(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドであって、
ＡＸＬ膜貫通ドメインを欠き、野生型ＡＸＬ配列（配列番号：１）と比べて
以下の群：
１）Ｇｌｙ３２Ｓｅｒ，Ａｓｐ８７Ｇｌｙ，Ｖａｌ９２Ａｌａ，及びＧｌｙ１２７Ａｒｇ，
２）Ｇｌｕ２６Ｇｌｙ，Ｖａｌ７９Ｍｅｔ，Ｖａｌ９２Ａｌａ，及びＧｌｙ１２７Ｇｌｕ，並びに
３）Ｇｌｙ３２Ｓｅｒ，Ａｌａ７２Ｖａｌ，Ａｓｐ８７Ｇｌｙ，Ｖａｌ９２Ａｌａ，及びＧｌｙ１２７Ａｒｇ，
から選択される一組のアミノ酸修飾を有し、
前記修飾は成長停止特異的タンパク質６（ＧＡＳ６）への前記ＡＸＬポリペプチドの結合の親和性を増加させるものであり、
ただし、当該修飾の位置番号をｎとした場合、ｎ＋７が配列番号：１における位置番号に等しい、
ＡＸＬとＧＡＳ６との間の相互作用を阻害する、可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチド。
【請求項２】
Ｆｃドメインを含む融合タンパク質である、請求項１に記載の可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチド。
【請求項３】
ＧＡＳ６に対して少なくとも約１×１０−８Ｍ又は１×１０−９Ｍの親和性を有する、請求項１に記載の可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチド。
【請求項４】
治療有効量の請求項１から３のいずれか一項に記載の１つ以上の可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチド、又は医薬的に許容され得るそれらの塩を含む、医薬組成物。
【請求項５】
少なくとも１つの細胞傷害剤若しくは医薬的に許容され得る賦形剤又はそれらの組み合わせをさらに含む、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
哺乳動物患者における腫瘍の転移又は浸潤を処置、低減又は予防する方法に使用するための、請求項１から３のいずれか一項に記載の可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２０１０年１月２２日に出願された米国特許仮出願第６１／３３６，４７８号の優先権を主張するものであり、この仮出願の内容は参照により明確に組み込まれる。
本発明は、腫瘍浸潤及び転移、例えば、ＡＸＬ及び／又はＧＡＳ６に関連した経路による腫瘍浸潤又は転移の処置又は診断、に関する。
発明の分野
【背景技術】
【０００２】
浸潤及び転移は、癌における最も潜行性で生命を脅かす態様である。浸潤が最小の又は浸潤が無い腫瘍はうまく除去されることもあるが、その新生物が浸潤性になると、それはリンパ管及び／又は脈管によって多数の部位に広まることが出来、完全除去は非常に困難になる。浸潤及び転移は、局所浸潤と遠隔器官コロニー形成及び損傷という２つのプロセスによって宿主を殺す。局所浸潤は、関与する組織の機能を正常な器官機能の局所圧迫、局所破壊又は妨害によって損なわせるだろう。しかし、癌における最も有意な転換点は、遠隔転移の確立である。この時点ではもはや局所療法だけで患者が治癒されることはあり得ない。
【０００３】
転移のプロセスは、多数の宿主−腫瘍相互作用を伴うリンクした逐次的段階のカスケードである。この複雑なプロセスは、細胞を血管又はリンパ循環に侵入させ、遠隔血管又はリンパ床で停止させ、器官間質及び実質に活発に管外遊出させ、第二のコロニーとして増殖させる。転移の可能性は、局所微小環境に、血管新生に、ストローマ−腫瘍相互作用に、局所組織によるサイトカインの生成に、並びに腫瘍及び宿主細胞の分子表現型に影響される。
【０００４】
遠位播種が顕性でない場合がある又はまだ始まっていない場合があるにもかかわらず、局所微小浸潤が早々に起こることがある。腫瘍細胞は、原位置から浸潤性癌腫への移行中に上皮基底膜を透過して下にある間質ストローマに侵入する。下にあるストローマに浸潤すると、腫瘍細胞は、マトリックス断片及び成長因子を放出しながら、遠位播種のためにリンパ管及び血管に再び進入する。良性癌腫から浸潤性癌腫への移行中に上皮基底膜の構成、分布及び量の全般的な且つ広範にわたる変化が起こる。
【０００５】
癌予防及び処置の治療努力は、シグナル伝達経路又は選択変調タンパク質のレベルに集中されている。プロテインキナーゼ活性、カルシウム恒常性、及びオンコプロテイン活性化は駆動シグナルであり、従って、治療的介入のための基本的な調節部位であり得る。浸潤及び血管新生を調節するシグナル伝達経路におけるキナーゼは、転移の重要な調節因子であり得る。生化学的分子ターゲットの最大クラスの１つは、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫｓ）のファミリーである。現在までのところ最も一般的な受容体チロシンキナーゼ分子ターゲットは、ＥＧＦ及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体である。より新しいキナーゼ分子ターゲットとしては、ｃ−ｋｉｔのＩＩＩ型ＲＴＫファミリー、及びａｂｌが挙げられる。これらの分子の阻害剤は、古典的化学療法と併用で投与されている。
【０００６】
転移は、最終的には癌からの苦痛及び死亡率の多くについての原因である。転移性癌細胞を識別する分子及び機能性マーカーを同定する及びターゲットにする必要があり、並びにそれらの特異的阻害のための試薬を作り出す必要がある。
【０００７】
この分野に関する出版物としては、とりわけ、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．（２００９）２８（３９）：３４４２−５５；Ｕｌｌｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許出願第２００５０１８６５７１号；Ｂｅａｒｓｓ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許出願第２００８０２９３７３３号；Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２００４；６６（６）：４５０−７；Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００９）１５（１４）：４７４２−９；Ｗｉｍｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００１  ３７（１７）：２２６４−７４；Ｋｏｏｒｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００９  ８（７）：６１８−２６；Ｔａｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．（２００８）２７（２９）：４０４４−５５が挙げられる。
【０００８】
受容体チロシンキナーゼＡＸＬ（Ｕｆｏ及びＴｙｒｏ７としても公知）は、Ｔｙｒｏ３（Ｓｋｙ）及びＭｅｒ（Ｔｙｒｏ１２）を包含するチロシン受容体のファミリーに属する。ＡＸＬファミリーの共通のリガンドは、ＧＡＳ６（成長停止特異的タンパク質６）である。ヒトＡＸＬは、８９４アミノ酸ポリペプチドの合成を命令することが出来る２，６８２ｂｐオープン・リーディング・フレームである。２つの変異体ｍＲＮＡが特性付けされており、転写産物変異体１は、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＮＭ＿０２１９１３．３で入手され得、及び転写産物変異体２は、ＮＭ＿００１６９９．４で入手され得る。その天然タンパク質のポリペプチド配列は、配列番号：１として提供され、及びアミノ酸修飾に関してその配列を特に参照することが出来る。ＧＡＳ６／ＡＸＬの重要な細胞機能としては、細胞接着、遊走、食作用、及びアポトーシス阻害が挙げられる。ＧＡＳ６及びＡＸＬファミリー受容体は、組織及び疾患特異的様式で高度に調節される。
【０００９】
ＡＸＬは、細胞内領域が受容体チロシンキナーゼの典型的構造を有し、及び細胞外ドメインがカドヘリン型接着分子に類似したフィブロネクチンＩＩＩ及びＩｇモチーフを含有する点で、ユニークな分子構造を特徴とする。発達中に、ＡＸＬは、脳をはじめとする様々な器官で発現され、このことは、このＲＴＫが間葉及び神経発達に関与することを示唆している。成体でのＡＸＬ発現は低いが、様々な腫瘍において高い発現レベルに転ずる。これまでのところ、ＧＡＳ６はＡＸＬについてのたった１つの活性化リガンドである。
【００１０】
受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は、受容体二量体化を促進する及びその結果としてサイトゾルドメイン内のチロシン残基の自己リン酸化を促進するリガンドによって、一般に活性化される。その後、これらのリン酸化されたチロシン残基へのシグナル伝達タンパク質の結合が下流のシグナル伝達をもたらす。ＡＸＬファミリーＲＴＫは、典型的な成長因子ではなく血液凝固因子に似ているビタミンＫ依存性タンパク質ファミリーのメンバーであるＧＡＳ６によって活性化される点でユニークである。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、１つには、ＡＸＬ及び／又はＧＡＳ６関連経路が腫瘍浸潤及び／又は転移に関連づけられるという発見に基づく。従って、本発明は、例えばＡＬＸ及び／又はＧＡＳ６関連経路の阻害による、腫瘍浸潤及び／又は転移の処置に有用な、組成物及び／又は方法を提供する。加えて、本発明は、例えばＡＬＸ及び／又はＧＡＳ６の活性のレベルを検出することによる、腫瘍の浸潤性及び／若しくは転移性になりやすさ又は浸潤性及び／若しくは転移性になる尤度の判定に有用な、試薬及び方法を提供する。
【００１２】
１つの実施形態において、本発明は、可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドを提供し、前記ポリペプチドは、ＡＸＬ膜貫通ドメイン及び場合により細胞内ドメインを欠き、並びに野生型ＡＸＬ配列と比べて少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、並びに前記変更は、ＧＡＳ６へのＡＸＬポリペプチド結合の親和性を増加させる。一部の実施形態において、前記可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、野生型ＡＸＬ配列（配列番号：１）の１）１５−５０間、２）６０−１２０間、及び３）１２５−１３５間から成る群より選択される領域内に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。一部の他の実施形態において、前記可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、野生型ＡＸＬ配列（配列番号：１）の位置１９、２３、２６、２７、３２、３３、３８、４４、６１、６５、７２、７４、７８、７９、８６、８７、８８、９０、９２、９７、９８、１０５、１０９、１１２、１１３、１１６、１１８、１２７若しくは１２９又はそれらの組み合わせにおける少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。一部の他の実施形態において、前記可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、１）Ａ１９Ｔ、２）Ｔ２３Ｍ、３）Ｅ２６Ｇ、４）Ｅ２７Ｇ又はＥ２７Ｋ、５）Ｇ３２Ｓ、６）Ｎ３３Ｓ、７）Ｔ３８Ｉ、８）Ｔ４４Ａ、９）Ｈ６１Ｙ、１０）Ｄ６５Ｎ、１１）Ａ７２Ｖ、１２）Ｓ７４Ｎ、１３）Ｑ７８Ｅ、１４）Ｖ７９Ｍ、１５）Ｑ８６Ｒ、１６）Ｄ８７Ｇ、１７）Ｄ８８Ｎ、１８）Ｉ９０Ｍ又はＩ９０Ｖ、１９）Ｖ９２Ａ、Ｖ９２Ｇ又はＶ９２Ｄ、２０）Ｉ９７Ｒ、２１）Ｔ９８Ａ又はＴ９８Ｐ、２２）Ｔ１０５Ｍ、２３）Ｑ１０９Ｒ、２４）Ｖ１１２Ａ、２５）Ｆ１１３Ｌ、２６）Ｈ１１６Ｒ、２７）Ｔ１１８Ａ、２８）Ｇ１２７Ｒ又はＧ１２７Ｅ及び２９）Ｅ１２９Ｋ並びにそれらの組み合わせ及び保存的等価物から成る群より選択される少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。
【００１３】
さらに一部の他の実施形態において、前記可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、野生型ＡＸＬ配列（配列番号：１）と比べて次の位置におけるアミノ酸変更を含む：（ａ）グリシン３２；（ｂ）アスパラギン酸８７；（ｃ）バリン９２；及び（ｄ）グリシン１２７。さらに一部の他の実施形態において、前記可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、セリン残基で置換されているグリシン３２残基、グリシン残基で置換されているアスパラギン酸残基８７、アラニン残基で置換されているバリン９２残基、若しくはアルギニン残基で置換されているグリシン１２７残基、又はそれらの組み合わせ若しくは保存的等価物を含有する。なお一部の他の実施形態において、前記可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、野生型ＡＸＬ配列（配列番号：１）と比べて次の位置におけるアミノ酸変更を含む：（ａ）グルタミン酸２６；（ｂ）バリン７９；（ｃ）バリン９２；及び（ｄ）グリシン１２７。なお一部の他の実施形態において、前記可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、グリシン残基で置換されているグルタミン酸２６残基、メチオニン残基で置換されているバリン７９残基、アラニン残基で置換されているバリン９２残基、若しくはグルタミン酸残基で置換されているグリシン１２７残基、又はそれらの組み合わせ若しくは保存的等価物を含有する。
【００１４】
なおさらに一部の他の実施形態において、前記可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、野生型ＡＸＬポリペプチド（配列番号：１）の少なくともアミノ酸残基１−４３７、１９−４３７、１３０−４３７、１９−１３２、１−１３２を含む。なおさらに一部の他の実施形態において、前記可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、Ｆｃドメインを含む融合タンパク質である。
【００１５】
１つの実施形態において、前記可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、ＧＡＳ６に対して少なくとも約１×１０−５Ｍの親和性を有する。もう１つの実施形態において、前記可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、ＧＡＳ６に対して、少なくとも約１×１０−６Ｍの親和性を有する。さらにもう１つの実施形態において、前記可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、ＧＡＳ６に対して少なくとも約１×１０−７Ｍの親和性を有する。さらにもう１つの実施形態において、前記可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、ＧＡＳ６に対して少なくとも約１×１０−８Ｍの親和性を有する。さらにもう１つの実施形態において、前記可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、ＧＡＳ６に対して少なくとも約１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、又は１×１０−１２Ｍの親和性を有する。本明細書に記載する様々な実施形態において、前記可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、野生型ＡＸＬポリペプチドの親和性より少なくとも約２倍強い、ＧＡＳ６への親和性を呈示する。一部の実施形態において、前記可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、野生型ＡＸＬポリペプチドの親和性より少なくとも約３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、又は３０倍強い、ＧＡＳ６への親和性を呈示する。
【００１６】
もう１つの実施形態において、本発明は、ＧＡＳ６タンパク質（配列番号：２）に特異的に結合する、単離された抗体又はそれらの断片を提供する。一部の実施形態において、前記単離された抗体及びその断片は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）、又はそれらの組み合わせである。一部の他の実施形態において、前記単離された抗体又はその断片は、Ｒ２９９−Ｔ３１７、Ｖ３６４−Ｐ３７２、Ｒ３８９−Ｎ３９６、Ｄ３９８−Ａ４０６、Ｅ４１３−Ｈ４２９及びＷ４５０−Ｍ４６８から成る群より選択されるＧＡＳ６の１つ以上のアミノ酸領域に含まれるエピトープに結合する。さらに一部の他の実施形態において、前記単離された抗体又はその断片は、ＲＭＦＳＧＴＰＶＩＲＬＲＦＫＲＬＱＰＴ（配列番号：３）、ＶＧＲＶＴＳＳＧＰ（配列番号：４）、ＲＮＬＶＩＫＶＮ（配列番号：５）、ＤＡＶＭＫＩＡＶＡ（配列番号：６）、ＥＲＧＬＹＨＬＮＬＴＶＧＧＩＰＦＨ（配列番号：７）及びＷＬＮＧＥＤＴＴＩＱＥＴＶＫＶＮＴＲＭ（配列番号：８）から成る群より選択されるアミノ酸領域に含まれるエピトープに結合する。
【００１７】
さらにもう１つの実施形態において、本発明は、哺乳動物患者における腫瘍の転移又は浸潤を処置する、低減する又は予防する方法を提供する。１つの実施形態において、前記方法は、前記患者に有効用量の可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチド又は単離された抗ＧＡＳ６抗体若しくはその断片を投与することを含む。
【００１８】
さらにもう１つの実施形態において、本発明は、哺乳動物患者における腫瘍の転移又は浸潤を処置する、低減する又は予防する方法を提供する。１つの実施形態において、前記方法は、（ａ）ＡＸＬ活性の阻害剤（ｂ）ＧＡＳ６活性の阻害剤；及び（ｃ）ＡＸＬ−ＧＡＳ６相互作用の阻害剤から成る群より選択される１つ以上の阻害剤を投与することを含む。本明細書に記載する様々な実施形態において、前記阻害剤は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、小分子、抗体、抗体断片、又は抗体薬物コンジュゲートである。
【００１９】
なおさらにもう１つの実施形態において、本発明は、被験体において転移又は浸潤を被る腫瘍の能力を判定する方法を提供する。１つの実施形態において、前記方法は、腫瘍を有する被験体からの生体試料におけるＡＸＬ活性及び／又はＧＡＳ６活性のレベルを検出すること；及び前記生体試料におけるＡＸＬ及び／又はＧＡＳ６活性のレベルを所定レベルと比較することを含み、前記所定レベルに比しての増加は、腫瘍の浸潤又は転移素質を示す。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＡＸＬ発現は、ヒト乳及び卵巣癌における腫瘍進行及び転移と相関する。Ａ．正常乳房組織（正常）、原発性浸潤性乳管癌腫（悪性度１、２及び３）及びリンパ節転移（リンパ節）におけるＡＸＬ免疫組織化学的染色の代表画像。高レベルの膜ＡＸＬ染色が悪性度２（矢印）、悪性度３、及びリンパ節転移に存在することに注目すること。正常又は腫瘍ストローマ（＊）においてＡＸＬ染色は観察されなかった。Ｂ．正常卵巣上皮（矢印）、漿液性腺癌を有する患者に由来する病期ＩＩ、病期ＩＩＩ及び網転移におけるＡＸＬ免疫組織化学的染色の代表画像。正常及び腫瘍ストローマがＡＸＬ染色について陰性であったこと（＊）に注目すること。
