(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
土壌サンプルからの土壌由来物が低減された微生物の調製方法であって、
(1)少なくとも一部が電極である基板表面上に、微生物および微生物に結合した核酸解析阻害性の土壌由来物を含有する土壌サンプルを懸濁した液を電解液として配置し、前記電極に定電位を印加して、前記微生物の少なくとも一部を前記基板表面に付着させる工程、及び
(2)前記電極に高周波変動電位を印加して、前記基板表面に付着した微生物を生きた状態で、かつ微生物に結合した核酸解析阻害性の土壌由来物が低減された状態で剥離する工程を含み、
工程(1)における前記定電位は、-0.5V以上、-0.2V以下 (vs Ag/AgCl)または+0.2V以上、+0.4V以下(vs Ag/AgCl)であり、
工程(2)における前記高周波変動電位は、周波数が1KHz〜20MHzの範囲であり、かつ±0.1V(vs Ag/AgCl)またはそれより小さい電位の幅である、前記調製方法。
【請求項２】
工程(1)における電解液は、微生物に対する栄養源を含有しないことを特徴とする、請求項1に記載の調製方法。
【請求項３】
工程(1)における前記電解液は塩分濃度が10ｇ/Ｌ以下である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
工程(1)における前記電解液はリン酸緩衝液(Ca2+、Mg2+不含)である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項５】
工程(1)における前記電解液は人工海水または天然海水であり、工程(1)における前記定電位は、-0.4V超、-0.2V以下(vs Ag/AgCl)または+0.2V以上、+0.4V以下(vs Ag/AgCl)である、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記高周波変動電位は、矩形波、正弦波、または三角波である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
前記基板表面は、全面が電極である請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
工程(2)を実施した後に、さらに工程(1)および(2)を実施する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の製造方法。
【請求項９】
微生物を微生物叢組成物として調製するための、請求項1〜8のいずれか1項に記載の調製方法。
【請求項１０】
請求項1〜9のいずれか1項に定義された工程を含み、さらに得られた微生物または微生物叢組成物から核酸を抽出する工程を含む、核酸の調製方法。
【請求項１１】
請求項9に定義された工程を含み、さらに得られた微生物叢組成物から核酸を抽出し、抽出された核酸を解析する工程を含む、土壌サンプルに含まれる微生物叢の系統解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、定電位電解を利用した土壌微生物の調製方法に関する。本発明の方法は、陸または海底の土壌の微生物叢から土壌由来の核酸解析阻害性の物質の低減された微生物を得るために有用であり、土壌微生物からの核酸の調整、および土壌微生物の系統解析等において有用である。
【背景技術】
【０００２】
土壌や河川・海などの環境中には多種多様な微生物が存在している。近年では、環境中の微生物がもつ核酸のすべてを抽出・収集し、塩基配列を網羅的に調べるメタゲノム解析が行われており、それによりその環境中の微生物叢の系統解析ができ、またその環境全体でどのような物質代謝が起こっているかが予測可能である。メタゲノム解析はまた、特定の環境中に生存可能な微生物が有する有用物質の遺伝子の発見においても重要な手段となっている。
【０００３】
土壌より土壌微生物由来のDNAを回収する方法としては、特許文献1により、土壌、及び該微生物を含む溶液にアニオン性物質を加えることを特徴とするＤＮＡの回収方法が提案されている。一方、土壌サンプル由来の微生物は、土壌由来の粒子や有機物等と強固に結合していることがあり、それらが核酸解析において阻害的に作用することが知られている（非特許文献1）。
【０００４】
他方、本発明者らは、微生物を生きた状態で一つずつ個別にまたは少ない集団で基板表面上に固定化して配置できる新たな手段、およびこの新たな手段を用いて固定化した微生物を生きた状態で剥離(脱固定化)する手段について検討してきた（非特許文献2）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平7-163353
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Roh C, Villatte F, Kim BG, Schmid RD 2006. Comparative study of methods for extraction and purification of environmental DNA from soil and sludge samples. Appl. Biochem. Biotechnol. 134: 97-112.
【非特許文献２】小山純弘ら, 2011. ITOパターン電極による生きた微生物の付着および剥離の電気制御, 第12回極限環境生物学会年会要旨. O-11. 44-45
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これまで、セルソーターによる微生物の解析においても、土壌微粒子に複数個の微生物が強固に付着しているような場合は、微生物をsingle cell レベルで直接解析することが極めて困難であった。
【０００８】
本発明は、土壌由来であって、一つずつ個別の微生物または微生物叢組成物をして、土壌由来物の混在が低減されたものを調整することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、前掲非特許文献2に記載された生きた微生物（原核生物）を分散させた栄養源を含まないバッファを電解液として、電気化学反応の生じない、微弱な電位を印加することで、陰極基板上に生きた微生物を付着させることができることを見出した。さらに、この方法で電極基板上に付着した微生物（原核生物）は、電極に高周波変動電位を印加することで、ほとんどダメージを受けることなく、電極表面上から生きた状態で定量的に剥離・回収することができるのみならず、その際に土壌微生物を、核酸解析阻害性の土壌由来物から引き離すことができることを見出した。またこのようにして得られた微生物叢組成物から核酸を抽出し、16S rRNAの解析のためにPCRを行ったところ、阻害は見られず、良好に解析できることも見出した。これらの知見に基づいて本発明はなされた。
