(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
食品製品を含む組成物であって、
前記食品製品は、粗カフェインから回収された植物化学物質画分からなり、
前記植物化学物質画分は、カフェインに対するポリフェノールの比が２０、１０〜３０もしくは４０、または１０を超え、
前記植物化学物質画分は、粗カフェインの水懸濁液の濾過プロセスからの保持液であり、
前記粗カフェインは、未焙煎コーヒー豆の超臨界二酸化炭素脱カフェインプロセスからの生成物である、
ことを特徴とする組成物。
【請求項２】
食品製品を生産するプロセスであって、
食品または食品の成分に、請求項１に記載の粗カフェインから回収された植物化学物質画分を補充するステップを含み、それにより前記食品製品が生産される、
ことを特徴とするプロセス。
【請求項３】
医薬品製剤を含む組成物であって、
前記医薬品製剤は、粗カフェインから回収された植物化学物質画分からなり、
前記植物化学物質画分は、カフェインに対するポリフェノールの比が２０、１０〜３０もしくは４０、または１０を超え、
前記植物化学物質画分は、粗カフェインの水懸濁液の濾過プロセスからの保持液であり、
前記粗カフェインは、未焙煎コーヒー豆の超臨界二酸化炭素脱カフェインプロセスからの生成物である、
ことを特徴とする組成物。
【請求項４】
医薬品製剤を生産するプロセスであって、
医薬品または医薬品の成分に、請求項３に記載の粗カフェインから回収された植物化学物質画分を補充するステップを含み、それにより前記医薬品製剤が生産される、
ことを特徴とするプロセス。
【請求項５】
化粧品製品を含む組成物であって、
前記化粧品製品は、粗カフェインから回収された植物化学物質画分からなり、
前記植物化学物質画分は、カフェインに対するポリフェノールの比が２０、１０〜３０もしくは４０、または１０を超え、
前記植物化学物質画分は、粗カフェインの水懸濁液の濾過プロセスからの保持液であり、
前記粗カフェインは、未焙煎コーヒー豆の超臨界二酸化炭素脱カフェインプロセスからの生成物である、
ことを特徴とする組成物。
【請求項６】
化粧品製品を生産するプロセスであって、
化粧品または化粧品の成分に、請求項５に記載の粗カフェインから回収された植物化学物質画分を補充するステップを含み、それにより前記化粧品製品が生産される、
ことを特徴とするプロセス。
【請求項７】
栄養補助食品製品を含む組成物であって、
前記栄養補助食品製品は、粗カフェインから回収された植物化学物質画分からなり、
前記植物化学物質画分は、カフェインに対するポリフェノールの比が２０、１０〜３０もしくは４０、または１０を超え、
前記植物化学物質画分は、粗カフェインの水懸濁液の濾過プロセスからの保持液であり、
前記粗カフェインは、未焙煎コーヒー豆の超臨界二酸化炭素脱カフェインプロセスからの生成物である、
ことを特徴とする組成物。
【請求項８】
栄養補助食品製品を生産するプロセスであって、
栄養補助食品または栄養補助食品の成分に、請求項７に記載の粗カフェインから回収された植物化学物質画分を補充するステップを含み、それにより前記栄養補助食品製品が生産される、
ことを特徴とするプロセス。
【請求項９】
生物学的医薬品製剤を含む組成物であって、
前記生物学的医薬品製剤は、粗カフェインから回収された植物化学物質画分からなり、
前記植物化学物質画分は、カフェインに対するポリフェノールの比が２０、１０〜３０もしくは４０、または１０を超え、
前記植物化学物質画分は、粗カフェインの水懸濁液の濾過プロセスからの保持液であり、
前記粗カフェインは、未焙煎コーヒー豆の超臨界二酸化炭素脱カフェインプロセスからの生成物である、
ことを特徴とする組成物。
【請求項１０】
生物学的医薬品製剤を生産するプロセスであって、
生物学的医薬品または生物学的医薬品の成分に、請求項９に記載の粗カフェインから回収された植物化学物質画分を補充するステップを含み、それにより前記生物学的医薬品が生産される、
ことを特徴とするプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術分野は、食品製品、医薬品製剤、化粧品製品、栄養補助食品製品、および生物学的医薬品製剤の材料としてのコーヒー材料またはコーヒー抽出物、ならびに関連プロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
関連出願
本出願は、２０１０年１０月１３日に出願された米国特許仮出願第６１／３９２，８２８号の利益を主張するものであり、その仮出願を参照により全体として本明細書に組み込む。
【０００３】
粗カフェインは、未焙煎コーヒー豆の脱カフェインの主な副生成物である。脱カフェインコーヒーは、コーヒーの総消費量の約１０％を占める。したがって、何千トンもの粗カフェインが毎年生産される。未焙煎コーヒー豆には、カフェイン以外に、クロロゲン酸を含めて、多種多様な生物活性植物化学物質（非特許文献１）およびコーヒー油（非特許文献２）が含まれている。ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ（植物化学物質）という語の「ｐｈｙｔｏ−」は、植物を意味するギリシャ語ｐｈｙｔｏに由来する。したがって、ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ（植物化学物質）は植物の化学物質（ｐｌａｎｔ  ｃｈｅｍｉｃａｌ）である。非カフェイン植物化学物質の一部は、脱カフェインプロセス中に必然的に除去され、黄緑色の粗カフェインが生じる。
【０００４】
粗カフェインは、飲料、食品、および医薬品（ｍｅｄｉｃｉｎｅ）で使用される純カフェインを製造するための出発材料である。非カフェイン残渣は、廃棄物として通常廃棄される。本発明者らは、コーヒー植物化学物質の健康上の有用性を実証した多くの研究を考慮に入れて（非特許文献３；非特許文献４）、粗カフェインも、これらの非カフェイン成分が存在するため、有用性のある効果を発揮できると仮定した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第３，８７９，５６９号明細書
【特許文献２】英国特許第２，２３５，１２１号明細書
【特許文献３】欧州特許第０４８２６７５号明細書
【特許文献４】欧州特許第０４３９７１０号明細書
【特許文献５】独国特許第３，４４５，５０２号明細書
【特許文献６】米国特許第４，９１１，９４１号明細書
【特許文献７】米国特許第４，８２０，５３７号明細書
【特許文献８】米国特許第５，１５３，０１５号明細書
【特許文献９】国際公開第９２／０３０６１号
【特許文献１０】欧州特許第５４７１１９号明細書
【特許文献１１】国際公開第９４／２６１２５号
【特許文献１２】米国特許第４，４１１，９２３号明細書
【特許文献１３】欧州特許第０１５１２０２号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Michael, N. C., Journal of the Science of Food and Agriculture 1999, 79, 362-372
【非特許文献２】Araujo, J. M. A. and Sandi, D., Food Chemistry 2007, 101, 1087-1094
【非特許文献３】Svilaas, A. et al., Journal of Nutrition 2004, 134, S62-S67
【非特許文献４】Daglia, M. et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry 2000, 48, 1449-1454
【非特許文献５】Hannay, J.B. & Hogarth, J.(1879)Proc. Roy. Soc. London, 29, 324
【非特許文献６】Palmer, M.V. & Ting, S.S.(1995)Food Chem., 52, 345-52
【非特許文献７】Zosel, K.(1965)Chem. Abstr., 63, 110456
【非特許文献８】Lack, E., Seidlitz, H. & Toro, P.(1989)In:Proceedings of the 13th ASIC Colloquium(Paipa)pp. 236-245, ASIC, Paris, France
【非特許文献９】Brunner, G.(1987)In:Proceedings of the 12th ASIC Colloquium(Montreux)pp. 294-305, ASIC, Paris, France
【非特許文献１０】Gabel, P.W., Sarge, S. & Camenga, H.K.(1987)In:Proceedings of the 12th ASIC Colloquium(Montreux)pp. 306-312, ASIC, Paris, France
【非特許文献１１】Quijano-Rico, M.(1987)In:Proceedings of the 12th ASIC Colloquium(Montreux)pp. 187-193, ASIC, Paris, France
【非特許文献１２】Linnig, D.A., Leyers, W.E. & Novak, R.A.(1991)In:Proceedings of the 14th ASIC Colloquium(San Francisco), pp.357-64, ASIC, Paris, France
【非特許文献１３】McCoy, B.J.(1993)In:Proceedings of the 6th International Congress on Engineering and Food, Chiba, Japan, Vol. 2, Blackie, Glasgow
【非特許文献１４】Tokunaga, Y., Fujii, T. & Nakamura, K.(1997)Biosci. Biotech. Biochem., 61, 1024-1026
【非特許文献１５】Chu, Y. F. et al, Journal of Agricultural and Food Chemistry 2009, 57, 9801 -9808
【非特許文献１６】Sim, W. L. S. et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry 2009, 57, 3409-3414
【非特許文献１７】Diabetes Care 2003, 26, s5-20
【非特許文献１８】Altman, R. et al., Arthritis Rheum 1990, 33, 1601-10
【非特許文献１９】Altman, R. et al., Arthritis Rheum 1991, 34, 505-14
【非特許文献２０】Altman, R. et al.. Arthritis Rheum 1986, 29, 1039-49
【非特許文献２１】Hochberg MC et al., Arthritis Rheum 1995, 38, 1541-6
【非特許文献２２】Hochberg MC et al., Arthritis Rheum 1995, 38, 1535-40
【非特許文献２３】ArnettFC et al., Arthritis Rheum 1988, 31, 315- 324.
【非特許文献２４】Arthritis Rheum 2002, 46, 328-346.
【非特許文献２５】Patrignani, P. et al., J Pharmacol Exp Ther 1994, 271, 1705-12
【非特許文献２６】McKhann G. et al., Neurology 1984, 34, 939-44
【非特許文献２７】The Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders: 4th Edition of the American Psychiatric Association (DSM-IV, 1994)
【非特許文献２８】Crook, T.H. et al., Developmental Neuropsychology, 1986, 2, 261-276
【非特許文献２９】Singleton, V. L. and Rossi, J. A., Jr., Am. J. Enol. Vitic., 1965, 16, 144-158
【非特許文献３０】Ou, B. et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry 2001, 49, 4619-4626
【非特許文献３１】Wu, X. et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry 2004, 52, 4026-4037
【非特許文献３２】Huang, D. et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry 2002, 50, 1815-1821
【非特許文献３３】Mosmann, T., Journal of Immunological Methods 1983, 65, 55-63
【非特許文献３４】Cheng, I. H. et al., Nature Medicine 2004, 10, 1190-1192
【非特許文献３５】Sim, W. L. S. et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry 2009, 57, 3409-3414
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、粗カフェインについて、フェノール含有量、親水性および親油性酸素ラジカル吸収能（ＯＲＡＣｈｙｄｒｏおよびＯＲＡＣｌｉｐｏ）、マウス初代神経細胞の過酸化水素誘導細胞死からの保護、培養ヒト骨格筋細胞および脂肪細胞における抗高血糖効果、ならびに強力な炎症メディエーターであるシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）に対する阻害作用を評価した。本発明者らは、粗カフェイン中の生物活性化合物の化学構造を決定するために、抗酸化性化合物の活性を指標とした分画と、続いて液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）多重反応モニタリング（ＭＲＭ）分析とを行った。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第１の実施態様は、食品製品を含む組成物であって、前記食品製品は、粗カフェインから回収された植物化学物質画分からなり、前記植物化学物質画分は、カフェインに対するポリフェノールの比が約２０、１０〜３０もしくは４０、または１０を超える組成物である。