【図２】ＡＸＬの遺伝子不活性化は、乳房及び卵巣転移の阻止に十分である。Ａ．ｓｈスクランブル（ｓｈＳＣＲＭ）及びｓｈＡＸＬ（ｓｈＡＸＬ）ＭＤＡ−２３１細胞を尾静脈注射されたマウスの肺におけるＨ＆Ｅ及びＡＸＬ免疫組織化学的染色。写真は、１群あたり５匹のマウスの代表である。グラフは、ｓｈＳＣＲＭ又はｓｈＡＸＬ  ＭＤＡ−２３１細胞を注射されたマウス（ｎ＝５）からの全肺におけるヒトＧＡＳＰＤＨ及びＡＸＬ発現の実時間ＰＣＲ分析を図示するものである。Ｂ．ｓｈスクランブル（ｓｈＳＣＲＭ）及びｓｈＡＸＬ（ｓｈＡＸＬ）ＳＫＯＶ３ｉｐ．１細胞注射の２８日後に撮影されたマウスの写真。ｓｈＳＣＲＭを注射されたマウスが腹腔全体に非常に多くの転移（丸で囲まれている）を発生させたことに注目すること。ｓｈＡＸＬ群については、最大腫瘍量を有するマウスが示される。右側のグラフは、５ｍｍより大きいサイズの腹膜転移のマウス１匹あたりの平均数、及び最大腫瘍の平均重量を図示するものである。写真は、１群あたり５匹のマウスの代表である。Ｃ．ｓｈＳＣＲＭ及びｓｈＡＸＬ  ＯＶＣＡＲ−８細胞注射の３４日後に撮影されたマウスの写真。ｓｈＳＣＲＭ注射マウスが、腹腔全体に非常に多くの転移（丸で囲まれている）を発生させたことに注目すること。右側のグラフは、腹膜転移のマウス１匹あたりの平均数、及び平均総腫瘍重量を図示するものである。写真は、１群あたり８匹のマウスの代表である。
【図３】ＡＸＬの遺伝子不活性化は、インビトロでの乳房若しくは卵巣腫瘍細胞増殖及びインビボでの成長に影響を及ぼさない。Ａ．スクランブル対照（ｓｈＳＣＲＭ）又はＡＸＬ（ｓｈＡＸＬ）に対するｓｈＲＮＡターゲティング配列を安定的に発現するＭＤＡ−２３１、ＳＫＯＶ３ｉｐ．１、及びＯＶＣＡＲ−８細胞についての細胞成長曲線。測定は、三重反復で行われた。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。Ｂ．４８日の時間経過にわたって成長させた同所性ＭＤＡ−２３１（１群あたりマウスｎ＝８）及び皮下ＳＫＯＶ３ｉｐ．１腫瘍（１群あたりｎ＝４マウス）の平均腫瘍容積。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。
【図４】ＡＸＬは、インビトロで卵巣及び乳房腫瘍細胞浸潤を調節する。Ａ．対照（ｓｈＳＣＲＭ）及びＡＸＬ欠損（ｓｈＡＸＬ）ＭＤＡ−２３１、ＳＫＯＶ３ｉｐ．１及びＯＶＣＡＲ−８細胞のコラーゲン浸潤アッセイ。写真は、１群あたり３試料の代表であり、コラーゲンへの細胞のプレーティングの７日後に撮影された。ＡＸＬ欠損細胞（丸い）と比較してＡＸＬ野生型細胞において観察された浸潤性表現型（枝分かれ）に注目すること。グラフは、コラーゲン浸潤アッセイの定量化を示す。Ｂ．ｓｈＡＸＬ及びｓｈＳＣＲＭ  ＳＫＯＶ３ｉｐ．１細胞におけるＭＭＰ−２発現の実時間ＰＣＲ分析。発現値は、１８Ｓに正規化された；ｎ＝３。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。アスタリスクは、スチューデントｔ検定によって判定してｓｈＳＣＲＭと比較した発現の有意な増加又は減少を示す（＊＊、Ｐ＜０．００１）。Ｃ．ｓｈＳＣＲＭ又はｓｈＡＸＬ  ＳＫＯＶ３ｉｐ．１細胞（ｎ＝６）のＭＭＰ−２レポーターアッセイ。Ｄ．血清飢餓ＳＫＯＶ３ｉｐ．１細胞から回収されたならし培地におけるプロ−及び活性−ＭＭＰ２活性についてのゼラチン・ザイモグラフィー・アッセイ。Ｅ．スクランブル対照（ｓｈＳＣＲＭ）又はＡＸＬ（ｓｈＡＸＬ）をターゲットにするｓｈＲＮＡ配列を発現するＳＫＯＶ３ｉｐ．１細胞及びＧＡＳ６で又はＰＩ３ＫＫ阻害剤Ｌｙ２９４００２とＧＡＳ６で処置された飢餓ＳＫＯＶ３ｉｐ細胞（ｓｔｒｖｅ）における、Ｓｅｒ４７３でのホスホ−ＡＫＴ（Ｐ−ＡＫＴ）、全ＡＫＴ（ＡＫＴ）及びＡＸＬ発現のウエスタンブロット分析。Ｆ．ＧＡＳ６で又はＧＡＳ６とＰＩ３Ｋ阻害剤Ｌｙ２９４００２（Ｌｙ＋ＧＡＳ６）で処置された飢餓ＳＫＯＶ３ｉｐ細胞（ｓｔｒｖｅ）におけるＭＭＰ−２レポーターアッセイ。
【図５】可溶性ＡＸＬエクトドメイン療法は、インビトロでＡＸＬシグナル伝達及び浸潤を阻害する。Ａ．可溶性ＡＸＬ療法についてのメカニズムの略図。可溶性ＡＸＬ（ｓＡＸＬ）は、内因性ＡＸＬシグナル伝達を阻害するためのおとり受容体として機能する。Ｂ．スクランブル対照（ｓｈＳＣＲＭ）又はＡＸＬ（ｓｈＡＸＬ）をターゲットにするｓｈＲＮＡ配列を発現するＭＤＡ２３１、ＳＫＯＶ３ｉｐ．１及びＯＶＣＡＲ−８細胞、並びにＧＡＳ６で又はＰＩ３Ｋ阻害剤Ｌｙ２９４００２（Ｌｙ）とＧＡＳ６で処置された飢餓ＳＫＯＶ３ｉｐ．１細胞（ｓｔｒｖｅ）における、Ｓｅｒ４７３でのホスホ−ＡＫＴ（Ｐ−ＡＫＴ）、全ＡＫＴ（ＡＫＴ）及びＡＸＬ発現のウエスタンブロット分析。Ｃ．可溶性ＡＸＬ受容体（ｓＡＸＬ）を含有するならし培地又は対照培地（−）で処置された細胞におけるホスホ−ＡＫＴ  Ｓｅｒ４７３発現のウエスタンブロット分析。すべての細胞は、４８時間、飢餓させられ、ＧＡＳ６（＋）又はビヒクル（−）で処置された。Ｄ．対照ベクター又はｓＡＸＬを含有するならし培地で処置されたＭＤＡ−２３１細胞におけるコラーゲン浸潤アッセイ。
【図６】可溶性ＡＸＬ受容体での処置は、転移が確立されたマウスにおいて転移性腫瘍量を抑制する。Ａ．可溶性ＡＸＬ受容体処置研究の略図。ヌードマウスは、１×１０６のＳＫＯＶ３ｉｐ．１細胞をｉ．ｐ．注射された。内植の５日後、肉眼的病変の存在がマウスにおいて検証された（示されているのは、注射後第５日における腹膜転移を有するマウスの代表写真であり、転移病変が丸で囲まれている）。第７日において、マウスは、ＩｇＧ２ａ−Ｆｃ対照（Ａｄ−Ｆｃ）又は可溶性ＡＸＬ受容体（Ａｄ−ｓＡＸＬ）を発現するアデノウイルスを注射された。アデノウイルス注射後３−４日ごとにウエスタンブロット分析によって血清ｓＡＸＬ発現レベルが評定された。腫瘍細胞内植後第２８日、すべてのマウスにおいて腫瘍量が評定された。Ｂ．腫瘍細胞注射後第２８日におけるＡｄ−ｓＡＸＬ又はＡｄ−Ｆｃを発現するアデノウイルスで処置されたマウスの代表写真。転移病変が丸で囲まれている。グラフは、１群あたり７匹のマウスについての平均総腫瘍数及び重量を示す。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。Ａｄ−Ｆｃ処置マウスとＡｄ−ｓＡＸＬ処置マウスの間に腫瘍数及び重量の統計的相違（ｐ＝０．０１、スチューデントｔ検定）が観察された（＊）。Ｃ．Ａｄ−Ｆｃ又はＡｄ−ＡＸＬで処置されたマウスの腫瘍におけるＭＭＰ−２発現の実時間ＰＣＲ分析。
【図７】可溶性ＡＸＬエクトドメイン療法は、正常組織毒性を誘導しない。Ａ．対照（Ｆｃ）又は可溶性ＡＸＬ療法（ｓＡＸＬ）で処置されたマウスの完全ＣＢＣ及び血清化学分析。Ｂ．Ｆｃ又はｓＡＸＬで処置されたマウスから採取された肝臓及び腎臓組織のＨ＆Ｅ染色。
【図８】転移の可溶性ＡＸＬ受容体阻害に付随する分子メカニズムを図解する概略図。可溶性ＡＸＬ受容体（ｓＡＸＬ）療法は、ＡＸＬリガンドＧＡＳ６に結合するおとり受容体として機能する。ｓＡＸＬは、細胞浸潤及び転移を刺激する内因性ＧＡＳ６−ＡＸＬシグナル伝達事象を阻害する。
【図９】ＡＸＬ欠損乳及び卵巣癌細胞系の産生。Ａ．ヒト乳及び卵巣癌細胞系のパネルにおけるＡＸＬ発現のウエスタンブロット分析。熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）がタンパク質負荷対照として使用された。Ｂ．スクランブル対照（ｓｈＳＣＲＭ）又はＡＸＬ（ｓｈＡＸＬ）に対するｓｈＲＮＡターゲティング配列で安定的にトランスフェクトされた転移性乳（ＭＤＡ−２３１）卵巣（ＳＫＯＶ３ｉｐ．１及びＯＶＣＡＲ−８）癌細胞系におけるＡＸＬ発現のウエスタンブロット分析。ｓｈＡＸＬ細胞系がＡＸＬ発現の有意な低減を有することに注目すること。
【図１０】ＡＸＬは、乳及び卵巣腫瘍細胞接着又は生存に影響を及ぼさない。Ａ−Ｂ．化学誘引物質としての血清へのボイデンチャンバー遊走アッセイにおけるＭＤＡ−２３１（Ａ）及びＳＫＯＶ３ｉｐ．１（Ｂ）細胞の細胞遊走パーセント。Ｃ−Ｄ．細胞外マトリックスタンパク質へのＭＤＡ−２３１（Ａ）ＳＫＯＶ３ｉｐ．１（Ｂ）細胞接着の分析。略記：ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、フィブロネクチン（ＦＮ）、Ｉ型コラーゲン（Ｃｏｌ  Ｉ）、ＩＶ型コラーゲン（Ｃｏｌ  ＩＶ）、ラミニン（ＬＮ）、フィブロネクチン（ＦＢＮ）。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。Ｅ−Ｆ．ＸＴＴアッセイによって判定した、血清除去後のＡＸＬ野生型及びＡＸＬ欠損ＭＤＡ−２３１（Ｅ）及びＳＫＯＶ３ｉｐ．１（Ｆ）腫瘍細胞の生存分析。
【図１１】可溶性ＡＸＬ受容体での処置は、ＯＶＣＡＲ−８転移が確立したマウスにおいて転移性腫瘍を阻害する。Ａ．可溶性ＡＸＬ受容体処置研究の略図。ヌードマウスは、５×１０６  ＯＶＣＡＲ−８細胞をｉ．ｐ．注射された。内植の１４日後、肉眼的病変の存在がマウスにおいて検証された（示されているのは、注射後第１４日における腹膜転移を有するマウスの代表写真であり、転移病変が丸で囲まれている）。第１４日において、マウスは、ＩｇＧ２α−Ｆｃ対照（Ａｄ−Ｆｃ）及び可溶性ＡＸＬ受容体（Ａｄ−ｓＡＸＬ）を発現するアデノウイルスを注射された。血清ｓＡＸＬ発現レベルは、ウエスタンブロット分析によって評定された。腫瘍細胞内植後第３４日、すべてのマウスにおいて腫瘍量が評定された。Ｂ．腫瘍細胞注射後第２８日におけるＡｄ−ｓＡＸＬ又はＡｄ−Ｆｃを発現するアデノウイルスで処置されたマウスの代表写真。転移病変が丸で囲まれている。Ｃ．グラフは、１群あたり８匹のマウスについての平均総腫瘍数及び重量を示す。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。Ａｄ−Ｆｃ処置マウスとＡｄ−ｓＡＸＬ処置マウスの間に腫瘍数及び重量の統計的相違（ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定）が観察された（＊）。
【図１２】ＧＡＳ６へのＡＸＬライブラリーソート５産物の結合。野生型ＡＸＬ（Ａ）又は定向進化ワークからのプールされたＡＸＬソート５産物（Ｂ）のいずれかを発現する酵母細胞のフロー・サイトメトリー・ドット・プロット。データは、実施例２において説明するとおりのオフ速度試験後の結合を示す。２ｎＭ  Ｇａｓ６への結合のレベルが左列に示されており、４時間解結合段階後のＧａｓ６への結合のレベルが中央列に示されており、及び６時間解結合段階後のＧａｓ６への結合のレベルが右列に示されている。その細胞表面上での特定のタンパク質の発現について陽性である細胞（各フロー・サイトメトリー・ドット・プロットの右上象限）についてのＧａｓ６への結合レベル（ｙ軸）は、下の棒グラフで定量される。プールされたソート５産物は、野生型ＡＸＬと比較して有意に向上されたＧａｓ６結合を示す。
【図１３】強化されたＡＸＬ変異体のＧＡＳ６への結合。左のパネルは、野生型ＡＸＬ（緑丸）と比較してＡＸＬ突然変異体Ｓ６−１（赤四角）及びＳ６−２（青菱形）によるＧａｓ６への平衡結合を示す。突然変異体Ｓ６−１及びＳ６−２は、より低い濃度のＧａｓ６への有意に高い結合レベルを呈示し、このことが、野生型ＡＸＬと比較してこれらの突然変異体に対するより強い親和性を実証する。右パネルは、野生型又は遺伝子操作Ｇａｓ６−ＡＸＬ相互作用の解離動態を示す。野生型Ｇａｓ６−ＡＸＬ相互作用（「野生型」）は、時間の関数として迅速に解離するが、Ｇａｓ６とＳ６−１の間の遺伝子操作された相互作用（「Ｓ６−１」）又はＧａｓ６とＳ６−２の間の遺伝子操作された相互作用（「Ｓ６−２」）は、結合の有意に増加された保持を示す。
【図１４】精製ＡＸＬ  Ｓ６−１−Ｆｃの腹膜内送達は、野生型ＡＸＬ−Ｆｃ及びＡＸＬ  Ｅ５９Ｒ／Ｔ７７Ｒ−Ｆｃに比して強化された治療効果を示す。３つの処置群、ＡＸＬ  Ｅ５９Ｒ／Ｔ７７Ｒ−Ｆｃ、野生型ＡＸＬ−Ｆｃ及びＡＸＬ  Ｓ６−１−Ｆｃ、からのマウスの剖検からの２つの代表画像が示されている。黒い円は、画像で見える転移病変を示すが、必ずしもすべての転移部位を示しているとは限らない。野生型ＡＸＬ−Ｆｃは、陰性対照、ＡＸＬ  Ｅ５９Ｒ／Ｔ７７Ｒ、と比べて転移の中等度阻害を示すが、ＡＸＬ  Ｓ６−１は、転移のほぼ完全阻害を示す。
【図１５】ＳＫＯＶ３ｉｐ．１異種移植モデルにおける転移の阻害。上の２つのグラフには、各処置群において計数された平均転移病変数を示すために２つの異なるやり方で同じデータセットが示されている。類似して、下の２つのグラフは、各処置群におけるマウスから切除されたすべての転移の総重量の概要を示す同じデータセット示す。病変の数（上パネル）と全重量（下パネル）の両方の減少によって示されるように、野生型ＡＸＬ−Ｆｃは、陰性対照Ｅ５９Ｒ／Ｔ７７Ｒ−Ｆｃと比較して転移の進展を阻害する。病変の数（上パネル）と全重量（下パネル）によって評定すると、ＡＸＬ  Ｓ６−１−Ｆｃは、野生型ＡＸＬ−ＦｃとＡＸＬ  Ｅ５９Ｒ／Ｔ７７Ｒ−Ｆｃ両方と比較して腫瘍量の有意な低減を示す。これらのデータは、ＡＸＬ  Ｓ６−１の強化された親和性が野生型に比して向上された治療効力をもたらすこと、及びＡＸＬ  Ｓ６−１−Ｆｃが転移の管理のための実行可能な処置であることを実証する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
定義
後続の説明の中では、細胞培養分野において従来用いられている多数の用語が広範に用いられる。本明細書及び請求項の明瞭で一致した理解、並びにそのような用語に与えられている範囲を提供するために、以下の定義が提供される。
【００２２】
転移性細胞上のＡＸＬ又はそのリガンドＧＡＳ６の「阻害剤」、「活性化剤」及び「変調剤」は、受容体又はリガンド結合又はシグナル伝達についてのインビトロ及びインビボアッセイを用いて同定される、阻害、活性化又は変調分子、例えばリガンド、受容体、アゴニスト、アンタゴニスト並びにそれらのホモログ及びミメティック、をそれぞれ指すために用いられる。
【００２３】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書では交換可能に用いられる。これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学的ミメティックであるアミノ酸に、並びに天然に存在するアミノ酸ポリマー及び天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。
【００２４】
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、並びに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸アナログ及びアミノ酸ミメティックを指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされたもの、並びに後に修飾されるアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、ガンマ−カルボキシグルタメート、及びＯ−ホスホセリン、である。アミノ酸アナログは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基及びＲ基に結合しているアルファ炭素、を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム、を指す。そのようなアナログは、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾されたペプチド主鎖を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸ミメティックは、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化合物を指す。アミノ酸を表すために本発明において用いられるすべての単一文字は、例えばＡはアラニンを意味する、Ｃはシステインを意味するなど、当分野において常例的に用いられる認知されたアミノ酸記号に従って用いられる。アミノ酸は、該当位置の前及び後の単一文字によって、元のアミノ酸（その位置の前）から変更アミノ酸（位置の後）への変更を反映するように表される。例えば、Ａ１９Ｔは、位置１９のアミノ酸アラニンがトレオニンに変更されることを意味する。
【００２５】
用語「被験体」、「個体」及び「患者」は、処置のために評定される及び／又は処置される哺乳動物を指すために本明細書では交換可能に用いられる。ある実施形態において、前記哺乳動物はヒトである。従って、用語「被験体」、「個体」及び「患者」は、癌性組織を除去するために切除術（外科手術）を受けた者又はその候補である者を含めて、限定ではないが卵巣若しくは前立腺の腺癌、乳癌、膠芽腫などをはじめとする癌を有する個体を包含する。被験体は、ヒトである場合があるが、他の哺乳動物、特に、ヒト疾患の実験室モデルとして有用な哺乳動物、例えばマウス、ラットなど、も包含する。
【００２６】
用語「腫瘍」は、本明細書において用いられる場合、悪性であろうと良性であろうとすべての新生物性細胞成長及び増殖、並びにすべての前癌性及び癌性細胞及び組織を指す。
【００２７】
用語「癌」、「新生物」及び「腫瘍」は、細胞増殖に対する制御の有意な喪失を特徴とする異常成長表現型を呈示するような、自律的、無秩序成長を呈示する細胞を指すために、本明細書では交換可能に用いられる。一般に、本出願における検出、分析、分類又は処置のために興味のある細胞としては、前癌性（例えば良性）、悪性、前転移性、転移性及び非転移性細胞が挙げられる。癌の例としては、卵巣癌、膠芽腫、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路癌、甲状腺癌、腎癌、癌腫、黒色腫、頭頸部癌、及び脳癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
癌の「病理」は、患者の健康で幸福な状態（ｗｅｌｌ−ｂｅｉｎｇ）を損なわせるすべての現象を包含する。これには、限定ではないが、異常な又は制御不能な細胞成長；転移；隣接細胞の正常な機能化への干渉；サイトカイン又は他の分泌産物の異常レベルでの放出；炎症反応又は免疫応答の抑制又は悪化；新形成；前悪性病変；悪性病変；周囲又は遠隔組織又は器官、例えばリンパ節、の浸潤などが挙げられる。
【００２９】
本明細書において用いられる場合、用語「癌再発」及び「腫瘍再発」、並びにそれらの文法上の異形は、癌の診断後の新生物性又は癌性細胞のさらなる成長を指す。詳細には、さらなる癌性細胞成長が癌性組織において起こると、再発が起こるだろう。類似して、腫瘍の細胞が局所又は遠隔組織及び器官へと広まると「腫瘍進展」が起こる；従って、腫瘍進展は、腫瘍転移を包含する。腫瘍成長が、関与する組織の機能を正常器官機能の圧迫、破壊又は妨害によって損なわせるように局部的に広がると、「腫瘍浸潤」が起こる。
