(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主のコリネバクテリウム属細菌に、下記(b)のDNA、(b)及び(a)のDNA、(b)及び(c)のDNA、又は(b)、(a)及び(c)のDNAを導入することにより得られる形質転換体。
(a) コリネバクテリウム グルタミカム由来のアセトヒドロキシ酸シンターゼをコードするDNAにおいて、このDNAがコードするアミノ酸配列の156番目のグリシンをグルタミン酸に変異（G156E）させる変異が導入されたDNA
(b) コリネバクテリウム グルタミカム由来のアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードするDNAにおいて、このDNAがコードするアミノ酸配列の34番目のセリンをグリシンに変異させ（S34G）、48番目のロイシンをグルタミン酸に変異させ（L48E）、及び49番目のアルギニンをフェニールアラニンに変異させる（R49F）変異が導入されたDNA
(c)リシニバチルス スフェリカス由来のロイシンデヒドロゲナーゼをコードするDNA、又はこのDNAの塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
【請求項２】
コリネバクテリウム グルタミカム由来のアセトヒドロキシ酸シンターゼをコードするDNAにおいて、このDNAがコードするアミノ酸配列の156番目のグリシンをグルタミン酸に変異（G156E）させる変異が導入されたDNAが、配列番号37の塩基配列からなるDNAであり、
コリネバクテリウム グルタミカム由来のアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードするDNAにおいて、このDNAがコードするアミノ酸配列の34番目のセリンをグリシンに変異させ（S34G）、48番目のロイシンをグルタミン酸に変異させ（L48E）、49番目のアルギニンをフェニールアラニンに変異させる（R49F）変異が導入されたDNAが、配列番号57の塩基配列からなるDNAであり、
リシニバチルス スフェリカス由来のロイシンデヒドロゲナーゼをコードするDNAが、配列番号40の塩基配列からなるDNAである請求項１に記載の形質転換体。
【請求項３】
さらに、コリネバクテリウム グルタミカム由来のジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードするDNA又はこのDNAの塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAが導入されている請求項１又は２に記載の形質転換体。
【請求項４】
宿主のコリネバクテリウム属細菌が、乳酸脱水素酵素遺伝子が破壊され、又は欠損したものである請求項１〜３の何れかに記載の形質転換体。
【請求項５】
コリネバクテリウム グルタミカム VAL4（受託番号：NITE BP-1122）形質転換体。
【請求項６】
請求項１〜５の何れかに記載の形質転換体を、還元条件下、糖類を含有する反応液中で反応させる工程と、反応液中のバリンを回収する工程とを含むバリンの製造方法。
【請求項７】
反応工程において、形質転換体が増殖しない請求項６記載のバリンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バリン生産技術に関する。さらに詳しくは、バリン生産機能を付与するために特定の遺伝子操作が施されたコリネ型細菌の形質転換体、及びこの形質転換体を用いた効率的なバリンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
地球温暖化、及び化石資源枯渇問題を背景に、再生可能資源を原料とした化学品の製造は、バイオ燃料製造と並び、新産業バイオリファイナリーとして低炭素社会実現の重要な方策であることが認識され、大きな注目が集まっている。
必須アミノ酸の一つであるバリンは、医薬、食品、化粧品の成分や、家畜飼料添加物などとして有用な物質である。従来、バリンは、発酵法やタンパク質の加水分解により生産されている。
しかし、再生可能資源を原料とした発酵法によるバリン生産は、乳酸やエタノールの生産と比較して、原料となる糖類から代謝反応段数が大変多く、また生産物であるバリンにより代謝酵素がフィードバック阻害を受ける等の理由により生産性が低いことが工業的生産の課題となっていた。【０００３】
遺伝子組換え菌によるバリン生産技術としては、特許文献１、２に記載の技術が挙げられる。
特許文献１は、Ｌ−イソロイシン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子、Ｌ−ロイシン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子、及びＤ−パントテン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子を弱化または欠失させて、Ｌ−バリン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子をその発現が増加するように変異させたコリネバクテリウム グルタミカムを用いてバリンを製造する技術を開示している。
また、特許文献２は、トランスアミナーゼＣの活性を増加させたコリネバクテリウム属細菌を用いてバリンを製造する技術を開示している。
しかし、特許文献１、２の方法は、バリンの生産性が実用上十分とはいない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００９−５２１９６０
【特許文献２】特表２００８−５１４１９１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、糖類を原料として効率よくバリンを製造できる微生物、及びこの微生物を用いて糖類を原料として効率よくバリンを製造できる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
コリネ型細菌は、解糖系によりグルコースをピルビン酸にまで分解する。コリネ型細菌は、さらに、ピルビン酸をアセトヒドロキシ酸シンターゼにより２−アセトラクテートに代謝し、２−アセトラクテートをアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼにより２，３−ジヒドロキシイソバレレートに代謝し、２，３−ジヒドロキシイソバレレートをジヒドロキシ酸デヒドラターゼにより２−ケトイソバレレートに代謝し、２−ケトイソバレレートをトランスアミナーゼによりバリンに代謝する。【０００７】
本発明者らは、コリネ型細菌に、配列番号37の塩基配列からなるアセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子、配列番号57の塩基配列からなるアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ遺伝子、及び配列番号40の塩基配列からなるロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子の何れか1以上の遺伝子を導入した形質転換体は、糖類を原料として、効率よくバリンを生産することを見出した。
配列番号37の塩基配列からなるDNAは、コリネバクテリウム  グルタミカムのアセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子(ilvBN遺伝子)の変異体であり、配列番号57の塩基配列からなるDNAはコリネバクテリウム  グルタミカムのアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ遺伝子（ilvC遺伝子）の変異体である。
また、配列番号40の塩基配列からなるDNAはロイシンデヒドロゲナーゼをコードするものであり、コリネ型細菌において、本来トランスアミナーゼが触媒する２−ケトイソバレレートからバリンへの変換を触媒することができる。なお、トランスアミナーゼが他のアミノ酸からアミノ基を２−ケトイソバレレートに転移するのに対して、ロイシンデヒドロゲナーゼは無機のＮＨ４＋からアミノ基を２−ケトイソバレレートに転移することができる。【０００８】
また、本発明者は、この形質転換体において、宿主のコリネ型細菌の染色体上に存在するラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊又は欠損しているときは、一層効率よくバリンを生産できることを見出した。【０００９】
さらに本発明者らは、この形質転換体は、還元条件下の反応液中で実質的に増殖しない状態で反応させる場合、好気性の反応液中で増殖させつつ反応させる場合に比べて、バリン生産効率が高いことを見出した。【００１０】
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下の形質転換体及びバリンの製造方法を提供する。
項１．  宿主のコリネ型細菌に、下記(a)、(b)、及び(c)の何れか1以上のDNAを導入することにより得られる形質転換体。
(a) コリネバクテリウム グルタミカム由来のアセトヒドロキシ酸シンターゼをコードするDNAにおいて、このDNAがコードするアミノ酸配列の156番目のグリシンをグルタミン酸に変異（G156E）させる変異が導入されたDNA、又はこのDNAの塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアセトヒロドキシ酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(b) コリネバクテリウム グルタミカム由来のアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードするDNAにおいて、このDNAがコードするアミノ酸配列の34番目のセリンをグリシンに変異させ（S34G）、48番目のロイシンをグルタミン酸に変異させ（L48E）、49番目のアルギニンをフェニールアラニンに変異させる（R49F）変異が導入されたDNA、又はこのDNAの塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(c)リシニバチルス スフェリカス由来のロイシンデヒドロゲナーゼをコードするDNA、又はこのDNAの塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
項２．  コリネバクテリウム グルタミカム由来のアセトヒドロキシ酸シンターゼをコードするDNAにおいて、このDNAがコードするアミノ酸配列の156番目のグリシンをグルタミン酸に変異（G156E）させる変異が導入されたDNAが、配列番号37の塩基配列からなるDNAであり、
コリネバクテリウム グルタミカム由来のアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードするDNAにおいて、このDNAがコードするアミノ酸配列の34番目のセリンをグリシンに変異させ（S34G）、48番目のロイシンをグルタミン酸に変異させ（L48E）、49番目のアルギニンをフェニールアラニンに変異させる（R49F）変異が導入されたDNAが、配列番号57の塩基配列からなるDNAであり、
リシニバチルス スフェリカス由来のロイシンデヒドロゲナーゼをコードするDNAが、配列番号40の塩基配列からなるDNAである項１に記載の形質転換体。
項３．  さらに、コリネバクテリウム グルタミカム由来のジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードするDNA又はこのDNAの塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAが導入されている項１又は２に記載の形質転換体。
項４．  宿主のコリネ型細菌が、乳酸脱水素酵素遺伝子が破壊され、又は欠損したものである項１〜３の何れかに記載の形質転換体。
項５．  コリネバクテリウム グルタミカム VAL4（受託番号：NITE BP-1122）形質転換体。
項６．  項１〜５の何れかに記載の形質転換体を、還元条件下、糖類を含有する反応液中で反応させる工程と、反応液中のバリンを回収する工程とを含むバリンの製造方法。
項７．  反応工程において、形質転換体が実質的に増殖しない項６記載のバリンの製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の形質転換体は、特定配列のアセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子、特定配列のアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ遺伝子、及び特定配列のロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子の何れか1以上の遺伝子を導入したコリネ型細菌であることにより、従来公知の形質転換体に比べて、糖類からバリンを高効率で製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例で使用したベクターの構築を示す図である。
【図２】実施例で使用したベクターの構築を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）形質転換体
宿主
コリネ型細菌とは、バージーズ・マニュアル・デターミネイティブ・バクテリオロジー〔Bargeys Manual of Determinative Bacteriology、Vol. 8、599（1974）〕に定義されている一群の微生物であり、通常の好気的条件で増殖するものならば特に限定されるものではない。具体例を挙げれば、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌、マイクロコッカス属菌等が挙げられる。コリネ型細菌の中ではコリネバクテリウム属菌が好ましい。
【００１４】
コリネバクテリウム属菌としては、コリネバクテリウム  グルタミカム、コリネバクテリウム  エフィシェンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム  アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム  ハロトレランス（Corynebacterium halotolerance）、コリネバクテリウム  アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）等が挙げられる。中でも、安全でかつバリン生産性が高い点で、コリネバクテリウム  グルタミカムが好ましい。好適な菌株として、コリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R株（FERM P-18976）、ATCC13032株、ATCC13869株、ATCC13058株、ATCC13059株、ATCC13060株、ATCC13232株、ATCC13286株、ATCC13287株、ATCC13655株、ATCC13745株、ATCC13746株、ATCC13761株、ATCC14020株、ATCC31831株、MJ-233（FERM BP-1497）、MJ-233AB-41（FERM BP-1498）等が挙げられる。中でも、R株（FERM P-18976）、ATCC13032株、ATCC13869株が好ましい。