【０００９】
その関連実施態様は、第１の実施態様に記載の組成物であって、前記植物化学物質画分が粗カフェインの水懸濁液の濾過プロセスの保持液であり、前記粗カフェインが未焙煎コーヒー豆の脱カフェインプロセスの生成物である組成物である。
【００１０】
別の関連実施態様は、食品製品を生産するプロセスであって、食品または食品の成分に、第１の実施態様またはその関連実施態様に記載されているものである、粗カフェインから回収された植物化学物質画分を補充するステップを含み、それにより前記食品製品が生産されるプロセスである。
【００１１】
第２の実施態様は、医薬品製剤を含む組成物であって、前記医薬品製剤は、粗カフェインから回収された植物化学物質画分からなり、前記植物化学物質画分は、カフェインに対するポリフェノールの比が約２０、１０〜３０もしくは４０、または１０を超える組成物である。
【００１２】
その関連実施態様は、第２の実施態様に記載の組成物であって、前記植物化学物質画分が、粗カフェインの水懸濁液の濾過プロセスの保持液であり、前記粗カフェインが未焙煎コーヒー豆の脱カフェインプロセスの生成物である組成物である。
【００１３】
別の関連実施態様は、医薬品製剤を生産するプロセスであって、医薬品または医薬品の成分に、第２の実施態様またはその関連実施態様に記載されているものである、粗カフェインから回収された植物化学物質画分を補充するステップを含み、それにより前記医薬品製剤が生産されるプロセスである。
【００１４】
第３の実施態様は、化粧品製品を含む組成物であって、前記化粧品製品は、粗カフェインから回収された植物化学物質画分からなり、前記植物化学物質画分は、カフェインに対するポリフェノールの比が２０、１０〜３０もしくは４０、または１０を超える組成物である。
【００１５】
その関連実施態様は、第３の実施態様に記載の組成物であって、前記植物化学物質画分が、粗カフェインの水懸濁液の濾過プロセスの保持液であり、前記粗カフェインが未焙煎コーヒー豆の脱カフェインプロセスの生成物である組成物である。
【００１６】
別の関連実施態様は、化粧品製品を生産するプロセスであって、化粧品または化粧品の成分に、第３の実施態様またはその関連実施態様に記載されているものである、粗カフェインから回収された植物化学物質画分を補充するステップを含み、それにより前記化粧品製品が生産されるプロセスである。
【００１７】
第４の実施態様は、栄養補助食品製品を含む組成物であって、前記栄養補助食品製品は、粗カフェインから回収された植物化学物質画分からなり、前記植物化学物質画分は、カフェインに対するポリフェノールの比が約２０、１０〜３０もしくは４０、または１０を超える組成物である。
【００１８】
その関連実施態様は、第４の実施態様に記載の組成物であって、前記植物化学物質画分が、粗カフェインの水懸濁液の濾過プロセスの保持液であり、前記粗カフェインが未焙煎コーヒー豆の脱カフェインプロセスの生成物である組成物である。
【００１９】
別の関連実施態様は、栄養補助食品製品を生産するプロセスであって、栄養補助物または栄養補助物の成分に、第４の実施態様またはその関連実施態様に記載されているものである、粗カフェインから回収された植物化学物質画分を補充するステップを含み、それにより前記栄養補助食品製品が生産されるプロセスである。
【００２０】
第５の実施態様は、生物学的医薬品製剤を含む組成物であって、前記生物学的医薬品製剤は、粗カフェインから回収された植物化学物質画分からなり、前記植物化学物質画分は、カフェインに対するポリフェノールの比が約２０、１０〜３０もしくは４０、または１０を超える組成物である。
【００２１】
その関連実施態様は、第５の実施態様に記載の組成物であって、前記植物化学物質画分が、粗カフェインの水懸濁液の濾過プロセスの保持液であり、前記粗カフェインが未焙煎コーヒー豆の脱カフェインプロセスの生成物である組成物である。
【００２２】
別の関連実施態様は、生物学的医薬品製剤を生産するプロセスであって、生物学的医薬品または生物学的医薬品の成分に、第５の実施態様またはその関連実施態様に記載されているものである、粗カフェインから回収された植物化学物質画分を補充するステップを含み、それにより前記生物学的医薬品製剤が生産されるプロセスである。
【００２３】
第６の実施態様は、神経保護を促進するプロセスであって、神経保護を必要とする対象者を特定するステップと、神経保護を促進するのに有効な量の第１の実施態様、第２の実施態様、第３の実施態様、第４の実施態様、もしくは第５の実施態様、またはそれらの関連実施態様のいずれかに記載の組成物を前記対象者に投与するステップとを含むプロセスである。
【００２４】
第６の実施態様に関連した実施態様は、神経保護を促進するプロセスであって、神経保護を促進するのに有効な量の第１の実施態様、第２の実施態様、第３の実施態様、第４の実施態様、もしくは第５の実施態様、またはそれらの関連実施態様のいずれかに記載の組成物を対象者に投与するステップと、前記対象者における神経保護を測定するステップとを含むプロセスである。
【００２５】
第７の実施態様は、ＣＯＸ−２を阻害するプロセスであって、ＣＯＸ−２の阻害を必要とする対象者を特定するステップと、ＣＯＸ−２を阻害するのに有効な量の第１の実施態様、第２の実施態様、第３の実施態様、第４の実施態様、もしくは第５の実施態様、またはそれらの関連実施態様のいずれかに記載の組成物を前記対象者に投与するステップとを含むプロセスである。
【００２６】
第７の実施態様に関連した実施態様は、ＣＯＸ−２を阻害するプロセスであって、ＣＯＸ−２を阻害するのに有効な量の第１の実施態様、第２の実施態様、第３の実施態様、第４の実施態様、もしくは第５の実施態様、またはそれらの関連実施態様のいずれかに記載の組成物を対象者に投与するステップと、前記対象者におけるＣＯＸ−２の阻害を測定するステップとを含むプロセスである。
【００２７】
第８の実施態様は、グルコース取り込みを刺激するプロセスであって、グルコース取り込みの刺激を必要とする対象者を特定するステップと、グルコース取り込みを刺激するのに有効な量の第１の実施態様、第２の実施態様、第３の実施態様、第４の実施態様、もしくは第５の実施態様、またはそれらの関連実施態様のいずれかに記載の組成物を前記対象者に投与するステップとを含むプロセスである。
【００２８】
第８の実施態様に関連した実施態様は、グルコース取り込みを刺激するプロセスであって、グルコース取り込みを刺激するのに有効な量の第１の実施態様、第２の実施態様、第３の実施態様、第４の実施態様、もしくは第５の実施態様、またはそれらの関連実施態様のいずれかに記載の組成物を対象者に投与するステップと、前記対象者におけるグルコース取り込みの刺激を測定するステップとを含むプロセスである。
【００２９】
第９の実施態様は、認知症または年齢に関連した認知機能低下を治療するプロセスであって、認知症または年齢に関連した認知機能低下の治療を必要とする対象者を特定するステップと、認知症または年齢に関連した認知機能低下を治療するのに有効な量の第１の実施態様、第２の実施態様、第３の実施態様、第４の実施態様、もしくは第５の実施態様、またはそれらの関連実施態様のいずれかに記載の組成物を前記対象者に投与するステップとを含むプロセスである。
【００３０】
第９の実施態様に関連した実施態様は、認知症または年齢に関連した認知機能低下を治療するプロセスであって、認知症または年齢に関連した認知機能低下を治療するのに有効な量の第１の実施態様、第２の実施態様、第３の実施態様、第４の実施態様、もしくは第５の実施態様、またはそれらの関連実施態様のいずれかに記載の組成物を対象者に投与するステップと、前記対象者における認知症または年齢に関連した認知機能低下の治療を測定するステップとを含むプロセスである。
【００３１】
第１０の実施態様は、炎症を抑制するプロセスであって、炎症の抑制を必要とする対象者を特定するステップと、炎症を抑制するのに有効な量の第１の実施態様、第２の実施態様、第３の実施態様、第４の実施態様、もしくは第５の実施態様、またはそれらの関連実施態様のいずれかに記載の組成物を前記対象者に投与するステップとを含むプロセスである。
【００３２】
第１０の実施態様に関連した実施態様は、炎症を抑制するプロセスであって、炎症を抑制するのに有効な量の第１の実施態様、第２の実施態様、第３の実施態様、第４の実施態様、もしくは第５の実施態様、またはそれらの関連実施態様のいずれかに記載の組成物を対象者に投与するステップと、前記対象者における炎症の抑制を測定するステップとを含むプロセスである。
【００３３】
第１１の実施態様は、糖尿病を治療するプロセスであって、糖尿病の治療を必要とする対象者を特定するステップと、糖尿病を治療するのに有効な量の第１の実施態様、第２の実施態様、第３の実施態様、第４の実施態様、もしくは第５の実施態様、またはそれらの関連実施態様のいずれかに記載の組成物を前記対象者に投与するステップとを含むプロセスである。
【００３４】
第１１の実施態様に関連した実施態様は、糖尿病を治療するプロセスであって、糖尿病を治療するのに有効な量の第１の実施態様、第２の実施態様、第３の実施態様、第４の実施態様、もしくは第５の実施態様、またはそれらの関連実施態様のいずれかに記載の組成物を対象者に投与するステップと、前記対象者における糖尿病の治療を測定するステップとを含むプロセスである。
【００３５】
第１２の実施態様は、第６の実施態様もしくは第９の実施態様、またはそれらの関連実施態様のどちらかに記載のプロセスであって、特定するステップまたは測定するステップが、神経心理学的検査によって行われるプロセスである。
【００３６】
第１３の実施態様は、第７の実施態様もしくは第１０の実施態様、またはそれらの関連実施態様のどちらかに記載のプロセスであって、特定するステップまたは測定するステップが、リウマチ学の基準で行われるプロセスである。
【００３７】
第１４の実施態様は、第８の実施態様もしくは第１１の実施態様、またはそれらの関連実施態様のどちらかに記載のプロセスであって、特定するステップまたは測定するステップが、血中グルコース濃度で行われるプロセスである。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】カフェインを低減し、ポリフェノールを濃縮し、食品製品を最終生成物とするように、粗カフェインをさらに加工する流れ図である。
【図２】カフェインを低減し、ポリフェノールを濃縮し、医薬品製剤を最終生成物とするように、粗カフェインをさらに加工する流れ図である。
【図３】カフェインを低減し、ポリフェノールを濃縮し、化粧品製品を最終生成物とするように、粗カフェインをさらに加工する流れ図である。
【図４】カフェインを低減し、ポリフェノールを濃縮し、栄養補助食品製品を最終生成物とするように、粗カフェインをさらに加工する流れ図である。
【図５】カフェインを低減し、ポリフェノールを濃縮し、生物学的医薬品製剤を最終生成物とするように、粗カフェインをさらに加工する流れ図である。
【図６】コーヒー生産中に得られた粗カフェインの生物活性化合物を示す図である。
【図７】コーヒーからのカフェインの超臨界ＣＯ２抽出を示す図である。
【図８】過酸化水素で処置されたマウス初代神経細胞への効果を示す図であり、Ａは純カフェインを用いた場合、Ｂは粗カフェインを用いた場合である。
【図９】ヒト骨格筋細胞および脂肪細胞におけるグルコース取り込みのインスリン、粗カフェイン、および純カフェインによる刺激を示す図である。
【図１０】ＣＯＸ−２のアスピリン、レギュラーコーヒー、純カフェイン、および粗カフェインによる阻害を示す図である。
【図１１】非水溶性粒子の粗カフェインからの単離を示す図である。
【図１２】非水溶性粒子がマウス初代神経細胞を過酸化水素誘導細胞死から保護することを示す図である。
【図１３−１】多重反応モニタリング技法で非水溶性粒子の化学物質の液体クロマトグラフィー−質量分析同定を示す図であり、Ａはカフェー酸；Ｂはクマル酸を用いた場合である。
【図１３−２】多重反応モニタリング技法で非水溶性粒子の化学物質の液体クロマトグラフィー−質量分析同定を示す図であり、Ｃはバニリン酸；Ｄはクェルセチンを用いた場合である。
【図１３−３】多重反応モニタリング技法で非水溶性粒子の化学物質の液体クロマトグラフィー−質量分析同定を示す図であり、Ｅはカテキン；Ｆはアブシシン酸グルコースエステルを用いた場合である。
【図１３−４】多重反応モニタリング技法で非水溶性粒子の化学物質の液体クロマトグラフィー−質量分析同定を示す図であり、Ｇはトレオニンを用いた場合である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
コーヒーの脱カフェイン中に、何千トンもの粗カフェインが毎年得られ、植物化学物質がカフェインとともに除去される。本発明者らは、超臨界二酸化炭素（ｓｃＣＯ２）脱カフェインによって生産された粗カフェインの以下の特性を決定した：フェノール含有量、親水性および親油性酸素ラジカル吸収能（ＯＲＡＣｈｙｄｒｏおよびＯＲＡＣｌｉｐｏ）、神経細胞の過酸化水素誘導細胞死からの保護、ならびにグルコース取り込みを刺激する能力およびシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）を阻害する能力。粗カフェインは１０ｍｇのＣＥ／フェノール類１ｇを含有し、ＯＲＡＣｈｙｄｒｏが１４５μｍｏｌ  ＴＥ／ｇでありＯＲＡＣｌｉｐｏが６６μｍｏｌ  ＴＥ／ｇであったが、過酸化水素で処置された初代神経細胞の生存を増加させなかった。粗カフェインによって、グルコース取り込みが培養ヒト骨格筋細胞においては１．４５倍、培養ヒト脂肪細胞においては２．２０倍増加した。さらに、粗カフェインはアスピリンより高いＣＯＸ−２阻害効果を発揮した（粗カフェイン：ＩＣ５０＝２０μｇ／ｍＬ、アスピリン：ＩＣ５０＝１９０μｇ／ｍＬ）。純カフェインは、グルコース取り込みの刺激もＣＯＸ−２の阻害も示さなかった。本発明者らは、抗酸化剤を粗カフェインから非水溶性粒子（ＷＩＰ）として単離する濃縮方法を考案し、これによって、初代神経細胞が過酸化水素誘導細胞死から用量依存的に保護された。ＷＩＰのＯＲＡＣを指標とした分画とＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を組み合わせて、７つの生物活性成分を同定した：カフェー酸、クマル酸、バニリン酸、クェルセチン、カテキン、アブシシン酸グルコースエステル、およびトレオニン。本発明者らは、ＷＩＰとα−トコフェロールを組み合わせると、相乗効果が得られることを発見した。
