(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
構成タンパク質が人参メジャーラテックス様タンパク質（ｍａｊｏｒ  ｌａｔｅｘ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＭＬＰ１５１）および人参リボヌクレアーゼ様メジャー貯蔵タンパク質（ＲＮＡｓｅ−ｌｉｋｅ  ｍａｊｏｒ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）からなる人参から分離した糖リポタンパク質ジントニン（ｇｉｎｔｏｎｉｎ）またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）受容体作用剤。
【請求項２】
前記人参メジャーラテックス様タンパク質（ＭＬＰ１５１）は配列番号１〜配列番号４のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載のリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）受容体作用剤。
【請求項３】
前記人参メジャーラテックス様タンパク質（ＭＬＰ１５１）は、配列番号５のアミノ酸配列からなり、３箇所のＮ−グリコル化部位（Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）を有することを特徴とする、請求項１に記載のリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）受容体作用剤。
【請求項４】
前記人参リボヌクレアーゼ様メジャー貯蔵タンパク質は配列番号６〜配列番号１０のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載のリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）受容体作用剤。
【請求項５】
前記人参リボヌクレアーゼ様メジャー貯蔵タンパク質は配列番号１１のアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項１に記載のリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）受容体作用剤。
【請求項６】
（１）ＬＰＡ系統受容体遺伝子を含んでいるプラスミドおよび前記受容体を含んでいない空プラスミドの増幅および精製過程によって、空ベクター、およびＬＰＡ系統受容体を含む遺伝子を多量確保する段階と、
（２）Ｈａｅｍａｔｏｇｌｕｔｉｎ（ＨＡ）がタグされたＬＰＡ（ｔａｇｇｅｄ−ＬＰＡ）受容体をＢ１０３細胞にトランスフェクションさせて発現した後、ＨＡに対する１次抗体、および１次抗体に対する２次抗体としてＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）でコンジュゲートされた２次抗体を用いて、発色反応を誘導するウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を施すことにより、ＬＰＡ受容体タンパク質の発現を検証する段階と、
（３） Ｈａｅｍａｔｏｇｌｕｔｉｎ（ＨＡ）がタグされたＬＰＡ受容体をトランスフェクションさせて発現した後、ＨＡに対する１次抗体、および蛍光物質たるＣｙ３−コンジュゲートされた２次抗体を用いてこれらの受容体タンパク質の発現を共焦点レーザー顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｌａｓｅｒ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）によって検証する段階と、
（４）前記空プラスミド、およびそれぞれのＬＰＡ系統受容体を含むプラスミドをＢ１０３細胞にトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）する段階と、
（５）２〜３日後、トランスフェクションされたＢ１０３細胞にトリプシン（０．０５％ｔｒｙｐｓｉｎ  ｗｉｔｈ  ＥＤＴＡ、ｗ／ｖ）を処理して培養フラスコから細胞懸濁液（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）を準備する段階と、
（６）懸濁された細胞にＦｕｒａ−２（２．５μＭ）を処理して培養する段階と、
（７）Ｆｕｒａ−２を含有する懸濁された細胞を含むキュベットにジントニンを処理して細胞質内遊離ＣＡ２＋（ＦｒｅｅＣａ２＋）の増加を分光蛍光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）で確認し、細胞内カルシウムの増加量を定量する段階とを含んでなることを特徴とする、ジントニンとＬＰＡ受容体との相互作用確認方法。
【請求項７】
（８）ジントニンを処理する前に、ＬＰＡ受容体拮抗剤（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）およびシグナル伝達関連薬物（例えば、百日咳毒素（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ｔｏｘｉｎ）、ＰＬＣ抑制剤、ＩＰ３受容体拮抗剤（ｒｅｃｅｐｔｏｒａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）を前処理した後、ジントニンによる細胞内遊離Ｃａ２＋（ＦｒｅｅＣａ２＋）の増加作用を遮断または減少させることを検証する段階と、
（９）ジントニンがＬＰＡ受容体タンパク質のどのアミノ酸と相互作用してＬＰＡ受容体を活性化させるかを部位特異的突然変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）方法を用いて確認するための段階と、
（１０）ＬＰＡ受容体の他に、ＬＰＡが活性化させるものとして知られている他のオーファンＧＰＣＲ（ｏｒｐｈａｎ  ＧＰＣＲ）たるＧＰＲ３５およびＧＰＲ８７と、遊離脂肪酸ＧＰＣＲ（ｆｒｅｅ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ＧＰＣＲ）たるＧＰＲ４０、ＧＰＲ４１、ＧＰＲ４３およびＧＰＲ１２０をジントニンが活性化させるか否かを検証する段階とをさらに含むことを特徴とする、請求項６に記載のジントニンとＬＰＡ受容体との相互作用確認方法。
【請求項８】
人参由来の糖リポタンパク質ジントニンまたはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、創傷治癒用薬学組成物。
【請求項９】
人参由来の糖リポタンパク質ジントニンまたはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、血管平滑筋増殖に関連する疾患の予防および治療のための薬学組成物。
【請求項１０】
前記血管平滑筋増殖に関連する疾患は手術後の血管狭窄症または再発狭窄症であることを特徴とする、請求項９に記載の薬学組成物。
【請求項１１】
人参由来の糖リポタンパク質ジントニンまたはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、炎症の予防および治療のための薬学組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人参から分離同定した糖リポタンパク質たるジントニン（ｇｉｎｔｏｎｉｎ）の新規用途に係り、さらに詳しくは、ヒトを含む動物の体内に存在する内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）物質たるリゾホスファチジン酸（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ、ＬＰＡ）受容体に作用する天然薬用植物由来リガンド、並びにＬＰＡ受容体に関連した疾患などの予防および治療剤として機能する、人参糖リポタンパク質ジントニンに関する。
【背景技術】
【０００２】
人参は、一般に、長寿／生命延長のための強壮剤、または適応促進薬（ａｄａｐｔｏｇｅｎｉｃ ａｇｅｎｔ）として昔から利用されており、各種ストレス、疲労、疾病、癌および糖尿病に対抗して生体機能を向上させる。このような人参は、韓国だけでなく、中国、日本でも千年以上使われてきたが、最近世界で費やされる最も有名な薬草の一つである(Tyler, J. Pharm. Technol. 11, 214-220, 1995)。
人参成分の中でも、人参サポニンと呼ばれるジンセノサイド（Ｇｅｎｓｅｎｏｓｉｄｅｓ）は、１９６０年代初めに分離され、生理学的／薬理学的研究において代表的な成分として知られた後で多くの研究に用いられてきた(Shibata, et al. Tetraheadron Letters 1962, 1239-1245, 1963; Wagner-Jauregg and Roth, Pharm Acta Helv 37, 352-357, 1962)。この他にも、最近の研究では、人参には多糖類（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）、ポリアセチレン類（ｐｏｌｙａｃｅｔｙｌｅｎｅｓ）、水溶性タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）など、知られていない他の成分が含有されていることが明らかになった(Nah, Kor. J. Ginseng Sci. 21, 1-12, 1997)。
【０００３】
これに先立ち、本発明者は、糖、脂肪およびタンパク質成分からなっている新規な糖リポタンパク質（ｇｌｙｃｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）を人参から分離同定することに成功し、その糖リポタンパク質をジントニン（ｇｉｎｔｏｎｉｎ）と命名した。ジントニンは、公知の人参ジンサポニン（ジンセノイド）とは異なり、未だ確認／解明されていない細胞膜タンパク質との相互作用によるシグナル経路（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ）を介してその活性が現れるものと明らかになった。例えば、マウスＥＡＴ（Ｅｈｒｌｉｃｈ Ａｓｃｉｔｅｓ Ｔｕｍｏｒ）細胞にジントニンを処理する場合には、Ｇタンパク質共役受容体（Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、ＧＰＣＲｓ或いは７ＴＭ受容体）が活性化されるときのシグナル伝達経路のようにホスホリパーゼＣ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｃ、ＰＬＣ）に連結されているシグナル伝達経路を介して細胞質内遊離Ｃａ２＋（Ｆｒｅｅ Ｃａ２＋）の増加を一時的に誘発し、アフリカツメガエル卵母細胞 （Ｘｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓ）にジントニンを処理する場合には、ＰＴＸ非感受性Ｇタンパク質→ＰＬＣ→ＩＰ３→カルシウム貯蔵庫たる小胞体（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ、ＥＲ）におけるカルシウム放出を介してカルシウム依存性塩素チャネル（Ｃａ２＋ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ Ｃｈａｎｎｅｌ、ＣａＣＣ）が活性化されることを解明した(Pyo et al., J Ginseng Res, 35, 92-103, 2011)。
【０００４】
細胞内カルシウム（Ｃａ２＋）は、２次メッセンジャー（２ｎｄ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ）であって、ヒトを含む動物において多様な生理活性作用を果たすものと知られている。簡単な例を挙げると、細胞内における基本的なカルシウムの役割は、細胞膜の興奮性調節、神経伝達物質／ホルモンの放出および分泌、類似核分裂、シナプシスの柔軟性および各種カルシウムに依存する酵素活性化、並びにイオン通路の調節に関与する。細胞内カルシウムが他方（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）に移動するｇｌｏｂａｌ Ｃａ２＋ ｗａｖｅがある場合には受精（ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）、平滑筋、骨格筋肉、心臓筋肉などの各種筋肉の収縮、肝臓の代謝促進、遺伝子転写（ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）刺激、細胞増殖（ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）に関与する。
【０００５】
また、細胞と細胞との間（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ）でカルシウムが移動するｇｌｏｂａｌ Ｃａ２＋ｗａｖｅがある場合、創傷治癒促進、胆汁／インスリンの分泌、および一酸化窒素（ＮＯ）の生成促進に関与すると知られている(Berridge et al., Natuare 395. 645-648, 1998)。
細胞内で必要とする細胞内カルシウムの提供は主に２つの経路を介して行われる。第一に、脱分極（ｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）のように興奮性細胞の細胞膜の興奮の際にｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ Ｃａ２＋通路（ｃｈａｎｎｅｌｓ）が活性化されるとき、このイオン通路を介して流入したカルシウムにより細胞内カルシウムが増加し、第二に、細胞外でＧＰＣＲリガンド（ＧＰＣＲ ｌｉｇａｎｄ）がそれに該当するＧＰＣＲに結合する場合、Ｇタンパク質（一般にＧαｑ／１１タンパク質）→ＰＬＣ→ＩＰ３受容体→ＥＲ Ｃａ２＋貯蔵庫→Ｃａ２＋放出経路（ｐａｔｈｗａｙ）を介して細胞質内遊離Ｃａ２＋（Ｆｒｅｅ Ｃａ２＋）の増加を誘導する(Berridge et al., Natuare 395. 645-648, 1998)。
【０００６】
細胞膜Ｇタンパク質共役受容体（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｌｐｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）に作用する神経伝達物質およびホルモンなどのリガンドによる一時的遊離Ｃａ２＋の増加を誘導する細胞膜シグナル伝達過程は、普遍的にＧαｑ／１１タンパク質→ＰＬＣ→ＩＰ３受容体→ＥＲ Ｃａ２＋貯蔵庫→Ｃａ２＋放出を介して細胞内カルシウムを増加させるシグナル伝達過程に連結されているシグナル伝達経路を介して行われる(Berridge et al., Nature 395. 645-648, 1998)。
前述したように、動物細胞にジントニンを処理する場合、Ｇαｑ／１１タンパク質→ＰＬＣ→ＩＰ３受容体→ＥＲ Ｃａ２＋貯蔵庫→Ｃａ２＋を増加させるシグナル伝達経路を介して細胞質内遊離Ｃａ２＋の増加を誘発する現象を示しているが、ジントニンが細胞質内遊離Ｃａ２＋の増加を誘発するために、細胞膜に存在するどの種類のタンパク質（受容体）と相互作用するかについては未だ解明されていない。
【０００７】
一方、グリセロール（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ−）およびスフィンゴシンベースリン脂質（ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ）は、細胞膜に非常に豊富であり、主に膜を構成する構造的な成分である。また、これらの成分は血液にも存在し、代謝過程を経る場合、一部はリゾリン脂質（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ）が形成される(Okudaira et al., Biochimie 92, 698-706. 2010)。
例えば、これらのリゾリン脂質にはリゾホスファチジルコリン（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｌｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ＬＰＣ）があるが、ＬＰＣがオートタキシン（ａｕｔｏｔａｘｉｎ）としても知られているリゾホスホリパーゼＤ（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄ）という酵素の作用を受けてリゾホスファチジン酸（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ、ＬＰＡ；１− ｏｒ ２−ａｃｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏｌ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が生成される(Aoki, Seminars Cell & Dev. Biol. 15, 477-489, 2004; Okudaira et al., Biochimie 92, 698-706. 2010)。
【０００８】
初期にはＬＰＡが血小板の活性の際に生成されるものと知られ、止血、創傷治癒および組織再生に関連があると報告されたが、最近の研究によれば、ＬＰＡは血小板の他に血漿、血清（ｓｅｒｕｍ）、唾液、精液（ｓｅｍｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ）、卵胞液（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｆｌｕｉｄ）などで１〜５μＭ程度存在すると知られている(Aoki, Seminars Cell & Dev. Biol. 15, 477-489, 2004)。また、脂肪細胞、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、脳および各種器官などの多様な細胞に広く分布すると明らかになった(Pages et al., Prostaglandins 64, 1-10, 2001)。
【０００９】
血液に存在するＬＰＡは、主に血漿タンパク質（例えば、アルブミン）と結合する場合にさらに安定し、主に血漿タンパク質（主にアルブミン）と結合して血液循環の際に血漿タンパク質と共に循環しながら、ターゲット臓器に存在するＬＰＡ受容体と結合してその効果を発揮する(Croset et al., Biochem J 345, 61-67, 2000)。ＬＰＡのリン酸基（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｒｏｕｐ）とグリセロール骨格（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｂａｃｋｂｏｎｅ）部位がＬＰＡ作用に重要な役割を果たし(Jalink et al., Biochem J. 307, 609-615, 1995)、リン酸基が血液中に存在するＬＰＡは１〜５μＭ程度で存在しても、血液または細胞膜にあるリゾリン脂質ホスファターゼ（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）という酵素によってＬＰＡのリン酸基が最も短時間で除去されてＬＰＡが不活性化されるため、酵素の影響を受けて容易に代謝されず長期間作用するＬＰＡ類似体（ＬＰＡ ａｎａｌｏｇｓ）の合成または開発に関する多くの研究を行っているが、臨床的応用に適した化合物は未だ発見されていない(Pilquil et al., Prostaglandins. 64, 83-92, 2001; Brindley and Pilquil, J Lipid Res. 50 SupplS225-230, 2009; Croset et al., Biochem J 345. 61-67, 2000; Deng et al., Gastroenterology 132. 1834-1851, 2007)。
【００１０】
ＬＰＡは、単純な脂質の一つであって、細胞質（ｃｙｔｏｐｌａｓｍ）において２次メッセンジャーとして役割を果たすが、さらに重要なことは、ＬＰＡがリゾホスファチジン酸（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ、ＬＰＡ）および脊椎動物の細胞膜タンパク質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）と相互作用して細胞の生理学的／薬理学的作用を発揮することであるが、ＬＰＡが結合して作用する受容体は大脳発生期に神経細胞が最初新生する（ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｉｃ）部位たる脳の脳室帯（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｚｏｎｅ）で最初にクローニング（ｃｌｏｎｉｎｇ）が確認された(Hecht et al., 135, 1071-1083, 1996)。
前記ＬＰＡ受容体は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲｓ）の一つであり、内皮分化遺伝子系受容体（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ（ＥＤＧ）ｆａｍｉｌｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）とは塩基配列（ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）およびタンパク質相同性（ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）が多いものと示され、初期にはＥＤＧ ｆａｍｉｌｙに大きく分類され、さらに多くの研究を介してＬＰＡ受容体とＳ１Ｐ受容体のｓｕｂｆａｍｉｌｉｅｓに分類された(Chun J et al., Pharmacol Rev. 62, 579-587, 2010)。また、ＬＰＡ受容体はさらに６種類のｓｕｂｔｙｐｅｓに分けられている(Chun J et al., Pharmacol Rev. 62, 579-587, 2010)。
【００１１】
現在までＬＰＡ１〜ＬＰＡ６受容体に分類されており、特にＬＰＡ１とＬＰＡ２受容体は脳に多く分布して脳の発生（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、脳回（ｇｙｒｕｓ）形成および神経細胞の新生（ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）に関与していることが知られている(An et al., J Biol Chem 283, 7906-7910, 1998)。
ＬＰＡ１とＬＰＡ２を含む他のＬＰＡ受容体は、他のＧＰＣＲｓに比べて大脳発生から成体に至るまで、ヒトを含む脊椎動物のほぼ全ての臓器に広く分布しており、これらのＬＰＡ受容体は、ほぼ全ての臓器（心血管系、神経系、内分泌系、生殖器系、免疫系）で多種の生理学的、薬理学的作用を果たす(Skoura and Hla, J Lipid Res. 50, S293-S298, 2009)。
さらに詳しくは、ＬＰＡがＧＰＣＲｓの一つであるＬＰＡ１〜ＬＰＡ６受容体に結合してそれぞれの受容体を活性化させる場合、細胞分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）、細胞移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎおよびｍｏｔｉｌｉｔｙ）、細胞形態（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）変化、細胞増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、細胞生存（ｓｕｒｖｉｖａｌ）、血管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、炎症（ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）、血小板凝集（ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）、およびその他の多様な種類の生理学／薬理学的作用を調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）すると知られている(Toman and Spiegel, Neurochemical Research 27, 619-627, 2002; Gardall et al., 2006)。
