(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）(i)皮膚弾力改善効能を評価しようとする候補物質を用いずにコラーゲンと糖を反応させた糖化コラーゲン対照群と、（ii）コラーゲン、糖及び皮膚弾力改善効能を評価しようとする候補物質を反応させた糖化コラーゲン実験群とを製造し、前記の対照群（i）及び実験群（ii）のそれぞれに線維芽細胞を混合し、コラーゲン水溶液を作る段階；
ｂ）前記対照群（i）及び実験群（ii）の各コラーゲン水溶液を培養挿入体の内部に入れてゲルとして固めて３次元的形態を構築する段階；
ｃ）上記ｂ）段階において培養挿入体の内部で作られた対照群（i）及び実験群（ii）の各ゲルをそれぞれ培養し、真皮模倣体を製造する段階；
ｄ）製造した真皮模倣体を培養挿入体から分離後、３次元イメージ撮影装置を利用して当該真皮模倣体の形態の３次元イメージを取得する段階；及び
ｅ）上記ｄ）段階のイメージ化結果から、真皮模倣体の少なくとも高さ又は体積の変化を測定する段階
を含む真皮模倣体を利用した皮膚弾力改善効能評価方法。
【請求項２】
前記３次元イメージ撮影装置は、デジタルカメラであることを特徴とする請求項１に記載の真皮模倣体を利用した皮膚弾力改善効能評価方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の皮膚弾力改善効能評価方法を利用した皮膚弾力を改善させる化粧料のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、実際真皮と類似の３次元の真皮模倣体を製作し、真皮模倣体の変形程度の差異を測定することによって、皮膚弾力改善効能を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚真皮（ｄｅｒｍｉｓ）のコラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）は膠原繊維、エラスチン（ｅｌａｓｔｉｎ）は弾力繊維と呼ばれるタンパク質であり、真皮を構成する結合組織の主成分であって、皮膚の引張強度を決定する重要な構成成分である。元気な皮膚中のコラーゲンと線維芽細胞は、相互作用を通じて優れた収縮力を発揮し、皮膚のモチモチ感と弾力を維持する。しかし、年を取るについて線維芽細胞が元気でないか、コラーゲンの質が落ちるか、両方間の付着ポイントが堅くない場合には、皮膚を支持する力が緩くなり、皮膚の伸縮性が低下し、弾力を失って、シワの原因になる。
【０００３】
皮膚弾力において核心要素が真皮コラーゲンと線維芽細胞間の相互作用及び結合力なので、従来、コラーゲンゲル収縮分析法（ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｇｅｌ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ、１７、７８８−７８９）を利用してコラーゲンと線維芽細胞の相互作用を測定していた。具体的には線維芽細胞とコラーゲンを混合してゲルを作って、一般培養ディッシュで培養した後、各ゲルの収縮程度を比較し、物質処理によるコラーゲンと線維芽細胞の相互作用の変化を観察し、デジタルイメージ（写真）を利用して各ゲルの表面積を計算することによって皮膚弾力度を評価した。
【０００４】
しかし、このような方法は、２次元的な結果を示すものなので、実際皮膚で起きることができる変化を３次元的に示し、さらに視覚的に示すことができないという短所がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者は、培養挿入体（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｓｅｒｔ）を利用して３次元的形態で構築した真皮模倣体を製造し、物質処理後、上記真皮模倣体の構造崩壊程度を観察することによって、実際皮膚で示すことができる変化を予測することができることを知見し、本発明を完成した。