(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＤＣＹ３（Ａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ  ３）遺伝子のメチル化水準を測定する製剤であって、単離された生物学的試料におけるＡＤＣＹ３遺伝子について当該製剤により測定されるメチル化水準が正常対照群より低ければ当該試料は胃癌であることを示しているとする
胃癌マーカー検出用組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物を含む胃癌診断用キット。
【請求項３】
前記キットは、ＲＴ−ＰＣＲキット、競争的ＲＴ−ＰＣＲキット、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲキット、ＤＮＡチップキット又はタンパク質チップキットであることを特徴とする
請求項２に記載の胃癌診断用キット。
【請求項４】
ＡＤＣＹ３遺伝子のメチル化水準を測定する前記製剤は、
（ａ）脱メチル化シトシン塩基を修飾する組成物、
（ｂ）配列番号２２と配列番号２３のヌクレオチドを含むプライマー対、配列番号２４と配列番号２５のヌクレオチドを含むプライマー対、及び配列番号２６と配列番号２７のヌクレオチドを含むプライマー対、からなるグループから選ばれる、ＡＤＣＹ３遺伝子のメチル化された配列に特異的な１以上のプライマー対、
（ｃ）配列番号２８と配列番号２９のヌクレオチドを含む、ＡＤＣＹ３遺伝子配列に特異的なプライマー対、
を含むことを特徴とする
請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
（ａ）単離された生物学的試料を提供する工程と、
（ｂ）ＡＤＣＹ３遺伝子のメチル化水準を測定する製剤で前記生物学的試料を処理する工程と、
（ｃ）前記（ｂ）工程で測定されたＡＤＣＹ３のメチル化水準を正常対照群と比較し、前記生物学的試料のメチル化水準が正常対照群より低いことを胃癌であることを示すものとする工程と、
を含む
ＡＤＣＹ３遺伝子のメチル化水準を測定することにより胃癌の診断用情報を提供する方法。
【請求項６】
（ａ）ＡＤＣＹ３ポリペプチドを発現する細胞を、胃癌治療剤候補物質で処理する工程と、
（ｂ）前記細胞内のＡＤＣＹ３遺伝子のメチル化水準を測定する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）において測定された前記メチル化水準が、前記候補物質を処理する前より高い場合、前記候補物質を胃癌治療剤であるとする工程と、
を含む
胃癌治療剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胃癌診断及び治療のためのＡＤＣＹ３（Adenylate cyclase 3）の用途に関し、より詳しくは、ＡＤＣＹ３のｍＲＮＡ又はそのタンパク質の発現水準、又はメチル化水準を測定する製剤を含む胃癌マーカー検出用組成物、前記組成物を含む胃癌診断用キット、生物学的試料に前記製剤を処理し、製剤と相補的に結合する物質の有無及びその量を対照群と比較することによって、胃癌を診断する方法、ＡＤＣＹ３ポリヌクレオチド又はＡＤＣＹ３ポリペプチドを抑制することができる製剤を含む胃癌治療及び予防用組成物、及び前記組成物を個体に投与し、胃癌を治療する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
全世界的に、胃癌は、癌による死亡の１、２位を争う死亡要因として知られている。特に、２０１１年に発表された中央癌登録本部資料によれば、２００９年に我が国では、胃癌が全体癌発生の１５．４％で２位となっており、男性では癌のうち１位を占めるほどに有病率の高い癌として知られている。
胃癌は、全く症状がない場合から激しい痛みに至るまで様々な様相を示している。また、胃癌の症状は、ある特定の特性を有するのではなく、一般的な消化器症状を示す。一般に、胃癌の初期には、症状がない場合がほとんどであり、あるとしても軽微であり、若干の消化不良や上腹部不便感を感じる程度であることから、ほとんどの人がこれを看過し易く、胃癌の死亡率を高める原因になることが多い。
【０００３】
現在までの胃癌の検査手段は、物理的なものが大部分だった。一つ目の方法としては胃腸Ｘ線撮影で、二重造影法、圧迫撮影法、粘膜撮影法などがある。二つ目の方法としては、胃内視鏡で胃の中を目で直接観察可能となり、Ｘ線検査では見つからない非常に小さな病変も見つけることができるだけでなく、胃癌が疑わしい場所で、直接組織検査を行うことができ、その診断率を高めている。しかし、この方法は、衛生上の問題と検査が進む間、患者に苦痛を与える短所がある。そこで、近頃は、胃癌から特異的に発現される遺伝子マーカーの発現水準を測定することによって、胃癌を診断しようとする研究が活発に行われている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者らは、苦痛と不便を最小化しうる胃癌の診断方法及び治療剤を開発するために鋭意研究を行った結果、特定遺伝子及び遺伝子の発現産物が胃癌診断マーカーとしてだけでなく、治療剤のターゲットとして使用できることを確認し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の目的は、ＡＤＣＹ３（Adenylate cyclase 3）のｍＲＮＡ又はそのタンパク質の発現水準、又はメチル化水準を測定する製剤を含む胃癌マーカー検出用組成物を提供することである。
【０００６】
本発明の別の目的は、前記組成物を含む胃癌診断用キットを提供することである。
【０００７】
本発明のさらに別の目的は、生物学的試料に、ＡＤＣＹ３のｍＲＮＡ又はそのタンパク質の発現水準を測定する製剤を処理し、前記製剤と前記製剤に相補的なポリヌクレオチド又はタンパク質の結合を検出する一方、前記検出された量を正常対照群と比較し、胃癌を診断する方法を提供することである。
【０００８】
本発明のさらに別の目的は、ＡＤＣＹ３  ｍＲＮＡの発現を抑制するオリゴヌクレオチド、又はＡＤＣＹ３タンパク質の活性を抑制する抗体又はその抗原結合断片を含む胃癌治療及び予防用組成物を提供することである。
【０００９】
本発明のさらに別の目的は、前記組成物を個体に投与する工程を含む胃癌の治療方法を提供することである。
【００１０】
本発明のさらに別の目的は、ＡＤＣＹ３ポリペプチドを発現する細胞に、胃癌治療剤候補物質を処理する工程及びＡＤＣＹ３ポリペプチドの発現水準を測定する工程を含む胃癌治療剤のスクリーニング方法を提供することである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のＡＤＣＹ３を胃癌診断用マーカーとして用いたとき、高診断感度及び特異度を有し、胃癌を診断することができ、胃癌による死亡率の低減に大きく寄与し得る利点がある。更に、本発明のＡＤＣＹ３の発現を調節し得る製剤を用い、胃癌の予防及び治療に応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】胃癌細胞及び組織におけるＡＤＣＹ３の発現量を示す。図１ａは、胃癌細胞及び正常細胞におけるＡＤＣＹ３  ｍＲＮＡの発現量を示し、図１ｂは、胃癌組織及び正常組織におけるＡＤＣＹ３  ｍＲＮＡの相対的な量を示し、図１ｃは、様々なヒト組織におけるＡＤＣＹ３  ｍＲＮＡの発現を示す。