【００４０】
定義
別段の定義のない限り、本明細書で使用される用語は、本発明が属する技術分野の技術者が通常理解するのと同じ意味を有する。
【００４１】
「食品」という用語は、米国連邦食品医薬品化粧品法（Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｆｏｏｄ，  Ｄｒｕｇ，  ａｎｄ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ（ＦＤ＆Ｃ）Ａｃｔ）に記載されているように、（１）人または他の動物用の食品または飲み物に使用される物品、（２）チューインガム、および（３）任意のこのような物品の成分に使用される物品を意味する。
【００４２】
「医薬品」という用語は、米国連邦食品医薬品化粧品法に記載されているように、公式の米国薬局方、公式の米国ホメオパシー薬局方、または公式の国民医薬品集、またはそれらのうちのいずれかの任意の補遺で認められている物品、人または他の動物における疾患の診断、治癒、緩和、治療、または予防で使用するための物品、人または他の動物の体の構造または任意の機能に影響を及ぼすよう意図されている（食品を除く）物品、およびまさに指定された任意の物品の成分として使用するための物品を意味する。
【００４３】
「化粧料」という用語は、米国連邦食品医薬品化粧品法に記載されているように、清浄、美化、魅力の促進、または外見の変更のために人体またはその任意の部分に擦り込む、注ぐ、振りかける、もしくは噴霧する、差し込む、またはその他の方法で塗布するよう意図されている物品、および任意のこのような物品の成分として使用するための物品を意味する。
【００４４】
「栄養補助食品」という用語は、米国連邦食品医薬品化粧品法に記載されているように、以下の栄養補助食品成分（ｄｉｅｔａｒｙ  ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）の１つまたは複数を有するまたは含む、食事に補充するよう意図されている生成物を意味する：ビタミン、ミネラル、ハーブまたは他の植物、アミノ酸、総食事摂取量を増加させることにより食事に補充するために人間が使用する栄養補助食品物質（ｄｉｅｔａｒｙ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）、またはまさに記載された任意の成分の濃縮物、代謝物、構成物、抽出物、もしくは組合せ。
【００４５】
「生物学的医薬品」という用語は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって定義されているように、生物学的製造プロセスにより識別される医薬品の小集団を意味する。
【００４６】
これらの定義は、原薬を医薬品製剤と区別するのに役立つ。医薬品製剤は、完成した形、例えば原薬を含有する経口固体剤形の医薬品製剤である。疾患の診断、治癒、緩和、治療、または予防における医薬品の能力の証拠を得るための有効性の研究が行われる。診断、治癒、緩和、治療、または予防は、１００％の有効性を表さない。むしろ、診断、治癒、緩和、治療、または予防は、１％と１００％との間のどこかであるレベルの有効性を表す。
【００４７】
食品は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって定義されているように、以下の一般食品というカテゴリーを包含する：焼いた製品およびベーキング用ミックス（すべてのそのまま食べられる製品および食べる前に焼くだけでよい製品、小麦粉、ならびに給仕する前に調製が必要なミックスを含む）；アルコール性飲料（麦芽飲料、ワイン、蒸留酒、およびカクテルミックスを含む）；非アルコール性飲料および飲料ベース（スペシャルティーまたはスパイスティー、清涼飲料、コーヒー代用品、ならびに果実および野菜フレーバー付きゼラチン飲料のみを含む）；朝食用シリアル（そのまま食べられるシリアル、ならびにインスタントおよびレギュラーのホットシリアルを含む）；チーズ（カッテージチーズおよびホエイチーズ、クリームチーズ、ナチュラルチーズ、おろし用チーズ、プロセスチーズ、スプレッドチーズ、ディップチーズ、ならびに多種多様のチーズを含む）；チューインガム（すべての形態を含む）；コーヒーおよび茶（レギュラー、脱カフェイン、およびインスタントタイプを含む）；調味料および薬味（プレーンな味付けソースおよびスプレッド、オリーブ、ピクルス、ならびに薬味を含むが、スパイスもハーブも含まない）；糖菓および糖衣（キャンディおよびフレーバー付き糖衣、マシュマロ、ベーキング用チョコレート、ならびに赤砂糖、角砂糖、氷砂糖、カエデ糖、粉糖、および粗糖を含む）；乳製品類似物（非乳製品ミルク、冷凍または液体クリーマー、コーヒーホワイトナー、トッピングをはじめとする非乳製品を含む）；卵製品（液状卵、冷凍卵、または乾燥卵、およびそれらから作られた卵料理、すなわち春巻、エッグフーヤン、卵サラダ、および複数コースの冷凍卵料理を含むが、新鮮な卵を含まない）；油脂（マーガリン、サラダ用ドレッシング、バター、サラダ油、ショートニング、および料理用油を含む）；魚肉製品（魚肉、貝類をはじめとする水生動物を含むすべての調理済みメインディッシュ、サラダ、前菜、複数コースの冷凍料理、およびスプレッドを含むが、鮮魚を含まない）；新鮮な卵（新鮮殻付き卵のみから作られた加熱調理した卵および卵料理を含む）；鮮魚（新鮮で冷凍された魚、貝をはじめとする水生動物のみを含む）；新鮮な果実および果汁（生の果実、かんきつ類、メロン、およびベリーのみ、ならびにそれらから作られた自家製「エード」およびポンチを含む）；新鮮な肉（新鮮なまたは自家冷凍した牛肉または子牛肉、豚肉、子羊肉または羊肉のみ、およびそれらから作られた新鮮な肉を含む自家製料理、サラダ、前菜、またはサンドイッチ用スプレッドを含む）；新鮮な家禽肉（新鮮なまたは自家冷凍した家禽肉および狩猟鳥肉のみ、ならびにそれらから作られた新鮮な家禽肉を含む自家製料理、サラダ、前菜、またはサンドイッチ用スプレッドを含む）；新鮮な野菜、トマト、およびジャガイモ（新鮮な自家製野菜のみを含む）；冷凍乳製品デザートおよびミックス（アイスクリーム、アイスミルク、シャーベットをはじめとする冷凍乳製品デザートおよび特製品を含む）；果実アイスおよびアイスケーキ（すべての冷凍果実アイスおよびアイスケーキを含む）；ゼラチン、プディング、およびフィリング（フレーバー付きゼラチンデザート、プディング、カスタード、パフェ、パイフィリング、およびゼラチンベースのサラダを含む）；穀物製品およびパスタ（肉も野菜も含まない、マカロニおよびヌードル製品、米料理、ならびに複数コースの冷凍料理を含む）；肉汁およびソース（すべてのミートソースおよび肉汁、ならびにトマトソース、ミルクソース、バターソース、および特製ソースを含む）；ハードキャンディおよび咳止めドロップ（すべてのハードタイプのキャンディを含む）；ハーブ、種子、スパイス、調味料、ブレンド物、抽出物、および着香料（すべての天然および人工のスパイス、ブレンド物、ならびにフレーバーを含む）；自家製ジャムおよびゼリー（自家製ジャム、ゼリー、フルーツバター、プリザーブ、およびスイーツスプレッドのみを含む）；市販のジャムおよびゼリー（商業的に加工されたジャム、ゼリー、フルーツバター、プリザーブ、およびスイーツスプレッドのみを含む）；肉製品（すべての肉、ならびに商業的加工によって調理された、または商業的に加工された肉を使用して、家庭で調理された、肉を含む料理、サラダ、前菜、複数コースの冷凍肉料理、およびサンドイッチの材料を含む）；全乳および脱脂乳（全乳、低脂肪乳、および脱脂液乳のみを含む）；乳製品（フレーバー付き乳および乳飲料、粉乳、トッピング、スナック菓子用ディップ、スプレッド、減量用乳飲料をはじめとする乳由来製品を含む）；ナッツおよびナッツ製品（殻付きのまたは殻をむいた木の実、ピーナッツ、ココナッツ、ならびにナッツおよびピーナッツスプレッドを含む）；植物タンパク質製品（米国科学アカデミー／研究評議会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ）「再構成植物タンパク質」カテゴリー、ならびに植物タンパク質から作られた肉、家禽肉、魚の代用品、類似品、および増量剤製品を含む）；家禽肉製品（すべての家禽肉、ならびに商業的加工によって調理された、または商業的に加工された家禽肉を使用して、家庭で調理された、家禽肉を含む料理、サラダ、前菜、複数コースの冷凍家禽肉料理、およびサンドイッチ材料を含む）；加工された果実および果汁（すべての商業的に加工された果実、かんきつ類、ベリー、および混合物、それらから作られたサラダ、ジュース、ジュースポンチ、濃縮物、希釈物「エード類」、飲料の代用品を含む）；加工された野菜および野菜ジュース（すべての商業的に加工された野菜、野菜料理、複数コースの冷凍野菜食、ならびに野菜ジュースおよびブレンドを含む）；スナック菓子食品（ポテトチップ、プレッツェルをはじめとする新規スナック菓子を含む）；ソフトキャンディ（キャンディバー、チョコレート、ファッジ、ミントをはじめとするチューイングキャンディまたはヌガーキャンディを含む）；自家製スープ（肉、魚、家禽肉、野菜、および自家製コンビネーションスープを含む）；スープおよびスープミックス（商業的に調理された肉、魚、家禽肉、野菜、ならびにコンビネーションスープおよびスープミックスを含む）；白色グラニュー糖（白色グラニュー糖のみを含む）；砂糖代用品（顆粒状、液状、および錠剤状の砂糖用品を含む）；ならびに甘口ソース、トッピング、シロップ（チ��コレート、ベリー、果実、コーンシロップ、ならびにメープル甘口ソースおよびトッピングを含む）。
未焙煎コーヒー豆の脱カフェイン
カフェインは、コーヒー中の生理活性成分であり、集中的に研究されてきた。カフェインは、Ｒｕｎｇｅによって１８２０年に発見された。このプリンの化学名は、１，３，７−トリメチルキサンチン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｘａｎｔｈｉｎｅ）である。これは、融点２３６℃の針状結晶であるとされる。コーヒー豆には、種および起源に応じて０．８と２．８％の間のカフェインが含まれている。
【００４８】
カフェインを最小限に抑えながら、コーヒー飲料の望ましい属性を維持するために、本当に多くの脱カフェインプロセスが開発されてきた。フレーバーと芳香の損失を最小限に抑えるために、コーヒーの商業的脱カフェインは、現在のところ焙煎前の未焙煎コーヒー豆に対して実施されている。様々な脱カフェイン手順は、３つのグループに大別することができる：溶媒脱カフェイン、水脱カフェイン、および超臨界ＣＯ２脱カフェイン。
【００４９】
「脱カフェインコーヒー」は、ＥＵ諸国では、最大カフェイン濃度が、乾燥質量で０．１％であることを意味する。米国では、豆中に最初に含まれていた量の３％未満であることを意味する。
【００５０】
すべての脱カフェインプロセスは、主に５つのステップを必要とする：カフェイン−クロロゲン酸カリウム複合体を可溶化し、カフェインを抽出に利用できるものにするために、生豆を水で膨潤させるステップ；カフェインを豆から溶媒で抽出するステップ；水蒸気蒸留して、すべての溶媒残渣を豆から除去するステップ（適用される場合）；吸着剤を再生するステップ（適用される場合）；および脱カフェインコーヒー豆をその最初の水分含有量になるまで乾燥するステップ。
【００５１】
超臨界ＣＯ２脱カフェイン
超臨界流体抽出法の概念は、１８７９年に初めて認識された。非特許文献５は、固体化合物が超臨界流体に溶解できることを報告するものであった。超臨界流体技術の食品加工への応用例ではほとんどすべて、ＣＯ２を溶媒として使用する。濃密ＣＯ２は、食品加工において重要な広範囲の化合物にとって強力な溶媒であるだけでなく、比較的不活性で、安価で、無毒性で、リサイクル可能で、不燃性で、高純度のものが容易に入手可能であり、残渣を残さない。臨界点は３１．１℃および７．５８ＭＰａ（７５．８バール）であるので、近臨界および超臨界ＣＯ２を様々な温度および圧力で使用することができ、比較的安全で、使いやすく、特に熱に不安定な化合物の抽出に適している（非特許文献６）。化合物の超臨界流体に対する溶解性は、溶媒の密度、および溶質の溶媒に対する物理化学的親和性に依存している。溶解した化合物は、密度を下げるために単に圧力を下げるまたは温度を上げるだけで、あるいは化合物を適切な吸着剤に吸着させることによって回収することができる。しかし、この技術の不利な点として、高圧操作のため初期投資および維持費が高いことを認めなければならない。コストは、商業化において最も重要な問題である。
【００５２】
圧縮ＣＯ２を脱カフェインに使用する応用は、１９６０年代中頃に初めて記載された（非特許文献７）。このプロセス条件は、７０〜９０℃および１６０〜２２０バールである。利用可能な３つの方法が示唆された：（１）湿潤させた未焙煎豆を、圧力容器中でＣＯ２の気流と混合する。カフェインは豆からＣＯ２中に拡散し、洗浄塔へと運ばれる。そこで、カフェインは水に吸収される。１０時間リサイクルした後、ほとんどすべてのカフェインは洗浄水に溶解し、その洗浄水から、カフェインを蒸留により分離することができる。（２）第１の提案で概要を記した抽出条件を使用して、ＣＯ２流体が活性炭床を通って、カフェインが吸着されることによって、カフェインをＣＯ２流体から除去する。（３）未焙煎コーヒー豆と活性炭ペレットの混合物を圧力容器に導入し、ＣＯ２を９０℃および２２０バールにする。５時間で、カフェインは、豆からＣＯ２を通して直接活性炭上に拡散する。抽出した後、コーヒー豆を、振動ふるいにより活性炭ペレットから分離する。
【００５３】
これらの３つの方法を基に、経済性または品質の点からプロセス改良を含む本当に多くの進展があった。
【００５４】
Ｚｏｓｅｌの第２のプロセスに基づいて、湿潤させた未焙煎コーヒー豆のＣＯ２脱カフェインを、１９７９年以降ＨＡＧ  Ｃｏｍｐａｎｙがドイツで商業的に使用していることが報告され、湿潤超臨界ＣＯ２で、カフェインの定量的抽出が実現している（特許文献１）。
【００５５】
