(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子型１ｂのＣ型肝炎ウイルスに感染しているヒトから採取された検体中に含まれるＣ型肝炎ウイルスのコア領域中のアミノ酸配列の第７０番目のアルギニンのグルタミンへの変異を、同一のヒトにおいて時系列的に定量検出し、当該アミノ酸の変異量を示す後の定量値が前の定量値よりも月単位又は年単位で増加している場合（初診時に当該変異が認められなかった場合を含む）に、これを肝臓癌への移行シグナルとすることを特徴とする、肝臓癌のリスクの検出方法。
【請求項２】
検体におけるＣ型肝炎ウイルスが、初診時においてコア領域中のアミノ酸配列の第７０番目のアルギニンのグルタミンへの変異を含んでいることを特徴とする、請求項１に記載の肝臓癌のリスクの検出方法。
【請求項３】
Ｃ型肝炎ウイルスのコア領域中のアミノ酸配列の第７０番目のアルギニンをコードする塩基配列が、ＣＡＧ若しくはＣＡＡ、に変異していることを特徴とする、請求項１又は２に記載の肝臓癌のリスクの検出方法。
【請求項４】
アミノ酸の変異量の定量検出を、Ｃ型肝炎ウイルスのコア領域中のアミノ酸配列の第７０番目のアミノ酸をコードする遺伝子を含む遺伝子増幅産物を基にして行うことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の肝臓癌のリスクの検出方法。
【請求項５】
アミノ酸の変異量の定量検出を、Ｃ型肝炎ウイルスのコア領域中のアミノ酸配列の第７０番目のアミノ酸をコードする遺伝子を含む遺伝子増幅産物を基にして、インベーダーアッセイ法により行うことを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の肝臓癌のリスクの検出方法。
【請求項６】
アミノ酸の変異量の定量検出を、Ｃ型肝炎ウイルスのコア領域中のアミノ酸配列の第７０番目のアミノ酸をコードする遺伝子を、リアルタイムＰＣＲ法による遺伝子増幅と並行して実行されるインベーダーアッセイ法、により行うことを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の肝臓癌のリスクの検出方法。
【請求項７】
検体は血液検体であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の肝臓癌のリスクの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾病のリスクの検出方法に関する発明であり、より具体的には、特定の遺伝子変異を指標として用いたＣ型肝炎ウイルスの感染者における肝臓癌のリスクの検出方法に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎は、主に血液を介してＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染することによって起こる、慢性型の肝炎である。ＨＣＶのスクリーニングが行われる以前の輸血肝炎の殆どが、このＣ型肝炎であった。現在は輸血後の肝炎は殆ど無くなったが、日本では慢性Ｃ型肝炎患者が７０万人程度いると推定されている。そして、このうち毎年７万人余りが肝硬変で、また２万人余りが肝臓癌で死亡している。日本におけるＨＣＶのキャリアは約１．５％（約２００万人）であるが、若年者に少なく、加齢と共に増加する傾向がある。
【０００３】
Ｃ型肝炎は、ＨＣＶ感染後平均６〜８週間の潜伏期を経て発症するが、約７５％が無症候性感染に終わり、発症した場合も症状は比較的軽症であり、多くはトランスアミナーゼ値の上昇により肝障害の存在が診断され、自らのＣ型肝炎の罹患を知ることになる。
【０００４】
ＨＣＶ感染においては、免疫学的機序による感染細胞の排除が有効に起こらず、半数以上の感染例が慢性化する。そして、慢性Ｃ型肝炎は１０〜２０年後に肝硬変、肝臓癌へと進展する。
【０００５】
現状ではＣ型肝炎に対する有効なワクチンは存在しない。慢性Ｃ型肝炎の治療法として、インターフェロン投与、又は、インターフェロンと抗ウイルス薬であるリバビリンの併用療法が有効であることが多い。特にインターフェロンとリバビリンの併用により、約半数のＨＣＶによる慢性肝炎を進行停止あるいは治癒に至らせることが可能となっている。