【図２】６個の胃癌細胞株（ＳＮＵ−２１６、ＳＮＵ−６３８、ＳＮＵ−７１９、ＡＧＳ、ＫＡＴＯＩＩＩ及びＭＫＮ２８）及び二つの正常細胞株（ＨＤＦ及びＨＭＥＣ）でのＲＴ−ＰＣＲによるＡＤＣＹファミリメンバーの発現の検出を示す。
【図３】ＡＤＣＹ３過剰発現された２９３細胞で、ＡＤＣＹ３の発現が細胞移動（図３ａ）、浸潤（図３ｂ）とコロニー形成（図３ｃ）に及ぼす影響、及びＳＮＵ−２１６胃癌細胞株で、ｓｉＲＮＡ処理にＡＤＣＹ３タンパク質発現の減少（図３ｄ）、細胞移動（図３ｅ）、浸潤（図３ｆ）、そしてコロニー形成能（図３ｇ）のＡＤＣＹ３サイレンシング効果を示す。
【図４】ＡＤＣＹ３発現構成（ｐＡｃ−ＧＦＰ−ＡＤＣＹ３）を感染させた２９３細胞で、ｍＲＮＡ及びタンパク質量の増加（Ａ）、ｃＡＭＰ量の増加（Ｂ）、及びｐ−ＣＲＥＢの増加（Ｃ）を示す。
【図５】図５aは、胃癌細胞株でＡＤＣＹ３のメチル化状態を分析したＣｐＧ島地図を示し（ａ、ｂ、ｃ；ＭＳ−ＨＲＭスクリーニング領域、ｄ；重亜硫酸塩塩基分析領域）、図５ｂは、ＨＲＭ分析結果を示し、ＨＲＭ１、２、３はＡのａ、ｂ、ｃ領域とそれぞれ一致する。図５ｃは、重亜硫酸塩塩基配列分析結果を示し、ＫＡＴＯＩＩＩ細胞株のみがパネルＡのｄ領域で激しいメチル化を示し、図５ｄは、５−Ａｚａ−ｄＣ処理によるジメチル化は陰性コントロールと比較した時、ＡＤＣＹ３プロモーターのメチル化を低減する結果を示し、図５ｅは、ｑＲＴ−ＰＣＲで評価した時、ＫＡＴＯＩＩＩ細胞株でＡＤＣＹ３発現を回復させる結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
一つの態様として、本発明は、ＡＤＣＹ３のｍＲＮＡ又はそのタンパク質の発現水準を測定する製剤を含む胃癌マーカー検出用組成物を提供する。
【００１４】
本発明の用語“ＡＤＣＹ３”とは、アデニル酸シクラーゼ３（adenylate cyclase 3）の略語であり、ＡＤＣＹ３は、アデニル酸シクラーゼファミリに属する約１２８ｋＤａに達する膜貫通酵素であり、第２次伝達者のｃＡＭＰの生成に関与するタンパク質を意味する。
【００１５】
前記ＡＤＣＹ３タンパク質は、１０余通りのタイプが知られているアデニル酸シクラーゼファミリの３番タイプであり、これをＡＤＣＹと命名している。これらのファミリのうちの一部は、いくつかの癌組織で発現が増加すると知られているが、本発明のＡＤＣＹ３と関連して、胃癌特異的発現増加について知られたものはなかった。ＡＤＣＹ３のタンパク質及びｍＲＮＡ情報は、公知のデータベースなどから得ることができる。例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎＢＡｎｋなどから得ることができるが、これらに制限されない。前記タンパク質のアミノ酸配列情報はＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ.ＮＰ＿００４０２７であってもよいが、これらに制限されない。
【００１６】
本発明のＡＤＣＹ３が胃癌において発現が増加するという事実を本発明で初めて明らかにした。本発明者らは実施例を通じて、６個の胃癌細胞株（ＳＮＵ−２１６、ＳＮＵ−６３８、ＳＮＵ−７１９、ＡＧＳ、ＫＡＴＯＩＩＩ、ＭＫＮ−２８）と２個の正常ヒト細胞株（ＨＤＦ、ＨＭＥＣ）でＡＤＣＹ３の発現水準において胃癌細胞株が正常細胞株と比較したとき、顕著に高いということを確認した（図１ａ）。さらに、周辺の正常部位と比較したときも、高いＡＤＣＹ３発現を示すことを確認することで（図１ｂ）、前記ＡＤＣＹ３が胃癌特異的診断マーカーとして利用できることを確認した。
【００１７】
本発明において、用語“マーカー又は診断マーカー（diagnosis marker）”とは、胃癌細胞又は胃癌疾患を持つ個体を、正常細胞又は正常個体と区分して、診断できる物質であり、正常細胞に比べて癌を持つ細胞又は個体で増加又は減少を示すポリペプチド、タンパク質又はポリヌクレオチド（例：ｍＲＮＡ等）、脂質、糖脂質、糖蛋白質又は糖（単糖類、二糖類、オリゴ糖類等）などのような有機生体分子を含む。本発明の目的上、本発明の胃癌診断マーカーは、正常細胞又は正常組織の細胞に比べて、胃癌細胞で特異的に高水準の発現を示すＡＤＣＹ３ポリペプチド又はこれをコーディングするポリヌクレオチドである。
【００１８】
本発明において、“ｍＲＮＡ発現水準測定”とは、胃癌を診断するために生物学的試料から胃癌マーカー遺伝子のｍＲＮＡ存在有無と発現程度を確認する過程であり、ｍＲＮＡの量を測定することによって分かる。そのための分析方法としては、ＲＴ−ＰＣＲ、競争的ＲＴ−ＰＣＲ（Competitive RT-PCR）、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Real-time RT-PCR）、ＲＮａｓｅ保護分析法（RPA; RNase
protection assay）、ノーザンブロッティング（Northern blotting）、ＤＮＡチップなどがあるが、これらに制限されるものではない。
【００１９】
本発明において、“タンパク質発現水準測定”とは、癌を診断するために生物学的試料における胃癌マーカー遺伝子で発現されたタンパク質の存在有無と発現程度を確認する過程であり、前記遺伝子のタンパク質に対して特異的に結合する抗体を用いて、タンパク質の量を確認する。そのための分析方法としては、ウェスタンブロット、ＥＬIＳＡ（enzymelinkedimmunosorbentasay）、放射線免疫分析（RIA： Radioimmuno assay）、放射免疫拡散法（radioimmunodiffusion）、オクテロニー（Ouchterlony）免疫拡散法、ロケット（rocket）免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈澱分析法（Immunoprecipitation
assay）、補体固定分析法（Complement
Fixation Assay）、ＦＡＣＳ、タンパク質チップ（protein chip）などがあるが、これらに制限されるものではない。
好ましくは、前記ｍＲＮＡ水準を測定する製剤は、本発明のＡＤＣＹ３ポリヌクレオチド又はその断片に対するプライマー対、プローブ、又はアンチセンスヌクレオチド（anti-sense nucleotide）であり、本発明のポリヌクレオチド配列により当業者がプライマー、プローブ、又はアンチセンスヌクレオチド配列を容易にデザインすることができる。
【００２０】
