(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＳＰＧ４遺伝子の突然変異の存在を同定する方法であって、
生物学的試料中に存在するヒトＳＰＧ４遺伝子をプライマーを用いて増幅させるか、または、生物学的試料をプローブを用いて分析すること（ここで、プライマーまたはプローブは単離されたＳＰＧ４の核酸であり、前記核酸は、
ａ）配列番号１もしくは配列番号２、またはこれらの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドの配列、
ｂ）配列番号１または配列番号２の配列の相同体または変異体、および
ｃ）ａ）およびｂ）の配列のいずれか１つに相補的なＤＮＡ配列または対応するＲＮＡ配列、
からなる群から選択される）と、
増幅結果または分析結果を分析してヒトＳＰＧ４遺伝子の変異の存在を同定すること
とを含んでなり、前記ヒトＳＰＧ４遺伝子の突然変異が、
-   エキソン７の1210 C→G
-   エキソン８の1233 G→A
-   エキソン８の1267 T→G
-   エキソン８の1283 T→G
-   エキソン８の1288 A→G
-   エキソン１０の1401 C→G
-   エキソン１１の1504 G→T
-   エキソン１１の1468 G→A
-   エキソン１３の1620 C→T
-   エキソン１５の1788 G→A
-   エキソン１５の1792 C→T
-   エキソン３の702 C→T
-   エキソン５の873 A→T
-   エキソン５の907 C→A
-   エキソン５の932 C→G
-   エキソン１０の1416 C→T
-   エキソン１５の1809 C→T
-   エキソン２の578-579 ins A
-   エキソン５の852 del 11
-   エキソン５の882-883 ins A
-   エキソン５の906 del T
-   エキソン９の1299 del G
-   エキソン９の1340 del 5
-   エキソン１１の1520 del T
-   エキソン１２の1574 del GG
-   エキソン１３の1634 del 22
-   エキソン１４の1684-1685 ins TT
-   エキソン１４の1685 del 4
-   イントロン４の808-2 A→G
-   イントロン６の1129+2 T→G
-   イントロン７の1223+1 G→T
-   イントロン８の1299+1 G→A
-   イントロン１１の1538+5 G→A
-   イントロン１１の1538+3 del 4
-   イントロン１３の1661+1 G→T
-   イントロン１３の1662-2 A→T
-   イントロン１５の1812+1 G→A
-   イントロン１５の1813-2 A→G  および
-   イントロン１６の1853+1 G→A 
からなる群から選択される少なくとも一つである、方法。
【請求項２】
突然変異が常染色体性優性遺伝性痙性対麻痺の原因である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ａ）配列番号１もしくは配列番号２、またはこれらの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドの配列、
ｂ）配列番号１または配列番号２の配列の相同体または変異体、および
ｃ）ａ）およびｂ）の配列のいずれか１つに相補的なＤＮＡ配列または対応するＲＮＡ配列、
からなる群から選択される、単離されたＳＰＧ４の核酸を含んでなる、ＳＰＧ４遺伝子に関連するＡＤ−ＨＳＰの診断法に用いるための、診断剤であって、
前記診断剤がＳＰＧ４遺伝子の変異を同定でき、前記ＳＰＧ４遺伝子の突然変異が、
-   エキソン７の1210 C→G
-   エキソン８の1233 G→A
-   エキソン８の1267 T→G
-   エキソン８の1283 T→G
-   エキソン８の1288 A→G
-   エキソン１０の1401 C→G
-   エキソン１１の1504 G→T
-   エキソン１１の1468 G→A
-   エキソン１３の1620 C→T
-   エキソン１５の1788 G→A
-   エキソン１５の1792 C→T
-   エキソン３の702 C→T
-   エキソン５の873 A→T
-   エキソン５の907 C→A
-   エキソン５の932 C→G
-   エキソン１０の1416 C→T
-   エキソン１５の1809 C→T
-   エキソン２の578-579 ins A
-   エキソン５の852 del 11
-   エキソン５の882-883 ins A
-   エキソン５の906 del T
-   エキソン９の1299 del G
-   エキソン９の1340 del 5
-   エキソン１１の1520 del T
-   エキソン１２の1574 del GG
-   エキソン１３の1634 del 22
-   エキソン１４の1684-1685 ins TT
-   エキソン１４の1685 del 4
-   イントロン４の808-2 A→G
-   イントロン６の1129+2 T→G
-   イントロン７の1223+1 G→T
-   イントロン８の1299+1 G→A
-   イントロン１１の1538+5 G→A
-   イントロン１１の1538+3 del 4
-   イントロン１３の1661+1 G→T
-   イントロン１３の1662-2 A→T
-   イントロン１５の1812+1 G→A
-   イントロン１５の1813-2 A→G  および
-   イントロン１６の1853+1 G→A 
からなる群から選択される少なくとも一つである、診断剤。
【請求項４】
請求項３の診断剤である少なくとも一種の化合物を含んでなる、ＡＤ−ＨＳＰの診断キットまたはパック。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は最も一般的な形態の常染色体性優性遺伝性痙性対麻痺（ＨＳＰ）の原因である、スパスチンをコードしているＳＰＧ４遺伝子の同定および特性決定、そのｃＤＮＡのクローニングおよび特性決定、およびまた対応するポリペプチドに関する。本発明はまたベクター、形質転換細胞、およびトランスジェニック動物、また診断方法ならびにキットおよび本発明のポリペプチドと直接的または間接的に相互作用し得る化学的または生化学的化合物を選択する方法に関する。
【０００２】
背景技術
優性遺伝性痙性対麻痺（ＨＳＰ）は下肢の両側相称かつ進行性痙直を特徴とする中枢神経系の変性疾患である。それら自体は臨床的には歩行困難により現れ、両肢の全体麻痺に進行する可能性がある。この種の疾患の生理病理学はこれまでのところ割合に記載されていない。しかしながら、病理解剖学的データにより発病が脊髄の随意運動性を担う錐体索に限定されると推定できる(Reid, 1997)。ＨＳＰには様々な臨床型および遺伝子型のものがある。下肢の部分痙直に相当するいわゆる「単純」ＨＳＰは、その下肢痙直が神経学的または非神経学的タイプの他の臨床徴候に関連している「複合」ＨＳＰとは臨床上区別される(Bruyn et al., 1991)。遺伝学的見地から、ＨＳＰは常染色体性優性（ＡＤ−ＨＳＰ）、常染色体性劣性（ＡＲ−ＨＳＰ）またはＸ染色体性（Ｘ−ＨＳＰ）様式により遺伝し得る。常染色体性優性様式により最も一般的に遺伝する「単純」型ＨＳＰが最もよく起こる(ＨＳＰの約８０％)(Reid, 1997)。ＨＳＰの発病率は、疫学的研究が少なく、さらに臨床学的変化が多くあることから統計的に予測することは難しいが、デンマークでは０．９：１０００００、スペインのある地域では３〜９．６：１０００００(Polo et al., 1991)またはノルウェイでは１４：１０００００(Skre, 1974)（フランスでは約３：１０００００）と様々である。
【０００３】
ＨＳＰは、異なる家系間だけでなく、同じ家系の異なる患者間でも観察されるこの多くの臨床学的変化に加え、重要な遺伝子異質性によっても特徴づけられる。ＡＤ−ＨＳＰの場合、これまでに４つの遺伝子座が第１４染色体（遺伝子座ＳＰＧ３）(Hazan et al., 1993)、第２染色体（遺伝子座ＳＰＧ４）(Hazan et al., 1994; Hentali et al., 1994)、第１５染色体（遺伝子座ＳＰＧ８）(Fink et al., 1995)および第８染色体（遺伝子座ＳＰＧ８）(Hedera et al., 1999)上で同定されている。ＡＤ−ＨＳＰを示す多くの家系の調査では、第２染色体にある遺伝子がこの型の疾患の主要な遺伝子座であり、調査した家系の４０〜５０％に見られることがわかった(The Hereditary Spastic Paraplegia Working Group, 1996; Durr et al., 1996)。いくつかの遺伝子座ＳＰＧ４関連ＨＳＰ家系では先行的徴候が見られた：この徴候はデンマーク人の６家系においてＲＥＤ（Rapid Expansion Detection）手法を用いて示された（ＣＡＧ）ｎ反復配列の延長に関係していた(Nielsen et al., 1997)。しかしながら、調べたいずれの家系においてもこの方法またはＹＡＣ（酵母人工染色体）またはＢＡＣ（細菌人工染色体）クローン(Hazan et al., Genomics, 60 (3), 309-19, 1999)からなる物理的マップにおける（ＣＡＧ）ｎタイプの配列の系統調査によりこの延長が確認される可能性はなかった。
【０００４】
これまでのところ、２つの形態のＸ−ＨＳＰおよび１つの形態のＡＲ−ＨＳＰの原因である３つの遺伝子が同定されている。ニューロン特異的細胞付着分子、Ｌ１−ＣＡＭ（Ｌ１細胞付着分子）をコードする、Ｘｑ２８番（遺伝子座ＳＰＧ１）にある遺伝子の変異はその痙直が知的障害に関連している複合型ＨＳＰを引き起こし、ミエリン層の構成性分子をコードする、Ｘｑ２１番（遺伝子座ＳＰＧ２）にあるＰＬＰ（プロテオリピドタンパク質）遺伝子の変異は単純および複合型Ｘ−ＨＳＰを引き起こす(Saugier-Veber. P. et al., 1994)。さらに最近、対麻痺をコードする、１６ｑ２４．３番（座ＳＰＧ７）にある遺伝子、ＡＡＡ（様々な細胞活性に関連するＡＴＰアーゼ）タンパク質系(Confalonien et al., 1995)のミトコンドリアＡＴＰアーゼの変異は複合および単純型ＡＲ−ＨＳＰに関連していた(Casari et al., 1998)。
【０００５】
従って現在、最も一般的な形態のＡＤ−ＨＳＰの原因である遺伝子を同定し、特性決定する必要性が大いに残っている。この遺伝子の同定により、特に、関係する家系の出生前スクリーニング用試験の将来性のほか、脊髄の神経管束に特異的なこれらの変性をもたらす分子機構のいくつかがよりよく理解され、また患者の治療処置に関して基本的応答を得ることが可能になりさえするであろう。
正確にはこれが本発明の目的である。
【発明の概要】
【０００６】
遺伝子座ＳＰＧ４関連ＨＳＰ家系において組換え結果を調査することにより、Ｄ２Ｓ３５２およびＤ２Ｓ２３４７遺伝子マーカー間の位置範囲を決定した後、本発明者らは、約１．５Ｍｂと見積もった物理的距離にわたるＢＡＣのコンティグを確立し、ＳＰＧ４範囲を配列決定することに基づく位置クローニング戦略に取り組み、候補領域にある総ての遺伝子を完全に同定した。２つのＢＡＣ、Ｄ（ｂ３３６Ｐ１４）およびＧ（Ｂ７６３Ｎ４）の配列の解析により、約１００ｋｂの距離にわたって延びる１７のエキソンからなり、かつＡＡＡ系のタンパク質をコードする遺伝子と相同性を示す遺伝子の存在が明らかになった。この遺伝子の配列をＡＤ−ＨＳＰ家系の健康な人と影響を受けた人との間で比較することで患者の様々な突然変異を証明することができる。