【００１５】
なお、分子生物学的分類により、ブレビバクテリウム フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム ディバリカタム（Brevibacterium divaricatum）、コリネバクテリウム リリウム（Corynebacterium lilium）等のコリネ型細菌もコリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）に菌名が統一されている〔Liebl, W. et al., Transfer of Brevibacterium divaricatum DSM 20297T, "Brevibacterium flavum" DSM 20411, "Brevibacterium lactofermentum" DSM 20412 and DSM 1412, and Corynebacterium glutamicum and their distinction by rRNA gene restriction patterns. Int J Syst Bacteriol. 41:255-260. (1991)、駒形和男ら, コリネフォルム細菌の分類, 発酵と工業, 45:944-963 (1987)〕。
旧分類のブレビバクテリウム  ラクトファーメンタムATCC13869株、ブレビバクテリウム フラバムのMJ-233株（FERM BP-1497）、MJ-233AB-41株（FERM BP-1498）なども好適なコリネバクテリウム グルタミカムである。
ブレビバクテリウム属菌としては、ブレビバクテリウム アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）（例えばATCC6872株）等が挙げられる。
【００１６】
アースロバクター属菌としては、アースロバクター  グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）（例えばATCC8010株、ATCC4336株、ATCC21056株、ATCC31250株、ATCC31738株、ATCC35698株）等が挙げられる。
マイコバクテリウム属菌としては、マイコバクテリウム ボビス（Mycobacterium bovis）（例えばATCC19210株、ATCC27289株）等が挙げられる。
マイクロコッカス属菌としては、マイクロコッカス  フロイデンライヒ（Micrococcus freudenreichii）（例えばNo. 239株（FERM P-13221））、マイクロコッカス  ルテウス（Micrococcus leuteus）(例えばNo. 240株（FERM P-13222）)、マイクロコッカス ウレアエ（Micrococcus ureae）（例えばIAM1010株）、マイクロコッカス  ロゼウス（Micrococcus roseus）（例えばIFO3764株）等が挙げられる。
【００１７】
また、コリネ型細菌は、野生株の他に、その変異株や人為的な遺伝子組換え体であってもよい。例えば、ラクテート（乳酸）デヒドロゲナーゼ（lactate dehydrogenase：LDH）、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ（phosphoenolpyrvate carboxylase）、ピルビン酸カルボキシラーゼ（pyruvate carboxylase）、マレートデヒドロゲナーゼ（malate dehydrogenase）などの遺伝子の破壊又は欠失株が挙げられる。このような遺伝子破壊株を宿主として用いることにより、バリンの生産性を向上させたり、副生成物の生成を抑制したりすることができる。
中でも、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株が好ましい。この遺伝子破壊株は、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊されていることにより、ピルビン酸から乳酸への代謝経路が遮断されている。中でも、コリネバクテリウム グルタミカムの、特にR（FERM P-18976）株のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株が好ましい。
このような遺伝子破壊株は、遺伝子工学的手法により常法に従い作製できる。例えば、ＷＯ２００５／０１０１８２Ａ１に、乳酸デヒドロゲナーゼ破壊株、及びその作製方法が記載されている。
【００１８】
アセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子(ilvBN遺伝子)
アセトヒドロキシ酸シンターゼは、下記の反応を触媒する酵素である。
２ピルビン酸→２−アセトラクテート
本発明においては、アセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子として、コリネバクテリウム グルタミカム由来のアセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子において、この遺伝子がコードするアミノ酸配列の156番目のグリシンをグルタミン酸に変異（G156E）させるような変異が導入されたDNAを用いることができる。中でも、配列番号37の塩基配列からなるDNAが好ましい。
【００１９】
また、本発明では、コリネバクテリウム グルタミカム由来のアセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子において、この遺伝子がコードするアミノ酸配列の156番目のグリシンをグルタミン酸に変異（G156E）させるような変異が導入されたDNA又は配列番号37の塩基配列と、相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアセトヒドロキシ酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA(類縁体)も使用できる。
【００２０】
本発明において「ストリンジェントな条件」は、一般的な条件、例えば、Molecular  Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition,1989,Vol2,p11.45に記載された条件を指す。具体的には、完全ハイブリッドの融解温度(Ｔｍ)より5〜10℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合を指す。
【００２１】
また、本発明では、コリネバクテリウム グルタミカム由来のアセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子において、この遺伝子がコードするアミノ酸配列の156番目のグリシンをグルタミン酸に変異（G156E）させるような変異が導入されたDNA又は配列番号37の塩基配列からなるDNAの塩基配列と、同一性が90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上の塩基配列からなり、かつアセトヒドロキシ酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA（類縁体）も使用できる。
塩基配列の同一性は、GENETYX ver.8（GENETYX 株式会社ゼネティックス製）により算出した値である。
【００２２】
アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性は、100mMリン酸カリウム(pH7.5)、50mMピルビン酸ナトリウム、10mM MgCl2、0.1mMチアミンピロホスフェート、0.1mMフラビンアデニンジヌクレオチド、及び被験酵素を混合し、ピルビン酸の吸収を示す333nm(ε＝17.5/M・cm)の減少を指標に測定することができる。1分間に１μmolの２−アセト乳酸が形成される活性を、１ユニットのアセトヒドロキシ酸シンターゼ活性とする。
【００２３】
コリネバクテリウム グルタミカム由来のアセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子において、この遺伝子がコードするアミノ酸配列の156番目のグリシンをグルタミン酸に変異（G156E）させるような変異が導入されたDNA又は配列番号37の塩基配列からなるDNAの類縁体は、例えば、これらの塩基配列に基づき常法に従い設計したプライマー又はプローブを用いたPCR又はハイブリダイゼーションにより、他生物種のDNAライブラリーから選択することができ、これにより高確率でアセトヒドロキシ酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAが得られる。
【００２４】
アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ遺伝子（ilvC遺伝子）
アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼは、下記の反応を触媒する酵素である。
２−アセトアセテート→２，３−ジヒドロキシイソバレレート
本発明では、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ遺伝子として、コリネバクテリウム グルタミカム由来のアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ遺伝子において、この遺伝子がコードするアミノ酸配列の34番目のセリンをグリシンに変異させ（S34G）、48番目のロイシンをグルタミン酸に変異させ（L48E）、49番目のアルギニンをフェニールアラニンに変異させる（R49F）ような変異が導入されたDNAを用いることができる。中でも、配列番号57の塩基配列からなるDNAが好ましい。
【００２５】
また、本発明では、コリネバクテリウム グルタミカム由来のアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ遺伝子において、この遺伝子がコードするアミノ酸配列の34番目のセリンをグリシンに変異させ（S34G）、48番目のロイシンをグルタミン酸に変異させ（L48E）、49番目のアルギニンをフェニールアラニンに変異させる（R49F）ような変異が導入されたDNA又は配列番号57の塩基配列と、相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA(類縁体)も使用できる。
【００２６】
また、本発明では、コリネバクテリウム グルタミカム由来のアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ遺伝子において、この遺伝子がコードするアミノ酸配列の34番目のセリンをグリシンに変異させ（S34G）、48番目のロイシンをグルタミン酸に変異させ（L48E）、49番目のアルギニンをフェニールアラニンに変異させる（R49F）ような変異が導入されたDNA又は配列番号57の塩基配列からなるDNAの塩基配列と、同一性が90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上の塩基配列からなり、かつアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA（類縁体）も使用できる。
【００２７】
アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ活性は、100mMリン酸カリウム(pH7.5)、10mMアセト乳酸、5mM MgCl2、0.2mM NADPH、及び被験酵素を混合し、NADPHの吸収を示す340nm(ε＝6220/M・cm)の減少を指標に測定することが出来る。1分間に1μmolの2,3-ジヒドロキシイソ吉草酸が形成される活性を、1ユニットのアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ活性とする。
【００２８】
ロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子
本発明では、リシニバチルス スフェリカス由来のロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子を用いることができる。中でも、配列番号40の塩基配列からなるDNAが好ましい。
また、本発明では、リシニバチルス スフェリカス由来のロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子（DNA）又は配列番号40の塩基配列と、相補的な塩基配列からなるDNAと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA(類縁体)も使用できる。
また、本発明では、リシニバチルス スフェリカス由来のロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子（DNA）又は配列番号40のDNAの塩基配列と、同一性が90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上の塩基配列からなり、かつロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA（類縁体）も使用できる。
ロイシンデヒドロゲナーゼ活性は、100mM グリシン/NaOH(pH 9.5)、10mM 2-ケトイソ吉草酸、200mM 塩化アンモニウム、0.2mM NADH、及び被験酵素を混合し、NADHの吸収を示す340nm(ε＝6220/M・cm)の減少を指標に測定することが出来る。1分間に1μmolのバリンが形成される活性を、1ユニットのロイシンデヒドロゲナーゼ活性とする。
【００２９】
前述した通り、本発明の形質転換体は、下記(a)〜(c)の遺伝子の何れか1以上を宿主のコリネ型細菌に導入した株である。
