(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の群から選択されるいずれか一つ以上のマイクロRNAまたはその相補鎖分子のみが集積された、ラットにおけるヘキサナール曝露有無確認用マイクロアレイチップ：
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0000838(rno-miR-132-3p, Rattus norvegicus miR 132-3p, 配列番号1)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017369(rno-miR-667-5p, Rattus norvegicus miR667-5p, 配列番号2)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0003119(rno-miR-224-5p, Rattus norvegicus miR 224-5p, 配列番号3)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017878(rno-miR-3585-5p, Rattus norvegicus miR 3585-5p, 配列番号4)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0004726(rno-miR-101a-5p, Rattus norvegicus miR 101a-5p, 配列番号5)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0003201(rno-miR-382-5p, Rattus norvegicus miR 382-5p, 配列番号6)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0000861(rno-miR-184, Rattus norvegicus miR184, 配列番号7)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017139(rno-miR-181b-1-3p, Rattus norvegicus miR 181b-1-3p, 配列番号8)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0012846(rno-miR-201-5p, Rattus norvegicus miR 201-5p, 配列番号9)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0003198(rno-miR-376a-3p, Rattus norvegicusmiR 376a-3p,配列番号10)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0000855(rno-miR-153-3p, Rattus norvegicus miR 153-3p, 配列番号11)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0024851(rno-miR-1306-5p, Rattus norvegicus miR 1306-5p, 配列番号12)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0000901(rno-miR-299a-5p, Rattus norvegicus miR 299a-5p, 配列番号13)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0000561(rno-miR-327, Rattus norvegicus miR327, 配列番号14)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017872(rno-miR-3582, Rattus norvegicus miR3582, 配列番号15)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0024845(rno-miR-3068-5p, Rattus norvegicus miR 3068-5p, 配列番号16)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017028(rno-miR-326-5p, Rattus norvegicus miR 326-5p, 配列番号17)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017892(rno-miR-1249, Rattus norvegicus miR1249, 配列番号18)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0005312(rno-miR-411-5p, Rattus norvegicus miR 411-5p, 配列番号19)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0000896(rno-miR-292-5p, Rattus norvegicus miR 292-5p, 配列番号20)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017848(rno-miR-3568, Rattus norvegicus miR3568, 配列番号21)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0003177 (rno-miR-541-5p, Rattus norvegicus miR 541-5p, 配列番号22)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0000587(rno-miR-341, Rattus norvegicus miR341, 配列番号23)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017175(rno-miR-421-3p, Rattus norvegicus miR 421-3p, 配列番号24)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017304(rno-miR-411-3p, Rattus norvegicus miR 411-3p, 配列番号25)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0000865(rno-miR-190a-5p, Rattus norvegicus miR 190a-5p, 配列番号26)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017229(rno-miR-664-2-5p, Rattus norvegicus miR 664-2-5p, 配列番号27)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0001626(rno-miR-431, Rattus norvegicus miR431, 配列番号28)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0003199(rno-miR-381-3p, Rattus norvegicus miR 381-3p, 配列番号29)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017898(rno-miR-3594-5p, Rattus norvegicus miR 3594-5p, 配列番号30)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017855(rno-miR-1188-3p, Rattus norvegicus miR 1188-3p, 配列番号31)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0003194(rno-miR-376c-3p, Rattus norvegicus miR 376c-3p, 配列番号32)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0000577(rno-miR-337-3p, Rattus norvegicus miR 337-3p, 配列番号33)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0012857(rno-miR-678, Rattus norvegicus miR678, 配列番号34)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0012827(rno-miR-1224, Rattus norvegicus miR1224, 配列番号35)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0025054(rno-miR-6317, Rattus norvegicus miR6317, 配列番号36)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0024848(rno-miR-1843-3p, Rattus norvegicus miR 1843-3p, 配列番号37)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017151(rno-miR-200a-5p, Rattus norvegicus miR 200a-5p, 配列番号38)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017192(rno-miR-433-5p, Rattus norvegicus miR 433-5p, 配列番号39)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0004717(rno-miR-29b-2-5p, Rattus norvegicus miR 29b-2-5p, 配列番号40)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0005301(rno-miR-188-5p, Rattus norvegicus miR 188-5p, 配列番号41)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017306(rno-miR-425-3p, Rattus norvegicus miR 425-3p, 配列番号42)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0003121(rno-miR-483-3p, Rattus norvegicus miR 483-3p, 配列番号43)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0025073(rno-miR-6332, Rattus norvegicus miR6332, 配列番号44)、
