(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドであって、（ａ）配列番号４、５もしくは６のいずれか１つとの少なくとも９０％の同一性を有する、および／または配列番号４、５もしくは６のフラグメントを含むが；（ｂ）配列番号４、５もしくは６からの下記アミノ酸残基の１つ以上が非存在か、または異なるアミノ酸によって置換されているアミノ酸配列を含み：
【表２】
0005960055.tif 000016
（ｉ）宿主動物への投与後、配列番号４、５または６からなる野生型髄膜炎菌ポリペプチドを認識することができる抗体を惹起することができ、および（ｉｉ）（ｂ）の改変（単数または複数）を伴わないこと以外は同じポリペプチドよりもヒトＨ因子に対して低い親和性を有する、ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号４との少なくとも９０％の同一性を有する、および／または配列番号４のフラグメントを含み、宿主動物への投与後、配列番号４からなる野生型髄膜炎菌ポリペプチドを認知することができる抗体を惹起することができるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号４、５もしくは６からの下記アミノ酸残基が非存在か、または、異なるアミノ酸によって置換されている：
【表２Ａ】
0005960055.tif 000017
請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号４、５もしくは６からの下記アミノ酸残基の１つ以上が非存在か、または、異なるアミノ酸によって置換されている：
【表２Ｂ】
0005960055.tif 000018
請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号４、５もしくは６からの下記アミノ酸残基が非存在か、または、異なるアミノ酸によって置換されている：
【表２Ｃ】
0005960055.tif 000019
請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号４、５もしくは６からの下記アミノ酸残基の１つ以上が非存在か、または、異なるアミノ酸によって置換されている：
【表２Ｄ】
0005960055.tif 000020
請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記異なるアミノ酸がアラニンである、請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
改変ｆＨＢＰアミノ酸配列を設計するための方法であって、該方法は、（ｉ）配列番号１から９または配列番号２０から２２より選択される出発アミノ酸配列を提供する工程であって、ここで該出発アミノ酸配列からなるか、または該出発アミノ酸配列を含むタンパク質は、ヒトＨ因子に結合することができる工程；（ｉｉ）ペアワイズ・アラインメント・アルゴリズムを用いて、請求項１に記載の表に列挙したとおりの配列番号４、５または６における残基と整列させるアミノ酸残基を該出発アミノ酸配列内で同定する工程；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において同定したアミノ酸を欠失させることにより、または該アミノ酸を異なるアミノ酸で置き換えることにより、該改変ｆＨＢＰアミノ酸配列を提供する工程を含む、方法。
【請求項９】
（ｉ）（ａ）配列番号１から９もしくは配列番号２０から２２より選択される出発アミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号１から９もしくは配列番号２０から２２より選択されるアミノ酸配列を含む出発アミノ酸配列
であって、該出発アミノ酸配列からなるタンパク質が、ヒトＨ因子に結合することができる、出発アミノ酸配列
の、ペアワイズ・アラインメント・アルゴリズムを用いて、請求項１に記載の表に列挙し
たとおりの配列番号４、５または６における残基と整列されるアミノ酸残基に欠失または置換を有するアミノ酸配列からなる、改変ｆＨＢＰアミノ酸配列、あるいは
（ｉｉ）配列番号２３から２５および２８より選択されたアミノ酸配列
を含む、ポリペプチドであって、該ポリペプチドは、野生型ｆＨＢＰと比較して、殺菌性抗ｆＨＢＰ抗体を惹起する能力を維持しながら、ヒトＨ因子への結合低減を示す、ポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１から請求項７または請求項９に記載のポリペプチドをコードする、核酸。
【請求項１１】
請求項１から請求項７または請求項９のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、プラスミド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のプラスミドで形質転換された、宿主細胞。
【請求項１３】
髄膜炎菌細菌である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１から請求項７または請求項９に記載のポリペプチドを含む、請求項１３に記載の宿主細胞から調製された膜小胞。
【請求項１５】
請求項１から請求項７もしくは請求項９に記載のポリペプチドまたは請求項１４に記載の小胞を含む、免疫原性組成物。
【請求項１６】
アジュバントを含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記アジュバントがアルミニウム塩を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１５〜１７のいずれかに記載の組成物であって、該組成物は、哺乳動物に投与したとき髄膜炎菌に対して殺菌性である抗体応答を惹起する第二のポリペプチドをさらに含むが、但し該第二のポリペプチドが髄膜炎菌ｆＨＢＰでないことを条件とする、組成物。
【請求項１９】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹからの結合体化した莢膜糖をさらに含む、請求項１５〜１８のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】
結合体化した肺炎球菌莢膜糖をさらに含む、請求項１５〜１９のいずれかに記載の組成物。
【請求項２１】
哺乳動物における抗体応答を高めるための、請求項１５〜２０のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００９年１０月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／２７９，９７７号（この完全な内容は、全ての目的のために参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、免疫処置および特に、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（髄膜炎菌）などのＮｅｉｓｓｅｒｉａ属の病原菌によって引き起こされる疾患に対する免疫処置の分野のものである。
【背景技術】
【０００３】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、莢膜のあるグラム陰性細菌であり、これは、人口の約１０％の上気道（ｕｐｐｅｒ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｔｒａｃｔ）にコロニーを形成する。多糖ワクチンおよび結合体ワクチンを血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹに対して利用できるが、莢膜多糖はヒトにおける自己抗原であるポリシアル酸のポリマーであるので、このアプローチを血清群Ｂに適用することはできない。血清群Ｂに対するワクチンを開発するために、外膜小胞（ＯＭＶ）に含まれる表面に露出したタンパク質が用いられてきた。これらのワクチンは、血清殺菌性抗体応答を惹起し、疾患から保護するが、株交差保護（ｃｒｏｓｓ−ｓｔｒａｉｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）を誘導することはできない［１（非特許文献１）］。そのため、一部の研究者は、ワクチンにおいて使用するための特異的髄膜炎菌抗原に着目している［２（非特許文献２）］。
【０００４】
１つのそのような抗原が髄膜炎菌Ｈ因子結合タンパク質（ｆＨＢＰ）であり、これは、タンパク質「７４１」［参考文献３（特許文献１）における配列番号２５３５および２５３６；本明細書における配列番号１］、「ＮＭＢ１８７０」、「ＧＮＡ１８７０」［参考文献２（非特許文献２）に続いて、参考文献４〜６］、「Ｐ２０８６」、「ＬＰ２０８６」または「ＯＲＦ２０８６」［７〜９］としても公知である。このリポタンパク質は、すべての髄膜炎菌血清群にわたって発現され、多数の髄膜炎菌株において見つけられている。ｆＨＢＰ配列は、３つのファミリーに分類されており［４］（本明細書ではファミリーＩ、ファミリーＩＩおよびファミリーＩＩＩと呼ぶ）、所与のファミリーに対して惹起される血清は、同じファミリー内では殺菌性であるが、他の２つのファミリーのうちの１つを発現する株に対しては活性でない、すなわち、ファミリー内交差保護はあるが、ファミリー間交差保護はないことが見出されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第９９／５７２８０号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊｏｄａｒら、Ｌａｎｃｅｔ（２００２）３５９（９３１６）：１４９９〜１５０８
【非特許文献２】Ｐｉｚｚａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：１８１６〜１８２０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ｆＨに結合するｆＨＢＰの能力をその免疫原性から切り離すことにより改善された抗原が得られ得る。例えば、ｆＨＢＰ表面の重要なエピトープは、ｆＨ結合後、インビボの免疫系から隠される可能性がある。逆に言えば、ワクチン成分への宿主タンパク質の高親和性結合は、一部の被験体では、意図されたものでないワクチン接種後の結果につながる可能性がある。従って、本発明の目的は、野生型ｆＨＢＰと比較して、殺菌性抗ｆＨＢＰ抗体を惹起する能力を維持しながらｆＨへの結合低減を示す改変ｆＨＢＰを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
参考文献１０によりｆＨＢＰ／ｆＨ相互作用に重要な様々な残基が既に同定されている。例えば、２つの野生型グルタミン酸残基の変異により、ｆＨに対するそのタンパク質の親和性が２桁低減した。しかし、参考文献１０には、ｆＨＢＰの免疫原活性に対するこれら変化の影響は開示されていなかった。しかし、本明細書において示すように、二重Ｇｌｕ変異体を発現する細菌は、野生型ｆＨＢＰによって惹起される殺菌性抗体に対して感受性である。従って、ｆＨＢＰのｆＨ結合活性をその殺菌感受性から切り離すことができる。
【０００９】
完全長ｆＨＢＰは、株ＭＣ５８の場合、以下のアミノ酸配列（配列番号１）を有する：
【００１０】
【化１】
0005960055.tif 000002
この配列は、ｆＨＢＰファミリーＩ内のものである。成熟リポタンパク質には、配列番号１の最初の１９のアミノ酸が無く（配列番号４）、ΔＧ形態のｆＨＢＰには最初の２６のアミノ酸が無い（配列番号７）。
【００１１】
完全長ｆＨＢＰは、株２９９６の場合、以下のアミノ酸配列（配列番号２）を有する：
【００１２】
【化２】
0005960055.tif 000003
この配列は、ｆＨＢＰファミリーＩＩ内のものである。成熟リポタンパク質には、配列番号１の最初の１９のアミノ酸が無く（配列番号５）、ΔＧ形態のｆＨＢＰには最初の２６のアミノ酸が無い（配列番号８）。
【００１３】
完全長ｆＨＢＰは、株Ｍ１２３９の場合、以下のアミノ酸配列（配列番号３）を有する：
【００１４】
【化３】
0005960055.tif 000004
この配列は、ｆＨＢＰファミリーＩＩＩ内のものである。成熟リポタンパク質には、配列番号１の最初の１９のアミノ酸が無く（配列番号６）、ΔＧ形態のｆＨＢＰには最初の３１のアミノ酸が無い（配列番号９）。
【００１５】
ＮＭＲ研究によりｆＨＢＰ／ｆＨ相互作用に関与する様々なアミノ酸残基を同定している。従って、配列番号４、５および６のそれぞれに従って番号付けした以下の残基の１つ以上を、ｆＨ／ｆＨＢＰ相互作用を阻害するように改変し得る。
【００１６】
【表１】
0005960055.tif 000005
＊の印を付けた行が好ましい残基である。なぜなら、これらの残基は、参考文献１０におけるＸ線研究によって定義されたｆＨ結合部位中に存在しなかったからである。理論により拘束されることを望まないが、（ｉ）Ｘ線結晶と比較してＮＭＲ実験中に存在するより自然な条件のため、および／または（ｉｉ）ＮＭＲ研究にｆＨドメイン５を含めたため、これらの特別な（ｅｘｔｒａ）残基を同定することができた。
【００１７】
参考文献１１には、ｆＨと相互作用する残基が改変されているｆＨＢＰタンパク質が開示されている。改変が提案される具体的なアミノ酸残基としては、３８、４１、４２、４３、４４、８０、８２、８４、８５、８９、９１、９２、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２６、１２８、１２９、１３０、１３１、１３４、１９７、１９９、２０１、２０２、２０３、２０７、２０９、２１８、２２０、２２１、２２３、２２４、２３７、２３９、２４１、２４６および２４８（配列番号４に従って番号付けしたものであり、参考文献１１自体の番号付けより６５少ない）が挙げられる。参考文献１１における２つの好ましい残基は、Ｇｌｕ−２１８およびＧｌｕ−２３９である。なぜなら、これらの残基のアラニンへの変異は、タンパク質に「Ｈ因子結合のほぼ完全な除去」をもたらすからである。参考文献１１に列挙されている残基は、（配列番号４のみを参照すると）次のように、本明細書に記載される残基と重複する：４３、１１６、１１９、２２１および２４１。本発明のいくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号３５を含まない。
【００１８】
従って、本発明はポリペプチドであって、（ａ）配列番号４、５もしくは６のいずれか１つとの少なくともｋ％の同一性を有する、および／または配列番号４、５もしくは６のフラグメントを含むが；（ｂ）上の表に列挙したアミノ酸残基の１つ以上が欠失されているか、または異なるアミノ酸によって置換されているアミノ酸配列を含む、ポリペプチドを提供する。（ａ）のフラグメントは、（ｂ）の該当する表中の残基を含む。ポリペプチドは、宿主動物への投与後、配列番号４、５または６からなる野生型髄膜炎菌ポリペプチドを認識することができる抗体を惹起することができる。ポリペプチドは、同じ実験条件下で、（ｂ）の改変（単数または複数）を伴わないこと以外は同じポリペプチドよりもヒトＨ因子に対して低い親和性を有する。
【００１９】
従って、本発明はポリペプチドであって、（ａ）配列番号４との少なくともｋ％の同一性を有する、および／または配列番号４のフラグメントを含むが；（ｂ）上の表に列挙したアミノ酸残基の１つ以上が欠失されているか、または異なるアミノ酸によって置換されているアミノ酸配列を含む、ポリペプチドも提供する。ポリペプチドは、宿主動物への投与後、配列番号４からなる野生型髄膜炎菌ポリペプチドを認識することができる抗体を惹起することができる。ポリペプチドは、同じ実験条件下で、（ｂ）の改変（単数または複数）を伴わないこと以外は同じポリペプチドよりもヒトｆＨに対して低い親和性を有する。ポリペプチドは、同じ実験条件下で、配列番号４からなる野生型髄膜炎菌ポリペプチドよりヒトｆＨに対して低い親和性を有する。
【００２０】
同様に、本発明はポリペプチドであって、（ａ）配列番号５との少なくともｋ％の同一性を有する、および／または配列番号５のフラグメントを含むが；（ｂ）上の表に列挙したアミノ酸残基の１つ以上が欠失されているか、または異なるアミノ酸によって置換されているアミノ酸配列を含む、ポリペプチドを提供する。ポリペプチドは、宿主動物への投与後、配列番号５からなる野生型髄膜炎菌ポリペプチドを認識することができる抗体を惹起することができる。ポリペプチドは、同じ実験条件下で、（ｂ）の改変（単数または複数）を伴わないこと以外は同じポリペプチドよりもヒトｆＨに対して低い親和性を有する。ポリペプチドは、同じ実験条件下で、配列番号５からなる野生型髄膜炎菌ポリペプチドよりヒトｆＨに対して低い親和性を有する。
【００２１】
同様に、本発明はポリペプチドであって、（ａ）配列番号６との少なくともｋ％の同一性を有する、および／または配列番号６のフラグメントを含むが；（ｂ）上の表に列挙したアミノ酸残基の１つ以上が欠失されているか、または異なるアミノ酸によって置換されているアミノ酸配列を含む、ポリペプチドを提供する。ポリペプチドは、宿主動物への投与後、配列番号６からなる野生型髄膜炎菌ポリペプチドを認識することができる抗体を惹起することができる。ポリペプチドは、同じ実験条件下で、（ｂ）の改変（単数または複数）を伴わないこと以外は同じポリペプチドよりもヒトｆＨに対して低い親和性を有する。ポリペプチドは、同じ実験条件下で、配列番号６からなる野生型髄膜炎菌ポリペプチドよりヒトｆＨに対して低い親和性を有する。
【００２２】
ｋ値は、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または９９を超えるものから選択し得る。ｋ値は、好ましくは、９０以上である。
【００２３】
（ａ）のフラグメントは、（ｂ）の該当する表中の残基を含むが、その残基は、該当する配列番号の残基と比較したとき、欠失または置換されている。フラグメントは、一般に、少なくとも７アミノ酸長、例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、２４、２６、２８、４０、４５、５０、５５、６０連続アミノ酸またはそれを超えるものである。フラグメントは、概して配列番号からのエピトープを含む。
【００２４】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号４、５または６に比べて短縮されている、例えば、（配列番号７、８および９の場合のように）Ｎ末端においてポリ−グリシン配列を含めてポリ−グリシン配列まで短縮されている。従って、ポリペプチドは、上の表に列挙したアミノ酸残基の１つ以上が改変されている配列番号７、８または９のいずれか１つとの少なくともｋ％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【００２５】
ｆＨ親和性の低減は、理想的には少なくとも２倍低く（ｌｏｗｅｒ）、例えば、≧５倍、≧１０倍、≧５０倍、≧１００倍などであり、ｆＨ結合が完全に消去され得る。ｆＨ／ｆＨＢＰ相互作用の親和性は、参考文献１０に開示されている方法および試薬を使用して、例えば、固定化ｆＨおよび５０ｎＭの可溶性ｆＨＢＰ（または逆に）を使用して表面プラズモン共鳴により、適切に評価することができる。
