(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトCD70に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、該抗体又は抗原結合断片が、可変重鎖CDR3、可変重鎖CDR2及び可変重鎖CDR1を含む少なくとも1つの重鎖可変ドメイン(VH)、並びに、可変軽鎖CDR3、可変軽鎖CDR2及び可変軽鎖CDR1を含む少なくとも1つの軽鎖可変ドメイン(VL)を含み、
該可変重鎖CDR3が、
【化１】
0005982409.tif 000085
を含むか又はそれからなり；
該可変重鎖CDR2が、
【化２】
0005982409.tif 000086
を含むか又はそれからなり；
該可変重鎖CDR1が、
【化３】
0005982409.tif 000087
を含むか又はそれからなり；
該可変軽鎖CDR3が、
【化４】
0005982409.tif 000088
を含むか又はそれからなり；
該可変軽鎖CDR2が、
【化５】
0005982409.tif 000089
を含むか又はそれからなり；及び
該可変軽鎖CDR1が、
【化６】
0005982409.tif 000090
を含むか又はそれからなり、かつここで該VH及びVLドメインが、Fab断片として試験される場合、0.4×10-4 s-1〜4.8×10-4 s-1の範囲のヒトCD70に関するオフレート(Biacoreにより測定されたkoff)を示し、かつ該ヒトCD70に結合するFab領域が、重鎖可変ドメイン(VH)及び軽鎖可変ドメイン(VL)を含み、ここで該VH及びVLドメイン、又はそれらの1以上の相補性決定領域(CDR)が、ラクダ科動物種に由来する、前記抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
配列番号:223として示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％同一性のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、重鎖可変ドメイン(VH)、並びに配列番号:241として示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも90％同一性のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、軽鎖可変ドメイン(VL)を含む、請求項1記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
請求項1又は2記載の抗体と同じヒトCD70のエピトープに結合する、単離された抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
前記VH及びVLドメイン又はそれらの1以上のCDRがラマに由来し、且つ定常ドメインの1以上がヒト免疫グロブリンに由来する、ラマ-ヒトキメラ抗体である、請求項1〜3のいずれか一項記載の抗体。
【請求項５】
ヒトIgGのヒンジ領域、CH2ドメイン及びCH3ドメインを含む、請求項4記載の抗体。
【請求項６】
前記ヒトIgGが、ヒトIgG1である、請求項5記載の抗体。
【請求項７】
細胞表面上にヒトCD70を発現している細胞に対する抗体依存性細胞性細胞傷害作用(ADCC)、補体依存性細胞傷害作用(CDC)及び抗体依存性細胞性貪食作用(ADCP)から選択された1以上のエフェクター機能を示す、請求項1〜6のいずれか一項記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項８】
CD70-発現している癌細胞に対し抗体依存性細胞性細胞傷害作用(ADCC)、補体依存性細胞傷害作用(CDC)及び抗体依存性細胞性貪食作用(ADCP)の1以上を示す、請求項7記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項９】
未変性のヒトFcドメインを含む等価抗体と比べ、増強されたADCC機能を示す、請求項7又は8記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項１０】
非フコシル化IgGである、請求項1〜9のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１１】
請求項1〜10のいずれか一項記載の抗体又は抗原結合断片をコードしている、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
宿主細胞又は無細胞発現システムにおける抗原結合ポリペプチドの発現を可能にする調節配列に機能的に連結された、請求項11記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項１３】
請求項12記載の発現ベクターを含む、宿主細胞又は無細胞発現システム。
【請求項１４】
請求項13記載の宿主細胞又は無細胞発現システムを、該抗体又は抗原結合断片の発現を可能にする条件下で培養すること、並びに発現された抗体又は抗原結合断片を回収することを含む、組換え抗体又はその抗原結合断片の製造方法。
【請求項１５】
請求項1〜10のいずれか一項記載の抗体又は抗原結合断片、及び少なくとも1種の医薬として許容し得る担体又は賦形剤を含有する、医薬組成物。
【請求項１６】
請求項1〜10のいずれか一項記載の抗体又は抗原結合断片、及び細胞傷害剤を含有する、免疫複合体。
【請求項１７】
請求項1〜10のいずれか一項記載の抗体又は抗原結合断片の治療有効量を含む、ヒト患者における腫瘍細胞増殖を阻害するための医薬組成物。
【請求項１８】
ヒト患者においてCD70-発現している腫瘍細胞の増殖を阻害する用途のための、請求項1〜10のいずれか一項記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項１９】
ヒト患者において癌を治療又は予防する用途のための、請求項1〜10のいずれか一項記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項２０】
前記癌が、CD70の低コピー数の発現を示す癌であり、該癌は、大細胞型B細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、皮膚T細胞リンパ腫、胃癌、肺癌、黒色腫、膠芽細胞腫及び卵巣癌からなる群から選択される、請求項19記載の用途のための抗体又は抗原結合断片。
【請求項２１】
ヒト患者において免疫学的障害を治療する用途のための、請求項1〜10のいずれか一項記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項２２】
前記免疫学的障害が、自己免疫疾患、全身性紅斑狼瘡(SLE)、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、血管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、チャーグ-ストラウス病、顕微鏡的多発性血管炎、免疫複合体性血管炎、結節性多発動脈炎、川崎病、巨細胞性関節炎、腎炎、ベーチェット症候群、大動脈炎及び高安病からなる群から選択される、請求項21記載の用途のための抗体又は抗原結合断片。
【請求項２３】
請求項1〜10のいずれか一項記載の抗体の有効量を含み、ここでCD70-発現している細胞は、6時間後に該抗体の30％以下のインターナリゼーションを示し、且つここで該抗体は、ADCC、CDC及びADCPからなる群から選択される少なくとも1つのエフェクター機能を示す、ヒト患者においてCD70-発現している細胞を枯渇するための医薬組成物。
【請求項２４】
前記CD70-発現している細胞が、CD70-発現している癌細胞である、請求項23記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記CD70-発現している癌細胞が、バーキットリンパ腫、大細胞型B細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非-ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、膵癌、胃癌、膠芽細胞腫及び肺癌からなる群から選択される癌型である、請求項24記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記CD70-発現している癌細胞が、バーキットリンパ腫、大細胞型B細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫、胃癌及び肺癌からなる群から選択される癌型である、請求項24記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記CD70-発現している細胞が、CD70-発現している活性化されたT細胞である、請求項23記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記ヒトCD70に結合する抗体が、抗体-薬物複合体ではない、請求項23〜27のいずれか一項記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(技術分野)
本発明は、ヒトCD70タンパク質へ高親和性で結合し、且つ腫瘍細胞増殖の強力な阻害を示す、抗体及び抗原結合断片に関する。
【背景技術】
【０００２】
(背景)
サイトカイン受容体CD27は、細胞増殖及び分化に加え、アポトーシスにおいて役割を果たす、腫瘍壊死因子受容体(TFNR)スーパーファミリーの一員である。CD27のリガンドは、CD70であり、これはリガンドの腫瘍壊死因子ファミリーに属する。CD70は、2つの可能性のあるN-結合グリコシル化部位を有する20個のアミノ酸の親水性N-末端ドメイン及びC-末端ドメインを有する193個のアミノ酸ポリペプチドである(Goodwin, R.G.らの文献、(1993) Cell 73:447-56；Bowmanらの文献、(1994) Immunol 152: 1756-61)。これらの特徴を基に、CD70は、細胞外C-末端部分を有するII型膜貫通タンパク質であると決定された。
【０００３】
CD70は、活性化されたTリンパ球及びBリンパ球及び樹状細胞上に一過性に認められる(Hintzenらの文献、(1994) J. Immunol. 152: 1762-1773；Oshimaらの文献、(1998) Int. Immunol. 10: 517-26；Tesselaarらの文献、(2003) J. Immunol. 170: 33-40)。CD70発現は、正常細胞上の発現に加え、腎細胞癌、転移性乳癌、脳腫瘍、白血病、リンパ腫及び鼻咽腔癌を含む、様々な型の癌において報告されている(Junkerらの文献、(2005) J Urol. 173: 2150-3；Sloanらの文献、(2004) Am J Pathol. 164: 315-23；Held-Feindt及びMentleinの文献、(2002) Int J Cancer, 98: 352-6；Hishimaらの文献、(2000) Am J Surg Pathol. 24: 742-6；Lensらの文献、(1999) Br J Haematol. 106: 491-503)。CD70のCD27との相互作用は、細胞媒介性自己免疫疾患及びTNF-α産生の阻害において役割を果たすことも提唱されている(Nakajimaらの文献、(2000) J. Neuroimmunol. 109: 188-96)。
【０００４】
従って、CD70は、CD70発現により特徴付けられる癌、自己免疫疾患及び様々な他の疾患の治療の標的を表している。
【０００５】
WO 2006/0044643は、ADCC、ADCP、CDC又はADCの1以上を媒介することができ、且つ細胞増殖抑制剤若しくは細胞傷害剤へ複合することなく、CD70-発現している癌に対する細胞増殖抑制作用又は細胞傷害作用を発揮するか、又はCD70-発現している免疫学的障害に対する免疫抑制作用を発揮するかのいずれかである、抗体エフェクタードメインを含むCD70抗体を開示している。そこに例示された抗体は、1F6及び2F2と表示される2つのモノクローナル抗体の抗原-結合領域を基にしている。
【０００６】
WO 2007/038637は、CD70に結合する完全ヒトモノクローナル抗体を開示している。これらの抗体は、1×10-7 M以下のKDでのヒトCD70への結合により特徴付けられる。該抗体はまた、786-Oなどの、CD70を発現する腎細胞癌の腫瘍細胞株へ結合し、且つこれによりインターナリゼーションされる。
【発明の概要】
【０００７】
(発明の概要)
ヒトCD70タンパク質に結合し、且つ先行技術に説明されたCD70抗体とは異なる、一般にはこれを上回る特性を示す抗体又はそれらの抗原結合断片(本明細書においてCD70抗体と称される)を、本明細書において提供する。これらの抗体の優れた特性は、ヒト療法、特にCD70-発現している癌、同じく免疫学的障害の治療における使用に関して利点がある。
【０００８】
本明細書記載のCD70抗体は、ヒトCD70に対する極めて高い結合親和性により特徴付けられる。本明細書に記載の全ての好ましい実施態様は、「完全ヒト」起源の先行技術のCD70抗体を含む、ヒト療法のために提唱された最も強力な先行技術のCD70抗体よりも有意に高い、組換えヒトCD70への結合親和性(本明細書記載のBiacore(商標)表面プラズモン共鳴により測定された)を示す。加えて、本明細書に記載のCD70抗体の好ましい実施態様は全て、ヒト療法のために提唱された先行技術のCD70抗体と比較した場合、ヒト細胞株、具体的にはヒト癌細胞株の表面上に発現されたCD70に、優れた(すなわち、より高い親和性の)結合を示す。この細胞-表面CD70への優れた結合は、CD70を「低コピー数」で発現するヒト癌細胞株に関して特に顕著であり、且つヒト療法における該抗体の使用に直接関連している。また更に、本明細書記載のCD70抗体の好ましい実施態様は、ヒト治療上の使用に関して提唱された先行技術のCD70抗体と比較した場合、ヒト患者から単離された癌細胞、特に慢性リンパ性白血病(CLL)の患者から単離された癌細胞への実質的に改善された結合を示す。
【０００９】
従って、本発明の第一の態様において、ヒトCD70に結合する抗体又はそれらの抗原結合断片を提供し、該抗体又は抗原結合断片は、少なくとも1つの重鎖可変ドメイン(VH)及び少なくとも1つの軽鎖可変ドメイン(VL)を含み、ここで該VH及びVLドメインは、本明細書記載の標準Biacore(商標)プロトコールを用い、Fab断片として試験される場合、7×10-4 s-1未満のヒトCD70に関するオフレート(Biacore(商標)により測定されたkoff)を示す。
【００１０】
好ましい実施態様において、該抗体又は抗原結合断片は、少なくとも1つの重鎖可変ドメイン(VH)及び少なくとも1つの軽鎖可変ドメイン(VL)を含み、ここで該VH及びVLドメインは、5×10-4 s-1以下、又は2×10-4s-1以下、又は1×10-4s-1以下のヒトCD70に関するオフレートを示す。最も好ましくは、CD70抗体は、Fab断片として試験される場合、0.4×10-4 s-1〜4.8×10-4 s-1の範囲のCD70に関するオフレートを示すであろう。
【００１１】
同じく2つのFab領域を含むヒトCD70に結合する抗体も提供し、ここで各Fab領域は、ヒトCD70へ結合し、且つFab断片として試験される場合、5×10-4 s-1以下、又は2×10-4s-1以下、又は1×10-4s-1以下の、及び好ましくは0.4×10-4 s-1〜4.8×10-4 s-1の範囲のヒトCD70に関するオフレートを示す。これら2つのFab領域は、結合特性、例えばヒトCD70に関する親和性に関して、同一であってよいか、又はこれらは異なってよい。これら2つのFab領域は、ヒトCD70上の同じエピトープ又は重複するエピトープへ結合してよいか、或いはこれらは、ヒトCD70上の個別の重複しないエピトープへ結合してよい。これら2つのFab領域は、VH及びVLドメインの一方又は両方内のアミノ酸配列に関して、互いに異なってよい。
【００１２】
本明細書に提供するCD70抗体の好ましい実施態様は、極めて高いCD70への結合親和性に加え、CD70とそのリガンドCD27の間の相互作用の強力なブロック又は阻害を示すことができる。CD70への高い親和性結合とCD70/CD27相互作用の強力なブロックの両方を示す好ましいCD70抗体は、例えば、CD70とCD27を同時発現する自己免疫疾患及び癌の治療に関して、CD70/CD27シグナル伝達のブロックが(例えば、CD70抗体のエフェクター機能により媒介された細胞-死滅に加え)治療上の有効性を増強する疾患適応(disease indication)のための治療薬として、特に利点がある。
【００１３】
全ての本明細書記載のCD70抗体が、CD70への高親和性結合に加え、CD70/CD27相互作用の強力なブロックを示す訳ではない。CD70への非常に高い親和性結合を示すが、CD70/CD27相互作用の著しいブロックは示さない、数多くのCD70抗体も、本明細書に記載している。これらの抗体の特性は、本明細書において別所に記載している。高親和性非ブロック性CD70抗体の利用可能性は、治療上の可能性の範囲を増強／延長することができる。
【００１４】
ヒトCD70への非常に高い結合親和性を示す、本明細書記載のCD70抗体の好ましい実施態様はまた、ヒト治療上の使用に関して提唱された先行技術のCD70抗体により示されない結合特性の組合せにより特徴付けられる。従って、本明細書記載の好ましいCD70抗体は：
(a)ヒトCD70中のアミノ酸配列
【化１】
0005982409.tif 000002
内の結合；
(b)アカゲザル(Macaca mulatta)及びカニクイザル(Macaca cynomolgus)のCD70ホモログとの交差反応性；
(c)未変性ヒトCD70及び熱変性された組換えヒトCD70の両方への結合：
により特徴付けられる。
【００１５】
ヒト治療上の使用に関して提唱された先行技術の抗体によっては示されない、この結合特性の組合せは、先行技術のCD70抗体により結合されたエピトープとは異なる、CD70上の新規エピトープへの結合を示している。
【００１６】
好ましいCD70抗体により示された結合特性の組合せは、臨床薬開発の状況において利点がある。特にサル(simian)CD70ホモログとの交差-反応性は、霊長類モデルにおいて実行されるヒト治療での使用のために提唱されるCD70抗体に関する毒性の研究を可能にする。
【００１７】
好ましい本明細書記載のCD70抗体はまた更に、治療用抗体製品としての商業的製造に関する好ましい特性を示す。本明細書の別所に考察するように、本明細書に提供する好ましいCD70抗体は、臨床用等級の治療用抗体製品の商業的製造に利用される組換え発現システムにおいて、極めて高レベルの発現を示す。好ましいCD70抗体により達成可能な発現レベルは、「完全ヒト」治療用抗体製品についても典型的に達成されるレベルをはるかに超えている。加えて、好ましいCD70抗体製品(ヒト治療上の使用に適したフォーマットで組換え発現により製造された)は、代表的治療用抗体製品よりも優れている傑出した温度安定性を示す。
【００１８】
ヒトCD70への優れた結合親和性及び先に列挙した他の有利な特性を持つ本明細書において提供するCD70抗体は、ラクダ科動物-由来(例えば、ラマ-由来)である。ラクダ科動物-由来のCD70抗体は、単離されたか又は組換えにより発現されたモノクローナル抗体であることができる。好ましい実施態様は、ヒト化(又は生殖細胞系列化)されたモノクローナル抗体(例えば、ラクダ科動物-由来の抗体のヒト化バリアント)、キメラ抗体(例えば、ラクダ科動物-ヒトキメラ抗体)又はヒト化キメラ抗体(例えば、ラクダ科動物VH及びVLドメインのヒト化バリアントとヒト抗体の定常ドメインを含むキメラ抗体)であることができる。
【００１９】
ラクダ科動物-由来のCD70抗体は、ラクダ科ファミリーの種のVHドメイン若しくはVLドメインから得られた少なくとも1つの超可変ループ又は相補性決定領域を含むことができる。特定の実施態様において、CD70抗体又はそれらの抗原結合断片は、重鎖可変ドメイン(VH)及び軽鎖可変ドメイン(VL)を含むことができ、ここでVH及びVLドメイン、又はそれらの1以上のCDRは、ラクダ科動物-由来である。特定の実施態様において、該抗体又はそれらの抗原結合断片は、ラマVH及びVLドメイン、又はラマVH及びVLドメインのヒト生殖細胞系列化バリアントを含むことができる。この抗体又は抗原結合断片は、本明細書に記載のように「高いヒト相同性」を示すことができる。
【００２０】
本明細書記載のラクダ科動物-由来のCD70抗体は典型的には、最も近いマッチングしているヒト抗体生殖細胞系列配列との少なくとも90％(例えば、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、又は99％)の配列同一性を有するVH及び／又はVL領域アミノ酸配列を示す。
【００２１】
更に好ましい本発明の実施態様は、ラクダ科動物-由来のCD70抗体のヒト化(又はヒト生殖細胞系列化)バリアントを含む。特に本発明は、本明細書記載のラマ-由来のCD70抗体のヒト化又はヒト生殖細胞系列化バリアントを提供する。
【００２２】
更なる本発明の態様において、ヒトCD70に結合するキメララクダ科動物-ヒト抗体を提供し、ここで該抗体の抗原-結合部分(例えば、VH及び／若しくはVLドメイン又はそれらのCDR)は、ラクダ科動物-由来であり、且つ該抗体の定常領域は、ヒト抗体に由来する。特に本発明は、ヒトCD70に結合する、キメララマ-ヒト抗体を提供する。
【００２３】
本発明の更なる態様において、ヒトCD70に結合するキメララクダ科動物-ヒト抗体のヒト化バリアントを提供し、ここで該抗体の抗原-結合部分(例えば、VH及び／若しくはVLドメイン又はそれらのCDR)は、ラクダ科動物-由来の配列のヒト化バリアントであり、且つ該抗体の定常領域は、ヒト抗体に由来する。特に本発明は、ヒトCD70に結合するキメララマ-ヒト抗体のヒト化バリアントを提供する。
【００２４】
CD70抗体又はそれらの抗原結合断片の好ましい(しかし非限定的)実施態様は、具体的構造特徴、すなわち、CDR(配列番号:49-59、262若しくは263(重鎖CDR3)、又は配列番号：26-37、249、258若しくは259(重鎖CDR2)、又は配列番号:10-20、248、256若しくは257(重鎖CDR1)の1以上、或いは配列番号:148-168、271若しくは273(軽鎖CDR3)、又は配列番号:109-128若しくは270(軽鎖CDR2)、又は配列番号:77-95、若しくは250-253、267若しくは268(軽鎖CDR1)に示されたCDR配列、或いは全体の可変ドメイン(配列番号:177-188、212-223、274若しくは275(VH)、又は配列番号:189-211、230-245、276若しくは277(VL)の1以上)のいずれかの、特定されたアミノ酸配列を参照し、以下に定義される。これらの抗体は全て、ヒトCD70へ高親和性で結合し、Fab断片として試験される場合、5×10-4 s-1以下、及び典型的には0.4×10-4 s-1〜4.8×10-4 s-1の範囲のヒトCD70に関するオフレートを示す。
【００２５】
本発明はまた、これらの抗体のヒト化／生殖細胞系列化バリアントに加え、親和性バリアント及び本明細書に定義された保存的アミノ酸置換を含むバリアントも提供する。具体的には、ラクダ科動物-由来であるVH及びVLドメインを含むキメラ抗体、又はヒト抗体、特にヒトIgG1、IgG2、IgG3若しくはIgG4の定常ドメインに融合されたそれらのヒト生殖細胞系列化バリアントを提供する。先に定義した重鎖可変ドメインは、単一ドメイン抗体として利用することができるか、或いは通常型4本鎖抗体、又は例えばFab、Fab'、F(ab')2、二重特異性Fab’、及びFv断片、ダイアボディ、線状抗体、1本鎖抗体分子、1本鎖可変断片(scFv)及び多重特異性抗体などの他の抗原結合タンパク質内に含まれてよい。
【００２６】
CD70抗体の好ましい実施態様は、可変重鎖CDR3、可変重鎖CDR2及び可変重鎖CDR1を含む重鎖可変ドメインを含む抗体又はそれらの抗原結合断片であり、ここで該可変重鎖CDR3は：
配列番号：49, 配列番号：50, 配列番号：51, 配列番号：52, 配列番号：53, 配列番号：54, 配列番号：55, 配列番号：56, 配列番号：57, 配列番号：58, 配列番号：59, 配列番号：262 及び 配列番号：263、並びに列挙した配列のいずれか1つの配列バリアント：からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで該配列バリアントは、列挙した配列中に1、2又は3個のアミノ酸置換を含み；
該可変重鎖CDR2は：
【化２】
0005982409.tif 000003
のアミノ酸配列であって、式中
X1は、任意のアミノ酸、好ましくはD、T、S又はEであり、
X2は、任意のアミノ酸、好ましくはIであり、
X3は、任意のアミノ酸、好ましくはN、S、T又はYであり、
X4は、任意のアミノ酸、好ましくはN、M、S又はTであり、
X5は、任意のアミノ酸、好ましくはE、D、Y又はHであり、
X6は、任意のアミノ酸、好ましくはG、D、S又はNであり、
X7は、任意のアミノ酸、好ましくはG、Y、S、D又はMであり、
X8は、任意のアミノ酸、好ましくはT、E、S、N、Y又はRであり、
X9は、任意のアミノ酸、好ましくはT、A又はRであり、及び
X10は、任意のアミノ酸、好ましくはG又はSであるもの；並びに、
配列番号:30、配列番号:32、配列番号:33、配列番号:34、配列番号:249、配列番号:258及び配列番号:259のアミノ酸配列、並びに列挙した配列のいずれか1つの配列バリアント：からなる群から選択されるアミノ酸配列を任意に含み、ここで該配列バリアントは、列挙した配列中に1、2又は3個のアミノ酸置換を含み；並びに
該可変重鎖CDR1は：
【化３】
0005982409.tif 000004
のアミノ酸配列であって、式中
X1は、任意のアミノ酸、好ましくはV、G又はAであるもの；
【化４】
0005982409.tif 000005
のアミノ酸配列であって、式中
X1は、任意のアミノ酸、好ましくはD、T、S、N又はGであり、及び
X2は、任意のアミノ酸、好ましくはY、S又はPであるもの；並びに、
配列番号:10, 配列番号:15, 配列番号:16, 配列番号:248, 配列番号:256 及び 配列番号:257のアミノ酸配列、並びに列挙した配列のいずれか1つの配列バリアント：からなる群から選択されるアミノ酸配列を任意に含み、ここで該配列バリアントは、列挙した配列中に1、2又は3個のアミノ酸置換を含む。
【００２７】
前記重鎖可変ドメインは、列記した可変重鎖CDR3配列(HCDR3)のいずれか1つを、可変重鎖CDR2配列(HCDR2)のいずれか1つ、及び可変重鎖CDR1配列(HCDR1)のいずれか1つと組合せて含んでよい。しかし、HCDR3及びHCDR2及びHCDR1の特定の組合せが特に好ましく、これらは、単独の共通VHドメインに由来する「未変性」組合せである。これらの好ましい組合せは、表6及び表14Aに列記している。
【００２８】
本抗体又はそれらの抗原結合断片は加えて、VHドメインと対合し、抗原結合ドメインを形成する、軽鎖可変ドメイン(VL)を含んでよい。好ましい軽鎖可変ドメインは、可変軽鎖CDR3、可変軽鎖CDR2及び可変軽鎖CDR1を含むものであって、ここで該可変軽鎖CDR3は：配列番号:148, 配列番号:149, 配列番号:150, 配列番号:151, 配列番号:152, 配列番号:153, 配列番号:154, 配列番号:155, 配列番号:156, 配列番号:157, 配列番号:158, 配列番号:159, 配列番号:160, 配列番号:161, 配列番号:162, 配列番号:163, 配列番号:164, 配列番号:165, 配列番号:166, 配列番号:166, 配列番号:168, 配列番号:271 及び 配列番号:273、並びに列挙した配列のいずれか1つの配列バリアント：からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで該配列バリアントは、列挙した配列中に1、2又は3個のアミノ酸置換を含み；
該可変軽鎖CDR2は：
(a)
【化５】
0005982409.tif 000006
のアミノ酸配列であって、式中
X1は、任意のアミノ酸、好ましくはN又はSであり、
X2は、任意のアミノ酸、好ましくはN、S又はAであり、及び
X3は、任意のアミノ酸、好ましくはS、N又はTであるもの；
(b)
【化６】
0005982409.tif 000007
のアミノ酸配列であって、式中
X1は、任意のアミノ酸、好ましくはY、V又はLであり、
X2は、任意のアミノ酸、好ましくはK又はSであり、
X3は、任意のアミノ酸、好ましくはH又はNであり、及び
X4は、任意のアミノ酸、好ましくはG又はSであるもの；
(c)
【化７】
0005982409.tif 000008
のアミノ酸配列であって、式中
X1は、任意のアミノ酸、好ましくはV、I又はYであり、及び
X2は、任意のアミノ酸、好ましくはN又はTであるもの；
(d)
【化８】
0005982409.tif 000009
のアミノ酸配列であって、式中
X1は、任意のアミノ酸、好ましくはYであり、及び
X2は、任意のアミノ酸、好ましくはR又はMであるもの；
(e)
【化９】
0005982409.tif 000010
のアミノ酸配列であって、式中
X1は、任意のアミノ酸、好ましくはD又はGであり、及び
X2は、任意のアミノ酸、好ましくはS又はIであるもの；並びに、
配列番号:113、配列番号:116、配列番号:120及び配列番号:270のアミノ酸配列、並びに列挙した配列のいずれか1つの配列バリアント：からなる群から選択されるアミノ酸配列を任意に含み、ここで該配列バリアントは、列挙した配列中に1、2又は3個のアミノ酸置換を含み、並びに
該可変軽鎖CDR1は：
(a)
【化１０】
0005982409.tif 000011
のアミノ酸配列であって、式中
X1は、任意のアミノ酸、好ましくはS又はTであり、
X2は、任意のアミノ酸、好ましくはV又はAであり、
X3は、任意のアミノ酸、好ましくはS又はTであり、
X4は、任意のアミノ酸、好ましくはS、T又はGであり、
X5は、任意のアミノ酸、好ましくはN又はHであり、
X6は、任意のアミノ酸、好ましくはG、D又はEであるもの；
(b)
【化１１】
0005982409.tif 000012
のアミノ酸配列であって、式中
X1は、任意のアミノ酸、好ましくはS、N又はIであり、
X2は、任意のアミノ酸、好ましくはG又はAであり、
X3は、任意のアミノ酸、好ましくはN又はDであり、
X4は、任意のアミノ酸、好ましくはN又はSであり、
X5は、任意のアミノ酸、好ましくはV又はIであり、
X6は、任意のアミノ酸、好ましくはN又はSであるもの；
(c)
【化１２】
0005982409.tif 000013
のアミノ酸配列であって、式中
X1は、任意のアミノ酸、好ましくはG又はWであるもの；
(d)
【化１３】
0005982409.tif 000014
のアミノ酸配列であって、式中
X1は、任意のアミノ酸、好ましくはS又はTであり、
X2は、任意のアミノ酸、好ましくはE又はRであり、
X3は、任意のアミノ酸、好ましくはR又はNであり、
X4は、任意のアミノ酸、好ましくはG又はHであり、
X5は、任意のアミノ酸、好ましくはT又はAであるもの；
(e)
【化１４】
0005982409.tif 000015
のアミノ酸配列であって、式中
X1は、任意のアミノ酸、好ましくはV又はLであり、
X2は、任意のアミノ酸、好ましくはK又はTであり、
X3は、任意のアミノ酸、好ましくはT又はDであるもの；並びに、
配列番号:82、配列番号:87、配列番号:88、配列番号:250、配列番号:251、配列番号:252、配列番号:253、配列番号:267及び配列番号:268のアミノ酸配列、並びに列挙した配列のいずれか1つの配列バリアント：からなる群から選択されるアミノ酸配列を任意に含み、ここで該配列バリアントは、列挙した配列中に1、2又は3個のアミノ酸置換を含む。
【００２９】
前記軽鎖可変ドメインは、列記した可変軽鎖CDR3配列(LCDR3)のいずれか1つを、可変軽鎖CDR2配列(LCDR2)のいずれか1つ、及び可変軽鎖CDR1配列(LCDR1)のいずれか1つと組合せて含んでよい。しかし、LCDR3及びLCDR2及びLCDR1の特定の組合せが特に好ましく、これらは、単独の共通VLドメインに由来する「未変性」組合せである。これらの好ましい組合せは、表7及び表15Aに列記している。
【００３０】
VLドメインと対合し、CD70抗原の結合部位を形成するVHドメインを含む、任意の所与のCD70抗体又はそれらの抗原結合断片は、可変重鎖CDR3(HCDR3)、可変重鎖CDR2(HCDR2)、可変重鎖CDR1(HCDR1)、可変軽鎖CDR3(LCDR3)、可変軽鎖CDR2(LCDR2)及び可変軽鎖CDR1(LCDR1)の6つのCDRの組合せを含むであろう。先に列記したCDR配列群から選択される6つのCDRの全ての組合せは、許容され且つ本発明の範囲内であるが、6つのCDRの特定の組合せが特に好ましく；これらは、ヒトCD70への高親和性結合を示す単独のFab内の「未変性」組合せである。
【００３１】
6つのCDRの好ましい組合せは、下記からなる群から選択される、可変重鎖CDR3(HCDR3)、可変重鎖CDR2(HCDR2)、可変重鎖CDR1(HCDR1)、可変軽鎖CDR3(LCDR3)、可変軽鎖CDR2(LCDR2)及び可変軽鎖CDR1(LCDR1)の組合せを含むが、これらに限定されるものではない：
(i)配列番号:50を含むHCDR3、配列番号:27を含むHCDR2、配列番号:11を含むHCDR1、配列番号:160を含むLCDR3、配列番号:119を含むLCDR2、及び配列番号:250を含むLCDR1；
(ii)配列番号:49を含むHCDR3、配列番号:26を含むHCDR2、配列番号:10を含むHCDR1、配列番号:148を含むLCDR3、配列番号:109を含むLCDR2、及び配列番号:77を含むLCDR1；
(iii)配列番号:50を含むHCDR3、配列番号:27を含むHCDR2、配列番号:11を含むHCDR1、配列番号:149を含むLCDR3、配列番号:110を含むLCDR2、及び配列番号:78を含むLCDR1；
(iv)配列番号:50を含むHCDR3、配列番号:28を含むHCDR2、配列番号:11を含むHCDR1、配列番号:150を含むLCDR3、配列番号:111を含むLCDR2、及び配列番号:79を含むLCDR1；
(v)配列番号:50を含むHCDR3、配列番号:28を含むHCDR2、配列番号:11を含むHCDR1、配列番号:151を含むLCDR3、配列番号:110を含むLCDR2、及び配列番号:80を含むLCDR1；
(vi)配列番号:51を含むHCDR3、配列番号:29を含むHCDR2、配列番号:12を含むHCDR1、配列番号:152を含むLCDR3、配列番号:110を含むLCDR2、及び配列番号:80を含むLCDR1；
(vii)配列番号:52を含むHCDR3、配列番号:30を含むHCDR2、配列番号:13を含むHCDR1、配列番号:153を含むLCDR3、配列番号:112を含むLCDR2、及び配列番号:81を含むLCDR1；
