(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の標的核酸の検出方法であって、
標的核酸と、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼと、少なくとも１つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰを含有するデオキシヌクレオシド５’−三リン酸の混合物とを含む反応混合物を提供する工程；
該標的核酸を増幅する工程であって、該少なくとも１つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰがＤＮＡアンプリコンに組み込まれ、その結果、強化されたハイブリダイゼーション特性を有する修飾ＤＮＡのコピーが得られる、工程；
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを提供して、該少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを該修飾ＤＮＡにハイブリダイズさせて、複合体を形成する工程；および
該複合体を検出する工程であって、該複合体の存在が、該サンプル中の該標的核酸の存在の指標となる、工程；
を含む、方法。
【請求項２】
前記標的核酸が、ＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的核酸が、ＲＮＡであり、該標的核酸の増幅が、逆転写酵素を使用して該ＲＮＡの少なくとも１つのＤＮＡコピーを合成する段階を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
１つより多くのオリゴヌクレオチドプライマーが、前記標的核酸を増幅するために使用され、前記修飾ＤＮＡが、前記増幅の任意の段階において、該オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つのためのテンプレートとしての役割を果たす、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
１つより多くの標的核酸を増幅および検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーおよび少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを、増幅および検出される標的核酸ごとに提供する、請求項５に記載の方
法。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドプライマーの１つより多くを、増幅および検出される前記標的核酸ごとに提供し、ならびに前記修飾ＤＮＡの少なくとも１つが、前記増幅の任意の段階において、該オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つのためのテンプレートとしての役割を果たす、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記標的核酸の検出を、前記増幅後に行う、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記標的核酸の検出を、リアルタイムで行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰが、それぞれの天然ｄＮＴＰを完全に置換する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰが、それぞれの天然ｄＮＴＰを部分的に置換する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記反応混合物が、前記塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰの１つより多くを含み、該塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰは各々、それぞれの天然ｄＮＴＰを完全に、または部分的にのいずれかで置換する、請求項１、１０および１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰが、式Ｉ：
【化１】
0005878681.tif 000006
である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的核酸を増幅する工程および検出する工程を、前記サンプル中の該標的核酸の量を測定するために行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的核酸を増幅する工程が、等温増幅の使用を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的核酸を増幅する工程が、検出ＰＣＲの使用を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーが、標識を含有し、該標識を、前記修飾ＤＮＡの検出に使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記標識が、蛍光標識である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーが、二重鎖安定化修飾物を含有し、該二重鎖安定化修飾物が、修飾ヌクレオチドおよび／または前記オリゴヌクレオチドプライマーの５’末端にコンジュゲートしたテールのうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記テールが、インターカレーターを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記テールが、副溝バインダーを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記修飾ＤＮＡを検出する工程が、検出剤の使用を含み、該検出剤が、該修飾ＤＮＡと相互作用して検出シグナルをもたらし、該シグナルの検出が、前記反応混合物中の該修飾ＤＮＡの存在の指標となる、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記検出剤が、蛍光剤を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記蛍光剤が、前記修飾ＤＮＡと相互作用してその蛍光特性を変化させ、それによって、前記検出シグナルをもたらす、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記蛍光剤が、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ色素を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
（ｉ）少なくとも１つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰ、ならびに（ｉｉ）以下の成分：オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよび検出剤、のうちの少なくとも１つを含む、請求項１および２２のいずれか一項に記載の方法を行うためのキット。
【請求項２７】
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー、前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブが、同じ分子の部分またはフラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
１つより多くの標的核酸を、増幅および検出し、少なくとも１つの前記オリゴヌクレオチドプライマーを、増幅および／または検出される標的核酸ごとに提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
１つより多くのオリゴヌクレオチドプライマーおよび／または１つより多くのオリゴヌクレオチドプローブを、前記標的核酸を増幅および／または検出する工程において使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記オリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブまたは修飾ＤＮＡのうちの少なくとも１つが、前記増幅段階もしくは検出段階または両方の段階において固体支持体上に固定されている、請求項１に記載の方法。    
【請求項３１】
前記オリゴヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドプローブおよび／または修飾ＤＮＡのうちの少なくとも１つが、標識を含有し、該標識が、前記修飾ＤＮＡの検出を可能にする、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブが、前記標識を含有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記標識が、蛍光標識を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記オリゴヌクレオチドプローブが、ＦＲＥＴプローブであり、該ＦＲＥＴプローブが、前記修飾ＤＮＡと複合体を形成するとその蛍光特性を変化させ、該変化が、該複合体の存在の指標となる、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＦＲＥＴプローブが、ハイブリダイゼーション誘発ＦＲＥＴプローブを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ハイブリダイゼーション誘発ＦＲＥＴプローブが、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマーである、請求項２７および３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＦＲＥＴプローブが、切断可能なＦＲＥＴプローブを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記検出ＰＣＲを、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して行い、該オリゴヌクレオチドプライマーが、前記標的核酸の指数関数的増幅をもたらす、請求項１６に記載の方法。
【請求項３９】
前記検出ＰＣＲが、定量的ＰＣＲを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
サンプル中の標的核酸の検出方法であって：
標的核酸と、該標的核酸の指数関数的増幅をもたらすための少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼと、少なくとも１つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰを含有するデオキシヌクレオシド５’−三リン酸の混合物とを含む反応混合物中で検出ＰＣＲを用いて該標的核酸を増幅させる工程であって、該少なくとも１つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰがＤＮＡアンプリコンに組み込まれ、その結果、強化されたハイブリダイゼーション特性を有する修飾ＤＮＡのコピーが得られる、工程；
該修飾ＤＮＡにハイブリダイズして複合体を形成する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを使用して、該修飾ＤＮＡを検出する工程；および
該複合体を検出する工程であって、該複合体の存在が、該サンプル中の該標的核酸の存在の指標となる、工程；
を含む方法。
【請求項４１】
前記標的核酸が、ＤＮＡである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記標的核酸が、ＲＮＡであり、該標的核酸を増幅する工程が、逆転写酵素を使用して該ＲＮＡの少なくとも１つのＤＮＡコピーを合成する段階を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記オリゴヌクレオチドプライマーの１つおよび前記オリゴヌクレオチドプローブが、同じ分子のフラグメントの部分である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
１つより多くの標的核酸を、増幅および検出し、前記ポリヌクレオチドプライマーの少なくとも２つおよび前記オリゴヌクレオチドプローブの少なくとも１つを、標的核酸ごとに提供する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記修飾ＤＮＡを検出する工程を、前記増幅の後に行う、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記標的核酸の検出を、リアルタイムで行う、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
前記オリゴヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドプローブおよび／または修飾
ＤＮＡのうちの少なくとも１つが、前記増幅段階もしくは検出段階または両方の段階において固体支持体上に固定されている、請求項４０に記載の方法。
【請求項４８】
前記塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰが、それぞれの天然ｄＮＴＰを完全に置換する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４９】
前記塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰが、それぞれの天然ｄＮＴＰを部分的に置換する、請求項４０に記載の方法。
【請求項５０】
前記標的核酸を増幅する工程が、１つより多くの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰの使用を含み、該塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰは各々、それぞれの天然ｄＮＴＰを完全にまたは部分的にのいずれかで置換する、請求項４０に記載の方法。
【請求項５１】
前記塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰが、式Ｉ：
【化３】
0005878681.tif 000007
である、請求項４０に記載の方法。
【請求項５２】
前記標的核酸を増幅する工程および検出する工程を、前記サンプル中の該標的核酸の量を測定するために行う、請求項４０および４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記オリゴヌクレオチドプローブが、標識を含有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項５４】
前記標識が、蛍光標識を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記標識が、蛍光−偏光標識を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記オリゴヌクレオチドプライマーの一方もしくは両方、または前記オリゴヌクレオチドプローブ、または該プライマーの１つもしくは複数と該プローブとの両方が、１つ以上の二重鎖安定化修飾物を含有し、該二重鎖安定化修飾物が、修飾ヌクレオチドおよび／または前記オリゴヌクレオチドプライマーの５’末端にコンジュゲートしたテールのうちの少なくとも１つを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項５７】
前記テールが、インターカレーターを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記テールが、副溝バインダーを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記オリゴヌクレオチドプローブが、ＦＲＥＴプローブを含み、該ＦＲＥＴプローブが、前記修飾ＤＮＡと前記複合体を形成するとその蛍光特性を変化させ、該変化が、該複合体の存在の指標となる、請求項４０に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＦＲＥＴプローブが、ハイブリダイゼーション誘発ＦＲＥＴプローブを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ハイブリダイゼーション誘発ＦＲＥＴプローブが、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマーを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ハイブリダイゼーション誘発ＦＲＥＴプローブが、ｂｅａｃｏｎプローブを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＦＲＥＴプローブが、切断可能なＦＲＥＴプローブを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
前記切断可能なＦＲＥＴプローブが、ＴａｑＭａｎプローブを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記検出ＰＣＲが、定量的ＰＣＲを含む、請求項４０および４６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明の態様は、概して、新規の改善された核酸検出法に関し、さらに詳細には、塩基修飾二重鎖安定化ヌクレオシド三リン酸の使用を含む、新規の改善されたＰＣＲベース核酸検出法に関する。
【０００２】
（関連出願への相互参照）
この出願は、２００６年４月２８日に出願された米国仮特許出願第６０／７９５，７０５号および２００６年１０月４日に出願された同第６０／８４９，５２６号（これらの両方は、その全体が参考として本明細書に援用される）への優先権の利益を主張する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
Ｉ．ＤＮＡ検出技術。
【０００４】
核酸検出アッセイおよび感度。公知のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ検出技術は、相補性の原理に基づく。例えば、オリゴヌクレオチド配列を、所望のまたは所定の核酸標的配列と相補二重鎖を形成するその能力に基づいて選択し、その相補二重鎖を検出する（これがその反応混合物中の標的核酸の存在を示す）。そうしたハイブリダイゼーションベース検出アッセイは、少なくとも原則としては、対象となる核酸を試験サンプル中のその濃度に関係なく検出するはずである。しかし、そうした直接検出ハイブリダイゼーションアッセイの感度は限られており、幾つかの高感度直接核酸検出技術が、現在、開発中ではあるが、標的核酸の増幅は、典型的なＤＮＡ検出システムの重要な構成要素である。非常に多数の増幅技術が当該技術分野において公知であり、最も周知な例としては、次のものが挙げられる：鎖置換型増幅（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒ  Ｇ．Ｔ．ら、米国特許第５，２７０，１８４号；Ｄａｔｔａｇｕｐｔａ  Ｎ．ら、米国特許第６，２１４，５８７号；Ｗａｌｋｅｒ  Ｇ．Ｔ．ら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２４，３８４−３５３）；ローリングサークル型増幅（Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＲＣＡ）（Ｌｉｚａｒｄｉ  Ｐ．，米国特許第５，８５４，０３３号）；線形的標的等温多量体化および増幅（Ｌｉｎｅａｒ  ｔａｒｇｅｔ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＬＩＭＡ）（Ｈａｆｎｅｒ  Ｇ．Ｊ．ら（２００１）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３０，８５２−８６７）；ループ媒介増幅（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＬＭＡ）（Ｎｏｔｏｍｉ  Ｔ．およびＨａｓｅ  Ｔ．，米国特許第６，４１０，２７８号；Ｎｏｔｏｍｉ  Ｔ．ら（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２８，ｅ６３）；キメラまたは複合ＲＮＡ／ＤＮＡプライマーを使用する等温増幅（Ｃｌｅｕｚｉａｔ  Ｐ．およびＭａｎｄｒａｎｄ  Ｂ．，米国特許第５，８２４，５１７号；Ｋｕｒｎ  Ｎ．（２００１）米国特許第６，２５１，６３９号）；核酸配列ベース増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＳＢＡ）（Ｏｅｈｌｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ  Ｆ．ら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，１２８１１−１２８１６；Ｄａｖｅｙ  Ｃ．およびＭａｌｅｋ  Ｌ．Ｔ．，米国特許第６，０６３，６０３号）；ならびに他の方法。これらの技術の中で群を抜いて最も一般的な要素は、試験核酸の所望の／所定の標的配列と相補的ハイブリダイゼーション複合体を形成するオリゴヌクレオチドプライマーの使用であり、これは、ＤＮＡコピーの合成を開始させ、標的核酸増幅に備える。
【０００５】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いる核酸検出；プライマー設計における限界；核酸検出への障害。ＤＮＡは、たった２つの塩基対、Ａ−ＴおよびＧ−Ｃ、から成り、主として、ＤＮＡ二重鎖におけるこれらの塩基対の配列および配向が、すべての比較遺伝子レベルでの寿命の多様性の基礎となる。特に、Ｇ−Ｃ塩基対とＡ−Ｔ塩基対との間の安定性の違いは、ＤＮＡの機能および多様性を定義する上で重要な要因である。しかし、Ａ−Ｔリッチ配列とＧ−Ｃリッチ配列との間の二重鎖安定性の点でのそのような違いは、核酸検出にとって深刻な問題を提起する。プローブの形態であろうと、プライマーの形態であろうと、有用な検出オリゴヌクレオチドは、増幅および／または検出を容易にするのに適切な条件下で、それぞれの標的核酸配列と、安定した相補的ハイブリダイゼーション複合体を形成することができる必要がある。有意には、適切な検出オリゴヌクレオチドの同定は、標的核酸の熱力学的多様性のため、難しいまたは問題がある場合が多い。例えば、当該技術分野において認知されているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法の特徴である高温で十分に効用がある検出オリゴヌクレオチドの同定（例えば、Ｍｕｌｌｉｓ  Ｋ．Ｂ．ら、米国特許第４，６８３，１９５号、およびＭｕｌｌｉｓ  Ｋ．Ｂ．，米国特許第４，６８３，２０２号）は、標的配列内の特定のＡ−ＴおよびＧ−Ｃ配列組成（例えば、Ａ−Ｔリッチおよび／またはＧ−Ｃリッチ配列）の存在のため、問題がある場合が多く、また場合によっては阻まれる。
【０００６】
少なくとも理論上はＤＮＡまたはＲＮＡのたった１つほどの少ないコピーを増幅および検出することができる、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法論は、核酸の検出に革命を起こした。代表的なＰＣＲベース検出アッセイは、少なくとも２つのプライマーと１つの蛍光プローブとから成る。蛍光をナノモルレベルで検出することができ、このレベルは、十分にＰＣＲの感度および生産力の範囲内である。ＰＣＲプライマーは、一般に、対立するＤＮＡ鎖に結合するように設計され、すなわち、それらのプライマーは、一方の伸長が他方のプライマーのためのテンプレートを作るような配向で結合する。ＰＣＲ反応は、前のサイクルで合成されたＤＮＡフラグメントを変性工程（一般には９５℃）で「鎖分離」させ、その後、急冷して「アニーリング−伸長」段階を開始させる（一般に、５５−６５℃で行われる）というサイクルで進む。アニーリング段階において、プライマーは、増幅された鎖に再び結合し、好熱性ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。最適なＰＣＲ条件下では、増幅されたＤＮＡフラグメントの濃度がＰＣＲサイクルごとに倍増し、初期標的量／負荷量に依存して〜２０−４０サイクル後には検出可能なレベルに達する。
【０００７】
サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（「Ｔａｑ」；Ｔａｑポリメラーゼ）は、ＰＣＲ変性工程／段階の特徴的高温下でのその熱安定性のため、「検出」ＰＣＲにおいてプライマー伸長のために最も一般的に使用される標準酵素であり続けている。Ｔａｑポリメラーゼは、約７５℃で、１秒につき６０より多くのヌクレオチドを組み込む最大活性を示し（Ｔａｋａｇｉ  Ｍ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６３：４５０４-４５１０，１９９７；Ｉｎｎｉ
ｓ  Ｍ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：９４３６−９４４０，１９８８）、それ故、ＰＣＲに最適な伸長温度を規定する。原則的に、そうした高温（例えば、７５℃）でのＰＣＲの実施は、幾つかの利点をもたらす。例えば、高温での伸長は、変性工程／段階（約９５℃）とアニーリング／伸長工程／段階との温度ギャップ／差を２０℃に減少させ、その結果、ＰＣＲサイクル中の昇温に関する時間を節約することができ、この節約時間は、特定のリアルタイムＰＣＲ機器（例えば、ＡＢＩ  ７７００または７９００、およびＢｉｏ−Ｒａｄ  ｉＣｙｃｌｅｒＴＭなど）には有意であり得る。加えて、高温でのＰＣＲは、より配列特異的である。なぜなら、低温では、誤増幅およびプライマー−二量体の形成が、増進／加速されるからである。しかし、そうした最適なＴａｑ温度でＰＣＲを行う利点に反して、７０℃より高いアニーリング温度の使用は非常に稀であり、実施上の理由（例えば、プローブ／標的二重鎖安定性）から、プライマーアニー
リングに最も一般的に用いられる温度は、約５６−５８℃から約６０−６２℃の範囲であり、そしてどちらかと言えばアニーリング後に一般には追加の伸長段階（＞７２℃）を導
入して、その伸長工程／段階の効率を向上させる。残念なことに、追加の伸長段階（＞７２℃）の温度を上昇させることによってＰＣＲ反応のこの態様は向上するが、低いアニーリング温度への反応物の短時間の暴露でさえ、「ミスプライミング」およびプライマー−二量体形成を誘発し得る。それにもかかわらず、本質的に核酸またはＤＮＡの構造的および熱力学的多様性にかんがみて、代表的なアニーリング範囲（約５６−５８から約６０−６２℃）は存続している。すなわち、Ａ／Ｔリッチ二重鎖は、比較的高いＧ／Ｃ含有率を有する二重鎖より有意に安定性が劣り、およびより高いアニーリング温度を利用する反応条件は、先行技術の方法の範囲を有意に制限するであろう。例えば、図１に示す例示的なＴｍデータは、アニーリングと最適なＴａｑ伸長との間の差に基づく効率に関する問題を示している。
【０００８】
図１において、プライマー番号１（配列番号：１）は、長いモノおよびジヌクレオチドリピートを回避するように、および等しいＡ／Ｔ塩基比を有するように、ランダムに設計された、完全ＡＴリッチ２２−ｍｅｒオリゴヌクレオチドである。他のプライマー、番号２−２３（配列番号：２−２３）は、配列番号：１を基にして、ＴをＣにおよびＡをＧにそれぞれ変えることによりＧＣ含有率を徐々に増加させることによって誘導した。分かるように、これらの例示的な２２−ｍｅｒオリゴヌクレオチドの熱安定性は、そのＧＣ塩基含有率に依存して、４３から８５℃の広い温度範囲で変動する。例えば、３５−４０％未満のＧＣ含有率を有するプライマーは、６０℃でのＰＣＲのための安定性要求条件を満たしておらず、このことにより、ＰＣＲプライマー設計用のすべての最新ソフトウェアによって用いられる好ましいＧＣ含有率範囲が、約４０−８０％の範囲内である理由が解明される。実際、２２−ｍｅｒは、ＰＣＲプライマーの代表的な長さを表し、このプライマー長は、一般に、最低Ｔｍ要求値に対応する。しかし、その伸長が「ＧＣアイランド」まで伸びない限り、ＡＴ−リッチ配列内の分析のためのプライマー長の増加は、付随する熱安定性の問題を克服しない。図２は、（ｄＡ−ｄＴ）ｎホモポリマーが、６０℃よりわずかに上で「プラトー」値に達する傾向があり、２５−３０−ｍｅｒより長いオリゴヌクレオチドについては、塩基あたりの安定化効率（℃／塩基）増加が、急速に低下することを示している。加えて、極めてＡＴリッチなプライマーは、温度＞７０℃ではＰＣＲに用いることができない。さらに、長いプライマー（＞３０−４０−ｍｅｒ）は、付随する低い製造収率および量のため、使用が制限される。
【０００９】
多型変異および遺伝子発現の研究。システム設計に関する問題を随伴する可能性が最も低いＰＣＲ用途には、遺伝子発現の研究がある。なぜなら、標的遺伝子配列が、通常、比較的長く、そのため適切なプライマーおよびプローブの設計に十分な配列距離を提供するからである。対照的に、多型（例えば、ＳＮＰ）の検出のためのＰＣＲ設計は、標的多型の位置を限定し、またはその位置によって制限され、ならびに良好なシステムまたは検出設計の確立は、標的多型が、約６５−７０％を超えるＡＴ含有率を有する熱不安定性標的領域内に位置するとき、不可能ではないにせよ、概して困難である。一般的に言うと、ＰＣＲアンプリコンは、できる限り短くある必要がある。なぜなら、アンプリコンの長さは、一般に、ＰＣＲ収率に悪影響を及ぼし、その結果、核酸検出アッセイの全性能にも悪影響を及ぼすからである。
【００１０】
ＰＣＲ機器類。ＳＭＡＲＴＣＹＣＬＥＲ（商標）（Ｃｅｐｈｅｉｄ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、それぞれの反応セルまたは区画について個別に取り扱われる温度および時間プロフィールでＰＣＲアッセイを行うことができる、リアルタイム蛍光機器の一例である。しかし、該機器は、１６のＰＣＲ反応区画しか有さず、非常に優れてはいるが、その結果、特に、ハイスルプーットアッセイには適さない。すべての他の市販機器は、反応実行の際にすべての反応セルに対して共通のまたは一様なＰＣＲ条件を使用することに備えている。従って、これらの計測器に対しての高温ＰＣＲ管理様式の選択は、対象となる多数の標的の検出をはばみ、分析範囲を狭める場合がある。従って、このプロフィールの一様性の必要条件は、アッセイ温度の選択に影響を及ぼす、および／またはアッセイ温度の選択を左右する主要因である。加えて、多くのＦＲＥＴシステム設計（例えば、ＴａｑＭａｎ（商標）、およびＢｅａｃｏｎｓ（商標））において、プローブのＴｍスケールは、許容されるレベルより下への蛍光シグナルの低下が起こらないようにするために、プライマーのものより少なくとも５℃、より安定である必要がある。この必要条件が、より低いアニーリング温度を使用する動機の一因となっている。例えば、プライマーを７０℃のアニーリング温度で動作するように設計する場合、プローブＴｍは、＞７５℃である必要があり、これは、達成することが難しい必要条件である。
【００１１】
プローブおよびプライマーハイブリダイゼーション特性の強化。プローブおよびプライマーハイブリダイゼーション特性の強化するための多数の方法が、当該技術分野において公知である。例えば、「主溝結合部分」（ＭＧＢ−部分；Ｋｕｔｙａｖｉｎ  Ｉ．Ｖ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３７１８−３７２３，１９９７）とのコンジュゲーションは、ＴａｑＭａｎ（商標）技術（Ｋｕｔｙａｖｉｎ  Ｉ．Ｖ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２８：６５５−６６１，２０００）をよみがえらせた強い二重鎖安定剤である。同様に、ＭＧＢテールを有するＥｃｌｉｐｓｅプローブ（Ａｆｏｎｉｎａ  Ｉ．Ａ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３２：９４０−９４９，２００２）の場合では、プローブ長の実質的な減少を可能にすることが、偶発的に、より低い蛍光バックグラウンドを生じさせる結果となった。例えば、比較的短い１２−１８−ｍｅｒのＭＧＢ−ＴａｑＭａｎ（商標）プローブが、改善されたＳＮＰ識別の手だてとなることは証明されており（Ｋｕｔｙａｖｉｎ  Ｉ．Ｖ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２８：６５５−６６１，２０００）、比較的良好なシグナルレベルの提供および直接製造が、そうしたプローブの商業的成功および広い受け入れの一因となっている。加えて、タンパク質核酸（「ＰＮＡ」）誘導体（Ｏｒｔｉｚ，Ｅ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，１２，２１９−２２６，１９９８）はもちろん、Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（商標）（「ＬＮＡ（商標）」）誘導体は、ＦＲＥＴプローブの設計の際に使用される成功した修飾物である（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，Ｏ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３８：２９−３２，２００５；Ｙｏｕ，Ｙ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３４：ｅ６０，２００６）。しかし、残念なことに、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ）は、プローブ設計の際に潜在的に適用可能な、大部分ではなかったとしても、多くの構造修飾物を許容しない。例えば、ＬＮＡヌクレオチド類似体は、オリゴヌクレオチドプライマーに組み込むことができるが、これらの修飾物の数は、限定される。ＬＮＡ修飾プライマーの使用の例は、Ｌａｔｏｒｒａ  Ｄ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，１７：２５３−２５９，２００３；  Ｌａｔｏｒｒａ  Ｄ．ら、Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．，２２：７９−８５，２００３；Ｄｉ  Ｇｉｕｓｔｏ  Ｄ．Ａ．ａｎｄ  Ｋｉｎｇ  Ｇ．Ｃ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３２：ｅ３２，２００４に記載されている。
【００１２】
従って、組成的に基準から外れたまたは極端な核酸配列のＰＣＲ増幅および検出を改善するための、用途の広い単純なアプローチが、特に、Ａ−Ｔリッチ標的配列に関連して、明白に必要とされている。
【００１３】
ＩＩ．ヌクレオシド５’−三リン酸の修飾類似体を使用する核酸の酵素的合成。
【００１４】
核酸検出に関して今日までになされた有意な進歩にもかかわらず、プライマーおよびプローブのハイブリダイゼーション特性を強化する方法は、まだ最適ではない。
【００１５】
塩基修飾プライマー。二重鎖安定化部分およびヌクレオチド類似体を有する修飾オリゴヌクレオチドの製造は限られており、複雑であり、費用がかかる。例えば、Ｌｅｂｅｄｅｖ  Ｙ．および同僚（Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．，１３：１５−２１，１９９６）は、シトシンおよびアデニンの代わりに、それぞれ、５−メチルシトシン（５−ＭｅＣ）および２，６−ジアミノ−プリン（２−ａｍＡ）などの修飾塩基を含有するＰＣＲプライマーおよびプローブ（Ｐｒｏｓｎｙａｋ  Ｍ．Ｉ．ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２１：４９０−４９４，１９９４）を使用することの利点を立証した。これらのオリゴヌクレオチドは、相補配列に対して通常より高い親和性を有し、それらは、ＰＣＲ増幅においてそれらの通常の相補物より良好に動作する。有意には、そうしたプライマーおよびプローブの使用は、７２℃ほどもの高いアニーリング温度での増幅を可能にする（Ｌｅｂｅｄｅｖ  Ｙ．ら、Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．，１３：１５−２１，１９９６）。残念なことに、これらの塩基修飾プライマーは、最も可能性の高いところでは比較的高い製造コストのため、当該技術分野において採用されていない。
【００１６】
プライマー伸長およびＰＣＲにおける修飾ヌクレオシド５’−三リン酸の使用。修飾ＤＮＡまたはＲＮＡポリマーの作製における修飾５’−三リン酸の使用は、生物工学、ナノテクノロジー、分子生物学および医学での用途について報告されている。ポリヌクレオチドの化学合成は非能率的、且つ、困難であり、一定の構造修飾物は、それらの相対的不安定性のため、化学的に導入することができない。酵素的合成は、所望の生体ポリマーを作製するための代替アプローチであり、酵素的合成を支援するヌクレオチド修飾の範囲を決定するために非常に多数の研究が行われている。
【００１７】
修飾ポリヌクレオチドは、次の場合に使用されている：核酸の配列決定（Ｗａｒｄ  Ｂ．ら（２００５）米国特許第６，９０２，９１４号；Ｐｏｒｔｅｒ  Ｋ．Ｗ．ら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：１６１１−１６１７）；ならびに固定化および標識技術の開発、およびタンパク質と核酸との相互作用の研究（Ｓｅｅｌａ  Ｆ．ａｎｄ  Ｒｏｌｉｎｇ  Ａ．（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０：５５−６１；Ｂａｉｌｌｙ  Ｃ．ａｎｄ  Ｗａｒｉｎｇ  Ｍ．Ｊ．（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３：８８５−８９２；Ｂａｉｌｌｙ  Ｃ．ら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７：１０３３−１０４５；Ｂａｉｌｌｙ  Ｃ．ａｎｄ  Ｗａｒｉｎｇ  Ｍ．Ｊ．（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２６：４３０９−４３１４）。加えて、一定のヌクレオチド修飾が、次の場合に用いられている：核酸の触媒能力範囲の強化（Ｊａｇｅｒ  Ｓ．ａｎｄ  Ｆａｍｕｌｏｋ  Ｍ．（２００４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４３：３３３７−３３４０；非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）；エキソ−およびエンド−ヌクレアーゼからのポリヌクレオチドの保護（Ｗａｒｄ  Ｂ．ら（２００５）米国特許第６，９０２，９１４号；Ｓｕｍｍｅｒｓ  Ｊ．Ｓ．ａｎｄ  Ｓｈａｗ  Ｂ．Ｒ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，８：１１４７−１１５５；Ｓｈａｗ  Ｂ．Ｒ．ら（２００４）米国特許第６，８０８，８９７号；Ｐｏｒｔｅｒ  Ｋ．Ｗ．ら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：１６１１−１６１７；Ｓｅｅｌａ  Ｆ．ａｎｄ  Ｒｏｌｉｎｇ  Ａ．（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０：５５−６１）；ならびにメチル依存性エンドヌクレアーゼを研究するための二重鎖ＤＮＡポリマーの提供（Ｗｏｎｇ  Ｋ．Ｋ．ａｎｄ  ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ，Ｍ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：１０８１−１０８５）。
【００１８】