【００２６】
本発明は、改変ｆＨＢＰアミノ酸配列を設計するための方法であって、該方法は、（ｉ）出発アミノ酸配列を提供する工程であって、ここで該出発アミノ酸配列からなるか、または該出発アミノ酸配列を含むタンパク質は、ヒトＨ因子に結合することができる工程；（ｉｉ）ペアワイズ・アラインメント・アルゴリズムを用いて、上の表に示した配列番号４、５または６における残基と整列させるアミノ酸残基を該出発アミノ酸配列内で同定する工程；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において同定したアミノ酸を欠失させることにより、または該アミノ酸を異なるアミノ酸で置き換えることにより、改変ｆＨＢＰアミノ酸配列を提供する工程を含む、方法も提供する。工程（ｉｉ）および工程（ｉｉｉ）は１回以上繰り返すことができる。出発アミノ酸配列からなるか、または出発アミノ酸配列を含むタンパク質は、上記方法を行った後、同じタンパク質より高い親和性でヒトＨ因子に結合することができる。出発アミノ酸配列は、野生型の配列であり得、例えば、参考文献４、５、７、８、９、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００および２０１に開示されている野生型または改変または人工ｆＨＢＰアミノ酸配列のいずれかであり得る。例えば、出発アミノ酸配列は、本明細書における配列番号１から９または２０から２２のいずれかであり得る。
【００２７】
本発明は、この方法によって設計された改変ｆＨＢＰアミノ酸配列を含むポリペプチドも提供する。ポリペプチドは、免疫原性であり、ヒトＨ因子に結合することができる。
【００２８】
改変
本発明のポリペプチドは、表に列挙したアミノ酸残基の１つ以上、例えば２、３、４、５つまたは５つより多くの残基での改変を含む。
【００２９】
表に示した残基は、欠失されているか、または異なるアミノ酸によって置換されている。例えば、Ａｓｐ−３７は、他の１９の天然に存在するアミノ酸のいずれかによって置換され得る。置換を行うとき、いくつかの実施形態では、置き換えアミノ酸が、単純なアミノ酸、例えばグリシンまたはアラニンであり得る。他の実施形態では、置き換えアミノ酸は、非保存的である。保存的置換は、次の４群にて行うことができる：（１）酸性、すなわち、アスパルテート、グルタメート；（２）塩基性、すなわち、リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性、すなわち、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性、すなわち、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。いくつかの実施形態では、アラニンによる置換が好ましい。
【００３０】
１つより多くの改変を行うとき、それらの改変を以下のＡ〜Ｄ群より選択し得る：
Ａ：残基１１２、１１６、１１９、１２２および／または１２７
Ｂ：残基４３、４５、５６および／または８３
Ｃ：残基２１１、２１９、２２１および／または２４１
Ｄ：残基１３９、１４１、１４２、１４３および／または１９８。
【００３１】
従って、例えば、残基１１２を改変すべき場合に改変に好ましい第二残基は、１１６、１１９、１２２または１２７であり、残基４３を改変すべき場合に改変に好ましい第二残基は、４５、５６または８３である、などである。
【００３２】
シデロホア結合
ｆＨＢＰは、シデロカリンとの構造相同性を示す。シデロカリンは、エンテロバクチン（細菌シデロホア）に結合することができる。本明細書に示すように、ｆＨＢＰもエンテロバクチンに結合することができる。従って、本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ（例えば、髄膜炎菌）ｆＨＢＰとシデロホアとの複合体を提供する。
【００３３】
シデロホアは、鉄をキレート化することができるシデロホア内のリガンドによって通常は分類される。シデロホアは、カテコーラート、ヒドロキサマートまたはカルボキシラートであり得る。いくつかの実施形態において、シデロホアは、クエン酸ではない。シデロホアをフェリクロム、デスフェリオキサミンＢ、デスフェリオキサミンＥ、フサリニンＣ、オルニバクチン、エンテロバクチン、バシリバクチン、ビブリオバクチン、アゾトバクチン、ピオベルジン、アエロバクチン、サルモケリンまたはエルシニアバクチンから選択することができる。シデロホアは、好ましくはサルモケリンまたはさらに好ましくはエンテロバクチンである。
【００３４】
シデロホアは、キレート化鉄（Ｆｅ３＋）イオン、例えばＦｅ３＋の六配位八面体錯体、を通常は含む。しかし、鉄ではなく、いくつかの実施形態ではシデロホアがアルミニウム、ガリウム、クロム、銅、亜鉛、鉛、マンガン、カドミウム、バナジウム、インジウム、プルトニウムまたはウランのキレート化イオンを含み得る。
【００３５】
本発明は、ポリペプチドであって、（ａ）配列番号４、５もしくは６のいずれか１つとの少なくともｋ％の同一性を有する、および／または配列番号４、５もしくは６のフラグメントを含み、（ｂ）宿主動物への投与後、配列番号４、５または６からなる野生型髄膜炎菌ポリペプチドを認識することができる抗体を惹起することができるが、（ｃ）エンテロバクチンに結合しないアミノ酸配列を含む、ポリペプチドも提供する。ｋの値およびフラグメントの長さは、上記で定義される。
【００３６】
このポリペプチドは、配列番号４と比較して、アミノ酸１０２、１３６−１３８、１４８−１５４、１６６、２０５、２３０および２５４の１つ以上に変異を有し得る。従って、ペアワイズ・アラインメント・アルゴリズムを用いて配列番号４におけるこれらの残基の１つ以上と整列させるポリペプチド内のアミノ酸は、配列番号４におけるアミノ酸残基とは異なる。例えば、Ｌｙｓ−２５４は、非Ｌｙｓ残基によって（例えばアラニンによって）置き換えられ得る。従って、本発明は、例えば、配列番号２９、３０、３１および３２のいずれかを含むポリペプチドを提供する。
【００３７】
本発明は、改変ｆＨＢＰアミノ酸配列を設計するための方法であって、該方法は、（ｉ）出発アミノ酸配列を提供する工程であって、ここで該出発アミノ酸配列からなるか、または該出発アミノ酸配列を含むタンパク質は、ヒトＨ因子およびシデロホアに結合することができる工程；（ｉｉ）シデロホアと相互作用するアミノ酸残基を該出発アミノ酸配列内で同定する工程；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において同定したアミノ酸を欠失させることにより、または該アミノ酸を異なるアミノ酸で置き換えることにより、改変ｆＨＢＰアミノ酸配列を提供する工程を含む、方法も提供する。出発アミノ酸配列は、配列番号４、５または６のいずれか１つとの少なくともｋ％の同一性を有し得る。
【００３８】
ポリペプチド
本発明のポリペプチドは、様々な手段により、例えば化学合成により（少なくとも一部分）、プロテアーゼを使用してより長いポリペプチドを消化することにより、ＲＮＡからの翻訳により、細胞培養物からの（例えば、組換え発現からのまたはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ培養物からの）精製などにより調製することができる。Ｅ．ｃｏｌｉ宿主における異種発現は、好ましい発現経路である。
【００３９】
ｆＨＢＰは、天然にはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおけるリポタンパク質である。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現されるとその天然リーダー配列で脂質付加されることも判っている。本発明のポリペプチドは、脂質付加され得るＮ末端システイン残基を有することがある、例えば、パルミトイル基を含み、通常はトリパルミトイル−Ｓ−グリセリル−システインを形成している。他の実施形態において、前記ポリペプチドは、脂質付加されない。
【００４０】
ポリペプチドは、好ましくは、実質的に純粋なもしくは実質的に単離された形態（すなわち、他のＮｅｉｓｓｅｒｉａもしくは宿主細胞ポリペプチドが実質的に無い）または実質的に単離された形態で調製される。一般に、ポリペプチドは、天然に存在しない環境に提供される、例えば、それらは、それらの天然に存在する環境から分離される。一定の実施形態において、本ポリペプチドは、対照と比較して該ポリペプチドが豊富に存在する組成物で存在する。従って、精製されたポリペプチドを提供し、この場合の精製されたとは、そのポリペプチドが、他の発現ポリペプチドが実質的に無い組成物で存在することを意味し、実質的に無いとは、組成物の９０％未満、通常は６０％未満およびさらに通常は５０％未満を他の発現ポリペプチドが構成することを意味する。
【００４１】
ポリペプチドは、様々な形態（例えば、天然、融合、グリコシル化、非グリコシル化、脂質付加、ジスルフィド架橋など）をとる場合がある。
【００４２】
配列番号４から９は、Ｎ末端メチオニンを含まない。本発明のポリペプチドを生物学的宿主における翻訳によって生産する場合には開始コドンを必要とし、これは、殆どの宿主においてＮ末端メチオニンを提供する。従って、本発明のポリペプチドは、少なくとも発生期には、その配列番号の配列の上流にメチオニン残基を含むであろう。
【００４３】
いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドは、Ｎ末端に単一のメチオニン、そのすぐ後に前記配列番号の配列を有し；他の実施形態では、より長い上流配列を用いることがある。そのような上流配列は、短い（例えば、４０以下のアミノ酸、すなわち、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）こともある。例としては、タンパク質輸送を指示するリーダー配列、またはクローニングもしくは精製を助長する短いペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ、すなわち、Ｈｉｓｎ（この場合、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超える））が挙げられる。他の適するＮ末端アミノ酸配列は、当業者に明らかであろう（例えば、配列番号１、２および３に存在する天然の上流配列）。
【００４４】
本発明のポリペプチドは、前記配列番号の配列の最後のアミノ酸の下流にアミノ酸を含むこともある。そのようなＣ末端伸長部は、短い（例えば、４０以下のアミノ酸、すなわち、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）ことがある。例としては、タンパク質輸送を指示する配列、クローニングを助長する短鎖ペプチド配列もしくは精製を助長する短鎖ペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ、すなわち、Ｈｉｓｎ（この場合、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超える）、を含むもの）、またはポリペプチド安定性を強化する配列が挙げられる。他の適するＣ末端アミノ酸配列は、当業者に明らかであろう。
【００４５】
用語「ポリペプチド」は、任意の長さのアミノ酸ポリマーを指す。前記ポリマーは、線状であるまたは分岐していることがあり、修飾アミノ酸を含むことがあり、および非アミノ酸によって中断されていることもある。この用語は、天然に修飾されている、あるいは介入によって修飾されている（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは改変、例えば標識成分との結合体化）アミノ酸ポリマーも包含する。例えば、当該技術分野において公知の他の改変ばかりでなく、アミノ酸の１つ以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などを含む）を含有するポリペプチドも、この定義の中に含まれる。ポリペプチドは、一本鎖として存在する場合もあり、または会合鎖として存在する場合もある。
【００４６】
本発明のポリペプチドを固体支持体に取り付けるまたは固定することができる。
【００４７】
本発明のポリペプチドは、検出可能標識、例えば放射性標識、蛍光標識、またはビオチン標識、を含み得る。これは、免疫学的検定法に特に有用である。
【００４８】
参考文献１９９に開示されているように、ｆＨＢＰを、Ａ、ＢおよびＣと呼ばれる３つのドメインに分割することができる。配列番号１を例にとると、３つのドメインは、（Ａ）１〜１１９、（Ｂ）１２０〜１８３および（Ｃ）１８４〜２７４である：
【００４９】
【化４】
0005960055.tif 000006
成熟形態のドメイン「Ａ」、そのＮ末端のＣｙｓ−２０からＬｙｓ−１１９まで、を「Ａ成熟」と呼ぶ。多数のｆＨＢＰ配列が公知であり、標準的な方法を用いてこれらを容易に整列することができる。そのようなアラインメントにより、当業者は、（ａ）ＭＣ５８配列内の座標との比較により、任意の所与のｆＨＢＰ配列内のドメイン「Ａ」（および「Ａ成熟」）、「Ｂ」および「Ｃ」を、ならびに（ｂ）例えば置換を同定するために、多数のｆＨＢＰ配列内の単一残基を同定することができる。しかし、参照を容易にするために、それらのドメインを下に定義する：
−  所与のｆＨＢＰ配列内のドメイン「Ａ」は、ペアワイズ・アラインメント・アルゴリズムを用いて配列番号１に整列したとき、配列番号１のＭｅｔ−１に整列されたアミノ酸で開始し、配列番号１のＬｙｓ−１１９に整列されたアミノ酸で終わるその配列のフラグメントである。
−  所与のｆＨＢＰ配列内のドメイン「Ａ成熟」は、ペアワイズ・アラインメント・アルゴリズムを用いて配列番号１に整列したとき、配列番号１のＣｙｓ−２０に整列されたアミノ酸で開始し、配列番号１のＬｙｓ−１１９に整列されたアミノ酸で終わるその配列のフラグメントである。
−  所与のｆＨＢＰ配列内のドメイン「Ｂ」は、ペアワイズ・アラインメント・アルゴリズムを用いて配列番号１に整列したとき、配列番号１のＧｌｕ−１２０に整列されたアミノ酸で開始し、配列番号１のＧｌｙ−１８３に整列されたアミノ酸で終わるその配列のフラグメントである。
−  所与のｆＨＢＰ配列内のドメイン「Ｃ」は、ペアワイズ・アラインメント・アルゴリズムを用いて配列番号１に整列したとき、配列番号１のＬｙｓ−１８４に整列されたアミノ酸で開始し、配列番号１のＧｌｎ−２７４に整列されたアミノ酸で終わるその配列のフラグメントである。
【００５０】
前記ドメインを定義するために好ましいペアワイズ・アラインメント・アルゴリズムは、デフォルトパラメータを用いる（例えば、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列を用いて、ギャップ開始ペナルティ＝１０．０、およびギャップ伸長ペナルティ＝０．５での）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｈグローバル・アラインメント・アルゴリズム［１２］である。このアルゴリズムは、ＥＭＢＯＳＳパッケージの中のｎｅｅｄｌｅツールで適便に実行される［１３］。
【００５１】
いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、そのドメインＡを除去するように短縮される、すなわちドメインＡがＳＥＱ  ＩＤから省かれる。
【００５２】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、Ｎ末端の１０個までのアミノ酸（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）および／またはＣ末端の１０個までのアミノ酸（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）が欠失されることを除いて、上で説明したとおりのアミノ酸配列を含む。
【００５３】
核酸
本発明は、上で定義したとおりの本発明のポリペプチドをコードする核酸を提供する。
【００５４】
本発明の核酸は、多くの方法で、例えば、全部または一部分、化学合成（例えば、ＤＮＡのホスホルアミダイト合成）によって、ヌクレアーゼ（例えば、制限酵素）を使用する、より長い核酸の消化によって、（例えば、リガーゼまたはポリメラーゼを使用して）より短い核酸またはヌクレオチドを接合させることによって、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーから、等々、調製することができる。
【００５５】
本発明の核酸は、様々な形態、例えば、一本鎖形態、二本鎖形態、ベクター形態、プライマー形態、プローブ形態、標識形態、未標識形態などをとる場合がある。
【００５６】
本発明の核酸は、好ましくは、単離されたまたは実質的に単離された形態である。
【００５７】
用語「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにまたそれらの類似体、例えば改変された主鎖を含有するもの、ならびにまたペプチド核酸（ＰＮＡ）などを含む。
【００５８】
本発明による核酸を、例えば放射性または蛍光標識で、標識することができる。
【００５９】
本発明は、本発明のヌクレオチド配列を含む（プラスミドなどの）ベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター、例えば核酸免疫処置に適するもの）、およびそのようなベクターで形質転換された宿主細胞も提供する。
【００６０】
殺菌性応答
本発明の好ましいポリペプチドは、髄膜炎菌に対して殺菌性である抗体応答を惹起することができる。殺菌性抗体応答は、マウスで適便に測定され、ワクチン効力の標準指標である（例えば、参考文献２の文末脚注１４を参照のこと）。本発明のポリペプチドは、好ましくは、以下の３群の株のうちの少なくとも１つにおける少なくとも１つのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株に対して殺菌性である抗体応答を惹起することができる：
【００６１】
【化５】
0005960055.tif 000007
例えば、ポリペプチドは、血清群Ｂ  Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株ＭＣ５８、ｇｂ１８５およびＮＺ３９４／９８に対して有効な殺菌性応答を惹起することができる。
【００６２】
免疫処置
本発明のポリペプチドは、免疫原性組成物の活性成分として使用することができ、そのため本発明は、本発明のポリペプチドを含む免疫原性組成物を提供する。
【００６３】
本発明は、哺乳動物において抗体応答を高めるための方法も提供し、この方法は、本発明の免疫原性組成物を該哺乳動物に投与することを含む。前記抗体応答は、好ましくは、保護性抗体応答および／または殺菌性抗体応答である。本発明は、そのような方法において使用するための本発明のポリペプチドも提供する。
【００６４】
本発明は、本発明の免疫原性組成物を哺乳動物に投与することを含む、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ（例えば、髄膜炎菌）感染症から哺乳動物を保護するための方法も提供する。