【０００７】
従って本発明の目的は最も一般的な型のＡＤ−ＨＳＰの原因である、ＡＡＡ系の新規細胞核要素をコードするＳＰＧ４（またはＳＰＡＳＴ）遺伝子の同定および特性決定である。
【０００８】
第一の態様において、本発明の目的は、
ヒトＳＰＧ４遺伝子のゲノム配列である配列番号１の配列；
配列番号１の配列の核酸の相同体または変異体である核酸配列；
それに対して相補的な配列；および
その対応するＲＮＡの配列
からなる群から選択される配列の、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド、好ましくは２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００または２００個の連続するヌクレオチドを含んでなることを特徴とする、精製または単離されたＳＰＧ４遺伝子の核酸である。
【発明の具体的説明】
【０００９】
本発明はもちろんＤＮＡおよびＲＮＡ配列の両方とそれらとハイブリダイズする配列、ならびにそれに対応する二本鎖ＤＮＡに関する。
【００１０】
「核酸」、「核酸配列」または「核酸の配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、および「ヌクレオチド配列」とは、本明細書において等しく使用されており、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡならびにそのＤＮＡの転写産物、および／またはＲＮＡ断片、核酸の断片または領域が定義できる、改変されていても改変されていなくてもよい、正確に連続したヌクレオチドをさす、異常なヌクレオチドを含んでも含まなくてもよいその単離された天然、または合成断片をいうものとする。「異常なヌクレオチドを含んでも含まなくてもよい単離された天然、または合成ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ断片」とは、核酸の断片、セグメントまたは領域が定義できる、改変されていても改変されていなくてもよい、正確に連続したヌクレオチドを意味するものである。
【００１１】
本発明はそれらの天然の染色体環境、すなわち自然状態におけるゲノムヌクレオチド配列に関するものでないものと理解されるべきである。それは単離および／または精製された、すなわちそれらの環境が少なくとも部分的に改変されており、それらが直接的または間接的に、例えばコピーにより分離された配列を含んでいる。
【００１２】
「相同な核酸配列」とは、参照核酸配列に関して、特に欠失、末端切断、延長、キメラ融合および／または変異、特に点変異などのある改変を有し、かつ整列後にその核酸配列が参照核酸配列と少なくとも８０％、好ましくは９０％または９５％同一性を示す、配列をいうものとする。
【００１３】
本発明の目的のため、２つの核酸またはアミノ酸配列間の「同一性％」とは、最良の整列後に得られた、比較する２つの配列間で同一であるヌクレオチドのまたはアミノ酸残基の割合％をいい、この割合％は単に統計的なものであり、２つの配列間の差はランダムにかつその長さ全体にわたって分布している。２つの核酸またはアミノ酸配列間の配列比較は通常それらを最良に整列した後にこれらの配列を比較することにより行われる。この比較はセグメントによりまたは「比較のウィンドウ」により行われ、配列の類似する局所領域を同定して比較する。手動にの他、Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482]の局所相同アルゴリズムにより、Neddleman and Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443]の局所相同アルゴリズムにより、Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444]の類似性調査方法により、およびこれらのアルゴリズムを用いるコンピュータプログラム（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr. Madison, WIのGAP、BESTFIT、FASTAおよびＴＦASTA、またはBLAST NまたはBLAST P比較プログラムを用いて）により、比較する配列の最良の整列を行うことができる。
【００１４】
２つの核酸またはアミノ酸配列間の同一性％は、これら２つの最良に整列された配列を、比較する核酸またはアミノ酸配列の領域がこれら２つの配列間の最良の整列のために参照核酸配列に対して付加または欠失を含んでなってもよい、比較のウィンドウにより比較することで求められる。同一性％は２つの配列間でヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同一である同一位置数を求めて算出する。ここでは比較のウィンドウにおけるこの同一位置数を全位置数で割り、得られた結果に１００を掛けてこれら２つの配列間の同一性％を得る。
【００１５】
例えば、サイトhttp://www.ncb.nim.nih.gov/gorf/bj2.htmlで入手可能なＢＬＡＳＴプログラム「ＢＬＡＳＴ２配列」(Tatusova et al., "Blast2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol. Lett. 174: 247-260)を用いてもよい。ここで用いるパラメーターは誤りにより得られるものであり（特に、パラメーター「オープンギャップペナルティー」；５および「エクステンションギャップペナルティー」；２：選択されるマトリックスが、例えばプログラムにより推奨される「ＢＬＯＳＵＭ６２」マトリックス）、比較する２つの配列間の同一性％はプログラムにより直接算出される。
【００１６】
好ましくは、その相補配列が本発明の配列の１つと特異的にハイブリダイズし得る配列が含まれる。好ましくは特異的または高いストリンジェントハイブリダイゼーション条件とは、それらが２つの配列の一方とそのもう一方に相補的な配列間の整列後の同一性が少なくとも８０％、好ましくは９０％または９５％であるよう保証するものである。
【００１７】
高いストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションとは、温度およびイオン強度条件によって２つの相補ＤＮＡ断片間のハイブリダイゼーションを継続し得るようにそれらを選択することを意味する。例えば、上述のポリヌクレオチド断片を定義するためにはハイブリダイゼーション工程の高いストリンジェント条件が以下のように有利である。
【００１８】
ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションを２工程で行う：（１）５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム溶液に相当する）、５０％ホルムアミド、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０×デンハート、５％硫酸デキストランおよび１％サケ精子ＤＮＡを含有するリン酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）中、４２℃で３時間のプレハイブリダイゼーション；（２）プローブの大きさによる温度で（すなわちプローブの大きさ＞１００個ヌクレオチドの場合、４２℃）２０時間の実際のハイブリダイゼーション、次いで２×ＳＳＣ＋２％ＳＤＳにより２０℃で２０分間、２回の洗浄および０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳにより２０℃で２０分間、１回の洗浄。最終洗浄は０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳによりプローブの大きさ＞１００個ヌクレオチドの場合、６０℃で３０分間行う。規定の大きさのポリヌクレオチドの高いストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、Sambrook et al., 1989の教示に従い、当業者によって、より大きなまたはより小さなオリゴヌクレオチド用にも調整される。
【００１９】
参照核酸配列の「変異体である核酸配列」または「変異体である核酸」とは、対立遺伝子変異体、すなわち参照核酸配列の各々の変異に対応する核酸配列群をいうものである。これらの天然の変異配列は哺乳類、特にヒトに存在する多形性、特に病状を引き起こしおよび／または進行させ得る多形性に対応している。
【００２０】
本発明の配列は正常配列に関するものであるが、またそれらは正常配列に関して少なくとも１つの点突然変異、および好ましくは多くて１０％の突然変異を含む範囲で変異させた配列に関する。
【００２１】
特に変異核酸配列は配列番号１の配列のヒトＳＰＧ４遺伝子のゲノム配列の多形配列の、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド、好ましくは２０、２５、３０、５０、１００または２００個の連続するヌクレオチドのいずれもの配列および配列番号１の配列に関して、特にアミノ酸残基の末端切断、欠失、置換および／または付加に相当する少なくとも１つの突然変異を有する核酸配列を含んでなる。この場合、ここでは少なくとも１つの突然変異を有する変異核酸配列はＳＰＧ４遺伝子と関連しているＡＤ−ＨＳＰ型の病状と関連している。
【００２２】
好ましくは、本発明はその突然変異が正常配列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列の改変を引き起こす変異核酸配列に関する。
【００２３】
「変異核酸配列」とはまた、配列番号１のゲノム核酸配列のスプライス部位の突然変異の結果として生じるいずれのＲＮＡまたはｃＤＮＡをも意味するものである。
【００２４】
好ましくは、本発明は、
ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号７２、配列番号１０６の配列、または配列番号１、配列番号２、配列番号７２もしくは配列番号１０６の配列の少なくとも１５個、好ましくは２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００もしくは２００個の連続するヌクレオチドの配列；
ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号７２または配列番号１０６の配列の相同体または変異体である核酸配列；および
ｃ）ａ）およびｂ）で定義される配列に対応する相補配列またはＲＮＡ配列
（好ましくは、受託番号ＡＢ０２９００６としてＧｅｎＢａｎｋデータベースで確認される核酸を除く）
からなる群から選択される配列を含んでなる、精製または単離されたＳＰＧ４遺伝子の核酸に関する。
【００２５】
その配列が受入番号ＡＢ０２９００６としてＧｅｎＢａｎｋデータバンクで開示されている核酸はKazusa DNA Research Institute in Japan(Kikuno et al., DNA Research, 6, 197-205, 1999)により同定されたヒト脳ｍＲＮＡライブラリーの１００のｃＤＮＡのうちの１つの配列に対応している。
