(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼによって切断可能でないリンカーペプチドによって、安定化タンパク質のＣ末端に接続されたグループＩＩイントロン由来逆転写酵素を含む、安定化された逆転写酵素融合タンパク質であって、該グループＩＩイントロン由来逆転写酵素が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５からなる群より選択される配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含み、該安定化タンパク質が、溶解性向上タンパク質を含む、安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
【請求項２】
前記安定化タンパク質が、マルトース結合タンパク質またはＮ利用物質Ａタンパク質を含む、請求項１に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
【請求項３】
前記安定化タンパク質が、荷電アミノ酸を無荷電アミノ酸と置き換えることによって改変されている、請求項１に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
【請求項４】
前記リンカーペプチドが、剛性リンカーペプチドである、請求項１に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
【請求項５】
前記リンカーペプチドが、１アミノ酸から２０アミノ酸からなる、請求項１に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
【請求項６】
前記リンカーペプチドが、１アミノ酸から５アミノ酸からなる、請求項１に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
【請求項７】
前記リンカーペプチドが、３アミノ酸から５アミノ酸からなる、請求項１に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
【請求項８】
前記リンカーペプチドが、配列番号１２からなる、請求項１に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
【請求項９】
前記融合タンパク質が、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０からなる群より選択される配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含むアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
【請求項１０】
前記安定化された逆転写酵素融合タンパク質が、４５℃から６５℃の温度において２．０×１０−５以下のエラー頻度で逆転写を行うことができる、請求項１に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
【請求項１１】
ＲＮＡ分子からｃＤＮＡを調製するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）プライマーヌクレオチド配列を該ＲＮＡ分子に加える工程
（ｂ）１つ以上のデオキシリボヌクレオシド三リン酸またはジデオキシリボヌクレオシド三リン酸、およびプロテアーゼによって切断可能でないリンカーペプチドによって、安定化タンパク質のＣ末端に接続されたグループＩＩイントロン由来逆転写酵素を含む安定化された逆転写酵素融合タンパク質の存在下において、該ＲＮＡ分子の全部または一部に相補的なｃＤＮＡ分子を合成するのに十分な条件下で該ＲＮＡ分子をインキュベートする工程
を包含し、該グループＩＩイントロン由来逆転写酵素が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５からなる群より選択される配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含み、該安定化タンパク質が、溶解性向上タンパク質を含む、方法。
【請求項１２】
前記グループＩＩイントロン由来逆転写酵素が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５からなる群より選択される配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、ならびに、１アミノ酸から２０アミノ酸からなる前記切断可能でないリンカーペプチドを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記逆転写が、４５℃から６５℃の温度において２．０×１０−５以下のエラー頻度で行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０からなる群より選択される配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸を含む、安定化された逆転写酵素融合タンパク質を生成するためのＤＮＡ発現ベクターであって、ここで、該ポリペプチドはプロテアーゼによって切断可能でないリンカーペプチドを含む、ＤＮＡ発現ベクター。
【請求項１５】
安定化された逆転写酵素融合タンパク質を生成する方法であって、該方法は、以下の工程（ａ）請求項１４に記載のＤＮＡ発現ベクターを含む宿主細胞を培養する工程；
（ｂ）該ＤＮＡ発現ベクターによってコードされる該安定化された逆転写酵素融合タンパク質を発現させる工程；および
（ｃ）該安定化された逆転写酵素融合タンパク質を該宿主細胞から単離する工程
を包含する、方法。
【請求項１６】
前記グループＩＩイントロン由来逆転写酵素が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５からなる群より選択される配列と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
【請求項１７】
前記融合タンパク質が、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０からなる群より選択される配列と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する
ポリペプチドを含むアミノ酸配列を有する、請求項９に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
【請求項１８】
前記グループＩＩイントロン由来逆転写酵素が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５からなる群より選択される配列と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０からなる群より選択される配列と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸を含む、請求項１４に記載のＤＮＡ発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
継続出願のデータ
この出願は、２００９年３月４日に出願された米国仮特許出願第６１／１５７，３３２号（これは、参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
政府の資金供与
この研究は、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈからの助成金番号ＧＭ３７９４９−２２によって少なくとも部分的に支援された。米国政府は、本発明に一定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ＲＴ−ＰＣＲと省略される逆転写ポリメラーゼ連鎖反応は、ＲＮＡを増幅するための周知の手法である。ＲＴ−ＰＣＲでは、ＲＮＡ鎖を相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写し、次いでそれを、ポリメラーゼ連鎖反応においてＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅する。このプロセスの第１工程では、ＤＮＡプライマーとともにデオキシリボヌクレオチドホスフェートおよび逆転写酵素を用いてＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを生成する。
【０００４】
ＲＮＡ鋳型からのｃＤＮＡの合成は、ＲＮＡ鎖のらせんおよび他の様々な種類のねじれからなるＲＮＡの二次構造および三次構造によって妨げられ得る。ＲＮＡの二次構造および三次構造は、高温（例えば、５０℃超）で反応を行うこと、または変性用添加物を加えることによって、減少し得る。しかしながら、変性用添加物を加えることは、逆転写酵素の活性を低下させることが多いので、望ましくない。高温は、非特異的プライマーの結合を減少させることによってＤＮＡ合成の特異性を高めるという利点ももたらす。残念なことに現在のところ、高温で機能することができる逆転写酵素は、限られた数しか利用できず、これらのＤＮＡ重合の忠実度は、比較的低い。例えば、商業的に入手可能なＡｖｉａｎ  Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ逆転写酵素は、ＲＮａｓｅＨ活性を備え、３７℃で機能し得るが、わずか約１．７×１０−４という忠実度しか有しない。ＲＮａｓｅＨ活性は、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびプライマー結合部位と競合するがゆえに、ｃＤＮＡ収量が低下する。したがって、高い忠実度および処理能力を有する逆転写酵素を含む、高温で逆転写を行うことができる逆転写酵素が必要とされている。高温によって、ＲＮＡの二次構造および三次構造の妨害が減少し、より長くかつより特異性の高いプライマーを使用できるようになることによって逆転写の特異性が高まるので、そのような酵素は、有益である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要旨
１つの局面において、本発明は、安定化タンパク質（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）に接続された耐熱性逆転写酵素を含む安定化された（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ）逆転写酵素（ＲＴ）融合タンパク質を提供する。安定化された逆転写酵素融合タンパク質の１つの実施形態において、耐熱性逆転写酵素は、細菌の逆転写酵素である。さらなる実施形態において、細菌の逆転写酵素は、グループＩＩイントロン由来逆転写酵素である。細菌の耐熱性逆転写酵素の例としては、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ逆転写酵素およびＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ逆転写酵素が挙げられる。別の実施形態において、耐熱性逆転写酵素は、高い忠実度のｃＤＮＡ合成を示す。なおも別の実施形態において、耐熱性逆転写酵素は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５からなる群より選択される配列と実質的に類似のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【０００６】
安定化された逆転写酵素融合タンパク質は、逆転写酵素に連結されたときにその耐熱性逆転写酵素の有効期間および／または熱安定性および／または溶解性を高める安定化タンパク質を含む。ある特定の実施形態において、安定化タンパク質は、親和性タンパク質または溶解性向上タンパク質（例えば、マルトース結合タンパク質またはＮ利用物質Ａ（Ｎ−ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ａ）タンパク質）である。追加の実施形態において、安定化タンパク質は、ある特定の荷電アミノ酸を無荷電アミノ酸で置き換えることによって改変される。
【０００７】
安定化された逆転写酵素融合タンパク質は、耐熱性逆転写酵素を安定化タンパク質に接続するリンカーペプチドも含み得る。いくつかの実施形態において、このリンカーペプチドは、切断不可能なリンカーであり、他の実施形態では、切断不可能な剛性リンカーである。いくつかの実施形態において、リンカーペプチドは、１〜２０アミノ酸からなるが、他の実施形態では、リンカーペプチドは、１〜５または３〜５アミノ酸からなる。例えば、切断不可能な剛性リンカーペプチドは、５アラニンアミノ酸を含み得る。
【０００８】
追加の実施形態において、安定化された逆転写酵素融合タンパク質は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０からなる群より選択される配列と実質的に類似のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含むアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、安定化された逆転写酵素融合タンパク質は、約４５°〜約６５℃の温度において２．０×１０−５以下のエラー頻度の逆転写を行うことができる高い忠実度の逆転写酵素である。さらなる実施形態において、安定化された逆転写酵素融合タンパク質は、約８１℃までの温度において実質的なレベルの逆転写を行うことができる。
【０００９】
本発明の別の局面は、ＲＮＡ分子からｃＤＮＡを調製するための方法を提供し、その方法は、以下の工程：（ａ）プライマーヌクレオチド配列をＲＮＡ分子に加える工程、および（ｂ）１つ以上の修飾されたまたは修飾されていないデオキシリボヌクレオシド三リン酸またはジデオキシリボヌクレオシド三リン酸、および安定化タンパク質に接続された耐熱性逆転写酵素を含む安定化された逆転写酵素融合タンパク質の存在下において、そのＲＮＡ分子の全部または一部に相補的なｃＤＮＡ分子を合成するのに十分な条件下でそのＲＮＡ分子をインキュベートする工程を包含する。特定の実施形態において、耐熱性逆転写酵素は、リンカーペプチド（例えば、切断不可能なリンカーペプチドまたは切断不可能な剛性リンカーペプチド）によって安定化タンパク質に接続される。好ましくは、逆転写は、ＲＮＡが実質的に減少した量の安定な妨害性の二次構造または三次構造しか含まない温度範囲内で行われる。この方法の実施形態は、耐熱性逆転写酵素がグループＩＩイントロン由来逆転写酵素である実施形態を含む。この方法のさらなる実施形態において、耐熱性逆転写酵素は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５からなる群より選択される配列と実質的に類似のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含み、切断不可能なリンカーは、１〜２０アミノ酸からなり、安定化タンパク質は、親和性タンパク質または溶解性向上タンパク質である。この方法のなおもさらなる実施形態において、逆転写は、約４５°〜約６５℃の温度において、２．０×１０−５以下のエラー頻度で行われる。
【００１０】
本発明の別の局面は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０からなる群より選択される配列と実質的に類似のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を含む安定化された逆転写酵素融合タンパク質を生成するためのＤＮＡ発現ベクターを提供する。
【００１１】
本発明の別の局面は、安定化された逆転写酵素融合タンパク質を生成する方法を提供し、その方法は、以下の工程：（ａ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０からなる群より選択される配列と実質的に類似のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を含む安定化された逆転写酵素融合タンパク質を生成するためのＤＮＡ発現ベクターを含む宿主細胞を培養する工程；（ｂ）そのＤＮＡ発現ベクターによってコードされる安定化された逆転写酵素融合タンパク質を発現させる工程；および（ｃ）その安定化された逆転写酵素融合タンパク質を宿主細胞から単離する工程を包含する。
【００１２】
安定化された逆転写酵素融合タンパク質は、より高い温度および／またはより高い処理能力でのｃＤＮＡ合成を促進し得、そして／または逆転写の特異性（すなわち、忠実度）を高めるより長くより安定なプライマーの使用を可能にし得る。ゆえに、本発明の安定化されたＲＴ融合タンパク質は、研究用途などのいくつかの応用法にとって有用であり得る。
【００１３】
前述の全体的な説明と以下の詳細な説明の両方が、単に例示的かつ説明的であって、特許請求されるような本発明を限定するものではないことが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、剛性リンカーによってマルトース結合タンパク質に結合されたＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ由来の逆転写酵素のアミノ酸配列（配列番号６）の掲載である。アミノ酸残基１〜３６７は、改変されたマルトース結合タンパク質（配列番号１１）に相当し；アミノ酸残基３６８〜３７２は、剛性リンカー（配列番号１２）に相当し；そしてアミノ酸残基３７３〜９３５は、ＴｅＩ４ｃ  ＯＲＦ（配列番号１）に相当する。
【図２】図２は、剛性リンカーによってマルトース結合タンパク質に結合されたＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ由来の逆転写酵素のアミノ酸配列（配列番号７）の掲載である。アミノ酸残基１〜３６７は、マルトース結合タンパク質（配列番号１１）に相当し；アミノ酸残基３６８〜３７２は、剛性リンカー（配列番号１２）に相当し；そしてアミノ酸残基３７３〜９３５は、ＴｅＩ４ｆ  ＯＲＦ（配列番号２）に相当する。
【図３】図３は、剛性リンカーによってマルトース結合タンパク質に結合されたＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ由来の逆転写酵素のアミノ酸配列（配列番号８）の掲載である。アミノ酸残基１〜３６７は、マルトース結合タンパク質（配列番号１１）に相当し；アミノ酸残基３６８〜３７２は、剛性リンカー（配列番号１２）に相当し；そしてアミノ酸残基３７３〜９３５は、ＴｅＩ４ｈ＊ＯＲＦ（配列番号３）に相当する。
【図４】図４は、剛性リンカーによってマルトース結合タンパク質に結合されたＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の逆転写酵素のアミノ酸配列（配列番号９）の掲載である。アミノ酸残基１〜３６７は、マルトース結合タンパク質（配列番号１１）に相当し；アミノ酸残基３６８〜３７２は、剛性リンカー（配列番号１２）に相当し；そしてアミノ酸残基３７３〜１００８は、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧｓＩ１  ＯＲＦ（配列番号４）に相当する。
【図５】図５は、剛性リンカーによってマルトース結合タンパク質に結合されたＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の逆転写酵素のアミノ酸配列（配列番号１０）の掲載である。アミノ酸残基１〜３６７は、マルトース結合タンパク質（配列番号１１）に相当し；アミノ酸残基３６８〜３７２は、剛性リンカー（配列番号１２）に相当し；そしてアミノ酸残基３７３〜７９２は、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧｓＩ２  ＯＲＦ（配列番号５）に相当する。