Ｚｏｓｅｌの第１のプロセスの１変形例が「Ｓｃｈｏｅｌｌｅｒ−Ｂｌｅｃｋｍａｎｎ  Ｐｌａｎｔ」で実証されることが報告されている（非特許文献８）。水蒸気、水、またはその２つの組合せと接触させることによって、４０％と４５％の間の最適含水量まで湿潤させる。高圧抽出塔を設けたプラントが設計されている。ＣＯ２を含む溶解しているカフェインは吸着塔に流れ込み、向流の新鮮な水で脱カフェインされる。脱カフェイン率が（米国のように）９７％を超える必要がある場合、洗浄塔の後に、そのガス流を活性炭吸着塔に通さなければならない。連続した抽出装置のカスケードを適用すると、洗浄水中のカフェイン濃度が十分一定であることが保証される。
【００５６】
また、特許文献２に、湿潤させていない未焙煎コーヒー豆を、高圧反応器中、過飽和（１〜２重量％Ｈ２Ｏ）超臨界ＣＯ２で湿らせるプロセスが記載されている。脱カフェインは、反応器の全体にわたって、脱カフェインプロセスに最適であると言われる豆の水分約３５％で層ごとに行われる。カフェインスクラバーから生ずる水は過飽和とみなされ、コーヒー油およびコーヒーフレーバーを含有する。この水は、ＣＯ２の流れに対して向流の水を用いた、豆の第２の抽出ステップにも場合によっては使用される。
【００５７】
特許文献３には、湿潤させた豆を、３台以上の抽出装置のうちの１台中で、ＣＯ２雰囲気下に２５０バールおよび６０℃で数分から数時間まで保持する「間欠圧力システム」が公開されている。次いで、圧力を急速に解放し、それによって、水−カフェイン溶液の細胞から豆表面への駆出が行われる。反応器を２５０バール／６０℃に再加圧した後、ＣＯ２がコーヒー床を循環し、脱カフェインが完了する。カフェインは、洗浄塔中の水に吸収され、水分蒸発により分離する。この湿った豆を、最後に遠心機中で処理して、残留するカフェイン溶液を低減し、豆を予備乾燥する。
【００５８】
このシステムは、特許文献４に従って改良されたものである。超臨界ＣＯ２の代わりに、ＣＯ２で飽和されたカフェイン不含未焙煎コーヒー抽出物を、３００バールまでの圧力および１１０℃までの温度における１時間から数時間までの脱カフェインに使用する。圧力を迅速に解放した後、その液体で豆を２時間まで洗浄する。次いで、ＣＯ２で飽和されたカフェイン含有未焙煎コーヒー抽出物を、洗浄塔中にて超臨界ＣＯ２で脱カフェインする。水吸収塔中で、ＣＯ２からカフェインを分離する。
【００５９】
脱カフェインの溶媒として、ＣＯ２の代わりに超臨界亜酸化窒素を使用した実験も公表されている（非特許文献９）。亜酸化窒素は、同じ温度および圧力条件では密度がＣＯ２より高く、臨界温度が比較的低い（３６．５℃）ため、溶媒力がＣＯ２より高い。亜酸化窒素は、取扱いが不適切な場合には制御不能に分解する恐れがある。しかるに、脱カフェインに適した温度範囲では、発火源を避ければ、亜酸化窒素を安全に取り扱うことができる。
【００６０】
比表面積に依存する吸着能に関して、活性炭から得られた定量的データが報告されている（非特許文献１０）。「カフェイン比表面積」の算出および吸着熱の実験解析（カフェインの大きさが増加するにつれて、すなわち表面被覆率が増加するにつれて低下する）により、吸着能を予測することができる。
【００６１】
コーヒー生産国における適用については、非特許文献１１によって、新鮮な未焙煎コーヒー豆の脱カフェインが、各国に適合した現代技術として提案された。収穫、湿式調製、およびパーチメントの除去を行った後、未焙煎の豆を脱カフェインすることができる。通常の湿潤化ステップと乾燥ステップを回避すると、操業費の低減およびカップクオリティの改善がもたらされる。脱カフェイン自体は、超臨界ＣＯ２を用いて、昇温抽出（６０℃から８５℃まで連続的に上げ、したがって「熱応力」が低下する）で実現することができる（特許文献５）。
【００６２】
第１の半連続操作プロセスは、特許文献６で提案された。実質的にカフェインを含まない超臨界ＣＯ２を、未焙煎コーヒーが入っている垂直円柱状の抽出容器の一端に連続的に供給し、カフェインを含んだＣＯ２を他端から連続的に取り出す。湿らせたコーヒー豆を、加圧下（３００バール）で大きいボール弁およびロックホッパー装置により抽出容器に加える（特許文献７）。ボール弁を１つずつ開けることによって、容器の底部にある脱カフェインされた豆を、底部のロックホッパーに放出する。次いで、弁を閉じ、抽出を続ける。向流の水洗塔中で、カフェインが水相に分配されるのに好ましい分配係数をここで利用して、ＣＯ２流からカフェインを洗い落とす。吸収装置のカフェインを豊富に含んだ水を逆浸透により濃縮すると、純度９７％以上のカフェインが得られ、浸透液は、酸性の非カフェイン固形物を含み、固形物は、収率を改善し、抽出率を増加させるためのプロセスに加えられる。
【００６３】
改良されたＣＯ２脱カフェインプロセス設計は、特殊な超臨界ＣＯ２抽出プロセスを使用する商業規模のコーヒー脱カフェインのパイロットプラントのデータに基づくものである（非特許文献１２）。その設計は、高圧抽出容器設計であり、いくつかの塔を、ＣＯ２が１４〜３５ＭＰａおよび７０〜１３０℃で６〜１２時間、向流に連続的に通る。次いで、カフェインを含んだリッチなＣＯ２流体を、より低い温度（１５〜５０℃）および圧力（５〜１０ＭＰＡ）で水洗する。粗カフェインを含有する水溶液流が、別のプロセス（カフェイン回収および精製）用に販売されている。
【００６４】
ある種の物質を天然物から（例えば、カフェインを茶またはコーヒーから）超臨界ＣＯ２により抽出する特殊な装置が、特許文献８によって提案された。その設計は、円柱状水切りかごを同心状に備えた円柱状高圧容器を含み、水切りかごには、天然物および吸着剤が入っており、流体が外側の円柱状領域から内側の円柱状領域に流れる。圧力低下、および目詰まりの危険性が低減され、半径方向に増加する速度によって、吸着装置中の物質移動が改善され、装置はかなり小型である。
【００６５】
酸水溶液で前処理した後、脱カフェインされた未焙煎コーヒー豆を生成する方法が、特許文献９、特許文献１０によって記載されている。好ましくは１．５〜２％クエン酸を用いた酸性化によって、超臨界脱カフェイン時に起こるわずかな酸性度損失が相殺され、したがってコーヒー飲料のフレーバーと芳香が改善される。酸性化処理は、脱カフェインする前に、湿潤化ステップと組み合わせて実行することができる。
【００６６】
コーヒー豆の脱カフェインは、ＣＯ２を用いた超臨界流体抽出法の適用の一例と考えられた（非特許文献１３）。脱カフェインをＣＯ２流速、温度、および圧力の関数として測定した。脱カフェイン率は、温度と圧力の両方と共に増加する。数理モデルは、外部および粒子内拡散抵抗、ならびにカフェインの水とＣＯ２への分配を表している。水と超臨界ＣＯ２に分配されたカフェインの分配係数は、温度および圧力に依存する。脱カフェインより前に、生豆を水に浸漬すると、脱カフェイン率が向上する。
【００６７】
特許文献１１には、高圧容器中の湿潤させた未焙煎コーヒー層の上に液状水流を加える点以外は通常の条件下における超臨界ＣＯ２に基づいた新規脱カフェインシステムが公開されている。水の使用量は、未焙煎コーヒー（乾物量）１ｋｇ当たり１〜４ｋｇである。水飽和ＣＯ２雰囲気中で連続流動として適用される場合、カフェインの豆表面から流体への物質移動が改善され、脱カフェイン時間が約５０％減少する。約９分のパルス状として、１時間当たり１〜４パルスで適用される場合、高い百分率のクロロゲン酸（望ましくないものとみなされる）が除去され、ＣＯ２洗浄塔中で水に吸収され得る。
【００６８】
特許文献１２には、超臨界ＣＯ２流からカフェインを吸着するために、活性炭に代えて、イオン交換体を使用することが提案されている。強酸性陽イオン交換体は、活性炭よりかなり選択性が高いこと、塩水溶液または鉱酸で再生できること、耐圧性であることが明らかになった。カフェインを回収するには、再生水溶液を、カフェインが晶出するまで濃縮するか、または例えば塩化メチレンを用いた液液抽出にかける。
【００６９】
非特許文献１４には、活性炭に代えて、ゼオライト膜を用いて、カフェインを超臨界流体から分離する実験室試験が公開されている。ゼオライトを、管型アルミナ膜の表面に水熱合成によって薄層として被覆した。システムは、耐熱性および耐圧性が高く、カフェイン分離性能が良好であることがわかった。カフェイン回収率は報告されていなかった。
【００７０】
超臨界ＣＯ２脱カフェインプロセスの焙煎されたコーヒー（または茶葉）への適用が、特許文献１３によって記載されている。第１のステップにおいて、芳香成分を乾燥超臨界ＣＯ２によって抽出し、第２のステップにおいて、湿った焙煎コーヒーを、通常の条件下でＣＯ２を用いて脱カフェインする。その後、水溶性成分を脱カフェイン焙煎コーヒーから抽出する。コーヒー抽出物と芳香を含む超臨界乾燥ＣＯ２とを混合すると、そのうちの芳香成分が、除圧後に凝縮して、液体になる。次いで、抽出物を凍結乾燥することができる。
【００７１】
植物化学物質またはポリフェノール濃縮抽出物（または画分）
一実施態様において、図１から５を参照して、未焙煎コーヒーを、超臨界二酸化炭素脱カフェインによって抽出すると、粗カフェインが生成する。粗カフェインまたはその真空乾燥生成物を水に再懸濁させたものは、粗カフェインの水懸濁液の濾過プロセスの保持液を植物化学物質またはポリフェノール濃縮抽出物（または画分）として回収することによって、カフェインを低減し、ポリフェノールを濃縮するようにさらに加工される。食品（図１）、医薬品（図２）、化粧品（図３）、栄養補助食品（図４）、もしくは生物学的医薬品（図５）、または食品（図１）、医薬品（図２）、化粧品（図３）、栄養補助食品（図４）、もしくは生物学的医薬品（図５）の成分に、植物化学物質もしくはポリフェノール濃縮抽出物（または画分）を補充して、食品製品（図１）、医薬品製剤（図２）、化粧品製品（図３）、栄養補助食品製品（図４）、または生物学的医薬品製剤（図５）を生産する。図１から５において、植物化学物質もしくはポリフェノール濃縮抽出物（または画分）は、活性成分、あるいは添加剤または賦形剤または不活性（非治療的）材料として機能する。後者の例として、植物化学物質もしくはポリフェノール濃縮抽出物（または画分）は、食品製品（図１）、医薬品製剤（図２）、化粧品製品（図３）、栄養補助食品製品（図４）、または生物学的医薬品製剤（図５）の安定性または貯蔵寿命を改善するように抗酸化剤として機能する。前者の例として、植物化学物質もしくはポリフェノール濃縮抽出物（または画分）は、グルコース取り込みを刺激し、ＣＯＸ−２を阻害し、または神経保護薬として作用し、あるいは、さらに組織または皮膚にダメージを与える酸素ラジカルから保護するように製品の活性成分として機能する。
【００７２】
本発明者らは、抗酸化剤を粗カフェインから単離する濃縮方法を考案した。一実施態様において、粗カフェインは、超臨界二酸化炭素（ｓｃＣＯ２）脱カフェインプロセスの副生成物である。一実施例では、水分含有量が５０％になるまで未焙煎コーヒー豆を水に浸漬する。カフェインは、抽出装置で高温（９０〜１００℃）および高圧（３００気圧）において液体炭酸により除去される。液体炭酸を、抽出装置とカフェインが水と共に液体炭酸から除去されるスクラバーとの間で再循環させる。次いで、得られたカフェインリッチの水溶液を逆浸透で濃縮し、真空乾燥する。
【００７３】
一実施態様において、粗カフェインの近似組成が得られる。一実施例では、主要な成分は、カフェイン（９５．９５％）、水分（１．１０％）、および脂肪（１．０４％）であることがわかる。灰分、繊維、タンパク質、および糖の量はごくわずかである。
【００７４】
フェノール化合物は、未焙煎コーヒーの質量の約１０％に寄与する（非特許文献１５）。一実施態様において、粗カフェイン中のフェノール類の有無は、一例としてＦｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕアッセイを使用して決定される。一実施例では、全フェノール類のレベルは、１０ｍｇＣＥ／ｇ、または粗カフェインの約１質量％であることがわかる。
【００７５】
一実施態様において、粗カフェインの親水性および親油性画分の抗酸化活性が査定される。一実施例では、ＯＲＡＣｈｙｄｒｏは１４５μｍｏｌ  ＴＥ／ｇであることがわかり、ＯＲＡＣｌｉｐｏは６６μｍｏｌ  ＴＥ／ｇであることがわかる一方、純カフェインは、かなり低いＯＲＡＣｈｙｄｒｏ（６μｍｏｌ  ＴＥ／ｇ）およびＯＲＡＣｌｉｐｏ（０μｍｏｌ  ＴＥ／ｇ）と関連付けられることがわかる。
【００７６】
一実施態様において、粗カフェインのインビトロ抗酸化活性の生物学的相関を評価する。一実施例では、一次皮質神経細胞は、Ｈ２Ｏ２に起因する酸化ストレスの前に粗カフェインで前処置する。一対照では、Ｈ２Ｏ２は、細胞生存を用量依存的に減少させる。この例では、純カフェインは、初代神経細胞への毒性がないことがわかるが、Ｈ２Ｏ２に起因する細胞死を防止しない。同様に、この例では、粗カフェインは、初代神経細胞への毒性がないことがわかるが、純カフェインのＯＲＡＣ値よりはるかに高いときでさえ、Ｈ２Ｏ２に起因する細胞死を防止しない。
【００７７】
一実施態様において、粗カフェインのヒト骨格筋細胞および脂肪細胞におけるグルコース取り込みに及ぼす抗高血糖効果は、インスリンを正の対照として使用して決定される。一実施例では、１００ｎＭのインスリンは、ヒト骨格筋細胞におけるグルコース取り込みを２．０６倍の増加させるように刺激し、インスリンほど有効ではないものの、０．０１ｍｇ／ｍＬの粗カフェインは、グルコース取り込みを１．４５倍有意に増加させる。一方、この実施例では、０．０１ｍｇ／ｍＬの純カフェインは有意な効果をもたらさない。一実施例では、粗カフェインは、ヒト脂肪細胞におけるグルコース取り込みをインスリンより有効に刺激する。０．０１ｍｇ／ｍＬの粗カフェインは、グルコース取り込みの２．２０倍の増加を誘導するが、一方１００ｎＭのインスリンは、１．６倍の増加を誘導する。この実施例では、純カフェイン（０．０１ｍｇ／ｍＬ）は、グルコース取り込みに有意な効果をもたらさない。
【００７８】
一実施態様において、粗カフェインの抗炎症活性は、アスピリンを正の対照として使用して、粗カフェインの炎症性酵素ＣＯＸ−２に及ぼす効果を決定することによって評価する。一実施例では、粗カフェインはＣＯＸ−２活性を阻害する。ＩＣ５０値は２０μｇ／ｍＬ、であり、アスピリンの値（ＩＣ５０、１９０μｇ／ｍＬ）より９．５倍低く、これは、粗カフェインがアスピリンより強力なＣＯＸ−２阻害物質であることを示唆する。一方、この実施例では、レギュラーコーヒーの活性（ＩＣ５０、２０１０μｇ／ｍＬ）は、アスピリンの活性より約１０倍低い。この実施例では、純カフェインはＣＯＸ−２活性を阻害しない。
