(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
金被覆銀ナノプレートの懸濁液であって、
０μＭより多く５０μＭ以下の水溶性高分子を含み、
ｐＨが１０以下であることを特徴とする、懸濁液。
【請求項２】
前記金被覆銀ナノプレート上の金の厚みの平均が、１．０ｎｍ以下である、請求項１に記載の懸濁液。
【請求項３】
前記金被覆銀ナノプレート上の金の厚みの平均が、０．１〜０．７ｎｍである、請求項１又は２に記載の懸濁液。
【請求項４】
前記水溶性高分子の濃度が、０より多く２５μＭ以下である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の懸濁液。
【請求項５】
ｐＨが４〜１０である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の懸濁液。
【請求項６】
ｐＨが５〜９である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の懸濁液。
【請求項７】
前記金被覆銀ナノプレートが、被験物質に対する特異的結合物質を担持していることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の懸濁液。
【請求項８】
前記被験物質と前記特異的結合物質の組み合わせが、抗原とそれに結合する抗体、抗体とそれに結合する抗原、糖鎖又は複合糖質とそれに結合するレクチン、レクチンとそれに結合する糖鎖又は複合糖質、ホルモン又はサイトカインとそれに結合する受容体、受容体とそれに結合するホルモン又はサイトカイン、タンパク質とそれに結合する核酸アプタマー若しくはペプチドアプタマー、酵素とそれに結合する基質、基質とそれに結合する酵素、ビオチンとアビジン又はストレプトアビジン、アビジン又はストレプトアビジンとビオチン、ＩｇＧとプロテインＡ又はプロテインＧ、プロテインＡ又はプロテインＧとＩｇＧ、及び、第１の核酸とそれに結合する第２の核酸から成る群から選択される、請求項７に記載の懸濁液。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の懸濁液を使用して、前記被験物質を検出する方法であって、
該被験物質と前記特異的結合物質を担持した金被覆銀ナノプレートとの複合体を形成する工程、及び、
該複合体を検出する工程を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１０】
前記複合体の形成を、消光度測定、吸光度測定、濁度測定、粒度分布測定、粒子径測定、ラマン散乱光測定、色調変化の観察、凝集又は沈殿形成の観察、イムノクロマトグラフィー、電気泳動、及び、フローサイトメトリーから成る群から選択される手段によって検出する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記複合体の形成を、２００〜２５００ｎｍの範囲の前記金被覆銀ナノプレートの吸収波長における消光度測定又は吸光度測定によって検出する、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記複合体の形成を、４３０〜２０００ｎｍの範囲の前記金被覆銀ナノプレートの最大吸収波長における消光度測定又は吸光度測定によって検出する、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記複合体の形成を、前記金被覆銀ナノプレートの最大吸収波長よりも長波長側の前記複合体の形成に依存して消光度又は吸光度が上昇する波長領域における濁度測定によって検出する、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１４】
請求項７又は８に記載の懸濁液を含む、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法に使用するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金で被覆された銀ナノプレート（以下、金被覆銀ナノプレートともいう）の懸濁液に関する。
【背景技術】
【０００２】
銀ナノプレートは、光との相互作用（局在表面プラズモン共鳴：ＬＳＰＲ）により光を吸収するため、その懸濁液はナノプレートの形状に応じて色を示すことが知られている。更に、銀ナノプレートの大きさや形状を制御することにより、吸収する光を変化させること、すなわち色を変化させることができることも知られている。
この性質を利用して、銀ナノプレートは、被験物質の検出試薬の標識（例えば、目的タンパク質の検出に用いられる抗体の標識）として用いられている。
一方、銀ナノプレートは酸化により溶解してその形状が変化する。この酸化による銀ナノプレートの形状変化は、意図していた色の変化を引き起こし得る。
そこで、銀ナノプレートを酸化に対して安定化するため、銀ナノプレートの表面を金で被覆することが行われている（特許文献１及び非特許文献１〜２）。
また、被験物質に対する特異的結合物質を担持した着色ラテックス粒子の懸濁液を用いた診断薬が知られている。ラテックス粒子径０．０２〜２μｍのポリスチレン粒子などが知られており、有機色素によって赤色や青色に着色されている（特許文献２及び特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第３８８５０５４号
【特許文献２】特許第２６７７７５３号
【特許文献３】特開２００６−２６６９７０号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Materials Chemistry and Physics, 90 (2005), p.361-366
【非特許文献２】Angew. Chem. Int. Ed., 2012, 51, p.5629-5633
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
金被覆銀ナノプレートを標識として用いる検出技術の分野では、被験物質の検出感度を高めることが望まれている。一方、銀ナノプレートの懸濁液は酸化に弱いため、被験物質の検出のために応用できる用途が限られていた。そして、被験物質に対する特異的結合物質を担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液を安定化するために水溶性高分子を添加することがあるが、これを多量に添加すると、該金被覆銀ナノプレートによる被験物質の検出感度が低下する。したがって、本発明は、金被覆銀ナノプレートの安定な懸濁液であって、種々の被験物質の検出のために応用することができ、種々の検出手段に適合させることができ、かつ被験物質の検出感度の高い懸濁液を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、金被覆銀ナノプレートと検出試薬との複合体の形成条件と得られた複合体を用いて行った被験物質検出の結果について鋭意検討したところ、金被覆銀ナノプレートの懸濁液の物性及び組成を特定のものとすることで、該懸濁液の安定性を保持しつつ、被験物質の検出感度も高めることができることを見出した。また、本発明者等は、金被覆銀ナノプレートが、種々の被験物質に対する特異的結合物質を担持することができること、及び、種々の検出手段に適合し得ることも見出し、本発明を完成した。【０００７】
すなわち、本発明は、以下に示す懸濁液、該懸濁液を使用して被験物質を検出する方法、及び、該懸濁液を含み該方法に使用するためのキットを提供するものである。
〔１〕金被覆銀ナノプレートの懸濁液であって、
０〜５０μＭの水溶性高分子を含み、
ｐＨが１０以下であることを特徴とする、懸濁液。
〔２〕前記金被覆銀ナノプレート上の金の厚みの平均が、１．０ｎｍ以下である、前記〔１〕に記載の懸濁液。
〔３〕前記金被覆銀ナノプレート上の金の厚みの平均が、０．１〜０．７ｎｍである、前記〔１〕又は〔２〕に記載の懸濁液。
〔４〕前記水溶性高分子の濃度が、０〜２５μＭである、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載の懸濁液。
〔５〕ｐＨが４〜１０である、前記〔１〕〜〔４〕のいずれか一項に記載の懸濁液。
〔６〕ｐＨが５〜９である、前記〔１〕〜〔５〕のいずれか一項に記載の懸濁液。
〔７〕前記金被覆銀ナノプレートが、被験物質に対する特異的結合物質を担持していることを特徴とする、前記〔１〕〜〔６〕のいずれか一項に記載の懸濁液。
〔８〕前記被験物質と前記特異的結合物質の組み合わせが、抗原とそれに結合する抗体、抗体とそれに結合する抗原、糖鎖又は複合糖質とそれに結合するレクチン、レクチンとそれに結合する糖鎖又は複合糖質、ホルモン又はサイトカインとそれに結合する受容体、受容体とそれに結合するホルモン又はサイトカイン、タンパク質とそれに結合する核酸アプタマー若しくはペプチドアプタマー、酵素とそれに結合する基質、基質とそれに結合する酵素、ビオチンとアビジン又はストレプトアビジン、アビジン又はストレプトアビジンとビオチン、ＩｇＧとプロテインＡ又はプロテインＧ、プロテインＡ又はプロテインＧとＩｇＧ、及び、第１の核酸とそれに結合する第２の核酸から成る群から選択される、前記〔７〕に記載の懸濁液。
〔９〕前記〔７〕又は〔８〕に記載の懸濁液を使用して、前記被験物質を検出する方法であって、
該懸濁液を該被験物質と混合して、該被験物質と前記特異的結合物質を担持した金被覆銀ナノプレートとの複合体を形成する工程、及び、
該複合体を検出する工程を含むことを特徴とする、方法。
〔１０〕前記複合体の形成を、消光度測定、吸光度測定、濁度測定、粒度分布測定、粒子径測定、ラマン散乱光測定、色調変化の観察、凝集又は沈殿形成の観察、イムノクロマトグラフィー、電気泳動、及び、フローサイトメトリーから成る群から選択される手段によって検出する、前記〔９〕に記載の方法。
〔１１〕前記複合体の形成を、２００〜２５００ｎｍの範囲の前記金被覆銀ナノプレートの吸収波長における消光度測定又は吸光度測定によって検出する、前記〔９〕又は〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕前記複合体の形成を、４３０〜２０００ｎｍの範囲の前記金被覆銀ナノプレートの最大吸収波長における消光度測定又は吸光度測定によって検出する、前記〔９〕〜〔１１〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１３〕前記複合体の形成を、前記金被覆銀ナノプレートの最大吸収波長よりも長波長側の前記複合体の形成に依存して消光度又は吸光度が上昇する波長領域における濁度測定によって検出する、前記〔９〕又は〔１０〕に記載の方法。
〔１４〕前記〔７〕又は〔８〕に記載の懸濁液を含む、前記〔９〕〜〔１３〕のいずれか一項に記載の方法に使用するためのキット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の金被覆銀ナノプレートの懸濁液は、安定な懸濁液として調製され、種々の被験物質を高い感度で検出するために応用することができ、また、種々の検出手段に応用することができる。したがって、本発明の懸濁液を用いることにより、多様な被験物質の検出において正確な判定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＣＩＥ１９３１ｘｙ色度図における、イエロー、マゼンタ及びシアンの色度座標、並びに懸濁液Ｎ１、Ｂ１及びＰ１の色度座標を示す図である。
【図２】ＣＩＥ１９３１ｘｙ色度図における、赤色、青色及び緑色の色度座標、並びに混合液（Ｂ１＋Ｎ１）、混合液（Ｂ１＋Ｐ１）及び混合液（Ｎ１＋Ｐ１）の色度座標を示す図である。
【図３】銀ナノプレートの種粒子の光学特性を示す図である。
【図４】銀ナノプレートの種粒子のＳＥＭ観察写真を示す図である。
【図５】銀ナノプレート水懸濁液ａ、ｂ、ｃ、及びｄの光学特性を示す図である。
【図６】ｐＨ調整された金被覆銀ナノプレート懸濁液Ｂ１中の金被覆銀ナノプレートのＳＥＭ観察写真を示す図である。
【図７】ｐＨ調整された金被覆銀ナノプレート懸濁液Ｎ１中の金被覆銀ナノプレートのＳＥＭ観察写真を示す図である。
【図８】ｐＨ調整された金被覆銀ナノプレート懸濁液Ｐ１中の金被覆銀ナノプレートのＳＥＭ観察写真を示す図である。
【図９】ｐＨ調整された金被覆銀ナノプレート懸濁液Ｒ１中の金被覆銀ナノプレートのＳＥＭ観察写真を示す図である。
【図１０】イムノクロマト試験の手順を示す図である。
【図１１】イムノクロマト試験の輝度解析の結果を示す図である。
【図１２】イムノクロマト試験の輝度解析の結果を示す図である。
【図１３】イムノクロマト試験の輝度解析の結果を示す図である。
【図１４】イムノクロマト試験の輝度解析の結果を示す図である。
【図１５】イムノクロマト試験の輝度解析の結果を示す図である。
【図１６】イムノクロマト試験の輝度解析の結果を示す図である。
【図１７】イムノクロマト試験の輝度解析の結果を示す図である。
【図１８】イムノクロマト試験の輝度解析の結果を示す図である。
【図１９】イムノクロマト試験の輝度解析の結果を示す図である。
【図２０】イムノクロマト試験の輝度解析の結果を示す図である。
【図２１】イムノクロマト試験の輝度解析の結果を示す図である。
【図２２】イムノクロマト試験の輝度解析の結果を示す図である。
【図２３】イムノクロマト試験の輝度解析の結果を示す図である。
【図２４】マンノースを担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液にＣｏｎＡを添加した場合の消光度の変化を示す図である。
【図２５】抗ＨＢｓ抗原抗体を担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液Ｈ２（Ａ）、懸濁液Ｉ２（Ｂ）又は懸濁液Ｊ２（Ｃ）にＨＢｓ抗原を添加した場合の消光度の変化を示す図である。
【図２６】濁度に依存した消光度の上昇を示す図である。
【図２７】イムノクロマトグラフィーの輝度解析の結果を示す図である。
【図２８】イムノクロマトグラフィーの輝度解析の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明の金被覆銀ナノプレート懸濁液は、０〜５０μＭの水溶性高分子を含み、ｐＨが１０以下であることを特徴とする。
【００１１】
本発明の金被覆銀ナノプレートとは、銀ナノプレート（コア）の表面に金の被覆（シェル）を有するものをいう。
本発明では、被験物質の検出技術分野で着色標識として用いられている銀ナノプレートを特に制限なく用いることができるが、以下に好ましい態様を詳述する。
銀ナノプレートとは、銀から製造されたナノプレート（板）をいう。
銀ナノプレートの主面の最大長さとなる粒子径（円形の場合は直径に相当し、三角形の場合は最大辺の長さに相当する）は、通常１０〜１０００ｎｍであり、１０〜１５０ｎｍが好ましい。更に、銀ナノプレートのアスペクト比（粒子径／厚み）は、通常１．５以上であり、可視光領域にＬＳＰＲの吸収波長が発現して多色設計が可能な１．５〜１０が好ましい。近赤外光での検出に用いる場合には、ＬＳＰＲが８００〜２０００ｎｍで発現するようなアスペクト比（例えば、アスペクト比１１で９００ｎｍ付近にＬＳＰＲが発現）のプレート状銀ナノ粒子を用いればよい。
