(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列からなるＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を持つその免疫原性バリアントを含む、ＩＣＵ患者の死亡率を減少させるための薬理学的組成物。
【請求項２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の３つのＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を持つその免疫原性バリアントを含有するタンパク質複合体を含む、ＩＣＵ患者の死亡率を減少させるための薬理学的組成物。
【請求項３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の３つのＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を持つその免疫原性バリアントで少なくとも８０％を構成されるタンパク質複合体を含む、ＩＣＵ患者の死亡率を減少させるための薬理学的組成物。
【請求項４】
前記免疫原性バリアントが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列の少なくとも９５％同一性を持つ、請求項１から３のいずれか1項に記載の薬理学的組成物。
【請求項５】
前記ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質、又は免疫原性バリアントは、
（ａ）Ｃｙｓ１８−Ｃｙｓ２７−結合（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質、及びその免疫原性バリアント、（ｂ）Ｃｙｓ１８−Ｃｙｓ２７−結合とＣｙｓ３３−Ｃｙｓ４７−結合（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質、及びその免疫原性バリアント、並びに（ｃ）Ｃｙｓ１８−Ｃｙｓ４７−結合とＣｙｓ２７−Ｃｙｓ３３−結合（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質、及びその免疫原性バリアントからなる群から選択される、請求項１から４の何れか1項に記載の薬理学的組成物。
【請求項６】
（ａ）Ｃｙｓ１８−Ｃｙｓ２７−結合（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質、及びその免疫原性バリアント、（ｂ）Ｃｙｓ１８−Ｃｙｓ２７−結合とＣｙｓ３３−Ｃｙｓ４７−結合（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質、及びその免疫原性バリアント、並びに（ｃ）Ｃｙｓ１８−Ｃｙｓ４７−結合とＣｙｓ２７−Ｃｙｓ３３−結合（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質、及びその免疫原性バリアントの合計が、全ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質、及びその免疫原性バリアントの７５％以上である、請求項５に記載の薬理学的組成物。
【請求項７】
前記タンパク質複合体は、
（ａ）Ｃｙｓ１８−Ｃｙｓ２７−結合（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質、又はその免疫原性バリアント、及び／又は
（ｂ）Ｃｙｓ１８−Ｃｙｓ２７−結合とＣｙｓ３３−Ｃｙｓ４７−結合（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質、又はその免疫原性バリアント、及び／又は
（ｃ）Ｃｙｓ１８−Ｃｙｓ４７−結合とＣｙｓ２７−Ｃｙｓ３３−結合（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質、又はその免疫原性バリアントで構成される、請求項２から６の何れか１項に記載の薬理学的組成物。
【請求項８】
前記組成物がワクチンである、請求項１から７の何れか１項に記載の薬理学的組成物。
【請求項９】
ヒトの２８日死亡率が９０％より低い、請求項１から８の何れか１項に記載の薬理学的組成物。
【請求項１０】
ヒトの２８日死亡率が８５％より低い、請求項１から８の何れか１項に記載の薬理学的組成物。
【請求項１１】
ヒトの２８日死亡率が８０％より低い、請求項１から８の何れか１項に記載の薬理学的組成物。
【請求項１２】
ヒトの２８日死亡率が７５％より低い、請求項１から８の何れか１項に記載の薬理学的組成物。
【請求項１３】
アジュバントを含まない、請求項１から１２の何れか１項に記載の薬理学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのアミノ末端で、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｉｎｏｓａｓ）外膜タンパク質Ｆ（本明細書でまた「ＯｐｒＦ」または「ＯＭＰＦ」と呼ぶ）のカルボキシ末端部分のカルボキシ末端に融合する、緑膿菌外膜タンパク質Ｉ（本明細書でまた「ＯｐｒＩ」または「ＯＭＰＩ」と呼ぶ）を含む融合タンパク質を含むワクチンの新規利用、ならびに概融合タンパク質に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体、またはその薬理学的組成物の新規利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
院内感染は、病院またはヘルスケアサービスユニットにおける処置の結果である感染である。感染は、入院後４８時間またはそれ以上で、または退院後３０日以内にはじめて発生する場合に院内感染であると考慮される。この型の感染はまた、院内感染（Ｈｏｓｐｉｔａｌ−ａｃｑｕｉｒｅｄ）（または一般用語として、ヘルスケア関連感染）としてもよく公知である。米国において、米疾患管理センターは、細菌、混合を含む全ての型の微生物からの、およそ１．７百万の病院関連感染が、毎年９９，０００の死亡を引き起こすか、寄与していると見積もっている。病院調査が実施された欧州において、グラム陰性感染のカテゴリーが、毎年、２５，０００の死亡の３分の２に及ぶと見積もられている。院内感染は、重度の肺炎と、尿路、血流および他の体の部分の感染を引き起こしうる。多くの型が、抗生物質でたたくことが難しく、抗生物質耐性が、病院の外にいる人々に感染しうる、グラム陰性細菌に広がっている。
【０００３】
グラム陰性細菌において、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）と外膜タンパク質が、細菌エンベロープの主要な抗原性部分である。ＬＰＳに基づくワクチンが、１９７０年代に広く研究された（Ｐｒｉｅｂｅ  Ｇ，Ｐｉｅｒ  Ｇ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ２００３．Ｎｅｗ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｅｌｌｉｓ  ＲＷ，Ｂｒｏｄｅｕｒ  Ｂ．による編集、２６０−８２）。Ｐａｒｋｅ  Ｄａｖｉｓは、７つの異なる血清群のＬＰＳよりワクチンＰｓｅｕｄｏｇｅｎを産出した。非無作為試験において、がんおよびやけど患者にてＰｓｅｕｄｏｇｅｎで、いくつかの活性が観察されたが、嚢胞性線維症患者（ＣＦ）および白血病患者においては観察されなかった。ＬＰＳに基づくＰｓｅｕｄｏｇｅｎは非常に毒性であるので、したがって登録されていない（Ｐｒｉｅｂｅ、上記）。Ｏｐｒ’ｓ  ＦおよびＩの２つの異なる組換え体融合タンパク質のバージョンを使用して、ｖｏｎ  Ｓｐｅｃｈｔとその共同研究者らは、双方とも、ＬＤ５０の１０００倍高いチャレンジ用量に対して、能動免疫化が好中球減少マウスを保護可能であり、受動免疫化が、ＳＣＩＤマウスを保護可能であることを示した（ｖｏｎ  Ｓｐｅｃｈｔ  ＢＵ，  Ｋｎａｐｐ  Ｂ，  Ｍｕｔｈ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ  ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｌｅｔｈａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｂｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｏｒ  ｐａｓｓｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆ  ａｎｄ  Ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  １９９５；  ６３（５）：１８５５−１８６２；  Ｋｎａｐｐ  Ｂ，  Ｈｕｎｄｔ  Ｅ，  Ｌｅｎｚ  Ｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｆｕｓｉｏｎ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  １９９９；  １７（１３−１４）：１６６３−１６６６）。前記融合タンパク質はついで、高レベルの特定の血清抗体に達している健常人にて、安全性と免疫原性に関して試験された。嚢胞性線維症患者における粘膜免疫原性増強を達成するために、前記融合タンパク質のエマルゲル処方が開発され、健常人および肺障害患者にて安全性および免疫原性に関して試験された。しかしながら、血清抗体応答は、相対的に低かった。全身ｉ．ｍ．ブースターが、単なる粘膜ワクチン摂取スケジュールと比較して、血清抗体応答を増強させた。
【０００４】
１０〜１００ｋＤａの分子量範囲を有する、緑膿菌の４つの異なる株からなる外膜タンパク質調製物が、韓国においてワクチンとして開発された。このワクチンは最小量のポリサッカライドを含み、やけど患者での二重盲検、プラセボ対照試験にて試験された（Ｊａｎｇ  ＩＩ，  Ｋｉｍ  ＩＳ，  Ｐａｒｋ  ＷＪ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  １９９９；  １７（２）：  １５８−６８）。ワクチン抗原に対する抗体レベルが、プラセボ群（１９患者）にて２.３倍まで、ワクチン群（７６患者）にて４．９倍まで上昇した（（Ｋｉｍ  ＤＫ，  Ｋｉｍ  ＪＪ，  Ｋｉｍ  ＪＨ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｓｃｈｅｄｕｌｅｓ  ｆｏｒ  ａ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｂｕｒｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００１；  １９（９−１０）：１２７４−８３）。ＰｒｉｅｂｅとＰｉｅｒは、本試験での患者のフォローアップが不完全であり、解析が包括解析によってではなく、臨床転帰に関するデータがないことから、本研究を批評した（９）。同様のＯｐｒワクチンが、ロシアにて１０年早く試験された（Ｓｔａｎｉｓｌａｖｓｋｙ  ＥＳ，  Ｂａｌａｙａｎ  ＳＳ，  Ｓｅｒｇｉｅｎｋｏ  ＡＩ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｉｎｉｃｏ−ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｖａｃｃｉｎｅ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  １９９１；９（７）：４９１−４）。主に細胞壁タンパク質保護抗原を含む緑膿菌ワクチン（ＰＶ）が、１１９人のボランティアの免疫化によって、安全性および免疫原性に関して試験された。ＰＶワクチンはよく認容性であった。高レベルの特異的抗体が、５ヶ月の観察期間中持続した。抗体タイターは、９４〜９７％のボランティアにて増加し、さらには４５．６％にて、抗体タイター（ＥＬＩＳＡユニット数）は、２．５〜３倍およびそれ以上増加した。抗緑膿菌血漿が、緑膿菌感染の重症形態である４６人の患者（４０人の成人および６人の２歳までの胎児）の処置のために使用され、８７％の患者が回復した。１９９１年以後、ＰＶワクチンでのフォローアップ試験は存在しない。
【０００５】
院内感染は、世界中で、死亡および重度な疾患の主な原因の１つであり、先進国において、２００億ＵＳＤより大きな年間費用負担を引き起こす。米国および欧州において、約６００百人の患者が毎年感染し、１４０，０００死／年となる。院内感染の発生率は、医療介入と抗生物質耐性の増加のために、安定して増加している。したがって、例えば、やけど患者および繊維症患者、ＩＣＵ患者および人工呼吸器をつけたＩＣＵ患者のワクチン化によって、院内感染を通した死亡のリスクを最小化することが、前記患者における主要なアンメットメディカルニーズとなることが期待される。
【０００６】
本発明にしたがって、そのアミノ末端にて、緑膿菌外膜タンパク質Ｆ（ＯｐｒＦまたはＯＭＰＦ）のカルボキシ末端部分のカルボキシ末端に融合する、緑膿菌外膜タンパク質Ｉ（ＯｐｒＩまたはＯＭＰＩ）またはその断片を含む融合タンパク質を含むワクチン、とりわけＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の融合タンパク質を含む非アジュバントワクチンが、プラセボ対照としてのミョウバンに対して有意に、機械的人工呼吸器をつけた集中治療患者における死亡率を減少させることがここで驚くべきことに発見された。
【０００７】
機械的人工呼吸器をつけた集中治療患者は、Ｖｅnｔｉｌａｔｏｒ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ（ＶＡＰ）、敗血症または軟組織感染のような、緑膿菌または他の感染の、重度な、そしてしばしば生命を脅かす形態を獲得する特定のリスクを持つ。そのような感染はまた、やけど、重度なやけど、免疫抑制されるがんおよび移植患者、および嚢胞性線維症患者、集中治療ユニット（ＩＣＵ）患者または一般にすべての入院患者に影響を与えうる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
驚くべきことに、ＯｐｒＩが、そのＮ−末端にて、ＯｐｒＦのＣ末端（例えば以下で定義するように）に連結する融合タンパク質（本明細書でまた、「ＯｐｒＦ／Ｉ試薬」または「ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質」と呼ばれる）を含む非アジュバントワクチンが、機械的人工呼吸器をつけた集中治療患者にて、プラセボ対照としてのミョウバンに対して、有意に死亡数を減少させることが、本発明者らによって発見された。さらに、上記融合タンパク質を含むミョウバンアジュバントワクチンがまた、プラセボに比べて死亡率の減少を示した。
【０００９】
したがって、本発明の特定の発見にしたがって、以下が提供される。
１．１  （薬理学的に効果的な量のような）効果的な量のＯｐｒＦ／Ｉ試薬、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、機械的に人工呼吸器をつけた集中治療ユニット患者のような人工呼吸器をつけた集中治療ユニット患者に投与することを含む、前記患者における死亡率を減少させる方法、
１．２  （薬理学的に効果的な量のような）効果的な量のＯｐｒＦ／Ｉ試薬、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、嚢胞性線維症患者に投与することを含む、前記患者における死亡率を減少させる方法、
１．３  （薬理学的に効果的な量のような）効果的な量のＯｐｒＦ／Ｉ試薬、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、第一、第二または第三程度のやけど、好ましくは第三程度のやけどのようなやけど患者に投与することを含む、前記患者における死亡率を減少させる方法、
１．４  （薬理学的に効果的な量のような）効果的な量のＯｐｒＦ／Ｉ試薬、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、免疫抑制されるがんまたは移植患者に投与することを含む、前記患者における死亡率を減少させる方法、
１．５  （薬理学的に効果的な量のような）効果的な量のＯｐｒＦ／Ｉ試薬、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、集中治療ユニット患者に投与することを含む、前記患者における死亡率を減少させる方法、
１．６  （薬理学的に効果的な量のような）効果的な量のＯｐｒＦ／Ｉ試薬、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、入院患者に投与することを含む、前記患者における死亡率を減少させる方法、
１．７  （薬理学的に効果的な量のような）効果的な量のＯｐｒＦ／Ｉ試薬、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、４８時間以上機械的人工呼吸とりつけを必要とする集中治療ユニットに収容された患者に投与することを含む、前記患者における死亡率を減少させる方法、
１．８  （薬理学的に効果的な量のような）効果的な量のＯｐｒＦ／Ｉ試薬、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、手術される、または手術が予定されているヒトまたは非ヒト動物に、好ましくは少なくとも予定されている手術の２週間前に投与することを含む、前記ヒトまたは非ヒト動物における死亡率を減少させる方法、
１．９  （薬理学的に効果的な量のような）効果的な量のＯｐｒＦ／Ｉ試薬、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、（ベースジャンプ、バンジージャンプ、滑空、ハンググライダー、ハイワイヤ、スキージャンプ、スカイダイビング、スカイサーフィン、スカイフライング、インドアクライミング、アドベンチャーレース、過激なインラインスケーティング、ＢＭＸ、カービング、過激なモトクロス、過激なスキー、フリースタイルスキー、ランドおよびアイスヨット、マウンテンバイク、マウンテンボーディング、アウトドアクライミング、サンドボード、スケートボード、スノーボード、スノーモービル、スピードバイク、スピードスキー、スクーテリング、裸足のウォタースキー、クリフダイビング、フリーダイビング、ジェットスキー、オープンウォータースイミング、パワーボードレース、世界一周ヨットレース、スキューバダイビング、スノーケリング、スピードセーリング、サーフィン、ウェイクボード、急流カヤック、ウインドサーフィンのような）危険をはらんだスポーツを行っているヒトのような、集中治療ユニットに収納されるリスクのあるヒトに、好ましくは予定された危険をはらんだスポーツイベントの少なくとも２週間前に、投与することを含む、前記ヒトにおける死亡率を減少させる方法、
１．１０  （薬理学的に効果的な量のような）効果的な量のＯｐｒＦ／Ｉ試薬、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、ヒト、とりわけ任意の年齢、例えば２歳またはそれ以上の歳のヒトに投与することを含む、前記ヒトにおける死亡率を減少させる方法、
１．１１  （薬理学的に効果的な量のような）効果的な量のＯｐｒＦ／Ｉ試薬、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、任意の種類の感染を有するヒトに投与することを含む、前記ヒトにおける死亡率を減少させる方法であって、好ましくはさらに、習慣的なブースターワクチン摂取が含まれる方法、
１．１２  ＯｐｒＦ／Ｉ試薬が、ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、７〜１０およびｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１〜１３からなるポリペプチド、および前記ポリペプチドまたはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して指向する抗体またはその断片からなる群より選択される、以上で定義された方法、
１．１３  薬理学的組成物がワクチンである、以上で定義された方法、
１．１４  薬理学的組成物が、非アジュバントであるワクチンである、以上で定義された方法、
１．１５  第一薬物基質と第二薬物基質を共投与することであって、前記第一薬物基質が、（薬理学的に効果的な量のような）効果的な量の、ＯｐｒＦ／Ｉ試薬、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含むワクチンであり、前記第二薬物基質が、（薬理学的に効果的な量のような）効果的な量の、とりわけ死亡のリスクを減少させることに関して、患者、ヒトまたは非ヒト動物の状態を改善している、静脈内抗生物質のような抗生物質および他の薬物基質からなる群より選択される、以上で定義された方法、
１．１６  死亡率が、１００より少ない、以上で定義された方法、
１．１７  例えばＩＣＵ患者、好ましくは、人工呼吸器をつけたＩＣＵ患者における死亡率が、９５、好ましくは９０、より好ましくは８５、より好ましくは８０、より好ましくは７５、より好ましくは７０、より好ましくは６５より少ない、さらにより好ましくは６０より少ない、最も好ましくは５５より少ない、以上で定義された方法、
１．１８  ＯｐｒＦ／Ｉ試薬が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を有する３つのＯｐｒＦ／Ｉ試薬、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列と、少なくとも８５％、好ましくは９０％、とりわけ９５％の同一性を持つその免疫原性バリアントを含む（または少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％からなる）タンパク質複合体である、以上で定義された方法、
１．１９  ＯｐｒＦ／Ｉ試薬が、
（ａ）Ｃｙｓ１８−Ｃｙｓ２７−結合（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質、
（ｂ）Ｃｙｓ１８−Ｃｙｓ２７−結合とＣｙｓ３３−Ｃｙｓ４７−結合（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質、および
