(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ディスク面におけるグルーブおよびランドからなる溝構造またはピットが設けられた構造を有するトラック領域に固定化された生体高分子が結合している標識用ビーズを、光学的読み取り手段によって数量を計測するための試料分析用ディスクにおいて、
前記溝構造または前記ピットとして構成される凹部を構成する面と凸部を構成する面に対して、いずれか一方の面を親水性のある１０〜２０ｎｍ程の表面粗さとし、他方の面を撥水性のある表面粗さとし、前記凹部を構成する面と前記凸部を構成する面において親水性のある表面粗さとしたいずれか一方の面のみに、前記標識用ビーズが固定化されることを特徴とする、試料分析用ディスク。
【請求項２】
前記固定化される標識用ビーズの直径Ｒと、前記グルーブまたはピットの幅Ｗとの比率Ｒ／Ｗが、０．６≦Ｒ／Ｗ＜１．０の関係を満たすことを特徴とする、請求項１に記載の試料分析用ディスク。
【請求項３】
前記グルーブまたはピットの幅Ｗと、前記試料分析用ディスクの半径方向において隣接するグルーブまたはピットとの周期Ｔとの比率Ｗ／Ｔが、０．６５≦Ｗ／Ｔの関係を満たすことを特徴とする、請求項１または２に記載の試料分析用ディスク。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学的な方法により血液等の生体試料に含まれる抗原もしくは抗体などの生体高分子を分析するための、試料用分析ディスクに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、疾患の診断や健康診断における疾病の早期発見などを目的として、血液等に含まれる生体試料から抗原や抗体を検出する免疫検査法（イムノアッセイ）が様々な場面で用いられている。免疫検査法（イムノアッセイ）とは、生体試料に含まれる特定の抗原（または抗体）と特異的に結合する抗体（または抗原）に測定が可能な標識をつけ、両者が反応した結果を定量することで試料に含まれる抗原（または抗体）の濃度を求め疾患の判定を行う方法である。
【０００３】
この方法は比較的感度が高く、操作方法が簡単であることから様々な標識方法が開発された。例えば標識に放射性同位元素を使ったRIA法（ラジオイノムアッセイ）や酵素を利用したEIA法（エンザイムイムノアッセイ）、蛍光標識を使ったFIA法、化学発光を使ったCLIA法などがある。
【０００４】
中でも酵素を利用した方法のひとつであるELISA法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）は、マイクロプレートを用いた検査方法が広く一般に普及して利用されている。マイクロプレートを使った方法は、９６穴プレートと汎用のマイクロプレートリーダーを用いて多数の検体を一度に測定することが可能で、コストが比較的安価である。また、放射性物質を使うRIA法と比べ、使用する場所の制限が少ないといったメリットがある。しかしながら、プレートに抗体を固定する前処理、抗体と抗原を反応させる反応時間、反応しなかった標識を洗い流すB/F（bond/free）分離、標識の酵素反応などそれぞれに数十分から数時間を要し、トータルの検査時間は数時間から１日程度かってしまうという問題がある。
【０００５】
このため検査時間を短縮するために、微細加工の技術を利用してマイクロプレートの各ウェルでの操作手順を数センチ角のチップ上に置き換えた分析用チップ（Lab on a chip）も開発されている。抗体の固定や専用の試薬をチップ上に準備し、一般的なELISA法の前処理をあらかじめチップに施しておくことで処理時間を短縮する。また、抗原−抗体反応を数十マイクロメートルから数ミリメートルの狭い流路の中で行うことで反応時間を短縮している。これは、各検査用に専用の分析チップとすることで、検査時間を数十分に短縮することが可能としている。従来、患者の検体を採取した後、検査室に送り結果が出るまでに長い時間がかかっていた検査が、心筋マーカーなど一部の検査においては、診察室や患者のベッドサイドでの検査、いわゆるPOCT（ポイント・オブ・ケア・テスト）が可能な機器が開発されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００４−５３３６０６号公報
【特許文献２】特表２００６−５２１５５８号公報
【特許文献３】特表２００２−５３０７８６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１および特許文献２には、多検体を同時に検査が可能というマイクロプレートの利点と、短い時間で検査結果が得られる分析用チップの利点を合わせた特徴を持つ分析デバイスとして、円盤型の分析デバイスが提案されている。具体的には、円盤状のデバイスに複数のマイクロチャネル構造を設け、試料に含まれる物質を反応させるための固相物質が流路の一部に充填されている。蛍光色素等の標識をレーザにより励起して得られる蛍光の強度を光検出器によって検出することにより測定が行われる。また特許文献３には、ディスクを使用した方法で、光ディスクの構造を利用した方法が開示されている。光ディスクのトラック形状が形成されている面と同一の面に生体試料や粒子を付着させ、光ピックアップを用いて信号の変化を検出する方法が示されている。
【０００８】
