(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも有核細胞，血小板，核酸を内包するマイクロベシクルおよびヌクレアーゼを含む溶液に、パルス電界を印加し、該有核細胞および該血小板を破砕し、該マイクロベシクルを残存させる工程を含むことを特徴とする、マイクロベシクルに内包された核酸の抽出方法。
【請求項２】
上記パルス電界を印加する条件として、
パルス印加回数が、５０〜３０，０００回であり；
印加電圧が、１ｋ〜１００ｋＶであり；
印加時間が、１〜６００秒であり；および
周波数が、０．１〜１０００Ｈｚである請求項１に記載の核酸の抽出方法。
【請求項３】
上記核酸が、マイクロＲＮＡである請求項１または２に記載の核酸の抽出方法。
【請求項４】
上記溶液が、血液に由来する請求項１〜３のいずれかに記載の核酸の抽出方法。
【請求項５】
上記マイクロベシクルの直径が、３０ｎｍ〜１μｍである請求項１〜４のいずれかに記載の核酸の抽出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パルス電界を用いた血液遊離核酸を抽出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、血液（血漿または血清試料）中に遊離しているマイクロベシクルに内包された核酸（本発明において、「血中遊離核酸」と呼ぶ。）を疾患の診断や治療のために利用する手法に関して、盛んに研究開発が進められている。【０００３】
例えば、しばしば癌細胞で調節不全に陥るマイクロＲＮＡ（以下「ｍｉＲＮＡ」ともいう。）は、癌細胞の存在によって、その血中レベルが異なることから癌の分類や診断のためのマーカーとして有望視されている。ｍｉＲＮＡは内在性のＲＮａｓｅに対して極めて安定的な形態で血漿中に存在し、タンパク質のアミノ酸配列として翻訳されない１９〜２５ヌクレオチドの小さな非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、ヒトを含む生物に多数存在することが確認されており、系統的に高度に保存されている。これまで、特にヒトにおいては、約８００種類のｍｉＲＮＡが発見されている。【０００４】
ところで、一般に１ｃｍあたり１５〜５０ｋＶ、μｓ〔１０-6秒〕オーダーの極めて短いパルス幅の電圧を印加し、瞬間的に大きな電流を流すことにより殺菌を行う方法（高電圧パルス殺菌）が知られている。細菌などの微生物を高電圧パルス電界に曝すと、細胞膜を構成している脂質分子が乱され、細胞膜に穴が開いた状態になる。比較的弱い電界や短時間では修復可能な可逆的破壊が起こるが、強い電界を長時間印加すると不可逆的破壊を起こし、細胞が死滅する。【０００５】
このような殺菌方法に関して、例えば、特許文献１，２には以下のような発明が記載されている。【０００６】
特許文献１では、１対の円筒形電極と棒状電極の間に電圧を印加し、該電極間に存在する被処理液、例えば、食品加工水や清涼飲料水等を電気化学的に処理することによって、殺菌・浄化、脱色・脱臭、分解等の効果を高めることができる電気印加処理装置を提案している。【０００７】
特許文献２には、食品等の対象物に、印加電圧１０ｋＶ以上の電気パルスを作用させるパルス殺菌処理と高圧殺菌処理とを併用する耐熱性芽胞の殺菌方法が開示されている。【０００８】
また、高電圧パルスの応用例として、特許文献３には、細胞を含んだ懸濁液にパルス電界を印加する際に、細胞を完全に破砕しないように印加エネルギーを制御して、細胞内の有用物質（核酸、タンパク質等）を選択的に放出させる方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００２−１３３６号公報
【特許文献２】特開２００５−２８７３８３号公報
【特許文献３】特開平６−２７７０６０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従来、血液中のマイクロベシクル内の核酸を選択的に抽出するには、血液試料の血球細胞を遠心操作により分離し、上清を分取してホモジネート処理していた。遠心操作は工程が煩雑で、上清分取の際に血球が混入する可能性があるなどの問題があった。血球細胞が混入すると、正確なマイクロベシクル由来核酸を定量することができない。【００１１】