【００１２】
このようなＬＰＡ受容体は、多様な臓器で多様な生理学的作用を果たすため、ＬＰＡ受容体の作用に関連した医薬品の開発のための重要なターゲットとなっているが、未だ脊椎動物の血液または細胞質から発見され、ＬＰＡ分解酵素によって代謝／分解されて不活性化（ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）され易いＬＰＡの他には、ＬＰＡ受容体に作用するリガンド（特に、植物に由来するリガンド）は未だ報告されたことがない(Tigyi, Br J Pharmacol 161, 241-270, 2010)。
これらの受容体の活性に関与する最も重要な共通的特徴の一つは、ＬＰＡがＬＰＡ１〜ＬＰＡ６受容体に結合してそれぞれの受容体を活性化させる場合、多様な種類のＧＴＰ結合タンパク質（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ；Ｇαｉ/０、Ｇαｑ/１１、Ｇα１２/１３およびＧαｓ）と結合して多様なエフェクター系（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍｓ）に連係し、多様な生理学的作用を発揮することである(Yoshida and Ueda, Jpn J Pharmacol 87, 104-109, 2001)。
【００１３】
例えば、ＰＬＣが活性化され、次いで細胞質内遊離Ｃａ２＋の増加を誘発するが(Toman and Spiegel, 2002; Dubbin et al., J Neurosci 30, 7300-7309, 2010)、細胞質内遊離Ｃａ２＋は、既に２次メッセンジャーであって、上述のように生体信号（ｌｉｆｅ ｓｉｇｎａｌ）として各種酵素活性と遺伝子転写に至るまで多くの種類の生理活性作用を発揮すると知られているため(Berridge et al., Nature 395. 645-648, 1998)、ＬＰＡ１〜ＬＰＡ６受容体に作用するＬＰＡリガンドによる細胞質内遊離Ｃａ２＋増加作用が前述のＬＰＡ受容体の活性による多様な種類の生理活性作用に関与すると考えられている。但し、ＬＰＡ６受容体は、活性化される場合、細胞質内遊離Ｃａ２＋増加作用よりもアデニルシクラーゼ活性（ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）に連係していると報告された(Yanagida et al., J Biol Chem 284, 17731-17741, 2009)。
【００１４】
ＬＰＡ受容体がノックアウト（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）された動物についての研究結果、ＬＰＡ受容体が、胎仔の脳を含む多様な臓器の発達に影響を及ぼすと知られている。例えば、ＬＰＡ１受容体がノックアウトされた動物で脳の形成が正常的に行われずに死産してしまい(Choi et al., Biochim Biophys Acta 1781, 531-539, 2008)、また、生殖器の場合、雌では妊娠の際に胎仔の着床がうまく行われるものの、胎仔の数は減る現象が現れると報告されており、その他の多様な副作用があると知られている。ＬＰＡ３受容体がノックアウトされた動物の雄では精粗（ｔｅｓｔｉｓ）の発育と精子の形成がうまく行われないと知られている(Choi et al., Biochemica Biophysica Acta 1781, 531-539, 2008; Ye X. Hum Reprod Update. 2008 14, 519-536, 2008)。
【００１５】
本発明者は、ジントニンを動物細胞に処理する場合、最も低い濃度でもＧタンパク質→ＰＬＣ→ＩＰ３受容体→ＥＲ Ｃａ２＋貯蔵庫→Ｃａ２＋放出はＣａ２＋の増加につながる経路を介して細胞質内遊離Ｃａ２＋の増加を誘発するという根拠の上で、動物細胞膜ＧＰＣＲｓタンパク質のうちどの受容体を介して作用するかを確認するために多種の公知のＧタンパク質→ＰＬＣ→ＩＰ３受容体→ＥＲ Ｃａ２＋貯蔵庫→Ｃａ２＋放出経路を持つＧＰＣＲｓ遺伝子およびリガンドが、知られていない多種のオーファン（ｏｒｐｈａｎ）ＧＰＣＲｓ遺伝子をトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）および発現させた後、ジントニンの作用を検証した結果、ジントニンがＥＤＧ系統（ｆａｍｉｌｙ）受容体のうちＬＰＡ１（ｅｄｇ−２）、ＬＰＡ２（ｅｄｇ−４）、ＬＰＡ３（ｅｄｇ−７）、ＬＰＡ４およびＬＰＡ５受容体を活性化させ、百日咳毒素感受性および非感受性Ｇタンパク質→ＰＬＣ→ＩＰ３受容体→ＥＲ Ｃａ２＋貯蔵庫→Ｃａ２＋放出を介して細胞質内遊離Ｃａ２＋の増加を誘発する新規な人参由来生理活性リガンドであることを見出し、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
そこで、本発明の主な目的は、人参から分離同定した糖リポタンパク質たるジントニン（ｇｉｎｔｏｎｉｎ）の新規用途を提供することにある。
また、本発明の他の目的は、ジントニンの、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）受容体に関連した疾患などの予防、改善および治療剤としての用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記目的を達成するために、本発明は、人参から分離同定した糖リポタンパク質たるジントニンのリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）受容体に対する天然薬用植物由来リガンドとしての新規用途を提供する。
また、本発明は、人参由来の糖リポタンパク質ジントニンとＬＰＡ受容体との相互作用を確認する方法を提供する。
また、本発明は、人参由来の糖リポタンパク質ジントニンの、ＬＰＡ受容体の活性を増加させることにより細胞内のカルシウム濃度を効果的に増加させる、様々なカルシウム依存生理活性または／およびカルシウム濃度の低下に起因した疾患の予防、改善および治療剤としての用途を提供する。
【発明の効果】
【００１８】
上述したような本発明によれば、人参に存在する糖リポタンパク質たるジントニンがリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）受容体との相互作用を介してその生理学的、薬理学的にその効能を発揮する効果がある。
特に、ＬＰＡ受容体との相互作用により一連のシグナル伝達過程を活性化させて一時的に細胞質内遊離Ｃａ２＋の増加を誘発し、細胞内カルシウム濃度の一時的な増加により、これらのＬＰＡ受容体を発現する神経系、心血管系、内分泌系、生殖器系、消火器系、免疫系などを含む各種臓器において一時的に細胞内カルシウム濃度を増加させて生理活性作用を発揮することにより、カルシウムに依存する各種生理活性（例えば、強壮作用、免疫力増加、性機能強化、血管新生、抗糖尿作用など）および薬理活性の促進と、カルシウム濃度の低下に起因する各種疾患の予防、改善および治療に有用に使用できる。
また、本発明の組成物は、カルシウム不足による成長阻害などの予防、改善および治療にも効果を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明のジントニンのメタノール抽出前と後の透析膜の内部および外部に存在する成分に対する電気泳動後のクマシブルー染色結果を示す（ｌａｎｅ１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋ；ｌａｎｅ２、メタノール抽出前のジントニン；ｌａｎｅ３、メタノール抽出後の透析膜内部透析液；ｌａｎｅ４、メタノール抽出後の透析膜外部透析液）。
【図２】Ａは空ベクター（ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒ）、Ｈａｅｍａｔｏｇｌｕｔｉｎ（ＨＡ）−ｔａｇｇｅｄ ＬＰＡ１、ＨＡ−ｔａｇｇｅｄ ＬＰＡ２、およびＨＡ−ｔａｇｇｅｄ ＬＰＡ３受容体をＢ１０３細胞に一時的トランスフェクションさせた後、ＬＰＡ受容体のタンパク質発現をウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）で検証したものであり、Ｂは空ベクター、ＨＡ−ｔａｇｇｅｄ ＬＰＡ１、ＨＡ−ｔａｇｇｅｄ ＬＰＡ２、およびＨＡ−ｔａｇｇｅｄ ＬＰＡ３受容体をＢ１０３細胞に一時的トランスフェクションさせた後、ＨＡに対する１次抗体、および蛍光物質たるＣｙ３−コンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）された２次抗体を用いて、これらのＬＰＡ１、ＬＰＡ２およびＬＰＡ３受容体タンパク質の細胞膜発現を共焦点レーザー顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で検証したものである。
【図３】Ａは空ベクター、ＬＰＡ１（Ｌ１）、ＬＰＡ２（Ｌ２）、ＬＰＡ３（Ｌ３）、ＬＰＡ４（Ｌ４）、ＬＰＡ（Ｌ５）およびＬＰＡ６（Ｌ６）受容体をＢ１０３細胞に一時的トランスフェクションさせた後、ジントニン（１μｇ／ｍＬ）処理による細胞内カルシウム濃度の変化を示すものであり（＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．００１、空ベクター対比；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１、ＬＰＡ３受容体対比）、ＢはＬＰＡ受容体の他に、ＬＰＡによって活性化されるＧＰＲ３、ＧＰＲ８７、脂肪酸受容体として知られているＧＰＲ４０、ＧＰＲ４１、ＧＰＲ４３、ＧＰＲ１２０、Ｓ１Ｐ１およびＳ１Ｐ２受容体をＢ１０３細胞に一時的トランスフェクションさせた後、ジントニン（１μｇ／ｍＬ）処理による細胞内カルシウム濃度の変化を示すものである（＊ｐ＜０．００１、ＬＰＡ３受容体細胞発現対比）。
【図４】Ａは空ベクター或いはＬＰＡ３受容体をＢ１０３細胞に一時的トランスフェクションさせた後、濃度別ＬＰＡ処理による細胞内カルシウム濃度の変化を示すものであり、Ｂは空ベクター、ＬＰＡ１、ＬＰＡ２、ＬＰＡ３、ＬＰＡ４、ＬＰＡ５およびＬＰＡ６受容体をＢ１０３細胞に一時的トランスフェクションさせた後、濃度別ジントニン処理による細胞内カルシウム濃度の変化を示すものであり、Ｃは空ベクター、ＬＰＡ３またはＬＰＡ６受容体をＢ１０３細胞に一時的トランスフェクションさせた後、濃度別ジントニン処理によるｃＡＭＰの変化を示すものである。
【図５】Ａは空ベクター或いはＬＰＡ３受容体をＢ１０３細胞に一時的トランスフェクションさせた後、ジンセノサイドＲｂ１、ジンセノイドＲｇ１、ジンセノサイドＲｇ３或いはジントニン処理による細胞内カルシウム濃度の変化を示すものであり（＊ｐ＜０．００１、ジントニン（ＧＴ）処理ＬＰＡ３受容体細胞発現対比）、Ｂは空ベクター或いはＬＰＡ３受容体をＢ１０３細胞に一時的トランスフェクションさせた後、ジンセノサイドＲｂ１、ジンセノサイドＲｇ１の存在下でジントニン処理によるカルシウム濃度の変化を示すものである。
【図６】ＡはＬＰＡ１、ＬＰＡ２、ＬＰＡ３或いはＬＰＡ５受容体をＢ１０３細胞に一時的トランスフェクションさせた後、ＰＴＸを処理していないグループとＰＴＸを処理しているグループとの間でジントニン（１μｇ／ｍＬ）処理によるカルシウム濃度の変化を示すものであり、Ｂは前記Ａのヒストグラムである（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１、ＰＴＸ未処理対比）。
【図７】ＡはＬＰＡ１受容体をＢ１０３細胞に一時的トランスフェクションさせた後、ＬＰＡ受容体拮抗剤（Ｋｉ１６４２５）、ＰＬＣ抑制剤（Ｕ７３１２２）、ＩＰ３受容体拮抗剤（２−ＡＰＢ）、或いは細胞内カルシウムキレート剤（ｃｈｅｌａｔｏｒ）（ＢＡＰＴＡ）処理後、およびＣａ２＋遊離緩衝液におけるジントニン処理によるカルシウム濃度の変化を示すものであり（＊ｐ＜０．００１、ジントニン（ＧＴ）処理対比）、ＢはＬＰＡ３受容体をＢ１０３細胞に一時的トランスフェクションさせた後、ＬＰＡ受容体拮抗剤（Ｋｉ１６４２５）、ＰＬＣ抑制剤（Ｕ７３１２２）、ＩＰ３受容体拮抗剤（２−ＡＰＢ）、或いは細胞内カルシウムキレート剤（ＢＡＰＴＡ）処理後、およびＣａ２＋遊離緩衝液におけるジントニン処理によるカルシウム濃度の変化を示すものである（＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００１、ジントニン（ＧＴ）処理ＬＰＡ３受容体細胞発現対比）。
【図８】野生型ＬＰＡ３受容体、Ｒ３．２８Ａ突然変異ＬＰＡ３受容体、或いはＷ４．６４Ａ突然変異ＬＰＡ３受容体をＢ１０３細胞に一時的トランスフェクションさせた後、ジントニン処理によるカルシウム濃度の変化を示すものである（＊ｐ＜０．００１、野生型ＬＰＡ３受容体対比）。
【図９】ＮＭＤＡ受容体を発現するＸｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓにジントニンを処理する場合のＮＭＤＡ受容体活性増加誘導を確認したものであって、ＡはＮＭＤＡ受容体を発現するＸｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓにＮＭＤＡ（３００μＭ）を処理する場合、ＮＭＤＡ受容体の活性による内向き電流（ｉｎｗａｒｄ ｃｕｒｒｅｎｔ）が誘導され、回復された後でジントニン（１μｇ／ｍＬ）を処理すると、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓに内因性に存在するＬＰＡ受容体の活性を通じてＣａＣＣが活性化されたことを確認することができ、次いでさらにＮＭＤＡを処理する場合にはジントニン処理前よりさらに大きい内向き電流が誘導されるため、ジントニンの処理はＮＭＤＡ受容体活性の増加を誘導することを確認することができ、ＢはジントニンによるＮＭＤＡ受容体活性増加がジントニンの投与濃度に依存的であることを示しており、ＣはジントニンによるＮＭＤＡ受容体活性増加に対する濃度反応曲線（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｃｕｒｖｅ）である。
【図１０】ジントニン（１μｇ／ｍＬ）によるＮＭＤＡ受容体活性増加作用がＬＰＡ１およびＬＰＡ３受容体拮抗剤たるＫｉ１６４２５の処理によって遮断されることを確認したものであって、ＡはＫｉ１６４２５（１０μＭ）がジントニンによるＮＭＤＡ受容体活性増加作用を遮断することに対する代表的なトレースであり、ＢはＫｉ１６４２５がジントニンによるＮＭＤＡ受容体活性増加作用を遮断することに対する要約ヒストグラムである（＊ｐ＜０．０１、対照群（Ｃｏｎ）対比）。
【図１１】ジントニン（１μｇ／ｍＬ）によるＮＭＤＡ受容体活性増加作用に対するｕｐ−ｓｔｒｅａｍ細胞膜シグナル伝達過程を示すものであって、Ａは活性ＰＬＣ抑制剤Ｕ７３１２２（１μＭ）がジントニンによる内因性ＣａＣＣ活性およびＮＭＤＡ受容体活性増加作用を遮断することを示し、ＢはＩＰ３受容体拮抗剤たる２−ＡＰＢ（１００μＭ）がジントニンによる内因性ＣａＣＣ活性およびＮＭＤＡ受容体活性増加作用を遮断することを示し、ＣはＸｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓにＣａ２＋キレート剤たるＢＡＰＴＡ（１００μＭ、３ｈ処理）がジントニンによる内因性ＣａＣＣ活性およびＮＭＤＡ受容体活性増加作用を遮断することを示し、ＤはＵ−７３１２２、２−ＡＰＢ或いはＢＡＰＴＡ処理がジントニンによるＮＭＤＡ受容体活性増加作用を遮断することに対する要約ヒストグラムである（＊ｐ＜０．０１、対照群（Ｃｏｎ）対比）。
【図１２】ジントニンによるＮＭＤＡ受容体活性増加作用に対するｄｏｗｎ−ｓｔｒｅａｍシグナル伝達過程を示すものであって、Ａはタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）のリン酸化部位（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ）の一つであるＳ１３０８のセリン（ｓｅｒｉｎｅ）をアラニン（ａｌａｎｉｎｅ）（Ｓ１３０８Ａ）で突然変異させる場合、ジントニンの作用が抑制されることを示し （＊ｐ＜０．０１、対照群対比、＃ｐ＜０．０１、ｏｏｃｙｔｅｓｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｍｕｔａｎｔ Ｓ１３１２Ａ受容体対比）、Ｂはチロシンキナーゼ抑制剤（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）として知られているゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）（１０μＭ）の処理でジントニンによるＮＭＤＡ受容体活性増加作用を遮断することを示し（＊ｐ＜０．０１、対照群対比）、Ｃは活性（Ａｃｔｉｖｅ）Ｓｒｃ系統キナーゼ抑制剤（Ｓｒｃ−ｆａｍｉｌｙ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）たるＰＰ３はジントニンによるＮＭＤＡ受容体活性増加作用を抑制するが、不活性（ｉｎａｃｔｉｖｅ）Ｓｒｃ系統キナーゼ抑制剤たるＰＰ２はジントニンによるＮＭＤＡ受容体活性増加作用を抑制しないことを示し（＊ｐ＜０．０１、対照群対比）、ＤはＸｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓに活性或いは不活性ＲＰＴＰ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ α）を発現させた後、ジントニンによるＮＭＤＡ受容体活性増加作用が活性ＲＰＴＰの発現された細胞で遮断されたことを示す（＊ｐ＜０．０１、対照群対比）。
【図１３】ジントニンによる海馬切片長期増強（ＬＴＰ）の誘導程度を確認したものである（赤い矢印：ｔｈｅｔａ ｂｕｒｓｔ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ（ＴＢＳ）刺激開始時間）。
【図１４】ジントニンによる白色ラット海馬ＬＴＰ誘導増加に対する対照群と濃度別ジントニン投与群との間の時間別ｆｉｅｌｄ ｔｒａｃｅｓを示したものであり、対照群およびジントニン投与群のＴＢＳ（２０分）前の代表的ｆｉｅｌｄ ｔｒａｃｅ、およびＴＢＳを与えてから８０分後に生じたｆｉｅｌｄ ｔｒａｃｅである。
【図１５】ジントニンによる白色ラット海馬ＬＴＰ誘導に対する濃度別増加要約ヒストグラムである（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、対照群対比）。
【図１６】ジントニンによる長期記憶障害改善効能に対する受動的回避反応実験（ｐａｓｓｉｖｅ ａｖｏｉｄａｎｃｅ ｔｅｓｔ）の結果であって、ジントニン投与濃度別にスコポラミンによる長期記憶（ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｍｅｍｏｒｙ）障害を防御する効能があることを示している（＊ｐ＜０．０００１、スコポラミンを投与していないグループ；＊ｐ＜０．０１、ジントニンを投与していないグループ；陽性対照群として使用したタクリン結果は図示せず。）。
【図１７】ジントニンによる空間認知記憶および単純空間記憶障害改善効能に対するモリス水迷路実験（ｍｏｒｒｉｓ ｗａｔｅｒ ｍａｚｅ ｔｅｓｔ）の結果であって、図１７ａはジントニンが投与濃度別にスコポラミンによる空間認知記憶障害を防御する効能を持つことを確認することができ（＊ｐ＜０．０１、スコポラミン投与群のｄａｙ１と比較するとき；＃ｐ＜０．００１、スコポラミンのみ投与したグループと比較するとき；陽性対照群として使用したタクリンの結果は図示せず。）、図１７ｂはプラットフォームがあったクワドラント（ｑｕａｄｒａｎｔ）近くにおける水泳時間（ｓｗｉｍｍｉｎｇ ｔｉｍｅ）である（＃ｐ＜０．００１、ジントニンとスコポラミンを投与していないグループ；＊ｐ＜０．０１、ジントニンを投与していないグループ）。
【図１８】白色ラットから分離された副腎からのカテコールアミン分泌（ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）実験を示す図である。
【図１９】ジントニン処理によるカテコールアミンの分泌増加を示したものであって、それぞれ異なる濃度のジントニンを処理した後、１５分間隔で４分間灌流液（ｐｅｒｆｕｓａｔｅ）を収集し、括弧内の数字は使用した副腎の個数であり、縦軸は４分間分泌されたカテコールアミンの量（ｎｇ／ｐｅｒｆｕｓａｔｅ）であり、横軸は灌流液を収集した時間である。
【図２０】アセチルコリン処理によって分泌されるカテコールアミンに対するジントニンの効果であって、アセチルコリン（５．３２ｍＭ）の１回処理が様々な異なる濃度のジントニンによるカテコールアミンの放出に対する影響を示すものである（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ｎｓ：統計的に有意性がない）。
【図２１】ＡはジントニンによるＸｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓに発現したＢＫＣａＫ＋イオン通路の外向き（ｏｕｔｗａｒｄ）ＢＫＣａＫ＋イオン電流を投与濃度別に示すものであり、ＢはジントニンによるＢＫＣａＫ＋イオン通路の増加に対する濃度反応曲線（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｃｕｒｖｅ）である。
【図２２】ジントニンによるＢＫＣａＫ＋イオン通路活性作用がＬＰＡ１およびＬＰＡ３受容体拮抗剤たるＫｉ１６４２５処理によって遮断されることを示すものであって、ＡはＫｉ１６４２５（１０μＭ）がジントニンによるＢＫＣａＫ＋イオン通路活性作用を遮断することに対する代表的なｔｒａｃｅであり、ＢはＫｉ１６４２５がジントニンによるＢＫＣａＫ＋イオン通路活性作用を遮断することに対する要約ヒストグラムである（＊ｐ＜０．０１、対照群（Ｃｏｎ）対比）。
【図２３】ジントニンおよびジンセノサイドＲｇ３によるＢＫＣａＫ＋イオン通路活性作用に対する活性および不活性ＰＬＣ抑制剤の影響を示すものであって、Ａは活性ＰＬＣ抑制剤Ｕ７３１２２（１μＭ）に影響されたジントニンとジンセノサイドＲｇ３によるＢＫＣａＫ＋イオン通路活性作用に対する時間と電流の関係（ｔｉｍｅ−ｃｕｒｒｅｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）（左）および代表的なｔｒａｃｅｓ（右）であり、Ｂは不活性ＰＬＣ抑制剤Ｕ７３３４３に影響されたジントニンとジンセノサイドＲｇ３によるＢＫＣａＫ＋イオン通路活性作用に対する時間と電流の関係（左）と代表的なｔｒａｃｅｓ（右）であり、ＣはＵ７３１２２（１μＭ）がジントニンによるＢＫＣａＫ＋イオン通路活性作用を遮断することに対する要約ヒストグラム（＊ｐ＜０．０１、対照群（Ｃｏｎ）対比）であり、ＤはＹ７３３４３（１μＭ）がジントニンによるＢＫＣａＫ＋イオン通路活性作用を遮断することに対する要約ヒストグラムである（ａ．ジントニン投与前；ｂ．ジントニン投与；ｃ．ジンセノサイドＲｇ３投与；ｄ．薬物洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ ｏｕｔ）後）。
【図２４】ジントニンおよびジンセノサイドＲｇ３によるＢＫＣａＫ＋イオン通路活性作用に対するＩＰ３受容体拮抗剤およびカルシウムキレート剤（ｃｈｅｌａｔｏｒ）の影響を示すものであって、ＡはＩＰ３受容体拮抗剤２−ＡＰＢ（１００μＭ）に影響されたジントニンとジンセノサイドＲｇ３によるＢＫＣａＫ＋イオン通路活性作用に対する時間と電流の関係（左）と代表的なｔｒａｃｅｓ（右）であり、Ｂはカルシウムキレート剤たるＢＡＰＴＡ−ＡＭに影響されたジントニンとジンセノサイドＲｇ３によるＢＫＣａＫ＋イオン通路活性作用に対する時間と電流の関係（左）と代表的なｔｒａｃｅｓ（右）であり、Ｃは２−ＡＰＢ（１００μＭ）がジントニンによるＢＫＣａＫ＋イオン通路活性作用を遮断することに対する要約ヒストグラム（＊ｐ＜０．０１、対照群（Ｃｏｎ）対比）であり、ＤはＢＡＰＴＡ（１００μＭ、３ｈ）がジントニンによるＢＫＣａＫ＋イオン通路活性作用を遮断することに対する要約ヒストグラムである（ａ．ジントニン投与前；ｂ．ジントニン投与；ｃ．ジンセノサイドＲｇ３投与；ｄ．薬物洗浄後）。
