(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＨＢ−ＥＧＦに結合する抗体であって、下記（ａ）又は（ｂ）に記載の特徴を有し、かつ中和活性及び切断阻害活性を有する抗体
（ａ）  配列番号：２に記載のアミノ酸配列をＣＤＲ１として含み、配列番号：３に記載のアミノ酸配列をＣＤＲ２として含み、かつ配列番号：４に記載のアミノ酸配列をＣＤＲ３として含む軽鎖可変領域と、配列番号：６に記載のアミノ酸配列をＣＤＲ１として含み、配列番号：７に記載のアミノ酸配列をＣＤＲ２として含み、かつ配列番号：８に記載のアミノ酸配列をＣＤＲ３として含む重鎖可変領域とを保持する
（ｂ）  配列番号：１０に記載のアミノ酸配列をＣＤＲ１として含み、配列番号：１１に記載のアミノ酸配列をＣＤＲ２として含み、かつ配列番号：１２に記載のアミノ酸配列をＣＤＲ３として含む軽鎖可変領域と、配列番号：１４に記載のアミノ酸配列をＣＤＲ１として含み、配列番号：１５に記載のアミノ酸配列をＣＤＲ２として含み、かつ配列番号：１６に記載のアミノ酸配列をＣＤＲ３として含む重鎖可変領域とを保持する。
【請求項２】
ヒトＨＢ−ＥＧＦに結合する抗体であって、下記（ａ）又は（ｂ）に記載の特徴を有する抗体
（ａ）  配列番号：５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｂ）  配列番号：１３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する。
【請求項３】
ヒトＨＢ−ＥＧＦに結合する抗体であって、
配列番号：１８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する、抗体。
【請求項４】
請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載の抗体をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４に記載のＤＮＡを含む、宿主細胞。
【請求項６】
請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載の抗体を有効成分とする、癌を治療又は予防するための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質に対する抗体、該抗体をコードするＤＮＡ、前記抗体又は該ＤＮＡを含むハイブリドーマ、前記抗体を有効成分とする癌を治療又は予防するための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘパリン結合上皮細胞増殖因子様増殖因子（Ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ／ＨＢ−ＥＧＦ）は上皮細胞成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ／ＥＧＦ）ファミリーに属するタンパク質であり、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ１又はＥｒｂＢ４）に結合し、細胞の増殖、分化及び化学遊走等を促進することが明らかになっている（非特許文献１〜３）。【０００３】
また、ＨＢ−ＥＧＦは、生体内において、筋形成、心臓の形成、創傷治癒に寄与していることが明らかになっているため、ＨＢ−ＥＧＦは器官形成において重要な因子であると考えられている（非特許文献４〜６）。【０００４】
さらに、膵臓癌の増殖（非特許文献７）、胃癌の増殖（非特許文献８）、皮膚癌（非特許文献９）との関連、頭頸部癌の薬剤耐性との関連（非特許文献１０）、癌組織への血管新生（非特許文献１１）等、様々な点において、ＨＢ−ＥＧＦは癌の増殖、進行に関与していることが報告されており、ＨＢ−ＥＧＦは様々な癌においても重要な因子であることが明らかになっている。【０００５】
また、ＨＢ−ＥＧＦについては、先ずＩ型膜タンパク質（膜型ＨＢ−ＥＧＦ）として合成され、その後、細胞膜貫通部の直上の細胞外領域がプロテアーゼにより切断された後、１４〜２２キロダルトンの分泌型ＨＢ−ＥＧＦとして遊離することが明らかになっている（非特許文献１２及び１３）。そして、この切断によって生じた分泌型ＨＢ−ＥＧＦが、ＨＢ−ＥＧＦ発現細胞自身のＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ１を活性化するオートクライン様式や他の細胞のＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ１を活性化するパラクライン様式により、増殖因子として機能することも知られている。【０００６】
一方、膜型ＨＢ−ＥＧＦ自体も隣接する他の細胞のＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ１を活性化するジャックスタクライン様式により、増殖因子として機能することが知られている（非特許文献１４）。しかし、膜型ＨＢ−ＥＧＦは分泌型ＨＢ−ＥＧＦに比べ、細胞増殖活性が弱いことが示されている（非特許文献１１）。これらの結果から、プロテアーゼの切断によって分泌型ＨＢ−ＥＧＦを生じる過程が、ＨＢ−ＥＧＦが増殖因子として機能を発揮する上で重要であると考えられている。【０００７】
また、ＨＢ−ＥＧＦの切断部位にアミノ酸変異を導入することにより、膜型ＨＢ−ＥＧＦは発現するが分泌型ＨＢ−ＥＧＦは発現しないように調製された、変異型マウスが作製されている。そして、この変異型マウスの解析において、ＨＢ−ＥＧＦが全く発現していないノックアウトマウスと同様の心臓の器官形成における異常が観察されている（非特許文献５及び１５）。さらに、プロテアーゼ阻害剤によりＨＢ−ＥＧＦの切断を抑制することで、分泌型ＨＢ−ＥＧＦに起因する心肥大は抑制されることも示されており（非特許文献１６）、ＨＢ−ＥＧＦの器官形成における前述の重要な生理機能は、分泌型ＨＢ−ＥＧＦが担っていると考えられている。【０００８】
また、癌においては、切断されたＨＢ−ＥＧＦの細胞内領域（ＨＢ−ＥＧＦ−ＣＴＦ）が核に移行し細胞分裂を促進する機能も知られている（非特許文献１７）。さらに、プロテアーゼ阻害剤によるＨＢ−ＥＧＦ切断の抑制により、胃癌の増殖や浸潤を阻害しうることが示されている（非特許文献１８）。故に、癌細胞の増殖等においても、ＨＢ−ＥＧＦの切断過程が重要な要素であることが明らかになっている。【０００９】
以上の知見に基づき、ＨＢ−ＥＧＦが関与すると想定されている様々な疾患（心不全、神経疾患、肺疾患等）、特に癌の治療方法の研究、開発が進められている。例えば、卵巣癌細胞を移植したゼノグラフトマウスモデルにおいて、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体等の抗腫瘍効果が確認されている（非特許文献１９及び２０）。さらに、抗体によって、ＨＢ−ＥＧＦの切断を阻害し、分泌型ＨＢ−ＥＧＦの発生を抑制することで、癌細胞の増殖を阻害しうることも示されている（非特許文献２１）。このように、ＨＢ−ＥＧＦに結合し、抗腫瘍活性や切断阻害活性等の活性を発揮する抗体が開発されている。【００１０】
前述の通り、ＨＢ−ＥＧＦに対する抗体が、癌等の治療において十分な活性を有するため、すなわち細胞の増殖等におけるＨＢ−ＥＧＦが関与するシグナル伝達を完全に阻害するためには、（１）増殖因子等として機能する分泌型ＨＢ−ＥＧＦ及びＨＢ−ＥＧＦ−ＣＴＦを生じさせる切断を、強く阻害すること（切断阻害活性）、（２）分泌型ＨＢ−ＥＧＦ及び膜型ＨＢ−ＥＧＦとＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ１又はＥｒｂＢ４）との結合を阻害し、ひいては該ＥＧＦ受容体の活性化等を強く阻害すること（中和活性）、この２つの活性を兼ね備えることが必要であると想定される。【００１１】
しかしながら、例えば、非特許文献２１に記載の抗体は、前述の通り、切断阻害活性を有するものの、同文献には該抗体が中和活性を有していないことも明らかにされており、このように、ＨＢ−ＥＧＦが関与する疾患の治療、特に癌の治療において十分な活性を有する、ＨＢ−ＥＧＦに対する抗体は開発されていないのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｒａａｂ  Ｇ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ、１９９７年、１３３３巻、３号、Ｆ１７９〜Ｆ１９９
【非特許文献２】Ｏｎｏ  Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９４年、２９６巻、４９号、３１３１５〜３１３２１ページ
【非特許文献３】Ｅｌｅｎｉｕｓ  Ｋ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１９９７年、１６巻、６号、１２６８〜１２７８ページ
【非特許文献４】Ｃｈｅｎ，Ｘ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９５年、２７０巻、１８２８５〜１８２９４ページ
【非特許文献５】Ｉｗａｍｏｔｏ  Ｒ．ら、ＰＮＡＳ、２００３年、１００巻、６号、３２２１〜３２２６ページ
【非特許文献６】Ｍａｒｉｋｏｖｓｋｙ  Ｍ．ら、ＰＮＡＳ、１９９３年、９０巻、９号、３８８９〜３８９３ページ
【非特許文献７】Ｋｏｂｒｉｎ  Ｍ．Ｓ．ら、ＢＢＲＣ、１９９４年、２０２巻、３号、１７０５〜１７０９ページ
【非特許文献８】Ｎｅａｆ  Ｍ．ら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、１９９６年、６６巻、３号、３１５〜３２１ページ
【非特許文献９】Ｄｏｗｎｉｎｇ  Ｍ．Ｔ．ら、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｊ．、１９９７年、２９巻、１０号、７３５〜７４４ページ
【非特許文献１０】Ｈａｔａｋｅｙａｍａ  Ｈ．ら、ＰＬｏｓＯｎｅ、２０１０年、５巻、４号、ｅ９８７５
【非特許文献１１】Ｏｎｇｕｓａｈａ  Ｐ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓ．、２００４年、６４巻、５２８３〜５２９０ページ
【非特許文献１２】Ｓａｈｉｎ  Ｕ．ら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、２００４年、１６４巻、５号、７６９〜７７９ページ
【非特許文献１３】Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａ  Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９２年、２６７巻、９号、６２０５〜６２１２ページ
【非特許文献１４】Ｔａｋｅｍｕｒａ  Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９７年、２７２巻、３１０３６〜３１０４２ページ
【非特許文献１５】Ｙａｍａｚａｋｉ  Ｓ．ら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、２００３年、１６３巻、３号、４６９〜４７５ページ
【非特許文献１６】Ａｓａｋｕｒａ  Ｍ．ら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．、２００２年、８巻、１号、３５〜４０ページ
【非特許文献１７】Ｓｈｉｍｕｒａ  Ｔ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００８年、１４巻、１２号、３９５６〜３９６５ページ
【非特許文献１８】Ｓｈｉｍｕｒａ  Ｔ．ら、ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ、２０１２年、１２：２０５
【非特許文献１９】Ｍｉｙａｍｏｔｏ  Ｓ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００４年、６４巻、５７２０〜５７２７ページ
【非特許文献２０】Ｍｉｙａｍｏｔｏ  Ｓ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２０１１年、１７巻、２１号、６７３３〜６７４１ページ
【非特許文献２１】Ｈａｍａｏｋａ  Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０１０年、１４８巻、１号、５５〜６９ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、ヒトＨＢ−ＥＧＦに結合することにより、該ヒトＨＢ−ＥＧＦにおける切断を阻害し、かつ該ヒトＨＢ−ＥＧＦとＥＧＦ受容体との結合を阻害する抗体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、前記目的を達成すべく、ＨＢ−ＥＧＦタンパク質の細胞外領域からなる部分ペプチドをマウスに免疫し、ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質に対するモノクローナル抗体を取得した。そして、取得した抗ヒトＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体の中から、細胞表面に発現しているＨＢ−ＥＧＦに対して強い反応性を示す３抗体（３５−１抗体、２９２抗体及び１−１抗体）を選抜した。【００１５】
さらに、これら抗体のエピトープを解析した結果、３５−１抗体及び２９２抗体は、ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質において、１１５番目のフェニルアラニン、１１７番目のイソロイシン、１４０番目のグリシン、１４１番目のグルタミン酸及び１４２番目のアルギニンを認識していることが明らかになった。一方、１−１抗体は、１１５番目のフェニルアラニン、１４０番目のグリシン、１４１番目のグルタミン酸及び１４２番目のアルギニンを認識するが、前記２抗体とは異なり１１７番目のイソロイシンを認識しないことが明らかになった。【００１６】