【図６−１】図６は、ｐＭＡＬ発現構築物におけるＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ由来の逆転写酵素のＭａｌＥ−ＴｅＩ４ｃオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の剛性融合物のヌクレオチド配列（配列番号１３）の掲載である。
【図６−２】図６は、ｐＭＡＬ発現構築物におけるＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ由来の逆転写酵素のＭａｌＥ−ＴｅＩ４ｃオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の剛性融合物のヌクレオチド配列（配列番号１３）の掲載である。
【図６−３】図６は、ｐＭＡＬ発現構築物におけるＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ由来の逆転写酵素のＭａｌＥ−ＴｅＩ４ｃオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の剛性融合物のヌクレオチド配列（配列番号１３）の掲載である。
【図７−１】図７は、ｐＭＡＬ発現構築物におけるＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ由来の逆転写酵素のＭａｌＥ−ＴｅＩ４ｆ  ＯＲＦの剛性融合物のヌクレオチド配列（配列番号１４）の掲載である。
【図７−２】図７は、ｐＭＡＬ発現構築物におけるＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ由来の逆転写酵素のＭａｌＥ−ＴｅＩ４ｆ  ＯＲＦの剛性融合物のヌクレオチド配列（配列番号１４）の掲載である。
【図７−３】図７は、ｐＭＡＬ発現構築物におけるＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ由来の逆転写酵素のＭａｌＥ−ＴｅＩ４ｆ  ＯＲＦの剛性融合物のヌクレオチド配列（配列番号１４）の掲載である。
【図８−１】図８は、ｐＭＡＬ発現構築物におけるＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ由来の逆転写酵素のＭａｌＥ−ＴｅＩ４ｈ＊ＯＲＦの剛性融合物のヌクレオチド配列（配列番号１５）の掲載である。
【図８−２】図８は、ｐＭＡＬ発現構築物におけるＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ由来の逆転写酵素のＭａｌＥ−ＴｅＩ４ｈ＊ＯＲＦの剛性融合物のヌクレオチド配列（配列番号１５）の掲載である。
【図８−３】図８は、ｐＭＡＬ発現構築物におけるＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ由来の逆転写酵素のＭａｌＥ−ＴｅＩ４ｈ＊ＯＲＦの剛性融合物のヌクレオチド配列（配列番号１５）の掲載である。
【図９−１】図９は、ｐＭＡＬ発現構築物におけるＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の逆転写酵素のＭａｌＥ−ＧｓＩ１  ＯＲＦの剛性融合物のヌクレオチド配列（配列番号１６）の掲載である。
【図９−２】図９は、ｐＭＡＬ発現構築物におけるＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の逆転写酵素のＭａｌＥ−ＧｓＩ１  ＯＲＦの剛性融合物のヌクレオチド配列（配列番号１６）の掲載である。
【図９−３】図９は、ｐＭＡＬ発現構築物におけるＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の逆転写酵素のＭａｌＥ−ＧｓＩ１  ＯＲＦの剛性融合物のヌクレオチド配列（配列番号１６）の掲載である。
【図１０−１】図１０は、ｐＭＡＬ発現構築物におけるＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の逆転写酵素のＭａｌＥ−ＧｓＩ２  ＯＲＦの剛性融合物のヌクレオチド配列（配列番号１７）の掲載である。
【図１０−２】図１０は、ｐＭＡＬ発現構築物におけるＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の逆転写酵素のＭａｌＥ−ＧｓＩ２  ＯＲＦの剛性融合物のヌクレオチド配列（配列番号１７）の掲載である。
【図１０−３】図１０は、ｐＭＡＬ発現構築物におけるＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の逆転写酵素のＭａｌＥ−ＧｓＩ２  ＯＲＦの剛性融合物のヌクレオチド配列（配列番号１７）の掲載である。
【図１１】図１１は、種々の温度における逆転写酵素（ＲＴ）活性のポリ（ｒＡ）／オリゴ（ｄＴ）４２アッセイを示しているグラフを提供している。アッセイされた酵素は、ＭａｌＥ−ＲＦ−ＧｓＩ１、ＭａｌＥ−ＲＦ−ＧｓＩ２、ＭａｌＥ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｃ、ＭａｌＥ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｆ、ＭａｌＥ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｈ＊、ＬｔｒＡおよびＭａｌＥ−ＲＦ−ＬｔｒＡだった。ＲＴ（ＴｅＩ４ｃは５０ｎＭおよび他のすべてのＲＴは１００ｎＭ）を、７５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５および１ｍＭ  ＤＴＴにおいて１００ｎＭポリ（ｒＡ）／オリゴ（ｄＴ）４２および５μｌ［α−３２Ｐ］−ｄＴＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）とともにインキュベートすることによって反応を行った。示されている温度において１分間、上記反応媒質中でＲＴをポリ（ｒＡ）／オリゴ（ｄＴ）４２とともにプレインキュベートした後、［α−３２Ｐ］−ｄＴＴＰを加えることによって反応を開始し、線形の範囲内であることが確かめられた時間（ＴｅＩ４ｃ  ＲＴに対しては９０秒間および他のすべてのＲＴに対しては５分間）にわたってインキュベートし、そして２５０ｍＭの最終濃度になるようにＥＤＴＡを加えることによって停止した。材料および方法に記載されるように、反応産物をＷｈａｔｍａｎ  ＤＥ８１クロマトグラフィペーパー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  ｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ）上にスポットし、０．３Ｍ  ＮａＣｌおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウムで洗浄し、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒでスキャンして、そのフィルターに結合した放射能を定量化することによって、高分子量材料への［α−３２Ｐ］−ｄＴＴＰの重合を定量化した。プロットは、反応温度に応じた、そのフィルターに結合した放射能（ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ単位）を示している。
【図１２】図１２は、グループＩＩイントロンＲＴおよび融合タンパク質の模式図を示している。セクション１２（Ａ）は、グループＩＩイントロンによってコードされるＲＴとレトロウイルスＲＴとの比較を提供している。Ｌｌ．ＬｔｒＢイントロンによってコードされるＬｔｒＡタンパク質によって例証されるグループＩＩイントロンＲＴは、通常、４つの主要なドメイン：保存された配列ブロックＲＴ−１〜７を有するＲＴドメイン；Ｘ／サムドメイン；ＤＮＡ結合（Ｄ）ドメインおよびＤＮＡエンドヌクレアーゼ（Ｅｎ）ドメインを含む。グループＩＩイントロンＲＴのＲＴドメインおよびサムドメインは、ＨＩＶ−１  ＲＴによって例証されるレトロウイルスＲＴのそれと相同であるが、Ｎ末端の伸長ならびに上流（ＲＴ−０）および保存されたＲＴ配列ブロック間における挿入（例えば、ＬｔｒＡにおけるＲＴ−２ａ、３ａ、４ａおよび７ａならびにサムドメイン挿入物ｔｉ；Ｂｌｏｃｋｅｒら、ＲＮＡ  １１，１４−２８，２００５）に起因して、より大きい。レトロウイルスＲＴのサムドメインに特徴的な３つのα−ヘリックスの位置が、ＬｔｒＡとＨＩＶ−ＲＴの両方に対して示されている。Ｅｎドメインを欠くＧｓＩ２  ＲＴを除いて、この研究に使用されたグループＩＩイントロンＲＴのすべてがＥｎドメインを含む。セクション１２（Ｂ）は、グループＩＩイントロンＲＴ融合タンパク質を示している。グループＩＩイントロンＲＴ（ＩＥＰ）を、融合されたＮ末端のＭａｌＥ溶解性タグまたはＮｕｓＡ溶解性タグとともに発現させた。最初の構築物は、発現ベクターｐＭａｌＥ−ｃ２ｔにおいて、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位（下線部）を有する可撓性リンカーを介してＲＴのＮ末端に融合されたＭａｌＥ溶解性タグを含んでいた。図１１において試験されたこれらの最初の構築物のバリアントは、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位が欠失したｐＭａｌＥ−ｃ２ｔリンカーを含んでいた。改善された構築物は、５アラニン残基（下線部）を含む剛性リンカーを介してＲＴのＮ末端に融合された、改変されたＭａｌＥまたはＮｕｓＡタグを使用した。改変されたＭａｌＥタグでは、荷電アミノ酸残基がアラニン（イタリック体）に変更され、改変されたＮｕｓＡタグは、２つのＣ末端アミノ酸残基を失っている。
【図１３】図１３は、種々の剛性融合リンカーまたは溶解性タグ配列を有するＭａｌＥ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｃ  ＲＴの誘導体のＲＴ活性を示しているグラフを提供している。パネル１３（Ａ）は、６０℃におけるＲＴ活性を示している棒グラフを提供している。５０ｎＭタンパク質および１００ｎＭポリ（ｒＡ）／オリゴ（ｄＴ）４２を使用し、９０秒間インキュベートすることによって、図１１におけるように、ＭａｌＥ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｃ  ＲＴ（左のバー）または種々のタグもしくはリンカー配列を含むバリアント（右のバー）を用いた反応を行った。値は、３回の測定結果に対する平均値であり、エラーバーは、標準偏差を示している。パネル１３（Ｂ）は、ＮｕｓＡ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｃ  ＲＴに対するＲＴ活性の温度プロファイルを示しているグラフを提供している。図１１におけるように、５０ｎＭタンパク質および１００ｎＭポリ（ｒＡ）／オリゴ（ｄＴ）４２を使用し、示されている温度において２分間インキュベートすることによって、ＲＴ活性をアッセイした。ｙ軸は、各タンパク質（パネルＡ）または反応温度に応じたＮｕｓＡ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｃ  ＲＴ（パネルＢ）に対する、フィルターに結合した放射能（ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ単位）を示している。
【図１４】図１４は、種々の温度におけるＭａｌＥ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｃ、ＭａｌＥ−ＲＦ−ＧｓＩ２およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩのＲＴ活性によるｃＤＮＡ合成を比較しているグラフおよびオートラジオグラムを提供している。パネル（Ａ〜Ｃ）では、基質は、ＡｆｌＩＩＩで消化されたｐＢＳ  ＫＳ（＋）から転写された５３１ｎｔ  ＲＮＡ（５’標識３７ｎｔプライマーがアニールしたもの）であり、パネル（Ｄ〜Ｆ）では、基質は、５’標識４４ｎｔ  ＤＮＡプライマーがアニールした１．２ｋｂ  ｋａｎＲ  ＲＮＡだった。ＭａｌＥ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｃ  ＲＴ（パネルＡおよびＤ）およびＭａｌＥ−ＲＦ−ＧｓＩ２  ＲＴ（パネルＢおよびＥ）に対しては１００ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ  ＤＴＴ、ならびにＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴ（パネルＣおよびＦ）に対しては製造者の緩衝液において、１００ｎＭのアニールされた鋳型／プライマーを２００ｎＭ酵素とともにインキュベートすることによって反応を行った。ｄＮＴＰを最終濃度１．２５ｍＭとなるように加えることによって反応を開始し、示されている温度において３０分間インキュベートし、０．１％ＳＤＳ／２５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（最終濃度）を加えることによって反応を終結した後、フェノール−ＣＩＡ抽出した。その生成物を変性６％ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動によって解析し、そのゲルを乾燥し、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒを用いて定量化した。各パネルにおいて、上および下のオートラジオグラムは、それぞれ全長産物（矢印）および伸長されていないかまたは部分的に伸長されたプライマーを含むゲルの一部を示しており、棒グラフは、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒでの定量化に基づいて、全長ｃＤＮＡまで伸長したプライマーのパーセンテージを示している。「？」は、全長産物の定量化において使用されなかった未同定のバンドを示している。５’標識された１０ｂｐラダー（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）をサイズマーカーとして使用した。２つの鋳型プライマー基質の概略図をこの図の下に示す。
【図１５】図１５は、１．２ｋｂ  ｋａｎＲ  ＲＮＡ鋳型のヌクレオチド配列（配列番号２１）の掲載である。
【図１６】図１６は、ＭａｌＥ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｃ  ＲＴおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴによる種々の温度におけるｃＤＮＡ合成の量を比較するためにｑＲＴ−ＰＣＲから得られた片対数プロットを提供している。プライマーＰ０７８（Ｔｍ＝８０℃）がアニールした１．２ｋｂ  ｋａｎＲ  ＲＮＡを使用し、ＭａｌＥ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｃ  ＲＴまたはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴ（ＳＳＩＩＩ  ＲＴ）を用いてｃＤＮＡを合成し、ｎｔ１８８−２５７およびｎｔ５６２−６３４におけるプライマー／プローブセットを用いて検出した（プライマーセットｎｔ１８８−２５７を用いた検出についてのデータがこの図に示されている；プライマーセットｎｔ５６２−６３４を用いて得られたデータは、図１７に示されている）。ｑＰＣＲ増幅曲線は、サイクル数に対する蛍光（ΔＲＮ）の片対数プロットを示している。各サンプルに対して、２つ組のウェルを解析し、各増幅プロットにおいて示す。ＭａｌＥ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｃまたはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴによる各ｃＤＮＡ合成反応に対するサイクル閾値（ＣＴ）（蛍光が閾値０．４と交差するサイクル）が、曲線の下に示されている。ＣＴ値が低いほど、合成されるｃＤＮＡの数が多いと示唆される。
【図１７】図１７は、ＭａｌＥ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｃ  ＲＴおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴによるｃＤＮＡ合成の処理能力を比較するためにｑＲＴ−ＰＣＲから得られた片対数プロットを提供している。プライマーＰ０７８（Ｔｍ＝８０℃）がアニールした１．２ｋｂ  ｋａｎＲ  ＲＮＡを使用し、ＭａｌＥ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｃまたはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴを用いてｃＤＮＡを合成し、ｎｔ１８８−２５７およびｎｔ５６２−６３４におけるプライマー／プローブセットを用いて検出した。ｃＤＮＡサンプルを６０℃（Ａ、Ｂ）および６５℃（Ｃ、Ｄ）において得た。各サンプルについて、３つ組を解析し、各増幅プロットに示す。定量化され、希釈されたｐＥＴ９プラスミドの検量線から平均コピー数を得た。ＭａｌＥ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｃ  ＲＴに対して見られるように、この２つのプライマーセットを用いたときに同様の数のｃＤＮＡコピーが検出されたことは、ほとんどのｃＤＮＡがＲＮＡ鋳型の末端近くまで伸長することを示し、高処理能力が示唆される。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴに対して見られたような３’末端により近いプライマーセット（ｎｔ５６２−６３４）と比べて５’末端付近のプライマーセット（ｎｔ１８８−２５７）で検出されるｃＤＮＡコピー数が少ないことは、ＲＴが減衰しているか、または何らかの他の方法でＲＮＡ鋳型が５’末端に達することが妨げられていることが示唆される。
【図１８】図１８は、ＮｕｓＡ溶解性向上タンパク質のアミノ酸配列（配列番号３８）の掲載である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
別段定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。本明細書中の本発明の説明において使用される用語は、特定の実施形態だけを記載するためのものであって、本発明を限定することを意図していない。本明細書中で述べられるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、それらの全体が参考として援用される。
【００１６】
定義
本発明の説明および添付の請求項において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明らかに示さない限り、複数形も同様に含むと意図される。さらに、終点による数値の範囲の詳述は、その範囲内に含まれるすべての数を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などを含む）。
【００１７】
本明細書中で使用されるとき、「ポリペプチド」とは、アミノ酸のポリマーのことを指し、特定の長さのアミノ酸のポリマーのことを意味しない。したがって、例えば、ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、抗体および酵素という用語は、ポリペプチドの定義内に含まれる。この用語は、発現後修飾（例えば、グリコシル化（例えば、サッカリドの付加）、アセチル化、リン酸化など）を受けたポリペプチドも含む。
