ｏｌｅ＿３−３からの最初の６つの残基を複製することによって達成した。
【０３４０】
設計された全く新しいヌクレオチド配列を有するのではなく、システインをコードするトリプレットＴＧＴを（適宜）付加してＯｌｅ＿５−６を生成した。追加のグルタミン残基については、コドントリプレットＧＧＡを使用した。Ｏｌｅ＿６−７の追加のＮ末端６残基については、Ｏｌｅ＿３−３のＮ末端を複製し、インフレームで融合した。
【０３４１】
最初のシステインオレオシンと同一であるようにサブクローニング戦略を設計し、すなわち、ＮｏｔＩ／ＮｄｅＩによってオレオアクセプターにサブクローニングした。次いでこれをＬＲ反応によってｐＲＳｈ１（Winichayakul et al., 2008）に組み換える。シロイヌナズナのＤＧＡＴ１（Ｓ２５０Ａ）とオレオシン双方をそれ自体のＣａＭＶ３５ＳプロモータとＯＣＳターミネータのもとに原則として置く。ＤＧＡ１とオレオシンのクローンは双方共、ＵＢＱ１０イントロンを含有する。
【０３４２】
ＮｅｔＧｅｎｅ２を用いてＯｌｅ＿６−５−６とＯｌｅ＿６−７のスプライシングパターンを予測した。双方は、正鎖にてたった１つのドナーとアクセプターの部位を有し（双方共、認識の非常に高い確率を有する）、相補鎖では部位を有さないと予測された。
【０３４３】
データは、１−３又は３−１のシステインを含有するオレオシンは検出可能なレベルのＴＡＧを蓄積するが、これは３−３システインのオレオシンよりも確かに少ないことを示している（１−１は微量を蓄積したが、０−０は蓄積しなかった）。このことは、５−６及び６−７オレオシンが３−３構築物よりもさらに多くのＴＡＧを蓄積すると思われることを一層さらに強く示唆している。５−６及び６−７の構築物からの最初のデータは間もなく入手可能である。
【０３４４】
操作されたシステインを含有するオレオシンとＤＧＡＴ１による野生型シロイヌナズナの形質転換
５つのジスルフィド・オレオシン／ＤＧＡＴ１（Ｓ２０５Ａ）遺伝子構築物と対照１つ（ＤＧＡＴ１（Ｓ２０５Ａ）を含有するが、オレオシンを含有しない構築物）を植物バイナリーベクターｐＲＳｈ１に移し（Winichayakul et al., 2008）、アグロバクテリウムが介在する形質転換によって野生型シロイヌナズナを形質転換した。
【０３４５】
種菌における界面活性剤の存在のために微生物叢の浸漬は発達している長角果を損傷する傾向がある（Martinez-Trujillo et al., 2004）ので従来のフローラル・ディップ法の改変に従った。従って、マイクロピペットを用いて花ごとに一滴ずつの接種を行った。１週間後接種を繰り返して新しく発達した花に種菌を導入した。長角果が乾燥した際、種子を回収し、次いで清浄し、形質転換体のスクリーニングのために植え込んだ。
【０３４６】
ＢＡＳＴＡ選抜によって形質転換体のスクリーニングを行い、ＢＡＳＴＡ耐性についての分離比解析を用いて均質な形質転換体を選抜した。
【０３４７】
操作されたシステインを含有するオレオシンとＤＧＡＴ１による野生型シロツメクサの形質転換
シロツメクサ（白クローバ）の形質転換は、Ｖｏｉｓｅｙら（１９９４）の手順に従って実施した。
【０３４８】
種子を秤量し、精査（０．０６ｇｍ＝１００種子）当たり約４００〜５００の子葉（すなわち、２００〜２５０の種子）を提供した。遠心管内で７０％のエタノールにて種子を１分間すすいだ。循環ミキサーで１５分間振盪することによって漂白剤（５％利用可能な塩素）にて表面を滅菌し、その後無菌水で４回洗浄した。４℃で一晩種子に水分を吸収させた。
【０３４９】
シロイヌナズナを形質転換するのに使用した同様の構築物をアグロバクテリウム株ＧＶ３１０１で維持し、１００ｍｇ／Ｌの濃度でストレプトマイシンを含有する２５ｍｌのＭＧＬブロス（表４）に植菌した。２８℃にて回転振盪器上で（２００ｒｐｍ）一晩（１６時間）培養物を増殖させた。遠心（３０００×ｇ、１０分間）によって細菌培養物を回収した。上清を取り除き、細胞を５ｍｌの１０ｍＭのＭｇＳＯ４溶液に再浮遊させた。
