(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
静止期Ｔｒ１細胞集団を同定する方法であって、細胞集団上のＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、およびＣＤ６２Ｌマーカーの細胞表面の発現を検出することを含み、
−ＣＤ４と、
−低レベルのＣＤ１２７と、
−低レベルのＣＤ６２Ｌと、
を発現し、
−ＣＤ２５
を発現しない前記細胞が前記静止期Ｔｒ１細胞である、
方法。
【請求項２】
活性化Ｔｒ１細胞集団を同定する方法であって、細胞集団上のＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、およびＣＤ６２Ｌマーカーの細胞表面の発現を検出することを含み、
−ＣＤ４と、
−ＣＤ２５と、
−低レベルのＣＤ１２７と、
−低レベルのＣＤ６２Ｌと、
を発現する前記細胞が前記活性化Ｔｒ１細胞である、
方法。
【請求項３】
静止期および／または活性化Ｔｒ１細胞集団を単離するための方法であって、
−請求項１または２に記載の、静止期Ｔｒ１細胞集団および／または活性化Ｔｒ１細胞集団を同定することと、
−前記集団を単離することと、
を含む、方法。
【請求項４】
静止期および／または活性化Ｔｒ１細胞における細胞集団を濃縮するための方法であって、
−請求項１または２に記載の前記静止期および／または活性化Ｔｒ１細胞を同定することと、
−前記細胞を選択することと、
を含み、
それによって静止期および／または活性化Ｔｒ１細胞において濃縮された細胞集団が得られ、静止期および／または活性化Ｔｒ１細胞の百分率は、濃縮前の静止期および／または活性化Ｔｒ１細胞の百分率の少なくとも２倍である、
方法。
【請求項５】
静止期Ｔｒ１細胞および／または活性化Ｔｒ１細胞において細胞集団を枯渇させるための方法であって、
−請求項１に記載の前記静止期Ｔｒ１細胞および／または請求項２に記載の前記活性化Ｔｒ１細胞を同定することと、
−前記細胞を枯渇させることと、
を含み、
それによって静止期および／または活性化Ｔｒ１細胞において枯渇された細胞集団が得られ、静止期および／または活性化Ｔｒ１の百分率は、枯渇前の静止期および／または活性化Ｔｒ１細胞の百分率の多くとも０．７５倍である、
方法。
【請求項６】
ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、およびＣＤ６２Ｌの細胞表面の発現を検出するための抗体を含む、静止期および／または活性化Ｔｒ１細胞集団を同定または単離するためのキット。
【請求項７】
請求項１または２に記載の方法に従って、治療の前後で被験者から得られる生物学的試料における静止期および／または活性化Ｔｒ１細胞集団を同定することを含む、被験者における治療の効果をｉｎ  ｖｉｔｒｏでモニタリングするための方法であって、治療後の前記静止期および／または活性化Ｔｒ１細胞集団の増加は治療への反応に対応する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔｒ１細胞、静止期Ｔｒ１細胞及び／または活性化Ｔｒ１細胞を同定及び／または単離する方法、Ｔｒ１細胞、静止期Ｔｒ１細胞及び／または活性化Ｔｒ１細胞の濃縮集団、Ｔｒ１細胞、静止期Ｔｒ１細胞及び／または活性化Ｔｒ１細胞の枯渇集団、並びに慢性の炎症性疾患、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、がん、及び臓器移植の状態を診断または治療するための方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系の恒常性は、浸入する病原体への免疫反応と自己抗原への免疫寛容の間のバランスに依存する。中心及び末梢の耐性は、共に、Ｔ細胞の耐性を誘引及び維持する重要な機構である。ここ１０年、末梢姓の免疫寛容を維持する有意な役割を担うＴ細胞（Ｔｒｅｇ）の調節が大きな注目を集めている。Ｔｒｅｇは、ナチュラルＴｒｅｇ（ｎＴｒｅｇ）と、ＴＧＦβ誘発性Ｔｒｅｇ細胞、Ｔｒ１細胞、及びＴｈ３細胞のような誘発性Ｔｒｅｇ集団といった２つの異なるサブタイプに分けることができることが今や確固として確立されている。それらＴｒｅｇ集団が、末梢性免疫寛容において、主要な役割を担うため、慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、またはアレルギー疾患のような免疫学的条件の診断、影響評価、または処理を促進するよう、それら異なるＴｒｅｇサブセットを同定、単離、及び濃縮することが可能であることは、重要な問題となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
例えば、それら同定のため、ｎＴｒｅｇは、ＣＤ２５の発現によって同定されている。しかし、ＣＤ２５は、通常のＴ細胞の活性化マーカーであり、従って、Ｔｒｅｇ細胞に限定されない。ヒトｎＴｒｅｇの識別における近年の進歩は、細胞表面、またはＦｏｘｐ３、ＣＤ１２７（国際公開第２００７／１４０４７２号）、ＣＤ４５ＲＡ（国際公開第２００７／１１７６０２号）、ＣＤ１３４（国際公開第２００９／０３６５２１号）、及びＣＤ４９ｄ（国際公開第２００９／０４７００３号）のような細胞内マーカーの同定により、作られている。Ｔｒ１細胞に関しては、それら特異的な同定は、未だ困難であり、主に、ＩＬ−１０分泌決定に依存したままである。そのため、より良く、及びより正確にＴｒ１細胞を識別する手段を提供する必要がある。
【０００４】
加えて、Ｔｒ１細胞は、その症状を改善させるため、クローン病患者へＴｒ１細胞の注射するように、細胞治療に有用であることが証明されている。従って、それら細胞治療の点からより正確にＴｒ１細胞を同定及び単離する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、ＣＤ１２７及びＣＤ６２Ｌ細胞表面マーカーを使用して、Ｔｒ１細胞を特異的に同定し得ることを発見している。実際、ＣＤ４マーカー及び任意のＣＤ２５マーカーに加えて、それら２つのマーカーの使用は、通常の静止期及び活性化Ｔ細胞、並びに静止期及び活性化ｎＴｒｅｇの中からＴｒ１細胞を識別することを可能にする。
【０００６】
本発明は、細胞集団において、ＣＤ４、ＣＤ１２７、及びＣＤ６２Ｌマーカーの細胞表面の発現を検出することを含む、Ｔｒ１細胞集団を同定する方法であり、
−ＣＤ４と
−低レベルのＣＤ１２７と、
−低レベルのＣＤ６２Ｌを発現する細胞は、Ｔｒ１細胞である方法を目的の１つとする。
【０００７】
本発明は、細胞集団において、ＣＤ４、ＣＤ２５、及びＣＤ１２７とＣＤ６２Ｌのうち少なくとも１つのマーカーの細胞表面の発現を検出することを含み、静止期Ｔｒ１細胞集団を同定する方法であり、
−ＣＤ４と、
−低レベルのＣＤ１２７とＣＤ６２Ｌのうち少なくとも１つを発現し、
−ＣＤ２５
を発現しない細胞は、静止期Ｔｒ１細胞である方法を別の目的とする。
【０００８】
本発明は、細胞集団において、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、及びＣＤ６２Ｌマーカーの細胞表面の発現を検出することを含む、静止期Ｔｒ１細胞集団を同定する方法であり、
−ＣＤ４と、
−低レベルのＣＤ１２７と、
−低レベルのＣＤ６２Ｌとを発現し、
−ＣＤ２５を発現しない細胞は、静止期Ｔｒ１細胞である方法を別の目的とする。
本発明は、細胞集団において、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、及びＣＤ６２Ｌマーカーの細胞表面の発現を検出することを含む、活性化Ｔｒ１細胞集団を同定する方法であり、
−ＣＤ４と、
−ＣＤ２５と、
−低レベルのＣＤ１２７と、
−低レベルのＣＤ６２Ｌとを発現する細胞は、活性化Ｔｒ１細胞である方法を別の目的とする。
【０００９】
本発明は、本明細書において前述のように、静止期Ｔｒ１細胞集団または活性化Ｔｒ１細胞集団を同定すること、それら集団を単離することを含む、静止期または活性化Ｔｒ１細胞集団を単離する方法を別の目的とする。
【００１０】
本発明は、本明細書において、前述の方法によって得られた静止期Ｔｒ１細胞または活性化Ｔｒ１細胞の単離集団を別の目的とする。
【００１１】
本発明は、本明細書において、前述の方法によって得られたＴｒ１細胞の単離集団を別の目的とする。
【００１２】
本発明は、本明細書において、前述の方法によって得られた静止期Ｔｒ１細胞の単離集団を別の目的とする。
【００１３】
本発明は、本明細書において、前述の方法によって得られた活性化Ｔｒ１細胞の単離集団を別の目的とする。
【００１４】
本発明は、Ｔｒ１細胞において、細胞集団を濃縮する方法であり、
−ＣＤ４、低レベルのＣＤ１２７、及び低レベルのＣＤ６２Ｌを発現する細胞を同定することと、
−その細胞を選出することと、
−それにより、Ｔｒ１細胞において濃縮した細胞集団を得ることとを含み、
Ｔｒ１細胞の割合は、濃縮前のＴｒ１細胞の割合の少なくとも２倍である方法を別の目的とする。
【００１５】
本発明は、静止期Ｔｒ１細胞において、細胞集団を濃縮する方法であり、
−ＣＤ４と、低レベルのＣＤ１２７及びＣＤ６２Ｌのうち少なくとも１つとを発現し、ＣＤ２５を発現しない細胞を同定することと、
−その細胞を選出することと、
−それにより、静止期Ｔｒ１細胞において濃縮した細胞集団を得ることとを含み、
静止期Ｔｒ１細胞の割合は、濃縮前の静止期Ｔｒ１細胞の割合の少なくとも２倍である方法を別の目的とする。
【００１６】
本発明は、活性化Ｔｒ１細胞において、細胞集団を濃縮する方法であり、
−ＣＤ４及びＣＤ２５を発現し、低レベルのＣＤ１２７及び低レベルのＣＤ６２Ｌを発現する細胞を同定することと、
−その細胞を選出することと、
−それにより、活性化Ｔｒ１細胞において濃縮した細胞集団を得ることとを含み、
活性化Ｔｒ１細胞の割合は、濃縮前の活性化Ｔｒ１細胞の割合の少なくとも２倍である方法を別の目的とする。
【００１７】
本発明は、静止期及び／または活性化Ｔｒ１細胞において細胞集団を濃縮する方法であり、本明細書において前述のように、静止期及び／または活性化Ｔｒ１細胞を同定することと、その細胞を選出することと、それにより、静止期及び／または活性化Ｔｒ１細胞において濃縮した細胞集団を得ることとを含み、静止期及び／または活性化Ｔｒ１細胞の割合は、濃縮前の静止期及び／または活性化Ｔｒ１細胞の割合の少なくとも２倍である方法を別の目的とする。
【００１８】
本発明は、本明細書において前述のような方法に従い、得られたＴｒ１細胞、静止期Ｔｒ１細胞、または活性化Ｔｒ１細胞の濃縮した集団を別の目的とする。
【００１９】
本発明は、Ｔｒ１細胞、静止期Ｔｒ１細胞、または活性化Ｔｒ１細胞において細胞集団を枯渇する方法であり、
−本発明に従い、Ｔｒ１細胞、静止期Ｔｒ１細胞、または活性化Ｔｒ１細胞を同定することと、
−その細胞を枯渇することと、
−それにより、Ｔｒ１細胞、静止期Ｔｒ１細胞、または活性化Ｔｒ１細胞において、枯渇した細胞集団を得ることとを含み、
Ｔｒ１細胞、静止期Ｔｒ１細胞、または活性化Ｔｒ１細胞の割合は、枯渇前のＴｒ１細胞、静止期Ｔｒ１細胞、または活性化Ｔｒ１細胞の割合の最大０．５倍である方法を別の目的とする。
【００２０】
本発明は、静止期Ｔｒ１細胞及び／または活性化Ｔｒ１細胞を枯渇する方法であり、本明細書において、前に定義したように、静止期Ｔｒ１細胞及び／または活性化Ｔｒ１細胞を同定することと、その細胞を枯渇することと、それにより、静止期及び／または活性化Ｔｒ１細胞において枯渇した細胞集団を得ることとを含み、
静止期及び／または活性化Ｔｒ１細胞の割合は、枯渇前の静止期及び／または活性化Ｔｒ１細胞の割合の最大０．７５倍である方法を別の目的とする。
【００２１】
本発明は、上述の方法に従い、得られた静止期及び／または活性化Ｔｒ１細胞を枯渇した細胞集団を別の目的とする。
【００２２】
本発明は、上述の方法に従い、得られたＴｒ１細胞、静止期Ｔｒ１細胞、または活性化Ｔｒ１細胞を枯渇した細胞集団を別の目的とする。
【００２３】
本発明は、Ｔｒ１細胞集団、静止期Ｔｒ１細胞集団、または活性化Ｔｒ１細胞集団を同定または単離するキットであり、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ１２７及びＣＤ６２Ｌの細胞表面の発現を検出する手段を含むキットを別の目的とする。
【００２４】
本発明は、本明細書において、前述のような単離された静止期及び／または活性化Ｔｒ１細胞集団、または本明細書において、前述のような濃縮された静止期及び／または活性化Ｔｒ１細胞集団、または本明細書において前述のような静止期及び／または活性化Ｔｒ１細胞を枯渇した細胞集団を含む医薬組成物を別の目的とする。
【００２５】
一実施形態において、本明細書において、前述のような単離された静止期及び／または活性化Ｔｒ１細胞集団、または本明細書において、前述のような濃縮された静止期及び／または活性化Ｔｒ１細胞集団を含む医薬組成物は、感染症または移植またはアレルギー疾患に付随する免疫反応を防ぐまたは処置するためのもの、若しくは、炎症性の症状または自己免疫性の症状を防ぐまたは処置するためのものである。
【００２６】
本発明は、感染症または移植またはアレルギー疾患に付随する免疫反応を防ぐまたは処置するため、若しくは、炎症性の症状または自己免疫性の症状を防ぐまたは処置するための、本明細書において、前述のような単離及び／または濃縮されたＴｒ１細胞、静止期Ｔｒ１細胞または活性化Ｔｒ１細胞を別の目的とする。
