(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラミニン５を含んだ系で細胞を培養する方法において、
血清、血清アルブミン、プレアルブミン、免疫グロブリン、α−グロブリン、β−グロブリン、α１−アンチトリプシン（α１−ＡＴ）、へプトグロビン（Ｈｐ）、α２−マクログロブリン（α２−Ｍ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、トランスフェリン、レチノール結合タンパク（ＲＢＰ）又はアディポネクチンである細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質、並びに、ゼラチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するタンパク質、ペプトン、からなるグループから選択されるポリペプチドと、ラミニン５を固相化した条件下で前記細胞を培養することを含む、
ここにおいて、細胞培養容器を、１μｇ／ｍｌないし２００μｇ／ｍｌの間の濃度の前記ポリペプチドで固相化した後にラミニン５で固相化する、あるいは、１μｇ／ｍｌないし２００μｇ／ｍｌの間の濃度の前記ポリペプチドと、ラミニン５で同時に固相化する、
前記方法。
【請求項２】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するタンパク質が、受容体活性化因子ＮＦkＢリガンド（ＲＡＮＫＬ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ペプトンが、綿実由来ペプトン、大豆由来ペプトン、小麦由来ペプトン及びエンドウ豆由来ペプトンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細胞接着活性、細胞分散活性、創傷治癒活性、増殖促進活性、未分化維持活性及び多能性維持活性からなる群から選択される、ラミニン５の細胞  に対する活性が上昇する、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
細胞が、多能性幹細胞、組織幹細胞、体細胞、生殖細胞、及び肉腫細胞からなる群から選択される、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
多能性幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性生殖細胞、又は生殖幹細胞から選択され；
組織幹細胞が、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、又は造血幹細胞から選択され；あるいは、
体細胞が、肝細胞、膵細胞、筋細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、繊維芽細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞、又は、リンパ球、赤血球、白血球、単球、マクロファージ若しくは巨核球の血球細胞から選択される、
請求項５に記載の方法。
【請求項７】
細胞が、マウス、ラット及びヒトからなる群から選択される種に由来する、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ポリペプチドを３．１２５μｇ／ｍｌないし１２．５μｇ／ｍｌの間の濃度で使用する、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
２種類以上のポリペプチドを固相化する、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
血清、血清アルブミン、プレアルブミン、免疫グロブリン、α−グロブリン、β−グロブリン、α１−アンチトリプシン（α１−ＡＴ）、へプトグロビン（Ｈｐ）、α２−マクログロブリン（α２−Ｍ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、トランスフェリン、レチノール結合タンパク（ＲＢＰ）又はアディポネクチンである細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質、並びに、ゼラチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するタンパク質、ペプトン、からなるグループから選択されるポリペプチド
を１μｇ／ｍｌないし２００μｇ／ｍｌの間の濃度で含む、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法に使用するための、組成物。
【請求項１１】
さらにラミニン５を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
血清、血清アルブミン、プレアルブミン、免疫グロブリン、α−グロブリン、β−グロブリン、α１−アンチトリプシン（α１−ＡＴ）、へプトグロビン（Ｈｐ）、α２−マクログロブリン（α２−Ｍ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、トランスフェリン、レチノール結合タンパク（ＲＢＰ）又はアディポネクチンである細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質、並びに、ゼラチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するタンパク質、ペプトン、からなるグループから選択されるポリペプチドを、１μｇ／ｍｌないし２００μｇ／ｍｌの間の濃度で用いて固相化した、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法に使用するための、キット。
【請求項１３】
さらにラミニン５を固相化した、請求項１２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラミニン５を含んだ系で細胞を培養する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラミニンは様々な組織の基底膜に主として局在し、組織構造の維持及び細胞機能の制御において重要な役割を果たす細胞外マトリックスタンパク質である（Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ．，１８：１９−２８，１９９９；Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，２１８：２１３−２３４，２０００）。【０００３】
ラミニンの構造としては、α鎖、β鎖、γ鎖がそれぞれジスルフィド結合で連結されたヘテロ３量体分子であり、特徴的な十字架構造をとる。各鎖は複数のドメインからなり、ドメインＩおよびＩＩはトリプルへリックスを形成している。本出願前に、ラミニン分子は５種類のα鎖（α１ないしα５）、３種類のβ鎖（β１ないしβ３）、３種類のγ鎖（γ１ないしγ３）の異なる組み合わせによって、少なくとも１５種類が同定されており、実際にはその数倍の種類が存在することが示唆されている（Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．，  ９７，９１−９８，  ２００６；Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，２１８,２１３−２３４，２０００；Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２０：６５１７−６５２８，２０００；Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．８５，９７９−１０００，２００５）。これらα、β、γ鎖はそれぞれ異なる遺伝子によってコードされており、それぞれのラミニンアイソフォームは特有の存在部位や機能があり、主に細胞膜受容体インテグリンを介して細胞接着、増殖、運動、分化などを調節している（Ｄｅｖ.Ｄｙｎ．２１８，  ２１３−２３４，２０００；Ｐｈｙｓｉｏｌ.  Ｒｅｖ．８５，９７９−１０００，２００５）。【０００４】
例えば、生体内ではα２鎖は筋肉や神経組織を中心に存在しているのに対して、α３鎖は皮膚組織を中心に存在している。それぞれの機能も異なり、α２鎖の遺伝子異常は筋ジストロフィーを引き起こすのに対して、α３鎖の遺伝子異常は接合部型表皮水疱症という重篤な症状を引き起こす（Ｄｅｖ.Ｄｙｎ．２１８，  ２１３−２３４，２０００）。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験においても、全く異なる機能を示す。α２鎖を構成鎖として持つラミニン２やラミニン４は間葉系幹細胞に対して接着活性をほとんど示さないのに対して、α３鎖を構成鎖として持つラミニン５は非常に強い接着活性を示す（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２４，２３４６−２３５４，２００６）。このように各ラミニンアイソフォームを構成するα、β、γ鎖が異なると機能や活性も全く異なってくる。【０００５】
表１に１５種類のラミニン分子種とそのサブユニット構成を示す。【０００６】
【表１】
0005882198.tif 000002
【０００７】
ラミニン分子は、３本鎖のアミノ（Ｎ）末端部分（短腕）で互いに会合したり、他のマトリックス分子と会合して、基底膜を構築する。一方、α鎖のカルボキシ（Ｃ）末端には５つの相同な球状ドメイン（Ｇ１―Ｇ５ドメインまたはＬＧ１―ＬＧ５）が存在し、主にこの部分でインテグリンやその他のリセプターと結合する。【０００８】
ラミニン５
ラミニン５（カリニン、エピリグリン、ナイセイン、ラドシンとも呼ばれる）はα３鎖、β３鎖、γ２鎖からなるラミニンアイソフォームの一つであり、複数の研究機関で別々の経緯で発見された（Ｊ.  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１４，  ５６７−５７６，１９９１；Ｃｅｌｌ  ６５，５９９−６１０，１９９１；Ｊ.  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０１，７３８−７４３，１９９３；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９０，１１７６７−１１７７１，１９９３）。【０００９】
ラミニン５は各種細胞に対して強い細胞接着活性、細胞分散活性、細胞増殖活性等を示すことが報告されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９０，１１７６７−１１７７１，１９９３；Ｊ.  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１６，８６２−８６９，１９９４；Ｊ.  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２５，２０５−２１４，１９９４；Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.Ｃｅｌｌ．１６，８８１−８９０，２００５；Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２４，２３４６−２３５４，２００６）。国際公開ＷＯ２００７／０２３８７５は、ラミニン５を利用した間葉系幹細胞の培養技術を記載している。【００１０】