（ｃ）Ｃｙｓ１８−Ｃｙｓ４７−結合とＣｙｓ２７−Ｃｙｓ３３−結合（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質、
またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは９０％、とりわけ９５％同一性を持ち、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）にて特定されたのと同一のジスルフィド結合パターンを有する、その免疫原性バリアントからなる群より選択され、
好ましくは、ＯｐｒＦ／Ｉ試薬が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を有する３つのＯｐｒＦ／Ｉ試薬、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列と、少なくとも８５％、好ましくは９０％、とりわけ９５％の同一性を持つその免疫原性バリアントを含むタンパク質複合体であり、ａ）Ｃｙｓ１８−Ｃｙｓ２７−結合（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質、ｂ）Ｃｙｓ１８−Ｃｙｓ２７−結合とＣｙｓ３３−Ｃｙｓ４７−結合（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質、およびｃ）Ｃｙｓ１８−Ｃｙｓ４７−結合とＣｙｓ２７−Ｃｙｓ３３−結合（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質の合計が、７５％と等しいか大きい、以上で定義された方法。
【００１０】
好適な第二薬物基質には、例えば、ｉ）抗細菌化合物、例えばペニシリン類、セファロスポリン類、ポリミキシン類、キノロン類、スルホンアミド類、アミノグリコシド類、マクロライド類、テトラサイクリン類、ダプトマイシン類、チゲシクリン類、リンゾリド類、ｉｉ）抗真菌化合物、例えばポリエン抗真菌剤、ナタマイシン、リモシジン、フィリピン、ナイアスタチン、アムホテリシンＢ、カンジシン、ハミシンのような抗生物質が含まれてよい。
【００１１】
本明細書で使用するところの語句「共投与」または「混合投与」などは、単一の患者への、選択された治療的、または予防的薬剤の投与を包含する意味があり、薬剤が同一の投与経路によって、または同時に必ずしも投与されない処置または予防的レジメを含む意図がある。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】免疫原性メット上の主要評価項目−研究結果の免疫原性のまとめ（ＧＭＴ：Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  Ｍｅａｎ  Ｔｉｔｅｒｓ）
【図２】全てのワクチン群における対プラセボの死亡率の減少。１００ｍｃｇ  ｗ／ｏミョウバンにてワクチン摂取した群に対する死亡率の統計学的に有意な減少（２８日目にｐ＝０．０１９６）。
【図３】生存におけるＯｐｒＦ／Ｉタイターの有意な予測値。抗−ＯｐｒＦ／Ｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）ＩｇＧ  ＴＩＴＥＲＳを１４日目に測定した。Ｃｏｘ回帰解析が、生存におけるＯｐｒＦ／Ｉ  ＩｇＧタイターの有意な予測値を示した（ｐ＝０．０３３６）。
【図４】感染した患者における、対プラセボの生存率の減少。サブグループＣ（破線）：治験責任医師が感染を総合的に確認した患者。サブグループＤ（非破線）：治験責任医師が感染を総合的に確認していない患者。
【図５】本発明にしたがった、還元と、制御された再酸化工程を略図的に描写している。
【図６】発現後のＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質のＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルの重ね合わせと、還元後、および再酸化／精製後、ＩＭＡＣ上でのキャプチャリングを示している。
【図７】発現後のＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質のＳＥＣプロファイルの重ね合わせと、還元後、および再酸化／精製後、ＩＭＡＣ上でのキャプチャリングを示している。
【図８】再酸化ＩＭＡＣ／Ｇ５０プールのＲＰ−ＨＰＬＣ解析を示している。試料を、３００分後および２１時間後に解析した。
【図９】ｐＨ８．０およびｐＨ２での、ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質試料のＳＥＣ解析の間の保持時間における変化を示している。
【図１０】ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質の例示的産出および精製工程のフロースキームを示している。
【図１１】選出されたＱＳＨＰ画分の分離および解析ＲＰ−ＨＰＬＣ溶出プロファイルを示している。
【図１２】ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質のピークＰ１、Ｐ２およびＰ３のジスルフィド結合パターンを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
定義：
他に定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術的および科学的語句は、本発明が属する技術分野の当業者によって共通して理解されるのと同一の意味をもつ。
【００１４】
本発明の使用するところの語句「抗体」は、全抗体およびその任意の抗原結合断片（すなわち「抗原結合部分」）または一本鎖を含む。天然に存在する「抗体」は、ジスルフィド結合によって内部連結した少なくとも２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書にてＶＨと略す）と重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書にてＶＬと略す）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬからなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存される領域によって散在される、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、超可変性の領域内にさらに分割可能である。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順番、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配列される、３つのＣＤＲｓと４つのＦＲｓからなる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫システムの種々の細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的補体システムの第一構成要素（Ｃｌｑ）を含む、免疫グロブリンの宿主組織または因子への結合を仲介してよい。
【００１５】
本明細書で使用するところの、語句、抗体の「抗原結合部位」は、当該抗原に特異的に結合する能力を維持する無傷の抗体の１つまたはそれ以上の断片（例えばＯｐｒＦ／Ｉ試薬またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を意味する。抗体の抗原結合機能は、無傷の抗体の断片によって発揮されうる。語句抗体の「抗原結合部位」に包含される結合している断片の例には、Ｆａｂ断片、ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）ＶＨまたはｄＡｂドメインからなる一価断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ヒンジ領域にてジスルフィド橋によって連結した２つのＦａｂ断片を含む二価断片、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、ＶＨドメインまたはＶＬドメインからなる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）、単離相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。
【００１６】
さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別の遺伝子によってコードされるけれども、これらは、ＶＬとＶＨ領域を、一価分子を形成するために対になる一本鎖タンパク質鎖として作り上げることを可能にする人工ペプチドリンカーによって、組換え法を用いて結合可能である（一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）として知られる、例えばＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６５：５８７９−５８８３を参照のこと）。そのような一本鎖抗体には、１つまたはそれ以上の抗体の「抗原結合部位」が含まれる。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技術を用いて得られ、断片が、無傷の抗体と同一の様式にて有用性に関してスクリーンされる。抗原結合部位はまた、単一ドメイン抗体、マキシ体、ミニボディ、インターボディ、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲおよびｂｉｓ−ｓｃＦｖ内に組み込むことが可能である（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ．２００５．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３，９，１１２６−１１３６を参照のこと）。抗体の抗原結合部位は、ＩＩＩ型Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ（Ｆｎ３）のようなポリペプチドに基づいた足場内にグラフト可能である（フィブロネクチンポリペプチドモノボディを記述している米国特許第６，７０３，１９９号明細書を参照のこと）。抗原結合部位は、相補的軽鎖ポリペプチドとともに、一対の抗原結合領域を形成する、一対のタンデムＦｖセグメント（ＶＨ−ＣＨＩ−ＶＨ−ＣＭＩ）を含む一本鎖分子内に組み込むことが可能である（Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２、および米国特許第５，６４１，８７０号明細書）。
【００１７】
本明細書で使用するところの、語句「親和力」は、単一の抗原部位での抗体と抗原間の相互作用の強さを意味する。各抗原部位内で、抗体「アーム」の可変領域が、多数の部位にて抗原と、弱い非共有力をとおして相互作用し、相互作用が多ければ多いほど、親和力は強い。
【００１８】
本明細書で使用するところの、語句「親和性」は、抗体−抗原複合体の総合安定性または強度の情報程度を意味する。これは、３つの主要な要素、抗体エピトープ親和力、抗原と抗体両方の価数、および相互作用している部分の構造的アレンジメント、によって制御される。最終的に、これらの因子が、抗体の特異性を定義し、特定の抗体が、正確な抗原エピトープに結合している可能性である。
【００１９】
語句「アミノ酸」は、天然に存在する、および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能する、アミノ酸類似体およびアミノ酸ミメティックを意味する。天然に存在するアミン酸は、遺伝コードによってコードされるもの、ならびに後に改変されるアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、ｙ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似物は、天然に存在するアミノ酸と同一の基本的化学構造を有する化合物、すなわち水素に結合するアルファ炭素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを意味する。そのような類似体は、改変されたＲ基（例えばノルロイシン）または改変されたペプチド骨格を持つが、天然に存在するアミノ酸と同一の基本的化学構造を維持する。アミノ酸ミメティックは、アミノ酸の一般的な化学構造からは異なる構造を持つが、天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能する化学物質を意味する。
【００２０】
本明細書で使用するところの語句「結合特異性」は、個々の抗体結合部位の、ただ１つの抗原決定基と反応する能力を意味する。抗体の結合部位は、分子のＦａｂ部位中に存在し、重鎖および軽鎖の超可変領域から構築される。抗体の結合親和力は、抗体上の、単一の抗原決定基と単一の結合部位間の反応の強度である。これは、抗体の抗原決定基と結合部位間で働いている、誘引力および反発力の合計である。２つの物体間の特異的結合は、少なくとも１×１０７Ｍ−１、１０8Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１、１０１３Ｍ−１の平衡定数（ＫＡ）を持つ結合を意味する。用語抗体（例えばＯｐｒＦ／Ｉ試薬結合抗体）に「特異的に（または選択的に）結合する」は、例えば、異質のタンパク質または他の化合物の集団中、抗原（例えばＯｐｒＦ／Ｉ試薬）の存在の決定要因である結合反応を意味する。以上で言及した平衡定数（ＫＡ）に加えて、本発明のＯｐｒＦ／Ｉ試薬結合抗体は一般に、約１×１０−２ｓ−１、１×１０’３ｓ−１、１×１０４ｓ−１、１×１０’４ｓ−１またはそれより低い解離定数（Ｋｄ）も持ち、非特異的抗原への結合に関するその親和力よりも、少なくとも１０倍、好ましくは１００倍、または１０００倍まで、またはそれ以上である親和力でＯｐｒＦ／Ｉ試薬（類）に結合する。用語「抗原を認識している抗体」および「抗原に対して特異的な抗体」は、本明細書において、語句「抗原に対して特異的に結合する抗体」と相互互換的に使用される。
【００２１】
本明細書出使用するところの語句「対象」は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。
【００２２】
語句「非ヒト動物」には、全ての非ヒト脊椎動物、例えば非ヒト霊長類、齧歯類、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、トリ、両生類、は虫類などのような哺乳動物および非哺乳動物が含まれる。
【００２３】
語句「キメラ抗体」は、（ａ）定常領域、またはその一部が、抗原結合部位（可変領域）が、異なるまたは変更されたクラス、エフェクター機能および／または種、またはキメラ抗体に対して新規の特性を与える全体が異なる分子、例えば酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物などの定常領域と連結するように、変更、置換または交換される、または（ｂ）可変領域またはその一部が、異なるかまたは変更された抗原特異性を有する可変領域で変更、置換または交換される、抗体分子である。例えば、マウス抗体を、その定常領域を、ヒト免疫グロブリンからの定常領域で置換することによって改変可能である。ヒト定常領域での置換によって、キメラ抗体は、抗原を認識することにおいて、その特異性を維持可能であるが、一方で、本来のマウス抗体と比較して、ヒトでの抗原性が減少する。
【００２４】
語句「保存的修飾バリアント」は、アミノ酸および核酸配列両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的修飾バリアントは、同一の、または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、またはアミノ酸配列をコードしていない核酸の場合、本質的に同一の配列を意味する。遺伝コードの縮重のために、多数の機能的に同一の核酸が、任意の概タンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべてアミノ酸アラニンをコードしている。したがって、アラニンがコドンによって特定されるすべての位置において、コドンは、コードされたポリペプチドを変更することなしに、記述された相当するコドンの任意に変更可能である。そのような核酸バリアントは、「サイレントバリアント」と呼ばれ、保存的修飾バリエーションの一種である。ポリペプチドをコードしている本明細書のすべての核酸配列がまた、核酸のすべての可能性あるサイレントバリアントも記述している。当業者は、核酸中の各コドン（通常メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一の分子を産出するために改変可能である。したがって、ポリペプチドをコードしている核酸の各サイレントバリエーションは、各記述された配列中潜在的である。
【００２５】
ポリペプチド配列に関して、「保存的修飾バリアント」には、結果として化学的に同様のアミノ酸でのアミノ酸の置換となる、ポリペプチド配列に対する個々の置換、欠損または添加が含まれる。機能的に同様のアミノ酸を提供する保存置換表が本技術分野でよく公知である。そのような保存的修飾バリアントは、多型バリアント、種間相同体および本発明の対立遺伝子に加わるものであり、除外されない。以下の８つの群が、他に対して保存置換であるアミノ酸を含む。１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照のこと）。いくつかの実施形態において、語句「保存配列修飾」は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に有意に影響を与えないか、または変化させない、アミノ酸改変を意味するために使用される。
【００２６】
語句「交差ブロック」、「交差ブロックされた」および「交差ブロックしている」は、抗体または他の結合試薬の、標準の競合結合アッセイにおける、他の抗体または結合試薬の任意のＯｐｒＦ／Ｉ試薬への結合を干渉する能力を意味するために、本明細書にて相互互換的に使用される。
【００２７】
抗体または他の結合試薬が、他の抗体または結合分子のＯｐｒＦ／Ｉ試薬への結合を干渉することが可能である、したがって本発明にしたがって交差ブロックされたと言うことが可能かどうかの能力または程度は、標準の競合結合アッセイを用いて決定可能である。１つの好適なアッセイには、表面プラズモン共鳴技術を用いて相互作用の程度を測定可能なＢｉａｃｏｒｅ技術（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いることによって）の利用が含まれる。交差ブロックを測定するための他のアッセイは、ＥＬＩＳＡに基づくアプローチを使用する。
【００２８】
語句「エピトープ」は、抗体に特異的に結合可能なタンパク質決定基を意味する。エピトープは通常、アミノ酸または糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面基からなり、通常特異的な三次元構造特徴、ならびに特異的な荷電特徴を有する。立体配座および非立体配座エピトープは、還元溶媒の存在下で、前者への結合が失われる、また後者への結合は失われないことで区別される。
【００２９】
本明細書で使用するところの語句、ＩｇＧ抗体またはその断片（例えばＦａｂ断片）に対する「高親和力」は、標的抗原に対して、１０−８Ｍまたはそれ以下、１０−９Ｍまたはそれ以下、または１０−１０Ｍまたは１０−１１Ｍまたはそれ以下、または１０−１２Ｍまたはそれ以下、または１０−１３Ｍまたはそれ以下のＫＤを持つ抗体を意味する。しかしながら、「高親和力」結合は、他の抗体のイソタイプによって様々である。例えば、ＩｇＭイソタイプに対する「高親和力」結合は、１０−７Ｍまたはそれ以下、または１０−８Ｍまたはそれ以下のＫＤを持つ抗体を意味する。１つの様態において、本明細書で記述した抗ＯｐｒＦ／Ｉ抗体またはその抗原結合断片は、１ｎＭ以下、好ましくは２００ｐＭ以下、より好ましくは１００ｐＭ以下、またより好ましくは１０ｐＭ以下のＫＤを持つ。
【００３０】
本明細書で使用するところの語句「ヒト抗体」は、フレームワークおよびＣＤＲ領域両方が、ヒト由来の配列から誘導される、可変領域を有する抗体を含むことを意図する。さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域はまた、そのようなヒト配列、例えばヒト生殖細胞配列、またはヒト生殖細胞配列の変異バージョンからも誘導される。本発明のヒト抗体には、ヒト配列によってコードされないアミノ酸残基が含まれてよい（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのランダムまたは部位特異的変異導入によって、またはｉｎ  ｖｉｖｏでの体細胞変異によって導入された変異）。
【００３１】
語句「ヒトモノクローナル抗体」は、フレームワークとＣＤＲ領域両方がヒト配列から由来する可変領域を有する単一の結合特異性を示している抗体を意味する。１つの実施形態において、ヒトモノクローナル抗体は、トランスジェニック非ヒト動物、たとえばトランスジェニックマウスから得られるＢ細胞を含み、不死化細胞に融合したヒト重鎖トランスジーンと軽鎖トランスジーンを含むゲノムを有するハイブリドーマによって産出される。
【００３２】
「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体の反応性を維持するが、ヒトにおいて免疫原性はほとんどない抗体である。これは、例えば、非ヒトＣＤＲ領域を維持すること、およびそれらのヒトカウンターパート（すなわち定常領域ならびに可変領域のフレームワーク部分）にて、抗体の残りの部分を置換することによって達成可能である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８１：６８５１−６８５５，１９８４；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｉ．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：６５−９２，１９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６．１９８８；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．，２８：４８９−４９８．１９９１；およびＰａｄｌａｎ．Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．，３１：１６９−２１７，１９９４を参照のこと。ヒト工学技術の他の例には、米国特許第５，７６６，８８６号明細書にて開示されたＸｏｍａ技術が含まれるが、これに限定はされない。
