(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかのアミノ酸配列からなり、かつ炭素数２０の脂肪酸に対するω３不飽和化活性を有するポリペプチド：
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸の欠失、置換、挿入および付加から選択される変異を施されたアミノ酸配列；
（Ｄ）配列番号４に示されるアミノ酸配列；
（Ｅ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
または、
（Ｆ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸の欠失、置換、挿入および付加から選択される変異を施されたアミノ酸配列。
【請求項２】
請求項１記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
下記（ａ）〜（ｃ）、（ｅ）〜（ｇ）及び（ｉ）のいずれかで示されるヌクレオチド配列からなる請求項２記載のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列において、１〜２０個のヌクレオチドの欠失、置換、挿入および付加から選択される変異を施されたヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号３に示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）配列番号３に示されるヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列；
（ｇ）配列番号３に示されるヌクレオチド配列において、１〜２０個のヌクレオチドの欠失、置換、挿入および付加から選択される変異を施されたヌクレオチド配列；または、
（ｉ）該（ａ）〜（ｃ）又は（ｅ）〜（ｇ）で示されるヌクレオチド配列をコドン至適化したヌクレオチド配列。
【請求項４】
請求項２又は３記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５】
請求項２又は３記載のポリヌクレオチドが導入された形質転換細胞。
【請求項６】
請求項１記載のポリペプチドを発現する細胞を培養することを含む、エイコサペンタエン酸含有脂質の生産方法。
【請求項７】
請求項６記載の方法により生産されたエイコサペンタエン酸含有脂質を精製することを含む、エイコサペンタエン酸の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ω３不飽和化酵素活性を有する新規ポリペプチドおよび当該ポリペプチドをコードする遺伝子、ならびにエイコサペンタエン酸を生成するためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
高度不飽和脂肪酸は、不飽和結合を２つ以上持つ脂肪酸であり、ω６不飽和脂肪酸のリノール酸（ＬＡ、１８：２ｎ−６）、γ−リノレン酸（ＧＬＡ、１８：３ｎ−６）、アラキドン酸（ＡＲＡ、２０：４ｎ−６）、ω３不飽和脂肪酸のα−リノレン酸（ＡＬＡ、１８：３ｎ−３）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ、２０：４ｎ−３）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ｎ−３）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６ｎ−３）などが挙げられる。高度不飽和脂肪酸は、生体膜の主要構成成分として膜の流動性の調節に関与するほか、生体機能性成分の前駆体としても重要である。ＡＲＡやＥＰＡは、高等動物内においてプロスタグランジン、トロンボキサン、ロイコトリエンなどの前駆体であり、ＤＨＡは脳内に最も多量に存在する高度不飽和脂肪酸である。ＥＰＡは、血小板凝集阻害作用、血中中性脂肪低下作用、抗動脈硬化作用、血液粘度低下作用、血圧降下作用、抗炎症作用、抗腫瘍作用等の生理作用を有し、医薬品、食品、化粧品、飼料等の様々な分野に利用されている。また、近年では、生活習慣病予防の観点から、ω３不飽和脂肪酸の積極的な摂取が推奨され、需要の拡大が著しい脂質分子種である。【０００３】
生体のＤＨＡやＥＰＡは、食物から摂取される以外に、一部の生物ではＡＬＡから生合成される。一方、ヒトはＡＬＡを生合成できないため、ＤＨＡやＥＰＡはヒトにとって栄養学的に必須の脂肪酸である。ＥＰＡは主にタラ、ニシン、サバ、サケ、イワシ、オキアミ等の魚油、シュワネラ・リビングストネンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅｎｓｉｓ）等の海洋性低温細菌、ラビリンチュラ綱（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｅｔｅｓ）等の藻類などに多く含まれている。これらの生物資源からＥＰＡを抽出または精製する方法が知られている。最も一般的に行われているのは、魚油からのＥＰＡ精製である。しかしながら、魚油中のＥＰＡ含量は低い上に、魚油由来のＥＰＡは、抽出または精製の方法によっては、魚臭が残ったり、心疾患の原因とされるエルカ酸の含量が多くなったりするという問題を有している。【０００４】
近年、エネルギー問題などに関連して、細胞内に脂質を蓄積する脂質生産微生物が注目されており、種々の脂質を微生物学的に生産する方法が開発されている。例えば、糸状菌の１種であるモルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属に属する微生物を利用した高度不飽和脂肪酸の生産方法の研究が進められている。モルティエレラ属微生物は、ω３またはω６高度不飽和脂肪酸代謝経路を有し、ＥＰＡを生産することが知られている（非特許文献１）。特許文献１には、ＥＰＡを産生するモルティエレラ属微生物を培養してＥＰＡを得る方法が開示されている。特許文献２には、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）に変異処理を施した変異株を用いてＡＲＡやＥＰＡを生産する方法が開示されている。特許文献３には、モルティエレラ・アルピナから単離したω３不飽和化ポリペプチドの遺伝子を酵母に導入した形質転換株を用いて、ＥＰＡなどの高度不飽和脂肪酸を生産する方法が開示されている。【０００５】
しかし、モルティエレラ属微生物のω３不飽和化酵素は至適温度が低く、菌が増殖しやすい常温条件（２０℃程度）下では十分に機能しない。そのため、モルティエレラ属微生物を通常の培養温度で培養しても、ＥＰＡを効率よく生産することができない。さらに、モルティエレラ属微生物のω３不飽和化酵素は、炭素鎖長１８の脂肪酸に優先的に作用するため、上記モルティエレラ属微生物を利用する従来の方法では、炭素鎖長２０のＥＰＡを効率よく生産することは難しかった。【０００６】
したがって、炭素鎖長２０の脂肪酸（例えばＡＲＡ）から効率よくＥＰＡを合成することができるω３不飽和化酵素が求められている。特許文献４には、サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）から単離したω３不飽和化酵素が、特許文献５には、フィトフトラ・ラモルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｍｏｒｕｍ）から単離したΔ１７不飽和化酵素が、特許文献６には、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）から単離したΔ１７不飽和化酵素が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開昭６３−１４６９７号公報
【特許文献２】特開平１１−２４３９８１号公報
【特許文献３】特開２００６−０５５１０４号公報
【特許文献４】特表２００５−５１５７７６号公報
【特許文献５】特表２００９−５３４０３２号公報
【特許文献６】特表２０１０−５０８０１９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ．，１９８９，３２：１−４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、２０℃以上の常温下においても高い酵素活性を有するω３不飽和化酵素、および当該ω３不飽和化酵素を有し、ＥＰＡ等のω３不飽和脂肪酸を高濃度で含有する油脂を効率よく生産することのできる脂質生産細胞を提供することに関する。さらに本発明は、当該脂質生産細胞を利用したＥＰＡ高含有油脂の工業的生産手段を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明者らは、種々検討の結果、常温下においても、炭素数２０の脂肪酸に対して高いω３不飽和化活性を有する新規なω３不飽和化酵素、およびそれをコードする遺伝子を見出した。本発明者らはさらに、上記ω３不飽和化酵素をコードする遺伝子を導入した形質転換細胞において、常温下においてＥＰＡ等のＣ２０のω３不飽和脂肪酸の生産性が向上することを見出した。【００１１】
