(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
管状生分解性不織性ポリグリコール酸足場と、該管状生分解性ポリグリコール酸足場の各末端において非生分解性ポリエチレンテレフタレート支持体とを含む構築物であって、ポリグリコール酸の密度が45 mg/cc〜75 mg/ccであり、該密度が管状足場全体を通して均一であり、ポリグリコール酸の厚さが0.8〜1.2mmであり、ポリグリコール酸内の繊維の厚さが5〜20μmであり、かつポリエチレンテレフタレートの多孔度が≧200 cc/分/cm2であり、かつさらに前記支持体が細胞の接着および増殖を可能にすることを特徴とする、構築物。
【請求項２】
管状生分解性ポリグリコール酸足場の長さが1 cm〜100 cmである、請求項1記載の構築物。
【請求項３】
管状生分解性ポリグリコール酸足場の内径が3 mm〜6 mmである、請求項1記載の構築物。
【請求項４】
重金属混入物を含まない、請求項1記載の構築物。
【請求項５】
アルミニウム、バリウム、カルシウム、ヨウ素、ランタン、マグネシウム、ニッケル、カリウム、および亜鉛からなる群より選択される微量の重金属混入物を含む、請求項4記載の構築物。
【請求項６】
細胞外基質タンパク質をさらに含む、請求項1記載の構築物。
【請求項７】
細胞外基質タンパク質の厚さが、基質の最も薄い部分で200マイクロメートル超である、請求項6記載の構築物。
【請求項８】
(a) ポリグリコール酸の密度が45 mg/cc〜75 mg/ccであり、かつポリグリコール酸シートの厚さが0.8〜1.2 mmである、生分解性ポリグリコール酸シートを提供する段階、
(b) ポリグリコール酸シートの対向する端部どうしが界面で接触するように、マンドレルにポリグリコール酸シートを巻き付ける段階、
(c) 界面にわたって、シートの対向する各端部からポリグリコール酸繊維を引き出す段階、および
(d) 界面の片側から引き出されたポリグリコール酸繊維を界面の反対側のポリグリコール酸繊維に絡ませることによって、継ぎ目におけるポリグリコール酸の密度が45 mg/cc〜75 mg/ccであり、かつ継ぎ目におけるポリグリコール酸の厚さが0.8〜1.5 mmである、継ぎ目を形成する段階
を含む、管状ポリグリコール酸構築物を作製する方法であって、それによって均一なポリグリコール酸密度を有する管状生分解性ポリグリコール酸構築物が作製される、方法。
【請求項９】
重金属混入物を除去するために管状構築物を処理する段階をさらに含む、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
継ぎ目が前記処理後に元の状態のままである、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
ポリグリコール酸分解の速度を増加させるために管状構築物を処理する段階をさらに含む、請求項8記載の方法。
【請求項１２】
継ぎ目が前記処理後に元の状態のままである、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
構築物の最も薄い部分で200μmを超える厚さを有し、かつ≧3 mmの内径を有する、細胞外基質タンパク質およびポリグリコール酸を含む管状構築物であって、構築物が内膜過形成および石灰化抵抗性であり、ポリグリコール酸が該構築物の断面積の33％未満を構成し、かつ構築物が5％未満の無傷の細胞を含んで無細胞性である、管状構築物。
【請求項１４】
1％未満の無傷の細胞を含んで無細胞性である、請求項13記載の管状構築物。
【請求項１５】
その内径が3 mm〜6 mmである、請求項13記載の管状構築物。
【請求項１６】
その長さが1 cm〜100 cmである、請求項13記載の管状構築物。
【請求項１７】
最大で少なくとも200 mm Hgまで、液体漏出に対して不透過性である、請求項13記載の管状構築物。
【請求項１８】
動静脈移植片、冠動脈移植片、罹患末梢動脈のバイパス導管、卵管置換物、および尿路導管からなる群より選択される、請求項13記載の管状構築物。
【請求項１９】
細胞外基質タンパク質が、ヒロドキシプロリン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、およびI型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、VI型コラーゲン、XI型コラーゲン、XII型コラーゲン、フィブリリンI、テネイシン、デコリン、バイグリカン、バーシカン、またはアスポリンを含む、請求項13記載の管状構築物。
【請求項２０】
細胞外基質タンパク質が＞40μg/mg乾燥重量のヒドロキシプロリンを含む、請求項19記載の管状構築物。
【請求項２１】
細胞外基質タンパク質が管状構築物の周りに円周方向に配向される、請求項13記載の管状構築物。
【請求項２２】
300 ng/cm未満のβ-アクチンを含む、請求項13記載の管状構築物。
【請求項２３】
3％乾燥重量未満の脂質を含む、請求項13記載の管状構築物。
【請求項２４】
微量の二本鎖ゲノムDNAを含む、請求項13記載の管状構築物。
【請求項２５】
移植の6ヵ月以内に1％未満の石灰化を誘導する、請求項13記載の管状構築物。
【請求項２６】
移植の12ヵ月以内に1％未満の石灰化を誘導する、請求項13記載の管状構築物。
【請求項２７】
移植の6ヵ月の時点で、構築物との吻合部において天然脈管構造に1 mm未満の内膜過形成肥厚を誘導する、請求項13記載の管状構築物。
【請求項２８】
移植の6ヵ月の時点で、構築物との吻合部において天然脈管構造に0.25 mm未満の内膜過形成肥厚を誘導する、請求項13記載の管状構築物。
【請求項２９】
移植後に、その移植片直径の50％を超えて拡張しない、請求項13記載の管状構築物。
【請求項３０】
尿路導管である場合に、尿路導管が少なくとも4週間の尿への曝露に耐える、請求項18記載の管状構築物。
【請求項３１】
尿路導管である場合に、尿路導管が結晶化抵抗性である、請求項18記載の管状構築物。
【請求項３２】
2℃〜30℃で少なくとも12ヵ月間貯蔵することができる、請求項13記載の管状構築物。
【請求項３３】
(a) 3 mm〜6 mmの内径を有する管状生分解性ポリグリコール酸構築物を提供する段階、
(b) 管状生分解性ポリグリコール酸構築物上に、継代6代目またはそれ未満のヒト細胞を播種する段階、
(c) 管状生分解性ポリグリコール酸構築物上で細胞が細胞外基質タンパク質を分泌するような条件下で、細胞を培養する段階、
(d) 構築物が5％未満の無傷の細胞を含んで無細胞性であり、かつ構築物が内膜過形成および石灰化抵抗性であるように、段階(c)の構築物を脱細胞化する段階、ならびに
(e) ポリグリコール酸が該構築物の断面積の33％未満を構成し、かつ構築物の最も薄い部分で200μmを超える細胞外基質タンパク質の厚さを構築物が有するように、段階(c)のポリグリコール酸構築物を分解する段階
を含む、管状構築物を作製する方法であって、それによって脱細胞化された管状構築物が作製される、方法。
【請求項３４】
脱細胞化段階がドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の非存在下で行われる、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
脱細胞化段階がベンゾナーゼ（benzonase）をさらに含む、請求項33記載の方法。
【請求項３６】
構築物が、1％未満の無傷の細胞を含んで無細胞性である、請求項33記載の方法。
【請求項３７】
細胞が単一のドナーから得られるか、または細胞バンクから得られ、細胞バンクの細胞が複数のドナーからプールされる、請求項33記載の方法。
【請求項３８】
細胞がヒト大動脈から単離される、請求項33記載の方法。
【請求項３９】
細胞が平滑筋細胞を含む、請求項33記載の方法。
【請求項４０】
細胞が継代3代目またはそれ未満である、請求項33記載の方法。
【請求項４１】
細胞が、培養の最初の2〜6週間は11％〜30％のヒト血清を含む培地中で培養され、そして少なくとも付加的な4週間は1％〜10％のヒト血清を含む培地中で培養される、請求項33記載の方法。
【請求項４２】
培地が、高グルコース、インスリン、bFGF、およびEGFをさらに含む、請求項33記載の方法。
【請求項４３】
細胞が、構築物1 cm長当たり0.5×106個細胞〜構築物1 cm長当たり2×106個細胞で、管状生分解性ポリグリコール酸構築物上に播種される、請求項33記載の方法。
【請求項４４】
播種された細胞の各細胞、または各細胞の集団的子孫が、培養中の9週間をかけて、1 ngを超えるヒドロキシプロリンを産生する、請求項33記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2011年7月6日に出願された米国仮特許出願第61/430,381号の恩典を主張し、その内容は全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
患者自身の脈管構造が、事前の摘出のために利用できないか、または疾患により不適切である場合には、血管移植の必要性がかなりある。血管移植が必要とされ得る例には、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、および末期の腎疾患患者のための血液透析アクセスが含まれる。冠血管または末梢血管手術のための、今日までに最も成功している血管導管は、身体の他所から採取された患者自身の血管であり、これは脚の大伏在静脈である場合が多い。血液透析を必要とする患者の場合、理想的なアクセスは瘻、すなわち患者自身の動脈と静脈との接続である。
【０００３】
自己血管が利用できない場合には、血液透析のための動静脈アクセス(米国腎臓データシステム(U. S. Renal Data System)、「USRDS 2009 Annual Data Report: Atlas of Chronic Kidney Disease and End-Stage Renal Disease in the United States」(米国立衛生研究所(National Institutes of Health)、米国立糖尿病・消化器病・腎臓病研究所(National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases)、2009（非特許文献1）)または膝上末梢動脈バイパスなどの大口径(≧6 mm)適用に対して、合成ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)移植片が使用される場合が多い。しかしながら、血液透析のための動静脈PTFE移植片は、感染、血栓、または遠位吻合部もしくは流出静脈のいずれかにおける内膜過形成誘導性閉塞のために、わずか10ヵ月という不良な開存性中央値を有する(米国腎臓データシステム；Schild, et al., J Vasc Access 9, 231-235 (2008)（非特許文献2）)。脱細胞化したウシ内頸異種移植片、および死体からのヒト同種移植片血管などの、他の種類の移植片は、動脈瘤、石灰化、および血栓形成の傾向があり、そのため臨床的に広く認められていない(Sharp et al., Eur J Vasc Endovasc Surg 27, 42-44 (2004)（非特許文献3）；Dohmen et al., Tex Heart Inst J 30, 146-148 (2003)（非特許文献4）；Madden et al., Ann Vasc Surg 19, 686-691 (2005)（非特許文献5）)。膝下および冠動脈バイパス移植などの、小口径(すなわち、3〜4 mm)の血管が必要である場合には、合成移植片および同種移植片は容認しがたい低開存率を有するという理由で、患者自身の脈管構造(すなわち、内胸動脈、伏在静脈)が主に用いられる(例えば、開存性は、末梢および冠動脈バイパス手術において合成移植片および凍結保存移植片を用いた場合には3年時に＜25％であるのに対して、自己血管導管では＞70％である)(Chard, et al., J Thorac Cardiovasc Surg 94, 132-134 (1987)（非特許文献6）；Albers, et al., Eur J Vasc Endovasc Surg 28, 462-472 (2004)（非特許文献7）； Laub, et al., Ann Thorac Surg 54, 826-831 (1992)（非特許文献8）；Collins, et al., Circulation 117, 2859-2864 (2008)（非特許文献9）；Harris et al., J Vasc Surg 33, 528-532 (2001)（非特許文献10）；Albers, et al., J Vasc Surg 43, 498-503 (2006)（非特許文献11）)。したがって、拡張、石灰化、および内膜過形成に抵抗する、良好な開存性を有するすぐに利用可能な多用途の血管移植片が、実質的でかつ高まりつつある臨床的必要性を満たす。
【０００４】
今日までに、自己骨髄細胞をL-ラクチドとε-カプロラクトンのコポリマー上に播種すること(Shin'oka, et al., J Thorac Cardiovasc Surg 129, 1330-1338 (2005)（非特許文献12）)、または足場なしで自己の線維芽細胞および内皮細胞(EC)を培養すること(McAllister, et al., Lancet 373, 1440-1446 (2009)（非特許文献13）)によって形成された組織工学血管移植片が、早期臨床試験において有望な機能的結果を示した。これまで、後者のみが、動脈循環における使用に対して十分に物理的に強力であることが判明している。この患者特異的移植片は、自己線維芽細胞が組織のシートを生成する6〜9ヵ月の培養期間を必要とする。このシートをステンレス鋼マンドレル(直径4.8 mm)の周りに融合させ、内部の融合層を脱水し、移植片管腔に自己ECを播種する(McAllister, et al., Lancet 373, 1440-1446 (2009)（非特許文献13）)。生産コストが高く(移植片当たり≧$15,000(McAllister, et al., Regen Med 3, 925-937 (2008)（非特許文献14）)、かつ迅速な介入を必要とする患者にとって待ち時間が長いため(最長9ヵ月まで)、このアプローチが標準的な臨床診療となる可能性は低い。
【０００５】
したがって、当技術分野において、インビボでの副作用が最小からゼロであり、長期間機能し得る、効果的で、素早く利用でき、信頼性があり、かつ費用効果の高い組織工学構築物の必要性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】U. S. Renal Data System, "USRDS 2009 Annual Data Report: Atlas of Chronic Kidney Disease and End-Stage Renal Disease in the United States", National Institutes of Health, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, 2009
【非特許文献２】Schild, et al., J Vasc Access 9, 231-235 (2008)
【非特許文献３】Sharp et al., Eur J Vasc Endovasc Surg 27, 42-44 (2004)
【非特許文献４】Dohmen et al., Tex Heart Inst J 30, 146-148 (2003)
