(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５００）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＹＩＴ  １２３２０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０１）、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）ＹＩＴ  １２３２１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０２）及びストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）ＹＩＴ  １２３２２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０３）から選ばれる１種又は２種以上の乳酸菌を有効成分とする口腔内疾患の予防及び／又は治療剤。
【請求項２】
口腔内疾患が、歯周病である請求項１記載の口腔内疾患の予防及び／又は治療剤。
【請求項３】
ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５００）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＹＩＴ  １２３２０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０１）、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）ＹＩＴ  １２３２１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０２）及びストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）ＹＩＴ  １２３２２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０３）から選ばれる１種又は２種以上の乳酸菌を有効成分とする口臭の予防及び／又は改善剤。
【請求項４】
ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９と命名され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５００として寄託された乳酸菌、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＹＩＴ  １２３２０と命名され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０１として寄託された乳酸菌、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）ＹＩＴ  １２３２１と命名され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０２として寄託された乳酸菌、又はストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）ＹＩＴ  １２３２２と命名され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０３として寄託された乳酸菌。
【請求項５】
請求項４記載の乳酸菌を含有することを特徴とする飲食品。
【請求項６】
発酵製品である請求項５記載の飲食品。
【請求項７】
請求項４記載の乳酸菌を含有することを特徴とする口腔用組成物。
【請求項８】
ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５００）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＹＩＴ  １２３２０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０１）、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）ＹＩＴ  １２３２１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０２）及びストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）ＹＩＴ  １２３２２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０３）から選ばれる１種又は２種以上の乳酸菌の、口腔内疾患の予防及び／又は治療剤製造のための使用。
【請求項９】
口腔内疾患が、歯周病である請求項８記載の使用。
【請求項１０】
ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５００）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＹＩＴ  １２３２０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０１）、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）ＹＩＴ  １２３２１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０２）及びストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）ＹＩＴ  １２３２２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０３）から選ばれる１種又は２種以上の乳酸菌の、口臭の予防及び／又は改善剤製造のための使用。
【請求項１１】
口腔内疾患の予防及び／又は治療のための、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５００）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＹＩＴ  １２３２０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０１）、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）ＹＩＴ  １２３２１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０２）及びストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）ＹＩＴ  １２３２２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０３）から選ばれる１種又は２種以上の乳酸菌。
【請求項１２】
口腔内疾患が、歯周病である請求項１１記載の乳酸菌。
【請求項１３】
口臭の予防及び／又は改善のための、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５００）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＹＩＴ  １２３２０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０１）、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）ＹＩＴ  １２３２１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０２）及びストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）ＹＩＴ  １２３２２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０３）から選ばれる１種又は２種以上の乳酸菌。
【請求項１４】
配列番号４〜８から選ばれる塩基配列又は該塩基配列に相補的な配列からなるラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５００）に特異的なプライマー又はプローブ。
【請求項１５】
配列番号４及び８、配列番号５及び８、配列番号６及び８、配列番号７及び８から選ばれる塩基配列又は該塩基配列に相補的な配列からなるラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５００）に特異的なプライマーペア。
【請求項１６】
請求項１４又は１５記載のプライマー、プライマーペア又はプローブを使用することを特徴とするラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５００）の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、う蝕症、歯周病、口臭等の口腔内疾患や不快症状の予防、改善及び／又は治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
口臭は、見えない審美として快適な個人生活及び社会生活を送る上でその重要性が指摘されている。口臭が口腔のＱＯＬ（ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｆｅ：生活の質）に与える影響を定量的に測定した結果、形態的な審美以上に関与していることが報告されている（非特許文献１）。さらに、急激な高齢化社会を迎えた日本において、口臭は高齢者介助を困難にする一因としても懸念されている（非特許文献２）。【０００３】
口臭の主な原因は、硫化水素、メチルメルカプタン、ジメチルサルファイドの３種類の揮発性硫黄化合物（ＶＳＣ）である（非特許文献３、４）。ＶＳＣは、口腔内の剥離上皮細胞や白血球の残骸、食物等に含まれるシステイン、メチオニン等が口腔細菌により分解されることにより発生すると考えられている。口腔細菌を用いた培養試験で、フソバクテリウム属、ポルフィロモナス属、ベイヨネラ属及びスピロヘータ等の歯周病原性細菌が多量のＶＳＣを産生することが報告されている（非特許文献５）。また、口腔内から分離されたラクトバチルス・オリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｌｉｓ）に強いＶＳＣ産生能力があることも明らかにされている。ＶＳＣはそれ自体が強い不快臭であるとともに、低濃度でも生体組織に対する毒性を持つことから、単に口臭原因物質としてのみならず、歯周病の病態を悪化させる因子である可能性が高いことも報告されている（非特許文献６）。そのため、口腔細菌、特に歯周病原性細菌によるＶＳＣの産生を抑制し口臭を予防又は改善することはＱＯＬを高めるだけでなく、口腔の健康維持の上でも重要である。【０００４】
近年、プロバイオティクスの技術を口腔内でも利用する試みがなされ、例えば、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）  ＴＩ  ２７１１株（特許文献１）が、口臭やう蝕症、歯周病、口腔内感染症等に有用であることが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第４２０３８５５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】日公衛誌４９、２００２、ｐ２９８
【非特許文献２】（財）医療経済研究機構  平成７年度調査研究報告
