(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式HOQ-(CnH2n)-S(R1)(R2)-(CmH2m)-CH2-A
[式中、
n及びmは、0〜20の整数であり、
R1及びR2は互いに独立して、孤立電子対、=Oの酸素部分、=N-Rx(式中、Rxは直鎖若しくは分枝C1〜C6アルキル、直鎖若しくは分枝C1〜C6アルケニル(アルキル又はアルケニル基は任意選択で、1個又は複数のハロゲン基、ヒドロキシル基、アミノ若しくは置換アミノ基、カルボン酸基、ニトロ基又はシアノ基で置換されていてもよい)、又は芳香族基(任意選択で、アルキル及びアルケニル基について列挙された置換基、又はハロゲン基、ヒドロキシル基、アミノ基若しくは置換アミノ基(置換基は、1個又は2個のC1〜C3アルキル基である)、カルボン酸基、ニトロ基又はシアノ基のうち1個又は複数で置換されていてもよい)である)の窒素部分から選択され、
Aは重合性部分-PLRvC=CRuRw[式中、PLは、連結基であり、Ru、Rv及びRwは独立して、水素原子又はC1〜C3アルキル基を表す]であり、
Qは、直接結合又はC=O、C=NH若しくはC=NRp基(式中、Rp基は、C1〜C3アルキル基である)である]
を有する、薬物送達系におけるリンカーの使用であって、
前記リンカーは、その-OH、-COOH又は-NH基を介して生理活性分子と結合される、使用。
【請求項２】
生理活性分子が、グルココルチコステロイドである、請求項1に記載の使用。
【請求項３】
生理活性分子が、化学療法薬である、請求項1に記載の使用。
【請求項４】
リンカーが生分解性リンカーである、請求項1から3のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
薬物送達系が、薬物分子、ペプチド、タンパク質、造影剤、遺伝子構築物又はそれらの組み合わせである生理活性分子を放出する、請求項1から4のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
薬物送達系が、生理活性分子としてデキサメタゾン又はパクリタキセルを放出する、請求項1から5のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
活性成分を放出し得るポリマーマトリックスを含む制御放出系であって、活性成分が、請求項1で規定されたリンカーを介してポリマーマトリックスのポリマー分子に共有結合によって連結されている、制御放出系。
【請求項８】
リンカーとのコンジュゲーションを可能にする官能性部分を有する生理活性化合物を用意する工程と、リンカーの-OH含有部分又は-NH含有部分と生理活性化合物の前記官能性部分とのコンジュゲーションを開始させ、それによってプロドラッグを形成する工程と、前記プロドラッグをポリマーマトリックスに取り込み、コンジュゲートさせる工程とを含む、請求項7の制御放出系の調製方法。
【請求項９】
前記官能性部分が、第一級若しくは第二級アルコール又はCOOHである、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記リンカーの-OH含有部分又は-NH含有部分が、カルボン酸部分である、請求項8又は9に記載の方法。
【請求項１１】
グルココルチコステロイド又は化学療法薬に結合された、請求項1に記載のリンカー。
【請求項１２】
デキサメタゾン又はパクリタキセルに結合された、請求項11に記載のリンカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物送達系(DDS)、例えば、高分子ミセル又はヒドロゲルをベースとするDDSへの、構成単位(building block)及び/又は生理活性化合物の一時的に安定なコンジュゲーション(conjugation)を確実にする、特定の種類の生分解性リンカーに関する。さらに、本発明は、前記リンカーを含む化合物に関し、このような化合物は好ましくはプロドラッグである。さらに、本発明は、前記リンカー、特に前記生分解性リンカーの調製方法及び薬物送達系におけるそれらの使用を対象とする。さらに、本発明は、活性成分を放出し得るポリマーマトリックスを含む制御放出系であって、活性成分が前記リンカーを介してポリマーマトリックスのポリマー分子と共有結合によって連結されている制御放出系、及びこのような制御放出系の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
患者への生理活性化合物の送達は、低い溶解度、速いクリアランス、高毒性の発生又はそれらの組み合わせによって、しばしば妨げられる。これらの問題は、好適な薬物送達系中に生理活性化合物を取り込むことによって軽減できる。
【０００３】
高分子ミセル及びヒドロゲル系などのDDSは、薬物又は他の好適な生理活性化合物の標的化送達の有望な候補と考えられている。例えば、生分解性で温度感受性のポリヒドロキシプロピル-又はポリヒドロキシエチル-メタクリルアミドラクテートをベースとする高分子ミセルは、多種多様な疎水性の治療用化合物を封入し得る。このような系は、例えば、WO01/09198及びWO2005/087825に記載されている。特に、WO2005/087825は、例えば、疎水性修飾PEG-ポリメタクリルアミドブロックコポリマーをベースとするミセルについて詳述している。WO01/09198及びWO2005/087825のいずれに記載されたポリマーも、独特の組み合わせの温度感受性及び生分解性を示し、それらは、前記ポリマーから調製される送達系に容易な薬物負荷特性及び制御放出性をそれぞれ与える。
【０００４】
これら及び種々の他の、好ましくはナノサイズの粒子が、疾患の部位を選択的に標的とする薬物担体系の探索において、現在評価されている。この標的化送達は、治療有効性を改善すると同時に、封入化合物の毒性プロファイルを低減させることを目標とする。
【０００５】
特定の理論に束縛されることを望まないが、本発明の種類の薬物担体系は、血流中で長時間循環する系を形成し且つ系中に存在する活性成分を制御された方法で放出することが必要である、又は少なくとも望ましいと考えられる。即ち、1回の適用後に、遊離の活性成分を使用する際に達成できるよりも長時間にわたって活性成分の治療レベルをもたらすデポー系が必要とされている。このような系については、例えば、活性成分の種類、放出速度及び特異的な適応(医学的適応)に依存して放出が調整可能である際に、それは重要な利点である。
【０００６】
疾患又は障害が小胞の不整と関連するか又はそれを伴う場合には、長時間の循環は、薬物送達系の吸収増大及び薬物送達系からの活性成分の放出をもたらす可能性がある。この観点で、炎症及び腫瘍成長中における漏出性血管及び機能障害性リンパ排出により、例えば、静脈内投与後のナノ粒子の接近のためのゲートウェイが生じることが認められる。このいわゆる浸透保持増強(EPR)効果(enhanced permeation and retention effect)により、蓄積されたナノ担体が患部細胞の近くで薬物を放出する。このストラテジーの重要な態様は、血管外漏出の統計的確率を増加させるナノ担体の長い循環半減期である。
【０００７】
所望の長時間循環特性は、例えば、宿主免疫系による除去を妨げるナノ粒子の高密度親水性コーティングによって達成できる。この点で、ポリエチレングリコール(PEG)コーティングで被覆されているリポソームは、約8〜12時間の循環半減期を示し、注射用量の5%〜10%までが患部に蓄積するので、ゴールデンスタンダードと考えられる。
【０００８】
標的化領域における薬物濃度の上昇は、担体が標的部位に到達するまで封入薬物分子が結合したままである場合にのみ達成できることは明白である。薬物担体系の前記探索において、評価した系は、長い循環時間、及び送達系への活性成分の共有結合カップリングによる、例えば腫瘍組織への集積が改善され得ることがわかった。
【０００９】
特に、Rijckenらは、Biomaterials 2007年、28、5581〜5593頁の「Hydrolysable core-crosslinked thermosensitive polymeric micelles: synthesis, characterisation and in vivo studies」という表題の論文中で、ミセルコア中の疎水性修飾PEG-ポリメタクリルアミドブロックコポリマーの架橋、即ち、共有結合的コンジュゲーションが、マウスへの静脈内投与後に長時間の血液循環を実現することが立証されたことを記載している。さらに、空の架橋ミセルが腫瘍組織中に、非架橋ミセルと比較して6倍多く蓄積することがわかった。
