(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵プロセスにおいてグリコール酸を生産するための方法であって、
−炭素源を含んでなる適当な培養培地中で、大腸菌種の改変微生物を培養する工程、
−該微生物において外部刺激により標的遺伝子の発現を調整する工程、および
−該培養培地からグリコール酸を回収する工程
を含んでなり、
該微生物において、少なくともｉｃｄ遺伝子の発現が異種誘導プロモーターの制御下にあり、そのプロモーター活性が該外部刺激により調整される、方法。
【請求項２】
外部刺激が、物理的または化学的刺激である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
外部刺激が、温度または光の中から選択される物理的刺激である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
誘導プロモーターが、温度により誘導され、かつ
−λファージの改変レプレッサーにより調節されるプロモーター、例えば、
・プロモーターＰＲまたは該プロモーターＰＲの誘導体、
・プロモーターＰＬまたは該プロモーターＰＬの誘導体など、
−温度感受性Ｌａｃレプレッサーにより調節される改変ｌａｃプロモーター
の中から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記λファージの改変レプレッサーが、λレプレッサーｃＩの温度不安定性対立遺伝子、特にλレプレッサー対立遺伝子ｃＩ８５７である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
改変微生物において、遺伝子ｒｅｃＡが欠失している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
外部刺激が、化学的刺激であり、該刺激が、
−炭素異化代謝産物の抑制の変化、
−特定の炭素源の存在、または
−糖アルコールの存在
の中から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
誘導プロモーターの使用によって、３７℃〜４２℃でｉｃｄ遺伝子の発現が可能になり、２８℃〜３２℃でｉｃｄ遺伝子の発現が抑制される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
培養培地中の生産されたグリコール酸の回収が、培養培地中に存在するグリコール酸の誘導体および前駆体の回収を含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
グリコール酸生産の向上のために改変された大腸菌種の微生物であって、該改変微生物において、少なくともｉｃｄ遺伝子の発現が、請求項１〜９のいずれか一項に記載の異種誘導プロモーターの制御下にある、微生物。
【請求項１１】
前記誘導プロモーターの使用によって、３７℃〜４２℃でｉｃｄ遺伝子の発現が可能になり、２８℃〜３２℃でｉｃｄ遺伝子の発現が抑制される、請求項１０に記載の微生物。
【請求項１２】
３０世代後にグリコール酸生産が初期生産の少なくとも５０％である、請求項１０または１１に記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵によるグリコール酸の生産における誘導プロモーターの使用に関する。誘導プロモーターの使用によって、より安定したグリコール酸生産株がもたらされる。
【背景技術】
【０００２】
グリコール酸（ＨＯＣＨ２ＣＯＯＨ）、またはグリコレートは、カルボン酸のα−ヒドロキシ酸ファミリーの最も単純なメンバーである。グリコール酸は、極めて小さい分子に、アルコール官能基とやや強酸性の官能基の両方を有し二重機能性を備えている。グリコール酸はその特性により、井戸の復旧、皮革工業、石油ガス工業、クリーニングおよび繊維工業における使用を含む幅広い消費者および工業用途に、またパーソナルケア製品の成分として理想的なものとなる。
【０００３】
グリコール酸はまた、ポリグリコール酸を含んでなる熱可塑性樹脂をはじめとする多様なポリマー材料を製造するためにも使用することができる。ポリグリコール酸を含んでなる樹脂は優れた気体遮断性を有し、このような、ポリグリコール酸を含んでなる熱可塑性樹脂は、同じ特性を有する包装材料（例えば、飲料容器など）を作製するためにも使用し得る。ポリエステルポリマーは水性環境中で、制御可能な速度で徐々に加水分解する。ポリエステルポリマーはこの特性により、溶ける縫合糸などの生物医学用途や、ｐＨを下げるために酸の放出制御が必要とされる用途において有用なものとなる。現在、米国では、年間１５，０００トンを超えるグリコール酸が消費されている。
【０００４】
グリコール酸は、サトウキビ、ビーツ、ブドウおよび果物中に微量成分として天然に存在するが、主に合成により生産される。グリコール酸を生産するための技術は文献または特許出願において記載されている。例えば、Mitsui Chemicals, Inc.により、微生物を用いることによる、末端にヒドロキシル基を有する脂肪族多価アルコールからの該ヒドロキシカルボン酸の生産方法が記載されている（ＥＰ２０２５７５９Ａ１およびＥＰ２０２５７６０Ａ１）。この方法は、片岡道彦氏によって、エチレングリコール酸化微生物を用いたグリコール酸生産に関する研究論文において記載されたもののような生物変換である(Biosci. Biotechnol. Biochem., 2001)。
【０００５】
グリコール酸はまた、Dupont de Nemours and CoによってＷＯ２００６／０６９１１０および米国特許第７，４４５，９１７号において開示されているように、ニトリラーゼ活性が改善された変異ニトリラーゼを用いた、グリコロニトリルからの生物変換によっても生産される。これらの文献には、グリコロニトリル合成のために前駆体としてホルムアルデヒドおよびシアン化水素を用い、グリコロニトリルからのグリコール酸合成のためにニトリラーゼ活性を有する酵素触媒を用いるプロセスが教示されている。このプロセスの大きな欠点は、グリコロニトリルが、微量の酸または塩基の影響下で激しく重合する可能性がある化学物質であり、火災や爆発の危険があるということである。この物質は加熱により分解し、シアン化水素および酸化窒素を含む毒性ガスを発生する。そのため、グリコロニトリルは極めて危険な物質として記載されている。
【０００６】
細菌株を用いた、糖から、特に再生可能資源からの発酵によるグリコール酸の生産方法は、Metabolic Explorer社の特許出願（ＷＯ２００７／１４１３１６およびＷＯ２０１０／１０８９０９）において開示されている。
【０００７】
グリコール酸の生物学的生産には、細菌の中央代謝からの中間体の形成が必要される（図１を参照）。クレブス回路とグリオキシル酸短絡回路の合流点にあるイソクエン酸がそれらの１つである（トリカルボン酸回路およびグリオキシル酸側路、Neidhardt, F. C. (Ed. in Chief), R. Curtiss III, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. SchaechterおよびH. E. Umbarger (eds). 1996. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. American Society for Microbiologyに総説されている）。イソクエン酸は、（１）コハク酸とグリオキシル酸に分解されるか（ａｃｅＡ遺伝子によってコードされるイソクエン酸リアーゼにより触媒される反応）または（２）ｉｃｄ遺伝子によってコードされるイソクエン酸デヒドロゲナーゼによりα−ケトグルタル酸へ変換される。特許出願ＥＰ２０２７２７７に記載されている先行研究には、ｉｃｄ遺伝子の発現が減弱された株によるグリコール酸の良好な生産が示された。ＴＣＡ回路におけるフラックスを減少させてグリオキシル酸短絡回路に向かわせることによってグリコール酸生産の収率は大幅に高まったが、同時に、それによってその株は減弱した。
【発明の開示】
【０００８】
ｉｃｄ遺伝子の発現が減弱された株は、何世代にもわたって増殖させた場合には安定せず、これは工業用途ではかなり不都合である。著者らは、誘導プロモーターを使用することによりその問題の解決法を見出した。
【０００９】
バイオテクノロジーのプロセスにおける誘導プロモーターの使用は、工業バイオテクノロジーの分野である。これらのプロモーターは通常化学的または物理的刺激に応答し、これらの刺激は、プロピオネート（ＷＯ２００７００５８３７）、亜鉛（ＷＯ２００４０２０６４０）、アラビノース（ＷＯ１９９８０１１２３１）、温度(‘Microbial conversion of glycerol to 1,3-propanediol by an engineered strain of Escherichia coli.’ Tang X, Tan Y, Zhu H, Zhao K, Shen W. Appl Environ Microbiol. 2009 Mar; 75(6): 1628-34.)および光により例示される。
