(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトデルタ様リガンド４(ＤＬＬ４)に特異的に結合し、ヒトデルタ様リガンド４とＮｏｔｃｈ受容体間の相互作用を阻害するモノクローナル抗体であって、
ここで、前記モノクローナル抗体は、
配列番号２で記載された重鎖ＣＤＲ１;配列番号３で記載された重鎖ＣＤＲ２;及び配列番号４で記載された重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１６で記載された軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１７で記載された軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１８で記載された軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体、
配列番号２で記載された重鎖ＣＤＲ１；配列番号６で記載された重鎖ＣＤＲ２;及び配列番号７で記載された重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２０で記載された軽鎖ＣＤＲ１;配列番号２１で記載された軽鎖ＣＤＲ２;及び配列番号２２で記載された軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体、
配列番号２で記載された重鎖ＣＤＲ１;配列番号９で記載された重鎖ＣＤＲ２;及び配列番号１０で記載された重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と配列番号２４で記載された軽鎖ＣＤＲ１;配列番号２５で記載された軽鎖ＣＤＲ２；配列番号２６で記載された軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体、または、
配列番号１２で記載された重鎖ＣＤＲ１;配列番号１３で記載された重鎖ＣＤＲ２;及び配列番号１４で記載された重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２８で記載された軽鎖ＣＤＲ１;配列番号２９で記載された軽鎖ＣＤＲ２;及び配列番号３０で記載された軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体、である、
モノクローナル抗体。
【請求項２】
請求項１に記載のモノクローナル抗体であって、
前記モノクローナル抗体は、
配列番号１で記載された重鎖可変領域のアミノ酸配列及び配列番号１５で記載された軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体、
配列番号５で記載された重鎖可変領域のアミノ酸配列及び配列番号１９で記載された軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体、
配列番号８で記載された重鎖可変領域のアミノ酸配列及び配列番号２３で記載された軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体、または、
配列番号１１で記載された重鎖可変領域のアミノ酸配列及び配列２７で記載された軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体、である、
モノクローナル抗体。
【請求項３】
請求項１または２に記載のモノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項５】
請求項４の発現ベクターが導入された形質転換体。
【請求項６】
請求項４の発現ベクターの発現を含むヒトデルタ様リガンド４(ＤＬＬ４)に特異的に結合し、ヒトデルタ様リガンド４とＮｏｔｃｈ受容体間の相互作用を阻害するモノクローナルの製造方法。
【請求項７】
請求項１または２に記載のモノクローナル抗体を含む癌を予防又は治療するための薬学的組成物。
【請求項８】
前記癌は、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、肺癌、結腸癌、乳癌、子宮頚部癌、子宮内膜癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣腫瘍、膀胱癌、腎癌、肝癌、膵臓癌、骨癌、結合組織癌、皮膚癌、脳癌、甲状腺癌、白血病、ホジキン病、リンパ腫、多発骨髄腫、血液癌からなる群より選択されるものである請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
請求項１または２に記載のモノクローナル抗体を含む癌診断用組成物。
【請求項１０】
請求項１または２に記載のモノクローナル抗体を含む自己免疫疾患を予防又は治療する薬学的組成物。
【請求項１１】
前記自己免疫疾患は、リウマチ性関節炎、全身性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、アトピー皮膚炎、乾癬、円形脱毛症、喘息、クローン病、ベーチェット症候群、シェーグレン症候群、ギラン・バレー症候群、慢性甲状腺炎、多発性硬化症、強直性脊椎炎、脳脊髄炎、線維炎及び結節性多発動脈炎からなる群より選択されるものである請求項１０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デルタ様リガンド４(ＤＬＬ４)に特異的に結合する新規モノクローナル抗体に関し、具体的には、ヒトデルタ様リガンド４に特異的に結合してデルタ様リガンド４とＮｏｔｃｈ受容体間の結合を効果的に阻害するモノクローナル抗体、前期モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチド、前期ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前期発現ベクターを含む形質転換体、前期モノクローナル個体の製造方法、前期モノクローナル抗体を含む癌を予防又は治療するための薬学的組成物、前期モノクローナル抗体を含む癌診断用組成物、前期モノクローナル個体を用いた癌を診断するための方法及びモノクローナル抗体を含む自己免疫疾患を予防又は治療するための薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、脊椎動物から無脊椎動物に至るまで進化論的に高く保存されており、発生初期に細胞の運命を決定する非常に重要な役割を担うと報告されている。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、神経細胞、眼球細胞、リンパ球、筋肉細胞、血球などの分化を調節する主要因子として知られており、また、血管発生にも関与している。哺乳類には、４つのＮｏｔｃｈ受容体を持っており(Ｎｏｔｃｈ１、２、３及び４)、それぞれのＮｏｔｃｈ受容体は、３００−３５０ｋＤａの大きさを有するタンパク質として合成されｍゴルジ体でフーリン様転移酵素によってS1部位が切られることで、細胞表面でヘテロ二量体を形成する。さらに、哺乳類では、４つのＮｏｔｃｈリガンド(Ｊａｇｇｅｄ-１/２及びＤｅｌｔａ類リガンド(ＤＬＬ)1/３/４)が発見された。
【０００３】
Ｎｏｔｃｈ受容体及びリガンドは、いずれも膜タンパク質であり、２つの近接した細胞間の境界面に結合し、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を誘導する。細胞がそれぞれと接触するとき、これらの細胞の外側のドメインが直接的に結合してシグナル伝達が誘導し、リガンドと受容体の組み合わせによって異なった細胞反応が起きる。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達で、リガンドとＮｏｔｃｈが互いに結合すると、Ｎｏｔｃｈ受容体の構造的に変化し、以後、２回の順次的なタンパク質分解切断を受ける。一番目のタンパク質分解切断は、金属タンパク質分解酵素であるＡＤＡＭ１０/１７(a disintegrin and metalloprotease 10/17)/ＴＡＣＥ(TNF-αConverting enzyme)による細胞の外側のドメイン(S2部位)が切断されてから始まる。Ｓ２部位が切断されると、Ｎｏｔｃｈ受容体の膜間通領域のＳ３部位が切断される。二番目のタンパク質分解切断は、５つのサブユニットを持つγ-セクレターゼによって仲介される。γ-セクレターゼ複合体は、プレセニリン１、プレセニリン２、ニカストリン、Ｐｅｎ-２及びＡｐｈ１から構成されている。２回のタンパク質分解切断後、Ｎｏｔｃｈ 細胞内部分(ＮＩＣＤ)は、分離されて核の中に移動する。核の中で、ＮＩＣＤは、転写抑制因子であるＣＳＬ(CBF-1/Suppressor of Hairless/Lag-1)と結合し、ＣＳＬに結合していた補助抑制因子(CoR)のと交代する。ＮＩＣＤ/ＣＳＬ複合体は、補助活性因子(CoA)であるＭＡＭＬ(マスターマインド様)又はｐ３００などを集め、サイクリンＤ1、ｐ２１、ＮＦ-ｋＢ、ｃ−Ｍｙｃ、ｐｒｅ-Ｔａ(pre-T cell receptor alpha chain)、ＧＡＴＡ３、ＮＲＡＲＰ及びＤｅｌｔｅｘ1などのＮｏｔｃｈターゲット遺伝子を活性化させ発現を誘導する。
【０００４】
活性化されたＮｏｔｃｈシグナル伝達は、様々な癌モデルで腫瘍形成を誘発することが知られている。活性型ＮｏｔｃｈであるＮＩＣＤがラットの造血細胞で発現される場合、Ｔ細胞白血病/リンパ腫を引き起こし、活性型Ｎｏｔｃｈ１の約５０％が、T-All(T細胞急性リンパ芽球性
白血病)の約５０％発見された(非特許文献１)。さらに、乳癌の場合、Ｎｏｔｃｈ４受容体が、ＭＭＴＶ(マウス乳癌ウイルス)が挿入されたラット(CzechII)で過剰発現されることが発見され、これらのラットの乳腺腫瘍の発生が報告された(非特許文献２)。子宮頚部癌、肺癌、膵臓癌、卵巣癌、乳癌及び前立腺癌などの様々な癌でＮｏｔｃｈ受容体とリガンド及びＮｏｔｃｈシグナル伝達のターゲットが活性化されていることが報告されている(非特許文献３)。Ｎｏｔｃｈ１受容体が乳癌患者において 不良な予後と関連されており(非特許文献４)、前立腺癌においては、癌転移と関連している(非特許文献５)。