しかし、強化されたハイブリダイゼーション特性を有するポリヌクレオチドを調製するための修飾ｄＮＴＰ誘導体の使用例は、非常に稀である。具体的は、報告されている研究は、マイクロアレイハイブリダイゼーションによる検出および特性付けのための１本鎖、蛍光標識ＲＮＡの酵素的合成に関し、この場合、広範な配列および発現レベルにわたってマイクロアレイハイブリダイゼーションシグナルを改善する目的で、リボヌクレオシド５’−三リン酸（ｒＮＴＰ）が、ＲＮＡ重合において使用された。例えば、Ｎｇｕｙｅｎ  Ａ．ら（ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２：１４，２００２）は、二重鎖安定化リボヌクレオシド５’−三リン酸（ｒＮＴＰ）、例えば、２，６−ジアミノプリン  ｒ（２−ａｍＡ）ＴＰ、５−メチルウリジン  ｒ（５−ＭｅＵ）ＴＰおよび５−メチルシトシン  ｒ（５−ＭｅＣ）ＴＰ  ５’−三リン酸を使用し、対してＨａｃｉａ  Ｊ．Ｇ．および同僚（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２６：４９７５−４９８２，１９９８）は、ｒ（２−ａｍＡ）ＴＰ、ｒ（５−ＭｅＵ）ＴＰおよび５−（１−プロピニル）−ウリジン  ｒ（５−ＰｒＵ）ＴＰ類似体を研究した。Ｎｇｕｙｅｎらは、２，６−ジアミノ−プリン含有するＲＮＡサンプルが、大多数の配列についてシグナル強度を増大させる一方で、ｒ（５−ＭｅＵ）ＴＰおよびｒ（５−ＭｅＣ）ＴＰを使用した２つの他の二重鎖安定化修飾物は、シグナルの減少をもたらすことを見出した。対照的に、Ｈａｃｉａらは、５−メチルウリジン含有標的ＲＮＡについて、未修飾ＲＮＡ標的のものと同等のシングルヌクレオチドミスマッチハイブリダイゼーション特異性を維持しながらハイブリダイゼーションシグナルの局所強化を示すというプラスの結果を報告した。一方、彼らは、ｒ（２−ａｍＡ）含有ＲＮＡ標的についてのハイブリダイゼーションシグナル強度の減少を観察した。従って、これらの報告結果は、矛盾しており、確定的ではなく、ならびにその技術を、リボヌクレオシド５’−三リン酸（ｒＮＴＰ）の塩基修飾類似体の使用の任意の一般的またはさらなる適用性に関して明らかにしていない。
【００１９】
ヌクレオチドポリメラーゼは、ヌクレオチド内の糖部分の修飾に対して特に感受性であることが証明された（Ｋｅｍｐｅｎｅｅｒｓ  Ｖ．ら（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３３：３８２８−３８３６）。ｄＮＴＰにおける一定の糖修飾は、ウイルスＤＮＡポリメラーゼを阻害し、このことが、これらの化合物を医療化学にとって薬物候補として関心の高いものにしている（Ｍａｔｔｈｅｓ  Ｅ．ら（１９９１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，３５：１２５４−１２５７；Ｒｅｉｄ  Ｒ．ら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：３８９８−３９０４）。２’−フルオロ修飾２’−デオキシリボヌクレオシドは、ｄＮＴＰにおける糖修飾の追加例であるが、ＤＮＡ重合におけるこれらの誘導体は限られている（Ｏｎｏ  Ｔ．ら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：４５８１−４５８８）。Ｏｎｏ，Ｔ．らは、２’−フルオロｄＮＴＰ誘導体を妥当な効率で組み込むことができる、わずか４つのＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ（エキソ−）、Ｖｅｎｔ（エキソ−）、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（エキソ−）およびＵＩＴｍａを同定した。ＤＮＡポリメラーゼは、ｄＮＴＰのα−リン酸部分での比較的小さな修飾を許容することができ（Ｄｏｂｒｉｋｏｖ  Ｍ．Ｉ．ら（２００３）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，２２：１６５１−１６５５）、最も認知されている例は、チオ−（Ｗａｒｄ  Ｂ．ら（２００５）米国特許第６，９０２，９１４号）およびボラノ−ホスフェート誘導体（Ｓｕｍｍｅｒｓ  Ｊ．Ｓ．ａｎｄ  Ｓｈａｗ  Ｂ．Ｒ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，８：１１４７−１１５５；Ｓｈａｗ  Ｂ．Ｒ．ら（２００４）米国特許第６，８０８，８９７号）である。これらの修飾ｄＮＴＰの基質特性は、天然ヌクレオチドのものと同等であり、このため、それらをＰＣＲベースの配列決定に応用することができる（Ｗａｒｄ  Ｂ．ら（２００５）米国特許第６，９０２，９１４号；Ｐｏｒｔｅｒ  Ｋ．Ｗ．ら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：１６１１−１６１７）。しかし、これらの修飾物は、ＤＮＡハイブリダイゼーション特性に対してマイナスの効果を有し（Ｗａｎｇ  Ｊ．Ｘ．ら（２００５）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，２４：９５１−９５５）、このため、これらのボラノ修飾ｄＮＴＰは、検出ＰＣＲの実施の際、事実上、役立たない。
【００２０】
皮肉にも、二重鎖不安定化をもたらすｄＮＴＰ誘導体が、ＰＣＲにおいて最も適用性があることが見出されている。ＳｅｅｌａおよびＲｏｌｉｎｇ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０：５５−６１．１９９２）は、ｄＮＴＰの７−デアザプリン類似体の基質特性を調査し、７−デアザデオキシリボグアニシン５’−三リン酸（ｃ７ＧｄＴＰ）は、ＰＣＲ反応において天然ｄＧＴＰを完全に置換することができ、これに対して２つ他の研究した誘導体、７−デアザデオキシリボアデノシン５’−三リン酸（ｃ７ＡｄＴＰ）および７−デアザデオキシリボイノシン５’−三リン酸（ｃ７ＩｄＴＰ）は、親ｄＮＴＰの存在を必要とすることを見出した。これらが二重鎖不安定化修飾物であることも証明した。Ｇｏｕｒｌａｉｎ  Ｔ．ら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２９：１８９８−１９０５，２００１）は、ｃ７ＡｄＴＰの基質特性を、そのヘテロ環系のＣ７位へのペンダントアミノプロピル、Ｚ−アミノプロペニルおよびアミノプロピニル側鎖の組み込みによって改善することができることを証明したが、ＰＣＲ収率の正確な測定は行われず、検出ＰＣＲに対するこれらの誘導体の実用性および適用性は確立されていない。炭素原子によるプリンのＮ７位の置換は、二重鎖安定性を低下させ、この特性は、例えばポリＧリッチ配列についての周知の問題の解決に、効果的に利用することができる。例えば、Ｄｉｅｒｉｃｋ  Ｈ．ら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１：４４２７−４４２８，１９９３）は、ｃ７ＧｄＴＰおよびｃ７ＩｄＴＰ類似体を利用して、ＰＣＲテンプレートの配列決定中の時期尚早な酵素の休止を回避した。こうした不安定化効果は、デオキシイノシンにとっては特に重要であり、それぞれのｄＩＴＰ類似体は、ゲノムＤＮＡの存在下でのｍＲＮＡの選択的ＲＴ−ＰＣＲ増幅に成功裏に使用された（Ａｕｅｒ  Ｔ．ら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２４：５０２１−５０２６）。しかし、報告データは、ＰＣＲにおけるｄＩＴＰの適用が極めて限定され、これらの塩基修飾ヌクレオシド三リン酸を天然ｄＧＴＰの完全な代用物として用いることはできないことを示している。
【００２１】
デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）は、ＰＣＲにおいて一般に用いられている二重鎖不安定化ｄＮＴＰのさらに別の例である。これは、通常、チミジン５’−三リン酸（ｄＴＴＰ）の完全な代用物として適用される。ｄＵヌクレオシドを含有するＤＮＡは、ウラシルグリコシラーゼの存在下で、選択的に切断することができ（Ｄｅｍｐｌｅ  Ｂ．ら（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：７７３１−７７３５；Ｗｉｌｓｏｎ  ＩＩＩ  Ｄ．Ｍ．ら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：９３３−９３９；Ｓｔｒａｕｓｓ  Ｐ．Ｒ．ら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：１３０２−１３０７）、ならびにＰＣＲ反応前のサンプルの処理は、サンプルからサンプルへの汚染繰り越しの防止に役立つ（Ｇｅｌｆａｎｄ  Ｄ．Ｈ．ら（１９９５）米国特許第５，４１８，１４９号）。
【００２２】
５位で置換されたピリミジンは、ＤＮＡポリメラーゼによって適度に許容され、このため、そのそれぞれのｄＮＴＰ類似体をＰＣＲで使用することができる。修飾部分は、３−アミノ−プロピニルおよびＥ−３−アミノプロペニルリンカーによってカップリングされたイミダゾール４−酢酸およびウロカニン酸ほど大きい場合がある（非特許文献１）。これらの堅いリンカーとは対照的に、柔軟なアルキルは、ｄＮＴＰ基質特性に対してマイナスの影響を及ぼす。Ｈｅｌｄ，Ｈ．Ａ．ら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３０：３８５７−３８６９，２００２）は、炭素原子を３つまたは４つ含有するアルキルタイプのリンカーを介して付随する保護チオール基を有する５−修飾２’−デオキシウリジン誘導体を組み込む能力について、８つ異なるポリメラーゼを試験した。これらのポリメラーゼは、ＰＣＲにおいて塩基修飾ｄＵＴＰと別様に反応した。ＰＣＲ収率についての正確なデータは提供されていないが、該著者は、ＰＣＲ産物が多くの場合で観察されたと主張している。同様の結果が、Ｃ５位に（６−アミノへキシル）カルバモイルメチルまたは７−アミノ−２，５−ジオキサヘプチルリンカーを有する、２’−デオキシシチジン三リン酸の修飾類似体を研究したＫｕｗａｈａｒａ，Ｍ．ら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３：３７−３８，２００３）によって、得られた。両方の類似体は、結果として完全長修飾ＤＮＡを生じさせるＰＣＲにおけるＶｅｎｔ（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼの良好な基質であることが見出された。
【００２３】
特定の塩基修飾ｄＮＴＰを使用して報告された研究（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；Ｇｏｕｒｌａｉｎ  Ｔ．ら（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２９：１８９８−１９０５；Ｊａｅｇｅｒ  Ｓ．ａｎｄ  Ｆａｍｕｌｏｋ  Ｍ．（２００４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４３：３３３７−３３４０）では、二重鎖形成に対してプラスの熱力学的寄与があるのか、マイナスの熱力学的寄与があるのかは、今のところ不明である。さらに、塩基修飾物の二重鎖安定化効果が特定された場合では、例えば、５−メチル−シトシンの場合（Ｓｚｅｒ  Ｗ．（１９６５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０：１８２−１８６；Ｏｎｏ  Ａ．ａｎｄ  Ｕｅｄａ  Ｔ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１５：２１９−２３２；Ｂｕｔｋｕｓ  Ｖ．ら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１５：８４６７−８４７８；Ｓｚｅｒ  Ｗ．ａｎｄ  Ｓｈｕｇａｒ  Ｄ．（１９６６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１７：１７４−１８７；およびＵｅｓｕｇｉ  Ｓ．ら（１９８６）Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３４：５１−６０）では、場合によっては増幅産物をもたらさない、ＰＣＲの複雑さが報告されている（Ｗｏｎｇ  Ｋ．Ｋ．ａｎｄ  ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ，Ｍ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：１０８１−１０８５参照）。
【００２４】
２，６−ジアミノプリンは、著しい二重鎖安定化効果を有する別の塩基類似体である（Ｈｏｗａｒｄ  Ｆ．Ｂ．ら（１９６６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４１：４２９３−４２９５；Ｈｏｗａｒｄ  Ｆ．Ｂ．ら（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１５：３７８３−３７９５；Ｈｏｗａｒｄ  Ｆ．Ｂ．ａｎｄ  Ｍｉｌｅｓ  Ｈ．Ｔ．（１９８４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２３：６７２３−６７３２；Ｓｃｈｅｉｔ  Ｋ．Ｈ．ａｎｄ  Ｒａｃｋｗｉｔｚ  Ｈ．−Ｒ．（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１０：４０５９−４０６９；Ｇａｆｆｎｅｙ  Ｂ．Ｌ．ら（１９８４）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４０：３−１３）。しかし、Ｋｕｗａｈａｒａ  Ｍ．ら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｕｐｐｌ．，３：３７−３８，２００３）によると、ＰＣＲにおけるそれぞれのｄ（２−ａｍＡ）ＴＰ類似体の使用は、比較的短いアンプリコンに限定される。Ｂａｉｌｌｙ，Ｃ．らは、ｄＡＴＰの完全置換物として２，６−ジアミノプリンデオキシヌクレオシド三リン酸を使用することによる、比較的長い１６０ｂｐの２本鎖ＤＮＡフラグメントのＰＣＲ援用合成を記載している（Ｂａｉｌｌｙ  Ｃ．ａｎｄ  Ｗａｒｉｎｇ  Ｍ．Ｊ．（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３：８８５−８９２；Ｂａｉｌｌｙ  Ｃ．ら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７：１０３３−１０４５；Ｂａｉｌｌｙ  Ｃ．ａｎｄ  Ｗａｒｉｎｇ  Ｍ．Ｊ．（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２６：４３０９−４３１４）が、該著者は、有意に異常なＰＣＲ条件（アニーリング温度および時間）の使用を報告しており、これは、ＰＣＲにおけるｄ（２−ａｍＡ）ＴＰの使用効果に対する制限を表す。残念なことに、上に列挙した研究のすべてが、修飾ｄＮＴＰとそれぞれの天然デオキシヌクレオシド５’−三リン酸の基質特性との正確な比較を含まず、そのため、検出ＰＣＲのためのこれらの類似体の実際の使用効果は、当該技術分野において、未だ、不明瞭、且つ、不確実である。
【非特許文献１】Ｌｅｅ  Ｓ．Ｅ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２００１）２９：１５６５−１５７３
【非特許文献２】Ｈｅｌｄ  Ｈ．Ａ．ａｎｄ  Ｂｅｎｎｅｒ  Ｓ．Ａ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２００２）３０：３８５７−３８６９
【非特許文献３】Ｋｕｗａｈａｒａ  Ｍ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｕｐｐｌ．（２００３）３：３７−３８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
従って、要約すると、プライマーおよびプローブ修飾に集中している二重鎖安定化への伝統的なアプローチは非実用的であり、検出ＰＣＲでの増幅中に塩基類似体を組み込むことの実用性は、当該技術分野において、未だ、不明瞭、且つ、不明確である。
【００２６】
従って、および修飾ヌクレオチドの使用に関する相当な進歩にもかかわらず、オリゴヌクレオチドの相補複合体を安定させ、その上、標的核酸の高速、且つ、頑強な増幅および検出に備える、用途の広い単純で安価なアプローチが当該技術分野において必要とされていることは、明白である。組成的に基準から外れたまたは極端な核酸配列のＰＣＲ増幅および検出を改善するための、用途の広い単純なアプローチが、特に、Ａ−Ｔリッチ標的配列に関連して、当該技術分野において必要とされていることは、明白である。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
（本発明の態様の要旨）
本発明の態様は、より安定な増幅産物に備えるために、本明細書に開示する塩基修飾デオキシヌクレオシド５’−三リン酸（ｄＮＴＰ）を使用する核酸増幅を含む、核酸の新規検出方法を提供する。
【００２８】
特定の態様は、サンプル中の標的核酸の検出方法を提供し、該方法は、増幅および検出反応を含み、該増幅および／または検出反応において使用されるオリゴヌクレオチド成分のハイブリダイゼーション特性は、ＤＮＡポリメラーゼと少なくとも１つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰとを含む反応混合物中で、強化されたハイブリダイゼーション特性を有する修飾ＤＮＡを増幅することによって改善される。
【００２９】
追加の態様は、サンプル中の標的核酸の検出方法を提供し、該方法は、標的核酸と、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼと、少なくとも１つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰを含有するデオキシヌクレオシド５’−三リン酸の混合物とを含む反応混合物を提供する工程；標的核酸を増幅する工程であって、少なくとも１つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰがアンプリコンに組み込まれ、その結果、強化されたハイブリダイゼーション特性を有する修飾ＤＮＡのコピーが得られ、前記修飾ＤＮＡが、増幅の任意の段階において、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーのためのテンプレートとしての役割を果たす、工程；および修飾ＤＮＡを検出する工程であって、修飾ＤＮＡの存在が、前記サンプル中の標的核酸の存在の指標である、段階；を含む。
【００３０】
さらなる態様は、サンプル中の標的核酸の検出方法を提供し、該方法は、標的核酸と、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼと、少なくとも１つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰを含有するデオキシヌクレオシド５’−三リン酸の混合物とを含む反応混合物を提供する工程；標的核酸を増幅する工程であって、少なくとも１つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰがアンプリコンに組み込まれ、その結果、強化されたハイブリダイゼーション特性を有する修飾ＤＮＡのコピーが得られる、工程；少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを提供する工程；少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを修飾ＤＮＡにハイブリダイズさせて、複合体を形成する工程；および複合体を検出する工程であって、複合体の存在が、サンプル中の標的核酸の存在の指標となる，段階；を含む。
【００３１】
さらなる追加の態様は、サンプル中の標的核酸の検出方法を提供し、該方法は、標的核酸と、該標的核酸の指数関数的増幅に備えるために十分な少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼと、少なくとも１つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰを含有するデオキシヌクレオシド５’−三リン酸の混合物とを含む反応混合物中で検出ＰＣＲを用いて該標的核酸を増幅させる工程であって、少なくとも１つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰがアンプリコンに組み込まれ、その結果、強化されたハイブリダイゼーション特性を有する修飾ＤＮＡのコピーが得られる、工程；前記修飾ＤＮＡにハイブリダイズさせて複合体を形成する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを使用して、前記修飾ＤＮＡを検出する工程；および複合体を検出する工程であって、複合体の存在が、サンプル中の標的核酸の存在の指標となる、工程；を含む。
【００３２】
様々な実施形態の特定の態様において、標的核酸は、ＤＮＡである。他の態様において、標的核酸は、ＲＮＡである。一定の態様において、標的核酸は、ＲＮＡであり、および標的核酸の増幅は、逆転写酵素を使用して該ＲＮＡの少なくとも１つのＤＮＡコピーを合成する段階を含む。一部の態様では、１つより多くのオリゴヌクレオチドプライマーが、標的核酸を増幅するために使用され、修飾ＤＮＡは、その増幅の任意の段階において、該オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つのためのテンプレートとしての役割を果たす。追加の態様では、１つより多くの標的核酸が増幅され、検出される。一定の実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーが、増幅および検出される標的
核酸ごとに提供される。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーの１つより多くが、増幅および検出される前記標的核酸ごとに提供され、修飾ＤＮＡの少なくとも１つは、その増幅に任意の段階において、該オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのためのテンプレートとしての役割を果たす。一定の態様において、標的核酸の検出は、増幅後に行われる。他の態様において、標的核酸の検出は、リアルタイムで行われる。一定の実施形態において、塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰは、それぞれの天然ｄＮＴＰを完全に置換する。他の実施形態において、塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰは、それぞれの天然ｄＮＴＰの画分を表す。一定の態様において、反応混合物は、それぞれの天然ｄＮＴＰを置換する場合、またはそれぞれの天然ｄＮＴＰの画分を表す場合、各々の場合の塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰの１つより多くを含む。一定の態様において、塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰは、下記式Ｉである：
【００３３】
【化４】
0005878681.tif 000002
一定の実施形態において、標的核酸の増幅および検出は、前記サンプル中の該標的核酸の量を測定するために行われる。特定の実施の際、標的核酸の増幅は、等温増幅の使用を含む。他の態様において、標的核酸の増幅は、検出ＰＣＲの使用を含む。一定の実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドプローブおよび／または修飾ＤＮＡのうちの少なくとも１つは、標識を含有し、この標識が、修飾核酸の検出を可能にする。一定の態様において、標識は、蛍光標識である。一部の実施形態において、標識は、蛍光−偏光標識を含む。他の態様において、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーもしくは少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブのいずれか、またはそれらの両方が、１つ以上の構造修飾物を含有する。一部の実施形態において、構造修飾物は、二重鎖安定化修飾物である。一定の態様において、二重鎖安定化修飾物は、修飾ヌクレオチドを含む。追加の態様において、二重鎖安定化修飾物は、前記オリゴヌクレオチドプライマーの５’末端にコンジュゲートしたテールを含む。一定の実施形態において、テールは、インターカレーターを含む。他の実施形態において、テールは、副溝バインダー（ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ  ｂｉｎｄｅｒ）を含む。特定の実施形態において、修飾ＤＮＡを検出する工程は、検出剤の使用を含み、該検出剤は、該修飾ＤＮＡと相互作用して検出シグナルをもたらし、シグナルの検出が、反応混合物中の該修飾ＤＮＡの存在の指標となる。一部の態様において、検出剤は、蛍光剤を含む。一定の実施形態において、蛍光剤は、前記修飾ＤＮＡと相互作用すると蛍光特性を変化させ、その結果、検出シグナルをもたらす。一定の態様において、蛍光剤は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ色素を含む。
【００３４】
一定の態様において、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーおよび少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブは、同じ分子の部分またはフラグメントである。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、ＦＲＥＴプローブであり、ＦＲＥＴプローブは、修飾ＤＮＡと複合体を形成するとその蛍光特性を変化させ、それらの変化が、該複合体の存在の指標となる。一部の態様において、ＦＲＥＴプローブは、ハイブリダイゼーション誘発ＦＲＥＴプローブを含む。他の態様において、ハイブリダイゼーション誘発ＦＲＥＴプローブは、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマーである。一定の実施形態において、ハイブリダイゼーション誘発ＦＲＥＴプローブは、Ｂｅａｃｏｎプローブを含む。他の実施形態において、ＦＲＥＴプローブは、切断可能なＦＲＥＴプローブを含む。一定の態様において、切断可能なＦＲＥＴプローブは、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブを含む。
【００３５】
一部の態様において、オリゴヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドプローブおよび／または修飾ＤＮＡのうちの少なくとも１つは、増幅段階もしくは検出段階または両方の段階において固体支持体上に固定されている。
【００３６】
さらなる実施形態は、開示した方法のうちのいずれか１つの方法を行うためのキットを提供し、該キットは、ｉ）少なくとも１つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰ、ならびに（ｉｉ）成分：オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよび検出剤、のうちの少なくとも１つを含む。一定の態様において、キットは、少なくとも１つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰと、オリゴヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドプローブおよびＤＮＡポリメラーゼから選択される成分の少なくとも１つとを含む。追加のキット実施形態は、少なくとも１つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰと；２つのオリゴヌクレオチドプライマー（該オリゴヌクレオチドプライマーは、前記標的核酸の指数関数的増幅をもたらすように設計される）、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブ、および１つのＤＮＡポリメラーゼから選択される成分の少なくとも１つとを含む。
本発明は、以下の項目を提供する。
（項目１）
増幅および検出反応を含む、サンプル中の標的核酸の検出方法であって、該増幅および／または検出反応において使用されるオリゴヌクレオチド成分のハイブリダイゼーション特性が、ＤＮＡポリメラーゼと少なくとも１つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰとを含む反応混合物中で、強化されたハイブリダイゼーション特性を有する修飾ＤＮＡを増幅することによって改善される、方法。
（項目２）
サンプル中の標的核酸を検出する方法であって：
標的核酸と、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼと、少なくとも１つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰを含有するデオキシヌクレオシド５’−三リン酸の混合物とを含む反応混合物を提供する工程；
該標的核酸を増幅する工程であって、該少なくとも１つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰがアンプリコンに組み込まれ、その結果、強化されたハイブリダイゼーション特性を有する修飾ＤＮＡのコピーが得られ、該修飾ＤＮＡが、該増幅の任意の段階において該少なくとも１つのオリゴヌクレオチドのためのテンプレートとしての役割を果たす、工程；および
該修飾ＤＮＡを検出する工程であって、該修飾ＤＮＡの存在が、該サンプル中の標的核酸の存在の指標となる、工程；
を含む、方法。
（項目３）
前記標的核酸が、ＤＮＡである、請求項２に記載の方法。
（項目４）
前記標的核酸が、ＲＮＡである、請求項２に記載の方法。
（項目５）
前記標的核酸が、ＲＮＡであり、該標的核酸の増幅が、逆転写酵素を使用して該ＲＮＡの少なくとも１つのＤＮＡコピーを合成する段階を含む、請求項２に記載の方法。
（項目６）
１つより多くのオリゴヌクレオチドプライマーが、前記標的核酸を増幅するために使用され、前記修飾ＤＮＡが、前記増幅の任意の段階において、該オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つのためのテンプレートとしての役割を果たす、請求項２に記載の方法。
（項目７）
１つより多くの標的核酸を増幅および検出する、請求項２に記載の方法。
（項目８）
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを、増幅および検出される標的核酸ごとに提供する、請求項７に記載の方法。
（項目９）
前記オリゴヌクレオチドプライマーの１つより多くを、増幅および検出される前記標的核酸ごとに提供し、ならびに前記修飾ＤＮＡの少なくとも１つが、前記増幅の任意の段階において、該オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つのためのテンプレートとしての役割を果たす、請求項７に記載の方法。
（項目１０）
前記標的核酸の検出を、前記増幅後に行う、請求項２に記載の方法。
（項目１１）
前記標的核酸の検出を、リアルタイムで行う、請求項２に記載の方法。
（項目１２）
前記塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰが、それぞれの天然ｄＮＴＰを完全に置換する、請求項２に記載の方法。
（項目１３）
前記塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰが、それぞれの天然ｄＮＴＰの画分を表す、請求項２に記載の方法。
（項目１４）
前記反応混合物が、各々、それぞれの天然ｄＮＴＰを置換するか、またはそれぞれの天然ｄＮＴＰの画分を表す、前記塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰの１つより多くを含む、請求項２、１２および１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰが、式Ｉ：
【化１】
0005878681.tif 000003
である、請求項２に記載の方法。
（項目１６）
前記標的核酸を増幅する工程および検出する工程を、前記サンプル中の該標的核酸の量を測定するために行う、請求項２に記載の方法。
（項目１７）
前記標的核酸を増幅する工程が、等温増幅の使用を含む、請求項２に記載の方法。
（項目１８）
前記標的核酸を増幅する工程が、検出ＰＣＲの使用を含む、請求項２に記載の方法。
（項目１９）
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーが、標識を含有し、該標識を、前記修飾ＤＮＡの検出に使用する、請求項２に記載の方法。
（項目２０）
前記標識が、蛍光標識である、請求項１９に記載の方法。
（項目２１）
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーが、構造修飾物を含有する、請求項２に記載の方法。
（項目２２）
前記構造修飾物が、二重鎖安定化修飾物である、請求項２１に記載の方法。
（項目２３）
前記二重鎖安定化修飾物が、修飾ヌクレオチドを含む、請求項２２に記載の方法。
（項目２４）
前記二重鎖安定化修飾物が、前記オリゴヌクレオチドプライマーの５’末端にコンジュゲートしたテールを含む、請求項２２に記載の方法。
（項目２５）
前記テールが、インターカレーターを含む、請求項２４に記載の方法。
（項目２６）
前記テールが、副溝バインダーを含む、請求項２４に記載の方法。
（項目２７）
前記修飾ＤＮＡを検出する工程が、検出剤の使用を含み、該検出剤が、該修飾ＤＮＡと相互作用して検出シグナルをもたらし、該シグナルの検出が、前記反応混合物中の該修飾ＤＮＡの存在の指標となる、請求項２に記載の方法。
（項目２８）
前記検出剤が、蛍光剤を含む、請求項２７に記載の方法。
（項目２９）
前記蛍光剤が、前記修飾ＤＮＡと相互作用してその蛍光特性を変化させ、それによって
、前記検出シグナルをもたらす、請求項２８に記載の方法。
（項目３０）
前記蛍光剤が、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ色素を含む、請求項２９に記載の方法。
（項目３１）
（ｉ）少なくとも１つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰ、ならびに（ｉｉ）以下の成分：オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよび検出剤、のうちの少なくとも１つを含む、請求項２および２７のいずれか一項に記載の方法を行うためのキット。
（項目３２）
サンプル中の標的核酸の検出方法であって：
標的核酸と、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼと、少なくとも１つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰを含有するデオキシヌクレオシド５’−三リン酸の混合物とを含む反応混合物を提供する工程；
該標的核酸を増幅する工程であって、該少なくとも１つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰがアンプリコンに組み込まれ、その結果、強化されたハイブリダイゼーション特性を有する修飾ＤＮＡのコピーが得られる、工程；
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを提供する工程；
該少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを該修飾ＤＮＡにハイブリダイズさせて、複合体を形成する工程；および
該複合体を検出する工程であって、該複合体の存在が、該サンプル中の該標的核酸の存在の指標となる、工程；
を含む、方法。
（項目３３）
前記標的核酸が、ＤＮＡである、請求項３２に記載の方法。
（項目３４）
前記標的核酸が、ＲＮＡである、請求項３２に記載の方法。
（項目３５）
前記標的核酸が、ＲＮＡであり、該標的核酸を増幅する工程が、逆転写酵素を使用して該ＲＮＡの少なくとも１つのＤＮＡコピーを合成する段階を含む、請求項３２に記載の方法。
（項目３６）
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー、前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブが、同じ分子の部分またはフラグメントである、請求項３２に記載の方法。
（項目３７）
１つより多くの標的核酸を、増幅および検出し、少なくとも１つの前記オリゴヌクレオチドプライマーを、増幅および／または検出される標的核酸ごとに提供する、請求項３２に記載の方法。
（項目３８）
１つより多くのオリゴヌクレオチドプライマーおよび／または１つより多くのオリゴヌクレオチドプローブを、前記標的核酸を増幅および／または検出する工程において使用する、請求項３２に記載の方法。
（項目３９）
前記標的核酸を増幅する工程が、等温増幅反応の使用を含む、請求項３２に記載の方法。
（項目４０）
前記標的核酸を増幅する工程が、検出ＰＣＲの使用を含む、請求項３２に記載の方法。（項目４１）
前記標的核酸の検出を、前記増幅後に行う、請求項３２に記載の方法。
（項目４２）
前記標的核酸の検出を、リアルタイムで行う、請求項３２に記載の方法。
（項目４３）
前記オリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブまたは修飾核酸のうちの少なくとも１つが、前記増幅段階もしくは検出段階または両方の段階において固体支持体上に固定されている、請求項３２に記載の方法。
（項目４４）
前記塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰが、それぞれの天然ｄＮＴＰを完全に置換する、請求項３２に記載の方法。
（項目４５）
前記塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰが、それぞれの天然ｄＮＴＰの画分を表す、請求項３２に記載の方法。
（項目４６）
前記標的核酸を増幅する工程が、各々、それぞれの天然ｄＮＴＰを置換するか、またはそれぞれの天然ｄＮＴＰの画分を表す、１つより多くの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰの使用を含む、請求項３２、４４および４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰが、式Ｉ：
【化２】
0005878681.tif 000004
である、請求項３２に記載の方法。
（項目４８）
前記標的核酸を増幅する工程および検出する工程を、前記サンプル中の該標的核酸の量を測定するために行う、請求項３２に記載の方法。
（項目４９）
前記オリゴヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドプローブおよび／または修飾ＤＮＡのうちの少なくとも１つが、標識を含有し、該標識が、前記修飾ＤＮＡの検出を可能にする、請求項３２に記載の方法。
（項目５０）
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブが、前記標識を含有する、請求項４９に記載の方法。
（項目５１）
前記標識が、蛍光標識を含む、請求項５０に記載の方法。
（項目５２）
前記標識が、蛍光−偏光標識を含む、請求項５１に記載の方法。
（項目５３）
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーもしくは前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブのいずれか、またはそれらの両方が、１つ以上の構造修飾物を
含有する、請求項３２に記載の方法。
（項目５４）
前記１つ以上の構造修飾物が、二重鎖安定化修飾物を含む、請求項５３に記載の方法。（項目５５）
前記二重鎖安定化修飾物が、修飾ヌクレオチドを含む、請求項５４に記載の方法。
（項目５６）
前記二重鎖安定化修飾物が、二重鎖安定化テールを含む、請求項５４に記載の方法。
（項目５７）
前記テールが、インターカレーターを含む、請求項５６に記載の方法。
（項目５８）