【００１０】
本発明は以下の通りである。
[1]  (1)少なくとも一部が電極である基板表面上に、微生物および核酸解析阻害性の土壌由来物を含有する土壌サンプルを懸濁した液を電解液として配置し、前記電極に定電位を印加して、前記微生物の少なくとも一部を前記基板表面に付着させる工程、及び
(2)前記電極に高周波変動電位を印加して、前記基板表面に付着した微生物を生きた状態で剥離する工程、を含む、土壌サンプルからの核酸解析阻害性の土壌由来物の低減された微生物の調製方法であって、
工程(1)における前記定電位は、-0.5V以上、-0.2V以下(vs Ag/AgCl)または+0.2V以上、+0.4V以下(vs Ag/AgCl)であること、
工程(2)における前記高周波変動電位は、周波数が1KHz〜20MHzの範囲であり、かつ±0.1V(vs Ag/AgCl)またはそれより小さい電位の幅とすること
を特徴とする、前記調製方法。
[2]  工程(1)における電解液は、微生物に対する栄養源を含有しないことを特徴とする、[1]に記載の調製方法。
[3]  工程(1)における前記電解液は塩分濃度が10ｇ/Ｌ以下である、[1]または[2]に記載の方法。
[4]  工程(1)における前記電解液はリン酸緩衝液(Ca2+、Mg2+不含)である、[1]または[2]に記載の方法。
[5]  工程(1)における前記電解液は人工海水または天然海水であり、工程(1)における前記定電位は、-0.4V超、-0.2V以下(vs Ag/AgCl)または+0.2V以上、+0.4V以下(vs Ag/AgCl)である、[1]に記載の方法。
[6]  前記高周波変動電位は、矩形波、正弦波、または三角波である、[1]〜[5]のいずれか1項に記載の方法。
[7]  前記基板表面は、全面が電極である[1]〜[6]のいずれかに記載の方法。
[8]  工程(2)を実施した後に、さらに工程(1)および(2)を実施する、[1]〜[7]のいずれか1項に記載の製造方法。
[9]  微生物を微生物叢組成物として調製するための、[1]〜[8]のいずれか1項に記載の調製方法。
[10]  [1]〜[9]のいずれか1項に定義された工程を含み、さらに得られた微生物または微生物叢組成物から核酸を抽出する工程を含む、核酸の調製方法。
[11]  [9]に定義された工程を含み、さらに得られた微生物叢組成物から核酸を抽出し、抽出された核酸を解析する工程を含む、土壌サンプルに含まれる微生物叢の系統解析方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、微生物（原核生物）を生きた状態で電極表面上に付着させることが可能である。さらに本発明によれば、電極表面上に付着させる微生物を生きた状態で回収することができる。これらの方法は、グラム陰性菌である大腸菌とグラム陽性菌である枯草菌でも可能である。
【００１２】
本発明は、土壌中の様々な微生物を電極基板上へ誘引、付着させることにより、動物細胞で行われているsingle cell 解析のような、共焦点レーザー顕微鏡のような高機能光学顕微鏡を用いた、単一細胞間における遺伝子やタンパク質発現の比較解析が微生物においても可能となる。さらに解析後に微生物を回収することもできる。
【００１３】
さらに本発明の方法によれば、多剤耐性菌が混入した血液製剤などからの電気的な除菌やお風呂など水中に存在する微生物の除菌も可能である。
【００１４】
本発明によれば、土壌微生物（原核生物）を電極表面上に付着させ、さらに剥離させて回収することにより、核酸解析阻害性の土壌由来物の混在が低減された土壌微生物および土壌微生物叢組成物が調製できる。土壌微生物としては、グラム陰性菌である大腸菌とグラム陽性菌である枯草菌でも可能である。
【００１５】
本発明により、核酸解析阻害性の土壌由来物の混在が低減された土壌微生物または土壌微生物叢組成物は、核酸解析に供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１−１】電極チェンバーの写真と模式図を示す。
【図１−２】微生物の電極上への誘引付着と剥離回収の説明図を示す。
【図２】実施例1の土壌微生物の電極への誘引結果を示す。
【図３】実施例2の大腸菌と枯草菌の電極上への誘引付着と剥離回収結果を示す。
【図４】実施例3の土壌微生物の電極上への誘引付着結果を示す。
【図５】実施例4の土壌微生物の電気的剥離結果を示す。
【図６】実施例5の各種バッファ中における微生物の誘引付着結果を示す。
【図７】実施例5の人工海水中における微生物の誘引付着結果を示す。
【図８】土壌微生物の電極上への誘引付着と剥離回収（実施例6）を示す。
【図９】実施例6の系統解析結果を示す。
【図１０】実施例7のPCR結果を示す。
【図１１】実施例8の系統解析結果を示す。
【図１２】比較例1の培地中での微生物の電極上への誘引結果を示す。
【図１３】比較例2の280mMマンニトール水溶液中での微生物電極上への誘引結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
＜生きた微生物の固定化方法＞
本発明の第１の態様は、生きた微生物の固定化方法に関する。
この方法は、少なくとも一部が電極である基板表面上に、微生物を含有する溶液を電解液として配置し、前記電極に定電位を印加して、前記微生物の少なくとも一部を前記基板表面に付着させる工程(1)を含む。さらに、工程(1)における前記定電位は、-0.5V以上、-0.2V以下(vs Ag/AgCl)または+0.2V以上、+0.4V以下(vs Ag/AgCl)であること、及び工程(1)における電解液は、微生物に対する栄養源(培地)を含有しないことを特徴とする。
【００１８】
工程(1)