色を定量的に表す体系である表色系の一つであるマンセル・カラー・システムのマンセル値（以下、単にマンセル値ともいう）が５Ｙ  ８．５／１４で、ＣＩＥ１９３１ｘｙ色度図の座標（以下、単に色度座標ともいう）がｘ：０．４４９８、ｙ：０．４８１１であるイエロー（イエロー系色、４００〜５００ｎｍ付近にＬＳＰＲを発現するプレート状銀ナノ粒子）、マンセル値が５ＲＰ  ５／１４で、色度座標がｘ：０．４１４２、ｙ：０．２４２８であるマゼンタ（マゼンタ系色、５００〜６００ｎｍ付近にＬＳＰＲを発現するプレート状銀ナノ粒子）、マンセル値が７．５Ｂ  ６／１０で、色度座標がｘ：０．１９３４、ｙ：０．２３７４であるシアン（シアン系色、６００〜７５０ｎｍ付近にＬＳＰＲを発現するプレート状銀ナノ粒子）など、プレート状銀ナノ粒子のアスペクト比を調整することで任意のＬＳＰＲの吸収波長を選択できる。なお、図１は、ＣＩＥ１９３１ｘｙ色度図におけるイエロー、マゼンタ及びシアンの色度座標を示す。アスペクト比の異なる２種以上のプレート状銀ナノ粒子を混合して色を設計してもよい。例えば、イエローとマゼンタを混合し赤色（マンセル値：５Ｒ  ４／１４、色度座標  ｘ：０．５７３４、ｙ：０．３０５７）、マゼンタとシアンを混合し青色（マンセル値：１０Ｂ  ４／１４、色度座標  ｘ：０．１３１０、ｙ：０．１５８０）、イエローとシアンを混合し緑色（マンセル値：２．５Ｇ  ６．５／１０、色度座標  ｘ：０．３０００、ｙ：０．６０００）などが設計できる。なお、図２は、ＣＩＥ１９３１ｘｙ色度図における赤色、青色及び緑色の色度座標を示す。さらに、イエロー系色、マゼンタ系色、シアン系色が発現するアスペクト比の異なる３種以上のプレート状銀ナノ粒子を三原色とした減法混合を適用した多色設計を用いることができる。例えば、イエロー系色、マゼンタ系色、シアン系色のプレート状銀ナノ粒子を任意の割合で混合して黒色を設計した場合、イムノクロマト試験時の被験物質検出ラインは背景（白色）とのコントラスト差が大きくなるため視認性（検出感度）が高くなる。
【００１２】
銀ナノプレートの厚さは、プラズモン吸収することができるものであれば特に制限されず、一般的には４０ｎｍ以下であり、好ましくは５〜２０ｎｍである。
銀ナノプレートの形状は、プラズモン吸収することができるものであれば特に制限されず、意図する色に応じた形状を採用することができる。具体例としては三角形状、五角形状、六角形状等の多角形状や、角がカーブ状となった円形状等の形状があげられる。
本発明では、単一種類（単一形状）の銀ナノプレートを用いてもよく、形状の異なる複数種類の銀ナノプレートの混合物を用いてもよい。
銀ナノプレートの大きさ（主面の最大長さ）並びに形状は、意図する色又は最大吸収波長に応じて適宜設定することができる。銀ナノプレートの最大吸収波長は、４３０〜２０００ｎｍの範囲で調整してもよく、好ましくは４３０〜１５００ｎｍ、特に好ましくは４３０〜１０００ｎｍの範囲で調整してもよい。銀ナノプレートの大きさ及び形状と色との関係は、例えば特表２０１１−５０８０７２号公報に記載されている。例えば、銀ナノプレートを三形状および六角形状（主面の最大長さ：２０ｎｍ、厚さ：５．１ｎｍ）とすると、マゼンタ（極大吸収波長：５３８ｎｍ）を呈することができる。銀ナノプレートの最大吸収波長は、銀ナノプレート形成後の金による被覆、懸濁液のｐＨの調整、及び／又は、被験物質に対する特異的結合物質の担持後に安定する。
銀ナノプレートは市販品を用いてもよく、公知の製造方法や後述の実施例に記載の方法に従って製造したものを用いてもよい。
【００１３】
銀ナノプレートの表面を被覆する金の厚さは、銀ナノプレートの発色性能に影響を与えない限り特に制限されないが、厚みの平均が、好ましくは１．０ｎｍ以下、より好ましくは０．７ｎｍ以下である。金の被覆の厚さが１．０ｎｍ以下であると、銀ナノプレートのプラズモン吸収を維持しつつ、銀ナノプレートの酸化を抑制することができる。
金の厚さの下限は、銀ナノプレート表面の金による被覆という目的を達成できるものであれば特に制限されないが、厚みの平均が、好ましくは０．１ｎｍ以上又は０．３ｎｍである。なお、本発明における金の厚みの平均とは、高角散乱環状暗視野走査透過顕微鏡法（ＨＡＡＤＦ−ＳＴＥＭ）を用いて測定された、銀ナノプレート表面の金の厚みより算出すれば良い。具体的には、ＨＡＡＤＦ−ＳＴＥＭ像から任意の粒子１０個について各粒子の任意の部位１０点について、金の厚みを測定した計１００点のデータの内、上下１０％を除いた８０点の平均値を金の厚みの平均とすれば良い。
被覆方法は、銀ナノプレート表面の金による被覆という目的を達成できるものであれば特に制限されない。したがって、公知の被覆方法や後述の実施例に記載の被覆方法を用いることができる。
本発明の金被覆銀ナノプレートは、銀ナノプレートの全ての表面が金で被覆されているものであってもよく、銀ナノプレートの表面の一部が金で被覆されているものであってもよい。銀ナノプレートの表面の全て又は一部が金で被覆されたことは、電子顕微鏡による観察及び物理化学的性質の測定など、通常用いられる種々の方法によって確認することができる。例えば、銀ナノプレートの表面の全て又は一部が金で被覆されると、酸又はナトリウム若しくは塩化物イオンに対する安定性が上昇し、酸化に対して安定なものとなる。そうすると、金被覆処理後に、酸性溶液（例えば、２％過酸化水素水）又は緩衝液（例えば、１０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（二価イオンあり又はなし））中という銀ナノプレートにとって過酷な条件下で銀ナノプレートの懸濁液の分光特性（最大吸収波長）を測定しても、その分光特性が水中で測定したときと比較して僅かしか変化しない場合には、その銀ナノプレートは金で被覆されていると判断できる。
【００１４】
また、銀ナノプレートが金で被覆されていることは、金被覆銀ナノプレート懸濁液中の金及び銀濃度を測定することによっても確認できる。具体的には、以下の手順に示すように、懸濁液を遠心分離後、上澄み液を除去し、得られた沈殿物を、除去した上澄み液と同量の超純水で再度懸濁する。そして、その懸濁液に王水を添加後、煮沸して、得られた溶液を、ＩＣＰ発光分析装置を用いて分析する。
１．金被覆銀ナノプレート懸濁液を遠心分離（２５，０００ｒｐｍ、２
６，０００ｇ）後、上澄み液を除去し、得られた沈殿物を、除去し
た上澄み液と同量の超純水で再度懸濁する。
２．上記工程１で得られた懸濁液に王水を添加後、５分間煮沸して、金
及び銀を王水中へ溶解させる。
３．上記工程２で得られた溶液を、ＩＣＰ発光分析装置を用いて測定す
る。
なお、各金属の濃度は、任意濃度の標準サンプルを上述と同様に測定することで作成した検量線より算出する。
得られた各金属の濃度から、金と銀の比率が明らかとなり、銀ナノプレート表面が金で被覆されていること、そして、その金の厚さを確認することができる。例えば、三角形の銀ナノプレート上の金の厚さは、以下のようにして算出することができる。
１．ＩＣＰ発光分析結果（例）
金濃度：銀濃度＝１：４
２．銀ナノプレートの体積（形状：正三角形、高さ：３０ｎｍ、厚さ８ｎ
ｍの場合）
式：（三角形の面積）×（厚さ）
＝（３０ｎｍ×（３０×２÷√３）ｎｍ÷２）×８ｎｍ
＝４１５７ｎｍ3（＝４１５７×１０-21ｃｍ3）
３．銀の比重
１０．５１ｇ／ｃｍ3
４．三角形の銀ナノプレートの質量
式：（三角形の銀ナノプレートの体積）×（銀の比重）
＝（４１５７×１０-21ｃｍ3）×１０．５１ｇ／ｃｍ3
＝４．３７×１０-17ｇ
５．三角形の銀ナノプレートに被覆している金の質量（Ｘ）
１：４＝Ｘ：４．３７×１０-17ｇ
Ｘ＝１．０９×１０-17ｇ
６．金の比重
１９．３２ｇ／ｃｍ3
７．三角形の銀ナノプレートに被覆している金の体積
式：（金の質量）÷（金の比重）
＝１．０９×１０-17ｇ ÷ １９．３２ｇ／ｃｍ3
＝５．６４×１０-19ｃｍ3（＝５６４ｎｍ3）
８．三角形の銀ナノプレートの表面積
式：（三角形の面積）＋（粒子側面の面積）
＝（３０×（６０÷√３）÷２）×２＋（８×（６０÷√３））×３
＝１８７１ｎｍ2
９．三角形の銀ナノプレートに被覆している金の厚さ
式：（三角形の銀ナノプレートに被覆している金の体積）
÷（三角形の銀ナノプレートの表面積）
＝５６４ｎｍ3÷１８７１ｎｍ2
＝０．３０ｎｍ（＝３．０Å）
このように、ＩＣＰ発光分析装置を用いた分析の結果、金濃度と銀濃度の比率が１：４であることがわかった場合には、金被覆処理を施した銀ナノプレート（形状：正三角形、高さ：３０ｎｍ、厚さ８ｎｍの粒子の場合）の表面の金の厚さは、０．３０ｎｍであると計算できる。これは、金原子が一層から二層被覆していることを意味している。
【００１５】
なお、本発明において、「銀ナノプレートの表面を被覆する金」とは、銀ナノプレートの表面に存在している金を指すが、金単体で存在しているものに加えて、銀との合金の状態で存在しているものも含まれる。
金被覆銀ナノプレートは市販品を用いてもよく、公知の製造方法や後述の実施例に記載の方法に従って製造したものを用いてもよい。
本発明では、単一種類の金被覆銀ナノプレートを用いてもよく、形状や大きさの異なる複数種類の金被覆銀ナノプレートの混合物を用いてもよい。
【００１６】
本発明の金被覆銀ナノプレートの懸濁液（以下、本発明の懸濁液ともいう）では、固体の金被覆銀ナノプレートが液体の分散媒中に懸濁している。
分散媒としては、金被覆銀ナノプレートを分散できるものであれば特に制限なく用いることができる。具体例としては、水、水性緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水、トリス塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液など）、エタノールやメタノール等のアルコール類、アセトンやメチルエチルケトン等のケトン類、テトラヒドロフラン等が挙げられる。分散媒は、生化学実験において好適であるため、好ましくは水である。
分散媒は一種類であってもよく、複数種類の混合物であってもよい。
金被覆銀ナノプレートの懸濁液は、静置状態で金被覆銀ナノプレートが分散媒中に分散しているものであってもよく、静置状態では金被覆銀ナノプレートは沈降しているが振盪や超音波分散することにより分散媒中に分散するものであってもよい。
金被覆銀ナノプレートの懸濁液は、金被覆銀ナノプレートの製造方法を実施した結果生じた懸濁液をそのまま用いたものであってもよく（但し、後述の水溶性高分子濃度及びｐＨの要件を満たしていることを条件とする）、前記の懸濁液から金被覆銀ナノプレートを分離し、次いで分散媒中に分散させたものであってもよい。
懸濁液の製造方法に特に制限はなく、公知の製造方法や後述の実施例に記載の製造方法を用いることができる。
【００１７】
本発明の懸濁液の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して、好ましくは５０質量％以下、より好ましくは１〜０．００００１５質量％、特に好ましくは０．１〜０．００００１５質量％である。懸濁液の銀含有率が５０質量％以下であると、分散安定性の向上及び分光特性を利用した生化学試験（例えば、イムノクロマト試験）に用いた時に発色の確認（例えば、イムノクロマト試験の場合、検出ラインの目視確認）が容易なるといった効果が得られる。
【００１８】
本発明の懸濁液には、水溶性高分子が任意に含まれても含まれなくてもよく、その濃度の範囲は０〜５０μＭである。
本発明における水溶性高分子とは、分子量が５００〜１，０００，０００、好ましくは５００〜１００，０００の水溶性物質をいう。本発明における水溶性とは、常温常圧下で高分子が水に０．００１質量％以上溶解することをいう。
具体例としては、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアリルアミン、デキストラン、ポリメタクリルアミド、ポリビニルフェノール、ポリ安息香酸ビニル、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ビス（ｐ−スルホナトフェニル）フェニルホスフィンやポリスチレンスルホン酸等があげられる。これらの水溶性高分子を含有している、塗料やインクなどに用いられる市販の分散剤を、本発明の水溶性高分子として使用してもよい。また、本発明の懸濁液中の金属微粒子と化学結合する官能基である水酸基、メルカプト基、ジスルフィド基、アミノ基、カルボキシル基などで上記具体例の水溶性高分子が修飾されていてもよい。
本発明の懸濁液に含まれる水溶性高分子の種類は、該懸濁液の用途に応じて選択することができる。例えば、生体実験や細胞実験に使用する場合、生体適合性が良好なポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールやポリビニルアルコールなどを用いてもよい。
本発明の懸濁液が水溶性高分子を含む場合には、その懸濁液中に溶解又は分散している水溶性高分子の濃度（懸濁液１リットルあたりの水溶性高分子のモル数）は、５０μＭ以下、好ましくは２５μＭ以下、特に好ましくは１０μＭ以下である。水溶性高分子の濃度が５０μＭ以下であると、該濃度が５０μＭを超える場合と比較して、本発明の被験物質に対する特異的結合物質を担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液による該被験物質の検出感度を高めることができる。
また、別の好ましい態様では、本発明の懸濁液は水溶性高分子を含まない（すなわち０μＭ）。本発明の金被覆銀ナノプレートは、水溶性高分子がなくても、被験物質に対する特異的結合物質を担持することで安定な懸濁液を形成することができるので、特に被験物質の検出感度を高めるためには、水溶性高分子を含まなくてもよい。
本発明は特定の理論に拘束されるものではないが、水溶性高分子の濃度が５０μＭ以下であると、例えば、後述する被験物質に対する特異的結合物質が金被覆銀ナノプレートに良好に担持されるか、又は、被験物質に対する特異的結合物質を担持した金被覆銀ナノプレートが該被験物質と安定した複合体を形成するため、結果として該被験物質の検出感度が高まると考えられる。
【００１９】
水溶性高分子の濃度の測定方法として、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、ゲルろ過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）、示唆熱・熱重量測定（ＴＧ−ＤＴＡ）などが挙げられる。
ＮＭＲの場合、金被覆銀ナノプレートの懸濁液を乾燥させ、得られた固形分を重溶媒で溶解（分散）させて測定する。重溶媒には既知濃度の内部標準物質（例えば、マレイン酸）を予め添加し、得られたスペクトル中の水溶性高分子由来のシグナルの積分値と内部標準物質由来のシグナルの積分値を比較することで水溶性高分子の濃度を算出することができる。
また、ＧＰＣの場合、初めに複数の既知濃度の水溶性高分子水溶液を分析し、得られたチャート中の水溶性高分子由来のピーク面積より検量線を作成する。次に、金被覆銀ナノプレートの懸濁液を測定し、得られたチャート中の水溶性高分子由来のピーク面積より水溶性高分子の濃度を算出することができる。
さらに、ＴＧ−ＤＴＡの場合、金被覆銀ナノプレート懸濁液の乾燥固形分を測定した際の、重量変化から水溶性高分子量を算出することができる。
【００２０】
本発明の懸濁液のｐＨは１０以下であり、好ましくは４〜１０又は５〜１０、特に好ましくは５〜９又は６〜９である。ｐＨが１０以下であると、後述する被験物質に対する特異的結合物質を担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液による被験物質の検出感度が高くなる。
本発明は特定の理論に拘束されるものではないが、懸濁液のｐＨが１０以下であると、例えば、後述する被験物質に対する特異的結合物質が金被覆銀ナノプレートに良好に担持されるか、又は、被験物質に対する特異的結合物質を担持した金被覆銀ナノプレートが該被験物質と安定した複合体を形成するため、結果として該被験物質の検出感度が高まると考えられる。
本発明における懸濁液のｐＨは、本技術分野で用いられている一般的なｐＨ測定法、例えばガラス電極法において測定された室温下（２０〜３０℃）におけるｐＨをいう。
懸濁液のｐＨを調整するために、懸濁液へｐＨ調整剤を添加してもよい。ｐＨ調整剤としては公知の物質を使用することができる。具体例としては、ＰＢＳ緩衝液、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウムやクエン酸等をあげることができる。