【００２７】
本発明は、必要とする被検体において、免疫反応を増大させるため、本明細書において、前述のように、Ｔｒ１細胞、静止期Ｔｒ１細胞、または活性化Ｔｒ１細胞を枯渇した細胞集団を別の目的とする。一実施形態において、その細胞集団は、腫瘍抗原に特異的なＴ細胞集団である。
【００２８】
一実施形態において、本明細書において、前述のような静止期及び／または活性化Ｔｒ１細胞を枯渇した細胞集団を含む医薬組成物は、必要とする被検体において癌を処置するためのものである。別の実施形態において、その細胞集団は、腫瘍抗原に特異的なＴ細胞集団である。
【００２９】
本発明は、必要とする被検体の血液から、Ｔｒ１細胞、静止期Ｔｒ１細胞、または活性化Ｔｒ１細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで枯渇するため、本明細書において前述のように、枯渇する方法を別の目的とする。
【００３０】
本発明は、静止期Ｔｒ１細胞及び活性化Ｔｒ１細胞の混合物を含む医薬組成物であり、その混合物は、本明細書において前述の方法に従い、得られた、単離された静止期Ｔｒ１細胞集団をｉｎ  ｖｉｔｒｏで増やすことにより得られる医薬組成物を別の目的とする。
【００３１】
一実施形態において、その医薬組成物は、感染症または移植またはアレルギー疾患に付随する免疫反応を処置するため、若しくは、炎症性の症状、または自己免疫性の症状を防ぐまたは処置するためのものである。
【００３２】
本発明は、被検体における治療の効果をｉｎ  ｖｉｔｒｏで監視する方法であり、方法は、本明細書において前述の方法に従い、治療前及び治療後に被検体から得られた生物学的試料における静止期及び／または活性化Ｔｒ１細胞集団を同定することを含み、治療後の静止期及び／または活性化Ｔｒ１細胞集団の増加は、治療による反応に対応する方法を別の目的とする。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ＣＤ２５およびＣＤ１２７の表面発現、ならびに、ヒトのｎＴｒｅｇおよびＴｒ１細胞に対するＦｏｘｐ３の細胞内発現。結果が、ＣＤ３およびＣＤ２８分子のライゲーション（Ａｃｔ）を介して刺激された、または静止期状態（Ｒｅｓ）で培養された、４つの異なったＴｒ１およびｎＴｒｅｇ細胞集団上の発現している細胞の平均％として表される。
【図２】ヒトのｎＴｒｅｇおよびＴｒ１細胞上のＣＤ６２Ｌの表面発現。結果が、ＣＤ３およびＣＤ２８分子のライゲーション（Ａｃｔ）を介して刺激された、または静止期（Ｒｅｓ）で培養された、４つの異なったＴｒ１およびｎＴｒｅｇ細胞集団上の発現している細胞の平均％として表される。
【図３Ａ】ヒトのｎＴｒｅｇおよびＴｒ１細胞上のＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２５、およびＣＤ１２７の表面発現。結果が、ＣＤ３およびＣＤ２８分子のライゲーション（Ａｃｔ）を介して刺激された、または静止期（Ｒｅｓ）で培養された、Ｔｒ１およびｎＴｒｅｇ細胞集団の平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表される。
【図３Ｂ】ヒトのｎＴｒｅｇおよびＴｒ１細胞上のＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２５、およびＣＤ１２７のフローサイトメトリ染色の代表的なヒストグラムを示す。
【図４】マウスの活性ｎＴｒｅｇおよびＴｒ１細胞上のＣＤ６２Ｌの表面発現。結果が、発現している細胞の平均％として表される。
【図５Ａ】ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ１２７ｌｏ細胞上のＣＤ６２Ｌの表面発現。
【図５Ｂ】結果が、ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ１２７ｌｏ集団において発言しているＣＤ６２Ｌの細胞の百分率で表される。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以後記載されるような、特異的なサイトカイン分泌特性を特徴とし得る別個の細胞集団である。Ｔｒ１細胞は、抗原に遭遇している未変性なＣＤ４＋Ｔ細胞から分化する。従って、Ｔｒ１細胞は、活性化及び静止期といった２つの状態でｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発見され得る。本明細書において、上述のように、それら集団の特異的な表面の表現型が利用できないため、表面マーカーを使用することによりＴｒ１細胞、特に静止期及び活性化Ｔｒ１細胞を識別することは、現在、不可能である。本発明者らは、驚くべきことに、静止期Ｔｒ１細胞が、以下の表現型ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ１２７ｌｏ／−ＣＤ６２Ｌｌｏ／−を提示し、活性化Ｔｒ１細胞が、以下の表現型ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ／−ＣＤ６２Ｌｌｏ／−を提示することを発見した。通常、静止期Ｔ細胞が高レベルのＣＤ６２Ｌを発現することが当業界において周知であるため、これは、特に驚くべきことであった。
【００３５】
本発明は、ヒトＴｒ１細胞、特に、ヒト静止期Ｔｒ１細胞及びヒト活性化Ｔｒ１細胞を同定、単離、濃縮及び／または枯渇する方法を提供する。
【００３６】
本発明は、また、結果として生じるＴｒ１細胞、静止期Ｔｒ１細胞、及び活性化Ｔｒ１細胞集団または組成物、及び使用方法を提供する。
【００３７】
本発明は、細胞集団において、ＣＤ４、ＣＤ１２７、及びＣＤ６２Ｌマーカーの細胞表面の発現を検出することを含む、Ｔｒ１細胞集団を同定する方法であり、ＣＤ４、低レベルのＣＤ１２７、及び低レベルのＣＤ６２Ｌを発現する細胞は、Ｔｒ１細胞である方法を１つの目的とする。
【００３８】
本発明は、細胞集団において、ＣＤ４、ＣＤ２５、及びＣＤ１２７とＣＤ６２Ｌのうち少なくとも１つのマーカーの細胞表面の発現を検出することを含む、静止期Ｔｒ１細胞集団を同定する方法であり、ＣＤ４、低レベルのＣＤ１２７とＣＤ６２Ｌのうちの少なくとも１つを発現し、ＣＤ２５を発現しない細胞は、静止期Ｔｒ１細胞である方法を別の目的とする。
【００３９】
本発明は、細胞集団において、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、及びＣＤ６２Ｌマーカーの細胞表面の発現を検出することを含む、活性化Ｔｒ１細胞集団を同定する方法であり、ＣＤ４、ＣＤ２５、低レベルのＣＤ１２７、及び低レベルのＣＤ６２Ｌを発現する細胞は、活性化Ｔｒ１細胞である方法を別の目的とする。
【００４０】
本発明は、通常の静止期及び活性化Ｔ細胞、並びにナチュラル制御性静止期及び活性化Ｔ細胞のうち、静止期Ｔｒ１細胞集団及び／または活性化Ｔｒ１細胞集団を同定する方法であり、
静止期Ｔｒ１細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ１２７ｌｏ／−ＣＤ６２Ｌｌｏ／−であり、活性化ＴＲ１細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ／−ＣＤ６２Ｌｌｏ／−である方法を別の目的とする。
【００４１】
本明細書により、本発明者らは、Ｔｒ１細胞がＣＤ４ｍ、ＣＤ１２７、ＣＤ６２Ｌマーカーを使用して、特異的に同定されることを実証する。より詳細には、本発明者らは、また、静止期Ｔｒ１細胞が、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ６２Ｌマーカーを使用し、活性化ｔＲ１細胞から識別され得ることを示す。本明細書において用いられるように、用語「マーカー」は、細胞集団の識別に使用され得る、細胞の表面にあるタンパク質、炭水化物、脂質に関する。
【００４２】
本明細書において用いられるように、用語「発現」は、エンコードされたポリペプチドまたはタンパク質を含む、遺伝子、または遺伝子産物の発現と、ほぼ同じ意味である。遺伝子産物の発現は、例えば、ポリペプチドと結合する１つまたは複数の抗体を使用する免疫測定により、決定され得る。あるいは、遺伝子の発現は、ｍＲＮＡレベルの測定、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＰＣＲにより決定され得る。用語「未変性」は、当業界において周知であり、特異的な抗原に未だ遭遇していない免疫細胞、または細胞集団に関する。未変性のＴ細胞は、静止期細胞である。
【００４３】
用語「静止期」は、当業界において周知であり、増殖せず、サイトカインを産生せず、表面に、ＣＤ２５のような通常の免疫細胞活性化分子を発現しない免疫細胞または細胞集団に関する。静止期Ｔ細胞は、ネイティブＴ細胞またはメモリーＴ細胞であり得る。
【００４４】
用語「活性化」は、当業界において周知であり、増殖し、及び／またはサイトカインを産生し、その表面に、ＣＤ２５のような通常の免疫才能活性化分子を発現する免疫細胞または細胞集団に関する。
【００４５】
特に、Ｔリンパ球において、静止期状態から活性化状態までの流れは、その特異抗原を有するＴ細胞との遭遇により、若しくはサイトカインまたは分裂促進因子を活性化する活性化によって仲介される。
【００４６】
用語「低」または「ｌｏ」、またはＣＤ１２７ｌｏ／−、ＣＤ６２Ｌｌｏ／−、またはＣＤ２５Ｌｌｏ／−のような「ｌｏ／−」は、当業界において公知であり、対象の細胞マーカーの発現レベルに関し、ここで、細胞マーカーの発現レベルは、全体として分析されている細胞集団における細胞マーカーの発現レベルと比較して低い。より詳細には、用語「ｌｏ」は、１つまたは複数の別個の細胞集団よりも低いレベルで細胞マーカーを発現する別個の細胞集団に関する。
【００４７】
用語「高」または「ハイ」または「強陽性（ｂｒｉｇｈｔ）」は、当業界において公知であり、対象の細胞マーカーの発現レベルに関し、ここで、細胞マーカーの発現レベルは、全体として分析している細胞集団における細胞マーカーの発現レベルと比較して、高い。
【００４８】
用語「＋」及び「−」は、当業界において公知であり、対応の細胞マーカーの発現レベルに関し、ここで、「＋」に対応する細胞マーカーの発現レベルは、高い、または中間（「＋／−」とも表す）であり、「−」に対応する細胞マーカーの発現レベルは、低い、またはゼロである。一般的に、染色強度が、上位２、３、４、５％にある細胞は、「ハイ」と呼ばれ、集団の上位半分に入るものは、「＋」であると分類される。蛍光強度５０％以下に入る細胞は、「ｌｏ」細胞と呼ばれ、５％以下のものは、「−」細胞と呼ばれる。
【００４９】
本明細書において用いられるように、用語「ＣＤ１２７」は、「インターロイキン−７受容体」に関し、Ｔｒ１細胞表面にある。ＩＬ−７受容体のα鎖は、文献（例えば、Ｇｏｏｄｗｉｎら（１９９０）  Ｃｅｌｌ  ６０：９４１−９５１）に記載される。ＩＬ−７Ｒは、また、文献において、ＣＤ１２７とも称する。「ＣＤ１２７＋」は、ＣＤ１２７に向かう標識抗体を用いた処理の際、中間にまたは強陽性に染色される細胞に関する。「ＣＤ１２７ｌｏ／−」は、標識ＣＤ１２７抗体に接した際に、わずかに／ぼんやりと染色される、または全く染色されない種類の細胞に関する。一般的に、細胞は、当業者にとって既知であるように、染色強度における容易に識別可能な差に基づき、それらＣＤ１２７の発現レベルに従い、区別される。いくつかの実施形態において、細胞をＣＤ１２７ｌｏ／−細胞と呼ぶためのカットオフは、全ての細胞に観察される蛍光強度分布の点から設定することができ、蛍光強度が、５０％、４０％、３０％、または２０％以下に入る細胞は、ＣＤ１２７ｌｏ／−細胞と呼ぶ。ＣＤ１２７−細胞は、蛍光強度に対して、下位１０パーセント以下に入るものとして選定される。いくつかの実施形態において、染色されるＣＤ１２７の周波数分布は、全ての細胞で得られ、集団曲線は、高染色、及び低染色集団、及び各々の母分布の統計解析の点にから見て、最も統計学的におそらく、それらが属する集団に割り当てられる細胞に一致する。いくつかの実施形態において、ＣＤ１２７ｌｏ／−細胞は、ＣＤ１２７＋細胞よりも、２〜３倍低い強度で染色する。
【００５０】
本明細書において用いられるように、用語「ＣＤ６２Ｌ」は、リンパ球の遊走の決定的な接着分子であるＬ−セレクチンに関する。「ＣＤ６２Ｌ＋」は、ＣＤ６２Ｌに向けられる標識抗体で処理した際に、中間型または強陽性に染色する細胞に関する。「ＣＤ６２Ｌｌｏ／−」は、標識ＣＤ６２Ｌ抗体と接した際に、わずかに／ぼんやりと染色される、または全く染色されない種類の細胞に関する。一般的に、細胞は、当業者に既知であるように、染色強度における容易に識別可能な差に基づく、そのＣＤ６２Ｌ発現レベルに従い区別される。いくつかの実施形態において、細胞をＣＤ６２Ｌｌｏ／−細胞と呼ぶカットオフは、全ての細胞に観察される蛍光強度分布の点から設定することができ、蛍光強度が、５０％、４０％、３０％、または２０％以下に入る細胞は、ＣＤ６２Ｌｌｏ／−細胞と呼ぶ。ＣＤ６２Ｌ−細胞は、蛍光強度に関して、下位１０％パーセント以下に入るものとして選定される。いくつかの実施形態において、染色するＣＤ６２Ｌの周波数分布は、全ての細胞で得られ、集団曲線は、高染色、及び低染色集団、及び各々の母分布の統計解析の点にから見て、最も統計学的におそらく、それらが属する集団に割り当てられる細胞に一致する。いくつかの実施形態において、ＣＤ６２Ｌｌｏ／−細胞は、ＣＤ６２Ｌ＋細胞よりも、２〜３倍低い強度で染色する。
