(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
５０〜９０重量％のヒアルロン酸及び１０〜５０重量％のヒドロキシ（−ＯＨ）末端基を含む高分子を含む、ヒアルロン酸エポキシド誘導体フィルムであって、
該ヒドロキシ（−ＯＨ）末端基を含む高分子は、ヒアルロン酸に基づくヒアルロン酸エポキシド誘導体への物理的結合を有し、そして、ポリプロピレンオキシド、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド共重合体及びポリブチレンオキシドのいずれか１以上から選択され、
該ヒアルロン酸エポキシド誘導体は、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩又はそれらの混合物、並びにエポキシド架橋剤を含み、ここで、該エポキシド架橋剤は、該ヒアルロン酸、該ヒアルロン酸塩又はそれらの混合物１００重量部に対して１０〜２５重量部含まれており、そして
前記エポキシド架橋剤は、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル及びネオペンチルグリコールジグリシジルエーテルのいずれか１以上から選択されている、
ことを特徴とするヒアルロン酸エポキシド誘導体フィルム。
【請求項２】
前記ヒアルロン酸エポキシド誘導体フィルムの架橋密度が１ｍｏｌ％〜１００ｍｏｌ％であることを特徴とする請求項１に記載のヒアルロン酸エポキシド誘導体フィルム。
【請求項３】
前記ヒアルロン酸塩は、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸カルシウム、ヒアルロン酸マグネシウム、ヒアルロン酸亜鉛、ヒアルロン酸コバルト及びヒアルロン酸テトラブチルアンモニウムよりなる群から選ばれるいずれか１種以上であることを特徴とする請求項１に記載のヒアルロン酸エポキシド誘導体フィルム。
【請求項４】
前記ヒアルロン酸とエーテル共有結合を形成しうる高分子は、ヒアルロン酸、コラーゲン、アルギン酸、ヘパリン、ジェラチン、エラスチン、フィブリン、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、ヘパランサルフェート、硫酸コンドロイチン、デルマタン硫酸及びケラタン硫酸よりなる群から選ばれるいずれか１種以上であることを特徴とする請求項１に記載のヒアルロン酸エポキシド誘導体フィルム。
【請求項５】
前記ヒアルロン酸エポキシド誘導体フィルムは、癒着防止剤または骨誘導再生膜として
用いられることを特徴とする請求項１に記載のヒアルロン酸エポキシド誘導体フィルム。
【請求項６】
抗菌及び抗炎症天然物質をさらに含むことを特徴とする請求項５に記載のヒアルロン酸
エポキシド誘導体フィルム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒアルロン酸エポキシド誘導体フィルムに係り、さらに詳しくは、ヒドロキシ（−ＯＨ）末端基を含む高分子とヒアルロン酸とを混合した溶液にエポキシド架橋剤を反応して製造されて物理的強度、体内安定性、柔軟性、生体組織への付着性及び生体適合性を向上させたフィルム状のヒドロキシ末端基を含む高分子が含まれているヒアルロン酸誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９３４年にマイヤー（Meyer）とパルマー（Palmer）によって眼のガラス体液から最初に分離されたヒアルロン酸は、多価陰イオンムコ多糖体であって、自然系に広く存在する生体高分子物質である［Meyer K. et al.,Journal of Biology and Chemistry 107 629-34 (1934)］。ヒアルロン酸は、動物の胎盤、眼、関節などの連結組織内に多量存在し、ストレプトコッカス（Streptococcus）属微生物であるストレプトコッカス・エクイ（Streptococcus equi）、ストレプトコッカス・ズーエピデミクス（Streptococcuszooepidemicus）などからも産生される。構造的に、グルクロン酸とアミノ糖とがβ（１，３）グリコシド結合によって連結された繰り返し単位がさらにβ（１，４）グリコシド結合によって連続して連結された長い鎖構造を形成している［Balazs E. A. et al., Biochemical Journal, 235, 903,1986; Toole B.P. et al., Journal of Internal Medicine, 242, 35-40(1997)］。