【００１８】
「単離された」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、本明細書中で使用されるとき、自然環境から取り出されたか、組換え法を用いて生成されたか、または化学的もしくは酵素的に合成された、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのことを意味する。好ましくは、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、精製されており、すなわち、他の任意のポリペプチドまたはポリヌクレオチドおよび関連する細胞生成物または他の不純物を本質的に含まない。
【００１９】
「アミノ酸」は、一般式：ＮＨ２−ＣＲＨ−ＣＯＯＨ（側鎖であるＲは、Ｈまたは有機基である）を有する化合物のことを指すために本明細書中で使用される。Ｒが、有機基である場合、Ｒは、様々であり得、極性または非極性（すなわち、疎水性）である。以下の省略形が、本願全体を通して使用される：Ａ＝Ａｌａ＝アラニン、Ｔ＝Ｔｈｒ＝トレオニン、Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン、Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン、Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン、Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン、Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン、Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン、Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン、Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン、Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン、Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸、Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン、Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸、Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン、Ｋ＝Ｌｙｓ＝リジン、Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン、Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン、Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン、Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン。別段示されない限り、用語「アミノ酸」は、本明細書中で使用されるとき、上記の一般式をなおも保持するアミノ酸誘導体も含む。
【００２０】
ヌクレオチドは、有機塩基に連結されたペントース（ＲＮＡではリボース、およびＤＮＡではデオキシリボース）にリン酸エステル結合によって連結されたリン酸基からなる。核酸のモノマー単位が、ヌクレオチドである。天然に存在するＤＮＡおよびＲＮＡの各々は、４種の異なるヌクレオチドを含む：アデニン、グアニン、シトシンおよびチミン塩基を有するヌクレオチドは、天然に存在するＤＮＡに見られ、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシル塩基を有するヌクレオチドは、天然に存在するＲＮＡに見られる。塩基のアデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルは、それぞれＡ、Ｇ、Ｃ、ＴおよびＵと省略されることが多い。
【００２１】
ヌクレオチドには、遊離型の一リン酸、二リン酸および三リン酸の形態（すなわち、リン酸基が、それぞれ１、２または３つのリン酸部分を有する）が含まれる。したがって、ヌクレオチドには、リボヌクレオシド三リン酸（例えば、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＧおよびＧＴＰ）およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）ならびにそれらの誘導体が含まれる。また、ヌクレオチドには、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰおよびｄｄＴＴＰを含むｄｄＮＴＰ）およびその誘導体が含まれる。
【００２２】
「実質的に類似」は、所与の核酸配列またはアミノ酸配列が、参照配列と少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、なおもより好ましくは少なくとも９５％の同一性を共有することを意味する。さらに、保存された領域において保存的置換だけが行われたタンパク質を記載するかまたはコードする配列だけが、全体的に実質的に類似である。好ましい実質的に類似の配列は、そのポリペプチド特有の活性も保持する。保存的置換に代表的に見られる置換は、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの間の互いの置き換え；ヒドロキシル残基ＳｅｒとＴｈｒとの交換、酸性残基ＡｓｐとＧｌｕとの交換、アミド残基ＡｓｎとＧｌｎとの間の置換、塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇとの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置き換えである。
【００２３】
「プロモーター」とは、本明細書中で使用されるとき、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始を媒介する、ＤＮＡ内の配列のことを指す。転写プロモーターは、以下のようないくつかの異なる配列エレメントの１つ以上を含み得る：１）転写開始部位に存在する配列エレメント；２）転写開始部位の上流に存在する配列エレメント、および；３）転写開始部位の下流の配列エレメント。個別の配列エレメントは、ＲＮＡポリメラーゼ、およびＤＮＡ上のＲＮＡポリメラーゼの位置決めを促す転写因子が結合する、ＤＮＡ上の部位として機能する。
【００２４】
本明細書中で使用されるとき、用語「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）とは、クローニングまたは精製なしにゲノムＤＮＡの混合物中の標的配列のセグメントの濃度を高めるための方法のことを指す。例えば、ＰＣＲおよびその進展の概要を提供しているＢａｒｔｌｅｔｔら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：３−６（２００３）を参照のこと。標的配列を増幅するためのこのプロセスは、代表的には、大過剰の２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを、所望の標的配列を含むＤＮＡ混合物に導入した後の、ＤＮＡポリメラーゼの存在下における正確な配列の熱サイクル反応からなる。２種類のプライマーは、二本鎖標的配列のそれぞれの鎖に相補的である。増幅をもたらすために、その混合物を変性させ、次いで、プライマーを、標的分子内のそれらの相補的配列にアニールさせる。アニールの後、新しい相補鎖の対が形成されるように、ポリメラーゼを用いてプライマーを伸長させる。変性、プライマーのアニールおよびポリメラーゼ伸長の工程を多数繰り返すことにより、所望の標的配列の高濃度の増幅されたセグメントを得ることができる。別段述べられない限り、ＰＣＲは、本明細書中で使用されるとき、ＰＣＲの変形（例えば、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、ライゲーション媒介性ＰＣＲ、多重ＰＣＲ、逆転写ＰＣＲまたは当業者に公知の他の任意のＰＣＲ変形）も含む。
【００２５】
本明細書において使用されるとき、請求項の移行句におけるか本体におけるかに関係なく、用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」および「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ〜）」は、限度を設定しない意味を有すると解釈されるべきである。すなわち、これらの用語は、句「〜を少なくとも有する」または「〜を少なくとも含む」と同意語として解釈されるべきである。プロセスの文脈において使用されるとき、用語「〜を含む」は、そのプロセスが、列挙される工程を少なくとも含むが、追加の工程を含んでもよいことを意味する。化合物または組成物の文脈において使用されるとき、用語「〜を含む」は、その化合物または組成物が、列挙される特徴または構成要素を少なくとも含むが、追加の特徴または構成要素も含んでもよいことを意味する。
【００２６】
「融合タンパク質」とは、本明細書中で使用されるとき、共有結合された少なくとも２つの異種ポリペプチドを有するタンパク質のことを指し、ここで、一方のポリペプチドは、１つのタンパク質配列またはドメインに由来し、他方のポリペプチドは、第２のタンパク質配列またはドメインに由来する。
【００２７】
安定化された逆転写酵素融合タンパク質
本発明は、安定化タンパク質に接続された耐熱性逆転写酵素を含む安定化された逆転写酵素融合タンパク質を提供する。多くの実施形態において、耐熱性逆転写酵素は、リンカーペプチドを介して安定化タンパク質に接続される。しかしながら、耐熱性逆転写酵素および安定化タンパク質は、互いに直接融合され得る。融合タンパク質を構成するポリペプチドは、好ましくは、Ｎ末端とＣ末端とが連結される。しかしながら、この逆転写酵素および安定化タンパク質は、いずれかの順序で共に接続され得る。例えば、この２つのペプチド配列は、Ｃ末端からＮ末端に、またはＮ末端からＣ末端に接続され得る。いくつかの実施形態において、リンカーペプチドは、逆転写酵素および安定化タンパク質の接続性のＣ末端とＮ末端との間に含められる。
【００２８】
安定化タンパク質を耐熱性逆転写酵素に付着することによって、１つ以上の利点がもたらされ得る。安定化された逆転写酵素融合タンパク質は、以下の利点のうちの１つ以上を有し得る：（ａ）高温での高い安定性；（ｂ）高い処理能力、（ｃ）高い溶解性、および／または（ｄ）高い忠実度。いくつかの実施形態において、本発明の逆転写酵素は、上に列挙された複数の特性を有し得る。例えば、安定化された逆転写酵素融合タンパク質は、高い熱安定性かつ高い忠実度を有し得る。これらの利点は、時折、互いに由来することがある。例えば、高い溶解性をもたらすことによって、安定化された逆転写酵素融合タンパク質は、以前は不溶性だった高い忠実度の耐熱性逆転写酵素を可溶化した結果として、高い忠実度の転写をもたらすことができる生成物を提供することができる。融合タンパク質において安定化タンパク質を使用することによって、タンパク質発現の増加およびタンパク質フォールディングの改善などの他の利点ももたらされ得る。安定化タンパク質と耐熱性逆転写酵素との間にリンカーペプチドを含めることによって、これらの利点がさらに向上し得る。
【００２９】
安定化された逆転写酵素融合タンパク質は、本明細書中に記載されるように、耐熱性逆転写酵素および安定化タンパク質を含む。安定化された逆転写酵素融合タンパク質は、リンカーペプチドも含み得る。例えば、安定化された逆転写酵素融合タンパク質は、図１〜５に示されるそれぞれ配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０に示されるようなアミノ酸配列を有し得る。あるいは、安定化された逆転写酵素融合タンパク質は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０に示されるような配列の１つ以上と実質的に類似であるアミノ酸配列を有し得る。配列６〜１０によって提供される融合タンパク質と「実質的に類似」である安定化された逆転写酵素融合タンパク質のアミノ酸配列は、少なくとも８５％の同一性、より好ましくは９０％の同一性、なおもより好ましくは９５％の同一性を共有し、保存された領域において保存的なアミノ酸置換だけを含み得る。
【００３０】
耐熱性逆転写酵素
本発明は、耐熱性逆転写酵素を含む逆転写酵素融合タンパク質を提供する。用語「逆転写酵素」（すなわち、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）とは、逆転写酵素活性を有する酵素（すなわち、ＲＮＡ鋳型からのＤＮＡの合成を触媒する酵素）の群のことを指す。一般に、そのような酵素としては、レトロウイルスの逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素および細菌の逆転写酵素（例えば、グループＩＩイントロン由来逆転写酵素）ならびにそれらの変異体、バリアントまたは誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。細菌の逆転写酵素の例としては、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ逆転写酵素、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ逆転写酵素またはＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ逆転写酵素が挙げられる。さらなる細菌の逆転写酵素は、多くのクラスの逆転写酵素（すなわち、とりわけ、レトロン（ｒｅｔｒｏｎｓ）、グループＩＩイントロンおよび多様性を生み出すレトロエレメント）を記載している、Ｓｉｍｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３６，ｐ．７２１９−２９（２００８）およびＫｏｊｉｍａ  ａｎｄ  Ｋａｎｅｈｉｓａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，２５，ｐ．１３９５−０４（２００８）によって記載されている。逆転写酵素は、主に、ＲＮＡをｃＤＮＡに転写するために使用されており、次いで、そのｃＤＮＡは、さらなる操作のためにベクターにクローニングされ得るか、または様々な増幅方法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、自家持続配列複製（３ＳＲ）、多様なプライマー伸長反応、５’ＲＡＣＥ、化学修飾の検出、またはＲＮＡ鋳型を用いたＤＮＡの合成を必要とする他の手法）において使用され得る。
【００３１】
用語「耐熱性」とは、酵素またはタンパク質（例えば、逆転写酵素）が熱による失活に抵抗性である能力のことを指す。代表的には、そのような酵素は、高温環境において生育するように進化した好熱性生物（すなわち、好熱菌）から得られる。好熱菌は、本明細書中で使用されるとき、最適成長温度が４５℃以上であり、代表的な最高成長温度が７０℃以上の生物である。一般に、耐熱性酵素は、中温性生物由来の酵素などの代表的な酵素よりも熱失活に対して抵抗性である。したがって、耐熱性逆転写酵素の核酸合成活性は、熱処理によってある程度低下し得るが、中温性生物由来の逆転写酵素に対して起きるほどではない。「耐熱性」とは、３８℃超、好ましくは、約３８〜１００℃、より好ましくは、約４０〜８１℃の温度において活性である酵素のことも指す。特に好ましい温度範囲は、約４５℃〜約６５℃である。
【００３２】
いくつかの実施形態において、耐熱性逆転写酵素は、核酸合成混合物中において９０℃で３０秒間加熱した後に、その核酸合成活性の少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％）を保持する。対照的に、代表的な逆転写酵素は、高温では機能せず、そのような熱処理の後は核酸合成活性のほとんどが失われる。また、耐熱性逆転写酵素は、代表的には、より高い最適な核酸重合温度を有する。
【００３３】
いくつかの逆転写酵素は、耐熱性であり、ゆえに、ＰＣＲに基づく核酸合成において通常使用される温度では実質的に活性のままである。このことにより、単一の反応環境において逆転写とＤＮＡ増幅の両方を行うことができるという利点がもたらされる。そのような温度は、ｐＨ、鋳型およびプライマーのヌクレオチド組成、プライマーの長さ、ならびに塩濃度を含む反応パラメータに応じて、変動する。耐熱性逆転写酵素としては、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ（Ｔｅ）ＲＴ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｇｓ）ＲＴ、これらのＲＴの改変型、ならびにＡｖｉａｎ  ｍｙｏｂｌａｓｔｏｓｉｓウイルス（ＡＭＶ）ＲＴ、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）ＲＴおよびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＲＴの操作されたバリアントが挙げられる。高温環境（すなわち、３７℃超）に生息する生物から得られる逆転写酵素は、その生物の生息温度および合理的な程度だけ高い温度において安定であると予想することができる。
【００３４】
安定化された逆転写酵素融合タンパク質における使用に特に適している逆転写酵素のクラスは、グループＩＩイントロン由来逆転写酵素である。多種多様のグループＩＩイントロン由来逆転写酵素が知られている。例えば、１０５個の全長グループＩＩイントロン由来逆転写酵素を記載している、Ｍｏｂｉｌｅ  Ｇｒｏｕｐ  ＩＩ  ＩｎｔｒｏｎｓについてのＺｉｍｍｅｒｌｙ  Ｌａｂ  Ｗｅｂｓｉｔｅを参照のこと。このウェブサイトの使用法は、Ｄａｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３１，ｐ．４２４−２６（２００３）によって説明されている。
【００３５】
ある特定の実施形態において、耐熱性逆転写酵素は、グループＩＩイントロンによってコードされたものである。グループＩＩイントロンＲＴは、代表的には、４つの保存されたドメイン：レトロウイルスＲＴのフィンガーおよびパーム領域を特徴とする７つの保存された配列ブロック（ＲＴ１〜７）を含むＲＴドメイン；レトロウイルスＲＴのサムドメインに少なくとも部分的に対応するＲＮＡスプライシング活性に必要とされる領域であるＸドメイン；ＤＮＡ標的部位の認識に関与するＤＮＡ結合ドメインであるＤドメイン；およびＤＮＡ標的部位を切断して逆転写用のプライマーを生成するＤＮＡエンドヌクレアーゼドメインであるＥｎドメインからなる（図１２Ａ；Ｂｌｏｃｋｅｒら、ＲＮＡ  １１，１４−２８，２００５）。Ｅｎドメインは、いくつかのグループＩＩイントロンＲＴにおいて失われており、そのようなグループＩＩイントロンＲＴは、Ｅｎドメインの代わりに、ＤＮＡ複製フォークにおける新生鎖を使用して、逆転写を惹起する（Ｚｈｏｎｇら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２２，４５５５−４５６５，２００３）。グループＩＩイントロンＲＴのＲＴドメインおよびＸ／サムドメインは、Ｎ末端の伸長、Ｎ末端の追加の保存された配列ブロック（ＲＴ−０）、ならびにＲＴドメインおよびＸ／サムドメインにおける保存された配列ブロック間への挿入（これらのうちのいくつかは、非ＬＴＲ−レトロトランスポゾンＲＴと共有される）に起因して、レトロウイルスＲＴのそれよりも大きい。そのグループＩＩイントロンＲＴおよび関連ＲＴのより大きいサイズのＲＴドメインおよびサムドメインによって、逆転写中により高い処理能力および忠実度をもたらす鋳型ＲＮＡのより堅固な結合が可能となることが示唆されている。グループＩＩイントロンＲＴは、レトロウイルスＲＴとは異なり、ＲＮａｓｅＨドメインを欠き、代表的には、非常に低いＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性しか有しない（Ｓｍｉｔｈら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １９，２４７７−２４８７，２００５）。