特許文献１および特許文献２の方法は、ディスク上に設けられた流路に試料を展開し試薬と反応した結果を蛍光強度や吸光度の変化として検出し、試料に含まれる抗原や抗体の量を測定している。検出方法としてはウェルプレートを用いた方法と原理的に同じであり、溶液中に含まれる標識物質の濃度を蛍光や吸光度で測定している。そのため、定量的な測定が出来る濃度範囲が狭く、濃度の高い試料については数段階に希釈した複数のサンプルを用意する必要があった。一方、低濃度の試料を感度良く検出する方法として特許文献３では光ディスクのフォーカス面にラッテックスビーズや磁気ビーズを結合させて検出する方法が示されているが、光ディスクのフォーカス面には一般的にトラッキング信号を得るためのグルーブまたはピットのような凹凸構造が設けてあり、その凹凸構造の凹部分もしくは凸部分のどちらか一方にのみ標識用ビーズが載置されないとトラッキング信号を乱したり、隣接トラックでのクロストークが発生したりするなど、試料の定量性に問題を与えてしまう。
【０００９】
本発明はこのような問題点に鑑みなされたものであり、分析する試料に含まれる抗原や抗体を高い精度で検出が可能な、試料分析用ディスクを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために、第１の発明に係る試料分析用ディスク（１００）は、ディスク面におけるグルーブ（１０７）およびランド（１０８）からなる溝構造またはピット（１０９）が設けられた構造を有するトラック領域（１０５）に固定化された生体高分子が結合している標識用ビーズ（１１０）を、光学的読み取り手段によって数量を計測するための試料分析用ディスク（１００）において、前記溝構造または前記ピット（１０９）として構成される凹部（１２０）を構成する面と凸部（１２１）を構成する面に対して、いずれか一方の面を親水性のある１０〜２０ｎｍ程の表面粗さとし、他方の面を撥水性のある表面粗さとし、前記凹部（１２０）を構成する面と前記凸部（１２１）を構成する面において親水性のある表面粗さとしたいずれか一方の面のみに、前記標識用ビーズが固定化されることを特徴とする。
【００１３】
第２の発明に係る試料分析用ディスク（１００）は、第１の発明において、前記固定化される標識用ビーズ（１１０）の直径Ｒと、前記グルーブ（１０７）またはピット（１０９）の幅Ｗとの比率Ｒ／Ｗが、０．６≦Ｒ／Ｗ＜１．０の関係を満たすことを特徴とする。
【００１４】
第３の発明に係る試料分析用ディスク（１００）は、第１または第２の発明において、前記グルーブ（１０７）またはピット（１０９）の幅Ｗと、前記試料分析用ディスク（１００）の半径方向において隣接するグルーブ（１０７）またはピット（１０９）との周期Ｔとの比率Ｗ／Ｔが、０．６５≦Ｗ／Ｔの関係を満たすことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の試料分析用ディスクによれば、光ディスクの情報を再生する光学ピックアップと同様の構成で検出が可能であり、装置の小型化、低価格化が可能となるとともに、分析する試料に含まれる抗原や抗体を高い精度で測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明に係る試料分析用ディスクの読み取り装置の概念ブロック図
【図２】本発明に係る試料分析用ディスクの構成概念図
【図３Ａ】本発明に係る試料分析用ディスクにおけるトラック領域の断面模式図
【図３Ｂ】本発明に係る試料分析用ディスクにおけるトラック領域の断面模式図
【図４】本発明に係る試料分析用ディスクの断面構造とビーズの読み取り状態を表した模式図
【図５Ａ】試料分析用ディスク上における試料の反応を示す模式図
【図５Ｂ】試料分析用ディスク上における試料の反応を示す模式図
【図６】試料分析用ディスク上における試料の反応を示す模式図
【図７Ａ】本発明に係る試料分析用ディスクの製造工程を説明する模式図
【図７Ｂ】本発明に係る試料分析用ディスクの製造工程を説明する模式図
【図７Ｃ】本発明に係る試料分析用ディスクの製造工程を説明する模式図
【図７Ｄ】本発明に係る試料分析用ディスクの製造工程を説明する模式図
【図７Ｅ】本発明に係る試料分析用ディスクの製造工程を説明する模式図
【図７Ｆ】本発明に係る試料分析用ディスクの製造工程を説明する模式図
【図７Ｇ】本発明に係る試料分析用ディスクの製造工程を説明する模式図
【図８】本発明に係る試料分析用ディスクを用いた、標識用ビーズ検出信号例
【図９】標識用ビーズ検出信号の比較例
【発明を実施するための形態】
【００１７】
図１は、本発明における試料分析用ディスク１００を光学的に読み取り、抗体や抗原の検出を行う読み取り装置１の構成ブロック図である。
【００１８】
読み取り装置１の構成は、データやコンテンツ情報が記録された光ディスクを読み取る装置と同一の構成である。読み取り装置１は、スピンドルモータ２、対物レンズ３、アクチュエータ４、ビームスプリッタ５、レーザ発振器６、コリメータレンズ７、集光レンズ８、光検出部９、制御部１０を備える。
【００１９】
制御部１０は、回転制御部１１、計測部１２、フォーカスト・ラッキング制御部１３を備える。読み取り装置１の構成は、上記以外にも必要に応じて他の要素を備えてもよい。
【００２０】
スピンドルモータ２は、回転制御部１１の制御によって試料分析用ディスク１００を所定の回転速度で回転させる。対物レンズ３は、例えば開口数（NA）が０．８５の対物レンズであり、レーザ発振器６から出力されたレーザ光を、試料分析用ディスク１００の読み取り面に集光させる。
【００２１】
アクチュエータ４は、フォーカスト・ラッキング制御部１３の制御によって、レーザ発振器６から出力されたレーザ光を、試料分析用ディスク１００の読み取り面に集光させるための調整を行う、例えば２軸のアクチュエータである。ビームスプリッタ５は、レーザ発振器６から出力されたレーザ光を対物レンズ３の方向に反射させるとともに、試料分析用ディスク１００からの反射光を光検出部９に導く。
【００２２】
レーザ発振器６は、例えばBlu-ray（BD）ディスクの再生用と同一の波長４０５ｎｍの半導体レーザ発振器である。コリメータレンズ７は、レーザ発振器６から出力されたレーザ光を並行な光束とする。
【００２３】