【００３３】
２つまたはそれ以上の核酸またはポリペプチド配列に関する、語句「同一」またはパーセント「同一性」は、同一である２つまたはそれ以上の配列またはサブ配列を意味する。比較ウインドウ、または以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、またはマニュアル整列および目視検査によって測定したような計画的な領域にわたり最大応答に関して比較および整列した時に、２つの配列が特定の割合の同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチド（すなわち、特定の領域にわたり、または特定しない場合、全配列にわたり、６０％同一性、任意に６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一性）を持つ場合に、２つの配列が「本質的に同一」である。任意に、同一性は、長さにおいて少なくとも５０ヌクレオチド（または１０アミノ酸）である領域にわたり、より好ましくは、長さにおいて、１００〜５００または１０００またはそれ以上のヌクレオチド（または２０、５０、２００またはそれ以上のアミノ酸）である領域にわたり存在する。
【００３４】
配列比較のために、典型的には１つの配列が、参照配列として働き、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを用いる時、試験および参照配列をコンピュータに入力し、必要ならばサブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。デフォルトプログラムパラメータを使用可能であり、または他のパラメータを指定可能である。配列比較アルゴリズムがついで、プログラムパラメータに基づいて、参照配列と比較して試験配列に対して、パーセント配列同一性を計算する。本明細書で使用するところの「比較ウインド」には、そこで２つの配列を任意に整列させた後に、配列を同数の連続する位置の参照配列と比較してよい、２０〜６００、通常約５０〜約２００、より通常約１００〜約１５０からなる群より選択された連続位置の数の任意の１つのセグメントを参照する。比較のための配列の整列方法が本技術分野でよく公知である。比較のための配列の最適な整列は、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  （１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃのローカル相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０の相同配列アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４，１９８８の同一性方法のための検索によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実施によって（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ  ＦＡＳＴＡおよびＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｏｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ．ＷＩにおけるＴＦＡＳＴＡ）、またはマニュアル整列および目視検査（例えばＢｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｉｎｇｂｏｕ  ｅｄ．，２００３）を参照のこと）によって実施可能である。パーセント配列同一性と配列類似性を決定するために好適であるアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９７７、およびＡｌｔｓｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０に記述されている。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎをとして公的に入手可能である。本アルゴリズムには、クエリー配列中の長さＷの短いワードを同定することによる、高スコアリング配列対（ＨＳＰｓ）をまず同定することが含まれ、データベース配列中の同一の長さのワードと整列した時に、正の値の閾値とマッチするかまたは満足させるかいずれかである。Ｔは、近隣ワードスコア閾値として引用される（Ａｌｔｓｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、上記）。これらの初期近隣ワードヒットは、これらを含むより長いＨＳＰｓを探すための探索を開始するためのシーズとして働く。ワードヒットは、累積アルゴリズムスコアが増加可能である限り、各配列にそって両方の方向で伸張する。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関して、パラメータＭ（一対のマッチしている残基に対するリワードスコア、常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基に対するペナルティースコア、常に＜０）を用いて計算する。アミノ酸配列に関して、スコアリングマトリックスを使用して累積スコアを計算する。各方向でのワードヒットの伸張が、累積整列スコアが、その最大の達成値から、量Ｘまで減少する場合に停止し、累積スコアは、１つまたはそれ以上の負のスコアリング残基整列の累積のために、ゼロまたはそれ以下に行くか、いずれかの配列の末端が達せられる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、整列の感度およびスピードを決定する。（ヌクレオチド配列に対して）ＢＬＡＳＴＮプログラムは、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列に関して、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長、１０の期待値（Ｅ）およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５，１９８９を参照のこと）、５０のアルゴリズム（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４および両鎖の比較をデフォルトとして使用する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計学的解析を実施する（例えばＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７，１９９３を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの測定が、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、それによって２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のマッチが偶然発生する確率の指標が提供される。例えば、参照ヌクレオチドに対する試験核酸の比較における最小和確率が約０．２より小さい、より好ましくは約０．０１より小さい、最も好ましくは約０．００１より小さい場合に、参照配列と同様であると考慮される。２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性はまた、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティおよび４のギャップペナルティを用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）内に組み込まれてきた、Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１−１７，１９８８）のアルゴリズムを用いても決定可能である。加えて、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性を、Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重量および１、２、３、４、５または６の長さ重量を用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにて利用可能）中、ＧＡＰプログラム内に組み込まれてきた、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３，１９７０）アルゴリズムを用いて決定可能である。以上で言及した配列同一性の割合以外、２つの核酸配列またはポリペプチドが本質的に同一であるという他の示唆は、第一核酸によっ��コードされたポリペプチドが、以下で記述したような、第二核酸によってコードされたポリペプチドに対して発生した抗体と免疫学的に交差反応することである。従って、ポリペプチドは典型的に、第二ポリペプチドに対して本質的に同一であり、例えば、そこで２つのペプチドは、保存置換によってのみ異なる。２つの核酸配列が、本質的に同一である他の示唆は、２つの分子またはそれらの相補体が、以下で記述するように、切迫条件下、互いにハイブリッド形成することである。２つの核酸配列が本質的に同一であるまた他の示唆は、同一のプライマーが、配列を増幅するために使用可能であることである。
【００３５】
語句「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体から本質的に独立した抗体を意味する（例えば、ＯｐｒＦ／Ｉ試薬に特異的に結合する単離抗体は、任意のＯｐｒＦ／Ｉ試薬以外の抗原に特異的に結合する抗体から本質的に独立している）。ＯｐｒＦ／Ｉ試薬に特異的に結合する単離抗体はしかしながら、他の抗原への交差反応性を有する。さらに、単離抗体は、他の細胞性物質および／または化学物質から本質的に独立してよい。
【００３６】
語句「イソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によって提供される抗体クラス（例えばＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４のようなＩｇＧ）を意味する。イソタイプにはまた、これらのクラスの１つの改変形態が含まれ、改変は、例えばエフェクター機能またはＦｃ受容体への結合を増強する、または減少させるために、Ｆｃ機能を変更するように実施された。
【００３７】
本明細書で使用するところの語句「Ｋａｓｓｏｃ」または「Ｋａ」は、特定の抗体−抗原反応の結合速度を意味する意図があり、本明細書で使用するところの語句「Ｋｄｉｓ」または「Ｋｄ」は、特定の抗体−抗原反応の解離速度を意味する意図がある。本明細書で使用するところの語句「Ｋ０」は、結合定数を意味する意図が有り、ＫｄのＫａに対する比（すなわちＫｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される。抗体に対するＫ０値は、本技術分野でよく確立された方法を用いて決定可能である。抗体のＫ０を決定するための方法は、表面プラズモン共鳴を用いる、またはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムのようなバイオセンサーシステムを用いることによってである。
【００３８】
本明細書で使用するところの語句「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、単一分子組成物の抗体分子の調製物を意味する。モノクローナル抗体組成物は、特異的なエピトープに対して、単一の結合特異性と親和性を提示する。
【００３９】
語句「ポリヌクレオチド」と互換的に本明細書で使用するところの語句「核酸」は、一本鎖または二本鎖形態いずれかでの、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーを意味する。本語句は、合成、天然に存在する、および天然に存在しない、参照核酸と同様の結合特性をもつ、そして参照ヌクレオチドと同様の様式で代謝される、公知のヌクレオチド類似体または改変骨格残基または結合を含む核酸を包含する。そのような類似体の例には、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネートキラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡｓ）が含まれるが、これらの限定はされない。他の示唆しない限り、特定の核酸配列は、その保存的修飾バリアント（例えば縮重コドン置換）および相補配列、ならびに暗に示唆された配列を暗に包含する。とりわけ、以下で詳述するように、縮重コドン置換は、１つまたはそれ以上の選択された（またはすべての）コドンの第三位置が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換される配列を産出することによって達成されうる（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １９．５０８１．  １９９１；  Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ  ２６０：２６０５−２６０８，  １９８５；  ａｎｄ  Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｌ．  ａｌ．，  ＭｏＩ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８，  １９９４）。
【００４０】
語句「動作可能に連結した」は、２つまたはそれ以上のポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）セグメント間の機能的な関係を意味する。典型的には、転写制御配列の、転写された配列に対する機能的関係を意味する。例えば、プロモーターまたはエンハンサー配列は、適切な宿主細胞または他の発現系におけるコード配列の転写を刺激する、または調節する場合に、コード配列に動作可能に連結する。一般に、転写された配列に動作可能に連結するプロモーター転写制御配列は、転写された配列に物理的に連続しており、すなわち、これらはｃｉｓ動作している。しかしながら、エンハンサーのようないくつかの転写制御配列は、物理的に連続している必要はなく、またはその転写制御配列がその転写を増強するコード配列と近位に位置する必要はない。
【００４１】
本明細書で使用するところの語句「最適化された」は、産出細胞または有機体、一般には真核生物、例えばＰｉｃｈｉａの細胞、チャイニーズハムスター卵母細胞（ＣＨＯ）またはヒト細胞中で好ましいコドンを用いて、アミノ酸配列をコードするように変更されたヌクレオチド配列を意味する。最適化されたヌクレオチド配列は、完全に、または可能な限り、「親」配列としてまた公知である、開始ヌクレオチド配列によって本来コードされたアミノ酸配列を維持するように操作される。本明細書の最適化された配列は、哺乳動物中で好ましいコドンを持つように操作された。しかしながら、他の原核細胞または真核細胞中のこれらの配列の最適化された発現がまた本明細書で想定される。最適化されたヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列もまた最適化されていると言われる。
【００４２】
語句「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを意味するために本明細書で互換的に使用される。本語句は、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が、相当する天然に存在するアミノ酸の人工キメラミメティックであるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。他に指摘しない限り、特定のポリペプチド配列がまた、その保存修飾されたバリアントを暗に包含する。
【００４３】
本明細書で使用するところの語句「組換え体ヒト抗体」には、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックまたはトランスクロソーム的である動物（例えばマウス）から単離された抗体、それらから調製されたハイブリドーマ、ヒト抗体を発現するために形質転換された宿主細胞、例えばトランスフェクトーマから単離された抗体、組換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体のような組換え方法によって調製、発現、作製または単離された全てのヒト抗体、およびヒト免疫グロブリン遺伝子、他のＤＮＡに対する配列の全てまたは一部をスプライスすることを含む任意の他の方法によって調製、発現、作成または単離された抗体が含まれる。そのような組換え体ヒト抗体は、フレームワークおよびＣＤＲ領域が、ヒト生殖免疫グロブリン配列から由来する可変領域を有する。特定の実施形態においてしかしながら、そのような組換え体ヒト抗体を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異導入（またはヒトＩｇ配列に対するトランスジェニック動物を使用する場合、ｉｎ  ｖｉｖｏ体細胞変異導入）にかけてよく、したがって組換え体抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖ＶＨおよびＶＬ配列から由来し、関連する一方で、ｉｎ  ｖｉｖｏにて、ヒト抗体生殖レパートリー内に天然には存在しなくてよい配列である。
【００４４】
語句「組換え体宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、組換え体発現ベクターが導入された細胞を意味する。そのような語句は、特定の対象細胞のみを指すのではなく、そのような細胞の子孫も指す意図があることが理解されるべきである。特定の改変が、変異または環境の影響のいずれかによって、続く世代で発生しうるので、そのような子孫は実際、親細胞とは同一ではなくてよいが、本明細書で使用するところの語句「宿主」の範囲内に含まれる。
【００４５】
語句「対象」には、ヒトおよび非ヒト動物が含まれる。非ヒト動物には、全ての脊椎動物、例えば、霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類およびは虫類のような、哺乳動物および非哺乳動物が含まれる。言及した場合を除き、語句「患者」または「対象」は相互互換的に使用される。
【００４６】
語句「処置すること」には、疾患（例えば嚢胞性線維症）または感染（例えばＩＣＵ患者または入院患者または本明細書で他に記述されたような感染を予防または遅延させるような）感染の症状、合併症、または生化学的兆候の開始を予防するまたは遅延させるための、抗体を含むワクチンまたは組成物のような組成物の投与、症状を緩和すること、または疾患、状態または疾病のさらなる発展を停止させるまたは阻害させることが含まれる。疾患の発現後の症状の（疾患の開始を予防または遅延させるため、またはその臨床的またはサブ臨床的症状の発現を防止するための）予防的または治療的抑制または緩和であってよい。
【００４７】
語句「ベクター」は、それに連結したもう１つのポリヌクレオチドを輸送可能なポリヌクレオチド分子を意味する。ベクターの１つの型は「プラスミド」であり、これは、その中にさらなるＤＮＡセグメントをライゲートしてよい環状二本鎖ＤＮＡループを意味する。他の型のベクターは、アデノウイルス関連ウイルスベクター（ＡＡＶまたはＡＡＶ２）のようなウイルスベクターであり、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノム内にライゲートされてよい。特定のベクターが、導入された宿主細胞中自己複製可能である（例えば複製の細菌期限を有する細菌ベクターおよびエピソーマル哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーマル哺乳動物ベクター）を、宿主細胞内への導入に際して、宿主細胞のゲノム内に統合可能であり、それによって宿主ゲノムにそって複製される。さらに、特定のベクターは、動作可能に連結する遺伝子の発現を指向可能である。そのようなベクターは、「組換え発現ベクター」（または単に、「発現ベクター」）として本明細書で引用される。一般に、組換えＤＮＡ技術における発現ベクターの利用は、しばしばプラスミドの形態で、である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがもっとも一般的に利用される型のベクターであるので、相互互換的に使用されてよい。しかしながら、本発明は、等価の機能を提供する、ウイルスベクター（例えば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス）のような、そのような他の形態の発現ベクターを含む意図がある。
【００４８】
語句「ワクチン」は、特定の人々の集団における特定の感染および／または疾患に対する免疫を改善する生物学的調製物を意味する。ワクチンは典型的に、疾患を引き起こす微生物と似ている試薬を含み、しばしば微生物またはその毒素の弱化または殺傷形態からつくられ、または種々のそのような成分の断片または融合である。試薬は、試薬を外来と認識し、破壊し、「覚える」ために体の免疫系を刺激し、免疫系が、後に遭遇するこれらの任意の微生物をより簡単に認識し、破壊可能である。ワクチンは、（例えば、任意の天然または「野生」病原体によるさらなる感染の効果を予防するか、または緩和するため）予防的、または治療的（例えば癌、嚢胞性線維症の人々、免疫抑制される移植の人々に対するワクチンが治療的に処置されてよい）である。
【００４９】
語句「薬理学的に効果的な量の」または「薬理学的に許容可能な量の」本発明のＯｐｒＦ／Ｉ試薬は、本明細書で記述したような患者における感染、疾患または状態を処置するまたは予防する、例えば本明細書で記述したような患者またはヒトにおける死亡率を減少させるのに必要であるか、または十分な量である。効果的な量は、対象のサイズおよび体重、病気の型、または本発明の特定のＯｐｒＦ／Ｉ試薬のような因子に依存して変化可能である。たとえば、本発明のＯｐｒＦ／Ｉ試薬の選択は、なにが「薬理学的に効果的な量」を構成するかに影響を与えうる。当業者は、本明細書に含まれる因子を研究し、不必要な実験無しに、本発明の化合物の効果的な量に関する決定を行うことが可能である。
