(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３７の配列を含む、デザイナー骨形成タンパク質。
【請求項２】
ＡＬＫ２受容体に約２ｎＭ以下のＫDで結合し、ＡＬＫ３受容体に約２ｎＭ以下のＫDで結合し、ＡＬＫ６受容体に約１ｎＭ以下のＫDで結合し、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体に約２ｎＭ以下のＫDで結合し、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体に約０．５ｎＭ以下のＫDで結合し、ＢＭＰＲＩＩＡ受容体に約３．５ｎＭ以下のＫDで結合する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
Ｉ型またはＩＩ型の結合領域内に位置しない、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸突然変異をさらに含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
請求項１に記載のタンパク質を産生する方法であって、前記タンパク質をコードする核酸を宿主細胞内に導入すること、前記細胞を前記タンパク質が産生される条件下で培養すること、および前記タンパク質を精製することを含む方法。
【請求項５】
前記核酸が、配列番号１０３の配列を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項７】
配列番号７１の配列を含む、デザイナー骨形成タンパク質。
【請求項８】
ＡＬＫ２受容体に約２ｎＭ以下のＫDで結合し、ＡＬＫ３受容体に約２ｎＭ以下のＫDで結合し、ＡＬＫ６受容体に約１ｎＭ以下のＫDで結合し、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体に約２ｎＭ以下のＫDで結合し、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体に約０．５ｎＭ以下のＫDで結合し、ＢＭＰＲＩＩＡ受容体に約３．５ｎＭ以下のＫDで結合する、請求項７に記載のタンパク質。
【請求項９】
Ｉ型またはＩＩ型の結合領域内に位置しない、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸突然変異をさらに含む、請求項７に記載のタンパク質。
【請求項１０】
請求項７に記載のタンパク質を産生する方法であって、前記タンパク質をコードする核酸を宿主細胞内に導入すること、前記細胞を前記タンパク質が産生される条件下で培養すること、および前記タンパク質を精製することを含む方法。
【請求項１１】
前記核酸が、配列番号１３７の配列を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項７に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、骨形成タンパク質、改良された骨形成タンパク質を作製する方法、および骨形成タンパク質で患者を治療する方法の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
シスチンノットサイトカインスーパーファミリーは、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）タンパク質、糖タンパク質ホルモン、血小板由来成長因子様（ＰＤＧＦ様）タンパク質、神経成長因子（ＮＧＦ）、および、神経芽細胞腫において異常な、ディファレンシャルスクリーニングで選択された遺伝子（ＤＡＮ）ファミリー（例えばｃｅｒｂｅｒｕｓ）を含む、いくつかのサブファミリーに分けられる。そして、ＴＧＦβスーパーファミリーは、３つのサブファミリー、すなわちＴＧＦβ、アクチビン、および骨形態形成／増殖分化因子タンパク質（ＢＭＰ／ＧＤＦ）にさらに分けられる、およそ４３のメンバーを含む。
【０００３】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーは、正準的なシスチンノットトポロジーを含む。すなわち、シスチンノットは、６つのシステイン残基の異常な配置の結果である。ノットは、システイン１−４の間の結合、システイン２−５の間の結合、および環を形成する介在配列からなり、前記環を、システイン３−６の間のジスルフィド結合が通過している。これらのタンパク質の活性な形態は、ホモ二量体またはヘテロ二量体である。それぞれのケースにおいて、単量体のトポロジーはシステインノットによって安定化し、さらなるシステインは、さらなる鎖内結合に寄与し、かつ／または別のタンパク質単位との二量化を仲介する。Ｋｉｎｇｓｌｅｙ、１９９４、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．８：１３３〜１４６；Ｌａｎｄｅｒら、２００１、Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：８６０〜９２１を参照されたい。
【０００４】
ＢＭＰ／ＧＤＦは、ＴＧＦ−βタンパク質スーパーファミリーの最も数の多いメンバーである。ＢＭＰ／ＧＤＦサブファミリーには、限定はしないが、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３（オステオゲニン）、ＢＭＰ３ｂ（ＧＤＦ−１０）、ＢＭＰ４（ＢＭＰ２ｂ）、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７（骨形成タンパク質−１またはＯＰ１）、ＢＭＰ８（ＯＰ２）、ＢＭＰ８Ｂ（ＯＰ３）、ＢＭＰ９（ＧＤＦ２）、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１（ＧＤＦ１１）、ＢＭＰ１２（ＧＤＦ７）、ＢＭＰ１３（ＧＤＦ６、ＣＤＭＰ２）、ＢＭＰ１５（ＧＤＦ９）、ＢＭＰ１６、ＧＤＦ１、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５（ＣＤＭＰ１、ＭＰ５２）、およびＧＤＦ８（ミオスタチン）が含まれる。ＢＭＰは、骨形成タンパク質（ＯＰ）、増殖分化因子（ＧＤＦ）、または軟骨由来形態形成タンパク質（ＣＤＭＰ）と呼ばれることがある。ＢＭＰはまた、他の動物種にも存在する。さらに、ヒト集団の異なるメンバーの間で、ＢＭＰ配列においてある程度の対立遺伝子変異が存在する。
【０００５】
ＢＭＰは、長いプロドメイン、１つまたは複数の切断部位、および成熟ドメインを含む前駆タンパク質として、天然に発現する。この前駆タンパク質はその後、細胞の機構によってプロセシングされて、二量体の成熟ＢＭＰ分子をもたらす。プロドメインは、ＢＭＰの正確なフォールディングおよびプロセシングに役立つと考えられている。さらに、全てではないが一部のＢＭＰにおいて、プロドメインは、成熟ドメインに非共有結合し得、シャペロンならびに阻害剤として作用し得る（例えば、Ｔｈｉｅｓら、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  １８：２５１〜９（２００１））。
【０００６】
ＢＭＰのシグナル伝達は、ＢＭＰ二量体が２つのＩ型セリン／スレオニンキナーゼ受容体および２つのＩＩ型セリン／スレオニンキナーゼ受容体に結合すると開始する。Ｉ型受容体には、限定はしないが、ＡＬＫ−１（アクチビン受容体様キナーゼ１（Ａｃｔｉｖｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｋｉｎａｓｅ  １））、ＡＬＫ−２（ＡｃｔＲＩａまたはＡｃｔＲＩとも呼ばれる）、ＡＬＫ−３（ＢＭＰＲＩａとも呼ばれる）、およびＡＬＫ−６（ＢＭＰＲＩｂとも呼ばれる）が含まれる。ＩＩ型受容体には、限定はしないが、ＡｃｔＲＩＩａ（ＡｃｔＲＩＩとも呼ばれる）、ＡｃｔＲＩＩｂ、およびＢＭＰＲＩＩが含まれる。ヒトゲノムは、７つのＩ型受容体および５つのＩＩ型受容体を含む１２の受容体セリン／スレオニンキナーゼファミリーメンバーを含有し、これらは全て、ＴＧＦ−βのシグナル伝達に関与する（参照することによってその開示が本明細書に組み込まれる、Ｍａｎｎｉｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８：１９１２〜３４（２００２）））。したがって、１２の受容体および４３のスーパーファミリーメンバーが存在し、このことは、少なくとも一部のＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーが同一の（１つまたは複数の）受容体に結合することを示唆する。ＢＭＰの結合の後、ＩＩ型受容体は、Ｉ型受容体をリン酸化し、Ｉ型受容体は転写因子のＳｍａｄファミリーのメンバーをリン酸化し、Ｓｍａｄは核に移行し、多くの遺伝子の発現を活性化する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＢＭＰは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの最も数の多いメンバーの中にあり、胚のパターン形成および組織の特定化、ならびに成体組織における創傷の治癒プロセスおよび修復プロセスの促進などの、細胞プロセスおよび発生プロセスの様々な組み合わせを制御する。ＢＭＰは、骨および軟骨の形成を誘発する能力によってまず単離された。ＢＭＰのシグナル伝達は、骨折および関連する組織損傷の際に誘発性であり、骨の再生および修復をもたらす。それらの受容体に対する親和性が変化したＢＭＰ分子は、天然タンパク質と比較して生物学的活性が向上している。このようなＢＭＰは、インビボでの活性が増大したタンパク質を含み、より低いタンパク質レベルでさらに優れたまたは変化した活性を提供し、それによって、改良されたタンパク質治療薬を提供することによって、とりわけ組織の再生、修復などのための、潜在的な改良された治療薬を提供し得る。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、少なくとも１つのＩ型またはＩＩ型受容体結合ドメインにおいて少なくとも１つの突然変異を含むデザイナーＢＭＰタンパク質であって、突然変異が、対応する野生型ＢＭＰによるＩ型またはＩＩ型受容体に対する結合と比較してＩ型またはＩＩ型ＢＭＰ受容体に対する結合の変化を付与するデザイナーＢＭＰタンパク質を含む。
【０００９】
１つの態様において、タンパク質は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８、およびＢＭＰ９からなる群から選択される。
【００１０】
別の態様において、タンパク質は、ＩＩ型結合ドメインＡ、ＩＩ型結合ドメインＢ、Ｉ型結合ドメイン、およびその任意の組み合わせの中に、少なくとも１つの突然変異を含む。
【００１１】
本発明はまた、少なくとも１つのＩ型またはＩＩ型受容体結合ドメインにおいて少なくとも１つの突然変異を含むアミノ酸配列を含むデザイナー骨形成タンパク質であって、突然変異が、野生型ＢＭＰ２によるＩ型またはＩＩ型受容体に対する結合と比較してＩ型またはＩＩ型ＢＭＰ受容体に対する結合の変化を付与するデザイナー骨形成タンパク質を含む。
【００１２】
１つの態様において、突然変異は、ＩＩ型結合ドメインＡ内の突然変異であり、前記突然変異は、配列番号１の配列に関してＶ３３、Ｐ３６、Ｈ３９、およびＦ４１での突然変異からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異である。
【００１３】
別の態様において、突然変異は、ＩＩ型結合ドメインＡ内の突然変異であり、前記突然変異は、配列番号１に関してＶ３３Ｉ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｈ３９Ａ、およびＦ４１Ｎからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異である。
【００１４】
さらに別の態様において、突然変異は、ＩＩ型結合ドメインＢ内の突然変異であり、前記突然変異は、配列番号１の配列に関してＥ８３、Ｓ８５、Ｍ８９、Ｌ９２、Ｅ９４、Ｅ９６、Ｋ９７、およびＶ９９での突然変異からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異である。
【００１５】
さらなる態様において、突然変異は、ＩＩ型結合ドメインＢ内の突然変異であり、前記突然変異は、配列番号１に関してＥ８３Ｋ、Ｓ８５Ｎ、Ｍ８９Ｖ、Ｌ９２Ｆ、Ｅ９４Ｄ、Ｅ９６Ｓ、Ｋ９７Ｎ、およびＶ９９Ｉからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異である。
【００１６】
別の態様において、突然変異は、Ｉ型結合ドメイン内の突然変異であり、前記突然変異は、配列番号１の配列に関してＨ４４、Ｐ４８、Ａ５２、Ｄ５３、Ｌ５５、Ｓ５７、Ｎ６８、Ｓ６９、Ｖ７０、Ｎ７１の後での単一アミノ酸の挿入、Ｓ７２、Ｋ７３、Ｉ７４、Ａ７７、およびＶ８０での突然変異からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異である。
【００１７】
さらに別の態様において、突然変異は、Ｉ型結合ドメイン内の突然変異であり、前記突然変異は、配列番号１の配列に関してＨ４４Ｄ、Ｐ４８Ｓ、Ａ５２Ｎ、Ｄ５３Ａ、Ｌ５５Ｍ、Ｓ５７Ａ、Ｎ６８Ｈ、Ｓ６９Ｌ、Ｖ７０Ｍ、Ｎ７１の後でのＰの挿入、Ｓ７２Ｅ、Ｋ７３Ｙ、Ｉ７４Ｖ、Ａ７７Ｐ、およびＶ８０Ａからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異である。
【００１８】
さらなる態様において、タンパク質は、配列番号１の配列に関してアミノ酸Ｈ４４、Ｐ４８、Ａ５２、Ｄ５３、Ｌ５５、Ｓ５７、Ｎ６８、Ｓ６９、Ｖ７０、Ｎ７１の後での単一アミノ酸の挿入、Ｓ７２、Ｋ７３、Ｉ７４、Ａ７７、およびＶ８０のそれぞれでの突然変異を含む。
【００１９】
別の態様において、タンパク質は、配列番号１の配列に関してアミノ酸Ｈ４４、Ｐ４８、Ａ５２、Ｄ５３、Ｌ５５、Ｓ５７、Ｎ６８、Ｓ６９、Ｖ７０、Ｎ７１の後での単一アミノ酸の挿入、Ｓ７２、Ｋ７３、Ｉ７４、Ａ７７、およびＶ８０のそれぞれでの突然変異を含み、前記突然変異は、Ｈ４４Ｄ、Ｐ４８Ｓ、Ａ５２Ｎ、Ｄ５３Ａ、Ｌ５５Ｍ、Ｓ５７Ａ、Ｎ６８Ｈ、Ｓ６９Ｌ、Ｖ７０Ｍ、Ｎ７１の後でのＰの挿入、Ｓ７２Ｅ、Ｋ７３Ｙ、Ｉ７４Ｖ、Ａ７７Ｐ、およびＶ８０Ａである。
【００２０】
さらに別の態様において、タンパク質は、配列番号１の配列に関してアミノ酸Ｖ３３、Ｐ３６、Ｈ３９、Ｓ８５、Ｍ８９、Ｌ９２、Ｅ９４、Ｅ９６、Ｋ９７、およびＶ９９のそれぞれでの突然変異を含む。
【００２１】
別の態様において、タンパク質は、配列番号１の配列に関してアミノ酸Ｖ３３、Ｐ３６、Ｈ３９、Ｓ８５、Ｍ８９、Ｌ９２、Ｅ９４、Ｅ９６、Ｋ９７、およびＶ９９のそれぞれでの突然変異を含み、前記突然変異は、Ｖ３３Ｉ、Ｐ３６Ｋ、Ｈ３９Ａ、Ｓ８５Ｎ、Ｍ８９、Ｌ９２Ｆ、Ｅ９４Ｄ、Ｅ９６Ｓ、Ｋ９７Ｎ、およびＶ９９Ｉである。
【００２２】
さらなる態様において、タンパク質は、配列番号１の配列に関してアミノ酸Ｖ３３、Ｐ３６、Ｈ３９、Ｈ４４、Ｐ４８、Ａ５２、Ｄ５３、Ｌ５５、Ｓ５７、Ｎ６８、Ｓ６９、Ｖ７０、Ｎ７１の後での単一アミノ酸の挿入、Ｓ７２、Ｋ７３、Ｉ７４、Ａ７７、およびＶ８０、Ｓ８５、Ｍ８９、Ｌ９２、Ｅ９４、Ｅ９６、Ｋ９７、およびＶ９９のそれぞれでの突然変異を含む。
【００２３】
さらに別の態様において、タンパク質は、配列番号１の配列に関してアミノ酸Ｖ３３、Ｐ３６、Ｈ３９、Ｈ４４、Ｐ４８、Ａ５２、Ｄ５３、Ｌ５５、Ｓ５７、Ｎ６８、Ｓ６９、Ｖ７０、Ｎ７１の後での単一アミノ酸の挿入、Ｓ７２、Ｋ７３、Ｉ７４、Ａ７７、およびＶ８０、Ｓ８５、Ｍ８９、Ｌ９２、Ｅ９４、Ｅ９６、Ｋ９７、およびＶ９９のそれぞれでの突然変異を含み、前記突然変異は、Ｖ３３Ｉ、Ｐ３６Ｋ、Ｈ３９Ａ、Ｈ４４Ｄ、Ｐ４８Ｓ、Ａ５２Ｎ、Ｄ５３Ａ、Ｌ５５Ｍ、Ｓ５７Ａ、Ｎ６８Ｈ、Ｓ６９Ｌ、Ｖ７０Ｍ、Ｎ７１の後でのＰの挿入、Ｓ７２Ｅ、Ｋ７３Ｙ、Ｉ７４Ｖ、Ａ７７Ｐ、およびＶ８０Ａ、Ｓ８５Ｎ、Ｍ８９、Ｌ９２Ｆ、Ｅ９４Ｄ、Ｅ９６Ｓ、Ｋ９７Ｎ、およびＶ９９Ｉである。
【００２４】
さらに別の態様において、タンパク質は、配列番号１の配列に関してアミノ酸Ｖ３３、Ｐ３６、Ｈ３９、Ｈ４４、Ｐ４８、Ａ５２、Ｄ５３、Ｌ５５、Ｓ５７、Ｎ６８、Ｓ６９、Ｖ７０、Ｎ７１の後での単一アミノ酸の挿入、Ｓ７２、Ｋ７３、Ｉ７４、Ａ７７、およびＶ８０、Ｓ８５、Ｍ８９、Ｌ９２、Ｅ９４、Ｅ９６、Ｋ９７、およびＶ９９のそれぞれでの突然変異を含み、前記突然変異は、Ｖ３３Ｉ、Ｐ３６Ｒ、Ｈ３９Ａ、Ｈ４４Ｄ、Ｐ４８Ｓ、Ａ５２Ｎ、Ｄ５３Ａ、Ｌ５５Ｍ、Ｓ５７Ａ、Ｎ６８Ｈ、Ｓ６９Ｌ、Ｖ７０Ｍ、Ｎ７１の後でのＰの挿入、Ｓ７２Ｅ、Ｋ７３Ｙ、Ｉ７４Ｖ、Ａ７７Ｐ、およびＶ８０Ａ、Ｓ８５Ｎ、Ｍ８９、Ｌ９２Ｆ、Ｅ９４Ｄ、Ｅ９６Ｓ、Ｋ９７Ｎ、およびＶ９９Ｉである。
【００２５】
別の態様において、タンパク質は、ＡＬＫ２受容体に約２ｎＭ以下のＫＤで、ＡＬＫ３受容体に約２ｎＭ以下のＫＤで、ＡＬＫ６受容体に約１ｎＭ以下のＫＤで、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体に約２ｎＭ以下のＫＤで、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体に約０．５ｎＭ以下のＫＤで、ＢＭＰＲＩＩＡ受容体に約３．５ｎＭ以下のＫＤで結合する。
【００２６】
１つの態様において、タンパク質はさらに、Ｉ型またはＩＩ型の結合領域内に位置しない、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸突然変異を含む。
【００２７】
本発明は、配列番号８〜７３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むデザイナー骨形成タンパク質を含む。
【００２８】
本発明は、配列番号１２のアミノ酸配列を含むデザイナー骨形成タンパク質を含む。
【００２９】
本発明は、配列番号１４のアミノ酸配列を含むデザイナー骨形成タンパク質を含む。
【００３０】
本発明は、配列番号３６のアミノ酸配列を含むデザイナー骨形成タンパク質を含む。
【００３１】
本発明は、配列番号３７のアミノ酸配列を含むデザイナー骨形成タンパク質を含む。
【００３２】
本発明は、少なくとも１つのＩ型またはＩＩ型受容体結合ドメインにおいて少なくとも１つの突然変異を含むデザイナーＢＭＰタンパク質を産生する方法であって、突然変異が、対応する野生型ＢＭＰによるＩ型またはＩＩ型受容体に対する結合と比較してＩ型またはＩＩ型ＢＭＰ受容体に対する結合の変化を付与する方法を含む。本方法は、タンパク質をコードする核酸を宿主細胞内に導入すること、細胞をタンパク質が産生される条件下で培養すること、およびタンパク質を精製することを含む。
【００３３】
１つの態様において、核酸は、配列番号７４〜１３９のいずれか１つの核酸配列から選択される配列を含む。
【００３４】
本発明は、少なくとも１つのＩ型またはＩＩ型受容体結合ドメインにおいて少なくとも１つの突然変異を含むアミノ酸配列を含むデザイナーＢＭＰ６タンパク質であって、突然変異が、野生型ＢＭＰ６によるＩ型またはＩＩ型受容体に対する結合と比較してＩ型またはＩＩ型ＢＭＰ受容体に対する結合の変化を付与するデザイナーＢＭＰ６タンパク質を含む。
【００３５】
１つの態様において、突然変異は、ＩＩ型結合ドメインＡ内の突然変異であり、前記突然変異は、配列番号４の配列に関してＩ５７、Ｋ６０、Ｇ６１、Ａ６３、Ｎ６５、Ｙ６６、およびＤ６８での突然変異からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異である。
【００３６】
別の態様において、突然変異は、ＩＩ型結合ドメインＢ内の突然変異であり、前記突然変異は、配列番号４の配列に関してＫ１０８、Ｎ１１０、Ａ１１１、Ｖ１１４、Ｆ１１７、Ｄ１１９、Ｎ１２０、Ｓ１２１、Ｎ１２２、Ｖ１２３、およびＩ１２４からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異である。
【００３７】
さらに別の態様において、突然変異は、Ｉ型結合ドメイン内の突然変異であり、前記突然変異は、配列番号４の配列に関してＳ７２、Ｎ７６、Ａ７７、Ｈ７８、Ｍ７９、Ｎ８０、Ａ８１、Ｎ８３、Ｖ８７、Ｔ８９、Ｈ９２、Ｌ９３、Ｍ９４、Ｎ９５、Ｐ９６、Ｅ９７、Ｙ９８、Ｖ９９、およびＰ１００での突然変異からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異である。
【００３８】
別の態様において、突然変異は、配列番号４の配列に関してアミノ酸残基Ｉ５７、Ｋ６０、Ｇ６１、Ａ６３、Ｎ６５、Ｙ６６、およびＤ６８のそれぞれでの突然変異である。
【００３９】
さらなる態様において、突然変異は、配列番号４のアミノ酸配列に関してアミノ酸残基Ｋ１０８、Ｎ１１０、Ａ１１１、Ｖ１１４、Ｆ１１７、Ｄ１１９、Ｎ１２０、Ｓ１２１、Ｎ１２２、Ｖ１２３、およびＩ１２４のそれぞれでの突然変異である。
【００４０】
さらに別の態様において、突然変異は、配列番号４のアミノ酸配列に関してアミノ酸残基Ｓ７２、Ｎ７６、Ａ７７、Ｈ７８、Ｍ７９、Ｎ８０、Ａ８１、Ｎ８３、Ｖ８７、Ｔ８９、Ｈ９２、Ｌ９３、Ｍ９４、Ｎ９５、Ｐ９６、Ｅ９７、Ｙ９８、Ｖ９９、またはＰ１００のそれぞれでの突然変異である。
【００４１】
別の態様において、少なくとも１つのＩ型またはＩＩ型受容体結合ドメインにおいて少なくとも１つの突然変異を含むアミノ酸配列を含むデザイナーＢＭＰ６タンパク質であって、突然変異が、野生型ＢＭＰ６によるＩ型またはＩＩ型受容体に対する結合と比較してＩ型またはＩＩ型ＢＭＰ受容体に対する結合の変化を付与するデザイナーＢＭＰ６タンパク質は、Ｉ型またはＩＩ型の結合ドメイン内に位置しない、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸突然変異をさらに含む。
【００４２】
本発明は、配列番号８から７３の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を含む。
【００４３】
１つの態様において、核酸は、配列番号１２、配列番号１４、配列番号３６、および配列番号３７の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。＄＄
【００４４】
本発明は、配列番号７４〜１３９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を含む。
【００４５】
１つの態様において、核酸は、配列番号７８、配列番号８０、配列番号１０２、および配列番号１０３の配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００４６】
本発明は、少なくとも１つのＩ型またはＩＩ型受容体結合ドメインにおいて少なくとも１つの突然変異を含むアミノ酸配列を含むデザイナーＢＭＰ６タンパク質を産生する方法であって、突然変異が、野生型ＢＭＰ６によるＩ型またはＩＩ型受容体に対する結合と比較してＩ型またはＩＩ型ＢＭＰ受容体に対する結合の変化を付与する方法を含む。本方法は、前記タンパク質をコードする核酸を宿主細胞内に導入すること、前記細胞を前記タンパク質が産生される条件下で培養すること、および前記タンパク質を精製することを含む。
【００４７】
本発明は、その必要がある患者における骨量減少を伴う骨疾患を治療する方法を含む。本方法は、治療有効量の、少なくとも１つのＩ型またはＩＩ型受容体結合ドメインにおいて少なくとも１つの突然変異を含むデザイナーＢＭＰタンパク質であって、突然変異が、対応する野生型ＢＭＰタンパク質によるＩ型またはＩＩ型受容体に対する結合と比較してＩ型またはＩＩ型ＢＭＰ受容体に対する結合の変化を付与するデザイナーＢＭＰタンパク質を患者に投与し、それによって患者における骨疾患を治療することを含む。
【００４８】
本発明は、その必要がある患者における線維症を治療する方法を含む。本方法は、治療有効量の、少なくとも１つのＩ型またはＩＩ型受容体結合ドメインにおいて少なくとも１つの突然変異を含むデザイナーＢＭＰタンパク質であって、突然変異が、対応する野生型ＢＭＰによるＩ型またはＩＩ型受容体に対する結合と比較してＩ型またはＩＩ型ＢＭＰ受容体に対する結合の変化を付与するデザイナーＢＭＰタンパク質を患者に投与し、それによって線維症を治療することを含む。
【００４９】
本発明は、組織における骨形成を誘発する方法を含む。本方法は、組織を、少なくとも１つのＩ型またはＩＩ型受容体結合ドメインにおいて少なくとも１つの突然変異を含むデザイナーＢＭＰタンパク質であって、突然変異が、対応する野生型ＢＭＰによるＩ型またはＩＩ型受容体に対する結合と比較してＩ型またはＩＩ型ＢＭＰ受容体に対する結合の変化を付与するデザイナーＢＭＰタンパク質と接触させ、それによって前記組織における骨形成を誘発することを含む。
【００５０】
本発明を説明する目的で、特定の本発明の実施形態が図面において示される。しかし、本発明は、図面において示される実施形態の正確な配置および手段に限定されるわけではない。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】パネルＡ〜Ｃを含み、様々な野生型ＢＭＰおよびデザイナーＢＭＰのアミノ酸配列のアラインメントを示し、Ｉ型受容体とＩＩ型受容体との相互作用に関与する可能性のあるこれらのタンパク質の領域を示す（四角の中）図である。図１Ａは、野生型ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８、およびＢＭＰ９のアミノ酸配列のアラインメントを示す。図１Ｂは、様々なデザイナーＢＭＰのアミノ酸配列のアラインメントを示し、対応する野生型ＢＭＰはＢＭＰ２である。図１Ｃは、様々なデザイナーＢＭＰ６分子のアミノ酸配列のアラインメントを示し、対応する野生型ＢＭＰはＢＭＰ６である。
【図２】２つのＩ型ＢＭＰ受容体および２つのＩＩ型ＢＭＰ受容体に対する野生型ＢＭＰ２ホモ二量体の結合を示す、構造モデルの説明である。
【図３】パネルＡおよびＢを含み、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（図３Ａ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（図３Ｂ）において生産されたヒトＢＭＰ２におけるヒスチジンドアストップ（Ｈ５４）の位置を示す構造モデルの図である。
【図４】パネルＡおよびＢを含み、グリカンテザーおよび潜在的なヒスチジン（Ｈｉｓ）ドアストップの位置を示す図である。図４Ａは、全てＣＨＯにより生産されたＢＭＰ２内にある、ドアストップ方向にないグリカンテザー（Ｎ５６にあるＮ結合型グリカン）およびヒスチジン５４、ならびにグリカンテザーとＲ１６との相互作用を示す。図４Ｂは、ＢＭＰ６におけるＨ７８での、ならびにＢＭＰ２におけるＲ１６に対応するＲ３９での、ドアストップ立体構造にないグリカンテザー（Ｎ８０にあるＮ結合型グリカン）およびヒスチジンを示す。ＢＭＰ２とＢＭＰ６との間の対応するアミノ酸を示す、ＢＭＰ２（１１−ＫＳＳＣＫＲＨＰ）およびＢＭＰ６（３５−ＫＴＡＣＲＫＨＥ）の配列アラインメントは、図の一番上に示されている。
【図５】パネルＡ〜Ｄを含み、ＢＭＰおよびデザイナーＢＭＰを精製するためのプロセスにおける様々なステップを示す図である。図５Ａは、セルファインスルフェートカラムを用いるＢＭＰの勾配溶出を示すクロマトグラムを示す。図５Ｂは、セルファインスルフェートカラムステップから得られた画分の試料を含有する、クマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元型は左側、還元型は右側）ゲルの画像である。図５Ｃは、分取逆相精製ステップから得られるプロフィールを示すクロマトグラムを示す。図５Ｄは、分取逆相精製ステップによって得られる画分の試料を含有する、ＢＭＰのクマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元型は左側、還元型は右側）ゲルの画像である。
【図６】パネルＡ〜Ｄを含み、各ゲル画像の一番上に示される、精製されたＢＭＰ２野生型および様々な突然変異体を示す、クマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質ゲルの画像を示す図である。ゲルは、非還元条件（図６Ａおよび６Ｂ）および還元条件（図６Ｃおよび６Ｄ）下でランした。
【図７】野生型ＢＭＰ２およびＢＭＰ２／６ヘテロ二量体の骨形成活性を、グラフの凡例において示されている様々なデザイナーＢＭＰに対して比較する、Ｃ２Ｃ１２前筋芽細胞におけるアルカリホスファターゼアッセイの結果を示す図である。