【図２５】ジントニンおよびジンセノサイドＲｇ３によるＢＫＣａＫ＋イオン通路活性作用に対するＰＫＣ活性剤（ａｃｔｉｖａｔｏｒ）の影響を示すものであって、ＡはＰＭＡ（１μＭ）に影響されたジントニンとジンセノサイドＲｇ３によるＢＫＣａＫ＋イオン通路活性作用に対する時間と電流の関係（下）と代表的なｔｒａｃｅｓ（上）であり、ＢはＰＭＡ（１００ｎＭ、３ｈ）がジントニンによるＢＫＣａＫ＋イオン通路活性作用を遮断することに対する要約ヒストグラムである（ａ．ジントニン投与前；ｂ．ジントニン投与；ｃ．ジンセノサイドＲｇ３投与；ｄ．ジンセノサイドＲｇ３投与後）。
【図２６】創傷治癒（ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ）に対するジントニン効果を示すものであって、Ａは培養されたＨＵＶＥＣｓにピペットチップ（ｐｉｐｅｔｔｅ ｔｉｐ）で掻き傷（ｓｃｒａｔｃｈｉｎｇ ｗｏｕｎｄ）を誘導して細胞同士の間に傷をつけて間隔を与えたとき、２０時間後、対照群（Ｃｏｎ）は空間が満たされないが、ジントニン（３０μｇ／ｍＬ）を処理した場合は空き空間が満たされることを示し、Ｂはジントニンを処理していないグループ（ｃｏｎｔｒｏｌ）とジントニンを処理しているグループ間の時間と創傷治癒の関係を示すものであり、Ｃは対照群とジントニン処理（３０μｇ／ｍＬ）群間の、傷をつけた後、空き空間の面積を計算して空き空間に対する％換算である（＊ｐ＜０．０１、対照群対比、ＶＧ：血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ））。
【図２７】血管形成促進に対するジントニン効果を示すものであって、Ａはジントニン投与濃度別のＢｒ−ＤＵ混成（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を促進することにより、ＨＵＶＥＣｓの増殖を増加させることを示し（＊ｐ＜０．０１、対照群対比）、Ｂはジントニン投与濃度別のＨＵＶＥＣｓの移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）促進を示し（＊ｐ＜０．０１、対照群対比）、ＣはジントニンによるＨＵＶＥＣｓの増殖および移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）促進が新生血管形成促進を誘導することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、人参から分離同定した糖リポタンパク質たるジントニンのリゾホスファチジン酸（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ、ＬＰＡ）受容体ｓｕｂｔｙｐｅｓに対する天然薬用植物由来リガンド（ｌｉｇａｎｄ）としての用途を提供する。
具体的に、本発明は、ＬＰＡ受容体に作用する新規リガンドを提供する。
本発明に係る前記新規リガンドは人参から分離同定した糖リポタンパク質ジントニンであり、前記ジントニンは構成タンパク質が人参メジャーラテックス様タンパク質（ｍａｊｏｒ ｌａｔｅｘ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＭＬＰ１５１）と人参リボヌクレアーゼ様メジャー貯蔵タンパク質（ＲＮＡｓｅ−ｌｉｋｅ ｍａｊｏｒ ｓｔｏｒａｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）からなることを特徴とする。
また、前記人参メジャーラテックス様タンパク質（ＭＬＰ１５１）は、配列番号１〜４のアミノ酸配列を含むことが特徴である。また、前記人参メジャーラテックス様タンパク質（ＭＬＰ１５１）は配列番号５のアミノ酸配列からなり、３箇所のＮ−グリコシル化部位（Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）を有する。
【００２１】
配列番号５：
mgltgklicq tgiksdgdvf helfgtrphh vpnitpaniq gcdlhegefg kvgsvviwny 
sidgnamiak eeivaideed ksvtfkvveg hlfeefksiv fsvhvdtkge dnlvtwsidy
ekl nes vkdp tsyldfllsv trdieahhlp k
【００２２】
この際、前記配列における、下線部分はプロテオーム解析によって得たペプチド断片（配列番号１〜４）に該当する部分であり、斜体のアミノ酸部位はＮ−グリコシル化部位である。
また、前記人参リボヌクレアーゼ様メジャー貯蔵タンパク質（ＲＮＡｓｅ−ｌｉｋｅ ｍａｊｏｒ ｓｔｏｒａｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）は、配列番号６〜１０のアミノ酸配列を含み、配列番号１１のアミノ酸配列からなることが特徴である。
【００２３】
配列番号１１：
mraiyiisvi ivslsifswg gnarsdypwa mfalrlqwpa gfcevnnacd tksllntfti 
hglypynakgtpalycdgta fdvnsvsdfl aemhlawpsh etntediqfw ehewkkhgrc
seallkqtdy frtalafrka fdivgllnqe giypnndlyr pkmikeaikk hlnavpeidf 
tknenseyvl tdinvcvnqq atrfvdcptd datddyrlkf vrlpskmkfa dprtnsii
【００２４】
この際、前記配列における下線部分はプロテオーム解析によって得たペプチド断片（配列番号６〜１０）に該当する部分である。
また、前記ジントニンは、ＬＰＡ受容体の作用剤として活性を有することが特徴である。
本発明において、前記ジントニンは水参、白参、紅参、長脳参、培養参および山参などの根、茎および葉などから分離することができ、人参は西洋参、中国人参および高麗人参（Ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ Ｃ．Ａ．Ｍｅｙｅｒ）など全種類の人参を含む。好ましくは、４〜６年根の高麗人参から製造した紅参を使用することが良いが、これに限定されるものではない。
【００２５】
また、本発明は、ジントニンとＬＰＡ受容体との相互作用を確認する方法を提供する。
本発明では、ＬＰＡ系統（ｆａｍｉｌｙ）受容体が、大部分の臓器を構成する細胞に内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）に存在するため、これらの受容体を内因性に含有していないものと知られている細胞（ｎｕｌｌ ｃｅｌｌ）Ｂ１０３ラット神経芽腫細胞（ｒａｔ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌ；Ｂ１０３細胞）を用い(Valentine et al., Biochim Biophys Acta 1780. 597-605)、ＬＰＡ１（ｅｄｇ−２）、ＬＰＡ２（ｅｄｇ−４）、ＬＰＡ３（ｅｄｇ−７）、ＬＰＡ４、ＬＰＡ５およびＬＰＡ６受容体をそれぞれコードする遺伝子を含んでいるプラスミド（ｐｌａｓｍｉｄｓ；ベクター）と含んでいないプラスミド（空ベクター）を、これらの受容体を内因性に発現していない培養されたＢ１０３細胞にそれぞれ一時的トランスフェクション（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させた後、２〜３日後に細胞懸濁（ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）を準備して細胞透過（ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ）させ、カルシウムに結合する蛍光物質Ｆｕｒａ−２ＡＭを処理した後、ジントニンを処理して細胞内遊離Ｃａ２＋（Ｆｒｅｅ Ｃａ２＋）の増加誘発作用を分光蛍光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）を用いて確認することを特徴とする。
【００２６】
具体的に、本発明に係るジントニンがＬＰＡ受容体と相互作用することを確認する方法は、
（１）ＬＰＡ系統（ｆａｍｉｌｙ）受容体遺伝子を含んでいるプラスミド（ｐｌａｓｍｉｄｓ）、および前記受容体を含んでいない空プラスミド（ｅｍｐｔｙ ｐｌａｓｍｉｄ）の増幅および精製過程（ｍａｘｉ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）を介して、空ベクター、およびＬＰＡ系統受容体を含む遺伝子を多量で確保する段階と、（２）ＨＡ（Ｈａｅｍａｔｏｇｌｕｔｉｎ）がタグされたＬＰＡ（ｔａｇｇｅｄ−ＬＰＡ）受容体をＢ１０３細胞にトランスフェクションさせて発現した後、ＨＡに対する１次抗体、および１次抗体に対する２次抗体としてＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）でコンジュゲートされた２次抗体を用いて、発色反応を誘導するウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を施してＬＰＡ受容体タンパク質の発現を検証する段階と、（３）ＨＡ（Ｈａｅｍａｔｏｇｌｕｔｉｎ）がタグされたＬＰＡ受容体をトランスフェクションさせて発現した後、ＨＡに対する１次抗体、および蛍光物質たるＣｙ３−コンジュゲートされた２次抗体を用いて、これら受容体タンパク質の発現を共焦点レーザー顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を用いて検証する段階と、（４）前記空プラスミド、およびそれぞれのＬＰＡ系統受容体を含むプラスミドをＢ１０３細胞にトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）する段階と、（５）２〜３日後、トランスフェクションされたＢ１０３細胞にトリプシン（０．０５％ ｔｒｙｐｓｉｎ ｗｉｔｈ ＥＤＴＡ、ｗ／ｖ）を処理して培養フラスコから細胞懸濁液（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）を準備する段階と、（６）懸濁された細胞にＦｕｒａ−２（２．５μＭ）を処理して培養する段階と、（７）Ｆｕｒａ−２を含有する懸濁細胞を含むキュベットにジントニンを処理して細胞質内遊離Ｃａ２＋の増加を分光蛍光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）で確認し、細胞内カルシウムの増加量を定量する段階とを含む。
【００２７】
また、上記に加えて、（８）ジントニンを処理する前にＬＰＡ受容体拮抗剤（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）およびシグナル伝達関連薬物（例えば、百日咳毒素（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｔｏｘｉｎ）、ＰＬＣ抑制剤、ＩＰ３受容体拮抗剤（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）を前処理した後、ジントニンによる細胞質内遊離Ｃａ２＋の増加作用を遮断し或いは減らすことを検証する段階と、（９）ジントニンがＬＰＡ受容体タンパク質のどのアミノ酸と相互作用してＬＰＡ受容体を活性させるかを部位特異的突然変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）方法を用いて確認するための段階と、（１０）ＬＰＡ受容体の他に、ＬＰＡが活性化させるものとして知られている別のオーファンＧＰＣＲ（ｏｒｐｈａｎ ＧＰＣＲ）たるＧＰＲ３５およびＧＰＲ８７と、遊離脂肪酸ＧＰＣＲ（ｆｒｅｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ＧＰＣＲ）たるＧＰＲ４０、ＧＰＲ４１、ＧＰＲ４３およびＧＰＲ１２０をジントニンが活性化させるか否かを検証する段階とをさらに含むこともできる。
また、本発明は、前記ジントニンの、ＬＰＡ受容体の活性を増加させることにより細胞内のカルシウム濃度を効果的に増加させる、様々なカルシウム依存生理活性または／およびカルシウム濃度の低下に起因した疾患の予防、改善および治療剤としての用途を提供する。
【００２８】
具体的に、本発明は、人参由来の糖リポタンパク質ジントニンまたはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、ＮＭＤＡ受容体活性および海馬ＬＴＰ増進による学習能力向上および記憶増進用薬学組成物を提供する。
また、本発明は、人参由来の糖リポタンパク質ジントニンまたはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、抗ストレス、ストレス抵抗力の増進およびストレスによる疲労の回復促進に役立つ薬学組成物を提供する。
また、本発明は、人参由来の糖リポタンパク質ジントニンまたはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、創傷治癒用薬学組成物を提供する。
また、本発明は、人参由来の糖リポタンパク質ジントニンまたはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、血管平滑筋増殖（ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）に関連する疾患の予防および治療のための薬学組成物を提供する。
また、本発明は、人参由来の糖リポタンパク質ジントニンまたはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、炎症（ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）の予防および治療のための薬学組成物を提供する。
また、本発明は、人参由来の糖リポタンパク質ジントニンまたはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、カルシウム濃度の低下に起因する疾患の予防および治療のための薬学組成物を提供する。
また、本発明は、人参由来の糖リポタンパク質ジントニンまたはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、神経細胞死によって誘発される退行性脳神経系疾患の予防および治療のための薬学組成物を提供する。
【００２９】
本発明において、カルシウム依存性生理活性は強壮作用、免疫力増加、性機能強化、血管新生、抗糖尿作用などがあり、前記血管平滑筋の増殖は手術後の血管狭窄症または再発狭窄症などの疾患を含む。また、前記カルシウム濃度の低下に起因する疾患は、統合失調症（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｅｒｎｉａ）、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ）、ハンチントン病（Ｈｕｎｇｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）、家族性片麻痺性片頭痛（Ｆａｍｉｌｉａｌ ｈｅｍｉｐｌｅｇｉｃ ｍｉｇｒａｉｎｅ）、癲癇（Ｅｉｌｅｐｓｙ）、一過性運動失調症（ｅｐｉｓｏｄｉｃ ａｔａｘｉａ）、脊髄小脳失調症（ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ａｔａｘｉａｓ）などから選ばれる１種以上の疾患を含み、前記神経細胞死によって誘発される退行性脳神経系疾患は脳卒中、中風、記憶喪失、記憶損傷、痴呆、健忘症、パーキンソン病、ピック病、クロイツフェルト・ヤコブ（Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄ−Ｊａｋｏｂ）病などから選ばれる１種以上の疾患を含むが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
人参は長い間生薬として使われてきたものであって、人参から分離した本発明のジントニンも毒性および副作用などの問題が全くない。
本発明のジントニンを含む、様々なカルシウム依存生理活性または／およびカルシウム濃度の低下に起因した疾患の予防および治療用薬学的組成物は、組成物の全重量に対して、前記ジントニンを０．０００１〜１０重量％、好ましくは０．００１〜１重量％含む。
また、本発明の組成物は、薬学的組成物の製造に通常使用する適切な担体、賦形剤および希釈剤をさらに含むことができ、本発明のジントニンの薬学的投与形態は、単独で、或いは他の薬理的活性化合物との結合だけでなく適当な集合として使用できる。
【００３１】
本発明に係るジントニンを含む組成物は、それぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形、外用剤、坐薬および滅菌注射溶液の形態に剤形化して使用できる。前記組成物に含有できる担体、賦形剤および希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギナート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱物油を挙げることができる。製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調製される。経口投与のための固形製剤には錠剤、丸薬、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれる。このような固形製剤は、前記ジントニンまたはその分画物に少なくとも１種の賦形剤、たとえば澱粉、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混ぜることにより調製される。また、単純な賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの潤滑剤も使用される。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、流動パラフィン以外に、様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。非経口投与のための製剤には、滅菌した水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐薬が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としてはプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能なエステルなどが使用でき、坐薬の基剤としてはｗｉｔｅｐｓｏｌ、ｍａｃｒｏｇｏｌ、ｔｗｅｅｎ６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用できる。
【００３２】
本発明の組成物の好ましい投与量は、患者の状態および体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路および期間によって異なるが、当業者によって適切に選択できる。ところが、好ましい効果のために、本発明の組成物は１日０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇで投与することが良い。投与は１日１回投与してもよく、１日数回に分けて投与してもよい。前記投与量はいずれの観点からも本発明の範囲を限定するものではない。
本発明の薬学組成物は、ラット、マウス、家畜、ヒトなどの哺乳動物に様々な経路で投与できる。投与の全ての方式は予想できるが、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内頸膜または脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）注射によって投与できる。
【００３３】
本発明のジントニンを含む組成物は、前述したような剤形として、カルシウム濃度の低下に起因する疾患の予防および治療のための薬剤、食品および飲料などに様々に利用でき、前記ジントニンを添加することが可能な食品としては、例えば各種食品類、飲料、ガム、お茶、ビタミン複合剤、健康機能性食品類などがある。
本発明のジントニンは、毒性および副作用が殆どないので、予防目的で長期間服用の際にも安心して使用することができる。
本発明のジントニンは、様々なカルシウム依存生理活性または／およびカルシウム濃度の低下に起因した疾患の予防を目的として食品または飲料に添加できるが、この際、食品の場合、前記ジントニンを食品の全重量に対して０．０１〜１５重量％で加えることができ、健康機能性飲料の場合、組成物１００ｍＬを基準として、前記ジントニンを０．０２〜５ｇ、好ましくは０．３〜１ｇの割合で加えることができる。
【００３４】
本発明の健康機能性飲料の組成物は、指示された割合で必須成分として前記ジントニンを含有する以外は、他の成分には特別な制限がなく、通常の飲料のように様々な香味剤または天然炭水化物などをさらに含むことができる。この際、前記天然炭水化物は、例えば、ブドウ糖、果糖などの単糖類、マルトース、スクロースなどの二糖類、およびデキストリン、シクロデキストリンなどの多糖類などの通常の糖、並びにキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールなどがある。また、香味剤としては、天然香味剤（タウマチン、ステビア抽出物、例えばレバウジオシドＡ、グリシルヒジンなど）および合成香味剤（サカリン、アスパルテムなど）を有利に使用することができる。前記天然炭水化物の割合は本発明の組成物１００ｍＬに対して一般に約１〜２０ｇ、好ましくは約５〜１２ｇである。
【００３５】
上記の他に、本発明の抽出物は、様々な栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤および天然風味剤などの風味剤、着色剤および増進剤（チーズやチョーコレットなど）、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含有することができる。その他に、本発明の抽出物は、天然果物ジュース、および果物ジュース飲料や野菜飲料の製造のための果肉を含有することができ、このような成分を独立して或いは組み合わせて使用することができる。また、前記添加剤の割合は、あまり重要ではないが、本発明の抽出物１００重量部に対して０〜約２０重量部の範囲で選択されることが一般的である。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は本発明を例示するためのもので、本発明の範囲を限定するものではないことは、当該分野における通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【００３７】
実施例１．ジントニンの配列確認
１−（１）．ジントニンのメタノール透析
人参からジントニンを分離して（韓国特許出願第１０−２０１０−００５２９１３号参照）ジントニン２００ｍｇを１００％（ｗ／ｖ）メタノール１０〜１５ｍＬに溶解させた後、溶解したジントニンを透析膜（ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ：６，０００〜８，０００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）に入れ、３０〜５０倍の体積の１００％メタノールを用いて４８時間透析した。
透析中にメタノールを２回交換した。透析後には、透析膜内に残っている透析膜内部透析液（ｉｎｎｅｒ ｄｉａｌｙｓａｔｅ）と透析膜の外に出た透析膜外部透析液（ｏｕｔｅｒ ｄｉａｌｙｓａｔｅ）を別々に濃縮乾燥させて定量した。
【００３８】
１−（２）．Ｉｎ−ｇｅｌ ｔｒｙｐｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎの実施
前記で収得した透析膜内に残っている成分（透析膜内部透析液）を乾燥させた後、１００μｇ／ｍＬを用いて１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。
図１はメタノール透析前後のジントニンの電気泳動後のクマシブルー染色結果を示す。
メタノール透析前のジントニンのバンド（ｂａｎｄ）は、広く広がって（ｂｒｏａｄ）おりながらバンドの染色も強くなされていない形態であるが（図１の２ｌａｎｅ）、メタノール透析後のジントニンのバンドは、分子量の大きい変化なしで広く広がっているが、その染色はメタノール透析前のそれより一層強くなされていることが分かる（図１の３ｌａｎｅ）。
一方、メタノール透析後、透析膜の外に抜け出した成分（透析膜外部透析液）は、クマシブルーに染色されていないものと示された（図１の４ｌａｎｅ）。
前述したような結果は、ジントニンの脂肪成分がクマシブルーによるタンパク質染色に影響を及ぼしていることを示唆する。