また、かかる抗体について鋭意研究を重ねた結果、３５−１抗体及び２９２抗体はいずれもヒトＨＢ−ＥＧＦにおける切断を阻害できることを見出した。さらに、ヒトＨＢ−ＥＧＦとＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）とが結合することによって生じる該ＥＧＦＲのリン酸化をいずれの抗体も抑制できること、すなわち中和活性を有していることも見出した。一方、１−１抗体は、切断阻害活性を有しているものの、中和活性を有していなかった。そのため、３５−１抗体及び２９２抗体は、ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質の１１７番目のイソロイシンを含めて認識することにより、切断阻害活性及び中和活性を有し、１−１抗体は、１１７番目のイソロイシンを認識しないことにより中和活性を有していないことが明らかになり、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体が強い中和活性を発揮するためには、ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質の１１７番目のイソロイシンに結合することが必要であることが明らかとなった。【００１７】
また、本発明者らは、かかる切断阻害活性及び中和活性を有する３５−１抗体及び２９２抗体について、重鎖及び軽鎖の可変領域及びＣＤＲの配列を決定した。さらに、決定した配列に基づき、３５−１抗体については、定常領域をヒトＩｇＧに由来するものに置換したキメラ抗体、及び、可変領域のフレームワーク領域をヒト抗体のそれらに置換したヒト型化抗体を作製した。そして、得られたキメラ抗体を、癌細胞を移植したマウスに投与することによって、当該癌細胞のマウス体内における増殖が抑制されることも明らかにした。さらに、当該抗体は癌細胞に対して抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）を発揮することを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下＜１＞〜＜８＞を提供するものである。
＜１＞  ヒトＨＢ−ＥＧＦに結合する抗体であって、下記（ａ）又は（ｂ）に記載の特徴を有し、かつ中和活性及び切断阻害活性を有する抗体
（ａ）  配列番号：２に記載のアミノ酸配列をＣＤＲ１として含み、配列番号：３に記載のアミノ酸配列をＣＤＲ２として含み、かつ配列番号：４に記載のアミノ酸配列をＣＤＲ３として含む軽鎖可変領域と、配列番号：６に記載のアミノ酸配列をＣＤＲ１として含み、配列番号：７に記載のアミノ酸配列をＣＤＲ２として含み、かつ配列番号：８に記載のアミノ酸配列をＣＤＲ３として含む重鎖可変領域とを保持する
（ｂ）  配列番号：１０に記載のアミノ酸配列をＣＤＲ１として含み、配列番号：１１に記載のアミノ酸配列をＣＤＲ２として含み、かつ配列番号：１２に記載のアミノ酸配列をＣＤＲ３として含む軽鎖可変領域と、配列番号：１４に記載のアミノ酸配列をＣＤＲ１として含み、配列番号：１５に記載のアミノ酸配列をＣＤＲ２として含み、かつ配列番号：１６に記載のアミノ酸配列をＣＤＲ３として含む重鎖可変領域とを保持する。
＜２＞  ヒトＨＢ−ＥＧＦに結合する抗体であって、下記（ａ）又は（ｂ）に記載の特徴を有する抗体
（ａ）  配列番号：５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｂ）  配列番号：１３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する。
＜３＞  ヒトＨＢ−ＥＧＦに結合する抗体であって、
配列番号：１８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する、抗体。
＜４＞  ＜１＞〜＜３＞のうちのいずれか一に記載の抗体をコードするＤＮＡ。
＜５＞  ＜４＞に記載のＤＮＡを含む、宿主細胞。
＜６＞  ＜１＞〜＜３＞のうちのいずれか一に記載の抗体を有効成分とする、癌を治療又は予防するための組成物。
＜７＞  ＜６＞に記載の組成物を医薬として使用する方法。
＜８＞  ＜６＞に記載の組成物を癌患者に投与して治療する方法。
【００１８】
なお、配列番号：２〜４に記載のアミノ酸配列は、各々３５−１抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列であり、配列番号：５に記載のアミノ酸配列は、３５−１抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列であり、配列番号：６〜８に記載のアミノ酸配列は、各々３５−１抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列であり、配列番号：９に記載のアミノ酸配列は、３５−１抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。配列番号：１８に記載のアミノ酸配列は、３５−１ヒト型化抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列であり、配列番号：１９に記載のアミノ酸配列は、３５−１ヒト型化抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。配列番号：１０〜１２に記載のアミノ酸配列は、各々２９２抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列であり、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列は、２９２抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列であり、配列番号：１４〜１６に記載のアミノ酸配列は、各々２９２抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列であり、配列番号：１７に記載のアミノ酸配列は、２９２抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、ヒトＨＢ−ＥＧＦに結合することにより、該ヒトＨＢ−ＥＧＦにおける切断を阻害し、かつ該ヒトＨＢ−ＥＧＦとＥＧＦ受容体との結合を阻害する抗体を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】取得したヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質に対する抗体（３５−１抗体及び２９２抗体）と、ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質を細胞表面に発現する細胞株（ＨＢ−ＥＧＦ／ｓｔ２９３Ｔ）又は該タンパク質を細胞表面に発現していない細胞株（２９３Ｔ）との反応性をフローサイトメトリーによって解析した結果を示す、ヒストグラムである。図中、白いヒストグラムは各抗体と２９３Ｔとの反応性（陰性対照）を示し、黒いヒストグラムは各抗体とＨＢ−ＥＧＦ／ｓｔ２９３Ｔとの反応性を示す。縦軸は細胞数を示し、横軸は、抗体と細胞株との反応性（平均蛍光強度）を示す。
【図２】ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質に対する抗体（３５−１抗体、２９２抗体及び１−１抗体）と、各ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質のアミノ酸変異体との反応性をフローサイトメトリーによって解析した結果を示すグラフである。縦軸は各アミノ酸変異体に対する各抗体の結合強度（相対値）を示す。
【図３】ＰＭＡによって生じるヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質の切断に対する抑制活性を、本発明の抗体（３５−１抗体及び２９２抗体）について、フローサイトメトリーにより解析した結果を示すグラフである。縦軸は、ＰＭＡ添加後の細胞（ＨＡ−ＨＢ−ＥＧＦ／ｓｔＣＨＯ−Ｋ１）表面に残存しているヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質量（平均蛍光強度）を示す。横軸は、細胞に添加した各抗体の濃度を示す。
【図４】ＰＭＡによって生じるヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質の切断に対する抑制活性を、本発明の抗体（３５−１抗体）について、ウェスタンブロットにより解析した結果を示す写真である。なお、図中の「ＨＢ−ＥＧＦ−ＣＴＦ」は、ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質（全長ＨＢ−ＥＧＦ）が切断された後生じる、細胞膜側に残存している部分タンパク質（ＨＢ−ＥＧＦ  Ｃ末断片）を示す（図５においても同じ）。
【図５】ＰＭＡによって生じるヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質の切断に対する抑制活性を、本発明の抗体（３５−１抗体及び２９２抗体）について、ウェスタンブロットにより解析した結果を示す写真である。
【図６】ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質によって誘起されるＥＧＦＲのリン酸化に対する抑制活性を、本発明の抗体（３５−１抗体）についてウェスタンブロットにより解析した結果を示す写真である。図中、「ＥＧＦＲ」は各細胞におけるＥＧＦＲタンパク質の量を示し、「ｐ−ＥＧＦＲ」は各細胞におけるリン酸化されたＥＧＦＲタンパク質の量を示す（図中の表記に関し、図７及び８において同様である）。
【図７】ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質によって誘起されるＥＧＦＲのリン酸化に対する抑制活性を、本発明の抗体（３５−１抗体及び２９２抗体）についてウェスタンブロットにより解析した結果を示す写真である。
【図８】ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質によって誘起されるＥＧＦＲのリン酸化に対する抑制活性を、ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質に対する抗体（１−１抗体）についてウェスタンブロットにより解析した結果を示す写真である。
【図９】キメラ化した３５−１抗体を投与したゼノグラフトマウスにおける、腫瘍体積の経時的変化を示すグラフである。図中、「３５−１（高濃度）」は７５０ｕｇ／ｍｌにＰＢＳで希釈した抗体溶液を投与した結果を示し、「３５−１（低濃度）」は１５０ｕｇ／ｍｌにＰＢＳで希釈した抗体溶液を投与した結果を示し、「ＰＢＳ」はＰＢＳのみを投与した結果（陰性対照）を示す。
【図１０】キメラ化した３５−１抗体の抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）を分析した結果を示すグラフである。
【図１１】キメラ化した３５−１抗体（３５−１キメラ化抗体）及びヒト型化した３５−１抗体（３５−１ヒト型化抗体）と、ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質との反応性をＥＬＩＳＡによって解析した結果を示す、グラフである。図中、縦軸は、抗体とヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質との反応性（平均蛍光強度）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
後述の実施例において示す通り、本発明者らは、ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質における１１５番目のフェニルアラニン、１１７番目のイソロイシン、１４０番目のグリシン、１４１番目のグルタミン酸及び１４２番目のアルギニンに結合する２種の抗体（３５−１抗体及び２９２抗体）を取得した。さらに、これら抗体は、ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質の切断に対する強い抑制活性（切断阻害活性）と、ヒトＨＢ−ＥＧＦとＥＧＦＲとが結合することによって生じる該ＥＧＦＲのリン酸化に対する強い抑制活性（中和活性）とを有していることも見出した。一方、ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質の１１７番目のイソロイシンに結合しないヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質に対する抗体（後述の１−１抗体等）は中和活性を有していないことも見出した。従って、本発明は、ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質における１１７番目のイソロイシンに結合する抗体を提供する。
【００２２】
かかる抗体は、前記１１７番目のイソロイシン以外に、ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質における他のアミノ酸にも結合する抗体であってもよく、好ましくは、ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質における１１５番目のフェニルアラニン、１１７番目のイソロイシン、１４０番目のグリシン、１４１番目のグルタミン酸及び１４２番目のアルギニンに結合する抗体である。
【００２３】
本発明における「抗体」は、免疫グロブリンのすべてのクラス及びサブクラスを含む。「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体が含まれ、また抗体の機能的断片の形態も含む意である。「ポリクローナル抗体」は、異なるエピトープに対する異なる抗体を含む抗体調製物である。「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体（抗体断片を含む）を意味し、抗原上の単一の決定基を認識するものである。本発明の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。また、本発明の抗体は、自然環境の成分から分離され、及び／又は回収された（即ち、単離された）抗体である。
【００２４】
本発明において「ＨＢ−ＥＧＦ」は、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子様増殖因子、ＤＴＲ（ジフテリア毒素受容体）、ＤＴＳ、ＤＴＳＦ、ＨＥＧＦＬ等とも称されるタンパク質である。ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質は、典型的には、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿００１９３６で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＭ＿００１９４５で特定される塩基配列がコードするタンパク質）である。