【００２１】
本発明の懸濁液は、被験物質に対する特異的結合物質、すなわち検出試薬を標識するために用いることができる。換言すると、本発明の金被覆銀ナノプレートは、被験物質に対する特異的結合物質を担持することができる。用語「担持」は、共有結合若しくは非共有結合又は直接的若しくは間接的な結合などの様式にかかわらず、金被覆銀ナノプレートと被験物質に対する特異的結合物質とが結合して複合体を形成していることを意味している。担持の方法としては、通常の担持方法を特に制限なく用いることができ、物理吸着、化学吸着（表面への共有結合）、化学結合（共有結合、配位結合、イオン結合又は金属結合）等を利用して、金被覆銀ナノプレートと被験物質に対する特異的結合物質とを直接的に結合させる方法や、金被覆銀ナノプレートの表面に前述の水溶性高分子の一部を結合させて、該水溶性高分子の末端又は主鎖若しくは側鎖に、直接的又は間接的に被験物質に対する特異的結合物質を結合させる方法を採用することができる。例えば、被験物質に対する特異的結合物質が抗体である場合には、本発明の懸濁液と抗体の溶液とを混合し、振盪し、遠心分離することで、抗体を担持した金被覆銀ナノプレート（標識された検出試薬）を沈殿物として得ることができる。
【００２２】
本発明の被験物質に対する特異的結合物質としては、検出の対象である被験物質を、該被験物質との複合体形成により検出できるものであって、金被覆銀ナノプレートを標識として利用することができるものであれば、特に制限なく用いることができる。被験物質と被験物質に対する特異的結合物質との組み合わせの具体例としては、抗原とそれに結合する抗体、糖鎖又は複合糖質とそれに結合するレクチン、レクチンとそれに結合する糖鎖又は複合糖質、ホルモン又はサイトカインとそれに結合する受容体、受容体とそれに結合するホルモン又はサイトカイン、タンパク質とそれに結合する核酸アプタマー若しくはペプチドアプタマー、酵素とそれに結合する基質、基質とそれに結合する酵素、ビオチンとアビジン又はストレプトアビジン、アビジン又はストレプトアビジンとビオチン、ＩｇＧとプロテインＡ又はプロテインＧ、プロテインＡ又はプロテインＧとＩｇＧ、あるいは、第１の核酸とそれに結合する（ハイブリダイズする）第２の核酸等があげられる。前記第２の核酸は、前記第１の核酸と相補的な配列を含む核酸であってもよい。
【００２３】
被験物質が抗原である場合には、該抗原に対する特異的結合物質は抗体であってもよい。前記抗体は、前記抗原に対して特異的に結合するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体又はそれらの断片であってもよく、該断片は、Ｆ（ａｂ）フラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント又はＦ（ｖ）フラグメントであってもよい。被験物質としての抗原は、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、麦芽アグルチニン及びリシンなどのレクチンであってもよく、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ＲＳウイルス、ロタウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒト免疫不全ウイルス及びＢ型肝炎ウイルスなどのウイルス又はそれらが有する物質（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス抗原（ＨＢｓ抗原）又はインフルエンザウイルスのヘマグルチニン）であってもよく、アスペルギルス・フラバス、クラミジア、梅毒トレポネーマ、溶連菌、炭疽菌、黄色ブドウ球菌、赤痢菌、大腸菌、サルモネラ菌、ネズミチフス菌、パラチフス菌、緑膿菌及び腸炎ビブリオ菌などの病原性微生物又はそれらが有する物質（例えば、アスペルギルス・フラバスのアフラトキシン（Ｂ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２又はＭ１など）、腸管出血性大腸菌のベロ毒素又は溶連菌のストレプトリジンＯ）であってもよく、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、リウマチ因子及びＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）などの血中タンパク質であってもよく、ムチンなどの糖タンパク質であってもよく、インスリン、下垂体ホルモン（例えば、成長ホルモン（ＧＨ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、プロラクチン、又はメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ））、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、甲状腺ホルモン（例えば、ジヨードサイロニン又はトリヨードサイロニン）、絨毛性ゴナドトロピン、カルシウム代謝調節ホルモン（例えば、カルシトニン又はパラトルモン）、膵ホルモン、消化管ホルモン、血管作動性腸管ペプチド、卵胞ホルモン（例えば、エストロン）、天然又は合成黄体ホルモン（例えば、プロゲステロン）、男性ホルモン（例えば、テストステロン）、及び副腎皮質ホルモン（例えば、コルチゾール）などのホルモンであってもよく、セロトニン、ウロキナーゼ、フェリチン、サブスタンＰ、プロスタグランジン及びコレステロールなどのその他生体内物質であってもよく、前立腺性酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、アルカリ性フォスファターゼ、トランスアミナーゼ、トリプシン、ペプシノーゲン、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及び癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などの腫瘍マーカーであってもよく、血液型抗原などの糖鎖抗原であってもよく、ヘモグロビン及びトランスフェリンなどの便潜血の検出に用いられるマーカーであってもよい。そして、被験物質である抗原がホルモン又はサイトカインなどの生体内物質である場合には、該生体内物質に対する特異的結合物質は、抗体だけでなく受容体であってもよく、被験物質である抗原が糖鎖又は糖鎖を有する複合糖質である場合には、該糖鎖又は糖鎖を有する複合糖質に対する特異的結合物質は、抗体だけでなくレクチンであってもよい。また、被験物質としての抗原は、ペニシリン及びカドミウムなどのハプテンであってもよい。
【００２４】
被験物質が抗体である場合には、該抗体に対する特異的結合物質は抗原であってもよい。前記抗原は、前記抗体に対して特異的に結合する抗原全体又はその断片であってもよく、それらを他の担体と結合した融合物質であってもよい。被験物質としての抗体は、抗環状シトルリン化ペプチド（ＣＣＰ）抗体又は抗リン脂質抗体などの自己抗体であってもよく、抗クラミジア抗体、抗ＨＩＶ抗体又は抗ＨＣＶ抗体などの外来抗原に対する抗体であってもよい。
【００２５】
被験物質が糖鎖である場合には、該糖鎖に対する特異的結合物質はレクチンであってもよい。前記レクチンは、前記糖鎖に特異的に結合するガレクチン、Ｃ型レクチン、マメ科レクチン又はそれらの断片であってもよい。被験物質としての糖鎖は、単糖又は多糖であってもよく、それらがタンパク質又は脂質に結合した複合糖質であってもよい。例えば、被験物質がマンノースを含む糖鎖である場合には、該糖鎖に対する特異的結合物質としてマメ科レクチンのコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を使用することができる。
【００２６】
被験物質がレクチンである場合には、該レクチンに対する特異的結合物質は糖鎖であってもよい。前記糖鎖は、前記レクチンに特異的に結合する単糖、多糖、複合糖質又はそれらが他の担体と結合した融合物質であってもよい。被験物質としてのレクチンは、ガレクチン、Ｃ型レクチン又はマメ科レクチンであってもよい。例えば、被験物質がマメ科レクチンのコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）である場合には、該レクチンに対する特異的結合物質としてマンノースを含む糖鎖を使用することができる。
【００２７】
被験物質と被験物質に対する特異的結合物質との組み合わせが、タンパク質とそれに結合する核酸アプタマー若しくはペプチドアプタマーである場合には、核酸アプタマーは、例えば、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、Ｄ群赤痢菌・ソンネ赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、溶連菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、パラチフス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ）、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  Ｂ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、腸炎ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）等の細菌、ムチン１等の上皮の細胞表面に表れる腫瘍マーカー、若しくはβ−ガラクトシダーゼやトロンビン等の酵素等と結合するＤＮＡアプタマー、又は、ヒト免疫不全ウイルスのＴａｔタンパク質やＲｅｖタンパク質と結合するＲＮＡアプタマーであってもよく、ペプチドアプタマーは、例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の腫瘍性タンパク質ＨＰＶ１６  Ｅ６と結合するペプチドアプタマーであってもよい。
【００２８】
被験物質がビタミン類である場合には、該ビタミン類に対する特異的結合物質は、ビタミンＤと結合するトランスカルシフェリン及びビタミンＢ１２と結合するトランスコバラミンなどのビタミン結合タンパク質であってもよい。被験物質が抗生物質である場合には、該抗生物質に対する特異的結合物質は、ペニシリンに結合するＰＢＰ１及びＰＢＰ２などのペニシリン結合タンパクであってもよい。
被験物質又は被験物質に結合する物質としての核酸は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又は、それらの増幅物であってもよい。
【００２９】
本発明の懸濁液は、金被覆銀ナノプレートへ悪影響を与えない限り任意の成分を含んでいてもよい。任意成分としては、金被覆銀ナノプレートの製造方法を実施する際に用いた試薬（例えば、水素化ホウ素ナトリウムやアスコルビン酸）や、分散剤（例えば、クエン酸三ナトリウム）等があげられる。
【００３０】
本発明の被験物質に対する特異的結合物質を担持した金被覆銀ナノプレートは、対応する被験物質の検出に使用することができる。本発明の被験物質を検出する方法は、本発明の懸濁液を該被験物質と混合して、該被験物質と該被験物質に対する特異的結合物質を担持した金被覆銀ナノプレートとの複合体を形成する工程、及び、該複合体を検出する工程を含む。
前記複合体は、被験物質の検出の分野で通常用いられる手段又は凝集物若しくは沈殿物を検出するのに通常用いられる手段を、特に制限なく利用することによって検出することができる。例えば、前記複合体の形成を、消光度測定、吸光度測定、濁度測定、粒度分布測定、粒子径測定、ラマン散乱光測定、色調変化の観察、凝集又は沈殿形成の観察、イムノクロマトグラフィー法、電気泳動、及び、フローサイトメトリーから成る群から選択される手段によって検出してもよい。
【００３１】
イムノクロマトグラフィー法では、検出部位（ライン状）に金被覆銀ナノプレートが集合する。このとき、金被覆銀ナノプレートが可視域の光を吸収する場合、前記複合体の形成を色として認識することができる。本試験の結果は目視判定と、輝度差解析によって数値化できる。目視判定はイムノクロマト試験後の検出ライン有無を目視によって確認し、検出ラインが確認可能な最低被験物質濃度を検出感度とすることができる。輝度解析では、以下の輝度差１から輝度差２を引いた値の絶対値が２（検出限界輝度差）以上である時の最低被験物質濃度を検出感度とすることができる。
１．被験物質を含まない展開液を使用したイムノクロマト試験時の検出ラインと検出ライン以外の部分の輝度差
２．被験物質を含む展開液を使用したイムノクロマト試験時のイムノクロマト担体上の検出ラインと検出ライン以外の部分の輝度差
また、近赤外域の光を吸収する金被覆銀ナノプレートを使用したイムノクロマト試験においては、試験後に近赤外光を検出部に照射し、そのときの吸光を測定することで検出を確認することができる
【００３２】
次に、実施例により本発明の効果を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３３】
実施例１
（１）銀ナノプレートの種粒子の作製
２．５ｍＭのクエン酸ナトリウム水溶液２０ｍＬに、０．５ｇ／Ｌの分子量７０，０００ポリスチレンスルホン酸水溶液１ｍＬと、１０ｍＭの水素化ホウ素ナトリウム水溶液１．２ｍＬとを添加し、次いで、２０ｍＬ／ｍｉｎで攪拌しながら、０．５ｍＭの硝酸銀水溶液５０ｍＬを添加した。得られた溶液をインキュベーター（３０℃）中で６０分間静置し、銀ナノプレートの種粒子の水懸濁液を作製した。作製した水懸濁液（原液）の光学特性を図３に示す。光学特性の測定は、株式会社島津製作所製の紫外可視近赤外分光光度計ＭＰＣ３１００ＵＶ−３１００ＰＣを用い、光路長：１ｃｍ及び測定波長：１９０−１３００ｎｍの条件下で行われた。最大吸収を示す波長は球状銀ナノ粒子のＬＳＰＲである３９６ｎｍ（消光度３．３）であった。なお、本発明の消光度とは懸濁液を分光光度計で測定した際の吸光度の値である。また、ＳＥＭ観察写真を図４に示す。ＳＥＭ観察写真の解析には株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡ＳＵ−７０を用いた。粒子径は主に３ｎｍ以上、１０ｎｍ未満のプレート状粒子であった。【００３４】
（２）銀ナノプレートの作製（マゼンタ）
超純水２００ｍＬに、１０ｍＭのアスコルビン酸水溶液４．５ｍＬを添加し、更に（１）で作製した銀ナノプレート種粒子水懸濁液４ｍＬを添加した。得られた溶液に、０．５ｍＭの硝酸銀水溶液１２０ｍＬを３０ｍＬ／ｍｉｎで攪拌しながら添加した。硝酸銀水溶液の添加が終了した４分後に攪拌を停止し、２５ｍＭのクエン酸ナトリウム水溶液２０ｍＬを添加し、得られた溶液を大気雰囲気下のインキュベーター（３０℃）中で１００時間静置し、銀ナノプレートの水懸濁液ａを作製した。調製した懸濁液を超純水で４倍容に希釈した水懸濁液の光学特性を図５に示す。最大吸収を示す波長は５２６ｎｍ（消光度１．１）であった。光学特性の測定は、株式会社島津製作所製の紫外可視近赤外分光光度計ＭＰＣ３１００ＵＶ−３１００ＰＣを用い、光路長：１ｃｍ及び測定波長：１９０−１３００ｎｍの条件下で行われた。水懸濁液ａ中の銀ナノプレートをＳＥＭにより観察したところ、銀ナノプレートの平均粒子径は３１ｎｍであり、平均厚さは８ｎｍでアスペクト比は３．８であった。ＳＥＭ観察写真の解析には株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡ＳＵ−７０を用いた。【００３５】
（３）金被覆銀ナノプレートの作製