すなわち本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と８０％以上同一なアミノ酸配列からなり、かつ炭素数２０の脂肪酸に対するω３不飽和化活性を有するポリペプチドを提供する。
また本発明は、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
また本発明は、上記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
また本発明は、上記ポリヌクレオチドが導入された形質転換細胞を提供する。
さらに本発明は、上記ポリペプチドを発現する細胞を培養することを含む、エイコサペンタエン酸含有脂質の生産方法を提供する。
さらに本発明は、上記方法により生産されたエイコサペンタエン酸含有脂質を精製することを含む、エイコサペンタエン酸の生産方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のω３不飽和化酵素は、細胞が増殖しやすい２０℃以上の常温条件下において、炭素数２０の脂肪酸に対して高いω３不飽和化活性を有し、ＥＰＡ等のＣ２０のω３不飽和脂肪酸の生合成に機能を発揮することができる。したがって、本発明のω３不飽和化酵素を発現する細胞を培養すれば、当該細胞内で、ＥＰＡ等のＣ２０のω３不飽和脂肪酸を効率よく生産することが可能になる。ＥＰＡは、医薬品、食品、化粧品、飼料等の様々な分野で使用される重要な高度不飽和脂肪酸であることから、ＥＰＡの工業規模での生産に適用し得る本発明は、当該分野で極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ  １Ｓ−４における脂肪酸生合成経路。
【図２】Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ用形質転換バイナリーベクターの例。
【図３】実施例３および５で作製されたω３不飽和化酵素遺伝子導入Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ株の脂肪酸生産量。Ａ：培養液１ｍＬ中の各脂肪酸の生産量（ｍｇ）、Ｂ：乾燥菌体１ｍｇ中の各脂肪酸の生産量（ｍｇ）、Ｃ：総脂肪酸量に対する各脂肪酸組成（％）。ホスト株：対照、Ｇ＃１８およびＧ＃２２：実施例３で作製した株、Ｃ＃１４およびＣ＃１６：実施例５で作製した株。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書において、別途定義されない限り、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列におけるアミノ酸またはヌクレオチドの欠失、置換、付加または挿入に関して使用される「１個または複数個」とは、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜４個、なお好ましくは１〜３個、さらになお好ましくは１〜２個であり得る。また本明細書において、アミノ酸またはヌクレオチドの「付加」には、配列の一末端および両末端への１または複数個のアミノ酸またはヌクレオチドの付加が含まれる。
【００１５】
本明細書において、アミノ酸配列やヌクレオチド配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９３，９０：５８７３−５８７７）、またはＦＡＳＴＡ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９９０，１８３：６３−９８）を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５：４０３−４１０）。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによってヌクレオチド配列を解析する場合には、パラメータは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）。
【００１６】
本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、同一性が高いヌクレオチド配列同士、例えば９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列同士がハイブリダイズし、それより同一性が低いヌクレオチド配列同士がハイブリダイズしない条件をいう。より詳細には、本明細書における「ストリンジェントな条件」とは、求める同一性の高低によって、適宜条件を変えることができる。より高ストリンジェントな条件であるほど、より同一性の高い配列のみがハイブリダイズすることになる。低ストリンジェントな条件の例としては、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２〜５０℃程度の洗浄条件を挙げることができる。高ストリンジェントな条件の例としては、６×ＳＳＣ、０．０１Ｍ  ＥＤＴＡ、１×デンハルト液、０．５％ＳＤＳ、５５〜６８℃程度、または５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５５℃〜６８℃程度での洗浄条件を挙げることができる。他にハイブリダイゼーションに影響する要素としてはプローブの濃度や長さ、反応時間など複数の要素が考えられる。当業者であれば、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ，，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（２００１）を参照して、上記の条件や要素を適宜選択して適切なストリンジェンシーを決定することができる。
【００１７】
本明細書において、目的のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列上における、特定のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列上の特定の位置または領域に対する「対応する位置」または「対応する領域」は、目的のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と、基準となる特定の配列（参照配列）とを、各アミノ酸配列またはヌクレオチド配列中に存在する保存アミノ酸残基またはヌクレオチドに最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、上述のリップマン−パーソン法等に基づいて手作業で行うこともできるが、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２：４６７３−４６８０）をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗの改訂版であるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ２やＣｌｕｓｔａｌ  ｏｍｅｇａを使用することもできる。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ２およびＣｌｕｓｔａｌ  ｏｍｅｇａは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ［ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ［ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ］）のウェブサイト上で利用することができる。
【００１８】
本明細書において、「ω６高度不飽和脂肪酸代謝経路」とは、リノール酸（ＬＡ、１８：２ｎ−６）から、γ−リノレン酸（ＧＬＡ、１８：３ｎ−６）、ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ、２０：３ｎ−６）、アラキドン酸（ＡＲＡ、２０：４ｎ−６）などのω６高度不飽和脂肪酸を生産する代謝経路をいい、「ω３高度不飽和脂肪酸代謝経路」とは、α−リノレン酸（ＡＬＡ、１８：３ｎ−３）から、ステアリドン酸（ＳＤＡ、１８：４ｎ−３）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ、２０：４ｎ−３）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ｎ−３）などのω３高度不飽和脂肪酸を生産する代謝経路をいう（図１参照）。また本明細書において、「高度不飽和脂肪酸」とは、炭素鎖長が１８以上で不飽和結合数が２以上の長鎖脂肪酸をいう。さらに本明細書において、「Ｃ２０のω３不飽和脂肪酸」とは、炭素数２０のω３高度不飽和脂肪酸をいい、その例としては、ＥＰＡ、ＥＴＡが挙げられる。
【００１９】
本明細書において、「不飽和化活性」とは、脂肪酸鎖に炭素−炭素二重結合を導入する活性をいい、「不飽和化酵素」とは、当該不飽和化活性を有するタンパク質またはポリペプチドをいう。不飽和化活性および不飽和化酵素は、その活性により炭素−炭素二重結合が導入される脂肪酸上の位置によってさらに分類される。例えば、「ω３不飽和化活性」とは、脂肪酸のω末端から３番目と４番目の炭素の間に二重結合を導入する活性をいい、「ω３不飽和化酵素」とは、当該活性を持ち、ω３不飽和脂肪酸を産生する酵素である。例えば、ω３不飽和化酵素は、ＬＡ（１８：２ｎ−６）からＡＬＡ（１８：３ｎ−３）への変換酵素、ＧＬＡ（１８：３ｎ−６）からＳＤＡ（１８：４ｎ−３）への変換酵素、ＤＧＬＡ（２０：３ｎ−６）からＥＴＡ（２０：４ｎ−３）への変換酵素、およびＡＲＡ（２０：４ｎ−６）からＥＰＡ（２０：５ｎ−３）への変換酵素を含み得る。