【非特許文献３】Ａｒｃｈ  Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌ  １６、１９７１：５８７−５９７
【非特許文献４】Ｉｎｔ．Ｄｅｎｔ．Ｊ  ２８、１９７８：３０９−３１９
【非特許文献５】口腔衛生会誌５１、２００１、ｐ７７８−７９２
【非特許文献６】新潟歯学会誌３２、２００２、ｐ３０９−３１０
【非特許文献７】Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３９、１９９１：１７９−１８２
【非特許文献８】Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２４、２００５：３１−４０
【非特許文献９】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ５３、２００６：ｅ５−ｅ１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし一方で、口腔内のラクトバチルス属やストレプトコッカス属の細菌は、う蝕や感染性心内膜炎の原因の一つである可能性が指摘されている。ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）はう蝕原性菌として知られており、その有害性に関してはストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）よりも強く、う蝕の原因として臨床の分野で問題視されている細菌である。また、最も高頻度に検出される感染性心内膜炎の起因微生物は、ストレプトコッカス・サングィニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、ストレプトコッカス・オラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｏｒａｌｉｓ）等の口腔内のストレプトコッカス属の細菌であり（非特許文献７）、ラクトバチルス属の細菌の中にも、心内膜炎を惹起する株があることが報告されている（非特許文献８、９）。【０００８】
そのため、口腔内菌叢の健常化のために使用する細菌は、ＶＳＣの産生を抑制できることに加え、う蝕性及び感染性心内膜炎の起炎性がないことが望ましいが、これら性質を有する安全な菌はこれまでに報告されていない。【０００９】
したがって、本発明の課題は、口腔細菌による揮発性硫黄化合物の産生を抑制することができ、且つう蝕性及び感染性心内膜炎の起炎性がなく、口腔内で安全な新規乳酸菌株及びこれを用いた口腔内疾患や不快症状の予防、改善及び／又は治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、口腔内微生物について鋭意検討したところ、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）及びストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）に属する特定の乳酸菌が、歯面及び口腔内細胞への接着性が高く、口臭原因菌でもある歯周病原性細菌の増殖阻害作用を有し、ＶＳＣ産生を抑制できること、また、乳酸菌自体もＶＳＣ及び非水溶性グルカンを産生しないことを見出した。さらに当該乳酸菌は、う蝕性及び感染性心内膜炎の起炎性を持たないことから口腔内菌叢の健常化のために使用する細菌として有用であることを見出し、本発明を完成した。【００１１】
すなわち、本発明は、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）及びストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）から選ばれ、且つ下記（１）〜（６）の全ての性質を有する１種又は２種以上の乳酸菌を有効成分とする口腔内疾患の予防及び／又は治療剤を提供するものである。
（１）揮発性硫黄化合物（ＶＳＣ）産生能を有しない
（２）非水溶性グルカン産生能を有しない
（３）歯面及び／又は口腔内細胞への接着性を有する
（４）口臭原因菌及び／又は歯周病原性細菌に対する増殖阻害作用を有する
（５）感染性心内膜炎の起炎性を有しない
（６）う蝕性を有しない
また、本発明は、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）及びストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）から選ばれ、且つ下記（１）〜（６）の全ての性質を有する１種又は２種以上の乳酸菌を有効成分とする口臭の予防及び／又は改善剤を提供するものである。
（１）揮発性硫黄化合物（ＶＳＣ）産生能を有しない
（２）非水溶性グルカン産生能を有しない
（３）歯面及び／又は口腔内細胞への接着性を有する
（４）口臭原因菌及び／又は歯周病原性細菌に対する増殖阻害作用を有する
（５）感染性心内膜炎の起炎性を有しない
（６）う蝕性を有しない
また、本発明は、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９と命名され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５００として寄託された乳酸菌、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＹＩＴ  １２３２０と命名され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０１として寄託された乳酸菌、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）ＹＩＴ  １２３２１と命名され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０２として寄託された乳酸菌、又はストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）ＹＩＴ  １２３２２と命名され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０３として寄託された乳酸菌を提供するものである。
また、本発明は、上記乳酸菌を含有する飲食品を提供するものである。
更に、本発明は、上記乳酸菌を含有する口腔用組成物を提供するものである。【００１２】
また、本発明は、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）及びストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）から選ばれ、且つ下記（１）〜（６）の全ての性質を有する１種又は２種以上の乳酸菌の、口腔内疾患の予防及び／又は治療剤製造のための使用を提供するものである。
（１）揮発性硫黄化合物（ＶＳＣ）産生能を有しない
（２）非水溶性グルカン産生能を有しない
（３）歯面及び／又は口腔内細胞への接着性を有する
（４）口臭原因菌及び／又は歯周病原性細菌に対する増殖阻害作用を有する
（５）感染性心内膜炎の起炎性を有しない
（６）う蝕性を有しない
また本発明は、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）及びストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）から選ばれ、且つ下記（１）〜（６）の全ての性質を有する１種又は２種以上の乳酸菌の、口臭の予防及び／又は改善剤製造のための使用を提供するものである。
（１）揮発性硫黄化合物（ＶＳＣ）産生能を有しない
（２）非水溶性グルカン産生能を有しない
（３）歯面及び／又は口腔内細胞への接着性を有する
（４）口臭原因菌及び／又は歯周病原性細菌に対する増殖阻害作用を有する
（５）感染性心内膜炎の起炎性を有しない
（６）う蝕性を有しない
また、本発明は、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）及びストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）から選ばれ、且つ下記（１）〜（６）の全ての性質を有する１種又は２種以上の乳酸菌の有効量を投与することを特徴とする口腔内疾患の予防及び／又は治療方法を提供するものである。
（１）揮発性硫黄化合物（ＶＳＣ）産生能を有しない
（２）非水溶性グルカン産生能を有しない
（３）歯面及び／又は口腔内細胞への接着性を有する
（４）口臭原因菌及び／又は歯周病原性細菌に対する増殖阻害作用を有する
（５）感染性心内膜炎の起炎性を有しない
（６）う蝕性を有しない
また、本発明は、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）及びストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）から選ばれ、且つ下記（１）〜（６）の全ての性質を有する１種又は２種以上の乳酸菌の有効量を投与することを特徴とする口臭の予防及び／又は改善方法を提供するものである。
（１）揮発性硫黄化合物（ＶＳＣ）産生能を有しない
（２）非水溶性グルカン産生能を有しない
（３）歯面及び／又は口腔内細胞への接着性を有する
（４）口臭原因菌及び／又は歯周病原性細菌に対する増殖阻害作用を有する
（５）感染性心内膜炎の起炎性を有しない
（６）う蝕性を有しない
また、本発明は、口腔内疾患の予防及び／又は治療のための、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）及びストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）から選ばれ、且つ下記（１）〜（６）の全ての性質を有する１種又は２種以上の乳酸菌を提供するものである。
（１）揮発性硫黄化合物（ＶＳＣ）産生能を有しない
（２）非水溶性グルカン産生能を有しない
（３）歯面及び／又は口腔内細胞への接着性を有する
（４）口臭原因菌及び／又は歯周病原性細菌に対する増殖阻害作用を有する
（５）感染性心内膜炎の起炎性を有しない
（６）う蝕性を有しない
さらに本発明は、口臭の予防及び／又は改善のための、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）及びストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）から選ばれ、且つ下記（１）〜（６）の全ての性質を有する１種又は２種以上の乳酸菌を提供するものである。
（１）揮発性硫黄化合物（ＶＳＣ）産生能を有しない
（２）非水溶性グルカン産生能を有しない
（３）歯面及び／又は口腔内細胞への接着性を有する
（４）口臭原因菌及び／又は歯周病原性細菌に対する増殖阻害作用を有する
（５）感染性心内膜炎の起炎性を有しない
（６）う蝕性を有しない
また、本発明は、配列番号４〜８から選ばれる塩基配列又は該塩基配列に相補的な配列からなるラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５００）に特異的なプライマー又はプローブを提供するものである。
また、本発明は、配列番号４及び８、配列番号５及び８、配列番号６及び８、配列番号７及び８から選ばれる塩基配列又は該塩基配列に相補的な配列からなるラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５００）に特異的なプライマーペアを提供するものである。