【００３０】
本明細書において用いられる場合、用語「転移」は、原癌性腫瘍の器官に直接接続されていない器官又は身体部分での癌性腫瘍の成長を指す。転移は、原癌性腫瘍の器官に直接接続されていない器官又は身体部分での検出不能量の癌性細胞の存在である微小転移を包含すると解釈されるだろう。転移は、原腫瘍部位からの癌細胞の離脱、並びに身体の他の部分への癌細胞の遊走及び／又は浸潤などのプロセスの幾つかの段階と定義されることもある。従って、本発明は、原癌性腫瘍の器官に直接接続されていない器官若しくは身体部分での１つ以上の癌性腫瘍のさらなる成長及び／又はその成長に至るまでのプロセスにおける任意の段階についてのリスクを判定する方法を考えている。
【００３１】
癌の性質に依存して、適切な患者試料が得られる。本明細書において用いられる場合、句「癌性組織試料」は、癌性腫瘍から得られる任意の細胞を指す。転移していない充実性腫瘍の場合、概して、外科的に除去された腫瘍から組織試料が得られ、従来の技術により試験用に調製されることとなる。
【００３２】
この定義は、生物由来の血液及び他の液体試料、固体組織試料、例えば生検検体若しくは組織培養物、又はそれらから得られる細胞及びその後代を包含する。この定義は、それらの獲得後に任意のやり方で、例えば試薬での処置；洗浄；又は癌細胞などの一定の細胞集団の富化によって、操作された試料も包含する。この定義は、特定のタイプの分子、例えば核酸、ポリペプチドなど、について富化された試料も包含する。用語「生体試料」は、臨床試料を包含し、並びに外科的切除によって得られる組織、生検によって得られる組織、培養での細胞、細胞上清、細胞溶解産物、組織試料、器官、骨髄、血液、血漿、血清及びこれらに類するものも包含する。「生体試料」は、患者の癌細胞から得られる試料、例えば、患者の癌細胞から得られるポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドを含む試料（例えば、ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドを含む細胞溶解産物又は他の細胞抽出物）；並びに患者からの癌細胞を含む試料を包含する。患者からの癌細胞を含む生体試料は、非癌性細胞も含む場合がある。
【００３３】
用語「診断」は、乳癌、前立腺癌又は他のタイプの癌の分子サブタイプの同定などの、分子若しくは病的状態、疾患又は容態の同定を指すために本明細書では用いられる。
【００３４】
用語「予後」は、卵巣癌などの新生物性疾患の再発、転移性進展及び薬物耐性をはじめとする、癌寄与死亡又は進行の尤度の予測を指すために本明細書では用いられる。用語「予測」は、観察、実験又は科学的推理に基づいて、予告する又は推定する行為を指すために本明細書では用いられる。一例では、医師は、患者が原発性腫瘍の外科的除去及び／又は化学療法後に癌再発なしに一定の期間生存する尤度を予測することが出来る。
【００３５】
本明細書において用いられる場合、用語「処置」、「処置すること」及びこれらに類するものは、効果を得ることを目的として、薬剤を投与すること又は手順（例えば、放射線、外科的手順など）を行うことを指す。前記効果は、疾患若しくはその症状を完全の若しくは部分的に予防する点から予防的である場合があり、並びに／又は疾患及び／若しくはその疾患の症状についての部分的な若しくは完全な治癒を果たす点から治療的である場合がある。「処置」は、本明細書において用いられる場合、哺乳動物における、特にヒトにおける、任意の転移性腫瘍の任意の処置に及び、並びに（ａ）疾患の素因を有することがあるが（例えば、一次疾患に随伴又は起因し得る疾患を含めて）疾患を有するとまだ診断されていない被験体において、疾患又は疾患の症状が起こらないようにすること；（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、その発生を阻止すること；及び（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患の退縮を生じさせることを包含する。腫瘍（例えば、癌）処置において、治療薬は、腫瘍細胞の転移を直接減少させることが出来る。
【００３６】
処置することは、寛解；軽快；症状の減少又は病態を患者にとってより許容可能にすること；変性又は衰退速度の減速；又は変性の最終点をより少ない衰弱にすることなどの任意の客観的又は主観的パラメータをはじめとする、癌の処置又は改善又は予防の成功の任意の徴候を指す場合がある。前記症状の処置又は改善は、医師による検査の結果をはじめとする客観的パラメータに基づく場合もあり又は主観的パラメータに基づく場合もある。従って、用語「処置すること」は、新形成、例えば腫瘍又は癌、に随伴する症状又は容態の発生を予防する若しくは遅らせるための、又は緩和するための、阻止するための又は阻害するための本発明の化合物又は薬剤の投与を包含する。用語「治療効果」は、被験体における疾患、疾患の症状又は疾患の副作用の低減、消失又は予防を指す。
【００３７】
一定の実施形態において、「と併用で」、「併用療法」及び「併用産物」は、本明細書において用いられる場合、第一の療法と前記化合物の患者への並行投与を指す。併用で投与されるとき、各成分は、同時に投与されることもあり、又は異なる時点で任意の順序で逐次的に投与されることもある。従って、各成分は、別々にだが所望の治療効果をもたらすために時間の点で十分に接近して投与され得る。
【００３８】
本発明によると、前記第一の療法は、任意の適する治療薬、例えば細胞傷害剤、であってもよい。細胞傷害剤の１つの例示的クラスは化学療法薬であり、例えば、それらは、ＡＸＬ又はＧＡＳ６シグナル伝達を阻害するための処置と併用されることがある。例示的化学療法薬としては、アルデスロイキン、アルトレタミン、アミホスチン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クラドリビン、シサプリド、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドロナビノール、デュオカルマイシン、エポエチンアルファ、エトポシド、フィルグラスチム、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、グラニセトロン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、インターフェロンアルファ、イリノテカン、ランソプラゾール、レバミソール、ロイコボリン、メゲストロール、メスナ、メトトレキサート、メトクロプラミド、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、オメプラゾール、オンダンセトロン、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（商標））、ピロカルピン、プロクロロペラジン、リツキシマブ、サプロイン（ｓａｐｒｏｉｎ）、タモキシフェン、タキソール、塩酸トポテカン、トラスツズマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン及び酒石酸ビノレルビンが挙げられるが、これらに限定されない。卵巣癌処置のために、ＡＸＬ又はＧＡＳ６シグナル伝達阻害剤と併用されることがある好ましい化学療法剤は、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（商標））である。
【００３９】
他の併用療法は、放射線、外科手術、及びホルモン枯渇（Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．、９６：１５０７４−９、１９９９）である。血管新生阻害剤も本発明の方法と併用されることがある。
【００４０】
本発明の医薬組成物と公知癌療法薬の「併用投与」は、前記公知薬物と本発明の組成物の両方が治療効果を及ぼすような時点での前記薬物とＡＸＬ阻害剤の投与を意味する。そのような付随的投与は、本発明の化合物の投与に対するその薬物の並行（すなわち同時での）、事前又は後投与を含み得る。当業者は、本発明の特定の薬物及び組成物についての投与の適切なタイミング、順番及び投薬量を難なく決定するだろう。
【００４１】
本明細書において用いられる場合、「無病生存」は、患者の寿命に対する癌の影響に関して、そのような腫瘍再発及び／又は進展が無いこと並びに診断後の患者の運命を指す。句「全生存」は、患者の死因が癌の影響に直接起因しない可能性にかかわらず、診断後の患者の運命を指す。句「無病生存の尤度」、「再発のリスク」及びそれらの異形は、癌の診断後の患者における腫瘍再発又は進展の確率を指し、この確率は、本発明のプロセスに従って決定される。
【００４２】
本明細書において用いられる場合、用語「相関する」又は「と相関する」、及びこれらに類する用語は、２つの事例間の統計的関連性を指し、この場合の事象は、数、データセット及びこれらに類するものを包含する。例えば、前記事象が数を伴うとき、正の相関（本明細書では「順相関」とも呼ばれる）は、一方が増加するにつれて他方も増加することを意味する。負の相関（本明細書では「逆相関」とも呼ばれる）は、一方が増加するにつれて他方が減少することを意味する。
【００４３】
「投薬単位」は、治療される特定の個体のための単位投薬量として適している物理的に別個の単位を指す。各単位は、必要な製薬用担体と共同で所望の治療効果（単数又は複数）を生じさせるように計算された所定量の活性化合物（単数又は複数）を含有することが出来る。投薬単位形態についての仕様は、（ａ）活性化合物（単数又は複数）のユニークな特性及び達成される特定の治療効果（単数又は複数）、並びに（ｂ）そのような活性化合物（単数又は複数）の配合技術分野に固有の制限による指図を受けることがある。
【００４４】
「医薬的に許容され得る賦形剤」は、一般に安全であり非毒性であり望ましい医薬組成物の調製に有用である賦形剤を意味し、人間用製薬用途ばかりでなく獣医学的用途に許容され得る賦形剤も包含する。そのような賦形剤は、固体、液体、半固体、又は、エーロゾル組成物の場合には、気体であってもよい。
【００４５】
「医薬的に許容され得る塩及びエステル」は、医薬的に許容され得る、及び望ましい薬理特性を有する、塩及びエステルを意味する。そのような塩は、化合物中に存在する酸性プロトンが無機又は有機塩基と反応出来る場合に形成され得る塩を包含する。適する無機塩としては、アルカリ金属、例えばナトリウム及びカリウム、マグネシウム、カルシウム並びにアルミニウムとで形成されるものが挙げられる。適する有機塩としては、アミン塩基、例えばエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎ−メチルグルカミン、及びこれらに類するものが挙げられる。そのような塩としては、無機酸（例えば、塩酸及び臭化水素酸）及び有機酸（例えば、酢酸、クエン酸、マレイン酸、並びにアルカン−及びアレーン−スルホン酸、例えばメタンスルホン酸及びベンゼンスルホン酸）とで形成される酸付加塩も挙げられる。医薬的に許容され得るエステルとしては、化合物中に存在するカルボキシ、スルホニルオキシ及びホスホンオキシ基から形成されるエステル、例えばＣ１−６アルキルエステル、が挙げられる。２つの酸性基が存在するとき、医薬的に許容され得る塩又はエステルは、モノ酸モノ塩若しくはエステル又はジ塩若しくはエステルであることがあり；及び類似して、２つより多くの酸性基が存在する場合、そのような基の一部又はすべてが塩形成又はエステル化されていることがある。本発明において名を挙げる化合物は、非塩形成形態若しくは非エステル化形態で存在することがあり、又は塩形成形態及び／若しくはエステル化形態で存在することがあり、並びにそのような化合物の命名は、原（非塩形成及び非エステル化）化合物とその医薬的に許容され得る塩及びエステルの両方を包含することを意図されている。また、本発明において名を挙げる一定の化合物は、１つより多くの立体異性体形態で存在することがあり、そのような化合物の命名は、すべての単一立体異性体、及びそのような立体異性体の（ラセミ体であろうと、そうでなかろうと）すべての混合物を包含することを意図されている。
【００４６】
組成物、担体、希釈剤及び試薬を指す場合、用語「医薬的に許容され得る」、「生理的に許容可能な」、及びそれらの文法上の異形は、交換可能に用いられ、及びそれらの材料が、その組成物の投与を妨げる程に望ましくない生理作用を生じさせることなく、ヒトに又はヒトに対して投与出来ることを表す。
【００４７】
「治療有効量」は、疾患を治療するために被験体に投与されたとき、その疾患の処置を果たすのに十分である量を意味する。
詳細な説明
【００４８】
本発明に従って、可溶性ＡＸＬ変異体、例えば、野生型ＡＸＬポリペプチドの結合活性に実質的に等しい又は前記結合活性より良好であるＧＡＳ６への結合活性を有する可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドを提供する。本発明の一部の実施形態において、前記可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、治療薬として利用される。
【００４９】
配列番号：１の天然配列を参照して、ＡＸＬタンパク質は、残基２７−１２８の免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインと、残基１３９−２２２の第二のＩｇ様ドメインと、残基２２５−３３２及び３３３−４２７のフィブロネクチン３型ドメインと、チロシンキナーゼドメインを含む残基４７３−８９４の細胞内ドメインとを含む。７７９、８２１及び８６６におけるチロシン残基は、受容体二量体化に基づいて自己リン酸化されることとなり、及び細胞内シグナル伝達分子のためのドッキング部位として役立つ。可溶性形態のポリペプチドを放出する天然切断部位は、残基４３７−４５１に存する。
【００５０】
本発明のために、可溶性形態のＡＸＬは、認識可能な親和性、例えば高親和性、でＧＡＳ６を結合するのに十分であるポリペプチドの部分であり、これは、通常はシグナル配列と膜貫通ドメインの間、すなわち一般には配列番号：１の残基１９−４３７あたり、に存するが、残基１９、２５、３０、３５、４０、４５、５０あたりから、残基１３２、４５０、４４０、４３０、４２０、４１０、４００、３７５、３５０から３２１あたり、例えば残基１９−１３２、の短縮バージョンを含む又は前記短縮バージョンから成ることもある。一部の実施形態において、可溶性形態のＡＸＬは、膜貫通ドメイン及び場合により細胞内ドメインを欠く。
【００５１】
本発明の可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチド（ｓＡＸＬ変異体）は、可溶性形態の野生型ＡＸＬの中に１つ以上のアミノ酸修飾、例えば、ＧＡＳ６に対するその親和性を増加させる１つ以上のアミノ酸修飾、を備えている。本発明によると、アミノ酸修飾は、当分野において公知の又は後に発見される任意の自然に発生する又は人工のアミノ酸修飾を包含する。一部の実施形態において、アミノ酸修飾は、自然に発生する突然変異、例えば置換、欠失、付加、挿入など、を包含する。一部の他の実施形態において、アミノ酸修飾は、既存のアミノ酸の別のアミノ酸、例えばその保存的等価物、での置換を包含する。さらに一部の他の実施形態において、アミノ酸修飾は、１つ以上の既存のアミノ酸の非天然アミノ酸での置換、又は１つ以上の非天然アミノ酸の挿入を包含する。なお一部の他の実施形態において、アミノ酸修飾は、少なくとも１、２、３、４、５又は６又は１０のアミノ酸突然変異又は変更を包含する。
【００５２】
一部の例示的実施形態において、１つ以上のアミノ酸修飾は、可溶性形態のＡＸＬの特性を改変する、例えば安定性、結合活性及び／又は特異性などに影響を及ぼす、ために用いられることがある。クローン化遺伝子のインビトロ突然変異誘発のための技術は公知である。突然変異を走査するためのプロトコルの例は、Ｇｕｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：２２（１９９３）；Ｂａｒａｎｙ、Ｇｅｎｅ  ３７：１１１−２３（１９８５）；Ｃｏｌｉｃｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  １９９：５３７−９（１９８５）；及びＰｒｅｎｔｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ  ２９：３０３−１３（１９８４）において見つけられるだろう。部位特異的突然変異誘発のための方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９、ｐｐ．１５．３−１５．１０８；Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ  １２６：３５−４１（１９９３）；Ｓａｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：５９２−６（１９９２）；Ｊｏｎｅｓ及びＷｉｎｉｓｔｏｒｆｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２：５２８−３０  （１９９２）；  Ｂａｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １８：７３４９−５５（１９９０）；Ｍａｒｏｔｔｉ及びＴｏｍｉｃｈ、Ｇｅｎｅ  Ａｎａｌ  Ｔｅｃｈ  ６：６７−７０（１９８９）；並びにＺｈｕ  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １７７：１２０−４（１９８９）において見つけられるだろう。
【００５３】
一部の実施形態において、本発明のｓＡＸＬ変異体は、野生型ＡＸＬ（配列番号：１）の残基１８から１３０、残基１０から１３５、残基１５から４５、残基６０から６５、残基７０から８０、残基８５から９０、残基９１から９９、残基１０４から１１０、残基１１１から１２０、残基１２５から１３０、残基１９から４３７、残基１３０から４３７、残基１９から１３２、残基２１から１３２、残基２１から１２１、残基２６から１３２又は残基２６から１２１のうちの１つ以上の領域内に１つ以上のアミノ酸修飾を備えている。一部の他の実施形態において、本発明のｓＡＸＬ変異体は、野生型ＡＸＬ（配列番号：１）の残基２０から１３０、残基３７から１２４又は残基１４１から２１２のうちの１つ以上の領域内に１つ以上のアミノ酸修飾を備えている。さらに一部の他の実施形態において、本発明のｓＡＸＬ変異体は、野生型ＡＸＬ（配列番号：１）の位置１９、２３、２６、２７、３２、３３、３８、４４、６１、６５、７２、７４、７８、７９、８６、８７、８８、９０、９２、９７、９８、１０５、１０９、１１２、１１３、１１６、１１８、１２７又は１２９のうちの１つ以上の位置に１つ以上のアミノ酸修飾を備えている。
【００５４】