【図８】ＢＭＰ２と比較した、ＢＭＰＥによるさらに強いシグナル伝達およびＢＭＰ２／６に対する同等のシグナル伝達を示すＳｍａｄ活性に対しての指標となる、Ｃ２Ｃ１２のＢＭＰ応答エレメントルシフェラーゼ（ＢＲＥ−ルシフェラーゼ）アッセイの結果を示す図である。
【図９】パネルＡおよびＢを含み、様々なＢＭＰによって仲介される異所性骨形成を示す図である。図９Ａは、示された用量（０．１または０．５μｇ）の示されたＢＭＰ（ＢＭＰ２、ＢＭＰＥ、およびＢＭＰ２／６）を移植された各肢についての、μＣＴ分析によって決定された異所性の骨の量（ヒドロキシアパタイトのミリグラム数として計算される；ｍｇＨＡ）を示すグラフである。図９Ｂは、示された用量（０．１または０．５μｇ）の示されたＢＭＰ（ＢＭＰ２、ＢＭＰＧ、ＢＭＰＡ、およびＢＭＰＦ）を移植された各肢についての、μＣＴ分析によって決定された異所性の骨の量（ヒドロキシアパタイトのミリグラム数として計算される）を示すグラフである。表されるデータは、２回の個別の実験から得られたものである。
【図１０】パネルＡ〜Ｄを含み、４週目および８週目での非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の腓骨の骨切りモデルの結果を示すＸ線写真の画像を示す図である。Ｘ線写真は、それぞれ０．５ｍｇ／ｍｌ（肢当たり２５０μｇの送達された全ＢＭＰ）のＢＭＰＥおよびＢＭＰＧを投与された７頭の代表的なＮＨＰの腓骨を示す。各ＮＨＰには、対側肢において同用量のＷＴ  ＢＭＰ２を投与した。図１０Ａおよび１０Ｂは、各図の一番上に示されているＮＨＰについてのＸ線写真を示し、それぞれ４週目および８週目でのＢＭＰ２野生型と比較したＢＭＰＥの影響を示している。図１０Ｃおよび１０Ｄは、各図の一番上に示されているＮＨＰについてのＸ線写真を示し、それぞれ４週目および８週目でのＢＭＰ２野生型と比較したＢＭＰＧの影響を示している。
【図１１】ＢＭＰ−Ｅで処理された肢とＢＭＰ−２で処理された対側肢との骨容積を示すグラフである。
【図１２】野生型ＢＭＰ２と、ＢＭＰ−ＧＥＲ、ＢＭＰ−ＧＥＰ、およびＢＭＰ２／６ヘテロ二量体との骨形成活性を比較する、Ｃ２Ｃ１２前筋芽細胞におけるアルカリホスファターゼアッセイの結果を示すグラフである。
【図１３】示された用量（０．０５または０．２５μｇ）の示されたＢＭＰ（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−２／６、ＢＭＰ−Ｅ、ＢＭＰ−ＧＥＲ、およびＢＭＰ−６）を移植された各肢についての、μＣＴ分析によって決定された異所性の骨の量（ヒドロキシアパタイトのミリグラム数として計算される）を示すグラフである。
【図１４】示された用量（０．０５または０．２５μｇ）の示されたＢＭＰ（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−２／６、ＢＭＰ−Ｅ、ＢＭＰ−ＧＥＲ、およびＢＭＰ−６）を移植された各肢についての、μＣＴ分析によって決定された異所性の骨の量（ヒドロキシアパタイトのミリグラム数として計算される）を示すグラフである。これらは、図１３において示される実験とは別の実験から得られた結果である。
【図１５】パネルＡおよびＢを含み、５週目および１０週目での非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の腓骨の楔状骨切りモデルの結果を示す、Ｘ線写真の画像およびμＣＴ画像を示す図である。図１５Ａは、ＮＨＰの腓骨の楔状骨切りモデルにおいて得られた、５週目のＸ線写真の画像を示す。図１５Ａは、５週目に０．５ｍｇ／ｍｌ（肢当たり２５０μＧの送達された全ＢＭＰ）のＢＭＰ−ＧＥＲを一方の肢に投与され、ＷＴ  ＢＭＰ−２を対側肢に投与された、４頭の代表的なＮＨＰの腓骨の画像を示す。図１５Ｂは、１０週目での同一の肢のｕＣＴ画像を示し、各動物で、ＢＭＰ−ＧＥＲで処理された肢の仮骨が、ＢＭＰ２で処理された対側肢と比較して大きいことを示している。
【図１６】パネルＡ〜Ｃを含み、ＢＭＰ−ＧＥＲで処理された肢とＢＭＰ−２で処理された対側肢との、強度（図１６Ａ）、剛性（図１６Ｂ）、および仮骨の骨容積（図１６Ｃ）を示すグラフを示す図である。
【図１７】パネルＡ〜Ｃを含み、楔状欠損モデルの後の、リン酸カルシウムに基づいたセメントを担体として用いて、０．５ｍｇ／ｍｌのＢＭＰ−ＧＥＲで処理され、１．５ｍｇ／ｍｌＢＭＰ−２で対側肢を処理された、３頭の非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の腓骨の経時的な治癒のＸ線写真画像を示す図である。図１７Ａの上部のパネルは、以下のような、０．５ｍｇ／ｍｌのＧＥＲで処理された、ＮＨＰ１番の左腕についての結果を示す：パネル１および２は、それぞれ、開始時点でのＬＡＴ（側面）画像およびＡＰ（前後）画像を示し、パネル３および４は、それぞれ、２週目のＬＡＴ画像およびＡＰ画像を示し、パネル５および６は、それぞれ、４週目のＬＡＴ画像およびＡＰ画像を示し、パネル７および８は、それぞれ、６週目のＬＡＴ画像およびＡＰ画像を示し、パネル９および１０は、それぞれ、７週目のＬＡＴ画像およびＡＰ画像を示し、パネル１１および１２は、それぞれ、８週目のＬＡＴ画像およびＡＰ画像を示す。図１７Ａの下方のパネルは、以下のような、１．５ｍｇ／ｍｌのＢＭＰ−２で処理された、ＮＨＰ１番の右腕についての結果を示す：パネル１および２は、それぞれ、開始時点でのＬＡＴ（側面）画像およびＡＰ（前後）画像を示し、パネル３および４は、それぞれ、２週目のＬＡＴ画像およびＡＰ画像を示し、パネル５および６は、それぞれ、４週目のＬＡＴ画像およびＡＰ画像を示し、パネル７および８は、それぞれ、６週目のＬＡＴ画像およびＡＰ画像を示し、パネル９および１０は、それぞれ、７週目のＬＡＴ画像およびＡＰ画像を示し、パネル１１および１２は、それぞれ、８週目のＬＡＴ画像およびＡＰ画像を示す。図１７Ｂは、図１７ＡにおいてＮＨＰ１番について記載されたように、ＮＨＰ２番についての結果のＸ線写真を示し、図１７Ｃは、図１７ＡにおいてＮＨＰ１番について記載されたように、ＮＨＰ３番についての結果を示す。
【図１８】結晶構造ＢＭＰ−ＥおよびＢＭＰ−６ＷＴの描写および比較を示す構造モデルの図である。分解されグリカンの長さの差が強調されており、分解されたＢＭＰＥでのグリカンが、ＢＭＰ６でのグリカンよりもはるかに長いことを示している。このことは、ＢＭＰＥのグリカンがＢＭＰ６のグリカンよりも立体構造的に制約されており、その結果、さらに多くのグリカンがこのモデルにおいて描写され得ることを示す。ＢＭＰＥおよびＢＭＰ６の両方でのヒスチジンドアストップ残基は、類似の非ドアストップ立体配置で示される。同様に、ＢＭＰＥのグリカンを安定化させるアルギニングリカン「テザー」は、アルギニンとグリカンとの相互作用を表す点線によって示される。
【図１９】図１８において示されるＢＭＰＥとＢＭＰ６との比較のヒスチジンドアストップおよびアルギニンテザーの拡大図である。この画像は、共に非ドアストップ位置にある、ＢＭＰＥのＨ５４ヒスチジン残基およびＢＭＰ６の同等のヒスチジンの、類似の立体構造を示す。この画像はまたＲ１６テザリング（ＢＭＰＥグリカンの相互作用を介する）を示し、このＲ１６テザリングによってグリカンはさらに堅固となり、したがって、ＢＭＰ６のさらに「だらりとした」あまり制約されていないグリカンと比較して、モデルによってさらに描写され、その結果、ＢＭＰ６のグリカンはこのモデルにおいてあまり視覚化されない。このモデルの図はまた、ＢＭＰＥのアスパラギンＮ５６の類似の位置付けを示し、ＢＭＰ６のグリカンならびに同等のおよび同様に位置するアスパラギンのＮ結合型の付着を示している。この図はまた、アミノ酸残基とグリカンの遠位端との間の点線によって示されるＢＭＰＥのＥ１１０の潜在的なさらなるグリカンテザリング相互作用を説明する。分解されたグリカンの長さの差が強調され、より濃いＢＭＰ６グリカンが、ＢＭＰＥについて描写されるより明るい影の付いたさらに長いグリカンと比較してあまり分解され得ないことを示しており、このことは、ＢＭＰＥのグリカンがさらに立体構造的に制約されており、したがって構造分析の際にさらに描写されることを示している。
【図２０】ＢＭＰ−２、ＢＭＰＥ、およびＢＭＰ−６と、Ｅｎｄｏ−Ｈで処理されたその脱グリコシル化（Ｄｅｇｌｙ．）対応物との骨形成活性を比較する、Ｃ２Ｃ１２前筋芽細胞を用いるアルカリホスファターゼアッセイの結果を示すグラフである。
【図２１】Ｒ１６でのグリカンテザーの位置を示し、アルギニン残基（Ｒ１６）とグルタミン酸残基（ＢＭＰ２のＥ１０９に対応するＥ１１０）との間の安定化相互作用を示す、ＢＭＰＥの構造モデルを示す図である。この図は、Ｒ１６およびＥ１１０が両方とも、第３（β−マンノース）および第４（α−マンノース）のグリカン部分と複数の水素結合を形成することを示す。この図はまた、グリカンのＮ結合型付着部位をもたらす、Ｈ５４の潜在的な「ドアストップ」およびアスパラギン５６（Ｎ５６）の位置を示す。
【図２２】ＢＭＰ−Ｅの骨形成活性を、ＢＭＰ−２の天然阻害剤であるＮｏｇｇｉｎの増大用量の存在下で、ＢＭＰ−Ｅ−ＮＲ、ＢＭＰ−ＧＥＲ、およびＢＭＰ−ＧＥＲ−ＮＲと比較する、Ｃ２Ｃ１２前筋芽細胞を用いるアルカリホスファターゼアッセイの結果を示すグラフである。データは、アクチビン由来の配列を含むＢＭＰ−ＧＥＲ−ＮＲが高濃度でもＮｏｇｇｉｎによって阻害されなかったが、ＢＭＰ−ＧＥＲはＮｏｇｇｉｎ阻害に対して感受性であったことを実証する。したがって、アクチビン由来の配列の付加によって、ＢＭＰ−ＧＥＲはＮｏｇｇｉｎ耐性（ＮＲ）となった。これらの結果は、少なくともこのインビトロアッセイにおいて、Ｎｏｇｇｉｎ感受性であるＢＭＰ−ＧＥＲおよびＢＭＰＥが、タンパク質のＣ末端領域がアクチビン由来の配列で置き換えられると、Ｎｏｇｇｉｎ耐性（ＮＲ）となることを実証する。
【図２３】特定の用量の示されたＢＭＰで処理されたラットの異所性インプラントについての、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって決定される骨スコアを示すグラフである。データは、ＢＭＰ−ＧＥＲの骨形成活性が、分子のＣ末端配列がアクチビン由来の配列で置き換えられると大きく減少したことを示す（ＮＲ）。したがって、データは、ＢＭＰ−ＧＥＲ−ＮＲが、インビボでＢＭＰ−ＧＥＲほど活性が大きくなかったことを実証する。
【図２４】特定の用量の示されたＢＭＰで処理されたラットの異所性インプラントについての、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって決定される骨スコアを示すグラフである。データは、ＢＭＰ−Ｅの骨形成活性が、分子のＣ末端配列がアクチビン由来の配列で置き換えられると大きく減少し、実際、完全に抑止されたことを示す（ＮＲ）。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
本発明は、本明細書において「デザイナーＢＭＰ」、「デザイナー骨形成タンパク質」、および「デザイナータンパク質」と呼ばれる、「デザイナー」骨形態形成タンパク質に関する。本発明のデザイナーＢＭＰは、野生型の未修飾ＢＭＰ、例えば限定はしないが、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８、およびＢＭＰ９のアミノ酸配列に対応し得る。特定の実施形態において、デザイナーＢＭＰは、その対応する野生型ＢＭＰと比較して、Ｉ型および／またはＩＩ型ＢＭＰ受容体に対する結合の変化を示す。さらなる実施形態において、デザイナーＢＭＰは、その対応するＢＭＰと比較して、変化した半減期、免疫原性、または任意の薬物動態学的／薬力学的（ＰＫ／ＰＤ）パラメータを有するよう修飾され得る。
【００５３】
定義
本明細書において別段の定義がない限り、本発明に関して用いられる科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈により別段の要求がない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。通常、本明細書において記載される細胞および組織の培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸の化学、ならびにハイブリダイゼーションに関して用いられる専門用語、および前記のものの技術は、当技術分野において周知であり一般的に用いられるものである。
【００５４】
本発明の方法および技術は、通常、別段の指示がない限り、当技術分野において周知の、ならびに本明細書の全体を通して引用および議論される様々な一般的なおよびさらに具体的な参考文献において記載されているような方法に従って行われる。このような参考文献には、例えば、参照することによって本明細書に組み込まれる、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ（２００２）；ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９９０）が含まれる。酵素反応および精製技術は、当技術分野において一般的に行われるように、または本明細書において記載されるように、製造者の説明書に従って行われる。本明細書において記載される、分析化学、合成有機化学、ならびに医薬化学および薬化学に関して用いられる専門用語、ならびに前記のものの実験手順および実験技術は、当技術分野において周知であり一般的に用いられるものである。標準的な技術が、化学合成、化学分析、医薬の調製、製剤、および送達、ならびに患者の治療に用いられる。
【００５５】
本明細書において用いられる場合、以下の用語のそれぞれは、この節におけるそれに関連する意味を有する。
【００５６】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、その冠詞の文法的対象の１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を言うために本明細書において用いられる。例えば、「エレメント」は、１つのエレメントまたは２つ以上のエレメントを言う。
【００５７】
本願において、「または」の使用は、別段の記載が無い限り、「および／または」を意味する。
【００５８】
従来の表記が、ポリペプチド配列を表現するために本明細書において用いられ、すなわち、ポリペプチド配列の左端がアミノ末端であり、ポリペプチド配列の右端がカルボキシル末端である。本明細書において用いられる場合、２０個の従来のアミノ酸およびそれらの略記は、従来の使用法に従う。参照することによって本明細書に組み込まれる、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版、Ｅ．Ｓ．ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ編、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、Ｍａｓｓ．（１９９１））を参照されたい。本明細書において用いられる場合、アミノ酸は、以下に示す、その正式名称、それに対応する３文字コード、またはそれに対応する１文字コードによって表される。
【００５９】
【表１】
0005985480.tif 000002
【００６０】
「保存的なアミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基によって置換されるものである。通常、保存的なアミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的には変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的な置換によって互いに異なるケースでは、配列同一性パーセントまたは類似性の程度が、置換の保存的性質を補正するように上方に調整され得る。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４３：３０７〜３１（１９９４）を参照されたい。
【００６１】
類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸のグループの例には、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリンおよびスレオニン、３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン、４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン、６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに７）硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニンが含まれる。好ましい保存的なアミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタメート−アスパルテート、およびアスパラギン−グルタミンである。
【００６２】
あるいは、保存的な置き換えは、参照することによって本明細書に組み込まれる、Ｇｏｎｎｅｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３〜１４４５（１９９２）において開示されているＰＡＭ２５０対数尤度マトリクスにおいて正の値を有する任意の変化である。「中程度に保存的な」置き換えは、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリクスにおいて負ではない値を有する任意の変化である。
【００６３】
好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低減させる、（２）酸化に対する感受性を低減させる、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変化させる、（４）このような類似体の他の物理化学的または機能的特性を付与するかまたは修飾するものである。置換、欠失、および／または挿入を含む類似体は、特定のペプチド配列以外の配列の様々な突然変異タンパク質を含み得る。例えば、単一または複数のアミノ酸置換（好ましくは保存的なアミノ酸置換）を、特定の配列（好ましくは、ポリペプチドの、分子間接触を形成する１つまたは複数のドメインの外側の部分、例えば、ＣＤＲまたはＩ型もしくはＩＩ型受容体結合部位の外側）において生じさせることができる。保存的なアミノ酸置換は、親配列の構造的特徴を実質的には変化させないはずである（例えば、置き換えアミノ酸は、親配列において生じるらせんを破壊しないか、または親配列を特徴付けする他のタイプの二次構造を妨害しない傾向にあるはずである）。当技術分野において認識されているポリペプチドの二次構造および三次構造の例は、参照することによって本明細書に組み込まれる、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．ＢｒａｎｄｅｎおよびＪ．Ｔｏｏｚｅ編、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９９１））；およびＴｈｏｒｎｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５（１９９１）において記載されている。
【００６４】
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「核酸分子」、「核酸配列」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡ状の一連のヌクレオチド塩基（「ヌクレオチド」とも呼ばれる）を言い、２つ以上のヌクレオチドからなる任意の鎖を意味する。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖の、キメラ混合物もしくは誘導体またはその修飾型であり得る。オリゴヌクレオチドは、例えば分子の安定性、そのハイブリダイゼーションパラメータなどを向上させるために、塩基部分、糖部分、またはホスフェート骨格で修飾され得る。ヌクレオチド配列は、典型的には、タンパク質および酵素を作製するために細胞機構によって用いられる情報を含む、遺伝情報を担持する。これらの用語には、二本鎖または一本鎖の、ゲノムのおよびｃＤＮＡの、ＲＮＡの、任意の合成の、ならびに遺伝子操作されたポリヌクレオチドが含まれ、センスポリヌクレオチドおよびアンチセンスポリヌクレオチドの両方が含まれる。これにはまた、修飾された塩基、例えばチオウラシル、チオグアニン、およびフルオロウラシルを含有する核酸、または糖質もしくは脂質を含有する核酸が含まれる。
【００６５】
ヌクレオチド配列の文脈では、「実質的に同一」という用語は、本明細書において、第１および第２のヌクレオチド配列が、共通の機能的活性を有するポリペプチドをコードするように、または共通の構造的ポリペプチドドメインもしくは共通の機能的ポリペプチド活性をコードするように、第２の核酸配列においてアラインされたヌクレオチドに同一の十分なまたは最少の数のヌクレオチドを含有する、第１の核酸配列を言うために用いられる。例えば、参照配列に対して少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列。
【００６６】
本明細書における「デザイナーＢＭＰ核酸」および文法的同等物は、デザイナーＢＭＰをコードする核酸を意味する。
【００６７】
「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書において区別せずに用いられる。これらの用語は、ペプチド結合を介して互いに連結している連続的なアミノ酸鎖を言う。この用語は、個別の単位として機能する１つまたは複数のタンパク質を含む。単一のポリペプチドが個別の機能単位であり、個別の機能単位を形成するために他のポリペプチドとの永続的または一時的な物理的関連を要しない場合、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、区別せずに用いられ得る。個別の機能単位が、互いに物理的に関連する複数のポリペプチドからなる場合、本明細書において用いられる「タンパク質」という用語は、物理的に結合し個別の単位として共に機能する、複数のポリペプチドを言う。本発明に従った発現されるタンパク質は、タンパク質治療薬であり得る。タンパク質治療薬は、それが作用する身体における一領域、またはそれが中間体を介して間接的に作用する身体の一領域に対する生物学的影響を有するタンパク質である。タンパク質治療薬の例は、以下でさらに詳細に論じられる。
【００６８】
本明細書において用いられる「デザイナーＢＭＰ」という用語は、突然変異を有さない対応する野生型ＢＭＰと比較して少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含むＢＭＰタンパク質に関し、デザイナーＢＭＰは、Ｉ型および／またはＩＩ型受容体への対応する野生型ＢＭＰの結合と比較して、少なくともＩ型受容体および／または少なくとも１つのＩＩ型受容体への結合が検出可能に変化している。
【００６９】
「対応する野生型タンパク質」は、任意の突然変異を導入する前のデザイナーＢＭＰの野生型を意味する。例えば、デザイナーＢＭＰがデザイナーＢＭＰ２である場合、対応する野生型ＢＭＰは野生型ＢＭＰ２である。したがって、１つの実施形態において、デザイナーＢＭＰの設計は、必ずしもそうではないが、野生型ＢＭＰ配列で開始し得、突然変異（例えば、アミノ酸の置換、欠失、および／または挿入）が前記野生型配列内に導入されている。したがって、デザイナーＢＭＰは野生型ＢＭＰと対応し得、突然変異の位置は、例えば、野生型の対応するまたは「参照」ＢＭＰ配列のアミノ酸配列と対応し、前記配列に関連があり、かつ／または前記配列と関連すると言うことができる。
【００７０】
本発明のタンパク質は、本明細書において記載されるポリペプチドの断片、誘導体、類似体、または変異体、およびその任意の組み合わせを含む。「断片」、「変異体」、「誘導体」、および「類似体」という用語は、本発明のタンパク質を言う場合、それが由来した元であるタンパク質の機能的特性の少なくとも一部を保持する、任意のタンパク質を含む。
【００７１】
本明細書において用いられる用語「断片」は、ポリペプチドを言い、そのポリペプチドに固有の、またはそのポリペプチドの特徴である、所与のポリペプチドの任意の個別の部分と定義される。本明細書において用いられるこの用語はまた、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも一部を保持する、所与のポリペプチドの任意の個別の部分を言う。特定の実施形態において、保持される活性の一部は、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも１０％である。特定の実施形態において、保持される活性の一部は、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％である。特定の実施形態において、保持される活性の一部は、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。特定の実施形態において、保持される活性の一部は、完全長ポリペプチドの活性の１００％以上である。あるいは、またはさらに、本明細書において用いられるこの用語はまた、完全長ポリペプチドにおいて見られる確立された配列エレメントを少なくとも含む、所与のポリペプチドの任意の部分を言う。一部の実施形態において、配列エレメントは、完全長ポリペプチドの少なくとも約４〜５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれを超えるアミノ酸の長さである。本発明のタンパク質の断片には、タンパク質分解性の断片、ならびに欠失断片が含まれる。
【００７２】
本発明のタンパク質の変異体には、上記の断片、およびまたアミノ酸の置換、欠失、または挿入によってアミノ酸配列が変化したポリペプチドが含まれる。変異体は、天然または非天然であり得る。非天然の変異体は、当技術分野において知られている突然変異生成技術を用いて産生され得る。変異タンパク質は、保存的なまたは非保存的なアミノ酸の置換、欠失、または挿入を含み得る。
【００７３】
本発明のタンパク質には、機能的側基の反応によって化学的に誘導体化された１つまたは複数の残基を有するタンパク質が含まれる。本発明のタンパク質として同様に含まれるものは、２０個の標準的なアミノ酸の１つまたは複数の天然アミノ酸誘導体を含有するポリペプチドである。例えば、４−ヒドロキシプロリンはプロリンの代わりに置換され得、５−ヒドロキシリジンはリジンの代わりに置換され得、３−メチルヒスチジンはヒスチジンの代わりに置換され得、ホモセリンはセリンの代わりに置換され得、オルニチンはリジンの代わりに置換され得る。
【００７４】
本明細書において用いられる「組換えによって発現されるポリペプチド」および「組換えポリペプチド」は、そのポリペプチドを発現するように操作された宿主細胞から発現されるポリペプチドを言う。特定の実施形態において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。特定の実施形態において、この操作は、１つまたは複数の遺伝子修飾を含み得る。例えば、宿主細胞は、発現されるポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種遺伝子の導入によって遺伝子修飾され得る。非相同組換えによって発現されるポリペプチドは、宿主細胞において通常発現されるポリペプチドに同一または類似であり得る。非相同組換えによって発現されるポリペプチドはまた、宿主細胞に対して外来であり得、例えば、宿主細胞において通常発現されるポリペプチドに対して異種であり得る。特定の実施形態において、非相同組換えによって発現されるポリペプチドは、キメラである。例えば、ポリペプチドの一部は、宿主細胞において通常発現されるポリペプチドに同一または類似のアミノ酸配列を含有し得、一方、他の部分は、宿主細胞に対して外来のアミノ酸配列を含有する。さらに、またはあるいは、ポリペプチドは、共に宿主細胞において通常発現される２つ以上の異なるポリペプチドから得られるアミノ酸配列を含有し得る。さらに、ポリペプチドは、共に宿主細胞に対して外来の２つ以上のポリペプチドから得られるアミノ酸配列を含有し得る。一部の実施形態において、宿主細胞は、１つまたは複数の内因性遺伝子の活性化または上方調節によって遺伝子修飾される。
【００７５】
