(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
パラコッカス属微生物ＴＳＬＧＯ３−２株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２０３５）。
【請求項２】
パラコッカス属微生物ＴＳＬＧＯ３−２株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２０３５）を培養し、菌体からリコペンを回収することを特徴とする、リコペンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乾燥菌体重量１ｇあたり２５ｍｇ以上のリコペンを生産可能なカロテノイド類生産性パラコッカス属微生物及びそれを用いたリコペンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リコペンはトマトやスイカに含まれる赤色色素であり、天然の食用色素として有用な化合物である。近年では、その優れた抗酸化活性による発癌抑制効果が着目され、サプリメントなど健康食品への応用もなされている。リコペンの主な供給はトマト等農作物からの抽出であるが、これらの天然物はリコペンの含量が少ないため大量の原料が必要となり、また生産コストがかかる。そこで、より効率的で安定供給可能な生産方法の確立が望まれている。
【０００３】
生産性の改良として藻類による生産（例えば特許文献１参照）やケカビによる生産（例えば特許文献２参照）が示されている。しかしながらこれらの微生物は通常の微生物と比べて発酵に時間がかかり、発酵法が複雑である。また細胞壁が硬いため抽出に複雑な工程を経る必要があるという問題がある。そのため、培養が容易で目的物の抽出がしやすい微生物での合成が望まれている。
【０００４】
これに対して、海洋性アグロバクテリウム属（後にパラコッカス属へ再分類された）微生物Ｎ−８１１０６株（特開平７−１８４６６８号）を用いた変異育種により、培地１リットルあたりリコペン３９．６ｍｇを生産するＴＳＴＴ００３株（平成１７年１０月２５日に独立行政法人産業技術総合研究所  特許微生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−２０６９６として受託されている）株の樹立が報告されている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平９−３１３１６７号公報
【特許文献２】特開２００３−３０４８９５号公報
【特許文献３】特開２００７−１５１４７４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、工業的なリコペンの生産を考慮して、従来報告されている微生物よりも更に生産性が向上した微生物と、その微生物を用いたリコペンの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題に関し鋭意検討した結果、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、乾燥菌体重量１ｇあたり２５ｍｇ以上のリコペンを生産可能なカロテノイド類生産性パラコッカス属微生物である。また本発明はかかる微生物を培養し、菌体又は培養液からリコペンを回収することを特徴とする、リコペンの生産方法である。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
本発明の微生物は、乾燥菌体重量１ｇあたり２５ｍｇ以上のリコペンを生産可能なカロテノイド類生産性パラコッカス属微生物である。この微生物は、カロテノイドの生産性を有するパラコッカス属細菌を育種することにより得ることができる。育種に使用する好適なパラコッカス属細菌としては、具体的に、本出願人により見出された、既にあるレベルのカロテノイド生産性を有するＴＳＴＴ０５２株（平成１７年１０月１８日に独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−２０６９０として寄託され、平成１９年１月９日に原寄託についてＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７５４として受託されている）を例示することができる。その他にも、カロテノイド生産性パラコッカス属細菌ＴＳＮ１８Ｅ７株を育種することも例示できる。また更には、海洋性アグロバクテリウム属微生物（後に、パラコッカス属に属する微生物として再分類された）Ｎ−８１１０６株を例示することができる。前記したＴＳＴＴ０５２株はＴＳＮ１８Ｅ７株を育種して得られた株であり、ＴＳＮ１８Ｅ７株（特開２００５−５８２１６号）はＮ−８１１０６株を育種して得られた株だからである。
【０００９】
Ｎ−８１１０６株は細胞中にアスタキサンチン、β−カロテン、β−クリプトキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、カンタキサンチン、３’−ヒドロキシエキネノン、シス−アドニキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチンなどの多様なカロテノイドを蓄積することが知られている。
【００１０】