しかしながら、各種細胞の培養においてラミニン５の種々の活性を一般に上昇させる効率的な方法は、本願発明前には得られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００７／０２３８７５
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００９／１２３３４９
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ．，１８：１９−２８，１９９９
【非特許文献２】Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，２１８：２１３−２３４，２０００
【非特許文献３】Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．，  ９７，９１−９８，  ２００６
【非特許文献４】Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２０：６  ５１７−６５２８，２０００
【非特許文献５】Ｐｈｙｓｉｏｌ.  Ｒｅｖ．８５，９７９−１０００，２００５
【非特許文献６】Ｊ.  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１４，  ５６７−５７６，１９９１
【非特許文献７】Ｃｅｌｌ．６５，５９９−６１０，１９９１
【非特許文献８】Ｊ.  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０１，  ７３８−７４３，１９９３
【非特許文献９】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９０，１１７６７−１１７７１，１９９３
【非特許文献１０】Ｊ.  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１６，８６２−８６９，１９９４
【非特許文献１１】Ｊ.  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２５，２０５−２１４，１９９４
【非特許文献１２】Ｍｏｌ.  Ｂｉｏｌ.  Ｃｅｌｌ．１６，８８１−８９０，２００５
【非特許文献１３】Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２４，２３４６−２３５４，２００６
【非特許文献１４】Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６３：ｐ．２８８−２９２，１９９４
【非特許文献１５】Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  １１２，  １−１０，  １９９９
【非特許文献１６】Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ３１０，  ２５６−２６９，  ２００５
【非特許文献１７】Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  １１９，  ３２０６−３２１８，  ２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、ラミニン５を含んだ系で細胞を培養する方法において、ラミニン５の活性を上昇させる技術を提供することを目的とする。【００１４】
本発明者らは、ラミニン５を含んだ系で細胞を培養する方法において、特定のポリペプチドをラミニン５とともに併用するとラミニン５の様々な活性が上昇することを見いだし本発明を想到した。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、好ましい態様として以下の態様を含む。
［態様１］
ラミニン５を含んだ系で細胞を培養する方法において、
血清、血清アルブミン、プレアルブミン、免疫グロブリン、α−グロブリン、β−グロブリン、α１−アンチトリプシン（α１−ＡＴ）、へプトグロビン（Ｈｐ）、α２−マクログロブリン（α２−Ｍ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、トランスフェリン、レチノール結合タンパク（ＲＢＰ）又はアディポネクチンである細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質、並びに、ゼラチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するタンパク質、ペプトン、からなるグループから選択されるポリペプチドを培養系に含むことを特徴とする前記方法。
［態様２］
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するタンパク質が、受容体活性化因子ＮＦ(Ｂリガンド（ＲＡＮＫＬ）である、態様１に記載の方法。
［態様３］
ペプトンが、綿実由来ペプトン、大豆由来ペプトン、小麦由来ペプトン及びエンドウ豆由来ペプトンからなる群から選択される、態様１に記載の方法。
［態様４］
細胞培養容器を、ポリペプチドで処理した後にラミニン５で処理する、あるいは、ポリペプチドとラミニンで同時に処理する、態様１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
［態様５］
細胞接着活性、細胞分散活性、創傷治癒活性、増殖促進活性、未分化維持活性及び多能性維持活性からなる群から選択される、ラミニン５の細胞に対する活性が上昇する、態様１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
［態様６］
細胞が、多能性幹細胞、組織幹細胞、体細胞、生殖細胞、及び肉腫細胞からなる群から選択される、態様１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
［態様７］
多能性幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性生殖細胞、又は生殖幹細胞から選択され；
組織幹細胞が、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、又は造血幹細胞から選択され；あるいは、
体細胞が、肝細胞、膵細胞、筋細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、繊維芽細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞、又は、リンパ球、赤血球、白血球、単球、マクロファージ若しくは巨核球の血球細胞から選択される、
態様６に記載の方法。
［態様８］
細胞が、マウス、ラット及びヒトからなる群から選択される種に由来する、態様１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
［態様９］
ポリペプチドを１μｇ／ｍｌないし２００μｇ／ｍｌの間の濃度で使用する、態様１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
［態様１０］
ポリペプチドを３．１２５μｇ／ｍｌないし１２．５μｇ／ｍｌの間の濃度で使用する、態様１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
［態様１１］
２種類以上のポリペプチドを細胞培養系に含ませる、態様１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
［態様１２］
血清、血清アルブミン、プレアルブミン、免疫グロブリン、α−グロブリン、β−グロブリン、α１−アンチトリプシン（α１−ＡＴ）、へプトグロビン（Ｈｐ）、α２−マクログロブリン（α２−Ｍ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、トランスフェリン、レチノール結合タンパク（ＲＢＰ）又はアディポネクチンである細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質、並びに、ゼラチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するタンパク質、ペプトン、からなるグループから選択されるポリペプチド
を含む、ラミニン５を含んだ系で細胞を培養する方法に使用するための組成物。
［態様１３］
さらにラミニン５を含む、態様１２に記載の組成物。
［態様１４］
血清、血清アルブミン、プレアルブミン、免疫グロブリン、α−グロブリン、β−グロブリン、α１−アンチトリプシン（α１−ＡＴ）、へプトグロビン（Ｈｐ）、α２−マクログロブリン（α２−Ｍ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、トランスフェリン、レチノール結合タンパク（ＲＢＰ）又はアディポネクチンである細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質、並びに、ゼラチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するタンパク質、ペプトン、からなるグループから選択されるポリペプチド
を含む、ラミニン５を含んだ系で細胞を培養する方法に使用するための、キット。
［態様１５］
さらにラミニン５を含む、態様１４に記載のキット。
【発明の効果】
【００１６】
本発明において、ラミニン５と特定のポリペプチドを併用することにより、細胞接着活性、細胞分散活性、創傷治癒活性、増殖促進活性、未分化維持活性及び多能性維持活性からなる群から選択される、ラミニン５の細胞に対する活性が上昇する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、精製した組換えヒトラミニン５をＳＤＳポリアクリルアミドゲルにて電気泳動した図である。なお図１の右レーンが、１μｇの組換えヒトラミニン５を電気泳動した結果である。
【図２】図２は、組換えヒトラミニン５（０．２５μｇ／ｍｌ）と種々の血中タンパク質が、ＢＲＬ細胞に対する細胞接着活性に及ぼす効果を示した図である。図２Ａ−Ｄは、各々ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清（ＨＳ）およびＩｇＧの図に示した各濃度（０−８００μｇ／ｍｌ）の結果を示す。
【図３】図３は、横軸に示した各濃度（０−２μｇ／ｍｌ）の、組換えヒトラミニン５のＢＲＬ細胞に対する細胞接着活性を上昇させる、ＨＳＡの至適濃度を調べた結果を示す。
【００１８】
図３Ａ
黒菱形印、  組換えヒトラミニン５のみ
白四角印、  組換えヒトラミニン５＋ＨＳＡ  ０．７８１２５μｇ／ｍｌ
白三角印、  組換えヒトラミニン５＋ＨＳＡ  ３．１２５μｇ／ｍｌ
バツ印、  組換えヒトラミニン５＋ＨＳＡ  １２．５μｇ／ｍｌ
図３Ｂ
黒菱形印、  組換えヒトラミニン５のみ
白四角印、  組換えヒトラミニン５＋ＨＳＡ  １２．５μｇ／ｍｌ
白三角印、  組換えヒトラミニン５＋ＨＳＡ  ５０μｇ／ｍｌ
バツ印、  組換えヒトラミニン５＋ＨＳＡ  ２００μｇ／ｍｌ
【図４】図４は、横軸に示した各濃度（０−２μｇ／ｍｌ）の、組換えヒトラミニン５のＢＲＬ細胞に対する細胞接着活性を上昇させる、組換えＨＳＡ（ｒＨＳＡ）の至適濃度を調べた結果を示す。
【００１９】