（２）で作製した銀ナノプレート水懸濁液１２０ｍＬに、０．１２５ｍＭのポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（分子量：４０，０００）の水溶液９．１ｍＬを添加し、０．５Ｍのアスコルビン酸水溶液１．６ｍＬを添加した後、０．１４ｍＭの塩化金酸水溶液９．６ｍＬを０．５ｍＬ／ｍｉｎで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター（３０℃）中に２４時間静置し、銀ナノプレートの表面が金で被覆された金被覆銀ナノプレートの水懸濁液（以下、懸濁液Ａ１）を作製した。
懸濁液Ａ１の主要分散媒は水であった。
懸濁液Ａ１に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長（粒子径）の平均が３１ｎｍの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は８ｎｍであった。また、懸濁液Ａ１に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は０．３０ｎｍであった。
懸濁液Ａ１におけるポリスチレンスルホン酸（本発明における水溶性高分子に該当）の濃度は０．９８ｎＭであった。
懸濁液Ａ１におけるＰＶＰ（本発明における水溶性高分子に該当）の濃度は８．１μＭであった。なお、金の厚みの平均は、ＨＡＡＤＦ−ＳＴＥＭ像から任意の金被覆ナノプレート粒子１０個について、各粒子の任意の部位１０点について、金の厚みを測定した計１００点のデータの内、上下１０％を除いた８０点の平均値を用いた（後述の懸濁液Ｂ１及びＤ１も同様）。
懸濁液Ａ１のｐＨは、室温下（２０℃）で４．０であった。ｐＨ測定は株式会社堀場製作所のｔｗｉｎｐＨメータ Ｂ−２１２（ガラス電極法）を用いた（以下、同様）。
懸濁液Ａ１の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して０．００１６質量％であった。【００３６】
（４）懸濁液Ａ１のｐＨ調整
（３）で得られた懸濁液Ａ１の１．９５ｍＬに２００ｍＭのＰＢＳ緩衝液０．０５ｍＬおよび１９０ｍＭの炭酸ナトリウム水溶液０．０２５ｍＬを攪拌しながら添加し、ｐＨ調整された金被覆ナノプレート懸濁液（以下、懸濁液Ｂ１）を作製した。
懸濁液Ｂ１の主要分散媒は水であった。
懸濁液Ｂ１に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が３１ｎｍの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は８ｎｍであった。また、懸濁液Ｂ１に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は０．３０ｎｍであった。ＳＥＭ観察写真を図６に示す。ＳＥＭ観察写真の解析には株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡ＳＵ−７０を用いた。
懸濁液Ｂ１の３倍希釈溶液の色調はマゼンタであった。
懸濁液Ｂ１の色度座標はｘ＝０．４２７６、ｙ＝０．１７５１であった。ＣＩＥ１９３１ｘｙ色度図における色度座標を図１に示す。
色度座標の測定は、株式会社島津製作所製の紫外可視近赤外分光光度計ＭＰＣ３１００ＵＶ−３１００ＰＣを用い、光路長：１ｃｍ及び分光光度計操作用ソフトウェア「カラー測定ソフトウェア（株式会社島津製作所製）」にて照明：Ｄ６５、視野：２°と設定した条件下で行われた。
懸濁液Ｂ１におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は０．９４ｎＭであった。
懸濁液Ｂ１におけるＰＶＰの濃度は７．８μＭであった。
懸濁液Ｂ１のｐＨは、室温下（２０℃）で７．３であった。
懸濁液Ｂ１の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して０．００１５質量％であった。【００３７】
実施例２
実施例１の（４）と同様にして、実施例１の（３）で作製した懸濁液Ａ１（ｐＨ４．０）を１９０ｍＭ  炭酸ナトリウム水溶液でｐＨ５．２に調整し、懸濁液Ｆ１を作製した。懸濁液Ｆ１におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は０．９４ｎＭであり、懸濁液Ｆ１におけるＰＶＰの濃度は７．８μMであった。
実施例３
実施例１の（４）と同様にして、実施例１の（３）で作製した懸濁液Ａ１（ｐＨ４．０）を１９０ｍＭ  炭酸ナトリウム水溶液でｐＨ９．８に調整し、懸濁液Ｇ１を作製した。懸濁液Ｇ１におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は０．９４ｎＭであり、懸濁液Ｇ１におけるＰＶＰの濃度は７．８μＭであった。【００３８】
実施例４
実施例１の（２）で作製した銀ナノプレートの水懸濁液１２０ｍＬに、超純水９．１ｍＬ、０．１４ｍＭの塩化金酸水溶液９．６ｍＬを０．５ｍＬ／ｍｉｎで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター（３０℃）中に２４時間静置し、銀ナノプレートの表面が金で被覆された金被覆銀ナノプレートの水懸濁液を作製した。
作製した金被覆銀ナノプレートの水懸濁液１．９９ｍＬに２００ｍＭのＰＢＳ緩衝液０．０１ｍＬおよび１９０ｍＭの炭酸ナトリウム水溶液０．０２５ｍＬを攪拌しながら添加し、ｐＨ調整された金被覆銀ナノプレート懸濁液（以下、懸濁液Ｉ１）を作製した。
懸濁液Ｉ１の主要分散媒は水であった。
懸濁液Ｉ１に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が３１ｎｍの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は８ｎｍであった。また、懸濁液Ｉ１に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は０．３０ｎｍであった。
懸濁液Ｉ１の３倍希釈溶液の色調はマゼンタであった。
懸濁液Ｉ１におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は０．９４ｎＭであった。
懸濁液Ｉ１のｐＨは、室温下（２０℃）で７．８であった。
懸濁液Ｉ１の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して０．００１６質量％であった。【００３９】
実施例５
実施例１の（２）で作製した銀ナノプレートの水懸濁液１２０ｍＬに、０．７８０ｍＭのポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（分子量：４０，０００）の水溶液９．１ｍＬを添加し、０．５Ｍのアスコルビン酸水溶液１．６ｍＬを添加した後、０．１４ｍＭの塩化金酸水溶液９．６ｍＬを０．５ｍＬ／ｍｉｎで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター（３０℃）中に２４時間静置し、銀ナノプレートの表面が金で被覆された金被覆銀ナノプレートの水懸濁液を作製した。
作製した金被覆銀ナノプレートの水懸濁液１．９５ｍＬに２００ｍＭのＰＢＳ緩衝液０．０５ｍＬおよび１９０ｍＭの炭酸ナトリウム水溶液０．０２５ｍＬを攪拌しながら添加し、ｐＨ調整された金被覆銀ナノプレート懸濁液（以下、懸濁液Ｊ１）を作製した。
懸濁液Ｊ１の主要分散媒は水であった。
懸濁液Ｊ１に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が３１ｎｍの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は８ｎｍであった。また、懸濁液Ｊ１に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は０．３０ｎｍであった。
懸濁液Ｊ１の３倍希釈溶液の色調はマゼンタであった。
懸濁液Ｊ１におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は０．９４ｎＭであった。
懸濁液Ｊ１におけるＰＶＰの濃度は４９μＭであった。
懸濁液Ｊ１のｐＨは、室温下（２０℃）で７．３であった。
懸濁液Ｊ１の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して０．００１５質量％であった。【００４０】
実施例６
実施例１の（２）で作製した銀ナノプレートの水懸濁液１２０ｍＬに、０．０２５ｍＭの末端がチオール基で修飾されたポリエチレングリコールであるＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−０２０ＳＨ（分子量：２，０００、ＮＯＦ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ製）の水溶液９．１ｍＬを添加し、０．５Ｍのアスコルビン酸水溶液１．６ｍＬを添加した後、０．１４ｍＭの塩化金酸水溶液９．６ｍＬを０．５ｍＬ／ｍｉｎで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター（３０℃）中に２４時間静置し、銀ナノプレートの表面が金で被覆された金被覆銀ナノプレートの水懸濁液を作製した。
作製した金被覆銀ナノプレートの水懸濁液１．９５ｍＬに２００ｍＭのＰＢＳ緩衝液０．０５ｍＬおよび１９０ｍＭの炭酸ナトリウム水溶液０．０２５ｍＬを攪拌しながら添加し、ｐＨ調整された金被覆銀ナノプレート懸濁液（以下、懸濁液Ｋ１）を作製した。
懸濁液Ｋ１の主要分散媒は水であった。
懸濁液Ｋ１に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が３１ｎｍの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は８ｎｍであった。また、懸濁液Ｋ１に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は０．３０ｎｍであった。
懸濁液Ｋ１の３倍希釈溶液の色調はマゼンタであった。
懸濁液Ｋ１におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は０．９４ｎＭであった。
懸濁液Ｋ１におけるＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−０２０ＳＨの濃度は１．６μＭであった。
懸濁液Ｋ１のｐＨは、室温下（２０℃）で７．３であった。
懸濁液Ｋ１の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して０．００１５質量％であった。【００４１】
実施例７
銀ナノプレートの作製（色調：イエロー）
超純水２００ｍＬに、１０ｍＭのアスコルビン酸水溶液４．５ｍＬを添加し、更に実施例１の（１）で作製した銀ナノプレート種粒子水懸濁液１２ｍＬを添加した。得られた溶液に、０．５ｍＭの硝酸銀水溶液１２０ｍＬを３０ｍＬ／ｍｉｎで攪拌しながら添加した。硝酸銀水溶液の添加が終了した４分後に攪拌を停止し、２５ｍＭのクエン酸ナトリウム水溶液２０ｍＬを添加し、得られた溶液を大気雰囲気下のインキュベーター（３０℃）中で１００時間静置し、銀ナノプレートの水懸濁液ｂを作製した。調製した懸濁液を超純水で４倍容に希釈した水懸濁液の光学特性を図５に示す。最大吸収を示す波長は４５４ｎｍ（消光度１．１）であった。光学特性の測定は、株式会社島津製作所製の紫外可視近赤外分光光度計ＭＰＣ３１００ＵＶ−３１００ＰＣを用い、光路長：１ｃｍ及び測定波長：１９０−１３００ｎｍの条件下で行われた。水懸濁液ｂ中の銀ナノプレートをＳＥＭにより観察したところ、銀ナノプレートの平均粒子径は１８ｎｍであり、平均厚さは８ｎｍでアスペクト比は２．２であった。ＳＥＭ観察写真の解析には株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡ＳＵ−７０を用いた。【００４２】
金被覆銀ナノプレートの作製
上述のように作製した銀ナノプレート水懸濁液１２０ｍＬに、０．１２５ｍＭのポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（分子量：４０，０００）の水溶液９．１ｍＬを添加し、０．５Ｍのアスコルビン酸水溶液１．６ｍＬを添加した後、０．１４ｍＭの塩化金酸水溶液９．６ｍＬを０．５ｍＬ／ｍｉｎで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター（３０℃）中に２４時間静置し、銀ナノプレートの表面が金で被覆された金被覆銀ナノプレートの水懸濁液（以下、懸濁液Ｍ１）を作製した。
懸濁液Ｍ１の主要分散媒は水であった。
懸濁液Ｍ１に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長（粒子径）の平均が１８ｎｍの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は８ｎｍであった。また、懸濁液Ｍ１に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は０．３０ｎｍであった。
懸濁液Ｍ１におけるポリスチレンスルホン酸（本発明における水溶性高分子に該当）の濃度は０．９８ｎＭであった。
懸濁液Ｍ１のｐＨは、室温下（２０℃）で４．０であった。ｐＨ測定は株式会社堀場製作所のｔｗｉｎｐＨメータ Ｂ−２１２（ガラス電極法）を用いた（以下、同様）。
懸濁液Ｍ１の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して０．００１６質量％であった。【００４３】
懸濁液Ｍ１のｐＨ調整
懸濁液Ｍ１  １．９５ｍＬに２００ｍＭのＰＢＳ緩衝液０．０５ｍＬおよび１９０ｍＭの炭酸ナトリウム水溶液０．０２５ｍＬを攪拌しながら添加し、ｐＨ調整された金被覆ナノプレート懸濁液（以下、懸濁液Ｎ１）を作製した。
懸濁液Ｎ１の主要分散媒は水であった。
懸濁液Ｎ１に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が１８ｎｍの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は８ｎｍであった。また、懸濁液Ｎ１に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は０．３０ｎｍであった。
ＳＥＭ観察写真を図７に示す。ＳＥＭ観察写真の解析には株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡ＳＵ−７０を用いた。
懸濁液Ｎ１の３倍希釈溶液の色調はイエローであった。
懸濁液Ｎ１の色度座標はｘ＝０．５０７０、ｙ＝０．４７７４であった。ＣＩＥ１９３１ｘｙ色度図における色度座標を図１に示す。
また、懸濁液Ｂ１とＮ１を混合した混合液（Ｂ１＋Ｎ１）の色調は赤色であった。混合液（Ｂ１＋Ｎ１）の色度座標はｘ＝０．６０５７、ｙ＝０．３３１７であった。
ＣＩＥ１９３１ｘｙ色度図における色度座標を図０５２０−２に示す。
懸濁液Ｎ１におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は０．９４ｎＭであった。
懸濁液Ｎ１におけるＰＶＰの濃度は７．８μＭであった。
懸濁液Ｎ１のｐＨは、室温下（２０℃）で７．３であった。
懸濁液Ｎ１の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して０．００１５質量％であった。
懸濁液Ｎ１を実施例７とした。【００４４】
実施例８
（１）銀ナノプレートの作製（色調：シアン）