本発明において、用語“プライマー”は、短い遊離の３’ヒドロキシル基（free 3 '-hydroxyl group）を有する核酸配列であり、相補的リンテンプレートと塩基対を形成することができ、テンプレート鎖複写のための開始点として機能する短い核酸配列を意味する。プライマーは、適切な緩衝溶液及び温度で重合反応（即ち、ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素）のための試薬及び異なる４つヌクレオシドトリホスフェートの存在下でＤＮＡ合成を開示することができる。本発明では、ＡＤＣＹ３ポリヌクレオチドのセンス及びアンチセンスプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅を実施し、所望の生成物の生成有無を通して胃癌を診断することができる。ＰＣＲ条件、センス及びアンチセンスプライマーの長さは、当業界に公知されたものに基づいて適切に変えればよい。
【００２１】
本発明において、用語“プローブ”とは、ｍＲＮＡと特異的に結合しうる、短くは数個の塩基〜長くは数百個の塩基に該当するＲＮＡ又はＤＮＡなどの核酸断片を意味し、標識化（labeling）され、特定ｍＲＮＡの存在有無を確認することができる。プローブは、オリゴヌクレオチドプローブ、一本鎖ＤＮＡプローブ、二本鎖ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブなどの形態に作製されてもよい。本発明では、本発明のＡＤＣＹ３ポリヌクレオチドと相補的なプローブを用いて、ハイブリダイズし、ハイブリダイゼーション有無を通して胃癌疾患の発病を診断することができる。適当なプローブの選択及びハイブリダイゼーション条件は、当業界に公知されたものに基づいて変えればよい。
【００２２】
本発明のプライマー又はプローブは、ホスホルアミデート（Phosphoramidite）固体支持体方法、又はその他の広く公知された方法を用いて化学的に合成することができる。また、このような核酸配列は、当該分野に公知された多くの手段を用いて変形してもよい。このような変形の非制限的な例としては、メチル化、キャップ化、天然ヌクレオチド一つ以上の同族体への置換、及びヌクレオチド間の変形、例えば、荷電されない連結体（例：メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメート等）又は荷電された連結体（例：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）への変形がある。
【００２３】
前記プライマー又はプローブは、８個又はそれ以上のヌクレオチドを含むのが好ましく、ハイブリダイゼーション方法は、本発明のＡＤＣＹ３ポリヌクレオチドに、前記プライマー又はプローブを露出又は接触させることで達成される。好ましくは、これらの配列は、非特異的結合を最小化するよう適宜調節された条件で、ハイブリダイズされる。例えば、約８０％〜９０％の同じ配列の検出のための適切な条件は、０．２５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２，６．５％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン内、４２℃で、一晩ハイブリダイズし、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ内、５５℃で最終洗浄することを含む。また、約９０％以上の同じ配列の検出のための適切な条件は、０．２５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２、６．５％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン内、６５℃で一晩ハイブリダイゼーションし、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ内、６０℃で最終洗浄することを含む。
【００２４】
本発明のＡＤＣＹ３タンパク質（以下、‘ＡＤＣＹ３ポリペプチド’と記載することがある。）水準を測定する製剤は、好ましくは抗体である。本発明において用語“抗体”とは、当該分野で公知された用語であり、抗原性部位に対して指示される特異的なタンパク質分子を意味する。本発明の目的上、抗体は、本発明のマーカーであるＡＤＣＹ３ポリペプチドに対して特異的に結合する抗体を意味し、このような抗体は、各遺伝子を通常的な方法で発現ベクターにクローニングし、前記マーカー遺伝子によりコーディングされるタンパク質を得て、得られたタンパク質から通常的な方法で製造することができる。ここには、前記タンパク質で作られ得る部分ペプチドも含まれる。本発明の部分ペプチドとは、最小限７個のアミノ酸、好ましくは、９個のアミノ酸、より好ましくは、１２個以上のアミノ酸を含む。本発明の抗体の形態は、特に制限されなく、ポリクロナール抗体、モノクロナール抗体又は抗原結合性を有するものであればその一部も本発明の抗体に含まれ、あらゆる免疫グロブリン抗体が含まれる。さらに、本発明の抗体には、ヒト化抗体などの特殊抗体も含まれる。このような本発明のＡＤＣＹ３タンパク質に対する抗体は、当業界の公知された方法で製造され得る全ての抗体を含む。
【００２５】
本発明の胃癌診断マーカーの検出に使われる抗体は、２個の全長の軽鎖及び２個の全長の重鎖を有する完全な形態だけでなく、抗体分子の機能的な断片を含む。抗体分子の機能的な断片とは、少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）、Ｆ（ａｂ'）２及びＦｖなどがある。
【００２６】
また、本発明の胃癌マーカー検出用組成物は、ＡＤＣＹ３遺伝子のメチル化水準を測定する製剤を含んでいてもよい。最近、癌と関連した遺伝子発現でＤＮＡメチル化の役割が研究されており、一般に、ＤＮＡメチル化によってｍＲＮＡ発現が調節されることが明らかになっている。これにより、本発明ではＡＤＣＹ３遺伝子のメチル化水準を測定することで、メチル化水準が低い場合、胃癌と診断することができる。
【００２７】
本発明の用語“メチル化”は、塩基にメチル基が付いて遺伝子発現様相が変わることを意味する。本発明の目的上、メチル化は、ＡＤＣＹ３遺伝子で起こる。本発明のメチル化は、具体的にＡＤＣＹ３遺伝子の塩基配列にＣとＧの塩基が連続して存在することを、ＣｐＧが密集されているＣｐＧ島のシトシンで起こることを含み、それにより、転写因子の結合が妨害され、特定遺伝子の発現が遮断されることを含む。
【００２８】
本発明の用語“メチル化水準の測定”は、核酸配列のメチル化程度を測定することであり、本発明の目的上、ＡＤＣＹ３遺伝子のメチル化水準を測定することが重要である。前記メチル化水準の測定は、当業界のメチル化水準を測定する公知方法を制限がなく使用可能である。その例としては、Ｇｏｌｄｅｎｇａｔｅ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐａｎｅｌ
Ｉ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ、ＥｐｉＴＹＰＥＲ（登録商標）分析、メチル化特異的なＰＣＲ（methylation-specific polymerase chain reaction）（以下、‘ＭＳＰ’ともいう。）や自動塩基分析などの方法で検査することができる。