【０００３】
ヒアルロン酸は、生体適合性に優れており、しかも、溶液状態で高い粘弾性の特性を有することから、化粧品添加剤などの化粧品用途だけではなく、眼科用手術補助剤、関節機能改善剤、薬物伝達物質及び点眼剤などの種々の用途に広く用いられている。しかしながら、ヒアルロン酸自体だけでは生体内（in vivo）または酸、アルカリなどの条件で分解され易いためその使用が制限的である。この理由から、構造的に安定したヒアルロン酸誘導体を開発するための多大な努力が注がれてきている[Laurent T.C. et al., Portland PressLtd, London, 1998]。
【０００４】
ヒアルロン酸誘導体は、優れた生体適合性、物理的安定性及び生分解性を有していることから、成形補助物、関節機能改善剤、薬物伝達体、細胞培養担体（scaffold）及び手術後の癒着防止剤など種々の用途に用いるために開発されている。
【０００５】
ヒアルロン酸を誘導体化する方法の一つであるエポキシド架橋剤を用いて誘導体化する技術は、溶液、ゲル、繊維、スポンジ、フィルムなど様々な形の開発が行われており、米国登録特許第４，５００，６７６号、第４，７１３，４４８号、第４，７１６，２２４号、第４，７１６，１５４号、第４，８８６，７８７号、第４，９６３，６６６号、第５，８２７，９３７号などにはその製造方法が開示されている。
【０００６】
しかしながら、前記ヒアルロン酸エポキシド誘導体フィルムは、乾燥中に収縮現象が発生して均一なフィルムに製造するのに制限があり、精製中に物理的強度が弱くなるという問題点などが発生する。
【０００７】
上記のヒアルロン酸エポキシド誘導体フィルムの製造の際して発生する問題点を克服するために、ヒアルロン酸（hyaluronic acid；ＨＡ）及びカルボキシルメチルセルロース（carboxymethylcellulose；ＣＭＣ）の表面架橋により柔軟性及び物理的強度が改善されたフィルム（例えば、下記の特許文献１参照）が開発されたが、ヒアルロン酸の組成が高くなると物理的強度が弱くて濡れた状態で捲り上がるという現象が発生し、カルボキシルメチルセルロースの組成が高くなると生分解速度が低下して必要以上に長時間残留して異物反応を引き起こすなどの問題点が発生する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
特許文献１：大韓民国公開特許第２００９−００１２４３９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は上記の従来の技術の問題点を解消するためになされたものであり、その目的は、従来の技術において問題視されていたカルボキシルメチルセルロース誘導体部分を使用しないつつも、ヒアルロン酸誘導体の乾燥及び精製中に発生する問題点を改善して均一な形態及び優れた物理的強度を有するヒアルロン酸エポキシド誘導体フィルムを提供するところにある。
【００１０】
本発明のヒアルロン酸エポキシド誘導体フィルムは、優れた物理的強度、体内安定性、柔軟性、生体組織への付着性及び生体適合性を有するところに特徴がある。
【００１１】
本発明の前記目的及びその他の目的は、後述する本発明によって達成可能である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、従来の技術において発生する問題点を解消するために案出されたものであり、ヒドロキシ末端基を含む高分子を用いてヒアルロン酸エポキシド誘導体を乾燥及び精製する間に発生する収縮及び物理的強度の弱化現象を防いで均一な形態及び優れた物理的強度を有し、しかも、体内安定性、柔軟性、生体組織への付着性及び生体適合性などが向上したヒアルロン酸エポキシド誘導体フィルムを提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ヒアルロン酸エポキシド誘導体フィルムの均一性と物理的強度、体内安定性、柔軟性、生体組織への付着性及び生体適合性などを改善することができる。
【００１４】
また、本発明のヒアルロン酸エポキシド誘導体フィルムは、優れた生体適合性、生分解性、物理的安定性などを有していることから、創傷被覆材、細胞培養担体、薬物伝達体、 骨誘導再生膜及び組織癒着防止剤など様々な用途に使用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の一実施形態によるヒアルロン酸が架橋結合された構造にヒドロキシ末端基を含む高分子が物理的に結合されている構造を示し、精製後にヒドロキシ末端基を含む高分子がほとんど除去された状態での構造を示す模式図である。