【０００５】
デルタ様４(Dl4)又はデルタ様リガンド４(以下「ＤＬＬ４」という)は、血管内皮細胞で過剰発現されているＮｏｔｃｈタンパク質に結合するデルタ部類の一つであり、血管新生を調節する主な要素として知られている。ＤＬＬ４は、特に、血管内皮細胞で過剰発現されているＮｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ４受容体に結合する。ＤＬＬ４は、正常的な血管でも発現するが、癌の血管では非常に過剰発現されていることが知られている(非特許文献６)。血管新生は、元の血管から形成される新しい血管による機構を意味する。特に、腫瘍において、血管新生は、癌組織の低酸素領域に酸素と栄養分を供給してもらうために、ＶＥＧＦのような血管新生因子によって引き起こる。腫瘍において、血管新生は、腫瘍の成長だけでなく、腫瘍の転移においても重要な役割を果たすことが知られている。腫瘍において、ＤＬＬ４によるＮｏｔｃｈシグナル伝達をブロックすると、血管新生が容易に調節されず、それによって、癌の成長が抑制される。さらに、ＤＬＬ４によるＮｏｔｃｈシグナル伝達が抑制されると、制御性Ｔ細胞(Treg)の数を増加させることによって、自己免疫疾患を治療することができる(特許文献１)。このような理由から、ＤＬＬ４は、癌及び自己免疫疾患の治療において新しいターゲットになる。
【０００６】
ＤＬＬ４をターゲットとして、癌又は自己免疫疾患を治療するために、様々な部分でＮｏｔｃｈシグナル伝達を抑制するための研究がなされている。その例として、Ｎｏｔｃｈ/リガンド結合を阻害する受容体であるデコイ、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達でＮｏｔｃｈタンパク質の切断に関与するγ-セクレターゼ抑制剤及びＮｏｔｃｈシグナル伝達に関与するタンパク質又はＮｏｔｃｈのターゲット遺伝子を抑制するためのｍｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡを含む。これらの様々なＮｏｔｃｈシグナル伝達を抑制するための方法の中で、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の初期に作用することができるＮｏｔｃｈに対するリガンドに結合するモノクローナル抗体に対する研究の重要性が多くなってきており、特に、臨床研究のためのヒトのＤＬＬ４に特異的に結合可能で、免疫原生の危険性を最小化しながらＤＬＬ４/Ｎｏｔｃｈ受容体の相互作用を効果的に阻害できるヒトモノクローナル抗体の開発が要求されてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国公開特許第２０１１−０１８９２００号
【特許文献２】米国公開特許２０１１−０１８９２００号
【特許文献３】米国公開特許２０１１−０１１７０７９号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Science 2004; 306:71-269
【非特許文献２】Journal of Virology 1987; 61:66-74
【非特許文献３】Clin Cancer Res 2006; 12(4):1074-79
【非特許文献４】Cancer Reserach 2005; 65:8530-7
【非特許文献５】Cancer Research 2004;64:6854-7
【非特許文献６】Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol 2008; 5(5):250-67
【非特許文献７】Cancer Res 2007;67(23):11244-53
【非特許文献８】Novartis Found Symp 2007;283:106-20
【非特許文献９】J Immunol 2011;187(5)2322-8
【非特許文献１０】Nature 1976;256:495
【非特許文献１１】A Companion to Methods in Enzymology 2:119
【非特許文献１２】J.Virol. 2001 Jul;75(14):6692-9
【非特許文献１３】Ann. Rev. Immunol 1994.12:433
【非特許文献１４】Cancer Res 2011;71:6030-6039
【非特許文献１５】Nature 1994;368:150-4
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明者らは、ヒトＤＬＬ４に特異的に結合できると同時に、ＤＬＬ４/Ｎｏｔｃｈ受容体の相互作用を効果的に阻害し及び免疫原生の危険性を最小化できるヒトモノクローナル抗体を開発するために鋭意努力した。その結果、本発明者らは、ヒト抗体のライブラリーから重鎖及び軽鎖のドメインが全てヒト由来であるヒトＤＬＬ４に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体を製作し、ＤＬＬ４とＮｏｔｃｈタンパク質の間の相互作用を効果的に阻害できるヒトモノクローナル抗体を見出し、それにｙって、癌のような疾病の治療に効果的に使用できることで、本発明の完成に至った。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の目的は、ヒトデルタ様リガンド(ＤＬＬ４)に特異的に結合し、同時にヒトデルタ様リガンド４とＮｏｔｃｈ受容体間の相互作用を阻害する新規モノクローナル抗体を提供することである。
【００１１】
本発明の他の目的は、前記モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び前記発現ベクターを含む形質転換体を提供することである。
【００１２】
本発明のさらに他の目的は、前記モノクローナル抗体を製造する方法を提供することである。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、前記モノクローナル抗体を含む癌を治療するための薬物学組成物を提供することである。
【００１４】
本発明のさらに他の目的は、前記モノクローナル抗体を用いて癌を治療する方法を提供することである。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、前記モノクローナル抗体を用いて、抗原-抗体反応を通じて癌の疑いのある個体から分離した生物学的試料のデルタ様リガンド４(ＤＬＬ４)タンパク質を検出する段階を含む方法である癌を診断する方法を提供することである。
【００１６】
本発明のさらに他の目的は、前記モノクローナル抗体を含む癌を診断するための組成物を提供することである。
【００１７】
本発明のさらに他の目的は、前記癌を診断するための組成物を含む癌を診断するためのキットを提供することである。
【００１８】
本発明のさらに他の目的は、前記モノクローナル抗体を含む自己免疫疾患を治療するための薬学的組成物を提供することである。
【００１９】
本発明のさらに他の目的は、前記モノクローナル抗体を用いて自己免疫疾患を治療する方法を提供することである。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によるヒトモノクローナル抗体は、ヒトＤＬＬ４に対して強い親和力を示し、Ｎｏｔｃｈ受容体へのＤＬＬ４の結合を効果的に阻害し、重鎖及び軽鎖ドメインである全てがヒト由来であるため、低い免疫原生を示す。従って、本発明のヒトモノクローナル抗体は、癌又は自己免疫診断のような疾患の診断及び治療に効果的に使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＤＬＬ４に対するモノクローナル抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。ＦＩＧ１で、フレームは、フレームワーク領域を、CDRは補性決定領域を意味する。
【図２】モノクローナル抗体のＤＬＬ４に対する結合能を酵素免疫吸着測定法(ELISA)を通じて分析した結果を示す。
【図３】ＤＬＬ４を人為的に過剰発現させたHEK２９３細胞において、ＤＬＬ４に対するモノクローナルのＤＬＬ４に対する結合能を流動細胞分析法を通じて検出した結果を示す((a)ＭＬＣＫ-１;(b)ＭＬＣＫ-２;(c)ＭＬＣＫ-３;(d)ＭＬＣＫ-４)。
【図４】モノクローナル抗体のＤＬＬ４に対する中和能をELISAを通じて分析した結果を示す。
【図５】ビアコア機器を使用して、抗原ＤＬＬ４と本発明の抗-ＤＬＬ４抗体であるＭＬＣＫ-１、ＭＬＣＫ-２、ＭＬＣＫ-３及びＭＬＣＫ-４との親和度を測定した結果を示す。
【図６】抗-ＤＬＬ４抗体であるＭＬＣＫ-２が、ＤＬＬ４を介したＨＵＶＥＣの増殖抑制をブロックすることを確認した図である。
【図７】抗-ＤＬＬ４抗体であるＭＬＣＫ-２が、ＤＬＬ４及びＮｏｔｃｈ間の相互作用の抑制を通じて、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を阻害することをウェスタンブロッティングによって確認した結果を示す。
【発明の実施するための形態】
【００２２】
一態様として、本発明は、ヒトデルタ様リガンド４とＮｏｔｃｈ受容体間の相互作用を阻害しながら、ヒトデルタ様リガンド４(ＤＬＬ４)に特異的に結合する新規モノクローナル抗体、特に、ヒトモノクローナル抗体を提供する。
【００２３】