【非特許文献５】Madden et al., Ann Vasc Surg 19, 686-691 (2005)
【非特許文献６】Chard, et al., J Thorac Cardiovasc Surg 94, 132-134 (1987)
【非特許文献７】Albers, et al., Eur J Vasc Endovasc Surg 28, 462-472 (2004)
【非特許文献８】Laub, et al., Ann Thorac Surg 54, 826-831 (1992)
【非特許文献９】Collins, et al., Circulation 117, 2859-2864 (2008)
【非特許文献１０】Harris et al., J Vasc Surg 33, 528-532 (2001)
【非特許文献１１】Albers, et al., J Vasc Surg 43, 498-503 (2006)
【非特許文献１２】Shin'oka, et al., J Thorac Cardiovasc Surg 129, 1330-1338 (2005)
【非特許文献１３】McAllister, et al., Lancet 373, 1440-1446 (2009)
【非特許文献１４】McAllister, et al., Regen Med 3, 925-937 (2008)
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、管状不織性生分解性ポリグリコール酸足場を含む構築物であって、ポリグリコール酸の密度が約45 mg/cc〜約75 mg/ccであり、該密度が管状足場全体を通して均一である構築物を提供する。
【０００８】
管状生分解性ポリグリコール酸足場の長さは、約1 cm〜約100 cmであってよい。好ましくは、管状生分解性ポリグリコール酸足場の長さは、約10 cm〜約40 cmであってよい。管状生分解性ポリグリコール酸足場の内径は、約3 mm超であってよい。好ましくは、管状生分解性ポリグリコール酸足場の内径は、約3 mm〜約20 mmであってよい。
【０００９】
ポリグリコール酸の厚さは約0.8〜約1.5 mmであってよく、該厚さは管状足場を通して均一である。好ましくは、ポリグリコール酸は約0.8〜約1.2 mmであってよく、該厚さは管状足場を通して均一である。ポリグリコール酸内の繊維の厚さは、約5〜約20μmであってよい。ポリグリコール酸の多孔度は、約90％〜約98％であってよい。
【００１０】
本発明の構築物は、管状生分解性ポリグリコール酸足場の各末端において、非生分解性ポリエチレンテレフタレート支持体をさらに含み得る。非生分解性ポリエチレンテレフタレート支持体は、当技術分野で公知の任意の手段によって、管状生分解性ポリグリコール酸足場に付着させることができる。好ましくは、ポリエチレンテレフタレート支持体は、縫合により付着させる。ポリエチレンテレフタレートの多孔度は、≧200 cc/分/cm2であってよい。管状生分解性ポリグリコール酸足場および非生分解性ポリエチレンテレフタレート支持体は、細胞の接着および増殖を可能にし得る。他の態様では、管状足場の各末端を支持するために、他の非生分解性ポリマーが使用され得る。
【００１１】
本発明の構築物は、重金属混入物を実質的に含まない。好ましくは、構築物は、アルミニウム、バリウム、カルシウム、ヨウ素、ランタン、マグネシウム、ニッケル、カリウム、および亜鉛からなる群より選択される、微量の重金属混入物しか含まない。
【００１２】
本発明の構築物は、生分解性ポリグリコール酸足場内に、およびその周りに、細胞外基質タンパク質をさらに含み得る。好ましくは、細胞外基質タンパク質の厚さは、基質の最も薄い部分で約200マイクロメートル超である。
【００１３】
本発明はまた、(a) ポリグリコール酸の密度が約45 mg/cc〜約75 mg/ccであり、ポリグリコール酸シートの厚さが約0.8〜約1.2 mmである、生分解性ポリグリコール酸シートを提供する段階、(b) ポリグリコール酸シートの対向する端部どうしが界面で接触するように、マンドレルにポリグリコール酸シートを巻き付ける段階；(c) 界面にわたって、シートの対向する各端部からポリグリコール酸繊維を引き出す段階、および(d) 界面の片側から引き出されたポリグリコール酸繊維を界面の反対側のポリグリコール酸繊維に絡ませることによって、継ぎ目におけるポリグリコール酸の密度が約45 mg/cc〜約75 mg/ccであり、継ぎ目におけるポリグリコール酸の厚さが約0.8〜約1.5 mmである継ぎ目を形成する段階を含む、管状ポリグリコール酸構築物を作製する方法であって、それによって均一なポリグリコール酸密度を有する管状生分解性ポリグリコール酸構築物が作製される、方法を提供する。本発明はまた、本明細書に記載される方法によって形成された管状生分解性ポリグリコール酸構築物を提供する。
【００１４】
構築物は、動静脈移植片、冠動脈移植片、末梢動脈バイパス導管、卵管置換物、および尿路導管からなる群より選択され得る。マンドレルは、当技術分野で公知の任意の材料を含み得る。好ましくは、マンドレルはガス透過性シリコンチューブを含む。
【００１５】
絡ませる段階は、その後の処理段階において継ぎ目を元の状態に保つことを可能にする、当技術分野で公知の任意に方法によって行うことができる。好ましくは、絡ませる段階はフェルト針で行われる。
【００１６】
本発明の方法は、重金属混入物を除去するために管状構築物を処理する段階をさらに含み得る。好ましくは、管状構築物を1つまたは複数の非極性溶媒で処理し、その後エタノールなどの第一級アルコールで処理する。好ましくは、継ぎ目は該処理後に元の状態のままである。この処理はまた、チューブの形成前に生分解性足場に対して行ってもよい。
【００１７】
本発明の方法は、ポリグリコール酸分解の速度を増加させるため、および/またはポリグリコール酸の湿潤性を増加させるために、管状構築物を処理する段階をさらに含み得る。好ましくは、管状構築物を強塩基で処理する。より好ましくは、強塩基は1 M NaOHである。好ましくは、継ぎ目は該処理後に元の状態のままである。この処理はまた、チューブの形成前に生分解性足場に対して行ってもよい。
【００１８】
本発明の方法は、管状生分解性ポリグリコール酸足場の末端において非生分解性ポリエチレンテレフタレート支持体を付着させる段階をさらに含み得る。
【００１９】
本発明はまた、≧3 mmの内径を有する、細胞外基質タンパク質およびポリグリコール酸を含む管状構築物であって、構築物が免疫および石灰化抵抗性であり、ポリグリコール酸が該構築物の断面積の33％未満を構成し、構築物が5％未満の細胞、2％未満の細胞、1％未満の細胞を含んで実質的に無細胞性であるか、または細胞を含まない、管状構築物を提供する。好ましくは、細胞は無傷の細胞である。好ましくは、ポリグリコール酸は、構築物の断面積の10％未満を構成する。より好ましくは、ポリグリコール酸は、構築物の断面積の5％未満を構成する。最も好ましくは、ポリグリコール酸は、構築物の断面積の3％未満を構成する。
【００２０】
細胞外基質タンパク質構築物は、2000 mg Hgを超える破裂圧力を構成し得る。構築物は、120 gを超える縫合強度を構成し得る。管状構築物の内径は、約3 mm〜約20 mmであってよい。管状構築物の厚さは、構築物の最も薄い部分で約200マイクロメートル超であってよい。構築物は、液体に対して不透過性であってよい。好ましくは、構築物は、最大で少なくとも200 mm Hg、少なくとも300 mm Hg、または少なくとも400 mm Hgまで、液体漏出に対して不透過性である。構築物の長さは約1 cm〜約100 cmである。好ましくは、構築物の長さは約10 cm〜約40 cmである。
【００２１】
細胞外基質タンパク質は、ヒロドキシプロリン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、およびI型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、VI型コラーゲン、XI型コラーゲン、XII型コラーゲン、フィブリリンI、テネイシン、デコリン、バイグリカン、バーシカン、およびアスポリンを含み得る。好ましくは、細胞外基質タンパク質は、＞40μg/mg乾燥重量のヒドロキシプロリンを含み得る。いくつかの態様において、構築物は、エラスチン、MAGP1、および/またはMAGP2を含まない。好ましくは、細胞外基質タンパク質は、構築物の意図されるレシピエントに対して同種、自己、または異種の細胞から産生される。好ましくは、細胞外基質タンパク質は一部、管状構築物の周りに円周方向に配向される。
【００２２】
構築物は、300 ng/cm未満のβ-アクチンを含み得る。構築物は、3％乾燥重量未満の脂質を含み得る。構築物は、微量または検出不可能な量の二本鎖ゲノムDNAを含み得る。好ましくは、DNAの量は、ゲル電気泳動によって決定される通りである。
【００２３】
構築物は、インビボでの移植に際して石灰化をほとんど誘導しない。好ましくは、構築物は、移植の6ヵ月以内に1％未満の石灰化を誘導する。より好ましくは、構築物は、移植の12ヵ月以内に1％未満の石灰化を誘導する。最も好ましくは、構築物は、移植の12ヵ月以内に石灰化を生じない。
【００２４】
構築物は、インビボでの移植に際して免疫応答をほとんど誘導しない。好ましくは、血管移植片として移植された場合、構築物は、移植の6ヵ月の時点で、天然脈管構造および移植片の構築物との吻合部において、1 mm未満の内膜過形成肥厚を誘導する。より好ましくは、構築物は、移植の6ヵ月の時点で、天然脈管構造の構築物との吻合部において、0.25 mm未満の内膜過形成肥厚を誘導する。
【００２５】
構築物は、移植後に、その移植片直径の50％を超えて拡張しない。構築物は、約2℃〜約30℃で貯蔵することができる。好ましくは、約2℃〜約30℃での貯蔵は、少なくとも3ヵ月間許容される。最も好ましくは、約2℃〜約30℃での貯蔵は、少なくとも12ヵ月間許容される。
【００２６】
本発明はまた、(a) 管状生分解性ポリグリコール酸構築物を提供する段階、(b) 管状生分解性ポリグリコール酸構築物上に、継代6代目またはそれ未満のヒト細胞を播種する段階、(c) 細胞が管状生分解性ポリグリコール酸構築物上で細胞外基質タンパク質を分泌するような条件下で、細胞を培養する段階、(d) 構築物が5％未満の細胞を含んで実質的に無細胞性であり、構築物が免疫および石灰化抵抗性であるように、段階(c)の構築物を脱細胞化する段階、ならびに(e) ポリグリコール酸が、該構築物の断面積の33％未満を構成するように、段階(c)のポリグリコール酸構築物を分解する段階を含む、管状構築物を作製する方法であって、それによって脱細胞化された管状構築物が作製される方法を提供する。本発明はまた、本明細書に記載される方法によって形成された脱細胞化管状構築物を提供する。
【００２７】
好ましくは、構築物は、2％未満の細胞、1％未満の細胞を含んで実質的に無細胞性であるか、または細胞を含まない。好ましくは、細胞は無傷の細胞である。細胞は、意図されるレシピエントに対して同種、自己、または異種であってよい。好ましくは、細胞は同種である。
【００２８】
細胞は単一のドナーから得られるか、または細胞バンクから得られ、細胞バンクの細胞は複数のドナーからプールされる。好ましくは、細胞は、複数のドナーの細胞バンクから得られる。好ましくは、各ドナーは50歳未満であり、および/または血管疾患と診断されていない。細胞は、ヒト大動脈から単離され得る。好ましくは、細胞はヒト胸部大動脈から単離され得る。より好ましくは、細胞は平滑筋細胞を含む。
【００２９】
好ましくは、細胞は、継代5代目またはそれ未満、継代4代目またはそれ未満、継代3代目またはそれ未満である。細胞は、約6週間〜約11週間の培養期間にわたって培養することができる。細胞は、高グルコース、インスリン、bFGF、および/またはEGFを含む培地中で培養することができる。好ましくは、培地はDMEMを含む。好ましくは、細胞は、培養の最初の2〜6週間は、約11％〜約30％のヒト血清を含む培地中で培養され、培養期間の残りの期間(少なくとも4週間、少なくとも5週間)は、約1％〜約10％のヒト血清を含む培地中で培養される。より好ましくは、細胞はバイオリアクター中で培養される。
【００３０】
細胞は、構築物1 cm長当たり約0.5×106個細胞〜構築物1 cm長当たり約2×106個細胞で、管状生分解性ポリグリコール酸構築物上に播種することができる。好ましくは、播種された細胞の各細胞、または各細胞の集団的子孫は、培養中の9週間をかけて、1 ngを超えるヒドロキシプロリンを産生する。
【００３１】
特記されない限り、本明細書で用いられる専門用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって共通に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書において、文脈により別段の指示が明確にない限り、単数形はまた複数形も含む。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等の方法および材料も、本発明の実施または試験において用いることができるが、適切な方法および材料は以下に記載するものである。本明細書で言及された出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照により組み入れられる。本明細書で引用された参考文献は、主張される本発明の先行技術とは認められない。矛盾する場合には、定義を含め、本明細書が優先する。加えて、材料、方法、および実施例は説明に過ぎず、限定を意図するものではない。
【００３２】
以下に、本発明の基本的な諸特徴および種々の態様を列挙する。
［１］
管状生分解性不織性ポリグリコール酸足場を含む構築物であって、ポリグリコール酸の密度が約45 mg/cc〜約75 mg/ccであり、該密度が管状足場全体を通して均一であり、ポリグリコール酸の厚さが約0.8〜約1.2mmであり、かつポリグリコール酸内の繊維の厚さが約5〜約20μmである、構築物。
［２］
管状生分解性ポリグリコール酸足場の長さが約1 cm〜約100 cmである、［1］記載の構築物。
［３］
管状生分解性ポリグリコール酸足場の内径が約3 mm〜約6 mmである、［1］記載の構築物。
［４］
管状生分解性ポリグリコール酸足場の各末端に非生分解性ポリエチレンテレフタレート支持体をさらに含む構築物であって、ポリエチレンテレフタレートの多孔度が≧200 cc/分/cm2であり、かつ支持体が細胞の接着および増殖を可能にする、［1］記載の構築物。
［５］
重金属混入物を実質的に含まない、［1］記載の構築物。
［６］
アルミニウム、バリウム、カルシウム、ヨウ素、ランタン、マグネシウム、ニッケル、カリウム、および亜鉛からなる群より選択される微量の重金属混入物を含む、［5］記載の構築物。
［７］
細胞外基質タンパク質をさらに含む、［1］記載の構築物。
［８］
細胞外基質タンパク質の厚さが、基質の最も薄い部分で約200マイクロメートル超である、［7］記載の構築物。
［９］
(a) ポリグリコール酸の密度が約45 mg/cc〜約75 mg/ccであり、かつポリグリコール酸シートの厚さが約0.8〜約1.2 mmである、生分解性ポリグリコール酸シートを提供する段階、
(b) ポリグリコール酸シートの対向する端部どうしが界面で接触するように、マンドレルにポリグリコール酸シートを巻き付ける段階、
(c) 界面にわたって、シートの対向する各端部からポリグリコール酸繊維を引き出す段階、および
(d) 界面の片側から引き出されたポリグリコール酸繊維を界面の反対側のポリグリコール酸繊維に絡ませることによって、継ぎ目におけるポリグリコール酸の密度が約45 mg/cc〜約75 mg/ccであり、かつ継ぎ目におけるポリグリコール酸の厚さが約0.8〜約1.5 mmである、継ぎ目を形成する段階
