(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞周辺細胞抽出物からの抗体断片の精製のためのプロセスであって、
ａ）少なくとも１．５ｇ／Ｌの濃度の抗体断片を含有する混合物を陽イオン交換クロマトグラフィーにかけ、続いて溶離して、抗体断片を含有する第１の溶離液を生成する、抗体断片を捕捉するための第１のクロマトグラフィーステップ及び
ｂ）第１の溶離液を陰イオン交換クロマトグラフィーにかけて不純物を捕捉し、抗体断片を含有する流出物を生成する、第２のクロマトグラフィーステップ
を含む上記プロセス。
【請求項２】
請求項１に記載の２つのクロマトグラフィーステップを含み、更なるクロマトグラフィーステップを含まない、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
細胞周辺細胞抽出物からの抗体断片の精製のためのプロセスであって、
ａ）少なくとも１．５ｇ／Ｌの濃度の抗体断片を含有する混合物を陽イオン交換クロマトグラフィーにかけ、続いて溶離して、抗体断片を含有する第１の溶離液を生成する、抗体断片を捕捉するための第１のクロマトグラフィーステップ、
ｂ）第１の溶離液に適用する第１の限外ろ過、
ｃ）精製された第１の溶離液を陰イオン交換クロマトグラフィーにかけて不純物を捕捉し、抗体断片を含有する流出物を生成する、第２のクロマトグラフィーステップ、及び
ｄ）流出物に適用する第２の限外ろ過
から本質的に成る上記プロセス。
【請求項４】
クロマトグラフィーステップはすべて、クロマトグラフィーカラムで実行される、請求項１から３までのいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５】
陽イオン交換クロマトグラフィーは、溶離モードにおいて実行される、請求項１から４までのいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項６】
第１の陽イオンクロマトグラフィーステップは、連続する順で以下のステップ：
ａ）陽イオン交換カラムに、抗体断片を含有する混合物を導入するステップ、
ｂ）洗浄の間に、洗浄緩衝剤の伝導度、ｐＨ、及び塩濃度は本質的に変わらない、洗浄緩衝剤により陽イオン交換カラムを洗浄するステップ、並びに
ｃ）溶離緩衝剤により抗体断片を溶離するステップ
を含む、請求項１から５までのいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項７】
洗浄緩衝剤のｐＨは、第１のクロマトグラフィーステップ前の、抗体断片を含有する混合物のｐＨと同一である、請求項６に記載のプロセス。
【請求項８】
第１のクロマトグラフィーステップ前の、抗体断片を含有する混合物は、４．０〜５．０のｐＨを有する、請求項６又は７に記載のプロセス。
【請求項９】
第１のクロマトグラフィーステップにおいて、抗体断片を含有する混合物は、陽イオン交換クロマトグラフィーにかける前に、２００μｇ／ｍｌ〜１０，０００μｇ／ｍｌの量の細菌宿主細胞タンパク質を含有する、請求項１から８までのいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１０】
第１のクロマトグラフィーステップにおける陽イオン交換クロマトグラフィーは、少なくとも３００ｃｍ／ｈの流速で実行される、請求項１から９までのいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１１】
第１のクロマトグラフィーステップにおける陽イオン交換クロマトグラフィーは、６ｍＳ／ｃｍ以下の伝導度で実行される、請求項１から１０までのいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１２】
第１のクロマトグラフィーステップにおける陽イオン交換クロマトグラフィーは、樹脂に連結されたスルホニル、スルホプロピル、又はカルボキシメチルを含むクロマトグラフィーカラムにおいて実行される、請求項１から１１までのいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１３】
第１のクロマトグラフィーステップにおける陽イオン交換クロマトグラフィーカラムは、５０〜７５ｇ／Ｌ樹脂の抗体断片に対する動的結合容量を有する、請求項１から１２までのいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１４】
第１のクロマトグラフィーステップにおける陽イオン交換クロマトグラフィーカラム樹脂は、少なくとも５０μｍの平均粒径を有する、請求項１２又は１３に記載のプロセス。
【請求項１５】
最初の捕捉ステップの陽イオン交換クロマトグラフィーにおいて、樹脂１リットル当たり５〜１００ｇの抗体断片が導入される、請求項１から１４までのいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１６】
第２のクロマトグラフィーステップにおける陰イオン交換クロマトグラフィーは、四級アンモニウム（Ｑ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、又はトリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）を含む樹脂上で実行される、請求項１から１５までのいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１７】
抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はｓｃＦｖである、請求項１から１６までのいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１８】
Ｆａｂ又はＦａｂ’は、ＶＥＧＦ−Ａ、ＦｃＲｎ、ＯＸ４０、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体、Ｃ５、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＴＮＦα、ＩＬ１β、又はＣＤ４０−Ｌに特異的に結合する、請求項１７に記載のプロセス。
【請求項１９】
Ｆａｂ又はＦａｂ’は、アブシキシマブ、ラニビズマブ、パキセリズマブ、ＣＤＰ８７０、ＣＤＰ４８４、又はＣＤＰ７６５７である、請求項１８に記載のプロセス。
【請求項２０】
プロセスから回収される抗体断片は、１５０ｐｐｍ以下の量の宿主細胞タンパク質を含有する、請求項１から１９までのいずれか一項に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質精製の分野である。より具体的には、本発明は、抗体断片の精製のプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の大規模で経済的な精製は、バイオテクノロジー産業にとってますます重要な課題となりつつある。一般に、タンパク質は、そのタンパク質についての遺伝子を含有する組換えプラスミドの挿入によって対象のタンパク質を産生するように改変された哺乳動物細胞系又は細菌細胞系を使用する細胞培養によって産生される。使用される細胞系が生物であるので、それらに、糖、アミノ酸、及び増殖因子を含有する複合増殖培地を与えられなければならない。対象のタンパク質は、ヒト治療薬として使用するのに十分な純度まで、細胞に与えた化合物の混合物から及び細胞自体（フィードストリーム（ｆｅｅｄ  ｓｔｒｅａｍ））の副産物から単離されなければならない。フィードストリーム由来の不純物に関して、ヒト投与に使用するためのタンパク質について保健機関によって設定される基準は、非常に高い。当技術分野において知られているタンパク質についての多くの精製方法は、たとえば、精製されることとなるタンパク質の生物学的活性を不可逆的に危険にさらし得、そのため適していない低若しくは高ｐＨ、高塩濃度、又は他の極限条件の適用を必要とするステップを含有する。したがって、十分な純度までの所望のタンパク質の分離は、大変な課題をもたらす。歴史的に、タンパク質精製手法は、精製されることとなるタンパク質及び望まれないタンパク質混入物の間のサイズ、荷電、及び溶解性の分子特性における差異に基づいてきた。これらのパラメーターに基づくプロトコールは、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、示差沈殿（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、及びその他同種のものを含む。
【０００３】
抗体及び抗体断片は、様々な治療分野においてますます重要となっている。抗体、抗体断片を産生するための最も重要な方法のうちの１つは、組換え技術によるものである。そのような技術は、所望の抗体又は抗体断片を発現させるために宿主細胞を使用し、これは、次いで、産生培地から分離され、精製される。
【０００４】
抗体は、グリコシル化を必要とし、そのため、一般に、真核細胞、特に、ＣＨＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＮＳ０、ＢＨＫ、又はＳｐ２／０細胞などの哺乳動物細胞を用いる真核生物発現系において発現される。真核生物発現系において、抗体などの発現された対象のタンパク質は、一般に、細胞培養培地の中に分泌される。培地は、続いて、たとえば遠心分離又はろ過によって、タンパク質分泌細胞から容易に分離することができる。
【０００５】
現在の産業用抗体精製プラットフォームはほとんどすべて、プロテインＡを使用する（たとえばＷＯ９８／２３６４５において記載される）。プロテインＡは、哺乳動物免疫グロブリンのＦｃ部分に結合する細菌黄色ブドウ球菌の細胞壁において見つけられる細胞表面タンパク質である。プロテインＡは、ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ２に対する高い親和性並びにヒトＩｇＭ、ＩｇＡ、及びＩｇＥ抗体に対する中程度の親和性を有する。したがって、プロテインＡ精製は、Ｆｃ部分を欠く抗体断片にあまり適していない。
【０００６】