クマシブルー染色を施し、染色されたタンパク質部分を、ゲル（ｇｅｌ）から切り出した後、２５ｍＭ重炭酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）と５０％（ｗ／ｖ）アセトニトリルが含有されている溶液で洗浄した。ゲル切片（ｇｅｌ ｐｉｅｃｅ）はさらに４０ｍＭ重炭酸アンモニウム、１０％（ｗ／ｖ）アセトニトリルおよび２５μｇ／ｍＬのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）に入れた後、３７℃で１８〜２０時間培養した。
トリプシン処理によって消化されたペプチドは、５０ｍＭ重炭酸アンモニウム、５０％アセトニトリルおよび５％（ｗ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；ＴＦＡ）を用いて２回抽出した。この際、得られたペプチド抽出物（ｐｅｐｔｉｄｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ）を合わせた後、真空遠心分離機で凍結乾燥させ、使用前に４℃で貯蔵した。
【００３９】
１−（３）．イオン−移動度分光分析（ＩＭ−ＭＳ）の実施
Ｉｎ−ｇｅｌ ｔｒｙｐｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎの後、ジントニンに含有されているタンパク質成分の確認同定は、ソウル所在の韓国基礎科学支援研究所で実施した(Ono et al Mol. Cell Proteomics Sci. 5, 1338-1347, 2006; Gao et al., Mol. Cell Proteomics Sci. 7, 2399-2409, 2008)。
上記の実験で凍結乾燥したペプチドを０．１％蟻酸（ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ）２０μＬに溶かした後、ＮａｎｏＬｏｃｋＳｐｒａｙイオン源（ｉｏｎ ｓｏｕｒｃｅ）を取り付けたｎａｎｏＡＣＱＵＩＴＹ超高圧力液体クロマトグラフィー（ｕｌｔｒａｐｒｅｓｓｕｒｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＵＰＬＣ）とＳｙｎａｐＱ−ＴＯＦ（Ｔｉｍｅ ｏｆ ｆｉｇｈｔ）質量分析計（ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）を用いてＬＣ／ＭＳＥで分析した（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＵＫ）。
具体的に、再浮遊したペプチド（ｒｅｓｕｓｐｅｎｄｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ；５μＬ）は、０．１％蟻酸がある溶液で５分間流量（ｆｌｏｗ ｒａｔｅ）１０μＬ／ｍｉｎの条件でＷａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８ ｔｒａｐｐｉｎｇ  ｃｏｌｕｍｎ（１８０μｍ ｉ．ｄ．×２０ｍｍ ｌｅｎｇｔｈ ｗｉｔｈ ５μｍ ｐａｒｔｉｃｅｌ ｓｉｚｅ）に注入した。
【００４０】
ペプチドは、前置カラム（ｐｒｅ−ｃｏｌｕｍｎ）で溶出し、７５μｍ ｉ．ｄ．×２５０ｍｍ ｌｅｎｇｔｈ ｃｏｌｕｍｎ ｐａｃｋｅｄ ｗｉｔｈ ＢＥＨ１３０ Ｃ１８樹脂（ｒｅｓｉｎ）と粒子サイズ１．７μｍ（溶出速度２８０ｎｌ／ｍｉｎ）の条件で５５分間線形勾配（ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）３〜４５％（ｗ／ｖ）Ｂを用いて分離した（Ａ：０．１％（ｗ／ｖ） ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｗａｔｅｒ、Ｂ：０．１％（ｗ／ｖ）ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）。カラムは９０％（ｗ／ｖ）Ｂで２５分間洗浄した。
使用したカラムはさらに次の実験実施前に３％Ｂで２０分間さらに平衡化した。全カラムの温度は３５℃に調整し、実施するＭａｓｓ ａｃｃｕｒａｃｙは４００ｆｍｏｌ／μｍと流量５００ｎｌ／ｍｉｎを維持するＮａｎｏＡＣＱＵＩＴＹ ＮａｎｏＬｏｃｋＳｐｒａｙの補助ポンプ（ａｕｘｉｌｉａｒｙ ｐｕｍｐ）を介して伝達されるペプチド［ｇｌｕ１］−フィブリノペプチドＢ（ｆｉｂｒｉｎｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｂ）を用いて検証した。
【００４１】
ペプチドは、陽イオンモード（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｏｎ ｍｏｄｅ）で分析したとともに、典型的な分解能（ｔｙｐｉｃａｌ ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ ｐｏｗｅｒ）１０，０００ｆｗｈｍを持つｖモードで作動するようにした。分析に先立ち、ＴＯＦ分析器（ａｎａｌｙｚｅｒ）は３０ｅＶの衝突エネルギーと５０〜１９９０ｍ／ｚのｍａｓｓ ｒａｎｇｅ で得られた［ｇｌｕ１］−フィブリノペプチドＢ断片（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）を標準として補正（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）した。
Ｑ−ＴＯＰはＬＣ／ＭＳＥ獲得モード（ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｍｏｄｅ）で作動するようにし、ＭＳＥモードは適切なｄｕａｌ ｅｘａｃｔ ｍａｓｓ ｐｒｏｔｏｃｏｌに応じてデータを獲得するようにプログラム化した。
ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ Ｇｌｏｂａｌ ＳＥＲＶＥＲ  ｖｅｒｓｉｏｎ ２．４（ＰＬＧＳ２．４）に統合されたＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ Ｇｌｏｂａｌ ＳＥＲＶＥＲ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．４（ＰＬＧＳ２．４）が分析によって得られた全ての原データファイル（ｒａｗ ｄａｔａ ｆｉｌｅ）をプロセスするようにした。それぞれのプロセスされたデータファイル（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｄａｔａ ｆｉｌｅ）は、ＵｎｉＰｒｏｔ（www.uniprot.org、Ｍａｙ ３、２０１１ Ｒｅｌｅａｓｅｄ  ｖｅｒｓｉｏｎ、ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｅｎｔｒｉｅｓ ３，２１３）で得られたＡｐｉａｌｅｓタンパク質データベース（Ａｐｉａｌｅｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ）から検索した。
【００４２】
それぞれの試料のｌｏｗ／ｈｉｇｈ ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒａから得られたタンパク質の同定は、少なくとも一つのペプチドが３つの断片イオン（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｏｎ）と一致し、或いは一つのタンパク質が７個の断片イオンと一致し、或いは一つのタンパク質が２個のペプチドと一致するように要求する階級的接近（ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ）によって作動するようにした。
人参を含む植物に含有されているタンパク質を同定する方法の一つは、タンパク質電気泳動したバンド切片に含有されているタンパク質成分をプロテオーム解析（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）方法によって確認する方法が広く用いられている(Nam et al., Proteomics 3, 2351-2367, 2003)。
下記表１に示すように、ジントニンの電気泳動結果として生じたタンパク質バンド（図１参照）からタンパク質を抽出し、トリプシン消化（ｔｒｙｐｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）の後にＩＭ−ＭＳ（Ｉｏｎ−ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）分析を実施した結果、ジントニンに含有されたタンパク質は２種であると確認された。
ジントニンを構成するタンパク質に該当するペプチド断片（ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）が人参ＭＬＰ１５１の場合には４（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ−ｌｉｋｅ ｓｔｏｒａｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）の場合には５つのペプチド断片を含有するものと示された。
【００４３】
【表１】
0005899321.tif 000002
【００４４】
言い換えれば、プロテオーム解析方法を用いた結果、ジントニンに含有されているタンパク質の成分が人参ＭＬＰ１５１と人参リボヌクレアーゼ様貯蔵タンパク質であることを確認することができた。
これらのタンパク質は、ＭＬＰ１５１の分子量が約１７ｋＤａであり、人参リボヌクレアーゼ様貯蔵タンパク質の分子量が約２７ｋＤａであると知られているが、実際に、人参リボヌクレアーゼ様貯蔵タンパク質の場合には、人参からＣ末端の一部が切断（ｔｒｕｃａｔｉｏｎ）された分子量２０〜２１ｋＤａのリボヌクレアーゼ様貯蔵タンパク質も発見される(Kim et al., J Plant Physiol. 161, 837-845, 2004)。
図１に示すように、ジントニンの分子量は約１３〜１５ｋＤａであると確認される。
ところが、プロテオーム解析によって得られたジントニンのタンパク質成分の分子量は１７〜２７ｋＤａであって、実際のジントニンの分子量とは差異がある。このようなジントニンのタンパク質分析によって明らかになったタンパク質の分子量と電気泳動結果として得られたジントニンの分子量との差異は、ジントニンにはタンパク質成分だけではなく、糖および荷電成分が共に存在し、これらの成分が電気泳動の際にゲル移動（ｇｅｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）に影響を及ぼすためであると判断される。
【００４５】
実施例２．細胞膜ＬＰＡ受容体タンパク質発現の検証
ＬＰＡ受容体を発現していない細胞（ｎｕｌｌ−ｃｅｌｌ）たるＢ１０３細胞は、Ｉｓｈｉｉなどの方法(Ishii et al., (2000) Mol Pharmacol 58. 895-902; Lee et al., (2006) J Biol Chem 281. 23589-23597; Yanagida et al., (2009) J Biol Chem 284. 17731-17741)によって、ＤＭＥＭ培地に、加熱不活性化した（ｈｅａｔ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ）１０％ＦＢＳ、ストレプトマイシンおよびペニシリンを添加したＤＭＥＭ培地を用いて、５％ＣＯ２／９５％空気培養器で培養した。
また、ヒトＬＰＡ受容体サブタイプ（Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｔｙｐｅｓ）、オーファンＧＰＣＲ（ｏｒｐｈａｎ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）および他のＧＰＣＲ関連受容体プラスミドは、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ Ｓ＆Ｔ ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ(www.cDNA.org)から購入した。
まず、各ＧＰＣＲ受容体を含んでいるプラスミドをＴＥ緩衝液（ｂｕｆｆｅｒ）で溶かした後、１〜１００ｎｇをＥ．Ｃｏｌｉ（ＤＨ５α）（ＥＣＯＳ、Ｉｎｔｒｏｎ）にトランスフェクションし、抗生剤アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）を含有している固体ＬＢ培地を含むペトリ皿（ｐｅｔｒｉ ｄｉｓｈ）に塗抹（ｓｍｅａｒｉｎｇ）した後、３７℃で一晩（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）培養した。ペトリ皿に生じたコロニー（ｃｏｌｏｎｅｙ）５〜６個を取り、アンピシリンを含んでいるＬＢ液体培地で培養した後、ＤＮＡ ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ過程を介して、購入したそれぞれの受容体プラスミドを増幅し、増幅されたそれぞれの受容体の遺伝子サイズをＤＮＡ電気泳動によって確認した。該当遺伝子が合う場合、一部を群体（ｓｔｏｃｋ）として貯蔵し、残りはさらに大量で増幅するＤＮＡ ｍａｘｉ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎを実施し、Ｂ１０３ラットの神経芽腫細胞（ｒａｔ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）にトランスフェクションして使用する程度の十分な量の各ＬＰＡ受容体ｓｕｂｔｙｐｅｓ（ＬＰＡ１〜ＬＰＡ６）および他のＧＰＣＲ遺伝子に対するｃＤＮＡｓを確保した。
【００４６】
ＬＰＡ受容体ｓｕｂｔｙｐｅｓに対する一時的トランスフェクション（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００を用いて行った。それぞれのＬＰＡ受容体（ＬＰＡ１、ＬＰＡ２、ＬＰＡ３、ＬＰＡ４、ＬＰＡ５およびＬＰＡ６）を含んでいるプラスミド（１０．８μｇ）を、１０ｃｍの皿で培養したＢ１０３細胞にトランスフェクションし、２日後に実験に利用した。
ＬＰＡ受容体でトランスフェクションされたＢ１０３細胞において実際にＬＰＡ受容体タンパク質が発現されるかを確認するために、ＬＰＡ受容体を含んでいない空プラスミド、およびＨＡ（ｈｅｍａｔｏｇｌｕｔｉｎ）−ＬＰＡ遺伝子を含むプラスミド(Lee et al., J Biol Chem 281, 23589-23597, 2006)を、内因性にＬＰＡ受容体を含んでいないＢ１０３細胞にトランスフェクションした後、細胞ホモジネート（ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅｓ）において細胞膜の豊富な細胞膜分画（ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ）を用いて、ＨＡに対する１次抗体を用いるウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を実施した。
【００４７】
その結果、ＬＰＡ受容体を含んでいない空プラスミドをトランスフェクションした細胞では、ＬＰＡ受容体に対するタンパク質の発現がなされないことを観察することができたが、ＬＰＡ受容体遺伝子を持っているプラスミドをトランスフェクションした細胞では、ＬＰＡ受容体タンパク質が発現されたことを観察することができた。よって、ジントニンがＬＰＡ受容体発現細胞に作用して細胞内カルシウム濃度の増加を誘導することを確認した（図２のＡ参照）。
また、ＬＰＡ受容体を内因性に発現しないｎｕｌｌ Ｂ１０３細胞、およびＬＰＡ受容体ｓｕｂｔｙｐｅｓを発現したＢ１０３細胞において、ＬＰＡ受容体タンパク質発現を共焦点レーザー顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を用いて確認した。
このために、ＬＰＡ受容体を含んでいない空プラスミド、およびＨＡ（ｈｅｍａｔｏｇｌｕｔｉｎ）−ＬＰＡ遺伝子を含むプラスミド(Ishii et al., Mol Pharmacol 58, 895-902, 2000; Lee et al., J Biol Chem 281, 23589-23597, 2006)をＢ１０３細胞に発現させた後、まずＨＡに対する１次抗体を細胞膜と反応させてラベリング（ｌａｂｅｌｉｎｇ）し、１次抗体に対する２次抗体でありながら蛍光物質たるｃｙ３でコンジュゲートされた抗体でラベリングして、共焦点レーザー顕微鏡（Ｆｌｕｏｖｉｅｗ ＦＶ１０００、Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＵＳＡ）によって、細胞膜にＬＰＡ受容体が発現されることを確認した。図２のＢはＬＰＡ受容体が細胞膜に発現されたことを示している。
【００４８】
実施例３．ジントニンによるＬＰＡ受容体、別のオーファンＧＰＣＲ受容体およびＳ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２受容体の活性による細胞内カルシウムの変化およびｃＡＭＰの形成に及ぼす影響の確認
ＬＰＡ受容体をトランスフェクションさせていないＦｕｒａ−２ＡＭ処理Ｂ１０３細胞にＬＰＡを処理する場合、細胞内遊離カルシウム［Ｃａ２＋］ｉの一時的な増加を誘導しないが、ＬＰＡ受容体をトランスフェクションしたＦｕｒａ−２ＡＭ処理Ｂ１０３細胞にＬＰＡを処理する場合、細胞内遊離カルシウム［Ｃａ２＋］ｉの一時的な増加を誘導することが明らかになった(Bandoh et al., J Biol Chem 274. 27776-27785, 1999; Im et al., Mol Pharmacol 57. 753-759, 1999)。
本発明では、ジントニンまたはジンセノサイドＲｂ１、Ｒｇ１が、ＬＰＡ受容体をトランスフェクションさせていないＦｕｒａ−２ＡＭ処理Ｂ１０３細胞、およびＬＰＡ受容体をトランスフェクションしたＦｕｒａ−２ＡＭ処理Ｂ１０３細胞において［Ｃａ２＋］ｉの一時的増加に効果を示すかを確認するために、Ｆｕｒａ−２ＡＭで前処理したＢ１０３細胞（２〜４×１０６／ｍＬ）を１．５ｍＭ Ｃａ２＋含有緩衝液（ｂｕｆｆｅｒ）またはＣａ２＋遊離緩衝液（ｆｒｅｅ ｂｕｆｆｅｒ）に懸濁して３７℃で３０分間培養した後、ジントニン或いはジンセノサイドを添加し、Ｂ１０３細胞における細胞内カルシウムの濃度に及ぼす効果を確認した。
但し、利用可能な純粋分離された個別ジントニン量の限界のため、粗（ｃｒｕｄｅ）ジントニンを用いてＢ１０３細胞（ＡＴＴＣ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ、ＵＳＡ）における［Ｃａ２＋］ｉの増加について実験した。
【００４９】
具体的に、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ等の方法(Jorgensen N.K., Peterson S. F. and Hoffman E.K. Am J Physiol Cell Physiol,276, 26-37, 1999)によって、１２０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１．５ｍＭのＣａＣｌ-２、１０ｍＭのグルコースおよび２５ｍＭのＨＥＰＥＳからなるＣａ２＋含有緩衝液（ｐＨ７．４）と、１２０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのＥＧＴＡ、１０ｍＭのグルコースおよび２５ｍＭのＨＥＰＥＳからなるＣａ２＋遊離緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて、３７℃の培養器で３０分間振盪しながら２．５μＭのＦｕｒａ ２−ＡＭにＢ１０３細胞（１〜２×１０６／ｍＬ）を混合し、過量のｆｕｒａ−２ＡＭは細胞をＣａ２＋含有緩衝液またはＣａ２＋未含有緩衝液で３回洗浄して除去した。
［Ｃａ２＋］ｉは、ＲＦ−５３００ＰＣ細胞内イオン測定システム（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｏｎ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｊａｐａｎ）を用いてＦｕｒａ−２ＡＭ処理細胞で推定した。
【００５０】
具体的に、Ｆｕｒａ−２ＡＭ処理細胞は、最終的に２〜４×１０６／ｍＬとなるまで実験緩衝液で希釈した後、ポリスチレンキュベット（Ｅｌｋａｙ  Ｕｌｔｒａ−ＵＶ）に移し、細胞はテフロンでコートされた磁石を用いて攪拌し、キュベットハウジングは３７℃に調節した。励起波長（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｓ）はコンピュータ制御の下で３４０ｎｍと３８０ｎｍを交互にし、放出（ｅｍｉｓｓｉｏｎ）は５１０ｎｍで検出した。この際、励起および放出の隙間の幅は３ｎｍとし、背景補正はＪｏｒｇｅｎｓｅｎ等の方法に準じて行った。
測定された３４０ｎｍと３８０ｎｍの比率値（ｒａｔｉｏ ｖａｌｕｅ） は、Ｈｏｕｎｓｅｌｌ等の式(Hounsell,E.F.,Davies,M.J.,and Smith,K.D.(1997)Protein protocol handbood,Humanna press,Totawa,803-804)を用いて［Ｃａ２＋］ｉの値に変換した。
［Ｃａ２＋］＝Ｋｄ［（Ｒ−Ｒｍｉｎ）／（Ｒｍａｘ−Ｒ）］（Ｓｆ３８０／Ｓｂ３８０）
但し、Ｋｄは解離定数（２２４ｎＭ）であり、Ｒは測定された３４０ｎｍと３８０ｎｍの蛍光比（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒａｔｉｏ）であり、ＲｍａｘおよびＲｍｉｎは５０μｇ／ｍＬのジギトニンを添加したＣａ２＋飽和濃度でのＲ値および２０ｍＭのＥＧＴＡを添加したＣａ２＋未含有緩衝液でのＲ値である。また、Ｓｆ３８０とＳｂ３８０はジギトニンとＥＧＴＡを添加したときの３８０ｎｍでの蛍光強度（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）である(Grynkiewicz, G., M. Poenie, and R. Y. Tsien., J Biol Chem 260: 3440-3450, 1985)。
【００５１】
ＬＰＡ受容体を発現していないｎｕｌｌ Ｂ１０３細胞と、それぞれのＬＰＡ受容体ｓｕｂｔｙｐｅｓを発現したＢ１０３細胞におけるジントニンによる細胞質内カルシウム［Ｃａ２＋］ｉおよびｃＡＭＰの変化を確認した結果、図３のＡに示すように、ＬＰＡ受容体に対する遺伝子を含んでいないプラスミド（空ベクター）をトランスフェクションして、ＬＰＡ受容体を発現していないＢ１０３細胞において、ジントニンは細胞内カルシウムの濃度を増加させる作用が殆どなかった（細胞内カルシウム濃度の増加２２．７±４．１ｎＭ）。ジントニンによるＬＰＡ受容体ｓｕｂｔｙｐｅｓ（ＬＰＡ１〜ＬＰＡ６）を発現するＢ１０３細胞にジントニン（１μｇ／ｍＬ）を処理する場合、ＬＰＡ１、ＬＰＡ２、ＬＰＡ３およびＬＰＡ５受容体を発現するＢ１０３細胞では、細胞内カルシウムの濃度をそれぞれ１８５．９±１２．８、２０８．３±１３．０、２０６．５±１１．２および２９７．５±２１．８ｎＭ増加させた。ところが、ＬＰＡ４受容体に対するジントニンの作用は６１．６±１１．８ｎＭであって他のＬＰＡ受容体に比べて微弱であり、ＬＰＡ６受容体に対するジントニンの作用はなかった。
【００５２】
一方、ＬＰＡ受容体の活性は、細胞内カルシウムの増加だけでなく、細胞内ｃＡＭＰ形成抑制或いは刺激に連結されていることが報告された(Ishii et al., Mol Pharmacol 58, 895-902, 2000; Contos et al., Mol Pharmcol 58, 1188-1196, 2000; Kimura et al., J Biol Chem. 276, 15208-15215. 2001)。特に、ＬＰＡ６受容体の活性は細胞内カルシウムの増加に連結されているのではなく、細胞内ｃＡＭＰ形成経路に連結されていると報告された(Yanagida et al., J Biol Chem 284, 17731-17741, 2009)。
ＬＰＡ３とＬＰＡ６受容体を発現するＢ１０３細胞における、ジントニンによる細胞内ｃＡＭＰの変化を確認するために、ジントニン処理の際にＬＰＡ３とＬＰＡ６受容体を発現するＢ１０３細胞における細胞内ｃＡＭＰの変化を測定した結果、ジントニンは細胞内ｃＡＭＰ濃度の変化には影響を及ぼさかったと確認された（図４のＣ参照）。
したがって、ジントニンによるＬＰＡ受容体の活性は主に細胞内カルシウムの増加に連結されていることが分かった。
【００５３】