【００３６】
グループＩＩイントロンは、セルフスプライシング反応について知られているＲＮＡのクラスをコードする。ある特定のインビトロ条件下において、グループＩＩイントロンによってコードされるＲＮＡは、タンパク質の助けなしに、前駆体ｍＲＮＡから自身を切除し、隣接エキソンをライゲートすることができる。このスプライシング反応のメカニズムは、核のプレｍＲＮＡイントロンのスプライシングと似ている。いくつかのグループＩＩイントロンは、逆転写酵素（ＲＴ）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）もコードし、活性で可動性のエレメントである。そのＯＲＦは、代表的には、グループＩＩイントロンによってコードされるＲＮＡのドメインＤＩＶに見られる。グループＩＩイントロンＲＴは、触媒的に活性なＲＮＡ構造を安定化することによってＲＮＡスプライシングを補助し、次いで、「レトロホーミング」と呼ばれるプロセスによるイントロンの可動性を促進するリボ核タンパク質（ＲＮＰ）において、切除されたイントロンＲＮＡに結合した状態である。ＲＮＰ内の切除されたイントロンＲＮＡがＤＮＡ標的部位に直接挿入され、ＲＴによって逆転写されるメカニズムによって、レトロホーミングは生じる。グループＩＩイントロンが適切なＤＮＡ配列を標的にすることをそのイントロンが促進するレトロホーミングにおいて、グループＩＩイントロンＲＴは、代表的には２〜２．５ｋｂ長であり、高度に安定かつコンパクトな二次構造および三次構造に折り畳まれる、そのイントロンＲＮＡの正確なｃＤＮＡコピーを生成しなければならない。したがって、グループＩＩイントロンＲＴは、その生物学的機能を果たすために、高い処理能力および忠実度を有さなければならない。グループＩＩイントロン由来ＲＴはまた、ＲＮａｓｅＨ活性を欠くが、このことは、ＲＮａｓｅＨが、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを特異的に分解し、任意のＲＮＡのただ１回のコピーを許容し、全長ｃＤＮＡの収量を減少させ得るので、有益であり得る。
【００３７】
今までに評価されたグループＩＩイントロン由来逆転写酵素に基づくと、これらのＲＴは、代表的には、比較的高い忠実度および高い処理能力を示す。逆転写の忠実度とは、ＲＮＡからＤＮＡへの逆転写中のヌクレオチドの取り込みの信頼性のことを指し、より高い忠実度は、より少ない数の誤り（例えば、誤取り込み）でヌクレオチドが複製されることである。より高い特異性は、より長くより特異的なプライマーを使用すること（より高い温度において逆転写を行う能力を必要とする）によってもたらされ得る。例えば、グループＩＩイントロン逆転写酵素は、２．０×１０−５以下のエラー頻度で逆転写することができ、ここで、エラー頻度は、誤りなしで生じるヌクレオチド複製事象の数に対して生じるヌクレオチドの写し違いの割合である。高い忠実度の転写の他の例としては、１×１０−４、７．５×１０−５、５×１０−５、２．５×１０−５、１×１０−５および５×１０−６というエラー頻度が挙げられる。グループＩＩイントロン由来ＲＴの高い忠実度のさらなる説明については、Ｃｏｎｌａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３３，ｐ．５２６２−７０（２００５）を参照のこと。
【００３８】
適当なグループＩＩ由来イントロン逆転写酵素の例としては、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５に示される逆転写酵素が挙げられ、それらは、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ（ＴｅＩ４ｃ、ｆおよびｈ＊）およびＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＧｓＩ１およびＧｓＩ２）から得られる。これらの配列は、図１〜５に示されている。本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５に示されるものと実質的に類似のグループＩＩイントロン由来逆転写酵素も含む。配列１〜５によって提供される逆転写酵素と「実質的に類似」である逆転写酵素は、少なくとも８５％の同一性、より好ましくは９０％の同一性、なおもより好ましくは９５％の同一性を共有し、保存された領域に保存的なアミノ酸置換だけを含み得る。いくつかのグループＩＩイントロン由来ＲＴの熱安定性は、図１１に示されており、図１１は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５に示されるような逆転写酵素を含む安定化された逆転写酵素融合タンパク質が、図１１に示されるように評価されたときにそれが融合タンパク質の一部であるか否かに関係なく、中温性のＬｌ．ＬｔｒＢ逆転写酵素よりも高い熱安定性を有することを証明している。中温性のＬｌ．ＬｔｒＢは、単独で、または融合タンパク質の一部として、約３５℃という最適温度を示した。
【００３９】
本明細書中で述べられるように、耐熱性グループＩＩイントロン由来ＲＴの改変型もまた使用され得る。例えば、配列番号３のＴｅＩ４ｈ＊ＲＴは、天然型の逆転写酵素ではないが、活性部位がアミノ酸配列ＹＡＧＤからアミノ酸配列ＹＡＤＤに改変されることにより、他の活性なグループＩＩイントロン由来ＲＴの活性部位により似ている誘導体である。
【００４０】
所与のアミノ酸配列が参照配列と「実質的に類似」である量は、例えば、Ｔａｔｕｓｏｖａら（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１７４，ｐ．２４７−５０（１９９９））によって記載されているような、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＤａｔａｂａｓｅセクションのＢＬＡＳＴの項目下においてワールドワイドウェブ上で利用可能なＢＬＡＳＴ２検索アルゴリズムのＢｌａｓｔｐプログラム，バージョン２．２．１０などの配列解析ソフトウェアを用いて配列情報を比較することによって測定され得る。好ましくは、行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２；オープンギャップペナルティ＝１１、伸長ギャップペナルティ＝１、ギャップｘ＿ドロップオフ＝５０、期待値＝１０、ワードサイズ＝３および必要に応じてフィルターオンをはじめとした、すべてのＢＬＡＳＴ２検索パラメータに対してデフォルトの値を使用する。ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列を比較する際、構造的類似性は、「類似性」と呼ばれ、同一性は、「同一性」と呼ばれる。
【００４１】
アミノ酸の同一性は、候補ポリペプチドと参照アミノ酸配列との比較において定義され、２つのアミノ酸配列（すなわち、候補アミノ酸配列および参照アミノ酸配列）の長さにわたって同一のアミノ酸の数を最適化するようにその配列の残基をアラインメントすることによって測定される；同一のアミノ酸の数を最適化するためにアラインメントを行う際に一方または両方の配列にギャップが許容されるが、各配列のアミノ酸は、適切な順序のままでなければならない。
【００４２】
グループＩＩイントロン由来逆転写酵素についての構造と機能の相互関係を裏付ける情報が入手可能である。例えば、細菌の逆転写酵素のＲＴドメインを分類し、アラインメントしているＳｉｍｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３６，ｐ．７２１９−２９（２００８）、ならびに７つの保存されたドメインおよび４２個の保存された位置を示す８２個のＲＴ配列のアラインメントを提供しているＸｉｏｎｇら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，９，ｐ．３３５３−６２（１９９０）を参照のこと。Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  Ｌｌ．ＬｔｒＢイントロンＲＴ（ＬｔｒＡタンパク質）の３次元モデルを提供しており、タンパク分解性の切断部位および保存された領域を記載しており、かつＨＩＶ−１  ＲＴに対するＬｔｒＡの配列アラインメント解析を提供している、Ｂｌｏｃｋｅｒら、ＲＮＡ，１１，ｐ．１４−２８（２００５）もまた参照のこと。したがって、配列番号６〜１０に示されているものと実質的に類似である種々の安定化された逆転写酵素融合タンパク質は、保存された領域の外側のアミノ酸の改変、および保存された公知の領域内のアミノ酸の保存的改変のみによって容易に得ることができる。
【００４３】
１つの実施形態において、本発明は、高温、すなわち、３７℃超において、対応する未結合逆転写酵素の半減期よりも長い半減期を有する、逆転写酵素活性を有する安定化された逆転写酵素融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の逆転写酵素の半減期は、５０℃において５分以上、好ましくは１０分以上であり得る。いくつかの実施形態において、本発明の逆転写酵素は、約２５分と等しいかまたはそれより長い半減期、好ましくは、約５０分と等しいかまたはそれより長い半減期、より好ましくは、約１００分と等しいかまたはそれより長い半減期、最も好ましくは、約２００分と等しいかまたはそれより長い半減期（例えば、５０℃において）を有し得る。
【００４４】
安定化タンパク質
本発明の安定化された逆転写酵素融合タンパク質は、安定化タンパク質も含む。安定化タンパク質は、本明細書中で定義されるとき、融合タンパク質の全体的な安定性を高めるように機能する、融合タンパク質の一部を形成するタンパク質である。安定性には、タンパク質がそのコンフォメーションおよび活性を保持する能力が含まれる。さらに、安定化タンパク質は、好ましくは、溶解性向上タンパク質に関して本明細書中でさらに記載されるように、融合タンパク質の溶解性を向上する。これは、発現が不十分であり、通常ＲＮＰにおいて堅固に結合されているイントロンＲＮＡの非存在下では不溶性であると見出されているグループＩＩイントロンＲＴに関して特に有益であり得る（Ｖｅｌｌｏｒｅら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０，７１４０−７１４７，２００４；Ｎｇら、Ｇｅｎｅ  ３９３，１３７−１４４，２００７）。有効な安定化タンパク質は、独立したフォールディングドメインを含むタンパク質、および／またはタンパク質が凝集する性質に影響し得るミスフォールドした長命の中間体に折り畳まれないタンパク質を含む。独立したフォールディングドメインを提供し得るタンパク質は、Ｊａｎｉｎら、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４２，ｐ．２１−７８（１９８３）によって記載されており、ミスフォールドした長命の中間体に折り畳まれないタンパク質は、Ｉｄｉｃｕｌａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１４，ｐ．５８２−５９２（２００５）によって記載されている。例えば、安定化タンパク質は、５０以上のアミノ酸を含むタンパク質であり得る。他の実施形態において、安定化タンパク質は、１００以上のアミノ酸を含む、より大きなタンパク質であり得る。本明細書中に提供されるマルトース結合タンパク質およびＮｕｓＡタンパク質によって例証されるように、安定化タンパク質はまた、約２５０アミノ酸〜約４００アミノ酸のサイズを有し得る。安定化タンパク質は、耐熱性タンパク質でもあり得る。
【００４５】
安定化タンパク質は、親和性タンパク質でもあり得るか、または親和性タンパク質を含み得る。親和性タンパク質という用語は、本明細書中で使用されるとき、そのタンパク質に対して高い結合定数（すなわち「親和性」）を示す容易に入手可能なリガンドが存在するタンパク質のことを指す。親和性タンパク質は、親和性タグの役割として使用されることが多い。当業者に公知であるように、親和性タンパク質は、親和性精製（タグがアフィニティーカラム内のリガンドに結合する）などの手法によって、親和性タンパク質に接続されたかまたは融合されたタンパク質の精製を促進するために、融合タンパク質において提供され得る。適当な親和性タンパク質は、当該分野で公知である。例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、ＦＬＡＧタグペプチド、ビオチンアクセプターペプチド、ストレプトアビジン結合ペプチドおよびカルモジュリン結合ペプチドをはじめとしたいくつかの適当な親和性タンパク質を記載しているＷａｕｇｈ，Ｄ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３，ｐ．３１６−３２０（２００５）を参照のこと。親和性タンパク質を含む融合タンパク質の調製および使用については、例えば、米国特許第５，６４３，７５８号、同第５，６５４，１７６号および同第７，００１，７４５号を参照のこと。
【００４６】
安定化タンパク質はまた、溶解性向上タンパク質でもあり得る。組換え的に発現された融合タンパク質は、宿主細胞および／またはその後の応用方法において、低い溶解性を示し得るが、それは、水性環境における融合タンパク質の溶解性を実質的に高める溶解性向上タンパク質をその融合タンパク質に含めることによって改善され得る。使用されるいくつかの溶解性向上タンパク質は、親和性タンパク質でもあり、ゆえに、溶解性向上親和性タンパク質と記載され得る。溶解性向上タンパク質の例としては、アラビノース結合タンパク質、キチン結合タンパク質、セルロース結合タンパク質およびマルトース結合タンパク質などの糖結合タンパク質が挙げられる。溶解性向上タンパク質の他の例としては、Ｎｏｖａｇｅｎ（登録商標）によって提供されるＮｕｓＡおよびＤｓｂ溶解性タグ、ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭによって提供される溶解性向上タグ（ＳＥＴ）が挙げられる。Ｈａｒｒｉｓｏｎが、ＮｕｓＡ溶解性タグによって提供される非常に高い溶解性を証明しており、Ｃｏｌｌｉｎｓ−Ｒａｃｉｅが、Ｄｓｂの溶解性の向上を報告している。Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｒ．Ｇ．，ｉｎＮｏｖａｔｉｏｎｓ，１１，ｐ．４−７（２０００）およびＣｏｌｌｉｎｓ−Ｒａｃｉｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３，ｐ．９８２−８７（１９９５）を参照のこと。
【００４７】
いくつかの実施形態において、溶解性向上タンパク質または親和性タンパク質などの安定化タンパク質は、それらの性能を改善するために改変され得る。改変は、そのタンパク質の正常な野生型配列と比べて、安定化タンパク質のタンパク質配列内のアミノ酸の１つ以上の置換、付加または欠失を提供することを含み得る。例えば、親和性タンパク質または溶解性向上タンパク質などの安定化タンパク質は、そのタンパク質のある特定の領域において荷電アミノ酸を無荷電アミノ酸で置き換えることによって改変され得る。荷電アミノ酸は、正または負に帯電した側鎖を有するアミノ酸を含む。正に帯電した側鎖を有するアミノ酸の例としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。負に帯電した側鎖を有するアミノ酸の例としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸などが挙げられる。無荷電アミノ酸としては、アラニン、セリン、トレオニン、グルタミン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンおよびチロシンが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、マルトース結合タンパク質は、荷電アミノ酸の１つ以上をアラニンで置き換えることによって改変され得る。
【００４８】
適当な親和性タンパク質の例としては、図１〜５に示される配列番号１１に示されるマルトース結合タンパク質のアミノ酸配列および配列番号１１と実質的に類似の配列が挙げられる。親和性タンパク質の改変は必要ないが、配列番号１１に示されるマルトース結合タンパク質は、Ｃ末端付近において３つの荷電アミノ酸をアラニンで置き換えることによって改変されたことに注意されたい。別の適当なタンパク質、この場合、可溶化タンパク質は、図１８に示される配列番号３８に示されるアミノ酸配列を有するＮ利用物質Ａ（ＮｕｓＡ）タンパク質である。本発明のさらなる実施形態において、マルトース結合タンパク質を含む本明細書中に記載される融合タンパク質では、マルトース結合タンパク質がＮ利用物質Ａタンパク質で置き換えられ得る。
【００４９】
リンカーペプチド
いくつかの実施形態において、安定化された逆転写酵素融合タンパク質は、安定化タンパク質と耐熱性逆転写酵素との間に位置するリンカーペプチドも含む。好ましくは、リンカーペプチドは、切断不可能なリンカーペプチドである。「〜の間に位置する」とは、本明細書中の融合タンパク質に関して記載されるとき、リンカーペプチドが、安定化タンパク質および逆転写酵素の各々のＮまたはＣ末端に化学結合（例えば、アミド結合）によって接続されていることを意味する。例えば、リンカーペプチドは、アミド結合を介して、安定化タンパク質のＣ末端領域および耐熱性逆転写酵素のＮ末端領域に接続され得る。切断不可能とは、リンカーペプチドが、プロテアーゼによる切断に直ちに感受性でないことを意味する。
【００５０】
追加の実施形態において、リンカーペプチドは、剛性リンカーペプチド；すなわち、比較的非可撓性のペプチドリンカーである。剛性リンカーペプチドは、可撓性を完全に欠くように求められないが、グリシンリッチペプチドリンカーなどの可撓性リンカーペプチドよりも著しく可撓性でない。剛性リンカーペプチドは、可撓性を比較的欠いている結果として、剛性リンカーペプチドによって共に付着された２つのタンパク質ドメイン（この場合には安定化タンパク質および耐熱性逆転写酵素である）の動きが小さくなる。アルファヘリックス構造などの秩序のある鎖を提供するリンカーペプチドは、剛性リンカーペプチドを提供し得る。例えば、アルギニン、ロイシン、グルタメート、グルタミンおよびメチオニンのすべてが、らせん状のリンカーの形成に対して比較的高い傾向を示す。しかしながら、多くのプロリン残基を含む非らせん状リンカーは、同様に著しい剛性を示し得る。剛性リンカーの例としては、ポリリジンおよびポリ−ＤＬ−アラニンポリリジンが挙げられる。剛性ペプチドリンカーのさらなる説明は、Ｗｒｉｇｇｅｒｓら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，８０，ｐ．７３６−４６（２００５）によって提供される。さらに、剛性リンカーペプチドは、Ｇｅｏｒｇｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１５，ｐ．８７１−７９（２００３）によって記載されたリンカーデータベースに記載されている。好ましくは、剛性リンカーペプチドは、切断不可能なリンカーペプチド；すなわち、切断不可能な剛性リンカーペプチドでもある。
【００５１】