【００１０】
しかし、これらの架橋ミセルコア中への薬物化合物の非架橋取り込みは、注射直後の薬物分子の急速な放出を防ぐことができなかった。WO2010/033022において、ミセルコアへの薬物分子の共有結合による取り込みによって、薬物は循環の延長の利益を実際に受け得ることが立証された。循環の延長は、結果的に腫瘍組織の薬物濃度を上昇させた。特に、皮下モデルの場合には、25倍高い薬物濃度のデータが見出された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】WO01/09198
【特許文献２】WO2005/087825
【特許文献３】WO2010/033022
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Rijckenら、「Hydrolysable core-crosslinked thermosensitive polymeric micelles: synthesis, characterisation and in vivo studies」、Biomaterials 2007年、28、5581〜5593頁
【非特許文献２】Rijckenら、Biomacromolecules、2005年、6(4):2343-2351頁
【非特許文献３】Rijckenら、Biomaterials、2007年28(36):5581〜5593頁
【非特許文献４】Stenekes及びHennink、Polymer、2000年、41(15)、5563〜5569頁
【非特許文献５】Banciuら  J. Contr. Release、2008年、127(2)、131〜136頁
【非特許文献６】Schiffelersら、Neoplasia、2005年、7(2)、118〜127頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、これらの既知の系を改善する(例えば、パクリタキセル(PTX)及びデキサメタゾン(DMS)に関して本明細書中で以下に示される通りであるが、本発明は、薬物を含む種々の活性成分に適用でき、したがって、全ての種類の疾患及び適応症の処置において適用できることが強調される)。このような系は、任意の種類の既知の技法を使用して、例えば、静脈内投与又は埋め込みによって適用し得る。これは、例えば、高分子ミセル及びヒドロゲルの標的組織選択性を確実に改善するであろう。
【００１４】
より詳細には、薬物は、その治療効果を及ぼし得る時間内に放出されなければならない。生分解性連結部を用いることによって、元の薬物分子は、特定の制御放出プロファイルに従って放出されるであろう。本発明は、その後に長時間血液循環に留まり、取り込まれている薬物をこれらの生理的条件(pH7.4)下で所定の速度に従って放出する、ミセル送達賦形剤などのDDSの静脈内投与を目標とする。したがって、生理的条件下で、例えば24〜48時間以内に加水分解することによって、制御された方法に従って元の薬物化合物を放出する新規な共有結合薬物リンカーを開発することが必要とされている。この調整可能性は、薬物(若しくは別の生理活性材料)、リンカー及び/又はポリマーの化学的コンジュゲーションのいずれかにおける調整可能性を必要とする。さらに、薬物送達系において使用する分子は、本質的に安全で、短期又は長期毒性の問題を引き起こさないことが必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、薬物送達系(DDS、例えば、高分子ミセル又はヒドロゲル)への、構成単位及び/又は生理活性化合物の一時的に安定なコンジュゲーションを確実にする、新規な種類の生分解性リンカーに関する。本明細書中において、「構成単位」は、反応性部分によって(部分的に)誘導体化される可能性がある、天然由来又は合成由来のいずれかの薬物送達系中に(自己)集合するのに使用される構成成分である。よく知られている例としては、脂質、コレステロール、種々の可能なポリマー(例えば、PLGA、PLA、キトサン)が挙げられる。本明細書中において、「生理活性化合物」は、体内で予防効果及び/若しくは治療効果を発揮し得る、特定の器官/経路をインビボで可視化するのに使用される、又は両者の組み合わせである、天然由来又は合成由来のいずれかの化合物である。
【００１６】
特に、第1の態様において、本発明は、(i)OH含有部分、好ましくはヒドロキシル基若しくはカルボン酸部分又は-NH含有部分、例えば、アミノ基若しくは置換NH-基(置換基は、C1〜C3アルキル基である)と、(ii)ジアルキル化イオウ原子と、(iii)コンジュゲーション部分とを含むリンカーに関する。これらのリンカーは、生理的条件下において生分解性である。
【００１７】
より具体的には、これらのリンカーの重要な特徴は、取り込まれた化合物又は薬物送達系の構成成分の連結部がその後に加水分解され、その結果、化合物が放出され且つ/又はDDSが不安定化されることである。対応する加水分解動態は、その種類のリンカーを修飾することによって調整可能である。
【００１８】
好ましい一実施形態において、リンカーは、OH含有部分、例えば、カルボン酸と、誘導体化されたジアルキル化イオウ原子と、コンジュゲーション部分を含む。このようなリンカーは、下記式によって例示できる。
HOQ-(CnH2n)-S(R1)(R2)-(CmH2m)-CH2-A
{式中、
n及びmは、0〜20、好ましくは1〜10の整数であり、好ましい実施形態において、nは、1〜5、より好ましくは1〜3の整数であり、且つmは、1〜7、より好ましくは1〜5の整数であり、
R1及びR2は互いに独立して、孤立電子対、=Oなどの酸素部分、=N-Rx[式中、Rxは均一又は不均一な原子団、好ましくは独立して、直鎖若しくは分枝C1〜C6アルキル、直鎖若しくは分枝C1〜C6アルケニル(アルキル又はアルケニル基は任意選択で、1個又は複数のハロゲン基、ヒドロキシル基、アミノ若しくは置換アミノ基、カルボン酸基、ニトロ基又はシアノ基で置換されていてもよい)、又は芳香族基、好ましくはフェニル基(任意選択で、アルキル及びアルケニル基について列挙された置換基、又はハロゲン基、ヒドロキシル基、アミノ基若しくは置換アミノ基(置換基は、1個又は2個のC1〜C3アルキル基である)、カルボン酸基、ニトロ基又はシアノ基のうち1個又は複数で置換されていてもよい)である]などの窒素部分から選択され、
Aはコンジュゲーション部分であり、
Qは、直接結合、C=O、C=NH又はC=NRp基(式中、RpはC1〜C3アルキルである)であり、HO-Q基は、HR9N-Q基(式中、R9は、水素原子又はC1〜C3アルキル基のいずれかであることができる)で置換されていてもよい}。
【００１９】
下記式において、HO-Q基は、カルボン酸基であり、コンジュゲーション部分Aは重合性メタクリレートであり、それらの部分については、後述の実施例においても例証する。
【００２０】
【化１】
0005934221.tif 000002
【００２１】
好適なコンジュゲーション基は、式-PL-RvC=CRuRw{式中、-PL-は、連結基、例えば、-O-、-NH-、置換-N-[置換基は、C1〜C3アルキル、-O-C(O)-、-O-(C(O))r-C6H26-(式中、rは0又は1であり、bは1〜6の整数である)である]であり、Ru、Rv及びRwは独立して、水素原子又はC1〜C3基を表す}の重合性部分である。
【００２２】
架橋ミセルからの薬物又は他の生理活性構成成分の早すぎる放出は、架橋工程において、生分解性連結部を介して封入プロドラッグをミセルコアと共有結合によって固定することによって克服される。ミセルコアの架橋時におけるポリマー網目構造中へのプロドラッグの共有結合による組み込み、及び制御放出を可能にするために、例えば、種々の加水分解感受性リンカーを使用して、重合性メタクリレート基を薬物に結合させる。加水分解感受性リンカーは、ミセルからの薬物の放出速度を微調整できるように特別に設計される。より具体的には、ヒドロキシエチルメタクリレートを、薬物分子、例えば、修飾が容易で且つ立証された抗腫瘍効果を有するモデル薬物DMSと、スルフィド(DMSL1)、スルフォキシド(DMSL2)及びスルホン(DMSL3)エステルを介してコンジュゲートさせる。イオウ原子の酸化度が増加すると、その電子求引性が増加し、したがって、隣接エステル結合の加水分解速度が増加する。したがって、これらのリンカーは、生分解性であるだけでなく、本発明にかなりの柔軟性をもたらすことがわかった。