工程(1)は、少なくとも一部が電極である基板表面上で定電位を印加する工程である。少なくとも一部が電極である基板としては特に制限はない。前記基板表面は、全面が電極であっても、一部が電極であり、一部は、非電極(基板)であってもよい。さらに、少なくとも一部が電極である基板は、例えば、電極以外の基板に電極層を設けたものであっても、カーボン電極等のように全体が電極であるものであってもよい。電極以外の基板に電極層を設けたものの場合、基板は、絶縁性の基板の表面の一部または全部に電極を有するものであることができる。そのような電極を有する基板は、例えば、スライドガラスに酸化インジウム(ITO)をコーティングしたものであることができる。但し、絶縁性の基板は、スライドガラスに限定される意図ではなく、非導電性の固体であれば特に制限はなく、非導電性の有機材料や無機材料からなるものであることができる。非導電性の有機材料や無機材料としては、ガラス以外に、例えば、プラスチックやセラミックス等を挙げることもできる。電極は、酸化インジウム(ITO)に限定される意図ではなく、公知の電極材料からなるものを適宜利用できる。
【００１９】
基板に電極層を設けたもの場合、基板表面の全部に電極層を設けたもの、電極基板の表面の一部に電極層を設けたもののいずれであってもよく、電極基板の表面の一部に電極層を設けたものの場合、電極層は例えば、アレイ状であっても縞状であってもよい。電極層の大きさ(面積や寸法)は適宜決定できる。例えば、電極の面積は、例えば、1〜900cm2の範囲であることができる。
【００２０】
また、アレイ状とは、例えば、縦列及び横列それぞれに複数の微小領域として、電極層が配置されることを意味する。縦列及び横列それぞれの微小領域の数は特に制限はなく、微生物の種類(サイズ)や微生物をアレイ状に配置した基板の利用目的等に応じて適宜決定できるが、例えば、縦10〜105×横10〜105の範囲であることができる。但し、この範囲に限定される意図ではない。アレイ状電極層表面の形状は、矩形(三角形、正方形、長方形、多角形等)や円形、楕円形等、適宜決定できる。アレイ状の各電極表面の寸法は、1つの電極表面に1つの微生物が付着できる寸法であることができる。微生物の寸法は、様々であるので、付着させる微生物の寸法に応じて、電極表面の寸法は適宜決定できる。また、アレイ状の各電極表面の寸法は、1つの電極表面に2つ以上の微生物が付着できる寸法であることもできる。さらに、各電極の間隔も、例えば、25〜100μmの範囲であることができる。
【００２１】
また、縞状の電極層は、例えば、同じ幅の帯状の電極層を等間隔または異なる間隔で複数設けたもの、異なる幅の帯状の電極層を等間隔または異なる間隔で複数設けたもののいずれであってもよい。帯状の電極層の幅及び帯状の電極層の間の間隔は、特に制限はないが、いずれも独立に例えば、25〜100μmの範囲であることができる。
【００２２】
基板表面へのアレイ状または縞状電極層の形成は、例えば、基板表面に電極層をコーティングし、アレイ状または縞状電極表面用のマスクを電極層表面に形成し、次いで、マスクを介して電極層表面をエッチングし、マスクを除去することで形成することができる。あるいは、基板表面へのアレイ状または縞状電極表面の形成は、基板表面に電極層をアレイ状または縞状電極表面用のマスクを介してコーティングし、次いでマスクを除去することで形成することができる。電極層の形成や電極層表面のエッチング等は、常法を用いて適宜実施できる。
【００２３】
工程(1)では、微生物を含有する溶液を電解液として配置し、前記電極に定電位を印加して、前記微生物の少なくとも一部を前記基板表面に付着させる。工程(1)における前記定電位は、-0.5V以上、-0.2V以下(vs Ag/AgCl)または+0.2V以上、+0.4V以下(vs Ag/AgCl)である。実施例において具体的に示すように、微生物を付着させる電極に印加される定電位が、上記範囲である場合に、電解液に含まれる微生物は、特異的に電極に生きた状態で付着する。電極に印加される定電位が上記範囲を外れると、微生物は電極に付着しないか、あるいは電極に付着はしても生きた状態ではなくなる。上記定電位は、Ag/AgClを参照電極として表示をしているが、Ag/AgCl以外の参照電極を用いて表示することも可能であり、Ag/AgCl以外の参照電極を用いて表示した定電位であっても、Ag/AgClを参照電極として表示した場合に上記範囲であれば、本発明の条件を満たすことは理解されるべきである。尚、Ag/AgClを参照電極として表示した場合に、-1.06Vが水素発生電位であり、+1.69Vが酸素発生電位である。
【００２４】
電極への定電位の印加時間は、微生物の種類、電解液の種類、電解液中の微生物の濃度、印加される電位等を考慮して、適宜決定できるが、例えば、1〜48時間の範囲とすることができる。
【００２５】
さらに、工程(1)における電解液は、微生物に対する栄養源を含有しない。上記定電位の印加による微生物の基板表面への付着は、電解液が、電解液に含まれる微生物に対する栄養源を含まない場合にのみ生じることである。電解液が、電解液に含まれる微生物に対する栄養源を含む場合には、理由は定かではないが、微生物は電極に付着しない。微生物に対する栄養源とは、微生物の培養に必要な栄養源であり、通常の微生物培養に用いられる培地の成分の一部または全部である。より具体的に、上記電解液に含まれない栄養源とは、例えば、糖、タンパク質、アミノ酸、脂肪酸、脂質、核酸などである。
【００２６】
また、「栄養源を含有しない」とは、微生物の生育に実質的に寄与できない微量の栄養源の含有を排除するものではない。微生物を含有するサンプルから微生物を含有する電解液を調製する際に、サンプルに含まれる栄養源を除去すること無しに、電解液の原液とサンプルを混合することで、サンプルに付随して電位の印加に供される電解液に含まれることになる微量の栄養源を含有する電解液は、本発明においては、「栄養源を含有しない」電解液と定義される。但し、微生物を含有するサンプルをそのまま電解液の原液と混合することで電解液を調製することもできるが、微生物を含有するサンプルをろ過等により、サンプルに付随する栄養源を洗浄した後に、電解液の原液と混合することで、サンプルに付随する栄養源量を低減することもできる。
【００２７】
電解液中の微生物の濃度は、特に制限はないが、例えば、微生物を1つ1つ個別に電極表面に付着させたい場合には、電解液中の微生物の濃度は、比較的低い方が好ましい。但し、印加される定電位および定電位の印加時間によっても、微生物の電極への付着量は変化するので、電解液中の微生物の濃度は1つの変数に過ぎない。電解液中の微生物の濃度は、これらの観点を考慮して、適宜決定できる。
【００２８】