集光レンズ８は、ビームスプリッタ５より導かれた光を光検出部９に導く。光検出部９は、フォトダイオードであり、試料分析用ディスク１００から反射された光の光量に対応する検出信号を計測部１２およびフォーカスト・ラッキング制御部１３に出力する。
【００２４】
制御部１０は、例えばＣＰＵ（Central Processing Unit）やＤＳＰ（Digital Signal Processor）により構成され、図示しない記憶部等を備える。制御部１０は、図示しない操作部による操作に応じた各種制御、光検出部９により出力された検出信号に基づく各種制御等を行う。上記各種制御のうち、本発明の説明に必要な制御として、回転制御部１１による制御、計測部１２による制御、フォーカスト・ラッキング制御部１３による制御がある。回転制御部１１、計測部１２、フォーカスト・ラッキング制御部１３は、制御部１０における処理やプログラム等によって実現される。
【００２５】
回転制御部１１は、スピンドルモータ２を制御し、試料分析用ディスク１００を所定の回転数で回転させる。計測部１２は、光検出部９により出力された検出信号よりＲＦ信号を生成し、生成したＲＦ信号によりグルーブ１０７やピット１０９上に固定化された標識用ビーズ１１０を計数する。
【００２６】
フォーカスト・ラッキング制御部１３は、光検出部９により出力された検出信号よりＦＥ（フォーカスエラー）信号やＴＥ（トラッキングエラー）信号を生成し、生成した各信号の値によって、アクチュエータ４等を制御し、試料分析用ディスク１００の読み取り面に集光させる制御や、トラックに追従させる制御を行う。
【００２７】
次に、本発明の試料分析用ディスク１００の構造について、図２から図４を用いて説明する。図２は、本発明に係る試料分析用ディスク１００の概念図である。
【００２８】
試料分析用ディスク１００は、例えばＣＤ（Compact Disc）やＤＶＤ（Digital Versatile Disc）等と同じ直径の円盤形状であり、素材もポリカーボネートなど同様な素材を用いる。
【００２９】
試料分析用ディスク１００は、内周側に複数の注入孔１０１を、試料分析用ディスク１００の中心に対して回転対称に備えられる。注入孔１０１は、試料を滴下させるための孔であり、その容積は検査に必要な試料を計量する大きさになっている。
【００３０】
また、注入孔１０１の各々からは滴下された試料が流れる流路１０２が、試料分析用ディスク１００の中心から見て放射状に備えられる。さらに、流路１０２の各々に接続され、試料分析用ディスク１００の外周部に位置する検出領域１０４が備えられる。また、流路１０２の一部には、試料に含まれる特定の抗原に対して結合する抗体が修飾された標識用ビーズ１１０が規定量充填されているビーズ充填部１０３が備えられる。
【００３１】
試料分析用ディスク１００は、ディスク上で抗原、抗体、標識用ビーズ１１０などの試料の反応操作を施すエリアを設けるために、ＭＥＭＳ等のプロセスを利用し、流路１０２を設けることも可能である。
【００３２】
さらに、試料分析用ディスク１００の外周部には、検出領域１０４を含むように、光ディスクの信号面と同様の構造である、スパイラル状のグルーブ１０７またはピット１０９が形成されるトラック領域１０５が備えられる。トラック領域１０５にグルーブ１０７が形成されていることにより、試料分析用ディスク１００の読み取り面には、図３Ａに示すように、溝となるグルーブ１０７とランド１０８とが存在する。また、トラック領域１０５にピット１０９が形成されている場合は、図３Ｂに示すように、スパイラル状にピット１０９が形成されている。
【００３３】
このため、図３Ａにおいては、グルーブ１０７が凹部１２０であり、ランド１０８が凸部１２１である。また、図３Ｂにおいては、ピット１０９が凹部１２０であり、ピット１０９以外が凸部１２１となる。
【００３４】
図４は、試料分析用ディスク１００の断面構造と標識用ビーズ１１０の読み取り状態を表した模式図である。試料分析用ディスク１００の内周側には、深さ１００μｍから５００μｍの流路１０２が形成されており、分析対象の試料が通過する流路１０２の一部に特定の抗体が修飾された標識用ビーズ１１０が充填されているビーズ充填部１０３が備えられる。
【００３５】
抗原−抗体反応は溶液中で抗原と抗体が接触することで反応し標識用ビーズ１１０と分析対象の抗原が結合する。一般にイムノアッセイで対象としている抗原の溶液中の濃度は非常に薄い。そのため流路１０２の大きさを小さくし、狭い領域に多くの標識用ビーズ１１０を充填し反応効率を上げることで短時間に標識用ビーズ１１０と結合するようにする。
【００３６】
ビーズ充填部１０３において試料と反応した標識用ビーズ１１０は試料分析用ディスク１００の回転による遠心力でさらに外側の領域に流れ検出領域１０４に展開される。検出領域１０４は光ディスクと同様にグルーブ１０７やピット１０９が設けられている。ＢＤの場合、厚さ０．１ｍｍの保護層１０６を通して信号を読み取るように規格が定められている。一般的なＢＤ用光ピックアップの対物レンズ３は、保護層１０６までの距離（作動距離）が０．３ｍｍから０．４ｍｍ程度で設計されているものが多い。よって、装置の設計余裕を考慮すると流路１０２の深さに対して検出領域１０４で試料が展開される厚さ方向のスペースは薄くすることが好ましい。
【００３７】
また標識用ビーズ１１０を１個ずつ計数するために、流路１０２に充填されている標識用ビーズ１１０が厚さ方向に重ならない十分な面積となる必要がある。検出領域１０４の面積は、流路１０２に充填された標識用ビーズ１１０の個数と標識用ビーズ１１０の直径から決まる面積を掛けた面積よりも、グルーブ１０７もしくはピット１０９の面積が大きくなるように作られている。標識用ビーズ１１０に磁気ビーズを使用した場合には、磁気によりグルーブ１０７やピット１０９の形成された面に標識用ビーズ１１０を誘導することで反応時間を短縮することも出来る。