【００６５】
本発明は、医薬として（例えば、免疫原性組成物として、もしくはワクチンとして）または診断用試薬として使用するための本発明のポリペプチドを提供する。本発明は、哺乳動物におけるＮｅｉｓｓｅｒｉａ（例えば髄膜炎菌）感染症を予防するための医薬の製造における本発明の核酸、ポリペプチドまたは抗体の使用も提供する。
【００６６】
前記哺乳動物は、好ましくはヒトである。前記ヒトは、成人または好ましくは小児であり得る。前記ワクチンが予防用のものである場合、前記ヒトは、好ましくは小児（例えば、幼児（ｔｏｄｄｌｅｒ）または乳児）であり、前記ワクチンが治療用のものである場合、前記ヒトは、好ましくは成人である。小児のために意図されたワクチンを、例えば安全性、投薬量、免疫原性などを評価するために、成人に投与することもできる。
【００６７】
前記使用および方法は、髄膜炎（特に、細菌性、例えば髄膜炎菌性、髄膜炎）および菌血症をはじめとする（しかしこれらに限定されない）疾患の予防／処置に特に有用である。
【００６８】
治療的処置の効力は、本発明の組成物の投与後にＮｅｉｓｓｅｒｉａ感染をモニターすることによって試験することができる。予防的処置の効力は、前記組成物投与後にｆＨＢＰに対する免疫応答をモニターすることによって試験することができる。本発明の組成物の免疫原性は、それらを試験被験体（例えば、小児１２〜１６月齢、または動物モデル［１４］）に投与し、その後、血清殺菌性抗体（ＳＢＡ）およびＥＬＩＳＡ力価（ＧＭＴ）をはじめとする標準的なパラメータを測定することによって、決定することができる。これらの免疫応答を一般に組成物投与から約４週間後に測定し、その組成物の投与前に測定した値と比較することとなる。少なくとも４倍または８倍のＳＢＡ増加が好ましい。組成物の１回より多い用量を投与する場合、投与後測定を１回より多く行ってもよい。
【００６９】
本発明の好ましい組成物は、許容可能な割合のヒト被験体についての各抗原性成分に対する血清保護（ｓｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）の基準を超える抗体力価を患者に付与することができる。それより上だと宿主をその抗原に対して血清変換させると考えられる関連抗体力価を有する抗原は周知であり、そのような力価は、ＷＨＯなどの機関によって公表されている。好ましくは、被験体の統計的に有意なサンプルの８０％より多く、さらに好ましくは９０％より多く、さらにいっそう好ましくは９３％より多く、および最も好ましくは９６〜１００％を血清変換させる。
【００７０】
本発明の組成物は、一般に、患者に直接投与されることとなる。直接送達は、非経口注射によって（例えば、皮下的に、腹腔内的に、静脈内的に、筋肉内的に、もしくは組織の間質腔に）、または直腸投与（ｒｅｃｔａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、経口投与、膣投与（ｖａｇｉｎａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、局所投与、経皮投与、鼻腔内投与、眼への投与（ｏｃｕｌａｒ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、耳への投与（ａｕｒａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、肺投与（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）もしくは他の粘膜投与によって達成することができる。大腿または上腕への筋肉内投与が好ましい。注射は針（例えば皮下注射針）によるだろうが、無針注射を代替的に使用してもよい。典型的な筋肉内用量は、約０．５ｍＬである。
【００７１】
本発明を用いて、全身性免疫および／または粘膜免疫を惹起することができる。
【００７２】
投薬処置は、単回用量スケジュールである場合もあり、または多回用量スケジュールである場合もある。多回用量は、初回免疫処置スケジュールおよび／または追加免疫処置スケジュールで用いることができる。初回用量スケジュールの後、追加抗原量スケジュールを行うことができる。初回抗原刺激用量（ｐｒｉｍｉｎｇ  ｄｏｓｅ）間（例えば、４〜１６週の間）および初回抗原刺激（ｐｒｉｍｉｎｇ）と追加抗原刺激（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）の間の適切なタイミングを慣例的に決定することができる。
【００７３】
本発明の免疫原性組成物は、該組成物を受ける患者に有害な抗体の生産をそれ自体が誘導しない任意の物質であり得る、および過度の毒性を伴わずに投与することができる、薬学的に許容され得る担体を一般に含むであろう。薬学的に許容され得る担体としては、水、食塩液、グリセロールおよびエタノールなどの液体を挙げることができる。補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質およびこれらに類するもの、もそのようなビヒクル中に存在する場合がある。適する担体の詳細な論述は、参考文献１５において入手できる。
【００７４】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ感染症は、身体の様々な領域を罹患させるため、本発明の組成物を様々な形態で調製することができる。例えば、前記組成物を注射剤として、液体の溶液または懸濁液いずれかとして、調製することができる。注射前の液体ビヒクルへの溶解（ｓｏｌｕｔｉｏｎ）または懸濁に適する固体形態も調製することができる。前記組成物を局所投与用に、例えば軟膏、クリームまたは粉末として、調製することができる。前記組成物を、経口投与用に、例えば錠剤もしくはカプセルとして、または（場合により着香された）シロップとして、調製する。前記組成物を、微粉末または噴霧剤を使用する肺投与用に、例えば吸入剤として、調製することができる。前記組成物を坐剤またはペッサリーとして調製することができる。前記組成物を鼻、耳または眼投与用に、例えば滴剤（ｄｒｏｐ）として、調製することができる。
【００７５】
前記組成物は、好ましくは無菌である。好ましくは、発熱物質不含である。好ましくは、例えばｐＨ６とｐＨ８の間、一般におおよそｐＨ７に緩衝されている。組成物が水酸化アルミニウム塩を含む場合、ヒスチジン緩衝液を使用することが好ましい［１６］。本発明の組成物は、ヒトに対して等張性であり得る。
【００７６】
免疫原性組成物は、免疫学的有効量の免疫原、ならびに必要に応じて他の指定成分のうちの任意の他のものを含む。「免疫学的有効量」とは、単回用量でのまたは一連の投与の一部としての個体に対するその量の投与が、処置または予防に有効であることを意味する。この量は、処置を受ける個体の健康および身体の状態、年齢、処置を受ける個体の分類群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、抗体を合成する個体の免疫系の能力、所望される保護の程度、ワクチンの処方、処置する医師の病状についての評価、および他の関連因子に依存して様々である。その量は比較的広い範囲になると予想され、慣例的な試行を通してそれを決定することができる。投薬処置は、単回用量スケジュールである場合もあり、または多回用量スケジュール（例えば、追加抗原量を含む）である場合もある。前記組成物を他の免疫調節剤と共に投与することができる。
【００７７】
本発明の組成物に使用することができるアジュバントとしては、以下のものが挙げられるが、それらに限定されない：
Ａ．無機質含有組成物
本発明におけるアジュバントとしての使用に適する無機質含有組成物としては、無機塩類、例えばアルミニウム塩およびカルシウム塩が挙げられる。本発明は、無機塩類、例えば、水酸化物（例えば、オキシ水酸化物）、リン酸塩（例えば、ヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩）、硫酸塩など［例えば、参考文献１７の第８および９章参照］、または異なる無機質化合物の混合物を含み、前記化合物は、任意の適する形態（例えば、ゲル、結晶質、非晶質など）をとり、吸着が好ましい。前記無機質含有組成物を金属塩の粒子として調合することもできる［１８］。
【００７８】
有用なリン酸アルミニウムアジュバントは、０．６ｍｇ  Ａｌ３＋／ｍＬで含まれる、０．８４と０．９２の間のＰＯ４／Ａｌモル比を有する非晶質ヒドロキシリン酸アルミニウムである。
【００７９】
Ｂ．油エマルジョン（ｏｉｌ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ）
本発明におけるアジュバントとしての使用に適する油エマルジョン組成物としては、水中スクアレン型エマルジョン、例えばＭＦ５９［参考文献１７の第１０章；参考文献１９も参照のこと］（マイクロフルイダイザーを使用してサブミクロン粒子に調合された、５％スクアレン、０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、および０．５％  Ｓｐａｎ  ８５）が挙げられる。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を使用することもできる。
【００８０】
有用な水中油型エマルジョンは、少なくとも１つの油および少なくとも１つの界面活性剤を代表的に含み、該油（単数または複数）および界面活性剤（単数または複数）は、生分解性（代謝性）および生体適合性である。前記エマルジョン中の油滴は、一般に、直径が１μｍ未満であり、マイクロフルイダイザーでこれらの小さなサイズを達成して、適するエマルジョンを生じさせる。２２０ｎｍ未満のサイズを有する液滴は、濾過滅菌に付すことができるので、好ましい。
【００８１】
前記エマルジョンは、動物（例えば魚類）または植物の供給源からのものなどの油を含むことができる。植物油の供給源としては、堅果、種子および穀粒が挙げられる。ラッカセイ油、ダイズ油、ヤシ油およびオリーブ油が、最も一般的に利用できる堅果油の例である。例えばホホバ豆から得られる、ホホバ油を使用することができる。種子油としては、紅花油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油およびこれらに類するものが挙げられる。穀粒の群の中で、トウモロコシ油が最も容易に入手できるが、他の穀物粒、例えばコムギ、オートムギ、ライムギ、イネ、テフ、ライコムギおよびこれらに類するものの油も使用することができる。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０炭素脂肪酸エステルは、種子油中に天然に存在しないが、堅果油および種子油から出発して適切な材料の加水分解、分離およびエステル化によって調製することができる。哺乳動物の乳からの脂肪および油は代謝性であり、従って、本発明の実施の際に使用することができる。動物源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、鹸化および他の手段についての手順は、当該技術分野において周知である。殆どの魚類は、容易に回収できる代謝性の油を含有する。例えば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨油、例えば鯨ろうが、ここで使用することができる魚油のいくつかの例である。多数の分岐鎖油が５炭素イソプレン単位で生化学的に合成されており、一般にテルペノイドと呼ばれる。サメ肝油は、スクアレン、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサン、として公知の、分岐した不飽和テルペノイドを含有し、これは、ここで特に好ましい。スクワラン、スクアレンの飽和類似体、も好ましい油である。スクアレンおよびスクワランを含む、魚油は、商業的供給源から容易に入手することができ、または当該技術分野において公知の方法によって得ることができる。他の好ましい油は、トコフェロール（下記参照）である。油の混合物を使用することができる。
【００８２】
界面活性剤をそれらの「ＨＬＢ」（親水親油バランス）によって分類することができる。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、およびさらに好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般にＴｗｅｅｎと呼ばれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；商品名ＤＯＷＦＡＸＴＭで販売されている、エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー、例えば、線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；反復エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が様々であり得るオクトキシノール、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、すなわちｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に興味深い；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；リン脂質、例えばホスファチジルコリン（レシチン）；ノニルフェノールエトキシレート、例えばＴｅｒｇｉｔｏｌＴＭＮＰシリーズ；ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールから誘導されたポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知）、例えばトリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ  ３０）；ならびにソルビタンエステル（一般にＳＰＡＮとして公知）、例えばソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ  ８５）およびソルビタンモノラウレートをはじめとする（しかしこれらに限定されない）界面活性剤と共に用いることができる。非イオン性界面活性剤が好ましい。前記エマルジョンに含めるために好ましい界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ  ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ  ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチンおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。
【００８３】
界面活性剤の混合物、例えばＴｗｅｅｎ  ８０／Ｓｐａｎ  ８５混合物、を使用することができる。ポリオキシエチレンソルビタンエステル、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ  ８０）、とオクトキシノール、例えばｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、の組み合わせも適する。別の有用な組み合わせは、ラウレス９とポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。
【００８４】
界面活性剤の好ましい量（重量％）は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０）０．０１％から１％、特に約０．１％；オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、またはＴｒｉｔｏｎシリーズの他の洗剤）０．００１％から０．１％、特に０．００５％から０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ラウレス９）０．１％から２０％、好ましくは０．１％から１０％および特に０．１％から１％または約０．５％である。
【００８５】
好ましくは、油滴の実質的にすべて（例えば、個数で少なくとも９０％）が、１μｍ未満、例えば、≦７５０ｎｍ、≦５００ｎｍ、≦４００ｎｍ、≦３００ｎｍ、≦２５０ｎｍ、≦２２０ｎｍ、≦２００ｎｍ、またはそれより小さい直径を有する。
【００８６】
スクアレン、Ｔｗｅｅｎ  ８０およびＳｐａｎ８５のうちの１つの特に有用なサブミクロンエマルジョン。前記エマルジョンの体積による組成は、約５％スクアレン、約０．５％ポリソルベート８０および約０．５％  Ｓｐａｎ  ８５である。重量によると、これらの比は、４．３％スクアレン、０．５％ポリソルベート８０および０．４８％  Ｓｐａｎ  ８５になる。このアジュバントは、より詳細に参考文献１７の第１０章および参考文献２２の第１２章に記載されているように、「ＭＦ５９」［１９〜２１］として公知である。このＭＦ５９エマルジョンは、有利には、クエン酸イオン、例えば１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム緩衝液、を含む。
【００８７】
Ｃ．サポニン製剤［参考文献１７の第２２章］
サポニン製剤も本発明においてアジュバントとして使用することができる。サポニンは、広範な植物種の樹皮、葉、茎、根およびさらに花において見つけられるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの不均一な群である。Ｑｕｉｌｌａｉａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ樹木の樹皮からのサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。Ｓｍｉｌａｘ  ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ））、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライダルベール（ｂｒｉｄｅｓ  ｖｅｉｌ））、およびＳａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（ソープルート（ｓｏａｐ  ｒｏｏｔ））からのサポニンを市場で得ることもできる。サポニンアジュバント製剤としては、精製製剤、例えばＱＳ２１、ならびに脂質製剤、例えばＩＳＣＯＭ、が挙げられる。ＱＳ２１は、ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭとして市販されている。
【００８８】
サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製されている。これらの技術を用いて特定の精製画分が同定されており、それらとしては、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃが挙げられる。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の生産方法は参考文献２３に開示されている。サポニン製剤は、コレステロールなどのステロールも含み得る［２４］。