工程(1)における前記電解液は、塩分濃度が10ｇ/Ｌ以下であることが、微生物を生きた状態で電極に付着させるという観点からは好ましい。塩分濃度は、好ましくは、0〜10ｇ/Ｌの範囲である。さらに、工程(1)における前記電解液は、緩衝液であることが、微生物を生きた状態で電極に付着させるという観点からは好ましい。緩衝液の塩分濃度も10ｇ/Ｌ以下であることが好ましい。緩衝液としては、特に制限はないが、例えば、リン酸緩衝液(Ca2+、Mg2+不含)であることが、微生物を生きた状態で電極に付着させるという観点からは好ましい。リン酸緩衝液以外に、MOPS(3-Morpholinopropanesulfonic acid)、Tricine(N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]glysine)、HEPES(N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N'-(2-ethanesulfonic acid)などを用いることもできる。但し、電極への微生物の付着率が高いという観点からはリン酸緩衝液(Ca2+、Mg2+不含)が好ましい。緩衝液のpHは、微生物の種類に応じて適宜選択できるが、例えば、通常の微生物の場合には、5〜9の範囲である。
【００２９】
工程(1)における前記電解液は、人工海水または天然海水であることができ、その場合の、工程(1)における前記定電位は、-0.4V超、-0.2V以下(vs Ag/AgCl)または+0.2V超、+0.4V以下(vs Ag/AgCl)であることが好ましい。人工海水または天然海水の塩分濃度は、40〜50ｇ/Ｌ程度であり、塩濃度が高いと-0.5V〜 -0.4Vの範囲では、電極に付着した微生物の生存率が低下する傾向があるからである。
【００３０】
本発明の方法で、電極表面に生きた状態で付着させることができる微生物は、特に制限はない。実施例で示すように、グラム陰性菌である大腸菌、およびグラム陽性菌である枯草菌は、電極表面に生きた状態で付着させることができる。電極表面に生きた状態で付着させることができる微生物は、限定されるものではないが、例えば、Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus halodurans, Shewanella violacea, Shewanella oneidensis, Shewanella surugensis, Kocuria rosea, Kocuria 4B, Shewanella abyssi, Shewanella kaireiticaなどであることができる。
本発明者らは、枯草菌、Bacillus halodurans、Shewanella violacea、Kocuria rosea、Shewanella oneidensisについても、定電位印加による電極基板上への付着の影響を調査した。その結果、S.violaceaでは人工海水中で-0.3V vs. Ag/AgCl、それ以外の微生物は大腸菌と同様リン酸緩衝液(Ca2+、Mg2+不含)中で-O.4V vs.Ag/AgClの定電位を印加した電極上に強く引き寄せられることが確認された。
【００３１】
＜生きた微生物の調製方法＞
本発明の第２の態様は、生きた微生物の調製方法に関する。
この方法は、
(1)少なくとも一部が電極である基板表面上に、微生物を含有する溶液を電解液として配置し、前記電極に定電位を印加して、前記微生物の少なくとも一部を前記基板表面に付着させる工程、及び
(2)前記電極に高周波変動電位を印加して、前記基板表面に付着した微生物を生きた状態で剥離する工程、を含む。
【００３２】
さらに、工程(1)における前記定電位は、-0.5V以上、-0.2V以下(vs Ag/AgCl)または+0.2V以上、+0.4V以下(vs Ag/AgCl)であること、工程(2)における前記高周波変動電位は、周波数が1KHz〜20MHzの範囲であり、かつ±0.1V(vs Ag/AgCl)またはそれより小さい電位の幅とすること、及び
工程(1)における電解液は、微生物に対する栄養源を含有しないこと、
工程(2)における電解液は、塩分濃度が40ｇ/Ｌ以下であることを特徴とする。
【００３３】
第２の態様における工程(1)は、第１の態様における工程(1)と同様である。
【００３４】
工程(2)では、工程(1)で得られた微生物が生きた状態で付着した電極に高周波変動電位を印加して、前記基板表面に付着した微生物を生きた状態で剥離する。電極に付着した微生物及び電極近傍の非電極表面上の微生物は、高周波変動電位を印加することで剥離する。高周波変動電位は、具体的には、周波数は1KHｚ〜20MHzの範囲、好ましくは1〜15MHzの範囲とすることができ、電位は、±0.1V(vs Ag/AgCl)またはそれより小さい電位の幅とすることができ、例えば、±10mV(vs Ag/AgCl)、±9mV(vs Ag/AgCl)、±8mV(vs Ag/AgCl)などにすることもできる。高周波変動電位の波形は、例えば、矩形波、正弦波、三角波等であることができる。
【００３５】
工程(2)における電解液は、塩分濃度を40ｇ/Ｌ以下とすることができる。工程(1)における電解液は塩分濃度が10ｇ/Ｌを超える人工海水または天然海水であっても、電位を調整することで微生物を生きた状態で電極表面に付着させる事ができる。工程(1)および(2)における電解液は同一組成であっても異なる組成であっても良い。さらに、工程(2)における電解液は、工程(1)における電解液と同様に、栄養源を含有しない。
【００３６】
工程(2)においては、電極表面上のみならず、電極近傍の非電極表面上の微生物も剥離でき、非電極表面上で剥離できる微生物は、電極からの距離が、高周波変動電位の周波数と電位にもよるが、約100μm以内である。高周波変動電位の印加の際には、電極上の微生物には電位が直接的に印加され、非電極表面上の微生物には電位が間接的に印加される。従って、電位の印加による微生物へのストレスは、非電極表面上の微生物の方が相対的に小さく、電位の印加によって微生物の損傷が生じる場合(そのような高周波変動電位の条件)であっても、非電極表面上の微生物の方が、損傷が少ないか、または無い傾向がある。電位の印加によって微生物の損傷が生じる程の強い高周波変動電位を採用するのは、微生物の付着が強固であり、剥離しにくい場合であるので、そのような場合には、非電極表面上の微生物の剥離を優先的に行うような、電極の形状や配置、さらには、非電極表面の選択を行い、非電極表面上の微生物の剥離を積極的に行うこともできる。
【００３７】
本発明の方法においては、図1-2に示すように、工程(1)において基板の電極表面または電極及び非電極表面に微生物を付着させる。付着させる微生物は、例えば、土壌サンプルのようなものであっても、あるいは微生物を含有する培養液であってもよい。これらの微生物を含有するサンプルを適宜、電解液を用いて希釈して所定の濃度に調整した後、定電位印加を実施する。定電位印加により電極及び非電極表面に微生物を付着は必要により、例えば、共焦点顕微鏡等を用いて観察することもできる。