【図２】本発明の試験例１に従い、ヒドロキシ末端基を含む高分子の含有有無によるフィルム形状を比較した写真である。
【図３】本発明の試験例２に従い、ヒドロキシ末端基を含む高分子を含有するヒアルロン酸エポキシド誘導体フィルムのＩＲスペクトルを示す図である。
【図４】本発明の試験例３に従い、ヒアルロン酸エポキシド誘導体フィルム（実験群１、２、３）と、癒着防止剤（商品名：インターシード（Interceed）、比較群１）及び骨誘導再生膜（商品名：バイオガイド（Bio-Gide）、比較群２）の引張り強度を比較した図である。
【図５】本発明の試験例４に従い、ヒアルロン酸エポキシド誘導体フィルムの有機溶媒の処理有無による引張り強度を比較した図である。
【図６】本発明の試験例５に従い、ヒアルロン酸エポキシド誘導体フィルムの生体内の残留期間を組織染色により比較した写真である。
【図７】癒着防止能を評価した試験例６の動物実験において、本発明のヒアルロン酸エポキシド誘導体フィルムを使用した実験群（３種）と、癒着防止剤（商品名:インターシード、比較群１）及び癒着防止剤を使用しなかった対照群での癒着等級及び癒着の強さを示すグラフである。
【図８】骨再生の度合いを評価した試験例７の動物実験において、本発明のヒアルロン酸エポキシド誘導体フィルムを使用した実験群３と、骨誘導再生膜（商品名：バイオガイド、比較群２）及び骨欠損部にいかなる処置もしなかった対照群での骨再生の度合いを示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、ヒドロキシ（−ＯＨ）末端基を含む高分子を含有するヒアルロン酸エポキシド誘導体フィルムを提供する。
【００１７】
以下、本発明について詳述する。
【００１８】
具体的に、本発明は、ヒアルロン酸とヒドロキシ末端基を含む高分子とを混合し、２以上のエポキシド基を有するエポキシド架橋剤を用いてヒアルロン酸を架橋化させたものである。ここで、ヒドロキシ末端基を含む高分子は、図１に示すように,フィルムへの固化中の収縮現象を防ぎ、精製中に徐々に除去されてヒアルロン酸誘導体フィルムが変形されることを防ぐ。
【００１９】
また、ヒアルロン酸エポキシド誘導体を精製した後に有機溶媒に沈殿して精製中に弱くなった物理的強度を改善することができる（図６）。
【００２０】
前記ヒアルロン酸エポキシド誘導体フィルムは、ヒアルロン酸が５０〜９０重量％であり、前記ヒドロキシ末端基を含む高分子が１０〜５０重量％である。
【００２１】
前記ヒアルロン酸エポキシド誘導体フィルムの架橋密度は、１ｍｏｌ％〜１００ｍｏｌ％であることが好ましく、さらに好ましくは、５ｍｏｌ％〜５０ｍｏｌ％である。架橋密度が１ｍｏｌ％未満である場合には吸水力が高くて変形が起こり易く、しかも、精製し難いのに対し、１００ｍｏｌ％を超える場合には割れ易く、しかも、多量の架橋剤が残留している可能性が高くなる。
【００２２】
本発明において、ヒアルロン酸エポキシド誘導体は、ヒアルロン酸またはヒアルロン酸塩単独、あるいは、ヒアルロン酸またはヒアルロン酸塩、及びヒアルロン酸とエーテル共有結合を形成しうる高分子とともにエポキシド架橋剤によって反応して製造されうる。
【００２３】
ここで、ヒアルロン酸塩は、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸カルシウム、ヒアルロン酸マグネシウム、ヒアルロン酸亜鉛、ヒアルロン酸コバルト及びヒアルロン酸テトラブチルアンモニウムよりなる群から選ばれるいずれか１種以上であり、好ましくは、ヒアルロン酸ナトリウムを用いるが、これに限定されない。
【００２４】
本発明において、ヒアルロン酸とエーテル共有結合を形成しうる高分子は、ヒアルロン酸、コラーゲン、アルギン酸、ヘパリン、ジェラチン、エラスチン、フィブリン、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、ヘパランサルフェート、硫酸コンドロイチン、デルマタン硫酸及びケラタン硫酸よりなる群から選ばれるいずれか１種以上であることが好ましい。
【００２５】