超純水２００ｍＬに、１０ｍＭのアスコルビン酸水溶液４．５ｍＬを添加し、更に実施例１の（１）で作製した銀ナノプレート種粒子水懸濁液２ｍＬを添加した。得られた溶液に、０．５ｍＭの硝酸銀水溶液１２０ｍＬを３０ｍＬ／ｍｉｎで攪拌しながら添加した。硝酸銀水溶液の添加が終了した４分後に攪拌を停止し、２５ｍＭのクエン酸ナトリウム水溶液２０ｍＬを添加し、得られた溶液を大気雰囲気下のインキュベーター（３０℃）中で１００時間静置し、銀ナノプレートの水懸濁液ｃを作製した。調製した懸濁液を超純水で４倍容に希釈した水懸濁液の光学特性を図５に示す。最大吸収を示す波長は６２６ｎｍ（消光度１．１）であった。光学特性の測定は、株式会社島津製作所製の紫外可視近赤外分光光度計ＭＰＣ３１００ＵＶ−３１００ＰＣを用い、光路長：１ｃｍ及び測定波長：１９０−１３００ｎｍの条件下で行われた。水懸濁液ｃ中の銀ナノプレートをＳＥＭにより観察したところ、銀ナノプレートの平均粒子径は５０ｎｍであり、平均厚さは１０ｎｍでアスペクト比は５．０であった。ＳＥＭ観察写真の解析には株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡ＳＵ−７０を用いた。【００４５】
（２）金被覆銀ナノプレートの作製
上述のように作製した銀ナノプレート水懸濁液１２０ｍＬに、０．１２５ｍＭのポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（分子量：４０，０００）の水溶液９．１ｍＬを添加し、０．５Ｍのアスコルビン酸水溶液１．６ｍＬを添加した後、０．１４ｍＭの塩化金酸水溶液９．６ｍＬを０．５ｍＬ／ｍｉｎで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター（３０℃）中に２４時間静置し、銀ナノプレートの表面が金で被覆された金被覆銀ナノプレートの水懸濁液（以下、懸濁液Ｏ１）を作製した。
懸濁液Ｏ１の主要分散媒は水であった。
懸濁液Ｏ１に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長（粒子径）の平均が５０ｎｍの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は１０ｎｍであった。また、懸濁液Ｏ１に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は０．３０ｎｍであった。
懸濁液Ｏ１の３倍希釈溶液の色調はシアンであった。
懸濁液Ｏ１におけるポリスチレンスルホン酸（本発明における水溶性高分子に該当）の濃度は０．９８ｎＭであった。
懸濁液Ｏ１のｐＨは、室温下（２０℃）で４．０であった。ｐＨ測定は株式会社堀場製作所のｔｗｉｎｐＨメータ Ｂ−２１２（ガラス電極法）を用いた（以下、同様）。
懸濁液Ｏ１の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して０．００１６質量％であった。【００４６】
（３）懸濁液Ｏ１のｐＨ調整
懸濁液Ｏ１  １．９５ｍＬに２００ｍＭのＰＢＳ緩衝液０．０５ｍＬおよび１９０ｍＭの炭酸ナトリウム水溶液０．０２５ｍＬを攪拌しながら添加し、ｐＨ調整された金被覆ナノプレート懸濁液（以下、懸濁液Ｐ１）を作製した。
懸濁液Ｐ１の主要分散媒は水であった。
懸濁液Ｐ１に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が５０ｎｍの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は１０ｎｍであった。また、懸濁液Ｐ１に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は０．３０ｎｍであった。
ＳＥＭ観察写真を図８に示す。ＳＥＭ観察写真の解析には株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡ＳＵ−７０を用いた。
懸濁液Ｐ１の３倍希釈溶液の色調はシアンであった。
懸濁液Ｐ１の色度座標はｘ＝０．１４６７、ｙ＝０．２０９０であった。ＣＩＥ１９３１ｘｙ色度図における色度座標を図１に示す。
また、懸濁液Ｂ１とＰ１を混合した混合液（Ｂ１＋Ｐ１）の色調は青色、懸濁液Ｎ１とＰ１を混合した混合液（Ｎ１＋Ｐ１）の色調は緑色であった。
混合液（Ｂ１＋Ｐ１）の色度座標はｘ＝０．１７３１、ｙ＝０．０６７５、混合液（Ｎ１＋Ｐ１）の色度座標はｘ＝０．２５４９、ｙ＝０．５７１２であった。ＣＩＥ１９３１ｘｙ色度図における色度座標を図２に示す。
懸濁液Ｐ１におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は０．９４ｎＭであった。
懸濁液Ｐ１におけるＰＶＰの濃度は７．８μＭであった。
懸濁液Ｐ１のｐＨは、室温下（２０℃）で７．３であった。
懸濁液Ｐ１の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して０．００１５質量％であった。【００４７】
実施例９
（１）銀ナノプレートの作製（色調：薄いシアン）
超純水２００ｍＬに、１０ｍＭのアスコルビン酸水溶液４．５ｍＬを添加し、更に実施例１の（１）で作製した銀ナノプレート種粒子水懸濁液１ｍＬを添加した。得られた溶液に、０．５ｍＭの硝酸銀水溶液１２０ｍＬを３０ｍＬ／ｍｉｎで攪拌しながら添加した。硝酸銀水溶液の添加が終了した４分後に攪拌を停止し、２５ｍＭのクエン酸ナトリウム水溶液２０ｍＬを添加し、得られた溶液を大気雰囲気下のインキュベーター（３０℃）中で１００時間静置し、銀ナノプレートの水懸濁液ｄを作製した。調製した懸濁液を超純水で４倍容に希釈した水懸濁液の光学特性を図５に示す。最大吸収を示す波長は７０４ｎｍ（消光度１．０）であった。光学特性の測定は、株式会社島津製作所製の紫外可視近赤外分光光度計ＭＰＣ３１００ＵＶ−３１００ＰＣを用い、光路長：１ｃｍ及び測定波長：１９０−１３００ｎｍの条件下で行われた。水懸濁液ｄ中の銀ナノプレートをＳＥＭにより観察したところ、銀ナノプレートの平均粒子径は７４ｎｍであり、平均厚さは８ｎｍでアスペクト比は９．２であった。ＳＥＭ観察写真の解析には株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡ＳＵ−７０を用いた。【００４８】
（２）金被覆銀ナノプレートの作製
上述のように作製した銀ナノプレート水懸濁液１２０ｍＬに、０．１２５ｍＭのポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（分子量：４０，０００）の水溶液９．１ｍＬを添加し、０．５Ｍのアスコルビン酸水溶液１．６ｍＬを添加した後、０．１４ｍＭの塩化金酸水溶液９．６ｍＬを０．５ｍＬ／ｍｉｎで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター（３０℃）中に２４時間静置し、銀ナノプレートの表面が金で被覆された金被覆銀ナノプレートの水懸濁液（以下、懸濁液Ｑ１）を作製した。
懸濁液Ｑ１の主要分散媒は水であった。
懸濁液Ｑ１に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長（粒子径）の平均が７４ｎｍの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は８ｎｍであった。また、懸濁液Ｑ１に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は０．３０ｎｍであった。
ＳＥＭ観察写真を図９に示す。ＳＥＭ観察写真の解析には株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡ＳＵ−７０を用いた。
懸濁液Ｑ１の３倍希釈溶液の色調は薄いシアンであった。
懸濁液Ｑ１におけるポリスチレンスルホン酸（本発明における水溶性高分子に該当）の濃度は０．９８ｎＭであった。
懸濁液Ｑ１のｐＨは、室温下（２０℃）で４．０であった。ｐＨ測定は株式会社堀場製作所のｔｗｉｎｐＨメータ Ｂ−２１２（ガラス電極法）を用いた（以下、同様）。
懸濁液Ｑ１の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して０．００１６質量％であった。【００４９】
（３）懸濁液Ｑ１のｐＨ調整
懸濁液Ｑ１  １．９５ｍＬに２００ｍＭのＰＢＳ緩衝液０．０５ｍＬおよび１９０ｍＭの炭酸ナトリウム水溶液０．０２５ｍＬを攪拌しながら添加し、ｐＨ調整された金被覆ナノプレート懸濁液（以下、懸濁液Ｒ１）を作製した。
懸濁液Ｒ１の主要分散媒は水であった。
懸濁液Ｒ１に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が７４ｎｍの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は８ｎｍであった。また、懸濁液Ｒ１に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は０．３０ｎｍであった。
懸濁液Ｒ１の３倍希釈溶液の色調は薄いシアンであった。
懸濁液Ｒ１におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は０．９４ｎＭであった。
懸濁液Ｒ１におけるＰＶＰの濃度は７．８μＭであった。
懸濁液Ｒ１のｐＨは、室温下（２０℃）で７．３であった。
懸濁液Ｒ１の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して０．００１５質量％であった。【００５０】
実施例１０
（１）金被覆銀ナノプレートの作製
上述の実施例１の（３）金被覆銀ナノプレートの作製、における塩化金酸水溶液の濃度を０．１４ｍＭから０．４２ｍＭに変更した以外は、懸濁液Ａ１の作製と同様にして金被覆銀ナノプレートの水懸濁液（以下、懸濁液Ｓ１）を作製した。
懸濁液Ｓ１の主要分散媒は水であった。
懸濁液Ｓ１に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長（粒子径）の平均が３１ｎｍの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は８ｎｍであった。また、懸濁液Ｓ１に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は０．８５ｎｍであった。
懸濁液Ｓ１におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は０．９８ｎＭであった。
懸濁液Ｓ１におけるＰＶＰの濃度は８．１μＭであった。なお、金の厚みの平均は、ＨＡＡＤＦ−ＳＴＥＭ像から任意の金被覆ナノプレート粒子１０個について、各粒子の任意の部位１０点について、金の厚みを測定した計１００点のデータの内、上下１０％を除いた８０点の平均値を用いた。
懸濁液Ｓ１のｐＨは、室温下（２０℃）で４．０であった。ｐＨ測定は株式会社堀場製作所のｔｗｉｎｐＨメータ Ｂ−２１２（ガラス電極法）を用いた。
懸濁液Ｓ１の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して０．００１６質量％であった。【００５１】
（２）懸濁液Ｓ１のｐＨ調整
（１）で得られた懸濁液Ｓ１の１．９５ｍＬに２００ｍＭのＰＢＳ緩衝液０．０５ｍＬおよび１９０ｍＭの炭酸ナトリウム水溶液０．０２５ｍＬを攪拌しながら添加し、ｐＨ調整された金被覆ナノプレート懸濁液（以下、懸濁液Ｔ１）を作製した。
懸濁液Ｔ１の主要分散媒は水であった。
懸濁液Ｔ１に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が３１ｎｍの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は８ｎｍであった。また、懸濁液Ｔ１に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は０．９０ｎｍであった。
懸濁液Ｔ１の３倍希釈溶液の色調はマゼンタであった。
懸濁液Ｔ１におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は０．９４ｎＭであった。
懸濁液Ｔ１におけるＰＶＰの濃度は７．８μＭであった。
懸濁液Ｔ１のｐＨは、室温下（２０℃）で７．４であった。
懸濁液Ｔ１の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して０．００１５質量％であった。【００５２】
比較例
（１）水溶性高分子の濃度が高い例（その１）
実施例１の（２）で作製した銀ナノプレートの水懸濁液１２０ｍＬに、１．２５ｍＭのポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（分子量：４０，０００）の水溶液９．１ｍＬを添加し、０．５Ｍのアスコルビン酸水溶液１．６ｍＬを添加した後、０．１４ｍＭの塩化金酸水溶液９．６ｍＬを０．５ｍＬ／ｍｉｎで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター（３０℃）中に２４時間静置し、銀ナノプレートの表面が金で被覆された金被覆銀ナノプレートの水懸濁液を作製した。
作製した金被覆銀ナノプレートの水懸濁液１．９５ｍＬに２００ｍＭのＰＢＳ緩衝液０．０５ｍＬおよび１９０ｍＭの炭酸ナトリウム水溶液０．０２５ｍＬを攪拌しながら添加し、ｐＨ調整された金被覆銀ナノプレート懸濁液（以下、懸濁液Ｄ１）を作製した。
懸濁液Ｄ１の主要分散媒は水であった。
懸濁液Ｄ１に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が３１ｎｍの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は８ｎｍであった。また、懸濁液Ｄ１に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は０．３０ｎｍであった。
懸濁液Ｄ１の３倍希釈溶液の色調はマゼンタであった。
懸濁液Ｄ１におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は０．９４ｎＭであった。
懸濁液Ｄ１におけるＰＶＰの濃度は７８μＭであった。
懸濁液Ｄ１のｐＨは、室温下（２０℃）で７．３であった。
懸濁液Ｄ１の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して０．００１５質量％であった。【００５３】
（２）ｐＨが高い例
実施例１の（４）と同様にして、実施例１の（３）で作製した懸濁液Ａ１（ｐＨ４．０）を２００ｍＭ  水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１１．５に調整し、懸濁液Ｈ１を作製した。懸濁液Ｈ１におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は０．９４ｎＭであり、懸濁液Ｈ１におけるＰＶＰの濃度は７．８μMであった。【００５４】
（３）水溶性高分子の濃度が高い例（その２）
実施例１の（２）で作製した銀ナノプレートの水懸濁液１２０ｍＬに、１．２５ｍＭの末端がチオール基で修飾されたポリエチレングリコールであるＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−０２０ＳＨ（分子量：２，０００、ＮＯＦ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ製）の水溶液９．１ｍＬを添加し、０．５Ｍのアスコルビン酸水溶液１．６ｍＬを添加した後、０．１４ｍＭの塩化金酸水溶液９．６ｍＬを０．５ｍＬ／ｍｉｎで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター（３０℃）中に２４時間静置し、銀ナノプレートの表面が金で被覆された金被覆銀ナノプレートの水懸濁液を作製した。
作製した金被覆銀ナノプレートの水懸濁液１．９５ｍＬに２００ｍＭのＰＢＳ緩衝液０．０５ｍＬおよび１９０ｍＭの炭酸ナトリウム水溶液０．０２５ｍＬを攪拌しながら添加し、ｐＨ調整された金被覆銀ナノプレート懸濁液（以下、懸濁液Ｌ１）を作製した。
懸濁液Ｌ１の主要分散媒は水であった。