(viii)配列番号:53を含むHCDR3、配列番号:31を含むHCDR2、配列番号:14を含むHCDR1、配列番号:154を含むLCDR3、配列番号:113を含むLCDR2、及び配列番号:82を含むLCDR1；
(ix)配列番号:54を含むHCDR3、配列番号:32を含むHCDR2、配列番号:15を含むHCDR1、配列番号:155を含むLCDR3、配列番号:114を含むLCDR2、及び配列番号:83を含むLCDR1；
(x)配列番号:55を含むHCDR3、配列番号:33を含むHCDR2、配列番号:16を含むHCDR1、配列番号:156を含むLCDR3、配列番号:115を含むLCDR2、及び配列番号:84を含むLCDR1；
(xi)配列番号:56を含むHCDR3、配列番号:34を含むHCDR2、配列番号:17を含むHCDR1、配列番号:157を含むLCDR3、を配列番号:116を含むLCDR2、及び配列番号:85を含むLCDR1；
(xii)配列番号:57を含むHCDR3、配列番号:35を含むHCDR2、配列番号:18を含むHCDR1、配列番号:158を含むLCDR3、配列番号:117を含むLCDR2、及び配列番号:84を含むLCDR1；
(xiii)配列番号:58を含むHCDR3、配列番号:36を含むHCDR2、配列番号:19を含むHCDR1、配列番号:159を含むLCDR3、配列番号:118を含むLCDR2、及び配列番号:86を含むLCDR1；
(xiv)配列番号:50を含むHCDR3、配列番号:27を含むHCDR2、配列番号:11を含むHCDR1、配列番号:161を含むLCDR3、配列番号:120を含むLCDR2、及び配列番号:88を含むLCDR1；
(xv)配列番号:50を含むHCDR3、配列番号:27を含む HCDR2、配列番号:11を含むHCDR1、配列番号:162を含むLCDR3、配列番号:121を含むLCDR2、及び配列番号:89を含むLCDR1；
(xvi)配列番号:50を含むHCDR3、配列番号:27を含むHCDR2、配列番号:11を含むHCDR1、配列番号:163を含むLCDR3、配列番号:122を含むLCDR2、及び配列番号:90を含むLCDR1；
(xvii)配列番号:51を含むHCDR3、配列番号:29を含むHCDR2、配列番号:12を含むHCDR1、配列番号:164を含むLCDR3、配列番号:123を含むLCDR2、及び配列番号:91を含むLCDR1；
(xviii)配列番号:51を含むHCDR3、配列番号:29を含むHCDR2、配列番号:12を含むHCDR1、配列番号:164を含むLCDR3、配列番号:124を含むLCDR2、及び配列番号:91を含むLCDR1；
(xix)配列番号:59を含むHCDR3、配列番号:37を含むHCDR2、配列番号:12を含むHCDR1、配列番号:165を含むLCDR3、配列番号:125を含むLCDR2、及び配列番号:92を含むLCDR1；
(xx)配列番号:59を含むHCDR3、配列番号:37を含むHCDR2、配列番号:20を含むHCDR1、配列番号:165を含むLCDR3、配列番号:126を含むLCDR2、及び配列番号:93を含むLCDR1；
(xxi)配列番号:59を含むHCDR3、配列番号:37を含むHCDR2、配列番号:20を含むHCDR1、配列番号:166を含むLCDR3、配列番号:127を含むLCDR2、及び配列番号:92を含むLCDR1；
(xxii)配列番号:59を含むHCDR3、配列番号:37を含むHCDR2、配列番号:20を含むHCDR1、配列番号:167を含むLCDR3、配列番号:128を含むLCDR2、及び配列番号:94を含むLCDR1；
(xxiii)配列番号:59を含むHCDR3、配列番号:37を含むHCDR2、配列番号:20を含むHCDR1、配列番号:168を含むLCDR3、配列番号:110を含むLCDR2、及び配列番号:95を含むLCDR1；
(xxiv)配列番号:262を含むHCDR3、配列番号:258を含むHCDR2、配列番号:256を含むHCDR1、配列番号:271を含むLCDR3、配列番号:110を含むLCDR2、及び配列番号:267を含むLCDR1；
(xxv)配列番号:263を含むHCDR3、配列番号:259を含むHCDR2、配列番号:257を含むHCDR1、配列番号:273を含むLCDR3、配列番号:270を含むLCDR2、及び配列番号:268を含むLCDR1。
【００３２】
更に好ましいヒトCD70への高親和性結合を示すCD70抗体は：
アミノ酸配列
配列番号：177, 配列番号：178, 配列番号：179, 配列番号：180, 配列番号：181, 配列番号：182, 配列番号：183, 配列番号：184, 配列番号：185, 配列番号：186, 配列番号：187, 配列番号：188, 配列番号：212, 配列番号：213, 配列番号：214, 配列番号：215, 配列番号：216, 配列番号：217, 配列番号：218, 配列番号：219, 配列番号：220, 配列番号：221, 配列番号：222, 配列番号：223, 配列番号：224, 配列番号：225, 配列番号：226, 配列番号：227, 配列番号：228, 配列番号：229, 配列番号：274 及び 配列番号：275、及び列挙した配列の1つと少なくとも90％、95％、97％、98％又は99％の配列同一性を示すアミノ酸配列：からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインを含み、並びに、任意にアミノ酸配列
配列番号：189, 配列番号：190, 配列番号：191, 配列番号：192, 配列番号：193, 配列番号：194, 配列番号：195, 配列番号：196, 配列番号：197, 配列番号：198, 配列番号：199, 配列番号：200, 配列番号：201, 配列番号：202, 配列番号：203, 配列番号：204, 配列番号：205, 配列番号：206, 配列番号：207, 配列番号：208, 配列番号：209, 配列番号：210, 配列番号：211, 配列番号：223, 配列番号：230, 配列番号：231, 配列番号：232, 配列番号：233, 配列番号：234, 配列番号：234, 配列番号：236, 配列番号：237, 配列番号：238, 配列番号：239, 配列番号：240, 配列番号：241, 配列番号：242, 配列番号：243, 配列番号：244, 配列番号：245, 配列番号：245, 配列番号：247, 配列番号：248, 配列番号：276 及び 配列番号：277、及び列挙した配列の1つと少なくとも90％、95％、97％、98％又は99％の配列同一性を示すアミノ酸配列：
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む、単離された抗体又はそれらの抗原結合断片を含む。
【００３３】
先に列記したVH及びVLドメイン配列群から選択されたVHドメインとVLドメインの全ての可能性のある対合は、許容され且つ本発明の範囲内であるが、VHとVLの特定の組合せが特に好ましく；これらは、ヒトCD70への高親和性結合を示す単独のFab内の「未変性」組合せである。従って、高親和性CD70結合を示す好ましいCD70抗体又はそれらの抗原結合断片は、下記からなる群から選択される、重鎖可変ドメイン(VH)及び軽鎖可変ドメイン(VL)の組合せを含むものである：
(i)配列番号:223のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:241のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(ii)配列番号:177のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:189のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(iii)配列番号:178のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:190のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(iv)配列番号:179のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:191のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(v)配列番号:179のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:192のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(vi)配列番号:180のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:193のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(vii)配列番号:181のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:194のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(viii)配列番号:182のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:195のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(ix)配列番号:183のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:196のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(x)配列番号:184のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:197のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(xi)配列番号:185のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:198のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(xii)配列番号:186のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:199のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(xiii)配列番号:187のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:200のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(xiv)配列番号:178のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:201のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(xv)配列番号:178のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:202のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(xvi)配列番号:178のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:203のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(xvii)配列番号:178のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:204のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(xviii)配列番号:180のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:205のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(xix)配列番号:180のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:206のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(xx)配列番号:188のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:207のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(xxi)配列番号:188のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:208のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(xxii)配列番号:188のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:209のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(xxiii)配列番号:188のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:210のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(xxiv)配列番号:188のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:211のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(xxv)配列番号:274のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:276のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(xxvi)配列番号:275のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:277のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン。
【００３４】
先に列記した具体的VH/VL組合せの各々について、列挙したVHドメイン配列と少なくとも90％、92％、95％、97％又は99％のアミノ酸配列同一性を有するVHドメインと、列挙したVLドメイン配列と少なくとも90％、92％、95％、97％又は99％のアミノ酸配列同一性を有するVLドメインとを組合せることは、許容され且つ本発明の範囲内である。
【００３５】
先の段落、及び本明細書の別所において、抗体／抗原結合断片の構造は、列挙した参照配列(所与の配列番号を伴う)との％配列同一性を基に規定される。この文脈において、2つのアミノ酸配列間の％配列同一性は、最適な様式で並置され、且つそこで比較されるべきアミノ酸配列は、これら2つの配列間の最適なアラインメントのために参照配列に付加又は欠失を含むことができる、これら2つの配列を比較することにより決定することができる。同一性の割合は、アミノ酸残基が2つの配列間で同一である同一位置の数を決定し、この同一位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数で除算し、且つこれら2つの配列間の％同一性を得るために、得られた結果を100倍することにより計算される。典型的には、比較ウインドウは、比較される配列の完全長に相当する。例えば、これはBLASTプログラム"BLAST 2 Sequences"(Tatusovaらの文献、「Blast 2 sequences−タンパク質配列及びヌクレオチド配列比較のための新規ツール(Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences)」、FEMS Microbiol Lett. 174:247-250)を使用し可能であり、このプログラムはサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html上で入手可能であり、且つ使用したパラメータは、デフォルトで供されたものであり(特にパラメータは、"オープンギャップペナルティ"：5、及び"イクステンションギャップペナルティ"：2；選択したマトリックスは、例えば、本プログラムにより提唱されたマトリックス"BLOSUM 62"である)、比較されるべき2つの配列間の％同一性は、本プログラムにより直接算出される。
【００３６】
ヒトCD70への極めて高い親和性結合を含む特に有利な特性の組合せを示す、本明細書に提供する最も好ましいCD70抗体は、付随する実施例において27B3と記されるラマ-由来のFabの抗原-結合部分に加え、付随する実施例において規定した生殖細胞系列化バリアントを含むヒト生殖細胞系列化バリアント27B3を基にしたものである。27B3とその生殖細胞系列化バリアント、特にバリアント41D12のCDR又は完全可変ドメインを基にしたバリアントは、以下のようにまとめられる極めて有利な特性の組合せを示す：組換えヒトCD70への高親和性結合、細胞表面CD70への強力な結合、癌細胞株、特に「低コピー数」でCD70を発現する細胞株上に発現されたCD70への特異的結合、及び患者試料(CLL)から単離された癌細胞への強力な結合、CD70/CD27相互作用の強力なブロック、強力なエフェクター機能−特にヒトIgG1定常領域とのキメラとして発現された場合、及び特に非フコシル化IgG1として発現された場合、霊長類種における毒性研究を可能にするアカゲザル及びカニクイザルのCD70ホモログとの交差反応性、未変性(すなわち細胞表面)CD70及び熱変性されたCD70の両方への結合、特定の癌細胞株上の部分的又は低レベルのインターナリゼーション。これらの組合せの特徴は全て、41D12、及び実際は他の27B3バリアント及び類似した特性を示す他の本明細書記載のCD70抗体を、CD70-関連疾患、具体的にはCD70-発現している癌及び免疫学的障害の治療における治療上の使用のための傑出した候補とする。
【００３７】
27B3、及びそのバリアントは、
【化１５】
0005982409.tif 000016
として示される重鎖可変CDR3配列の存在により特徴付けられる。
従って、CD70抗体又はそれらの抗原結合断片の好ましい実施態様は、重鎖可変ドメインを含むものであり、ここで該可変重鎖CDR3は、配列番号:50のアミノ酸配列又はそれらの配列バリアントを含むか又はそれらからなり、ここで該配列バリアントは、列挙した配列中に1、2又は3個のアミノ酸置換を含む。
【００３８】
より好ましい実施態様は、27B3又は27B3のヒト生殖細胞系列化バリアントと同じ重鎖CDRの組合せを含む、抗体又はそれらの抗原結合断片である。従って、該抗体又はそれらの抗原結合断片は、重鎖可変ドメインを含むことができ、ここで
該可変重鎖CDR3は、配列番号:50のアミノ酸配列又はそれらの配列バリアントを含むか又はそれらからなり；
該可変重鎖CDR2は、配列番号:27、配列番号:249からなる群から選択されるアミノ酸配列及びそれらの配列バリアントを含むか又はそれらからなり；並びに
該可変重鎖CDR1は、配列番号:11、配列番号:248からなる群から選択されるアミノ酸配列及びそれらの配列バリアントを含むか又はそれらからなり；ここで該配列バリアントは、列挙した配列中に1、2又は3個のアミノ酸置換(例えば、保存的置換、ヒト化置換又は親和性バリアント)を含む。
【００３９】
CDR配列の列挙した群内からのHCDR3、HCDR2及びHCDR1の任意の組合せは、許容され且つ本発明の範囲内であるが、しかし特定の組合せが特に好ましい。従って、好ましい実施態様において、抗原又はそれらの抗原結合断片は、重鎖可変ドメインを含むことができ、ここでHCDR3、HCDR2及びHCDR1の組合せは、下記から選択される：
(a)該可変重鎖CDR3が、
【化１６】
0005982409.tif 000017
又はそれらの配列バリアントを含むか又はそれらからなり；
該可変重鎖CDR2が、
【化１７】
0005982409.tif 000018
又はそれらの配列バリアントを含むか又はそれらからなり；及び
該可変重鎖CDR1が、
【化１８】
0005982409.tif 000019
又はそれらの配列バリアントを含むか又はそれらからなり；
ここで該配列バリアントは、列挙した配列中に1、2又は3個のアミノ酸置換(例えば、保存的置換、ヒト化置換又は親和性バリアント)を含むもの；
(b)該可変重鎖CDR3が、
【化１９】
0005982409.tif 000020
又はそれらの配列バリアントを含むか又はそれらからなり；
該可変重鎖CDR2が、
【化２０】
0005982409.tif 000021
又はそれらの配列バリアントを含むか又はそれらからなり；及び
該可変重鎖CDR1が、
【化２１】
0005982409.tif 000022
又はそれらの配列バリアントを含むか又はそれらからなり；
ここで該配列バリアントは、列挙した配列中に1、2又は3個のアミノ酸置換(例えば、保存的置換、ヒト化置換又は親和性バリアント)を含むもの；
(c)該可変重鎖CDR3が、
【化２２】
0005982409.tif 000023
又はそれらの配列バリアントを含むか又はそれらからなり；
該可変重鎖CDR2が、
【化２３】
0005982409.tif 000024
又はそれらの配列バリアントを含むか又はそれらからなり；及び
該可変重鎖CDR1が、
【化２４】
0005982409.tif 000025
又はそれらの配列バリアントを含むか又はそれらからなり；
ここで該配列バリアントは、列挙した配列中に1、2又は3個のアミノ酸置換(例えば、保存的置換、ヒト化置換又は親和性バリアント)を含むもの。
【００４０】
好ましい実施態様において、該抗体又はそれらの抗原結合断片はまた、該重鎖可変ドメインと対合された軽鎖可変ドメイン(VL)を含む。好ましい軽鎖可変ドメインにおいて、該可変軽鎖CDR3は、配列番号:160又はそれらの配列バリアントを含むか又はそれらからなり；
該可変軽鎖CDR2は、配列番号:119、配列番号:110及び列挙した配列の配列バリアント：からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれらからなり；並びに
該可変軽鎖CDR1は、配列番号:87、配列番号:250、配列番号:251、配列番号:252、配列番号:253及び列挙した配列の配列バリアント：からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれらからなり、並びに、
ここで該配列バリアントは、列挙した配列中に1、2又は3個のアミノ酸置換(例えば、保存的置換、ヒト化置換又は親和性バリアント)を含む。
【００４１】
軽鎖CDR配列の列挙した群内からのLCDR3、LCDR2及びLCDR1の任意の組合せは、許容され且つ本発明の範囲内であるが、しかし特定の組合せが特に好ましい。従って好ましい実施態様において、抗原又はそれらの抗原結合断片は、軽鎖可変ドメインを含むことができ、ここでLCDR3、LCDR2及びLCDR1の組合せは、下記から選択される：
(a)該可変軽鎖CDR3が、
【化２５】
0005982409.tif 000026
又はそれらの配列バリアントを含むか又はそれらからなり；
該可変軽鎖CDR2が、
【化２６】
0005982409.tif 000027
又はそれらの配列バリアントを含むか又はそれらからなり；及び
該可変軽鎖CDR1が、
【化２７】
0005982409.tif 000028
又はそれらの配列バリアントを含むか又はそれらからなり、
ここで該配列バリアントは、列挙した配列中に1、2又は3個のアミノ酸置換(例えば、保存的置換、ヒト化置換又は親和性バリアント)を含むもの；
(b)該可変軽鎖CDR3が、
【化２８】
0005982409.tif 000029
又はそれらの配列バリアントを含むか又はそれらからなり；
該可変軽鎖CDR2が、
【化２９】
0005982409.tif 000030
又はそれらの配列バリアントを含むか又はそれらからなり；及び
該可変軽鎖CDR1が、
【化３０】
0005982409.tif 000031
又はそれらの配列バリアントを含むか又はそれらからなり、
ここで該配列バリアントは、列挙した配列中に1、2又は3個のアミノ酸置換(例えば、保存的置換、ヒト化置換又は親和性バリアント)を含むもの。
【００４２】
27B3のヒト「生殖細胞系列化」バリアントに関する他の好ましい軽鎖CDR組合せは、表15Aに示している。
【００４３】
CD70抗体又はそれらの抗原結合断片の最も好ましい実施態様は、重鎖可変ドメイン(VH)及び軽鎖可変ドメイン(VL)を含み、ここでヒトCD70の結合部位を形成する6つのCDRの組合せは：
該可変重鎖CDR3は、
【化３１】
0005982409.tif 000032
又はそれらの配列バリアントを含むか又はそれらからなり；
該可変重鎖CDR2は、
【化３２】
0005982409.tif 000033
又はそれらの配列バリアントを含むか又はそれらからなり；
該可変重鎖CDR1は、
【化３３】
0005982409.tif 000034
又はそれらの配列バリアントを含むか又はそれらからなり；
該可変軽鎖CDR3は、
【化３４】
0005982409.tif 000035
又はそれらの配列バリアントを含むか又はそれらからなり；
該可変軽鎖CDR2は、
【化３５】
0005982409.tif 000036
又はそれらの配列バリアントを含むか又はそれらからなり；及び
該可変軽鎖CDR1は、
【化３６】
0005982409.tif 000037
又はそれらの配列バリアントを含むか又はそれらからなり、
ここで該配列バリアントは、列挙した配列中に1、2又は3個のアミノ酸置換(例えば、保存的置換、ヒト化置換又は親和性バリアント)を含むもの：である。
【００４４】
他の好ましい6つのCDRの組合せは、表14A(重鎖)及び表15A(軽鎖)に列記した27B3のヒト生殖細胞系列化バリアントにおいて生じるそれらの「未変性」の組合せである。
【００４５】
27B3及びその生殖細胞系列化バリアントを基にした前述の好ましい実施態様において、該抗体は好ましくは、ヒト抗体、特にヒトIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4のCH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン及びCH3ドメインを含む。最も好ましい実施態様は、ヒトIgG1である。ヒトIgG1に関して、抗体依存性細胞性細胞傷害作用(ADCC)、補体依存性細胞傷害作用(CDC)又は抗体依存性細胞性貪食作用(ADCP)のエフェクター機能の1以上を最大化するように操作されることが、なお更に好ましい。特に好ましいのは、非フコシル化ヒトIgG1、例えばBioWa社のPotelligent(商標)技術を用い作製した非フコシル化IgG1である。
【００４６】
27B3と表示されたFab及び27B3のヒト生殖細胞系列化バリアントを基にしたヒトCD70への高親和性結合を示す更に好ましいCD70抗体は：
アミノ酸配列配列番号：178, 配列番号：212, 配列番号：213, 配列番号：214, 配列番号：215, 配列番号：216, 配列番号：217, 配列番号：218, 配列番号：219, 配列番号：220, 配列番号：221, 配列番号：222, 配列番号：223, 配列番号：224, 配列番号：225, 配列番号：226, 配列番号：227, 配列番号：228, 配列番号：229, 配列番号：274 及び 配列番号：275、及び列挙した配列の1つと少なくとも90％、95％、97％、98％又は99％の配列同一性を示すアミノ酸配列：からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインを含み、並びに、任意にアミノ酸配列配列番号：201, 配列番号：230, 配列番号：231, 配列番号：232, 配列番号：233, 配列番号：234, 配列番号：234, 配列番号：236, 配列番号：237, 配列番号：238, 配列番号：239, 配列番号：240, 配列番号：241, 配列番号：242, 配列番号：243, 配列番号：244, 配列番号：245, 配列番号：245, 配列番号：247, 配列番号：248, 配列番号：276 及び 配列番号：277 、及び列挙した配列の1つと少なくとも90％、95％、97％、98％又は99％の配列同一性を示すアミノ酸配列：からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを任意に含む、単離された抗体又はそれらの抗原結合断片を含む。
【００４７】
先に列記したVH及びVLドメイン配列の群から選択したVHドメイン及びVLドメインの全ての可能性のある対合は、許容され且つ本発明の範囲内であるが、しかしVHとVLの特定の組合せが特に好ましく；これらは、ヒトCD70に高親和性結合を示す単独のFab内の「未変性」の組合せである。表14B及び15Bに列挙した27B3の生殖細胞系列化バリアントの場合、当初のVH/VL対合を維持することが好ましいことがある。従って、高親和性CD70結合を示す好ましいCD70抗体又はそれらの抗原結合断片は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインの組合せを含むものであり、ここで該組合せは、下記からなる群から選択される：
(i)配列番号:223のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:241のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(ii)配列番号:178のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:190のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(iii)配列番号:212のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:230のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(iv)配列番号:213のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:231のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(v)配列番号:214のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:232のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(vi)配列番号:215のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:235のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(vii)配列番号:216のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:234のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(viii)配列番号:217のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:235のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(ix)配列番号:218のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:236のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(x)配列番号:219のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:237のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(xi)配列番号:220のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:238のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(xii)配列番号:221のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:239のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(xiii)配列番号:222のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:240のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(xiv)配列番号:224のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:242のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(xv)配列番号:225のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:243のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(xvi)配列番号:226のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:244のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(xvii)配列番号:227のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:245のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(xviii)配列番号:228のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:246のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(xix)配列番号:229のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:247のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(xx)配列番号:223のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:244のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