マイクロRNA登録番号(miRbase) MIMAT0000780(rno-miR-7b, Rattus norvegicus miR 7b, 配列番号45)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017163(rno-miR-221-5p, Rattus norvegicus miR 221-5p, 配列番号46)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017904(rno-miR-328b-3p, Rattus norvegicus miR 328b-3p, 配列番号47)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017131(rno-miR-145-3p, Rattus norvegicus miR 145-3p, 配列番号48)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017807(rno-miR-3549, Rattus norvegicus miR3549, 配列番号49)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017089(rno-let-7f-1-3p, Rattus norvegicus let 7f-1-3p, 配列番号50)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0004733(rno-miR-136-3p, Rattus norvegicus miR136-3p, 配列番号51)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017201 (rno-miR-483-5p, Rattus norvegicus miR 483-5p, 配列番号52)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0025051(rno-miR-3102, Rattus norvegicus miR3102, 配列番号53)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0025050(rno-miR-6315, Rattus norvegicus miR6315, 配列番号54)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0000887(rno-miR-217-5p, Rattus norvegicus miR 217-5p, 配列番号55)、
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0025057(rno-miR-3075, Rattus norvegicus miR3075, 配列番号56)。
【請求項２】
1）ヘキサナールを曝露させた実験群と正常対照群のラットの体細胞からマイクロRNAを含むtotal RNAを分離する工程と、
2）工程1）の実験群と対照群のRNAをそれぞれ異なる蛍光物質で標識する工程と、
3）工程2）の蛍光物質で標識されたRNAを、請求項1のマイクロRNAマイクロアレイチップと混成化させる工程と、
4）工程3）の反応したマイクロRNAマイクロアレイチップを分析する工程と
5）工程4）の分析したデータから、請求項1のマイクロアレイチップに集積されたマイクロRNAの発現程度を対照群と比較して確認する工程とを含むヘキサナール曝露に対するマイクロRNA発現有無を確認する方法。
【請求項３】
工程1）の体細胞が、ラット肺細胞またはラット肺癌細胞、または肺組織であることを特徴とする、請求項２に記載のヘキサナール曝露に対するマイクロRNA発現有無を確認する方法。
【請求項４】
前記肺組織が、Fischer344（SD系）ラット肺組織であることを特徴とする、請求項３に記載のヘキサナール曝露に対するマイクロRNA発現有無を確認する方法。
【請求項５】
工程3）の蛍光物質が、Cy3（Cyanine 3）、Cy5（Cyanine 5）、FITC（poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate）、RITC（rhodamine-B-isothiocyanate）とローダミン（rhodamine）からなる群から選択して用いることを特徴とする、請求項２に記載のヘキサナール曝露に対するマイクロRNA発現有無を確認する方法。
【請求項６】
1）ヘキサナールを曝露させた実験群と正常対照群のラットの体細胞からマイクロRNAを含むtotal RNAを分離する工程と、
2）前記の実験群および対照群のRNAをcDNAに合成する工程と、
3）工程2）の実験群と対照群のcDNAを、それぞれ下記の群から選択されるいずれか一つ以上のマイクロRNAを増幅することができるプライマーを用いて、リアルタイムPCRを行なう工程：
マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0000861（rno-miR-184, Rattus norvegicus miR184, 配列番号7）、
マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0000561（rno-miR-327, Rattus norvegicus miR327, 配列番号14）、
マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0017892（rno-miR-1249, Rattus norvegicus miR1249, 配列番号18）、
マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0017848（rno-miR-3568, Rattus norvegicus miR3568, 配列番号21）、
マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0001626（rno-miR-431, Rattus norvegicus miR431, 配列番号28）、
マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0017898（rno-miR-3594-5p, Rattus norvegicus miR 3594-5p, 配列番号30）、
マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0017855（rno-miR-1188-3p, Rattus norvegicus miR 1188-3p, 配列番号31）、
マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0012857（rno-miR-678, Rattus norvegicus miR678, 配列番号34）、
マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0012827（rno-miR-1224, Rattus norvegicus miR1224, 配列番号35）、および
マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0017807（rno-miR-3549, Rattus norvegicus miR3549, 配列番号49）;および
4）工程3）の遺伝子産物を対照群と比較して発現の程度を確認する工程とを含むヘキサナールに対する曝露有無を確認する方法。
【請求項７】
請求項1のマイクロRNAマイクロアレイチップを含む、ラットにおけるヘキサナール曝露に対するマイクロRNA発現有無確認用キット。
【請求項８】
ラットの肺組織をさらに含むことを特徴とする、請求項７に記載のヘキサナールに対する曝露有無確認用キット。
【請求項９】
ラットの肺組織が、Fischer344（SD系）ラットであることを特徴とする、請求項８に記載のヘキサナールに対する曝露有無確認用キット。
【請求項１０】
下記のマイクロRNAに相補的でマイクロRNAを増幅することができるプライマーを含む、ラットにおけるヘキサナール曝露有無確認用キット：
マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0000861（rno-miR-184, Rattus norvegicus miR184, 配列番号7）、
マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0000561（rno-miR-327, Rattus norvegicus miR327, 配列番号14）、
マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0017892（rno-miR-1249, Rattus norvegicus miR1249, 配列番号18）、
マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0017848（rno-miR-3568, Rattus norvegicus miR3568, 配列番号21）、
マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0001626（rno-miR-431, Rattus norvegicus miR431, 配列番号28）、
マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0017898（rno-miR-3594-5p, Rattus norvegicus miR 3594-5p, 配列番号30）、
マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0017855（rno-miR-1188-3p, Rattus norvegicus miR 1188-3p, 配列番号31）、
マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0012857（rno-miR-678, Rattus norvegicus miR678, 配列番号34）、
マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0012827（rno-miR-1224, Rattus norvegicus miR1224, 配列番号35）、
マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0017807（rno-miR-3549, Rattus norvegicus miR3549, 配列番号49）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘキサナール曝露有無確認用マイクロRNAおよびそれを用いた確認方法に関するもので、より詳細には、ヘキサナール曝露によって特異的に発現が変化するマイクロRNAおよびそれを用いたヘキサナールに対する曝露有無を確認する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