比較的短いポリペプチドが、リンカーペプチドとしての用途にとって好ましい。例えば、リンカーペプチドは、１〜２０アミノ酸を含み得る。リンカーペプチドは、１〜１５、１〜１０、１〜５または３〜５アミノ酸も含み得る。リンカーペプチドとして使用され得る特定の配列の例としては、アラニンアミノ酸から形成された、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドおよびペンタペプチドが挙げられる。１つの適当な剛性リンカーペプチドは、ＡＡＡＡＡ（配列番号１２）であり、別の適当な剛性リンカーペプチドは、ＡＡＡＥＦ（配列番号１８）である。融合タンパク質においてリンカーペプチド（例えば、剛性リンカーペプチド）を使用することによって、１つ以上の利点がもたらされ得る。例えば、理論に拘束するつもりはないが、剛性リンカーペプチドを使用することにより、融合タンパク質の２つの半分の動きの量が互いに比べて減少することによって、融合タンパク質が安定化され得ると考えられる。非常に短い（すなわち、１または２アミノ酸）リンカーを使用することができるが、３〜５アミノ酸を含むリンカーを使用することが好ましい。
【００５２】
リンカーペプチドは、プロテアーゼによって切断可能または切断不可能であり得る。親和性タンパク質は、親和性タンパク質が除去され得るように、切断可能なペプチドを用いて融合タンパク質における別のタンパク質に会合されることが多い。しかしながら、本発明では、安定化タンパク質（例えば、親和性タンパク質）は、本明細書中に記載される理由のために、逆転写酵素に結合したままである。したがって、通常、リンカーペプチドは、切断不可能であることが好ましい。しかしながら、切断可能なリンカーもいくつかの実施形態において使用され得る。例えば、プロテアーゼ切断に感受性の、切断可能な剛性リンカーペプチドを含む切断可能なリンカーは、その後の工程で安定化タンパク質が除去されることが望まれる場合および融合タンパク質の使用中に切断プロテアーゼへの曝露が回避される場合に、使用することができる。
【００５３】
安定化された逆転写酵素融合タンパク質の使用
本発明は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ）からｃＤＮＡを調製するための方法も提供し、その方法は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）などの他の方法に必要とされる。本明細書中で使用されるとき、用語「ＲＴ−ＰＣＲ」とは、ＲＮＡ配列の複製および増幅のことを指す。この方法では、逆転写は、例えば、米国特許第５，３２２，７７０号に記載されているように、ＰＣＲにつなげられる。ＲＴ−ＰＣＲでは、酵素の逆転写酵素活性に起因して、ＲＮＡ鋳型をｃＤＮＡに変換し、次いで、同じまたは異なる酵素の重合活性を用いて増幅する。
【００５４】
本発明の実施において、ｃＤＮＡ分子は、ｃＤＮＡ分子（一本鎖または二本鎖）を形成する組成物の酵素の作用による核酸分子の逆転写に好ましい条件下で、当該分野で周知の方法を用いて細胞、組織または器官から得られた１つ以上の核酸分子（例えば、ＲＮＡ）を本発明の組成物と混合することによって、生成され得る。したがって、本発明の方法は、（ａ）１つ以上の核酸鋳型（好ましくは、１つ以上のＲＮＡまたはｍＲＮＡ鋳型（例えば、ｍＲＮＡ分子の集団））を、本発明の安定化されたＲＴ融合タンパク質と混合する工程、および（ｂ）その混合物を、１つ以上の核酸鋳型の全部または一部のｃＤＮＡ合成を可能にするのに十分な条件下でインキュベートする工程を包含する。
【００５５】
１つの局面において、この方法は、（ａ）プライマーをＲＮＡ分子に加える工程、および（ｂ）１つ以上のデオキシリボヌクレオシド三リン酸またはジデオキシリボヌクレオシド三リン酸、および安定化タンパク質に接続された耐熱性逆転写酵素を含む安定化された逆転写酵素融合タンパク質の存在下において、そのＲＮＡ分子の全部または一部に相補的なｃＤＮＡ分子を合成するのに十分な条件下でそのＲＮＡ分子をインキュベートする工程を包含する。プライマーをＲＮＡ分子に加える工程は、プライマーをＲＮＡ分子にハイブリダイズする工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、安定化された逆転写酵素融合タンパク質は、安定化タンパク質を耐熱性逆転写酵素に接続するリンカーペプチドも含み得る。好ましくは、ＲＮＡが実質的に減少した量の妨害性の安定な二次構造または三次構造しか含まない温度範囲内で逆転写が行われる。これは、約４５℃〜約８１℃の温度であり得、より好ましい温度範囲は、約４５℃〜約６５℃である。これは、ＲＮＡがかなりの量の安定な二次構造または三次構造を形成しない温度範囲とも記載され得る。グループＩＩイントロン由来ＲＴの高い忠実度および他の利点に起因して、それらを使用することが、好ましい場合がある。例えば、安定化された逆転写酵素融合タンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５からなる群より選択される配列と実質的に類似のアミノ酸配列同一性を有するグループＩＩイントロン由来逆転写酵素を含み得、切断不可能なリンカーは、１〜２０アミノ酸からなり、安定化タンパク質は、溶解性向上タンパク質または親和性タンパク質を含む。また、安定化された逆転写酵素融合タンパク質は、安定化ペプチドと逆転写酵素との間にリンカーペプチド（１〜２０アミノ酸の長さを有し得、切断不可能なリンカーであり得るか、または剛性リンカーであり得る）も含み得る。この方法の実施形態は、２．０×１０−５以下のエラー頻度で逆転写を行い得る。特に、約４５℃〜約６５℃の温度において。
【００５６】
安定化された逆転写酵素融合タンパク質は、他の用途でも使用され得る。例えば、安定化されたＲＴ融合タンパク質は、差次的に発現されたｍＲＮＡの５’末端のクローニング；ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ（ＲＡＣＥ）と呼ばれるプロセス、およびＲＮＡリガーゼ媒介性ＲＡＣＥ（ＲＬＭ−ＲＡＣＥ）などのそのバリエーションに使用され得る。安定化されたＲＴ融合タンパク質は、ＲＮＡにおけるケミカルフットプリント法のマッピング、ディファレンシャルディスプレイＲＴ−ＰＣＲ（細胞集団内の遺伝子発現の解析を可能にするもの）および医学診断用インサイチュＰＣＲにも使用され得る。
【００５７】
安定化された逆転写酵素融合タンパク質の調製
安定化された逆転写酵素融合タンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターは、組換え宿主細胞における安定化された逆転写酵素融合タンパク質の高レベル発現のために使用され得る。発現ベクターとしては、クローニングベクター、改変クローニングベクター、特異的に設計されたプラスミド、またはウイルスが挙げられ得るが、これらに限定されない。適切な細胞型において組換え安定化された逆転写酵素融合配列を発現させるために種々の発現ベクターが使用され得る。例えば、細菌ベクター、哺乳動物ベクター、真菌ベクターおよび昆虫ベクターが、それぞれ細菌、哺乳動物細胞、真菌細胞および昆虫細胞における発現のために使用され得る。
【００５８】
安定化された逆転写酵素融合タンパク質は、安定化された逆転写酵素融合タンパク質を発現することができるヌクレオチド配列を得て、次いで、そのヌクレオチド配列を宿主細胞において発現させることによって調製され得る。次いで、宿主細胞によって発現された安定化された逆転写酵素融合タンパク質は、宿主細胞の性質に部分的に応じて、当業者に公知の種々の手法を用いて精製され得る。
【００５９】
本発明の安定化された逆転写酵素融合タンパク質を発現することができるヌクレオチド配列は、当業者に公知の種々の方法を用いて調製され得る。例えば、そのヌクレオチド配列は、本明細書中の実施例１に記載されるように、様々なリンカー、逆転写酵素および安定化タンパク質が結合されている組換えプラスミドを用いて調製され得る。
【００６０】
本発明は、安定化された逆転写酵素融合タンパク質を発現することができる核酸分子を含むベクターで形質転換されたかまたはトランスフェクトされた宿主細胞にも関する。組換え宿主細胞は、原核生物または真核生物であり得、それらとしては、大腸菌などの細菌、酵母などの真菌細胞、哺乳動物細胞（ウシ、ブタ、サルおよびげっ歯類起源の細胞株が挙げられるがこれらに限定されない）；および昆虫細胞（ショウジョウバエおよびカイコ由来細胞株が挙げられるがこれらに限定されない）が挙げられるがこれらに限定されない。そのような組換え宿主細胞は、安定化された逆転写酵素融合タンパク質または生物学的に等価な形態を生成するのに適した条件下で培養され得る。本明細書中で定義されるとき、用語「宿主細胞」は、トランスジェニック人間の身体、ヒト胎児またはヒト胚における宿主細胞を含まないと意図される。
【００６１】
上で述べたように、安定化された逆転写酵素融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターは、組換え宿主細胞における安定化された逆転写酵素融合タンパク質の発現のために使用され得る。ゆえに、本発明の別の局面は、組換え宿主細胞において安定化された逆転写酵素融合タンパク質を発現させるためのプロセスであり、そのプロセスは：（ａ）安定化された逆転写酵素融合タンパク質をコードするヌクレオチドの配列を含む核酸を含むベクターを適当な宿主細胞に導入する工程（その安定化された逆転写酵素融合タンパク質は、直接またはリンカーを介して安定化タンパク質に接続された耐熱性逆転写酵素を含む）および（ｂ）その宿主細胞を、安定化された逆転写酵素融合タンパク質の発現を可能にする条件下で培養する工程を包含する。安定化された逆転写融合タンパク質は、耐熱性逆転写酵素および安定化タンパク質を接続するリンカーペプチドを含むなどの本明細書中に記載される特徴のいずれかを備えるように様々であり得る。
【００６２】
宿主細胞において安定化された逆転写酵素融合タンパク質を発現させた後、その安定化された逆転写酵素融合タンパク質を回収することにより、精製された安定な逆転写酵素融合タンパク質が得られ得る。いくつかのタンパク質精製手順が、利用可能であり、使用に適している。例えば、本明細書中に提供される実施例２を参照のこと。組換えタンパク質は、塩分画（ｓａｌｔ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイト吸着クロマトグラフィおよび疎水性相互作用クロマトグラフィの様々な組み合わせまたは個別の適用によって、細胞の溶解産物および抽出物から精製され得る。本発明のいくつかの実施形態では、親和性タグの使用によって、タンパク質の精製が促進され得る。例えば、安定化された逆転写酵素融合タンパク質は、融合タンパク質の逆転写酵素部分または安定化タンパク質部分に特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いて作製されたイムノアフィニティーカラムを使用することによって、他の細胞タンパク質から分離され得る。加熱を用いることによって、高温で安定でないがゆえに沈降する宿主タンパク質から安定化された逆転写酵素融合タンパク質を分離することができる。
【００６３】
安定化されたＲＴ融合タンパク質を発現することができる核酸は、宿主細胞においてその融合タンパク質を効率的に発現するように設計された配列を含む発現カセット中に組み立てられ得る。そのカセットは、好ましくは、安定化された逆転写酵素融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に連結された、プロモーターなどの関係する転写調節配列および翻訳調節配列、ならびに終止配列とともに、オープンリーディングフレームを含む。例えば、そのオープンリーディングフレームは、それぞれ図１〜５に示されるような配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０からなる群より選択される配列と実質的に類似のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を含み得る。好ましい実施形態において、プロモーターは、大腸菌における発現用のＴ７またはｔａｃプロモーターであるが、当業者は、他のいくつかの公知のプロモーターのいずれかを使用してもよいことを認識するだろう。大腸菌は、ｒｈｏ非依存性ターミネーターおよびｒｈｏ依存性ターミネーターも有し、迅速なＤＮＡ複製のためにＴ７ポリメラーゼを使用することができる。真核細胞では、ポリアデニル化部位を含むことが、ｍＲＮＡの適正なプロセシングの助けになる。
【００６４】
上記オープンリーディングフレームは、それぞれ図６〜１０に示されているような配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７に示されるようなポリヌクレオチド配列も含み得る。あるいは、上記オープンリーディングフレームは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７に示されるポリヌクレオチド配列と実質的に類似のポリヌクレオチド配列を含み得る。この特定の文脈において、用語「実質的に類似」とは、同じアミノ酸をコードするコドンが交換可能に使用されて、そのヌクレオチド配列が、なおも配列番号６〜１０に対応するアミノ酸配列の翻訳をもたらし得る、ヌクレオチド配列のバリアントのことを指す。安定化された逆転写酵素融合タンパク質のオープンリーディングフレームポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９５％の同一性または少なくとも約９８％の同一性を有する。
【００６５】
ヌクレオチドの同一性は、候補安定化された逆転写酵素融合タンパク質のオープンリーディングフレームと、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列との比較において定義され、それらの配列の長さにわたって同一ヌクレオチドの数を最適化するようにその２つのポリヌクレオチドの残基をアラインメントすることによって判定される；共有されるヌクレオチドの数を最適化するために、アラインメントを作成する際に一方または両方の配列にギャップが許容されるが、それでもなお、各配列におけるヌクレオチドは、適切な順序のままでなければならない。好ましくは、２つのヌクレオチド配列は、Ｔａｔｕｓｏｖａら（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１７４，ｐ．２４７−５０（１９９９））によって記載されているような、また、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＤａｔａｂａｓｅセクションのＢＬＡＳＴの項目下においてワールドワイドウェブ上で利用可能な、ＢＬＡＳＴ２検索アルゴリズムのＢｌａｓｔｎプログラムを用いて比較される。好ましくは、マッチリワード（ｒｅｗａｒｄ  ｆｏｒ  ｍａｔｃｈ）＝１、ミスマッチペナルティ＝−２、オープンギャップペナルティ＝５、伸長ギャップペナルティ＝２、ギャップ×ドロップオフ＝５０、期待値＝１０、ワードサイズ＝１１および必要に応じてフィルターオンをはじめとした、すべてのＢＬＡＳＴ２検索パラメータに対するデフォルトの値を使用する。ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを用いて２つのヌクレオチド配列を比較する際、ヌクレオチドの同一性は、「同一性」と呼ばれる。
【００６６】
ヌクレオチド配列からのタンパク質の調製に関して、可能性のある４種類のヌクレオチド塩基の「トリプレット」コドンが、６０を超えるバリアント型として存在し得ることに注意されたい。これらのコドンは、たった２０種類の異なるアミノ酸に対するメッセージ（ならびに転写の開始および終結）しか提供しないので、いくつかのアミノ酸は、２つ以上のコドンによってコードされ得、この現象は、コドン冗長性として知られる。したがって、安定化された逆転写酵素融合タンパク質の特定のアミノ酸配列を調製するために使用されるヌクレオチド配列は、使用される特定のコドンに応じて、かなり変動し得る。完全に理解されていない理由により、別のコドンは、異なるタイプの細胞の内在性ＤＮＡに均一に存在せず、ある特定のタイプの細胞では、ある特定のコドンに対する自然の階層または「優先度」が存在する。したがって、いくつかの実施形態において、安定化された逆転写酵素融合タンパク質を発現させるために使用されるコドンの選択は、より高いレベルの発現をもたらす特定のコドンを使用することによって最適化され得る。
【００６７】
本発明によれば、安定化された逆転写酵素融合タンパク質の発現カセットがベクターに挿入される。このベクターは、好ましくは、プラスミドまたはアデノウイルスベクターであるが、プロモーターに連結された線形ＤＮＡまたは他のベクター（例えば、アデノ随伴ウイルスまたは改変ワクシニアウイルス、レトロウイルスまたはレンチウイルスのベクター）も使用してもよい。特に、大腸菌プラスミドベクターの使用が、好ましい。
【００６８】
安定化された逆転写酵素融合タンパク質を開発するためおよび評価するために、本発明者らによって行われた研究の詳細な説明が、以下に提供される。
【００６９】
ＭａｌＥ融合タンパク質としてのグループＩＩイントロンＲＴの発現および精製
不十分にしか働かないタンパク質の発現および溶解性は、時折、マルトース結合タンパク質（ＭａｌＥ）またはＮ利用物質Ａ（ＮｕｓＡ）のような高度に可溶性のタンパク質の融合によって改善され得る（Ｎａｌｌａｍｓｅｔｔｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ４５，１７５−１８２，２００５）。さらに、ＭａｌＥタグによってアミロースアフィニティークロマトグラフィを介したタンパク質の精製が容易になる。それゆえ、本発明者らは、グループＩＩイントロンＲＴが、ＭａｌＥ融合物として発現され、精製され得るかを試験した。はじめに、ＭａｌＥタグを、発現ベクターｐＭａｌ−ｃ２ｔにおいてＴＥＶプロテアーゼで切断可能なリンカーを介して上記ＲＴのＮ末端に融合した（図１２Ｂ）。Ｔ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓグループＩＩイントロンＲＴのうちのいくつかに対するＭａｌＥ−ＲＴ融合タンパク質は、大腸菌において十分発現し、核酸を除去するポリエチレンイミン（ＰＥＩ）沈殿の後のアミロースアフィニティークロマトグラフィおよびヘパリンＳｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィを含む手順によって精製することができた。さらに、精製の直後にアッセイされた未切断のＭａｌＥ−ＲＴ融合タンパク質は、高い耐熱性ＲＴ活性を有した。しかしながら、これらのタンパク質の収率は、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓタンパク質の場合、＜０．２ｍｇ／ｌだった。さらに、ＭａｌＥタグが、ＴＥＶプロテアーゼを用いた切断によって除去されたとき、そのＲＴは、直ちに不溶性の沈殿物を形成した一方、そのタグが未切断で放置された場合、ＭａｌＥ−ＲＴ融合タンパク質は、ＲＴ活性を失い続け、氷上で保存されるかまたは５０％グリセロール中で急凍されたときであっても数日中に分解された。溶解性タグの存在下で正しく折り畳まれたタンパク質は、そのタグが切断された後も溶解性のままの傾向があるので（Ｎａｌｌａｍｓｅｔｔｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ４５，１７５−１８２，２００５）、後者の知見は、驚くべきものだった。付着されたＭａｌＥタグを有するときは活性であるが有しないときは活性でなかったグループＩＩイントロンＲＴは、例外と思われる。この安定化タンパク質が耐熱性逆転写酵素に付着されたままでなければならないという知見は、安定化タンパク質が、耐熱性逆転写酵素を溶解性かつ活性に維持する際に積極的な役割を果たすことを示唆する。
【００７０】