図４Ａ
黒菱形印、  組換えヒトラミニン５のみ
白四角印、  組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ  ０．７８１２５μｇ／ｍｌ
白三角印、  組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ  ３．１２５μｇ／ｍｌ
バツ印、  組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ  １２．５μｇ／ｍｌ
図４Ｂ
黒菱形印、  組換えヒトラミニン５のみ
白四角印、  組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ  １２．５μｇ／ｍｌ
白三角印、  組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ  ５０μｇ／ｍｌ
バツ印、  組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ  ２００μｇ／ｍｌ
【図５】図５は、横軸に示した各濃度（０−２μｇ／ｍｌ）の、組換えヒトラミニン５のＢＲＬ細胞に対する細胞接着活性を上昇させる、ゼラチン（Ｇｅｌ）、ｓＲＡＮＫＬおよびペプトン（Ｐｅｐ）の効果を調べた結果を示す。
【００２０】
図５Ａ
黒菱形印、  組換えヒトラミニン５のみ
白四角印、  組換えヒトラミニン５＋ＨＳＡ  １０μｇ／ｍｌ
白三角印、  組換えヒトラミニン５＋Ｇｅｌ  １０μｇ／ｍｌ
図５Ｂ
黒菱形印、  組換えヒトラミニン５のみ
白四角印、  組換えヒトラミニン５＋ＨＳＡ  １２．５μｇ／ｍｌ
白三角印、  組換えヒトラミニン５＋ｓＲＡＮＫＬ  ５０μｇ／ｍｌ
図５Ｃ
黒菱形印、  組換えヒトラミニン５のみ
白四角印、  組換えヒトラミニン５＋ＨＳＡ  １０μｇ／ｍｌ
白三角印、  組換えヒトラミニン５＋Ｐｅｐ  １０μｇ／ｍｌ
【図６】図６は、横軸に示した各濃度（０−２μｇ／ｍｌ）の、組換えヒトラミニン５のＢＲＬ細胞に対する細胞接着活性を上昇させる、Ｐｅｐの各濃度における効果を調べた結果を示す。
【００２１】
黒菱形印、  組換えヒトラミニン５のみ
白菱形印、  組換えヒトラミニン５＋Ｐｅｐ  １５．６μｇ／ｍｌ
黒四角印、  組換えヒトラミニン５＋Ｐｅｐ  ６２．５μｇ／ｍｌ
白四角印、  組換えヒトラミニン５＋Ｐｅｐ  ２５０μｇ／ｍｌ
白三角印、  組換えヒトラミニン５＋Ｐｅｐ  １０００μｇ／ｍｌ
【図７】図７は、組換えヒトラミニン５（０．２５μｇ／ｍｌ）と種々の糖類が、ＢＲＬ細胞に対する細胞接着活性に効果を及ぼすかを調べた結果を示した図である。図７Ａ−Ｄは、各々キシロース（Ｘｙｌ）、トレハロース（Ｔｒｅ）、マンノース（Ｍａｎ）およびラクトース（Ｌａｃ）の図に示した各濃度（０−１０μｇ／ｍｌ）の結果を示す。
【図８】図８は、組換えヒトラミニン５（０．２５μｇ／ｍｌ）と種々の糖類がより高濃度において、ＢＲＬ細胞に対する細胞接着活性に影響を及ぼすかを調べた結果を示した図である。図８Ａは、１００μｇ／ｍｌのＴｒｅおよびＭａｎの結果を示す。図８Ｂは、１００μｇ／ｍｌのＸｙｌおよびＬａｃの結果を示す。
【図９】図９は、組換えヒトラミニン５（０．２５μｇ／ｍｌ）と種々のアミノ酸が、ＢＲＬ細胞に対する細胞接着活性に効果を及ぼすかを調べた結果を示した図である。
【００２２】
図９Ａ
黒菱形印、  組換えヒトラミニン５のみ（対照）
白四角印、  組換えヒトラミニン５＋ＨＳＡ  １０μｇ／ｍｌ
白三角印、  組換えヒトラミニン５＋グリシン（Ｇｌｙ）  １０μｇ／ｍｌ
薄黒三角印、  組換えヒトラミニン５＋Ｇｌｙ  １００μｇ／ｍｌ
黒三角印、  組換えヒトラミニン５＋Ｇｌｙ  １０００μｇ／ｍｌ
図９Ｂ
黒菱形印、  組換えヒトラミニン５のみ（対照）
白四角印、  組換えヒトラミニン５＋ＨＳＡ  １０μｇ／ｍｌ
白三角印、  組換えヒトラミニン５＋アルギニン（Ａｒｇ）  １０μｇ／ｍｌ
薄黒三角印、  組換えヒトラミニン５＋Ａｒｇ  １００μｇ／ｍｌ
黒三角印、  組換えヒトラミニン５＋Ａｒｇ  １０００μｇ／ｍｌ
【図１０】図１０は、２種類の血中タンパク質を用いた場合の、組換えヒトラミニン５の細胞接着活性に及ぼす相乗効果を示した図である。横軸に示した各血中タンパク質を各々示した濃度で使用した。
【図１１】図１１は、細胞培養器を処理する順番を検討した結果を示す。組換えヒトラミニン５は、横軸に示した濃度（０−２μｇ／ｍｌ）使用した。
【００２３】
黒菱形印、  ｒＬｍ５のみ
白四角印、  細胞培養プレートをｒＨＳＡで処理した後にｒＬｍ５で処理（ｒＨＳＡ→ｒＬｍ５）
白三角印、  細胞培養プレートをｒＨＳＡとｒＬｍ５で同時に処理（ｒＬｍ５＋ｒＨＳＡ）
バツ印、  細胞培養プレートをｒＬｍ５で処理した後にｒＨＳＡで処理（ｒＬｍ５→ｒＨＳＡ）
【図１２】図１２は、横軸に示した各濃度（０−２μｇ／ｍｌ）の、組換えヒトラミニン５のＨＴ１０８０細胞に対する細胞接着活性を上昇させる、組換えＨＳＡ（ｒＨＳＡ）の至適濃度を調べた結果を示す。
【００２４】
図１２Ａ
黒菱形印、  組換えヒトラミニン５のみ（対照）
白四角印、  組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ  ０．７８１２５μｇ／ｍｌ
白三角印、  組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ  ３．１２５μｇ／ｍｌ
バツ印、  組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ  １２．５μｇ／ｍｌ
図１２Ｂ
黒菱形印、  組換えヒトラミニン５のみ（対照）
白四角印、  組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ  １２．５μｇ／ｍｌ
白三角印、  組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ  ５０μｇ／ｍｌ
バツ印、  組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ  ２００μｇ／ｍｌ
【図１３】図１３は、横軸に示した各濃度（０−２μｇ／ｍｌ）の、組換えヒトラミニン５のヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）細胞に対する細胞接着活性を上昇させる、組換えＨＳＡ（ｒＨＳＡ）の至適濃度を調べた結果を示す。
【００２５】
図１３Ａ
黒菱形印、  組換えヒトラミニン５のみ（対照）
白四角印、  組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ  ０．７８１２５μｇ／ｍｌ
白三角印、  組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ  ３．１２５μｇ／ｍｌ
バツ印、  組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ  １２．５μｇ／ｍｌ
図１３Ｂ
黒菱形印、  組換えヒトラミニン５のみ（対照）
白四角印、  組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ  １２．５μｇ／ｍｌ
白三角印、  組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ  ５０μｇ／ｍｌ
バツ印、  組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ  ２００μｇ／ｍｌ
【図１４】図１４は、横軸に示した各濃度（０−１６μｇ／ｍｌ）の、組換えヒトラミニン５のＥＢ３細胞に対する細胞接着活性を上昇させる、組換えＨＳＡ（ｒＨＳＡ）の至適濃度を調べた結果を示す。
【００２６】
図１４Ａ
黒菱形印、  組換えヒトラミニン５のみ（対照）
白四角印、  組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ  ０．７８１２５μｇ／ｍｌ
白三角印、  組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ  ３．１２５μｇ／ｍｌ
バツ印、  組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ  １２．５μｇ／ｍｌ
図１４Ｂ
黒菱形印、  組換えヒトラミニン５のみ（対照）
白四角印、  組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ  １２．５μｇ／ｍｌ
白三角印、  組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ  ５０μｇ／ｍｌ
バツ印、  組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ  ２００μｇ／ｍｌ
【図１５】図１５は、図に示した各濃度の組換えヒトラミニン５に、ｒＨＳＡ（１２．５μｇ／ｍｌ）を添加した場合の、ＥＢ３細胞の接着分析後の細胞形態を示す写真である。左側がｒＨＳＡを使用しない場合（対照）、右側がｒＨＳＡを使用した場合である。
【図１６】図１６は、ＨＳＡがヒトラミニン５以外の他のラミニンアイソフォームに対しても、ラミニン５と同様に細胞接着活性上昇効果が認められるかを調べた結果を示した図である。ラミニン５（０−２μｇ／ｍｌ）は各々横軸に示した濃度を用いた。
【００２７】
黒菱形印、  組換えヒトラミニン５のみ（対照）
白菱形印、  組換えヒトラミニン５＋ＨＳＡ  １０μｇ／ｍｌ
【図１７】図１７は、ｒＨＳＡがヒトラミニン５以外の他の細胞外マトリックスタンパク質やラミニンアイソフォームに対しても、ラミニン５と同様に細胞接着活性に対する上昇効果が認められるかを調べた結果を示した図である。他の細胞外マトリックスタンパク質としてビトロネクチン（Ｖｎ／ＳＩＧＭＡ）、他のラミニンアイソフォームとしてラミニン２（Ｌｍ２／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた。ラミニン５（０−２μｇ／ｍｌ）およびビトロネクチン（０−３２μｇ／ｍｌ）、Ｌｍ２(０−３２μｇ／ｍｌ)は各々横軸に示した濃度を用いた。
【００２８】
図１７Ａ
黒菱形印、  組換えヒトラミニン５のみ（対照）
白菱形印、  組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ  １０μｇ／ｍｌ
黒丸印、  Ｖｎのみ（対照）
白丸印、  Ｖｎ＋ｒＨＳＡ  １０μｇ／ｍｌ
図１７Ｂ
黒菱形印、  組換えヒトラミニン５のみ（対照）
白菱形印、  組換えヒトラミニン５＋ｒＨＳＡ  １０μｇ／ｍｌ
黒四角印、  Ｌｍ２のみ（対照）
白四角印、  Ｌｍ２＋ｒＨＳＡ  １０μｇ／ｍｌ
【図１８】図１８は、横軸に示した各濃度（０−０．２μｇ／ｍｌ）の組換えヒトラミニン５のＢＲＬ細胞に対する細胞分散活性について、ｒＨＳＡ（１０μｇ／ｍｌ）の活性上昇効果を調べた結果を示す。ｒＬｍ５の濃度が０．０２μｇ／ｍｌの際に特にｒＨＳＡによる活性の上昇効果が著しいことが観察された。
【図１９】図１９は、各濃度（０−０．２μｇ／ｍｌ）の組換えヒトラミニン５のＢＲＬ細胞に対する細胞分散活性について、ｒＨＳＡ（１０μｇ／ｍｌ）の活性上昇効果を調べた結果を示した写真である。