【０３５０】
分離用顕微鏡を用いて子葉を種子から分離した。先ず、種子の外皮と内胚乳を取り除いた。子葉間に刃を入れ、残りの柄を介して細片することによって外科用メスにより子葉を基から分離した。子葉外植片をＣＲ７培地にて無菌フィルター盤上で回収した。
【０３５１】
形質転換のために、アグロバクテリウム懸濁液の３μｌアリコートを各分離子葉に分配した。プレートを封止し、１６時間明期のもとで２５℃にて培養した。７２時間の同時培養に続いて、グルホシネートアンモニウム（２．５ｍｇ／Ｌ）とチメンチン（３００ｍｇ／Ｌ）を補完したＣＲ７培地を含有するプレートに形質転換した子葉を移し、培養室に戻した。
【０３５２】
芽の再生に続いて、グルホシネートアンモニウム（２．５ｍｇ／Ｌ）とチメンチン（３００ｍｇ／Ｌ）を補完したＣＲ５培地に外植片を移した。新しいＣＲ５培地を含有する選抜まで週３回再生している芽を継代した。
【０３５３】
根の形成が起きると、グルホシネートアンモニウム選抜を含有するＣＲ０培地を含有する槽に未発育の植物を移した。この段階で再生体の大きな塊を個々の未発育植物に分けた。次いで選抜下で成長している根のついた全植物を無菌ピートプラグに鉢植えした。ピートプラグでいったん定着すると植物を次いで温室に移した。
【０３５４】
【表４】
0005934101.tif 000005
【０３５５】
ＦＡＭＥＳ  ＧＣ／ＭＳの結果は、トランスジェニックシロツメクサ（ＤＧＡＴ（Ｓ２０５Ａ）とＯｌｅ＿３−３、Ｏｌｅ＿５−６又はＯｌｅ＿６−７のいずれかを含有する）が、野生型と比べて葉の高い総脂質特性を有することを示した（図１７）。葉脂質の高いレベルとオレオシンで操作されたシステインの最高数との間に一般的な相関があった。
【０３５６】
ＦＡＭＥＳ  ＧＣ／ＭＳの結果は、トランスジェニックシロツメクサ（ＤＧＡＴ（Ｓ２０５Ａ）とＯｌｅ＿３−３、Ｏｌｅ＿５−６又はＯｌｅ＿６−７のいずれかを含有する）が、シロイヌナズナでも見られたように、野生型と比べて高いＣ１８：１及びＣ１８：２の葉脂質特性を有することを示した（図１８）。葉のＣ１８：１及びＣ１８：２の最高レベルは最高数の操作したシステインを含有するオレオシンで形質転換した植物にて見い出された。
葉（及び種子）における油体集合体の判定
【０３５７】
免疫ブロット解析（抗ゴマ種子オレオシン抗体による、Scott et al., 2007）を用いてさらなるスクリーニングを行ってオレオシンタンパク質を過剰発現する株を決定した。この方法を用いて、スクロース密度勾配を用いて油体（ＯＢ）を推定上の形質転換体のＴ２種子から抽出し、又は変性／還元緩衝液にて葉から全タンパク質を抽出し、又はタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜に移し、ゴマオレオシンに対して産生させた抗体によって検証した（Scott et al., 2007）。
【０３５８】
５００μｌのＯＢ緩衝液（６００ｍＭのスクロースを含有する１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）にて２５ｍｇの種子から粗精製の油体（ＯＢ）を抽出した。１３，０００×ｇで遠心した後、水性層を慎重に吸い取り、底の沈殿物を壊すことなく脂肪パッド層を２００μｌのＯＢ緩衝液に再懸濁した。２０μｌの各ＯＢ抽出物を４×負荷色素及び１０×還元剤に加え、７０℃で５分間加熱し、免疫ブロット解析用の４〜１２％ポリアクリルアミドゲル上に負荷した。１：７５０希釈の抗ゴマオレオシン抗体（１°Ａｂ）と１時間、二次抗体（１：１０，０００）とさらに１時間、ブロットをインキュベートした。
【０３５９】