懸濁液Ｌ１に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が３１ｎｍの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は８ｎｍであった。また、懸濁液Ｌ１に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は０．３０ｎｍであった。
懸濁液Ｌ１の３倍希釈溶液の色調はマゼンタであった。
懸濁液Ｌ１におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は０．９４ｎＭであった。
懸濁液Ｌ１におけるＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−０２０ＳＨの濃度は７８μＭであった。
懸濁液Ｌ１のｐＨは、室温下（２０℃）で７．３であった。
懸濁液Ｌ１の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して０．００１５質量％であった。
上述のように、本発明の金被覆銀ナノプレートの懸濁液及び比較例としての懸濁液を調製することができた。懸濁液Ａ１、Ｂ１、Ｆ１、Ｇ１、Ｉ１，Ｊ１、Ｋ１、Ｎ１、Ｐ１、Ｄ１、Ｈ１、Ｌ１、又はＴ１中の水溶性高分子（ポリスチレンスルホン酸（ＰＳＳ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）又はチオール修飾ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＳＨ））の濃度、ｐＨ及び色調（マゼンタ（Ｍ）、イエロー（Ｙ）、シアン（Ｃ）又は薄いシアン（ＰＣ））を、後掲の表２にまとめた。【００５５】
試験例１
実施例及び比較例の各懸濁液を下記手順のイムノクロマト試験に用いて、試験結果を評価した。
（１）イムノクロマト試験に使用する展開液の作製（金被覆銀ナノプレートへの特異的結合物質の担持（検出試薬の標識））
５ｍＭのＰＢＳ（−）緩衝液中における濃度５０μｇ／ｍＬのＢ型肝炎ウイルス抗原（ＨＢｓ抗原）に対する抗体（品名：Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ  ＨＢｓＡｇ、製造元：Ａｒｉｓｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）（イムノクロマト法における検出抗体）の溶液０．２ｍＬと、金被覆銀ナノプレート懸濁液（懸濁液Ａ１、Ｂ１、Ｆ１、Ｇ１、Ｉ１，Ｊ１、Ｋ１、Ｎ１、Ｐ１、Ｄ１、Ｈ１、Ｌ１、又はＴ１）１．８ｍＬを混合し、得られた混合物を室温下で３０分間振とうした。次いで、遠心分離（２５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）を行い、抗体−金被覆銀ナノプレート複合体を沈殿させ、上澄み液１．８５ｍＬを除去した。その後、抗体−金被覆銀ナノプレート複合体を、４．９μＭのＢＳＡを含有する１．８５ｍＬの５ｍＭ  ＰＢＳ（−）緩衝液を添加して再分散させ、紫外可視分光光度計 Ａｇｉｌｅｎｔ  ８４５３（アジレント・テクノロジー株式会社製）を使用して消光度（Ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ）２．０になるように調整し、展開液を作製した。【００５６】
使用した金被覆銀ナノプレート懸濁液と作製された展開液との関係を、以下の表１に示す。
【表１】
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【００５７】
（２）イムノクロマト試験
図１０に示す手順により、Ｂ型肝炎ウイルス抗原（ＨＢｓ抗原）を被験物質としたイムノクロマト試験を、抗ＨＢｓ抗原抗体（捕獲抗体）を直線状（図１０の検出ライン）に固定化したイムノクロマト試験紙を用いて行った。
イムノクロマト試験紙はイムノクロマト試験紙の受託作製会社（有限会社バイオデバイステクノロジー）より購入したものを使用した。捕獲抗体を直線状に固定する際、捕獲抗体を５ｍＭ  ＰＢＳ（−）緩衝液で濃度１ｇ／ｍＬに調整したものを使用した。
第１展開液（図１０（ａ）で用いる展開液）は、５ｍＭのＰＢＳ（−）緩衝液中におけるＨＢｓ抗原（品名：ＨＢｓＡｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓｕｂｔｙｐｅ  ａｄｒ）、製造元：Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）の溶液であった。第１展開液として、ＨＢｓ抗原の濃度が０．６０μＭ、０．０６μＭ、０．００６μＭ、０．０００６μＭ又は０Ｍ（ブランク）の溶液を用意した。
第２展開液は５ｍＭのＰＢＳ（−）緩衝液であった。
第３展開液（図１０（ｃ）で用いた展開液）は、上述の展開液Ａ１、Ｂ１、Ｆ１、Ｇ１、Ｉ１，Ｊ１、Ｋ１、Ｎ１、Ｐ１、Ｄ１、Ｈ１、Ｌ１又はＴ１であった。【００５８】
具体的な試験手順は以下の通りであった。
イムノクロマト試験紙に、第１展開液１５μＬを展開させた（図１０（ａ））。第１展開液の展開により、ＨＢｓ抗原が試験紙の検出ライン上に固定化された捕獲抗体によって捕獲される（図１０（ｂ））。
次いで、第２展開液３０μＬを展開させて、イムノクロマト試験紙上の余剰抗原の洗浄を行った。
最後に、第３展開液６０μＬを展開させた（図１０（ｃ））。第３展開液の展開により、試験紙の検出ライン上で捕獲されたＨＢｓ抗原へ検出抗体（抗体−金被覆銀ナノプレート複合体）が結合する（図１０（ｄ））。
同一の手順をＨＢｓ濃度の異なる各第１展開液を用いて繰り返した。【００５９】
（３）イムノクロマト試験の目視判定による評価
第３展開液展開後の検出ラインにおける金被覆銀ナノプレートの着色（懸濁液の色調、すなわち、展開液Ｂ１を使用した際はマゼンタ、展開液Ｎ１を使用した際はイエロー、展開液Ｐ１を使用した際はシアン）を目視で確認することにより、ＨＢｓ抗原の有無を判定した。結果を後掲の表２に示す。【００６０】
（４）イムノクロマト試験の輝度解析による評価
第３展開液展開後のイムノクロマト試験紙をスキャニング（装置名：Ｃａｎｏ  Ｓｃａｎ  ＬｉＤＥ５００Ｆ、製造元：キヤノン株式会社）し、検出ライン（捕獲抗体の固定化部分）の最低輝度と、検出ライン以外の部分の最低輝度とを画像解析ソフト（Ｉｍａｇｅ−Ｊ：アメリカ国立衛生研究所でＷａｙｎｅ  Ｒａｓｂａｎｄが開発したオープン・ソースで公有の画像処理ソフトウェア（http://imagej.nih.gov/ij/））を用いて数値化した。最低輝度は、対象領域（検出ライン又は検出ライン以外の部分）における異なる箇所の輝度を５回測定し、得られた数値の中央値を採用した。輝度差（検出ラインの最低輝度−検出ライン以外の部分の最低輝度）を計算し、結果を次の表２及び図１１〜２３に示す。
【表２】
0005960374.tif 000003
【００６１】
抗体を担持していない金被覆銀ナノプレートの懸濁液Ｂ１を第３展開液として使用しても、検出ラインの色は変化せず、輝度差も生じなかった。結果を次の表３に示す。
【表３】
0005960374.tif 000004
【００６２】
それに対して、抗ＨＢｓ抗原抗体を担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液を第３展開液として用いると、検出ラインが着色（懸濁液の色調に着色、すなわち、展開液Ｂ１を使用した際はマゼンタ、展開液Ｎ１を使用した際はイエロー、展開液Ｐ１を使用した際はシアン）され、顕著な輝度差も測定された。これは、上記抗ＨＢｓ抗原抗体を担持した金被覆銀ナノプレートが、検出ラインの捕捉抗体に捕捉されたＨＢｓ抗原と複合体を形成したことによるものである。
また、ｐＨが１０以下の懸濁液Ａ１、Ｂ１、Ｆ１、Ｇ１、Ｉ１、Ｊ１、Ｋ１、Ｎ１、Ｐ１、Ｄ１、Ｌ１、又はＴ１から調製した展開液は、ｐＨが１１．５の懸濁液Ｈ１から調製した展開液よりも高い輝度差が生じたので、これよりも検出感度が高いことがわかった。
そして、水溶性高分子（ＰＶＰ又はＰＥＧ−ＳＨ）の濃度が５０μＭ以下である懸濁液Ｂ１、Ｆ１、Ｇ１、Ｉ１、Ｊ１、Ｋ１、Ｎ１、Ｐ１、又はＴ１から調製した展開液は、水溶性高分子の濃度が７８μＭである懸濁液Ｄ１又はＬ１から調製した展開液よりも高い輝度差が生じたので、これらよりも検出感度が高いことがわかった。特に、懸濁液Ｉ１から調製した展開液Ｉ１は、０．０００６μＭのＨＢｓ抗原を使用した場合にも輝度差が生じた。【００６３】
実施例１１
１．金属微粒子懸濁液の作製
１−１．銀ナノプレートの作製
１−１−１．銀ナノプレートの種粒子の作製
２．５ｍＭのクエン酸ナトリウム水溶液２０ｍＬに、０．５ｇ／Ｌの分子量７０，０００ポリスチレンスルホン酸水溶液１ｍＬと、１０ｍＭの水素化ホウ素ナトリウム水溶液１．２ｍＬとを添加し、次いで、２０ｍＬ／ｍｉｎで攪拌しながら、０．５ｍＭの硝酸銀水溶液５０ｍＬを添加した。得られた溶液をインキュベーター（３０℃）中に６０分間静置し、銀ナノプレートの種粒子の水懸濁液を作製した。【００６４】
１−１−２．銀ナノプレート懸濁液Ａ２の作製
超純水２００ｍｌに、１０ｍＭのアスコルビン酸水溶液４．５ｍＬを添加し、上述の銀ナノプレートの種粒子の水懸濁液１２ｍｌを添加した。得られた溶液に、０．５ｍＭの硝酸銀水溶液１２０ｍＬを３０ｍＬ／ｍｉｎで攪拌しながら添加した。硝酸銀水溶液の添加が終了した４分後に攪拌を停止し、２５ｍＭのクエン酸ナトリウム水溶液２０ｍｌを添加し、得られた溶液を大気雰囲気下のインキュベーター（３０℃）中に１００時間静置し、プレート状銀ナノ粒子の水懸濁液である銀ナノプレート懸濁液Ａ２を調製した。【００６５】
１−１−３．銀ナノプレート懸濁液Ｂ２の作製
上記銀ナノプレートの種粒子の水懸濁液の添加量を１２ｍｌから４ｍｌに変更した以外は、銀ナノプレート懸濁液Ａ２と同様にして、プレート状銀ナノ粒子の水懸濁液である銀ナノプレート懸濁液Ｂ２を調製した。【００６６】
１−１−４．銀ナノプレート懸濁液Ｃ２の作製
上記銀ナノプレートの種粒子の水懸濁液の添加量を１２ｍｌから２ｍｌに変更した以外は、銀ナノプレート懸濁液Ａ２の調製と同様にして、プレート状銀ナノ粒子の水懸濁液である銀ナノプレート懸濁液Ｃ２を調製した。【００６７】
１−２．金被覆銀ナノプレートの作製
１−２−１．金被覆銀ナノプレート懸濁液Ａ２の作製
上記銀ナノプレート懸濁液Ａ２の１２０ｍｌに、０．１２５ｍＭのポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（分子量：４０，０００）の水溶液９．１ｍｌを添加し、０．５Ｍのアスコルビン酸水溶液１．６ｍｌを添加した後、０．４２ｍＭの塩化金酸水溶液９．６ｍｌを０．５ｍＬ／ｍｉｎで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター（３０℃）中に２４時間静置し、金被覆銀ナノプレート懸濁液Ａ２を調製した。【００６８】
金被覆銀ナノプレート懸濁液Ａ２の主要分散媒は水であった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液Ａ２に含まれる金被覆銀ナノプレートを走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により観察したところ、主面の最大長（粒子径）の平均が１８ｎｍの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は８ｎｍであった。なお、金被覆銀ナノプレートの主面の最大長（粒子径）の平均は、ＳＥＭ画像（株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡ＳＵ−７０で撮影）中の任意の金被覆銀ナノプレート１００個の最大長（粒子径）を測定した計１００点のデータの内、上下１０％を除いた８０点の平均値を用いた（後述の金被覆銀ナノプレート懸濁液Ｂ２及びＣも同様）。そして、金被覆銀ナノプレート懸濁液Ａ２に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さは、高角散乱環状暗視野走査透過顕微鏡法（ＨＡＡＤＦ−ＳＴＥＭ）によれば、平均０．２５ｎｍであった。なお、金の厚みの平均は、ＨＡＡＤＦ−ＳＴＥＭ像から任意の金被覆銀ナノプレート粒子１０個について、各粒子の任意の部位１０点について、金の厚みを測定した計１００点のデータの内、上下１０％を除いた８０点の平均値を用いた（後述の金被覆銀ナノプレート懸濁液Ｂ２及びＣも同様）。
また、金被覆銀ナノプレート懸濁液Ａ２における金の濃度は０．０５６ｍｇ／Ｌ、銀の濃度は０．２２６ｍｇ／Ｌであり、以下の計算方法により算出された金の厚さは０．２１ｎｍであった。
１．ＩＣＰ発光分析結果
金濃度：銀濃度＝０．０５６（ｍｇ／Ｌ）：０．２２６（ｍｇ／Ｌ）
＝１：４．０４
２．銀ナノプレートの体積（形状：正三角形、粒子径：１８ｎｍ、厚さ８
ｎｍ）
式：（三角形の面積）×（厚さ）
＝（１８ｎｍ×（１８√３／２）ｎｍ÷２）×８ｎｍ
＝１１２２ｎｍ3（＝１１２２×１０-21ｃｍ3）
３．銀の比重
１０．５１ｇ／ｃｍ3
４．三角形の銀ナノプレートの質量
式：（正三角形の銀ナノプレートの体積）×（銀の比重）
＝（１１２２×１０-21ｃｍ3）×１０．５１ｇ／ｃｍ3
＝１．１８×１０-17ｇ
５．三角形の銀ナノプレートに被覆している金の質量（Ｘ）
１：４．０４＝Ｘ：１．１８×１０-17ｇ
Ｘ＝０．２９×１０-17ｇ
６．金の比重
１９．３２ｇ／ｃｍ3
７．三角形の銀ナノプレートに被覆している金の体積
式：（金の質量） ÷（金の比重）
＝０．２９×１０-17ｇ ÷ １９．３２ｇ／ｃｍ3
＝１．５１×１０-19ｃｍ3（＝１５１ｎｍ3）
８．三角形の銀ナノプレートの表面積
式：（三角面の面積）＋（粒子側面の面積）
＝（１８ｎｍ×（１８√３／２）ｎｍ ÷２）×２）
＋（８ｎｍ×１８ｎｍ×３）
＝７１３ｎｍ2
９．三角形の銀ナノプレートに被覆している金の厚さ
式：（正三角形の銀ナノプレートに被覆している金の体積）
÷（正三角形の銀ナノプレートの表面積）
＝１５１ｎｍ3÷７１３ｎｍ2
＝０．２１ｎｍ
なお、金の濃度および銀の濃度は、以下の手順で分析した（後述の金被覆銀ナノプレート懸濁液Ｂ２及びＣも同様）。
１．０．５ｍＬの金被覆銀ナノプレート懸濁液Ａ２を遠心分離（２５，
０００ｒｐｍ、２６，０００ｇ）後、上澄み液を除去し、得られた
沈殿物を、除去した上澄み液と同量の超純水で再度懸濁した。
２．上記工程１で得られた懸濁液に王水１５ｍＬを添加後、５分間煮沸
して、金及び銀を王水中へ溶解させた。
３．上記工程２で得られた溶液を、ＩＣＰ発光分析装置（株式会社島津
製作所製、ＩＣＰＳ−７５１０）を用いて測定した。
金被覆銀ナノプレート懸濁液Ａ２におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は０．９８ｎＭであった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液Ａ２におけるＰＶＰの濃度は８．１μＭであった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液Ａ２のｐＨは、室温下（２０℃）で４．０であった。ｐＨ測定は株式会社堀場製作所のｔｗｉｎｐＨメータ Ｂ−２１２（ガラス電極法）を用いた（以下、同様）。
金被覆銀ナノプレート懸濁液Ａ２の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して０．００１６質量％であった。【００６９】
１−２−２．金被覆銀ナノプレート懸濁液Ｂ２の作製
上記銀ナノプレート懸濁液Ｂ２の１２０ｍｌに、０．１２５ｍＭのＰＶＰ（分子量：４０，０００）の水溶液９．１ｍｌを添加し、０．５Ｍのアスコルビン酸水溶液１．６ｍｌを添加した後、０．４２ｍＭの塩化金酸水溶液９．６ｍｌを０．５ｍＬ／ｍｉｎで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター（３０℃）中に２４時間静置し、金被覆銀ナノプレート懸濁液Ｂ２を調製した。【００７０】