【図２０】図２０は、横軸に示した各濃度（０−０．１ｇ／ｍｌ）の組換えヒトラミニン５のＢＲＬ細胞に対する創傷治癒活性について、ｒＨＳＡ（１０μｇ／ｍｌ）の活性上昇効果を調べた結果を示す。ｒＬＭ５の濃度が０．０１２５−０．０５μｇ／ｍｌの際に特にｒＨＳＡによる活性の上昇効果が著しいことが観察された。
【図２１】図２１は、各濃度（０−０．１ｇ／ｍｌ）の組換えヒトラミニン５のＢＲＬ細胞に対する創傷治癒活性について、ｒＨＳＡ（１０μｇ／ｍｌ）の活性上昇効果を調べた結果を示した写真である。
【図２２】図２２は、組換えヒトラミニン５のｈＭＢＣ細胞に対する増殖活性について、ｒＨＳＡ（１０μｇ／ｍｌ）の活性上昇効果を調べた結果を示した図である。
【００２９】
バツ印、  血清のみ  コートなし
白四角印、  Ｐａｎｅｘｉｎ添加（Ｐ）
黒三角印、  Ｐ／ｒＬｍ５  １μｇ／ｍｌ
白三角印、  Ｐ＋Ｆ（ｂＦＧＦ）／コートなし
白丸印、  Ｐ＋Ｆ／ｒＬｍ５  １μｇ／ｍｌ
白菱形印、  Ｐ＋Ｆ／ｒＬｍ５  ０．２μｇ／ｍｌ
黒四角印、  Ｐ＋Ｆ／ｒＬｍ５  ０．２μｇ／ｍｌ＋ｒＨＳＡ  １０μｇ／ｍｌ
【図２３】図２３は、組換えヒトラミニン５のＥＢ３細胞に対する増殖活性について、ｒＨＳＡ（１０μｇ／ｍｌ）の活性上昇効果を調べた結果を示した図である。
【００３０】
白菱形印、  Ｌｍ５（２μｇ／ｍｌ）
黒四角印、  Ｌｍ５（０．２μｇ／ｍｌ）＋ｒＨＳＡ  １２．５μｇ／ｍｌ
薄黒四角印、  Ｌｍ５（０．２μｇ／ｍｌ）＋ｒＨＳＡ  ３．１２５μｇ／ｍｌ
白四角印、  Ｌｍ５（０．２μｇ／ｍｌ）
【図２４】図２４は、組換えヒトラミニン５のＥＢ３細胞に対する増殖活性について、各種細胞支持材料を用いた場合における、ｒＨＳＡの活性上昇効果を調べた結果を示した図である。
【００３１】
黒丸印、  増殖培地（Ｓ）＋ウシゼラチン（Ｇ）
黒四角印、  ＫＳＲ−ＧＭＥＭ（Ｋ）＋Ｌｍ５（Ｌ）（０．０５μｇ／ｍｌ）＋ｒＨＳＡ（Ｈ）  １２．５μｇ／ｍｌ）
白四角印、  ＫＳＲ−ＧＭＥＭ（Ｋ）＋Ｌｍ５（Ｌ）（０．０５μｇ／ｍｌ）
【図２５】図２５は、図２４で増殖の認められたＳ＋Ｇ及びＫ＋Ｌ（０．０５μｇ／ｍｌ）＋Ｈ（１２．５μｇ／ｍｌ）について、未分化マーカーの検出を行った結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は、ラミニン５を含んだ系で細胞を培養する方法に関する。
【００３３】
本発明の方法は、ラミニン５を含んだ系で細胞を培養する方法において、
血清、血清アルブミン、プレアルブミン、免疫グロブリン、α−グロブリン、β−グロブリン、α１−アンチトリプシン（α１−ＡＴ）、へプトグロビン（Ｈｐ）、α２−マクログロブリン（α２−Ｍ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、トランスフェリン、レチノール結合タンパク（ＲＢＰ）又はアディポネクチンである細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質、並びに、ゼラチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するタンパク質、ペプトン、からなるグループから選択されるポリペプチドを培養系に含むことを特徴とする。
【００３４】
ラミニン５
本発明の方法は、多能性幹細胞の培養にあたり、ラミニン５を含んだ系で該多能性幹細胞を培養することを、最も顕著な特徴とする。
【００３５】
ラミニン５は、多くの細胞種に対して、他のラミニンアイソフォームを含めた各種細胞外マトリックスタンパク質と比べて強い接着活性を示すことが報告されている（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１６，８６２−８６９，１９９４、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２５，２０５−２１４，１９９４、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ．１６，８８１−８９０，２００５）。
【００３６】
表１に示されるようにラミニン５は、α３鎖、β３鎖、γ２鎖からなるラミニン分子であり、表皮の真皮への結合に中心的な役割を果たしており、殆どの細胞においてインテグリンα３β１に優先的に結合するが、細胞によってはインテグリンα６β１、α６β４にも結合する。ラミニン５におけるα３鎖Ｇ２ドメインのα３Ｇ２Ａ配列（ＲＥＲＦＮＩＳＴＰＡＦＲＧＣＭＫＮＬＫＫＴＳ）やＧ３ドメインのＫＲＤ配列がインテグリンに対する主要な結合部位であることが解明されている。
【００３７】
またラミニン５は３量体として分泌された後、プロテアーゼによる限定分解を受けてα３鎖のＣ末端に存在するＧ４およびＧ５ドメインが除去され、１９０ｋＤａ（非切断型）から１６０ｋＤａ（切断型）へ変換されることが知られている。通常の方法で単離されるラミニン５にはＧ４、Ｇ５ドメインが存在しない。このようなα３鎖切断型ラミニン５は非切断型ラミニン５に比べて高い細胞接着促進活性、運動促進活性、および神経再生促進活性を有することが知られている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０（２００５），１４３７０―１４３７７）。
【００３８】
本発明のラミニン５は、特に限定されず、Ｇ４及びＧ５ドメインを含むままの非切断型であってもよく、あるいはＧ４及びＧ５ドメイン全体あるいはその一部が除去された切断型であってもよい。
【００３９】
また、ラミニン５タンパク質は天然型であっても、あるいはその生物学的活性、特に細胞接着促進活性保持したまま１又はそれ以上のアミノ酸残基が修飾された修飾型であってもよい。また、本発明におけるラミニン５タンパク質は本明細書に記載した特徴を有する限り、その起源、製法などは限定されない。即ち、本発明のラミニン５タンパク質は、天然産のタンパク質、遺伝子工学的手法により組換えＤＮＡから発現させたタンパク質、あるいは化学合成タンパク質の何れでもよい。
【００４０】
ラミニン５タンパク質の由来は特に、限定されないが、好ましくは、ヒト由来のものである。再生医療の材料を得る目的などでヒト多能性幹細胞を培養する場合には、他の動物に由来する材料の使用を避けるという意味で、ヒト由来のラミニン５を用いることが好適である。
【００４１】
本明細書中の配列表の配列番号１−６は、ヒトラミニン５のα３鎖、β３鎖及びγ２鎖の塩基配列及びアミノ酸配列を示す。本発明で使用するラミニン５タンパク質は、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列、またはこの配列において１またはそれ以上のアミノ酸が欠失、付加、または置換されているアミノ酸配列を有するα３鎖（アミノ酸残基Ｎｏ．１―Ｎｏ．１７１３）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９, ２２７７９―２２７８７, １９９４）、配列番号４のアミノ酸配列、またはこの配列において１またはそれ以上のアミノ酸が欠失、付加、または置換されているアミノ酸配列を有するβ３鎖（アミノ酸残基Ｎｏ．１―Ｎｏ．１１７０）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９, １１０７３―１１０８０、１９９４）、及び配列番号６のアミノ酸配列、またはこの配列において１またはそれ以上のアミノ酸が欠失、付加、または置換されているアミノ酸配列を有するγ２鎖（アミノ酸残基Ｎｏ．１―Ｎｏ．１１９３）（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１９,６７９―６９３、１９９２）の各サブユニットからなるタンパク質である。
【００４２】
α３鎖の球状ドメイン（Ｇ１―Ｇ５ドメイン）はそれぞれ、配列番号１のアミノ酸残基Ｎｏ．７９４―Ｎｏ．９７０、Ｎｏ．９７１―Ｎｏ．１１３９、Ｎｏ．１１４０―Ｎｏ．１３５３、Ｎｏ．１３５４―Ｎｏ．１５２９およびＮｏ．１５３０―Ｎｏ．１７１３に相当する。
【００４３】
ラミニン５の各鎖は、対応する配列番号で示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加、または置換されているアミノ酸配列を有するものであってもよい。このような天然のタンパク質と相同なアミノ酸配列を有するタンパク質も、本発明において使用可能である。変更可能なアミノ酸数は、α３鎖、β３鎖及びγ２鎖の各アミノ酸配列において、限定されるわけではないが、好ましくは１ないし３００アミノ酸残基、１ないし２００アミノ酸残基、１ないし１５０アミノ酸残基、１ないし１２０アミノ酸残基、１ないし１００アミノ酸残基、１ないし８０アミノ酸残基、１ないし５０アミノ酸残基、１ないし３０アミノ酸残基、１ないし２０アミノ酸残基、１ないし１５アミノ酸残基、１ないし１０アミノ酸残基、１ないし５アミノ酸残基である。公知の部位特異的突然変異法で修飾可能な数のアミノ酸残基、例えば、１ないし１０アミノ酸残基、１ないし５アミノ酸残基がより好ましい。
【００４４】
アミノ酸の保存的置換を行って元の機能を保持しているタンパク質またはポリペプチドを得ることができることは、当技術分野においてよく知られている。そのような置換には、アミノ酸を類似の物理化学的特性を有する残基で置き換えること、例えば、１つの脂肪酸残基（Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａ）を別なもので、または塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇ、酸性残基ＧｌｕとＡｓｐ、アミド残基ＧｌｎとＡｓｎ、ヒドロキシル残基ＳｅｒとＴｙｒ、または芳香族残基ＰｈｅとＴｙｒの間で置換することが含まれる。
【００４５】
また、本発明で用いるラミニン５は、配列番号２、４、６に記載されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有し、かつ細胞接着活性を促進することができるタンパク質であってもよい。
【００４６】
同一性は、同一である残基の数を、既知の配列または既知の配列のドメイン中の残基の総数で割り、１００を乗ずることにより計算する。標準的なパラメーターを用いて配列の同一性を決定するためのコンピュータープログラムは、例えば、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ＰＳＩ―ＢＬＡＳＴ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５, ３３８９―３４０, １９９７）、ＢＬＡＳＴ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３―４１０, １９９０）、およびＳｍｉｔｈ―Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５―１９７, １９８１）が利用可能である。好ましくは、これらのプログラムのデフォルト設定を用いるが、所望によりこれらの設定を変更してもよい。
【００４７】
本発明におけるラミニン５タンパク質は本明細書に記載した特徴を有する限り、その起源、製法などは限定されない。即ち、本発明のラミニン５タンパク質は、ラミニン５を分泌するヒト或いは動物細胞の培養液上清、あるいはそこから精製した天然型ラミニン５タンパク質であってもよい。しかしラミニン５は、当該技術分野において知られる組換えＤＮＡ技術を用いて各サブユニットを発現させることにより遺伝子組換えタンパク質として効果的に製造することができる。しかし不必要な動物性の因子を避けるという意味から、ラミニン５をヒト組換えタンパク質として得ることは特に好ましい。