(a) コリネバクテリウム グルタミカム由来のアセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子において、この遺伝子がコードするアミノ酸配列の156番目のグリシンをグルタミン酸に変異（G156E）させる変異が導入された遺伝子、又はその類縁体
(b) コリネバクテリウム グルタミカム由来のアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ遺伝子において、この遺伝子がコードするアミノ酸配列の34番目のセリンをグリシンに変異させ（S34G）、48番目のロイシンをグルタミン酸に変異させ（L48E）、49番目のアルギニンをフェニールアラニンに変異させる（R49F）変異が導入された遺伝子、又はその類縁体
(c)リシニバチルス スフェリカス由来のロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子、又はその類縁体
導入遺伝子の組み合わせは、(a)と(b)との組み合わせ、(a) と(c) との組み合わせ、(b) と(c) との組み合わせ、(a) と(b) と(c) との組み合わせの何れであってもよい。中でも、(a) と(b) と(c) との組み合わせが好ましい。
【００３０】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ遺伝子
また、何れの場合も、さらに、宿主に、コリネバクテリウム グルタミカム由来ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ遺伝子(特に、配列番号43の塩基配列からなるDNA)、又はその類縁体を導入することが好ましく、これにより一層バリン生産性が高いものとなる。
類縁体には、配列番号43の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAや、配列番号43の塩基配列と同一性が90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上の塩基配列からなり、かつジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAが含まれる。
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性は、2,3-ジヒドロキシイソ吉草酸から2-ケトイソ吉草酸を形成する際の、2-ケトイソ吉草酸の増加に伴う340nmの吸光度上昇を指標として測定できる（Dennis H.F., et.al., The role and properties of the iron-sulfur cluster in Escherichia coli dihydroxy-acid dehydratase. J. Biol. Chem., 268:14732-14742 (1993)）。活性測定用の反応液は、50mM トリス−塩酸緩衝液pH 8.0、10mM塩化マグネシウム、6mM 2,3-ジヒドロキシイソ吉草酸を用いる。30℃で酵素液1を反応液に添加することにより反応を開始し、反応液の吸光度減少の傾きと2,3-ジヒドロキシイソ吉草酸を含まない反応液の吸光度減少の傾きの差から、モル吸光係数190M-1cm-1を利用して活性値を算出できる。
【００３１】
形質転換のためのベクターの構築
PCRで増幅したアセトヒドロキシ酸シンターゼをコードするDNA、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードするDNA、及びロイシンデヒドロゲナーゼをコードするDNAは、それぞれ、宿主で増幅できる適切なベクターにクローニングすればよい。
プラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内で自律複製機能を司る遺伝子を含むものであれば良い。その具体例としては、ブレビバクテリウム  ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）2256由来のpAM330〔特開昭58-67699〕、〔Miwa, K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48:2901-2903（1984）〕 及び 〔Yamaguchi, R. et al., Determination of the complete nucleotide sequence of the Brevibacterium lactofermentum plasmid pAM330 and the analysis of its genetic information. Nucleic Acids Symp. Ser. 16:265-267（1985）〕、コリネバクテリウム グルタミカム ATCC13058由来のpHM1519 〔Miwa, K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48:2901-2903（1984）〕及びpCRY30 〔Kurusu, Y. et al., Identification of plasmid partition function in coryneform bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 57:759-764 （1991）〕、コリネバクテリウム グルタミカム T250由来のpCG4〔特開昭57-183799〕、〔Katsumata, R. et al., Protoplast transformation of glutamate-producing bacteria with plasmid DNA. J. Bacteriol.、159:306-311 （1984）〕、pAG1、pAG3、pAG14、pAG50〔特開昭62-166890〕、pEK0、pEC5、pEKEx1 〔Eikmanns, B.J. et al., A family of Corynebacterium glutamicum/Escherichia coli shuttle vectors for cloning, controlled gene expression, and promoter probing. Gene, 102:93-98 （1991）〕などが挙げられる。
【００３２】
好ましいプロモーターとしては、コリネバクテリウム  グルタミカムR由来のグリセルアルデヒド3-フォスフェートデヒドロゲナーゼA遺伝子(gapA)のプロモーターPgapA、マレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（mdh）のプロモーターPmdh、ラクテートデヒドロゲナーゼA遺伝子（ldhA）のプロモーターPldhAなどが挙げられ、中でも、PgapAが好ましい。
好ましいターミネーターとしては、大腸菌rRNAオペロンのrrnB T1T2 ターミネーター、大腸菌のtrpA ターミネーター、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）のtrp ターミネーターなどが挙げられ、中でも、rrnB T1T2 ターミネーターが好ましい。
【００３３】
形質転換
形質転換方法は、公知の方法を制限無く使用できる。このような公知の方法として、例えば塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、電気パルス法などが挙げられる。中でも、コリネ型細菌には、電気パルス法が好適であり、電気パルス法は、公知の方法 〔Kurusu, Y. et al., Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophic complementation. Agric. Biol. Chem. 54:443-447 （1990）〕 及び 〔Vertes A.A. et al., Presence of mrr- and mcr-like restriction systems in Coryneform bacteria. Res. Microbiol. 144:181-185 （1993）〕により行うことができる。
【００３４】
形質転換体は、微生物の培養に通常使用される培地を用いて培養すればよい。この培地としては、通常、炭素源、窒素源、無機塩類及びその他の栄養物質等を含有する天然培地又は合成培地等を用いることができる。
炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、マンノース、マルトース、マンニトール、キシロース、アラビノース、ガラクトース、澱粉、糖蜜、ソルビトール、グリセリン等の糖質又は糖アルコール；酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸又はグルコン酸等の有機酸；エタノール、プロパノール等のアルコール等が挙げられる。また、所望によりノルマルパラフィン等の炭化水素等も用いることができる。炭素源は、１種を単独で使用でき、又は２種以上を混合して使用してもよい。培地中のこれら炭素源の濃度は、通常、約0.1〜10（ｗ／ｖ％）とすればよい。
窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等が挙げられる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ベプトン、NZ−アミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、１種を単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。培地中の窒素源濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約0.1〜10（ｗ／ｖ％）とすればよい。
無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト又は炭酸カルシウム等が挙げられる。これら無機塩は、１種を単独で使用してもよく、また2種以上を混合して使用してもよい。培地中の無機塩類濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.01〜1（ｗ／ｖ％）とすればよい。
栄養物質としては、例えば肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、又は動植物若しくは微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられる。栄養物質の培地濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常、約0.1〜10（ｗ／ｖ％）とすればよい。さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、例えば、ビオチン、チアミン（ビタミンB1）、ピリドキシン（ビタミンB6）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
培地のｐＨは約５〜８が好ましい。
【００３５】
好ましい微生物培養培地としては、A培地〔Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182-196 (2004)〕、BT培地〔Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103 (2004)〕等が挙げられる。
培養温度は約１５〜４５℃とすればよく、培養時間は約１〜７日間とすればよい。
【００３６】
宿主染色体遺伝子の破壊又は欠失
前述したように、宿主のコリネ型細菌は、その染色体上に存在するラクテート（乳酸）デヒドロゲナーゼ遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子、及びマレートデヒドロゲナーゼ遺伝子の１以上が、破壊され、又は欠失していることが好ましく、これにより一層効率良くバリンを製造することができる。
遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能する酵素タンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡで細菌を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を欠失型又は破壊型の遺伝子に置換することができる。欠失型又は破壊型の遺伝子によってコードされる酵素タンパク質は、生成したとしても、野生型酵素タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失している。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子欠失又は破壊は既に確立しており、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを利用する方法などがある（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。
具体的には、例えば、ラクテート（乳酸）デヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊又は欠失したコリネ型細菌は、J.  Mol. Microbiol. Biotechnol., Vol.8, 243-254(2004)に記載の方法で取得できる。
【００３７】
（ＩＩ）バリンの製造方法
上記説明した本発明の形質転換体を、還元条件下、糖類を含有する反応液中で反応させる工程と、反応液中のバリンを回収する工程とを含む方法によりバリンを製造することができる。
【００３８】
微生物の増殖
反応に先立ち、形質転換体を好気条件下で、温度約２５〜３８℃で、約１２〜４８時間培養して増殖させることが好ましい。
【００３９】
培養用培地
反応に先立つ形質転換体の好気的培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類およびその他の栄養物質等を含有する天然培地または合成培地を用いることができる。
炭素源として、糖類（グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラクトースのような単糖；スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、キシロビオース、トレハロースのような二糖；澱粉のような多糖；糖蜜等）、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリンのような糖アルコール；酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸のような有機酸；エタノール、プロパノールのようなアルコール；ノルマルパラフィンのような炭化水素等も用いることができる。