さらに、本発明は、前記プライマー、プライマーペア又はプローブを使用することを特徴とするラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５００）の検出方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の乳酸菌は、歯面及び口腔内に定着し、う蝕原性細菌や口臭原因菌でもある歯周病原性細菌の増殖阻害作用を有し、一方でＶＳＣ産生能、非水溶性グルカン産生能、う蝕性及び感染性心内膜炎の起炎性を持たないので、口腔内菌叢の健常化を図り、う蝕症、歯周病、口臭等の様々な口腔内疾患又は不快症状の予防、改善又は治療効果を発揮する医薬品、飲食品、ペットフード、口腔内組成物等に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＹＩＴ  １２３１９〜１２３２１を接触させたウシエナメル質の硬度変化を示す図である。
【図２】ＹＩＴ  １２３１９〜１２３２１を接触させたウシエナメル質から回収されたバイオフィルム中の非水溶性グルカン量を示す図である。
【図３】ＹＩＴ  １２３２２を接触させたウシエナメル質の硬度変化を示す図である。
【図４】ＹＩＴ  １２３２２を接触させたウシエナメル質から回収されたバイオフィルム中の非水溶性グルカン量を示す図である。
【図５】ＹＩＴ  １２３２１を接触させたウシエナメル質の硬度変化を示す図である。
【図６】ＹＩＴ  １２３２１のスクロース資化性を示す図である。
【図７】ＹＩＴ  １２３１９に特異的なプライマーペアで増幅させたＤＮＡバンドを示す図である（矢印は特異的なＤＮＡバンドを、また使用したプライマーペアを隣に記す）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明に用いられる乳酸菌としては、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）及びストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）に属する乳酸菌株が挙げられ、これら菌株の１種又は２種以上であってもよい。
具体的には、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９と命名され、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（住所：茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に２０１１年４月２８日付で（以下、同じ）ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５００として寄託された乳酸菌、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＹＩＴ  １２３２０と命名され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０１として寄託された乳酸菌、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）ＹＩＴ  １２３２１と命名され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０２として寄託された乳酸菌、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）ＹＩＴ  １２３２２と命名され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０３として寄託された乳酸菌が挙げられる。当該乳酸菌には、これらを親株とする子孫株（自然変異株、変異処理による変異株、遺伝子操作による変異株等）も含まれる。
【００１６】
上記ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５００）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＹＩＴ  １２３２０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０１）、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）ＹＩＴ  １２３２１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０２）及びストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）ＹＩＴ  １２３２２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０３）は、後記実施例に示すように、ヒト口腔内から本発明者らによって初めて分離されたものであり、１６Ｓ−ｒＤＮＡ遺伝子配列により相同性検索を行った結果、ラクトバチルス・クリスパータス、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ガッセリ又はストレプトコッカス・ミティスに属する菌株と判定された。これら乳酸菌株は、次の特徴的な性質（１）〜（６）を有することから新規な菌株であることが判明した。
（１）揮発性硫黄化合物（ＶＳＣ）産生能を有しない
（２）非水溶性グルカン産生能を有しない
（３）歯面及び／又は口腔内細胞への接着性を有する
（４）口臭原因菌及び／又は歯周病原性細菌に対する増殖阻害作用を有する
（５）感染性心内膜炎の起炎性を有しない
（６）う蝕性を有しない
また、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）ＹＩＴ  １２３２１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０２）は次の性質（７）を有することが確認された。
（７）スクロースを資化しない
【００１７】
なお、本明細書において、(１)「揮発性硫黄化合物（ＶＳＣ）産生能を有しない」とは、後記実施例に示す試験（試験例２）で、ＶＳＣの産生能が＋/−(Ｈ2Ｓ＜０．７０μｇ／１０ｍｌ／Ｏ．Ｄ．、ＣＨ3ＳＨ＜１．１７μｇ／１０ｍｌ／Ｏ．Ｄ．)のものをいい、より好ましくは−(検出下限値以下)のものをいう。当該性質（１）を有する乳酸菌は、口臭原因物質であり、さらには歯周病の病態を悪化させる因子であるＶＳＣを産生しない点で好ましい。
また、本明細書において、（２）「非水溶性グルカン産生能を有しない」とは、後記実施例に示す試験（試験例３）で、非水溶性グルカン産生能が＋/−(菌体が付着する)のものをいい、より好ましくは−(産生しない)のものをいう。当該性質（２）を有する乳酸菌は、う蝕の原因となる非水溶性グルカンを産生しない点で好ましい。
また、本明細書において、（３）「歯面への接着性を有する」とは、後記実施例に示す試験（試験例５）で、Ｓ-ＨＡへの接着率が１．０％以上のものをいい、より好ましくは１０％以上のものをいう。また、本明細書において、（３）「口腔内細胞への接着性を有する」とは、後記実施例に示す試験（試験例６）で、口腔内細胞への接着性がＴｏｔａｌ  ３０ｃｅｌｌｓ／０．１６ｍｍ2以上のものをいう。当該性質（３）において、歯面又は口腔内細胞への接着性を有する乳酸菌は、経口的に投与された場合等、短い滞留時間であっても口内により定着しやすい点で好ましく、同様の点から、歯面及び口腔内細胞への接着性を有する乳酸菌がより好ましい。
また、本明細書において、（４）「口臭原因菌及び／又は歯周病原性細菌に対する増殖阻害作用を有する」とは、後記実施例に示す試験(試験例７)で阻止円径（直径）の合計が９ｍｍ以上のものをいう。当該性質（４）を有する乳酸菌は、口臭及び／又は歯周病等に対する優れた予防・治療効果を奏する点で好ましい。
また、本明細書において、（５）「感染性心内膜炎の起炎性を有しない」とは、後記実施例に示す試験（試験例８）で、ラット心内膜炎起炎性が陰性のものをいう。当該性質（５）を有する乳酸菌は、安全性が極めて高く、飲食品、口腔用組成物等として好適に利用できる。
また、本明細書において、（６）「う蝕性を有しない」とは、後記実施例に示す試験（試験例９）で、人工口腔装置による試験後のウシエナメル質の硬度低下割合が５％未満であるものをいう。当該性質（６）を有する乳酸菌は、う蝕の原因となる非水溶性グルカンを産生せず、エナメル質を脱灰しない点で好ましい。
さらにまた、本明細書において、（７）「スクロースを資化しない」とは、後記実施例に示す試験（試験例９）で、スクロースを菌の増殖基質として利用できないものをいう。当該性質（７）を有する乳酸菌は、乳酸を発生しにくく、う蝕リスクを低減できる点で好ましい。
【００１８】
本発明においては、上記乳酸菌の菌体を、乳酸菌培養の常法に従って培養し、得られた培養物から遠心分離等の集菌手段によって分離されたものをそのまま用いることのみならず、培養終了後の乳酸菌培養物をそのまま、あるいは培地を濃縮した濃縮物として使用することもできる。また、生菌体のみならず菌体の処理物であってもよい。該処理物は、常法の処理によって得られるものであれば特に限定されるものではなく、例えば、加熱処理、抗生物質等の薬物による処理、ホルマリン等の化学物質による処理、紫外線による処理、γ線等の放射線処理等による死菌体、その凍結乾燥物、これらを含有する培養物；細菌の超音波等による破砕液、細菌の酵素処理液、これらを濾過や遠心分離等の固液分離手段によって分離した固体残渣等；細胞壁を酵素若しくは機械的手段により除去した処理液、当該処理液の濃縮物、それらの希釈物、それらの乾燥物等；細菌を界面活性剤等によって溶解した後、エタノール等によって沈殿させて得られる核酸含有画分；前記細菌の超音波等による破砕液や細胞の酵素処理液等に対し、各種クロマトグラフィー等による分離等の分離・精製処理を行ったもの等が挙げられる。
【００１９】
乳酸菌を培養する培地は、特に限定されず、様々な培地を用いることができる。
例えば、グルコース、フラクトース、ガラクトース、スクロース等の炭素源、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、亜硫酸ソーダ、チオ硫酸ソーダ、リン酸アンモニウム等の無機塩類、ポリペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー等の有機栄養源の他、必要に応じて各種アミノ酸、ビタミン類が添加されてなる乳酸菌の増殖用として通常用いられる栄養培地の他、乳を含む乳培地を用いることができる。
【００２０】
培養は、菌体が良好に生育する条件であればよい。培養方法は、特に限定されず、通気培養、嫌気培養、攪拌培養、振盪培養、静置培養等が挙げられ、生産性を考慮して、好気的条件下で静置培養するのが好ましい。
また、培養温度は、通常、１０〜５０℃、好ましくは２５〜３７℃であり、培養期間は、通常６時間〜３日間、好ましくは８時間〜３日間である。
【００２１】
また、培地のｐＨ（２５℃）は、３〜１０、好ましくは５〜８である。培地のｐＨを調整する緩衝剤としては、例えば、炭酸、酢酸、クエン酸、フマル酸、リンゴ酸、乳酸、グルコン酸、酒石酸等の有機酸塩、リン酸、塩酸、硫酸等の無機塩、水酸化ナトリウム等の水酸化物、アンモニア又はアンモニア水等が挙げられ、これらを単独又は２種以上組み合わせて用いてもよい。
【００２２】
本発明の口腔内疾患の予防及び／又は治療剤における「口腔内疾患」としては、う蝕原性細菌、歯周病原性細菌、カンジダ菌等の口腔内の病原性細菌によって引き起こされる口腔内疾患をいい、例えば、う蝕症、歯肉炎、歯周炎等の歯周病、口腔カンジダ症が挙げられる。口腔内疾患は好ましくは、歯肉炎、歯周炎等の歯周病である。