【００４８】
ラミニン５のα３鎖をコードする、配列番号１の核酸残基Ｎｏ．１―Ｎｏ．５１３９を含むＤＮＡ配列、β３鎖をコードする配列番号３の核酸残基Ｎｏ．１２１―Ｎｏ．３６３０及びγ２鎖をコードする配列番号５の核酸残基Ｎｏ．１１８―Ｎｏ．３６９６の塩基配列に基づいてプライマーを設計し、適切なｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により目的とする配列を増幅することにより製造することができる。このようなＰＣＲ手法は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｍｉｃｈａｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９９０に記載されている。
【００４９】
ラミニン５の各鎖遺伝子をコードするＤＮＡを、適当なベクター中に組み込み、これを真核生物または原核生物細胞のいずれかに、各々の宿主で発現可能な発現ベクターを用いて導入し、それぞれの鎖を発現させることにより所望のタンパク質を得ることができる。ラミニン５を発現させるために用いることができる宿主細胞は特に限定されるものではなく、大腸菌、枯草菌等の原核宿主細胞、および酵母、真菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核生物宿主が挙げられる。
【００５０】
ラミニン５を発現するように構築したベクターを、トランスフォーメーション、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション等により、上記の宿主細胞中に導入することができる。ベクターを含む細胞を適当な培地中で成長させて、本発明で使用するラミニン５タンパク質を産生させ、細胞または培地から精製することにより、ラミニン５タンパク質を得ることができる。精製はサイズ排除クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、および免疫アフィニティークロマトグラフィー等を用いて行うことができる。
【００５１】
ラミニン５については、特開２００１―１７２１９６に詳細な記載があり、本明細書中に援用する。
【００５２】
ラミニンの構造としては、α鎖、β鎖、γ鎖がそれぞれジスルフィド結合で連結されたヘテロ３量体分子であり、特徴的な十字架構造をとる。各鎖は複数のドメインからなり、ドメインＩおよびＩＩはトリプルへリックスを形成している。本出願前に、ラミニン分子は５種類のα鎖（α１ないしα５）、３種類のβ鎖（β１ないしβ３）、３種類のγ鎖（γ１ないしγ３）の異なる組み合わせによって、少なくとも１５種類が同定されており、実際にはその数倍の種類が存在することが示唆されている。代表的なラミニンであるラミニン１はα１、β１、γ１で構成されるヘテロ３量体分子であり、本出願にて用いているラミニンであるラミニン５はα３、β３、γ２で構成される。例えば、ラミニン１とラミニン５のポリペプチド鎖の相同性をＧｅｎｅｔｙｘなどのソフトウエアーで解析するとα１とα３の相同性は４２％、β１とβ３の相同性は４１％、γ１とγ２の相同性は５４％である。したがって、同じラミニンという名前がついていても、ラミニン１とラミニン５はそれぞれ（α１、β１、γ１）と（α３、β３、γ２）という全く異なる３つの遺伝子によってコードされたα鎖、β鎖、γ鎖から構成され、また同じα鎖の中でもそれぞれ異なる２つの遺伝子でコードされるα１とα３の相同性はたかだか４２％であり、ラミニン１とラミニン５は異なった性質を示すと考えられている。
【００５３】
実施例３の中で示したように、他の細胞外マトリックスであるビトロネクチン、他のラミニンアイソフォームであるラミニン２は、ＨＳＡによる活性上昇作用は認められなかった。（図１７）。以上のことから、活性上昇作用は細胞外マトリックスタンパク質全般に起こる現象ではなく、さらにラミニンであってもどのアイソフォームでも起こる共通の現象でないことが分かった。
【００５４】
ポリペプチド
本発明は、細胞培養において、Ｌｍ５を含む細胞培養系において、特定のポリペプチドを併せて使用することにより、種々のＬｍ５の活性を上昇させることを特徴とする。
【００５５】
ポリペプチドは、血清、血清アルブミン、プレアルブミン、免疫グロブリン、α−グロブリン、β−グロブリン、α１−アンチトリプシン（α１−ＡＴ）、へプトグロビン（Ｈｐ）、α２−マクログロブリン（α２−Ｍ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、トランスフェリン、レチノール結合タンパク（ＲＢＰ）又はアディポネクチンである細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質、並びに、ゼラチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するタンパク質、ペプトン、からなるグループから選択される。
【００５６】
１）血中タンパク質
本発明においては、好ましくは、血中タンパク質、より好ましくは、細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質をラミニン５タンパク質とともに使用する。
【００５７】
血中タンパク質は、好ましくは血清、血清アルブミン、プレアルブミン、免疫グロブリン、α−グロブリン、β−グロブリン、α１−アンチトリプシン（α１−ＡＴ）、へプトグロビン（Ｈｐ）、α２−マクログロブリン（α２−Ｍ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、トランスフェリン、レチノール結合タンパク（ＲＢＰ）又はアディポネクチンから選択される。これらはいずれも細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質である。
【００５８】
「細胞外マトリックス」とは、細胞外の空間を充填する物質であると同時に骨格的役割（例：動物の軟骨や骨）、細胞接着における足場の役割（例：基底膜やフィブロネクチン）、細胞増殖因子などの保持・提供する役割（例：ヘパラン硫酸に結合する細胞増殖因子FGF）などを担う。多細胞生物を構成する個々の細胞の多くは細胞外マトリックスのベッドあるいは巣に埋もれて生活しているとも言える。ヒトを含めた脊椎動物の細胞外マトリックスに顕著な成分は、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチンやラミニンといった糖タンパク質（一部は細胞接着分子）である。「細胞外マトリックスタンパク質」とは、このような細胞外マトリックスを構成するタンパク質を意味する。
【００５９】
本発明における、「細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質」とは、血中タンパク質のうちでも、細胞接着等に関与する細胞外マトリックスタンパク質以外のものを意味する。これらは、いずれも公知のタンパク質であり当業者は適宜入手することが可能である。
【００６０】
「細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質」は、限定されるわけではないが、好ましくは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ／例えば、Ｎａｃａｌａｉより入手可能）、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ／例えば、ＳＩＧＭＡより入手可能）、またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ／例えば、ＳＩＧＭＡより入手可能）である。
【００６１】
「細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質」は、あるいは、免疫グロブリンであってもよい。免疫グロブリンは当業者に周知であり、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどが含まれる。例えば、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ／例えば、オリエンタル酵母工業株式会社より入手可能）を使用することができる。
【００６２】
２）ゼラチン
ゼラチンとは、動物の皮膚や骨、腱などの結合組織の主成分であるコラーゲンに熱を加えて抽出したもので、タンパク質を主成分とする。
【００６３】
３）腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するタンパク質
「腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ、ＴＮＦ）」は、サイトカインの一種であり、狭義にはＴＮＦはＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β（リンホトキシン（ＬＴ）−α）およびＬＴ−βの３種類である。「ＴＮＦファミリーに属するタンパク質」には、受容体活性化因子ＮＦkＢリガンド（ＲＡＮＫＬ）、Ｆａｓリガンド、ＣＤ４０リガンド等の少なくとも１９種類以上の分子が含まれる。
【００６４】
本発明において、「ＴＮＦファミリーに属するタンパク質」の例として、好ましくは、受容体活性化因子ＮＦ(Ｂリガンド（ＲＡＮＫＬ）が使用されうる。
【００６５】
４）ペプトン
「ペプトン」とは、タンパク質をタンパク質分解酵素で分解したものである。生体内ではタンパク質が胃でペプシンにより消化されてペプトンとなり、膵臓で分泌される膵液や空腸で分泌される腸液によりさらにアミノ酸まで消化される。
【００６６】
微生物の栄養源として適しているため、培地においてしばしば添加される。この培地栄養源としてのペプトンは、蛋白質をアミノ酸および低分子量のペプチドまで加水分解したもので、一般には牛乳の蛋白質（ミルクカゼイン）を酵素分解（豚の膵臓から抽出したパンクレアチンなどのプロテアーゼを使用）したものが一般的に使用されている。
【００６７】
限定されるわけではないが、ペプトンは好ましくは植物由来のものが使用される。例えば、綿実由来ペプトン、大豆由来ペプトン、小麦由来ペプトン及びエンドウ豆由来ペプトンからなる群から選択される。
【００６８】
実施例１に示されるように、アミノ酸単体では、ラミニン５の活性を上昇させるという本発明の効果は得られなかった。よって、本発明において、「ペプトン」は、アミノ酸単体まで消化されたものは含まない。
【００６９】
細胞
本発明の方法において培養される細胞の種類、由来は特に限定されない。
【００７０】
好ましくは、多能性幹細胞、組織幹細胞、体細胞、生殖細胞、及び肉腫細胞からなる群から選択される。限定されるわけではないが、好ましくは、多能性幹細胞は、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性生殖細胞、又は生殖幹細胞から選択される。好ましくは、組織幹細胞は、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、又は造血幹細胞から選択される。好ましくは、体細胞は、肝細胞、膵細胞、筋細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、繊維芽細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞、又は、リンパ球、赤血球、白血球、単球、マクロファージ若しくは巨核球の血球細胞から選択される。