【００３８】
試料分析用ディスク１００の構造がグルーブ構造の場合、検出領域１０４に捕捉されている標識用ビーズ１１０の位置を、対物レンズ３により集光されたスポット光が通過した場合、反射した反射光の位相が変化し、光検出部９で得られる検出信号の光量が変化する。標識用ビーズ１１０の直径がＢＤの最短ピット長とほぼ等しい場合、トラック上に標識用ビーズ１１０が１個から検出することが出来る。
【００３９】
標識用ビーズ１１０を検出した位置は試料分析用ディスク１００の検出領域１０４、すなわちグルーブ１０７やピット１０９を持つ部分で流路１０２と接続していない部分に、予めアドレス信号として記録しておくことで半径方向とトラック方向の情報を得ることが出来る。
【００４０】
その他の方法として、グルーブ構造の場合はグルーブ１０７をカッティングする際にディスクの半径方向にうねりを生じるように試料分析用ディスク１００を製作し、その変動をＴＥ信号から検出して、周波数からディスク上のアドレスを計算する方法であるウォブル検出を利用しても良い。
【００４１】
また、信号面にＢＤ―ＲやＢＤ−ＲＷのような記録型または追記型のディスクと同様な相変化材料や色素材料を用いることで情報を追記することも可能である。例えば滴下した試料のIDナンバーを追記することで、装置から一旦試料分析用ディスク１００を取り出し、再び分析のために装置で読み取る場合の試料の特定に利用する。また、すでに利用済みの試料分析用ディスク１００に誤って別の試料を滴下してしまうことを防止することが出来る。
【００４２】
次に、本発明の試料分析用ディスク１００を用いた、分析用試料の分析について、図５および図６に基づき説明する。
【００４３】
注入孔１０１より試料が注入され、読み取り装置１によって試料分析用ディスク１００を回転させると滴下された試料は遠心力により抗原−抗体反応のための流路１０２に導かれる。流路１０２につながる部分には試料に含まれる特定の抗原に対して結合する抗体が修飾された標識用ビーズ１１０が規定量充填されている。
【００４４】
標識用ビーズ１１０は直径が１００ｎｍから１μｍ程度の大きさのポリマー粒子、または内部にフェライト等の磁性材料を含む磁気ビーズ等を用いる。また、金コロイドなどの金属微粒子やシリカビーズ等を用いることも可能である。標識用ビーズ１１０の直径は、標識用ビーズ１１０の直径は、検出に利用する光学系により最適な大きさが決定する。光学的解像限界ｄは使用するレーザの波長λと、対物レンズの開口数ＮＡから、次式のように表すことができる。
【数１】
0005899908.tif 000002
【００４５】
光学系を限定しなければこの範囲ではないが、現在一般に普及している光ディスクの中で、もっとも高解像度のものはＢｌｕ−ｒａｙ  Ｄｉｓｃ（ＢＤ）で波長４０５ｎｍの半導体レーザの光を開口数（ＮＡ）０．８５の対物レンズでディスク上にスポットを集光させることができる。ＢＤの信号の最短ピット長は約１５０ｎｍである。したがって、ＢＤの光学系を利用する場合には、上記光学的解像限界ｄを表す式より、標識用ビーズの大きさは直径およそ１２０ｎｍ程度の大きさまで信号として検出することが出来る。既存の光ディスクのドライブ、特に光ピックアップに利用されている部品を利用することが出来れば、現在高額な分析装置と同等もしくはそれ以上の高精度な生体高分子が測定（検出）できる分析装置を非常に安価に製造することが出来るという利点がある。
【００４６】
また、標識用ビーズ１１０の表面には試料に含まれる抗原２００と特異的に結合する抗体２１０をあらかじめ結合させておく。抗体２１０の種類には様々なものがあり、例えばB型肝炎の検査の場合には血液中に含まれるHBｓ抗原と特異的に結合するHBｓAgモノクローナル抗体を修飾しておく。修飾する抗体２１０の種類は検出する抗原２００の種類にあわせ特異的に結合するものを選択する。
【００４７】
流路１０２中で抗体２１０が修飾された標識用ビーズ１１０と試料が混合されると、試料に含まれる抗原２００が標識用ビーズ１１０の表面に修飾された抗体２１０と結合し、標識用ビーズ１１０、抗体２１０、抗原２００の複合物が形成される。
【００４８】
この段階で溶液中には試料に含まれる抗原２００の量に応じて、抗原２００と抗体２１０が反応した複合物の標識用ビーズ１１０と、抗原２００と反応していない標識用ビーズ１１０が一定の割合で存在している。さらに試料分析用ディスク１００の遠心力により、流路１０２で反応した溶液を外周部の検出領域１０４に展開させる。
【００４９】
検出領域１０４は、流路１０２の底面が接する面が、光ディスクの信号面と同様に、スパイラル状のグルーブ構造またはピット構造となっている。グルーブ構造の場合、グルーブ１０７の幅は標識として使用する標識用ビーズ１１０の直径とほぼ同じ幅になっている。また、ピット構造の場合は、各ピット１０９の幅が標識用ビーズ１１０の直径とほぼ同じ幅になっていることが好ましい。
【００５０】
グルーブ１０７もしくはピット１０９の幅に対して、標識用ビーズ１１０の直径に小さく例えば半分以下の直径である場合、グルーブ１０７内に複数個の標識用ビーズ１１０が凝集して固定化され、試料を精度良く検出することが困難となってしまう。そのため、グルーブ１０７もしくはピット１０９の幅は、標識用ビーズ１１０の大きさと同じかそれ以下が好ましく、標識用ビーズ１１０が２個以上固定化しないためには、標識用ビーズ１１０の大きさは、グルーブ１０７もしくはピット１０９の幅に対して、最低でも半分以上である必要がある。好ましくは、標識用ビーズ１１０の直径（大きさ）Ｒと基板表面上の微細凹凸周期構造であるグルーブ１０７またはピット１０９の幅Ｗの比率Ｒ／Ｗが、以下の式に示される関係を満たす必要がある。
【数２】
0005899908.tif 000003
【００５１】