金被覆銀ナノプレート懸濁液Ｂ２の主要分散媒は水であった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液Ｂ２に含まれる金被覆銀ナノプレートをＳＥＭにより観察したところ、主面の最大長（粒子径）の平均が３１ｎｍの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は８ｎｍであった。そして、金被覆銀ナノプレート懸濁液Ｂ２に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は、ＨＡＡＤＦ−ＳＴＥＭによれば、０．３０ｎｍであった。
また、金被覆銀ナノプレート懸濁液Ｂ２における金の濃度は０．０４５ｍｇ／Ｌ、銀の濃度は０．１８５ｍｇ／Ｌであり、上述のＩＣＰ発光分析結果に基づいた計算方法により算出された金の厚さは０．２８ｎｍであった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液Ｂ２におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は０．９８ｎＭであった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液Ｂ２におけるＰＶＰの濃度は８．１μＭであった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液Ｂ２のｐＨは、室温下（２０℃）で４．０であった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液Ｂ２の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して０．００１６質量％であった。【００７１】
１−２−３．金被覆銀ナノプレート懸濁液Ｃ２の作製
上記銀ナノプレート懸濁液Ｃ２の１２０ｍｌに、０．１２５ｍＭのＰＶＰ（分子量：４０，０００）の水溶液９．１ｍｌを添加し、０．５Ｍのアスコルビン酸水溶液１．６ｍｌを添加した後、０．４２ｍＭの塩化金酸水溶液９．６ｍｌを０．５ｍＬ／ｍｉｎで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター（３０℃）中に２４時間静置し、金被覆銀ナノプレート懸濁液Ｃ２を調製した。【００７２】
金被覆銀ナノプレート懸濁液Ｃ２の主要分散媒は水であった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液Ｃ２に含まれる金被覆銀ナノプレートをＳＥＭにより観察したところ、主面の最大長（粒子径）の平均が５０ｎｍの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は１０ｎｍであった。そして、金被覆銀ナノプレート懸濁液Ｂ２に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は、ＨＡＡＤＦ−ＳＴＥＭによれば、０．４５ｎｍであった。
また、金被覆銀ナノプレート懸濁液Ｃ２における金の濃度は０．０４７ｍｇ／Ｌ、銀の濃度は０．１８６ｍｇ／Ｌであり、上述のＩＣＰ発光分析結果に基づいた計算方法により算出された金の厚さは０．４１ｎｍであった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液Ｃ２におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は０．９８ｎＭであった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液Ｃ２におけるＰＶＰの濃度は８．１μＭであった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液Ｃ２のｐＨは、室温下（２０℃）で４．０であった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液Ｃ２の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して０．００１６質量％であった。【００７３】
１−３．金被覆銀ナノプレート懸濁液のｐＨ調整
１−３−１．ｐＨ調整した金被覆銀ナノプレート懸濁液（懸濁液Ｄ２）の調製
１−２−１で得られた金被覆銀ナノプレート懸濁液Ａ２の１．９５ｍＬに２００ｍＭのＰＢＳ緩衝液０．０５ｍＬおよび１９０ｍＭの炭酸ナトリウム水溶液０．０２５ｍＬを攪拌しながら添加し、ｐＨ調整された金被覆銀ナノプレート懸濁液（以下、懸濁液Ｄ２）を作製した。【００７４】
懸濁液Ｄ２の主要分散媒は水であった。
懸濁液Ｄ２に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が１８ｎｍの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は８ｎｍであった。そして、懸濁液Ｄ２に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は、ＨＡＡＤＦ−ＳＴＥＭによれば、０．２５ｎｍであった。
懸濁液Ｄ２の３倍希釈溶液の色調はイエローであった。
懸濁液Ｄ２におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は０．９４ｎＭであった。
懸濁液Ｄ２におけるＰＶＰの濃度は７．８μＭであった。
懸濁液Ｄ２のｐＨは、室温下（２０℃）で７．３であった。
懸濁液Ｄ２の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して０．００１５質量％であった。【００７５】
１−３−２．ｐＨ調整した金被覆銀ナノプレート懸濁液（懸濁液Ｅ２）の調製
１−２−２で得られた金被覆銀ナノプレート懸濁液Ｂ２の１．９５ｍＬに２００ｍＭのＰＢＳ緩衝液（＋又は−）０．０５ｍＬおよび１９０ｍＭの炭酸ナトリウム水溶液０．０２５ｍＬを攪拌しながら添加し、ｐＨ調整された金被覆銀ナノプレート懸濁液（以下、懸濁液Ｅ２）を作製した。ここで、２００ｍＭのＰＢＳ緩衝液（＋）とは、二価イオンを含むＰＢＳ緩衝液（１．０ｍＭのＭｇ2+及び１．８ｍＭのＣａ2+）のことをいい、２００ｍＭのＰＢＳ緩衝液（−）とは、二価イオンを含まないＰＢＳ緩衝液のことをいう。【００７６】
懸濁液Ｅ２の主要分散媒は水であった。
懸濁液Ｅ２に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が３１ｎｍの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は８ｎｍであった。そして、懸濁液Ｅ２に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は、ＨＡＡＤＦ−ＳＴＥＭによれば、０．３０ｎｍであった。
懸濁液Ｅ２の３倍希釈溶液の色調はマゼンタであった。
懸濁液Ｅ２におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は０．９４ｎＭであった。
懸濁液Ｅ２におけるＰＶＰの濃度は７．８μＭであった。
懸濁液Ｅ２のｐＨは、室温下（２０℃）で７．３であった。
懸濁液Ｅ２の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して０．００１５質量％であった。【００７７】
１−３−３．ｐＨ調整された金被覆銀ナノプレート懸濁液（懸濁液Ｆ２）
１−２−３で得られた金被覆銀ナノプレート懸濁液Ｃ２の１．９５ｍＬに２００ｍＭのＰＢＳ緩衝液０．０５ｍＬおよび１９０ｍＭの炭酸ナトリウム水溶液０．０２５ｍＬを攪拌しながら添加し、ｐＨ調整された金被覆銀ナノプレート懸濁液（以下、懸濁液Ｆ２）を作製した。【００７８】
懸濁液Ｆ２の主要分散媒は水であった。
懸濁液Ｆ２に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が５０ｎｍの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は１０ｎｍであった。そして、懸濁液Ｆ２に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は、ＨＡＡＤＦ−ＳＴＥＭによれば、０．４５ｎｍであった。
懸濁液Ｆ２の３倍希釈溶液の色調はシアンであった。
懸濁液Ｆ２におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は０．９４ｎＭであった。
懸濁液Ｆ２におけるＰＶＰの濃度は７．８μＭであった。
懸濁液Ｆ２のｐＨは、室温下（２０℃）で７．３であった。
懸濁液Ｆ２の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して０．００１５質量％であった。【００７９】
２．金被覆銀ナノプレートへの特異的結合物質の担持
２−１．金被覆銀ナノプレートへの糖鎖の担持
２−１−１．金被覆銀ナノプレート（懸濁液Ｅ２）へのメルカプトエチルマンノースの担持  上記懸濁液Ｅ２（ＰＢＳ緩衝液（＋）で調製したもの）４ｍＬの入った９ｍＬ容バイヤル瓶に１−メルカプトエチルマンノース（Ｍｗ：２７０．２７４）１０ｍｇを添加、３０℃下で１２時間、マグネチックスターラーを使用し５００ｒｐｍで撹拌し、マンノースを担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液Ｇ２を調製した。
なお、１−メルカプトエチルマンノースは有機化学的手法にて合成した。具体的にはマンノース（関東化学株式会社製）を原料とし、１位のアセチル化、ブロモエチル化、チオアセチル化、脱アセチル化を経て合成した。１−メルカプトエチルマンノースの化学式を以下に示す。
0005960374.tif 000005
【００８０】
２−２．金被覆銀ナノプレートへの抗体の担持
２−２−１．金被覆銀ナノプレートへの抗Ｂ型肝炎ウイルス抗原抗体の担持
５ｍＭのＰＢＳ（−）緩衝液中における濃度５０μｇ／ｍＬのＢ型肝炎ウイルス抗原（ＨＢｓ抗原）に対する抗体（品名：Ｇｏａｔ ａｎｔｉ ＨＢｓＡｇ、製造元：Ａｒｉｓｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）（以下、抗ＨＢｓ抗原抗体ともいう）の溶液２ｍＬと、上記懸濁液Ｄ２の１８ｍＬを混合し、得られた混合物を室温下で３０分間振とうした。次いで、遠心分離（２５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）を行い、抗体を担持した金被覆銀ナノプレートを沈殿させ、上澄み液１８.５ｍＬを除去した。その後、上記抗体を担持した金被覆銀ナノプレートを５ｍＭのＰＢＳ（−）緩衝液１８．５ｍＬで再分散させ、抗ＨＢｓ抗原抗体を担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液Ｈ２を調製した。
上記懸濁液Ｅ２（ＰＢＳ緩衝液（−）で調製したもの）及び懸濁液Ｆ２についても同様に抗体を担持させ、抗ＨＢｓ抗原抗体を担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液Ｉ２及びＪ２をそれぞれ調製した。
懸濁液Ｈ２、Ｉ２及びＪ２中の抗ＨＢｓ抗原抗体を担持した金被覆銀ナノプレートの最大吸収波長は、それぞれ４５８ｎｍ、５３２ｎｍ及び６３０ｎｍだった。
調製した懸濁液Ｈ２、Ｉ２及びＪ２は、緩衝液中で安定に分散しており、分光特性もほとんど変化しないかったことから、これらはいずれも酸化に対して安定性が高いことがわかった。【００８１】
３．被験物質との相互作用
３−１．糖鎖を担持した金被覆銀ナノプレートとレクチンとの相互作用
上記マンノースを担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液Ｇ２（ＰＢＳ（＋））を５本のエッペンチューブへ５００μＬずつ分注、５ｍＭのＰＢＳ（＋）緩衝液中における濃度１０μＭのコンカナバリンＡ（略称：ＣｏｎＡ、品名：コンカナバリンＡ、製造元：株式会社オイルミルズ製）溶液５μＬ（ＣｏｎＡ物質量：５０ｐｍｏｌ、添加後の濃度：０．１μＭ）、１０μＬ（ＣｏｎＡ物質量：１００ｐｍｏｌ、添加後の濃度：０．２μＭ）、２５μＬ（ＣｏｎＡ物質量：２５０ｐｍｏｌ、添加後の濃度：０．５μＭ）、５０μＬ（ＣｏｎＡ物質量：５００ｐｍｏｌ、添加後の濃度：１．０μＭ）を各エッペンチューブへ添加、撹拌後、３０℃下で１時間静置した。【００８２】
（１）色調変化及び沈殿形成
マンノースを担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液Ｇ２にＣｏｎＡ（５０μＬ）を添加した後の静置中に、該懸濁液の色調変化及び該懸濁液中の沈殿形成を目視によって観察した。結果を表４に示す。
【表４】
0005960374.tif 000006
【００８３】
（２）消光度測定
各相互作用溶液の消光度測定を株式会社島津製作所製の紫外可視近赤外分光光度計ＭＰＣ３１００ＵＶ−３１００ＰＣを用い、光路長：１ｃｍ及び測定波長：３００−１０００ｎｍの条件下で実施した。測定結果を図２４及び表５に示す。
【表５】
0005960374.tif 000007
【００８４】
糖鎖を担持していない金被覆銀ナノプレートの懸濁液にＣｏｎＡを添加しても消光度は変化しなかった（データは掲載せず）のに対して、マンノースを担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液Ｇ２にＣｏｎＡを添加すると、該ＣｏｎＡの添加量に依存して消光度が減少した。これは、ＣｏｎＡとマンノースを担持した金被覆銀ナノプレートとが複合体を形成したことによる変化である。【００８５】
３−２．抗体を担持した金被覆銀ナノプレートと抗原との相互作用
上記抗ＨＢｓ抗体を担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液Ｈ２（ＰＢＳ（−））を２本の９ｍＬ容バイヤル瓶へ５ｍＬずつ分注し、５ｍＭのＰＢＳ（−）緩衝液中における濃度５μＭのＢ型肝炎ウイルス抗原（略称：ＨＢｓＡｇ、品名：ＨＢｓＡｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓｕｂｔｙｐｅ ａｄｒ）、製造元：Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）溶液５０μＬ（ＨＢｓ抗原物質量：２５０ｐｍｏｌ、添加後の濃度：５０ｎＭ）、および、５ｍＭのＰＢＳ（−）緩衝液中における濃度１０μＭのＢ型肝炎ウイルス抗原溶液５０μＬ（ＨＢｓ抗原物質量：５００ｐｍｏｌ、添加後の濃度：１００ｎＭ）をそれぞれバイヤル瓶へ添加、撹拌後、３０℃下で１時間静置した。【００８６】
（１）消光度測定
懸濁液Ｈ２から調製した各相互作用溶液の消光度測定を、株式会社島津製作所製の紫外可視近赤外分光光度計ＭＰＣ３１００ＵＶ−３１００ＰＣを用い、光路長：１ｃｍ及び測定波長：３００−１０００ｎｍの条件下で実施した。測定結果を図２５Ａに示す。
また、懸濁液Ｉ２又は懸濁液Ｊ２を使用した際の結果を図２５Ｂ及び図２５Ｃに示す。【００８７】
抗体を担持していない金被覆銀ナノプレートの懸濁液にＨＢｓ抗原を添加しても消光度は変化しなかった（データは掲載せず）のに対して、抗ＨＢｓ抗原抗体を担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液Ｈ２、Ｉ２又はＪ２にＨＢｓ抗原を添加すると、該ＨＢｓ抗原の添加量に依存して消光度が減少した。これは、ＨＢｓ抗原と抗ＨＢｓ抗原抗体を担持した金被覆銀ナノプレートとが複合体を形成したことによる変化である。【００８８】
（２）濁度測定