【００７９】
一実施態様において、粗カフェインは、カフェインを低減し、ポリフェノールを濃縮するようにさらに加工される。超臨界二酸化炭素脱カフェインにより得られた粗カフェイン、または水に再懸濁させたその真空乾燥物を懸濁して、懸濁液を形成し、この懸濁液の非水溶性粒子（ＷＩＰ）を濾過で回収する。一実施例では、この方法によって、カフェイン含有量が５％未満に低減する。一実施例では、ＷＩＰ画分には、１．６％のカフェインしか含まれておらず、粗カフェインの約６０倍少ない。一実施例では、ＷＩＰ画分中のフェノール類の有無は、一例としてＦｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕアッセイを使用して決定される。一実施例では、全フェノール類のレベルは、３１３ｍｇ  ＣＥ／ｇ、またはＷＩＰ画分の約３０質量％であることがわかる。一実施例では、ＷＩＰ画分のＯＲＡＣｈｙｄｒｏ値およびＯＲＡＣｌｉｐｏ値は、それぞれ１３２１μｍｏｌ  ＴＥ／ｇおよび３３２μｍｏｌ  ＴＥ／ｇであり、粗カフェインのＯＲＡＣｈｙｄｒｏ値およびＯＲＡＣｌｉｐｏ値より、それぞれ約９倍および５倍高いことがわかる。一実施例では、ＷＩＰの抗酸化活性は、マウス初代神経細胞において評価される。一実施例では、ＷＩＰは毒性を示さず、過酸化水素によって惹起される酸化ストレスにおける細胞死を用量依存的に有意に改善する。一実施例では、ＷＩＰ（１０００μｇ／ｍＬ）は、Ｈ２Ｏ２（２５０〜１０００μＭ）で処置されたマウス初代神経細胞の生存を約３．５倍増加させる。一実施態様において、カフェインに対する全フェノール類の比は、約２０、１０〜３０または４０、または１０を超える。
【００８０】
一実施態様において、ＷＩＰの抗酸化活性を指標とした分画およびＬＣ−ＭＳ分析を行う。一実施例では、Ｃ−１８カラムでのフラッシュクロマトグラフィーによって、ＷＩＰを複数の画分に分離し、それぞれの画分のＯＲＡＣｈｙｄｒｏを決定した。一実施例では、最も高い抗酸化能を示す画分（単数または複数）をＬＣ−ＭＳ分析にかける。
【００８１】
一実施態様において、最も高い抗酸化能を示す画分において、カフェー酸、クマル酸、バニリン酸、クェルセチン、カテキン、アブシシン酸グルコースエステル、およびトレオニンという７つの化学物質が同定される。これらのうち、カフェー酸、クマル酸、バニリン酸、クェルセチン、およびカテキンは、周知のフェノール系抗酸化剤である。アブシシン酸は植物ホルモンであるが、グルコースエステルコンジュゲートとして存在するとき、不活性であり、トレオニンはアミノ酸である。
【００８２】
一実施態様において、粗カフェインとＷＩＰの相乗効果は、他の生物学的抗酸化剤と組み合わせたとき決定される。一実施例では、ＯＲＡＣアッセイを、リノレアートマイクロエマルション系用（非特許文献１６）に適合させて、粗カフェイン、ＷＩＰ、アスコルビン酸、カテキン、クロロゲン酸、ＷＩＰ＋カテキン、またはＷＩＰ＋クロロゲン酸と組み合わせたα−トコフェロール（ビタミンＥの形）の抗酸化活性を決定する。この実施例では、データは相対的ＯＲＡＣとして表す。１００％の相対的ＯＲＡＣは、混合物の抗酸化活性が、各成分の抗酸化活性の合計に匹敵すること（相加作用）を意味するが、１００％を超える相対的ＯＲＡＣは、混合物の抗酸化活性が、各成分の抗酸化活性の合計を超えること（相乗効果）を意味する。一実施例では、粗カフェインおよびアスコルビン酸は、α−トコフェロールとの組合せで相加的抗酸化効果を示す。一方、この実施例では、ＷＩＰ、カテキン、およびクロロゲン酸は、α−トコフェロールとの組合せで相乗効果を示す。
【００８３】
抽出
抽出は、この用語が薬剤に関して使用されるとき、植物または動物組織の薬理活性部分と不活性（ｉｎａｃｔｉｖｅ）または不活性（ｉｎｅｒｔ）成分を、様々な抽出手順で選択溶媒を使用することによって分離するものである。植物から得られた生成物は、ほとんど経口用または外用を対象とする比較的不純な濃縮物である。得られた調製物は、一般的に生薬と呼ばれる。
【００８４】
医薬品および生物学的医薬品の製造
原薬は最も頻繁に、錠剤やカプセル剤などの固体剤形によって経口投与されるが、散剤も最も簡素な剤形として投与することができる。錠剤およびカプセル剤の調製に使用される大規模生産方法は、通常、活性成分以外に他の材料の存在を必要とする。添加剤を製剤に含めて、取扱いを容易にし、物理的外見を向上させ、安定性を改善し、および投与後の医薬品の血流への送達を助けることもできる。
【００８５】
錠剤は、好適な希釈剤と共にまたはなしに原薬を含む固体医薬剤形と定義とすることができ、従来から圧縮または成形方法で調製されてきた。最近では、積層板のパンチング、電子析出（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）法、および立体印刷方法を使用して、錠剤が作製されている。
【００８６】
圧縮錠は圧縮により形成され、最も簡素な形では、特殊なコーティングを含まない。圧縮錠は、粉末、結晶質、または顆粒状の材料単独で、あるいは結合剤、崩壊剤、放出制御ポリマー、滑沢剤、希釈剤、およびほとんどの場合着色剤と組み合わせて作製される。今日市販されている錠剤の大部分は、コーティングされていないまたはコーティングされた状態の圧縮錠である。
【００８７】
すべての錠剤圧縮機器の基本的な機械ユニットは、底部からダイにはまり込む下側のパンチと、製錠用材料をダイキャビティに充填した後に頂部からダイキャビティに入る、同じ形状および大きさのヘッドを有する上側パンチとを備える。錠剤は、両パンチに加えられた圧力で形成され、続いてダイから排出される。商業的な錠剤調製に通常使用される一般方法は３つある：湿式造粒法、乾式造粒法、および直接圧縮。
【００８８】
活性または治療材料に加えて、錠剤は、いくつかの不活性材料を含む。後者は、添加剤または賦形剤と呼ばれる。これらは、完成した錠剤において果たす役割に従って分類することができる。第１の群は、十分な加工および圧縮特性を製剤に付与する助けとなるものを含む。これらには、希釈剤（例えば、第二リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、ラクトース、セルロース、カオリン、マンニトール、塩化ナトリウム、乾燥澱粉、および粉糖）、結合剤（例えば、澱粉、ゼラチン、糖、ゴム、セルロース誘導体、およびポリビニルピロリドン）、流動化剤（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）、および滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、グリセリルトリベハナート（ｇｌｙｃｅｒｙｌ  ｂｅｈａｎａｔｅ）、水添植物油、およびポリエチレングリコール）が含まれる。添加される物質の第２の群は、完成した錠剤に望ましい物理的特性を追加する助けとなる。この群には、崩壊剤（例えば、澱粉、粘土、セルロース、アルギン、ゴム、および架橋ポリマー）、界面活性剤、着色剤、ならびに咀嚼錠の場合はフレーバーおよび甘味剤、ならびに徐放錠の場合はポリマー、またはロウなどの疎水性材料、もしくは他の溶解遅延性材料が含まれる。場合によっては、抗酸化剤または他の材料を添加して、安定性および貯蔵寿命を改善することができる。
【００８９】
最も広く使用され、最も一般的な錠剤調製方法は、湿式造粒法である。この方法のステップは、秤量、混合、造粒、湿式スクリーニング、乾燥、乾式スクリーニング、滑沢、および圧縮からなる。ＣＴアスコルビン酸ＵＳＰ（５０ｍｇ）の１つの湿式造粒製剤は、下記の通りである。
【００９０】
【表１】
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【００９１】
最初の３つの材料を無水エチルアルコールに溶かしたエチルセルロース（５％）と共に顆粒化し、さらに無水アルコールを追加して、湿式顆粒を得る。ステンレス鋼スクリーンに通して湿式スクリーニングを行い、室温で乾燥する。ステンレス鋼スクリーンに通して乾式スクリーニングを行い、残りの３つの材料を組み込む。徹底的に混合し、圧縮する。平坦で面取りを施した１／４インチのパンチを使用する。
【００９２】
乾式造粒は、秤量、混合、スラッギング、乾式スクリーニング、滑沢、および圧縮を含む。ＣＴビタミンＢ複合体の１つの乾式造粒製剤は、下記の通りである。
【００９３】
【表２】
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【００９４】
すべての材料を一緒に混合する。スラッグに圧縮する。粉砕し、顆粒をスクリーニングする。１／４インチの凹形パンチを使用して、錠剤に再圧縮する。
【００９５】
直接圧縮は、粉末材料から錠剤を直接圧縮することを伴う。より安価であるが、原材料と適合性があるとは限らない。ＣＴアスコルビン酸ＵＳＰ（２５０ｍｇ）の１つの直接圧縮製剤は以下の通りである：
【００９６】
【表３】
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【００９７】
すべての材料を好適なブレンダーでブレンドする。１／４インチの標準凹形パンチを使用して、圧縮する。
【００９８】
カプセル剤は、原薬を好適な形の硬質または軟質の可溶性ゼラチンシェルに封入した固体剤形である。錠剤と比較して、硬質ゼラチンカプセル剤に充填するための粉末は、最低限の製剤への努力しか必要でない。散剤は、通常ラクトース、マンニトール、炭酸カルシウム、または炭酸マグネシウムなどの希釈剤を含む。ステアラートなどの滑沢剤も頻繁に使用される。軟質シェルカプセル剤用ゼラチンは、通常グリセリン、ソルビトール、または同様のポリオールを添加することによって可塑化される。
【００９９】
薬用チューインガムは、いくつかの成分を１枚の生成物に組み込む種々の混合プロセスによって製造することができ、圧延シートから、ユニットが抜き打ちまたは裁断される。典型的な薬用チューインガム用製剤は、以下の通りである：
【０１００】
【表４】
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【０１０１】
薬用チューインガムは、圧縮をはじめとするプロセスで作製することができるが、今日主として使用されている方法は、混合、圧延、および完成したユニットの抜き打ちである。
【０１０２】
新薬開発は、様々な化合物に対して様々な経路で進めることができるが、一般モデルとして長い間役に立ってきた開発パラダイムが明らかになっている。大まかには、パラダイムは、創薬および開発を一続きの（おそらく重なり合う）フェーズの進行として描くものである。創薬プログラムは、アッセイと呼ばれる前臨床試験および動物モデルにおいて試験される化合物の合成をもたらす。臨床（ヒト）試験は、通常連続した３つのフェーズを通して進行する。第Ｉ相では、安全な用量を確立し、化合物の吸収、分布、代謝効果、排泄、および毒性に関する情報を収集するのに、少数の通常は健常なボランティアが試験される。米国において臨床試験を実施するには、製造業者は、まず新薬治験開始申請書（ＩＮＤ）をＦＤＡに申請しなければならない。第ＩＩ相は、標的とされる疾患または病態の対象者で実施され、安全性に関する証拠および有効性に関する予備的データが得られるように設計される。この相において試験対象者の数は、第Ｉ相の試験対象者数より大きく、何百人に達することがある。最終的な承認前の臨床試験相の第ＩＩＩ相は、通常いくつかの大規模（しばしば多施設）治験からなり、有効性をしっかりと確立し、まれに起こる副作用を明らかにするように設計される。１つの化合物の第ＩＩＩ相治験における対象者数は、合計何千にもなり得る。医薬開発者は安全性と有効性の十分な証拠が得られたと考えると、試験結果を規制当局への製造販売承認申請書にまとめる。米国では、製造業者は、新薬申請書（ＮＤＡ）または生物学的製剤承認申請書（ＢＬＡ）をＦＤＡに再調査および承認を求めて提出する。
【０１０３】
糖尿病
糖尿病（ＤＭ）は、高血糖；脂質、炭水化物、およびタンパク質の代謝の変化；ならびに血管疾患の合併症のリスク増加を特徴とする一群の症候群からなる。大部分の患者は、臨床的に１型または２型糖尿病として分類することができる。ＤＭまたは炭水化物不耐症は、ある種の他の病態または症候群にも関連している。ＤＭの診断の判断基準は、いくつかの医療機関によって提案されてきた。米国糖尿病協会（ＡＤＡ）の判断基準としては、ランダム血中グルコース濃度が２００ｍｇ／ｄｌを超える、空腹時血中グルコース濃度が１２６ｍｇ／ｄｌを超える、または経口グルコース負荷の摂取の２時間後の血中グルコース濃度が２００ｍｇ／ｄｌを超えることが挙げられる。非特許文献１７。
【０１０４】
実質的にすべての形のＤＭは、インスリンの血中濃度の低下（インスリン欠乏）および末梢組織のインスリンに対する応答の低下（インスリン抵抗性）によって引き起こされる。これらの異常は、炭水化物、脂質、ケトン、およびアミノ酸の代謝の変化に至り、症候群の中心的特徴は高血糖である。インスリンは、肝糖産生を阻害し、筋および脂肪組織によるグルコースの取り込みおよび代謝を刺激することによって、血中グルコース濃度を低下させる。
【０１０５】
正常に近い血糖は、インスリンおよび経口血糖降下剤を使用している患者において達成することができる。目的は、空腹時血中グルコース濃度９０〜１２０ｍｇ／ｄｌおよび食後２時間値１５０ｍｇ／ｄｌ未満を実現することである。あまり規則正しくない患者またはインスリン拮抗ホルモンの応答が不完全な患者において、より高い空腹時血中グルコース濃度（例えば、１４０ｍｇ／ｄｌ）および食後２時間血中グルコース濃度（例えば、２００から２５０ｍｇ／ｄｌ）を許容する必要があり得る。
【０１０６】
粗カフェインは、ヒト脂肪および筋細胞におけるグルコース取り込みを刺激する。好適な抗糖尿病剤は、インスリンの作用と同様の作用を有するべきであり、またはインスリン抵抗性を特徴とするインスリン作用において不十分であることを回避すべきである。本発明者らは、インスリン感受性組織の２つの初代ヒト細胞培養物：筋管および脂肪細胞を用いて研究して、粗カフェインのインスリン様活性を評価した。ＦＤＡクリアランスは、粗カフェインまたはその画分が、例えばＣ５７ＢＬ／６ならびにｏｂおよびｄｂ変異体などの糖尿病のインスリン欠乏マウスモデルにおいて、高血糖を低下させる点でいかに有効であるかを査定するために動物試験を必要とすることがある。例えば、器官培養物、またはＬ６Ｅ９筋管や３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞などのインスリン感受性組織の初代細胞培養物もしくは細胞培養株を用いて研究して、粗カフェインまたはその画分のインスリン様活性を評価する別のアッセイを必要とすることがあり得る。データは、糖尿病の対象者または糖尿病を発症するリスクがある対象者においてグルコース取り込みを刺激し、糖尿病を治療するのにこれらの抽出物の有効性および最適用量を確立するための臨床（ヒト）試験を行うべきであると示している。