う蝕原性細菌としては、例えば、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、歯周病原性細菌としては、例えば、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、トレポネーマ・デンティコーラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、タンネレラ・フォーサイシア（Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ ｆｏｒｓｙｔｈｉａ）、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）等が挙げられ、口腔カンジダ症原因菌としては、例えば、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）等が挙げられる。
【００２３】
本発明の口臭の予防及び／又は改善剤における「口臭原因菌」としては、例えば、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、トレポネーマ・デンティコーラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、ベイヨネラ・ディスパー（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ｄｉｓｐａｒ）等が挙げられる。
【００２４】
後記実施例に示すように、本発明の乳酸菌は、歯面及び口腔内に接着し、口臭原因菌・歯周病原性細菌であるポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）及びアグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）に対して増殖阻害作用を有する。また、本発明の乳酸菌は、口臭の原因となるＶＳＣや、う蝕の原因となる非水溶性グルカンを産生せず、また、エナメル質を脱灰せず、さらに感染性心内膜炎を惹起しないことが確認された。
従って、本発明の乳酸菌は、口腔内細菌叢の健常化を図り、口腔内の病原性細菌によって引き起こされるう蝕症、歯肉炎、歯周炎等の歯周病、口腔カンジダ症、口臭等の様々な口腔内疾患又は不快症状の予防、改善又は治療のための医薬品、飲食品、ペットフード、口腔用組成物等として使用することができる。
【００２５】
医薬品として使用する場合における経口投与製剤の剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、糖衣錠、丸剤、細粒剤、散剤、粉剤、徐放性製剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、凍結乾燥剤、液剤、エリキシル剤等が挙げられる。
【００２６】
上記製剤は、常法によって製造でき、また、本発明の乳酸菌を単独で使用してもよく、薬学的に許容される担体と組み合わせて使用してもよい。該担体としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤；デンプン、デキストリン、アラビアゴム末、ゼラチン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等の結合剤；ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース等の崩壊剤；ラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリソルベート８０等の界面活性剤；タルク、ロウ類、水素添加植物油、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレングリコール等の滑沢剤；軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム等の流動性促進剤；注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、オリーブ油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等の希釈剤等が挙げられる。また、必要に応じて、矯味剤、着色剤、香料、殺菌剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、吸収助剤、酸化防止剤、増粘剤、等張化剤等の慣用の添加剤を適宜添加することもできる。
【００２７】
また、飲食品、ペットフード等として使用する場合には、本発明の乳酸菌に必要に応じて種々の栄養成分を加えて、上記飲食品等に含有せしめればよい。この飲食品等は、例えば、う蝕症、歯周病、口臭の予防又は改善に有用な保健用食品又は食品素材として利用でき、これらの飲食品等又はその容器には、前記の効果を有する旨の表示を付してもよい。
【００２８】
飲食品等の形態としては、飲食品等として使用可能な添加剤を適宜使用し、慣用の手段を用いて食用に適した形態、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペースト等に成形してもよく、また種々の食品、例えば、ハム、ソーセージ等の食肉加工品、かまぼこ、ちくわ等の水産加工品；パン、菓子、バター、粉乳、発酵飲食品に添加して使用し、又は水、果汁、牛乳、清涼飲料、茶飲料等の飲料に添加して使用してもよい。これらの中でも、有効成分である乳酸菌を含有する発酵乳、発酵飲料（乳酸菌飲料）、発酵豆乳、発酵果汁、発酵植物液等の発酵製品、錠剤、カプセルなどのサプリメント製品が好ましい。
発酵製品の製造は常法にしたがって製造することができる。例えば発酵乳は、殺菌した乳培地に乳酸菌を接種培養し、これを均質化処理して発酵乳ベースを得る。次いで別途調製したシロップ溶液を添加混合し、ホモゲナイザー等で均質化し、さらにフレーバーを添加して最終製品とすることができる。このようにして得られる発酵乳は、プレーンタイプ、ソフトタイプ、フルーツフレーバータイプ、固形状、液状等のいずれの形態の製品とすることもできる。
【００２９】
口腔用組成物として使用する場合の具体的な形態としては、洗口剤、マウスウォッシュ、練歯磨、粉歯磨、水歯磨、口腔用軟膏剤、ゲル剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、グミゼリー、トローチ、タブレット、カプセル、キャンディー、チューインガム等が挙げられ、好ましくは、練歯磨、洗口剤、グミゼリー、トローチ、錠剤、タブレットが挙げられる。
【００３０】
上記医薬品、飲食品、ペットフード、口腔用組成物等における本発明の乳酸菌の含有量は、特に限定されず、一日投与量又は摂取量に合わせて適宜調節すれば良いが、例えば剤型が液体の場合には、乳酸菌体濃度を１×１０6ＣＦＵ／ｍＬ〜１×１０8ＣＦＵ／ｍＬとすることが好ましく、固体の場合には、１×１０7ＣＦＵ／ｇ〜１×１０10ＣＦＵ／ｇとすることが好ましい。
【００３１】
本発明の乳酸菌を使用する際の投与量又は摂取量に厳格な制限はない。対象者や適用疾患等の様々な使用態様によって得られる効果が異なるため、適宜設定することが望ましいが乳酸菌の菌数を、１×１０3ＣＦＵ以上を１日量として含有する量が好ましく、１×１０3〜１×１０13ＣＦＵを１日量として含有する量がより好ましく、１×１０6〜１×１０10ＣＦＵを１日量として含有する量が特に好ましい。
【００３２】
ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）  ＹＩＴ１２３１９及び他のラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）のゲノムＤＮＡを解析したところ、配列番号４〜８から選ばれる塩基配列が、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９に特異的であること、及びこれらの塩基配列を有するプローブ又はプライマーを用いればラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９の遺伝子が特異的に検出又は増幅できることを見出した。
【００３３】
本発明のプローブ又はプライマーは、配列番号４〜８から選ばれる塩基配列又は該塩基配列に相補的な配列からなり、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５００）に菌株特異的なプローブ又はプライマーである。
【００３４】
前記プライマーとしては、配列番号４及び配列番号５、配列番号４及び６、配列番号４及び７、配列番号４及び８から選ばれる塩基配列又は該塩基配列に相補的な配列からなるプライマーが、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５００）に対する特異性が高い点でより好ましい。
【００３５】
前記プローブ又はプライマーを用いることで、生理・生化学的性状の確認など煩雑な操作を行うことなく検体から抽出したラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５００）由来のＤＮＡを使ったＰＣＲ反応により、迅速かつ簡便に当該菌株の同定・解析・検出等を行うことが可能となる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。【００３７】
試験例１  口腔細菌の分離
１）被験者と試料の採取
被験者５６名（男性３４名、女性２２名、２５〜６６歳、平均年齢４０．６歳）より歯垢（唾液を含む）と舌苔を別個に採取した。この口腔試料は採取後、使用するまで氷上に静置した。菌の分離に際しては、これらの試料を等量混合後、その３００μＬを２．７ｍＬの滅菌嫌気輸送培地に添加し、１０-1希釈液を作製した（好気・嫌気培養用３．０ｍＬ×各１本）。【００３８】
２）口腔細菌の培養と分離
ブルセラウサギ溶血平板培地（ＢＲＵ平板培地、トリプトペン  １０．０ｇ、ペプタミン  １０．０ｇ、酵母エキス  ２．０ｇ、グルコース  １．０ｇ、塩化ナトリウム  ５．０ｇ、酸性亜硫酸ナトリウム  ０．１ｇ、ヘミン  ５．０ｍｇ、ビタミンＫ１  １．０ｍｇ、発育補助液  １０．０ｍＬ、兎溶血液  ６０．０ｍＬ、寒天  １５．０ｇ、ｐＨ７．０）への口腔試料の塗布操作は、嫌気グローブボックス内で行った。ディスポーザブル試験管（ＦＡＬＣＯＮ２０５８）に滅菌嫌気希釈液を１．８ｍＬ分注し、１０-1希釈液を２００μＬ添加して１０-2希釈液を作製した。以下同様にして１０-10希釈液まで作製し、各希釈液１００μＬを平板培地に塗布した後、表１に示す条件で培養した。