【００２９】
本発明の一実施例では、ＡＤＣＹ３発現の高い胃癌細胞株でＡＤＣＹ３遺伝子のメチル化水準が低いことを確認することで（図５ｃ）、プロモーター部位のＣｐＧ島のＤＮＡメチル化により、ＡＤＣＹ３発現が調節されることを確認し、ＡＤＣＹ３遺伝子のメチル化水準を測定する場合、胃癌を診断しうるマーカーとして使用できることを確認した。
【００３０】
本発明の用語“胃癌”とは、胃で発生する癌腫（悪性腫瘍）を総称する意味である。胃に発生する悪性腫瘍には、胃腺癌、リンパ腫、胃粘膜下腫瘍、平滑筋肉種などがあり、この中の９８％が胃腺癌である。好ましくは、胃癌とは、胃腺癌を意味する。胃癌の症状としては、上腹部不快感、上腹部痛み、消化不良、膨満感、食欲不振などがあるが、このような症状だけでは診断が難しく、一般的に放射線検査又は胃内視鏡などで診断が可能であり、組織検査で最終診断することができる。本発明では、上記の面倒且つ複雑な診断方法を使用しなく、単に胃癌マーカーであるＡＤＣＹ３の量を測定することで簡単に診断できる利点がある。
【００３１】
本発明の好ましい一実施例では、本発明に係るＡＤＣＹ３を除いた残りのＡＤＣＹメンバーは、胃癌特異的に発現しないことを確認した（図２）。このような結果は、全てのＡＤＣＹが胃癌で発現するものではなく、ＡＤＣＹメンバー中でＡＤＣＹ３だけが胃癌特異的に発現するということを意味し、それにより、ＡＤＣＹ３を胃癌特異的マーカーとして利用可能であることを示唆するので、ＡＤＣＹ３のｍＲＮＡ又はそのタンパク質の発現水準、又はメチル化水準を測定する製剤を含む本発明の胃癌マーカー検出用組成物は、前記胃癌の診断のためのマーカーとして利用できることを確認した。
【００３２】
別の一つの態様として、本発明は、ＡＤＣＹ３のｍＲＮＡ又はそのタンパク質の発現水準を測定する製剤を含む胃癌診断用キットを提供する。
【００３３】
本発明において、用語“診断”とは、生物学的試料又は組織サンプルで本発明のＡＤＣＹ３ポリペプチド及びこれをコーディングするポリヌクレオチドの存在又は部材を測定することで、前記遺伝子の発現と関連した疾患の存在又は特徴を確認することを意味する。
【００３４】
本発明のキットは、胃癌診断マーカーであるＡＤＣＹ３ポリペプチド又はこれをコーディングするポリヌクレオチドの発現水準を確認することで、マーカーを検出することができる。本発明のキットは、胃癌診断マーカーの発現水準を測定するためのプライマー、プローブ又は選択的にマーカーを認知する抗体又は抗原結合能を維持するこれらの断片だけでなく、前記ポリペプチド又はポリヌクレオチド分析方法に適した一つ又はそれ以上の他の構成成分組成物又は装置が含まれ得る。例えば、本発明のポリヌクレオチド又は遺伝子の定量検出のための診断キットは、ＡＤＣＹ３ポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドに特異的に結合する１種以上のオリゴヌクレオチドを含んでもよいが、ＡＤＣＹ３のオチド又は一部配列に対応するプライマー、逆転写酵素、Ｔａｑポリメラーゼ、ＰＣＲ用プライマー及びｄＮＴＰを含んでいてもよく、ポリヌクレオチド発現水準を測定するために、前記“ｍＲＮＡ発現水準測定”と関連して記述された分析方法を用いたキットを利用してもよい。
【００３５】
好ましくは、本発明のＡＤＣＹ３タンパク質の水準を測定する胃癌診断キットは、本発明のＡＤＣＹ３タンパク質に特異的に結合する抗体を含んでもよい。また、タンパク質水準を測定するキットは“タンパク質発現水準測定”のために使用される前述された方法を用いたキットを制限することなく使用することができ、好ましくは、ＥＬＩＳＡキット又はタンパク質チップキットであってもよい。
【００３６】
抗体を用いたタンパク質発現有無測定は、ＡＤＣＹ３タンパク質及びその抗体間の抗原−抗体複合体を形成することで測定され、様々な方法で前記複合体の形成量を測定することで、定量的に検出することができるようになる。
【００３７】
本発明において、用語“抗原−抗体複合体”とは、胃癌マーカータンパク質とこれに特異的な抗体の結合物を意味し、原−抗体複合体の形成量は、検出ラベル（detection label）のシグナルの大きさを通して定量的な測定が可能となる。
【００３８】
例えば、胃癌疑いのある個体及び正常対照群の抗原−抗体複合体形成量を比較することで、ＡＤＣＹ３タンパク質の有意な発現量増加を判断し、特定個体での胃癌発病を診断することができる。胃癌の疑いのある個体の試料に、本発明のＡＤＣＹ３タンパク質に対する抗体を処理すれば、ＡＤＣＹ３タンパク質と抗体が抗原−抗体複合体を形成することとなり、これは、前述されたＥＬIＳＡ、ＲＩＡ、サンドウィッチ分析、ウェスタンブロット、放射線免疫拡散法、オクテロニー、免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈澱分析、補体固定分析、ＦＡＣＳ、タンパク質チップ及び免疫ブロット法を含むキットによりその量を測定することができる。また、前記分析結果を正常個体の定量結果と比較分析することで、本発明のＡＤＣＹ３タンパク質の発現増加に伴う胃癌発病を診断することができる。
【００３９】
さらに別の一つの態様として、本発明は、生物学的試料に、ＡＤＣＹ３のｍＲＮＡ又はそのタンパク質の発現水準を測定する製剤を処理し、前記製剤と前記製剤に相補的なポリヌクレオチド又はタンパク質の結合を検出する一方、前記検出された量を正常対照群と比較し、胃癌を診断する方法を提供する。
前記胃癌の診断方法は、本発明で胃癌マーカーとして明らかにされたＡＤＣＹ３の水準をｍＲＮＡ水準又はタンパク質水準で検出することで、胃癌の発病を診断することができる。
【００４０】
本発明において、用語“生物学的試料”とは、ＡＤＣＹ３遺伝子又はタンパク質発現水準を検出し得る試料を意味し、その例には、組織、細胞、全血、血清、血漿、唾液、喀痰、脳脊髓液又は尿のような試料などを含むが、これらに制限されない。前記生物学的試料でｍＲＮＡ又はタンパク質の分離は公知の工程を用いて行うことができる。
【００４１】
本発明の方法は、正常対照群における遺伝子発現水準を胃癌疑いのある個体の遺伝子発現水準と比較することで、胃癌疑いのある個体における実際の胃癌疾患発病を診断することができる。即ち、胃癌と推定される試料又は細胞から本発明のマーカーの発現水準を測定し、正常試料又は細胞から本発明のマーカーの発現水準を測定し、両者を比較した後、本発明のマーカーの発現水準が正常試料ものより、胃癌と推定される試料由来のものに比べ、より高い水準に発現されれば、胃癌と推定される試料を胃癌と予測することができる。
【００４２】