【００５０】
語句「ｍｃｇ」はマイクログラムと同義語である。
【００５１】
語句「死亡率」は、本発明の文脈中、ユニット時間あたり、いくつかの集団の大きさにスケールを合わせた、当該集団中の死亡数（一般に、または特定の原因による）の程度を意味する。本発明の実験パートは、例えば、ＩＣＵに到着して（０日０）からＩＣＵでの２８日目までの期間中の、人工呼吸器をつけたＩＣＵ患者の集団における、死亡率、すなわち死亡数を記述している（本明細書でまた、２８日目死亡率と呼ぶ）。
【００５２】
語句「死亡リスク」または単に「死亡率」は、本発明の文脈中、異なる試験または患者群の死亡率の比較程度を達するために、程度を校正するための比計算を意味する。簡単に記すと、死亡リスクまたは死亡率は、薬物で処置した患者（例えばＯｐｒＦ／Ｉ処置患者群）における死亡率対プラセボ対照患者における死亡率の比×１００であり、すなわち、死亡リスク（死亡率）＝薬物処置群における死亡率／プラセボ群における死亡率（×１００）である。死亡率が約１００に等しければ、薬物処置およびプラセボ群間の差はなく、死亡率が１００より大きければ死亡率が、プラセボ群よりも薬物処置群で高く、死亡率が１００より小さい場合、死亡率は、プラセボ群とよりも薬物処置群で低い。
【００５３】
本発明のＯｐｒＦ／Ｉ試薬
本発明は、そのアミノ末端で、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のような、緑膿菌膜タンパク質Ｆ（全長外膜タンパク質Ｆ、またはＯｐｒＦ＝ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５と呼ばれる）のカルボキシ末端部分のカルボキシ末端に融合する、緑膿菌外膜タンパク質Ｉ（全長外膜タンパク質ＩまたはＯｐｒＦ＝ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６と呼ばれる）を含む融合タンパク質およびそのバリアントの本明細書でさらなる記述するような利用に関する（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびそのバリアントはまた、「ＯｐｒＦ／Ｉ試薬」または「ＯｐｒＦ／Ｉ試薬類」として本明細書でまた参照される）。
【００５４】
好ましい様態において、前記融合タンパク質は、天然のＯｐｒＦタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）のアミノ酸１９０からアミノ酸３４２までの配列を持つ外膜タンパク質Ｆのカルボキシ末端部分、または天然のＯｐｒＩタンパク質のアミノ酸２１からアミノ酸８３までの配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）を持つ外膜タンパク質Ｉのアミノ末端に融合した、天然のＯｐｒＦタンパク質のアミノ酸１９０からアミノ酸３５０までの配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を持つ外膜タンパク質Ｆのカルボキシ末端部分を含む。本発明のさらに好ましい様態において、前記融合タンパク質は、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＯｐｒＦ／Ｉ試薬のような、Ａｌａ−（Ｈｉｓ）６タグを含む。
【００５５】
さらなる様態において、ＯｐｒＦ／Ｉ試薬は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１〜１３、とりわけＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のような、本明細書で特定された任意の配列のバリアントからなるか、または含んでよい。１つの実施様態は、機能的に活性なバリアントであり、および／または以上で特定した配列に対して少なくとも５０％配列同一性、とりわけ少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、またより好ましくは少なくとも９０％、またより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは９９％配列同一性を持つ。バリアントは、とりわけバリアントの活性が、配列変更なしに、配列の活性の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、またより好ましくは少なくとも７０％、またより好ましくは少なくとも８０％、とりわけ少なくとも９０％、とりわけ少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％の量となる場合、そのバリアントが誘導された配列の生物活性を示す場合に、機能的に活性なバリアントとして見なされる。活性は、「実験パート」または相当する動物試験にて記述したように試験可能であった。
【００５６】
したがって、ＯｐｒＦ／Ｉ試薬は、そのアミノ末端で、緑膿菌外膜タンパク質Ｆのカルボキシ末端部分のカルボキシ末端と融合した緑膿菌外膜タンパク質Ｉを含むか、からなる融合タンパク質として特徴付けてよく、とりわけ
（ｉ）緑膿菌外膜タンパク質Ｉは全長外膜タンパク質Ｉ、とりわけＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５である、
（ｉｉ）緑膿菌外膜タンパク質Ｆは全長外膜タンパク質Ｆ、とりわけＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６である、
（ｉｉｉ）ＯｐｒＦ／Ｉ試薬は、ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、７〜１０、および／またはｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４を含むか、またはからなる、
（ｉｖ）ＯｐｒＦ／Ｉ試薬はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１からなるか、または含む、
（ｖ）ＯｐｒＦ／Ｉ試薬は、前記ポルペプチドまたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して指向する抗体またはその断片からなるか、または含む、
（ｖｉ）ＯｐｒＦ／Ｉ試薬は、機能的に活性なバリアントである、および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して少なくとも５０％配列同一性、とりわけ少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、まだより好ましくは少なくとも９０％、またより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは９９％配列同一性を持つ、
（ｖｉｉ）ＯｐｒＦ／Ｉ試薬は、天然のＯｐｒＦタンパク質のアミノ酸１９０からアミノ酸３４２までの配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）を持つ、外膜タンパク質Ｆのカルボキシ末端部分、または天然のＯｐｒＦタンパク質のアミノ酸１９０からアミノ酸３５０までの配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を持つ外膜タンパク質Ｆのカルボキシ末端を含む、
（ｖｉｉｉ）ＯｐｒＦ／Ｉ試薬は、天然のＯｐｒＩタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）のアミノ酸２１からアミノ酸８３までの配列を持つ外膜タンパク質Ｉのアミノ末端を含む、
（ｉｘ）ＯｐｒＦ／Ｉ試薬は、天然のＯｐｒＦタンパク質のアミノ酸１９０からアミノ酸３４２までの配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）を持つ外膜タンパク質Ｆのカルボキシ末端、または天然のＯｐｒＩタンパク質のアミノ酸２１からアミノ酸８３までの配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）を持つ外膜タンパク質Ｉのアミノ末端に融合した、天然のＯｐｒＦタンパク質のアミノ酸１９０からアミノ酸３５０までの配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を持つ外膜タンパク質Ｆのカルボキシ末端部分を含むか、またはからなる、
（ｘ）融合タンパク質が、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、１１〜１３のＯｐｒＦ／Ｉ試薬中のような、Ａｌａ−（Ｈｉｓ）６タグを含む。
【００５７】
本発明はさらに、そのアミノ末端にて、緑膿菌外膜タンパク質ＯｐｒＦのカルボキシ末端部分のカルボキシ末端に融合する緑膿菌外膜タンパク質Ｉを含む融合タンパク質の、本明細書でさらに記述したような利用に関し、そこで、前記カルボキシ末端部分が、１つまたはそれ以上の表面曝露Ｂ−細胞エピトープＳＥＥ１、ＳＥＥ２、ＳＥＥ３およびＳＥＥ４を含む。これらのＢ−細胞エピトープは、ＯｐｒＦの以下のアミノ酸（ａａ）位置に配置される。ＳＥＥ１＝ａａ２１２〜２４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＳＥＥ２＝ａａ２４３〜２５６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、ＳＥＥ３＝ａａ２８５〜２９８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）およびＳＥＥ４＝ａａ３３２〜３５０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）（Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２），Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０，ｐｐ．３４９７−３５０３を参照のこと）。
【００５８】
本発明の他の様態は、上述融合タンパク質の少なくとも１つを含む薬理学的組成物の、本明細書でさらに記述した利用である。
【００５９】
本発明の他の様態は、上述融合タンパク質の少なくとも１つを含むワクチンの、本発明書でさらに記述した利用である。
【００６０】
さらに、本発明は、１つまたはそれ以上の上記融合タンパク質に指向したモノクローナルまたはポリクローナル抗体の、本明細書でさらに記述したような利用に関する。これらの抗体はまた、例えば緑膿菌による対照への感染に対する、能動的保護を提供するために、薬理学的組成物中で使用してもよく、したがって、本明細書でさらに記述するような急性設定にての利用に関しても有用であり、示唆されうる。
【００６１】
前記ＯｐｒＦ／Ｉ試薬およびそれを作製する方法が、例えば、抗原に関して、また欧州特許第７１７１０６号明細書、Ｖｏｎ  Ｓｐｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｍａｙ  １９９５，ｐ．１８５５−１８６２）中、そして本明細書実験パート中記述される。要するに、前記ＯｐｒＦ／Ｉ試薬は、真核または厳格細胞中、前記融合タンパク質に関してコードしている核酸の発現をもたらすことを含む工程にしたがって産出されてよい。例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のようなＯｐｒＦ／Ｉ試薬が、例えば水酸化アルミニウム（４００ｍｃｇ）あり、またはなしで、生理食塩水溶液（０．８１％重量／容量）中、１００ｍｃｇの用量で、（筋肉内または静脈内、好ましくは筋肉内投与のためのような）注射可能であるように処方されてよい。一旦特異的抗原が公知であれば、抗体の作製は本技術分野でよく公知であり、例えば完全ヒト抗体の産出および作製の場合、国際特許第２００８０５５７９５号パンフレットおよび第０４１０２１９８号パンフレットのような方法に従って実施されてよい。
【００６２】
上記説明を考慮して、本発明の特に好ましい実施形態は、ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質の混合物、とりわけ複合体であり、各ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質は、そのカルボキシ末端にて、緑膿菌外膜タンパク質Ｉのアミノ末端の一部に融合する緑膿菌外膜タンパク質Ｆの一部を含み、緑膿菌外膜タンパク質Ｆの前記部分は、天然の緑膿菌外膜タンパク質Ｆのアミノ酸１９０〜３４２を含み、緑膿菌外膜タンパク質Ｉの前記部分は、天然の緑膿菌外膜タンパク質Ｉのアミノ酸２１〜８３を含み、各ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質は、Ａｌａ−（Ｈｉｓ）６−Ｎ−末端を含み、前記混合物が、
（ａ）Ｃｙｓ１８−Ｃｙｓ２７−結合のみを持つＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、
（ｂ）Ｃｙｓ１８−Ｃｙｓ２７−結合とＣｙｓ３３−Ｃｙｓ４７−結合を持つＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）、および／または
（ｃ）Ｃｙｓ１８−Ｃｙｓ４７−結合とＣｙｓ２７−Ｃｙｓ３３−結合を持つＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）
を、とりわけトリマーの形態で含む。
【００６３】
アミノ酸ナンバリングは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列に従う。前記混合物の純度は、ＲＰ−ＨＰＬＣによって好ましく測定されたように、混合物の全タンパク質含量と比較して、少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％〜約９０％、とりわけ少なくとも約８５％、例えば７５％〜９０％または８５％〜９０％である。
【００６４】
以上で説明したように、本発明の特定の利点は、ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質が、望まない凝集、とりわけ高分子量凝集を形成しないが、好ましくはトリマーであることである。興味深いことに、ＯｒｐＦ／Ｉ融合タンパク質トリマーは球形状の代わりに細長い形状と、高い流体力学半径、とりわけ５．６ｎｍ計算ストークス半径を持つ。トリマーは、例えばｐＨ約７および室温のような生理学的条件下、溶液中で安定であり、すなわち解離はモニタされなかった。
【００６５】
したがって、本発明の他の様態は、そのカルボキシまったんで、緑膿菌外膜タンパク質Ｉのアミノ末端の一部と融合する、緑膿菌外膜タンパク質Ｆの一部を含むトリマーＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、とりわけ９５％同一性をもつその免疫原性バリアントであり、緑膿菌外膜タンパク質Ｆの前記部分が、天然の緑膿菌外膜タンパク質Ｆのアミノ酸１９０〜３４２を含み、緑膿菌外膜タンパク質Ｉの前記部分が、天然の緑膿菌外膜タンパク質Ｉのアミノ酸２１〜８３を含む。
【００６６】
好ましくはトリマーＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質は、以上で説明したのと同一のジスルフィド結合を有する。さらに、トリマーＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質（群）は、また以上で説明したように、混合物内に存在しうる。
【００６７】
本発明のＯｐｒＦ／Ｉ試薬に対する新規および独創的利用
本発明の特定の発見にしたがって、以下の新規および独創的方法および／または利用が提供される。
１．１  （薬理学的に効果的な量のような）効果的な量のＯｐｒＦ／Ｉ試薬、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、機械的に人工呼吸器をつけた集中治療ユニット患者のような人工呼吸器をつけた集中治療ユニット患者に投与することを含む、前記患者における死亡率を減少させる方法、
１．２  効果的な量のＯｐｒＦ／Ｉ試薬、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、嚢胞性線維症患者に投与することを含む、前記患者における死亡率を減少させる方法、
１．３  （薬理学的に効果的な量のような）効果的な量のＯｐｒＦ／Ｉ試薬、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、第一、第二または第三程度のやけど、好ましくは第三程度のやけどのようなやけど患者に投与することを含む、前記患者における死亡率を減少させる方法、
１．４  （薬理学的に効果的な量のような）効果的な量のＯｐｒＦ／Ｉ試薬、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、免疫抑制されるがんまたは移植患者に投与することを含む、前記患者における死亡率を減少させる方法、
１．５  （薬理学的に効果的な量のような）効果的な量のＯｐｒＦ／Ｉ試薬、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、集中治療ユニット患者に投与することを含む、前記患者における死亡率を減少させる方法、
１．６  （薬理学的に効果的な量のような）効果的な量のＯｐｒＦ／Ｉ試薬、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、入院患者に投与することを含む、前記患者における死亡率を減少させる方法、
１．７  （薬理学的に効果的な量のような）効果的な量のＯｐｒＦ／Ｉ試薬、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、４８時間以上機械的人工呼吸とりつけを必要とする集中治療ユニットに収容された患者に投与することを含む、前記患者における死亡率を減少させる方法、
１．８  （薬理学的に効果的な量のような）効果的な量のＯｐｒＦ／Ｉ試薬、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、手術される、または手術が予定されているヒトまたは非ヒト動物に、好ましくは少なくとも予定されている手術の２週間前に投与することを含む、前記ヒトまたは非ヒト動物における死亡率を減少させる方法、
１．９  （薬理学的に効果的な量のような）効果的な量のＯｐｒＦ／Ｉ試薬、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、（ベースジャンプ、バンジージャンプ、滑空、ハンググライダー、ハイワイヤ、スキージャンプ、スカイダイビング、スカイサーフィン、スカイフライング、インドアクライミング、アドベンチャーレース、過激なインラインスケーティング、ＢＭＸ、カービング、過激なモトクロス、過激なスキー、フリースタイルスキー、ランドおよびアイスヨット、マウンテンバイク、マウンテンボーディング、アウトドアクライミング、サンドボード、スケートボード、スノーボード、スノーモービル、スピードバイク、スピードスキー、スクーテリング、裸足のウォタースキー、クリフダイビング、フリーダイビング、ジェットスキー、オープンウォータースイミング、パワーボードレース、世界一周ヨットレース、スキューバダイビング、スノーケリング、スピードセーリング、サーフィン、ウェイクボード、急流カヤック、ウインドサーフィンのような）危険をはらんだスポーツを行っているヒトのような、集中治療ユニットに収納されるリスクのあるヒトに、好ましくは予定された危険をはらんだスポーツイベントの少なくとも２週間前に、投与することを含む、前記ヒトにおける死亡率を減少させる方法、
１．１０  （薬理学的に効果的な量のような）効果的な量のＯｐｒＦ／Ｉ試薬、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、ヒト、とりわけ任意の年齢、例えば２歳またはそれ以上の歳のヒトに投与することを含む、前記ヒトにおける死亡率を減少させる方法、
１．１１  （薬理学的に効果的な量のような）効果的な量のＯｐｒＦ／Ｉ試薬、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および任意の薬理学的に許容可能な賦形剤を含む薬理学的組成物を、任意の種類の感染を有するヒトに投与することを含む、前記ヒトにおける死亡率を減少させる方法であって、好ましくはさらに、習慣的なブースターワクチン摂取が含まれる方法、
１．１２  ＯｐｒＦ／Ｉ試薬が、ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、７〜１０およびｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１〜１３からなるポリペプチド、および前記ポリペプチドまたはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して指向する抗体またはその断片からなる群より選択される、以上で定義された方法、
１．１３  薬理学的組成物がワクチンである、以上で定義された方法、
１．１４  薬理学的組成物が、非アジュバントであるワクチンである、以上で定義された方法、
１．１５  第一薬物基質と第二薬物基質を共投与することであって、前記第一薬物基質が、（薬理学的に効果的な量のような）効果的な量の、ＯｐｒＦ／Ｉ試薬、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含むワクチンであり、前記第二薬物基質が、（薬理学的に効果的な量のような）効果的な量の、とりわけ死亡のリスクを減少させることに関して、患者、ヒトまたは非ヒト動物の状態を改善している、静脈内抗生物質のような抗生物質および他の薬物基質からなる群より選択される、以上で定義された方法、
１．１６  死亡率が、１００より少ない、以上で定義された方法、
１．１７  例えばＩＣＵ患者、好ましくは、人工呼吸器をつけたＩＣＵ患者における死亡率が、９５、好ましくは９０、より好ましくは８５、より好ましくは８０、より好ましくは７５、より好ましくは７０、より好ましくは６５より少ない、さらにより好ましくは６０より少ない、最も好ましくは５５より少ない、以上で定義された方法、