【００５１】
本明細書において用いられるように、用語「ＣＤ４」は、単球及びマクロファージに加え、成熟ヘルパーＴ細胞及び未成熟な胸線細胞に通常発見される細胞表面糖タンパク質に関する。Ｔ細胞において、ＣＤ４は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の共同受容体であり、チロシンキナーゼｌｃｋを補充する。そのＤ１部分を用いて、ＣＤ４は、ＭＨＣクラスＩＩ分子のβ２ドメインに付着できる。「ＣＤ４＋」は、標識抗ＣＤ４抗体と接した際にわずかに染色する細胞に関し、「ＣＤ４−」は、蛍光標識ＣＤ４抗体と接した際に、少なくともわずかに、ぼんやりと染色するまたは全く染色しない種類の細胞に関する。一般的に、細胞は、ＣＤ４染色が、明白に二峰性であるため、染色強度における容易に識別可能な差に基づき、そのＣＤ４発現レベルに従い区別される。いくつかの実施形態において、ＣＤ４染色の強度分布は、全ての細胞に得られ、集団曲線は、高染色、及び低染色集団、及び各々の母分布の統計解析の点にから見て、最も統計学的におそらく、それらが属する集団に割り当てられる細胞に一致する。いくつかの実施形態において、ＣＤ４−細胞は、ＣＤ４＋細胞よりも、２〜３倍低い強度で染色する。
【００５２】
本明細書において用いられるように、用語「ＣＤ２５」は、５５ｋＤの分子量を有する単鎖糖タンパク質、インターロイキン−２受容体のαサブユニットに関する。モノカイン  インターロイキン１の存在下で、抗原または分裂促進因子を有するＴ細胞の活性化に続いて、インターロイキン２（ＩＬ−２）は、急速に合成され、分泌される。これに対応して、Ｔ細胞の亜集団は、ＩＬ−２の高親和性受容体を発現する。それら細胞は、ヘルパー、抑制因子、及び細胞障害性機能を仲介することが可能なＴ細胞集団を増やし、増殖する。ＩＬ−２受容体は、Ｔ細胞にのみ発見されるわけではない。「ＣＤ２５ｈｉ」は、標識抗ＣＤ２５抗体と接した際に強陽性に染色する細胞に関し、「ＣＤ２５＋」は、標識抗ＣＤ２５抗体と接した際、軽度に強陽性に染色する細胞に関し、「ＣＤ２５ｌｏ／−」は、標識ＣＤ２５抗体に接した際、最小陽性に鈍く染色する、または全く染色されない種類の細胞に関する。一般的に、張業者に既知であるように、細胞は、染色強度における差に基づいて、そのＣＤ２５の発現レベルに従い、選定される。いくつかの実施形態において、細胞をＣＤ２５の発現カテゴリーがｈｉ、＋、ｌｏ、または−細胞であると選定するカットオフは、全ての細胞に観察される蛍光強度分布の点から設定することができる。一般的に、染色強度が
上位２、３、４、または５％の細胞は、「ｈｉ」と呼ばれ、細胞集団の上位半分に入るものは、「＋」と分類される。蛍光強度が５０％以下に入る細胞は、ＣＤ２５ｌｏ細胞と呼ばれ、５％以下のものは、ＣＤ２５−細胞と呼ばれる。
【００５３】
本明細書において用いられるように、用語「Ｆｏｘｐ３」は、転写抑制因子として作用すると信じられている核タンパク質Ｆｏｘｐ３に関する（Ｈｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３；Ｙａｓａｙｋｏ，  Ｊ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ，  ２７：６８−７３（２００１）；Ｆｏｎｔｅｎｏｔ，  Ｊ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ４：３３０−３３６（２００３）；Ｋｈａｔｔｒｉ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ４：３３７−３４２（２００３））。細胞内に位置するため、Ｆｏｘｐ３の発現は、標識抗Ｆｏｘｐ３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ｉｎｃまたはＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、細胞内フローサイトメトリにより評価され得る。
【００５４】
本発明に記載されるように、Ｔｒ１細胞は、活性化の点で、高レベルなＩＬ−１０、及び中間レベルなＴＧＦ−βを分泌することが可能である。Ｔｒ１細胞は、高レベルなＩＬ−１０、中間レベルなＴＧＦ−β及び中間レベルなＩＦＮ−γを産生するが、ＩＬ−４またはＩＬ−２はわずか産生するまたは全く産生しないといったその独特のサイトカイン特性によって部分的に、特徴付けられ得る。サイトカイン産生は、通常、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８抗体またはインターロイキン−２、ＰＭＡ＋イオノマイシンのようなＴリンパ球の多クローン性活性化因子を用いた活性化後、細胞の培養で評価される。あるいは、サイトカイン産生は、細胞を示す抗原によって示される特異的なＴ細胞抗原を用いた活性化後、細胞の培養で評価される。高レベルなＩＬ−１０は、少なくとも約５００ｐｇ／ｍｌ、通常、約１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８または２０千ｐｇ／ｍｌ以上またはそれ以上に対応する。中間レベルのＴＧＦ−βは、少なくとも約１０００ｐｇ／ｍｌ、通常、約２００、３００、４００、６００、８００または１０００ｐｇ／ｍｌ以上またはそれ以上に対応する。中間レベルのＩＦＮ−γは、０．１ｐｇ／ｍｌ〜少なくとも４００ｐｇ／ｍｌの間、通常約６００、８００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００または２０００ｐｇ／ｍｌ以上またはそれ以上に含まれる濃度に対応する。わずかまたは、零のＩＬ−４またはＩＬ−２は、約５００ｐｇ／ｍｌ未満、好ましくは約２５０、１００、７５または５０ｐｇ／ｍｌ未満またはそれ以下に対応する。
【００５５】
Ｔｒ１細胞は、操作上、細胞表面マーカーにより特徴付けられ得る。それら細胞表面マーカーは、特異的に細胞表面マーカーに結合する試薬によって認識され得る。例えば、Ｔｒ１細胞の表面にあるタンパク質、炭水化物または脂質は、特定のタンパク質、または炭水化物に特異的な抗体によって、（マーカーへの抗体の使用のため、Ｈａｒｌｏｗ、抗体の使用  （研究室マニュアル（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．  １９９９）参照、また実施例参照）。Ｔｒ１細胞の表面にある、及びそれら細胞の表面にないマーカーの組は、Ｔｒ１細胞に特有である。従って、Ｔｒ１細胞は、細胞表面マーカーを使用して、正及び負の選択により選択され得る。Ｔｒ１細胞によって発現する細胞表面マーカー（「正のマーカー」）に結合する試薬は、Ｔｒ１細胞の正の千楽に使用され得る（すなわち、細胞表面マーカーを発現する細胞を残す）。逆に、負の選択は、特定の細胞表面マーカーがＴｒ１細胞によって発現しない事実に因る。従って、「負のマーカー」（すなわち、マーカーがＴｒ１細胞の細胞表面にない）は、負のマーカーに特異的な試薬に結合する細胞の除去によりＴｒ１細胞にない集団にある細胞の削減に使用され得る。
【００５６】
一実施形態において、検出される細胞表面マーカーの発現に基づく細胞間の識別は、細胞の対照集団による発現平均を用いて、細胞表面マーカーの発現を比較することにより生じる。例えば、Ｔｒ１細胞上のマーカーの発現は、Ｔｒ１細胞と同一の資料由来の他の細胞にある同一のマーカーの発現平均と比較され得る。マーカーの発現による細胞の識別の他の方法は、試薬の組み合わせを使用して、フローサイトメトリにより細胞にゲートをかけることを含む（Ｇｉｖａｎ  Ａ，  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：  Ｆｉｒｓｔ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，  （Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９２）；  Ｏｗｅｎｓ  Ｍ  Ａ  ＆  Ｌｏｋｅｎ  Ｍ  Ｒ．，  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  （Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９５）参照）。
【００５７】
「試薬の組み合わせ」は、Ｔｒ１細胞の表面に存在する（正のマーカー）または存在しない（負のマーカー）細胞表面マーカーに結合する、または正及び負のマーカーの組み合わせに結合する少なくとも２つの試薬を意味する。例えば、Ｔｒ１細胞表面マーカーに特異的な抗体の組み合わせの使用により、様々な試料／組織からＴｒ１細胞を単離及び／または濃縮する。
【００５８】
試料から得られた細胞のうち表現型の特徴に選択することにより、種特異的に多様なマーカーを認識する抗体は、濃縮に使用され、Ｔｒ１細胞を選択する。「濃縮」は、細胞の濃縮された集団にあり、細胞の分画されていない組にマーカーを有する多くの細胞と比較する最、分画細胞組に特定のマーカーを有する数の増加した細胞に基づき、定義され得る。特定の実施形態において、Ｔｒ１細胞は、Ｔｒ１細胞に特異的な細胞表面マーカーに結合する試薬を使用し、例えば、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）、固相磁気ビーズなどのような細胞分類アッセイを使用してそれら細胞を分け、細胞集団から濃縮される。いくつかの実施形態において、細胞を分類する方法の組み合わせ、例えば、磁気選択が使用され得り、その後にＦＡＣＳが続く。濃縮を強くするため、正の選択は、Ｔｒ１細胞の単離のための負の選択と組み合わされる。細胞表面マーカーを使用するＴｒ１細胞の単離／濃縮は、任意の順序で行われ得ることを意図する。従って、正の選択ステップは、負の選択ステップのすぐ先に起こり得り、また、逆であっても良い。単離／濃縮は、正の選択及び負の選択ステップをグループ化することにより行われることをも熟慮する。従って、単離／濃縮は、まず、方法のうち、正の選択ステップを行い、その後、方法のうちの負の選択ステップを行うことにより実行され、また逆であっても良い。
【００５９】
本発明に記載の「抗Ｘ抗体」または「Ｘ抗体」は、Ｘに特異的に結合することができる抗体である。例えば、抗ＣＤ１２７抗体、またはＣＤ１２７抗体は、ＣＤ１２７を結合する。本発明に従い使用する抗体は、組み換え型抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒトモノクローナル抗体、ヒト化または霊長類化モノクローナル抗体及び抗体断片を含むが、これに限定されない。非常に多くの、リンパ球生物マーカー特異抗体は、市販されている。それらは、抗ＣＤ１２７、抗ＣＤ４、抗ＣＤ６２Ｌ、及び抗ＣＤ２５抗体を含む。「抗体」は、抗原と特異的に結合し、認識する免疫グロブリン遺伝子、またはその断片からフレームワーク領域を含むポリペプチドに関する。認識される免疫グロブリン遺伝子は、無数の免疫グロブリン可変領域の遺伝子に加え、κ、λ、α、γ、δ、ε、及びμ  定常領域遺伝子を含む。軽鎖は、κまたはλのいずれかに分類される。重鎖は、γ、δ、ε、またはμに分類され、ここで、順に、免疫グロブリン階級を、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥと定義する。通常、抗体の抗原結合領域は、結合の特異性及び親和性の点で、最も決定的であり得る。例示的な、免疫グロブリン（抗体）の構造単位は、四量体を構成する。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対で構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）及び１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原認識に主に関与する約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を定義する。用語「可変軽鎖」（ＶＬ）及び「可変重鎖」（ＶＨ）は、それぞれ、それら軽鎖及び重鎖に関する。抗体は、例えば、未変化の免疫グロブリンとして、または、多様なペプチターゼを用いた消化により産生する多くの特徴がはっきりした断片として存在する。従って、ペプシンは、ヒンジ領域のジスルフィド結合の下で抗体を消化し、Ｆ（ａｂ）’２を産生し、Ｆａｂの二量体自体は、ジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１と繋がる軽鎖である。Ｆ（ａｂ）’２は、温和な条件下で減らされ得り、ヒンジ領域のジスルフィド結合を切断し、それにより、Ｆ（ａｂ）’２二量体をＦａｂ’単量体に変換する。Ｆａｂ’単量体は、ヒンジ領域の入り部を有する基本的なＦａｂである（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ  ｅｄ．，  ３ｄ  ｅｄ．  １９９３））。様々な抗体断片は、未変化の抗体の消化の点から定義されるが、そのような断片が、化学的に、または組み換えＤＮＡ方法論を使用することのいずれかにより、新規に合成され得ることを当業者は理解するであろう。