最近になって、遺伝子発現を調節する新しい調節性RNAの一部類としてマイクロRNA（miR, miRNA）が台頭している。これらの小型（典型的にヌクレオチド18-24個の長さ）非暗号化RNA分子は、RNA分解の促進、mRNAの翻訳阻害、および遺伝子転写への影響を通じてタンパク質の発現パターンを調節することができる。マイクロRNAは、標的遺伝子の発現を抑制することにより、発達および分化、細胞増殖制御、ストレス応答、細胞死滅（apoptosis）など、様々な生物学的過程を調節する。現在、約1800個以上のヒトのマイクロRNAが知られており、国内外で活発に研究が進められている。
【０００３】
マイクロRNAは、RNAポリメラーゼII（pol II）又はRNAポリメラーゼIII（pol III; 非特許文献１参照）によって転写され、転写された個々のマイクロRNA遺伝子、タンパク質、暗号化遺伝子のイントロンまたは複数の密接に関連したマイクロRNAを主に暗号化するポリシストロン転写物から誘導することができる。RNA pol IIまたはpol IIIによるmiRNA遺伝子の転写は、一般的に数千塩基長のプライマリmiRNA転写物（pri-miRNAs）と呼ばれる最初の転写物を生産する。核では、pri-miRNAsは、RNAse、ドローシャ（Drosha）により加工されて、70ないし100ヌクレオチドヘアピン型前駆体（pre-miRNAs）を生産する。細胞に運ばれた後、ヘアピンpre-miRNAは、二重鎖miRNAを生産するためにダイサーによって追加で加工される。成熟したmiRNA鎖は、RNA-誘導沈黙複合体（RISC）の中に混合されて、ここで成熟したmiRNAは、塩基対の相補性によってその標的mRNAsと結合する。MiRNA塩基対がmRNA標的と完全に一致する比較的にまれな場合には、これがmRNAの分解を促進する。さらに一般的に、miRNAsは標的mRNAsと不完全な異形二重鎖を形成してmRNA翻訳に影響を与える。
【０００４】
マイクロRNAのメカニズムは、癌の発症、細胞の老化、臓器の成長などに重要な影響を及ぼしており、それにより、マイクロRNA関連の研究は、癌の発生、老化などの生命現象の因果関係の究明に中枢的な役割をするだけでなく、将来、発生および分化や幹細胞を用いた細胞治療剤の開発などの研究にも適用することができる韓国のバイオ研究の核心的分野としての地位を得ることができると予想される。したがって、マイクロRNAマーカーの発掘は、癌を含む疾病の早期診断の可能性を予測することに大きく役立つところに意義がある。
【０００５】
のみならず、マイクロRNAマーカーは、環境性疾患が急激に増加している状況下で、特定の環境有害物質の曝露予測にも有用に用いられると考えられる。今までは、環境有害物質の曝露に伴う遺伝子（mRNA）変化の様相とそれに伴う疾病との関連性に関した研究が主に進行されてきたが、最近、マイクロRNAとの関連性に対する関心が増加するにつれて、ベンゼン、ヒ素またはRDXのような有害物質の曝露に伴うマイクロRNAの発現変化を観察し、特異的に発現が変化するマイクロRNAとその標的遺伝子を、有害物質に対するマーカーとして提示した（非特許文献２参照）。また、発掘されたマイクロRNAは、曝露予測のためのマーカーとしてだけでなく、標的遺伝子の発現を調節する調節子として環境有害物質による毒性機序予測のためのマーカーとしても有用に用いることができる。このように、マイクロRNAマーカーの環境有害物質曝露と毒性機序予測における役割が非常に重要であるにもかかわらず、現在、マイクロRNA関連の研究は、主に疾病診断用マーカーの発掘に限られており、多様な環境中に曝露する可能性が非常に大きい揮発性有機化合物類のような有害物質曝露によるマイクロRNAの発現変化に関する研究は不足している。また、後天的遺伝学的変化は、遺伝子発現のような遺伝的変化の多様性に比べてその程度がひどくないので、多数のマーカーが必要な遺伝子発現プロファイリングに比べて、わずか一つのマイクロRNAやDNAメチレーションのようなエピジェネティックマーカーでも、疾病や有害物質の曝露を初期に診断することができるという利点だけでなく、非侵襲的方法で診断することができるという利点がある。各マイクロRNAが多様な標的遺伝子を調節して、高等真核生物では、千個余りのマイクロRNAが存在するので、マイクロRNAによって調節することができる潜在的な回路が非常に多いと予想されている。
【０００６】
ヘキサナールは、代表的な揮発性有機化合物類であるアルデヒド類の一つである。アルデヒドは大部分呼吸を通じて曝露され、呼吸による曝露は、血管を通じて急速に全身に伝えられるようになる。アルデヒド類の中でもヘキサナールは、呼吸器の上部気道および粘膜はもちろん、目や皮膚組織に影響を与えることが報告されており、慢性閉塞性肺疾患（Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD）および肺癌患者の診断のためのマーカーとして用いられるほど、肺疾患と密接な関連がある物質として報告されている。血流に乗って流れる揮発性有機化合物は、肺胞膜の拡散現象によって肺に影響を及ぼすようになり、ヘキサン（hexane）、メチルペンタン（methylpentan）、イソプロペン（isopropene）、ベンゼン（benzene）などは、疾患のマーカーとして使用されていて（非特許文献３）、最近、吸気ガス分析（exhaled breath analysis）を通じて捕集された物質の揮発性有機化合物類分析結果から、簡単な肺がん診断法が開発され用いられている。揮発性有機化合物類中のアルデヒド類（Aldehydes）は、肺癌疾患者に表れる代表的な物質として報告されている（非特許文献４）。したがって、ヘキサナールなどのアルデヒド類特異的バイオマーカーの発掘は、肺疾患およびヘキサナールの環境への曝露をスクリーニングするために用いることができる。
【０００７】
また、揮発性有機化合物類であるアルデヒド類の人体毒性程度と遺伝子発現の変化に対する研究は、一部報告されているが、代表的なアルデヒドとして知られているホルムアルデヒド、アセトアルデヒド（Formaldehyde、Acetaldehyde）などの研究にほぼ限定されている。このようにヘキサナールのヒトに対する潜在的な危害性にもかかわらず、人体での危害度評価データが十分ではなく、曝露に対する検索方法もGC-MS（Gas Chromatography-Mass Spectrometer）またはHPLC（High Performance Liquid Chromatography）などの古典的な方法に限られている。GC-MSまたはHPLC方法などを用いると定量は可能であるが、分析のための適正条件を設定しなければならず、高価の装備などが必要である。それで、DNAマイクロアレイチップまたはプライマー（primer）を用いるリアルタイム（real time）PCR（Real-time reverse transcript polymerase chain reaction）などによって、より速くより簡便なスクリーニング（screening）方法が可能となった。このような分析手法を用いた迅速な危害性評価を通じて人体での毒性作用、特に癌をはじめとする様々な疾患誘発に関与するマイクロRNA発現の変化有無などを探索することができる分子的指標を発掘して活用し、ヘキサナールの人体への曝露に対する適切な対策と管理を行なうことが重要な課題といえる。
【０００８】
1997年に初めてマイクロRNAが明らかにされて以来、哺乳類、微生物など複数種のマイクロRNAが急速に明らかにされて、Sanger miRBASE database、miRDB、miRNA Target databaseなど、さまざまな種類のデータベースに登録されている。このように明らかになったマイクロRNAのデータを基に、遺伝子の機能を研究するためにオミックス（Omics）基盤の研究が活発に行われている。一回の実験で数千個の遺伝子の発現を分析するために、マイクロアレイ（microarray）分析を行なう（非特許文献５）。
【０００９】
マイクロアレイは、cDNA（complementary DNA）や20〜25塩基対（base pair）の長さのオリゴヌクレオチド（oligonucleotide）のセットをガラス上に集積化したものである。cDNAマイクロアレイは、学校内の研究室やAgilent社、Genomic Solutions社などの会社で、チップ上にcDNA収集物を機械的に固定化するか、またはインクジェット（ink jetting）方法を用いて製造している（非特許文献６）。オリゴヌクレオチドマイクロアレイは、Affymetrix社で フォトリソグラフィ（photolithography）工程を用いて、チップ上で直接合成する方法で作られており、Agilent社などは、合成したオリゴヌクレオチドを固定化する方法で生産している（非特許文献６）。
【００１０】
遺伝子の発現分析のためには、組織などの試料からマイクロRNAを得て、マイクロアレイにあるオリゴヌクレオチドと交雑反応を行なう。得られたマイクロRNAは、蛍光または同位元素で標識化する。
【００１１】
マイクロアレイを通じて遺伝子発現を測定する方法としては、大きく分けてtwo-dye方式とone-dye方式がある。相補結合反応を測定する時、対照群試料と実験群の試料に、それぞれ2つの異なる蛍光（例えば、Cye3とCye5）で標識した後、マクロアレイで反応させて測定する方法をtwo-dyeマクロアレイといい、両方の試料に同じ蛍光を処理した後、二つの異なるマクロアレイで反応させて測定する方法をone-dyeマクロアレイという（非特許文献７）。
【００１２】
最近DNAマクロアレイ技術を用いた先端技術である毒性ゲノミクス（Toxicogenomics）研究などと組み合わせて、大量（high throughput）に医薬品および新医薬の候補物質は、もちろん、代表的な環境汚染物質をはじめ、すべての化学物質による特定の組織や細胞株で発現するマイクロRNAの発現パターンの分析、量的な分析が可能となった。これにより、特定細胞内の特定マイクロRNAの発現頻度を解析することにより、環境汚染物質の有害作用と関連した遺伝子の発掘が可能であり、これにより、環境汚染物質の有害作用と分子的メカニズムを理解することになり、さらに毒性を誘発する物質の検索と確認が可能になるだろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Qi,P.ら. Cell. Mol. Immunol. 2006年, 第3巻, p.411-419
【非特許文献２】A. Baccarelli＆V. Bollati, Curr Opin Pediatr. 2009年, 第21巻, p.243-251
【非特許文献３】Vet Sci, 2004年, 第5(1)巻, p.11-18
【非特許文献４】J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2010年, 第878（27）巻, p.2643-2651
【非特許文献５】Schena, M. ら, Proc. Natl. Acad. Sci. 米国, 1996年, 第93巻, p.10614-10619