１．１８  ＯｐｒＦ／Ｉ試薬が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を有する３つのＯｐｒＦ／Ｉ試薬、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列と、少なくとも８５％、好ましくは９０％、とりわけ９５％の同一性を持つその免疫原性バリアントを含む（または少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％からなる）タンパク質複合体である、以上で定義された方法、
１．１９  ＯｐｒＦ／Ｉ試薬が、
（ａ）Ｃｙｓ１８−Ｃｙｓ２７−結合（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質、
（ｂ）Ｃｙｓ１８−Ｃｙｓ２７−結合とＣｙｓ３３−Ｃｙｓ４７−結合（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質、および
（ｃ）Ｃｙｓ１８−Ｃｙｓ４７−結合とＣｙｓ２７−Ｃｙｓ３３−結合（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質、
またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは９０％、とりわけ９５％の同一性を持ち、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）にて特定されたのと同一のジスルフィド結合パターンを有する、その免疫原性バリアントからなる群より選択され、
好ましくは、ＯｐｒＦ／Ｉ試薬が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を有する３つのＯｐｒＦ／Ｉ試薬、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列と、少なくとも８５％、好ましくは９０％、とりわけ９５％の同一性を持つその免疫原性バリアントを含むタンパク質複合体であり、ａ）Ｃｙｓ１８−Ｃｙｓ２７−結合（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質、ｂ）Ｃｙｓ１８−Ｃｙｓ２７−結合とＣｙｓ３３−Ｃｙｓ４７−結合（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質、およびｃ）Ｃｙｓ１８−Ｃｙｓ２７−結合とＣｙｓ２７−Ｃｙｓ３３−結合（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質の合計が、等しいか、７５％より大きい、以上で定義された方法。
【００６８】
好適な第二薬物基質には、例えば、ｉ）抗細菌化合物、例えばペニシリン類、セファロスポリン類、ポリミキシン類、キノロン類、スルホンアミド類、アミノグリコシド類、マクロライド類、テトラサイクリン類、ダプトマイシン類、チゲシクリン類、リンゾリド類、ｉｉ）抗真菌化合物、例えばポリエン抗心筋剤、ナタマイシン、リモシジン、フィリピン、ナイアスタチン、アムホテリシンＢ、カンジシン、ハミシン、ｉｉｉ）第一基質のＯｐｒＦ／Ｉ試薬が抗原である場合、本明細書で定義したようなＯｐｒＦ／Ｉに対して指向した抗体、が含まれてよい。
【００６９】
本明細書で使用するところの語句「共投与」または「混合投与」などは、単一の患者への、選択された治療的、または予防的薬剤の投与を包含する意味があり、薬剤が同一の投与経路によって、または同時に必ずしも投与されない処置または予防的レジメを含む意図がある。
【００７０】
以上にかわって、本発明はまた、以下を提供する。
２．上記１．１〜１．１９下定義したような任意の方法での利用のための、ＯｐｒＦ／Ｉ試薬、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、または
３．上記１．１〜１．１９下定義したような任意の方法での利用のための、薬理学的組成物の調製における利用のためのＯｐｒＦ／Ｉ試薬、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、または
４．１つまたはそれ以上の薬理学的に許容可能な希釈液または担体と一緒の、ＯｐｒＦ／Ｉ試薬、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含む、上記１．１〜１．１９下定義したような任意の方法での利用のための、薬理学的組成物、
５．１  ａ）ＯｐｒＦ／Ｉ試薬、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含むワクチンである第一試薬で、前記ワクチンは任意に比アジュバントである、
ｂ）例えば以上で開示したような、抗細菌または抗真菌化合物である共試薬
を含む、薬理学的組成物
５．２  ａ）ＯｐｒＦ／Ｉ試薬、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して指向する抗体またはその断片である第一試薬、および
ｂ）例えば以上で開示したような、抗細菌または抗真菌化合物である共試薬
を含む薬理学的組成物。
【００７１】
本明細書で使用するところの語句「薬理学的組み合わせ」は、１つ以上の活性成分の混合または組み合わせの結果である産物を意味し、活性成分の固定および非固定組み合わせ両方を含む。語句「固定組み合わせ」は、活性成分、例えばＯｐｒＦ／Ｉ試薬と共試薬両方を、単一エントリーまたは処方の形態で、同時に患者に投与することを意味する。語句「非固定組み合わせ」は、活性成分、例えばＯｐｒＦ／Ｉ試薬と共試薬両方を患者に、同時に、ともに、または連続していずれかで、特定の時間制限なしに別のエンティティとして投与することを意味し、そこでそのような投与により、患者の体の中で、２つの化合物の治療的に効果的なレベルが提供される。
【００７２】
入院患者、嚢胞性線維症患者、ＩＣＵ患者、機械的人工呼吸器をつけたＩＣＵ患者、重度なやけど患者のようなやけど患者、免疫抑制されているか、または免疫抑制されうるがんおよび／または移植患者、たとえば本明細書以上で特定するような手術をされるか、される予定のあるヒトまたは非ヒト動物のような好適な群における死亡率の減少における、ＯｐｒＦ／Ｉ試薬、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の、単独での、または本明細書または他で記述されたような他の薬物基質との組み合わせでの利用が、例えば実験パートにて本明細書以下で記述する方法にしたがって、動物試験法ならびにさらなる臨床試験においてさらに示されてよい。
【００７３】
ワクチンを含む本発明の薬理学的組成物を、よく公知で、本技術分野で通常実施される方法にしたがって調製可能である（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．  ２０ｔｈ  ｅｄ．  ２０００；  ａｎｄ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  -  Ｆａｃｔ  Ｓｈｅｅｔ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎを参照のこと。例えば、ワクチンがその働きを改善することを助けるための、ミョウバンのようなアジュバントおよびエンハンサー、ワクチンが変化しないままであることを助けるための保存剤および安定化剤（例えばアルブミン、フェノール、グリシン））。薬理学的組成物は好ましくはＧＭＰ条件下で製造される。典型的には、薬理学的に効果的な量のＯｐｒＦ／Ｉ試薬を、本発明の薬理学的組成物中で使用する。ＯｐｒＦ／Ｉ試薬は、当業者に公知の従来の方法によって、薬理学的に許容可能な調剤形態内に処方される。調剤レジメは、最適な望む応答（例えば治療的または予防的応答）を提供するように調整される。例えば、２つのユニット調剤形態が、例えば（実験パートにおけるワクチン、すなわちＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含むワクチンのような）ワクチンの場合投与されてよく、または（例えば抗体組成物の場合）種々の分割投与を、時間にわたり投与してよく、または用量を、治療状況の要求によって示唆されるように均等に減少または増加させてよい。投与の簡便さ、および調剤の均一性のために、調剤ユニット形態内で非経口組成物を処方することがとりわけ有益である。本明細書で使用するような調剤ユニット形態（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の１００ｍｃｇユニット形態）は、処置されるべき対象に対して単一調剤として適した物理的に分離したユニットを意味し、各ユニットは、要求された薬理学的担体または賦形剤と一緒に、望む薬理学的効果を産出するように計算された、先に決定された量の活性ＯｐｒＦ／Ｉ試薬を含む。
【００７４】
本発明の薬理学的組成物中の活性成分の実際の調剤レベルは、患者に毒性ではなく、特定の患者、組成物、投与様式に対する望む薬理学的応答を達成するように効果的である活性成分の量を得るために、様々であってよい。選択された調剤レベルは、使用した本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、使用している特定の化合物の排出速度、処置の期間、使用した特定の組成物との組み合わせで使用した他の薬物、化合物および／または物質、処置されている患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康、前投薬歴および同様の因子を含む種々の薬物動態的因子に依存する。
【００７５】
医師または獣医師は、望む治療効果を達成するために必要であるよりも低いレベルにて、薬理学的組成物中で使用された本発明のＯｐｒＦ／Ｉの用量を開始し、徐々に望む効果が達成されるまで調剤ユニットを増加可能である。一般に、本明細書で記述したような人々の集団の予防的および治療的処置のための、効果的な用量の本発明の組成物は、投与方法、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか、動物であるか、投与された他の医薬品、および処置が予防であるのか治療であるのか、を含む、多くの異なる因子に依存して変化する。処置調剤は、安全性および効果を最適化するために漸増する必要がある。本発明のワクチンまたは抗体のようなＯｒｐＦ／Ｉ試薬での全身投与のために、調剤は、約０．０１〜１００ｍｃｇ／宿主体重ｋｇ、より通常は１〜１５ｍｃｇ／宿主体重ｋｇの範囲である。例示的処置レジメは、全身投与、例えばワクチンに関して２回または１回、または抗体処置に関して二週間に一回または一ヶ月に一回または３〜６ヶ月に一回を伴う。例示的処置レジメは、１００ｍｃｇ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１からなるワクチンに関して０日目および７日目に二回、およびＮａＣｌ水溶液容量あたり０．８１％重量の全身投与を伴う。
【００７６】
本発明のさらなる様態において、本発明は以下の薬理学的組成物を提供する。
１．１  本明細書で記述したようなＯｐｒＦ／Ｉ試薬、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と、任意に薬理学的に許容可能な賦形剤を含む、機械的人工呼吸器をつけた集中治療ユニット患者のような、人工呼吸器をつけた集中治療ユニット患者における死亡率を減少させることにおける利用のための薬理学的組成物。
１．２  本明細書で記述したようなＯｐｒＦ／Ｉ、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と、任意に薬理学的に許容可能な賦形剤を含む、嚢胞性線維症患者における死亡率を減少させることにおける利用のための薬理学的組成物。
１．３  本明細書で記述したようなＯｐｒＦ／Ｉ、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と、任意に薬理学的に許容可能な賦形剤を含む、第一、第二または第三程度のやけど、好ましくは第三程度のやけどのようなやけど患者における死亡率を減少させることにおける利用のための薬理学的組成物。
１．４  本明細書で記述したようなＯｐｒＦ／Ｉ、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と、任意に薬理学的に許容可能な賦形剤を含む、免疫抑制されるがんまたは移植患者における死亡率を減少させることにおける利用のための薬理学的組成物。
１．５  本明細書で記述したようなＯｐｒＦ／Ｉ、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と、任意に薬理学的に許容可能な賦形剤を含む、集中治療ユニット患者における死亡率を減少させることにおける利用のための薬理学的組成物。
１．６  本明細書で記述したようなＯｐｒＦ／Ｉ、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と、任意に薬理学的に許容可能な賦形剤を含む、入院患者における死亡率を減少させることにおける利用のための薬理学的組成物。
１．７  本明細書で記述したようなＯｐｒＦ／Ｉ、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と、任意に薬理学的に許容可能な賦形剤を含む、４８時間以上の間機械的人工呼吸器が必要である集中治療ユニットに収容された患者における死亡率を減少させることにおける利用のための薬理学的組成物。
１．８  本明細書で記述したようなＯｐｒＦ／Ｉ、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と、任意に薬理学的に許容可能な賦形剤を含む、手術される、または手術が予定されているヒトまたは非ヒト動物における死亡率を減少させることにおける利用のための薬理学的組成物。
１．９  好ましくは予定された危険をはらんだスポーツイベントの少なくとも２週間前に、投与される、本明細書で記述したようなＯｐｒＦ／Ｉ、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と、任意に薬理学的に許容可能な賦形剤を含む、（ベースジャンプ、バンジージャンプ、滑空、ハンググライダー、ハイワイヤ、スキージャンプ、スカイダイビング、スカイサーフィン、スカイフライング、インドアクライミング、アドベンチャーレース、過激なインラインスケーティング、ＢＭＸ、カービング、過激なモトクロス、過激なスキー、フリースタイルスキー、ランドおよびアイスヨット、マウンテンバイク、マウンテンボーディング、アウトドアクライミング、サンドボード、スケートボード、スノーボード、スノーモービル、スピードバイク、スピードスキー、スクーテリング、裸足のウォタースキー、クリフダイビング、フリーダイビング、ジェットスキー、オープンウォータースイミング、パワーボードレース、世界一周ヨットレース、スキューバダイビング、スノーケリング、スピードセーリング、サーフィン、ウェイクボード、急流カヤック、ウインドサーフィンのような）危険をはらんだスポーツを行っているヒトのような、集中治療ユニットに収納されるリスクのあるヒトにおける死亡率を減少させることにおける利用のための薬理学的組成物。
１．１０  本明細書で記述したようなＯｐｒＦ／Ｉ、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と、任意に薬理学的に許容可能な賦形剤を含む、ヒト、とりわけ任意の年齢、例えば２歳またはそれ以上の歳のヒトにおける死亡率を減少させることにおける利用のための薬理学的組成物。
１．１１  本明細書で記述したようなＯｐｒＦ／Ｉ、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と、任意に薬理学的に許容可能な賦形剤を含む、任意の種類の感染を有するヒトにおける死亡率を減少させることにおける利用のための薬理学的組成物。
１．１２  ＯｐｒＦ／Ｉ試薬が、ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、３、７〜１０およびｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１〜１３からなるポリペプチド、および前記ポリペプチドまたはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して指向する抗体またはその断片からなる群より選択される、以上で定義されたような利用のための薬理学的組成物。
１．１３  薬理学的組成物がワクチンである、以上で定義されたような利用のための薬理学的組成物。
１．１４  薬理学的組成物が、非アジュバントであるワクチンであるか、少なくともミョウバンによってアジュバントされない、以上で定義されたような利用のための薬理学的組成物。
１．１５  第一薬物基質と第二薬物基質の共投与を含み、前記第一薬物基質が、（薬理学的に効果的な量のような）効果的な量のＯｐｒＦ／Ｉ試薬、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含むワクチンであり、前記第二薬物基質が、（薬理学的に効果的な量のような）効果的な量の、とりわけ死亡のリスクを減少させることに関して、患者、ヒトまたは非ヒト動物の状態を改善している、静脈内抗生物質のような抗生物質および他の薬物基質からなる群より選択される薬剤である、以上で定義されたような利用のための薬理学的組成物。
１．１６  死亡率が、１００より少ない、以上で定義されたような利用のための薬理学的組成物。
１．１７  例えばＩＣＵ患者、好ましくは、人工呼吸器をつけたＩＣＵ患者における死亡率が、９５、好ましくは９０、より好ましくは８５、より好ましくは８０、より好ましくは７５、より好ましくは７０、より好ましくは６５より少ない、さらにより好ましくは６０より少ない、最も好ましくは５５より少ない、以上で定義されたような利用のための薬理学的組成物。
【００７７】
抗体組成物は通常、多重に投与される。単一調剤間の間隔は、毎週、毎月または毎年であってよい。間隔はまた、患者における抗体の血中濃度の測定によって示唆されるように不定期でもよい。全身投与のいくつかの方法において、調剤は、１〜１０００μｇ／ｍｌ、いくつかの方法では２５〜５００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度を達成するように調整される。あるいは、抗体を、徐放処方として投与可能であり、この場合、要求される投与の頻度は小さい。調剤および頻度は、患者における抗体の半減期に依存して変化する。一般に、ヒト化抗体は、キメラ抗体および非ヒト抗体のものよりも長い半減期を示す。調剤および投与頻度は、処置が予防的であるか、治療的であるかに依存して変化してよい。予防的適用において、比較的少ない調剤が、長時間にわたり、比較的低頻度間隔で投与される。何人かの患者は、その残りの寿命において、処置を与え続ける。治療的適用において、疾患の進行が減少または止められるまで、好ましくは、患者が疾患の症状の部分的または完全改善示すまで、比較的短い間隔で、比較的高い調剤が必要とされる。その後、患者には、予防的レジメを投与可能である。
【表１−１】
0005893640.tif 000002
【表１−２】
0005893640.tif 000003
【表１−３】
0005893640.tif 000004
【表１−４】
0005893640.tif 000005
【００７８】
本発明の実験パート
0005893640.tif 000006
【００７９】
Ａ．物質
一般物質
ＮａＯＨ（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ）、ＮａＣｌ（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ）、Ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）、Ｌ−Ｃｙｓｔｉｎｅ（Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ）、ＨＣｌ（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ）、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）  ＨＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）  ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。全ての他の物質は、他に言及しない場合、解析グレードであった。
【００８０】
処方緩衝液：ダルベッコ１×ＰＢＳ  ｐＨ７．４（Ｈ１５−００２）、１×濃度（ｇ／Ｌ）
ＫＣｌ        ０．２  ｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４    ０．２  ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ      ８．０  ｇ／Ｌ
Ｎａ２ＨＰＯ４  無水  １．１５  ｇ／Ｌ
【００８１】
薬物基質
臨床試験のために使用した薬物基質は、ＯｐｒＦ／Ｉ試薬Ａｌａ−（Ｈｉｓ）６−ＯｐｒＦ１９０−３４２−ＯｐｒＩ２１−８３タンパク質（＝ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）である。融合タンパク質構造は、Ｎ−末端Ｈｉｓ６タグを有する、２つの緑膿菌外膜タンパク質のエピトープ、ＯｐｒＦとＯｐｒＩからなる：Ｍｅｔ−Ａｌａ（Ｈｉｓ）６−ＯｐｒＦ１９０−３４２−ＯｐｒＩ２１−８３タンパク質。これは、２２４  ＡＡ融合タンパク質として、大腸菌（Ｅ．cｏｌｉ）内に発現した組換え体である。Ｎ−末端Ｍｅｔが発現後に開裂する。Ｈｉｓ６タグを含むＮ−末端ＯｐｒＦ断片は、アミノ酸Ａ−１（Ａ）からアミノ酸１６０−Ｅまでの範囲であり、位置１６１〜２２３にてＯｐｒＩ断片が続く。開始物質の構造（すなわち関連ＤＮＡ構造物）、Ａｌａ−（Ｈｉｓ）６−ＯｐｒＦ１９０−３４２−ＯｐｒＩ２１−８３タンパク質および３つのジスルフィドパターンバリアントを含むそのトリマー配座異性体の発現および精製をさらに以下で記述する。
【００８２】
一般方法
タンパク質試料の還元
ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質試料を、他に言及しないならば、β−メルカプトエタノール（２．５％  ｖ／ｖ最終容量、およそ３６０ｍＭ最終濃度）で還元した。試料をＲＴにて２０〜３０分間インキュベートして、ジスルフィド結合の完全還元を確かにした。