ここで用いられる、用語「抗体」とは、特異的に抗原を認識する受容体の役割をするタンパク質分子を意味し、特定の抗原と免疫学的な反応性を持つ免疫グロブリン分子を含む。前記用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、全抗体及び抗体断片もまた含む。さらに、前記用語は、キメラ性抗体(例えば、人間化ネズミ科抗体)及び二価又は二重特異性分子(例えば、二重特異性抗体)、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディーを含む。全抗体は、２つの全長の軽鎖及び２つの全長の重鎖を持ち、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合で連結されている。前記全抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びＩｇＧを含み、ＩｇＧは、サブタイプとして、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む。前記抗体の断片は、抗原に結合する機能を持つ断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２及びFvを含む。Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域及び重鎖の最初の不変領域(ＣＨ１ドメイン)を持つ構造として１つの抗原結合部位を持つ。Ｆａｂ'は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に少なくてもシステイン残基を含むヒンジ領域を持つという点でＦａｂと異なる。Ｆ(ａｂ')２抗体は、Ｆａｂ'のヒンジ領域のシステイン残基間のジスルフィド結合によって生成される。Ｆｖ(可変断片)は、重鎖可変部位及び軽鎖可変部位のみを持つ最小の抗体断片を意味する。二本鎖Ｆｖ(dsFv)は、重鎖可変部位とジスルフィド結合によって軽鎖可変部位と連結されており、一本鎖Ｆｖ(scFv)は、一般的にペプチドリンカーを通じて重鎖可変領域が軽鎖可変領域と共有結合で連結されている。このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ(例えば、全体抗体をパパインで切断することで、Ｆａｂ断片を得ることができ、ペプシンで切断することで、Ｆ(ａｂ')２断片を得ることができる)、好ましくは、遺伝子組み換え技術を通じて、抗体断片を作製することができる。
【００２４】
ここで用いられる、用語「モノクローナル抗体」とは、実際的に同一の抗体集団から取得した単一分子組成を持つ抗体分子を意味し、このモノクローナルは、特定のエピトープに対して単一結合特異性及び親和度を示す。
【００２５】
一般に、免疫グロブリンは、重鎖及び軽鎖を持つ。それぞれの重鎖及び軽鎖は、不変領域及び可変領域(前記領域は、さらにドメインとして知られている)を含む。軽鎖及び重鎖の可変領域は、相補性決定領域(以下「CDR」という)と呼ばれる３つの多変可能な領域によって阻害された４つの構造(フレームワーク)領域を含む。前記ＣＤＲは、主に抗原のエピトープに結合する役割をする。ＣＤＲのそれぞれの鎖は、一般にＮ-末端から始まり順に数えて、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と呼ばれ、また、一般にＣＤＲが位置する鎖によって識別される。
【００２６】
ここで用いられる、用語「ヒト抗体」とは、免疫グロブリンから由来する分子として、相補性決定領域、フレームワーク（構造）領域を含む抗体全長のアミノ酸配列がヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列からなることを意味する。ヒト抗体は、一般に、ヒトの疾患の治療に用いられるが、これは３つ以上の潜在的長点を有する。まず、ヒト抗体は、ヒト免疫システムにより容易に相互作用することができるため、ターゲット細胞は、例えば、補体-依存性細胞毒性(CDC)又は抗体-依存性細胞性毒性(ADCC)によってより効果的に破壊され得る。二番目に、ヒト免疫システムは、前記抗体を外来のものと認識しないという利点がある。三番目に、抗体が、より少ない頻度でより少ない量の薬物を投与した場でも、ヒト循環系におけるその半減期が、天然的に発生する抗体と類似しているという利点がある。従って、本発明によるヒトモノクローナル抗体は、ＤＬＬ４に対する強い親和力を示し、ＤＬＬ４を発現する細胞(例‐癌細胞)が、Ｎｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ４受容体に結合することを効果的に阻害し、また重鎖及び軽鎖のドメイン全てがヒト由来であるため、低い免疫原生を示す。従って、本発明のモノクローナル抗体は、癌又は自己免疫疾患などの疾病の治療のために効果的に利用することができる。
【００２７】
ここで用いられる、用語「ヒトデルタ様リガンド４(ＤＬＬ４) に特異的に結合するモノクローナル抗体」とは、ＤＬＬ４に結合でき、ＤＬＬ４の生物学的活性の抑制を誘導する抗体を意味し、本発明で「抗ＤＬＬ４抗体」と交互に使用され得る。前記ＤＬＬ４に特異的に結合するモノクローナルは、ＤＬＬ４に特異的に結合してＤＬＬ４とＮｏｔｃｈ受容体間の相互作用を阻害するものであれば、制限されない。前記モノクローナル抗体の実施例は、前記で説明したように、全抗体及び抗体断片を含む。本発明のモノクローナル抗体は、ＤＬＬ４とＮｏｔｃｈタンパク質間の相互作用を阻害しながら、ヒトＤＬＬ４に特異的に結合し、それによって、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達が関与する癌又は自己免疫疾患などの疾病の治療に効果的に使用され得る。
【００２８】
前記ＤＬＬ４に特異的に結合するモノクローナル抗体は、好ましくは配列番号２に記載される重鎖ＣＤＲ１を含む モノクローナル抗体であり得、ＤＬＬ４に特異的に結合するが、それらに制限されない。
【００２９】
前記配列番号２で記載された重鎖ＣＤＲ１を含むモノクローナル抗体は、好ましくは、配列番号２で記載された重鎖ＣＤＲ１；配列番号３で記載された重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号４で記載された重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と配列番号１６で記載された軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１７で記載された軽鎖ＣＤＲ３；及び配列番号１８で記載された軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体であり得る。より好ましくは、配列番号２で記載された重鎖ＣＤＲ１は、配列番号１で記載された重鎖可変領域のアミノ酸配列及び配列番号１５で記載された軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体であり得るが、それらに制限されない。本発明の一実施例では、配列番号１で記載されたアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１５で記載されたアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むヒトモノクローナル抗体を「ＭＬＣＫ-１」と命名した。
【００３０】
さらに、前記配列番号２で記載された重鎖ＣＤＲ１を含むモノクローナル抗体は、好ましくは、配列番号２で記載された重鎖ＣＤＲ１；配列番号６で記載された重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号７で記載された重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と配列番号２０で記載された軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２１で記載された軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２２で記載された軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体であり得る。より好ましくは、配列番号２で記載された重鎖ＣＤＲ１を含むモノクローナル抗体は、配列番号５で記載された重鎖可変領域のアミノ酸配列及び配列番号１９で記載された軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体であり得るが、それらに制限されない。本発明の一実施例では、配列番号５で記載されたアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１９で記載されたアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むヒトモノクローナル抗体を「ＭＬＣＫ-２」と命名した。
【００３１】
さらに、前記配列番号２で記載された重鎖ＣＤＲ１を含むモノクローナル抗体は、好ましくは、配列番号２で記載された重鎖ＣＤＲ１；配列番号９で記載された重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１０で記載された重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と配列番号２４で記載された軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２５で記載された軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２６で記載された軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体であり得る。より好ましくは、配列番号２で記載された重鎖ＣＤＲ１を含むモノクローナル抗体は、配列番号８で記載された重鎖可変領域のアミノ酸配列及び配列番号２３で記載された軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体であり得るが、それらに制限されない。本発明の一実施例では、配列番号８で記載されたアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２３で記載されたアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むヒトモノクローナル抗体を「ＭＬＣＫ-３」と命名した。