【００３８】
工程(2)においては、微生物が基板の電極表面または電極及び非電極表面に付着した電極に高周波変動電位を印加する。これにより、電極表面または電極及び非電極表面に付着した微生物を生きた状態で剥離することができる。
【００３９】
本発明の方法において、工程(1)において基板の電極表面または電極及び非電極表面に付着した微生物の生存率は、付着させる条件によるが、例えば、50〜100%の範囲である。また、工程(2)において基板の電極表面または電極及び非電極表面から剥離・回収される微生物の生存率は、剥離させる条件によるが、例えば、50〜100%の範囲である。
【００４０】
本発明の方法は、剥離した微生物を、さらに培養して微生物を増殖する工程を含むことができる。微生物を培養する方法は、微生物の種類に応じて適宜採用できる。
【００４１】
＜核酸解析阻害性の土壌由来物の除去＞
本発明の第３の態様は、土壌由来であるが、核酸解析阻害性の土壌由来物の混在の低減された、微生物又は微生物叢組成物の調製方法に関する。
この方法は、
(1)少なくとも一部が電極である基板表面上に、微生物および核酸解析阻害性の土壌由来物を含有する土壌サンプルを懸濁した溶液を電解液として配置し、前記電極に定電位を印加して、前記微生物の少なくとも一部を前記基板表面に付着させる工程、及び
(2)前記電極に高周波変動電位を印加して、前記基板表面に付着した微生物を生きた状態で剥離する工程、を含む。
【００４２】
第３の態様における工程(1)および（2）は、第１および第２の態様における工程(1)および（2）と同様である。
【００４３】
土壌には様々な成分が含まれている。土壌に存在する有機物はまず生物か非生物に分けられ、次に非生物は動植物の遺体と腐植に分けることができる。この腐植は、土壌有機物とも呼ばれ、多糖類・タンパク質・アミノ酸・脂質・リグニンなどで構成される非腐植物質と、高分子有機物の混合物である腐植物質に分けられる。腐植物質に対してアルカリ処理を施し、溶解しないものをヒューミンという。溶解するものに対して酸処理を施し、不溶なものを腐植酸といい、溶解するものをフルボ酸という。
【００４４】
土壌からの菌体由来の核酸の回収には、２種類の方法が知られている。土壌より細菌画分を分離した後、集菌した菌体より核酸を回収する方法と、土壌中で直接、菌体を溶菌した後、回収する方法である。しかしながら、いずれの場合においても、土壌由来物（たとえば、ヒューミン、腐食酸、フルボ酸等）に菌体や核酸が吸着されてしまったり、土壌由来物が核酸解析のための反応において、反応を阻害するという問題が生じることがある。しかしながら、本発明の方法によれば、このような不都合がないか、又は低減されうる。
【００４５】
本発明で「土壌」というときは、特に記載した場合を除き、陸地（農地、森林等を含む。）の土壌；河川、湖沼、海、深海および温泉等の底泥；ならびに火山泥および火山灰を含む。本発明で「微生物叢組成物」というときは、特に記載した場合を除き、土壌から、そこに含まれる微生物叢の組成がそのままであるように調整した、複数の微生物を含むと考えられる構成物をいう。本発明で微生物または微生物叢組成物に関連して土壌由来物の混在が「低減された」というときは、特に記載した場合を除き、核酸の解析を阻害する土壌由来物が、核酸解析を有効に行える程度にまで除かれている状態をいう。
【００４６】
本発明の方法は、得られた微生物または微生物叢組成物から核酸を抽出する工程を含む、核酸の調製方法とすることもできる。核酸には、DNAおよびRNAが含まれる。
【００４７】
本発明により得られた微生物叢組成物から抽出された核酸は、核酸解析阻害性の物質が低減されているので、PCRなどの核酸解析のためのサンプルとすることができる。核酸阻害性の物質を十分に低減するためには、上述の工程(1)および(2)を、複数回、例えば2〜3回、繰り返してもよい。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
【００４９】
実施例1
以下に示す手順で、図1-1に示す3電極チェンバーのITO電極上への微生物の付着および剥離を行い、生死判別を行った(図1-2参照)。
1）農薬を使用していない神奈川県横須賀市内の菜園土壌0.5gをDulbecco's PBS(-) (Wako, Osaka, Japan)に加え、総量5mlとし、5分間ボルテックスで撹拌する。
2）Dulbecco's PBS(-)で104倍希釈し、10μg/mlの土壌サンプルを調整する。
3）死んだ微生物が電極に誘引されるかを検討するために、Dulbecco's PBS(-)に溶解した0.02％(w/v)アジ化ナトリウム(Wako, Osaka, Japan)で104倍希釈し、10μg/mlの土壌サンプルを調整する。または、60℃の70％EtOHで1h処理した土壌サンプルを用いた。
4）3電極チェンバー(図1-1参照)に5mlの土壌サンプル液を加え、-0.4V vs. Ag/AgCl, 24h, 室温にて電位印加する。
5）24時間電位印加後、上ずみ土壌サンプルを回収し、新鮮なDulbecco's PBS(-)でITOパターン電極基板を数回軽く洗浄する。
6）新鮮なDulbecco's PBS(-)5mlを3電極チェンバーに加え、±10mV vs. Ag/AgCl, 9MHz三角波電位をさらに1h, 室温にて電位印加する。
7）1時間電位印加後、上ずみPBS(-)サンプルを回収し、新鮮なDulbecco's PBS(-)でITOパターン電極基板を数回軽く洗浄する。
8）5）のITO電極上に付着している、デヒドロゲナーゼ活性を持つ生きた微生物をBacstain CTC rapid staining kit for microscopy (Dojindo, Kumamoto, Japan)で蛍光染色した後、共焦点レーザー顕微鏡(FV500, Olympus, Tokyo, Japan)で観察する。
9）5）および7）のITO電極上に付着している微生物をLive/dead Baclight bacterial viability kits (Molecular probes, Eugene, OR, USA)で蛍光染色し、共焦点レーザー顕微鏡（FV500）で生死判別をする。
10）5）および7）で回収した上ずみサンプル中の微生物をLive/dead Baclight bacterial viability kitsで蛍光染色し、ヘマサイトメーターを用いて共焦点レーザー顕微鏡（FV500）で生死判別をする。