【００１０】
効率的なグリコール酸生産は経路の緻密な調整を必要とする。グリコール酸生産を最大とし、生産株の安定性を向上させるには、プロセス中に特定の重要な酵素の発現を調整できることが有益となり得る。例えば、ｉｃｄ遺伝子の発現はバイオマス生産には絶対必要であるが、グリコール酸生産には必要なく、ａｃｅＡの場合はその逆である。従って、誘導プロモーターの使用は、工業レベルでグリコール酸を生産する総収率を向上させる上で注目されるものであり得る。
【００１１】
現時点では、グリコール酸生産に関与する遺伝子の発現を制御するための誘導プロモーターの使用は考慮も報告もされたことがない。
【００１２】
本発明者らは、グリコール酸生合成などの複雑な代謝経路に関与する遺伝子の遺伝子発現を調節するために使用される場合に異種誘導プロモーターが有益であることを見出した。
【００１３】
発明の概要
本発明は、発酵プロセスにおいてグリコール酸を生産するための方法であって、
−炭素源を含んでなる適当な培養培地中で改変微生物を培養する工程、
−該微生物において外部刺激により標的遺伝子の発現を調整する工程、および
−該培養培地からグリコール酸を回収する工程
を含んでなり、
該改変微生物において、グリコール酸生産に関与する少なくとも１つの遺伝子の発現が異種誘導プロモーターの制御下にあり、そのプロモーター活性が該外部刺激により調整される方法に関する。
【００１４】
本発明はまた、グリコール酸生合成に関与する少なくとも１つの遺伝子の発現が異種誘導プロモーターの制御下にある、グリコール酸生産のために改変された微生物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】グリコール酸生合成経路。
【００１６】
発明の具体的説明
本発明は、発酵プロセスにおいてグリコール酸を生産するための方法であって、
−炭素源を含んでなる適当な培養培地中で改変微生物を培養する工程、
−該微生物において外部刺激により標的遺伝子の発現を調整する工程、および 
−該培養培地からグリコール酸を回収する工程
を含んでなり、
該改変微生物において、グリコール酸生産に関与する少なくとも１つの遺伝子の発現が異種誘導プロモーターの制御下にあり、そのプロモーター活性が該外部刺激により調整される方法に関する。
【００１７】
「グリコール酸」または「グリコレート(gycolate)」とは、互換的に用いられ、同じ意味を有する。それらの用語は、カルボン酸のα−ヒドロキシ酸ファミリーの最も単純なメンバーである式ＨＯＣＨ２ＣＯＯＨの分子を表す。
【００１８】
本発明によれば、「発酵プロセス」、「発酵」または「培養」とは、適当な増殖培地での細菌の増殖を表して互換的に用いられる。
【００１９】
発酵プロセスにおいてグリコール酸を生産するための方法は当業者によく知られている。プロセスを至適化するために、炭素源の選択など、発酵プロセスの種々の因子を調整することができる。
【００２０】
「適当な培養培地」とは、微生物の培養および増殖に適当な培地である。このような培地は、微生物の発酵の分野で周知であり、培養される微生物によって異なる。適当な培養培地は、炭素源を含んでなる。「炭素源」とは、微生物によって代謝され得る任意の炭素源を意味し、その基質は少なくとも１つの炭素原子を含む。炭素源は、グルコース、スクロース、単糖類（フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノースなど）、オリゴ糖類（ガラクトース、セロビオースなど）、多糖類（セルロースなど）、デンプンまたはその誘導体、グリセロールおよび単一炭素基質からなる群の中から選択され、それによってグリオキシル酸が生産される。特に好ましい炭素源はグルコースである。もう１つの好ましい炭素源はスクロースである。
【００２１】
本発明の特定の実施形態では、炭素源は再生可能な供給原料に由来する。再生可能な供給原料は、短期のうちに、目的生成物へのその変換を可能とするに十分な量で再生され得る、特定の工業プロセスに必要とされる原料と定義される。
【００２２】
発酵は一般に、少なくとも１つの単純炭素源、および必要であれば代謝産物の生産のための補助基質を含有する、使用する微生物に適合された適当な培養培地の入った発酵槽で行われる（特許出願ＥＰ０９１７１２９７．６に記載のとおりである）。
【００２３】
当業者ならば、本発明による微生物に対する培養条件を定義することができる。特に、細菌は２０℃〜５５℃の間、好適には２５℃〜４０℃の間、より具体的には、大腸菌(E. coli)では約３０℃〜３７℃の温度で発酵される。
【００２４】
大腸菌に対する既知の培養培地の例として、その培養培地はＭ９培地(Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32: 120-128)、Ｍ６３培地(Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)またはSchaefer et al. (1999, Anal. Biochem. 270: 88-96)により定義されているものなどの培地と同一または類似の組成であり得る。
【００２５】
「微生物」とは、細菌、酵母または真菌を表す。細菌はグラム陽性菌またはグラム陰性菌の中から選択される。好適には、微生物は、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)などのグラム陰性菌の中から、またはバチルス科(Bacillaceae)、ストレプトミセス科(Streptomycetaceae)およびコリネバクテリウム科(Corynebacteriaceae)などのグラム陽性菌の中から選択される。より好適には、微生物は、エシェリキア属(Escherichia)、クレブシェラ属(Klebsiella)、パンテア属(Pantoea)、サルモネラ菌属(Salmonella)またはコリネバクテリウム属(Corynebacterium)の種である。いっそうより好適には、微生物は、大腸菌（Escherichia coli）またはコリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)種のいずれかである。
【００２６】
「改変微生物」とは、グリコール酸生産の向上を示す遺伝的に改変された微生物を表す。「グリコール酸生産の向上」とは、微生物により生産されるグリコール酸の量、特にグリコール酸収率（炭素源当たりに生産されるグリコール酸の割合）が、対応する非改変微生物に比べて改変微生物で高いことを意味する。
【００２７】
本発明の方法で用いられる改変微生物は、
−グリコール酸生産を向上させるために改変されている、および
−グリコール酸生産に関与する少なくとも１つの遺伝子の発現が誘導プロモーターの直接的または間接的制御下にある
という２つの特徴を有する。
【００２８】
「培養培地からグリコール酸を回収する」とは、グリコール酸を回収する操作を表す。グリコール酸の回収は、細菌中または培地中でのグリコレートの濃縮、および発酵培養の最終産物中に場合により一部または全量（０〜１００％）が残存している発酵液および／またはバイオマスからのグリコール酸の単離からなる工程により行われる。場合により、該プロセスは、工程（ａ）で生産されたグリコール酸を少なくともグリコール酸二量体への重合工程を通じて回収すること、および（ｂ）グリコール酸二量体、オリゴマーおよび／またはポリマーからの脱重合によりグリコール酸を回収することからなる工程を含む。本発明の特定の実施形態によれば、回収工程は、培養培地中に存在するグリコール酸の誘導体および前駆体を回収することを含む。
【００２９】
「標的遺伝子の発現を調整すること」とは、遺伝子の発現を可能にするかまたは抑制することを意味する。この調整は、誘導プロモーターを用いて達成される。当業者ならば、この調整の目的に応じて、使用する誘導系の種類が分かる。
【００３０】
「誘導プロモーター」とは、そのプロモーター活性が外部刺激に対して増強または低減され得るプロモーターを表す。刺激は、温度、光、化学物質などの、本来物理的または化学的なものであり得る。
【００３１】
標的遺伝子の誘導は、刺激の直接的または間接的伝達を介して得ることができる。
【００３２】
間接的伝達は、誘導プロモーターの制御下にありかつグリコール酸生合成に関与する標的遺伝子の発現を駆動する特定のプロモーターを認識する異種ＲＮＡポリメラーゼを用いることにより達成することができる。この場合、誘導プロモーターは標的遺伝子のプロモーターには直接連結されていないが、標的遺伝子の前記プロモーターを転写するＲＮＡポリメラーゼの発現を駆動する。
【００３３】
これらの異種ＲＮＡポリメラーゼは、例えば、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたは当業者に知られているその他のポリメラーゼとすることができる。