一方、５．０％羊血液加ＴＳＡ平板培地（ＴＳＡ平板培地、カゼインペプトン  １５．０ｇ、ダイズペプトン  ５．０ｇ、塩化ナトリウム  ５．０ｇ、羊脱繊維血液  ５０．０ｍＬ、寒天  １５．０ｇ、ＤＷ  １０００ｍＬ、ｐＨ７．３）、ＭＲＳ平板培地（Ｐｒｏｔｅｏｓｅ  Ｐｅｐｔｏｎｅ  Ｎｏ．３  １０．０ｇ、Ｂｅｅｆ  Ｅｘｔｒａｃｔ  １０．０ｇ、Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ５．０ｇ、Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  ２０．０ｇ、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０  １．０ｇ、Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ  ２．０ｇ、Ｓｏｄｉｕｍ  Ａｃｅｔａｔｅ  ５．０ｇ、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ  ０．１ｇ、Ｍａｎｇａｎｅｓｅ  Ｓｕｌｆａｔｅ  ０．０５ｇ、Ｄｉｐｏｔａｓｓｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ２．０ｇ、Ａｇａｒ  １５ｇ、ＤＷ  １０００ｍＬ）、ＬＢＳ平板培地（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｄｉｇｅｓｔ  ｏｆ  Ｃａｓｅｉｎ  １０．０ｇ、Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ５．０ｇ、Ｍｏｎｏｐｏｔａｓｓｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ６．０ｇ、Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ  ２．０ｇ、Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  ２０．０ｇ、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０  １．０ｇ、Ｓｏｄｉｕｍ  Ａｃｅｔａｔｅ  Ｈｙｄｒａｔｅ  ２５．０ｇ、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ  ０．５７５ｇ、Ｍａｎｇａｎｅｓｅ  Ｓｕｌｆａｔｅ  ０．１２ｇ、Ｆｅｒｒｏｕｓ  Ｓｕｌｆａｔｅ  ０．０３４ｇ、Ａｇａｒ  １５．０ｇ、Ｌａｂ−ｌｅｍｃｏ  ｐｏｗｄｅｒ（Ｏｘｏｉｄ）  ８ｇ，Ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ，ｔｒｉｈｙｄｏｒａｔｅ  １５ｇ、ＤＷ  １０００ｍＬ  Ａｃｅｔａｔｅ  ３．７ｍＬ）、及びＭｉｔｉｓ−Ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ平板培地（ＭＳ平板培地、Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｓｅ  １０ｇ、Ｂａｃｔｏ  Ｐｒｏｔｅｏｓｅ  Ｐｅｐｔｏｎｅ  Ｎｏ．３  ５ｇ、Ｂａｃｔｏ  Ｐｒｏｔｅｏｓｅ  Ｐｅｐｔｏｎｅ  ５ｇ、Ｂａｃｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  １ｇ、Ｂａｃｔｏ  Ｓａｃｃｈａｒｏｓｅ  ５０ｇ、Ｄｉｐｏｔａｓｓｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ４ｇ、Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  ０．０７５ｇ、Ｂａｃｔｏ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｖｉｏｌｅｔ  ０．０００８ｇ、Ｂａｃｔｏ  Ａｇａｒ  １５ｇ  ＤＷ  １０００ｍＬ、ｐＨ７．０±０．２）については、スパイラルシステム（自動平板塗布装置）を用いて試料を塗布した後、表１に示す条件で培養した。【００３９】
【表１】
0005982376.tif 000002
【００４０】
各種平板培地に生育した口腔内細菌数を表２に示す。
ＭＲＳ、ＭＳ及びＬＢＳ平板培地について、希釈率の高い希釈液を塗布した平板培地から順に、形態の異なるコロニーから釣菌し、ＭＲＳあるいはＢＨＩ液体培地（子ウシ脳浸出物  １２．５ｇ、ウシ心筋浸出物  ５．０ｇ、プロテオースペプトン  １０．０ｇ、ブドウ糖  ２．０ｇ、塩化ナトリウム  ５．０ｇ、リン酸水素二ナトリウム  ２．５ｇ、ＤＷ  １０００ｍＬ、ｐＨ７．４±０．２）で増殖させた後、２×ＢＨＩ：グリセロール＝１：１溶液に懸濁し、−８０℃で保存し、以下の試験に供した。【００４１】
【表２】
0005982376.tif 000003
【００４２】
試験例２  ＶＳＣ産生能の評価
試験例１で分離した凍結保存菌株を用いた。また、陽性対照株としてフソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）  ＹＩＴ  ６０６９を用いた。
上記分離菌株をＭＲＳ液体培地に接種し、３７℃で２４時間嫌気培養した。この菌体の培養液０．０４ｍＬを１％  Ｄ−（＋）−グルコース、６６ｍＭ  ＤＬ−メチオニン（終濃度５００−１，５００μＭ）を含む変法ＧＡＭ液体培地（ペプトン  ５．０ｇ、ダイズペプトン  ３．０ｇ、プロテオーゼペプトン  ５．０ｇ、消化血清末  １０．０ｇ、酵母エキス末  ２．５ｇ、肉エキス末  ２．２ｇ、肝臓エキス末  １．２ｇ、ブドウ糖  ０．５ｇ、溶性デンプン  ５．０ｇ、Ｌ−トリプトファン  ０．２ｇ、Ｌ−システイン塩酸塩  ０．３ｇ、チオグリコール酸ナトリウム  ０．３ｇ、Ｌ−アルギニン  １．０ｇ、ビタミンＫ１  ５ｍｇ、ヘミン  １０ｍｇ、リン酸二水素カリウム  ２．５ｇ、塩化ナトリウム  ３．０ｇ、ＤＷ  １０００ｍＬ、ｐＨ７．３）４ｍＬに植え継ぎ、３７℃で嫌気的に培養した。培養開始２４時間後、培養液に６．０Ｎの塩酸溶液０．１６ｍＬを添加してｐＨを１以下に低下させ、菌体の物質代謝を停止させた。
その後、ヘッドスペースに揮発した揮発性硫黄化合物（ＶＳＣ）をガスクロマトグラフ或いはオーラルクロマにより分析した。なお、３７℃で２４時間嫌気的にインキュベートした培地を陰性対照とした。【００４３】
試験例３  非水溶性グルカン産生能の評価
試験例１で分離した凍結保存菌株をＢＨＩ又はＭＲＳ液体培地に２白金耳接種し、３７℃で２４時間嫌気培養した。この菌体の培養液０．０４ｍＬを１％スクロースを含むＨＩ（ウシ心筋浸出物  ５．０ｇ、プロテオースペプトン  １０．０ｇ、ブドウ糖  ２．０ｇ、塩化ナトリウム  ５．０ｇ、リン酸水素二ナトリウム  ２．５ｇ、ＤＷ  １０００ｍＬ、ｐＨ７．４±０．２）、又はＭＲＳ＋ＨＩの混合（７：３）液体培地４ｍＬに植え継ぎ、試験管を４５度に傾けて３７℃で嫌気的に培養した。
非水溶性グルカンの産生能は、試験管壁へ付着するグルカンの量及びその付着強度で評価した。培養２４時間後に、試験管から培養液を除去し、ＰＢＳ  ４ｍＬを加えておだやかに３回転させ、管壁を洗浄した。ＰＢＳを除いた後、試験管の壁面に付着している非水溶性グルカン量を表３の基準に従って、視覚的に判定した。【００４４】
試験例２及び３の結果を表３に示す。試験例１で分離した凍結保存菌株のうち、表３の点線で囲った計２４１株を選抜した。このうち、ＭＲＳ及びＭＳ培地から単離したストレプトコッカス様細菌が１７６株、ＬＢＳ培地から単離したラクトバチルス様の細菌が６５株であった。
なお、陽性対照株であるフソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）  ＹＩＴ  ６０６９は、メチオニンの添加量に依存してＶＳＣを産生した。【００４５】
【表３】
0005982376.tif 000004
【００４６】
試験例４  菌種の同定
ＤＮＡをベンジル・クロライド法により抽出した。培養後の菌体を８３０×ｇ、１０分間遠心分離し、菌体を得た。この菌体に２００μＬ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎバッファー、４００μＬ  塩化ベンジル、３００ｍｇのガラスビーズ（直径０．１ｍｍ）を加えた。ＦａｓｔＰｒｅｐにより振盪した後（スピード６．５、３０秒間）、遠心分離（２０，０００×ｇ、５分間、４℃）して得られた上清に当量のイソプロパノールを添加し良く攪拌した。遠心分離（２０，０００×ｇ、１０分間、４℃）して上清を除去した後、１５０μＬの７０％エタノールを添加し、再度遠心分離し得られた沈殿を風乾し、適量のＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）に溶解した。ＰＣＲ反応液は全量２５μＬ中に３．２μＬの１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（１×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ＝１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2）、２．５μＬの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、０．５μＬの２５ｐｍｏｌ／μＬ  ｐｒｉｍｅｒｓ（Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ  ６３Ｆ；配列番号１、Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  １５Ｒ；配列番号２）、０．５ｕｎｉｔｓの  ＤＮＡ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ｈｏｔｓｔａｒｔ）、１μＬの１０ｎｇ／ｍＬ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡとした。ＰＣＲ反応は、９４℃、２０秒、（９４℃、２０秒、５５℃、２０秒、７２℃、９０秒）×３０ｃｙｃｌｅｓ、７２℃３分とした。ダイターミネーター法により分離株の１６Ｓ−ｒＤＮＡ塩基配列を決定した。シーケンス反応用のプライマーは５２０Ｒ（配列番号３）とし、ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎに登録してある菌種の配列とのホモロジーを比較して、９８％以上の類似性を有するものを同一種とした。使用したプライマーを表４に示す。真正細菌および古細菌の１６Ｓ−ｒＤＮＡには、その両端あるいは内部に１０か所程度高度に保存された領域があり、６３Ｆ、１５Ｒ及び５２０Ｒなどのこれらの配列に基づいてデザインされたプライマーを用いることで、細菌の種類に関わらず遺伝子を増幅したり、配列を解析したりできる。【００４７】
【表４】
0005982376.tif 000005
【００４８】
試験例２及び３で選抜した２４１株について、１６Ｓ−ｒＤＮＡ塩基配列を用いて菌種を同定した結果、ストレプトコッカス様細菌は主にストレプトコッカス・オラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｏｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）、ストレプトコッカス・サングィニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）等に同定された。また、ラクトバチルス様細菌の中で最も分離数が多かったのはラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）であった。【００４９】
試験例５  歯面への接着性の評価
試験例２及び３の結果より選抜した２４１株のなかから、同定試験の結果、安全性に問題があると判断された菌株を除外し、以下の試験に使用した。【００５０】
試料の調製方法及びハイドロキシアパタイト（ＨＡ）への接着性評価はＧｉｂｂｏｎｓらの方法（Ｇｉｂｂｏｎｓ，Ｒ．Ｊ．，Ｅ．Ｃ．Ｍｏｒｅｎｏ，ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．Ｓｐｉｎｅｌｌ“Ｍｏｄｅｌ  ｄｅｌｉｎｅａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａ  ｓａｌｉｖａｒｙ  ｐｅｌｌｉｃｌｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｏｒ  ｏｎｔｏ  ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ．”Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．１９７６：１４：１１０９−１１１２）に従った。