従って、本明細書において用いられるように、用語「抗体」は、抗体全体を変形すること、または組み換えＤＮＡ方法論（例えば、単鎖Ｆｖ）を使用することにより新規に合成すること、またはファージディスプレイライブラリを使用して同定すること（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４  （１９９０）参照）のいずれかにより、産生される抗体断片をも含む。いくつかの実施形態において、対象物の高親和性リガンドは、抗体に代わり使用され得る。抗体への「特異的（または選択的）結合」及び「〜との特異的な（または選択的な）免疫反応」といった句は、タンパク質またはペプチドに関する場合、タンパク質の存在を確定する、タンパク質及び他の生体物質の不均一な集団にあることもある結合反応に関する。そのような条件下での抗体との特異的結合は、特定のタンパク質のその特異性のために選択される抗体を必要とする。例えば、ポリクローナル抗体は、選択される抗原を用いて、他のタンパク質を用いない特異的な免疫反応性があるポリクローナル抗体のみを得るよう選択され得る。この選択は、他の分子と交互作用する抗体以外を除くことにより成し遂げられ得る。好ましくは、「標識」または「検出可能な分子」は、共有結合で、または非共有結合で抗体に付く。標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、または他の物理的手段で検出可能であり得る。特に有用な標識は、蛍光色素である。抗体に標識を付ける方法は、当業者に周知である。特に好ましい標識は、生理的条件下で、所定の酵素と接することにより、容易に、切断、または単離、または加水分解を目的とし得るリン化―によって抗体に付けられるものである。抗体は、また、常磁性マイクロ粒子（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、ドイツ）のような磁気粒子に抱合され得る。磁気的に標識抗体と結合した活性化Ｔ細胞は、磁気細胞単離を含む技術を使用して単離され得るが、これに限定されない。他の多くの表面抗原分類に加え、ＣＤ１２７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４びＣＤ２５への適切な標識抗体は、市販されており、当業者によって既知である。抗体は、試料と接する前、または後に、並びにＣＤと接する前または後に標識が付き得る。ＣＤ抗体は、ＣＤ抗体と結合する標識抗体と接することにより標識が付き得る。本明細書において用いられるように、用語「ＣＤ」または「表面抗原分類」または「共通の決定要因」は、抗体によって認識される細胞表面の分子に関する。
【００６０】
本発明によれば、Ｔｒ１細胞集団は、細胞集団における、ＣＤ４、ＣＤ１２７、及びＣＤ６２Ｌマーカーの細胞表面の発現を検出することにより同定され得る。ＣＤ４を発現する（すなわち、ＣＤ４＋である）、及び低レベルのＣＤ１２７とＣＤ６２Ｌを発現する（すなわち、ＣＤ１２７ｌｏ／−及びＣＤ６２Ｌｌｏ／−である）細胞は、Ｔｒ１細胞に対応する。
【００６１】
本発明によれば、静止期Ｔｒ１細胞集団は、細胞集団における、ＣＤ４、ＣＤ２５、及びＣＤ１２７とＣＤ６２Ｌの少なくとも１つのマーカーの細胞表面の発現を検出することにより、同定され得る。ＣＤ４を発現する（すなわち、ＣＤ４＋である）、及び低レベルのＣＤ１２７とＣＤ６２Ｌの少なくとも１つを発現する（すなわち、ＣＤ１２７ｌｏ／−及び／またはＣＤ６２Ｌｌｏ／−である）、また好ましくは、低レベルのＣＤ１２７とＣＤ６２Ｌ、及びＣＤ２５を発現しない（すなわち、ＣＤ２５−である）細胞は、静止期Ｔｒ１細胞に対応する。
【００６２】
本発明の一実施形態において、マーカーＦｏｘｐ３も評価され、ＣＤ４を発現し、（すなわち、ＣＤ４＋である）、及び低レベルのＣＤ１２７とＣＤ６２Ｌの少なくとも１つを発現する（すなわち、ＣＤ１２７ｌｏ／−及び／またはＣＤ６２Ｌｌｏ／−である）、また好ましくは、低レベルのＣＤ１２７とＣＤ６２Ｌを発現し、ＣＤ２５を発現しない（すなわち、ＣＤ２５−である）、またさらに、Ｆｏｘｐ３を発現しない（すなわち、Ｆｏｘｐ３−である）細胞は、静止期Ｔｒ１細胞に対応する。
【００６３】
本発明によれば、活性化Ｔｒ１細胞集団は、細胞集団における、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ１２７及びＣＤ６２Ｌマーカーの細胞表面の発現を検出することにより同定され得る。ＣＤ４及びＣＤ２５を発現し（すなわち、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）、低レベルのＣＤ１２７及びＣＤ６２Ｌを発現する（すなわち、ＣＤ１２７ｌｏ／−及びＣＤ６２Ｌｌｏ／−である）細胞は、活性化Ｔｒ１細胞である。
【００６４】
一実施形態において、マーカーＦｏｘｐ３も評価され、ＣＤ４及びＣＤ２５を発現し（すなわち、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）、低レベルのＣＤ１２７及びＣＤ６２Ｌを発現し（すなわち、ＣＤ１２７ｌｏ／−及び／またはＣＤ６２Ｌｌｏ／−である）、Ｆｏｘｐ３を発現する（すなわち、Ｆｏｘｐ３＋である）細胞は、活性化Ｔｒ１細胞である。
【００６５】
そのようなＴｒ１細胞を同定／選択するためのそのようなマーカー（ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ６２Ｌ及Ｆｏｘｐ３）に結合する好ましい試薬は、抗体である。別の実施形態において、抗体は、蛍光色素または磁気粒子に抱合される。別の実施形態において、細胞の選択は、フローサイトメトリ、蛍光活性化セルソーター、磁気選択、アフィニティークロマトグラフィーまたはパニング、並びにその組み合わせによって行われる。
【００６６】
本発明は、本明細書において前述のような同定方法、その後のその単離により得られたＴｒ１細胞の単離集団を別の目的とする。
【００６７】
本発明は、本明細書において、前述のような同定方法、その後の単離により得られた静止期Ｔｒ１細胞の単離集団を別の目的とする。
【００６８】
本発明は、本明細書において、前述のような同定方法、その後の単離により得られた活性化Ｔｒ１細胞の単離集団を別の目的とする。
【００６９】
本発明は、本明細書において、前述のような同定方法、その後の単離により得られた静止期及び活性化Ｔｒ１細胞の単離集団を別の目的とする。
【００７０】
「単離」は、自然な環境（末梢血のような）から除去され、単離、または単離され、自然に存在するが、細胞が単離されることに基づき、細胞表面マーカーを欠く他の細胞から少なくとも、約７５％遊離、８０％遊離、８５％遊離、好ましくは、約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％遊離である、細胞または細胞集団に関する。
細胞集団の単離方法は、当業者にとって周知であり、限定するものではないが、フローサイトメトリ、磁気選択、アフィニティークロマトグラフィーまたはパニング、並びにその組み合わせによるセルソーターを含む。
【００７１】
本発明は、本明細書において、前述のような静止期Ｔｒ１細胞及び／または活性化Ｔｒ１細胞の単離された細胞集団を含む、またはこれからなる医薬組成物を別の目的とする。
【００７２】
一実施形態において、そのような医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体を含む。
【００７３】
本明細書において、使用される薬学的に許容可能な担体は、従来のものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｏｓｏｌ，  Ａ．  Ｅｄ．  （１９８０）は、本発明の組成物の医薬品の送達に適した組成物及び製剤を記載する。一般的に、担体の性質は、採用される投与様式に依存するであろう。例えば、非経口製剤は、大抵、ビヒクルとして、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、ブドウ糖溶液、ゴマ油、グリセリン、エタノール、それらの組み合わせ等のような薬学的及び生理的に許容可能な液体を含む注入液を含む。単体及び組成物は、無菌であり、製剤は、投与様式に適する。生物学的に中立な担体に加えて、投与される医薬組成物は、湿潤剤、または乳化剤、保存料、及びｐＨ緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウム、またはソルビタンモノラウレートのような微量の無毒な補助物質を含有し得る。組成物は、液体溶液、懸濁液、または乳濁液であり得る。
【００７４】
本発明は、
−ＣＤ４及び低レベルのＣＤ１２７及びＣＤ６２Ｌを発現する細胞を同定すること、
−その細胞を選択すること、
−それにより、Ｔｒ１細胞において濃縮された細胞集団を得ることを含む、Ｔｒ１細胞で細胞集団を濃縮する方法を別の目的とする。
【００７５】
本発明は、
−ＣＤ４及び低レベルのＣＤ１２７及びＣＤ６２Ｌの少なくとも１つ、好ましくは、低レベルのＣＤ１２７及びＣＤ６２Ｌを発現し、ＣＤ２５を発現しない細胞を同定すること、
−その細胞を選択すること、
−それにより、静止期Ｔｒ１細胞において濃縮された細胞集団を得ることを含む、静止期Ｔｒ１細胞で細胞集団を濃縮する方法を別の目的とする。
【００７６】
本発明は、
−ＣＤ４及びＣＤ２５、並びに低レベルのＣＤ１２７及びＣＤ６２Ｌを発現する細胞を同定すること、
−その細胞を選択すること、
−それにより、活性化Ｔｒ１細胞において濃縮された細胞集団を得ることを含む、活性化Ｔｒ１細胞で細胞集団を濃縮する方法を別の目的とする。
【００７７】
本発明は、本明細書において前述のような方法に従い得られたＴｒ１細胞の濃縮された細胞集団を別の目的とする。
【００７８】
本発明は、本明細書において前述のような方法に従い得られた静止期Ｔｒ１細胞の濃縮された細胞集団を別の目的とする。
【００７９】
本発明は、本明細書において前述のような方法に従い得られた活性化Ｔｒ１細胞の濃縮された細胞集団を別の目的とする。
【００８０】
その細胞を選択／濃縮するマーカー（ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、及びＣＤ６２Ｌ）に結合する好ましい試薬は、抗体である。別の実施形態において、抗体は、蛍光または磁気粒子に抱合される。別の実施形態において、細胞選択は、フローサイトメトリ、蛍光活性化セルソーター、磁気選択、アフィニティークロマトグラフィーまたはパニング、並びにその組み合わせによって行われる。
【００８１】
Ｔｒ１細胞を濃縮した組成物／集団は、Ｔｒ１細胞の割合が元々得ていた細胞集団におけるＴｒ１細胞の割合よりも高いものである。可能ではあるが、濃縮したＴｒ１細胞の集団は、同一のＴｒ１細胞の集団を含有する必要はない。特定の実施形態において、組成物のその細胞の少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％または約９９％は、Ｔｒ１細胞である。別の実施形態において、濃縮された組成物／集団におけるＴｒ１細胞の割合は、濃縮前のＴｒ１細胞の割合の、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍である。本明細書において用いられるように、数値の先に来る用語「約」は、当該数値の値の１０％前後を意味する。
【００８２】
Ｔ細胞を含有するいずれかの細胞ソースを、Ｔｒ１細胞を単離／濃縮するために使用し得る。使用可能なソースは、末梢血、髄液、脾臓、胸線、リンパ節、骨髄、パイエル板及び扁桃腺を含むが、これらに限定されない。
【００８３】
濃縮方法は、濃縮工程の各ステップに付随する濃縮レベルに基づき、変えることができる。濃縮のレベル及びＴｒ１細胞の純度の割合は、限定するものではないが、ドナー、細胞／組織ソース、ドナーの病状を含む多くの因子に依存するであろう。特定の実施形態において、Ｔｒ１細胞は、少なくとも約２倍、約５倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約２５倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約５０倍、約５５倍、約６０倍、約６５倍、約７０倍、約７５倍、約８０倍、約８５倍、約９０倍、約９５倍、約１００倍、約１０５倍、約１１０倍、約１１５倍、約１２０倍、約１３０倍、約１４０倍、約１５０倍、または約２００倍に濃縮される。
【００８４】
細胞を単離、単離、または選択する方法は、限定するものではないが、抗体を覆う磁気ビーズを使用する磁気単離（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、米国特許第５，７５９，７９３号明細書）及び固相マトリックス（例えば、板）に取り付けられた抗体を使用するアフィニティ−クロマトグラフィーまたは「パニング」を含む。正確な単離を提供する別の技術は、複数の色のチャネル、低い角度、及び鈍角光散乱検出チャネル、またはインピーダンスチャネルを有するような変動する度合の高度さを有し得る蛍光表示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を含む。死細胞は、死細胞、例えば、（ヨウ化プロピジウム、ＬＤＳ）に付随する色素を用いた選択によって除去され得る。赤血球は、例えば、水簸、溶血、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ勾配により除去され得る。技術は、選択する細胞の生存に過度に有害でないものが採用され得る。