リコペンは、中間代謝物として速やかに次の代謝物に変換される。従って、育種は、リコペンの生産性を向上するとともに、リコペンを代謝する経路を遮断するものであることが好ましい。育種の具体的な内容としては、自然突然変異により派生した優良微生物を選別していく方法などの他に、変異原物質や紫外線で細胞を処理することによって変異を加速させたのちにリコペンの生産性及び蓄積性が向上した微生物を選別する方法や、以上の様な方法で得られた性質の異なる微生物同士を細胞融合させる方法などを例示することができる。中でも、変異原物質を用いる方法は短期間に有用な微生物を得る方法として好ましく、具体的に変異原物質としてＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、メタンスルホン酸エチル等の化合物を使用する方法が例示できる。より具体的に、ＴＳＴＴ０５２株を用いる育種について一例を述べれば、予め培養して得られたＴＳＴＴ０５２株の菌体を前記のような変異原物質の水溶液に懸濁して一定時間接触した後に、遠心分離などの方法で菌体を回収して変異原物質を除去する。その後平板培地上で培養し、優良微生物のコロニーを選択する。コロニーの選択はリコペン生産菌に特有の桃色が濃いコロニーを選択・分離し、液体培養を行い、次いで、菌体からカロテノイドを抽出してリコペン蓄積量や組成をＨＰＬＣなどで分析し、生産性の向上した微生物を絞り込むことが例示できる。
【００１１】
リコペンの生産性及び蓄積性は、乾燥菌体重量１ｇあたりから回収できるリコペン量によって評価することができる。一例を挙げると、固体培地を利用した場合には任意のコロニーをピックアップし、液体培養後、増殖能やカロテノイド生産量を定量することにより評価すればよい。本出願人がＴＳＴＴ０５２株を用いる育種により見出したＴＳＬＧＯ３−２株（平成２２年１２月１５日に独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−２２０３５として受託されている）は、後述する実施例に示すように、乾燥菌体重量１ｇあたり２５ｍｇ以上のリコペンを生産可能なカロテノイド類生産性パラコッカス属微生物である。なお、参考までに述べれば、培地１Ｌ当たりの菌体量は、培養条件等によって異なるが、２０ｇ程度である。
【００１２】
本発明のリコペンの生産方法は、上述した育種により得られる微生物を培養することからなる。培養条件は、一般に公知の条件を用いることができる。本発明のリコペンの生産方法においては、培養は培養液中で行うことが好ましい。例えば培養温度を１０から３５℃に、培地のｐＨを６から９の範囲にそれぞれ設定し、２０から２００時間培養させることが例示できる。培養温度については培養初期、中期、後期に区別してそれぞれの段階で温度を変えてもよい。
【００１３】
培養に用いる栄養培地の培地成分としては、炭素源には廃糖蜜、グルコース、フルクトース、マルトース、ショ糖、デンプン、乳糖、グリセロール、酢酸等が、窒素源にはコーンスティープリカー、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粕等の天然成分や、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩等やグルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン等のアミノ酸類が、無機塩にはリン酸１ナトリウム、リン酸２ナトリウム、リン酸１カリウム、リン酸２カリウム等のリン酸塩や塩化ナトリウム等が、金属イオンには塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸第１鉄、硫酸第２鉄、塩化第１鉄、塩化第２鉄、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化銅、硫酸マンガン、塩化マンガン等が、ビタミン類として酵母エキスやビオチン、ニコチン酸、チアミン、リボフラビン、イノシトール、ピリドキシン等が使用できる。
【００１４】
上記のような栄養培地を使用した好適な培養条件は、培養温度２０から３０℃、ｐＨが約７．０から７．６、培養時間が６０から１８０時間である。また培地中の糖濃度については、低濃度かつ枯渇しない条件に維持することが好ましく、グルコースなどの高濃度な糖溶液を用いて流加することが好ましい。  本発明の微生物を培養すると、リコペンを含むカロテノイドが生産され、かつ、その代謝が遮断されているためにリコペンが菌体内又は培養液に蓄積される。カロテノイドの抽出は、菌体又は培養液からカロテノイド（リコペン）を安定かつ効率良く回収されれば特に限定はなく、例えばメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジクロロメタン、クロロフォルム、ジメチルフォルムアミド、ジメチルスルフォキシド等の抽出溶媒による抽出を例示できるが、中でもアセトンが好ましい。抽出されたカロテノイドは、液体クロマトグラフィー等を利用して高純度に分離、精製することも可能である。液体クロマトグラフィーの分離原理としてはイオン交換、疎水性相互作用、分子ふるい等を挙げることができる。好ましくは、逆相クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィーである。また高速液体クロマトグラフィーによれば、抽出したカロテノイドの定量を行うこともできる。
【００１５】