(xxi)配列番号:223のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号:245のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン。
【００４８】
先に列記した具体的VH/VL組合せの各々に関して、同じく、列挙したVHドメイン配列と少なくとも90％、92％、95％、97％又は99％の同一性のアミノ酸配列を有するVHドメインと、列挙したVLドメイン配列と少なくとも90％、92％、95％、97％又は99％の同一性の有するVLドメインを組合せることが、許容され且つ本発明の範囲内である。
【００４９】
最も好ましい実施態様は、41D12と表示された、ヒト生殖細胞系列化バリアントの未変性VH/VL組合せを基にしたCD70抗体又はそれらの抗原結合断片である。従って、配列番号:223として示されたアミノ酸配列、それらの生殖細胞系列化バリアント及び親和性バリアント、並びにそれらと少なくとも90％、95％、97％、98％若しくは99％の同一性であるアミノ酸配列：からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれらからなる重鎖可変ドメイン(VH)、並びに、配列番号:241として示されたアミノ酸配列、それらの生殖細胞系列化バリアント及び親和性バリアント、並びにそれらと少なくとも90％、95％、97％、98％若しくは99％の同一性であるアミノ酸配列：からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれらからなる軽鎖可変ドメイン(VL)を含む、抗体又はそれらの抗原結合断片も、本明細書において提供する。
【００５０】
それにもかかわらず、VHドメインのアミノ酸配列が、配列番号:223として示された配列と100％未満の配列同一性を示す実施態様は、配列番号:223のHCDR1、HCDR2及びHCDR3(各々、配列番号:11、27及び50)と同じであるが、フレームワーク領域内にアミノ酸配列変動を示す重鎖CDRを含むことができる。同様に、VLドメインのアミノ酸配列が、配列番号:241として示された配列と100％未満の配列同一性を示す実施態様は、配列番号:241のLCDR1、LCDR2及びLCDR3(各々、配列番号:250、116及び160)と同じであるが、フレームワーク領域内にアミノ酸配列変動を示す重鎖CDRを含むがことができる。
【００５１】
41D12のVH及びVLドメイン又はそれらのバリアントを基にした前述の好ましい実施態様において、該抗体は好ましくは、ヒト抗体、特にヒトIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4の、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン及びCH3ドメインを含む。最も好ましい実施態様は、ヒトIgG1である。ヒトIgG1に関して、ADCC、CDC又はADCPの1以上におけるエフェクター機能を最大化するように操作されることが、なお更に好ましい。好ましくはPotelligent(商標)発現システムを用い調製される、脱-フコシル化されたヒトIgG1が、特に好ましい。
【００５２】
別の有利な実施態様は、配列番号:225として示されたアミノ酸配列、それらの生殖細胞系列化バリアント及び親和性バリアント、並びにそれらと少なくとも90％、95％、97％、98％若しくは99％の同一性であるアミノ酸配列：からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれらからなる重鎖可変ドメイン(VH)、並びに、配列番号:243として示されたアミノ酸配列、それらの生殖細胞系列化バリアント及び親和性バリアント、並びにそれらと少なくとも90％、95％、97％、98％若しくは99％の同一性であるアミノ酸配列：からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれらからなる軽鎖可変ドメイン(VL)を含む、抗体又はそれらの抗原結合断片である。
【００５３】
別の有利な実施態様は、配列番号:226として示されたアミノ酸配列、それらの生殖細胞系列化バリアント及び親和性バリアント、並びにそれらと少なくとも90％、95％、97％、98％若しくは99％の同一性であるアミノ酸配列：からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれらからなる重鎖可変ドメイン(VH)、並びに、配列番号:244として示されたアミノ酸配列、それらの生殖細胞系列化バリアント及び親和性バリアント、並びにそれらと少なくとも90％、95％、97％、98％若しくは99％の同一性であるアミノ酸配列：からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれらからなる軽鎖可変ドメイン(VL)を含む、抗体又はそれらの抗原結合断片である。
【００５４】
(CD70抗体の特徴／特性)
前述の態様及び実施態様において、CD70抗体又はそれらの抗原結合断片は、各々、下記の特徴又は特性の1つ以上、又は任意の組合せを示すことができる：
前記抗体又は抗原結合断片は、ヒトCD70へ高親和性で結合し、Fab断片として試験される場合、ヒトCD70に関するオフレート7×10-4 s-1以下、好ましくは5×10-4 s-1以下、及び典型的には0.4×10-4 s-1〜4.8×10-4 s-1の範囲を示すことができる。
【００５５】
前記抗体又は抗原結合断片は、ヒトCD70へ高親和性で結合し、且つCD70とCD27の間の相互作用を阻害することができる。或いは、前記抗体又は抗原結合断片は、ヒトCD70へ結合することはできるが、CD70とCD27の間の相互作用は阻害しない。
前記抗体又は抗原結合断片は、CD70-発現している細胞の表面のヒトCD70と高親和性で結合することができる。
【００５６】
前記抗体又は抗原結合断片は、CD70-発現している細胞の表面のヒトCD70に結合し、ゆっくり又は部分的にのみインターナリゼーションされることができる。本発明の重要な態様は、CD70抗体は、多くのCD70-発現している癌細胞株を含む、多数のCD70-発現している細胞株について事実上非常に不充分にインターナリゼーションされるという知見である。この知見は、CD70抗体は、腎細胞癌細胞株に結合した後、迅速にインターナリゼーションされ(Adamらの文献、British Journal of Cancer (2006) 95: 298-306；及び、WO 2007/038637参照)、且つ該抗体の治療上の使用に直接関わっているという先に公表された報告とは正反対である。CD70抗体は癌細胞に結合した後に非常に不充分にインターナリゼーションされるという知見は、多くのCD70-発現している癌、及び実際にCD70-関連した免疫学的疾患の治療のための治療戦略は、特にADCC、CDC又はADCPのいずれか1以上の抗体エフェクター機能と組合せられた、CD70への極めて高い親和性結合を基にすべきであり、CD70抗体が、治療薬、例えば細胞傷害剤若しくは細胞増殖抑制剤の部分と連結された免疫複合体の使用は基にしていないという結論を強力に裏付けている。
【００５７】
前記抗体又は抗原結合断片は、ヒトCD70において、アミノ酸配列HIQVTLAICSS (配列番号:342)内で結合することができ；
前記抗体又は抗原結合断片は、サル起源のCD70、具体的にはアカゲザル(Macaca mulatta)及びカニクイザル(Macaca cynomolgus)のCD70ホモログとの交差反応性を示すことができる。
【００５８】
前記抗体又は抗原結合断片は、未変性ヒトCD70(例えば、ヒト患者から単離された細胞株又はCD70-発現している細胞などの細胞表面に発現されたCD70)及び熱変性された組換えヒトCD70の両方に結合することができる。
【００５９】
前記抗体又は抗原結合断片は、例えばCHK1SV細胞株(BioWa/Lonzaに独占使用権)などの組換え抗体発現システムにおいて、治療用抗体製品に関する過去の平均の1〜2g/Lと比べ、非常に高い生成収量(＞4g/L)を提供することができ、このことは実質的に製造コストの削減をもたらす。
前記抗体又は抗原結合断片は、37℃の貯蔵条件下、及び凍結-解凍サイクルにおいて、高度に安定することができ、このことも大きいコスト削減要因である。
【００６０】
前記抗体は、細胞表面上にヒトCD70タンパク質を発現している細胞に対する抗体依存性細胞性細胞傷害作用(ADCC)、補体依存性細胞傷害作用(CDC)及び抗体依存性細胞性貪食作用(ADCP)から選択された1以上のエフェクター機能を示す。
前記抗体は、例えば、癌細胞若しくは他の悪性細胞、又は免疫細胞などの、CD70-発現している細胞に対し、ADCCを示すことができる。
【００６１】
前記抗体は、未変性ヒトFcドメインを含む等価抗体である参照抗体と比べ、増強されたADCC機能を示すことができる。非限定的実施態様において、このADCC機能は、未変性ヒトFcドメインを含む参照抗体と比べ、少なくとも10倍増強されることができる。この文脈において、「等価」とは、増強されたADCC機能を伴う抗体が、実質的に同じ抗原-結合特異性を示し、及び／又は(未変性ヒトFcと比べて)ADCCを増強する目的でなされるあらゆる改変を除いて、参照抗体と同一のアミノ酸配列を共有することを意味し得る。
【００６２】
前記抗体又は抗原結合断片は、細胞傷害剤又は細胞増殖抑制剤と複合せずに、インビボ腫瘍異種移植片モデルにおける腫瘍増殖を阻害することができる。非限定的実施態様において、この腫瘍増殖機能の阻害は、参照抗体SGN70と比べ、少なくとも10倍増強され得る。
前記抗体又は抗原結合断片は、CD70-発現している細胞のアポトーシスを誘導することができる。
【００６３】
前記抗体は、ヒトIgG、最も好ましくはヒトIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4の、ヒンジ領域、CH2ドメイン及びCH3ドメインを含むことができる。
前記抗体は、本明細書の別所記載のように、抗体エフェクター機能を増強する改変などの、Fc領域の改変を含むことができる。特に前記抗体は、非フコシル化IgGであることができる。
【００６４】
更なる態様において、本発明はまた、先に列記したCD70抗体及びそれらの抗原結合断片をコードしているポリヌクレオチド分子、加えて該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、該ベクターを含む宿主細胞、並びにCD70抗体の組換え発現／生成の方法も提供する。
【００６５】
なお更なる態様において、本発明は、先に記載のCD70抗体のいずれか1つ、及び医薬として許容し得る担体又は賦形剤を含有する医薬組成物を提供する。
なお更なる本発明の態様は、特に癌の治療における、先に列記したCD70抗体を使用する医学的治療方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
(図面の簡単な説明)
本発明は、下記の実施例及び添付図面を参照し、更に理解されるであろう：
【図１】図1は、786-O細胞(上側)及びRaji細胞(下側)で免疫化したラマに関する組換えCD70についてELISAで試験した免疫応答を示す。
【図２】図2は、ELISAにより測定した、ラマ-由来のCD70 Fab及び参照CD70 Fabによる、CD27のCD70への結合の阻害を図示している。
【図３】図3は、結合ELISA(黒色)又は阻害ELISA(白色)において試験されたラマ-由来のFabに関するシグナルのグラフ表示である。
【図４】図4は、ELISAにより測定した、キメララマ-ヒトCD70 mAb及び参照CD70 mAbによる、ヒトCD70(A及びB)又はアカゲザルCD70(C)へのCD27の結合の阻害を図示している。
【図５】図5は、FACS分析により示された、786-O細胞(A)又はMHH-PREB-1細胞(B)へのキメララマ-ヒトCD70 mAbの結合を示す。
【図６】図6は、Raji細胞ベースの共培養効力アッセイにおけるCD70特異的キメララマ-ヒトmAbによる阻害を示す。
【図７】図7は、786-O細胞に対する標準Cr51放出ADCCアッセイの結果を示す。
【図８】図8は、9％ヒト血清の存在下でのU266細胞に対するCDCアッセイの結果を示す。
【図９】図9は、786-O細胞に対するADCPアッセイにおけるキメララマ-ヒトCD70 mAbの有効性を明らかにしている。
【図１０】図10は、2つの独立した実験における、786-O細胞に対する時間の関数として、様々なキメララマ-ヒトCD70 mAbに関するMFI OUTとして評価した、抗体のインターナリゼーションを図示している。
【図１１】図11は、キメララマ-ヒトCD70 mAb 41D12、アイソタイプ対照及びFc-死滅対照による処置後の、Raji異種移植片モデルにおけるマウスの生存を明らかにしている。
【図１２】図12は、クローン27B3のVH及びVLアミノ酸配列の、各々、ヒト生殖細胞系列遺伝子セグメントVH3-38及びVL8-61のアミノ酸配列とのアラインメントを示している。
【図１３】図13は、37℃で5週間インキュベーションした後採取した生殖細胞系列化された27B3 mAbバリアント試料のゲル濾過分析を示す。
【図１４】図14は、異なる温度でのインキュベーション後様々な時点で採取した、生殖細胞系列化されたCD70 mAb試料の、Biacoreを使用し測定した、CD70結合における効力を示す。
【図１５】図15は、CD70-発現している癌細胞株へのCD70 mAbの結合親和性を示す。
【図１６】図16は、CD70を発現しているCLL患者細胞へのCD70 mAbの親和性を示す。
【図１７】図17は、CD70 mAbに結合したSU-DHL-6細胞の溶解を示す。
【図１８】図18は、ELISAにより測定した、CD70 mAbによるCD27のCD70への結合の阻害を示す。
【図１９】図19は、様々な種由来のCD70配列のアラインメントを示す。
【図２０】図20は、ヒトU266細胞、アカゲザルLCL8864細胞及びカニクイザルHSC-F細胞へのCD70 mAbの結合親和性を示す。
【図２１】図21は、ELISAにより測定した、CD70 mAbによる、ヒト、アカゲザル及びカニクイザルのCD70へのCD27の結合の阻害を示す。
【図２２】図22は、ELISAにより測定した、CD70 mAbの変性された組換えCD70への結合を示す。
【図２３】図23は、エピトープマッピングに使用したCD70キメラ配列を示す。
【図２４】図24は、786-O細胞に対する時間の関数としてのCD70 mAbの抗体インターナリゼーションを図示する。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
(定義)
「抗体」又は「免疫グロブリン」−本明細書で使用する用語「免疫グロブリン」は、何らかの関連のある特異的な免疫反応性を有するかどうかに関わらず、2本の重鎖及び2本の軽鎖の組合せを有するポリペプチドを含む。「抗体」とは、関心対象の抗原(例えばヒトCD70)に対し有意な既知の特異的免疫反応活性を有するそのような集成体をいう。用語「CD70抗体」は、ヒトCD70タンパク質に関して免疫学的特異性を示す抗体を意味するように本明細書において使用する。本明細書の別所に記載するように、ヒトCD70に関する「特異性」は、CD70の種ホモログとの交差反応を除外しない。抗体及び免疫グロブリンは、軽鎖と重鎖の間の鎖内共有結合を伴う又は伴わずに、軽鎖及び重鎖で構成される。脊椎動物系の基本的免疫グロブリン構造は、かなり良く理解されている。
【００６８】
一般的用語「免疫グロブリン」は、生化学的に区別することができる抗体の5つの個別のクラスを含む。抗体の5つのクラスは全て、本発明の範囲内であり、下記の考察は概して免疫グロブリン分子のIgGクラスに関する。IgGに関して、免疫グロブリンは、分子量およそ23,000ダルトンの2本の同一のポリペプチド軽鎖、及び分子量53,000〜70,000の2本の同一の重鎖を含む。これら4本の鎖は、「Y字」配置でジスルフィド結合により連結され、ここで軽鎖は、「Y字」の口で始まり且つ可変領域を通じて続く重鎖を腕木で支えている(bracket)。
【００６９】
抗体の軽鎖は、カッパ又はラムダ(κ、λ)のいずれかとして分類される。各重鎖クラスは、κ軽鎖又はλ軽鎖のいずれかと結合され得る。一般に軽鎖及び重鎖は、互いに共有結合され、これら2本の重鎖の「尾」部は、ジスルフィド共有結合により、又は免疫グロブリンがハイブリドーマ、B細胞若しくは遺伝子操作された宿主細胞のいずれかにより作製される場合は非共有結合により、互いに結合されている。重鎖において、アミノ酸配列は、Y字配置の分岐端のN-末端から、各鎖の底のC-末端へと並んでいる。当業者は、重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ又はイプシロン(γ、μ、α、δ、又はε)として分類され、その一部はサブクラス(例えばγ1-γ4)に分類されることを理解するであろう。これは、抗体の「クラス」を、各々、IgG、IgM、IgA、IgD、又はIgEと決定するこの鎖の本質である。免疫グロブリンサブクラス(アイソタイプ)、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1などは、良く特徴付けられ、機能性特化をもたらすことがわかっている。これらのクラス及びアイソタイプの各々の改変された型を、本開示を考慮し、当業者は容易に識別することができ、従ってこれらは本発明の範囲内である。
【００７０】
前述のように、抗体の可変領域は、その抗体が、抗原上のエピトープを選択的に認識し、且つ特異的に結合することを可能にする。すなわち、抗体のVLドメインとVHドメインは一緒に、三次元的に抗原結合部位を規定する可変領域を形成する。この4つ一組の抗体構造は、Y字の各アームの端に存在する抗原結合部位を形成する。より詳細には、抗原結合部位は、VH鎖及びVL鎖の各々の上の3つの相補性決定領域(CDR)により規定される。
【００７１】
「CD70タンパク質」又は「CD70抗原」−本明細書で使用する用語「CD70タンパク質」又は「CD70抗原」又は「CD70」は、互換的に使用し、且つTNFRSF27/CD27のリガンドであるTNFリガンドファミリーの一員をいう。用語「ヒトCD70タンパク質」又は「"ヒトCD70抗原」又は「ヒトCD70」は、互換的に使用し、特に人体において及び／又はヒト培養細胞株の表面に天然に発現された未変性のヒトCD70タンパク質、更にはそれらの組換え型及び断片を含む、ヒトホモログをいう。ヒトCD70の具体例は、NCBI参照配列寄託番号NP_001243で示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、又はその細胞外ドメインを含む。
【００７２】
「結合部位」−本明細書で使用する用語「結合部位」は、関心対象の標的抗原(例えばヒトCD70)への選択的結合に係わっているポリペプチドの領域を含む。結合ドメインは、少なくとも1つの結合部位を含む。結合ドメインの例としては、抗体可変ドメインが挙げられる。本発明の抗体分子は、1つの結合部位又は複数(例えば、2、3若しくは4つ)の結合部位を含むことができる。
【００７３】
「から誘導された」−本明細書で使用する用語である指定のタンパク質(例えばCD70抗体又はその抗原結合断片)「から誘導された」とは、そのポリペプチドの起源をいう。一実施態様において、特定の出発ポリペプチドから誘導されたポリペプチド又はアミノ酸配列は、CDR配列又はそれらに関連した配列である。一実施態様において、特定の出発ポリペプチドから誘導されたアミノ酸配列は、近接していない。例えば一実施態様において、1、2、3、4、5又は6のCDRが、出発抗体から誘導される。一実施態様において、特定の出発ポリペプチド又はアミノ酸配列から誘導されるポリペプチド又はアミノ酸配列は、出発配列のアミノ酸配列又はそれらの部分と本質的に同一であるアミノ酸配列であって、ここで該部分は、少なくとも3〜5個のアミノ酸、少なくとも5〜10個のアミノ酸、少なくとも10〜20個のアミノ酸、少なくとも20〜30個のアミノ酸、又は少なくとも30〜50個のアミノ酸からなり、又はそうでなければ当業者が、出発配列にその起源を有するとして同定可能であるアミノ酸配列を有する。一実施態様において、出発抗体から誘導された1以上のCDR配列は、変更され、バリアントCDR配列、例えば親和性バリアントを生じ、ここで該バリアントCDR配列は、CD70結合活性を維持している。
【００７４】
「ラクダ科動物-由来の」−特定の好ましい実施態様において、本発明のCD70抗体分子は、CD70抗原によるラクダ科動物の能動免疫により生じたラクダ科動物通常型抗体から誘導されたフレームワークアミノ酸配列及び／又はCDRアミノ酸配列を含む。しかし、ラクダ科動物-由来のアミノ酸配列を含むCD70抗体は、ヒトアミノ酸配列(すなわち、ヒト抗体)又は他の非-ラクダ科の哺乳動物種から誘導されたフレームワーク配列及び／又は定常領域配列を含むように操作することができる。例えば、ヒト又は非-ヒト霊長類フレームワーク領域、重鎖部分、及び／又はヒンジ部分を、対象のCD70抗体に含むことができる。一実施態様において、1以上の非-ラクダ科動物アミノ酸が、「ラクダ科動物-由来の」CD70抗体のフレームワーク領域に存在することができ、例えばラクダ科動物フレームワークアミノ酸配列は、その中に対応するヒト又は非-ヒト霊長類アミノ酸残基が存在する1以上のアミノ酸変異を含むことができる。更にラクダ科動物-由来のVHドメイン及びVLドメイン、又はそれらのヒト化されたバリアントは、ヒト抗体の定常ドメインに連結され、本明細書の別所に広く記載するキメラ分子を作製することができる。
【００７５】
「保存的アミノ酸置換」−「保存的アミノ酸置換」は、その中のアミノ酸残基が、類似側鎖を持つアミノ酸残基で置き換えられているものである。類似側鎖を持つアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されており、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β-分枝側鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)、及び芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。従って免疫グロブリンポリペプチド内の非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基と置き換えることができる。別の実施態様において、アミノ酸の列(string)は、側鎖ファミリーメンバーの順番及び／又は組成が異なる構造的に類似した列で置き換えることができる。
【００７６】
「重鎖部分」−本明細書で使用する用語「重鎖部分」は、免疫グロブリン重鎖の定常ドメインから誘導されたアミノ酸配列を含む。重鎖部分を含むポリペプチドは、以下の少なくとも1つを含む：CH1ドメイン、ヒンジ(例えば、上部、中央、及び／又は下部ヒンジ領域)ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン、又はそれらのバリアント若しくは断片。一実施態様において、本発明の抗体又は抗原結合断片は、免疫グロブリン重鎖のFc部分(例えば、ヒンジ部分、CH2ドメイン、及びCH3ドメイン)を含むことができる。別の実施態様において、本発明の抗体又は抗原結合断片は、定常ドメインの少なくとも一部分(例えば、CH2ドメインの全て又は一部)を欠いている。いくつかの実施態様において、少なくとも1つ、及び好ましくは全ての定常ドメインが、ヒト免疫グロブリン重鎖から誘導されている。例えば好ましい一実施態様において、重鎖部分は、完全ヒトヒンジドメインを含む。別の好ましい実施態様において、重鎖部分は、完全ヒトFc部分(例えば、ヒト免疫グロブリン由来のヒンジ、CH2及びCH3ドメイン配列)を含む。
【００７７】
特定の実施態様において、重鎖部分の構成的定常ドメインは、異なる免疫グロブリン分子に由来している。例えば、ポリペプチドの重鎖部分は、IgG1分子から誘導されたCH2ドメイン、及びIgG3又はIgG4分子から誘導されたヒンジ領域を含むことができる。他の実施態様において、定常ドメインは、異なる免疫グロブリン分子の部分を含むキメラドメインである。例えば、ヒンジは、IgG1分子由来の第一の部分、及びIgG3又はIgG4分子由来の第二の部分を含むことができる。先に示したように、当業者には、重鎖部分の定常ドメインは、天然の(野生型の)免疫グロブリン分子から、アミノ酸配列が変動するように改変され得ることは理解されるであろう。すなわち、本明細書に開示された本発明のポリペプチドは、1以上の重鎖定常ドメイン(CH1、ヒンジ、CH2又はCH3)に、及び／又は軽鎖定常ドメイン(CL)に、変更又は改変を含むことができる。改変の例としては、1つ以上のドメイン内の1個以上のアミノ酸の付加、欠失又は置換が挙げられる。
【００７８】
「キメラ」−「キメラ」タンパク質は、本来は天然には連結しない第二のアミノ酸配列に連結された第一のアミノ酸配列を含む。これらのアミノ酸配列は、融合ポリペプチドにおいて一緒にされた個別のタンパク質において正常に存在することができるか、或いはこれらは同じタンパク質内において正常に存在するが、融合ポリペプチド内では新たな並びで配置されることができる。キメラタンパク質は、例えば、キメラ合成によるか、又はその中にペプチド領域が所望の関係でコードされているポリヌクレオチドの作出及び翻訳により作製することができる。キメラCD70抗体の例は、ヒト抗体、例えばヒトIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4の定常ドメインに融合された、ラクダ科動物-由来のVHドメイン及びVLドメイン、又はそれらのヒト化されたバリアントを含む融合タンパク質が挙げられる。
【００７９】
「可変領域」又は「可変ドメイン」−用語「可変領域」及び「可変ドメイン」は、本明細書において互換的に使用し、且つ同等の意味を有することが意図される。用語「可変」とは、可変ドメインVH及びVLのある部分は、抗体間で配列が大きく異なるという事実をいい、且つ特定の抗体の各々のその標的抗原に対する結合及び特異性において使用される。しかしその可変性は、抗体の可変ドメインを通じて均等には分散していない。これは、抗原結合部位の一部を形成しているVLドメイン及びVHドメインの各々において「超可変ループ」と称される3つのセグメントに集中している。Vλ軽鎖ドメインの第一、第二及び第三の超可変ループは、本明細書においてL1(λ)、L2(λ)及びL3(λ)と称され、且つVLドメインにおいて残基24-33(9、10又は11個のアミノ酸残基からなる、L1(λ))、49-53(3個の残基からなる、L2(λ))及び90-96(5個の残基からなる、L3(λ))を含むと定義され得る(Moreaらの文献、Methods, 20:267-279 (2000))。Vκ軽鎖ドメインの第一、第二及び第三の超可変ループは、本明細書において、L1(κ)、L2(κ)及びL3(κ)と称され、且つVLドメインにおいて残基25-33(6、7、8、11、12又は13個の残基からなる、L1(κ))、49-53(3個の残基からなる、L2(κ))及び90-97(6個の残基からなる、L3(κ))を含むと定義され得る(Moreaらの文献、Methods, 20:267-279 (2000))。VHドメインの第一、第二及び第三の超可変ループは、本明細書において、H1、H2及びH3と称され、且つVHドメインにおいて残基25-33(7、8又は9個の残基からなる、H1)、52-56(3又は4個の残基からなる、H2)及び91-105(長さが高度に変動する、H3)を含むと定義され得る(Moreaらの文献、Methods, 20: 267-279 (2000))。
【００８０】
用語L1、L2及びL3は、別に指摘しない限りは、各々、VLドメインの第一、第二及び第三の超可変ループを意味し、且つVκ及びVλ両アイソタイプから得られた超可変ループを包含している。用語H1、H2及びH3は、各々、VHドメインの第一、第二及び第三の超可変ループを意味し、且つγ、ε、δ、α又はμを含む、公知の重鎖アイソタイプのいずれかから得られた超可変ループを包含している。
【００８１】
前述の超可変ループL1、L2、L3、H1、H2及びH3は、各々、以下に規定するように、「相補性決定領域」又は「CDR」の一部を含むことができる。超可変ループ(HV)は構造を基に規定されるのに対し、相補性決定領域(CDR)は配列可変性を基に規定されるので、用語「超可変ループ」と「相補性決定領域」は、厳密には同義語ではなく(Kabatらの文献、「免疫学的関心のあるタンパク質の配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)」、第5版、Public Health Service、米国国立衛生研究所(NIH)、Bethesda、MD.、1983)、且つHVとCDRの境界は、一部のVHドメイン及びVLドメインにおいて異なることがあってよい。
【００８２】
前記VL及びVHドメインのCDRは、典型的には、下記のアミノ酸を含むと定義されることができる：軽鎖可変ドメイン中の残基24-34(CDRL1)、50-56(CDRL2)及び89-97(CDRL3)、並びに重鎖可変ドメイン中の残基31-35又は31-35b(CDRH1)、50-65(CDRH2)及び95-102(CDRH3)；(Kabatらの文献、「免疫学的関心のあるタンパク質の配列」、第5版、Public Health Service、NIH、Bethesda、MD.、(1991))。従ってこれらのHVは、対応するCDR内に含まれることができ、且つ別に指摘しない限りは、本明細書におけるVH及びVLドメインの「超可変ループ」の言及は、対応するCDRも包含すると解釈されなければならず、その逆もまた同様である。
【００８３】
可変ドメインのより高度に保存された部分は、以下に定義したように、フレームワーク領域(FR)と称される。未変性の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、各々、3つの超可変ループにより接続された、β-シート配置を主として採用している4つのFR(各々、FR1、FR2、FR3及びFR4)を含む。各鎖内の超可変ループは、これらのFRにより密に近接して保持され、且つ他方の鎖由来の超可変ループと一緒に、抗体の抗原結合部位の形成に貢献する。抗体の構造解析は、相補性決定領域により形成された結合部位の配列と形状の間の関係を明らかにした(Chothiaらの文献、J. Mol. Biol., 227: 799-817 (1992))；Tramontanoらの文献、J. Mol. Biol., 215: 175-182 (1990))。それらの高度な配列可変性にもかかわらず、これら6つのループの5つは、「カノニカル構造」と称される、主鎖高次構造の小さいレパトアのみを採用している。これらの高次構造は、まず第一にループの長さにより決定され、且つ第二に、それらのパッキング、水素結合又は通常でない主鎖高次構造を推定する能力を通じ、高次構造を決定するループ内及びフレームワーク領域内の特定位置での重要残基の存在により決定される。
【００８４】
「CDR」−本明細書で使用する用語「CDR」又は「相補性決定領域」は、重鎖及び軽鎖の両ポリペプチドの可変領域内に認められる近接していない抗原結合部位を意味する。これらの特定の領域は、Kabatらの文献、J. Biol. Chem. 252: 6609-6616 (1977)、及びKabatらの文献、「免疫学的関心のあるタンパク質の配列」(1991)、及びChothiaらの文献、J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)、及びMacCallumらの文献、J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)に説明されており、そこでこれらの定義は、互いに比較した場合のアミノ酸残基の重複又はサブセットを含んでいる。先に引用した各参考文献により定義されたCDRを包含しているアミノ酸残基を、比較のために示す。好ましくは、用語「CDR」は、配列比較を基にKabatにより定義されるCDRである。
【００８５】
【表１】
0005982409.tif 000038
【００８６】
「フレームワーク領域」−本明細書で使用する用語「フレームワーク領域」又は「FR領域」は、可変領域の一部であるが、CDRの一部ではない、アミノ酸残基を含む(例えば、CDRのKabat定義を使用する)。従って、可変領域フレームワークは、長さが約100〜120個のアミノ酸であるが、CDRの外側のそれらのアミノ酸のみを含む。重鎖可変領域の具体例及びKabatらにより定義されたCDRについて、フレームワーク領域1は、アミノ酸1-30を包含する可変領域のドメインに相当し；フレームワーク領域2は、アミノ酸36-49を包含する可変領域のドメインに相当し；フレームワーク領域3は、アミノ酸66-94を包含する可変領域のドメインに相当し、且つフレームワーク領域4は、アミノ酸103からその可変領域の末端までの可変領域のドメインに相当している。軽鎖のフレームワーク領域は同様に、軽鎖可変領域CDRの各々により隔てられている。同様に、Chothiaら又はMcCallumらによるCDRの定義を使用し、フレームワーク領域の境界は、先に説明したように、それぞれのCDR末端により隔てられる。好ましい実施態様において、CDRは、Kabatにより定義されているものである。
【００８７】
抗体は水性環境においてその三次元立体配置を推定するので、天然の抗体において、各モノマー抗体に存在する6つのCDRは、抗原結合部位を形成するように特異的に配置されているアミノ酸の短い近接しない配列である。重鎖及び軽鎖可変ドメインの残りは、アミノ酸配列においてより少ない内部分子の可変性を示し、且つフレームワーク領域と称される。これらのフレームワーク領域は大部分、β-シート高次構造を採用し、且つこれらのCDRは、β-シート構造に接続し、場合によってはβ-シート構造の一部を形成しているループを形成する。従ってこれらのフレームワーク領域は、鎖内非共有相互作用により正確に方向付けられた6つのCDRの配置を供するスカフォールドを形成するように働く。配置されたCDRにより形成された抗原結合部位は、免疫反応性抗原上のエピトープに対する表面相補性を規定する。この相補性表面は、免疫反応性抗原エピトープに対する抗体の非共有結合を促進する。当業者により、CDRの位置は、容易に同定され得る。
【００８８】
「ヒンジ領域」−本明細書で使用する用語「ヒンジ領域」は、CH1ドメインをCH2ドメインに接続する重鎖分子の部分を含む。このヒンジ領域は、およそ25の残基を含み、且つ柔軟性があり、結果的に2つのN-末端抗原結合領域が独立して動くことを可能にしている。ヒンジ領域は、上部、中央、及び下部ヒンジドメインの3つの別のドメインに更に分割することができる(Rouxらの文献、J. Immunol. 1998 161: 4083)。「完全ヒト」ヒンジ領域を含むc-Met抗体は、下記表2に示したヒンジ領域配列の一つを含むことができる。
【００８９】
【表２】
0005982409.tif 000039
【００９０】