【００３４】
直接的伝達は、１つの標的遺伝子の発現が誘導プロモーターの制御下にある場合に達成される。
【００３５】
「異種誘導プロモーターの制御下」とは、誘導プロモーターがその遺伝子の天然プロモーターではなく、それに機能し得る形で連結された遺伝子の発現レベルを少なくとも部分的に制御するように導入されたものであることを表す。誘導プロモーターの活性は、生物因子または非生物因子の有無によって誘導される。遺伝子の発現は、当業者の必要に応じてオン、オフが可能である。これらのプロモーターは化学的に調節（テトラサイクリン、ホルモンなどの存在下）されても、または物理的に調節（特に熱または光による）されてもよい。
【００３６】
本発明の特定の実施形態では、グリコール酸生産に関与する少なくとも１つの遺伝子の発現は異種誘導プロモーターの直接的制御下にある。この誘導プロモーターは物理的刺激によりまたは化学的刺激により誘導され得る。
【００３７】
本発明の第１の態様において、外部刺激は温度または光の中から選択される、すなわち、誘導プロモーターは、温度誘導プロモーターまたは光誘導プロモーターである。
【００３８】
誘導プロモーターは、有利には温度により誘導され、
−λファージの改変レプレッサーにより調節されるプロモーター、例えば、
・プロモーターＰＲまたは該プロモーターＰＲの誘導体、
・プロモーターＰＬまたは該プロモーターＰＬの誘導体など、
−温度感受性Ｌａｃレプレッサーにより調節される改変ｌａｃプロモーター
の中から選択される。
【００３９】
これらのプロモーターに関し、書誌参照は以下である。
・A genetic switch. Ptashne M. Blackwell Scientific, Cambridge, MA. 1986; 
・A genetic switch: Phage lambda revisited. Ptashne M. Cold Spring Harbor Lab Press. Cold Spring Harbor, NY. 2004; 
・The bacteriophages, Part II: Life of phages, 8. Gene regulatory circuitry of phage λ. Little J. 2nd edition 2004. Richard Calendared. Oxford University Press; 
・Bukrinsky et al., Gene, 70 (1998) 415-417; 
・Mandal & Lieb, 1976, 
・Winstanley et al., 1989。
【００４０】
レプレッサーは、プロモーター領域の特定の結合部位に結合し、それによりプロモーターへのＲＮＡポリメラーゼの接近を制限し、転写の開始または伸長を減じることによって、同族プロモーターからの発現を抑制する。
【００４１】
本発明の態様によれば、λファージ改変レプレッサーはλレプレッサーｃＩの温度不安定性対立遺伝子である。有利には、該レプレッサーはλレプレッサー対立遺伝子ｃＩ８５７である(On a thermosensitive repression system in the Escherichia coli lambda bacteriophage. Sussman R, Jacob F. C. R. Hebd. Seances Acad. Sci. 1962, 254, p1517)。Sussman et al.は、３２℃で培養した場合には溶原状態にあるが、温度４０℃で１時間培養を維持した場合にその溶解が誘導される、新規バクテリオファージ変異株を報告している。
【００４２】
本発明の特定の態様では、グリコール酸生産のための改変微生物において、タンパク質ＲｅｃＡをコードする遺伝子ｒｅｃＡが欠失されている。タンパク質ＲｅｃＡは、ｃＩに対してプロテアーゼとして作用することが知られている。従って、ＲｅｃＡをコードする遺伝子の欠失によって、λレプレッサーｃＩのタンパク質分解は排除される。
【００４３】
温度誘導プロモーターは有利にはプロモーターＰＲまたは誘導体、およびプロモーターＰＬまたは誘導体の間で選択することができる。
【００４４】
別の実施形態では、温度誘導プロモーターは温度感受性Ｌａｃレプレッサーにより調節される改変ｌａｃプロモーターである。
【００４５】
本発明の第２の態様において、外部刺激は化学的刺激である、すなわち、誘導プロモーターは化学的に調節される。特に、プロモーター活性の誘導は炭素異化代謝産物の抑制の変化に関係している。炭素異化代謝産物の抑制により活性化されるプロモーターは、低濃度のグルコースまたはグルコースの不在下で、アクチベーター「ｃＡＭＰレプレッサータンパク質」（ＣＲＰ）を介して正の調節を受ける。
【００４６】
本発明の別の実施形態では、誘導プロモーターは、特定の炭素源または糖アルコールの存在により誘導される。炭素源または糖アルコールにより誘導されるプロモーターの例としては、それぞれアラビノースまたはラフィノースプロモーター、およびマンニトールプロモーターまたはグルシトールプロモーターが挙げられる。
【００４７】
誘導の原理はタンパク質構造に基づいている。特定の刺激（物理的または化学的刺激のいずれか）により活性化されるプロモーターでは、同族レプレッサーはその天然型で活性である。特定の刺激の存在によってこのレプレッサーの構造変化が誘導され、この変化によってプロモーターに結合することができなくなり、それによって遺伝子転写が活性化される。逆に、特定の刺激により抑制されるプロモーターでは、同族レプレッサーはその天然型で不活性であり、特定の刺激の存在によってその構造変化が誘導され、この変化によって、遺伝子転写を抑制し得る活性型レプレッサーがもたらされる。
【００４８】
当業者ならば、使用する生物、培養条件および標的遺伝子発現の調整目的に応じて、物理的または化学的刺激により活性化または抑制される誘導プロモーターを選択することができる。
【００４９】
本発明の特定の態様によれば、目的遺伝子(「標的遺伝子」)の発現は「間接的伝達」を介して調節される、すなわち、グリコール酸生産に関与する少なくとも１つの遺伝子は異種ＲＮＡポリメラーゼにより転写され、その異種ＲＮＡポリメラーゼの発現が誘導プロモーターの制御下にある。
【００５０】
本発明の特定の実施形態では、異種ＲＮＡポリメラーゼはＴ７、Ｔ３ポリメラーゼから選択される。
【００５１】
本発明によれば、「標的遺伝子」は、グリコール酸生産またはその前駆体の生産に関与する少なくとも１つの遺伝子である。標的遺伝子は、異種誘導プロモーターの直接的または間接的制御下にあり、すでに説明したように、遺伝子は誘導プロモーターの直接的制御下にあるか、または遺伝子は誘導ＲＮＡポリメラーゼにより転写されるか、またはそれら両方の組合せである。
【００５２】
微生物においてグリコール酸生産に関与する遺伝子は当技術分野で公知であり、グリコール酸特異的生合成経路に関与する遺伝子、ならびに前駆体供給経路に関与する遺伝子およびグリコール酸消費経路に関与する遺伝子を含んでなる。
【００５３】
グリコール酸の効率的生産には、グリコール酸特異的経路およびいくつかの前駆体供給経路の至適化が必要である。グリコール酸生産株は特許出願ＥＰ２０２７２２７およびＷＯ２０１０／１０８９０９に記載されており、これらは引用することにより本願の一部とされる。
【００５４】
特に、前記グリコール酸生産株は、以下の改変の少なくとも１つを含んでなる。
−グリコレート以外の産物へのグリオキシル酸の変換の低減
（ａｃｅＢ、ｇｌｃＢ、ｇｃｌ、ｅｄａの減弱）
−グリコレートの実質的代謝不能（ｇｌｃＤＥＦＧ、ａｌｄＡの減弱）
−グリオキシル酸経路フラックスの増大（ｉｃｄ、ａｃｅＫ、ｐｔａ、ａｃｋＡ、ｐｏｘＢ、ｉｃｌＲもしくはｆａｄＲの減弱および／またはａｃｅＡの過剰発現）
−グリコレートへのグリオキシル酸の変換の増大（ｙｃｄＷの過剰発現）
−ＮＡＤＰＨのアベイラビリティーの増大（ｐｇｉ、ｕｄｈＡ、ｅｄｄの減弱）。
【００５５】
前記グリコール酸生産株は、以下の改変の少なくとも１つをさらに含んでなってよい。
−遺伝子ｌｄｈＡおよびｍｇｓＡの減弱
−遺伝子ａｒｃＡの減弱
−遺伝子ｇｌｃＡ、ｌｌｄＰおよびｙｊｃＧの少なくとも１つの減弱
【００５６】
本発明によれば、グリコール酸生産のためにすでに改変されている株においてグリコール酸生産を増大させるために、グリコール酸生産に関与する下記遺伝子の少なくとも１つを、そのプロモーター活性が外部刺激により調整される誘導プロモーターの制御下に置くことができる。
【００５７】
ａ）ＴＣＡ回路とグリオキシル酸短絡回路の交差点に関与する酵素をコードする遺伝子：
【表１】
0005882310.tif 000002
【００５８】
ｂ）グリコール酸生合成に直接的関与する酵素をコードする遺伝子：
【表２】
0005882310.tif 000003
【００５９】
ｃ）補因子ＮＡＤＰＨの生産および細胞のレドックス状態の調節に直接的または間接的に関与する酵素をコードする遺伝子：