反対に標識用ビーズ１１０の直径が、グルーブ１０７またはピット１０９の幅よりも大きい場合、標識用ビーズ１１０がグルーブ１０７またはピット１０９からはみ出す形となるため、トラッキング信号を乱したり、隣接トラックでのクロストークが発生したりするなど、試料の定量性に問題を与えてしまう。
【００５２】
更には、例えばピペット等で試料を滴下させただけの場合、ランド１０８の部分にも標識用ビーズ１１０が固定化されてしまうため、クロストーク成分が発生して精度良く計測することが困難となってしまう。このため、ランド１０８に標識用ビーズ１１０が固定化されないような、ランド１０８とグルーブ１０７の幅の比率、もしくはピット１０９の幅についても配慮し、グルーブ１０７もしくはピット１０９の内部にのみ標識用ビーズ１１０が固定化される必要がある。
【００５３】
良好なＴＥ信号を得るためには、一般的にランドグルーブ比（ランド１０８とグルーブ１０７の幅の比率）は０．５程度が良いとされているが、トラッキング誤差信号を損ねない範囲内でランドグルーブ比が大きい方が好ましい。好ましくは、基板表面上の微細凹凸周期構造であるグルーブ１０７またはピット１０９の幅Ｗと、グルーブ１０７またはピット１０９の周期Ｔの比率Ｗ／Ｔが、以下の式の関係を満たす必要がある。
【数３】
0005899908.tif 000004
【００５４】
グルーブ１０７またはピット１０９の深さは、ＴＥ信号の出力に最適な深さ（一般的にはλ／８程度）とするのが好ましいが、用いる標識用ビーズ１１０の大きさと出力（検出）信号の関係や、試料分析用ディスク１００の表面におけるキズやゴミとの信号を区別するなどの観点から、最適な信号レベルが得られる深さにすればよく、この限りではない。
【００５５】
これらの検出領域１０４には、標識用ビーズ１１０の表面に修飾したものと同じ種類の抗体２１０がシランカップリング等の方法で固定されている。検出領域１０４に展開された溶液に含まれている抗原２００、すなわち流路１０２の中で抗体２１０が修飾された標識用ビーズ１１０と反応した複合物は、さらに検出領域１０４に固定されている抗体２１０と結合し、標識用ビーズ１１０、抗体２１０、抗原２００、固相化抗体によるサンドイッチ型の複合物を形成し、検出領域１０４の基板上に固定化される。抗原２００と反応していない標識用ビーズ１１０は、検出領域１０４にとどまらず、遠心力によりさらにディスク外周送られ、検出領域１０４の外に排出される。
【００５６】
グルーブ１０７のみに固定化された標識用ビーズ１１０の反応速度を早めたり、検出精度を向上させるために、標識用ビーズ１１０の内部にフェライトなどの磁性体材料を用いて、試料分析用ディスク１００の外部または内部より磁気操作を行うことも可能である。
【００５７】
図５は試料分析用ディスク１００上で、抗原２００と抗体２１０が反応した後の複合物の構成を模式的に表した図である。図５Ａは、ウェルプレートで行われるのと同様の抗原−抗体反応を利用したサンドイッチ法による原理により、試料に含まれる抗原２００に計測可能な標識である標識用ビーズ１１０が付けられた状態で、検出領域１０４に固定されていることになる。サンドイッチ法は検出対象の絶対量に対して出力がリニアに得られることから定量測定が行いやすい方法として多く用いられている。固定化の方法はこれに限らず、競合法など他の方法を用いることも出来る。
【００５８】
また、検出対象が抗原２００ではなく抗体２１０の場合には、図５Ｂに示すように、抗体２１０に特異的に結合する抗原２００を検出領域１０４に固定化しておき、二次抗体２１１により標識用ビーズ１１０を結合させる方法によって、抗原２００の検出と同様にサンドイッチ法による測定を行うことが出来る。
【００５９】
図６は、試料分析用ディスク１００の半径方向に対して異なる抗体をつけた場合の検出領域１０４の説明をするものである。分析対象の試料に含まれる複数の抗原２００Ａ〜２００Ｃに対して特異的に結合するモノクローナル抗体２１２を試料分析用ディスク１００のトラックを複数の領域に分けて固定してある。
【００６０】
標識用ビーズ１１０には、複数の抗原に結合するポリクローナル抗体２１３が修飾されている。検出領域１０４に展開された標識用ビーズ１１０は、半径位置に応じて異なる抗原と反応し、グルーブ１０７またはピット１０９に結合する。
【００６１】
通常、蛍光や酵素反応により複数の抗原を同時に検出するためには、複数の標識を利用して、蛍光波長の違いや発色の違いを検出しているが、その場合は複数の波長の光源や波長フィルターと光検出器の組み合わせが必要となる。図６に示した手法は、試料分析用ディスク１００の半径位置をアドレスから得ることにより、同じ検出方法で複数の抗原をほぼ同時に計測することが出来る。さらに、複数の抗原の含まれる比率から、統計的に疾病の可能性を判定するような分析方法の場合にも、同一試料を同じ条件で測定することが出来、別々に計測した場合の誤差に比べ測定ばらつきを小さくすることが可能となる。
【００６２】
次に、本発明の試料分析用ディスク１００の製造方法について、図７Ａから図７Ｇを用いて説明する。本発明の試料分析用ディスク１００は、ＣＤ、ＤＶＤなどと類似の方法で作製される。
【００６３】
先ず、図７Ａに示すように、光学研磨が施され、洗浄し十分に乾燥させた円盤状の基板５０１に対し、マグネトロンスパッタ等により膜厚が１０ｎｍ〜１００ｎｍ程度の無機レジスト膜５０２を成膜する。基板５０１としては、石英ガラス基板またはシリコンウエハー基板を使用することができる。特にシリコンウエハー基板は、半導体分野で使用されており、十分に研磨及び洗浄された状態で入手が可能であり、石英ガラスに比べ表面が平滑性と洗浄度とが高い。さらに、シリコンウエハー基板は導電性を有するため、スタンパを作製する際に別途導電膜を形成する必要が無いため好適である。
【００６４】