さらに一部の他の実施形態において、本発明のｓＡＸＬ変異体は、一切の限定なく１）Ａ１９Ｔ、２）Ｔ２３Ｍ、３）Ｅ２６Ｇ、４）Ｅ２７Ｇ又はＥ２７Ｋ、５）Ｇ３２Ｓ、６）Ｎ３３Ｓ、７）Ｔ３８Ｉ、８）Ｔ４４Ａ、９）Ｈ６１Ｙ、１０）Ｄ６５Ｎ、１１）Ａ７２Ｖ、１２）Ｓ７４Ｎ、１３）Ｑ７８Ｅ、１４）Ｖ７９Ｍ、１５）Ｑ８６Ｒ、１６）Ｄ８７Ｇ、１７）Ｄ８８Ｎ、１８）Ｉ９０Ｍ又はＩ９０Ｖ、１９）Ｖ９２Ａ、Ｖ９２Ｇ又はＶ９２Ｄ、２０）Ｉ９７Ｒ、２１）Ｔ９８Ａ又はＴ９８Ｐ、２２）Ｔ１０５Ｍ、２３）Ｑ１０９Ｒ、２４）Ｖ１１２Ａ、２５）Ｆ１１３Ｌ、２６）Ｈ１１６Ｒ、２７）Ｔ１１８Ａ、２８）Ｇ１２７Ｒ又はＧ１２７Ｅ及び２９）Ｅ１２９Ｋ並びにそれらの組み合わせを含む、１つ以上のアミノ酸修飾を備えている。
【００５５】
さらに一部の他の実施形態において、本発明のｓＡＸＬ変異体は、野生型ＡＸＬ（配列番号：１）の位置３２、８７、９２若しくは１２７又はそれらの組み合わせにおける１つ以上のアミノ酸修飾、例えばＧ３２Ｓ；Ｄ８７Ｇ；Ｖ９２Ａ及び／又はＧ１２７Ｒ、を備えている。さらに一部の他の実施形態において、本発明のｓＡＸＬ変異体は、野生型ＡＸＬ（配列番号：１）の位置２６、７９、９２、１２７又はそれらの組み合わせにおける１つ以上のアミノ酸修飾、例えばＥ２６Ｇ、Ｖ７９Ｍ；Ｖ９２Ａ及び／又はＧ１２７Ｅ、を備えている。
【００５６】
本発明によると、本発明のｓＡＸＬ変異体は、さらに修飾される、例えば様々な目的で多種多様な他のオリゴペプチド又はタンパク質に連結される、ことがある。例えば、本発明のｓＡＸＬ変異体に対して様々な翻訳後又は発現後修飾が行われることがある。例えば、適切なコーディング配列を利用することにより、ファルネシル化又はプレニル化を生じさせることが出来る。一部の実施形態において、本発明のｓＡＸＬ変異体はＰＥＧ化されることがあり、この場合、そのポリエチレンオキシ基が血流中での寿命増進に備える。本発明のｓＡＸＬ変異体は、補体結合していることがある、ＩｇＧアイソタイプのＦｃなどの、他のタンパク質と、リシン、アブリン、ジフテリア毒素若しくはこれらに類するものなどの毒素と、又はターゲット細胞上の特定の部分へのターゲティングを可能にする特定の結合剤と、化合されることもある。
【００５７】
一部の実施形態において、本発明のｓＡＸＬ変異体は融合タンパク質である、例えば、第二のポリペプチドとインフレームで融合されている。一部の実施形態において、前記第二のポリペプチドは、例えば融合タンパク質が循環から急速に一掃されることとならないように、融合タンパク質のサイズを増加させることが出来る。一部の他の実施形態において、前記第二のポリペプチドは、Ｆｃ領域の一部又は全部である。一部の他の実施形態において、前記第二のポリペプチドは、Ｆｃと実質的に同様である、例えばサイズ増加及び／又はＩｇ分子とのさらなる結合若しくは相互作用をもたらす、任意の適するポリペプチドである。さらに一部の他の実施形態において、前記第二のポリペプチドは、アルブミンタンパク質、例えばヒト血清アルブミンタンパク質、の一部又は全部である。
【００５８】
一部の他の実施形態において、前記第二のポリペプチドは、ｓＡＸＬ変異体の取り扱い、例えばｓＡＸＬ変異体の精製、に、又はインビトロ若しくはインビボでのその安定性の増加に有用である。例えば、本発明のｓＡＸＬ変異体は、キメラ又は融合ポリペプチドを生じさせる結果となるように、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常ドメインの一部と化合されることがある。これらの融合タンパク質は精製を助長し、及びインビボで増加された半減期を示す。１つの報告例は、ヒトＣＤ４−ポリペプチドの最初の２つのドメインと哺乳動物免疫グロブリンの重又は軽鎖の定常領域の様々なドメインとから成るキメラタンパク質を説明している。欧州特許出願公開第３９４，８２７号；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３３１：８４−８６、１９８８。（ＩｇＧのために）ジスルフィド結合二量体構造を有する融合タンパク質は、他の分子を結合する及び中和する点で、単量体分泌タンパク質又はタンパク質断片のみより効率的である場合もある。Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６４、１９９５。
【００５９】
さらに一部の他の実施形態において、前記第二のポリペプチドは、融合ポリペプチドの精製を助長するペプチドなどのマーカー配列である。例えば、前記マーカーアミノ酸配列は、数ある中でもｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、Ｃａｌｉｆ．、９１３１１）に備えられているタグなどのヘキサ−ヒスチジンペプチドであってもよく、これらの多くが市販されている。例えばＧｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２１−８２４、１９８９に記載されているように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の適便な精製に備える。精製に有用なもう１つのペプチドタグ、「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する。Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７、１９８４。
【００６０】
なお一部の他の実施形態において、前記第二のポリペプチドは、本発明のｓＡＸＬ変異体の特性の向上に有用なエンティティーである。例えば、宿主細胞からの精製又はその後の取り扱い及び保管中の安定性及び耐久性を向上させるために、追加のアミノ酸、特に荷電アミノ酸、の領域が前記ポリペプチドのＮ末端に付加されることがある。また、精製を助長するために本発明のｓＡＸＬ変異体にペプチド部分が付加され、その後、そのポリペプチドの最終調製前に除去されることがある。ポリペプチドの取り扱いを助長するためのペプチド部分の付加は、当技術分野においてよく知られている常例的技術である。
【００６１】
なおさらに一部の実施形態において、本発明のｓＡＸＬ変異体は、野生型ＡＸＬに少なくとも等しい又は野生型ＡＸＬより良好である、ＧＡＳ６への結合活性を有する。一部の他の実施形態において、本発明のｓＡＸＬ変異体は、野生型ＡＸＬのものより少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍又は６倍大きい、ＧＡＳ６への結合活性又は親和性を有する。一部の他の実施形態において、本発明のｓＡＸＬ変異体は、少なくとも約１×１０−６、１×１０−７、１×１０−８又は１×１０−９Ｍの、ＧＡＳ６への結合活性又は親和性を有する。さらに一部の他の実施形態において、本発明のｓＡＸＬ変異体は、インビボ、インビトロ又は両方でＧＡＳ６への野生型ＡＸＬ結合を阻害することが出来る、前記結合を阻害する、又は前記結合と競合する。さらに一部の他の実施形態において、本発明のｓＡＸＬ変異体は、本出願の実施例２に提供するようなＡＸＬ  Ｓ６−１、ＡＸＬ  Ｓ６−２及び／又はＡＸＬ  Ｓ６−５の結合を阻害する、又は前記結合に競合する。さらに一部の他の実施形態において、本発明のｓＡＸＬ変異体は、本出願の実施例２に提供する任意のｓＡＸＬ変異体の結合を阻害する、又は前記結合に競合する。
【００６２】
ＧＡＳ６に結合する分子の能力は、例えばアッセイプレートにコーティングされたＧＡＳ６に結合する推定リガンドの能力によって、判定され得る。１つの実施形態において、ＧＡＳ６への本発明のｓＡＸＬ変異体の結合活性は、リガンド、例えばＧＡＳ６又はｓＡＸＬ変異体、を固定することによって、アッセイされ得る。例えば、前記アッセイは、Ｎｉ活性化ＮＴＡ樹脂ビーズ上へのＨｉｓタグに融合されたＧＡＳ６の固定化を含むことがある。薬剤は、ある期間、所与の温度でインキュベートされた適切なバッファー及びビーズに添加され得る。未結合材料を除去するための洗浄後、結合タンパク質は、例えばＳＤＳ、高ｐＨのバッファー、及びこれらに類するもので遊離され、分析され得る。
【００６３】
なおさらに他の実施形態において、本発明のｓＡＸＬ変異体は、野生型ＡＸＬの末端安定性より良好な末端安定性を有する。一部の実施形態において、本発明のｓＡＸＬ変異体の融解温度は、野生型ＡＸＬの融解温度より少なくとも５℃、１０℃、１５℃又は２０℃高い。
【００６４】
本発明によると、本発明のｓＡＸＬ変異体は、本発明のｓＡＸＬ変異体の一次配列を改変しない１つ以上の修飾を備えている場合もある。例えば、そのような修飾としては、ポリペプチドの化学的誘導体化、例えばアセチル化、アミド化、カルボキシル化など、を挙げることが出来る。そのような修飾としては、グリコシル化の修飾、例えば、ポリペプチドのグリコシル化パターンをその合成及びプロセッシング中に又はさらなるプロセッシング段階において修飾することにより、例えば、哺乳動物グリコシル化又は脱グリコシル化酵素などのグリコシル化に影響を及ぼす酵素にそのポリペプチドを暴露することにより、行われるものも挙げることが出来る。一部の実施形態において、本発明のｓＡＸＬ変異体は、リン酸化アミノ酸残基、例えばホスホチロシン、ホスホセリン又はホスホトレオニン、を有するｓＡＸＬ変異体を包含する。
【００６５】
一部の他の実施形態において、本発明のｓＡＸＬ変異体は、タンパク質分解に対するそれらの耐性を向上させるように、又は可溶性を最適化するように、又はそれらを治療薬としてより適するものにするように、さらに修飾された変異体を包含する。例えば、本発明のｓＡＸＬ変異体は、天然に存在するＬ−アミノ酸以外の残基、例えばＤ−アミノ酸又は天然に存在しない合成アミノ酸、を含有するｓＡＸＬ変異体のアナログをさらに包含する。Ｄ−アミノ酸は、そのアミノ酸残基の一部が置換されていてもよく、又はすべてが置換されていてもよい。
【００６６】
さらに一部の他の実施形態において、本発明のｓＡＸＬ変異体は、共有結合で又は非共有結合で連結された少なくとも２つの同じ又は異なるｓＡＸＬ変異体を包含する。例えば、一部の実施形態において、本発明のｓＡＸＬ変異体は、例えば適切なサイズを有するが望ましくない凝集を回避するように、共有結合で連結された２、３、４、５又は６つの同じ又は異なるｓＡＸＬ変異体を包含する。
【００６７】
本発明によると、本発明のｓＡＸＬ変異体は、当分野において公知の又は後に発見される任意の適する手段によって生産され得る、例えば、真核又は原核細胞から生産、インビトロで合成、などされ得る。前記タンパク質が原核細胞によって生産される場合、それは、アンフォールディング、例えば熱変性、ＤＴＴ還元など、によりさらにプロセッシングされることがあり、及び当技術分野において公知の方法を用いてさらにリフォールディングされることがある。
【００６８】
前記ポリペプチドは、当技術分野において公知であるような従来の方法を用いて、インビトロ合成によって調製されることがある。様々な商用合成機器、例えば、カリフォルニア州フォスターシティーのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂａｃｋｍａｎなどによる自動合成装置が利用可能である。合成装置を使用することにより、天然に存在するアミノ酸が非天然アミノ酸で置換されることがある。個々の配列及び調製の仕方は、利便性、経済性、必要な純度、及びこれらに類するものによって決められるであろう。
【００６９】
前記ポリペプチドは、従来の組換え合成法に従って単離及び精製されることもある。発現宿主から溶解産物が調製され、ＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、又は他の精製技術を用いてその溶解産物が精製されることがある。通例、使用される組成物は、その産物の調製方法及びその精製方法に関連した不純物に関連して、少なくとも２０重量％、より通常は少なくとも約７５重量％、好ましくは少なくとも約９５重量％、及び治療目的では、通常、少なくとも約９９．５重量％の所望の産物を含む。通常、前記百分率は、全タンパク質に基づくであろう。
【００７０】
コーディング配列及び適切な転写／翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築するために、当業者に周知である方法が使用され得る。これらの方法としては、例えば、インビトロ組み換えＤＮＡ技術、合成技術及びインビボ組み換え／遺伝子組み換えが挙げられる。或いは、興味のあるポリペプチドをコードすることが出来るＲＮＡが化学合成され得る。当業者は、本発明のポリペプチドのいずれについても、適するコーディング配列を生じさせるために周知のコドン使用頻度表及び合成方法を容易に利用することが出来る。直接化学合成法としては、例えば、Ｎａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９９のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９−１５１のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．、２２：１８５９−１８６２のジエチルホスホルアミダイト法；及び米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体法が挙げられる。化学合成は、一本鎖オリゴヌクレオチドを生成する。これは、相補配列でのハイブリダイゼーションにより、又はテンプレートとしてその一本鎖を使用するＤＮＡポリメラーゼでの重合により、二本鎖ＤＮＡに転化され得る。ＤＮＡの化学合成は、多くの場合、約１００塩基の配列に制限されるが、より短い配列のライゲーションによって、より長い配列が得られ得る。或いは、部分配列がクローン化され、適切な制限酵素を使用して適切な部分配列が切断されることもある。
【００７１】
核酸は、単離され、相当な純度で得られ得る。通常、他の天然に存在する核酸配列が実質的に無い、一般に、少なくとも約５０％、通常は少なくとも約９０％の純度である核酸、例えばＤＮＡ又はＲＮＡのいずれか、が得られることとなり、これらは、概して「組換体」である、例えば、自然に存在する染色体上では通常は会合していない１つ以上のヌクレオチドが隣接している。本発明の核酸は、線状分子として提供されることがあり、又は環状分子内に備えられていることがあり、及び自律複製分子（ベクター）内に又は複製配列の無い分子内に備えられていることがある。前記核酸分子の発現は、それら自体の配列によって調節されることがあり、又は当技術分野において公知の他の調節配列によって調節されることがある。本発明の核酸は、トランスフェリンポリカチオン媒介ＤＮＡ移入、裸の又は封入された核酸でのトランスフェクション、リポソーム媒介ＤＮＡ移入、ＤＮＡ被覆ラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、エレクトロポレーション、遺伝子ガン、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、及びこれらに類するものなどの、当技術分野において利用可能な様々な技術を用いて、適する宿主細胞に導入されることがある。
【００７２】
一部の実施形態において、本発明は、構成的に又は１つ以上の調節要素のもとで本発明の１つ以上のｓＡＸＬ変異体をインビトロ又はインビボで発現させるための発現ベクターを提供する。一部の実施形態において、本発明は、構成的に又は１つ以上の調節要素のもとで本発明のｓＡＸＬ変異体を発現するための１つ以上の発現ベクターを含む細胞集団を提供する。
【００７３】
本発明のもう１つの態様に従って、ＧＡＳ６タンパク質に特異的に結合する単離された抗体又はそれらの断片を提供する。ＧＡＳ６（成長停止特異的タンパク質６）は、構造的には血漿ビタミンＫ依存性タンパク質のファミリーに属する。ＧＡＳ６は、天然抗凝血性タンパク質Ｓとの高い構造的相同性を有し、同じモジュール組成を共有し、４０％配列同一性を有する。ＧＡＳ６は、ＴＡＭファミリーの受容体チロシンキナーゼ、Ｔｙｒｏ３、ＡＸＬ及びＭｅｒＴＫ、とのその相互作用により成長因子様特性を有する。ヒトＧＡＳ６は、リン脂質膜への結合を媒介するガンマ−カルボキシグルタメート（Ｇｌａ）リッチドメインと、４つの上皮成長因子様ドメインと２つのラミニンＧ様（ＬＧ）ドメインとから成る６７８アミノ酸タンパク質である。ヒトＧＡＳ６の転写産物変異体の配列は、ＧｅｎｂａｎｋにおいてそれぞれＮＭ＿００１１４３９４６．１；ＮＭ＿００１１４３９４５．１；及びＮＭ＿０００８２０．２で入手され得る。
【００７４】
ＧＡＳ６は、そのビタミンＫ依存性ＧＬＡ（ガンマ−カルボキシグルタミン酸）モジュールによりホスファチジルセリン含有膜と及びそのカルボキシ末端ＬａｍＧドメインによりＴＡＭ膜受容体と相互作用する、ユニークな作用メカニズムを用いる。
【００７５】
本発明によると、本発明の単離された抗体は、ＧＡＳ６に対する認識可能な結合特異性を有する任意の単離された抗体を包含する。一部の実施形態において、単離された抗体は、部分的又は完全ヒト化抗体である。一部の他の実施形態において、単離された抗体は、モノクローナル又はポリクローナル抗体である。さらに一部の他の実施形態において、単離された抗体は、例えば異なる源からの一貫領域、可変領域及び／若しくはＣＤＲ３又はそれらの組み合わせを有する、キメラ抗体である。さらに一部の他の実施形態において、単離された抗体は、本明細書に記載する様々な特徴の組み合わせである。
【００７６】
本発明によると、本発明の単離された抗体の断片は、ＧＡＳ６へのポリペプチドの認識可能な特異的結合に十分又は必要である抗体の領域を含有するポリペプチドを（抗体足場に関連して又は非抗体足場関連して）包含する。一部の実施形態において、本発明の単離された抗体の断片としては、可変軽鎖、可変重鎖、重鎖若しくは軽鎖の１つ以上のＣＤＲ又はそれらの組み合わせ、例えばＦａｂ、Ｆｖなど、が挙げられる。一部の実施形態において、本発明の単離された抗体の断片としては、一本鎖抗体、例えばＳｃＦｖ、を含有するポリペプチドが挙げられる。さらに一部の実施形態において、本発明の単離された抗体の断片としては、単独での可変領域、又はＦｃ領域の一部、例えばＣＨ１領域、との組み合わせでの可変領域が挙げられる。なお一部の実施形態において、本発明の単離された抗体の断片としては、ミニボディー、例えばＶＬ−ＶＨ−ＣＨ３、又ダイアボディーが挙げられる。
【００７７】
一部の実施形態において、本発明の単離された抗体は、ＡＸＬと相互作用する１つ以上のアミノ酸領域に含まれる又は前記アミノ酸領域によって提供されるエピトープに結合する。一部の他の実施形態において、本発明の単離された抗体は、ＧＡＳ６の１つ以上のアミノ酸領域、例えばＧＡＳ６のＬ２９５−Ｔ３１７、Ｅ３５６−Ｐ３７２、Ｒ３８９−Ｎ３９６、Ｄ３９８−Ａ４０６、Ｅ４１３−Ｈ４２９及びＷ４５０−Ｍ４６８、に含まれる又は前記アミノ酸領域によって提供されるエピトープに結合する。
【００７８】
さらに一部の他の実施形態において、本発明の単離された抗体は、１つ以上のアミノ酸領域、例えばＬＲＭＦＳＧＴＰＶＩＲＬＲＦＫＲＬＱＰＴ（配列番号：３）、ＥｌＶＧＲＶＴＳＳＧＰ（配列番号：４）、ＲＮＬＶＩＫＶＮ（配列番号：５）、ＤＡＶＭＫＩＡＶＡ（配列番号：６）、ＥＲＧＬＹＨＬＮＬＴＶＧＩＰＦＨ（配列番号：７）及びＷＬＮＧＥＤＴＴＩＱＥＴＶＶＮＲＭ（配列番号：８）、に含まれる又は前記アミノ酸領域によって提供されるエピトープに結合する。
【００７９】