配列間の相同性または配列同一性（これらの用語は、本明細書において区別せずに用いられる）の計算は、以下のように行われる。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、配列を、最適な比較の目的でアラインする（例えば、ギャップを、最適なアラインメントのために、第１および第２のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方の中に導入することができ、非相同配列を、比較の目的で、無視することができる）。典型的な実施形態において、比較の目的でアラインされる参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％もしくは６０％、または少なくとも７０％、８０％、９０％、もしくは１００％である。対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基またはヌクレオチドを次に比較する。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合、分子は、その位置で同一である（本明細書において用いられる場合、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と同一である）。
【００７６】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸の同一性パーセントを決定するために、配列を、最適な比較の目的でアラインする（例えば、ギャップを、第２のアミノ酸配列または核酸配列との最適なアラインメントのために、第１のアミノ酸配列または核酸配列の配列内に導入することができる）。２つの配列の間の同一性パーセントは、配列が共有する同一な位置の数に応じる（すなわち、相同性％＝同一な位置の数／位置の総数×１００）。２つの配列の間の相同性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。２つの配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：５８７３〜７（１９９３）におけるように修正された、Ｋａｒｌｉｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７：２２６４〜８（１９９０）のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３〜１０（１９９０）のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラム内に組み込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチドサーチは、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で行うことができる。
【００７７】
ＢＬＡＳＴタンパク質サーチは、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で行うことができる。比較の目的でギャップアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５：３３８９〜４０２（１９９７）において記載されているように利用することができる。ＢＬＡＳＴプログラムおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを用いることができる。
【００７８】
２つの配列の間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮して、配列が共有する同一な位置の数に応じる。
【００７９】
配列の比較および２つの配列の間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。１つの実施形態において、２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれか、ならびにギャップの重み１６、１４、１２、１０、８、６、または４、および長さの重み１、２、３、４、５、または６を用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能である）におけるＧＡＰプログラム内に組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４８：４４３〜５３（１９７０））を用いて決定される。さらに別の実施形態において、２つのヌクレオチド配列の間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクス、ならびにギャップの重み４０、５０、６０、７０、または８０、および長さの重み１、２、３、４、５、または６を用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｇｃｇ．ｃｏｍのインターネットで入手可能である）におけるＧＡＰプログラムを用いて決定される。１つの典型的なパラメータセット（および別段の特定がない限り用いられるべきもの）は、ギャップペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ４、およびフレームシフトギャップペナルティ５を有するＢｌｏｓｓｕｍ  ６２スコアリングマトリクスである。
【００８０】
２つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０の重み残基表、ギャップ長ペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）内に組み込まれている、Ｅ．ＭｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｍｙｅｒｓら、Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｓｃｉ  ４：１１〜７（１９８８））のアルゴリズムを用いて決定することができる。
【００８１】
本明細書において用いられる「教材」という用語には、本明細書において列挙される様々な疾患または障害に作用する、前記疾患または障害を軽減する、または治療するためのキット内の本発明の化合物、組み合わせ、および／または組成物の有用性を伝えるために用いられ得る、刊行物、記録、図、または任意の他の発表媒体が含まれる。場合によって、またはあるいは、教材は、本明細書のあらゆる箇所で開示されているものを含む、細胞、組織、または哺乳動物における疾患または障害を軽減する１つまたは複数の方法を記載し得る。
【００８２】
キットの教材は、例えば、本発明の化合物および／もしくは組成物を含有する容器に固定され得るか、または化合物および／もしくは組成物を含有する容器と共に出荷され得る。あるいは、教材は、レシピエントが教材および化合物を協調的に用いることを意図して、容器とは別に出荷され得る。
【００８３】
注釈がある場合を除き、「患者」または「対象」という用語は、区別せずに用いられ、ヒト患者および非ヒト霊長類などの哺乳動物、ならびに獣医学的対象、例えばウサギ、ラット、およびマウス、ならびに他の動物を言う。好ましくは、患者は、ヒトを言う。
【００８４】
本明細書において区別せずに用いられる「有効量」または「治療有効量」という用語は、組織または哺乳動物、好ましくはヒトに投与されると、化合物の不存在下で検出される応答と比較して検出可能な治療応答を仲介する量である。治療応答、例えば、限定はしないが、線維症の阻害および／または減少、骨量または骨密度の増大などは、例えば本明細書において開示されている方法などを含む、当技術分野において認識されている多くの方法によって容易に評価することができる。
【００８５】
当業者には、本明細書において投与される化合物または組成物の有効量が、治療される疾患または症状、疾患の段階、治療される哺乳動物の年齢および健康および身体状態、疾患の重症度、投与される特定の化合物などの多くの因子に基づいて、変化し、容易に決定され得ることが理解されよう。
【００８６】
本明細書において用いられる場合、「治療する」は、患者が疾患の症候（例えば、骨密度の低下、骨折、線維症など）を経験する頻度を低減させることを意味する。この用語には、本発明の化合物または作用物質を投与して、疾患の症候、合併症、または生化学的兆候の発病を予防するかまたは遅延させて、症候を軽減するか、または疾患、症状、もしくは障害のさらなる進行を阻止もしくは阻害することが含まれる。治療は、予防的なもの（疾患の発病を予防するかもしくは遅延させるため、またはその臨床的なもしくは準臨床的な症候の兆候を予防するため）、または治療的な、疾患の兆候後の、症候の抑制もしくは軽減であり得る。
【００８７】
本明細書において用いられる「特異的に結合する」という語句は、特異的分子に認識および結合するが、試料内の他の分子は実質的に認識または結合しない化合物、例えば、タンパク質、核酸、抗体などを意味する。例えば、試料内の同族受容体（例えば、ＢＭＰのＩ型またはＩＩ型受容体、その同族抗原と結合する抗体など）を認識および結合するが、試料内の他の分子は実質的に認識または結合しない、ＢＭＰタンパク質、抗体、またはペプチド阻害剤である。したがって、指定されたアッセイ条件下では、特定の結合部分（例えば、ＢＭＰまたはその受容体結合断片）は、特定の標的分子に優先的に結合し、試験試料内に存在する他の成分には有意な量では結合しない。様々なアッセイフォーマットを、目的の分子に特異的に結合する抗体を選択するために用いることができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイ、免疫沈降、ＢＩＡｃｏｒｅ、ＦＡＣＳ、Ｏｃｔｅｔ、およびウェスタンブロット分析は、ＢＭＰ受容体と特異的に反応するＢＭＰを同定するために用いることができる多くのアッセイの一部である。典型的には、特異的なまたは選択的な反応は、バックグラウンドシグナルまたはバックグラウンドノイズの少なくとも２倍であり、さらに好ましくはバックグラウンドシグナルまたはバックグラウンドノイズよりも少なくとも５倍大きく、さらに典型的にはバックグラウンドの１０倍超であり、さらに具体的には、ＢＭＰは、平衡解離定数（ＫＤ）が≦１００μＭである場合、さらに好ましくは≦１０μＭ、さらに好ましくは≦１μＭ、さらに好ましくは≦１００ｎＭ、最も好ましくは≦１０ｎＭである場合に、ＢＭＰ受容体を「特異的に結合する」と言われる。
【００８８】
「ＫＤ」という用語は、特定のリガンド−受容体相互作用の平衡解離定数を言う。
【００８９】
「結合親和性」は通常、分子（例えばＢＭＰリガンド）の結合部位とその結合パートナー（例えば、ＢＭＰのＩ型またはＩＩ型受容体）との間の非共有結合的な相互作用を合わせた強度を言う。別段の指示がない限り、本明細書において用いられる場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、ＢＭＰおよびその同族受容体）の間の１：１の相互作用を反映する、固有の結合親和性を言う。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、通常、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。
【００９０】
親和性は、本明細書において記載されるものを含む、当技術分野において知られている一般的な方法によって測定することができる。低親和性ＢＭＰは通常、受容体にゆっくりと結合し、すぐに解離する傾向があるが、一方、高親和性ＢＭＰは通常、受容体にさらに速く結合し、さらに長く結合したままである傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が、当技術分野において知られており、これらのいずれも、本発明の目的のために用いることができる。具体的な例示的な実施形態は、本明細書のあらゆる箇所で記載されている。
【００９１】
「ｋｏｎ」という用語は、本明細書において用いられる場合、単位：Ｍ−１秒−１で測定される、会合定数または会合速度定数、すなわち正反応または複合体形成反応の特異的反応速度を言うものである。
【００９２】
「ｋｏｆｆ」という用語は、本明細書において用いられる場合、単位：秒−１で測定される、解離定数または解離速度定数、すなわち抗体／抗原複合体からの抗体の解離についての特異的反応速度を言うものである。
【００９３】
「Ｋｄ」という用語は、本明細書において用いられる場合、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数を言うものである。これは、式：
ｋｏｆｆ／ｋｏｎ＝Ｋｄ
によって計算される。
【００９４】
本明細書において用いられる「結合の変化」という用語は、デザイナーＢＭＰが、同一のＩ型および／またはＩＩ型受容体に対する対応する野生型ＢＭＰの結合と比較した場合、少なくともＩ型受容体および／またはＩＩ型受容体に対する異なる結合特異性を含むことを意味する。デザイナーＢＭＰは、受容体に対する野生型ＢＭＰの結合と比較して、その受容体とさらに大きなまたはさらに小さな親和性で結合し得る。例えば、野生型ＢＭＰが特定のＩ型受容体に特定の結合親和性で結合した場合、対応するデザイナーＢＭＰは、その受容体に、野生型ＢＭＰと比較してさらに大きなまたはさらに小さな親和性で結合する。さらに、おそらく、デザイナーＢＭＰが、野生型ＢＭＰが結合する受容体にもはや検出可能に結合しない場合、デザイナーＢＭＰは、野生型ＢＭＰが検出可能に結合しなかった受容体に特異的に結合し、またその逆も同様である。したがって、結合の変化は、対応する野生型ＢＭＰによるその受容体の結合と比較した、Ｉ型またはＩＩ型受容体に対するデザイナーＢＭＰによる結合における任意の検出可能な変化を包含する。おそらく、デザイナーＢＭＰは、対応する野生型ＢＭＰについてのｋｏｎ値と比較してさらに大きなもしくはさらに小さなｋｏｎ値を有し、かつ／またはデザイナーＢＭＰは、対応する野生型ＢＭＰのｋｏｆｆ値と比較してさらに大きなもしくはさらに小さなｋｏｆｆ値を有し、その結果、デザイナーＢＭＰのＫｄは、同一のＢＭＰ受容体への対応する野生型ＢＭＰのＫｄよりも大きいまたは小さい。したがって、デザイナーＢＭＰと対応する野生型ＢＭＰとの間の結合の特徴および／または親和性値における任意の差は、本明細書において用いられる「結合の変化」という用語に包含される。
【００９５】
「表面プラズモン共鳴」という用語は、本明細書において用いられる場合、例えばＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ、およびＰｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を用いる、バイオセンサーマトリクス内のタンパク質濃度の変化の検出によるリアルタイムの生体特異性相互作用の分析を可能にする、光学的現象を言う。さらなる説明については、例えば、Ｊｏｈｎｓｓｏｎら、Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９〜２６（１９９３）；Ｊｏｈｎｓｓｏｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：６２０〜６２７（１９９１）；Ｊｏｈｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５〜１３１（１９９５）；およびＪｏｈｎｎｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８〜２７７（１９９１）を参照されたい。
【００９６】
本明細書において用いられる場合、「実質的に純粋」は、目的の種が、存在する主要な種であること（すなわち、モル濃度ベースで、それが組成物内の任意の他の個別の種よりも豊富であること）を意味し、好ましくは、実質的に精製された画分は、目的の種（例えば、デザイナーＢＭＰ）が、存在する全ての高分子種の少なくとも約５０パーセント（モル濃度ベースで）を占める、組成物である。通常、実質的に純粋な組成物は、組成物内に存在する全ての高分子種の約８０パーセント超、さらに好ましくは約８５％、９０％、９５％、および９９％超を占める。最も好ましくは、目的の種は、組成物が単一の高分子種から基本的になる、本質的な均質性（汚染物質種が、従来の検出方法によって組成物内に検出され得ない）まで精製される。
【００９７】
説明
骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）
本明細書のあらゆる箇所で先に述べたように、ＢＭＰは、ＴＧＦ−βタンパク質スーパーファミリーのメンバーであり、その全ては、６つの保存されたシステイン残基によって特徴付けされる（Ｌａｎｄｅｒら、（２００１）Ｎａｔｕｒｅ、４０９：８６０〜９２１）。ＢＭＰ／ＧＤＦサブファミリーには、限定はしないが、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３（オステオゲニン）（例えば、米国特許第６，１７７，４０６号を参照されたい）、ＢＭＰ３ｂ（ＧＤＦ−１０）（例えば、米国特許第６，２０４，０４７号を参照されたい）、ＢＭＰ４（ＢＭＰ２ｂ）（例えば、米国特許第６，２４５，８８９号を参照されたい）、ＢＭＰ５（例えば、米国特許第５，５４３，３９４号を参照されたい）、ＢＭＰ６（例えば、米国特許第６，６１３，７４４号を参照されたい）、ＢＭＰ７（骨形成タンパク質−１またはＯＰ１）（例えば、米国特許第５，１４１，９０５号を参照されたい）、ＢＭＰ８（ＯＰ２）（例えば、米国特許第５，６８８，６７８号を参照されたい）、ＢＭＰ８Ｂ（ＯＰ３）（例えば、米国特許第５，８５４，０７１号を参照されたい）、ＢＭＰ９（ＧＤＦ２）（例えば、米国特許第６，２８７，８１６号を参照されたい）、ＢＭＰ１０（例えば、米国特許第５，７０３，０４３号を参照されたい）、ＢＭＰ１１（ＧＤＦ１１）（例えば、米国特許第６，４３７，１１１号を参照されたい）、ＢＭＰ１２（ＧＤＦ７）（例えば、米国特許第６，０２７，９１９号を参照されたい）、ＢＭＰ１３（ＧＤＦ６、ＣＤＭＰ２）（例えば、米国特許第６，０２７，９１９号を参照されたい）、ＢＭＰ１５（ＧＤＦ９）（例えば、米国特許第６，０３４，２２９号を参照されたい）、ＢＭＰ１６（例えば、米国特許第６，３３１，６１２号を参照されたい）、ＧＤＦ１（例えば、米国特許出願第２００４／００３９１６２号を参照されたい）、ＧＤＦ３（例えば、米国特許第６，０２５，４７５号を参照されたい）、ＧＤＦ５（ＣＤＭＰ１、ＭＰ５２）（例えば、米国特許第５，９９４，０９４号を参照されたい）、およびＧＤＦ８（ミオスタチン）（例えば、米国特許第５，８２７，７３３号を参照されたい）が含まれる。
【００９８】
ＢＭＰは、その同族受容体に特異的に結合し、前記受容体には、Ｉ型受容体：ＡＬＫ−Ｉ、ＡＬＫ−２（ＡｃｔＲＩａまたはＡｃｔＲＩとも呼ばれる）、ＡＬＫ−３（ＢＭＰＲＩａとも呼ばれる）、およびＡＬＫ−６（ＢＭＰＲＩｂとも呼ばれる）、ならびにＩＩ型受容体：ＡｃｔＲＩＩａ（ＡｃｔＲＩＩとも呼ばれる）、ＡｃｔＲＩＩｂ、およびＢＭＰＲＩＩが含まれる。ＢＭＰ−受容体の結合相互作用は、広く研究されており、Ｉ型および／またはＩＩ型受容体それぞれへの各野生型ＢＭＰの結合特異性は、通常、当技術分野において知られており、表１に示される。例えば、Ｎｉｃｋｅｌら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  ２０：３６７〜７７（２００９）；Ｈｅｉｎｅｃｋｅら、ＢＭＣ  Ｂｉｏｌ  ７：５９（２００９）を参照されたい。
【００９９】
【表２】
0005985480.tif 000003
【０１００】
骨形成活性が向上したデザイナー骨形態形成タンパク質
本願は、一部には、各ＢＭＰ二量体が４つのＢＭＰ受容体、すなわち２つのＩ型受容体および２つのＩＩ型受容体に結合するという理解に基づいている。各受容体への各ＢＭＰの特異性は、表１において上記に示すように、当技術分野において知られている。また、各受容体へのＢＭＰの結合を仲介する様々なＢＭＰの受容体結合領域は、マッピングされており、表２に示される。例えば、野生型ＢＭＰ２およびＢＭＰ４がＩ型ＢＭＰ受容体Ａｌｋ−３およびＡＬＫ−６に高い親和性で結合し、ＩＩ型ＢＭＰ受容体に低い親和性で結合することが良く明らかにされている。他方で、野生型ＢＭＰ６およびＢＭＰ７は、ＩＩ型受容体ＡｃｔｒＩＩＡ、ＡｃｔｒＩＩＢ、およびＢＭＰＲＩＩに高い親和性で結合するが、それらがＩＩ型に結合するよりも低い親和性でＩ型受容体に結合することが知られている。およそ１２の受容体との相互作用を介してシグナル伝達するおよそ４３のＴＧＦβスーパーファミリーメンバーから生じる異なる細胞応答は、各リガンドが、異なる親和性でそれが結合する受容体の特異的レパートリーを利用することに起因すると考えられている。Ｉ型およびＩＩ型の結合ドメインを、表２に記載する。
【０１０１】
【表３】
0005985480.tif 000004
【０１０２】
デザイナーＢＭＰの受容体結合を変化させるための合理的なアミノ酸置換
１つの実施形態において、本発明は、アミノ酸突然変異を少なくとも１つの受容体結合部位に導入し、それによって、それらの受容体に対する対応する野生型ＢＭＰの結合と比較して、デザイナーＢＭＰによるＩ型およびＩＩ型ＢＭＰ受容体に対する結合を変化させることを含む。すなわち、野生型ＢＭＰ２はＩ型受容体に対する比較的高い親和性を示し、一方、野生型ＢＭＰ６はＩＩ型受容体に対する高い親和性を示すことが、当技術分野において周知である。野生型ＢＭＰ２およびＢＭＰ６のヘテロ二量体が、Ｉ型受容体およびＩＩ型受容体の両方に比較的高い親和性で結合することが、当技術分野においてさらに知られており、各ＢＭＰは、各受容体に対するさらに高い親和性結合部位を提供すると考えられる。以下の表３を参照されたい。ＢＭＰ２／６ヘテロ二量体は、インビトロおよびインビボの両方での骨形成アッセイにおいて、ＢＭＰ２もしくはＢＭＰ６単独またはホモ二量体よりも活性であることが知られている。表３は、Ｉ型およびＩＩ型受容体に対するＢＭＰ２およびＢＭＰ６の結合親和性の例を示す。
【０１０３】
【表４】
0005985480.tif 000005
【０１０４】
したがって、Ｉ型および／またはＩＩ型受容体に対する結合が向上したデザイナーＢＭＰを提供することが本発明の目的である。図１Ａおよび表２において示されるように、各ＢＭＰは、受容体の結合に寄与する３つの結合部位を含む。Ｎ末端からＣ末端に向かって、各ＢＭＰは、ＩＩ型受容体結合部位Ａ、Ｉ型受容体結合部位、および第２のＩＩ型受容体結合部位Ｂを含む。野生型ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８、およびＢＭＰ９の典型的なアラインメントが図１において説明されているが、当業者には、ＴＧＢβスーパーファミリーのメンバーの間の様々なアミノ酸の相対的な位置付けを提供する周知のアラインメントが存在することが理解されよう。このようなアラインメントは、とりわけ、国際公開公報第ＷＯ２００９／０８６１３１（例えば、図１５〜１７、図３１Ａ）、ＷＯ２００８／０５１５２６（図９〜１２）、ＷＯ２００５／１１８６３６（図６）、ＷＯ２００５／１１８６３５、ＷＯ２００５／１１３５８５（図３）、ＷＯ２００１／９２２９８（図６Ａ〜６Ｃ）、Ｋｉｒｓｃｈら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１９：３３１４〜３３２４（２０００）（図１）、米国特許出願公開第２００７／０２９３４２５号（図６）、Ｇｒｏｐｐｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ４２０：６３６〜６４２（２００２）、Ｎｉｃｋｅｌら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．Ａｍ．８３：７〜１４（２００１）、およびＷｅｂｅｒら、ＢＭＣ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌ．７：６（２００７）において提供されている。したがって、様々なＴＧＦβスーパーファミリーメンバーのアミノ酸配列のアラインメントを含む、当技術分野において周知のタンパク質配列アラインメントアルゴリズムおよびツール、ならびに本明細書において提供される開示を用いて、別のＢＭＰ／ＧＤＦタンパク質における任意の位置のアミノ酸に対する、１つのＢＭＰ／ＧＤＦタンパク質における対応するアミノ酸を決定することができる。１つの実施形態において、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、およびＢＭＰ−９における対応するアミノ酸残基が示されている（例えば、図１Ａを参照されたい）。
【０１０５】
本発明の一部の実施形態において、デザイナーＢＭＰは、Ｉ型結合ドメインまたはＩＩ型結合ドメインにおいて突然変異を含み、突然変異は、Ｉ型またはＩＩ型ＢＭＰ受容体に対する結合の変化を付与する。一部の実施形態において、デザイナーＢＭＰは、Ｉ型結合ドメインおよび第１の（結合ドメインＡ）または第２の（結合ドメインＢ）ＩＩ型結合ドメインの両方において１つまたは複数の突然変異を含む。他の実施形態において、デザイナーＢＭＰは、両ＩＩ型結合ドメインにおいて１つまたは複数の突然変異を含む。他の実施形態において、デザイナーＢＭＰは、第１のＩＩ型結合ドメイン、第２のＩＩ型結合ドメイン、およびＩ型結合ドメインにおいて１つまたは複数の突然変異を含む。一部の実施形態において、デザイナーＢＭＰは、Ｉ型結合ドメインにおいて１つまたは複数の突然変異を含む。
【０１０６】
一部の実施形態において、突然変異は、Ｉ型受容体に対する結合を向上させる。他の実施形態において、突然変異は、ＩＩ型受容体に対する結合を向上させる。他の実施形態において、突然変異は、Ｉ型またはＩＩ型受容体に対する結合を減少させる。一部の実施形態において、突然変異は、以下でさらに完全に説明されるように、グリカンテザーを生成または破壊する。一部の実施形態において、突然変異は、以下でさらに完全に説明されるように、Ｈｉｓドアストップを生成または破壊する。
【０１０７】
ＢＭＰは当技術分野において良く特徴付けされ理解されているため、当然のことながら、本明細書において提供される開示が提供されれば、デザイナーＢＭＰの活性にさらに影響しない、生成され得る考えられる突然変異の位置が理解される。したがって、本発明のデザイナーＢＭＰは、変異ＢＭＰの受容体結合親和性に影響しない、さらなる挿入、欠失、または置換を含有するという点で、対応する野生型ＢＭＰまたはデザイナーＢＭＰと異なる変異ＢＭＰを包含する。一部の非限定的な実施形態において、当業者には、システインノットの形成に関与するシステインおよび受容体の相互作用に関与するアミノ酸は、突然変異していないか、または保存的な置換で変化していないが、他のアミノ酸は、デザイナーＢＭＰの生物学的活性に悪影響を及ぼすことなく、さらに自由に置換、挿入、または欠失され得ることが理解されよう。
【０１０８】
別段の記載が無い限り、設計または修飾されたＢＭＰの全ての位置的番号付けは、成熟天然ＢＭＰの配列に基づくことに留意されたい。デザイナーＢＭＰは、変異の所定の性質、すなわち、ＢＭＰ配列の天然の対立遺伝子変異または種間変異からそれらを区別する特徴によって特徴付けされる。デザイナーＢＭＰの変異体は、以下に記載される適切なアッセイを用いて決定されるように、１つまたは複数の細胞型における対応する野生型ＢＭＰまたはデザイナーＢＭＰの活性の少なくとも５０％を保持していなくてはならない。野生型の活性の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％を保持する変異体がさらに好ましく、野生型よりも活性な変異体が特に好ましい。デザイナーＢＭＰは、Ｎ末端、Ｃ末端、または内部に、挿入、欠失、および／または置換を含有し得る。好ましい実施形態において、設計または修飾されたＢＭＰは、最も類似したヒトＢＭＰ配列と異なる少なくとも１つの残基を有し、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の異なる残基がさらに好ましい。
【０１０９】
本発明のデザイナーＢＭＰは、対応する野生型ＢＭＰタンパク質配列と、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を維持する。
【０１１０】
本発明のデザイナーＢＭＰは、対応する野生型ＢＭＰタンパク質配列のＣ末端領域の保存されたシステインドメインと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を維持し得る。
【０１１１】