【００８５】
便宜上、抗体は、例えば、Ｔｒ１細胞の単離を容易にすることを可能にする磁気ビーズ、アビジンまたはストレプトアビジンと高い親和性を有して結合するビオチン、蛍光活性化セルソーターを用いて使用され得る蛍光色素、ハプテンなど多くの異なる目的の標識で抱合され得る。多重染色解析は、ＦＡＣＳまたは免疫磁気単離とフローサイトメトリの組み合わせで採用され得る。多重染色解析は、例えば、非ＣＤ４＋免疫細胞マーカー（ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、ＴＣＲγ／δ及びグリコホリンＡ）、ＣＤ４、ＣＤ２５，ＣＤ１２７及びＣＤ６２Ｌのような複数の表面抗原に基づく細胞の単離を目的とする。多重染色解析での使用が発見される蛍光色素は、限定するものではないが、例えば、フィコエリトリン及びアロフィコシアニンのようなフィコビリンタンパク質、フルオレセン、及びテキサスレッドを含む。
【００８６】
磁気単離は、磁場勾配で、遠心管またはカラムのような容器内に磁性物質を選択的に残すために使用される工程である。Ｔｒ１細胞は、免疫親和性相互作用を含む特定の相互作用を介して、細胞の表面に磁性粒子を結合することによって、磁性を有する標識を付けられ得る。適切な容器内にＴｒ１細胞を含有する懸濁液は、その後、懸濁液において、他の細胞からＴｒ１細胞を単離するのに十分な力の磁場勾配に晒される。その後、血管は、標識のない細胞を除去するため適切な液体で洗浄され得り、Ｔｒ１細胞の精製懸濁液を得る。
【００８７】
磁性標識システムの大部分は、その表面に共有結合で結合する単クローン抗体またはストレプトアビシンを有する超常磁性粒子を使用する。細胞単離を適用する上で、それら粒子は、対象の細胞に磁性を有する標識を付け、保持するポジティブ選択、または所望でない細胞の大部分に磁性を有する標識を付け、保持するネガティブ選択のいずれかに使用され得る。使用する粒子の直径は、ＭＡＣ粒子（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）及びＳｔｅｍＳｅｐ（商標）コロイド（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の約５０〜１００ｎｍから、ＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＩｍａｇ粒子（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の１５０〜４５０ｎｍを含み、最大でＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）の４．２μｍまで広く変化する。使用される粒子の種類は、標識の付いた細胞を単離するために採用される磁気技術による影響を受ける。
【００８８】
磁気単離技術には、２つの重要な階級があり、両者は、便宜上、及び実践的な理由で、電磁石と対して永久磁石を使用する。第１階級は、対象の標的にラベルを付けるのに
小さく、磁性弱い粒子を使用し、磁化可能なマトリックスを用いて、カラムでそれら標的を単離するカラム系高勾配磁場単離技術である。磁場がカラムに印加される際、非常に高い勾配が、マトリックスの表面の近辺で発生する。高い勾配は、それら相対的に磁性の弱い粒子を使用して標識を付けた標的を単離するために必要とされる。第２階級は、対象の標的に標識を付けるためにより強い磁性を有する粒子を使用する管系技術である。それら対象の標的は、その後、管の外の磁石によって発生した磁場勾配によって遠心型の管内で単離される。この方法は、勾配を発生する磁化可能なマトリックスに依存せず、それゆえ、硬化な使い捨てカラムや不都合な洗浄及び汚染物の処理を有する再利用可能なカラムを必要としないことが利点である。
【００８９】
磁石内に配置されると、非標識の細胞は放出されるが、標的細胞は、最も高い磁場強度の領域位に向かって遊走し、磁場内に保持される。標的細胞は、その後、収集され、磁場の除去後、使用され得る。ネガティブ選択が要求される場合、非標識の細胞は、維持され、様々な適用に利用され得る。
【００９０】
ＦＡＣＳは、それらがレーザービームを通過するため、光散乱特性に基づき、細胞の亜集団の単離を可能にする。前述の光の散乱（ＦＡＬＳ）は、細胞の大きさに関し、側面散乱特性（ＳＳＣ）として既知な直角光散乱は、細胞密度、細胞内容量、及び核原形質非、すなわち細胞の複雑さに関する。細胞が、蛍光性抱合抗体を有する標識を付けられ得るため、それらは、さらに、抗体（蛍光）強度によって特徴付けられ得る。
【００９１】
特定の実施形態において、本発明のＴｒ１細胞は、免疫磁性クロマトグラフィーを使用して単離される。例えば、抗ＣＤ４抗体は、磁気ビーズに取り付けられる。それら抗体標識磁気ビーズは、親和性精製の基礎として使用される。Ｔ細胞の抗体標識各分は、磁性アフィニティ―カラムに適用される。浮遊細胞は、破棄され、接着細胞じゃ、磁場の除去により磁性カラムから溶出する。別の実施形態において、細胞は、まず抗体（例えば、抗ＣＤ４）を有する標識を付けられ、その後、磁気ビーズまたは球体を運搬する二次抗体を有する標識を付けられる。
【００９２】
別の実施形態において、Ｔｒ１細胞が有する二次抗体の免疫反応性は、Ｔｒ１細胞集団の濃縮のために使用され得る。二次抗体の使用は、一般的に当業界において既知である。通常、二次抗体は、第１抗体の定常部に抗体免疫反応性がある。好ましい二次抗体は、抗ウサギ、抗マウス、抗ラット、抗ヤギ、抗ウマ、免疫グロブリンを含み、市販される。市販されるキットは、限定するものではないが、磁性粒子及び蛍光色素のような標識薬剤に抱合される二次抗体を提供する。
【００９３】
本発明の一実施形態において、Ｔｒ１細胞、静止期Ｔｒ１細胞または活性化Ｔｒ１細胞の集団を濃縮する方法は、
−非ＣＤ４＋細胞のマーカーと結合する少なくとも１つの試薬と細胞集団を接触し、それにより非ＣＤ４＋細胞を枯渇することと、
−本明細書において前述のように、Ｔｒ１細胞、静止期Ｔｒ１細胞、または活性化Ｔｒ１細胞を同定し、それらを選択及び単離することとを含み得る。
【００９４】
非ＣＤ４＋に結合するマーカーの例としては、限定するものではないが、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ１２３及びグリコホリンＡを含む。
【００９５】
そのマーカーに結合する好ましい試薬は、抗体である。別の実施形態において、抗体は、蛍光色素または磁性粒子に抱合される。別の実施形態において、細胞選択は、フローサイトメトリ、蛍光活性化セルソーター、磁気選択、アフィニティークロマトグラフィー、またはパニング、若しくはその組み合わせによって行われる。
【００９６】
本発明の一実施形態において、本発明に従い単離されるＴｒ１細胞は、さらに、国際公開第２００６／１０８８８２号に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法によって増殖し得る。そのような方法は、
ａ）昆虫支持細胞のような支持細胞を、３５℃以下の温度Ｔ１、培地Ｍｆで培養することと、
ここで、その温度Ｔ１は、支持細胞の増殖を可能にし、その支持細胞は、以下の細胞表面タンパク質
−ＣＤ３／ＴＣＲ複合体
−ＣＤ２８タンパク質
−ＩＬ−２受容体
−ＣＤ２タンパク質
−ＩＬ−４受容体
と相互作用する因子を発現する、
ｂ）その培地Ｍｆが透明であってもなくても、ステップａ）で得られた支持細胞を培地Ｍｐに含有されるＴｒ１細胞集団と接触することと、
ここで、その培地Ｍｐは、Ｔｒ１細胞集団、支持細胞、及び培地Ｍｐ含む混合物を得るためにステップａ）で引用される因子を初めから含有しない、
ｃ）ステップｂ）で得られた混合物を、少なくとも３５℃である温度Ｔ２で培養することと
ここで、その温度は、Ｔｒ１細胞集団は増殖し、支持細胞は増殖しないよう選択されている、
ｄ）そのように増殖したＴｒ１細胞集団を回復することとを含む。
【００９７】
上述の細胞表面タンパク質と相互作用する因子の例としては、
−抗ＣＤ３単クローン抗体または修飾抗ＣＤ３抗体、ここで、ＣＤ３重鎖の抗ＣＤ３細胞質内ドメインは、膜貫通ドメインで置換される、
−抗ＣＤ２８抗体またはその断片、若しくはＣＤ８０またはＣＤ８６タンパク質
−支持細胞によって分泌されるＩＬ−２
−ＣＤ５８タンパク質
−ＩＬ−４及びＩＬ−１３を含む群から選択されるインターロイキン
を含む。
【００９８】
本発明の実施形態において、このようにして得られたＴｒ１細胞は、Ｔ細胞をクローン化する従来の方法によってクローン化され得る。
【００９９】
本発明の実施形態において、このようにして得られたＴｒ１細胞またはＴｒ１細胞のクローンは、保存のために凍結され得る。
【０１００】
本発明は、
−ＣＤ４及び低レベルのＣＤ１２７及びＣＤ６２Ｌを発現する細胞を同定することと、
−その細胞を枯渇することと、
−それにより、Ｔｒ１細胞において枯渇された細胞集団を取得／単離することとを含む、Ｔｒ１細胞において細胞集団を枯渇する方法を別の目的とする。
【０１０１】
本発明は、
−ＣＤ４及び低レベルのＣＤ１２７及びＣＤ６２Ｌの少なくとも１つ、好ましくは、低レベルのＣＤ２７及びＣＤ６２Ｌを発現し、ＣＤ２５を発現しない細胞を同定することと、
−その細胞を枯渇することと、
−それにより、静止期Ｔｒ１細胞において枯渇された細胞集団を取得／単離することとを含む、静止期Ｔｒ１細胞において細胞集団を枯渇する方法を別の目的とする。
【０１０２】
本発明は、
−ＣＤ４、ＣＤ２５及び低レベルのＣＤ１２７及びＣＤ６２Ｌを発現する細胞を同定することと、
−その細胞を枯渇することと、
−それにより、活性化Ｔｒ１細胞において枯渇された細胞集団を取得／単離することとを含む、活性化Ｔｒ１細胞において細胞集団を枯渇する方法を別の目的とする。
【０１０３】
Ｔｒ１細胞を枯渇した組成物／集団は、Ｔｒ１細胞の割合が、初めに得られた細胞集団におけるＴｒ１細胞の割合よりも低いものである。
【０１０４】
本発明は、本明細書において前述の方法に従い得られたＴｒ１細胞が枯渇した細胞集団を別の目的とする。
【０１０５】
本発明は、本明細書において前述の方法に従い得られた静止期Ｔｒ１細胞が枯渇した細胞集団を別の目的とする。
【０１０６】
本発明は、本明細書において前述の方法に従い得られた活性化Ｔｒ１細胞が枯渇した細胞集団を別の目的とする。
【０１０７】
本明細書において上記のように、細胞を単離する方法は、限定するものではないが、抗体を覆う磁気ビーズを使用する磁気単離、アフィニティ―クロマトグラフィーまたは固相マトリックス（例えば、板）に取り付けられる抗体を使用する「パニング」及び蛍光活性化セルソーターを含む。選択される代わりに、Ｔｒ１細胞は、枯渇される。
【０１０８】
一実施形態において、枯渇組成物／集団におけるＴｒ１細胞の割合は、最大でも、枯渇前のＴｒ１細胞の割合の０．７５倍、０．７倍、０．６倍、０．５倍、０．４倍、０．３倍、０．２倍、０．１５倍、０．１倍である。
【０１０９】
本発明は、静止期及び／または活性化Ｔｒ１細胞が枯渇した細胞集団を含む、またはこれからなる医薬組成物及び薬学的に許容可能な担体を別の目的とする。
【０１１０】
本発明は、Ｔｒ１細胞集団、静止期Ｔｒ１細胞集団、及び／または活性化Ｔｒ１細胞集団を同定または単離するキット、またはＴｒ１細胞、静止期Ｔｒ１細胞、または活性化Ｔｒ１細胞において、細胞集団を濃縮または枯渇するキットを別の目的とし、そのキットは、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、及びＣＤ６２Ｌの細胞表面の発現を検出する試薬を含む。
【０１１１】
好ましくは、その試薬は、抗体である。別の実施形態において、その抗体は、蛍光色素または磁気粒子に抱合される。
【０１１２】
別の実施形態において、そのキットは、Ｆｏｘｐ３の発現を検出する試薬をさらに含む。好ましくは、その試薬は、抗体である。より好ましくは、その抗体は、蛍光色素に抱合される。
【０１１３】
本発明は、必要とする被検体において、免疫反応を抑制し、本発明に従い、効果的な量の単離または濃縮Ｔｒ１細胞、静止期Ｔｒ１細胞、または活性化Ｔｒ１細胞の被検体への投与を含む方法を別の目的とする。
【０１１４】
−本明細書において前述の方法に従い、生物学的試料から静止期Ｔｒ１細胞を単離することと、
−そのＴｒ１細胞を増殖することと、
−増殖したＴｒ１細胞を被検体に投与することとを含む、必要とする被検体において免疫反応を抑制する方法を別の目的とする。
【０１１５】
従って、被検体に投与される増殖したＴｒ１細胞は、その抑制的な活性化によって望まれない免疫反応を抑制し、それにより、望まれない免疫反応に付随する症状の処置を可能にする。
【０１１６】
細胞療法の観点における静止期Ｔｒ１細胞を単離することの利点の一つは、投与される細胞集団が純粋であることである。静止期Ｔｒ１細胞を使用することのもう一つの利点は、その効率性である。実際に、既に活性化したＴ細胞集団を活性化することが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞死を誘導し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの効率の低下につながることは、当業者にとって既知である。純粋なＴｒ１細胞集団を使用することにおけるさらに別の利点は、時間効率および費用対効果にある。実際、細胞療法用に十分な数において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでこの集団を拡大させるのに、約２週間で足りる。