炭素源は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。
【００４０】
窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムのような無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等を使用できる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、NZ−アミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。窒素源の培地中の濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約0.1〜10（ｗ／ｖ％）とすればよい。
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等が挙げられる。無機塩は、１種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。無機塩類の培地中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.01〜1（ｗ／ｖ％）とすればよい。
【００４１】
栄養物質としては、肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、動植物又は微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられる。栄養物質の培地中の濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常約0.1〜10（ｗ／ｖ％）とすればよい。
さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビタミンB1）、ピリドキシン（ビタミンB6）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
培地のｐＨは約６〜８が好ましい。
【００４２】
具体的な好ましいコリネ型細菌用培地としては、A培地〔Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182-196 (2004)〕、BT培地〔Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103 (2004)〕等が挙げられる。これらの培地において、糖類濃度を上記範囲にして用いればよい。
反応液
反応液としては、炭素源、窒素源、及び無機塩類等を含有する天然反応液または合成反応液を用いることができる。
炭素源としては糖類を用いる。糖類としては、グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラクトースのような単糖；スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、キシロビオース、トレハロースのような二糖；澱粉のような多糖；糖蜜等が挙げられる。また、稲わら、バガス、コーンストーバー等の非可食農産廃棄物や、スイッチグラス、ネピアグラス、ミスキャンサス等のエネルギー作物を糖化酵素などで糖化したグルコースや、キシロース等の複数の糖を含む糖化液を用いることもできる。中でも、単糖が好ましく、グルコースがより好ましい。また、グルコースを含む糖類（二糖、オリゴ糖、多糖）も好ましい。
炭素源として、糖類の他に、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリンのような糖アルコール；酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸のような有機酸；エタノール、プロパノールのようなアルコール；ノルマルパラフィンのような炭化水素等も用いることができる。
炭素源は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。
反応液中の糖類の濃度は、約1〜20（ｗ／ｖ％）が好ましく、約2〜10（ｗ／ｖ％）がより好ましく、約2〜5（ｗ／ｖ％）がさらにより好ましい。
また、糖類を含む全炭素源の反応液中の濃度は、通常、約2〜5（ｗ／ｖ％）とすればよい。
【００４３】
窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムのような無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等を使用できる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、NZ−アミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。窒素源の反応液中の濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約0.1〜10（ｗ／ｖ％）とすればよい。
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等が挙げられる。無機塩は、１種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。無機塩類の反応液中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.01〜1（ｗ／ｖ％）とすればよい。
【００４４】
さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビタミンB1）、ピリドキシン（ビタミンB6）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
反応液のｐＨは約６〜８が好ましい。
【００４５】
具体的な好ましいコリネ型細菌用反応液としては、前述したBT培地等が挙げられる。これらの培地において、糖類濃度を上記範囲にして用いればよい。
【００４６】
反応条件
反応温度、即ち形質転換体の生存温度は、約２０〜５０℃が好ましく、約２５〜４７℃がより好ましい。上記温度範囲であれば、効率良くバリンを製造できる。
また、反応時間は、約１〜７日間が好ましく、約１〜３日間がより好ましい。
培養は、バッチ式、流加式、連続式の何れでもよい。中でも、バッチ式が好ましい。
反応は、好気的条件で行ってもよく、還元条件で行ってもよい。
【００４７】
＜還元条件＞
還元条件では、コリネ型細菌は実質的に増殖せず、一層効率的にバリンを生産させることができる。
還元条件は、反応液の酸化還元電位で規定される。反応液の酸化還元電位は、約−２００ｍＶ〜−５００ｍＶが好ましく、約−２５０ｍＶ〜−５００ｍＶがより好ましい。
反応液の還元状態は簡便にはレサズリン指示薬（還元状態であれば、青色から無色への脱色）で推定できるが、正確には酸化還元電位差計（例えば、BROADLEY  JAMES社製、ORP  Electrodes）を用いて測定できる。
【００４８】
還元条件にある反応液の調整方法は、公知の方法を制限なく使用できる。例えば、反応液の液体媒体として、蒸留水などの代わりに反応液用水溶液を使用してもよく、反応液用水溶液の調整方法は、例えば硫酸還元微生物などの絶対嫌気性微生物用の培養液調整方法（Pfennig, N. et al., (1981) : The dissimilatory sulfate−reducing  bacteria，In The Prokaryotes，A Handbook on Habitats Isolation and  Identification of Bacteria，Ed．by Starr，M．P．et al., p926-940， Berlin，Springer Verlag．）や「農芸化学実験書  第三巻、京都大学農学部  農芸化学教室編、1990年第26刷、産業図書株式会社出版」などが参考となり、所望する還元条件下の水溶液を得ることができる。
具体的には、蒸留水などを加熱処理や減圧処理して溶解ガスを除去することにより、還元条件の反応液用水溶液を得ることができる。この場合、約１０ｍｍＨｇ以下、好ましくは約５ｍｍＨｇ以下、より好ましくは約３ｍｍＨｇ以下の減圧下で、約１〜６０分程度、好ましくは約５〜４０分程度、蒸留水などを処理することにより、溶解ガス、特に溶解酸素を除去して還元条件下の反応液用水溶液を作成することができる。
また、適当な還元剤（例えば、チオグリコール酸、アスコルビン酸、システィン塩酸塩、メルカプト酢酸、チオール酢酸、グルタチオン、硫化ソーダ等）を添加して還元条件の反応液用水溶液を調整することもできる。
これらの方法を適宜組み合わせることも有効な還元条件の反応液用水溶液の調整方法である。
【００４９】
反応中も反応液を還元条件に維持することが好ましい。反応途中での還元条件を維持するために、反応系外からの酸素の混入を可能な限り防止することが望ましく、具体的には、反応系を窒素ガス等の不活性ガスや炭酸ガス等で封入する方法が挙げられる。酸素混入をより効果的に防止する方法としては、反応途中において本発明の好気性細菌の菌体内の代謝機能を効率よく機能させるために、反応系のｐＨ維持調整液の添加や各種栄養素溶解液を適宜添加する必要が生じる場合もあるが、このような場合には添加溶液から酸素を予め除去しておくことが有効である。
【００５０】
バリンの回収
上記のようにして培養することにより、反応液中にバリンが生産される。反応液を回収することによりバリンを回収できるが、さらに、公知の方法でバリンを反応液から分離することもできる。そのような公知の方法として、イオン交換樹脂法、濃縮法、晶析法、活性炭吸着溶離法等が挙げられる。
【実施例】
【００５１】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１  変異アセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子のクローニング
(1)バリンアナログ耐性株の取得
コリネバクテリウム グルタミカム （Corynebacterium glutamicum）R株を、300μg/mlのN-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジンに、30℃で１時間曝し、次いで、A培地 [(NH2)2CO  2 g、(NH4)2SO4  7 g、KH2PO4  0.5 g、K2HPO4  0.5 g、MgSO4.7H2O  0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O  1 ml、0.02% (w/v) biotin solution  1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract  2 g、vitamin assay casamino acid  7 gを蒸留水1 Lに溶解]中で、約109cells/mlになるまで培養した。菌体を回収し、最少培地(BT培地)で洗浄した後、4%グルコース、バリンアナログである4%DL-α-アミノブチレートを含むBT平板培地に塗布して、30℃で5日間培養した。【００５２】
バリンアナログを含む平板培地上で生育した変異株を、A液体培地 10mlの入った試験管に植菌し、33℃にて16時間、好気的に振盪培養を行った。得られた培養菌体を遠心分離（4℃、14,500 rpm, 2分）により回収し、BT培地 [Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103 (2004)] 2mlで洗菌後、BT培地1mlで懸濁した。次に、BT培地10mlに終濃度OD610=0.1となるように懸濁液から植菌し、33℃にて48時間、好気的に振盪培養を行い、L-バリンの生産性の高い株をスクリーニングした。
バリンの定量は、サンプリングした培養液を遠心分離（4℃、14,500 rpm, 1分）し、得られた上清液をアミノ酸分析システム(島津製作所製、Prominence）で分析することにより行った。分析条件を以下の表１に示す。【００５３】
【表１】
0005960701.tif 000002
【００５４】
(2)変異アセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子のクローニング及び塩基配列の決定
上記のようにして取得したバリン高生産株の染色体DNA抽出は、A培地 [(NH2)2CO  2 g、(NH4)2SO4  7 g、KH2PO4  0.5 g、K2HPO4  0.5 g、MgSO4.7H2O  0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O  1 ml、0.02% (w/v) biotin solution  1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract  2 g、vitamin assay casamino acid  7 gを蒸留水1 Lに溶解] に、炭素源として、最終濃度4%になるように50% (w/v)グルコース溶液を添加し、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで33℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット（商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製）を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００５５】
得られた染色体DNAを用いてアセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子の配列解析を行った結果、156番目のアミノ酸グリシンがグルタミン酸にアミノ基置換していることを明らかにした。【００５６】
実施例２  バリン生産遺伝子のクローニングと発現
(1) 微生物からの染色体DNAの抽出