「CH2ドメイン」−本明細書で使用する用語「CH2ドメイン」は、慣習的番号付けスキームを使用し、例えば抗体のほぼ残基244から残基360まで伸びる重鎖分子の部分を含む(残基244から360、カバット番号付けシステム；及び、残基231-340、EU番号付けシステム、Kabat EAらの文献、「免疫学的関心のあるタンパク質の配列」、Bethesda、US Department of Health and Human Services, NIH. 1991)。CH2ドメインは、別のドメインと密に対合しない点で独特である。むしろ、2つのN-結合型分岐した糖鎖が、無傷の未変性のIgG分子の2つのCH2ドメイン間に差し挟まれている。また、CH3ドメインは、CH2ドメインから、IgG分子のC-末端まで伸びていて、およそ108残基を含むことも良く実証されている。
【００９１】
「断片」−用語「断片」とは、無傷の又は完全な抗体又は抗体鎖よりもより少ないアミノ酸残基を含む抗体又は抗体鎖の一部又は部分をいう。用語「抗原結合断片」とは、抗原に結合するか、或いは抗原結合(すなわち、ヒトCD70への特異的結合)について無傷の抗体(すなわち、それらが誘導された無傷の抗体)と競合する、免疫グロブリン又は抗体のポリペプチド断片をいう。本明細書で使用する用語、抗体分子の「断片」とは、抗体の抗原結合断片、例えば、抗体軽鎖可変ドメイン(VL)、抗体重鎖可変ドメイン(VH)、単鎖抗体(scFv)、F(ab’)2断片、Fab断片、Fd断片、Fv断片、単一ドメイン抗体断片(DAb)を含む。断片は、例えば、無傷の又は完全な抗体又は抗体鎖の化学処理若しくは酵素処理によるか、又は組換え手段により得ることができる。
【００９２】
「結合価」−本明細書で使用する用語「結合価」とは、ポリペプチド中の可能性のある標的結合部位の数をいう。各標的結合部位は、1つの標的分子又は標的分子上の特異的部位に特異的に結合する。ポリペプチドが2以上の標的結合部位を含む場合、各標的結合部位は、同じ又は異なる分子に特異的に結合することができる(例えば、異なるリガンド又は異なる抗原、或いは同じ抗原上の異なるエピトープに結合することができる)。対象の結合分子は、ヒトCD70分子に特異的な結合部位を少なくとも1つ有する。
【００９３】
「特異性」−用語「特異性」とは、所与の標的、例えばCD70と結合する(例えば免疫反応する)能力をいう。ポリペプチドは、単一特異性であり、且つ標的に特異的に結合する結合部位を1以上含むことができるか、或いはポリペプチドは、多重特異性であり、且つ同じ又は異なる標的に特異的に結合する2以上の結合部位を含むことができる。一実施態様において、本発明の抗体は、2以上の標的に特異的である。例えば、一実施態様において、本発明の多重特異性結合分子は、腫瘍細胞上に発現されたCD70と第二の分子に結合する。腫瘍細胞上に発現された抗原に結合する抗原結合部位を含む抗体の例は、当該技術分野において公知であり、且つそのような抗体由来の1以上のCDRは、本発明の抗体に含むことができる。
【００９４】
「合成の」−ポリペプチドに関して本明細書で使用する用語「合成の」は、天然ではないアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。例えば、天然ではないポリペプチドは、天然のポリペプチドの改変された形態であるか(例えば、付加、置換又は欠失などの変異を含む)、又は事実上天然には連結されない第二のアミノ酸配列(これは天然であってもなくてもよい)に、アミノ酸の線状配列で連結された第一のアミノ酸配列(これは天然であってもなくてもよい)を含む。
【００９５】
「操作された」−本明細書で使用する用語「操作された」は、合成手段による(例えば、組換え技術、インビトロペプチド合成、ペプチドの酵素的又は化学的カップリング、又はこれらの技術のいくつかの組合せによる)、核酸又はポリペプチド分子の操作を含む。好ましくは、本発明の抗体は操作されており、例えば、ヒト化及び／又はキメラ抗体、並びに抗原結合、安定性／半減期又はエフェクター機能などの1以上の特性を改善するよう操作されている抗体を含む。
【００９６】
「改変された抗体」−本明細書で使用する用語「改変された抗体」は、天然に生じないように変更された抗体の合成の形態を含み、例えば、少なくとも2つの重鎖部分を含むが2つの完全重鎖は含まない抗体(例えば、ドメイン欠失された抗体又はミニボディ(minibody))；2つ以上の異なる抗原又は単独の抗原上の異なるエピトープに結合するように変更された抗体の多重特異性形態(例えば、二特異性、三特異性など)；scFv分子に結合された重鎖分子などがある。scFv分子は、当該技術分野において公知であり、且つ例えば米国特許第5,892,019号に説明されている。加えて、用語「改変された抗体」は、抗体の多価の形態(例えば、同じ抗原の3以上のコピーに結合する三価、四価などの抗体)を含む。別の実施態様において、本発明の改変された抗体は、CH2ドメインを欠く少なくとも1つの重鎖部分を含み、且つ受容体リガンド対の一員の結合部分を含むポリペプチドの結合ドメインを含む融合タンパク質である。
【００９７】
用語「改変された抗体」は、CD70抗体のアミノ酸配列バリアントを意味するように本明細書で使用することもできる。当業者には、CD70抗体は、それが誘導されたCD70抗体に比べ、アミノ酸配列が変動しているバリアントCD70抗体を作出するように改変することができることは、理解されるであろう。例えば、保存的置換又は「非必須」アミノ酸残基での変化につながるヌクレオチド又はアミノ酸の置換を行うことができる(例えば、CDR及び／又はフレームワーク残基において)。アミノ酸置換は、1以上のアミノ酸の、天然の又は非天然のアミノ酸との置き換えを含むことができる。
【００９８】
「ヒト化置換」−本明細書で使用する用語「ヒト化置換」とは、CD70抗体(例えば、ラクダ科動物-由来のCD70抗体)中のVH又はVLドメイン中の特定の位置に存在するアミノ酸残基が、参照ヒトVH又はVLドメイン中の同等の位置に生じるアミノ酸残基により置き換えられるアミノ酸置換をいう。参照ヒトVH又はVLドメインは、ヒト生殖細胞系列によりコードされたVH又はVLドメインであってよい。ヒト化置換は、本明細書に定義されたように、CD70抗体のフレームワーク領域及び／又はCDRに行うことができる。
【００９９】
「ヒト化バリアント」−本明細書において使用する用語「ヒト化バリアント」とは、参照CD70抗体と比べ1以上の「ヒト化置換」を含むバリアント抗体をいい、ここで該参照抗体の部分(例えば、VHドメイン及び／又はVLドメイン又は少なくとも1つのCDRを含むそれらの一部)は、非-ヒト種由来のアミノ酸(amino)を有し、且つ「ヒト化置換」は、非-ヒト種由来のアミノ酸配列内に起こる。
【０１００】
「生殖細胞系列化バリアント」−用語「生殖細胞系列化バリアント」は、「ヒト化置換」が、CD70抗体(例えば、ラクダ科動物-由来のCD70抗体)のVH又はVLドメイン中の特定の位置に存在する1以上のアミノ酸残基が、ヒト生殖細胞系列によりコードされた参照ヒトVH又はVLドメイン中の同等の位置に生じるアミノ酸残基により置き換えられる「ヒト化バリアント」を具体的に指すように、本明細書において使用する。いずれか所定の「生殖細胞系列化バリアント」に関して、生殖細胞系列化バリアントへと置換された置き換えアミノ酸残基は、専ら若しくは優先的に単独のヒト生殖細胞系列-コードされたVH又はVLドメインから得られることは、一般的である。用語「ヒト化バリアント」と「生殖細胞系列化バリアント」は、本明細書において互換的に使用することが多い。1以上の「ヒト化置換」のラクダ科動物-由来の(例えば、ラマ由来の)VH又はVLドメインへの導入は、結果的にラクダ科動物(ラマ)-由来のVH又はVLドメインの「ヒト化バリアント」を生成する。この置換されたアミノ酸残基が優先的又は専ら単独のヒト生殖細胞系列-コードされたVH又はVLドメイン配列に由来する場合、結果的にラクダ科動物(ラマ)-由来のVH又はVLドメインの「ヒト生殖細胞系列化バリアント」が生じる。
【０１０１】
「親和性バリアント」−本明細書で使用する用語「親和性バリアント」とは、参照CD70抗体と比べアミノ酸配列に1以上の変化を示す「バリアント抗体」をいい、ここで該親和性バリアントは、ヒトCD70タンパク質について参照抗体と比べ変更された親和性を示す。典型的には、親和性バリアントは、ヒトCD70について参照CD70抗体と比べ変化された親和性を示すであろう。好ましくは、親和性バリアントは、ヒトCD70について参照CD70抗体と比べ「改善された」親和性を示すであろう。この改善は、ヒトCD70についてより低いKD、又はヒトCD70についてより遅いオフレート、又は非-ヒトCD70ホモログとの交差反応性のパターンの変更のいずれかであることができる。親和性バリアントは典型的には、参照CD70抗体と比べ、CDRのアミノ酸配列に1以上の変化を示す。そのような置換は、CDRの所定の位置に存在する当初のアミノ酸の、天然のアミノ酸残基又は非天然のアミノ酸残基であってよい異なるアミノ酸残基との置き換えを生じることができる。このアミノ酸置換は、保存的又は非保存的であることができる。
【０１０２】
「高ヒト相同性」−重鎖可変ドメイン(VH)及び軽鎖可変ドメイン(VL)を含む抗体は、このVHドメイン及びVLドメインが一緒に、最も良くマッチしているヒト生殖細胞系列VH配列及びVL配列と少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を示す場合に、高ヒト相同性を有するとみなされるであろう。高ヒト相同性を有する抗体は、例えば、ラクダ科動物の通常型抗体のVH及びVLドメインを含む抗体、加えてそのような抗体の操作された、特にヒト化若しくは生殖細胞系列化されたバリアント及びまた「完全ヒト」抗体を含む、ヒト生殖細胞系列配列と十分に高い％配列同一性を示す、未変性の非ヒト抗体のVH及びVLドメインを含む抗体を含むことができる。
【０１０３】
一実施態様において、高ヒト相同性を伴う抗体のVHドメインは、フレームワーク領域FR1、FR2、FR3及びFR4にわたり、1つ以上のヒトVHドメインと、80％以上のアミノ酸配列同一性又は配列相同性を示すことができる。他の実施態様において、本発明のポリペプチドのVHドメインと最も良くマッチしているヒト生殖細胞系列VHドメイン配列の間のアミノ酸配列同一性又は配列相同性は、85％以上、90％以上、95％以上、97％以上、又は最大99％若しくは100％でさえであることができる。
【０１０４】
一実施態様において、高ヒト相同性を伴う抗体のVHドメインは、フレームワーク領域FR1、FR2、FR3及びFR4にわたり、最も近いマッチしたヒトVH配列と比べ、1以上(例えば1〜10)のアミノ酸配列ミスマッチを含むことができる。
【０１０５】
別の実施態様において、高ヒト相同性を伴う抗体のVLドメインは、フレームワーク領域FR1、FR2、FR3及びFR4にわたり1つ以上のヒトVLドメインと、80％以上の配列同一性又は配列相同性を示すことができる。他の実施態様において、本発明のポリペプチドのVLドメインと最も近いマッチしたヒト生殖細胞系列VLドメイン配列の間のアミノ酸配列同一性又は配列相同性は、85％以上、90％以上、95％以上、97％以上、又は最大99％若しくは100％でさえであることができる。
【０１０６】
一実施態様において、高ヒト相同性を伴う抗体のVLドメインは、フレームワーク領域FR1、FR2、FR3及びFR4にわたり、最も近いマッチしたヒトVL配列と比べ、1以上(例えば1〜10)のアミノ酸配列ミスマッチを含むことができる。
【０１０７】
高ヒト相同性を伴う抗体と、ヒト生殖細胞系列VH及びVLの間の％配列同一性を解析する前に、そのカノニカルフォールドを決定することができ、このことは、H1及びH2又はL1及びL2(及びL3)に関するカノニカルフォールドの同一の組合せを伴うヒト生殖細胞系列セグメントファミリーの同定を可能にする。引き続き、関心対象の抗体の可変領域と最高度の配列相同性を有するヒト生殖細胞系列ファミリーのメンバーが、配列相同性のスコア化のために選択される。超可変ループL1、L2、L3、H1及びH2のショティアカノニカルクラスの決定は、www.bioinf.org.uk/abs/chothia.htmlのウェブページ上で公に利用可能なバイオインフォマティクスツールにより実行することができる。このプログラムのアウトプットは、データファイルにおける重要残基の必要要件を示す。これらのデータファイルにおいて、重要残基の位置は、各位置で可能なアミノ酸と共に示される。関心対象の抗体の可変領域の配列は、インプットとして入力され、且つカバット番号付けスキームを割り当てるために、最初にコンセンサス抗体配列と並置される。このカノニカルフォールドの解析は、Martin及びThorntonにより開発された自動化された方法によりもたらされた重要残基鋳型のセットを使用する(Martinらの文献、J. Mol. Biol. 263: 800-815 (1996))。
【０１０８】
H1及びH2又はL1及びL2(及びL3)に関するカノニカルフォールドの同じ組合せを使用する、公知の特定のヒト生殖細胞系列Vセグメントにより、配列相同性に関するベストマッチングファミリーメンバーを決定することができる。関心対象の抗体のVH及びVLドメインフレームワークアミノ酸配列と、ヒト生殖細胞系列によりコードされた対応する配列の間の％配列同一性は、バイオインフォマティクスツールにより決定することができるが、実際にはこれらの配列の手作業によるアラインメントも適用することができる。ヒト免疫グロブリン配列は、VBase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)又はPluckthun/Honeggerデータベース(http://www.bioc.unizh.ch/antibody/Sequences/Germlines)のような、いくつかのタンパク質データベースから同定することができる。ヒト配列を関心対象の抗体のVH又はVLドメインのV領域と比較するために、配列アラインメントアルゴリズム、例えばウェブサイトwww.expasy.ch/tools/#alignなどを介して利用可能なものを使用することができるが、同じく配列の限定されたセットとの手作業によるアラインメントも行うことができる。カノニカルフォールドの同じ組合せを持ち、且つ各鎖のフレームワーク領域1、2、及び3との最高度の相同性を伴うこれらのファミリーのヒト生殖細胞系列軽鎖及び重鎖配列が選択され、且つ関心対象の可変領域と比較され；またこのFR4は、ヒト生殖細胞系列JH及びJK又はJL領域に対してチェックされる。
【０１０９】
全体の％配列相同性の計算において、FR1、FR2及びFR3の残基は、カノニカルフォールドの同じ組合せを持つヒト生殖細胞系列ファミリーから最も近いマッチング配列を用いて評価されることに留意されたい。カノニカルフォールドの同じ組合せを持つ同じファミリーの最も近いマッチングのメンバー又は他のメンバーと異なる残基のみが、スコア化される(NB-プライマーにコードされた差異は除外する)。しかしヒト化の目的のためには、カノニカルフォールドの同じ組合せを有さない他のヒト生殖細胞系列ファミリーのメンバーと同じフレームワーク領域内の残基は、先に記載のストリンジェントな条件に従い「ネガティブ」とスコア化されるという事実にもかかわらず、これらは「ヒト」と考えることができる。この前提は、Quとその同僚(Quらの文献、Clin. Cancer Res. 5: 3095-3100 (1999))並びにOnoとその同僚(Onoらの文献、Mol. Immunol. 36: 387-395 (1999))により研究されたように、FR1、FR2、FR3及びFR4の各々が、その最も近いマッチングのヒト生殖細胞系列配列と個別に比較され、その結果ヒト化された分子は、異なるFRの組合せを含むという、ヒト化のための「ミックス及びマッチ」法を基本にしている。個々のフレームワーク領域の境界は、ショティア番号付けスキームの改変である、IMGT番号付けスキームを用いて割り当てることができる(Lefrancらの文献、NAR, 27: 209-212 (1999)；imgt.cines.fr)。
【０１１０】
高ヒト相同性を伴う抗体は、以下に詳細に考察するように、ヒト又はヒト-様のカノニカルフォールドを有する超可変ループ又はCDRを含むことができる。一実施態様において、高ヒト相同性を伴う抗体のVHドメイン又はVLドメインのいずれかの中の少なくとも1つの超可変ループ又はCDRは、非ヒト抗体、例えばラクダ科の種由来の通常型抗体のVHドメイン又はVLドメインから得るか又は誘導することができ、その上ヒト抗体において生じるカノニカルフォールド構造と実質的に同一である予測された又は実際のカノニカルフォールド構造を示す。
【０１１１】
ヒト生殖細胞系列によりコードされたVHドメイン及びVLドメインの両方に存在する超可変ループの一次アミノ酸配列は、定義により、高度に可変性であるが、VHドメインのCDR H3以外の全ての超可変ループは、カノニカルフォールドと称されるわずかに数種類の独特な構造の高次構造を採用し(Chothiaらの文献、J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)；Tramontanoらの文献、Proteins, 6: 382-94 (1989))、これは超可変ループの長さ及びいわゆるカノニカルアミノ酸残基の存在の両方によって決まる(Chothiaらの文献、J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987))ことは、当該技術分野においてよく確立されている。無傷のVH又はVLドメイン中の超可変ループの実際のカノニカル構造は、構造解析(例えばX線結晶解析)により決定することができるが、特定の構造に特徴的である重要なアミノ酸残基を基に、カノニカル構造を予測することも可能である(以下に更に考察する)。本質的に、各々のカノニカル構造を決定する残基の特異的パターンは、そのカノニカル構造が未知の構造のVH又はVLドメインの超可変ループにおいて認められることを可能にする「署名(signature)」を形成し；その結果カノニカル構造は、一次アミノ酸配列だけを基に予測することができる。
【０１１２】
高ヒト相同性を伴う抗体中のいずれか所定のVH又はVL配列の超可変ループに関して予測されたカノニカルフォールド構造は、www.bioinf.org.uk/abs/chothia.html、www.biochem.ucl.ac.uk/~martin/antibodies.html、及びwww.bioc.unizh.ch/antibody/Sequences/Germlines/Vbase_hVk.htmlから公に利用可能であるアルゴリズムを用いて解析することができる。これらのツールは、クエリーVH又はVL配列を、公知のカノニカル構造のヒトVH又はVLドメイン配列に対して並置すること、並びにクエリー配列の超可変ループに関して生じたカノニカル構造の予測を可能にする。
【０１１３】
VHドメインの場合、H1及びH2ループは、少なくとも下記の第一の判定基準、好ましくは両方の判定基準が満たされる場合、ヒト抗体において生じることがわかっているカノニカルフォールド構造と「実質的に同一の」カノニカルフォールド構造を有するものとして、スコア化することができる：
1.残基の数により決定された、最も近いマッチングのヒトカノニカル構造クラスと、同一の長さ、
2.対応するヒトH1及びH2のカノニカル構造クラスに関して説明された重要なアミノ酸残基との、少なくとも33％の同一性、好ましくは少なくとも50％の同一性。
(前述の解析を目的として、H1及びH2ループは、個別に処理され、且つ各々その最も近いマッチングのヒトカノニカル構造クラスに対し比較されることに留意されたい)。
【０１１４】
前記解析は、関心対象の抗体のH1及びH2ループのカノニカル構造の予測に頼っている。例えばX線結晶解析を基に関心対象の抗体のH1及びH2ループの実際の構造がわかっている場合には、関心対象の抗体のH1及びH2ループはまた、そのループの長さは最も近いマッチングのヒトカノニカル構造クラスの長さと異なる(典型的には±1又は±2個のアミノ酸)が、関心対象の抗体のH1及びH2ループの実際の構造はヒトカノニカルフォールドの構造とマッチする場合に、ヒト抗体において生じることがわかっているカノニカルフォールド構造と「実質的に同一の」カノニカルフォールド構造を有するものとしてスコア化することができる。
【０１１５】
ヒトVHドメインの第一及び第二の超可変ループ(H1及びH2)に関してヒトカノニカル構造クラスにおいて認められた重要なアミノ酸残基は、Chothiaらの文献(J. Mol. Biol. 227: 799-817 (1992))に記載されており、この文献の内容はその全体が引用により本明細書中に組み込まれている。特に、引用により本明細書中に具体的に組み込まれているChothiaらの文献の802頁の表3は、ヒト生殖細胞系列において認められたH1カノニカル構造の重要な位置での好ましいアミノ酸残基を列記しているのに対し、同じく具体的に引用によりに組み込まれている803頁の表4は、ヒト生殖細胞系列において認められたCDR H2カノニカル構造の重要な位置での好ましいアミノ酸残基を列記している。
【０１１６】
一実施態様において、高ヒト相同性を伴う抗体のVHドメイン中のH1及びH2の両方は、ヒト抗体において生じるカノニカルフォールド構造と実質的に同一である予測された又は実際のカノニカルフォールド構造を示す。
【０１１７】
高ヒト相同性を伴う抗体は、そこで超可変ループH1及びH2が、少なくとも1つのヒト生殖細胞系列VHドメインにおいて生じることがわかっているカノニカル構造の組合せと同一であるカノニカルフォールド構造の組合せを形成するVHドメインを含むことができる。H1及びH2でのカノニカルフォールド構造のある種の組合せのみが、ヒト生殖細胞系列によりコードされたVHドメインにおいて実際に生じることが認められている。ある実施態様において、高ヒト相同性を伴う抗体のVHドメイン中のH1及びH2は、非ヒト種、例えばラクダ科の種のVHドメインから得ることができ、その上ヒト生殖細胞系列又は体細胞変異されたVHドメインにおいて生じることがわかっているカノニカルフォールド構造の組合せと同一であると予測された又は実際のカノニカルフォールド構造の組合せを形成する。非限定的実施態様において、高ヒト相同性を伴う抗体のVHドメイン中のH1及びH2は、非ヒト種、例えばラクダ科の種のVHドメインから得ることができ、且つ1-1、1-2、1-3、1-6、1-4、2-1、3-1及び3-5のカノニカルフォールド組合せのひとつを形成する。
【０１１８】
高ヒト相同性を伴う抗体は、ヒトVHと高い配列同一性／配列相同性の両方を示し、且つヒトVHと構造相同性を示す超可変ループを含むVHドメインを含むことができる。
【０１１９】
高ヒト相同性を伴う抗体のVHドメイン中のH1及びH2に存在するカノニカルフォールド、並びにそれらの組合せに関して、全体の一次アミノ酸配列の同一性の観点で、高ヒト相同性を伴う抗体のVHドメインと最も近いマッチングを示すヒトVH生殖細胞系列配列に「補正」されることは有利である。例として、最も近い配列マッチングがヒト生殖細胞系列のVH3ドメインとである場合、H1及びH2に関して、ヒトVH3ドメインにおいても自然に生じるカノニカルフォールドの組合せを形成することは有利であることができる。非ヒト種から誘導された高ヒト相同性を伴う抗体、例えば、ラクダ科動物の通常型抗体から誘導されたVH及びVLドメインを含む抗体、特にヒト化されたラクダ科動物のVH及びVLドメインを含む抗体の場合、このことは特に重要である。
【０１２０】
従って一実施態様において、高ヒト相同性を伴うCD70抗体のVHドメインは、フレームワーク領域FR1、FR2、FR3及びFR4にわたりヒトVHドメインと80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、97％以上、又は最大99％若しくは100％でさえもの配列同一性又は配列相同性を示すことができ、且つ加えて、同じ抗体のH1及びH2は、非ヒトの(例えば、ラクダ科の種から誘導された)VHドメインから得られるが、同じヒトVHドメインにおいて天然に生じることがわかっているカノニカルフォールド組合せと同じである予測された又は実際のカノニカルフォールド構造の組合せを形成する。
【０１２１】
他の実施態様において、高ヒト相同性を伴う抗体のVLドメインのL1及びL2は、各々、非ヒト種のVLドメイン(例えば、ラクダ科動物-由来のVLドメイン)から得られ、且つ各々、ヒト抗体において生じるカノニカルフォールド構造と実質的に同一である予測された又は実際のカノニカルフォールド構造を示す。
【０１２２】
前述のVHドメインと同様に、Vλ型及びVκ型の両方のVLドメインの超可変ループは、長さにより、及び特定のカノニカル位置での重要なアミノ酸残基の存在によっても一部決定される、限られた数の高次構造又はカノニカル構造を採用することができる。
【０１２３】
高ヒト相同性を有する関心対象の抗体内の、非ヒト種、例えばラクダ科の種のVLドメインから得られたL1、L2及びL3ループは、少なくとも下記の第一の判定基準、好ましくは両方の判定基準が満たされる場合、ヒト抗体において生じることがわかっているカノニカルフォールド構造と「実質的に同一の」カノニカルフォールド構造を有するものとして、スコア化することができる：
1.残基の数により決定された、最も近いマッチングのヒトの構造クラスと、同一の長さ、
2.Vλ又はVκレパトアのいずれかからの、対応するヒトL1又はL2のカノニカル構造クラスに関して説明された重要なアミノ酸残基との、少なくとも33％の同一性、好ましくは少なくとも50％の同一性。
(前述の解析を目的として、L1及びL2ループは、個別に処理され、且つ各々その最も近いマッチングのヒトカノニカル構造クラスに対し比較されることに留意されたい)。
【０１２４】
前記解析は、関心対象の抗体のVLドメインのL1、L2及びL3ループのカノニカル構造の予測に頼っている。例えばX線結晶解析を基にL1、L2及びL3ループの実際の構造がわかっている場合には、関心対象の抗体から誘導されたL1、L2又はL3ループはまた、そのループの長さは最も近いマッチングのヒトカノニカル構造クラスの長さと異なる(典型的には±1又は±2個のアミノ酸)が、これらのラクダ科ループの実際の構造はヒトカノニカルフォールドとマッチする場合に、ヒト抗体において生じることがわかっているカノニカルフォールド構造と「実質的に同一の」カノニカルフォールド構造を有するものとして、スコア化することができる。
【０１２５】
ヒトVλ及びVκドメインのCDRに関してヒトカノニカル構造クラスにおいて認められた重要なアミノ酸残基は、Moreaらの文献、Methods, 20: 267-279 (2000)、及びMartinらの文献、J. Mol. Biol., 263: 800-815 (1996)に説明されている。同じくヒトVκドメインの構造的レパトアは、Tomlinsonらの文献、EMBO J. 14: 4628-4638 (1995)に、並びにVλドメインの構造的レパトアは、Williamsらの文献、J. Mol. Biol., 264: 220-232 (1996)に説明されている。これらの論文の全ての内容は、引用により本明細書中に組み込まれている。
【０１２６】
高ヒト相同性を伴う抗体のVLドメイン中のL1及びL2は、ヒト生殖細胞系列VLドメインにおいて生じることがわかっているカノニカルフォールド構造の組合せと同一である予測された又は実際のカノニカルフォールド構造の組合せを形成することができる。非限定的実施態様において、高ヒト相同性を伴う抗体(例えば、ラクダ科動物-由来のVLドメインを含む抗体又はそれらのヒト化されたバリアント)のVλドメイン中のL1及びL2は、11-7、13-7(A,B,C)、14-7(A,B)、12-11、14-11及び12-12のカノニカルフォールド組合せのひとつを形成することができる(Williamsらの文献、J. Mol. Biol. 264: 220-32 (1996)に規定され、且つhttp://www.bioc.uzh.ch/antibody/Sequences/Germlines/ VBase_hVL.htmlに示されている)。非限定的実施態様において、Vκドメイン中のL1及びL2は、2-1、3-1、4-1及び6-1のカノニカルフォールド組合せのひとつを形成することができる(Tomlinsonらの文献、EMBO J. 14: 4628-38 (1995)に規定され、且つhttp://www.bioc.uzh.ch/antibody/Sequences/Germlines/VBase_hVK.htmlに示されている)。
【０１２７】
更なる実施態様において、高ヒト相同性を伴う抗体のVLドメインのL1、L2及びL3の3つは全て、実質的なヒト構造を示すことができる。高ヒト相同性を伴う抗体のVLドメインは、ヒトVLと高い配列同一性/配列相同性の両方を示すこと、同じくVLドメイン中の超可変ループはヒトVLと構造相同性を示すことが好ましい。
【０１２８】
一実施態様において、高ヒト相同性を伴うCD70抗体のVLドメインは、フレームワーク領域FR1、FR2、FR3及びFR4にわたりヒトVLドメインと80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、97％以上、又は最大99％若しくは100％でさえもの配列同一性を示すことができ、且つ加えて、超可変ループL1及び超可変ループL2は、同じヒトVLドメインにおいて天然に生じることがわかっているカノニカルフォールド組合せと同じであると予測された又は実際のカノニカルフォールド構造の組合せを形成することができる。
【０１２９】
当然、ヒト-コードされたVH/VL対合と最大の配列及び構造の相同性を伴うVH/VL対合(ラクダ科動物-由来したVH/VL対合)を含む高ヒト相同性を伴う抗体を提供するために、ヒトVHとの高い配列同一性/配列相同性を及びまたヒトVHの超可変ループとの構造相同性をも示すVHドメインを、ヒトVLとの高い配列同一性／配列相同性を及びまたヒトVLの超可変ループとの構造相同性をも示すVLドメインと組合せることが想定されている。
【０１３０】
先にまとめたように、本発明は、高親和性でヒトCD70へ結合する抗体及びそれらの抗原結合断片に、少なくとも一部関連している。本発明のCD70抗体及び抗体断片の特性及び特徴を、ここで更に詳細に説明する。
【０１３１】
(CD70結合及び親和性)
特定の態様において、本明細書に提供する抗体及びそれらの抗原結合断片は、ヒトCD70へ高親和性で結合する。ヒトCD70へ高親和性で結合する抗体又はそれらの抗原結合断片は、ヒトCD70について、及びより特定するとヒトCD70の細胞外ドメインについて、約10nM以下、又は1nM以下、又は0.1nM以下、又は10pM以下の結合親和性(KD)を示すことができる。
【０１３２】
前記CD70抗体(又は抗原結合断片)は、VH及びVLドメインがFabの形態で発現される場合、7×10-4s-1未満、好ましくは5×10-4s-1未満、又は2×10-4s-1未満、1×10-4s-1未満のヒトCD70結合の解離のオフレートを示すVH及びVLドメインを含むことができる。典型的には、このオフレートは、0.4×10-4s-1〜4.8×10-4s-1の範囲内に収まるであろう。結合親和性(KD)及び解離速度(koff)は、付随する実施例に説明するように、例えば表面プラズモン共鳴(BIAcore)などの、当業者に周知の標準技法を用いて測定することができる。簡単に述べると、被験試料50μlを、PBS 200μl＋0.02％ Tweenに添加し、下記のように1/400希釈する：試料(1mg/ml)5μl＋HBS-EP+(Biacore緩衝液)195μl、更に10μl＋HVS-EP+ 90μl＝2.5μg/mlに希釈する。Biacore分析は、製造業者の提供するプロトコールを使用し、高度にCD70コートされたCM5チップ(4000 RU)を用い、室温で実行する。
【０１３３】
これに関して、オフレートは、Fabの形態のVH及びVLの組合せについて測定されるが、これはVHドメインとVLドメインは、CD70結合に同等に寄与することを意味しないことは、留意されなければならない。多くのVH/VL組合せに関して、CD70結合に主に寄与するのはVHドメインであり、VLドメインは、溶解度及び／又はVH/VL対合の安定性に寄与する。
【０１３４】
本明細書記載のCD70抗体又はそれらのFab断片の、組換えヒトCD70への結合はまた、ELISAにより評価することもできる。
【０１３５】
本明細書記載のCD70抗体は更に、無傷の細胞、例えば786-O腎臓癌細胞及び他の癌細胞株の表面上に発現されたCD70への結合を示すことができる。CD70抗体のCD70-発現している細胞への結合は、フローサイトメトリーにより評価することができる。付随する実施例において示された結果は、バリアント41D12(非フコシル化IgG1 ARGX-110として発現された場合)を含む好ましいCD70抗体は、細胞-表面CD70への非常に強力な結合を示すことを明らかにしている。実際、多くの細胞株に関して、ARGX-110は、比較規準の先行技術の抗体SGN70よりもより強力な結合を示す。
【０１３６】
ARGX-110は、とりわけ、細胞株Raji、SU-DHL-6、MHHPREB1、Mino、Mec1、JVM-2、HH及びEBC-1を含む低コピー数でCD70を発現する細胞株への、並びに同じく患者(例えばCLL患者)から単離された癌細胞への、強力な結合を示し、両方の場合において、ARGX-110の結合はSGN70よりも著しく強力であることは、特に注目に値する。低コピー数細胞株及びCLL患者材料への「改善された」結合は、大部分、組換えCD70へのARGX-110の極めて高い親和性を反映している。これらの結合の特徴は、細胞傷害性部分若しくは細胞増殖抑制部分に連結された免疫複合体としてよりもむしろ、特に強力なエフェクター機能を発揮するIgG(例えば、非フコシル化IgG1)として利用される場合の、癌治療における類似した特性を持つ本明細書記載のARGX-110(41D12を基にした)及び他のCD70抗体の特定の有用性を裏付けている。該抗体の臨床での実用に関して、組換えCD70及び細胞表面CD70への高親和性結合(すなわち、先行技術のCD70抗体により達成され得るものよりもより高い親和性)の意義は、PBMC試料が癌細胞株により「スパイク」され、その後CD70抗体により処置される実験により、付随する実施例において明らかにしている。このシステムにおいて、ARGX-110による治療は、比較規準CD70抗体であるMDX1411及びSGN70よりも、標的癌細胞の有意により多い溶解を生じた。
【０１３７】
本明細書記載のCD70抗体は、ヒトCD70、及びより具体的にはヒトCD70の細胞外ドメインへの高親和性結合を示すが、CD70の非-ヒトホモログとの交差-反応性は、排除されない。実際、ヒトCD70への高親和性結合に加え、これらはサルCD70ホモログ、具体的にはアカゲザル及びカニクイザルのCD70ホモログとも交差反応することは、27B3及びその生殖細胞系列化バリアント、特に41D12を含む本明細書記載の多くのCD70抗体の有利な特徴である。
【０１３８】
これに関して、付随する実施例20.2において説明するように、CD70-CD27阻害ELISAにおいて、ヒト、対、サル(アカゲザル又はカニクイザル)のCD70についてIC50の差異が、5倍未満、好ましくは3倍未満又は2倍未満である場合、CD70抗体は、サルCD70ホモログ、例えばアカゲザル及びカニクイザルのCD70ホモログとの交差-反応性を示すとみなすことができる。ヒト及びサルCD70への結合親和性、従ってブロック能は、広い意味で同等でなければならない。