【００８９】
サポニンとコレステロールの組み合わせを用いて、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれるユニークな粒子を形成することができる［参考文献１７の第２３章］。ＩＳＣＯＭは、リン脂質、例えばホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリン、も代表的に含む。任意の公知のサポニンをＩＳＣＯＭに使用することができる。好ましくは、ＩＳＣＯＭは、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣのうちの１つ以上を含む。ＩＳＣＯＭは、参考文献２４〜２６にさらに記載されている。場合により、ＩＳＣＯＭには追加の洗剤がまったく無いことがある［２７］。
【００９０】
サポニン系アジュバントの開発についての総説は、参考文献２８および２９において見つけることができる。
【００９１】
Ｄ．ビロソームおよびウイルス様粒子
ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）も本発明においてアジュバントとして使用することができる。これらの構造は、場合によりリン脂質と併せられたまたはリン脂質を用いて調合された、ウイルス由来の１つ以上のタンパク質を一般に含有する。これらは、一般的に、非病原性、非複製性であり、一般的に、天然ウイルスゲノムを全く含有しない。前記ウイルスタンパク質を組換え産生することができ、または完全なウイルスから単離することができる。ビロソームまたはＶＬＰにおける使用に適するこれらのウイルスタンパク質としては、インフルエンザウイルス（例えば、ＨＡまたはＮＡなど）、Ｂ型肝炎ウイルス（例えば、コアまたはカプシドタンパク質）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡ−ファージ、Ｑβ−ファージ（例えば、コートタンパク質）、ＧＡ−ファージ、ｆｒ−ファージ、ＡＰ２０５ファージ、およびＴｙ（例えば、レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１）に由来するタンパク質が挙げられる。ＶＬＰは、参考文献３０〜３５においてさらに論じられている。ビロソームは、例えば、参考文献３６においてさらに論じられている。
【００９２】
Ｅ．細菌誘導体または微生物誘導体
本発明における使用に適するアジュバントとしては、細菌誘導体または微生物誘導体、例えば、腸内細菌リポ多糖（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、リピドＡ誘導体、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびＡＤＰリボシル化毒素およびその無毒化誘導体が挙げられる。
【００９３】
ＬＰＳの非毒性誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が挙げられる。３ｄＭＰＬは、４、５または６本のアシル化鎖を有する３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの混合物である。３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの好ましい「小粒子」形態は参考文献３７に開示されている。３ｄＭＰＬのそのような「小粒子」は、０．２２μｍ膜による滅菌濾過に充分な小ささである［３７］。他の非毒性ＬＰＳ誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ模倣物、例えばアミノアルキルグルコサミニドリン酸塩誘導体、例えば、ＲＣ−５２９が挙げられる［３８、３９］。
【００９４】
リピドＡ誘導体としては、ＯＭ−１７４などのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉからのリピドＡの誘導体が挙げられる。ＯＭ−１７４は、例えば参考文献４０および４１に、記載されている。
【００９５】
本発明におけるアジュバントとしての使用に適する免疫刺激性オリゴヌクレオチドとしては、ＣｐＧモチーフを含有するヌクレオチド配列（リン酸結合（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｏｎｄ）によってグアノシンに連結された非メチル化シトシンを含有するジヌクレオチド配列）が挙げられる。パリンドローム配列またはポリ（ｄＧ）配列を含有する二本鎖ＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドも免疫刺激性であることが証明されている。
【００９６】
前記ＣｐＧは、ヌクレオチド改変／アナログ、例えばホスホチオエート改変、を含む場合があり、二本鎖または一本鎖である場合がある。参考文献４２、４３および４４には、可能なアナログ置換、例えば、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンでのグアノシンの置き換えが開示されている。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果が、参考文献４５〜５０においてさらに論じられている。
【００９７】
前記ＣｐＧ配列をＴＬＲ９に指向させることができる（例えばモチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴ）［５１］。前記ＣｐＧ配列は、Ｔｈ１免疫応答の誘導に特異的であることがあり（例えば、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮ）、またはＢ細胞応答の誘導にさらに特異的であり得る（例えば、ＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮ）。ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮは、参考文献５２〜５４において論じられている。好ましくは、前記ＣｐＧはＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮである。
【００９８】
好ましくは、前記ＣｐＧオリゴヌクレオチドを、５’末端がレセプター認識に利用できるように、構築する。場合により、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列をそれらの３’末端で付着させて、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成していてもよい。例えば、参考文献５１および５５〜５７を参照のこと。
【００９９】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドなどに基づく特に有用なアジュバントは、ＩＣ３１ＴＭとして公知である［５８］。従って、本発明で使用するアジュバントは、（ｉ）少なくとも１つの（および好ましくは多数の）ＣｐＩモチーフ（すなわち、イノシンに連結してジヌクレオチドを形成しているシトシン）を含むオリゴヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド数１５〜４０の間）と、（ｉｉ）少なくとも１つの（および好ましくは多数の）Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓトリペプチド配列を含むポリカチオン性ポリマー、例えばオリゴペプチド（例えば、アミノ酸数５〜２０の間）との混合物を含み得る。前記オリゴヌクレオチドは、２６−ｍｅｒ配列５’−（ＩＣ）１３−３’（配列番号３３）を含むデオキシヌクレオチドであり得る。前記ポリカチオン性ポリマーは、１１−ｍｅｒアミノ酸配列ＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ（配列番号３４）を含むペプチドであり得る。
【０１００】
細菌のＡＤＰリボシル化毒素およびそれらの無毒化誘導体を本発明においてアジュバントとして使用することができる。好ましくは、前記タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラ（「ＣＴ」）または百日咳（「ＰＴ」）に由来する。粘膜アジュバントとしての無毒化ＡＤＰリボシル化毒素の使用は、参考文献５９に記載されており、非経口アジュバントとしての使用は参考文献６０に記載されている。前記毒素またはトキソイドは、好ましくは、ＡサブユニットとＢサブユニットの両方を含むホロ毒素の形態である。好ましくは、前記Ａサブユニットは、無毒化変異を含み；好ましくは、前記Ｂサブユニットは変異されていない。好ましくは、前記アジュバントは無毒化ＬＴ変異体、例えばＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２およびＬＴ−Ｇ１９２である。アジュバントとしてのＡＤＰリボシル化毒素およびそれらの無毒化誘導体、特にＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２の使用は、参考文献６１〜６８において見つけることができる。有用なＣＴ変異体は、ＣＴ−Ｅ２９Ｈである［６９］。アミノ酸置換に関する数値上の言及は、好ましくは、参考文献７０に示されているＡＤＰリボシル化毒素のＡサブユニットおよびＢサブユニットのアラインメントに基づくものであり、この参考文献はその全体が参照により具体的に本明細書に援用されている。
【０１０１】
Ｆ．ヒト免疫修飾因子（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ）
本発明におけるアジュバントとしての使用に適するヒト免疫修飾因子としては、サイトカイン、例えばインターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２［７１］など）［７２］、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子が挙げられる。好ましい免疫修飾因子は、ＩＬ−１２である。
【０１０２】
Ｇ．生体付着剤（ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅｓ）および粘膜付着剤（ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｅｓ）
生体付着剤および粘膜付着剤もまた、本発明においてアジュバントとして使用することができる。適する生体付着剤としては、エステル化ヒアルロン酸マイクロスフェア［７３］または粘膜付着剤、例えば、ポリ（アクリル酸）の架橋誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖およびカルボキシメチルセルロースが挙げられる。キトサンおよびその誘導体を本発明においてアジュバントとして使用することもできる［７４］。
【０１０３】
Ｈ．マイクロ粒子
マイクロ粒子も本発明においてアジュバントとして使用することができる。生分解性で非毒性である材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）とポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）から形成されるマイクロ粒子（すなわち、直径が約１００ｎｍから約１５０μｍ、さらに好ましくは直径が約２００ｎｍから約３０μｍ、および最も好ましくは直径が約５００ｎｍから約１０μｍの粒子）であって、負電荷を有する表面（例えば、ＳＤＳで）または正電荷を有する表面（例えば、ＣＴＡＢなどのカチオン性洗剤で）を有するように場合により処理されたものであるマイクロ粒子が好ましい。
【０１０４】
Ｉ．リポソーム（参考文献１７の第１３及び１４章）
アジュバントとしての使用に適するリポソーム製剤の例は、参考文献７５〜７７に記載されている。
【０１０５】
Ｊ．ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル製剤
本発明における使用に適するアジュバントは、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル［７８］を含む。そのような製剤は、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤［７９］、ならびに少なくとも１つの追加の非イオン性界面活性剤、例えばオクトキシノール、と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤［８０］をさらに含む。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステオリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン（ｐｏｌｙｏｘｙｔｈｅｙｌｅｎｅ）−８−ステオリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【０１０６】
Ｋ．ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ）
ＰＣＰＰ製剤は、例えば、参考文献８１および８２に記載されている。
【０１０７】
Ｌ．ムラミルペプチド
本発明におけるアジュバントとしての使用に適するムラミルペプチドの例としては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）が挙げられる。
【０１０８】
Ｍ．イミダゾキノロン化合物
本発明におけるアジュバントとしての使用に適するイミダゾキノロン化合物の例としては、参考文献８３および８４にさらに記載されているＩｍｉｑｕａｍｏｄおよびそのホモログ（例えば、「Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ  ３Ｍ」）が挙げられる。
【０１０９】
本発明は、上で特定したアジュバントのうちの１つ以上の態様の組み合わせも含み得る。例えば、以下のアジュバント組成物を本発明において使用することができる：（１）サポニンと水中油型エマルジョン［８５］；（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）［８６］；（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（場合により＋ステロール）［８７］；（５）３ｄＭＰＬと、例えばＱＳ２１および／または水中油型エマルジョンとの組み合わせ［８８］；（６）サブミクロンエマルジョンにミクロ流動化された、またはより大きな粒径のエマルジョンを生じさせるようにボルテックスされた、１０％スクワランと０．４％  Ｔｗｅｅｎ  ８０ＴＭと５％プルロニック−ブロックポリマーＬ１２１とｔｈｒ−ＭＤＰとを含有する、ＳＡＦ；（７）２％スクアレンと、０．２％  Ｔｗｅｅｎ  ８０と、モノホスホリルリピド（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ）Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群からの１つ以上の細菌細胞壁成分とを含有する、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）を含有する、ＲｉｂｉＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）；ならびに（８）１つ以上の無機塩類（例えば、アルミニウム塩）＋ＬＰＳの非毒性誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）。
【０１１０】
免疫刺激剤として作用する他の物質は、参考文献１７の第７章に開示されている。
【０１１１】
水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウムアジュバントの使用が特に好ましく、一般に、抗原は、これらの塩に吸着される。他の好ましいアジュバントの組み合わせとしては、Ｔｈ１およびＴｈ２アジュバント、例えばＣｐＧとミョウバンまたはレシキモドとミョウバン、の組み合わせが挙げられる。リン酸アルミニウムと３ｄＭＰＬの組み合わせを用いてもよい。
【０１１２】
さらなる抗原性成分
本発明の組成物は、改変ｆＨＢＰポリペプチドを含む。これは、組成物が、抗原の複合体も不明確な（ｕｎｄｅｆｉｎｅｄ）混合物も含むべきでない場合、例えば、組成物に外膜小胞を含まないことが好ましい場合、有用である。好ましくは、本発明のポリペプチドを異種宿主において組み換え発現させ、その後、精製する。
【０１１３】
ｆＨＢＰポリペプチドを含むばかりでなく、本発明の組成物は、１つ以上のさらなるＮｅｉｓｅｒｉａ免疫原も含み得る。なぜなら、１細菌あたり１つより多くの免疫原をターゲットにするワクチンは、エスケープ突然変異体を選択する可能性を減少させるからである。従って、組成物は、髄膜炎菌に対して殺菌性である抗体応答を、哺乳動物に投与されたとき、惹起する第二のポリペプチドを含む場合がある。前記第二のポリペプチドは、髄膜炎菌ｆＨＢＰであり得るが、一般的には、ｆＨＢＰではなく、例えば、２８７配列、ＮａｄＡ配列、９５３配列、９３６配列などであり得る。
【０１１４】
前記組成物に含めるための抗原としては、
（ａ）参考文献８９に開示されている４４６の偶数ＳＥＱ  ＩＤ（すなわち、２、４、６、．．．、８９０、８９２）；
（ｂ）参考文献９０に開示されている４５の偶数ＳＥＱ  ＩＤ（すなわち、２、４、６、．．．、８８、９０）；
（ｃ）参考文献３に開示されている、１６７４の偶数ＳＥＱ  ＩＤ２〜３０２０、偶数ＳＥＱ  ＩＤ３０４０〜３１１４、およびすべてのＳＥＱ  ＩＤ３１１５〜３２４１；
（ｄ）参考文献２からの２１６０のアミノ酸配列ＮＭＢ０００１からＮＭＢ２１６０；
（ｅ）任意のサブタイプの、好ましくは組換え発現された、髄膜炎菌ＰｏｒＡタンパク質；または
（ｆ）（ａ）から（ｅ）の改変体、ホモログ、オルソログ、パラログ、変異体など
のうちの１つ以上を含むポリペプチドが挙げられる。
【０１１５】
いずれのそのようなさらなるナイセリア（ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌ）免疫原も、本発明の改変ｆＨＢＰに対して別のポリペプチドとして存在し得るか、または（ｏｆ）改変ｆＨＢＰとの融合ポリペプチドとして存在し得る。例えば、髄膜炎菌９３６ポリペプチドとｆＨＢＰポリペプチドとの融合体は公知である［１００］。
【０１１６】