さらに一部の他の実施形態において、本発明の単離された抗体は、ＧＡＳ６のＬ２９５−Ｔ３１７、Ｅ３５６−Ｐ３７２、Ｒ３８９−Ｎ３９６、Ｄ３９８−Ａ４０６、Ｅ４１３−Ｈ４２９及びＷ４５０−Ｍ４６８の領域内に含まれる又は前記領域内の少なくとも１、２、３、４、５又は６つのアミノ酸によって提供されるエピトープに結合する。さらに一部の他の実施形態において、本発明の単離された抗体は、ＬＲＭＦＳＧＴＰＶＩＲＬＲＦＫＲＬＱＰＴ（配列番号：３）、ＥｌＶＧＲＶＴＳＳＧＰ（配列番号：４）、ＲＮＬＶＩＫＶＮ（配列番号：５）、ＤＡＶＭＫＩＡＶＡ（配列番号：６）、ＥＲＧＬＹＨＬＮＬＴＶＧＩＰＦＨ（配列番号：７）及びＷＬＮＧＥＤＴＴＩＱＥＴＶＶＮＲＭ（配列番号：８）の領域内に含まれる又は前記領域内の少なくとも１、２、３、４、５又は６つのアミノ酸によって提供されるエピトープに結合する。
【００８０】
なお一部の他の実施形態において、本発明の単離された抗体は、野生型ＡＸＬ又は本発明のｓＡＸＬ変異体とＧＡＳ６の間の結合を阻害出来る、前記結合を阻害する、又は前記結合と競合する。
【００８１】
本発明によると、本発明のｓＡＸＬ変異体と単離された抗体の両方は、治療応用に、例えば人間の処置に、適する医薬組成物で提供され得る。一部の実施形態において、本発明の医薬組成物は、本発明の１つ以上の治療エンティティー、例えばＧＡＳに対するｓＡＸＬ変異体及び／若しくは単離された抗体又はそれらの医薬的に許容され得る塩、エステル若しくは溶媒和物或いはそれらの任意のプロドラッグ、を備えている。一部の実施形態において、本発明の医薬組成物は、別の細胞傷害剤、例えば別の抗腫瘍剤、との組み合わせで本発明の１つ以上の治療エンティティーを備えている。さらに一部の他の実施形態において、本発明の医薬組成物は、別の医薬的に許容され得る賦形剤との組み合わせで本発明の１つ以上の治療エンティティーを備えている。
【００８２】
なお一部の他の実施形態において、本発明の治療エンティティーは、活性治療薬、すなわち、と様々な他の医薬的に許容され得る成分とを含む医薬組成物として、多くの場合、投与される。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１５版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９８０参照）。好ましい形態は、所期の投与方式及び治療応用に依存する。前記組成物は、所望される調合物に依存して、医薬的に許容され得る非毒性担体又は希釈剤も備えていることがあり、前記担体又は希釈剤は、動物又はヒトへの投与用の医薬組成物を調合するために一般に使用されるビヒクルと定義される。前記希釈剤は、併用物の生物活性に影響を及ぼさないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液及びハンクス溶液である。加えて、前記医薬組成物又は調合物は、他の担体、アジュバント又は非毒性、非治療用、非免疫原性安定剤及びこれらに類するものを備えていることもある。
【００８３】
なお一部の他の実施形態において、本発明の医薬組成物は、タンパク質、多糖類、例えばキトサン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸及びコポリマー（例えば、ラテックス官能化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）、アガロース、セルロース、及びこれらに類するもの）、ポリマーのアミノ酸、アミノ酸コポリマー並びに脂質凝集体（例えば、油滴又はリポソーム）などの、大きい、ゆっくりと代謝される高分子を備えていることもある。加えて、これらの担体は、免疫刺激剤（すなわち、アジュバント）として機能することが出来る。
【００８４】
本発明のさらにもう１つの態様に従って、ＡＸＬシグナル伝達経路及び／又はＧＡＳ６シグナル伝達経路を阻害することによって腫瘍転移又は腫瘍浸潤を処置する、低減する又は予防するための方法を提供する。一部の実施形態において、本発明の方法は、ＡＸＬの活性、ＧＡＳ６の活性、又はＡＸＬとＧＡＳ６の相互作用を阻害することを包含する。例えば、ＡＸＬ又はＧＡＳ６の活性は、遺伝子発現レベル、ｍＲＮＡプロセッシングレベル、翻訳レベル、翻訳後レベル、タンパク質活性化レベルなどで阻害され得る。一部の他の例おいて、ＡＸＬ又はＧＡＳ６の活性は、小分子、生体分子、例えばポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、抗体薬物コンジュゲートなど、によって阻害され得る。一部の他の例において、ＡＸＬ又はＧＡＳ６の活性は、本発明の１つ以上のｓＡＸＬ変異体又は単離された抗体によって阻害され得る。
【００８５】
さらに他の実施形態において、本発明の方法は、治療有効量又は有効用量の本発明の治療エンティティー、例えば、ＡＸＬ活性若しくはＧＡＳ６活性の阻害剤、又はＡＸＬとＧＡＳ６の間の相互作用の阻害剤、を治療の必要がある被験者に投与することを包含する。一部の実施形態において、本明細書に記載する、例えば転移性癌の処置のための、本発明の治療エンティティーの有効用量は、投与の手段、ターゲット部位、患者の生理状態、患者がヒトであるのか動物であるのか、施される他の薬物療法、及び処置が予防的であるのか治療的であるのかをはじめとする多くの異なる要因に依存して変わる。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物をはじめとする非ヒト哺乳動物も処置されることがある。処置投薬量は、安全性及び効力を最適にするためにタイトレーションを必要とする。
【００８６】
一部の実施形態において、前記投薬量は、約０．０００１から１００ｍｇ／ｋｇ宿主体重、及びより通常は０．０１から５ｍｇ／ｋｇ宿主体重の範囲であり得る。例えば、投薬量は、１ｍｇ／ｋｇ体重、若しくは１０ｍ／ｋｇ体重、又は１−１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であってもよい。例示的処置レジメは、２週間ごとに１回、又は１ヶ月に１回、又は３から６ヶ月ごとに１回の投与を伴う。本発明の治療エンティティーは、通常は幾度も投与される。単回投薬間の間隔は、週１回、月１回又は年１回であってもよい。間隔は、患者における治療エンティティーの血中レベルを測定することによって示されることに応じて不規則であってもよい。或いは、本発明の治療エンティティーは、徐放調合物として投与されることがあり、この場合、より少ない頻度での投与が求められる。投薬量及び頻度は、患者におけるそのポリペプチドの半減期に依存して変わる。
【００８７】
予防応用の場合、比較的低い投薬量が長期間にわたって比較的低い頻度間隔で投与される。一部の患者は、残りの寿命にわたって処置を受け続ける。治療応用の場合、疾患の進行が低減又は終結されるまで、好ましくは、患者が疾患の症状の部分的な又は完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高い用量が時として必要とされる。その後、患者は、予防レジメを施されることがある。
【００８８】
なお他の実施形態において、本発明の方法は、卵巣癌、乳癌、肺癌、肝臓癌、結腸癌、胆嚢癌、膵臓癌、前立腺癌及び／又は膠芽腫の腫瘍転移又は腫瘍浸潤の処置、低減又は予防を包含する。
【００８９】
なおさらに一部の他の実施形態では、予防応用のために、疾患又は容態に罹患しやすい又は別様に疾患又は容態のリスクを有する患者に、その疾患のリスクの消失若しくは低減、その疾患の重症度の低下、又はその疾患の発症の遅延に十分な量で、医薬組成物又は薬物が投与され、前記疾患は、その疾患の生化学的、組織学的及び／又は行動的症状、その合併症、並びにその疾患の発生中に提示される中間的病的表現型を包含する。
【００９０】
なおさらに一部の他の実施形態では、治療応用のために、そのような疾患に罹患しやすい又はすでに罹患している患者に、その疾患の（生化学的、組織学的及び／又は行動的）症状の治癒又は少なくとも部分的阻止に十分な量で、本発明の治療エンティティーが投与され、前記疾患は、その合併用及びその疾患の発生中の中間的病的表現型を包含する。治療的又は予防的処置を遂行するために妥当な量は、治療又は予防有効量と定義される。予防及び治療レジメ両方において、薬剤は、通常、十分な応答が達成されるまで幾度かの投薬で投与される。典型的には、その応答がモニターされ、癌の再発があると反復投薬が施される。
【００９１】
本発明によると、転移性癌の処置のための組成物は、非経口、局所、静脈内、腫瘍内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、腹膜内、鼻腔内又は筋肉内手段によって投与されることがある。最も典型的な投与経路は静脈内又は腫瘍内経路であるが、他の経路も同じく有効である。
【００９２】
腹膜内投与のための本発明の組成物は、水、油、食塩水、グリセロール又はエタノールなどの滅菌液であってもよい製薬用担体を伴う生理的に許容され得る希釈剤中の物質の溶液又は懸濁液の注射用投薬量として投与されることがある。加えて、湿潤又は乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝物質及びこれらに類するものなどの補助物質が組成物中に存在することがある。医薬組成物の他の成分は、石油、動物、植物又は合成起源のもの、例えば落花生油、大豆油及び鉱物油、である。一般に、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなどのグリコールは、特に注射用溶液のための、液体担体として好ましい。抗体は、活性成分の徐放を可能にするような様式で調合され得るデポー注射又はインプラント製剤の形態で投与されることがある。例示的組成物は、ＨＣｌでｐＨ６．０に調整された、５０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジンと１５０ｍＭ  ＮａＣｌとから成る水性バッファー中で調合された５ｍｇ／ｍＬのモノクローナル抗体を含む。
【００９３】
典型的に、組成物は、注射剤として、水溶液又は水性懸濁液いずれかとして、調製される；注射前の液体ビヒクルへの溶解又は懸濁に適する固体形態も調製され得る。前記製剤は、上で論じたように、アジュバント効果強化のために乳化される又はリポソーム若しくは微粒子、例えばポリラクチド、ポリグリコリド若しくはコポリマー、に封入されることもある。Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７、１９９０及びＨａｎｅｓ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２８：９７−１１９、１９９７。本発明の薬剤は、活性成分の徐放又は拍動放出を可能にするような様式で調合され得るデポー注射又はインプラント製剤の形態で投与されることがある。
【００９４】
他の投与方式に適する追加の調合物としては、経口、鼻腔内及び肺用調合物、坐剤及び経皮塗布薬が挙げられる。
【００９５】
坐剤のための結合剤及び担体としては、例えば、ポリアルキレングリコール又はトリグリセリドが挙げられる；そのような坐剤は、０．５％から１０％、好ましくは１％−２％の範囲で活性成分を含有する混合物から形成されることがある。経口調合物は、製薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース及び炭酸マグネシウムなどの賦形剤を備えている。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放性調合物又は粉末の形態をとり、及び１０％−９５％、好ましくは２５％−７０％の活性成分を含有する。
【００９６】
局所適用は、結果として経皮又は皮内送達を生じさせることが出来る。局所投与は、前記薬剤とコレラ毒素又はその解毒誘導体若しくはサブユニット又は他の類似の細菌毒素との共同投与によって助長されることがある。Ｇｌｅｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８５１、１９９８。共同投与は、それらの成分を混合物として使用することによって、又は化学的架橋若しくは融合タンパク質としての発現により得られる連結分子として使用することによって、達成され得る。
或いは、経皮送達は、皮膚パッチを使用して又はトランスフェロソームを使用して達成され得る。Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：３５２１−２４、１９９５；Ｃｅｖｃ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３６８：２０１−１５、１９９８．
【００９７】
一般に、前記医薬組成物は、無菌の、実質的に等張性のものとして、及び米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）のすべての適正製造規範（Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ：ＧＭＰ）に完全に従って調合される。
【００９８】
好ましくは、本明細書に記載する治療有効用量の抗体組成物は、実質的毒性を生じさせることなく治療的恩恵をもたらすであろう。
【００９９】
本明細書に記載するタンパク質の毒性は、細胞培養又は実験動物での標準的製薬学的手順により、例えばＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）又はＬＤ１００（集団の１００％に致死的な用量）を決定することにより、判定され得る。毒性効果と治療効果の間の用量比が治療指数である。これらの細胞培養アッセイ及び動物研究から得られるデータは、人間での使用のために毒性でない投薬量範囲を公式化する際に使用され得る。本明細書に記載するタンパク質の投薬量は、毒性が殆ど又は全く無い有効用量を含む循環濃度範囲内に好ましくは存する。前記投薬量は、利用される剤形及び利用される投与経路に依存してこの範囲内で変動し得る。正確な調合、投与経路及び投薬量は、患者の容態を考慮して個々の医師により選択され得る（例えば、Ｆｉｎｇｌ  ｅｔ  ａｌ．、１９７５、Ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｃｈ．１を参照のこと）。
【０１００】
本発明の組成物（例えば、可溶性ＡＸＬ変異体及びそれらの調合物）と使用のための説示とを含むキットも本発明の範囲内である。前記キットは、少なくとも１つの追加の試薬をさらに含有することがある。典型的に、キットは、そのキットの内容物の所期の用途を示すラベルを備えている。用語ラベルは、キット上に若しくはキットと共に供給される、又はキットに別様に付随する任意の記載又は記録材料を包含する。
【０１０１】
本発明のさらにもう１つの態様に従って、興味のある被験体からの生体試料におけるＡＸＬ活性又はＧＡＳ６活性のレベルを検出及び／又は判定することにより腫瘍浸潤及び／又は転移を被る腫瘍の能力を判定するための方法を提供する。一部の実施形態において、ＡＸＬ活性又はＧＡＳ６活性のレベルは、ｍＲＮＡ発現のレベル、タンパク質発現のレベル、タンパク質活性化のレベル、又はＡＸＬ若しくはＧＡＳ６の活性に直接若しくは間接的に対応する任意の適する指標によって測定される。一部の実施形態において、生体試料中のＡＸＬ活性又はＧＡＳ６活性のレベルは、所定のレベル、例えば、腫瘍浸潤若しくは腫瘍転移を発生していない腫瘍からの又は正常組織からの試料の集団に基づいてＡＸＬ活性又はＧＡＳ６活性の正常レベル又は範囲を確立することにより得られた標準レベルと、さらに比較される。例えば、所定のレベル又は標準レベルに比してのＡＸＬ活性又はＧＡＳ６活性の増加は、腫瘍浸潤又は腫瘍転移を被る腫瘍の素質を示す。
【０１０２】
本明細書に引用するすべての出版物及び特許は、それぞれの個々の出版物又は特許が参照により組み込まれていると具体的にかつ個々に示されているかのごとく、参照により本明細書に組み込まれており、並びにそれらの出版物が引用されている関係でそれらの方法及び／又は材料を開示及び記載するために参照により組み込まれている。いずれの出版物についての引用も、本出願日前のその開示についてのものであり、並びに先行発明のために本発明がそのような出版物に先行する資格が無いことの承認と解釈されるべきものではない。さらに、提供する出版物の日付は、実際の出版日と異なることがあり、実際の出版日は独自に確認されることが必要である場合がある。
【０１０３】
本開示を読むことで当業者にはわかるであろうが、本明細書において説明及び例証する個々の実施形態のそれぞれは、本発明の範囲又は精神から逸脱することなく他の幾つかの実施形態のいずれかについての特徴から容易に分離され得る又は前記特徴と容易に組み合わせられ得る、別個の成分及び特徴を有する。列挙されている任意の方法は、列挙されている事象の順序で行われることがあり、又は理論的に可能である任意の他の順番で行われることがある。以下では、本発明の部分を例証するために実施例が説明される。
実験
【実施例１】
【０１０４】
ＡＸＬシグナル伝達の治療的遮断は転移性腫瘍進行を阻害する
転移性疾患のための治療ターゲットとしてのＡＸＬの実証はほぼ手つかずであり、より重要なこととして、ＡＸＬターゲティングのインビボ相関現象は実証されていない。本発明者らは、ＡＸＬがヒト乳及び卵巣癌患者における転移のマーカーであること、並びにこれらの患者における疾患の重症度が原発性腫瘍におけるＡＸＬタンパク質の量と相関することを証明する。最も重要なこととして、本発明者らは、転移が既に存在するマウスにおいて可溶性ＡＸＬエクトドメインの投与により腫瘍転移がうまく処置され得ることを証明する。メカニズム的には、転移性疾患を有する動物におけるＡＸＬシグナル伝達の阻害は、減少した浸潤及びＭＭＰ活性を生じさせる結果となる。本発明者らの発見は、可溶性ＡＸＬエクトドメインの投与による腫瘍細胞におけるＡＸＬシグナル伝達カスケードの阻害が転移性腫瘍進行の阻害に十分であることを実証する。
【０１０５】
この研究において、本発明者らは、ＡＸＬがヒト癌における転移の肝要な要因であるかどうか、及びＡＸＬシグナル伝達の治療的遮断が転移性疾患にとって有効な処置であり得るかどうかを試験した。本発明者らは、転移性乳及び卵巣癌の開始及び進行におけるＡＸＬの役割を直接評定するために遺伝学的アプローチと治療的アプローチの両方を利用する。
【０１０６】
ＡＸＬは、ヒト癌における腫瘍進行及び転移のマーカーである。本発明者らは、先ず、乳又は卵巣癌を有する患者からの正常組織、原発性腫瘍及び転移におけるＡＸＬ発現を比較した。乳癌に隣接する正常な検体の１００％において、乳房上皮細胞は、ＡＸＬの拡散した細胞質及び核染色を示し、これは、ＡＸＬが膜結合受容体であることにかんがみてバックグラウンド染色であると考えられた（ｎ＝２７、図１Ａ）。しかし、原発性乳房腫瘍では、腫瘍上皮における膜ＡＸＬ染色が、悪性度１検体の２５％（１／４）、悪性度２検体の７６％（１０／１３）及び悪性度３検体の１００％（１８／１８）に存在した（図１Ａ及び表１）。加えて、ＡＸＬは、リンパ節転移の８８％（８／９）において発現された。
【０１０７】
漿液性卵巣癌検体に関しては、先ず正常卵巣表層上皮（ＯＳＥ）におけるＡＸＬ発現を検査した。卵巣腫瘍の大部分はこれらの細胞から生ずると考えられるからである。正常ＯＳＥを保持した卵巣癌患者試料では、ＡＸＬが検体の０％（０／５）において発現された（図１Ｂ）。対照的に、原発性腫瘍上皮における膜ＡＸＬ染色は、病期ＩＩ患者試料の６６％（６／９）及び病期ＩＩＩ患者試料の８３％（５３／６４）に存在した（図１Ｂ及び表Ｉ）。加えて、網及び腹膜などの共通転移部位からの腫瘍試料は、それぞれ検体の７５％（２４／３２）及び９０％（２３／３０）において高いＡＸＬ発現を示した（図１Ｂ及び表Ｉ）。これらの発見は、原発腫瘍内でのＡＸＬ発現が、進行した疾患及び転移性腫瘍において示されるので、転移と相関することの証拠となる。さらに、これらのデータは、ヒト乳及び卵巣癌に由来する転移が高レベルのＡＸＬを発現することの証拠となる。