【０１３９】
(CD70とCD27の間の相互作用)
特定の態様において、本明細書に提供するCD70抗体又はそれらの抗原結合断片は、高親和性でヒトCD70に結合し、且つCD70とCD27の間の相互作用をブロックすることができる。
【０１４０】
CD70のCD27への結合をブロックするCD70抗体又はそれらの抗原結合断片の能力は、捕獲された組換えCD70(Flag-TNC-CD70)又は有向で(directed)コートされたCD70といずれかの組換えCD27-Fcを使用する、ELISAにより評価することができる。本明細書記載のCD70抗体は、CD70とCD27の間の相互作用を、300ng/ml以下、又は200ng/ml以下、又は110ng/ml以下、又は70ng/ml以下、又は50ng/ml以下のIC50で、阻害することができる。
【０１４１】
CD70のCD27への結合をブロックするCD70抗体又はそれらの抗原結合断片の能力は、付随する実施例において説明したように、Raji細胞(ヒトB細胞リンパ腫)及びHT1080-CD27細胞(CD27によりトランスフェクションされたヒト上皮細胞株)の共培養を基にしたアッセイにおいても、評価することができる。CD70とCD27の間の相互作用を阻害する説明されたCD70抗体は、この共培養アッセイにおいて、500ng/ml以下、又は300ng/ml以下、又は100ng/ml以下、又は50ng/ml以下、又は30ng/ml以下のIC50を示すことができる。
【０１４２】
41D12(ARGX-110)を含む、27B3及びそれらの生殖細胞系列化バリアントを基にした好ましいCD70抗体は、ELISAシステムにおいて、CD70/CD27相互作用の強力なブロックを示す。実際、ARGX-110は、比較規準の抗体SGN70及びMDX1411よりも、有意により強力にCD70/CD27相互作用をブロックする。CD70とCD27の間の相互作用は、腫瘍の微小環境内で、腫瘍細胞の生存、増殖及び／又は免疫抑制に寄与する。従って、CD70への高親和性結合に加え、CD70/CD27相互作用の強力な阻害は、特定のCD70-発現している癌又は免疫学的障害、例えばCD70とCD27を同時発現する自己免疫疾患及び癌の治療における改善された臨床転帰に寄与し得る。
【０１４３】
他の実施態様において、CD70抗体又はそれらの抗原結合断片は、ヒトCD70に結合することはできるが、CD70とCD27の間の相互作用を阻害することはできない。CD70に結合するがCD70とCD27の間の相互作用を阻害しないCD70抗体は、捕獲された組換えCD70(Flag-TNC-CD70)又は有向でコートされたCD70のいずれかと組換えCD27-Fcを使用するELISAを基に評価することができる。付随する実施例において明らかにするように、CD70に結合するが、CD70/CD27相互作用を有意な程度には阻害しない多くのFabが、同定されている。特に、59D10として本明細書において同定されたFabクローンは、Biacoreにより測定された組換えCD70への強力な結合を示すが、ELISAにより評価した場合、CD70/CD27相互作用は有意な程度にはブロックしない。CD70に結合するが、CD70とCD27の間の相互作用は阻害しない本明細書記載のCD70抗体は依然、無傷の抗体エフェクター機能、すなわちADCC、CDC、ADCP又はADCの1以上を持ち、且つインビボにおいて腫瘍細胞増殖を阻害する。CD70に高親和性で結合するが、ブロックしないCD70抗体は、「1アーム(one-armed)」抗体、又はPEG化されたFab生成物として、又はCD70を発現している標的細胞と厳密な一価の相互作用を提供するいずれか他の抗体フォーマットで、有利に利用することができる。
【０１４４】
(CD70エピトープ)
特定の態様において、本明細書記載のCD70抗体は、ヒトCD70の細胞外ドメイン内のエピトープへ結合する。
用語「エピトープ」とは、抗体と接触する抗原(例えばヒトCD70)の部分をいう。エピトープは、線状である、すなわちアミノ酸の1つの配列への結合に関与するか、又は高次構造である、すなわち必ずしも近接していない抗原の様々な領域のアミノ酸の2以上の配列への結合に関与するかであることができる。
【０１４５】
本明細書に提供するCD70抗体は、ヒトCD70タンパク質の細胞外ドメイン内の異なる(重複又は非重複の)エピトープに結合することができる。例えば、付随する実施例において1C2及び9E1と表示されるFabは、明らかに、ヒトCD70上の異なる非重複のエピトープに結合する。
【０１４６】
本明細書において別所記載したように、好ましいCD70抗体41D12(ARGX-110)は、いずれか公知の先行技術のCD70抗体によっては示されない、特に有用な結合の特徴の組合せ、すなわち：
(a)ヒトCD70中のアミノ酸配列
【化３７】
0005982409.tif 000040
内の結合；
(b)アカゲザル(Macaca mulatta)及びカニクイザル(Macaca cynomolgus)のCD70ホモログとの交差反応性；
(c)未変性ヒトCD70及び熱変性された組換えヒトCD70への結合：
を示す。
【０１４７】
いずれか所定のCD70抗体に関して、アミノ酸配列
【化３８】
0005982409.tif 000041
内でヒトCD70に結合する能力は、例えば、付随する実施例20.4に説明したマウス-ヒトキメラCD70結合分析を使用し、当業者により容易に決定することができる。
【０１４８】
サルCD70ホモログとの交差-反応性も、例えば、FACs分析、表面プラズモン共鳴(Biacore(商標))によるか、又はCD70-CD27阻害ELISAを用い、当業者により容易に決定することができる。これに関して、付随する実施例20.2に説明するようなCD70-CD27阻害ELISAにおけるヒト、対、サル(アカゲザル又はカニクイザル)のCD70のIC50についての差異が、5倍未満、好ましくは3倍未満又は2倍未満である場合、CD70抗体は、サルCD70ホモログ、例えばアカゲザル及びカニクイザルのCD70ホモログとの交差-反応性を示すとみなすことができる。
【０１４９】
本明細書記載のCD70抗体はまた、未変性ヒトCD70及び熱変性された組換えヒトCD70の両方に結合する能力を明らかにすることができる。この連結に関して、「未変性」ヒトCD70への結合は、付随する実施例に説明するCD70+細胞株のいずれか、又は更には患者材料から単離された天然のCD70-発現している細胞(例えば、付随する実施例におけるようにCLL患者から単離された細胞)、活性化されたT細胞などの、CD70-発現している細胞の表面上に発現されたCD70への結合により示される。従って「未変性」ヒトCD70への結合は、当業者により容易に試験することができる。
【０１５０】
熱変性された組換えヒトCD70への結合は、付随する実施例20.3に説明するように試験することができる。熱変性された組換えヒトCD70への有意な結合を明らかにするためには、CD70抗体は、このアッセイにおいて620nmでのOD 0.6以上を示さなければならないことが好ましい。
【０１５１】
(部分的又は緩徐なインターナリゼーション)
好ましいCD70抗体41D12(ARGX-110)を含む、本明細書記載のCD70抗体は、腎臓癌細胞株において部分的インターナリゼーションを示し、これは抗体のインターナリゼーションが786-O腎臓癌細胞において試験される場合、結合した抗体の実質的割合、すなわち少なくとも30〜40％は、37℃でのインキュベーションの6時間後、更には24時間後であっても、外部にあり続けることを意味する。加えて、CD70抗体は、遅い速度のインターナリゼーションを示すこともできる。これに関して、CD70抗体は、参照CD70抗体9D1(VH配列番号:178；VL配列番号:190)よりもより遅い速度でインターナリゼーションされる場合、緩徐なインターナリゼーションを示すとみなされる。
【０１５２】
付随する実施例において明らかにするように、異なる癌細胞株は、CD70抗体のインターナリゼーションの程度において有意差を示す。大部分の癌細胞株は、例えARGX-110との6時間のインキュベーション後であっても、結合したCD70抗体の30％未満、更には10％未満のインターナリゼーションを示すことは、特に重大である。これらの結果は、CD70-発現している癌の治療における、強力なエフェクター機能を持つCD70抗体(エフェクター機能を増強するよう操作されたバリアントを含む)の有用性をはっきりと裏付けている。CD70は、「インターナリゼーションする」標的であることが、科学文献においてこれまでに報告されており；従って、CD70-発現している癌及び免疫疾患の両方の治療のために、CD70抗体-薬物免疫複合体を開発することが提唱されている。従って、本明細書に提示した結果は、細胞-表面結合したCD70抗体のインターナリゼーションは、稀な事象であること、及び大部分のCD70-発現している細胞株は、結合したCD70抗体を有意な程度にはインターナリゼーションしないことを決定的に明らかにし、これは極めて驚くべきことである。
【０１５３】
(ラクダ科動物-由来のCD70抗体)
更に別の態様において、本明細書記載の抗体又はそれらの抗原結合断片は、ラクダ科ファミリーの種のVHドメイン又はVLドメインから得られる、少なくとも1つの超可変ループ又は相補性決定領域を含むことができる。特に該抗体又は抗原結合断片は、ヒトCD70抗原による、非近交系ラクダ科動物、例えばラマの能動免疫により得られた、VH及び／又はVLドメイン、又はそれらのCDRを含み得る。
【０１５４】
「ラクダ科ファミリーの種のVHドメイン又はVLドメインから得られる超可変ループ又は相補性決定領域」とは、その超可変ループ(HV)又はCDRが、ラクダ科免疫グロブリン遺伝子によりコードされている超可変ループ又はCDRのアミノ酸配列と同一であるか、又は実質的に同一であるアミノ酸配列を有することを意味する。この文脈において、「免疫グロブリン遺伝子」は、生殖細胞系列遺伝子、再編成を受けている免疫グロブリン遺伝子、及び同じく体細胞変異された遺伝子を含む。従って、ラクダ科の種のVH又はVLドメインから得られたHV又はCDRのアミノ酸配列は、成熟したラクダ科通常型抗体に存在するHV又はCDRのアミノ酸配列と同一であることができる。この文脈において用語「から得られた」とは、CD70抗体のHV又はCDRは、ラクダ科免疫グロブリン遺伝子により当初コードされたアミノ酸配列(又はそれらの重要でないバリアント)を具現化するという意味での構造的関係を暗示している。しかしこれは、CD70抗体の調製に使用される製造方法の観点から特定の関係を必ずしも暗示していない。
【０１５５】
ラクダ科動物-由来のCD70抗体は、とりわけ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカ、ヴィクーニャ、グアナコ又はラクダを含む、任意のラクダ科動物の種に由来することができる。
【０１５６】
ラクダ科動物-由来のVH及びVLドメイン、又はそれらのCDRを含むCD70抗体は、典型的には組換えにより発現されたポリペプチドであり、且つキメラポリペプチドであることができる。用語「キメラポリペプチド」とは、そうでなければ近接して生じることのない2つ以上のペプチド断片の並立により作製される人工の(非天然の)ポリペプチドをいう。この定義に含まれるのは、例えばラクダ科動物とヒトのような、2以上の種によりコードされたペプチド断片の並立により作製された「種」キメラポリペプチドである。
【０１５７】
ラクダ科動物-由来のCDRは、配列番号:49-59、262若しくは263(重鎖CDR3)、又は配列番号:26-37、249、258若しくは259(重鎖CDR2)、又は配列番号:10-20、248、256若しくは257(重鎖CDR1)として示されたCDR配列の1つ、又は配列番号:148-168、271若しくは273(軽鎖CDR3)、又は配列番号:109-128若しくは270(軽鎖CDR2)、又は配列番号:77-95、若しくは250-253、267及び268(軽鎖CDR1)として示されたCDR配列の1つを含むことができる。
【０１５８】
一実施態様において、全VHドメイン及び／又は全VLドメインは、ラクダ科ファミリーの種から得ることができる。具体的実施態様において、ラクダ科動物-由来のVHドメインは、配列番号:177-188、212-223、274又は275として示されたアミノ酸配列を含むのに対し、ラクダ科動物-由来のVLドメインは、配列番号:189-211、230-245、276又は277(VL)として示されたアミノ酸配列を含むことができる。次にラクダ科動物由来のVHドメイン及び／又はラクダ科動物由来のVLドメインは、1つ以上のアミノ酸の置換、挿入又は欠失がラクダ科動物アミノ酸配列に導入されるタンパク質操作に供される。これらの操作された変化は、ラクダ科動物配列に対するアミノ酸置換を含むことが好ましい。このような変化は、ラクダ科動物-コードされたVH又はVLドメイン中の1個以上のアミノ酸残基が、相同のヒト-コードされたVH又はVLドメイン由来の同等の残基と置き換えられる「ヒト化」又は「生殖細胞系列化」を含む。
【０１５９】
ヒトCD70抗原によるラクダ科動物(例えばラマ)の能動免疫により得られた単離されたラクダ科動物VH及びVLドメインは、本発明に従い抗原結合ポリペプチドを操作するための基礎として使用することができる。無傷のラクダ科動物VH及びVLドメインから出発し、この出発ラクダ科動物配列から逸脱する1つ以上のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を操作することが可能である。特定の実施態様において、そのような置換、挿入又は欠失は、VHドメイン及び／又はVLドメインのフレームワーク領域中に存在することができる。一次アミノ酸配列におけるそのような変化の目的は、恐らく好ましくない特性(例えば、ヒト宿主における免疫原性(いわゆるヒト化)、可能性のある生成物の不均一性及び／又は不安定性の部位(グリコシル化、脱アミド化、異性体化など)を減らすか、或いはこの分子のいくつかの他の好ましい特性(例えば、溶解度、安定性、生物学的利用能など)を増強することである。別の実施態様において、一次アミノ酸配列の変化は、能動免疫により得られたラクダ科VH及び／又はVLドメインの1つ以上の超可変ループ(又はCDR)において操作することができる。このような変化は、抗原結合親和性及び／若しくは特異性を増強するために、又は恐らく好ましくない特性、例えばヒト宿主における免疫原性(いわゆるヒト化)、可能性のある生成物の不均一性及び／又は不安定性の部位、グリコシル化、脱アミド化、異性体化などを減少するために、或いはこの分子のいくつかの他の好ましい特性、例えば溶解度、安定性、生物学的利用能などを増強するために導入することができる。
【０１６０】
従って一実施態様において、本発明は、ラクダ科動物-由来のVH又はVLドメインと比べ、VHドメイン又はVLドメインのいずれかの少なくとも1つのフレームワーク又はCDR領域に少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、バリアントCD70抗体を提供し、その例は、配列番号:177-188、212-223、274又は275として示されたアミノ酸配列を含むラクダ科動物VHドメイン、及び配列番号:189-211、230-245、276又は277として示されたアミノ酸配列を含むラクダ科動物VLドメインを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１６１】
他の実施態様において、ラクダ科動物-由来のVH及びVLドメイン(又はそれらの操作されたバリアント)並びに非ラクダ科動物の抗体由来の1つ以上の定常ドメイン、例えばヒト-コードされた定常ドメイン(又はそれらの操作されたバリアント)を含む、「キメラ」抗体分子を提供する。そのような実施態様において、VHドメイン及びVLドメインは両方とも、ラクダ科動物の同じ種から得ることが好ましく、例えば、VH及びVLの両方がラマ・グラマ由来であるか、又はVH及びVLの両方がラマ・パコス由来である(操作されたアミノ酸配列の変動の導入前)ことは好ましい。そのような実施態様において、VH及びVLドメインの両方は、単独の動物、特にヒトCD70抗原により能動免疫化された単独の動物に由来することができる。
【０１６２】
ラクダ科VH及び／又はVLドメインの一次アミノ酸配列において変化を操作する代わりに、個別のラクダ科動物-由来の超可変ループ若しくはCDR、又はそれらの組合せを、ラクダ科動物VH/VLドメインから単離し、且つCDRグラフティングすることにより、代替(すなわち非ラクダ科)のフレームワーク、例えばヒトVH/VLフレームワークへ移すことができる。特に非限定的実施態様において、ラクダ科動物-由来のCDRは、配列番号:49-59(重鎖CDR3)、又は配列番号:26-37(重鎖CDR2)、又は配列番号:10-20(重鎖CDR1)として示されたアミノ酸配列を有するCDR、又は配列番号:148-168(軽鎖CDR3)、又は配列番号:109-128(軽鎖CDR2)、又は配列番号:77-95(軽鎖CDR1)として示されたCDR配列のひとつから選択することができる。
【０１６３】
ラクダ科動物-由来のVH及びVLドメイン、又はそれらのCDRを含むCD70抗体は、VHドメイン及びVLドメインの両方が存在する様々な異なる実施態様をとることができる。本明細書において用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、且つそれらがヒトCD70タンパク質について適切な免疫学的特異性を示す限りは、モノクローナル抗体(完全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)を包含するが、これらに限定されるものではない。本明細書において使用する用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体をいい、すなわちその集団を構成する個々の抗体は、少量存在し得る可能性のある天然の変異を除いて、同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異性があり、単独の抗原部位に対し向けられている。更に、抗原上の異なる決定基(エピトープ)に対し向けられた様々な抗体を典型的には含む通常型(ポリクローナル)抗体調製品とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単独の決定基又はエピトープに対して向けられる。
【０１６４】
「抗体断片」は、完全長抗体の一部、一般にそれらの抗原結合ドメイン又は可変ドメインを含む。抗体断片の例は、Fab、Fab'、F(ab')2、二重特異性Fab'、及びFv断片、ダイアボディ、線状抗体、単鎖抗体分子、単鎖可変部断片(scFv)、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む(Holliger及びHudsonの文献、Nature Biotechnol., 23:1126-36 (2005)を参照することとし、その内容は引用により本明細書中に組み込まれている。)。
【０１６５】
非限定的実施態様において、ラクダ科動物-由来のVH及びVLドメイン、又はそれらのCDRを含むCD70抗体は、CH1ドメイン及び／又はCLドメインを含むことができ、それらのアミノ酸配列は、完全に又は実質的にヒトである。本発明の抗原結合ポリペプチドが、ヒト治療上の使用が意図された抗体である場合、これは、その抗体の定常領域全体、又は少なくともそれらの一部について典型的には、完全に又は実質的にヒトアミノ酸配列を有する。従って、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメイン及びCLドメイン(並びに存在するならばCH4ドメイン)の1つ以上若しくは任意の組合せは、そのアミノ酸配列に関して完全に又は実質的にヒトであることができる。
【０１６６】
有利なことに、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメイン及びCLドメイン(並びに存在するならばCH4ドメイン)は全て、完全に又は実質的にヒトアミノ酸配列を有することができる。ヒト化又はキメラ抗体、又は抗体断片の定常領域の文脈において、用語「実質的にヒト」とは、ヒト定常領域との少なくとも90％、又は少なくとも92％、又は少なくとも95％、又は少なくとも97％、又は少なくとも99％のアミノ酸配列同一性をいう。この文脈において用語「ヒトアミノ酸配列」は、生殖細胞系列、再編成された及び体細胞変異された遺伝子を含む、ヒト免疫グロブリン遺伝子によりコードされたアミノ酸配列をいう。本発明はまた、「完全にヒト」ヒンジ領域の存在が明確に必要とされるそれらの実施態様を除き、ヒト配列に関して1つ以上のアミノ酸の付加、欠失又は置換により変更されている「ヒト」配列の定常ドメインを含むポリペプチドも意図している。
【０１６７】
本発明のCD70抗体中の「完全にヒト」ヒンジ領域の存在は、該抗体の免疫原性を最小化し且つ安定性を最適にするという両方の恩恵がある。
【０１６８】
本明細書の別所において考察するように、1つ以上のアミノ酸の置換、挿入又は欠失は、重鎖及び／又は軽鎖の定常領域内、特にFc領域内になされることが意図されている。アミノ酸置換は、置換されたアミノ酸の、異なる天然のアミノ酸との、又は非天然若しくは改変されたアミノ酸との置き換えを生じることができる。例えばグリコシル化パターンの変化(例えば、N-又はO-結合型グリコシル化部位の付加又は欠失による)などの、他の構造上の改変も許される。抗体の意図された用途に応じて、Fc受容体へのその結合特性に関して本発明の抗体を改変すること、例えばエフェクター機能を調節することが望ましいことがある。例えば、システイン残基をFc領域に導入することができ、これによりこの領域内での鎖内ジスルフィド結合形成が可能になる。こうして作出されたホモ二量体型抗体は、改善されたインターナリゼーション能並びに／又は増強された補体媒介性細胞傷害作用及び抗体依存性細胞性細胞傷害作用(ADCC)を有し得る。Caronらの文献、J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes B.の文献、J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)を参照されたい。或いはCD70抗体は、二重Fc領域を有し、且つこれにより増強された補体溶解能及びADCC能を有するよう操作することができる。Stevensonらの文献、Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)を参照されたい。本発明はまた、化学療法薬、毒素(例えば、細菌、真菌、植物若しくは動物起源の酵素的に活性がある毒素、又はそれらの断片)、又は放射性同位元素(すなわち、放射性複合体)などの、細胞毒性物質に複合された、本明細書に記載の抗体を含む免疫複合体も意図している。またChan及びCarterにより説明されているように(引用により本明細書中に組み込まれている、Nature Reviews: Immunology, Vol.10, pp301-316, 2010)、Fc領域を、半減期を延長するように操作することもできる。
【０１６９】
更に別の実施態様において、Fc領域は、抗体依存性細胞性細胞傷害作用(ADCC)を媒介する抗体の能力を増大し、及び／又は1以上のアミノ酸の改変によりFcγ受容体に対する抗体の親和性を増加するように改変される。
【０１７０】
また別の実施態様において、抗体のグリコシル化が改変される。例えば、無グリコシル化抗体を作製することができる(すなわち、抗体はグリコシル化されない)。グリコシル化は、例えば、CD70標的抗原に対する抗体の親和性を増大するように、変更することができる。そのような糖改変は、例えば抗体配列内の1以上のグリコシル化部位の変更により達成することができる。例えば、1以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の排除を生じ、これによりその部位でのグリコシル化を排除する1以上のアミノ酸置換を行うことができる。そのような無グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増大することができる。
【０１７１】
またフコシル基の量が減少した低フコシル化抗体又は非フコシル化抗体(Natsumeらの文献、Drug Design Development and Therapy, Vol.3, pp7-16, 2009に説明されている)、又は増加した二分岐GlcNac構造を有する抗体などの、変更されたグリコシル化型を有するバリアントCD70抗体が、想定されている。そのような変更されたグリコシル化パターンは、抗体のADCC活性を増大し、典型的には「未変性の」ヒトFcドメインを含む等価抗体と比べADCCの10倍の増強を生じることが明らかにされている。そのような糖改変は、例えば変更されたグリコシル化酵素機構を持つ宿主細胞において抗体を発現することにより達成することができる(Yamane-Ohnuki及びSatohの文献、mAbs 1:3, 230-236, 2009に説明されている)。増強されたADCC機能を伴う非フコシル化抗体の例としては、BioWa社のPotelligent(商標)技術を用い作製されたものがある。
【０１７２】
本発明は、特定の実施態様において、キメララクダ科／ヒト抗体、及び特にVH及びVLドメインが完全にラクダ科動物の配列(例えば、ラマ又はアルパカ)のものであり、且つその抗体の残りが完全にヒト配列のものであるキメラ抗体を包含することができる。CD70抗体は、ラクダ科動物-由来のVH及びVLドメイン、又はそれらのCDRの「ヒト化」又は「生殖細胞系列化」バリアントを含む抗体、並びにVH及びVLドメインが、ヒトCD70抗原によるラクダ科動物の能動免疫により得られたラクダ科動物VH及びVLドメインと比べ、そのフレームワーク領域内に1つ以上のアミノ酸置換を含む、ラクダ科動物／ヒトキメラ抗体を含むことができる。そのような「ヒト化」は、出発のラクダ科VH又はVLドメイン中のミスマッチしたアミノ酸残基を、ヒト生殖細胞系列-コードされたVH又はVLドメイン中に認められた等価残基と置き換えることにより、ヒト生殖細胞系列VH又はVLドメインとの％配列同一性を増大する。
【０１７３】
CD70抗体はまた、ラクダ科動物抗体に由来した、例えばヒトCD70タンパク質による能動免疫により生じたラクダ科動物CD70抗体に由来した、又はそうでなければラクダ科動物遺伝子によりコードされたCDR(又は超可変ループ)が、ヒトVH及びVLフレームワーク上にグラフティングされており、その抗体の残りも完全にヒト起源である、CDR-グラフティング抗体であることもできる。そのようなCDR-グラフティングCD70抗体は、配列番号:49-59、262若しくは263(重鎖CDR3)、又は配列番号:26-37、249、258若しくは259(重鎖CDR2)、又は配列番号:10-20、248、256若しくは257(重鎖CDR1)として示されたアミノ酸配列を有するCDR、又は配列番号:148-168、271若しくは273(軽鎖CDR3)、又は配列番号:109-128若しくは270(軽鎖CDR2)、又は配列番号:77-95、若しくは250-253、267及び268(軽鎖CDR1)として示されたCDR配列のひとつを含むことができる。
【０１７４】
前述のヒト化、キメラ及びCDR-グラフティングCD70抗体、特にヒトCD70抗原によるラクダ科動物の能動免疫から誘導された超可変ループ又はCDRを含む抗体は、関心対象のポリペプチドを作出するように操作され、且つ非限定的に細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞を含む、原核宿主細胞又は真核宿主細胞を使用し、通常の組換えDNA操作及び発現技術を用い、容易に産生することができ、それらの一部は本明細書に説明され且つ付随する実施例において例示されている。
【０１７５】
ラクダ科動物-由来のCD70抗体は、VHドメイン及び／又はVLドメインの超可変ループ又はCDRが、ヒトCD70に対し生じた通常型ラクダ科動物抗体から得られるが、該(ラクダ科動物由来の)超可変ループ又はCDRの少なくとも1つは、ラクダ科動物-コードされた配列と比べ1つ以上のアミノ酸の置換、付加又は欠失を含むように操作されているバリアントを含む。そのような変化は、超可変ループ／CDRの「ヒト化」を含む。この方式で操作されているラクダ科動物由来のHV/CDRは、ラクダ科動物-コードされたHV/CDRのアミノ酸配列と「実質的に同一」であるアミノ酸配列を依然示すことができる。この文脈において、「実質的同一性」とは、ラクダ科動物-コードされたHV/CDRとの、わずかに1つ、又はわずかに2つのアミノ酸配列ミスマッチを容認することができる。CD70抗体の特定の実施態様は、配列番号:49-59、262若しくは263(重鎖CDR3)、又は配列番号:26-37、249、258若しくは259(重鎖CDR2)、又は配列番号:10-20、248、256若しくは257(重鎖CDR1)として示されたCDR配列、又は配列番号:148-168、271若しくは273(軽鎖CDR3)、又は配列番号:109-128若しくは270(軽鎖CDR2)、又は配列番号:77-95、若しくは250-253、267及び268(軽鎖CDR1)として示されたCDR配列の1つのヒト化されたバリアントを含むことができる。
【０１７６】
本明細書に提供するラクダ科動物-由来のCD70抗体は、任意のアイソタイプであることができる。ヒト治療上の使用が意図された抗体は、典型的にはIgA、IgD、IgE、IgG、IgM型であり、頻繁にはIgG型であり、その場合これらは4種のサブ-クラスIgG1、IgG2a及びb、IgG3又はIgG4のいずれかに属することができる。これらのサブ-クラスの各々において、そのFc部分内に1つ以上のアミノ酸の置換、挿入若しくは欠失を生じるか、又は例えばFc-依存型機能性を増強若しくは低下させるために、他の構造上の改変を生じることが可能である。
【０１７７】
(ラクダ科動物-由来のVH及びVLドメインのヒト化)
ラクダ科動物通常型抗体は、引用により本明細書中に組み込まれているUS 12/497,239に考察されているように、下記の要因のために、ヒト治療薬としての有用性のある抗体の調製のための都合の良い出発点を提供する：
1)ラクダ科動物VH及びVLドメインとそれらのヒト対応物の間の高い％配列相同性；
2)ラクダ科動物VH及びVLドメインのCDRと、それらのヒト対応物(すなわち、ヒト-様カノニカルフォールド構造及びカノニカルフォールドのヒト-様組合せ)の間の高度な構造相同性。
ラクダ科動物(例えばラマ)のプラットフォームはまた、得ることができるCD70抗体の機能多様性に関して著しい利点を提供する。
【０１７８】
ヒト治療に関するラクダ科動物VHドメイン及び／又はラクダ科動物VLドメインを含むCD70抗体の有用性は、例えば、それらのヒト宿主に対する免疫原性を少なくするために、天然のラクダ科動物VH及びVLドメインの「ヒト化」により更に改善することができる。ヒト化の全般的目的は、親のVH及びVLドメインにより形成された抗原結合部位の特異性及び親和性は維持しつつも、ヒト対象へ導入された場合に、VH及びVLドメインが最小の免疫原性を示す分子を作製することである。
【０１７９】
ヒト化、いわゆる「生殖細胞系列化」の一つの手法は、ラクダ科動物VH又はVLドメインのアミノ酸配列において、これをヒトVH又はVLドメインの生殖細胞系列配列に近づける変化を操作することに関与している。
【０１８０】
ラクダ科動物VH(又はVL)ドメインとヒトVH(又はVL)ドメインの間の相同性の決定は、(所定のVH又はVLドメイン中の)変化されるべきラクダ科動物アミノ酸残基の選択及び適切な代替アミノ酸残基の選択の両方についての、ヒト化プロセスの重要な工程である。
【０１８１】
ラクダ科動物通常型抗体をヒト化するための手法は、多数の新規ラクダ科動物VH(及びVL)ドメイン配列、典型的には標的抗原に結合することがわかっている体細胞変異されたVH(又はVL)ドメインの、ヒト生殖細胞系列VH(又はVL)配列、ヒトVH(及びVL)コンセンサス配列、加えてラマ・パコスから入手可能な生殖細胞系列配列情報とのアラインメントを基に、開発されている。以下の節は、(i)ラクダ科動物-由来のVH若しくはVLドメイン又はそれらのCDRにおける置き換えのための「ラクダ科動物」アミノ酸残基を選択すること、及び(ii)いずれか所定のラクダ科動物VH(又はVL)ドメインをヒト化する場合に、置換するための置き換える「ヒト」アミノ酸残基を選択すること：に適用することができる原理を概説している。この手法を使用し、配列番号:49-59、262若しくは263(重鎖CDR3)、又は配列番号:26-37、249、258若しくは259(重鎖CDR2)、又は配列番号:10-20、248、256若しくは257(重鎖CDR1)として示されたアミノ酸配列を有するラクダ科動物-由来のCDR、又は配列番号:148-168、271若しくは273(軽鎖CDR3)、又は配列番号:109-128若しくは270(軽鎖CDR2)、又は配列番号:77-95、若しくは250-253、267若しくは268(軽鎖CDR1)として示されたCDR配列の1つのヒト化されたバリアント、並びにまた配列番号:177-188、212-223、274若しくは275として示された配列を有するラクダ科動物-由来のVHドメイン及び配列番号:189-211、230-245、276若しくは277として示された配列を有するラクダ科動物-由来のVLドメインのヒト化バリアントを調製することができる。
【０１８２】
工程1.  ヒト化されるべき成熟型ラクダ科動物配列と最高の相同性／同一性を示す、ヒト(生殖細胞系列)ファミリー及びこのファミリーのメンバーの選択。いずれか所定のラクダ科動物VH(又はVL)ドメインと最も近いマッチングのヒト生殖細胞系列を同定するための全般的手順は、以下に概説されている。
工程2.  生殖細胞系列化に使用される特異的ヒト生殖細胞系列ファミリーメンバーの選択。これは、最高の相同性を伴う生殖細胞系列、又は同じファミリー由来の別の生殖細胞系列ファミリーメンバーであることが好ましい。
工程3.  選択されたヒト生殖細胞系列に最も近いラクダ科動物生殖細胞系列に関するアミノ酸利用の表を基にした生殖細胞系列化について考えられる好ましい位置の同定。
工程4.  最も近いヒト生殖細胞系列から逸脱しているラクダ科動物生殖細胞系列におけるアミノ酸を変更する試み；FR残基の生殖細胞系列化は、CDR残基よりも好ましい。
【０１８３】
a.  生殖細胞系列化に使用される選択されたヒト生殖細胞系列から逸脱している位置が好ましく、これについてラクダ科動物配列に認められたアミノ酸は、選択された生殖細胞系列とマッチせず、且つ同じサブクラスの他の生殖細胞系列においては認められない(Vに加えJコードされたFRアミノ酸の両方)。
b.  選択されたヒト生殖細胞系列ファミリーメンバーから逸脱しているが、同じファミリーの他の生殖細胞系列において使用される位置も、生殖細胞系列化プロセスにおいて扱うことができる。
c.  選択されたヒト生殖細胞系列への追加のミスマッチ(例えば、追加の体細胞変異に起因する)も、扱うことができる。