本発明の組成物は、２８７抗原を含み得る。この２８７抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８について公表されているゲノム配列［９１］の中に、遺伝子ＮＭＢ２１３２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：７２２７３８８；本明細書における配列番号１０）として含まれていた。それ以来、多くの株からの２８７抗原の配列が公表されている。例えば、対立遺伝子形態の２８７は、参考文献９２の図５および１５において、ならびに参考文献３の実施例１３および図２１（そこでは配列番号３１７９から３１８４）で見ることができる。２８７抗原の様々な免疫原性フラグメントも報告されている。本発明での使用に好ましい２８７抗原は、（ａ）配列番号１０との５０％またはそれを超える同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれを超える）を有する、および／または（ｂ）配列番号１０の少なくとも「ｎ」の連続アミノ酸（この場合の「ｎ」は７またはそれを超える（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれを超える））のフラグメントを含む、アミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号１０からのエピトープを含む。本発明の最も有用な２８７抗原は、被験体への投与後、アミノ酸配列である配列番号１０からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合することができる抗体を惹起することができる。本発明での使用に有利な２８７抗原は、被験体への投与後に殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起することができる。
【０１１７】
本発明の組成物は、ＮａｄＡ抗原を含み得る。このＮａｄＡ抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８について公表されているゲノム配列［９１］の中に遺伝子ＮＭＢ１９９４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：７２２７２５６；本明細書における配列番号１１）として含まれていた。それ以来、多くの株からのＮａｄＡ抗原の配列が公表されており、ナイセリア付着因子としてのこのタンパク質の活性は十分に立証されている。ＮａｄＡの様々な免疫原性フラグメントも報告されている。本発明での使用に好ましいＮａｄＡ抗原は、（ａ）配列番号１１との５０％またはそれを超える同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれを超える）を有する、および／または（ｂ）配列番号１１の少なくとも「ｎ」の連続アミノ酸（この場合の「ｎ」は７またはそれを超える（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれを超える））のフラグメントを含む、アミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号１１からのエピトープを含む。本発明の最も有用なＮａｄＡ抗原は、被験体への投与後、アミノ酸配列である配列番号１１からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合することができる抗体を惹起することができる。本発明での使用に有利なＮａｄＡ抗原は、被験体への投与後に殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起することができる。配列番号６が１つのそのようなフラグメントである。
【０１１８】
本発明の組成物は、ＮｓｐＡ抗原を含み得る。このＮｓｐＡ抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８について公表されているゲノム配列［９１］の中に遺伝子ＮＭＢ０６６３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：７２２５８８８；本明細書における配列番号１２）として含まれていた。この抗原は、参考文献９３および９４から従来公知であった。それ以来、多くの株からのＮｓｐＡ抗原の配列が公表されている。ＮｓｐＡの様々な免疫原性フラグメントも報告されている。本発明での使用に好ましいＮｓｐＡ抗原は、（ａ）配列番号１２との５０％またはそれを超える同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれを超える）を有する、および／または（ｂ）配列番号１２の少なくとも「ｎ」の連続アミノ酸（この場合の「ｎ」は７またはそれを超える（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれを超える））のフラグメントを含む、アミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号１２からのエピトープを含む。本発明の最も有用なＮｓｐＡ抗原は、被験体への投与後、アミノ酸配列である配列番号１２からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合することができる抗体を惹起することができる。本発明での使用に有利なＮｓｐＡ抗原は、被験体への投与後に殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起することができる。
【０１１９】
本発明の組成物は、髄膜炎菌ＨｍｂＲ抗原を含み得る。完全長ＨｍｂＲ配列は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８について公表されているゲノム配列［９１］の中に遺伝子ＮＭＢ１６６８（本明細書における配列番号１３）として含まれていた。本発明は、完全長ＨｍｂＲ配列を含むポリペプチドを使用できるが、多くの場合、部分的ＨｍｂＲ配列を含むポリペプチドを使用する。従って、いくつかの実施形態において、本発明に従って使用されるＨｍｂＲ配列は、配列番号１３との少なくともｉ％の配列同一性（この場合のｉの値は、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９であるか、またはそれを超える）を有するアミノ酸配列を含み得る。他の実施形態において、本発明に従って使用されるＨｍｂＲ配列は、配列番号１３からの少なくともｊの連続アミノ酸（この場合のｊの値は、７、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０であるか、またはそれを超える）のフラグメントを含み得る。他の実施形態において、本発明に従って使用されるＨｍｂＲ配列は、（ｉ）配列番号１３との少なくともｉ％の配列同一性を有する、および／または（ｉｉ）配列番号１３からの少なくともｊの連続アミノ酸のフラグメントを含む、アミノ酸配列を含み得る。ｊアミノ酸の好ましいフラグメントは、配列番号１３からのエピトープを含む。そのようなエピトープは、ＨｍｂＲの表面に位置するアミノ酸を通常は含む。有用なエピトープとしては、ヘモグロビンへのＨｍｂＲの結合に関与するアミノ酸を有するものが挙げられる。なぜなら、これらのエピトープに結合する抗体は、宿主ヘモグロビンに結合する細菌の能力を阻止することができるからである。ＨｍｂＲのトポロジー、およびその重要な機能性残基が、参考文献９５の中で研究された。本発明の最も有用なＨｍｂＲ抗原は、被験体への投与後、アミノ酸配列である配列番号１３からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合することができる抗体を惹起することができる。本発明での使用に有利なＨｍｂＲ抗原は、被験体への投与後に殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起することができる。
【０１２０】
本発明の組成物は、ＮｈｈＡ抗原を含み得る。このＮｈｈＡ抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８について公表されているゲノム配列［９１］の中に遺伝子ＮＭＢ０９９２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：７２２６２３２；本明細書における配列番号１４）として含まれていた。例えば参考文献９２および９６以来、多くの株からのＮｈｈＡ抗原の配列が公表されており、ＮｈｈＡの様々な免疫原性フラグメントも報告されている。それはＨｓｆとしても公知である。本発明での使用に好ましいＮｈｈＡ抗原は、（ａ）配列番号１４との５０％またはそれを超える同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれを超える）を有する、および／または（ｂ）配列番号１４の少なくとも「ｎ」の連続アミノ酸（この場合の「ｎ」は７またはそれを超える（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれを超える））のフラグメントを含む、アミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号１４からのエピトープを含む。本発明の最も有用なＮｈｈＡ抗原は、被験体への投与後、アミノ酸配列である配列番号１４からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合することができる抗体を惹起することができる。本発明での使用に有利なＮｈｈＡ抗原は、被験体への投与後に殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起することができる。
【０１２１】
本発明の組成物は、Ａｐｐ抗原を含み得る。このＡｐｐ抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８について公表されているゲノム配列［９１］の中に遺伝子ＮＭＢ１９８５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：７２２７２４６；本明細書における配列番号１５）として含まれていた。それ以来、多くの株からのＡｐｐ抗原の配列が公表されている。Ａｐｐの様々な免疫原性フラグメントも報告されている。本発明での使用に好ましいＡｐｐ抗原は、（ａ）配列番号１５との５０％またはそれを超える同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれを超える）を有する、および／または（ｂ）配列番号１５の少なくとも「ｎ」の連続アミノ酸（この場合の「ｎ」は７またはそれを超える（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれを超える））のフラグメントを含む、アミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号１５からのエピトープを含む。本発明の最も有用なＡｐｐ抗原は、被験体への投与後、アミノ酸配列である配列番号１５からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合することができる抗体を惹起することができる。本発明での使用に有利なＡｐｐ抗原は、被験体への投与後に殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起することができる。
【０１２２】
本発明の組成物は、Ｏｍｐ８５抗原を含み得る。このＯｍｐ８５抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８について公表されているゲノム配列［９１］の中に遺伝子ＮＭＢ０１８２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：７２２５４０１；本明細書における配列番号１６）として含まれていた。それ以来、多くの株からのＯｍｐ８５抗原の配列が公表されている。Ｏｍｐ８５に関するさらなる情報は、参考文献９７および９８において見つけることができる。Ｏｍｐ８５の様々な免疫原性フラグメントも報告されている。本発明での使用に好ましいＯｍｐ８５抗原は、（ａ）配列番号１６との５０％またはそれを超える同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれを超える）を有する、および／または（ｂ）配列番号１６の少なくとも「ｎ」の連続アミノ酸（この場合の「ｎ」は７またはそれを超える（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれを超える））のフラグメントを含む、アミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号１６からのエピトープを含む。本発明の最も有用なＯｍｐ８５抗原は、被験体への投与後、アミノ酸配列である配列番号１６からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合することができる抗体を惹起することができる。本発明での使用に有利なＯｍｐ８５抗原は、被験体への投与後に殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起することができる。
【０１２３】
本発明の組成物は、９３６抗原を含み得る。この９３６抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８について公表されているゲノム配列［９１］の中に遺伝子ＮＭＢ２０９１（本明細書における配列番号１７）として含まれていた。本発明での使用に好ましい９３６抗原は、（ａ）配列番号１７との５０％またはそれを超える同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれを超える）を有する、および／または（ｂ）配列番号１７の少なくとも「ｎ」の連続アミノ酸（この場合の「ｎ」は７またはそれを超える（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれを超える））のフラグメントを含む、アミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号１７からのエピトープを含む。本発明の最も有用な９３６抗原は、被験体への投与後、アミノ酸配列である配列番号１７からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合することができる抗体を惹起することができる。９３６抗原は、ｆＨＢＰの良好な融合パートナーである（例えば、参考文献９９および１００参照）。
【０１２４】
ある組成物は、配列番号１８を含むポリペプチド；配列番号１９を含むポリペプチド；配列番号１７を含む融合ポリペプチドおよび本発明のｆＨＢＰを含み得る（参考文献９９および１００参照）。
【０１２５】
ある組成物は、配列番号１８を含むポリペプチド；配列番号１９のアミノ酸２４−３５０を含むポリペプチド；配列番号１７を含む融合ポリペプチドおよび本発明のｆＨＢＰを含み得る（参考文献９９および１００参照）。
【０１２６】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａポリペプチド抗原に加えて、前記組成物は、他の疾患または感染症に対する免疫処置のための抗原を含むことができる。例えば、前記組成物は、以下のさらなる抗原のうちの１つ以上を含むことができる：
−  Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹからの糖抗原、例えば、血清群Ｃからの参考文献１０１に開示されている糖［参考文献１０２も参照のこと］または参考文献１０３に開示されている糖。
−  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからの糖抗原［例えば、１０４、１０５、１０６］。
−  Ａ型肝炎ウイルスからの抗原、例えば不活化ウイルス［例えば、１０７、１０８］。−  Ｂ型肝炎ウイルスからの抗原、例えば表面抗原および／またはコア抗原［例えば、１０８、１０９］。
−  ジフテリア抗原、例えばジフテリアトキソイド［例えば、参考文献１１０の第３章］例えば、ＣＲＭ１９７変異体［例えば、１１１］。
−  破傷風抗原、例えば破傷風トキソイド［例えば、参考文献１１０の第４章］。
−  Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓからの抗原、例えば、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓからの百日咳ホロ毒素（ＰＴ）および線維状赤血球凝集素（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）（ＦＨＡ）、場合によりペルタクチンおよび／または凝集原２および３との組み合わせでも［例えば、参考文献１１２および１１３］。
−  Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂからの糖抗原［例えば、１０２］。
−  ポリオ抗原（単数または複数）［例えば、１１４、１１５］例えばＩＰＶ。
−  麻疹、耳下腺炎および／または風疹抗原［例えば、参考文献１１０の第９、１０および１１章］。
−  インフルエンザ抗原（単数または複数）［例えば、参考文献１１０の第１９章］、例えば赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質。
−  Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓからの抗原［例えば、１１６］。
−  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）からのタンパク質抗原［例えば、１１７、１１８］。
−  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）からの糖抗原。
−  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群連鎖球菌）からの抗原［例えば、１１８、１１９、１２０］。
−  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓからの抗原［例えば、１２１］。
【０１２７】
前記組成物は、これらのさらなる抗原のうちの１つ以上を含み得る。
【０１２８】
毒性タンパク質抗原を、必要な場合には、無毒化することができる（例えば、化学的および／または遺伝学的手段による百日咳毒素の無毒化［１１３］）。
【０１２９】
ジフテリア抗原を前記組成物に含める場合、破傷風抗原および百日咳抗原も含めることが好ましい。同様に、破傷風抗原を含める場合、ジフテリア抗原および百日咳抗原も含めることが好ましい。同様に、百日咳抗原を含める場合、ジフテリア抗原および破傷風抗原も含めることが好ましい。従って、ＤＴＰの組み合わせが好ましい。
【０１３０】
糖抗原は、好ましくは、結合体の形態である。前記結合体のための担体タンパク質は、より詳細に下で論じる。
【０１３１】
前記組成物中の抗原は、典型的には、それぞれ少なくとも１μｇ／ｍＬの濃度で存在するであろう。一般に、いずれの所与の抗原の濃度も、その抗原に対して免疫応答を惹起するために十分なものであろう。
【０１３２】