【００２０】
本明細書において、「Δ１７不飽和化活性」とは、脂肪酸のカルボキシル末端から１７番目と１８番目の炭素の間に二重結合を導入する活性をいい、「Δ１７不飽和化酵素」とは、当該活性を有し、Δ１７不飽和脂肪酸を産生する酵素である。例えば、Δ１７不飽和化酵素は、ＤＧＬＡ（２０：３ｎ−６）からＥＴＡ（２０：４ｎ−３）への変換酵素、およびＡＲＡ（２０：４ｎ−６）からＥＰＡ（２０：５ｎ−３）への変換酵素を含み得る。
【００２１】
「ω３不飽和化酵素」と「Δ１７不飽和化酵素」は、炭素数２０の脂肪酸に対して、同じ位置（ω末端から３番目と４番目の炭素間＝カルボキシル末端から１７番目と１８番目の炭素間）に不飽和結合を導入する。したがって、本明細書において、「炭素数２０の脂肪酸に対するω３不飽和化活性」は、「Δ１７不飽和化活性」と言い換えることができる。
【００２２】
本明細書において、「常温下で酵素活性を有する」とは、酵素活性の至適温度が２０℃以上、好ましくは２０〜４０℃であるか、または２０℃において至適温度での活性の７０％以上、好ましくは８０％以上の活性を有することをいう。例えば、本明細書において、酵素が「常温下で炭素数２０の脂肪酸に対するω３不飽和化活性を有する」とは、該酵素の炭素数２０の脂肪酸に対するω３不飽和化活性の至適温度が２０〜４０℃であること、あるいは、２０℃における該酵素の炭素数２０の脂肪酸に対するω３不飽和化活性が、該酵素の至適温度での炭素数２０の脂肪酸に対するω３不飽和化活性に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上であることを意味する。
【００２３】
本明細書において、微生物の機能や性状、形質に対して使用する用語「本来」とは、当該機能や性状、形質が当該微生物の野生型に存在していることを表すために使用される。対照的に、用語「外来」とは、当該微生物に元から存在するのではなく、外部から導入された機能や性状、形質を表すために使用される。例えば、ある微生物に外部から導入された遺伝子は、外来遺伝子である。外来遺伝子は、それが導入された微生物と同種の微生物由来の遺伝子であっても、異種の生物由来の遺伝子であってもよい。
【００２４】
本発明により提供されるω３不飽和化酵素は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ常温下で炭素数２０の脂肪酸に対するω３不飽和化活性を有するポリペプチドである。当該ポリペプチドの例としては、以下のアミノ酸配列からなり、かつ常温下で炭素数２０の脂肪酸に対するω３不飽和化活性を有するポリペプチドが挙げられる。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入および付加から選択される変異を施されたアミノ酸配列。
（Ｄ）配列番号４に示されるアミノ酸配列；
（Ｅ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（Ｆ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入および付加から選択される変異を施されたアミノ酸配列。
上記アミノ酸配列におけるアミノ酸の欠失、置換、挿入および付加の位置は、変異後のポリペプチドに常温下での炭素数２０の脂肪酸に対するω３不飽和化活性が保持される限り、特に限定されない。
【００２５】
さらに、本発明のω３不飽和化酵素としては、上述した（Ａ）〜（Ｆ）で示されるアミノ酸配列において、各アミノ酸が、性質の類似するアミノ酸の群に属するアミノ酸と置換されていてもよいタンパク質が挙げられる。類似するアミノ酸による置換の位置および数は、置換後のポリペプチドに常温下での炭素数２０の脂肪酸に対するω３不飽和化活性が保持される限り、特に限定されない。性質の類似するアミノ酸としては、例えば、グリシンとアラニン、バリンとロイシンとイソロイシン、セリンとトレオニン、アスパラギン酸とグルタミン酸、アスパラギンとグルタミン、リシンとアルギニン、システインとメチオニン、フェニルアラニンとチロシン等が挙げられる。
【００２６】
好ましくは、本発明のω３不飽和化酵素は、常温下、好ましくは２０℃〜４０℃の温度下で、炭素数２０の脂肪酸に対して特異的に作用するω３不飽和化酵素である。
【００２７】
配列番号２および配列番号４に示されるω３不飽和化酵素は、いずれも、鞭毛菌の１種であるプレクトスピラ・ミリアンドラ（Ｐｌｅｃｔｏｓｐｉｒａ  ｍｙｒｉａｎｄｒａ）に由来する酵素である。ＢＬＡＳＴ解析の結果、配列番号２および配列番号４に示されるω３不飽和化酵素は、互いに約９８．９％という高いアミノ酸配列同一性を有するが、一方で、公知のタンパク質と極めて異なるアミノ酸配列を有する新規なポリペプチドであることが明らかになった。配列番号２および配列番号４に示されるω３不飽和化酵素のアミノ酸配列と、サプロレグニア等に由来する公知のω３不飽和化酵素（例えば、特許文献４〜６に開示されるω３不飽和化酵素）のアミノ酸配列との配列同一性は、最大７０％である。
【００２８】
本発明者らは、プレクトスピラ・ミリアンドラのゲノムをもとに、ω３不飽和化酵素をコードする推定ＯＲＦからなるポリヌクレオチドを構築した。このポリヌクレオチドは、配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなる、配列番号２に示される本発明のω３不飽和化酵素をコードするポリヌクレオチドである。また本発明者らは、プレクトスピラ・ミリアンドラｍＲＮＡを標的とした逆転写反応により、配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなるｃＤＮＡを得た。これは、配列番号４に示される本発明のω３不飽和化酵素をコードするポリヌクレオチドである。したがって、配列番号１または配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドはいずれも、イントロン配列を含まないポリヌクレオチドであり、プレクトスピラ・ミリアンドラ細胞内に存在するゲノムＤＮＡとは異なるポリヌクレオチドである。
【００２９】
したがって本発明はまた、本発明のω３不飽和化酵素をコードするポリヌクレオチド（以下、本発明のω３不飽和化酵素遺伝子とも称する）を提供する。本発明のω３不飽和化酵素遺伝子の例としては、以下に示されるヌクレオチド配列からなる、常温下で炭素数２０の脂肪酸に対するω３不飽和化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその相補鎖が挙げられる。
（ａ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列において、１個または複数個のヌクレオチドの欠失、置換、挿入および付加から選択される変異を施されたヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号３に示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）配列番号３に示されるヌクレオチド配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列；
（ｇ）配列番号３に示されるヌクレオチド配列において、１個または複数個のヌクレオチドの欠失、置換、挿入および付加から選択される変異を施されたヌクレオチド配列；
または、
（ｈ）配列番号３に示されるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするヌクレオチド配列。
上記ヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの欠失、置換、挿入および付加の位置は、変異後のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドが常温下で炭素数２０の脂肪酸に対するω３不飽和化活性を保持する限り、特に限定されない。
【００３０】
本発明のω３不飽和化酵素は、公知の方法に従って、好ましくは化学合成法または生物学的合成法によって、製造することができる。化学合成法の例としては、常法により、側鎖官能基を保護した各アミノ酸を逐次結合し、ペプチド鎖を伸張する方法を挙げることができる。生物学的合成法の例としては、本発明のω３不飽和化酵素遺伝子から本発明のω３不飽和化酵素を発現させた後、生成した酵素を単離、必要に応じてさらに精製する方法を挙げることができる。
【００３１】