【０００６】
Ｃ型肝炎を引き起こすＨＣＶには、遺伝子型１ｂと遺伝子型２があることが知られており、遺伝子型１ｂの方が多く、かつ、難治性の割合も高い。遺伝子型１ｂと遺伝子型２の識別手段は確立されており（非特許文献１）、ＨＣＶ  ＲＮＡのＮＳ５領域の塩基配列に基づいて容易に識別することが可能である。このような現状のもと、本発明者らは遺伝子型１ｂのＨＣＶのコア領域中のアミノ酸配列の第７０番目のアルギニンが他のアミノ酸に変異していることと、第９１番目のアミノ酸がメチオニンであることを指標として、インターフェロンとリバビリンの併用療法の有効性を予見可能なことを見出し、先般特許を取得した（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第４７９４９４４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Chayama k et al., Genotypic subtyping of hepatitis C virus. J Gastroenterol Hepatol 1993; 8: 150156
【非特許文献２】Kato N et al.,Molecular cloning of the human hepatitis C virus genome from Japanese patients with non-A,non-B hepatitis. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87: 95249528
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記の通り、Ｃ型肝炎の感染者は慢性的な経緯を辿るものの、長期間を経て肝硬変や肝臓癌に進展する比率が非常に多いことが深刻な問題となっている。仮に、これらの疾患に進展する可能性を把握することができれば、明確な指標に基づいた食事法等の日々の生活習慣の見直しや、肝機能改善薬等の投与等の予防的な措置を行うよう、説得力を伴った指導や処方を行うことが可能になる。すなわち、Ｃ型肝炎に起因する肝硬変や肝臓癌発症のリスクを効果的に減ずることができる。
【００１０】
本発明の目的は、ＨＣＶに感染しているヒトにおける、肝硬変や肝臓癌に進展するリスクを検出する手段を見出し、Ｃ型肝炎患者における予防的な措置を積極的に選択する指標を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、長期に渉りＣ型肝炎の感染者のＨＣＶの遺伝子の解析を行ったところ、驚くべきことに、肝臓癌に進展した遺伝子型１ｂのＨＣＶの感染者は、感染初期に比べて当該ＨＣＶのコア領域中のアミノ酸配列の第７０番目のアルギニンの他のアミノ酸への変異の比率が増加していることを突き止めた。そして、これを指標として無症状であることが多いＣ型肝炎の感染者において、少なくとも肝臓癌発症のリスクの検出手段を提供可能であることを見出した。
【００１２】
すなわち本発明は、遺伝子型１ｂのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染しているヒトから採取された検体中に含まれるＣ型肝炎ウイルスのコア領域中のアミノ酸配列の第７０番目のアルギニンの他のアミノ酸への変異を、同一のヒトにおいて時系列的に定量検出し、当該アミノ酸の変異量を示す後の定量値が前の定量値よりも増加している場合に、これを肝臓癌への移行シグナルとすることを特徴とする、肝臓癌のリスクの検出方法（以下、本発明の検出方法ともいう）を提供する発明である。
【００１３】
本発明の検出方法において、「Ｃ型肝炎ウイルスのコア領域中のアミノ酸配列の第７０番目のアルギニン」（以下、「第７０番目のアルギニン」と略記することもある）に対する「他のアミノ酸」は、少なくともグルタミン又はヒスチジンであることが認められる。すなわち、Ｃ型肝炎ウイルスのコア領域中をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）における２０８〜２１０番目の領域の塩基配列が、アルギニンをコードするＣＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＴ又はＣＧＣから、グルタミンをコードするＣＡＧ若しくはＣＡＡ、又は、ヒスチジンをコードするＣＡＴ若しくはＣＡＣ、に変異していることが認められる。