コリネバクテリウム グルタミカム （Corynebacterium glutamicum） R (FERM P-18976)からの染色体DNA抽出は、A培地 [(NH2)2CO  2 g、(NH4)2SO4  7 g、KH2PO4  0.5 g、K2HPO4  0.5 g、MgSO4.7H2O  0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O  1 ml、0.02% (w/v) biotin solution  1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract  2 g、vitamin assay casamino acid  7 gを蒸留水1 Lに溶解] に、炭素源として、最終濃度4%になるように50% (w/v)グルコース溶液を添加し、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで33℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット（商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製）を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００５７】
リジニバチルス スファエリカス（Lysinibacillus sphaericus）NBRC 3525からの染色体DNA抽出は、NBRC Medium No.802培地[polypeptone 10 g, yeast extract 2 g, MgSO4・7H2O 1 gを蒸留水1 Lに溶解]に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで30℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００５８】
(2) クローニングベクターの構築
クローニングベクターpCRB21の構築
コリネバクテリウム カゼイ JCM12072由来のプラスミドpCASE1のDNA複製起点（以降、pCASE1-oriと記す）配列、及びクローニングベクターpHSG398（タカラバイオ株式会社製）をそれぞれ含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、pCASE1-ori配列、クローニングベクターpHSG398をそれぞれクローン化するべく、配列番号1（pCASE1-ori配列）、配列番号2（クローニングベクター pHSG398）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。【００５９】
pCASE1-ori配列増幅用プライマー
（a-1）；  5’- GGCAG AGATCT AGAACGTCCGTAG -3’  （配列番号3）
（b-1）；  5’- CGGAA AGATCT GACTTGGTTACGATG -3’（配列番号4）
尚、プライマー（a-1）及び（b-1）には、BglII制限酵素部位が付加されている。
クローニングベクターpHSG398増幅用プライマー
（a-2）；  5’- CAGTGG AGATCT GTCGAACGGAAG -3’  （配列番号5）
（b-2）；  5’- CCGTT AGATCT AGTTCCACTGAGC -3’  （配列番号6）
尚、プライマー（a-2）及び（b-2）には、BglII制限酵素部位が付加されている。【００６０】
鋳型DNAは、Japan. Collection of Microorganisms (JCM)より入手したコリネバクテリウム カゼイ JCM12072から抽出したトータルDNA及びクローニングベクターpHSG398（タカラバイオ株式会社製）を用いた。【００６１】
実際のPCRは、Veritiサーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
0005960701.tif 000003
*) pCASE1-ori配列を増幅する場合はプライマー（a-1）と（b-1）の組み合わせ、クローニングベクターpHSG398を増幅する場合はプライマー（a-2）と（b-2）の組み合わせで行った。【００６２】
0005960701.tif 000004
【００６３】
上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、pCASE1-ori配列の場合約1.5-kb、クローニングベクターpHSG398の場合約2.2-kbのDNA断片が検出できた。【００６４】
上記のPCRにより増幅したコリネバクテリウム カゼイ株由来のプラスミドpCASE1-ori配列含む約1.5-kb DNA断片10μl及びクローニングベクターpHSG398を含む約2.2-kb DNA断片10μlを各々制限酵素BglIIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ （タカラバイオ株式会社製）1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションA液とした。
得られたライゲーションA液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、クロラムフェニコール50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素BglIIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpHSG398約2.2-kbのDNA断片に加え、pCASE-ori配列の約1.5-kb DNA断片が認められた。
pCASE1-ori配列を含むクローニングベクターをpCRB21と命名した。【００６５】
クローニングベクターpCRB22の構築
コリネバクテリウム カゼイ JCM12072由来のプラスミドpCASE1のDNA複製起点（以降、pCASE1-oriと記す）配列、及びクローニングベクターpHSG298（タカラバイオ株式会社製）をそれぞれ含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、pCASE1-ori配列、クローニングベクターpHSG298をそれぞれクローン化するべく、配列番号7（pCASE1-ori配列）、配列番号8（クローニングベクター pHSG298）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。【００６６】
pCASE1-ori配列増幅用プライマー
（a-3）；  5’- GGCAG AGATCT AGAACGTCCGTAG -3’  （配列番号9）
（b-3）；  5’- CGGAA AGATCT GACTTGGTTACGATG -3’（配列番号10）
尚、プライマー（a-3）及び（b-3）には、BglII制限酵素部位が付加されている。
クローニングベクターpHSG298増幅用プライマー
（a-4）；  5’- GCTGG AGATCT AGGTTTCCCGAC -3’  （配列番号11）
（b-4）；  5’- GGGAA AGATCT CGTGCCAGCTGC -3’  （配列番号12）
尚、プライマー（a-4）及び（b-4）には、BglII制限酵素部位が付加されている。【００６７】
鋳型DNAは、Japan. Collection of Microorganisms (JCM)より入手したコリネバクテリウム カゼイ JCM12072から抽出したトータルDNA及びクローニングベクターpHSG298（タカラバイオ株式会社製）を用いた。【００６８】
実際のPCRは、Veritiサーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
0005960701.tif 000005
*) pCASE1-ori配列を増幅する場合はプライマー（a-3）と（b-3）の組み合わせ、クローニングベクターpHSG298を増幅する場合はプライマー（a-4）と（b-4）の組み合わせで行った。【００６９】
0005960701.tif 000006
【００７０】
上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、pCASE1-ori配列の場合約1.4-kb、クローニングベクターpHSG298の場合、約2.7-kbのDNA断片が検出できた。【００７１】
上記のPCRにより増幅したコリネバクテリウム カゼイ株由来のプラスミドpCASE1-ori配列含む約1.4-kb DNA断片10μl及びクローニングベクターpHSG298を含む約2.7-kb DNA断片10μlを各々制限酵素BglIIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ （タカラバイオ株式会社製）1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションB液とした。
得られたライゲーションB液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素BglIIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpHSG298約2.7-kbのDNA断片に加え、pCASE-ori配列の約1.4-kb DNA断片が認められた。
pCASE1-ori配列を含むクローニングベクターをpCRB22と命名した。【００７２】
クローニングベクターpCRB12の構築
コリネバクテリウム グルタミカム内で複製可能なプラスミドpCG1 [(特開昭57−134500)] 由来のDNA複製起点（以降、pCG1-oriと記す）配列、及びクローニングベクターpHSG298（タカラバイオ株式会社製）をそれぞれ含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、pCG1-ori配列、クローニングベクターpHSG298をそれぞれクローン化するべく、配列番号13（pCG1-ori配列）、配列番号14（クローニングベクターpHSG298）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。【００７３】
pCG1-ori配列増幅用プライマー
（a-5）；  5’- GCGAA AGATCT AGCATGGTCGTC -3’   （配列番号15）
（b-5）；  5’- GTGAGC AGATCT GGAACCGTTATC -3’  （配列番号16）
なお、プライマー（a-5）及び（b-5）には、BglII制限酵素部位が付加されている。
クローニングベクターpHSG298増幅用プライマー
（a-6）；  5’- GCTGG AGATCT AGGTTTCCCGAC -3’  （配列番号17）
（b-6）；  5’- GGGAA AGATCT CGTGCCAGCTGC -3’  （配列番号18）
尚、プライマー（a-6）及び（b-6）には、BglII制限酵素部位が付加されている。【００７４】
鋳型DNAは、pCG1 [(特開昭57−134500)] 及びクローニングベクターpHSG298（タカラバイオ株式会社製）を用いた。【００７５】
実際のPCRは、Veritiサーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
0005960701.tif 000007
*) pCG1-ori配列を増幅する場合はプライマー(a-5)と(b-5)の組み合わせ、クローニングベクターpHSG298を増幅する場合はプライマー(a-6) と (b-6) の組み合わせで行った。【００７６】
0005960701.tif 000008
上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、pCG1-ori配列の場合約1.9-kb、クローニングベクターpHSG298の場合、約2.7-kbのDNA断片が検出できた。【００７７】
上記のPCRにより増幅したプラスミドpCG1由来pCG1-ori遺伝子含む約1.9-kb DNA断片10μl及びクローニングベクターpHSG298を含む約2.7-kb DNA断片10μlを各々制限酵素BglIIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ （タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションC液とした。
得られたライゲーションC液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素BglIIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpHSG298約2.7-kbのDNA断片に加え、pCG1-ori配列の約1.9-kb DNA断片が認められた。
pCG1-ori配列を含むクローニングベクターをpCRB12と命名した。【００７８】
クローニングベクターpCRB207の構築
コリネバクテリウム グルタミカムR由来のグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）をコードするgapA遺伝子のプロモーター配列（以降、PgapAと記す）を含むDNA断片、及びクローニングベクターpKK223-3（ファルマシア社製）由来rrnBT1T2双方向ターミネーター配列（以降、ターミネーター配列と記す）を含むDNA断片を以下の方法により増幅した。
PCRに際して、PgapA配列及びターミネーター配列をそれぞれクローン化するべく、配列番号19（PgapA配列）、配列番号20（ターミネーター配列）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。【００７９】
PgapA配列増幅用プライマー
（a-7）；  5’- CTCT GTCGAC CCGAAGATCTGAAGATTCCTG -3’
（配列番号21）
(b-7); 5’- CTCT GTCGAC GGATCC CCATGG TGTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG -3’
（配列番号22）
尚、プライマー（a-7）には、SalI制限酵素部位が、プライマー（b-7）には、SalI、BamHI及びNcoI制限酵素部位が付加されている。
ターミネーター配列増幅用プライマー
（a-8）；  5’- CTCT GCATGC CCATGG CTGTTTTGGCGGATGAGAGA -3’
（配列番号23）
（b-8）；  5’- CTCT GCATGC TCATGA AAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG -3 
（配列番号24）
尚、プライマー（a-8）には、SphI及びNcoI制限酵素部位が、プライマー（b-8）には、SphI及びBspHI制限酵素部位が付加されている。【００８０】
鋳型DNAは、コリネバクテリウム グルタミカム R (FERM P-18976)から抽出した染色体DNA及びpKK223-3プラスミド（ファルマシア社製）を用いた。【００８１】