【００２３】
換言すれば、イオウ原子の誘導体化の種類は顕著な効果を有する。詳細には、種々の酸化状態のイオウを得て、使用することにより、エステルカルボニル原子の電子密度を増加又は減少させることによって隣接エステルの安定性を主として決定できることがわかった。重要なことには、イオウ原子の誘導体化の種類は、さらなる微調整又は不安定化効果を可能にする。イオウ原子上に種々の置換基を用いてさらなる修飾を行うことができ、その窒素及び酸素含有部分の例を以下に示す。例えば、窒素原子上におけるさらなる誘導体化は、さらなる微調整又は不安定化効果を可能にする。さらに、2個未満の遊離電子対を含有しているイオウ含有リンカーは、キラルである可能性がある。典型的な例を以下の表に示すが、これらに限定するものではない。
【００２４】
【表１】
0005934221.tif 000003
【００２５】
この表中で、R3〜R4は独立して、水素原子、C1〜C3アルキル基又は一般的な電子押し出し性若しくは電子供与性を有する他の部分、例えば、フルオロ置換基などのハロゲン置換基若しくはアルキン部分の意味を有する。さらに、カルボン酸部分に対するリンカー中の(誘導体化されている)イオウ原子の位置(前記式でnとして示されている)、及びコンジュゲーション部分Aに対するリンカーの(誘導体化されている)イオウ原子の位置(前記式でmとして示されている)は、リンカーの生分解性及び活性成分の放出に影響を与え得る。
【００２６】
前述したこれらの示された変数は、エステル結合形成の化学的最適化を毎回必要とするのではなく、リンカー分子に対する薬物/構成単位の単一のコンジュゲーション方法を使用できる。制御薬物送達のためのエステル結合、エーテル結合又はアミド結合の近くで電子求引部分又は電子供与部分によってさらに誘導体化される可能性があるジアルキル化イオウをベースとする本発明のリンカーは、隣接するイオウ誘導体による前記結合の加水分解感受性の活性化(不活性化)に影響を及ぼすのに使用でき、制御薬物送達のための前記結合の加水分解感受性を特化することができ、加水分解速度に関して広い時間幅を網羅する。
【００２７】
好ましい実施形態において、本発明は、デキサメタゾン又はパクリタキセルにそのCOOH基を介して結合された前記リンカーを含む化合物に関する。あるいは、リンカーが(第一級又は第二級)OH部分を含有し、薬物がCOOH部分を含有し得るであろう。しかし、本発明は、これらの活性構成成分に限定するものではない。取り込まれる生理活性化合物の種類としては、それらに限定するものではないが、薬物分子、例えば、(グルコ)コルチコステロイド型の若しくはケモスタット型の薬物分子、ペプチド/タンパク質、造影剤、遺伝物質又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【００２８】
第2の態様において、本発明は、薬物送達系におけるリンカーとしての、特に生分解性リンカーとしての、前記第1の態様による化合物の使用に関する。特に、これらの化合物は、生理的条件下で生分解性である生分解性リンカーとして使用される。「生理的条件」は、本発明のDDSを用いて処置される生物体中に存在する条件であり、ヒトの場合には、これらの条件はpH約7.4及び温度約37℃を包含する。このリンカーは、担体分子と活性成分の間に存在する。即ち、活性成分はマトリックス材料に共有結合的に結合し、したがって、コア架橋系の一部となる。好適な活性成分は、薬物分子、例えば、(グルコ)コルチコステロイド型の若しくはケモスタット型の薬物分子、ペプチド/タンパク質、造影剤、遺伝物質又はそれらの組み合わせである。この使用の好ましい一実施形態において、薬物送達系は、活性成分としてデキサメタゾン又はパクリタキセルを放出する。
【００２９】
本発明のリンカー分子を使用して、活性成分を含み且つ放出するDDSを合成及び形成するためには、リンカーとのコンジュゲーションを可能にする、構成単位及び/又は生理活性化合物上の官能性部分を利用可能にすることが1つの要件である。構成単位又は生理活性化合物上のこの官能性、反応性部分は、当業者ならば、自身の一般化学知識に基づいて選択でき、例えば、第一級若しくは第二級アルコール若しくはアミン又はCOOH基であることができる。好ましい一実施形態において、これは、第一級若しくは第二級アルコール又はCOOH基である。
【００３０】
その後の工程で、リンカーのカルボン酸部分と、例えば、構成単位又は生理活性化合物のアルコール部分とのコンジュゲーションを開始させ、それによってエステル結合を形成する。このコンジュゲーションを、以下の反応スキームによって例示する。
【００３１】
【化２】
0005934221.tif 000004
【００３２】
このスキームにおいて、Xは、例えば、H又はCH3であることができ、R1及びR2は、前記の意味を有する。好ましくは、R1とR2は、同時にHであることはない。
【００３３】
前記の一般的なコンジュゲーションの結果として、プロドラッグ又は修飾構成単位が、本発明のさらなる態様として得られる。
【００３４】
このプロドラッグ又は修飾構成単位を、その後に(段階的に)DDS中に取り込み、DDSとコンジュゲートさせる。この種類のコンジュゲーションとしては、縮合反応(例えば、カルボン酸とアルコール部分)、(ラジカル)重合反応、クリック反応及び(誘導体化されている)リンカーをポリマー系とコンジュゲートさせる同様な方法が挙げられるが、これらに限定するものではない。本発明のさらなる態様によれば、形成された結合は、以下にさらに詳述する調整可能な速度で時間内に加水分解される。
【００３５】
送達系構成成分の薬物、構成単位又は生理活性作用剤と構成単位の両方のいずれかを、前記種類のリンカーを介して互いに共有結合によって連結させることができる。
【００３６】
これらの工程は、参照により本明細書中に組み込まれているWO2010/033022の発明を構成している方法に従って、本発明のDDSの詳細な調製方法を提供する。
【００３７】
したがって、本発明の重合性薬物又はプロドラッグは、ミセルなどのDDSのコアに二段法で組み込む。第一に、疎水性薬物コンジュゲート(conjugate)を、例えばミセル形成時に、疎水性コアに物理的に取り込んだ。第二に、ポリマーを、ミセルコア中でラジカル重合によって架橋させ、新しく形成された絡み合った網目構造中で薬物(プロドラッグ)を同時に共重合させた。本発明によれば、10重量%(最終薬物/ポリマー濃度)の負荷容量(loading capacity)で、高効率のプロドラッグ封入(95%超)が得られた。動的光散乱によって観察されるように、結果として生じるミセルはかなり単分散であり、サイズが約60〜90nm(多分散指数0.1未満)であった。
【００３８】
したがって、本発明のさらなる態様は、活性成分を放出し得る、ポリマーマトリックスを含む制御放出系であって、活性成分が本発明のリンカーを介して共有結合によってポリマーマトリックスのポリマー分子と連結されている制御放出系である。
【００３９】
本発明の種類のリンカーの使用は、ミセルを形成できるポリマーの使用に限定するものではなく、また、ポリマーナノ粒子、ミクロスフェア、ヒドロゲル若しくはコーティング又は当業者に知られている同様なDDS中への(薬物)分子の生分解性取り込みを可能にする。
【００４０】
これらの(薬物負荷)送達系の適用に関して、非限定的な例は、(i)インビボ投与時における、例えば、経口適用、血流中への注入又は器官若しくは腫瘍中への直接注入による、(架橋)ミセル中に取り込まれた(薬物)分子の制御放出、(ii)静脈内投与(ナノゲル)時又は局在的投与(マクロゲル)時のいずれかにおける、(架橋)ポリマーヒドロゲル中に取り込まれた薬物及び/又はタンパク質分子の制御放出、及び(iii)取り込まれた薬物分子を含む装置のコーティング時における(薬物)分子の制御放出である。
【００４１】
さらなる態様において、本発明は、本発明のリンカーの調製方法を対象とする。この態様の第1の実施形態において、ブロモ酢酸アルキルをメルカプトアルコールと反応させ、続いて、得られたアルコールをA-Cl(Aはコンジュゲーション部分である)と反応させ、アルキル基を分割する。