【００２５】
また、ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質は、このような典型的なアミノ酸配列を有するもの以外に、天然においてアミノ酸が変異したものも存在しうる。従って、本発明にかかるヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質には、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるものも含まれる。アミノ酸配列の置換、欠失、挿入若しくは付加は、一般的には、１０アミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内、３アミノ酸以内、１アミノ酸）である。
【００２６】
なお、抗体が、ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質において、１１７番目のイソロイシン等に結合する抗体であるかどうか（ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質において、１１７番目のイソロイシン等を認識する抗体であるかどうか）は、当業者であれば、後述の実施例３に示すような、免疫学的解析手法（フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降等）を利用して評価することができる。
【００２７】
また、本発明の抗体が結合するアミノ酸を含む部位、すなわち「エピトープ」は、ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質中に存在する抗原決定基（抗体中の抗原結合ドメインが結合する抗原上の部位）を意味する。従って、本発明におけるエピトープは、アミノ酸の一次配列中において連続する複数のアミノ酸からなるポリペプチド（線状エピトープ）であってもよく、アミノ酸の一次配列中において隣接していないアミノ酸が、ペプチド又はタンパク質の折り畳み等の三次元構造によって近傍にくることにより形成されるポリペプチド（不連続エピトープ、構造的エピトープ）であってもよい。また、かかるエピトープとしては、典型的には、少なくとも１つ、及び最も普通には少なくとも５つ（例えば８〜１０個、６〜２０個）のアミノ酸からなる。
【００２８】
本発明の抗体によって抑制される「ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質の切断」は、ＰＭＡ等によって活性化されたＡＤＡＭ１２等のプロテアーゼによる、ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質のジャクスタメンブレンドメイン内における切断を意味する。ジャックスタメンブレンドメインは、典型的にはＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿００１９３６に記載のＮ末端から１４５〜１６１番目のアミノ酸からなる領域である。また、かかる切断を抑制する活性は、例えば、後述の実施例４に示す方法にて評価することができる。
【００２９】
本発明の抗体によって抑制される「ヒトＨＢ−ＥＧＦとＥＧＦ受容体との結合」において、「ヒトＨＢ−ＥＧＦ」とは前記ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質の全長（膜型ＨＢ−ＥＧＦ）のみならず、前記切断によって細胞外に放出される部分タンパク質（分泌型ＨＢ−ＥＧＦ）を含む意味である。例えば、分泌型ＨＢ−ＥＧＦとしては、配列番号：１に記載のＮ末端から１番目から１４９番目のアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられ、ＨＢ−ＥＧＦ−ＣＴＦとしては、配列番号：１に記載のＮ末端から１５０番目から２０８番目のアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。また、本発明にかかる「ＥＧＦ受容体」は、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１）又はＥｒｂＢ４である。
【００３０】
さらに、本発明の抗体によって抑制される「ヒトＨＢ−ＥＧＦとＥＧＦ受容体との結合」には、前記ヒトＨＢ−ＥＧＦと前記ＥＧＦ受容体との結合のみならず、該結合に伴うＥＧＦＲ又はＥｒｂＢ４の構造の変化、該構造の変化によって誘導されるＥＧＦＲ又はＥｒｂＢ４のホモあるいはヘテロ二量体化、該二量体化に伴うＥＧＦＲ又はＥｒｂＢ４のリン酸化、該リン酸化によって惹起されるＭＡＰＫ経路の活性化、前記リン酸化によって惹起されるＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路の活性化を含む意味である。本発明の抗体による抑制の対象として、好ましくはＥＧＦＲのリン酸化であり、より好ましくは癌細胞におけるＥＧＦＲのリン酸化である。また、かかるリン酸化を抑制する活性は、例えば、後述の実施例５に示す方法にて評価することができる。
【００３１】
また、本発明の抗体は、前述のヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質の切断を抑制する活性（切断阻害活性）及びヒトＨＢ−ＥＧＦとＥＧＦ受容体との結合を抑制する活性（中和活性）に加え、細胞の増殖を抑制する活性（細胞増殖抑制活性）又は抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）を有していることが好ましく、切断阻害活性、中和活性、細胞増殖抑制活性及びＡＤＣＣ活性を有していることがより好ましい。
【００３２】
本発明における「細胞の増殖の抑制」は、細胞の増殖自体（細胞の分裂）の抑制のみならず、細胞の死（アポトーシス等）の誘導による細胞の増殖抑制を含む意味である。本発明の抗体による抑制の対象として、好ましくは癌細胞の増殖であり、より好ましくはｉｎ  ｖｉｖｏにおける癌細胞の増殖（腫瘍の増大）である。かかるｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍の増殖を抑制する活性は、例えば、後述の実施例６に示す方法にて評価することができる。本発明の抗体の好ましい態様は、当該方法において、抗体投与開始時における腫瘍体積を１００％とした際に、抗体の投与を開始してから３０日経過後の腫瘍体積を２３０％以下（例えば、２２０％以下、２１０％以下、２００％以下、１９０％以下、１８０％以下、１７０％以下）に抑えることのできる抗体である。
【００３３】
また、本発明の抗体による細胞障害の標的として、好ましくは癌細胞である。かかる癌細胞に対するＡＤＣＣ活性は、例えば、後述の実施例７に示す方法にて評価することができる。本発明の抗体の好ましい態様は、当該方法において、標的細胞に添加した濃度が１μｇ／ｍｌである場合に、ＡＤＣＣ活性が１０％以上（例えば、２０％以上、３０％以上）である抗体である。
【００３４】
本発明の抗体による増殖抑制の対象及び／又は細胞障害の標的となる癌の種類としては、ＨＢ−ＥＧＦと多種の癌との関連は、例えば非特許文献７〜１１及び１７〜２１に示す通り明らかになっているので、特に制限はない。
【００３５】
本発明の抗体の他の好ましい態様としては、ヒトＨＢ−ＥＧＦに結合する抗体であって、下記（ａ）又は（ｂ）に記載の特徴を有する抗体が挙げられる。
（ａ）  配列番号：２〜４に記載のアミノ酸配列（後述の３５−１抗体の軽鎖可変領域におけるＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列）又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：６〜８に記載のアミノ酸配列（後述の３５−１抗体の重鎖可変領域におけるＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列）又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｂ）  配列番号：１０〜１２に記載のアミノ酸配列（後述の２９２抗体の軽鎖可変領域におけるＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列）又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１４〜１６に記載のアミノ酸配列（後述の２９２抗体の重鎖可変領域におけるＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列）又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する。
【００３６】
また、本発明の抗体のより好ましい態様としては、ヒトＨＢ−ＥＧＦに結合する抗体であって、下記（ａ）又は（ｂ）に記載の特徴を有する抗体が挙げられる。
（ａ）  配列番号：５に記載のアミノ酸配列（後述の３５−１抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列）又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：９に記載のアミノ酸配列（後述の３５−１抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列）または該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｂ）  配列番号：１３に記載のアミノ酸配列（後述の２９２抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列）又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１７に記載のアミノ酸配列（後述の２９２抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列）又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列とを含む重鎖可変領域とを保持する。
【００３７】
本発明の抗体には、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト型化抗体（ヒト化抗体）、ヒト抗体、及び、これら抗体の機能的断片が含まれる。本発明の抗体を医薬としてヒトに投与する場合は、副作用低減の観点から、キメラ抗体、ヒト型化抗体、あるいはヒト抗体が望ましく、本発明のヒト型化抗体の好ましい態様としては、ヒトＨＢ−ＥＧＦに結合する抗体であって、配列番号：１８に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１９に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する、抗体が挙げられる。
【００３８】
本発明において「キメラ抗体」とは、ある種の抗体の可変領域とそれとは異種の抗体の定常領域とを連結した抗体である。キメラ抗体は、例えば、抗原をマウスに免疫し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変部（可変領域）を切り出して、ヒト骨髄由来の抗体定常部（定常領域）遺伝子と結合し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入して産生させることにより取得することができる（例えば、特開平８−２８０３８７号公報、米国特許第４８１６３９７号公報、米国特許第４８１６５６７号公報、米国特許第５８０７７１５号公報）。また、本発明において「ヒト型化抗体」とは、非ヒト由来の抗体の抗原結合部位（ＣＤＲ）の遺伝子配列をヒト抗体遺伝子に移植（ＣＤＲグラフティング）した抗体であり、その作製方法は、公知である（例えば、ＥＰ２３９４００、ＥＰ１２５０２３、ＷＯ９０／０７８６１、ＷＯ９６／０２５７６参照）。本発明において、「ヒト抗体」とは、すべての領域がヒト由来の抗体である。ヒト抗体の作製においては、ヒトＢ細胞より活性のある抗体の産生をスクリーニングする方法、ファージディスプレイ法、免疫することで、ヒト抗体のレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を利用すること等が可能である。ヒト抗体の作製手法は、公知である（例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３：６５−９３（１９９５）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１−５９７（１９９１）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１４６−１５６（１９９７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：７２２−７２７（２０００）、特開平１０−１４６１９４号公報、特開平１０−１５５４９２号公報、特許２９３８５６９号公報、特開平１１−２０６３８７号公報、特表平８−５０９６１２号公報、特表平１１−５０５１０７号公報）。
【００３９】
本発明において抗体の「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、抗原に結合するものを意味する。本発明にかかる抗体の「機能的断片」の態様としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー、多特異性抗体、及びこれらの重合体が挙げられる。
【００４０】
ここで「Ｆａｂ」とは、１つの軽鎖及び重鎖の一部からなる免疫グロブリンの一価の抗原結合断片を意味する。抗体のパパイン消化によって、また、組換え方法によって得ることができる。「Ｆａｂ’」は、抗体のヒンジ領域の１つ又はそれより多いシステインを含めて、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端でのわずかの残基の付加によって、Ｆａｂとは異なる。「Ｆ（ａｂ’）２」とは、両方の軽鎖と両方の重鎖の部分からなる免疫グロブリンの二価の抗原結合断片を意味する。
【００４１】