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、皮膚弾力改善効能を３次元的に評価することができる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は、ａ）(i)皮膚弾力改善効能を評価しようとする候補物質を用いずにコラーゲンと糖を反応させた糖化コラーゲン対照群と、（ii）コラーゲン、糖及び皮膚弾力改善効能を評価しようとする候補物質を反応させた糖化コラーゲン実験群とを製造し、前記の対照群（i）及び実験群（ii）のそれぞれに線維芽細胞を混合し、コラーゲン水溶液を作る段階；ｂ）前記対照群（i）及び実験群（ii）の各コラーゲン水溶液を培養挿入体の内部に入れてゲルとして固めて３次元的形態を構築する段階；ｃ）上記ｂ）段階において培養挿入体の内部で作られた対照群（i）及び実験群（ii）の各ゲルをそれぞれ培養し、真皮模倣体を製造する段階；ｄ）製造した真皮模倣体を培養挿入体から分離後、３次元イメージ撮影装置を利用して当該真皮模倣体の形態の３次元イメージを取得する段階；及びｅ）上記ｄ）段階のイメージ化結果から、真皮模倣体の少なくとも高さ又は体積の変化を測定する段階；を含む真皮模倣体を利用した皮膚弾力改善効能評価方法を提供する。
【０００８】
また、本発明は、前述した皮膚弾力改善効能評価方法を利用した皮膚弾力を改善させる化粧料のスクリーニング方法を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、真皮模倣体を利用して物質処理による真皮模倣体の崩壊程度を３次元イメージで評価することによって、物質処理による線維芽細胞とコラーゲン繊維間の結合力及び相互作用変化を観察することができると共に、上記変化が実際皮膚で起こすことができる変化を予測することができ、弾力低下、垂れなどの現象を視覚的に示すことができ、且つ、本発明の評価方法により皮膚弾力を改善させることができる製品を容易にスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明による真皮模倣体の断面図をＨＥ（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−ｅｏｓｉｎ）染色写真を通じて示したものである。
【図２】図２は、従来コラーゲンゲル収縮分析法及び本発明による真皮模倣体を利用した評価方法を利用するときの結果を示したものである。
【図３】図３は、本発明による真皮模倣体を利用して皮膚弾力改善効能を評価した結果を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、真皮模倣体利用して皮膚の弾力変化を３次元で示すことによって、化粧品が提供する皮膚弾力改善効能を視覚的に表現することができる方法に関する。
【００１２】
本発明による真皮模倣体を利用して皮膚弾力改善効能を評価する方法は、下記の段階を含む：
ａ）(i)皮膚弾力改善効能を評価しようとする候補物質を用いずにコラーゲンと糖を反応させた糖化コラーゲン対照群と、（ii）コラーゲン、糖及び皮膚弾力改善効能を評価しようとする候補物質を反応させた糖化コラーゲン実験群とを製造し、前記の対照群（i）及び実験群（ii）のそれぞれに線維芽細胞を混合し、コラーゲン水溶液を作る段階；ｂ）前記対照群（i）及び実験群（ii）の各コラーゲン水溶液を培養挿入体の内部に入れてゲルとして固めて３次元的形態を構築する段階；ｃ）上記ｂ）段階において培養挿入体の内部で作られた対照群（i）及び実験群（ii）の各ゲルをそれぞれ培養し、真皮模倣体を製造する段階；ｄ）製造した真皮模倣体を培養挿入体から分離後、３次元イメージ撮影装置を利用して当該真皮模倣体の形態の３次元イメージを取得する段階；及びｅ）上記ｄ）段階のイメージ化結果から、真皮模倣体の少なくとも高さ又は体積の変化を測定する段階。
【００１３】
従来の評価方法であるコラーゲンゲル収縮分析法は、線維芽細胞とコラーゲンを混合してゲルを作った後、一般培養ディッシュで培養し、コラーゲンゲルを製造し、製造期間中にコラーゲンゲルは、培地内に浮かんでいる状態である。一方、本発明による評価方法は、培養挿入体（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｓｅｒｔ）を利用して３次元的な形態を構築し、コラーゲンゲルを一般培養ディッシュでなく、培養挿入体の内部に付着させて培養させるという点において差異がある。この際、培養過程中に線維芽細胞による真皮改造過程（ｄｅｒｍａｌ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）が起きる。真皮改造過程は、線維芽細胞がコラーゲン繊維と結合し、コラーゲン繊維の配列を調節することによって、真皮模倣体を構造的に安定化させる過程である。