これらの困難を克服するために、本発明者らは、グループＩＩイントロンＲＴが、切断不可能な剛性リンカーを介してＭａｌＥタグをこのタンパク質に付着することによって活性型で安定化され得るかを試験した。そのようなＭａｌＥとの剛性融合物は、代表的には、荷電アミノ酸残基をアラニンで置き換えるというＭａｌＥタグのＣ末端における変更とともに、３〜５個のアラニン残基のリンカー領域を有する（Ｓｍｙｔｈら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １９，２４７７−２４８７，２００３）。これらの剛性融合リンカーは、コンフォメーションの不均一性を減少させ、構造決定のための、リンカーが付着した状態でのタンパク質の結晶化を可能にした（Ｓｍｙｔｈら、同文献）。ここで試験されたＭａｌＥ−ＲＦ−ＲＴ融合物について、ｐＭａｌ−ｃ２ｔ  ＴＶＤＥＡＬＫＤＡＱＴＮＳ３Ｎ１０ＬＥＮＬＹＦＱＧＥＦ（配列番号１９）のＭａｌＥ／リンカー領域を、ＴＶＤＡＡＬＡＡＡＱＴＡＡＡＡＡ（配列番号２０）に改変し、それをＭａｌＥ−ＲＦ（剛性融合）タグと称した（図１２Ｂ）。
【００７１】
ＭａｌＥ−ＲＦタグが、グループＩＩイントロンＲＴの活性に影響するか否かを迅速に評価するために、本発明者らは、ＭａｌＥ−ＲＦ−ＲＴが、インビボにおいてレトロホーミングを支持し得るか否かを試験した。最初の試験では、選択されたＲＴは、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  Ｌｌ．ＬｔｒＢイントロンによってコードされるＬｔｒＡタンパク質、および耐熱性Ｔ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＴｅＩ４ｈイントロンによってコードされるＲＴの活性化された誘導体であるＴｅＩ４ｈ＊ＲＴだった。３７℃でのレトロホーミングアッセイでは、ＭａｌＥ−ＲＦ−ＬｔｒＡタンパク質は、天然ＬｔｒＡに対する８６％と比べて、２０％という効率でレトロホーミングを支持したのに対し、４８℃でのレトロホーミングアッセイでは、ＭａｌＥ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｈ＊タンパク質は、非融合ＴｅＩ４ｈ＊タンパク質に対する１００％と比べて、８７％という効率でレトロホーミングを支持した；表１を参照のこと。このように、著しいことに、両方のＭａｌＥ−ＲＦ−ＲＴが、付着されたマルトース結合タンパク質の剛性リンカー配列が存在するにもかかわらず、高いがいくらか低下した効率でレトロホーミングを支持する能力を保持する。これらの知見から、これらのタンパク質が、ＲＴ活性、ＲＮＡスプライシング活性およびＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性をはじめとしたレトロホーミングに必要とされるすべての活性を実質的なレベルで保持することが暗示される。この可動性アッセイは、活性なグループＩＩイントロンＲＴに対する簡便なスクリーニングを提供する。
【００７２】
【表１】
0005882064.tif 000002
【００７３】
Ｌｌ．ＬｔｒＢイントロン（ＬｔｒＡタンパク質）（Ｇｕｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９，４５２−４５７，２０００，Ｋａｒｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９，１１６２−１１６７，２００１）およびＴｅＩ４ｈ＊について以前に記載されているように、レトロホーミングアッセイを大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）において行った。ＣａｐＲイントロン−ドナープラスミドは、Ｔ７ｌａｃプロモーターを使用することにより、両脇に短い５’エキソンおよび３’エキソン（それぞれＥ１およびＥ２）を伴うΔＯＲＦイントロン（Ｉ−ΔＯＲＦ）ならびにＤＩＶ内のＴ７プロモーター、その後に続くＲＴ  ＯＲＦ（これはＥ２の下流に存在する）を発現する。ＡｍｐＲレシピエントプラスミドは、プロモーターを有しないｔｅｔＲ遺伝子の上流にクローニングされる、イントロンに対する標的部位（ライゲートされたＥ１−Ｅ２配列）を含む。示される温度において１時間にわたってＩＰＴＧ（ＬｔｒＡおよびＭａｌＥ−ＲＦ−ＬｔｒＡに対しては０．１ｍＭ、ならびにＴｅＩ４ｈ＊およびＭａｌＥ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｈ＊に対しては０．５ｍＭ）を用いてイントロンの発現を誘導した。Ｔ７プロモーターを有するイントロンの標的部位へのレトロホーミングは、ｔｅｔＲ遺伝子の発現を活性化し、それにより、ＴｅｔＲ＋ＡｍｐＲコロニーの選択が可能となる。レトロホーミングの効率を、（ＡｍｐＲ＋ＴｅｔＲ）／ＡｍｐＲコロニーの比として算出した。
【００７４】
これらの知見に促されて、本発明者らは、いくつかのグループＩＩイントロンＲＴを、ベクターｐＭａｌ−ｃ２ｔにおいて剛性リンカーを介してそのタンパク質のＮ末端に融合されたＭａｌＥタグとともに発現するプラスミドを構築した。試験されたＲＴには、上記プラスミドアッセイを用いてレトロホーミングを支持する能力を予め試験していたいくつかのＴ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓグループＩＩイントロンＲＴ、および以前に高収率かつ高活性で精製することが困難だったグループＩＩイントロンＲＴに関係する２つのＧ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓグループＩＩイントロンＲＴ（Ｖｅｌｌｏｒｅら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０，７１４０−７１４７，２００４；Ｎｇら、Ｇｅｎｅ  ３９３，１３７−１４４，２００７）が含まれた。いくつかの構築物において、本発明者らは、精製において全長タンパク質について濃縮するために、さらにＣ末端Ｈｉｓ６−タグを付加した。このＭａｌＥ−ＲＦ−ＲＴ融合タンパク質を大腸菌において発現させ、核酸のＰＥＩ沈殿の後のアミロースアフィニティークロマトグラフィおよびヘパリンＳｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィを含む手順によって精製した。Ｃ末端Ｈｉｓ６タグを有する構築物については、さらにＮｉカラムクロマトグラフィ工程を含めた。それらのタンパク質を、５０％グリセロールを含む精製緩衝液に対して透析し、急速冷凍し、−８０℃で保存した。最終的なタンパク質調製物は、＞９５％純粋、０．５〜２．２ｍｇ／ｍｌの収率で、ＲＴ活性は、少なくとも６ヶ月間の貯蔵後に低下しなかった。
【００７５】
ＲＴアッセイ
熱安定性を評価するために、本発明者らは、まず、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ由来の融合物ＭａｌＥ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｃ、ＴｅＩ４ｈ＊およびＴｅＩ４ｆ、ならびにＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＭａｌＥ−ＲＦ−ＧｓＩ１およびＧｓＩ２のＲＴ活性を２５〜７７℃の温度においてアッセイした。これらの最初のアッセイは、鋳型−プライマー基質としてポリ（ｒＡ）／オリゴ（ｄＴ）４２を使用し、高分子量材料への３２Ｐ−ｄＴＴＰの重合を定量化することによって行われた。高温でもポリ（ｒＡ）鋳型にアニールしたままであるように、比較的長い４２ｎｔのｄＴプライマーを用いた（Ｔｍの計算値＝６９℃）。Ｎ末端ＭａｌＥ−ＲＦタグを有するＬｔｒＡタンパク質および有しないＬｔｒＡタンパク質を、中温性のＲＴコントロールとして平行してアッセイした（図１１）。ＬｔｒＡタンパク質は、ＭａｌＥの剛性融合タグを有しても有しなくても約３５℃の至適温度を有したのに対し、他の５つのＭａｌＥ−ＲＦ−ＲＴは、４５〜６１℃の範囲のより高い至適温度を有した。２つの最も活性かつ耐熱性のＲＴであるＭａｌＥ−ＲＦ−ＧｓＩ２およびＭａｌＥ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｃは、６１℃という至適温度を有し、７０℃において実質的な活性を保持した（このアッセイは、プライマー−鋳型の塩基対形成の安定性によって制限され得る）。この２つのＲＴのうち、ＭａｌＥ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｃは、最も高い活性を有し、線形の範囲内に残すために、他のＲＴ（１００ｎＭ，５分）よりも低いタンパク質濃度（５０ｎＭ）かつ短い時間（９０秒）でアッセイされた。マルトース（１０μＭ〜１ｍＭ）を含めること（これは、ＭａｌＥタグのコンフォメーションに影響し得る）が、ＲＴ活性に対してあったとしてもわずかに影響するだけであることが、ＭａｌＥ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｃタンパク質を用いた試験によって示された。
【００７６】
ＲＴ活性に対するタグおよびリンカーの変更の影響
タグおよびリンカーの最適な特性を測定するために、本発明者らは、ＭａｌＥ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｃ  ＲＴのバリアントを構築した。ＭａｌＥ−ＲＴ−ＴｅＩ４ｃ  ＲＴ（左のバー）およびバリアントタンパク質（右のバー）を精製し、上に記載したようにポリ（ｒＡ）／オリゴ（ｄＴ）４２を用いてＲＴ活性についてアッセイした（図１３Ａ）。ＭａｌＥ−ＲＴ−ＴｅＩ４ｃは、アラニンに変更された３つの荷電アミノ酸残基を含む改変ＭａｌＥタグ（ＭａｌＥ（ｍｏｄ））およびＲＴのＮ末端に連結された５アラニン残基のリンカーを有する。５アラニン残基リンカーが除去されたかまたは１または２アラニン残基に短縮されたバリアントは、改変ＭａｌＥタグを野生型ＭａｌＥ（ＭａｌＥ（ＷＴ））で置き換えたバリアントのような、実質的なＲＴ活性であるが低下したＲＴ活性を有した（図１３Ａ）。ＭａｌＥ（ＷＴ）タグの後に、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位が欠失したｐＭａｌ−ｃ２ｔリンカーを有するＴｅＩ４ｃのバリアントもまた、実質的なＲＴ活性であるが低下したＲＴ活性を有した（図１３Ａ）。野生型ＭａｌＥタグがＴｅＩ４ｃ  ＲＴのＣ末端に付着されたバリアントは、大腸菌において十分に発現せず、これはおそらく、新生ＴｅＩ４ｃ  ＲＴが、ＭａｌΕタグの事前の発現なしでは適切に折り畳むことができないことを反映している。最後に、ＭａｌΕの代わりにＮｕｓＡ（Ｎ利用物質タンパク質）へのＮ末端の剛性融合を有するバリアントは、実質的な耐熱性ＲＴ活性を有した（図１３ＡおよびＢ）。
【００７７】
ｃＤＮＡ合成に対する温度プロファイル
図１４は、耐熱性グループＩＩイントロンＲＴのうちの２つ（ＭａｌΕ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｃおよびＭａｌＥ−ＲＦ−ＧｓＩ２）を、５５℃で活性であると報告されている商業的に入手可能なＲＴであるＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）（Ｐｏｔｔｅｒら、Ｆｏｃｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ）２５．１，１９−２４，２００３）と比較して、インビトロで転写されたＲＮＡ鋳型（その３’末端にＤＮＡプライマーがアニールしたもの）を用いた種々の温度におけるｃＤＮＡ合成のアッセイを示している。一方の鋳型は、ＡｆｌＩＩＩで消化されたｐＢＳ  ＫＳ（＋）から合成された５３１ｎｔインビトロ転写物（３２Ｐ標識された３７ｎｔのＤＮＡプライマーがアニールしたもの）であり（図１４Ａ〜Ｃ）、他方は、３２Ｐ標識された４４ｎｔのＤＮＡプライマーを有する１．２ｋｂ  ｋａｎＲ  ＲＮＡ（配列番号２１；図１５に示されるもの）だった（図１４Ｄ〜Ｅ）。この反応物を、示されている温度で３０分間インキュベートし、生成物を変性６％ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動によって解析した。各パネルにおいて、上および下のオートラジオグラムは、それぞれ全長産物および伸長されていないかまたは部分的に伸長されたプライマーを含むゲルの一部を示しており、棒グラフは、全長ｃＤＮＡまで伸長したプライマーのパーセンテージを示している。
【００７８】
５３１ｎｔのＲＮＡ鋳型を用いたとき、ＭａｌＥ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｃ  ＲＴは、６１〜８１℃という全長ｃＤＮＡ合成に最適な温度を有した。ＭａｌＥ−ＲＦ−ＧｓＩ２  ＲＴは、３７〜６９℃の温度で全長ｃＤＮＡを合成した一方で、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴは、５７℃を超える温度で活性を有しなかった（図１４Ａ〜Ｃ）。１．２ｋｂ  ＲＮＡ鋳型を用いたとき、ＭａｌＥ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｃおよびＭａｌＥ−ＲＦ−ＧｓＩ２  ＲＴは、それぞれ６１〜８１℃および６１〜６９℃という至適温度を有し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴはまた、５７℃を超える温度で活性を有しなかった（図１４Ｄ〜Ｅ）。
【００７９】
ｑＲＴ−ＰＣＲによるｃＤＮＡ合成の解析
ゲル解析に加えて、本発明者らは、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して、１．２ｋｂ  ＲＮＡ鋳型を用い、ＭａｌＥ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｃおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴによって合成されたｃＤＮＡの量を比較した。本発明者らは、まず、５０〜７５℃の温度において生成された全長ｃＤＮＡの量を比較した（図１６）。ｑＰＣＲ用のｃＤＮＡは、鋳型として５×１０８コピーのｋａｎＲ  ＲＮＡ、２００ｎＭ  ＭａｌＥ−ＲＴ−ＴｅＩ４ｃまたは２００ＵのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴを含む反応物中で、６つの異なる温度において３０分間合成された。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩを用いた反応は、製造者の仕様書に従って行った。ｄＮＴＰを除くすべての成分を含む反応混合物を、所望の温度において２分間プレインキュベートし、ｄＮＴＰを加えることによって開始した。３０分後、その反応を、ドライアイス上で直ちに凍結することによって終結した。各ｃＤＮＡ合成の５μｌを、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ混合物、ならびにカナマイシンＲＮＡのｎｔ１８８−２５７および５６２−６３４に位置する２つの順方向、逆方向および二重標識のプライマープローブ混合物を含むｑＰＣＲ反応に使用した。そのＲＮＡの５’末端に最も近いプライマーセット（ｎｔ１８８−２５７）を用いたとき、ＭａｌＥ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｃ  ＲＴに対するサイクル閾値（ＣＴ）値は、試験されたすべての温度においてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴに対するものよりも著しく低かった（図１６）ことから、ＭａｌＥ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｃが、ＲＮＡ鋳型の５’末端付近まで伸長したｃＤＮＡをより多く合成したことが示唆される。特に、合成されたｃＤＮＡの量の差は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩの活性が急速に低下する５５〜６５℃の温度において最も著明だった。
【００８０】
ＭａｌＥ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｃおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴによるｃＤＮＡ合成の処理能力を比較するために、６０および６５℃において得られた同じｃＤＮＡサンプルを、２つの異なる単位複製配列プライマー／プローブセット：９２０ｎｔ長のｃＤＮＡを検出する１８８−２５７、および５４６ｎｔ長のｃＤＮＡを検出する５６２−６３４を用いて解析した（図１７）。この場合では、ｃＤＮＡサンプルに対するサイクル閾値結果を、Ｎｏｖａｇｅｎ（登録商標）二本鎖ＤＮＡプラスミドベクターｐＥＴ９ａを用いて得られた検量線に対してプロットすることにより、コピー数当量（ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）を決定した。１８８−２５７単位複製配列プライマー／プローブセットを用いたとき、６０℃においてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＲＴを用いたときの６４，４５６コピーに対して、９７２，８１５コピーが、ＭａｌＥ−ＲＦ−４ｃ  ＴｅＩ４ｃ  ＲＴを用いたとき検出され（約１５倍の差）、その比は、６５℃では６６１に対して７３２，５５９に増加した（約１１００倍の差）。さらに、両方の温度において、ＭａｌＥ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｃ  ＲＴでは、２つのプライマーセットによって検出されたｃＤＮＡのコピー数にほとんど差が示されないことから、ＭａｌＥ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｃ  ＲＴが、高処理能力を示唆する、ほぼ全長のｃＤＮＡを合成したことが示される。対照的に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴでは、両方の温度において５６２−６３４プライマーセットよりも１８８−２５７プライマーセットによって検出されるより長いｃＤＮＡの数が少なかったことから、このＲＴは、ＲＮＡの５’末端に達する前に減衰するか、または別途妨害され、より短いｃＤＮＡを合成すると示唆される。
【００８１】
ＴｅＩ４ｃおよびＴｅＩ４ｈ＊ＲＴによるヌクレオチド取り込みの忠実度
ＴｅＩ４ｈ＊およびＴｅＩ４ｃ  ＲＴ（すなわち、天然のグループＩＩイントロンＲＴであって、安定化されたＲＴ融合タンパク質ではない）の固有の忠実度を、大腸菌プラスミドアッセイにおいてレトロホーミングを起こしたイントロンの配列を決定することによって、まず評価した（表２）。３７および４８℃におけるＴｅＩ４ｈ＊−ΔＯＲＦイントロンＲＮＡのレトロホーミングを促進するＴｅＩ４ｈ＊ＲＮＡに対する最大エラー頻度は、それぞれ１．６×１０−５および４．１×１０−６だった。ＴｅＩ４ｃ  ＲＴは、１つのグループＩＩイントロン（ＴｅＩ３ｃ）が別のもの（ＴｅＩ４ｃ）に挿入され、両方のイントロンを効率的に動けるようにし得る配置である、「ツイントロン（ｔｗｉｎｔｒｏｎ）」の外側のイントロンによってコードされる。４８℃におけるＴｅＩ３ｃまたはＴｅＩ４ｃのレトロホーミングを促進するＴｅＩ４ｃ  ＲＴに対する最大エラー頻度は、１．１×１０−５および２．２×１０−５だった。これらのエラー頻度は、３７℃において約１０−５という、Ｌｌ．ＬｔｒＢイントロンのレトロホーミングを促進するＬｌ．ＬｔｒＢイントロンＲＴ（ＬｔｒＡ）に対して以前に推定されたものに匹敵する（Ｃｏｎｌａｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３，５２６２−５２７０，２００５）。