【００１４】
本明細書において、「非変異型（ＨＣＶ）」と記載した場合には、上記第７０番目のアミノ酸がアルギニンであることを意味するものであり、「変異型（ＨＣＶ）」と記載した場合には、当該アミノ酸がアルギニン以外のアミノ酸であることを意味することとする。
【００１５】
上記アミノ酸変異量の定量検出は、Ｃ型肝炎ウイルスのコア領域中のアミノ酸配列の第７０番目のアミノ酸をコードする遺伝子を含む領域（以下、ターゲット領域ともいう）の遺伝子増幅産物を基にして行うことが好適である。そして、当該定量検出はインベーダーアッセイ法、特に、リアルタイムＰＣＲ法によるターゲット領域の遺伝子増幅と並行して実行されるインベーダーアッセイ法（Ｑ−インベーダー法）、により行われることが好適であるが、これらの手法に限定されるものではない。
【００１６】
本発明の検出方法を行う基となる検体は、血清検体や血漿検体等の血液検体であることが好適である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、遺伝子型１ｂのＨＣＶの感染者における、少なくとも肝臓癌への進展のリスクの検出手段が提供される。肝臓癌に進展するＨＣＶの感染者の多くは肝硬変を経ることが知られていることから、本発明により、Ｃ型肝炎に起因する肝硬変や肝臓癌発症のリスクを効果的に減ずる途が提供されることになる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】Ｑ−インベーダー法の測定原理を示す図面である。図中、向かって左側の「WT」表示の側が「非変異型」を示しており、右側の「MT」表示の側が「変異型」を示している。それぞれ、下記図２に示すＦ（フォワード）プライマーとＲ（リバース）プライマーを用いてリアルタイムＰＣＲ法によるターゲット領域の増幅を行い、当該遺伝子増幅産物をゲノムＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）として、特定の一塩基が「Ｇ」（非変異型）であるか「Ａ」（変異型）であるかの検出をインベーダー法の手順に従って行い、それぞれ検出されたシグナルをカウントして、所望する変異型の相対比率を求めることができる。
【図２】実施例で行ったＱ−インベーダー法の初期模式図である。非変異型の枠に示した鋳型塩基配列を配列番号１７として、変異型の枠に示した鋳型塩基配列を配列番号１８とする。
【図３】初診時にＨＣＶが認められた検体提供者における、経時的な変異型の相対比率の上昇と肝臓癌発症の関係を検討した結果を示すグラフである。
【図４】初診時は実質的に非変異型ＨＣＶのみに感染していた検体提供者における、変異型の事後的出現と肝臓癌発症の関係を検討した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の検出方法の対象は、遺伝子型１ｂのＨＣＶ（以下、特に断りのある場合を除き、「ＨＣＶ」と記載した場合は「遺伝子型１ｂのＨＣＶ」を意味するものとする）の感染者における、当該ＨＣＶ、さらに詳しくは当該ＨＣＶの遺伝子（核酸）又は構成アミノ酸である。当該検出対象は、被験者のＨＣＶを含む検体から得ることができる。当該検体としては、血清、血漿、全血等の血液検体、肝臓からの生検検体等が例示されるが、ＨＣＶが含まれ得る検体であれば特に限定されない。これらの中でも、血液検体、特に血清検体又は血漿検体であることが、ＨＣＶが含まれる可能性が大きく、かつ、採取と処理が簡便であり、好適である。
【００２０】
ＨＣＶの遺伝子配列及びそれがコードするアミノ酸配列は既に公知であり、例えば、非特許文献２及びGenBank Accession No.D90208には、プロトタイプＨＣＶ遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列(HCVJ)が開示されている。配列番号１に、遺伝子型１ｂのプロトタイプＨＣＶのコア領域の塩基配列を、それがコードするアミノ酸配列と共に示す。