【００２６】
好ましくは、本発明は、配列番号２の配列の、それに対して相補的な配列の、またはその対応するＲＮＡの配列の、ｎｔ７１４〜８０９（末端を含む）断片の少なくとも１５個の連続するヌクレオチド、好ましくは２０、２５、３０、５０または７５個の連続するヌクレオチドの配列を少なくとも１つ含んでなる、本発明の精製または単離された核酸に関する。
【００２７】
好ましくは、本発明は次の群：
配列番号１の配列；
ヒト・スパスチンをコードしているｃＤＮＡ配列である、配列番号２の配列；
図５に示されたネズミ・スパスチンをコードしている不完全ｃＤＮＡ配列を示す、「マウス」系、配列番号７２、およびその完全配列を示す配列番号１０６の配列；
配列番号１、配列番号２、配列番号７２または配列番号１０６の配列の相同体または変異体である核酸配列；
それに対して相補的な配列；および
その対応するＲＮＡの配列
から選択される配列を含んでなる、精製または単離された本発明の核酸に関する。
【００２８】
好ましくは、本発明は、ヒトの本来の多形性に対応する少なくとも１つの突然変異を含んでなる、本発明の精製または単離された核酸に関するものであり、特にその位置および性質は表５で確認できる。
【００２９】
本発明の核酸配列を含んでなるプローブまたはプライマーもまた本発明の一部をなす。
【００３０】
従って本発明は本発明のヌクレオチド配列から誘導できるものであり、さらに特にＰＣＲ法などの増幅方法、または関連する方法を用いて本発明のヌクレオチド配列、特に変異配列を証明することのできるプライマーセットに関する。
【００３１】
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列から、特にそれらとハイブリダイズし得る配列から推定でき、さらにそのヌクレオチド配列を証明できる、特に正常配列と変異配列とを識別することのできるプローブセットに関する。
【００３２】
本発明は特に、配列番号４〜配列番号７１の配列から選択される配列を有するプローブまたはプライマーに関する。
【００３３】
本発明はまた、核酸配列を検出、同定、アッセイまたは増幅するためのプローブまたはプライマーとしての本発明の核酸配列の使用に関する。
【００３４】
本発明によれば、核酸配列を検出、同定、アッセイまたは増幅するプロセスにおいてプローブまたはプライマーとして使用できるポリヌクレオチドの最小サイズは１５塩基、好ましくは２０塩基、またはより好ましくは２５〜３０塩基である。
【００３５】
本発明のプローブおよびプライマーセットは、当業者に十分公知な方法を用いて放射性または非放射性化合物で直接的または間接的に標識して検出および／または定量シグナルを得ればよい。
【００３６】
本発明の非標識ポリヌクレオチド配列はプローブまたはプライマーとして直接使用できる。
【００３７】
一般に、多くの用途に使用できる配列を得るためには配列を標識する。本発明のプライマーまたはプローブの標識は放射性元素または非放射性分子を用いて行われる。
【００３８】
使用される放射性同位元素としては３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、３Ｈまたは１２５Ｉが挙げられる。非放射性物質としてはビオチン、アビジンまたはストレプトアビジンなどのリガンド、ジオキシゲニン、ハプテン、色素および放射発光性、化学発光性、生物発光性、蛍光性または燐光性薬剤などの発光剤から選択される。
【００３９】
従って本発明のポリヌクレオチドは特に、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法(Erlich. 1989; Innis et al., 1990、およびRolfs et al., 1991)を用いるプロセスにおいてプライマーおよび／またはプローブとして使用できる。この手法では増幅しなければならない断片を組み立てるオリゴヌクレオチドプライマー対を選択する必要がある。例えば、米国特許第４，６８３，２０２号に記載される手法を挙げられる。例えばアガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動後、またはゲル濾過もしくはイオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法の後に増幅された断片を同定し、次いで配列決定することができる。増幅の特異性は、プライマーとして本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列、およびマトリックスとしてこれらの配列または誘導された増幅産物を含有するプラスミドを用いて制御できる。増幅されたヌクレオチド断片をハイブリダイゼーション反応において試薬として用い、生物学的サンプルにおいてその増幅されたヌクレオチド断片のものと相補的な配列を有する標的核酸の存在を証明することができる。
【００４０】
本発明はまた本発明のプライマーを用いた増幅により得ることのできる核酸にも向けられる。
【００４１】
ＰＣＲ（ＰＣＲ様）の代わりとして標的核酸を増幅する他の手法を、本発明のヌクレオチド配列を有するプライマー対を用いて使用できることが有利である。「ＰＣＲ様」とは、核酸配列の直接的または間接的再生産を用いる、またはその標識系が増幅されているあらゆる方法をいうものとする。これらの手法はもちろん公知であり、一般にそれらはポリメラーゼによるＤＮＡの増幅を含んでいる：元のサンプルがＲＮＡである場合、事前に逆転写を行うことが望ましい。現在、この増幅が可能な、例えばＳＤＡ（鎖置換増幅）法(Walker et al., 1992)、Kwoh et al. in 1989により記載されたＴＡＳ（転写に基づく増幅系）法、Guatelli et al. in 1990により記載された３ＳＲ（自立配列複製）法、Kievitis et al. in 1991により記載されたＮＡＳＢＡ（核酸配列に基づく増幅）法、ＴＭＡ（転写により媒介される増幅）法、Landegren et al. in 1988により記載され、Barany et al. in 1991により改変された、易熱性リガーゼを用いるＬＣＲ（リガーゼ鎖反応）手法、Segev in 1992により記載されたＲＣＲ（修復連鎖反応）法、Duck et al. in 1990により記載されたＣＰＲ（サイクリングプローブ反応）法、およびMiele et al. in 1983により記載され、特にChu et al. in 1986ならびにLizardi et al. in 1988、後にBurg et al.、さらにまたStone et al. in 1996 により改変されたＱ−β−レプリカーゼ増幅法などの極めて多くの方法がある。
【００４２】
検出される標的ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである場合、本発明のプライマーを用いる増幅反応を行う前に、または本発明のプローブを用いる検出プロセスを行う前に逆転写型酵素を用いて生物学的サンプルに含まれるｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを得ることが有利である。次いで得られたｃＤＮＡは本発明の増幅または検出プロセスにおいて用いられるプライマーまたはプローブの標的として役立つ。
【００４３】
プローブハイブリダイゼーション法は種々の方法により行うことができる(Matthews et al., 1988)。最も一般的な方法は、種々の組織の細胞から、または培養中の細胞から抽出した核酸を支持体（ニトロセルロース、ナイロンまたはポリスチレン）に固定化し、さらに所定の条件下で固定化した標的核酸をプローブとともにインキュベートするものである。ハイブリダイゼーション後に過剰なプローブを排除し、形成されたハイブリッド分子を適当な方法（プローブと結合した放射能、蛍光性または酵素活性の測定）を用いて検出する。
【００４４】
本発明の核酸プローブのもう１つの具体例によれば、後者を捕捉プローブとして用いることができる。本件では「捕捉プローブ」とよばれるプローブを支持体に固定化し、これを用いて調べる生物学的サンプルから得られた標的核酸を特異的ハイブリダイゼーションにより捕捉する。次いで容易に検出可能なエレメントで標識した「検出プローブ」とよばれる第２のプローブを用いて標的核酸を検出する。
【００４５】
表３で確認される本発明のスプライス受容部位または供与部位配列（配列番号７４〜配列番号１０５）もまた本発明の一部をなす。
【００４６】
もう１つの態様では、本発明は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングする、またはスパスチンをコードしている単離されたゲノムまたはｃＤＮＡをクローニングする方法であって、本発明の核酸配列を用いる方法を含んでなる。
【００４７】
これらの方法のうち、特に、
本発明の核酸配列を用いるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングおよび単離されたｃＤＮＡのクローニング(Sambrook et al., 1989; Suggs et al., 1981; Woo et al., 1979)；
ゲノムライブラリー、例えばＢＡＣのスクリーニング(Chumakov et al., 1992;Chumakov et al., 1995)、および所望によりスパスチンをコードしているＳＰＧ４遺伝子の単離および染色体の限局化、さらに完全配列決定を可能にする本発明の配列を用いるＦＩＳＨによる遺伝子解析(Cherif et al., 1990)が挙げられる。
【００４８】
特に本発明によれば、これらの方法は他の哺乳類、特にマウスのＳＰＧ４遺伝子のゲノム配列またはｃＤＮＡを同定して得るために用いてよい。
【００４９】
これらのスクリーニングおよび／またはクローニング方法は特に、本発明の核酸とゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーにある核酸とのハイブリダイゼーション工程を含んでなる。
【００５０】
本発明はまた、配列番号１の配列のＳＰＧ４遺伝子の発現を促進および／または調節する核酸配列を同定する方法であって、本発明の核酸を用いる方法を含んでなる。
【００５１】
当業者に利用できるコンピュータツールにより、本発明のゲノム核酸配列を用い、遺伝子発現を制御するのに必要かつ十分なプロモーター調節ボックスを容易に同定することが可能となる。特にＴＡＴＡ、ＣＣＡＡＴおよびＧＣボックス、またシス位で本発明の遺伝子発現を制御する刺激性調節配列（「エンハンサー」）または阻害性調節配列（「サイレンサー」）が挙げられ、これらの調節配列の中でもＩＲＥ、ＭＲＥおよびＣＲＥが挙げられる。
【００５２】
本発明はまた、ヒトＳＰＧ４にある突然変異、特に常染色体性優性遺伝性痙性対麻痺の原因である突然変異を同定する方法であって、本発明の核酸配列を用いる方法に関する。
【００５３】
これらの突然変異を同定するこれらの方法は特に以下の工程を含んでなる：（ｉ）解析される生物学的サンプル由来のＤＮＡの単離、または生物学的サンプルのｍＲＮＡからのｃＤＮＡの作製；（ii）本発明のプライマーを用いる、突然変異を含むと考えられる標的ＤＮＡの特異的増幅；（iii）増幅産物、特に増幅産物の大きさおよび／または配列の、参照配列に対する解析。
【００５４】
「本発明の突然変異を同定する方法」とはまた、それに対して突然変異が同定された核酸を得ることが可能な方法をいうものとする。