次に、図７Ｂに示すように、基板５０１上に形成された無機レジスト膜５０２に対し、ＤＶＤ等の既存の露光装置等で用いられるような波長４００ｎｍ程度のレーザ光５０４を、開口数ＮＡが０．９程度の対物レンズ５０５で集光させることによって入力情報信号に基づいて露光を行い、所望の潜像パターン５０３を形成する。
【００６５】
次に、図７Ｃに示すように、基板５０１上の無機レジスト膜５０２に形成された潜像パターン５０３に対し現像を行い、潜像パターン５０３を除去しレジストパターン５０６を形成する。ここで、現像の際に用いられる現像液としては、主としてアルカリ性の現像液を用いる。
【００６６】
無機レジスト膜５０２としては、露光に使用するレーザ光５０４の波長における露光感度が高いタングステン（Ｗ）の酸化物が用いられる。タングステン（Ｗ）の酸化物の一種であるＷＯ2は室温で安定であり、過熱することによりＷＯ3となる。スパッタリング法で形成されたＷＯ2はアモルファス構造であり、レーザ光５０４で露光されることにより加熱され結晶構造のＷＯ3となることで、現像液に用いられるアルカリ溶液に可溶となる。
【００６７】
次に、図７Ｄに示すように、基板５０１上に形成されたレジストパターン５０６をマスクとして、基板５０１の露出部をドライエッチングすることにより基板５０１に直接エッチングパターン５０７を形成する。エッチングガスとして、ＣＦ4、ＣＨＦ3、Ｃ3Ｆ8、Ｃ4Ｆ8等のフルオロカーボン系ガスを用いることにより、レジストパターン５０４に対して基板５０１のエッチングレートを高くすることができ、選択比の大きなエッチングかできる。
【００６８】
特に、基板５０１に石英ガラスを用いて、フロロカーボン系ガスとしてＣＨＦ3を用いたエッチングは、図７Ｄにおける下方向へのエッチングレートが、左右方向へのエッチングレート比べ大きな異方性エッチングを行うことができるため、円盤状の基板５０１のディスク半径方向におけるエッチングパターン５０７の断面形状は矩形に近い形となり、凹凸形状の側面は円盤状の基板５０１の板面に対して概ね直交した状態となる。更に、エッチングによって凹凸形状を形成するため、従来レジスト膜の膜厚で規定されていた凹凸形状の深さが、エッチング条件により制御可能であり、深い溝の形成も可能である。
【００６９】
このエッチング工程で用いるフルオロカーボン系ガスに微量の水素ガスを添加することによりエッチングの際に生成されるラジカルポリマーの量を増やすことができ、凹凸構造の凹部１２０と凸部１２１で異なる表面粗さとすることが出来る。結果として、図７Ｄで示したエッチングパターン５０７の表面粗さを大きくすることができ、凹部１２０を凸部１２１よりも親水性のある表面粗さとすることが出来る。
【００７０】
エッチング工程で添加する水素の量により表面粗さをコントロールすることができ、特に本実施例のように親水性のある表面粗さとする場合、１０〜２０ｎｍ程の表面粗さが最適である。表面粗さが３０ｎｍ以上となるとトラッキング信号および検出信号のノイズが増え測定精度に影響を与えてしまう。
【００７１】
次に、図７Ｅに示すように、基板５０１上に形成されたレジストパターン５０６に対して、フロロカーボン系ガスを用いて、フロロカーボン系ガス雰囲気下で電圧を印加して等方的にレジストパターンのアッシングおよびトリミングを行い、レジストパターン５０６の除去、及び表面の粗度を低減し、入力情報信号に基づいたエッチングパターン５０７を有する円盤状の原盤５０８を得る。
【００７２】
ここで、フロロカーボン系ガスとしては、ＣＦ4、ＣＨＦ3、Ｃ3Ｆ8、Ｃ4Ｆ8等を用いる。特に、ＣＦ4は、等方性エッチングを行いやすいため、エッチングガスとして好適である。
【００７３】
図７Ｆに示すように、円盤状の光ディスクの原盤５０８の凹凸形状が形成された面に対してスパッタリング法により厚さ５０〜２００ｎｍのＮｉ膜を形成した後、電鋳法により、厚さ１００〜５００μｍのＮｉメッキ膜を形成することにより、原盤５０８に形成されているエッチングパターン５０７を転写して凸凹形状を有する円盤状のスタンパ５０９を作製する。
【００７４】
スタンパ５０９に形成される凸凹形状は、原盤５０８に形成されているエッチングパターン５０７と凹凸が逆の関係になる。次に、図７（ｇ）に示すように、凸凹形状を有する円盤状のスタンパ５０９を射出成型機（図示せず）に装着して、射出成型法により、内周から外周に向かって、或いは外周から内周に向かって入力情報信号に基づいたグルーブ１０７またはピット１０９が螺旋状に形成された凹凸形状を有する円盤状の試料分析用ディスク１００を成形する。上記射出成形を繰り返すことにより、試料分析用ディスク１００を大量に複製することができる。
【００７５】
次に、本発明における試料分析用ディスク１００を、本発明の製造方法に基づいて製造し、試料を分析した実施例について説明する。
【００７６】
先ず、図７Ａに示すように、表面研磨を施し洗浄及び乾燥を行った石英ガラスからなる基板５０１に対し、マグネトロンスパッ夕方式によりタングステン（Ｗ）の合金ターゲットを用いて、アルゴン４４ｓｃｃｍ、酸素６ｓｃｃｍを導入して反応性スパッタリングを行い、無機レジスト膜５０２として膜厚が５０ｎｍであるアモルファス構造の無機レジスト膜５０２を形成した。
【００７７】
次に、図７Ｂに示すように、石英ガラス製の基板５０１上に形成されたアモルファス構造の無機レジスト膜５０２に対し、波長４０５ｎｍの半導体レーザによるレーザ光５０４と、ＮＡ＝０．９０の対物レンズ５０５を有する回転一軸系の露光装置を用いて、線速度５．０ｍ／ｓの速さで露光を行い、トラックピッチ３２０ｎｍの等幅のグルーブ１０７とランド１０８が連続したパターンであるランドグルーブ形状の潜像パターン５０３を形成した。アモルファス構造の無機レジスト膜５０２の露光された潜像パターン５０３の領域は結晶状態に変化する。レーザ光５０４の発光パターンを制御することにより、ピット形状やランダム変調信号などランドグルーブ形状以外の任意の潜像パターン５０３を形成することができる。
