(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イン・ヴィトロで、幹細胞特性を有する化学療法剤耐性癌細胞を単離する方法であって、
（ｉ） アガロースでコーティングされた、アガロース含有ビーズ内に癌細胞のサンプルをカプセル化することと、
（ｉｉ） 前記癌細胞の少なくとも一部を死滅させるのに十分な時間、前記ビーズを、少なくとも１つの抗癌化学療法剤と接触させることと、
（ｉｉｉ） 前記ビーズから生存細胞を除去することと、
（ｉｖ） 前記生存細胞を、少なくとも１つの幹細胞特性について分析試験することと、
（ｖ） 前記幹細胞特性を示す細胞を、前記幹細胞特性を示さない細胞から単離することを含む方法。
【請求項２】
前記幹細胞特性はＯＣＴ４の発現である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記化学療法剤はドセタキセルである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記癌細胞は哺乳類細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記哺乳類細胞はヒト細胞である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
イン・ヴィトロで、対象の物質が抗癌有効性を有するか否かを決定する方法であって、
（ｉ）アガロースを含有する、アガロースでコーティングされたビーズ内にカプセル化された癌細胞のサンプルに、前記物質を、所定濃度で所定期間接触させることと、
（ｉｉ）前記物質によって死滅した前記癌細胞の割合を同定することと、
（ｉｉｉ）前記割合を、対照薬剤によって死滅した、アガロースを含有するアガロースでコーティングされたビーズ内にカプセル化された前記細胞の割合と比較することを含み、
前記物質によって死滅した割合がより高いことが前記対象に対する抗癌有効性の指標となる方法。
【請求項７】
前記癌細胞は哺乳類細胞である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記哺乳類癌細胞はヒト癌細胞である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
イン・ヴィトロで、対象の物質が抗癌幹細胞活性を有するか否かを決定する方法であって、
アガロースを含有するアガロースでコーティングされたビーズ内にカプセル化された癌幹細胞を、前記物質と接触させることと、前記物質と接触していない癌幹細胞含有ビーズに対して残存細胞数を比較することを含み、その間の差異が前記物質が抗癌幹細胞活性を有することの指標となる方法。
【請求項１０】
イン・ヴィトロで、癌を患う対象の予後を決定するための方法であって、
（ｉ） アガロースでコーティングされた、アガロース含有ビーズ内に、前記対象から採取された癌細胞のサンプルをカプセル化することと、
（ｉｉ）前記アガロースでコーティングされた、アガロース含有ビーズと、有効として知られる濃度の、前記癌細胞に対して有効と知られる抗癌剤とを、有効として知られる時間の間、接触させることと、
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）における時間の後に前記ビーズ内に残存している癌細胞の割合を測定することと、を含み、
（ｉｖ）良好な予後の患者と比較して癌細胞の割合が多いことが前記対象の不良な予後の兆候である方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、双方とも２０１０年１１月２３日に出願された米国仮特許出願番号第６１／４５８，３９０号及び６１／４５８，３９１号の優先権を主張し、その全体が参照により援用される。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、癌幹細胞を単離する方法、及びこのようにして単離された癌幹細胞に関する。本発明は、さらに、対象の化合物が抗腫瘍剤として潜在的有効性を有するか否かを決定するために対象の化合物をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
化学療法及び寛解後の癌による死亡の大半は、最初に治療された腫瘍の再発が原因である。周知の癌療法は、必ずしもそうではないが、患者に「治癒した」と宣言できる程度まで腫瘍を排除する場合もあるため、このことは多少意外に思われる。