「可変領域断片（Ｆｖ）」は、完全な抗原認識及び結合部位を有する最少の抗体断片である。Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が非共有結合により強く連結されたダイマーである。「一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」は、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、これらの領域は、単一のポリペプチド鎖に存在する。「ｓｃ（Ｆｖ）２」は、２つの重鎖可変領域及び２つの軽鎖可変領域をリンカー等で結合して一本鎖にしたものである。「ダイアボディー」とは、二つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片であり、この断片は、同一ポリペプチド鎖の中に軽鎖可変領域に結合した重鎖可変領域を含み、各領域は別の鎖の相補的領域とペアを形成している。「多特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。例えば、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現により調製することができる。
【００４２】
本発明の抗体には、望ましい活性（抗原への結合活性、前記切断阻害活性、前記中和活性、他の生物学的特性）を減少させることなく、そのアミノ酸配列が修飾された抗体が含まれる。本発明の抗体のアミノ酸配列変異体は、本発明の抗体鎖をコードするＤＮＡへの変異導入によって、またはペプチド合成によって作製することができる。そのような修飾には、例えば、本発明の抗体のアミノ酸配列内の残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を含む。抗体のアミノ酸配列が改変される部位は、改変される前の抗体と同等の活性を有する限り、抗体の重鎖または軽鎖の定常領域であってもよく、また、可変領域（フレームワーク領域及びＣＤＲ）であってもよい。ＣＤＲ以外のアミノ酸の改変は、抗原との結合親和性への影響が相対的に少ないと考えられるが、現在では、ＣＤＲのアミノ酸を改変して、抗原へのアフィニティーが高められた抗体をスクリーニングする手法が公知である（ＰＮＡＳ，１０２：８４６６−８４７１（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：４８５−４９３（２００８）、国際公開第２００２／０５１８７０号、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：２４８８０−２４８８７（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：３４５−３５１（２００８））。
【００４３】
改変されるアミノ酸数は、好ましくは、１０アミノ酸以内、より好ましくは５アミノ酸以内、最も好ましくは３アミノ酸以内（例えば、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。アミノ酸の改変は、好ましくは、保存的な置換である。本発明において「保存的な置換」とは、化学的に同様な側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換することを意味する。化学的に同様なアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基のグループは、本発明の属する技術分野でよく知られている。例えば、酸性アミノ酸（アスパラギン酸及びグルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン・アルギニン・ヒスチジン）、中性アミノ酸においては、炭化水素鎖を持つアミノ酸（グリシン・アラニン・バリン・ロイシン・イソロイシン・プロリン）、ヒドロキシ基を持つアミノ酸（セリン・トレオニン）、硫黄を含むアミノ酸（システイン・メチオニン）、アミド基を持つアミノ酸（アスパラギン・グルタミン）、イミノ基を持つアミノ酸（プロリン）、芳香族基を持つアミノ酸（フェニルアラニン・チロシン・トリプトファン）で分類することができる。
【００４４】
また「同等の活性を有する」とは、抗原への結合活性、前記切断活性又は前記中和活性が対象抗体（代表的には、後述の実施例において示す、３５−１抗体又は２９２抗体）と同等（例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上）であることを意味する。抗原への結合活性は、例えば、後述の実施例において示す通り、抗原との反応性をＥＬＩＳＡにより解析することや、抗原を発現する細胞を作製し、抗体サンプルとの反応性をフローサイトメーターで解析することにより評価することができる。前記切断活性は、例えば、後述の実施例に示す方法にて、ＰＭＡ刺激を与えた細胞表面における膜型ＨＢ−ＥＧＦの残存率を指標として、またはＰＭＡ刺激を与えた細胞表面におけるＨＢ−ＥＧＦ−ＣＴＦの発生率を指標として評価することができる。また、前記中和活性は、ＨＢ−ＥＧＦタンパク質による刺激を与えた癌細胞におけるＥＧＦＲタンパク質のリン酸化の程度を指標として評価することができる。
【００４５】
また、本発明の抗体の改変は、例えば、グリコシル化部位の数又は位置を変化させる等の抗体の翻訳後プロセスの改変であってもよい。これにより、例えば、抗体のＡＤＣＣ活性を向上させることができる。抗体のグリコシル化とは、典型的には、Ｎ−結合又はＯ−結合である。抗体のグリコシル化は、抗体を発現するために用いる宿主細胞に大きく依存する。グリコシル化パターンの改変は、糖生産に関わる特定の酵素の導入又は欠失等の公知の方法で行うことができる（特開２００８−１１３６６３号公報、米国特許第５０４７３３５号、米国特許第５５１０２６１号、米国特許第５２７８２９９号、国際公開第９９／５４３４２号）。さらに、本発明においては、抗体の安定性を増加させる等の目的で脱アミド化されるアミノ酸若しくは脱アミド化されるアミノ酸に隣接するアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより脱アミド化を抑制してもよい。また、グルタミン酸を他のアミノ酸へ置換して、抗体の安定性を増加させることもできる。本発明は、こうして安定化された抗体をも提供するものである。
【００４６】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であれば、抗原（ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質、その部分ペプチド（例えば、ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質のＥＧＦドメイン）、又はこれらを発現する細胞等）で動物を免疫し、その抗血清から、従来の手段（例えば、塩析、遠心分離、透析、カラムクロマトグラフィー等）によって、精製して取得することができる。
【００４７】
また、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法や組換えＤＮＡ法によって作製することができる。
【００４８】
ハイブリドーマ法としては、代表的には、コーラー及びミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５））が挙げられる。この方法における細胞融合工程に使用される抗体産生細胞は、前記抗原で免疫された動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、ヤギ、ニワトリ、ラクダ）の脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球などである。免疫されていない動物から予め単離された上記の細胞又はリンパ球等に対して、抗原を培地中で作用させることによって得られた抗体産生細胞も使用することが可能である。ミエローマ細胞としては公知の種々の細胞株を使用することが可能である。抗体産生細胞及びミエローマ細胞は、それらが融合可能であれば、異なる動物種起源のものでもよいが、好ましくは、同一の動物種起源のものである。ハイブリドーマは、例えば、抗原で免疫されたマウスから得られた脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞との間の細胞融合により産生され、その後のスクリーニングにより、ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質における１１７番目のイソロイシン等に結合する抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質における１１７番目のイソロイシン等に結合するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを培養することにより、また、ハイブリドーマを投与した哺乳動物の腹水から、取得することができる。
【００４９】
組換えＤＮＡ法は、本発明の抗体をコードするＤＮＡをハイブリドーマやＢ細胞等からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞（例えば哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞等）に導入し、本発明の抗体を組換え抗体として産生させる手法である（例えば、Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７  ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０００  ＯＸＦＯＲＤ  ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＰＲＥＳＳ、Ｖａｎｄａｍｍｅ  Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２：７６７−７７５（１９９０））。本発明の抗体をコードするＤＮＡの発現においては、重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよく、重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよい（国際公開第９４／１１５２３号公報  参照）。本発明の抗体は、上記宿主細胞を培養し、宿主細胞内又は培養液から分離・精製し、実質的に純粋で均一な形態で取得することができる。抗体の分離・精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている方法を使用することができる。トランスジェニック動物作製技術を用いて、抗体遺伝子が組み込まれたトランスジェニック動物（ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等）を作製すれば、そのトランスジェニック動物のミルクから、抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である。
【００５０】
従って、本発明は、本発明の抗体をコードするＤＮＡ、本発明の抗体を産生する又は本発明の抗体をコードするＤＮＡを含むハイブリドーマをも提供することができる。
【００５１】
また、本発明の抗体においては、薬剤若しくはプロドラッグ等の化合物又は分子が結合していてもよい。かかる抗体を投与することにより、ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質が発現している部位（例えば、癌細胞）に、該化合物又は分子を送達することができる。そのような薬物又はプロドラッグとしては特に制限はないが、本発明の抗体による抗腫瘍効果を相加的又は相乗的に増強するという観点から、抗腫瘍性を有する物質が好ましい。かかる抗腫瘍性を有する物質としては特に制限されるものではなく、例えば、抗癌剤（イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、イリノテカンの代謝産物ＳＮ−３８（１０−ヒドロキシ−７−エチルカンプトテシン）、アドリアマイシン、タキソール、５−フルオロウラシル、ニムスチン、ラミニスチン等のアルキル化剤、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド等の代謝拮抗剤、エトポシド、ビンクリスチン等の植物アルカロイド、マイトマイシン、ブレオマイシン等の抗癌性抗生物質、シスプラチン等の白金製剤、ソラフェニブ、エルロチニブ等の分子標的剤、メトトレキセート、シトシンアラビノシド、６−チオグアニン、６−メルカプトプリン、シクロフォスファミド、イフォスファミド、ブスルファン等が挙げられる。また、放射性同位体も本発明の抗体に結合する抗腫瘍性を有する物質として好適に利用できる。
【００５２】
また、抗体と前記化合物又は分子との結合も、当該技術分野で公知の方法により行うことができ、直接的結合及び間接的結合のいずれでもよい。例えば、直接的な結合として、共有結合を利用することができる。間接的な結合としては、リンカーを介した結合を利用することができる。かかるリンカーを介した結合については、当業者であれば、例えばＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６；Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．編，Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ），Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ，１９９７；Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆ．  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．編，Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗ  ５４（４），２００２の記載を参照しながら行うことができる。本発明の抗体１分子に結合する前記化合物又は分子の数は、理論的には特に限定されないが、抗体と化合物等とからなる複合体の安定性や製造容易性等の観点から、通常１〜１０個、好ましくは１〜８個である。
【００５３】
また、後述の実施例において示す通り、癌細胞の増殖等において重要な要素である、ＨＢ−ＥＧＦタンパク質の切断と、ＥＧＦＲのリン酸化とを、本発明の抗体により抑制できることから、癌の治療又は予防に利用することができる。従って、本発明は、本発明の抗体を有効成分とする癌を治療又は予防するための組成物、並びに本発明の抗体の治療上又は予防上の有効量を、ヒトに投与する工程を含んでなる、癌を治療又は予防するための方法（前記組成物を癌患者に投与して治療する方法等）をも提供するものである。また、本発明は、前記組成物を医薬として使用する方法を提供するものである。なお、本発明の抗体が標的とする癌としては、前述の通り特に制限はなく、多種の癌が標的となり得る。