【０１０８】
ＡＸＬは、腫瘍転移の肝要な要因である。転移におけるＡＸＬの機能的役割を検査するために、本発明者らは、乳及び卵巣転移のマウスモデルにおいてＡＸＬを阻害する遺伝学的アプローチを利用した。このために、本発明者らは、高レベルのＡＸＬ発現を有する転移性細胞系を同定するためにヒト乳及び卵巣癌細胞系のパネルをＡＸＬタンパク質発現についてスクリーニングした。本発明者らの臨床的発見に類似して、ＡＸＬは、転移性乳（ＮＣＩ−ＡＤＲ−ＲＥＳ、ＭＤＡ−２３１、ＨＳ  ５７８Ｔ、ＢＴ−５４９）及び卵巣（ＳＫＯＶ３、ＯＶＣＡＲ−８、ＥＳ−２、ＭＥＳＯＶ、ＨＥＹＡ８）細胞系の大部分において高度に発現され、これに対して転移の可能性が低い細胞系ではＡＸＬが検出不能な又は低いレベルで発現された（ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ４３５、Ｔ４７Ｄ、ＩＧＲＯＶ１、ＯＶＣＡＲ−３；図９）。ＡＸＬ欠損転移性乳房（ＭＤＡ−２３１）及び卵巣（ＳＫＯＶ３ｉｐ．１及びＯＶＣＡＲ−８）細胞系は、以前に記載されたＡＸＬ  ｓｈＲＮＡターゲティング配列を使用して産生された。ウエスタンブロット分析は、ｓｈＡＸＬターゲティング配列を発現する細胞が、スクランブル対照ｓｈＲＮＡターゲティング配列を発現する細胞と比較して５％未満のＡＸＬタンパク質を発現することを裏付けた（ｓｈＳＣＲＭ、図９Ｂ）。
【０１０９】
乳房腫瘍転移の後期におけるＡＸＬの役割を直接評定するために、本発明者らは、ヌードマウスの尾静脈にＡＸＬ−野生型（ｓｈＳＣＲＭ）及びＡＸＬ欠損（ｓｈＡＸＬ）ＭＤＡ−２３１細胞を注射し、第２８日に肺における腫瘍量を評価した。肺の顕微鏡評価は、ｓｈＲＮＡスクランブル（ｓｈＳＣＲＭ）ＭＤＡ−２３１細胞を注射した５／５マウスが、ＡＸＬについて陽性の着色した転移性病巣を発生させることを明らかにした（図２Ａ）。対照的に、ｓｈＲＮＡ  ＡＸＬ（ｓｈＡＸＬ）を注射した０／５マウスは、組織学的評価に基づき、肺転移を発生させた（図２Ａ）。これらのマウスの肺における腫瘍量を定量するために、本発明者らは、ヒトＧＡＰＤＨについての実時間ＰＣＲ分析を行った。図２Ａは、ｓｈＳＣＲＭ  ＭＤＡ−２３１細胞を注射されたマウスの肺が高レベルのヒトＧＡＰＤＨを発現したことを明示しており、これは、ＭＤＡ−２３１に由来する転移性病変の存在を示す。加えて、ｓｈＳＣＲＭ注射マウスは肺においてヒトＡＸＬを発現した。これは、ＡＸＬ陽性腫瘍細胞の存在を示唆する（図２Ａ）。対照的に、ｓｈＡＸＬ腫瘍細胞を注射したマウスは、肺においてヒトＧＡＰＤＨ又はＡＸＬを発現しなかった。これらの発見は、ＡＸＬの遺伝的不活性化が、このモデルにおける肺転移形成の完全抑制に十分であることを実証する。
【０１１０】
ＡＸＬの遺伝的不活性化がインビボで転移する卵巣癌細胞の能力に影響を及ぼすかどうかを判定するために、本発明者らは、卵巣癌の腹膜異種移植片モデルを使用して転移を形成するｓｈＳＣＲＭ及びｓｈＡＸＬ  ＳＫＯＶ３ｉｐ．１細胞の能力を比較した。このモデルは、ヒト卵巣転移の腹膜播種を反復し、マウスは、ＳＫＯＶ３ｉｐ．１細胞の腹膜注射後に腹水と腸間膜、横隔膜、肝臓及び他の腹膜表面に付着した１００より多くの小さな転移性病変とから成る進行性疾患を急速に発生させる（図３Ｂ）。ＳＫＯＶ３ｉｐ．１腹膜転移におけるＡＸＬ発現の免疫組織化学的分析は、ヒト卵巣転移に類似してＡＸＬがＳＫＯＶ３ｉｐ．１転移病変において高度に発現されることを明らかにした。このことは、これが卵巣転移におけるＡＸＬの役割を調査するための妥当なモデル系であることを示している（データを示さない）。ｓｈＳＣＲＭ及びｓｈＡＸＬ細胞の腹膜注射の２８日後、ｓｈＳＣＲＭマウスは、マウスを犠牲にすること及びｓｈＳＣＲＭ注射マウスとｓｈＡＸＬ注射マウスの間の腫瘍量の変化を調査することを本発明者らに余儀なくさせる、重篤な腹水及び病的状態の徴候を提示した。ｓｈＳＣＲＭ細胞を注射したマウスは、腹水及び＞１００の腹膜転移を発生させたが、ｓｈＡＸＬ細胞を注射したマウスは、殆ど転移を発生させなかった（図２Ｂ）。５ｍｍより大きいサイズの腹膜転移の平均数は、ｓｈＳＣＲＭ注射マウスにおける１３．４＋／−４．３からｓｈＡＸＬ注射マウスにおける０．８＋／−０．５へと有意に低減された（図２Ｂ）。類似して、これらの腫瘍の平均重量は、ｓｈＳＣＲＭ注射マウスにおける２３６＋／−７４ｍｇからｓｈＡＸＬ注射マウスにおける３９．２＋／−１８ｍｇへと有意に低減された（図２Ｂ）。これらの発見を支持して、ＯＶＣＡＲ−８細胞におけるＡＸＬ発現のノックダウンは、総卵巣腹膜腫瘍質量及び腫瘍数を有意に阻害した（図２Ｃ）。まとめると、これらの発見は、ＡＸＬが乳及び卵巣腫瘍転移についての肝要な要因であることを実証する。
【０１１１】
インビボでの転移形成におけるＡＸＬの重要な役割にかんがみて、次に、本発明者らは、ＡＸＬが転移を特異的に調節するかどうか、又はＡＸＬが腫瘍細胞増殖及び成長の調節に一般的役割を果たすかどうかを判定しようと努めた。これらの問題に取り組むために、本発明者らは、ＡＬＸ野生型（ｓｈＳＣＲＭ）細胞とＡＸＬ欠損（ｓｈＡＸＬ）細胞の間の総細胞数が１０−１４日の期間にわたって計数されるインビトロ増殖アッセイを行った。本発明者らは、ｓｈＳＣＲＭ細胞とｓｈＡＸＬ  ＭＤＡ−２３１、ＳＫＯＶ３ｉｐ．１又はＯＶＣＡＲ−８細胞の間に細胞成長の有意な差を見出さなかった（図３）。類似して、ｓｈＳＣＲＭ細胞とｓｈＡＸＬ細胞の間に同所性ＭＤＡ−２３１又は皮下ＳＫＯＶ３ｉｐ．１腫瘍成長の有意な差は観察されなかった（図３）。これらの発見は、ＡＸＬが腫瘍細胞増殖又はインビボでの皮下成長に求められないことを示している。全体的にみて、本発明者らの発見は、ＡＸＬが乳房及び卵巣腫瘍における腫瘍転移を特異的に調節することを示している。
【０１１２】
ＡＸＬは、腫瘍細胞浸潤を調節する。ＡＸＬ媒介転移についての可能性のあるメカニズムを決定するために、本発明者らは、不偏アプローチを採用し、増殖、浸潤、遊走、接着及び生存をはじめとする転移カスケードに関連した肝要な細胞機能におけるＡＸＬの役割を直接比較した。本発明者らは、ｓｈＡＸＬ  ＭＤＡ−２３１、ＳＫＯＶ３ｉｐ．１及びＯＶＣＡＲ−８細胞が、Ｉ型コラーゲンを通って浸潤する能力が有意に損なわれることを発見した（図４Ａ）。本発明者らは、ｓｈＡＸＬ細胞における細胞遊走のささやかな減少も観察したが、ＥＣＭタンパク質への接着又は血清除去後の生存の差を見出すことは出来なかった。これは、この転移カスケードにおいて主としてＡＸＬが浸潤に影響を及ぼすことを示す。
【０１１３】
分子レベルで、ＭＭＰ−９は、最近、乳癌細胞におけるＡＸＬ媒介浸潤のエフェクターとして同定された。従って、本発明者らは、ＭＭＰ−９発現又は活性がＡＸＬ欠損卵巣腫瘍細胞においても改変されるかどうかを調査した。ＳＫＯＶ３ｉｐ．１細胞はＭＭＰ−９を発現しないが、本発明者らは、ＭＭＰ−２がこれらの細胞において高度に発現されること及びＭＭＰ−２  ｍＲＮＡがｓｈＡＸＬ細胞において有意に減少されることを発見した（図４Ｂ）。ＭＭＰ−２ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイは、ＭＭＰ−２プロモーター活性がｓｈＳＣＲＭ細胞と比較してｓｈＡＸＬ細胞において有意に減少されることを明らかにした。このことは、ＡＸＬが転写レベルでＭＭＰ−２を調節することを示している（図４Ｃ）。ゼラチン・ザイモグラフィー・アッセイは、ＭＭＰ−２分泌タンパク質レベルもｓｈＳＣＲＭ  ＳＫＯＶ３ｉｐ．１細胞と比較してｓｈＡＸＬ細胞において有意に低減されることを示した（図４Ｄ）。まとめると、これらの発見は、ヒト卵巣癌細胞におけるＭＭＰ−２発現及び活性の上流調節剤としてのＡＸＬについての役割を示唆している。
【０１１４】
次に、本発明者らは、ＡＸＬ媒介ＭＭＰ−２発現に関与するシグナル伝達経路を解明しようと努めた。ＧＡＳ６によるＡＸＬの活性化は、ＰＩ３Ｋ、ＲＡＳ、ＭＡＰＫ、ＳＲＣ及びＰＬＣをはじめとする多数の細胞内シグナル伝達経路を直接誘導することが報告されている。これらの経路の中で、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路が卵巣癌細胞におけるＭＭＰ−２発現及び浸潤を調節することは証明されている。ＰＩ３Ｋシグナル伝達がＳＫＯＶ３ｉｐ．１細胞においてＡＸＬの喪失による影響を受けるかどうかを判定するために、本発明者らは、ＡＸＬ野生型及びＡＸＬ欠損ＳＫＯＶ３ｉｐ．１細胞におけるＳｅｒ４７３でのホスホ−ＡＫＴ（Ｐ−ＡＫＴ）についてのウエスタンブロット分析を行った。本発明者らは、ｓｈＳＣＲＭ  ＳＫＯＶ３ｉｐ．１細胞と比較してｓｈＡＸＬ細胞においてＰ−ＡＫＴ発現の非常に大きな阻害を見出した（図４Ｅ）。加えて、ＰＩ３Ｋ阻害剤Ｌｙ２９４００２での処置がＧＡＳ６誘導Ｐ−ＡＫＴ発現を完全に排除するので、飢餓ＳＫＯＶ３ｉｐ．１細胞のＧＡＳ６刺激はＰ−ＡＫＴのＰＩ３Ｋ依存性誘導を生じさせた（図４Ｅ）。ＰＩ３Ｋ経路がＡＸＬ媒介ＭＭＰ−２発現に関与するかどうかを判定するために、本発明者らは、ＧＡＳ６及びＬｙ２９４００２の存在下でＭＭＰ−２ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイを行った。ＧＡＳ６刺激の結果として起こるＭＭＰ−２プロモーター活性の誘導は、ＬＹ２９４００２処置によって完全に遮断された。このことは、ＧＡＳ６／ＡＸＬシグナル伝達がＰＩ３Ｋシグナル伝達事象によってＭＭＰ−２発現を調節することを示唆している（図４Ｆ）。
【０１１５】
ＡＸＬの治療的阻害は、マウスにおける転移性腫瘍進行を有意に抑制する。本発明者らの発見は、ＡＸＬが転移にとって肝要な要因であることをこれまでに実証しており、治療的遮断が転移性疾患のための有効な処置であり得るという仮説を支持する。この仮説を考査するために、本発明者らは、ＡＸＬシグナル伝達を阻害するための治療戦略として可溶性ＡＸＬエクトドメインを利用した。可溶性ＡＸＬエクトドメインは、おとり受容体として機能的に作用し、並びにインビトロ及びインビボでＧＡＳ６をナノモルの親和性で結合することが以前に証明されている（図５Ａ）。本発明者らは、先ず、可溶性ＡＸＬエクトドメインでの処置が転移性腫瘍細胞におけるＡＸＬシグナル伝達及び浸潤の阻害に十分であるかどうかを検査した。ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達は、様々な細胞タイプにおいてＡＸＬによって調節される。本発明者らは、ＳＫＯＶ３ｉｐ．１細胞においてＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達がＧＡＳ６／ＡＸＬシグナル伝達によって調節されること、及びＧＡＳ６処置ＳＫＯＶ３ｉｐ．１細胞において可溶性ＡＸＬエクトドメイン（ｓＡＸＬ）での処置がＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ活性化を低減出来たことを発見した（図５Ｂ及びＣ）。類似して、コラーゲン中のＭＤＡ−２３１細胞のｓＡＸＬでの処置は、細胞浸潤の劇的な低減に十分であった。このことは、ｓＡＸＬ処置がインビトロでＡＸＬシグナル伝達及び浸潤に影響を及ぼすことを示唆している（図５Ｄ）。
【０１１６】
本発明者らは、次に、卵巣癌の高転移性モデルにおいてｓＡＸＬ処置が転移性腫瘍進行に影響を及ぼすかどうかを検査した。本発明者らは、先ず、ヌードマウスにおいてＳＫＯＶ３ｉｐ．１転移性病変を確立し（第１日）、肉眼的病変の検証後、第７日にｓＡＸＬでの処置を開始した。肝臓が注射後２８日までの間ｓＡＸＬタンパク質の全身生産量をマウスの血清に放出するｓＡＸＬ療法が、アデノウイルス系を使用して果たされた（図６Ａ）。第２８日における腫瘍量の肉眼分析は、ｓＡＸＬ療法を受けたマウスがＦｃ対照療法で処置されたマウスと比較して腫瘍量の有意な（ｐ＜０．０１）低減を有したことを明らかにした。ＳＫＯＶ３ｉｐ．１腫瘍モデルにおいて、総腫瘍重量及び腫瘍数は、Ｆｃ処置マウスと比較してｓＡＸＬで処置したマウスにおいて６３％減少された（図６Ｂ）。類似して、ＯＶＣＡＲ−８モデルにおいて、総腫瘍重量及び腫瘍数は、有意にそれぞれ４７％及び４２％減少した（図１１）。本発明者らは、実時間ＰＣＲ分析によってＳＫＯＶ３ｉｐ．１におけるＭＭＰ２発現レベルを検査し、Ｆｃ対照処置マウスと比較してｓＡＸＬ処置マウスの腫瘍においてＭＭＰレベルが有意に減少されることを発見した（図６Ｃ）。これらの結果は、単剤ＡＸＬ療法が、確立された疾患を有するマウスにおける転移性腫瘍量の有意な低減に十分であることの証拠となる。加えて、本発明者らの発見は、転移性腫瘍成長に対するＡＸＬの治療効果が、少なくとも一部はＭＭＰ活性の調節による浸潤の阻害を伴うだろうことを示唆している。
【０１１７】
ＭＭＰをターゲットにする以前の抗転移阻害剤は、正常組織毒性に対して有意な影響を及ぼすことが証明されていることにかんがみて、本発明者らは、２１日間ｓＡＸＬ療法で処置したマウスにおける正常組織毒性の総合分析を行った。本発明者らは、ｓＡＸＬ又はＦｃ療法で処置したヌードマウスにおいて行動異常、肉眼的異常及び顕微鏡的異常を観察しなかった（図７）。
【０１１８】
浸潤及び遊走は、腫瘍転移の病理発生に寄与する重要な細胞内因特性である。これらのプロセスをターゲットにする治療薬は、転移を阻害するための有用な戦略であり得、及び転移性疾患を有する患者に臨床的恩恵をもたらすことが出来ると仮定した。この報告において、本発明者らは、受容体チロシンキナーゼＡＸＬが腫瘍細胞浸潤及び転移を支配する肝要な要因であることを実証する。最も重要なこととして、本発明者らは、転移性疾患が既に存在するマウスにおいて可溶性ＡＸＬ受容体を使用するＡＸＬシグナル伝達の治療的遮断が転移性腫瘍進行の有意な阻害に十分であることを証明する。メカニズム的には、本発明者らの研究は、可溶性ＡＸＬ療法が、少なくとも一部はＭＭＰ活性及び浸潤の阻害により腫瘍転移を阻害することを示す。最後に、本発明者らは、本発明者らの発見の臨床的重要性を強調するために、ヒト卵巣及び乳癌患者からの転移及び進行期原発性腫瘍においてＡＸＬが高度に発現されることを証明する。
【０１１９】
ＡＸＬがヒト癌における転移についての肝要な要因であること、及びＡＸＬシグナル伝達の治療的遮断が転移性疾患のための有効な処置であることを、本明細書において実証する。ここで、本発明者らは、乳及び卵巣癌患者からの転移及び進行期原発性腫瘍試料においてＡＸＬが高度に発現されることを実証する。本発明者らは、ヌードマウスモデルを使用する疾患を用いて、ＡＸＬが転移性乳及び卵巣癌の開始に肝要であることを遺伝学的に実証する。最も重要なこととして、本発明者らは、高特異的で非毒性の可溶性ＡＸＬ受容体を抗ＡＸＬ療法として開発済みであり、転移性疾患が既に存在するマウスにおいて可溶性ＡＸＬ受容体療法が転移性腫瘍進行の有意な阻害に十分であることを実証する。本発明者らの発見は、腫瘍細胞におけるＡＸＬシグナル伝達カスケードの阻害が転移性疾患の開始と進行の両方を遮断出来ることを実証する。本発明者らのデータは、進行した及び転移性の乳及び卵巣癌のための新規治療ターゲットとしてＡＸＬを関係づけ、及び抗ＡＸＬ療法が転移性疾患の開始と進行の両方を制御出来ることを示唆する。
【０１２０】
ＭＭＰは、腫瘍細胞浸潤及び転移の調節に重要な役割を果たす。しかし、腫瘍細胞がＭＭＰ活性を誘導するメカニズムは、依然として不明である。ＭＭＰ発現は、ヒト癌において増加され、腫瘍進行及び不良な患者生存と相関する。ＭＭＰにおける遺伝子増幅及び活性化突然変異はヒト癌では滅多に見いだされず、このことは、他の要因が癌におけるＭＭＰ発現増進の原因であることを示唆している。本発明者らのデータは、ＭＭＰ−２発現がヒト卵巣癌細胞において転写レベルでＡＸＬによって調節されることの証拠を提供する。ＡＸＬがＭＭＰ−２発現を調節する正確なメカニズムは依然として確定されていないが、本発明者らは、ＰＩ３Ｋ経路の薬理学的阻害がＧＡＳ６刺激細胞においてＭＭＰ−２プロモーター活性を低減することを実証する。これは、ＰＩ３Ｋ経路についての役割を示している（図８）。重要なこととして、本発明者らの結果は、ＡＸＬの治療的遮断が腫瘍におけるＭＭＰ活性を阻害するための有効で非毒性の戦略であり得るこを示している。広域スペクトルＭＭＰ阻害剤は、高い正常組織毒性レベルのため、癌試験では不首尾に終わった。本発明者らの発見は、抗ＡＸＬ療法の予測副作用が最小であることを示している。本発明者らは、マウスにおける可溶性ＡＸＬエクトドメイン療法のアデノウイルス媒介送達に随伴する正常組織毒性を一切観察しなかった。さらに、生殖細胞系ＡＸＬ及びＧＡＳ６ノックアウトマウスは生育可能であり、成体として表現型的に正常である。このことは、ＡＸＬ又はＧＡＳ６が発育及び正常組織機能に求められないことを示唆している。
【０１２１】
本発明者らは、転移性卵巣癌の高転移性モデルにおいて単剤ＡＸＬ療法が転移性腫瘍進行の阻害に十分であることを証明する。これらの発見には、卵巣癌の処置についての重要な臨床的含意がある。米国では毎年おおよそ１４，６００人が卵巣癌で死亡する。アバスチン（ｍＡｂターゲティングＶＥＧＦ）及びタルセバ（小分子ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤）は進行及び再発卵巣癌の処置のために臨床試験中であるが、最近、卵巣癌の処置のためにＦＤＡに認可された生物製剤は無い。卵巣癌のための標準的療法は、疾患を最適に減量する外科手術、続いての細胞傷害性白金−タキサン併用療法を含む。これらの努力にもかかわらず、卵巣癌と診断された患者の８０パーセントは再発疾患を発生し、これらの患者のうちの３０％しか診断の５年後に生存しない。
【０１２２】
本発明者らのデータは、ＡＸＬ療法が進行及び再発卵巣癌の処置に有効なアジュバント療法であることを証明する。本発明者らの研究において用いた転移性卵巣腫瘍進行のモデルは、外科的減量術後のヒト患者における再発疾患の発生に似ている。本発明者らは、疾患が確立されたマウスにおいてＡＸＬ療法が転移性腫瘍量を６３％低減出来ることを発見した。疾患進行中の新たな転移性病変の確立は、有意に低減された。この観察は、ＡＸＬが細胞増殖又は成長ではなく主として腫瘍細胞浸潤に影響を及ぼすことを実証する本発明者らの発見と一致する。考え合わせると、本発明者らの結果は、ＡＸＬ療法が主に抗転移剤として機能すること及び現行の細胞傷害剤との併用療法として最も有効であり得ることを示している。
【０１２３】
まとめると、ＡＸＬは転移の肝要な要因であり、ＡＸＬシグナル伝達の遮断は転移において治療的恩恵を有する。これらの研究は、転移性疾患のための抗ＡＸＬ療法にとって重要な前臨床データを提供する。
方法
【０１２４】