【非特許文献６】Sellheyer, K. ら, J. Am. Acad. Dermatol. 2004年, 第51巻, p.681-692
【非特許文献７】Vivian, G. ら, Nature, 1999年, 第21巻, p.15-19
【発明の概要】
【００１４】
そこで、本発明者らは、ラットのマイクロRNA約719個が集積されたオリゴマイクロアレイを用いてヘキサナールのマイクロRNA発現プロファイルを、実際にヘキサナールを曝露させたラットの肺組織からヘキサナールの曝露によって特異的に発現が変化するマイクロRNAを発掘し、ヘキサナール曝露時にマイクロRNAの発現有無を検出することができるバイオマーカー及びそれを用いた曝露有無を確認する方法を確立して、本発明を完成した。
【００１５】
本発明の目的は、ヘキサナールの曝露によって特異的に発現が変化するマイクロRNA及び前記バイオマーカーを用いたヘキサナールに対する曝露有無を確認する方法を提供することである。
【００１６】
前記目的を達成するために、本発明は、ヘキサナール曝露によって特異的に発現変化を起こすことを特徴とするヘキサナール曝露有無確認用マイクロRNAバイオマーカーを提供する。
【００１７】
また、本発明は、前記バイオマーカー遺伝子配列の全部または一部を含むオリゴヌクレオチドまたはその相補鎖分子が集積されたヘキサナールに対する曝露有無確認用マイクロRNAマイクロアレイチップを提供する。
【００１８】
また、本発明は、前記バイオマーカーを用いたヘキサナールに対するマイクロRNA発現有無を確認する方法を提供する。
【００１９】
さらに、本発明は、ヘキサナールに対するマイクロRNA発現有無確認用検索キットを提供する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のヘキサナール（Hexanal）曝露に対するマイクロRNA発現有無確認用バイオマーカーおよびそれを用いた確認方法は、マイクロRNAマイクロアレイチップを通じて選別された反応マイクロRNAをバイオマーカーとして用いてヘキサナールのモニタリングおよび危害性を判定するのに有用であり、ヘキサナールによって惹起される毒性作用機序を究明するためのツールとして用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】マイクロアレイチップを用いて、ヘキサナールを曝露させたFischer344（SD系）ラットの肺組織の全体マイクロRNA発現様相を分析した結果を示す図である。
【図２】3種のヘキサナール曝露濃度によって、共通して発現が変化する56種のマイクロRNAの発現様相を分析した結果を示す図である。
【図３ａ】ヘキサナール曝露によって発現が変化したマイクロRNAをマイクロアレイチップとリアルタイムRT-PCR（Real-time reverse transcript polymerase chain reaction）を用いて、対照群と比べて発現の増減を比較した図である。
【図３ｂ】ヘキサナール曝露によって発現が変化したマイクロRNAをマイクロアレイチップとリアルタイムRT-PCR（Real-time reverse transcript polymerase chain reaction）を用いて、対照群と比べて発現の増減を比較した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２３】
本発明は、ヘキサナール（Hexanal）の曝露によって特異的に発現変化を起こすヘキサナール特異的曝露有無確認用マイクロRNAバイオマーカーを提供する。
【００２４】
前記バイオマーカーは、ヘキサナール曝露によって1.3倍以上発現が増加または減少したマイクロRNAで構成されている。
【００２５】
本発明は、下記のように構成された群から選択されることを特徴とするバイオマーカーを提供する：
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0000838(rno-miR-132-3p, Rattus norvegicus miR 132-3p, 配列番号1)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017369(rno-miR-667-5p, Rattus norvegicus miR667-5p, 配列番号2)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0003119(rno-miR-224-5p, Rattus norvegicus miR 224-5p, 配列番号3)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017878(rno-miR-3585-5p, Rattus norvegicus miR 3585-5p, 配列番号4)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0004726(rno-miR-101a-5p, Rattus norvegicus miR 101a-5p, 配列番号5)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0003201(rno-miR-382-5p, Rattus norvegicus miR 382-5p, 配列番号6)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0000861(rno-miR-184, Rattus norvegicus miR184, 配列番号7)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017139(rno-miR-181b-1-3p, Rattus norvegicus miR 181b-1-3p, 配列番号8)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0012846(rno-miR-201-5p, Rattus norvegicus miR 201-5p, 配列番号9)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0003198(rno-miR-376a-3p, Rattus norvegicusmiR 376a-3p,配列番号10)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0000855(rno-miR-153-3p, Rattus norvegicus miR 153-3p, 配列番号11)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0024851(rno-miR-1306-5p, Rattus norvegicus miR 1306-5p, 配列番号12)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0000901(rno-miR-299a-5p, Rattus norvegicus miR 299a-5p, 配列番号13)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0000561(rno-miR-327, Rattus norvegicus miR327, 配列番号14) 、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017872(rno-miR-3582, Rattus norvegicus miR3582, 配列番号15)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0024845(rno-miR-3068-5p, Rattus norvegicus miR 3068-5p, 配列番号16)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017028(rno-miR-326-5p, Rattus norvegicus miR 326-5p, 配列番号17)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017892(rno-miR-1249, Rattus norvegicus miR1249, 配列番号18)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0005312(rno-miR-411-5p, Rattus norvegicus miR 411-5p, 配列番号19)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0000896(rno-miR-292-5p, Rattus norvegicus miR 292-5p, 配列番号20)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017848(rno-miR-3568, Rattus norvegicus miR3568, 配列番号21)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0003177 (rno-miR-541-5p, Rattus norvegicus miR 541-5p, 配列番号22)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0000587(rno-miR-341, Rattus norvegicus miR341, 配列番号23)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017175(rno-miR-421-3p, Rattus norvegicus miR 421-3p, 配列番号24)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017304(rno-miR-411-3p, Rattus norvegicus miR 411-3p, 配列番号25)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0000865(rno-miR-190a-5p, Rattus norvegicus miR 190a-5p, 配列番号26)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017229(rno-miR-664-2-5p, Rattus norvegicus miR 664-2-5p, 配列番号27)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0001626(rno-miR-431, Rattus norvegicus miR431, 配列番号28)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0003199(rno-miR-381-3p, Rattus norvegicus miR 381-3p, 配列番号29)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017898(rno-miR-3594-5p, Rattus