好ましくは、前記方法は、本発明のＡＤＣＹ３ポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドをマーカーとして用いるとき、（ａ）生物学的試料を提供する工程と、（ｂ）前記生物学的試料に、ＡＤＣＹ３の発現水準を測定し得る製剤を処理する工程と、（ｃ）前記製剤と前記製剤に相補的なポリヌクレオチドの結合を検出する工程と、（ｄ）検出された量を正常対照群と比較する工程と、を含む。また、本発明のＡＤＣＹ３ポリペプチドマーカーを利用する場合、（ａ）生物学的試料を提供する工程と、（ｂ）前記生物学的試料に、ＡＤＣＹ３タンパク質に対する抗体を処理する工程と、（ｃ）抗体−抗原複合体を検出する工程と、（ｄ）検出された量を正常対照群と比較する工程と、を含んでもよく、前記方法を利用して本発明のＡＤＣＹ３タンパク質を検出することができる。
【００４３】
さらに別の一つの態様として、本発明は、ＡＤＣＹ  ｍＲＮＡの発現を抑制するオリゴヌクレオチド、又はＡＤＣＹ３タンパク質の活性を抑制する抗体又はその抗原結合断片を含む癌治療及び予防用組成物を提供する。
【００４４】
好ましくは、本発明の組成物は、ＡＤＣＹ３  ｍＲＮＡの発現を抑制する物質を含んでもよく、前記ｍＲＮＡの発現を抑制する物質は、ｓｉＲＮＡ,ｓｈＲＮＡ、アプタマー及びアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選ばれていてもよい。
【００４５】
本発明の用語“ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）”は、ＲＮＡ干渉又は遺伝子サイレンシングを媒介し得る約２０ヌクレオチド大きさの小さな核酸分子を意味し、ｓｉＲＮＡが細胞内に導入されれば、Ｄｉｃｅｒタンパク質により認知され、前記ｅＩＦ３ｍポリペプチドをコーディングする遺伝子を分解し、結局、遺伝子の発現を阻害する。前記ｓｉＲＮＡは、これらに制限されなく、好ましくは、配列番号１の核酸配列を有するものであってもよい。
【００４６】
“ｓｈＲＮＡ（short hairpin RNA）”は、ｓｉＲＮＡターゲット配列のセンス及びアンチセンス配列が５−９個の塩基で構成されたループ（loop）を挟んで位置した短ヘアピンＲＮＡ（short hairpin RNA）を意味する。
【００４７】
“アプタマー”とは、小さなＲＮＡ断片を意味し、２０〜６０ｎｔ程度の小さなサイズを有するオリゴマー分子である。配列に応じて、様々な３次元構造を有してもよく、特定物質と高い親和力を有することができ、目的とするターゲット配列と反応して、效果的に抑制が可能となる。
【００４８】
用語“アンチセンス”は、アンチセンスオリゴマーがワトソン・クリック塩基対形成によりＲＮＡ内の標的配列とハイブリダイズされ、標的配列内で、典型的にｍＲＮＡとＲＮＡ：オリゴマーヘテロ二量体の形成を許容する、ヌクレオチド塩基の配列及びサブユニット間バックボーンを有するオリゴマーを称する。オリゴマーは、標的配列に対する正確な配列相補性又は近似相補性を有してもよい。このアンチセンスオリゴマーは、ｍＲＮＡの翻訳を遮断又は阻害し、ｍＲＮＡのスプライス変異体を生産するｍＲＮＡのプロセシング過程を変えさせる。従って、本発明のアンチセンスオリゴマーは、ＡＤＣＹ３ポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドに相補的なアンチセンスオリゴマーである。
【００４９】
また、好ましくは、本発明の組成物は、ＡＤＣＹ３タンパク質の活性又は発現を抑制する物質を含む、癌の成長又は転移を抑制する組成物であってもよい。好ましくは、前記活性抑制物質は、ＡＤＣＹ３タンパク質を特異的に認識する抗体である。このような抗体は、単クローン抗体及びこれに対するキメラ抗体（chimeric antibody）、ヒト化抗体（humanized antibody）及びヒト抗体（human antibody）を全て含む。また、前記抗体は、ＡＤＣＹ３タンパク質を特異的に認識する結合の特性を有する限り、２個の重鎖（heavy chain）と２個の軽鎖（light chain）の全長を有する完全な形態だけでなく、抗体分子の機能的な断片を含む。抗体の分子の機能的な断片とは、少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味しており、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）,Ｆ（ａｂ'）２及びＦｖなどがある。
【００５０】
本発明の好ましい一実施例では、本発明に係るＡＤＣＹ３が過剰発現された細胞で細胞の移動性及び浸潤性を増加し、コロニー形成能を増加させることを確認することによって、腫瘍形成に関連していることを確認しており（図３ａ）〜３ｃ）、ＡＤＣＹ３特異的なｓｉＲＮＡを処理し、その発現を下向調節する場合、細胞の移動性及び浸潤性を低減し、コロニー形成能を低減することを確認することで、腫瘍形成と関連した効果を低減させることを確認した（図３ｄ〜３ｇ）。
【００５１】
したがって、本願発明の胃癌治療効果は、胃癌の転移抑制によって達成されるものであってもよい。一般に、胃癌のような悪性腫瘍は成長速度が速く、周辺組織に浸潤しながら転移（metastasis）が生じ、さらに悪化される。本願発明のＡＤＣＹ３発現及び活性抑制用組成物は、細胞の移動性及び浸潤性を低減させ、コロニー形成能を低減させ、胃癌転移を抑制することで、窮極的に胃癌を治療することができる効果がある。
【００５２】
好ましくは、本発明の組成物は、投与方式に応じて許容可能な担体を含んでいてもよい。
【００５３】
医薬的に許容しうる担体、賦形剤又は添加剤と一緒に混合されてもよい。医薬的に許容可能な担体の種類の例には、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、リポソーム及び前記成分のうち、いずれか一つの以上の成分を混合して使用してもよく、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液など通常的に使用される他の添加剤を更に含んでもよい。また、投与目的に応じて希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を添加し、水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒又は錠剤に製剤化することができ、標的器官に特異的に作用するよう標的器官又は組織特異的抗体又はその他のリガンドを前記担体と結合して使用することができる。前記のような担体、賦形剤又は添加剤の種類は、当業界の通常的な製剤を全て含んでもよく、前記例により使用可能な担体、賦形剤又は添加剤の種類が制限されるものではない。
【００５４】
前記のような組成物は、目的又は必要に応じて、当業界で使用される通常的な方法、投与経路、投与量に従って適切に個体に投与できる。投与経路の例は、経口、非経口、皮下、腹腔内、肺内、及び鼻腔内であり、局部的免疫抑制治療のために、必要であれば、病変内の投与を含む適宜方法で投与される。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与が含まれる。また、当業界に公知された方法により、適切な投与量及び投与回数が選ばれてもよく、実際に投与される本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ又は、ｓｈＲＮＡを含む組成物の量及び投与回数は、予防又は治療しようとする症状の種類、投与経路、性別、健康状態、食餌、個体の年齢及び体重、及び疾患の重症度のような様々な因子により適切に決定される。