実際のPCRは、Veritiサーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
0005960701.tif 000009
*) PgapA配列を増幅する場合はプライマー(a-7)と(b-7)の組み合わせ、ターミネーター配列を増幅する場合はプライマー(a-8) と (b-8) の組み合わせで行った。【００８２】
0005960701.tif 000010
【００８３】
上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、PgapA配列の場合約0.6-kb、ターミネーター配列の場合、約0.4-kbのDNA断片が検出できた。【００８４】
上記のPCRにより増幅したコリネバクテリウム グルタミカム R由来PgapA配列を含む約0.6-kb DNA断片10μlとクローニングベクターpCRB22約4.1-kbを各々制限酵素SalIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ （タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションD液とした。
得られたライゲーションD液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素SalIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpCRB22約4.1-kbのDNA断片に加え、PgapA配列）の約0.6-kb DNA断片が認められた。
PgapA配列を含むクローニングベクターをpCRB206と命名した。【００８５】
上記PCRにより増幅したpKK223-3プラスミド由来ターミネーター配列を含む約0.4-kb DNA断片10μlを制限酵素NcoI及びBspHIで、上述のクローニングベクターpCRB206  2μlを制限酵素NcoIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ （タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションE液とした。
得られたライゲーションE液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpCRB206約4.7-kbのDNA断片に加え、ターミネーター配列の約0.4-kb DNA断片が認められた。
rrnBT1T2ターミネーター配列を含むクローニングベクターをpCRB207と命名した。【００８６】
(3) バリン生産遺伝子のクローニング
コリネバクテリウム グルタミカム由来のバリン生産遺伝子のクローニング
コリネバクテリウム グルタミカム由来のアセトヒドロキシ酸シンターゼをコードするilvBN遺伝子、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードするilvC遺伝子、ジビドロキシ酸デヒドラターゼをコードするilvD遺伝子及びトランスアミナーゼ遺伝子をコードするilvE遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、ilvBN遺伝子、ilvC遺伝子、ilvD遺伝子及びilvE遺伝子をそれぞれクローン化するべく、配列番号25（コリネバクテリウム グルタミカムilvBN遺伝子）、配列番号26（コリネバクテリウム グルタミカムilvC遺伝子）、配列番号27（コリネバクテリウム グルタミカムilvD遺伝子）及び配列番号28（コリネバクテリウム グルタミカムilvE遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。【００８７】
ilvBN遺伝子増幅用プライマー
（a-9）；  5’- CTCT TCATGA ATGTGGCAGCTTCTCAAC -3’
（配列番号29）
（b-9）；  5’- CTCT TCATGA TTAGATCTTGGCCGGAGC -3’
（配列番号30）
尚、プライマー（a-9）及び（b-9）には、BspHI制限酵素部位が付加されている。【００８８】
ilvC遺伝子増幅用プライマー
（a-10）；  5’- CTCT CCATGG CTATTGAACTGCTTTATGATG -3’
（配列番号31）
（b-10）；  5’- CTCT CCATGG AGATCTTTAAGCGGTTTCTGCGCGA -3’
（配列番号32）
尚、プライマー（a-10）及び（b-10）には、NcoI制限酵素部位が付加されている。
ilvD遺伝子増幅用プライマー
（a-11）；  5’- GA CCCGGG GAGCAGATTTGAAAAGCGCATCATG -3’
（配列番号33）
（b-11）；  5’- GA CCCGGG GGTACC GTATTTGCAACGGGGAGCTCCACCA -3’
（配列番号34）
尚、プライマー（a-11）にはSmaI制限酵素部位が、（b-11）にはSmaI及びKpnI制限酵素部位が付加されている。
ilvE遺伝子増幅用プライマー
（a-12）；  5’- GA CCCGGG CATCCCATAAAATGGGGCTGACTAG -3’
（配列番号35）
（b-12）；  5’- GA CCCGGG GAGCTC CCCTGACTCCACCCCCTACGTCTCA -3’
（配列番号36）
尚、プライマー（a-12）にはSmaI制限酵素部位が、（b-12）にはSmaI及びSacI制限酵素部位が付加されている。【００８９】
コリネバクテリウム グルタミカム バリン高生産変異株由来のバリン生産遺伝子のクローニング
コリネバクテリウム グルタミカム バリン高生産株由来の変異アセトヒドロキシ酸シンターゼをコードするilvBN遺伝子含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、変異ilvBN遺伝子をそれぞれクローン化するべく、配列番号37（コリネバクテリウム グルタミカム 変異ilvBN遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。【００９０】
変異ilvBN遺伝子増幅用プライマー
（a-13）；  5’- CTCT TCATGA ATGTGGCAGCTTCTCAAC -3’
（配列番号38）
（b-13）；  5’- CTCT TCATGA TTAGATCTTGGCCGGAGC -3’
（配列番号39）
尚、プライマー（a-13）及び（b-13）には、BspHI制限酵素部位が付加されている。【００９１】
リジニバチルス  スファエリカス由来のバリン生産遺伝子のクローニング
リジニバチルス スファエリカス由来のロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子をコードするleudh遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、leudh遺伝子をクローン化するべく、配列番号40（リジニバチルス  スファエリカスleudh遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。【００９２】
leudh遺伝子増幅用プライマー
（a-14）；  5’- ACG CCCGGG AGGAGGTACGGATGGAAATCTTCAAGTATAT -3’
（配列番号41）
（b-14）；  5’- TCGG CCCGGG GAGCTC TTAACGGCCGTTCAAAATATTTTT -3’
（配列番号42）
尚、プライマー（a-14）にはSmaI制限酵素部位が、（b-14）にはSmaI及びSacI制限酵素部位が付加されている。【００９３】
鋳型DNAは、コリネバクテリウム グルタミカムは、コリネバクテリウム グルタミカムR及びコリネバクテリウム グルタミカム  バリン高生産株から抽出した染色体DNAを用いた。リジニバチルス  スファエリカスは、NITE Biological Resource Center（NBRC）より入手したリジニバチルス スファエリカスNBRC 3525から抽出した染色体DNAを用いた。【００９４】
実際のPCRは、Veritiサーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
0005960701.tif 000011
*) コリネバクテリウム グルタミカムilvBN遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-9) と (b-9) の組み合わせ、コリネバクテリウム グルタミカムilvC遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-10) と (b-10) 、コリネバクテリウム グルタミカム ilvD遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-11) と (b-11) の組み合わせ、コリネバクテリウム グルタミカムilvE遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-12) と (b-12) の組み合わせ、コリネバクテリウム グルタミカム バリン高生産株 変異ilvBN遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-13) と (b-13) の組み合わせ、リジニバチルス  スファエリカスleudh遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-14) と (b-14) の組み合わせで行った。【００９５】
0005960701.tif 000012
【００９６】
上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、コリネバクテリウム グルタミカムilvBN遺伝子の場合約2.4-kb、コリネバクテリウム グルタミカムilvC遺伝子の場合約1.0-kb、コリネバクテリウム グルタミカムilvD遺伝子の場合約2.0-kb、コリネバクテリウム グルタミカムilvE遺伝子の場合約1.3-kb、コリネバクテリウム グルタミカム バリン高生産株 変異ilvBN遺伝子の場合約2.4-kbリジニバチルス スファエリカスleudh遺伝子の場合約1.1-kbのDNA断片が検出できた。【００９７】
(4) バリン生産遺伝子発現プラスミドの構築
バリン生産遺伝子のpCRB207へのクローニング
上記項(3)に示したPCRにより増幅したコリネバクテリウム グルタミカム株由来ilvBN遺伝子を含む約2.4-kb DNA断片10μlを制限酵素BspHIで、コリネバクテリウム グルタミカムilvC遺伝子を含む約1.0-kb DNA断片10μlを制限酵素NcoIで、PgapAプロモーターを含有するクローニングベクターpCRB207  2μlを制限酵素NcoIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、3種類のDNA断片を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ株式会社製）  1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションF液とした。
また、上記項(3)に示したPCRにより増幅したコリネバクテリウム グルタミカム バリン高生産株由来 変異ilvBN遺伝子を含む約2.4-kb DNA断片10μlを制限酵素BspHIで、コリネバクテリウム グルタミカム由来ilvC遺伝子を含む約1.0-kb DNA断片10μlを制限酵素NcoIで、PgapAプロモーターを含有するクローニングベクターpCRB207  2μlを制限酵素NcoIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、3種類のDNA断片を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ株式会社製）  1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションG液とした。【００９８】
得られたライゲーションF液及びG液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
各々培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRB207約5.1-kbのDNA断片に加え、コリネバクテリウム グルタミカム株由来ilvBN遺伝子及びilvC遺伝子（ライゲーションF液）の場合、約3.4-kbの挿入断片が、コリネバクテリウム グルタミカム バリン高生産株由来 変異ilvBN遺伝子及びコリネバクテリウム グルタミカム株由来ilvC遺伝子（ライゲーションG液）の場合、約3.4-kbの挿入断片が、認められた。
コリネバクテリウム グルタミカム株由来ilvBNC遺伝子を含むプラスミドをpCRB207-ilvBNC/CG、コリネバクテリウム グルタミカム バリン高生産株由来 変異ilvBNC遺伝子を含むプラスミドをpCRB207-ilvBNGEC/CGと命名した。【００９９】
バリン生産遺伝子のpCRB21へのクローニング
上述のプラスミドpCRB207-ilvBNC/CG及びpCRB207-ilvBNGEC/CGを制限酵素BamHIで切断し、アガロース電気泳動後、アガロースゲルからQIAquick Gel Extraction Kit（株式会社キアゲン社製）によって回収したgapAプロモーターとコリネバクテリウム グルタミカム株由来ilvBNC遺伝子及びターミネーター配列を連結した約4.4-kbのDNA断片とBamHIで切断したクローニングベクターpCRB21約3.7-kbを70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させたDNA断片を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションH液及びI液とした。
得られたライゲーションH液及びI液を用い、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、クロラムフェニコール50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素BamHIで切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRB21約3.7-kbのDNA断片に加え、コリネバクテリウム グルタミカム株由来ilvBNC遺伝子（ライゲーションH液）の場合、長さ約4.4-kbの挿入断片が、コリネバクテリウム グルタミカム バリン高生産株由来 変異ilvBN遺伝子及びコリネバクテリウム グルタミカム株由来ilvC遺伝子（ライゲーションI液）の場合、約3.4-kbの挿入断片が、認められた。