【００５０】
結果を図2に示す。
土壌中の生きた微生物（原核生物）を、電気化学反応の生じない、微弱なマイナス電位を印加した電極基板上に付着させることができた（図２上段参照）。死んだ微生物は、微弱なマイナス電位を印加した電極表面に吸着しなかった（図２下段参照）
【００５１】
(2）電極基板上に付着した微生物（原核生物）へ、高周波変動電位（±10mVvs. Ag/AgCl, 9MHz,三角波）を印加することで、ほとんどダメージを与えずに、電極表面上から微生物を99％以上剥離・回収することができた。（図２中段）。高周波変動電位印加１時間後の電極表面上に残った微生物の生存率は91％（＝517/566cells）。土壌中からの生きた菌体の回収率は84％（＝154/183）で、ヘマサイトメーターで測定した結果、５０マイクログラムの土壌から3ｘ106個の微生物を回収することに成功した。
【００５２】
実施例2
(1）以下に示す手順で、図1-1に示す3電極チェンバーのITO電極上への微生物の付着および剥離を行い、生死判別を行った(図1-2参照)。
1）大腸菌または枯草菌を5mlのLuria-Bertani培地(LB培地, Difco laboratories, Inc., Detroit, MI, USA)で37℃にて120rpmで一晩培養する。
2）遠心処理して上ずみを捨てた後、ペレットを5mlのDulbecco's PBS(-)に再懸濁する。
3）ヘマサイトメーターでセルカウントした後、1×106cells/wellの微生物を3電極チェンバーに播種する。
4）-0.4V vs. Ag/AgCl, 24h, 室温にて電位印加する。
5）24時間電位印加後、上ずみを回収し、新鮮なDulbecco's PBS(-)でITOパターン電極基板を数回軽く洗浄する。
6）新鮮なDulbecco's PBS(-)5mlを3電極チェンバーに加え、±10mV vs. Ag/AgCl, 9MHz 三角波電位をさらに1h, 室温にて電位印加する。
7）1時間電位印加後、上ずみPBS(-)サンプルを回収し、新鮮なDulbecco's PBS(-)でITOパターン電極基板を数回軽く洗浄する。
8）5）のITO電極上に付着している、デヒドロゲナーゼ活性を持つ生きた微生物をBacstain CTC rapid staining kit for microscopy(Dojindo, Kumamoto, Japan)で蛍光染色した後、共焦点レーザー顕微鏡(FV500, Olympus, Tokyo, Japan)で観察する。
9）7）のITO電極上に付着している微生物をLive/dead Baclight bacterial viability kits (Molecular probes, Eugene, OR, USA)で蛍光染色し、共焦点レーザー顕微鏡（FV500）で生死判別をする。
10）5）および7）で回収した上ずみサンプル100μlをLB寒天プレートに播き、コロニーをカウントする。
【００５３】
結果を図3に示す。グラム陰性菌である大腸菌とグラム陽性菌である枯草菌でも上述の電気的な付着に成功した。さらに、電極に付着した微生物を剥離できた。
【００５４】
高周波変動電位印加１時間後の電極表面上に残った微生物の生存率は大腸菌が93％（＝152/164cells）であり、枯草菌が40％（＝140/348 cells）であった。土壌中からの生きた菌体の回収率は大腸菌が80％（＝86/108コロニー）で、枯草菌が54％（＝128/237コロニー）であった。
【００５５】
実施例3
以下の手順で、実施例1と同様の方法で、印加する電位を変化させて土壌中の微生物を電極表面に付着させた。
1）神奈川県横須賀市内の農薬を使用していない菜園土壌0.5gをDulbecco's PBS(-) (Wako, Osaka, Japan)に加え、総量5mlとし、5分間ボルテックスで撹拌する。
2）Dulbecco's PBS(-)で104倍希釈し、10μg/mlの土壌サンプルを調整する。
3）3電極チェンバーに5mlの土壌サンプル液を加え、各種定電位を24h, 室温にて電位印加する。
4）24時間電位印加後、新鮮なDulbecco's PBS(-)でITOパターン電極基板を数回軽く洗浄する。
5）ITO電極上に付着している、デヒドロゲナーゼ活性を持つ生きた微生物をBacstain CTC rapid staining kit for microscopy(Dojindo, Kumamoto, Japan)で蛍光染色した後、共焦点レーザー顕微鏡(FV500, Olympus, Tokyo, Japan)で観察する。
【００５６】
結果を図4に示す。土壌中の微生物は、-0.2V、-0.3V、-0.4V vs. Ag/AgClの定電位を24時間印加した条件で、電極基板上への付着が確認された。一部の土壌中の微生物は、+0.4Ｖの定電位を24時間印加しても付着するタイプが確認された。
【００５７】
実施例4
以下の手順で、実施例1と同様の方法で電極表面に付着させた微生物を、印加する高周波変動電位を変化させて電極表面から剥離させた。
1）神奈川県横須賀市内の農薬を使用していない菜園土壌0.5gをDulbecco's PBS(-) (Wako, Osaka, Japan)に加え、総量5mlとし、5分間ボルテックスで撹拌する。
2）Dulbecco's PBS(-)で104倍希釈し、10μg/mlの土壌サンプルを調整する。
3）3電極チェンバー(図1-1)に5mlの土壌サンプル液を加え、-0.4V vs. Ag/AgCl, 24h, 室温にて電位印加する。
4）24時間電位印加後、新鮮なDulbecco's PBS(-)でITOパターン電極基板を数回軽く洗浄する。
5）新鮮なDulbecco's PBS(-)5mlを3電極チェンバーに加え、±4mV、±6mV、±8mV、±10mV vs. Ag/AgCl, 9MHz三角波電位をさらに1h, それぞれ室温にて電位印加する。
6）1時間電位印加後、新鮮なDulbecco's PBS(-)でITOパターン電極基板を数回軽く洗浄する。
7）4）のITO電極上に付着している、デヒドロゲナーゼ活性を持つ生きた微生物をBacstain CTC rapid staining kit for microscopy(Dojindo, Kumamoto, Japan)で蛍光染色した後、共焦点レーザー顕微鏡(FV500, Olympus, Tokyo, Japan)で観察。