【０１８４】
以下の手法を使用し、所定のラクダ科動物VH(又はVL)ドメインについて、最も近いマッチングのヒト生殖細胞系列を決定することができる：
ラクダ科とヒトの生殖細胞系列VH及びVLの間の％配列同一性を分析する前に、それらのカノニカルフォールドを最初に決定することができ、これはH1及びH2又はL1及びL2(及びL3)についてカノニカルフォールドの同一の組合せを持つヒト生殖細胞系列セグメントのファミリーの同定を可能にする。引き続き、関心対象のラクダ科可変領域との最高度の配列相同性を有するヒト生殖細胞系列ファミリーメンバーを、配列相同性のスコア化のために選択することができる。超可変ループL1、L2、L3、H1及びH2のショティアカノニカルクラスの決定を、www.bioinf.org.uk/abs/chothia.htmlのウェブページにおいて公に入手可能なバイオインフォマティクスツールにより実行することができる。このプログラムのアウトプットは、データファイルにおける重要な残基の必要要件を示している。これらのデータファイルにおいて、重要な残基の位置が、各位置で許容されるアミノ酸と共に示される。該抗体の可変領域の配列は、インプットとして入力し、且つカバット番号付けスキームに割りあてるために、最初にコンセンサス抗体配列と並置する。カノニカルフォールドの分析は、Martin及びThorntonにより開発された自動化された方法(Martinらの文献、J. Mol. Biol. 263:800-815 (1996))により誘導された重要残基鋳型のセットを使用する。個々のフレームワーク領域の境界は、ショティアの番号付けスキームの改作であるIMGT番号付けスキーム(Lefrancらの文献、NAR 27:209-212 (1999)；http://imgt.cines.fr)を用いて割りあてることができる。
【０１８５】
H1及びH2又はL1及びL2(及びL3)についてのカノニカルフォールドの同じ組合せを使用する、既知の特定のヒト生殖細胞系列Vセグメントにより、配列相同性に関して最良のマッチングのファミリーメンバーを決定することができる。ラクダ科VH及びVLドメインフレームワークアミノ酸配列とヒト生殖細胞系列によりコードされた対応する配列の間の％配列同一性は、バイオインフォマティクスツールを用いて決定することができるが、配列の手作業のアラインメントも使用することができる。ヒト免疫グロブリン配列は、VBase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)又はPluckthun/Honeggerデータベース(http://www.bioc.unizh.ch/antibody/Sequences/Germlines)などのいくつかのタンパク質データベースから同定することができる。ヒト配列をラクダ科VH又はVLドメインのV領域と比較するために、www.expasy.ch/tools/#alignなどのウェブサイトを介して入手可能であるような配列アラインメントアルゴリズムを使用することができるが、また手作業のアラインメントを、限定された配列セットで行うこともできる。カノニカルフォールドの同じ組合せ、並びに各鎖のフレームワーク領域1、2及び3との最高度の相同性を持つファミリーのヒト生殖細胞系列軽鎖及び重鎖配列を選択し、且つ関心対象のラクダ科可変領域と比較することができ；またFR4は、ヒト生殖細胞系列JH及びJK又はJL領域に対しチェックされる。
【０１８６】
全体の％配列相同性の計算において、FR1、FR2及びFR3の残基は、カノニカルフォールドの同一の組合せを持つヒト生殖細胞系列ファミリーからの最も近いマッチした配列を用いて評価されることに留意されたい。カノニカルフォールドの同じ組合せを持つ同じファミリーの最も近いマッチングのメンバー又は他のメンバーとは異なる残基のみ、スコア化される(NB−何らかのプライマーでコードされた差異は除外される)。しかし、ヒト化の目的のためは、カノニカルフォールドの同一の組合せを有さない、他のヒト生殖細胞系列ファミリーのメンバーと同じフレームワーク領域の残基は、前述のストリンジェントな条件に従い「ネガティブ」とスコア化されるという事実にも関わらず、これらはヒト化について考慮することができる。この仮定は、Qu及びその同僚(Quらの文献、Clin. Cancer Res. 5:3095-3100 (1999))並びにOno及びその同僚(Onoらの文献、Mol. Immunol. 36:387-395 (1999))により実施されたように、FR1、FR2、FR3及びFR4の各々がその最も近いマッチしているヒト生殖細胞系列配列と個別に比較され、且つその結果ヒト化された分子は、異なるFRの組合せを含むという、ヒト化のための「ミックス及びマッチング」手法を基にしている。
【０１８７】
(交差競合する抗体)
本明細書に開示された分子と「交差競合する」モノクローナル抗体又はそれらの抗原結合断片は、本CD70抗体が結合する部位と同一であるか、又はその部位と重複する部位でヒトCD70に結合するものである。競合するモノクローナル抗体又はそれらの抗原結合断片は、例えば抗体競合アッセイにより、同定することができる。例えば、精製された又は部分的に精製されたヒトCD70の試料は、固形支持体に結合することができる。次に本発明の抗体化合物又はそれらの抗原結合断片、及びそのような本発明の抗体化合物と競合し得ることが疑われるモノクローナル抗体又はそれらの抗原結合断片が添加される。これら2種の分子の一方は、標識されている。標識化合物及び非標識化合物が、CD70上の個別の離れた部位に結合する場合、標識化合物は、疑わしい競合する化合物が存在するかどうかに関わらず、同じレベルで結合するであろう。しかしこの相互作用の部位が同じ又は重複する場合、非標識化合物は競合し、且つ該抗原に結合した標識化合物の量は減少するであろう。非標識化合物が過剰に存在する場合、結合するとしても非常にわずかな標識化合物が結合するであろう。本発明の目的のために、競合するモノクローナル抗体又はそれらの抗原結合断片は、本抗体化合物のCD70への結合を、約50％、約60％、約70％、約80％、約85％、約90％、約95％、又は約99％減少するものである。そのような競合アッセイを実行する手順の詳細は、当該技術分野において周知であり、且つ例えばHarlow及びLaneの著書「抗体、実験マニュアル(Antibodies, A Laboratory Manual)」、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、Cold Spring Harbor、New York、567-569頁、ISBN 0-87969-314-2(1988)において認めることができる。そのようなアッセイは、精製された抗体を用い、定量的に実行することができる。標準曲線は、1つの抗体の、それ自身に対する滴定により確立され、すなわち、標識物と競合物の両方で同じ抗体が使用される。非標識の競合するモノクローナル抗体又はそれらの抗原結合断片が、プレートへの標識分子の結合を阻害する能力が、滴定される。これらの結果はプロットされ、所望の結合阻害度を達成するために必要な濃度が比較される。
【０１８８】
好ましい実施態様は、ラマ-由来のFab 27B3を含む抗体、及び特に41D12(ARGX-110)を含むその生殖細胞系列化バリアントと、ヒトCD70への結合に関して交差競合し、且つ結合特性、すなわち：
(a)ヒトCD70中のアミノ酸配列
【化３９】
0005982409.tif 000042
内の結合；
(b)アカゲザル(Macaca mulatta)及びカニクイザル(Macaca cynomolgus)のCD70ホモログとの交差反応性；
(c)未変性の及び熱変性された組換えヒトCD70への結合：
の同じ組合せを示す、抗体である。
【０１８９】
(CD70抗体をコードしているポリヌクレオチド)
本発明はまた、本発明のCD70抗体をコードしているポリヌクレオチド分子、同じく宿主細胞又は無細胞発現システムにおいて本抗原結合ポリペプチドの発現を可能にする調節配列に機能的に連結された本発明のCD70抗体をコードしているヌクレオチド配列を含む発現ベクター、並びにこの発現ベクターを含む宿主細胞又は無細胞発現システムも提供する。
【０１９０】
本発明のCD70抗体をコードしているポリヌクレオチド分子は、例えば、組換えDNA分子を含む。用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド分子」は、本明細書において互換的に使用され、且つ1本鎖又は2本鎖のいずれかのDNA又はRNA分子、及び1本鎖の場合、その相補配列の分子をいう。核酸分子の考察において、特定の核酸分子の配列又は構造は、5'から3'方向で配列が提供される通常の慣習に従い本明細書において説明する。本発明の一部の実施態様において、核酸又はポリヌクレオチドは、「単離され」ている。この用語は、核酸分子に適用される場合、それが起源とする生物の天然のゲノム内でそれが直ぐ近接している配列から分離されている核酸分子をいう。例えば「単離された核酸」は、プラスミドベクター若しくはウイルスベクターなどのベクターに挿入されたDNA分子、又は原核細胞若しくは真核細胞若しくは非-ヒト宿主生物のゲノムDNAに組み込まれたDNA分子を含むことができる。用語「単離されたポリヌクレオチド」とは、RNAに適用される場合、主に先に定義された単離されたDNA分子によりコードされたRNA分子をいう。或いは、この用語は、その自然の状態(すなわち細胞又は組織内)ではそれが会合されるであろう他の核酸から精製／分離されているRNA分子をいうことができる。単離されたポリヌクレオチド(DNA又はRNAのいずれか)は、生物学的手段又は合成手段により直接作製され、且つその作製時に存在する他の成分から分離された分子を更に表すことができる。
【０１９１】
一実施態様において、本発明は、本明細書において41D12と表示される生殖細胞系列化されたラマ-由来のFabのVHドメイン及びVLドメインをコードしているヌクレオチド配列を提供し、ここで該VHドメインは、配列番号:223として示されるアミノ酸配列を有し、且つ該VHドメインは、配列番号:241として示されるアミノ酸配列を有する。好ましい実施態様において、配列番号:223として示されたアミノ酸配列を有するVHドメインをコードしているヌクレオチド配列は、配列番号:344として示されるヌクレオチド配列を含み、且つ配列番号:241として示されるアミノ酸配列を有するVLドメインをコードしているヌクレオチド配列は、配列番号:345として示されるヌクレオチド配列を含む。
【０１９２】
一実施態様において、本発明は、本明細書において57B6と表示される生殖細胞系列化されたラマ-由来のFabのVHドメイン及びVLドメインをコードしているヌクレオチド配列を提供し、ここで該VHドメインは、配列番号:274として示されるアミノ酸配列を有し、且つ該VHドメインは、配列番号:276として示されるアミノ酸配列を有する。好ましい実施態様において、配列番号:274として示されたアミノ酸配列を有するVHドメインをコードしているヌクレオチド配列は、配列番号:346として示されるヌクレオチド配列を含み、且つ配列番号:276として示されるアミノ酸配列を有するVLドメインをコードしているヌクレオチド配列は、配列番号:347として示されるヌクレオチド配列を含む。
【０１９３】
一実施態様において、本発明は、本明細書において59D10と表示される生殖細胞系列化されたラマ-由来のFabのVHドメイン及びVLドメインをコードしているヌクレオチド配列を提供し、ここで該VHドメインは、配列番号:275として示されるアミノ酸配列を有し、且つ該VHドメインは、配列番号:277として示されるアミノ酸配列を有する。好ましい実施態様において、配列番号:275として示されたアミノ酸配列を有するVHドメインをコードしているヌクレオチド配列は、配列番号:348として示されるヌクレオチド配列を含み、且つ配列番号:277として示されるアミノ酸配列を有するVLドメインをコードしているヌクレオチド配列は、配列番号:349として示されるヌクレオチド配列を含む。
【０１９４】
本発明のCD70抗体の組換え生成に関して、これをコードしている組換えポリヌクレオチドは、(標準の分子生物学的技術を用いて)調製され、且つ選択された宿主細胞、又は無細胞発現システムにおいて発現するために、複製可能なベクターに挿入されることができる。好適な宿主細胞は、原核細胞、酵母細胞、又はより高等な真核細胞、具体的には哺乳動物細胞であることができる。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、SV40により形質転換されたサル腎CV1株(COS-7、ATCC CRL 1651)；ヒト胎児腎株(293細胞又は懸濁培養における増殖のために継代された293細胞、Grahamらの文献、J. Gen. Virol. 36: 59 (1977))；ベビーハムスター腎細胞(BHK、ATCC CCL 10)；チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFR(CHO、Urlaubらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980))；マウスセルトリ細胞(TM4、Matherの文献、Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980))；マウス骨髄腫細胞SP2/0-AG14(ATCC CRL 1581；ATCC CRL 8287)又はNSO(HPAカルチャーコレクション番号85110503)；サル腎細胞(CV1、ATCC CCL 70)；アフリカミドリザル腎細胞(VERO-76、ATCC CRL-1587)；ヒト子宮頸癌細胞(HELA、ATCC CCL 2)；イヌ腎細胞(MDCK、ATCC CCL 34)；バッファロー系ラット肝細胞(BRL 3A、ATCC CRL 1442)；ヒト肺細胞(W138、ATCC CCL 75)；ヒト肝細胞(Hep G2、HB 8065)；マウス乳癌(MMT 060562、ATCC CCL51)；TRI細胞(Matherらの文献、Annals N. Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；並びに、ヒト肝癌株(Hep G2)、更にはDSMのPERC-6細胞株である。これらの宿主細胞の各々における使用に適した発現ベクターも、概して当該技術分野において公知である。
【０１９５】
用語「宿主細胞」は一般に、培養された細胞株をいうことは留意しなければならない。本発明の抗原結合ポリペプチドをコードしている発現ベクターが導入されているヒト全体は、「宿主細胞」の定義から明白に除外される。
【０１９６】
(抗体産生)
重要な態様において、本発明はまた、CD70抗体の発現が可能である条件下で、CD70抗体をコードしているポリヌクレオチド(例えば発現ベクター)を含む宿主細胞(又は無細胞発現システム)を培養すること、及び発現されたCD70抗体を回収することを含む、本発明のCD70抗体を産生する方法を提供する。この組換え発現プロセスは、ヒト治療上の使用が意図されたモノクローナル抗体を含む、本発明のCD70抗体の大規模製造において使用することができる。インビボ治療上の使用に適した組換え抗体の大規模製造に好適なベクター、細胞株及び製造プロセスは、一般に、当該技術分野において入手可能であり、且つ当業者には周知であろう。
【０１９７】
別に注記するように、特にFab 27B3をベースにした抗体及び41D12(ARGX-110)などのその生殖細胞系列化バリアントを含む、本明細書に提供するCD70抗体は、大規模での商業的製造に特に有益である特徴を示す。具体的には、商業的規模の組換え発現システムにおいて達成可能である極めて高い製造収量(＞4g/L)は、製造コストを劇的に低下するであろう。
【０１９８】
好ましい実施態様はまた、37℃で試験される場合の、並びに同じく数回の凍結-解凍サイクルにわたる温度安定性も示し、このことも再度、臨床用製品の商業的製造及び貯蔵に関して極めて有益である。驚くべきことに、41D12及び40F1を含むFab 27B3のいくつかのヒト生殖細胞系列化バリアントは、27B3それ自身と比べ改善された温度安定性を示す。
【０１９９】
従って更なる態様において、本発明は、ヒトCD70に結合する単離された抗体又はそれらの抗原結合断片を提供し、該抗体又は断片は、配列番号:178に示されたアミノ酸配列に対応する重鎖可変ドメインを含み、但しH6、H18、H24、H31、H56、H74、H74、H77、H79、H83、H84、H89、H93、H94、H108、H110、及びH112からなる群から選択されるカバット位置での少なくとも1つのアミノ酸は、別のアミノ酸により置換されることを条件とする。
この抗体又はそれらの抗原結合断片は、配列番号:178に示されたアミノ酸配列を伴う重鎖可変ドメインを含む抗体又はそれらの抗原結合断片よりも大きい温度安定性を示すことができる。
【０２００】
更なる実施態様において、配列番号:201に示されたアミノ酸配列に対応する軽鎖可変ドメインを含む、CD70抗体又は抗原結合断片を提供し、但しL2、L11、L12、L25、L26、L30、L46、L53、L60、L61、L67、L68、L76、L80、L81、L85、及びL87からなる群から選択されるカバット位置での少なくとも1つのアミノ酸は、別のアミノ酸により置換されることを条件とする。
【０２０１】
この抗体又はそれらの抗原結合断片は、配列番号:201に示されたアミノ酸配列を伴う重鎖可変ドメインを含む抗体又はそれらの抗原結合断片よりも大きい温度安定性を示すことができる。
【０２０２】
特定の実施態様において、CD70抗体又はそれらの抗原結合断片は、以下を含む：
a)H6、H18、H24、H31、H56、H74、H74、H77、H79、H83、H84、H89、H93、H94、H108、H110、及びH112からなる群から選択されるカバット位置での1以上のアミノ酸置換を含む配列番号:178に示されたアミノ酸配列を伴う重鎖可変ドメイン；並びに
b)L2、L11、L12、L25、L26、L30、L46、L53、L60、L61、L67、L68、L76、L80、L81、L85、及びL87からなる群から選択されるカバット位置での1以上のアミノ酸置換を含む配列番号:201に示されたアミノ酸配列を伴う軽鎖可変ドメイン。
【０２０３】
請求項24記載のこの抗体又はそれらの抗原結合断片は、配列番号:178に示されたアミノ酸配列を伴う重鎖可変ドメイン及び配列番号:201に示されたアミノ酸配列を伴う軽鎖可変ドメインを含む抗体又はそれらの抗原結合断片よりもより大きい温度安定性を示すことができる。
【０２０４】
(CD70抗体の治療的有用性)
本明細書に提供するCD70抗体又はそれらの抗原結合断片は、インビボにおける癌性腫瘍細胞の増殖を阻害するために使用することができ、従ってCD70-発現している癌の治療において有用である。
【０２０５】
従って本発明の更なる態様は、本明細書記載のCD70抗体又は抗原結合断片の治療有効量を、それを必要とする患者へ投与することを含む、ヒト患者において腫瘍細胞増殖を阻害する方法、同じく癌を治療又は予防する方法に関する。
【０２０６】
本発明の別の態様は、ヒト患者におけるCD70-発現している腫瘍細胞の増殖を阻害するために使用する、本明細書記載のCD70抗体又は抗原結合断片を提供する。
本発明のまた更なる態様は、ヒト患者における癌の治療又は予防における使用のための、本明細書記載のCD70抗体又は抗原結合断片を提供する。
【０２０７】
その増殖が本明細書記載のCD70抗体の使用により阻害され得る好ましい癌としては、腎臓癌(例えば腎細胞癌)、乳癌、脳腫瘍、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病を含む慢性又は急性白血病、リンパ腫(例えば、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫、リンパ球性リンパ腫、原発性CNSリンパ腫、T細胞リンパ腫)、鼻咽頭癌、黒色腫(例えば、転移性悪性黒色腫)、前立腺癌、結腸癌、肺癌、骨癌、膵癌、皮膚癌、頭頚部癌、皮膚又は眼球内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、睾丸癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、膣癌、陰門癌、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形癌、膀胱癌、腎臓又は尿管の癌、腎盂癌、中枢神経系(CNS)の新生物形成、腫瘍血管新生、脊髄軸内腫瘍(spinal axis tumor)、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、中皮腫が挙げられる。
【０２０８】
本明細書記載のCD70抗体は同じく、例えば、明細胞RCCなどの腎細胞癌(RCC)、膠芽細胞腫、乳癌、脳腫瘍、鼻咽頭癌、非ホジキンリンパ腫(NHL)、急性リンパ性白血病(ALL)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫(ALCL)、多発性骨髄腫、皮膚T細胞リンパ腫、結節性小切れ込み核細胞型リンパ腫、リンパ球性リンパ腫、末梢T細胞リンパ腫、レナートリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、T細胞白血病/リンパ腫(ATLL)、成人T細胞白血病(T-ALL)、中心芽細胞(enteroblastic)/中心細胞(cb/cc)濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞リンパ節症(AILD)-様T細胞リンパ腫、HIV関連体腔性リンパ腫、胎生期癌、鼻咽頭の未分化癌(例えばシュミンケ腫瘍)、キャッスルマン病、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、マントル細胞リンパ腫及び他のB細胞リンパ腫を含む、CD70を発現している腫瘍細胞の存在により特徴付けられる腫瘍原性障害を有する対象を治療するために使用することもできる。
【０２０９】
具体的実施態様は、ラマ-由来のFab 27B3又はその生殖細胞系列化バリアントの1つ、特に41D12(ARGX-110)を含む抗体による、先に列記した癌のいずれか1つの治療に関する。特に、先に列記した癌のいずれか1つは、ヒトIgG1の定常領域に融合された41D12(27B3の生殖細胞系列化バリアント)のFab領域を含む抗体を用い治療することができる。後者の実施態様において、ヒトIgG1定常領域は更に、抗体エフェクター機能を最大化するために(例えば、点変異の追加により)操作することができるか、又は41D12-IgG1抗体は、再度抗体エフェクター機能を増強するために、非フコシル化することができる。
【０２１０】
別所に注記するように、本明細書記載のCD70抗体、特に27B3及びその生殖細胞系列化バリアントは、例えば、大細胞型B細胞リンパ腫細胞株SU-DHL-6、慢性リンパ球性白血病細胞株JVM-2、皮膚T細胞リンパ腫細胞株HH、胃癌細胞株MKN-45、肺癌細胞株A549及びEBC-1、黒色腫細胞株WM852及びWM793、膠芽細胞腫細胞株GaMG、及び卵巣癌細胞株OAW-42、SKOv3及びOVCAR3などの、細胞-表面CD70を低コピー数で発現しているヒト癌細胞株に対し特に強力な結合を示す。実際、これらの低コピー数癌細胞株への41D12(ARGX-110)の親和性は、SGN70及びMDX1411などの、比較規準の先行技術の抗体よりも有意に高い。
【０２１１】
低コピー数癌細胞株への「改善された」親和性は、付随する実施例における細胞スパイク実験により明らかにされるように、対応する癌の臨床治療に直接関連している。低コピー数細胞株の細胞(例えば、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫細胞株SU-DHL-6)が、健常ドナーから新たに単離されたPBMCへスパイクされる場合、癌細胞株の細胞は優先的に、実施例のCD70抗体ARGX-110により枯渇される。
【０２１２】
従って本発明の更なる態様は、本明細書記載のCD70抗体又は抗原結合断片の治療有効量を、それを必要とする患者へ投与することを含む、癌を治療又は予防する方法に関し、ここで該癌は、CD70の低コピー数の発現を示す癌である。
【０２１３】
本発明はまた、ヒト患者における癌の治療又は予防に使用するための、本明細書記載のCD70抗体又は抗原結合断片を提供し、ここで該癌は、CD70の低コピー数の発現を示す癌である。
これらの態様の各々において、低コピー数の癌は、大細胞型B細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、皮膚T細胞リンパ腫、胃癌、肺癌、黒色腫、膠芽細胞腫及び卵巣癌からなる群から選択されることが好ましい。
【０２１４】
具体的実施態様は、ラマ-由来のFab 27B3、又は特に41D12(ARGX-110)を含むその生殖細胞系列化バリアントの1つを含む抗体による、低コピー数の癌の治療に関する。特に、先に列記した低コピー数の癌のいずれか1つを、ヒトIgG1の定常領域に融合された41D12(27B3の生殖細胞系列化バリアント)のFab領域を含む抗体を用いて治療することができる。
【０２１５】
本明細書記載のCD70抗体はまた、CD70の発現により特徴付けられる免疫学的障害の治療にも有用である。そのような免疫学的障害の具体例としては、以下が挙げられる：関節リウマチ、自己免疫性脱髄疾患(例えば、多発性硬化症、アレルギー性脳脊髄炎)、内分泌性眼病、ぶどう膜網膜炎、全身性エリスマトーデス、重症筋無力症、グレーヴス病、糸球体腎炎、自己免疫性肝障害、炎症性腸疾患(例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病)、アナフィラキシー、アレルギー反応、シェーグレン症候群、I型糖尿病、原発性胆汁性肝硬変症、ヴェーゲナー肉芽腫症、線維筋痛、多発筋炎、皮膚筋炎、多発性内分泌不全、シュミット症候群、自己免疫性ブドウ膜炎、アジソン病、副腎炎、甲状腺炎、橋本甲状腺炎、自己免疫性甲状腺疾患、悪性貧血、胃萎縮症、慢性肝炎、ルポイド肝炎、アテローム性動脈硬化症、亜急性皮膚エリテマトーデス、副甲状腺機能低下症、Dressier's症候群、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑病、溶血性貧血、尋常性天疱瘡、天疱瘡、疱疹状皮膚炎、円形脱毛症、類天疱瘡、強皮症、進行性全身性硬化症、CREST症候群(石灰沈着症、レイノー現象、食道運動障害、手指硬化症、及び毛細血管拡張症)、男性及び女性の自己免疫性不妊、硬直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、混合性結合組織病、結節性多発性動脈炎、全身性壊死性血管炎、アトピー性皮膚炎、アトピー性鼻炎、グッドパスチャー症候群、シャーガス病、サルコイドーシス、リウマチ熱、喘息、反復流産、抗-リン脂質症候群、農夫肺、多形性紅斑、心臓切開術後症候群、Gushing's症候群、自己免疫性慢性活動性肝炎、鳥飼育者肺、中毒性表皮融解症、アルポート症候群、肺胞炎、アレルギー性肺胞炎、線維化肺胞炎、間質性肺炎、結節性紅斑、壊疽性膿皮症、輸血反応、高安動脈炎、リウマチ性多発性筋痛、側頭動脈炎、住血吸虫症、巨細胞性動脈炎、回虫症、アスペルギルス症、サンプター症候群、湿疹、リンパ腫様肉芽腫症、ベーチェット病、カプラン症候群、川崎病、デング熱、脳脊髄炎、心内膜炎、心内膜心筋線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、乾癬、胎児赤芽球症、好酸球性筋膜炎、シュールマン症候群、フェルティ症候群、フィラリア症、毛様体炎、慢性毛様体炎、異時性毛様体炎、フックス毛様体炎、IgA腎症、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、移植片対宿主拒絶反応、移植拒絶反応、心筋症、イートン・ランバート症候群、再発性多発性軟骨炎、クリオグロブリン血症、エヴァンス症候群、及び自己免疫性性腺機能不全、Bリンパ球障害(例えば、全身性エリスマトーデス、グッドパスチャー症候群、関節リウマチ、及び1型糖尿病)、Th1-リンパ球障害(例えば、関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、シェーングレン症候群、橋本甲状腺炎、グレーヴス病、原発性胆汁性肝硬変症、ヴェーゲナー肉芽腫症、結核、又は移植片対宿主拒絶反応)、又はTh2-リンパ球障害(例えば、アトピー性皮膚炎、全身性エリスマトーデス、アトピー性喘息、鼻炎結膜炎、アレルギー性鼻炎、オーメン症候群、全身性硬化症、又は慢性移植片対宿主拒絶反応)、チャーグ-ストラウス病、顕微鏡的多発性血管炎、及び高安動脈炎。
【０２１６】
具体的実施態様は、ラマ-由来のFab 27B3、又は特に41D12(ARGX-110)を含むその生殖細胞系列化バリアントを含む抗体による、先に列記した免疫学的障害のいずれか1つの治療に関連している。特に、先に列記した癌は、ヒトIgG1の定常領域に融合された41D12(27B3の生殖細胞系列化バリアント)Fab領域を含む抗体を用いて治療することができる。後者の実施態様において、ヒトIgG1定常領域は更に、抗体エフェクター機能を最大化するように、操作することができるか(例えば、点変異の追加により)、或いは41D12-IgG1抗体は、再度抗体エフェクター機能を増強するために、非フコシル化することができる。
【０２１７】
本明細書で使用する用語「治療する」又は「治療」は、症状、障害、状態又は疾患の重症度を遅延、中断、阻止、管理、改善、停止、軽減することを意味するが、必ずしも全ての疾患に関連した症状、状態又は障害の全体の排除に関与しない。
【０２１８】
ヒト治療上の使用に関して、本明細書に記載のCD70抗体は、「有効量」で治療を必要とするヒト対象へ投与することができる。用語「有効量」とは、ヒト患者への単回投与量又は反復投与量での投与時に、疾患の治療における治療的有効性を提供するCD70抗体の量又は投与量をいう。本CD70抗体の治療有効量は、1回の投与量当たり約0.1mg/kg〜約20mg/kgの範囲の量を含むことができる。任意の個々の患者に関する治療有効量は、腫瘍組織内の細胞表面CD70などのバイオマーカーに対するCD70抗体の作用をモニタリングすること、又は腫瘍退縮などの症状をモニタリングすることなどにより、医療専門家により決定することができる。いずれか所定の時点で投与される抗体の量は、単独での使用又は他の治療薬と組合せての使用かに関わらず、CD70抗体の最適量が治療過程で投与されるように、変動することができる。
【０２１９】
併用療法として、任意の他の癌治療と組合せて、本明細書記載のCD70抗体、又はそのような抗体を含有する医薬組成物を投与することも意図される。
【０２２０】
(CD70発現している細胞を枯渇するための不充分にインターナリゼーションされる抗体の使用)
本明細書記載の驚くべき知見は、癌細胞株の表面上に発現されたCD70に結合されたCD70抗体は、不充分にインターナリゼーションされるということである。このことは、先行技術ではCD70は「インターナリゼーションする標的」としてこれまで説明されているので、驚くべき結果である。結合したCD70抗体の正確なインターナリゼーション度において、様々な癌細胞型の間で変動はあるが、結合したCD70抗体を「完全にインターナリゼーションする」癌細胞は、認められない。例えば、先に迅速にインターナリゼーションすると説明されている腎臓癌細胞株は、実際には、結合した抗体ARGX-110を最大約70％インターナリゼーションすることが示されている。多くの他の癌細胞株は、結合したARGX-110を30％未満、20％未満、又は10％未満さえもインターナリゼーションする。
【０２２１】
様々な癌細胞株間でのインターナリゼーション度の変動は、疾患適応に大きく依存し、同様の結果が、様々なCD70抗体の使用で観察されている。しかし特定の細胞株における不充分なインターナリゼーションが、抗体ARGX-110を使用する場合に、特に明らかである。多くの癌細胞について観察された低いインターナリゼーション度は、インビボにおいて癌細胞を枯渇する(例えば、死滅するか又は増殖を阻害する)ための、強力なエフェクター機能を伴うCD70抗体の使用の論理的根拠を提供する。結合したCD70抗体は多くの癌細胞上で比較的不充分にインターナリゼーションされるので、該抗体は、その細胞表面上に結合し続け、これによりヒト患者の免疫系との相互作用によりエフェクター機能(ADCC、CDC、ADCP)を引き起こし得る。
【０２２２】
従って、本発明の更に重要な態様は、ヒトCD70に結合する抗体の有効量をヒト患者へ投与することを含む、ヒト患者においてCD70-発現している細胞を枯渇する方法に関し、ここで該CD70-発現している細胞は、6時間後に該抗体の30％以下、25％以下、20％以下、15％以下、10％以下又は5％以下のインターナリゼーションを示し、且つここで該抗体は、ADCC、CDC及びADCPからなる群から選択される少なくとも1つのエフェクター機能を示す。
【０２２３】
この方法において、CD70抗体(活性化したエフェクター機能を伴う)を使用し、CD70発現している細胞を「枯渇」する。このCD70-発現している細胞の枯渇は、例えば、CD70-発現している癌の予防処置のため、又はCD70-関連した免疫学的障害の予防処置のためなど、治療的又は予防的処置の基礎を形成することができる。CD70-発現している抗体が枯渇される正確な機序は、CD70抗体により示されるエフェクター機能の種類によって左右されるが、結合した抗体の不充分なインターナリゼーションと組合せられた、細胞-表面CD70へのCD70抗体の強い(高親和性)結合に左右されるであろう。
【０２２４】
特定の実施態様において、CD70-発現している細胞は、CD70-発現している癌細胞である。特に、CD70-発現している癌細胞は、バーキットリンパ腫、大細胞型B細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非-ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、膵癌、胃癌、膠芽細胞腫及び肺癌からなる群から選択される癌型であることができる。これらの癌の各々に由来した細胞株は、6時間にわたり、結合したCD70抗体の30％以下をインターナリゼーションすることを明らかにしている。更なる実施態様において、CD70-発現している癌細胞は、バーキットリンパ腫、大細胞型B細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非-ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、胃癌、膠芽細胞腫及び肺癌からなる群から選択される癌型であることができる。これらの癌の各々に由来した細胞株は、6時間にわたり、結合したCD70抗体の20％以下をインターナリゼーションすることを明らかにしている。更なる実施態様において、CD70-発現している癌細胞は、バーキットリンパ腫、大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、胃癌、及び肺癌からなる群から選択される癌型であることができる。これらの癌の各々に由来した細胞株は、6時間にわたり、結合したCD70抗体の10％以下をインターナリゼーションすることを明らかにしている。