また、ＬＰＡに反応するものと知られている他のオーファンＧＰＣＲであるＧＰＲ３５(Oka et al., Biochem Biophys Res Commun. 395, 232-237, 2010)およびＧＰＲ８７(Tabata et al., Biochem Biophys Res Commun. 363, 861-866, 2007)と、遊離脂肪酸（ｆｒｅｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ）に結合する脂肪酸受容体（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）として知られているＧＰＲ４０、ＧＰＲ４１、ＧＰＲ４３およびＧＰＲ１２０ (Hirasawa et al., Biol Pharm Bull. 31, 1847-1851, 2008)をＢ１０３細胞に発現させた後、ジントニンの作用を確認した。
図３のＢに示すように、ジントニンは、ＧＰＲ３５を発現するＢ１０３細胞において微弱に細胞内カルシウムを増加させるが、他の受容体を発現するＢ１０３細胞においては細胞内カルシウムの増加を誘導しないものと確認された。このような結果は、ジントニンがカルシウム濃度の変化については主にＬＰＡ受容体ｓｕｂｔｙｐｅｓに選択的に作用することを示す。
【００５４】
実施例４．ＬＰＡ受容体が発現された細胞におけるＬＰＡとジントニンによる投与濃度別の細胞質内遊離Ｃａ２＋変化の測定
ジントニンを含む濃度反応曲線を得るために、観察されたピーク（ｐｅａｋ）の振幅を標準化および図表化した後、Ｏｒｇｉｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ）を用いて下記のＨｉｌｌ式に対応させた。
【００５５】
ｙ／ｙｍａｘ＝［Ａ］ｎ／（［Ａ］ｎ＋［ＥＣ５０］ｎ）
【００５６】
式中、ｙはジントニンの与えられた濃度における％活性であり、ｙｍａｘは最大ピーク細胞内カルシウム濃度の変化（ｍａｘｉｍｕｍ ｐｅａｋ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｌｃｉｕｍ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）であり、［ＥＣ５０］は最大反応の５０％を示すことが可能なジントニンの濃度であり、［Ａ］はジントニンの濃度である。また、ｎは相互作用係数（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）であり、全ての値は平均±標準誤差で表した。対照群のデータとジントニン処理群のデータとの平均差はｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’s ｔ−ｔｅｓｔを用いて分析した。統計学的有意性はＰ＜０．０５で検定した。
ＬＰＡ受容体を含んでいないプラスミドと、確保されたそれぞれのＬＰＡ受容体ｓｕｂｔｙｐｅｓのうち代表的なＬＰＡ３受容体を、内因性のＬＰＡ受容体を発現していないｎｕｌｌ Ｂ１０３ラット神経芽腫細胞（ｒａｔ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌ）(Valentine et al., Biochim Biophys Acta 1780, 597-605, 2008)にトランスフェクションし、これらの各ＬＰＡ３受容体が発現されるようにした後、ＬＰＡ受容体リガンドであるＬＰＡを処理する場合、細胞内カルシウムが増加することを検証することにより、ＬＰＡ３受容体がろくにＢ１０３細胞に正常的に発現され、ＬＰＡによく反応するかを確認した結果、ＬＰＡはＬＰＡ３受容体を発現させたＢ１０３細胞における細胞内カルシウムをＬＰＡ処理濃度に依存的に増加させることが分かった。この際、ＬＰＡに対するＥＣ-５０は５８．９±５．５４ｎＭであった（図４のＡ参照）。
【００５７】
ところが、ＬＰＡ３受容体を発現していないＢ１０３細胞では、細胞内カルシウムの濃度を増加させる作用が殆どないことが分かった（図４のＡ参照）。
また、ＬＰＡ受容体ｓｕｂｔｙｐｅｓ（ＬＰＡ１〜ＬＰＡ６）を発現するＢ１０３細胞における、ジントニンによる処理濃度別の細胞内カルシウム濃度の増加を確認した結果、図３のＢに示すように、ジントニンによるＬＰＡ１、ＬＰＡ２、ＬＰＡ３およびＬＰＡ５受容体の活性による細胞内カルシウムの増加に対するＥＣ５０はそれぞれ０．１０±０．０２、０．００４０±０．０００４、０．１２±０．０１および０．０４６±０．００３ｎＭであった。
特に、他のＬＰＡ受容体ｓｕｂｔｙｐｅｓに比べてＬＰＡ２受容体に対するＥＣ５０値が低いことからみて、ジントニンはＬＰＡ２受容体に対してさらに親和性が強いものと確認された。
【００５８】
実施例５．ジントニンおよびジンセノサイドＲｂ１、Ｒｇ１およびＲｇ３によるＬＰＡ受容体の活性による細胞質内遊離Ｃａ２＋増加の比較
人参から分離同定したジントニン、および今まで人参の生理学的／薬理学的有効成分として知られているジンセノサイド(Nah et al., CNS Drug Rev. 13, 381-404, 2007)がＬＰＡ受容体の活性によって細胞内カルシウムの増加を誘導するか否かを確認するために、人参に存在するジンセノサイドのうち最も含量が多くて代表的なジンセノサイドとして知られているジンセノサイドＲｂ１、ジンセノサイドＲｇ１或いはジンセノサイドＲｇ３を用いてジントニンと比較した。
ＬＰＡ受容体をトランスフェクションさせていないＦｕｒａ−２ＡＭ処理Ｂ１０３細胞にＬＰＡを処理する場合、細胞内遊離カルシウム［Ｃａ２＋］ｉの一時的な増加を誘導しないが、ＬＰＡ受容体をトランスフェクションしたＦｕｒａ−２ＡＭ処理Ｂ１０３細胞にＬＰＡを処理する場合、細胞内遊離カルシウム［Ｃａ２＋］ｉの一時的な増加を誘導することが明らかになった(Bandoh et al., J Biol Chem 274. 27776-27785, 1999; Im et al., Mol Pharmacol 57. 753-759, 1999)。
【００５９】
本発明では、ジントニンまたはジンセノサイドＲｂ１、Ｒｇ１が、ＬＰＡ受容体をトランスフェクションさせていないＦｕｒａ−２ＡＭ処理Ｂ１０３細胞と、ＬＰＡ受容体をトランスフェクションしたＦｕｒａ−２ＡＭ処理Ｂ１０３細胞において［Ｃａ２＋］ｉの一時的増加に効果を示すかどうかを確認するために、Ｆｕｒａ−２ＡＭで前処理したＢ１０３細胞（２〜４×１０６／ｍＬ）を１．５ｍＭのＣａ２＋含有緩衝液またはＣａ２＋遊離緩衝液に懸濁して３７℃で３０分間培養した後、ジントニン或いはジンセノサイドを添加し、Ｂ１０３細胞における細胞内カルシウムの濃度に及ぼす効果を確認した。
但し、利用可能な純粋分離された個別ジントニン量の限界のため、粗（ｃｒｕｄｅ）ジントニンを用いてＢ１０３細胞（ＡＴＴＣ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ、ＵＳＡ）における［Ｃａ２＋］ｉの増加について実験した。
【００６０】
具体的に、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ等の方法(Jorgensen N.K., Peterson S. F. and Hoffman E.K. Am J Physiol Cell Physiol,276, 26-37, 1999)によって、１２０ｍＬのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１．５ｍＭのＣａＣｌ-２、１０ｍＭのグルコースおよび２５ｍＭのＨＥＰＥＳからなるＣａ２＋含有緩衝液（ｐＨ７．４）と、１２０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＮのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのＥＧＴＡ、１０ｍＮのグルコースおよび２５ｍＭのＨＥＰＥＳからなるＣａ２＋遊離緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて、３７℃の培養器で３０分間振盪しながら２．５μＭのＦｕｒａ ２−ＡＭにＢ１０３細胞（１〜２×１０６／ｍＬ）を混合し、過量のｆｕｒａ−２ＡＭは細胞をＣａ２＋含有緩衝液またはＣａ２＋未含有緩衝液で３回洗浄して除去した。
［Ｃａ２＋］ｉは、ＲＦ−５３００ＰＣ細胞内イオン測定システム（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｏｎ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｊａｐａｎ）を用いてＦｕｒａ−２ＡＭ処理細胞で測定された。
【００６１】
具体的に、Ｆｕｒａ−２ＡＭ処理細胞は、最終的に２〜４×１０６／ｍＬとなるまで実験緩衝液で希釈した後、ポリスチレンキュベット（Ｅｌｋａｙ Ｕｌｔｒａ−ＵＶ）に移し、細胞はテフロンでコートされた磁石を用いて攪拌し、キュベットハウジングは３７℃に調節した。励起波長（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｓ）はコンピュータ制御の下で３４０ｎｍと３８０ｎｍを交互にし、放出（ｅｍｉｓｓｉｏｎ）は５１０ｎｍで検出した。この際、励起および放出の隙間の幅は３ｎｍとし、背景補正はＪｏｒｇｅｎｓｅｎ等の方法に準じて行うが、ジギトニンおよびＥＧＴＡはｆｕｒａ−２ＡＭが完全にＣａ２＋と化合しＣａ２＋から解離する状態を作るためのＣａ２＋濃度調節試薬（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ ｒｅａｇｅｎｔ）として使用した。
測定された３４０ｎｍと３８０ｎｍの比率値（ｒａｔｉｏ ｖａｌｕｅ） は、Ｈｏｕｎｓｅｌｌ等の式(Hounsell,E.F.,Davies,M.J.,and Smith,K.D.(1997)Protein protocol handbood,Humanna press,Totawa,803-804)を用いて［Ｃａ２＋］ｉの値に変換した。
【００６２】
［Ｃａ２＋］＝Ｋｄ［（Ｒ−Ｒｍｉｎ）／（Ｒｍａｘ−Ｒ）］（Ｓｆ３８０／Ｓｂ３８０）
【００６３】
但し、Ｋｄは解離定数（２２４ｎＭ）であり、Ｒは測定された３４０ｎｍと３８０ｎｍの蛍光比（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒａｔｉｏ）であり、ＲｍａｘおよびＲｍｉｎは５０μｇ／ｍＬのジギトニンを添加したＣａ２＋飽和濃度でのＲ値、および２０ｍＭのＥＧＴＡを添加したＣａ２＋未含有緩衝液でのＲ値である。また、Ｓｆ３８０とＳｂ３８０はジギトニンとＥＧＴＡを添加したときの３８０ｎｍでの蛍光強度（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）である(Grynkiewicz, G., M. Poenie, and R. Y. Tsien., J Biol Chem 260: 3440-3450, 1985)。
ジントニンを含む濃度反応曲線を得るために、観察されたピークの振幅を標準化および図表化した後、Ｏｒｉｇｉｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ）を用いて下記のＨｉｌｌ式に対応させた。
【００６４】
ｙ／ｙｍａｘ＝［Ａ］ｎ／（［Ａ］ｎ＋［ＥＣ５０］ｎ）
【００６５】
式中、ｙはジントニンの与えられた濃度における％活性であり、ｙｍａｘは最大ピーク細胞内カルシウム濃度の変化（ｍａｘｉｍｕｍ ｐｅａｋ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｌｃｉｕｍ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）であり、［ＥＣ５０］は最大反応の５０％を示すことが可能なジントニンの濃度であり、［Ａ］はジントニンの濃度である。また、ｎは相互作用係数（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）であり、全ての値は平均±標準誤差で表した。対照群のデータとジントニン処理群のデータとの平均差はｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’s ｔ−ｔｅｓｔを用いて分析した。統計学的有意性はｐ＜０．０５で検定した。
【００６６】
その結果、図５のＡに示すように、ジントニンはＬＰＡ３受容体の活性による細胞内カルシウムの濃度を増加させたが、ジンセノサイドＲｂ１、Ｒｇ１、Ｒｇ３（それぞれ１０μＭ）はその作用がなく、ジントニンと共に存在してもジントニンの作用を妨害しないものと確認された。よって、ジンセノサイドはＬＰＡ受容体の活性作用を誘導せず（図４  のＢ参照）、ジントニンがＬＰＡ受容体の活性によって細胞内カルシウム増加作用を発揮することが分かった。
【００６７】
実施例６．ジントニンによるＬＰＡ受容体の活性に対するＬＰＡ受容体拮抗剤Ｋｉ１６４２５の影響の確認
ジントニンがＬＰＡ受容体に結合し、ＬＰＡ受容体の活性によって細胞内カルシウムの濃度を増加させると、ジントニンの作用はＬＰＡ受容体拮抗剤によって遮断できると予想される。これを確認するために、ＬＰＡ受容体拮抗剤がジントニン作用を遮断するかどうかを実験した。
図７に示すように、ジントニンによるＬＰＡ１〜ＬＰＡ５受容体の活性の際に、ＬＰＡ１およびＬＰＡ３受容体拮抗剤であるＫｉ１６４２５(Ohta et al., Mol Pharmacol 64. 994-1005, 2003)処理によって、ＬＰＡ１とＬＰＡ３受容体を発現する細胞においてＬＰＡ受容体の活性を防ぐ場合、ジントニンによる細胞内カルシウム濃度増加作用が遮断されることが確認された。よって、ジントニンはＬＰＡ受容体の活性によって細胞内カルシウム濃度を増加させることが分かった。
【００６８】
実施例７．ジントニンによるＬＰＡ受容体の活性に対する細胞外カルシウムおよびＣａ２＋キレート剤ＢＡＰＴＡの影響の確認
Ｇαｑ／１１結合タンパク質（Ｇαｑ／１１−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）に連結された大部分のＧＰＣＲｓに対するリガンドを処理する場合、細胞内カルシウム濃度が増加するが、この際、増加したカルシウムのソース（ｓｏｕｒｃｅ）は細胞外（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）に存在するカルシウムの流入によって増加させるか、或いはカルシウム貯蔵庫たる小胞体（ＥＲ）に存在するＩＰ３受容体の活性によってカルシウム貯蔵庫からのカルシウム放出を促進させて細胞内カルシウム（Ｃａ２＋）の増加を誘導すると知られている(Berridge et al., Natuare 395. 645-648, 1998)。
本発明では、ジントニンによるＬＰＡ受容体の活性に対する細胞外カルシウムの影響に関する実験によって、ジントニンによる細胞内カルシウム増加のソースがどこに由来するかを確認した。
【００６９】
その結果、ジントニンによってＬＰＡ１とＬＰＡ３受容体を発現する細胞において、ジントニンによるＬＰＡ受容体の活性によって誘導された［Ｃａ２＋］ｉの一時的な増加が、細胞外のＣａ２＋を除去（Ｃａ２＋を含有せず且つ０．２ｍＭのＥＧＴＡを含有する緩衝液を使用）することにより大きく減少した（図７参照）。これは、細胞外のＣａ２＋もジントニン処理の際にＬＰＡ受容体の活性を介して細胞内に入り込むことを意味する。
一方、細胞外のＣａ２＋がなくても、ジントニンによるＬＰＡ受容体の活性によって誘導された［Ｃａ２＋］ｉの小幅の増加は、細胞内に貯蔵されたＣａ２＋の放出が行われることを示唆する。また、ジントニンを、ＬＰＡ受容体を発現する細胞に処理する場合には、細胞内のＣａ２＋キレート剤であるＢＡＰＴＡを前処理すると、ジントニンによる細胞内カルシウムの増加が消滅するものと確認された（図７参照）。
前述のような結果は、ジントニンがＬＰＡ受容体を活性化させ、ＬＰＡ受容体の活性が、細胞外または細胞内に由来する細胞内カルシウムの増加を誘導することを証明している。
【００７０】
実施例８．ジントニンによるＬＰＡ受容体の活性に対するシグナル伝達の確認
ＬＰＡによるＬＰＡ受容体の活性は、ＬＰＡ受容体を発現する細胞の種類によって、百日咳毒素（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｔｏｘｉｎ、ＰＴＸ）感受性ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇαｉ／０）の活性、或いは百日咳毒素非感受性ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇαｑ／１１或いはＧα１２／１３）の活性、或いは両方（Ｇαｉ／０、Ｇαｑ／１１或いはＧα１２／１３）部分的に混合されたＧＴＰ結合タンパク質の活性を通じて行われていると報告された(An et al., Mol Pharmacol 54, 881-886, 1998; Yoshida and Ueda, Jpn J Pharmacol 87, 104-109, 2001)。
【００７１】
まず、ジントニンのＬＰＡ受容体活性を通じての細胞内カルシウム増加作用が百日咳毒素（ＰＴＸ）感受性ＧＴＰ結合タンパク質の活性を通じて行われるかを確認したが、図６に示すように、ＬＰＡ３受容体を発現するＢ１０３細胞にＰＴＸ（２００ｎｇ／ｍＬ、１６時間）を処理する場合、ＰＴＸを処理していないグループに比べて２５％程度有意にジントニンの作用が減少することが分かった。
このような結果は、ジントニンのＬＰＡ３受容体活性による細胞内カルシウム増加作用は主にＰＴＸ非感受性Ｇαｑ／１１或いはＧα１２／１３タンパク質の活性を通じて行われるが、部分的にはＧαｉ／０タンパク質もジントニン作用に関与することを示す（図６のＢ参照）。
一般にＧαｑ／１１結合タンパク質に共役されたＧＰＣＲｓの活性はホスホリパーゼＣ （ＰＬＣ）を活性化させる。ＰＬＣの活性化はジアシルグリセロール（ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ、ＤＡＧ）とＩＰ３を生成するが、ＤＡＧはタンパク質キナーゼＣ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ、ＰＫＣ）を活性化させ、ＩＰ３は細胞内カルシウム貯蔵庫でたる小胞体（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ、ＥＲ）に存在するＩＰ３受容体を活性化させて、ＥＲに貯蔵されているカルシウムが細胞質内に出るようにして細胞内カルシウムの濃度を増加させるものと知られている(Berridge et al., Natuare 395. 645-648, 1998)。
【００７２】
本発明では、ＬＰＡ３受容体を発現するＢ１０３細胞において細胞内カルシウムの濃度を増加させるジントニンの作用がＰＬＣの活性を通じて行われるか否かを確認した。
その結果、図７に示すように、活性ＰＬＣ抑制剤（ａｃｔｉｖｅ ＰＬＣ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）であるＵ７３１２２の処理は、著しくジントニンの作用を遮断するものと確認された。また、ＩＰ３受容体拮抗剤である２−ＡＰＢを処理する場合にも、ジントニンの作用が消滅するものと確認され、ジントニンはＬＰＡ受容体への結合−Ｇαｑ／１１結合タンパク質の活性化−ＰＬＣの活性化−ＤＡＧおよびＩＰ３の生成−ＩＰ３受容体の活性化−細胞内カルシウムの増加につながる経路を通じて細胞内カルシウムの増加を誘導することが分かった。
また、ＬＰＡ受容体を発現するＢ１０３細胞にＰＫＣ活性剤（ａｃｔｉｖａｔｏｒ）たるＰＭＡを前処理してＰＫＣを予め活性化させる場合、ジントニンによる細胞内カルシウムの増加が抑制されることからみて、ジントニンによる細胞内カルシウムの増加作用にＰＫＣが関与していることが分かった(Urs et al., J Biol Chem. 283, 5249-5257. 2008)（図示せず）。
【００７３】
実施例９．突然変異ＬＰＡ受容体に対するジントニンの影響の確認
ＬＰＡ受容体タンパク質に対するＬＰＡ結合部位と思われる特定のアミノ酸を他のアミノ酸に突然変異させた突然変異（ｍｕｔａｎｔ）ＬＰＡ受容体をＢ１０３細胞にトランスフェクションした後、ＬＰＡを処理する場合、ＬＰＡの作用が著しく減少または消滅すると報告された(Valentine et al., J Biol Chem 283, 12175-12187, 2008)。
これはＬＰＡ受容体にＬＰＡが結合する特定アミノ酸部位が存在し、ＬＰＡがこの特定アミノ酸に結合してその効果を発揮するものと知られているが、本発明では、ＬＰＡ受容体においてＬＰＡ結合部位として知られている特定アミノ酸を突然変異させる場合、ジントニンのＬＰＡ受容体活性による細胞内カルシウムの増加作用に影響を与えるか否かを、ＬＰＡ３受容体を用いて確認した。
図８に示すように、ＬＰＡ１〜ＬＰＡ３受容体においてＬＰＡが共通に結合すると報告された部位であるＡｒｇ３．２８残基（ｒｅｓｉｄｕｅ）をＡｒｇ３．２８Ａｌａ（すなわち、ＡｒｇをＡｌａに突然変異させる；Ｒ３．２８Ａ）に突然変異させた、或いはＬＰＡ３受容体にＬＰＡが結合すると報告された部位Ｔｒｐ４．６４残基をＴｒｐ４．６４Ａｌａ（すなわち、ＴｒｐをＡｌａに突然変異させる；Ｗ４．６４Ａ）に突然変異させたＬＰＡ受容体(Valentine et al., J Biol Chem 283, 12175-12187, 2008)をＢ１０３細胞にトランスフェクションさせた後、ジントニン作用を野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）のそれと比較してみたとき、野生型ではジントニンによる細胞内カルシウムの増加が現れるが、突然変異ＬＰＡ受容体をトランスフェクションした細胞ではジントニンの作用が大きく減少することを示している。よって、ジントニンによるＬＰＡ受容体の活性はＬＰＡ受容体に対するＬＰＡ結合部位との相互作用によって行われ、ジントニンはＬＰＡ受容体の活性のためにＬＰＡ結合部位を共有するものと確認された。
【００７４】
実施例１０．ジントニンによるＮＭＤＡ受容体活性の確認
ＮＭＤＡ（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ）受容体は、主に中枢神経系の海馬（ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）に多く存在し、リガンド結合部位とイオン通路を共に持つイオン性（ｉｏｎｏｔｒｏｐｉｃ）グルタミン酸受容体の一つである。この受容体の活性は選択性なしに（ｎｏｎ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ）陽イオン通路（ｃａｔｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ）を開く機能を持っている。
この受容体の特徴は、電圧に依存的に開き、グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）結合部位があり、細胞外のＭｇ２＋イオンによって遮断されることであると知られている。よって、ＮＭＤＡ（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ）受容体が活性化される場合、Ｎａ＋およびＣａ２＋イオンが細胞内に入り込み、Ｋ＋イオンが細胞外に出て後シナプス（ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ）の神経細胞の脱分極（ｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）を誘発する(Dingledine et al., Pharmacol. Rev. 51, 7-61. 1999; Cull-Candy et al., Curr. Opin. Neurobiol. 11, 327-335, 2001; Paoletti and Neyton, Curr Opin Pharmacol 7, 39-47, 2007)。
【００７５】
また、ＮＭＤＡ受容体が中枢神経系、特に海馬において重要な役割を果たすことは、この受容体が活性化されて入り込んできたＣａ２＋イオンはシナプス可塑性（ｓｙｎａｐｔｉｃ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）と密接な関連がある長期増強（ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ、ＬＴＰ）を誘発させて学習（ｌｅａｒｎｉｎｇ）と記憶（ｍｅｍｏｒｙ）において最も重要な役割を果たすと知られている(Purves, Dale, George J. Augustine, David Fitzpatrick, William C. Hall, Anthony-Samuel LaMantia, James O. McNamara, Leonard E. White Neuroscience, 4th Ed.. Sinauer Associates. pp. 191-195. http://www.sinauer.com/neuroscience4e. synaptic plasticity)。