【００３２】
さらに、前記ＤＬＬ４に特異的に結合するモノクローナル抗体は、好ましくは、配列番号１２で記載された重鎖ＣＤＲ１；配列番号１３で記載された重鎖ＣＤＲ２；配列番号１４で記載された重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と配列番号２８で記載された軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２９で記載された軽鎖ＣＤＲ２；配列番号３０で記載された軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体であり得る。より好ましくは、配列番号１１で記載された可変領域のアミノ酸配列及び配列番号２７で記載された可変領域のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体であり得るが、それらに制限されない。本発明の一実施例では、配列番号１１で記載されたアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２７で記載されたアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むヒトモノクローナル抗体を「ＭＬＣＫ-４」と命名した。
【００３３】
前記ＭＬＣＫ-１、ＭＬＣＫ-２、ＭＬＣＫ-３及びＭＬＣＫ-４の重鎖及び軽鎖可変領域の配列を図１に示した。
【００３４】
本発明のヒトモノクローナル抗体が不変領域を含む場合、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭ、又はこれらの組み合わせ、並びにこれらのハイブリットから由来する不変領域を含むことができる。
【００３５】
本発明の用語「組み合わせ」とは、同一起源の単鎖免疫グロブリン不変領域をコードするポリペプチドが、二量体又は多量体を形成する異なる起源の単鎖ポリペプチドと連結されていることを意味する。その例として、二量体又は多量体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭの不変領域からなるグループより選択される２つ以上の不変領域を形成することができる。
【００３６】
本発明の用語「ハイブリット」とは、２つ以上の異なる起源の免疫グロブリン重鎖不変領域にをコードする配列が単鎖免疫グロブリン重鎖不変領域内に存在することを意味する。その例として、ドメインのハイブリットは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４から選択される１〜４つのドメインから構成され得る。
【００３７】
一方、ＩｇＧのサブタイプであるＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４重鎖不変領域の組み合わせ又はハイブリットもまた可能である。これらの組み合わせ及びハイブリットは、前記に説明したとおりである。前記ＩｇＧ１重鎖不変領域は、配列番号３１で記載されたＩｇＧ１重鎖不変領域であり得る；ＩｇＧ２重鎖不変領域は、配列番号３２で記載されたＩｇＧ２重鎖不変領域であり得る；ＩｇＧ３重鎖不変領域は、配列番号３３で記載されたＩｇＧ３重鎖不変領域であり得る；及びＩｇＧ４重鎖不変領域は、配列番号３４で記載されたＩｇＧ４重鎖不変領域であり得るが、本発明の範囲は、そられに制限されるものではない。
【００３８】
さらに、本発明の前記ＤＬＬ４に特異的なモノクローナル抗体が、軽鎖不変領域を含み、前記軽鎖不変領域は、ラムダ(λ)又はカッパ(κ)軽鎖由来であり得る。前記モノクローナル抗体の軽鎖不変領域がラムダ軽鎖由来である場合、配列番号３５で記載されたラムダ軽鎖不変領域であり得るが、これらに制限されるものではない。
【００３９】
本発明の用語「デルタ様リガンド４(ＤＬＬ４)」は、Ｎｏｔｃｈ受容体に結合するデルタクラスリガンドの一つとして、好ましくは、Ｎｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ４に結合するタンパク質を意味するが、それらに制限されるものではない。ＤＬＬ４は、どの哺乳類のＤＬＬ４でもあり得るが、好ましくは、ヒトＤＬＬ４であり得る。本発明の目的上、ＤＬＬ４は、癌細胞又は血管内皮細胞で発現するＮｏｔｃｈ１又は４受容体のいずれにも結合でき、癌の成長を誘導したり、自己免疫疾患の進行を誘導するタンパク質を意味するが、それらに制限されるものではない。
【００４０】
前記ＤＬＬ４は、癌の血管系を含む様々な癌細胞で過剰発現されており、癌モデルにおいて、腫瘍内の脈管機能を向上させることによって、癌の増殖と転移に関与することが知られている。また、ＤＬＬ４の抑制は、自己免疫疾患を治療できることが知られている。
【００４１】
前記ＤＬＬ４タンパク質は、天然型又は変異体ＤＬＬ４タンパク質を含むが、それらに制限されるものではない。ここで用いられる用語、天然型ＤＬＬ４タンパク質は、一般に、天然型ＤＬＬ４タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味し、そして、The phrase前記天然型ＤＬＬ４タンパク質のアミノ酸配列は、一般に、自然に発生するＤＬＬ４で発見されるアミノ酸配列を意味する。前記ＤＬＬ４に対する情報は、米国国立保健研究
所のＧｅｎｅＢａｎｋを含む公知のデータベースから得ることができ、例えば、Gene bank Accession Number NM_019074.3(Gene ID: 54567)であるＤＬＬ４の情報であり得るが、それらに制限されるものではない。
【００４２】
本発明の用語「Ｎｏｔｃｈ受容体」とは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を媒介するタンパク質を意味し、Ｎｏｔｃｈと交互して使用することができる。前記Ｎｏｔｃｈ受容体は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を媒介するどのタンパク質でもあり得る。好ましくは、Ｎｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ４受容体であり得るが、それらに制限されるものではない。本発明の目的上、前記Ｎｏｔｃｈ受容体は、哺乳類のＤＬＬ４に結合するどんなタンパク質でもあり得るが、好ましくは、ヒトＤＬＬ４に結合するタンパク質であってもよい。本発明の用語「Ｎｏｔｃｈ」は、全ての天然型Ｎｏｔｃｈ又は変異体Ｎｏｔｃｈタンパク質を含むことを意味する。ここで用いられる用語「天然型Ｎｏｔｃｈ」とは、天然型Ｎｏｔｃｈタンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味し、前記(The phrase)「天然型Ｎｏｔｃｈタンパク質のアミノ酸配列」とは、一般に、自然に発生するＮｏｔｃｈ受容体から発見されるアミノ酸を意味する。
【００４３】
本発明の用語「ヒトデルタ様リガンド４とＮｏｔｃｈ受容体間の相互作用の阻害」は、本発明のＤＬＬ４に特異的なモノクローナル抗体が、ＤＬＬ４に結合してＤＬＬ４とＮｏｔｃｈ受容体間の相互作用を阻害することを意味し、好ましくは、ＤＬＬ４に特異的なモノクローナル抗体が、ＤＬＬ４に結合してＤＬＬ４とＮｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ４受容体との相互作用を阻害することを意味するが、それらに制限さえるものではない。本発明のＤＬＬ４に特異的なモノクローナル抗体は、ＤＬＬ４との結合によるＮｏｔｃｈ受容体の構造的変化を防ぐことで、ＤＬＬ４とＮｏｔｃｈ受容体間の相互作用の阻害する。従って、Ｎｏｔｃｈタンパク質の加水分解を防ぎ、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を阻害する。癌において、ＤＬＬ４がＮｏｔｃｈ受容体に結合すると、血管内皮細胞間のシグナル伝達又は癌のがん幹細胞と血管内皮膚細胞間のＮｏｔｃｈシグナル伝達が活性化され、血管の大きさを増大し、腫瘍内の脈管機能が向上し、それによって、癌の増殖と転移への役割を担うことが知られている(非特許文献７)。従って、癌においては、ＤＬＬ４によりＮｏｔｃｈシグナル伝達がブロックされると、血管新生がうまく調節されず、それによって、癌の成長を抑制することができる。さらに、ＤＬＬ４がブロックされると、血管新生部位の末端の細胞から外側抑制の欠失は、過剰な発芽を引き起こすようである。その結果、低い生産性及び酸素を供給するための還流を有する血管新生の反応が低下することによる結果として、癌周辺の低酸素を誘導を減少させることができ、抗ＶＥＧＦ治療において抵抗性を示す癌に対しても、抗癌効果を結果として示す。(非特許文献８)。従って、ＤＬＬ４とＮｏｔｃｈ間の相互作用を効果的に抑制する本発明のＤＬＬ４に特異的なヒトモノクローナル抗体は、癌の治療に効果的に使用することができる。さらに、ＤＬＬ４の抑制が制御性Ｔ細胞の発達を促進させ、脳脊髄炎などの自己免疫疾患を緩和させることが知られている(非特許文献９)。さらに、ＤＬＬ４アンタゴニストは、自己免疫疾患の治療に利用でき(特許文献２)、そして抗体などのＤＬＬ４結合タンパク質が、自己免疫疾患の治療に使用できることが知られている(特許文献３)。従って、ＤＬＬ４に効果的に結合してＤＬＬ４とＮｏｔｃｈ受容体間の相互作用を抑制する本発明の抗体は、自己免疫疾患の治療でも効果的に使用され得る。
【００４４】