グリコシル化を必要としないタンパク質は、好ましくは、グラム陰性菌などの原核細胞を用いる原核生物発現系において発現される。特に、グリコシル化を必要としない抗体、たとえばＦａｂ、Ｆａｂ’、又はｓｃＦｖなどの抗体断片は、好ましくは、そのような系において発現される。原核生物発現系、特に、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）系又は他のグラム陰性菌は、経済的に魅力的な方法において、たとえば抗体断片などの、グリコシル化を必要としないタンパク質の生産を可能にする。大腸菌におけるタンパク質の生産は、商品がより低コストであり、薬剤開発プロセスがより急速であるため、特に有益である（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ，  ２００３；  Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ，  ２００３）。原核生物、特に大腸菌タンパク質発現系は、当技術分野においてよく知られている（Ｓｗａｒｔｚ，２００１；Ｊａｎａ  ａｎｄ  Ｄｅｂ，２００５；Ｔｅｒｐｅ，２００６）。原核細胞は、細胞において発現された、対象の異種タンパク質を活発に分泌しない。しかしながら、大腸菌などのグラム陰性原核細胞は、抗体断片などの細胞において発現された異種タンパク質をそれらがジスルフィド結合を形成することができる細胞周辺腔の中に輸送するように改変することができる。細胞周辺腔からのこれらの異種タンパク質の単離は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の実質的な放出をももたらす原核細胞の外膜の破壊を必要とする。グラム陰性原核細胞の外膜を破壊し、続いて異種タンパク質を含有する細胞培養液を回収するための方法は、当技術分野においてよく知られている。大腸菌における抗体断片の生産はまた、切断型軽鎖、軽鎖のグルタチオン付加物、及び軽鎖二量体などの副産物の産生をももたらす（Ｂａｔｔｅｒｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【０００７】
大腸菌発現系などの原核生物発現系から収集される細胞培養液（フィードストリーム）、特に、グラム陰性菌からの細胞周辺細胞抽出物は、原核生物又は真核生物発現系において発現される対象の異種タンパク質から分離される必要があるＨＣＰ、細菌ＤＮＡ、及び内毒素の相対的な量及び組成において、真核生物発現系から収集される細胞培養液と実質的に異なる。ＨＣＰの濃度並びにＨＣＰの複雑性及び不均一性は、発現系又は細胞系及び細胞培養条件に依存する（Ａｒｕｎａｋｕｍａｒｉ，２００９）。原核生物発現系において、特にグラム陰性原核生物発現系において発現される抗体断片の精製は、そのため、異なる課題に直面し、異なるアプローチを必要とする（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ  ａｎｄ  Ｇｌｏｖｅｒ，２００１）。モノクローナル抗体断片の精製の基本原理は、当技術分野において知られている（Ｓｐｉｔａｌｉ，２００９）。微生物細胞において産生される活性成分としての抗体断片を含む、ＵＳ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）及びＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  Ａｇｅｎｃｙ（ＥＭＡ）によって現在承認されている２つの医薬品がある。セルトリズマブペゴール（Ｃｉｍｚｉａ（登録商標））は、ＴＮＦαに特異的に結合するＦａｂを含み、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）に特異的に結合するＦａｂ断片である。微生物フィードストリームからのラニビズマブの精製は、４つのクロマトグラフィーステップを用いるプロセスを使用して実行される（Ｗａｌｓｈ，２００７）。医薬品アブシキシマブ（ＲｅｏＰｒｏ（登録商標））は、ヒト血小板の糖タンパク質（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に結合し、血小板凝集を阻害するキメラヒトマウスモノクローナル抗体７Ｅ３のＦａｂ断片を含む。キメラ７Ｅ３抗体は、哺乳動物細胞培養における連続的な灌流によって産生される。４８Ｋｄ  Ｆａｂ断片は、パパインを用いる消化及びカラムクロマトグラフイーの後に精製完全長抗体から得られる。
【０００８】
アフィニティークロマトグラフィーは、対象のタンパク質（又はタンパク質の群）及びクロマトグラフィーマトリックスに連結された特異的なリガンドの間の可逆的な相互作用に基づいてタンパク質を分離する。対象のタンパク質及びクロマトグラフィーマトリックスに連結されたリガンドの間の相互作用は、静電気若しくは疎水的相互作用、ファンデルワールス力、及び／又は水素結合の結果とすることができる。親和性媒体から標的分子を溶離するために、相互作用は、競合的なリガンドを使用して特異的に又はｐＨ、イオン強度、若しくは極性を変化させることによって非特異的に逆転させることができる。アフィニティー精製は、クロマトグラフィーマトリックスに共有結合することができる生物特異的なリガンドを必要とする。連結されたリガンドは、標的分子に対するその特異的結合親和性を保持しなければならず、非結合物質を洗浄した後に、リガンド及び標的分子の間の結合は、標的分子が活性形態で取り出されるのを可能にするために可逆的でなければならない。その一般的な使用にもかかわらず、アフィニティークロマトグラフィーは、特に治療用タンパク質を精製するのに必要な工業規模で費用がかかる。
【０００９】
イオン交換クロマトグラフィーは、イオン化可能な分子を精製するために使用することができる。イオン化分子は、固相支持体マトリックスに付加された逆に荷電された分子とのそれらの荷電基の非特異的な静電的相互作用に基づいて分離され、それによって、固相とより強く相互作用するそれらのイオン化分子を遅延させる。それぞれのタイプのイオン化分子の正味の荷電及びマトリックスに対するその親和性は、荷電基の数、それぞれの基の荷電、及び荷電固相マトリックスとの相互作用について競合する分子の性質によって変動する。これらの差異は、イオン交換クロマトグラフィーによる様々な分子タイプの分析をもたらす。固相に結合された分子の溶離は、一般に、イオン交換マトリックスの荷電部位について溶質と競合するように緩衝剤のイオン強度（つまり伝導度）を増加させることによって達成される。ｐＨを変化させ、それによって溶質の荷電を変更することは、溶質の溶離を達成するための他の方法である。伝導度又はｐＨの変化は、緩やかなものであってもよい（勾配溶離）又は段階的なものであってもよい（段階溶離）。一般的な２つのタイプの相互作用が、知られている。正荷電表面と相互作用する負荷電アミノ酸側鎖（たとえばアスパラギン酸及びグルタミン酸）によって媒介される陰イオン交換クロマトグラフィー及び負荷電表面と相互作用する正荷電アミノ酸残基（たとえばリシン及びアルギニン）によって媒介される陽イオン交換クロマトグラフィー。陰イオン交換体は、弱いもの又は強いものとして分類することができる。弱陰イオン交換体上の荷電基は、弱塩基であり、これは、高ｐＨで、脱プロトン化され、そのため、その荷電を緩める。ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セルロースは、弱陰イオン交換体の例であり、アミノ基は、ｐＨ約９未満で正に荷電し得、より高いｐＨ値で徐々に荷電を失う。ＤＥＡＥ又はジエチル−（２−ヒドロキシ−プロピル）アミノエチル（ＱＡＥ）は、たとえば、対イオンとして塩化物を有する。
【００１０】
溶離緩衝剤のイオン強度の増加による溶離（溶離クロマトグラフィー）に対する代替物は、結合タンパク質よりも固定相に対して高い動的親和性を有する分子を使用する溶離である。イオン交換クロマトグラフィーを実行するこのモードは、置換クロマトグラフィーと呼ばれる。置換クロマトグラフィーは、溶質が移動相調整剤中に脱着されず、移動度の差異によって分離されるという点でクロマトグラフィーのあらゆる他のモードとは基本的に異なる（Ｔｕｇｃｕ，  ２００８）。置換の際に、分子は、フィードストリーム由来のいかなる構成成分よりも固定相に対する高い親和性を有する置換分子の前進性の衝撃波によって、クロマトカラムを下に移動するように強制される。高い保持力の、操作の他のモードと比較して、より高い産物濃度及び純度をもたらすのは、この強制的な移動であり、カラムの中への置換物溶液の持続的な注入が続く。
【００１１】
動的結合容量は、定められた流動条件下でカラム中のクロマトグラフィー樹脂に結合するであろう対象のタンパク質の量を説明する。クロマトグラフィー樹脂に対する動的結合容量は、実行条件（たとえば流速、ｐＨ、及び伝導度）、試料の起源、試料調製、並びに存在する他の結合不純物に依存性である。動的結合容量は、対象の既知濃度のタンパク質を含有する試料を導入し、カラム流出物（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）における濃度をモニターすることによって決定される（Ｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。イオン交換樹脂の動的結合容量は、対象のタンパク質が流出物中に回収され始める、導入の間のポイントとして定義される。典型的に、導入物と比較した、流出物中の対象のタンパク質の割合についての１０％の値は、このポイントを定めるために使用される（ＭｃＣｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。不純物除去のために、流出物中の不純物についての閾値は、用途に特有の基準によって設定される。
【００１２】
ＷＯ９９／５７１３４、ＷＯ２００４／０２４８６６、及びＷＯ２００７／１１７４９０は、イオン交換クロマトグラフィーを含むタンパク質又は抗体精製プロセスに関する。このプロセスは、哺乳動物細胞において産生される抗体を使用して例証される。ＷＯ２００９／０５８８１２は、陽イオン交換クロマトグラフィーを含む抗体精製プロセスに関する。このプロセスは、哺乳動物細胞において産生される抗体を使用して例証される。ＷＯ２００７／１０８９５５は、イオン交換クロマトグラフィーが後続する陽イオン交換クロマトグラフィーを含むタンパク質精製のツーステップ非親和性イオン交換クロマトグラフプロセスに関する。ＷＯ２００７／１０８９５５における実施例は、哺乳動物細胞において産生される完全ヒト抗体の精製について記載する。複数回の洗浄ステップは、陽イオン交換クロマトグラフィーの間に実行され、溶離液は、陰イオン交換クロマトグラフィーに先立って希釈される。Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ  ｅｔ  ａｌ．は、陽イオン交換クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーを使用する、実験室規模でのＦａｂ’の精製について記載する（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ＷＯ２００４／０３５７９２は、細菌細胞培養から精製される抗体断片調製物中のＰｈｏＳタンパク質不純物を低下させるために突然変異体ＰｈｏＳタンパク質を発現する大腸菌株の生成に関する。