本発明は、上記のような問題を排し、血液中のマイクロベシクルに内包されている核酸を簡易迅速に抽出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、血液由来試料に適切な条件でパルス電界を印加した場合、白血球や血小板等の大きな血球細胞は破砕するが、マイクロＲＮＡ等を内包するマイクロベシクルは破壊されず、また血液由来の酵素は失活しないことを見出した。さらに、パルス電界で破砕され、血球細胞から漏出した核酸は、血液由来試料に内在しているヌクレアーゼによって分解される一方、ｍｉＲＮＡはマイクロベシクルに内包された状態のまま回収できることも見出し、本発明を完成するに至った。【００１３】
すなわち、本発明の、マイクロベシクルに内包された核酸の抽出方法は、少なくとも有核細胞，血小板，核酸を内包するマイクロベシクルおよびヌクレアーゼを含む溶液に、パルス電界を印加し、該有核細胞および該血小板を破砕し、該マイクロベシクルを残存させる工程を含むことを特徴とする。【００１４】
本発明である核酸の抽出方法において、上記パルス電界発生装置は特に限定されないが、パルス電界を印加する条件として、パルス印加回数が、５０〜３０，０００回であり；印加電圧が、１ｋ〜１００ｋＶであり；印加時間が、１〜６００秒であり；および周波数が、０．１〜１０００Ｈｚであることが好ましい。【００１５】
上記核酸は、マイクロＲＮＡであることが好ましい。【００１６】
上記溶液は、血液に由来することが好ましい。【００１７】
上記マイクロベシクルの直径は、３０ｎｍ〜１μｍであることが好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、工程が煩雑な遠心分離操作、および血球が混入する可能性がある等問題のある上清分取の操作が不要であり、簡易迅速にマイクロベシクルに内包されている核酸を抽出して正確に定量することを可能とする核酸の抽出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、本発明である核酸の抽出方法の一態様(B)および遠心分離操作(11)後、上清を分取する操作(12)からなる従来法の一態様(A)を模式的に示した図である。
【図２】図２は、実施例１および比較例１で得られたＰＣＲ検出値〔Ｃｔ値〕をそれぞれ縦軸および横軸としてプロットした図である。
【図３】図３は、実施例１で用いたパルス電界発生装置の回路図を示す。パルス電界発生装置は、交流電源電圧〔ＡＣ〕（１００Ｖ）を所望の電圧〔Ｖ1〕に可変的に設定するスライドトランス〔ＳＴ〕と、電圧〔Ｖ1〕を充電電圧〔Ｖ2〕に昇圧する昇圧トランス〔ＨＴ〕と、ＨＴからの充電電流〔Ｉ1〕を整流する高圧整流器〔ＨＲ〕と、充電制限回路として機能する高圧抵抗〔Ｒ〕およびコンデンサ〔Ｃ〕とを備えて構成されている。ＨＴからのＩ1は、ＨＲにより整流されて、Ｒを介してＣに充電される。Ｃに蓄えられた電気エネルギーは、スパークギャップ〔ＳＧ〕を介して瞬間的に放電され、放電電流〔Ｉ2〕として流れ、処理槽〔ＴＣ〕にパルス電圧〔Ｖp〕が印加される。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
次に、本発明である核酸の抽出方法について具体的に説明する。
【００２１】
＜核酸抽出方法＞
本発明の、マイクロベシクルに内包された核酸の抽出方法は、少なくとも有核細胞，血小板，核酸を内包するマイクロベシクルおよびヌクレアーゼを含む溶液に、パルス電界を印加し、該有核細胞および該血小板を破砕し、該マイクロベシクルを残存させる工程を含むことを特徴とする。
【００２２】
本発明である核酸の抽出方法は、該工程の後、さらにホモジネートする工程を含むことが好ましい。ホモジネートは当該分野において公知の処理方法を用いることができ、このようなホモジネート処理を施すことによって、該マイクロベシクルに内包された核酸のみを抽出・回収することができる。
【００２３】
（溶液）