【００８３】
ＲＰ−ＨＰＬＣ
下流開発ワークのために、ＩＭＡＣ／Ｇ５０中の特定のＯｐｒＦ／Ｉ含量の推定が、段階収率を計算するために必要であった。ＯｐｒＦ／Ｉ含量をＲＰ−ＨＰＬＣによって決定した。ＨＰＬＣシステムを、精製した、天然の（還元していない）ＯｐｒＦ／Ｉワーキング標準で校正した。ワーキング標準のタンパク質含量を、ε０．１％＝０．３７３の１ｍｇ／ｍＬ溶液に対して計算した論理的減衰係数に基づいて、ＵＶ２８０ｎｍ測定によって決定した。ＲＰ−ＨＰＬＣによるＩＭＡＣ／Ｇ５０プールの解析の前に、一部をＤＴＴまたはβ−メルカプトエタノール（１００ｍＭ最終濃度）の添加によって還元して、種々の凝集した、および間違って折りたたまれた（もっとも可能性があるのは、ジスルフィド混乱した）ＯｐｒＦ／Ｉバリアントを分断させた。試料を室温にて３０分間インキュベートし、ＲＰ−ＨＰＬＣによって解析した。還元後、単一ピークとして溶出したＯｐｒＦ／Ｉを、未処理ＩＭＡＣ／Ｇ５０プールと比較した。ＩＭＡＣ／Ｇ５０後の還元ＯｐｒＦ／Ｉの含量を、ピークエリアの統合によって計算した。
すべての他の試料（例えば再酸化したＯｐｒＦ／Ｉ、ＱＳ−ＨＰからの区画など）を、さらなる処理なしに直接注入し、ＯｐｒＦ／Ｉ濃度を計算した。
【００８４】
再酸化した試料を、ＲＰ−ＨＰＬＣによって即時に解析可能であり、またはジスルフィド結合の形成を、ｐＨ２〜３までの酸化（〜２０μＬ  ６％ＨＣｌ／１ｍｌ再酸化溶液）によってクエンチし、続く解析のために２〜８℃にて保存可能である。
【００８５】
解析ＲＰ−ＨＰＬＣ
試料の解析ＲＰ−ＨＰＬＣ解析を、Ｄｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００  ＨＰＬＣシステムに連結したＪｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、３００Ａ、５μｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上で実施した。溶媒Ａは、０．１％  ＴＦＡを含む水であり、溶媒Ｂは０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルであった。ピークの分離を、１ｍＬ／分の流速にて１３分間、２７％Ｂから３７％Ｂの直線勾配溶出によって実施した。カラム温度を４０℃に決定した。ピーク検出を、２１４ｎｍと２８０ｎｍで実施した。
【００８６】
分離ＲＰ−ＨＰＬＣ
分離ＲＰ−ＨＰＬＣを、解析ＲＰ−ＨＰＬＣによって検出した個々のピークの単離のために使用した。精製を、Ａｋｔａ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒクロマトグラフィーシステムに連結したＪｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１０ｍｍ×２５０ｍｍ、３００Ａ、５μｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上で実施した。分離スケールでの定常相は、解析スケールで使用したものと同一であった。溶媒Ａは０．１％ＴＦＡを含む水であり、溶媒Ｂは０．１％ＴＦＡを含む水中の８０％アセトニトリルであった。試料容量は、２〜４ｍＬ（総タンパク質ロード＜２ｍｇ）であった。ピークの分離を、２．５ｍＬ／分の流速にて、８カラム容量にわたり、３５％Ｂから４０％Ｂまでの直線勾配溶出によって実施した。カラム温度を４０℃に設定した。ピーク検出を２８０および２１４ｎｍにて実施した。０．８ｍＬの画分を回収し、ｐＨを０．２５ｍＬ  ０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０の添加によって、ｐＨ〜７に調整した。より多量（〜０．５〜２ｍｇ）のＰ１〜４を、種々の分離精製実行によって調製した。個々のピークを含む望む画分のプール後、試料を、５ｋＤａ超遠心装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いておよそ５回濃縮した。濃縮したプールを、ＰＤ１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって脱塩し、緩衝液を、最終薬物産物処方緩衝液（０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ〜７で希釈した１／１０ＰＢＳ）に対して交換した。単離したＯｐｒＦ／Ｉバリアントを含む最終試料を、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＥＣ−ＨＰＬＣによって、純度および含量に関して解析した。ＲＰ−ＨＰＬＣによって決定した相対純度は、少なくとも９０％であった。試料を、さらなる解析まで、−２０℃にて保存した。
【００８７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、ＭＥＳランニング緩衝液を用いて、４〜１２％  ＮｕＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で実施した。試料を、還元または非還元条件下、ＬＤＳサンプリング緩衝液と混合し、他に言及しない場合、７０℃にて５分間インキュベートした。染色を、コロイドクーマシーまたは銀染色で実施した（Ｈｅｕｋｅｓｈｏｖｅｎ）。
【００８８】
ウエスタンブロット解析
ウエスタンブロッティングを、抗体抗ＯｐｒＦ／Ｉ  ９４４／５  Ｄ５エピトープ（１：２００００希釈）および９６６／３６３  Ｅ３エピトープ（１：１００００希釈）で実施した。
【００８９】
ｐＨおよび伝導度測定
試料および緩衝液のｐＨおよび伝導度の測定のために、ＷＴＷ  ７２０システムを使用した。伝導度を、２５℃にて、直線温度保証モデルを用いて測定した。
【００９０】
エンドトキシン測定
エンドトキシン測定を、発色ＬＡＬ−アッセイ（Ｃａｍｂｒｅｘ）で実施した。選択した試料をまた、従来のゲルクロットアッセイ（Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ試験）にて、外部の認定研究所でも測定した。
【００９１】
宿主細胞タンパク質測定（ＨＣＰ）
ＨＣＰｓの定量のために、ジェネリック大腸菌ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡキット（Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用した。
【００９２】
ペプチド−質量フィンガープリントおよびジスルフィドマッピング
分離ＲＰＣから得た精製した画分を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって解析した。試料を、還元なしで、または還元およびアルキル化の後、ＡｓｐＮまたはトリプシンで消化した。
【００９３】
ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量分析
ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ解析を、Ｖｏｙａｇｅｒ  ＳＴＲ  ４０６９システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で実施した。０．１％ＴＦＡ／３０％ＡｃＮ中に溶解したシナピン酸を試料マトリックスとして使用した。ＤＳ試料を、試料マトリックスで５倍希釈し、２μｌを標的上に配置した。遅延抽出モードと陽性極性を使用した。システムを、ＢＳＡ（質量校正キット、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で外部校正した。内部校正のために、ミオグロビン（Ｓｉｇｍａ  Ｍ−０６３０、平均Ｍｒ  １６９５１．５）をおよそ１００μｇ／ｍＬの濃度にて、ＤＳ試料内にスパイクした。内部校正のための質量精度を、外部校正±０．６％（例えば２４１００±１４５Ｄａ）に対して、およそ±０．３％（例えば２４１００±７２Ｄａ）で推定可能である。
【００９４】
ネイティブＰＡＧＥ
ネイティブＰＡＧＥＴＭ  Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌシステムは、ネイティブ（非還元）電気泳動を実施するために、中性周辺ｐＨ、プレキャストポリアクリルアミドミニゲルシステムである。ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質試料のネイティブＰＡＧＥを、製造業者の取り扱い説明書にしたがって、ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ  ４−１６％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で実施した。試料緩衝液は、５０ｍＭ  ＢｉｓＴｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１６ｍＭ  ＨＣｌ、１０％  ｗ／ｖグリセロール、０．００１％Ｐｏｎｃｅａｕ  Ｓ、ｐＨ７．２であった。ランニング緩衝液は、５０ｍＭ  ＢｉｓＴｒｉｓ、５０ｍＭトリシン、ｐＨ６．８であった。カソード緩衝液は、０．０２％クーマシーＧ−２５０を含むランニング緩衝液であった。
【００９５】
Ｎ−末端シークエンシング
Ｎ−末端シークエンシングを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４９４ＨＴ機器と、Ｎ−末端Ｅｄｍａｎシークエンシングの方法を用いて実施し、そこでタンパク質のＮ−末端アミノ酸を、化学的に連続して取り除き、ＨＰＬＣによって同定した。タンパク質をまず、ＰＶＤＦ膜上にブロッティングするか、またはバイオブレン処置ガラスファイバーフィルター上に吸収するかいずれかによって、シークエンシング装置内部に固定化した。続いて、結合したタンパク質が、高ｐＨにて、Ｅｄｍａｎ試薬（フェニルイソチオシアネート、ＰＩＴＣ）と反応した。本反応後、得られた化合物を、無水酸を用いてタンパク質を切断された。カップリングおよび開裂工程を、必要なほど多くの回数繰り返した。通常１５〜２０ＡＡが解析可能であった。開裂された産物を、無水酸でその安定なフェニルチオヒダントイン、ＰＴＨに変換し、ついで、オンボードＨＰＬＣを用いて解析した。アミノ酸の同定を、標準混合物と比較して、溶出時間を比較することによって達成した。ＨＰＬＣからデータを、配列のビジュアルリーチングのためにコンピュータ上で回収した。
【００９６】
チオール基のアルキル化
タンパク質中の遊離チオール基を、システインの遊離チオール基と選択的に反応して、カルボキシアミドメチルシステインを産出する、ヨードアセトアミドを用いたアルキル化によって検出可能である。遊離チオール基が存在する場合、共有的にブロックされて、付着したヨードアセトアミド分子あたり５７Ｄａの質量増加となる。
【００９７】
４７ｍｇのヨードアセトアミドを、１ｍＬ  １Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中に溶解した（０．２Ｍヨードアセトアミド溶液）。それぞれ２００μＬの精製したピーク１、２および３（タンパク質濃度およそ２００μｇ／ｍＬ）を、２０μＬのヨードアセトアミドストック溶液と混合した（最終ヨードアセトアミド濃度〜０．０２Ｍ）。ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質試料（タンパク質濃度およそ１ｍｇ／ｍＬ）を、およそ３３０μｇ／ｍＬの最終濃度まで、ＰＢＳにて３倍希釈した。３０μＬのヨードアセトアミドストック溶液を、３００μＬの希釈したＤＳに加えた。他の実験において、試料を、希釈およびアルキル化の前に５ｍＭ  ＤＴＴ（２０分）で還元した。すべての試料を、３０分間、暗所中、室温にてインキュベートし、続いてＬＣ−ＭＳ解析した。
【００９８】
静的光散乱解析
クロマトグラフシステムは、Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００ポンプおよびデガッサ、Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００オートサンプラーおよびＵｌｔｉｍａｔｅ３０００カラムコンパートメントを含むＤｉｏｎｅｘからのＨＰＬＣシステムからなる。カラムおよびクロマトグラフ条件は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣに関して記述したものと同様であった。全ての溶媒を、０．１μｍ  Ｓｕｐｏｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅフィルター（Ｐａｌｌ  ＶａｃｕＣａｐ  ６０）を通して濾過した。１００μＬの注入容量を、他に言及しない場合にすべての試料で使用した。
【００９９】
クロマトグラフ検出器は、オンラインモードにて使用した、２１４ｎｍおよび２８０ｎｍに設定したＤｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００フォトダイオードアレイ検出器、Ｓｈｏｄｅｘ  ＲＩ−１０１屈折指標検出器、およびＤＡＷＮ  ＴＲＥＯＳ  ＭＡＬＳ（多角光散乱）検出器（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含んだ。クロマトグラフデータ回収および解析を、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウェアパッケージ（ｖｅｒｓ．６．８０、Ｄｉｏｎｅｘ）を用いて実施した。ＭＡＬＳ−シグナルの実験的回収およびデータ解析を、ＡＳＴＲＡソフトウェアパッケージ（バージョン５．３．２．１３、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で実施した。本ソフトウェアを用いて、ＵＶ−およびＲＩ−シグナルにそって、光散乱シグナル（３ＭＡＬＳ角度）を回収し、続いて解析可能であった。
【０１００】
解析超遠心（ＡＵＣ）
すべての実験を、５０．０００ｒｐｍおよび２５℃にて、ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ  ＸＬ−Ｉ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅで実施した。試料を、１２ｍｍ光路長の、サファイアキャップ２セクターチタンセンターピース中に配置した。３９０μＬの溶液および溶媒を、それぞれ試料および参照セクター中に配置した。沈降トレースを、屈折指標（干渉光学）における局所差違を記録することによって検出した。試料を、１０倍希釈で、またはさらなる希釈無しで解析した。拡散補正Ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ（ＳＣＤ）をＰ．Ｓｃｈｕｃｋ，ＮＩＨ（Ｐｅｔｅｒ  Ｓｃｈｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｖｏｌ５４，Ｉｓｓｕｅ５，ページ３２８−３４１、２０００年１０月）によって提案された有限エレメントアプローチを用いて計算した。摩擦比ｆ／ｆ０を、フィッティング変数として処理した。緩衝液（リン酸緩衝食塩水、ＰＢＳ）の密度および粘度ならびにタンパク質の部分特異的容量（ｖ）を、Ｓｅｄｎｔｅｒｐでの組成から計算した。これらの値を、それぞれのＳＣＤを計算するときに使用した。
【０１０１】
ＲＰ−ＨＰＬＣによる水酸化アルミニウムを含むＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質試料の解析
処方されたＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質の一部（０．２５ｍｌ）を、２０℃にて１０分間、１６０００×ｇにて遠心し、上清から、水酸化アルミニウム沈殿を分離した。透明な上清を取り除き、ＲＰ−ＨＰＬＣによって、未結合融合タンパク質の解析のために使用した。残ったペレットを、０．２５ｍｌの水中０．１％  ＴＦＡ（ｐＨ〜２）中で再懸濁させた。試料をＲＴにて２時間インキュベートし、つづいて１０分間、室温にて１６．０００ｇでの遠心をして、アルミニウム粒子をスピンダウンした。透明な上清をＲＰ−ＨＰＬＣによる解析のために使用した（ＴＦＡ脱着）。
【０１０２】
特定の方法および結果
ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質の発現と回収
ＯｐｒＦ／Ｉは、緑膿菌外膜部分タンパク質ＯｐｒＦおよびＯｐｒＩの融合タンパク質である。そのＮ−末端にてＨｉｓ６−タグを含む、２２４のａａ融合タンパク質として発現する。Ｎ−末端Ｍｅｔが、大腸菌での発現の後に開裂する。（Ｎ−末端メチオニンを含む）発現したタンパク質の一次構造をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で示している。
【０１０３】
天然のタンパク質の分子量が、２４１１８．２Ｄａ（完全還元タンパク質、Ｎ−末端メチオニン無し）と計算された。ｐＩは５．３と計算された。
【０１０４】
本実施例のタンパク質は、Ｎ−末端ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含む、外膜タンパク質ＦおよびＩの融合タンパク質である。本タンパク質は、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＴｒｃ−Ｋａｎ−ＯｐｒＦ／Ｉ＿Ｈｉｓ株中で発現させた。ＯｐｒＦ／Ｉ−Ｈｉｓタンパク質を３０℃にて可溶性形態で細胞内に発現させた。
【０１０５】
細胞溶解
ＯｐｒＦ／Ｉは、とりわけ高濃度のＮａＣｌとイミダゾールなしでの溶解緩衝液を使用する時に、細菌プロテアーゼによって分解されうる。したがって、細胞を、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０６Ｍイミダゾールからなる冷却溶解緩衝液（緩衝液中細胞ペーストの１：５希釈）中に再懸濁させた。０．５Ｍ  ＮａＣｌの添加がとりわけ、溶解物中の分子のタンパク質分解を阻害した。再懸濁と続く均質化（８００ｂａｒにて２サイクル）を、冷室温にて実施し、溶解物をすぐに氷上に置いた。より高い温度が、産物の分解またはより高いプロテアーゼ活性を導きうる。
【０１０６】
ＩＭＡＣ−銅捕獲段階
（銅イオンでロードした）Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦを、Ｈｉｓ−タグ化ＯｐｒＦ／Ｉを捕獲するために使用した。溶解物をロードした後、溶出を、異なる濃度のイミダゾール、０．０７Ｍ、０．３２５Ｍおよび０．５Ｍイミダゾールで実施した。ＯｐｒＦ／Ｉ含有画分が、２つの別のピークとして、０．３２５Ｍイミダゾールにて溶出する。解析データは、ＲＰ−ＨＰＬＣ溶出プロファイルが種々のピークを含むことを示した。同一の試料を、還元条件（ＤＴＴまたはβ−ＭＥの添加）下で解析した場合、ただ１つのピークが観察された。未処理試料中の種々のピークが、ほぼ確実に天然の分子のジスルフィド混乱バリアントおよび凝集体であった。
【０１０７】
例示的精製実行を、８．５９Ｌの発酵ブロスと等価である、９９２ｇ細胞ペーストで実施した。ＩＭＡＣ精製およびＳｈｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ５０上での脱塩（以下を参照のこと）の後、ＯｐｒＦ／Ｉの総量はおよそ１６００ｍｇであり、これは、１８６ｍｇ  ＯｐｒＦ／Ｉ／リットル発酵ブロスと等価である。
【０１０８】
Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０上での脱塩
本段階は、低分子量不純物（たとえばイミダゾール、銅など）の含量を減少させ、緩衝液交換を実施した。ローディング容量は、カラム容量のおよそ２０％であった。溶出緩衝液０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０を使用した。これは、還元および再酸化のために使用した緩衝液と同一であった。あるいは、本段階をまた、１００Ｋカットオフ膜でのＵＦ／ＤＦによって置換した。
【０１０９】
還元
ＩＭＡＣ／Ｇ５０段階の後、ＯｐｒＦ／Ｉは、図５で略図的に描写したようなジスルフィドスクランブリングによって引き起こされた、誤ってたたまれた形態（高および低分子量凝集体）の不均一混合物として存在する。ジスルフィド結合の還元を、５ｍＭ  ＤＴＴで実施し、すべての分子間および分子内ジスルフィド結合を切断した。完全に還元したタンパク質は、ＲＰ−ＨＰＬＣデータにしたがって、単一ピークとして溶出する。ＤＴＴを、β−ＭＥによって置換可能である。ＤＴＴは、水溶液中で長期間安定ではないので、新たに調製したＤＴＴ溶液（水中１Ｍ、１時間以内に使用）の一部を、穏やかに攪拌して、ＩＭＡＣ／Ｇ５０プールに加える（１Ｍ  ＤＴＴストック溶液の５ｍＬ／リットルＩＭＡＣ／Ｇ５０プール）。このプールを、攪拌せずに３０分間、室温にてインキュベートする。試料を、ＲＰ−ＨＰＬＣによって解析して、還元の進行をモニタ可能である。
【０１１０】
再酸化
再酸化条件の最適化のために、異なる酸化還元システム（ＧＳＳＧ／ＧＳＨ、シスタミン／システアミン、シスチン／システイン）を、ジスルフィド結合の正確なリシャッフリングを許容するために、低濃度のＤＴＴ（１ｍＭ）の存在下で試験した。再酸化の進行（ジスルフィド結合の形成）を、折りたたみバリアントは異なる保持時間を持つので、種々の時間間隔の後に、ＲＰ−ＨＰＬＣによってモニタ可能である。種々の酸化還元システムの初期研究の後、シスチンを酸化試薬として使用することが決まった。シスタミン／システアミンでの再酸化は、試験した条件下では、成功しなかった。ＩＭＡＣ／Ｇ５０プールの還元／再酸化前後の代表的なＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＥＣ溶出プロファイルを図６および図７で示している。０．５ｍＭシスチンの存在下での再酸化の後、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＥＣによって観察された溶出プロファイルは、「未処理」ＩＭＡＣ／Ｇ５０プールと比較して、非常により均一であった。還元前にＩＭＡＣプール中に存在する種々のピークが、還元条件下１つの主要なピークにシフトする。再酸化の後、１つの主要なピーク（図８にてピーク２と命名）が、還元されたタンパク質と比較して、異なる保持時間にて観察された。ピーク２は、正確に折りたたまれたＯｐｒＦ／Ｉを表すべきである。ピーク２は、折りたたみバリアントであるべきである、３つのより小さなピーク（図８中ピーク１、ピーク３およびピーク４）によって囲まれる。図８中ピーク５およびピーク６と命名した、およそ１３．１７および１３．８１分にて溶出されるピークは、他の折りたたみバリアント（ＭＳデータにしたがって、ジスルフィド架橋凝集体）である。