【００１３】
ＣＤＰ８７０は、ＷＯ０１／９４５８５（その全体が参照によって本明細書において組み込まれる）に記載されるように、ＰＥＧ成分に化学的に連結された、遺伝的に改変された抗体断片（Ｆａｂ’）である。ＣＤＰ８７０は、強力なヒトＴＮＦα中和特性を有する。
【００１４】
原核生物、特に、大腸菌発現系などのグラム陰性菌から収集される細胞培養液から抗体断片を精製する方法についての当技術分野における必要性がある。非常に高い力価の抗体断片若しくはＨＣＰ又は抗体断片及びＨＣＰの両方を含有する細胞抽出物の処理をするのに適している、原核生物、特に、大腸菌発現系などのグラム陰性菌から収集される細胞周辺細胞抽出物から抗体断片を精製する方法についての当技術分野における特有の必要性がある。抗体断片の高力価発現は、経済的方法での大量の抗体断片の精製に適した方法を必要とする：カラムサイズ、緩衝剤使用量、及び処理時間の低下（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｄａｔａ  ｆｉｌｅ  １１−００２５−７６  ＡＥ，２００７）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
精製の必要条件及び課題は、真核細胞培養から精製される必要があるタンパク質と、細菌細胞培養から精製されたタンパク質について実質的に異なる。特有の難しさは、たとえば、存在する細菌宿主細胞タンパク質の量のために、タンパク質が、グラム陰性菌の細胞周辺細胞抽出物から精製される必要がある場合に直面する。さらなる難しさは、タンパク質が、異種タンパク質を発現するグラム陰性細菌培養物から非常に高度な濃度まで精製される必要がある場合に、克服される必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明者らは、驚いたことに、細胞周辺細胞抽出物からの抗体断片の精製のための新しいプロセスを発見し、プロセスは、高濃度の抗体断片を含む細胞周辺細胞抽出物にとって非常に効率的であり、適している。
【００１７】
本発明の態様では、細胞周辺細胞抽出物からの抗体断片の精製のためのプロセスであって、抗体断片を含有する混合物を陽イオン交換クロマトグラフィーにかけ、続いて溶離して、抗体断片を含有する第１の溶離液を生成する、抗体断片を捕捉するための第１のクロマトグラフィーステップ、及び第１の溶離液を陰イオン交換クロマトグラフィーにかけて不純物を捕捉し、抗体断片を含有する流出物を生成する、第２のクロマトグラフィーステップ、及び当該抗体断片の回収を含むプロセスを提供する。
【００１８】
他の態様では、本発明は、細胞周辺細胞抽出物からの抗体断片の精製のためのプロセスであって、抗体断片を含有する混合物を陽イオン交換クロマトグラフィーにかけ、続いて溶離して、抗体断片を含有する第１の溶離液を生成する、抗体断片を捕捉するための第１のクロマトグラフィーステップ；第１の溶離液に適用する第１の限外ろ過；精製された第１の溶離液を陰イオン交換クロマトグラフィーにかけて不純物を捕捉し、抗体断片を含有する流出物を生成する、第２のクロマトグラフィーステップ、及び流出物に適用する第２の限外ろ過、並びに当該抗体断片の回収から本質的に成るプロセスを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｃａｐｔｏ  Ｓ（商標））での第１の捕捉ステップから得られる、伝導度（点線）に沿った、紫外線の吸光度［ミリ吸光度単位（ｍＡＵ）で測定］（実線）によってモニターされるタンパク質（Ｆａｂ’を含む）のクロマトグラムを示す。クロマトグラムは、大容量をカラムに導入することができ、この間、いくつかのタンパク質が結合せず、伝導度の増加と共に少容量のＦａｂ’を含む結合タンパク質の回収が続くことを示す。
【図２】陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｃａｐｔｏ  Ｑ（商標））でのステップから得られるクロマトグラムを示す。クロマトグラムは、再生ピークにおいて回収された結合不純物と共に、Ｆａｂ’の非結合及び導入後の洗浄中のその出現を示す。
【図３】捕捉導入物、捕捉溶離液、及び陰イオン交換流出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図４】陰イオン交換クロマトグラフィー前（レーン２）及び後（レーン３）の試料中に存在する宿主細胞タンパク質を検出するためのウエスタンブロットを示す。
【図５】ＣＤＰ８７０のアミノ酸配列を示す。
【００２０】
［配列の簡単な説明］
配列番号１は、ＣＤＰ８７０のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列を示す。
【００２１】
配列番号２は、ＣＤＰ８７０のＣＤＲＨ２のアミノ酸配列を示す。
【００２２】
配列番号３は、ＣＤＰ８７０のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を示す。
【００２３】
配列番号４は、ＣＤＰ８７０のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列を示す。
【００２４】
配列番号５は、ＣＤＰ８７０のＣＤＲＬ２のアミノ酸配列を示す。
【００２５】
配列番号６は、ＣＤＰ８７０のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を示す。
【００２６】
配列番号７は、軽鎖可変領域ＣＤＰ８７０のヌクレオチド及び予測されるアミノ酸配列を示す。
【００２７】
配列番号８は、重鎖可変領域ＣＤＰ８７０のヌクレオチド及び予測されるアミノ酸配列を示す。
【００２８】
配列番号９は、移植抗ＴＮＦαＦａｂ  ＣＤＰ８７０軽鎖のアミノ酸配列を示す。
【００２９】
配列番号１０は、移植抗ＴＮＦαＦａｂ  ＣＤＰ８７０重鎖のアミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
第１の態様では、本発明は、細胞周辺細胞抽出物からの抗体断片の精製のためのプロセスであって、抗体断片を含有する、細胞周辺細胞抽出物などの混合物を陽イオン交換クロマトグラフィーにかけ、続いて溶離して、抗体断片を含有する第１の溶離液を生成する、抗体断片を捕捉するための第１のクロマトグラフィーステップ、及び第１の溶離液を陰イオン交換クロマトグラフィーにかけて不純物を捕捉し、抗体断片を含有する流出物を生成する、第２のクロマトグラフィーステップ、及び当該抗体断片の回収を含むプロセスに関する。
【００３１】
第２の態様では、本発明は、細胞周辺細胞抽出物からの抗体断片の精製のためのプロセスであって、抗体断片を含有する、細胞周辺細胞抽出物などの混合物を陽イオン交換クロマトグラフィーにかけ、続いて溶離して、抗体断片を含有する第１の溶離液を生成する、抗体断片を捕捉するための、第１のクロマトグラフィーステップ、第１の溶離液に適用する第１の限外ろ過、精製された第１の溶離液を陰イオン交換クロマトグラフィーにかけて不純物を捕捉し、抗体断片を含有する流出物を生成する、第２のクロマトグラフィーステップ、流出物に適用する第２の限外ろ過、及び当該抗体断片の回収から本質的に成るプロセスに関する。
【００３２】
本発明の第１の態様の第１の実施形態では、本発明の第１の態様によるプロセスは、２つのクロマトグラフィーステップのみを含む。
【００３３】
本発明の第２の態様によるプロセスにおける本発明の第２の態様の第１の実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィー後の限外ろ過及び陰イオン交換クロマトグラフィー後の限外ろ過は、タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）によって実行される。
【００３４】
本発明の第１又は第２の態様の第１の実施形態によるプロセスにおける本発明の第１又は第２の態様の第２の実施形態では、クロマトグラフィーステップはすべて、クロマトグラフィーカラムで実行される。
【００３５】
本発明の第１又は第２の態様の第１又は第２の実施形態によるプロセスにおける本発明の第１又は第２の態様の第３の実施形態では、第１のクロマトグラフィーステップの陽イオン交換クロマトグラフィーは、溶離モードにおいて実行される。
【００３６】
本発明の第１又は第２の態様の第２又は第３の実施形態によるプロセスにおける本発明の第１又は第２の態様の第４の実施形態では、第１のクロマトグラフィーステップの陽イオン交換クロマトグラフィーは、連続する順で以下のステップ
ａ）陽イオン交換カラムに、抗体断片を含有する、細胞周辺細胞抽出物などの混合物を導入するステップ、
ｂ）洗浄の間に、洗浄緩衝剤の伝導度、ｐＨ、及び塩濃度を変化させない、洗浄緩衝剤により陽イオン交換カラムを洗浄するステップ、並びに
ｃ）溶離緩衝剤により抗体断片を溶離するステップ
を含む。
【００３７】
本発明の第１又は第２の態様の第４の実施形態によるプロセスにおける本発明の第１又は第２の態様の第５の実施形態では、洗浄緩衝剤のｐＨは、第１のクロマトグラフィーステップ前の、抗体断片を含有する、細胞周辺細胞抽出物などの混合物のｐＨと同一である。
【００３８】
本発明の第１又は第２の態様の第１、第２、第３、第４、又は第５の実施形態によるプロセスにおける本発明の第１又は第２の態様の第６の実施形態では、第１のクロマトグラフィーステップ前の、抗体断片を含有する、細胞周辺細胞抽出物などの混合物は、４．０〜５．０のｐＨ、好ましくは４．３〜４．７のｐＨ、より好ましくは４．３〜４．５のｐＨ、最も好ましくは４．５のｐＨを有する。
【００３９】
本発明の第１又は第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、又は第６の実施形態によるプロセスにおける本発明の第１又は第２の態様の第７の実施形態では、抗体断片を含有し、最初の捕捉ステップとして陽イオン交換クロマトグラフィーにかける混合物は、少なくとも１．５ｇ／Ｌ、若しくは少なくとも３ｇ／Ｌ、若しくは少なくとも４ｇ／Ｌ、若しくは少なくとも５ｇ／Ｌ、若しくは少なくとも７．５ｇ／Ｌ、若しくは少なくとも１０ｇ／Ｌ、若しくは少なくとも２０ｇ／Ｌ、若しくは少なくとも４０ｇ／Ｌの濃度、又は３〜４０ｇ／Ｌの濃度、若しくは４〜２０ｇ／Ｌの濃度、若しくは５〜１５ｇ／Ｌの濃度の総タンパク質を含有する。
【００４０】
本発明の第１又は第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、又は第７の実施形態によるプロセスにおける本発明の第１又は第２の態様の第８の実施形態では、抗体断片を含有し、最初の捕捉ステップとして陽イオン交換クロマトグラフィーにかけられている混合物は、少なくとも３ｇ／Ｌ、若しくは少なくとも４ｇ／Ｌ、若しくは少なくとも５ｇ／Ｌ、若しくは少なくとも７．５ｇ／Ｌ、若しくは少なくとも１０ｇ／Ｌ、若しくは少なくとも２０ｇ／Ｌの濃度、又は３〜２０ｇ／Ｌの濃度、若しくは４〜５０ｇ／Ｌの濃度、若しくは５〜１０ｇ／Ｌの濃度の抗体断片を含有する。