本発明で用いる「溶液」は、少なくとも有核細胞，血小板，核酸を内包するマイクロベシクルおよびヌクレアーゼを含むものであり、より具体的には、例えば、血液，血漿・血清などの血液に由来するものが挙げられる。
【００２４】
「有核細胞」とは、赤血球や血小板のように核を持たない細胞は含まず、特に溶液が血液に由来する場合、例えば、白血球などが挙げられる。
【００２５】
「血小板」は、成熟した巨核球（巨大核細胞）の細胞質が千切れて形成された無核細胞の一種であるが、活性化された血小板はＰＭＰ〔血小板マイクロパーティクル〕を放出することが知られている。このＰＭＰはマイクロＲＮＡを内包することから、エキソソームと同様の形態であると言える。よって、本発明において、ＰＭＰは下記マイクロベシクルに包含されるものと定義する。
【００２６】
上記マイクロベシクルが内包する「核酸」としては、ｍｉＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ以外のＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）やＤＮＡも含まれる。
【００２７】
「マイクロベシクル」とは、血液中に存在する、脂質で覆われた膜小胞の総称であり、その直径は、好ましくは３０ｎｍ〜１μｍ程度であり、マイクロパーティクルやエキソソームと同義として使用することができる。また、マイクロベシクルの直径が上記範囲外であっても、パルス電界の印加条件を適切に調整することにより本発明の核酸抽出方法を適用することが可能である。
【００２８】
なお、直径が通常６〜２２μｍ（マクロファージの場合は、２０〜５０μｍである。）である白血球はマイクロベシクルより大きいため、適切に調整された条件でパルス電界を印加すると、白血球等の有核細胞は破砕されるが、マイクロベシクルは破砕されずに残存する。
【００２９】
「ヌクレアーゼ」は、核酸を分解する酵素の総称であり、ＤＮＡを基質にするデオキシリボヌクレアーゼも、ＲＮＡを基質にするリボヌクレアーゼも含み、特に溶液が血液に由来する場合、内在性ヌクレアーゼに相当する。
【００３０】
（パルス電界）
本明細書において、パルス電界〔ＰＥＦ；Ｐｕｌｓｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｆｉｅｌｄ〕は、高電圧パルスと同義である。
【００３１】
パルス電界を印加する諸条件は、上記溶液にパルス電界を印加した際、有核細胞および血小板の内外で電荷の分極が生じ、膜が破壊されて細胞内容物が外に漏出するのに対し、該溶液中のヌクレアーゼはパルス電界では失活せず、またマイクロベシクルは血球に比べて小さいので、パルス電界では破壊されないという本発明の作用効果を奏する範囲内で適宜調整することができる。
【００３２】
パルス電界を印加する好ましい条件としては、パルス印加回数が、５０〜３０，０００回であり；印加電圧が、１ｋ〜１００ｋＶであり；印加時間が、１〜６００秒であり；および周波数が、０．１〜１０００Ｈｚである。より好ましくは、パルス印加回数が、５００〜１０，０００回であり；印加電圧が、５ｋ〜５０ｋＶであり；印加時間が、１０〜３００秒であり；および周波数が、１〜１００Ｈｚである。パルス電界をこのような条件の範囲内で適宜調整しながら上記溶液に印加すると、効率的に有核細胞および血小板を破砕できる一方、マイクロベシクルを残存させ、ヌクレアーゼを失活させないようにすることができるため好適である。有核細胞および血小板は破砕されると、有核細胞由来の核酸および血小板に含まれることがある核酸が漏出し、溶液に含まれるヌクレアーゼによって速やかに分解される。パルス電界処理した溶液はそのまま、従来の遠心分離操作によって得られたマイクロベシクルを含む上清を用いる場合と同様にしてホモジネートすることができ、マイクロベシクル由来の核酸のみを抽出し回収することができる。
【００３３】
また、高電圧パルスを印加する装置は、本発明の核酸抽出方法において、従来と同様のパルス電界発生装置（例えば、特許文献１〜３に記載されているもの）を用いることができ、特に限定されない。
【実施例】
【００３４】