【０００４】
腫瘍の再発並びに腫瘍の成長を本質的に説明するために提起されている理論は、「癌幹細胞」又は「ＣＳＣ」理論である。即ち、この理論は、幹細胞のいくつかの特性を有する癌細胞の希少集団が、非対称分裂を行うことにより置換幹細胞となり、さらに系統が制限された腫瘍増殖細胞集団になると仮定している。これらの「新しい」細胞は急激に増殖し、幹細胞と比べて腫瘍の過半数を占めるようになる。幹細胞は、サイクルが遅く、静止状態であり、急激に分裂する細胞を標的とする治療法に耐性がある。このため、腫瘍内の細胞の大半はこれらの標的治療法の１つ以上に感応性を有する一方で、幹細胞様の化学療法耐性癌細胞の小集団は破壊されず、そのために上述のサイクルが繰り返される。
【０００５】
明らかに、これらの幹細胞様癌細胞を同定する必要性、並びに特定の対象または患者における腫瘍内に存在する幹細胞様癌細胞を定量化する必要性がある。また、腫瘍学の分野では、数多くの癌化学療法が認識されているが、「万能薬はない」。標的治療法や、潜在的に有用な抗腫瘍薬を特定するためのさらに普遍的な方法を開発する必要性が依然としてある。
【０００６】
そのすべてが参照により援用される米国特許第５，８８８，４９７号明細書、米国特許第６，３０３，１５１号明細書、米国特許第６，８０８，７０５号明細書、米国特許第６，８１８，２３０号明細書、米国特許第７，０４１，５０４号明細書、および米国特許第７，２９７，３３１号明細書には、アガロースでコーティングされたアガロースビーズ内に癌細胞をカプセル化する方法について開示されている。例えば参照により援用される米国特許出願公開第２００７／００７１７３２号明細書において他の細胞の種類（島）と関連して示されているとおり、アガロースの種類は多様であり得る。
【０００７】
このような癌細胞のカプセル化についての研究の結果、幹細胞に匹敵する特性を有する可能性がある細胞集団が発生することが観察された。従って、上記の参照文献に記載された材料を使って、幹細胞様特性をさらに有する化学療法耐性癌細胞を単離できるか否かを究明することに関心が持たれた。このような過程で、対象の化合物について癌に対して有効であるか否かを決定するためのスクリーニングに上記のカプセルを用いることができることも分かった。
【０００８】
本発明の上記の態様及びその他の態様がどのようにして達成されるかは、以下の開示で理解されよう。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【０００９】
その開示が参照により援用されるSmith, et al., Canc Res., 71(3): 716-724 (2011)、及びSmith et al., Canc. Res. 71(3): 724-735 (2011)に従って、ＲＥＮＣＡ細胞を含有する、アガロースでコーティングされたアガロースビーズを調製した。得られたビーズを１２週間培地中で培養した。
【００１０】
次に、ビーズのサンプルを、３つの異なる濃度のうちの１つの濃度の、１つの周知の抗癌剤に暴露した。この暴露において、これらのビーズは、この抗癌剤の周知の半減期に基づく期間、その抗癌剤の存在下で培養された。
【００１１】
培養後、ビーズを２回洗浄し、ナイーブ培地に移した。さらに、未処理のビーズ、並びに抗癌剤を可溶化するために用いられた任意の賦形剤に暴露されたビーズを含む対照を調製した。
【００１２】
抗癌剤に暴露した後、ビーズの組織学的検証を１週間行った。変化がないケースがある一方で、抗癌剤により細胞生存率の完全な損失に至ったケースや、中間効果があったケースもあった。結果は以下のとおりである。
【表１】
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【実施例２】
【００１３】
ドセタキセル及びパクリタキセルを用いた処理では、カプセル化された腫瘍コロニー内の細胞の全ては破壊されなかった。従って、これらの抗癌剤で処理されたビーズはさらなる研究のために選択された。低濃度のカルボプラチンまたは中濃度のビノレルビンで処理されたビーズも使用できたであろう。
【００１４】
パクリタキセル及びドセタキセルで処理されたビーズは、これら２つの抗癌剤の送達媒体であるＤＭＳＯに暴露された対象ビーズと同様に、標準条件下で培養された。培養期間は１８週間であった。