【０２２５】
他の実施態様において、CD70-発現している細胞は、CD70-発現している活性化されたT細胞であることができ、これは結合したCD70抗体の検出可能なインターナリゼーションを全く示さない(具体的にはARGX-110のインターナリゼーションは、6時間にわたり認められない)。結合したCD70抗体はCD70+活性化されたT細胞によりインターナリゼーションされないというこの知見は、例えば関節リウマチ、乾癬、SLEなどの自己免疫疾患を含む、CD70+活性化されたT細胞により媒介される免疫学的疾患の治療における、ARGX-110を含むが、これに限定されるものではない、強力なエフェクター機能(ADCC、CDC又はADCP)を伴うCD70抗体の使用を、強力に裏付けている。
【０２２６】
先に列記した実施態様は、本質的に任意のCD70抗体を利用することができる。具体的実施態様において、該抗体は、Raji、SU-DHL-6、MHHPREB1、Mino、Mec1、JVM-2、MKN-45、A549、U87MG、PANC-1、PANC-89、L428、Granta 519、Rec-1及びEBC-1からなる群から選択される、CD70-発現している癌細胞株において、6時間後に、30％以下、25％以下、20％以下、15％以下、10％以下又は5％以下のインターナリゼーションを示すことが実験で示されている任意のCD70抗体であることができる。事実上、付随する実施例において説明した細胞株インターナリゼーションアッセイは、特定の疾患適応が、強力なエフェクター機能を有するCD70抗体により、若しくはCD抗体-薬物複合体(以下に説明する)により標的化されるかどうかを決定するため、並びに同じく特定の疾患適応の治療における使用に適したCD70抗体を同定するための両方のスクリーニングとして使用することができる。
【０２２７】
従って、本発明はまた、ヒトCD70に結合する抗体の有効量をヒト患者に投与することを含む、ヒト患者においてCD70-発現している癌細胞を枯渇する方法を提供し、ここで該抗体は、Raji、SU-DHL-6、MHHPREB1、Mino、Mec1、JVM-2、MKN-45、A549、U87MG、PANC-1、PANC-89、L428、Granta 519、Rec-1及びEBC-1からなる群から選択されるCD70-発現している癌細胞株において、6時間後に30％以下のインターナリゼーションを示し、且つここで該抗体は、ADCC、CDC及びADCPからなる群から選択される少なくとも1つのエフェクター機能を示す。一実施態様において、ヒト患者においてCD70-発現している癌細胞を枯渇するために使用される抗体は、Raji、SU-DHL-6、Granta 519、Rec-1、Mec1、JVM-2、MKN-45、A549及びEBC-1からなる群から選択されるCD70-発現している癌細胞株において、6時間にわたり10％以下のインターナリゼーションを示し、且つ同じくADCC、CDC及びADCPからなる群から選択される少なくとも1つのエフェクター機能を示す抗体であることができる。
【０２２８】
本発明のこの態様の具体的実施態様は、ヒトCD70へ極めて高い親和性で結合する本明細書記載のCD70抗体のいずれかを利用することができる。好ましい実施態様は、ラマ-由来のFabを含む抗体27B3、又は特に41D12(ARGX-110)を含むその生殖細胞系列化バリアントの1つを利用することができる。特に好ましい実施態様は、ヒトIgG1の定常領域へ融合された41D12(27B3の生殖細胞系列化バリアント)のFab領域を含む抗体を利用する。後者の実施態様において、ヒトIgG1定常領域は更に、抗体エフェクター機能を最大化するために(例えば、点変異の追加により)操作することができるか、又は41D12-IgG1抗体は、再度抗体エフェクター機能を増強するために、非フコシル化することができる。
【０２２９】
CD70-発現している細胞を枯渇するための不充分なインターナリゼーションのCD70抗体の使用の背後にある理論的根拠は、抗体エフェクター機能に頼っているので、本発明のこの態様で使用される抗体は、CD70抗体が、医薬品、細胞傷害剤、細胞増殖抑制剤、薬物の一部などに連結されている免疫複合体ではないことが好ましい。実際、本発明のこの態様の特別な利点は、患者の安全性の視点(可能性のある毒性物質の投与を避ける)及び経済的視点(抗体-薬物複合体の合成のコストを避ける)の両方から望ましい、抗体-薬物複合体を使用する必要性の回避である。
【０２３０】
(著しいインターナリゼーションのCD70抗体により細胞を死滅するための抗体-薬物複合体の使用)
本実施例において、CD70抗体のインターナリゼーション度において著しい細胞毎の差異が存在すること、及びこれらの差異は、CD70抗体の性質よりもむしろ細胞型に大きく左右される(しかし差異は、抗体ARGX-110を使用した場合に特に顕著である)ことが明らかにされている。結合したCD70抗体の著しいインターナリゼーション度、すなわち6時間後に30％以上、好ましくは40％以上、より好ましくは50％以上、又は更には60％以上のインターナリゼーションを示すこれらの細胞型について、代替治療戦略は、CD70抗体-薬物複合体の使用を基にすることができる。
【０２３１】
従って、本発明の更に重要な態様は、ヒトCD70に結合する抗体及び細胞傷害剤又は細胞増殖抑制剤の一部を含有する抗体-薬物複合体の有効量をヒト患者へ投与することを含む、ヒト患者においてCD70-発現している細胞を枯渇する方法に関連し、ここで該CD70-発現している細胞は、6時間後に、ヒトCD70へ結合する該抗体の30％以上、40％以上、50％以上、又は60％以上のインターナリゼーションを示す。
【０２３２】
具体的実施態様において、CD70-発現している細胞は、6時間以内に、抗体-薬物複合体の基礎を形成するCD70抗体を40％〜70％、好ましくは50％〜70％インターナリゼーションすることができる。
【０２３３】
この方法において、CD70抗体-薬物複合体を使用し、CD70発現している細胞を枯渇する。このCD70-発現している細胞の枯渇は、例えば、CD70-発現している癌の予防処置のため、又はCD70-関連した免疫学的障害の予防処置のためなど、治療的又は予防的処置の基礎を形成することができる。CD70-発現している抗体が枯渇される正確な機序は、抗体-薬物複合体の性質によって、すなわち「薬物」部分が細胞傷害性又は細胞増殖抑制性であるかどうかによって、左右されるが、結合した抗体の著しいインターナリゼーションと組合せられた、細胞-表面CD70へのCD70抗体の強い(高親和性)結合に左右されるであろう。
【０２３４】
特定の実施態様において、CD70-発現している細胞は、CD70-発現している癌細胞である。特に、CD70-発現している癌細胞は、皮膚T細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、腎細胞癌、星状細胞腫、黒色腫及び卵巣癌からなる群から選択される癌型であることができる。これらの癌の各々に由来した細胞株は、6時間にわたり、結合したCD70抗体の30％より多くをインターナリゼーションすることを明らかにしている。更なる実施態様において、CD70-発現している癌細胞は、腎細胞癌、星状細胞腫、黒色腫及び卵巣癌からなる群から選択される癌型であることができる。これらの癌の各々に由来した細胞株は、6時間にわたり、結合したCD70抗体の50％より多くをインターナリゼーションすることを明らかにしている。
【０２３５】
本発明のこの態様の具体的実施態様において、抗体-薬物複合体は、極めて高い親和性によりヒトCD70へ結合する、本明細書記載のCD70抗体のいずれかを基にすることができる。好ましい実施態様において、抗体-薬物複合体は、ラマ-由来のFabを含む抗体27B3、又は特に41D12を含むその生殖細胞系列化バリアントの1つを基にしている。ヒト治療上の使用が意図された抗体-薬物複合体の性質は、特に例えば細胞傷害剤又は細胞増殖抑制剤などの「薬物」部分の性質、並びにこの薬物部分のCD70抗体部分への複合の手段に関して一般に当該技術分野において公知である。CD70抗体-薬物複合体の例は、例えば、WO 2004/073656に開示されている。
【０２３６】
(医薬組成物)
本発明の範囲は、1種以上の医薬として許容し得る担体又は賦形剤と共に製剤化された、本発明のCD70抗体、又はそれらの抗原結合断片の1つ又は組合せを含有する医薬組成物を含む。そのような組成物は、CD70抗体の1つ又は組合せ(例えば、2以上の異なるもの)を含むことができる。
【０２３７】
ヒト治療上の使用のための抗体の製剤技術は、当該技術分野において周知であり、且つ例えば、Wangらの文献、Journal of Pharmaceutical Sciences, 第96巻、1-26頁、2007年において検証されている。
【０２３８】
(参考文献の組込み)
様々な刊行物が、前述の説明において及び以下の実施例を通じて引用されており、その各々は、その全体が引用により本明細書中に組み込まれている。
【実施例】
【０２３９】
(実施例)
本発明は、以下の非限定的な実験的実施例を参照し、更に理解されるであろう。
【０２４０】
(実施例1：ラマの免疫化)
ラマの免疫化及び末梢血リンパ球(PBL)の収集に加え、引き続きのRNA抽出及び抗体断片の増幅を、De Haardとその同僚により説明されたように行った(De Haard Hらの文献、J. Bact., 187: 4531-4541, 2005)。2頭のラマを、CD70-発現している786-O細胞(ATCC-CRL-1932)により、及び2頭のラマをCD70-発現しているRaji細胞(ATCC-CCL-86)により免疫化した。細胞は、各免疫化のために新たに調製し、且つFACS分析によりCD70発現について検証した。これらのラマは、およそ107個の生存細胞を、6週間にわたり週1回頸部へ筋肉内注射することにより免疫化した。フロイントの不完全アジュバントを、これらの細胞免疫化の部位から2、3cm離して、頸筋に注射した。
【０２４１】
免疫応答を調べるために、血液試料10mlを免疫化前及び後に採取した。ラマ由来の血清を、組換えCD70(Flag-TNC-CD70)に対する抗体の存在について、免疫化の前(0日目)及び後(55又は69日目)にELISAにより試験した。抗体検出として、通常型抗体と重鎖抗体の間を識別しないヤギ抗-ラマIgG1/2(Bethyl, A160-100P)を使用した点は留意されなければならず、このことは測定されたCD70反応は、総IgG由来であることを意味する。結果は図1に示している。
【０２４２】
最後の免疫化から3〜4日後、血液400mlを採取し、PBLを単離するためにフィコール-パク勾配法を、並びにRNAを調製するためにChomczynski Pらの文献に説明された方法(Anal. Biochem. 162: 156-159, 1987)を用い、PBLから総RNAを抽出した。平均してRNA収量450μgが達成され、その80μgアリコートを、VHCH1、VλCλ及びVκCκ遺伝子セグメントのランダムcDNA合成及び引き続きの増幅に使用した。
【０２４３】
(実施例2：ライブラリー構築)
独立したVλCλ及びVκCκライブラリーを、タグ付けしないプライマーによる25サイクル、引き続きこれらのプライマーのタグ付け型を用い10サイクルを行う、2段階PCRを用いて構築した(De Haard Hらの文献、Biol. Chem. 274, 1999)。VHCH1ライブラリーを、同じ手法を用い、並行して作製した。個々のライブラリーのサイズは、107〜1010 cfuであった。次にVλCλ及びVκCκライブラリーからの軽鎖を、VHCH1-発現しているベクターに、個別に再クローニングし、各々、「ラムダ」及び「カッパ」ラマFab-ライブラリーを作製した。或いは、消化されたVHCH1アンプリコンを、VλCλ及びVκCκライブラリーへ直接クローニングし、個別のVHCH1ライブラリーの構築を回避した。軽鎖シャッフリングは一般に重鎖シャッフリングよりもより良い親和性バリアントを生むので、本発明者らは、プレクローニングされた軽鎖ライブラリーを作製し、且つこれらの一次レパトアにおいて重鎖アンプリコンを直接クローニングした。
【０２４４】
最終のファージディスプレイライブラリーは、5×108〜2×109 cfuの間であった。完全長Fab含有クローンの割合の分析によるこれらのライブラリーの品質管理は、PCRを用いて慣習的に行った。
【０２４５】
(実施例3：選択及びスクリーニング)
2〜3回のファージ選択を、標準プロトコールを用い、捕獲された組換えCD70(Flag-TNC-CD70)又は直接コートされたCD70のいずれかについて行った。結合したファージの溶出は、トリプシンにより行った。
【０２４６】
TG1へトランスフェクトされた選択されたファージから、個別のコロニーを、96ウェルプレート内での増殖のために無作為に採取した。標準プロトコールに従いIPTG誘導した後、Fabを含むペリプラスム画分(ペリス(peris))を調製した。全ての選択において及び4頭のラマ全てについて、阻害ELISAにより決定されたように、CD27とCD70の間の相互作用を阻害することが可能であるFabを発現することができるいくつかのクローンが認められた(図2及び3)。このアッセイにおいて、Flag-TNC-CD70は、抗-Flag mAbにより捕獲し、且つCD27-Fcの結合は、CD70 Fab (図2及び3)又はCD70 mAb(図4)の存在下又は非存在下、ビオチニル化された抗-CD27 mAb及びホースラディッシュ-複合されたストレプトアビジン(strep-HRP)により検出した。図2Bにおいて、9D1と同一のVHを有するが若干異なる軽鎖を含む27B3は、CD27のCD70への結合をより効率的にブロックするように見え、このことはBiacore上で測定されるこのFabのより良いオフレートと一致する(in line)(データは示さず)ことを認めることができる。表3は、CD70阻害ELISAにおいて試験した、様々なラマ‐ヒトキメラmAbに関するブロック能(IC50として表される)を示している。Fab 27B3は、ほぼ0.4nMのIC50を有し、このことは更にキメララマ‐ヒトIgG1へのフォーマット化で改善し、0.25nMのIC50を生じるのに対し、他の軽鎖を伴うmAb 9D1は、3倍効力が弱い(0.73nM)ように見える。図3は、ブロック活性(阻害ELISA、白色バー参照)及びCD70結合(結合ELISA、黒色バー)について、ラマCD70 Fabを試験する複合実験である。結合ELISAに関して、Flag-TNC-CD70は、抗-Flag mAbにより捕獲され、且つこれらのFabの結合は、Fd断片のC-末端に融合したMYCタグを認識する抗-myc-HRP mAbを用い検出した。比較目的で、CD70に対する既知のモノクローナル抗体(US 2010/0129362 A1に開示されたSGN70、クローン1F6；及び、WO 2008/074004の図5A及び5Bに開示されたMDX69A7)を、並行して試験した。ELISAにおいて純粋な結合を示し、且つ非-ブロック性である多くのラマ-由来のFabクローンを同定した(図3参照−例えば、Fabクローン45H8、45C4、46A2、46G7、46E4、46F12及び46G12)。Fabとしてはブロック活性を有さないがキメラIgGへ転換した場合には拮抗性である(表3参照)クローン59D10が、興味深い。結合及びブロックするラマ-由来のFabクローンのVH及びVLドメインのアミノ酸配列は、本明細書の別所に示している(表6−9)。
【０２４７】
【表３】
0005982409.tif 000043
【０２４８】
mAb 27B3及び57B6はまた、アカゲザルの組換えCD70(FLAG-TNC-アカゲザルCD70)とCD27の間の相互作用を阻害するそれらの能力について試験した。先に説明した阻害ELISAにより決定されたIC50値は、各々、150ng/ml及び135ng/mlであった。
【０２４９】
(実施例4：ヒト及びアカゲザルCD70への親和性)
精製されたラマ-由来の抗-CD70ブロックFabのオフレートを、Biacoreを用いて決定した。組換えヒトCD70を、CM5 Biacoreチップ上に固定した。この固定は、Biacore社により提供された方法に従い、且つNHS/EDCキット(Biacore AB社)を用いて行った：このチップの活性化後、pH5の10mM酢酸緩衝液中の組換えCD70の溶液50μg/mlを調製し、この溶液1μl(50ng)を注入し、表面密度およそ1000RUを生じた。
【０２５０】
CD70 mAbであるARGX-110、MDX2H5及びSGN70のFabを、トリプシン消化により調製した(SGN70及びMDX69A7は、本明細書別所に記載されており、MDX2H5は、MDX1411とも称され、これはWO 2008/074004の図1A及び1Bに説明されている)。濃度およそ100〜400μg/mlのFabを、Hepes-緩衝食塩水(0.1M Hepes、1.5M NaCl、30mM EDTA、0.5％v/v界面活性剤P20)中に6倍希釈した。これらを注入し(30μl)、且つ流量30μl/分でフローセルを通過させた。FabがCD70に結合した後、そのオフレートを、10分間モニタリングした。解離後、10mM NaOH 5μlを注入することにより、フローセル表面を再生した。Fabへの親和性に応じて、表面の再生には、時折のNaOHの反復注入が必要であった。オフレート分析は、BIAevaluationソフトウェアを適用することにより実施した。最初に、ブランク試行のセンソグラム(sensogram)を、コートされたフローセルで得られたものから減算した。その後オフレートを、Fitキネティックアプリケーションを用い時間範囲10分間について決定し、且つKd値を計算した。更に、CD70に関するCD27のオフレートも決定した。これらのオフレートは表4にまとめている。
【０２５１】
試験した全てのラマ-由来のFabは、ヒト組換えCD70及びアカゲザル組換えCD70へ、Biacoreオフレートを基に0.4〜4.8×10-4 s-1の範囲の明らかに非常に低いオフレート(すなわち高い親和性)で結合する。ヒトCD70に関するラマ-由来のFabのオフレートは、参照mAb由来のFab(7〜30×10-4 s-1)に関してよりもはるかに良い。最良のオフレートを有するラマ-由来のFabは、CD70とのCD27の相互作用に関して、CD27のそれと同等のオフレートを有する(0.8×10-4 s-1)ことが示された。Biacoreを使用するオフレートの測定下限は、およそ0.4×10-4 s-1であることは留意されなければならない。従って、Biacorにより評価した場合この限界近くまで下降するオフレートを伴うラマ-由来のFabは、実際、CD70についてはより高い親和性さえも示すかもしれない。
【０２５２】
【表４】
0005982409.tif 000044
【０２５３】
(実施例5：キメララマ-ヒトCD70 mAbのCD70陽性細胞への結合)
関心対象のラマ-由来のFabクローンのVH及びVLを、ヒトIgG1の定常領域及びヒトCλ(全ての可変軽鎖領域はラムダ起源である)へ融合し、且つ特許出願WO 2009/145606に開示されたシステムにおいて二価キメラモノクローナル抗体として作製した。これらのキメララマ-ヒトmAbは、プロテインA上で、引き続きゲル濾過により精製した。
【０２５４】
786-O細胞を、キメララマ-ヒトCD70阻害するmAbの1/5連続希釈物(20μg/ml〜0.25 ng/ml)と一緒にインキュベーションし、且つこれらのmAbの該細胞への結合を、抗-ヒトFc-FITC抗体(供給業者Binding Site社からの1/500希釈した複合体AF006)を用い検出した。10,000個細胞/条件の蛍光を、フローサイトメーターを用いて測定し、且つ蛍光の中央値をプロットした。これらの結果を図5に示している。これらのmAbのほとんどは、高親和性で786-O細胞へ結合する。SIMPLE抗体1C2は、最良のオフレート及びブロック能を有することが示されているFabであるが、これは細胞表面に発現されたCD70を認識することができず(データは示さず)、従って更なる試験は行わなかった。SIMPLE抗体27B3は、細胞結合した受容体への最良の親和性を有し、EC50は0.24nMであった。
【０２５５】
更なる実験において、NHL-由来のMHH-PREB-1細胞(105個細胞)を、キメララマ-ヒトCD70阻害mAbの濃度勾配(20μg/ml〜0.25ng/ml)と一緒にインキュベーションし、且つこれらのmAbの該細胞への結合を、抗-ヒトIgG-FITC抗体を用い検出した。結果を図5Bに示す。57B6及び59D10に関するEC50値は、各々、83ng/ml及び74ng/mlであった。
【０２５６】
(実施例6：キメララマ-ヒトCD70 mAbによる共培養実験における阻害)
細胞ベースのアッセイにおいてブロック能を決定するために、Wyzgolとその同僚により説明されたシステムを使用した(J Immunol (2009) 183: 1851‐1861)。ヒトCD27でトランスフェクションされた線維肉腫細胞株HT1080は、三量体組換えCD70とのライゲーション時にIL-8を分泌し、且つ中和mAbによるこの相互作用のブロックは、低下したサイトカインレベルにより測定することができる。B細胞リンパ腫Raji細胞株をCD70の給源として利用したこのアッセイの改変版を適用したが、この分子は該細胞表面に発現され、その結果可溶性CD70よりもより関連していた。
【０２５７】
Raji細胞を培養し、且つFACS分析によりCD70発現についてチェックした。次に細胞を、96-ウェル組織培養プレート(50,000個細胞/ウェル)において、抗-CD70 mAbと混合し、RTで1時間インキュベーションした。HT1080-CD27細胞を添加し(10,000個細胞/ウェル)、完全に混合した。この共培養物を、インキュベーターに移し、37℃で一晩増殖させた。上清を収集し、それらのIL-8含量をELISAにより分析した。SIMPLE抗体に関する結果を図6に示し、且つ参照CD70 mAbと比較する。IC50値は、SGN70について42ng/ml及びMDX69A7について143ng/mlであるのに比べ、キメララマ-ヒトCD70 mAbのそれは3〜517ng/mlである(表5参照)。SIMPLE抗体27B3(IC50は33pM)及び9G2(IC50は20pM)は、ベンチマークSGN70(IC50は370pM)よりも10〜20倍より強力であり、再度ベンチマークMDX69A7(1nM)よりも3倍より強力である。従って、キメララマ-ヒトmAbは、CD27とCD70の間の相互作用のブロックにおいて極めて強力であり、且つこの高度に関連したバイオアッセイにおいてベンチマーク抗体をしのいでいると結論することができる。
【０２５８】
【表５】
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【０２５９】
(実施例7：抗体依存性細胞性細胞傷害活性)
抗体依存性細胞性細胞傷害作用(ADCC)を、McEarchernらの文献(Blood, (2007) 109: 1185‐1192)に説明された、標準Cr51-放出アッセイを用いて測定した。ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を、標準フィコール分離により、ヘパリン処理した全血から精製し、且つNK細胞(すなわち、エフェクター細胞)の給源として使用した。いくつかの個別のドナー由来の血液を使用した。これらの細胞を、ヒトIL-2(NK細胞の刺激のため)200U/mlを含有する培地中に2×106個/mlで懸濁し、且つ37℃で一晩インキュベーションした。翌日、接着細胞及び非接着細胞を収集し、培養培地で1回洗浄した。標的細胞は、786-O細胞(RCC)であり、且つCr51で標識した。標的細胞対エフェクター細胞の比は、1:20であり、且つインキュベーションは、培養培地中に異なる濃度で存在する抗体と2時間行った。キメララマ-ヒトmAbに加えベンチマーク抗体を、様々な濃度で、786-O細胞に対するADCC活性について試験した。
【０２６０】
溶解率は、下記式により決定した：
％溶解＝（試料CPM−自然放出CPM）／（最大放出CPM−自然放出CPM）×100。
【０２６１】
これらの結果は、キメララマ-ヒトmAbは全て、ADCC活性を介し標的細胞の溶解を誘導することを明らかにしている(図7)。SIMPLE mAb 27B3は、およそ1μg/mlの効力を有し、従ってベンチマークSGN70と同等のIC50を有する親和性バリアント9D1よりも10倍より強力であり、これはまたベンチマークMDX69A7よりもADCCにおいて2.5倍より強力である。SIMPLE抗体27B3は、クラス最高の受容体‐リガンドブロック能と優れたADCC効力とを兼ね備えているので、従って好ましい治療プロファイルを有する。
【０２６２】
(実施例8：CD70特異性mAbの補体依存性細胞傷害能)
前記抗体の補体依存性細胞傷害作用(CDC)特性を、McEarchernらの文献(Blood, (2007) 109: 1185-1192)に説明された標準アッセイにおいて決定した。最初の対照実験において、U266(MM)細胞及びMHH-PREB1(NHL)細胞を、FACS分析により、CD70抗原の存在について試験した。次の実験において、キメララマ-ヒトCD70 mAbを、3つの異なる濃度及び3、6又は9％ヒト血清(ヒト補体の給源として)の存在下で、両方の細胞株についてのCDC活性について試験した。U266細胞は、9％血清の存在下で、最良のシグナル/ノイズ比を生じることが結論付けられた。
【０２６３】
次の実験において、U266細胞を、キメララマ-ヒトmAb(図8、上側パネル)又は参照CD70 mAb(図8、下側パネル)と、0.001〜20μg/mlで、9％ヒト血清の存在又は非存在下で混合し、37℃で2時間インキュベーションした。細胞を遠心沈降させ、且つヨウ化プロピジウムを添加し、死滅細胞の数を決定した。細胞溶解は、FACSで測定した。CDC活性は、U266細胞に対し、9％ヒト血清の存在下で、全てのキメララマ-ヒトmAbにおいて明らかにされた。SIMPLE抗体27B3は、ベンチマークSGN70と同様のIC50を有するが、再度MDX69A7は、1/10倍の効力である。
【０２６４】
(実施例9：抗体依存性細胞性貪食作用能)
SIMPLE mAbの抗体依存性細胞性貪食作用(ADCP)特性を分析するために、McEarchernらの文献(Blood, (2007) 109: 1185-1192)により説明されたアッセイを実行した。このアッセイにおいて、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を、標準フィコール分離により、ヘパリン処理した全血から精製した。異なるドナー由来の血液を使用した。細胞を、組織培養フラスコ内で、10％FCSを含有するRPMI中で37℃で一晩インキュベーションした。非接着細胞を除去し、接着細胞を、500U/ml rhGM-CSF(7.5μg/75ml)を含有するX-VIVO 15培地75ml中で15日間培養した。15日後、接着細胞を収集した(単球由来マクロファージ(MDM))。
【０２６５】
赤色色素PKH26を負荷した8.0×104個の標的細胞(786-O細胞)を、mAbと一緒に、V-字底96ウェルプレート中で、氷上で30分間インキュベーションした。次に、2.0×104個MDM細胞を添加し(標的対エフェクター(786-0対MDM)比は4:1)、且つ37℃で1時間のインキュベーション後、細胞を遠心分離し、1％BSAのPBS 100μl中に再懸濁し、V-字底96ウェルプレートへ移した。このプレートを氷上に維持しながら、マクロファージ染色のために、抗-CD11bモノクローナル抗体(FITC複合した)を、30分間添加し、その後細胞を、PBSで2回洗浄し、且つ1％パラホルムアルデヒド(PBS中)で固定した。試料をFACSにより分析し、ここで貪食作用は、二重染色した細胞についてスコア化した。結果は図9に示し、これらは、試験した全てのキメララマ-ヒトmAbは、ADCPの誘導において強力であることを明らかにしている。SIMPLE 抗体27B3は、濃度1μg/mlで、マクロファージによる標識した腫瘍細胞の最大50％の貪食作用を誘導し、そのIC50はおよそ100ng/ml(0.4nM)である。
【０２６６】
(実施例10：腫瘍細胞株786-Oにおける抗-CD70のインターナリゼーション)
CD70抗体の腎臓癌由来の細胞株786-Oへの結合は、抗体‐受容体複合体の迅速な(1時間以内)インターナリゼーションを生じることが、明らかにされている(Adamらの文献、Br J Cancer (2006) 95: 298‐306)。CD70に対するSIMPLE抗体及びベンチマークmAbのインターナリゼーションを試験するために、786-O細胞を、96-ウェルマイクロタイタープレート上で培養し、且つ37℃で一晩インキュベーションした。2.5μg/ml mAbを添加し、細胞と一緒に37℃で0〜24時間インキュベーションした。プレートを、ストリッピング緩衝液(150mM NaCl、100mMグリシン、pH＝2.5；コード「IN」、CD70によりインターナリゼーションされたmAbの量を表す)、又はPBS(コード「OUT」、細胞の外側で受容体に結合したmAbの量を表す)により、5分間3回洗浄した。引き続き、細胞を、4％パラホルムアルデヒドでRTで30分間固定し、PBSで洗浄し、且つ0.2％Triton-X-100(「IN」)又はPBS(「OUT」)と一緒に5分間インキュベーションした。次に細胞を2回洗浄し、100mMグリシンと一緒にRTで10分間インキュベーションし、引き続きPBS＋1％BSAと一緒に30分間インキュベーションした。最終的に細胞を、ヤギ抗-ヒトFc(Jackson immunoresearch社、109-005-098)及び抗-ヤギIRDYE800(Li-cor社、926-32214)により染色し、その後Li-Cor Odyssey赤外スキャナー上で分析した。細胞の外側に残存する抗体、すなわちインターナリゼーションされない抗体を、図10において平均MFI OUTとしてスコア化した。結果は、いくつかのmAbは、他のmAbよりも細胞表面により長く残存する(より高いシグナル)ことを明らかにしている。しかしいずれのmAbも、完全にはインターナリゼーションされず：最初(0〜2時間)は、mAbインターナリゼーションは、非常に迅速であるが、その後定常状態に達したように見え、そこでは37℃で24時間のインキュベーション後であっても、mAbの30〜40％は細胞の外側に残存し続ける。SIMPLE抗体27B3は、ベンチマーク抗体SGN70及びMDX69A7と同じほど迅速にインターナリゼーションする。SIMPLE抗体9E1及び19G10は、他のもの同様、24時間のインキュベーション後であっても、依然細胞の外側に高レベルで残存する(図10の下側パネル)ことが観察されることは興味深い。ADCC、CDC及びADCP作用を効果的に誘導するために、高レベルのCD70特異性抗体は、細胞死滅に寄与するエフェクター免疫細胞を動員するよう、標的化された癌細胞の外側に残存することは重要である。他方で、迅速にインターナリゼーションする抗体は、抗体薬物複合体(ADC)としての可能性を有する。
【０２６７】
(実施例11：腫瘍異種移植片モデルにおけるキメララマ-ヒトmAbのインビボ有効性)
播種された疾患を確立するために、0.2mL PBS中のRaji細胞106個を、C.B.-17重度複合免疫不全(SCID)マウス(Harlan社、インディアナポリス、IN)の外側尾静脈へ注射した。注射後、全てのマウスをプールし、その後1群9匹のマウスで、様々な処置群に無作為に配置した。腹腔内注射による細胞の移植後、1、4、8、11、15日目に、抗体0.5mlを投与した。マウスは、少なくとも週2回モニタリングし、且つマウスが15％〜20％の体重減少、背中を丸める姿勢、嗜眠、頭蓋の膨潤、又は脱水を含む疾患の兆候を示した場合、屠殺した。マウスは用量反応方式で41D12 mAbによる処置を受け取った。加えて、41D12のFc-破壊型(dead version)を、10mg/kgで試験した。このFc-破壊型は、先に文献において説明されており、これはADCC及びCDC活性を有さず、ADCP活性は極めて低い(McEarchernらの文献、Clin Cancer Res (2008) 14(23):7763-72)。結果を、図11に生存曲線として示している。これらのデータは、対照マウスの生存時間の中央値は、27日であることを示している。41D12の0.1mg/kgと等しいかこれよりも多い投与量が投与された場合、生存期間の中央値は、少なくとも67日まで延長された。投与量0.01mg/kgは、依然有効である。41D12のFc-破壊型は、インビボにおいて効力を有さず、これはこのモデルにおけるADCC、CDC及びADCPの重要性を例示している。
【０２６８】
(実施例12：非フコシル化mAbの発現)
少ない量のフコシル基を有する抗体は、ADCCを10〜1000倍増大することが明らかにされている(Iidaらの文献、Clin Cancer Res. (2006) 12(9): 2879‐2887)。フコシル転移酵素遺伝子(FUT8、BioWa社)を欠くCHO細胞株Ms704-PF及びMS705を、キメララマ-ヒトCD70 mAbの重鎖及び軽鎖をコードしている真核生物発現ベクターにより電気穿孔した。薬物耐性クローンを、Excell 325-PF CHO培地における増殖により選択した。クローンを、標準CD70結合ELISAにより、IgG産生についてスクリーニングした。
【０２６９】
【表６】
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【０２７０】
【表７】
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【０２７１】
【表８】
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【０２７２】
【表９】
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【０２７３】
(実施例13：抗-CD70 mAb 27B3の生殖細胞系列化)
mAb 27B3のVH及びVL領域と同じカノニカルフォールド構造及び最高のアミノ酸配列同一性を有するヒト生殖細胞系列遺伝子セグメントを、既知のヒト生殖細胞系列遺伝子配列と比較することにより同定した。mAb 27B3に最も近いヒトVH及びVL領域は、各々、ヒトVH3‐48(FR同一性89.7％)及びヒトVL8-61(FR同一性86.1％)であった。JH及びJLのヒト生殖細胞系列遺伝子セグメント配列に最も近いヒト生殖細胞系列は、各々、JH5及びJL7であった。mAb 27B3のVH及びVL領域の最も近いヒト生殖細胞系列VH及びVL配列との配列のアラインメントを、図12に示している。SIMPLE抗体27B3とヒト生殖細胞系列配列のV領域の比較は、12の候補のVH領域のヒト化変異の候補、及び13のVL領域のそれ(CDR1に2及びCDR2に1)を同定した。27B3のVH及びVL配列におけるヒト化変異の概要を、導入された多様性をカバーするのに必要とされるライブラリーサイズと一緒に、表10及び表11に示している。
【０２７４】
【表１０】