細胞系。卵巣ＳＫＯＶ３、ＳＫＯＶ３ｉｐ．１及びＨＥＹＡ８細胞は、Ｇｏｒｄｏｎ  Ｍｉｌｌｓ博士（ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）から寄贈品として得られた。卵巣ＥＳ−２及びＭＥＳＯＶ細胞は、Ｂｒａｎｉｍｉｒ  Ｓｉｋｉｃ博士（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から寄贈品として得られた。ＭＤＡ−２３１、ＯＶＣＡＲ−３及びＭＣＦ−７細胞は、ＡＴＣＣから購入された。ＩＧＲＯＶ−１及びＯＶＣＡＲ−８は、ＮＣＩ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃ  ＤＣＴＤ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから購入された。細胞は、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて１０％熱不活性化ウシ胎仔血清と１％ペニシリンとストレプトマイシンとを補足した適切な培地中３７℃で培養された。乳及び卵巣癌細胞系のＮＣＩ６０パネルからの細胞ペレットは、Ｇｉｏｖａｎｉ  Ｍｅｌｉｌｌｏ博士（ＮＣＩ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ）によって提供された。
【０１２５】
患者及び組織マイクロアレイ。ヒト乳房組織マイクロアレイは、ＵＳ  Ｂｉｏｍａｘ（ＢＲ１００２）から購入された。卵巣ヒト組織マイクロアレイは、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔから得られた。合計７３のパラフィン包埋腫瘍試料は、１９９５から２００１年のＳｔａｎｆｏｒｄ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの事前に処置を受けていない卵巣癌患者から得られた。これらの原発性卵巣腫瘍試料は、患者１人につき２試料から成る組織マイクロアレイに組み立てられた。腹膜からの追加の３０の腫瘍試料もこのマイクロアレイにおいて評価された。すべての患者は、漿液性卵巣癌を有し、病期分類情報は、世界産婦人科連合会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｏｂｓｔｅｒｉｃｓ）基準に従って得られた。すべての検体及びそれらの対応する臨床情報は、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの施設内治験審査委員会によって承認されたプロトコルのもとで収集された。網からの３２の転移病変を検査するために、追加の市販腫瘍マイクロアレイが使用された（ＵＳ  Ｂｉｏｍａｘ）。
【０１２６】
ＡＸＬ免疫組織化学。パラフィン包埋組織スライドは、標準的な免疫組織化学的方法に従ってキシレンで脱パラフィンされ、再水和され、アンマスキングされた。ＡＸＬ一次抗体（ＲａｎｄＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、１：５００希釈で使用された。すべての試料についての陰性対照は、二次抗体のみを使用して投薬された。抗原−抗体複合体は、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  ＡＢＣシステム（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びＤＡＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を製造業者のプロトコルに従って使用して視覚化された。スライドはヘマトキシリンで対比染色された。腫瘍細胞の膜に関するＡＸＬ染色は、ＡＸＬ発現について陽性の細胞の百分率によって顕微鏡で評点づけされた（不在は０、質が劣る試料は１、５９−６０％は２、及び６１−１００％は３）。
【０１２７】
レポーターアッセイ。１６５９ｂｐのＭＭＰ−２プロモーターによって誘導されたＭＭＰ−２レポータープラスミドは、寄贈品であった。ルシフェラーゼ活性は、ｓｈＳＣＲＭ及びｓｈＡＸＬ  ＳＫＯＶ３ｉｐ．１細胞においてＤｕａｌ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって判定され、Ｍｏｎｏｌｉｇｈｔ  ２０１０  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）で測定された。ホタルルシフェラーゼ活性は、Ｒｅｎｉｌｌａ活性に正規化された。アッセイは、三重反復で行われ、２回繰り返された。
【０１２８】
一過的及びレトロウイルトランスフェクション。一過的ＤＮＡトランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の説示に従って用いて行った。０．１μｇのＭＭＰ−２  ｃＤＮＡ（ＯｐｅｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、６ウエルディッシュにトランスフェクトされた。
【０１２９】
ｓｉＲＮＡ：ＡＸＬ又をターゲットにするｓｉＲＮＡ配列又は対照は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎから購入された。すべてのｓｉＲＮＡトランスフェクションは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｓｍａｒｔ  ＰｏｏｌｓとＤｈａｒｍａｆｅｃｔ  １トランスフェクション試薬（コロラド州ラファイエットのＤｈａｒｍａｃｏｎ）を製造業者のプロトコルに従って使用して行った。
【０１３０】
ｓｈＲＮＡ：ＡＸＬ  ＲＮＡの特異的分解のためのオリゴは、以前に記載された５’−ＧＡＴＴＴＧＧＡＧＡＡＣＡＣＡＣＴＧＡ−３’として合成した。スクランブル配列は、非ターゲティングｓｈＲＮＡ  ５’−ＡＡＴＴＧＴＡＣＴＡＣＡＣＡＡＡＡＧＴＡＣ−３’として使用された。これらのオリゴは、ＲＮＡｉ−Ｒｅａｄｙ  ｐＳｉｒｅｎ  ＲｅｔｒｏＱ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）ベクターにクローン化され、これらのベクターを用いてＳＫＯＶ３ｉｐ．１、ＭＤＡ−２３１及びＯＶＣＡＲ−８細胞がレトロウイルスにより形質導入された。感染細胞は、ピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ）で選択され、ポリクローナル集団は、ウエスタンブロット分析によってデクラーゼＡＸＬ発現レベルについて試験された。
【０１３１】
プラスミド。アミノ酸１−４５１に対応するＡＸＬエクトドメインは、ヒトＡＸＬ  ｃＤＮＡ（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から増幅され、ＣＭＶ駆動ｐＡＤＤ２アデノウイルスシャトルベクターにクローン化された。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者に従って用いて、対照ベクター又はＡＸＬ  １−４５１でのＨＣＴ１１６細胞への一過的ＤＮＡトランスフェクションが行われた。トランスフェクションの４８−７２時間後にならし培地が回収された。
【０１３２】
接着アッセイ。ＳＫＯＶ３ｉｐ．１  ｓｈＳＣＲＭ及びｓｈＡＸＬ細胞は、５ｕｍ  ＣＭＦＤＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で蛍光標識された。細胞は洗浄され、非酵素的細胞解離バッファー（Ｇｉｂｃｏ）を使用して剥離された。細胞（５×１０ｅ５）は９６ウエルプレートにプレーティングされ、５０ｕｇ／ｕＬのＩ型コラーゲン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でプレコートされた。３７℃での６０分インキュベーション後、細胞は、注意深く５回洗浄された。蛍光分光光度計を使用して蛍光活性（励起、４９４ｎｍ；発光５１７ｎｍ）が測定された。
【０１３３】
Ｉ型コラーゲンへのＳＫＯＶ３ｉｐ．１接着。ＳＫＯＶ３ｉｐ．１  ｓｈＳＣＲＭ及びｓｈＡＸＬ細胞は、５ｕｍ  ＣＭＦＤＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で蛍光標識された。細胞は洗浄され、非酵素的細胞解離バッファー（Ｇｉｂｃｏ）を使用して剥離された。細胞（５×１０ｅ５）は９６ウエルプレートに三重反復でプレーティングされ、５０ｕｇ／ｕＬのＩ型コラーゲン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でプレコートされた。３７℃での６０分インキュベーション後、細胞は、注意深く５回洗浄された。蛍光分光光度計を使用して蛍光活性（励起、４９４ｎｍ；発光５１７ｎｍ）が測定された。
【０１３４】
ＥＣＭタンパク質へのＭＤＡ−２３１接着。ＭＤＡ−２３１  ｓｈＳＣＲＭ及びｓｈＡＸＬ（０．５×１０＾６）細胞は、ラミニンとコラーゲンＩ及びＩＶとフィブロネクチンとフィブリノゲンとを含むＥＣＭタンパク質のアレイが入っているウエルに三重反復でプレーティングされた。細胞は３７℃で１時間インキュベートされ、ＰＢＳで洗浄された。接着細胞は染色され、製造業者のプロトコル（ＣｅｌｌＢｉｏｌａｂｓ）に従ってＯＤ５６０で定量された。
【０１３５】
遊走アッセイ。細胞遊走は、以前に記載されているようにインビトロで検査された。簡単に言うと、細胞は２４時間、血清枯渇され、未コーティングインサート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に三重反復で接種され（２．５×１０４細胞）、化学誘引物質としてＦＢＳが入っているチャンバに移され、２４時間インキュベートされた。非浸潤細胞を除去した後、膜の下側の細胞が固定され、染色され、計数された。それぞれの膜について５視野が計数された。遊走％は、次のように決定された：（ｓｈＡＸＬ細胞中の遊走する細胞の平均＃／ｓｈＳＣＲＭ細胞中の遊走する細胞の平均＃）×１００。実験は三重反復で行われ、３回繰り返された。
【０１３６】
コラーゲン浸潤アッセイ。コラーゲン浸潤アッセイは、以前に記載されているように行われた。簡単に言うと、５３３細胞は、４８ウエルプレート上のＩ型コラーゲンにプレーティングされた。標準培地で又はならし対照培地若しくはｓＡＸＬ−ならし培地を加えた培地で５−７日間、細胞が培養され、写真が撮られた。コラーゲンを通しての浸潤は、２０Ｘ視野あたりの枝分かれ表現型を提示する腫瘍細胞の百分率を計算することによって定量された。１試料あたり３視野が計数された。実験は三重反復で行われ、３回繰り返された。
【０１３７】
ゼラチン基質ザイモグラフィー。ＳＫＯＶ３ｉｐ．１  ｓｈＳＣＲＭ及びｓｈＡＸＬ細胞は４８時間、血清飢餓させられ、２５，０００細胞が９６ウエルプレートにプレーティングされ、２４時間後にならし培地が回収された。等体積のならし培地が、還元条件下で１０％ザイモグラムゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上を泳動された。電気泳動後、ゲルは、ＳＤＳを除去するために２．５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で洗浄され、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２及び０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ｐＨ７．８）中で洗浄され、一晩、３７℃でインキュベートされた。４０％メタノール及び１０％氷酢酸に溶解された０．２５％（ｗ／ｖ）Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｒ２５０で３０分間、ザイモグラムが染色された。ゲルは４０％メタノール及び１０％氷酢酸で変色させた。実験は三重反復で行われ、３回繰り返された。
【０１３８】
細胞増殖アッセイ。単層成長曲線のために、細胞（５０，０００）が６０ｍｍディッシュに三重反復でプレーティングされた。３日ごとに、細胞はトリプシン処理され、細胞計数器（Ｃｏｕｌｔｅｒ  ｃｏｕｎｔｅｒ）を使用して計数され、５０，０００細胞が再びプレーティングされ、計数された。
【０１３９】
ＸＴＴ生存アッセイ。細胞生存度は、以前に記載されているようにＸＴＴアッセイによって測定された。簡単に言うと、０．３ｍｇ／ｍＬ  ＸＴＴ及び２．６５μｇ／ｍＬ  Ｎ−メチルジベンゾピラジンメチルスルファートを伴うフェノールレッド不含培地と共に血清供給又は飢餓細胞（０、３、６及び７日）がインキュベートされた。それらの９６ウエルプレートは、１から２時間、３７℃インキュベーターに戻された。４５０ｎｍでの吸収を測定することによってＸＴＴの代謝が定量された。
【０１４０】
タンパク質単離及びウエスタンブロット分析。タンパク質溶解産物は、９Ｍ尿素、０．０７５Ｍ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７．６）の中に採収された。タンパク質溶解産物は、ブラッドフォードアッセイを用いて定量され、標準法を用いる還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付された。ウエスタンブロットは、ＡＸＬに対する抗体（ＲｎａｄＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、アルファチューブリンに対する抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、ＡＫＴに対する抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ホスホ−ＡＫＴに対する抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）でプローブされた。
【０１４１】
ＧＡＳ６刺激のために、細胞は２４時間、血清飢餓させられた。その後、細胞は、４００ｎｇ／ｍＬのＧＡＳ６での１５分間の処置の前に４時間、２５ｕｍのＰＩ３Ｋ阻害剤（Ｌｙ２９４００２、Ｂｉｏ  Ｍｏｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）で又はＡＸＬエクトドメインを含有する１００Ｌのならし培地で処置された。
【０１４２】
マウスの血清中でのｓＡＸＬ発現の分析のために、各試料からの１．５Ｌの血清がゲル電気泳動によって分析された。
【０１４３】
アデノウイルスの産生及び生産。アミノ酸１−４５１に対応するＡＸＬエクトドメインは、ＡＸＬ  ｃＤＮＡ（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から増幅され、以前に記載されているような相同組み換え、続いての２９３細胞におけるアデノウイルス生産及びＣｓＣｌ勾配精製によってＥ１−Ｅ３−Ａｄ染色５のＥ１領域にクローン化された。ｓＡＸＬアデノウイルスの生産及び精製は、以前に記載されているように行われた。マウスＩｇＧ２−Ｆｃ免疫グロブリン断片を発現する陰性対照ウイルスの産生及び生産は、以前に記載されている。
【０１４４】
腹膜異種移植片としてのＳＫＯＶ３ｉｐ．１及びＯＶＣＡＲ−８細胞の成長。動物を伴うすべての手順及びそれらのケアは、施設内及びＮＩＨガイドラインに従ってＳｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの施設内動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｍｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓａｇｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。
【０１４５】
対照及びＡＸＬ  ＳＫＯＶ３ｉｐ．１及びＯＶＣＡＲ−８細胞は、０．５ｍＬのＰＢＳ中それぞれ１×１０６及び５×１０６細胞で雌ヌードマウスにｉ．ｐ．注射された。犠牲にした後、腹水が定量され、転移病変が計数され、及び腫瘍重量を計量するためにすべての可視病変が切開され、除去された。
【０１４６】
ＳＫＯＶ３ｉｐ．１及びＯＶＣＡＲ−８親細胞は、０．５ｍＬのＰＢＳ中それぞれ１×１０６及び５×１０６細胞で雌ヌードマウスにｉ．ｐ．注射された。腫瘍細胞注射の７（ＳＫＯＶ３ｉｐ．１）又は１４（ＯＶＣＡＲ−８）日後、マウスは、尾静脈に、０．１ｍＬ  ＰＢＳ中のｓＡＸＬ又は対照１．９×１０８アデノウイルスｐｆｕを注射された。犠牲にした後、腹水が定量され、転移病変が計数され、及び総腫瘍重量を計量するためにすべての可視病変が切開され、除去された。
【０１４７】
組織毒性研究。ＳＫＯＶ３ｉｐ．１親細胞は、０．５ｍＬのＰＢＳ中それぞれ１×１０６及び５×１０６細胞で雌ヌードマウスにｉ．ｐ．注射された。腫瘍細胞注射の７日後、マウスは、尾静脈に、０．１ｍＬ  ＰＢＳ中のｓＡＸＬ又は対照１．９×１０８アデノウイルスｐｆｕを注射された。第２８日にマウスは犠牲にされた。血液が採取され、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉvｅｒｓｉｔｙの比較医学科により、総合的代謝パネル及びＣＢＣ分析が行われた。肝臓、腎臓、脳及び脾臓をはじめとするすべての主要器官から組織試料が採取され、１０％ホルマリンで固定され、パラフィンに包埋され、切片にされ、ヘマトキシリン及びエオシンで染色された。
【０１４８】
インビボ尾静脈転移アッセイ。対照及びＡＸＬ  ｓｈＲＮＡ  ＭＤＡ−２３１細胞は、０．１ｍＬのＰＢＳ中５×１０５細胞でヌードマウスの尾静脈に静脈内注射された。注射の４週間後、マウスは犠牲にされた。ヘマトキシリン及びエオシンで染色されたホルマリン固定、パラフィン包埋肺のそれぞれの断面を用いて、肺病巣の顕微鏡評価が行われた。大きな核を有する及びＡＸＬ発現について陽性である最低４つのヒト細胞での肺病巣の正確な同定が認定病理専門医によって確認された。全肺から単離されたＲＮＡにおけるヒトＧＡＰＤＨ及びＡＸＬ発現の実時間ＰＣＲ分析により、マウスの肺における腫瘍量が定量された。
【０１４９】
同所性腫瘍としてのＭＤＡ−２３１の成長。ＭＤＡ−２３１細胞は、０．１ｍＬのＰＢＳ中の１０７細胞の乳房脂肪体への皮内注射後の週齢６週雌ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウスにおいて、皮下同所性腫瘍として成長された。腫瘍は、３８日の時間経過にわたってキャリパで測定された。容積は、次の式を用いて計算された：幅２×長さ×０．５。
【０１５０】
皮下腫瘍としてのＳＫＯＶ３ｉｐ．１細胞の成長。０．１ｍＬのＰＢＳ中の５００万個の細胞が週齢６週雌ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウスの側腹部に皮下内植された。腫瘍は、４５日の時間経過にわたってキャリパで測定された。容積は、次の式を用いて計算された：幅２×長さ×０．５。
【０１５１】