オレオシンは天然にて種子では発現されるが、葉では発現されない。しかしながら、我々は双方共ＣａＭＶ３５Ｓプロモータの制御下でオレオシンとのＤＧＡＴ１の同時発現を有するので、これによって検出可能なレベルのオレオシンが葉に蓄積することが可能になることが期待され得る。ゴマオレオシンに対して産生させた抗体を用いた免疫ブロットによって、種子で組換えオレオシンの高い発現を伴う形質転換株からの葉を解析した。
【０３６０】
以下の表５は、生成された推定上の形質転換体の数及び種子と葉で組換えオレオシンを発現する植物の数を要約する。
【表５】
0005934101.tif 000006
【０３６１】
葉に蓄積した組換えオレオシンのレベルは種子よりもかなり低いことに留意すべきである。しかしながら、双方の葉で検出可能なレベルを蓄積している個々の株の比率は、オレオシンを単独で発現させた場合よりもはるかに大きい（Ｒｏｂｅｒｔｓラボ、未発表データ）ということは、葉におけるＤＧＡＴ１とオレオシンの同時発現がオレオシンのさらに高い発現を招いたことを示している。
【０３６２】
ＤＧＡＴ１（Ｓ２０５Ａ）とジスルフィドオレオシンを同時発現しているトランスジェニック植物からの葉の分析
種子にてオレオシンタンパク質を過剰発現するホモ接合性株の種子を発芽させて２、３、４又は５週間成長させた。誘導体化させることなく、遊離の脂肪酸、ジアシルグリセリド、ワックスエステル、ステロールエステル及びトリアシルグリセリドの分離と特定を可能にするＲＴＸ６５ＴＧ  Ｒｅｓｔｅｋカラムを用いたＧＣ／ＭＳと同様にＦＡＭＥＳ  ＧＣ／ＭＳのために十分な葉材料を回収した。
【０３６３】
ＦＡＭＥＳ  ＧＣ／ＭＳ解析のための材料の調製
１０ｍｇの凍結乾燥した葉粉末を１３×１００ｍｍのネジ蓋付きチューブに入れ、１０μｌの非メチル化内部標準（Ｃ１５：０ＦＡ、４ｍｇ／ｍｌ、ヘプタンに溶解した）を加えた。この混合物に、水スカベンジャーとしての５％の２，２−ジメトキシプロパンで処理した１ｍｌのメタノール性ＨＣｌ試薬（無水メタノールを用いて１Ｍに希釈した３Ｍ溶液の１ｍｌ）を加えた。次いでＮ２気体でチューブをフラッシュし、次いでテフロン（登録商標）製の蓋で直ちに封をし、８０℃で１時間加熱した。チューブを室温に冷却した後、１０μｌの事前にメチル化した標準（ヘプタンに溶解したＣ１７：０の４ｍｇ／ｍｌ）を加えた。この混合物に０．６ｍｌのヘプタンと１．０ｍｌの０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌを加え、ボルテックスによって十分に混合した。室温にて５００ｒｐｍで１分間遠心した後、１００μｌの上層（ヘプタンを含有する）を回収し、ＧＣ／ＭＳ解析用の茶色のバイアルに組み込んだ平底のガラス製インサートに移した。
【０３６４】
ＦＡＭＥＳ  ＧＣ／ＭＳ解析
ＳＧＥキャピラリーカラムＢＰＸ７０（５０ｍ×０．２２ｍｍ×０．２５μｍ）を用いてＦＡＭＥＳ  ＧＣ／ＭＳを解析した。ＧＣ／ＭＳの条件は以下のとおりであった：温度は、１５℃／分で８０℃から１５０℃まで、次いで８℃／分で２５０℃までにプログラムし、１０分間等温に保持した。試料はスプリット方式で注入し；２８．４ｍｌ／分の全流量；０．８２ｍｌ／分のカラム流量；及び３．０ｍｌ／分のパージ流量。圧力は１５０ｋＰａで保持し、イオン源温度は２００℃であり、界面温度は２６０℃保持した。５０ｍ／ｚで開始し、３５０ｍ／ｚで終了する走査方式で質量分光法によって標的化合物を取得した。
【０３６５】
ＴＡＧ及び極性脂質の抽出
Ｒｕｉｚ−Ｌoｐｅｚら（２００３）の改変された方法を用いてＴＡＧを抽出した。手短には、各ＴＡＧの解析について、風袋重量を測ったネジ蓋付きチューブに３４〜８０ｍｇの間の凍結乾燥した葉粉末を入れ、秤量し、ＭｅＯＨ中０．１７ＭのＮａＣｌを２．４ｍｌ加え、ボルテックスによって混合した。４．８ｍｌのヘプタンと１０μｌの内部標準（Ｃ１４：０、１０μｇ／μｌ）を加えた後、懸濁液を穏やかに混合し、振盪することなく８０℃の水槽にて２時間インキュベートした。室温に冷却した後、上相（脂質を含有する）を新しいネジ蓋付きチューブに移し、Ｎ気体のもとで乾燥するまで蒸発させた。最終的に、乾燥させた粉末を１００μｌのヘプタンに再懸濁し、十分に混合し、ＴＡＧ分析用の茶色のガラスバイアルに組み込んだ平底のガラス製インサートに移した。