【００７１】
細胞が由来する生物種も特に限定されない。好ましくは、マウス、ラット、ヒト、サル、ブタ、イヌ、ヒツジ、ヤギなどの哺乳類、並びに、ニワトリなどの鳥類などに由来する。より好ましくは、マウス、ラット及びヒトからなる群から選択される種に由来する。
【００７２】
本発明において「多能性幹細胞」とは、あらゆる組織の細胞へと分化する能力（分化多能性）を有する幹細胞の総称することを意図する。本明細書において後述する実施例ではＥＳ細胞（ＥＢ３細胞）を用いて検討を行っているが、本発明の方法に使用できる多能性幹細胞には、胚性幹細胞のみに限らず、哺乳動物の成体臓器や組織の細胞、骨髄細胞、血液細胞、更には胚や胎児の細胞等に由来する、胚性幹細胞に類似した形質を有する全ての多能性幹細胞が含まれる。この場合、胚性幹細胞と類似の形質とは、胚性幹細胞特異的な遺伝子の発現や内胚葉、中胚葉、外胚葉の全ての胚葉への分化能を有するといった、胚性幹細胞に特異的な細胞生物学的性質をもって定義することができる。
【００７３】
限定されるわけではないが、本発明の方法で増殖させることができる細胞の具体例としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、生殖幹細胞（ＧＳ細胞）等が挙げられる。なお本発明における多能性幹細胞として、ＥＳ細胞とｉＰＳ細胞が好ましい。ｉＰＳ細胞は倫理的な問題もない等の理由により特に好ましい。多能性幹細胞としては公知の任意のものを使用可能であるが、例えば、国際公開ＷＯ２００９／１２３３４９（ＰＣＴ／ＪＰ２００９／０５７０４１）に記載の多能性幹細胞を使用可能である。
【００７４】
「組織幹細胞」とは、分化可能な細胞系列が特定の組織に限定されているが、多様な細胞種へ分化可能な能力（分化多能性）を有する幹細胞を意味する。例えば骨髄中の造血幹細胞は血球のもととなり、神経幹細胞は神経細胞へと分化する。このほかにも肝臓をつくる肝幹細胞、皮膚組織になる皮膚幹細胞などさまざまな種類がある。
【００７５】
「体細胞」とは、多細胞生物を構成する細胞のうち生殖細胞以外の細胞のことを言う。有性生殖においては次世代へは受け継がれない。本明細書においては、「多能性幹細胞」、「組織幹細胞」以外の種々の細胞を意味する。
【００７６】
ラミニン５を含んだ系
本発明においては、ラミニン５を含んだ系で細胞を培養する。本発明で「ラミニン５を含んだ系」とは、細胞の培養システム中に何らかの形でラミニン５を含むことを意味するものであり、その態様は特に限定されない。
【００７７】
本発明において、ラミニン５を含んだ系で細胞を培養するのに、ラミニン５で処理した、特にラミニン５でコーティングした培養容器を用いることが好適な態様である。
【００７８】
本発明において「細胞培養容器」とは、は特に限定されるものではなく、細菌の混入を防ぐために滅菌処理され、かつ細胞を培養するのに適した任意の材料、任意の形状の容器を用いることができる。そのような培養容器の例として、本技術分野で一般的に用いられている培養用ディッシュ、培養用フラスコ、培養用シャーレ、９６ウェル、４８ウェル、１２ウェル、６ウェル、４ウェル等の培養用プレート、培養用ボトルなどを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
【００７９】
本発明においては、細胞培養においてラミニン５及びポリペプチドを使用することを特徴とする。好ましくは、細胞培養容器の表面にラミニン５及びポリペプチドを固相化する（コーティングする）などの処理を施す。培養容器の表面にラミニンを固相化する処理技術は本技術分野で公知であり、当業者は本発明の目的に応じて任意の培養容器を採用して該容器をラミニン５及びポリペプチドで処理し、該容器を本発明の方法で細胞を培養するのに用いることができる。
【００８０】
細胞培養容器の処理に使用されるラミニン５の量は特に限定されない。好ましくは、０．０１μｇ／ｍｌ以上、好ましくは０．１〜１５μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１μｇ／ｍｌ−２μｇ／ｍｌのラミニン５溶液で処理した場合、良好な結果が得られる。
【００８１】
本発明の一態様において、培養容器の内部表面にラミニン５を塗布した後に乾燥するなどして培養容器をラミニン５で処理してもよい。ラミニン５処理した培養容器にＧＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）やＤＭＥＭなどの細胞の培養に一般的に使用される培地を入れ、その培地中に多能性幹細胞を添加する。次いで、公知の適切な培養条件下、例えば限定するわけではないが３７℃、５％二酸化炭素気層条件下などで細胞の培養を行う。
【００８２】
本願発明では、好ましくは、細胞培養容器をラミニン５及びポリペプチドで処理する（コーティングする）。細胞培養器を処理する順番は特に限定されないが、好ましくは、ポリペプチドで処理した後にラミニン５で処理する、あるいは、ポリペプチドとラミニンで同時に処理する。
【００８３】
よって、本発明は前述のポリペプチドを含む、細胞培養容器コーティング用の組成物、又は細胞培養容器コーティング剤も提供する。本発明の組成物又は剤は、ポリペプチドとともにラミニン５を同時に含んでもよい。本願発明はさらに、前述のポリペプチドを含む細胞培養用培地を含む、キットも提供する。前述のポリペプチド及びラミニン５を含む細胞培養用培地を含む、キットも提供される。本発明のキットは、上記細胞培養用培地の他に、さらに、プレコート培養ディッシュ、プレコート培養プレート等を含んでもよい。
【００８４】
本発明と組成物、剤及びキットは、ラミニン５を含んだ系で細胞を培養する方法に使用することができる。
【００８５】
ポリペプチドの使用量
本発明において、ポリペプチドの使用量は特に限定されない。当業者は使用するポリペプチドの種類等に要素に応じて適切な量を適宜選択することが可能である。
【００８６】
限定されるわけではないが、好ましくは、ポリペプチドは１μｇ／ｍｌないし２００μｇ／ｍｌの間の濃度で使用する、実施例１において、ＨＳＡ、ＢＳＡ、ＨＳ、ＩｇＧなどの血中タンパク質を用いた場合、３．１２５μｇ／ｍｌないし１２．５μｇ／ｍｌの間の濃度で使用すると特に好ましいことが明らかにされた。また、綿実由来ペプトンを使用した場合、より高濃度、好ましくは１５．６μｇ／ｍｌないし１０００μｇ／ｍｌで使用すると、ラミニン５の細胞活性上昇効果を示すことが認められた。
【００８７】
ポリペプチドの併用
本発明の好ましい１態様において、２種類以上のポリペプチドを細胞培養系に含ませる。実施例１において、ポリペプチドとしてｒＨＳＡとＩｇＧを併用すると、各々を単独で使用した場合では大きな効果が確認できないくらいの低濃度（０．２５μｇ／ｍｌ）であっても、両者を併用することにより、ｒＨＳＡ  １０μｇ／ｍｌを使用した場合と同程度の強い接着活性上昇効果が認められた。よって２種以上のポリペプチドの併用により相加効果ではなく、相乗効果が得られると考えられる。
【００８８】
本発明の効果
本発明において、ラミニン５タンパク質が細胞培養において奏する種々の活性が、ポリペプチドとの併用において上昇される。限定されるわけではないが、ラミニン５タンパク質の効果としては、細胞接着活性、細胞分散活性、創傷治癒活性、増殖促進活性、未分化維持活性及び多能性維持活性が含まれる。
【００８９】
「細胞接着活性」とは、細胞を接着させる効果を意味する。図２、図３及び図４において、ｒＬｍ５（０．１２５μｇ／ｍｌ）にＨＳＡを併用することで、ｒＬｍ５（２μｇ／ｍｌ）と同等の接着活性が得られた。また、同様に、図１３において、よりｒＬｍ５（０．５μｇ／ｍｌ）にＨＳＡを併用することで、ｒＬｍ５（２μｇ／ｍｌ）と同等の接着活性が得られた。よって、本願発明においてポリペプチドの使用により、ポリペプチドを使用しない場合と比較して好ましくは、細胞接着活性が１．２倍以上、より好ましくは４倍以上、もっとも好ましくは８倍以上上昇する。
【００９０】
「細胞分散活性」とは、細胞を分散させる効果を意味する。本願発明においてポリペプチドの使用により、ポリペプチドを使用しない場合と比較して好ましくは、細胞分散活性が２倍以上上昇する。
【００９１】
「創傷治癒活性」とは、傷を治癒する効果を意味する。即ち、物理的に外傷を受けて細胞がいなくなった部分に、例えばラミニン５などを塗布することで、塗布した部分に周りから細胞を遊走させてくる活性である。傷を治癒する効果は、例えば、損傷を受けてから一定時間（例えば１６時間経過後）の傷の幅を測定することによって治癒率を確認することが可能である。実施例５では、ヒトラミニン５に加えてポリペプチド（ｒＨＳＡ）を併用することにより傷の治癒率が６０％から８０％に上昇した。
【００９２】
「増殖促進活性」とは、細胞の増殖を促進させる効果を意味する。例えば、細胞行ってから一定期間経過後の細胞数を測定することによって、細胞増殖の効果を確認することが可能である。
【００９３】
「未分化維持活性」とは、培養される細胞が未分化の細胞、例えば、多能性幹細胞、組織幹細胞の場合、その未分化の状態を維持することを意味する。ラミニン５でこれらの細胞を培養する場合、細胞の分化は進まず、未分化の状態が維持される。本発明において、ラミニン５とポリペプチドを併用した場合も未分化の状態が維持されることが確認された（実施例７、図２５）。例えばＳｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４などの未分化マーカーを測定することにより、培養中に組織幹細胞が分化していないか評価することができる。
【００９４】
「多能性維持活性」とは、培養される細胞が多能性を有する細胞、例えば、多能性幹細胞の場合、その多能性を維持することを意味する。本発明において、ラミニン５とポリペプチドを併用した場合も、多能性が維持される。
【実施例】
【００９５】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００９６】
実施例１  組換えヒトラミニン５（ｒＬｍ５）の調製
本実施例では、公知の方法に従って組み換えヒトラミニン５タンパク質を調製した。【００９７】
α３鎖（配列番号１）、β３鎖（配列番号３）、γ２鎖（配列番号３）のｃＤＮＡを導入したヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ２９３（Ｌｍ５−ＨＥＫ２９３）から回収した無血清培養上清を４℃、３０００ｒｐｍで５分遠心した。ヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ２９３は、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３２，６０７−６１２（２００２）に従って得た。次いで、Ｈｅｐａｒｉｎ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけ、溶出した。マウス抗Ｌｍ−α３（抗ラミニンα３）モノクローナル抗体（ＢＧ５）をＰｒｏｔｅｉｎＡ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に共有結合させた抗体カラムにｒＬｍ５含有画分を通し、次いで溶出した。なお、モノクローナル抗体ＢＧ５はラミニンα３Ｂ鎖Ｎ末端断片を抗原として公知のモノクローナル抗体作成方法に従って、本発明者らが作製した抗体である。【００９８】