本発明では、ジントニンによるＮＭＤＡ受容体の活性を確認するために、次のとおり、ＮＭＤＡ受容体を発現するＸｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓにおけるＮＭＤＡ受容体の活性を測定した。
【００７６】
１０−（１）．ＮＭＤＡ受容体に対する遺伝子およびＮＭＤＡ受容体に対するｃＲＮＡの準備
ＮＭＤＡ受容体サブユニット（ＮＲ１およびＮＲ２）に対するｃＤＮＡを使用した(Zheng et al., J Neurosci. 17, 8676-8686, 1997)。ＮＭＤＡ受容体サブユニット（ＮＲ１とＮＲ２）に対するｃＲＮＡｓ（１００ｎｇ／４０ｎｌ）は、それぞれのｏｏｃｙｔｅの動物（ａｎｉｍａｌ）或いは植物極（ｖｅｇｅｔａｌ ｐｏｌｅ）に１０ｍＬのｍｉｃｒｏｄｉｓｐｅｎｓｅｒ（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を用いて注入し、注入４〜５日後に実験に利用した(Zheng et al., J Neurosci. 17, 8676-8686, 1997)。
【００７７】
１０−（２）．Ｏｏｃｙｔｅの準備
Ｘｅｎｏｐｕｓ Ｉ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ、ＵＳＡ）から得たＸｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓを最上の規格指針にしたがって保管および処理し、ｏｏｃｙｔｅｓ（卵子）を分離するためにカエルを３−アミノ安息香酸エチルエステル（３−ａｍｉｎｏ ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ ｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）の通気溶液（ａｅｒａｔｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ｃｌｌａｇｅｎａｓｅ）で処理した後、８２．５ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２．５ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが含まれたカルシウム遊離（Ｃａ２＋ ｆｒｅｅ）培地で２時間攪拌して分離した。
Ｖ−ＶＩ段階の卵子を収集し、５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを追加したＮＤ９６（９６ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１．８ｍＭのＣａＣｌ２、および５ｍＭのＨＥＰＥＳ；ｐＨ ７．４）で保管した。前記卵子を含む溶液は連続的に軽く振盪しながら１８℃に維持し、毎日交換した。
【００７８】
１０−（３）．ＮＭＤＡ受容体活性の測定
二電極式ボルテージクランプ（ｔｗｏ−ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ｖｏｌｔａｇｅ ｃｌａｍｐ）記録は、小型のプレキシガラス（ｐｌｅｘｉｇｌａｓｓ）ネットチャンバー（５ｍＬ）に置かれた個別的な卵子から得た。電気生理学実験（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）は、３ＭのＫＣｌで充填したマイクロ電極（抵抗：０．２〜０．７ＭΩ）と卵子固定増幅器（Ｏｏｃｙｔｅ Ｃｌａｍｐ ａｍｐｌｉｆｉｅｒ；ＯＣ−７２５Ｃ、Ｗａｒｎｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、ＣＴ、ＵＳＡ）を使用した。ＮＭＤＡ受容体の活性に対する電気生理学的記録のために、まず、ｏｏｃｙｔｅｓはＭｇ２＋ ｆｒｅｅ ＮＤ９６（９６ｍＭのＮａＯＨ、２ｍＭのＫＯＨ、０．３ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６ ｗｉｔｈ ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）で灌流した。Ｏｏｃｙｔｅｓは−６０ｍＶ保持電位（ｈｏｌｄｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）で固定し、ＮＭＤＡ電流（３００ｍＭ ＮＭＤＡ＋１０ｍＭグリシンの投与によって誘導）を記録した(Zheng et al., J Neurosci. 17, 8676-8686, 1997; Chang and Kuo, J Neurosci. 28, 1546-1556, 2008)。
【００７９】
その結果、図９のＡに示すように、ＮＭＤＡ受容体を発現するｏｏｃｙｔｅｓにＮＭＤＡを処理する場合、内向き電流（ｉｎｗａｒｄ ｃｕｒｒｅｎｔ）が誘導されてＮＭＤＡ受容体が成功的に発現されていることが分かった。図９のＢおよびＣに示すように、ＮＭＤＡ受容体を発現させたＸｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓにおいて、ジントニンは投与濃度別にＮＭＤＡ受容体の活性による内向き電流を増加させ、ＥＤ５０は０．４９±０．１０μｇ／ｍＬであると確認された。
また、ジントニンによるＮＭＤＡ受容体活性増加作用は、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓに内因性に存在するＬＰＡ１受容体(Kimura et al., J Biol Chem. 276, 15208-15215, 2001)の活性によるＧタンパク質−ＰＬＣ−ＩＰ３−Ｃａ２＋経路というシグナル伝達経路を介してＮＭＤＡ受容体活性増加作用が行われている可能性を示しているため、ＬＰＡ受容体拮抗剤を処理する場合、ジントニンによるＮＭＤＡ受容体活性増加作用が遮断されるかどうかを確認した。
その結果、図１０のＡに示すように、ＬＰＡ１とＬＰＡ３受容体拮抗剤として知られているＫｉ１６４２５（１０μＭ）(Ohta et al., Mol Pharmacol 64. 994-1005, 2003)を処理する場合、ＮＭＤＡによるＮＭＤＡ受容体の活性には影響を及ぼさないが、ジントニンによるＣａＣＣ活性が減少し、ジントニンによるＮＭＤＡ受容体活性増加作用が統計学的に有意に抑制されるから（＊ｐ＜０．００１、対照群対比）、ジントニンは細胞膜に内因性に存在するＬＰＡ受容体を活性化させてＮＭＤＡ受容体活性増加を誘導することを確認した（図１０のＢ参照）。
【００８０】
また、ジントニンによるＮＭＤＡ受容体活性作用に対するシグナル伝達過程を確認した結果、活性ＰＬＣ（ａｃｔｉｖｅ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｃ）抑制剤（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）であるＵ７３１２２（１μＭ）を処理する場合、ＮＭＤＡによる内向き電流を遮断しないが、ジントニンによるＣａＣＣ活性を抑制するものと確認された。また、ジントニンによるＮＭＤＡ受容体活性増加作用を遮断するものと確認された（図１１のＡ参照）。ところが、不活性ＰＬＣ（ｉｎａｃｔｉｖｅ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｃ）抑制剤であるＵ７３３４３（１μＭ）を処理する場合には、ジントニンによるＮＭＤＡ受容体活性作用を遮断する作用がないものと確認された（図示せず）。
また、ＩＰ３受容体拮抗剤である２−ＡＰＢを処理する場合にも、ＮＭＤＡによる内向き電流を遮断しないが、ジントニンによるＣａＣＣ活性を抑制し、ジントニンによるＮＭＤＡ受容体活性増加作用を遮断するものと確認された（図１１のＢ参照）。
また、細胞質内カルシウムキレート剤であるＢＡＰＴＡ−ＡＭを処理する場合にも、ＮＭＤＡによる内向き電流を遮断しないが、ジントニンによるＣａＣＣ活性を抑制し、ＮＭＤＡ受容体活性増加作用を遮断するものと確認された（図１１のＣ参照）。よって、ジントニンは、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓに内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）に存在するＬＰＡ１受容体(Kimura et al., J Biol Chem. 276, 15208-15215, 2001)を活性化させ、ＮＭＤＡ受容体シグナル伝達とは異なるＰＬＣ−ＩＰ３−Ｃａ２＋経路というｕｐ−ｓｔｒｅａｍシグナル伝達経路を介してＮＭＤＡ受容体活性増加を誘導することを確認した（図１１のＤ参照）。
【００８１】
一方、ＮＭＤＡ受容体は、細胞質内カルシウムの増加によるタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）によってリン酸化される場合、活性が増加し、ＰＫＣによってリン酸化される部位（ｓｉｔｅｓ）を持っており、ＰＫＣの活性はＮＭＤＡ受容体の活性を誘導するものと報告された(Urushihara et al., J Biol Chem 267, 11697-11700, 1992; Zheng et al., J Neuroscience 15, 8676-8686, 1997; Lia et al., Mol Pharmaocol 59, 960-964, 2001)。また、Ｇαｑ／１１タンパク質共役受容体の活性はＰＫＣ、チロシンキナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）およびＳｒｃ系統（Ｓｒｃ−ｆａｍｉｌｙ）チロシンキナーゼのシグナル伝達経路を通じてＮＭＤＡ受容体の活性と連係していることを報告した(Lu et al., Nature neuroscience 2, 331-338, 1999)。
本発明では、ジントニンによるＮＭＤＡ受容体活性増加作用と、細胞膜シグナル伝達に対するｄｏｗｎ−ｓｔｒｅａｍに関与するキナーゼおよびタンパク質ホスファターゼ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）との連関性を確認した。
【００８２】
本発明で確認したキナーゼおよびチロシンホスファターゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）はＰＫＣ、チロシンキナーゼおよびＳｒｃ系統キナーゼであり、タンパク質ホスファターゼは受容体タンパク質チロシンホスファターゼ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＲＰＴＰ）αである。ＰＫＣはＰＬＣ活性の際にＩＰ３の他にジアシルグリセロール（ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ、ＤＡＧ）が生成されるが、ＤＡＧはＰＫＣを活性化させるものと知られており、ＲＰＴＰはＧαｑ／１１タンパク質共役受容体の活性によって活性化されたＳｒｃ系統キナーゼおよびチロシンキナーゼの作用を調節する重要な酵素として知られている(Tsai et al., EMBO J, 18, 109-118, 1999; Petrone et al., EMBO J 22, 4121-4131, 2003)。
次の段階では、チロシンキナーゼ、Ｓｒｃ系統キナーゼ、および受容体タンパク質チロシンホスファターゼ（ＲＰＴＰ）の役割を確認した。
図１２のＡに示すように、ＰＫＣによってリン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）される部位として知られているＮＭＤＡ受容体の１３０８番目に存在するセリン（Ｓ１３０８）をアラニンに突然変異させた突然変異ＮＭＤＡ受容体（Ｓ１３０８Ａ）を発現する細胞ではジントニンによるＮＭＤＡ受容体活性増加作用が抑制されるが、突然変異ＮＭＤＡ受容体（Ｓ１３１２Ａ）ではジントニンによるＮＭＤＡ受容体活性増加作用が維持されることが確認された。よって、ジントニンによるＰＫＣ活性はＮＭＤＡ受容体の特定部位（Ｓ１３０８）のリン酸化を促進させ、リン酸化されたＮＭＤＡ受容体はその活性が増加し、ジントニンによるＮＭＤＡ受容体活性増加作用はＰＫＣ活性に連係していることが分かった。
【００８３】
また、一般なチロシンキナーゼ抑制剤（ｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）としてよく知られているゲニステイン（１０μＭ）を処理する場合、ジントニンによるＮＭＤＡ受容体活性増加作用が抑制されることが確認された。よって、ジントニンはチロシンキナーゼの活性を誘発させ、活性化されたチロシンキナーゼはＮＭＤＡ受容体のチロシン残基（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅ）をリン酸化させてＮＭＤＡ受容体活性増加を誘導することが分かった（図１２のＢ参照）。
また、Ｓｒｃ系キナーゼの活性抑制剤（ａｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）であるＰＰ２（３０μＭ）を処理する場合にもジントニンの作用が遮断されるが、不活性抑制剤（ｉｎａｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）であるＰＰ３（３０μＭ）処理は効果がないことが確認された。よって、ジントニンによるＮＭＤＡ受容体活性増加作用はジントニンがこれらのキナーゼの活性を誘導することにより誘発されることが分かった（図１２のＣ参照）。
【００８４】
また、活性或いは不活性リンタンパク質ホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＲＰＴＰ）αを発現するｏｏｃｙｔｅｓにおいてジントニンによるＮＭＤＡ受容体活性増加作用が減少するものと確認された（図１２のＤ参照）。
また、脱リン酸酵素の活性は、ジントニンによる様々なキナーゼ活性によるＮＭＤＡ受容体のリン酸化がＮＭＤＡ受容体の活性増加につながるが、ＲＰＴＰの発現によりＮＭＤＡ受容体がリン酸化されることを遮断することにより、ジントニンによるＮＭＤＡ受容体活性増加作用を抑制することが確認された。よって、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓへのジントニンの処理はｘｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓに内因性に存在するＬＰＡ受容体を活性化させ、活性化された受容体はＰＬＣ−ＩＰ３−Ｃａ２＋経路を介して細胞質内カルシウム濃度の増加につながり、増加した細胞質内カルシウムはカルシウムに存在するＰＫＣ、チロシンキナーゼおよびＳｒｃ系タンパク質キナーゼの活性を誘導し、結果としてＮＭＤＡ受容体活性増加作用を誘発するものと確認された。
【００８５】
実施例１１．ジントニンによる白色ラット海馬切片における長期増強（ＬＴＰ）の誘導に及ぼす影響の確認
長期増強（Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ）は、２つの神経細胞の間で同時刺激に由来するシグナル伝達過程の長期間の上昇或いは強化として知られている(Cooke and Bliss, Brain 129, 1659-1673, 2006)。この現象は神経細胞間のシナプス可塑性（ｓｙｎａｐｔｉｃ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）の主要原因となり、シナプス間の結束力（ｓｙｎａｐｔｉｃ ｓｔｒｅｎｇｔｈ）の強化を誘発して学習および記憶が行われる過程として広く知られている。よって、ＬＴＰは学習（ｌｅａｒｎｉｎｇ）と記憶（ｍｅｍｏｒｙ）の根本となる現象として知られている(Bliss and Collingridge, Nature 361, 31-39, 1003)。
ＬＴＰは、学習と記憶に関与するものと知られている大脳の海馬（ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）から主に観察される。海馬を用いてシナプス伝達を研究するとき、テタニー（ｔｅｔａｎｙ）刺激によるＬＴＰを誘導して研究するが、このモデルは脳において情報を記憶するシナプスの役割のうち活性依存変化（ａｃｔｉｖｉｔｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｈａｎｇｅ）を研究するためのモデルである。テタニー刺激が行われる間、大きくて長い脱分極が起こるが、これはＮＭＤＡ受容体が活性化を誘導し、その結果Ｃａ２＋の透過性が高くなり、Ｃａ２＋がＮＭＤＡ受容体通路を介して細胞内に入り込むと、シナプス効力（ｓｙｎａｐｔｉｃ ｅｆｆｉｃａｃｙ）を増強させる一連の過程を誘発する。このような理由により、ＮＭＤＡ受容体活性を通じて受容体通路から入ってきたＣａ２＋イオンが、ＬＴＰの誘導役割を果たすスイッチであるというのである。
【００８６】
ＮＭＤＡ受容体通路に依存的なシナプス可塑性は、学習と記憶の細胞基盤（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂａｓｉｓ）の役割を果たすことができると知られている。
前述したように、ジントニンはＮＭＤＡ受容体の活性を増加させるものと確認され、ジントニンが白色ラット海馬切片（ｓｌｉｃｅｓ）のＬＴＰ生成に及ぼす影響を確認するために(Moon et al., Neursci. Lett. 466, 114-119, 2009; Lee et al., J Neurosci. Res. 89, 96-107, 2011)、ジントニンの３つの異なる濃度（０．１、１或いは１０μｇ／ｍＬ）を処理する場合のＬＴＰ誘発への影響について調べた。
【００８７】
１１−（１）．白色ラット海馬切片（ｒａｔ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｓｌｉｃｅｓ）の準備
３〜５週齢の雄白色ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ ｓｔｒａｉｎ）（Ｃｈａｒｌｓ Ｒｉｖｅｒ、Ｕ．Ｓ．Ａ）を麻酔剤の使用なしで速く犠牲させて頭を得た(Steidl et al., Brain Res. 1096, 70-84, 2006)。Ｒｏｎｇｅｕｒ（Ｆｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｏｏｌｓ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いて頭蓋骨を除去し、脳を取り出して直ちに氷で冷却させ、酸素で飽和された（９５％Ｏ２／５％ＣＯ２）スクロースを含む人工髄液（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ；ｓａＣＳＦ）（組成：スクロース２４８ｍＭ、ＮａＨＣＯ-３２６ｍＭ、グルコース１０ｍＭ、ＫＣｌ３ｍＭ、ＣａＣｌ２２ｍＭ、ＭｇＣｌ２１ｍＭ、ＨＥＰＥＳ１０ｍＭ、ｐＨ７．４）に浸漬した。
海馬切片は、ｖｉｂｒａｔｏｍ（ＭＡ７５２ ｍｏｔｏｒｉｓｅｄ ａｄｖａｎｃｅ ｖｉｂｒｏｓｌｉｃｅ；Ｃａｍｐｄｅｎ ｉｎｃ．）を用いて４００μｍの厚さに切って人工髄液（ａｒｔｉｆｉｃａｉｌ  ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ）（ａＣＳＦ）（組成：ＮａＯＨ１２４ｍＭ、ＮａＨＣＯ３２６ｍＭ、グルコース１０ｍＭ、ＫＣｌ３ｍＭ、ＣａＣｌ２２ｍＭ、ＭｇＣｌ２１ｍＭ、ＨＥＰＥＳ１０ｍＭ、ｐＨ７．４）内で１時間安定させた(Lelong and Rebel, J Pharmacol Toxicol Methods. 39, 203-210, 1998)。
【００８８】
１１−（２）．白色ラット海馬切片（ｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｓｌｉｃｅ、ＯＨＳＣ）の培養
ＯＨＳＣはＳｔｏｐｐｉｎｉ等の方法(Stoppini et al., J Neurosci Methods 37, 173-182, 1991)によって培養し、全ての手続きは滅菌した実験台で行った。
前述のように準備された白色ラットの脳は、直ちに氷で冷たくなったＨＢＳＳ−培地（ＬＢ ００３−０１、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ、ＵＳＡ）に浸して海馬を分離した後、組織粉砕機（ｔｉｓｓｕｅ ｃｈｏｐｐｅ；Ｍｉｃｋｌｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ．，Ｓｕｒｒｅｙ、ＵＫ）を用いて４００μｍの厚さに切り出した。切り出された切片はｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｎｓｅｒｔ（ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｅｔｈｙｌｅｎｅ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ、０．４μｍ、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＣＭ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）に置き、これを培養液で充填した。
【００８９】
この際、培養液の組成は５０％ＭＥＭ−培地（ＬＭ ００７−０１、ＪＢＩ、Ｄａｅｇｕ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）、２５％ウマ血清（ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ；Ｓ １０４−０１、Ｄａｅｇｕｅ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）、２５％ハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ；ＬＢ ００３−１、ＪＢＩ、Ｄａｅｇｕ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）、６ｇ／ＬのＤ−グルコース（Ｇ−７５２８、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）、１ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇ−８５４０、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｈ−４０３４、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）および１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ＬＳ ２０２−０２、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、ＵＳＡ）であり、ｐＨは７．１に調節した。培養液は毎２〜３日ごとに１回ずつ交換し、培養器（３６℃、９５％Ｏ２、５％ＣＯ２）で培養された海馬切片は１４日後に実験に利用した。
【００９０】
１１−（３）．電気生理学的記録
１）ＭＥＡプローブ（ｐｒｏｂｅｓ）における海馬切片（ｓｌｉｃｅ）の準備
ＭＥＡプローブを使う前に、ＭＥＡプローブ（Ｍｕｌｔｉ ｃｈａｎｎｅｌ ｓｙｓｔｅｍ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ；ｅａｃｈ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ；３０×３０μｍ、ｄｉｓｔａｎｃｅ：２００μｍ）の表面は０．１％ポリエーテルイミド（ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｉｍｉｄｅ；ＰＥＩ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）でコートし、９０分間滅菌実験台でＵＶの下に乾燥させた。プローブは２次蒸留水で１〜２回洗浄した。Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｎｓｅｒｔにある海馬切片は、分離してプローブの近くに置き、周辺の水分を除去し、新しいａＣＳＦ溶液を切片上に注いだ。