ＲＮＡ及び実時間ＰＣＲ分析。ＲＮＡは、トリゾールを製造業者のプロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って使用して、細胞及び組織から単離された。ｃＤＮＡは、逆転写ＰＣＲ用のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔファーストストランド合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、２μｇのＤＮアーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）処理ＲＮＡから合成された。ＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するＰＣＲ増幅に１マイクロリットルのｃＤＮＡが付された。特異的ターゲット遺伝子を増幅するために、次のプライマーセットが使用された：１８Ｓ  ＦＷＤ：５−ＧＣＣＣＧＡＡＧＣＧＴＴＴＡＣＴＴＴＧＡ−３  ＲＥＶ：５−ＴＣＣＡＴＴＡＴＴＣＣＴＡＧＣＴＧＣＧＧＴＡＴＣ−３；ＡＸＬ  ＦＷＤ：５−ＧＴＧＧＧＣＡＡＣＣＣＡＧＧＧＡＡＴＡＴＣ−３  ＲＥＶ：５−ＧＴＡＣＴＧＴＣＣＣＧＴＧＴＣＧＧＡＡＡＧ；ＧＡＰＤＨ  ５−ＡＴＧＧＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧ−３  ＲＥＶ：５−ＧＧＧＧＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＣＡＡＣＡＡＴＡ−３；ＭＭＰ−２  ＦＷＤ：５−ＧＣＣＣＣＡＧＡＣＡＧＧＴＧＡＴＣＴＴＧ−３  ＲＥＶ  ５−ＧＣＴＴＧＣＧＡＧＧＧＡＡＧＡＡＧＴＴＧＴ−３。ＰＣＲ増幅は、Ｐｒｉｓｍ  ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行われた。用いた熱サイクリングプロフィールは、５０℃で２分間及び９５℃で１０分間の変性、続いて９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間の変性サイクルであった。ｍＲＮＡを正規化するために１８Ｓが使用された。相対ｍＲＮＡ発現レベルは、相対標準曲線法を製造業者の説示（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って用いて決定された。
【０１５２】
統計解析。ＡＸＬ発現と腫瘍形成及び転移との関連性についての検定は、フィッシャーの正確確率検定を用いて行われた。すべての他の統計検定は、スチューデントｔ検定を用いて行われた。＜０．０５のｐ値を有する値は、統計的に有意と見なされた。
【０１５３】
略記：ＧＡＳ６、成長阻止特異的遺伝子６；ＭＭＰ−２、マトリックスメタロプロテイナーゼ；ＥＯＣ、上皮性卵巣癌；ＥＣＭ、細胞外マトリックス；ＡＫＴ、ｖ−ａｋｔマウス胸腺腫ウイルス癌遺伝子ホモログ。
【０１５４】
表１．腫瘍パラメータに対するＡＸＬ染色の統計解析
【表１】
0005965322.tif 000002
【実施例２】
【０１５５】
本発明者らは、アデノウイルス発現系を使用するマウスにおける野生型可溶性ＡＸＬの過発現による細胞ＡＸＬへのＧＡＳ６リガンド結合の阻害が、腫瘍数及びサイズによって測定して、未処置対照と比較して腫瘍量を減少させる結果となることを証明した。これは、前臨床マウスモデルにおいて転移の進行を阻害するための肝要なターゲット及び有効な戦略としてのＧＡＳ６及びＡＸＬの重要性をさらに強調する。
【０１５６】
リガンドＧＡＳ６に対して高い親和性を有し、それによりそのリガンドを封鎖して内因性ＡＸＬシグナル伝達を減少させることが出来る、ＡＸＬ細胞外ドメインの遺伝子操作可溶性変異体がここでは提供される。遺伝子操作変異体は、Ｇａｓ６に対して、野生型ＡＸＬと比較して実質的に向上された親和性を有する。
【０１５７】
ＡＸＬの細胞外ドメインは、２つのＩｇＧ様ドメイン及び２つのフィブロネクチン様ドメインを含む。主要ＧＡＳ６結合部位はＩｇ１ドメイン内にあり、副次的ＧＡＳ６結合部位はＩｇ２ドメイン内にある。
【０１５８】
主要結合部位の親和性をさらに強化するために、本発明者らは、ＡＸＬ  ＳｗｉｓｓＰｏｒｔエントリーＰ３０５３０に対応する１９−１３２の切断点を有するＩｇ１ドメインを遺伝子工学で作製した。標準的な分子生物学技術を用いてＡＸＬ受容体のＩｇ１ドメインのエラープローンＰＣＲを行うことにより、突然変異体ライブラリーが作られた。酵母表層提示を用いてそのライブラリーが発現され、可溶性ＧＡＳ６への強化された結合親和性を呈示する突然変異体を単離するために蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によってスクリーニングされた。本発明者らのライブラリー・スクリーニング・アプローチにおいて、突然変異体タンパク質ライブラリーは、それぞれの逐次的ラウンドがそのライブラリーのサイズを低減すると同時に、この場合はＧＡＳ６への高い親和性である、所望の突然変異体タンパク質特性を富化する、多数のソーティングラウンドに付された。
【０１５９】
ＧＡＳ６に対して有意に強い親和性を有するＡＸＬ突然変異体を得るために、後のソーティングラウンドにおいて、本発明者らは、「オフ速度」ソートを用いた。オフ速度ソートのために、タンパク質突然変異体のライブラリーは、先ず、可溶性ＧＡＳ６と共にインキュベートされ、その後、その溶液から未結合ＧＡＳ６を除去するためにバッファーで洗浄される。次に、その突然変異体ライブラリーは、室温で２、４、６、１２又は２４時間、過剰な可溶性競合物質の存在下でインキュベートされる。この過剰な競合物質は、解結合段階を不可逆的にさせる、酵母提示ＡＸＬから解離するＧＡＳ６の封鎖に役立つ。ＧＡＳ６への結合を保持する突然変異体ＡＸＬタンパク質は、ＦＡＣＳを使用して回収される。０、４及び６時間のオフ速度段階後のプールされたソート５産物によるＧＡＳ６への結合の分析は、これらの産物がＧＡＳ６への持続的結合の点で、野生型ＡＸＬに比べて有意な向上を呈示することを示す（図１２参照）。棒グラフは、ドットプロットからのデータを定量するものであり、ライブラリーメンバーの有意な向上を明示している。これらの産物のシークエンシングは、プールされたソート５産物について観察されるＧａｓ６に対する向上した親和性を付与するＡｘｌ  Ｉｇ１ドメイン内の幾つかの突然変異を同定した（図１２及び表２）。第６ソーティングラウンドは、ソート５産物からの３つの特異的クローンをさらに富化した。表２は、ソートラウンド５及びラウンド６産物に含有されるＡＸＬ配列内のユニークなアミノ酸突然変異を示す。この表において、一番上の行の残基番号は、野生型ＡＸＬ中のアミノ酸残基を示す。二番目の行は、野生型ＡＸＬの所与の位置で見出される残基を示す。後続の行には、所与の突然変異体に存在するアミノ酸突然変異が指定されている。突然変異体内の特定残基についてのアミノ酸の不在（例えば、表２中の空白スペース又は空白セル）は、このアミノ酸残基が野生型残基から突然変異されないことを意味する。当業者によく理解されているようにアミノ酸残基についての標準的な一文字記号が用いられている。
【０１６０】
明らかにされるのは、ソート５及び６産物からのユニークな配列、並びに野生型ＡＸＬと比較してプールされたソート５産物についてのＧＡＳ６結合の相当な向上を明示するプールされたクローンの特性である。
【０１６１】
この定方向進化アプローチを用いて単離される突然変異体は、表３に示すアミノ酸置換を備えている。
【０１６２】
表３．定方向進化を用いて単離された突然変異体
【表２】
0005965322.tif 000003
【０１６３】
Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（ＥＭＢＯ  Ｊ  ２００６）によって報告されたＧＡＳ６−ＡＸＬ複合体の結晶構造によると、Ｅ２６Ｇ、Ｇ３２Ｓ、Ｎ３３Ｓ及びＧ１２７Ｒ／Ｅを除いて、上に示したすべての突然変異は、ＡＸＬとＧＡＳ６の間の結合界面に存する。
【０１６４】
第６ソーティングラウンドからの個々の突然変異体、ＡＸＬ  Ｓ６−１及びＡＸＬ  Ｓ６−２、は、さらなる調査のために選択された。野生型又は突然変異体ＡＸＬタンパク質のＧＡＳ６との相互作用の親和性を比較するために、野生型ＡＸＬ、ＡＸＬ  Ｓ６−１及びＡＸＬ  Ｓ６−２の平衡結合滴定が行われた。データは４点Ｓ字状曲線に当てはめられ、中点が平衡結合定数、ＫＤ、として使われた。突然変異体ＡＸＬ  Ｓ６−１及びＡＸＬ  Ｓ６−２は、野生型ＡＸＬと比較して、ＧＡＳ６結合親和性の実質的な向上を提示する（図１３及び表４）。野生型ＡＸＬは、Ｇａｓ６に対して２．４±１．２×１０−９Ｍの結合親和性（ＫＤ）を有し；ＡＸＬ  Ｓ６−２は、Ｇａｓ６に対して１．８９±０．３７×１０−１０Ｍの結合親和性（ＫＤ）を有し；及びＡＸＬ  Ｓ６−１は、Ｇａｓ６に対して１．１２±０．２３×１０−１０Ｍの結合親和性（ＫＤ）を有する。ＡＸＬ  Ｓ６−１及びＡＸＬ  Ｓ６−２について、これは、野生型ＡＸＬと比較して、それぞれ２２倍及び１２．８倍強いＧＡＳ６結合親和性である（表４）。
【０１６５】
表４．Ｇａｓ６への野生型及び突然変異体ＡＸＬタンパク質の結合親和性（ＫＤ）
【表３】
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【０１６６】
本発明者らは、可変温度円偏光二色性スキャンを用いて野生型及び突然変異体ＡＸＬタンパク質の温度安定性も調査した。この技術は、フォールディングされたタンパク質の二次構造要素のアンフォールディングを温度の関数としてモニターする。各タンパク質の楕円率が温度の関数としてモニターされ、そのデータが標準的な二状態アンフォールディング曲線に当てはめられた。融解温度（Ｔｍ）がこのアンフォールディング曲線の中点である。野生型ＡＸＬは、４１．３±０．６℃の融解温度を呈示し；ＡＸＬ  Ｓ６−１は、５４．０±０．９℃の融解温度（野生型ＡＸＬよりおおよそ１３℃高い熱安定性）を呈示し；Ａｘｌ  Ｓ６−２は、４１．５５±０．０２℃の融解温度（野生型ＡＸＬとほぼ同様の熱安定性）を呈示した（表５）。
【０１６７】
表５．可変温度円偏光二色性スキャンによって判定された野生型及び突然変異体ＡＸＬタンパク質の熱安定性。
【表４】
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【０１６８】
【表５】
0005965322.tif 000006
【実施例３】
【０１６９】
可溶性Ａｘｌ変異体は転移性腫瘍進行をインビボで阻害する
ＧＡＳ６−ＡＸＬシグナル伝達は、乳癌、肺癌及び結腸癌並びに最近では、ここに提示するワークにより、卵巣癌を含む、多くの侵攻性形態の充実性腫瘍の進行に結びつけられている。ＡＸＬ発現と疾病状態及び患者予後との間に明確な相関関係が観察されているが、転移の処置のための治療ターゲットとしてのＡＸＬの確証は、ほぼ手つかずのままである。実施例１において、本発明者らは、原発性腫瘍でのＡＸＬ発現レベルが疾患の重症度と相関することで、ＡＸＬが現実にヒト乳及び卵巣癌患者における転移のマーカーであることを証明する。これらの結果は、ＧＡＳ６−ＡＸＬシグナル伝達経路の拮抗が転移性疾患の処置のための治療の窓口を提供出来ることを示唆している。実施例１に概要を示したように、治療ターゲットしてのＡＸＬの可能性を確証するために、ヒト卵巣癌の侵攻性マウスモデルにおけるアデノウイルス送達を用いてＡＸＬの野生型細胞外ドメインの可溶性形態が投与された。本発明者らは、腫瘍転移が、対照と比較して可溶性ＡＸＬ処置を受けたマウスにおいて有意に低減されることを証明した。これらのデータは、可溶性ＡＸＬを使用する腫瘍細胞におけるＧＡＳ６−ＡＸＬシグナル伝達の拮抗が疾患の転移性進行を阻害出来ることを実証した。これらの結果を基に事を進めて、本発明者らは、ＧＡＳ６へのより高い親和性を有する、遺伝子操作ＡＸＬ突然変異体が、抗転移剤としてより大きな効力を惹起すること、及び可溶性ＡＸＬの送達の治療的により妥当な様式が有意な結果をなおもたらすことを証明した。
【０１７０】
この研究において、本発明者らは、実験１において概要を示した同じヒト卵巣癌モデルを使用し、転移性疾患が既に存在するマウスに精製可溶性ＡＸＬ（ｓＡＸＬ）変異体を腹膜内投与した。本発明者らは、野生型ＡＸＬとＡＸＬ  Ｓ６−１、遺伝子操作高親和性突然変異体、の両方を試験し、両方を、ＧＡＳ６結合が完全に破壊される形態のＡＸＬ、Ｅ５９Ｒ／Ｔ７７Ｒ、と比較した。すべての転移性病変の数及び総重量の両方によって評定して腫瘍量の低減が野生型ＡＸＬとＡＸＬ  Ｅ５９Ｒ／Ｔ７７Ｒの陰性対照の両方に比べて有意に低減されたので、本発明者らの結果は、ＡＸＬ  Ｓ６−１の強化された親和性が、より大きな治療効力を生じさせる結果となることを著しく示している。これらの発見は、転移の阻害のための治療ターゲットとしてＡＸＬ及びＧＡＳ６をさらに確証し、並びに遺伝子操作高親和性ＡＸＬ突然変異体Ｓ６−１をＧＡＳ６−ＡＸＬシグナル伝達系の強力なアンタゴニストとして支持する。
【０１７１】
実施例１は、ｓＡＸＬのアデノウイルス送達が治療効力をもたらしたことを実証しているが、この送達方法は臨床的に妥当でないため、本発明者らは、精製されたｓＡＸＬの送達が同様の結果をもたらすことを確認した。薬物動態を向上させるために野生型ＡＸＬ、ＡＸＬ  Ｓ６−１及びＡＸＬ  Ｅ５９Ｒ／Ｔ７７ＲがマウスＩｇＧ２ａの結晶性断片領域（Ｆｃ）に融合された。これら３つのＡＸＬ融合（ＡＸＬ−Ｆｃ）変異体の唯一の差は、表６Ａに概要が示されている、ＡＸＬ  Ｉｇ１ドメインにおいて見いだされる突然変異である。ＡＸＬ−Ｆｃタンパク質をコードするＤＮＡは、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌｌ制限部位を使用してＣＭＶ駆動ｐＡＤＤ２アデノウイルスシャトルベクターにクローン化された。Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎキットを製造業者により説明されたとおりに使用して、これら３つのＡＸＬ突然変異体をコードするｐＡＤＤ２プラスミドがＨＥＫ２９３細胞に独立してトランスフェクトされた。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、培養上清からタンパク質が精製された。
【０１７２】
【表６】
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【０１７３】
インビボで転移を阻害するＡＸＬ−Ｆｃ突然変異体の能力を評定するために、本発明者らは、実施例１に概要を示したのと同じヒト卵巣癌の腹膜異種移植片モデルを使用した。マウスがＳＫＯＶ３ｉｐ．１細胞の投与後４週間に腹水及び多く（＞１００）の小さな転移性病変から成る高浸潤性疾患を急速に発生させるので、このモデルはヒト卵巣癌転移の腹膜播種を再現する。殆どの患者が診断時に有意な転移性疾患を提示するので、このモデルはヒト卵巣癌の非常に正確な代表である。マウスはＳＫＯＶ３ｉｐ．１細胞を注射され、播種のために７日間、腫瘍が放置された。第７日に本発明者らはマウスを３つの研究群に分け、野生型ＡＸＬ−Ｆｃ、Ｓ６−１−Ｆｃ又はＥ５９Ｒ／Ｔ７７Ｒ−Ｆｃのいずれかの処置の投与を始めた。リン酸緩衝食塩水に溶解された精製タンパク質が１０ｍｇ／ｋｇの用量で３週間にわたって週に２回、合計６回、マウスに投与された。可視転移性病変数並びにすべての病変の総重量によって測定して全腫瘍量を評定するために、第２８日にすべてのマウスが犠牲にされ、剖検が行われた。処置群間に顕著な差があった。代表画像が図１４に示されている。Ｅ５９Ｒ／Ｔ７７Ｒ−Ｆｃの陰性対照処置を受けたマウスは、平均８６．３±２１．９の腹膜転移を有した。野生型ＡＸＬ−Ｆｃを受けたマウスについては、その数は４８．１±６．９に低減されたが、遺伝子操作ＡＸＬ群、Ｓ６−１−Ｆｃ、のマウスについては、平均で８．３±１．６の転移性病変しか観察されなかった（図１５（上のパネル））。すべての可視病変が切除され、全転移性腫瘍量を評定するためにマウスごとにまとめて計量された。Ｅ５９Ｒ／Ｔ７７Ｒ−Ｆｃ、野生型Ｆｃ及びＳ６−１−Ｆｃ処置群は、それぞれ５６７±９２、４３０±３６及び１８８±５５ｍｇの腫瘍量を呈示したので、遺伝子操作ＡＸＬ処置群（Ｓ６−１−Ｆｃ）は、また、最も顕著な応答を示した、図１５（下のパネル）。
【０１７４】
まとめると、これらの発見は、転移の処置のための治療ターゲットとしてＡＸＬをさらに確証し、ＡＸＬのリガンド、ＧＡＳ６、の中和が有効な抗転移処置戦略であることを実証する。重要なこととして、Ｇａｓ６への検出可能な結合を提示しないＡＸＬ−Ｆｃ融合体（ＡＸＬ  Ｅ５９Ｒ／Ｔ７７Ｒ−Ｆｃ）を含むタンパク質は、腫瘍転移を予防せず；Ｇａｓ６に中等度の親和性で結合するＡＸＬ−Ｆｃ融合体（野生型ＡＸＬ−Ｆｃ）を含むタンパク質は、腫瘍転移のわずかな阻害を示し；Ｇａｓ６への非常に強い親和性を有するＡＸＬ−Ｆｃ融合体（ＡＸL Ｓ６−１−Ｆｃ）を含むタンパク質は、腫瘍転移の有意な阻害を示す。まとめると、これは、Ｇａｓ６とＡＸＬについての相互作用のエピトープが腫瘍転移に肝要であり、ＡＸL  Ｓ６−１−Ｆｃタンパク質によるＧａｓ６上のこのエピトープの強力な阻害が腫瘍転移を有意に阻害することを示す。従って、ＡＸＬ  Ｓ６−１−Ｆｃタンパク質、又はＧａｓ６−Ａｘｌ相互作用を強力に遮断する任意のタンパク質が、転移性疾患のための有望な治療候補である。加えて、本発明者らは、精製可溶性ＡＸＬタンパク質の直接投与が実行可能な処置法であることも実証し、このアプローチを臨床的に確証する。
実施例３についての方法
【０１７５】
細胞系。卵巣ＳＫＯＶ３ｉｐ．１は、１０％ウシ胎仔血清と１％ペニシリンとストレプトマイシンとを補足した適切な培地中３７℃で５％ＣＯ２インキュベーターにおいて培養された。
【０１７６】
ＡＸＬ−Ｆｃ融合体。完全長ＡＸＬ突然変異体、アミノ酸１９−４４０、は、マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃ領域への直接融合体としてＣＭＶ駆動ｐＡＤＤ２アデノウイルスシャトルベクターにクローン化された。ヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３細胞の一過的ＤＮＡトランスフェクションは、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎキットを製造業者によって説明されたとおりに使用して遂行された。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、５日後に培養上清からＦｃ−融合タンパク質が精製された。精製タンパク質は、追加の添加剤又は担体を伴わないリン酸緩衝食塩溶液に入れられた。
【０１７７】
ＳＫＯＶ３ｉｐ．１腹膜異種移植。動物を伴うすべての手順及びそれらのケアは、施設内及びＮＩＨガイドラインに従ってＳｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの施設内動物実験委員会によって承認された。週齢６週雌ヌードマウスは、１×１０６  ＳＫＯＶ３ｉｐ．１細胞を腹膜内注射された。細胞投与の７日後、マウスは、Ｓ６−１−Ｆｃ、野生型ＡＸＬ−Ｆｃ又はＥ５９Ｒ／Ｔ７７Ｒ−Ｆｃでの処置のために３群にランダムに分割された。精製可溶性ＡＸＬ−Ｆｃタンパク質が１０ｍｇ／ｋｇの投薬量で週２回、腹膜内注射によって投与された。投薬は３週間継続され、その後、マウスは犠牲にされた。剖検が行われ、転移性病変が計数され、その後、まとめて計量されるように切除された。マウスごとに全病変数とすべての疾患組織の総重量の両方によって腫瘍量が決定された。
【０１７８】
統計解析：スチューデントｔ検定が用いられ、報告される誤差は平均値の標準誤差（ＳＥＭ）である。＜０．０１のｐ値を有する値は有意と見なされた。
【０１７９】
上述の発明は、理解の明瞭さを目的として例証及び例によって多少詳細に説明されているが、添付の請求項の精神又は範囲から逸脱することなく一定の変更及び修飾が本発明に行われ得ることは、本発明の教示に照らして当業者には容易に分かるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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