コリネバクテリウム グルタミカム株由来ilvBNC遺伝子を含むプラスミドをpCRB-BNC、コリネバクテリウム グルタミカム バリン高生産株由来ilvBNC遺伝子を含むプラスミドをpCRB-BNGECと命名した（図１）。【０１００】
バリン生産遺伝子のpKK223-3へのクローニング
上記項(3)に示したPCRにより増幅したコリネバクテリウム グルタミカム株由来ilvD遺伝子を含む約2.0-kb DNA断片、コリネバクテリウム グルタミカム株由来ilvE遺伝子を含む約1.3-kb DNA断片、リジニバチルス スファエリカス株由来leudh遺伝子を含む約1.1-kb DNA断片10μl及びtacプロモーターを含有するクローニングベクターpKK223-3（ファルマシア社製）2μlを各々制限酵素SmaIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ  （タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションN液、O液及びP液とした。【０１０１】
得られた3種のライゲーションN液、O液及びP液それぞれを、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、アンピシリン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
各々培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpKK223-3約4.6-kbのDNA断片に加え、コリネバクテリウム グルタミカム株由来ilvD遺伝子（ライゲーションN液）の場合、長さ約2.0-kbの挿入断片が、コリネバクテリウム グルタミカム株由来ilvE遺伝子（ライゲーションO液）の場合、長さ約1.3-kbの挿入断片が、リジニバチルス スファエリカス株由来leudh遺伝子（ライゲーションP液）の場合、長さ約1.1-kbの挿入断片が認められた。【０１０２】
コリネバクテリウム グルタミカム株由来ilvD遺伝子を含むプラスミドをpKK223-3-ilvD/CG、コリネバクテリウム グルタミカム株由来ilvE遺伝子を含むプラスミドをpKK223-3-ilvE/CG、リジニバチルス  スファエリカス株由来leudh遺伝子を含むプラスミドをpKK223-3-leudh/LSとそれぞれ命名した。【０１０３】
バリン生産遺伝子のpCRB12へのクローニング
上述のプラスミドpKK223-3- ilvD/CGから、tacプロモーター及びコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R由来ilvD遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、tacプロモーター及びコリネバクテリウム グルタミカム株由来ilvD遺伝子（配列番号43；Ptac-ilvD配列）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。【０１０４】
Ptac-ilvD配列増幅用プライマー
（a-17）；  5’- ATAT CCTGCAGGCTAGC GCTGTGCAGGTCGTAAATCACT -3’
（配列番号44）
（b-17）；  5’- ATAT GCTAGC T CCTGCAGG TATTTGCAACGGGGAGCTC -3’
（配列番号45）
尚、プライマー（a-17）にはSse8387I及びNheI制限酵素部位が、（b-17）にはNheI及びSse8387I制限酵素部位が付加されている。
鋳型DNAは、上述のプラスミドpKK223-3-ilvD/CGを用いた。【０１０５】
実際のPCRは、Veritiサーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
0005960701.tif 000013
*) Ptac-ilvD/CG配列を増幅する場合はプライマー(a-17)と(b-17)の組み合わせで行った。
0005960701.tif 000014
【０１０６】
上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、Ptac-ilvD配列約2.2-kbのDNA断片が検出できた。【０１０７】
上記のPCRにより増幅したtacプロモーター配列及びコリネバクテリウム  グルタミカム由来ilvD配列を含む約2.2-kb DNA断片10μlとクローニングベクターpCRB12  2μlを各々制限酵素Sse8387Iで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ （タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションQ液とした。
得られたライゲーションQ液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア  コリHST02を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素Sse8387Iで切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpCRB12約3.7-kbのDNA断片に加え、Ptac-ilvD配列（ライゲーションQ液）の場合、約2.2-kbのDNA断片が認められた。
コリネバクテリウム  グルタミカム株由来ilvD遺伝子を含むプラスミドをpCRB12-ilvD/CGと命名した。【０１０８】
上述のプラスミドpKK223-3- ilvE/CG及びpKK223-3-leudh/LSから、tacプロモーター及びコリネバクテリウム グルタミカム由来ilvE遺伝子及びリジニバチルス  スファエリカス株由来leudh遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、tacプロモーター融合コリネバクテリウム グルタミカム株由来ilvE遺伝子（配列番号46；Ptac-ilvE配列）及びtacプロモーター融合リジニバチルス  スファエリカス株由来leudh遺伝子（配列番号47；Ptac-leudh配列）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。
Ptac-ilvE配列増幅用プライマー
（a-18）；  5’- ATAT GCTAGC T CCTGCAGG CTGTGCAGGTCGTAAATCAC -3’
（配列番号48）
（b-18）；  5’- ATAT CCTGCAGGCTAGC ATCCCTGACTCCACCCCCTAC -3’
（配列番号49）
尚、プライマー（a-18）にはNheI及びSse8387I制限酵素部位が、（b-18）にはSse8387I及びNheI制限酵素部位が付加されている。
Ptac-leudh配列増幅用プライマー
（a-19）；  5’- ATAT GCTAGC T CCTGCAGG CTGTGCAGGTCGTAAATCAC -3’
（配列番号50）
（b-19）；  5’- ATGC CCTGCAGGCTAGC GTTAACGGCCGTTCAAAATAT -3’
（配列番号51）
尚、プライマー（a-19）にはNheI及びSse8387I制限酵素部位が、（b-19）にはSse8387I及びNheI制限酵素部位が付加されている。
鋳型DNAは、上述のプラスミドpKK223-3-ilvE/CG及pKK223-3-leudh/LSを用いた。【０１０９】
実際のPCRは、Veritiサーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
0005960701.tif 000015
*) Ptac-ilvE/CG配列を増幅する場合はプライマー(a-18)と(b-18)の組み合わせ、Ptac-leudh/LS配列を増幅する場合はプライマー(a-19)と(b-19)の組み合わせで行った。
0005960701.tif 000016
【０１１０】
上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、Ptac-ilvE/CG配列約1.5-kbのDNA断片及びPtac-leudh/LS配列約1.3-kbのDNA断片が検出できた。【０１１１】
上記のPCRにより増幅したtacプロモーター配列融合コリネバクテリウム  グルタミカム由来ilvE配列を含む約1.5-kb DNA断片及びtacプロモーター配列融合リジニバチルス  スファエリカス株由来leudh配列を含む約1.3-kb DNA断片10μlとtacプロモーター配列融合コリネバクテリウム  グルタミカム由来ilvD配列を含むpCRB12-ilvD/CG  2μlを各々制限酵素NheIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ （タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションR液及びS液とした。
得られたライゲーションR液及びS液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア  コリHST02を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素NheIで切断し、挿入断片を確認した。この結果、tacプロモーター配列融合コリネバクテリウム グルタミカム由来ilvD配列を含むpCRB12-ilvD/CG約5.9-kbのDNA断片に加え、Ptac-ilvE配列（ライゲーションR液）の場合、約1.5-kbのDNA断片、Ptac-leudh配列（ライゲーションS液）の場合、約1.3-kbのDNA断片が認められた。
コリネバクテリウム グルタミカム株由来ilvD及びilvE遺伝子を含むプラスミドをpCRB-DEと命名した。コリネバクテリウム グルタミカム株由来ilvD及びリジニバチルス  スファエリカス株由来leudh遺伝子を含むプラスミドをpCRB-DLDと命名した（図２）。【０１１２】
(5）バリン生産遺伝子へのPCRを用いた部位特異的変異導入
コリネバクテリウム グルタミカム株由来のアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードするilvC遺伝子に、バリン生産性を向上させる変異を導入するため、コリネバクテリウム グルタミカム株由来ilvBNC遺伝子配列及びコリネバクテリウム グルタミカム バリン高生産株由来ilvBNC遺伝子配列を含むDNA断片を以下の方法により増幅した。
PCRに際して、コリネバクテリウム グルタミカム株由来ilvBNC遺伝子配列を含むプラスミドpCRB-BNC及びコリネバクテリウム グルタミカム バリン高生産株由来ilvBNC遺伝子配列を含むプラスミドpCRB-BNGECをクローン化するべく、配列番号52（ilvC遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。【０１１３】
ilvC(S34G)変異導入用プライマー
（a-15）；  5’- CGCACACGGCCAGAACC -3’      （配列番号53）
（b-15）；  5’- GGTTCTGGCCGTGTGCG -3’      （配列番号54）
尚、下線部分は変異導入塩基である。
ilvC(L48E, R49F)変異導入用プライマー
（a-16）；  5’- CATTGGTGAGTTCGAGGGC -3’    （配列番号55）
（b-16）；  5’- GCCCTCGAACTCACCAATG -3’    （配列番号56）
尚、下線部分は変異導入塩基である。【０１１４】
(5)-1  ilvC(S34G)変異導入
鋳型DNAは、コリネバクテリウム グルタミカム株由来 ilvBNC遺伝子配列を含有するプラスミドpCRB-BNC及びコリネバクテリウム  グルタミカム  バリン高生産株由来 変異ilvBNC遺伝子配列を含有するプラスミドpCRB-BNGECを用いた。【０１１５】
実際のPCRは、Veritiサーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
0005960701.tif 000017
*)pCRB-BNC配列及びpCRB-BNGEC配列を増幅するプライマーは(a-15)と(b-15)の組み合わせで行った。
0005960701.tif 000018
【０１１６】
上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、pCRB-BNC配列を含む約8.1-kbのDNA断片及びpCRB-BNGEC配列を含む約8.1-kbのDNA断片が検出できた。【０１１７】
上記のPCRにより増幅したpCRB-BNCを含む約8.1-kb DNA断片10μ及びpCRB-BNGECを含む約8.1-kb DNA断片にT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ  （宝酒造株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションJ液及びK液とした。
得られたライゲーションJ液及びK液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、クロラムフェニコール50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドの塩基配列をシーケンス解析で確認することにより変異導入サイトの挿入を確認した。
コリネバクテリウム グルタミカム株由来のアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードするilvC遺伝子の34番目のアミノ酸セリンをグリシンに変更したilvC配列を含むプラスミドをクタ−をpCRB-BNCSM及びpCRB-BNGECSMと命名した。【０１１８】
(5)-2  ilvC(L48E, R49F)変異導入
鋳型DNAは、上記1. ilvC(S34G)変異導入で構築したpCRB-BNCSM及び pCRB-BNGECSMを用いた。
実際のPCRは、Veritiサーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
0005960701.tif 000019
*)pCRB-BNCSM配列及びpCRB-BNGECSMを増幅するプライマーは(a-16)と(b-16)の組み合わせで行った。