を含む、管状ポリグリコール酸構築物を作製する方法であって、それによって均一なポリグリコール酸密度を有する管状生分解性ポリグリコール酸構築物が作製される、方法。
［１０］
重金属混入物を除去するために管状構築物を処理する段階をさらに含む、［9］記載の方法。
［１１］
継ぎ目が前記処理後に元の状態のままである、［10］記載の方法。
［１２］
ポリグリコール酸分解の速度を増加させるために管状構築物を処理する段階をさらに含む、［9］記載の方法。
［１３］
継ぎ目が前記処理後に元の状態のままである、［12］記載の方法。
［１４］
［9］記載の方法によって形成された管状生分解性ポリグリコール酸構築物。
［１５］
構築物の最も薄い部分で約200μmを超える厚さを有し、かつ≧3 mmの内径を有する、細胞外基質タンパク質およびポリグリコール酸を含む管状構築物であって、構築物が内膜過形成および石灰化抵抗性であり、ポリグリコール酸が該構築物の断面積の33％未満を構成し、かつ構築物が5％未満の無傷の細胞を含んで実質的に無細胞性である、管状構築物。
［１６］
1％未満の無傷の細胞を含んで実質的に無細胞性である、［15］記載の管状構築物。
［１７］
その内径が約3 mm〜約6 mmである、［15］記載の管状構築物。
［１８］
その長さが約1 cm〜約100 cmである、［15］記載の管状構築物。
［１９］
最大で少なくとも200 mm Hgまで、液体漏出に対して不透過性である、［15］記載の管状構築物。
［２０］
動静脈移植片、冠動脈移植片、罹患末梢動脈のバイパス導管、卵管置換物、および尿路導管からなる群より選択される、［15］記載の管状構築物。
［２１］
細胞外基質タンパク質が、ヒロドキシプロリン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、およびI型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、VI型コラーゲン、XI型コラーゲン、XII型コラーゲン、フィブリリンI、テネイシン、デコリン、バイグリカン、バーシカン、またはアスポリンを含む、［15］記載の管状構築物。
［２２］
細胞外基質タンパク質が＞40μg/mg乾燥重量のヒドロキシプロリンを含む、［21］記載の管状構築物。
［２３］
細胞外基質タンパク質が管状構築物の周りに円周方向に配向される、［15］記載の管状構築物。
［２４］
300 ng/cm未満のβ-アクチンを含む、［15］記載の管状構築物。
［２５］
3％乾燥重量未満の脂質を含む、［15］記載の管状構築物。
［２６］
微量の二本鎖ゲノムDNAを含む、［15］記載の管状構築物。
［２７］
移植の6ヵ月以内に1％未満の石灰化を誘導する、［15］記載の管状構築物。
［２８］
移植の12ヵ月以内に1％未満の石灰化を誘導する、［15］記載の管状構築物。
［２９］
移植の6ヵ月の時点で、構築物との吻合部において天然脈管構造に1 mm未満の内膜過形成肥厚を誘導する、［15］記載の管状構築物。
［３０］
移植の6ヵ月の時点で、構築物との吻合部において天然脈管構造に0.25 mm未満の内膜過形成肥厚を誘導する、［15］記載の管状構築物。
［３１］
移植後に、その移植片直径の50％を超えて拡張しない、［15］記載の管状構築物。
［３２］
尿路導管である場合に、尿路導管が少なくとも4週間の尿への曝露に耐える、［20］記載の管状構築物。
［３３］
尿路導管である場合に、尿路導管が結晶化抵抗性である、［20］記載の管状構築物。
［３４］
約2℃〜約30℃で少なくとも12ヵ月間貯蔵することができる、［15］記載の管状構築物。
［３５］
(a) 約3 mm〜約6 mmの内径を有する管状生分解性ポリグリコール酸構築物を提供する段階、
(b) 管状生分解性ポリグリコール酸構築物上に、継代6代目またはそれ未満のヒト細胞を播種する段階、
(c) 管状生分解性ポリグリコール酸構築物上で細胞が細胞外基質タンパク質を分泌するような条件下で、細胞を培養する段階、
(d) 構築物が5％未満の無傷の細胞を含んで実質的に無細胞性であり、かつ構築物が内膜過形成および石灰化抵抗性であるように、段階(c)の構築物を脱細胞化する段階、ならびに
(e) ポリグリコール酸が該構築物の断面積の33％未満を構成し、かつ構築物の最も薄い部分で約200μmを超える細胞外基質タンパク質の厚さを構築物が有するように、段階(c)のポリグリコール酸構築物を分解する段階
を含む、管状構築物を作製する方法であって、それによって脱細胞化された管状構築物が作製される、方法。
［３６］
脱細胞化段階がドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の非存在下で行われる、［35］記載の方法。
［３７］
脱細胞化段階がベンゾナーゼ（benzonase）をさらに含む、［35］記載の方法。
［３８］
構築物が、1％未満の無傷の細胞を含んで実質的に無細胞性である、［35］記載の方法。
［３９］
細胞が単一のドナーから得られるか、または細胞バンクから得られ、細胞バンクの細胞が複数のドナーからプールされる、［35］記載の方法。
［４０］
細胞がヒト大動脈から単離される、［35］記載の方法。
［４１］
細胞が平滑筋細胞を含む、［35］記載の方法。
［４２］
細胞が継代3代目またはそれ未満である、［35］記載の方法。
［４３］
細胞が、培養の最初の2〜6週間は約11％〜約30％のヒト血清を含む培地中で培養され、そして少なくとも付加的な4週間は約1％〜約10％のヒト血清を含む培地中で培養される、［35］記載の方法。
［４４］
培地が、高グルコース、インスリン、bFGF、およびEGFをさらに含む、［44］記載の方法。
［４５］
細胞が、構築物1 cm長当たり約0.5×106個細胞〜構築物1 cm長当たり約2×106個細胞で、管状生分解性ポリグリコール酸構築物上に播種される、［35］記載の方法。
［４６］
播種された細胞の各細胞、または各細胞の集団的子孫が、培養中の9週間をかけて、1 ngを超えるヒドロキシプロリンを産生する、［35］記載の方法。
［４７］
［35］記載の方法によって形成された管状構築物。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】すぐに利用可能な細胞外基質タンパク質構築物を作製するために用いられるアプローチの模式図である。各構築物は、(段階A)ポリマー足場上でヒト細胞を培養することによって実験室で作製され、該足場は、細胞が細胞外基質タンパク質を産生して組織を形成する(段階B)のと同時に分解する。次に細胞材料を除去して、細胞外基質タンパク質を残し(段階C)、これは、患者が必要とする時まで冷蔵するか、または室温でもしくは何らかの他の貯蔵手段によって貯蔵することができる。細胞由来の細胞外基質タンパク質構築物は、細胞なしで(段階D、直径≧6 mm)、または小口径(3〜4 mm)適用にはレシピエントの内皮細胞を播種して(段階E)、移植することができる。
【図２】図2A〜2Gは、移植部位および観察を示す写真である。図2Aは、ヒヒモデルにおいて腋窩動脈(a)と上腕静脈(v)の間に移植されたヒト細胞由来の6 mm構築物(g)を示す。図2Bは、移植後4週間目に、16G針で最初にアクセスした動静脈移植片(g)を示す。図2Cは、開存性移植片(g)を実証する代表的な外植片血管造影図である。動脈吻合部(aa)、静脈吻合部(va)、および上腕静脈(v)を示す。図2Eは、頸動脈バイパスとしてのイヌ細胞由来の3 mm構築物(g)を、移植時に介在する頸動脈(ca)を閉鎖したクリップと共に示す。図2Eは、1年目の、管腔狭窄がなく開存性であることを実証する代表的な血管造影図である。図2Fは、心臓に移植された、イヌ細胞由来の直径3 mmの構築物(g)を示す。図2Gは、1ヵ月目の、拡張のない開存性移植片(g)を実証するCTスキャンを示す。
【図３】図3A〜3Fは、移植前の脱細胞化ヒト構築物を示す写真である。図3Aは、移植前の直径6 mmの脱細胞化ヒト細胞外基質タンパク質構築物を示す。図3Bは、H&E染色した切片中に細胞が存在しないこと(矢印は残存PGAを指す)、および脱細胞化構築物に典型的な多孔性構造を実証する、代表的な脱細胞化構築物を示す。図3Cは、I型コラーゲンについて強くかつ散在性に染色された脱細胞化構築物を示す。図3Dは、組織化されたIII型コラーゲンについて染色された脱細胞化構築物を示す。図3Eは、組織化されたフィブロネクチンについて染色された脱細胞化構築物を示す。図3Fは、組織化されたビトロネクチンについて染色された脱細胞化構築物を示す。細胞外基質タンパク質について陽性に染まる領域を、白抜きの矢尻で示す。3C〜Fでは、細胞外基質タンパク質の円周方向の整列が明白である。図C〜Fでは、DAB染色が多孔性構造をマスクすることに留意されたい。スケールバー、100μm。
【図４】図4A〜4Iは、インビボで再構築された、外植された構築物を示す写真である。図4Aは、緩い外部外膜様層(g：移植片、a：「外膜」)の形成を実証する、6ヵ月目にヒヒモデルから外植された直径6 mmのヒト細胞外基質タンパク質構築物を示す。図4Bは、1年目に頸動脈バイパスモデルから外植された直径4 mmのイヌ構築物を示す(矢印は吻合縫合線を示す)。図4Cは、6ヵ月のヒヒ外植片における、エラスチンを示すMovat's染色(黒色)である。図4Dは、動脈吻合部に近接した移植片壁に高密度に集合する細胞を示す、6ヵ月目の直径6 mmのヒヒ外植片のH&E染色である(D〜Iにおいて、矢尻は染色された細胞を指す)。図4Eは、ヒヒモデルにおいて6ヵ月後に、α-平滑筋アクチン陽性細胞(褐色)が吻合部位近傍の構築物壁に集合したことを示す(注記：濃い染色は管腔表面下で観察されたが、管腔上の細胞はアクチン陽性ではなかった)。図4Fは、これらの細胞が、周囲の外膜様組織から構築物移植片中間部に浸潤し始めたことを示す(図4F〜4Hにおいて、矢印は移植片壁の深さを規定する)。図4Gは、イヌモデルにおいて、1ヵ月目に、周囲の外膜様組織からイヌ頸動脈バイパス移植片の移植片中間部分に浸潤するα-平滑筋アクチン陽性細胞(緑色)が観察されたことを示す。図4Hは、1年目に、アクチン陽性細胞がイヌ移植片壁の深さの至るところに観察されたことを示す。図4Iは、管腔細胞におけるフォン・ヴィルブランド因子についての陽性染色を実証する、ヒヒから外植された構築物を示す(吻合部近傍の切片を表示)。スケールバー、100μm。
【図５】図5A〜5Fは、細胞外基質タンパク質構築物が非免疫原性であったことを示す写真およびグラフである。図5Aは、移植後4週間目のヒヒにおける、ホモジナイズした移植片材料およびPBS(陰性対照)の皮内注射が、明白な硬化も発赤も示さなかったことを示す。図5Bは、移植時(0週目)および移植の24週間後に単離され、PTFE(陰性対照；移植していない)および構築物(標識TEVG)のセグメントに曝露した後のT細胞の代表的な増殖を示すグラフであり、移植片が免疫学的に許容されることを実証した。図5Cは、ヒヒにおける6ヵ月目の、構築物の吻合部位における浸潤細胞の大きな集団を示すH&E染色の写真である。図5Dは、ヒヒにおいて6ヵ月目に、吻合部位における細胞のほんのわずかな集団しか、CD3(Tリンパ球マーカー)について陽性に染まらないことを示す。図5Eは、ヒヒにおいて6ヵ月目に、吻合部位における細胞のほんのわずかな集団しか、CD20(Bリンパ球マーカー)について陽性に染まらないことを示す。図5Fは、ヒヒモデルから6ヵ月目に外植されたヒト構築物中にアリザリンレッド染色での石灰化が存在しないこと(赤色の欠如)を示す。矢印は染色された細胞を指す。スケールバー、300μm。
【図６】多くのレシピエントのための多くの細胞外基質タンパク質構築物を作製するために、一人のドナーの細胞が用いられる模式図である。
【図７Ａ】管状ポリマー構築物を示す写真である。図7Aは、均一なPGA密度を示す。
【図７Ｂ】管状ポリマー構築物を示す写真である。図7Bは、低密度領域および高密度領域を有する、不均一なPGA密度を示す。
【図７Ｃ】管状ポリマー構築物を示す写真である。図7Cは、管状構築物の全体的な密度と一致する均一に絡まった継ぎ目、およびPETアンカーを有する、管状ポリマー構築物を示す。
【図７Ｄ】管状ポリマー構築物を示す写真である。図7Dは、継ぎ目が不十分に絡まり、様々な密度(高密度領域および低密度領域)を有する、管状ポリマー構築物を示す。
【図８】静脈内膜過形成の写真である。図8Aは、本発明の細胞外基質タンパク質構築物の静脈吻合部を示す。図8Bは、PTFE移植片に隣接した実質的な静脈内膜過形成を示す。
【図９Ａ】尿路導管としての本発明の細胞外基質タンパク質構築物の使用を示す写真である。図9Aは、導管が尿管との端々吻合および端側吻合を支持し、後腹膜面に潜りこんでいることを示す。皮膚において、導管は皮膚と共にストーマを形成する。
【図９Ｂ】尿路導管としての本発明の細胞外基質タンパク質構築物の使用を示す写真である。図9Bは、尿が迂回している、細胞外基質タンパク質導管皮膚ストーマを示す。手術の治癒過程中に開放導管を維持するために診療所で日常的に用いられるステントが、皮膚ストーマを通して細胞外基質タンパク質導管中に挿入されて示されている。
【図９Ｃ】尿路導管としての本発明の細胞外基質タンパク質構築物の使用を示す写真である。図9Cは、尿路変向導管のストーマから排出している尿を蓄積するオストミーバッグを示す。
【図９Ｄ】尿路導管としての本発明の細胞外基質タンパク質構築物の使用を示す写真である。図9Dは、濃縮尿に28日間曝露した後の導管を示す。
【図９Ｅ】尿路導管としての本発明の細胞外基質タンパク質構築物の使用を示す写真である。図9Eは、濃縮尿に4週間曝露した後、導管が結晶化に抵抗し、物理学的および力学的に無傷のままであったことを示す。
【図１０】卵管導管としての本発明の細胞外基質タンパク質構築物の使用を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
発明の詳細な説明
本発明は、生分解性ポリマー足場を含む構築物であって、ポリマー材料の密度が約45 mg/cc〜約75 mg/ccであり、該密度が管状足場全体を通して均一である構築物を提供する。本明細書で用いられる均一とは、足場の表面積の100％にわたる、密度の30％以下、15％以下、10％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、1％以下の変動と定義される。足場は、当技術分野で公知の任意の形状であってよい。好ましくは、足場は管状である。当技術分野で公知の任意の合成生分解性ポリマー材料が使用され得る。好ましくは、ポリマー材料はポリグリコール酸である。足場は、当技術分野で公知の任意の形態であってよい。好ましくは、足場はフェルト状である。これらの構築物は、本明細書において互換的に「ポリマー構築物」、「ポリマー足場」、「ポリグリコール酸(PGA)構築物」、または「ポリグリコール酸(PGA)足場」と称される。
【００３５】
管状生分解性ポリグリコール酸足場の長さは、約1 cm〜約100 cmであってよい。好ましくは、管状生分解性ポリグリコール酸足場の長さは、約10 cm〜約40 cmであってよい。より好ましくは、長さは、少なくとも少なくとも5 cm長、少なくとも10 cm長、少なくとも12 cm長、少なくとも13 cm長、少なくとも14 cm長、少なくとも20 cm長、少なくとも25 cm長、または少なくとも30 cm長であってよい。管状生分解性ポリグリコール酸足場の内径は、約3 mmに等しいか、またはそれ以上であってよい。好ましくは、管状生分解性ポリグリコール酸足場の内径は、約3 mm〜約20 mm、例えば少なくとも3 mm、少なくとも4 mm、少なくとも5 mm、または最大約20 mmまでの任意の整数値などであってよい。
【００３６】
ポリグリコール酸の厚さは約0.8〜約1.5 mmであってよく、該厚さは管状足場を通して均一である。好ましくは、ポリグリコール酸は約0.8〜約1.2 mmであってよい。ポリグリコール酸内の繊維の厚さは、約5〜約20μmであってよい。ポリグリコール酸の多孔度は、約90％〜約98％であってよい。