【００５５】
さらに別の一つの態様として、本発明は、前記組成物を個体に投与する工程を含む胃癌の治療方法を提供する。個体に投与される組成物は、前記同様であり、ＡＤＣＹ３  ｍＲＮＡの発現を抑制するオリゴヌクレオチド、又はＡＤＣＹ３タンパク質の活性を抑制する抗体又はその抗原結合断片を含む胃癌治療及び予防用組成物であってもよい。
【００５６】
個体に投与される組成物の形態は、前述の通りに、投与方式により許容可能な担体を含んでもよく、その投与方法、投与経路、投与量についても前述のように、様々な因子により適切に決定される。
【００５７】
さらに別の一つの態様として、本発明は、ＡＤＣＹ３ポリペプチドを発現する細胞に胃癌治療剤候補物質を処理する工程と、ＡＤＣＹ３ポリペプチドの発現水準を測定する工程と、を含む胃癌治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００５８】
本発明の胃癌治療剤スクリーニング方法は、候補物質の処理によりＡＤＣＹ３発現が増加される場合、前記候補物質を胃癌疾患を促進する物質と判断できる。また、候補物質によりＡＤＣＹ３発現が減少する場合、処理された候補物質が胃癌治療剤として使用できるものと判断できるようにする。このようなスクリーニング方法において、その活性測定は、ＡＤＣＹ３発現水準によって容易に判断される。
【００５９】
さらに別の一つの態様として、本発明は、ＡＤＣＹのｍＲＮＡ又はそのタンパク質の発現水準、又はメチル化水準を測定する製剤、又はこれを含む組成物の胃癌マーカー検出用途を提供する。前記ＡＤＣＹ３及び組成物については前記同様であり、その用途を提供することによって、胃癌診断に用いることができる。
【００６０】
さらに別の一つの態様として、本発明は、ＡＤＣＹ３ｍＲＮＡの発現を抑制するオリゴヌクレオチド、又はＡＤＣＹ３タンパク質の活性を抑制する抗体又はその抗原結合断片、又はこれを含む組成物の胃癌治療及び予防用途を提供する。前記ＡＤＣＹ３及び組成物については前記同様であり、その用途を提供することによって、胃癌治療及び予防に使用することができる。
【００６１】
実施例
以下、本発明を、実施例を参照して詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に実施するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６２】
実施例１．細胞及び組織試料の準備
ヒト癌細胞株（ＳＮＵ−２１６、ＳＮＵ−６３８、ＳＮＵ−７１９−ＫＣＬＢ、Seuol, Korea;ＡＧＳ、ＫＡＴＯＩＩＩ、ＭＫＮ２８、ＨＣＴ−１１６、ＳＮＵ−８１、ＳＫ−ＢＴ−３、Manassas, USA）、ヒト表皮繊維芽細胞（ＨＤＦ、ＡＴＣＣから分譲される。）及び２９３細胞は１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳと１×ペニシリン−ストレプトマイシン（Invitrogen, USA）を含む培地（Cellgro,USA）で培養した。ヒト乳房表皮細胞（ＨＭＥＣ、Lonza,Switzerland）は、供給者から提供を受けた方法に従って培養した。また、正常及び胃癌組織（表１）は、国立癌センターの機関倫理審議委員会からヒト対象の研究承認（承認番号：ＮＣＣＮＣＳ−０８−１２７）を受け、ヘルシンキ宣言の原則に基づいて確保した。
【００６３】
【表１】
0006005272.tif 000002
【００６４】
実施例２．ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＲＴ−ＰＣＲ及びノーザンブロットを介したＡＤＣＹ３のｍＲＮＡ確認
【００６５】
ｃＤＮＡは、培養細胞から２μｇの無作為プライマーとＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ  Ｆｉｓｒｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Invtrogen）を用いて合成した。また、Ｈｕｎａｍ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅｃ  ＤＮＡ  ｐａｎｅｌＩ（Clontech, USA）とＨｕｍａｎ  Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＭＴＣ  ｐａｎｅｌ（Clontech, USA）を使用し、ヒト組織ｃＤＮＡを得た。ＲＴ−ＰＣＲとｑＲＴ−ＰＣＲのためのプライマーは、インターネットサイト“Primer3（http：//frodo.wi.mit.edu/primers/）”を利用し、ＡＤＣＹについて二つの連続的なエキソンを含むよう作製した（表２）。
【００６６】
【表２】
0006005272.tif 000003
【００６７】
ｑＲＴ−ＰＣＲ反応は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０（Roche
appliedscience, UK）とＡＢＩ  ７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ-Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Applied Biosystems）を用い、β−アクチンをもとに、相対的な量を測定するか、絶対量（absolute quantification）をもとにする標準曲線を用いて定量を行った。
【００６８】
ノーザンブロットのために、全体ＲＮＡ（２０μｇ／レーン）をＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ｍｅｍｂｒａｎｅ（Amersham
Biosicence, UK）にＵＶ−固定し、３２Ｐ−標識されたプローブが含まれたＵＬＴＲＡｈｙｂ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ambion,
USA）で、４２℃で、一晩間反応させた後、−８０℃で、Ｂｉｏ  Ｍａｘ  ＭＳフィルム（Kodak, USA）を用いて確認した。
【００６９】
実施例３．ＡＤＣＹ３発現依存型細胞移動と調節による浸潤評価
ＡＤＣＹ３の過剰発現のために、ＨＥＫ―２９３細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Invitrogen）を用いて、ｐＡｃＧＦＰ１−ＡＤＣＹ３ベクターを導入しており、陰性対照群として、ｐＡｃＧＦＰ１−Ｃ１ベクターを導入した。
【００７０】
また、ＡＤＣＹ３遺伝子の発現を抑制するために、６ウェルプレートに、それぞれ５×１０４細胞濃度のヒト胃癌細胞ＳＮＵ−２１６を用意し、ＡＤＣＹ３特異的なｓｉＲＮＡ（ｓｉＡＤＣＹ３：ＳＩ０００５８８４９５’−ＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＡ−３’、配列番号１）及び陰性対照群として使用されたｓｉＲＮＡ（Cat.No.1027280, Qiagen）をＨｉＰｅｒｆｅｃｔ（Qiagen）を用いて処理した。