【００５５】
対応するタンパク質の発現を改変し得る突然変異を有する本発明のＳＰＧ４遺伝子のプロモーターおよび／または調節配列も本発明の一部をなす。
【００５６】
本発明のこれまでの方法の１つを用いて得られることを特徴とする核酸、または高いストリンジェント条件（２つの配列の一方と、もう一方に相補的な配列との間の相同性が少なくとも８０％）下で該核酸とハイブリダイズし得る核酸、特に変異体または相同体、特に配列番号１の配列のＳＰＧ４遺伝子の対立遺伝子変異体の、または配列番号２の配列のそのｃＤＮＡの核酸配列、またマウスなどの他の哺乳類の相同遺伝子のゲノム配列も本発明の一部をなす。
【００５７】
本明細書において「Ｓｐｇ４」とはヒトＳＰＧ４遺伝子に相同なマウス遺伝子をいうものとする。
【００５８】
もちろんゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡをスクリーニングするための本発明の核酸配列の、プローブまたはプライマーとしての使用も本発明の主題の一部をなす。
【００５９】
もう１つの態様では、本発明は、本発明の核酸によってコードされている精製または単離されたポリペプチドであって、好ましくはその配列が受託番号ＡＢ０２９００６としてＧｅｎＢａｎｋデータベースで確認される５８４アミノ酸ペプチドを除くものを含んでなる。
【００６０】
本明細書において「ポリペプチド」とは、同等にタンパク質またはペプチドをいうのに使用される。
【００６１】
好ましくは、本発明は、以下の群から選択されるアミノ酸を含んでなる本発明のポリペプチドに関する：
配列番号３の配列、ヒトＳＰＧ４遺伝子のｃＤＮＡの配列番号２の配列によってコードされているヒト・スパスチンに対応；
配列番号７３の配列、マウスＳｐｇ４遺伝子の不完全なｃＤＮＡの配列番号７２の配列によってコードされているネズミ・スパスチン断片に対応（なおこの配列７３は図４Ａの「ＳＰＡＳＴ＿マウス」の欄に示されている；
配列番号１０７の配列、マウスＳｐｇ４遺伝子の完全ｃＤＮＡの配列番号１０６の配列によってコードされているネズミ・スパスチンに対応；
配列番号３、配列番号７３または配列番号１０７の配列のポリペプチドの相同体および変異体であるポリペプチド配列；および
少なくとも８、１０、１５、３０または５０個の連続するアミノ酸の、その断片配列。
【００６２】
また好ましくは、本発明の主題は、
ａ）配列番号３、配列番号７３、配列番号１０７の配列、またはこれらの配列の１つの少なくとも１０個の連続するアミノ酸の配列；および
ｂ）配列番号３、配列番号７３または配列番号１０７の配列の相同体または変異体である配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、本発明のポリペプチドである。
【００６３】
また好ましくは、本発明の主題は、配列番号３の配列のａａ１９７〜２２８（末端を含む）断片の少なくとも８個、好ましくは少なくとも１０、１５、２０または３０個の連続するアミノ酸の配列を含んでなる、本発明のポリペプチドである。
【００６４】
また好ましくは、本発明の主題は、以下の群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる本発明のポリペプチドである：
配列番号３、配列番号７３および配列番号１０７の配列（なお、この配列はヒトにおける本来の多形性に対応する少なくとも１つの突然変異、特にその性質と位置が以下の表５で確認されるもの、または本発明に従いＳＰＧ４遺伝子の突然変異を同定する方法を用いて同定され得るものを有する）；および
少なくとも８、１０、１５、３０または５０個の連続するアミノ酸の、その断片配列。
【００６５】
本発明は天然型のポリペプチドに関するものではない、すなわちそれらの環境中では得られないと理解されるべきである。特に本発明は天然源から精製によって得られるか、あるいは遺伝子組換えによるか、または化学合成によって得られ、従って非天然アミノ酸を含むペプチドに関する。本発明のヌクレオチド配列の１つを用いて行うことができる組換えペプチドの生産は、高い純度の所望のポリペプチドを得ることができるので特に有利である。
【００６６】
「同種ポリペプチド」とは特に１以上の欠失もしくは末端切断、延長、キメラ融合および／または１以上の置換といった参照ポリペプチドに対してある改変を有するポリペプチドをいうものとし、そのアミノ酸配列は整列後に参照アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％または９５％の同一性を示す。
【００６７】
「変異型ポリペプチド」（またはタンパク質変異体）とは、上記の変異型核酸配列によってコードされているポリペプチドのセットをいうものとする。
【００６８】
特に変異型ポリペプチドは配列番号１の配列のＳＰＧ４遺伝子の変異型ゲノム配列によってコードされているいずれかのポリペプチドを含み、そのアミノ酸配列は配列番号３の配列に対して特に末端切断、欠失、置換および／またはアミノ酸残基の付加に対応する少なくとも１つの突然変異を有する。この場合、少なくとも１つの突然変異を有する変異型ポリペプチドはＡＤ−ＨＳＰ型の病状に関連している。
【００６９】
「変異型ポリペプチド」とはまた、配列番号１のゲノム核酸配列におけるスプライス部位の突然変異から生じたいずれかのポリペプチドをいうものとする。
【００７０】
本発明はまた、本発明の核酸配列を含むクローニングおよび／または発現ベクターも含む。
【００７１】
宿主細胞において該配列の発現および／もしくは分泌させるエレメント、または本細胞接近配列を含むことを特徴とする発明のベクターもまた本発明の一部をなす。
【００７２】
本発明のプロモーターおよび／または調節配列を含むことを特徴とするベクターもまた本発明の一部をなす。
【００７３】
該ベクターは好ましくはプロモーター、末端切断開始および終結シグナル、また転写調節に好適な領域を含む。それらは細胞内で安定して維持でき、かつ、所望により翻訳タンパク質の分泌を具現化する特定のシグナルを持つべきである。
【００７４】
これら種々の制御シグナルは使用される宿主細胞に対して選択される。これを達成するため、本発明の核酸配列は選択された宿主内で自律的に複製するベクター、または選択された宿主に組み込まれるベクターに挿入することができる。
【００７５】
自律的に複製する系のうち、宿主細胞に対してプラスミドまたはウイルス型の系が用いるのが好ましく、可能なウイルスベクターとしては特にアデノウイルス(Perricaudet et al., 1992)、レトロウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルスまたはヘルペスウイルス(Epstein et al., 1992)がある。当業者ならばこれらの系の各々に対して使用可能な技術が分かる。
【００７６】
宿主細胞の染色体への配列の組み込みが望まれる場合には、例えばプラスミドまたはウイルス型の系を使用すればよく、かかるウイルスとしては例えばレトロウイルス(Temin, 1986)またはＡＡＶ(Carter, 1993)がある。
【００７７】
非ウイルスベクターの中でも、付随ＶＩＣＡＬ、酵母での発現のための酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ネズミ細胞での発現のためのマウス人工染色体（ＭＡＣ）、好ましくはヒト細胞での発現のためのヒト人工染色体（ＨＡＣ）によって開発された技術に従う裸のＤＮＡまたは裸のＲＮＡ裸などの裸のポリヌクレオチドが好ましい。
【００７８】
かかるベクターは当業者に一般に用いられている方法に従い製造され、それらから得られたクローンは、リポフェクション、エレクトロポレーションまたは熱ショックのような標準的な方法を用いて好適な宿主に導入することができる。
【００７９】
本発明はまた宿主細胞、特に本発明のベクターで形質転換された原核および真核細胞、また本発明の形質転換細胞の１つを含んでなる、ヒトを除くトランスジェニック動物を含む。
【００８０】
これらの目的に使用できる細胞の中では、もちろん細菌細胞(Oline and Lee, 1993)が挙げられるが、酵母細胞(Buckholz, 1993)、ならびに動物細胞、特に哺乳類細胞の培養物(Edwards and Aruffo, 1993)および特にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、また例えばバキュウロウイルスを手段とする方法の使用が可能となる昆虫細胞(Luckow, 1993)も挙げられる。本発明のタンパク質を発現するのに好ましい細胞宿主はＣＨＯ細胞である。
【００８１】
本発明の哺乳類の中でも、本発明のポリペプチドを発現するマウス、ラットまたはウサギなどの動物が好ましい。
【００８２】
本発明の哺乳類の中でも、ＳＰＧ４遺伝子の２つの対立遺伝子のうち少なくとも一方の配列がヒトの本来の多形性に対応する少なくとも１つの突然変異を含むことを特徴とする形質転換細胞を含んでなるもの、特にその性質および位置が以下の表５で確認されるもの、または本発明に従うＳＰＧ４遺伝子の突然変異を同定するための方法を用いて同定され得るものもまた好ましい。
【００８３】
本発明の哺乳類の中でも、本発明のスパスチンをコードする遺伝子が機能的でないか、またはノックアウトされていることを特徴とする、マウス、ラットまたはウサギなどの動物も好ましい。
【００８４】
本明細書でさらに特に有利な動物モデルには、特に、
ＳＰＧ４遺伝子の２つの対立遺伝子配列のうち少なくとも一方に、その位置および性質が表５で確認されるか、または本発明に従う方法を用いて同定される少なくとも１つの突然変異を有するトランスジェニック動物（これらのトランスジェニック動物は例えば胚幹細胞における相同組換え、これらの幹細胞の胚への導入、生殖系細胞に作用するキメラの選択および該キメラの増殖によって得られる）；
本発明の突然変異の１つが導入され得るＳＰＧ４遺伝子を過剰発現するトランスジェニック動物（好ましくはマウス）（このマウスは例えば本来、または組織種選択的に偏在する強いプロモーターの制御下での遺伝子コピーの徒論巣Ｆｅ句ションにより、あるいはウイルス転写後に得られる）；
ＬＯＸＰ／ＣＲＥレコンビナーゼ系(Rohlmann et al., 1996)またはこの遺伝子の発現を不活性化する他のいずれかの系を用いて不活性化することによる本発明のＳＰＧ４遺伝子の欠失を作り出したトランスジェニック動物（好ましくはマウス）
がある。
【００８５】
本発明の細胞および哺乳類は以下に記載されるように本発明のポリペプチドを生産する方法に使用できるし、また解析およびＤＮＡ（ゲノムまたはｃＤＮＡ）ライブラリースクリーニングのためモデルとしても使用できる。
【００８６】
このように上記の形質転換細胞または哺乳類は本発明のポリペプチドと、本発明のポリペプチドの活性に直接的または間接的に関わる化学またはタンパク質化合物との間の相互作用を調べるためにモデルとして使用することができ、これは働きを持つようになる種々のメカニズムや相互作用を調べるためともなる。
【００８７】
それらは特に本発明のポリペプチド、特に本発明の配列番号３の配列のヒト・スパスチンまたはその変異体と、補因子として、あるいは阻害剤、特に競合阻害剤として（すなわちこれらは本発明のポリペプチドの活性に対してアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有する）相互作用する産物を選択するのに使用できる。好ましくは該形質転換細胞またはトランスジェニック動物は特に上記のＳＰＧ４遺伝子と関連している病状に対抗することができる産物の選択を可能にするモデルとして使用される。