１μｇの精製ｒＬｍ５を還元条件にて変性した後、５−２０％ゲルを用いＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にてα３鎖、β３鎖、γ２鎖のサイズ、純度を確認したところ、それぞれ１６０ｋＤａ、１３５ｋＤａ、１０５ｋＤａのバンドが確認できた。図１に精製ｒＬｍ５についてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った結果の写真を示す。ＣＳ−Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて解析した結果、精製ｒＬｍ５の純度は約９８％であった。このようにして調製したｒＬｍ５を以下の実施例において使用した。【００９９】
実施例２  細胞接着アッセイ
本実施例では、各種細胞に対するｒＬｍ５およびｒＬｍ５に添加物を加えた際の接着アッセイの結果を示す。【０１００】
細胞はラット肝細胞株（ＢＲＬ）、マウスＥＳ細胞株（ＥＢ３）、ヒト肉腫細胞株（ＨＴ１０８０）、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の４種類を用いた。ＢＲＬは横浜市立大学大学院  生命ナノシステム科学研究科  ゲノムシステム科学専攻から提供を受けた。ＥＢ３は、大阪大学医学系研究科  未来医療開発専攻Ｇ６  分子治療学講座  幹細胞制御分野から提供を受けた。ＨＴ１０８０は理化学研究所バイオリソースセンターより入手した（ＲＣＢ１９５６）。ｈＭＳＣはロンザ社（ＬＯＮＺＡ）より入手した。【０１０１】
各種細胞は以下の培地を用いて培養・増殖させた。ＢＲＬは１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＥＢ３は１０％ＦＢＳ、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、１０００Ｕ／ｍｌ  ＥＳＧＲＯ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、及び１０-4Ｍ  ２−メルカプトエタノール（ＷＡＫＯ）を添加したＧＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）、ＨＴ１０８０は１０％ＦＢＳを添加したＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ）、ｈＭＳＣはＭＳＣＧＭ（ＬＯＮＺＡ）を用いた。ただし、接着アッセイではこれらの培地から血清を除いた無血清培地を用いた。【０１０２】
濃度調製したｒＬｍ５で９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を３７℃で２時間または４℃で一晩処理し、ＰＢＳ（−）で処理表面を洗浄後、１．２％ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ）溶液にて３７℃で１時間ブロッキング処理を行った。必要に応じてｒＬｍ５の処理はヒト血清アルブミン（ＨＳＡ／Ｎａｃａｌａｉ）、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ／ＳＩＧＭＡ）、ヒト血清（ＨＳ／ＯＹＣ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ／ＳＩＧＭＡ）、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ／ＯＹＣ）、ウシゼラチン（Ｇｌ／ＳＩＧＭＡ）、組換えヒトＲｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦ−κＢ  Ｌｉｇａｎｄ（ｓＲＡＮＫＬ／ＯＹＣ）、綿実由来ペプトン（Ｐｅｐ／ＤＭＶ）、グリシン（Ｇｌｙ／Ｎａｃａｌａｉ）、アルギニン（Ａｒｇ／Ｎａｃａｌａｉ）、トレハロース（Ｔｒｅ／ＳＩＧＭＡ）、キシロース（Ｘｙｌ／Ｗａｋｏ）、マンノース（Ｍａｎ／Ｗａｋｏ）、ラクトース（Ｌａｃ／Ｗａｋｏ）を混ぜて処理を行った。各種細胞は血清を添加しない無血清培地にて洗浄後、２００００個／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ2、９５％空気の気層条件下で１時間培養を行った。ただし、ＥＢ３は３００００個／ウェルで播種した。培養後、ボルテックスミキサーで軽く震動させて接着の弱い細胞をプレート表面から浮遊させ、パーコール（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）処理にて該細胞を除いた。接着した細胞を２５％グルタルアルデヒド（Ｎａｃａｌａｉ）で固定し、２．５％クリスタルバイオレット（Ｎａｃａｌａｉ）にて染色してＯＤ５９５を測定することで様々な条件でのｒＬｍ５の接着活性を評価した。【０１０３】
図２〜１１にＢＲＬを用いた接着アッセイの結果を、図１２にＨＴ１０８０を用いた接着アッセイの結果を、図１３にｈＭＳＣを用いた接着アッセイの結果を、図１４、１５にＥＢ３を用いた接着アッセイの結果を示す。【０１０４】
０．２５μｇ／ｍｌのｒＬｍ５にて処理する際にＨＳＡ、ＢＳＡ、ＨＳ、ＩｇＧを併用すると併用しない時と比較して接着活性の上昇が認められた。このことから血中タンパク質にｒＬｍ５の接着活性を上昇させる効果があることが分かった（図２）。ＨＳＡの至適濃度を検討するため、０〜２００μｇ／ｍｌのＨＳＡを併用したところ、３．１２５〜１２．５μｇ／ｍｌに至適濃度があることが分かった（図３）。さらに、この活性上昇作用を示す物質を特定するために０〜２００μｇ／ｍｌのｒＨＳＡを併用したところ、ＨＳＡと同じく３．１２５〜１２．５μｇ／ｍｌに至適濃度があることが分かった。このことから、活性上昇作用を示す物質は天然型タンパク質に含まれる不純物等ではないことが分かった（図４）。【０１０５】
次にＨＳＡ、ＢＳＡ、ＨＳ、ＩｇＧなどの血中タンパク質以外のタンパク質でも同様の作用があるかをＧｌ、ｓＲＡＮＫＬ、Ｐｅｐで検討したところ、それぞれの物質にて作用に多少の違いは認められたが、ＨＳＡのような接着活性上昇作用が認められた（図５）。Ｐｅｐにおける活性上昇作用はわずかであったが、より広範囲で濃度（０〜１０００μｇ／ｍｌ）を検討したところ、高濃度で強い活性上昇作用を示すことが分かった（図６）。以上のことからポリペプチド、或いはペプチドであれば活性上昇作用を示すことが分かった。【０１０６】
次に糖類を検討した。０．２５μｇ／ｍｌのｒＬｍ５にＸｙｌ、Ｍａｎ、Ｌａｃ、Ｔｒｅを併用したところ、ポリペプチド、或いはペプチドのような活性上昇作用は認められなかった（図７）。より高濃度（１００μｇ／ｍｌ）で併用してもＨＳＡのような強い活性上昇作用は認められなかった（図８）。【０１０７】
次にアミノ酸を検討した。ｒＬｍ５に０〜１０００μｇ／ｍｌのＧｌｙ、Ａｒｇを併用したところ、糖類と同様にｒＨＳＡのような強い活性上昇作用は認められなかった（図９）。Ａｒｇについては活性減少が認められた。【０１０８】
以上のことから、糖類やアミノ酸のような低分子では活性上昇作用は示さないことが分かった。【０１０９】
次に複数のタンパク質の併用を検討した。０．１２５μｇ／ｍｌのｒＬｍ５に０．５μｇ／ｍｌのｒＨＳＡのみ、或いは０．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧのみを併用した時には、１０μｇ／ｍｌのｒＨＳＡを併用した時に比べて接着活性は低かったが、０．５μｇ／ｍｌのｒＨＳＡと０．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧを組み合わせて併用したところ、１０μｇ／ｍｌのｒＨＳＡを併用した時と同等の接着活性を示した（図１０）。このことから複数種のタンパク質を組み合わせてもｒＬｍ５の接着活性を上昇させ得ることが分かった。【０１１０】
次に併用方法について１０μｇ／ｍｌのｒＨＳＡを用いて検討した。ｒＨＳＡにて処理した後にｒＬｍ５で処理した場合（ｒＨＳＡ→ｒＬｍ５）、これまでと同様にｒＨＳＡとｒＬｍ５を同時に処理した場合（ｒＬｍ５＋ｒＨＳＡ）、ｒＬｍ５で処理した後にｒＨＳＡで処理した場合（ｒＬｍ５→ｒＨＳＡ）を比較検討した。その結果、前処理と同時は接着活性上昇作用を示すのに対して、後処理では接着活性上昇作用を示さないことが分かった（図１１）。【０１１１】
次にＢＲＬ以外の細胞においても同様の活性上昇作用が認められるかをＨＴ１０８０、ｈＭＳＣ、ＥＢ３を用いて検討した。検討では０〜２００μｇ／ｍｌのｒＨＳＡの併用を検討した。その結果、細胞種によって活性上昇作用に多少の違いは認めらたが、全ての細胞で活性の上昇が認められ、さらにＢＲＬと同様に３．１２５〜１２．５μｇ／ｍｌに至適濃度があることが分かった（図１２〜１４）。ＥＢ３について接着アッセイ後の細胞形態を図１５に示す。【０１１２】
以上のことから、ポリペプチド、或いはペプチドを併用して処理することで、様々な細胞に対してｒＬｍ５の接着活性を上昇させられることが分かった。また、併用の際のポリペプチド濃度は３．１２５〜１２．５μｇ／ｍｌが至適であり、併用方法としては同時でなくても良く、事前に処理しておくだけで十分にｒＬｍ５の活性を上昇させることが出来ることが分かった。【０１１３】
実施例３  他の細胞外マトリックスタンパク質やラミニンアイソフォームにおける活性上昇作用の検討
本実施例では、ヒトビトロネクチン（Ｖｎ／ＳＩＧＭＡ）、ヒトラミニン２（Ｌｍ２／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、他の細胞外マトリックスタンパク質やラミニンアイソフォームにもｒＬｍ５と同様の活性上昇作用が認められるかをラット肝細胞株（ＢＲＬ）を用いた接着アッセイにて検討した結果を示す。アッセイは実施例２記載の方法に準じて行った。【０１１４】
図１６に１０μｇ／ｍｌのＨＳＡを、図の１７に１０μｇ／ｍｌのｒＨＳＡを併用した際の接着アッセイの結果を示す。その結果、ｒＬｍ５のようにＨＳＡやｒＨＳＡを併用することによる活性上昇作用は、ＶｎやＬｍ２では一切認められなかった。以上のことから、活性上昇作用は細胞外マトリックスタンパク質全般に起こる現象ではなく、さらにラミニンであってもどのアイソフォームでも起こる共通の現象ではないことが分かった。【０１１５】
実施例４  ＢＲＬ細胞を用いた細胞分散アッセイ
本実施例では、ラット肝細胞株（ＢＲＬ）細胞に対するｒＬｍ５およびｒＬｍ５に添加物を加えた際の細胞分散アッセイの結果を示す。ＢＲＬは横浜市立大学大学院  生命ナノシステム科学研究科  ゲノムシステム科学専攻から提供を受けた。【０１１６】
ＢＲＬ細胞は１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２を用いて培養・増殖させた。ただし、細胞分散アッセイでは1％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ/Ｆ１２培地を用いた。【０１１７】
濃度調製したｒＬｍ５で２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を４℃で一晩処理し、ＰＢＳ（−）で処理表面を洗浄後、１％ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ）溶液にて３７℃で１時間ブロッキング処理を行った。必要に応じてｒＬｍ５の処理はｒＨＳＡを混ぜて行った。ｒＬｍ５処理表面をＰＢＳ（−）にて洗浄後、細胞を１％ＦＢＳ培地にて洗浄し、７０００個／ウェルで播種の後に３７℃、５％ＣＯ2、９５％空気の気層条件下で４０時間培養を行った。培養後、ボルテックスミキサーで軽く震動させて接着の弱い細胞をプレート表面から浮遊させ、パーコール処理にて該細胞を除いた。接着した細胞を２５％グルタルアルデヒドで固定し、ランダムな３視野の写真を撮り、単一細胞数を数えた。【０１１８】