【００２１】
本発明の検出方法では、検体中に含まれるＨＣＶの遺伝子がコードするコア領域中のアミノ酸配列の第７０番目のアルギニンの、他のアミノ酸への変異を定量検出することを特徴とする。すなわち、検体のＨＣＶにおける上記ターゲット領域のアミノ酸配列、又は、これをコードする遺伝子の塩基配列の決定と定量を行う。具体的には、当該ターゲット領域のアミノ酸配列をコードする遺伝子の特定塩基の１以上における非変異型塩基からの変化を、統計学的に確定定量可能な回数行い、これにより得られた、第７０番目のアルギニンがどの程度他のアミノ酸に変化しているか、についての定量値を求める。そして、同一の検体提供者において時系列的に当該定量検出を行い、上記アミノ酸又は塩基の変異量を示す後の定量値が前の定量値よりも増加している場合に、これを肝臓癌への移行シグナルとすることにより、ＨＣＶに感染している検体提供者が少なくとも肝臓癌へ進展するリスクを検出することができる。上記アミノ酸又は塩基の変異量が増加している、とは、前回の変異量を示す定量値よりも次回の定量値が有意差を伴って増加していることを意味するものである。その典型例として、後述する実施例では「１０％以上の相対比率の増加」を肝臓癌への進展のリスクの存在指標としているが、これに限定されるものではない。この第７０番目のアミノ酸はＨＣＶのコア蛋白質を構成するアミノ酸であることから、本発明の検出方法においてはアミノ酸の変異レベルでの把握を行うことが好適である。第７０番目のアルギニン（ｃＤＮＡ塩基レベル：CGG、CGA、CGT又はCGC）に対する他のアミノ酸は、少なくともグルタミン（ｃＤＮＡ塩基レベル：CAG又はCAA）又はヒスチジン（ｃＤＮＡ塩基レベル：CAT又はCAC）であることが認められる。
【００２２】
本発明における「時系列的な定量検出」同士の間隔は、ＨＣＶによる感染から肝硬変や肝臓癌への進展期間が、上述したように極めて長期間であるため、通常の臨床検査における間隔よりも長期に渉るものである。具体的には、年単位、又は、月単位程度の間隔をもって時系列的な定量検出を行うことにより、肝臓癌への進展リスクを検出することが現実的であると考えられる。つまりＨＣＶ感染が当事者に判明するのは、通常は初診時での検査によるものであるが、その時点を起点として、年単位又は月単位の計画を立てて本発明の検出方法を行うことになる。
【００２３】
ＨＣＶの感染者が、生活習慣に気を配る必要があることは本発明の検出方法で陰性判定がされたからといっても本質的に変わるものではないと考えられる。しかしながら陽性判定がされた場合には、生活習慣の改善の指導や肝機能改善剤の処方等の積極的な方策を、説得力を伴って行うことが特に高リスク患者に対して可能となる。これは、極めて長期間であるが故に管理が難しいＨＣＶ感染者のコンプライアンスを実質を伴って向上させ、ＨＣＶ感染者の生命を守ることに大いなる貢献をすることができる。
【００２４】
本発明の検出方法における７０番目のアミノ酸又はこれをコードする遺伝子における変異の検出手段としては、当該変異を定量することが可能である限り特に限定されるものではないが、現実的には統計学的に確定定量可能な回数を一検査において行うことが必要となり、そのためには大量の検出対象物と当該検出対象物に対する効率的な検出手段が必要となる。これらの条件のうち検出対象物の大量性を満足する手段として、ＰＣＲ法等の遺伝子増幅方法により得られる遺伝子増幅産物を用いることが挙げられる。すなわち、典型的には検体のＨＣＶの遺伝子ＲＮＡから得られるｃＤＮＡに対してＰＣＲ法等の遺伝子増幅方法を行い、これにより得られる遺伝子増幅産物における７０番目のアミノ酸をコードする遺伝子における変異を検出して、その相対比率を算出することにより、本発明の検出方法における指標の基となる遺伝子変異の定量を行うことができる（ダイレクトシークエンシング法等）。この定量を典型的には月単位又は年単位の時間を置いた時系列において行って、遺伝子変異の比率を示す定量値の増減を算出することによって、検体提供者における肝臓癌への進展のリスクを求めることができる。そして上記ＰＣＲ法等の遺伝子増幅方法の中でも、リアルタイムＰＣＲ法を行うことが効率的である。