本発明において、ヒドロキシ末端基を含む高分子としては、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリプロピレンオキシド、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド共重合体、ポリエチレンオキシド−ポリ乳酸共重合体、ポリエチレンオキシド−ポリ乳酸グリコール酸共重合体、ポリエチレンオキシド−ポリカプロラクトン共重合体、ポリブチレンオキシド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類、ポリオキシ−エチレンひまし油誘導体類、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類及びポリオキシエチレンステアレート類よりなる群から選ばれるいずれか１種以上を挙げることができる。
【００２６】
本発明のヒアルロン酸がエポキシド架橋剤によって誘導体化される過程を下記の反応式１に示す。
【００２７】
反応式１
【化１】
0005934132.tif 000002
【００２８】
本発明のエポキシド架橋剤は、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（polyethylene glycol diglycidyl ether）、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（1,4-butanediol diglycidyl ether）、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ethylene glycol diglycidyl ether）、１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル（1,6-hexanediol diglycidyl ether）、プロピレングリコールジグリシジルエーテル（propylene glycol diglycidyl ether）、ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル（poly(tetramethylene glycol)diglycidyl ether）、ポリテトラメチレングリコールジグリシジルエーテル（poly(propylene glycol)diglycidyl ether）、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル（neopentyl glycol diglycidyl ether）、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル（polyglycerol polyglycidyl ether）、ジグリセロールポリグリシジルエーテル（diglycerol polyglycidyl ether）、グリセロールポリグリシジルエーテル（glycerol polyglycidyl ether）、トリメチルプロパンポリグリシジルエーテル（trimethylpropane polyglycidylether）、１，２−（ビス（２，３−エポキシプロポキシ）エチレン（1,2-(bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene）、ペンタエリスリトールポリグリシジルエーテル（pentaerythritol polyglycidylether）及びソルビトールポリグリシジルエーテル（sorbitol polyglycidyl ether）よりなる群から選ばれるいずれか一種であることが好ましい。
【００２９】
前記２以上のエポキシ官能基を含む架橋剤は、ヒアルロン酸のヒドロキシ（−ＯＨ）末端基と反応してエーテル結合を形成して架橋が行われる。
【００３０】
前記ヒアルロン酸エポキシド架橋剤の重量比は、前記ヒアルロン酸の繰り返し単位１００重量部に対して１〜１００重量部であることが好ましく、さらに好ましくは、５重量部〜５０重量部である。重量比が５重量部未満である場合に吸水力が高くて変形が起こり易く、しかも、精製し難いのに対し、５０重量部を超える場合には割れ易く、しかも、多量の架橋剤が残留している可能性が高くなる。
【００３１】
本発明のヒアルロン酸エポキシド誘導体フィルムの物理的強度を改善するために用いられる有機溶媒としては、ジメチルスルホキシド（dimethyl sulfoxide；ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（dimethylformamide；ＤＭＦ）、アセトニトリル(acetonitrile) 、テトラヒドロフラン（tetrahydrofuran；ＴＨＦ）、アセトン、アセトン水溶液、メタノールまたはエタノールなどのＣ１〜Ｃ６のアルコールまたはアルコール水溶液が使用可能である。
【００３２】