図１８および１９に細胞分散アッセイの結果を示す。Ｌｍ５が低濃度（０．０２μｇ）の際にｒＨＳＡを加えた場合は有意に細胞分散活性の上昇が認められた。【０１１９】
以上のことから、ｒＨＳＡをはじめとするポリペプチドの併用は細胞接着活性だけでなく、ｒＬｍ５の活性としてすでに報告されている細胞分散活性についても活性上昇作用が認められた。【０１２０】
実施例５  ＢＲＬ細胞を用いた創傷治癒アッセイ
本実施例では、ラット肝細胞株（ＢＲＬ）細胞に対するｒＬｍ５およびｒＬｍ５に添加物を加えた際の創傷治癒アッセイの結果を示す。ＢＲＬは横浜市立大学大学院  生命ナノシステム科学研究科  ゲノムシステム科学専攻から提供を受けた。【０１２１】
ＢＲＬは１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２を用いて培養・増殖させた。ただし、創傷治癒アッセイでは前記培地の他に培地から血清を除いた無血清培地を添加した培地を用いた。【０１２２】
２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に細胞を１０％ＦＢＳ培地にて１６００００個/ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ2、９５％空気の気層条件下で３時間培養を行った。培養後各ウェルの接着細胞集団にブルーチップを用いて一定幅の傷をつけ血清を除いた無血清培地にて２回洗浄を行った。無血清培地にて濃度調製したｒＬｍ５で各ウェルを３７℃で1時間処理した。必要に応じてｒＬｍ５の処理はｒＨＳＡを混ぜて行った。ｒＬｍ５処理後、血清を除いた無血清培地で処理表面を2回洗浄し、無血清培地を添加した。また顕微鏡にて観察し、傷をつけた付近の写真を撮影した。その後無血清培地にて３７℃、５％ＣＯ2、９５％空気の気層条件下で１６時間培養を行い、同一部位付近の写真を撮影し（図２１）、傷の治り具合を開始時の傷と１６時間後の傷の幅を測定し、創傷治癒率を計算した。【０１２３】
図２０に得られた創傷治癒率の結果を示す。Ｌｍ５にｒＨＳＡを加えた場合は有意に創傷治癒活性の上昇が認められた。【０１２４】
以上のことから、ｒＨＳＡをはじめとするポリペプチドの併用は細胞接着活性や細胞分散活性だけでなく、ｒＬｍ５の活性としてすでに報告されている創傷治癒活性についても活性上昇作用が認められた。【０１２５】
実施例６  ヒト間葉系幹細胞を用いた増殖アッセイ
本実施例では、各種細胞支持材料を使用した場合におけるｈＭＳＣを用いた増殖アッセイの結果を示す。【０１２６】
増殖アッセイでは１０％ＦＢＳの代わりに、５％Ｐａｎｅｘｉｎ（ＰＡＮ−ｂｉｏｔｅｃｈ社）を添加した培地（Ｐ）と５％Ｐａｎｅｘｉｎ及び１ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）を添加した培地（Ｐ＋Ｆ）を用いた。また比較のため、１０％ＦＢＳを含有する維持培地（Ｓｅｒｕｍ）も用いた。濃度調製した各種細胞外マトリックスタンパク質にて処理した６ウェルプレート（ＮＵＮＣ）に、各培地に置き換えたｈＭＳＣを３８４００個／ウェルで播種した。３７℃、５％ＣＯ2、９５％空気の気層条件下で１０日間培養し、３日後、７日後、１０日後にそれぞれ酵素処理により細胞を回収し、血球計算盤にて細胞数を計測した。【０１２７】
細胞支持材料は、１ｍｇ／ｍｌのｒＬｍ５、０．２μｇ／ｍｌのｒＬｍ５、０．２μｇ／ｍｌのｒＬｍ５に１０μｇ／ｍｌのｒＨＳＡを添加したものにそれぞれ調製した。【０１２８】
図２２に、各培養条件下でｈＭＳＣの増殖に対する影響を検討した結果を示す。０．２μｇ／ｍｌのｒＬｍ５に対して、ｒＨＳＡを添加した場合、有意に細胞増殖の上昇が認められた。【０１２９】
以上のことから、ｒＨＳＡをはじめとするポリペプチドの併用は細胞接着活性や細胞分散活性、創傷治癒活性だけでなく、ｒＬｍ５の活性としてすでに報告されている間葉系幹細胞の増殖促進活性についても活性上昇作用が認められた。このことから、ｒＨＳＡをはじめとするポリペプチドの併用はｒＬｍ５の持つ活性の全てについて上昇させることが出来ることが予想された。【０１３０】
実施例７  ＥＢ３を用いた増殖アッセイ
本実施例では、ｒＬｍ５を細胞支持材料として用いた場合におけるＥＢ３を用いた増殖アッセイの結果を示す。【０１３１】
ＥＢ３の維持培地は実施例２に記載の増殖培地の１０％ＦＢＳの代わりに、１０％ノックアウトTM血清代替添加物（ＫＳＲ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した培地（ＫＳＲ−ＧＭＥＭ）を用いた。濃度調製した各種細胞外マトリックスタンパク質にて処理した１２ウェルプレート（ＮＵＮＣ）に、ＥＢ３を４３０００個／ウェルで播種した。３７℃、５％ＣＯ2、９５％空気の気層条件下で２日間培養後、酵素処理により細胞を回収し、血球計算盤にて細胞数を計測した。【０１３２】
再び、濃度調製したｒＬｍ５にて処理した１２ウェルプレートにＥＢ３を４３０００個／ウェルで播種した。この操作を繰り返すことで、ＥＢ３に対する各条件でのｒＬｍ５の増殖効果を比較した。ｒＬｍ５は、２μｇ／ｍｌ（Ｌ（２））、０．２μｇ／ｍｌ（Ｌ（０．２））、０．２μｇ／ｍｌのｒＬｍ５に３．１２５μｇ／ｍｌのｒＨＳＡを添加したもの（Ｌ（０．２）＋Ｈ（３．１２５））、０．２μｇ／ｍｌのｒＬｍ５に１２．５μｇ／ｍｌのｒＨＳＡを添加したもの（Ｌ（０．２）＋Ｈ（１２．５））にそれぞれ調製した。【０１３３】
図２３に、各培養条件下でＥＢ３を５回継代した際に最終的に理論上何倍に増殖したかを算出した結果を示す。図２３の結果から、０．２μｇ／ｍｌのｒＬｍ５のみに比べて０．２μｇ／ｍｌのｒＬｍ５にｒＨＳＡを加えた実験区では約３倍の細胞増殖が認められ、２μｇ／ｍｌのｒＬｍ５を用いた場合と同等であった。【０１３４】
以上のことから、マウスＥＳ細胞の増殖においてもｒＨＳＡの併用効果が認められた。【０１３５】
実施例８  ＥＢ３を用いた増殖アッセイと未分化マーカーの検出
本実施例では、各種細胞支持材料を使用した場合におけるＥＢ３を用いた増殖アッセイの結果とＲＴ−ＰＣＲによる未分化マーカーの検出結果を示す。【０１３６】
ＥＢ３の増殖アッセイにて播種した細胞数および継代間隔は実施例７と同様に行った。増殖アッセイに用いた培地は実施例２に記載の増殖培地（Ｓ）とＫＳＲ−ＧＭＥＭ(Ｋ)を用いた。また、１２ウェルプレートを処理した各種細胞外マトリックスタンパク質は、１ｍｇ／ｍｌのＧｌ、０．０５μｇ／ｍｌのｒＬｍ５（Ｌ０．０５）、０．０５μｇ／ｍｌのｒＬｍ５に１２．５μｇ／ｍｌのｒＨＳＡを添加したもの（Ｌ０．０５＋Ｈ１２．５）を用いた。【０１３７】
図２４に、各培養条件下でＥＢ３を３回継代した際に最終的に理論上何倍に増殖したかを算出した結果を示す。図２４の結果から、０．０５μｇ／ｍｌのｒＬｍ５のみでは途中で増殖が止まってしまったのに対して０．０５μｇ／ｍｌのｒＬｍ５にｒＨＳＡを加えた実験区では増殖が認められた。【０１３８】
次に、増殖の認められたＳ＋Ｇ、Ｋ＋Ｌ（０．０５）＋Ｈ（１２．５）についてマウスＥＳ細胞の未分化マーカーとして知られるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇの遺伝子に関してＲＴ−ＰＣＲにて未分化マーカーの検出を行った。なお、Ｓ＋Ｇの条件よりマウスＥＳ細胞の未分化維持因子として知られるＬＩＦを除いた状態で同様の期間維持した実験区を陰性の対照区（Ｓ（ＬＩＦ−）＋Ｇｌ）として設定した。【０１３９】
ＲＮＡは３回継代培養したＥＢ３からＴＲＩＺＯＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。抽出後、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写反応によりｃＤＮＡ合成を行った。合成したｃＤＮＡを鋳型として表２に示すプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。【０１４０】
【表２】
0005882198.tif 000003
【０１４１】
各遺伝子の変性反応は９４℃  ３０秒、アニーリング反応は３０秒、伸長反応は７２℃  ２０秒で行った。アニーリング反応はＯｃｔ４は６１℃、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇは５４℃の温度で行った。【０１４２】
図２５にＲＴ−ＰＣＲにて未分化マーカーを検出した結果を示す。図２５の結果より、Ｓ＋Ｇｌと同様にＫ＋Ｌ（０．０５）＋Ｈ（１２．５）では３つの未分化マーカーを発現していることが分かった。このことから、ｒＬｍ５にｒＨＳＡを併用した場合でもＥＢ３は未分化性を維持していることが示唆された。【０１４３】
以上のことから、ｒＬｍ５とｒＨＳＡとの併用は増殖において効果があるだけでなく、維持されたマウスＥＳ細胞は未分化性を正常に維持していることが示唆された。
【配列表フリーテキスト】
【０１４４】
＜配列番号１＞
配列番号１は、ヒトラミニンα３鎖の塩基配列を示す。
＜配列番号２＞
配列番号２は、ヒトラミニンα３鎖のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号３＞
配列番号３は、ヒトラミニンβ３鎖の塩基配列を示す。
＜配列番号４＞
配列番号４は、ヒトラミニンβ３鎖のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号５＞
配列番号５は、ヒトラミニンγ２鎖の塩基配列を示す。
＜配列番号６＞
配列番号６は、ヒトラミニンγ２鎖のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号７−１４＞
配列番号７−１４は、ＥＢ３細胞における未分化マーカー検出のための、ＲＴ−ＰＣＲ用プライマーの塩基配列を示す。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２２】
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【図２４】
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【図１】
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【図９】
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【図１５】
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【図１９】
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【図２１】
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【図２３】
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【図２５】
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【配列表】
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