本発明の一実施例において、前記ＤＬＬ４特異的ヒトモノクローナル抗体であるＭＬＣＫ-１、ＭＬＣＫ-２、ＭＬＣＫ-３及びＭＬＣＫ-４を製作し、対照群に比べて、前記抗体に対してヒトＤＬＬ４との結合能のパーセンテージが、それぞれ４７．８２％、５９％、５２．８５％及び５２．４６％であることを証明し(図３)、これら抗体は、０．１μＭという低い抗体濃度で、ＤＬＬ４とヒトＮｏｔｃｈ１受容体間の結合をほとんどブロックすることが観察された(図４)。さらに、本発明の抗-ＤＬＬ４抗体ＭＬＣＫ-１, ＭＬＣＫ-２,ＭＬＣＫ-３及びＭＬＣＫ-４のｈＤＬＬ４に対するＫｄ(Ｍ)は、それぞれ２．６３×１０-７Ｍ、１．７１×１０-9Ｍ、６．９６×１０-9Ｍ及び２．１３×１０-6Ｍであった(図５)。また、血管内皮細胞の増殖は、濃度依存的にＤＬＬ４によって阻害された(図６)。また、ＤＬＬ４-Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の活性は、ＮＩＣＤの生成の抑制をもたらす(図７)。これらの結果は、本発明のＤＬＬ４特異的ヒトモノクローナル抗体が、ＤＬＬ４とＮｏｔｃｈ受容体間の結合を効果的にブロックし及びＮｏｔｃｈシグナル伝達を抑制することによって、自己免疫疾患に対する抗癌効果及び治療効果を提供できることを示す。
【００４５】
他の態様として、本発明は、前述したモノクローナル抗体を製造する方法を提供する。
【００４６】
本発明のモノクローナル抗体は、従来のモノクローナル抗体製造技術を用いて容易に製造することができる。例えば、モノクローナル抗体を製造する方法は、免疫された動物から得られたＢリンパ球を用いてハイブリドーマを製造することで、行うことができ(非特許文献１０)又はファージディスプレイ技術を用いることによって行うことができるが、それらに制限されるものではない。
【００４７】
ファージディスプレイを用いた抗体ライブラリーは、ハイブリドーマを製作することなく、Ｂリンパ球から直接的に得られた抗体遺伝子を持つファージの表面で抗体を発現させる方法である。ファージディスプレイ法によって、Ｂ-細胞不滅化によるモノクローナル抗体を生成することに関連し、多くの困難を、ファージディスプレイ法によって克服することができる。従来のファージディスプレイは、１)ファージ外皮タンパク質ｐIII(又はpIV)のN-末端に該当する領域にランダム配列を有するオリゴヌクレオチドを挿入する；２)ランダム配列を有する前記オリゴヌクレオチドによってコードされる天然型の外皮タンパク質及びポリペプチドの融合タンパク質を発現させる；３)前記オリゴヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに結合できる受容体物質を処理する；４)受容体に結合するペプチド−ファージ粒子を、低いpH又は結合競争力のある分子を利用して溶出させる；５)パンニングによって溶出したファージを宿主細胞内で増幅させる；６)所望の量のファージを得るために前記段階を繰り返す；及び７)パンニングによって選別されたファージクローンのＤＮＡ配列を有する活性化ペプチドの配列を決定する段階から構成される。
【００４８】
好適な実施例において、本発明のモノクローナル抗体の製造方法は、ファージディスプレイ法によって行ってもよい。当分野の当業者は、例えば、Barbas(非特許文献１１，１２)など及びWinterなど(非特許文献１３)の論文などに記載されているファージディスプレイ技術を参考して、前記本発明の製造方法の前記段階を容易に行うことができる。抗体ライブラリーを構築するために使用できるファージの例は、それに制限されないが、fd, M13, f1, If1, Ike, Zj/Z, Ff, Xf, Pf1及びPf3などの繊維状ファージを含む。また、前記繊維状ファージの表面上に異種の遺伝子の発現のための使われ得るベクターの例は、それに制限されないが、fUSE5, fAFF1, fd-CAT1又はfdtetDOGなどのファージベクター又はpHEN1, pComb3, pComb8又はpSEXなどのファージミドベクターを含む。さらに、組み換えファージの成功的な再感染のために要求される野生型外皮タンパク質を提供するために使用できるヘルパーファージの例は、それに制限されないが、M13K07及びVCSM13を含む。
【００４９】
本発明のハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体又はファージディスプレイクローンをコードするポリヌクレオチドは、従来の手続きを用いて容易に単離され、配列分析することができる(その例として、ハイブリドーマ又はファージの鋳型ＤＮＡから目的の重鎖及び軽鎖領域を特異的に増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用することで)。ひとまず、前記ポリヌクレオチドが単離されると、発現ベクター内に入れることができ、次に、適切な宿主細胞に遺伝子導入して、形質転換された宿主細胞(つまり、形質変換体)から所望のモノクローナル抗体を生産することができる。従って、本発明のヒトモノクローナル抗体を製造する方法は、ヒトモノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを増幅させる段階を含むが、それらに制限されるものではない。
【００５０】
他の態様として、本発明は、前記モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオヂド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び前記発現ベクターを含む形質転換体を提供する。
【００５１】
前記モノクローナルは、前記の説明のとおりである。
【００５２】
本発明による前記モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、特に制限されないが、哺乳類細胞(例えば、ヒト、サル、ウサギ、ラット、ハムスター又はマウス細胞など)、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞又はバクテリア細胞(例えば、大腸菌など)を含む真核又は原核細胞から前期ポリヌクレオチドを複製及び/又は発現可能なベクターであり得る。好ましくは、宿主細胞でポリヌクレオチドが発現できるように、適切なプロモータと作動可能であるように連結されており、少なくとも一つの選別マーカーを含むベクターであり得る。その例として、前記ベクターは、 ファージ、プラスミド、コスミド、微小染色体、ウィルス又はレトロウィルスに導入された前記ポリヌクレオチドを含む。
【００５３】
前記モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、前記モノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖を含むベクター又は、前記モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含むいずれの発現ベクターであり得る。
【００５４】
本発明の前記発現ベクターが形質変換体を形成するために導入される必要がある細胞は、大腸菌、ストレプトミセス(Streptomyces)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)などのバクテリア細胞；酵母細胞；ピキア・パストリス(Pichia pastoris)などの菌類細胞；ショウジョウバエ(Drosophila)又はスポドプテラ(Spodoptera)Sf9細胞などの昆虫細胞；CHO(中国のハムスター卵巣細胞)細胞、SP２/０(マウス骨髄腫)、ヒトリンパ芽球、COS、NSO(マウスの骨髄腫)、２９３T、ボーズメラノーマ、HT-１０８０、BHK(ベビーハムスター腎臓細胞)、HEK(ヒト胎児由来腎臓
細胞)、PERC.6(ヒト網膜細胞)などの動物細胞など；又は植物細胞を含む。
【００５５】
本発明の用語「導入」は、前記モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞に伝達する方法を意味する。このような導入は、calcium phosphate-DNA coprecipitation、DEAE-dextran-mediated transfection、ポリブレン-媒介-トランスフェクション、エレクトロポレーション、微量注射法、リポソーム-媒介-トランスフェクション、リポソーム-媒介-トランスフェクション、リポフェクション及び原形質体融合法を含む当分野に公知の様々な方法によって行うことができる。また、形質転換導入は、所望の試料をウイルス粒子を用いた感染を手段として細胞内に伝達することを意味する。さらに、遺伝子 ボンバードメントによってベクターを宿主細胞内に導入することができる。本発明で導入は形質移入と混用されて使用され得る。
【００５６】
他の態様として、本発明は、前記モノクローナル抗体を含む癌を予防又は治療するための薬学的組成物を提供する。
【００５７】
本発明のモノクローナル抗体は、ＤＬＬ４に結合してＤＬＬ４とＮｏｔｃｈ受容体間の結合を阻害し、それによって、癌の成長の抑制に関与することができる。ここで、前記ＤＬＬ４及びＮｏｔｃｈ受容体は、 前記の説明のとおりである。
【００５８】
本発明の用語「癌」は、本発明の抗体によって治療できるどんな種類の癌も意味する。前記モノクローナル抗体によって治療できる癌の例は、それに制限されないが、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、肺癌、結腸癌、乳癌、子宮頚部癌、子宮内膜癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣腫瘍、膀胱癌、腎癌、肝癌、膵臓癌、骨癌、結合組織癌、皮膚癌、脳癌、甲状腺癌、白血病、ホジキン病、リンパ腫、多発骨髄腫及び血液癌(blood cancer)を含む。
【００５９】
本発明の用語「予防」とは、前記組成物を投与することによって癌の発病を抑制又は遅延させる全ての行為を意味し、「治療」とは、組成物を投与することによって癌の症状が好転又は有利に変化する全ての行為を意味する。
【００６０】
前記薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含んでもよい。
【００６１】