8）6）のITO電極上に付着している微生物をLive/dead Baclight bacterial viability kits(Molecular probes, Eugene, OR, USA)で蛍光染色し、共焦点レーザー顕微鏡（FV500）で生死判別をする。
9）4）と6）のITO電極上に付着している50×50μm2当たりの微生物量から剥離率を算出する。
【００５８】
結果を図5に示す。各種電位を1時間印加した時の、微生物の生存率と電極基板上からの剥離率を示した。±10mVＶが生存率89％、剥離率99.8％と最も良い条件で剥離できた。
【００５９】
実施例5
以下の手順で、実施例1と同様の方法で、使用する電解液を変化させて土壌中の微生物を電極表面に付着させた。
1）10g/LのMOPS(Dojindo), Tricine (Dojindo), HEPES (cell culture tested, Sigma, St Louis, MO, USA)、pH7に調整する。
2）人工海水（30g/L NaCl, 0.7g/L KCl, 5.3g MgSO4-7H2O, 10.8g MgCl2-6H2O, 1.0g/L CaSO4-2H2O）を調整する。
3）神奈川県横須賀市内の農薬を使用していない菜園土壌0.5gを各種バッファーまたは人工海水中に加え、総量5mlとし、5分間ボルテックスで撹拌する。
4）各種バッファーまたは人工海水で104倍希釈し、10μg/mlの土壌サンプルを調整する。
5）3電極チェンバーに5mlの土壌サンプル液を加え、各種定電位を24h, 室温にて電位印加する。
6）24時間電位印加後、新鮮なDulbecco's PBS(-)でITOパターン電極基板を数回軽く洗浄する。
7）ITO電極上に付着している、デヒドロゲナーゼ活性を持つ生きた微生物をBacstain CTC rapid staining kit for microscopy(Dojindo, Kumamoto, Japan)で蛍光染色した後、共焦点レーザー顕微鏡(FV500, Olympus, Tokyo, Japan)で観察。
【００６０】
(1)各種バッファー
結果を図6に示す。-0.4V vs. Ag/AgClで24時間、10g/Lの各種バッファー中で土壌中の微生物の電気吸着を試みた。その結果、PBS(-)が最も電気的な吸着に適していた。次にMOPSバッファとTricineバッファ。HEPESは微生物の電極上への吸着を多少阻害した。
【００６１】
(2)人工海水
結果を図7に示す。人工海水は-0.3V〜+0.6V vs. Ag/AgClの間で、電流が発生せず、吸着した微生物のダメージは確認できなかった。人工海水中における微生物の電気吸着の最適条件は、-0.3V vs. Ag/AgClであった。
【００６２】
実施例6（深海底泥中に存在する細菌の系統解析）
1．菌叢の調整
以下に示す手順で、図1-1に示す3電極チェンバーのITO電極上への微生物の付着および剥離を2回繰り返し行った（図8参照)。
1）日本国・相模湾の湧水域の、深さ1,176mで採取された深海底泥5gをDulbecco's PBS(-) (Wako, Osaka, Japan)に加え、総量50mlとし、5分間ボルテックスで撹拌する。
2）3電極チェンバー(図1-1参照)に5mlの土壌サンプル液を加え、-0.4V vs. Ag/AgCl, 4℃にて電位印加する。
3）2時間電位印加後、新鮮なDulbecco's PBS(-)でITOパターン電極基板を数回軽く洗浄する。
4）新鮮なDulbecco's PBS(-)5mlを3電極チェンバーに加え、±10mV vs. Ag/AgCl, 9MHz 三角波電位を4℃にて電位印加する。
5）30分間電位印加後、新鮮なDulbecco's PBS(-)でITOパターン電極基板を数回軽く洗浄する。
6）2)〜5)を再度実施し、上ずみPBS(-)サンプルを回収する。
【００６３】
2．系統解析
2.1.  DNA抽出
電気剥離したサンプルは、凍結乾燥してボリュームダウンしてから、ISOIL Large for Beads ver.2（ニッポンジーン株式会社）を用いてDNA抽出を行った。また、対照として、溶菌処理をした深海底泥から直接、DNAを抽出した。
【００６４】
2.2  シーケンス解析
2.2.1  PCR増幅
20ng のDNAを用い、LA-Taq polymerase（タカラバイオ株式会社）を使用し、96℃, 2min. - (96℃, 20sec. - 55℃, 15sec. - 72℃, 90sec.) x 25 - 72℃, 7min. - 4℃, ∞のプログラムでPCRを実施した。使用したprimerは、一般的にバクテリア解析に使用されている下記のものである。
Bac 27F：5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'（配列番号1）
Bac 1492R：5'-GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'（配列番号2）
【００６５】
2.2.2  電気泳動＆抽出・精製
増幅サンプルが少量であり、かつUVによるダメージを与えたくなかったので、染色材としてはSyBr Green Iを使用した。ゲル抽出には、NucleoSpin Extract II（タカラバイオ社）を使用した。
【００６６】
2.2.3  サブクローニング＆形質転換
TA cloning vectorである、pT7 Blue2 T-vector（タカラバイオ社）を使用した。ligaseは、ligation high2（東洋紡株式会社）を使用した。ligation sampleで大腸菌DH5を形質転換し、LB培地（アンピシリン, IPTG, X-Gal選択培地）にてpositive cloneをピックし、96穴プレート、LB培地（アンピシリン）で培養した。vector primerであるM13Rv, M13M4でコロニーPCRを行い、positive cloneを選択した。
2.2.4  シーケンスサンプル調製
primer dimerや未反応primerを除去するため、コロニーPCRで確認の取れたpositive PCR productをExo及びSAP(Shrimp Alkaline phosphatase)（双方ともUsb社）で2回処理した。次いでExo-SAP処理したサンプルを常法に従い、シーケンス反応させた。Primerとして、vectorのprimerであるM13Rv, M13M4バクテリア用primerであるBac338Fの３種類を使用した。
M13Rv : 5'-TGT GGA ATT GTG AGC GG-3'（配列番号3）
M13M4 : 5'-GTT TTC CCA GTC ACG AC-3'（配列番号4）