デザイナーＢＭＰは、さらなる修飾、例えば、安定性もしくは免疫原性などのさらなるタンパク質特性を変化させる、またはペグ化もしくはグリコシル化などの翻訳後修飾を可能にするかもしくは防止する突然変異を含み得る。デザイナーＢＭＰは、限定はしないが、１つまたは複数の側鎖または末端の合成誘導体化、グリコシル化、ペグ化、循環置換、環化、タンパク質またはタンパク質ドメインへの融合、およびペプチドタグまたは標識の付加を含む、共翻訳時修飾または翻訳後修飾を受け得る。
【０１１２】
遺伝子コードの縮重に起因して、非常に多くの核酸が作製され得、その全ては、デザイナーＢＭＰのアミノ酸配列を変化させない方法で１つまたは複数のコドンの配列を単純に修飾することによって、本発明のデザイナーＢＭＰをコードする。本発明のデザイナーＢＭＰは、ＷＯ２００８／０５１５２６またはＷＯ２００９／０８６１３１において記載されているこれらの配列を含まない。
【０１１３】
上記のように、ＢＭＰは、長いプロドメイン、１つまたは複数の切断部位、および成熟ドメインを含む前駆タンパク質として天然に発現される。この前駆タンパク質はその後、細胞の機構によってプロセシングされて、二量体の成熟ＢＭＰ分子をもたらす。好ましい実施形態において、本発明のデザイナーＢＭＰは、類似の様式で産生される。プロドメインは、ＢＭＰの正確なフォールディングおよびプロセシングに役立つと考えられている。さらに、全てではないが一部のＢＭＰにおいて、プロドメインは、成熟ドメインに非共有結合し得、シャペロンおよび阻害剤として作用し得る（例えば、Ｔｈｉｅｓら（２００１）Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ、１８：２５１〜２５９）。好ましくは、本発明の修飾されたＢＭＰは、この形態で、産生されかつ／または治療的に投与される。あるいは、ＢＭＰは、限定はしないが、成熟ドメインが直接的に産生されるかもしくは封入体から再フォールディングされる、または完全長の無傷の前駆タンパク質を含むものを含む、他の形態で産生され得る。本発明のデザイナーＢＭＰは、これらのおよび他の形態で有用である。
【０１１４】
特定の実施形態において、本発明のデザイナーＢＭＰは、骨格ＢＭＰ、すなわち、デザイナーＢＭＰが対応する野生型ＢＭＰを含む。特定の実施形態において、この骨格ＢＭＰは、野生型ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８、またはＢＭＰ９骨格であり得る。
【０１１５】
本発明の一部の実施形態において、デザイナーＢＭＰは、Ｉ型結合ドメインおよび／またはＩＩ型結合ドメインにおいて少なくとも１つの突然変異を含み、突然変異は、突然変異を含まない対応する野生型ＢＭＰの結合と比較して、Ｉ型またはＩＩ型ＢＭＰ受容体に対する結合の変化を付与する。一部の実施形態において、デザイナーＢＭＰは、Ｉ型結合ドメインにおいて少なくとも１つの突然変異を含み、ＩＩ型結合ドメインにおいて少なくとも１つの突然変異を含む。他の実施形態において、デザイナーＢＭＰは、ＩＩ型結合ドメインＡおよびＩＩ型結合ドメインＢ内に少なくとも１つの突然変異を含む。他の実施形態において、デザイナーＢＭＰは、ＩＩ型結合ドメインＡ、ＩＩ型結合ドメインＢ、およびＩ型結合ドメインにおいて少なくとも１つの突然変異を含む。
【０１１６】
特定の実施形態において、突然変異は、アミノまたは核酸の置換、欠失、および／または挿入を含み得る。好ましい実施形態において、突然変異は、アミノ酸置換を含む。
【０１１７】
一部の実施形態において、骨格ＢＭＰは野生型ＢＭＰであり、突然変異は、表４〜６において列挙される突然変異の１つまたは複数である。デザイナーＢＭＰは、これらの表において列挙される突然変異の任意の組み合わせおよび任意の数を含有し得る。
【０１１８】
一部の実施形態において、骨格ＢＭＰは野生型ＢＭＰであり、突然変異は、表４〜６において列挙される突然変異の１つまたは複数である。デザイナーＢＭＰは、これらの表において列挙される、または本明細書のあらゆる箇所において開示される突然変異の、順列ならびにいずれかおよび全てを含有し得る。
【０１１９】
【表５】
0005985480.tif 000006
【０１２０】
【表６】
0005985480.tif 000007
【０１２１】
【表７】
0005985480.tif 000008
【０１２２】
一部の実施形態において、突然変異は、Ｉ型受容体に対する結合を向上させる。他の実施形態において、突然変異は、ＩＩ型受容体への結合を向上させる。他の実施形態において、突然変異は、Ｉ型またはＩＩ型受容体に対する結合を減少させる。
【０１２３】
上記の表４〜６は、本発明の例示的な突然変異の非限定的な編集を提供し、突然変異の位置は、対応する野生型ＢＭＰのアミノ酸配列に関して提供されている。したがって、一部の実施形態において、デザイナーＢＭＰは、突然変異の以下の好ましい組み合わせを含む。
【０１２４】
特定の実施形態において、デザイナーＢＭＰに対する対応する野生型ＢＭＰは、ＢＭＰ２である。さらに、ＩＩ型受容体結合ドメインＡ内の少なくとも１つの突然変異は、Ｖ３３、Ｐ３６、Ｇ３７、Ｈ３９、Ｆ４１、Ｙ４２、およびＨ４４からなる群から選択される突然変異である。
【０１２５】
他の実施形態において、デザイナーＢＭＰは、ＩＩ型受容体結合ドメインＡ内に少なくとも１つの突然変異を含み、Ｉ型受容体結合ドメイン内に少なくとも１つのさらなる突然変異をさらに含む。Ｉ型受容体結合ドメイン内の突然変異は、配列番号１の配列に関してＰ４８、Ｆ４９、Ａ５２、Ｄ５３、Ｈ５４、Ｌ５５、Ｎ５６、Ｓ５７、Ｎ５９、Ｖ６３、Ｔ６５、Ｎ６８、Ｓ６９、Ｖ７０、Ｎ７１、Ｓ７２、Ｋ７３、Ｉ７４、およびＰ７５での少なくとも１つの突然変異である。
【０１２６】
さらなる実施形態において、デザイナーＢＭＰは、ＩＩ型受容体結合ドメインＡ内に少なくとも１つの突然変異を含み、Ｉ型受容体結合ドメイン内に少なくとも１つの突然変異を含み、ＩＩＢ型受容体結合ドメイン内に少なくとも１つのさらなる突然変異をさらに含む。ＩＩ型受容体結合ドメインＢ内の突然変異は、配列番号１の配列に関してＥ８３、Ｓ８５、Ａ８６、Ｍ８９、Ｌ９２、Ｅ９４、Ｎ９５、Ｅ９６、Ｋ９７、Ｖ９８、およびＶ９９での少なくとも１つの突然変異である。
【０１２７】
一部の実施形態において、デザイナーＢＭＰは、配列番号１の配列に関してアミノ酸Ｈ４４、Ｐ４８、Ａ５２、Ｄ５３、Ｌ５５、Ｓ５７、Ｎ６８、Ｓ６９、Ｖ７０、Ｎ７１の後でのＰの挿入、Ｓ７２、Ｋ７３、Ｉ７４、Ａ７７、およびＶ８０のそれぞれでの突然変異を含む。
【０１２８】
１つの実施形態において、デザイナーＢＭＰは、以下の突然変異：配列番号１の配列に関してＨ４４Ｄ、Ｐ４８Ｓ、Ａ５２Ｎ、Ｄ５３Ａ、Ｌ５５Ｍ、Ｓ５７Ａ、Ｎ６８Ｈ、Ｓ６９Ｌ、Ｖ７０Ｍ、Ｎ７１の後でのＰの挿入、Ｓ７２Ｅ、Ｋ７３Ｙ、Ｉ７４Ｖ、Ａ７７Ｐ、およびＶ８０Ａを含む。
【０１２９】
一部の実施形態において、デザイナーＢＭＰは、配列番号１の配列に関してアミノ酸Ｖ３３、Ｐ３６、Ｈ３９、Ｓ８５、Ｍ８９、Ｌ９２、Ｅ９４、Ｅ９６、Ｋ９７、およびＶ９９のそれぞれでの突然変異を含む。
【０１３０】
一部の実施形態において、デザイナーＢＭＰは、配列番号１の配列に関してアミノ酸Ｖ３３Ｉ、Ｐ３６Ｋ、Ｈ３９Ａ、Ｓ８５Ｎ、Ｍ８９、Ｌ９２Ｆ、Ｅ９４Ｄ、Ｅ９６Ｓ、Ｋ９７Ｎ、およびＶ９９Ｉのそれぞれでの突然変異を含む。
【０１３１】
他の実施形態において、デザイナーＢＭＰは、以下の突然変異：配列番号１の配列に関してＶ３３Ｉ、Ｐ３６Ｋ、Ｈ３９Ａ、Ｈ４４Ｄ、Ｐ４８Ｓ、Ａ５２Ｎ、Ｌ５４Ｍ、Ｓ５６Ｍ、Ｎ６８Ｈ、Ｖ７０Ｍ、Ｓ７２Ｅ、Ｋ７３Ｅ、Ｋ７３の後でのＹの挿入、Ｉ７４Ｖ、７７ＡＰ、Ｓ８５Ｎ、Ｍ８９Ｖ、Ｌ９２Ｆ、Ｅ９４Ｄ、Ｅ９６Ｓ、Ｋ９７Ｎ、およびＶ９９Ｉを含む。
【０１３２】
さらに他の実施形態において、デザイナーＢＭＰは、以下の突然変異：配列番号１の配列に関してＶ３３Ｉ、Ｐ３６Ｒ、Ｈ３９Ａ、Ｈ４４Ｄ、Ｐ４８Ｓ、Ａ５２Ｎ、Ｌ５４Ｍ、Ｓ５６Ｍ、Ｎ６８Ｈ、Ｖ７０Ｍ、Ｓ７２Ｅ、Ｋ７３Ｅ、Ｋ７３の後でのＹの挿入、Ｉ７４Ｖ、７７ＡＰ、Ｓ８５Ｎ、Ｍ８９Ｖ、Ｌ９２Ｆ、Ｅ９４Ｄ、Ｅ９６Ｓ、Ｋ９７Ｎ、およびＶ９９Ｉを含む。
【０１３３】
特定の実施形態において、デザイナーＢＭＰに対する対応する野生型ＢＭＰは、ＢＭＰ４である。特定の実施形態において、ＩＩ型受容体結合ドメインＡ内の少なくとも１つの突然変異は、配列番号２のＶ３５、Ｐ３８、Ｇ３９、Ｑ４１、Ｆ４３、Ｙ４４、およびＨ４６である。
【０１３４】
他の実施形態において、デザイナーＢＭＰ４は、ＩＩ型受容体結合ドメインＡ内に少なくとも１つの突然変異を含み、Ｉ型受容体結合ドメイン内に少なくとも１つのさらなる突然変異をさらに含む。Ｉ型受容体結合ドメイン内の突然変異は、配列番号２のＰ５０、Ａ５４、Ｄ５５、Ｈ５６、Ｌ５７、Ｎ５８、Ｓ５９、Ｎ６１、Ｖ６５、Ｔ６７、Ｎ７０、Ｓ７１、Ｖ７２、Ｎ７３、Ｓ７４、Ｓ７５、Ｉ７６、およびＰ７７での少なくとも１つの突然変異である。
【０１３５】
さらなる実施形態において、デザイナーＢＭＰ４は、ＩＩ型受容体結合ドメインＡ内に少なくとも１つの突然変異を含み、Ｉ型受容体結合ドメイン内に少なくとも１つの突然変異を含み、ＩＩＢ型受容体結合ドメイン内に少なくとも１つのさらなる突然変異をさらに含む。ＩＩ型受容体結合ドメインＢ内の突然変異は、配列番号２のＥ８５、Ｓ８７、Ａ８８、Ｍ９１、Ｌ９４、Ｅ９６、Ｋ９７、Ｖ９８、およびＶ９９での少なくとも１つの突然変異である。
【０１３６】
特定の実施形態において、デザイナーＢＭＰに対する対応する野生型ＢＭＰは、ＢＭＰ５である。特定の実施形態において、ＩＩ型受容体結合ドメインＡ内の突然変異は、配列番号３のＩ５６、Ｅ５９、Ｇ６０、Ａ６２、Ｆ６４、Ｙ６５、またはＤ６７での少なくとも１つの突然変異である。
【０１３７】
他の実施形態において、デザイナーＢＭＰは、ＩＩ型受容体結合ドメインＡ内に少なくとも１つの突然変異を含み、Ｉ型受容体結合ドメイン内に少なくとも１つのさらなる突然変異をさらに含む。Ｉ型受容体結合ドメイン内の突然変異は、配列番号３のＳ７１、Ｆ７２、Ｎ７５、Ａ７６、Ｈ７７、Ｍ７８、Ｎ７９、Ａ８０、Ｎ８２、Ｖ８６、Ｔ８８、Ｈ９１、Ｌ９２、Ｍ９３、Ｆ９４、Ｐ９５、Ｄ９６、Ｈ９７、Ｖ９８、またはＰ９９での少なくとも１つの突然変異である。
【０１３８】
さらなる実施形態において、デザイナーＢＭＰは、ＩＩ型受容体結合ドメインＡ内に少なくとも１つの突然変異を含み、Ｉ型受容体結合ドメイン内に少なくとも１つの突然変異を含み、ＩＩＢ型受容体結合ドメイン内に少なくとも１つのさらなる突然変異をさらに含む。ＩＩ型受容体結合ドメインＢ内の突然変異は、配列番号３のＫ１０７、Ｎ１０９、Ａ１１０、Ｖ１１３、Ｆ１１６、Ｄ１１８、Ｓ１１９、Ｓ１２０、Ｎ１２１、Ｖ１２２、またはＩ１２３での少なくとも１つの突然変異である。
【０１３９】
特定の実施形態において、デザイナーＢＭＰに対する対応する野生型ＢＭＰは、ＢＭＰ６である。特定の実施形態において、ＩＩ型受容体結合ドメインＡ内の突然変異は、配列番号４のＩ５７、Ｋ６０、Ｇ６１、Ａ６３、Ｎ６５、Ｙ６６、またはＤ６８での少なくとも１つの突然変異である。
【０１４０】
他の実施形態において、デザイナーＢＭＰ６は、ＩＩ型受容体結合ドメインＡ内に少なくとも１つの突然変異を含み、Ｉ型受容体結合ドメイン内に少なくとも１つのさらなる突然変異をさらに含む。Ｉ型受容体結合ドメイン内の突然変異は、配列番号４のＳ７２、Ｎ７６、Ａ７７、Ｈ７８、Ｍ７９、Ｎ８０、Ａ８１、Ｎ８３、Ｖ８７、Ｔ８９、Ｈ９２、Ｌ９３、Ｍ９４、Ｎ９５、Ｐ９６、Ｅ９７、Ｙ９８、Ｖ９９、またはＰ１００での少なくとも１つの突然変異である。
【０１４１】
さらなる実施形態において、デザイナーＢＭＰ６は、ＩＩ型受容体結合ドメインＡ内に少なくとも１つの突然変異を含み、Ｉ型受容体結合ドメイン内に少なくとも１つの突然変異を含み、ＩＩＢ型受容体結合ドメイン内に少なくとも１つのさらなる突然変異をさらに含む。ＩＩ型受容体結合ドメインＢ内の突然変異は、配列番号４のＫ１０８、Ｎ１１０、Ａ１１１、Ｖ１１４、Ｆ１１７、Ｄ１１９、Ｎ１２０、Ｓ１２１、Ｎ１２２、Ｖ１２３、またはＩ１２４での少なくとも１つの突然変異である。
【０１４２】
特定の実施形態において、デザイナーＢＭＰに対する対応する野生型ＢＭＰは、ＢＭＰ７である。特定の実施形態において、ＩＩ型受容体結合ドメインＡ内の突然変異は、配列番号５のＩ５７、Ｅ６０、Ｇ６１、Ａ６３、Ｙ６５、Ｙ６６、またはＥ６８での少なくとも１つの突然変異である。
【０１４３】
他の実施形態において、デザイナーＢＭＰ７は、ＩＩ型受容体結合ドメインＡ内に少なくとも１つの突然変異を含み、Ｉ型受容体結合ドメイン内に少なくとも１つのさらなる突然変異をさらに含む。Ｉ型受容体結合ドメイン内の突然変異は、配列番号５のＡ７２、Ｆ７３、Ｎ７６、Ｓ７７、Ｙ７８、Ｍ７９、Ｎ８０、Ａ８１、Ｎ８３、Ｖ８７、Ｔ８９、Ｈ９２、Ｆ９３、Ｉ９４、Ｎ９５、Ｐ９６、Ｅ９７、Ｔ９８、Ｖ９９、またはＰ１００での少なくとも１つの突然変異である。
【０１４４】
さらなる実施形態において、デザイナーＢＭＰ７は、ＩＩ型受容体結合ドメインＡ内に少なくとも１つの突然変異を含み、Ｉ型受容体結合ドメイン内に少なくとも１つの突然変異を含み、ＩＩＢ型受容体結合ドメイン内に少なくとも１つのさらなる突然変異をさらに含む。ＩＩ型受容体結合ドメインＢ内の突然変異は、配列番号５のＱ１０８、Ｎ１１０、Ａ１１１、Ｖ１１４、Ｆ１１７、Ｄ１１９、Ｓ１２０、Ｓ１２１、Ｎ１２２、Ｖ１２３、またはＩ１２４での少なくとも１つの突然変異である。
【０１４５】
特定の実施形態において、デザイナーＢＭＰに対する対応する野生型ＢＭＰは、ＢＭＰ８である。特定の実施形態において、ＩＩ型受容体結合ドメインＡ内の突然変異は、配列番号６のＩ５７、Ｑ６０、Ｇ６１、Ｓ６３、Ｙ６５、Ｙ６６、またはＥ６８での少なくとも１つの突然変異である。
【０１４６】
他の実施形態において、デザイナーＢＭＰ８は、ＩＩ型受容体結合ドメインＡ内に少なくとも１つの突然変異を含み、Ｉ型受容体結合ドメイン内に少なくとも１つのさらなる突然変異をさらに含む。Ｉ型受容体結合ドメイン内の突然変異は、配列番号６のＳ７２、Ｆ７３、Ｄ７６、Ｓ７７、Ｃ７８、Ｍ７９、Ｎ８０、Ａ８２、Ｎ８３、Ｌ８７、Ｓ８９、Ｈ９２、Ｌ９３、Ｍ９４、Ｍ９５、Ｐ９６、Ｄ９７、Ａ９８、Ｖ９９、またはＰ１００での少なくとも１つの突然変異である。
【０１４７】
さらなる実施形態において、デザイナーＢＭＰ８は、ＩＩ型受容体結合ドメインＡ内に少なくとも１つの突然変異を含み、Ｉ型受容体結合ドメイン内に少なくとも１つの突然変異を含み、ＩＩＢ型受容体結合ドメイン内に少なくとも１つのさらなる突然変異をさらに含む。ＩＩ型受容体結合ドメインＢ内の突然変異は、配列番号６のＫ１０８、Ｓ１１０、Ａ１１１、Ｖ１１４、Ｙ１１７、Ｄ１１８、Ｓ１１９、Ｓ１２０、Ｎ１２１、Ｎ１２２、Ｖ１２３、またはＩ１２４での少なくとも１つの突然変異である。
【０１４８】
特定の実施形態において、ＩＩ型受容体結合ドメインＡ内の突然変異は、配列番号７のＩ２７、Ｋ３０、Ｅ３１、Ｅ３３、Ｙ３５、またはＥ３６での少なくとも１つの突然変異である。
【０１４９】
他の実施形態において、デザイナーＢＭＰ９は、ＩＩ型受容体結合ドメインＡ内に少なくとも１つの突然変異を含み、Ｉ型受容体結合ドメイン内に少なくとも１つのさらなる突然変異をさらに含む。Ｉ型受容体結合ドメイン内の突然変異は、配列番号７のＦ４２、Ｆ４３、Ａ４６、Ｄ４７、Ｄ４８、Ｖ４９、Ｔ５０、Ｐ５１、Ｋ５３、Ｖ５７、Ｔ５９、Ｈ６２、Ｌ６３、Ｋ６４、Ｆ６５、Ｐ６６、Ｔ６７、Ｋ６８、Ｖ６９、またはＧ７０での少なくとも１つの突然変異である。
【０１５０】
さらなる実施形態において、デザイナーＢＭＰ９は、ＩＩ型受容体結合ドメインＡ内に少なくとも１つの突然変異を含み、Ｉ型受容体結合ドメイン内に少なくとも１つの突然変異を含み、ＩＩＢ型受容体結合ドメイン内に少なくとも１つのさらなる突然変異をさらに含む。ＩＩ型受容体結合ドメインＢ内の突然変異は、配列番号７のＫ７８、Ｓ８０、Ｐ８１、Ｖ８４、Ｋ８７、Ｄ８９、Ｍ９０、Ｇ９１、Ｖ９２、Ｐ９３、またはＴ９４での少なくとも１つの突然変異である。
【０１５１】
デザイナーＢＭＰの典型的なアミノ酸配列を、以下の表７に示す。表７は、設計された分子の名称および配列を示す。
【０１５２】
【表８−１】
0005985480.tif 000009
【０１５３】
【表８−２】
0005985480.tif 000010
【０１５４】
【表８−３】
0005985480.tif 000011
【０１５５】
上記に列挙されたデザイナーＢＭＰは本発明の実施形態を含むが、本発明は、いかなる特定の分子にも全く限定されない。その代わりに、本発明は、受容体結合の変化を含む任意のデザイナーＢＭＰを包含し、前記デザイナーＢＭＰは、ＩＩ型受容体結合ドメインＡ内に少なくとも１つの突然変異を含み、さらに好ましくは、デザイナーＢＭＰは、Ｉ型受容体結合ドメイン内に少なくとも１つのさらなる突然変異を含み、最も好ましくは、デザイナーＢＭＰは、ＩＩ型受容体結合ドメインＢ内にさらに別の少なくとも１つのさらなる突然変異を含む。
【０１５６】
他の実施形態において、本発明のデザイナーＢＭＰは、上記の配列の１つに少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一なアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、デザイナーＢＭＰは、配列番号８〜７３の配列に少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一なアミノ酸配列を含む。
【０１５７】
さらに別の実施形態において、デザイナーＢＭＰは、配列番号８〜７３のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、デザイナーＢＭＰのアミノ酸配列は、配列番号８〜７３の配列の１つからなる。
【０１５８】
さらに、１つの実施形態において、デザイナーＢＭＰは、配列番号１２の配列に少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一なアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号１２の配列である。さらに別の実施形態において、デザイナーＢＭＰはＢＭＰＥである。
【０１５９】
さらなる実施形態において、デザイナーＢＭＰは、配列番号１４の配列に少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一なアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号１４の配列である。さらに別の実施形態において、デザイナーＢＭＰはＢＭＰＧである。
【０１６０】
別の実施形態において、デザイナーＢＭＰは、配列番号３６の配列に少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一なアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号３６の配列である。さらに別の実施形態において、デザイナーＢＭＰはＢＭＰＧＥである。
【０１６１】
別の実施形態において、デザイナーＢＭＰは、配列番号３７の配列に少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一なアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号３７の配列である。さらに別の実施形態において、デザイナーＢＭＰはＢＭＰＧＥＲである。
【０１６２】
本発明のデザイナーＢＭＰは、上記の配列のいずれか１つの断片を含み得る。１つの実施形態において、デザイナーＢＭＰの断片は、配列番号８〜７３の配列のいずれか１つの配列に由来する、少なくとも連続した２０、２２、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４１、４３、４４、４５、４７、５０、５３、５４、５６、５８、６０、６２、６６、６８、７０、７１、７４、７７、８０、８３、８５、８８、９０、９１、９３、９５、９７、９９、１００、１０２、１０５、１０８、１１０、１１２、１１５、１１７、１１９、１２０、１２１、１２２、または１２５個のアミノ酸からなる配列の断片を含み得る。
【０１６３】
ＢＭＰが、タンパク質のアミノ末端および／またはカルボキシル末端に関して異種であることが多いことは、当技術分野において周知である。すなわち、本発明は、デザイナーＢＭＰのＣ末端およびまたはＮ末端からの少なくとも１０個のアミノ酸残基、好ましくは９個のアミノ酸残基、さらに好ましくは８個のアミノ酸残基、さらに好ましくは７個のアミノ酸残基、好ましくは６個のアミノ酸残基、さらに好ましくは５個のアミノ酸残基、好ましくは４個のアミノ酸残基、さらに好ましくは３個のアミノ酸残基、さらに好ましくは２個のアミノ酸残基、最も好ましくは１個のアミノ酸残基の欠失を含む、アミノ末端および／またはカルボキシル末端でのアミノ酸の欠失／トランケーションを含む、デザイナーＢＭＰを含む。
【０１６４】
別の実施形態において、本発明は、配列番号８〜７３の配列のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、かつタンパク質のアミノ末端および／またはカルボキシル末端からの欠失／トランケーションをさらに含む、デザイナーＢＭＰタンパク質を含む。別の実施形態において、本発明は、配列番号８〜７３の配列のいずれかのアミノ酸配列を含むＢＭＰタンパク質に由来するデザイナーＢＭＰタンパク質を含み、前記タンパク質は、デザイナーＢＭＰタンパク質のアミノ酸配列のＣ末端およびまたはＮ末端からの少なくとも１０個のアミノ酸残基、好ましくは９個のアミノ酸残基、さらに好ましくは８個のアミノ酸残基、さらに好ましくは７個のアミノ酸残基、好ましくは６個のアミノ酸残基、さらに好ましくは５個のアミノ酸残基、好ましくは４個のアミノ酸残基、さらに好ましくは３個のアミノ酸残基、さらに好ましくは２個のアミノ酸残基、最も好ましくは１個のアミノ酸残基の欠失を含む、アミノ末端および／またはカルボキシル末端でのアミノ酸の欠失／トランケーションを含む。
【０１６５】
グリコシル化によって仲介される受容体親和性の変化を有するＢＭＰの構造設計
本明細書において開示されているデータは、グリコシル化されていない、大腸菌において産生されたＢＭＰ２ホモ二量体（本明細書において「大腸菌ＢＭＰ２」と呼ばれる）が、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞において産生された、グリコシル化されたＢＭＰ２（本明細書において「ＣＨＯ  ＢＭＰ２」と呼ばれる）ほど活性ではないことを実証する。さらに、本明細書において開示されているデータは、大腸菌が産生したＢＭＰ６ホモ二量体が、哺乳動物細胞の培養において産生されたＢＭＰ６ホモ二量体と比較して基本的に非機能的であることをさらに実証する。
【０１６６】
本明細書において開示されているデータは、Ｉ型受容体結合領域において、ＣＨＯ  ＢＭＰ２と比較して大腸菌ＢＭＰ２の結晶構造に有意な変異が存在することを実証する。
【０１６７】
１つの実施形態において、デザイナーＢＭＰは、グリコシル化によって仲介される変化した立体構造を含み、それによって結合モチーフに影響し、前記結合モチーフは同様に、Ｉ型受容体に対する結合の変化を仲介する。これは、哺乳動物（例えばＣＨＯ）細胞が産生した野生型ＢＭＰ２において、Ｄ５３は受容体界面の方を向き、一方、Ｈ５４は受容体と反対の方を向くという、本発見に基づく。これは、Ｄ５３残基が受容体界面と反対の方を向き、Ｈ５４残基が受容体に向かって並んで、図３に示されるようにプロリン残基に重なり、「ドアストップ」として明らかに作用する、大腸菌が産生したＢＭＰ２と対照的である。さらに、本明細書において開示されているデータは、完全にグリコシル化され、かつ活性な、ＣＨＯが産生したＢＭＰ６がまた、入り込んできている受容体の方を向くヒスチジン残基、すなわち、ヒスチジン「ドアストップ」を含むことを、初めて実証する。
【０１６８】
いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、本明細書において開示されているデータは、「ドアストップ」残基を受容体界面から離れるように動かすことが、ＢＭＰリガンドとその受容体との間の結合の増大を仲介し得ることを、初めて示唆する。データはさらに、ドアストップ残基が、ドアストップを除去するようにそれ自体が突然変異し得るか、または他の残基が、ドアストップ残基の位置を移動させるように突然変異し得ることを実証する。さらに、本明細書において開示されているデータはさらに、他の残基が「グリカンテザー」を生じさせるように突然変異され得、このグリカンテザーが同様に、グリカンのテザリングがドアストップ残基を再方向付けするように、グリカンを方向付けし得ることを実証する。
【０１６９】
したがって、一部の実施形態において、デザイナーＢＭＰは、グリカンテザーに影響する、かつ／またはヒスチジンドアストップ構造を除去する、少なくとも１つのアミノ酸突然変異を組み込むことによって産生され得、それによって、受容体結合が変化したデザイナーＢＭＰが提供される。
【０１７０】
要するに、一部の実施形態において、本発明のデザイナーＢＭＰは、Ｉ型および／またはＩＩ型受容体結合を変化させる、ＢＭＰのＩ型および／またはＩＩ型結合ドメインにおける少なくとも１つの突然変異を含み得る。１つの実施形態において、ＢＭＰ配列は、操作されたＢＭＰまたは「デザイナー」ＢＭＰの受容体結合および／または骨形成活性を変化および向上させるために、ＢＭＰの受容体親和性を変化させるように操作される。１つの実施形態において、この操作は、とりわけ、デザイナーが由来する元である親ＢＭＰよりもＩ型受容体およびＩＩ型受容体の両方に対する高い親和性を示すデザイナーＢＭＰ分子を生じさせるために、Ｉ型およびＩＩ型受容体結合に関与する残基を同定すること、ならびに前記残基を置き換えることを伴う。
【０１７１】
他の実施形態において、本発明のデザイナーＢＭＰは、新たなアルギニン「グリカンテザー」を生じさせる、または既存のものを破壊してＩ型受容体結合ドメインを再成形する突然変異を含む。すなわち、ＢＭＰ２のＲ１６に等しい、最初のシステインから２残基Ｃ末端側の位置にあるアルギニンに対する突然変異は、ＢＭＰの表面上に「テザリングされる」グリカン鎖を生じさせ、結果的に、突然変異を有さない野生型ＢＭＰと比較して、前らせんループ領域の立体構造を変化させると考えられる。他の実施形態において、本発明のデザイナーＢＭＰは、Ｉ型受容体をＢＭＰとのさらなる係合から阻止する「ドアストップ」残基を変化させる、生成する、または破壊する（消失させる）少なくとも１つの突然変異を含み得る。すなわち、デザイナーＢＭＰとＩ型受容体との相互作用を妨げる、または増大させるように方向付けされている、デザイナーＢＭＰにおけるＨ５４またはその対応する同等な残基の突然変異。
【０１７２】
一部の実施形態において、アミノ酸突然変異は、デザイナーＢＭＰの立体構造に影響して、その結果、突然変異は、さもなければ対応する野生型ＢＭＰにおいて存在する、アルギニン「グリカンテザー」の生成およびまたは消失を仲介する。一部の実施形態において、突然変異は、デザイナーＢＭＰにおけるヒスチジンドアストップ立体構造を生成するかまたは除去する／消失させる、立体構造の変化を仲介し、ここで、このようなドアストップ立体構造は、対応する野生型ＢＭＰにおいてそれぞれ存在しないかまたは活性ではない。
【０１７３】
したがって、本明細書において提供される教示に触れた当業者には、ＴＧＦβスーパーファミリーメンバーにおけるアルギニン「グリカンテザー」および／またはヒスチジン「ドアストップ」の存在または不存在が、限定はしないが本明細書において例示される方法を含む、タンパク質の構造分析のための当技術分野において知られている任意の方法を用いて評価され得ることが理解されよう。「ドアストップ」残基の存在が同定されれば、少なくとも１つの突然変異を分子内に導入して、ヒスチジンを受容体結合界面と反対の方に再方向付けすることができる。あるいは、「グリカンテザー」を生成または増強させる突然変異を導入して、ヒスチジン「ドアストップ」の阻害的影響を、もし存在する場合には低減し、またはさらに好ましくはなくすことができる。
【０１７４】
ＴＧＦβスーパーファミリーメンバーがＢＭＰ２である１つの実施形態において、ヒスチジンドアストップを除去する突然変異は、Ｈ５４の別のアミノ酸での置換である。一部の実施形態において、Ｈ５４は、アラニン、グリシン、セリン、またはスレオニンで置き換えられる。
【０１７５】