本発明の用語「薬学的に許容可能な担体」とは、生物体にかなり大きな刺激を誘発することなく、生物核的活性及び投与された化合物の特性を抑止しない担体及び希釈体を意味する。薬学的に許容可能な担体の例は、液状溶液で製剤化される組成物において許容される薬学的担体としては、滅菌及び生体に適したものとして、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれら二つ以上の混合物を含む溶液の形態の本発明の組成物を製剤して用いることができる。必要に応じて、本発明の組成物は、水溶液、懸濁剤、乳剤、丸薬、カプセル、顆粒及び錠剤などの注射可能な製剤を製剤化するために、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤をさらに含んでもよい。
【００６２】
前記薬学的組成物は、経口又は非経口の様々な製形であり得る。薬学的組成物は、
充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤を含む希釈剤又は賦形剤を用いて製形化される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセルなどが含まれる。このような固形製剤は、少なくとも一つ以上の化合物に一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、炭酸カルシウム、スクロース又はラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調剤する。単純な賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム又はタルクなどのような潤滑剤もまた使用され得る。さらに、経口投与のための液状製剤には、懸濁剤、内溶液剤、乳剤、シロップ剤などが含まれる。一般に、単純希釈剤及び流動パラフィンとして使われる水以外に、様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。 プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが、非水溶液剤及び懸濁剤として使用され得る。坐剤のベースは、ウィテップゾール、マクロゴール、ｔｗｅｅｎ ６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用され得る。
【００６３】
前記薬学的組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内容液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥剤及び坐剤からなる群より選択されるいずれか一つの製形であり得る。
【００６４】
前記本発明の組成物は、薬学的に有効な量で投与され得る。
【００６５】
本発明の用語「薬剤学的に有効な量」とは、医学治療に適用可能な合理的な利益/危険の比率で疾患を治療するのに十分な量を意味する。組成物の効果的な服用レベルは、個体の種類、疾病重症度、個体の年齢及び性別、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路、排出比率、治療期間、組成物と組み合わせて使用される薬物及び医学分野に良く知られる要素によって決定され得る。本発明の薬学的組成物は、個別で投与又は他の治療剤と併用して投与され得、従来の治療剤と順次的又は同時に投与され得る。前記組成物は、そして単一又は多重剤形として投与され得る。前記で述べた全ての要素を考慮して、副作用を引き起こすことなく、最大の効果を示せる最小限の量の組成物を投与することが重要であり、この最小量は、当分野の当業者によって容易に決定することができる。
【００６６】
他の態様として、本発明は、前記モノクローナル抗体を使用して癌を治療する方法を提供する。
【００６７】
ここで、前記モノクローナル抗体及び癌は、前記に説明したとおりである。
【００６８】
前記癌を治療する方法は、モノクローナル抗体並びに薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物を、癌を有する又は癌の疑いのある個体に投与する段階を含んでもよい。ここで、前記薬学的に許容可能な担体は、前記に説明したとおりである。前記個体の例は、ウシ、豚、羊、鳥、犬、ヒトを含む哺乳動物を含む。前記個体は、本発明の前記組成物の投与によって癌が治療されるどんな個体でもあり得る 。
【００６９】
前記組成物は、治療的に有効な量で単一又は多重剤形として投与され得る。ここで、組成物は、液剤、散剤、エーロゾル、カプセル剤、腸溶性錠剤、又はカプセル剤又は坐剤の剤形として投与され得る。さらに、組成物は、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、経口、鼻腔内、肺内、直腸内に投与され得るが、それらに制限されない。しかし、組成物を経口投与時、ペプチドは胃で消化され、これらの理由から経口用組成物は、活性薬剤をコーティングしたり、胃における分解から保護されるように製形化されなければならない。さらに、薬物学的組成物は、活性物質が標的細胞へ移動可能な任意の装置を用いて投与され得る。
【００７０】
他の態様として、本発明は、前記に述べたモノクローナル抗体を利用して癌の疑いのある個体から分離された生物学的試料のデルタ様リガンド４(ＤＬＬ４)タンパク質を抗原−抗体反応を通じて検出する段階を含む癌を診断する方法を提供する。
【００７１】
ここで、前記モノクローナル抗体、癌、個体及びＤＬＬ４タンパク質は、前記に述べたとおりである。
【００７２】
前記癌を診断する方法は、本発明のＤＬＬ４特異的モノクローナル抗体を、癌の疑いのある個体から分離された生物学的試料と反応させ、抗原-抗体の複合体形成を検出することで、ＤＬＬ４タンパク質を検出することができ、それによって、癌の診断のための情報を提供でき、又は癌を診断することができる。前記ＤＬＬ４は、卵巣癌細胞を含む様々な癌細胞で過剰発現しており(非特許文献１４)、癌は、正常細胞又は組織などの対照群と、生物学的試料内のＤＬＬ４の発現量を比較することで癌を診断することができるが、それらに制限されるものではない。
【００７３】
具体的に、癌の診断方法は、 (a) 抗原−抗体反応を通じてＤＬＬ４タンパク質検出するために、前記に述べたモノクローナル抗体を癌の疑いのある個体から分離された生物学的試料に処理する；(b)前記(a)段階で検出されたＤＬＬ４タンパク質のレベルと対照群を比較する、及びもし、生物学的試料内のＤＬＬ４タンパク質のレベルが対照群と比較して高ければ、癌を有する個体であると判断する段階を含む癌の診断のための情報を提供又は癌を診断する方法であり得る。
【００７４】
本発明の用語「生物学的試料」とは、組織、細胞、全血液、血清、血漿、組織剖検試料(脳、皮膚、リンパ節、脊髄など)、細胞培養上清液、破裂された真核細胞及び細菌発現系を含むことを意味するが、それらに制限されるものではない。ＤＬＬ４タンパク質の存在又は癌の有無を確認するために、これらの生物学的試料を操作したり又は操作しない状態で本発明の抗体と反応させることができる。
【００７５】
本発明の用語「抗原−抗体複合体」とは、試料中のＤＬＬ４タンパク質の抗原及びＤＬＬ４タンパク質の抗原を認識する本発明のモノクローナル抗体との結合物を意味し、この抗原−抗体複合体の形成は、比色法、電気化学法、蛍光法、発光法、粒子計数法、肉眼測定法及び液体シンチレーション計測法からなる群より選択される任意の方法で検出することができるが、それらに制限されるものではなく、様々な方法が使用され得る。
【００７６】
本発明において、様々なラベルは、抗原-抗体複合体を検出するために使用され得る。ラベルの具体的な例は、それに制限されないが、酵素、蛍光物、リガンド、発光物、微小粒子及び放射性同位元素からなるグループより選択され得る。
【００７７】
ラベル検出として使用される酵素の例は、アセチルコリンエステラーゼ、アルカリ-
フォスファターゼ、β-Ｄ-ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ及びβ-ラクタマーゼを含む。蛍光材料の例は、Eu3+,Eu3+ キレート剤、クリプテートなどを含む。リガンドの例は、ビオチン誘導体などを含み、発光材料の例は、アクリジニウムエステル、イソルミノール誘導体などを含む。さらに、微小粒子の例は、コロイド金、着色されたラテックスなどを含み、放射性同位元素の例は、57Co,3H,125I,and125I- ボルトン・ハンター試薬を含む。
【００７８】
好ましくは、抗原-抗体複合体は酵素免疫吸着法(ELISA)を用いて検出することができる。ＥＬＩＳＡ法の例は、固体支持体に付着した抗原を認識するラベルされた抗体を利用する直接的ＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着した抗体を認識する抗体複合体には、捕獲抗体を認識するラベルされた２次抗体を利用する間接的ＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着された抗体と抗原の複合体で抗原を認識するラベルされた抗体を利用する直接的サンドイッチＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着した抗体と抗原の複合体で抗体と抗原が反応し、次いでラベルされた２次抗体と反応した抗体との反応を含む間接的サンドイッチＥＬＩＳＡを含む
【００７９】
前記モノクローナル抗体は、検出ラベルを持つことができ、もしも前記モノクローナル抗体が検出ラベルを持たないとすれば、検出ラベルを持つ他の抗体の処理によって検出し捕獲することができる。
【００８０】
他の態様として、本発明は、前記に述べたモノクローナル抗体を含む癌を診断するための組成物を提供する。
【００８１】
ここで、前記モノクローナル抗体及び癌は、前記に述べたとおりである。
【００８２】
本発明のＤＬＬ４特異的モノクローナル抗体を含む診断用組成物を、癌のようなＤＬＬ４の発現レベルと関連した疾患又はＤＬＬ４によって媒介される疾患であるＤＬＬ４の発現を診断に利用することができる。 
【００８３】
さらに他の態様として、本発明は、前記に述べた診断用組成物を含む癌を診断するキットを提供する。
【００８４】
ここで、前記組成物及び癌は、前記て述べたとおりである。