切片を含んでいるＭＥＡアレイ（ａｒｒａｙ）をＭＥＡ１０６０増幅器（Ｍｕｌｔｉ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の界面側へ移動し、切片が温度調節器（Ｍｕｌｔｉ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｓｙｓｔｅｍ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって３２℃に到達した後、刺激が切片に到達するようにした。ＭＥＡアレイの溶液はＡｇ／ＡｇＣｌペレットを用いて接地（ｇｒｏｕｎｄｉｎｇ）されるようにした。
【００９１】
２）長期増強（ＬＴＰ）の誘導
両極性定電流パルス（ｂｉｐｏｌａｒ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｕｌｓｅｓ）は、内蔵型分離器（ｂｕｉｌｔ−ｉｎ ｉｓｏｌａｔｏｒ；Ｍｕｌｔｉ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に取り付けられているデジタル刺激器（ｄｉｇｉｔａｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）を介して得られたデータ収集ソフトウェア（ｄａｔａ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ）で生成されるようにした。典型的な反応（ｔｙｐｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）を集めるために、電極の一つはＳｃｈａｆｆｅｒ ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ ｆｉｂｅｒｓ領域で刺激電極位置（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）として、もう一つは記録電極位置（ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）としてアンモン角（Ｃｏｒｎｕ ａｍｍｏｎｉｓ）１の放射状層（ｓｔｒａｔｕｍ ｒａｄｉａｔｕｍ）で選択した(Shimono et al., Neural Plast. 9(4), 249-254, 2002)。
ＬＴＰは標準プロトコル（１００Ｈｚ ｔｈｅｔａ ｂｕｒｓｔ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）を用いて生成されるようにした。簡略に記述すると、テタヌス刺激（ｔｅｔａｎｉｃｃ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）は１００Ｈｚで１秒間適用し、３０秒間隔で２回繰返し行った。ＬＴＰ誘導の後に部位電位（ｆｉｅｌｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ、ＦＰ）記録は毎３０秒ごとに単一パルス刺激（ｓｉｎｇｌｅ ｐｕｌｓｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）によって１２０分間さらに行った。刺激と記録はＲｅｃｏｒｄｅｒ−Ｒａｃｋ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｕｌｔｉ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた。
【００９２】
３）ジントニンの処理
実験期間中に、切片は持続的に９５％Ｏ２と５％ＣＯ２を含有するαＣＳＦ溶液を用いて１ｍＬ／ｍｉｎの速度にて灌流（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）し、ＴＢＳ（Ｔｈｅｔａ ｂｕｒｓｔ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）のない正常的な条件における記録時間表（ｔｉｍｅ ｓｃｈｅｄｕｌｅ）、ＴＢＳのみある記録条件、およびＴＢＳとジントニンを共に処理した条件は図１３に示した。
【００９３】
４）データ分析
ＭＣ＿Ｒａｃｋ（ｖ．３．２．１．０、Ｍｕｌｔｉ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）とキムテソン博士によって製作された分析システム（Ｄｒ．Ｔａｅ−Ｓｕｎｇ Ｋｉｍ、ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｅｄｉｃａｌ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｋｙｕｎｇ−ｈｅｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）が取り付けられているＭａｔＬａｂ（ｖ．７．０．１、Ｔｈｅ Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ ｉｎｃ．）を用いてデータを分析した(Moon et al., Neursci. Lett. 466, 114-119, 2009; Lee et al., J Neurosci. Res. 89, 96-107, 2011)。
その結果、図１３における縦軸のｆＥＰＳＰｓ（ｆｉｅｌｄ ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ）と横軸の時間との関係から分かるように、ＴＢＳ（Ｔｈｅｔａ ｂｕｒｓｔ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）を与える場合、ジントニンを処理していない切片ではＬＴＰが刺激によって誘導されるが、ジントニンを処理する場合、投与濃度別にジントニンを処理していない海馬切片に比べてＬＴＰ誘導がさらに大きく形成されていることを確認することができた。
【００９４】
また、図１４ではＴＢＳ（２０分）前の代表的なｆｉｅｌｄ ｔｒａｃｅと、ＴＢＳを与えてから８０分後に生じたｆｉｅｌｄ ｔｒａｃｅを示している。ジントニンを処理していない切片（ｃｏｎｔｒｏｌ）では、部位電位が大きく活性化されないが、ジントニンを投与する場合、部位電位が投与濃度別に増加することを示している。図１４はｔｏｔａｌ ｆＥＰＳＰＳ（ｔｏｔａｌ  ｆｉｅｌｄ ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ）活性を要約した結果であって、ジントニンを処理していない対照群が１５２．８±７．２１％であるが、これに対し、ジントニン０．１μｇ／ｍＬで１８０．９０±７．５３％、１μｇ／ｍＬで２０５．３２±６．４０％、１０μｇ／ｍＬで２１４．１４±１１．５５％の増加を示している。よって、ジントニン処理は培養した海馬切片においてＬＴＰ形成を刺激すると確認された（ｎ＝４、それぞれの切片数）（図１５参照）。
【００９５】
実施例１２．ジントニンによる長期記憶および空間認知能力向上の確認
中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の活性は長期増強（ＬＴＰ）の誘発と連係しており、誘発されたＬＴＰは学習（ｌｅａｒｎｉｎｇ）と記憶（ｍｅｍｏｒｙ）の増進に最も重要な役割を果たすものと知られており(Rezvani AH., In: Levin ED, Buccafusco JJ, editors. Animal Models of Cognitive Impairment. Boca Raton (FL): CRC Press; 2006. Chapter 4)、前述したように、ジントニンはＮＭＤＡ受容体活性増加作用を誘導することが確認された。よって、本発明では、マウスを用いて、ジントニンが記憶に及ぼす影響を確認するために、受動的回避反応実験（ｐａｓｓｉｖｅ ａｖｏｉｄａｎｃｅ ｔｅｓｔ）およびモリス水迷路実験（ｍｏｒｒｉｓ ｗａｔｅｒ ｍａｚｅ ｔｅｓｔ）を行った。
【００９６】
１２−（１）受動的回避反応実験による長期記録力向上テスト
オリエンタル社（Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）から購入し、韓国の建国大学校の動物管理ガイドラインに準じて飼育した雄ＩＣＲマウス（２５〜２８ｇ）を、Ｙａｎｇなどの方法(Yang et al., Biol Pharm Bull 32, 1710-1715, 2009)に準じて記憶維持力の損傷およびジントニンによる記憶損傷抑制作用を受動的回避実験で測定した。
この際、測定器具は、２つの同一サイズ（２０×２０×２０ｃｍ）の明るい部屋と暗い部屋から構成し（Ｇｅｒｍｉｎｉ Ａｖｏｉｄａｎｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）、底部には電気衝撃を与えることが可能な金属棒を格子状に設置し、２つの部屋の間には自動的に動くギロチン型の小さい門（５×５ｃｍ）を設置した。
【００９７】
１）学習セッション
まず、習得試験（ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｔｒｉａｌ）のために、門を閉じた状態でマウスを明るい部屋に位置させ、１０秒の適応期間の後、２つの部屋の間の門が自動的に開くようにした。マウスが暗い所を好む習性によって、明るい所を回避して暗い部屋に入ると、自動門が閉となり、３秒間０．５ｍＡの電気衝撃を加えた。門が開いた時点から暗い部屋に入るまでの待ち時間（ｌａｔｅｎｃｙ ｔｉｍｅ）を測定した。実験開始１２０分の前にジントニン（２５、５０、１００ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ）を投与し、陽性対照群にはタクリン（ｔａｃｒｉｎｅ；１０ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ）を投与した。ジントニン或いはタクリン投与３０分後、スコポラミン（ｓｃｏｐｏｌａｍｉｎｅ）（０．９ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を投与して記憶障害を誘導し(Araujo et al., Prog Neuropsycopharmcol Biol Psychiatry 29, 411-422, 2005)、これに対する対照群には生理食塩水を投与した。スコポラミン投与３０分後に実験を開始した。１８０秒の実験時間内に白いマウスが暗い部屋に入らない場合に実験から除外させた。
【００９８】
２）テストセッション
学習セッション２４時間後、ジントニン投与なしで実験を行った。マウスをさらに明るい部屋に位置させ、１０秒の適応期間の後に門を開き、門の開時点からマウスが暗い部屋に入るまでの待ち時間（ｌａｔｅｎｃｙ ｔｉｍｅ）を測定して記録した。
受動的回避反応実験によって、スコポラミンで誘導した長期記憶（ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｍｅｍｏｒｙ）障害に対するジントニン効果を測定した。受動的回避反応実験における待ち時間は図１６に示した。スコポラミン投与群の獲得試験においては、グループ間の待ち時間の差異は観察されなかったが、ジントニンはスコポラミンによって減少した待ち時間をジントニン濃度依存的に増加させるものと確認された。
すなわち、スコポラミン単独投与群は２３．０７±１．９５ｓであったが、ジントニン投与群は２５、５０および１００ｍｇ／ｋｇでそれぞれ７８．２４±７．８３ｓ、１６９．２２±１２．９７ｓ、１８３．４３±１０．８９ｓであって、待ち時間を投与濃度別に増加させるものと確認された。
上記の結果より、ジントニンは、スコポラミンにより誘導される長期記憶障害（損傷）から脳神経系を保護する効果があることを確認することができた。
【００９９】
１２−（２）．モリス水迷路実験による空間認知記憶向上テスト
モリス水迷路実験（ｍｏｒｒｉｓ ｗａｔｅｒ ｍａｚｅ）は、内部がのっぺりしている円形のプール（直径９０ｃｍ、深さ４５ｃｍ）を用いて、プールの内部に５００ｍＬの牛乳入り水（２０±１℃）を３０ｃｍの負荷さに満たした後、照明が暗くて防音処理が施された実験室に多様な視覚信号（ｖａｒｉｏｕｓ ｖｉｓｕａｌ ｃｕｅｓ）と共に置いた。前記プールを４つのクワドラント（ｑｕａｄｒａｎｔ）に分け、白色のプラットフォーム（直径６ｃｍ、高さ２９ｃｍ）を４つのクワドラントのうちいずれか一つに位置させた。この際、前記プラットフォームは水面から１ｍの下に沈んでいて見えない。
初日の実験はプラットフォームのない状態でマウスに６０秒間の水泳訓練のみ行った。次に、４日間プラットフォームのある状態でマウスに１日４回のテストを行った。マウスはプラットフォームに上がると、１０秒だけ留まることができるようにし、もしマウスが６０秒内にプラットフォームに到達しなければ、１０秒間プラットフォームにのせておいた。マウスをさらに元のケージに移し、赤外線ランプの下でマウスに体を乾かす時間を与え、試験間の時間間隔を３０秒とした。
【０１００】
それぞれのテストの間、隠されたプラットフォームを探すのにかかる時間をｖｉｄｅｏ ｃａｍｅｒａ−ｂａｓｅｄ Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｏｄｕｌｕｓ、Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で記録した。
それぞれの訓練テストにおいて、マウスをプールの４つのクワドラントのうちいずれか一つを向かうようにしてプールの水中に入れ、毎日マウスの位置を変え、最後の訓練試験セッションの翌日にマウスを検証した。このために、プラットフォームをプールから除去し、マウスが６０秒間プラットフォームを探して泳ぐことができるようにした。さらに、マウスがプールの４つのクワドラントのうち、プラットフォームが位置していたクワドラント側で泳ぐ時間を記録した。生理食塩水に溶かしたジントニン（２５、５０或いは１００ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）、または陽性対照群としてのタクリン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）を毎日試験１時間前に投与した。マウスの記憶障害はジントニン投与３０分後にスコポラミン（０．９ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で誘導した。対照群には生理食塩水のみを投与した。
【０１０１】
１）潜時
ジントニン濃度別（２５、５０および１００ｍｇ／ｋｇ）の空間学習能力に対する影響はモリス水迷路実験によって測定した。生理食塩水を投与した対照群の場合、水面の下に置かれたプラットフォームの位置を非常に速く習得した。その結果、実験１日〜４日まで潜時が著しく減少したことを確認することができた（１７ａ参照）。これとは対照的に、スコポラミン投与群の潜時（Ｌａｔｅｎｔ ｔｉｍｅ）は４日間若干の変化を誘導するものと確認された。スコポラミン処理群は対照群に比べて相対的に長い潜時を訓練日（ｔｒａｉｎｇｉｎｇ ｄａｙ）全般にわたって示した（図１７ａ参照）。ジントニン処理はスコポラミン処理によって増加した潜時を統計学的に有意に減少させ、ジントニンによる潜時の増加は濃度依存的であるものと確認された（図１７ａ参照）。
言い換えれば、ジントニン処理群において潜時が初日から４日まで引き続き減少したことからみて、ジントニンが、スコポラミンによって誘導された空間認知記憶損傷を顕著に抑制および防御することを確認することができた。
【０１０２】
２）単純空間認知記憶
マウスの単純空間認知記憶を試験するためにプラットフォームがない状況で、もともとプラットフォームがあったクワドラントにおける水泳時間（ｓｗｉｍｍｉｎｇ ｔｉｍｅ）を測定した。
その結果は、図１７ｂに示すように、逃避台があったクワドラントにおける水泳時間の場合、すなわち、スコポラミン単独投与群は１３．４７±１．８６ｓであったが、ジントニン投与群は２５、５０および１００ｍｇ／ｋｇでそれぞれ２１．３３±３．１３ｓ、２４．５３±３．９１ｓ、２５．１７±４３ｓであって、水泳時間を投与濃度別に増加させるものと確認された。
すなわち、ジントニン処理群が対照群と比較してジントニン投与依存的に著しく高い値を持つことからみて、ジントニンは単純空間認知記憶を増加させることを確認することができた（図１７ｂ参照）。
【０１０３】
実施例１３．ジントニンによる白色ラット副腎（ｒａｔ ａｄｒｅｎａｌ ｇｌａｎｄ）からのカテコールアミンの分泌（ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）に対する影響の確認
カテコール基を含み且つアミン基が付いたカテコールアミンは、ドパミン、エピネフリンおよびノルエピネフリンの総称であって、中枢神経系および抹消神経系から主に放出されるホルモンとして知られている。
中枢神経系では、意識を維持しかつ意識を明瞭にし、ヒトや動物が覚めているようにして集中力を発揮せしめる作用をする。中枢神経系にカテコールアミンが足りない場合、注意欠陥過活動性障害 （Ａｔｔｅｎｔｉｏｎ Ｄｅｆｉｃｉｔ Ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ Ｄｉｓｏｒｄｅｒ、ＡＤＨＤ）およびうつ病（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）が現れる。まは、カテコールアミンは外部からの各種ストレスに対抗して、ヒトを含む動物の身体恒常性の維持に寄与する。
【０１０４】
副腎などの抹消神経系から放出されるカテコールアミンは、主にエピネフリンから構成されており、運動、ストレス或いは危険に処したとき、交感神経系が興奮する場合、副腎髄質（ａｄｒｅｎａｌ ｍｅｄｕｌｌａ）のクロム親和性細胞（ｃｈｒｏｍａｆｆｉｎ ｃｅｌｌｓ）に存在するＧタンパク質共役受容体の活性によってカテコールアミンが血液に放出されるものと知られている(Currie, Cell Mol Neurobiol. 8, 1201-1208, 2010)。放出されたカテコールアミンは、運動やストレスの際に貯蔵された糖または脂肪の分解を促進し、身体に必要なエネルギーを提供して運動力の向上、ストレス克服およびストレスによる疲労の回復に役立てることに重要な役割を果たす。また、ストレスの下で抹消血管を収縮させて血圧を維持し、血液循環を増加させて低血圧を予防および治療する役割を果たす(Purves, Dale, George J. Augustine, David Fitzpatrick, William C. Hall, Anthony-Samuel LaMantia, James O. McNamara, and Leonard E. White (2008). Neuroscience. 4th ed. Sinauer Associates. pp. 137-138)。
本発明では、ジントニンの白色ラット副腎からのカテコールアミン放出に対する影響を次のとおり確認した。
【０１０５】
１３−（１）．実験動物の準備
２００〜３００ｇの雄白色ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ ｒａｔｓ、２００〜３００ｇ）にチオペンタールナトリウム（ｔｈｉｏｐｅｎｔａｌ ｓｏｄｉｕｍ）（５０ｍｇ／ｋｇｍ）を腹腔内に注入して麻酔させた後、ＷａｋａｄｅおよびＷｏｏなどの方法によって分離した(Wakade, J Physiol. 313, 463-480, 1981; Woo et al., Korean J Physiol Pharmacol., 12, 155-164, 2008)。
簡単に説明すると、分離された副腎を灌流するために、カニューレ（ｃａｎｎｕｌａ）を図１８に示すように挿入し、ヘパリン（４００ＩＵ／ｍＬ）を、カニューレ挿入中に血液の凝固を防ぐために大静脈（ｖｅｎａ ｃａｖａ）に注入した。その後、副腎をラットのボディから分離してルーサイトチャンバー（ｌｕｃｉｔｅ ｃｈａｍｂｅｒ）に移し、３７±１℃を保持した。
【０１０６】
１３−（２）．副腎の灌流
副腎は、蠕動ポンプ（ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ ｐｕｍｐ；ＩＳＣＯ(R) ｐｕｍｐ、ＷＩＺ Ｃｏ．Ｕ．Ｓ．Ａ）を用いて０．３３ｍＬ／ｍｉｎの速度で灌流（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）した。灌流に用いられた溶液はＫｒｅｂｓ−ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎであり、その組成は次のとおりである（ｍＭ）：ＮａＣｌ、１１８．４；ＫＣｌ、４．７；ＣａＣｌ２、２．５；ＭｇＣｌ２、１．１８；ＮａＨＣＯ３、２５；ＫＨ２ＰＯ４、１．２；グルコース、１１．７。
灌流溶液は持続的に９５％Ｏ２＋５％ＣＯ２を含むガスを用いて泡が立つようにし、溶液のｐＨ７．４〜７．５を維持した。また、灌流溶液はカテコールアミンの酸化を防ぐためにＥＤＴＡ（１０ｍｇ／ｍＬ）およびアスコルビン酸（１００ｍｇ／ｍＬ）を添加した(Woo et al., Korean J Physiol Pharmacol., 12, 155-164, 2008)。
【０１０７】
１３−（３）．ジントニンおよび薬物の投与
ジントニン（１〜１０μｇ／ｍＬ）或いはシクロピアゾン酸（ｃｙｃｌｏｐｉａｚｏｎｉｃ ａｃｉｄ；１０μＭ）を４分間灌流しながら処理し、アセチルコリン（５．３２ｍＭ）は三方活栓（ｔｈｒｅｅ−ｗａｙ ｓｔｏｐｃｏｃｋ）を用いて５０μＬを単回注入した。
【０１０８】
１３−（４）．カテコールアミンを含んでいる灌流液の収集
まず、カテコールアミンの分泌を刺激する物質を処理する前に先立ち、刺激なしで自発的に放出されるカテコールアミンが一定の水準、すなわち背景（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）或いは基底レベル（ｂａｓａｌ ｌｅｖｅｌ）となるまで５〜１０分間待った後、ジントニン或いは他の薬物を副腎に灌流して処理し、副腎を介して出てくる灌流液（ｐｅｒｆｕｓａｔｅ）を４分間隔で収集した。薬物刺激で放出されたカテコールアミンの量は、背景或いは基底レベルから、測定されたカテコールアミンの量を差し抜いたものと計算した(Woo et al., Korean J Physiol Pharmacol., 12, 155-164, 2008)。
また、ジントニンが自発的に放出されるカテコールアミンに対する影響、および他のカテコールアミン放出刺激薬物投与の際に放出されるカテコールアミンに対するジントニンの影響を確認するために、副腎を、ジントニンを含み或いはジントニンおよび他の薬物と共に含有されているＫｒｅｂｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎで９０分間灌流し、放出されたカテコールアミンの量が背景レベルとなるまで灌流液を収集した。収集された副腎灌流液は、４℃を維持するチューブに保管した。
【０１０９】
１３−（５）．放出されたカテコールアミンの定量
灌流液に含有されているカテコールアミンの定量は、Ａｎｔｏｎ、ＳａｙｒｅおよびＬｉｍの方法に従って蛍光法（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｍｅｔｈｏｄ）で蛍光分光光度計（ｆｌｕｏｒｏｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ；Ｋｏｎｔｒｏｎ Ｃｏ．， Ｍｉｌａｎｏ、Ｉｔａｌｙ）を用いて行った。この際、灌流液は０．２ｍＬを使用した(Woo et al., Korean J Physiol Pharmacol., 12, 155-164, 2008)。
【０１１０】
１３−（６）．統計分析
各グループ間に放出されたカテコールアミンの量に対する統計学的分析は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔおよびＡＮＯＶＡ ｔｅｓｔを施し、Ｐ値が０．０５以下となるときに有意性があるものとした。
その結果、図１９に示すように、ジントニンを分離された白色ラットの副腎に１５分間隔で灌流する場合、ジントニンは投与濃度別に副腎からのカテコールアミンの放出を持続的に促進させることが確認された。
また、図２０に示すように、予めアセチルコリン５．３２ｍＭを処理した後、ジントニンを濃度別に処理すると、ジントニン１μｇ／ｍＬを処理する場合には全く効果がなく、ジントニン３μｇ／ｍＬを処理する場合には持続的にカテコールアミンの放出を促進させるものと確認された。ジントニンを１０μｇ／ｍＬに増加させる場合、初期（０〜４分）にはカテコールアミンの放出を維持するが、その後にはカテコールアミンが放出されないことからみて、初期アセチルコリン処理によるムスカリン性（ｍｕｓｃａｒｉｎｉｃ）またはニコチン性（ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ）アセチルコリン受容体の活性はジントニン１０μｇ／ｍＬでの反応性を抑制するものと確認された。これは、２つの受容体の間で交差脱感作（ｃｒｏｓｓ ｄｅｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）作用が誘発されることを示している（図２０参照）。