以下に、本発明のω３不飽和化酵素の生物学的合成法についてさらに詳しく説明する。まず、本発明のω３不飽和化酵素遺伝子を調製する。当該遺伝子は、本発明のω３不飽和化酵素のアミノ酸配列や、プレクトスピラ・ミリアンドラ等の微生物のゲノムＤＮＡの配列情報に基づいて、公知の方法に従い化学合成法によって製造してもよく、または上述したプレクトスピラ・ミリアンドラ等の微生物から単離してもよい。本発明のω３不飽和化酵素遺伝子を微生物から単離する場合、例えば、当該微生物の全ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製し、当該ｃＤＮＡライブラリーからのスクリーニングにより目的とする本発明の遺伝子のｃＤＮＡを単離することができる。スクリーニングの際には、本発明の遺伝子のヌクレオチド配列に基づいてプローブまたはプライマーを設計し、当該プローブまたはプライマーとストリンジェントな条件でハイブリダイズするｃＤＮＡを選択すればよい。あるいは、当該微生物の全ＲＮＡから、配列特異的な逆転写反応により、目的のｃＤＮＡを選択的に合成することができる。選択されたｃＤＮＡは、ＰＣＲ等の公知の方法により増幅することができる。
【００３２】
またあるいは、本発明のω３不飽和化酵素遺伝子は、上記の手順で単離または合成された遺伝子に対して、紫外線照射や部位特異的変異導入のような公知の突然変異導入法により突然変異を導入することによって、作製することができる。例えば、配列番号１または配列番号３に示されるポリヌクレオチドに対して公知の方法で突然変異導入し、変異ポリヌクレオチドを得る。当該変異ポリヌクレオチドから発現したポリペプチドのω３不飽和化活性を調べて所望の活性を有するポリペプチドをコードするものを選択することによって、本発明のω３不飽和化酵素遺伝子を取得することができる。
【００３３】
さらに、上記の手順で調製された本発明のω３不飽和化酵素遺伝子は、当該遺伝子を導入して発現させる細胞におけるコドン使用頻度にあわせて、コドンを至適化されることが好ましい。各種生物が使用するコドンの情報は、Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）から入手可能である。例えば、配列番号１および配列番号３で示されるω３不飽和化酵素遺伝子をモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）のコドン使用頻度（ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｓｈｏｗｃｏｄｏｎ．ｃｇｉ？ｓｐｅｃｉｅｓ＝６４５１８）にあわせてコドン至適化した場合、それぞれ、配列番号５および配列番号６で示されるポリヌクレオチドとなる。したがって、本発明のω３不飽和化酵素遺伝子としては、上記（ａ）〜（ｈ）に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを基に、各種生物のコドン使用頻度にあわせてコドンを至適化されたポリヌクレオチドが挙げられる。
【００３４】
次に、調製された本発明のω３不飽和化酵素遺伝子から、本発明のω３不飽和化酵素を発現させる。当該酵素は無細胞系で発現させてもよいが、本発明のω３不飽和化酵素遺伝子を宿主細胞に導入して形質転換細胞を得、当該形質転換細胞に本発明のω３不飽和化酵素を発現させてもよい。
【００３５】
本発明のω３不飽和化酵素遺伝子を導入する宿主細胞としては、細菌、真菌、藻類などの微生物の細胞が好ましいが、特に限定されない。宿主細胞への遺伝子の導入には、本発明のω３不飽和化酵素遺伝子を含むベクターを用いることができる。導入に使用されるベクターの種類は、宿主細胞の種類や、クローニングの方法、遺伝子発現の方法等に応じて適宜選択することができる。例えば、細胞のゲノム外に存在するベクター上の遺伝子から直接本発明のω３不飽和化酵素を発現させる場合、発現ベクターが好ましく用いられる。適切なベクターに本発明のω３不飽和化酵素遺伝子を組み込み、得られた本発明のω３不飽和化酵素遺伝子を含むベクターを、宿主細胞へ導入する。細胞へのベクターの導入には、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）法、コンピテント細胞法、プロトプラスト法、リン酸カルシウム共沈法、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＡＴＭＴ）法およびその改変法（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００９，７５：５５２９−５５３５）などの公知の方法を使用することができる。このとき、ベクターに適切なマーカー遺伝子を組み込んでおけば、マーカーの発現を指標に、本発明の遺伝子を含むベクターが導入された形質転換細胞を選別することができる。
【００３６】
上記形質転換細胞により、本発明のω３不飽和化酵素が発現される。発現された本発明のω３不飽和化酵素は、公知のタンパク質の単離または精製法によって単離、および必要に応じて精製することができる。
【００３７】
本発明のω３不飽和化酵素は、細胞が増殖しやすい常温、例えば２０℃以上の温度条件下において高いω３不飽和化活性を有し、ＥＰＡ等のＣ２０のω３不飽和脂肪酸の生合成に機能を発揮することができる。したがって、本発明のω３不飽和化酵素を発現する細胞を常温で培養すれば、当該細胞が容易に増殖するとともに、その増殖した細胞内で発現した本発明のω３不飽和化酵素によりＣ２０のω３不飽和脂肪酸の生合成が行われるので、ＥＰＡ等のＣ２０のω３不飽和脂肪酸を効率よく生産することが可能になる。
【００３８】
したがって、本発明は、本発明のω３不飽和化酵素を発現する細胞を培養することを含む、Ｃ２０のω３不飽和脂肪酸の生産方法を提供する。Ｃ２０のω３不飽和脂肪酸としては、ＥＴＡおよびＥＰＡが挙げられ、好ましくはＥＰＡである。本発明はまた、本発明のω３不飽和化酵素を発現する細胞を培養することを含む、ＥＰＡ含有脂質の生産方法を提供する。さらに本発明は、上記本発明のＥＰＡ含有脂質の生産方法により生産されたＥＰＡ含有脂質を精製することを含む、ＥＰＡの生産方法を提供する。
【００３９】
上記本発明のω３不飽和化酵素を発現する細胞としては、当該酵素を本来発現する細胞であってもよく、または当該酵素を発現するように改変された細胞であってもよい。本発明のω３不飽和化酵素を本来発現する細胞としては、プレクトスピラ・ミリアンドラが挙げられる。本発明のω３不飽和化酵素を発現するように改変された細胞としては、上述したような、本発明のω３不飽和化酵素遺伝子の導入により本発明のω３不飽和化酵素の発現能を獲得した形質転換細胞が挙げられる。当該形質転換細胞は、植物、細菌、真菌、藻類などに由来する任意の細胞であり得るが、細菌、真菌、藻類などの微生物の細胞であることが好ましい。あるいは、上記プレクトスピラ・ミリアンドラを、本発明のω３不飽和化酵素の発現が向上するように改変して、本発明のＥＰＡ含有脂質の生産方法に用いることができる。
【００４０】
本発明のＥＰＡ含有脂質の生産方法において、上記本発明のω３不飽和化酵素を発現する細胞は、本発明のω３不飽和化酵素の働きによってＥＰＡを生産する。したがって、当該細胞は、本発明のω３不飽和化酵素の発現能を有することに加えて、当該酵素の基質となるアラキドン酸（ＡＲＡ）を生産する能力を本来有するか、またはＡＲＡを生産することができるように改変されている。好ましくは、当該細胞は、ω６高度不飽和脂肪酸代謝経路を本来有するか、または当該経路を有するように改変されている。より好ましくは、当該細胞は、ω６高度不飽和脂肪酸代謝経路およびω３高度不飽和脂肪酸代謝経路を本来有するか、または当該両経路を有するように改変されている。図１に示すように、ω６高度不飽和脂肪酸代謝経路により生成されたＡＲＡは、ω３不飽和化酵素の働きによりＥＰＡへと変換される。あるいは、ＤＧＬＡ等の炭素数２０のω６高度不飽和脂肪酸は、ω３不飽和化酵素の働きによりＥＴＡ等の炭素数２０のω３高度不飽和脂肪酸へと変換され、そしてこれらのω３高度不飽和脂肪酸から、ω３高度不飽和脂肪酸代謝経路によりＥＰＡが生成される。
【００４１】
したがって、本発明のＥＰＡ含有脂質の生産方法に使用される細胞の好適な例としては、本発明のω３不飽和化酵素を発現する能力を有し、かつω６高度不飽和脂肪酸代謝経路を有しアラキドン酸を産生することができる脂質生産微生物（ｏｌｅａｇｉｎｏｕｓ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）が挙げられる。より好ましくは、当該脂質生産微生物は、さらにω３高度不飽和脂肪酸代謝経路を有する。そのような脂質生産微生物の例としては、上述したプレクトスピラ・ミリアンドラ、およびω６高度不飽和脂肪酸代謝経路によりアラキドン酸産生する能力を有する脂質生産微生物であって、好ましくはさらにω３高度不飽和脂肪酸代謝経路を有し、かつ本発明のω３不飽和化酵素を発現するように改変されたものが挙げられる。
【００４２】
上記本発明のω３不飽和化酵素を発現するように改変された脂質生産微生物は、ω６高度不飽和脂肪酸代謝経路を有しアラキドン酸を産生する能力を有し、好ましくはさらにω３高度不飽和脂肪酸代謝経路を有する脂質生産微生物に、本発明のω３不飽和化酵素遺伝子を導入することにより得ることができる。当該脂質生産微生物への本発明のω３不飽和化酵素遺伝子の導入は、宿主細胞への遺伝子導入に関して上述した手順に従って行うことができるが、以下により具体的な手順を説明する。
【００４３】