本発明は、ＢＭＰ２についてのこのような「ドアストップ」を除去する突然変異を開示するが、当業者には、当技術分野における知識に基づいて、いかにして他のＴＧＦβスーパーファミリーメンバーについての対応する突然変異を同定するか、および「ドアストップ」を有さない突然変異体、すなわち、さもなければ結合界面に面するかまたは結合界面内に突き出ることによって受容体結合を妨げる残基を除去または再方向付けする突然変異体を容易に産生するかが理解されよう。タンパク質の立体構造に対する突然変異の影響は、限定はしないが本明細書において開示されているものなどの、タンパク質の構造分析のための当技術分野において認識されている任意の方法を用いて決定することができる。あるいは、ドアストップを除去し、Ｉ型受容体に対するリガンドの結合を増大させ得る突然変異は、当技術分野において利用可能なコンピュータモデリング方法を用いてインシリコで同定することができる。したがって、本発明は、さもなければ受容体界面内に存在するヒスチジン「ドアストップ」残基を有さないという点でＩ型受容体との結合が向上している、ＴＧＦβスーパーファミリーメンバーの設計を包含する。
【０１７６】
本発明はさらに、いかにしてアルギニングリカンテザーを生成または破壊する他のＴＧＦβファミリーメンバーについての突然変異を同定するかの理解を、当業者に提供する。テザーを有さないタンパク質にアルギニングリカンテザーを付加する突然変異は、本発明によって考慮される。したがって、本発明は、Ｉ型受容体結合ドメインの立体構造を変化させるアルギニングリカンテザーを含有するという点でＩ型受容体との結合が向上している、ＴＧＦβスーパーファミリーメンバーの設計を包含する。
【０１７７】
一部の実施形態において、グリカンテザーが不要になる、ヒスチジンドアストップの除去は、グリコシル化を伴わずに産生され得るが生物学的活性は維持しているデザイナーＢＭＰを提供する。例えば、デザイナーＢＭＰは、哺乳動物細胞とは異なるグリコシル化活性を有する、またはグリコシル化活性が存在しない細胞、例えば、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または粘菌細胞において産生され得る。特定の実施形態において、デザイナーＢＭＰは、大腸菌において産生され得、生物学的活性を維持する。
【０１７８】
したがって、一部の実施形態において、本発明は、グリコシル化を有さないかまたは変化したグリコシル化を含む細胞において産生され得るＢＭＰを設計および産生するための方法を提供し、その結果、哺乳動物細胞によって産生されるものと異なる変化したグリカンが産生される。すなわち、本発明は、さもなければ受容体結合を損なうまたは阻害するドアストップ残基を除去する突然変異を導入するための方法を包含する。本発明の教示を提供された当業者には、受容体−リガンド界面に影響するドアストップ残基が、残基を完全に除去するように突然変異され得るか、または他の突然変異が、残基が界面と反対の方に方向付けされるように導入され得ることが理解されよう。このような他の突然変異には、限定はしないが、グリカンの立体構造を変化させ、それによってドアストップ残基が結合界面と反対の方に方向付けされるようにリガンドの立体構造を変化させる、グリカンテザーの提供が含まれる。
【０１７９】
デザイナーＢＭＰをコードする核酸
本発明はまた、本明細書において記載されるデザイナーＢＭＰをコードする核酸を含む。本明細書において記載されるデザイナーＢＭＰをコードする核酸は、当技術分野において知られている多くの方法に従って調製することができる。
【０１８０】
１つにおいて、デザイナーＢＭＰをコードする核酸は、全遺伝子合成によって、または野生型ＢＭＰもしくは修飾されたＢＭＰをコードする核酸の部位特異的突然変異生成によって調製される。鋳型特異的ライゲーション、反復ＰＣＲ、カセット突然変異生成、部位特異的突然変異生成、または当技術分野において周知の他の技術を含む方法を利用することができる（例えば、Ｓｔｒｉｚｈｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１５０１２〜１５０１７（１９９６）；ＰｒｏｄｒｏｍｏｕおよびＰｅｒｌ、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．５：８２７〜８２９（１９９２）；ＪａｙａｒａｍａｎおよびＰｕｃｃｉｎｉ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２：３９２〜３９８（１９９２）；ならびにＣｈａｌｍｅｒｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３０：２４９〜２５２（２００１）を参照されたい）。
【０１８１】
したがって、本発明の実施形態は、本発明のデザイナーＢＭＰをコードする核酸分子を含み得る。特定の実施形態において、本発明は、配列番号８〜６６のアミノ酸配列の１つをコードする核酸分子を提供する。
【０１８２】
他の実施形態において、核酸分子は、配列番号１２のアミノ酸配列に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一なアミノ酸配列を含むデザイナーＢＭＰタンパク質をコードする。一部の実施形態において、核酸分子は、配列番号１２のアミノ酸配列を含むデザイナーＢＭＰタンパク質をコードする。別の実施形態において、核酸分子は、表８に示されるＢＭＰＥのアミノ酸配列をコードする。
【０１８３】
他の実施形態において、核酸分子は、配列番号１４のアミノ酸配列に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一なアミノ酸配列を含むデザイナーＢＭＰタンパク質をコードする。一部の実施形態において、核酸分子は、配列番号１４のアミノ酸配列を含むデザイナーＢＭＰタンパク質をコードする。別の実施形態において、核酸分子は、表８に示されるＢＭＰＧのアミノ酸配列をコードする。
【０１８４】
他の実施形態において、核酸分子は、配列番号３６のアミノ酸配列に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一なアミノ酸配列を含むデザイナーＢＭＰタンパク質をコードする。一部の実施形態において、核酸分子は、配列番号３６のアミノ酸配列を含むデザイナーＢＭＰタンパク質をコードする。別の実施形態において、核酸分子は、表８に示されるＢＭＰＧＥのアミノ酸配列をコードする。
【０１８５】
他の実施形態において、核酸分子は、配列番号３７のアミノ酸配列に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一なアミノ酸配列を含むデザイナーＢＭＰタンパク質をコードする。一部の実施形態において、核酸分子は、配列番号３７のアミノ酸配列を含むデザイナーＢＭＰタンパク質をコードする。別の実施形態において、核酸分子は、表８に示されるＢＭＰＧＥＲのアミノ酸配列をコードする。
【０１８６】
デザイナーＢＭＰをコードする典型的なヌクレオチド配列を、以下の表８に示す。表８は、コードされるタンパク質の名称およびそのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を示す。通常、成熟タンパク質をコードする配列は、以下に列挙される配列のヌクレオチド８４７で開始する。
【０１８７】
【表９−１】
0005985480.tif 000012
【０１８８】
【表９−２】
0005985480.tif 000013
【０１８９】
【表９−３】
0005985480.tif 000014
【０１９０】
【表９−４】
0005985480.tif 000015
【０１９１】
【表９−５】
0005985480.tif 000016
【０１９２】
【表９−６】
0005985480.tif 000017
【０１９３】
【表９−７】
0005985480.tif 000018
【０１９４】
【表９−８】
0005985480.tif 000019
【０１９５】
【表９−９】
0005985480.tif 000020
【０１９６】
【表９−１０】
0005985480.tif 000021
【０１９７】
【表９−１１】
0005985480.tif 000022
【０１９８】
【表９−１２】
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【０１９９】
【表９−１３】
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【０２００】
【表９−１４】
0005985480.tif 000025
【０２０１】
【表９−１５】
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【０２０２】
【表９−１６】
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【０２０３】
【表９−１７】
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【０２０４】
【表９−１８】
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【０２０５】
【表９−１９】
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【０２０６】
【表９−２０】
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【０２０７】
【表９−２１】
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【０２０８】
【表９−２２】
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【０２０９】
【表９−２３】
0005985480.tif 000034
【０２１０】
【表９−２４】
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【０２１１】
【表９−２５】
0005985480.tif 000036
【０２１２】
他の実施形態において、デザイナーＢＭＰをコードする核酸分子は、配列番号７４〜１３９で示される核酸配列の１つに少なくとも４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一な核酸配列、またはその断片を含む。他の実施形態において、デザイナーＢＭＰをコードする核酸分子は、表８で示される核酸配列の１つに少なくとも４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一な核酸配列、またはその断片を含む。別の実施形態において、デザイナーＢＭＰをコードする核酸分子は、配列番号７４〜１３９で示される任意の配列の核酸配列を含む。さらに別の実施形態において、核酸分子は、配列番号７４〜１３９の核酸配列のいずれか１つの核酸配列からなる。
【０２１３】
別の実施形態において、デザイナーＢＭＰをコードする核酸分子は、配列番号７８の核酸配列に少なくとも４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一な核酸配列、またはその断片を含む。別の実施形態において、デザイナーＢＭＰをコードする核酸分子は、配列番号７８の核酸配列を含む。さらに別の実施形態において、核酸分子は、ＢＭＰＥをコードする配列番号７８の核酸配列からなる。
【０２１４】
別の実施形態において、デザイナーＢＭＰをコードする核酸分子は、配列番号８０の核酸配列に少なくとも４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一な核酸配列、またはその断片を含む。別の実施形態において、デザイナーＢＭＰをコードする核酸分子は、配列番号８０の核酸配列を含む。さらに別の実施形態において、核酸分子は、ＢＭＰＧをコードする配列番号８０の核酸配列からなる。
【０２１５】
別の実施形態において、デザイナーＢＭＰをコードする核酸分子は、配列番号１０２の核酸配列に少なくとも４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一な核酸配列、またはその断片を含む。別の実施形態において、デザイナーＢＭＰをコードする核酸分子は、配列番号１０２の核酸配列を含む。さらに別の実施形態において、核酸分子は、ＢＭＰＧＥをコードする配列番号１０２の核酸配列からなる。
【０２１６】
別の実施形態において、デザイナーＢＭＰをコードする核酸分子は、配列番号１０３の核酸配列に少なくとも４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一な核酸配列、またはその断片を含む。別の実施形態において、デザイナーＢＭＰをコードする核酸分子は、配列番号１０３の核酸配列を含む。さらに別の実施形態において、核酸分子は、ＢＭＰＧＥＲをコードする配列番号１０３の核酸配列からなる。
【０２１７】
デザイナーＢＭＰを産生する方法
ＢＭＰは、長いプロドメイン、１つまたは複数の切断部位、および成熟ドメインを含む前駆タンパク質として、天然に発現する。この前駆タンパク質はその後、細胞の機構によってプロセシングされて、典型的には、二量体の成熟ＢＭＰ分子をもたらす。一部の実施形態において、デザイナーＢＭＰは、類似の様式で産生される。プロドメインは、ＢＭＰのフォールディングおよびプロセシングにおいて役割を有すると考えられている。さらに、一部のＢＭＰにおいて、プロドメインは、成熟ドメインに非共有結合し得、溶解度増強剤、シャペロン、または阻害剤として作用し得る。一部の実施形態において、ＢＭＰは、封入体から直接的に産生されるかまたは封入体から再フォールディングされる、成熟ドメインとして産生され得る。他の実施形態において、ＢＭＰは、化学合成またはタンパク質産生のための任意の他の既知の方法を介して産生される。
【０２１８】
１つの実施形態において、デザイナーＢＭＰは、限定はしないが当技術分野において周知の合成方法などの、化学合成方法を用いて産生される。
【０２１９】
一部の実施形態において、デザイナーＢＭＰをコードする核酸は、全遺伝子合成によって、または、野生型ＢＭＰ、デザイナーＢＭＰ、もしくは変異ＢＭＰをコードする核酸の部位特異的突然変異生成によって調製される。方法には、鋳型特異的ライゲーション、ＰＣＲ、カセット突然変異生成、部位特異的突然変異生成、制限酵素消化およびライゲーション、または当技術分野において周知の他の技術が含まれる（例えば、Ｐｒｏｄｒｏｍｏｕら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ５：８２７〜９（１９９２）；Ｊａｙａｒａｍａｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２：３９２〜８（１９９２）；Ｃｈａｌｍｅｒｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３０：２４９〜５２（２００１）；ならびにＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（２００１）を参照されたい）。
【０２２０】
一部の実施形態において、デザイナーＢＭＰをコードする遺伝子を含む発現ベクターが調製される。様々な宿主細胞のための多くのタイプの適切な発現ベクターおよび適切な調節配列が、当技術分野において知られている。発現ベクターは、限定はしないがプロモーター配列、リボソーム結合部位、転写ターミネーターシグナル、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサー配列またはアクチベーター配列を含む、転写および翻訳の調節配列を含有し得る。一部の実施形態において、調節配列は、プロモーター配列ならびに転写開始配列および転写停止配列を含む。さらに、発現ベクターは、発現ベクターを２つの生物内に維持することを可能にする２つの複製系などの、さらなるエレメントを含み得る。発現ベクターは、染色体外ベクター、または宿主細胞ゲノム内に組み込まれるベクターであり得る。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、ゲノム内への組み込みを促進するための、宿主細胞ゲノムに相同な少なくとも１つの配列を含有する。ベクターを組み込むための構築物は、当技術分野において周知である。一部の実施形態において、発現ベクターは、安定的に形質転換された宿主細胞の選択を可能にするための選択マーカー遺伝子を含む。選択マーカー遺伝子は、当技術分野において周知であり、用いられる宿主細胞によって変化する。
【０２２１】
発現ベクターは、宿主細胞からデザイナーＢＭＰを分泌させるための分泌リーダー配列またはシグナルペプチド配列を含み得る。適切な分泌リーダー配列およびシグナルペプチドは、当技術分野において知られている。
【０２２２】
デザイナーＢＭＰをコードする核酸は、デザイナーＢＭＰが核酸から発現されるように、単独でまたは発現ベクターと組み合わせて宿主細胞内に導入することができる。導入の方法は主に、宿主細胞のタイプによって決定される。典型的なトランスフェクション／形質転換方法には、ＣａＰＯ４沈殿、リポソーム融合、エレクトロポレーション、ウイルス感染、デキストランを利用したトランスフェクション、ポリブレンを利用したトランスフェクション、プロトプラスト融合、直接的なマイクロインジェクション、および他の当技術分野において知られている方法が含まれる。デザイナーＢＭＰをコードする核酸は、宿主細胞ゲノム内に安定的に組み込まれ得るか、または細胞質内に一時的にもしくは安定的に存在し得る。
【０２２３】
デザイナーＢＭＰを発現させるための適切な宿主細胞には、限定はしないが酵母細胞、細菌細胞、古細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、および動物細胞を含む、野生型ＢＭＰまたは天然ＢＭＰを発現させるために適切な任意の細胞が含まれる。一部の実施形態において、宿主細胞は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または大腸菌である。一部の実施形態において、宿主細胞は、２９３（例えば、２９３−Ｔおよび２９３−ＥＢＮＡ）細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯＫ１およびＤＧ４４）細胞、ＣＯＳ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、またはＣ２Ｃ１２細胞などの、哺乳動物細胞である。他の適切な細胞は、ＡＴＣＣカタログにおいて見ることができる。デザイナーＢＭＰは、限定はしないが植物および動物を含む、さらに複雑な生物において産生され得る。１つの実施形態において、細胞は、デザイナーＢＭＰの核酸を含む発現ベクター以外の外因性の核酸を含有するように、さらに遺伝子操作され得る。
【０２２４】
一部の実施形態において、デザイナーＢＭＰは、デザイナーＢＭＰをコードする核酸を含有する発現ベクターで形質転換された宿主細胞を、デザイナーＢＭＰの発現を誘発するかまたは生じさせるための適切な条件下で培養することによって産生される。デザイナーＢＭＰの発現に適切な条件は、天然ＢＭＰまたは野生型ＢＭＰを発現させるために適切であることが知られている、同一の条件である。これらの条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択によって変化し、通常の実験を通して当業者によって容易に確認され得る。
【０２２５】
一部の実施形態において、デザイナーＢＭＰは、発現後に精製または単離され得る。標準的な精製方法には、電気泳動技術、分子的技術、免疫学的技術、ならびに、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、および逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーを含むクロマトグラフィー技術、ならびにクロマトフォーカシングが含まれる。適切な精製技術における全体的なガイダンスは、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｉｎ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ＮＹ、第３版（１９９４）において見ることができる。必要な精製の程度は、所望の使用に応じて変化し、場合によっては、精製は不要である。
【０２２６】
細菌細胞からの精製の結果、封入体におけるＢＭＰの発現、および次の、ＣＨＡＰＳ／Ｈｉｇｈ塩系における再フォールディングのステップが生じる。哺乳動物細胞からの精製は、セルファインスルフェートカラムおよび逆相クロマトグラフィーカラムを介する２ステップの精製を伴い得る。
【０２２７】
一部の実施形態において、デザイナーＢＭＰは、共有結合的にまたは非共有結合的に修飾され得る。共有結合的な修飾は、タンパク質の標的化されたアミノ酸残基と、選択された側鎖残基または末端残基との反応が可能な有機誘導体化剤とを反応させることによって、タンパク質に導入され得る。修飾のための最適な部位は、限定はしないが、目視検査、構造分析、配列分析、および分子シミュレーションを含む、様々な基準を用いて選択することができる。
【０２２８】
一部の実施形態において、デザイナーＢＭＰは、少なくとも１つのエレメント、同位体、または化学的化合物で標識され得る。標識は、同位体標識、例えば放射性同位体または重同位体であり得る。一部の実施形態において、標識は、免疫標識、例えば抗体または抗原であり得る。一部の実施形態において、標識は、着色標識または蛍光標識、例えばフルオレセインであり得る。一部の実施形態において、標識は、ビオチン、タグ（例えば、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ、Ｈｉｓ）であり得る。
【０２２９】
デザイナーＢＭＰは、デザイナーＢＭＰを、タンパク質に結合する抗体もしくはタンパク質の精製において用いるための支持マトリクスまたは表面に架橋するため、またはスクリーニングアッセイにおける結合を検出するための、二官能性の作用物質で誘導体化され得る。一般的に用いられる架橋剤には、限定はしないが、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３'−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性のイミドエステル、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性のマレイミドが含まれる。他の修飾には、グルタミニル残基およびアスパラギニル残基の、それぞれ対応するグルタミル残基およびアスパルチル残基への脱アミド化、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリル残基またはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン側鎖、アルギニン側鎖、およびヒスチジン側鎖のアミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ｐｐ．７９〜８６（１９８３））、Ｎ末端アミンのアセチル化、および任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。このような誘導体化によって、溶解度、吸収、血液脳関門を通る輸送、血清半減期などが向上し得る。デザイナーＢＭＰの修飾は、あるいは、タンパク質の任意の考えられる望ましくない副作用をなくすかまたは弱め得る。このような影響を仲介し得る部分は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９８０）において開示されている。
【０２３０】
デザイナーＢＭＰの別のタイプの共有結合的な修飾は、米国特許第４，６４０，８３５号、米国特許第４，４９６，６８９号、米国特許第４，３０１，１４４号、米国特許第４，６７０，４１７号、米国特許第４，７９１，１９２号、または米国特許第４，１７９，３３７号において記載されている様式での、タンパク質の、様々な非タンパク性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンの１つへの連結を含む。当技術分野において周知のように、様々な結合化学を、ＰＥＧの付着を行うために用いることができる。
【０２３１】
別の実施形態において、デザイナーＢＭＰは、タンパク質の、ＣｏｖＸ体リンカーを介する、限定はしないが、米国特許第５，７３３，７５７号および米国特許公開ＵＳ２００９／００９８１３０において記載されているＣｏｖＸ体などの、ＣｏｖＸ体抗体への連結を含む。このようなＣｏｖＸ体は、限定はしないが向上した安定性および延長した血清半減期を含む、向上した特徴を示し得る。
【０２３２】
デザイナーＢＭＰの受容体結合活性をアッセイする方法
デザイナーＢＭＰの受容体結合活性は、野生型ＢＭＰの活性を評価するために用いられる任意の方法を用いて評価することができる。
【０２３３】
１つまたは複数のＢＭＰ受容体に対するデザイナーＢＭＰの親和性は、受容体結合アッセイによって決定することができる。例えば、ＡＬＫ−２、ＡＬＫ−３、ＡＬＫ−６、ＡｃｔＲＩＩ、ＡｃｔＲＩＩｂ、またはＢＭＰＲＩＩに対する親和性を決定することができる。適切な結合アッセイには、限定はしないが、ＥＬＩＳＡ、蛍光の異方性および強度、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ（Ｐｅａｒｃｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８：８１〜８９（１９９９））、ＤＥＬＦＩＡアッセイ、ならびにＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ；Ｂｏｓｓｅ  Ｒ．、Ｉｌｌｙ  ＣおよびＣｈｅｌｓｋｙ  Ｄ（２００２）から市販されている）が含まれる。
【０２３４】
一部の実施形態において、Ｂｉａｃｏｒｅまたは表面プラズモン共鳴アッセイが用いられる。例えば、ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５：５７２〜５７７（２００１）を参照されたい。Ｂｉａｃｏｒｅ実験は、ＴＧＦ−βアイソフォームの、その受容体に対する結合を特徴付けするために、これまでに用いられている（Ｄｅ  Ｃｒｅｓｃｅｎｚｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６：２９６３２〜２９６４３（２００１）；Ｄｅ  Ｃｒｅｓｃｅｎｚｏら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２８：１１７３〜１１８３）（２００３）。
【０２３５】
他の実施形態において、プレートベースの直接的な結合アッセイを用いて、１つまたは複数のＢＭＰ受容体に対する１つまたは複数の修飾されたＢＭＰの親和性を決定する。この方法は、ＢＭＰが抗ＢＭＰモノクローナル抗体を用いて捕捉され、次にＢＭＰ受容体−Ｆｃ融合タンパク質を用いて検出される、修正されたサンドイッチＥＬＩＳＡである。
【０２３６】
他の実施形態において、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイ（Ｂｏｓｓｅ  Ｒ．ら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏｔｅ  Ｒｅｆ  ＃４０６９、ｈｔｔｐ：／／ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ．ｃｏｍ／Ｎｏｔｅｓ／Ｓ４０６９−０８０２．ｐｄｆ（２００２））を用いて、受容体および阻害剤の結合を特徴付けすることができる。蛍光アッセイもまた、受容体および阻害剤の結合を特徴付けするために用いることができる。例えば、ＢＭＰ２またはＢＭＰ２の受容体もしくは阻害剤を、蛍光染料（適切な染料の例については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓのカタログを参照されたい）で標識することができる。さらに、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）を用いて、受容体の結合親和性を決定することができる。例えば、ＢＭＰ受容体−Ｆｃ融合体は、タンパク質Ａで被覆されたＳＰＡビーズまたはフラッシュプレートに結合し得、Ｓ３５で標識されたＢＭＰで処理され得る。結合事象の結果、光が生じる。
【０２３７】