norvegicus miR 3594-5p, 配列番号30)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017855(rno-miR-1188-3p, Rattus norvegicus miR 1188-3p, 配列番号31)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0003194(rno-miR-376c-3p, Rattus norvegicus miR 376c-3p, 配列番号32)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0000577(rno-miR-337-3p, Rattus norvegicus miR 337-3p, 配列番号33)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0012857(rno-miR-678, Rattus norvegicus miR678, 配列番号34)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0012827(rno-miR-1224, Rattus norvegicus miR1224, 配列番号35)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0025054(rno-miR-6317, Rattus norvegicus miR6317, 配列番号36)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0024848(rno-miR-1843-3p, Rattus norvegicus miR 1843-3p, 配列番号37)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017151(rno-miR-200a-5p, Rattus norvegicus miR 200a-5p, 配列番号38)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017192(rno-miR-433-5p, Rattus norvegicus miR 433-5p, 配列番号39)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0004717(rno-miR-29b-2-5p, Rattus norvegicus miR 29b-2-5p, 配列番号40)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0005301(rno-miR-188-5p, Rattus norvegicus miR 188-5p, 配列番号41)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017306(rno-miR-425-3p, Rattus norvegicus miR 425-3p, 配列番号42)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0003121(rno-miR-483-3p, Rattus norvegicus miR 483-3p, 配列番号43)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0025073(rno-miR-6332, Rattus norvegicus miR6332, 配列番号44)、マイクロRNA登録番号(miRbase) MIMAT0000780(rno-miR-7b, Rattus norvegicus miR 7b, 配列番号45)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017163(rno-miR-221-5p, Rattus norvegicus miR 221-5p, 配列番号46)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017904(rno-miR-328b-3p, Rattus norvegicus miR 328b-3p, 配列番号47)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017131(rno-miR-145-3p, Rattus norvegicus miR 145-3p, 配列番号48)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017807(rno-miR-3549, Rattus norvegicus miR3549, 配列番号49)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017089(rno-let-7f-1-3p, Rattus norvegicus let 7f-1-3p, 配列番号50)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0004733(rno-miR-136-3p, Rattus norvegicus miR136-3p, 配列番号51)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017201 (rno-miR-483-5p, Rattus norvegicus miR 483-5p, 配列番号52)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0025051(rno-miR-3102, Rattus norvegicus miR3102, 配列番号53)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0025050(rno-miR-6315, Rattus norvegicus miR6315, 配列番号54)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0000887(rno-miR-217-5p, Rattus norvegicus miR 217-5p, 配列番号55)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0025057(rno-miR-3075, Rattus norvegicus miR3075, 配列番号56)。
【００２６】
本発明者らは、ヘキサナールの曝露に対するマイクロRNA発現有無確認用バイオマーカーを発掘するために、既存に確立されたインビボ実験手法に基づいてヘキサナールの吸入曝露実験を行なった。ヘキサナール曝露濃度は、既存の文献で報告されたアルデヒドを用いたラットモデルの曝露実験結果とヘキサナールの物理化学的特性による飽和濃度、ガス発生器の特徴などを考慮して選定し（表1）、曝露方法は、鼻部曝露吸引装置（Nose-only inhalation chamber）を用いて、１日１回、１回当たり約４時間、５週間吸入させた。対照群の物質は、フィルター透過クリーンエアを使用した。
【００２７】
【表１】
0005985676.tif 000002
【００２８】
以後、前記の濃度でヘキサナールを曝露させて対照群と実験群ラットの肺組織からマイクロRNAを含むtotal RNAを分離して、蛍光物質（Cy3）で標識した。前記蛍光標識されたマイクロRNAをAgilent社のRat miRNA array v19.0（8 x 15k）（Agilent、米国）と混成化し、蛍光画像をスキャンして、マイクロRNA発現様相の違いを分析した（図1参照）。マイクロRNA発現様相を分析した結果、発現が1.3倍以上変化したマイクロRNA338種を選別した。これらのうち、発現が1.3倍以上に増加したマイクロRNAが22種、減少したマイクロRNAが316種で、総338種であり曝露濃度別に発現が変化したマイクロRNAは、下記の表のとおりである（表2）。低濃度処理群では、86種（1種が発現増加、85種が発現減少）のマイクロRNA、中濃度処理群では、86種（18種が発現増加、68種が発現減少）のマイクロRNA、高濃度処理群では、166種（3種が発現増加、163種が発現減少）のマイクロRNAが、ヘキサナール曝露によって発現が変化したことを確認できた。これらのマイクロRNAは、ヘキサナールの曝露時に毒性と関連しているとの報告はない。
【００２９】
【表２】
0005985676.tif 000003
【００３０】
また、本発明は、前記バイオマーカーマイクロRNA配列の全部または一部を含むオリゴヌクレオチドまたはその相補鎖分子が合成/集積されたヘキサナールに特異的な曝露有無確認用マイクロRNAマイクロアレイチップを提供する。
【００３１】
マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0000838(rno-miR-132-3p, Rattus norvegicus miR 132-3p, 配列番号1)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017369(rno-miR-667-5p, Rattus norvegicus miR667-5p, 配列番号2)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0003119(rno-miR-224-5p, Rattus norvegicus miR 224-5p, 配列番号3)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017878(rno-miR-3585-5p, Rattus norvegicus miR 3585-5p, 配列番号4)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0004726(rno-miR-101a-5p, Rattus norvegicus miR 101a-5p, 配列番号5)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0003201(rno-miR-382-5p, Rattus norvegicus miR 382-5p, 配列番号6)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0000861(rno-miR-184, Rattus norvegicus miR184, 配列番号7)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017139(rno-miR-181b-1-3p, Rattus norvegicus miR 181b-1-3p, 配列番号8)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0012846(rno-miR-201-5p, Rattus norvegicus miR 201-5p, 配列番号9)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0003198(rno-miR-376a-3p, Rattus