【００４１】
本発明の第１又は第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、又は第８の実施形態によるプロセスにおける本発明の第１又は第２の態様の第９の実施形態では、最初の捕捉ステップの陽イオン交換クロマトグラフィーは、少なくとも３００ｃｍ／ｈ、好ましくは３００〜２０００ｃｍ／ｈ、より好ましくは３５０〜１５００ｃｍ／ｈさらにより好ましくは３５０〜１０００ｃｍ／ｈ、最も好ましくは、４００〜７００ｃｍ／ｈの流速で実行される。
【００４２】
本発明の第１又は第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、又は第９の実施形態によるプロセスにおける本発明の第１又は第２の態様の第１０の実施形態では、最初の捕捉ステップの陽イオン交換クロマトグラフィーは、６ｍＳ／ｃｍ以下、好ましくは６〜２ｍＳ／ｃｍ、より好ましくは５〜３ｍＳ／ｃｍ、さらにより好ましくは４．５〜３．５ｍＳ／ｃｍの伝導度で実行される。
【００４３】
本発明の第１又は第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、又は第１０の実施形態によるプロセスにおける本発明の第１又は第２の態様の第１１の実施形態では、最初の捕捉ステップの陽イオン交換クロマトグラフィーは、アガロースの架橋ビーズ状形態（たとえばＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）又はＳｕｐｅｒｏｓｅ（商標））、修飾メタクリレートポリマー（たとえばテンタクル、ヒドロキシル化）；シリカ；セラミック、及びスチレンジビニルベンゼンを含むが、これらに限定されない当技術分野において知られている適した物質の樹脂に連結された、スルホニル、スルホプロピル、又はカルボキシメチルを含む樹脂上で実行される。
【００４４】
本発明の第１又は第２の態様の第１１の実施形態によるプロセスにおける本発明の第１又は第２の態様の第１２の実施形態では、最初の捕捉の陽イオン交換クロマトグラフィーの樹脂は、少なくとも５０ｇ／Ｌの樹脂、又は少なくとも６０ｇ／Ｌの樹脂、又は少なくとも７５ｇ／Ｌの樹脂、又は少なくとも１５０ｇ／Ｌ樹脂、又は５０〜１５０ｇ／Ｌ樹脂、又は６０〜１００ｇ／Ｌ樹脂、又は５０〜７５ｇ／Ｌ樹脂の抗体断片に対する動的結合容量を有する。
【００４５】
本発明の第１又は第２の態様の第１１又は第１２の実施形態によるプロセスにおける本発明の第１又は第２の態様の第１３の実施形態では、最初の捕捉の陽イオン交換クロマトグラフィーの樹脂は、少なくとも５０μｍ、好ましくは６０〜３００μｍ、より好ましくは７０〜２００μｍ、さらにより好ましくは８０〜１００μｍの平均粒径を有する。
【００４６】
本発明の第１又は第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、又は第１３の実施形態によるプロセスにおける本発明の第１又は第２の態様の第１４の実施形態では、最初の捕捉ステップにおいて陽イオン交換クロマトグラフィーにかけられる抗体断片を含有する混合物は、約２００μｇ／ｍｌ〜１０，０００μｇ／ｍｌ、約５００μｇ／ｍｌ〜５０００μｇ／ｍｌ、約１０００μｇ／ｍｌ〜４０００μｇ／ｍｌ、又は約２０００μｇ／ｍｌ〜４０００μｇ／ｍｌの量の細菌宿主細胞タンパク質を含有する。
【００４７】
本発明の第１又は第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、又は第１４の実施形態によるプロセスにおける本発明の第１又は第２の態様の第１５の実施形態では、最初の捕捉ステップの陽イオン交換クロマトグラフィーにおいて、１リットルの樹脂当たり５〜１００ｇの抗体断片、１リットルの樹脂当たり１０〜９０ｇの抗体断片、又は１リットルの樹脂当たり２０〜７５ｇの抗体断片が導入される。
【００４８】
本発明の第１又は第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、又は第１５の実施形態によるプロセスにおける本発明の第１又は第２の態様の第１６の実施形態では、第２のクロマトグラフィーステップにおける陰イオン交換クロマトグラフィーは、アガロースの架橋ビーズ状形態（たとえばＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）又はＳｕｐｅｒｏｓｅ（商標））、修飾メタクリレートポリマー（たとえばテンタクル、ヒドロキシル化）；シリカ；セラミック、及びスチレンジビニルベンゼンを含むが、これらに限定されない当技術分野において知られている適した物質の樹脂に連結された、四級アンモニウム（Ｑ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、又はトリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）を含む樹脂上で実行される。第２のクロマトグラフィーステップはまた、セルロース及びポリエチレンを含むが、これらに限定されない当技術分野に知られている適した物質の膜に連結された、四級アンモニウム又はポリ（アリルアミン）を含む膜上で実行されてもよい。
【００４９】
本発明の第１又は第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、又は第１６の実施形態によるプロセスにおける本発明の第１又は第２の態様の第１７の実施形態では、第２のクロマトグラフィーステップにおける陰イオン交換クロマトグラフィーカラムは、少なくとも５０μｍ、好ましくは６０〜３００μｍ、より好ましくは７０〜２００μｍ、さらにより好ましくは８０〜１００μｍの平均の特定のサイズを有する。
【００５０】
本発明の第１又は第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、又は第１７の実施形態によるプロセスにおける本発明の第１又は第２の態様の第１８の実施形態では、第２のクロマトグラフィーステップにおける陰イオン交換クロマトグラフィーは、６〜１０のｐＨ、好ましくは７〜９、より好ましくは８〜９、さらにより好ましくは８．５のｐＨで実行される。
【００５１】
本発明の第１又は第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、又は第１８の実施形態によるプロセスにおける本発明の第１又は第２の態様の第１９の実施形態では、第２のクロマトグラフィーステップにおける陰イオン交換クロマトグラフィーは、実行され、２０ｇ／Ｌの樹脂を超える、好ましくは、３０ｇ／Ｌの樹脂を超える、さらにより好ましくは４０ｇ／Ｌの樹脂を超える、又は２０〜８０ｇ／Ｌ樹脂、若しくは２０〜４０ｇ／Ｌ樹脂のプロセス関連性の不純物に対する結合容量を有する。
【００５２】
本発明の第１又は第２の態様の第２０の実施形態では、本発明の第１又は第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、又は第１９の実施形態によるプロセスは、高速タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＨＰＴＦＦ）ステップを含まない。
【００５３】
本発明の第１又は第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、又は第２０の実施形態によるプロセスにおける本発明の第１又は第２の態様の第２１の実施形態では、回収される抗体断片は、１５０ピーピーエム（ｐａｒｔｓ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ：ｐｐｍ）以下、又は１２０ｐｐｍ以下、又は１００ｐｐｍ以下の量の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含有する。
【００５４】
本発明の第１又は第２の態様の実施形態のいずれかによるプロセスにおけるさらなる実施形態では、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、又はラクダ科の動物の抗体である。
【００５５】
本明細書において使用される用語「アフィニティークロマトグラフィー」は、対象のタンパク質又は対象の抗体が、生物特異的なリガンドに可逆的に且つ特異的に結合する、タンパク質分離技術を指す。好ましくは、生物特異的なリガンドは、クロマトグラフィーの固相物質に共有結合され、溶液がクロマトグラフィーの固相物質と接触するとき、溶液中の対象のタンパク質に接触可能である。対象のタンパク質（たとえば抗体）は、クロマトグラフィーのステップの間に生物特異的なリガンド（たとえば抗原、基質、補助因子、又はホルモン）に対してその特異的結合親和性を保持するが、混合物中の他の溶質及び／又はタンパク質は、認め得るほどに又は特異的にリガンドに結合しない。固定されたリガンドへの対象のタンパク質の結合は、混入タンパク質又はタンパク質不純物がクロマトグラフィーの媒体を通過するのを可能にするが、対象のタンパク質は、固相物質上の固定されたリガンドに特異的に結合したままである。特異的に結合した、対象のタンパク質は、次いで、低ｐＨ、高ｐＨ、高塩、競合リガンド、及びその他同種のものにより、固定されたリガンドから活性形態で取り出され、溶離緩衝剤と共にクロマトカラムを通過し、カラムをより早期に通過させた混入タンパク質又はタンパク質不純物がない。任意の物質を、そのそれぞれの特異的結合タンパク質、たとえば抗体の精製のためのリガンドとして使用することができる。
【００５６】
用語「アグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）」及び「非グリコシル化」は、本明細書において区別なく使用され、抗体などのタンパク質へのグリコシル成分又は炭水化物成分の特異的な翻訳後の追加の欠如を指す。
【００５７】