リアルタイムＰＣＲ法を用いる遺伝子の変異の検出方法としては、Ｑ−インベーダー法（Ｑ−Ｉｎｖａｄｅｒ法）、サイバーグリーン法(Szuhai K. Sandhaus E. Kolkman-Uljee SM. Lemaitrem, Truffert JC, Dirks RW., Tanke HJ, Fleuren GJ, Schuuring E, Raap AK. A novel strategy for human papill omavirus detection and genotyping with SybrGreen and molecular beacon polymerase chain reaction. Am J Pathol. 2001 Nov;159(5):1651-60.)、スコーピオンプローブ法、モレキュラービーコンプローブ法(Takacs, T., Jeney, C., Kovacs, L., Mozes, J., Benczic, M., Sebe, A. 2008. Molecular beacon-based real-time PCR method for detection of 15 high-risk and 5 low-risk HPV typs. J. Virol. Methods. 149, 153-162)等が挙げられ、これらの例示列挙した諸手法を適宜改変して本発明を行うことができる。そして、Ｑ−インベーダー法又はその適宜な改変法は、本発明において行われる好適な方法の一つである。Ｑ−インベーダー法は、リアルタイムＰＣＲ法による遺伝子増幅と並行して実行されるインベーダーアッセイ法であり、リアルタイムＰＣＲ法による遺伝子増幅産物に対して逐次インベーダーアッセイ法を行い、そのシグナルをモニタリングして熱サイクル数におけるクロッシングポイント（Ｃｐ値）を算出する遺伝子定量法である。その原理を図１において示す。この方法では多くの異なるターゲット塩基を共通の蛍光プローブで定量測定できる。
【実施例】
【００２５】
本発明を実施例により具体的に開示する。
［試験の内容］
（１）被験検体
本発明の検証試験は、遺伝子型１ｂのＣ型肝炎ウイルスに感染した１３５名の患者の血清（過去からのストック血清）を、虎の門病院分院（神奈川、日本）から入手して行った。被験血清は、基本的には初診時に初回の第７０番目のアミノ酸の変異の定量を行い、以後５年ごとに同様の定量を行った（最長２０年）。肝臓癌（ＨＣＣ）に進展した検体提供者に関しては、少なくとも発癌時と最終的な観察時における定量値を開示する。なお、本試験はDeclaration of Helsinkiの倫理規定に則り行われ、虎の門病院の倫理委員会に承認された。各々の検体提供者にはインフォームドコンセントを行った。
【００２６】
（２）インベーダープローブ等の設計
Ｑ−インベーダー法を実行する際に用いるリアルタイムＰＣＲ法における遺伝子増幅用プライマーを表１に示した。またＱ−インベーダー法におけるインベーダー反応用の、ＨＣＶコア蛋白質における第７０番目のアルギニンのグルタミンへの変異（R70/Q）を検出するためのプライマリープローブとインベーダーオリゴは、表２に示したものを用いた。第７０番目のアミノ酸をコードする塩基の近傍領域のヴァリエーションは、ＮＣＢＩのデータベース由来のＨＣＶのコア領域の５５種類の個々のシークエンスにより確認された。
【００２７】
【表１】
0005960509.tif 000002
【００２８】
表１の上から順に配列番号２、３とする。
【００２９】
【表２】
0005960509.tif 000003
【００３０】
表２の上から順に配列番号４〜１６とする。
【００３１】
（３）ＨＣＶ  ＲＮＡの抽出とｃＤＮＡの合成
ＨＣＶ  ＲＮＡは、２００μlの血清から抽出され、PureLink Viral RNA/DNA Mini Kit(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)付属のRNAse/DNAse-free water  10μl中に溶出した。ｃＤＮＡは、市販のキット(SuperScript III cDNA Synthesis Kit, Life Technologies)付属の20μlの反応液中でランダムプライマーにより合成された。