norvegicusmiR 376a-3p,配列番号10)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0000855(rno-miR-153-3p, Rattus norvegicus miR 153-3p, 配列番号11)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0024851(rno-miR-1306-5p, Rattus norvegicus miR 1306-5p, 配列番号12)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0000901(rno-miR-299a-5p, Rattus norvegicus miR 299a-5p, 配列番号13)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0000561(rno-miR-327, Rattus norvegicus miR327, 配列番号14) 、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017872(rno-miR-3582, Rattus norvegicus miR3582, 配列番号15)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0024845(rno-miR-3068-5p, Rattus norvegicus miR 3068-5p, 配列番号16)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017028(rno-miR-326-5p, Rattus norvegicus miR 326-5p, 配列番号17)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017892(rno-miR-1249, Rattus norvegicus miR1249, 配列番号18)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0005312(rno-miR-411-5p, Rattus norvegicus miR 411-5p, 配列番号19)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0000896(rno-miR-292-5p, Rattus norvegicus miR 292-5p, 配列番号20)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017848(rno-miR-3568, Rattus norvegicus miR3568, 配列番号21)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0003177 (rno-miR-541-5p, Rattus norvegicus miR 541-5p, 配列番号22)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0000587(rno-miR-341, Rattus norvegicus miR341, 配列番号23)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017175(rno-miR-421-3p, Rattus norvegicus miR 421-3p, 配列番号24)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017304(rno-miR-411-3p, Rattus norvegicus miR 411-3p, 配列番号25)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0000865(rno-miR-190a-5p, Rattus norvegicus miR 190a-5p, 配列番号26)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017229(rno-miR-664-2-5p, Rattus norvegicus miR 664-2-5p, 配列番号27)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0001626(rno-miR-431, Rattus norvegicus miR431, 配列番号28)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0003199(rno-miR-381-3p, Rattus norvegicus miR 381-3p, 配列番号29)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017898(rno-miR-3594-5p, Rattus norvegicus miR 3594-5p, 配列番号30)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017855(rno-miR-1188-3p, Rattus norvegicus miR 1188-3p, 配列番号31)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0003194(rno-miR-376c-3p, Rattus norvegicus miR 376c-3p, 配列番号32)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0000577(rno-miR-337-3p, Rattus norvegicus miR 337-3p, 配列番号33)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0012857(rno-miR-678, Rattus norvegicus miR678, 配列番号34)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0012827(rno-miR-1224, Rattus norvegicus miR1224, 配列番号35)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0025054(rno-miR-6317, Rattus norvegicus miR6317, 配列番号36)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0024848(rno-miR-1843-3p, Rattus norvegicus miR 1843-3p, 配列番号37)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017151(rno-miR-200a-5p, Rattus norvegicus miR 200a-5p, 配列番号38)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017192(rno-miR-433-5p, Rattus norvegicus miR 433-5p, 配列番号39)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0004717(rno-miR-29b-2-5p, Rattus norvegicus miR 29b-2-5p, 配列番号40)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0005301(rno-miR-188-5p, Rattus norvegicus miR 188-5p, 配列番号41)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017306(rno-miR-425-3p, Rattus norvegicus miR 425-3p, 配列番号42)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0003121(rno-miR-483-3p, Rattus norvegicus miR 483-3p, 配列番号43)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0025073(rno-miR-6332, Rattus norvegicus miR6332, 配列番号44)、マイクロRNA登録番号(miRbase) MIMAT0000780(rno-miR-7b, Rattus norvegicus miR 7b, 配列番号45)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017163(rno-miR-221-5p, Rattus norvegicus miR 221-5p, 配列番号46)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017904(rno-miR-328b-3p, Rattus norvegicus miR 328b-3p, 配列番号47)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017131(rno-miR-145-3p, Rattus norvegicus miR 145-3p, 配列番号48)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017807(rno-miR-3549, Rattus norvegicus miR3549, 配列番号49)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017089(rno-let-7f-1-3p, Rattus norvegicus let 7f-1-3p, 配列番号50)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0004733(rno-miR-136-3p, Rattus norvegicus miR136-3p, 配列番号51)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0017201 (rno-miR-483-5p, Rattus norvegicus miR 483-5p, 配列番号52)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0025051(rno-miR-3102, Rattus norvegicus miR3102, 配列番号53)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0025050(rno-miR-6315, Rattus norvegicus miR6315, 配列番号54)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0000887(rno-miR-217-5p, Rattus norvegicus miR 217-5p, 配列番号55)、マイクロRNA登録番号(miRbase)MIMAT0025057(rno-miR-3075, Rattus norvegicus miR3075, 配列番号56)。