本発明の免疫原性組成物は、治療的に（すなわち、既存の感染症を処置するために）使用することもでき、予防的に（すなわち、将来の感染症を防ぐために）使用することもできる。
【０１３３】
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質抗原の使用の代替として、該抗原をコードする核酸（好ましくはＤＮＡ、例えばプラスミド形態のもの）を使用することができる。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、ｆＨＢＰ配列に加えて、髄膜炎菌血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹのうちの１、２、３または４つからの結合体化した莢膜糖抗原を含む。他の実施形態において、本発明の組成物は、ｆＨＢＰ配列に加えて、少なくとも１つの結合体化した肺炎球菌莢膜糖抗原を含む。
【０１３５】
髄膜炎菌血清群Ｙ、Ｗ１３５、ＣおよびＡ
現行の血清群Ｃワクチン（ＭｅｎｊｕｇａｔｅＴＭ［１２２、１０１］、ＭｅｎｉｎｇｉｔｅｃＴＭおよびＮｅｉｓＶａｃ−ＣＴＭ）は、結合体化した糖を含む。ＭｅｎｊｕｇａｔｅＴＭおよびＭｅｎｉｎｇｉｔｅｃＴＭは、ＣＲＭ１９７担体に結合体化したオリゴ糖抗原を有し、これに対してＮｅｉｓＶａｃ−ＣＴＭは、破傷風トキソイド担体に結合体化した（脱−Ｏ−アセチル化した）完全な多糖を用いる。ＭｅｎａｃｔｒａＴＭワクチンは、血清群Ｙ、Ｗ１３５、ＣおよびＡそれぞれからの結合体化した莢膜糖抗原を含有する。
【０１３６】
本発明の組成物は、髄膜炎菌血清群Ｙ、Ｗ１３５、ＣおよびＡのうちの１つ以上からの莢膜糖抗原を含むことがあり、この場合、該抗原は、担体タンパク質（単数もしくは複数）に結合体化している、および／またはオリゴ糖である。例えば、前記組成物は、血清群Ｃ；血清群ＡおよびＣ；血清群Ａ、ＣおよびＷ１３５；血清群Ａ、ＣおよびＹ、血清群Ｃ、Ｗ１３５およびＹからの；または血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹの４つすべてからの莢膜糖抗原を含み得る。
【０１３７】
１用量あたりの各髄膜炎菌糖抗原の典型的な量は、（糖として表して）１μｇと２０μｇの間、例えば約１μｇ、約２．５μｇ、約４μｇ、約５μｇまたは約１０μｇである。
【０１３８】
混合物が、血清群Ａと血清群Ｃの両方からの莢膜糖を含む場合、ＭｅｎＡ糖：ＭｅｎＣ糖の比（ｗ／ｗ）は、１より大きいことがある（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１またはそれより大きい）。
【０１３９】
混合物が、血清群Ｙと血清群ＣおよびＷ１３５の一方または両方とからの莢膜糖を含む場合、ＭｅｎＹ糖：ＭｅｎＷ１３５糖の比（ｗ／ｗ）は、１より大きいことがあり（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１またはそれより大きい）、および／またはＭｅｎＹ糖：ＭｅｎＣ糖の比（ｗ／ｗ）は、１未満であり得る（例えば、１：２、１：３、１；４、１；５、またはそれより低い）。血清群Ａ：Ｃ：Ｗ１３５：Ｙからの糖の好ましい比（ｗ／ｗ）は、１：１：１：１；１：１：１：２；２：１：１：１；４：２：１：１；８：４：２：１；４：２：１：２；８：４：１：２；４：２：２：１；２：２：１：１；４：４：２：１；２：２：１：２；４：４：１：２；および２：２：２：１である。血清群Ｃ：Ｗ１３５：Ｙからの糖の好ましい比（ｗ／ｗ）は、１：１：１；１：１：２；１：１：１；２：１：１；４：２：１；２：１：２；４：１：２；２：２：１および２：１：１である。実質的に等しい質量の各糖を使用することが好ましい。
【０１４０】
莢膜糖をオリゴ糖の形態で使用することができる。これらは、（例えば加水分解による）精製莢膜多糖のフラグメント化（通常は、この後に所望のサイズのフラグメントの精製が続くだろう）によって適便に形成される。
【０１４１】
多糖のフラグメント化は、好ましくは、オリゴ糖における３０未満（例えば、血清群Ａについては１０と２０の間、好ましくはおおよそ１０；血清群Ｗ１３５およびＹについては１５と２５の間、好ましくはおおよそ１５〜２０；血清群Ｃについては１２と２２の間；など）の最終平均重合度（ＤＰ）を生じさせるように行う。ＤＰは、イオン交換クロマトグラフィーによりまたは比色アッセイにより適便に測定することができる［１２３］。
【０１４２】
加水分解を行う場合、一般に、加水分解産物を寸法で分類して、短い長さのオリゴ糖を除去することとなる［１０２］。これは、様々な方法、例えば、限外濾過、その後のイオン交換クロマトグラフィー、で達成することができる。血清群Ａについては好ましくは約６以下の重合度を有するオリゴ糖を除去し、ならびに血清群Ｗ１３５およびＹについては好ましくはおおよそ４未満のものを除去する。
【０１４３】
ＭｅｎｊｕｇａｔｅＴＭにおいて使用されているような、好ましいＭｅｎＣ糖抗原は、参考文献１２２に開示されている。
【０１４４】
糖抗原を化学修飾することができる。これは、血清群Ａについての加水分解の低減に特に有用である［１２４；下記参照］。髄膜炎菌糖の脱−Ｏ−アセチル化を行うことができる。オリゴ糖については、修飾を解重合の前に行ってもよいし、または後に行ってもよい。
【０１４５】
本発明の組成物がＭｅｎＡ糖抗原を含む場合、該抗原は、好ましくは、天然糖上のヒドロキシル基の１つ以上がブロッキング基によって置き換えられている改変糖である［１２４］。この改変は、加水分解に対する耐性を改善する。
【０１４６】
共有結合性結合体化（ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）
本発明の組成物中の莢膜糖は、通常、担体タンパク質（単数または複数）に結合体化している。一般に、結合体化は、糖をＴ非依存性抗原からＴ依存性抗原へ変換させ、したがって免疫学的記憶に初回抗原刺激を充てるので、糖の免疫原性を強化する。結合体化は、小児用ワクチンに特に有用であり、周知の技術である。
【０１４７】
典型的な担体タンパク質は、細菌毒素、例えばジフテリアもしくは破傷風毒素、またはそれらのトキソイドもしくは変異体である。ＣＲＭ１９７ジフテリア毒素変異体［１２５］は有用であり、ＰＲＥＶＮＡＲＴＭ製品における担体である。他の適する担体タンパク質としては、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質複合体［１２６］、合成ペプチド［１２７、１２８］、熱ショックタンパク質［１２９、１３０］、百日咳タンパク質［１３１、１３２］、サイトカイン［１３３］、リンホカイン［１３３］、ホルモン［１３３］、成長因子［１３３］、様々な病原体由来抗原からの多数のヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞エピロープを含む人工タンパク質［１３４］、例えばＮ１９［１３５］、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅからのプロテインＤ［１３６〜１３８］、ニューモリシン［１３９］またはその非毒性誘導体［１４０］、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ［１４１］、鉄取込みタンパク質［１４２］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅからの毒素Ａまたは毒素Ｂ［１４３］、組換えＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａエキソプロテインＡ（ｒＥＰＡ）［１４４］、などが挙げられる。
【０１４８】
任意の適する結合体化反応を、必要に応じて任意の適するリンカーと共に、用いることができる。
【０１４９】
前記糖は、典型的には、結合体化前に活性化または官能化される。活性化は、例えば、シアニル化試薬、例えばＣＤＡＰ（例えば、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリミジニウムテトラフルオロボラート［１４５、１４６など］）を含み得る。他の適する技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性化エステル、ノルボラン（ｎｏｒｂｏｒａｎｅ）、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ−ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵなどを使用する。
【０１５０】
リンカー基による連結は、任意の公知の手順、例えば参考文献１４７および１４８に記載されている手順、を用いて行うことができる。他のタイプの連結は、多糖の還元アミノ化、得られたアミノ基とアジピン酸リンカー基の一方の端とのカップリング、そしてその後、そのアジピン酸リンカー基のもう一方の端へのタンパク質のカップリングを含む［１４９、１５０］。他のリンカーとしては、Ｂ−プロピオンアミド［１５１］、ニトロフェニル−エチルアミン［１５２］、ハロアシルハリド［１５３］、グリコシド連結［１５４］、６−アミノカプロン酸［１５５］、ＡＤＨ［１５６］、Ｃ４からＣ１２部分［１５７］などが挙げられる。リンカーの使用の代替として、直接連結を用いることができる。タンパク質への直接連結は、例えば参考文献１５８および１５９に記載されているような、多糖の酸化、その後のタンパク質での還元アミノ化を含み得る。
【０１５１】
糖へのアミノ基の（例えば、末端＝Ｏ基を−ＮＨ２で置き換えることによる）導入、続いてアジビン酸ジエステル（例えば、アジピン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステル）での誘導体化、そして担体タンパク質との反応を含むプロセスが好ましい。もう１つの好ましい反応は、例えばＭｅｎＡまたはＭｅｎＣについて、プロテインＤ担体でのＣＤＡＰの活性化を用いる。
【０１５２】
外膜小胞
本発明の組成物は、ＯＭＶの典型的な特徴である、抗原の複合体も不明確な混合物も含むべきでないことが好適である。しかし、ｆＨＢＰはＯＭＶの効力を強化することが判っている［６］ので、特に、ＯＭＶ調製に使用される株において本発明のポリペプチドを過剰発現させることにより、本発明をＯＭＶと併用することができる。
【０１５３】
このアプローチは、一般に、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ微小小胞［１６０］、「天然ＯＭＶ」［１６１］、ブレブまたは外膜小胞［例えば、参考文献１６２から１６７、など］の調製を改善するために用いることができる。これらは、例えば免疫原性を増す（例えば免疫原を過剰発現する）ように、毒性を低減するように、莢膜多糖合成を阻害するように、ＰｏｒＡ発現をダウンレギュレートするように、等々、遺伝子操作された細菌から調製することができる［１６８〜１７１］。それらは、高ブレブ形成性の株（ｈｙｐｅｒｂｌｅｂｂｉｎｇ  ｓｔｒａｉｎ）から調製することができる［１７２〜１７５］。非病原性Ｎｅｉｓｓｅｒｉａからの小胞を含み得る［１７６］。ＯＭＶは、洗剤を使用せずに調製することができる［１７７、１７８］。それらは、それらの表面で非Ｎｅｉｓｓｅｒｉａタンパク質を発現することができる［１７９］。それらのＬＰＳを枯渇させることができる。それらを組換え抗原と混合することができる［１６２、１８０］。異なるクラスＩ外膜タンパク質サブタイプ（例えば、３つのサブタイプをそれぞれが提示する２つの異なる遺伝子操作小胞集団を使用して６つの異なるサブタイプ［１８１、１８２］、または３つのサブタイプをそれぞれが提示する３つの異なる遺伝子操作小胞集団を使用して９つの異なるサブタイプ、など）を有する細菌からの小胞を使用することができる。有用なサブタイプとしては、Ｐ１．７，１６；Ｐ１．５−１，２−２；Ｐ１．１９，１５−１；Ｐ１．５−２，１０；Ｐ１．１２−１，１３；Ｐ１．７−２，４；Ｐ１．２２，１４；Ｐ１．７−１，１；Ｐ１．１８−１，３，６が挙げられる。
【０１５４】
さらなる詳細は、下で与える。
【０１５５】
タンパク質発現
細菌発現技術は、当該技術分野において公知である。細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼに結合することおよびコーディング配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３’）転写を開始することができる、任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、コーディング配列の５’末端の近位に通常は存在する転写開始領域を有するだろう。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。細菌プロモーターは、オペレーターと呼ばれる第２のドメインも有することがあり、このドメインは、ＲＮＡ合成が開始する隣接ＲＮＡポリメラーゼ結合部位と重複していることがある。遺伝子リプレッサータンパク質はオペレーターに結合し、それによって特定の遺伝子の転写を阻害することができるので、オペレーターは、ネガティブ調節（誘導性）転写を可能にする。構成的発現は、オペレーターなどのネガティブ調節エレメントの不在下で起こり得る。加えて、遺伝子アクチベータータンパク質結合配列によってポジティブ調節を達成することができ、該配列は、存在する場合には通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列の近位（５’）に存在する。遺伝子アクチベータータンパク質の例は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｌａｃオペロンの転写開始を助けるカタボライト活性化タンパク質（ＣＡＰ）である［Ｒａｉｂａｕｄら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：１７３］。従って、調節発現はポジティブであることまたはネガティブであることがあり、それにより、転写を増進することまたは低減することがある。
【０１５６】
代謝経路酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例として、糖代謝酵素、例えばガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）［Ｃｈａｎｇら（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ  １９８：１０５６］、およびマルトース、に由来するプロモーター配列が挙げられる。さらなる例としては、トリプトファン（ｔｒｐ）などの生合成酵素に由来するプロモーター配列が挙げられる［Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９８０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８：４０５７；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎら（１９８１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９：７３１；米国特許第４，７３８，９２１号；ＥＰ−Ａ−００３６７７６およびＥＰ−Ａ−０１２１７７５］。β−ラクタマーゼ（ｂｌａ）プロモーター系［Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ（１９８１）「Ｔｈｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｍｉｓｔａｋｅｓ．」Ｉｎ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ３（Ｉ．Ｇｒｅｓｓｅｒ編）］、バクテリオファージラムダＰＬ［Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１２８］およびＴ５［米国特許第４，６８９，４０６号］プロモーター系も、有用なプロモーター配列を提供する。興味深いもう１つのプロモーターは、誘導性アラビノースプロモーター（ｐＢＡＤ）である。
【０１５７】
加えて、天然に存在しない合成プロモーターも細菌プロモーターとして機能する。例えば、ある細菌プロモーターまたはバクテリオファージプロモーターの転写活性化配列を、別の細菌プロモーターまたはバクテリオファージプロモーターのオペロン配列と接合して、合成ハイブリッドプロモーターを作ることができる［米国特許第４，５５１，４３３号］。例えば、ｔａｃプロモーターは、ｌａｃリプレセッサーによって調節される、ｔｒｐプロモーター配列とｌａｃオペロン配列の両方から構成されるハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターである［Ａｍａｎｎら（１９８３）Ｇｅｎｅ  ２５：１６７；ｄｅ  Ｂｏｅｒら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２１］。さらに、細菌プロモーターとしては、細菌ＲＮＡポリメラーゼに結合して転写を開始する能力を有する、非細菌起源の天然に存在するプロモーターを挙げることができる。非細菌起源の天然に存在するプロモーターを、適合性ＲＮＡポリメラーゼとカップリングさせて、原核生物においていくつかの遺伝子の高レベルの発現を生じさせることもできる。バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、カップリングされたプロモーター系の一例である［Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；Ｔａｂｏｒら（１９８５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ８２：１０７４］。加えて、ハイブリッドプロモーターは、バクテリオファージプロモーターおよびＥ．ｃｏｌｉオペレーター領域から構成される場合もある（ＥＰ−Ａ−０  ２６７  ８５１）。
【０１５８】
機能性プロモーター配列に加えて、有効なリボソーム結合部位は、原核生物における外来遺伝子の発現にも有用である。Ｅ．ｃｏｌｉの場合、このリボソーム結合部位は、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列と呼ばれ、開始コドン（ＡＴＧ）と該開始コドンの３ヌクレオチド〜１１ヌクレオチド上流に位置する３ヌクレオチド〜９ヌクレオチドの長さの配列とを含む。ＳＤ配列は、該ＳＤ配列とＥ．ｃｏｌｉ  １６Ｓ  ｒＲＮＡの３’との間の塩基対合によってリボソームへのｍＲＮＡの結合を促進すると考えられる［Ｓｔｅｉｔｚら（１９７９）「Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｉｇｎａｌｓ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ．」Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ編）］。弱いリボソーム結合部位を有する真核生物遺伝子および原核生物遺伝子を発現させるために［Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．」Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ］。