【００８２】
【表２】
0005882064.tif 000003
【００８３】
示されるイントロンおよびＲＴを発現するドナープラスミド、ならびにプロモーターを有しないｔｅｔＲ遺伝子の上流にクローニングされたイントロン標的部位（ライゲーションされたＥ１−Ｅ２）配列を含むレシピエントプラスミドを用いて大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）においてレトロホーミングを行った。ＴｅｔＲコロニーを選択した後、５’−および３’−組込みジャンクションに対して、それぞれプライマーＲｓｅｎｓｅ（５’−ＡＣＡＡＡＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＧＣＧＣＡＣ；配列番号２２）およびＴｅ６８０ｒｃ（５’−ＧＴＴＧＧＴＧＡＣＣＧＣＡＣＣＡＧＴ；配列番号２３）ならびにＴｅ４２０ｆ（５’−ＡＡＣＧＣＧＧＴＡＡＧＣＣＣＧＴＡ；配列番号２４）およびＲｅｖ２ｐＢＲＲ（５’−ＡＡＴＧＧＡＣＧＡＴＡＴＣＣＣＧＣＡ；配列番号２５）を用いて、レシピエントプラスミド中の標的部位に組み込まされたイントロンをコロニーＰＣＲによって増幅した。次いで、ＰＣＲフラグメントの配列を決定した。表２は、レトロホーミングの誘導温度、配列決定されたイントロンヌクレオチドの総数、変異（エラー）の数、およびエラー頻度を示している。
【００８４】
安定化されたＲＴ融合タンパク質を調製するためおよび特徴づけるための方法の以下の実施例は、例証の目的のために含められ、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【００８５】
実施例１：組換えプラスミド
ｐＭａｌＥ−ＴｅＩ４ｃ、ｐＭａｌＥ−ＴｅＩ４ｆ、ｐＭａｌＥ−ＴｅＩ４ｈ＊は、ｔａｃプロモーターの後ろにクローニングされた、融合されるＮ末端ＭａｌＥタグを有する、示される可動性のグループＩＩイントロンのＲＴ  ＯＲＦを、発現ベクターｐＭａｌ−ｃ２ｔ内に含む。後者は、ｐＭａｌ−ｃ２ｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ  ＭＡ）の誘導体であり、ＭａｌＥと発現されるタンパク質との間のＸａ因子プロテアーゼ切断部位が、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位によって置き換えられたものである（Ｋｒｉｓｔｅｌｌｙら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５９，１８５９−１８６２，２００３）。ＴｅＩ４ｈ＊ＲＴは、ＲＴ−５におけるＹＡＧＤモチーフがＹＡＤＤに変更されている、天然ＴｅＩ４ｈ  ＲＴの誘導体である。ｐＥＴ１１（ＴｅＩ４ｆ）、ｐＵＣ１９（ＴｅＩ４ｃ）またはｐＡＣＤ２Ｘ（ＴｅＩ４ｈ＊）にクローニングされたＴ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓのＢＰ１株由来のグループＩＩイントロンを含む組換えプラスミドが、以前に報告されている。制限酵素認識部位を追加するプライマーを用いてＲＴ  ＯＲＦをＰＣＲ増幅し、次いで、そのＰＣＲ産物をｐＭａｌ−ｃ２ｔの対応する部位（ＴｅＩ４ｃ  ＲＴ，ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ部位；ＴｅＩ４ｆ  ＲＴ，ＢａｍＨＩ部位；ＴｅＩ４ｈ＊ＲＴ，ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩ部位）にクローニングすることによって、これらの最初の構築物からｐＭａｌＥ−ＲＴプラスミドを得た。Ａｃｃｕｐｒｉｍｅポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｍａｋａｒｏｖａら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９，９７０−９７２，２０００）を用いるＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＰＣＲ法によって、ＴＥＶプロテアーゼによって切断可能なリンカー（ＴＶＤＥＡＬＫＤＡＱＴＮＳ３Ｎ１０ＬＥＮＬＹＦＱＧ；配列番号１９）を剛性リンカー（ＴＶＤＡＡＬＡＡＡＱＴＡＡＡＡＡ；配列番号２０）で置き換えることによってｐＭａｌＥ−ＲＦ−タンパク質（例えば、ｐＭａｌＥ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｃ）と表示される組換えプラスミドを、対応するｐＭａｌＥ−ＲＴプラスミドから得た。
【００８６】
種々のリンカーを有するｐＭａｌＥ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｃの誘導体を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ法を用いるＰＣＲ突然変異誘発によって構築した。５’ＥｃｏＲＩ部位および３’ＰｓｔＩ部位を導入するプライマーを用いてｐＭａｌ−ｃ２ｔのＭａｌＥセグメント、ならびに５’ＮｄｅＩ部位および３’ＥｃｏＲＩ部位を導入する遺伝子特異的プライマーを用いてｐＭａｌＥ−ＴｅＩ４ｃのＴｅＩ４ｃ  ＯＲＦをそれぞれ増幅し、それらのフラグメントを、ＮｄｅＩおよびＰｓｔＩで消化されたｐＭａｌ−ｃ２ｔにクローニングすることによって、ＭａｌＥタグをｐＭａｌ−ｃ２ｔにおけるＴｅＩ４ｃ  ＯＲＦのＣ末端に融合した。
【００８７】
剛性リンカーを介して上記タンパク質に融合されたＮ末端ＮｕｓＡタグおよびＣ末端Ｈｉｓ６タグとともにＴｅＩ４ｃ  ＲＴを発現するｐＮｕｓＡ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｃ−Ｈｉｓを、ＳａｃＩＩおよびＫｐｎＩ部位を追加するプライマーを用いてｐＭＡＬ−ＴｅＩ４ｃからＴｅＩ４ｃ  ＲＴ  ＯＲＦをＰＣＲ増幅し、得られたＰＣＲ産物を、ｐＥＴ−５０ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）の対応する部位の間にクローニングすることによって、構築した。次いで、ＰＣＲ突然変異誘発を用いることにより、ＮｕｓＡの最後の２つの荷電残基（ＤおよびＥ）、既存のリンカーおよび２つのＮ末端Ｈｉｓ６タグ（ＮＩＣＷＦＧＤＥＡＴＳＧＳＧＨ６；配列番号２６）のうちの１つを、剛性リンカー配列（ＮＩＣＷＦＧＡＡＡＡＡ；配列番号２７）に置き換えた。第２のＮ末端Ｈｉｓ６タグを、ＰＣＲ突然変異誘発によって除去し、Ｈｉｓ６タグを、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＰＣＲによってＴｅＩ４ｃ  ＲＴのＣ末端に融合した。
【００８８】
Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ１０株のゲノムＤＮＡ（Ｇｒｅｇ  Ｄａｖｉｓ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）から得たもの）由来のＲＴ  ＯＲＦを、上記イントロンならびに追加されたＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ部位（ＧｓＩ１）またはＢａｍＨＩ部位（ＧｓＩ２）を増幅するプライマーを用いるＰＣＲによってＰＣＲ増幅し、次いで、そのＰＣＲ産物をｐＭａｌ−ｃ２ｔの対応する部位の間にクローニングすることによって、ｐＭａｌＥ−ＧｓＩ１およびｐＭａｌＥ−ＧｓＩ２を構築した。ＧｓＩ１は、Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｒｅｃＡ遺伝子に挿入されたサブグループＩＩＢ２イントロンであり、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ（Ｃｈｅｅら、Ｇｅｎｅ  ３６３，２１１−２２０，２００５）およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ（Ｎｇら、Ｇｅｎｅ  ３９３，１３７−１４４，２００７）のｒｅｃＡ遺伝子において、以前に報告されたＲＴをコードするグループＩＩイントロンに関係する。クローニングされたＧｓＩ１  ＲＴ  ＯＲＦが、そのゲノム配列（ＣＰ００１７９４）に対応することを確かめた。ＧｓＩ２は、Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓゲノムでは多コピーで見られるグループＩＩＣイントロンである。クローニングされたＧｓＩ２  ＲＴ  ＯＲＦは、Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓゲノム（ＣＰ００１７９４）におけるＧｓＩ２の全長６コピーのうちの１コピーのゲノム配列に対応し、Ｖｅｌｌｏｒｅら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０，７１４０−７１４７，２００４）によってクローニングされたＲＴ  ＯＲＦに対して３つのアミノ酸配列変更を有する。対応するｐＭａｌＥ−ＲＦ−ＲＴ構築物は、上に記載されたように、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＰＣＲによってｐＭａｌＥ−ＲＴ構築物から得られた。
【００８９】
ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を追加するプライマーを用いてｐＩｍｐ−２のＬｔｒＡ  ＯＲＦ（Ｓａｌｄａｎｈａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８，９０６９−９０８３，１９９９）をＰＣＲ増幅し、次いで、そのＰＣＲ産物をｐＭａｌ−ｃ２ｔの対応する部位の間にクローニングすることによってｐＭａｌＥ−ＬｔｒＡを構築し、上に記載されたように、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＰＣＲによってｐＭａｌＥ−ＲＦ−ＬｔｒＡをｐＭａｌＥ−ＬｔｒＡから得た。
【００９０】
実施例２：タンパク質精製
ｐＭａｌＥ−ＲＴまたはｐＭａｌＥ−ＲＦ−ＲＴ構築物の発現の場合は、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２／ｐＲＡＲＥ（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ  ＮＪ）またはＳｃａｒａｂＸｐｒｅｓｓ／ｐＲＡＲＥ  Ｔ７ｌａｃ（Ｓｃａｒａｂｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）を、その発現プラスミドで形質転換し、ＴＢまたはＬＢ培地中で中対数期（Ｏ．Ｄ．６００＝０．８）まで３７℃で生育した。イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ；最終１ｍＭ）を中対数期の細胞に加えることによって（ｐＭａｌＥ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｃ、ＴｅＩ４ｆ、ＴｅＩ４ｈ＊、ＧｓＩ１およびＧｓＩ２）、または自己誘導培地（０．２％ラクトース、０．０５％グルコース、０．５％グリセロール、２４ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４を含むＬＢ）中で細胞を生育することによって（ｐＭａｌＥ−ＬｔｒＡおよびｐＭａｌＥ−ＲＦ−ＬｔｒＡ）、発現を誘導した。いずれの場合も、誘導は、１８〜２５℃において約２４時間であり、その後、細胞を遠心分離によってペレットにし、緩衝液Ａ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、０．５Ｍ  ＫＣｌまたはＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ））に再懸濁し、−８０℃で凍結した。
【００９１】
ＭａｌＥ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｃ、ＴｅＩ４ｆ、ＴｅＩ４ｈ＊およびそれらの誘導体の精製のために、細胞懸濁液を解凍し、氷上においてリゾチーム（１ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）で１５分間処理し、ドライアイス上で３回凍結融解し、氷上において６０％の強さの１０秒間の破壊を３もしくは４回または３０秒間の破壊を１回（破壊の間に１０秒間）で超音波処理し（Ｂｒａｎｓｏｎ  ４５０  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ，Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ，Ｄａｎｂｕｒｙ  ＣＴ）、１８，５００×ｇ、４℃において３０分間遠心分離した。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を０．１％の最終濃度になるように加え、Ａｖａｎｔｉ  Ｊ−Ｅ遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ  ＣＡ）のＪ１６．２５ローターにおいて１５，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離することによって、核酸を沈殿させた。得られた上清を、アミロースカラム（１０ｍｌカラム体積；Ａｍｙｌｏｓｅ  Ｈｉｇｈ−Ｆｌｏｗ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、緩衝液Ａで平衡化されたもの）に適用し、そのカラムを各々５カラム体積の緩衝液Ａ（０．５Ｍ、１．５Ｍまたは０．５Ｍ  ＫＣｌを含む）で洗浄し、次いで、１０ｍＭマルトースを含む緩衝液Ａで溶出した。タンパク質画分をプールし、ＫＣｌ（ＭａｌＥ−ＲＦ−４ｃ、４ｆ、４ｈ＊、ＭａｌＥ−ＬｔｒＡおよびＭａｌＥ−ＲＦ−ＬｔｒＡに対しては１００ｍＭ；ＭａｌＥ−ＲＦ−ＧｓＩ１またはＧｓＩ２に対しては５０ｍＭ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０％グリセロールを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５で予め平衡化されたヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（３つのタンデム型の１ｍｌカラム；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．）を介してさらに精製した。タンパク質を同じ緩衝液におけるカラムに適用し、充填濃度から２Ｍ  ＫＣｌという４０カラム体積の勾配で溶出した。タンパク質は、約８００ｍＭ  ＫＣｌで溶出した。ピーク画分をプールし、貯蔵のために２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、０．５Ｍ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴおよび５０％グリセロールに対して透析した。凍結されたタンパク質は、少なくとも６ヶ月間、ＲＴ活性の低下を示さなかった。
【００９２】
０．２％ＰＥＩを用いて核酸を沈殿させ、アミロースカラムから溶出されたタンパク質を最終的なヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムの前にニッケルカラムでさらに精製したことを除いて、同様に、Ｎ末端ＭａｌＥタグおよびＣ末端Ｈｉｓ６−タグを有するＭａｌＥ−ＲＦ−ＧｓＩ１タンパク質を精製した。結合緩衝液（５００ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、４０ｍＭイミダゾールおよび１０％グリセロール）で平衡化されたニッケルカラム（５ｍｌのＨｉｓＴｒａｐＴＭ  ＨＰ  Ｎｉｃｋｅｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪ）に、アミロースカラムからのプールされたタンパク質画分を充填し、１０カラム体積の結合緩衝液で洗浄し、５カラム体積の溶出緩衝液（５００ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、４００ｍＭイミダゾールおよび１０％グリセロール）で溶出し、上清をヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに直接充填した。ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムからのピーク画分をプールし、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、０．５Ｍ  ＫＣｌ、５０％グリセロールに対して透析し、上に記載したように保存した。
【００９３】
ＮｕｓＡ融合物の場合、大腸菌ＳｃａｒａｂＸｐｒｅｓｓ／ｐＲＡＲＥ  Ｔ７ｌａｃ細胞を、１８℃において４８時間、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導し、ニッケル緩衝液Ａ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＫＣｌ、３０ｍＭイミダゾール、１０％グリセロール）に再懸濁した。上に記載したように細胞を破壊した後、最終濃度０．２％のポリエチレンイミンを加え、その後、１０，０００×ｇで１５分間遠心分離することによって、溶解産物から核酸を沈殿させた。上清を、ニッケル緩衝液Ａで予め平衡化された５ｍｌのニッケル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに適用し、次いで、５００ｍＭイミダゾールを含むニッケル緩衝液Ａで溶出した。タンパク質画分をプールし、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび２０％グリセロールで予め平衡化された２つの接続された１ｍｌのヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに直接充填した。タンパク質を、２０カラム体積の０．１〜１．５Ｍ  ＫＣｌ勾配で溶出し、ピーク画分をプールし、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、０．５Ｍ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、５０％グリセロールに対して透析し、上に記載したように保存した。
【００９４】
実施例３：逆転写酵素アッセイ
種々の温度におけるＲＴ活性を、鋳型−プライマーとしてポリ（ｒＡ）／オリゴ（ｄＴ）４２を用いて３２Ｐ−ｄＴＴＰの組み込みを定量化することによってアッセイした。ＲＴ（５０ｎＭのＭａｌＥ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｃ  ＲＴまたは１００ｎＭの他のすべてのＲＴ）を、種々の温度（２５〜７７℃の範囲）において１×ＲＴ緩衝液（７５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５および１ｍＭ  ＤＴＴ）中で１００ｎＭポリ（ｒＡ）／オリゴ（ｄＴ）４２とともにプレインキュベートし、５μＣｉ［α−３２Ｐ］−ｄＴＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ）を加えることによって、反応を開始した。その反応物を線形の範囲内の時間にわたってインキュベートし、２５０ｍＭの最終濃度になるようにＥＤＴＡを加えることによって反応を停止した。反応産物をＷｈａｔｍａｎ  ＤＥ８１クロマトグラフィペーパー（１０×７．５ｃｍシート；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にスポットし、０．３Ｍ  ＮａＣｌおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウムで３回洗浄し、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｍｏｄｅ  Ｉｍａｇｅｒ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でスキャンすることにより、結合した放射能を定量化した。