【００３２】
本発明のヘキサナール検索用マイクロRNAマイクロアレイチップは、当業者に公知の方法で作製することができる。前記マイクロアレイチップを作製する方法は、下記のとおりである。前記探索されたバイオマーカーをプローブマイクロRNA分子として用いて、チップの基板上に固定化させるためにインクジェット方式などを用いることが好ましいが、これに限定されるものではなく、本発明の好ましい実施例では、SurePrint inkjet micro droppingマイクロアレイを用いた。前記DNAマイクロアレイチップの基板は、エポキシ（epoxy）、アミノシラン（amino-silane）、ポリ-L-リジン（poly-L-lysine）およびアルデヒド（aldehyde）からなる群から選択される1つの活性基がコーティングされたものが好ましいが、これに限定されるものではない。また、前記基板は、スライドグラス、プラスチック、金属、シリコン、ナイロン膜、およびニトロセルロース膜からなる群から選択され得るが、これに限定されるものではなく、本発明の好ましい実施例では、エポキシがコーティングされたスライドグラスを用いた。
【００３３】
また、本発明は、前記バイオマーカーを用いたヘキサナールの曝露に対するマイクロRNA発現有無を確認する方法を提供する。
【００３４】
本発明は、下記のような過程を含むヘキサナールの曝露に対するマイクロRNA発現有無を確認する方法を提供する：
1）ヘキサナールを曝露させた実験群と正常対照群の体細胞からマイクロRNAを含むtotal RNAを分離する工程;
2）工程1）の実験群と対照群のRNAをそれぞれ異なる蛍光物質で標識する工程;
3）工程2）の蛍光物質で標識されたRNAを前記マイクロRNAマイクロアレイチップと混成化させる工程;
4）工程3）の反応したマイクロRNAマイクロアレイチップを分析する工程;および
5）工程4）で分析したデータから、本発明のバイオマーカーの発現レベルを、対照群と比較して確認する工程を含むヘキサナールに対する曝露有無を確認する方法を提供する。
【００３５】
前記曝露有無を確認する方法において、前記工程1）の体細胞は、ヒト肺細胞またはヒト肺癌細胞、または肺組織であることが好ましく、前記肺組織は、Fischer344（SD系）ラットを使用することが好ましいが、これ限定されるものではなく、ラット肺組織であれば、すべて使用可能である。
【００３６】
前記曝露有無を確認する方法において、工程2）の蛍光物質は、Cy3、Cy5、FITC（poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate）、RITC（rhodamine-B-isothiocyanate）およびローダミン（rhodamine）からなる群から選択されることが好ましいが、これに限定されるものではなく、当業者に公知の蛍光物質はすべて使用可能である。
【００３７】
前記曝露有無を確認する方法において、工程3）のマイクロRNAマイクロアレイチップは、Agilent社のRat miRNA array v19.0（8 x 15k）（Agilent,米国）等を用いることが好ましいが、これに限定されるものではなく、ラットマイクロRNAのうち、本発明において、前記の共通して発現が変化したマイクロRNA（表3参照）が搭載されたマイクロアレイチップであれば使用可能で、前記本発明者が作製したマイクロRNAマイクロアレイチップを使用することが最も好ましい。また、工程4）の分析方法は、GeneSpring GX12.6.1ソフトウェア（Agilent,米国）を用いることが好ましいが、これに限定されるものではなく、当業者に公知の分析ソフトウェアを用いてもよい。
【００３８】
また、本発明は、
1）ヘキサナールを曝露させた実験群と正常対照群の肺組織からマイクロRNAを含むtotal RNAを分離する工程と、
2）前記の実験群と対照群のRNAをcDNAに合成する工程と、
3）工程2）の実験群と対照群のcDNAをそれぞれ前記マイクロアレイチップに集積されたマイクロRNAを増幅することができるプライマーを用いて、リアルタイムRT-PCR（Real-time reverse transcript polymerase chain reaction）を実行する工程；
マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0000861（rno-miR-184, Rattus norvegicus miR184, 配列番号7）、マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0000561（rno-miR-327, Rattus norvegicus miR327, 配列番号14）、マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0017892（rno-miR-1249, Rattus norvegicus miR1249, 配列番号18）、マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0017848（rno-miR-3568, Rattus norvegicus miR3568, 配列番号21）、マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0001626（rno-miR-431, Rattus norvegicus miR431, 配列番号28）、マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0017898（rno-miR-3594-5p, Rattus norvegicus miR 3594-5p, 配列番号30）、マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0017855（rno-miR-1188-3p, Rattus norvegicus miR 1188-3p, 配列番号31）、マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0012857（rno-miR-678, Rattus norvegicus miR678, 配列番号34）、マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0012827（rno-miR-1224, Rattus norvegicus miR1224, 配列番号35）、マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0017807（rno-miR-3549, Rattus norvegicus miR3549, 配列番号49）;および
4）前記の工程3）の遺伝子産物を対照群と比較して発現の程度を確認する工程を含むヘキサナールへの曝露有無を確認する方法を提供する。
【００３９】
前記の工程2）のプライマーは、マイクロRNAを増幅することができるプライマーであることが好ましいが、これに限定されない。
【００４０】
したがって、本発明のバイオマーカーは、ヘキサナールに特異的に遺伝子発現が増加または減少するので、ヘキサナールの曝露をモニタリングおよび判定するのに有用に用いることができる。
【００４１】
【表３】
0005985676.tif 000004
0005985676.tif 000005
0005985676.tif 000006
【００４２】
また、本発明は、ヘキサナール曝露に対するマイクロRNA発現有無確認用キットを提供する。
【００４３】
本発明は、前記本発明で作製したマイクロRNAマイクロアレイチップを含むヘキサナール曝露に対するマイクロRNA発現有無確認用キットを提供する。
【００４４】
前記確認用キットにラット肺組織を追加的に含むヘキサナール曝露に対するマイクロRNA発現有無確認用キットを提供する。前記ラット肺組織は、Fischer344（SD系）ラットの肺組織であり、対照群と実験群のグループから得られるものを使用することが好ましい。
【００４５】
前記キットに追加的に蛍光物質を含むことができ、前記蛍光物質は、ストレプトアビジンコンジュゲートアルカリ性ホスファターゼ（streptavidin-like phosphatase conjugate）、化学蛍光物質（chemiflurorensce）と化学発光物質（chemiluminescent）からなる群から選択されることが好ましいが、これに限定されるものではなく、本発明の好ましい実施例では、Cy3を用いた。
【００４６】
前記キットに追加的反応試薬を含むことができ、前記反応試薬は、混成化に用いる緩衝溶液、蛍光染料の化学的誘導剤のような標識試薬、洗浄緩衝液などで構成することができるが、これに限定されるものではなく、当業者に公知のマイクロRNAマイクロアレイチップの混成化反応に必要な反応試薬はすべて含ませることができる。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明を実施例に詳細に説明する。
【００４８】
ただし、下記の実施例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。
【００４９】
<実施例1>動物モデル選定と化学物質曝露
<1-1>ラットモデル選定および化学物質の処理
本発明者らは、既存の研究と報告を通じてヘキサナール曝露実験のための適正な動物モデルとしてFischer344（SD系）ラットを選定し、既存の文献で報告されたアルデヒドを用いたラットモデルの曝露実験結果とヘキサナールの物理化学的特性による飽和濃度、ガス発生器の特徴を考慮して、曝露濃度を600ppm、1000ppm、1,500ppmに選定した。曝露方法は、鼻部曝露吸引装置（Nose-only inhalation chamber）を用いた反復吸入方式を選択して、5週間吸入させた。対照物質には、フィルター透過クリーンエアを用いて、１日１回、１回当たり約４時間曝露して、試験物質であるヘキサナールもまた、１日１回、１回当たり約４時間、合計20回曝露させた。
【００５０】
<1-2>肺組織試料
ラットから摘出した肺組織を重量測定した後、RNA抽出に適切な量にカットしてクライオチューブ（cryo tube）に入れた。得られた肺組織は、液体窒素を用いてスナップフローズン（snap frozen）した後、-80℃で保管した。
【００５１】
<実施例2>マイクロアレイ実験
<2-1>標的マイクロRNAの分離と蛍光物質標識
ヘキサナール曝露群と非曝露群の肺組織からのRNA抽出は、トリゾール（trizol）試薬（Invitrogen life technologies, 米国）を用い、製造社の方法にしたがってマイクロRNAを含む全体RNAを分離した。ゲノムDNAは、RNA精製中にRNase-free DNase set（Qiagen, 米国）を用いて除去した。各全体RNA試料の濃度は、分光光度計であるNanoDrop ND1000 spectrophotometer（NanoDrop Technologies Inc., 米国）を用いて測定し、純度はExperion（Automated Electrophoresis station, Bio-Rad）で確認した。