各分離菌株をＭＲＳ液体培地４ｍＬに接種し、２４時間培養した。培養後、遠心分離（１，９１２×ｇ、１０分間、４．０℃）し、ＰＢＳで２回洗浄した。５５０ｎｍでの吸光度が１．０となるようにＰＢＳで希釈した菌液をＨＡへの接着性試験に用いた。
本試験で使用する唾液は、下記のように採取した。蒸留水でうがい後、パラフィンガムを噛み、その刺激により分泌される唾液を遠心管に集めた。タンパク分解酵素を失活させるために、６０°Ｃで３０分間加熱した後、遠心分離（１０，０００×ｇ、１０分間、４．０℃）を行い、上清を得た。５名分の唾液を等量ずつ混合した後、フィルター滅菌（０．２２μｍ）し、使用するまで４℃で保存した。
ハイドロキシアパタイトビーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ４０μｍ）５ｍｇをＰＢＳで洗浄した後、加熱調製した唾液を４ｍＬ添加し、３７℃で３０分間振盪した。振盪後、ＰＢＳで２回洗浄したビーズを唾液処理ＨＡ（Ｓ−ＨＡ）として使用した。また、唾液の代わりにＰＢＳを添加して同条件で調製したビーズをＰＢＳ処理ＨＡ（Ｐ−ＨＡ）として使用した。
菌液２ｍＬをＳ−ＨＡおよびＰ−ＨＡに添加し、３７℃で１時間振盪させた。また、対照として菌液のみを同条件で振盪した。反応後１０分間室温で静置し、上清１ｍＬを新しいチューブに採取した。微細なＨＡを溶解させるために上清に０．１Ｍ  ＥＤＴＡを１００μＬ添加し、攪拌後１時間室温で静置した。その後、５５０ｎｍでの吸光度を測定し、下式（１）によりＨＡビーズに接着した菌の割合を接着率（％）として算出した。【００５１】
【数１】
0005982376.tif 000006
【００５２】
結果を表５及び６に示す。試験例２及び３で選抜した２４１株の内、ストレプトコッカス属に分類された菌株の７６％がＳ−ＨＡに接着した。また、一般的に乳酸桿菌の歯面への接着性は低いとされている（Ｈ．Ｊ．Ｂｕｓｓｃｈｅｒ．“Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｔｏ  Ｅｎａｍｅｌ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｏｏｔｈ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  ｂｙ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｂｉｏ−Ｙｏｇｈｕｒｔ”Ｃａｒｉｅｓ  Ｒｅｓ  １９９９：３３：４０３−４０４．）が、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）の順に高いＳ−ＨＡへの接着性を示した。【００５３】
【表５】
0005982376.tif 000007
【００５４】
【表６】
0005982376.tif 000008
【００５５】
試験例６  口腔内細胞への接着性の評価
試験例２及び３の結果より選抜した２４１株のなかから、同定試験の結果、安全性に問題があると判断された菌株を除外し、以下の試験に使用した。【００５６】
１）細胞株の培養
ＨＯ−１−Ｎ−１細胞（ＪＣＲＢ０８３１：ヒト頬粘膜扁平上皮ガン由来細胞、以下「ＨＯ」と略す）及びＨＳＣ−３細胞（ＪＣＲＢ０６２３：ヒト舌扁平上皮ガン由来細胞、以下「ＨＳＣ」と略す）を５．０％ＣＯ2２、３７℃で培養した。ＨＯ細胞には、１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社  １１８８５）を、ＨＳＣ培地には１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＧＩＢＣＯ社  １１３２０）を用いた。【００５７】
２）細胞への接着性の評価
１０％牛胎児血清を含む培地を用いて、細胞を１．０×１０5個／ｍＬになるように懸濁した。この懸濁液を、Ｌａｂ−Ｔｅｋ  ＩＩ  チャンバースライド（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ）に、１ウェルあたり２００μＬ加え、４８〜９６時間培養した。その後、スライドガラス表面に付着しなかった細胞をＲＰＭＩ１６４０で洗浄・除去した。ＭＲＳ液体培地で一晩培養後、生菌数をＯＤ660＝０．２５に調整した分離株を、１ウェルあたり２００μＬ添加した後、３７℃で１０分間インキュベートした。その後、細胞をＲＰＭＩ１６４０で３回洗浄し、細胞に接着していない菌を除去した。スライド上の付着物をグラム染色した後、０．１６ｍｍ2あたりに含まれる細胞上に接着した菌数を光学顕微鏡を用いて測定した。なお、測定は、任意に選んだ６視野について行った。【００５８】
結果を表７及び８に示す。ラクトバチルス属では７株、ストレプトコッカス属では１７株に、０．１６ｍｍ2に含まれる細胞に対して、ＨＯ細胞とＨＳＣ細胞の合計で１０個以上の菌の接着が認められた。
ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＹＩＴ  １２３２０、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）ＹＩＴ  １２３２１及びストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）ＹＩＴ  １２３２２には、いずれも単位面積あたり３０個以上の強い接着性が認められた。【００５９】
【表７】
0005982376.tif 000009
【００６０】
【表８】
0005982376.tif 000010
【００６１】
試験例７  口臭原因菌（歯周病原性細菌）に対する増殖阻害評価
上記の試験例の結果より、表１０及び１１に示す菌株を選抜した。対象菌株として、口臭原因菌且つ歯周病原性細菌であるポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）  ＡＴＣＣ  ３３２７７、プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）  ＡＴＣＣ  ２５６１１、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）  Ｙ４、う蝕原性細菌であるストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＡＴＣＣ  ２５１７５、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）ＡＴＣＣ  ３３４７８を用いた。【００６２】
分離菌株を４．０ｍＬのＭＲＳ液体培地に一白金耳を植菌した。２４時間培養後、遠心分離（１，９１２×ｇ、１０分間、４℃）して上清を得た。さらにこの上清を０．２２μｍのフィルターでろ過したろ液を試験試料とした。各試料の抗菌活性はＲａｄｉａｌ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ａｓｓａｙによって測定した。ＴＳ培地（Ｔｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）６．０ｍｇ、Ｔｗｅｅｎ２０  ２．０μＬ、ａｇａｒｏｓｅ  １００ｍｇ、Ｈ2Ｏ  １０ｍＬ）１０ｍＬに各対象菌株のＢＨＩ培養液１００μＬを添加し十分に攪拌した後、シャーレ内で固めた。培地が固まったら、直径２．５ｍｍの穴を作り、そこへ試験試料５．０μＬを加えた。３７℃で１時間培養後にＴＳ培地（Ｔｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ  （Ｄｉｆｃｏ）０．６ｍｇ、ａｇａｒｏｓｅ１００ｍｇ、Ｈ2Ｏ  １０ｍＬ）を重層させ、３７°Ｃで培養した。培養条件は表９に記載した。培養後、穴の外側にできた菌の増殖していないクリアゾーン領域（阻止円径）の直径を次式（２）より計測した。
阻止円径（ｍｍ）＝試験試料のクリアゾーンの直径（ｍｍ）−穴の直径（ｍｍ）  （２）【００６３】
【表９】
0005982376.tif 000011
【００６４】
結果を表１０及び１１に示す。分離菌株のうちラクトバチルス属の培養上清に、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する強い増殖阻害効果が認められた。また、プレボテラ・インターメディアやアグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンスに対しても増殖阻害効果が認められた。今回の試験では、培養上清のｐＨを７．０に調整してもポルフィロモナス・ジンジバリスに対する阻害効果を示す株が認められたことから、これらの株は有機酸以外にも、過酸化水素やバクテリオシン等の抗菌物質を産生している可能性が高いと考えられた。また、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９には、う蝕原性細菌であるミュータンス連鎖球菌（ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）及びストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ））に対する増殖阻害効果が認められた。培養上清のｐＨを７．０に調整して試験した結果、増殖阻害効果は認められなかったが、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）及びストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）は酸を産生し、菌自身は耐酸性であるため、ｐＨの低下により増殖が抑制される可能性は低いと考えられる。したがって、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９は、過酸化水素やバクテリオシンなどの抗菌物質を産生している可能性があると考えられた。【００６５】
ストレプトコッカス属でも、１５株の培養上清に口臭原因菌（歯周病原性細菌）に対する増殖阻害効果が認められたが、効果の強さは、ラクトバチルス属の分離株と比較すると弱かった。これらは、ｐＨを７．０に調整してもポルフィロモナス・ジンジバリスの増殖を阻害することが可能であったことから、ラクトバチルス属の分離菌株と同様に、過酸化水素やバクテリオシンなどの抗菌物質を産生している可能性が考えられた。
ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＹＩＴ  １２３２０、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）ＹＩＴ  １２３２１及びストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）ＹＩＴ  １２３２２には、いずれも阻止円径（直径）の合計が９ｍｍ以上の強い増殖阻害効果が認められた。【００６６】
【表１０】
0005982376.tif 000012
【００６７】
【表１１】
0005982376.tif 000013
【００６８】
試験例８  ラット実験的心内膜炎モデルを用いた感染性心内膜炎の起炎性の評価
上記試験例の結果より、表１２及び１３に示す菌株を選抜した。陽性対照として心内膜炎起炎菌であるラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）  ＹＩＴ  ０２２７を使用した。【００６９】
試験動物として、生後８週齢のＣｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）系雄性ラット１０２匹（日本チャールス・リバー株式会社）を用いた。