【０１５９】
プロモーター配列をＤＮＡ分子と直接連結することができ、この場合、Ｎ末端の第１のアミノ酸は、常に、ＡＴＧ開始コドンによってコードされるメチオニンである。所望される場合には、Ｎ末端のメチオニンを、ブロモシアンとのｉｎ  ｖｉｔｒｏインキュベーションによってまたは細菌メチオニンＮ末端ペプチダーゼとのｉｎ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏインキュベーションによって、タンパク質から切断することができる（ＥＰ−Ａ−０２１９２３７）。
【０１６０】
通常、細菌によって認識される転写終結配列は、翻訳終止コドンに対して３’に位置する、従って、プロモーターと共にコーディング配列に隣接する、調節領域である。これらの配列は、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドに翻訳することができるｍＲＮＡの転写を指示する。転写終結配列は、転写の終結を支援するステムループ構造を形成することができる約５０ヌクレオチドのＤＮＡ配列を含むことが多い。例としては、強力プロモーターを有する遺伝子（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｔｒｐ遺伝子、および他の生合成遺伝子）に由来する転写終結配列が挙げられる。
【０１６１】
通常、プロモーターとシグナル配列（所望される場合）と関心のあるコーディング配列と転写終結配列とを含む、上で説明した成分を、一緒に発現構築物の中に入れる。発現構築物は、多くの場合、レプリコン、例えば、細菌などの宿主中で安定して維持することができる染色体外エレメント（例えば、プラスミド）、中に維持される。レプリコンは複製システムを有するので、発現のためにまたはクローニングおよび増幅のために原核生物宿主中にレプリコンを維持することができる。加えて、レプリコンは、高コピー数プラスミドである場合もあり、低コピー数プラスミドである場合もある。高コピー数プラスミドは、一般に、約５から約２００、通常、約１０から約１５０の範囲のコピー数を有するであろう。高コピー数プラスミドを含有する宿主は、好ましくは、少なくとも約１０、およびさらに好ましくは少なくとも約２０のプラスミドを含有するであろう。高コピー数ベクターまたは低コピー数ベクターのいずれかを、該宿主に対する該ベクターおよび外来タンパク質の効果に依存して選択することができる。
【０１６２】
あるいは、発現構築物を、組み込みベクターを使用して細菌ゲノムに組み込むことができる。組み込みベクターは、通常、該ベクターを組み込むことが可能である細菌染色体に相同な配列を少なくとも１つは含有する。組み込みは、ベクター中の相同ＤＮＡと細菌染色体との組換えの結果として生ずるようである。例えば、様々なＢａｃｉｌｌｕｓ株からのＤＮＡを用いて構築された組み込みベクターは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ染色体に組み込まれる（ＥＰ−Ａ−０１２７３２８）。組み込みベクターはまた、バクテリオファージ配列またはトランスポゾン配列から構成されることもある。
【０１６３】
通常、染色体外発現構築物および組み込み発現構築物は、形質転換された細菌株の選択が可能である選択マーカーを含有することができる。選択マーカーを細菌宿主において発現させることができ、ならびに選択マーカーは、細菌をアンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン（ネオマイシン）およびテトラサイクリンなどの薬物に対して耐性にさせる遺伝子を含むことができる［Ｄａｖｉｅｓら（１９７８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３２：４６９］。選択マーカーは、生合成遺伝子、例えばヒスチジン生合成経路におけるもの、トリプトファン生合成経路におけるものおよびロイシン生合成経路におけるもの、も含むことができる。
【０１６４】
あるいは、上で説明した成分のいくつかを、一緒に形質転換ベクターに入れることができる。形質転換ベクターは、上で説明したように、レプリコン中に維持されるまたは組み込みベクターに発展される選択マーカーから、通常、構成される。
【０１６５】
発現ベクターおよび形質転換ベクター、染色体外レプリコンまたは組み込みベクターのいずれか、は、多数の細菌への形質転換のために開発された。例えば、とりわけ、以下の細菌のための発現ベクターが開発された：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ［Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：５５８２；ＥＰ−Ａ−００３６２５９およびＥＰ−Ａ−００６３９５３；ＷＯ  ８４／０４５４１］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ［Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１２８；Ａｍａｎｎら（１９８５）Ｇｅｎｅ  ４０：１８３；Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；ＥＰ−Ａ−０  ０３６  ７７６、ＥＰ−Ａ−０  １３６  ８２９およびＥＰ−Ａ−０  １３６  ９０７］、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｅｍｏｒｉｓ［Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５］、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ［Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５］、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ［米国特許第４，７４５，０５６号］。
【０１６６】
細菌宿主への外因性ＤＮＡの導入方法は当該分野において周知であり、通常、ＣａＣｌ２または他の薬剤、例えば二価陽イオンおよびＤＭＳＯ、で処理した細菌の形質転換を含む。ＤＮＡをエレクトロポレーションによって細菌細胞に導入することもできる。形質転換手順は、通常、形質転換すべき細菌種によって変わる。例えば、［Ｍａｓｓｏｎら（１９８９）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６０：２７３；Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：５５８２；ＥＰ−Ａ−００３６２５９およびＥＰ−Ａ−００６３９５３；ＷＯ８４／０４５４１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ］、［Ｍｉｌｌｅｒら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８５６；Ｗａｎｇら（１９９０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：９４９，Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ］、［Ｃｏｈｅｎら（１９７３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９：２１１０；Ｄｏｗｅｒら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：６１２７；Ｋｕｓｈｎｅｒ（１９７８）「Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｗｉｔｈ  ＣｏｌＥ１−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｌａｓｍｉｄｓ．Ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｈ．Ｗ．ＢｏｙｅｒおよびＳ．Ｎｉｃｏｓｉａ編）；Ｍａｎｄｅｌら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３：１５９；Ｔａｋｅｔｏ（１９８８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９４９：３１８；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ］、［Ｃｈａｓｓｙら（１９８７）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．４４：１７３  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ］；［Ｆｉｅｄｌｅｒら（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １７０：３８、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ］；［Ａｕｇｕｓｔｉｎら（１９９０）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６６：２０３，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ］、［Ｂａｒａｎｙら（１９８０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４４：６９８；Ｈａｒｌａｎｄｅｒ（１９８７）「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，ｉｎ：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｊ．ＦｅｒｒｅｔｔｉおよびＲ．Ｃｕｒｔｉｓｓ  ＩＩＩ編）；Ｐｅｒｒｙら（１９８１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５；Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５；Ｓｏｍｋｕｔｉら（１９８７）Ｐｒｏｃ．４ｔｈ  Ｅｖｒ．Ｃｏｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １：４１２，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ］参照。
【０１６７】
宿主細胞
本発明は、本発明のポリペプチドを発現する細菌を提供する。前記細菌は、髄膜炎菌であり得る。前記細菌は、前記ポリペプチドを構成的に発現することがあるが、いくつかの実施形態において、発現は、誘導性プロモーターの制御下にあることがある。前記細菌は、前記ポリペプチドを過剰発現することがある（参考文献１８３参照）。前記ポリペプチドの発現は、相変異性（ｐｈａｓｅ  ｖａｒｉａｂｌｅ）でないことがある。
【０１６８】
本発明は、本発明の細菌から調製される外膜小胞も提供する。本発明の細菌から小胞を生産するためのプロセスも提供する。これらの株から調製される小胞は、該小胞内に免疫学的に利用可能な（ｉｍｍｕｎｏａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）形態で存在するはずである本発明のポリペプチドを好ましくは含む、すなわち、本発明の精製ポリペプチドに結合することができる抗体も、該小胞内に存在するポリペプチドには結合できるはずである。
【０１６９】
これらの外膜小胞は、該外膜のタンパク質成分を含む小胞をそこから形成する髄膜炎菌外膜の破壊または髄膜炎菌外膜からのブレブ形成によって得られる、任意のプロテオリポソーム小胞（ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｏｓｏｍｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅ）を含む。従って、この用語は、ＯＭＶ（時として「ブレブ」と呼ぶ）、微小小胞（ＭＶ［１６０］）および「天然ＯＭＶ」（「ＮＯＭＶ」［１６１］）を含む。
【０１７０】
ＭＶおよびＮＯＭＶは、細菌成長中に自発的に形成して培地に放出される、天然に存在する膜小胞である。ＭＶは、ブロス培地でＮｅｉｓｓｅｒｉａを培養すること、（例えば、濾過により、または細胞のみをペレット化し、より小さい小胞はペレット化しない低速遠心分離により）そのブロス培地中の全細胞をより小さなＭＶから分離すること、その後、（例えば、濾過により、ＭＶの示差沈降または凝集により、ＭＶをペレット化する高速遠心分離により）その細胞枯渇培地からＭＶを回収することによって得ることができる。ＭＶの生産に使用するための株は、一般に、培養中に生産されるＭＶの量に基づいて選択することができる。例えば、参考文献１７４および１７５には高いＭＶ生産を有するＮｅｉｓｓｅｒｉａが記載されている。
【０１７１】
ＯＭＶは、細菌から人工的に調製され、洗剤処理を用いて（例えば、デオキシコラートで）または非洗剤手段によって（例えば、参考文献１７８参照）ＯＭＶを調製することができる。ＯＭＶを形成するための技術としては、胆汁酸塩洗剤（例えば、リトコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、デオキシコール酸、コール酸、ウルソコール酸などの塩、デオキシコール酸ナトリウム［１８４および１８５］がＮｅｉｓｓｅｒｉａの処理に好ましい）での、該洗剤を沈殿させない十分な高さのｐＨ［１８６］での、細菌の処理が挙げられる。他の技術は、超音波処理、均質化、微小流動化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓａｔｉｏｎ）、キャビテーション、浸透圧性ショック、粉砕、フレンチプレス、ブレンディングなどのような技術を用いて、実質的に洗剤不在下で行うことができる［１７８］。洗剤をまったく使用しないまたは少ない洗剤を使用する方法は、ＮｓｐＡなどの有用な抗原を保持することができる［１７８］。例えば、ある方法は、約０．５％以下、例えば約０．２％、約０．１％、＜０．０５％または０％、デオキシコール酸塩を有するＯＭＶ抽出緩衝液を使用することがある。
【０１７２】
ＯＭＶ調製の有用なプロセスは、参考文献１８７に記載されており、高速遠心分離ではなくその代わりに粗製のＯＭＶの限外濾過を含む。このプロセスには、限外濾過後の超遠心分離の段階が含まれる。
【０１７３】
本発明で使用するための小胞は、任意の髄膜炎菌株から調製することができる。前記小胞は、通常は血清群Ｂ株からのものであるが、Ａ、Ｃ、Ｗ１３５またはＹなどのＢ以外の血清群からそれらを調製することが可能である（例えば、参考文献１８６には血清群Ａについてのプロセスが開示されている）。前記株は、任意の血清型（例えば、１、２ａ、２ｂ、４、１４、１５、１６など）、任意の血清亜型、および任意の免疫型（例えば、Ｌ１；Ｌ２；Ｌ３；Ｌ３，３，７；Ｌ１０；など）のものであり得る。前記髄膜炎菌は、超侵襲性および超強毒性系統、例えば、次の７つの超強毒性系統：亜群Ｉ；亜群ＩＩＩ；亜群ＩＶ−１；ＥＴ−５複合体；ＥＴ−３７複合体；Ａ４クラスター；系統３を含めて、任意の適する系統からのものであり得る。
【０１７４】
本発明の細菌は、本発明のポリペプチドをコードすることに加えて、１つ以上のさらなる改変を有することがある。例えば、それらは、改変ｆｕｒ遺伝子［１８８］を有することがある。ｎｓｐＡ発現が、付随するｐｏｒＡとｃｐｓのノックアウトでアップレギュレートされ得る。さらに、ＯＭＶ生産のためのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのノックアウト変異体が、例えば、参考文献１９３に開示されている。参考文献１８９には、６つの異なるＰｏｒＡサブタイプを発現するように改変された株からの小胞の構築が開示されている。ＬＰＳ生合成に関与する酵素のノックアウトによって達成される低い内毒素レベルを有する変異体Ｎｅｉｓｓｅｒｉａも使用することができる［１９０、１９１］。これらまたは他の変異体は、すべて、本発明で使用することができる。
【０１７５】
従って、本発明で使用する株は、いくつかの実施形態では、１つより多くのＰｏｒＡサブタイプを発現することができる。６価および９価のＰｏｒＡ株が以前に構築されている。株は、ＰｏｒＡサブタイプ：Ｐ１．７，１６；Ｐ１．５−１，２−２；Ｐ１．１９，１５−１；Ｐ１．５−２，１０；Ｐ１．１２−１，１３；Ｐ１．７−２，４；Ｐ１．２２，１４；Ｐ１．７−１，１および／またはＰ１．１８−１，３，６のうちの２、３、４、５、６、７、８または９つを発現することができる。他の実施形態において、株はＰｏｒＡ発現についてダウンレギュレートされていることがあり、例えば、この場合、ＰｏｒＡの量は、野生型レベルに比べて（例えば株Ｈ４４／７６に比べて）、少なくとも２０％（例えば、≧３０％、≧４０％、≧５０％、≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧９０％、≧９５％、など）低減されており、またはノックアウトされていることさえある。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、株は、一定のタンパク質を（対応する野生型株に比べて）過剰発現することができる。例えば、株は、ＮｓｐＡ、プロテイン２８７［１６２］、ｆＨＢＰ［１８３］、ＴｂｐＡおよび／またはＴｂｐＢ［１８０］、Ｃｕ，Ｚｎ−スーパーオキシドディスムスターゼ、ＨｍｂＲなどを過剰発現することができる。
【０１７７】
本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を細菌染色体に組み込むことができ、または本発明のポリペプチドをコードする遺伝子は、エピソーム形態で、例えばプラスミド内に、存在することができる。
【０１７８】
有利には、小胞生産のために、前記ポリペプチドの発現が相変異を確実に受けないように髄膜炎菌を遺伝子操作することができる。髄膜炎菌における遺伝子発現の相変異性を低減するまたはそれを無くす方法は、参考文献１９２に開示されている。例えば、遺伝子を構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターの制御下に置くことができ、またはその相変異性の原因となるＤＮＡモチーフを除去または置き換えることによる。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、株は、参考文献１６６、１６８、１７２および１９３に開示されているノックアウト変異および／または過剰発現変異のうちの１つ以上を含み得る。ダウンレギュレーションおよび／またはノックアウトのために好ましい遺伝子としては、以下が挙げられる：
【０１８０】
【化６】
0005960055.tif 000008