前記テールが、副溝バインダーを含む、請求項５６に記載の方法。
（項目５９）
前記オリゴヌクレオチドプローブが、ＦＲＥＴプローブであり、該ＦＲＥＴプローブが、前記修飾ＤＮＡと複合体を形成するとその蛍光特性を変化させ、該変化が、該複合体の存在の指標となる、請求項３２に記載の方法。
（項目６０）
前記ＦＲＥＴプローブが、ハイブリダイゼーション誘発ＦＲＥＴプローブを含む、請求項５９に記載の方法。
（項目６１）
前記ハイブリダイゼーション誘発ＦＲＥＴプローブが、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマーである、請求項３６および６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
前記ハイブリダイゼーション誘発ＦＲＥＴプローブが、Ｂｅａｃｏｎプローブを含む、請求項６０に記載の方法。
（項目６３）
前記ＦＲＥＴプローブが、切断可能なＦＲＥＴプローブを含む、請求項５９に記載の方法。
（項目６４）
前記切断可能なＦＲＥＴプローブが、ＴａｑＭａｎプローブを含む、請求項６３に記載の方法。
（項目６５）
前記検出ＰＣＲを、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して行い、該オリゴヌクレオチドプライマーが、前記標的核酸の指数関数的増幅をもたらすのに適する、請求項４０に記載の方法。
（項目６６）
前記検出ＰＣＲが、定量的ＰＣＲを含む、請求項４０および６５のいずれか一項に記載の方法。
（項目６７）
少なくとも１つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰと、オリゴヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドプローブおよびＤＮＡポリメラーゼから選択される成分の少なくとも１つとを含む、請求項３２に記載の方法を行うためのキット。
（項目６８）
サンプル中の標的核酸の検出方法であって：
標的核酸と、該標的核酸の指数関数的増幅をもたらすのに十分な少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼと、少なくとも１つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰを含有するデオキシヌクレオシド５’−三リン酸の混合物とを含む反応混合物中で検出ＰＣＲを用いて該標的核酸を増幅させる工程であって、該少なくとも１つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰがアンプリコンに組み込まれ、その結果、強化されたハイブリダイゼーション特性を有する修飾ＤＮＡのコピーが得られる、工程；
該修飾ＤＮＡにハイブリダイズさせて複合体を形成する少なくとも１つのオリゴヌクレ
オチドプローブを使用して、該修飾ＤＮＡを検出する工程；および
該複合体を検出する工程であって、該複合体の存在が、該サンプル中の該標的核酸の存在の指標となる、工程；
を含む方法。
（項目６９）
前記標的核酸が、ＤＮＡである、請求項６８に記載の方法。
（項目７０）
前記標的核酸が、ＲＮＡであり、該標的核酸を増幅する工程が、逆転写酵素を使用して該ＲＮＡの少なくとも１つのＤＮＡコピーを合成する段階を含む、請求項６８に記載の方法。
（項目７１）
前記オリゴヌクレオチドプライマーの１つおよび前記オリゴヌクレオチドプローブが、同じ分子のフラグメントの部分である、請求項６８に記載の方法。
（項目７２）
１つより多くの標的核酸を、増幅および検出し、前記ポリヌクレオチドプライマーの少なくとも２つおよび前記オリゴヌクレオチドプローブの少なくとも１つを、標的核酸ごとに提供する、請求項６８に記載の方法。
（項目７３）
前記修飾ＤＮＡを検出する工程を、前記増幅の後に行う、請求項６８に記載の方法。
（項目７４）
前記標的核酸の検出を、リアルタイムで行う、請求項６８に記載の方法。
（項目７５）
前記オリゴヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドプローブおよび／または修飾ＤＮＡのうちの少なくとも１つが、前記増幅段階もしくは検出段階または両方の段階において固体支持体上に固定されている、請求項６８に記載の方法。
（項目７６）
前記塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰが、それぞれの天然ｄＮＴＰを完全に置換する、請求項６８に記載の方法。
（項目７７）
前記塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰが、それぞれの天然ｄＮＴＰの画分を表す、請求項６８に記載の方法。
（項目７８）
前記標的核酸を増幅する工程が、各々、それぞれの天然ｄＮＴＰを置換するか、またはそれぞれの天然ｄＮＴＰの画分を表す、１つより多くの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰの使用を含む、請求項６８に記載の方法。
（項目７９）
前記塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰが、式Ｉ：
【化３】
0005878681.tif 000005
である、請求項６８に記載の方法。
（項目８０）
前記標的核酸を増幅する工程および検出する工程を、前記サンプル中の該標的核酸の量を測定するために行う、請求項６８および７４のいずれか一項に記載の方法。
（項目８１）
前記オリゴヌクレオチドプローグが、標識を含有する、請求項６８に記載の方法。
（項目８２）
前記標識が、蛍光標識を含む、請求項８１に記載の方法。
（項目８３）
前記標識が、蛍光−偏光標識を含む、請求項８２に記載の方法。
（項目８４）
前記オリゴヌクレオチドプライマーの一方もしくは両方、または前記オリゴヌクレオチドプローブ、または該プライマー（単数もしくは複数）および該プローブの両方が、１つ以上の構造修飾物を含有する、請求項６８に記載の方法。
（項目８５）
前記１つ以上の構造修飾物が、二重鎖安定化修飾物を含む、請求項８４に記載の方法。（項目８６）
前記二重鎖安定化修飾物が、修飾ヌクレオチドを含む、請求項８５に記載の方法。
（項目８７）
前記二重鎖安定化修飾物が、二重鎖安定化テールを含む、請求項８５に記載の方法。
（項目８８）
前記テールが、インターカレーターを含む、請求項８７に記載の方法。
（項目８９）
前記テールが、副溝バインダーを含む、請求項８７に記載の方法。
（項目９０）
前記オリゴヌクレオチドプローブが、ＦＲＥＴプローブを含み、該ＦＲＥＴプローブが、前記修飾ＤＮＡと前記複合体を形成するとその蛍光特性を変化させ、該変化が、該複合体の存在の指標となる、請求項６８に記載の方法。
（項目９１）
前記ＦＲＥＴプローブが、ハイブリダイゼーション誘発ＦＲＥＴプローブを含む、請求項９０に記載の方法。
（項目９２）
前記ハイブリダイゼーション誘発ＦＲＥＴプローブが、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマーを含む、請求項７１および９１のいずれか一項に記載の方法。
（項目９３）
前記ハイブリダイゼーション誘発ＦＲＥＴプローブが、ｂｅａｃｏｎプローブを含む、請求項９１に記載の方法。
（項目９４）
前記ＦＲＥＴプローブが、切断可能なＦＲＥＴプローブを含む、請求項９０に記載の方法。
（項目９５）
前記切断可能なＦＲＥＴプローブが、ＴａｑＭａｎプローブを含む、請求項９４に記載の方法。
（項目９６）
前記検出ＰＣＲが、定量的ＰＣＲを含む、請求項６８および７４のいずれか一項に記載の方法。
（項目９７）
少なくとも１つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰと、２つのオリゴヌクレオチドプライマーであって、該標的核酸の指数関数的増幅をもたらすように設計されるプライマー、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブおよび１つのＤＮＡポリメラーゼから選択される成分の少なくとも１つとを含む、請求項６８に記載の方法を行うためのキット。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
本発明の態様は、本明細書において開示するような塩基修飾デオキシヌクレオシド５’−三リン酸（例えば、例示的な図２−１１のものを含む）を使用する核酸増幅を含む、新規核酸検出法を提供する。
【００３８】
定義：
本明細書において用いる場合、生化学、核酸化学、分子生物学および分子遺伝学の用語および記号は、当分野における標準的な取決めおよびテキスト、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）；Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２）；Ｇａｉｔｓ，ｅｄ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８４）；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７５）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ｅｄ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）などに従う。加えて、本発明の理解を容易にするために、多数の用語を本明細書において定義する。
【００３９】
用語「サンプル」は、本明細書において用いる場合、対象となる核酸を含有するまたは含有すると思われる任意の物質を指し、従って、核酸、細胞、生物、組織、流体（例えば、髄液またはリンパ液）のサンプル、および次のものを含む（しかし、それらに限定されない）サンプルを包含する：血漿、血清、尿、涙、便、呼吸および尿生殖器官、唾液、異なる器官からのフラグメント、組織、血球、インビトロ細胞培養物サンプル、飲料水などの天然源からの天然の分離株類、微生物試料、ならびに核酸分子を含有すると推測される物または試料。
【００４０】
用語「標的核酸」または「対象となる核酸」は、本発明の１つ以上の方法を用いて増幅および検出されることとなる、核酸または核酸のフラグメントを指す。２つ以上の標的核酸は、例えば、同じ核酸分子のフラグメントである場合もあり、または異なる核酸分子のフラグメントである場合もある。本明細書において用いる場合、標的核酸は、少なくとも１つのヌクレオチドによりヌクレオチド配列に関して一致しない場合、それらは異なる。この態様では、例えば、対象となる２つの核酸が、配列において有意な同一度を有するが、少数のヌクレオチドによって異なる（例えば、挿入、欠失）または単一のヌクレオチドによって異なる（ＳＮＰ）多型変異を検出するために、本発明の態様を用いることができる。本発明態様の標的核酸は、原核生物、真核生物、植物、動物およびウイルスをはじめとする（しかし、これらに限定されない）いずれの生物または他の源に由来していてよく、ならびに合成核酸であってもよい。標的核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはそれらの変異体もしくは誘導体を含有し得る。標的核酸は、１本鎖であってもよいし、または２本鎖であってもよく、ならびに対象となる核酸が、２本鎖であるまたはあると思われる場合、用語「標的核酸」は、２本鎖核酸のいずれかの鎖における特異的な配列を指す。従って、本明細書における特定の実施形態については、対象となる任意の１本鎖核酸に対する完全補体を同じ標的核酸とみなす。一定の実施形態において、「標的核酸」は、増幅および検出に使用される２つのプライマー配列の間に存在する。特定の態様において、対象となる核酸は、本発明の方法を適用する前にサンプル源から単離され、精製される。好ましくは、標的核酸には、本発明の増幅および検出反応に干渉するタンパク質および／または任意の他の物質が十分にない。市販のキットおよび専門機器を含む（しかし、これらに限定されない）当該技術分野において認知されている多くの方法を、標的核酸の単離および精製に利用することができる。例えば、核酸は、フェノール／クロロホルム有機試薬での有機抽出、続いてエタノール沈殿を用いて、単離することができる（Ａｕｓｕｂｅｌら，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｉ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３））。核酸を精製するためのさらに他の公知のアプローチは、固相吸着法（Ｗａｌｓｈら（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１０：５０６−５１３，Ｂｏｏｍら、米国特許第５，２３４，８０９号）および塩誘導ＤＮＡ沈殿法（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６：１２１５）である。一般に、サンプル中に存在する対象となる核酸の量は限られており、従って、本発明の方法を用いる検出を容易にするために適する増幅手順を用いて、標的核酸を増幅する必要がある。
【００４１】
本明細書において用いる場合、用語「増幅」および標的核酸を「増幅すること」は、対象となる核酸の多数のコピーを、例えばＤＮＡコピーの形態で、生じさせる手順を指す。標的核酸を増幅するための多数の方法およびプロトコルが、当該技術分野において公知である。
【００４２】
用語「アプリコン」は、ポリヌクレオチド増幅反応の産物（単数または複数）を指し、ならびに対象となる核酸１つ以上から複製される、１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドの集団を指すこともある。アプリコンは、１つ以上の標的核酸を含む多数の複製物がそれらの産物である様々な増幅反応によって、生産することができる。
【００４３】
増幅は、増幅反応の温度が有意に変化または変動しない場合、本明細書において用いる「等温性」であり得る。これらの技術の例としては、次のものが挙げられるが、それらに限定されない：鎖置換型増幅（ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒ  Ｇ．Ｔ．ら、米国特許第５，２７０，１８４号；Ｄａｔｔａｇｕｐｔａ  Ｎ．ら、米国特許第６，２１４，５８７号；Ｗａｌｋｅｒ  Ｇ．Ｔ．ら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２４，３８４−３５３）；ローリングサークル型増幅（ＲＣＡ）（Ｌｉｚａｒｄｉ  Ｐ．，米国特許第５，８５４，０３３号）；線形的標的等温多量体化および増幅（ＬＩＭＡ）（Ｈａｆｎｅｒ  Ｇ．Ｊ．ら（２００１）Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３０：８５２−８６７）；ループ媒介増幅（ＬＭＡ）（Ｎｏｔｏｍｉ  Ｔ．ａｎｄ  Ｈａｓｅ  Ｔ．，米国特許第６，４１０，２７８号；Ｎｏｔｏｍｉ  Ｔ．ら（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２８，ｅ６３）；キメラまたは複合ＲＮＡ／ＤＮＡプライマーを使用する等温増幅（Ｃｌｅｕｚｉａｔ  Ｐ．ａｎｄ  Ｍａｎｄｒａｎｄ  Ｂ．，米国特許第５，８２４，５１７号；Ｋｕｒｎ  Ｎ．（２００１）米国特許第６，２５１，６３９号）；および他の方法。増幅技術は、ＤＮＡ配列の増幅とともにＲＮＡの合成および増幅を含む場合がある；例えば、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）（Ｏｅｈｌｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ  Ｆ．ら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１２８１１−１２８１６；Ｄａｖｅｙ  Ｃ．ａｎｄ  Ｍａｌｅｋ  Ｌ．Ｔ．，米国特許第６，０６３，６０３号）。当該技術分野において認知されている増幅技術が、核酸検出の際に意味があり重要である設計、複雑さ、効率、特異性、精度および他のパラメータの局面で多様であることは、理解されるであろう。例えば、増幅は、線形的である場合もあり、または時間（および／またはＰＣＲにおけるサイクル数）の関数として指数関数的である場合もある。
【００４４】
好ましい実施形態において、標的核酸の増幅は、「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）（Ｍｕｌｌｉｓ  Ｋ．Ｂ．ら、米国特許第４，６８３，１９５；Ｍｕｌｌｉｓ  Ｋ．Ｂ．，米国特許第４，６８３，２０２号）を用いて遂行される。最も一般的に用いられるＰＣＲプロフィールは、２つのオリゴヌクレオチドプライマー（それぞれの鎖について１つ）を利用し、これらは、一方のプライマーの伸長が、次のＰＣＲサイクルにおいて他方のプライマーのためのテンプレートとなるように設計される。一般に、ＰＣＲは、（ｉ）標的核酸を含む２本鎖核酸の鎖を分離する変性工程、続いて、（ｉｉ）その標的核酸に隣接する位置にプライマーをアニールさせるアニーリング工程；および（ｉｉｉ）５’から３’の方向でそれらのプライマーを伸長する伸長工程の繰り返し（またはサイクル）から成り、それによって、標的核酸に相補的な配列を有する「アンプリコン」核酸を形成する。自動サーマルサイクラーを使用して、上の３つの工程のそれぞれを異なる温度で行うことができる。これらのＰＣＲサイクルを、望みどおりの回数繰り返し、その結果、少なくとも理論上は、使用するプライマーの５’末端によってその末端が規定される標的ＤＮＡの指数関数的蓄積を生じさせることができる。特定の温度、各工程でのインキュベーション時間、および工程間の変化率は、関連技術分野の当業者に周知の多数の要因に依存し、関連する例は、非常に多数の出版物掲載プロトコル、例えば、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  Ｍ．Ｊ．ら（１９９１および１９９５）などにおいて見出すことができる。ＰＣＲの条件は、広範にわたって変化し得るが、従来のＰＣＲの場合、２本鎖標的核酸は、温度＞９０℃で変性され、プライマーは、５０−７５℃の範囲の温度でアニールされ、および伸長は、好ましくは、７２−７８℃の範囲で行われる。核酸検出に使用されるＰＣＲについて言えば、増幅特異性および時間が重要な要因である。従って、好ましい実施形態において、核酸は、「検出ＰＣＲ」を用いて増幅および検出される。
【００４５】
本明細書において用いる場合、用語「検出ＰＣＲ」は、１つ以上の標的核酸を増幅および検出するために行わるＰＣＲであって、好ましくは、（１）検出ＰＣＲのサイクル時間は、少なくとも１０分以下である（好ましくは５分未満、およびさらにより好ましくは２分未満である）；および（２）検出ＰＣＲサイクルの中の最低温度（通常はアニーリング温度）は、少なくとも５０℃以上である必要がある（好ましくは、この温度は、５５℃より高く、さらに好ましくは６０℃より高く、およびさらにより好ましくは６５℃より高い）という２つの必要条件を満たすＰＣＲを指す。本明細書の実施例において示すように、本発明の態様は、核酸増幅および検出に使用されるオリゴヌクレオチド成分のハイブリダイゼーション特性を実質的に改善する。そしてまた、これにより、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長に最適な温度値（例えば、７２−７５℃）にＰＣＲのアニーリング温度を上昇させることができ、その結果、アニーリング段階と伸長段階との「合体」を可能にする。従って、好ましい実施形態において、ＰＣＲは、（ｉ）鎖変性段階、および（ｉｉ）複合アニーリング／伸長段階という二段階で行われる。検出可能な標的核酸濃度を実現するために必要なＰＣＲサイクルの数は、一般には知られていない初期標的核酸負荷量（量）、およびそれぞれのＰＣＲサイクルでの増幅収率に依存する。用語「検出ＰＣＲ」は、「ＲＴ−ＰＣＲ」、「リアルタイムＰＣＲ」、「ネストＰＣＲ」、「定量的ＰＣＲ」、「マルチプレックスＰＣＲ」などを含む（しかし、これらに限定されない）、反応の派生形を包含する。
【００４６】
特定の実施形態において、標的核酸のＰＣＲ増幅および検出は、１つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して遂行される。このアプローチは、標的核酸の線形的増幅であり、これは、指数関数的ＰＣＲ設計と同等の増幅レベルに達するために、実質的により多くの初期標的負荷量、あるいは実質的により多くのＰＣＲサイクルを必要とする。
【００４７】
対象となる核酸がＲＮＡである場合、公知の方法によって、例えば、Ｓｉｍｐｓｏｎ  Ｄ．ら（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１５１：４８７−４９２およびＢｅｌｙａｖｓｋｙ  Ａ．ら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１７：２９１９−２９３２などに記載されているように、それをＰＣＲの前にＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖に、または二重鎖ｃＤＮＡに転化させることができる。これらの方法は、ＲＮＡテンプレートにハイブリダイズさせたオリゴヌクレオチドプライマーを伸長することができる「逆転写酵素」酵素活性を利用して、デオキシヌクレオシド５’−三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下での相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成に対処する；すなわち、米国特許第５，１６８，０３８号（これは、その全体が本明細書に参照により組み込まれる）に記載されているような「逆転写ＰＣＲ」または「ＲＴ−ＰＣＲ」。
【００４８】
一定の好ましい態様において、標的核酸の検出は、「リアルタイム」で行うことができる。標的増幅中にすべての検出成分を利用することができ、且つ、反応条件（例えば、温度、緩衝剤、塩、補因子、スカベンジャーなど）が反応の両方の段階−増幅および検出−を支援する（その結果、増幅反応の進行につれて標的核酸を測定することができ、増幅された物質の検出に必要な後続の処理工程の数を減少させることができる）とき、リアルタイム検出が可能である。従って、用語「リアルタイムＰＣＲ」は、本明細書において用いる場合、反応生成物、例えば増幅された標的核酸、の量を、その反応の進行につれてモニタリングするＰＣＲを指す。リアルタイムＰＣＲは、主として、反応において標的核酸の増幅をモニタリングするための化学現象の検出に関して異なる。例えば、Ｇｅｌｆａｎｄら、米国特許第５，２１０，０１５号には、５’−ヌクレアーゼ切断可能ＦＲＥＴプローブ（「ＴａｑＭａｎ」）の使用が記載されており；Ｔｙａｇｉら、米国特許第５，９２５，５１７号には、ハイブリダイゼーション誘発ＦＲＥＴプローブ（「Ｂｅａｃｏｎｓ」）の使用が記載されている（これら両方の特許は、本明細書に参照により組み込まれる）。リアルタイムＰＣＲについての検出化学の総説は、Ｄｉｄｅｎｋｏ  Ｖ．Ｖ．（２００１）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３１：１１０６−１１２１；Ｍａｃｋａｙ  Ｉ．Ｍ．ら（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３０  １２９２−１３０５，およびＭａｃｋａｙ  Ｊ．，Ｌａｎｄｔ  Ｏ．（２００７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３５３  ２３７−２６２においても見出すことができる（これらも本明細書に参照により組み込まれる）。
【００４９】
用語「ネストＰＣＲ」は、本明細書において用いる場合、第１のＰＣＲの増幅産物が、新たなプライマーセットを使用する第２のＰＣＲのためのサンプルとなり、それらのプライマーのうちの少なくとも１つが、第１のＰＣＲの増幅産物の内部位置に結合する、二段階ＰＣＲを指す。
【００５０】
用語「マルチプレックスＰＣＲ」は、本明細書において用いる場合、多数の標的核酸を同時に増幅および検出するＰＣＲを指す。通常、このＰＣＲでは、増幅される配列ごとに標的特異的プライマーセットを利用する。
【００５１】
用語「定量的ＰＣＲ」は、本明細書において用いる場合、サンプル中の１つ以上の特定の標的配列の存在度を測定するために設計されたＰＣＲを意味する。定量的測定は、標的核酸と別々にまたは一緒にアッセイすることができる１つ以上の参照核酸配列を用いて行われる。定量的ＰＣＲのための技術は、当該技術分野において周知であり、それらは、本明細書に参照により組み込まれる次の原稿において例示されている：Ｇｕ  Ｚ．ら（２００３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４１：４６３６−４６４１；Ｂｅｃｋｅｒ−Ａｎｄｒｅ  Ｍ．ａｎｄ  Ｈａｈｌｂｒｏｃｋ  Ｋ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１７：９４３７−９４４６；Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｗ．Ｍ．ら（１９９９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２６：１１２−１２２，１２４−１２５；Ｌｕｔｆａｌｌａ  Ｇ．ａｎｄ  Ｕｚｅ  Ｇ．（２００６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，４１０：３８６−４００；Ｃｌｅｍｅｎｔｉ  Ｍ．ら（１９９３）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．２：１９１−１９６；Ｄｉｖｉａｃｃｏ  Ｓ．ら（１９９２）Ｇｅｎｅ，１２２：３１３−３２０。
【００５２】
本明細書において用いる場合、用語「検出剤」は、特定の態様では、特定の様式で核酸と会合する任意の分子または粒子を指し、この会合複合体を任意の物理的、化学的または生物学的手段によって検出することができる。最も一般的に使用される検出剤は、インターカレーティング色素および蛍光剤である。例えば、Ｗｉｔｔｗｅｒ  Ｃ．Ｔ．らが米国特許第６，１７４，６７０号および同第６，５６９，６２７号に記載したようなインターカレーティング色素を使用して、ＰＣＲにおける増幅産物を検出することができる。
【００５３】
用語「蛍光剤」は、蛍光シグナルをもたらす検出剤を意味する。好ましい蛍光剤は、核酸と相互作用すると蛍光特性を変化させ、その結果、検出可能なシグナルをもたらす分子である。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩおよびＩＩは、Ｓｃｈｎｅｅｂｅｒｇｅｒ  Ｃ．ら（１９９５）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．，４：２３４−２３８およびＭａｃｋａｙ  Ｊ．，Ｌａｎｄｔ  Ｏ．（２００７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３５３：２３７−２６２に記載されているような一般に使用される蛍光剤の例である。
【００５４】
用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、本明細書では交換可能に用いており、それぞれ、ヌクレオチドモノマーの線状ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドは、一般に、サイズに関しては、少数のモノマー単位、例えば５−４０（このとき、それらは「オリゴヌクレオチド」と呼ばれる）から数千のモノマー単位の範囲にわたる。正確なサイズは、多数の要因に依存するであろうし、そしてまたそれらは、そのオリゴヌクレオチドの最終的な機能および用途に依存する。一般に、オリゴヌクレオチドは、化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、またはこれらの組み合わせをはじめとする任意の方法で生成することができる。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが、文字の配列、例えば「ＣＣＧＴＡＴＧ」、によって表されるときは常に、その本中に特に別の指定がない限り、ヌクレオチドは、５’→３’左から右への順序であること、ならびに別の指定がない限りまたは文脈から明白でない限り、「Ａ」は、デオキシアデノシンを示し、「Ｃ」は、デオキシシチジンを示し、「Ｇ」は、デオキシグアノシンを示し、および「Ｔ」は、デオキシチミジンを示すことは理解される。通常、ＤＮＡポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって連結されたこれら４つのデオキシリボヌクレオシドを含み、これに対してＲＮＡは、「Ｔ」の代わりにウリジン（「Ｕ」）を伴う、４つのそれらのリボース対応物を含む。
【００５５】
用語「天然ヌクレオシド」は、本明細書において用いる場合、天然源から単離されたＤＮＡにおいて一般に見出すことができる４つのデオキシヌクレオシドを指す。天然ヌクレオシドは、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシンおよびデオキシチミジンである。この用語は、チミジンの代わりにウリジンを伴う、それらのリボース対応物も包含する。
【００５６】
本明細書において用いる場合、用語「非天然ヌクレオシド」は、ＤＮＡおよびＲＮＡポリマーについて天然ヌクレオシドとはあらゆる点で構造が異なるヌクレオシド類似体を指す。対象となる自然発生核酸の一部は、上で定義した天然ヌクレオシドとは構造的に異なるヌクレオシドを含有することがあり、例えば、真核生物のＤＮＡには５−メチル−シチジンが組み込まれていることがあり、ｔＲＮＡがそれらのヌクレオシド類似体の一部を有することは周知である。しかし、それにもかかわらず、本明細書における特定の態様において用いる場合の用語「非天然ヌクレオシド」は、これらのヌクレオシド修飾物を、たとえそれらを天然源において見出すことができたとしても、包含する。例えば、リボチミジンは、本明細書では、非天然ヌクレオシドとみなす。
【００５７】
用語「天然ｄＮＴＰ」は、上で定義した４つの天然ヌクレオシドのうちの１つを代表するデオキシヌクレオシド５’−三リン酸を指す。
【００５８】
用語「塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰ」は、本明細書において用いる場合、非天然塩基を含有する（塩基修飾）、およびＤＮＡポリメラーゼの存在下で他のｄＮＴＰを有するポリマーに組み込まれたとき、強化されたハイブリダイゼーション特性を有する修飾ＤＮＡを生じさせる（二重鎖安定化）、デオキシヌクレオシド５’−三リン酸を指す。例示的な態様に従って、塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰの例を図３に示す。本明細書において用いる場合、塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰは、それぞれの天然ｄＮＴＰの類似体であり、例えば、ｄ（５−ＭｅＣ）ＴＰ（５−メチルシトシン）は、ｄＣＴＰ（シトシン）の類似体であり、ｄ（２−ａｍＡ）ＴＰ（２−アミノアデノシン（２，６−ジアミノプリンとも呼ばれる））は、ｄＡＴＰ（アデノシン）の類似体である、等々。一定の実施形態において、塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰは、それぞれの天然ｄＮＴＰを完全に置換する。これは、例えば、ｄ（５−ＭｅＣ）ＴＰが増幅反応に用いられる場合、その反応はｄＣＴＰを含有しないことを意味する。他の実施形態において、塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰは、それぞれの天然ｄＮＴＰの画分を表す。これは、天然ｄＮＴＰおよびその類似体の両方がその反応混合物中に存在することを意味し、一般に、この場合、塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰは、それぞれの天然ｄＮＴＰのモル量の少なくとも１／２０の画分（５％）を表す。
【００５９】
用語「オリゴヌクレオチド成分」は、本発明の増幅または検出反応のいずれか、または両方を行う際に必要とされる、または役立つ、ポリヌクレオチド性状の任意の分子を指す。オリゴヌクレオチド成分としては、オリゴヌクレオチドプライマー、プローブ、ハイブリダイゼーションおよび切断エンハンサー、エフェクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。オリゴヌクレオチド成分は、標識される場合があり、またはオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ設計の際に用いられるものをはじめとする構造修飾物を有する場合がある。
【００６０】
用語「オリゴヌクレオチドプライマー」は、本明細書において用いる場合、標的核酸にハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼの存在下での第２の核酸鎖の酵素的合成をプライミングする、１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。本明細書において用いるこの場合では、標的核酸は、オリゴヌクレオチドプライマーのための「テンプレートとしての役割を果たす」。「オリゴヌクレオチドプライマー」は、精製された制限消化物の場合のように自然に発生することもあり、または合成生産されることもある。特定の態様において、プライマーは、テンプレートの特定の配列の鎖に対して実質的に相補的である領域をその３’末端に有するように選択される。プライマー伸長が発生するには、プライマーとテンプレート鎖がハイブリダイズするために十分に相補性である必要がある。オリゴヌクレオチドプライマー配列は、そのテンプレートの正確な配列を反映する必要はない。例えば、プライマーの５’末端に非相補的ヌクレオチドフラグメントが付いており、そのプライマーの残部が、その鎖に対して実質的に相補的である場合もある。プライマー配列が、ハイブリダイズするテンプレートの配列との十分な相補性を有し、その結果、そのオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物の合成のためのテンプレート−プライマー複合体を形成することを条件として、非相補的塩基またはより長い配列をプライマー内に散在させてもよい。
【００６１】
ここで用いる場合、用語「オリゴヌクレオチドプローブ」は、二重鎖構造を形成する標的核酸またはその標的核酸との他の複合体を、そのプローブ内の少なくとも１つの配列とその標的核酸内の配列との相補性に基づいて検出する際に使用される、オリゴマーまたはポリマーを指す。本発明のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、「修飾」されている場合があり、または「構造修飾物」を含有する場合がある。
【００６２】
用語「構造修飾物」は、通常は合成の類いであり、天然核酸中に一般には存在しない任意の化学物質、例えば、原子、部分、残基、ポリマー、リンカーまたはヌクレオチド類似体を指す。本明細書において用いる場合、用語「構造修飾物」は、天然核酸中にはめったに存在しないヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体も含み、これらとしては、イノシン（ヒポキサンチン）、５−ブロモウラシル、５−メチルシトシン、５−ヨードウラシル、２−アミノアデノシン、６−メチルアデノシン、シュードウリジンなどが挙げられるが、それらに限定されない。
【００６３】
「二重鎖安定化修飾物」は、２本鎖核酸中に存在するとき、構造修飾物を有さない（例えば、天然ヌクレオチドから成る）それぞれの核酸複合体と（通常はＴｍとして測定される）熱安定性の点で比較して二重鎖安定化効果をもたらす、構造修飾物を指す。二重鎖安定化修飾物は、オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーの合成に最も一般的に適用される構造修飾物である。オリゴヌクレオチドプライマーにおける構造修飾物の使用には一定の規則および制限があることは、通常の当業者には理解されるであろう。ＤＮＡ合成の開始を可能にするには、これらのプライマーの３’末端がブロックされていてはならない。例えば、副溝バインダー（ＭＧＢ）をコンジュゲートさせてプライマーハイブリダイゼーション特性を強化する場合、該ＭＧＢ部分は、通常は５’末端にカップリングさせる（Ａｆｏｎｉａ  Ｉ．ら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：２６５７−２６６０）。一定のヌクレオチド類似体をオリゴヌクレオチドプライマーに組み込むことができるが、これらの修飾物の数は限られている。そうしたヌクレオチド類似体の例としては、本明細書に参照により組み込まれる引用参考文献の教示によると、「ユニバーサル」塩基（Ｂｕｒｇｎｅｒ  Ｄ．ら（２００４）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，２３：７５５−７６５）および「ロックされた核酸」（「ＬＮＡ」）（Ｌａｔｏｒｒａ  Ｄ．ら（２００３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，１７：２５３−２５９；Ｌａｔｏｒｒａ  Ｄ．ら（２００３）Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．，２２：７９−８５；Ｄｉ  Ｇｉｕｓｔｏ  Ｄ．Ａ．ａｎｄ  Ｋｉｎｇ  Ｇ．Ｃ．（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３２：ｅ３２）が挙げられるが、これらに限定されない。一定の塩基修飾ヌクレオチド類似体は、ＤＮＡポリメラーゼによって十分許容され、これらの類似体は、一切の制限なくプライマー設計の際に使用することができる。そうした塩基修飾ヌクレオチド類似体の例としては、５−メチルシトシンおよびジアミノプリン（Ｌｅｂｅｄｅｖ  Ｙ．ら（１９９６）Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．，１３：１５−２１）が挙げられるが、これらに限定されない。オリゴヌクレオチドプライマーとは異なり、オリゴヌクレオチドプローブには、構造修飾物の使用に制限がない場合がある。例えば、Ｏｒｔｉｚ  Ｅ．ら（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，１２：２１９−２２６によると、オリゴヌクレオチドプローブは、完全に非天然「ペプチド核酸」（「ＰＮＡ」）モノマーでできている場合がある；例えば、これらのプローブは、それらの構造に天然ヌクレオチドを有さない。他の塩基修飾ヌクレオチド類似体（Ｌｅｂｅｄｅｖ  Ｙ．ら（１９９６）Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．，１３：１５−２１）または糖修飾ヌクレオチド類似体、例えばＬＮＡ（Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｍ．Ｐ．ら（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３２：ｅ５５；Ｓｉｍｅｏｎｏｖ  Ａ．ａｎｄ  Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ  Ｔ．Ｔ．（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３０：ｅ９１）の適用も、プローブに幅広く応用できる。オリゴヌクレオチドプローブは、それぞれの末端にコンジュゲー��したＭＧＢ部分を有する場合がある。例えば、５’−ＭＧＢコンジュゲート型ＦＲＥＴプローブは、検出ＰＣＲにおいて切断されず、これらのプローブは、Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ  Ｎ．ら（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ，２５：２６８−２７５に記載されているような、ハイブリダイゼーションによって誘発される作用メカニズムによって、シグナルをもたらす。対照的に、３’−ＭＧＢコンジュゲート型ＦＲＥＴプローブは、５’−ヌクレアーゼ分解からブロックされず、これらのプローブは、Ｋｕｔｙａｖｉｎ  Ｉ．Ｖ．ら（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｅｓ  Ｒｅｓ．，２８：６５５−６６１において例示されているようなＴａｑポリメラーゼによる切断によって、蛍光シグナルを生じさせる。