特定の実施形態において、Ｉ型またはＩＩ型受容体に対する特定のＢＭＰ突然変異体のＫＤは、ヒトＩｇＧ−Ｆｃに対する受容体細胞外ドメインの融合を用いて決定することができる。受容体は、抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃセンサーを用いてオクテットセンサーに結合させることができ、ＢＭＰを溶液内で受容体細胞外ドメインに結合させて、Ｋｏｎ速度およびＫｏｆｆ速度を決定することができる。Ｏｃｔｅｔシステムは、生体分子の相互作用のリアルタイムな無標識分析を可能にするため、ならびに親和性、動態、および濃度についての情報を提供するための、特許を取得しているＢｉｏＬａｙｅｒ干渉法（ＢＬＩ）を利用する。タンパク質がＯｃｔｅｔセンサーに結合すると、センサーを通過する光は波長がシフトし、これは、分光光度計で測定することができる。変化の比率は、分析物がセンサーに結合すると、また分析物が結合を失うと、測定される。
【０２３８】
デザイナーＢＭＰの骨形成活性をアッセイする方法
デザイナーＢＭＰの骨形成活性は、野生型ＢＭＰの活性を評価するために用いられる任意の方法を用いて評価することができる。
【０２３９】
ＢＭＰは、多くのタイプの細胞の成長および分化を促進する。分化は、例えば、アルカリホスファターゼのための発光レポーター、またはアルシアンブルーもしくはＰＮＰＰなどの熱量測定試薬を用いて、モニタリングすることができる（Ａｓａｈｉｎａら（１９９６）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ、２２２：３８〜４７；Ｉｎａｄａら（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｖｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２２：３１７〜３２２；Ｊｏｒｔｉｋｋａら（１９９８）Ｌｉｆｅ  ＳｃＬ  ６２：２３５９〜２３６８；Ｃｈｅｎｇら（２００３）Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ９５Ａ：１５４４〜１５５２）。
【０２４０】
ラットの肢芽軟骨の分化アッセイもまた、一次細胞における活性をモニタリングするために用いることができる。代替的な実施形態において、レポーター遺伝子またはキナーゼアッセイを用いることができる。ＢＭＰはＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路を活性化するため、ＧＦＰまたはルシフェラーゼなどのＳＴＡＴ応答性のレポーターを含有するＢＭＰ応答性細胞系を用いることができる（Ｋｕｓａｎａｇｉら（２０００）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．、１１：５５５〜５６５）。例えば、腎臓細胞におけるＢＭＰ活性を、細胞ベースのアッセイを用いて決定することができる。例えば、ＷａｎｇおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｒｇ（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７９：２３２００〜２３２０６を参照されたい。
【０２４１】
骨形成活性は、全てＩｓａａｃｓら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２４：１４６９〜１４７７（２０１０）において記載されている、アルカリホスファターゼ、ＢＲＥ−ルシフェラーゼ、またはアリザリンレッド石灰化などの、細胞ベースのアッセイにおいて測定することができる。
【０２４２】
骨形成活性はまた、ラットの異所性骨アッセイまたは哺乳動物の骨成長モデルを介して、インビボで測定することができる。一部の実施形態において、骨形成活性は、非ヒト霊長類モデルにおいて測定される。これらのモデルは、Ｉｓａａｃｓら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２４：１４６９〜１４７７（２０１０）において記載されている。
【０２４３】
骨量および骨の質を評価するための方法は、当技術分野において知られており、これには、限定はしないが、例えば、Ｌａｎｅら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．１８：２１０５〜２１１５（２００３）において記載されている、Ｘ線回折、ＤＸＡ、ＤＥＱＣＴ、ｐＱＣＴ、化学分析、密度分画、組織測光法、組織形態計測、および組織化学分析が含まれる。皮質骨密度を決定するための１つのアッセイは、ＭｉｃｒｏＣＴアッセイである。ｐＱＣＴ測定の後、例えば大腿骨でＳｃａｎｃｏ  ｍＣＴ４０（Ｓｃａｎｃｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＡＧ）を用いて、ｍｉｃｒｏＣＴ評価を行うことができる。
【０２４４】
骨の成長／密度／強度を評価するための、任意の既知のまたは後に開発されたインビトロ方法またはインビボ方法を用いて、本発明のデザイナーＢＭＰの骨形成活性を評価することができる。
【０２４５】
医薬組成物
本発明のデザイナーＢＭＰは、その必要がある哺乳動物、好ましくはヒトに、医薬組成物の一部として投与するために製剤され得る。組成物は、任意の適切な手段によって、例えば、非経口的に、経口的に、または局所的に投与することができる。設計されたＢＭＰが、注入によるように局所的に所望の組織部位に投与される場合、または例えば静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、眼窩内投与、眼投与、脳室内投与、頭蓋内投与、嚢内投与、髄腔内投与、脳槽内投与、腹腔内投与、口腔内投与、直腸投与、膣投与、鼻腔内投与、もしくはエアロゾル投与などによって全身的に投与される場合、組成物は、好ましくは、水溶液を含む。溶液は、好ましくは、哺乳動物へのその投与が哺乳動物の正常な電解質および体液の容積バランスに悪影響を及ぼさないように、生理学的に許容できる。水性溶液は、したがって、例えば、正常な生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ、０．１５Ｍ）、ｐＨ７〜７．４を含み得る。
【０２４６】
経口的または非経口的な全身投与に有用な溶液は、例えば「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（参照することによってその開示が本明細書に組み込まれる、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．、１９９０）において記載されている、薬学分野において周知の任意の方法によって調製することができる。製剤は、例えば、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物由来の油、水素化されたナフタレンなどを含み得る。直接的な投与のための製剤は、特に、グリセロールおよび他の高粘度の組成物を含み得る。
【０２４７】
例えば、ヒアルロン酸、コラーゲン、リン酸三カルシウム、ポリブチレート、ポリラクチド、ポリグリコリド、およびラクチド／グリコリドコポリマーを含む、生体適合性の、好ましくは生体吸収性のポリマーは、インビボでのデザイナーＢＭＰの放出を制御するための有用な賦形剤であり得る。本発明のデザイナーＢＭＰのための他の潜在的に有用な非経口送達系には、エチレン酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な注入系、およびリポソームが含まれ得る。吸入投与のための製剤は、賦形剤として例えばラクトースを含有し得るか、または、例えばポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココレート、もしくはデオキシコレートを含有する水性溶液であり得るか、または点鼻薬の形態でもしくは鼻腔内に塗布されるゲルとして投与するための油性溶液であり得る。
【０２４８】
あるいは、本明細書において記載されるように同定される、デザイナーＢＭＰ２およびＢＭＰ６を含む本発明のデザイナーＢＭＰは、経口的に投与することができる。例えば、デザイナーＢＭＰの液体製剤は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（上記）において記載されているような標準的な実施に従って調製することができる。このような液体製剤は、次に、投与のために飲料または別の栄養補助食品に添加することができる。経口投与はまた、これらの液体製剤のエアロゾルを用いて行うことができる。あるいは、当技術分野において認識されている乳化剤を用いて調製された固体製剤は、経口投与に適した錠剤、カプセル、またはトローチに加工することができる。
【０２４９】
場合によって、デザイナーＢＭＰは、所望の組織によるタンパク質の取り込みを増強するための手段を含む組成物に製剤することができる。例えば、テトラサイクリンおよびジホスホネート（ビスホスホネート）は、哺乳動物において全身的に提供されると、特に骨のリモデリングの区域で、骨塩に結合することが知られている。したがって、このような成分は、本発明のデザイナーＢＭＰの骨組織への送達を増強させるために用いることができる。あるいは、細胞表面抗原などの所望の標的組織と特異的に会合しているアクセス可能な物質に特異的に結合する抗体またはその部分もまた、用いることができる。必要に応じて、このような特異的な標的化分子は、例えば、化学的架橋によって、または例えばＡｓｐ−Ｐｒｏ連結などの酸に不安定な結合を生じさせるための標準的な遺伝子操作技術を用いることによって、本発明のデザイナーＢＭＰに共有結合し得る。有用な標的化分子は、例えば、米国特許第５，０９１，５１３号の教示に従って、設計することができる。
【０２５０】
また、デザイナーＢＭＰの一部が、担体マトリクス、すなわち不溶性のポリマーマトリクスと組み合わせられると、最も高いレベルのインビボでの活性を示し得ることが考えられる。例えば、参照することによってその開示が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，２６６，６８３号を参照されたい。現在好ましい担体マトリクスは、本質的に、異種、同種、または自源性である。しかし、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ酪酸、その誘導体およびコポリマーを含む合成材料もまた、適切な担体マトリクスを生成するために用いることができると考えられる。好ましい合成のおよび天然由来のマトリクス材料、その調製物、それを本発明のデザイナーＢＭＰと製剤するための方法、ならびに投与方法は、当技術分野において周知であり、したがって、本明細書において詳述しない。例えば、米国特許第５，２６６，６８３号を参照されたい。
【０２５１】
特定の実施形態において、デザイナーＢＭＰは、その必要がある哺乳動物に、単独で、または組織の形態形成に対して有利な影響を有することが知られている別の物質と組み合わせて、投与することができる。このような物質（ここでは補因子）の例には、組織の修復および再生を促進する、ならびに／または炎症もしくは線維症を阻害する物質が含まれる。骨粗しょう症の個体における骨組織の成長を刺激するための有用な補因子の例には、例えば、限定はしないが、ビタミンＤ３、カルシトニン、プロスタグランジン、副甲状腺ホルモン、デキサメタゾン、エストロゲン、およびＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩが含まれる。神経組織の修復および再生に有用な補因子には、神経成長因子が含まれ得る。他の有用な補因子には、消毒剤、抗生物質、抗ウイルス剤および抗真菌剤、鎮痛剤、ならびに麻酔薬を含む、症候を軽減する補因子が含まれる。
【０２５２】
デザイナーＢＭＰは、好ましくは、薬学的に許容できる無毒の賦形剤および担体と混合することによって、医薬組成物内に製剤される。上記のように、このような組成物は、特に液体溶液もしくは懸濁液の形態での、全身投与、例えば非経口投与；特に錠剤もしくはカプセルの形態での経口投与；または特に粉末、点鼻薬、もしくはエアロゾルの形態での鼻腔内投与のために調製され得る。組織表面への接着が望ましい場合、組成物は、参照することによってその開示が本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ  ＵＳ９１／０９２７５において開示されているような、フィブリノーゲン−トロンビン分散剤または他の生体接着剤を含み得る。組成物はしたがって、所望の組織表面に塗られ得るか、噴霧され得るか、または別の方法で塗布され得る。
【０２５３】
投与されると、本発明の医薬組成物は、典型的には、発熱性物質を有さない生理学的に許容可能な形態で送達される。さらに、組成物は、骨の軟骨または組織の損傷の部位への送達のために、望ましくカプセル化され得るかまたは粘性形態で注入され得る。局所投与は、創傷の治癒および組織の修復に適切であり得る。骨および／または軟骨の形成にとって好ましくは、組成物は、骨および軟骨の発生のための構造を提供し、また体内に最適に再吸収され得る、ＢＭＰタンパク質を骨および／または軟骨の損傷の部位に送達し得るマトリクスを含む。このようなマトリクスは、他の移植型の医学的用途に現在用いられている材料で形成され得る。
【０２５４】
マトリクス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、美容的外観、および界面特性に基づく。デザイナーＢＭＰ組成物の特定の用途は、適切な製剤を規定する。組成物のための考えられるマトリクスは、生分解性で化学的に規定されたカルシウムスルフェート、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸、およびポリ無水物であり得る。他の考えられる材料は、骨または真皮コラーゲンなどのように、生分解性であり、生物学的に良く規定されている。さらなるマトリクスは、純粋なタンパク質または細胞外マトリクス成分を含む。他の考えられるマトリクスは、焼結されたヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミネート、または他のセラミックなどのように、生分解不可能であり化学的に規定されている。マトリクスは、ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイト、またはコラーゲンおよびリン酸三カルシウムなどの、上記のタイプの材料のいずれかの組み合わせを含み得る。バイオセラミックは、組成、例えばカルシウム−アルミネート−ホスフェートにおいて変化し得、孔サイズ、粒子サイズ、粒子形状、および生分解性が変化するように処理される。
【０２５５】
投与レジメンは、デザイナーＢＭＰタンパク質の作用を変化させる様々な因子を考慮して、担当医師によって決定される。これらの因子には、限定はしないが、形成させたい骨重量、骨の損傷の部位、損傷した骨の状態、創傷のサイズ、損傷した組織のタイプ、患者の年齢、性別、および食餌、任意の感染の重症度、投与時間、ならびに他の臨床的因子が含まれる。投与量は、再構成において用いられるマトリクスのタイプで変化し得る。ＩＧＦＩ（インスリン様成長因子Ｉ）などの他の既知の成長因子の、最終組成物への添加もまた、投与量に影響し得る。進行は、骨の成長および／または修復の断続的な評価によってモニタリングすることができる。骨の成長または修復を評価する１つの方法は、当技術分野において認識されている多くの方法の中で、ｘ線イメージングおよび／またはＣＴスキャンによる。
【０２５６】
組成物は、治療有効量、例えば、所望の効果を誘発するために十分な時間にわたり適切な濃度のデザイナーＢＭＰを標的組織に提供する量で、ヒトまたは他の哺乳動物に非経口投与または経口投与するために、製剤することができる。好ましくは、本発明の組成物は、老化した組織（例えば、骨減少性の骨組織）に対する組織特異的な機能の維持もしくは組織特異的な表現型の回復、または組織における線維性の応答の阻害もしくは逆転などの、モルフォゲンに関連する生物学的応答に対する、哺乳動物の要求を軽減するかまたは和らげる。
【０２５７】
当業者には理解されるであろうが、治療用組成物における記載される化合物の濃度は、投与される薬剤の投与量、採用される化合物の化学的特徴（例えば疎水性）、および投与経路を含む、多くの因子に応じて変化する。投与される薬剤の好ましい投与量はまた、疾患のタイプおよび程度、組織の喪失または欠損、特定の患者の全体的な健康状態、選択された化合物の相対的な生物学的有効性、化合物の製剤、製剤における賦形剤の存在およびタイプ、ならびに投与経路などの変数に依存する可能性が高い。
【０２５８】
大まかに言うと、本発明の化合物は、非経口投与では約０．１〜１０％ｗ／ｖの化合物を含有する水性の生理学的緩衝溶液で提供され得る。典型的な用量範囲は、１日当たり体重１ｋｇ当たり約１０ｎｇ〜約１ｇであり、好ましい用量範囲は、体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜１００ｍｇである。
【０２５９】
治療的使用
デザイナーＢＭＰは、野生型ＢＭＰが有用な任意の適応に、またはＴＧＦβスーパーファミリーメンバーを用いることができる任意の方法に、用いることができる。デザイナーＢＭＰは、骨および軟骨の形態形成の発生カスケードを誘発し得、Ｓｍａｄシグナル伝達経路を誘発または仲介し得る。デザイナーＢＭＰは、限定はしないが、対応する野生型ＢＭＰよりも優れた骨量、骨の剛性、および骨密度の生成を含む、骨のより優れた増生および修復を誘発する。したがって、デザイナーＢＭＰは、組織における骨形成を誘発するために用いることができる。また、デザイナーＢＭＰは、体内の様々な位置における骨および軟骨の増殖を誘発するために用いることができる。例えば、デザイナーＢＭＰは、膝、肘、くるぶし、および指などの関節を修復するために用いることができる。例えば、デザイナーＢＭＰは、関節炎または他の軟骨変性疾患に罹患している患者における軟骨の再生に有用であり得る。さらに、デザイナーＢＭＰは、損傷に起因する軟骨の破断の治療に用いられる。さらに、デザイナーＢＭＰは、患者における骨の成長の誘発に有用である。例えば、デザイナーＢＭＰは、骨折もしくは骨の破損、骨粗しょう症に罹患している患者、または脊椎固定術が必要な患者の治療に、あるいは脊椎、脊椎骨などの修復に用いられる。
【０２６０】
別の実施形態において、本発明は、骨の増生および／または修復の方法を含む。したがって、本発明は、治療有効量のデザイナーＢＭＰを、検出可能な骨の増生または修復をそれが仲介する部位に投与することを包含する。
【０２６１】
別の実施形態において、本発明は、Ｓｍａｄの発現を誘発または増大する方法を含む。本方法は、Ｓｍａｄ介在性の発現経路を含む細胞を本発明のデザイナーＢＭＰと接触させることを含む。
【０２６２】
デザイナーＢＭＰは、骨または骨の軟骨と異なる、哺乳動物における様々な組織についての、骨の形態形成および組織の形態形成の発生カスケードを誘発し得る。このモルフォゲン活性は、前駆細胞の増殖および分化を誘発する能力、ならびに、骨、軟骨、石灰化されていない骨格組織または結合組織、および他の成体組織の形成をもたらす事象の進行を通して、分化した表現型を支持および維持する能力を含む。
【０２６３】
例えば、デザイナーＢＭＰは、代謝性骨疾患において骨量の減少を予防するためおよび／または骨量を増大させるための治療に用いることができる。骨形成タンパク質を用いて代謝性骨疾患における骨量の減少を予防するためおよび／または骨量を増大させるための治療の一般的な方法は、参照することによってその開示が本明細書に組み込まれる米国特許第５，６７４，８４４号において開示されている。デザイナーＢＭＰはまた、骨の破損、骨折、および軟骨の破断などの損傷部位での骨または軟骨を置き換えるかまたは修復するために投与することができる。本発明のデザイナーＢＭＰは、歯周組織の再生に用いることができる。骨形成タンパク質を用いる歯周組織の再生のための一般的な方法は、参照することによってその開示が本明細書に組み込まれる米国特許第５，７３３，８７８号において開示されている。
【０２６４】
デザイナーＢＭＰは、肝臓の再生に用いることができる。骨形成タンパク質を用いる肝臓の再生のための一般的な方法は、参照することによってその開示が本明細書に組み込まれる米国特許第５，８４９，６８６号において開示されている。デザイナーＢＭＰは、慢性腎不全の治療に用いることができる。骨形成タンパク質を用いる慢性腎不全の治療のための一般的な方法は、参照することによってその開示が本明細書に組み込まれる米国特許第６，８６１，４０４号において開示されている。デザイナーＢＭＰは、中枢神経系の虚血または外傷の後の機能的回復を増強させるために用いることができる。骨形成タンパク質を用いる、中枢神経系の虚血または外傷の後の機能的回復を増強させるための一般的な方法は、参照することによってその開示が本明細書に組み込まれる米国特許第６，４０７，０６０号において開示されている。
【０２６５】
デザイナーＢＭＰは、樹状細胞の成長を誘発するために用いることができる。骨形成タンパク質を用いる、樹状細胞の成長を誘発するための一般的な方法は、参照することによってその開示が本明細書に組み込まれる米国特許第６，９４９，５０５号において開示されている。
【０２６６】
デザイナーＢＭＰは、神経細胞の接着を誘発するために用いることができる。骨形成タンパク質を用いる、神経細胞の接着を誘発するための一般的な方法は、参照することによってその開示が本明細書に組み込まれる米国特許第６，８００，６０３号において開示されている。
【０２６７】
デザイナーＢＭＰは、パーキンソン病を治療および阻止するために用いることができる。骨形成タンパク質を用いる、パーキンソン病を治療および阻止するための一般的な方法は、参照することによってその開示が本明細書に組み込まれる米国特許第６，５０６，７２９号において開示されている。
【０２６８】
上記の様々な治療的使用のために、本発明の修飾されたＢＭＰを用いる一般的な方法を修正することは、当業者の技術の範囲内である。本発明の修飾されたＢＭＰの治療用途の典型的な実施形態は、以下にさらに記載される。
【０２６９】
デザイナーＢＭＰは、罹患しているかまたは損傷している哺乳動物組織を修復するために用いることができる。修復される組織は、好ましくは評価され、過剰な壊死性のまたは干渉性の瘢痕組織は、外科的方法、化学的方法、切除方法、または医療分野において知られている他の方法によって、必要に応じて除去される。デザイナーＢＭＰが次に、外科的移植または注入によって、無菌の生体適合組成物の一部として、組織部位に直接的に提供され得る。あるいは、修飾されたＢＭＰによって刺激された前駆細胞を含有する無菌の生体適合組成物が、組織部位に提供され得る。罹患しているかまたは損傷している、その部位で既存の組織は、前駆細胞の増殖および組織特異的な分化を可能にするための適切なマトリクスを提供する。さらに、損傷しているかまたは罹患している組織部位、特に外科的手段によってさらに傷んでいる組織部位は、モルフォゲン許容状態の環境を提供する。一部の組織では、修飾されたＢＭＰの全身的な提供が十分であろうことが予想される。
【０２７０】
デザイナーＢＭＰは、損傷後の瘢痕組織の形成を予防するかまたは実質的に阻害するために用いることができる。デザイナーＢＭＰが新たに損傷した組織部位に提供されると、デザイナーＢＭＰは、その部位で組織の形態形成を誘発し得、未分化結合組織への移動性線維芽細胞の凝集を予防する。デザイナーＢＭＰは、好ましくは、損傷の５時間以内に無菌の医薬調製物として組織部位内に注入される。
【０２７１】
例えば、デザイナーＢＭＰは、部分的な肝切除の後の実質的に損傷した肝臓組織のタンパク質誘発性の形態形成のために用いることができる。この一般的なプロトコルの変型を、他の組織に用いることができる。一般的な方法は、組織の基本的に再生しない部分を切除し、修飾されたＢＭＰを好ましくは可溶性医薬調製物として、切除された組織部位に提供し、創傷を閉じ、後にその部位を試験することを伴う。骨のように、肝臓は、胎児後の損傷の際に再生する能力を有する。
【０２７２】
別の実施例として、デザイナーＢＭＰはまた、象牙質形成を誘発するために用いることができる。これまで、損傷に対する歯髄組織の予測不可能な応答は、歯科における基本的な臨床的問題である。標準的な歯科的外科的手順を用いて、小さい領域（例えば２ｍｍ）の歯髄を、試料歯の髄質の真上のエナメルおよび象牙質を除去することによって（穿孔によって）外科的に露出させ、歯冠歯髄組織の部分的な切断を行い、止血を誘発し、髄質治療を行い、標準的な手順によって虫歯を密封し詰め物を行うことができる。
【０２７３】
本発明のデザイナーＢＭＰは、線維症を治療するために用いることができる。線維症は、身体の様々な部分に位置し得、また特定の種類のものであり得、例えば、線維症は、腎臓、例えば、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、同種移植拒絶反応、およびＨＩＶ腎症において観察されるような線維症において位置し得、肝臓、例えば、肝硬変および静脈閉塞性疾患において位置し得、肺、例えば、特発性線維症（および自己免疫線維症）において位置し得、皮膚、例えば、全身性硬化症、ケロイド、瘢痕、および好酸球増加症筋痛症候群において位置し得、中枢神経系、例えば眼内線維症において位置し得、心血管系、例えば血管再狭窄において位置し得、鼻、例えば鼻ポリープにおいて位置し得、骨または骨髄において位置し得、内分泌器官において位置し得、また胃腸系において位置し得る、
【０２７４】
１つの実施形態において、ＢＭＰ７の結合特徴を有するデザイナーＢＭＰ、またはその有用な修飾（半減期の延長、野生型ＢＭＰ７と比較して同一のまたは異なる受容体に対する結合親和性の増大、限定はしないがＮｏｇｇｉｎなどのＢＭＰ７アンタゴニストによる阻害に対する耐性）は、線維症を治療、改善、または解消させるために有用であり得る。すなわち、Ｗｅｉｓｋｉｒｃｈｅｎら、２００９、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉ．１４：４９９２〜５０１２において最近概説されているように、ＴＧＦβ１は、限定はしないが上皮から間葉への移行を含む、線維症の増大をもたらすカスケードを仲介する。ＴＧＦβ１の線維症誘発性の影響は、ＢＭＰ７によって阻害または逆転され得る。同様に、Ｌｏｕｒｅｉｒｏら、２０１０、Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２５：１０９８〜１１０８を参照されたい。さらに、特定の線維性症状はまた、ＢＭＰ４の投与によって治療または改善され得る（Ｐｅｇｏｒｉｅｒら、２０１０、Ｒｅｓｐ．Ｒｅｓ．１１：８５を参照されたい）。したがって、本発明は、受容体の結合を変化させて、その必要がある患者における線維症を治療するための潜在的な有用な治療薬を提供するために、ＢＭＰ７フレームワーク、ならびに／または本明細書のあらゆる箇所で開示されているＩ型およびＩＩ型突然変異を組み込むことに基づく、デザイナーＢＭＰを包含する。
【０２７５】
線維性障害は、多くの原因によって誘発され得、これらの原因には、化学療法、例えば、ブレオマイシン、クロラムブシル、シクロホスファミド、メトトレキサート、ムスチン、またはプロカルバジン治療の結果生じる肺の線維症；偶発的なまたは放射線照射療法におけるように目的のある、放射線照射への曝露、例えば、放射線照射の結果生じる間質性肺疾患（ＩＬＤ）；環境因子もしくは産業因子、または化学物質、煙、金属、蒸気、ガスなどの汚染物質、例えば、アスベストまたは炭塵から生じるＩＬＤ；薬剤または薬剤の組み合わせ（例えば、抗生物質（例えば、ペニシリン、スルホンアミドなど）、心血管薬（例えば、ヒドララジン、ベータ遮断薬など）、ＣＮＳ薬（フェニトイン、クロルプロマジンなど）、抗炎症薬（例えば、金塩、フェニルブタゾンなど）などがＩＬＤを生じさせ得る）；免疫反応障害、例えば、真皮線維症を伴う慢性的な移植片対宿主疾患；ＩＬＤの既知の原因である誤嚥性肺炎などの病状、および寄生体誘発性の線維症；ならびに創傷、例えば、ＣＮＳの穿通性損傷におけるものなどの、鈍的外傷、外科的切開、戦場での創傷などが含まれる。
【０２７６】
特定の実施形態において、ＢＭＰＥなどの、Ｉ型受容体ＡＬＫ２への結合が向上しているデザイナーＢＭＰを、ＡＬＫ２に関連する疾患を治療するために用いることができる。
【０２７７】
キット
本発明は、治療有効量の本発明のデザイナーＢＭＰを、アプリケーターおよび本発明の方法を実施するためのデザイナーＢＭＰの使用を説明する教材と共に含む、様々なキットを含む。典型的なキットが以下に記載されるが、他の有用なキットの内容物は、本開示に照らして当業者に明らかとなろう。これらのキットのそれぞれは、本発明に含まれる。
【０２７８】