【００７１】
ＡＤＣＹ３のタンパク質発現を評価するために、抗−ＡＤＣＹ３（ａｂ１４７７８、Abcam, England）、抗−ＧＦＰ（ｓｃ―９９９６、Santa Cruz
Biotechnology, USA）、抗−ＣＲＥＢ、抗−リン酸化−ＣＲＥＢ  Ｓｅｒ１３３（#８２１２、Cell Signaling Technology, USA）、抗−β−アクチン、抗−α−チューブリン（Sigma-Aldrich, USA）抗体を用い、ウェスタンブロットを通じて総−ＣＲＥＢとリン酸化−ＣＲＥＢの量を測定した。
【００７２】
細胞移動は、３７℃で、８μｍのｐｏｒｅ  ｆｉｌｔｅｒ  ｉｎｓｅｒｔ（BD, USA）を用い、一晩下方に移動した細胞を１％クリスタルバイオレットで染色し、ＶＥＲＳＡｍａｘ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Molecular Devices, USA）を用い、Ａ５６４で測定し、確認した。
【００７３】
浸潤評価は、  Ｍａｒｔｉｇｅｌ−ｃｏａｔｅｄ  ｉｎｓｅｒｔで、４８時間、培養した後、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ（登録商標）（Sysmex, Japan）で染色された細胞等の数を測定し、確認した。
コロニー形成能は、６ウェルプレートにおいて、１ウェル当たり１×１０３細胞を７日間培養した後、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ（登録商標）で染色し、生き残ったコロニー数を測定し、確認した。
【００７４】
実施例４．ｃＡＭＰ量の測定
ＡＤＣＹ３とそれらのファミリタンパク質等の発現に伴う活性変化を確認するために、ＡＤＣＹ３発現に伴うｃＡＭＰ量の増加を確認した。１ウェル当たり２×１０４個の２９３細胞を含む９６ウェル培養皿上で、４００ｎｇのpＡｃＧＦＰ又はｐＡｃＧＦＰ−ＡＤＣＹ３を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いて形質導入した。
【００７５】
ｃＡＭＰ量は５０μＬの細胞溶解物をＣａｔｃｈＰｏｉｎｔ  ｃｙｃｌｉｃ−ＡＭＰ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Cat#R8088, Molecular Devices, Sunnyvale, USA）を用い、製造業者の方法に従って測定し、確認した。
【００７６】
実施例５．プロモーターメチル化分析とｉｎ ｖｉｔｒｏ脱メチル化
ＡＤＣＹ３プロモーターのメチル化状態を評価するために、  重亜硫酸塩処理された誘電体ＤＮＡに、ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｋｉｔ（ZYMO Research, USA）及びＥｐｉＤｅｓｉｇｎｅｒ（Sequenom,
USA）を用い、デザインしたメチル化した特異的なプライマーを処理した（表３）。
【００７７】
【表３】
0006005272.tif 000004
【００７８】
高−解像度溶融実験（High-resolution melting assay;
MS-HRM）を１０ｎｇの重亜硫酸塩が処理された誘電体ＤＮＡとＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Roshe applied
science）のＲｅｓｏＬｉｇｈｔ  ｄｙｅを用い、製造業者から提供された方法で処理した後、Ｇｅｎｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｐｒｏｇｒａｍ（Roshe）を用いて分析した。重亜硫酸塩配列の確認のために、３９ＣｐＧ部位を含むプロモーター領域を重亜硫酸塩処理した胃癌細胞誘電体ＤＮＡから増幅し、ＴＯＰＯ−ＴＡベクター（Invitrogen）を用いてクローニングし、３７３０ｘｌＤＮＡ分析器（Applied
Biosystems）を用いて、配列を確認した。
【００７９】
ＡＤＣＹ３で脱メチル化効果を確認するために、ＫＡＴＯＩＩＩ細胞を、最終濃度を１０μＭにし、９６時間、５−Ａｚａ−２'−デオキシシチジン（５−Ａｚａ−ｄＣ; Sigma Aldrich, USA）を処理するか、若しくは処理しない培地で培養し、ＡＤＣＹ３のｍＲＮＡ量をｑＲＴ−ＰＣＲを用いて測定した。
【００８０】
実施例６．統計学的分析
データの統計学的有意性は、Ｓｕｔｄｅｎｔ’Ｓ  ｔ−検定を用いて確認した。Ｐ−値は、０．０５より小さいとき、統計学的に有意と判断した。Ｓｕｔｄｅｎｔ’Ｓ  ｔ−検定はグループ間の差を測定して行った。
【００８１】
結果
１．胃癌でＡＤＣＹ３の増加された発現
２７名の胃癌患者で、正常組織と胃癌組織と間に比較したマイクロアレイ分析結果、ＡＤＣＹ３が胃癌組織及び細胞で顕著に過剰発現されることを確認し、ＡＤＣＹ３が胃癌診断のための遺伝子になり得ることを見出した。このような発見を確認するために、ＡＤＣＹ３の上向−調節がヒト胃癌の進行とどのような関わりあるのか確認するために、本発明者らは、ｑＲＴ−ＰＣＲを遂行し、ＡＤＣＹ３発現量を確認した。６個の胃癌細胞株（ＳＮＵ−２１６、ＳＮＵ−６３８、ＳＮＵ−７１９、ＡＧＳ、ＫＡＴＯＩＩＩ、ＭＫＮ−２８）と２個の正常ヒト細胞株（ＨＤＦ、ＨＭＥＣ）で、ＡＤＣＹ３のｍＲＮＡ量がほとんどの胃癌細胞株が正常細胞株と比較したとき、顕著に高いことが明らかになった（図１ａ）。また、２１個の韓国の胃癌細胞組織のうちの１９個（９５％）がＡＤＣＹ３  ｍＲＮＡの発現が高く示されており、特に、２１個中の１１個（５１．４％）が周辺の正常部位と比較したとき、高いＡＤＣＹ３発現を示した（図１ｂ）。
【００８２】
さらに、他の癌及び正常細胞株で、ＡＤＣＹ３の選択的スプライシングイソフォーム（alternative spliced isoform）の存在有無をノーザンブロット分析で確認した。スプライス変異体（splice varients）が見つけられなく、４.４ｋｂでＡＤＣＹ３の単転写体を測定することができ、このサイズは、データベースのｍＲＮＡのサイズと一致した（図１ｃ）。
【００８３】
２．胃癌でＡＤＣＹ３の増加された発現の特異性
ＡＤＣＹファミリは、ＡＤＣＹ1〜ＡＤＣＹ１０の１０個の互いに異なるメンバーで構成されており、いずれも、それらの活性部位の配列相同性を共有する。進化学的に、ＡＤＣＹ３はＣｌｕｓｔｒａｌＷを用いて、それらのオープン・リーディング・フレームを羅列して比較したとき、ＡＤＣＹ２、ＡＤＣＹ４及びＡＤＣＹ７と近い。癌発生でＡＤＣＹ３発現の分析に先立って、ＡＤＣＹファミリメンバー間のプライマー相互反応性を調べるために、発現データを確認した。胃癌細胞ＳＮＵ−２１６、ＳＮＵ−６３８、ＳＮＵ−７１９、ＡＧＳ、ＫＡＴＯＩＩＩ、ＭＫＮ−２８及び正常細胞ＨＤＦ、ＨＭＥＣで、様々なＡＤＣＹメンバーの特異的なプライマーでＲＴ−ＰＣＲを行ったとき、ＡＤＣＹ３を除いた残りのＡＤＣＹメンバーは、胃癌特異的に発現しないことを確認した。具体的に、ＡＤＣＹ６及びＡＤＣＹ７は、胃癌細胞及び正常細胞でいずれも発現しており、残りのＡＤＣＹメンバーはほとんど発現しなく、それぞれの細胞別に一部だけ発現していたことを確認した（図２）。このような結果は、全てのＡＤＣＹが胃癌で発現するのでなく、ＡＤＣＹメンバーの中からＡＤＣＹ３だけが胃癌特異的に発現することを意味し、それにより、ＡＤＣＹ３を胃癌特異的マーカーとして利用可能であることが示された。