次に、本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。【００３５】
［実施例１］
（サンプル１の調製）
末梢血試料を静脈よりＥＤＴＡ凝固防止剤含有試験管中に採取し、生理食塩水で１０倍希釈した。この溶液を、図３に示す回路図に従うパルス電界発生装置の処理層〔ＴＣ〕に５ｍＬ充填し、パルス印加回数が６０００回；印加電圧が１０ｋＶ/ｃｍ；印加時間が２分間；周波数が５０Ｈｚのパルス電界を印加した。得られた溶液をサンプル１の血液由来試料とした。【００３６】
該処理層〔ＴＣ〕として、電極面積７ｃｍ2の円形ステンレス電極を間隔１ｃｍで対向して配置しているものを用いた。【００３７】
（マイクロベシクル由来ｍｉＲＮＡの抽出，逆転写およびリアルタイムＰＣＲ）
上述のようにして得られたサンプル１について、「ｍｉｒＶａｎａ  ｍｉＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」（Ａｍｂｉｏｎ社製；商品名）を用いてマイクロベシクル由来の全ｍｉＲＮＡを抽出した。【００３８】
得られたｍｉＲＮＡを、「Ｍｅｇａｐｌｅｘ  ｐｒｉｍｅｒ  ｐｏｏｌｓ」（アプライドバイオシステムス社製；商品名）を用いて逆転写した。【００３９】
得られたｃＤＮＡを、「ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ＴａｑＭａｎ  ［Ｒ］  Ａｒｒａｙ」（アプライドバイオシステム社製；商品名）にアプライし、リアルタイムＰＣＲによりサイクル数（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ；Ｃｔ値）を測定した。結果を図２に示す。【００４０】
［比較例１］
（従来の遠心法によるサンプル２の調製）
末梢血試料を静脈よりＥＤＴＡ凝固防止剤含有試験管中に採取し、直ちに２０００Ｇ、１０分間の遠心分離にかけ、血球を分離した遠心法による血漿を調製した。この血漿を生理食塩水で１０倍希釈し、サンプル２の血液由来試料とした。【００４１】
（マイクロベシクル由来ｍｉＲＮＡの抽出，逆転写およびリアルタイムＰＣＲ）
上述のようにして得られたサンプル２についても、実施例１と同様にしてＣｔ値を測定した。結果を図２に示す。【００４２】
［結果および考察］
図２から、実施例１および比較例１でそれぞれ検出されたｍｉＲＮＡ（ここではＣｔ値が３５サイクル未満のものをいう。）のプロットはほとんど変わらず、傾きが１、Ｒ2が０．９７を示した。これは、遠心法による血球分離後のマイクロベシクル由来ｍｉＲＮＡ（比較例１）とパルス電界を印加したことによる血球破壊とマイクロベシクル由来ｍｉＲＮＡ（実施例１）との数および量がほぼ一致していることを示している。したがって、パルス電界による血球破壊は、操作が簡便であるにもかかわらず、従来の遠心法による血球分離と同程度の精度でマイクロベシクル由来ｍｉＲＮＡを検出できることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明の核酸抽出方法は、採取した血液からマイクロベシクル由来の核酸、好ましくはマイクロＲＮＡを簡易迅速に抽出できることから、マイクロＲＮＡを発癌の診断マーカーとして用いて簡易迅速に臨床診断を実現できる。
【符号の説明】
【００４４】
１・・・白血球
２・・・血小板
３・・・マイクロベシクル
４・・・赤血球
５・・・マイクロＲＮＡ
６・・・内在性ヌクレアーゼを含有している血液サンプル
１１・・・遠心分離操作
１２・・・上清を分取する操作
１３・・・従来法により得られたホモジネート
２１・・・パルス電界〔ＰＥＦ〕を印加する操作
２２・・・本発明により得られたホモジネート
Ａ・・・従来法の一態様
Ｂ・・・本発明の核酸の抽出方法の一態様
【図１】
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【図２】
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【図３】
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