本発明は、その必要がある患者における代謝性骨疾患における骨量の減少を予防するためおよび／または骨量を増大させるための治療のためのキットを含む。キットは、本発明のデザイナーＢＭＰを含む。キットはさらに、キットの成分を患者に投与するための、限定はしないがシリンジ、骨セメント混合装置などを含む、アプリケーターを含む。さらに、キットは、患者における骨量を治療もしくは予防するためおよび／または骨量を増大させるためのキットの使用のための情報を患者に説明する教材を含む。
【０２７９】
さらに好ましくは、キットは、配列番号８〜７３のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する抗体から選択される少なくとも１つのデザイナーＢＭＰを含み、さらに好ましくは、デザイナーＢＭＰは、配列番号１２、配列番号１４、配列番号３６、および配列番号３７のアミノ酸配列を含む。好ましくは、デザイナーＢＭＰは、ＢＭＰＥ、ＢＭＰＧ、ＢＭＰＧＥ、およびＢＭＰＧＥＲである。
【０２８０】
キットは、骨量減少を予防するためおよび／または骨量を増大させるための治療のための任意の数のさらなる治療物質を含み得る。このような物質は、先に記載されており、その他多数のなかでも、治療用化合物、サイトカイン、ビタミン、ＴＧＦβスーパーファミリーの他のメンバーを含む。
【０２８１】
本発明はまた、骨量減少を予防するためおよび／または骨量を増大させるために有効な量（例えば、１０ｍｇ／ｋｇ超、少なくとも１５ｍｇ／ｋｇ、または１５ｍｇ／ｋｇ）のデザイナーＢＭＰを含む製品（例えば、ｉ．ｖ．投与または経口投与に適合した投与形態）に関する。特定の実施形態において、製品は、デザイナーＢＭＰを含む１つまたは複数の容器、ならびに骨量減少を治療もしくは予防するためおよび／または骨量を増大させるために用いるためのラベルおよび／または指示を含む。
【０２８２】
本発明はまた、その必要がある患者における組織または器官における線維症を治療または予防するためのキットを含む。キットは、本発明のデザイナーＢＭＰを含む。キットはさらに、キットの成分を患者に投与するための、限定はしないがシリンジまたはタンパク質を送達するための装置、混合装置などを含む、アプリケーターを含む。さらに、キットは、患者における線維症を治療または予防するためのキットの使用のための情報を患者に説明する教材を含む。
【０２８３】
さらに好ましくは、キットは、配列番号８〜７３のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質から選択される少なくとも１つのデザイナーＢＭＰを含み、さらに好ましくは、デザイナーＢＭＰは、配列番号１２、配列番号１４、配列番号３６、および配列番号３７のアミノ酸配列を含む。好ましくは、デザイナーＢＭＰは、ＢＭＰＥ、ＢＭＰＧ、ＢＭＰＧＥ、またはＢＭＰＧＥＲである。
【０２８４】
キットは、骨量減少を予防するためおよび／もしくは骨量を増大させるため、または線維症を治療もしくは予防するための治療のための任意の数のさらなる治療物質を含み得る。このような物質は、先に記載されており、その他多数のなかでも、治療用化合物、サイトカイン、ビタミン、ＴＧＦβスーパーファミリーの他のメンバーを含む。
【０２８５】
本発明はまた、骨量減少を予防するためおよび／もしくは骨量を増大させるため、または線維症を治療もしくは予防するために有効な量（例えば、１ｍｇ／ｋｇ超、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１５ｍｇ／ｋｇ、または１５ｍｇ／ｋｇ）のデザイナーＢＭＰを含む製品（例えば、ｉ．ｖ．投与または経口投与に適合した投与形態）に関する。特定の実施形態において、製品は、デザイナーＢＭＰを含む１つまたは複数の容器、ならびに骨量減少を治療もしくは予防するためおよび／または骨量を増大させるため、あるいは線維症を治療または予防するために用いるためのラベルおよび／または指示を含む。
【０２８６】
本発明は、以下の実験的実施例を参照することによって、さらに詳細に記載される。これらの実施例は、説明のみを目的として提供されており、別段の特定がない限り、限定するためものものではない。したがって、本発明は、以下の実施例に限定されるものと解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書において提供される教示の結果明らかとなる、任意のおよび全ての変型を包含すると解釈されるべきである。
【実施例】
【０２８７】
（実施例１）
デザイナーＢＭＰタンパク質の産生および精製
哺乳動物細胞培養物を用いる産生
野生型ＢＭＰおよびデザイナーＢＭＰを産生および分泌する組換え宿主ＣＨＯ細胞を、標準的な組換えＤＮＡ手順を用いて生成した。馴化培地を、接着細胞培養物から生成した。簡潔に述べると、ＣＨＯ細胞を、１０％ｄＦＢＳを含有する培地に播種し、３〜４日間にわたりコンフルエンスに近くなるまで成長させた。この成長相の後、成長培地を廃棄し、細胞をＰＢＳ−ＣＭＦで１回すすぎ、その後、２００ｕｇ／ｍｌの硫酸デキストラン、２ｍＭの酪酸ナトリウム、および１０ｍＭのＨＥＰＥＳを補った無血清培地に交換した。細胞を次に、３１℃の温度で７日間にわたり培養した。馴化培地を採取し、０．２ｕＭの滅菌濾過を用いて澄明化した。馴化培地を、精製まで−２０℃で保管した。
【０２８８】
デザイナーＢＭＰの精製
ＣＨＯ細胞馴化培地から新たなデザイナーＢＭＰ分子を精製するために、ＢＭＰを、２つのステップからなる従来のクロマトグラフィーによって捕捉し、結果を、パネルＡ〜Ｄを含む図５に示す。他の新たなデザイナーＢＭＰの全てが基本的に類似の様式で精製されたため、ＢＭＰＥの精製の詳細のみをここに示す。
【０２８９】
ＣＨＯ馴化培地（ＣＨＯ  ＣＭ）（ｐＨは、１．０ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）で８．０にｐＨ調整された）を、２０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ８．０）で平衡させたセルファインスルフェートカラム（６５ｍｌ、２．６×１２．３ｃｍ）にロードした。カラムを、１０カラム容積（ＣＶ）の２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１０ＣＶの５０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．６）、および１０ＣＶの緩衝液Ａ（６．０Ｍの尿素、５０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ５．６）で洗浄した。ＢＭＰを、５ＣＶを超える０〜１．０ＭのＮａＣｌ線形勾配で溶出した（緩衝液Ｂ＝６．０Ｍの尿素、５０ｍＭのＭＥＳ、１．０ＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．６）。塩化ナトリウム勾配を適用すると、ＢＭＰ２の特徴である伝導率３０と４５ｍＳ／ｃｍとの間の広いピークが観察された（図５Ａ）。画分を、クマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分析し、ＢＭＰ含有画分をプールした。画分内のＢＭＰを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ非還元ゲル上の還元性二量体として同定した（図５Ｂの左側のパネル）。セルファインスルフェートクロマトグラフィーステップから得られたＢＭＰプールをさらに、１０×２５０ｍｍのＶｙｄａｃ１５μｍ  Ｃ８カラム上で分取逆相ＨＰＬＣによって精製し（溶媒Ａ＝０．１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ＝９０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ）、ＢＭＰを、およそ３２％のアセトニトリルで溶出した。逆相クロマトグラフィーステップの軌跡を図５Ｃに示す。タンパク質を濃縮し、アセトニトリルを、ｓｐｅｅｄｖａｃを用いて除去し、濃縮物を、透析を介してＭＦＲ−１６９緩衝液内に製剤した。精製されたＢＭＰを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ａ２８０、およびＬＡＬアッセイによって特徴付けした（エンドトキシン）。同一のゲル画分（Ｆ１３〜Ｆ１８）を示す非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（図５Ｄの左側）および還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（図５Ｄの右側）の写真を示す。全部で１６個のＢＭＰデザイナータンパク質を、基本的に同一のレベルの純度、およびＣＭ１Ｌ当たり０．３〜１．４ｍｇの発現／精製の収量まで精製し、結果を、写真を示す図６に示す（図６）。簡潔に述べると、野生型ＢＭＰ２（ＷＴ）、ならびにデザイナーＢＭＰであるＢＭＰＳＥ、ＢＭＰＥ、Ｅ１０９Ｒ、ＢＭＰＤ、ＢＭＰ  Ｓ８５Ｒ、ＢＭＰ  ＳＮＥ、ＢＭＰＢ、およびＢＭＰ−ＥＮを、非還元型ゲル（図６Ａ）および還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図６Ｂ）の写真に示し、デザイナーＢＭＰ  ａｉ（ＢＭＰＡの変異体）、ａｉｉ（ＢＭＰＡの変異体）、ｃ（ＢＭＰＣ）、ｈｉ（ＢＭＰＩの変異体）、ｈｉｉ、ｉ、ｆ、およびｇを、非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図６Ｃ）および還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図６Ｄ）の写真に示す。
【０２９０】
（実施例２）
インビトロおよびインビボでのアッセイを用いて実証されたデザイナーＢＭＰの骨形成活性
アルカリホスファターゼアッセイ
９６ウェルプレート内のウェル当たりおよそ８０００個のＣ２Ｃ１２細胞を、示されたＢＭＰおよび示された用量で処理した。処理の２４時間後、プレートを、アルカリホスファターゼを測定するために処理し、これは、骨形成活性についての当技術分野において認識されているアッセイである。培養培地を除去し、プレートを、カルシウム／マグネシウムを有さないＰＢＳで２回洗浄した。５０μｌの４−リン酸メチルウンベリフェリル（４−ＭＵＰ液体アルカリホスファターゼ基質；Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｍ３１６８）を各ウェルに添加し、プレートを、暗所で、３７℃で１５分間にわたりインキュベートした。蛍光を、Ｖｉｃｔｏｒルミノメーター（設定：３５５ｎＭでの励起、４６０ｎＭでの発光、１１２０のＣＷランプエネルギー）で、ウェル当たり１秒測定した。読み取りが完了した後、５０μｌの２×タンパク質アッセイ溶解緩衝液（２００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．８）／０．４％トリトンＸ−１００）を各ウェルに添加し、タンパク質濃度を、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を製造者のマイクロプレート手順に従って用いて決定した。アルカリホスファターゼの測定値を次に、全タンパク質濃度に対して正規化した（すなわち、タンパク質１マイクログラム当たりの蛍光分析単位）。図７におけるグラフによって示されるように、複数のデザイナーＢＭＰ分子で処理されたＣ２Ｃ１２の筋肉の前筋芽細胞は、野生型ＢＭＰ２（小さい丸を有する太線）での処理と比較して、骨芽細胞の分化のマーカーであるアルカリホスファターゼ活性の有意な増大を示した。ＷＴ  ＢＭＰ２と比較して増大したＡＰ活性を示すデザイナーＢＭＰには、デザイナーＢＭＰＡ、デザイナーＢＭＰＦ、デザイナーＢＭＰＧ、およびデザイナーＢＭＰＥが含まれた。驚くべきことに、デザイナーＢＭＰＥは、ＢＭＰ２のＩ型受容体およびＢＭＰ６のＩＩ型受容体の両方と高い親和性で結合することが知られている野生型ＢＭＰ２／６ヘテロ二量体（四角を有する太線）のものと同等の活性を実証した。デザイナーＢＭＰＥは、ＢＭＰ２への、低い親和性のＢＭＰ６のＩ型結合領域の導入の結果である。ＢＭＰＥはＩ型受容体およびＩＩ型受容体の両方に対して低い親和性の結合を有すると予測されたため、デザイナーＢＭＰＥ分子の非常に高い活性は、非常に驚くべきことであった。興味深いことに、他のデザイナーＢＭＰ分子、すなわちデザイナーＢＭＰＡ、デザイナーＢＭＰＦ、およびデザイナーＢＭＰＧは、ＢＭＰ２に導入された、ＢＭＰ６のＩＩ型（高親和性）受容体に結合する野生型ＢＭＰ６の領域を有し（図１Ｂを参照されたい）、これらのデザイナーＢＭＰは、ＢＭＰ２と比較して増大した活性を示したが、野生型ＢＭＰ２／６ヘテロ二量体ほど高くはなかった（図７）。
【０２９１】
ＢＲＥ−ルシフェラーゼアッセイ
ＢＭＰ応答エレメントであるルシフェラーゼレポーター（エレメントは、Ｉｄ１プロモーターに由来する）を安定的に発現するＣ２Ｃ１２細胞を、９６ウェルのウェル当たり８０００個細胞で平板培養し、示されたＢＭＰおよび用量で処理した。処理の４８時間後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｄｕａｌ−Ｇｌｏアッセイキットを用いて読み取った。
【０２９２】
本明細書において開示されているデータは、ＢＭＰＥの活性が、アルカリホスファターゼアッセイにおいてＢＭＰ−２／６の活性に同等なだけではなく、図８において示されるように、Ｃ２Ｃ１２細胞におけるＢＲＥ−ルシフェラーゼアッセイにおいても同等であることを実証した。さらに、ＢＭＰＥは、ＢＲＥ−ルシフェラーゼアッセイにおいて、野生型ＢＭＰ−２と比較しておよそ１０〜２０倍優れた活性を実証した（図８）。したがって、ＢＲＥ−ルシフェラーゼ（ＢＲＥ−ｌｕｃ）アッセイにおいて観察された結果は、この同一の細胞型におけるアルカリホスファターゼ（Ａｌｋ−ｐｈｏｓ）活性アッセイにおいて得られた結果と強く相関した（図７および図８を比較されたい）。Ａｌｋ−ｐｈｏｓアッセイおよびＢＲＥ−ｌｕｃアッセイの両方から得られた結果はまた、野生型ＢＭＰ２および示されたデザイナーＢＭＰについて、表１０に示す。
【０２９３】
いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、これらのデータは、ＢＭＰＥに対する高親和性受容体としてのＡＬＫ−２の付加が、その骨形成活性の増大の理由であり得ることを示唆する。これは、ＡＬＫ−２突然変異が、幼児が不適切な異所性骨形成を発症する疾患である進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）の原因であることが明らかにされているためである。したがって、ＡＬＫ−２の結合の突然変異は、骨形成の増大と関連し、ＢＭＰＥの骨形成活性の増大と相関し得る。したがって、ＢＭＰＥは、Ｉ型受容体ＡＬＫ−２、３、および６に対する高い親和性を有する、新たなクラスのＢＭＰ分子である。
【０２９４】
細胞の石灰化についてのアリザリンレッド染色
Ｃ２Ｃ１２細胞を、６ウェル組織培養プレート内で４×１０４個細胞／ｃｍ２の密度で平板培養し、５％ＣＯ２／９５％加湿空気のインキュベーター内で３７℃で一晩インキュベートした。回収期間の後、培養培地を、新たに調製した骨形成分化培地、すなわち、５０ｕｇ／ｍｌのＬ−アスコルビン酸リン酸エステル（Ｌ−アスコルビン酸リン酸マグネシウム塩のｎ水和物、和光純薬工業株式会社、カタログ番号０１３−１２０６１）、β−グリセロールリン酸（β−グリセロールリン酸二ナトリウム塩、１０ｍＭの五水和物、Ｆｌｕｋａ  ＢｉｏＣｈｅｍｉｃａカタログ番号５００２０）、および１００ｎＭのメナジオン亜硫酸水素ナトリウム（ビタミンＫ３、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｍ２５１８）を含有する成長培地で置き換えた。示されたＢＭＰを所望の濃度で適切なウェルに添加した。プレートを、２〜３日ごとに培地を置き換えながら、３７℃でおよそ１５日間にわたりインキュベートした。細胞を、標準的な公開されたプロトコルに従って、アリザリンレッド染色で染色した。
【０２９５】
以下の表９において示されるように、デザイナーＢＭＰＥは、アリザリンレッド染色によって示されるように、対応する野生型ＢＭＰ２よりもかなり大きな程度で、Ｃ３Ｈ１０Ｔ−１／２マウス間葉系幹細胞の石灰化を誘発した。すなわち、以下でさらに完全に論じられるように、全て表９において示されるように、野生型ＢＭＰ−２がＣ３Ｈ１０Ｔ−１／２細胞の石灰化を誘発し得なかった用量（５、２５、５０、および１００ｎｇ／ｍｌ）で、ＢＭＰＥホモ二量体は、ＢＭＰ−２／６ヘテロ二量体の石灰化に類似した強力な石灰化を誘発した。したがって、アリザリンレッド染色アッセイの結果はさらに、本明細書において先に開示された、Ａｌｋ−ｐｈｏｓアッセイおよびＢＲＥ−ｌｕｃアッセイにおいて得られた結果と相関する。
【０２９６】
【表１０】
0005985480.tif 000037
【０２９７】
ラットの筋肉内の異所性骨アッセイ
デザイナーＢＭＰによるインビトロで観察されたさらに強力な骨形成活性が、インビボでの同様の増大した活性に対応したかどうかを決定するために、ラットの異所性骨形成アッセイを行った。簡潔に述べると、１６０マイクロリットルの緩衝液内の示された総量のデザイナーＢＭＰを含浸させたＡＣＳ（吸収可能なコラーゲンスポンジ）を、８週齢のオスのＬｏｎｇ  Ｅｖａｎｓラットのハムストリング筋内に移植した。さらに具体的には、３つの８ｍｍの生検パンチしたＡＣＳディスクを、再吸収不可能な絹の縫合糸で共に縫合した。スポンジを、図９のチャートにおいて示されるＢＭＰの量（すなわち、０．１μｇまたは０．５μｇ）を含有する１６０マイクロリットルのＢＭＰ溶液で湿らせた。湿らせたスポンジを、室温で２０分間にわたり平衡させた。スポンジを次に、各ラットのハムストリング筋内に左右対称に外科的に置いた。各ＢＭＰ（野生型分子およびデザイナー分子）を、４頭のラットの両肢内に置いた。移植の２週間後、動物を屠殺し、ハムストリング筋を解剖し、１０％ホルマリン内に置き、μＣＴ（Ｓｃａｎｃｏ  Ｉｎｃ．）によってスキャンして、存在する異所性の骨の量を決定した。処理された動物の肢内に存在する、ミリグラム表示のヒドロキシアパタイトの量（ｍｇＨＡ）を、図９に示す。図９Ａは、ＢＭＰ２、ＢＭＰＥ、およびＢＭＰ２／６ヘテロ二量体の結果を示す。図９Ｂは、ＢＭＰ２、ＢＭＰＧ、ＢＭＰＡ、およびＢＭＰＦの結果を示す。デザイナーＢＭＰのそれぞれについて、異所性の骨は、野生型ＢＭＰ２が検出可能な骨量を形成し得なかった用量で、形成された。野生型ＢＭＰ２とデザイナーとの１対１の比較において、ＢＭＰＥは、野生型ＢＭＰ２／６ヘテロ二量体と同程度まで異所性の骨を誘発し得、これは、先に開示されたインビトロでの実験で得られた結果をほぼ適合している。デザイナーＢＭＰであるＢＭＰＧ、ＢＭＰＡ、およびＢＭＰＦはまた、野生型ＢＭＰ２と比較して有意に高い異所性骨形成を実証した（図９Ｂ）。このアッセイから得られる結果を図９に示し、また表１０に示す。
【０２９８】
【表１１】
0005985480.tif 000038
【０２９９】
（実施例３）
ＢＭＰ受容体の結合
デザイナーＢＭＰの骨形成活性の増大のメカニズムをさらに解明するために、ＢＭＰ受容体のパネルでの各デザイナーＢＭＰの結合動態分析を、Ｏｃｔｅｔシステム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）を用いて行った。Ｏｃｔｅｔ  ＱＫ分析を、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＴＢＳ内で度で行った。試料を、１０００ｒｐｍで撹拌した。抗ヒトＩｇＧのＯｃｔｅｔチップを、１０ｕｇ／ｍＬの各受容体−ヒトＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質で２０分間にわたり飽和させ、この結果、典型的には、一列に並んだ８個のチップ内で飽和した、受容体の捕捉レベルとなった。各ＢＭＰを、７倍連続希釈物（典型的には２００〜３ｎＭを１組ずつ）および緩衝液ブランクとして調製した。各受容体／ＢＭＰ結合対を、少なくとも２組ずつランした。会合を１０分間にわたりモニタリングし、解離を、緩衝液単独内で３０にわたって追跡した。動態パラメータ（ｋｏｎおよびｋｏｆｆ）および親和性（ＫＤ）を、部分的結合１：１モデルを用いるＯｃｔｅｔデータ分析ソフトウェア６．０を製造者の指示に従って用いて計算した。
【０３００】
表１２において示されるデータは、野生型ＢＭＰ２タンパク質およびＢＭＰ６タンパク質がそれぞれ、それぞれＩ型受容体（ＡＬＫ−３およびＡＬＫ−６）およびＩＩ型受容体（ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＢＭＰＲＩＩ）に対する予想される高い親和性の結合を実証したことを示す。野生型ＢＭＰ２／６ヘテロ二量体は、ＢＭＰ２のＩＩ型結合ドメインＡおよびＢが野生型ＢＭＰ６のドメインで置き換えられているデザイナーＢＭＰＧがそうであったように、Ｉ型およびＩＩ型受容体の両グループに対する高い親和性の結合を示した。デザイナーＢＭＰＥは、ＩＩ型結合領域において突然変異が生じなかったため、予想通り、ＩＩ型受容体に対する、野生型ＢＭＰ２と同様の親和性を示した。予想外に、デザイナーＢＭＰＥは、ＢＭＰ６のＩ型結合ドメインがＢＭＰ２のＩ型結合ドメインで置換されたＩ型受容体ＡＬＫ−３およびＡＬＫ−６に対する、高い親和性の結合を維持し、一方、同様に予想外に、２ｎｍのＫＤでＩ型受容体ＡＬＫ−２に結合した。したがって、ＢＭＰＥは、驚くべきことに、ＷＴ  ＢＭＰ２でもＷＴ  ＢＭＰ６でも観察されなかった、ＡＬＫ−２に対する非常に高い親和性の結合を獲得した。
【０３０１】
【表１２】
0005985480.tif 000039
【０３０２】
表１３において示されるように、配列番号１で示される野生型ＢＭＰ２のアミノ酸配列に関してアミノ酸残基３６（Ｐ３６Ｒ）でプロリンまたはアルギニンを含むＢＭＰＧおよびＢＭＰＥの突然変異を組み合わせて、それぞれＢＭＰ−ＧＥＰ（ＢＭＰＧＥ  Ｐ３６とも呼ばれる）およびＢＭＰ−ＧＥＲ（ＢＭＰＧＥ  Ｐ３６Ｒとも呼ばれる）を生じさせると、ＡＬＫ−２を含む全てのＩ型およびＩＩ型ＢＭＰ受容体で高い親和性、低いｎＭのＫＤを実証する、デザイナーＢＭＰが生じた。
【０３０３】
【表１３】
0005985480.tif 000040
【０３０４】
したがって、本明細書において開示されているデータは、ＢＭＰ−ＧおよびＢＭＰ−Ｅの特質を組み合わせており、その結果、限定はしないがＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ６、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＢＭＰＲＩＩＡを含む、Ｉ型受容体およびＩＩ型受容体の両方の広範なレパートリーに対する高い親和性の結合を実証する、限定はしないがＢＭＰ−ＧＥＲおよびＢＭＰ−ＧＥＰなどの、新たなデザイナーＢＭＰを実証する。データはさらに、ＷＴ  ＢＭＰ２のアミノ酸配列（配列番号１）の残基番号３６にあるプロリンをアルギニンに置き換えることによって、アミノ酸が置き換えられていないそれ以外は同一なＢＭＰと同程度に有効なデザイナーＢＭＰが生じることを実証した。ＢＭＰ−ＧＥＲによって例示されるこれらの新たな骨形成ＢＭＰによって、高レベルの生物学的活性がもたらされ、したがって、さらに低い投与、および一部のケースにおいてはさらに迅速な骨形成応答が可能になり、このことは、これらの分子が非常に有効な治療薬を提供することを強く示唆する。
【０３０５】
（実施例４）
非ヒト霊長類におけるインビボでの骨形成活性
ＮＨＰ腓骨の骨切りモデル
本発明の新たなデザイナーＢＭＰの潜在的な治療的能力をさらに評価するために、デザイナーＢＭＰＥおよびＢＭＰＧの活性を、ＮＨＰ（非ヒト霊長類）腓骨の骨切りモデルにおいて、野生型ＢＭＰ２の活性と比較した。
【０３０６】
腓骨の骨幹中央部の骨切りを、７．５±０．２ｋｇの平均体重（および標準偏差）および７〜１０歳の範囲の年齢を有する成体のオスのカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）において、１ｍｍの刃を有する振動ノコギリで左右対称に行った。髄内の小さなキルシュナー鋼線を、先に記載された腓骨の骨切りモデルに加えて、さらに均一な捻転性の生体力学的試験のために、近位および遠位の骨端の整列を維持した。このモデルの２つの主要な利点は、この手順による罹患率が低いことから左右対称の研究設計を利用し得ること、ならびに、動物を屠殺することなく、その後の生体力学的および組織学的な評価を行うために、骨切り部位を含む腓骨の６〜８ｃｍのセグメントを除去し得ることである。０．５ｍｇ／ｍｌの野生型ＢＭＰまたはデザイナーＢＭＰの５００μＬの溶液を、３０ｍｍ×１５ｍｍのＡＣＳスポンジに添加した。外科手術の後に、スポンジで欠損箇所の周りを覆った。骨格的に成熟したＮＨＰの各肢の腓骨のおよそ２ｍｍの骨折を、対側肢において、０．５ｍｇ／ｍｌ用量のデザイナーＢＭＰ分子（全部で２５０μｇが送達される）または同量の野生型ＢＭＰ２を含むＡＣＳスポンジで覆った。したがって、各動物には、一方の肢に野生型ＢＭＰを、対側肢にデザイナーＢＭＰを投与した。
【０３０７】
このモデルにおいて、デザイナーＢＭＰＥおよびＢＭＰＧを選択したが、それは、それぞれが、異なるクラスのデザイナー分子に相当するためである。デザイナーＢＭＰＧは、Ｉ型受容体およびＩＩ型受容体の両方に対して高い親和性を示し、一方、ＢＭＰＥは、高い親和性でのＩ型受容体ＡＬＫ−３およびＡＬＫ−６の結合に加えて、Ｉ型受容体ＡＬＫ−２に高い親和性で結合する。Ｘ線写真を２週間ごとに得て、各動物における、デザイナーＢＭＰ分子で処理された肢の治癒を、野生型ＢＭＰ２で処理された対側肢の治癒と比較した。図１０Ａ〜１０Ｃにおいて示されるように、各群から７頭の動物を含むデータは、野生型ＢＭＰ２で処理された肢において観察される骨形成と比較して、各デザイナーＢＭＰ（ＢＭＰＥは図１０Ａにおいて示され、ＢＭＰＧは図１０Ｂ〜１０Ｃにおいて示される）分子で処理された肢においてさらに早く、かつさらに確実に仮骨が形成されることを実証した。
【０３０８】
以下の表１４および１５は、野生型ＢＭＰ２で処理された肢とデザイナーＢＭＰＥで処理された肢との間で観察された骨量および骨容積の差の定量的評価を提供するデータを記載する。図１１において示されるように、ＢＭＰＥの投与によって、野生型ＢＭＰ２で処理された肢における骨容積の増大と比較すると、骨容積（ｍｍ３）が平均３３％増大した。このμＣＴ分析は、仮骨が存在する天然の骨の全てを含み、したがって、ＢＭＰ−Ｅは、同一の動物においてＢＭＰ−２よりもさらに堅固であった。
【０３０９】
【表１４】
0005985480.tif 000041
【０３１０】
【表１５】
0005985480.tif 000042
【０３１１】
野生型ＢＭＰ２に関してＰ３６のアルギニンでの置き換えは、ＢＭＰＧＥの活性に影響しなかった
配列番号１で示される野生型ＢＭＰ２のアミノ酸配列に関して位置３６にあるプロリンは、野生型ＢＭＰ２へのＮｏｇｇｉｎ耐性の付与および骨形成活性の増大の提供において重要であると考えられている（例えば、ＷＯ２００９／０８６１３１を参照されたい）。したがって、ＢＭＰＧＥの新たな活性に対する、保存されていないアミノ酸置換でのＰ３６の置き換えの影響を評価するために、ＢＭＰＧＥＰのＰ３６をアルギニンに突然変異させて、ＢＭＰＧＥＲを生じさせ、２つのデザイナー分子の骨形成活性をインビトロで評価した。図１２における本明細書において開示されているデータは、アルギニンでのＰ３６の置き換え（Ｐ３６Ｒ）が新たなＢＭＰ−ＧＥデザイナーＢＭＰの結合親和性に影響せず、ＢＭＰＧＥＰおよびＢＭＰＧＥＲの両方がＢＭＰ２／６ヘテロ二量体として活性であったことを実証する。
【０３１２】
ＢＭＰ−ＧＥＲは、ＢＭＰ２／６ヘテロ二量体に匹敵するインビボでの活性を有する
図１３および１４において示されるように、ラットの異所性実験は、全ての分子がＡＣＳスポンジ上に送達されると、非常に低い用量の０．２５ｕｇの全ＢＭＰで、異所性の骨の形成の促進について、ＢＭＰ−ＧＥＲがＢＭＰ−２／６と同程度に有効であることを示す。図１３は、異所性で形成されたＨＡのミリグラム数をμＣＴ分析によって定量した場合、ＢＭＰ−２／６およびＢＭＰ−ＧＥＲのみが、この低い用量でＢＭＰ−２よりも有意に活性であったが、ＢＭＰＥまたはＢＭＰＧではそうではなかったことを示す。
【０３１３】