本発明によるヒアルロン酸エポキシド誘導体は、水和された状態で乾燥することにより、フィルム、メンブレイン、スポンジ、粉末状に製造可能である。
【００３３】
本発明によるヒアルロン酸エポキシド誘導体フィルムは吸水力が高いので、傷からの&#28183;出物及び血液などを速やかに吸収して止血効果及び傷治癒に役立つ。
【００３４】
また、前記ヒアルロン酸エポキシド誘導体フィルムは物理的強度が高いので（図４）操作し易く、周りの組織から患部を保護することができる。なお、分解酵素への安定性を有していることから、所定時間物理的なバリアを形成し、その後に完全に分解されて生体に吸収される（図６）。
【００３５】
これらの特性を有することから、ヒアルロン酸エポキシド誘導体フィルムは組織修復用材料,骨誘導再生膜または癒着防止剤の用途に使用可能であり、ヒアルロン酸エポキシド誘導体フィルムの用途はこれらに限定されない。
【００３６】
また、本発明による骨誘導再生膜または癒着防止剤は、抗菌及び抗炎症天然物質をさらに含んでいてもよく、前記抗菌性及び抗炎症性天然物質としては、緑茶、キョウオウ、黒大豆種皮、バラの花びら、シャクヤク根、キキョウ、大豆もやし、有色麦種皮、椿の花びら、そば、グレープフルーツ、甘草、黄蓮、黄耆、&#40643;栢、&#40643;&#33449;、桂皮、牧草、覆盆子、五倍子、イブキ、レンギョウ、唐辛子の葉、薄荷、ヘビイチゴ、クワ、ハンゲショウ、松の木、薬用ヨモギ、ドクダミ、ソメイヨシノ、スズタケまたはササゲ茎エキスが挙げられる。
【００３７】
以下、本発明の理解への一助となるために好適な実施例を挙げるが、下記の実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の範疇および技術思想の範囲内において種々の変更および修正が可能であるということは当業者にとって自明であり、このような変形および修正が特許請求の範囲に属するということも言うまでもない。
【００３８】
［実施例］
実施例１〜４：ヒアルロン酸と混合して使用可能な高分子の架橋形成有無
この実験において、ヒアルロン酸と混合して使用可能な高分子が架橋されてエーテル共有結合を形成するか否かを判断するために、１重量％のヒアルロン酸、アルギン酸、ジェラチン、コラーゲンをそれぞれ１重量％のヒアルロン酸溶液と５０／５０にて混合し、ポリエチレンオキシドを５重量％添加した後、ここにそれぞれのエポキシド架橋剤（１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリプロピレンジグリシジルエーテル、ネオペンチルジグリシジルエーテル）を混合された高分子の繰り返し単位１００重量部に対して５重量部の割合で添加して１２時間室温において架橋反応を行った後、固形物を取り出して脱イオン水中に１時間保管した。固形物が脱イオン水に溶解するか否かを確認して架橋形成の有無を判断した。
【００３９】
【表１】
0005934132.tif 000003
【００４０】
前記表１に示すように、ヒアルロン酸、アルギン酸、ジェラチン、コラーゲンをそれぞれのエポキシド架橋剤と混合して製造された固形物は脱イオン水に溶解せず、膨潤されて存在するということが確認された。上記の結果から、ヒアルロン酸、アルギン酸、ジェラチン、コラーゲンをエポキシド架橋剤と混合する場合にエーテル共有結合が形成されて脱イオン水中に安定して存在するということが確認された。
【００４１】
実施例５：ヒドロキシ末端基を含む高分子を含有するヒアルロン酸エポキシド誘導体フィルムの製造
この実験において、ヒドロキシ末端基を含む高分子としてポリプロピレンオキシドを用いた。０．２５ＮＮａＯＨに１０重量％のヒアルロン酸と３０重量％のポリプロピレンオキシドとを混合した溶液をそれぞれ３つの反応器に用意した。前記溶液のヒアルロン酸１００重量部に対してポリエチレングリコールジグリシジルエーテルをそれぞれ５重量部、１０重量部、２５重量部の割合にて添加した。室温下で２４時間反応させた後、四角皿にとって均一に広げた後、１２時間かけて室温下で乾燥して１次フィルムを製造した。１次フィルムを精製水により洗浄して非反応物及びポリプロピレンオキシドを除去した後にエタノールに沈殿し、且つ、収縮して２次フィルムを製造した。２次フィルムを精製水により再膨潤し、且つ、乾燥して最終的な誘導体フィルムを製造した。本発明の実験を行うために製造された誘導体フィルムを、架橋剤の割合に応じて、実験群１（５重量部）、実験群２（１０重量部）、実験群３（２５重量部）と命名した。
【００４２】
比較例１：ヒドロキシ末端基を含む高分子を含有していないヒアルロン酸エポキシド誘導体フィルムの製造