菌体からの抽出に際しては、例えば、培養終了後、菌体を培地から遠心分離操作、デカンテーション又はろ過等の方法を用いて分離し、使用し易い粘度にまで水を加えてスラリーとしておくと良い。後に、調製スラリーを例えばガラスビーズ、ジルコニアビーズを用いた破砕機又は高圧ホモジナイザーを使用して均一化し、好ましくはスプレー乾燥法にて乾燥し、抽出に供するのである。またここで、リコペンの分解を防ぐために、スラリーにアスコルビン酸等の酸化防止剤を加えてもよい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の新規微生物により、健康食品や食用色素などとして有用なリコペンを効率よく製造することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】２Ｄ０３８株のカロテノイド生産パターンを示すＨＰＬＣチャートである。
【図２】ＴＳＬＧＯ３−２株を用いた発酵槽培養におけるリコペン生産量の経時変化を示した図である。
【図３】ＴＳＬＧＯ３−２株のカロテノイド生産パターンを示すＨＰＬＣチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を更に詳細に説明するために実施例を記載するが、実施例は本発明の一実施形態であり、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００１９】
実施例１  変異導入及びリコペン生産株の作製
ＴＳＴＴ０５２株を表１に示す培地３ｍＬに植菌し、試験管中、２５℃、１５０ｒｐｍで１晩振とう培養を行った。この培養液のうち１ｍＬを１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移し、１５，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により菌体を回収した。この菌体をｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（以下緩衝液Ａとする）１ｍＬに懸濁し、次いで３ｍｇ／ｍＬのＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下ＮＴＧとする）水溶液１０μＬを加え、３０〜６０分間静置した。その後、遠心分離して上清を除去し、緩衝液Ａに再懸濁する操作を２回繰り返してＮＴＧを除去した。さらに、表１に示す培地１ｍＬにこの菌体を懸濁し、試験管中、２５℃、１５０ｒｐｍで４〜５時間振とう培養した。得られた培養液を適度に希釈し、表２に示す組成の平板培地に塗布して、２５℃で１週間静置培養を行った。生育してきたコロニーのうちリコペン生産菌に特有の桃色を呈するコロニーを選別し、フラスコ培養による変異株の評価に供した。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
【表２】
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実施例２  変異株の評価
実施例１で選別した変異株を、表１に示す培地３ｍＬに植菌し、試験管中、２５℃、１５０ｒｐｍで１晩振とう培養した。次いでこの培養液０．５ｍＬを、１００ｍＬ容バッフル付三角フラスコに入れた表１に示す培地６０ｍＬへ植菌し、２５℃、１２０ｒｐｍで６日間振とう培養を行った。培養中は培養液を適宜抜き取り、濁度（ＯＤ６６０ｎｍ）、残存グルコース濃度、培地ｐＨ、及びカロテノイド生産量を経時的に分析した。カロテノイド生産量の定量は以下のように行った。まず培養液０．８ｍＬを１．５ｍＬ容エッペンドルフチューブに移し、１５，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により菌体を回収した。この菌体を５０μＬの純水に懸濁し、次いで５５０μＬのジメチルホルムアミド、及び１０００μＬのアセトンを順次加え振とうすることでカロテノイドを抽出した。抽出残渣を１５，０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離により除去した後、ＴＳＫｇｅｌ−ＯＤＳ８０ＴＭカラム（東ソー社製）を用いた高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣとする）で各種カロテノイドを定量した。なお、カロテノイドの分離はＡ液として純水とメタノールの５：９５の混合溶媒、Ｂ液としてメタノールとテトラヒドロフランの７：３の混合溶媒を用い、１ｍＬ／ｍｉｎの流速で、Ａ液を５分間カラムに通液させた後、同じ流速においてＡ液からＢ液へ５分間の直線濃度勾配溶出を行い、さらにＢ液を５分間通過させることにより行った。カロテノイド濃度は４７０ｎｍの吸光度をモニターし、既知濃度のリコペン試薬（和光純薬社製）で作成した検量線より濃度を算出した。
【００２２】
上記の方法に従って変異株のリコペン生産性を評価し、リコペンを選択的に高生産する新規変異株２Ｄ０３８株を取得した。２Ｄ０３８株のカロテノイド生産パターンを図１に示す。
【００２３】
実施例３  ２Ｄ０３８株への変異導入及び優良微生物の作製
実施例１と同様に、２Ｄ０３８株を表１に示す培地３ｍＬに植菌し、試験管中、２５℃、１５０ｒｐｍで１晩振とう培養を行った。この培養液のうち１ｍＬを１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移し、１５，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により菌体を回収した。この菌体を１ｍＬの緩衝液Ａに懸濁し、次いで３ｍｇ／ｍＬのＮＴＧ水溶液１０μＬを加え、３０〜６０分間静置した。その後、遠心分離して上清を除去し、緩衝液Ａに再懸濁する操作を２回繰り返してＮＴＧを除去した。さらに、表１に示す培地１ｍＬにこの菌体を懸濁し、試験管中、２５℃、１５０ｒｐｍで４〜５時間振とう培養した。得られた培養液を適度に希釈し、表２に示す組成の平板培地に塗布して、２５℃で１週間静置培養を行った。生育してきたコロニーのうち桃色の強いものを選別し、フラスコ培養による変異株の評価に供した。