抗ＨＢｓ抗原抗体を担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液Ｉ２にＨＢｓ抗原を添加したときの波長７００ｎｍ付近における消光度を、該懸濁液の濁度としてとして測定した。測定結果を図２６に示すが、これは図２５Ｂの一部拡大図である。【００８９】
抗体を担持していない金被覆銀ナノプレートの懸濁液にＨＢｓ抗原を添加しても濁度は変化しなかった（データは掲載せず）のに対して、抗ＨＢｓ抗原抗体を担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液Ｉ２にＨＢｓ抗原を添加すると、該ＨＢｓ抗原の添加量に依存して濁度が上昇した。これは、ＨＢｓ抗原と抗ＨＢｓ抗原抗体を担持した金被覆銀ナノプレートとが複合体を形成したことによる変化である。【００９０】
実施例１２
１．金被覆銀ナノプレートの作製
１−１．金被覆銀ナノプレート懸濁液（懸濁液Ｋ２）の作製
実施例１１の１−１−３で作製した銀ナノプレート懸濁液Ｂ２の１２０ｍｌに、０．１２５ｍＭのＰＶＰ（分子量：４０，０００）の水溶液９．１ｍｌを添加し、０．５Ｍのアスコルビン酸水溶液１．６ｍｌを添加した後、０．４２ｍＭの塩化金酸水溶液９．６ｍｌを０．５ｍＬ／ｍｉｎで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター（３０℃）中に２４時間静置し、金被覆銀ナノプレート懸濁液Ｋ２を調製した。【００９１】
懸濁液Ｋ２の主要分散媒は水であった。
懸濁液Ｋ２に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長（粒子径）の平均が３１ｎｍの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は８ｎｍであった。また、懸濁液Ｋ２に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は０．３０ｎｍであった。
懸濁液Ｋ２におけるポリスチレンスルホン酸（本発明における水溶性高分子に該当）の濃度は０．９８ｎＭであった。
懸濁液Ｋ２におけるＰＶＰの濃度は８．１μＭであった。なお、金の厚みの平均は、ＨＡＡＤＦ−ＳＴＥＭ像から任意の金被覆銀ナノプレート粒子１０個について、各粒子の任意の部位１０点について、金の厚みを測定した計１００点のデータの内、上下１０％を除いた８０点の平均値を用いた。
懸濁液Ｋ２のｐＨは、室温下（２０℃）で４．０であった。ｐＨ測定は株式会社堀場製作所のｔｗｉｎｐＨメータ Ｂ−２１２（ガラス電極法）を用いた（以下、同様）。
懸濁液Ｋ２の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して０．００１６質量％であった。【００９２】
１−２．ｐＨ調整した金被覆銀ナノプレート懸濁液（懸濁液Ｌ２）の調製
上記１−１で作製した懸濁液Ｋ２ １．９５ｍＬに２００ｍＭのＰＢＳ緩衝液０．０５ｍＬ及び１９０ｍＭの炭酸ナトリウム水溶液０．０２５ｍＬを攪拌しながら添加し、ｐＨ調整した金被覆銀ナノプレート懸濁液（以下、懸濁液Ｌ２）を作製した。【００９３】
懸濁液Ｌ２の主要分散媒は水であった。
懸濁液Ｌ２に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が３１ｎｍの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は８ｎｍであった。また、懸濁液Ｌ２に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は０．３０ｎｍであった。
懸濁液Ｌ２におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は０．９４ｎＭであった。
懸濁液Ｌ２におけるＰＶＰの濃度は７．８μＭであった。
懸濁液Ｌ２のｐＨは、室温下（２０℃）で７．３であった。
懸濁液Ｌ２の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して０．００１５質量％であった。【００９４】
１−３．ｐＨ調整した金被覆銀ナノプレート懸濁液（懸濁液Ｍ２）の調製
実施例１１の１−１−３で作製した銀ナノプレート懸濁液Ｂ２の１２０ｍｌに、１．２５ｍＭのＰＶＰ（分子量：４０，０００）の水溶液９．１ｍｌを添加し、０．５Ｍのアスコルビン酸水溶液１．６ｍｌを添加した後、０．４２ｍＭの塩化金酸水溶液９．６ｍｌを０．５ｍＬ／ｍｉｎで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター（３０℃）中に２４時間静置し、銀ナノプレートの表面が金で被覆された金被覆銀ナノプレートの水懸濁液を作製した。
作製した金被覆銀ナノプレートの水懸濁液１．９５ｍＬに２００ｍＭのＰＢＳ緩衝液０．０５ｍＬおよび１９０ｍＭの炭酸ナトリウム水溶液０．０２５ｍＬを攪拌しながら添加し、ｐＨ調整した金被覆銀ナノプレート懸濁液（以下、懸濁液Ｍ２）を作製した。【００９５】
懸濁液Ｍ２の主要分散媒は水であった。
懸濁液Ｍ２に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が３１ｎｍの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は８ｎｍであった。また、懸濁液Ｍ２に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は０．３０ｎｍであった。
懸濁液Ｍ２におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は０．９４ｎＭであった。
懸濁液Ｍ２におけるＰＶＰの濃度は７８μＭであった。
懸濁液Ｍ２のｐＨは、室温下（２０℃）で７．３であった。
懸濁液Ｍ２の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して０．００１５質量％であった。【００９６】
１−４．ｐＨ調整した金被覆銀ナノプレート懸濁液（懸濁液Ｎ２）の調製
実施例１１の１−１−３で作製した銀ナノプレート懸濁液Ｂ２の１２０ｍｌに、０．１２５ｍＭのＰＶＰ（分子量：４０，０００）の水溶液９．１ｍｌを添加し、０．５Ｍのアスコルビン酸水溶液１．６ｍｌを添加した後、０．４２ｍＭの塩化金酸水溶液９．６ｍｌを０．５ｍＬ／ｍｉｎで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター（３０℃）中に２４時間静置し、銀ナノプレートの表面が金で被覆された金被覆銀ナノプレートの水懸濁液を作製した。
作製した金被覆銀ナノプレートの水懸濁液１．９５ｍＬに２００ｍＭのＰＢＳ緩衝液０．０５ｍＬおよび２００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液を攪拌しながら添加し、ｐＨ調整した金被覆銀ナノプレート懸濁液（以下、懸濁液Ｎ２）を作製した。【００９７】
懸濁液Ｎ２の主要分散媒は水であった。
懸濁液Ｎ２に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が３１ｎｍの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は８ｎｍであった。また、懸濁液Ｎ２に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は０．３０ｎｍであった。
懸濁液Ｎ２におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は０．９４ｎＭであった。
懸濁液Ｎ２におけるＰＶＰの濃度は７．８μＭであった。
懸濁液Ｎ２のｐＨは、室温下（２０℃）で１１．５であった。
懸濁液Ｎ２の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して０．００１５質量％であった。【００９８】
２．金被覆銀ナノプレートへの抗体の担持及びイムノクロマトグラフィーに使用する展開液の作製
５ｍＭのＰＢＳ（−）緩衝液中における濃度５０μｇ／ｍＬのアフラトキシンＢ１に対する抗体（品名：ＡＦＢ１（Ａｆｌａｔｏｘｉｎ  Ｂ１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ、製造元：ＩＭＭＵＮＥ  ＣＨＥＭ）の溶液０．２ｍＬと、金被覆銀ナノプレート懸濁液（懸濁液Ｋ２、Ｌ２、Ｍ２又はＮ２）１．８ｍＬを混合し、得られた混合物を室温下で３０分間振とうした。次いで、遠心分離（２５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）を行い、抗体を担持した金被覆銀ナノプレートを沈殿させ、上澄み液１．８５ｍＬを除去した。その後、抗体を担持した金被覆銀ナノプレートを４．９μＭのＢＳＡを含有する５ｍＭ ＰＢＳ（−）緩衝液で再分散させ、紫外可視近赤外分光光度計（装置名：紫外可視近赤外分光光度計ＭＰＣ３１００ＵＶ−３１００ＰＣ、製造元：株式会社島津製作所）を使用して消光度（Ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ）２．０になるように調整し、懸濁液である展開液Ｋ２、Ｌ２、Ｍ２又は、Ｎ２を作製した。展開液Ｋ２、Ｌ２、Ｍ２及びＮ２の最大吸収波長は、５３２ｎｍだった。作製された展開液と金被覆銀ナノプレート懸濁液との関係を表６に示す。
【表６】
0005960374.tif 000008
【００９９】
３．被験物質との相互作用のイムノクロマトグラフィーによる検出（その１）
実施例１の（２）と同様の手順により、アフラトキシンＢ１を被験物質としたイムノクロマトグラフィーを、抗アフラトキシンＢ１抗体（捕獲抗体）を直線状（図１０の検出ライン）に固定化したイムノクロマト試験紙を用いて行った。
イムノクロマト試験紙はイムノクロマト試験紙の受託作製会社（有限会社バイオデバイステクノロジー）より購入したものを使用した。捕獲抗体を直線状に固定する際、抗アフラトキシンＢ１抗体を５ｍＭ ＰＢＳ（−）緩衝液で濃度１ｇ／ｍＬに調整した溶液を使用した。
第１展開液（図１０（ａ）で用いる展開液）は、５ｍＭのＰＢＳ（−）緩衝液中におけるアフラトキシンＢ１（品名：アフラトキシンＢ１、製造元：Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）の溶液であった。第１展開液として、アフラトキシンＢ１の濃度が０．６０μＭ、０．０６μＭ、０．００６μＭ又は０Ｍ（ブランク）の溶液を用意した。
第２展開液は５ｍＭのＰＢＳ（−）緩衝液であった。
第３展開液（図１０（ｃ）で用いる展開液）は、上記２で作製した展開液Ｋ２、Ｌ２、Ｍ２又はＮ２であった。【０１００】
具体的な試験手順は以下の通りであった。
イムノクロマト試験紙に、第１展開液１５μＬを展開させた（図１０（ａ））。第１展開液の展開により、アフラトキシンＢ１が試験紙の検出ライン上に固定化された捕獲抗体によって捕獲される（図１０（ｂ））。
次いで、第２展開液３０μＬを展開させて、イムノクロマト試験紙上の余剰抗原の洗浄を行った。
最後に、第３展開液６０μＬを展開させた（図１０（ｃ））。第３展開液の展開により、試験紙の検出ライン上で捕獲されたアフラトキシンＢ１へ検出抗体（抗アフラトキシンＢ１抗体を担持した金被覆銀ナノプレート）が結合する（図１０（ｄ））。
同一の手順をアフラトキシンＢ１濃度の異なる各第１展開液を用いて繰り返した。【０１０１】
（１）イムノクロマトグラフィーの目視判定による評価
第３展開液展開後の検出ラインにおける金被覆銀ナノプレートの着色（マゼンタ）を目視で確認することにより、アフラトキシンＢ１の有無を判定した。結果を表７に示す。
【表７】
0005960374.tif 000009
【０１０２】
抗体を担持していない金被覆銀ナノプレートの懸濁液を第３展開液として使用しても検出ラインの色は変化しなかった（データは掲載せず）のに対して、抗アフラトキシンＢ１抗体を担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液を第３展開液として用いると、検出ラインがマゼンタに着色された。これは、上記抗アフラトキシンＢ１抗体を担持した金被覆銀ナノプレートが、検出ラインの捕捉抗体に捕捉されたアフラトキシンＢ１と複合体を形成したことによるものである。また、展開液Ｌ２を用いた場合にのみ、０．００６μＭのアフラトキシンＢ１を検出することができた。【０１０３】
（２）イムノクロマトグラフィーの輝度解析による評価
第３展開液展開後のイムノクロマト試験紙をスキャニング（装置名：Ｃａｎｏ Ｓｃａｎ ＬｉＤＥ５００Ｆ、製造元：キヤノン株式会社）し、検出ライン（捕獲抗体の固定化部分）の最低輝度と、検出ライン以外の部分の最低輝度とを画像解析ソフト（Ｉｍａｇｅ−Ｊ：アメリカ国立衛生研究所でＷａｙｎｅ Ｒａｓｂａｎｄが開発したオープン・ソースで公有の画像処理ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／））を用いて数値化した。最低輝度は、対象領域（検出ライン又は検出ライン以外の部分）における異なる箇所の輝度を５回測定し、得られた数値の中央値を採用した。輝度差は、次の式：
輝度差＝検出ラインの最低輝度−検出ライン以外の部分の最低輝度
により計算した。【０１０４】
（２−１）ｐＨの影響
展開液Ｋ２、Ｌ２又はＮ２を使用した場合の輝度差を表８及び図２７に示す。
【表８】
0005960374.tif 000010
【０１０５】
抗体を担持していない金被覆銀ナノプレートの懸濁液を第３展開液として使用しても輝度差は生じなかった（データは掲載せず）のに対して、抗アフラトキシンＢ１抗体を担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液を第３展開液として用いると、顕著な輝度差が測定された。これは、上記抗アフラトキシンＢ１抗体を担持した金被覆銀ナノプレートが、検出ラインの捕捉抗体に捕捉されたアフラトキシンＢ１と複合体を形成したことによるものである。また、ｐＨ７．３の懸濁液Ｌ２から調製した展開液Ｌ２又はｐＨ４．０の懸濁液Ｋ２から調製した展開液Ｋ２は、ｐＨ１１．５の懸濁液Ｎ２から調製した展開液Ｎ２よりも高い輝度差が生じたので、これよりも検出感度が高いことがわかった。展開液Ｌ２を使用した場合には、０．００６μＭのアフラトキシンＢ１においても輝度差が生じ、特に検出感度が高いことがわかった。【０１０６】
（２−２）水溶性高分子の影響
展開液Ｌ２又はＭ２を使用した場合の輝度差を表９及び図２８に示す。
【表９】
0005960374.tif 000011
【０１０７】
水溶性高分子であるＰＶＰの濃度が７．８μＭである懸濁液Ｌ２から調製した展開液Ｌ２は、０．００６μＭのアフラトキシンＢ１においても輝度差が生じ、ＰＶＰの濃度が７８μＭである懸濁液Ｍ２から調製した展開液Ｍ２よりも検出感度が高いことがわかった。【０１０８】
以上より、本発明の被験物質に対する特異的結合物質を担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液は、安定な懸濁液として調製されること、種々の被験物質の検出のために応用することができること、種々の検出手段に適合し得ること、及び、高い感度で該被験物質を検出することができることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明は、金被覆銀ナノプレートを標識として用いる検出技術の分野で利用することができる。本発明の懸濁液を用いることにより、多様な被験物質の検出において正確な判定が可能となる。
【図１】
0005960374.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
0005960374.tif 000019
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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