【００９５】
他のＲＴアッセイでは、ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーがアニールしたＲＮＡ鋳型を使用した。そのＲＮＡ鋳型は、ＡｆｌＩＩＩで消化されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（＋）から合成された５３１ｎｔのインビトロ転写物（Ｔ７Ｍｅｇｓｃｒｉｐｔキット（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いて転写されたもの）、またはＰｒｏｍｅｇａ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）から購入した１．２ｋｂ  ｋａｎＲ  ＲＮＡだった。製造者の指示書に従って、３７℃において４時間、インビトロ転写を行った。Ｔｕｒｂｏ  ＤＮａｓｅ  Ｉを用いてＤＮＡ鋳型を消化した後（５分，３７℃）、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１；フェノール−ＣＩＡ）を用いてＲＮＡを抽出し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）スピンカラムによる２サイクルのゲル濾過によって精製した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を使用することによって、ＲＮＡ濃度を測定した。ＲＮＡを、Ｍｉｌｌｉ−ＱグレードＨ２Ｏ中に保存し、−２０℃で保存した。
【００９６】
上記ＲＮＡの３’末端に相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーを、ＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ；ＡｆｌＩＩＩプライマー：５’−ＣＣＧＣＣＴＴＴＧＡＧＴＧＡＧＣＴＧＡＴＡＣＣＧＣＴＣＧＣＣＧＣＡＧＣＣＧ；配列番号２８；Ｐ０７８カナマイシンＲｅｖ５’−ＧＧＴＧＧＡＣＣＡＧＴＴＧＧＴＧＡＴＴＴＴＧＡＡＣＴＴＴＴＧＣＴＴＴＧＣＣＡＣＧＧＡＡＣ；配列番号２９）によって合成した。プライマー濃度をＡ２６０によって測定した。それらのプライマーを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を製造者の指示書に従って用いて５’３２Ｐ標識し、遊離ヌクレオチドを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムに通すゲル濾過によって除去した。それらのプライマーを、１．０：１．１のモル比で鋳型と混合し、１０％の勾配設定のＧｅｎｅＡｍｐ９７００ＰＣＲサイクラーにおいて、２分間８２℃に加熱することによってアニールさせ、次いで、室温に冷却した。
【００９７】
ｃＤＮＡ合成のゲル解析のために、１００ｎＭのアニールされた鋳型／プライマーを、ＭａｌＥ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｃ  ＲＴに対しては１００ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＤＴＴ中、ならびにＭａｌＥ−ＲＦ−ＧｓＩ２  ＲＴに対しては１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＤＴＴ中の２００ｎＭ酵素とともにインキュベートした。ｄＮＴＰおよびＭｇＣｌ２を、それぞれ１．２５ｍＭおよび１０ｍＭの最終濃度となるように加えることによって反応を開始し、示される温度において３０分間インキュベートし、０．１％ＳＤＳ／２５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（最終濃度）を加えることによって終結した後、フェノール−ＣＩＡ抽出した。生成物を、変性６％ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動によって解析し、そのゲルを乾燥し、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒを用いて定量化した。５’標識された１０ｂｐラダー（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）をサイズマーカーとして使用した。
【００９８】
実施例４：定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）
ｑＰＣＲ解析用のｃＤＮＡを、１×ＲＴ緩衝液（７５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＤＴＴ、５×１０８コピーのｋａｎＲ  ＲＮＡ、２００ｎＭ  ＭａｌＥ−ＲＦ−ＴｅＩ４ｃ  ＲＴおよび１ｍＭ  ｄＮＴＰを含む２０μｌ反応物中で３０分間、個別の実験について指定された温度において生成した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた類似反応を、製造者の仕様書に従って行った。反応物を種々の温度において２分間インキュベートし、ｄＮＴＰを加えることによって反応を開始した。３０分間インキュベートした後、その反応物をドライアイス上で直ちに凍結することによって反応を停止した。ｑＰＣＲに対して５μｌのｃＤＮＡ反応物を使用した。
【００９９】
１２．５μｌの２×ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）、７．５μｌの順方向、逆方向および二重標識のプローブ混合物（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡから個別に購入したオリゴヌクレオチド）ならびに５μｌのｃＤＮＡ鋳型からなる２５μｌの反応混合物が各ウェルに入った、光学的なキャップを備えた９６ウェルプレートにおいてｑＰＣＲ解析を行った。７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において９６００エミュレーションモードプロトコル（５０℃２分、９５℃１０分、次いで、９５℃１５秒および６０℃６０秒を合計４５サイクルのサイクル反応）を用いて、その混合物をインキュベートした。データを収集し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎｓ２．２または２．３を用いて解析した。
【０１００】
Ｎｏｖａｇｅｎ（登録商標）二本鎖ＤＮＡプラスミドベクターｐＥＴ９ａ（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用して、ｋａｎＲ  ｃＤＮＡのレベルを定量化した。そのｐＥＴ９ａベクターは、ｋａｎＲコード配列（塩基３５２３−４３３５）を含み、各プライマー／プローブ結合部位においてＰｒｏｍｅｇａ  １．２ｋｂ  ｋａｎＲ  ＲＮＡと１００％の配列相同性を有する。精製され定量化されたｐＥＴ９ａ  ＤＮＡベクターを１×１０９コピー／μｌの原液アリコートに段階希釈し、−２０℃で保存した。各ランについて、新しい原液を解凍し、次いで、段階希釈することにより、ｑＰＣＲにおいて使用する定量用検量線を作成した。次いで、ｃＤＮＡサンプルに対するサイクル閾値の結果を、その検量線に対してプロットすることにより、コピー数当量を決定した。
【０１０１】
使用したプライマーは、以下だった：
Ｐ０７８カナマイシンＲＴ−１１０７Ｒ  ５’−ＧＧＴＧＧＡＣＣＡＧＴＴＧＧＴＧＡＴＴＴＴＧＡＡＣＴＴＴＴＧＣＴＴＴＧＣＣＡＣＧＧＡＡＣ−３’；配列番号２９（Ｔｍ＝８０℃）  。
【０１０２】
プライマーセットｎｔ１８８−２５７：
順方向−−Ｐ０２９ｋａｎ−１８８Ｆ：５’−ＧＧＧＴＡＴＡＡＡＴＧＧＧＣＴＣＧＣＧ−３’；配列番号３０  。
【０１０３】
逆方向−−Ｐ０３０ｋａｎ−２５７Ｒ：５’−ＣＧＧＧＣＴＴＣＣＣＡＴＡＣＡＡＴＣＧ−３’；配列番号３１  。
【０１０４】
Ｔａｑｍａｎプローブ−−Ｐ０３１ｋａｎ−２１３Ｔ：５’（６−カルボキシフルオレセイン（６ＦＡＭ））−ＴＣＧＧＧＣＡＡＴＣＡＧＧＴＧＣＧＡＣＡＡＴＣ−３’；（Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＦＱ；暗い非蛍光クエンチャー）；配列番号３２  。
【０１０５】
単位複製配列７０ｂｐ：
５’ＧＧＧＴＡＴＡＡＡＴＧＧＧＣＴＣＧＣＧＡＴＡＡＴＧＴＣＧＧＧＣＡＡＴＣＡＧＧＴＧＣＧＡＣＡＡＴＣＴＡＴＣＧＡＴＴＧＴＡＴＧＧＧＡＡＧＣＣＣＧ−３’；配列番号３３  。
【０１０６】
プライマーセット（ｎｔ５６２−６３４）：
順方向−−Ｐ００１ｋａｎ−５６２Ｆ：５’−ＣＧＣＴＣＡＧＧＣＧＣＡＡＴＣＡＣ−３’；配列番号３４  。
【０１０７】
逆方向−−Ｐ００２ｋａｎ−６３４Ｒ：５’−ＣＣＡＧＣＣＡＴＴＡＣＧＣＴＣＧＴＣＡＴ−３’；配列番号３５  。
【０１０８】
Ｔａｑｍａｎプローブ−−Ｐ００３ｋａｎ−５８１Ｔ：５’（６−ＦＡＭ）−ＡＴＧＡＡＴＡＡＣＧＧＴＴＴＧＧＴＴＧＡＴＧＣＧＡＧＴＧＡ−３’−（ＴＡＭＲＡ）；配列番号３６  。
【０１０９】
単位複製配列７３ｂｐ
５’ＣＧＣＴＣＡＧＧＣＧＣＡＡＴＣＡＣＧＡＡＴＧＡＡＴＡＡＣＧＧＴＴＴＧＧＴＴＧＡＴＧＣＧＡＧＴＧＡＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣＧＡＧＣＧＴＡＡＴＧＧＣＴＧＧ−３’；配列番号３７  。
【０１１０】
実施例５：レトロホーミングアッセイ
抗生物質が以下の濃度：アンピシリン，１００μｇ／ｍｌ；クロラムフェニコール，２５μｇ／ｍｌ；テトラサイクリン，２５μｇ／ｍｌで加えられたＬＢ培地において生育された大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）（ＮｏｖａｇｅｎＴＭ）において、レトロホーミングアッセイを行った。イントロンドナープラスミドであるｐＡＣＤ２Ｘの誘導体（Ｓａｎ  Ｆｉｌｉｐｐｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３２４，９３３−９５１，２００２）は、ｃａｐＲマーカーを有し、Ｔ７ｌａｃプロモーターを使用することにより、両脇に短い５’  エキソンおよび３’エキソン（それぞれＥ１およびＥ２）を伴うΔＯＲＦイントロン（Ｉ−ΔＯＲＦ）ならびにＤＩＶ内のＴ７プロモーター、その後に続くＲＴ  ＯＲＦ（これはＥ２の下流に存在する）を発現する。レシピエントプラスミドであるｐＢＲＲ−ｔｅｔの誘導体（Ｇｕｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９，４５２−４５７，２０００；Ｋａｒｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９，１１６２−１１６７，２００１）は、ａｍｐＲマーカーを有し、プロモーターを有しないｔｅｔＲ遺伝子の上流にクローニングされたイントロンに対する標的部位（ライゲーションされたＥ１−Ｅ２配列）を含む。後者は、Ｔ７プロモーターを有するイントロンの挿入によって活性化され、それにより、ＴｅｔＲ＋ＡｍｐＲコロニーに対する選択が可能となる。これらのアッセイの場合、細胞を、ＣａｐＲドナープラスミドおよびＡｍｐＲレシピエントプラスミドで同時形質転換し、クロラムフェニコールおよびアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢ培地に接種し、振盪しながら（２００ｒｐｍ）３７℃で一晩生育した。少量（５０μｌ）の一晩培養物を、同じ抗生物質を含む５ｍｌの新鮮ＬＢ培地に接種し、上記のとおり１時間生育した。次いで、その細胞を、個別の実験について表１のレジェンドに明記された条件下においてＩＰＴＧで１時間誘導した。次いで、その培養物を氷上に置き、氷冷ＬＢで希釈し、アンピシリンまたはアンピシリン＋テトラサイクリンを含むＬＢ寒天上に種々の希釈でプレーティングした。そのプレートを３７℃で一晩インキュベートした後、（ＴｅｔＲ＋ＡｍｐＲ）／ＡｍｐＲコロニーという比として可動性効率を計算した。
（項目１）  安定化タンパク質に接続された耐熱性逆転写酵素を含む、安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
（項目２）  上記耐熱性逆転写酵素が、細菌の逆転写酵素を含む、項目１に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
（項目３）  上記細菌の逆転写酵素が、グループＩＩイントロン由来逆転写酵素を含む、項目２に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
（項目４）  上記細菌の逆転写酵素が、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ逆転写酵素またはＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ逆転写酵素である、項目３に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
（項目５）  上記耐熱性逆転写酵素が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５からなる群より選択される配列と少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含む、項目１に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
（項目６）  上記安定化タンパク質が、親和性タンパク質または溶解性向上タンパク質を含む、項目１に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
（項目７）  上記安定化タンパク質が、マルトース結合タンパク質またはＮ利用物質Ａタンパク質を含む、項目６に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
（項目８）  上記安定化タンパク質が、荷電アミノ酸を無荷電アミノ酸と置き換えることによって改変されている、項目６に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
（項目９）  上記耐熱性逆転写酵素が、リンカーペプチドによって上記安定化タンパク質に接続されている、項目１に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
（項目１０）  上記リンカーペプチドが、切断不可能なリンカーペプチドである、項目９に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
（項目１１）  上記切断不可能なリンカーペプチドが、剛性リンカーペプチドである、項目１０に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
（項目１２）  上記リンカーペプチドが、１アミノ酸から２０アミノ酸からなる、項目１０に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
（項目１３）  上記リンカーペプチドが、１アミノ酸から５アミノ酸からなる、項目１０に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
（項目１４）  上記リンカーペプチドが、３アミノ酸から５アミノ酸からなる、項目１０に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
（項目１５）  上記剛性リンカーペプチドが、配列番号１２からなる、項目１１に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
（項目１６）  上記融合タンパク質が、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０からなる群より選択される配列と少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含むアミノ酸配列を有する、項目１に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
（項目１７）  上記安定化された逆転写酵素融合タンパク質が、約４５°から約６５℃の温度において２．０×１０−５以下のエラー頻度で逆転写を行うことができる、項目１に記載の安定化された逆転写酵素融合タンパク質。
（項目１８）  ＲＮＡ分子からｃＤＮＡを調製するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）プライマーヌクレオチド配列を該ＲＮＡ分子に加える工程
（ｂ）１つ以上のデオキシリボヌクレオシド三リン酸またはジデオキシリボヌクレオシド三リン酸、および安定化タンパク質に接続された耐熱性逆転写酵素を含む安定化された逆転写酵素融合タンパク質の存在下において、該ＲＮＡ分子の全部または一部に相補的なｃＤＮＡ分子を合成するのに十分な条件下で該ＲＮＡ分子をインキュベートする工程
を包含する、方法。
（項目１９）  上記耐熱性逆転写酵素が、切断不可能なリンカーペプチドによって上記安定化タンパク質に接続されている、項目１８に記載の方法。
（項目２０）  上記ＲＮＡが実質的に減少した量の安定な妨害性の二次構造または三次構造を有する温度範囲内で、逆転写が行われる、項目１８に記載の方法。
（項目２１）  上記耐熱性逆転写酵素が、グループＩＩイントロン由来逆転写酵素である、項目１８に記載の方法。
（項目２２）  上記耐熱性逆転写酵素が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５からなる群より選択される配列と少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含み、上記切断不可能なリンカーが、１アミノ酸から２０アミノ酸からなり、そして上記安定化タンパク質が、親和性タンパク質または溶解性向上タンパク質を含む、項目１９に記載の方法。
（項目２３）  上記逆転写が、約４５℃から約６５℃の温度において２．０×１０−５以下のエラー頻度で行われる、項目１８に記載の方法。
（項目２４）  配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０からなる群より選択される配列と少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸を含む、安定化された逆転写酵素融合タンパク質を生成するためのＤＮＡ発現ベクター。
（項目２５）  安定化された逆転写酵素融合タンパク質を生成する方法であって、該方法は、以下の工程
（ａ）項目２４に記載のＤＮＡ発現ベクターを含む宿主細胞を培養する工程；
（ｂ）該ＤＮＡ発現ベクターによってコードされる該安定化された逆転写酵素融合タンパク質を発現させる工程；および
（ｃ）該安定化された逆転写酵素融合タンパク質を該宿主細胞から単離する工程
を包含する、方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１８】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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