【００３７】
本発明の構築物は、管状生分解性ポリグリコール酸足場の各末端において、非生分解性ポリエチレンテレフタレート支持体をさらに含み得る。非生分解性ポリエチレンテレフタレート支持体は、当技術分野で公知の任意の手段によって、管状生分解性ポリグリコール酸足場に付着させることができる。好ましくは、ポリエチレンテレフタレート支持体は、縫合により付着させる。ポリエチレンテレフタレートの多孔度は、≧200 cc/分/cm2であってよい。管状生分解性ポリグリコール酸足場および非生分解性ポリエチレンテレフタレート支持体は、細胞の接着および増殖を可能にし得る。あるいは、管状足場の各末端における支持体として、他の非分解性ポリマーを用いることもできる。
【００３８】
本発明の構築物は、重金属混入物を実質的に含まない。好ましくは、構築物は、アルミニウム、バリウム、カルシウム、ヨウ素、ランタン、マグネシウム、ニッケル、カリウム、および亜鉛からなる群より選択される、微量の重金属混入物しか含まない。アルミニウムは、約1.5 ppm〜約5 ppmの量で存在してよい。バリウムは、約0.03 ppm〜約0.06 ppmの量で存在してよい。カルシウムは、約10 ppm〜約4 ppmの量で存在してよい。ヨウ素は、約0.1 ppm〜約0.04 ppmの量で存在してよい。ランタンは、約0.05 ppm〜約0.3 ppmの量で存在してよい。マグネシウムは、約0.5 ppm〜約3.5 ppmの量で存在してよい。ニッケルは、約0.1 ppm〜約1 ppmの量で存在してよい。カリウムは、約5 ppm〜約40 ppmの量で存在してよい。亜鉛は、約1 ppm〜約5 ppmの量で存在してよい。
【００３９】
本発明の構築物は、生分解性ポリグリコール酸足場内に、およびその周りに、細胞外基質タンパク質をさらに含み得る。好ましくは、細胞外基質タンパク質の厚さは、構築物の最も薄い部分で約200マイクロメートル超である。
【００４０】
本発明はまた、(a) ポリグリコール酸の密度が約45 mg/cc〜約75 mg/ccであり、ポリグリコール酸シートの厚さが約0.8〜約1.2 mmである、生分解性ポリグリコール酸シートを提供する段階、(b) ポリグリコール酸シートの対向する端部どうしが界面で接触するように、マンドレルにポリグリコール酸シートを巻き付ける段階；(c) 界面にわたって、シートの対向する各端部からポリグリコール酸繊維を引き出す段階、および(d) 界面の片側から引き出されたポリグリコール酸繊維を界面の反対側のポリグリコール酸繊維に絡ませることによって、継ぎ目におけるポリグリコール酸の密度が約45 mg/cc〜約75 mg/ccであり、継ぎ目におけるポリグリコール酸の厚さが約0.8〜約1.5 mmである継ぎ目を形成する段階を含む、管状ポリグリコール酸構築物を作製する方法であって、それによって均一なポリグリコール酸密度を有する管状生分解性ポリグリコール酸構築物が作製される、方法を提供する。本発明はまた、本明細書に記載される方法によって形成された管状生分解性ポリグリコール酸構築物を提供する。
【００４１】
マンドレルは、当技術分野で公知の任意の材料を含み得る。好ましくは、マンドレルはガス透過性シリコンチューブを含む。
【００４２】
絡ませる段階は、その後の処理段階において継ぎ目を元の状態に保つことを可能にする、当技術分野で公知の任意に方法によって行うことができる。好ましくは、絡ませる段階はフェルト針で行われる。
【００４３】
本発明の方法は、重金属混入物を除去するために管状構築物を処理する段階をさらに含み得る。好ましくは、管状構築物を1つまたは複数の非極性溶媒で処理し、エタノールなどの少なくとも1つの第一級アルコールで処理する。好ましくは、継ぎ目は該処理後に元の状態のままである。この処理はまた、チューブの形成前に生分解性足場に対して行ってもよい。
【００４４】
本発明の方法は、ポリグリコール酸分解の速度を増加させるため、および/またはポリグリコール酸の湿潤性を増加させるために、管状構築物を処理する段階をさらに含み得る。好ましくは、管状構築物を強塩基で処理する。より好ましくは、強塩基は1 M NaOHである。好ましくは、継ぎ目は該処理後に元の状態のままである。この処理はまた、チューブの形成前に生分解性足場に対して行ってもよい。
【００４５】
本発明の方法は、管状生分解性ポリグリコール酸足場の末端において非生分解性ポリエチレンテレフタレート支持体を付着させる段階をさらに含み得る。これらの支持体は、管状構築物の他の処理の前または後に付着させることができる。
【００４６】
本発明はまた、≧3 mmの内径を有する、細胞外基質タンパク質およびポリマー材料を含む管状構築物であって、構築物が免疫および石灰化抵抗性であり、ポリマー材料が該構築物の断面積の33％未満を構成し、構築物が5％未満の細胞を含んで実質的に無細胞性である、管状構築物を提供する。免疫の刺激は、いくつかの態様において、レシピエントへの構築物材料の皮内注射に対する、注射の48時間後の反応によって判定される。好ましくは、ポリマー材料はポリグリコール酸である。これらの構築物は、本明細書において互換的に「細胞外基質タンパク質構築物」、「脱細胞化構築物」と称されるか、またはインビボでの使用に応じて「移植片」、「導管」、もしくは「血管」と称され得る。
【００４７】
細胞外基質タンパク質構築物は、いくつかの解剖学的位置および疾患状態において用いることができる。構築物は、動静脈移植片、冠動脈移植片、末梢動脈バイパス導管、卵管置換物、および尿路導管からなる群より選択され得る。例えば、細胞外基質タンパク質構築物は、血液透析を受けている患者における動静脈移植片として、患者における妨害物をバイパスする際の冠動脈移植片として、末梢動脈疾患(PAD)患者において罹患した末梢動脈をバイパスするため、または尿路導管として有用である。細胞外基質タンパク質構築物の直径および長さは、これらの種々の用途に対して異なり、外科的取り付け場所も同様に異なる。例えば、冠動脈移植片は冠動脈に取り付けるものであり、末梢動脈移植片は末梢動脈に取り付けるものであり、尿路導管は典型的には、ストーマを形成するために尿管を皮膚につなげるものである。
【００４８】
米国では毎年、およそ10,000名の患者が膀胱切除術を受け、尿を体外に排出するために尿路導管を必要とする(Healthcare Cost and Utilization Project (2007). N.I.S.)。ほぼすべての症例において、非禁制型尿路変向、または間欠的にカテーテル挿入して、禁制ストーマを通して尿を排出させる禁制型尿路変向のいずれかを形成するために、患者から腸が摘出される(Konety BR, Joyce GF, Wise M (2007) Bladder and upper tract urothelial cancer. J Urol 177: 1636-1645)。患者は、腸の摘出部位において、吻合部漏出および腹膜炎を含む合併症を患う場合がある。加えて、回腸尿路導管は虚血および壊死を患う場合があり、これは穿孔、吻合部崩壊、ストーマ問題、および導管からの尿の漏出を引き起こし得る。長期的には、多くの患者は、導管壁を通した尿中電解質の再吸収に起因して、慢性高塩素血症性代謝性アシドーシスを患う。回腸導管は細菌をかくまうため、導管由来の細菌がより近位の尿路系に感染することから、患者はまた通常、再発性尿路感染症および腎盂腎炎を患う。したがって、回腸導管の使用に付随する合併症の多くを回避する、尿路変向のための改良法の著しい医学的必要性が存在する(Konety BR, Allareddy V (2007) Influence of post-cystectomy complications on cost and subsequent outcome. J Urol 177:280-287；Dahl DM, McDougan WS (2009) Use of intestinal segments and urinary diversion. In: Wein AJ, Kavoussi LR, Novick AC (eds) Campbell-Walsh Urology. 9th Edn.)。
【００４９】
驚くべきことに、本発明の細胞外基質タンパク質構築物は、自己回腸と比較した場合に、有意に優れた特性を提供する。例えば、膀胱手術が完全に回避されるため、患者の腸の切除が必要とされない。本明細書に記載されるように、本発明の尿路導管は予め製造されて貯蔵され、患者はすぐにそれを利用することができる。本発明の細胞外基質タンパク質構築物は、尿路導管として用いられる場合、その管腔内容物を活発に吸収しないため、高塩素血症性代謝性アシドーシスのリスクが実質的に減少する。本発明の細胞外基質タンパク質構築物は、尿路導管として用いられる場合、腸管細菌叢をかくまわないため、再発性尿路感染症のリスクが顕著に減少する。本発明の細胞外基質タンパク質構築物は、尿路導管として用いられる場合、粘液を産生せず、そのため粘液産生性の回腸導管と比較した場合に、ストーマの詰まりのリスクが減少する。本発明の細胞外基質タンパク質構築物は非生物であるため、不適切な脈管構造に起因する組織虚血のリスクは本質的にない。むしろ、宿主細胞が無生物導管に徐々に遊走し、同時に微小血管ネットワークを形成する。虚血がなければ、ストーマ狭窄のリスクは減少する。本発明の細胞外基質タンパク質構築物は、3〜20 mmまたはそれ以上の範囲の直径で、かつ最長100 cmまでの長さで成長させることができるため、尿を皮膚表面に迂回させるのに最も適した寸法を有する尿路導管を作製することが可能である。尿路導管は、尿への慢性的曝露に耐え、導管壁を通した尿の活発な拡散に抵抗する。
【００５０】
卵管瘢痕は、不妊を引き起こし得る主要な問題である。いくつかの性感染症と関連しているような感染症は、卵管において瘢痕組織を形成させ得る。瘢痕組織は次に、卵管を遮断するかまたは損傷する。遮断された卵管は卵子の受精を妨げ、損傷した卵管は子宮外妊娠を引き起こし得る。米国では、毎年750,000名を上回る女性が急性骨盤内炎症性疾患の発症を経験し、結果としてこれらの女性のうち10〜15％は不妊症となる(Pelvic Inflammatory Disease (PID) - CDC Fact Sheet, National Center for HIV/AIDS, Viral Hepatitis, STD, and TB Prevention, Division of STD Prevention, September 2011)。毎年、米国ではおよそ550名の女性が卵管癌に罹患する(Vapiwala, N, and Hill-Kayser, C, Fallopian Tube Cancer: The Basics, OncoLink, Abramson Cancer Center of the University of Pennsylvania, 2010)。図10は、豚モデルにおいて、卵管の切除されたセグメントを置きかえるために、本発明の細胞外基質タンパク質構築物を、端々吻合術で縫合することができることを示す。
【００５１】
管状構築物は、構築物が免疫抵抗性および/または石灰化抵抗性であるよう、それが実質的に無細胞性であるように、脱細胞化される。好ましくは、構築物は、2％未満の細胞、1％未満の細胞を含んで実質的に無細胞性であるか、または細胞を含まない。細胞は無傷の細胞である。細胞は生細胞または死細胞であってよい。
【００５２】
管状構築物は、存在するポリマー材料の量を最小限にするために処理される。好ましくは、ポリマー材料はポリグリコール酸である。組織の断面積の50％未満、45％未満、40％未満、35％未満、33％未満、30％未満、25％未満、20％未満、15％未満、10％未満、5％未満、3％未満、または1％未満が合成ポリマー材料を含むように、ポリマー材料を分解するかまたは除去することができる。断面積の計算は管腔を含まない。
【００５３】
細胞外基質タンパク質構築物の長さおよび直径は、所望される解剖学的適用によって異なり得る。細胞外基質タンパク質構築物酸足場の長さは、約1 cm〜約100 cmであってよい。好ましくは、長さは約10 cm〜約40 cmである。より好ましくは、長さは、少なくとも少なくとも5 cm長、少なくとも10 cm長、少なくとも12 cm長、少なくとも13 cm長、少なくとも14 cm長、少なくとも20 cm長、少なくとも25 cm長、または少なくとも30 cm長であってよい。細胞外基質タンパク質構築物の内径は、約3 mmに等しいか、またはそれ以上であってよい。好ましくは、内径は、約3 mm〜約8 mm、例えば少なくとも3 mm、少なくとも4 mm、少なくとも5 mm、少なくとも6 mm、少なくとも7 mm、または少なくとも8 mmなどである。より好ましくは、内径は約3 mm〜約20 mmであってよい。
【００５４】
驚くべきことに、細胞外基質タンパク質構築物は、少なくとも600 mm、少なくとも700 mm、少なくとも800 mm、少なくとも900 mm、少なくとも1000、少なくとも1100 mm、少なくとも1200 mm、少なくとも1300 mm、少なくとも1400 mm、少なくとも1500 mm、少なくとも1600 mm、少なくとも1700、少なくとも1800 mm、少なくとも1900 mm、または少なくとも2000 mm Hgの破裂圧力を構成し得る。破裂圧力は、当技術分野で公知の任意の手段によって；例えば、構築物が破裂するかまたは分離した孔を形成するまで、液体を用いて漸増圧力で構築物を膨張させることによって、測定することができる。好ましくは、構築物は、2000 mm Hgを超える破裂強度を有する。同様に驚いたことに、構築物は、60 g、70 g、80 g、90 g、または120 gを超える縫合強度を構成し得る。好ましくは、構築物は120 gを超える縫合強度を構成する。縫合強度は、当技術分野で公知の任意の手段によって；例えば、構築物の端部から2 mm離れた位置で構築物に6-0縫合糸を挿入することによって、測定することができる。管状構築物の厚さは、構築物の最も薄い部分で約200マイクロメートル超であってよい。構築物は、液体に対して不透過性であってよい。液体は、生理食塩水、または血液もしくは尿などの生体液であってよい。液体に対して不透過性とは、大気圧、200 mm Hg、300 mm Hg、または400 mm Hgにおいて、液体で満たした後の構築物から液体流出が最終的にないことと定義される。好ましくは、構築物は、最大で少なくとも200 mm Hg、少なくとも300 mm Hg、または少なくとも400 mm Hgまで、液体漏出に対して不透過性である。血管中の標準圧力が120 mm Hg以下であること、および高血圧における重篤なステージ4の血圧が、最大230 mm Hgまで達することを考えると、本明細書で提供される細胞外基質タンパク質構築物は、健常患者および病気の患者の両方において漏出および浸出に抵抗する。尿管圧がおよそ30 mmHgであることを考えると、この構築物はまた、尿管導管として使用する際に尿の漏出に抵抗する。いかなる理論にも拘束されないが、本明細書で提供される細胞外基質タンパク質構築物は、細胞外基質タンパク質(例えば、コラーゲン)が、構築物材料1 cm2当たり856±221マイクログラムヒロドキシプロリンの密度で構築物中に密に詰め込まれているために、漏出および浸出に抵抗する。
【００５５】