【００６４】
本明細書において用いる場合、「ハイブリダズすること」、「ハイブリダイゼーション」または「アニーリング」は、Ｍａｒｍｕｒ  Ｊ．，Ｌａｎｅ  Ｄ．（１９６０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，４６：４５３−４６１、およびＤｏｔｙ  Ｐ．ら（１９６０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，４６：４６１−４７６に最初に記載されたような、最も一般的には二重鎖または２本鎖複合体である塩基対により相補複合体を形成する２つ以上のポリヌクレオチドの間の相互作用のプロセスを指す。核酸二重鎖の安定性は、融解温度、すなわち「Ｔｍ」によって測定される。指定条件下での特定の核酸二重鎖のＴｍは、平均で塩基対の半分が解離する温度である。
【００６５】
ポリヌクレオチドの「ハイブリダイゼーション特性」は、このポリヌクレオチドまたはそのフラグメントが別の相補ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントと配列特異的複合体を形成する能力を指す。「ハイブリダイゼーション特性」は、本明細書では、一般に、相補複合体安定性も指す。この態様では、「ハイブリダイゼーション特性」を、「融解温度」または「Ｔｍ」と同様に用いる。
【００６６】
本明細書において用いる場合、ポリヌクレオチドの「改善された」または「強化されたハイブリダイゼーション特性」は、ｐＨ、塩濃度および組成などの反応条件の変化（例えば、マグネシウムイオン濃度の増加、インターカレーターまたは副溝バインダーなどの複合体安定剤の存在など）を含む（しかし、これらに限定されない）任意の要因に起因する、このポリヌクレオチドとその相補配列との複合体の安定性の増大を指す。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性を、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド長の増加または減少によって改変することもできる。ハイブリダイゼーション特性強化の原因または基礎は、通常は本明細書の文脈でわかる。ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性を、ポリヌクレオチドの構造修飾物によって強化することもできる。例えば、本発明のアッセイにおける塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰの使用は、修飾ＤＮＡの増幅をもたらし、この場合、この修飾ＤＮＡを、強化されたハイブリダイゼーション特性を有すると表現する。これは、本明細書において用いる場合の用語「強化されたハイブリダイゼーション特性」の最も一般的な用法である。これは、この修飾ＤＮＡと、例えばオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーとの相補複合体の熱安定性またはＴｍが、それぞれの天然塩基を含むＤＮＡのものより大きいことを意味する。
【００６７】
「融解温度」または「Ｔｍ」は、通常は２本鎖の、核酸の相補複合体が、１本鎖へと半解離する温度を指す。これらの用語は、同じポリヌクレオチドの２つ以上のフラグメントが互いに相補的に相互作用して、複合体、例えばヘアピン様構造などを形成する、ポリヌクレオチド二次構造の安定性を説明する際にも用いる。Ｔｍ値の簡単な推定値は、核酸が１Ｍ  ＮａＣｌの水溶液中に存在する場合、方程式Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）を用いて計算することができる。さらに正確な計算は、「最近隣」アプローチの塩基対熱力学（Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ  Ｋ．Ｊ．ら（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：３７４６−３７５０；ＳａｎｔａＬｕｃｉａ  Ｊ．Ｊｒ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：１４６０−１４６５）を用いて行うことができる。
【００６８】
用語「標識」は、検出可能なシグナルをもたらすために使用することができ、核酸またはオリゴヌクレオチドに取り付けることができる、任意の原子または分子を指す。標識としては、同位体、放射性標識、例えば３２Ｐ；結合部分、例えばビオチン；ハプテン、例えばジオキシゲニン；発光性、質量タグ；リン光または蛍光部分、蛍光色素（単独で、またはＦＲＥＴ効果により発光スペクトルを抑制するまたはシフトさせることができる他の色素もしくは部分と併用で）が挙げられるが、これらに限定されない。標識は、蛍光、放射活性、比色法、重力法、Ｘ線回折または吸収、磁性、酵素活性、質量分析法、結合親和性などによって検出することができるシグナルをもたらすことができる。標識は、荷電部分である場合もあり、あるいは、中性の電荷である場合もある。標識は、核酸またはタンパク質配列、を含む、またはから成ることがあるが、これは、その標識を含むその配列が検出可能な場合に限る。
【００６９】
「蛍光標識」は、蛍光シグナルをもたらす標識を指す。蛍光標識は、一般には蛍光色素であるが、タンパク質のような高分子またはＲｏｂｅｌｅｋ  Ｒ．ら（２００４）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７６，６１６０−６１６５に記載されているような量子ドットなどの無機材料から作られた粒子をはじめとする（しかし、これらに限定されない）任意の分子を包含し得る。
【００７０】
「ＦＲＥＴ」は、Ｆｏｅｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動効果の略語である。ＦＲＥＴは、励起が、光子の放出を伴わずに双極子−双極子相互作用によってドナー蛍光体からアクセプター蛍光体へと移動する、２色素分子間で発生する距離依存性相互作用である。結果として、ドナー分子の蛍光が消光され、アクセプター分子が励起することとなる。ＦＲＥＴの効率は、スペクトル特性、相対配向、およびドナー発色団とアクセプター発色団との間の距離に依存する（Ｆｏｅｒｓｔｅｒ  Ｔ．（１９６５）Ｄｅｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｉｎ  Ｓｉｎａｎｏｇｌｕ，Ｏ．（ｅｄ．），Ｍｏｄｅｒｎ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｉｓｔａｎｂｕｌ  Ｌｅｃｔｕｒｅｓ，ｐａｒｔ  ＩＩＩ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：９３−１３７）。ランダム双極子配向であり、ドナーの発光スペクトルおよびアクセプターの吸収スペクトルの間に良好なオーバーラップを有する場合では、ＦＲＥＴの効率は、分子間分離の逆６乗に依存する（Ｃｌｅｇｇ  Ｒ．Ｍ．（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２１１：３５３−３８８；Ｃｌｅｇｇ  Ｒ．Ｍ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，６：１０３−１１０；Ｓｅｌｖｉｎ  Ｐ．Ｒ．（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２４６：３００−３３４）。このため、ＦＲＥＴを生体高分子の寸法と同等の距離にわたって有効となり（Ｓｔｒｙｅｒ  Ｌ．ａｎｄ  Ｈａｕｇｌａｎｄ  Ｒ．Ｐ．（１９６７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，５８：７１９−７２６）、この効果は、生物医学的研究、特に、核酸検出のためのプローブ設計において幅広く用いられている（Ｄｉｄｅｎｋｏ  Ｖ．Ｖ．（２００１）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３１：１１０６−１１２１）。
【００７１】
本明細書において用いる場合、用語「ＦＲＥＴプローブ」は、ＦＲＥＴ効果に基づく検出である、対象となる核酸の検出のために使用される、蛍光オリゴヌクレオチドを指す。ＦＲＥＴプローブは、一般に、２つの発色団を含有する。アクセプター発色団は、通常、レポーティング蛍光体の蛍光を消光するために選択される非蛍光色素である（Ｅｆｔｉｎｋ  Ｍ．Ｒ．（１９９１）Ｉｎ  Ｌａｋｏｗｉｃｚ  Ｊ．Ｒ．（ｅｄ．），Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｖ．２：５３−１２６）。標的核酸とプローブとの配列特異的ハイブリッドの形成は、プローブの蛍光特性を変化させることとなり、それによって核酸標的を検出することができる。ＦＲＥＴ効果を活用する多くの検出設計が今日までに報告されている。本発明を実施するために使用することができる最も一般的なＦＲＥＴプローブは、ＴａｑＭａｎ（商標）（Ｌｉｅ  Ｙ．Ｓ．ａｎｄ  Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ  Ｃ．Ｊ．（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，９：４３−４８；Ｌｉｖａｋ  Ｋ．Ｊ．ら（１９９５）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，４：３５７−３６２）；Ｂｅａｃｏｎ（Ｔｙａｇｉ  Ｓ．ａｎｄ  Ｋｒａｍｅｒ  Ｆ．Ｒ．（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：３０３−３０８；Ｂｏｎｎｅｔ  Ｇ．ら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：６１７１−６１７６；Ｔｙａｇｉ  Ｓ．ら（２０００）  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８：１１９１−１１９６；Ｍａｒｒａｓ  Ｓ．Ａ．Ｅ．ら（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３０：ｅ１２２；Ｐｉａｔｅｋ  Ａ．Ｓ．ら（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６  ３５９−３６３；Ｌｅｗｉｎ  Ｓ．Ｒ．ら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：６０９９−６１０３）；Ｅｃｌｉｐｓｅ（Ａｆｏｎｉｎａ  Ｉ．Ａ．ら（２００２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３２：９４０−９４９）；Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマー（Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ  Ｄ．ら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：８０４−８０７；Ｔｈｅｌｗｅｌｌ  Ｎ．ら（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２８：３７５２−３７６１）；自己消光性（Ｌｉｖａｋ  Ｋ．Ｊ．ら、米国特許第５，７２３，５９１号）プローブであり、列挙した原稿および特許は、本明細書に参照により組み込まれる。ＦＲＥＴプローブは、単一のオリゴヌクレオチドを含む場合もあり、または１つより多くのオリゴヌクレオチドを含む場合もある；例えば、Ａｄｊａｃｅｎｔ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎプローブ（Ｈｅｌｌｅｒ  Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  Ｌ．Ｅ．（１９８５）Ｉｎ  Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ，Ｄ．Ｔ．ａｎｄ  Ｆａｌｋｏｗ，Ｓ．（ｅｄｓ．），Ｒａｐｉｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ａｇｅｎｔｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２４５−２５６；Ｃａｒｄｕｌｌｏ  Ｒ．Ａ．ら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：８７９０−８７９４；Ｇｕｎｄｒｙ  Ｃ．Ｎ．ら（１９９９��Ｇｅｎｅｔ．Ｔｅｓｔ．，３：３６５−３７０）。ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブの様々な設計および用途に関する詳細な総説は、Ｄｉｄｅｎｋｏ  Ｖ．Ｖ．（２００１）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３１：１１０６−１１２１において見出すことができる。
【００７２】
本明細書において用いる場合、「修飾ＤＮＡ」は、少なくとも１つ、好ましくは１つより多くの塩基修飾二重鎖安定化ヌクレオチドが組み込まれているＤＮＡを指す。修飾ＤＮＡの増幅は、本発明の重要な構成要素である。好ましい実施形態において、標的核酸は、少なくとも１つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰを含有するデオキシヌクレオシド５’−三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下でオリゴヌクレオチドプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを使用して修飾標的ＤＮＡを増幅することによって検出される。しかし、本明細書において用いる場合、「修飾ＤＮＡ」は、塩基が修飾されたものおよび二重鎖を安定させるもの以外の任意の構造ヌクレオチド修飾物を、それらの存在が、特定の増幅もしくは検出反応の選択により、または強化されたハイブリダイゼーション以外の特定の特性を有するＤＮＡの提供により必要とされる場合には、追加で含有することがある。例えば、Ｗａｌｋｅｒ  Ｇ．Ｔ．ら（１９９３）米国特許第５，２７０，１８４に記載されているＳＤＡ増幅は、２本鎖ＤＮＡの一方の鎖のニッキングを促進するために、α−チオｄＡＰＴ類似体の使用を必要とする。修飾ＤＮＡに、例えばデオキシウリジン（ｄＵ）モノマーをさらに組み込むこともできる。この塩基修飾がＤＮＡ二重鎖を不安定化することは公知であるが、それでもやはり、こうした修飾ＤＮＡの使用は本発明の範囲内である。通常、このｄＵ適用の目的は、Ｇｅｌｆａｎｄ  Ｄ．Ｈ．ら（１９９５）米国特許第５，４１８，１４９号に記載されているようなサンプルからサンプルへの汚染繰り越しの防止にあるからである。
【００７３】
「反応混合物」は、標的核酸、ＤＮＡポリメラーゼ、オリゴヌクレオチドプライマー、プローブまたは他のオリゴヌクレオチド成分などの主成分に加えて、検出剤、特殊酵素、ヌクレオシド５’−三リン酸（修飾されているものを含む）、反応中にｐＨを選択レベルで維持するための緩衝剤、塩、補因子、および添加剤、例えば、１−メチル−２−ピロリジノン、グリセロール、ポリ（エチレングリコール）、ジメチルスルホキシドまたはホルムアルデヒドなどを含む（しかし、これらの含有に限定されない）ことがある、増幅もしくは検出反応または両方を行うためのすべての必要反応体を含有する溶液を一般に指す。
【００７４】
ここで用いる場合、用語「キット」は、材料を送達するための任意のシステムを指す。反応アッセイに関連して、そうした送達システムは、反応成分、例えばオリゴヌクレオチド、緩衝成分、添加剤、反応増進剤、酵素など、の保管、ある場所から別の場所への輸送または送達を可能にする要素をそのアッセイを行うための書面による説示を一般に備えている適切な容器の中に含む。キットは、関連した反応試薬および支持材料を収容する１つ以上の閉鎖容器または箱を含む場合もある。このキットは、２つ以上の別の容器を含むことがあり、この場合、それらの容器のそれぞれが、全キット成分の一部分を含む。それらの容器を、一緒にまたは別々に、所期のレシピエントに送達することができる。
【００７５】
用語「固体支持体」は、別の材料を取り付けることができる固体構造を提供する任意の材料を指す。そうした材料としては、シリコン、プラスチック、金属、ガラス、セラミック表面などが挙げられるが、これらに限定されない。固体支持体は、剛性または非剛性性状のもの、例えばゲル、ゴム、ポリマーなど、であり得、ならびにビーズのような球形を含む任意のタイプの形であってよい。本発明の一定の実施形態は、増幅もしくは検出段階または両方において固体支持体上に固定されている反応成分、例えばオリゴヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドプローブまたは修飾ＤＮＡ、を少なくとも１つ有する。生体材料は、それがランダムでない化学的または物理的相互作用により固体支持体と会合しているとき、固体支持体に「固定」されている。固定化または取り付けは、特殊スペーサー分子またはリンカー基を用いる二重結合によるものであり得る。しかし、固定化が二重結合性または永続性である必要はない。
【００７６】
ここで用いる場合、「検出アッセイ」または「アッセイ」は、対象となる核酸を検出するために行われる反応または反応の連鎖を指す。本アッセイは、必従的にまたはリアルタイムで行われる増幅および検出反応、核酸単離および中間精製段階、固定化、標識付けなどをはじめとする多数の段階から成り得る。
【００７７】
例示的な態様の詳細な説明
本発明の特定の態様は、強化されたハイブリダイゼーション特性を有する修飾核酸（例えば、ＤＮＡ）の増幅および検出を含む、改善された核酸検出法に関する。好ましい態様において、修飾核酸（例えば、ＤＮＡ）は、ＤＮＡポリメラーゼおよび塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰの存在下でのオリゴヌクレオチドプライマーの伸長によって生産および増幅される。本発明の態様は、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブと修飾ＤＮＡとの複合体を安定化することにより、増幅もしくは検出段階または両方に恩恵をもたらす。
【００７８】
一定の態様において、ＰＣＲは、好ましいＤＮＡ増幅技術である。１つの態様において、本発明は、Ａ／Ｔ塩基対とＧ／Ｃ塩基対との間の安定性の違いを減少させることに役立ち、その結果、Ａ／Ｔリッチ二重鎖を選択的に安定させ、このようにして、従来のアプローチで検出できなかった核酸配列の検出を含むアッセイ設計を可能にする。
【００７９】
一定の態様において、本発明は、ＰＣＲ反応温度を最適な条件に上昇させる、および核酸検出アッセイを加速する手立てとなる。
【００８０】
追加の態様は、オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブの長さを、その長さの減少が有益である場合、減少させることを可能にする。
【００８１】
好ましい実施形態において、本発明は、ＦＲＥＴプローブを使用して対象となる核酸を反応の進行につれて検出する、改善されたリアルタイムＰＣＲアッセイに関する。
【００８２】
さらに別の好ましい実施形態において、本発明は、サンプル中の標的核酸の量を決定するために行われる、改善されたリアルタイムＰＣＲアッセイに関する。
【００８３】
特定に実施形態において、本発明は、対象となる１つより多くの核酸を増幅および検出するための方法、例えば、マルチプレックスＰＣＲを提供する。
【００８４】
一般に、本明細書において開示する本発明の態様は、ＤＮＡ分子の合成、増幅および検出に基づく実質的にいずれの核酸検出アッセイにも恩恵をもたらすが、但し、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド成分（例えば、オリゴヌクレオチドプライマー（単数または複数）およびプローブ（単数または複数））が、増幅もしくは検出、いずれかの段階の間に、または両方の段階の間に、増幅ＤＮＡにハイブリダイズすることを条件とする。本発明の態様によると、オリゴヌクレオチド成分は、修飾ＤＮＡにハイブリダイズすると、複合体（例えば、相補二重鎖、プライマーのための伸長複合体）を形成し、この複合体は、ＤＮＡを二重鎖安定化塩基類似体で修飾しない従来のアプローチと比較してハイブリダイゼーション特性が強化された本発明の修飾ＤＮＡため、より安定している。
【００８５】
本発明が、（ｉ）増幅段階もしくは検出段階または両方のためのオリゴヌクレオチド成分の設計を発展させ、単純化すること、（ｉｉ）従来のアプローチを用いて（例えば、高いＡ／Ｔ含有率のため）適用することができなかった（アッセイできなかった）標的核酸配列を設計に盛り込むこと、（ｉｉｉ）増幅もしくは検出段階のいずれか、または両方の反応温度を、可能である（例えば、重要な酵素の熱不安定性による制約を受けない）ならばいつでも、上昇させること、（ｉｖ）増幅もしくは検出段階のいずれか、または両方を加速すること（例えば、アッセイ時間の短縮）、（ｖ）より短いオリゴヌクレオチド成分の使用、従って、オリゴヌクレオチド成分の製造費用の減少を可能にすること、などを含む（しかし、これらに限定されない）様々な手段で核酸検出アッセイに恩恵をもたらすことができることは、通常の当業者には理解されるであろう。
【００８６】
特定の態様において、前記方法は、ＤＮＡ増幅もしくは検出反応のいずれかまたはそれらの組み合わせの選択によって決定される多数の要因を反映している。ＤＮＡ増幅および検出のための非常に多数の技術が今日までに報告されており、最も認知されており一般に用いられている技術を参照しながら、本発明を用いるためのガイダンスを本明細書の中で提供し、例示する。一般に、本発明のプラスの寄与（利点）は、アッセイ反応温度を上昇させるにつれて増大することが期待され、４０℃、好ましくは５０℃、好ましくは５５℃、より好ましくは６０℃、より好ましくは６５℃、およびさらにより好ましくは７０℃を超える温度で行われるシステムに最大の恩恵をもたらす。
【００８７】
本発明の適用は、一般に、ＰＣＲベースの検出アッセイに大きな恩恵をもたらす。例えば、本発明の態様は、ＰＣＲ温度（アニーリング温度）を上昇させることができ、その結果、アッセイの速度を上げること、および誤増幅に関連した当該技術分野において認知されているＰＣＲの問題（例えば、プライマー−二量体形成）を緩和または本質的に排除することができ、加えて、ＰＣＲの多重使用能力を改善する。
【００８８】
本明細書に開示する本発明の態様は、核酸検出アッセイにおいてオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブのハイブリダイゼーション特性を強化するための先行技術（本明細書における「背景技術」を参照のこと）と比較して、容易に実施され、費用効率がよい。さらに、本発明の態様は、本明細書の一定の実施例において立証するように、これらの従来のアプローチと任意および有効に併用することができる。
【００８９】
Ｉ．強化されたハイブリダイゼーション特性を有する修飾ＤＮＡの増幅。
【００９０】
一定の実施形態において、強化されたハイブリダイゼーション特性を有する修飾ＤＮＡは、「等温増幅反応」を用いて増幅される。等温ＤＮＡ増幅反応は、定常または一定温度で通常は行われる。本発明を実施する際に有用であり得る等温増幅反応の例としては、次のものが挙げられるが、それらに限定されない：鎖置換型増幅（ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒ  Ｇ．Ｔ．ら，米国特許第５，２７０，１８４号；Ｄａｔｔａｇｕｐｔａ  Ｎ．ら，米国特許第６，２１４，５８７号；Ｗａｌｋｅｒ  Ｇ．Ｔ．ら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２４，３８４−３５３；Ｗａｋｌｅｒ  Ｇ．Ｔら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：３９２−３９６；Ｓｐａｒｇｏ  Ｃ．Ａ．ら（１９９６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，１０  ２４７−１４５）、ローリングサークル型増幅（ＲＣＡ）（Ｌｉｚａｒｄｉ  Ｐ．，米国特許第５，８５４，０３３号；Ｂａｎｅｒ  Ｊ．ら（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２６：５０７３−５０７８）、線形的標的等温多量体化および増幅（ＬＩＭＡ）（Ｈａｆｎｅｒ  Ｇ．Ｊ．ら（２００１）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３０，８５２−８６７）、ループ媒介増幅（ＬＭＡ）（Ｎｏｔｏｍｉ  Ｔ．およびＨａｓｅ  Ｔ．，米国特許第６，４１０，２７８号；Ｎｏｔｏｍｉ  Ｔ．ら（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２８，ｅ６３）；キメラまたは複合ＲＮＡ／ＤＮＡプライマーを使用する等温増幅（Ｃｌｅｕｚｉａｔ  Ｐ．およびＭａｎｄｒａｎｄ  Ｂ．，米国特許第５，８２４，５１７号；Ｋｕｒｎ  Ｎ．（２００１）米国特許第６，２５１，６３９号）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）（Ｏｅｈｌｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ  Ｆ．ら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，１２８１１−１２８１６；Ｄａｖｅｙ  Ｃ．およびＭａｌｅｋ  Ｌ．Ｔ．，米国特許第６，０６３，６０３号）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＡＤ）（Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｍ．，Ｘｕ  Ｙ．ａｎｄ  Ｋｏｎｇ  Ｈ．（２００４）ＥＭＢＯ  ｒｅｐｏｒｔ，５：７９５−８００；Ａｎ  Ｌ．，Ｔｎａｇ  Ｗ．，Ｒａｎａｌｌｉ  Ｔ．Ａ．，Ｋｉｍ  Ｈ．−Ｊ．，Ｗｙｔｉａｚ  Ｊ．，ａｎｄ  Ｋｏｎｇ  Ｈ．（２００５）ＪＢＣ，２８０：２８９５２−２８９５８）（すべて本明細書に参照により組み込まれる）および多数の他の方法。最も一般的に用いられる等温増幅反応の総説は、Ａｎｄｒａｓ  Ｓ．Ｃ．ら（２００１）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：２９−４４において見出すことができ、ならびに選択された任意の特定の増幅計画に関するＤＮＡ増幅反応を行うための詳細なガイダンスは、上に列挙した参考文献において見出すことができ、そしてまたこれらの参考文献は、同じ主題の類いの他の出版物への言及を含んでおり、任意の特定の増幅反応を行うためにそれらが有用であることがわかる場合もある。
【００９１】
特定の態様において、強化されたハイブリダイゼーション特性を有する修飾ＤＮＡは、上で言及した等温技術を用いて作製することができるが、但し、それらの反応において少なくとも１つの、および好ましくは１つより多くの天然ｄＮＴＰが、図３に例示するそれぞれの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰによって完全にまたは部分的に置換されることを条件とする。
【００９２】
一定の態様において、修飾ＤＮＡは、少なくとも１つの、および好ましくは１つより多くのオリゴヌクレオチドプライマーと配列特異的様式で相互作用して、伸長複合体（例えば、相補二重鎖）を形成し、この複合体は、ＤＮＡが二重鎖安定化塩基類似体で修飾されない従来のアプローチのものと比較して強化されたハイブリダイゼーション特性を有する本発明の修飾ＤＮＡのため、より安定している。これらは、上で論じた様々な手段で増幅段階に恩恵をもたらす。特定の増幅反応、特に、ＤＮＡポリメラーゼ以外の酵素（制限エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡポリメラーゼなど）を含む増幅反応の性質に依存して、上記方法の一定の調整または変型を塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰの使用に適用できることは、通常の当業者には理解されるであろう。塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰの適用は、好ましくは、その反応またはＤＮＡ合成の重要な成分であるそうした他の酵素の活性には干渉しないであろう。これは、特定の増幅計画において使用される塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰの選択を左右する場合があり、その選択は、当該技術分野において周知である、これらの酵素の特性に基づいて行うことができる。例えば、ＳＤＡ増幅は、２本鎖ＤＮＡの一方の鎖のみのニッキングを促進するためにα−チオｄＮＴＰ類似体を使用する必要がある。従って、好ましくは、そうした特定の適用には、それぞれの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰの使用を避けることとなろう。ＳＤＡにおいて使用される制限エンドヌクレアーゼの性質に依存して、これらの酵素は、例えばシトシンのメチル化に対して、感受性である場合があり、好ましくは、修飾ＤＮＡの作製における５−メチル−シトシンの使用は、制限されるまたは回避されるであろう。制限エンドヌクレアーゼの特性に対するガイダンスは、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍら、ｅｄｓ．，（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，９．１．１−９．１．３において見出すことができる。一定の塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰ、例えば、２，６−ジアミノプリン類似体の適用は、ＮＡＳＢＡ反応では制限されることがある。なぜなら、そうした類似体の使用が、この特定の増幅のためのプライマー設計の際に必要とされるＲＮＡポリメラーゼプロモーター領域の特性を改変することがあるからである。所望される場合には、ｄＴＴＰをｄＵＴＰ類似体によって置換して、それぞれの修飾ＤＮＡを生じさせる。これは、Ｇｅｌｆａｎｄ  Ｄ．Ｈ．ら（１９９５）米国特許第５，４１８，１４９号に記載されているようなサンプルからサンプルへの汚染繰り越しを防止する際の周知アプローチである。こうした繰り越し防止法の適用は、図３に例示する特定の５−置換デオキシウリジンｄＮＴＰ類似体の使用を減少または制限する場合がある。
【００９３】
検出ＰＣＲは、本発明の修飾ＤＮＡの好ましい増幅法である。１つの実施形態において、検出ＰＣＲは、標的修飾ＤＮＡの線形的増幅をもたらすオリゴヌクレオチドプライマーを使用して行うことができる。好ましい実施形態において、検出ＰＣＲは、指数的増幅をもたらすように設計される２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して行われる。
【００９４】
ＰＣＲプライマー設計の一例を図４に示す。図４は、本発明の例示的な態様におけるＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイにおいて使用した９６−ｍｅｒ標的オリゴデオキシリボヌクレオチド（配列番号：２４）、フォワードＰＣＲプライマー（配列番号：２５）、リバースＰＣＲプライマー（配列番号：２６）および２２−ｍｅｒ蛍光プローブ（配列番号：２７）の配列を示す。Ｓｃｏｒｐｉｏｎアッセイは、リバースプライマー（配列番号：２６）およびＳｃｏｒｐｉｏｎプライマー（配列番号：２８）を使用して行った（これらのプライマーの構造も示す）。Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマー（配列番号：２８）において、ヘアピン形成性ＦＲＥＴプローブ（相補末端配列に下線を引く）は、長い柔軟なＣ１８−リンカー（Ｇｌｅ  Ｒｅｓｅｒａｃｈ）によって、フォワードプライマーの５’末端に接続される。使用したプライマーおよびプローブは、すべて天然ヌクレオシドから作製されているか、あるいは修飾塩基が組み込まれていた。塩基修飾オリゴヌクレオチドを使用した場合、太字の字体で示す位置を２，６−ジアミノ−プリンまたは５−メチルシトシンでそれぞれ置換した。配列番号：２４の配列の下線を引いた箇所がリバースプライマーの結合部位である（リバース、３’→５’配向で示す）。「ＦＡＭ」は、６−フルオレセインを指し、「Ｑ」は、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＢＬＡＣＫ  ＨＯＬＥ  ＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）（ＢＨＱ１）を指す。
【００９５】
検出ＰＣＲのための反応混合物のサンプルは、図５において見出すことができる。図５Ａ−５Ｄは、ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ（商標）（Ｃｅｐｈｅｉｄ）でのリアルタイムＰＣＲ中にＴａｑＭａｎ（登録商標）検出アッセイについて得られた蛍光モニタリングの例示的な結果を示すものである。使用した標的オリゴヌクレオチド（配列番号：２４）、フォワードＰＣＲプライマー（配列番号：２５）、リバースＰＣＲプライマー（配列番号：２６）およびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（配列番号：２７）の配列は、図４にあるとおりである。ＰＣＲ開始時の反応混合物（２５μＬ）中の成分の最終濃度は、フォワードおよびリバースＰＣＲプライマー−２００ｎＭ；ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ−２００ｎＭ；標的オリゴヌクレオチド−１０，０００コピー／反応；ｄＮＴＰ−それぞれ２００μＭ；ＪＵＭＰ  ＳＴＡＲＴ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ）−５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中、０．０４Ｕ／μＬであった。バックグラウンド蛍光を引いた。６５から７５℃まで様々なアニーリング温度「Ｘ」で、ＰＣＲサイクリングプロフィール（９５°２’）→（９５°１０”→Ｘ°４５”）５５を用いた。
【００９６】
図５Ａは、未修飾プライマーおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブをすべての天然ｄＮＴＰとともに用いた例示的な実験セットを示すものである。
【００９７】
図５Ｂは、図５Ａのものに類似しているが、２’−デオキシリボアデノシン−５’−三リン酸（ｄＡＴＰ）を２’−デオキシリボ−２，６−ジアミノプリンヌクレオシド−５’−三リン酸（ｄ（２−ａｍＡ）ＴＰ）で完全に置換した、例示的な実験の結果を示す。
【００９８】
図５Ｃは、この例示的な実験セットで使用した塩基修飾プライマーおよびプローブを示すが、この場合、すべてのヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）は天然であった。
【００９９】
図５Ｄは、図５Ｂおよび図５Ｃの両方のシステム修飾を組み合わせ、同時に用いた、リアルタイムＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイを表し；すなわち、塩基修飾プライマーおよびプローブをｄＡＴＰの完全ｄ（２−ａｍＡ）ＴＰ置換とともに用いた。
【０１００】
修飾ＤＮＡを増幅するための代表的な本発明の検出ＰＣＲは、標的核酸と、一対のオリゴヌクレオチドプライマーと、適するＤＮＡポリメラーゼと、少なくとも１つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰを含有するデオキシヌクレオシド５’−三リン酸の混合物とを含む。マグネシウムイオンは、多くのＤＮＡポリメラーゼの触媒活動を可能にするため、反応混合物中に好ましくは存在する。適切な保存溶液を使用して反応成分を混合して、例えば、２５μＬの反応混合物の次の濃度を生じさせる：ＰＣＲプライマー−それぞれ２００ｎＭ；ＪｕｍｐＳｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ）−５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中、０．０４Ｕ／ｍＬ、およびｄＮＴＰ−それぞれ２００μＭ。この場合、４つの天然ｄＮＴＰ（例えば、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰまたはｄＡＴＰ）のうちの１つ以上が、塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰで完全にまたは部分的に置換され、その一部の例を図３に示す。上に挙げた成分に加えて、検出ＰＣＲ反応混合物は、検出剤、ＤＮＡポリメラーゼ以外の特殊酵素、ＫＣｌおよびＭｇＣｌ２以外の塩、補因子および添加剤、例えば、１−メチル−２−ピロリジノン、グリセロール、ポリ（エチレングリコール）、ジメチルスルホキシドまたはホルムアミドなどを含む場合があるが、これらの含有に限定されない。
【０１０１】
検出ＰＣＲ中の標的核酸濃度は、一般には未知であり、１反応あたり１コピー（分子）ほどの低さである場合もある。本発明とともに使用するための標的核酸は、原核生物、真核生物、植物、動物およびウイルスをはじめとする（しかし、これらに限定されない）任意の生物または他の源に由来していてもよく、ならびに合成核酸であってもよい。標的核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはそれらの変異体を含有し得る。標的核酸は、１本鎖であってもよいし、または２本鎖であってもよい。対象となる核酸が、２本鎖ＤＮＡである場合、通常はそれを変性させた後、反応混合物のインキュベーションによるＰＣＲ温度サイクリングを、例えば９５℃で２分間行う。抗体でブロックされたＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＪｕｍｐＳｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ））を検出ＰＣＲにおいて使用するとき、その初期熱インキュベーション（９５℃で２分間）が、そのポリメラーゼも活性化する。対象となる核酸は、本発明の方法に適用する前にそのサンプル源から単離および精製することができる。好ましくは、これらの標的核酸には、増幅および検出反応に干渉するタンパク質および任意の他の物質が十分にない。市販のキットおよび特殊機器を含む多数の方法を、標的核酸の単離および精製に利用することができる。例えば、核酸は、フェノール／クロロホルム有機試薬での有機抽出、続いてエタノール沈殿を用いて、単離することができる（Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｉ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３））。固相吸着法（Ｗａｌｓｈら（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１０：５０６−５１３，Ｂｏｏｍら、米国特許第５，２３４，８０９号）および塩誘導ＤＮＡ沈殿法（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６：１２１５）は、核酸を精製するためのさらに他の公知のアプローチである。対象となる核酸がＲＮＡである場合、例えば、Ｓｉｍｐｓｏｎ  Ｄ．ら（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１５１：４８７−４９２およびＢｅｌｙａｖｓｋｙ  Ａ．ら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１７：２９１９−２９３２に記載されている、公知の方法によって、ＰＣＲの前にそれをＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖にまたは二重鎖ｃＤＮＡに転化させることができる。これらの方法は、ＲＮＡテンプレートにハイブリダイズさせたオリゴヌクレオチドプライマーを伸長することができる逆転写酵素を利用して、デオキシヌクレオシド５’−三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下での相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成する；すなわち、「逆転写ＰＣＲ」または「ＲＴ−ＰＣＲ」、およびＴｅｃｏｔｔ  Ｌ．ら（１９９２）の米国特許第５，１６８，０３８号（これは、その全体が本明細書に参照により組み込まれる）に記載されているとおり。例えばＮＡＳＢＡのような、一定の増幅反応は、最初のｃＤＮＡコピーを合成する必要がなく、これらの技術は、ウイルスＲＮＡの検出の際に有用である。