本発明のω３不飽和化酵素遺伝子を導入されるべき脂質生産微生物の例としては、プレクトスピラ属菌、酵母菌、およびモルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、ウンベロプシス（Ｕｍｂｅｌｏｐｓｉｓ）属等の糸状菌などが挙げられるが、これらに限定されない。酵母菌としては、子嚢菌酵母、担子菌酵母、分裂酵母、出芽酵母などが挙げられる。上記のうち、好ましい例としては、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ、以下の本明細書においてＭ．ａｌｐｉｎａということがある）、モルティエレラ・クラミドスポラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒａ）、モルティエレラ・エロンガタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｅｌｏｎｇａｔａ）、モルティエレラ・エキシグア（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｅｘｉｇｕａ）、モルティエレラ・フィグロフィラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）、モルティエレラ・エピガマ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｅｐｉｇａｍａ）、モルティエレラ・アクロトナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｃｒｏｔｏｎａ）、モルティエレラ・ミヌティシマ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ）、モルティエレラ・リギコラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｌｉｇｎｉｃｏｌａ）、モルティエレラ・クロノシスティス（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｃｌｏｎｏｃｙｓｔｉｓ）、モルティエレラ・ナナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｎａｎａ）、モルティエレラ・フミコラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｈｕｍｉｃｏｌａ）、モルティエレラ・バイニエリ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｂａｉｎｉｅｒｉ）、モルティエレラ・ヒアリン（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｈｙａｌｉｎｅ）、モルティエレラ・グロバルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｇｌｏｂａｌｐｉｎａ）、ウンベロプシス・ナナ（Ｕｍｂｅｌｏｐｓｉｓ  ｎａｎａ）、ウンベロプシス・イサベリナ（Ｕｍｂｅｌｏｐｓｉｓ  ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）等のモルティエレラ属微生物が挙げられ、より好ましくは、モルティエレラ・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）、モルティエレラ・クロノシスティス、モルティエレラ・ナナ、モルティエレラ・フミコラ、モルティエレラ・バイニエリ、モルティエレラ・ヒアリン、モルティエレラ・グロバルピナなどが挙げられる。
【００４４】
さらに、上記本発明の遺伝子を導入されるべき脂質生産微生物は、ω６高度不飽和脂肪酸代謝経路を有しアラキドン酸を産生する能力を有する限りにおいて、上述したプレクトスピラ属、酵母、およびモルティエレラ属、ムコール属、ウンベロプシス属等の微生物の変異株であってもよい。当該変異株は、本発明のω３不飽和化酵素以外のω３不飽和化酵素を発現する必要はないので、当該微生物が本来有するω３不飽和化酵素を欠く欠損株であってもよい。このような変異株や欠損株の例としては、Ｍ．ａｌｐｉｎａ  １Ｓ−４（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８７，５１（３）：７８５−７９０）、Ｍ．ａｌｐｉｎａ  ＳＴ１３５８（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０１０，７４：９０８−９１７）などが挙げられる。
【００４５】
上記脂質生産微生物の変異株や欠損株は、常法、例えば、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、メタンスルホン酸メチル（ＭＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９２，１３８：９９７−１００２）、５−ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）、シスプラチン、マイトマイシンＣ等の変異原による処理や、放射線照射、紫外線照射、高熱処理等による突然変異誘発、またはＲＮＡｉによる遺伝子発現抑制などによって得ることができる。
【００４６】
本発明のω３不飽和化酵素遺伝子は、上記微生物のゲノム内に導入されてもよく、または発現ベクターに組み込まれた状態でゲノム外に導入されてもよい。いずれの場合も、本発明のω３不飽和化酵素遺伝子は、当該遺伝子を含むベクターとともに導入することが好ましい。遺伝子導入に用いるベクターは、遺伝子が導入される微生物の種類や、クローニングの方法、遺伝子発現の方法等に応じて、当業者が適宜選択することができる。例えば、モルティエレラ属微生物に対するゲノム外への遺伝子導入に用いるベクターとしては、ｐＤ４ベクター（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０００，６６（１１）：４６５５−４６６１）、ｐＤＺｅｏベクター（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２００５，１００（６）：６１７−６２２）、ｐＤｕｒａ５ベクター（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００４，６５（４）：４１９−４２５）、ｐＤＸベクター（Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，２００９，５５（３）：３４９−３５６）、ｐＢＩＧ３ｕｒａ５（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００９，７５：５５２９−５５３５）などが挙げられる。
【００４７】
さらに、上記ベクターには、組み込まれた本発明の遺伝子を発現させるためのプロモーター配列もしくは転写終結シグナル配列、または目的遺伝子が導入された形質転換体を選択するための選択マーカー遺伝子が含まれていることが好ましい。プロモーターとしては高発現プロモーターが好ましい。例えば、モルティエレラ属微生物用の好ましい高発現プロモーターとしては、Ｍ．ａｌｐｉｎａ由来のＰＰ３プロモーターおよびＳＳＡ２プロモーター、ならびにこれらのプロモーターの配列に置換、欠失、付加等を加えて改変したプロモーターが挙げられるが、導入した遺伝子を高発現させることができれば、これらに限定されない。選択マーカー遺伝子としては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、カルボキシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子、ロイシン、ヒスチジン、メチオニン、アルギニン、トリプトファン、リジン等のアミノ酸要求変異を相補する遺伝子、ウラシル、アデニン等の核酸塩基要求性変異を相補する遺伝子などを挙げることができる。好ましい選択マーカー遺伝子の例としては、ウラシル要求性変異を相補する遺伝子が挙げられる。例えば、Ｍ．ａｌｐｉｎａのウラシル要求性変異株（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００４，６８：２７７−２８５）が開発されている。このようなウラシル要求株に対しては、選択マーカー遺伝子としてオロチジン−５'−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｕｒａ３遺伝子）、またはオロチジル酸ピロホスホリラーゼ遺伝子（ｕｒａ５遺伝子）を使用することができる。ベクターを構築するための手順や使用する試薬類、例えば制限酵素またはライゲーション酵素等の種類については、特に限定されるものではない。当業者は、通常の知識に従って、または市販品を適宜用いてベクターを構築することができる。
【００４８】
Ｍ．ａｌｐｉｎａへの本発明のω３不飽和化酵素遺伝子の導入に使用することができる形質転換バイナリーベクターの例を、図２に示す。当該ベクターにおいては、恒常的高発現プロモーターであるＳＳＡ２プロモーターの下流に、本発明のω３不飽和化酵素をコードするポリヌクレオチド（ＰｍＤ１７ＸＸｍｏｄ）が連結されており、さらにターミネーターとしてｓｄｈＢターミネーター、形質転換体の選択マーカーとしてｕｒａ５遺伝子が組み込まれている。
【００４９】