【００１４】
上記のように製造された真皮模倣体の断面図を図１に示した。図１の写真は、ＨＥ（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−ｅｏｓｉｎ）染色したものであり、これを見れば、本発明の真皮模倣体は、線維芽細胞による真皮改造過程を通じて実際真皮層のようにコラーゲンマトリックスで線維芽細胞がネットワークを形成していて、本発明の真皮毛糸逓加実際真皮と構造的に非常に類似していることを確認することができる。
【００１５】
本発明では、真皮模倣体を製造するためにコラーゲンと糖を反応させてコラーゲン糖化（ｇｌｙｃａｔｉｏｎ）が誘導されたものでコラーゲンゲルを作る。皮膚老化によりコラーゲン糖化が起き、これは、コラーゲンと線維芽細胞の結合を低下させて皮膚弾力が低下し、皮膚垂れ現象が起きるようになる。したがって、本発明では、弾力が劣化する真皮模倣体を製造するために、実際皮膚で起きるコラーゲン糖化を誘導した。糖化されたコラーゲンの場合には、真皮改造過程がコラーゲン繊維に付いている糖に起因して円滑に行われないので、糖化されたコラーゲンで製作された真皮模倣体は、構造的に不安定になる。この際、コラーゲン糖化を誘導するために使用される糖の種類としては、特に限定されないが、好ましくは、リボースを使用する。
【００１６】
また、本発明では、皮膚弾力改善効能を評価しようとする候補物質を糖と一緒に同時に添加し、コラーゲンと反応させることによって、候補物質のコラーゲン糖化抑制能を評価することによって、これを通じて候補物質の皮膚弾力改善効能を評価する。この際、既存のコラーゲンゲル収縮分析法は、コラーゲンゲルの２次元的な結果を提供し、コラーゲンゲルの収縮程度をゲルの表面積変化により判断した。しかし、本発明の真皮模倣体を利用した評価方法は、３次元的な結果を提供し、真皮模倣体の構造崩壊程度を真皮模倣体の体積変化により判断することができる。
【００１７】
本発明による真皮模倣体を利用した皮膚弾力改善効能評価方法を利用することによって、皮膚弾力改善に効果があるものと推測される候補物質を処理し、これらが弾力改善に及ぶ効能を視覚的に示して評価することができるので、皮膚弾力改善効能を有する物質を容易にスクリーニングすることができる。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。
【００１９】
［参考例１］真皮模倣体の製造方法
本発明において使用する真皮模倣体は、下記の方法で製造することができる
【００２０】
１．エピチューブ（Ｅｐｉ  ｔｕｂｅ）に４０μＬの１０Ｘ  Ｐバッファー｛ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ粉末、Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ））３個、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２営養分混合物（Ｆ−１２粉末、Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）１個、抗生剤−抗真菌剤（ＰＳＦ、Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）４ｍＬを滅菌した蒸留水４００ｍＬに入れ、溶かしたもの｝、４０μＬの再構成バッファー（Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）（０．０５Ｍ  ＮａＯＨ  １００ｍＬに２．２ｇのＮａＨＣＯ3と４．７７ｇのＨＥＰＥＳを溶かした後、濾過したもの）、２μＬの５Ｍ  ＮａＯＨを入れ、よく混ぜる。
【００２１】
２．上記１に正常コラーゲン水溶液または糖化されたコラーゲン水溶液３２０μＬを入れ、ピペットを利用してよく混ぜる。
【００２２】