【表３】
0005882310.tif 000004
【００６０】
ｄ）アンプレロティック経路(anplerotic pathways)に関与する遺伝子：
【表４】
0005882310.tif 000005
【００６１】
ｅ）酢酸代謝に関与する酵素をコードする遺伝子：
【表５】
0005882310.tif 000006
【００６２】
ｆ）グリコレートの膜輸送に関与する酵素をコードする遺伝子：
【表６】
0005882310.tif 000007
【００６３】
ｇ）副産物としてのラクテートの生産に関与する酵素をコードする遺伝子：
【表７】
0005882310.tif 000008
【００６４】
本発明によれば、グリコール酸生産を増大させるために、前述の遺伝子の少なくとも２つの遺伝子およびこれらの遺伝子の任意の組合せが誘導プロモーターの制御下に置かれる。
【００６５】
本発明の好ましい実施形態では、遺伝子ｉｃｄの発現は異種誘導プロモーターの直接的または間接的制御下にある。
【００６６】
酵素イソクエン酸デヒドロゲナーゼは、ＴＣＡ回路に属し、α−ケトグルタル酸へのイソクエン酸の変換を触媒する。イソクエン酸は、バイオマスへと導くＴＣＡ回路とグリコール酸へと導くグリオキシル酸短絡回路の合流点にあるため、これらの経路へのその分配はグリコール酸の生産に大きな影響を与える。
【００６７】
特定の実施形態では、遺伝子ｉｃｄは誘導プロモーターの制御下にあり、その誘導プロモーターによって、３７℃〜４２℃でｉｃｄ遺伝子の発現が可能になり、２８℃〜３２℃でｉｃｄ遺伝子の発現が抑制される。
【００６８】
本発明の好ましい実施形態では、改変微生物は、バイオマスを生産するために３７℃〜４２℃（ｉｃｄが発現される条件）およびグリコール酸を生産するために２８℃〜３０℃（ｉｃｄが抑制される条件）で増殖させる。
【００６９】
本発明の特定の実施形態では、培養培地中の生産されたグリコール酸の回収工程は、培養培地中に存在するグリコール酸の誘導体および前駆体の回収を含む。グリコール酸の「誘導体または前駆体」とは、グリコール酸の形成および分解の代謝経路における総ての中間化合物を表す。グリコール酸の前駆体は、特に、クエン酸、イソクエン酸、グリオキシル酸、一般に、グリオキシル酸回路の総ての化合物である。グリコール酸の誘導体は、特に、グリコール酸エチルエステル、グリコール酸メチルエステルなどのグリコール酸エステル、およびポリグリコール酸などのグリコレート含有ポリマーである。
【００７０】
誘導プロモーターにより制御される遺伝子は、染色体上のその天然の位置にあってもよいし、または天然でない位置に組み込まれてもよい。最適なグリコール酸生産を得るには、誘導プロモーターにより制御される遺伝子を１回または数回組み込む必要がある場合がある。同様に、最適な発現を得るには、一コピーまたは数コピーの調節遺伝子が必要となる場合がある。レプレッサー遺伝子コピーとプロモーターの種々の比率を用いて発現を緻密に調整することができる。
【００７１】
誘導プロモーターの制御下にある遺伝子は遺伝子座に組み込まれ、その改変がメチオニン生産に悪影響を与えないのが好適である。遺伝子を組み込み得る遺伝子座の例は下記の通りである。
【００７２】
【表８】
0005882310.tif 000009
0005882310.tif 000010
0005882310.tif 000011
0005882310.tif 000012
0005882310.tif 000013
0005882310.tif 000014
0005882310.tif 000015
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0005882310.tif 000017
0005882310.tif 000018
0005882310.tif 000019
【００７３】
本発明はまた、グリコール酸生産に関与する少なくとも１つの遺伝子の発現が、上に定義した異種誘導プロモーターの直接的または間接的制御下にある、グリコール酸生産の向上のために改変された微生物に関する。
【００７４】
前記微生物には、いくつかの改変、特に、以下の代謝性変化を可能とする改変が事前に導入された。
【００７５】
ｉ）前記微生物は、リンゴ酸シンターゼ（ａｃｅＢおよびｇｌｃＢ）、グリオキシル酸カルボリガーゼ（ｇｃｌ）および２−ケト−３−デオキシグルコン酸６−リン酸アルドラーゼ（ｅｄａ）をコードする遺伝子の不活性化により、グリオキシル酸をグリコレート以外の化合物へ代謝することができない。
ｉｉ）前記微生物は、遺伝子ｇｌｃＤＥＦおよびａｌｄＡの減弱により、グリコレートを代謝することができない。
ｉｉｉ）ｉｃｄ、ａｃｅｋ、ｐｔａ、ａｃｋ、ｐｏｘＢ、ｉｃｌＲまたはｆａｄＲの減弱および／またはａｃｅＡの過剰発現により、グリオキシル酸経路フラックスが増大される。
ｉｖ）ｙｃｄＷのような内因性コード遺伝子の過剰発現により、グリコレートへのグリオキシル酸の変換が増大される。
ｖ）遺伝子ｐｇｉ、ｕｄｈＡおよびｅｄｄの発現の減弱により、ＮＡＤＰＨのアベイラビリティーが増大される。
【００７６】
改変は特許出願ＥＰ２０２７２２７およびＷＯ２０１０／１０８９０９に記載されており、これらは引用することにより本明細書の一部とされる。
【００７７】
本発明の記載において、遺伝子およびタンパク質は大腸菌における対応する遺伝子の名称を用いて識別される。しかしながら、特に断りのない限り、これらの名称の使用は本発明に従うより一般的な意味を有し、他の生物、より詳しくは微生物における対応する遺伝子およびタンパク質の総てを包含する。
【００７８】
当業者ならば、ＧｅｎＢａｎｋに示されている既知の遺伝子に関する参照番号を用いて他の生物、細菌株、酵母、真菌、哺乳類、植物などにおける等価な遺伝子を決定することができる。この常法は、有利には、他の微生物由来の遺伝子との配列アラインメントを行い、縮重プローブを設計して、他の生物における対応する遺伝子をクローニングすることにより決定することができるコンセンサス配列を使用して行われる。これらの分子生物学の常法は当業者によく知られており、例えば、Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York)に記載されている。
【００７９】
ＰＦＡＭ(アラインメントのタンパク質ファミリーデータベースおよび隠れマルコフモデル(protein families database of alignments and hidden Markov models); (http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)は、タンパク質配列アラインメントを多数集めたものである。各ＰＦＡＭにより、多重アラインメントを視覚化し、タンパク質ドメインを調べ、生物間の分布を評価し、他のデータベースへのアクセスを確保し、既知のタンパク質構造を視覚化することができる。
【００８０】
主要な系統発生系を示す、完全に配列決定されたゲノムからのタンパク質配列を比較することにより、ＣＯＧ（タンパク質のオーソロガス群のクラスター(clusters of orthologous groups of proteins)；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）が得られる。各ＣＯＧは、少なくとも３つの系から定義されるので、前に保存されたドメインを同定することができる。
【００８１】
相同配列およびそれらの相同性％を同定する手段は当業者によく知られており、特にＢＬＡＳＴプログラムが挙げられ、このプログラムは、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/から、このウェブサイトに示されているデフォルトパラメーターとともに利用することができる。次に、得られた配列を、例えばプログラムＣＬＵＳＴＡＬＷ(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)またはＭＵＬＴＡＬＩＮ(http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/multalin.html)を、これらのウェブサイトに示されているデフォルトパラメーターとともに用いて活用する（例えば、アラインする）ことができる。
【００８２】
本発明の特定の態様では、グリコール酸を生産するために事前に遺伝的に改変された微生物は、ｉｃｄ、ａｃｅＡ、ｙｃｄＷ、ｐｇｉ、ｐｎｔＡＢ、ｕｄｈＡ、ａｒｃＡ、ｍａｅＡ、ｍａｅＢ、ｍｄｈ、ｐｃｋ、ｐｐｃ、ａｃｋＡ、ｐｔａ、ｐｏｘＢ、ｌｌｄＰ、ｇｌｃＡ、ｙｊｃＧ、ｌｄｈＡおよびｍｇｓＡの中から選択される、遺伝子発現が異種誘導プロモーターの制御下にある少なくとも１つの遺伝子を含む。より好ましくは、異種誘導プロモーターの制御下にある遺伝子はｉｃｄである。
【００８３】
本発明の好ましい態様では、改変微生物において、誘導プロモーターの使用によって、３７℃〜４２℃でｉｃｄ遺伝子の発現が可能になり、２８℃〜３２℃でｉｃｄ遺伝子の発現が抑制される。