本発明のω３不飽和化酵素遺伝子を微生物のゲノム内に直接導入する方法としては、相同組換え法が挙げられる。本発明の遺伝子とともに導入先とするゲノムの相補配列を含むベクターを準備し、そのベクターを微生物に導入すれば、相同組換えにより当該微生物のゲノム上の標的とする位置に本発明のω３不飽和化酵素遺伝子が組み込まれる。当該ベクターには、必要に応じて、上述したプロモーター配列、転写終結シグナル配列または選択マーカー遺伝子が一緒に組み込まれていてもよい。
【００５０】
微生物へのベクターの導入手段は、微生物やベクターの種類に応じて当業者が適宜選択すればよい。例えば、モルティエレラ属微生物等の真菌類への導入の場合、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）法、ＡＴＭＴ法およびその改変法（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００９，７５：５５２９−５５３５）などが挙げられ、ＡＴＭＴ法およびその改変法が好ましいが、目的の形質を安定して保持する形質転換体を得ることができれば、遺伝子導入法はこれらの方法に限定されない。
【００５１】
さらに、本発明のＥＰＡ含有脂質の生産方法に使用される、本発明のω３不飽和化酵素を発現する細胞は、そのω６高度不飽和脂肪酸代謝経路を活性化させるような改変を施されていてもよい。例えば、当該細胞に、Δ１２不飽和化酵素をコードする遺伝子を導入して当該酵素を高発現させることによって、当該細胞内でのオレイン酸からリノール酸への変換が促進されて、ω６高度不飽和脂肪酸代謝経路を活性化させることができる。当該経路の活性化は、本発明の酵素の基質となるω６高度不飽和脂肪酸量を増加させるので、結果としてＥＰＡの産生が促進される。あるいは、本発明のω３不飽和化酵素を発現する細胞に、Δ１５不飽和化酵素をコードする遺伝子を導入して当該酵素を高発現させることによって、ＬＡからＡＬＡ、またはＧＬＡからＳＤＡへの変換を促進してω３高度不飽和脂肪酸代謝経路を活性化させることができる。さらに、本発明のω３不飽和化酵素を発現する細胞には、Δ１２不飽和化酵素をコードする遺伝子およびΔ１５不飽和化酵素をコードする遺伝子の両方を導入してもよい。
【００５２】
本発明のＥＰＡ含有脂質の生産方法において、以上の手順で得られた本発明のω３不飽和化酵素を発現する細胞は、液体培地または固体培地に接種され、培養される。培養の条件は、細胞の種類に応じて当業者が最適化することができる。例えば、当該細胞が真菌の場合、菌株の胞子、菌糸、または予め培養して得られた前培養液を、上記培地に接種して培養することができる。培地の炭素源としてはグルコース、フルクトース、キシロース、サッカロース、マルトース、可溶性デンプン、コーンスターチ、グリセロール、マンニトール、脂質、アルカン、アルケン等が挙げられるが、これらに限定されない。窒素源としてはペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、カザミノ酸、コーンスティープリカー、大豆タンパク、脱脂ダイズ、綿実カス、小麦フスマ等の天然窒素源の他に、尿素等の有機窒素源、ならびに、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等の無機窒素源が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、大豆油、ココナッツ油、コーン油等の脂質を添加してもよい。添加する脂質は、大豆油、コーン油等のリノール酸を多く含む油脂が好ましく、大豆油がより好ましい。また、微量栄養源として、リン酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸銅等の無機塩、またはビタミン等も適宜添加することができる。これらの培地成分は、培養する微生物の生育を害しない濃度であれば特に制限されない。例えば、炭素源は培地中０．１〜４０質量％、好ましくは１〜２５質量％、窒素源は０．０１〜１０質量％、好ましくは０．１〜１０質量％の濃度とすることができる。Ｍ．ａｌｐｉｎａまたはその変異株を培養する場合、後述のＣｚａｐｅｋ培地、Ｃｚａｐｅｋ−ｄｏｘ培地、グルコース・酵母エキス（以下、「ＧＹ」ともいう）培地、ＳＣ培地等を好適に使用することができる。あるいは、モルティエレラ属微生物用の培地については、公知の文献（例えば国際公開第９８／２９５５８号）を参考にすることもできる。培地のｐＨは４〜１０、好ましくは６〜９であり得る。培養は、通気撹拌培養、振盪培養または静置培養であり得る。
【００５３】
上記細胞の増殖を促してＥＰＡの収量を増加させるためには、当該細胞の培養は至適生育温度で行われることが好ましい。例えば、当該細胞は、約５〜６０℃、好ましくは約１０〜５０℃、より好ましくは約１０〜４０℃、さらに好ましくは約２０〜４０℃、なお好ましくは約２０〜３０℃で培養され得る。例えば、細胞がＭ．ａｌｐｉｎａまたはその変異株の場合、約１０〜４０℃、好ましくは約２０〜４０℃、より好ましくは約２０〜３０℃で培養するのがよい。当該細胞の培養期間は、例えば２〜２０日間、好ましくは２〜１４日間であり得る。なお、モルティエレラ属微生物の培養法については、公知の文献（例えば、特開平６−１５３９７０号公報）を参考にすることもできる。
【００５４】
上記手順で本発明のω３不飽和化酵素を発現する細胞を培養することによって、当該細胞内にＥＰＡを高含有する脂質が生産される。培養終了後、培養液を遠心分離、ろ過等の常用の手段にかけ、細胞を分離する。例えば、培養液を遠心分離またはろ過して液体分を除き、分離された細胞を洗浄後、凍結乾燥、風乾等により乾燥させ、乾燥細胞を得る。当該細胞から、有機溶媒抽出等の公知の手法により、目的とする脂質を抽出することができる。有機溶媒としてはヘキサン、エーテル、酢酸エチル、酢酸ブチル、クロロホルム、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン等の、高度不飽和脂肪酸の溶解性が高く、かつ水と分離可能な溶媒が挙げられる。または、これらの有機溶媒を組み合わせて使用することもできる。抽出物から減圧等で有機溶媒を留去することにより、目的の脂質を抽出することができる。あるいは、細胞を乾燥させずに、湿細胞から脂質の抽出を行うこともできる。得られた脂質は、脱ガム、脱酸、脱臭、脱色、カラム処理、蒸留等一般的な方法を適宜用いてさらに精製されてもよい。
【００５５】
上記抽出した脂質の中には、本発明の方法の目的物であるＥＰＡ以外に、夾雑物となる各種脂肪酸が含まれている。したがって、上記脂質をさらに精製してより純度の高いＥＰＡを取得することができる。ＥＰＡは、脂質から直接分離することもできるが、一旦脂質中の脂肪酸を低級アルコールとのエステル誘導体に変換した後に、目的とするＥＰＡのエステル誘導体を分離することが好ましい。エステル誘導体は、炭素数、二重結合の数、位置の違い等に応じて、各種分離精製操作を用いることによって分離することができるため、容易に目的の脂肪酸のエステル誘導体を得ることができる。しかしながら、ＥＰＡと炭素数が同一で二重結合数が一つ異なるアラキドン酸は、ＥＰＡとの分離が難しいため、ＥＰＡを含有する脂質中にアラキドン酸は少ないことが好ましい。エステル誘導体は、エチルエステル誘導体が好ましい。エステル化には、塩酸、硫酸、ＢＦ３等の酸触媒、またはナトリウムメトキシド、水酸化カリウム等の塩基触媒を含む低級アルコールを使用することができる。得られたエステル誘導体から、銀錯体法（例えば、特許第２７８６７４８号、特許第２８９５２５８号、特許第２９３５５５５号、特許第３００１９５４号）、カラムクロマトグラフィー、低温結晶化法、尿素付加分別法等を単独または組み合わせて、目的とするＥＰＡのエステル誘導体を分離することができる。分離したＥＰＡのエステル誘導体を、アルカリで加水分解した後、エーテル、酢酸エチル等の有機溶媒で抽出することにより、ＥＰＡを精製することができる。ＥＰＡは塩の形態で精製されてもよい。
【００５６】
本発明によるＥＰＡを高含有する脂質の生産を工業的な規模で行う場合、例えば、本発明のω３不飽和化酵素を発現する脂質生産微生物をタンク中等で大規模培養し、フィルタープレス等でろ過し、細胞を回収して乾燥後、ボールミル等で細胞を破砕し、有機溶媒で脂質を抽出することができる。また、工業規模で微生物中の成分を抽出して利用する方法や、脂質からＥＰＡを精製する方法は数多く知られており、これらを適宜改変して本発明の方法に利用することもできる。
【００５７】
本発明のω３不飽和化酵素を用いてＥＴＡを生産するためには、好ましくは、上述した本発明のω３不飽和化酵素を発現する細胞においてΔ５不飽和化酵素の活性を低下させる。これによって、該細胞はＥＰＡの代わりにＥＴＡを主に生産する。細胞のΔ５不飽和化酵素活性の低下は、例えば、Δ５不飽和化酵素欠損株に本発明の酵素を発現させるか、またはＲＮＡｉによって細胞におけるΔ５不飽和化酵素の発現を阻害することによって達成することができる。細胞の培養、細胞からのＥＴＡ含有脂質の抽出、ＥＴＡの精製の手順は、上述したＥＰＡの場合と同様である。
【００５８】
本発明で得られたＥＰＡ、ＥＴＡまたはそれらの塩は、ヒトまたは非ヒト動物用の医薬品、化粧料、食品、飼料等の製造に使用することができる。当該医薬品の剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、ドライシロップ剤、液剤、懸濁剤等の経口剤；注腸剤、坐剤等の経腸製剤；点滴剤；注射剤；外用剤；経皮、経粘膜、経鼻剤；吸入薬；貼布剤等が挙げられる。また当該化粧料の形態としては、クリーム、乳液、ローション、懸濁液、ジェル、パウダー、パック、シート、パッチ、スティック、ケーキ等、化粧品が通常とり得る任意の形態が挙げられる。