【００２４】
実施例２と同様に、選別した変異株を表１に示す培地３ｍＬに植菌し、試験管中、２５℃、１５０ｒｐｍで１晩振とう培養した。次いでこの培養液１ｍＬを、１００ｍＬ容バッフル付三角フラスコに入れた表３に示す培地２０ｍＬへ植菌し、２５℃、１２０ｒｐｍで６日間振とう培養を行った。培養中は培養液を適宜抜き取り、濁度（ＯＤ６６０ｎｍ）、残存グルコース濃度、培地ｐＨ、及びカロテノイド生産量を経時的に分析した。カロテノイド生産量の定量は以下のように行った。まず培養液０．１ｍＬを１．５ｍＬ容エッペンドルフチューブに移し、１５，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により菌体を回収した。この菌体を２０μＬの純水に懸濁し、次いで４８０μＬのジメチルホルムアミド、及び５００μＬのアセトンを順次加え振とうすることでカロテノイドを抽出した。抽出残渣を１５，０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離により除去した後、実施例２に記載の方法に従ってＨＰＬＣ分析によりカロテノイドを定量した。
【００２５】
上記の方法に従って変異株の増殖性やリコペン生産性を評価し、２Ｄ０３８株と同等のリコペン生産性を持ち、増殖性が向上した変異株ＴＳＬＧＯ３−２株を取得した。表４に培養終了時の濁度及びリコペン生産量を示す。表４の通り、ＴＳＬＧＯ３−２株は親株である２Ｄ０３８株より有意に菌体増殖性が向上した優良株である。
【００２６】
【表３】
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【００２７】
【表４】
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実施例４  発酵槽での新規微生物の培養及びカロテノイドの定量
表１に示す培地６０ｍＬにＬＧＯ３−２株を植菌し、１００ｍＬバッフル付三角フラスコ中、２５℃、１２０ｒｐｍで１晩振とう培養を行い前々培養とした。次いでこの培養液３ｍＬを、５００ｍＬ容バッフル付三角フラスコに入れた表５に示す培地１００ｍＬへ植菌し、２５℃、１２０ｒｐｍで１晩振とう培養を行い前培養とした。次いで、表６に示す培地１．８Ｌを全容３．０Ｌ発酵槽（サクラ精機社製、ＴＦＬＣ−３）に入れ、１２１℃、２０分間で滅菌後、得られた前培養液を９０ｍＬ植菌し、約１４０時間培養した。発酵槽の操作は次のようにした。まず、発酵槽の培養温度は２８℃、ｐＨは７．０〜７．６とし、ｐＨの調整は１０％のアンモニア水溶液を用いた。また発酵槽の攪拌速度は、培養開始時には５１６ｒｐｍとし、培養３０時間において５４０ｒｐｍまで上昇させた。培養過程に発生する炭素源不足は、７０％グルコースを適宜添加することにより補った。グルコース濃度は、１０ｇ／Ｌで培養を開始し、培養１９時間においてグルコースの追加を開始して、０．０１ｇ／Ｌ〜２．５ｇ／Ｌとなるように調節した。
【００２８】
【表５】
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【００２９】
【表６】
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図２にＯＤ６６０ｎｍ及びリコペン生産量の経時変化を示す。図のように、培養時間の経過と共にリコペンの生産量が増加し、培養開始後約７０時間でＯＤ６６０の値は最高となる。この時の菌体乾燥重量は培地１リットルあたり約３１ｇであり、カロテノイド生産量は培地１リットルあたり約３６５ｍｇ、うちリコペンの生産量は培地１リットルあたり約３６５ｍｇであった。培養開始後約１２５時間でリコペンの生産量は最大となる。この時の菌体乾燥重量は培地１リットルあたり約２３ｇであり、カロテノイド生産量は培地１リットルあたり約６３２ｍｇ、うちリコペンの生産量は培地１リットルあたり約６１５ｍｇ（菌体乾燥重量１ｇあたり約２６ｍｇ）であった。そして培養開始後約１７０時間では菌体量は減少した。この時の菌体乾燥重量は培地１リットルあたり約２２．５ｇであり、カロテノイド生産量は培地１リットルあたり約５９３ｍｇ、うちリコペンの生産量は培地１リットルあたり約５７６ｍｇ（菌体乾燥重量１ｇあたり約２６ｍｇ）であった。
【００３０】
図３に、菌体培養後１２５時間経過した時点で取得した菌体を２０μＬの純水に懸濁し、次いで４８０μＬのジメチルホルムアミド、及び５００μＬのアセトンを順次加え振とうすることでカロテノイドを抽出し、抽出残渣を１５，０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離により除去した後、実施例２に記載の方法に従ってＨＰＬＣ分析したカロテノイド生産パターンを示す。また表７には、このパターンから算出されたカロテノイド等の生産量とその割合を示す。生産されたカロテノイドの９７％がリコペンであり、本発明によりリコペンを効率的に製造できたことが分かる。
【００３１】
【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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