【００８４】
本発明の別の実施形態では、前記微生物は、３０世代後に初期生産の少なくとも５０％、好適には、３０世代後に初期生産の少なくとも７０％、最も好ましくは、３０世代後に初期生産の９０％のグリコール酸生産を示す。
【００８５】
前記微生物は、工業規模での数世代の発酵培養の間中、はるかに安定したグリコール酸生産を示す。
【００８６】
当業者ならば、発酵プロセスにおける特定の微生物についての世代数を決定することができる。細菌集団は世代ごとに２倍になる。培養物中の細胞数を決定するために、当業者は大腸菌に対して次式；０．４ＯＤ単位＝２．１０８細胞／ｍＬを用いる（ＯＤ単位は光学濃度単位または吸光度を意味する）。
【実施例】
【００８７】
以下の実施例に記載するグリコール酸生産株を構築するために用いた一般プロトコール
プロトコール１：組換えのためのＰＣＲ産物の導入および組換え体の選択（ＦＲＴ系）
遺伝子または遺伝子間領域の置換のために選択し、表１に示したオリゴヌクレオチドを用いて、プラスミドｐＫＤ３由来のクロラムフェニコール耐性カセットまたはプラスミドｐＫＤ４由来のカナマイシン耐性カセットのいずれかを増幅した(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000))。次に、得られたＰＣＲ産物をエレクトロポレーションによって、プラスミドｐＫＤ４６（発現されるλ  Ｒｅｄ系（γ、β、ｅｘｏ）が相同組換えに極めて好都合である）を担持するレシピエント株に導入した。次に、抗生物質耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、表２に示す適当なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析により確認した。
【００８８】
プロトコール２：遺伝子の欠失のためのファージＰ１を用いた形質導入
ファージＰ１を用いた形質導入法により、ある大腸菌株から別の大腸菌株へのＤＮＡ移入を行った。このプロトコールは、（ｉ）単一遺伝子改変を含むドナー株でのファージ溶解液の調製と、（ｉｉ）このファージ溶解液によるレシピエント株の形質導入、の２工程であった。
【００８９】
ファージ溶解液の調製
・１０ｍｌのＬＢ＋Ｃｍ  ３０μｇ／ｍｌ／Ｋｍ  ５０μｇ／ｍｌ＋グルコース０．２％＋ＣａＣｌ２  ５ｍＭに、単一遺伝子改変を有するＭＧ１６５５株の一晩培養物１００μｌを植菌する。
・振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートする。
・ドナー株ＭＧ１６５５で調製したＰ１ファージ溶解液１００μｌ（およそ１×１０９ファージ／ｍｌ）を加える。
・３７℃で３時間、総ての細胞が溶解するまで振盪する。
・２００μｌのクロロホルムを加え、ボルテックスにかける。
・４５００ｇで１０分間遠心分離して細胞残渣を除去する。
・上清を滅菌試験管に移し、２００μｌのクロロホルムを加える。
・溶解液を４℃で保存する。
【００９０】
形質導入
・ＬＢ培地中の大腸菌レシピエント株の一晩培養物５ｍｌを１５００ｇで１０分間遠心分離する。
・２．５ｍｌの１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、５ｍＭ  ＣａＣｌ２に細胞ペレットを懸濁させる。
・対照試験管：１００μｌの細胞
１００μｌの、単一遺伝子改変を有するＭＧ１６５５株のＰ１ファージ。
・供試試験管：１００μｌの細胞＋１００μｌの、単一遺伝子改変を有するＭＧ１６５５株のＰ１ファージ。
・振盪せずに３０℃で３０分間インキュベートする。
・各試験管に１００μｌの１Ｍクエン酸ナトリウムを加え、ボルテックスにかける。
・１ｍＬのＬＢを加える。
・振盪しながら３７℃で１時間インキュベートする。
・試験管を７０００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、ＬＢ＋Ｃｍ  ３０μｇ／ｍｌ／Ｋｍ  ５０μｇ／ｍｌのディッシュ上に播種する。
・３７℃で一晩インキュベートする。
【００９１】
その後、抗生物質耐性形質導入体を選択し、欠失の挿入を、表２に示す適当なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析により確認した。
【００９２】
プロトコール３：組換えのためのＰＣＲ産物の導入および組換え体の選択（Ｃｒｅ−ＬＯＸ系）
遺伝子または遺伝子間領域の置換のために選択し、表１に示したオリゴヌクレオチドを用いて、プラスミドｌｏｘＰ−ｃｍ−ｌｏｘＰ(Gene Bridges)由来のクロラムフェニコール耐性カセットまたはプラスミドｌｏｘＰ−ＰＧＫ−ｇｂ２−ｎｅｏ−ｌｏｘＰ(Gene Bridges)由来のネオマイシン耐性カセットのいずれかを増幅した。次に、得られたＰＣＲ産物をエレクトロポレーションによって、プラスミドｐＫＤ４６（発現されるλ  Ｒｅｄ系（γ、β、ｅｘｏ）が相同組換えに極めて好都合である）を担持するレシピエント株に導入した。次に、抗生物質耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、表２に示す適当なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析により確認した。
【００９３】
【表９】
0005882310.tif 000020
【００９４】
【表１０】
0005882310.tif 000021
【００９５】
実施例１
発酵によりグリコール酸を生産するための温度誘導性株の構築：ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔｕｘａＣＡ：：ＲＮ／ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２：：Ｋｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）
大腸菌株ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）を、特許出願ＷＯ２０１０／１０８９０９に示されている記載に従って構築した。
【００９６】
１．ＭＧ１６５５  ΔｕｘａＣＡ：：ＲＮ／ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２：：Ｋｍ株の構築
ｕｘａＣＡ領域をＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２断片に置き換えるために、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている、プロトコール１に詳述した相同組換え戦略を用いた。この戦略は、考慮する領域の大部分を欠失させるとともに、カナマイシン耐性カセットと付加的ＤＮＡを挿入することを可能とする。
【００９７】
この目的で、以下に詳述するように、プラスミドｐＵＣ１８−ＤｕｘａＣＡ−ＲＮ／ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２を構築した。
【００９８】
断片ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２をＰＣＲにより合成し、ベクターｐＵＣ１８−ＤｕｘａＣＡ−ＳＭＣ−Ｋｍ（ＳＭＣは多重クローニング部位）にクローニングした。
【００９９】
・プラスミドｐＵＣ１８−ＤｕｘａＣＡ−ＳＭＣ−Ｋｍを構築するために、ＤｕｘａＣＡ・ＳＭＣ−Ｋｍ断片を、ＰＣＲにより、ＭＧ１６５５  ＤｕｘａＣＡ−ＳＭＣ−ＫｍゲノムＤＮＡを鋳型として得、ｐＵＣ１８(Norrander et al., 1983, Gene 26, 101-106)にクローニングした。
【０１００】
・ＭＧ１６５５  ＤｕｘａＣＡ−ＳＭＣ−Ｋｍ株の構築：
ｕｘａＣＡ領域を前記ＳＭＣ−Ｋｍのものに置き換えるために、相同組換え法を用い、表１に示したオリゴヌクレオチドＯｍｅ  １５０６−Ｄ  ｕｘａＣＡ−ＳＭＣ  ＦおよびＯｍｅ  １５０７−Ｄ  ｕｘａＣＡ−ＳＭＣ  Ｒ（配列番号１および配列番号２）を用いてＰＣＲ産物を合成した。
【０１０１】
Ｏｍｅ  １５０６−Ｄ  ｕｘａＣＡ−ＳＭＣ  Ｆ（配列番号１）
【化１】
0005882310.tif 000022
この配列は以下の領域を有する。
・領域ｕｘａＣＡの配列（３２４２７９７〜３２４２７２４）（ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）と相同な領域（斜体の大文字）
・Ｔ７ファージ由来のＴ７Ｔｅ転写ターミネーター配列に関する領域（下線の大文字）(Harrington K.J., Laughlin R.B. and Liang S. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Apr 24;98(9):5019-24.)
・カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域（大文字）(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)
【０１０２】
Ｏｍｅ  １５０７−Ｄ  ｕｘａＣＡ−ＳＭＣ  Ｒ（配列番号２）
【化２】
0005882310.tif 000023
この配列は以下の領域を有する。
・領域ｕｘａＣＡの配列（３２３９８３０〜３２３９８７９）（ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）と相同な領域（斜体の大文字）
・ＡｐａＩ、ＢｓｔＺ１７Ｉ、ＳａｃＩＩ、ＸｈｏＩ、ＡｖａＩ、ΒａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＫｐｎＩ、ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩ制限部位を担持するＳＭＣに関する領域（下線の大文字）
・カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域（大文字）(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)
【０１０３】
得られたＰＣＲ産物をエレクトロポレーションによって、ＭＧ１６５５株（ｐＫＤ４６）に導入した。次に、カナマイシン耐性形質導入体を選択し、抗生物質カセットの挿入を、表２に示したオリゴヌクレオチドＯｍｅ  １６１２−ｕｘａＣＡ＿Ｒ３およびＯｍｅ  １７７４−ＤｕｘａＣＡ＿Ｆ（配列番号１５および配列番号１６）を用いたＰＣＲ分析により確認した。選択されたクローンをＤＮＡ配列決定法によりバリデートした。最終株をＭＧ１６５５  ＤｕｘａＣＡ−ＳＭＣ−Ｋｍと呼称した。
・プラスミドｐＵＣ１８−ＤｕｘａＣＡ−ＳＭＣ−Ｋｍの構築：
ＤｕｘａＣＡ−ＳＭＣ−Ｋｍ領域を、ＰＣＲにより、鋳型としてのＭＧ１６５５  ＤｕｘａＣＡ−ＳＭＣ−Ｋｍ株のゲノムＤＮＡと、表１に示したオリゴヌクレオチドＯｍｅ  １５１５−ｕｘａＣＡ  Ｒ２およびＯｍｅ  １５１６−ｕｘａＣＡ  Ｆ２（配列番号３および配列番号４）から増幅した。
【０１０４】
Ｏｍｅ  １５１５−ｕｘａＣＡ  Ｒ２（配列番号３）
【化３】
0005882310.tif 000024
この配列はｕｘａＣＡの下流領域（３２３９０２１〜３２３９０４４）と相同である。
【０１０５】
Ｏｍｅ  １５１６−ｕｘａＣＡ  Ｆ２（配列番号４）
【化４】
0005882310.tif 000025
この配列は以下の領域を有する。
・余分な塩基を含む領域（大文字）
・ＥｃｏＲＶ制限部位を担持する領域（下線の大文字）
・ｕｘａＣＡの上流領域（３２４３４２５〜３２４３４０２）と相同な領域（斜体の大文字）。
【０１０６】
次に、ＰＣＲ産物（末端平滑化用ＤＮＡポリメラーゼにより得た）を制限酵素ＥｃｏＲＶにより切断し、ｐＵＣ１８のＳｍａＩ部位にクローニングした。得られたプラスミドを配列決定法により確認し、ｐＵＣ  １８−ＤｕｘａＣＡ−ＳＭＣ−Ｋｍと呼称した。
【０１０７】
・プラスミドｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２の構築のために、断片ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２をＰＣＲにより合成し、上に記載したプラスミドｐＵＣ１８−ＤｕｘａＣＡ−ＳＭＣ−Ｋｍにクローニングした。
【０１０８】
第１の工程では、ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２領域を、ＰＣＲにより、鋳型としてのｐＦＣｌベクター(Mermet-Bouvier & Chauvat, 1994, Current Microbiology, vol. 28, pp 145-148)と、表１に挙げたオリゴヌクレオチドＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ｉｃｄ  ＦおよびＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２  Ｒ（配列番号５および配列番号６）から増幅した。第２の工程では、断片ｉｃｄ−ＴＴ０２を、ＰＣＲにより、オリゴヌクレオチドＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２  ＦおよびＴＴ０２−ｉｃｄ  Ｒ（配列番号７および配列番号８）を用いて、ＭＧ１６５５ゲノムＤＮＡから増幅した。第３の工程では、ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２領域を、ＰＣＲにより、鋳型としてのＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２とｉｃｄ−ＴＴ０２のＰＣＲ産物混合物と、オリゴヌクレオチドＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ｉｃｄ  ＦおよびＴＴ０２−ｉｃｄ  Ｒ（配列番号５および配列番号８）を用いて合成した。この最終ＰＣＲ産物をｐＳＣＢベクター(Stratagene)にクローニングし、得られたプラスミドを配列決定法により確認し、ｐＳＣＢ−ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２と呼称した。
【０１０９】
ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ｉｃｄ  Ｆ（配列番号５）
【化５】
0005882310.tif 000026
この配列は以下の領域を有する。
・余分な塩基を含む領域（大文字）
・ＡｐａＩおよびＢｓｔＺ１７Ｉ制限部位を担持する領域（下線の大文字）
・ＴＴａｄｃｃａ転写ターミネーター配列（ｐＳＯＬ１メガプラスミドの１７９８４７〜１７９８０７と相同な、クロストリジウム・アセトブチリクム(Clostridium acetobutylicum)由来ａｄｃ遺伝子の転写ターミネーター）に関する領域（斜体の大文字）
・ｃＩ８５７遺伝子の３’末端と相同な領域（太字の大文字）
ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２  Ｒ（配列番号６）
【化６】
0005882310.tif 000027
【０１１０】
この配列は以下の領域を有する。
・ｉｃｄ遺伝子の５’末端（１１９４３７８〜１１９４３４６）と相同な領域（大文字）
・ＰｓｉＩ制限部位を作出するためにＲＢＳ０１＊２型ＲＢＳを得るための５塩基（下線斜体の大文字）を除き、λバクテリオファージＰＲプロモーターと相同な領域（下線の大文字）
ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２  Ｆ（配列番号７）
【化７】
0005882310.tif 000028
【０１１１】
この配列は以下の領域を有する。
・ｉｃｄ遺伝子の５’末端（１１９４３４６〜１１９４３７８）と相同な領域（大文字）
・ＰｓｉＩ制限部位を作出するためにＲＢＳ０１＊２型ＲＢＳを得るための５塩基（下線斜体の大文字）を除き、λバクテリオファージＰＲプロモーターと相同な領域（下線の大文字）
ＴＴ０２−ｉｃｄ  Ｒ（配列番号８）
【化８】
0005882310.tif 000029
【０１１２】
この配列は以下の領域を有する。
・余分な塩基を含む領域（大文字）
・ＥｃｏＲＶ制限部位を担持する領域（斜体の大文字）
・大腸菌のｒｒｎＢ遺伝子の転写ターミネーターＴ１(Orosz A, Boros I and Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9)に相当するＴＴ０２転写ターミネーター配列と相同な領域（下線の大文字）
・ｉｃｄ遺伝子の３’末端（１１９５５９６〜１１９５５７０）と相同な領域（太字の大文字）
・ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２断片をベクターｐＵＣ１８−ＤｕｘａＣＡ−ＳＭＣ−Ｋｍに導入するために、プラスミドｐＳＣＢ−ΤΤａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ΤΤ０２を制限酵素ＡｐａＩおよびＥｃｏＲＶによって処理し、得られたＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２断片をベクターｐＵＣ１８−ＤｕｘａＣＡ−ＳＭＣ−ＫｍのＡｐａＩ／ＳｍａＩ部位にクローニングし、ベクターｐＵＣ１８−ＤｕｘａＣＡ−ＲＮ／ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ΤΤ０２：：Ｋｍを得た。
【０１１３】
最後に、相同組換えによりｕｘａＣＡ領域をＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２：：Ｋｍに置き換えるために、プラスミドｐＵＣ１８−ＤｕｘａＣＡ−ＲＮ／ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２：：ＫｍをＭｌｕＩおよびＮｒｕＩによって制限酵素処理し、ＤＮＡ断片ＤｕｘａＣＡ−ＲＮ／ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２：：Ｋｍをエレクトロポレーションによって、ＭＧ１６５５株（ｐＫＤ４６）に導入した。次に、カナマイシン耐性形質導入体を選択し、染色体へのＤｕｘａＣＡ−ＲＮ／ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２：：Ｋｍの挿入を、オリゴヌクレオチドＯｍｅ  １６１２−ｕｘａＣＡ＿Ｒ３およびＯｍｅ  １７７４−ＤｕｘａＣＡ＿Ｆ（配列番号１５および配列番号１６）を用いたＰＣＲ分析により確認した。その株をＭＧ１６５５  ＤｕｘａＣＡ−ＲＮ／ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２：：Ｋｍと呼称した。
【０１１４】
２．ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔｕｘａＣＡ：：ＲＮ／ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２：：Ｋｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）株の構築
ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）株において、ｕｘａＣＡ領域をＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２：：Ｋｍに置き換えるために、構築物ΔｕｘａＣＡ：：ＲＮ／ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２：：Ｋｍを、Ｐ１ファージ形質導入（プロトコール２を参照）によって、ＭＧ１６５５  ΔｕｘａＣＡ：：ＲＮ／ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２：：Ｋｍ株からＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ株に移入した。抗生物質耐性形質導入体を選択し、染色体へのΔｕｘａＣＡ：：ＲＮ／ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２：：Ｋｍの挿入を、オリゴヌクレオチドＯｍｅ  １６１２−ｕｘａＣＡ＿Ｒ３（配列番号１５）およびＯｍｅ  １７７４−ＤｕｘａＣＡ＿Ｆ（配列番号１６）を用いたＰＣＲ分析により確認した。得られた株をＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔｕｘａＣＡ：：ＲＮ／ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２：：Ｋｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａと呼称した。
【０１１５】
最後に、プラスミドｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１（特許出願ＥＰ０９１５５９７１，６およびＵＳ６１１６２，７１２において従前に記載されている）をエレクトロポレーションによって導入し、ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔｕｘａＣＡ：：ＲＮ／ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２：：Ｋｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）を得、ＡＧ１３８５と呼称した。
【０１１６】
実施例２
発酵によりグリコール酸を生産するための温度誘導性株の構築：ＭＧ１６５５  ＴＴａｄｃｃａ／ＣＩ８５７／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ：：Ｋｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔａｃｅＫ：：Ｃｍ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）
大腸菌株ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）を、特許出願ＥＰ０９１５５９７１，６およびＵＳ６１１６２，７１２に示されている記載に従って構築した。
【０１１７】
１．ＭＧ１６５５  ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ：：Ｋｍ株の構築
大腸菌ＭＧ１６５５株において、天然ｉｃｄプロモーターをＤＮＡ断片ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ０１／ＲＢＳ０１＊２：：Ｋｍに置き換えた。天然ｉｃｄプロモーターをＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ０１／ＲＢＳ０１＊２  ＤＮＡ断片に置き換えるために、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え戦略を用いた。構築はプロトコール１に記載した手法によって行った。
【０１１８】
ＭＧ１６５５  ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ：：Ｋｍ株を構築するために、遺伝子ｃＩ８５７、プロモーターＰＲ０１およびカナマイシンカセット（Ｋｍ）を、ＰＣＲにより、表１に記載したオリゴヌクレオチド（配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２）を用いて、ＭＧ１６５５  ΔｕｘａＣＡ：：ＲＮ／ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２：：ＫｍゲノムＤＮＡにおいて増幅した。
【０１１９】
ｙｍｆＣ−ＴＴ０７  Ｆ（配列番号９）
【化９】
0005882310.tif 000030
この配列は以下の領域を有する。
・ｙｍｆＣ遺伝子の５’末端（１１９４１２５〜１１９４１７５）と相同な領域（大文字）
・Ｔ７ファージ由来のＴ７Ｔｅ転写ターミネーター配列に関する領域（下線の大文字）(Harrington K.J., Laughlin R.B. and Liang S. 2001, PNAS Apr 24;98(9):5019-24.)
・カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域（太字の大文字）(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
【０１２０】
ＰＲ０１−Ｒ（配列番号１０）
【化１０】
0005882310.tif 000031
この配列はＰＲ０１変異型ＰＲプロモーターを得るための１塩基（太字の大文字）を除き、λバクテリオファージＰＲプロモーターと相同である。
【０１２１】
ＰＲ０１−Ｆ（配列番号１１）
【化１１】
0005882310.tif 000032
この配列はＰＲ０１変異型ＰＲプロモーターを得るための１塩基（太字の大文字）を除き、λバクテリオファージＰＲプロモーターと相同である。
ｉｃｄ−Ｒ（配列番号１２）
【化１２】
0005882310.tif 000033
【０１２２】
この配列はｉｃｄ遺伝子（１１９４４３４〜１１９４３９９）と相同である。
まず、ＰＣＲ断片ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ：：Ｋｍをエレクトロポレーションによって、ＭＧ１６５５株（ｐＫＤ４６）に導入し、ＭＧ１６５５  ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ：：Ｋｍ株を得た。カナマイシン耐性形質導入体を選択した。ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ：：Ｋｍ断片の挿入を、表２に挙げたオリゴヌクレオチドＯｍｅ  ７０４  ｓｅｑ  Ｐｔｒｃ−ｉｃｄ  ＦおよびＯｍｅ  ７０５  ｓｅｑ  Ｐｔｒｃ−ｉｃｄ  Ｒ（配列番号１７および配列番号１８）を用いたＰＣＲ分析により確認し、次に、配列決定法によりバリデートした。得られた株をＭＧ１６５５  ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ：：Ｋｍと呼称した。
【０１２３】
２．ＭＧ１６５５  ＴＴａｄｃｃａ／ＣＩ８５７／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ：：Ｋｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔａｃｅＫ：：Ｃｍ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）株の構築
構築物ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ：：Ｋｍを、形質導入（プロトコール２を参照）によって、ドナー株ＭＧ１６５５  ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ：：Ｋｍから受容株ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ株に移入した。次に、カナマイシン耐性形質導入体を選択し、ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２：：Ｋｍ領域の挿入を、オリゴヌクレオチドＯｍｅ  ７０４  ｓｅｑ  Ｐｔｒｃ−ｉｃｄ  Ｆ（配列番号１７）およびＯｍｅ  ７０５  ｓｅｑ  Ｐｔｒｃ−ｉｃｄ  Ｒ（配列番号１８）を用いたＰＣＲ分析により確認した。その株をＭＧ１６５５  ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２：：Ｋｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａと呼称した。
【０１２４】
大腸菌株ＭＧ１６５５  ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２：：Ｋｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ（ｐＫＤ４６）において、表１に記載したオリゴヌクレオチドＯｍｅ  ０２０５−ＤａｃｅＢＡＫＲおよびＯｍｅ  ０７００−ＤａｃｅＫ  Ｆ（配列番号１３および配列番号１４）を用いて、前述した相同組換えによって、遺伝子ａｃｅＫを欠失させた（プロトコール３を参照）。
【０１２５】
Ｏａｇ  ００７４−ＤａｃｅＫ−ｌｏｘＰ  Ｒ（配列番号１３）
【化１３】
0005882310.tif 000034
この配列は以下の領域を有する。
・遺伝子ａｃｅＫの配列（４２１６６２１〜４２１６７０２）（ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）と相同な領域（大文字）
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅に関する領域（下線の大文字）（参照配列Gene Bridges）
【０１２６】
Ｏａｇ  ００７５−ＤａｃｅＫ−ｌｏｘＰ  Ｆ（配列番号１４）
【化１４】
0005882310.tif 000035
この配列は以下の領域を有する。
・遺伝子ａｃｅＫの配列（４２１８２９８〜４２１８２２０）と相同な領域（大文字）（ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅に関する領域（下線の大文字）（参照配列Gene Bridges）
【０１２７】
次に、クロラムフェニコールおよびカナマイシン耐性形質導入体を選択し、表２に挙げたオリゴヌクレオチドＯｍｅ  ０１６９−ＢＡＫ  ＦおよびＯｍｅ  ０７０１−ａｃｅＫ  Ｆ（配列番号１９および配列番号２０）を用いたＰＣＲ分析により確認した。最後の工程では、プラスミドｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１をＭＧ１６５５  ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２：：Ｋｍ  ΔａｃｅＢ  ΔｇｃｌΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔａｃｅＫ：：Ｃｍ株に導入した。最終ＭＧ１６５５  ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２：：Ｋｍ  ΔａｃｅＢ  ΔｇｃｌΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔａｃｅＫ：：Ｃｍ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）株をＡＧ１４１３と呼称した。
【０１２８】
生産株の発酵
温度誘導性株ＡＧ１３８５およびＡＧ１４１３においてグリコール酸生産を判定した。これらの株の構築は実施例１および実施例２に記載している。それらの株の遺伝子型は以下を用いた：
ＡＧ０６６２：  ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）
ＡＧ０６６２の構築は、特許出願ＷＯ２００７／１４１３１６Ａ、ＵＳ６１／１６２，７１２およびＥＰ０９１５５９７１．６に記載されている。
【０１２９】
ＡＧ１３８５：  ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ＡｕｘａＣＡ：：ＲＮ／ＴＴａｄｃｃａ−ｃＩ８５７−ＰＲ／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ−ＴＴ０２：：Ｋｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ
Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ（ｐＭＥ  １０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅ  Ａ−ＴＴ０１）
ＡＧ１４１３：  ＭＧ１６５５  ＴＴａｄｃｃａ／ＣＩ８５７／ＰＲ０１／ＲＢＳ０１＊２−ｉｃｄ：：Ｋｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔροχΒ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ΔａｃｅＫ：：Ｃｍ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）