0005960701.tif 000020
【０１１９】
上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、pCRB-BNCSM配列を含む約8.1-kbのDNA断片及びpCRB-BNGECSM配列を含む約8.1-kbのDNA断片が検出できた。【０１２０】
上記のPCRにより増幅したpCRB-BNCSMを含む約8.1-kb DNA断片10μ及びpCRB-BNGECSMを含む約8.1-kb DNA断片にT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ  （宝酒造株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションL液及びM液とした。
得られたライゲーションL液及びM液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、クロラムフェニコール50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドの塩基配列をシーケンス解析で確認することにより変異導入サイトの挿入を確認した。
コリネバクテリウム グルタミカム株由来のアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードするilvC遺伝子の34番目のアミノ酸セリンをグリシンに、48番目のアミノ酸ロイシンをグルタミン酸に、49番目のアミノ酸アルギニンをフェニルアラニンに変更したilvC配列を含むプラスミドをpCRB-BNCTM及びpCRB-BNGECTMと命名した（図１）。【０１２１】
(6) バリン生産遺伝子導入株の構築
上述のプラスミドpCRB-BNC及びpCRB-DEを用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem.、Vol. 54、443-447(1990) 及びRes. Microbiol.、Vol. 144、181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカムR ldhA mutant [J. Mol. Microbiol. Biotechnol.、Vol. 8、243-254(2004)]株を形質転換し、カナマイシン 50μg/ml及びクロラムフェニコール 5μg/mlを含むA寒天培地に塗布した。
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入プラスミドを確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRB-BNC及びpCRB-DEの導入が認められた。
得られた株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）VAL1と命名した。【０１２２】
上述のプラスミドpCRB-BNCTM及びpCRB-DEを用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem.、Vol. 54、443-447(1990) 及びRes. Microbiol.、Vol. 144、181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカムR ldhA mutant [J. Mol. Microbiol. Biotechnol.、Vol. 8、243-254(2004)]株を形質転換し、カナマイシン 50μg/ml及びクロラムフェニコール 5μg/mlを含むA寒天培地に塗布した。
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入プラスミドを確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRB-BNCTM及びpCRB-DEの導入が認められた。
得られた株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）VAL2と命名した。【０１２３】
上述のプラスミドpCRB-BNCTM及びpCRB-DLDを用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem.、Vol. 54、443-447(1990) 及びRes. Microbiol.、Vol. 144、181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカムR ldhA mutant [J. Mol. Microbiol. Biotechnol.、Vol. 8、243-254(2004)]株を形質転換し、カナマイシン 50μg/ml及びクロラムフェニコール 5μg/mlを含むA寒天培地に塗布した。
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入プラスミドを確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRB-BNCTM及びpCRB-DLDの導入が認められた。
得られた株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）VAL3と命名した。【０１２４】
上述のプラスミドpCRB-BNGECTM及びpCRB-DLDを用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem.、Vol. 54、443-447(1990) 及びRes. Microbiol.、Vol. 144、181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカムR ldhA mutant [J. Mol. Microbiol. Biotechnol.、Vol. 8、243-254(2004)]株を形質転換し、カナマイシン 50μg/ml及びクロラムフェニコール 5μg/mlを含むA寒天培地に塗布した。
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入プラスミドを確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRB-BNGECTM及びpCRB-DLDの導入が認められた。
得られた株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）VAL4と命名した。【０１２５】
本株の遺伝子組換えの概要を、表２にまとめて示す。
コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）VAL4は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8（郵便番号292-0818）の独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センターに寄託した（受託日：2011年8月11日、受託番号：NITE BP-1122）。
【表２】
0005960701.tif 000021
＊)  表内の表示の略語は以下の通り
＜遺伝子起源略語＞
CG；  コリネバクテリウム グルタミカム由来
LS；  リジニバチルス スファエリカス由来
ΔldhA；乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子破壊
ilvBNC；野生型アセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子、及び野生型アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ遺伝子
ilvBNCTM；野生型アセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子、及び変異アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ遺伝子(S34G, L48E, R49F)
ilvBNGECTM；変異アセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子（G156E）、及び変異アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ遺伝子(S34G, L48E, R49F)
ilvD；野生型ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ遺伝子
ilvE；野生型トランスアミナーゼ遺伝子
leudh；野生型ロイシンデヒドロゲナーゼ遺伝子【０１２６】
実施例３  コリネバクテリウム グルタミカム  バリン生産遺伝子導入株のバリン生成実験
バリン生産遺伝子であるアセトヒドロキシ酸シンターゼをコードするコリネバクテリウム グルタミカムのilvBN遺伝子もしくはバリン高生産性の変異型ilvBNGE遺伝子、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードするコリネバクテリウム グルタミカムのilvC遺伝子もしくはバリン高生産性の変異型ilvCTM遺伝子、ジビドロキシ酸デヒドラターゼをコードするコリネバクテリウム グルタミカムのilvD遺伝子、トランスアミナーゼをコードするコリネバクテリウム グルタミカムのilvE遺伝子もしくはロイシンデヒドロゲナーゼをコードするリジニバチルス スファエリカスのleudh遺伝子を様々な組合せで遺伝子組換えした場合の効果を調べる為に、コリネバクテリウム グルタミカム  R ldhA mutant(L-乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子破壊)株に実施例２で示したように各遺伝子を導入し、バリンの生産比較を行った。【０１２７】
実施例２（表２）に示した各種バリン生産株を、カナマイシン50μg/ml及びクロラムフェニコール5μg/mlを含むA寒天培地[(NH2)2CO  2g、(NH4)2SO4  7g、KH2PO4  0.5 g、K2HPO4  0.5 g、MgSO4.7H2O  0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O  1 ml、0.02% (w/v) biotin solution  1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract  2 g、vitamin assay casamino acid  7 g、glucose 40 g、寒天 15 gを蒸留水1Lに懸濁] に塗布し、28℃、20時間暗所に静置した。【０１２８】
上記のプレートで生育したコリネバクテリウム グルタミカム  バリン生産遺伝子導入株を、各抗生物質を含むA液体培地[(NH2)2CO  2g、(NH4)2SO4  7g、KH2PO4  0.5 g、K2HPO4  0.5 g、MgSO4.7H2O  0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O  1 ml、0.02% (w/v) biotin solution  1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract  2 g、vitamin assay casamino acid  7 g、glucose 40 gを蒸留水1Lに溶解] 10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、28℃にて15時間、好気的に振盪培養を行った。【０１２９】
＜好気培養＞
上記条件で生育したコリネバクテリウム グルタミカム  バリン生成株を、カナマイシン50μg/ml、クロラムフェニコール 5μg/ml及びゼオシン25μg/ml を含有したA液体培地500mlの入った容量2Lの三角フラスコに植菌し、28℃にて15時間、好気的に振盪培養を行った。【０１３０】
＜還元条件でのバリン製造＞
このようにして培養増殖されたそれぞれの菌体は、遠心分離 (4℃、5,000×g, 15分)により菌体を回収した。得られた菌体を、40g cell dry weight l-1となるようにBT(-尿素)液体培地〔0.7% 硫酸アンモニウム、0.05% リン酸二水素カリウム、0.05% リン酸水素二カリウム、0.05% 硫酸マグネシウム・7水和物、0.0006% 硫酸鉄・7水和物、0.00042% 硫酸マンガン水和物、0.00002% ビオチン、0.00002% チアミン塩酸塩〕に懸濁した。このそれぞれの菌体懸濁液60mlを容量100mlメディウム瓶に入れ、還元条件下（酸化還元電位；-450 mV）、グルコースを8%となるように添加し、33℃に保った水浴中で攪拌しながら反応させた。この時、反応液のpHが7.0を下回らないように2.5Nのアンモニア水を用いてpHコントローラー (エイブル株式会社製、型式：DT-1023）でコントロールしながら反応した。
24時間後にサンプリングした反応液を遠心分離 (4℃、15,000×g、10分) し、得られた上清液を用いてバリンの定量を行った。【０１３１】
結果を以下の表３に示す。
バリン生産関連遺伝子発現プラスミドを導入していないコリネバクテリウム グルタミカム  ΔldhA株は5.37 mMのバリンを、VAL1株は53.9 mMのバリンを生成していた。すなわちilvBNCDE遺伝子の高発現によりバリン生成量が約10倍増大した。
VAL1株と比較して、VAL2株は239mMのバリンを生成していた。すなわち野生型ilvC遺伝子から変異型ilvCTM遺伝子に変換し、高発現することにより、バリン生成量がさらに約4.4倍増大した。
VAL2株と比較して、VAL3株は1170mMのバリンを生成していた。すなわち、ilvE遺伝子からleudh遺伝子に変換し、高発現することにより、バリン生成量がさらに約4.9倍増大した
VAL3株と比較して、VAL4株は1470mMのバリン生成していた。すなわち、野生型ilvBN遺伝子から変異型ilvBNGE遺伝子に変換し、高発現することにより、バリン生成量がさらに1.3倍増大した。【０１３２】
【表３】
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＊)  表内の表示の略語は、表２と同じ
【産業上の利用可能性】
【０１３３】
本発明方法によれば、微生物を用いて実用的な効率でバリンを製造することができる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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