実験的心内膜炎（非細菌性心内膜炎）モデル動物の作出は以下のように行った。麻酔剤としてケタラール（塩酸ケタミン５０ｍｇ／ｍＬ含有）とセラクタール（塩酸キシラジン２０ｍｇ／ｍＬ含有）を１８：５の割合で混合した後、２ｍＬ／ｋｇの投与量で腹腔内に投与した。その後、麻酔下で頚部皮膚を切開して右頚動脈を露出させ、外径０．６１ｍｍのポリエチレンチューブ（夏目製作所、ＳＰ１０）を用いた約２０ｃｍのカテーテルを右頚動脈から左心室に挿入・留置した。非細菌性血栓性心内膜炎動物を作出した翌日に、１ｍＬディスポーザブルシリンジと注射針２７Ｇを用いて菌液を０．５ｍＬ／ラットとなるように尾静脈内投与した。
投与菌液は、次のように調製した。先ず、ＭＲＳ培地４ｍＬに分離株１０μＬを植菌し、３７℃で２０時間培養した。この培養液１００μＬを新鮮なＭＲＳ培地１０ｍＬに植菌し、さらに３７℃で２０時間培養した。培養終了後、培養液を遠心分離（１，６７０×ｇ、  １０分間、４．０℃）して上清を除去した。培地と等量の生理食塩水を加え、ボルテックスにより十分に攪拌・洗浄した後、再度遠心分離（１，６７０×ｇ、１０分間、４．０℃）して上清を除去した。この洗浄操作を三度繰り返した後、規格菌数（４．０〜９．０×１０6ＣＦＵ／ｍＬ）となるように生理食塩水を加えて希釈し、投与用の菌液とした。
被験菌株投与日から４日後に採血した末梢静脈血を生理食塩水で段階希釈し、原液０．５ｍＬおよび１０-2希釈液１．０ｍＬを混釈法によりＭＲＳ平板培地にプレーティングした。３７℃で３日間培養後、平板上に生育したコロニーを計数して、血液１ｍＬ中の生菌数を算出した。同様に疣贅を含む心臓のホモジネート液を生理食塩水で段階希釈し、原液、１０-2、１０-4、１０-6希釈液１．０ｍＬを混釈法によりＭＲＳ平板培地にプレーティングした。３７℃で３日間培養後、平板上に生育したコロニーを計数して、生菌数を算出した。なお、２枚のプレートのどちらにもコロニーを検出しない場合に、どちらか１枚のプレートから１個のコロニーが認められたと仮定して、１を疣贅重量で除した数値を検出限界値とした。【００７０】
結果を表１２及び１３に示す。陽性対照であるＹＩＴ  ０２２７を投与したラットでは、血液から６例中５例（１〜２８ＣＦＵ／ｍＬ）で、疣贅からは全検体（１．４×１０3〜１．７×１０6ＣＦＵ／ｈｅａｒｔ）で投与菌が検出された。一方、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＬＢＳ  １７−１１、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＹＩＴ  １２３２０、及びラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）ＹＩＴ  １２３２１を投与したラットでは、血液及び疣贅からは投与菌が検出されなかった。よって、これらの菌株はラットでの心内膜炎起炎性は陰性であると判定された。
また、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）ＹＩＴ  １２３２２を投与したラットでは、血液からは投与菌が検出されず、疣贅からも１検体のみ菌が検出されるにとどまったことから陰性であると判定された。それ以外の菌株を投与したラットでは、全個体の疣贅から投与菌が検出され、検出菌数も高かった（６．２×１０4〜９．４×１０6ＣＦＵ／ｈｅａｒｔ）ことから、いずれの株も陽性と判定された。【００７１】
【表１２】
0005982376.tif 000014
【００７２】
【表１３】
0005982376.tif 000015
【００７３】
試験例９  人工口腔装置を用いたう蝕性の評価
ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＹＩＴ  １２３２０、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）ＹＩＴ  １２３２１、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）ＹＩＴ  １２３２２、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＬＢＳ  １７−１１及びラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）ＬＢＳ  ４６−５２を使用した。また、陽性対照としてストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）６７１５、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）ＡＴＣＣ  ３３４７８を使用した。【００７４】
分離菌株をストックした試験管から新鮮なＴＳ培地又はＭＲＳ培地４ｍＬの入った試験管に３白金耳植菌して３７℃にて１６時間嫌気培養した。この培養液４ｍＬを、１Ｌの新鮮なＴＳ又はＭＲＳ培地に植菌し、３７℃で１６時間嫌気培養した。この培養液を遠心分離（４，８３０×ｇ、２０分間、４℃）して集菌した。これをＰＢＳで洗浄した後、さらに遠心分離した菌体を２００ｍＬのＰＢＳに懸濁した。一部をサンプリングしてＰＢＳで１／１０希釈した後、その濁度を５４０ｎｍにて測定し、全体をＯＤ５４０＝０．５あるいは１．０となるようにＰＢＳを用いて調整した。
この菌液によるウシエナメル質の硬度変化を人工口腔装置により測定した。具体的には、ｐＨの経時変化を人工バイオフィルム下に設置したｐＨメーターにより測定した。また、ウシエナメル質の硬度変化を実験前と実験後における歯片のＶｉｃｋｅｒｓ硬度の変化から求めた。さらに、各ウシエナメル質切片を０．５Ｎ  ＮａＯＨ（２ｍＬ）に０℃で１０分間浸漬し、人工バイオフィルムを遊離させた後に遠心分離し（４，８３０×ｇ、２０分間）、菌体と上清（非水溶性グルカン分画）に分画した。菌体をＰＢＳに懸濁してＯＤ５４０  ｎｍの濁度を測定した値から歯片ｍｍ2当たりの菌体量を求めた。また、上清中の非水溶性グルカン量をＰｈｅｎｏｌ硫酸法により測定した。
なお、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）ＹＩＴ  １２３２１については、菌体濃度と反応時間をそれぞれ２倍にした条件で人工口腔装置によるう蝕性を評価した。【００７５】
結果を図１〜４に示す。う蝕原性細菌であるストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）  ６７１５の場合、スクロース存在下で２０時間、本菌と接触させたウシエナメル質の硬度は試験開始前と比較して約６０〜８０％低下していた（図１、３）。また、エナメル質からは、非水溶性グルカンと菌体が回収されたことから（図２）、本菌がエナメル質表面に非水溶性グルカンを主体とするバイオフィルムを形成し、その中で酸を産生することにより脱灰を進めた結果、硬度が低下したと考えられた。
一方、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＹＩＴ  １２３２０、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）ＹＩＴ  １２３２１及びストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）ＹＩＴ  １２３２２の硬度の低下割合は、いずれの株も５％未満であった（図１、３）。また、いずれの菌株を作用させたエナメル質からも非水溶性グルカンは回収されなかった（図２、４）。【００７６】
ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）ＹＩＴ  １２３２１について、菌体濃度と反応時間をそれぞれ２倍にした条件で人工口腔装置によるう蝕性を調べた結果を図５に示す。エナメル質硬度の低下割合は元の条件とほぼ同程度（４．４％低下）であったことから、本菌を過剰摂取してもう蝕を誘発する可能性は低いと考えられた。【００７７】
ウシエナメル質の硬度が低下しない原因を調べるため、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）ＹＩＴ  １２３２１のスクロース資化性を調べた。スクロース資化性は、ＩＬＳ液体培地（ＢＢＬ  Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ  Ｐｅｐｔｏｎｅ（ＢＤ）  １０ｇ、Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ（ＢＤ）  ５ｇ、Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｓｅ（ＢＤ）  ３ｇ、ＫＨ2ＰＯ4  ３ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4  ３ｇ、（ＮＨ4）3Ｃ6Ｈ5Ｏ7  ２ｇ、Ｌａｃｔｏｓｅ  ２０ｇ、Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ・ＨＣｌ  ０．２ｇ、ＣＨ3ＣＯＯＮａ  １ｇ、Ｔｗｅｅｅｎ８０  １ｇ、Ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  １１．５ｇ／１００ｍＬ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．６８ｇ／１００ｍＬ、ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ  ２．４ｇ／１００ｍＬ）  ５ｍＬ、ＤＷ  １０００ｍＬ）のラクトースをスクロースに置き換えた培地を用いて、３７℃、２４時間培養した。菌の増殖はＯＤ６６０ｎｍで測定した培養液の吸光度で表した。
その結果、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）ＹＩＴ  １２３２１はスクロースを増殖基質として利用できないことが明らかとなった（図６）。ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）の標準菌株（ＹＩＴ  ０１９２Ｔ）はスクロースを資化できることから、この性質は株特異的であると考えられた。【００７８】
以上の結果から、今回試験した分離菌株のラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＹＩＴ  １２３２０、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）ＹＩＴ  １２３２１及びストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）ＹＩＴ  １２３２２は、う蝕の原因にならないと考えられた。特にＹＩＴ  １２３２１は、スクロースを資化しないため、より有用であると考えられた。
これら、ＹＩＴ  １２３１９、ＹＩＴ  １２３２０、ＹＩＴ  １２３２１及びＹＩＴ  １２３２２は、新規な菌株であり、それぞれ独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（住所：茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５００）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＹＩＴ  １２３２０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０１）、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）ＹＩＴ  １２３２１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０２）及びストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）ＹＩＴ  １２３２２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０３）として寄託された。【００７９】