【０１１７】
本発明の一実施形態において、静止期Ｔｒ１細胞は、末梢血もしくは臍帯血などの血液、または、リンパ節生検、腸もしくは滑膜生検、もしくは粘膜組織生検などの組織生検、または、気管支肺胞洗浄または脳脊髄液から得ることができる。
【０１１８】
別の実施形態において、静止期Ｔｒ１細胞は、自己由来または同種異系である。本明細書で使用する用語「同種異系細胞」は、一人の被験者（ドナー）から単離され、別の者（患者または宿主）に注入される細胞を指す。本明細書で使用する用語「自己由来細胞」は、単離され、同一の被験者に戻して注入される細胞を指す。
【０１１９】
静止期Ｔｒ１細胞集団を拡大させるための方法は、当該分野において周知である。
【０１２０】
本発明の一実施形態において、静止期Ｔｒ１細胞が、国際公開第２００６／１０８８８２号に記載されるようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大される。前述の方法は、
ａ）３５℃に達しない温度Ｔ１で、培養培地Ｍｆ中において、昆虫フィーダー細胞などであるフィーダー細胞を培養することであって、前述の温度Ｔ１はフィーダー細胞の増殖を可能にし、前述のフィーダー細胞は以下の細胞表面タンパク質、
−ＣＤ３／ＴＣＲ複合体、
−ＣＤ２８のタンパク質、
−ＩＬ−２受容体、
−ＣＤ２タンパク質、
−ＩＬ−４受容体、
と相互作用する因子を発現する、培養の工程、
ｂ）工程ａ）で得られたフィーダー細胞を、それらの培養培地Ｍｆの除去の如何にかかわらず、培養培地Ｍｐにおいて含まれるＴｒ１細胞集団と接触させることであって、Ｔｒ１細胞集団、フィーダー細胞、および培養培地Ｍｐを含む混合物を得るため、前述の培養培地Ｍｐは、工程ａ）で述べた因子を最初は含まない、接触の工程、
ｃ）少なくとも３５℃である温度Ｔ２にて、工程ｂ）で得られた混合物を培養することであって、前述の温度は、Ｔｒ１細胞集団が増殖し、フィーダー細胞が増殖しないよう選択されている、培養の工程、
ｄ）このように拡大されたＴｒ１細胞集団を回収する、回収の工程、
を含む。
【０１２１】
上記で述べた細胞表面タンパク質と相互作用する因子の例として、
−ＣＤ３重鎖の抗ＣＤ３細胞質内ドメインが膜貫通ドメインに置き換えられている、抗ＣＤ３モノクローナル抗体または修飾抗ＣＤ３抗体、
−ＣＤ８０またはＣＤ８６タンパク質、
−フィーダー細胞から分泌されるＩＬ−２、
−ＣＤ５８タンパク質、
−ＩＬ−４およびＩＬ−１３を含む群から選択されるインターロイキン、
が挙げられる。
【０１２２】
抗ＣＤ３モノクローナル抗体は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体、より有利には修飾された抗ＣＤ３抗体を介してＴ細胞集団を活性化するために使用することができ、前述の修飾抗ＣＤ３抗体が、フィーダー細胞の細胞膜に繋ぎ留まり、Ｔ細胞のＣＤ３／ＴＣＲタンパク質複合体と相互作用するよう、抗ＣＤ３抗体の修飾は、細胞質内ドメインの膜貫通ドメインへの置き換えにより構成されている。抗原特異的Ｔｒ１細胞の表面に存在するＣＤ２８タンパク質と相互作用し、フィーダー細胞によって発現される因子は、抗ＣＤ２８モノクローナル抗体、または、ＣＤ２８分子を架橋することができるその断片であり得、このような場合、抗ＣＤ２８モノクローナル抗体の修飾は、それがフィーダー細胞の細胞表面に繋ぎ留まるために膜貫通ドメインを追加することによって、予想することができる。好ましくは、抗ＣＤ２８モノクローナル抗体の代わりに、ＣＤ２８における天然リガンド、すなわち、例えば、Ｂ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）タンパク質などのＢ７ファミリータンパク質のメンバーが用いられる。
【０１２３】
ＣＤ２と相互作用するフィーダー細胞によって発現される因子は、抗ＣＤ２モノクローナル抗体、または、ＣＤ２分子を架橋することができるその断片であり得、抗ＣＤ２モノクローナル抗体の修飾は、フィーダー細胞の細胞表面に繋ぎ留まるために貫通ドメインを追加することにより、予想することができる。好ましくは、抗ＣＤ２モノクローナル抗体の代わりに、ＣＤ２における天然リガンド、すなわち、ＣＤ５８タンパク質が用いられる。
【０１２４】
フィーダー細胞の細胞膜に繋ぎ留められる因子に加えて、インターロイキンなどの分泌される因子もまた、抗原特異的Ｔｒ１細胞集団の拡大のために必要とされる。これらのインターロイキンにおいて、ＩＬ−２は、抗原特異的Ｔｒ１細胞の表面に存在するＩＬ−２受容体と相互作用し、および、ＩＬ−４またはＩＬ−１３のいずれかは、抗原特異的Ｔｒ１細胞のＩＬ−４受容体と相互作用する。
【０１２５】
本発明の別の実施形態において、静止期Ｔｒ１細胞は、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、および／またはＩＬ−１５などのサイトカインの存在下で、抗−ＣＤ３／２８ビーズを用いてＴｒ１細胞を培養することにより、拡大される。前述の静止期Ｔｒ１細胞を拡大するための前述のキットの例は、インビトロジェン社によって商品化されたＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）キット（Ｃａｔ  Ｎ°１１１−４１Ｄ）である。
【０１２６】
本発明の別の実施形態において、静止期Ｔｒ１細胞が、抗原の存在下で、自己由来ＰＢＬ、白血球、ＰＢＭＣ、抗原提示細胞、またはＬ細胞などのＭＨＣクラスＩＩを発現する人工抗原提示細胞を用いてＴｒ１細胞を培養することにより、拡大される。
【０１２７】
本発明の別の実施形態において、静止期Ｔｒ１細胞が、ＩＬ−２などのサイトカインの存在下で、ＰＨＡなどのマイトジェンを用いてＴｒ１細胞を培養することにより、拡大される。
【０１２８】
本発明の一実施形態において、このように拡大されたＴｒ１細胞は、クローニングＴ細胞用の従来の方法を使用してクローニングすることができる。
【０１２９】
本発明の一実施形態において、このように拡大されたＴｒ１細胞、またはクローン化されたＴｒ１細胞は、保存のために凍結することができる。
【０１３０】
本発明の一実施形態において、拡大されたＴｒ１細胞は、一抗原に特異的、または複数の抗原に特異的である。
【０１３１】
拡大されたＴｒ１細胞が特異的である抗体の例は、自己抗原、一般的なヒトの食事由来の食物抗原、多発性硬化症関連抗原または関節関連抗原などの炎症性抗原、およびアレルゲンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３２】
用語「一般的なヒトの食事由来の食物抗原」は、以下の非限定的なリスト：リポカリンなどのウシ抗原、Ｃａ結合Ｓ１００、α−ラクトアルブミン、ベータラクトグロブリンなどのラクトグロブリン、ウシ血清アルブミン、カゼイン、における食物抗原などの、ヒトに対して一般的な食品由来である、免疫原性ペプチドを指す。食物抗原はまた、パルブアルブミンなどの大西洋鮭抗原、オボムコイド、オボアルブミン、Ａｇ２２、コンアルブミン、リゾチーム、または鶏血清アルブミンなどの鶏抗原、ピーナッツ抗原、トロポミオシンなどのエビ抗原、アグルチニンまたはグリアジンなどの小麦抗原、セロリプロフィリンなどのセロリ抗原、ニンジンプロフィリンなどのニンジン抗原、ソーマチン、リンゴ脂質輸送タンパク質、リンゴプロフィリンなどのリンゴ抗原、梨プロフィリン、イソフラボンレダクターゼなどの梨抗原、エンドキチナーゼなどのアボカド抗原、アプリコット脂質輸送タンパク質などのアプリコット抗原、桃脂質輸送タンパク質または桃プロフィリンなどの桃抗原、ＨＰＳ、大豆プロフィリン、または（ＳＡＭ  ２２）ＰＲ−ＩＯプロットなどの大豆抗原であり得る。
【０１３３】
用語「自己抗原」とは、前述の個々のタンパク質由来の免疫原性ペプチドを指す。それは、一例として、以下の非限定的なリスト：アセチルコリン受容体、アクチン、アデニンヌクレオチド輸送体、アドレナリン受容体、芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ、アシアロ糖タンパク質受容体、殺菌性／透過性増加タンパク質（ＢＰｉ）、カルシウム感知受容体、コレステロール側鎖切断酵素、ＩＶ型コラーゲン鎖、チトクロームＰ４５０  ２Ｄ６、デスミン、デスモグレイン−１、デスモグレイン−３、Ｆ−アクチン、ＧＭ−ガングリオシド、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、グルタミン酸受容体、Ｈ／Ｋ  ＡＴＰアーゼ、１７−ヒドロキシラーゼ、２１−ヒドロキシラーゼは、ＩＡ−２（ＩＣＡＳ１２）、インスリン、インスリン受容体、内因性因子１型、白血球機能抗原１、ミエリン関連糖タンパク質、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質、ミオシン、Ｐ８０−コリン、ピルビン酸脱水素酵素複合体Ｅ２（ＰＤＣ−Ｅ２）、ヨウ化ナトリウム共輸送体、ＳＯＸ−１０、甲状腺および眼筋共有タンパク質、サイログロブリン、甲状腺ペルオキシダーゼ、甲状腺刺激ホルモン受容体、組織トランスグルタミナーゼ、転写コアクチベーターＰ７５、トリプトファン水酸化酵素、チロシナーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、ＡＣＴＨ、アミノアシルｔＲＮＡ−ヒスチジル、カルジオリピン、炭酸脱水酵素ＩＩ、セントロメア関連タンパク質、ＤＮＡ依存性ヌクレオソーム刺激ＡＴＰアーゼ、フィブリラリン、フィブロネクチン、グルコース６リン酸イソメラーゼ、β２−グリコプロテインＩ、ゴルジン（９５、９７、１６０、１８０）、熱ショックタンパク質、半接着斑（ｈｅｍｉｄｅｓｍｏｓｏｍａｌ）タンパク質１８０、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、ケラチン、ＩｇＥ受容体、Ｋｕ−ＤＮＡタンパク質キナーゼ、Ｋｕ−核タンパク質、Ｌａのリン酸タンパク質、ミエロパーオキシダーゼ、プロテイナーゼ３、ＲＮＡポリメラーゼＩ−ＩＩＩ、シグナル認識タンパク質、トポイソメラーゼＩ、チューブリン、ビメンチン、ミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）、プロテオリピドタンパク質、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質（ＯＳＰ／クローディン１１）、環状ヌクレオチド３’ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰａｓｅ）、ＢＰの抗原１（ＢＰＡＧｌ−ｅ）、トランスアルドラーゼ（ＴＡＬ）、ヒトのミトコンドリア自己抗原  ＰＤＣ−Ｅ２（Ｎｏｖｏ１および２）、ＯＧＤＣ−Ｅ２（Ｎｏｖｏ３）、ＢＣＯＡＤＣ−Ｅ２（Ｎｏｖｏ４）、水疱性類天疱瘡（ＢＰ）１８０、ラミニン５（ＬＮ５）、ＤＥＡＤボックスタンパク質４８（ＤＤＸ４８）、またはインスリノーマ関連抗原−２、における自己抗原であり得る。
【０１３４】
用語「多発性硬化症関連抗原」は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質（ＭＯＧ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、オリゴデンドロサイトミエリンオリゴタンパク質（ＯＭＧＰ）、ミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質（ＯＳＰ／クローディン１）、熱ショックタンパク質、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質（ＯＳＰ）、ＮＯＧＯ  Ａ、糖タンパク質ポロニウム、末梢ミエリン蛋白質２２（ＰＭＰ２２）、２’３’−環状ヌクレオチド３”−ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰａｓｅ）、それらの断片、それらの変異体、およびそれらの混合物を指す。
【０１３５】
用語「関節関連抗原」は、シトルリン−置換環状および線状フィラグリンペプチド、ＩＩ型コラーゲンペプチド、ヒト軟骨糖タンパク質３９（ＨＣｇｐ３９）ペプチド、ＨＳＰ、異質核リボヌクレオタンパク質（ｈｎＲＮＰ）のＡ２ペプチド、ｈｎＲＮＰ  ＢＬ、ｈｎＲＮＰ  Ｄ、Ｒｏ６０／５２、ＨＳＰ６０、６５、７０および９０、ＢｉＰ、ケラチン、ビメンチン、フィブリノゲン、Ｉ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型およびＶ型コラーゲンペプチド、アネキシンＶ、グルコース６リン酸イソメラーゼ（ＧＰＩ）、アセチル−カルパスタチン、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）、アルドラーゼ、トポイソメラーゼＩ、ｓｎＲＮＰ、ＰＡＲＰ、Ｓｃｌ−７０、Ｓｃｌ−１００、陰イオン性カルジオリピンおよびホスファチジルセリンを含むリン脂質抗原、中立的に荷電したホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリン、マトリックスメタロプロテアーゼ、フィブリリン、アグリカンを指す。