【００４２】
さらなる実施形態において、得られた生成物を、例えば過ヨウ素酸ナトリウムを用いて、さらに酸化させる。
【００４３】
さらなる実施形態において、アルキルブロモアンタックス(alkylbromoantax)をメルカプトアルコールと反応させ、続いて、イオウ原子を完全に酸化し、得られたアルコールをA-Cl(Aはコンジュゲーション部分である)と反応させ、アルキル基を分割する。
【００４４】
これらの方法は、実施例1において全細部にわたって例示する。
【００４５】
本発明のさらに別の態様は、リンカーとのコンジュゲーションを可能にする官能性部分、好ましくは第一級若しくは第二級アルコール又はCOOHを有する構成単位及び/又は生理活性化合物を用意する工程と、リンカーの-OH含有部分又は-NH含有部分、例えば、カルボン酸部分と、構成単位又は生理活性化合物の前記官能性部分とのコンジュゲーションを開始させ、それによってプロドラッグ又は修飾構成単位を形成する工程と、前記プロドラッグ又は修飾構成単位をポリマーマトリックスに取り込み、コンジュゲートさせる工程とを含む、制御放出系の調製方法である。
【００４６】
ポリマーマトリックスと活性成分(薬物、構成単位)との間に形成された連結部、例えば、エステル連結部が存在するため、形成された制御放出系は、分解制御及び制御放出を受けやすい。特に、連結部、とりわけエステル連結部は、生理的条件下で時間内に加水分解する。
【００４７】
先に概略を説明したように、本発明の重要な態様は、リンカー中のエステル基(=置換基)などの加水分解性基の近くの部分が、(エステル)加水分解を遅延又は促進することである。分子的に言えば、置換基は、イオウ原子であり、加水分解性連結部のより近くに又は加水分解性連結部からより遠くに(前記で示した式中のnの意味が反映される)配置されて、それぞれ、(エステル)安定性を低減又は増強することができ、電子求引部分による誘導体化によってさらに活性化されるか、又は電子供与部分による誘導体化によって不活性化される。換言すれば、前記置換基の選択と位置は、望ましい加水分解速度への実際の微調整を可能にする。実際の結果は、(元の)薬物分子の放出及び/又はDDSの崩壊が、置換基の種類及び位置によって実際に制御された速度に従って起こっていることである。
【００４８】
本発明の概念を、生分解性で温度感受性のポリヒドロキシプロピル-又はポリヒドロキシエチル-メタクリルアミドラクテートをベースとする高分子ミセル(これらに限定するものではないが)によって例示する。長時間循環及び腫瘍蓄積を確実にするために、これらのミセルはコア架橋させる。例えば体内への注入によって、例えば、静脈内投与によって、処置される体内に導入した後に封入薬物が急速に排出されるのを制限するために、及び/又は標的組織選択性を増加させるために、本発明のリンカーを使用する。
【００４９】
この種の高分子ミセルは、多種多様な(わずかに)疎水性の治療用化合物を封入し得る。以下において、デキサメタゾン(DMS)及びパクリタキセル(PTX)を、例示的な活性構成成分として使用する。
【００５０】
新規な種類のDMS及びPTXのプロドラッグは、架橋ミセルの網目構造中に共有結合によって組み込むことができ、実際に制御された放出をインビトロで示し得る(数日〜数週間)ことが示されるであろう。
【００５１】
遊離薬物の場合の0.09時間及び非共有結合によって封入されたDMSの場合の0.12時間と比較して、14時間と循環における半減期が非常に長いことから、CCLミセルへのプロドラッグの共有結合による連結(linkage)が、血流中における早すぎるバースト放出を防止することが立証される。この循環半減期は、現時点でゴールデンスタンダードと考えられている、立体的に安定化されているリポソーム中のデキサメタゾンリン酸塩(DMS-P)(7.6時間)よりも長いことが明らかである。その結果、共架橋されたプロドラッグは、有意に増強された腫瘍蓄積(遊離薬物の場合より23倍高い)をもたらす。治療有効性は、遊離DMS-Pと比較した、皮下メラノーマ腫瘍成長の同様な遅延によって立証された。
【００５２】
特に、オリゴラクテート側鎖によって誘導体化された温度感受性ポリ(N-ヒドロキシアルキルメタクリルアミド)である、生体吸収性(bioresorbable)ポリマーをベースとする高分子ミセルが開発される。温度感受性ブロック及びPEG-ブロックを有するこれらのブロックコポリマーは、0℃では完全に水溶性であるが、調整可能な相転移温度より高温に加熱すると、約70nmの小さい単分散ミセルへと迅速に自己集合する。この方法を使用すると、ミセルコア内に多種多様な疎水性薬物をほぼ定量的に封入される。
【００５３】
前述のように、このようなミセルの安定性は、重合性メタクリレート基による温度感受性ブロックの修飾後に、ブロックコポリマーの共有結合的架橋によって既に増強されていた。得られたコア架橋ミセルはインビトロで優れた安定性を示す一方で、それらの生分解性を十分に保持した。最も重要なことに、ミセルの架橋は、マウスにおいて長時間の血液循環(半減期13時間)を達成し、腫瘍への高い持続性蓄積を達成するのに重要であった。
【００５４】
本発明は、薬物負荷ミセルの静脈内投与後に、ミセルの急速な解離及び/又は薬物のバースト放出のいずれかによる過度に速いクリアランスを回避する。特に、一連の重合性DMS又はPTXプロドラッグを共有結合によって包含させることによって、デキサメタゾン及びパクリタキセルの放出速度がそれぞれ実際に制御されたことが示されるであろう。さらにまた、このプロドラッグ負荷ミセル複合体(complex)は、血液循環が実際に長く(t1/2約14時間)、はるかに長時間の治療レベルが得られ、このような複合体はマウスの皮下腫瘍組織を高効率で標的化できた。
【００５５】
本発明によれば、薬物又は他の疎水性化合物は、生分解性リンカーを介してミセル内に固定された際に、コア架橋ミセルの腫瘍への蓄積増強によって利益を受けることが示されている。この共有結合的コンジュゲーションが、バースト放出のない実際の腫瘍標的化担体系をもたらす。マウスに使用する際、本発明は、腫瘍退縮に関して及び関節リウマチのマウスモデルにおいて明らかに治療有効性を示す。
【００５６】
前述のように、新規リンカー中の加水分解性(エステル)結合の感受性を加水分解に合わせて調整することによって、放出速度を制御することが可能である。正確な種類のリンカーを使用することによって、最終的な制御放出プロファイルが決定され、その結果、元の活性な化合物が放出される。
【００５７】
さらに、このストラテジーは、ヒドロキシル-、-COOH及び-NHを含有する生理活性化合物に広範に適用可能である。
【００５８】
長時間循環する架橋ミセル自体の生分解性により、腎クリアランスによって排出され得る小さい断片への崩壊が確実となる。ナノ微粒子薬物担体のゴールデンスタンダードとしてのリポソームと比較して、本発明のこの薬物送達系は、
(i)持続性血液循環-長期間にわたる血液/組織レベル(例えば、タキソールで6時間、PTXLx(本発明)で60時間以下)をもたらすデポー、及び
(ii)漏出性脈管構造を有する組織、例えば、腫瘍及び炎症性組織へのより高い蓄積
をもたらす。毛細血管浸透性の上昇した部位での受動的蓄積によりミセルプラットフォームの適用性が増す。
【００５９】
本発明のさらなる魅力的な特徴は、多種多様な疎水性化合物のほぼ定量的な封入効率である。
【００６０】
本発明は、高分子ミセルに限定するものではない。また、他の周知の種類の薬物送達賦形剤、例えば、ポリマー-薬物コンジュゲートも本発明の利益を受けることができる。好適なポリマー-薬物コンジュゲートを合成すること及び可能な薬物送達系の範囲内でこれを取り込むことは、当業者の範囲内である。
【００６１】
本発明の高分子ミセルは、持続放出プロファイルを有する実際の担体として作用し、組織への蓄積増強及び埋め込み制御放出メカニズムの役割をする。選択的な薬物送達に加えて、これは、病態生理学的環境及び/又は抗癌薬又は抗炎症薬の薬物相互作用経路の秩序を解明するためのメカニズム研究を行う多くの可能性を開く。
【００６２】