本明細書において使用される用語「抗体」（単数又は複数）は、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含むモノクローナル又はポリクローナル四量体完全長抗体を指す。免疫グロブリン（単数又は複数）という用語は、それぞれ、「抗体」（単数又は複数）と同義的に使用される。本明細書において使用される用語「抗体」（単数又は複数）は、当技術分野において知られている組換え技術によって生成される組換え抗体を含むが、これらに限定されない。「抗体」（単数又は複数）は、ヒト、非ヒト霊長動物（たとえば、チンパンジー、ヒヒ、アカゲザル、若しくはカニクイザル由来などのヒト）、げっ歯動物（たとえばマウス、ラット、ウサギ、若しくはモルモット由来）、ヤギ、ウシ、又はウマの種などの、哺乳動物種由来のものを含む、任意の起源のものとすることができる。本明細書における抗体は、対象の「抗原」に対するものである。好ましくは、抗原は、生物学的に重要なポリペプチドであり、疾患又は障害に罹患している哺乳動物への抗体の投与は、その哺乳動物において治療上の効能をもたらしてもよい。しかしながら、非ポリペプチド抗原に対する抗体もまた、企図される。抗原がポリペプチドである場合、それは、増殖因子又はサイトカインなどの、膜貫通分子（たとえば受容体）又はリガンドであってもよい。本発明によって包含される、抗体に対する好ましい分子標的は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、及びＣＤ４０−ＬなどのＣＤポリペプチド；ＦｃＲＮ；ＯＸ４０；ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、又はＨＥＲ４受容体などのＨＥＲ受容体ファミリーのメンバー；ＬＦＡ−１、Ｍａｃ１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ、及びそのα又はβサブユニットを含むａｖ／ｂ３インテグリンなどの細胞接着分子（たとえば抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８、又は抗ＣＤ１１ｂ抗体）；ＩＬ−１α及びβ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７形態、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＴＮＦα、及びＴＮＦβなどのケモカイン及びサイトカイン又はそれらの受容体；ＶＥＧＦなどの増殖因子；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ−４；ポリペプチドＣ；などを含む。
【００５８】
本明細書において使用される用語「抗体断片」（単数又は複数）は、アグリコシル化抗体又は抗体のアグリコシル化部分、一般に、その抗原結合領域又は可変領域を指す。抗体断片の例は、Ｆｃ部分を欠く又は有していない任意の抗体を含む。抗体断片の例はまた、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片；二重特異性抗体；三重特異性抗体（ｔｒｉａｂｏｄｙ）；四重特異性抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）；ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）；Ｄｏｍａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（商標）などの、単一の、２つ、又は３つの免疫グロブリンドメインから本質的に成る抗体（単数又は複数）；単鎖抗体；上記のもののいずれかの二特異性、三特異性（ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）、四特異性（ｔｅｔｒａｓｐｅｃｉｆｉｃ）、又は多特異性変異体をも含む。本明細書において使用される用語「抗体断片」（単数又は複数）はまた、ラクダ科の動物の抗体（たとえばＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（商標）などの、ラクダ又はラマ由来の）及びその誘導体をも指す。抗体断片は、当技術分野においてよく知られている（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，２００５）。様々な技術は、抗体断片の産生のために開発されており、当技術分野において知られている（Ｇｌｏｖｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ，２００４）。本明細書において使用される用語「抗体断片」（単数又は複数）は、ヒト、ヒト化、霊長動物化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）、及びキメラ抗体断片を含む。
【００５９】
本明細書において使用される用語「緩衝剤」は、溶液におけるその存在によって、ｐＨにおける単位変化を引き起こすために追加されなければならない酸又はアルカリの量を増加させる物質を指す。緩衝液は、その酸−塩基コンジュゲート構成成分の作用によってｐＨにおける変化に抵抗する。生物学的試薬と共に使用するための緩衝液は、溶液のｐＨが生理的な範囲内にあるように、一定の濃度の水素イオンを一般に維持することができる。従来の緩衝剤構成成分は、有機及び無機塩類、酸、並びに塩基を含むが、これらに限定されない。
【００６０】
本明細書において使用される用語「クロマトグラフィー」は、混合物の個々の溶質が、移動相の影響下で又は結合及び溶離プロセスにおいて、固定された媒体を通って移動する速度の差異の結果として、混合物中の対象の物質が、混合物中の他の物質から分離されるプロセスを指す。
【００６１】
本明細書において使用されるクロマトグラフィーに関連する用語「クロマトグラフィーカラム」又は「カラム」は、クロマトグラフィーマトリックス又は樹脂により充填されるシリンダー又はよく中空の柱の形態をしている容器を指す。クロマトグラフィーマトリックス又は樹脂は、精製のために使用される物理的及び／又は化学的な特性を提供する物質である。
【００６２】
本明細書において使用される用語「伝導度」は、水溶液が２つの電極の間で電流を伝導する能力を指す。溶液において、電流は、イオンの移動によって生じる。そのため、水溶液中に存在するイオンの量が増加すると共に、溶液はより高い伝導度を有するようになるであろう。伝導度についての測定の単位は、センチメートル当たりのミリジーメンス（ｍＳ／ｃｍ）であり、伝導度計を使用して測定することができる。溶液の伝導度は、その中のイオンの濃度を変化させることによって変更されてもよい。たとえば、溶液中の緩衝剤の濃度及び／又は塩（たとえばＮａＣｌ又はＫＣｌ）の濃度は、所望の伝導度を達成するために変更されてもよい。
【００６３】
本明細書において使用される用語「溶離液」は、クロマトグラフィー物質への当該物質の結合及びクロマトグラフィー物質から物質を分離するための溶離緩衝剤の追加の後に得られる物質（たとえば抗体断片又は混入物質）を含む液体組成物を指す。溶離液は、精製プロセスにおけるステップに関して言及されてもよい。たとえば、用語「第１の溶離液」は、第１のクロマトグラフィーのステップからの溶離液を指し、用語「第２の溶離液」は、第２のクロマトグラフィーのステップからの溶離液を指す、などである。
【００６４】
本明細書において使用される用語「流出物」は、分子が結合を伴うことなく物質を通過するように、当該物質を含む混合物にクロマトグラフィー物質を通過させることによって得られる物質（たとえば抗体断片又は混入物質）を含む液体組成物を指す。
【００６５】
本明細書において使用される用語「混合物」は、これもまた存在し得る他の物質から精製されることが要求される、対象の少なくとも１つの抗体断片を含む、少なくとも部分的に液体の組成物を指す。混合物は、たとえば、懸濁液、水溶液、有機溶剤系、又は水性／有機混合溶媒若しくは溶液とすることができる。混合物は、多くの場合、多くの生体分子（タンパク質、抗体、ホルモン、及びウイルスなど）、小分子（塩、糖、脂質など）、並びにさらに粒子状物質を含む複雑な混合物又は溶液である。生物学的起源の典型的な混合物は、水溶液又は懸濁液として出発してもよいが、それはまた、溶媒沈殿、抽出、及びその他同種のものなどの早期の分離ステップにおいて使用される有機溶媒を含有してもよい。
【００６６】
本明細書において使用される用語「細胞周辺細胞抽出物」は、外膜の破壊及び細胞周辺腔からの物質の放出の後に、グラム陰性原核細胞の細胞培養物から得られる組成物を指す。細胞周辺細胞抽出物は、液体であることがよくあり、また、特定の物質又は気体を含有してもよい。用語「細胞周辺細胞抽出物」はまた、たとえば、不溶性物質を除去するために、細胞周辺腔からの収集の後にさらに処理されてもよい液体組成物を含む。
【００６７】
用語「精製」又は「精製すること」又は「精製された」は、抗体又は抗体断片などの、対象のタンパク質を含有する混合物から、ＨＣＰ、ＤＮＡ、又は塩などの不要な物質を除去する又は低下させるプロセスを指す。「精製ステップ」は、対象のタンパク質を含む組成物において１５０ｐｐｍ未満の、その代わりに、１２０ｐｐｍ未満、１００ｐｐｍ未満、９０ｐｐｍ未満、８０ｐｐｍ未満、７０ｐｐｍ未満、６０ｐｐｍ未満、５０ｐｐｍ未満、４０ｐｐｍ未満、３０ｐｐｍ未満、２０ｐｐｍ未満、１０ｐｐｍ未満、５ｐｐｍ未満、又は３ｐｐｍ未満のＨＣＰを含む組成物を指すために本明細書において使用される「均一な」組成物をもたらす、全体的な精製プロセスの一部であってもよい。
【００６８】
本明細書において使用される用語「限外ろ過」は、たとえば対象のタンパク質を含有する、溶液などの混合物が、濃縮又は精製の目的のために膜を通過する、圧力により駆動されるプロセスを指す。限外ろ過膜は、典型的に、逆浸透膜及び精密ろ過膜の平均孔径の間である１〜５０ｎｍの平均孔径を有する。孔径は、ある分子重量のタンパク質を保持するその能力によって通常、定量化され、ｋＤａの名目分子量カットオフ値（ＮＭＷＣＯ）の表現で通常、示される。限外ろ過は、その速度が溶質のサイズに依存性である、与えられる圧力駆動力に応じて膜を横切る様々な物質のろ過の速度の差異に基づいて溶質を分離する。したがって、混合物中の溶質又は溶液は、サイズ差異に基づいて分離される。限外ろ過は、タンパク質濃縮、緩衝剤交換、及び脱塩、タンパク質精製、ウイルス排除、並びに浄化のための下流のプロセシングにおいて使用されることがよくある。用語「限外ろ過」は、溶液などの混合物が限外ろ過膜を水平に通過するタンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）を含む。用語「限外ろ過」は、溶質がサイズだけでなく、サイズ及び荷電に基づいて分離される高速タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＨＰＴＦＦ）を含まない。
【００６９】
本明細書において使用される用語「総タンパク質」は、任意のサイズのタンパク質断片を含む試料中のすべてのタンパク質を本質的に指す。しばしば、細胞周辺細胞抽出物又は他の細胞培養回収物に関して、「総タンパク質」は、試料中に含有されるＨＣＰ及び細胞培養において発現される異種タンパク質の両方を指す。総タンパク質は、当技術分野においてよく知られている方法を使用して決定することができる。
【００７０】