【００５４】
本発明の抗体を有効成分とする癌を治療又は予防するための組成物は、本発明の抗体と任意の成分、例えば生理食塩水、葡萄糖水溶液又はリン酸塩緩衝液等を含有する形態で使用することができる。本発明の癌を治療又は予防するための組成物は、必要に応じて液体又は凍結乾燥した形態で製形化しても良く、任意に薬学的に許容される担体若しくは媒体、例えば、安定化剤、防腐剤、等張化剤等を含有させることもできる。
【００５５】
薬学的に許容される担体としては、凍結乾燥した製剤の場合、マンニトール、ラクトース、サッカロース、ヒトアルブミン等を例として挙げることができ、液状製剤の場合には、生理食塩水、注射用水、リン酸塩緩衝液、水酸化アルミニウム等を例として挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００５６】
本発明の癌を治療又は予防するための組成物の投与方法は、投与対象の年齢、体重、性別、健康状態等により異なるが、経口投与、非経口投与（例えば、静脈投与、動脈投与、局所投与）のいずれかの投与経路で投与することができる。当該組成物の投与量は、患者の年齢、体重、性別、健康状態、癌の進行の程度及び投与する組成物の成分により変動しうるが、一般的に静脈内投与の場合、成人には体重１ｋｇ当たり１日０．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは１〜１００ｍｇである。
【００５７】
本発明の癌を治療又は予防するための方法においては、本発明の抗体を投与する方法としては前述の通り特に制限はなく、経口投与、非経口投与のいずれかの投与経路で投与することができる。当業者であれば前記薬学的に許容される担体若しくは媒体等を選択し、適した組成物の形態をとることにより達成できる。ヒトに投与される本発明の抗体の治療上又は予防上の「有効量」は、前述の通り、当業者であれば、患者の年齢、体重、性別、健康状態、癌の進行の程度、投与経路等を考慮して決定することができる。また、本発明の抗体の投与対象となる「ヒト」としては特に制限はなく、例えば、癌を罹患しているヒト（癌患者）が挙げられる。また、予防、癌の再発を抑えるという観点から、癌を化学療法、放射線療法、外科療法等によって除去した後のヒトであってもよい。
【００５８】
さら、本発明の癌を治療又は予防するための方法においては、本発明の抗体を投与する工程の他、本発明の抗体の有効性を評価する工程を含んでいてもよい。すなわち、
本発明の抗体の治療上又は予防上の有効量をヒトに投与する工程と、
該投与後のヒトにおいて、本発明の抗体の有効性を評価する工程とを含む、
癌を治療又は予防するための方法を、本発明は提供する。
【００５９】
本発明の抗体の「有効性の評価」については特に制限はなく、例えば、投与後の腫瘍のサイズ、癌の転移能又は各種癌マーカーの発現が投与前と比べ低減していれば、癌の治療等において本発明の抗体は有効であると判定することができる。また、癌に伴う異常、例えば、体重減少、腹痛、背痛、食欲低下、嘔気、嘔吐及び全身性倦怠感、虚弱、並びに黄疸等を指標としても、本発明の抗体の有効性を評価することができる。さらに、本発明の抗体による治療後、腫瘍組織を切除した場合、該腫瘍組織におけるＨＢ−ＥＧＦが関与するシグナル伝達の程度を調べることによっても、癌の治療等において本発明の抗体は有効であると判定することができる。例えば、腫瘍組織において通常亢進されるＥＧＦＲのリン酸化が、本発明の抗体の投与によって阻害されていることが検出されれば、癌の治療等において本発明の抗体は有効であると判定することができる。
【００６０】
本発明の抗体は、前述の通り、多種の癌においてＨＢ−ＥＧＦタンパク質の発現亢進等が認められているため、癌の治療や予防のみならず、癌の検査への応用も考えられる。特に、本発明の抗体のエピトープが存在するＥＧＦドメインは、ＨＢ−ＥＧＦタンパク質の細胞外領域であるため、細胞免疫染色やフローサイトメトリー等において、簡便かつ効率良く、ＨＢ−ＥＧＦタンパク質を発現している癌細胞を検出することができる。また、本発明は、上記本発明の抗体を有効成分とする癌の検査薬及びキットを提供する。
【００６１】
本発明の抗体を癌の検査に用いる場合あるいは癌の治療における腫瘍部位の検出に用いる場合、本発明の抗体は、標識したものであってもよい。標識としては、例えば、放射性物質、蛍光色素、化学発光物質、酵素、補酵素を用いることが可能である。本発明の抗体を検査薬として調剤するには、合目的な任意の手段を採用して任意の剤型でこれを得ることができる。例えば、精製した抗体についてその抗体価を測定し、適当にＰＢＳ等で希釈した後、０．１％アジ化ナトリウム等を防腐剤として加えることができる。また、例えば、ラテックス等に本発明の抗体を吸着させたものについて抗体価を求め、適当に希釈し、防腐剤を添加して用いることもできる。
【００６２】
また、本発明の検査薬を構成成分として含む、癌を検出するためのキットもまた、本発明に含まれる。かかるキットには、本発明の検査薬の他に、例えば、抗原抗体反応（ＥＬＩＳＡ法、免疫組織化学染色法、フローサイトメトリー等）を実施するための種々の試薬（二次抗体、発色試薬、染色試薬、緩衝液、対照標品等）、反応容器、操作器具、及び／又は説明書を含めることができる。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また、本実施例において、特段の断りがない限り、「ＨＢ−ＥＧＦ」は、配列番号：１（ＮＣＢＩリファレンスシークエンス：ＮＰ＿００１９３６）に記載のアミノ酸配列（１〜２０８番目のアミノ酸）からなる、ヒト由来の膜型ＨＢ−ＥＧＦタンパク質を示す。また、ＨＢ−ＥＧＦがプロテアーゼによって切断（シェディング）され細胞外に放出される部分タンパク質を「分泌型ＨＢ−ＥＧＦ」と称し、当該切断後、細胞膜側に残存している部分タンパク質を「ＨＢ−ＥＧＦ−ＣＴＦ（ＨＢ−ＥＧＦ  Ｃ末断片）」と称する。なお、ＨＢ−ＥＧＦにおいて、ＥＧＦドメインは、Ｎ末端から１０７〜１４４番目のアミノ酸からなる領域であり、ジャックスタメンブレンドメイン（シェディング領域）は、Ｎ末端から１４５〜１６１番目のアミノ酸からなる領域であり、細胞外領域は、Ｎ末端から１〜１６１番目のアミノ酸からなる領域であり、トランスメンブレン（膜貫通ドメイン）は、Ｎ末端から１６２〜１８３番目のアミノ酸からなる領域である。【００６４】
（実施例１）
ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質に対する抗体を以下に示す方法にて作製した。【００６５】
＜ＨＢ−ＥＧＦのｃＤＮＡ取得＞
ヒト膵臓癌細胞ＡｓＰＣ−１（ＡＴＣＣ、カタログ番号：ＣＲＬ−１６８２）から作製したｃＤＮＡライブラリーから、ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質（配列番号：１に記載の１〜２０８番目のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードするＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅した。得られたＰＣＲ産物をＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製、カタログ番号：６９８２０）にクローニングし、塩基配列を確認した。また、このようにして得られたベクターをｈＨＢ−ＥＧＦ−ｐＴ７と名づけた。【００６６】
＜膜型ＨＢ−ＥＧＦを発現する細胞の作製＞
ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質の全長を安定発現する動物細胞を、以下のように作製した。すなわち先ず、ｈＨＢ−ＥＧＦ−ｐＴ７を鋳型として、ＰＣＲ法にて増幅させたＤＮＡの末端をＮｏｔＩとＢａｍＨＩとで切断し、動物細胞用発現ベクターのＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入した。動物細胞用の発現ベクターには、ＣＭＶプロモーターで制御され、ＩＲＥＳ配列により目的遺伝子とＰｕｒｏｍｙｃｉｎ−ＥＧＦＰ融合タンパク質とが同時に発現されるｐＱＣｘｍｈＩＰＧを用いた。ｐＱＣｘｍｈＩＰＧは、本発明者らが「ＢＤ  Ｒｅｔｒｏ−Ｘ  Ｑベクターズ」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製、カタログ番号：６３１５１６）のｐＱＣＸＩＰレトロウィルスベクターを改変したベクターである。作製したベクターは、ＨＢ−ＥＧＦ−ｐＱＣｘｍｈＩＰＧと名付けた。【００６７】
また、リコンビナントＨＢ−ＥＧＦ分子の細胞膜上の発現を確認するために、オーバーラップ・エクステンションＰＣＲ法にてＮ末端から２４番目と２５番目のアミノ酸の間にＨＡタグを付加したＨＡ−ＨＢ−ＥＧＦを調製した。そして、ＨＡ−ＨＢ−ＥＧＦも前記同様に、ｐＱＣｘｍｈＩＰＧに挿入した。作製したベクターは、ＨＡ−ＨＢ−ＥＧＦ−ｐＱＣｘｍｈＩＰＧと名付けた。【００６８】
次に、作製したベクターを、パントロピック  レトロウィルス発現システム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製、カタログ番号：Ｋ１０６３−１）を用いて以下のように２９３Ｔ細胞又はＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入した。【００６９】
先ず、コラーゲンにてコートした１００ｍｍディッシュに、８０〜９０％コンフルエント状態のＧＰ２−２９３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製、カタログ番号：Ｋ１０６３−１）を準備し、リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号：１１６６８−０１９）を用いて、上記の通り構築した発現ベクター（ＨＢ−ＥＧＦ−ｐＱＣｘｍｈＩＰＧ又はＨＡ−ＨＢ−ＥＧＦ−ｐＱＣｘｍｈＩＰＧ）とｐＶＳＶ−Ｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製、カタログ番号：Ｋ１０６３−１）とを１１．２ｕｇずつ共導入した。４８時間後、ウイルス粒子を含む上清を回収し、超遠心（１８，０００ｒｐｍ、１．５時間、４℃）によってウイルス粒子を沈殿させ、その沈殿物を３０ｕＬのＴＮＥ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ＝７．８］、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で懸濁し、レトロウイルスベクター濃縮液を調製した。次いで、このレトロウイルスベクター濃縮液５ｕＬを、８ｕｇ／ｍＬの臭化ヘキサジメトリン（ＳＩＧＭＡ社製、カタログ番号：Ｈ−９２６８）を含んだ１５０ｕＬのＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ社製、カタログ番号；Ｄ５７９６）−１０％ＦＢＳで希釈し、ウイルス粒子含有培地を調製した。【００７０】
次に、９６穴のマイクロプレートに約４０％コンフルエントの状態になるように細胞を準備し、これら細胞の培地を、前記ウイルス粒子含有培地に交換した。そして、これら細胞を、Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製、カタログ番号：Ｐ−８８３３）を含む選択培地にて培養することによって、目的遺伝子が発現している細胞（ＨＢ−ＥＧＦ／ｓｔ２９３Ｔ、ＨＡ−ＨＢ−ＥＧＦ／ｓｔ２９３Ｔ、ＨＢ−ＥＧＦ／ｓｔＣＨＯ−Ｋ１、ＨＡ−ＨＢ−ＥＧＦ／ｓｔＣＨＯ−Ｋ１）を得た。なお、２９３Ｔ細胞の培養には５ｕｇ／ｍＬのＰｕｒｏｍｙｃｉｎを含む培地を、ＣＨＯ−Ｋ１細胞の培養には１０ｕｇ／ｍＬのＰｕｒｏｍｙｃｉｎを含む選択培地を用いた。【００７１】
＜ＨＢ−ＥＧＦの部分長を分泌発現する細胞の作製＞
分泌型ＨＢ−ＥＧＦ（配列番号：１に記載のＮ末端から１番目から１４９番目のアミノ酸配列からなるタンパク質）又はＨＢ−ＥＧＦ細胞外領域（配列番号：１に記載のＮ末端から１番目から１６１番目のアミノ酸配列からなるタンパク質）を発現する動物細胞を、以下のようにして作製した。【００７２】
ｈＨＢ−ＥＧＦ−ｐＴ７を鋳型として、ＰＣＲ法にて増幅させたＨＢ−ＥＧＦ部分長ＤＮＡの末端をＮｏｔＩとＢａｍＨＩとで切断し、動物細胞分泌発現用ベクターｐＱＣｘｍｈＩＰＧのＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入した。分泌型ＨＢ−ＥＧＦ（ＨＢ−ＥＧＦｖ５）をコードするＤＮＡを挿入したベクターをＨＢ−ＥＧＦｖ５−ｐＱＣｘｍｈＩＰＧと名付け、ＨＢ−ＥＧＦ細胞外領域（ＨＢ−ＥＧＦｖ４）をコードするＤＮＡを挿入したベクターをＨＢ−ＥＧＦｖ４−ｐＱＣｘｍｈＩＰＧと名付けた。【００７３】
そして、作製したベクターを上記と同様に、パントロピック  レトロウィルス発現システムを用いて２９３Ｔ細胞に導入し、５ｕｇ／ｍＬのＰｕｒｏｍｙｃｉｎを含む選択培地で培養することによって、目的遺伝子を安定的に発現する細胞株（ＨＢ−ＥＧＦｖ５／ｓｔ２９３Ｔ及びＨＢ−ＥＧＦｖ４／ｓｔ２９３Ｔ）を樹立した。【００７４】
＜ＨＢ−ＥＧＦ部分長精製タンパク質（動物細胞由来リコンビナントタンパク質）の調製＞
前記にて樹立した発現細胞株（ＨＢ−ＥＧＦｖ５／ｓｔ２９３Ｔ及びＨＢ−ＥＧＦｖ４／ｓｔ２９３Ｔ）を、２９３用培地（製品名：ＣＤ２９３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１Ｌにて各々培養した。培養上清を回収し、そこからＴＡＬＯＮ精製キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製、カタログ番号：Ｋ１２５３−１）を用いてリコンビナントタンパク質を精製した。精製したタンパク質（ＨＢ−ＥＧＦｖ５及びＨＢ−ＥＧＦｖ４）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットにて確認した。さらにプロテインアッセイキットＩＩ（ＢｉｏＲａｄ社製、カタログ番号：５００−０００２ＪＡ）を用いてタンパク質濃度を決定した。【００７５】
＜抗原免疫＞