【０１０２】
代表的なＰＣＲは、（ｉ）２本鎖核酸の鎖を分離する変性工程、続いて、（ｉｉ）標的配列に隣接する位置にプライマーをアニールさせるアニーリング工程；およびその後、（ｉｉｉ）５’から３’の方向でそれらのプライマーを伸長する伸長工程の繰り返しから成り、それによって、標的配列に相補的なＤＮＡ鎖を形成する。自動サーマルサイクラーを使用して、上の工程のそれぞれを異なる温度で行うことができる。これらのＰＣＲサイクルを、望みどおりの回数繰り返し、その結果、使用するプライマーの５’末端によってその末端が規定される標的ＤＮＡフラグメントの指数関数的蓄積を生じさせることができる。特定の温度、各工程でのインキュベーション時間、および工程間の変化率は、当業者に周知の多数の要因に依存し、例は、非常に多数の出版物掲載プロトコル、例えば、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  Ｍ．Ｊ．ら（１９９１および１９９５）などにおいて見出すことができる。ＰＣＲの条件は、有意な範囲にわたって変化し得るが、従来のＰＣＲの場合、２本鎖標的核酸は、温度＞９０℃で変性され、プライマーは、５０−７５℃の範囲の温度でアニールされ、および伸長は、好ましくは、７２−７８℃の範囲の温度で行われる。増幅特異性およびアッセイ時間は、検出ＰＣＲにおける重要な要因である。
【０１０３】
２工程ＰＣＲ実施形態：
図５−１１ならびに図５、６、９、１０および１１に例示するように、本発明は、核酸検出において使用するオリゴヌクレオチド成分のハイブリダイゼーション特性を実質的に改善し、そしてまた、これにより、Ｔａｑのような熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの動作に最適な７２−７５℃の範囲の温度までＰＣＲのアニーリング温度を上昇させることができる。従って、好ましい態様において、これは、アニーリング段階と伸長段階との「合体」をもたらす。
【０１０４】
（本明細書において上で詳細に論じた）図５Ａ−５Ｄは、ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ（商標）（Ｃｄｐｈｅｉｄ）でのリアルタイムＰＣＲ中にＴａｑＭａｎ（登録商標）検出アッセイに関連して本発明の方法を用いる蛍光モニタリングの例示的な結果を示すものである。使用した標的オリゴヌクレオチド（配列番号：２４）、フォワードＰＣＲプライマー（配列番号：２５）、リバースＰＣＲプライマー（配列番号：２６）およびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（配列番号：２７）の配列は、図４にあるとおりである。図５Ａは、未修飾プライマーおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブをすべての天然ｄＮＴＰとともに用いた例示的な実験セットを示すものである。図５Ｂは、図５Ａのものに類似しているが、天然２’−デオキシリボアデノシン−５’−三リン酸（ｄＡＴＰ）を２’−デオキシリボ−２，６−ジアミノプリンヌクレオシド−５’−三リン酸（ｄ（２−ａｍＡ）ＴＰ
）で完全に置換した、例示的な実験の結果を示す。図５Ｃにおける例示的な実験セットでは塩基修飾プライマーおよびプローブを使用したが、すべてのヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）は天然であった。図５Ｄは、図５Ｂおよび図５Ｃの両方のシステム修飾を組み合わせ、同時に用いた、リアルタイムＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイを表す；すなわち、塩基修飾プライマーおよびプローブをｄＡＴＰの完全ｄ（２−ａｍＡ）ＴＰ置換とともに用いた。
【０１０５】
図６Ａ−６Ｄは、天然ｄＮＴＰ（図６Ａにおいて使用したもの）のうちの１つを５−ブロモ−２’−デオキシリボウリジン−５’−三リン酸（ｄ（５−ＢｒＵ）ＴＰ、図６Ｂ）；５−プロピニル−２’−デオキシリボウリジン−５’−三リン酸（ｄ（５−ＰｒＵ）ＴＰ、図６Ｃ）および５−メチル−２’−デオキシリボ−シチジン−５’−三リン酸（ｄ（５−ＭｅＣ）ＴＰ、図６Ｄ）でそれぞれ完全に置換した場合のリアルタイムＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイの結果を示す。図６Ａは、図５Ａと同一であり、直接比較を容易にするためにここに示す。ＰＣＲプライマーおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは未修飾であった。他のＰＣＲ反応組成、成分濃度および温度／時間プロフィールは、図５に示す例示的な実験に関して説明したのと同じであった。
【０１０６】
図７Ａ−７Ｄは、変動アニーリング温度（立方体１つごとに１℃で示す）での例示的なＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイにおけるリアルタイム蛍光モニタリングの結果を示す。図７Ｂは、２つの天然ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰおよびｄＴＴＰ）をそれらのそれぞれの塩基修飾類似体ｄ（２−ａｍＡ）ＴＰおよびｄ−（５−ＰｒＵ）ＴＰで完全に置換した場合のＰＣＲ反応に関する蛍光曲線を示す。図７Ａでの結果は、図５Ａにおいて示したものと同一である。ＰＣＲプライマーおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、未修飾であった。他のＰＣＲ反応組成、成分濃度および温度／時間プロフィールは、図５の例示的な実験に関して説明したのと同じであった。図７Ａおよび７Ｂの下にそれぞれ示すパネルダイアグラム図７Ｃおよび７Ｄは、図７Ａおよび７Ｂに示すものと同じ結果であるが、対数スケールでプロットしてある。蛍光曲線閾値（「Ｃｔ」）を矢印で示す。蛍光曲線閾値は、それらの対数曲線がＸ軸（ｉ）を指すまたは（ｉｉ）と交差するサイクル数とした。
【０１０７】
図８Ａおよび８Ｂは、リアルタイム蛍光曲線を示すものである。図８Ａは、図７Ｂの実験において用いたのと同じＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイおよび反応組成について得られた複合リアルタイム蛍光曲線を示すものであるが、ＰＣＲプロフィールは異なった；すなわち、（９５°２’）→（９Ｘ°ＹＹ”→６７°４５”）５５。この場合では、アニーリング温度は一定であり（６７℃）、変性条件は、立方体ごとに示すとおり、温度（Ｘ＝９５−９７℃）および時間（ＹＹ＝１０または１５秒）に関して変動させた。ＰＣＲプライマーおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、未修飾であった。他のＰＣＲ反応組成および成分濃度は、図５に関して説明したのと同じであった。図８Ｂ（右）は、図８Ａにおけるものと同じ実験を示すが、蛍光を対数スケールでプロットしてある。９５°１０”および９７°１５”曲線についての蛍光曲線閾値（「Ｃｔ」）を矢印によって示す。
【０１０８】
図９は、例示的な図５、６および７において示したＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイのシグナル動作をＰＣＲのアニーリング温度に対して示すものである。ＰＣＲサイクル５０での個々の反応ごとの蛍光を、その反応において用いたアニーリング温度に対してプロットした。２つの天然ｄＮＴＰをｄ（２−ａｍＡ）ＴＰおよびｄ（５−ＰｒＵ）ＴＰで置換した場合では、そのアッセイ（図７）で観察されたＣｔ値の４−サイクル「遅延」のため、サイクル５４において蛍光データを取った。矢印は、そのアッセイシグナルのほぼ半分（３００蛍光単位）に達したときのアニーリング温度を指している。
【０１０９】
図１０Ａ−１０Ｃは、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ検出アッセイについて得られた蛍光モニタリングの結果を示すものである。使用した標的オリゴヌクレオチド、フォワードおよびＳｃｏｒｐｉｏｎ  ＰＣＲプライマーの構造は、図４に示すとおりである。ＰＣＲ開始時の反応混合物（２５μＬ）中の成分の最終濃度：フォワードおよびＳｃｏｒｐｉｏｎ  ＰＣＲプライマー−２００ｎＭ；標的オリゴヌクレオチド−１０，０００コピー／反応；ｄＮＴＰ−それぞれ２００μＭ；ＪＵＭＰ  ＳＴＡＲＴ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ）−５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中、０．０４Ｕ／μＬ。バックルラウンド蛍光を引いた。６１から７５℃までの様々なアニーリング温度Ｘで、ＰＣＲプロフィール（９５°２’）→（９５°１０”→Ｘ°４５”）５５を用いた。
【０１１０】
図１０Ａは、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ検出システムをすべての天然ｄＮＴＰとともに用いた、例示的な実験セットを示すものである。図１０Ｂは、図１０Ａに類似した実験結果を示しているが、天然ｄＡＴＰをｄ（２−ａｍＡ）ＴＰ塩基修飾類似体で完全に置換した。図１０Ｃも図１０Ａに類似した実験セットを示すが、この場合では、天然ｄＮＰＴのうちの２つ、特に、ｄＡＴＰおよびｄＴＴＰを、それぞれの塩基修飾類似体ｄ（２−ａｍＡ）ＴＰおよびｄ（５−ＰｒＵ）ＴＰで完全に置換した。Ｃｔ値の安定性を保証するために、図１０Ｃの実験セットでは、（９５°２’）→（９７°１５”→Ｘ°４５”）５５というわずかに異なるＰＣＲプロフィールを用いた。
【０１１１】
図１１は、図１０からのＳｃｏｒｐｉｏｎアッセイのシグナル動作をＰＣＲのアニーリング温度に対して示すものである。ＰＣＲサイクル５０での個々の反応ごとの蛍光を、その反応において用いたアニーリング温度に対してプロットした。矢印は、そのアッセイシグナルのほぼ半分（１５０蛍光単位）に達したときのアニーリング温度を指している。
【０１１２】
従って、好ましい実施形態において、検出ＰＣＲは、２工程、（ｉ）鎖変性および（ｉｉ）アニーリング／伸長段階（組み合わせたもの）で行われる。検出可能な標的核酸濃度を生じさせるために必要なＰＣＲサイクル数は、一般には未知である初期標的核酸負荷量に依存する。本明細書において用いる場合のＰＣＲ時間／温度プロフィールは、本明細書では、例えば（９５°２’）→（９７°１５”→Ｘ°４５”）５５と記録することがある。これは、ＰＣＲ正規サイクルの前に、反応混合物を９５℃で２分間インキュベートし（ポリメラーゼ活性化）、その後、５５のサイクル（この場合、ＤＮＡアンプリコンを９５°で１０秒間変性させ、続いてＸ°で４５秒間インキュベートした（２工程ＰＣＲ））を行ったことを意味する。Ｘは、通常は５０℃より高い、好ましくは５５℃より高い、好ましくは６０℃より高い、より好ましくは６５℃より高い、およびさらにより好ましくは７０℃より高い、総合アニーリング／伸長温度である。
【０１１３】
ＰＣＲ反応を行うための追加のガイダンスは、例えば、Ｃｌｅｍｅｎｔｉ  Ｍ．ら（１９９３）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．，２：１９１−１９６；Ｃｌｅｇｇ  Ｒ．Ｍ．（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２１１：３５３−３８８；Ｃｌｅｍｅｎｔｉ  Ｍ．ら（１９９３）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．，２：１９１−１９６；Ｌｉｅ  Ｙ．Ｓ．ａｎｄ  Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ  Ｃ．Ｊ．（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，９：４３−４８；Ｌｉｖａｋ  Ｋ．Ｊ．ら（１９９５）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，４：３５７−３６２；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  Ｍ．Ｊ．ら，ｅｄｓ（１９９１）ＰＣＲ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  Ｍ．Ｊ．ら，ｅｄｓ（１９９５）ＰＣＲ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ、および本明細書において言及する多数の他の原稿において見出すことができる。
【０１１４】
ＩＩ．対象となる核酸の検出
ＤＮＡ検出技術。本発明の修飾ＤＮＡは、電気的力（例えば、電気泳動）、重力（例えば、沈降）、分光法（例えば、放射線分光法、ＵＶ、質量分析法、蛍光、化学発光、化学蛍光など）、吸着、磁性、クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ、逆相、イオン交換、体積排除、など）、タンパク質との反応（制限酵素（ｒｅｓｔｒｉｃｔａｓｅ）、エンドヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、キナーゼおよび他の酵素活性）、結合親和性などをはじめとする（しかし、これらに限定されない）、任意の物理的、化学的または生物学的手段によって検出することができる。一定の実施形態において、修飾ＤＮＡは、増幅段階中または直後に標識され、その標識が修飾ＤＮＡの検出に利用される。有用な標識としては、同位体、放射性標識、例えば３２Ｐ、結合部分、例えばビオチン、発光および質量タグ、リン光または蛍光部分、蛍光色素（単独で、またはＦＲＥＴ効果により発光スペクトルを抑制するまたはシフトさせることができる他の色素もしくは部分と併用で）が挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態において、本発明の修飾ＤＮＡは、増幅反応中（リアルタイム）または後に検出剤を使用して検出することができる。好ましい検出剤は、インターカレーティング色素および蛍光剤、例えば臭化エチジウムである。例えば、Ｗｉｔｔｗｅｒ
Ｃ．Ｔ．らにより米国特許第６，１７４，６７０号および同第６，５６９，６２７号に、ならびにＨｉｇｕｃｈｉ  Ｒ．ら（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：４１３−４１７；Ｈｉｇｕｃｈｉ  Ｒ．ら（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：１０２６−１０３０に記載されているインターカレーティング色素を使用して、ＰＣＲにおける増幅産物を検出することができる。好ましい蛍光剤は、核酸と相互作用するとその蛍光特性を変化させ、その結果、検出可能なシグナルをもたらす分子である。Ｓｃｈｎｅｅｂｅｒｇｅｒ  Ｃ．ら（１９９５）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．，４：２３４−２３８およびＭａｃｋａｙ  Ｊ．，Ｌａｎｄｔ  Ｏ．（２００７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３５３：２３７−２６２（これらは、本明細書に参照により組み込まれる）に記載されているように、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩおよびＩＩは、好ましい蛍光剤である。
【０１１５】
オリゴヌクレオチドプローブ。１つの実施形態において、本発明の修飾ＤＮＡは、オリゴヌクレオチドプローブを使用して検出される。本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、修飾ＤＮＡと配列特異的様式で相互作用して、複合体（例えば、相補二重鎖）を形成し、この複合体は、ＤＮＡが二重鎖安定化塩基類似体で修飾されない従来のアプローチのものと比較して強化されたハイブリダイゼーション特性を有する本発明の修飾ＤＮＡのため、より安定している。一般に、この複合体の安定性が検出の感度を決める。オリゴヌクレオチドプローブと修飾ＤＮＡとの複合体の安定化は、本明細書において上で論じたような様々な手段で、検出アッセイに恩恵をもたらし得る。
【０１１６】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブに標識を組み込むことができ、この標識が本発明の修飾ＤＮＡの検出の際に利用される。好ましい実施形態において、この標識は、蛍光標識であり、蛍光偏光技術によって修飾ＤＮＡを検出する際に使用される。さらにいっそう好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、ＦＲＥＴプローブである。修飾ＤＮＡの検出におけるＦＲＥＴプローブの適用は、リアルタイムでの検出アッセイの実施、およびサンプル中の標的核酸の量の測定に関する極めて重要な利点をもたらす。増幅反応がＰＣＲであるとき、このタイプのアッセイは、「定量的ＰＣＲ」と呼ばれる。ＦＲＥＴプローブは、一般に２つの発色団を含有する。「受容体」発色団は、「レポーティング」蛍光体の蛍光を消光するために選択される非蛍光染料であり得る（Ｅｆｔｉｎｋ  Ｍ．Ｒ．（１９９１）Ｉｎ  Ｌａｋｏｗｉｃｚ  Ｊ．Ｒ．（ｅｄ．），Ｔｏｐｉｃｓ
ｉｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｖ．２：５３−１２６）。標的核酸とプローブとの配列特異的ハイブリッドの形成は、プローブの蛍光特性の変化をもたらし、それによって核酸標的を検出する。リアルタイムＦＲＥＴベースのアッセイは、特に臨床診断に、よく適している。ここで留意すべき重要な要因は、上で論じているインターカレーティング色素および蛍光剤（例えば、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ）の場合とは異なり、検出が配列特異的であり、事実上、偽陽性結果をなくす。ＦＥＴ効果を活用する多くの検出設計が今日までに報告されている。
【０１１７】
第１のＦＲＥＴ戦略は、ハイブリダイゼーション誘発ＦＲＥＴプローブアプローチであり、これは、標的核酸と蛍光オリゴヌクレオチドプローブとの配列特異的複合体形成の結果としてのドナー色素とアクセプター色素との間の距離変化に基づく。例えば、Ａｄｊａｃｅｎｔ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅ法は、例えば、Ｅｆｔｉｎｋ  Ｍ．Ｒ．（１９９１）Ｉｎ  Ｌａｋｏｗｉｃｚ  Ｊ．Ｒ．（ｅｄ．），Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｖ．２：５３−１２６；Ｈｅｌｌｅｒ  Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  Ｌ．Ｅ．（１９８５）Ｉｎ  Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ，Ｄ．Ｔ．ａｎｄ  Ｆａｌｋｏｗ，Ｓ．（ｅｄｓ．），Ｒａｐｉｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ａｇｅｎｔｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２４５−２５６；Ｃａｒｄｕｌｌｏ  Ｒ．Ａ．ら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：８７９０−８７９４に記載されているように、隣接する標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズする２つのオリゴヌクレオチドプローブを利用する。両方のプローブが標的ＤＮＡにハイブリダイズされたとき、ドナーおよびアクセプター蛍光体が、十分空間的近位になるように、それぞれのプローブの適切なプローブ末端をＦＲＥＴ−ペア色素の一方で標識して、検出可能なＦＲＥＴに備える。
【０１１８】
代替アプローチは、Ｌｉｖａｋ  Ｋ．Ｊ．ら，米国特許第５，７２３，５９１号に記載されているような自己消光性蛍光プローブである。これらのプローブは、同じプローブの両末端にコンジュゲートされた蛍光レポーターおよび消光剤部分を含む。ランダムオリゴヌクレオチドコイリングのため、消光剤部分は、レポーター色素の蛍光を消光するために十分に該色素の近くにある。プローブを相補ポリヌクレオチド標的にハイブリダイズさせると、消光剤部分とレポーター部分とが分離され、このようにしてレポーター色素の蛍光発光を可能にする。自己消光性蛍光プローブアプローチは、ハイブリダイズさせていないプローブにおける甚だ不十分なＦＲＥＴ効果、そしてまたこれが高い傾向バックグラウンドをもたらすため、適用が制限される。バックグラウンドの問題は、柔軟なＰＮＡ骨格を有するオリゴヌクレオチドを合成することによって解決することができる、例えば、Ｏｒｔｉｚ  Ｅ．ら（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，１２：２１９−２２６。
【０１１９】
あるいは、効率的なＦＲＥＴは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ（分子間ステム形成によりＦＲＥＴ色素が極めて近接した状態になるヘアピン形オリゴヌクレオチドプローブ）、例えば、Ｔｙａｇｉ  Ｓ．ａｎｄ  Ｋｒａｍｅｒ  Ｆ．Ｒ．（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：３０３−３０８；Ｂｏｎｎｅｔ  Ｇ．ら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：６１７１−６１７６；Ｔｙａｇｉ  Ｓ．ら（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８：１１９１−１１９６；Ｍａｒｒａｓ  Ｓ．Ａ．Ｅ．ら（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３０：ｅ１２２、を使用して遂行される。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ法は、それらの著しく低い蛍光バックグラウンドのため、本発明を実施する際に好ましい技術である。これらのプローブは、例えば、Ｐｉａｔｅｋ  Ａ．Ｓ．ら（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：３５９−３６３；Ｌｅｗｉｎ  Ｓ．Ｒ．ら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：６０９９−６１０３に記載されているようなリアルタイムＰＣＲにおける使用に十分に適応する。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓは、改善された多型識別能力を有する。
【０１２０】
ＰＣＲプライマーの１つへのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎプローブの共有結合性連結は、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマーのユニークな特性である、例えば、Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ  Ｄ．ら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：８０４−８０７；Ｔｈｅｌｗｅｌｌ  Ｎ．ら（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２８：３７５２−３７６１。「Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ」の場合、ＰＣＲプライマーの５’末端が、長い柔軟なリンカーによってＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎの３’末端にコンジュゲートされる。このリンカーは、ＤＮＡポリメラーゼのテンプレートでなく、従って、そのＢｅａｃｏｎ配列を超える伸長を防ぐ。該Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎのゲノム部分は、該プライマーの標的伸長産物に結合するように設計され、該プローブは、それに共有結合的に連結される。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓとは異なり、ＳｃｏｒｐｉｏｎｓにおけるＤＮＡ検出段階は、分子間反応である。これは、遅いハイブリダイゼーション動態に関連したＢｅａｃｏｎ技術のさらに別の問題を克服するために役立つ。
【０１２１】
Ｅｃｌｉｐｓプローブは、低い蛍光バックグラウンドを有するハイブリダイゼーションベースＦＲＥＴプローブのさらに別の例である（Ａｆｏｎｉｎａ  Ｉ．Ａ．ら（２００２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３２：９４０−９４９）。Ｅｃｌｉｐｓｅプローブ設計は、２つのＦＲＥＴ色素（これらのうちの一方は、非蛍光またはダーク・消光剤である）に加えて、５’末端に副溝結合（ＭＧＢ）部分を含む。Ｋｕｔｙａｖｉｎ  Ｉ．Ｖ．ら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３７１８−３７２３において論じられているようなＭＧＢ−部分の強い、ＤＮＡ−二重鎖安定化効果のため、これらのプローブは、わずか１２−２０−ｍｅｒという短いものであり、しかもなお、リアルタイムＰＣＲ検出に必要なハイブリダイゼーション特性を維持するように、設計することができる。これらのプローブの５’末端におけるＢＧＭ−テールの置換は、５’−ヌクレアーゼ切断を完全に阻止し、ハイブリダイゼーションによって誘発される色素分離のみに起因して蛍光シグナルを生じさせる。この蛍光バックグラウンドは低く、Ｅｃｌｉｐｓｅプローブは、ＳＮＰを容易に識別する。
【０１２２】
ＦＲＥＴ色素を遠ざけることによるＦＲＥＴ破壊のメカニズムには一定の制限がある。例えば、ＦＲＥＴ効果を完全に撤廃することは困難であり、プローブは、少なくとも２０−２４−ｍｅｒである必要がある。短い８−１２ｂｐプローブ−標的二重鎖の場合、「残留」消光が２０−５０％ほどにも達する場合がある（Ｃａｒｄｕｌｌｏ  Ｒ．Ａ．ら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：８７９０−８７９４）。さらに、レポーター色素は、隣接塩基によって、特に、スペクトルのオーバーラップがほとんど無いにもかかわらずグアニンによって、一部、消光される場合がある。この効果は周知であり、ならびにこの効果は、自己消光型蛍光プライマーの名で、またはＬＵＸプライマー（Ｌｉｇｈｔ  Ｕｐｏｎ  ｅＸｔｅｎｓｉｏｎの略語）という名でも知られているＤＮＡ検出技術、例えば、Ｎａｚａｒｅｎｋｏ  Ｉ．ら（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３０：ｅ３７；Ｎａｚａｒｅｎｋｏ  Ｉ．ら（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３０：２０８９−２１９５において使用されている。この技術は、フルオレセイン（ＦＡＭ）のような「緑色」色素で最良に動作する。しかし、ＬＵＸプライマーは、配列特異的ではない。プライマー−二量体をはじめとする、ＬＵＸプライマー伸長のいずれの産物も蛍光シグナルを生じさせるであろう。
【０１２３】
切断可能ＦＲＥＴプローブ。ＦＲＥＴを撤廃するための最良の戦略は、標的核酸へのそれらの結合に基づくオリゴヌクレオチドプローブの切断に基づく。ＴａｑＭａｎ（商標）技術は、リアルタイム核酸検出法として開発されたものであり、サーマス・アクアティカス（Ｔａｑ）ポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を利用する、例えば、Ｌｉｅ  Ｙ．Ｓ．ａｎｄ  Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ  Ｃ．Ｊ．（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，９：４３−４８。２つのＰＣＲプライマー結合部位の間に位置する標的配列にアニールするために、二重標識ＦＲＥＴプローブを設計する。鎖伸長中に、Ｔａｑポリメラーゼは、プライマー部位から下流にハイブリダイズされているプローブを切断して、その消光剤からレポーター色素を放出させ、こうしてＦＲＥＴを永久に、且つ、不可逆的に破壊する、例えば、Ｌｉｖａｋ  Ｋ．Ｊ．ら（１９９５）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，４：３５７−３６２。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブに基づく方法は、本発明の態様を実施するために最も好ましい技術の一部である。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ切断は不可逆的であり、所与のＰＣＲサイクルで生じたシグナルは、その特定のサイクルにおいて生じたシグナルにすべての前のものを加えた合計である。しかし、「古典的」ＴａｑＭａｎ（商標）プローブの高い蛍光バックグラウンドは、この利点を雲らせる。３’末端におけるＭＧＢ部分とのコンジュゲーションは、このパラメータの有意な改善をもたらす（Ｋｕｔｙａｖｉｎ  Ｉ．Ｖ．ら（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２８：６５５−６６１）。比較的短い１２−１８−ｍｅｒ  ＭＧＢ−ＴａｑＭａｎ（商標）プローブは、改善されたＳＮＰ識別特性を有する。しかし、ＴａｑＭａｎ（商標）技術は、尚、密接にＰＣＲ性能に結びついており、これに対してサイクリングプローブ技術（Ｃｙｃｌｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＣＰＴ）は、比較的独立している。
【０１２４】
サイクリングプローブ技術（ＣＰＴ）。サイクリングプローブ技術（ＣＰＴ）も、本発明の方法を実施するために好ましい検出システムである。これらの反応は、配列特異的様式で標的核酸に結合するオリゴヌクレオチドプローブの連続切断に基づく。適切なエンドヌクレアーゼは、その複合体を認識し、プローブを切断するが、標的鎖は無損傷で放置し、それを次の切断ラウンドに再循環させる。ハイブリダイズされたプローブが内部で切断されると、切断産物は、もとのプローブより弱いハイブリッドを形成し、これらのプローブフラグメントが標的鎖から解離し、それを追加の切断反応ラウンドに利用することができる。標的とする再循環は、標的分子につき１つより多くのプローブを切断できることを意味する。ＣＰＴ反応における、ＴａｑＭａｎ（商標）をはじめとする、上で言及したすべての他の技術とは異なり、シグナルは、２つの主変数、標的濃度と時間、の関数である。標的濃度を固定すると、やがて、シグナルは線形的に増大する。反応の進行を反映して、切断は減速し、本質的にすべてのＣＰＴプローブが切断されると、結局、停止する。幾つかのシステム設計が報告されている。第１のアプローチは、Ｆｏｎｇ  Ｗ．ら（２０００）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３８：２５２５−２５２９；Ｍｏｄｒｕｚａｎ  Ｚ．ら（２０００）Ｄｉａｇｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，３７：４５−５０に記載されているような、標的ＤＮＡに結合するとＲＮアーゼＨによって切断されるキメラＤＮＡ−ＲＮＡプローブの使用に基づく。これらのＤＮＡプローブは、オリゴヌクレオチド鎖の中央に少なくとも４−５のリボヌクレオチドを有するように設計される。ＲＮアーゼＨは、ハイブリダイズされたプローブのＲＮＡ部分のみを切断し、標的ポリヌクレオチドは、別の未切断プローブ分子にハイブリダイズさせるために再循環される。適切な条件下、これは、プローブ切断反応のサイクリングをもたらす。ＲＮアーゼＨの熱安定性類似体の最近の発見および単離は、例えば、Ｈａｒｖｅｙ  Ｊ．Ｊ．ら（２００４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３３３：２４６−２５５において立証されているように、このＤＮＡ検出技術とＰＣＲとの併用を可能にした。それぞれのＦＲＥＴプローブは、タカラバイオ株式会社（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）から入手することができる。
【０１２５】
第２のＣＰＴアプローチは、大腸菌からのエンドヌクレアーゼＩＶ（ＤＮＡにおける脱塩基部位および他の関連損傷の修復を開始させるＡＰエンドヌクレアーゼ）の基質特異性に基づく。ＦＲＥＴプローブおよびエンハンサーは、部分的に分解された脱塩基部位を擬態する前記ＡＰエンドヌクレアーゼの基質を、共同して形成する。該酵素は、この人工基質を認識し、プローブの３’末端を「クリップ」し、それによって、レポーター色素を放出させ、ＦＲＥＴを破壊する。Ｋｕｔｙａｖｉｎ  Ｉ．Ｖ．ら（２００４）米国特許出願第２００４０１０１８９３号に記載されているように、この反応は、ナノモルの標的ＤＮＡ濃度でまたはナノモル以下の標的ＤＮＡ濃度でさえ高い切断プローブ収率を達成するサイクリングモードで、行うことができる。
【０１２６】
第３の、およびおそらく市場で最先端のサイクリングプローブ技術は、ＩＮＶＡＤＥＲ（商標）検出アッセイである。これは、一定のポリメラーゼのフラップまたは５’−エンドヌクレアーゼ活性を利用して、２つの部分的にオーバーラップするオリゴヌクレオチドを標的ＤＮＡへのそれらの結合に基づいて切断する。ＩＮＶＡＤＥＲ（商標）アッセイは、一般に、２つの連続したサイクリング切断反応から成る。切断反応をもたらすために使用される酵素は、ＣＬＥＡＶＡＳＥ（合成能力が実質的に低減されたまたは完全に削除されたＤＮＡポリメラーゼ）である、例えば、Ｄａｈｌｂｅｒｇ  Ｊ．Ｅ．ら（１９９７）米国特許第５，６９１，１４２号；Ｄａｈｌｂｅｒｇ  Ｊ．Ｅ．ら（１９９８）米国特許第５，８３７，４５０号；Ｂｒｏｗ  Ｍ．Ａ．Ｄ．ら（１９９８）米国特許第５，８４６，７１７号；Ｐｒｕｄｅｎｔ  Ｊ．Ｒ．ら（１９９９）米国特許第５，９８５，５５７号；Ｈａｌｌ  Ｊ．Ｇ．ら（１９９９）米国特許第５，９９４，０６９号；Ｂｒｏｗ  Ｍ．Ａ．Ｄ．ら（１９９９）米国特許第６，００１，５６７号；Ｐｒｕｄｅｎｔ  Ｊ．Ｒ．ら（２０００）米国特許第６，０９０，５４３号；Ｐｒｕｄｅｎｔ  Ｊ．Ｒ．ら（２００２）米国特許第６，３４８，３１４号；Ｐｒｕｄｅｎｔ  Ｊ．Ｒ．ら（２００５）米国特許第６，８７５，５７２号；Ａｉｚｅｎｓｔｅｉｎ  Ｂ．Ｄ．ら（２００５）米国特許第６，９１３，８８１号；Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ  Ｂ．ａｎｄ  Ｋｉｎｇｓｍｏｒｅ  Ｓ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１２：２１−２７。この検出システムは、事前の標的ＤＮＡ増幅を一切必要としない場合もある、非常に効率的なシグナル増幅アッセイである。しかし、事前の核酸増幅は、ＩＮＶＡＤＥＲアッセイを適用する際に好ましいアプローチである。主たる関心事は、時間とともに線形的に増加するバックグラウンド蛍光である。これは、カセットプローブの非特異的切断によって生成される。さらに、このアッセイは、増幅を適用しないとき、相当な標的ＤＮＡ負荷量を必要とする、例えば、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ  Ｂ．ａｎｄ  Ｋｉｎｇｓｍｏｒｅ  Ｓ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１２：２１−２７。核酸増幅技術とＣＰＴとの併用は、Ｓｏｒｇｅ  Ｊ．Ａ．（２００１）米国特許第６，５８９，７４３号に二次構造を有するオリゴヌクレオチドプローブについて記載されているように、重要な利点をもたらす。
【０１２７】
引用し、上で説明した核酸検出技術は、本技術分野における技術革新および方法の例示的画分である。オリゴヌクレオチドプローブ、特にＦＲＥＴプローブの使用に基づく多数の他の技術が存在する。オリゴヌクレオチドプローブの標的核酸によるハイブリダイゼーションに基づく技術のすべてが、本発明の使用の恩恵に浴するであろう。オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ設計のための規則、反応混合物の好ましい組成、反応条件、アッセイの特徴ならびにその適用範囲および制限、ならびに検出反応を行うための他の重要な情報を含む、特定の検出反応の実施に関する詳細なガイダンスは、上で引用した原稿および特許（これらは、本明細書に参照により組み込まれる）において見出すことができる。
【０１２８】
ＩＩＩ．検出アッセイ成分
ＤＮＡポリメラーゼ。ＤＮＡポリメラーゼは、本発明の核酸アッセイの実施における重要な成分である。本発明に従って有用なＤＮＡポリメラーゼは、天然ポリメラーゼ、ならびに５’から３’のおよび／または３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼ突然変異体の両方を含む。核酸ポリメラーゼは、異なる熱安定性度を有し得る。ＤＮＡポリメラーゼの選択は、本発明において適用される増幅および検出反応の選択に通常は関係する、多数の要因によって決定される。一定の実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーを伸長することができる温度で鎖置換活性を示す。ＤＮＡ増幅が、ＤＮＡ鎖の１本の置換に基づく等温増幅の多くの場合において、例えば、ＳＤＡおよびローリングサイクル型増幅において、好ましくは、ＤＡＮポリメラーゼは、５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性を欠く。本発明のＤＮＡポリメラーゼは、バクテリオファージ、古菌、真性細菌および真核生物の酵素をはじめとする様々な天然源から単離することができる。
【０１２９】
５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性の両方を欠く市販の酵素としては、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（ｅｘｏ−Ｔ７；ＵＳＢ）、Ｐｆｕ  ｅｘｏ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、ｅｘｏ−ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、ｅｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｂｓｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、Ｉｓｏｔｈｅｒｍ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、Ｓｔｏｆｆｅｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ），ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（ＵＳＢ）、およびＴａｑＦＳ（Ｈｏｆｆｉｎａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）が挙げられる。検出ＰＣＲアッセイに有用である熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの例としては、Ｐｆｕ、Ｔａｑ、Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔおよびＵｌＴｍａ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ、ならびにサーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）種またはサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）からの他のポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。検出ＰＣＲのための熱安定性ポリメラーゼは、好ましくは、温度＞９０℃、より好ましくは、＞１００℃で活性を維持する。一定の検出反応、例えばＴａｑＭａｎアッセイ、は、５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性を発現するＤＮＡポリメラーゼの使用を必要とする。本明細書において提供する実施例では、ＳｉｇｍａからのＪｕｍｐＳｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した。