【００１５】
ＤＭＳＯで処理されたビーズ内にカプセル化された細胞は、通常の形態、すなわち内部の残屑（debris）を取り囲む細胞１〜２個分の厚さの細胞の周縁部からなる楕円形の腫瘍コロニーを示した。対照的に、３．５μｇ／ｍｌのパクリタキセルで処理されたビーズは、６週間は細胞の損失を示し、１８週までに処理前の細胞数に戻った。ドセタキセル（５μｇ／ｍｌ）で処理されたビーズは、処理後６週間で、１ビーズ当たりわずか１〜２個の細胞という一貫したパターンを示した。ビーズの約１０％は、１８週で１つまたは２つの大きなコロニーを発生した。
【００１６】
細胞損失を定量化するため、細胞核をカウントできるように、ＤＭＳＯ対照、パクリタキセルグループ及びドセタキセルグループの代表ビーズを、標準的な方法で切開し、染色した。結果は、ＤＭＳＯで処理されたビーズに正規化された。
【００１７】
パクリタキセルで処理した場合、１〜３週間で、１コロニーあたり約２５％の細胞の初期損失があった。ビーズの大半は生存細胞を含んだ。１８週間後、細胞数は増加し、対照のＤＭＳＯビーズと同等になった。ドセタキセルで処理されたビーズの場合、生存細胞は非常に急激に失われ、処理後６週間でコロニーにはわずか１〜２個の生存細胞しか存在しなかった。１８週目には、ビーズの約１０％が１つ又は２つの大きな細胞コロニーを発生した。これにより、希少なドセタキセル耐性ＲＥＮＣＡ細胞がビーズ内に新しいコロニーを形成できることが示された。
【実施例３】
【００１８】
最近の証拠では、胚幹細胞のマーカーであるＯＣＴ４（「オクタマー結合転写因子４」）を他の転写因子とともに使用することにより、成熟細胞を多能性幹細胞様に誘導できることが示唆されている。例えば、Park et al., Nature 451 (7475): 141-146 (2008)を参照されたい。幹細胞のさらなるマーカー特性は、例えば、本明細書に参照により援用されるInternational Stem Cell Initiative, et al, Nat. Biotechnol 25(7):803-16 (2007)に記載されている。
【００１９】
ドセタキセルで処理した細胞に残存した細胞が処理後６週間でこのマーカーを示すか否かを検証するために実験を行った。
【００２０】
生存細胞を同定するため、ＤＡＰＩで細胞を染色した。一方、標準的な免疫化学手順により、ＯＣＴ４に対するウサギポリクローナル抗体、及びＦｌｕｏｒ４８８共役体で標識されたヤギ抗−Ｉｇ６抗体を用いて、ＯＣＴ４に対して染色した。
【００２１】
結果は、生存細胞がＯＣＴ４を発現したことを示した。ドセタキセル耐性であることにより得られた発現は、残存する細胞が癌幹細胞であることを示唆する。
【実施例４】
【００２２】
癌幹細胞の必要条件は、癌細胞のコロニーを形成する能力である。上述の癌幹細胞が癌細胞のコロニーを形成し得るか否かを決定するため、ビーズからコロニーを取り除き、除去から５〜６週間後に生きている細胞を機械的破壊により採取し、ＲＰＭＩ１６４０と１０％新生子牛血清の中でピンセットを使ってコロニーを細分化した。次に、アガロース残骸を最小限に抑えるために懸濁液を４０μｍ細胞ろ過器に通し、遠心分離によりペレット化した。細胞ペレットをナイーブ培地中で再懸濁し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（１０％新生子牛血清を補充したＲＰＭＩ１６４０中２００細胞／ｍｌ）またはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで培養した。同化させるため、レシピエントマウスからの一滴の血液を２００個の細胞と混合して血餅を形成し、血液を採取したマウスの腎臓被膜下に移植した。その後、これらのマウスにおける腫瘍の成長を観察した。精製された幹細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの移植後の腫瘍の発生は、当該技術分野において承認された、癌幹細胞を同定する「判断基準」と考えられる。
【００２３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで成長したＲＥＮＣＡ細胞は、単層で成長した通常のＲＥＮＣＡ細胞よりかなり大きく、約１６週間、細胞の成長が観察されなかった。培養後１６〜１７週間で、細胞はプラークを形成し、１週間経過すると増殖を始め、培養物中で単層として成長した。しかし、単層成長開始後２週間で、これらの細胞の成長速度は通常のＲＥＮＣＡ細胞と同等となり、大きさと形態も含めて、通常のＲＥＮＣＡ単層細胞と同様に見えた。