【００８８】
本発明はまた、本発明のポリペプチドと直接的または間接的に相互作用し得る、かつ／またはこれらのポリペプチドの発現もしくは活性を調整し得る化学または生化学化合物をスクリーニングするための、本発明の細胞、哺乳類またはポリペプチドの使用に関する。
【００８９】
本発明はまた、組換えポリペプチドを合成するための、本発明の核酸配列の使用に関する。
【００９０】
組換え型で本発明のポリペプチドを生産する方法はそれ自体本発明に含まれ、形質転換細胞、特に本発明の細胞または哺乳類が本発明の核酸配列によりコードされている組換えポリペプチドを発現させる条件下で培養して組換えポリペプチドを回収することを特徴とする。
【００９１】
前記の生産方法を用いて得ることができる組換えポリペプチドもまた本発明の一部をなす。
【００９２】
上記のようにして得られた組換えポリペプチドはグリコシル化形態および非グリコシル化形態のいずれであってもよく、天然の三次構造を持っていても持っていなくともよい。
【００９３】
これらのポリペプチドは当業者に公知の組換えポリペプチド生産法に従って、上記に定義された核酸配列に基づいて生産できる。この場合、使用される核酸配列は細胞宿主内でその発現が可能となるシグナルの制御下に置かれる。
【００９４】
組換えポリペプチドの生産に有効な系は本発明のベクターおよび宿主細胞を必要とする。
【００９５】
これらの細胞は上記で定義されたベクターに挿入されたヌクレオチド配列を宿主細胞に導入し、次いでトランスフェクトされたヌクレオチド配列の複製および／または発現させる条件下で該細胞を培養することによって得ることができる。
【００９６】
使用される組換えポリペプチド精製法は当業者には公知である。組換えポリペプチドは細微溶解物および抽出物から、および／または培地上清から、分画、クロマトグラフィー法、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いる免疫親和性技術などといった個々に使用される、または併用される方法により精製することができる。
【００９７】
本発明のポリペプチドは、化学合成により（これは多くの公知のペプチド合成法の１つ、例えば固相を手段とする技術、もしくは部分的固相技術を用いる技術を用いる）、あるいは断片の縮合または通常の溶液合成によって得ることができる。
【００９８】
固相合成法は当業者に十分公知である。特にStewart et al.(1984)およびBodansky (1984)を参照。
【００９９】
化学合成によって得られ、かつ、対応する非天然アミノ酸を含み得るポリペプチドもまた本発明に含まれる。
【０１００】
本発明のポリペプチドを特異的に認識し得ることを特徴とするモノクローナルもしくはポリクローナル抗体またはその断片、キメラ抗体、あるいは免疫複合体も本発明の一部をなす。
【０１０１】
特に通常の手順に従い遺伝子組換えまたはペプチド合成によって作製された特異的ポリクローナル抗体は本発明のポリペプチドに対して免疫化された動物の血清から得ることができる。
【０１０２】
本発明のあるポリペプチド、その変異体または免疫フラグメントを特異的に認識する抗体が有利であることが特に記載される。
【０１０３】
特異的モノクローナル抗体はKohler and Milstein, 1975によって記載された通常のハイブリドーマ培養法に従って得ることができる。
【０１０４】
本発明の抗体は例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、またはＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）２フラグメントである。それらはまた検出可能かつ／または定量可能なシグナルを得るために標識抗体または免疫複合体の形態であってもよい。
【０１０５】
本発明はまた、本発明のポリペプチドを検出および／または精製する方法であって、本発明の抗体を使用することを特徴とする方法に関する。
【０１０６】
本発明はまた、本発明の方法を用いて得られる精製ポリペプチドを含んでなる。
【０１０７】
さらにポリペプチドを精製するためのそれらの使用の他、本発明の抗体、特にモノクローナル抗体はまた生物学的サンプルにおいてこれらのポリペプチドを検出するのに使用できる。
【０１０８】
このようにそれらは例えば免疫蛍光もしくは金標識により、または酵素的免疫複合体を用い、特異的組織切片において本発明のポリペプチド、特に配列番号３の配列のポリペプチドまたはその変異体の配列を免疫細胞化学的または免疫組織化学的に解析する手段からなる。
【０１０９】
それらは特に、生物学的サンプルまたは組織におけるこれらのポリペプチドの異常な発現を証明することを可能にし、これによって疾病の進行の監視や分子診断に有用なものとなる。
【０１１０】
さらに一般的には、本発明の抗体は、本発明の正常なまたは変異型のポリペプチドの発現が認められるはずであるいずれの状況にも有利に使用できる。
【０１１１】
本発明に従い対立遺伝子変異性、突然変異、欠失、異形接合性の欠如、またはＳＰＧ４遺伝子のいずれかの遺伝的異常性を調べる方法であって、本発明の核酸配列または抗体を用いることを特徴とする方法もまた本発明の一部をなす。
【０１１２】
このように本発明はＳＰＧ４遺伝子に関連した病状の遺伝子型診断法であって、本発明の核酸配列を用いることを特徴とする方法を含む。
【０１１３】
好ましくは、本発明は、患者由来の生物学的サンプルを用いる、ＳＰＧ４遺伝子配列の少なくとも１つの突然変異の存在に関連する疾患の遺伝子型診断法であって、以下の工程：
ａ）必要に応じて、解析される生物学的サンプル由来のゲノムＤＮＡを単離し、または生物学的サンプルのＲＮＡからのｃＤＮＡを作製し；
ｂ）本発明のプライマーを用いて、突然変異を含むと考えられるＳＰＧ４遺伝子のＤＮＡ配列を特異的増幅させ；
ｃ）得られた増幅産物を解析し、それらの配列とその対応する正常なＳＰＧ４遺伝子配列との比較する、
ことを含むことを特徴とする方法に関する。
【０１１４】
本発明はまた、ＳＰＧ４遺伝子によりコードされているポリペプチド、特に配列番号３の配列のポリペプチドの異常な発現に関連する疾病を診断する方法であって、そのポリペプチドとその抗体との特異的な免疫学的複合体の形成を可能にする条件下で本発明の１以上の抗体と試験される生物学的材料とを接触させて、形成される可能性のある免疫学的複合体を検出および／または定量することを特徴とする方法に関する。
【０１１５】
これらの方法は例えば、患者由来の生物学的サンプルを用いて上記の配列のうち少なくとも１つにおける突然変異の存在を調べることによる、本発明に従うＳＰＧ４遺伝子における突然変異の存在に関連するＡＤ−ＨＳＰの診断法、特に出生前診断法に向けられる。解析される核酸配列は等しくゲノムＤＮＡであっても、ｃＤＮＡであっても、あるいはｍＲＮＡであってもよい。
【０１１６】
本発明に基づく核酸または抗体はまた、患者における陽性診断、またはリスクのある個体、特に家系に疾病履歴を持つ個体における前徴候診断を可能にするために用いてもよい。
【０１１７】
もちろん野生型遺伝子に対してある遺伝子の突然変異を証明することが可能な極めて多くの方法が存在する。それらは本質的に２つの主要なカテゴリーに分類できる。第１のタイプの方法は、変異型配列とその対応する野生型配列とを比較することによって突然変異の存在を検出するものであり、第２のタイプの方法は、例えば突然変異の存在による誤対合の証拠によって突然変異の存在を間接的に検出するものである。
【０１１８】
これらの方法では記載されている本発明のプローブおよびプライマーを使用できる。それらは通常、少なくとも１５個のヌクレオチド、好ましくは２０、２５または３０個のヌクレオチドを含んでなる精製された核酸ハイブリダイゼーション配列であり、本発明の核酸配列と特異的にハイブリダイズし得ることを特等とする。
【０１１９】
好ましくは特異的ハイブリダイゼーション条件は上記または実施例に記載されているようなものである。これらの核酸ハイブリダイゼーション配列の長さは１５、２０または３０〜２００ヌクレオチド、好ましくは１０〜５０ヌクレオチドの範囲であってよい。
【０１２０】
対立遺伝子変異性、突然変異、欠失、異形接合性の欠如、または遺伝的異常性を調べる方法の中でも、本発明の核酸配列を有するプライマー対を用いる、異常性があると思われる本発明の標的配列に関する少なくとも１つのいわゆるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）またはＰＣＲ様増幅工程を含む方法が好ましい。これらの増幅産物は標的とされる産物の検出およびアッセイを行う前に好適な制限酵素で処理してもよい。
【０１２１】
本発明のＳＰＧ４遺伝子の突然変異はその翻訳産物の種々の改変の原因であり得、これらの改変はおそらく診断的アプローチに使用できる。具体的にはこれらの突然変異に関連する抗原性の改変は特異的抗体の開発を可能とすると考えられる。変異型の遺伝子産物はこれらの方法を用いて識別できる。これらの改変は総て例えばＲＩＡまたはＥＬＩＳＡのような、正常なポリペプチドまたは変態を認識するモノクローナルまたはポリクローナル抗体の使用に基づいたいくつかの十分公知な方法を用いて診断的アプローチに利用できる。
【０１２２】
このように本発明の主題はまた、以下の化合物群から選択される少なくとも１つの化合物：
ａ）本発明の特にプライマーまたはプローブとしての核酸；および
ｂ）本発明の抗体
を含んでなることを特徴とする、本発明に従うＳＰＧ４遺伝子における突然変異の存在に関連するＡＤ−ＨＳＰを特に診断するための診断キットまたはパックでもある。
【０１２３】
もう１つの態様では、本発明はＳＰＧ４遺伝子に関連するＡＤ−ＨＳＰを予防および／または治療することができる化学化合物または生化学化合物を選択する方法であって、本発明の核酸配列、本発明のポリペプチド、本発明のベクター、本発明の細胞、本発明の哺乳類または本発明の抗体を使用することを特徴とする方法を含む。
【０１２４】
本発明のポリペプチドと、または本発明の核酸と直接的または間接的に相互作用し得る化学化合物または生化学化合物を選択し、かつ／またはこれらのポリペプチドの発現もしくは活性を調整することを可能とする方法であって、本発明のポリペプチド、本発明の形質転換細胞または本発明の哺乳類と候補化合物とを接触させて該ポリペプチドの活性の改変を検出することを含む方法も本発明に含まれる。
【０１２５】
例えば、限定するものではないが、マッチメーカー・ツー・ハイブリッド・システム２など、細菌または酵母のツーハイブリッド系を、マッチメーカー・ツー・ハイブリッド・システム２（カタログ番号Ｋ１６０４−１, Clontech）とともに提供されている取扱い説明書に従って用いて、本発明のポリペプチドと相互作用し得る分子を同定する方法が挙げられる。
【０１２６】
本発明に従いＳＰＧ４遺伝子のプロモーターおよび／または調節配列と相互作用するタンパク質をコードしている核酸はClontech製のマッチメーカー・ワン・ハイブリッド・システムキット（カタログ番号Ｋ１６０３−）とともに提供されている取扱い説明書に記載されるもののようなワンハイブリッド系を用いてスクリーニングおよび／または選択することができる。
【０１２７】