３．上記２に１０4個の線維芽細胞（ｈｕｍａｎ  ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ＨＤＦｎ、Ｃａｓｃａｄｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、ＵＳＡ）を入れ、ピペットでよく混合し、線維芽細胞が溶液中に均一に分布するようにする。
【００２３】
４．１２ウェル細胞培養ディッシュの内部に培養挿入体｛ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｓｅｒｔ、１２ｍｍ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ｝を装着し、上記３の混合液を培養挿入体の内部に入れた後、３７℃で３０分間反応させてコラーゲン水溶液を固める。
【００２４】
５．コラーゲンが完全に固くなれば、培養挿入体の内部及び外部に共に線維芽細胞培養培地（Ｍ１０６、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、ＵＳＡ）を入れ、一晩培養する。その後、３日に一度ずつ培地を交換しながら約一週間真皮模倣体を培養する。この過程で線維芽細胞とコルラゼン繊維間の相互作用により真皮改造過程が起きる。
【００２５】
［実施例１］コラーゲンゲル収縮分析法と真皮模倣体を利用した評価方法の比較
コラーゲンとリボースを反応させて、コラーゲン糖化（ｇｌｙｃａｔｉｏｎ）を誘導した後、コラーゲンゲルと真皮模倣体をそれぞれ作って、コラーゲン糖化が皮膚に与える影響を評価した。
【００２６】
具体的に、真皮模倣体は、上記参考例１の方法で製造したものであり、この際、参考例１の製造方法での段階２で使用した糖化されたコラーゲン溶液は、コラーゲンにリボースを０、６２．５、１２５及び２５０ｍＭの濃度で処理し、コラーゲン糖化を誘導したものである。また、リボースとしては、Ｄ−（−）−リボース（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を水に溶かした後、０．２μｍフィルター｛Ｍｉｎｉｓａｒｔ（登録商標）、ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ  ｓｔｅｄｉｍ  ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ｝で精製して使用した。
【００２７】
また、具体的なコラーゲンの糖化方法は、次の通りである。コラーゲンの汚染防止のためにクリーンベンチ内でコラーゲン水溶液｛タイプＩコラーゲン（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を０．１％酢酸に溶かして、最終濃度を３ｍｇ／ｍＬに作ったもの｝に特定濃度（６２．５、１２５及び２５０ｍＭ）でＤ−（−）−リボースを添加し、３６０度回転が可能な混合器（ｒｏｔａｔｉｏｎ  ｍｉｘｅｒ）に装着した後、常温で３日間反応させることによって、コラーゲンの糖化を誘導した。
【００２８】
上記のような方法で真皮模倣体の培養が終了すれば、外科用メスを利用して真皮模倣体を培養挿入体から分離し、細胞培養ディッシュ上に載置し後、時間の経過による真皮模倣体の体積変化を観察した。一般的に真皮模倣体は、培養挿入体から分離し、約１０分後に観察し、ＤＳＬＲカメラ（Ｃａｎｏｎ  Ｋｉｓｓ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｎ、Ｃａｎｏｎ  Ｉｎｃ．、Ｊａｐａｎ）を利用して３次元イメージを得、イメージ上の各真皮模倣体の高さの差に重点を置いてイメージを分析した。
【００２９】
構造的に安定した真皮模倣体は、体積変化が大きくないが、不安定な真皮模倣体の場合は、培養挿入体から分離すれば、時間が経過するにつれて崩れる現象が発生し、イメージ上で高さが低くなり、次第に体積が減少するようになる。したがって、イメージ上の真皮模倣体の高さは、真皮模倣体の構造的安定性と比例するようになる。
【００３０】
また、比較のためにこれと共に上記のような濃度のリボースを処理して得た糖化されたコラーゲンに線維芽細胞を混合したコラーゲンゲルを一般培養ディッシュで培養し、これに対するデジタルイメージ写真を得て、２次元的方法であるコラーゲンゲル収縮分析法を実施した。
【００３１】
上記２つの方法で得た結果は、図２に示した。