【０１３０】
塩基修飾二重鎖安定化デオキシヌクレオシド５’−三リン酸（ｄＮＴＰ）。本発明の強化されたハイブリダイゼーション特性を有する修飾ＤＮＡは、少なくとも１つの、および好ましくは１つより多くの塩基修飾二重鎖安定化デオキシヌクレオシド５’−三リン酸を含むｄＮＴの混合物中、ＤＮＡポリメラーゼの存在下でのテンプレート依存性オリゴヌクレオチドプライマー伸長反応において増幅される。本発明を実施する際に有用なｄＮＴＰ類似体の例としては、図３に示すものが挙げられるが、それらに限定されない。本発明の増幅反応は、一般に、４つすべてのｄＮＴＰ（ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰまたはｄＡＴＰ）を含み、この場合、これらの天然ｄＮＴＰのうちの１つ以上が、それぞれの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰで部分的にまたは完全に置換される。本発明の塩基修飾二重鎖安定化デオキシヌクレオシドは、ヌクレオチド塩基が修飾されている２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有する。これらのヌクレオシド類似体は、例えば、Ｔｏｗｎｓｅｎｄ  Ｌ．Ｂ．，ｄｅ．（１９８８）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹに例示されている周知の有機化学技術を適用することによって、合成することができる。それぞれの５’−三リン酸は、例えば、Ｖａｇｈｅｆｉ  Ｍ．，ｅｄ．（２００５）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ａｎａｌｏｇｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓに記載されているプロトコルを用いて、得ることができる。図３に示すものの多くを含む、本発明の塩基修飾二重鎖安定化デオキシヌクレオシドは、市場の供給業者、例えば、Ｔｒｉｌｉｎｋ（米国、カリフォルニア州）から入手することができる。
【０１３１】
一定の増幅スキームにより必要とされる場合には、本発明の反応混合物に、塩基が修飾されたものおよび二重鎖を安定させるもの以外のｄＮＴＰ類似体も組み込むことができる。例えば、Ｗａｌｋｅｒ  Ｇ．Ｔ．ら（１９９３）米国特許第５，２７０，１８４号に記載されているＳＤＡ増幅は、２本鎖ＤＮＡの一方の鎖のニッキングを促進するためにα−チオｄＮＴＰ類似体の使用を必要とする。さらに別の例は、デオキシウリジン５’−三リン酸（ｄＵＵＰ）である。この塩基修飾物がＤＮＡ二重鎖を不安定にすることは公知であるが、それでもなお、こうした修飾ＤＮＡの使用は本発明の範囲内である。ｄＵＴＰ適用の主目的は、Ｄｅｌｆａｎｄ  Ｄ．Ｈ．ら（１９９５）米国特許第５，４１８，１４９号（これは、本明細書に参照により組み込まれる）に記載されているように、サンプルからサンプルへの汚染繰り越しの防止にある。
【０１３２】
ＤＮＡ増幅反応の選択に依存して、本発明の反応成分は変わり得る。主成分に加えて、本発明の反応混合物は、検出剤、特殊酵素（例えば、逆転写酵素、ヌクレアーゼ、ＦＥＮエンドヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、ＲＮアーゼ（ＲＮアーゼＨを含む）、ＲＮＡポリメラーゼ、ヘリカーゼなど）、反応中にｐＨを選択されたレベルで維持するための緩衝剤、塩、補因子および誘導体、例えば、１−メチル−２−ピロリジノン、グリセロール、ポリ（エチレングリコール）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはホルムアルデヒドなどを含む場合がある（しかし、これらに限定されない）。
【０１３３】
オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ。オリゴヌクレオチドプライマーは、本発明のすべての増幅反応において修飾ＤＮＡの合成および増幅を開始させる。前記オリゴヌクレオチドプライマーは、精製された制限消化物の場合のように自然に発生する場合もあり、または合成生産されることもある。ＤＮＡポリメラーゼの存在下でプライマー伸長が発生するには、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーが、テンプレート鎖とハイブリダイズために十分に相補的である必要がある。オリゴヌクレオチドプライマーの配列は、それらがハイブリダイズするように設計される標的核酸の正確な配列を反映する必要はない。例えば、プライマーの５’末端に非相補的ヌクレオチドフラグメントが付いており、そのプライマー配列の残部が、その鎖に対して実質的に相補的である場合もある。プライマー配列とテンプレートの配列とがハイブリダイズするために十分な相補性を有し、その結果、そのオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物の合成のためのテンプレート−プライマー複合体を形成することを条件として、非相補的塩基またはより長い配列をプライマー内に散在させてもよい。このプライマー設計は、特定の増幅反応によって誘導される。例えば、ＳＤＡ増幅のために設計されるプライマーには、増幅反応を支援する制限エンドヌクレアーゼの配列が組み込まれる、例えば、Ｗａｌｋｅｒ  Ｇ．Ｔ．ら，米国特許第５，２７０，１８４号；Ｄａｔｔａｇｕｐｔａ  Ｎ．ら，米国特許第６，２１４，５８７号；Ｗａｌｋｅｒ  Ｇ．Ｔ．ら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２４：３８４−３５３；Ｗａｌｋｅｒ  Ｇ．Ｔ．ら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：３９２-３９６；Ｓｐａｒｇｏ  Ｃ．Ａ．ら（１９９６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，１０：２４７−２５６。
【０１３４】
本発明に有用な合成オリゴヌクレオチドプライマーは、構造修飾物、例えば、原子、部分、残基、ポリマー、リンカーを含有する場合があり、これらは、通常は合成の類いであり、天然核酸中には一般に存在しない。合成オリゴヌクレオチドプライマーには、検出可能ラベル、例えば、同位体、放射性標識、例えば３２Ｐ、結合部分、例えばビオチン、ハプテン、例えばジオキシゲニン、発光性、質量タグ、リン光または蛍光部分、蛍光色素などを組み込むことができる。プライマーは、通常、ＤＮＡ増幅中に組み込まれるので、その標識を使用して本発明の修飾ＤＮＡを検出することができる。オリゴヌクレオチドプライマーには、イノシン（ヒポキサンチン）、５−ブロモウラシル、５−メチルシトシン、５−ヨードウラシル、２−アミノアデノシン、６−メチルアデノシン、シュードウリジンなどをはじめとする（しかし、これらに限定されない）、天然核酸中にはめったに存在しないヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体も組み込むことができる。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーには、二重鎖安定化効果をもたらす構造修飾物が組み込まれる。しかし、本発明のすべての態様において、プライマーの３’末端は、ＤＮＡ合成を開始させるためにブロックされていてはならない。オリゴヌクレオチドプライマーの設計の際に使用することができる好ましい構造修飾物の例としては、通常は５’末端にカップリングされる副溝バインダー（ＭＧＢ）（Ａｆｏｎｉａ  Ｉ．ら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：２６５７−２６６０）および一定のヌクレオチド類似体が挙げられる（しかし、これらに限定されない）が、これらの修飾物の数は、限定され得る。ヌクレオチド類似体の例としては、「ユニバーサル」塩基（Ｂｕｒｇｎｅｒ  Ｄ．ら（２００４）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，２３：７５５−７６５）および「ロックされた核酸」（「ＬＮＡ」）（Ｌａｔｏｒｒａ  Ｄ．ら（２００３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，１７：２５３−２５９；Ｌａｔｏｒｒａ  Ｄ．ら（２００３）Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．，２２：７９−８５；Ｄｉ  Ｇｉｕｓｔｏ  Ｄ．Ａ．ａｎｄ  Ｋｉｎｇ  Ｇ．Ｃ．（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３２：ｅ３２）が挙げられる。多数の塩基修飾ヌクレオチド類似体は、ＤＮＡポリメラーゼによって十分許容され、これらの類似体は、プライマー設計において使用することができる。そうした塩基修飾ヌクレオチド類似体の例としては、５−メチルシトシンおよび２，６−ジアミノプリン（Ｌｅｂｅｄｅｖ  Ｙ．ら（１９９６）Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．，１３：１５−２１）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３５】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーを標識することができ、標識された修飾ＤＮＡを増幅するためにそれらを使用することができる。この標識は、核酸検出段階において使用される。好ましい標識は、蛍光標識である。１つの態様において、オリゴヌクレオチドプライマーは、オリゴヌクレオチドプローブ、例えば、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマー（Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ  Ｄ．ら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：８０４−８０７；Ｔｈｅｌｗｅｌｌ  Ｎ．ら（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２８：３７５２−２７６１）とカップリングさせることができる。
【０１３６】
プローブ。本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、本発明の増幅の産物（修飾ＤＮＡ）と、プローブ内の少なくとも１つの配列と修飾ＤＮＡ内のそれぞれの配列との相補性のため、二重鎖構造または他の複合体を形成することができるオリゴマーまたはポリマーである。本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、修飾されるまたは構造修飾物を含有することがある。一般に、本オリゴヌクレオチドプローブ中には一定の修飾物が存在し、それらは、通常、本発明の修飾ＤＮＡの検出の際に使用される標識に関係する。蛍光標識オリゴヌクレオチドおよび特に、ＦＲＥＴプローブは、本発明の好ましい検出成分である。オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーが本発明の修飾ＤＮＡにハイブリダイズすると、それらは、安定化相補複合体を形成する。なぜなら、本発明の修飾ＤＮＡは、ＤＮＡを二重鎖安定化塩基類似体で修飾しない従来のアプローチのものと比較して強化されたハイブリダイゼーション特性を発現するからである。オリゴヌクレオチドプライマーとは異なり、オリゴヌクレオチドプローブには、構造修飾物の使用に関する制限がほとんどない。これは、ハイブリダイゼーション誘発ＦＲＥＴプローブ技術には特にあてはまる。例えば、本明細書において用いる場合のオリゴヌクレオチドプローブは、完全に非天然ＰＮＡモノマーで作られていてもよい、例えば、Ｏｒｔｉｚ  Ｅ．ら（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，１２：２１９−２２６。ＬＮＡなどのプローブ設計における他の塩基修飾または糖修飾ヌクレオチド類似体の使用も幅広く応用できる（Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｍ．Ｐ．ら（２００４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３２：ｅ５５；Ｓｉｍｅｏｎｏｖ  Ａ．ａｎｄ  Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ  Ｔ．Ｔ．（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３０：ｅ９１））。オリゴヌクレオチドプローブは、いずれかの末端にコンジュゲートされたＭＧＢ部分を有することができる。例えば、５’−ＭＧＢコンジュゲート型ＦＲＥＴプローブは、検出ＰＣＲにおいて切断されず、これらのプローブは、Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ  Ｎ．ら（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ，２５：２６８−２７５に記載されているようなハイブリダイゼーションによって誘発される作用メカニズムにより、シグナルをもたらす。３’−ＭＧＢコンジュゲート型ＦＲＥＴプローブは、５’−ヌクレアーゼ分解からブロックされず、これらのプローブは、Ｋｕｔｙａｖｉｎ  Ｉ．Ｖ．ら（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｅｓ  Ｒｅｓ．，２８：６５５−６６１に例示されているように、Ｔａｑポリメラーゼによる切断により蛍光シグナルを生じさせる。これらの場合において、プローブ切断アプローチを用いるとき、構造修飾物の、特に切断部位の配列内での、使用には制限がかかることがある。
【０１３７】
オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、当該技術分野において周知である技術を用いて合成することができる。プライマーは、例えば、適切な配列のクローニングおよび制限消化分析によって作製できるが、好ましいアプローチは、直接化学合成である。オリゴヌクレオチドは、例えば、Ｂｒｏｗｎ  Ｅ．Ｌ．ら（１９７９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６８：１０９−１５１に開示されているホスホジエステル法、Ｎａｒａｎｇ  Ｓ．Ａ．ら（１９７９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６８：９０−９８に記載されているホスホトリエステル法をはじめとする、適する化学合成法によって作製することができる。好ましいアプローチは、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  Ｍ．Ｈ．，Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ  Ｍ．Ｄ．（１９８４）米国特許第４，４５８，０６６号に開示されており、市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置の１つを使用して行われる、固体支持体法と併用での、Ｂｅａｕｃａｇｅ  Ｓ．Ｌ．，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  Ｍ．Ｈ．（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９−１８６２に開示されているジエチルホスホラミデート法である。
【０１３８】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブに蛍光色素で標識する必要があるとき、広範な蛍光体をプローブおよびプライマー設計および合成に適用することができる。利用可能な蛍光体としては、クマリン、フルオロセイン（ＦＡＭ、通常、６−フルオロセインまたは６−ＦＡＭ）、テトラクロロフルオロセイン（ＴＥＴ）、ヘキサクロロフルオロセイン（ＨＥＸ）、ローダミン、テトラメチルローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄおよびＲＯＸが挙げられるが、これらに限定されない。蛍光体は、可視スペクトル内または可視スペクトル外、例えば紫外もしくは赤外範囲で吸収および放射するように選択することができる。本発明のＦＲＥＴプローブには、一般に、一対の蛍光体が組み込まれ、これらのうちの一方は、非蛍光発色団（一般に、「ダーク消光剤」と呼ばれる）であり得る。当該技術分野において説明されている、適するダーク消光剤としては、特に、Ｄａｂｃｙｌおよびその誘導体、例えばメチルレッドが挙げられる。市販の非蛍光消光剤、例えば、Ｅｃｌｉｐｓｅ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）およびＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）も、本発明のＦＲＥＴプローブの合成に利用することができる。好ましい消光剤は、ダーク消光剤、またはアッセイの選択された検出範囲内で蛍光を発しない蛍光体のいずれかである。
【０１３９】
本発明の標識オリゴヌクレオチド成分を製造するためのドナーおよびアクセプター蛍光体は、適する蛍光基、例えば、６−ＦＡＭ（６−カルボキシフルオロセイン）；６−ヘキサクロロ−フルオロセイン（［４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロ−（３’，６’−ジピバロイルフルオロセイニル）−５−カルボン酸］）；６−テトラクロロ−フルオロセイン（［４，７，２’，７’−テトラクロロ−（３’，６’−ジピバロイルフルオロセイニル）−６−カルボン酸］）；６−ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン；Ｄａｂｃｙｌ（４−（（４−ジメチルアミノ）フェニル）アゾ）安息香酸）；Ｃｙ５（インドジカルボシアニン−５）；Ｃｙ３（インド−ジカルボシアニン−３）；などから選択することができる。
【０１４０】
本発明を実施するためのオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、上で論じたおよび引用した技術をはじめとする、当該技術分野において公知の特定の増幅または検出に関する規則および規定に従って設計される。オリゴヌクレオチド成分には一定の一般的必要条件があり、例えば、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性は、融解温度（Ｔｍ）と通常は呼ばれる特定の反応の温度に対処する必要がある。Ｔｍは、オリゴヌクレオチド成分と標的核酸との相補複合体が、１本鎖に半解離した状態になる温度と定義する。Ｔｍ値の簡単な推定値は、核酸が１Ｍ  ＮａＣｌの水溶液中に存在する場合、方程式Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）を用いて計算することができる。さらに正確な計算は、「最近隣」アプローチの塩基対熱力学（Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ  Ｋ．Ｊ．ら（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：３７４６−３７５０；ＳａｎｔａＬｕｃｉａ  Ｊ．Ｊｒ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：１４６０−１４６５）を用いて行うことができる。Ｏｌｉｇｏ（商標）、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎ、およびインターネットで入手できるプログラム（Ｐｒｉｍｅｒ３およびＯｌｉｇｏ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒを含む）をはじめとする市販のプログラムも、本発明による有用な核酸配列のＴｍを計算するために用いることができる。市販のプログラム、例えば、Ｖｉｓｕａｌ  ＯＭＰ（ＤＮＡ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）、Ｂｅａｃｏｎ  ｄｅｓｉｇｎｅｒ  ７．００（Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｂｉｏｓｏｆｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、は、ＰＣＲベースの増幅反応およびＮＡＳＢＡ増幅反応のためのＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ、ＴａｑＭａｎおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ検出システムでのリアルタイムアッセイの設計に有用である。一般に、オリゴヌクレオチドプローブのＴｍ値は、対応する増幅プライマーのＴｍより５−７℃高い。
【０１４１】
最近隣熱力学パラメータは、天然塩基についてしか決定されていない（Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ  Ｋ．Ｊ．ら（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：３７４６−３７５０参照）。修飾核酸類似体についての類似の値を入手することができず、このため、本発明の塩基修飾オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブについてのＴｍ値を正確に予測することはできない。しかし、１つのデオキシアデノシンのｄ（２−ａｍＡ）（２，６−ジアミノプリン）による置換および１つのチミジンの５−プロピニルウリジンによる置換が、ランダムに取った２０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドのＴｍ値を０．８−１℃上昇させるという条件で、推定を行うことができる。これらの修飾ヌクレオチドを修飾ＤＮＡ鎖に組み込むとき、同じ推定を用いることができるが、これは、二次構造を形成する際の長いポリヌクレオチドの増加傾向（「コイリング」効果）のため、いっそう精度が低くなる場合がある。ＭＧＢコンジュゲート型オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブのＴｍ値は、Ｋｕｔｙａｖｉｎ  Ｉ．Ｖ．ら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３７１８−３７２３のガイダンスに従ってアッセイすることができる。３’−ＭＧＢ  ＴａｑＭａｎプローブの融解温度は、製造業者（米国、カリフォルニア州のＡＢＩ）によって提供されている市販のソフトウェアを使用して、予測することができる。
【０１４２】
ＩＶ．本発明の検出アッセイの実施：
増幅および検出のための核酸の作製。本発明の特定の態様は、試験サンプル中の標的核酸の検出方法に関する。サンプルは、検出すべき核酸以外の、通常は生物学的性質の、材料を含有する、細胞、組織、流体、血漿、血清、尿、涙、便、唾液、異なる器官のフラグメント、組織、血球などであり得る。増幅および検出段階を行う前に、対象となる核酸を、一般に、サンプルから精製および単離する必要がある。好ましくは、標的核酸には、増幅および検出反応に干渉するタンパク質および任意の他の物質が十分にない。標的核酸の単離および精製には、市販のキットおよび専門機器を含む多数の方法を利用することができる。例えば、核酸は、フェノール／クロロホルム有機試薬での有機抽出、それに続くエタノール沈殿、固相吸着法、および塩誘導ＤＮＡ沈殿法を用いて、単離することができる。核酸単離技術を行う際のガイダンスは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら，ｅｄｓ．（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｉ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｗａｌｓｈら（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１０：５０６−５１３；Ｂｏｏｍら、米国特許第５，２３４，８０９号；Ｍｉｌｌｅｒら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６：１２１５において見出すことができる。一般に、異なる源から単離される対象となる核酸の量を制限して、直接検出を可能にする。従って、適する増幅手順を用いてそれらの標的核酸を増幅する必要がある。
【０１４３】
修飾ＤＮＡの増幅および検出。対象となる精製された核酸は、本明細書において引用し、論じるものをはじめとする増幅および検出技術の併用によって増幅および検出することができるが、但し、選択される任意の増幅に必要なすべての試薬に加えて、その増幅反応が、本発明の修飾ＤＮＡの多数のコピーを生じさせるために少なくとも１つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰを含むことを条件とする。１つの実施形態において、標的核酸の検出は、増幅後に行われる。一定の態様では、これらの２段階を「時間および空間」で完全に切り離して、検出反応の成分が、増幅中の反応混合物中に存在しないようにすることができる。これは、検出反応が別々の反応容器またはチューブで行われる場合を含む。そうした場合、増幅反応からの修飾ＤＮＡ（全量または小部分）を、検出反応を行う反応容器に移してもよい。あるいは、増幅が完了した後、検出成分をその反応容器に添加してもよい。修飾ＤＮＡは、検出反応に加える前に、例えばアルコール沈殿法または市販のキットを使用して、増幅成分から完全にまたは部分的に精製することができる。別の実施形態において、検出反応の成分のすべてまたは一部が増幅反応中に存在するが、例えば検出段階を支援しない反応温度のため、検出は進行しない。核酸増幅が本質的に完了すると、その反応温度の変化によって検出反応が誘発される。この反応分離戦略は、本明細書において論じている、および参照するものを含む（しかし、これらに限定されない）増幅および検出反応の大部分を１つの核酸検出アッセイの中で併用できるようにする。リアルタイム実行用に設計されるＴａｑＭａｎ（商標）のような検出反応は、例外であり得る。しかし、この戦略は、定量的核酸測定を面倒にする。本発明を実施するために好ましい核酸検出アッ
セイは、リアルタイム検出アッセイである。
【０１４４】
リアルタイムアッセイにおける増幅および検出反応のコンパイルには一定の考慮事項があることは、通常の当業者には理解されるであろう。一般に、ＳＤＡおよびローリングサークルなどの鎖置換に基づく増幅システムは、ＴａｑＭａｎおよびＩｎｖａｄｅｒ技術などのエキソヌクレアーゼ活性の利用を必要とする検出反応にはほとんど適合しないだろう。リアルタイムアッセイは、臭化エチジウムまたはＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉのような検出剤を使用して行うことができる。しかし、このアプローチは、対象となる多数の核酸の検出（多重アッセイ）の可能性をなくし、その検出反応は、配列特異的でなく、従って、対象となる産物と誤増幅の産物、例えばプライマー−二量体、とを区別できない。配列特異的検出成分（一般にはＦＲＥＴプローブ）が増幅反応に干渉しない例が報告されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｚｉｐｐｅｒと呼ばれる蛍光プローブが、ローリングサークル型増幅と有効に併用され（Ｙｉ  Ｊ．ら（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．，３４：ｅ８１ｅ）、ならびに幾つかの検出技術がＮＡＳＢＡ増幅と併用された（Ｎｉｅｓｔｅｒｓ  Ｈ．Ｇ．（２００１）Ｍｅｔｈｏｄｓ，２５：４１９−４２９）。ＰＣＲは、非常に互換性のある反応であり、多くのリアルタイムアッセイは、今日まで、この増幅システムに基づいて開発されおり、例えば、これは、本明細書において引用する非常に多数の特許および原稿に反映されている。本明細書において提供する実施例も、ＦＲＥＴプローブ検出反応、ＴａｑＭａｎおよびＳｃｏｒｐｉｏｎ技術を利用するリアルタイム検出ＰＣＲを例証する。
【０１４５】
好ましい実施形態では、同じ反応混合物中の１つより多くの標的核酸を増幅および検出する（多重アッセイ）。好ましくは、多数の核酸の検出をリアルタイムで行う。これは、オリゴヌクレオチドプローブなどの検出成分を、独立して検出することができる異なる部分で標識するとき達成される。ＦＲＥＴプローブを用いるとき、これは、スペクトルの異なる部分で光を放射するレポーティング蛍光体の選択によって達成される。
【実施例】
【０１４６】
Ｖ．実施例：
通常の当業者は、本発明に従って修飾ＤＮＡを増幅および検出する際に本発明が塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰを使用することに驚かされることだろう。核酸検出アッセイの必要条件、特に、検出ＰＣＲの難しい時間および温度制約を満たすには、修飾ｄＮＴＰの基質特性は、天然ｄＮＴＰのものと厳密に一致する必要がある。ｄＮＴＰの構造変化には、通常、ＤＮＡポリメラーゼとの相互作用に関するそれらの基質特性の負の変化が付随することは、当該技術分野において十分に確立されている（本明細書における「背景技術」参照）。例えば、修飾ｄＮＴＰをあまり効率的に組み込むことができず、これは、核酸検出アッセイに許容されない程に増幅を遅速させる場合がある。さらに、ＤＮＡポリメラーゼは、特にＰＣＲにおいて、２つの互いに異なる機会：（ｉ）成長ＤＮＡ鎖に修飾ｄＮＴＰを組み込むとき、および（ｉｉ）前のサイクルにおいて生産された塩基修飾テンプレートを使用してＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｅｅｋ相補物を組み込むとき；に修飾塩基に直面する。Ｓａｗａｉ  Ｈ．ら（２００２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，１３：３０９−３１６によって行われた研究によると、これら２つの機会における塩基修飾に対するＤＮＡポリメラーゼの応答は異なることがある。修飾ＤＮＡ内の二次構造要素の優先的安定化が、この件についてのさらに別の理由である。本発明の実施例において標的核酸として使用した９６−ｍｅｒ標的オリゴデオキシリボヌクレオチドを含めて、事実上、いずれの、ランダムに取ったポリヌクレオチドも、そのポリヌクレオチド内の１つの配列とその同じポリヌクレオチドのさらに別の配列との「偶発的」相補性のため、二次構造の要素、例えば、バルジループ、内部ループ、ヘアピン、Ｙ構造、非相同ループなどを構成する。本発明の修飾ＤＮＡでは、オリゴヌクレオチド成分（プライマーまたはプローブ）と（オリゴヌクレオチドが修飾されない場合の）１本の鎖しか修飾されない修飾ＤＮＡとで形成された複合体とは対照的に、二重鎖の両方の鎖に二重鎖安定化修飾物が組み込まれる。原核生物、ファージおよび真核生物からの幾つかのタイプのＤＮＡポリメラーゼの進歩は、二次構造にフォールディングすると予測された、一定のＤＮＡ配列では妨げられる（例えば、ＬａＤｕｃａ  Ｒ．Ｊ．ら（１９８３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２２：５１７７−５１８８；Ｂｅｄｉｎｇｅｒ  Ｐら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１６８８０−１６８８６；Ｂｉｅｒｎｅ  Ｈ．ａｎｄ  Ｍｉｃｈｅｌ  Ｂ．（１９９４）  Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３：１７−２３）。核酸における二次構造の安定化は、ＲＮＡ検出の際に観察される一定の二重鎖安定化塩基修飾のマイナスの結果の原因であった（Ｎｇｕｙｅｎ  Ａ．ら（２００２）ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２：１４；Ｈａｃｉａ  Ｊ．Ｇ．ら（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２６：４９７５−４９８２。このように、当該技術分野において認識されている増幅および検出反応の複雑さのため、核酸検出アッセイに対する、特に、検出ＰＣＲに対するいずれの修飾ｄＮＴＰまたはそれらの組み合わせの効果も、本発明まで予測できなかったことは、当業者には理解されるであろう。
【０１４７】
しかし、驚くべきことに、本発明の塩基修飾ｄＮＴＰは、検出ＰＣＲにおいて非常によく動作した。（本明細書中で詳細に論じている）図５、６および１０に示す実験は、これらの実施例において使用した塩基修飾ｄＮＴＰが、検出ＰＣＲアッセイに対する損害を一切伴わずに、それらのそれぞれの天然ヌクレオシド５’−三リン酸を完全に置換することができることを証明している。天然ｄＮＴＰのうちの１つをｄ（２−ａｍＡ）ＴＰ、ｄ（５−ＭｅＣ）、ｄ（５−ＢｒＵ）ＴＰまたはｄ（５−ＰｒＵ）ＴＰで置換した検出アッセイは、本質的に、同じ蛍光シグナルおよび同一のＣｔ値を示した。閾値点（Ｃｔ）の安定性は、特に重要である。増幅プロセスに対する塩基修飾ｄＮＴＰの一切のマイナス効果がＰＣＲ収率の低下につながることとなり、例えば、これは、その閾値の増加に反映されるであろう。この効果の一例は、図７Ｂにおいて見出すことができる。
【０１４８】
試験したすべての塩基修飾ｄＮＴＰは、それぞれのｄＮＴＰ置換が、アッセイ性能の喪失を一切伴うことなくＰＣＲ温度の上昇を可能にしたので、強化されたハイブリダイゼーション特性を有する修飾ＤＮＡアプリコンを生じさせた。（本明細書中で詳細に論じている）図９および１１は、システム安定化効果のよりよい代表を提供する、（本明細書中で詳細に論じている）図５、６および１０において行った実験の概要を示す。この効果のスケールは、それらのｄＮＴＰ類似体の間および中で異なり、次の順序に従って増大する：ｄ（５−ＢｒＵ）ＴＰ＝ｄ（５−ＰｒＵ）ＴＰ＜ｄ（５−ＭｅＣ）ＴＰ＜ｄ（２−ａｍＡ）ＴＰ＜ｄ（５−ＰｒＵ）ＴＰ＋ｄ（２−ａｍＡ）ＴＰ。しかし、この順序は、本質的に個々の塩基修飾ｄＮＴＰの熱力学的寄与の間の絶対的な傾向または比を必ずしも反映しているとは限らず、そのアッセイにおいて使用したオリゴヌクレオチドの特定の塩基組成に依存して変わることがある。本発明の方法は、研究した検出反応、切断可能なＦＲＥＴプローブ（ＴａｑＭａｎ、図５、６および９）とハイブリダイゼーション誘発ＦＲＥＴプローブ（Ｓｃｏｒｐｉｏｎ、図１０および１１）との両方に恩恵をもたらす。
【０１４９】
図５におけるアッセイの実施例は、本発明が、二重鎖安定化のために開発された他の従来の技術と、特に、Ｌｅｂｅｄｅｖ  Ｙ．ら（１９９６）Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．，１３
１５−２１およびＰｒｏｓｎｙａｋ  Ｍ．Ｉ．ら（１９９４）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２１：４９０−４９４に記載されている修飾プライマーおよびプローブと、有効に併用できることを示している。塩基性修飾物を標的ＤＮＡに組み込もうと（図５Ｂ）、またはプライマーおよびプローブ構造に組み込もうと（図５Ｃ）、同様のシステム安定化が観察した。両方のアプローチの併用（図５Ｄ）は、安定なシステム動作が７５℃ほども高い温度で観察された、未だかつてない累積効果をもたらした；非常に有意な功績。ここで使用したＪｕｍｇＳｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ）は、天然Ｔａｑポリメラーゼの抗体ブロックバージョンである。このポリメラーゼは熱安定性であり、ＰＣＲ変性段階の高温に耐えて最大活性を発現し、約７５℃で毎秒６０を超えるヌクレオチドを組み込む（Ｔａｋａｇｉ  Ｍ．ら（１９９７）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，６３：４５０４-４５１０；Ｉｎｎｉｓ  Ｍ．Ａ．ら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：９４３６−９４４０）。いずれの特定の理論による拘束も受けないが、７０℃を超えるＰＣＲ温度を用いるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション特性に関して予想された急速な低下は、その最適な動作の温度範囲に入るＴａｑポリメラーゼ活性の増大によって十分に補償することができる。これは、６５から７５℃の広い温度範囲でのリアルタイム曲線の間に本質的に差がない理由の説明となり得る。実際、こうした高温でのＰＣＲの実施は、多くの点で非常に有益であり得る。例えば、これは、温度上昇に関する時間を節約し、時間の節約は、ＡＢＩ  ７７００または７９００およびＢｉｏ−Ｒａｄ  ｉＣｙｃｌｅｒのような一部のリアルタイム型機器には有意であり得る。高温でのＰＣＲは、より配列特異性でもある。最適な温度でＰＣＲを行うことの利点は明らかであるが、７０℃より高いアニーリング温度の使用について出版物に掲載された報告は、非常に稀である。低温でのＰＣＲの相対的な能率の悪さは当該技術分野において周知であり、一般には追加の伸長段階（＞７２℃）を導入してこの問題を解決している。しかし、低温への反応物の短い暴露であっても、「ミスプライミング」およびプライマー−二量体形成を誘発し得る。ＰＣＲにおいて低温を用いる主な理由は、ＤＮＡそれ自体および特にその構造的および熱力学的多様性である。Ａ／Ｔリッチ二重鎖は、高いＧ／Ｃ含有率を有する二重鎖より有意に安定性が劣る。図３に示す例示的な二重鎖安定化ｄＮＴＰは、いずれも、核酸検出アッセイにおいて本発明を実施する際に使用することができる。しかし、ｄＡＴＰおよびｄＴＴＰの塩基修飾類似体の使用が好ましい。これらの塩基修飾ヌクレオチドの増幅産物への組み込みは、Ａ−Ｔ塩基対を安定させる。天然Ａ−Ｔ塩基対のＧ−Ｃに対する相対的不安定性は、常に論点になっており、Ａ−Ｔリッチ標的の一部を不確定なものにし、または増幅不能および従って検出不能にさえする。本発明は、この問題に有効な解決をもたらす。さらに、本発明の有効性は、検出される核酸の塩基組成に正比例する。標的配列のＡ／Ｔ含有率が高いほど、核酸検出アッセイにおいて本発明を適用して達成することができる恩恵が大きい。
【０１５０】
ＤＮＡへの二重鎖安定化ヌクレオシドの組み込みは、ＰＣＲアプリコンをある程度まで安定させることができ、この場合、ＰＣＲ融解段階でアプリコン鎖の鎖分離が問題になってくるだろう。こうした効果は、図７に示す実験において観察された。ｄＡＴＰおよびｄＴＴＰのそれらの修飾類似体ｄ（２−ａｍＡ）ＴＰおよびｄ（５−ＰｒＵ）ＴＰでの完全置換は、Ｃｔ値の４サイクルの増加をもたらした。ｄ（２−ａｍＡ）ＴＰ−ｄ（５−ＰｒＵ）ＴＰ塩基対の安定性は、天然Ｇ−Ｃに近似していると予測される。Ｇ／Ｃリッチ二重鎖は極めて熱安定性であり、それらのＰＣＲにおける鎖分離に関連した問題は周知である。２つの修飾ｄＮＴＰの適用（図７）は、アンプリコン二重鎖を過度に安定させるという仮説を立てた。実際、図８に示す実験は、これが正しいことを証明した。変性段階の温度および／または時間のわずかな増加がＣｔ値を正常に戻した（サイクル２６）。
【０１５１】