【０１３６】
用語「アレルゲン」は、吸入アレルゲン、摂取アレルゲン、または接触アレルゲンを指す。アレルゲンの例として、これらに限定されないが、花粉（Ｃｕｐ、６月）、チリダニ類（Ｄｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔｙｒ、Ｌｅｐ）、犬、猫、および齧歯類（Ｃａｎ、フェル、ハツカネズミ、ラット）由来の吸入アレルゲンが挙げられる。接触アレルゲンの例として、これらに限定されないが、重金属（ニッケル、クロム、金など）、ラテックス、ハロタンなどのハプテン、ヒドララジンが挙げられる。
【０１３７】
本発明の一実施形態では、拡大されたＴｒ１細胞は、経口、筋肉内、内部組織、静脈内または腹腔内の注射、鼻腔内吸入、肺吸入、皮膚内または関節内注射用に処方することができる。
【０１３８】
好ましくは、拡大されたＴｒ１細胞は、患者の筋肉内、腹腔内、もしくは静脈内注射、またはリンパ節への直接注射によって、より好ましくは、静脈内注射によって投与することができる。
【０１３９】
本発明の別の目的は、静止期Ｔｒ１細胞および活性化Ｔｒ１細胞の混合物、ならびに、薬学的に許容可能なキャリアである、拡大されたＴｒ１細胞を含む、または、拡大されたＴｒ１細胞で構成される、医薬組成物である。
【０１４０】
本発明の別の目的は、静止期Ｔｒ１細胞および活性化Ｔｒ１細胞の混合物を含む医薬組成物であって、混合物は、上記に記載の方法により得られる単離された静止期Ｔｒ１細胞集団を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大することによって得られる。
【０１４１】
したがって、医薬組成物は、以下の表現型ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ１２７ｌｏ／−ＣＤ６２Ｌｌｏ／−を有する静止期Ｔｒ１細胞、および、以下の表現型ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ／−ＣＤ６２Ｌｌｏ／−を有する活性化Ｔｒ１細胞を含む。
【０１４２】
それを必要とする被験者に投与される拡大されたＴｒ１細胞の表現型が、フローサイトメトリにより分析することができる。
【０１４３】
拡大の工程の終了時に、拡大されたＴｒ１細胞は、２つの状態：静止期状態または活性化状態、のままである。進んで理論に拘束されることなく、本発明者らは、静止期Ｔｒ１細胞および活性化Ｔｒ１細胞の混合物を含む組成物が、活性化Ｔｒ１細胞が投与直後に炎症を抑制することができ、一方、静止期Ｔｒ１細胞がｉｎ  ｖｉｖｏで増殖するよう生体内原位置で活性化される必要があり、長期でその抑制された活性を発揮するものとして利点を有することを示唆する。
【０１４４】
一実施形態において、被験者は、骨髄移植もしくは臓器移植などの移植を受けたまたは受けている。
【０１４５】
別の実施形態において、被験者は、微生物感染、ＲＳＶ感染症、アレルギーなどの感染症を有する。
【０１４６】
本発明の別の目的は、本発明に係る被験者への単離もしくは濃縮されたＴｒ１細胞、静止期Ｔｒ１細胞、または活性化Ｔｒ１細胞を有効量投与することを含む、それを必要とする被験者における炎症状態を予防するまたは治療するための方法である。
【０１４７】
本発明の別の目的は、本発明に係る被験者への単離もしくは濃縮されたＴｒ１細胞、静止期Ｔｒ１細胞、または活性化Ｔｒ１細胞を有効量投与することを含む、それを必要とする被験者における自己免疫状態を予防するまたは治療するための方法である。
【０１４８】
本発明の一実施形態において、細胞集団を、濃縮Ｔｒ１細胞の組成物がその後導入される被験者から、得ることができる。
【０１４９】
本発明の一実施形態において、被験者は、免疫応答の抑制を所望する者であり得る。
【０１５０】
本発明の一実施形態において、被験者は、非自己免疫性炎症性腸疾患、術後癒着、冠動脈疾患、肝線維症、急性呼吸窮迫症候群、急性炎症性膵炎、内視鏡的逆行性胆道膵管造影誘発性膵炎、熱傷、冠状動脈、脳および末梢動脈のアテローム、虫垂炎、胆嚢炎、憩室炎、内臓の線維性疾患、創傷治癒、皮膚の瘢痕化疾患（ケロイド、汗腺の化膿性）、肉芽腫性疾患（サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変）、喘息、壊疽性膿皮症、スウィート症候群、ベーチェット病、原発性硬化性胆管炎、および膿瘍を含む、これらに限定されない、任意の疾患／障害などの、炎症状態または炎症性疾患／障害による影響を受けたヒトである。
【０１５１】
本発明の別の実施形態において、被験者は、ヒトの全身性エリテマトーデスに代表される一般的な自己免疫疾患だけでなく、紅斑性狼瘡、尋常性天疱瘡、甲状腺炎、血小板減少性紫斑病、バセドウ病、糖尿病、若年性糖尿病、自発的な自己免疫性糖尿病、重症筋無力症、アジソン病、関節リウマチ、強直性脊椎炎、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎などの関節炎状態、多発性硬化症、乾癬、ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、強皮症、自己免疫炎症性腸疾患、クローン病、大腸炎、食物アレルギーに関連した腸の炎症などの腸の炎症性疾患、シェーグレン症候群、橋本病、重症筋無力症、自己免疫性多腺性内分泌障害症候群、Ｉ型糖尿病（ＴＩＤＭ）、自己免疫性胃炎、自己免疫ブドウ膜網膜炎、多発性筋炎、および甲状腺炎を含む、これらに限定されない、自己免疫状態または自己免疫疾患／障害による影響を受けたヒトである。本明細書中で使用される「自己抗原（ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ）」または「自己抗原（ｓｅｌｆ−ａｎｔｉｇｅｎ）」は、哺乳動物にとって生まれつきのものであり、および、前述の哺乳動物の疾患において免疫原性である、抗原またはエピトープを指す。
【０１５２】
本発明の細胞はまた、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、造血幹細胞移植、および移植片拒絶などの移植反応を予防または治療するために使用することができる。
【０１５３】
別の実施形態において、被験体者は、アレルギー状態または喘息状態による影響を受けている。アレルギー状態または喘息状態の例として、これらに限定されないが、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、結膜炎、アトピー性皮膚炎、接触アレルギー、アレルギーの吸入、アレルギーの摂取、およびアナフィラキシーが挙げられる。
【０１５４】
患者へのＴｒ１細胞の導入は、養子細胞移植などの当該技術分野で周知の方法を使用して行われる。つまり、細胞の混合集団が標的のドナーから抽出される。適用に応じて、細胞を、寛解の期間中または病気の活動期に抽出することができる。通常、これは、全血を抜き出すこと、および、白血球搬出（白血球除去）により顆粒球を採取することによって行われる。例えば、大量の白血球搬出（ＬＶＬ）は、血液の白血球収量を最大にすることが示されている。採取されたリンパ球は、本明細書中に記載のものなどのＴｒ１−特異的細胞マーカーに基づく細胞単離技術を用いて単離し、その後、患者に、養子免疫抑制のため、一般的には細胞のドナー（ドナーとレシピエントが異なる移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の場合を除く）に、輸血することができる。
【０１５５】
約１０３〜１０１１、好ましくは１０４〜１０１０、好ましくは１０５〜１０９、好ましくは１０６〜１０９、より好ましくは１０６〜１０８のＴｒｌ細胞が患者に注入される。
【０１５６】
本明細書で用いられるように、用語「有効量」は、その障害もしくは１つもしくはそれ以上のその症状の重症度および／もしくは持続時間を（ある程度まで）低減させるもしくは改善させる、障害の進行を防ぐ、障害の緩解を引き起こす、障害に関連する１つもしくはそれ以上の症状の再発、発生、発症もしくは進行を防ぐ、障害を検出する、または別の治療（例えば、予防剤または治療剤）における予防または治療の効果（複数可）を増強もしくは向上させるのに十分な治療の物質または組成物の量を意味する。有効量は、被験者の年齢、性別、人種、種族、全身状態など、治療される症状の重症度、投与された特定の薬剤、治療の期間、任意の同時に行われている治療の性質、使用された薬学的に許容される担体、ならびに当業者の知識および専門知識内の因子などによって異なる。必要に応じて、任意の個々の場合における「有効量」は、適切な文章および文学を参照することによって、ならびに／または日常的な実験を用いることによって、当業者により決定することができる（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｄｓ．  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  ２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  （２０００），  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  ＭＤ；  Ｂｒａｕｎｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｄｓ．  Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  １５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  （２００１），  ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，  ＮＹ；  Ｂｅｒｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｄｓ．  Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  （１９９２），  Ｍｅｒｃｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｒａｈｗａｙ  ＮＪ  を参照）。
【０１５７】
用語「予防する」、「防ぐ」、および「予防」は、本明細書中において、治療（例えば、予防剤もしくは治療剤）における投与、もしくは組み合わせによる治療（例えば、予防剤もしくは治療剤の組み合わせ）における投与由来の、被験者における、障害の発生もしくは発症の抑制、または、障害の１つもしくはそれ以上の症状の再発、発症、もしくは発生の予防を指す。「治療」または「治療すること」は、少なくとも、宿主の障害に関連する症状の改善が達成されることを意味し、改善は、治療されている状態に関連するパラメータ、例えば症状の大きさの低減を少なくとも指す広い意味で使用される。このように、治療はまた、病的状態、または少なくともそれに関連する症状が、例えば発生が予防されるなど、完全に抑制される、または、例えば宿主がもはや状態、もしくは少なくとも状態を特徴付ける症状を患っていないといった終了などの停止される状態を含む。
【０１５８】
本明細書で使用されるように、用語「被験者」は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを指す。
【０１５９】
本発明の別の目的は、前述の被験者に、上記に記載のＴｒ１細胞、静止期Ｔｒ１細胞、または活性化Ｔｒ１細胞が枯渇した有効量の細胞集団を投与することを含む、それを必要とする被験者において移植された細胞集団の免疫応答を増加させるための方法である。
【０１６０】
本発明の別の目的は、前述の被験者に、上記に記載の静止期Ｔｒ１細胞または活性化Ｔｒ１細胞が枯渇した有効量の細胞集団を投与することを含む、それを必要とする被験者において移植された細胞集団の免疫応答を増加させるための方法である。
【０１６１】
したがって、移植された細胞集団におけるＴｒ１細胞の欠如は、Ｔｒ１細胞がその抑制活性を行わないことにより、所望の免疫応答の増加が可能である。
【０１６２】
一実施形態において、前述の方法は、がんの治療を受けている被験者を治療するためのものである。
【０１６３】
一実施形態において、移植された細胞集団は、抗原特異的エフェクターＴ細胞集団である。好ましくは、前述のＴ細胞集団は、黒色腫のＭＡＲＴ−１（メランＡ）または黒色腫のＭＡＧＥ１、２、３、などの腫瘍抗原、甲状腺髄、小細胞肺癌、結腸および／または気管支扁平上皮癌・・・に特異的である。
【０１６４】
前述の実施形態において、移植された細胞集団は、治療されるべき患者に投与される前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの静止期および／または活性化Ｔｒ１細胞において枯渇している。
【０１６５】