【００５２】
<2-2>標識されたマイクロRNAの製造
オリゴマイクロアレイ分析のために、前記実施例<2-1>で得られたヘキサナール曝露群全体RNAに蛍光物質を標識した。蛍光標識は、Agilent社のmiRNA complete labeling and Hybridization kitを用いて製造社の方法にしたがって行った。前記の得られた全体RNA2μl（100ng）に0.4μlの10X CIPバッファー, 1.1μlのヌクレアーゼ・フリー水, 0.5μlのCalf Intestinalホスファターゼを入れて37℃で30分間反応させた後、2.8μlの100％DMSOを添加しして100％で5〜10分間反応させ、すぐに氷に移した。染料（Dye）を標識させるために1μlの10X T4 RNAリガーゼバッファー、3μlのCyanine3-pCp、0.5μlのT4 RNA ligaseを入れて16℃で2時間反応させた。前記ラベリング（labeling）された試料は、Micro Bio-Spin6 columnを使用して精製した。精製したRNAは、55℃のvacuum concentratorで完全に乾燥させて18μlのヌクレアーゼ・フリー水で溶解した後、4.5μlの10X GE Blocking Agentを入れて22.5μlの2X Hi-RPMハイブリダイゼーションバッファーを入れた。準備された試料は、100℃で5分間反応させてすぐに氷に移し、5分間反応させた後、混成化反応に用いた。
【００５３】
<2-3>混成化反応
混成化及び洗浄過程は、（株）イバイオジェンの指示方法にしたがって行なった。混成化は、20時間55℃のオーブンで行った。 DNAマイクロアレイチップには、Rat miRNA array v19.0（8 x 15k）（Agilent, 米国）を用いた。
【００５４】
<2-4>蛍光画像の取得と遺伝子スクリーニング
スライド上の混成化画像は、Agilent C scanner（Agilent technologies, 米国）でスキャンし、抽出されたデータは、Agilent GeneSpring GX12.6.1（Agilent technologies）を用いてnormalizationを経て、各マイクロRNAの発現様相を分析した。
【００５５】
その結果、オリゴチップ上に存在する約719個のマイクロRNAの中で対照群に比べてヘキサナール曝露群のグループで有意に発現変化を示したマイクロRNAを、GeneSpring GX12.6.1 softwareを用いて対照群と実験群のマイクロRNA発現様相を分析した結果、発現が1.3倍以上に増加したマイクロRNAが22種、減少したマイクロRNAが316種で総338種であった（表2及び図1）。これらのマイクロRNAは、ヘキサナールの人体曝露時、毒性と関連しているという報告はない。低濃度処理群では、86種（1種が発現増加、85種が発現減少）のマイクロRNA、中濃度処理群では、86種（18種が発現増加、68種が発現減少）のマイクロRNA、高濃度処理群では、166種（3種が発現増加、163種が発現減少）のマイクロRNAが、ヘキサナール曝露によって発現が変化したことを確認することができた（表2）。
【００５６】
前記のマイクロRNA発現データを用いて、3種類の濃度のヘキサナール処理群で共通して発現変化を示す56種（1種が発現増加、55種が発現減少）のマイクロRNAを選別した（図2および表3）。併せて、前記遺伝子は、本発明で使用したヘキサナールを処理した時、ラットの肺組織で毒性と関連があるという報告はなかった。
【００５７】
<実施例3>リアルタイムRT-PCR（Real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction）定量確認
前記マイクロアレイの結果からヘキサナールの3種類の曝露濃度によって共通して発現が変化した前記<実施例2>遺伝子のうち、10種の遺伝子[マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0000861（rno-miR-184, Rattus norvegicus miR 184, 配列番号7）、マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0000561（rno-miR-327, Rattus norvegicus miR327, 配列番号14）、マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0017892（rno-miR-1249, Rattus norvegicus miR 1249, 配列番号18）、マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0017848（rno-miR-3568, Rattus norvegicus miR3568, 配列番号21）、マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0001626（rno-miR-431, Rattus norvegicus miR 431, 配列番号28）、マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0017898（rno-miR-3594-5p, Rattus norvegicus miR 3594-5p, 配列番号30）、マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0017855（rno-miR-1188-3p, Rattus norvegicus miR 1188-3p, 配列番号31）、マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0012857（rno-miR-678, Rattus norvegicus miR678, 配列番号34）、マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0012827（rno-miR-1224, Rattus norvegicus miR1224, 配列番号35）、マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0017807（rno-miR-3549, Rattus norvegicus miR3549, 配列番号49）]の発現変化の程度を調査し、定量するために、My IQリアルタイムPCR（My IQ Real-time PCR）（Bio-rad, 米国）を用いて、定量的リアルタイムRT-PCRを実施した。
【００５８】
具体的には、前記実施例<2-1>で得られた全体RNAとmiScript RT kit（Qiagen, 米国）を用いて製造社の方法にしたがってcDNAを合成した。前記cDNAをmiScript SYBR Green PCR kit（Qiagen, 米国）を用いて下記の<表4>のように試薬を混合した後、PCRチューブに入れて、工程1：95℃、15分;工程2（40回反復）：工程2-1：94℃、15秒;工程2-2：55℃、30秒;工程2-3：70℃、30秒のプログラムを設計したMy IQリアルタイムPCR機械で反応を行った。PCR産物を定量するために、サイバーグリーン（SYBR Green）で染色した。サイバーグリーン染色は、二重らせんDNAに結合する染色法で、PCR過程中に二重らせんDNAが生成されるほど蛍光強度（fluroscense intensity）が増加することになる。まず、PCRに用いた標的遺伝子と内在性（endogenous）対照群（RNU6B）のプライマーをサイバーグリーンマスターミックス（Master mix）に添加してPCRを実施した後、適切な濃度を選択するプライマー適合化（primer optimization）過程を行なった。合成されたcDNA試料と、それぞれのプライマー（表5）を混合して、サイバーグリーンマスターミックスを添加した後、PCRを行ない、定量ソフトウェアを用いて分析した。
【００５９】
【表４】
0005985676.tif 000007
【００６０】
その結果、図3に示すように、マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0000861（rno-miR-184, Rattus norvegicus miR184, 配列番号7）、マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0000561（rno-miR-327, Rattusnorvegicus miR327, 配列番号14）、マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0017892（rno-miR-1249, Rattus norvegicus miR1249, 配列番号18）、マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0017848（rno-miR-3568, Rattusnorvegicus miR3568, 配列番号21）、マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0001626（rno-miR-431, Rattus norvegicus miR431, 配列番号28）、マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0017898（rno-miR-3594-5p, Rattus norvegicus miR 3594-5p, 配列番号30）、マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0017855（rno-miR-1188-3p, Rattus norvegicus miR 1188-3p, 配列番号31）、マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0012857（rno-miR-678, Rattus norvegicus miR678, 配列番号34）、マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0012827（rno-miR-1224, Rattus norvegicus miR1224, 配列番号35）、マイクロRNA登録番号（miRbase）MIMAT0017807（rno-miR-3549, Rattus norvegicus miR3549, 配列番号49）の発現は、前記実施例<2-4>のマイクロアレイチップの結果と非常に類似して表れることを確認した（図3）。
【００６１】
【表５】
0005985676.tif 000008
【図１】
0005985676.tif 000009
【図２】
0005985676.tif 000010
【図３ａ】
0005985676.tif 000011
【図３ｂ】
0005985676.tif 000012
【配列表】
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