【０３６６】
ＴＡＧのＧＣ／ＭＳ解析
Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ（ＨＰ）のＧＣとＳｈｉｍａｄｚｕ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＭＳ（ＱＰ２０１０）にてＴＡＧの分析を行った。分析はすべて、電子衝撃（ＥＩ）イオン化方式におけるＲＥＳＴＥＫキャピラリーカラムＭＸＴ−６５ＴＧ（６５％ジフェニル／３５％ジメチルポリシロキサン、３０．０ｍ×０．１０μｍ厚さ×０．２５ｍｍ直径）にて行った。キャリア気体としてヘリウムを使用した。試料はすべて、１．０μｌアリコート及び１．２ｍｌ／分のカラム流量にてスプリットレス方式で注入した。ガスクロマトグラフは、１５℃／分で２００℃から３７０℃までプログラムし、３７０℃で１５分間等温を保持した。試料注入ポートの温度は３５０℃、カラムオーブンの温度は２００℃に維持し、１３１．１ｋＰａの圧力及び３．０ｍｌ／分のパージ流量とした。質量分光法の条件は以下のとおりであった：イオン源温度はＧＣ・ＭＳ実行の間２６０℃で維持し、質量スペクトルは、７０ｅＶのイオン化電圧、６０μＡの放射電流及び３５０℃の界面温度で得た。取得方式は走査当たり５０００、０．２５秒の速度での走査によった。４５ｍ／ｚ〜１０９０ｍ／ｚの電荷比まで質量によるクロマトグラフのピークを９分に開始し、２５分に終了して回収した。
実施例８：Ｎ及びＣ末端の親水性鎖にて追加のシステイン残基を含有するように操作したさらなるオレオシン、カレオシン及びステロレオシン
【０３６７】
オレオシン、カレオシン及びステロレオシンのＮ及びＣ末端の親水性鎖にてシステインを操作するために本出願者らは、ゴマ種子オレオシン、受入番号ＡＡＤ４２９４２（すなわち、ＯＢの表面にあると予測される荷電残基をシステインで置換している）と同じ戦略を用いた。場合によっては、相対的に均一に空間を空ける負に荷電したアミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）のみを置換することが可能だった。ゴマのオレオシン、ＡＡＤ４２９４２の場合、時には電荷の置換に関して妥協することが必要だった。以下の実施例では、２つのオレオシン（ＡＡＢ７１２２７及びＡＡＦ１３７４３）がＣ末端鎖で２つの外因性システインを含有することが留意されるべきである。これらは操作後、変わらず残る。
【０３６８】
アミノ酸置換の位置を決定するために、親水性鎖当たり１又は３のシステインを含有する形態（すなわち、Ｏｌｅ＿０−０、Ｏｌｅ＿１−１、Ｏｌｅ＿３−１、Ｏｌｅ＿１−３、Ｏｌｅ＿３−３）と同様に元々の形態でのゴマのオレオシン（ＡＡＤ４２９４２）によって各タンパク質を並べた。親水性鎖（疎水性プロットにより決定した）のそれぞれのＮ末端又はＣ末端におけるグルタミン酸及びアスパラギン酸を次いで、関連するリジン、アルギニン及びグルタミンの残基（ゴマのオレオシン（ＡＡＤ４２９４２）ではすべて上手く変えた）のように、灰色の四角で強調した。次いで互いの空間と共に、これら残基のシステインへの変異を考慮した。次いで、元々のペプチド配列と操作した配列のみによって最終的な置換を示す。この場合、各鎖でたった３つのシステインが操作されたが、数は多かったり少なかったりであり得る。代わりのやり方は、単離における各タンパク質と共に機能するが、疎水性プロットによる親水性領域の特定によって単に始まり、次いで最適な荷電アミノ酸による置換の工程を始める。