１０重量％のヒアルロン酸を０．２５ＮＮａＯＨに溶かしてヒアルロン酸溶液を用意した。前記溶液のヒアルロン酸１００重量部に対してポリエチレングリコールジグリシジルエーテルを２５重量部の割合にて添加した後、室温下で２４時間反応させた。前記溶液を四角皿にとって均一に広げた後、１２時間かけて室温下で乾燥して１次フィルムを製造し、精製水により洗浄して非反応物を除去した。水和された誘導体をエタノールに沈殿して収縮させて２次フィルムを製造した後、精製水により再膨潤し、且つ、乾燥して最終的な誘導体フィルムを製造した。前記比較例１に従い製造された誘導体フィルムは実験群４と命名した。
【００４３】
［試験例］
試験例１：ヒドロキシ末端基を含む高分子の含有有無によるフィルム形状の比較
ヒドロキシ末端基を含む高分子フィルムの均一性を確認するために、実施例５及び比較例１に従いそれぞれ製造された１次フィルムの形状を写真により比較した。
【００４４】
図２に示すように、ヒドロキシ末端基を含む高分子が含有されていないフィルムは、乾燥後に大幅に収縮されて巻き上がっているのに対し、ヒドロキシ末端基を含む高分子が含有されたフィルムは周縁部に僅かな収縮はあったが、巻き上がり現象は見られなかった。以上の結果から、溶液からフィルムへの固化中にヒドロキシ末端基を含む高分子が収縮を防ぐ役割を果たすということが確認された。
【００４５】
試験例２：ヒアルロン酸エポキシド誘導体フィルムの構造分析
１重量％のヒアルロン酸を脱イオン水に溶解してヒアルロン酸溶液を製造し、１０重量％のヒドロキシ末端基を含む高分子を脱イオン水に溶解して溶液を製造した。製造された溶液をそれぞれ四角皿にとって室温下で１２時間かけて乾燥してヒアルロン酸フィルム及びヒドロキシ末端基を含む高分子フィルムを製造した。ＡＴＲ−ＩＲを用いて、前記製造されたヒアルロン酸フィルム、ヒドロキシ末端基を含む高分子フィルム、実験群３及び実験群４の構造を分析した。
【００４６】
図３は、ＩＲスペクトルを比較したものであり、ヒドロキシ末端基を含む高分子フィルムは２８８５ｃｍ−１（Ｃ−Ｈ、メチレン）において強いピークを示し、これと同様に、ヒドロキシ末端基を含む高分子が含有された実験群３も２９２５ｃｍ−１において強いピークが観察されてヒアルロン酸とヒドロキシ末端基を含む高分子とが混合されているということが確認された。上記の結果から、ヒドロキシ末端基を含む高分子が含有されたヒアルロン酸誘導体には、精製後にもヒドロキシ末端基を含む高分子が所定量残留しているということが確認された。
【００４７】
試験例３：ヒアルロン酸誘導体エポキシド誘導体の物理的強度の測定
実施例５に従い製造された実験群１、２、３と、癒着防止剤（商品名:インターシード、米国のＪ＆Ｊ社製、比較群１）及び骨誘導再生膜（商品名：バイオガイド、スイスのガイストリッヒ・ファーマ社製、比較例２）の物理的強度値をそれぞれ比較・分析した。測定のために、試料を３ｃｍ×１ｃｍに切り出して万能材料試験機（米国のインストロン社製）のグリップに載せた後、１０ｍｍ／分の速度で引っ張りながら材料にかかる力を測定した。
【００４８】
図４は、実験群及び比較群の引張り力（Ｎ）の値を比較したものであり、架橋剤の含量が増大するほど、物理的強度が増大して全ての実験群において比較群１（インターシード）よりも高い値を示す。しかしながら、実験群１においては比較群２（バイオガイド）よりもやや低い値を示すが、統計学的に有意差を示していない。
【００４９】
上記の結果から、ヒアルロン酸誘導体フィルムが癒着防止剤または骨誘導再生膜として用いられるのに適した物理的強度を有するということを確認した。
【００５０】
試験例４：有機溶媒の処理有無による物理的強度の比較
実施例５の製造中に水和されたヒアルロン酸誘導体をエタノールにより処理した試料と処理しなかった試料の物理的強度を比較するために、実験群１、２、３と、実施例５の製造中に水和されたヒアルロン酸誘導体をエタノールにより沈殿せずに乾燥して製造した試料をそれぞれ用意した。それぞれの試料を実施例５の方法と同様にして用意して物理的強度を測定した。
【００５１】
図５に示すように、エタノールに沈殿して製造した試料は、エタノールに沈殿せずに製造した試料よりも高い物理的強度を示す。以上の結果から、ヒアルロン酸誘導体をエタノールなどの有機溶媒により処理する工程により、ヒアルロン酸誘導体の物理的強度が高くなるということが確認された。
【００５２】
試験例５：ヒアルロン酸エポキシド誘導体フィルムの生体内残留期間の評価