このような結果より、本発明のジントニンが副腎からのカテコールアミンの放出を促進させ、放出されたカテコールアミンはエネルギー代謝の活性、精神神経系の活性、集中力の維持などに活用可能であることが分かる。
【０１１１】
実施例１４．ジントニンによる、血管に存在するＢＫＣａＫ＋イオン通路活性の確認
Ｌａｒｇｅ−ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ Ｃａ２＋−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｋ＋ ｃｈａｎｎｅｌｓ（ＢＫＣａ）は、Ｋ＋イオン通路中の一つであって、ミオサイト（ｍｙｏｃｙｒｗａ）を除いた、主にヒトおよび動物の血管を構成する血管平滑筋細胞（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ）に存在する。主要機能は血管緊張（ｖａｓｃｕｌａｒ ｔｏｎｅ）を調節して血管の収縮後に弛緩が正常的に行われるようにする役割を果たす(Eichhorn et al., Naunyn-Schiemdeberg's Arch Pharmacol 376, 145-1551, 2007)。
ＢＫＣａＫ＋イオン通路の機能異常は、高血圧（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）を誘発するうえ、運動失調（ａｔａｘｉａ）および膀胱機能異常を引き起こし、特に高血圧、勃起不全（ｅｒｅｃｔｉｌｅ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）および膀胱機能異常による尿失禁（ｕｒｉｎａｒｙ ｉｎｃｏｎｔｉｎｅｎｃｅ）をもたらすとよく知られている(Ledoux et al., Physiol. 21, 69-78, 2006)。
また、ＢＫＣａＫ＋イオン通路は、血管平滑筋が脱分極により収縮（ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）する過程でカルシウムが細胞内に入り込むと、活性化されて血管収縮から血管の弛緩、陰茎海綿体の弛緩および膀胱平滑筋の弛緩を誘導する重要なイオン通路であるため(Eichhorn et al., Naunyn-Schiemdeberg's Arch Pharmacol 376, 145-1551, 2007)、ＢＫＣａＫ＋イオン通路を活性化させる薬物（ＢＫＣａＫ＋イオン通路ｏｐｅｎｅｒ）は、高血圧、勃起障害（ｅｒｅｃｔｉｌｅ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）および尿失禁などの症状を治療する目的で活用されている(Ledoux et al., Physiol. 21, 69-78, 2006)。
本発明では、ジントニンによって、血管に存在するＢＫＣａＫ＋イオン通路が活性化されるか否かを確認するために、次のとおり、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ ｏｏｃｙｔｅｓにおけるＢＫＣａＫ＋イオン通路の活性を測定した。
【０１１２】
１４−（１）．Ｏｏｃｙｔｅの準備
Ｘｅｎｏｐｕｓ Ｉ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ、ＵＳＡ）から得たＸｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓを最上の規格指針に従って保管および処理し、ｏｏｃｙｔｅｓ（卵子）を分離するためにカエルを３−アミノ安息香酸エチルエステル（３−ａｍｉｎｏ ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ ｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）の通気溶液（ａｅｒａｔｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で麻酔させて手術した後、コラゲナーゼ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）で処理し、しかる後に、８２．５ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ-２、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２．５ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが含まれたカルシウム遊離（Ｃａ２＋ ｆｒｅｅ）培地で２時間攪拌して分離した。
Ｖ−ＶＩ段階の卵子を収集して５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ） を追加したＮＤ９６（９６ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭａＣｌ２、１．８ｍＭのＣａＣｌ２、および５ｍＭのＨＥＰＥＳ；ｐＨ７．４）で保管し、前記卵子を含む溶液は連続的に軽く振盪しながら１８℃に維持し、毎日交換した。
【０１１３】
１４−（２）．ＢＫＣａＫ＋イオン通路の測定
二電極式ボルテージクランプ（ｔｗｏ−ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ ｖｏｌｔａｇｅ ｃｌａｍｐ）記録は、小型のプレキシガラス（ｐｌｅｘｉｇｌａｓｓ）ネットチャンバー（５ｍＬ）に置かれた個別的な卵子から得た。電気生理学実験（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）は３ＭのＫＣｌで満たしたマイクロ電極（抵抗：０．２〜０．７ＭΩ）と卵子固定増幅器（Ｏｏｃｙｔｅ Ｃｌａｍｐ ａｍｐｌｉｆｉｅｒ；ＯＣ−７２５Ｃ、Ｗａｒｎｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、ＣＴ、ＵＳＡ）を用いて室温でＢＫＣａＫ＋イオン通路の活性を記録した(Choi et al., Mol Cells 31, 133-140, 2011)。ＢＫＣａＫ＋イオン通路の活性に対する電気生理学的記録のために、まず、ｏｏｃｙｔｅｓはＣｌ−およびＣａ２＋イオンがない溶液 （９６ｍＭのＮａＯＨ、２ｍＭのＫＯＨ、８ｍＭのＭｇ−ｇｌｕｃｏｎａｔｅ、５ｍＭのＨＥＰＥｓ、５ｍＭのＥＧＴＡ、ｐＨ７．４ ｗｉｔｈ ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）に内因性Ｃｌ−ｃｈａｎｎｅｌｓを抑制するためにＣｌ− ｃｈａｎｎｅｌ ｂｌｏｃｋｅｒたる５００μＭ ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ−９−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄを添加した(Lu et al., J. Biol. Chem. 265, 16190-16194.1990)。Ｏｏｃｙｔｅｓは−８０ｍＶの保持電位（ｈｏｌｄｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）で固定（ｃｌａｍｐ）し、膜電圧を１０間隔で＋４０ｍＶで４００ｍｓ間脱分極させた後、生成された外向き電流（ｏｕｔｗａｒｄ ｃｕｒｒｅｎｔ）を記録した。
【０１１４】
図２１のＡに示すように、ＢＫＣａＫ＋イオン通路を発現させたＸｕｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓにおいて、ジントニンは投与濃度別にＢＫＣａＫ＋イオン通路を活性化させ、ＥＤ５０は０．７１±０．０８μｇ／ｍＬであることが確認された（図１２のＢ参照）。また、ジントニンは、電流電圧曲線（ｃｕｒｒｅｎｔ−ｖｏｌｔａｇｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）から分かるように、膜電圧に依存的に（ｖｏｌｔａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｎｎｅｒ）ＢＫＣａＫ＋イオン通路を活性化させることが確認された（図示せず）。また、ジントニンを繰り返し処理する場合、ＢＫＣａＫ＋イオン通路の活性に対する効果が減少した。すなわち、脱感作（ｄｅｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）が起こるものと確認された（図示せず）。
一方、ジントニンによるＢＫＣａＫ＋イオン通路の活性作用は、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓに内因性に存在するＬＰＡ１受容体(Kimura et al., J Biol Chem. 276, 15208-15215, 2001)の活性によるＧタンパク質−ＰＬＣ−ＩＰ３−Ｃａ２＋経路というシグナル伝達経路を介して行われていることを示してい。よって、ＬＰＡ受容体拮抗剤を処理する場合、ジントニンによるＢＫＣａＫ＋イオン通路の活性作用が遮断されるかを確認した。
その結果、図２２のＡに示すように、ＬＰＡ１とＬＰＡ３受容体拮抗剤であるＫｉ１６４２５（１０μＭ）を処理する場合(Ohta et al., Mol Pharmacol 64. 994-1005, 2003)、ジントニンによるＢＫＣａＫ＋イオン通路の活性作用が遮断されることからみて、ジントニンはＬＰＡ受容体を活性化させてＢＫＣａＫ＋イオン通路を活性化させることが確認された（図２２のＢ参照）。
【０１１５】
また、ジントニンによるＢＫＣａＫ＋イオン通路の活性作用に対するシグナル伝達過程を確認した。
活性ＰＬＣ（ａｃｔｉｖｅ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｃ）抑制剤であるＵ７３１２２（１μＭ）の処理はジントニンによるＢＫＣａＫ＋イオン通路の活性作用を遮断するが（図２３のＡおよびＣ参照）、不活性ＰＬＣ（ｉｎａｃｔｉｖｅ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｃ）抑制剤であるＵ７３３４３（１μＭ）の処理はジントニンによるＢＫＣａＫ＋イオン通路の活性作用を遮断する作用がないことが確認された（図２３のＢおよびＤ参照）。ところが、ジンセノサイドＲｇ３は、活性ＰＬＣ抑制剤であるＵ７３１２２（１μＭ）の処理によって抑制されていないことからみて、ジントニンとは異なる経路を介して作用することが分かった(Choi et al., Mol Cells. 31, 133-140, 2011)。
【０１１６】
また、ＩＰ３受容体拮抗剤である２−ＡＰＢ（１００μＭ）を処理する場合にも、ジントニンによるＢＫＣａＫ＋イオン通路の活性作用を遮断し（図２４のＡおよびＣ参照）、細胞質内カルシウムキレート剤であるＢＡＰＴＡ−ＡＭ（１００μＭ）を処理する場合にも、ＢＫＣａＫ＋イオン通路の活性作用を遮断することが確認された（図２４のＢおよびＤ参照）。よって、ジントニンは、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓに内因性に存在するＬＰＡ１受容体(Kimura et al., J Biol Chem. 276, 15208-15215, 2001)を活性化させ、ＰＬＣ−ＩＰ３−Ｃａ２＋経路というシグナル伝達経路を介してＢＫＣａＫ＋イオン通路の活性に作用するが、ジンセノサイドＲｇ３は、２−ＡＰＢおよびＢＡＰＴＡ−ＡＭ処理によって抑制されておらず、ジントニンとは異なる経路を介して作用することが分かった(Choi et al., Mol Cells. 31, 133-140, 2011)。
また、ジントニンによるＢＫＣａＫ＋イオン通路の活性作用に対するＰＫＣ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ）の連関性を確認するために、本発明では、ＰＫＣ活性剤であるＰＭＡがジントニンによるＢＫＣａＫ＋イオン通路の活性に及ぼす影響を確認した。
図２５に示すように、ＰＭＡ（１μＭ）を前処理する場合、ジントニンによるＢＫＣａＫ＋イオン通路の活性作用が消滅するが、ジンセノサイドＲｇ３の作用は維持されることからみて、これらの両成分はＢＫＣａＫ＋イオン通路の活性経路が異なることが分かった。すなわち、ＰＫＣの活性はジントニン作用に関与していることを示している。
【０１１７】
実施例１５．ＨＵＶＥＣを用いたジントニンの創傷治癒効果の確認
ＨＵＶＥＣｓにはＬＰＡ１とＬＰＡ３受容体が内因性に存在すると知られている(Lin et al., BBRC 363, 1001-1008, 2007; Lin et al., Cellular Signalling 20, 1804-1814, 2008)。
本発明では、ジントニンの創傷治癒効果を確認するために、ＨＵＶＥＣを加熱不活性化した（ｈｅａｔ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ）２０％ ＦＢＳ、３ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、５ｕｎｉｔｓ／ｍＬのヘパリン（ｈｅｐａｒｉｎ）、ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）およびペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）を添加したＭ１９９培地を用いて５％ＣＯ２／９５％酸素培養器で培養した。
【０１１８】
ＨＵＶＥＣ（２．５×１０５／ウェル）を２４ウェルプレートに分注して２４時間培養した後、さらに１％ＦＢＳ含有Ｍ１９９培地で６時間培養した。２００μＬのピペットチップで、細胞が成長した各ウェルの中央に線を描いて傷付けた後、浮き上がった細胞を除去するために１％ＦＢＳ含有Ｍ１９９培地で２回洗浄した。細胞にジントニン（３０μｇ／ｍＬ）を処理して培養し、各ウェルのジントニン処理前と後の細胞模様をＩｎｖｅｒｔｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ＡｘｉｏＶｅｒｔ２００；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）で観察し、写真撮影して（１００×）、ジントニンを処理していない細胞と比較した。
ピペットチップで傷付けた部分における細胞成長程度の分析のために、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ（ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ ４、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）を用いて、細胞が回復されていない傷部位面積を測定した（図２６のＡ参照）とともに、掻き傷（ｓｃｒａｔｃｈｉｎｇ ｗｏｕｎｄ）部位にジントニンが存在していない状態とジントニンが存在する状態における、傷により空いている部位が充填される時間過程（図２５のＢ参照）、およびジントニンが存在するときと存在しないときの傷部位の面積をパーセントとして表して比較した（図２６のＣおよびＤ参照）。
【０１１９】
実施例１６．ＨＵＶＥＣを用いたジントニンの血管形成促進効果の確認
１６−（１）．ＨＵＶＥＣｓにおけるジントニンによる細胞増殖に及ぼす影響の確認
ＢｒＤＵは、細胞増殖過程で新しいＤＮＡが合成されるとき、ＤＮＡに挿入されるものと知られている(Porstmann et al. Immunol. Methods 82, 169-179, 1985)。
本発明では、ＨＵＶＥＣ（ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）を用いてジントニンの細胞増殖に対する効果を確認するために、ＢｒＤＵ ａｓｓａｙ方法(Won et al., J Pharmacol Sci 108, 372-379, 2008; Chen et al., Cell Physiol Biochem 22, 307-314, 2008)に従ってＢｒＤＵ細胞増殖ＥＬＩＳＡキット（ＢｒＤＵ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ；Ｒｏｃｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、細胞に挿入されたＢｒＤＵの相対量を測定した。
【０１２０】
ジントニン処理の前日、細胞を９６ウェルプレートに各ウェルあたり３×１０３ずつ分注し、２４時間後に１％ＦＢＳ含有Ｍ１９９培地で交換して６時間培養した後、さらに培地を新しい１％ＦＢＳ含有Ｍ１９９培地で取り替えてジントニンを処理し、２４時間培養した。細胞にＢｒＤＵラベリング（ｌａｂｅｌｌｉｎｇ）試薬を入れ、さらに２４時間培養した後、細胞の培地を除去し、１０％ＦＢＳ含有Ｍ１９９で洗浄して固定液で固定した後、抗−ＢｒＤＵ−過酸化剤（ａｎｔｉ−ＢｒＤＵ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）抗体と光度計（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ；Ｖｅｒｉｔａｓ、Ｔｕｒｎｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）を用いて、細胞内に入り込んだＢｒＤｕの相対的な量を定量した。
その結果、ジントニンは、処理濃度に依存的にＢｒ−ＤＵのＨＵＶＥＣｓの混成（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を増加させて細胞の増殖を刺激するものと確認された（図２７のＡ参照）。
【０１２１】
１６−（２）．ＨＵＶＥＣｓにおけるジントニンによる細胞移動に及ぼす影響の確認
細胞移動（ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）効果を測定するために、Ｂｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒ（Ｎｅｕｒｏ Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃ．、 Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）を使用する方法を用いた(Kim et al. Biol Pharm Bull 30: 1674-1679, 2007; Lee et al.Am J Physiol Cell Physiol 278:C612-C618, 2000)。
Ｂｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒ（４８ウェル）の下端のウェルに、Ｍ１９９培地（０．１％ＢＳＡ含有）に溶かしたジントニンを入れ、その上に、コラーゲンでコートしたポリカーボネートメンブレイン（ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ、８μｍ ｐｏｒｅｓ）をのせた後、チャンバーを組み立てた。そして、チャンバーの上端のウェルにはＨＵＶＥＣ懸濁液（５×１０４セル／ウェル）を入れた後、３７℃で７０〜８０分間培養し、移動細胞がメンブレインの上方から下方に移動するようにした。その後、チャンバーを解体して、メンブレインにある細胞をＤｉｆｆ Ｑｕｉｋ（Ｓｙｓｍｅｘ、Ｋｏｂｅ、Ｊａｐａｎ）で固定および染色し、メンブレインに付いているままでスライド上に付着させた後、移動していない細胞を拭き取って除去し、光学顕微鏡を用いて、移動した細胞の数を数えて比較した（倍率×２００）。
その結果、図２７のＢに示すように、ジントニンは処理濃度に依存的に細胞移動を促進させることを確認することができた。
【０１２２】
１６−（３）．ジントニンによる血管チューブ（Ｔｕｂｅ）形成の確認
ジントニンの血管形成に対する効果があるかどうかを確認するために、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）上におけるチューブ様構造の形成効果を比較した(Kim et al. Biol Pharm Bull 30: 1674-1679)。
細胞の培地をＭ１９９培地（１％ＦＢＳ）で交換して６時間培養した後、トリプシンで処理してＭ１９９培地（１％ＦＢＳ）に懸濁し、しかる後に、成長因子の量を減らしたマトリゲル（２５０μＬ／ウェル）で予めコートした２４ウェルプレートに分注した（２×１０５セル／ウェル）。
細胞を、Ｍ１９９培地（１％ＦＢＳ）に溶かしたジントニン（３０μｇ／ｍＬ）で処理し、３７℃で４時間培養した後、チューブ形成を顕微鏡（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＡｘｉｏＶｅｒｔ２００、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を用いて観察し、撮影して比較した結果（倍率×１００）、ジントニンは処理血管チューブ形成を促進させるものと確認された（図２７のＣ参照）。
【０１２３】
実施例１７．ジントニンの抗癌剤投与による下痢および粘膜炎抑制効果の確認
胃腸管消火器にもＬＰＡ受容体が分布していると知られており、これら受容体の活性は放射線（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｃａｎｃｅｒ）および抗癌剤（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｇａｉｎｓｔ ｃａｎｃｅｒ）による消火器内皮細胞死滅（ｒａｄｉａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）作用を抑制するものと報告された(Deng et al., Gastroenterology 123, 206-216, 2002; Deng et al., Gastroenterology 132, 1834-1851, 2007)。
一方、血液系癌の治療に使用する抗癌剤であるブスルファン（Ｂｕｓｕｌｆａｎ）は、投与の際に人に現れる様々な副作用の中でも下痢と粘膜炎を誘発するものと知られている(Escal■n et al., Bone Marrow Transplant. 44, 89-96. 2009)。
本発明では、ジントニンが抗癌剤の投与による下痢および下痢による粘膜炎誘発抑制作用を確認するために、マウスを用いて、ブスルファン投与後に誘発される下痢（ｄｉａｒｒｈｅａ）および粘膜炎（ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ）に対するジントニンの予防および治療効果を観察した。
【０１２４】
具体的に、ジントニンはブスルファン投与３日前から口腔で１００ｍｇ／ｋｇを投与し、ブスルファン（４０ｍｇ／ｋｇ）投与群はジントニンの代わりに生理食塩水を投与した。３日後にブスルファン（４０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に投与し、１０日間下痢および粘膜炎の誘発有無を観察した。
下痢の場合、全体実験群１５匹にブスルファンを処理したとき、８匹から下痢が観察されて５３．５％であったが、ジントニンを前処理する場合には３匹（２０％）のみから観察され、約３０％以上ブスルファンによる下痢を抑制することが確認された。
また、粘膜炎の場合も、全体実験群１５匹にブスルファンを処理したとき、７匹から肛門周囲に粘膜炎が観察（４６．７％）されたが、ジントニンを前処理する場合には２匹（１３．３％）のみから観察され、ブスルファンによる肛門周囲の粘膜炎を３３．４％抑制することが確認された（下記表２参照）。
【０１２５】
【表２】
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【０１２６】
以上、本発明の内容の特定部分を詳細に記述したが、 このような具体的記述は好適な実施様態に過ぎないもので、本発明の範囲を限定するものではないことは、当該分野における通常の知識を有する者にとって明白であろう。よって、本発明の実質的な範囲は添
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【配列表】
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