その他の態様では、本発明は、ＳＰＧ４遺伝子の発現または活性を調べるための本発明の核酸もしくはポリペプチド、本発明のベクター、本発明の細胞、または本発明の哺乳類の使用を含む。
【０１２８】
本発明のその他の特徴および利点は実施例および図面を示す本明細書の以下の説明で明らかにする。なお、図面の説明は以下に示されている。
【実施例】
【０１２９】
例１：材料および方法
１）候補領域のサブクローニングおよび配列決定
２種のヒトゲノムライブラリー、ＣＩＴＢ＿９７８＿ＳＫＢ（Research Geneticsgが販売）およびＲＰＣＩ−１１(Osoegawa et al., 1998)を起源とし、ＳＰＧ４範囲を包含する１２のＢＡＣを選択し、配列決定した(Hazan et al., Genomics, 60 (3), 309-19, 1999)。各ＢＡＣの４０μｇのＤＮＡをＣｖｉＪＩ制限酵素(CHIMERx)で部分的に消化し、０．４％ＬＭＰアガロースゲル(FMC)での電気泳動により分離した。そのサイズが３．５および１０ｋｂの領域で変化するＤＮＡ画分をβ−アガラーゼ(Biolabs)で溶出し、予め、Ｓｍａｌで消化して脱リン酸化したプラスミドベクターｐＢＡＭ３と５×ベクターにつき１×挿入物の割合で連結した。エレクトロコンピテント大腸菌(E. coli)ＤＨ１０Ｂ菌(GIBCO-BRL)をエレクトロポレーションにより種々の連結物で形質転換した。各ＢＡＣより、２０％が１０ｋｂの挿入物を有するクローン、４０％が５ｋｂの挿入物を有するクローンおよび４０％が３ｋｂの挿入物を有するクローンからなる、約１０００〜１５００のサブクローン（８〜１０当量のゲノム）を単離した。これらのクローンの挿入物の末端をＬＩＣＯＲ４２００自動シーケンサーで配列決定した。各ＢＡＣの配列をＰｈｒｅｄおよびＰｈｒａｐプログラムを用いていくつかのコンティグからなる主鎖に構成した。各コンティグ間のホールを標識したジデオキシヌクレオチドを用いてＡＢＩ３７７シーケンサー(PE-Applied Biosystems)で配列決定した。これらの配列コンティグに含まれるエキソンをＧＲＡＩＬ  II、ＧＥＮＳＣＡＮ、ＦＧＥＮＥＨおよびＧｅｎｉｅコンピュータプログラムを用いて推定した。またその配列をＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸプログラムを用いてＥＭＢＬおよびＧｅｎＢａｎｋ核酸およびタンパク質データベースにおいて比較した。プロモーター配列の決定はＴＳＳＧおよびＴＳＳＷコンピュータプログラムを用いて行った。これら総ての配列解析の結果をＧｅｎｏｔａｔｏｒ配列注解プログラムを用いて視覚化した。
【０１３０】
２）ｃＤＮＡクローニング
ＳＰＧ４遺伝子のｃＤＮＡをＭａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ増幅キット(Clontech)を用いて製造業者の教示に従い、胎児脳、成人脳および成人肝臓のポリＡ＋ＲＮＡにおける５’および３’ＲＡＣＥ−ＰＣＲ試験により単離した。種々のプライマー対を用い、第１のＰＣＲに次ぎに内部ＰＣＲを行った。そのプライマーの配列を以下の表１に示す。
【０１３１】
【表１】
0005965594.tif 000002
【０１３２】
ＲＡＣＥ−ＰＣＲ産物をＴＡ−クローニングキットを用いてクローニングし、その対応するクローンをＡＢＩ３７７(PE-Applied Biosystems)で配列決定した。ＳＰＧ４転写物の配列は６人の健康な個体のリンパ芽球由来のｃＤＮＡ集団から増幅したＰＣＲ産物の配列決定により確認した。
【０１３３】
３）突然変異の検出
調査される家系の１患者と６人の対照個体のリンパ芽球株からＲＮＡ  ＰＬＵＳＲキット(bioprobe Systems)を用いて全ＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡ合成を標準条件下で、ランダム６量体プライマー(Pharmacia)１００ｐｍｏｌおよびSuperscript II逆転写酵素(Gibco BRL)２００単位を用いて、ＲＮＡ５００ｎｇ〜１μｇにおいて行った。親および対照のｃＤＮＡにおいてＳＰＧ４オープンリーディングフレームの総てを包含する重複断片を生ずる４種のＰＣＲ増幅を行った。断片ＩをＳＰＡ＿Ｄｂ／ＳＰＡ＿Ｄｍプライマーを用い、次いでＳＰＡ＿Ｄｃ／ＳＰＡ＿Ｄｎプライマーを用いて、内部ＰＣＲにより増幅した。断片II、IIIおよびIVを各々、ＳＰＡ＿Ａｄ／ＳＰＡ＿Ａｍ、ＳＰＡ＿Ｂａ／ＳＰＡ＿ＢｍおよびＳＰＡ＿Ｃａ／ＳＰＡ＿Ｃｍプライマー（表１にあるこれらのプライマーの配列を参照）を用いて増幅した。各々の増幅をｃＤＮＡ４μｌ（−１／７番目の調製物）、各プライマー２０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ２００μＭ、ＫＣｌ５０ｍＭ、Ｔｒｉｓ１０ｍＭ、ｐＨ９、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｔｒｉｔｏｎＸ−１００  ０．１％、ゼラチン０．０１％およびＴａｑポリメラーゼ（Ｃｅｔｕｓ−ＰＥ）２．５単位を含有する全量５０μｌで行った。ＰＣＲ反応は「ホットスタート」プロセスに従い行った：９４℃で５分間の最初の変性工程後にＴａｑポリメラーゼを９２℃で加える。次ぎにサンプルを変性（９４℃で４０秒間）、ハイブリダイゼーション（５５℃で５０秒間、断片Ｉを除く：５８℃で５０秒間）および伸長（７２℃で１分間）、次ぎに最終伸長工程（７２℃で５分間）３５サイクルに付す。ＰＣＲ産物を断片Ｉ、II、IIIおよびIV各々に対して、ＳＰＡ＿Ｄｃ／ＳＰＡ＿Ｄｎ、ＳＰＡ＿Ａｃ／ＳＰＡ＿Ａｎ、ＳＰＡ＿Ｂｂ／ＳＰＡ＿ＢｎおよびＳＰＡ＿Ｃｂ／ＳＰＡ＿Ｃｍプライマーを用いてＡＢＩ３７７自動シーケンサー(PE-Applied Biosystems)で配列決定した。
【０１３４】
また親および対照のＳＰＧ４遺伝子の１７の推定エキソンを配列決定することにより突然変異を探し、または確認した。各エキソンをエキソン１（ｇＳＰＡｅｘ１ｃ／ｇＳＰＡｅｘ１ｍ）、およびｇＳＰＡｅｘ１０ａ／ｇＳＰＡｅｘ１２ｍおよびｇＳＰＡｅｘ１１ａ／ｇＳＰＡｅｘ１２ｍプライマー対を用いて同時増幅されるエキソン１０、１１および１２を除く、対応する「ａ＋ｍ」プライマー対（以下の表２参照）を用いて増幅した。
【０１３５】
【表２】
0005965594.tif 000003
0005965594.tif 000004
【０１３６】
アドバンテージＧＣゲノムＰＣＲキット(Clontech) を用いて製造業者の教示に従い増幅されるエキソン１以外には、４種のわずかに異なるＰＣＲプログラム（１、２、３および４）を用いてＳＰＧ４エキソン（表２参照）を増幅した。増幅は総て、ゲノムＤＮＡ１００ｎｇ、各プライマー５０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ２５０μＭ、１×TakaraバッファーおよびTakara  Ｌａ  Ｔａｑ  Ｔａｑポリメラーゼ(Shuzo Co.)１単位を含有する容量５０μｌで行った。ＰＣＲ反応は「ホットスタート」プロセスに従い行った：９６℃で５分間の最初の変性工程後にＴａｑポリメラーゼを９４℃で加える。次ぎにサンプルを変性（９４℃で４０秒間）、ハイブリダイゼーション（プログラム１：６０℃で５０秒間、プログラム２：５８℃で５０秒間、プログラム３および４：５５℃で５０秒間）および伸長（プログラム１および４：７２℃で１分間、プログラム２および３：７２℃で４０秒間）、次ぎに最終伸長工程（７２℃で１０分間）３０サイクルに付す。これらのＰＣＲ産物の配列決定をＰＣＲプライマーまたは「ｂ」および「ｎ」と呼ばれる内部プライマー（表２参照）のいずれかを用いてＡＢＩ３７７シーケンサー(PE-Applied Biosystems)で行った。
【０１３７】
４）ＳＰＧ４の同定
ネズミ・オルトログＳＰＧ４に対応するマウス胚盤胞およびＥ８胚ｃＤＮＡライブラリー由来のｃＤＮＡクローン９７７３１２（ＥＳＴ  ＡＡ５６０３２７）および５６８２３４（ＥＳＴ  ＡＡ１０７８６６）をＩＭＡＧＥコンソーシアムを用いて単離し、ＡＢＩ３７７シーケンサー(PE-Applied Biosystems)で実験室で配列決定した。ＳＰＧ４およびそのネズミ・オルトログＳＰＧ４の発現プロフィールを調べるために、種々の胎児ならびに成人ヒト組織、およびまたマウス組織(ＭＴＣパネル、Clontech)由来のｃＤＮＡコレクションを、ヒトｃＤＮＡについてはＳＰＡ＿Ｃａ／ＳＰＡ＿Ｃｍプライマー対を用いた、およびマウスｃＤＮＡについてはＳＰＡ＿Ｃａ／ｓｐａｍ（ｓｐａｍ：５’−ＡＣＣＧＡＡＧＴＣＡＡＧＡＧＣＣＴＡＴＣ−３’）対を用いたＰＣＲにより製造業者のプロトコールに従って調べた。ＰＣＲ条件は、サンプルを成人ヒト組織ならびにマウス組織由来のｃＤＮＡについては３２サイクル、および胎児組織由来のｃＤＮＡについては２８サイクルに付したことを除き、リンパ芽球株ｃＤＮＡ由来のＳＰＧ４の増幅に用いるもの（§突然変異の検出参照）である。増幅産物を２％ＬＭＰアガロースゲルでの電気泳動により泳動させた。
【０１３８】
５）患者由来の筋肉生検の組織学的解析
Casari et al., 1998に記載された標準的な方法によりＳＰＧ４遺伝子座に関する家系の患者由来の筋肉生検において組織学的かつ組織酵素解析を行った。
【０１３９】
６）公開データベースにおける受託番号
ＳＰＧ４（またはＳＰＡＳＴ）ｃＤＮＡおよび推定タンパク質配列、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ  ＡＪ２４６００１；不完全Ｓｐｇ４  ｃＤＮＡクローン、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ  ＡＪ２４６００２；ＳＰＧ４（またはＳＰＡＳＴ）遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ  ＡＪ２４６００３。
【０１４０】
例２：ＳＰＧ４遺伝子範囲の配列解析
組換え結果の解析によりＳＰＧ４候補領域をＤ２Ｓ３５２およびＤ２Ｓ２３４７マーカー（１９、２０）間０ｃＭの遺伝子範囲に限定することが可能になる。３７ＢＡＣからなるＳＰＧ４範囲の予備配列決定マップを作製した(Hazan et al., in press in Genomics)；候補領域は約１．５Ｍｂの物理的距離に及んでいる。クローンＡおよびＥ間の４ｋｂの単一ホールを除く、ＳＰＧ４領域にわたって伸びている１２の重複ＢＡＣを選択し、配列決定した（図１Ａ）。注目される領域の約７０％に及んでいるこれらの７のＢＡＣ（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧ）はすでに配列決定されている。これらの７のＢＡＣ配列を核酸およびタンパク質データベースのものと比較し、４種のエキソン推定プログラムを用いて解析した。これらの予備的配列解析により、キサンチンデヒドロゲナーゼ、ステロイドＳα−レダクターゼ２およびＴＧＦβ結合タンパク質をコードする遺伝子に対応する３つを含む、１４の可能性ある転写単位を示すことが可能になる。配列解析により検出された１４の遺伝子のうち９つのものはすでにＥＳＴ（「Expressed Sequence Taq」）データベースにおいて確認されており、ＳＰＧ４範囲に位置していた(Hazan et al., in press in Genomics)：残る５つの遺伝子は候補領域の配列決定により同定のみできる。これら５つの新規遺伝子の１つはそのコード領域の３’においてＡＡＡタンパク質系をコードする遺伝子と相同性を示した(Confalonieri et al., 1995)。より完全な配列解析により、ＳＰＧ４（またはＳＰＡＳＴ）と呼ばれるこの遺伝子が１７のエキソンからなり、かつ２つの隣接するＢＡＣクローン、ＤおよびＧに包含される約９０ｋｂの領域にわたっていることが示された（図１Ｂ参照）。この遺伝子の最初の３つの推定エキソンは用いられる４種の推定プログラムのうちの２種、ＧＲＡＩＬ  IIおよびＧＥＮＳＣＡＮ（それらはマウス胚盤胞ＥＳＴ、ＡＡ５６０３２７と強い相同性を示す）によりＢＡＣ  Ｄにおいて同定された。最後の１４のエキソンはＢＡＣ  Ｇにおいて見出せる。エキソン７〜１７から推定されるタンパク質配列はＹｔａ６ｐ(Schnail et al., 1994)、ＴＢＰ６(Schnail et al., 1994)およびＥｎｄ１３酵母タンパク質、またＳＫＤ１マウスタンパク質(Perier et al., 1994)も含む、ＡＡＡ系サブクラスと有意に相同である。