本発明の方法に従って精製することができる抗体断片は、組換え抗体断片をコードする１つ又は複数の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を培養することによって産生することができる。宿主細胞は、好ましくは原核細胞、好ましくはグラム陰性細菌である。より好ましくは、宿主細胞は、大腸菌細胞である。タンパク質発現のための原核生物宿主細胞は、当技術分野においてよく知られている（Ｔｅｒｐｅ，２００６）。宿主細胞は、抗体断片などの対象のタンパク質を産生するように遺伝的に改変された組換え細胞である。組換え大腸菌宿主細胞は、ＭＣ４１００、ＴＧ１、ＴＧ２、ＤＨＢ４、ＤＨ５α、ＤＨ１、ＢＬ２１、Ｋ１２、ＸＬ１Ｂｌｕｅ、及びＪＭ１０９などを含む、任意の適した大腸菌株に由来してもよい。１つの例は、組換えタンパク質発酵のための一般に使用される宿主株である大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）である。抗体断片はまた、修飾大腸菌株、たとえば代謝突然変異体又はプロテアーゼ欠損大腸菌株を培養することによって産生することができる。
【００７１】
本発明の方法に従って精製することができる抗体断片は、タンパク質の性質、産生の規模、及び使用される大腸菌株に依存して、大腸菌宿主細胞の周辺質又は宿主細胞培養上清において典型的に見つけられる。これらのコンパートメントにタンパク質を向けるための方法は、当技術分野においてよく知られている（Ｍａｋｒｉｄｅｓ，１９９６）。大腸菌の周辺質にタンパク質を導くための適したシグナル配列の例は、大腸菌ＰｈｏＡ、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＴ、ＬａｍＢ、及びＯｍｐＦシグナル配列を含む。タンパク質は、天然の分泌経路に依存することによって又はタンパク質分泌を引き起こすための外膜の限られた漏出の誘発によって上清に向けられてもよく、これらの例は、ｐｅｌＢリーダー、プロテインＡリーダー、バクテリオシン放出タンパク質の同時発現の使用、培地へのグリシンの追加に加えた、マイトマイシン誘発性のバクテリオシン放出タンパク質、及び膜透過処理のためのｋｉｌ遺伝子の同時発現である。最も好ましくは、本発明の方法において、組換えタンパク質は、宿主大腸菌の周辺質において発現される。
【００７２】
大腸菌宿主細胞における組換えタンパク質の発現はまた、誘発性の系の制御下にあってもよく、大腸菌における組換え抗体の発現は、誘発性のプロモーターの制御下にある。大腸菌における使用に適した多くの誘発性のプロモーターは、当技術分野においてよく知られており、プロモーターに依存し、組換えタンパク質の発現は、温度又は増殖培地における特定の物質の濃度などの因子を変化させることによって誘発することができる。誘発性のプロモーターの例は、ラクトース又は非加水分解性ラクトースアナログ、イソプロピル−ｂ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により誘発性である大腸菌ｌａｃ、ｔａｃ、及びｔｒｃプロモーター並びにそれぞれホスフェート、トリプトファン、及びＬ−アラビノースによって誘発されるｐｈｏＡ、ｔｒｐ、及びａｒａＢＡＤプロモーターを含む。発現は、たとえば、誘発因子の追加又は誘発が温度依存性である場合、温度の変化によって誘発されてもよい。組換えタンパク質発現の誘発が、培養物への誘発因子の追加によって達成される場合、誘発因子は、たとえば１回若しくは複数回の追加によって又は飼料を通しての誘発因子の緩やかな追加によって、発酵系及び誘発因子に依存して、任意の適した方法によって追加されてもよい。誘発因子の追加及びタンパク質発現の実際の誘発の間に遅延があってもよい、たとえば誘発因子がラクトースである場合、任意の先在する炭素源がラクトースより前に利用されると同時に、タンパク質発現の誘発が生じる前に、遅延があってもよいことが十分に理解されるであろう。
【００７３】
大腸菌宿主細胞培養物（発酵）は、大腸菌の増殖及び組換えタンパク質の発現を支持する任意の培地において培養されてもよい。培地は、たとえば（Ｄｕｒａｎｙ  Ｏ，２００４）において記載されるものなどの任意の合成培地であってもよい。
【００７４】
大腸菌宿主細胞の培養は、必要とされる生産規模に依存して、振盪フラスコ又は発酵槽などの任意の適した容器において行われてもよい。１，０００リットル〜約１００，０００リットルの容量を有する様々な大規模発酵槽が利用可能である。好ましくは、１，０００〜５０，０００リットル、より好ましくは、１，０００〜１０，０００又は１２，０００リットルの発酵槽が使用される。０．５〜１，０００リットルの容量を有する、より小規模の発酵槽もまた、使用されてもよい。
【００７５】
大腸菌の発酵は、タンパク質及び必要とされる収率に依存して、任意の適した系、たとえば、連続、回分又は半回分モードで実行されてもよい。回分モードは、使用されてもよく、栄養素又は誘発因子の追加は、必要とされる場合、１回である。その代わりに、半回分培養は、使用されてもよく、培養物は、発酵槽中に最初に存在する栄養素を使用して維持することができる最大比増殖速度で回分モードの前誘発で増殖され、１つ又は複数の栄養素供給管理形態は、発酵が完了するまで増殖速度を制御するために使用される。半回分モードはまた、大腸菌宿主細胞の代謝を制御し、より高度な細胞密度に達するのを可能にするために、前誘発に使用されてもよい。
【００７６】
所望の場合、宿主細胞は、発酵培地からの収集にかけられてもよい、たとえば、宿主細胞は、遠心分離、ろ過、又は濃縮によって試料から収集されてもよい。特に、本発明の方法は、治療用の品質の抗体の大規模工業生産に適している。
【００７７】
一実施形態では、本発明によるプロセスは、陽イオン交換クロマトグラフィー捕捉ステップ前に、細胞培養回収物の遠心分離のステップ、その後に続く、抽出緩衝剤の追加による宿主細胞の懸濁を含む。
【００７８】
抗体断片などの対象のタンパク質が宿主細胞の細胞周辺腔中に見つけられる大腸菌発酵プロセスについては、宿主細胞からタンパク質を放出することが必要とされる。放出は、機械若しくは加圧処理、凍結融解処理、浸透圧衝撃、抽出剤、又は熱処理による細胞溶解などの、任意の適した方法によって達成されてもよい。タンパク質放出のためのそのような抽出方法は、当技術分野においてよく知られている。
【００７９】
好ましい実施形態では、抽出緩衝剤は、試料に追加され、試料は、次いで、熱処理ステップにかけられる。熱処理ステップは、好ましくは、米国特許第５，６５５，８６６号において詳細に記載されるとおりである。熱処理ステップは、他の抗体関連性の物質の除去を促進することによって、可溶性の、正確にフォールドされ、且つ構築された抗体断片の試料を得ることを可能にする。
【００８０】
熱処理ステップは、試料を所望の高い温度にかけることによって実行される。最も好ましくは、熱処理ステップは、３０℃〜７０℃の範囲内で実行される。温度は、所望されるように選択することができ、精製についての抗体の安定性に依存してもよい。他の実施形態では、温度は、４０℃〜６５℃の範囲内に、好ましくは、４０℃〜６０℃の範囲内に、より好ましくは、４５℃〜６０℃の範囲内に、さらにより好ましくは、５０℃〜６０℃の範囲内にあり、最も好ましくは、５５℃〜６０℃、５８℃〜６０℃、又は５９℃である。したがって、最低温度は、３０℃、３５℃、又は４０℃であり、最高温度は、６０℃、６５℃、又は７０℃である。
【００８１】
熱処理ステップは、好ましくは、長時間実行される。熱処理の長さは、好ましくは、１〜２４時間、より好ましくは、４〜１８時間、さらにより好ましくは、６〜１６時間、最も好ましくは、１０〜１４時間、又は１０〜１２時間、たとえば１２時間である。したがって、熱処理のための最小の時間は、１、２、又は３時間であり、最大の時間は、２０、２２、又は２４時間である。
【００８２】
特定の実施形態では、熱処理は、１０〜１６時間、５０℃〜６０℃で、より好ましくは、１０〜１２時間、５９℃で実行される。当業者は、当該試料及び産生されている抗体の特徴に適するように温度及び時間を選択することができることを理解するであろう。
【００８３】
抽出のステップの後に、抗体断片などの対象のタンパク質を含有する混合物は、ｐＨを調整するステップ前に、遠心分離及び／又はろ過のステップにかけられてもよい。
【００８４】
さらなる実施形態では、本発明の第１又は第２の態様の実施形態のいずれかによるプロセスは、ＶＥＧＦ−Ａ、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体、Ｃ５、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＴＮＦα、ＩＬ１β、ＣＤ４０−Ｌ、ＯＸ４０、又はＩＣＯＳに特異的に結合する抗体断片、たとえばＦａｂ又はｓ  Ｆａｂ’で実行される。
【００８５】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の第１又は第２の態様の実施形態のいずれかによるプロセスは、ＷＯ  ０１／０９４５８５（この内容は参照によって本明細書において組み込まれる）において記載されるように、ヒトＴＮＦα、より好ましくは、ＣＤＰ８７０に対して特異性を有する抗体断片である抗体断片を含む細胞周辺細胞抽出物で実行される。
【００８６】
一実施形態では、ヒトＴＮＦαに対して特異性を有する抗体断片は、重鎖を含み、可変ドメインは、ＣＤＲＨ１について配列番号１において示される配列、ＣＤＲＨ２について配列番号２において示される配列、又はＣＤＲＨ３について配列番号３において示される配列を有するＣＤＲを含む。
【００８７】
一実施形態では、抗体断片は、ＣＤＲＬ１について配列番号４において示される配列、ＣＤＲＬ２について配列番号５において示される配列、又はＣＤＲＬ３について配列番号６において示される配列を有するＣＤＲを含む。
【００８８】
一実施形態では、抗体断片は、ＣＤＲＨ１について配列番号１において示される配列、ＣＤＲＨ２について配列番号２において示される配列、又はＣＤＲＨ３について配列番号３において示される配列を有するＣＤＲ及びＣＤＲＬ１について配列番号４において示される配列、ＣＤＲＬ２について配列番号５において示される配列、又はＣＤＲＬ３について配列番号６において示される配列を有するＣＤＲを含む。
【００８９】
一実施形態では、抗体断片は、ＣＤＲＨ１についての配列番号１、ＣＤＲＨ２についての配列番号２、ＣＤＲＨ３についての配列番号３、ＣＤＲＬ１についての配列番号４、ＣＤＲＬ２についての配列番号５、及びＣＤＲＬ３についての配列番号６を含む。
【００９０】
抗体断片は、好ましくは、ＣＤＲ移植抗体断片分子であり、典型的に、可変ドメインは、ヒトアクセプターフレームワーク領域及び非ヒトドナーＣＤＲを含む。
【００９１】