変異体株を使用する場合、いくつかの実施形態において、それは、以下の特徴のうちの１つ以上、またはすべて、を有することがある：（ｉ）髄膜炎菌ＬＯＳを短縮するためのダウンレギュレートされたまたはノックアウトされたＬｇｔＢおよび／またはＧａｌＥ；（ｉｉ）アップレギュレートされたＴｂｐＡ；（ｉｉｉ）アップレギュレートされたＮｈｈＡ；（ｉｖ）アップレギュレートされたＯｍｐ８５；（ｖ）アップレギュレートされたＬｂｐＡ；（ｖｉ）アップレギュレートされたＮｓｐＡ；（ｖｉｉ）ノックアウトされたＰｏｒＡ；（ｖｉｉｉ）ダウンレギュレートされたまたはノックアウトされたＦｒｐＢ；（ｉｘ）ダウンレギュレートされたまたはノックアウトされたＯｐａ；（ｘ）ダウンレギュレートされたまたはノックアウトされたＯｐｃ；（ｘｉｉ）欠失されたｃｐｓ遺伝子複合体。短縮されたＬＯＳは、シアリル−ラクト−Ｎ−ネオテトラオースエピトープを含まないものであり得る、例えば、ガラクトース欠損ＬＯＳであり得る。ＬＯＳは、α鎖を有さないことがある。
【０１８１】
小胞の調製に使用する髄膜炎菌株に依存して、それらは、その株の天然ｆＨＢＰ抗原を含むことがあり、または含まないことがある［１９４］。
【０１８２】
ＬＯＳが小胞内に存在する場合、小胞をそのＬＯＳおよびタンパク質成分に連結するように処理することが可能である（「ブレブ内（ｉｎｔｒａ−ｂｌｅｂ）」結合体化［１９３］）。
【０１８３】
一般
用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含する。例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、排他的にＸからなる（ｃｏｎｓｉｓｔ）ことがあり、または何かの追加、例えば、Ｘ＋Ｙ、を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）ことがある。
【０１８４】
数値ｘに関する用語「約」は、任意選択的なものであり、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１８５】
語「実質的に」は、「完全に」を除外しない。例えば、Ｙが「実質的に無い」組成物には、Ｙが完全に無いことがある。必要に応じて、語「実質的に」を本発明の定義から割愛してもよい。
【０１８６】
「配列同一性」は、パラメーター・ギャップ開始ペナルティ＝１２およびギャップ伸長ペナルティ＝１でアフィンギャップ検索を用いて、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）で実行して、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムにより、好ましくは、決定する。
【０１８７】
血清群の後、髄膜炎菌類分類は、血清型、血清亜型そしてその後、免疫型を含み、標準的な命名法により、血清群、血清型、血清亜型、および免疫型をそれぞれコロンで区切って列挙する、例えば、Ｂ：４：Ｐ１．１５：Ｌ３，７，９。血清群Ｂの中には、しばしば疾患を引き起こす（超侵襲性）系統もあり、他の系統より重篤な形態の疾患を引き起こす（超強毒性）系統もあり、疾患をごく稀にしか引き起こさない系統もある。７つの超強毒性系統、すなわち、亜群Ｉ、ＩＩＩおよびＩＶ−１、ＥＴ−５複合体、ＥＴ−３７複合体、Ａ４クラスターおよび系統３、が認知されている。これらは、多座位酵素電気泳動（ＭＬＥＥ）によって定義されているが、髄膜炎菌を分類するために多座位配列タイピング（ＭＬＳＴ）も用いられている。４つの主要な超強毒性クラスターは、ＳＴ３２複合体、ＳＴ４４複合体、ＳＴ８複合体、およびＳＴ１１複合体である。
【０１８８】
一般に、本発明は、特に参考文献４、５、７、８、９、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００および２０１に開示されている様々なｆＨＢＰ配列を包含しない。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
ポリペプチドであって、（ａ）配列番号４、５もしくは６のいずれか１つとの少なくとも９０％の同一性を有する、および／または配列番号４、５もしくは６のフラグメントを含むが；（ｂ）配列番号４、５もしくは６からの下記アミノ酸残基の１つ以上が非存在か、または異なるアミノ酸によって置換されているアミノ酸配列を含み：
【表２】
0005960055.tif 000009
（ｉ）宿主動物への投与後、配列番号４、５または６からなる野生型髄膜炎菌ポリペプチドを認識することができる抗体を惹起することができ、および（ｉｉ）（ｂ）の改変（単数または複数）を伴わないこと以外は同じポリペプチドよりもヒトＨ因子に対して低い親和性を有する、ポリペプチド。
（項目２）
配列番号４との少なくとも９０％の同一性を有する、および／または配列番号４のフラグメントを含み、宿主動物への投与後、配列番号４からなる野生型髄膜炎菌ポリペプチドを認知することができる抗体を惹起することができるアミノ酸配列を含む、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３）
改変ｆＨＢＰアミノ酸配列を設計するための方法であって、該方法は、（ｉ）出発アミノ酸配列を提供する工程であって、ここで該出発アミノ酸配列からなるか、または該出発アミノ酸配列を含むタンパク質は、ヒトＨ因子に結合することができる工程；（ｉｉ）ペアワイズ・アラインメント・アルゴリズムを用いて、項目１に記載の表に列挙したとおりの配列番号４、５または６における残基と整列させるアミノ酸残基を該出発アミノ酸配列
内で同定する工程；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において同定したアミノ酸を欠失させることにより、または該アミノ酸を異なるアミノ酸で置き換えることにより、該改変ｆＨＢＰアミノ酸配列を提供する工程を含む、方法。
（項目４）
（ｉ）項目３に記載の方法によって設計された改変ｆＨＢＰアミノ酸配列、または（ｉｉ）配列番号２３から３２より選択されたアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
（項目５）
項目１、項目２または項目４に記載のポリペプチドをコードする、核酸。
（項目６）
項目１、項目２または項目４のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、プラスミド。
（項目７）
項目６に記載のプラスミドで形質転換された、宿主細胞。
（項目８）
髄膜炎菌細菌である、項目７に記載の宿主細胞。
（項目９）
項目１、項目２または項目４に記載のポリペプチドを含む、項目８に記載の宿主細胞から調製された膜小胞。
（項目１０）
項目１、項目２もしくは項目４に記載のポリペプチドまたは項目９に記載の小胞を含む、免疫原性組成物。
（項目１１）
アジュバントを含む、項目１０に記載の組成物。
（項目１２）
前記アジュバントがアルミニウム塩を含む、項目１１に記載の組成物。
（項目１３）
項目１０〜１２のいずれかに記載の組成物であって、該組成物は、哺乳動物に投与したとき髄膜炎菌に対して殺菌性である抗体応答を惹起する第二のポリペプチドをさらに含むが、但し該第二のポリペプチドが髄膜炎菌ｆＨＢＰでないことを条件とする、組成物。
（項目１４）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹからの結合体化した莢膜糖をさらに含む、項目１０〜１３のいずれかに記載の組成物。
（項目１５）
結合体化した肺炎球菌莢膜糖をさらに含む、項目１０〜１４のいずれかに記載の組成物。
（項目１６）
項目１０〜１５のいずれかに記載の免疫原性組成物を投与することを含む、哺乳動物における抗体応答を高めるための方法。
【発明を実施するための形態】
【０１８９】
ｆＨＢＰ変異
参考文献１０には、配列番号１の位置２３７および２５８のグルタミン酸残基をアラニンに変異させた「Ｅ２８３Ａ、Ｅ３０４Ａ」と呼ばれる変異体ｆＨＢＰが開示されている。表面プラズモン共鳴により二重変異体タンパク質の親和性が未変異タンパク質に比べて２桁より大きく低減されることが示され、試薬を５０ｎＭで使用したとき検出可能な相互作用はなかった。その著者らは、変異体タンパク質のいかなる免疫原性に関しても報告しなかった。
【０１９０】
ＦＡＣＳを用いて、ヒトｆＨの生きている髄膜炎菌への結合を研究した。このアッセイにより、すべての試験株においてｆＨが細菌に結合することを確認した。用量関連結合が明らかであった。ポリクローナル抗ｆＨＢＰとのインキュベーション（１：１００比）は、この結合を阻害できた。
【０１９１】
天然ｆＨＢＰ遺伝子を二重グルタメート変異体で置き換えた変異体株を作った。これらの変異株が評価できるほどｆＨに結合しなかったという参考文献１０の知見をＦＡＣＳにより確認した。ｆＨの結合は、変異株およびΔｆＨＢＰノックアウト株では同様であった。対照的に、抗ｆＨＢＰ血清は、野生型株および変異株に結合したが、ΔｆｈＢＰ株には結合しなかった。
【０１９２】
参考文献１００に開示されているワクチンで免疫したヒト患者から得た血清をＳＢＡアッセイによって組換え株に対する殺菌効力について試験した。（ｉ）野生型ｆＨＢＰまたは（ｉｉ）変異体ｆＨＢＰを有する組換え株の間でＳＢＡ感受性に有意な差は無かった。これらのデータは、ｆＨ結合が殺菌活性に影響を及ぼさないことを示唆している。
【０１９３】
従って、ｆＨに結合するｆＨＢＰの能力をその免疫原性から切り離すことができる。この知見は、ｆＨＢＰを抗原として改善できることを意味する。そのタンパク質を、その免疫原特性を保持しながらｆＨとのその相互作用を最小にするように作製することができる。低減されたｆＨ結合は、例えば、そのタンパク質のエピトープが体内でｆＨによって覆い隠されないこと、例えばそのタンパク質をｆＨによる干渉なく免疫系への提示に最適化することができること、を意味する。
【０１９４】
ＮＭＲ研究
参考文献１０では、Ｘ線結晶学を用いて、ｆＨＢＰとｆＨの補体制御タンパク質（ＣＣＰ）ドメイン６および７との相互作用を研究した。対照的に、ＮＭＲを用いて、ｆＨＢＰとＣＣＰドメイン５から７との溶液相互作用（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）を研究した。ＨＳＱＣを用いて、ヒトｆＨのＣＣＰドメイン５から７を伴うか、または伴わない１５Ｎ標識ｆＨＢＰ（分子比１：１）を分析した。これらの実験によりｆＨと相互作用する残基、またはその相互作用に起因する残基の配座変化（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｃｈａｎｇｅ）を同定した。
【０１９５】
残基３７、３８、４１、４２、４３、４５、５６、８０、８２、８３、８４、８６、８９、９１、９５、１１２、１１５、１１６、１１９、１２１、１２２、１２４、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３９、１４１、１４３、１６０、１６３、１８８、１９８、１９９、２０７、２１０、２１１、２１３、２１９、２２０、２２１、２２３、２３７、２４１、２４２および２４８（配列番号４に従って番号付けした）は、ｆＨ／ｆＨＢＰ相互作用による摂動を受けた（ｐｅｒｔｕｒｂｅｄ）表面露出残基である。残基３１、３２、３６、３９、４０、４４、５７、６４、７４、７６、７８、８０、９３、９６、９７、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０９、１１０、１１１、１２９、１３２、１３５、１５２、１６５、１７７、１７９、１９６、１９８、２０６、２１２、２２４、２２５、２２６、２３６、２３８、２４８、２４９、２５０および２５１も摂動を受けたが、埋没している。
【０１９６】
これらの残基は、ｆＨＢＰのＮ末端ドメインとＣ末端ドメインの両方を含む広大な領域を規定する。注目に値することとして、ｆＨＢＰのＮドメインとＣドメインを接続するリンカー内に位置する表面露出残基（Ｔｈｒ１３９、Ｐｈｅ１４１、Ａｓｐ１４２およびＬｙｓ１４３）およびｆＨＢＰのドメイン−ドメイン界面に位置するいくつかの埋没残基（Ｇｌｎ９７、Ｔｙｒ９９、Ｇｌｎ１０１、Ｈｉｓ１０３、Ｐｈｅ１２９、Ｇｌｙ１３２、Ａｌａ１３５、Ｉｌｅ２２６、Ｇｌｙ２３６、Ｓｅｒ２３７、Ｈｉｓ２４８、Ｉｌｅ２４９、Ｇｌｙ２５０およびＬｅｕ２５１）は摂動を受けた。これは、ｆＨｂｐの分子内転位が複合体形成中に発生することを示唆している。
【０１９７】
溶液中で摂動を受けた表面露出残基の総数は、参考文献１０で見られるものより大きい接触面積を規定するが、そこで見られる残基すべてをなお含有する。２つの重要な例外は、Ｇｌｕ２１８およびＧｌｕ２３９によって代表され、これらは、ＮＭＲ実験ではわずかにしか影響を受けないように想定される。
【０１９８】
配座変化が分子内で発生すると仮定すると、矛盾を説明することができる。遊離ｆＨＢＰの構造と比較した場合にｆＨＢＰのＮおよびＣドメインの逆配向が変化したｆＨＢＰ−ｆＨ複合体についての相互作用のモデルによって、より多い摂動残基数を正当化することができる。他の相違は、ｆＨｂｐとｆＨドメイン７とのさらなる接触に起因し得る。
【０１９９】
変異ｆＨＢＰ配列
ＮＭＲ構造により、ｆＨとのタンパク質の相互作用を低減するようにｆＨＢＰ内で変異させることができる残基が得られる。残基を個々にまたは組み合わせで変異させることができ、結果として生じたタンパク質を、常用のアッセイを用いて、（ｉ）ｆＨ相互作用についておよび（ｉｉ）殺菌抗体を惹起する能力について試験することができる。例えば、ＭＣ５８抗原中の以下の残基をアラニンに変異させて試験する：４３、４５、５６、８３、１１２、１１６、１１９、１２２、１２７、１３９、１４１、１４２、１４３、１９８、２１１、２１９、２２１、２４１。従って、例えば、これらの方法により、配列番号２３から２７を含むタンパク質が得られる。
【０２００】
これらの残基を４つのクラスタ、ＡからＤ、にまとめる：
Ａ：残基１１２、１１６、１１９、１２２、１２７
Ｂ：残基４３、４５、５６、８３
Ｃ：残基２１１、２１９、２２１、２４１
Ｄ：残基１３９、１４１、１４２、１４３、１９８。
【０２０１】
それぞれのクラスタは、ＮＭＲ実験によって同定された残基から主としてなり、それぞれがタンパク質表面の別個の領域を規定する。
【０２０２】
予備実験により、クラスタＡ残基における変異がｆＨ／ｆＨＢＰ結合に影響を及ぼすことが明らかになった。
【０２０３】
同定された残基は、野生型配列における改変だけに適するのではない。例えば、参考文献２０１は、ファミリー間抗ｆＨＢＰ殺菌抗体を惹起する能力を増大させるように改変された形態のｆＨＢＰ（例えば、本明細書における配列番号２０から２２）を開示している。これらのタンパク質は、ＮＭＲ同定残基において、有用な免疫原特性を保持しながらそれらのｆＨ結合活性を増大させるようにさらに改変することができる。例えば、配列番号２０は、配列番号４からのＡｓｐ−３７（配列番号２０自体の番号付けによるＡｓｐ−３０）を含む。この残基を（例えば、配列番号２８を生じさせるために、グリシンに）変異させることができ、（ｉ）参考文献１０の方法を用いて、ｆＨとのその相互作用の親和性を試験することができ、（ｉｉ）参考文献４の方法を用いて、殺菌抗体を惹起するその能力を試験することができる。
【０２０４】
シデロホア結合
ｆＨＢＰは、リポカリンとの強い構造相同性を有するβバレルドメインを含む。髄膜炎菌ｆＨＢＰを４つの異なる鉄負荷シデロホア（エンテロバクチン、サルモケリン、エルシニアバクチン、アエロバクチン）と混合し、トリプシンで消化した。消化パターンは、微量の未消化タンパク質が残存したエンテロバクチンとサルモケリンとの混合物を除き、すべてのサンプルについて対照と同様であった。サイズ排除クロマトグラフィーは、ｆＨＢＰとエンテロバクチンの共溶出を示したが、陰性対照ではこの共溶出は見られなかった。未変性ＰＡＧＥもｆＨＢＰとエンテロバクチンとの相互作用を示した。
【０２０５】
βバレルを含有するｆＨＢＰのＢＣフラグメントもエンテロバクチンと相互作用することができた。
【０２０６】
エンテロバクチンまたはサルモケリンとの２４時間のインキュベーション後、高ＭＷバンドをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって可視化した。これは、シデロホアがｆＨＢＰ二量体化（または三量体化）を媒介していることを示した。
【０２０７】
ＮＭＲ研究により、エンテロバクチンの存在下でシグナルが摂動を受ける残基が明らかになった。配列番号４に従って番号付けすると、残基は１０２、１３６−１３８、１４８−１５４、１６６、２０５、２３０および２５４であった。これらの残基は、すべて、十分に規定された領域に位置する。これは、特異的相互作用を示す。エンテロバクチンをそのβバレル内に結合するシデロカリンとは異なり、ｆＨＢＰは、バレルの外面で相互作用する。特に、ＡｒｇおよびＬｙｓ残基が関与する（Ａｒｇ−１４９、Ａｒｇ−１５３、Ｌｙｓ−２３０、Ｌｙｓ−２５４）。
【０２０８】
エンテロバクチンと相互作用する残基は、ｆＨと相互作用する残基と異なる。従って、ｆＨＢＰは、ｆＨおよびシデロホアに同時に結合し得る。
【０２０９】
固定化ｆＨＢＰを使用するＢｉａｃｏｒｅアッセイによっても、鉄負荷エンテロバクチンとの相互作用が確認された。エンテロバクチンは、マイクロモル濃度の親和性を有して用量依存的様式でｆＨＢＰに結合する。サルモケリン（別のカテコラート）への結合も見られたが、エルシニアバクチンまたはエアロバクチンへの結合は見られなかった。
【０２１０】
ｆＨＢＰを、エンテロバクチンとプレインキュベーションして、およびプレインキュベーションせずに、血清殺菌アッセイで試験した。エンテロバクチンの存在は、殺菌力価に影響を与えなかった。
【０２１１】
シデロホア相互作用を消去するために、アミノ酸残基１０２、１３６−１３８、１４８−１５４、２３０および／または２５４を変異させ得る。この番号付けは、配列番号４によるものであり、配列番号５および６における対応するアミノ酸残基は、アラインメントによって容易に同定することができる。配列番号４を出発点として用いて、例えば残基Ａｒｇ−１４９、Ｔｒｙ−１５２、Ａｒｇ−１５３および／またはＬｙｓ−２５４をアラニンで置換して配列番号２９−３２を生じさせることができる。
【０２１２】
本発明を単なる例として上で説明しており、本発明の範囲および精神を維持しながら変更を加えることができることは理解される。
【０２１３】
【化７】
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【０２１４】
【化８】
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【０２１５】
【化９】
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【０２１６】
【化１０】
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【０２１７】
【化１１】
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【０２１８】
【化１２】
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【配列表】
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