【０１４１】
４種のエキソン推定プログラムのうちＦＧＥＮＥＨが最も信頼性がありかつ最も能力が優れており、２ｐ２１〜２２のこの染色体領域の大部分の遺伝子の検出を可能にすると思われる。この所見はまたＳＰＧ４遺伝子にも当てはまる。この１５のエキソンはこのプログラムを用いて示されるが、４、９または１１のエキソンだけは各々、Ｇｅｎｉｅ、ＧＲＡＩＬ  IIおよびＧＥＮＳＣＡＮプログラムを用いて位置決定する。次ぎにこの遺伝子のゲノム構成（図１Ｂ）をＳＰＧ４ｃＤＮＡの配列を決定することにより確認する。イントロン／エキソン連結については以下の表３に示す：エキソンサイズは４１ｂｐ（エキソン１６）〜１．４１０ｋｂ（エキソン１７）の範囲にわたっており、イントロンサイズは１４０ｂｐ（イントロン１１）〜２３．２４７ｋｂ（イントロン１）の範囲にわたっている。
【０１４２】
【表３】
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【０１４３】
例３：ＳＰＧ４ｃＤＮＡの同定
成人肝臓ならびに脳および胎児脳ｃＤＮＡのコレクションにおいて５’および３’ＲＡＣＥ−ＰＣＲにより数度の連続増幅を行い、ＳＰＧ４転写物の同定を行った。転写物の５’領域がＧＣ高含量であることから（９０％のＧＣはｎｔ２６３位の前に置かれた６０ｂｐにある）、総ての５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲによりＳＰＧ４ｃＤＮＡのｎｔ２６３位で終結する（図２）増幅産物を得た。コード領域の総てを包含する４つの重複ＰＣＲ産物を６人の対照個体のリンパ芽球由来のｃＤＮＡから増幅し、ＳＰＧ４転写物の配列を確かめる補助手段により完全に配列決定した。ＰＣＲおよびＲＡＣＥ−ＰＣＲ産物総ての配列を調節することにより１２５ｂｐの非翻訳５’領域（「５’非翻訳領域」の代わりに５’ＵＴＲ）を前に置いた１８４８ｂｐのオープンリーディングフレーム、さらに後に続くポリＡテール上流〜３５ｂｐのｎｔ３２２７−３２３２位間のポリアデニル化部位を含む（図２）１２９０ｂｐの３’ＵＴＲ領域を含んでなる、３２６３ｂｐの配列を再構築することができる。ＳＰＧ４ｃＤＮＡとＥＳＴデータバンクとの比較により、第２のポリアデニル化部位を含んでなるさらに延長された３’非コード領域（＋１８０ｂｐ）を含むＥＳＴ  Ｎ４７９７３をはじめとする６人のヒトＥＳＴとの有意な相同性を検出することができる。翻訳開始部位を、プリンがイニシエーターＡＴＧの３ｎｔ上流に配置され、それ自身が停止コドンを前に置かれることとなる翻訳開始に「好適な関係」として定義されるコサック共通配列（ＣＴＧＴＧＡａｔｇＡ）の存在により同定した。３２６３ｂｐのｃＤＮＡ配列はＳＰＧ４遺伝子の１７のエキソンから推定される転写配列と同一である。ＴＳＳＧおよびＴＳＳＷコンピュータプログラムを用いる５’領域の配列解析によりエキソン１のｎｔ１位の４３ｂｐ上流に配置されたＴＡＴＡボックス型のプロモーター配列の存在が示される。
【０１４４】
例４：ＳＰＧ４遺伝子における突然変異
ＳＰＧ４遺伝子座が関連した家系の１４人の患者（各家系から１人の患者）のリンパ芽球由来のＳＰＧ４  ｃＤＮＡにおいてヘテロ接合突然変異を調べた。１４人の患者と、また６人の健康な対照個体においてＳＰＧ４  ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームを包含する４つの重複ＰＣＲ断片Ｉ、II、IIIおよびIVを増幅し、配列決定した。ＰＣＲ断片IVのアガロースゲル電気泳動により、スイスの同じ地域に源を発する家系２９９２、５２２６および５３３０の３人の患者ではスプライス部位の微量欠失または突然変異を示す同じ強度の３つのバンドが示された；家系２９９２および５３３０の２人の健康な個体には２つの付加的なバンドは存在しなかった（図３Ａ）。これらの３家系の患者ではエキソン１６のゲノム配列によりイントロン１５のスプライス受容部位（ＡＧ）のヘテロ接合Ａ→Ｇ突然変異が示された（図３Ｂ）；この突然変異はエキソン１６の欠失の後、異常転写物におけるリーディングフレームシフトを引き起こすものである。夫および妻をはじめとする健康な構成員のうち、スプライス部位のこの突然変異を有するものはいない。これらのスイスの３家系の総ての患者における同一突然変異の同定により、おそらくはハプロタイプの研究により示された共通の祖先の存在が立証される。
【０１４５】
アミノ酸置換をタンパク質配列（Ｓ３６２Ｃ、Ｃ４４８ＹおよびＲ４９９Ｃ）に導入する３つの点突然変異、１２１０Ｃ→Ｇ、１４６８Ｇ→Ａおよび１６２０Ｃ→Ｔが、各々家系６２４、４０１４および６１８の患者におけるＰＣＲ断片IIIおよびIVを配列決定することにより示された。これらの３つの置換総てにはタンパク質配列におけるシステインの欠失または挿入を誘導するシステイン残基が含まれる。４６５個のアミノ酸（ａａ）からなる末端切断型タンパク質を誘導する停止コドンを出現させる１ｂｐの欠失、１５２０ｄｅｌＴをＡ家系の患者において検出した。以下の表４に概略を示す５つの突然変異はいずれも、彼らが本明細書において調べた７家系の健康な兄弟姉妹または配偶者のいずれであろうと、調べた対照個体では見られなかった。これらの５つの突然変異はＡＡＡ系の総ての構成員においてＡＴＰアーゼ活性を担うと推定されるいくつかのタンパク質モチーフからなる非常に保存されたドメイン、またはＡＡＡカセット(Beyer, 1997)のタンパク質配列に重大な影響を与える。
【０１４６】
【表４】
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【０１４７】
上記のこれらの５つの突然変異に加え、その他の３６の家系のＡＤ−ＨＳＰ患者においてヘテロ接合突然変異の研究を行い、ＳＰＧ４遺伝子の発現産物を改変するまたは改変すると思われるその他の３４の突然変異を示すことができた。
【０１４８】
これらその他の３４の突然変異の特徴を、上記の最初の５つの変異も加えて以下の表５に概略を示している。
【０１４９】
【表５】
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【０１５０】
例５：スパスチンのタンパク質配列の解析
ＳＰＧ４のオープンリーディングフレームはスパスチンと呼ばれ、その分子量が約６７．２キロダルトン（ｋＤ）である６１６ａａタンパク質をコードする。タンパク質データベースのこのアミノ酸配列をＢＬＡＳＴプログラムを用いて比較することにより、スパスチンのＣ末端においてＡＡＡ系のいくつかの構成員と著しく相同である領域を示すことができた。ＡＡＡカセットに含まれるＡＡＡ系の「典型的」モチーフはＰｒｏＤｏｍおよびＰｒｏｓｉｔｅタンパク質ドメインデータベースにおける配列比較により３４２位と５９９位との間に確認される（図２参照）。ＷａｌｋｅｒＡならびにＢモチーフおよびまたＡＡＡタンパク質の最小共通モチーフを含む３つの保存された典型的ドメインはそれぞれ、ａａ３８２〜３８９、４３７〜４４２および４８０〜４９８位のＡＡＡカセットにおいて確認される（図２）。ＡＴＰ結合ドメインに対応し、ｐ−ループとも呼ばれるＷａｌｋｅｒＡモチーフ、「ＧＰＰＧＮＧＫＴ」およびＢモチーフ、「ＩＩＦＩＤＥ」はスパスチンをはじめとしてＡＡＡ系の総ての構成員の間で非常に保存される。
【０１５１】
進化上極めて遠い生物由来のこのＡＴＰアーゼ系の１５０のタンパク質に存在するＡＡＡカセットを比較することにより、この群のタンパク質を確認されたＡＡＡカセット数（１または２）およびこれらの種々のカセット間の配列相同性(Beyer, 1997)に関して、いくつかの部分群に分類することができる。ＡＡＡ系の総てのタンパク質のうち、スパスチンはＡＡＡの特定のサブクラスと、より詳しくは問題の生物体のゲノムの完全な配列決定によりその大部分が同定された次のタンパク質：シーノラブディチス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)の２つのタンパク質、Ｏ１６２９９およびＱ１８１２８；サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)の２６Ｓプロテアソーム２つのサブユニット、Ｙｔａ６ｐ（Ｑ０２８４５）およびＴＢＰ６（Ｐ４０３２６）(Schnail et al., 1994)；シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)のプロテアソームのサブユニット（Ｏ４３０７８）；Ｓ．セレビシエのＳＡＰ１（Ｐ３９９５５）およびＥＮＤ１３（Ｐ５２９１７）タンパク質およびネズミＳＫＤ１タンパク質（Ｐ４６４６７）(Perier et al., 1994)とより著しい相同性を示している。スパスチンとこれら８種のタンパク質との多数のアライメントを図４Ａに示している。ＡＡＡカセットを含む２５７個のアミノ酸（ａａ３４２〜５９９位）のうち、スパスチンはＹｔａ６ｐ（Ｑ０２８４５）酵母タンパク質、Ｏ１６２９９線虫類タンパク質およびＴＢＰ６（Ｐ４０３２６）酵母タンパク質とそれぞれ、５２％、５１％および５０％の配列同一性を示している。ＰｒｏＤｏｍデータベースにおいてスパスチンのタンパク質配列を解析することにより同様の結果が得られた。ここでは酵母の２６Ｓプロテアソームの推定サブユニットで見られる相同な３つのドメインの存在（９２、１７９および６２２６と呼ばれ、ａａ３４２〜４０９位、４１１〜５０９位および５１２〜５９９位に対応している）が示された。さらにこのＡＡＡ部分群の構成員は共通してロイシンジッパー型モチーフを含んでおり、このうち２つがＰｒｏｓｉｔｅデータベースにおいて配列を解析することにより、ａａ５０〜７８位および５０８〜５２９位のスパスチンのタンパク質配列において検出できた（図２参照）。またこの解析によりａａ４７８〜４８６位間に確認されるヘリックスループの二量体化モチーフ−ヘリックス型の存在も推定できた。
【０１５２】
スパスチンのタンパク質配列とＡＦＧ３、ＲＣＡ１およびＹＭＥ１酵母タンパク質などのミトコンドリアメタロプロテアーゼ、およびさらに稀少型ＡＲ−ＨＳＰに関連するパラプレギンのものとを比較することにより、ＡＡＡ系のこれら５つの構成員間の相同性がＡＡＡカセットを含む２５７ａａ領域に限定されることがわかる（図４Ｂ）。この領域においてスパスチンとパラプレギンとの配列同一性はわずか２９％であるが、タンパク質配列のこの同一部分でパラプレギンとＡＦＧ３酵母タンパク質とは５７％同一である。この配列比較によりスパスチンがパラプレギンおよび他のミトコンドリアメタロプロテアーゼのように、同じＡＡＡ部分群に属していないことが示される。さらに、タンパク質の細胞下分布が推定できるＰＳＯＲＴIIプログラムを用いるスパスチン配列のコンピュータ解析によりスパスチンが核タンパク質であることが示されることは明らかである。可能性ある核分布シグナル（ＮＬＳ）、ＲＧＫＫＫはａａ７〜１１位間に示されたが、パラプレギンでの観察とは異なり、ミトコンドリアへの引き入れの特徴であるシグナルペプチドは検出されなかった。