本発明の制御放出系は、これらに限定するものではないが、癌、感染症、眼科疾患、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、マイコプラズマ感染症、寄生虫感染症、炎症、皮膚科的疾患、心血管疾患、中枢神経系疾患、自己免疫疾患、増殖性疾患、関節炎、精神病性疾患、乾癬、糖尿病、代謝障害、肺疾患、呼吸器疾患、肺疾患、COPD、筋骨格系疾患、気腫、浮腫、ホルモン疾患からなる群から選択される疾患を含む疾患の処置に好適である。本発明の制御放出系はまた、治療的又は予防的のいずれであっても、ワクチン接種において使用される麻酔薬の送達に好適である。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】異なるプロドラッグCCL PMからのDMS放出曲線を示すグラフである。
【図２】緩衝液pH7.4での37℃におけるPTXプロドラッグ負荷HEMAm CCL PMのPTX放出動態を示すグラフである。
【図３】緩衝液pH7.4での37℃におけるPTXL2プロドラッグ負荷HEMAm及びHEMAm CCL PMのPTX放出動態を示すグラフである。
【図４】B16F10担腫瘍マウスにおける複数回(3日間隔)のi.v.投与時における、HPMAmミセル中で共架橋されたDMSL2の相対腫瘍成長速度(左)及び動物生存期間(右)を示すグラフである。
【図５】膝関節にコラーゲン抗体誘発関節炎を有するマウスにおける、遊離薬物又はDMSL3 (CD102)としてのDMS 10mg/kgの関節炎のスコアを示すグラフである。
【図６ａ】PTXL1、PTXL2及びPTXL3ミセルから放出されたパクリタキセルを示すグラフである。
【図６ｂ】PTXL1、PTXL2及びPTXL3ミセルから放出されたパクリタキセルを示すグラフである。
【図６ｃ】PTXL3の場合に、パクリタキセルが取り込まれたミセルを保存する際に示される血液パターンを示すグラフである。
【図７】PTXL2ミセルのi.v.注射時に観察された血液パターンを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
以下の実施例において、以下の材料を使用する。
放射標識された3H-無水酢酸及び14C-無水酢酸はそれぞれ、Amersham(Roosendaal、オランダ)及びPerkin Elmer(Boston、米国)の製品である。Ultima Gold液体シンチレーションカクテル及びSolvable組織可溶化剤は、Perkin Elmer Bioscience BV(Groningen、オランダ)から購入した。デキサメタゾン(98%超)、重水(D2O)及びトリフルオロ酢酸(TFA)は、Sigma Aldrich(Zwijndrecht、オランダ)から受け取ったままの状態で使用した。デキサメタゾン-リン酸塩(DMS-P)は、Bufa、Uitgeest(オランダ)で購入した。過酸化水素及び過硫酸カリウム(KPS)はいずれも、Merck (KGaA、Darmstadt(ドイツ))から入手した。パクリタキセル(PTX、MP Biomedicals Inc、Illkirch(フランス))、タキソール(Mayne Pharma、Brussels(ベルギー))、N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン(TEMED、Fluka Chemie AG、Buchs(スイス))、アセトニトリル(ACN、Biosolve Ltd.、Valkenswaard(オランダ))は全て、受け取ったままの状態で使用した。Biorad Laboratories(Hercules、米国)からのドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の20%の溶液は、pH5の緩衝液(酢酸アンモニウム、120mM)で1:1に希釈した。緩衝液は全て、使用前に0.2μmフィルター(Schleicher & Schuell MicroScience GmbH、Dassel(ドイツ))に通して濾過した。
【００６５】
さらに、実施例において、ミセルの平均粒径(Zave)及び多分散指数(PD)は、Malvern ALV/CGS-3ゴニオメーターを用いて動的光散乱(DLS)によって決定した。1H-NMRスペクトルは、Gemini 300 MHz  スペクトロメーター(Varian Associates Inc.、NMR Instruments、Palo Alto(米国カリフォルニア州) )を用いて記録した。ミセル分散液の放射活性は、Ultima Gold液体シンチレーションカクテル中で測定し、Packard Tricarb 2200 CA液体シンチレーションカウンターでカウントした。
【実施例１】
【００６６】
本発明のリンカーの合成
前記表中に例示した薬物リンカーL1、L2及びL3は、以下の経路に従って合成した。
【００６７】
【化３】
0005934221.tif 000005
【００６８】
L1に関しては、詳細には、以下の工程を実施した。
【００６９】
【化４】
0005934221.tif 000006
【００７０】
tert-ブチル2-(2-ヒドロキシエチルチオ)アセテート(2):tert-ブチルブロモアセテート1(15g、0.077mol、1当量)及びトリエチルアミン(16g、0.16mol、2当量)を、窒素下でCH2Cl2(100mL)に溶解させ、0℃に冷却した。混合物に、2-メルカプトエタノール(6.3g、0.081mol、1.05当量)をゆっくりと添加し、反応混合物を室温まで温めた。反応混合物をさらに1時間撹拌した。反応の完了を、TLCによって監視した(酢酸エチル(EtOAc):ヘキサン(Hex)、1:1(v/v)、Rf:0.88)。塩基抽出及び酸抽出はそれぞれ、1M KCO3(pH10)及び1M NaOAc(pH 3.5)を用いて2回実施した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、MgSO4を用いて乾燥させ、直径185mmのワットマン濾紙に通して濾過した。濾液を真空濃縮し(CH2Cl2)、9.2g(収率62%)の2を無色油として得た。
【００７１】
【数１】
0005934221.tif 000007
【００７２】
2-(2-tert-ブトキシ-2-オキソエチルチオ)エチルメタクリレート(3): 2(8.6g、0.045mol、1当量)及びトリエチルアミン(9.05g、0.089mol、2当量)を、窒素下において氷上でCH2Cl2(20mL)に溶解させた。混合物に塩化メタクリロイル(5.6g、0.054mol、1.2当量)をゆっくりと添加した。反応混合物を室温まで温め、2時間撹拌した。反応の完了を、TLCによって確認した(EtOAc:Hex、1:1(v/v)、Rf:0.86)。過剰の塩化メタクリロイルをメタノールによって除去して、メタクリル酸メチルを形成した。3を、pH=8の飽和NaHCO3溶液で2回抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、MgSO4を用いて乾燥させ、直径185mmのワットマン濾紙に通して濾過した。濾液を真空濃縮した。EtOAc、Hex及びCH2Cl2をそれぞれ用いる共溶媒蒸発を実施して、揮発性不純物を除去した。10.5g(収率90%)の3を、黄色油として得た。
【００７３】
【数２】
0005934221.tif 000008
【００７４】
2-(2-(メタクリロイルオキシ)エチルチオ)酢酸(4):3(2g、7.7mmol、1当量)を、窒素下において氷上でトリフルオロ酢酸(TFA)(10mL)中にゆっくりと溶解させた。重合を防ぐために、反応混合物に極微量のヒドロキノンモノメチルエーテル(MEHQ)を添加した。反応混合物を、室温まで昇温させ、反応混合物を55℃で2時間撹拌した。反応の完了を、TLCによって監視した(CHCl3/MeOH/HOAc、9:1:0.1(v/v)、Rf:0.17)。過剰のTFAを、蒸発及びCH2Cl2との共蒸発によって除去し、残渣をシリカゲルカラム(Hex/EtOAc 4:1(v/v))で精製した。純粋な4を、MgSO4で乾燥させ、直径185mmのワットマン濾紙に通して濾過した。濾液を真空濃縮した。1g(収率63%)の4を、淡黄色油として得た。
【００７５】
【数３】
0005934221.tif 000009
【００７６】
L2に関しては、以下の工程を実施した:
【００７７】
【化５】
0005934221.tif 000010
【００７８】