【００３２】
（４）Ｑ−インベーダー法の実行
変異型と非変異型のＨＣＶの相対的な定量分析は、Ｑ−インベーダーアッセイにより行われた。２種の蛍光シグナル(carboxyfluorescein 又は FAMは非変異型用； REDmond RED 又は RED は変異型用)が、クリベースと２種の公知の蛍光プローブを用いたFRET mixを含有するUniversal General Purpose Reagent(TWT)で、単一反応において検出することができた。図２に、ここで行われたＱ−インベーダーアッセイの初期模式図を示した。鋳型ｃＤＮＡは、５００ｎＭのＨＣＶ−１ｂコア領域増幅用プライマー、３００ｎＭの各々の初期プローブ、７００ｎＭのインベーダーオリゴ、２ＵのAmpliTaq gold(Life Technologies)、Universal General Purpose Reagent (TWT) 及び FRET mix の中に添加された。
【００３３】
当該反応混合物は、384-PCR plate (Roche, Basel, Switzerland)中において、９５℃・２０分間、前もって加熱され、２ステップＰＣＲ反応がLightCycler 480 (Roche)中において、４０サイクル行われた(95℃ 15秒, 65℃ 60秒) 。ＦＡＭ（波長／バンド幅：励起４６５ｎｍ；消光５１０ｎｍ）、及び、ＲＥＤ（励起５３３ｎｍ；消光６１０ｎｍ）の蛍光値が、各々のサイクルの６５℃におけるインキュベーション／延長ステップの終わりにおいて、通常のリアルタイムＰＣＲ法により計測された。得られた結果を解析することにより、クロッシングポイント（Ｃｐ）がLightCycler 480 softwareによるフィットポイント（fit point）法により得られた。
【００３４】
以上の内容で、冒頭に記載した１３５血清検体における第７０番目のアミノ酸におけるアルギニン（非変異型）とグルタミン（変異型）の比率の経時的な変化をモニタリングした。当該比率は「変異型のコピー数／（非変異型のコピー数＋変異型のコピー数）」である。
【００３５】
表３は、肝臓癌（ＨＣＣ）発症７２例の結果を示し、表４は、非発症６３例の結果を示している。
【００３６】
【表３】
0005960509.tif 000004
【００３７】
【表４】
0005960509.tif 000005
【００３８】
上記表３と表４の結果から、初診時以降に変異型の比率が１０％以上増加したものを「変異型の比率が上昇した」症例として検討した。表５と図３は、初診時において既に変異型の存在が認められた検体も含めて経過を検討した結果を示している。
【００３９】
【表５】
0005960509.tif 000006
【００４０】
表５の結果は、初診時にＨＣＶ感染が認められた場合、変異型の相対比率が上昇した場合には、その他の場合と比べて明らかに肝臓癌の発症例が多かったことを示している（χ二乗検定：ｐ＝０．００２、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ｔｅｓｔ：ｐ＝０．００２）。
【００４１】
次に表６と図４には、初診時において変異型が認められなかった検体（変異型の相対比率が１％未満）における結果を検討した結果を示している。
【００４２】
【表６】
0005960509.tif 000007
【００４３】
表６の結果より、初診時に変異型が認められなかった症例においても、肝臓癌に進展した症例が認められ、それらの中でも変異型が出現した場合には明らかに肝臓癌進展のリスクが高まっていることが明らかになった（χ二乗検定：ｐ＝０．００４、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ｔｅｓｔ：ｐ＝０．００５）。なお、「変異型が出現した」とは１０％以上相対比率が上昇することを意味することとした。
【図１】
0005960509.tif 000008
【図２】
0005960509.tif 000009
【図３】
0005960509.tif 000010
【図４】
0005960509.tif 000011
【配列表】
0005960509000001.app