【０３６９】
表６は、本出願者らが親水性部分にシステインを導入するように修飾した追加のオレオシン及びカレオシンを示す。
【表６】
0005934101.tif 000007
【０３７０】
以下の表７は修飾オレオシンの配列番号を参照する
【表７】
0005934101.tif 000008
上記実施例に記載されたように修飾された配列を発現させて、油体、エマルション、トランスジェニック宿主細胞、植物などを作出し、それぞれの特性を調べることができる。
【０３７１】
本発明の範囲を前述の実施例のみに限定することは意図するものではない。当業者によって十分に理解されるように、本発明の範囲から逸脱することなく多数の変異が可能である。
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【表８】
0005934101.tif 000009
【表９】
0005934101.tif 000010
【表１０】
0005934101.tif 000011
【表１１】
0005934101.tif 000012
【表１２】
0005934101.tif 000013
【表１３】
0005934101.tif 000014
【表１４】
0005934101.tif 000015
【表１５】
0005934101.tif 000016
【表１６】
0005934101.tif 000017
【表１７】
0005934101.tif 000018
【図８】
0005934101.tif 000019
【図１０】
0005934101.tif 000020
【図１３】
0005934101.tif 000021
【図１−１】
0005934101.tif 000022
【図１−２】
0005934101.tif 000023
【図１−３】
0005934101.tif 000024
【図１−４】
0005934101.tif 000025
【図１−５】
0005934101.tif 000026
【図１−６】
0005934101.tif 000027
【図１−７】
0005934101.tif 000028
【図１−８】
0005934101.tif 000029
【図２−１】
0005934101.tif 000030
【図２−２】
0005934101.tif 000031
【図２−３】
0005934101.tif 000032
【図２−４】
0005934101.tif 000033
【図２−５】
0005934101.tif 000034
【図２−６】
0005934101.tif 000035
【図２−７】
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【図２−８】
0005934101.tif 000037
【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図３−７】
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【図３−８】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図４−７】
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【図４−８】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−７】
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【図５−８】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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