好ましくは、抗体断片は、軽鎖可変ドメインＣＤＰ８７０（配列番号７）及び重鎖可変ドメインＣＤＰ８７０（配列番号８）を含む。
【００９２】
抗体断片は、修飾Ｆａｂ断片であることが好ましく、修飾は、エフェクター又はレポーター分子の付加を可能にするための、１つ又は複数のアミノ酸のその重鎖のＣ末端への追加である。好ましくは、さらなるアミノ酸は、エフェクター又はレポーター分子が付加されてもよい、１つ又は２つのシステイン残基を含有する修飾ヒンジ領域を形成する。そのような修飾Ｆａｂ断片は、好ましくは、配列番号１０として示される配列を含む又はそれから成る重鎖及び配列番号９として示される配列を含む又はそれから成る軽鎖を有する。
【００９３】
さらなる実施形態では、本発明の第１又は第２の態様の実施形態のいずれかによるプロセスは、アブシキシマブ、ラニビズマブ、パキセリズマブ、ＣＤＰ４８４、又はＣＤＰ７６５７で実行される。
【００９４】
平衡化
本発明のさらなる実施形態では、最初の捕捉ステップのための陽イオン交換クロマトグラフィーカラムは、必要とされるｐＨ及び伝導度で緩衝するため（たとえば、ｐＨ５の５０ｍＭ酢酸ナトリウム又はｐＨ４．０の５０ｍＭ乳酸ナトリウム）に、適した組成の陰イオン緩衝剤により平衡化される。平衡化は、少なくとも２カラム容量の平衡化緩衝剤を使用して達成することができるが、また、１Ｍ  ＮａＣｌを含有する、２カラム容量の緩衝剤（カラムが、関連する対カチオンにより十分に満たされていることを確実にするために）、その後に続く、少なくとも２カラム容量の平衡化緩衝剤を用いる２ステップの平衡化プロセスを含んでいてもよい。
【００９５】
本発明のさらなる実施形態では、第２のクロマトグラフィーステップの陰イオン交換クロマトグラフィーカラムは、平衡化緩衝剤が理想的には陽イオン緩衝剤、たとえば、ｐＨ８．０の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ又はｐＨ７．０の２０ｍＭ  ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＨＣｌであるという点を除いて、同じ方法で平衡化される。陰イオン交換クロマトグラフィーカラムの平衡化はまた、１Ｍ  ＮａＣｌを含有する緩衝剤（カラムが、関連する対アニオンにより十分に満たされていることを確実にするために）、その後に続く、平衡化緩衝剤を用いる２ステップ平衡化プロセス又は平衡化緩衝剤を直接用いる単一のステップを使用して達成することができる。
【００９６】
洗浄
本発明のさらなる実施形態では、最初のステップのために陽イオン交換クロマトグラフィーカラムへの導入後、カラムは、少なくとも２カラム容量の平衡化緩衝剤により洗浄される。さらなる不純物は、より高い伝導度、たとえば０．５ｍＳｃｍ以上の伝導度を有する洗浄緩衝剤を使用することによって除去されてもよい。
【００９７】
本発明のさらなる実施形態では、第２のクロマトグラフィーステップのために陰イオン交換クロマトグラフィーカラムへの導入後、カラムは、２カラム容量までの平衡化緩衝剤により洗浄される。同様のｐＨ及び伝導度を有する他の緩衝剤もまた、使用されてもよい。プロセス関連性の不純物の最大限の除去が所望される場合、より高い伝導度を有する緩衝剤は、推奨されない。
【００９８】
溶離
本発明のさらなる実施形態では、抗体断片は、より高いｐＨ、より高い伝導度、又はその２つの組み合わせのどちらかの緩衝剤を使用して、最初の捕捉ステップにおいて陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから溶離される。伝導度の増加は、５０ｍＭを超える、好ましくは１００ｍＭを超える、さらにより好ましくは２００ｍＭを超える濃度の平衡化緩衝剤へのＮａＣｌ（又は他の塩）の追加により達成することができる。
【００９９】
本発明のさらなる実施形態では、第２のクロマトグラフィーステップにおける陰イオン交換クロマトグラフィーカラムからの抗体断片の溶離は、導入及び洗浄のステップの間に生じる。結合した、プロセス関連性の不純物は、より低いｐＨ、より高い伝導度、又はその両方の組み合わせのどちらかの緩衝剤を使用することによって溶離することができる。理想的には、より高い伝導度は、少なくとも７０ｍＳ／ｃｍであるはずである。
【０１００】
これまでに本発明を十分に記載してきたが、本発明は、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、また、不必要な実験作業を伴わないで、広範囲の等価なパラメーター、濃度、及び条件内で実行することができることが、当業者らによって十分に理解されるであろう。本発明が、その特定の実施形態に関連して記載されてきたが、さらなる修飾が可能であることが理解されるであろう。本出願は、一般に、本発明の原理に従って、また、本発明が属する当技術分野内の知られている又は通常の実施の範囲内に入り、上文に記載される本質的な特徴に適用されてもよく、添付の請求項の範囲に従う、本開示からのそのような逸脱を含めて、本発明のあらゆる変形、使用、又は適応を包含するように意図される。
【０１０１】
本明細書において使用されるように、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、１つ又は複数のを意味してもよい。本明細書における用語「又は」の使用は、選択肢のみを指すように又は選択肢が相互に排他的であることが明示的に示されない限り、「及び／又は」を意味するために使用されるが、本開示は選択肢のみ並びに「及び／又は」を指す定義を支持する。本明細書において使用されるように、「他の」は、少なくとも第２の又はそれ以上の、を意味してもよい。
【０１０２】
本明細書において使用されるように、「Ｘ〜Ｙ」は、Ｘ及びＹを含む範囲を意味してもよい。
【０１０３】
雑誌の記事若しくは要約、公開若しくは非公開の米国若しくは外国特許出願、発行された米国若しくは外国特許、又は任意の他の参考文献を含む、本明細書において引用されるすべての参考文献は、引用される参考文献において示されるデータ、表、図、及び本文をすべて含めて、本明細書において参照によって全体的に組み込まれる。さらに、本明細書において引用される参考文献内に引用される参考文献の全内容もまた、参照によって全体的に組み込まれる。
【０１０４】
知られている方法ステップ、通常の方法ステップ、知られている方法、又は通常の方法に対する言及は、本発明のあらゆる態様、説明、又は実施形態が関連する技術分野において開示されている、教示されている、又は示唆されているという許可では決してない。
【実施例】
【０１０５】
（例１）
ＣＤＰ８７０  Ｆａｂ’は、１．９ｇ／Ｌの濃度で、大腸菌Ｗ３１１０宿主細胞において異種タンパク質として発現された。異種タンパク質は、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡの追加及び５０℃での熱処理によって宿主細胞の細胞周辺腔から放出された。細胞性の物質は、遠心分離を通して除去し、異種タンパク質を含有する細胞抽出物は、ｐＨ４．５までの酢酸の追加を通して調整した。次いで、ｐＨを調整した細胞抽出物は、遠心分離及び０．２μｍろ過による深層ろ過の組み合わせを使用して浄化した。
【０１０６】
浄化した抽出物（フィードストリーム）は、３．５ｍＳ／ｃｍの伝導度を達成するために、水により４の希釈係数により希釈した。
【０１０７】
次いで、ＣＤＰ８７０  Ｆａｂ’を含有するフィードストリームは、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＣａｐｔｏ  Ｓ（商標）陽イオン交換カラム［デキストランリンカーを介して付加されたスルホネート陽イオン交換リガンドを有する高度に架橋された強固なアガロースビーズ（平均粒径９０μｍ）（イオン容量０．１１〜０．１４ｍｍｏｌ  Ｎａ＋／ｍｌ）］上に４００ｃｍ／ｈの流速で、約７５ｇ／Ｌ樹脂に導入された。Ｃａｐｔｏ  Ｓ（商標）陽イオン交換カラムは、７．７ｍｍの直径を有する２０ｃｍのカラムベッド高を有した。カラムは、酢酸によりｐＨ４．５に調整した、６カラム容量の５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝剤により、フィードストリーム導入前に平衡化された。
【０１０８】
導入後に、カラムは、すべての非結合物質が洗い落されるまで、酢酸によりｐＨ４．５に調整した、５カラム容量の５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝剤により洗浄された。ＣＤＰ８７０  Ｆａｂ’画分は、酢酸によりｐＨ４．５に調整した５０ｍＭ酢酸ナトリウム及び２５０ｍＭ  ＮａＣｌの濃度までの勾配の２０カラム容量により溶離した。溶離されたＣＤＰ８７０  Ｆａｂ’は、２８０ｎｍのＵＶ吸光度が０．２６ＡＵ／ｃｍを超えた場合、それが０．５４ＡＵ／ｃｍ未満に低下するまで収集された。
【０１０９】
ＣＤＰ８７０  Ｆａｂ’プールは、１０ｋＤａの名目分子量カットオフ値を有するポリエーテルスルホンベースの限外ろ過膜を使用して、遠心濃縮器において限外ろ過にかけ、６ｍｇ／ｍＬまでのＣＤＰ８７０  Ｆａｂ’プールの濃度がもたらされた。続いて、ダイアフィルトレーションは、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ中のＣＤＰ８７０  Ｆａｂ’プールがｐＨ８．０及び１．１ｍＳ／ｃｍの伝導度に達するまで実行した。６容量の緩衝剤が、ダイアフィルトレーションに必要とされた。
【０１１０】
ＣＤＰ８７０  Ｆａｂ’プールは、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＣａｐｔｏ  Ｑ（商標）陰イオン交換クロマトグラフィーカラム［デキストランリンカーを介して付加された第四級アミン陰イオン交換リガンドを有する高度に架橋された強固なアガロースビーズ（平均粒径９０μｍ）（イオン容量０．１６〜０．２２ｍｍｏｌ  Ｃｌ−／ｍｌ）］上に、５００ｃｍ／ｈの流速で、１リットルの樹脂当たり約５ｇのＣＤＰ８７０  Ｆａｂ’を適用して導入した。Ｃａｐｔｏ  Ｑ（商標）陰イオン交換カラムは、７．７ｍｍの直径を有する１０ｃｍのカラムベッド高を有した。カラムは、塩酸によりｐＨ８．０に調整した、３カラム容量の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１Ｍ  ＮａＣｌ緩衝剤及び塩酸によりｐＨ８．０に調整した、５カラム容量の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓの緩衝剤により、陰イオン交換クロマトグラフィーステップ前に平衡化した。
【０１１１】
次いで、カラムは、ＣＤＰ８７０  Ｆａｂ’を回収するために５カラム容量の平衡化緩衝剤により洗浄した。
【０１１２】