Bac338F : 5'-ACT CCT ACG GGA GGC AGC-3'（配列番号5）
【００６７】
2.2.5  配列解析
3 primerのよる解析結果から、サンプルごとにコンティグを作成し、Mothur（http://www.mothur.org/wiki/Main_Pageより入手可能）を用いて解析した。具体的には、上述のように得られた配列（今回は20クローンずつ）のmultifastAファイルを作成し、TerminalでMothurを起動させることにより解析した。
【００６８】
2.3  結果
結果を図9に示した。深海底泥から直接抽出したDNAを用いた場合と、電気吸脱着を2回行って得られた微生物叢組成物から抽出したDNAを用いた場合とでは、結果にほとんど差がなかった。
【００６９】
実施例７（畑土壌に存在する細菌の系統解析）
神奈川県横須賀市内のブドウ畑から泥サンプルを回収し、16s rRNA遺伝子による細菌の系統解析を試みた。電気吸脱着の際の温度を室温とするほかは、実施例６と同様の条件で菌叢組成物を得た。また第1回目の吸脱着後にも上清の一部を回収し、PCR解析に供した。
結果を図10および11に示した。土壌サンプルに2回電気吸脱着を試みると、土壌中に含まれるPCR反応阻害物質が十分に除去できた。電気吸脱着1回目と2回目の系統解析から、得られる細菌に差はほとんど現れなかった。一方、土壌サンプルから直接DNAを回収することはできても、16s-rRNA遺伝子による微生物の系統解析のためのPCRはできなかった。
【００７０】
比較例1
以下の手順で、実施例1と同様の方法で、使用する電解液を培地(栄養源を含む)に替えて土壌中の微生物を電極表面に付着させた。土壌微生物が培地中でも、電極基板上に付着するか検討した。
1）神奈川県横須賀市内の農薬を使用していない菜園土壌0.5gをDulbecco's PBS(-) (Wako, Osaka, Japan)に加え、総量5mlとし、5分間ボルテックスで撹拌する。
2）Luria-Bertani培地(LB培地, Difco laboratories, Inc., Detroit, MI, USA)で104倍希釈し、10μg/mlの土壌サンプルを調整する。
3）3電極チェンバー図1-1に5mlの土壌サンプル液を加え、-0.4V vs. Ag/AgCl, 24h, 室温にて電位印加する。
4）24時間電位印加後、新鮮なDulbecco's PBS(-)でITOパターン電極基板を数回軽く洗浄する。
5）ITO電極上に付着している微生物をLive/dead Baclight bacterial viability kits(Molecular probes, Eugene, OR, USA)で蛍光染色し、共焦点レーザー顕微鏡（FV500）で観察する。
【００７１】
結果を図12に示す。培地中では、土壌微生物は電極基板上に誘引付着しなかった。
【００７２】
比較例2-1
以下の手順で、実施例1と同様の方法で、使用する電解液をマンニトール溶液に替えて土壌中の微生物を電極表面に付着させた。
1）神奈川県横須賀市内の農薬を使用していない菜園土壌0.5gを280mMマンニトール水溶液 (Wako, Osaka, Japan)に加え、総量5mlとし、5分間ボルテックスで撹拌する。
2）280mMマンニトール水溶液で104倍希釈し、10μg/mlの土壌サンプルを調整する。
3）3電極チェンバーに5mlの土壌サンプル液を加え、-0.4V vs. Ag/AgCl, 24h, 室温にて電位印加する。
4）24時間電位印加後、新鮮なDulbecco's PBS(-)でITOパターン電極基板を数回軽く洗浄する。
5）ITO電極上に付着している微生物をLive/dead Baclight bacterial viability kits (Molecular probes, Eugene, OR, USA)で蛍光染色し、共焦点レーザー顕微鏡（FV500）で観察する。
【００７３】
結果を図13の上段に示す。280mMマンニトール水溶液中では、本発明の条件では、微生物は電圧を印加しない場合(open circuit)と同程度にしか付着しなかった。
【００７４】
比較例2-2
以下の手順で、実施例1と同様の方法で、使用する電解液をマンニトール溶液に替えて土壌中の微生物を電極表面に付着させ、次いでマンニトール溶液中で剥離させた。
1）神奈川県横須賀市内の農薬を使用していない菜園土壌0.5gをDulbecco's PBS(-) (Wako, Osaka, Japan)に加え、総量5mlとし、5分間ボルテックスで撹拌する。
2）Dulbecco's PBS(-)で104倍希釈し、10μg/mlの土壌サンプルを調整する。
3）3電極チェンバーに5mlの土壌サンプル液を加え、-0.4V vs. Ag/AgCl, 24h, 室温にて電位印加する。
4）24時間電位印加後、新鮮なDulbecco's PBS(-)でITOパターン電極基板を数回軽く洗浄する。
5）280mMマンニトール水溶液5mlを3電極チェンバーに加え、±10mV vs. Ag/AgCl, 9MHz 三角波電位をさらに1h, それぞれ室温にて電位印加する。
6）1時間電位印加後、新鮮なDulbecco's PBS(-)でITOパターン電極基板を数回軽く洗浄する。
7）ITO電極上に付着している微生物をLive/dead Baclight bacterial viability kits (Molecular probes, Eugene, OR, USA)で蛍光染色し、共焦点レーザー顕微鏡（FV500）で観察をする。
【００７５】
結果を図13の下段に示す。付着した微生物は、本発明で用いた高周波変動電位印加の条件では、ほとんど剥離せず死滅してしまった。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明は微生物を扱う分野に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００７７】
配列番号1：PCRプライマーBac 27F
配列番号2：PCRプライマーBac 1492R
配列番号3：PCRプライマーM13Rv
配列番号4：PCRプライマーM13M4
配列番号5：PCRプライマーBac338F
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
0005888734.tif 000015
【配列表】
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