2-(2-(メタクリロイルオキシ)エチルスルフィニル)酢酸(5):アセトニトリル(ACN)(10mL)中4(1g、4.9mmol、1当量)を、H2O(10mL)中に溶解した過ヨウ素酸ナトリウム溶液(1.1g、4.9mmol、1当量)と混合した。反応混合物を、RTで終夜撹拌した。反応の完了を、TLCによって確認した(CHCl3/MeOH/TFA、75:25:0.1(v/v)、Rf:0.23)。反応混合物を、吸引濾過によって濾過して、EtOAcによってヨウ素酸ナトリウム塩を除去し、MgSO4で乾燥させ、直径185mmのワットマン濾紙に通して濾過した。濾液を真空濃縮し、CH2Cl2を用いて共蒸発させた。0.87g(収率81%)の5を、白色固体として得た。
【００７９】
【数４】
0005934221.tif 000011
【００８０】
L3に関しては、以下の工程を実施した。
【００８１】
【化６】
0005934221.tif 000012
【００８２】
tert-ブチル2-(2-ヒドロキシエチルスルホニル)アセテート(6):2(2.0g、10.4mmol、1当量)を、ACN(20mL)及びCCl4(20mL)に溶解させた。反応混合物に、激しく撹拌しながらNaIO4(6.7g、31mmol、3当量)の水30mL中溶液を添加した。2相をエマルジョンとなるまで混合後、RuCl3(43mg、0.21mmol、0.02当量)を一度添加した。次いで、反応混合物を35℃に加熱し、終夜撹拌した。反応はTLCによって監視した(EtOAc/Hex、3:2、Rf値: 6: 0.16、2: 0.53)。反応完了後、反応混合物をエーテル(100mL)で希釈し、15分間激しく撹拌し、MgSO4で乾燥させ、直径185mmのワットマン濾紙に通して濾過した。残渣をエーテルで洗浄し(3x30mL)、濾液をドラフト内で真空濃縮した。その後、これをシリカゲルカラム(EtOAc/Hex、3:2(v/v))で精製した。1.15g(収率50%)の6を、黄色油として得た。
【００８３】
【数５】
0005934221.tif 000013
【００８４】
2-(2-tert-ブトキシ-2-オキソエチルスルホニル)エチルメタクリレート(7):純粋な6(1g、4.6mmol、1当量)を、窒素下において乾燥ジクロロメタン(DCM)(10mL)に溶解させた。トリエチルアミン(0.93g、9.2mmol、2当量)及び塩化メタクリロイル(0.57g、5.5mmol、1.2当量)を、氷上で反応混合物に以下の順で添加した。反応混合物を室温まで昇温させ、3時間撹拌した。反応の完了を、TLCによって確認した(EtOAc/Hex、3:2(v/v)、Rf値:7:0.69、6:0.27)。過剰の塩化メタクリロイルをメタノールによって除去して、メタクリル酸メチルを形成した。塩基抽出(NaHCO3、pH 8)を2回行った。反応混合物をMgSO4によって乾燥させ、直径185mmのワットマン濾紙に通して濾過した。濾液を真空濃縮した。濾液をシリカゲルカラム(100%EtOAc)で精製した。1.15g(収率86%)の7を、オレンジ色油として得た。
【００８５】
【数６】
0005934221.tif 000014
【００８６】
2-(2-(メタクリロイルオキシ)エチルスルホニル)酢酸(8):純粋な7(1.2g、3.9mmol)を、窒素下でTFA(15mL)に溶解させた。混合物に極微量のMEHQを添加し、反応混合物を55℃において3時間撹拌した。反応の完了を、TLCによって確認した(EtOAc/Hex/TFA:60:40:0.1%(v/v)、Rf:0.38)。反応混合物をシリカゲルカラム(EtOAc/Hex、3/2)で精製した。0.6g(収率65%)の8を、黄色油として得た。
【００８７】
【数７】
0005934221.tif 000015
【実施例２】
【００８８】
リンカー2-(クロロカルボニルオキシ)エチルメタクリレート(HEMA-クロロホルメート)の合成
ヒドロキシエチルメタクリレート(HEMA、1.3g、10mmol)及びトリエチルアミン(1.1g、11mmol)のクロロホルム10mL中溶液を、0℃において、撹拌されているホスゲン(トルエン中20%溶液、15.6ml、30mmol)のクロロホルム15mL溶液に滴加した。混合物を0℃において1時間撹拌し、続いて50mbarの圧力下に置いて、過剰のホスゲンを除去した。30分後に、混合物を、ロータリーエバポレーターを用いてさらに減圧濃縮した。生成物をTHF 25mLに溶解させ、濾過して、固形Et3N・HClを除去した。THFを減圧蒸発させ、残渣をクーゲルロール蒸留(90℃、0.6mmHg)によって精製して、HEMA-クロロホルメートを無色油(1.3g、67%)として得た。
【実施例３】
【００８９】
プロドラッグの合成
デキサメタゾン及びパクリタキセルを、モデル薬物化合物として用いた。これらの疎水性薬物分子を前記リンカーで誘導体化し、それによって生分解性プロドラッグを形成した。
【００９０】
【化７】
0005934221.tif 000016
【００９１】
この合成スキームにおいて、Rは、一酸化されたイオウ又は二酸化されたイオウである、即ち、リンカーL1、L2又はL3である。
【００９２】
2-(2-(2-((8S,9R,10S,11S,16R,17R)-9-フルオロ-11,17-ジヒドロキシ-10,13,16-トリメチル-3-オキソ-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-ドデカヒドロ-3H-シクロペンタ[α]フェナントレン-17-イル)-2-オキソエトキシ)-2-オキソエチルチオ)エチルメタクリレート(DMSL1):4(0.25g、1.2mmol、1.05当量)及び4-(ジメチルアミノ)-ピリジン(DMAP)(0.077g、0.63mmol、0.5当量)を、窒素下で乾燥CH2Cl2(20mL)に溶解させた。反応混合物を氷上で冷却し、次いで混合物に、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)(0.29g、1.4mmol、1.1当量)を、乾燥THF(20mL)中に溶解したDMS(0.5g、1.3mmol、1当量)と共に添加した。反応混合物を、室温となるまで放置し、終夜撹拌後、反応の完了を、TLCによって確認した(EtOAc/Hex、3:2(v/v)、Rf:0.76)。溶媒のほとんどを蒸発させ、残りの混合物を15cmシリカゲルカラム上で精製した(EtOAc/Hex、3:2(v/v)、Rf:0.44)。0.5gr(収率70%)のDMSL1を、綿毛状の白色固体として得た。
【００９３】
【数８】
0005934221.tif 000017
【００９４】
2-(2-(2-((8S,9R,10S,11S,16R,17R)-9-フルオロ-11,17-ジヒドロキシ-10,13,16-トリメチル-3-オキソ-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-ドデカヒドロ-3H-シクロペンタ[α]フェナントレン-17-イル)-2-オキソエトキシ)-2-オキソエチルスルフィニル)エチルメタクリレートメタクリレート(DMSL2):5(0.54g、2.4mmol、1.05当量)を、乾燥THF(5mL)に溶解させ、DMAP(0.14g、1.2mmol、0.5当量)を、窒素下で溶液に添加した。氷上で冷却後、乾燥THF(25mL)中デキサメタゾン溶液(0.91g、2.3mmol、1当量)及びDCC(0.525g、2.5mmol、1.1当量)を混合物に添加した。反応混合物はゆっくりと室温まで温め、RTで終夜撹拌した。反応の完了を、TLCによって確認した(EtOAc/Hex、20:1(v/v)、Rf:0.24)。溶媒のほとんどを蒸発させ、残りの溶液を20cmシリカゲルカラム(EtOAc/Hex、20:1(v/v))で精製した。1g(収率73%)のDMSL2を、綿毛状の黄色固体として得た。
【００９５】
【数９】
0005934221.tif 000018
【００９６】