【０１１１】
ＬＣ−ＭＳによるピーク１のさらなる特性化は、ピーク２と比較して、２４０Ｄａの分子量での増加を示した。この質量シフトは、ほぼ確実に、２つの分子システインの共有結合によって引き起こされた。遊離システインが、ＤＴＴのシステインとの反応によって形成され、結果として２分子システインとなった。酸化剤（ＧＳＳＧまたはシスチン）の濃度の増加にて、ピーク１が増加する一方で、ピーク２が、減少することがさらに発見された。
【０１１２】
ＳＥＣによる再酸化後の主要ピークの評価が、タンパク質がモノマーとして存在しないことを示している。ＳＥＣカラムを、１．３５〜６７０ｋＤａの範囲の参照タンパク質（ＢｉｏＲａｄのサイズ排除標準）で校正した。主要ピークの保持時間（〜２５分）は、球形状および、固定相との非特異的相互作用無しの想定下、〜１８０ｋＤａの計算された理論質量に相当する。この定義された多重状態が、適用され、ＮａＣｌ．の存在下、中性ｐＨにて、水溶液中安定であると見られる処理および処方条件下、好ましく形成されたことが観察された。ｐＨ７〜８にて、ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質が、１８０ｋＤａに相当しているマルチマーとして溶出し、一方酸性試料（ｐＨ〜２）中、ピークは、およそ５５ｋＤａに相当しているより高い保持時間（〜２８分）にシフトとする（図９を参照のこと）。保持時間のこの効果は、低ｐＨにてマルチマーの解離によって引き起こされうる。
【０１１３】
第一組の実験において、ＧＳＳＧおよびＧＳＨを、再酸化試薬として試験した。５ｍＭ  ＤＴＴ中の還元したＩＭＡＣ／Ｇ５０プールを、穏やかにかき混ぜながら、ＧＳＳＧ（０〜４ｍＭ）を含む、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．０中に５倍希釈した。ＤＴＴはＧＳＳＧと反応し、ＧＳＨ、ＧＳＳＧおよび還元／酸化ＤＴＴを形成する。試験した最終再酸化条件は、ＧＳＨ、ＧＳＳＧおよびＤＴＴの広範囲の異なる比をカバーしている。試料の一部をまた、種々の時間間隔後、ＨＣｌでクエンチし、ＲＰ−ＨＰＬＣによって解析した。ＧＳＳＧ濃度の増加にて、ピーク１が増加し、ピーク２が減少する。ピーク１の形成は、再酸化工程にて非常に早く発生し、長時間一定に残る。ピーク１＋２に対する総回収は、完全に還元したタンパク質（１００％）から開始して、〜６０％であることが推定され、すべての検出されたピークの回収は、開始物質と比較しておよそ９０％であった。
【０１１４】
第二組の実験において、シスチンとシステインを、再酸化試薬として試験した。還元されたＩＭＡＣ／Ｇ５０プール（５ｍＭ  ＤＴＴ）を、種々の濃度のシスチン（０〜３ｍＭ）およびシステイン（０〜３ｍＭ）を含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．０中に５倍希釈した。最終ＤＴＴ濃度は１ｍＭであった。０．２Ｍのシスチンのストック溶液を、０．５Ｍ  ＮａＯＨ中で調製したことを注意のこと。試料を、室温にて３００分後および一晩のインキュベーション後に解析した。２つの時間点間の、各個々の実験に対するＲＰ−ＨＰＬＣピークパターンでの差違は、１ｍＭ  ＤＴＴを含み、シスチンを含まない試料を除いて、観察されなかった。タンパク質をまた、５時間後還元し、一晩インキュベーション後にピーク２が現れた。最終シスチンおよびシステイン濃度に依存して、異なる比のピーク１とピーク２が検出された。ＲＰ−ＨＯＬＣプロファイルは、ピーク１濃度が、０．５ｍＭシスチンの存在下でもっとも低かったことを示した。
【０１１５】
ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦによる精製
再酸化後の陰イオン交換クロマトグラフィーによる処理ストリームを含むＯｐｒＦ／Ｉのさらなる精製を、残っているエンドトキシンとｇＤＮＡの含量を減少させるために試験した。これらの残っている不純物は、中性〜わずかに塩基性ｐＨにて、より高い伝導度にてでさえも、陽イオン交換培地に結合し、一方産物は、フロースルー中残るはずである。ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを試験し、樹脂上へのＯｐｒＦ／Ｉの結合による任意の主要な産物の欠損なしに、エンドトキシンを除去するための良好な特性を持つことがわかった。
【０１１６】
Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（ＱＳＨＰ）による精製
再酸化とＤＥＡＥフロースルークロマトグラフィーの後、タンパク質溶液をさらにＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰによって精製した。ＱＳＨＰによる精製が、主要プール中の〜２ＥＵ／ｍｇのエンドトキシン濃度をもたらし、これは許容可能な低レベル内である。
【０１１７】
超濾過／透析
最後に、ＱＳ−ＨＰプールを、処方緩衝液（１×ＰＢＳ緩衝液  ｐＨ７．４、ダルベッコ、Ｃａ、Ｍｇなし）に対して透析した。１０ｋＤａまたは３０ｋＤａ再生セルロース膜（Ａmｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １５遠心フィルター装置、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用した。ＯｐｒＦ／Ｉが、３０ｋＤａ膜の浸透中検出された。したがって、１０ｋＤａ膜を、処方緩衝液中の最終ＵＦ／ＤＦに対して使用し、結果として＞９５％の段階収率となった。プールを、ＵＶ測定に基づいて、１ｍｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度に調整した。
【０１１８】
全産出および精製工程の概説を図１０で示す。約３４％〜約４０％の精製ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質の総合収率が達成された。
【０１１９】
精製ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質の特性か
ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質バリアントの予備単離
ＱＳＨＰクロマトグラフィー段階からの選択された側画分を、予備単離のために使用した。典型的な予備溶出プロファイルと、検出されたピークのノミネーションを図１１に示す。個々のピークを含むすべての画分を合わせて、還元および非還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによって解析した。還元条件下、すべてのバンドが、ＯｐｒＦ／Ｉ標準と比較して同様の移動特性をもった。非還元条件下、およそ６０ｋＤａ（分子量マーカ−に対して校正した）にて検出された多量体ＯｐｒＦ／Ｉバリアントの含量は、ピークＣ、Ｄ、５および６に対して増加した。すべてのバンドをまた、モノクローナル抗ＯｐｒＦ／Ｉ抗体を用いてウエスタンブロット解析によって検出した。これらの結果は、ＲＰ−ＨＰＬＣによって検出されたすべてのピークが、産物関連であることを示唆している。この発見はまた、個々の画分のペプチド質量フィンガープリント解析によって確認された。最終のＤＳにおいて、Ｐ１、２、３、４および５のみが、ＲＰＣによって検出可能である。他のピーク、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄおよび６は、主要画分からＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ上での分離クロマトグラフィーによって分離可能であった。Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰクロマトグラフィーの間、小さなピークが、主要ピーク前に溶出された。この画分は、解析ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴｏＦによる検出では、より高い濃度のＯｐｒＦ／Ｉ分解産物（７ｋＤａのピークとして示される）を含んだ。このピークはまた、１５．５ｋＤａおよび７．２ｋＤａ  ＯｐｒＦ／Ｉ断片からなる産物関連断片であることも示された。
【０１２０】
ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質バリアントの解析特性化
精製したＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質は、ＲＰ−ＨＰＬＣによって示されたような分子の異なる形態からなる（図８を参照のこと）。５つのピークが、ＲＰ−ＨＰＬＣによって検出可能であった。ピーク２（Ｐ２）は、ピーク１（Ｐ１）、ピーク３（Ｐ３）およびピーク４（Ｐ４）によって囲まれた、５０〜５５％の相対含量でのもっとも顕著なピークであった。ピーク５（Ｐ５）は、わずかに高い保持時間にて溶出されている他のピークからよく分離された。相対ピーク含量を表２にて要約した。β−ＭＥまたはＤＴＴでの試料の還元の後、溶出プロファイルが変化する。１つの主要なピークが溶出し、個々のバリアントが、同一のクロマトグラフ保持時間を示す。これらの結果に基づき、Ｐ１〜Ｐ４が、ジスルフィド結合における差違によって引き起こされる折りたたまれたバリアントとして認識される。
【表２】
0005893640.tif 000007
【０１２１】
ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ解析
ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ解析に関して、システムを、ＢＳＡに対して外部で校正した。内部校正のために、ミオグロビンを使用した。すべての４つの試料が、同様の質量スペクトルを示した。主要シグナルは、天然のＯｐｒＦ／Ｉモノマーからであり、続いて、ＯｐｒＦ／Ｉダイマーおよびトリマーピークであった。表３は、内部校正後に得た分子量を要約している。予想された分子量からの偏差は、実験誤差（±０．３％）内であった。２４ｋＤａ、４８ｋＤａおよび７２ｋＤａでの質量ピークが検出され、これは、単量体、二量体および三量体ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質の存在を示している。
【表３】
0005893640.tif 000008
【０１２２】
ネイティブＰＡＧＥ
非還元および還元条件下、ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質試料のネイティブＰＡＧＥを、以上で説明したように実施した。クーマシーブルー染色後のバンド強度を、濃度測定によって評価した。天然条件下、１つのＯｐｒＦ／Ｉ主要バンドが、およそ９４〜９７％の相対強度にて、およそ１８０ｋＤａの範囲で検出された。還元条件下、明白な分子サイズは、２０６ｋＤａと測定された。明確な分子量は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣデータと良好な相関があるが、ＯｐｒＦ／Ｉ質量が８０ｋＤａ（トリマー）の範囲内であったＳＥＣ−ＭＡＬＳおよびＡＵＣ結果からは異なった。ネイティブＰＡＧＥの分離機構は、ネイティブＳＥＣと同様であり、分離特性は、ゲルを通過した時の、タンパク質複合体の形状に強く依存する。この結果は、ＯｐｒＦ／Ｉが、高い流体力学半径を持つ、ある程度細長い形状を有することを裏付ける。
【０１２３】
Ｎ−末端シークエンシング
２つの異なる試料の最初の１３または１５ａａを解析した。理論および推定アミノ酸配列間に差は発見されなかった。シークエンシング結果により、Ｎ−末端Ｍｅｔが、発現の間完全に開裂したことが確認された。
【０１２４】
チオール基のアルキル化
ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質試料のチオール基のアルキル化の結果は、質量が、ヨードアセトアミドの４つの結合した分子に相当する、＋２２６Ｄａのアルキル化後に増加したことを示した（理論質量増加、＋２２８Ｄａ；結合したヨードアセトアミド分子あたり、＋５７Ｄａの質量増加）。還元タンパク質が、４つの遊離システイン残基を含むので、本結果は推測された。すべての他の試料は、質量の増加を示さなかった。これらの結果に基づいて、ＲＰ−ＨＰＬＣのピークＰ１（図８）は、１つのさらなるジスルフィド結合を含む、二つ折りシステイン化バリアントとして考えられる。ピークＰ２およびＰ３は、２つのジスルフィド結合を含むバリアントとして考えられた。
【０１２５】
静的光散乱（ＳＥＣ／ＭＡＬＳ）
屈折率でのＳＥＣ／２８０ｎｍでのＵＶ検出を、タンパク質の特性化と分子量検出のために、光散乱と組み合わせた。分子量は、２３〜２６分で溶出している主要ピークの切片にわたって一定であったので、定義された単分散分子種が溶出された。主要ピークに関しておよそ８０〜８６ｋＤａの範囲の分子量が検出された。累積質量画分は、９４〜９８％の範囲内であった（種１）。
【０１２６】
２０〜２２分の間に溶出している高分子量画分（種２）が、１４０〜１９０ｋＤａの範囲内の分子量を示した。高分子量画分に対する、低いＲａｙｌｅｉｇｈシグナル強度のために、検出された分子量が、より高い程度の変動を示した。種２の累積質量画分が、１２０〜２００ｋＤａの範囲にて、０．５〜１％の範囲内であった。
【０１２７】
これらの結果は、ＯｐｒＦ／Ｉが、トリマーとして存在すること（種１）、およびタンパク質の小さな部分のみが、より高い分子量の凝集体を形成すること（種２）を示している。
【０１２８】
ＳＥＣ−ＭＡＬＳによって得た結果はまた、ＡＵＣ結果とよい相関である（以下を参照のこと）。ＳＥＣ／ＵＶ検出およびネイティブＰＡＧＥによって得た結果は、１８０ｋＤａの範囲にて、ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質に対するより高い分子量を示唆した。ＳＥＣおよびネイティブＰＡＧＥによって得た結果は、球状タンパク質形状の推定に基づき、一方タンパク質形状は、静的光散乱またはＡＵＣデータに影響を与えない。適用した異なる方法からの結果に基づいて、ＯｐｒＦ／Ｉトリマーは、球形状では存在しないが、大きな流体力学半径を示すと結論づけられた。
【０１２９】
解析超遠心（ＡＵＣ）
沈降速度プロファイルを記録し、ＳｅｄＦｉｔソフトウェアにて解析して、試料コンポーネントの沈降係数値を産出した。個々の種１（ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質主要ピーク）およびピーク２（凝集体）に対する得られた計算された沈降係数と分子量を測定した。ドミナントコンポーネント種１に対する沈降係数値は、研究したすべての試料に対してかなり良好に一致する。このことは、試験した異なる試料間で、有意な差が存在しないことを示唆する。主要コンポーネント種１のモル質量は、本パラメータに対して、実験的変動内で異なる。これは一般に、ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質のトリマーを示唆する。配列から計算したように、モノマーおよびトリマーのモル質量は、それぞれ２４．１ｋｇ／モルおよび７２．３ｋｇ／モルである。
【０１３０】
このトリマーの解離は、試験した濃度範囲にわたって発生しなかった。トリマーに対するストークス半径を５．６ｎｍであると計算した。推定したトリマー質量の球形タンパク質のストークス−半径は２．８ｎｍである。これは、非常に非対称および／または水和分子を示唆する。種２は、種々の沈降係数にて、異なるピークとして現れた。これは、種２が、非特異的凝集とは反対に、異なる化学量論（ヘキサマー、ナノマーなど）をもつコンポーネントに相当することを示唆する。これらのデータは、天然のＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質がトリマーとして存在することを示しているＳＥＣ−ＭＡＬＳ結果に非常によく相関するが、ＳＥＣおよびネイティブＰＡＧＥによって得られた計算分子量からは有意に異なる（非球形状による質量の過大評価）。沈降速度実験からの第一およびもっとも信頼できるパラメータは、沈降係数それ自身である。ＳＣＤの計算のために、単一の摩擦係数が、計算したすべての沈降係数に対して適用するために推測された。フィッティング段階にて最適化された。摩擦係数は、ＳＣＤのモル質量分布（ＭＭＤ）への変換のために必要である。本研究において、沈降係数＜２Ｓに対するシグナルのみが、１０倍希釈で見られた。可能性は、種１が変化しなかったので、本ピークが、ＯｐｒＦ／Ｉの推定モノマーに相当すると規定されうる。結論として、ＯｐｒＦ／Ｉは、三量体分子として溶液内に存在する。試験した濃度範囲にわたり解離は発生しなかった。
【０１３１】
ジスルフィドマッピング
ＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳ解析を用いるジスルフィド結合マッピング
試料ピーク１（Ｐ１）の潜在的システイン化が、トリプシン消化の直線モードスペクトル中で示されうる。システイン残基を含むペプチドが、システイン化効果を示している、約２４０Ｄａの差を示した（２システイン）。
【０１３２】
２１００．０ＤａのＭＨ＋を示している参照試料のシステイン３３およびシステイン４７間の潜在的ジスルフィド架橋ペプチドが、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳによって断片化された。２つの標識されたシステインが、ジスルフィド橋によって架橋される。本ペプチドはまた、試料ピーク１（Ｐ１）およびピーク２（Ｐ２）で発見されたが、試料ピーク３（Ｐ３）では発見されなかった。
【０１３３】
ナノ−ＭＳ／ＭＳ解析を用いるジスルフィド結合マッピング
本研究の目的は、ピーク１、２および３間のジスルフィド橋パターンにおける差を同定することである。ピークを単離し、濃縮した。第一配列は、位置１８（Ｃ１）、２７（Ｃ２）、３３（Ｃ３）および４７（Ｃ４）にて４つのシステイン残基を含む（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を参照のこと）。オンラインＬＣ／ＥＳ−ＭＳによる無傷の分子量測定のデータから、ピーク１が１つのジスルフィド橋と２つのシステイン化を含み、ピーク２および３が２つのジスルフィド橋を持つことが結論づけられた。すべての３つのピークのトリプシン消化によって、ペプチド断片１〜５５が産出され、これはタンパク質のすべての４つのシステインを含む。３つのピーク中の本断片に関して観察された質量により、アサイメントが、無傷のＭＷ解析を形成することが確認された。すべての３つのピークからのペプチド断片１〜５５を回収し、ＡｓｐＮにて補助消化し、ＬＣ−ＭＳによって解析した。生データの解釈に基づいて、図１２にしたがった構造が、３つの異なるピーク中のプレドミナントコンポーネントに対して導かれた。
【０１３４】
これらの発見は、ＡｓｐＮ補助消化からの選択されたシグナルの還元とＭＳ／ＭＳ実験によって確認された。ジスルフィド橋パターンに加えて、脱アミド化が３つの異なるピークで観察された。トリプシンペプチド１２０〜１３２にて、Ａｓｎ１２４がおそらく部分的に脱アミド化される。異なるペプチドにおいて、Ａｓｎ４５の脱アミド化が同様に観察された。
【０１３５】
安定性における温度の影響
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（還元および非還元条件）を、１０日にわたり、異なる温度にてインキュベートしたＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質試料に関して走らせた。還元ゲル中のＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質主要バンドの相対含量を、２〜８℃試料（参照）へのバンド強度の校正によって、ゲルの濃度評価によって計算した。１０日の保存期間にわたり、−８０℃、−２０℃、２〜８℃およびＲＴ（２０℃）にて保存した試料に対して、分解およびバンドパターンにおける変化は観察されなかった。
【０１３６】
安定性におけるｐＨの影響
ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質試料を、ｐＨ１．９８〜ｐＨ１１．１にて異なるｐＨ値でインキュベートし、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＥＣ−ＨＰＬＣによって解析した。非共有トリマーに相当するＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質の主要ピークが、２〜８℃にて２３日の保存期間にわたり、ｐＨ５．９〜１１．１にて、およそ９０％一定であった。トリマーは、低ｐＨ（ｐＨ２）にて可逆的に分離する。
【０１３７】
添加物／アジュバントとしての水酸化アルミニウム
ＲＰ−ＨＰＬＣ結果は、ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質がさらに、水酸化アルミニウム上への結合によって、ｐＨ４．８８にて安定化可能であり、高回収で脱着可能であったことを示した。
【０１３８】
異なるＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質画分の免疫原性
５匹のＢＡＬＢ／ｃマウス／群に、１ｍｌの異なるＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質画分（ＲＰ−ＨＰＬＣ画分のピーク１、２および３）と、未画分化ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質（ＤＳ）を、０日および１４日にて、ｉ．ｐ．で与えた。２１日目に、マウスの血液を、特定の抗体に関して試験し、値（ＧＭＴ［μｇ／ｍｌ］＋ＳＤ）を特定の用量（μｇタンパク質）にて決定した。結果を表４にて要約する。
【表４】
0005893640.tif 000009
【０１３９】