【００７８】
次に、図７Ｃに示すように、石英ガラス製の基板５０１上に形成された潜像パターン５０３に対し、現像をおこなった。現像は、アルカリ性であるテトラメチルアンモニウムハイドロオキサイド溶液（濃度２．３８ｗｔ％）を現像液として用い、潜像パターン５０３が形成された石英ガラス製の基板５０１を室温で２０分間液侵して、潜像パターン５０３を除去することによりレジストパターン５０６を形成した。
【００７９】
次に、図７Ｄに示すように、石英ガラス製の基板５０１上に形成されたレジストパターン５０６をマスクとして、ＣＨＦ３と水素ガスの混合ガスを用いて、石英ガラス製の基板５０１の露出部に対してドライエッチングを行なった。混合ガスにおける水素ガスの混合比分圧は０．１とした。
【００８０】
ドライエッチングは、異方性を高めるため４Ｐａの雰囲気下で１００Ｗの電力を６分間印加することにより行ない、石英ガラス製の基板５０１にラインアンドスペース形状のエッチングパターン５０７を形成した。エッチングパターン５０７は、深さ１４０ｎｍであり、グルーブ半値幅は２２０ｎｍであった。
【００８１】
次に、図７Ｄに示すように、石英ガラス製の基板５０１上に形成されたエッチングパターン５０７に対し、ＣＦ4ガスを用いてアッシングをおこなった。アッシングは、ＣＦ4と０2との混合比５：２のガスを用い１５Ｐａの雰囲気下で７０Ｗの電力を印加することによって行い、レジストパターン５０６の除去を行う。これによって、図７Ｅに示すエッチングパターン５０７を有する原盤５０８が形成された。
【００８２】
次に、図７Ｆに示すように、原盤５０８上にスパッタリング法により厚さ１５０ｎｍのＮｉ膜を形成した後、電鋳法により、厚さ３００μｍのＮｉメッキ膜を形成することにより、原盤５０８に形成されているエッチングパターン５０７を転写してスタンパ５０９を作製した。
【００８３】
次に、図７Ｇに示すように、スタンパ５０９を射出成型機に装着して、射出成型法により、内周から外周に向かって、螺旋状のランドグルーブ形状が形成された試料分析用ディスク１００を成形した。成形された試料分析用ディスク１００の形状は、厚さは１．１ｍｍであり、トラックピッチが３２０ｎｍ、深さ１４０ｎｍで、グルーブ半値幅は２２０ｎｍであった。また、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）によりグルーブ１０７およびランド１０８の表面粗さを測定したところ、グルーブ１０７の表面粗さは約１６ｎｍ、ランド１０８の表面粗さは約３ｎｍであった。
【００８４】
次に、上記実施例で作製された試料分析用ディスク１００上に、抗体となるビオチンを１０μＬピペットで滴下させた。次に、濃度１００μg／ｍＬの直径１４０ｎｍの標識用ビーズ１１０の表面にビオチンを修飾させ、さらにビオチンに特異的に反応するアビジンを修飾させた溶媒１μＬを基板上の１０μＬビオチンを滴下した場所にピペットで滴下させ、基板上でサンドイッチ抗原−抗体反応を行った後、未反応の標識用ビーズ１１０を純水で洗い流し、その後基板表面を乾燥させた。
【００８５】
この試料分析用ディスク１００を線速度５．０ｍ／ｓ一定で回転させながら、波長４０５ｎｍの半導体レーザ光を０．３５ｍＷで発光し、ＮＡが０．８５の対物レンズ３で基板表面に集光させ、反射して戻ってきた光を光検出部９における４分割フォトダイオードで受光し、フォトダイオードの各成分の信号を制御してスパイラル状のグルーブ１０７にトラッキングをかけながら総和信号を観察した。
【００８６】
標識用ビーズ１１０の計測カウント数は、１００トラック分の合計をカウントした。その結果、標識用ビーズ１１０のカウント数は４５６８５個であった。検出信号の一部分が例えば図８のように計測することができ、標識用ビーズ１１０の１個に対応する信号が標識用ビーズ１１０の存在しない信号レベルに対し、十分低い信号レベルとして検出することができ、その周波数成分を解析した結果、確かに標識用ビーズ１１０の１個分の直径である１４０ｎｍと一致した。
【００８７】
図８は、標識用ビーズ１１０を検出したときの検出電圧を表した図であり、例えば検出信号が平坦な部分Ａは、標識用ビーズ１１０が検出されていない箇所であり、Ｂのように部分的に低い値をとる箇所は、標識用ビーズ１１０が検出された箇所である。このように、標識用ビーズ１１０を検出した信号を明確に特定することができる。
【００８８】
次に、高濃度から低濃度の標識用ビーズ１１０のカウント精度を確認するため、上記実施例で用いた標識用ビーズ１１０の表面にビオチンを修飾させ、さらにビオチンに特異的に反応するアビジンを修飾させた溶媒の濃度に対し、１００倍、１０倍、１倍、１／１０倍、１／１００倍、１／１０００倍の６種類の濃度の溶媒を用いる以外は上記実施例と同様の方法で標識用ビーズ１１０の個数をカウントした結果を表１に示す。濃度に比例した計測結果が得られ、高濃度から低濃度まで非常に精度の高い計測結果が得られている。また、濃度１倍の結果が図８の計測結果とほぼ一致し、再現性も高いことが確認できた。
【表１】
0005899908.tif 000005
【００８９】
次に、比較例１として標識用ビーズ１１０の直径が、グルーブ１０７の幅よりも大きい場合の例として、用いる標識用ビーズ１１０の直径を３００ｎｍとした以外は上記実施例と同様の方法で、標識用ビーズ１１０のカウントを行った。標識用ビーズ１１０の直径が大きく、隣接するトラックへのクロストーク成分の増加による影響により安定したトラッキングを取ることが困難で、標識用ビーズ１１０の個数をカウントすることができなかった。
【００９０】