【００８４】
３．胃癌進行中におけるＡＤＣＹ３の役割
胃癌でＡＤＣＹ３遺伝子の機能を理解するために、まず、ＡＤＣＹ３が過剰発現された２９３細胞で細胞移動と浸潤の特性を実験した。細胞移動実験で移動した細胞数は、ｐＡｃＧＦＰ−ＡＤＣＹ３感染細胞で顕著に増加され（Ｐ＝０.０１）、Ａ５６４測定によりＡＤＣＹ３が過剰発現されたとき、細胞移動が約４３％増加されていたことを確認した（図３ａ）。細胞移動と同様に、ＡＤＣＹ３が感染された２９３細胞は、空ベクターコントロールと比較するとき、４．９５倍浸潤性（invasiveness）の増加を示した（Ｐ＝０.０２）（図３ｂ）。このような結果は、ＡＤＣＹ３の過剰発現が細胞の移動性と浸潤性を増加させていること示す。また、ｐＡｃＧＦＰ−ＡＤＣ３過剰発現が足場依存性細胞増殖（anchorage-dependent cell growth）に影響を及ぼすかを明らかにするために、コロニー形成能を実験した。その結果、空ベクター対照群よりｐＡｃＧＦＰ−ＡＤＣＹ３感染細胞で１．５倍増加した（Ｐ＜０．００５）（図３ｃ）。このような結果から、ＡＤＣＹ３が腫瘍形成と関連した効果があることを確認することができた。
【００８５】
前記のようなＡＤＣＹ３の腫瘍形成関連効果がＡＤＣＹ３特異的なｓｉＲＮＡの処理により阻害されるかを確認するために、前記実施例１及び２で、ＡＤＣＹ３が過剰発現されるものと確認されたＳＮＵ−２１６胃癌細胞株に、ＡＤＣＹ３特異的ｓｉＲＮＡを処理し、その機能が阻害されるかを確認した。ＡＤＣＹ３  ｓｉＲＮＡを処理するとき、その発現が下向調節され（図３ｄ）、細胞移動を２１％低減させ（Ｐ＝０．０１５）（図３ｅ）、細胞の浸潤性を５．２９倍低減させた（Ｐ＝０．０１６）（図３ｆ）。また、細胞コロニー形成能は、ＡＤＣＹ３  ｓｉＲＮＡ処理細胞で、ＮＣｓｉＲＮＡ処理細胞より１．８倍低減された（Ｐ＝０．００２）（図３ｇ）。このような結果から、ＡＤＣＹ３の発現を抑制する場合、腫瘍形成と関連した効果を低くし、それにより、ＡＤＣＹ３が細胞増殖を加速することを確認することができた。
【００８６】
さらに、胃癌の進行で、ＡＤＣＹ３の上向調節の機能的役割を理解するために、ｐＡｃＧＦＰ−ＡＤＣＹ３が感染された細胞で、ｃＡＭＰ量を測定した。まず、ＡＤＣＹ３の過剰発現を確認するために、ｑＲＴ−ＰＣＲによりｍＲＮＡの量を、ウェスタンブロットでタンパク質の量を確認した（図４のＡ）。次に、ＡＤＣＹ３感染された２９３細胞は、ｃＡＭＰ濃度が空ベクターコントロールと比較するとき、１．９９倍増加したことを確認しており（Ｐ＝０．０００２）、これにより、ＡＤＣＹ３が過剰発現されればｃＡＭＰ濃度に影響を及ぼすことを確認した（図４のＢ）。前記結果と関連して、胃癌の進行で、ｃＡＭＰの蓄積の効果を、ＣＲＥＢ活性を通して調べた。空ベクターコントロールとｐＡｃ−ＧＦＲ−ＡＤＣＹ３伝達された細胞間で一定であったが、総−ＣＲＥＢ（ｔ−ＣＲＥＢ）とタンパク質のＳｅｒ１３３残基のリン酸化−ＣＲＢＥ（ｐ−ＣＲＥＢ）の量を比較した。ｃＡＭＰ量と一致するように、ｔ−ＣＲＥＢ量は空ベクターコントロールとｐＡｃ−ＧＦＰ−ＡＤＣＹ３伝達された細胞間で一定であったが、ｐ−ＣＲＥＢの量は、ｐＡｃ−ＧＦＰ−ＡＤＣＹ３感染された細胞で顕著に増加されていた（図４のＣ）。このような結果から、ＡＤＣＹ３が過剰発現された場合、細胞増殖を調節する信号伝達因子の増加を確認することができた。
【００８７】
４．プロモーター部位ＣｐＧメチル化のＡＤＣＹ３発現調節
癌と関連した遺伝子発現で、ＤＮＡメチル化の役割が近頃研究されており、ＡＤＣＹ３  ｍＲＮＡの発現がＤＮＡメチル化により調節されるのかを確認した。最初に翻訳開始部位（translation start site）の１ｋｂ上流を含むＡＤＣＹ３プロモーター部位に対して、メチル化−敏感性高解像度融合（methylation-sensitive
high resolution melting; MS-HRM）分析をした。しかし、高密度（high-density）のＣｐＧ部位のため、翻訳開始部位（ＡＴＧコドン）の−５８５から−１２９上流部位の４５７ｂｐを含む３個のプライマー対のみが設計されており、その部位をＨＲＭで分析した（図５ａ）。結果は、明確なメチル化の差を示していない。これは、恐らく、これらの領域が機能を有するＣｐＧ島を正確に含まない部位であるからである（図５ｂ）。従って、更に上流に位置した翻訳開始部位の−６９４から−３８７を含むＣｐＧ島に位置する３０８ｂｐ重亜硫酸塩処理したＤＮＡをクローニングし、塩基配列分析をした。その結果、ＡＤＣＹ３を発現しないＫＡＴＯＩＩＩ細胞株は過メチル化（hypermethylation）を、ＳＮＵ−２１６、ＳＮＵ−６３８、ＳＮＵ−７１９、ＡＧＳとＭＫＮ−２８のようなＡＤＣＹ３をたくさん発現する細胞株は、メチル化の量が小さいことを確認した（図５ｃ）。プロモーターＣｐＧメチル化によるＡＤＣＹ発現の調節は、５−Ａｚａ−ｄＣのようなジメチル化物質をＫＡＴＯＩＩＩ細胞株に処理し、確認した。この処理による結果からＡＤＣＹ３プロモーターのＣｐＧ部位、特に、ＣｐＧ部位３１−３９がジメチル化され（図５ｄ）、陰性コントロールと比較したとき、ｑＲＴ−ＰＣＲによるＡＤＣＹ３  ｍＲＮＡの発現量が回復されることを確認した（図５ｅ）。まとめると、このような結果は、プロモーター部位のＣｐＧ島のＤＮＡメチル化がＡＤＣＹ３発現を調節することを暗示する。
【図１ａ】
0006005272.tif 000005
【図１ｂ】
0006005272.tif 000006
【図１ｃ】
0006005272.tif 000007
【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
0006005272.tif 000010
【図３ｃ】
0006005272.tif 000011
【図３ｄ】
0006005272.tif 000012
【図３ｅ】
0006005272.tif 000013
【図３ｆ】
0006005272.tif 000014
【図３ｇ】
0006005272.tif 000015
【図４】
0006005272.tif 000016
【図５ａ】
0006005272.tif 000017
【図５ｂ】
0006005272.tif 000018
【図５ｃ】
0006005272.tif 000019
【図５ｄ】
0006005272.tif 000020
【図５ｅ】
0006005272.tif 000021
【配列表】
0006005272000001.app