図７における実験は、検出ＰＣＲにおける本発明の適用可能性に関する態様の潜在的限定を示している。しかし、有意なことに、この潜在的な過安定化の問題点を解決するために２つの方法がある。第１のアプローチを図８に示す。過度に安定化されたアプリコンにおける完全な鎖分離は、ＰＣＲ変性段階の温度および時間を増加させることによって達成することができる。このアプローチは、約１００℃以上でのＴａｑポリメラーゼの相対的不安定性によって、多少制限される。しかし、好熱生物から単離された一定のＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑより熱安定性である。例えば、Ｐｆｕは、超好熱性古細菌パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）からの高熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｄ．Ｗ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｔｈｅ  ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。このＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼも、そのポリメラーゼによるヌクレオチド組み込みエラーの修正を可能にする、３’から５’のエキソヌクレアーゼ（校正）活性を示す。しかし、それは、５’から３’のエンドヌクレアーゼ活性を有さず、その適用は、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマー、ＢｅａｃｏｎまたはＥｃｌｉｐｓｅプローブのようなハイブリダイゼーション誘発検出システムに限定され得る。第２のアプローチでは、それぞれのｄＮＴＰの不完全または部分置換を適用することができる。特定の態様によると、天然および／または二重鎖安定化類似体を含有するｄＮＴＰのバランスのとれた組成物を、すべての所与の標的ＤＮＡ配列について見つけることができる。この組成は、ＰＣＲに干渉しない上、アッセイに安定化をもたらすであろう。こうした組成物において、一定のｄＮＴＰは、完全に天然のものであり、その一方で、他のすべてまたは他の一部は、それぞれの二重鎖安定化類似体で完全にまたは部分的に置換されている場合がある。個々のｄＮＴＰの部分または完全置換は、本発明の２つ以上の二重鎖安定化類似体の混合物によるものであってもよい。例えば、ｄＣＴＰを、ｄ（５−ＭｅＣ）ＴＰとｄ（５−ＢｒＣ）ＴＰとの混合物で完全にまたは部分的に置換することができる。ここで説明した２つの互いに異なるアプローチを、個々にまたはそれらの組み合わせで適用して、本発明を実施し、しかしＰＣＲにおけるアンプリコンの過度の安定化を回避することができる。
【０１５２】
ＴａｑＭａｎおよびＳｃｏｒｐｉｏｎアッセイ（図４における設計を参照のこと）は、通常の検出システムとして以前に開発されたものである。本発明の二重鎖安定化ｄＮＴＰの適用（図５−７および１０）は、シグナルおよび閾値動作を一切変えずに、ＰＣＲアニーリング温度の上昇を可能にする（図９および１１）。本発明において使用するすべての塩基類似体についての安定化効果を決定することができ、これらのデータを新たに開発するシステムの設計に用いることができる。そしてまた、これが設計成功の手立てとなる。ＰＣＲオリゴヌクレオチドの長さを減少させることができ、あるいは、ＰＣＲ温度を上昇させることができる。反応温度が高いほど、すべての増幅反応段階が早くなる。
【０１５３】
本発明は、間接的にだが絶対的に、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブのハイブリダイゼーション特性を改善する。ＰＣＲにおけるオリゴヌクレオチドプライミングを支援する二重鎖安定化技術の数は限られているので、ＰＣＲプライマーの安定化は、特に重要である。
【０１５４】
引用した関連する参考文献
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Ｂｒｏｗ  Ｍ．Ａ．Ｄ．，Ｈａｌｌ  Ｊ．Ｓ．Ｇ．，Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ  Ｖ．，Ｏｌｉｖｅ  Ｄ．Ｍ．，Ｐｒｕｄｅｎｔ  Ｊ．Ｒ．  （１９９９）  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｂｙ  ｉｎｖａｄｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｌｅａｖａｇｅ．  ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ＃６，００１，５６７．
Ｂｒｏｗｎ  Ｅ．Ｌ．，Ｂｅｌａｇａｊｅ  Ｒ．，Ｒｙａｎ  Ｍ．Ｊ．，Ｋｈｏｒａｎａ  Ｈ．Ｇ．  （１９７９）  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｔＲＮＡ  ｇｅｎｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６８：１０９−１５１．  
Ｂｕｒｇｎｅｒ  Ｄ．，Ｄ’Ａｍａｔｏ  Ｍ．，Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ  Ｄ．Ｐ．，Ｌｏａｋｅｓ  Ｄ．  （２００４）  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｌｌｅｌｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  ａｎ  ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｂａｓｅ−ａｎａｌｏｇｕｅ  ｍｉｓｍａｔｃｈ，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，２３：７５５−７６５．
Ｂｕｔｋｕｓ  Ｖ．，Ｋｌｉｍａｓａｕｓｋａｓ  Ｓ．，Ｐｅｔｒａｕｓｋｉｅｎｅ  Ｌ．，Ｍａｎｅｌｉｅｎｅ  Ｚ．，Ｊａｎｕｌａｉｔｉｓ  Ａ．，Ｍｉｎｃｈｅｎｋｏｖａ  Ｌ．Ｅ．  ａｎｄ  Ｓｃｈｙｏｌｋｉｎａ  Ａ．Ｋ．  （１９８７）  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎ４−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ  ａｎｄ  ５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１５：８４６７−８４７８．
Ｃａｒｄｕｌｌｏ  Ｒ．Ａ．，Ａｇｒａｗａｌ  Ｓ．，Ｆｌｏｒｅｓ  Ｃ．，Ｚａｍｅｃｎｉｋ  Ｐ．Ｃ．  ａｎｄ  Ｗｏｌｆ  Ｄ．Ｅ．  （１９８８）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，８５：８７９０−８７９４．
Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  Ｍ．Ｈ．，Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ  Ｍ．Ｄ．  （１９８４）  Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ＃４，４５８，０６６．
Ｃｌｅｇｇ  Ｒ．Ｍ．  （１９９２）  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２１１：３５３−３８８．
Ｃｌｅｇｇ  Ｒ．Ｍ．  （１９９５）  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，６：１０３−１１０．
Ｃｌｅｍｅｎｔｉ  Ｍ．，Ｍｅｎｚｏ  Ｓ．，Ｂａｇｎａｒｅｌｌｉ  Ｐ．，Ｍａｎｚｉｎ  Ａ．，Ｖａｌｅｎｚａ  Ａ．，Ｖａｒａｌｄｏ  Ｐ．Ｅ．  （１９９３）  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ａｎｄ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ．  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．  ２：１９１−１９６．
Ｃｌｅｕｚｉａｔ  Ｐ．  ａｎｄ  Ｍａｎｄｒａｎｄ  Ｂ．  （１９９８）  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｂｙ  ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒｓ，ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ＃５，８２４，５１７．  
Ｄａｈｌｂｅｒｇ  Ｊ．Ｅ．，Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ  Ｖ．Ｉ．，Ｂｒｏｗ  Ｍ．Ａ．Ｄ．  （１９９７）  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．  ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ＃５，６９１，１４２．
Ｄａｈｌｂｅｒｇ  Ｊ．Ｅ．，Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ  Ｖ．Ｉ．，Ｂｒｏｗ  Ｍ．Ａ．Ｄ．  （１９９８）  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ５’  ｎｕｃｌｅａｓｅ．  ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ＃５，８３７，４５０．
Ｄａｔｔａｇｕｐｔａ  Ｎ．，Ｓｔｕｌｌ  Ｐ．Ｄ．，Ｓｐｉｎｇｏｌａ  Ｍ．，ａｎｄ  Ｋａｃｉａｎ  Ｄ．Ｌ．  （２００１）  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ＃６，２１４，５８７．
Ｄａｖｅｙ  Ｃ．  ａｎｄ  Ｍａｌｅｋ  Ｌ．Ｔ．  （２０００）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ，ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ＃６，０６３，６０３．
Ｄｅｍｐｌｅ  Ｂ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ａ．  ａｎｄ  Ｆｕｎｇ  Ｄ．  （１９８６）  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩＩＩ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩＶ  ｒｅｍｏｖｅ  ３’  ｂｌｏｃｋｓ  ｆｒｏｍ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ｉｎ  Ｈ２Ｏ２−ｄａｍａｇｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，８３：７７３１−７７３５．
Ｄｉｄｅｎｋｏ  Ｖ．Ｖ．  （２００１）  ＤＮＡ  ｐｒｏｂｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  （ＦＲＥＴ）：ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３１，１１０６−１１２１．
Ｄｉｅｒｉｃｋ  Ｈ．，Ｓｔｕｌ  Ｍ．，Ｄｅ  Ｋｅｌｖｅｒ  Ｗ．，Ｍａｒｙｎｅｎ  Ｐ．  ａｎｄ  Ｃａｓｓｉｍａｎ  Ｊ．−Ｊ．  （１９９３）  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄＩＴＰ  ｏｒ  ７−ｄｅａｚａ  ｄＧＴＰ  ｄｕｒｉｎｇ  ＰＣＲ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１：４４２７−４４２８．
Ｄｉ  Ｇｉｕｓｔｏ  Ｄ．Ａ．  ａｎｄ  Ｋｉｎｇ  Ｇ．Ｃ．  （２００４）  Ｓｔｒｏｎｇ  ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＬＮＡ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ  ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ａｓｓａｙｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３２：ｅ３２．
Ｄｉｖｉａｃｃｏ  Ｓ．，Ｎｏｒｉｏ  Ｐ．，Ｚｅｎｔｉｌｉｎ  Ｌ．，Ｍｅｎｚｏ  Ｓ．，Ｃｌｅｍｅｎｔｉ  Ｍ．，Ｂｉａｍｏｎｔｉ  Ｇ．，Ｒｉｖａ  Ｓ．，Ｆａｌａｓｃｈｉ  Ａ．，Ｇｉａｃｃａ  Ｍ．  （１９９２）  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｔｅｍｐｌａｔｅｓ，Ｇｅｎｅ，１２２：３１３−３２０．
Ｄｏｂｒｉｋｏｖ  Ｍ．Ｉ．，Ｓｅｒｇｕｅｅｖａ  Ｚ．Ａ．，Ｓｈａｗ  Ｂ．Ｒ．  （２００３）  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  （ａｌｐｈａ−Ｐ−ｂｏｒａｎｏ）−２’，３’−ｄｉｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ  ５’−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｉｎｔｏ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ＭＭＬＶ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ａｎｄ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，２２（５−８）：１６５１−１６５５．      
Ｄｏｔｙ  Ｐ．，Ｍａｒｍｕｒ  Ｊ．，Ｅｉｇｎｅｒ  Ｊ．，Ｓｃｈｉｌｄｋｒａｕｔ  Ｃ．  （１９６０）  Ｓｔｒａｎｄ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ：ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，４６：４６１−４７６．
Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  Ｆ．，ｅｄ．，（１９９１）  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．
Ｅｆｔｉｎｋ  Ｍ．Ｒ．  （１９９１）  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ：ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｉｎ  Ｌａｋｏｗｉｃｚ  Ｊ．Ｒ．  （ｅｄ．），Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｖ．２：５３−１２６．
Ｆｏｎｇ  Ｗ．，Ｍｏｄｒｕｓａｎ  Ｚ．，ＭｃＮｅｖｉｎ  Ｊ．，Ｍａｒｏｓｔｅｎｍａｒｋｉ  Ｊ．，Ｚｉｎ  Ｂ．  ａｎｄ  Ｂｅｋｋａｏｕｉ  Ｆ．  （２０００）  Ｒａｐｉｄ  ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｕｓｉｎｇ  ｃｙｃｌｉｎｇ  ｐｒｏｂｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３８：２５２５−２５２９．
Ｆoｒｓｔｅｒ  Ｔ．  （１９６５）  Ｄｅｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．  Ｉｎ  Ｓｉｎａｎｏｇｌｕ，Ｏ．  （ｅｄ．），Ｍｏｄｅｒｎ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｉｓｔａｎｂｕｌ  Ｌｅｃｔｕｒｅｓ，ｐａｒｔ  ＩＩＩ．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：９３−１３７．
Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｗ．Ｍ．，Ｗａｌｋｅｒ  Ｓ．Ｊ．，Ｖｒａｎａ  Ｋ．Ｅ．  （１９９９）  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ：ｐｉｔｆａｌｌｓ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２６：１１２−１２２，１２４−１２５．
Ｇａｆｆｎｅｙ  Ｂ．Ｌ．，Ｍａｒｋｙ  Ｌ．Ａ．  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ  Ｒ．Ａ．  （１９８４）  Ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｕｒｉｎｅ  ２−ａｍｉｎｏ  ｇｒｏｕｐ  ｏｎ  ＤＮＡ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．  ＩＩ．  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄ［ＣＧＴ（２−ＮＨ２）ＡＣＧ］，ｄ［ＣＣＵ（２−ＮＨ２）ＡＣＧ］，ａｎｄ  ｄ［ＣＧＴ（２−ＮＨ２）ＡＴ（２−ＮＨ２）ＡＣＧ］．  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４０：３−１３．  
Ｇａｉｔ  Ｍ．Ｊ．，ｅｄ．，（１９８４）  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ．
Ｇｅｌｆａｎｄ  Ｄ．Ｈ．，Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｐ．Ｍ．，Ｓａｉｋｉ  Ｒ．Ｋ．，Ｗａｔｓｏｎ  Ｒ．Ｍ．  （１９９３）  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ＃５，２１０，０１５．
Ｇｅｌｆａｎｄ  Ｄ．Ｈ．，Ｋｗｏｋ  Ｓ．Ｙ．，Ｓｎｉｎｓｋｙ  Ｊ．Ｊ．  （１９９５）  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ  ｕｓｉｎｇ  ＤＵＴＰ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｕｒａｃｉｌ．  ＵＳ  ｐａｔｅｎｔ  ＃５，４１８，１４９．
Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ Ｏ．，Ｌａｎｄｔ Ｏ．，Ｓｃｈｕｍａｎｎ Ｒ．Ｒ．，Ｇｏｂｅｌ Ｕ．Ｂ．，Ｈａｍａｎｎ Ｌ．  （２００５）  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ／ＦＲＥＴ  ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  １６Ｓ  ｒＤＮＡ  ｂｙ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３８：２９  -  ３２．
Ｇｏｕｒｌａｉｎ  Ｔ．，Ｓｉｄｏｒｏｖ  Ａ．，Ｍｉｇｎｅｔ  Ｎ．，Ｔｈｏｒｐｅ  Ｓ．Ｊ．，Ｌｅｅ  Ｓ．Ｅ．，Ｇｒａｓｂｙ  Ｊ．Ａ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｄ．Ｍ．  （２００１）  Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ：ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｌｉｎｋｅｒ  ｌｅｎｇｔｈ  ａｎｄ  ｒｉｇｉｄｉｔｙ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２９：１８９８−１９０５．
Ｇｕ  Ｚ．，Ｂｅｌｚｅｒ  Ｓ．Ｗ．，Ｇｉｂｓｏｎ  Ｃ．Ｓ．，Ｂａｎｋｏｗｓｋｉ  Ｍ．Ｊ．，Ｈａｙｄｅｎ  Ｒ．Ｔ．  （２００３）  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４１：４６３６−４６４１．
Ｇｕｎｄｒｙ  Ｃ．Ｎ．，Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｐ．Ｓ．，Ｈｅｒｍａｎｎ  Ｍ．Ｇ．，Ｒｅｅｄ  Ｇ．Ｈ．  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｗｅｒ  Ｃ．Ｔ．  （１９９９）  Ｒａｐｉｄ  Ｆ５０８ｄｅｌ  ａｎｄ  Ｆ５０８Ｃ  ａｓｓａｙ  ｕｓｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｔｅｓｔ．，３：３６５−３７０．
Ｈａｃｉａ  Ｊ．Ｇ．，Ｗｏｓｋｉ  Ｓ．Ａ．，Ｆｉｄａｎｚａ  Ｊ．，Ｅｄｇｅｍｏｎ  Ｋ．，Ｈｕｎｔ  Ｎ．，ＭｃＧａｌｌ  Ｇ．，Ｆｏｄｏｒ  Ｓ．Ｐ．Ａ．  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｆ．Ｓ．  （１９９８）  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｈｉｇｈ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２６：４９７５−４９８２．  
Ｈａｆｎｅｒ  Ｇ．Ｊ．，Ｙａｎｇ  Ｉ．Ｃ．，Ｗｏｌｔｅｒ  Ｌ．Ｃ．，Ｓｔａｆｆｏｒｄ  Ｍ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｇｉｆｆａｒｄ  Ｐ．Ｍ．  （２００１）  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｙ  Ｂｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３０，８５２−８６７
Ｈａｌｌ  Ｊ．Ｇ．，Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ  Ｖ．Ｉ．，Ｍａｓｔ  Ａ．Ｌ．，Ｂｒｏｗ  Ｍ．Ａ．Ｄ．  （１９９９）  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｃｌｅａｖａｇｅｓ．  ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ＃５，９９４，０６９．
Ｈａｒｖｅｙ  Ｊ．Ｊ．，Ｌｅｅ  Ｓ．Ｐ．，Ｃｈａｎ  Ｋ．，Ｋｉｍ  Ｊ．Ｈ．，Ｈｗａｎｇ  Ｅ．−Ｓ．，Ｃｈａ  Ｃ．−Ｙ．，Ｋｎｕｔｓｏｎ  Ｊ．Ｒ．  ａｎｄ  Ｈａｎ  Ｍ．Ｋ．  （２００４）  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣａｔａＣｌｅａｖｅ  ｐｒｏｂｅ  ｉｎ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ，Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３３３：２４６−２５５．
Ｈｅｌｄ  Ｈ．Ａ．  ａｎｄ  Ｂｅｎｎｅｒ  Ｓ．Ａ  （２００２）  Ｃｈａｌｌｅｎｇｉｎｇ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｙｓｔｅｍｓ：ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ａｎａｌｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ５−ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｓｕｌｆｕｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３０：３８５７−３８６９．
Ｈｅｌｌｅｒ  Ｍ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  Ｌ．Ｅ．  （１９８５）  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．  Ｉｎ  Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ，Ｄ．Ｔ．  ａｎｄ  Ｆａｌｋｏｗ，Ｓ．  （ｅｄｓ．），Ｒａｐｉｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ａｇｅｎｔｓ．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２４５−２５６．
Ｈｉｇｕｃｈｉ  Ｒ．，Ｄｏｌｌｉｎｇｅｒ  Ｇ．，Ｗａｌｓｈ  Ｐ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  Ｒ．  （１９９２）  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：４１３−４１７．
Ｈｉｇｕｃｈｉ  Ｒ．，Ｆｏｃｋｌｅｒ  Ｃ．，Ｄｏｌｌｉｎｇｅｒ  Ｇ．，ａｎｄ  Ｗａｔｓｏｎ  Ｒ．  （１９９３）  Ｋｉｎｅｔｉｃ  ＰＣＲ：Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：１０２６−１０３０．
Ｈｏｗａｒｄ  Ｆ．Ｂ．，Ｆｒａｚｉｅｒ  Ｊ．  ａｎｄ  Ｍｉｌｅｓ  Ｈ．Ｔ．  （１９６６）  Ａ  ｎｅｗ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｂｙ  ｔｈｒｅｅ  ｉｎｔｅｒｂａｓｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｂｏｎｄｓ，ｐｏｌｙ−２−ａｍｉｎｏａｄｅｎｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ＋  ｐｏｌｙｕｒｉｄｙｌｉｃ  ａｃｉｄ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２４１：４２９３−  ４２９５．    
Ｈｏｗａｒｄ  Ｆ．Ｂ．，Ｆｒａｚｉｅｒ  Ｊ．  ａｎｄ  Ｍｉｌｅｓ  Ｈ．Ｔ．  （１９７６）  Ｐｏｌｙ（２−ａｍｉｎｏａｄｅｎｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）：Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙ（ｕｒｉｄｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１５：３７８３−３７９５．
Ｈｏｗａｒｄ  Ｆ．Ｂ．  ａｎｄ  Ｍｉｌｅｓ  Ｈ．Ｔ．  （１９８４）  ２ＮＨ２Ａ・Ｔ  ｈｅｌｉｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｉｂｏ−  ａｎｄ  ｄｅｏｘｙｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｒｉｅｓ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｅｎｅｒｇｅｔｉｃ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ２ＮＨ２Ａ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２３：６７２３−６７３２．
Ｉｎｎｉｓ  Ｍ．Ａ．，Ｍｙａｍｂｏ  Ｋ．Ｂ．，Ｇｅｌｆａｎｄ  Ｄ．Ｈ．  ａｎｄ  Ｂｒｏｗ  Ｍ．Ａ．Ｄ．  （１９８８）  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｎｄ  ｄｉｒｅｃｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ−ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，８５：９４３６−９４４０．
Ｊaｇｅｒ  Ｓ．  ａｎｄ  Ｆａｍｕｌｏｋ  Ｍ．  （２００４）  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄｓ．  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．，４３：３３３７−３３４０．
Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｍ．Ｐ．，Ｈａｕｐｔ  Ｌ．Ｍ．，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  Ｌ．Ｒ．  （２００４）  Ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  （ＬＮＡ）  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  （ＳＮＰ）  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３２：ｅ５５．
Ｋｅｍｐｅｎｅｅｒｓ  Ｖ．，Ｒｅｎｄｅｒｓ  Ｍ．，Ｆｒｏｅｙｅｎ  Ｍ．  ａｎｄ  Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ  Ｐ．  （２００５）  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＤＮＡ−ｄｅｐｅｎｄａｎｔ  ｃｙｃｌｏｈｅｘｅｎｙｌ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ−ｄｅｐｅｎｄａｎｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３３：３８２８−３８３６．
Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  Ａ．，ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ  Ｔ．  （１９９２）  ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．
Ｋｕｒｎ  Ｎ．  （２００１）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｌｉｎｅａｒ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ｕｓｉｎｇ  ａ  ＲＮＡ−ＤＮＡ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  ｐｒｉｍｅｒ，ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ＃６，２５１，６３９．
Ｋｕｔｙａｖｉｎ  Ｉ．Ｖ．，Ａｆｏｎｉｎａ  Ｉ．Ａ．，Ｍｉｌｌｓ  Ａ．，Ｇｏｒｎ  Ｖ．Ｖ．，Ｌｕｋｈｔａｎｏｖ  Ｅ．Ａ．，Ｂｅｌｏｕｓｏｖ  Ｅ．Ｓ．，Ｓｉｎｇｅｒ  Ｍ．Ｊ．，Ｗａｌｂｕｒｇｅｒ  Ｄ．Ｋ．，Ｌｏｋｈｏｖ  Ｓ．Ｇ．，Ｇａｌｌ  Ａ．Ａ．，Ｄｅｍｐｃｙ  Ｒ．，Ｒｅｅｄ  Ｍ．Ｗ．，Ｍｅｙｅｒ  Ｒ．Ｂ．  ａｎｄ  Ｈｅｄｇｐｅｔｈ  Ｊ．  （２０００）  ３’−Ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ  ｂｉｎｄｅｒ−ＤＮＡ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｔ  ＰＣＲ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２８：６５５−６６１．
Ｋｕｔｙａｖｉｎ  Ｉ．Ｖ．，Ｌｕｋｈｔａｎｏｖ  Ｅ．Ａ．，Ｇａｍｐｅｒ  Ｈ．Ｂ．  ａｎｄ  Ｍｅｙｅｒ  Ｒ．Ｂ．  （１９９７）  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｒｏｌｏｉｎｄｏｌｅ  ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｂａｓｅ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３７１８−３７２３．
Ｋｕｔｙａｖｉｎ  Ｉ．Ｖ．，Ｍｉｌｅｓｉ  Ｄ．，Ｈｏｅｋｓｔｒａ  Ｍ．Ｆ．  （２００４）  Ａｂａｓｉｃ  ｓｉｔｅ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｓｓａｙ．  ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ＃２００４０１０１８９３．
Ｋｕｗａｈａｒａ  Ｍ．，Ｈｏｓｏｓｈｉｍａ  Ｓ．，Ｔａｋａｈａｔａ  Ｙ．，Ｋｉｔａｇａｔａ  Ｒ．，Ｓｈｏｊｉ  Ａ．，Ｈａｎａｗａ  Ｋ．，Ｏｚａｋｉ  Ａ．Ｎ．，Ｏｚａｋｉ  Ｈ．，Ｓａｗａｉ  Ｈ．  （２００３）  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ＰＣＲ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  Ｓｕｐｐｌ．，３：３７−３８．
ＬａＤｕｃａ  Ｒ．Ｊ．，Ｆａｙ  Ｐ．Ｊ．，Ｃｈｕａｎｇ  Ｃ．，ＭｃＨｅｎｒｙ  Ｃ．Ｓ．，Ｂａｍｂａｒａ  Ｒ．Ａ．  （１９８３）  Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｕｓｉｎｇ  ｏｆ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  ｆｏｕｒ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩＩ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２２：５１７７-５１８８．
Ｌａｔｏｒｒａ  Ｄ．，Ａｒａｒ  Ｋ．，Ｈｕｒｌｅｙ  Ｊ．Ｍ．  （２００３）  Ｄｅｓｉｇｎ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＬＮＡ  ｉｎ  ＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒｓ，Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｒｏｂｅｓ，１７：２５３−２５９．
Ｌａｔｏｒｒａ  Ｄ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ  Ｋ．，Ｗｏｌｔｅｒ  Ａ．，Ｈｕｒｌｅｙ  Ｊ．Ｍ．  （２００３）  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＳＮＰ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ３’  ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  （ＬＮＡ）  ｐｒｉｍｅｒｓ，Ｈｕｍ．  Ｍｕｔａｔ．，２２：７９−８５．  
Ｌｅｅ  Ｓ．Ｅ．，Ｓｉｄｏｒｏｖ  Ａ．，Ｇｏｕｒｌａｉｎ  Ｔ．，Ｍｉｇｎｅｔ  Ｎ．，Ｔｈｏｒｐｅ  Ｓ．Ｊ．，Ｂｒａｚｉｅｒ  Ｊ．Ａ．，Ｄｉｃｋｍａｎ  Ｍ．Ｊ．，Ｈｏｒｎｂｙ  Ｄ．Ｐ．，Ｇｒａｓｂｙ  Ｊ．Ａ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｄ．Ｍ．  （２００１）  Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ：ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｌｉｎｋｅｒ  ｌｅｎｇｔｈ  ａｎｄ  ｒｉｇｉｄｉｔｙ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２９：１５６５−１５７３．
Ｌｅｂｅｄｅｖ  Ｙ．，Ａｋｏｐｙａｎｓ  Ｎ．，Ａｚｈｉｋｉｎａ  Ｔ．，Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ  Ｙ．，Ｐｏｔａｐｏｖ  Ｖ．，Ｓｔｅｃｅｎｋｏ  Ｄ．，Ｂｅｒｇ  Ｄ．，Ｓｖｅｒｄｌｏｖ  Ｅ．  （１９９６）  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ２−ａｍｉｎｏａｄｅｎｉｎｅ  ａｎｄ  ５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ  ａｒｅ  ｍｏｒｅ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｓ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ＰＣＲ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔｈａｎ  ｔｈｅｉｒ  ｎｏｎｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔｓ，Ｇｅｎｅｔ．  Ａｎａｌ．，１３，１５−２１．
Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ  Ａ．Ｌ．  （１９７５）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．
Ｌｅｗｉｎ  Ｓ．Ｒ．，Ｖｅｓａｎｅｎ  Ｍ，Ｋｏｓｔｒｉｋｉｓ  Ｌ．，Ｈｕｒｌｅｙ  Ａ．，Ｄｕｒａｎ  Ｍ．，Ｚｈａｎｇ  Ｌ．，Ｈｏ  Ｄ．Ｄ．，Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ  Ｍ．  （１９９９）  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ  ｏｎ  ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，７３：６０９９−６１０３．
Ｌｉｅ  Ｙ．Ｓ．  ａｎｄ  Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ  Ｃ．Ｊ．  （１９９８）  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：５’  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｓｓａｙｓ．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，９：４３−４８．
Ｌｉｖａｋ  Ｋ．Ｊ．，Ｆｌｏｏｄ  Ｓ．Ｊ．Ａ，Ｍａｒｍａｒｏ  Ｊ．，Ｇｉｕｓｔｉ  Ｗ．，Ｄｅｅｔｚ  Ｋ．  （１９９５）  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｗｉｔｈ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｄｙｅｓ  ａｔ  ｏｐｐｏｓｉｔｅ  ｅｎｄｓ  ｐｒｏｖｉｄｅ  ａ  ｑｕｅｎｃｈｅｄ  ｐｒｏｂｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｕｓｅｆｕｌ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，４：３５７−３６２．
Ｌｉｖａｋ  Ｋ．Ｊ．，Ｆｌｏｏｄ  Ｓ．Ｊ．Ａ．，Ｍａｒｍａｒｏ  Ｊ．  ａｎｄ  Ｍｕｌｌａｈ  Ｋ．Ｂ．  （１９９８）  Ｓｅｌｆ−ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅ．  ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ＃５，７２３，５９１．
Ｌｉｚａｒｄｉ  Ｐ．  （１９９８）  Ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ＃５，８５４，０３３．
Ｌｕｔｆａｌｌａ  Ｇ．  ａｎｄ  Ｕｚｅ  Ｇ．  （２００６）  Ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，４１０：３８６−４００．