実施例５に従い製造された試料の生体内残留期間を評価するために、動物実験を行った。実験動物としては、８週齢のスプラーグ&#8722;ドーリー(Sprague-Dawley)系ラットを用いた。麻酔剤をラットの下腹部に注射して麻酔を行い、背部に５ｍｍ×１０ｍｍのサイズの試片をそれぞれ移植し、２週目、４週目、１２週目に組織学的分析（ヘマトキシリン・エオシン染色）により試片の残留有無を評価した。
【００５３】
前記実験結果を図６に示す。図６に示すように、実験群１は、２週目までは生体内で観察されたが、４週目、１２週目には観察されなかった。実験群２及び３は、１２週目まで生体内に残留するということが確認された。上記の結果から、ヒアルロン酸エポキシド誘導体フィルムは、架橋剤の含量に応じて生体内での残留期間に違いを示すが、ヒアルロン酸エポキシド誘導体は生体内において容易に分解せず、所定時間安定して維持されるということが確認された。
【００５４】
試験例６：ヒアルロン酸エポキシド誘導体フィルムの組織癒着防止能の評価
実施例５に従い製造された試料の組織癒着防止能を評価するために、動物モデル（スプラーグ&#8722;ドーリー系ラット）を用いた。麻酔剤をラットの下腹部に注射して麻酔を行った。麻酔されたラットの腹部を切開し、腹膜の表皮部分に１ｃｍ×２ｃｍのサイズの傷を骨バーを用いて付け、この傷と当接している盲腸に表皮が僅かに剥がれる程度に傷を付けた。傷と傷との間にいかなる癒着防止剤も使用しなかった対照群と、比較群１（インターシード）及び実施例５に従い製造された実験群１、２及び３の組織癒着を比較・観察した。各試料は、２ｃｍ×３ｃｍのサイズに切って使用した。組織癒着度に応じて、４段階（０、１、２、３、数字が大きいほど癒着が激しい）の癒着評価システムを用いてその成績を合算し、平均を取った(A. A. Luciano, et al.,"Evaluation of commonly used adjuvants in the prevention of postoperativeadhesions", Am. J. Obstet. Gynecol.146, 88-92 (1983))。
【００５５】
また、組織癒着が発生した種に対して癒着の強さを３段階（１、２、３、数字が大きいほど癒着の強さが高い）で測定してその成績を合算し、平均を取った。
【００５６】
前記動物実験による組織癒着の度合い及び癒着の強さを図７に示す。図７に示すように、本発明の実験群１、実験群２、実験群３の癒着の度合いはそれぞれ０．６７±０．８２、１．２５±０．９６、０であり、２．６±０．５４である対照群だけではなく、２．５±０．５８である比較群１に比べても低い値を示す。なお、癒着の強さを測定した値も、実験群１、実験群２、実験群３はそれぞれ０．５±０．５４、１±０．８、０であって、１．６±０．５４である対照群、１．７５±０．５である比較群１に比べて低い値を示す。
【００５７】
癒着防止能の試験結果、本発明のヒアルロン酸エポキシド誘導体フィルムは、架橋の割合によって僅かな違いはあるが、対照群だけではなく、比較群１に比べて低い値を示して、組織の癒着を防ぐのに有効であることが確認された。
【００５８】
試験例７：ヒアルロン酸エポキシド誘導体フィルムの骨再生の度合いの評価
実施例５に従い製造された実験群３の骨再生効果を確認するために、８週齢のスプラーグ&#8722;ドーリー系ラットを動物モデルとして使用した。実験動物を麻酔した後、額部分の中央の皮膚を約４ｃｍ切開した後、骨膜を切開して横に退けた状態で脳硬膜と頭蓋正中部を通る血管の損傷に注意しながら、直径８ｍｍの歯科用ドリルを用いて臨界寸法欠損である直径８ｍｍのサイズ[J. P Schmitz et al., Clin.Orthop. Relat. Res., 205, 299(1986)]の欠損部を形成した後、実験群３及び比較群２をΦ１２ｍｍの円形に切り取って欠損部位を覆い、骨膜と皮膚をそれぞれ縫合した。なお、骨欠損部にいかなる処理もせずに縫合した対照群についても実験を行った。１２週間飼育した後、動物を犠牲にして骨欠損部を採取し、マイクロＣＴ、軟Ｘ線により骨再生効果を評価した。
【００５９】
図８に示すように、実験群１の方が対照群に比べて骨再生能に優れているということが分かり、しかも,骨誘導再生膜である比較群２（商品名：バイオガイド）と同じ骨再効果を示す。この結果から、ヒアルロン酸誘導体フィルムが優れた骨再生能を有するということを確認した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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