【００８５】
さらに、前記癌診断用キットは、分析に適した一つ以上の他の構成成分を持つ組成物、溶液又は装置をさらに含んで構成され得る。
【００８６】
さらに他の態様として、本発明は、前記に述べたモノクローナル抗体を含む自己免疫疾患を予防又は治療するための薬学的組成物を提供する。
【００８７】
ここで、前記モノクローナル抗体、予防及び治療は、前記に延べたとおりである。さらに、前記薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができ、ここで、薬学的組成物は前記に述べたとおりである。
【００８８】
本発明の用語「自己免疫疾患」は、病的な固体の抗原に対する免疫反応によって起こる直間接的な疾患を総称する意味する。自己免疫疾患の例は、リウマチ性関節炎、全身性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、アトピー皮膚炎、乾癬、円形脱毛症、喘息、クローン病、ベーチェット症候群、シェーグレン症候群、ギラン・バレー症候群、慢性甲状腺炎、多発性硬化症、強直性脊椎炎、脳脊髄炎、線維炎及び結節性多発動脈炎であり得る。
【００８９】
前記に述べたように、本発明のＤＬＬ４特定ヒトモノクローナル抗体は、調節T細胞の発達を促進することができ、それによって自己免疫疾患の治療に利用することができる。
【００９０】
さらに他の態様として、本発明は、前記に述べたモノクローナル抗体を利用して自己免疫疾患を治療する方法を提供する。
【００９１】
具体的に、自己免疫疾患の治療方法は、モノクローナル抗体を含む薬学的組成物 並びに薬学的に許容可能な担体を自己免疫疾患を有する疑いのある個体に投与する段階を含む。ここで、前記自己免疫疾患、個体及び薬学的に許容可能な担体は前記に述べたとおりである。
【発明の実施もための形態】
【００９２】
以下、本発明を下記実施例でより具体的に説明する。しかし、理解のために、これらの実施例は、例示的目的であり本発明の範囲を制限するためではない。
【実施例１】
【００９３】
抗ＤＬＬ４抗体の製造
実施例１−１：この実施例で用いられたＤＬＬ４の細胞外ドメイン抗体は、Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍから購入されたヒトＤＬＬ４タンパク質(Cat: 1506-D4/CF)である。前記ＤＬＬ４抗原タンパク質は、ＤＬＬ４のアミノ酸残基２７〜５２２番のアミノ酸を含む。また、そのタンパク質のＣ-末端がヒスチジンでタグされている。
【００９４】
次に、さらに他のＤＬＬ４細胞外ドメインの特定の領域に対する抗原を生産した。その特定の領域は、ＤＬＬ４のアミノ酸残基の２７〜２５１番のアミノ酸を含む。この領域は、Ｎｏｔｃｈ１受容体と結合することが知られているdelta/serrate/lag-2(ＤＳＬ)ドメインと呼ばれるモチーフを含有する(非特許文献１５)。Ｆｃタンパク質に融合されたＤＬＬ４細胞外ドメインの欠失断片をコードするポリヌクレオチド上流にＣＭＶプロモーターを含む哺乳類プラスミド発現ベクターを標準組み換えＤＮＡ技術を使用して生成した。Ｆｃタンパク質に融合されたヒトＤＬＬ４のキメラであるＤＬＬ４の欠失断片をコードする追加的構築物もまた標準組み換えＤＮＡ技術を使用して生成した。Ｆｃタンパク質に融合されたヒトＤＬＬ４の２７〜２５１番のアミノ酸残基を含む 組み換え融合タンパク質は、HEK293細胞に一時的に形質移入し細胞内で発現させた。抗原タンパク質の製造のために、条件培養液を７２時間毎に集め、この過程は、４回繰り返された。抗原タンパク質は、プロテインA親和力クロマトグラフィーを通じて条件培養液から精製された。
【００９５】
実施例１−２：ライブラリーファージの製造
１０μｇ/ｍLの組み換えヒトＤＬＬ４溶液(Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ)を免疫試験管に添加して４℃で一晩試験管表面にタンパク質を吸着させた。１％のウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)溶液を試験管に添加してＤＬＬ４が付着されない表面を保護した。試験管を空けたあと、１％のＢＳＡ溶液に分散された１０１２ＣＦＵの抗体ファージライブラリーを入れ、抗原と結合させた。非特異的に結合したファージを除くため、リン酸緩衝生理食塩水-０．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０(ＰＢＳ-Ｔ)溶液で５回洗い、残っている抗原特異的ファージ抗体を１００ｍＭトリエチルアミン溶液を利用して回収した。回収したファージを１Ｍトリスバッファー(pH7.4)で中和させ、次いで 大腸菌ＥＲ２５３７に３７℃で１時間感染させた。形質移入された大腸菌をカルベニシリン含有のＬｕｒｉａ-Ｂｅｒｔａｎｉ(ＬＢ)寒天培地に塗抹し、３７℃で一晩培養した。翌日に培養された大腸菌を４ｍLのスーパーブロス(SB)-カルベニシリン培養液に懸濁して１５％グリセロールを添加した。次に、細胞懸濁液の一部は、-８０℃に保管し、残りの５０ｍLを２０ｍLのSB-カルベニシリ培養液に、２％ブドウ糖溶液を添加して３７℃で培養した。培養液の吸光度が６００ｎｍで０．６になると、遠心分離して培養液を除去し、残った細胞ペレットは再び２０ｍLのSB-カルベニシリン培養液に懸濁し、１０１２ＰＦＵのＶＣＳＭ１３ヘルパーファージを加えた。細胞培養液は、ゆっくり攪拌し３７℃で培養した。翌日、培養液を遠心分離し、培養液のみをポリエチレングリコール８０００(PEG8000)を４％、塩化ナトリウム(NaCl)３％を添加して４℃で３０分間沈殿させ、次に遠心分離した。上清液を除去し沈殿したファージをＰＢＳ１ｍLに懸濁し、これをライブラリーとして使用し、前記パンニング過程を繰り返すことで、抗原特異的クローンを増幅/濃縮した。
【００９６】
実施例１−３：ファージでスプレイを通じたパンニング
ヒトＤＬＬ４タンパク質内のＮｏｔｃｈ１と結合する部位に結合する抗体を選別するためのに、ヒトＤＬＬ４タンパク質とヒトＤＬＬ４の特異的領域を示す断片(２７番アミノ酸〜２５１番アミノ酸)を交差して進行し、３回まで進行した。その後、抗体遺伝子を含むLB-寒天培地に塗抹した。培養して単一クローンを得てこれを４００μLのSB-カルベニシリン培養液に摂取、培養した後、IPTGで誘導してscFv形態のタンパク質を大腸菌で発現させた。大腸菌をTES溶液(Tris, EDTA, Sucrose)に懸濁した後、４℃で１時間放置した後、遠心分離抽出し、これをELISA法を利用して組み換えヒトＤＬＬ４抗原とscFvとの結合を確認・するのに使用した。結合したscFvは、HRP-anti-HA抗体とTMB基質を利用して検出した。これから確認された抗原特異的抗体クローンは、塩基配列分析を通じて分析した。
【実施例２】
【００９７】
抗ＤＬＬ４抗体のＤＬＬ４に対する結合力のアッセイ
前記実施例１から分離された抗体をそれぞれＭＬＣＫ-１、ＭＬＣＫ-２、ＭＬＣＫ-３及びＭＬＣＫ-４と命名し、それぞれの配列番号１である重鎖可変領域と配列番号１５である軽鎖可変領域(ＭＬＣＫ-１)、配列番号５である重鎖可変領域と配列番号１９である軽鎖可変領域(ＭＬＣＫ-２)、配列番号８である重鎖可変領域と配列番号２３である軽鎖可変領域(ＭＬＣＫ-３)及び配列番号１１である重鎖可変領域と配列番号２７である軽鎖可変領域(ＭＬＣＫ-４)を含むことを確認した。このような分離された抗体の抗原に対する親和度を下記のように分析した。
【００９８】
抗ＤＬＬ４抗体−抗原結合の親和度は、ELISA−基盤溶液結合試験を使用して評価した。９６−ウェル微細力価プレートを４℃で一晩ＰＢＳ溶液中の２μｇ/ｍLの濃度のｈＤＬＬ４-Hisタンパク質でコーティングし、非特異的な結合部位は、ＢＳＡで２時間ほどブロックした。９６-ウェル微細力価プレート上で、抗ＤＬＬ４抗体(精製させたタンパク質)を抗体の一定の濃度に従い０ｎM〜１２８ｎM範囲で微細力価プレートに移した。移した後、２時間処理した後に、プレートを０．０５％の２０を含むＰＢＳで５回洗浄し、プレート−結合されたＤＬＬ４抗体をHRP-接合されたFab多重くろーナル抗体試薬(Pierce)で検出するために１：10,000比率にし、微細力価プレートに移した後、1時間３７度で反応させた。反応後、基質を使用して発色させた。酵素反応を中止させ、マイクロプレートリーダを用いて４５０ｎｍで吸光度を記録した。その結果、それぞれの抗体全て濃度依存的にＤＬＬ４に対する結合力が増加することを確認した(図２)。
【００９９】
実施例３：抗ＤＬＬ４抗体のＤＬＬ４リガンドに対する結合能の測定
ELISA結果と共にＦＡＣＳ分析を通じて抗ＤＬＬ４抗体がＤＬＬ４に結合する能力を測定した。
【０１００】
この実験のために、ヒトＤＬＬ４を安定的に発現させるヒト腎細胞(HEK293)を製造し、前記製造された細胞とＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ(BD Biosciences)機器を用いて、抗ＤＬＬ４抗体とＤＬＬ４の結合した程度を測定した。ＤＬＬ４を安定的に発現させるHEK293細胞を解離させて、ＰＢＳで洗浄した後、細胞数を合わせた後、それぞれのＤＬＬ４モノクローナル抗体を10μｇ処理後、室温で30分間反応した。反応後、細胞をＰＢＳで洗浄後、ＦＩＴＣラベルされた不可変領域(Fc)特異的な抗体をＰＢＳで懸濁して４℃で1時間反応した。反応後、細胞をＰＢＳで洗浄し、FACSCalibur機器上で測定した。対照群は、ＦＩＴＣラベルされた不可変領域(Fc)特異的な抗体のみ処理した。それぞれのＤＬＬ４モノクローナル抗体を処理した実験群でヒトＤＬＬ４-モノクローナル抗体−ＦＩＴＣ結合による移動された判読結果を対照群の結合と比較した。
【０１０１】
その結果であるそれぞれのモノクローナル抗体がヒトＤＬＬ４抗原に結合した程度を図３に示した。結合程度は、対照群と比較して、ＭＬＣＫ-１を示した(図３)。
【０１０２】
このような結果は、本発明のＭＬＣＫ-１,ＭＬＣＫ-２,ＭＬＣＫ-３及びＭＬＣＫ-４抗体がヒトＤＬＬ４に対して優れた結合能を持つことを示す。