【０１０７】
炎症
炎症過程は、傷害性刺激に対する応答である。プロスタグランジンは、炎症の発生に関与する。アスピリンおよびＮＳＡＩＤＳ（非ステロイド系抗炎症薬）は、プロスタグランジンの生合成を阻害する。プロスタグランジン合成経路の最初の酵素は、シクロオキシゲナーゼまたはＣＯＸである。この酵素はアラキドン酸を不安定中間体に変換し、トロンボキサンＡ２および様々のプロスタグランジンの産生に至る。アスピリンとＮＳＡＩＤＳの治療用量は、ＣＯＸ酵素およびプロスタグランジン産生を阻害する。
【０１０８】
シクロオキシゲナーゼには、シクロオキシゲナーゼ−１（ＣＯＸ−１）とシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）の２つの形がある。ＣＯＸ−１は、大部分の正常な細胞および組織においてみられ、炎症に付随するサイトカインおよび炎症性メディエーターはＣＯＸ−２の産生を誘発する。ＣＯＸ−１は胃上皮細胞で発現されるが、ＣＯＸ−２は発現されない。この部位におけるＣＯＸ−１の阻害は、ＮＳＡＩＤＳを用いた療法を複雑にする胃の有害事象の主な原因になると思われ、したがってＣＯＸ−２の阻害に特異的なＮＳＡＩＤＳの開発の論理的根拠を提供する。
【０１０９】
大部分のＮＳＡＩＤＳは、ＣＯＸ−１とＣＯＸ−２の両方を阻害し、選択性がほとんどない。ＮＳＡＩＤＳの抗炎症作用には、潰瘍発生の可能性の低下が伴うはずであるという仮説は、ＣＯＸ−１に対してＣＯＸ−２の選択性を高めた医薬品を設計する試みを推進した。これらの試みによって、例えば、選択的ＣＯＸ−２阻害物質であるセレコキシブの承認および製造販売に至った。
【０１１０】
アスピリンは、共有結合でＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２を修飾し、シクロオキシゲナーゼ活性を非可逆的に阻害している。一方、ＮＳＡＩＤＳの大部分は、シクロオキシゲナーゼ活性の可逆的競合的阻害剤として作用する。選択的ＣＯＸ−２阻害物質は、ＮＳＡＩＤＳの同等の効果的用量より、胃潰瘍を誘発しやすくないことが明らかになり、これが、例えばセレコキシブのＦＤＡ承認の基礎を形成した。
【０１１１】
ＮＳＡＩＤＳの主な臨床的適用は、関節炎などの筋骨格障害の治療における抗炎症剤である。関節炎という用語は、実際には関節の炎症を意味し、線維筋痛、痛風、および狼瘡にまで及ぶ。２つの一般的な形のうち、変形性関節症は、関節リウマチより蔓延している。
【０１１２】
変形性関節症は、関節内の軟骨およびその下にある骨の変性を特徴とする疾患であり、炎症を伴う。米国リウマチ学会（ＡＣＲ）は、手（非特許文献１８）、臀部（非特許文献１９）、および膝（非特許文献２０）の変形性関節症に関する臨床的分類ガイドラインを公表した。膝の変形性関節症の管理用アルゴリズムは非特許文献２１に記載されており、臀部の変形性関節症の管理用アルゴリズムは非特許文献２２に記載されている。
【０１１３】
関節リウマチは、身体の複数の関節において顕在化し、炎症性滑膜（関節の裏打ち）ならびに軟骨および骨のびらんに至る全身性炎症疾患である。１９８７年の米国リウマチ学会の基準は、関節リウマチの臨床診断で使用して、疫学的研究において関節リウマチを定義する。７つのＡＣＲ基準のうち４つを満たさなければならない。これらの基準は、臨床観察（例えば、関節患部の数）、臨床検査（例えば、リウマトイド因子陽性）、およびＸ線検査（例えば、関節びらんのＸ線の証拠）に基づいている。非特許文献２３。
【０１１４】
歴史的に、ＲＡの薬理学的治療は、従来からピラミッド法に従ってきた。すなわち、治療は、対象者が以前の医薬品に非応答性である場合、コルチコステロイド／非ステロイド抗炎症薬で始まり、次いで疾患修飾性抗リウマチ薬に進み、最後に生物学的反応修飾物質に進む（非特許文献２４）。
【０１１５】
粗カフェインは、炎症性酵素ＣＯＸ−２を阻害する。本発明者らは、とりわけヘムをヒト組換えＣＯＸ−２および試験材料と一緒に含む混合物にアラキドン酸を添加することによって開始される反応における酸素消費量を査定することによって測定される粗カフェインのＣＯＸ−２活性を評価した。ＦＤＡクリアランスは、粗カフェインまたはその画分が、例えば関節炎のモデルにおいて、ＣＯＸ−２を阻害する点でいかに有効であるかを査定する動物試験を必要とすることがある。最も広く使用されているモデルは、アジュバント誘発性関節炎、コラーゲン誘発性関節炎（ｃｏｌｌａｇｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、抗原誘発性関節炎、および連鎖球菌細胞壁関節炎（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、さらに最近ではトランスジェニックモデルである。さらに、例えば非特許文献２５によって開発され、１９９７年１２月にＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｍｏｄｅ  ｏｆ  Ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＯＸ−２  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎにおいて、ＣＯＸ−２およびＣＯＸ−１の阻害を算定する標準方法として採用すべきインビトロアッセイとして合意が得られたヒト全血アッセイによって測定される、粗カフェインまたはその画分のＣＯＸ−２活性を評価するインビトロアッセイを必要とすることがある。データは、炎症を発症しているまたは炎症を発症するリスクがある対象者においてＣＯＸ−２を阻害し、炎症を治療するのにこれらの抽出物の有効性および最適用量を確立すための臨床（ヒト）試験を行うべきであると示している。
【０１１６】
認知症
アルツハイマー病は、後半の人生において認知症の主な原因である。認知症は、日常生活および活動に支障をきたすほどの認知機能の低下を指す広義語である。可能性の高い（ｐｒｏｂａｂｌｅ）アルツハイマー病の最も広く受け入れられている診断基準は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ａｎｄ  ＳｔｒｏｋｅおよびＡｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎが提供しているものである（ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ：非特許文献２６）。これらの基準には、臨床検査によって確立し、神経心理学的検査によって確認された認知症の存在が含まれている。認知症は、意識障害がなく、精神活性物質が存在し、またはそれ自体でひとりでにこれらの進行性障害の原因となることがある他の何らかの病態、神経学的状態、もしくは精神状態にある高齢者における複数の進行性認知障害を含むものと説明される。非特許文献２７にも、アルツハイマー型認知症の診断基準の概要が記されているが、通常ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ基準と矛盾しない。ＤＳＭ−ＩＶは、血管性認知症の診断基準、ならびにＨＩＶ疾患、頭部外傷、パーキンソン病、ハンチントン病、ピック病、クロイツフェルトヤコブ病、および他の一般病態および病因を含めて、他の一般病態による認知症の診断基準も提供する。認知症の新たな原因および変種が解明され続けており、認知症性疾患の診断基準も改良され続けている。
【０１１７】
Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｎ  Ａｇｉｎｇ  （ＮＩＡ）  ａｎｄ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎは、アルツハイマー病の診断基準を更新する努力を先導している。１９８４年の診断基準の公開以降、アルツハイマー病の分野における最も重要な進歩には、下記の点がある（１）アルツハイマー病が引き起こす脳における変化および付随する認知障害は長年かけてゆっくりと展開し、認知症は、何年にも及ぶ病態の蓄積の最終段階であることを表していること；（２）早期発症型アルツハイマー病における予測遺伝子は、最終的に臨床症状と脳病変の両方を招く初期事象が、βアミロイドの代謝障害で始まることを示唆すること；（３）ＡＰＯＥ遺伝子のｅ４対立遺伝子は、６５歳以上で発症と定義される遅発型アルツハイマー病の主要な遺伝的リスクファクターとして十分に受け入れられていること；（４）アルツハイマー病のバイオマーカーが開発され、検証中であること。これらは、下記のカテゴリーに入る：（ａ）アミロイド陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）イメージングおよび脳脊髄液（ＣＳＦ）中のβアミロイドレベルを含めて、βアミロイド病理のバイオマーカー；（ｂ）ＣＳＦタウおよびホスホ−タウのレベルを含めて、神経細胞傷害のバイオマーカー；（ｃ）ＰＥＴスキャンによるフルオロデオキシグルコース（ＦＤＧ）の取り込みの低下を含めて、神経細胞機能障害のバイオマーカー；および（ｄ）構造的磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）スキャンによる脳萎縮を含めて、神経変性のバイオマーカー。
【０１１８】
ＮＩＡ／Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎのワーキンググループは、今日存在していると通常考えられているアルツハイマー病の３段階−臨床症状発症前アルツハイマー病、アルツハイマー病による軽度認知障害（ＭＣＩ）、およびアルツハイマー型認知症を中心に組織化されている。「臨床症状発症前」のグループは、疾患を発症するリスクの予測の助けとなり得る査定方法を特定するための研究事項を計画している。明白な症状のない人においてアルツハイマー病脳の変化があることを確定し、最終的に疾患を発症する可能性がある人を特定するために、早期認知機能低下を特定するためのバイオマーカーをはじめとする臨床査定ツールが検討されつつある。「ＭＣＩ」のグループは、ＭＣＩの基準を改善中であり、これは、認知症前の認知変化を指摘し、ＭＣＩとアルツハイマー病をよりよく識別するのに役立つことになる。発生している認知変化、バイオマーカーといかに関連付けすることができるか、またアルツハイマー型認知症への進行が切迫している可能性をこれらの方法のいずれが最もよく示唆しているかをよりよく理解するための研究が進行中である。「アルツハイマー型認知症」のグループは、診断の助けとなり得る利用可能なバイオマーカーをはじめとする査定を含めるようにアルツハイマー病の既存の診断基準を改定中である。これらの３つの作業グループからの草案が完成した後、次のステップは、専門家による論評の対象となるジャーナルで公開、続いて基準を治験に組み込むことによる体系的な検証である。
【０１１９】
記憶能力および認知能力の低下は、ヒトにおいて実際には老化の正常な結果である。若い頃に比べて客観的な記憶低下を伴うが、同年代に比べて正常な認知機能を有する高齢者を描くのに「加齢関連性記憶障害」という新しいカテゴリーがＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＭＨ）作業グループによって提案された（非特許文献２８）。グループの推奨は、このような人々を特定する際に役立つ明示的な操作定義および心理測定基準（ｐｓｙｃｈｏｍｅｔｒｉｃ  ｃｒｉｔｅｒｉａ）を含むものであった。この病態の他の用語としては、「年齢相応の記憶低下」および「年齢に関連した認知機能低下」が挙げられる。ＤＳＭ−ＩＶ（１９９４年）には、年齢に関連した認知機能低下の診断分類がまとめられている。
【０１２０】
粗カフェインのＷＩＰ画分は、カフェインを低減し、ポリフェノールを濃縮し、その上抗酸化剤を濃縮させたが、神経保護活性を増強する。本発明者らは、マウス初代神経細胞を研究の対象として、粗カフェインのＷＩＰ画分の神経保護活性を評価した。ＦＤＡクリアランスは、粗カフェインまたはその画分が、例えばタウモデル、ＡＰＰモデル、セクレターゼモデル、ＡｐｏＥモデル、および軸索輸送モデルなどのアルツハイマー病のマウスモデルにおいて、または例えばパーキンソン病の動物モデルにおいて、または例えばハンチントン病の動物モデルにおいて、神経細胞を保護する点でいかに有効であるかを査定するために動物試験を必要とすることがある。器官型脳切片培養物または神経細胞組織培養調製物（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）を研究の対象として、粗カフェインまたはその画分の神経保護活性を評価するために別のアッセイを必要とすることがある。データは、認知症および年齢に関連した認知機能低下の対象者または認知症および年齢に関連した認知機能低下を発症するリスクがある対象者において神経保護活性を増強し、認知症および年齢に関連した認知機能低下を治療するのにこれらの抽出物の有効性および最適用量を確立するための臨床（ヒト）試験を行うべきであると示している。
【０１２１】
投与量の決定
母集団の５０％に指定された効果を生じるのに必要とされる医薬品の用量が、半有効量であり、ＥＤ５０と略される。医薬品の前臨床試験において、半致死量は実験動物で判定して、ＬＤ５０と略される。ＬＤ５０とＥＤ３０の比は、医薬品が所望の作用対有害作用をもたらす際にいかに選択的であるかを提示する治療係数という指標である。高い治療係数を示す医薬品が好ましい。
【０１２２】
抽出物の投与量の決定は、ＥＤ５０、ＬＤ５０、および治療係数ならびに以下の点を考慮する順序による。食事性フェノール類の全摂取量は約１ｇ／ｄである。単一のフェノール化合物１０から１００ｍｇを消費した後、最大血漿中濃度は、０．１から１０μｍｏｌ／Ｌの範囲である。
【０１２３】