次に、比較例２として、標識用ビーズ１１０の直径が、グルーブ１０７の幅よりも小さい場合の例として、用いる標識用ビーズ１１０の直径を１００ｎｍとした以外は上記実施例と同様の方法で、標識用ビーズ１１０のカウントを行った。この場合、トラッキング信号は安定しており、標識用ビーズ１１０の個数をカウントすることができた。その結果を表２に示す。また、検出信号の一部分について、図９に示す。
【表２】
0005899908.tif 000006
【００９１】
図９は、標識用ビーズ１１０を検出したときの検出電圧を表した図であり、例えば検出信号が平坦な部分Ａは、標識用ビーズ１１０が検出されていない箇所であり、Ｂのように部分的に低い値をとる箇所は、標識用ビーズ１１０が検出された箇所であるが、Ｃのように不明瞭な信号も検出されている。これは、標識用ビーズ１１０が小さすぎるため、グルーブ１０７に対して複数の標識用ビーズ１１０が固定化されたり、グルーブ１０７の中心からオフセットした状態で標識用ビーズ１１０が固定化された結果によるもので、溶媒の濃度に比例した結果が得られず、高濃度から低濃度まで精度の高い結果を得ることはできなかった。
【００９２】
次に、比較例３として、原盤作製工程でのエッチングガスをＣＨＦ３のみで行なうことによって、グルーブ１０７の表面粗さとランド１０８の表面粗さとをほぼ同一とした試料分析用ディスク１００を作成し、同様に標識用ビーズ１１０を計測した。
【００９３】
作製された試料分析用ディスク１００は実施例１と同様の形状で、厚さは１．１ｍｍであり、トラックピッチが３２０ｎｍ、深さ１４０ｎｍで、グルーブ半値幅は２２０ｎｍであった。原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）によりグルーブ１０７およびランド１０８の表面粗さを測定したところ、グルーブ１０７の表面粗さは約４ｎｍ、ランド１０８の表面粗さは約３ｎｍであった。
【００９４】
この試料分析用ディスク１００用いて実施例と同様の方法で標識用ビーズ１１０のカウントを行なった結果を表３に示す。
【表３】
0005899908.tif 000007
【００９５】
比較例３の結果としては、比較例２と同様に検出信号レベルが不均一であった。また、グルーブ１０７とランド１０８の表面粗さがほぼ同一であるため、グルーブ１０７だけでなくランド１０８にも標識用ビーズ１１０が載置されている。したがって、隣接するグルーブ１０７およびランド１０８によるクロストーク成分が増え、トラッキング信号が乱れる。さらに、標識用ビーズ１１０の存在しない信号レベルにとランド１０８に載置された標識用ビーズ１１０の信号レベルは区別がつかないため、実施例と比較すると、標識用ビーズ１１０の計測数は半分程度となってしまい、高濃度から低濃度までの試料の計測に対して、精度の高い結果を得ることは出来なかった。
【００９６】
本発明の実施の形態は、その要旨を逸脱しない限り、様々に変更可能である。上記実施例においては、ビオチンとアビジンによる反応により低濃度から高濃度の免疫学的生体高分子の結合した標識用ビーズ１１０の個数をカウントした例を示したが、計測したい生体高分子の種類に応じて、例えばB型肝炎などの抗原とそれに対応する抗体を同様の形で用いることも可能である。
【００９７】
さらに、抗原−抗体サンドイッチ法も同様に用いることが出来る。また、基板の面積的な制限の許す範囲で複数の種類の抗原−抗体反応をディスクの円周上のエリアを区分けして同時に行い、複数の種類の標識用ビーズ１１０のカウントを同時に計測することも可能である。
【００９８】
また、用いられる抗原２００、抗体２１０、標識用ビーズ１１０の種類と試料分析用ディスク１００の表面における表面粗さや濡れ性などによっては、表紙起用ビーズ１１０と試料分析用ディスク１００との密着性が悪く、抗原２００や抗体２１０と反応した標識用ビーズ１１０が純水で洗い流されてしまい、濃度に比例した精度の高い検出が困難となる場合がある。このような場合、標識用ビーズ１１０の密着性を確保するため、試料分析用ディスク１００の表面に薄膜を形成したり、シランカップリング剤の塗布やプラズマ処理などの表面処理を、基板表面上で抗原―抗体反応をさせる前に最適な条件化の下で実施することも可能である。
【００９９】
また、隣接する凹部１２０と凸部１２１は、凹凸形状を構成する側面を共有しているが、この側面は凹部１２０または凸部１２１のいずれを構成するものとしてもよい。
【符号の説明】
【０１００】
１：読み取り装置、２：スピンドルモータ、３：対物レンズ、４：アクチュエータ、５：ビームスプリッタ、６：レーザ発振器、７：コリメータレンズ、８：集光レンズ、９：光検出部、１０：制御部、１００：試料分析用ディスク、１０１：注入孔、１０２：流路、１０３：ビーズ充填部、１０４：検出領域、１０５：トラック領域、１０６：保護層、１０７：グルーブ、１０８：ランド、１０９：ピット、１１０：標識用ビーズ、１２０：凹部、１２１：凸部、２００：抗原、２１０：抗体
【図１】
0005899908.tif 000008
【図２】
0005899908.tif 000009
【図３Ａ】
0005899908.tif 000010
【図３Ｂ】
0005899908.tif 000011
【図４】
0005899908.tif 000012
【図５Ａ】
0005899908.tif 000013
【図５Ｂ】
0005899908.tif 000014
【図６】
0005899908.tif 000015
【図７Ａ】
0005899908.tif 000016
【図７Ｂ】
0005899908.tif 000017
【図７Ｃ】
0005899908.tif 000018
【図７Ｄ】
0005899908.tif 000019
【図７Ｅ】
0005899908.tif 000020
【図７Ｆ】
0005899908.tif 000021
【図７Ｇ】
0005899908.tif 000022
【図８】
0005899908.tif 000023
【図９】
0005899908.tif 000024