細胞外基質タンパク質は、ヒロドキシプロリン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、およびI型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、VI型コラーゲン、XI型コラーゲン、XII型コラーゲン、フィブリリンI、テネイシン、デコリン、バイグリカン、バーシカン、およびアスポリンを含み得る。好ましくは、細胞外基質タンパク質は、＞40μg/mg乾燥重量のヒドロキシプロリンを含み得る。好ましくは、細胞外基質タンパク質は、同種、自己、または異種の細胞から産生される。好ましくは、細胞外基質タンパク質は一部、管状構築物の周りに円周方向に配向される。細胞外基質タンパク質の円周方向の配向は、縫合のための「アンカー」を提供する。図3中の矢印は、繊維の円周方向の配向を強調表示している。対照的に、細胞外基質の主に軸方向の配向を有することは、繋留させるための構造を有する縫合を提供せず；むしろ、縫合は軸方向に整列した繊維から滑り落ちる。
【００５６】
構築物は、300 ng/cm未満のβ-アクチンを含み得る。好ましくは、構築物は＜150 ng/cmのβ-アクチンを含む。β-アクチンの量は、当技術分野で公知の任意の手段によって；例えばELISAアッセイによって、決定することができる。構築物は、3％乾燥重量未満の脂質を含み得る。脂質の量は、当技術分野で公知の任意の手段によって；例えばガスクロマトグラフィー-質量分析によって、決定することができる。構築物は、微量または検出不可能な量の二本鎖ゲノムDNAを含み得る。好ましくは、DNAの量は、ゲル電気泳動によって決定される通りである。
【００５７】
構築物は、インビボでの移植に際して石灰化をほとんど誘導しない。好ましくは、構築物は、移植の6週間以内、3ヵ月以内、6ヵ月以内、9ヵ月以内、または12ヵ月以内に1％未満の石灰化を誘導する。より好ましくは、構築物は、移植の6週間以内、3ヵ月以内、6ヵ月以内、9ヵ月以内、または12ヵ月以内に0.5％未満の石灰化を誘導する。最も好ましくは、構築物は、移植の6週間以内、3ヵ月以内、6ヵ月以内、9ヵ月以内、または12ヵ月以内に石灰化を生じない。石灰化は、当技術分野で任意の手段によって決定することができ；例えば、石灰化は、組織学的切片において、アリザリンレッド染色などの組織化学的染色を用いて、カルシウムについて陽性に染まる構築物の面積の割合によって測定される。
【００５８】
構築物は、インビボでの移植に際して、レシピエントへの移植片材料粒子の皮内注射の48時間後の膨疹形成および発赤によって規定される、免疫応答をほとんど誘導しない。好ましくは、構築物は、血管移植片として移植された場合、移植の3ヵ月、6ヵ月、9ヵ月、または12ヵ月の時点で、天然脈管構造の構築物との吻合部において、1 mm未満の内膜過形成肥厚を誘導する。より好ましくは、構築物は、移植の6ヵ月の時点で、天然脈管構造の構築物との吻合部において、1 mm、0.75 mm、0.5 mm、0.4 mm、0.3 mm、または0.25 mm未満の内膜過形成肥厚を誘導する。
【００５９】
驚いたことに、細胞外基質タンパク質構築物は、移植時のそれらの直径の50％を超えて、40％を超えて、30％を超えて、または20％を超えて拡張しない。このことは、インビボにおいて非常に有益である。同様に驚いたことに、細胞外基質タンパク質構築物は非常に貯蔵安定的であり、脱細胞化の前または後に貯蔵することができる。構築物は、それらの完全性および移植可能性を損なうことなく、少なくとも1ヵ月間、2ヵ月間、3ヵ月間、4ヵ月間、6ヵ月間、8ヵ月間、12ヵ月間、18ヵ月間、または24ヵ月間、約2℃〜約30℃で貯蔵することができる。構築物の完全性は、例えば、開始値の少なくとも80％の縫合保持強度の保持によって評価するなど、当技術分野で公知の任意の手段によって評価することできる。構築物は、当技術分野で公知の任意の適切な生理学的緩衝液中で貯蔵することができる。緩衝液は、プロテアーゼ阻害剤またはイオンキレート剤を含み得る。細胞外基質タンパク質構築物はインビボ使用に対してすぐに利用できるため(待ち時間が最小であるかまたはない)、このことは非常に有益である。
【００６０】
本発明はまた、(a) 管状生分解性ポリグリコール酸構築物を提供する段階、(b) 管状生分解性ポリグリコール酸構築物上に、継代6代目またはそれ未満のヒト細胞を播種する段階、(c) 細胞が管状生分解性ポリグリコール酸構築物上で細胞外基質タンパク質を分泌するような条件下で、細胞を培養する段階、(d) 構築物が5％未満の細胞を含んで実質的に無細胞性であり、構築物が免疫および石灰化抵抗性であるように、段階(c)の構築物を脱細胞化する段階、ならびに(e) ポリグリコール酸が、該構築物の断面積の33％未満を構成するように、段階(c)のポリグリコール酸構築物を分解する段階を含む、管状構築物を作製する方法であって、それによって脱細胞化された管状構築物が作製される方法を提供する。本発明はまた、本明細書に記載される方法によって形成された脱細胞化管状構築物を提供する。
【００６１】
管状構築物は、構築物が免疫抵抗性および/または石灰化抵抗性であるよう、それが実質的に無細胞性であるように、脱細胞化される。好ましくは、構築物は、2％未満の細胞を含んで実質的に無細胞性である。より好ましくは、構築物は、1％未満の細胞を含んで実質的に無細胞性である。最も好ましくは、構築物は細胞を含まない。したがって、脱細胞化段階において、管状生分解性ポリグリコール酸構築物上に播種された細胞の25％超、40％超、50％超、75％超、85％超、90％超、95％超、98％超、または99％超が除去される。細胞は、構築物が移植される宿主に対して同種、自己、または異種であってよい。好ましくは、細胞は同種である。
【００６２】
細胞は単一のドナーから得られるか、または細胞バンクから得られ、細胞バンクの細胞は複数のドナーからプールされる。好ましくは、細胞は、複数のドナーの細胞バンクから得られる。好ましくは、各ドナーは50歳未満であり、および/または血管疾患と診断されていない。細胞は、ヒト大動脈、大腿動脈、腸骨動脈、頸動脈、橈骨動脈、尿管、膀胱壁、または皮膚から単離され得る。好ましくは、細胞はヒト大動脈から単離される。より好ましくは、細胞はヒト胸部大動脈から単離される。細胞は、平滑筋細胞、間葉細胞、線維芽細胞、線維細胞、および/または内皮細胞を含み得る。好ましくは、細胞は平滑筋細胞を含む。
【００６３】
播種される細胞は、10回未満、5回未満、5回未満、4回未満、3回未満、または2回未満継代された、継代数の少ない細胞である。好ましくは、細胞は継代3代目またはそれ未満である。細胞は、約6週間〜約11週間の培養期間にわたって培養することができる。ポリマー足場は、培養期中に任意の形態であってよい。それは最終的な形状であってもよいし、または培養期の後に成形することもできる。好ましくは、足場は管状である。あるいは、足場は培養後に管状形態に成形される。細胞の培養は、栄養、酸素供給、温度、力学的、および圧力条件を考慮に入れて、任意の慣習的な培地および装置を用いて行うことができる。培地は任意で、ウシ血清、ブタ血清、ヒツジ血清、ウマ血清、またはヒト血清を含み得る。そのような血清は、培養工程の特性を改善するための増殖因子および公知または未知の成分を提供し得る。細胞は足場上で培養されて増殖する際に、コラーゲン性細胞外基質を分泌する。好ましくは、細胞は、培養の最初の2〜6週間は、20％ヒト血清を含む培地中で培養され、培養期間の残りの期間は、10％ヒト血清を含む培地中で培養される。より好ましくは、細胞はバイオリアクター中で培養される。
【００６４】
細胞は、構築物1 cm長当たり約0.5×106個細胞〜構築物1 cm長当たり約2×106個細胞で、管状生分解性ポリグリコール酸構築物上に播種することができる。好ましくは、播種された細胞の各細胞、または各細胞の集団的子孫は、培養中の9週間をかけて、1 ngを超えるヒドロキシプロリンを産生する。
【００６５】
本発明の方法は、患者に移植する前に、脱細胞化管状構築物上に細胞を播種する段階をさらに含み得る。細胞は、平滑筋細胞または内皮細胞を含み得る。好ましくは、細胞は内皮細胞である。細胞は、同種または自己細胞であってよい。好ましくは、細胞は自己細胞である。最も好ましくは、細胞は自己内皮細胞である。
【００６６】
脱細胞化細胞外基質タンパク質構築物は、脱細胞化ヒト死体血管に勝るいくつかの利点を有する。第一に、死体ヒト脈管構造は結紮されるべき小さな分岐を有するのに対して、工学的組織は分岐のないチューブからなる。第二に、脱細胞化細胞外基質タンパク質構築物は、層状エラスチンの層のない緩い組織構造を有する。この緩い構造により、脱細胞化溶液が容易に工学的組織に透過して、過剰に曝露することなく、細胞外基質の完全性を損傷する可能性があり、かつまたインビボでの細胞再増殖を向上させる可能性のある細胞材料を除去することが可能になる。第三に、脱細胞化死体血管移植片アプローチは、一般的な心臓血管外科的手技に適した直径を有する利用可能な血管組織の量がドナー1名につき限られているのに対して、脱細胞化細胞外基質タンパク質構築物アプローチを用いることは、ドナー1名につき大量の移植片を作製できるようにすることによって、健常組織ドナーの効果を最大限に生かす。細胞外基質タンパク質構築物は、バイパスされる天然動脈脈管構造とより適切に一致し得る種々の直径で作製することができる。対照的に、脱細胞化ヒト死体血管は特定の直径のために作製することはできず、小さな天然血管と大きなバイパス移植片との間でサイズの不一致が起こり得、潜在的に開存率の減少を招く。
【００６７】
構築物は、例えば以前に記載されたような(Dahl, et al., Cell Transplantation 12, 659-666 (2003))、当技術分野で公知の任意の手段を用いて、脱細胞化することができる。1つの好ましい脱細胞化溶液は、8 mM CHAPSまたは0.07〜1.8 mM SDSのいずれかを含む、0.12 M水酸化ナトリウム、1 M塩化ナトリウム、および25 mM EDTAを添加したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む。別の好ましい脱細胞化溶液はSDSを含まない。本発明の脱細胞化方法は、DNAを消化するためのベンゾナーゼ（benzonase）段階を含み得る。好ましくは、ベンゾナーゼ段階は、2 U/mL Benzonase、47 mM Tris、1.4 mM塩化マグネシウム、および19 mM塩化ナトリウムを含む、pH 8.0の溶液を含む。
【００６８】
PGAは、直ちに代謝される分解産物を伴う、FDAに認可された分解性縫合材料であるため、移植時に細胞外基質タンパク質構築物中にわずかな残存PGA断片が存在することは問題ではない。さらに、PGAは、血管再構築に対していかなる公知の悪影響も及ぼさずに、血管移植片成分として用いられている(Shin'oka, et al., J Thorac Cardiovasc Surg 129, 1330-1338 (2005))。本研究で作製されたヒト細胞由来移植片は、組織作製のための支持体として同様にPGAを使用した、以前の報告に記載されたものよりも1桁分強力であった(Poh, et al., Lancet 365, 2122-2124 (2005); McKee, et al., EMBO Rep 4, 633-638 (2003))。しかしながら、これらの以前の報告は、ヒト静脈細胞または継代数の多い市販のヒト大動脈細胞を使用したことに注意することが重要である(Poh, et al., Lancet 365, 2122-2124 (2005)；McKee, et al., EMBO Rep 4, 633-638 (2003))。以前の報告では、PGAのシートをチューブになるよう縫合するために高密度のPGA縫合糸を使用することで、細胞外基質タンパク質構築物中に相当量の残存PGAが残り、これによって細胞外基質タンパク質構築物の強度が減少した(Dahl, et al., Ann Biomed Eng 35, 348-355 (2007))。
【００６９】
膝上末梢バイパス手術および血液透析アクセスなどの大口径適用において、PTFE血管移植片は、日常的な臨床使用を保証するのに十分良好に機能する(Harris, et al., J Vasc Surg 33, 528-532 (2001))。したがって、大口径細胞外基質タンパク質構築物は、管腔のEC播種なしに使用することができる。しかしながら、小口径適用の場合には、高度に適合し(表3)かつECを含む、患者自身の脈管構造以外の機能的血管移植片を見出すことは極めて困難であった(Harris, et al., J Vasc Surg 33, 528-532 (2001))。移植片閉塞のリスクを最小限にするために、抗血栓性管腔表面を提供する目的で、小口径末梢設定および冠動脈設定における移植前に、ECを細胞外基質タンパク質構築物上に播種した。ECは、細胞外基質タンパク質構築物を用いてバイパス術を行う前に、イヌの末梢動脈または静脈から単離した。これは、血管移植片播種のためのECの単離について以前に報告された末梢血管採取アプローチと類似している(McAllister, et al., Lancet 373, 1440-1446 (2009)；Deutsch, et al., J Vasc Surg 49, 352-362 (2009))。自己ECはまた、脂肪組織(Arts, et al., Lab Invest 81, 1461-1465 (2001))または循環血液(Kalka, et al., Proc Nat Acad Sci 97, 3422-3427 (2000)；Hill, et al., New Eng J Med 348, 593-600 (2003))からより迅速に単離することもでき、これにより、内皮化のための患者の待ち時間が数週間から数日間または場合によりさらには数時間まで短縮され得た。
【００７０】
管腔EC被覆の乏しい小口径細胞外基質タンパク質構築物について83％という開存率が観察されたことから、移植の持続期間を通した全身的な抗血小板療法の設定では、移植片機能のために、移植前の完全な管腔EC被覆は必要ではないことが示唆される。移植時の乏しいEC被覆はまた、移植片単離中に内皮が剥離される場合の多い伏在静脈移植片においても観察される(Roubos, et al., Circulation 92, II31-36 (1995))。移植時にわずかなECが存在することは、抗血栓性シグナルの十分な放出を提供することにより、または細胞外基質タンパク質構築物管腔表面に対するレシピエントECの動員を助けることによって、インビボで開存性を維持するのに役立つ可能性がある(Lee, et al., Circulation 114, 150-159 (2006))。その一方で、細胞外基質タンパク質構築物は、他の合成血管移植片材料よりも血栓形成性が低い可能性があり、移植時に管腔表面上にECなしで機能する可能性がある。
【００７１】
免疫原性の機能的影響(長期間での内膜過形成、動脈瘤性拡張、または石灰化(Sclafani, et al., Arch Facial Plast Surg 2, 130-136 (2000)；Mitchell and Libby, Circ Res 100, 967-978 (2007)；Yankah and Wottge, J Card Surg 12, 86-92 (1997)))は、ヒヒまたはイヌの研究において観察されず、開示された組織工学血管移植片が非免疫原性であることが実証された。対照的に、非調和的な異種細胞外基質タンパク質および同種細胞(それぞれ、ウシ血管異種移植片およびヒト死体凍結保存血管同種移植片において見出される)は、免疫学的応答およびそれらの機能的副作用を誘発する(Allaire, et al., Surgery 122, 73-81 (1997)；Carpenter, and Tomaszewski, J Vasc Surg 27, 492-499 (1998))。細胞外基質タンパク質構築物は、長期移植における内膜過形成の形成に抵抗した。細胞外基質タンパク質構築物は、動静脈移植片としての6ヵ月の時点で、動脈バイパス移植片としての1ヵ月の時点のPTFEよりも少ない新生内膜過形成を示し(Lumsden, et al., J Vasc Surg 24, 825-833 (1996))、このことは、動静脈移植片が典型的に動脈バイパス移植片よりもより実質的な内膜肥厚を誘発することを考えると、有望である。端側頸動脈バイパスが、1ヵ月の時点で広範な内膜過形成を生じるモデルとして記載されていることを考えると(Kapadia, et al., J Surg Res 148, 230-237 (2008))、イヌ末梢バイパス研究において1年の時点で内膜過形成が存在しないことは驚くべきことである。