【０１３０】
ＡＧ０６６２株はｉｃｄ遺伝子発現が減弱されている。培養の温度が何度であっても、細胞のイソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性（ＩＣＤ）はおよそ５０ｍＵＩ／ｍｇである（表４）。
【０１３１】
ＡＧ１３８５およびＡＧ１４１３株はｉｃｄ遺伝子の温度誘導性コピーを有する。３７℃では、ｉｃｄ発現は最大であり、ＩＣＤ活性は１０００ｍＵＩ／ｍｇを上回るのに対し、３０℃では、ｉｃｄ発現は抑制され、ＩＣＤ活性はおよそ５０〜１００ｍＵＩ／ｍｇである（実施例５を参照）。
【０１３２】
実施例３
工業に適した条件でグリコール酸を生産するためのＡＧ０６６２、ＡＧ１３８５およびＡＧ１４１３株の発酵培養
ＡＧ０６６２、ＡＧ１３８５およびＡＧ１４１３株の安定性をアッセイするために、工業プロセスのための最小数に相当する３０世代の間、それらを連続培養した後、発酵槽でのそれらの性能を判定した。
【０１３３】
この目的で、各株の培養（３〜５回の間）を、４０ｇ／ｌのＭＯＰＳおよび１０ｇ／ｌのグルコースを添加した合成培地ＭＭＬ８ＡＧ１＿１００（表１の組成を参照）の入ったバッフル付フラスコで連続的に行った。フラスコを２００ｒｐｍにて、３７℃で２日間撹拌した（最終ＯＤ６〜８の間）。
【０１３４】
【表１１】
0005882310.tif 000036
【０１３５】
さらに、Ｍｕｌｔｉｆｏｒｓ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ(Infers)上に組み立てた７００ｍＬ実施容量の容器で連続培養物を増殖させた。各容器には、２０ｇ／ｌのグルコースおよび５０ｍｇ／ｌのスペクチノマイシンを添加した２００ｍｌの合成培地ＭＭＬ１１ＡＧ１＿１００を充填し、ＯＤ０．０１〜０．８の間まで植菌した。
【０１３６】
【表１２】
0005882310.tif 000037
【０１３７】
培養は０．２  ｌｐｍで通気しながら３７℃で行い、撹拌（初期：３００ｒｐｍ；最大：１２００ｒｐｍ）および酸素供給（０〜４０ｍｌ／分）を制御することによって溶存酸素を３０％飽和より高く維持した。ｐＨは塩基（ＮＨ４ＯＨ  ７．５％ｗ／ｗおよびＮａＯＨ  ２．５％ｗ／ｗの混合物）の添加によりｐＨ６．８±０．１に調整した。発酵は、７００ｇ／ｌグルコース供給液を用い、不連続フェドバッチ式で行った（表３を参照）。培養培地中のグルコースが消費されたら、供給パルスによって２０ｇ／ｌのグルコース濃度に戻した。
【０１３８】
【表１３】
0005882310.tif 000038
【０１３９】
３７℃で増殖させた３０世代の後、集団からサンプル採取し、グリセロール中、−８０℃で保存した（４０％ｗ／ｗの滅菌グリセロール溶液で希釈）。
【０１４０】
その後、各集団をグリコール酸の生産について試験した。
【０１４１】
ＡＧ０６６２株およびその誘導集団（３０世代）に用いる発酵条件は特許出願ＥＰ０９１５５９７１．６およびＥＰ０９１７１２９７．６にすでに記載されている。
【０１４２】
温度誘導性株ＡＧ１３８５およびＡＧ１４１３に用いる発酵プロセスを下の実施例４に記載する。
【０１４３】
ＡＧ０６６２、ＡＧ１３８５およびＡＧ１４１３株およびそれらそれぞれの誘導集団（±３０世代）のグリコール酸生産を表４に示す。
【０１４４】
【表１４】
0005882310.tif 000039
【０１４５】
表４で分かるように、ＡＧ０６６２株は、性能試験の前に３０世代の間培養した場合のその株の性能が、試験前に培養していない場合よりもはるかに低いため、極めて不安定である。
【０１４６】
性能の損失は高いＩＣＤ活性とも関係している（表４）。
【０１４７】
ｉｃｄ発現を向上させることができ、それによって細胞のＩＣＤ活性を向上させることができる総ての突然変異は、増殖速度を高め、生産収率を低下させる。ＡＧ０６６２の集団は進化し組み換えて、より高いｉｃｄ発現をもたらした。この集団におけるＩＣＤ活性は母株よりも１０倍高い（５０ｍＵＩ／ｍｇに代わって１０４５ｍＵＩ／ｍｇ）。
【０１４８】
その一方で、ｉｃｄ発現を駆動する温度誘導プロモーターを担持する両株（ＡＧ１３８５およびＡＧ１４１３）の性能は、（Ｉ）試験前に３０世代の間の増殖を行わないまたは（ＩＩ）その増殖を行うという２つの条件を比較した場合、性能試験における変化はほんのわずかでしかない。従って、グリコール酸生産株において温度誘導性ｉｃｄ遺伝子が存在することにより株安定性は向上する。
【０１４９】
イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性（ＩＣＤ）は、実施例５に記載するプロトコールに従って、同じＯＤで各株およびそれぞれの集団について測定した。
【０１５０】
グリコール酸生産を最大とするには、ＩＣＤの活性は低くすべきである；およそ５０〜１００ｍＵＩ／ｍｇ。
【０１５１】
実施例４
温度誘導性株の発酵プロセス
温度誘導性株に用いるプロトコールは、ｉｃｄ遺伝子の温度調節による特異的改変に関する特許ＥＰ０９１７１２９７．６に記載されている「ｐＨの上昇」プロトコールに基づく。
【０１５２】
ＡＧ１３８５およびＡＧ１４１３株を用いて発酵を実現した。
【０１５３】
各株について、独立した前培養を、４０ｇ／ｌのＭＯＰＳおよび１０ｇ／ｌのグルコースを添加した５５ｍｌの合成培地ＭＭＬ８ＡＧ１＿１００を充填した５００ｍｌバッフル付エルレンマイヤーフラスコで、３７℃で２日間行った（ＯＤ７〜１０の間）。２０ｍＬの各前培養物を用いて、発酵槽に植菌した。
【０１５４】
Ｍｕｌｔｉｆｏｒｓ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ(Infors)上に組み立てた７００ｍＬ実施容量の容器で培養物を増殖させた。各容器には、２０ｇ／ｌのグルコースおよび５０ｍｇ／ｌのスペクチノマイシンを添加した２００ｍｌの合成培地ＭＭＬ１１ＡＧ１＿１００を充填し、ＯＤ約１に植菌した。
【０１５５】
培養は０．２  ｌｐｍで通気しながら３０℃で行い、撹拌（初期：３００ｒｐｍ；最大：１２００ｒｐｍ）および酸素供給（０〜４０ｍｌ／分）を制御することによって溶存酸素を３０％飽和より高く維持した。
【０１５６】
ｐＨは塩基（ＮＨ４ＯＨ  ７．５％ｗ／ｗおよびＮａＯＨ  ２．５％ｗ／ｗの混合物）の添加によりｐＨ６．８±０．１に調整した。発酵は、７００ｇ／ｌグルコース供給液を用い、不連続フェドバッチ式で行った。
【０１５７】
培養培地中のグルコースが消費されたら、供給パルスによって２０ｇ／ｌのグルコース濃度に戻した。
【０１５８】
５回目の供給パルス（グルコース消費１００ｇ／Ｌ）の後、ｐＨを２時間かけて６．８から７．４へ調整し、培養終了まで一定に保った。
【０１５９】
これらの条件下で増殖させたＡＧ１３８５およびＡＧ１４１３株のグリコール酸生産を下の表５に示す。
【０１６０】
【表１５】
0005882310.tif 000040
【０１６１】
実施例５
イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＣＤ）活性アッセイ
イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性をアッセイするために、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ（６５００ｒｐｍで１×３０秒、Bertin Technologies）により細胞（２５ｍｇ）を溶解し、１２０００ｇ（４℃）で３０分間遠心分離することにより細胞残渣を除去した。タンパク質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄ法により測定した。ＩＣＤ活性は容量３００μｌ、ｐＨ８．２および３０℃で測定した。アッセイ混合物には、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＮＡＤＰ＋、０．５ｍＭオキサレートおよび３〜６μｇの粗細胞抽出物を含めた。反応混合物を３０℃で１０分間インキュベートした。次に、１０ｍＭのイソシトレートを加えて、反応を開始させた。ＮＡＤＰＨ形成による３４０ｎｍでの吸光度（ε＝４．５７μｍｏｌ−１．ｍＬ．ｃｍ−１）の変化を３０℃で３０分間モニタリングした。
【０１６２】
【表１６】
0005882310.tif 000041
【０１６３】
参照文献
0005882310.tif 000042
【図１】
0005882310.tif 000043