ＨＢ−ＥＧＦｖ４はＰＢＳにて希釈し、同量のコンプリートアジュバント（ＳＩＧＭＡ社製、カタログ番号：Ｆ５８８１）と混合してエマルジョンにし、４〜５週齢のＣ３Ｈマウス（日本エスエルシー社製）等に１匹当たり５〜２０ｕｇ、３〜７日おきに６回免疫した。最終免疫の３日後にマウスからリンパ球細胞を摘出し、マウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｕ１（Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１）と、次に示す方法にて融合させた。【００７６】
＜細胞融合＞
細胞融合は以下の一般的な方法を基本として行った。全ての培地中のＦＢＳは、５６℃で３０分間保温する処理によって非働化したものを使用した。Ｐ３Ｕ１は、ＲＰＭＩ１６４０−１０％ＦＢＳ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ含有）で培養して準備した。摘出したマウスリンパ球細胞とＰ３Ｕ１を１０：１〜２：１の割合で混合し、遠心した。沈殿した細胞に５０％ポリエチレングリコール４０００（Ｍｅｒｃｋ社製、カタログ番号：１．０９７２７．０１００）を徐々に加えながら穏やかに混合後、遠心した。沈殿した融合細胞を、１５％ＦＢＳを含むＨＡＴ培地（ＲＰＭＩ１６４０、ＨＡＴ−ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号：１１０６７−０３０）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）で適宜希釈し、９６穴のマイクロプレートに２００ｕＬ／ウェルで播種した。融合細胞をＣＯ２インキュベータ（５％ＣＯ２、３７℃）中で培養し、コロニーが形成されたところで培養上清をサンプリングし、次に示す通りスクリーニングを行った。【００７７】
＜抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体産生細胞の選択＞
抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体を産生するハイブリドーマは、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって選定した。アッセイにはそれぞれ免疫原として使用したリコンビナントヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質を９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート（ｎｕｎｃ社製）に０．５ｕｇ／ｍＬ、５０ｕＬ／ウェルで分注し、室温２時間又は４℃一晩静置して吸着させたものを用いた。溶液を除去後、１％  ＢＳＡ（ナカライ社製、カタログ番号：０１８６３−３５）−５％スクロース（ＷＡＫＯ社製）−ＰＢＳを１５０ｕＬ／ウェル加え、室温で２時間静置し、残存する活性基をブロックした。静置後、溶液を除去し、一次抗体としてハイブリドーマ培養上清を５０ｕＬ／ウェル分注し、１時間静置した。該プレートを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで洗浄後、二次抗体として１／１００００倍希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＭＢＬ社製、カタログ番号：３３０）を５０ｕＬ／ウェル加えて室温で１時間静置した。該プレートを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで洗浄後、発色液（５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．８ｍＭ  ３．３’．５．５’テトラメチルベンチジン−２ＨＣｌ、１０％Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、０．６２５％ポリエチレングリコール４０００、５ｍＭクエン酸一水和物、５ｍＭ  Ｈ２Ｏ２）を５０ｕＬ／ウェル添加し室温２０分静置して発色させ、１Ｍリン酸を５０ｕＬ／ウェル添加して発色を停止させた後、主波長４５０ｎｍ及び副波長６２０ｎｍにおける吸光度をプレートリーダー（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて測定した。【００７８】
ここで選択したハイブリドーマの培養上清は、さらに、免疫原として使用したリコンビナントタンパク質と同一のタグ配列を持つ他の精製リコンビナントタンパク質に反応しないことを同様のＥＬＩＳＡによって確認した。これにより、産生される抗体はタグ部分やリンカー部分ではなくＨＢ−ＥＧＦを認識するものであることを確認した。【００７９】
そして、産生する抗体がＨＢ−ＥＧＦを特異的に認識することが確認されたハイブリドーマは、１５％ＦＢＳを含むＨＴ培地（ＲＰＭＩ１６４０、ＨＴ−サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号：２１０６０−０１７）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）で拡大培養した後、限界希釈法によって単クローン化した。【００８０】
＜抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体の取得＞
前記にて単クローン化した各ハイブリドーマを無血清培地（ＧＩＢＣＯ社製、カタログ番号：１２３００−０６７）で培養し、その培養上清から、プロテインＡ−セファロースを用いた一般的なアフィニティー精製法により抗体を精製した。これら抗体のヒトＨＢ−ＥＧＦに対する反応性は、前記同様に、免疫原として使用した精製タンパク質を用いた酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって確認し、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体を産生するハイブリドーマを取得した。【００８１】
（実施例２）
＜取得抗体の細胞表面ＨＢ−ＥＧＦに対する反応性＞
実施例１にて取得した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体のうち、細胞表面ＨＢ−ＥＧＦに強く反応するものを、フローサイトメトリーを用いた一般的な方法によって選定した。同数のＨＢ−ＥＧＦ／ｓｔ２９３Ｔ（５×１０＾４個）又は２９３Ｔ（５×１０＾４個）に対し、同濃度の各取得抗体（５ｕｇ／ｍＬ）と同濃度の二次抗体（ベックマンコールター社製、カタログ番号：ＩＭ０８５５の抗体を１／２００に希釈して使用）とを反応させ、フローサイトメトリーにおける平均蛍光強度を解析した。なお、このフローサイトメトリーにおいて、陰性対照としてマウスＩｇＧ１（アイソタイプコントロール、ＭＢＬ社製、カタログ番号：Ｍ０７５−３）をコントロール抗体として用い、ＨＢ−ＥＧＦ／ｓｔ２９３Ｔ又は２９３Ｔと反応しないことを確認した。得られた結果を図１に示す。【００８２】
図１に示す通り、取得した抗体のうち、３５−１抗体及び２９２抗体等は細胞表面上のＨＢ−ＥＧＦに強く反応する抗体であることが明らかになった。【００８３】
（実施例３）
＜取得抗体のエピトープ解析＞
以下に示す方法にて、アミノ酸点変異型ＨＢ−ＥＧＦに対する抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体の反応性をフローサイトメトリーにて解析し、取得抗体が結合するエピトープの同定を試みた。【００８４】
先ず、フローサイトメトリーに供するアミノ酸点変異型ＨＢ−ＥＧＦを発現する細胞を調製した。すなわち、ＨＢ−ＥＧＦ−ｐＱＣｘｍｈＩＰＧを鋳型とし、部位特異的変異導入法により、表１に示す変異型ＨＢ−ＥＧＦをコードする遺伝子を作製した。得られた変異型ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子を、動物細胞用発現ベクターｐＱＣｘｍｈＩＰＧに挿入し、各変異型ＨＢ−ＥＧＦをコードするベクターを調製した。そして、これらベクターを各々２９３Ｔ細胞に遺伝子導入し、一過性に発現をさせることにより、アミノ酸点変異型ＨＢ−ＥＧＦを発現する細胞を調製した。【００８５】
【表１】
0005838427.tif 000002
【００８６】
また、フローサイトメトリーに陽性対照として供するため、ＨＢ−ＥＧＦ−ｐＱＣｘｍｈＩＰＧを２９３Ｔ細胞に遺伝子導入し、一過性に発現をさせることにより、野生型ＨＢ−ＥＧＦを発現する細胞を調製した。【００８７】
次に、野生型ＨＢ−ＥＧＦ又は各変異型ＨＢ−ＥＧＦを発現した細胞に対し、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体（５ｕｇ／ｍＬ）と二次抗体（ベックマンコールター社製、カタログ番号：ＩＭ０８５５の抗体を１／２００に希釈して使用））とを反応させ、フローサイトメトリーの平均蛍光強度を解析した。また、各変異体の発現量の違いを補正するため、アミノ酸点変異により結合能が変化しないヤギ由来の抗ヒトＨＢ−ＥＧＦポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ社製、カタログ番号：ＢＡＦ２５９の抗体を１ｕｇ／ｍｌにて使用）、ＳＡ−ＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号：Ｓ８６６の抗体を１／２００に希釈して使用）を反応させ、前記抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体同様に、フローサイトメトリーの平均蛍光強度を解析した。そして、得られた平均蛍光強度（抗体の反応性）に基づき、各変異型ＨＢ−ＥＧＦに対する各抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体の結合強度（相対値）を以下の式（式＊）にて算出した。得られた結果を図２に示す。
式＊：（変異型ＨＢ−ＥＧＦに対する抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体の反応性／変異型ＨＢ−ＥＧＦに対するヤギポリクローナル抗体の反応性）／（野生型ＨＢ−ＥＧＦに対する抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体の反応性／野生型ＨＢ−ＥＧＦに対するヤギポリクローナル抗体反応性）。【００８８】
また、前述の変異型ＨＢ−ＥＧＦに対する抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体の結合強度（相対値）が０．４以下である場合に、当該抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体は、当該変異体において置換される前のアミノ酸に結合する抗体であると判定した。【００８９】
図２に示した結果から明らかなように、３５−１抗体及び２９２抗体は、Ｇ１４０Ａ、Ｅ１４１Ｈ、Ｒ１４２Ａには殆ど反応せず、加えてＦ１１５Ａ、Ｉ１１７Ａへの反応性は著しく低いものであった。また、今回取得した抗体の一つ、１−１抗体は、Ｆ１１５Ａ、Ｒ１４２Ａには殆ど反応せず、加えてＧ１４０Ａ、Ｅ１４１Ｈへの反応性は著しく低いものであった。【００９０】
従って、取得した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体のうち、３５−１抗体及び２９２抗体は、ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質の１１５番目のフェニルアラニン、１１７番目のイソロイシン、１４０番目のグリシン、１４１番目のグルタミン酸及び１４２番目のアルギニンを認識していることが明らかとなった。また、１−１抗体は、１１５番目のフェニルアラニン、１４０番目のグリシン、１４１番目のグルタミン酸及び１４２番目のアルギニンを認識するが、前記２抗体とは異なり１１７番目のイソロイシンを認識しないことが明らかになった。【００９１】
（実施例４）
＜取得抗体のＨＢ−ＥＧＦ切断阻害活性＞
取得した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体によって、膜型ＨＢ−ＥＧＦの切断を阻害できるかどうかを、以下に示すフローサイトメトリーにて評価した。【００９２】
先ず、ＨＡ−ＨＢ−ＥＧＦ／ｓｔＣＨＯ−Ｋ１を、４８穴のマイクロプレートに１ウェルあたり１０００００細胞播種し、３７℃で６時間培養した。細胞がプレート底面に接着したことを確認したのち、血清を含まないＦ１２  Ｈａｍ’ｓ培地に交換して、さらに１５時間培養した。【００９３】
次に、３５−１抗体又はコントロール抗体（ＭＢＬ社製、カタログ番号：Ｍ０７５−３）を添加した培地に交換し、３７℃で３０分間インキュベートした。この際の抗体濃度は２５、５、１、０．２、０．０４ｕｇ／ｍＬの５段階とし、１ウェルあたりの培地量は２００ｕＬとした。続いて、５０００ｎＭに調整したＰＭＡ添加培地を１ウェルあたり２ｕＬ添加し混合することによって、最終濃度５００ｎＭとなるようにＰＭＡを添加した。３７℃で６０分間培養した後、ＰＢＳ−０．０５％  ＥＤＴＡで剥離し、細胞を回収した。なお、培地に添加したＰＭＡ（ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート）は、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）を活性化することにより、ＨＢ−ＥＧＦにシェディングを誘導することが明らかになっている。【００９４】
一連の処理を行ったのちに、これら細胞の表面に残存しているＨＢ−ＥＧＦを、ＨＢ−ＥＧＦのＮ末端に付加されているＨＡタグを認識する抗体を用いたフローサイトメトリーで検出することによって解析した。一次抗体として２ｕｇ／ｍＬに希釈したビオチン化抗ＨＡタグ抗体（ＭＢＬ社製、カタログ番号：Ｍ１３２−３）、二次抗体として１／１００希釈したＰＥ標識ストレプトアビジン（インビトロジェン社製、カタログ番号：Ｓ８６６）を使用し、常法に従って行った。得られた結果を図３に示す。なお、図３において、縦軸はフローサイトメトリーでの平均蛍光強度を示す。【００９５】
図３に示した結果から明らかなように、３５−１抗体及び２９２抗体のいずれにおいても、細胞表面に残存しているＨＢ−ＥＧＦの量は、抗体の添加濃度依存的に増大していった。【００９６】
次に、取得した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体によって、膜型ＨＢ−ＥＧＦの切断を阻害できるかどうかを、以下に示すウェスタンブロットにて評価した。【００９７】
先ず、ＨＡ−ＨＢ−ＥＧＦ／ｓｔＣＨＯ−Ｋ１を、４８穴のマイクロプレートに１ウェルあたり１０００００細胞播種し、３７℃で６時間培養した。細胞がプレート底面に接着したことを確認したのち、血清を含まないＦ１２  Ｈａｍ’ｓ培地に交換して、さらに１５時間培養した。【００９８】