図２の１）は、コラーゲンゲルが正常に収縮しない２次元的結果を示している。これは、リボース処理によってコラーゲンゲルが収縮せず、まるで横に広がったように見える。
【００３２】
また、図２の２）は、コラーゲン糖化によって弱くなった真皮模倣体が正常な形態を維持せず、変形される（崩れる）結果を示す。この方法は、３次元的な構造変化を示すことによって、コラーゲン糖化により真皮が弾力を失って変形し、垂れが起きるようになることを視覚的に示す。
【００３３】
このように図２を見れば、既存のコラーゲンゲル収縮分析法は、結果を２次元的に提示するが、本発明の方法は、結果を３次元的に視覚化して提示することができるので、実際皮膚で起きることができる変化をさらに効果的に示すことができる。
【００３４】
［実施例２］真皮模倣体を利用した皮膚弾力改善効能評価
皮膚弾力改善に効果がある物質をスクリーニングするために、本発明による上記参考例１の真皮模倣体を利用した。
【００３５】
具体的に、本実験では、コラーゲン糖化を誘導しないコラーゲン（正常コラーゲン）；６２．５ｍＭのリボースを処理し、コラーゲン糖化を誘導したコラーゲン；６２．５ｍＭのリボースと１０ｐｐｍトコフェロールを一緒に処理し、コラーゲン糖化を誘導したコラーゲン；及び６２．５ｍＭのリボースと１ｐｐｍ  ＤＰＨＰを一緒に処理し、コラーゲン糖化を誘導したコラーゲンを準備した。この際、リボースは、Ｄ−（−）−リボース（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を水に溶かした後、０．２μｍフィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ、ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ  ｓｔｅｄｉｍ  ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で精製して使用した。
【００３６】
また、具体的なコラーゲンの糖化方法は、次の通りである。コラーゲンの汚染防止のためにクリーンベンチ内でコラーゲン水溶液｛タイプＩコラーゲン（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を０．１％酢酸に溶かし、最終濃度を３ｍｇ／ｍＬに作ったもの｝に６２．５ｍＭの濃度でＤ−（−）−リボースと場合によって１０ｐｐｍトコフェロールまたは１ｐｐｍ  ＤＰＨＰを添加し、３６０度回転が可能な混合器（ｒｏｔａｔｉｏｎ  ｍｉｘｅｒ）に装着した後、常温で３日間反応させることによって、コラーゲンの糖化を誘導した。
【００３７】
上記のような方法で準備したコラーゲンに線維芽細胞を混合した後、これを３次元的形態で構築した培養挿入体｛１２ｍｍ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ｝の内部に付着して培養することによって、真皮模倣体を製造した。
【００３８】
真皮模倣体の培養が終了すれば、外科用メスを利用して真皮模倣体を培養挿入体から分離し、細胞培養ディッシュ上に載置した後、培養挿入体から分離し、約１０分後に観察したしＤＳＬＲカメラ（Ｃａｎｏｎ  Ｋｉｓｓ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｎ、Ｃａｎｏｎ  Ｉｎｃ．、Ｊａｐａｎ）を利用して３次元イメージを得て、イメージ上の各真皮模倣体の高さの差に重点を置いてイメージを分析した。それぞれの真皮模倣体に対する３次元イメージは、図３に示した。
【００３９】
図３を見れば、真皮模倣体がリボースの処理によって形態が崩れることを確認することができる。しかし、公知された抗老化物質であるトコフェロールまたはＤＰＨＰを一緒に処理した場合には、真皮模倣体の崩れが抑制されることを確認することができる。
【００４０】
このように本発明による方法を使用するとき、候補物質が皮膚老化によるコラーゲン糖化を抑制し、皮膚弾力を増加させることができることを視覚的に容易に評価することができ、本発明を利用して皮膚弾力の増加に役立つ物質を効果的にスクリーニングすることができる。
【図１】
0005934714.tif 000002
【図２】
0005934714.tif 000003
【図３】
0005934714.tif 000004