【００５９】
好ましくは、上記医薬品または化粧料は、血小板凝集阻害、血中中性脂肪低下、抗動脈硬化、血液粘度低下、血圧降下、抗炎症、抗腫瘍のための医薬品または化粧料であり得る。上記医薬品または化粧料は、ＥＰＡ、ＥＴＡまたはそれらの塩を有効成分として含有する。上記医薬品または化粧料はまた、医薬として許容される担体または化粧料として許容される担体、例えば、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、分散剤、乳化剤、防腐剤、酸化防止剤、着色剤、アルコール、水、水溶性高分子、香料、甘味料、矯味剤、酸味料等を含有していてもよく、さらに必要に応じて他の有効成分、例えば薬効成分、化粧成分等を含有していてもよい。上記医薬または化粧料は、ＥＰＡ、ＥＴＡまたはそれらの塩に、上記担体や他の有効成分を剤型に応じて配合し、常法に従って調製することにより、製造することができる。上記医薬または化粧料におけるＥＰＡまたはＥＴＡの含有量は、その剤型により異なるが、通常は、０．１〜９９質量％、好ましくは１〜８０質量％の範囲である。
【００６０】
上記飲食品または飼料は、ＥＰＡ、ＥＴＡまたはそれらの塩を有効成分として含有する。これらの飲食品または飼料は、血小板凝集阻害作用、血中中性脂肪低下作用、抗動脈硬化作用、血液粘度低下作用、血圧降下作用、抗炎症作用、抗腫瘍作用等の効果を企図して、その旨を表示した健康食品、機能性飲食品、特定保健用飲食品、病者用飲食品、家畜、競走馬、鑑賞動物等のための飼料、ペットフード等であり得る。
【００６１】
上記飲食品または飼料の形態は特に制限されず、ＥＰＡ、ＥＴＡまたはそれらの塩を配合できる全ての形態が含まれる。例えば、当該飲食品の形態としては、固形、半固形または液状であり得、あるいは、錠剤、チュアブル錠、粉剤、カプセル、顆粒、ドリンク、ゲル、シロップ、経管経腸栄養用流動食等の各種形態が挙げられる。具体的な飲食品の形態の例としては、緑茶、ウーロン茶や紅茶等の茶飲料、コーヒー飲料、清涼飲料、ゼリー飲料、スポーツ飲料、乳飲料、炭酸飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料、発酵乳飲料、粉末飲料、ココア飲料、アルコール飲料、精製水などの飲料、バター、ジャム、マーガリンなどのスプレッド類、ふりかけ、マヨネーズ、ショートニング、カスタードクリーム、ドレッシング類、パン類、米飯類、麺類、パスタ、味噌汁、豆腐、牛乳、ヨーグルト、スープまたはソース類、菓子（例えばビスケットやクッキー類、チョコレート、キャンディ、ケーキ、アイスクリーム、チューインガム、タブレット）などが挙げられる。上記飼料は、飲食品とほぼ同様の組成や形態で利用できることから、本明細書における飲食品に関する記載は、飼料についても同様に当てはめることが出来る。
【００６２】
上記飲食品または飼料は、ＥＰＡ、ＥＴＡまたはそれらの塩、ならびに飲食品や飼料の製造に用いられる他の飲食品素材、各種栄養素、各種ビタミン、ミネラル、アミノ酸、各種油脂、種々の添加剤（例えば呈味成分、甘味料、有機酸等の酸味料、界面活性剤、ｐＨ調整剤、安定剤、酸化防止剤、色素、フレーバー）等を配合して、常法に従って調製することにより製造することができる。あるいは、通常食されている飲食品または飼料にＥＰＡ、ＥＴＡまたはそれらの塩を配合することにより、本発明に係る飲食品または飼料を製造することができる。上記飲食品または飼料におけるＥＰＡまたはＥＴＡの含有量は、食品の形態により異なるが、通常は、０．０１〜８０質量％、好ましくは０．１〜５０質量％、より好ましくは１〜３０質量％の範囲である。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。【００６４】
（培地）
ＧＹ培地：２％（ｗ／ｖ）グルコース、１％酵母エキス。
Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ寒天培地：３％スクロース、０．２％ＮａＮＯ3、０．１％ＫＨ2ＰＯ4、０．０５％ＫＣｌ、０．０５％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１％ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、２％寒天、ｐＨ６．０。
ＹＰＤ培地：ポリペプトン２０ｇ、酵母抽出物１０ｇ、アデニン０．４ｇ、寒天２０ｇおよびグルコース２０ｇを１０００ｍＬの水に希釈。
ＬＢ−Ｍｇ寒天培地：１％トリプトン、０．５％酵母エキス、８５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５ｍＭ  ＮａＯＨ、１．５％寒天、ｐＨ７．０。
最少培地（ＭＭ）：１０ｍＭ  Ｋ2ＨＰＯ4、１０ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、２．５ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ2Ｏ、０．７ｍＭ  ＣａＣｌ2、９μＭ  ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、４ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4、１０ｍＭグルコース、ｐＨ７．０。
誘導培地（ＩＭ）：ＭＭに０．５％（ｗ／ｖ）グリセロール、２００μＭアセトシリンゴン、４０ｍＭ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）を加えて、ｐＨ５．３に調製。
ＳＣ培地：５．０ｇ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ（Ｄｉｆｃｏ）、１．７ｇ  （ＮＨ4）2ＳＯ4、２０ｇグルコース、２０ｇ寒天、２０ｍｇアデニン、３０ｍｇチロシン、１．０ｍｇメチオニン、２．０ｍｇアルギニン、２．０ｍｇヒスチジン、４．０ｍｇリジン、４．０ｍｇトリプトファン、５．０ｍｇスレオニン、６．０ｍｇイソロイシン、６．０ｍｇロイシン、６．０ｍｇ  Ｌフェニルアラニン。【００６５】
実施例１  ω３不飽和化酵素の同定
プレクトスピラ・ミリアンドラをＧＹ培地１０ｍＬ中にて２８℃で５日間振とう培養し、菌体を回収した。集菌した菌体を２ｍＬチューブに入れ、ビーズショッカー（Ｙａｓｕｉ  Ｋｉｋａｉ）を用いて１７００ｒｐｍ、１０秒×２回の条件にて破壊した。破壊した菌体から、ＩＳＯＧＥＮ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、製品プロトコールに従いｍＲＮＡを抽出した。抽出したｍＲＮＡを、Ｐｒｉｍｅ  ＳｃｒｉｐｔTMＩＩ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）およびプライマー〔５’−ＧＡＡＡＴＧＧＣＣＧＡＣＧＴＧＡＡＣＡＣＣＴＣＣＴＣＧＣ−３’（配列番号７）、および５’−ＣＴＡＴＧＣＧＣＧＣＴＴＧＧＴＧＡＧＣＡＣＣＴＣＧＣ−３’（配列番号８）〕を用いて逆転写し、配列番号３で示されるｃＤＮＡを調製した。このｃＤＮＡは、配列番号４で示されるアミノ酸配列のポリペプチドをコードしていた。【００６６】
次いで、配列番号３の配列から、プレクトスピラ・ミリアンドラのゲノムＤＮＡ検索を行い、相当するゲノムＤＮＡ配列を同定した。さらに当該ゲノムＤＮＡ配列からイントロンを除去したポリヌクレオチドを設計し、これをもとにＤＮＡを化学合成した。設計したポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド配列からなり、配列番号２で示されるアミノ酸配列のポリペプチドをコードしていた。配列番号２と配列番号４とでは、全アミノ酸配列３５５残基中、４つのアミノ酸が異なっていた（アミノ酸配列同一性約９８．９％）。【００６７】
上記で調製したｃＤＮＡ（配列番号３）を、酵母発現用ベクターｐＹＥ２２ｍ（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９５，５９：１２２１−１２２８）に組み込み、このベクターをサッカロマイセス・セレビシエＩｎｖＳｃ１株（トリプトファン要求性の油性酵母）にエレクトロポレーション法により導入し、形質転換した。上記で調製した合成ＤＮＡ（配列番号１）についても、同様にベクターを構築し、形質転換株を作製した。各形質転換株をＹＰＤ培地にて２８℃で１日間培養し、組み込んだｃＤＮＡからポリペプチドを発現させた。なお、この培養条件では当該油性酵母本来のω３不飽和化酵素は発現しない。次いで、培地に各種ω６不飽和脂肪酸：リノール酸（ＬＡ、１８：２ｎ−６）、γ−リノレン酸（ＧＬＡ、１８：３ｎ−６）、ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ、２０：３ｎ−６）、またはアラキドン酸（ＡＲＡ、２０：４ｎ−６）を添加して２８℃で２日間培養し、その後ω３不飽和化によって生成する対応するω３不飽和脂肪酸：α−リノレン酸（ＡＬＡ、１８：３ｎ−３）、ステアドリン酸（ＳＤＡ、１８：４ｎ−３）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ、２０：４ｎ−３）、またはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ｎ−３）の量をガス液体クロマトグラフィー（ＧＬＣ）により測定した。【００６８】