2-(2-(2-((8S,9R,10S,11S,16R,17R)-9-フルオロ-11,17-ジヒドロキシ-10,13,16-トリメチル-3-オキソ-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-ドデカヒドロ-3H-シクロペンタ[α]フェナントレン-17-イル)-2-オキソエトキシ)-2-オキソエチルスルホニル)エチルメタクリレート(DMSL3):8(67mg、0.28mmol、1.05当量)を乾燥DCM(10mL)に溶解させ、反応混合物に窒素下でDMAP(0.017g、0.14mmol、0.5当量)を添加した。デキサメタゾン(0.11g、0.27mmol、1当量)を乾燥THF(10mL)に溶解させた。混合物を氷上で冷却後、混合物に、DCC(0.21g、0.46mmol、1.1当量)をデキサメタゾンと共に添加した。反応混合物を、RTで終夜撹拌し、完了を、TLCで確認した(EtOAc/Hex、7:3(v/v)、Rf:0.47)。溶媒のほとんどを蒸発させ、残りの溶液を20cmシリカゲルカラム(EtOAc/Hex、7:3(v/v))で精製した。0.1g(収率60%)のDMSL3を、白色固体として得た。
【００９７】
【数１０】
0005934221.tif 000019
【００９８】
対応するPTXをベースとする化合物を、類推によって調製した。
【００９９】
所望ならば、放射性化合物3H-デキサメタゾン(エタノール中1mCi/mL)及び14C-パクリタキセル(14C-PTX)はそれぞれ、Perkin Elmer (Boston、米国)及びCampro Scientific BV (Veenendaal、オランダ)から入手した。その他の場合には、デキサメタゾンは、Sigma Aldrich (Zwijndrecht、オランダ)から入手し、パクリタキセルは、MP Biomedicals Inc.(Illkirch、フランス)から入手した。
【実施例４】
【０１００】
ポリマーの合成
使用するブロックコポリマーは、RijckenらによってBiomacromolecules、2005年、6(4):2343-2351頁及びBiomaterials、2007年28(36):5581〜5593頁に記載されたようにして調製した。ポリマーは、親水性モノメトキシ-PEG(Mn 5000g/mol)ブロックと、N-2-ヒドロキシプロピルメタクリルアミド(HPMAm)のモノラクテート(36%)及びジラクテート(64%)又はN-2-ヒドロキシエチルメタクリルアミド(HEMAm)のモノラクテート(20%)及びジラクテート(80%)のいずれかからなる温度感受性ブロックとを含有する。続いて、前記Biomaterialsの文献に既に記載されているようにして、ラクテート側鎖の一部分(10〜15%)を無水メタクリル酸との反応によってメタクリル化した。ブロックコポリマーの分子量及び臨界ミセル温度はそれぞれ、いずれの場合も、約25kDa及び8〜12℃であった。前記Biomaterialsの文献に既に記載されているようにして3H-又は14C-無水酢酸を用いて、3H-及び14C-標識メタクリル化ブロックコポリマーを得た。
【実施例５】
【０１０１】
薬物負荷ミセルの調製
一般的には、典型的な実験において、ブロックコポリマーは、部分メタクリル化オリゴラクテート単位を有するPEG-b-ポリ(N-ヒドロキシアルキルメタクリルアミド-オリゴラクテート)(温度感受性ポリマー)をベースとした。より具体的には、2-ヒドロキシプロピル-メタクリルアミド(HPMAm)及び2-ヒドロキシエチルメタクリルアミド(HEMAm)の2種類のポリマー主鎖を使用した。温度感受性ブロックコポリマーの水溶液を、前記プロドラッグのうちの1つの水混和性有機溶媒(好ましくは、低沸点のもの、例えば、エタノール又はテトラヒドロフラン)中濃縮溶液の少量と、ミセル形成をさせない温度で混合した(典型的には10：1の体積比で)。次いで、開始剤溶液(ラジカルを生じ得るKPS-TEMED、又は他のラジカル開始剤を使用できる)を添加し、その直後に、臨界ミセル形成温度(CMT)より高温となるまで急速加熱した。これにより、プロドラッグが疎水性相互作用によって疎水性コア中に非共有結合的に局在している単分散高分子ミセルが形成された。ミセル形成後、窒素雰囲気を作った。その結果、開始剤ラジカルにより、メタクリル化ポリマーと重合性プロドラッグ化合物との重合が誘発された。このいわゆる架橋プロセスにより、絡み合った網目構造が形成され、プロドラッグが架橋ミセルコア内に共有結合によって固定された(CCL PM)。
【０１０２】
DMS及びDMS-プロドラッグ負荷ミセルを、HPMAm又はHEMAm(いずれも14%メタクリル化)をベースとするポリマーを用いて調製した。ポリマーの氷冷酢酸アンモニウム緩衝溶液(pH 5)(8.3容量、4℃において終夜溶解)を、KPS(0.45容量)及びTEMED(0.25容量)と混合した。エタノール中DMS(プロドラッグ)(1容量)を添加し、続いて、激しく撹拌しながら50℃まで1分間急速加熱した。ポリマー、KPS、TEMED及び薬物の最終濃度はそれぞれ、20、1.35、3及び2mg/mLであった。続いて、RijckenらによってBiomaterials中の前記引用論文に記載されているようにして、各ミセルを構成しているポリマーをN2雰囲気下でRTにおいて1時間架橋させた。早期重合によってミセルの形態に影響を及ぼすことなく、メタクリレートが確実に完全に転換されるように、KPS及びTEMEDの濃度を最適化した(Stenekes及びHennink、Polymer、2000年、41(15)、5563〜5569頁によって記載されているようにして)。同様にして、PTX及びPTX-プロドラッグ負荷ミセルを調製した。
【０１０３】
DMS-P負荷リポソームを、既に文献記載されているようにして調製した(Banciuら  J. Contr. Release、2008年、127(2)、131〜136頁;Schiffelersら、Neoplasia、2005年、7(2)、118〜127頁)。簡単に言えば、モル比1.85:1.0:0.15の、適量のジパルミトイルホスファチジルコリン(Lipoid GmbH、Ludwigshafen(ドイツ))、コレステロール(Sigma、St.Louis(米国))及びポリエチレングリコール2000-ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(Lipoid GmbH)をそれぞれ、丸底フラスコ中のエタノールに溶解させた。脂質膜を、回転蒸発によって作製した。フィルムを、100mg/mL DMS-P溶液で水和した。リポソームのサイズを、最終細孔径50nmのポリカーボネート膜(Nuclepore、Pleasanton(米国))を通す複数の押出工程によって、減少させた。リポソームの平均粒径を、動的光散乱によって決定した。分画分子量10kDaのSlide-A-Lyzerカセット中で、4℃において、緩衝液を繰り返し交換しながら透析することによって、封入されていないDMS-Pを除去した。抽出後の水性相を用いて、既に記載されているようにして[8]高速液体クロマトグラフィーによってグルココルチコイドホスフェート含有量を決定し、水性相はDMS-Pを約5mg/mL含有していた。
【実施例６】
【０１０４】
インビトロ放出の研究
DMS-プロドラッグ負荷HPMAmコア-架橋(CCL)高分子ミセル(PM)(最終濃度DMS 2mg/mL)を、1%トゥイーンを含有するリン酸緩衝液(pH 7.4、150mM)又は1%トゥイーンを含有しているホウ酸塩緩衝液(pH 8.4、150mM及びpH 9.4、150mM)中で少なくとも10倍希釈し、37℃においてインキュベートした。DMSの放出を、BEH C18カラム(直径1.7μm、長さ50mm)から構成される、Waters AcquityシステムでのUPLC検出によって、カラム温度50℃において直接分析によって監視した。溶離剤はアセトニトリル/H2O(23:77、v/v)とし、流速は1mL/minとした。試料容量は、7.5μLとした。UV検出は246nmで行った。デキサメタゾン較正曲線は、0.2〜60μg/mLにおいて直線であった。
【０１０５】
異なるプロドラッグCCL PMからのDMS放出曲線は、使用したリンカーの種類によって、DMSの放出速度に大きな差があることをはっきりと示した(図1を参照のこと)。
【０１０６】
UPLCによって追跡された、時間内でのDMS放出は、明確なリンカー依存的な放出速度を示した。即ち、DMSL1は非常に緩徐な放出を示し、リンカー中のイオウ原子の酸化度の増加に伴って、放出速度が増加した。特定のエステルの加水分解は、pH8.4においてはpH7.4での加水分解速度と比較して加速されたので、加水分解速度が今度はpH依存的であった。pH5においては、種々のDMS製剤のDMSの放出は観察されなかった(データは示さず)。さらに、バースト放出がないことは、デキサメタゾンプロドラッグの共有結合による取り込みが全ての場合に完了したことを示している。同じ傾向が、異なるpH (即ち、7.4及び8.4)において、異なる種類のミセル(HPMAm及びHEMAmをベースとする)について一貫して観察される。