【００７２】
本発明の細胞外基質タンパク質構築物は、顕著な患者の待ち時間なしに利用することができ、移植片が培養されるのを患者が長期間待たなくてはならない、完全に自己の組織工学アプローチに勝る実質的な進歩を示す。本明細書で提供される構築物は、動静脈導管として、ならびに末梢(頸動脈)循環および冠循環における小口径動脈バイパスとして機能的である。診療所でこれまで用いられていた導管は、実質的な内膜過形成、動脈瘤、および石灰化を被った。有望なことには、脱細胞化細胞外基質タンパク質構築物は、様々な大型動物モデルにおいて、実質的な内膜過形成、拡張、および石灰化に抵抗する。これらのデータは、利用できる自己血管導管のない患者のための幅広い血管適用における、脱細胞化ヒト細胞外基質タンパク質構築物の使用を支持する。
【００７３】
本発明の様々な特徴をさらに説明するために、実施例を以下に提供する。実施例はまた、本発明を実行するために有用な方法論を説明する。これらの実施例は、主張される本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００７４】
実施例1
ポリマー足場の形成：
必要とされるPGAメッシュ(ポリグリコール酸フェルト)の適切な幅および長さを測定し、その大きさに切断する。例えば、3 mm〜1.35 cm×所望の長さ；4 mm〜1.66 cm×所望の長さ；または6 mm〜2.35 cm×所望の長さ。PGAメッシュは、Biomedical Structuresから入手することができる(1 mm厚、50 mg/cc(範囲45〜58)、20×30 cm)。メッシュの長さよりも10 cm長く切断した、適切な大きさにしたシリコンチューブにメッシュを巻き付ける。フェルト針を用いて、メッシュの片側から反対側へ繊維糸を引き出して、継ぎ目に沿ってPGA繊維を絡ませる。継ぎ目の端部に沿って全体にこれを繰り返す。シリコンチューブに接して繊維を密に絡ませて、メッシュの血管/管状形状を作出する。継ぎ目は、チューブの残りの部分よりも厚くてはならない。次に、メッシュチューブ全体にわたりいかなる裂け目、孔、または希薄な点も修復することにより、継ぎ目をしっかり固定する。
【００７５】
PGAは理想的には45〜75 mg/ccである。低密度(＜45 mg/cc)領域は、孔なしで継ぎ目を絡ませるのに十分な数のPGA繊維が不足している。低密度領域はまた細胞接着の減少を引き起こし、細胞接着不良は不十分な局所的細胞外基質産生を引き起こし得る。高密度(＞75 mg/cc) PGAは、最終生成物におけるより高密度のPGA残存物と関連している。図7aは、45〜75 mg/ccの範囲の密度を有する、均一密度のPGAフェルトを示す。図7bは、使用に許容できない、許容できないほど低密度(＜45 mg/cc)の領域、および最終生成物において残存PGAの増加を引き起こし得る高密度(＞75 mg/cc)の領域を有する、不均一密度のPGAフェルトを示す。
【００７６】
繊維を絡ませる方法を用いて、PGAシート(図7a中のPGAシートを参照されたい)をチューブにする。絡ませる方法は、シリコンマンドレルに一片のPGAを巻き付け、界面においてPGAの端部どうしを接触させる段階を含む。その後、条片のそれぞれの側からPGAの繊維を界面を越えて引き出し、界面の反対側の繊維の間に挿入する。その後の除去および表面処理に耐えるために十分強力な「継ぎ目」を作製するには、十分な数の繊維を引き出さなくてはならない。細胞がPGAチューブの周りに均一に分布され、均一な組織を生成するように、繊維はまた、継ぎ目の密度が管状足場の残りの部分と一致する様式で引き出さなくてはならない(図7cを参照されたい)。継ぎ目が均一でない場合(図7dを参照されたい)、密度が非常に低い領域はNaOH表面処理工程中に孔になる。加えて、PGA継ぎ目における低密度領域は局所的細胞播種不良を引き起こす可能性があり、これは最終移植片において希薄な点をもたらし得る。図7dに示されるような継ぎ目における高密度領域は、最終生成物においてPGA残存物を局所的に増加させ得る。移植片におけるPGAの局所的濃縮残存物は、移植片強度を局所的に減少させ得る(Dahl et al. Ann Biomed Eng 35 (3):348-355 (2007))。
【００７７】
ポリエチレンテレフタレート(PET)材料(Dacron材料)を、1 cmセグメント‐リブ約6〜7個分に切断する。Dacron材料はMaquetから入手することができる(製品番号174408、C-コードC1768、D8mm x L50cm、平均多孔度260 cc/分/cm2)。Dacronは容易に積み重ならないため、3または4 mmチューブに適合するように、Dacronカフに小さな三角楔を切り込む。Dacronをメッシュに縫合する場合には、メッシュおよびシリコンチューブにぴったりと適合するように、三角楔を閉じる。バイオリアクターへの6 mmチューブアタッチメントを収容するように、Dacronカフに小さな薄片、リブ約3個分を切り込む。4.0 SurgiproII縫合糸を用いて、最初に3または4 mmチューブに適合するように楔閉鎖部を縫合し、次に外科縫合糸を用いてカフをPGAメッシュチューブに取り付ける。カフの上部を通してランニングステッチで縫い、バイオリアクターへの巾着縫合閉鎖を作出する。管状PGA構築物は貯蔵することができ、または以下に記載するように処理することもできる。
【００７８】
図7cに示されるPGAの管状立体配置により、管状形状で細胞を播種し、その後増殖させることが可能になる。図7cに示されるポリエチレンテレフタレート(PET)カフは、組織の内部増殖を支持し、それによって増殖組織と一体化する。PETの非分解性特性により、それがバイオリアクターへのアンカーとして機能して、培養中に、固定された長さで組織を保持することが可能になる。対照的に、PGAチューブは組織増殖期中に分解する。PGAチューブの内径は、PGA足場を絡ませるマンドレルの外径によって規定され、この場合マンドレルはシリコン製である。図7cは、外径6 mmを有するシリコンマンドレルを示し、シリコンマンドレルの周りに形成されたPGAチューブは内径6 mmを有する。組織を生じるにつれて、収縮性細胞はシリコンチューブの周りでポリマーおよび組織を収縮させ、その結果、得られる組織の内径もまたシリコンチューブの外径によって規定される。容易に作製されるPGAチューブの内径(およびシリコンチューブマンドレルの外径)は、3〜6 mmの範囲内であり、より小さなまたはより大きな直径を有する組織は、所望の直径を有するシリコンチューブを使用することによって作製することができる。
【００７９】
除去工程を用いて、重金属、潤滑剤、および他の混入物を除去する。PGAチューブをマンドレル上に配置し、1つまたは複数の非極性溶媒、およびエタノールなどの少なくとも1つの第一級アルコールで少なくとも30分間、25 rpmで振盪させながら洗浄する。PGAチューブを一晩乾燥させる。
【００８０】
表1は、この除去方法が重金属混入物を実質的に除去することを示す。重金属混入物の存在および/または量は、当技術分野で公知の任意の手段によって；例えば質量分析によって、決定することができる。
【００８１】
【表１】
0005878181.tif 000002
【００８２】
NaOHによるPGAの処理は、PGA分解の速度を増加させることが示されている。例えば、NaOH処理を行わないと、8.5週間以内に50％の質量喪失が生じたが、1 M NaOHで1〜3分間処理すると、8.5週間以内に65〜70％の質量喪失が生じた(Prabhakar et al., (2003) Engineering porcine arteries: effects of scaffold modification. J Biomed Mat Res 67A:303-311)。
【００８３】
バイオリアクター中で組織を培養している際に、PGAチューブは分解する。PGAが分解する最中に、細胞は、最終的な移植片の質量の大部分を形成する細胞外基質タンパク質を産生している。例として、以下のことを考慮する：
バイオリアクター培養前の0時のPGA：
PGAシート密度：55 mg/cc
直径6 mmの移植片におけるPGAの0時の体積：0.235 cc/cmチューブ
直径6 mmの移植片におけるPGAの0時の密度はしたがって：(55 mg/cc)＊(0.235 cc/cmチューブ)＝12.9 mg PGA/cm移植片。
【００８４】
以下に記載されるバイオリアクター培養および脱細胞化後の最終細胞外基質タンパク質構築物中のPGA：
37Ｃの水性環境における8.5週間後のPGA質量の喪失：8.5週間後に30％のPGA質量が残存する
移植片1 cm当たりのPGA質量：(30％)×(12.9 mg PGA/cm移植片)＝3.9 mg PGA/cm移植片
6 mm移植片の平均湿重量：600 mg移植片/cm移植片
移植片質量当たりのPGA質量：(3.9 mg PGA/cm移植片)/(600 mg移植片/cm)＝0.0065 mg PGA/mg移植片。
【００８５】
したがって、本実施例において、PGAは最終的な水和質量の＜1％を構成する。同様に、同じ計算設定において75 mg PGA/cc PGAという最大のPGA密度規格を用いた場合にも、最終移植片質量の＜1％(0.0088 mg PGA/mg移植片)のPGAを含む移植片が作製される。
【００８６】
実施例2
動物の使用：
手順はすべて、デューク大学(Duke University)、イーストカロライナ大学(East Carolina University)、およびSyneCorを含むそれぞれの動物実験委員会によって承認された。動物は、「実験動物の管理と使用に関する指針(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)」(NIH, 1996)に従って人道的なケアを受けた。手術および血管造影はすべて、全身麻酔下にて無菌様式で行った。各手術後に、移植片開存性を確認し、創傷を閉鎖し、動物を回復させた。移植時に、動物にヘパリン(1000〜5000 U)で抗凝固処置を行った。手術前から研究が終了するまで毎日、ヒヒにアスピリン(10 mg/kg)を投与し、イヌに二重抗血小板療法(325 mgアスピリン/75 mgクロピドグレル)を施した。
【００８７】
細胞外基質タンパク質構築物の形成：
ヒト大動脈は、米国組織バンク協会(American Association of Tissue Banks)(AATB)に認可されかつFDA登録された組織バンク(CryoLife, Inc.)から入手し、これは移植の基準(FDA 21CFR1271、組織バンク化のAATB基準、および内部CryoLife判定基準)を満たした。ヒト平滑筋細胞(SMC)は、研究使用について同意が得られ、かつバイオバーデン(好気性細菌および真菌混入物)、無菌性、マイコプラズマ、およびエンドトキシンについて試験がなされたドナー大動脈(17〜49歳)から単離した。細胞は、使用前に液体窒素蒸気中(-135℃)で貯蔵した。プールされたドナーの移植片を培養するために、複数のドナーからの細胞をプールした。ヒト細胞は、継代2代目で使用した。
【００８８】
イヌSMCはイヌの頸動脈および大腿動脈から単離し、構築物レシピエントに対して同種であり、継代2〜4代目で使用した。
【００８９】
無菌工程を用いて、細胞(ヒトまたはイヌのいずれか)を管状ポリグリコール酸フェルト足場(ヒト構築物については内径6 mm、およびイヌ構築物については内径3または4 mm)上に播種し、バイオリアクター中で周期的に張力を負荷して(2.75 Hzで2.5％)(Niklason, et al., Science 284, 489-493 (1999))、構築物を作製した。ヒト構築物の成長のための培地は、20％血清、5ミリグラムインスリン/L、5マイクログラムbFGF/L、1マイクログラムEGF/L、100,000 UペニシリンG/L、3マイクログラム硫酸銅/L、50ミリグラムL-プロリン/L、40ミリグラムL-アラニン/L、50ミリグラムグリシン/L、および50ミリグラムアスコルビン酸/Lを添加した高グルコースDMEMであり、週に3度交換した。イヌ構築物の成長のための培地は、20％血清、10 ng/ml PDGF-BB、10 ng/ml bFGF、500 U/mlペニシリンG、3 ng/ml硫酸銅、50 ng/ml L-プロリン、20 ng/ml L-アラニン、および50 ng/mlグリシンを添加した低グルコースDMEMであり、週に1度交換した。週に3度、L-アスコルビン酸をイヌ細胞外基質タンパク質構築物培養物に添加した。
【００９０】
培養の7〜10週間後、無菌処理を用いて構築物を脱細胞化した。以前に記載されたように(Dahl, et al., Cell Transplantation 12, 659-666 (2003))、脱細胞化溶液は、8 mM CHAPSまたは0.07〜1.8 mM SDSのいずれかを含む、0.12 M水酸化ナトリウム、1 M塩化ナトリウム、および25 mM EDTAを添加したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含んだ。別の脱細胞化方法も使用し、この場合にはSDSを除去した。さらに、DNAを消化するために、pH 8.0の2 U/mL Benzonase、47 mM Tris、1.4 mM塩化マグネシウム、および19 mM塩化ナトリウムを用いて、ベンゾナーゼ段階を加えてもよい。細胞外基質タンパク質構築物を室温で最長6時間まで各溶液に曝露し、次にPBSで洗浄した。力学的試験、内皮細胞播種、および移植の前に、すべての細胞外基質タンパク質構築物を脱細胞化した。脱細胞化細胞外基質タンパク質構築物は、カルシウムおよびマグネシウム不含のリン酸緩衝生理食塩水中で4℃で貯蔵した。
【００９１】
細胞外基質タンパク質構築物の内皮化：
移植前に、イヌ細胞外基質タンパク質構築物に自己内皮細胞(EC)をインビトロで播種した。各セグメントからの増生によってECを単離するために、イヌの大腿動脈、頸動脈、または橈側皮静脈セグメント(3〜4 cm)を、10％ FBS、1×微小血管増殖補助剤、125 ug/mlヘパリン、および500 U/mlペニシリンGを添加した低グルコールDMEM中で、フィブロネクチンコーティングプレート上で培養した。ECの単離および拡大は21±2日を要し、細胞外基質タンパク質構築物へのECの接着および剪断プレコンディショニングはさらに2日を要した。ECの接着のため、移植片管腔にフィブロネクチン(100μg/ml)をコーティングし、EC(750,000個/ml)を播種し、ECの均等な分布を促すために10回転/時間での11時間の回転に曝露した。剪断プレコンディショニングは、移植前に、22時間にわたり段階的様式で(合計10段階)灌流培養液の平均速度を増加させ、末梢イヌ動脈について報告された平均速度(10〜16 cm/s (Pedley, The Fluid Mechanics of Large Blood Vessels (Cambridge University Press, Cambridge, UK, 1980))と一致するように、最大平均速度(10〜15 cm/s)を13時間維持することにより行った。
【００９２】
インビトロ解析：