その結果、炭素数２０のＤＧＬＡおよびＡＲＡは、いずれも対応するω３不飽和脂肪酸へと変換されたが、炭素数１８のＬＡおよびＧＬＡは対応するω３不飽和脂肪酸へと変換されなかった。このことから、上記合成ＤＮＡ（配列番号１）にコードされるポリペプチド（配列番号２）および上記ｃＤＮＡ（配列番号３）にコードされるポリペプチド（配列番号４）が、いずれも、常温下で炭素数２０の脂肪酸に対して基質特異的に作用するω３不飽和化酵素（すなわち、Δ１７不飽和化酵素）であることが確認された（表１）。【００６９】
【表１】
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【００７０】
実施例２  ω３不飽和化酵素遺伝子導入用ベクターの作製
配列番号１のヌクレオチド配列を、Ｍ．ａｌｐｉｎａにあわせてコドン至適化し、配列番号５で示されるポリヌクレオチドを得た。この配列番号５で示されるポリヌクレオチドのＣＤＳの上流および下流にＳｐｅＩおよびＢａｍＨＩサイトを構築し、ＳｐＭＡ−ＲＱ（ａｍｐＲ）プラスミドにクローニングした。調製したプラスミドを、ＳｐｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で処理し、得られた遺伝子の断片を、恒常的高発現プロモーターであるＳＳＡ２プロモーターを含むプラスミドｐＢＩＧ３５（京都府立大学から提供されたｐＢＩＧ２ＲＨＰＨ２を改変、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００９，７５：５５２９−５５３５に記載）に連結し、発現カセットを構築した。当該発現カセットを、さらに、ウラシル要求性のマーカー遺伝子（ｕｒａ５）とタンデムに連結させ、形質転換用バイナリーベクター、ｐＢＩＧＳＳＡ２ｐＰｍＤ１７ｇｅｎｏｍｅ−ｉｎｔｒｏｎ  ｍｏｄを構築した（図２）。【００７１】
実施例３  ω３不飽和化酵素遺伝子導入株の作製
Ｍ．ａｌｐｉｎａ（ウラシル要求性株）を０．０５ｍｇ／ｍＬウラシル含有Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ寒天培地で培養し、培養物を集菌し、次いでＭｉｒａｃｌｏｔｈ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）でろ過することで、Ｍ．ａｌｐｉｎａの胞子懸濁液を調製した。当該Ｍ．ａｌｐｉｎａ（ウラシル要求性株）に、実施例２で構築したｐＢＩＧＳＳＡ２ｐＰｍＤ１７ｇｅｎｏｍｅ−ｉｎｔｒｏｎ  ｍｏｄベクターを以下に説明するＡＴＭＴ法（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００９，７５：５５２９−５５３５）により導入し、ω３不飽和化酵素導入株を作製した。【００７２】
アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  Ｃ５８Ｃ１、京都府立大学から提供）に、上記バイナリーベクターｐＢＩＧＳＳＡ２ｐＰｍＤ１７ｇｅｎｏｍｅ−ｉｎｔｒｏｎ  ｍｏｄをエレクトロポレーションにて導入し、ＬＢ−Ｍｇ寒天培地にて２８℃で４８時間培養した。ＰＣＲ法で当該ベクターを含むアグロバクテリウムを選別した。当該ベクターを有するアグロバクテリウムを最小培地（ＭＭ）で２日間培養し、５，８００×ｇで遠心分離し、新鮮な誘導培地（ＩＭ）を加えて懸濁液を調製した。当該懸濁液を、８〜１２時間、２８℃でＯＤ660が０．４から３．７になるまでロータリーシェーカーで誘導培養した。培養後の菌懸濁液１００μＬを、等量の上記Ｍ．ａｌｐｉｎａ懸濁液（１０8ｍＬ-1）と混合し、ニトロセルロース膜（直径７０ｍｍ；ｈａｒｄｅｎｅｄ  ｌｏｗ−ａｓｈ  ｇｒａｄｅ  ５０、Ｗｈａｔｍａｎ）を載せた共培養培地（ＩＭと同様の組成、ただし、１０ｍＭグルコースの代わりに５ｍＭグルコースおよび１．５％寒天を含む）上に塗布し、２３℃で２〜５日間培養した。共培養後、当該膜をウラシルフリー、５０ｇ／ｍＬセフォタキシムおよび５０ｇ／ｍＬスペクチノマイシン、０．０３％Ｎｉｌｅ  ｂｌｕｅ  Ａ（Ｓｉｇｍａ）を含むＳＣ培地に移し、２８℃で５日間培養した。可視可能な真菌コロニーからの菌糸を、新鮮なウラシルフリーＳＣ培地に移した。ウラシルフリーＳＣ培地で増殖することができるが、５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）を含むＧＹ培地では増殖できない菌体を、形質を安定して保持するω３不飽和化酵素遺伝子導入株と判断した。形質を安定して保持する形質転換体を選抜するために当該作業を３回行った。【００７３】
実施例４  ω３不飽和化酵素遺伝子導入用ベクターの作製
配列番号３のヌクレオチド配列を、Ｍ．ａｌｐｉｎａにあわせてコドン至適化し、配列番号６で示されるポリヌクレオチドを得た。この配列番号６で示されるポリヌクレオチドを用いた以外は、実施例２と同様にして、形質転換用バイナリーベクターｐＢＩＧＳＳＡ２ｐＰｍＤ１７ｃＤＮＡｍｏｄを構築した（図２）。【００７４】
実施例５  ω３不飽和化酵素遺伝子導入株の作製
遺伝子導入用ベクターとしてｐＢＩＧＳＳＡ２ｐＰｍＤ１７ｃＤＮＡｍｏｄを用いた以外は、実施例３と同様の手順でω３不飽和化酵素導入株を作製した。【００７５】
実施例６  ω３不飽和化酵素遺伝子導入株によるω３不飽和脂肪酸の生産
実施例３および５で得られたω３不飽和化酵素遺伝子導入Ｍ．ａｌｐｉｎａ株を、それぞれ４ｍＬのＧＹ培地にて、２８℃で３、７、および１０日間、１２０ｒｐｍで好気的に培養した。対照として、当該ω３不飽和化酵素遺伝子を導入していないＭ．ａｌｐｉｎａ株を同様に培養した。各培養液から吸引ろ過にて菌体を回収し、１２０℃で３時間乾燥した。乾燥菌体に、０．５ｍｇ／ｍＬの内部標準（Ｍ．ａｌｐｉｎａが生合成できない炭素数２３の飽和脂肪酸）を含むジクロロメタン溶液１ｍＬおよび塩酸メタノール２ｍＬを加え、５５℃、２時間の温浴にて脂肪酸をメチルエステル化した。反応液に蒸留水１ｍＬとヘキサン４ｍＬを加えてヘキサン層を抽出し、減圧遠心して脂肪酸メチルエステルを回収した。
回収したサンプルをクロロホルムに溶解し、ガス液体クロマトグラフィー（ＧＬＣ）にてサンプル中の脂肪酸組成を測定した。ＧＬＣは、島津社製ＧＣ−２０１０を用い、ＧＬサイエンス社製キャピラリーカラムＴＣ７０（０．２５ｍｍ×６０ｍ）を用い、カラム温度１８０℃、気化室温度２５０℃、検出器温度２５０℃、キャリアガスＨｅ、メイクアップガスＮ2、Ｈ2流量４０ｍＬ／ｍｉｎ、Ａｉｒ流量４００ｍＬ／ｍｉｎ、スプリット比５０、分析時間３０ｍｉｎの条件にて行った。抽出された各脂肪酸の量を、ＧＬＣのチャートのピーク面積値から内部標準の脂肪酸量を基準として定量し、培養液１ｍＬ当たりおよび乾燥菌体１ｍｇあたりの各脂肪酸の量を算出した。さらに、総脂肪酸量に対する各脂肪酸の割合を求めた。
その結果、実施例３および実施例５のω３不飽和化酵素遺伝子導入株では、それぞれ、最大４０．８％および３９．６％のＥＰＡの蓄積がみられた（図３）。一方、対照株ではＥＰＡは産生されなかった（蓄積を測定できず）。【００７６】
実施例７  ω３不飽和化酵素活性の比較
本発明のω３不飽和化酵素を保有するプレクトスピラ・ミリアンドラと、Δ１７不飽和化酵素を保有することが報告されているサプロレグニア・ディクリナ（例えば、特許文献４）との間で、炭素数２０の脂肪酸に対するω３不飽和化活性を比較した。さらに、他の８種のサプロレグニア・ディクリナ類縁菌についてもω３不飽和化活性を調べた。
表２に記載のプレクトスピラ・ミリアンドラ（ＮＢＲＣ  Ｎｏ．３２５４８）、サプロレグニア・ディクリナ（ＮＢＲＣ  Ｎｏ．３２７１０）、および他の８種の菌株を、それぞれ５ｍＬのＧＹ培地にて、２８℃で７日間培養し、培養後の培地における、ω３不飽和化酵素の産物であるＥＰＡ（２０：５ｎ−３）と、その基質となるＡＲＡ（２０：４ｎ−６）の量を、ガス液体クロマトグラフィー（ＧＬＣ）により測定した。
その結果、表２に示すとおり、プレクトスピラ・ミリアンドラでは、サプロレグニア・ディクリナおよびその類縁菌と比べて、ＡＲＡに対するＥＰＡの含有比が高かった。これらの結果から、プレクトスピラ・ミリアンドラのω３不飽和化酵素が、ＡＲＡからＥＰＡへの変換効率が高く、効率よくＥＰＡを産生することができる酵素であることが示唆された。【００７７】
【表２】
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【要約】
常温下においても高い酵素活性を有するω３不飽和化酵素の提供。配列番号２に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ炭素数２０の脂肪酸に対するω３不飽和化活性を有するポリペプチド、およびその遺伝子。【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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