【０１５３】
例６：ＳＰＧ４およびそのネズミ類似遺伝子Ｓｐｇ４の発現プロフィール
ＥＳＴデータバンクにおいてＳＰＧ４の核酸配列を比較することにより、ＳＰＧ４と著しい相同性を示す数種類のヒト、ネズミおよびラットＥＳＴが検出できた。２つのネズミＥＳＴ、ＡＡ５６０３２７およびＡＡ１０７８６６に対応するマウス胚盤胞およびＥ８胚ｃＤＮＡクローンをＩＭＡＧＥコンソーシアムから得て、完全に配列決定した。これらのｃＤＮＡクローンの配列を構成することにより、１５１４ｂｐの不完全オープンリーディングフレームを含む１６８９ｂｐの一致配列が再構築できた。ヒトＳＰＧ４ｃＤＮＡとこのマウスｃＤＮＡとを比較することにより、ネズミ転写物が翻訳開始コドンを含む５’末端において約４６０ｂｐを欠失していることがわかった。マウスオープンリーディングフレームの後にポリＡテール〜２０ｂｐ上流にあるポリアデニル化部位を含む１７５ｂｐの３’非コード領域（３’ＵＴＲ）が続いている（図５）。ＳＰＧ４の核酸配列およびヒトスパスチンのタンパク質配列はマウスｃＤＮＡおよび推定タンパク質配列とそれぞれ、８９％（ｎｔ４６０〜１９８２位間）および９６％（ａａ１１３〜６１６位間）の同一性を示す。このようにかなりの相同性であることから、マウス転写物がＳＰＧ４のネズミ類似遺伝子に対応していることが確認でき、従ってＳｐｇ４と呼ばれている。
【０１５４】
種々のヒトおよびネズミ組織(Clontech)のｍＲＮＡを含んでなるノーザンブロットのＳＰＧ４およびＳｐｑ４ｃＤＮＡクローンとのハイブリダイゼーションでは１０日間の暴露後、マウス精巣の２．５ｋｂ転写物に対応する極めて弱いバンド以外、いずれの納得のゆく結果も得られなかった。この遺伝子の発現レベルが低いため、ＳＰＧ４およびＳｐｑ４の発現プロフィールを種々の成人および胎児組織由来の標準ｃＤＮＡコレクションにおけるＰＣＲ試験により求めた（図６Ａ〜６Ｃ参照）。ネズミＳｐｑ４遺伝子はマウス成人組織、さらにマウス胚Ｅ７〜Ｅ１７期においても至る所で発現される（図６Ａ）。Ｓｐｑ４のより高い発現は肝臓、骨格筋および精巣、さらに胚Ｅ１５期においても検出された。胚発生期のＳｐｑ４の初期発現は公開ＥＳＴデータバンクの胚盤胞、Ｅ８胚および胚癌腫ｃＤＮＡライブラリー由来のＥＳＴの存在により確認された。ヒトＳＰＧ４遺伝子はそれ自体、成人（図６Ｂ）および胎児（図６Ｃ）組織の至る所で発現されるが、胎児脳で顕著に発現されるであろう。
【０１５５】
例７：ＳＰＧ４遺伝子座が関連したＡＤ−ＨＳＰにおける酸化的リン酸化障害の否定
スパスチン突然変異がパラプレギンの場合と同様にミトコンドリアにおける酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）障害を誘発するか否かを確認するため、ＳＰＧ４遺伝子座が関連した１ＡＤ−ＨＳＰ家系の患者において筋生検を行った。筋生検の形態学的かつ組織酵素解析ではミトコンドリアにおけるＯＸＰＨＯＳ障害に特徴的なＲＲＦ（「破れた赤色線維(ragged red fiber)」）型筋繊維は全く示されなかった。総ての筋繊維が正常であろうという事実、さらにはスパスチンの核分布の推定によっても、ＳＰＧ４遺伝子座が関連したＡＤ−ＨＳＰが、ＳＰＧ７遺伝子座が関連したＡＲ−ＨＳＰとは異なり、ＯＸＰＨＯＳ型のミトコンドリア疾患ではないことが示されているようである。
【０１５６】
１．５Ｍｂ領域の配列決定に基づく位置的クローニングアプローチを用いて、発明者らは染色体バンド２ｐ２１〜ｐ２２にすでに確認されている最も一般的な型のＡＤ−ＨＳＰの原因となるＳＰＧ４（またはＳＰＡＳＴ）遺伝子を同定した。ＳＰＧ４遺伝子座との関連を示すＡＤ−ＨＳＰを有する４１家系の患者においてスパスチンと呼ばれる発現産物を改変するまたは改変すると思われる３９の突然変異が検出できた。スパスチンは核分布すると考えられ、かつ酵母の２６Ｓプロテアソームのサブユニットと著しい相同性を示すＡＡＡタンパク質系の新規構成員である。ＡＡＡカセットとよばれる２３０〜２５０ａａのドメインに限定された高い相同性にもかかわらず、このタンパク質系の多くの構成員は液胞内のタンパク質の輸送、細胞周期制御、細胞小器官の発生、すなわち転写制御などといった極めて多様な細胞機構に関係し得る。しかしながら、これら総ての細胞機構はタンパク質複合体の構成、機能または分解に関係しており、このことによりＡＡＡ系の構成員がいわゆる「シャペロン（chaperon）」タンパク質であることが示唆される。
【０１５７】
参考文献
【表６】
0005965594.tif 000009
【表７】
0005965594.tif 000010
【表８】
0005965594.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】ＳＰＧ４の範囲およびＳＰＧ４のゲノム構成の物理的マップを示す。  図１Ａ：  太字で示されるＤ２Ｓ３５２およびＤ２Ｓ２３４７遺伝子マーカーによって１．５Ｍｂの候補領域が定められている。多形マーカーおよびその他のＳＴＳの位置は標準的な文字で示され、ＥＳＴの位置はイタリックで示されている。予備配列決定マップを構成するＢＡＣクローンが四角で示され、名称が上に示され、決定されていればクローンの正確な大きさが下に示されている。ＢＡＣ  Ａ、Ｂ、Ｃなどの名称の後には、クローンがＢＡＣライブラリーＣＩＴＢ＿９７８＿ＳＫＢに由来する場合には「ｂ」で始まり、またはライブラリーＲＰＳＩ−１１に由来する場合には「Ｂ」で始まるクローン名を含む括弧で示されている。  図１Ｂ：  ＳＡＣ  Ｄ（ｂ３３６Ｐ１４）およびＧ（Ｂ５６３Ｎ４）が重複するＳＰＧ４遺伝子の模式図。エキソン黒い四角でで示され、上にそれらの名称が示されている。  図１Ｃ：  ７つのＳＰＧ４遺伝子座関連ＡＤ−ＨＳＰ家系で同定されている５つの突然変異がエキソン７、１１および１３、ならびにイントロン１５のスプライス受容部位の位置にある。
【図２】スパスチンのＳＰＧ４  ｃＤＮＡの核酸およびタンパク質配列を示す。  下にある数字とともに１７本の垂直な線が種々のエキソン間の連結を示している。ＡＴＧ開始コドンはｎｔ１２６〜１２８番に位置し、終結に関する停止コドンはｎｔ１９７４〜１９７６番に位置している。エキソン１６の欠失を含むこれまでに確認された５つの突然変異はイタリックで示されている（ｎｔ１２１０、ｎｔ１４６８、ｎｔ１５２０、ｎｔ１６２０およびエキソン１６の欠失に関するｎｔ１８１３〜１８５３）。ポリアデニル化部位は下線を施したイタリックで示されている。推定核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ＲＧＫＫＫ、またＰｒｏＤｏｍデータベースにおける解析によって推定された３つの保存されたドメインはそれぞれａａ７〜１１番（ＮＬＳ）、３４２〜４０９番（ドメイン９２）、４１１〜５０９番（ドメイン１７９）、および５１２〜５９９番（ドメイン６２２６）に位置している。Ｐｒｏｓｉｔｅデーターベースにおける配列比較によって推定された４つのモチーフはａａ５０〜７８番と５０８〜５２９番の２つの「ロイシンジッパー」、ａａ３８２〜３８６番のＡＴＰ結合部位（またはＷａｌｋｅｒ  Ａモチーフ）、およびａａ４７８〜４８６番の「ヘリックス−ループ−ヘリックス」二量化ドメインである。Ｗａｌｋｅｒ  ＡおよびＢモチーフ「ＧＰＰＧＮＧＫＴ」および「ＩＩＦＩＤＥ」、またＡＡＡ最小共通［欠文］に下線で示されている。
【図３Ａ】３つのＳＰＧ４遺伝子座関連ＡＤ−ＨＰＳ家系の影響を受けた個々のものにおけるスプライス部位突然変異の同定。  図３Ａは、リンパ芽球ｃＤＮＡを用いるＳＰＧ４  ｃＤＮＡの断片ＩＶのＰＣＲ増幅を示す：ウェルＭ、サイズマーカーＶＩＩ(Boehringer)；ウェル１、影響を受けていない家系２９９２のメンバー；ウェル２、家系２９９２の患者；ウェル３、影響を受けていない家系５３３０のメンバー；ウェル４、家系５３３０の患者；ウェル５、家系５２２６の患者；ウェル６、陰性対照（ヒトゲノムＤＮＡ）。
【図３Ｂ】３つのＳＰＧ４遺伝子座関連ＡＤ−ＨＰＳ家系の影響を受けた個々のものにおけるスプライス部位突然変異の同定。  図３Ｂは、イントロン１５のスプライス受容部位の突然変異の配列グラフを示す。上は対照個体および下は家系２９９２の患者のゲノム配列。ｎｔ１８１３〜４番のアステリスクは患者のイントロン１５のスプライス受容部位の非保存的ヌクレオチドに影響を及ぼすＡ→Ｃの多形性を示している。
【図４Ａ】スパスチンの相同性。同一の残基は網掛け領域で強調されている。  種々の生物に由来する８つのタンパク質のＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗによって作り出され、ヒト・スパスチンとネズミ・スパスチン（配列番号７３）と強い配列相同性を有する複数のアライメント。
【図４Ｂ】スパスチンの相同性。同一の残基は網掛け領域で強調されている。  酵母メタロプロテアーゼＡＦＧ３、ＲＣＡ１およびＹＭＥ１、ならびにヒト・プララプレジンおよびスパスチンのＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗによるアライメント。
【図５】ＳＰＧ４  ｃＤＮＡおよびそのマウス・オルトログＳｐｇ４の核酸配列（配列番号７３）のＢＬＡＳＴＮによるアライメント。ネズミｃＤＮＡのポリアデニル化部位は下線を施したイタリックで示されている。停止コドンはネズミｃＤＮＡではｎｔ１５１５〜１５１７番に位置し、ヒトｃＤＮＡではｎｔ１９７４〜１９７６番に位置している。
【図６】ＳＰＧ４およびそのネズミ・オルトログＳｐｇ４の発現のＰＣＲ解析。  図６Ａ：  複数のマウス組織に由来するｃＤＮＡコレクション。ウェルＭ、サイズマーカーＶ(Boehringer)；ウェル１、心臓；ウェル２、脳；ウェル３、脾臓；ウェル４、肺；ウェル５、肝臓；ウェル６、骨格筋；ウェル７、腎臓；ウェル８、精巣；ウェル９、Ｅ７  ７日胚；ウェル１０、Ｅ１１  １１日胚；ウェル１１、Ｅ１５  １５日胚；ウェル１２、Ｅ１７  １７日胚；ウェル１３、陰性対照（ヒトゲノムＤＮＡ）。  図６Ｂ：  複数のヒト組織に由来するｃＤＮＡコレクション。ウェルＭ、サイズマーカーＶＩＩ(Boehringer)；ウェル１、脳；ウェル２、心臓；ウェル３、腎臓；ウェル４、肝臓；ウェル５、肺；ウェル６、膵臓；ウェル７、胎盤；ウェル８、骨格筋；ウェル９、陰性対照（ヒトゲノムＤＮＡ；ウェル１０、陰性対照（ＤＮＡを含まず）。  図６Ｃ：  複数のヒト胎児組織に由来するｃＤＮＡコレクション。ウェルＭ、サイズマーカーＶ(Boehringer)；ウェル１、脳；ウェル２、心臓；ウェル３、腎臓；ウェル４、肝臓；ウェル５、肺；ウェル６、骨格筋；ウェル７、脾臓；ウェル８、胸腺；ウェル９、陰性対照（ヒトゲノムＤＮＡ）；ウェル１０、陰性対照（ＤＮＡを含まず）。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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