縫合保持強度は、6-0 Prolene縫合糸(BV-1針)のループを各細胞外基質タンパク質構築物の端部から2 mmの位置に通し、縫合糸が組織から引き抜けるまで、10 g増量の重りを縫合糸ループにつるすことによって、測定した。縫合強度は、組織を裂くのに必要なグラム表示での重量と定義した。細胞外基質タンパク質構築物の縫合強度は、移植する前、およびヒヒからの外植後に測定した。破裂圧力は、以前に記載されたように(Dahl, et al., Cell Transplantation 12, 659-666 (2003))、破裂するまで、室温で生理食塩水を用いて6 mmヒト細胞外基質タンパク質構築物または3〜4 mmイヌ細胞外基質タンパク質構築物を膨張させることにより、移植前に測定した。破裂圧力は、細胞外基質タンパク質構築物が破裂した時点の膨張圧と定義した。
【００９３】
DNAを定量するため、細胞外基質タンパク質構築物セグメントをパパインで消化し、続いて改良Qiagenシリカベーススピンカラムを用いてDNAを精製した。得られた捕獲DNAを検出適合性の緩衝液を用いて溶出し、PicoGreenアッセイを用いてDNAを定量した。ヒドロキシプロリンは、クロラミンTおよびp-ジメチルアミノベンズアルデヒドを用いてパパイン消化試料中で測定し、コラーゲンはヒドロキシプロリンの量の10倍として計算した。
【００９４】
動物モデル：
ヒトとの系統的類似性を提供するために旧世界霊長動物モデルを選択し、これにより、免疫抑制することなく非架橋型ヒト基質含有移植片の移植が可能になった。成体雄ヒヒ(アヌビスヒヒ(Papio Anubis)、20〜30 kg)は、臨床的に関連した解剖学的設定において直径6 mmの細胞外基質タンパク質構築物の移植を支持するのに、身体的に十分大きい。しかしながら、霊長動物は他の動物よりも高価であり(Rashid, et al., Biomaterials 25, 1627-1637 (2004))、取り扱いおよび維持が難しく(Narayanaswamy, et al., J Vasc Intervent Radiol 11, 5-17 (2000))、かつ入手の可能性が限られている。したがって、動静脈研究にヒヒを使用し、小口径調査にはイヌを使用した。
【００９５】
人工血管の評価に関して科学界で広く受け入れられていることから(Tomizawa, et al., Circulation 90 (part2), II-160-II-166 (1994)；Bianco, et al., Large Animal Models in Cardiac and Vascular Biomaterials Research and Testing. B. D. Ratner, F. J. Schoen, A. S. Hoffman, J. E. Lemons, Eds., Biomaterials Science: An Introduction to Materials in Medicine (Elsevier Science & Technology Books, 2004))、イヌモデル(クラスA雑種犬、約25 kg)を直径3〜4 mmの細胞外基質タンパク質構築物の評価に使用した。イヌの研究は、自己ECを播種した同種無細胞性細胞外基質タンパク質構築物を使用し、これは最終的な小口径臨床使用に提唱されたアプローチを模倣している。
【００９６】
外科的移植技法：
9頭の成体雄ヒヒに、ヒト細胞外基質タンパク質構築物(内径6 mm)の動静脈留置を行った。細胞外基質タンパク質構築物1個は、大動脈-大静脈位置に1ヵ月間留置した。細胞外基質タンパク質構築物8個は、腋窩動脈と遠位上腕静脈との間に留置し、これは最長6ヵ月間にわたり、血液透析アクセスをシミュレートするのに適した表面部位を提供した。吻合はすべて、ランニング6-0 Prolene縫合技法を用いて作出した。
【００９７】
長期インビボ開存性を試験するため、自己ECを播種したイヌ細胞外基質タンパク質構築物(内径3〜4 mm)を、8-0 Prolene縫合糸を用いて5頭のイヌの頸動脈に端側に移植した。介在する天然頸動脈を外科用クリップで閉鎖した。
【００９８】
自己ECを播種したイヌ細胞外基質タンパク質構築物(内径3〜4 mm)を、3頭の犬の冠循環に移植した。左開胸によって、心臓を露出させた。正常温心肺バイパスを使用し、低温心停止法により心臓停止を達成した。近位冠動脈を結紮して、各細胞外基質タンパク質構築物を、左冠動脈前下行枝(8-0 Prolene)および上行大動脈(4.0 mm大動脈切開、7-0 Prolene)に縫合した。冠動脈バイパス術後に、動物を心肺バイパスから切り離し、回復させた。
【００９９】
免疫学的評価：
ヒト細胞由来構築物がヒヒに移植された調和的異種モデルにおいて、ヒト基質含有構築物の免疫原性を評価した。ホモジナイズした細胞外基質タンパク質構築物(0.1 mlの0.25 mgタンパク質/mlリン酸緩衝生理食塩水、PBS)およびPBS陰性対照(0.1 ml)の皮下注射を0日目および28日目に施行し、各注射の48〜72時間後に視覚的評価を行って、インビボ適応免疫応答が生じるかどうかを検出した。
【０１００】
加えて、ヒヒ移植の0、4、12、および24週間目にT細胞増殖を測定した。Ficoll勾配でリンパ球を単離し、各ウェル中の細胞外基質タンパク質構築物または陰性対照としてのPTFE移植片のセグメント(5 mm×5 mm)と共に、96ウェルプレートで7日間培養した。培地は、10％ウシ胎仔血清を添加したRPMI 1640であった。細胞を回収する18時間前に、BrdU(100μM)を各ウェルに添加した。回収した細胞を200μLの希釈live/dead色素(Invitrogen L23102)で室温で30分間染色し、次に80μLのCD3-APC抗体(BD 557597)で室温で50分間染色し、洗浄し、透過処理し(1×Cytofix/Cytoperm緩衝液および1×Cytoperm Plus；BD)、DNAを部分消化するために100μLのDNaseと共にインキュベートした。増殖細胞を50μLのBrdU-FITC抗体(BD 559619)で室温で20分間染色し、フローサイトメトリー解析(Accura C6)のために150μLの0.2％ BSA/DPBS中に懸濁した。データ解析のため、単一細胞を選択し、死細胞をゲートからはずした。増殖速度を、CD3+細胞中のCD3+/BrdU+細胞の割合として計算した。
【０１０１】
デュプレックス超音波：
ヒヒモデルにおいて、手術直後、ならびに2、4、12、24週間目に、デュプレックス超音波を用いて、移植片中間部の細胞外基質タンパク質構築物の直径、壁厚、および流速をモニターした。
【０１０２】
血管造影：
血管造影を用いて、移植片の拡張および狭窄を評価した。移植片の開存性は、Fitzgibbonの分類(Fitzgibbon, et al., J Am Coll Cardiol 28, 616-626 (1996))に従って規定した。
【０１０３】
1、3、および6ヵ月の時点で、腋窩動脈から上腕静脈まで留置されたすべてのヒヒの移植片を、移植片の中間または遠位部分において直接評価して(16G針、5-6Fカテーテル)(表6を参照されたい)、細胞外基質タンパク質構築物が血液透析アクセスのモデルとして穿刺に耐える能力を判定した。
【０１０４】
移植の1、4、12、26、および52週間後に、経皮的大腿動脈アプローチにより、イヌ構築物の血管造影を行った。
【０１０５】
コンピュータ断層血管造影：
冠動脈バイパス移植片のコンピュータ断層血管造影(64列スライス；General Electric、Lightspeed VCT)を行った。静脈内β遮断薬によって心臓の動きを最小限にし、イオヘキソール(350 mgI/ml)を造影剤として使用した。移植片の内径および断面積の評価には、スライス(0.625 mm厚)および軟部組織再構成アルゴリズムを使用した。
【０１０６】
組織診断：
組織を10％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン中に包埋し、スライスし(5μm切片)、ライトグリーン対比染色と共に、H&E、Movat's、またはアリザリンレッドSで染色した。組織切片はまた、脱水し(リン酸緩衝生理食塩水中の30％スクロース)、最適切削温度(OCT)コンパウンド中で凍結することにより、凍結切片作製用に調製した。凍結ヒヒ切片およびホルマリン固定イヌ切片において、蛍光染色または3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)染色のいずれかを用いて、α平滑筋アクチン(SMCおよび筋線維芽細胞マーカー；ヒヒ外植片：Dako M0851、1:50希釈；イヌ外植片：Sigma A2547、1:5000希釈)、フォン・ヴィルブランド因子(ECによって合成されるタンパク質；ヒヒ外植片：Dako M0616、1:25希釈；イヌ外植片：非染色)、CD3(成熟Tリンパ球上のT細胞受容体複合体の一部；Abcam ab699、1:25希釈)、CD20(成熟B細胞の表面上に発現されるタンパク質；Abcam ab9475、1:25希釈)、I型およびIII型コラーゲン(Novus NB600-1408およびNB600-594、いずれも1:200希釈)、フィブロネクチン(Novus NB110-1635、1:50希釈)、ならびにビトロネクチン(Novus NB110-57649、1:200希釈)について免疫染色を行った。アリザリン染色した切片を評価して、石灰化の非存在を確認した(切片7±1枚/動物、n＝動物11頭)。H&E染色した切片(切片11±2枚/動物、n＝動物12頭)の観察、ならびにCD3およびCD20についての免疫染色(切片3±1枚/動物、n＝動物2頭)により、免疫原性をさらに評価した。吻合部における天然血管の新生内膜厚を、下層組織の長さで除した新生内膜の総面積として計算した(Lumsden, et al., J Vasc Surg 24, 825-833 (1996))。顕微鏡に搭載されたカメラおよび画像解析ソフトウェアを測定に使用した。 
【０１０７】
統計解析：
2群の解析には、不等分散を仮定して、スチューデントの2標本t検定を用いて統計解析を行った。3つまたはそれ以上の群の間の有意差を判定するには、チューキーの事後比較と共に一元配置ANOVAを使用した。細胞ドナーの年齢の関数としてプロットした構築物の縫合強度が、0とは有意に異なる傾きを有するかどうかを評価するには、線形回帰を行った。0.05未満の両側P値は統計的有意性を示した。数値は平均値+/-平均値の標準誤差として示す。報告される「n」は、試験がなされた、個々に培養された構築物の数を示し(同じ移植片からの反復セグメントではない)、表中では括弧内で報告される。
【０１０８】
実施例3
同種細胞からの細胞外基質タンパク質構築物の作製および脱細胞化：
細胞外基質タンパク質構築物(直径3〜6 mm)を作製するため、死体ドナーから得られた同種平滑筋細胞(SMC)を、周期的な放射状張力を与えるバイオリアクター中で、急速分解性ポリグリコール酸(PGA)管状足場上で培養する(Niklason, et al., Science 284, 489-493 (1999))。培養期中に、SMCは細胞外基質タンパク質、主にコラーゲンを分泌して生合成血管組織を形成し(Niklason, et al., Science 284, 489-493 (1999))、PGAは分解する。培養期の終了時に、得られた組織を界面活性剤で脱細胞化し、分泌されたコラーゲン基質のみを残す(Dahl, et al., Cell Transplantation 12, 659-666 (2003))。脱細胞化工程は細胞を死滅させ、構築物から抗原性同種細胞を除去し、それによって、免疫原性がなく、任意のレシピエントにおいて使用することができる細胞外基質タンパク質構築物を作製するための、バンク化された同種細胞の使用が可能になる。これらの細胞外基質タンパク質構築物は、標準的なリン酸緩衝生理食塩水中で4℃で貯蔵することができ、動静脈アクセスの作製(直径6 mm)に、または末梢もしくは冠動脈設定における小口径血管移植(移植片直径3〜4 mm)に付随する血栓形成のリスクを軽減するための自己ECの播種に、直ちに利用することができる(McAllister, et al., Lancet 373, 1440-1446 (2009)；Kaushal, et al., Nat Med 7, 1035-1040 (2001)；Zilla, et al., Semin Vasc Surg 12, 52-63 (1999))。
【０１０９】
実施例4
脱細胞化ヒト細胞外基質タンパク質構築物の強度および安定性：
異なるドナーから作製された構築物の力学的一貫性を評価するために、19名のヒトドナーからの細胞を用いて、37個の脱細胞化細胞外基質タンパク質構築物(直径6 mm、長さ23 cm)を作製した(表2)。すべての構築物の端部から2 mmの位置で、6-0 Proleneを用いて縫合強度を測定した。生理食塩水を用いて2 cmの管状構築物を破裂するまで膨張させることにより、ランダムに選択した構築物で、破裂圧力を間欠的に試験した。縫合強度(表2)は、ドナーの年齢(P＝0.26;年齢17〜49歳)、男性ドナー由来であるか女性ドナー由来であるか(P＝0.52)、または移植片培養に単一ドナーを使用するか、プールされたドナー集団(プール当たりドナー2〜6名)を使用するか(P＝0.42)によって、有意に変化しなかった。細胞外基質タンパク質構築物の1群をランダムに選択し、12ヵ月間貯蔵した。細胞外基質タンパク質構築物は、リン酸緩衝生理食塩水中で4℃で12ヵ月間貯蔵した後、縫合強度、破裂圧力、またはコンプライアンスの有意な変化なしに(それぞれ、P=0.97、P＝0.18、およびP＝0.48)それらの強度を保持し、これは天然ヒト脈管構造について報告されている範囲内であった(表3)。細胞外基質タンパク質構築物は残存PGA断片を含み(貯蔵前には、細胞外基質タンパク質構築物組織切片の断面積の1.1±0.1％)、これは4℃での貯蔵中にさらに分解することはなかった(9ヵ月の貯蔵後では1.0±0.1％、P＝0.54)。
【０１１０】
表2は、ドナーデータ、および直径6 mmの脱細胞化ヒト細胞外基質タンパク質構築物の縫合強度を示す。データはすべて、平均値±SEM(試験した異なる移植片の数)として示す。
【０１１１】
【表２】
0005878181.tif 000003
【０１１２】
表3は、12ヵ月の貯蔵前および貯蔵後の細胞外基質タンパク質構築物、ならびに天然比較物の力学的特性を示す。
【０１１３】
【表３】
0005878181.tif 000004
【０１１４】
表4は最小および最大の壁厚を示し、表5は、細胞に基づく構築物または新鮮天然組織と比較した、本発明の脱細胞化細胞外基質タンパク質構築物のβ-アクチン、脂質、およびヒドロキシプロリン含量を示す。
【０１１５】
【表４】
0005878181.tif 000005
【０１１６】
ヒト細胞から作製された工学的組織に関する以前の報告は、有意により低い縫合強度(59 g)、有意により低い破裂圧力(59〜108 mmHg)、有意により小さい平均壁厚(181マイクロメートル)、および有意により低いヒドロキシプロリン含量(5〜16 mg/g乾燥重量)をもたらした(Poh, et al., Lancet 365, 2122-2124 (2005)；McKee, et al., EMBO Rep 4, 633-638 (2003))。Pohらのものと比較した場合の本構築物のこの優位性は、継代数の少ないヒト細胞の使用、およびバイオリアクター培養中に使用した特異的培地組成に起因する可能性があり、これらは両方とも、優れた細胞増殖、コラーゲン基質産生、およびしたがって力学的特性の改良に寄与した可能性がある。
【０１１７】
【表５】
0005878181.tif 000006
【０１１８】
本発明の構築物は生細胞を欠いている。βアクチンおよび脂質含量は、脱細胞化により減少する。対照的に、細胞を死滅させるが細胞残遺物を除去しない活力喪失アプローチは、新鮮組織の濃度と類似しているβアクチンおよび脂質の濃度を保持する可能性が高い。
【０１１９】
実施例5
動静脈モデルにおける脱細胞化ヒト細胞外基質タンパク質構築物：