ＣＤＰ８７０  Ｆａｂ’画分の収集は、２８０ｎｍのＵＶ吸光度が導入の開始直後に０．５ＡＵ／ｃｍを超えた場合に開始した。画分収集の終了は、洗浄の間に、ＵＶ吸光度が０．５ＡＵ／ｃｍ未満に低下した場合に行った。このステップによる抗体断片についての収率は、９０．５％であった。
【０１１３】
（例２）
ＣＤＰ８７０  Ｆａｂ’は、１．９ｇ／Ｌの濃度で、大腸菌宿主細胞において異種タンパク質として発現された。異種タンパク質は、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡの追加及び５０℃での熱処理によって宿主細胞の細胞周辺腔から放出された。細胞性の物質は、遠心分離を通して除去し、異種タンパク質を含有する細胞抽出物は、ｐＨ４．５までの酢酸の追加を通して調整した。次いで、ｐＨを調整した細胞抽出物は、遠心分離及び０．２μｍろ過による深層ろ過の組み合わせを使用して浄化した。
【０１１４】
浄化した抽出物（フィードストリーム）は、３．５ｍＳ／ｃｍの伝導度を達成するために、水により４の希釈係数により希釈した。
【０１１５】
次いで、ＣＤＰ８７０  Ｆａｂ’を含有するフィードストリームは、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＣａｐｔｏ  Ｓ陽イオン交換カラム［デキストランリンカーを介して付加されたスルホネート陽イオン交換リガンドを有する高度に架橋された強固なアガロースビーズ（平均粒径９０μｍ）（イオン容量０．１１〜０．１４ｍｍｏｌ  Ｎａ＋／ｍｌ）］上に３００ｃｍ／ｈの流速で、約５１ｇ／Ｌ樹脂に導入した。Ｃａｐｔｏ  Ｓ陽イオン交換カラムは、１６ｍｍの直径を有する２０ｃｍのカラムベッド高を有した。カラムは、酢酸によりｐＨ４．５に調整した、３カラム容量の５０ｍＭ酢酸ナトリウム／１Ｍ  ＮａＣｌ緩衝剤及び続いて、酢酸によりｐＨ４．５に調整した、４カラム容量の５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝剤により、フィードストリーム導入前に平衡化した。
【０１１６】
導入後に、カラムは、すべての非結合物質が洗い落されるまで、酢酸によりｐＨ４．５に調整した、６カラム容量の５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝剤により洗浄した。ＣＤＰ８７０  Ｆａｂ’画分は、酢酸によりｐＨ４．５に調整した５０ｍＭ酢酸ナトリウム及び２００ｍＭ  ＮａＣｌを有する、８カラム容量までの緩衝剤により溶離した。溶離されたＣＤＰ８７０  Ｆａｂ’は、２８０ｎｍのＵＶ吸光度が０．５ＡＵ／ｃｍを超えた場合、それが０．５ＡＵ／ｃｍ未満に低下するまで収集された。
【０１１７】
ＣＤＰ８７０  Ｆａｂ’プールは、１０ｋＤの名目分子量カットオフ値を有するポリエーテルスルホンベースの限外ろ過膜を使用して、遠心濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ）において限外ろ過にかけ、１８ｍｇ／ｍＬまでのＣＤＰ８７０  Ｆａｂ’プールの濃度がもたらされた。続いて、ダイアフィルトレーションは、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ中のＣＤＰ８７０  Ｆａｂ’プールがｐＨ８．３及び１．０ｍＳ／ｃｍの伝導度に達するまで実行した。６容量の緩衝剤が、ダイアフィルトレーションに必要とされた。
【０１１８】
ＣＤＰ８７０  Ｆａｂ’プールは、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＣａｐｔｏ  Ｑ陰イオン交換クロマトグラフィーカラム［デキストランリンカーを介して付加された第四級アミン陰イオン交換リガンドを有する高度に架橋された強固なアガロースビーズ（平均粒径９０μｍ）（イオン容量０．１６〜０．２２ｍｍｏｌ  Ｃｌ−／ｍｌ）］上に、２５０ｃｍ／ｈの流速で、１リットルの樹脂当たり約３０ｇのＣＤＰ８７０  Ｆａｂ’を適用して導入した。Ｃａｐｔｏ  Ｑ（商標）陰イオン交換カラムは、７．７ｍｍの直径を有する１０ｃｍのカラムベッド高を有した。カラムは、塩酸によりｐＨ８．３に調整した、３カラム容量の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１Ｍ  ＮａＣｌ緩衝剤及び塩酸によりｐＨ８．３に調整した、５カラム容量の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓの緩衝剤により、陰イオン交換クロマトグラフィーステップ前に平衡化した。
【０１１９】
次いで、カラムは、ＣＤＰ８７０  Ｆａｂ’を回収するために５カラム容量の平衡化緩衝剤により洗浄した。
【０１２０】
ＣＤＰ８７０  Ｆａｂ’画分の収集は、２８０ｎｍのＵＶ吸光度が導入の開始直後に０．５ＡＵ／ｃｍを超えた場合に開始した。画分収集の終了は、洗浄の間に、ＵＶ吸光度が２．０ＡＵ／ｃｍ未満に低下した場合に行った。
【０１２１】
（例３）
ＣＤＰ８７０  Ｆａｂ’は、２．５ｇ／Ｌの濃度で、大腸菌宿主細胞において異種タンパク質として発現された。異種タンパク質は、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡの追加及び５０℃での熱処理によって宿主細胞の細胞周辺腔から放出された。細胞性の物質は、遠心分離を通して除去し、異種タンパク質を含有する細胞抽出物は、ｐＨ４．５までの酢酸の追加を通して調整した。次いで、ｐＨを調整した細胞抽出物は、遠心分離及び０．２μｍろ過による深層ろ過の組み合わせを使用して浄化した。
【０１２２】
浄化した抽出物（フィードストリーム）は、４．０ｍＳ／ｃｍの伝導度を達成するために、水により４の希釈係数により希釈した。
【０１２３】
次いで、ＣＤＰ８７０  Ｆａｂ’を含有するフィードストリームは、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＣａｐｔｏ  Ｓ陽イオン交換カラム［デキストランリンカーを介して付加されたスルホネート陽イオン交換リガンドを有する高度に架橋された強固なアガロースビーズ（平均粒径９０μｍ）（イオン容量０．１１〜０．１４ｍｍｏｌ  Ｎａ＋／ｍｌ）］上に４００ｃｍ／ｈの流速で、約６０ｇ／Ｌ樹脂に導入した。Ｃａｐｔｏ  Ｓ陽イオン交換カラムは、２０ｃｍの直径を有する２４ｃｍのカラムベッド高を有した。カラムは、酢酸によりｐＨ４．５に調整した、３カラム容量の５０ｍＭ酢酸ナトリウム／１Ｍ  ＮａＣｌ緩衝剤及び続いて、酢酸によりｐＨ４．５に調整した、４カラム容量の５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝剤により、フィードストリーム導入前に平衡化した。
【０１２４】
導入後に、カラムは、すべての非結合物質が洗浄されるまで、酢酸によりｐＨ４．５に調整した、６カラム容量の５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝剤により洗浄した。ＣＤＰ８７０  Ｆａｂ’画分は、酢酸によりｐＨ４．５に調整した５０ｍＭ酢酸ナトリウム及び２５０ｍＭ  ＮａＣｌを有する、５カラム容量までの緩衝剤により溶離した。溶離されたＣＤＰ８７０  Ｆａｂ’は、２８０ｎｍのＵＶ吸光度が１．７５ＡＵ／ｃｍを超えた場合、それが０．５５ＡＵ／ｃｍ未満に低下するまで収集された。
【０１２５】
ＣＤＰ８７０  Ｆａｂ’は、１０ｋＤａ名目分子量カットオフ値を有する０．４ｍ２ポリエーテルスルホン膜（Ｐａｌｌ  １０ｋ  Ｏｍｅｇａ  Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ  Ｔ−Ｓｅｒｉｅｓ）を使用してタンジェンシャルフローモードで限外ろ過にかけた。ＣＤＰ８７０  Ｆａｂ’は、Ｆａｂ’溶液のｐＨがｐＨ８．５となり、伝導度が０．８ｍＳ／ｃｍとなるまで、５．８容量の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５によるダイアフィルトレーション前に、５１ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。Ｆａｂ’は、限外ろ過装置から回収し、システムからあらゆる残りのＦａｂ’を洗浄するために使用した６００ｍＬの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５緩衝剤と共にプールした。
【０１２６】
ＣＤＰ８７０  Ｆａｂ’プールは、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＣａｐｔｏ  Ｑ陰イオン交換クロマトグラフィーカラム［デキストランリンカーを介して付加された第四級アミン陰イオン交換リガンドを有する高度に架橋された強固なアガロースビーズ（平均粒径９０μｍ）（イオン容量０．１６〜０．２２ｍｍｏｌ  Ｃｌ−／ｍｌ）］上に、２００ｃｍ／ｈの流速で、１リットルの樹脂当たり約３７ｇのＣＤＰ８７０  Ｆａｂ’を適用して導入した。Ｃａｐｔｏ  Ｑ（商標）陰イオン交換カラムは、２０ｃｍの直径を有する２４ｃｍのカラムベッド高を有した。カラムは、塩酸によりｐＨ８．５に調整した、３カラム容量の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１Ｍ  ＮａＣｌ緩衝剤及び塩酸によりｐＨ８．５に調整した、５カラム容量の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓの緩衝剤により、陰イオン交換クロマトグラフィーステップ前に平衡化した。
【０１２７】
次いで、カラムは、ＣＤＰ８７０  Ｆａｂ’を回収するために５カラム容量の平衡化緩衝剤により洗浄した。
【０１２８】
ＣＤＰ８７０  Ｆａｂ’画分の収集は、２８０ｎｍのＵＶ吸光度が導入の開始直後に０．５ＡＵ／ｃｍを超えた場合に開始した。画分収集の終了は、洗浄の間に、ＵＶ吸光度が２．０ＡＵ／ｃｍ未満に低下した場合に行った。
（例４）
参考文献
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0005893622.tif 000003
【図１】
0005893622.tif 000004
【図２】
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【図３】
0005893622.tif 000006
【図４】
0005893622.tif 000007
【図５−１】
0005893622.tif 000008
【図５−２】
0005893622.tif 000009
【配列表】
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