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【０２７５】
【表１１】
0005982409.tif 000060
【０２７６】
ヒト化変異の全ての組合せを包含しているVH_27B3及びVL_27B3の生殖細胞系列化ライブラリーを、PCRベースの構築により作製した(例えば、Stemmerらの文献、Gene (1995) 164: 49‐53参照)。特定の位置で具体的変異と重複しているオリゴヌクレオチドは、PCRにより構築した。このライブラリーは、野生型ラマ残基が高親和性結合に重要である事象における結合の完全な喪失を防ぐために、各変異された位置に、ヒト及びラマの両方のアミノ酸を含んだ(例えば、Bacaらの文献、J. Biol. Chem. (1997) 272: 10678‐10684；Tsurushitaらの文献、J. Immunol. Methods (2004) 295: 9-19参照)。VHライブラリーは、約1×1010クローンを含み、VLライブラリーは、約8×109クローンを含む。これらのVH及びVLライブラリーを一緒にし、且つファージディスプレイスクリーニングに適したサイズ1×1010クローン(完全長Fab挿入物の91％)を持つ単独のFabライブラリーに再フォーマットした。表10及び表11において言及された全ての可能性のある変異をカバーするために必要とされる多様性に対し、最初の重鎖及び軽鎖ライブラリーは過剰であったが、一緒にしたFabライブラリーは、全ての可能性のある並べ替え(permutation)をカバーするのに十分な大きさであった(1.89×107)。
【０２７７】
(実施例14：高ヒトFR同一性を有する生殖細胞系列化された27B3 Fabの選択)
ファージディスプレイを使用し、CD70への高親和性及び高ヒトFR同一性の両方を持つ生殖細胞系列化された27B3 Fabを選択した。具体的には、Flag-TNC-CD70をビオチニル化し、且つ様々な量のFab発現しているファージと共に、様々な濃度でインキュベーションした。その後ファージとFlag-TNC-CD70の複合体を、ストレプトアビジンでコートされたマイクロタイタープレート上に捕獲し、ビオチニル化されなかったFlag-TNC-CD70を37℃で洗浄した。ファージをトリプシンで溶出し、TG1細胞の感染に使用した。5ラウンドの選択を行い、各ラウンドで洗浄のストリンジェンシーを増大した。選択の各ラウンドに使用した条件の詳細を、表12に示す。
【０２７８】
【表１２】
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選択のラウンド3、4及び5から溶出したファージを、TG1へトランスフェクションし、且つクローン的に播種し；個々のクローンを、更なる分析のために無作為に採取した。Fabを含むペリプラスム画分を、IPTG誘導した小規模培養物から調製した。各Fabのオフレートを、Biacore結合アッセイにおいて、CD70コートされたCM5チップを用いて決定した。27B3のオフレートに類似したオフレートを有するFabを持つクローンを、配列決定した。94％を上回る総ヒトFR配列同一性を持つクローンのオフレートは、個々のクローンのヒトFR同一性の割合(VH、VL及び総)と共に、表13に示す。
【０２７９】
配列決定したFabクローンの完全なアミノ酸配列は、表14及び15に示し、且つ27B3のCDRアミノ酸配列バリアントは、表16に示している。これらの配列の検証は、軽鎖のフレームワーク1は、アミノ酸2のプライマー領域に外部(extra)(非ヒト)変異を有することが多い(Aの代わりにT)ことを明らかにしている。クローン35G3、40F1及び39C3のバリアント(各々、クローン53C1、53B1及び53E1)は、2位での対応するヒトアミノ酸を有するものを作製した。更に、クローン41D12は更に、41D12の重鎖と軽鎖40F1(53A2)又は軽鎖53B1(53H1)との組合せにより、生殖細胞系列化した。
【０２８０】
【表１３】
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【０２８１】
【表１４】
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【０２８２】
【表１５】
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【０２８３】
【表１６】
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【０２８４】
【表１７】
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【０２８５】
(実施例15：生殖細胞系列化された27B3 mAbの温度安定性)
いくつかの生殖細胞系列化された27B3 mAbバリアントを、HEK293細胞において完全長ヒトIgG1分子として発現した。プロテインA精製後、生殖細胞系列化された27B3 mAbクローンの温度安定性を評価した。具体的には、各mAbを、様々な温度で(2〜5℃間隔で)、1時間、PBS緩衝液中濃度100μg/mlでインキュベーションした。その後mAbの温度を、制御された様式で低下し(2時間かけて25℃への低下、その後4℃で一晩インキュベーション)、且つ遠心分離を使用し、凝集物を除去した。上清中の活性mAbの量(総mAb濃度の百分率)を、Biacoreにより測定した。
【０２８６】
結果(表17に示す)は、ほとんどのクローンは、野生型27B3が有するものと類似した融解温度(Tm)を有することを示す。驚くべきことに、クローン41D12及び35G2は、27B3と比べ増加した熱安定性を有することを示している。
【０２８７】
【表１８】
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【０２８８】
生殖細胞系列化された27B3 mAbである41D12、35G2及び40F1の温度安定性を、様々な技術を用い更に研究した。被験mAbのアリコート(1ml)を、0.02％Tweenを含有するダルベッコのPBS中に、100μg/mlの濃度で調製した。緩衝液(0.02％Tweenを含有するダルベッコのPBS)のみを含む陰性対照アリコート及び0.02％Tweenを含有するダルベッコのPBS中にmAbを含む陽性対照アリコートも、調製した。各mAb調製に関して、アリコートを、4℃、RT及び37℃で、0〜8週間の期間貯蔵した。試料50μlを、1、7、14、21、28、35、56及び92日目に、分析のために、アリコートから取り出した。試料を-20℃で貯蔵し、参照として使用した。
【０２８９】
(15.1  試料のゲル濾過分析)
各時点で採取した試料をまた、Superdex200 10/300 GLカラムを用いるゲル濾過により分析した。被験試料50μlを、PBS＋0.02％Tween-20の200μlへ添加した。試料(125μl)を、ゲル濾過のために採取した。分析前に試料を遠心分離し、比較的大きい凝集物を除去した。モノマー性ピークの割合(％)及びモノマー性ピーク面積に加え、保持容量を測定した。結果を、表19、20及び21に示す。
【０２９０】
【表１９】
0005982409.tif 000070
【０２９１】
【表２０】
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【０２９２】
【表２１】
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【０２９３】
37℃で5週間のインキュベーション後に採取した35G2、40F1及び41D12試料のゲル濾過分析の結果を、図13に示す。2つの小さいピークが、比較的高い保持時間(いくらかの凝集物の存在を示す)及び比較的低い保持時間(いくらかの分解産物の存在を示す)で認められる。結果は、該タンパク質の大部分は無傷であり、且つ凝集しないことを明らかにしている。
【０２９４】
(BIACOREによる試料の分析)
特定の時点で採取した試料を、Biacoreを用いCD70結合における効力について試験した。試料50μlを、PBS＋0.02％Tweenの200μlへ添加し、下記のように1/400希釈した：試料(1mg/ml)5μl＋HBS-EP+(Biacore緩衝液)195μl、更に10μl＋HVS-EP+ 90μl＝2.5μg/mlに希釈した。Biacore分析を、高度にCD70コートされたCM5チップ(4000 RU)を用いて行った。mAb 40F1、35G2及び41D12の結果を、図16に示している。参照試料は、100％試料である。
【０２９５】
これらの結果は、37℃でインキュベーションした場合、mAbが経時的に若干効力(抗原CD70の親和性)を失うことを明らかにしている。41D12に関して、勾配及び最大シグナル(R0)の両方をプロットしている(図16C及びD参照)。
【０２９６】
次に、生殖細胞系列化された27B3 mAbである41D12、35G2及び40F1の凍結-解凍の安定性を、試験した。従って、これらのmAbの0.7mlアリコート(5mg/ml)を、-20℃で少なくとも6時間凍結し、RTで1時間解凍した。このサイクルを、9回繰り返し(そのため全部で10回の凍結-解凍サイクル)、試料を先のようにゲル濾過により分析した。結果は、これらのmAbは、10サイクルの凍結解凍時に安定しており；分解産物又は凝集物はゲル濾過において認められないことを明らかにしている。
【０２９７】
【表２２】
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【０２９８】
試料はまた、先に説明したBiacoreにおいて効力についても試験した。結果は、10回の凍結-解凍サイクル後に、これらのmAbは依然その効力の97％を有することを明らかにしている(試験した3種全てのmAbについて)。
【０２９９】
【表２３】
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【０３００】
(実施例16：生殖細胞系列化された27B3 mAbのADCC効力)
いくつかの生殖細胞系列化された27B3バリアントを、完全長ヒトIgG1分子として、HEK293細胞において発現した。プロテインA精製後、生殖細胞系列化された27B3 mAbのADCC効力を評価した。ADCCを、実施例7において先に説明した方法を用い、測定した。
【０３０１】
生殖細胞系列化27B3 mAbの親27B3と比較した相対IC50を、Raji共培養アッセイ(実施例6に説明した方法)において、ADCC効力及びCD70/CD27ブロック能の両方に関して、表18に示す。＜1.0の数字は、親の27B3に比べ生殖細胞系列化バリアントの改善されたIC50を示す。これらのデータから、生殖細胞系列化バリアント41D12は、ADCC効力に加え、最良のTmと組合せたCD70/CD27ブロック能を維持したと結論付けることができる。
【０３０２】
【表２４】
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【０３０３】
(実施例17：非フコシル化CD70 mAb ARGX-110を発現している細胞株ARGX-110の構築及び選択)
生殖細胞系列化27B3クローン41D12のVH及びVLアミノ酸配列をコードしている二重遺伝子ベクターを作製した(zaアロタイプ)。41D12の重鎖(配列番号:344)及び軽鎖(配列番号:345)をコードしているヌクレオチド配列を、下記表30に示す。
【０３０４】
Potelligent(登録商標)CHOK1SV細胞を、電気穿孔法により二重遺伝子ベクターで安定してトランスフェクトした。6ラウンドのトランスフェクションを行った。各ラウンドにおいて、各電気穿孔法からの細胞を、化学的に規定された動物成分非含有(CDACF)培地CM63の200mLへ添加し、1ウェルにつき50μLで、40を超える96-ウェルプレートに播種した。トランスフェクションの翌日、選択剤L-メチオニンスルホキシミン(MSX)を含有するCM63培地150μLを、各ウェルに添加し、最終MSX濃度50μMとした。およそ3、4及び5週間のインキュベーション後、プレートを、クローニングミラー(cloning mirror)を用い、コロニーの存在についてスクリーニングした。同定されたコロニーは更に、コロニーが単独又は複数の細胞から生じたかどうかを評価するために、顕微鏡を用い試験した。
【０３０５】
245個のコロニーを、同定し、且つOctetベースの方法を用い抗体産生についてスクリーニングした。抗体濃度は、0〜172μg/mLの範囲であった。スクリーニングした245個の細胞株のうち、214個は、抗体産生について陽性であった。これらの細胞株は、生産力を基にランク付けし、上位70の細胞株を選択した。これらの70個の細胞株の培養を、最初に静置培養において、次に懸濁培養により拡大した。許容し得る増殖を示した30種の細胞株を選択し、バッチ振盪フラスコ培養の生産力スクリーニングにおいて更に評価した。4、6、8及び10日目に培養物を脱気し、12日目に収穫した。収穫した上清試料中の抗体の濃度を、プロテインA含有カラムを用い、HPLCで決定した。30種の細胞株からの試料の抗体濃度は、109〜877mg/Lの範囲であった。バッチ振盪フラスコ評価の結果を使用し、生産力を基に、細胞株をランク付けした。上位20の細胞株を、更なる評価のために選択した。
【０３０６】
ARGX-110抗体を発現しているこれらの20個の選択された細胞株に関する成長及び生産力のデータは、CDACF培地を使用する振盪フラスコ流加培養において試験し、且つ結果を、表24に示した。収穫時の抗体濃度は、プロテインA HPLCカラム上で決定して、857〜3922mg/Lの範囲であった。細胞株F13を選択し、使い捨て10L細胞バッグバイオリアクターに接種した。収穫物の抗体濃度4327mg/Lが達成された。この細胞株は、振盪フラスコ流加培養において、収穫時の抗体濃度2711mg/Lを達成し、且つ評価した6種の細胞株全て(B1、D4、D5、F1、F13及びF18)の中で2番目に高い特異的生産速度であった(2.22pg/細胞/時)。この細胞株はまた、許容可能な増殖特性を示した。
【０３０７】
【表２５】
0005982409.tif 000076
【０３０８】
(実施例18：CD70 mAbの親和性)
(18.1  CD70発現している癌細胞株への親和性)
いくつかの癌細胞株を、ARGX-110及びSGN70(US 2010/0129362に説明された)の結合に関して、飽和mAb濃度(少なくとも2μg/ml)で、FACS分析により試験した。これは、4℃(mAbと一緒の細胞の1時間インキュベーション)又は37℃(mAbと一緒の細胞の15分間インキュベーション)のいずれかで行った。結合は、抗-hIgG1-Fc-FITC(AF006、Binding Site社)又は抗-hIgG1-Fc-PE抗体(eBioscience社、12-4998)を用いて行った。
【０３０９】
蛍光は、フローサイトメーターを用いて測定した。結果を、表25にまとめる。この表の第三列は、ARGX-110は、試験した様々な細胞株に、低(+)、中(++)又は高(+++)親和性で結合したかどうかを示している。
【０３１０】
右側の列においては、37℃で実行した実験に関するARGX-110に関するFACSシグナル(MFI)を、SGN70に関するFACSシグナル(MFI)により除算した。これらの結果は、ARGX-110は、SGN70よりも比較的高い親和性で該細胞に結合することを明らかにし、より低いコピー数の細胞株に関して、特にこれは抗体の高親和性結合がより容易に手に入ることを予想することができる。
【０３１１】
【表２６】
0005982409.tif 000077
【０３１２】
更なる実験において、濃度範囲にわたる、CD70 mAbであるARGX-110、SGN70及びMDX1411[前記参照]の見かけの結合親和性を、異なる細胞株について決定した。細胞を、連続希釈したCD70結合mAbと一緒に、4℃で1時間インキュベーションし、且つ結合を、抗-hIgG1-Fc-FITC又は抗-hIgG-Fc-PE抗体を用いて検出した。蛍光は、フローサイトメーターを用いて測定し、且つ蛍光中央値をプロットした。これらの結果を、図15に示している。
【０３１３】
これらの結果は、細胞上のCD70に関する3つの異なるmAbの親和性は、同等であるが、一部の細胞株SU-DHL-6、A549及びMKN45に関して、ARGX-110の結合は、MDX1411及びSGN70と比べて優れていることを明らかにしている。SU-DHL-6、A549及びMKN45への結合に関するEC50は、全てのmAbについて、U266や多くの他のものなどの他の細胞株でのEC50と比べ、はるかに高く、このことは恐らくこのmAbは、1本のアーム(Fab)でのみ結合し、最早結合力がなく、その結果より低い親和性を生じることを示しているであろう。実際、Biacoreで試験した場合、ARGX-110のFabの親和性は、SGN70及びMDX1411に対しはるかに高い(下記参照)。
【０３１４】
(18.2  CD70発現している患者細胞への親和性)
慢性リンパ球性白血病(CLL)患者(2名は高リスク患者、1名は低リスク患者)から採取した初代細胞を、RPMI 1640＋10％FBS中の丸底96ウェルプレートに250,000個細胞/ウェルで播種し、且つRPMI＋10％FBS中のmAbを、濃度5μg/mlで添加した。37℃で最大5時間インキュベーションした後、細胞を、氷冷したPBSにより2回洗浄した。Alexa Fluor 647で標識したヤギ抗-ヒトIgG(Invitrogen社、カタログ番号21445)を、PBS/1％BSA中に1/500希釈し、4℃で20分間インキュベーションした。プレートを、氷冷したPBSにより2回洗浄し、4％パラホルムアルデヒドを室温で15分間添加し、細胞を固定した。シグナルを、FACSにより測定した。結果は図16に示している。これらの結果は、ARGX-110は、CLL患者由来の細胞へ良好に結合するのに対し、SGN70は、ほとんど結合シグナルを生じなかったことを明らかにしている。
【０３１５】
(18.3  Biacoreにおける組換えCD70に関するCD70 Fabの親和性)
組換えヒトCD70を、CM5 Biacoreチップ上に固定した。この固定は、Biacore社により提供された方法に従い、且つNHS/EDCキット(Biacore AB社)を用いて行い：チップの活性化後、pH5の10mM酢酸緩衝液中の組換えCD70の溶液50μg/mlを調製し、且つこの溶液(50ng)1μlを注入し、およそ1000RUの表面密度を生じた。
【０３１６】
パパイン消化により、CD70 mAbであるARGX-110、MDX1411及びSGN70に関するFabを調製した。これらのFabは、濃度およそ100〜400μg/mlで、HEPES-緩衝食塩水(0.1M HEPES、1.5M NaCl、30mM EDTA、0.5％v/v界面活性剤P20)中に6倍希釈した。これらを注入し(30μl)、且つフローセル中を流量30μl/分で通過させた。FabのCD70への結合後、そのオフレートを、10分間モニタリングした。解離後、フローセル表面を、10mM NaOH 5μlの注入により再生した。Fabの親和性に応じ、表面を再生するには、時にはNaOHの複数回の注入が必要であった。BIAevaluationソフトウェアを適用し、オフレート分析を行った。最初に、ブランク試行のセンソグラムを、コートされたフローセルで得られたものから減算した。その後オフレートを、Fitキネティックアプリケーションを用い時間範囲10分間について決定し、且つKd値を計算した。これらのオフレートは表26にまとめている。
【０３１７】
【表２７】
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【０３１８】
(18.4  CD70 mAbにより結合されたSU-DHL-6細胞の溶解を評価するためのスパイク実験)
SU-DHL-6細胞(びまん性大細胞型B細胞リンパ腫細胞株)を、ウェルに50,000個細胞/ウェルでピペッティングし、次にこれを、300,000個の健常ドナー由来の新たに単離されたPBMC/ウェルへスパイクし、且つmAbを異なる濃度で添加した。これらの試料を、2日間インキュベーションし、細胞株の枯渇について、FACSにより分析した(抗-ヒトCD19 APC(eBioscience社17-0199-42)により測定)。細胞死滅における最良の効力が、ARGX-110により得られ、これはまた最高の溶解率(％)を生じた。これらの結果を図17に示している。
【０３１９】
(実施例19：CD70 mAbのCD27-CD70ブロック活性)
CD70とCD27の間の相互作用は、腫瘍微小環境内での腫瘍細胞の生存、増殖及び／又は免疫抑制に寄与し得る。従ってCD70 mAbのCD70とCD27の間の相互作用をブロックする能力を、ELISAにより評価した。
【０３２０】
このアッセイにおいて、マイクロタイタープレート(Nunc Maxisorb社)を、最初にPBS中に1250倍希釈した抗-FLAG M2モノクローナル抗体(Sigma Aldrich社、F3165)100μl(最終濃度およそ3.5μg/mlを実現)により、4℃で一晩コーティングした。このプレートを、PBS-Tweenにより1回洗浄し、PBS-1％カゼイン300μlと一緒に、RTで2時間インキュベーションした。プレートを、PBS-Tweenにより更に3回洗浄した。PBS-0.1％カゼイン中に希釈した5ng/ml (80pM)Flag-TNC-CD70の100μl(The Journal of Immunology, 2009, 183: 1851‐1861)を、プレートに添加し、且つ振盪しながらRTで1時間インキュベーションした。プレートを、PBS-Tweenにより5回洗浄した。試験するCD70 mAbを、プレートに添加し；ストック抗体溶液をPBS-0.1％カゼイン中に希釈することにより、様々な濃度を実現した。その後直ちに、組換えヒトCD27 Fcキメラ(R&D systems社、382-CD、MW＝46.5kDa)1μg/ml(最終濃度6.5nM)の50μlを添加し、振盪しながらRTで1時間インキュベーションした。このプレートを、PBS Tweenで5回洗浄した。PBS-0.1％カゼイン中に500倍希釈したビオチニル化された抗-CD27(eBioscience社、13-0271)100μlを添加し、プレートを、振盪しながらRTで更に1時間インキュベーションした。プレートを、PBS Tweenで5回洗浄した。PBS-0.1％カゼイン中に5000倍希釈したStrep-HRP(Jackson Immunoresearch社、016-030-084)100μlを添加し、このプレートをRTで、振盪しながら、更に1時間インキュベーションした。プレートを、PBS-Tweenで5回洗浄した。プレートにTMB 100μlを添加し、ODを620nmで測定した。
【０３２１】
このアッセイを使用し、ARGX-110のブロック能を、SGN70及びMDX1411の効力と比較した。図18に示したように、ARGX-110は、CD70とCD27の間の相互作用のブロックにおいて、2つのベンチマークmAbよりもはるかに強力である(約100倍)(IC50 ARGX-110＝67ng/ml、MDX1411＝5500ng/ml及びSGN70＝4972ng/ml)。
【０３２２】
(実施例20：CD70 mAbの結合特性)
(20.1  非ヒト種のCD70との交差反応性)
CD70 mAbの動物での交差反応性の決定は、どの動物モデルを、インビボにおける概念研究の論証に使用することができるか、及びどの種が毒性研究に最も適しているかを評価する目的で有用である。アカゲザルCD70は、ヒトCD70と94％同一であり、カニクイザルCD70は、ヒトCD70と95％同一である。異なる種由来の配列のアラインメントを、図19に示している。ヒト配列と比較した差異を強調するために、マウスとラットのCD70配列も含んでいる。
【０３２３】
CD70 mAbであるARGX-110、SGN70及びMDX1411を、U266(ヒト多発性骨髄腫細胞株)、LCL8664細胞(アカゲザルB細胞リンパ腫細胞株、ATCC-CRL-1805)及びHSC-F細胞(カニクイザルT-細胞株、胎仔脾臓-由来のリンパ球、日本ヒューマンサイエンス振興財団)の細胞との結合について、濃度10〜20μg/mlから出発する連続希釈で試験した。
【０３２４】
ヤギ抗ヒトIgG1 FITCを用いて、検出を行った。試料は、FACSにより分析した。結果を、図20に示している。両方のサル細胞株におけるCD70のコピー数は、非常に低い(FACSにおける低いシグナル)。しかし、カニクイザル及びアカゲザルのCD70に関するSGN70及びMDX1411の親和性と比べ、ARGX-110は、これら両種のCD70について高親和性を有す。
【０３２５】
(20.2  CD70 mAbのブロック能)
CD70 mAb(ARGX-110、SGN70及びMDX1411)のCD70とCD27の間の相互作用をブロックする能力を、先に実施例19において説明したブロックELISAを用いて試験した。アッセイは、ヒト、アカゲザル及びカニクイザルFlag-TNC-CD70の各抗体のブロック能を測定するように改変した(Wyzgolらの文献、J. Immunol., 2009, 183: 1851‐1861)。
【０３２６】
ELISAにおいて、異なる種間のIC50値を直接比較するために、異なる種由来のCD70について、全く同じ条件を使用した。結果を図21に示し、これはヒト、アカゲザル及びカニクイザル由来の細胞を用いて認められた結果を裏付けている。ARGX-110は、変わらない効力を有し、従ってヒトと比べサルのCD70について変わらない親和性を有するのに対し、SGN70及び特にMDX1411は、ヒトCD70よりもサルについてより低い親和性を有する。IC50値は、表27にまとめている。
【０３２７】
【表２８】
0005982409.tif 000079
【０３２８】
(20.3  変性されたCD70への結合)
変性された組換えCD70へのCD70 mAbの結合を、ELISAにより評価した。組換えCD70を、95℃で5分間加熱し、引き続き直ちに氷上で5分間冷却することにより変性した。マイクロタイタープレートを、変性した又は変性していないCD70の5μg/mlでコーティングした。プレートをブロックし、且つ試験のためにCD70 mAbを、10μg/mlで適用した。洗浄後、mAbの結合を、抗-ヒトIgG-HRPを用いて検出した。コーティングの陽性対照として、CD70 mAbを使用する代わりに、抗-Flagマウス-由来mAbを適用し、抗-マウス-HRPにより検出した。TMBを基質として使用し、ODを620nmで測定した。このELISAからの結果を、図22に示している。これらの結果は、ARGX-110は、変性したCD70にも依然結合するのに対し、他のmAbは結合しないので、ARGX-110は、SGN70、MDX1411(MDX2H5)及びMDX69A7よりも、様々なエピトープに結合することを明らかにしている。他のmAbの中でも幾つかは、同じく変性したCD70へ結合する(例えば、5F4、9G2、57B6)。
【０３２９】
(20.4  マウス-ヒトキメラを使用するエピトープマッピング)
mAbのドメイン認知をマッピングするために、ヒト及びマウスCD70のドメインを交換することにより、ヒト-マウスCD70 ECD融合タンパク質を構築した。この構築は、標準組換えDNA法及びPCR法を用いて行った。マウスとヒトのキメラを、ELISAにおける捕獲のためにFlagタグを、及びタンパク質の三量体化のためにTNCを持つ真核生物発現ベクターへクローニングした(Flag-TNC-CD70)。タンパク質は、HEK293細胞において可溶性タンパク質として発現された。様々なキメラの配列を、図23に示している。
【０３３０】
Maxisorb(Nunc社)マイクロタイタープレートを、3.5μg/mlのマウスM2抗-Flag mAb(Sigma Aldrich社、F3165)によりコーティングし、且つ様々なキメラを捕獲した。試験するCD70 mAbの連続希釈を、濃度10μg/mlから出発し、3倍希釈まで生じるよう、適用した。2時間後、抗-ヒト-Fc-HRPを16000倍希釈で使用し、結合を検出した。染色は、ABTSで行い、OD405nmで測定した。陽性対照として、キメラヒト-マウスCD70バリアントに加え、良好な親和性でヒト及びマウスの両方のCD70に結合することができるCD27-Fcを適用した。結合のEC50値を表28にまとめている。
【０３３１】
【表２９】
0005982409.tif 000080
【０３３２】
これらの結果は、ARGX-110は、ヒトFlag-TNC-CD70、及びキメラ1、2.1、2.2、2.3及び2.4に結合することができるが、キメラ2、3及び4、及びマウスFlag-TNC-CD70には結合することができないことを明らかにしている。このことは、ARGX-110のエピトープは、下記のアミノ酸配列：
【化４０】
0005982409.tif 000081
内であることを指摘している。
【０３３３】
(実施例21：様々な腫瘍細胞株及び初代腫瘍細胞のCD70インターナリゼーション)
CD70抗体の腎臓癌由来細胞株786-O及びA498への結合は、抗体‐受容体複合体の迅速な(1時間以内)のインターナリゼーションを生じることが明らかにされている(Adamらの文献、Br. J. Cancer, (2006) 95: 298‐306)。mAbであるARGX-110、SGN70及びMDX1411のインターナリゼーションを試験するために、786-O細胞を、96-ウェルマイクロタイタープレートにおいて培養し、且つ37℃で一晩インキュベーションした。mAb 2.5μg/mlを添加し、該細胞と37℃で0〜24時間インキュベーションした。プレートを、ストリッピング緩衝液(150mM NaCl、100mMグリシン、pH＝2.5；コード「IN」、CD70によりインターナリゼーションされたmAbの量を表す)、又はPBS(コード「OUT」、該細胞の外側の受容体に結合したmAbの量を表す)により、5分間3回洗浄した。それに続き、細胞を4％パラホルムアルデヒドでRTで30分間固定し、PBSで洗浄し、且つ0.2％Triton-X-100(「IN」)又はPBS(「OUT」)と一緒に5分間インキュベーションした。次に、細胞を、2回洗浄し、100mMグリシンと一緒にRTで10分間インキュベーションし、引き続きPBS＋1％BSAと一緒に30分間インキュベーションした。最後に、細胞を、ヤギ抗-ヒトFc(Jackson immunoresearch社、109-005-098)及び抗-ヤギIRDYE800(Li-cor社、926-32214)により染色し、その後Li-Cor Odyssey赤外スキャナー上で分析した。時間の関数としてのmAb OUTの割合(％)を、図24に示している。
【０３３４】
これらの結果は、全てのmAbに関するインターナリゼーションは同等であること、及び該mAbはいずれも完全にはインターナリゼーションしないことを明らかにしている。最初に、0〜2時間の間に、該mAbのインターナリゼーションは非常に迅速に進行するが、その後定常状態に達したように見え、そこでは37℃で24時間のインキュベーション後であっても、mAbの約30％は細胞の外側に残存し続ける。
【０３３５】
CD70-結合したmAbのインターナリゼーションはまた、他の細胞株を用いて評価した。これらの実験において、細胞の外側のmAbのシグナルのみを、以下に説明したプロトコールに従いFACS分析を用い、時間の関数として測定した。この代替プロトコールは、先に説明された方法と比べ、信頼できる読み値であると決定された(図24、右側パネル参照)。
【０３３６】
懸濁細胞に関しては、細胞を遠心分離し、カウントし、且つペレットを密度5×105個細胞/mlとなるよう培地内に再懸濁し、この懸濁液100μlを、96-ウェルV-字底プレートの1つのウェルにつき添加した。接着細胞について、細胞を、96-ウェルプレートに播種し、且つ細胞が十分に接着するまで、37℃、5％CO2で増殖させた。細胞を、追加の48時間に線形の細胞増殖が可能になる密度で播種した。
【０３３７】
試験するmAbを希釈し、該細胞と一緒に37℃、5％CO2で、24時間、8時間、6時間、4時間、2時間、1時間、30分間、15分間、5分間、0分間(＝mAbなし)の異なる時間、インキュベーションした。インキュベーション後、プレートを氷上で、冷FACS緩衝液により洗浄し、インターナリゼーション反応を停止した。この段階で、接着細胞を、細胞解離溶液(Sigma社)を用いプレートから剥がし、V-字底96-ウェルプレートへと移した。次に、細胞を4℃で遠心沈降させた。プレートを優しく傾けるとにより、上清を除去した。細胞ペレットを冷FACS緩衝液100μl中に優しく再懸濁することにより、細胞を2回洗浄した。洗浄後、細胞ペレットを、FACS緩衝液中に1/500希釈した抗-hu IgG-FITC 100μl中に再懸濁した。プレートを、振盪しながら、4℃で30分間インキュベーションし、細胞を冷FACS緩衝液により更に3回洗浄した。細胞を、FACS緩衝液100μl中に再懸濁し、直ちに蛍光を測定した。中央値平均蛍光強度(MFI)を、時間に対してプロットした。
【０３３８】
いくつかの実験は、2回以上繰り返した。2回の実験の結果は、極めて同等であった。U266、SU-DHL-6及びRaji細胞を使用する一部の実験において、インターナリゼーション速度に対するmAb濃度の作用が存在するように見える場合は、濃度範囲(20ng/ml〜5μg/ml)を使用した。そのような作用は認められなかった(データは示さず)。
【０３３９】
試験した様々な細胞株に関する結果を、表29に示し、且つインターナリゼーションは共通の現象ではなく、実際には極めて稀な事象であることを明らかにしている。表29には、様々な細胞株について6時間後のインターナリゼーションの割合をまとめている。これらの結果は、ほとんどのARGX-110は、細胞の外側に結合し続け、細胞がADCC、CDC及びADCPをより受けやすくしていることを示している。
【０３４０】
【表３０】
0005982409.tif 000082
【０３４１】
【表３１】
0005982409.tif 000083
0005982409.tif 000084
【図１】
0005982409.tif 000091
【図２Ａ】
0005982409.tif 000092
【図２Ｂ】
0005982409.tif 000093
【図３】
0005982409.tif 000094
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
0005982409.tif 000096
【図４Ｃ】
0005982409.tif 000097
【図５Ａ】
0005982409.tif 000098
【図５Ｂ】
0005982409.tif 000099
【図６】
0005982409.tif 000100
【図７】
0005982409.tif 000101
【図８】
0005982409.tif 000102
【図９】
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【図１０】
0005982409.tif 000104
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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