6 mm細胞外基質タンパク質構築物の機能を評価するため、ヒト細胞から成長させた9個の細胞外基質タンパク質構築物(直径6 mm、長さ12.5±1.1 cm)を、動静脈導管としてヒヒに移植し(図2A)、1〜6ヵ月間観察した(表6)。動物1頭は、外科切開部位が引き開き、構築物が露出し、創傷感染が起こった後に排除した。残りの動物8頭に感染症は認められなかった。0、2、4、12、および24週目の細胞外基質タンパク質構築物のデュプレックス超音波測定により(表7)、直径に変化がないこと(P＝0.28)、壁厚に変化がないこと(P＝0.93)、および0週目と2週目の間に流速が増加したこと(P＜0.01)が示された。細胞外基質タンパク質構築物を通る流量は(表7)、血液透析に十分であった(＞300 mL/分 (B. Dixon, Kidney Int. 70, 1413-1422 (2006))。最初に、血液透析移植片の統合および再構築が可能となる、最初のアクセスに臨床的に関連する時間である4週間目に(図2B)、次に3ヵ月および6ヵ月目に、細胞外基質タンパク質構築物にアクセスした。8個の動静脈細胞外基質タンパク質構築物のうち、1ヵ月目には2/2が開存性であり、3ヵ月外植片では2/3が開存性であり、6ヵ月外植片では3/3が開存性であった(図2C)。おそらくは、持続的な指圧を必要とし、それが凝固を引き起こしたという、アクセスの技術的問題のために、1個の構築物のみが3ヵ月目に血栓形成を示した。したがって、ヒヒにおける動静脈6 mm細胞外基質タンパク質構築物の開存性は88％(7/8)であった。いずれの構築物においても、動脈瘤性拡張および石灰化は認められなかった。さらに、構築物は実質的な内膜過形成を示さなかった。6ヵ月時点の吻合部新生内膜過形成(管腔過形成厚0.11±0.05 mm)は、ヒヒモデルにおけるPTFE動脈バイパス移植片について1ヵ月時点で報告されたもの(0.25±0.09 mm)よりも少なかった(Lumsden, et al., J Vasc Surg 24, 825-833 (1996))。
【０１２０】
ヒヒモデルにおける細胞外基質タンパク質構築物について、静脈内膜過形成は3ヵ月の時点で最小である。細胞外基質タンパク質構築物の静脈吻合部を、構築物(G)を左側にし、静脈(V)を右側にして、図8aに示す。内膜過形成の小さな斑点が静脈上にわずかに見られ、これらの斑点を丸く囲ってある。対照的に、図8bは、ヒトにおいて、PTFE移植片に隣接した静脈が、実質的により多くの内膜過形成を有することを示す(内膜過形成の厚さの例として、丸く囲った領域を参照されたい)。さらに、移植片部分における内膜過形成の程度もまた、細胞外基質タンパク質構築物については最小であり、PTFE移植片については実質的である(Prichard et al., An early study on the mechanisms that allow tissue-engineered vascular grafts to resist intimal hyperplasia. J Cardiovasc Transl Res 4 (5):674-682, 2011)。
【０１２１】
表6は、移植された細胞外基質タンパク質構築物の概要を示す。
【０１２２】
【表６】
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【０１２３】
表7は、ヒヒに動静脈移植片として留置された細胞外基質タンパク質構築物のデュプレックス超音波測定を示す。
【０１２４】
【表７】
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【０１２５】
実施例6
小口径の末梢および冠動脈バイパスモデルにおける細胞外基質タンパク質構築物：
小口径(3〜4 mm)の細胞外基質タンパク質構築物の機能を、末梢および冠動脈バイパスのイヌモデルにおいて評価した。イヌ細胞外基質タンパク質構築物を同種イヌ細胞から作製し、脱細胞化し、意図されるレシピエント由来の自己ECを管腔に播種した。接着させたECを、細胞外基質タンパク質構築物の管腔内で伸長させ、整列させたが、完全なEC被覆は決して達成されなかった。むしろ、EC被覆は構築物ごとに大きく異なり、移植前に構築物から試料採取した部分において、0〜60％(14±8％)の被覆範囲であった。一般的には、それでも移植に適しているが、イヌ構築物はヒト構築物よりも弱かった(3 mmイヌ移植片について、破裂圧力は1618±67 mmHgであった；n＝39)。
【０１２６】
5個の内皮化イヌ細胞外基質タンパク質構築物(3〜5 cm長)を頸動脈バイパス移植片として移植し、1週間〜12ヵ月の期間、追跡した(図2D)。動物1頭は、開存性の移植片を伴って急性的に死亡した後に、排除した。移植片1個は、1週間目に閉塞した。1年間にわたって追跡した構築物2個を含め、他の構築物はすべて開存性のままであった(表6)。1年目の代表的な血管造影図(図2E)から、優れた長期開存性が実証された。移植された構築物において、狭窄も拡張も認められず、吻合部において内膜過形成は認められなかった。
【０１２７】
3個の内皮化イヌ細胞外基質タンパク質構築物(7〜10 cm長)を、イヌの左冠動脈前下行枝にも移植し(図2F)、最長1ヵ月間追跡した(表6)。動物1頭は開存性構築物を移植した翌日に死亡し、研究から排除した。冠動脈バイパス構築物はすべて、1週間および1ヵ月外植片において開存性であった(図2G)。すべての小口径イヌ細胞外基質タンパク質構築物(頸動脈循環および冠循環における合計6個)について、一次開存性は83％(5/6)であった。
【０１２８】
実施例7
インビボでの細胞外基質タンパク質構築物の再構成：
移植前は、細胞外基質タンパク質構築物は滑らかで均一であった(図3A)。組織学的評価(図3B)およびDNAの定量(0.74±0.10μg DNA/mg乾燥組織重量)から、細胞外基質タンパク質構築物の脱細胞化の程度が、臨床的に用いられている他の脱細胞化足場のものと類似していることが実証された(Derwin, et al., J Bone Joint Surg Am 88, 2665-2672 (2006))。構築物の細胞外基質は、天然脈管構造において最も広く行きわたっている型であるI型およびIII型コラーゲン、ならびにフィブロネクチンおよびビトロネクチンを含み、いずれも主に円周方向に整列していた(図3)。
【０１２９】
ヒヒおよびイヌへの移植後、細胞外基質タンパク質構築物は相当な再構成を示した。移植片すべてについて、外植片での肉眼的解析から、緩い線維性の外側「外膜」組織層の形成を伴った、滑らかな内部移植片組織表面が明らかになった(図4A)。細胞外基質タンパク質構築物は、外植片において、移植片周囲の収縮性線維性組織の著しい欠如を示した(図4A)。構築物は、吻合部位において天然脈管構造と良好に統合していた(図4B)。
【０１３０】
細胞外基質タンパク質構築物は、移植後に、再構築して天然動脈に組成的により類似するようになった。移植後の3ヵ月以内に、最も密度の高い浸潤宿主細胞を含む領域における(図4D)、ヒヒから外植された移植片の吻合部分で(図4C)、エラスチンが形成した。外植されたいかなる細胞外基質タンパク質構築物の移植片中間部においても、エラスチンは観察されなかった。SMCまたは筋線維芽細胞のいずれかであり得るα-平滑筋アクチン陽性細胞は、吻合部位近傍の細胞外基質タンパク質構築物の全層に高密度に集合し(図4E)、このことから、隣接する天然脈管構造からの遊走が示唆された。ヒヒモデルでは6ヵ月目から開始して、アクチン陽性細胞が、移植片中間部領域において、外膜様組織層から細胞外基質タンパク質構築物中に経壁的に浸潤したようである(図4F)。
【０１３１】
イヌモデルでは、α-平滑筋アクチン陽性細胞は、1ヵ月目までに経壁的に移植片中間部分に浸潤し始め(図4G)、1年目までに移植片中間部壁全体にわたって観察された(図4H)。おそらくはイヌにはより短い移植片が留置されたため、または種の違いのために、移植片中間部の細胞外基質タンパク質構築物壁への宿主細胞浸潤は、イヌモデルにおいてより迅速であった。両モデルにおいて、移植片中間部分(図4F、図G、図H)では吻合部近傍の部分(図4D、図E)よりも、細胞外基質タンパク質構築物壁内により少ない細胞が存在した。イヌ移植片(移植前に内皮化された)およびヒヒ移植片(内皮化されなかった)の両方において、フォン・ヴィルブランド因子(ECマーカー)陽性細胞は、吻合部位および移植片中間部近傍の両方で、細胞外基質タンパク質構築物の管腔表面上に観察された(図4I)。ECは、吻合された血管組織から遊走したか、周囲の組織から経壁的に遊走したか(Zilla et al., Biomaterials 28, 5009-5027 (2007))、または循環している前駆細胞に由来した(Asahara, et al., Science 275, 964-967 (1997))可能性がある。
【０１３２】
ヒヒの研究において、移植片中間部の細胞外基質タンパク質構築物セグメントを、外植片での力学的試験およびコラーゲン解析のために保存した。外植された細胞外基質タンパク質構築物は、表3中に報告された移植前の値と比較して、縫合強度の増加(276±28 g、n＝8、P＝0.01)を示したが、破裂圧力(3646±582 mmHg、n＝4、P＝0.67)またはコンプライアンス(3.4±2.3％/100 mmHg、n＝4、P＝0.70)の有意な変化は示さなかった。このように、細胞外基質タンパク質構築物は、移植片中間部分への細胞の完全な浸潤(図4F)も移植片中間部におけるエラスチンもないまま、力学的に頑強であった。移植前の細胞外基質タンパク質構築物(57±5％、n＝8)、外植片での細胞外基質タンパク質構築物(46±5％、n＝7)、流入腋窩動脈(46±5％、n＝7)、または移植片のない腕から外植された対照腋窩動脈(42±3％、n＝7；P＝0.07)の間で、コラーゲン密度の有意な変化は認められなかった。
【０１３３】
細胞外基質タンパク質構築物は非免疫原性であった。ホモジナイズした細胞外基質タンパク質構築物、および陰性対照としてのPBSの注射を、すべてのヒヒの皮内に、移植片の移植時および再び移植の4週間後に行った(図5A)。すべての注射部位において明白な硬化も発赤もないことから、レシピエントが移植片材料に感作されなかったことが示された。移植片の免疫原性はまた、細胞外基質タンパク質構築物を移植したヒヒから採血し、PTFE移植片(陰性対照)または細胞外基質タンパク質構築物に曝露したT細胞のインビトロ増殖を測定することによって測定した(図5B)。高密度細胞領域(図5C)の免疫染色は、CD3またはCD20陽性細胞のほんのわずかな集団しか示さず(図5D、図E)、移植片中間部分では検出不可能である場合が多かった。外植されたいかなる細胞外基質タンパク質構築物においても、異物巨細胞は観察されなかった。最後に、異種血管移植片またはエラスチン含有血管移植片において通常観察される石灰化は(Hilbert, et al., J Biomed Mater Res A 69, 197-204 (2004)；Hopkins, et al., J Thorac Cardiovasc Surg 137, 907-913, 913e901-904 (2009))、いずれのモデルのいかなる細胞外基質タンパク質構築物においても観察されなかった(図5F)。
【０１３４】
実施例8
コラーゲン性細胞外基質の合成を支持するために、分解性PGA足場上にヒト死体ドナー細胞またはイヌ細胞を培養することによって、細胞外基質タンパク質構築物を作製した。組織を非免疫原性にするために、界面活性剤に基づく脱細胞化段階により、抗原性細胞材料を除去した。細胞外基質タンパク質構築物は、最小のPGA断片を含み、緩衝液中で4℃で12ヵ月間貯蔵した後、天然血管と類似の力学的特性を保持した。ヒヒ動静脈モデルにおいて、直径6 mmの細胞外基質タンパク質構築物の機能が実証された。小口径(3〜4 mm)のイヌ細胞外基質タンパク質構築物の管腔にECを播種し、末梢および冠動脈バイパスのイヌモデルに移植した。細胞外基質タンパク質構築物は、吻合部位において天然脈管構造と良好に統合し、内膜過形成に抵抗した。α-平滑筋アクチン陽性細胞の浸潤、移植片管腔上のEC、および吻合部近傍のエラスチン形成が観察された。長期開存性が、最長1年間実証された。
【０１３５】
細胞外基質タンパク質構築物を作製するために同種ヒト細胞を使用する1つのアプローチにより、一人のヒトドナーが数十人の患者に移植片を提供することが可能になる(図6)。このアプローチは、自己組織工学および死体ヒト血管または動物血管に関連する1ドナー対1レシピエントモデルとは著しく異なる。一人のヒトドナーは、37個の大口径(内径6 mm)細胞外基質タンパク質構築物または74個の小口径(内径3 mm)細胞外基質タンパク質構築物を作製するのに十分大きな細胞バンクを提供する。複数のドナーから細胞をプールすることで、大きな細胞バンクの作製が可能となり、次には細胞バンク当たり多くの細胞外基質タンパク質構築物の製造が可能となる(すなわち、200〜500単位)。これは、完全に自己の組織工学アプローチよりも大きな規模の経済性を提供する。さらに、脱細胞化および単純な貯蔵法と組み合わせて同種細胞を使用することで、移植片作製のための培養期間と「切り離せる」ようになる。したがって、移植片は既に作製および貯蔵されているため、患者は移植片作製のための待ち時間がない。各患者に対するオーダーメードの移植片とは対照的に、必要時に患者が直ちに利用できる細胞外基質タンパク質構築物を作製する上で、移植片を貯蔵する能力が重要な段階である。これは、一般的に、特注の凍結保存設備および労力を要する融解手順なしでは長期間貯蔵することのできない細胞含有生成物からの重要な脱却である(Pascual, et al., Ann Vasc Surg 15, 619-627 (2001))。
【０１３６】
実施例9
ブタモデルを用いて、尿路変向のための導管を評価した。両方の尿管を、Wallace様式で導管に吻合した。尿管腫脹の通常の術後期に、早期の吻合部漏出および狭窄の両方を防ぐために、尿路変向ステントを各尿管中に留置した。導管を収容するために、皮膚および皮下組織の栓を除去した。筋膜を十字形に切開し、筋肉を分離し、後葉腹直筋鞘を十字形に切開した。次に、導管を腹壁に通し、縫合糸で皮膚および皮下組織にしっかり固定した。蓄尿用のストーマ周囲の皮膚に、皮膚保護剤およびオストミーパウチを取り付けた。後腹膜面に潜らせることによって移植片を腹腔の外側に維持し、これにより、移植片と他の腹部組織との間で癒着を形成するリスクを最小限にする。癒着形成は実際の臨床的問題であるため、このことは重要である。移植片を後腹膜面に潜らせること、尿管との吻合、およびストーマ部位での皮膚との吻合はすべて、血管新生の供給源への曝露を提供し、これは感染症の抵抗性に役立ち得る。腹膜、皮膚、尿管、および尿への曝露はまた、導管に集合する細胞の供給源を提供し得る。図9A〜9Eは、尿路導管としての、本発明の細胞外基質タンパク質構築物の使用を示す。結果から、導管が尿への慢性的曝露に耐えることが示される。濃縮されたヒト尿を回収し、37℃で4週間にわたり、尿路導管移植片のセグメントにポンプで通した。尿循環の4週間後、移植片は、移植片壁を通した尿の活発な拡散に抵抗した。導管の壁を介した著しい拡散の欠如は、ボトル中の濃縮尿が流動ループ中の移植片の外部の液体(この液体はリン酸緩衝生理食塩水であった)よりも色が濃かったという観察により実証される。対照的に、尿路変向の現在の最も基準となる移植片材料である回腸導管は、その内容物を活発に吸収する。
【０１３７】
表8は、尿曝露の前および4週間後の尿路導管の縫合強度を示す。
【０１３８】
【表８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０】
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