次に、３５−１抗体又はコントロール抗体（ＭＢＬ社製、カタログ番号：Ｍ０７５−３）を添加した培地に交換し、３７℃で３０分間インキュベートした。この際の抗体濃度は１００、１０、１ｕｇ／ｍＬの段階とし、１ウェルあたりの培地量は２００ｕＬとした。【００９９】
続いて、５０００ｎＭに調整したＰＭＡ添加培地を１ウェルあたり２ｕＬ添加し、混合することによって、最終濃度５００ｎＭとなるようにＰＭＡを添加した。また、ＰＭＡによる切断が誘導されていない条件下のＨＢ−ＥＧＦ−ＣＴＦの量を測定するため、培地のみ添加した細胞を用意した。さらに、非阻害時のＨＢ−ＥＧＦ−ＣＴＦの生成量を測定するため、抗体を添加せずＰＭＡのみを添加した細胞を用意した。そして、これら細胞を３７℃で６０分間培養した後、１ウェルあたり１００ｕＬのＳＤＳサンプルバッファー（６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ＝６．８）、５％  グリセロール、２％  ＳＤＳ、０．００３％  ＢＰＢ、５％  ２−メルカプトエタノール）で細胞を回収した。【０１００】
一連の処理を行った後に、これら細胞内のＨＢ−ＥＧＦ−ＣＴＦを、ＨＢ−ＥＧＦのＣ末端に付加されているｍｙｃタグを認識する抗体を用いたウェスタンブロットで検出することによって解析した。回収した細胞サンプルを加熱処理した後１０ｕＬずつをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、一次抗体として５０００倍希釈した抗ｍｙｃタグ抗体（ＭＢＬ社製、カタログ番号：Ｍ０４７−３）、二次抗体として５０００倍希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＭＢＬ社製、カタログ番号：３３０）を使用し、常法に従って行った。得られた結果を図４に示す。【０１０１】
また、インキュベーションの条件を、ＨＡ−ＨＢ−ＥＧＦ／ｓｔＣＨＯ−Ｋ１と、培地における添加濃度が２５、５、１、０．２又は０．０４ｕｇ／ｍＬである３５−１抗体、２９２抗体又は前記コントロール抗体とのインキュベーションに替え、前記同様に、これら抗体によって、膜型ＨＢ−ＥＧＦの切断を阻害できるかどうかをウェスタンブロットにて評価した。得られた結果を図５に示す。【０１０２】
図４及び５に示した結果から明らかなように、３５−１抗体及び２９２抗体のいずれにおいても、抗体の添加により、切断後細胞膜側に残存するＨＢ−ＥＧＦ−ＣＴＦの生成量は低減された。また、図には示さないが、１−１抗体においても、前記２抗体同様に、切断後細胞膜側に残存するＨＢ−ＥＧＦ−ＣＴＦの生成量は低減された。【０１０３】
以上の結果より、３５−１抗体、２９２抗体及び１−１抗体は、膜型ＨＢ−ＥＧＦに対する切断阻害活性を示すことが明らかになった。【０１０４】
（実施例５）
＜取得抗体のＨＢ−ＥＧＦ中和活性＞
ヒト肺がんの株化培養細胞であるＡ４３１（ＡＴＣＣ、カタログ番号：ＣＲＬ−１５５５）を用いて、ＨＢ−ＥＧＦで刺激した際に誘起されるＥＧＦＲのリン酸化を、取得した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体が阻害できるか、すなわち抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体にＨＢ−ＥＧＦを中和する活性の有無を、以下に示すウエスタンブロット法によって解析した。【０１０５】
先ず、ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ含有）にて培養したＡ４３１を、１２穴プレートに１ウェルあたり５００００細胞播種し、３７℃で６時間培養した。細胞がプレート底面に接着したことを確認したのち、血清を含まないＤＭＥＭ培地に交換して、さらに４８時間培養した。【０１０６】
次に、分泌型ＨＢ−ＥＧＦのリコンビナントタンパク質（ＨＢ−ＥＧＦｖ５）と、取得した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体（３５−１抗体、２９２抗体又は１−１抗体）とを、血清を含まないＤＭＥＭ培地２００ｕＬ中で混和し、３７℃で３０分間インキュベートした後、前記細胞に添加した。この際、リコンビナントタンパク質の濃度は５０ｎｇ／ｍＬであり、抗体濃度は１２５、２５、５、１、０．２及び０ｕｇ／ｍＬの抗体濃度は６段階とした。また、３５−１抗体については低濃度（１０、１、０．１、０．０１、０．００１及び０ｕｇ／ｍＬの６段階）でも試行した。また陽性対照として、ＨＢ−ＥＧＦのリコンビナントタンパク質（ＨＢ−ＥＧＦｖ５）のみを、陰性対照としてＨＢ−ＥＧＦを含まないＤＭＥＭ培地のみを添加した。これを３７℃で１５分間培養した後、１ウェルあたり１５０ｕＬのＳＤＳサンプルバッファー（６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ＝６．８）、５％グリセロール、２％  ＳＤＳ、０．００３％  ＢＰＢ、５％  ２−メルカプトエタノール）で細胞を回収した。【０１０７】
そして、回収した細胞サンプルを加熱処理した後、１５ｕＬずつをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、１／１０００希釈した抗リン酸化ＥＧＦＲウサギ抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ社製、カタログ番号：＃３７７７）又はＥＧＦＲウサギ抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ社製、カタログ番号：＃４２６７）と１／５０００希釈したＨＲＰ標識抗ウサギ抗体（ＭＢＬ社製、カタログ番号：４５８）を用いてウェスタンブロットを施行した。得られた結果を図６〜８に示す。【０１０８】
図６及び７に示した結果から明らかな通り、３５−１抗体及び２９２抗体はいずれもＨＢ−ＥＧＦによるＥＧＦＲのリン酸化を濃度依存的に阻害し、３５−１抗体及び２９２抗体はいずれもＨＢ−ＥＧＦ中和活性を有することが明らかになった。一方、図８に示した結果から明らかな通り、１−１抗体はＨＢ−ＥＧＦによるＥＧＦＲのリン酸化の阻害は認められず、ＨＢ−ＥＧＦ中和活性を有していないことが明らかになった。【０１０９】
前述の通り、３５−１抗体及び２９２抗体と、１−１抗体とは、ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質の１１７番目のイソロイシンがエピトープに含まれるか否かにおいて相違する。また、非特許文献２１には、ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質において、１３３番目のイソロイシン及び１３５番目のヒスチジンをエピトープとする抗体（７Ｅ１０、３Ｄ９）並びに１４１番目のグルタミン酸をエピトープとする抗体（３Ｈ４等）のいずれも切断阻害活性を有するものの、中和活性を有していないことが示されている。【０１１０】
従って、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体が中和活性を発揮するためには、ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質の１１７番目のイソロイシンに結合することが必要であることが明らかになった。【０１１１】
（実施例６）
＜進行癌モデルでの抗腫瘍活性評価＞
取得した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体の抗腫瘍活性を判定するため、ゼノグラフトマウスを用いて評価を行った。すなわち先ず、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ、カタログ番号：ＨＴＢ−２６）をＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ含有）で培養し、ＰＢＳ−０．０５％  ＥＤＴＡで剥離した。ＰＢＳにて洗浄後、ＲＰＭＩ１６４０培地で５×１０７細胞／ｍＬとなるように縣濁した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ社製、カタログ番号：３５４２３０）を等量加えて縣濁したのち、６週齢メスのヌードマウス（日本クレア社製、ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ−ｎｕ／ｎｕ）の右腹側部に２００ｕＬずつ皮下移植した。腫瘍体積が２００ｍｍ３前後になった時点で、各群の平均腫瘍体積が同等となるようにマウスを選抜した。同日から、７５０ｕｇ／ｍｌ（高濃度）又は１５０ｕｇ／ｍｌ（低濃度）にＰＢＳで希釈した抗体溶液を、コントロール群はＰＢＳを、２００ｕＬずつ腹空投与した（各群４匹）。なお、ゼノグラフトマウスに投与した抗体は、後述のキメラ化した３５−１抗体である。また、投与は一週間に２回、計６回行った。抗体投与時点からノギスで腫瘍径を測定し、腫瘍体積を以下の式により算出した。
式：腫瘍体積（ｍｍ３）＝長径×短径２×０．５
得られた結果を図９に示す。【０１１２】
図９に示した結果から明らかなように、３５−１抗体はヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の増殖を阻害した。すなわち、３５−１抗体は進行癌モデルにおいて抗腫瘍活性を有することが明らかとなった。【０１１３】
（実施例７）
＜抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）の評価＞
取得した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体のＡＤＣＣ活性を評価した。すなわち先ず、標的細胞としてヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を選択した。そして、該細胞をＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ含有）で培養し、ＰＢＳ−０．０５％  ＥＤＴＡで剥離したのち、ＰＢＳで洗浄後、ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ含有）にて至適濃度に調製した。エフェクター細胞の末梢血単核球（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ：ＰＢＭＣ）は、健常人末梢血から以下の方法で調製した。ベノジェクトＩＩ真空採血管（ＴＥＲＵＭＯ社）を用いて健常人末梢血を採血し、同量の生理食塩水を加えて希釈した。希釈した末梢血をＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（ｓｉｇｍａ社製、カタログ番号：１０７７１−５００ＭＬ）に重層し、８００ｇ、２０分間遠心分離し末梢血単核球を回収した後、ＰＢＳにて洗浄後、ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ含有）にて至適濃度に調製した。【０１１４】
ＡＤＣＣ活性の評価は、９６穴Ｕ底プレート（住友ベークライト社製、カタログ番号：ＭＳ−３０９ＵＲ）に、エフェクター細胞２５ｕＬと標的細胞５０ｕＬとを、標的細胞１に対してエフェクター細胞２０になるよう分注した後、ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ含有）で各濃度に希釈した抗体２５ｕＬを添加し、５％ＣＯ２、３７℃にて２０時間インキュベートした。なお、細胞に添加した抗体は、後述のキメラ化した３５−１抗体である。【０１１５】
抗体とのインキュベーション後、２００ｇにて１分間遠心分離し、上清５０ｕＬを９６穴プレートに回収した。そして、ＣｙｔｏＴｏｘ９６非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、コード番号：Ｇ１７８０）にて、上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を測定した。また、エフェクター細胞、標的細胞、抗体を添加した実験区におけるＬＤＨ値の他に、エフェクター細胞のＬＤＨ値、標的細胞のＬＤＨ値、さらに、標的細胞を、ＣｙｔｏＴｏｘ９６非放射性細胞毒性アッセイ付属のＬｙｓｉｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（９％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）にて可溶化した際の、最大細胞障害時のＬＤＨ値も同様に測定した。ＡＤＣＣ活性は次式により求めた。
式：細胞障害活性％＝（実験区におけるＬＤＨ値−エフェクター細胞のＬＤＨ値−標的細胞のＬＤＨ値）／（最大細胞障害時のＬＤＨ値−標的細胞のＬＤＨ値）×１００％
得られた結果を図１０に示す。【０１１６】
図１０に示した結果から明らかなように、３５−１抗体は抗体濃度依存的に細胞障害活性を示した。従って、３５−１抗体は、ＨＢ−ＥＧＦを発現している癌に対し、中和活性のみではなくＡＤＣＣによる抗腫瘍効果を示すことが明らかになった。【０１１７】
（実施例８）
＜３５−１抗体及び２９２抗体の重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の単離、並びにＣＤＲの同定＞
各ハイブリドーマを培養し、一般的な方法によりｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。次に、ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号：Ｌ１５０２−０１）を用いた５’−ＲＡＣＥ法により、ｃＤＮＡを取得した。このｃＤＮＡを鋳型とし、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ  ５’プライマー（５’−ＣＧＡＣＴＧＧＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＡ−３’、配列番号：２０）、ＣＨ１（マウスＩｇＧ１定常領域１）、３’プライマー（５’−ＡＡＴＴＴＴＣＴＴＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧ−３’、配列番号：２１）を用いて、プラチナ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ  ハイフィデリティ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号：１１３０４−０２９）でＰＣＲ（［９４℃  ３０秒、５７℃  ３０秒、７２℃  ５０秒］を３５サイクル）を実施し、抗体重鎖可変領域の遺伝子（ｃＤＮＡ）を増幅した。一方、抗体軽鎖についても同様にＧｅｎｅＲａｃｅｒ  ５’プライマーとＣｋ（κ定常領域）３’プライマー（５’−ＣＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴ−３’、配列番号：２２）を用いてＰＣＲを実施して、遺伝子（ｃＤＮＡ）を増幅した。増幅した遺伝子断片をそれぞれｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製、カタログ番号：６９８２０）にクローニングし、オートシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて配列を解析した。そして、得られた塩基配列に基づき、重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、並びに各可変領域におけるＣＤＲの配列を決定した。その結果は以下の通りである。