制御性Ｔ細胞の枯渇は、癌患者におけるワクチン媒介性免疫を増強することが示されている（Ｄａｎｎｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  １１５（１２）：３６２３−３６３３）。従って、本発明の別の実施の形態において、Ｔｒ１細胞、静止期Ｔｒ１細胞および／または活性化Ｔｒ１細胞の枯渇を癌や感染症を治療するための細胞療法に用いることができ、前述のＴＲ１細胞が治療にとって有毒または有害であり得ることが提言されている。例えば、癌の治療において、ワクチン接種／免疫療法プロトコルの前のＴｒ１細胞の一時的な枯渇は、重要であり得、前述の一時的な枯渇は、本発明の枯渇の方法に係る装置を介してｅｘ  ｖｉｖｏで患者の血液を枯渇させ、患者にそれをすぐ再注入することによって得られる。したがって、前述の実施形態において、患者の血液からの静止期および／または活性化Ｔｒ１細胞の枯渇が、装置を介してｅｘ  ｖｉｖｏで行われる。
【０１６６】
本発明の別の目的は、治療前および治療後の生物学的試料中の静止期および／または活性化Ｔｒ１細胞を同定することを含む、被験者における治療の効果をｉｎ  ｖｉｔｒｏでモニタリングするための方法であって、治療後の静止期および／または活性化Ｔｒ１細胞集団の増加は、治療への反応に対応する。
【０１６７】
Ｔｒ１細胞が、多発性硬化症、喘息、尋常性天疱瘡、および関節リウマチなどの自己免疫または炎症性疾患を患っている被験者で損なわれていることは、当該技術分野においては周知である。したがって、静止期および／または活性化Ｔｒ１細胞集団における増加が治療後に観察され得る被験者が、治療に反応する被験者である。
【０１６８】
本発明によれば、静止期および／または活性化Ｔｒ１細胞集団の同定は、上記に記載のように行われる。
【０１６９】
一実施形態において、生物学的試料は、治療前および治療後の異なる時点、例えば、治療中の毎週または毎月、被験者から得られる。
フローサイトメトリ
【実施例】
【０１７０】
実験手順
Ｔｒ１細胞単離
Ｔｒ１細胞を、Ｂｒｕｎら（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，  ２００９）に記載のように単離した。要するに、末梢血細胞を、食物抗原特異的Ｔｒ１細胞の増殖を可能にするために、Ｆｉｃｏｌｌ密度遠心単離によって単離し、食品抗原の存在下で１ｍｌ当たり２×ｌ０６の細胞数で培養した。培養の１３日後、細胞を、３週間限界希釈法によりクローニングした。成長しているクローンを、その後、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激剤ならびにサイトカイン（ＩＬ−２およびＩＬ−４）を使用して拡大した。クローンのＴｒ１細胞の同一性は、ＩＬ−１０の高い産生、ＩＦＮ−γの中程度の産生、およびＩＬ−４低い産生を示す細胞のサイトカイン産生プロファイル（Ｂｒｕｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，  ２００９を参照）により評価した。マウスのＴｒ１細胞の産生のために、脾細胞を、ＩＬ−１０、抗ＩＬ−１２、および抗ＩＬ−４の存在下で７日間、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体で活性化した。得られた細胞集団を、３週間、照射同系脾細胞および抗ＣＤ３抗体上でクローニングした。成長したクローンを、それらのサイトカイン分泌プロファイルに対して評価した。ＩＬ−１０の高い産生、ＩＦＮ−γの中程度の産生、およびＩＬ−４の低い産生を示すクローンを、Ｔｒ１細胞として同定した。
【０１７１】
ＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＴｒｅｇ細胞の単離
ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ  ＰＬＵＳ勾配（ＧＥヘルスケア社）上の密度沈降により、健康なボランティアの全血由来軟膜調製物から単離した。勾配インタフェースから回収した細胞を、ＲＰＭＩ  １６４０培地で２回洗浄し、計数し、すぐにＭＡＣＳおよび染色のために使用した。要するに、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＤ４単離キット（Ｄｙｎａｌ社）を用いてＰＢＭＣ全体からネガティブに選択し、９２〜９８％の純度でＣＤ４＋細胞集団を得た。精製したＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの拡大を、バタグリアら（Ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ２００６）に記載のように行った。すなわち、単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ２８抗体−コーティングされた磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＣＤ３／  ＣＤ２８のＴ細胞エキスパンダー、ダイナル・インビトロゲン社）で活性化した。細胞を、１００ｎＭラパマイシンの存在下で、５％プールのＡＢ型由来ヒト血清（シグマ社）、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを追加したＸ−ｖｉｖｏ１５培地の存在下で培養した。それぞれ７日間の刺激を３回行い、ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）を２回目の刺激の開始から追加した。
【０１７２】
フローサイトメトリ試験
ヒト細胞のフローサイトメトリ試験のために、以下の抗体：ＰＥ−結合抗−ＣＤ１２７（ベックマン・コールター社からのクローンＲ３４．３４）、ベクトン・ディッキンソン社からのＦＩＴＣ−標識抗−ＣＤ４抗体（クローン＃ＲＰ４−Ｔ４）、ＰｅＣｙ５標識抗ＣＤ６２Ｌ（ベクトン・ディッキンソン社からのクローンＤｒｅｇ５６）、およびアロフィコシアニン結合抗−ＣＤ２５（ベクトン・ディッキンソン社からのクローンＭ−Ａ２５１）を使用した。ヒトのＦｏｘｐ３に対する細胞質内染色を、メーカーの指示に従って、ＰＥ−結合抗−Ｆｏｘｐ３抗体（ＢＤからのクローン２５９  Ｄ／Ｃ７）および細胞質内染色キット（ＢＤ）を用いて行った。マウスの細胞上のフローサイトメトリ試験に対し、使用された抗体は、ＰＥＣｙ７−結合抗−ＣＤ４（クローンＲＭ４−１５）、ＡＰＣ−結合抗−ＣＤ２５（クローンＰＣ６１）、ＰＥ−結合ＦｏｘＰ３（クローンＭＦ２３）、およびＰＥ−結合抗−ＣＤ６２Ｌ（クローンＭｅｌｌ４）であった。すべての抗−マウス抗体を、ベクトン・ディッキンソン社から購入した。
【０１７３】
遺伝子発現の試験
遺伝子発現試験が、Ｄａｙｅｍら（Ｃｏｍｐ  Ｆｕｎｃｔ  Ｇｅｎｏｍ，  ２００３）に記載のＤＮＡマイクロアレイ解析を用いて行った。この目的のために、細胞試料を溶解し、ＲＮＡをトリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）試薬（インビトロゲン社）を用いて安定化した。ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ社からのＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉｋｉｔで精製し、残りのＤＮＡの残存量は、Ａｍｂｉｏｎ社（ＤＮＡフリー）からのＤＮａｓｅを用いて除去した。単離されたＲＮＡの濃度および品質は、光度計（サーモ）およびＡｇｉｌｅｎｔバイオアナライザ２１００で同定した。ＲＮＡは、ヒトＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社−ＨｕＧｅｎｅ−Ｌ＿０−ＳＴ−ＶＬ）でかけあわせた。
【０１７４】
結果
まず、天然ＣＤ４＋制御性細胞（ｎＴｒｅｇ細胞）を、ＣＤ２５分子の恒常的発現により記載した。さらに、ＣＤ２５はまた、Ｔ細胞のすべてのタイプの活性マーカーであり、したがって、ｎＴｒｅｇ細胞および活性化された従来のＴ細胞（ＣｏｎｖＴｃｅｌｌｓ）を区別することは不可能であった。同じ規則がまた、発現がｎＴｒｅｇ細胞上で恒常的であり、活性化された従来のＴ細胞（ｃｏｎｖＴ  ｃｅｌｌｓ）上で上方制御される、マスター制御遺伝子Ｆｏｘｐ３の発現についてもあてはまる。
【０１７５】
Ｔｒｅｇ細胞の恒常的マーカーとしてＦｏｘｐ３およびＣＤ２５が発見されてから数年後、ＣＤ１２７分子が、Ｔｒｅｇ細胞の表面上では恒常的に少ないが、従来のすべてのＴ細胞の表面上に恒常的に多く発現することが示され、活性化の際もこれらの２つの集団を区別する方法が得られた。
ｏＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ＝ｎＴｒｅｇ細胞（静止期および活性化された）
ｏＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｈｉ＝活性化された従来のＴ細胞
ｏＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｈｉ＝静止期の従来のＴ細胞
【０１７６】
ｎＴｒｅｇ細胞のほかに、別のよく研究された制御性細胞集団はまた、免疫寛容に関与している。Ｔｒ１リンパ球と呼ばれるこの集団はまた、上記の分子の発現によって表現型とされた。結果は以下のとおりである。
ｏＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ＝活性化Ｔｒ１細胞
ｏＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−ＣＤ２５−ＣＤ１２７ｌｏ＝静止期Ｔｒ１細胞
この結果は、静止期Ｔｒ１細胞がＣＤ２５およびＣＤ１２７の発現によって、またはＦｏｘｐ３、ＣＤ２５およびＣＤ１２７の発現によってｎＴｒｅｇ細胞と区別することができることを示す。しかし、活性化されたＴｒ１細胞は、ｎＴｒｅｇ細胞と同じ表現型を示す（図１）。
【０１７７】
別の表面分子が、これら２つの集団を区別することができるかどうかを調べるために、我々は、ヒトのｎＴｒｅｇ細胞およびヒトのＴｒ１細胞の両方の表面上にＣＤ６２Ｌを発現する細胞数を調べた。静止期および活性化Ｔｒｅｇ細胞の両方において多数の細胞がＣＤ６２Ｌを発現し、静止期または活性化Ｔｒ１細胞のいずれにおいても少数の細胞しかＣＤ６２Ｌを発現しない（図２）。重要なことには、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、およびＣＤ２５の染色における平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、以前に報告されているように、ｎＴｒｅｇが恒常的にＣＤ６２Ｌを発現していることを示している。これとは対照的に、ＣＤ６２Ｌは、Ｔｒ１細胞から恒常的に欠如している（図３）。したがって、ＣＤ６２Ｌ表現型は、上記マーカーのパネル上に含まれる場合に、活性化されたＴｒ１細胞およびｎＴｒｅｇ細胞を区別することができる。ＣＤ１２７の染色におけるＭＦＩは、４つの細胞集団すべてに対して低くなっている。ＣＤ２５の染色におけるＭＦＩは、ｎＴｒｅｇ細胞上で恒常的に高く、活性化されたＴｒ１細胞で高く、静止期Ｔｒ１細胞上で低いＭＦＩへと下方制御されている。この観察はまた、ＲＴ−ＰＣＲの実験でも確認された（図４）。
ｏＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−ＣＤ２５−ＣＤ１２７ｌｏＣＤ６２Ｌｌｏ＝静止期Ｔｒ１細胞
ｏＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏＣＤ６２Ｌｌｏ＝活性化されたＴｒ１細胞
ｏＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏＣＤ６２Ｌｈｉ＝ｎＴｒｅｇ細胞
図４は、ＣＤ６２Ｌ表面による活性化Ｔｒ１細胞およびｎＴｒｅｇ細胞間を区別する役割はまた、マウス由来細胞集団にもあてはまることを示す。
【０１７８】
健康な個人２人からの末梢血の白血球を、蛍光標識されたＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、およびＣＤ６２Ｌ特異的抗体で染色した。ＣＤ６２Ｌを発現する細胞の百分率は、ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ１２７ｌｏ表現型によって特徴付けられる細胞のサブセットで同定した。
【０１７９】
図５ＡおよびＢは、ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ１２７ｌｏ集団において、マーカーＣＤ６２Ｌが、ＣＤ６２Ｌｌｏ集団およびＣＤ６２Ｌｈｉ集団を区別することができることを示す。したがって、マーカーＣＤ４、ＣＤ２５、およびＣＤ１２７は、細胞集団における静止期Ｔｒ１細胞を区別するのに十分ではない。
【０１８０】
結論として、表１は、使用されるマーカーに応じて、各集団を区別する方法を示す。
【表１】
0006031436.tif 000002
【０１８１】
Ｆｏｘｐ３もまた、区別する細胞集団に対し任意で使用することができる。
【表２】
0006031436.tif 000003
【図１】
0006031436.tif 000004
【図２】
0006031436.tif 000005
【図３Ａ】
0006031436.tif 000006
【図３Ｂ】
0006031436.tif 000007
【図４】
0006031436.tif 000008
【図５Ａ】
0006031436.tif 000009
【図５Ｂ】
0006031436.tif 000010