【０１０３】
実施例４：抗ＤＬＬ４抗体の中和効果のアッセイ
抗ＤＬＬ４抗体に対してELISA-溶液競争試験を使用して抗ＤＬＬ４抗体の中和効果を評価した。
【０１０４】
９６−ウェル微細力価プレートを４℃で一晩５００ｎｇ/ｍLの濃度のｈＮｏｔｃｈ-1-hFcタンパク質(ＰＢＳで希釈)でウェル当たり１００μｌずつコーティングし、非特異的結合部位は、ＢＳＡで２時間ブロックした。
【０１０５】
９６−ウェル微細力価プレーと上で抗ＤＬＬ４抗体(精製されたタンパク質)を０ｎM〜１４０ｎM範囲の濃度で抗体を抗原タンパク質(ＤＬＬ４抗原、６００ｎｇ/ｍL)の系列希釈液と混合させた。前記抗原と抗体を３０分間処理した後に、遊離抗体の測定のために前記混合溶液をＤＬＬ４受容体であるｈＮｏｔｃｈ-1タンパク質で改めてコーティング(５０ｎｇ/ウェル)された微細力価プレートに移した。その後、前記プレートを２時間処理し、０．０５％含むＰＢＳで５回洗浄し、プレートに結合したＤＬＬ４抗原をHRP-接合させたHis抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体試薬で検出するために１：５００比率で前記HRP-接合されたHis抗-マウスＩｇＧポリクローナル抗体を微細力価プレートで処理した後、1時間３７℃で反応させた。その後、発色させ、酵素反応を中止させた。４５０ｎｍで吸光度を記録してその結果を図４に示しており、プレート−固定されたＮｏｔｃｈ１−Fcに結合されたヒトＤＬＬ４-Hisの５０％の減少を達成するのに必要な抗体の量を下記の表１に示した。
【０１０６】
【表１】
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【０１０７】
その結果、本発明の４つの抗体全て０．４〜３．７ｎMの値を示し、ＤＬＬ４リガンドであるヒトＮｏｔｃｈ１に対する結合を非常に低い濃度で阻害することを示した(図４及び表１)。このような結果は、本発明の４つの抗体がＤＬＬ４リガンドとＮｏｔｃｈとの結合を抑制させることを、癌細胞の成長を抑制できることを裏付けるものである。
【０１０８】
実施例５：抗体−ＤＬＬ４抗体の結合能の分析
抗ＤＬＬ４抗体の結合能を調べるために、ＢＩＡＣＯＲＥアッセイを実施した。
【０１０９】
具体的に、ＳＰＲ分析は、T200を使用し、緩衝液は、HBS-EPを使用した。表面準備は、表面準備_標的皇帝化を利用して、リガンドであるhＤＬＬ４を１０ｍMになるように希釈した後、CM5チップ表面に各試験が目標とするターゲット固定化ラベルほど固定させた。固定化は、一つのセットで進行し、本試験で最初のblankとして指定し、二つ目はｈＤＬＬ４として固定化した。最初は、非特異的結合及びバッファーによる変化の数値を見せるとして、試験結果は、Fc2-Fc1の数値を使用した。ｈＤＬＬ４と結合する物質として抗−ＤＬＬ４抗体であるＭＬＣＫ-１、ＭＬＣＫ-２、ＭＬＣＫ-３及びＭＬＣＫ-４をモル濃度として換算して１００ｎMに希釈した後、１/２連続希釈し５濃度区間で分析した。分析試料は、最小希釈倍数１００以上になるように高純度/高濃度で準備して緩衝液変換による影響を最小化した。全ての分析は、プログラムを用い、一試料に対して２倍数で進行し、全ての分析間では、再生段階をおき、試験の基準船が一定に維持されるようにした。このとき、Fc2-Fc1,Fc4-Fc3の結果からBaselineを０に設定した後、緩衝液注入部分を全体Ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍから引いた後、結果を１：１結合モデルで結合親和度を分析した。
【０１１０】
その結果、図５に示したように、ヒトＤＬＬ４に対するＭＬＣＫ-１抗体の結合能の程度を図３に示した。結合程度は、大将軍と比較して、 ＭＬＣＫ-１は、47.82(％)、ＭＬＣＫ-２(59％)、ＭＬＣＫ-３(52.85％)及びＭＬＣＫ-４(52.46％)を示した(図３)。
【０１１１】
実施例６：ＤＬＬ４抗体の血管内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)増殖に対する影響の分析
ＤＬＬ４に結合する抗体の血管内皮細胞増殖に対する影響を分析するために、対標的な抗−ＤＬＬ４小唄であるＭＬＣＫ-２抗体を用いて血管内皮細胞の増殖に及ぼす影響を調査した。
【０１１２】
具体的に、血管内皮細胞をLonza社から購入して実験に使用した。ＨＵＶＥＣの培養は１％ゼラチン(Sigma)に溶解されたＰＢＳ緩衝液(Gibco)でT-フラスコを常温で４〜６時間コーティングさせた後、ＰＢＳで洗浄して使用した。使用された培地はEGM-２Single Quot(Lonza)が含まれたEMB-2(Lonza)で、細胞培養は密集度が８０％が超えないように、３７℃、５％CO２培養を進行し、６以内の細胞を利用して実験した。血管内皮細胞の増殖抑制は次のような方法で行った。ｈＤＬＬ４がコーティングされたプレートを準備するために、実験前日９６−ウェルプレートにｒｈＤＬＬ４を緩衝液を使用して希釈した後、１００μｌ/ウェルでウェルに摂取して４℃で一晩静止させた。さらに、ＨＵＶＥＣは０．１％ＦＢＳが添加されたＥＢＭ−２最小培地で２４時間放置して血清による効果を最小化させた。実験当日ｒｈＤＬＬ４がコーティングされたプレートは、それぞれのウェルをＰＢＳで２回洗浄した後、それぞれの実験群別に改めて使用したEBM-2最小培地で希釈して処理して常温で２０分間静止させた。前日から２４時間静止したＨＵＶＥＣを単一細胞化したあと、EBM-2最小培地を使用し希釈した。希釈された細胞を抗体が処理されたウェルに摂取して９６時間静止した。細胞増殖が修了されたとき、各ウェルに１０μLずつ処理し、５時間後機器を用いて４５０ｎｍの波長で吸光度を測定し、細胞の増殖程度を各分別に比較した。
【０１１３】
その結果、図６に示すように、本発明の代表的な抗-ＤＬＬ４抗体は、ＤＬＬ４によるＨＵＶＥＣ増殖抑制を濃度依存的に解除させる結果を示した。
【０１１４】
実施例７：ＤＬＬ４抗体のＤＬＬ４/Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路抑制活性の分析
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達で、Ｎｏｔｃｈ受容体がＤＬＬ４と結合すると、Ｎｏｔｃｈ受容体の構造的変化をもたらし、Ｎｏｔｃｈ受容体が切断され、Ｎｏｔｃｈ受容体の細胞内部分(ＮＩＣＤ)が核内に移動されＮｏｔｃｈシグナル伝達を媒介する。それで、本は発明の抗ＤＬＬ４抗体がＤＬＬ４とＮｏｔｃｈ受容体間の結合を抑制し、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を防ぐことができるかの有無をＮｏｔｃｈ受容体の切断抑制の有無を通じて下記のように確認した。
【０１１５】
具体的に、ＤＬＬ４に結合する抗体のＤＬＬ４/Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路抑制活性を調べるために、ＨＵＶＥＣ細胞を用いて、シグナル伝達経路抑制の有無を確認した。実験前日６ウェルプレート(BD)に組み換えヒトＤＬＬ４を１μｇ/ｍLで緩衝溶液を使用して希釈させた後、１ｍL/ウェルで添加した後、４℃で一晩静止させた。rhＤＬＬ４を処理しない対照実験群では、緩衝溶液単独で１ｍｌ/ウェルで処理して同様に４℃で一晩静止させた。次の日、４℃の冷蔵庫でＤＬＬ４がコーティングされたプレートを出して、ＰＢＳで1回洗浄した後、EGM-2倍地を各ウェルに１ｍｌずつ処理し、各ウェルに１ｍｌずつ処理して、各ウェル別に抗体を処理した。最終培養液の量は２ｍｌであり、抗体処理を２倍にして常温で２０分間反応させた。抗体処理時間の間、７５Tプレートで培養されたＨＵＶＥＣを引き出し、培地除去後、単一細胞化した。遠心分離過程を通じて細胞を洗浄し、新鮮なEGM-2倍地を使用して細胞の個数を数えて希釈した後、それぞれのウェルに１ｍｌずつ摂取し、一晩培養した。０．２％FBSが含まれたEBM-2最小培地を準備し、一晩培養されたＨＵＶＥＣの各ウェル培地を除去し、ＰＢＳで1回洗浄した後、０．２％FBSが含まれたEBM-2最小培地を２ｍｌ処理した。さらに、それぞれウェルに前日処理した同様の濃度の抗体を処理し、一晩培養した。抗体が処理されたＨＵＶＥＣの各ウェルにｈVEGFを１００ｎｇ/ｍｌで処理し、５分間反応させた後、プレートを引き出し、素早く培地を捨て、ＰＢＳで1回洗浄した後、細胞溶解溶液を準備してそれぞれのウェルに１５０μｌを添加した。
【０１１６】
その次、このプレートを氷の上においてPPでそれぞれのウェルのＨＵＶＥＣを集めた後、１．５ｍLチューブに集めた後、氷に置いた。５分単位で氷から１．５ｍｌチューブを引き出してボルテックス３回後、再び氷に浸し、細胞溶解を行った後、これを遠心分離し、上清液を新しいチューブに移した後、定量を行い５×ＳＤＳサンプル緩衝液に混ぜ１００℃で１０分間沸騰した後、SDS-PAGえ分析を行った。このとき、用意されたタンパク質試料を４％〜１２％bis-TRISゼルを通じてSDS-PAGEを行い、大きさ別に分離した後、
【０１１７】
その結果、図７に示したように、本発明の代表的ＭＬＣＫ-２モノクローナル抗体の処理によって、ＤＬＬ４処理によって増加したＮＩＣＤを減少させる結果を示した(レーン７)
【０１１８】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想又は必須的特徴を変更することなく、他の具体的形態として実施できることを理解することができる。これと関連して、以上の技術した実施例は、全ての面で例指的なものであり、限定的なものではないこととして、理解されるべきである。本発明の範囲は、前記詳細な説明よりは、後述する特許請求範囲の意味及び範囲そしてそのその概念から全ての変更又は変更された形態が本発明の範囲に含まれるものとして解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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