前記した試験例２、３及び５において良好な結果が得られた菌株（ＶＳＣ産生能及び非水溶性グルカン産生能を有さず、歯面への接着性を有する菌株）について、試験例６乃至９の結果（一覧）を表１４に示す。本発明者らが口腔内から分離した約１６００株の微生物について鋭意検討した結果、本発明に係る（１）〜（６）の全ての性質を有する乳酸菌はわずかに４菌株が見出されたのみであり、そのような特異的な性質を有する乳酸菌は様々な口腔内疾患又は不快症状の予防又は改善のための飲食品、口腔用組成物等として極めて有用であることが確認された。【００８０】
【表１４】
0005982376.tif 000016
【００８１】
試験例１０  ヒトでの口腔内環境改善効果の検証
口腔内環境に対する本発明に係る乳酸菌ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９摂取の効果を調べるため、口臭のある被験者１７名を対象に１粒当たり３．３×１０８ｃｆｕ以上の生菌を含む試験食品を１日１回３粒、４週間連続摂取させた。【００８２】
試験食品摂取期の開始日（０週）および摂取４週目に被験者から刺激唾液（パラフィンガムを５分間噛みながら分泌される唾液）を採取し、下記の口腔内細菌数を測定した。
歯周病原性細菌量（ＰＣＲインベーダー法）、う蝕原性細菌量（培養法）、乳酸菌量（培養法）【００８３】
また、臨床パラメーターとして、摂取開始日、摂取４週に以下の各項目を測定した。歯肉炎指数およびプロービング時の出血は歯科医師が測定した。
評価項目
１）歯肉炎指数（ＧＩ：Ｌｅｅ  ＆  Ｓｉｌｌｎｅｓｓ、１９６３変法)
評価基準
０：臨床的に正常な歯肉
１：軽度の炎症、歯肉のわずかな色調変化があるもので、プローブによる歯肉辺縁内縁部の擦過により出血が認められない。
２：中等度の炎症、歯肉に発赤を伴う浮腫と光沢があり、歯肉辺縁内縁部の擦過により出血が認められる。
３：高度の炎症、著しい発赤、浮腫があり、自然出血、潰瘍形成がある。
診査部位
下記６歯の舌側、唇側・頬側、近心側、遠心側の合計２４歯面とした。【００８４】
【表１５】
0005982376.tif 000017
【００８５】
評価方法
下式を用い、診査部位の総点数より被験者ごとの平均歯肉炎スコアを算出した。【００８６】
【数２】
0005982376.tif 000018
【００８７】
２)プロービング時の出血（ＢＯＰ）
評価基準
０：出血が認められない
１：出血が認められる
診査部位
下記６歯の舌側、唇側・頬側、近心側、遠心側の合計２４歯面とした。【００８８】
【表１６】
0005982376.tif 000019
【００８９】
評価方法
下式を用い、診査部位の総点数より被験者ごとの平均プロービング時の出血スコアを算出した。【００９０】
【数３】
0005982376.tif 000020
【００９１】
ヒト試験に関するすべての統計解析については、統計解析ソフト（ＳＡＳ前臨床パッケージ  Ｖｅｒ．  ５．０、ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．）を用いた。各統計処理とも有意水準は５％とした。０週目の値に対して、摂取４週目あるいは８週目との値について、有意差検定を実施し、試験期間中の変動を解析した。【００９２】
被験者１７名の唾液中の菌数測定結果を表１７に示した。口臭原因物質を産生する歯周病原性細菌であるポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）及び、タンネレラ・フォーサイシア（Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ ｆｏｒｓｙｔｈｉａ）の菌数が当該乳酸菌摂取４週目に減少し（Ｐ＝０．０１９、０．００６、０．００５）、乳酸桿菌数が当該乳酸菌摂取４週目で増加した（Ｐ＝０．００１）。ミュータンス連鎖球菌は試験期間中に変化が認められなかった。【００９３】
【表１７】
0005982376.tif 000021
【００９４】
すなわち、本発明に係る乳酸菌の摂取により、口臭原因物質を産生する歯周病原性細菌（ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）及び、タンネレラ・フォーサイシア（Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ ｆｏｒｓｙｔｈｉａ）等）の菌数が減少することが確認され、当該乳酸菌が口腔内疾患・口臭の予防及び／又は治療剤として極めて有用であることが確認された。また、試験期間を通してう蝕の原因菌であるミュータンス連鎖球菌の菌数に変化は認められなかった。そのため、本発明に係る乳酸菌を摂取することによりう蝕のリスクが高まる可能性は低いと考えられた。【００９５】
さらに、プロービング時の出血および歯肉炎指数は、当該乳酸菌摂取４週目で摂取開始時にくらべ有意に低い値を示した。評価項目の解析結果を表１８に示した。【００９６】
【表１８】
0005982376.tif 000022
【００９７】
すなわち、本発明に係る乳酸菌の摂取により、歯肉炎等の歯周病の臨床パラメーターを改善する効果が確認され、当該乳酸菌が口腔内疾患・口臭の予防及び／又は治療剤として極めて有用であることが確認された。【００９８】
試験例１１  ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）陽性被験者での口臭抑制効果の検証
口臭に対する本発明に係る乳酸菌ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９摂取の効果を調べるため、歯周病原性細菌の一つで口臭原因物質を産生するポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）陽性被験者７名を対象に１粒当たり３．３×１０８ｃｆｕ以上の生菌を含む試験食品を１日１回３粒、８週間連続摂取させたときの揮発性硫黄化合物（ＶＳＣ）濃度をガスクロマトグラフィーで測定した。【００９９】
ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）陽性被験者群のＶＳＣ濃度の解析結果を表１９に示した。ＶＳＣ濃度を測定した結果、Ｈ２Ｓでは、当該乳酸菌摂取４、８週目で摂取開始時にくらべ有意に低い値を示した。また、Ｔｏｔａｌ  ＶＳＣでは当該乳酸菌摂取８週目で摂取開始時にくらべ有意に低い値を示した。【０１００】
【表１９】
0005982376.tif 000023
【０１０１】
すなわち、本発明に係る乳酸菌の摂取により、実際に口臭原因物質が低減される効果が確認され、当該乳酸菌が口腔内疾患・口臭の予防及び／又は治療剤として極めて有用であることが確認された。【０１０２】
試験例１２  プライマーの設計及び合成
ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９と他のラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）１７株のゲノムＤＮＡをＲＡＰＤ法により比較し、目的とする菌株（ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９）に特異的なＤＮＡ配列を三部位見出した。そして、これらの塩基配列を解読して、表２０に示すプライマーの候補群を選抜し、これらを適宜組み合わることにより、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９に特異的なプライマーペアを３５種設計した。【０１０３】
【表２０】
0005982376.tif 000024
【０１０４】
試験例１３  同種（ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）に対して特異的なプライマーペアの選抜
ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９および他のラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）２０株のゲノムＤＮＡに対し、設計した３５種のプライマーペアを用いたＰＣＲ反応を行った。その結果、表２１に示す４種のプライマーペアでは、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅産物がラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９のみ確認された（表２１、図７）。
ここで、Ｌｃ（Ｘ）２ａは配列番号４、Ｌｃ（Ｘ）２ｂは配列番号５、Ｌｃ（Ｘ）２ｃは配列番号６、Ｌｃ（Ｘ）２ｄは配列番号７、Ｌｃ（Ｘ）７ａは配列番号８を示す。【０１０５】
【表２１】
0005982376.tif 000025
【０１０６】
試験例１４  ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）以外の２７属１４３菌株に対して特異的なプライマーペアの選抜
表２２に示すラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９およびラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）以外のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属６５菌株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に近縁な７菌株、口腔の優先菌２２属７１菌株(合計２７属１４３菌株)のゲノムＤＮＡに対し、表２１に示す４種のプライマーペアを用いたＰＣＲ反応を行った。その結果、すべてのプライマーペアでラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９のみのＤＮＡ増幅産物が確認された。
試験例１３の結果と合わせて、２７属１６３菌株に対して反応せず、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）ＹＩＴ  １２３１９のみ反応する４種のプライマーペアが得られた。【０１０７】
【表２２】
0005982376.tif 000026
【０１０８】
試験例１５  タブレットの製造
表２３に示す成分（１粒あたり）を混和して、その混合物を打錠した。【０１０９】
【表２３】
0005982376.tif 000027
【０１１０】
得られたタブレットは、安定なものであり、服用し易いものであった。【０１１１】
【表２４】
0005982376.tif 000028
【０１１２】
得られたタブレットは、安定なものであり、服用し易いものであった。
【図１】
0005982376.tif 000029
【図２】
0005982376.tif 000030
【図３】
0005982376.tif 000031
【図４】
0005982376.tif 000032
【図５】
0005982376.tif 000033
【図６】
0005982376.tif 000034
【図７】
0005982376.tif 000035
【配列表】
0005982376000001.app