【００２４】
移植を受けた１０匹のマウスのうち、１匹が被膜下に腫瘍を発生し、誘導後９８日で死亡した。また、このマウスは肺転移も発生した。
【００２５】
上記の結果は、これらの細胞が癌幹細胞と考えられることを示す。
【００２６】
前述の実施例は、ドセタキセルなどの化学療法剤に耐性があり且つＯＣＴ４発現などの幹細胞の１つ以上の特性を有する癌細胞を単離する方法を含む、本発明の様々な態様を説明している。幹細胞のその他の特性は当該分野で周知であり、ここでは繰り返さない。上記方法は、癌細胞のサンプルをアガロース含有ビーズ内にカプセル化してからアガロースでコーティングすること、得られたビーズを培養してビーズ内に含有された癌細胞を培養すること、このビーズを化学療法剤と接触させること、及び生存している細胞をそのままで或いはビーズから除去し、ＯＣＴ４を発現している生存細胞を決定することを含む。
【００２７】
上述のように、本明細書中に記載された種類の細胞は被験者における癌の再発の原因であるため、本方法を、例えば、癌を発症した対象の予後を示すために使用することができる。基本的に、前記細胞の割合が高い場合、その患者の予後は、カプセル化されたサンプル内にこのような細胞を僅かしか又は全く示さない患者の場合に比べて不良であることを示す。
【００２８】
本発明の方法において、任意の化学療法剤、及び任意の種類の癌を使用してもよい。当業者であれば、癌治療のための多くのその他の周知の治療薬を認識するであろう。同様に、例えば上述の参照文献から、本明細書に記載されたものに加え、様々な癌及びアガロースを使用し得ることが理解されよう。また、本発明のビーズは、コラーゲンなどの材料、またはアガロースと相溶性があるその他の材料を含んでもよい。癌細胞は、好ましくは哺乳類細胞であり、最も好ましくはヒト細胞である。
【００２９】
しかし、単離された細胞は本明細書で報告された周知の化学療法剤に耐性であるという事実は、化学療法自体に耐性であることを意味するものではない。本明細書で試験した薬剤は、示されているように、一般的に、急速に増殖する細胞の破壊に有用な薬物である。アガロースでコーティングされたアガロースビーズ内に残存する細胞によって示される種類の細胞に適用されるその他の治療法が存在し、その治療法は当業者に周知であろう。本明細書で報告されていないが、このような薬物を上記の幹細胞様の化学療法耐性ＯＣＴ４発現細胞に対して試験してもよく、また、例えば、対象は治療の第一過程で標準的な抗癌剤を受け、続いて本明細書に記載された、単離された細胞の種類に沿った薬剤を受けるといった治療計画を作成してもよい。このような細胞は、ドセタキセルのような化学療法剤に耐性があり、ＯＣＴ４を発現する、単離された癌細胞である。本発明の本態様において、対象の物質を、第１の薬剤との接触後に残存する幹細胞様癌細胞に対して試験してもよく、或いは幹細胞様癌細胞の別のサンプルをカプセル化して同様に進めてもよい。
【００３０】
当業者であれば、本発明は、対象の化合物が抗腫瘍剤として有効であるか否かを同定するための方法に関することにも注目するであろう。理解されるように、本方法は、癌細胞のサンプルを含有する、アガロースでコーティングされたアガロースビーズに、選択された期間、選択された濃度で、対象の化合物を接触させること、及びこの化合物が対照よりも高い割合の細胞を破壊するか否かを決定することを含む。このような場合、この化合物は、混合された細胞集団内で癌細胞を破壊する場合や、細胞混合物から非幹細胞の癌細胞を排除する場合などの用途のような非治療関係に加えて、治療的にも有用であると考えられる。また、組み合わせ療法が適切であるか否かを明らかにするために、２つ以上の潜在的に有用な治療薬の「カクテル」や、周知の治療薬と試験化合物の組み合わせも考えられる。
【００３１】
本発明の他の特徴は当業者に明らかであり、ここで繰り返す必要はないであろう。
【００３２】
適用されてきた用語及び表現は、記載の用語として使用され、制限の用語として使用されない。このような用語及び表現の使用において、示された又は記載された特徴の均等物及びその部分を排除することは意図されておらず、本発明の範囲内で様々な変更が可能であることが理解される。