Ｍａｃｋａｙ  Ｉ．Ｍ．，Ａｒｄｅｎ  Ｋ．Ｅ．，Ｎｉｔｓｃｈｅ  Ａ．  （２００２）  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３０：１２９２−１３０５．  
Ｍａｃｋａｙ  Ｊ．，Ｌａｎｄｔ  Ｏ．  （２００７）  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｉｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，３５３：２３７−２６２．
Ｍａｒｒａｓ  Ｓ．Ａ．Ｅ．，Ｋｒａｍｅｒ  Ｆ．Ｒ．  ａｎｄ  Ｔｙａｇｉ  Ｓ．  （２００２）  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ｃｏｎｔａｃｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  ｉｎ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｏｂｅｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３０：ｅ１２２．
Ｍａｔｔｈｅｓ  Ｅ．，Ｒｅｉｍｅｒ  Ｋ．，ｖｏｎ  Ｊａｎｔａ−Ｌｉｐｉｎｓｋｉ  Ｍ．，Ｍｅｉｓｅｌ  Ｈ．  ａｎｄ  Ｌｅｈｍａｎｎ  Ｃ．  （１９９１）  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｂｙ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ  ｏｆ  ｓｕｇａｒ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ５−ｍｅｔｈｙｌｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｏｆ  ｏｔｈｅｒ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｓ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，３５：１２５４−１２５７．
ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  Ｍ．Ｊ．，Ｑｕｉｒｋｅ  Ｐ．，Ｔａｙｌｏｒ  Ｇ．Ｒ．，ｅｄｓ  （１９９１）  ＰＣＲ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ．    
ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  Ｍ．Ｊ．，Ｑｕｉｒｋｅ  Ｐ．，Ｔａｙｌｏｒ  Ｇ．Ｒ．，ｅｄｓ  （１９９５）  ＰＣＲ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ．    
Ｍｉｌｌｅｒ  Ｓ．Ａ．，Ｄｙｋｅｓ  Ｄ．Ｄ．  ａｎｄ  Ｐｏｌｅｓｋｙ  Ｈ．Ｆ．  （１９８８）  Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｓａｌｔｉｎｇ  ｏｕｔ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｎｕｃｌｅａｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６：１２１５．
Ｍｏｄｒｕｚａｎ  Ｚ．，Ｍａｒｉｏｗｅ  Ｃ．，Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ｄ．，Ｐｉｒｓｅｙｅｄｉ  Ｍ．  ａｎｄ  Ｂｒｙａｎ  Ｒ．  （２０００）  ＣＰＴ−ＥＩＡ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｖａｎＡ  ａｎｄ  ｖａｎＢ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ．  Ｄｉａｇｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．，３７：４５−５０．
Ｍｕｌｌｉｓ  Ｋ．Ｂ．  （１９８７）  Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ＃４，６８３，２０２．
Ｍｕｌｌｉｓ  Ｋ．Ｂ．，Ｅｒｌｉｃｈ  Ｈ．Ａ．，Ａｒｎｈｅｉｍ  Ｎ．，Ｈｏｒｎ  Ｇ．Ｔ．，Ｓａｉｋｉ  Ｒ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｓｃｈａｒｆ  Ｓ．Ｊ．  （１９８７）  Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ，ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ，ａｎｄ／ｏｒ−ｃｌｏｎｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ＃  ４，６８３，１９５．  
Ｍａｒｍｕｒ  Ｊ．，Ｌａｎｅ  Ｄ．  （１９６０）  Ｓｔｒａｎｄ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ：ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，４６：４５３−４６１．
Ｎａｒａｎｇ  Ｓ．Ａ．，Ｈｓｉｕｎｇ  Ｈ．Ｍ．，Ｂｒｏｕｓｓｅａｕ  Ｒ．  （１９７９）  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｒｉｅｓｔｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６８：９０−９８．  
Ｎａｚａｒｅｎｋｏ  Ｉ．，Ｌｏｗｅ  Ｂ．，Ｄａｒｆｌｅｒ  Ｍ．，Ｉｋｏｎｏｍｉ  Ｐ．，Ｓｃｈｕｓｔｅｒ  Ｄ．，Ｒａｓｈｔｃｈｉａｎ  Ａ．  （２００２）  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｕｓｉｎｇ  ｓｅｌｆ−ｑｕｅｎｃｈｅｄ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ｌａｂｅｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３０：ｅ３７．
Ｎａｚａｒｅｎｋｏ  Ｉ．，Ｐｉｒｅｓ  Ｒ．，Ｌｏｗｅ  Ｂ．，Ｏｂａｉｄｙ  Ｍ．，Ｒａｓｈｔｃｈｉａｎ  Ａ．  （２００２）  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｄ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｄｙｅｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３０：２０８９−２１９５．
Ｎｇｕｙｅｎ  Ａ．，Ｚｈａｏ  Ｃ．，Ｄｏｒｒｉｓ  Ｄ．  ａｎｄ  Ｍａｚｕｍｄｅｒ  Ａ．  （２００２）  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ  ｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｉｍｐａｃｔｓ  ｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｒａｔｉｏｓ．  ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２：１４．
Ｎｉｅｓｔｅｒｓ  Ｈ．Ｇ．  （２００１）  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｌｏａｄ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２５：４１９−４２９．
Ｎｏｔｏｍｉ  Ｔ．  ａｎｄ  Ｈａｓｅ  Ｔ．  （２００２）  Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ，ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ＃６，４１０，２７８．
Ｎｏｔｏｍｉ  Ｔ．，Ｏｋａｙａｍａ  Ｈ．，Ｍａｓｕｂｕｃｈｉ  Ｈ．，Ｙｏｎｅｋａｗａ  Ｔ．，Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｋ．，Ａｍｉｎｏ  Ｎ．，ａｎｄ  Ｈａｓｅ  Ｔ．  （２０００）  Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２８，ｅ６３．
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Ｏｎｏ  Ｔ．，Ｓｃａｌｆ  Ｍ．  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  Ｌ．Ｍ．  （１９９７）  ２’−Ｆｌｕｏｒｏ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：４５８１−４５８８．
Ｏｎｏ  Ａ．  ａｎｄ  Ｕｅｄａ  Ｔ．  （１９８７）  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｄｅｃａｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎ６−ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｉｎｅ，Ｎ４−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ  ａｎｄ  ５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ：ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｂｙ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  （Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｐａｒｔ  ７４）．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１５：２１９−２３２．
Ｏｒｔｉｚ  Ｅ．，Ｅｓｔｒａｄａ  Ｇ．  ａｎｄ  Ｌｉｚａｒｄｉ  Ｐ．Ｍ．  （１９９８）  ＰＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＣＲ  ａｍｐｌｉｃｏｎｓ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｒｏｂｅｓ，１２，２１９−２２６．
Ｐｉａｔｅｋ  Ａ．Ｓ．，Ｔｙａｇｉ  Ｓ．，Ｐｏｌ  Ａ．Ｃ．，Ｔｅｌｅｎｔｉ  Ａ．，Ｍｉｌｌｅｒ  Ｌ．Ｐ．，Ｋｒａｍｅｒ  Ｆ．Ｒ．，Ａｌｌａｎｄ  Ｄ．  （１９９８）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：３５９−３６３．
Ｐｏｒｔｅｒ  Ｋ．Ｗ．，Ｂｒｉｌｅｙ  Ｊ．Ｄ．，Ｓｈａｗ  Ｂ．Ｒ．  （１９９７）  Ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｂｏｒｏｎａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：１６１１−１６１７．
Ｐｒｏｓｎｙａｋ  Ｍ．Ｉ．，Ｖｅｓｅｌｏｖｓｋａｙａ  Ｓ．Ｉ．，Ｍｙａｓｎｉｋｏｖ  Ｖ．Ａ．，Ｅｆｒｅｍｏｖａ  Ｅ．Ｊ．，Ｐｏｔａｐｏｖ  Ｖ．Ｋ．，Ｌｉｍｂｏｒｓｋａ  Ｓ．Ａ．，Ｓｖｅｒｄｌｏｖ  Ｅ．Ｄ．  （１９９４）  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ２−ａｍｉｎｏａｄｅｎｉｎｅ  ａｎｄ  ５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｆｏｒ  ａｄｅｎｉｎｅ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｉｎ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２１：４９０−４９４．
Ｐｒｕｄｅｎｔ  Ｊ．Ｒ．，Ｈａｌｌ  Ｊ．Ｇ．，Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ  Ｖ．Ｉ．，Ｂｒｏｗ  Ｍ．Ａ．Ｄ．，Ｄａｈｌｂｅｒｇ  Ｊ．Ｅ．  （１９９９）  Ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ．  ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ＃５，９８５，５５７．
Ｐｒｕｄｅｎｔ  Ｊ．Ｒ．，Ｈａｌｌ  Ｊ．Ｇ．，Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ  Ｖ．Ｉ．，Ｂｒｏｗ  Ｍ．Ａ．Ｄ．  （２０００）  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ．  ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ＃６，０９０，５４３．
Ｐｒｕｄｅｎｔ  Ｊ．Ｒ．，Ｈａｌｌ  Ｊ．Ｇ．，Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ  Ｖ．Ｉ．，Ｂｒｏｗ  Ｍ．Ａ．Ｄ．，Ｄａｈｌｂｅｒｇ  Ｊ．Ｅ．  （２００２）  Ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ．  ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ＃６，３４８，３１４．
Ｐｒｕｄｅｎｔ  Ｊ．Ｒ．，Ｈａｌｌ  Ｊ．Ｇ．，Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ  Ｖ．Ｉ．，Ｂｒｏｗ  Ｍ．Ａ．Ｄ．，Ｄａｈｌｂｅｒｇ  Ｊ．Ｅ．  （２００５）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ．  ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ＃６，８７５，５７２
Ｒｅｉｄ  Ｒ．，Ｍａｒ  Ｅ．−Ｃ．，Ｈｕａｎｇ  Ｅ．−Ｓ．  ａｎｄ  Ｔｏｐａｌ  Ｍ．Ｄ．  （１９８８）  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｙｃｌｉｃ，ｄｉｄｅｏｘｙ，ａｎｄ  Ａｒａ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｂｙ  Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ，Ｈｕｍａｎ  α  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  β  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２６３：３８９８−３９０４．
Ｒｏｂｅｌｅｋ  Ｒ．，Ｎｉｕ  Ｌ．，Ｓｃｈｍｉｄ  Ｅ．Ｌ．，Ｋｎｏｌｌ  Ｗ．  （２００４）  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．，７６：６１６０−６１６５．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ｅ．Ｆ．  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｄ．Ｗ．  （２００１）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｔｈｅ  ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．  
ＳａｎｔａＬｕｃｉａ  Ｊ．  Ｊｒ．  （１９９８）  Ａ  ｕｎｉｆｉｅｄ  ｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒ，ｄｕｍｂｂｅｌｌ，ａｎｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＤＮＡ  ｎｅａｒｅｓｔ−ｎｅｉｇｈｂｏｒ  ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，９５：１４６０−１４６５．  
Ｓａｗａｉ  Ｈ．，Ｏｚａｋｉ−Ｎａｋａｍｕｒａ  Ａ．，Ｍｉｎｅ  Ｍ．，Ｏｚａｋｉ  Ｈ．  （２００２）  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＤＮＡｓ  ｂｙ  ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ａｎｄ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｂｅａｒｉｎｇ  ａ  ｓｐ３−ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ  ｃａｒｂｏｎ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｃ５  ａｌｐｈａ−ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｓｅｖｅｒａｌ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ．  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．，１３：３０９−３１６．
Ｓｃｈｅｉｔ  Ｋ．Ｈ．  ａｎｄ  Ｒａｃｋｗｉｔｚ  Ｈ．−Ｒ．  （１９８２）  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ａｎａｌｏｇｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ｄＡ）；  ｐｏｌｙ（２−ａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ−９−β−Ｄ−ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）  ａｎｄ  ｐｏｌｙ  ２−ａｍｉｎｏ−ｄｅｏｘｙａｄｅｎｙｌｉｃ  ａｃｉｄ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１０：４０５９−４０６９．
Ｓｃｈｎｅｅｂｅｒｇｅｒ  Ｃ．，Ｓｐｅｉｓｅｒ  Ｐ．，Ｋｕｒｙ  Ｆ．，Ｚｅｉｌｌｉｎｇｅｒ  Ｒ．  （１９９５）  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｂｙ  ｍｅａｎｓ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ＤＮＡ  ｓｔａｉｎ．  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．，４：２３４−２３８．
Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ  Ｂ．  ａｎｄ  Ｋｉｎｇｓｍｏｒｅ  Ｓ．  （２００１）  Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１２：２１−２７．
Ｓｅｅｌａ  Ｆ．  ａｎｄ  Ｒoｌｉｎｇ  Ａ．  （１９９２）  ７−Ｄｅａｚａｐｕｒｉｎｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＤＮＡ：ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｃ７ＧｄＴＰ，ｃ７ＡｄＴＰ  ａｎｄ  ｃ７ＩｄＴＰ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ＰＣＲ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｅｎｄｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０：５５−６１．
Ｓｅｌｖｉｎ  Ｐ．Ｒ．  （１９９５）  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２４６：３００−３３４．
Ｓｈａｗ  Ｂ．Ｒ．，Ｐｏｒｔｅｒ  Ｋ．Ｗ．，Ｓｅｒｇｕｅｅｖ  Ｄ．  （２００４）  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．  ＵＳ  ｐａｔｅｎｔ  ＃６，８０８，８９７．
Ｓｉｍｅｏｎｏｖ  Ａ．  ａｎｄ  Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ  Ｔ．Ｔ．  （２００２）  Ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｓｈｏｒｔ，ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｌｙ  ｌａｂｅｌｅｄ  ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  （ＬＮＡ）  ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３０：ｅ９１．
Ｓｉｍｐｓｏｎ  Ｄ．，Ｃｒｏｓｂｙ  Ｒ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｓｋｏｐｅｋ  Ｔ．Ｒ．  （１９８８）  Ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｐｒｔ  ｃＤＮＡ  ｆｏｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，１５１：４８７−４９２．
Ｓｏｒｇｅ  Ｊ．Ａ．  （２００１）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｐｒｏｂｅ  ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ＃６，５８９，７４３．
Ｓｐａｒｇｏ  Ｃ．Ａ．， Ｆｒａｉｓｅｒ  Ｍ．Ｓ．， Ｖａｎ  Ｃｌｅｖｅ  Ｍ．， Ｗｒｉｇｈｔ  Ｄ．Ｊ．， Ｎｙｃｚ  Ｃ．Ｍ．， Ｓｐｅａｒｓ  Ｐ．Ａ．， Ｗａｌｋｅｒ  Ｇ．Ｔ．  （１９９６）  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍ．  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＤＮＡ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，１０：２４７−２５６．
Ｓｔｒａｕｓｓ  Ｐ．Ｒ．，Ｂｅａｒｄ  Ｗ．Ａ．，Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ  Ｔ．Ａ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ  Ｓ．Ｈ．  （１９９７）  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ａｐｕｒｉｎｉｃ／ａｐｙｒｉｍｉｄｉｎｉｃ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎｄｉｃａｔｅｓ  ａ  Ｂｒｉｇｇｓ−Ｈａｌｄａｎｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２７２：１３０２−１３０７．
Ｓｔｒｙｅｒ  Ｌ．  ａｎｄ  Ｈａｕｇｌａｎｄ  Ｒ．Ｐ．  （１９６７）  Ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ：ａ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｒｕｌｅｒ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，５８：７１９−７２６．
Ｓｕｍｍｅｒｓ  Ｊ．Ｓ．  ａｎｄ  Ｓｈａｗ  Ｂ．Ｒ．  （２００１）  Ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ  ａｓ  ｍｉｍｉｃｓ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒｓ  ｉｎ  ＤＮＡ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，８：１１４７−１１５５．  
Ｓｚｅｒ  Ｗ．  （１９６５）  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐｏｌｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｉｄｙｌｉｃ  ａｃｉｄ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，２０：１８２−１８６．
Ｓｚｅｒ  Ｗ．  ａｎｄ  Ｓｈｕｇａｒ  Ｄ．  （１９６６）  Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐｏｌｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｉｄｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｔｗｉｎ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙ−ｉｎｏｓｉｎｉｃ  ａｃｉｄ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，１７：１７４−１８７．
Ｔａｋａｇｉ  Ｍ．，Ｎｉｓｈｉｏｋａ  Ｍ．，Ｋａｋｉｈａｒａ  Ｈ．，Ｋｉｔａｂａｙａｓｈｉ  Ｍ．，Ｉｎｏｕｅ  Ｈ．，Ｋａｗａｋａｍｉ  Ｂ．，Ｏｋａ  Ｍ．  ａｎｄ  Ｉｍａｎａｋａ  Ｔ．  （１９９７）  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＫＯＤ１  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ＰＣＲ．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６３：４５０４-４５１０．
Ｔｅｃｏｔｔ  Ｌ．，Ｂａｒｃｈａｓ  Ｊ．Ｄ．，Ｅｂｅｒｗｉｎｅ  Ｊ．  （１９９２）  Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅｓ，ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ＃５，１６８，０３８．  
Ｔｈｅｌｗｅｌｌ  Ｎ．，Ｍｉｌｌｉｎｇｔｏｎ  Ｓ．，Ｓｏｌｉｎａｓ  Ａ．，Ｂｏｏｔｈ  Ｊ．  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ  Ｔ．  （２０００）  Ｍｏｄｅ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｃｏｒｐｉｏｎ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ｔｏ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２８：３７５２−３７６１．
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【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】本発明の例示的態様に従って、２２−ｍｅｒ  ＰＣＲプライマー（配列番号：１−２３）の融解温度（Ｔｍ）とＧ／Ｃ−塩基含有率との間の依存関係を示す棒グラフを示す。プライマーの配列を右に示す。Ｔｍの計算は、２００ｎＭ  プライマーおよび２００ｎＭ  補体を伴う４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｔｉｒｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に対応する条件に基づいている。垂線の間のプライマーがＰＣＲアッセイ設計において好ましい。Ｇ／Ｃ含有率＜４０％のプライマーは、厳しいＰＣＲ条件（例えば、６０℃）下で安定なハイブリッドを形成するには低すぎるＴｍ値を有し、対して、Ｇ／Ｃ含有率＞８０％のプライマーは、アンプリコンの残部が高いＧ／Ｃ含有率を有する場合、そのアンプリコンを過度に安定化させ得る。
【図２】本発明の例示的態様に従って、二重鎖の長さに対してプロットしたホモポリマー（ｄＡ・ｄＴ）ｎ二重鎖の安定性の依存関係を示す。融解温度は、図１において説明したアプローチおよび条件を用いて計算した。
【図３】本発明の例示的態様において使用した塩基修飾２’−デオキシヌクレオシド５’−三リン酸の構造を示す。「Ｂ」は、修飾塩基を指し、「Ｘ」および「Ｙ」は、５位の置換部分である。
【図４】本発明の例示的態様におけるＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイにおいて使用した９６−ｍｅｒ標的オリゴデオキシリボヌクレオチド（配列番号：２４）、フォワードＰＣＲプライマー（配列番号：２５）、リバースＰＣＲプライマー（配列番号：２６）および２２−ｍｅｒ蛍光プローブ（配列番号：２７）の配列を示す。Ｓｃｏｒｐｉｏｎアッセイは、リバースプライマー（配列番号：２６）およびＳｃｏｒｐｉｏｎプライマー（配列番号：２８）を使用して行った（これらのプライマーの構造も示す）。Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマー（配列番号：２８）において、ヘアピン形成性ＦＲＥＴプローブ（相補末端配列に下線を引く）は、長い柔軟なＣ１８−リンカー（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅｒａｃｈ）によって、フォワードプライマーの５’末端に接続される。使用したプライマーおよびプローブは、すべて天然ヌクレオシドから作製されたものであるか、あるいは修飾塩基が組み込まれたものであった。塩基修飾オリゴヌクレオチドを使用した場合、太字の字体で示す位置を２，６−ジアミノ−プリンまたは５−メチルシトシンでそれぞれ置換した。配列番号：２４の配列の下線を引いた箇所がリバースプライマーの結合部位である（リバース、３’→５’配向で示す）。「ＦＡＭ」は、６−フルオレセインを指し、「Ｑ」は、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＢＬＡＣＫ  ＨＯＬＥ  ＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）（ＢＨＱ１）を指す。
【図５】図５Ａ−５Ｄは、ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ（商標）（Ｃｅｐｈｅｉｄ）でのリアルタイムＰＣＲ中にＴａｑＭａｎ（登録商標）検出アッセイについて得られた蛍光モニタリングの例示的な結果を示す。使用した標的オリゴヌクレオチド（配列番号：２４）、フォワードＰＣＲプライマー（配列番号：２５）、リバースＰＣＲプライマー（配列番号：２６）およびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（配列番号：２７）の配列は、図２のとおりである。ＰＣＲ開始時の反応混合物（２５μＬ）中の成分の最終濃度は、フォワードおよびリバースＰＣＲプライマー−２００ｎＭ；ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ−２００ｎＭ；標的オリゴヌクレオチド−１０，０００コピー／反応；ｄＮＴＰ−それぞれ２００μＭ；ＪＵＭＰ  ＳＴＡＲＴ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ）−５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中、０．０４Ｕ／μＬであった。バックグラウンド蛍光を引いた。６５から７５℃までの様々なアニーリング温度「Ｘ」で、ＰＣＲサイクリングプロフィール（９５°２’）→（９５°１０”→Ｘ°４５”）５５を用いた。図５Ａは、未修飾プライマーおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブをすべての天然ｄＮＴＰとともに用いた例示的な実験セットを示す。図５Ｂは、図５Ａのものに類似しているが、天然２’−デオキシリボアデノシン−５’−三リン酸（ｄＡＴＰ）を２’−デオキシリボ−２，６−ジアミノプリンヌクレオシド−５’−三リン酸（ｄ（２−ａｍＡ）ＴＰ）で完全に置換した、例示的な実験結果を示す。図５Ｃは、この例示的な実験セットでは塩基修飾プライマーおよびプローブを使用したが、すべてのヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）は天然であった。図５Ｄは、図５Ｂおよび図５Ｄの両方のシステム修飾を組み合わせ、同時に用いた、リアルタイムＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイを表す；すなわち、塩基修飾プライマーおよびプローブをｄＡＴＰの完全ｄ（２−ａｍＡ）ＴＰ置換とともに用いた。
【図６】図６Ａ−Ｄは、天然ｄＮＴＰ（図６Ａにおいて使用したもの）のうちの１つを５−ブロモ−２’−デオキシリボウリジン−５’−三リン酸（ｄ（５−ＢｒＵ）ＴＰ、図６Ｂ）；５−プロピニル−２’−デオキシリボウリジン−５’−三リン酸（ｄ（５−ＰｒＵ）ＴＰ、図６Ｃ）および５−メチル−２’−デオキシリボ−シチジン−５’−三リン酸（ｄ（５−ＭｅＣ）ＴＰ、図６Ｄ）でそれぞれ完全に置換した場合のリアルタイムＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイの結果を示す。図６Ａは、図５Ａと同一であり、直接比較を助長するためにここに示す。ＰＣＲプライマーおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは未修飾のものであった。他のＰＣＲ反応組成、成分濃度および温度／時間プロフィールは、図３に示す例示的な実験に関して説明したのと同じであった。
【図７】図７Ａ−７Ｄは、変動アニーリング温度（立方体１つごとに１℃で示す）での例示的なＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイにおけるリアルタイム蛍光モニタリングの結果を示す。図７Ｂは、２つの天然ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰおよびｄＴＴＰ）をそれらのそれぞれの塩基修飾類似体ｄ（２−ａｍＡ）ＴＰおよびｄ−（５−ＰｒＵ）ＴＰで完全に置換した場合のＰＣＲ反応に関する蛍光曲線を示す。図７Ａでの結果は、図５Ａにおいて示したものと同一である。ＰＣＲプライマーおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、修飾されていなかった。他のＰＣＲ反応組成、成分濃度および温度／時間プロフィールは、図５の例示的な実験に関して説明したのと同じであった。図７Ａおよび７Ｂの下にそれぞれ示すパネルダイアグラム図７Ｃおよび７Ｄは、図７Ａおよび７Ｂに示すものと同じ結果であるが、対数スケールでプロットしてある。蛍光曲線閾値（「Ｃｔ」）を矢印で示す。蛍光曲線閾値は、それらの対数曲線がＸ軸（ｉ）を指すまたは（ｉｉ）と交差するサイクル数とした。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、リアルタイム蛍光曲線を示す。図８Ａは、図７Ｂの実験において用いたのと同じＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイおよび反応組成について得られた複合リアルタイム蛍光曲線を示すが、ＰＣＲプロフィールは異なった；すなわち、（９５°２’）→（９Ｘ°ＹＹ”→６７°４５”）５５。この場合では、アニーリング温度は一定であり（６７℃）、変性条件は、立方体ごとに示すとおり、温度（Ｘ＝９５−９７℃）および時間（ＹＹ＝１０または１５秒）に関して変動させた。ＰＣＲプライマーおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、修飾されていなかった。他のＰＣＲ反応組成および成分濃度は、図５に関して説明したのと同じであった。図８Ｂ（右）は、図８Ａにおけるものと同じ実験を示すが、蛍光を対数スケールでプロットしてある。９５°１０”および９７°１５”曲線についての蛍光曲線閾値（「Ｃｔ」）を矢印によって示す。
【図９】例示的な図５、６および７において示したＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイのシグナル動作をＰＣＲのアニーリング温度に対して示す。ＰＣＲサイクル５０での個々の反応ごとの蛍光を、その反応において用いたアニーリング温度に対してプロットした。２つの天然ｄＮＴＰをｄ（２−ａｍＡ）ＴＰおよびｄ（５−ＰｒＵ）ＴＰで置換した場合では、そのアッセイ（図７）で観察されたＣｔ値の４−サイクル「遅延」のため、サイクル５４において蛍光データを取った。矢印は、そのアッセイシグナルのほぼ半分（３００蛍光単位）に達したときのアニーリング温度を指している。
【図１０】図１０Ａ−１０Ｃは、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ検出アッセイについて得られた蛍光モニタリングの結果を示す。使用した標的オリゴヌクレオチド、フォワードおよびＳｃｏｒｐｉｏｎ  ＰＣＲプライマーの構造は、図４に示したとおりである。ＰＣＲ開始時の反応混合物（２５μＬ）中の成分の最終濃度：フォワードおよびＳｃｏｒｐｉｏｎ  ＰＣＲプライマー−２００ｎＭ；標的オリゴヌクレオチド−１０，０００コピー／反応；ｄＮＴＰ−それぞれ２００μＭ；ＪＵＭＰ  ＳＴＡＲＴ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ）−５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中、０．０４Ｕ／μＬ。バックルラウンド蛍光を引いた。６１から７５℃までの様々なアニーリング温度Ｘで、ＰＣＲプロフィール（９５°２’）→（９５°１０”→Ｘ°４５”）５５を用いた。図１０Ａは、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ検出システムをすべての天然ｄＮＴＰとともに用いた、例示的な実験セットを示す。図１０Ｂは、図１０Ａに類似した実験結果を示しているが、天然ｄＡＴＰをｄ（２−ａｍＡ）ＴＰ塩基修飾類似体で完全に置換した。図１０Ｃも図１０Ａに類似した実験セットを示すものであるが、この場合では、天然ｄＮＰＴのうちの２つ、特に、ｄＡＴＰおよびｄＴＴＰを、それぞれの塩基修飾類似体ｄ（２−ａｍＡ）ＴＰおよびｄ（５−ＰｒＵ）ＴＰで完全に置換した。Ｃｔ値の安定性を保証するために、図１０Ｃの実験セットでは、（９５°２’）→（９７°１５”→Ｘ°４５”）５５というわずかに異なるＰＣＲプロフィールを用いた。
【図１１】図１０からのＳｃｏｒｐｉｏｎアッセイのシグナル動作をＰＣＲのアニーリング温度に対して示す。ＰＣＲサイクル５０での個々の反応ごとの蛍光を、その反応において用いたアニーリング温度に対してプロットした。矢印は、そのアッセイシグナルのほぼ半分（１５０蛍光単位）に達したときのアニーリング温度を指している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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