食品製品、医薬品製剤、化粧品製品、栄養補助食品製品、または生物学的医薬品製剤は、約０．０５重量％の抽出物、約０．１重量％の抽出物、約１重量％の抽出物、約５重量％の抽出物、約１０重量％の抽出物、約１５重量％の抽出物、約２０重量％の抽出物、約２５重量％の抽出物、約３０重量％の抽出物、約３５重量％の抽出物、約４０重量％の抽出物、約４５重量％の抽出物、約５０重量％の抽出物、約５５重量％の抽出物、約６０重量％の抽出物、約６５重量％の抽出物、約７０重量％の抽出物、約７５重量％の抽出物、約８０重量％の抽出物、約８５重量％の抽出物、約９０重量％の抽出物、約９５重量％の抽出物、または約９９重量％の抽出物を含有する。
【０１２４】
食品製造
食品添加物は、ＦＤ＆Ｃ法の２０１（ｓ）節（Ｓｅｃｔｉｏｎ  ２０１（ｓ）  ｏｆ  ｔｈｅ  ＦＤ＆Ｃ  Ａｃｔ）にて、ＧＲＡＳでもなく、１９５８年より前に認可されたものでもなく、その他の方法で食品添加物の定義から除外されたものでもない場合に任意の物質として定義されるものであり、その物質は、所期の使用によって、直接または間接に任意の食品（食品を生産、製造、充填（ｐａｃｋｉｎｇ）、加工、調製、処理、包装（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）、輸送、または保持する際に使用するための任意の物質を含み；かつ任意のこのような使用のための任意の放射線源を含む）の成分になる、またはその他の方法で任意の食品の特徴に影響を及ぼすことになる、あるいはそのようになるものと当然予想され得るものである。
【０１２５】
「ＧＲＡＳ」は、一般に安全とみなされている（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  Ａｓ  Ｓａｆｅ）という用語の頭字語である。ＦＤ＆Ｃ法の２０１（ｓ）節および４０９節にて、食品に意図的に添加される任意の物質が食品添加物であるが、有資格専門家の間で、物質がその所期の使用条件下で安全であることが十分にわかっていると一般にみなされていない限り、または物質の使用が、食品添加物の定義から別段に除外されていない限り、ＦＤＡの市販前調査および承認を受ける。
【０１２６】
化粧品製造
化粧品成分は、ＦＤ＆Ｃ法の下に、化粧品成分のラベル表示の目的でＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒによって確立された名称により、またはＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒによって確立された名称のない場合には、以下の概論：（ａ）ＣＴＦＡ（Ｃｏｓｍｅｔｉｃ，Ｔｏｉｌｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ｆｒａｇｒａｎｃｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．）化粧品成分辞典；（ｂ）米国薬局方；（ｃ）米国国民医薬品集；（ｄ）米国食品添加物公定書；および（ｅ）ＵＳＡＮ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ＵＳＰ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｎａｍｅｓの諸版および補遺に記載のその成分に採用された名称により特定される。どれにもその成分の名称が記載されていない場合、通常消費者に認知されている名称、あるいはは化学的もしくは専門的な名称または記述が使用される。
【０１２７】
栄養補助食品製造
栄養補助食品中の材料のタイプには、その特色として他の食品材料（例えば、水および砂糖）、および工業用添加物（ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｄｄｉｔｉｖｅ）または加工助剤（例えば、ゼラチン、澱粉、着色剤、安定剤、保存剤、およびフレーバー）が含まれる。
【実施例１】
【０１２８】
化学物質。別段に規定されていない限り、試薬はすべて、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）グレード水はＥＭＤ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）から購入し、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）ジヒドロクロリド（ＡＢＡＰ）はＷａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＵＳＡ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）から購入した。ランダムメチル化β−シクロデキストリン（ＲＭＣＤ；Ｔｒａｐｐｓｏｌ、医薬グレード）はＣｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｈｉｇｈ  Ｓｐｒｉｎｇｓ、ＦＬ）から入手した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ウィリアム培地Ｅ（ＷＭＥ）およびハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）はＧｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）から購入した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）はＡｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｌａｗｒｅｎｃｅｖｉｌｌｅ、ＧＡ）から得た。アラキドン酸およびＣＯＸ−２酵素はＣａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）から購入した。ＴＮＦ−αはＢｉｏｍｙｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。必須培地（１１０９００８１）および神経基本培地（２１１０３０４９）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から購入した。粗カフェインはＭａｘｉｍｕｓ  Ｃｏｆｆｅｅ  Ｇｒｏｕｐ（Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）から得た。酸素バイオセンサーシステム（ＯＢＳ）である特別なルテニウム色素をコーティングされた９６ウェルマイクロプレートはＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）から購入した。
【０１２９】
粗カフェイン。粗カフェインを超臨界二酸化炭素（ｓｃＣＯ２）脱カフェインプロセスの副産物として生産した。簡単に述べると、含水量が５０％になるまで、未焙煎コーヒー豆を水に浸漬した。抽出機内で、液体二酸化炭素によって高温（９０〜１００℃）および高圧（３００ａｔｍ）で、カフェインを取り出した。液体二酸化炭素を抽出機と、水を用いて液体二酸化炭素からカフェインを取り出すスクラバーとの間で再循環させた。次いで、生じたカフェインリッチな水溶液を逆浸透によって濃縮し、真空乾燥させた。粗カフェインの近似組成をＳｉｌｌｉｋｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ  Ｈｏｌｌａｎｄ、ＩＬ）によって分析した。
【０１３０】
全フェノール系誘導体。ＳｉｎｇｌｅｔｏｎおよびＲｏｓｓｉ（非特許文献２９）の方法に従って、粗カフェインのポリフェノール全含有率を決定した。クロロゲン酸標準１ミリリットルまたは粗カフェイン溶液を水１５ｍＬおよびフォリン−シオカルト１．０ｍＬ試薬と混合し、次いで室温で１０分間インキュベートした。２０％炭酸ナトリウム（３．０ｍＬ）を加え、４０℃で２０分間インキュベートした後に、Ａｇｉｌｅｎｔ  ８４５３ＵＶ−可視分光光度計（Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、吸光度を７５５ｎｍで測定した。ポリフェノール全含有率を、粗カフェイン１グラム当たりのクロロゲン酸当量のミリグラム（ＣＥ／ｇ）で表した。
【０１３１】
酸素ラジカル吸収能。親水性画分の抗酸化値（ＯＲＡＣｈｙｄｏｒｏ）を決定するために、オービタルシェーカーで、室温で１時間、粗カフェイン５ｇをアセトン／水（５０：５０ｖ／ｖ）２０ｍＬで抽出した。混合物をＲｏｔａｎｔａ  ４６０Ｒ遠心分離器（ＧＭＬ  Ｒａｍｓｅｙ、ＭＮ）内で１９７２×ｇで遠心分離した。Ｏｕ（非特許文献３０）から適合させた方法で、ＫＣ４３．０ソフトウェアによって制御されるＦＬ６００プレート蛍光リーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）で、上清のＯＲＡＣｈｙｄｒｏ値を決定した。励起波長は４８５（±２０）ｎｍに設定し、発光波長は５３０（±２５）ｎｍに設定した。親油性画分（ＯＲＡＣｌｉｐｏ）の抗酸化値を決定するために、粗カフェイン５ｇをヘキサン／ジクロロメタン（５０：５０ｖ／ｖ）１０ｍＬで２回抽出した。以前に公表された方法（非特許文献３１；非特許文献３２）に従って、合わせた有機相のＯＲＡＣ値を決定した。
【０１３２】
一次皮質ニューロン培養。一次ニューロン細胞培養物を、生後０日のＣ５７ＢＬ／６マウスから生じさせた。皮質をハンクス平衡塩溶液中に取り出し、３７℃で３０分間パパイン中でインキュベートすることによって、解離させた。解離された細胞をポリ−Ｌ−リシンコーティングされたプラスチック製プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）上、最小必須培地中に播種し、３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。次いで培地を、Ｂ−２７およびＬ−グルタミンを添加された神経基本培地に変えた。グリア細胞の増殖を低減するために、１μΜの５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（ＦｄＵ）もまた培地に加えた。４日後に、培地をＦｄＵを含まない神経基本培地に置き換え、細胞をさらに４日間増殖させた。すべての実験を、インビトロで８日間インキュベートされた細胞で行った。免疫細胞化学によって、培養細胞のうちの９０％超がニューロンであることが示された。
【０１３３】
細胞生存率。ＭＴＴからパープルホルマザンへのミトコンドリアによるコハク酸デヒドロゲナーゼ変換を測定する３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイを使用して、細胞生存率を定量化した（非特許文献３３；非特許文献３４）。細胞を９６ウェルプレート（１０５細胞／ウェル）に播種し、実験前に２４時間増殖させた。細胞を０、２５０、５００または１０００μｇ／ｍＬの粗カフェインまたは純カフェインで２時間、前処理した。次いで、培地を除去し、細胞を新鮮な培地で洗浄した。次いで、細胞を過酸化水素（Ｈ２Ｏ２、０〜１０００μΜ）で、３７℃、５％ＣＯ２で３０分間処理した。次いで、細胞をＭＴＴ（０．５ｍｇ／ｍＬ；Ｇｅｎｅｍａｒｋ、Ｔａｉｗａｎ）含有培地中、３７℃で４時間インキュベートした。培地を除去した後に、１０％ＳＤＳおよび２０ｍＭのＨＣＩを含有する溶解緩衝液１００μＬを各ウェルに加えてホルマザン結晶を溶かし、各ウェルの吸光度（５７０ｎｍ）を、ＫＣ４３．０ソフトウェアによって制御されるＦＬ６００プレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）で測定した。細胞生存パーセントを（ＯＤ５７０処理済み／ＯＤ５７０未処理）×ｌ００％として算出した。
【０１３４】
グルコース取り込み。ヒト脂肪細胞および骨格筋細胞を用いて、グルコース取り込みに対する粗カフェインのインビトロ作用を評価した（Ｚｅｎ−Ｂｉｏ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ、ＮＣ）。簡単に述べると、一次ヒト皮下脂肪細胞または一次ヒト筋芽細胞を９６ウェルマイクロプレートで分化させた。生じた脂肪細胞（分化２週後）または骨格筋細胞（分化１０日後）を粗カフェイン（０．００１〜０．５ｍｇ／ｍＬ、最終濃度）で、３Ｈ−２−デオキシグルコースの存在下で処理し；インスリン（１００ｎＭ）で処理された細胞を陽性対照として使用し、未処理細胞を陰性対照として使用した。陽性対照および陰性対照を包含するすべての試料を三重に試験した。３７℃および５％ＣＯ２での２時間のインキュベーションの後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、溶解させた。細胞溶解産物をシンチレーション液と混合し、各ウェルの放射能を分当たりカウント（ＣＰＭ）として測定した。
【０１３５】
ＣＯＸ−２阻害。Ｏｘｙｔｈｅｒｍ（Ｈａｎｓａｔｅｃｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ、Ｎｏｒｆｏｌｋ、Ｅｎｇｌａｎｄ）の反応チャンバー内、３７℃で、酸素消費を測定した。トリス緩衝液０．５ｍＬ（０．１Ｍ、ｐＨ８．０）、ヘム５μＬ［ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中１００μＭ］およびＣＯＸ−２酵素１０μＬからなる反応混合物を１分間インキュベートした。各試料５マイクロリットル（ＤＭＳＯまたはエタノール中）を加え、混合物をさらに１分間インキュベートした。アラキドン酸５μＬを加えることによって、アッセイを開始し、酸素濃度を監視した。当初酸素消費速度を、反応速度曲線から得た。ＣＯＸ−２阻害を当初酸素消費速度を５０％低下させる阻害薬濃度（ＩＣ５０）として表した。
【０１３６】