＜３５−１抗体の重鎖可変領域＞
配列番号：９
ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＲＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＳＧＹＹＭＨＷＶＫＱＳＰＥＫＳＬＥＷＩＧＥＩＮＰＳＴＧＧＩＴＹＮＱＫＦＫＡＫＡＴＬＴＶＤＲＳＳＳＴＡＹＭＱＬＫＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＴＲＩＴＷＡＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
＜３５−１抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１＞
配列番号：６
ＧＹＹＭＨ
＜３５−１抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２＞
配列番号：７
ＥＩＮＰＳＴＧＧＩＴＹＮＱＫＦＫＡ
配列番号：８
＜３５−１抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ３＞
ＩＴＷＡＦＡＹ
＜３５−１抗体の軽鎖可変領域＞
配列番号：５
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＴＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＲＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
＜３５−１抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ１＞
配列番号：２
ＳＡＳＳＳＶＴＹＭＹ
＜３５−１抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２＞
配列番号：３
ＤＴＳＮＬＡＳ
＜３５−１抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ３＞
配列番号：４
ＱＱＷＳＳＹＰＰＴ
＜２９２抗体の重鎖可変領域＞
配列番号：１７
ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＹＭＨＷＶＫＱＳＰＥＫＳＬＥＷＩＧＥＩＮＰＳＴＧＧＴＴＹＮＱＫＦＫＡＫＡＴＬＴＬＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＫＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＫＳＰＹＷＤＧＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
＜２９２抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１＞
配列番号：１４
ＧＹＹＭＨ
＜２９２抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２＞
配列番号：１５
ＥＩＮＰＳＴＧＧＴＴＹＮＱＫＦＫＡ
＜２９２抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ３＞
配列番号：１６
ＳＰＹＷＤＧＡＹ
＜２９２抗体の軽鎖可変領域＞
配列番号：１３
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＩＳＹＭＹＷＹＱＱＲＰＧＳＳＰＲＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＨＳＬＴＩＳＲＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＳＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
＜２９２抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ１＞
配列番号：１０
ＳＡＳＳＳＩＳＹＭＹ
＜２９２抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２＞
配列番号：１１
ＤＴＳＮＬＡＳ
＜２９２抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ３＞
配列番号：１２
ＱＱＷＳＳＹＰＳＴ【０１１８】
（実施例９）
＜３５−１キメラ化抗体の作製＞
決定した遺伝子配列をもとに以下のＰＣＲ増幅用プライマーを設計し、ＰＣＲによって抗体可変領域を増幅した。この際、分泌シグナル配列はロンザ社推奨の配列に変換し、また増幅断片の末端に制限酵素認識配列を付加した（重鎖可変領域にはＨｉｎｄＩＩＩ認識配列及びＸｈｏＩ認識配列を付加、軽鎖可変領域にはＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｓｉＷＩ認識配列を付加）。【０１１９】
得られたＰＣＲ産物を上記の制限酵素で切断し、常法によって、ヒトＩｇＧ１の定常領域を組み込んだロンザ社のヒトＩｇＧ１抗体産生用ベクターに挿入した。これらのベクターを使用して、ロンザ社推奨プロトコルに基づいてキメラ抗体産生細胞株を樹立し、それらの培養上清からＰｒｏｔｅｉｎＡを用いてキメラ化抗体（３５−１キメラ化抗体）を精製した。【０１２０】
（実施例１０）
＜３５−１ヒト型化抗体の作製＞
ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｉｎｇ法により、ヒト型化抗体を作製した。具体的には重鎖可変領域のＣＤＲ配列を除いたフレームワーク領域と、軽鎖可変領域のＣＤＲ配列を除いたフレームワーク領域に対しそれぞれホモロジー検索を行い、３５−１抗体と７３．５％相同性を持つ重鎖可変領域ヒト抗体配列と８６．３％相同性を持つ軽鎖可変領域ヒト抗体配列を選出した。このヒト抗体配列を鋳型配列とし、ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｉｎｇ法に従い３５−１のＣＤＲ配列に変換した可変領域の配列を決定した。常法によって、合成した可変領域配列をヒトＩｇＧ１の定常領域を組み込んだロンザ社のヒトＩｇＧ１抗体産生用ベクターに挿入し、以下に示す配列からなる重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有する３５−１ヒト型化抗体を作製した。
＜３５−１ヒト型化抗体重鎖可変領域＞
配列番号：１９
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＳＧＹＹＭＨＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＥＩＮＰＳＴＧＧＩＴＹＮＱＫＦＫＡＫＡＴＬＴＶＤＲＳＴＳＴＡＹＭＥＬＫＳＬＴＳＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＩＴＷＡＦＡＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
＜３５−１ヒト型化抗体軽鎖可変領域＞
配列番号：１８
ＱＩＶＬＴＱＳＰＴＴＭＡＡＳＰＧＥＫＩＴＩＴＣＳＡＳＳＳＶＴＹＭＹＷＹＱＱＲＰＧＦＳＰＫＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＧＴＭＥＡＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ【０１２１】
（実施例１１）
＜３５−１キメラ化抗体又は３５−１ヒト型化抗体の抗原に対する反応性＞
３５−１キメラ化抗体又は３５−１ヒト型化抗体のＨＢ−ＥＧＦに対する反応性を、フローサイトメトリーによって評価した。【０１２２】
フローサイトメトリーは、１次抗体として３５−１キメラ化抗体又は３５−１ヒト型化抗体を発現するヒトＩｇＧ１抗体産生用ベクターを導入した２９３Ｔ細胞の培養上清を用いて、前述と同様の方法で行った。培養上清中の抗体濃度は、サンドイッチＥＬＩＳＡ法にて算出した。サンドイッチＥＬＩＳＡ法は、ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＭＢＬ社製、コード番号：３０３Ｇ）を５ｕｇ／ｍＬ、５０ｕＬ／ウェルで固相した９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートに、２９３Ｔ細胞の培養上清を５０ｕＬ／ウェルで１時間反応させ、該プレートを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで洗浄後、検出抗体として１／１００００倍希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＭＢＬ社製、コード番号：３３０）を５０ｕＬ／ウェル加えて室温で１時間静置した。該プレートを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで洗浄後、発色液を５０ｕＬ／ウェル添加し室温２０分静置して発色させ、１Ｍリン酸を５０ｕＬ／ウェル添加して発色を停止させたのち、４５０ｎｍの吸光度をプレートリーダーにて測定した。培養上清中の抗体濃度は、濃度既知の抗体溶液を段階希釈して測定した値から標準曲線を作成し、培養上清の測定値から抗体濃度を算出した。得られた結果を図１１に示す。図１１に示す通り、３５−１キメラ化抗体及び３５−１ヒト型化抗体はＨＢ−ＥＧＦに濃度依存的に結合し、各々抗原に対する反応性が維持されていることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１２３】
以上説明したように、本発明によれば、ヒトＨＢ−ＥＧＦに結合することにより、該ヒトＨＢ−ＥＧＦにおける切断を阻害し、かつ該ヒトＨＢ−ＥＧＦとＥＧＦ受容体との結合を阻害する抗体を提供することが可能となる。また、本発明の抗体は、腫瘍の増殖を抑制する活性においても優れるため、癌を治療又は予防する点においても有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１２４】
配列番号：２
＜２２３＞  ３５−１抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ１
配列番号：３
＜２２３＞  ３５−１抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２
配列番号：４
＜２２３＞  ３５−１抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ３
配列番号：５
＜２２３＞  ３５−１抗体の軽鎖可変領域
配列番号：６
＜２２３＞  ３５−１抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１
配列番号：７
＜２２３＞  ３５−１抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２
配列番号：８
＜２２３＞  ３５−１抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ３
配列番号：９
＜２２３＞  ３５−１抗体の重鎖可変領域
配列番号：１０
＜２２３＞  ２９２抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ１
配列番号：１１
＜２２３＞  ２９２抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２
配列番号：１２
＜２２３＞  ２９２抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ３
配列番号：１３
＜２２３＞  ２９２抗体の軽鎖可変領域
配列番号：１４
＜２２３＞  ２９２抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１
配列番号：１５
＜２２３＞  ２９２抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２
配列番号：１６
＜２２３＞  ２９２抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ３
配列番号：１７
＜２２３＞  ２９２抗体の重鎖可変領域
配列番号：１８
＜２２３＞  ３５−１ヒト型化抗体の軽鎖可変領域
配列番号：１９
＜２２３＞  ３５−１ヒト型化抗体の重鎖可変領域
配列番号：２０〜２２
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列
【図２】
0005838427.tif 000003
【図３】
0005838427.tif 000004
【図９】
0005838427.tif 000005
【図１０】
0005838427.tif 000006
【図１１】
0005838427.tif 000007
【図１】
0005838427.tif 000008
【図４】
0005838427.tif 000009
【図５】
0005838427.tif 000010
【図６】
0005838427.tif 000011
【図７】
0005838427.tif 000012
【図８】
0005838427.tif 000013
【配列表】
0005838427000001.app