【０１０７】
したがって、エステル結合のβ位のイオウ原子の酸化状態は容易に変えることができ、したがって、様々な加水分解安定度を有する種々のリンカーを生成できることが示される。例えば、DMSの50%放出は、生理的条件において約1週間(DMSL3)から約4週間(DMSL1)の間で変動し得る。
【０１０８】
また、PTXプロドラッグ負荷HEMAm CCL PMの放出動態も評価した。
【０１０９】
(図2;pH7.4の緩衝液中での37℃におけるPTXプロドラッグ負荷HEMAm CCL PMのPTX放出動態を示している)。
【０１１０】
HEMAm CCL PMからのPTXの放出もまた、エステル結合のβ位で使用された置換基の種類によって異なっていた。しかし、PTXの全放出は、DMSの放出動態よりもはるかに速い。リンカーとコンジュゲートしている(リンカーに近い)薬物の原子もまた、加水分解に対するエステル結合の感受性にかなり影響を及ぼすことは、明らかである。
【０１１１】
さらに、緩衝液pH7.4での37℃におけるPTXL2プロドラッグ負荷HEMAm及びHEMAm CCL PMのPTX放出動態(各曲線は4つの独立した測定値の平均である)を示す図3から明らかなように、リンカーの加水分解速度もまた、ポリマーの親水性(含水量)によって、即ち、使用したポリマーの種類によって(HPMAm又はHEMAmのいずれをベースにするかによって)、わずかに影響される。HEMAmは、わずかにより親水性であり、その結果、リンカーとポリ(HEMAm-ラクテート)の乳酸側鎖はいずれも、より急速に加水分解される(WO2005/087825も参照のこと)。さらに、乳酸側鎖の加水分解速度は、ミセルコアの親水性(及び水の吸収)の増加速度に影響を与える。
【０１１２】
全体的に見て、これらのインビトロ放出研究は、元の薬物の放出動態の大きな差が、使用したリンカーの種類によって異なること並びに高分子ミセルの種類及び評価した薬物の種類に付随することをはっきりと示している。
【実施例７】
【０１１３】
i.v.投与後のDMSLx負荷高分子ミセルの治療有効性の研究
腫瘍モデル
皮下B16F10-黒色腫腫瘍(前記参照)を担持するマウスに、腫瘍が100〜200mm3の場合に、尾部にi.v.注射を行った。投与量及び製剤は、コア架橋HPMAmミセルに共有結合によって取り込まれたDMSL2 10mg/kg及び遊離DMS-P 10mg/kg又は生理食塩水とした(各群n=5〜6)。DMSL2負荷ミセルは、前述のようにしてpH5の緩衝液中で調製した。投与の直前に、ミセル溶液を、NaOH及びNaClによってそれぞれpH7.4及びイオン強度300 mOsmolarにした。腫瘍サイズは、キャリパーを用いて毎日測定し、体重も毎日計測した。注射は、ヒトのエンドポイント2000mm3まで、3日毎に繰り返した。対照群では、マウスは、処置開始の6日後に既にこのエンドポイントに到達した。DMSL2負荷ミセルの場合には、処置は実に20日まで、即ち、少なくとも6回の注射まで続けた。
【０１１４】
特に、治療有効性の研究に関しては、良好なインビトロ放出プロファイルを示した製剤の1つ、即ち、HPMAmミセル中で共架橋されたDMSL2を、遊離DMS及びPBSと比較した(図4;B16F10担腫瘍マウスにおける複数回(3日間隔)のi.v.投与時における、HPMAmミセル中で共架橋されたDMSL2の相対腫瘍成長速度(左)及び動物生存期間(右)を示す)。
【０１１５】
カプランマイヤー分析(図4、右)によれば、DMSL2ミセルは、PBSと比較して有意な(p=0.041)治療効果を有していた。また、遊離DMS-Pと比較して有効性が高い傾向があるが、これはそれほど有意なものではなかった(図4、左)。ミセル製剤の頻繁な投与(最高6回)にもかかわらず、いかなる局所毒性又は全身毒性の徴候も観察されなかった。さらに、毎日の測定時に、体重の減少は見られなかった。
【０１１６】
RAモデル
膝関節にコラーゲン抗体誘発関節炎を有するマウスに、DMS 10mg/kgを、遊離薬物又はDMSL3 (CD102)として単回i.v.注射した。プラセボとして生理食塩水をi.v.注射し、健常な非罹患関節を対照とした。結果は、静脈内注射時に、DMSL3 PMのみが、関節炎の症状(ここでは、関節腫脹)の有意な(ほぼ完全な)抑制をもたらしたことをはっきり示している。これは、遊離デキサメタゾンと比較して優れた薬物動態挙動(長期間にわたる放出速度及び炎症組織への増強された蓄積)を示している。結果を図5に示す。
【実施例８】
【０１１７】
i.v.投与後のPTXLx負荷高分子ミセルのPK及び治療有効性の研究
インビボでの薬物動態研究において、PTXL2 PM製剤(パクリタキセル約10mg/kg)の静脈内投与後のパクリタキセル血中濃度を、タキソール及び対照としてのPBSを用いた皮下B16F10腫瘍担持マウスに対する治療有効性研究において決定した。この観点で、以下の表を参照されたい。
【０１１８】
【表２】
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【０１１９】
特に、この表は、タキソール又はPTXL2-プロドラッグCCL PM製剤を皮下B16F10腫瘍担持マウスに静脈内投与後のパクリタキセル血中濃度を示している(LC-MSによって決定、定量限界(LOQ) 10.3ng/mL未満、n=3〜5)。遊離パクリタキセルのこれらの薬物動態データは、PTXプロドラッグ負荷CCL PMの長時間血中滞留及びPTXの制御放出を示した。
【０１２０】
健常マウスi.v.
PTXL1、PTXL2及びPTXL3ミセルを、PTXとしてマウスに12.5mg/kgの用量でiv投与した(試料採取時間当たり動物3匹)。対照として、タキソール及びアブラキサンもまた、現在の市販パクリタキセル製剤としての対照として投与した。血液試料及び種々の器官(肝臓、脾臓)を、注射後の様々の時点で採取した。
【０１２１】
図6a及び図6bにおいて、全ての曲線は、放出されたパクリタキセルに対応する。
【０１２２】
また、パクリタキセルが取り込まれたミセルを保存する際、PTXL3の場合には図6cに示されるような血液パターンが観察された。
【０１２３】
取り込まれ及び放出されたパクリタキセルは、PLXLxミセルの長時間循環プロファイルをはっきり示し、これはまた、パクリタキセルがミセル中に存在する間は分解から保護されることを示している。
【０１２４】
【表３】
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【０１２５】
上記表は、現在の市販製剤と比較した、長期血液循環の明らかな効能を示している。次に、調整可能な放出速度が観察され、パクリタキセルの最小量は徐放性のPTXL1の場合であり、放出パクリタキセルの最高量は(今のところ)放出が最も速いPTXL3の場合である。
【０１２６】
健常マウスi.p.及びs.c.
同様に、PTXl1ミセルはまた、皮下及び腹膜内に投与して、パクリタキセルがこの場合もまた時間内において制御放出されている血中レベルを生じる。これは、他の異なる投与経路であっても、放出メカニズムが実際に包括的であることを示している。
【０１２７】
健常ラット-i.v.注射
図7に示されたパターンは、PTXL2ミセルのi.v.注射時に観察された。
【０１２８】
最も重要な結果及び結論は、長時間血液循環プロファイル、及び血中のパクリタキセルの放出%がマウスにおける放出%に等しいこと、即ち、等しい放出メカニズムが観察されることである。
【０１２９】
種々の実施形態におけるこれらのリンカーの使用に関して最も重要なことは、種々の前臨床毒性研究において、マウス及びラットへの単回又は反復投与時に、この新しい種類のリンカー分子が十分に安全と思われたことである。次に、投与量を増加した際であっても、局所作用も全身作用も観察されず、したがって、これらの種類のリンカーもそれらの生分解性断片も顕著な副作用を引き起こさないことを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図７】
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