α−トコフェロールと組み合わせた場合の生理活性化合物の相乗効果。１５ｍＬ試験管内で、生じる溶液が透明に成るまで、リノール酸メチル（１．２ｇ）、Ｔｗｅｅｎ−２０（２．９ｇ）、ｎ−ブタノール（１．５ｇ）およびリン酸カリウム緩衝液（４．４ｇ）をボルテックス処理した。ＯＢＳマイクロプレートをトロロクス溶液標準（２０μＬ；５００、２５０、１２５、６２．５または３１．２５μＭ）の二重ウェルおよびリン酸緩衝液（２０μＬ）中で希釈された試料の三重ウェルで調製した。起こり得る周辺効果を回避するために、反応速度研究では周囲のウェルは使用しなかった。次いで、酸化基質であるリノール酸メチルのマイクロエマルジョン（２００μＬ）を加えた。プレートを３７℃で１０分間インキュベートし、その後、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）ジヒドロクロリド（ＡＡＰＨ、リン酸緩衝液中０．２０ｇ／ｍＬ）２０μＬを各ウェルに加え；各ウェルの最終体積は２４０μＬになった。マイクロエマルジョン２００μＬおよびリン酸緩衝液４０μＬを含有する対照ウェルを使用して、蛍光読み取りを正規化した。反応速度を３７℃で２時間監視したが、その際、Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴマイクロプレート蛍光リーダー（Ｂｉｏｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）によって、２分毎に読み取った。マイクロプレートリーダーに４８５ｎｍでの励起フィルター、５９０ｎｍの発光フィルターおよび酸素センサー生物系を装着し、十分な混合を保証するためにプレートを低い強度で２０秒間振盪し、その後、それぞれ読み取った。正規化の後に、蛍光データを反応の各時点で、酸素濃度へと変換した。試料のＯＲＡＣ値を、以前に記載された通りに決定した（非特許文献３５）。以前からの方法（非特許文献３５）に基づき、試料の相乗効果を次の通りに算出される相対ＯＲＡＣ値として表した：１００％×［１＋（混合物のＯＲＡＣ−各成分のＯＲＡＣの合計）／混合物のＯＲＡＣ］。
【０１３７】
液体クロマトグラフィーとタンデム型質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）とによる粗カフェイン化合物の活性誘導分別および構造解明。超臨界二酸化炭素脱カフェインから得られた粗カフェインをさらに処理して、カフェインを低減し、ポリフェノールを濃縮した。粗カフェインを真空乾燥させたので、これを水中に再懸濁させた。粗カフェイン１ｇを水７０ｍＬと共に室温で１５分間撹拌して、懸濁液を形成した。０．４５μｍ  ＺａｐＣａｐ−ＣＲナイロンフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で濾過することによって、この懸濁液の水不溶性粒子（ＷＩＦ）を収集し、室温で真空乾燥させた。全質量収率は１．１％であった。以前に記載されている通りに、乾燥ＷＩＰの近似組成、ＯＲＡＣおよび全フェノール含有率を分析した。
【０１３８】
次いで、勾配ポンプ、２５４ｎｍに設定されているＵＶ検出器、画分収集器（ＦＲ３４０）および１６×６０ｍｍ  Ｌｕｋｎｏｖａ  Ｃ１８カラム（Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ、ＭＡ）からなるＹａｍａｚｅｎフラッシュクロマトグラフィーシステムＡｌ−５８０（Ｓａｎ  Ｂｒｕｎｏ、ＣＡ）を用いて、ＷＩＰ３０ｍｇの分別を実施した。試料をカラムから、水およびメタノールを用いて溶離し；水／メタノール混合物を１７分間かけて流速１０ｍＬ／分で、９：１から１５：８５へと変化させた。１７の画分（１０ｍＬ／画分）を収集し、真空乾燥させ、ＯＲＡＣ値を決定した。
【０１３９】
ＭＡＣ−ＭＯＤ  ＨｙｄｒｏＢｏｎｄ（商標）ＰＳ−Ｃ１８カラム（５０×２．１ｍｍ、３μｍ；ＭＡＣ−ＭＯＤ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ、Ｃｈａｄｄｓ  Ｆｏｒｄ、ＰＡ）を装備しているＳｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣシステム（ポンプ：ＬＣ−２０ＡＴ；オートサンプラー：ＳＩＬ−ＨＴＣ；ＵＶ検出器：ＳＰＤ−２０Ａ；Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ）を用いるＬＣ−ＭＳによって、高ＯＲＡＣ値を有する画分をさらに分析した。移動相Ａは、０．４％ギ酸を含む水からなり、移動相Ｂはアセトニトリルであった。試料（１０μＬ）をＨＰＬＣによって室温で、流速０．６ｍＬ／分で分離した。移動相Ｂのパーセンテージを最初の３分で０％から７０％へと上げ、次の０．５分で９５％まで上げ、次の０．５分で９８％まで上げ、次いで１．５分間は９８％で維持した。次いで、移動相Ｂのパーセンテージを０．１分で０％に下げ、カラム再平衡のために０％で５分間維持した。
【０１４０】
ネガティブモードでのＥＳＩイオン源、イオン噴霧電圧４５００Ｖおよび温度５５０℃を用いるＡＢ／ＭＤＳ  ＳＣＩＥＸ  ４０００  Ｑ−トラップ検出器（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって、検出を行った。化学検出のために、複数の反応モニタリング（ＭＲＭ）を使用した。質量分析法は、独特のフラグメントパターン（ケミカルフィンガープリント）に各分子構造を分割することによって、同じ分子量を有する化学物質を識別する。ＭＲＭ技術を用いて、分子イオンおよびフラグメントイオンを同時検出することによって、該当する化学構造を解明することができる。
【０１４１】
統計分析。ＰＡＳＷ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  １８（Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）を使用して、一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いてテューキー事後比較検定によって、データを分析した。結果を平均±標準偏差（ＳＤ）として表している。Ｐ＜０．０５を統計的に有意とみなした。
【０１４２】
粗カフェインの近似組成についての結果。コーヒーを作る間に、生理活性化合物が粗カフェイン中に現れる（図６）。コーヒーを超臨界二酸化炭素（ｓｃＣＯ２）抽出によって脱カフェインした（図７）。ｓｃＣＯ２脱カフェインによって生じる粗カフェインを評定した。
【０１４３】
表１は、粗カフェインの近似組成を示している。主な成分はカフェイン（９５．９５％）、水分（１．１０％）および脂質（１．０４％）であった；灰分、繊維、タンパク質および糖の量は些末であった。
【０１４４】
本発明者らは、フォリン−シオカルトアッセイを使用して、粗カフェイン中のフェノール系誘導体の存在を決定し、全フェノール系誘導体のレベルが１０ｍｇ  ＣＥ／ｇ（表２）または粗カフェインに対して質量で約１％であることを見出した。
【０１４５】
粗カフェインの抗酸化活性についての結果。粗カフェインの親水性および親油性画分の抗酸化活性を評価した。ＯＲＡＣｈｙｄｒｏが１４５μｍｏｌ  ＴＥ／ｇであり、ＯＲＡＣｌｉｐｏが６６μｍｏｌ  ＴＥ／ｇであり、これに対して、純カフェインは、極めて低いＯＲＡＣｈｙｄｒｏ（６μｍｏｌ  ＴＥ／ｇ）およびＯＲＡＣｌｉｐｏ（０μｍｏｌ  ＴＥ／ｇ）を随伴することが見出された（表２）。
【０１４６】
粗カフェインのインビトロでの抗酸化活性の生物学的相関関係を評定する。Ｈ２Ｏ２誘発酸化ストレスの前に、一次皮質ニューロン細胞を粗カフェインで前処理した。図８におけるＡは、Ｈ２Ｏ２が用量依存的に細胞生存率を低下させることを示している。純カフェインは、一次ニューロン細胞に対して毒性がなかったが、Ｈ２Ｏ２誘発細胞死を防ぐことはなかった。同様に、図８におけるＢは、粗カフェインが一次ニューロン細胞に対して毒性がなかったが、Ｈ２Ｏ２誘発細胞死を防ぐことはなかったものの、粗カフェインのＯＲＡＣ値は、純カフェインのＯＲＡＣ値よりもかなり高いことを示している（表２）。
【０１４７】
グルコース取り込みに対する結果。陽性対照としてインスリンを使用して、ヒト骨格筋細胞および脂肪細胞におけるグルコース取り込みに対する粗カフェインの抗高血糖作用を決定した。ヒト骨格筋細胞において、１００ｎＭのインスリンは、グルコース取り込みの２．０６倍の上昇を刺激し、インスリンよりは有効性が劣るが、０．０１ｍｇ／ｍＬの粗カフェインは、グルコース取り込みを有意に１．４５倍上昇させた（図９）。対照的に、０．０１ｍｇ／ｍＬの純カフェインは、有意な作用をもたらさなかった。意外にも、ヒト脂肪細胞において、粗カフェインは、インスリンよりも有効にグルコース取り込みを刺激した。すなわち、０．０１ｍｇ／ｍＬの粗カフェインは、グルコース取り込みの２．２０倍の上昇を誘発した一方で、１００ｎＭのインスリンは、１．６倍の上昇を誘発した。純カフェイン（０．０１ｍｇ／ｍＬ）は、グルコース取り込みに対して有意な作用を発揮しなかった。一元ＡＮＯＶＡ、続いて多重比較のためのテューキー事後検定によって、データを分析した。結果を、平均±ＳＤとして表す。＊未処理のヒト骨格筋細胞と比較してＰ＜０．０５；＊＊未処理のヒト脂肪細胞と比較してＰ＜０．０５。これらのデータは、粗カフェインがヒト脂肪および筋肉細胞におけるグルコース取り込みを刺激することを示している。
【０１４８】
ＣＯＸ−２阻害についての結果。陽性対照としてアスピリンを使用して、炎症性酵素ＣＯＸ−２に対するその効果を決定することによって、粗カフェインの抗炎症活性を評定した。粗カフェインは、ＣＯＸ−２活性を阻害し；ＩＣ５０値は２０μｇ／ｍＬであり、これは、アスピリンのＩＣ５０値（ＩＣ５０、１９０μｇ／ｍＬ）の１／９．５未満であり（図１０）、これは、粗カフェインが、アスピリンよりも強力なＣＯＸ−２阻害薬であることを示している。対照的に、通常のコーヒーの活性（ＩＣ５０、２０１０μｇ／ｍＬ）は、アスピリンの活性の約１／１０未満であった。純カフェインはＣＯＸ−２活性を阻害しなかった。一元ＡＮＯＶＡ、続いて多重比較のためのテューキー事後検定によって、データを分析した。結果を、平均±ＳＤとして表す。＊アスピリンと比較してのＰ＜０．０５。これらのデータは、粗カフェインが炎症性酵素ＣＯＸ−２を阻害することを示している。
【０１４９】
粗カフェイン中の非カフェイン生理活性物質についての結果。粗カフェイン（１ｇ）および水（７０ｍＬ）を混合すると、微細な赤茶色の水不溶性粒子（ＷＩＰ）の水性懸濁液が生じ、これは、濾過によって単離することができることが観察された（図１１）。ＷＩＰ画分は、カフェインを１．６％しか、すなわち粗カフェインの約１／６０未満しか含有しなかった（表２）。フォリン−シオカルトアッセイを使用して、ＷＩＰ画分中におけるフェノール系誘導体の存在が決定され、全フェノール系誘導体のレベルは、３１３ｍｇ  ＣＥ／ｇ（表２）または質量ではＷＩＰ画分のうちの約３０％であることが見出された。ＯＲＡＣｈｙｄｒｏは１３２１μｍｏｌ  ＴＥ／ｇであり、ＯＲＡＣｌｉｐｏは３３２μｍｏｌ  ＴＥ／ｇであり、粗カフェインの値よりもそれぞれ約９倍および５倍高いことが見出された（表２）。さらに、ＷＩＰは脂質約２１％を含有し、このことが、ＷＩＰが水に溶けるよりも懸濁する主な理由であった。重要なので、ＷＩＰの抗酸化活性をマウス一次ニューロン細胞で評定した。ＷＩＰは毒性を示さず、Ｈ２Ｏ２誘導酸化ストレス下での細胞死を用量依存的に有意に改善することが見出された（図１２）。ＷＩＰ（１０００μｇ／ｍＬ）は、Ｈ２Ｏ２（２５０〜１０００μＭ）で処理されたマウス一次ニューロン細胞の生存率を約３．５倍上昇させた。これらのデータは、ＷＩＰの単離は、抗酸化物質を濃縮し、神経保護物質活性を増強する他にも、カフェインを減少させ、ポリフェノールを濃縮させることを示している。
【０１５０】
活性誘導分別および生理活性化合物の同定についての結果。ＷＩＰの抗酸化活性誘導分別およびＬＣ−ＭＳ分析を行った。Ｃ−１８カラムでのフラッシュクロマトグラフィーによって、ＷＩＰを１７の画分に分離し、それぞれの画分のＯＲＡＣｈｙｄｒｏを決定した（表３）。画分４および５は、全ＯＲＡＣｈｙｄｒｏのうちでそれぞれ２６．４％および４１．０％の最高の抗酸化能を実証し（表３）；したがって、それらをＬＣ−ＭＳ分析にかけた。
【０１５１】
７種の化学物質が両方の画分で同定された（表４）：コーヒー酸、クマル酸、バニリン酸、ケルセチン、カテキン、アブシジン酸グルコースエステルおよびトレオニン（図１３−１から図１３−４）。
【０１５２】
相乗効果についての結果。他の生物学的抗酸化物質と組み合わせた場合の粗カフェインおよびＷＩＰの相乗効果を決定した。リノール酸マイクロエマルジョンシステム（Ｓｉｍ，Ｗ．Ｌ．Ｓ．；ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００９、５７、３４０９〜３４１４）に適合させたＯＲＡＣアッセイを使用して、粗カフェイン、ＷＩＰ、アスコルビン酸、カテキン、クロロゲン酸、ＷＩＰ＋カテキンまたはＷＩＰ＋クロロゲン酸と組み合わせた場合のα−トコフェロール（ビタミンＥの一形態）の抗酸化活性を決定した（表５）。データを相対ＯＲＡＣとして表した：１００％の相対ＯＲＡＣは、混合物の抗酸化活性が各成分の抗酸化活性の合計に等しいこと（相加効果）を意味する一方で、１００％超の相対ＯＲＡＣは、混合物の抗酸化活性が各成分の抗酸化活性の合計を超えたこと（相乗効果）を意味している。粗カフェインおよびアスコルビン酸は、α−トコフェロールと組み合わされた場合に相加抗酸化効果をもたらすことが見出された（表５）。対照的に、ＷＩＰ、カテキンおよびクロロゲン酸は、α−トコフェロールと組み合わされた場合に相乗効果をもたらした。これらのデータは、α−トコフェロールと組み合わされて使用されると、ＷＩＰが相乗効果を現すことを示している。
【０１５３】
本明細書および添付の特許請求の範囲によって本発明は定義されるので、これらの実施例および実施態様は例示であって、本発明の範囲を限定するものとして読まれるべきではない。
【０１５４】
本明細書中において挙げられている参照文献はすべて、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１５５】
【表５】
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【０１５６】
【表６】
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【０１５７】
【表７】
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【０１５８】
【表８】
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【０１５９】
【表９】
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【図６】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１２】
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