すべての画分ならびに未画分化ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質が特定の抗体を誘導したと結論づけた。ピーク２画分に対するＥＤ５０値がさらに、５．６μｇとして測定された（未画分化ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質：１．８μｇ）。
【０１４０】
結論
１．ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質ならびにその三量複合体は、ＩＭＡＣ−Ｃｕ捕獲段階にて開始して、４０％までの総収率で、架橋されたジスルフィド凝集体なしに産出および精製可能である（すなわち、ＳＥＣにしたがって、約９０％以上のトリマー含量および１％より少ない凝集体含量トのリマーの形態でのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）。
２．異なる産出ロット中で産出されたＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）は、非常に一貫した。
３．ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）は、およそ８０ｋＤａの平均分子量と、９４〜９８％の相対含量をもつ天然外膜タンパク質ＯｐｒＦとして、生理学的条件下、トリマーとして存在する。
４．本発明にしたがって産出されたＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）は、ＲＰ−ＨＰＬＣによって、種々のバリアントに分離可能である（図８および１２を参照のこと）。ピーク１（Ｐ１）は、位置１８（Ｃ１）と２７（Ｃ２）間にジスルフィド結合を含む、位置３３（Ｃ３）および４７（Ｃ４）にて二つ折りシステイン化付加物である（またＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１を参照のこと）。ピーク２（Ｐ２）は、位置１８（Ｃ１）〜２７（Ｃ２）および３３（Ｃ３）〜４７（Ｃ４）にて、２つのジスルフィド橋を含むバリアントである（またＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２参照のこと）。ピーク３（Ｐ３）はさらに、位置１８（Ｃ１）〜４７（Ｃ４）および２７（Ｃ２）〜３３（Ｃ３）にて、２つのジスルフィド橋を含むバリアントである（またＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３を参照のこと）。
５．ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）は、１０日の期間にわたり、−８０℃〜＋２０℃、および２〜８℃にて２３日間にわたりｐＨ５．９〜１１．１にて、安定である。ｐＨ４．８８にて、ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質をさらに、水酸化アルミニウム上に結合することによって、安定化可能である。
６．すべての３つのバリアント（ピーク１、２おひび３）ならびに未画分化ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質が、ＢＡＬＢ／ｃマウスのワクチン化の後に、特定の抗体を誘導した。
【０１４１】
臨床試験で使用した薬物産物は、ａ）Ａｌａ−（Ｈｉｓ）６−ＯｐｒＦ１９０−３４２−ＯｐｒＩ２１−８３タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ｂ）塩化ナトリウム、ｃ）注射のための水およびｄ）水酸化アルミニウムあり／なしからなる筋肉内に注射すべき、緑膿菌ワクチン（また「ＯｐｒＦ／Ｉワクチン」として本実験パートで呼ばれる）である（図５を参照のこと）。
【表５】
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【０１４２】
薬物産物の産出：凍結した薬物基質（Ａｌａ−（Ｈｉｓ）６−ＯｐｒＦ１９０−３４２−ＯｐｒＩ２１−８３タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）−ＰＢＳ緩衝液中タンパク質）を、２〜８℃にて一晩解凍し、０．９％塩化ナトリウム溶液で処方して、上記ナトリウム最終濃度に達する。最終処方を充填の直前に滅菌濾過する。ミョウバンアジュバント薬物産物無菌Ａｌ（ＯＨ）３を滅菌濾過段階後に加える。１．２ｍｌ（抽出可能用量１ｍｌ）の１ｍｌ用量分液のを、無菌発熱物質フリーガラスバイアル内に吸引して充たす。
【０１４３】
プラセボは、市販されており、登録されている生理学的ＮａＣｌ製品（ＮａＣｌ  ０．９％、イソトン塩化ナトリウム  ０．９％Ｂｒａｕｎ、５ｍＬ  Ｍｉｎｉ−Ｐｌａｓｃｏ（登録商標）コネクト）からなる。これは、５ｍｌ容器内で提供され、静脈内および皮下適用のために登録されている。室温にて保存する。ワクチンを完全に模倣するために、プラセボは、４００ｍｃｇ／ｍｌ  Ａｌ（ＯＨ）３を含む、０．９％生理食塩水によって１０倍ＰＢＳ希釈からなる。その名目用量は１ｍｌであり、２ｍｌガラスバイアル中に充填する。２〜８℃にて保存されるべきである。第２相臨床試験のためのプラセボは、同様の製造業者にて、水酸化アルミニウムを含む薬物産物として、類似工程を用いて、処方し、充填された。
【０１４４】
Ｂ．臨床試験
無作為、プラセボ対象、部分的盲検第２相パイロット試験デザイン：
１８〜８０歳の４８時間以上機械的人工呼吸器が必要な、ＩＣＵに収容された４００人のオスまたはメス患者を、１００または２００ｍｃｇミョウバンアジュバントＯｐｒＦ／Ｉワクチン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、１００ｍｃｇ非アジュバントＯｐｒＦ／Ｉワクチン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）またはプラセボ対象としてミョウバンを与えた、４処置群で、０日、７日にワクチン摂取した（試験した薬物産物のさらに詳細な記述に関しては、以上の物質セクションを参照のこと）。患者あたりの研究期間は、９０日であると推定し、総研究期間は１２〜１８ヶ月であると推定した。
【０１４５】
以下の評価項目を測定した。
主要：
・ＯｐｒＦ／Ｉワクチン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）またはプラセボを受領している患者におけるＥＬＩＳＡによって測定したＯｐｒＦ／Ｉ特異的ＩｇＧ抗体タイタ−によって決定したような１４日における免疫原性
副次：
・ＯｐｒＦ／Ｉワクチンまたはプラセボを受領している患者におけるＥＬＩＳＡによって測定したＯｐｒＦ／Ｉ特異的ＩｇＧ抗体タイタ−によって決定したような、７日、１４日後病院退院まで２週間間隔、ＩＣＵ退院日および９０日での免疫原性
・第一ワクチン接種後９０日までのワクチン接種期間の、重度な副作用および副作用の率
・第一ワクチン接種後９０日までの、安全性検査値（血液検査、血液生化学検査、尿検査）
・全身認容性（生命兆候：血圧、パルス、体温）
・局所認容性（局所注射部位反応）
・９０日まで、ＯｐｒＦ／Ｉワクチンまたはプラセボを受領している患者における、細菌（陽性血液培養として決定）または緑膿菌（ＮＮＩＳ  ＶＡＰ基準にしたがって決定）のような緑膿菌で侵襲的に感染した患者数
・ＯｐｒＦ／Ｉワクチンまたはプラセボを受領している患者における、緑膿菌気管気管支炎、緑膿菌陽性傷、尿および気管分泌を持つ患者数
・ＯｐｒＦ／Ｉワクチンまたはプラセボを受領している患者の全生存率
・ＩＣＵおよび病院滞在の長さ
・ＯｐｒＦ／Ｉワクチンまたはプラセボを受領している患者におけるＶＡＰの開始までの時間
・ＯｐｒＦ／Ｉワクチンまたはプラセボを受領している患者における抗生物質なしの日数
・ＯｐｒＦ／Ｉワクチンまたはプラセボを受領している患者における緑膿菌以外の病原菌による感染の予防
・器官機能（Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  Ｏｒｇａｎ  Ｆａｉｌｕｒｅ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ［ＳＯＦＡ］スコア）
・７、１４、９０およびＩＣＵ退院日のＯｐｒＦ／Ｉワクチンまたはプラセボを受領している患者における抗ヒスタミン抗体の存在
・７、１４日、病院退院までの２週間ごと、ＩＣＵ退院日、９０日におけるＯＰＡによる機能的ＩｇＧ抗体の測定
・７、１４日、ＩＣＵ退院日および９０日での、ＯｐｒＦ／Ｉ特異的ＩｇＧ抗体の親和性の測定
【０１４６】
試験結果
本試験の主要評価項目は、全ての群が、１４日において、プラセボ群（ＯｐｒＦ／Ｉワクチン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）群におけるＧＭＴｓ：９９５〜２１１７  ＥＬＩＳＡユニット／ｍｌ）と比較して、すべてのＯｐｒＦ／Ｉワクチン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）処置アームで有意に高かった、ＩｇＧ抗体Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  Ｍｅａｎ  Ｔｉｔｅｒｓ（ＧＭＴｓ）にて、良好なセロコンバージョン（すなわち、第一ワクチン接種後１４日まで、ＯｐｒＦ／Ｉ  ＩｇＧにおいて、少なくとも４倍増加）（ＯｐｒＦ／Ｉワクチン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）処置アームにて６５〜８１％）が示されたことに適合した（図１）。これは、０日〜１４日のＯｐｒＦ／Ｉ  ＩｇＧ中およそ４倍増加である。本試験集団で査定可能である限り、処置アーム間で処置突発副作用において有意な差はなく、局所および全身認容性は良好であるように見えた。報告された薬物関連副作用の数および性質により、安全性の憂慮はみあたらず、中間データに基づいて、Ｄａｔａ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｂｏａｒｄ（ＤＳＭＢ）によって確認された。
【０１４７】
副次免疫原性評価項目もまた本試験で満たされており、９０日の期間にわたって７回査定したＩｇＧ応答、およびオスオノファゴサイトーシスアッセイによる機能的抗体活性の測定、および抗体親和性の測定が含まれた。第二ワクチン接種後、全般的な強い免疫原性がすべてのワクチン群で観察された。用量応答が観察され、一方で非ミョウバンアジュバントワクチンは、ミョウバンアジュバントワクチンと少なくとも免疫原性は一緒であった。抗体親和性は、すべてのワクチン群にて同様であった。機能的オプソニン化取込が示され、ワクチン誘導ＩｇＧタイタ−とよく相関した。集中治療患者における免疫応答は、健常人における先に実施された第Ｉ総試験からの結果と比較して弱いことが明らかになった。これは、登録された患者の一般健康状態がわるいことから、予期しないものではなかった。
【０１４８】
本試験は、効果に関してパワーがあったわけではないが、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｐｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＣＥＣ）は、福次評価項目解析内で、感染率および死亡率が記録されたことを確認した。より低い死亡率が、対象群と比較して、すべてのワクチン群で観察された（図２）。死亡率の減少は、非アジュバントワクチンに対して統計学的に有意であった（ｐ＝０．０１９６）（プラセボ群にて４０．０％  ２８日死亡率と比較して、非アジュバントＯｐｒＦ／Ｉワクチン群にて２１．７％  ２８日死亡率）。試験終了まで生存した患者は、１４日より前に死亡した患者と比較して、第一ワクチン接種後１４日時点で、より高いＯｐｒＦ／Ｉ  ＩｇＧタイタ−を持った（図３）。Ｃｏｘ回帰解析は、生存におけるＯｐｒＦ／Ｉ  ＩｇＧタイタ−の有意な予後価値を示した（Ｐ＝０．０３３６。
【０１４９】
任意の群間での、緑膿菌感染率における有意な差は見られなかった。しかしながら、これは、現在の第ＩＩ相試験の比較的小さなサンプルサイズと、信頼のおける緑膿菌診断の方法論的制限が寄与しうる。さらに、ＯｐｒＦ／Ｉワクチン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）でのワクチン接種は、他の感染経路を含む、緑膿菌感染のクリアランスではなく、病原性に影響を与えうる。後者の推測は、試験の経過中、任意の種類の感染（病原体にかかわらず）を経験したＯｐｒＦ／Ｉワクチン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）ワクチン接種患者が、プラセボにてワクチン接種したが、任意の種類の感染（任意の病原体のため）をもつ患者と比較して、およそ１５％低い死亡率を示したという発見によって支持される（図４）。
【０１５０】
非ミョウバンアジュバントＯｐｒＦ／Ｉワクチン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）対ミョウバンアジュバントプラセボにて処置した、任意の感染をもつ患者における、観察されたおよそ１５％の死亡率の減少に関して、潜在する機構について推測のみ可能である。ワクチンは、殺菌免疫を提供することよりも、緑膿菌の病原性を減少させうる。ＯｐｒＦ（ワクチン抗原の部分）が、ヒトインターフェロン−ガンマに結合可能であり、それによって、緑膿菌の病原性因子の発現を変化させる（Ｗｕ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｏｓｔ  ｉｍｍｕｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００５；３０９：７７４−７）。ＯｐｒＦ／Ｉワクチンによって誘導されたＯｐｒＦに対する抗体は、この相互作用を阻止する（Ｂｉｎ  Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０１０：２８：４１１９−２２）。
【０１５１】
緑膿菌の病原性を減少させることは、他の病原体での続く感染の頻度を間接的に減少しうる。これに関して、緑膿菌の診断における悪名高い困難さを強調することが重要であり、これは、緑膿菌感染と死亡率間の原因となる関係を確立することを制限する。最後に、一般に免疫化は、感染の経路に正に影響を与えうる免疫調節効果を持つ。
【０１５２】
より大きな、効果的にパワーをもつ臨床試験が、死亡率および感染率における任意のワクチンの効果を評価し、確証するために必要であろう。
【０１５３】
他の鍵となる目的として、現在の第ＩＩ相試験は、この異なる標的集団におけるピボタル効果試験を実施する実行可能性を評価した。最終データは、予想された緑膿菌感染数を確認した。６〜１４％の観察されたアタック率は、１０〜２５％の推定された緑膿菌侵襲性感染率を持つ試験サイトのみが、本試験のために選択されたので、予想の範囲内である。
【０１５４】
好ましい様態
１．薬理学的に効果的な量のＯｐｒＦ／Ｉ試薬を入院患者に投与することを含む、例えば前記患者のようなヒトにおける死亡率を減少させる方法。
２．薬理学的に効果的な量のＯｐｒＦ／Ｉ試薬をＩＣＵ患者に投与することを含む、前記患者における死亡率を減少させる方法。
３．薬理学的に効果的な量のＯｐｒＦ／Ｉ試薬を人工呼吸器をつけたＩＣＵ患者に投与することを含む、前記患者における死亡率を減少させる方法。
４．薬理学的に効果的な量のＯｐｒＦ／Ｉ試薬をやけど患者に投与することを含む、前記患者における死亡率を減少させる方法。
５．薬理学的に効果的な量のＯｐｒＦ／Ｉ試薬を嚢胞性線維症患者に投与することを含む、前記患者における死亡率を減少させる方法。
６．治療的に効果的な量のＯｐｒＦ／Ｉ試薬および第二薬物基質を共投与することを含み、前記第二薬物基質が、抗細菌または抗真菌薬である、様態１〜５の任意の１つにしたがった方法。
７．治療的に効果的な量のＯｐｒＦ／Ｉ試薬の投与が、１００ｍｃｇの量で２回与えられる、様態１〜５の任意の１つにしたがった方法。
８．治療的に効果的な量にＯｐｒＦ／Ｉ試薬が、ＩＣＵに収容される少なくとも２週間前に与えられる、様態２〜３の任意の１つにしたがった方法。
９．ＯｐｒＦ／Ｉ試薬が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１〜１３のポリペプチド、その三量体形態、および任意の前記ポリペプチド対する抗体からなる群より選択される化合物である、以上の様態の任意の１つにしたがった方法。
１０．ＯｐｒＦ／Ｉ試薬が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の混合物との三量体形態を含むそれらの三量体形態、前記ポリペプチドまたは三量体形態の任意に対する抗体からなる群より選択される、以上の様態の任意の１つにしたがった方法。
１１．以上の様態の任意の１つにしたがった任意の方法での利用のためのＯｐｒＦ／Ｉ試薬。
１２．入院患者、ＩＣＵ患者、嚢胞性線維症患者、人工呼吸器をつけたＩＣＵ患者、またはやけど患者の死亡率の減少において使用するためのＯｐｒＦ／Ｉ試薬。
１３．ＯｐｒＦ／Ｉ試薬が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１をもつポリペプチドである、様態１２にしたがった死亡率の減少における利用のためのＯｐｒＦ／Ｉ試薬。
１４．１つまたはそれ以上の薬理学的に許容可能な希釈液またはそのための担体と一緒にＯｐｒＦ／Ｉ試薬を含む、様態１〜１０の任意の１つに従った任意の方法における利用のための薬理学的組成物。
１５．ａ）ＯｐｒＦ／Ｉ試薬である第一試薬
ｂ）抗細菌または抗真菌薬である共試薬
を含む薬理学的混合物。
１６．様態１〜１０の任意の方法、様態１１〜１３の任意のＯｐｒＦ／Ｉ試薬、または様態１４または１５の薬理学的組成物で、前記ＯｐｒＦ／Ｉ試薬が、そのアミノ末端で、緑膿菌外膜タンパク質Ｆのカルボキシ末端部分のカルボキシ末端に融合した、緑膿菌外膜タンパク質Ｉを含むか、からなる融合タンパク質であり、とりわけ、
（ｉ）緑膿菌外膜タンパク質Ｉが、完全長外膜タンパク質Ｉである、
（ｉｉ）緑膿菌外膜タンパク質Ｆが、完全長外膜タンパク質Ｆである、
（ｉｉｉ）ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１からなる、または含む、
（ｉｖ）ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質が、前記ポリペプチドまたはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対する抗体またはその断片からなる、
（ｖ）ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質が、機能的に活性なバリアントであり、および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して少なくとも５０％配列同一性、とりわけ少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、またより好ましくは少なくとも９０％、またより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは９９％配列同一性を持つ、
（ｖｉ）融合タンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を持つポリペプチド、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して８０％、８５％、９０％または９５％同一性をもつその免疫原性バリアントを含む（または少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％からなる）、
（ｖｉｉ）融合タンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を持つポリペプチド、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して８０％、８５％、９０％または９５％同一性をもつその免疫原性バリアントを含み（または少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％からなり）、前記ポリペプチドまたはそのバリアントが、ａ）Ｃｙｓ１８−Ｃｙｓ２７−結合（例えばＤＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１を参照のこと）、ｂ）Ｃｙｓ１８−Ｃｙｓ２７−結合とＣｙｓ３３−Ｃｙｓ４７−結合（例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２を参照のこと）、またはｃ）Ｃｙｓ１８−Ｃｙｓ４７−結合およびＣｙｓ２７−Ｃｙｓ３３−結合（例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３を参照のこと）のいずれかを持つ。
１７．以上の任意の様態にしたがったＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質を産出するための方法であって、
（ａ）前記ＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質を還元試薬で還元すること、および
（ｂ）還元したＯｐｒＦ／Ｉ融合タンパク質を、還元試薬の存在下、酸化還元試薬で酸化すること
の段階を含む方法。
１８．段階（ａ）にて、還元試薬の濃度が、約３ｍＭ〜約１０ｍＭであり、還元試薬が、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）またはβ−メルカプトエタノールである、様態１７にしたがった方法。
１９．段階（ｂ）において、酸化還元試薬の濃度が、約０．２ｍＭ〜約４ｍＭであり、酸化還元試薬が、グルタチオンジスルフィド／グルタチオン、または酸化還元試薬シスチン／システインであり、還元試薬の濃度が、約０．３７５ｍＭ〜約１．５ｍＭであり、還元試薬がジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）またはβ−メルカプトエタノールである、様態１７または１８にしたがった方法。
２０．反応温度が、約１８℃〜約２５℃である、様態１７〜１９の任意にしたがった方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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