同一の試料を脱塩し、骨形成について組織学によってスコア付けし（骨スコア）、これらの結果を図１４に示す。このスコアリング方法によって、０．２５ｕｇという低用量では、送達されたＢＭＰ−２は骨形成を有さず、ＢＭＰ−ＧＥＲおよび２／６は最高のスコアを有していた。ＢＭＰ−ＧおよびＢＭＰ−Ｅはまた、ＢＭＰ−２よりも有意に有効であったが、ＢＭＰ−ＧＥＲほどには活性ではなかった。
【０３１４】
骨形成および組織修復のインビボモデルにおけるＢＭＰ−ＧＥＲとＢＭＰ−２との比較
図１５および１６は、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−ＧＥＲの活性を比較する重篤なＮＨＰ腓骨切除モデルの結果を示す。このモデルにおいて、およそ４〜６ｍｍの幅を有する楔状をＮＨＰの各腓骨で除去し、その場所に戻し、チタン製のピンで留めた。欠損箇所を次に、０．５ｍｇ／ｍｌの用量の全部で２５０ｕｇのＢＭＰを含有するＡＣＳスポンジで覆った。各ＮＨＰにおいて、ＢＭＰ−２を一方の肢の中に置き、ＢＭＰ−ＧＥＲを対側肢の中に置いた。図１５Ａは、５週目に撮ったＸ線写真を示し、これは、６頭の動物のうち４頭における欠損を示している。ＢＭＰ−ＧＥＲの肢は、ＢＭＰ−２よりも有意に堅固な骨形成を示した。図１５Ｂ（図の下部のパネル）は、１０週目に屠殺した後の、同一の４頭の動物の腓骨のμＣＴ画像を示す。確認できるように、形成された骨の量は、ＢＭＰ２で処理された対側肢におけるよりもＢＭＰ−ＧＥＲの肢において非常に堅固である。
【０３１５】
図１６Ａ〜Ｃは、各動物の、ＢＭＰ−２で処理された肢とＢＭＰ−ＧＥＲで処理された肢とを比較する、強度、剛性、および仮骨の骨容積を比較する、これらの肢の分析を示す。平均で、ＢＭＰ−ＧＥＲで処理された肢は、反対側のＢＭＰ−２で処理された肢よりも、破損に２１％さらにトルクを要し（図１６Ａ）、２４％さらに剛性であり（図１６Ｂ）、仮骨は平均５５％大きかった（図１６Ｃ）。これらの比較の全ては、ペアワイズ分析によって０．０１未満のｐ値を有していた。これらのデータは、ＢＭＰ−ＧＥＲが同一の動物においてＢＭＰ−２よりも有意に早くかつ堅固に骨折の修復および骨形成を誘発したことを示す。
【０３１６】
ＢＭＰ−ＧＥＲは、３倍低い用量で、ＢＭＰ−２と同等にＮＨＰモデルにおいて骨形成を誘発した
ＮＨＰにおけるＢＭＰＥの骨形成の有効性をさらに評価するために、楔状欠損アッセイにおいて骨形成を誘発するＢＭＰＥの能力を、ＢＭＰ２の能力と比較した。図１７Ａ〜Ｃは、３頭の非ヒト霊長類における楔状欠損モデルを追跡した骨形成のＸ線写真を示し、ここで、リン酸カルシウムセメントベースの担体を用いて、１．５ｍｇ／ｍｌのＢＭＰ−２が一方の肢において用いられ、わずか０．５ｍｇ／ｍｌのＢＭＰ−ＧＥＲが他方の肢において用いられた。Ｘ線写真では、治癒および骨形成は、治療が高用量のＢＭＰ−２を用いるものであっても低容量のＢＭＰ−ＧＥＲを用いるものであっても、それぞれの動物で同等であった。したがって、用量の３分の１でも、ＢＭＰＥは骨形成の誘発においてＢＭＰ２に同等であり、このことは、このデザイナーＢＭＰの活性が野生型ＢＭＰ２と比較して大きく増大したことを実証する。
【０３１７】
（実施例５）
ＢＭＰの構造分析
ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−６の結晶化
それぞれ哺乳動物細胞において産生された、精製された、完全にグリコシル化された野生型ＢＭＰ２／６ヘテロ二量体、野生型ＢＭＰ２／２ホモ二量体、および野生型ＢＭＰ６／６ホモ二量体を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）内で６〜１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、結晶化を、１８℃で「ｍｏｓｑｕｉｔｏ」自動ロボットセットアップを用いて試みた（ＴＴＰ  ＬａｂＴｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）。最初の結晶化のヒットは各二量体で得られ、条件を、その後、回折の質が良好な結晶を得るために最適化した。
【０３１８】
野生型ＢＭＰ２／６、ＢＭＰ２／２、およびＢＭＰ６／６の結晶を、一時的に凍結防止し、液体窒素内で凍結し、その後、Ｘ線回折のデータをシンクロトロン源（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ  ＳＥＲ−ＣＡＴのＩＤビームライン）で回収した。データを処理し、プログラムＭｏｓｆｌｍ／Ｓｃａｌａを用いてスケーリングして、正確な結晶格子のタイプを推定し、データを組み込んだ／スケーリングした。分解能および単位格子パラメータを以下に列挙する：ＢＭＰ２／６は、非対称単位当たりヘテロ二量体のコピーを２つ有するＰ４３２１２の空間群に属し、これは、一方向に２．８Åまで回折し、他の２つの方向に３．０Åまで回折し、単位格子は、ａ＝ｂ＝１０５．２３Å、ｃ＝１８８．７３Å、α＝β＝γ＝９０°であった。ＢＭＰ２／２は、非対称単位当たりホモ二量体のコピーを２つ有するＰ３１の空間群に属し、これは２．７Åまで回折し、単位格子は、ａ＝ｂ＝６２．７４Å、ｃ＝１２６．３５Å、α＝β＝９０°、γ＝１２０°であった。ＢＭＰ６／６は、非対称単位当たりホモ二量体のコピーを１つ有するＰ３１２１の空間群に属し、これは、２．６Åまで回折し、単位格子は、ａ＝ｂ＝９７．４０Å、ｃ＝８５．６４Å、α＝β＝９０°、γ＝１２０°であった。ＢＭＰ２／６結晶の異方性回折の性質に起因して、データは、高分解能データの寄与を保つために、楕円状にトランケートされ、異方的にスケーリングされた。
【０３１９】
ＣＨＯのＢＭＰ２／６、ＢＭＰ２／２、およびＢＭＰ６／６の構造を、大腸菌ＢＭＰ２（ＰＤＢ受託：１ＲＥＷ）および大腸菌ＢＭＰ６（ＰＤＢ受託：２Ｒ５２）をサーチモデルとして用いて、プログラムＰｈａｓｅｒを用いる分子置き換え方法によって決定した。正確な分子置き換えの解を得、空間群を確認した後、Ｐｈａｓｅｒで計算された電子密度マップを用いて、サーチモデルの質を評価し、問題の領域（特に、Ｉ型およびＩＩ型受容体の結合を伴う区域）を、モデルのバイアスを避けるための再構築のために、オリジナルモデルから切り取った。
【０３２０】
構造モデルには、剛体としての精密化を行い、その後、模擬アニーリング、位置因子および温度因子の精密化を行った。切り取られた区域を、オミットマップを用いて再構築し、プロセスを、精密化が安定化するまで、ＴＬＳ精密化と共に反復した。最終的な精密化統計値は以下の通りである：ＢＭＰ２／６では、Ｒｗ／Ｒｆ＝０．２２３１／０．２７７５、結合のｒｍｓｄ＝０．００８、角度のｒｍｓｄ＝１．５４５；ＢＭＰ２／２では、Ｒｗ／Ｒｆ＝０．２１１４／０．２６５９、結合のｒｍｓｄ＝０．００５、角度のｒｍｓｄ＝０．９８２；ＢＭＰ６／６では、Ｒｗ／Ｒｆ＝０．２１７０／０．２５１０、結合のｒｍｓｄ＝０．００６、角度のｒｍｓｄ＝１．１８２。３つの構造全ては、Ｐｒｏｃｈｅｃｋの結果に基づいて、非常に良好な幾何学にある。
【０３２１】
ＣＨＯのＢＭＰ２／６の結晶構造は、広範なグリコシル化を明らかにした。特に、Ｉ型受容体の重要な結合モチーフである、ＣＨＯにより生産されるＢＭＰ２の前らせんループは、大腸菌により生産され再フォールディングされたＢＭＰ２の対応する領域と異なる。グリコシル化の存在下において、ＣＨＯのＢＭＰ２のループは、さらにらせん状である、細菌によって再フォールディングされたＢＭＰ２における同一の領域と比較した場合、固有に「ループ状の」立体構造を有する（Ｋｅｌｌｅｒら、Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １１：４８１〜４８８（２００４））。データは、図３Ａにおいて示されるように、ＣＨＯにより産生されるＢＭＰ２のＤ５３が受容体界面の方を指し、一方、Ｈ５４が受容体と反対の方を指すことを示した。大腸菌のＢＭＰ２において、Ｄ５３は受容体と反対の方を指し、Ｈ５４は受容体に向かって並んで（本明細書において「ヒスチジンドアストップ」と呼ばれる）、図３Ｂに示されるようにＢＭＰ２のＩ型受容体Ａｌｋ３上のプロリン残基（Ｐ４５）に重なっている（Ｈ５４は、あるいは、標識されたＨ３３６である）。いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、この重なりは、Ｉ型受容体が、大腸菌の再フォールディングしたＢＭＰ２に完全に結合することを防ぎ得、このことは、ＣＨＯのＢＭＰ２と比較して、大腸菌ＢＭＰ２の結合活性が低減していることを説明する。この構造的特徴は、図３Ａ〜Ｂにおいて記載されている。この図において、ヒスチジン５４（Ｈ５４）はＨ３３６と番号付けされており、アスパラギン５６（Ｎ５６）は標識されたＮ３３８であり、ＡＬＫ３のＰ４５は濃い灰色で示されている。
【０３２２】
図４において記載されているように、完全にグリコシル化されたＣＨＯのＢＭＰ６はまた、受容体結合部位を指すこの「ドアストップ」ヒスチジン残基を有する。このドアストップＨｉｓ構造モチーフは、ＢＭＰの間の共通の構造的特徴である（ＣＨＯのＢＭＰ２を除く）（例えば、Ｋｅｌｌｅｒら、Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １１：４８１〜８（２００４）；Ｋｏｔｚｓｃｈら、ＥＭＢＯ  Ｊ  ２８：９３７〜４７（２００９）を参照されたい）。いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、おそらく、ＣＨＯのＢＭＰ２の特定のグリカンは、アルギニン１６との広範な水素結合を介して連結している（「グリカンテザー」はまたＲ２９８とも呼ばれる）。このグリカンテザーは、図４Ａにおいて記載されており、グリカンとのその相互作用は、グリカンと本明細書においてＲ１６とも呼ばれるこのテザーＲ２９８との間の点線を用いて示されている。したがって、いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、グリカンテザーは、ＢＭＰ２分子の前らせんループの立体構造を安定化させるために役立ち得、その結果、ヒスチジンドアストップは、もし他の形で存在する場合、その代わりにＩ型受容体界面と反対の方に方向付けされ、それによって、リガンドが、ヒスチジンドアストップの存在下よりも優れた程度で受容体と接触することが可能になる。言い換えると、ＣＨＯのＢＭＰ２において観察されるようなヒスチジンドアストップの再方向付けは、グリカンテザリングの結果である可能性が最も高い。いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、本明細書において開示されているデータは、ヒスチジンドアストップが存在する場合、グリコシル化の不存在下でのドアストップの除去（すなわち、Ｈｉｓの方向を受容体界面と反対の方に変化させる突然変異を導入することによる）によって、Ｉ型受容体とのＢＭＰリガンドの結合が増大することを示唆する。
【０３２３】
ＢＭＰ２の低親和性のＩＩ型結合ドメインとＢＭＰ６のＩ型結合ドメインに類似している低親和性のＩ型結合ドメインとを含有するデザイナーＢＭＰＥは、（１）インビトロおよびインビボの両方でのアッセイにおける骨形成活性の増大、ならびに（２）低親和性のＩ型受容体結合ドメインの存在にも関わらず、Ｉ型受容体であるＡｌｋ２に結合する機能の予想外の獲得を有すること、を示す。いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、おそらく、この驚くべき発見は、ＢＭＰＥのＩ型受容体結合ドメインにおけるグリカン部分とＲ１６（「グリカンテザー」）との間で形成される複数の水素結合によって仲介される。このテザリング相互作用は、Ｈ５４（「ドアストップ」）を界面と離して置くことによってＡｌｋ２への適正な結合表面を有する、ＢＭＰＥ分子の前らせん領域での構造的再配置を仲介し得、それによって、ＢＭＰと受容体とのさらに密接な相互作用を可能にする。逆に、図４Ｂにおいて記載されるように、ＢＭＰＥのＩ型結合ドメインに類似している低親和性のＩ型結合ドメインも有するＢＭＰ６は、そのグリカン部分をテザリングするために必要なその「グリカンテザー」（Ｒ４１３）が、ＢＭＰＥテザー（Ｒ２９８／Ｒ１６）と比較して位置が変化しているため、Ａｌｋ２に結合しない。したがって、ＢＭＰ６において、グリカンはテザリングされておらず、ドアストップ（Ｈ４５４）は、リガンド−受容体の界面と離れて位置していない。「グリカンテザー」は、野生型のグリコシル化されたＢＭＰ２に固有の現象であることが分かり（ＣＨＯ細胞において生産されるＢＭＰ２によって例示されるように）、「グリカンテザー」を導入（または除去）することによるＢＭＰの前らせんループの構造的リモデリングを初めてここで用いて、他のＢＭＰのＩ型受容体結合能力を調節することができる。したがって、本明細書において提供される教示を今や有している当業者は、Ｈ５４を遠ざける突然変異を導入することによって、またはテザリングがＨ５４の移動を仲介するようにグリカンテザーに影響を与えることによって、ドアストップを受容体界面から離れて位置させるためにいかにしてＢＭＰを突然変異させるかを理解しており、また、これらの教示が、その受容体への結合が増大している（または、突然変異が、Ｈ５４をドアストップ位置に向かって動かすように導入されている場合には、低下している）ＢＭＰを設計するため、または機能獲得型突然変異を有するデザイナーＢＭＰを生成させて、それらが以前には結合しなかった新たな受容体にそれらが結合するようにするために用いられ得ることをさらに理解するであろう。以下にさらに完全に説明されるように、本発明は、改良された骨形成タンパク質を設計するためにいかにしてこの新たなドアストップ／テザー設計方法を用いるかを実証する。したがって、本発明は、変化した受容体結合を含む改良された骨形成タンパク質の合理的な設計のための新たな方法を提供する。
【０３２４】
何がＡＬＫ−２へのＢＭＰ−ＥおよびＢＭＰ−ＧＥＲの結合を推進するかをさらに完全に理解するために、ならびにドアストップ／グリカンテザーを用いて受容体結合に影響を与えることのこの新たなメカニズムをさらに解明するために、ＢＭＰ−Ｅの結晶構造を明らかにし、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−６の結晶構造と比較した。鍵となる構造的所見を図１８および１９に示す。図１８において記載されるように、ＢＭＰ−Ｅは、ＢＭＰ−６の中央らせん構造を維持しながら、ＢＭＰ−２の規則的な糖を維持する。図１８において示される構造は、ＢＭＰ−Ｅ、およびおそらくＢＭＰ−ＧＥＲが、Ｉ型受容体結合の重要な領域においてＢＭＰ−２およびＢＭＰ−６の両方と異なることを実証する。図１９は、ＢＭＰＥ（薄い灰色）およびＢＭＰ６（濃い灰色）の潜在的なＨｉｓドアストップを囲む領域を比較する拡大図である。この図は、両分子におけるヒスチジンおよびアスパラギンのアラインメントの類似性を実証し、またグリカンの位置付けの違いを示し、Ｒ１６（テザー）によるＢＭＰＥグリカンのテザリングを実証し、このテザリングによって、グリカンのさらに堅固な立体構造が生じ、その結果、分析によると、ＢＭＰ６（濃い灰色）に付与されるさらに短いグリカンと比較して、さらに長いグリカンがＢＭＰＥに付与される。
【０３２５】
ＢＭＰ−Ｅのグリカンが、ＡＬＫ−２との相互作用およびそのさらに高い活性を推進するかどうかを決定するために、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−６、およびＢＭＰ−ＥをＥｎｄｏ  Ｈで処理して、糖を２つのＧｌｃＮａｃ単位に切断した。Ａｌｋ−２に対するＢＭＰ−Ｅの結合親和性は４００ｎＭまで低下したが、ＡＬＫ−３およびＡＬＫ−６に対するその親和性は依然として３〜６ｎＭの範囲であり、このことは、無傷の炭水化物がこの相互作用に非常に重要であることを示す。この脱グリコシル化された突然変異体の活性もまた有意に低下した。図２０において示されているように、この実験において、Ｅｎｄｏ  Ｈで処理された脱グリコシル化されたＢＭＰ−Ｅの活性は右にシフトし、ＢＭＰ−６ＷＴにほとんど同等である。ＥＣ−５０は、３ｎＭからおよそ５０ｎＭにシフトする。これらのデータは、ＢＭＰ−Ｅの炭水化物がその活性に必須であり、これがＢＭＰ−ＧＥＲに変換されることを示し、それは、これが、フィンガードメインのみが異なるＢＭＰ−２に置換されたＢＭＰ−６の完全に同一の領域を有するためである。炭水化物は受容体結合および骨形成活性の増大に必須であるため、これらの結果は、大腸菌における、またはグリコシル化を欠く任意の他の系におけるＢＭＰ−ＥまたはＢＭＰ−ＧＥＲの産生が、ＢＭＰ−２ＷＴよりも優れた活性を有するＢＭＰを生じさせないことを示す。
【０３２６】
ＢＭＰ−ＥおよびＢＭＰ−ＧＥＲの結晶化
精製された、完全にグリコシル化されたＢＭＰ−Ｅを、２５mＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）内で８．７ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、結晶化を、１８℃で「ｍｏｓｑｕｉｔｏ」自動ロボットセットアップを用いて試みた（ＴＴＰ  ＬａｂＴｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）。最初の結晶化のヒットは各二量体で得られ、条件を、その後、回折の質が良好な結晶を得るために最適化した。
【０３２７】
ＢＭＰ−Ｅの結晶を、一時的に凍結防止し、液体窒素内で凍結し、その後、Ｘ線回折のデータをシンクロトロン源（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ  ＳＥＲ−ＣＡＴのＩＤビームライン）で回収した。データを処理し、ＣＣＰ４パッケージにおけるプログラムＭｏｓｆｌｍ／Ｓｃａｌａを用いてスケーリングして、正確な結晶格子のタイプを推定し、データを組み込んだ／スケーリングした。分解能および単位格子パラメータを以下に列挙する：ＢＭＰＥは、各非対称単位においてＢＭＰＥのコピーを２つ有するＰ４３２１２の空間群に属し、これは、２．７Åまで回折し、単位格子は、ａ＝ｂ＝６７．７８Å、ｃ＝１４８．０１Å、α＝β＝γ＝９０°であった。
【０３２８】
ＢＭＰＥの構造を、共にＰｆｉｚｅｒで決定された、完全にグリコシル化されたＣＨＯのＢＭＰ２およびＢＭＰ６をサーチモデルとして用いて、プログラムＰｈａｓｅｒを用いる分子置き換え方法によって決定した。正確な分子置き換えの解を得、空間群を確認した後、Ｐｈａｓｅｒで計算された電子密度マップを用いて、サーチモデルの質を評価し、問題の領域（特に、Ｉ型受容体の結合およびグリコシル化の周りの区域）を、モデルのバイアスを避けるための再構築のために、オリジナルモデルから切り取った。
【０３２９】
ＢＭＰＥの構造モデルは、剛体としての精密化を行い、その後、プログラムＰｈｅｎｉｘを用いて、模擬アニーリング、位置因子および温度因子の精密化を行った。切り取られた区域を、オミットマップを用いて再構築し、プロセスを、精密化が安定化するまで、ＴＬＳ精密化と共に反復した。最終的な精密化統計値は以下の通りである：Ｒｗ／Ｒｆ＝０．２２５２／０．２８４０、結合のｒｍｓｄ＝０．００６、角度のｒｍｓｄ＝０．９３５。構造は、Ｐｒｏｃｈｅｃｋの結果に基づいて、非常に良好な幾何学にある。
【０３３０】
ＢＭＰ２の残基４４〜８０がＢＭＰ６の対応する領域によって置き換えられているデザイナー分子であるＢＭＰＥは、ＢＭＰ６のＩ型受容体結合セグメントを有しながら、ＢＭＰ２の全体的なフレームワークを維持している。図２１において示されるように、結晶構造は、移植されたセグメントがＢＭＰ６におけるものと類似の立体構造を依然として保持し、前らせんループにおける小さならせんを形成し、その中で「ドアストップ」Ｈ５４が受容体の方を指していることを明らかにした。しかし、いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、おそらく、その両方ともが第３および第４のグリカン部分（それぞれ、β−マンノースおよびα−マンノース）との複数の水素結合を形成する、Ｒ１６およびＥ１１０＊（ＢＭＰ−２のＥ１０９）での「グリカンテザー」の存在に起因して、ＣＨＯのＢＭＰ２においてまさに見られるように、伸長したグリコシル化鎖がタンパク質表面に付着している。グリカン鎖のテザリングはまた、前らせんループを、フレームワーク全体に関して約２Å移動させた。いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、おそらく、驚くべきことに、ＢＭＰ２様のグリコシル化と組み合わされたＢＭＰ６様の前らせんループは、ＢＭＰ２またはＢＭＰ６と通常は相互作用しない、Ａｌｋ２受容体に対する結合エピトープを有する。脱グリコシル化によって、ＢＭＰＥは、Ａｌｋ２への結合が不可能になり、これは、ＢＭＰＥについてのＡｌｋ２認識の仲介におけるグリコシル化の重要性を浮き彫りにする。
【０３３１】
（実施例６）
Ｎｏｇｇｉｎ耐性
分泌されたＢＭＰ阻害剤Ｎｏｇｇｉｎに対する耐性がＢＭＰ−ＧＥＲまたはＢＭＰ−Ｅの活性を増大させるかどうかを調べるために、これらの潜在的な治療分子を、Ｎｏｇｇｉｎに対するそれらの耐性を潜在的に増大させるようにさらに修飾した。最近、大腸菌が産生したタンパク質において、野生型ＢＭＰ２へのアクチビン−ＡのＣ末端部分の組み込みが、Ｎｏｇｇｉｎ阻害に対する耐性を増大させることが実証された。ＷＯ２０１０／０９９２１９の例えば図１５および１６を参照されたい。したがって、本明細書において開示される新たなデザイナータンパク質が、アクチビン−Ａ配列の組み込みによってさらに改良され得るかどうかを決定するために、Ｎｏｇｇｉｎ耐性（ＮＲ）アミノ酸配列を、ＢＭＰ−Ｅ（配列番号１２）およびＢＭＰ−ＧＥＲ（配列番号３７）内に置換して、ＢＭＰ−Ｅ−ＮＲ（配列番号７０）およびＢＭＰ−ＧＥＲ−ＮＲ（配列番号７１）を生じさせた。図２２において示されるように、ＢＭＰ−Ｅ−ＮＲおよびＢＭＰ−ＧＥＲ−ＮＲは、ＢＭＰ−ＥおよびＢＭＰ−ＧＥＲと比較して、アルカリホスフェート活性アッセイにおいて同等のインビトロ活性を有し、Ｎｏｇｇｉｎに対して完全に耐性であるが、ＢＭＰ−ＥおよびＢＭＰ−ＧＥＲはＮｏｇｇｉｎに対して感受性である。
【０３３２】
ＢＭＰＥ−ＮＲおよびＢＭＰ−ＧＥＲ−ＮＲによってインビトロで実証されたＮｏｇｇｉｎ耐性についての潜在的な基礎を理解するために、ＩＩ型アクチビン受容体ＡｃｔＲＩＩＢに対するこれらの分子の結合親和性を評価した。以下の表１６において示されるように、アクチビン−Ａは、Ｎｏｇｇｉｎに結合し得ず、しかし、Ｎｏｇｇｉｎ耐性のＢＭＰ−Ｅ−ＮＲおよびＢＭＰ−ＧＥＲ−ＮＲはＮｏｇｇｉｎに結合するが、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−Ｅ、またはＢＭＰ−ＧＥＲほどには強力ではない。これらのデータはまた、Ｎｏｇｇｉｎ耐性のＢＭＰが、ＢＭＰ−ＧＥＲよりもさらに高い非常に高い親和性で、ＩＩ型ＢＭＰ受容体ＡｃｔＲＩＩＢに結合することを示す。いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、これらのデータは、ＢＭＰ−ＧＥＲ−ＮＲおよびＢＭＰ−Ｅ−ＮＲが、ＮｏｇｇｉｎよりもＢＭＰのＩＩ型受容体に対する親和性が非常に高いことに起因して、Ｎｏｇｇｉｎに対して耐性であり、したがって、大量のＮｏｇｇｉｎの存在下でさえもＢＭＰ受容体に結合し得ることを示唆する。
【０３３３】
【表１６】
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【０３３４】
アクチビン−ＡのＮｏｇｇｉｎ耐性部分を含むＢＭＰ−Ｅ分子およびＢＭＰ−ＧＥＲ分子はインビトロでのＮｏｇｇｉｎ耐性を実証したが、これらの結果は、インビボでの活性の向上に相関しなかった。すなわち、これらのＢＭＰ−Ｅ−ＮＲおよびＢＭＰ−ＧＥＲ−ＮＲの骨形成活性をラットの異所性アッセイにおけるＢＭＰ−ＥおよびＢＭＰ−ＧＥＲの骨形成活性と比較した場合、ＮＲ分子はあまり強力ではなかった。このデータを図２３および２４に示す。さらに具体的には、ＢＭＰ−ＧＥＲおよびＢＭＰ−ＧＥＲ−ＮＲについての骨スコアを比較し、試験した全ての濃度（０．１２５μｇ、０．２５μｇ、０．５μｇ、および１．０μｇ）で、ＢＭＰ−ＧＥＲは、図２３において示されるように、ＢＭＰ−ＧＥＲ−ＮＲよりも非常に優れていた。同様に、図２４は、ＢＭＰ−Ｅが、このインビボアッセイにおいて、ＢＭＰ−Ｅ−ＮＲと比較して非常に高い骨スコアを生じさせたことを実証する。したがって、ＢＭＰ−ＥおよびＢＭＰ−ＧＥＲの両方で、Ｎｏｇｇｉｎ耐性であると考えられている型は、そのＮＲ（Ｎｏｇｇｉｎ耐性）対応物よりもインビボであまり強力ではなく、ＢＭＰ−Ｅのケースでは、ほぼ全てのインビボ活性は、アクチビン−Ａの配列の組み込みに起因して失われた（ＢＭＰ−Ｅ−ＮＲとＢＭＰ−Ｅとを比較する図２４を参照されたい）。
【０３３５】
これらのデータは、Ｎｏｇｇｉｎ耐性を付与する可能性のある配列の組み込みを実証するが、特定のＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ）への結合の増大は、デザイナーＢＭＰのインビボでの骨形成活性を増大させなかった。
【０３３６】
さらに、Ｎｏｇｇｉｎの付加はインビボでのデザイナーＢＭＰの骨形成活性を向上させなかったが、実際は、それはそのインビボ活性を低下させると考えられ、本発明の新たなデザイナーＢＭＰは、野生型ＢＭＰと比較して骨形成の特徴の大きな増大を実証し、インビトロでのＮｏｇｇｉｎ耐性を実証しなくても、広範な用途のための潜在的な新たな治療方法を提供する。したがって、本発明のデザイナーＢＭＰは、他の使用の中でも骨の増生および修復のための、非常に向上した臨床的プロフィールを実証する、顕著な新たな潜在的治療薬を提供する。
【０３３７】
本明細書において引用されるそれぞれのおよび全ての特許、特許出願、および刊行物の開示は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３３８】
本発明は具体的な実施形態を参照して開示されているが、当然のことながら、本発明の他の実施形態および変形形態が、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく、当業者によって考えられ得る。添付の特許請求の範囲は、全てのこのような実施形態および同等の変形形態を含むと解釈されるものである。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕少なくとも１つのＩ型またはＩＩ型受容体結合ドメインにおいて少なくとも１つの突然変異を含むデザイナーＢＭＰタンパク質であって、突然変異が、対応する野生型ＢＭＰによるＩ型またはＩＩ型受容体に対する結合と比較してＩ型またはＩＩ型ＢＭＰ受容体に対する結合の変化を付与するデザイナーＢＭＰタンパク質。
〔２〕ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８、およびＢＭＰ９からなる群から選択される、前記〔１〕に記載のタンパク質。
〔３〕ａ．ＩＩ型結合ドメインＡ、
ｂ．ＩＩ型結合ドメインＢ、
ｃ．Ｉ型結合ドメイン、および
ｄ．上記の任意の組み合わせ
の中に、少なくとも１つの突然変異を含む、前記〔１〕に記載のタンパク質。
〔４〕少なくとも１つのＩ型またはＩＩ型受容体結合ドメインにおいて少なくとも１つの突然変異を含むアミノ酸配列を含むデザイナー骨形成タンパク質であって、突然変異が、野生型ＢＭＰ２によるＩ型またはＩＩ型受容体に対する結合と比較してＩ型またはＩＩ型ＢＭＰ受容体に対する結合の変化を付与するタンパク質。
〔５〕突然変異が、
ａ．配列番号１の配列に関してＶ３３、Ｐ３６、Ｈ３９、およびＦ４１での突然変異からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異である、ＩＩ型結合ドメインＡ内の突然変異、
ｂ．配列番号１に関してＶ３３Ｉ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｈ３９Ａ、およびＦ４１Ｎからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異である、ＩＩ型結合ドメインＡ内の突然変異、
ｃ．配列番号１の配列に関してＥ８３、Ｓ８５、Ｍ８９、Ｌ９２、Ｅ９４、Ｅ９６、Ｋ９７、およびＶ９９での突然変異からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異である、ＩＩ型結合ドメインＢ内の突然変異、
ｄ．配列番号１に関してＥ８３Ｋ、Ｓ８５Ｎ、Ｍ８９Ｖ、Ｌ９２Ｆ、Ｅ９４Ｄ、Ｅ９６Ｓ、Ｋ９７Ｎ、およびＶ９９Ｉからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異である、ＩＩ型結合ドメインＢ内の突然変異、
ｅ．配列番号１の配列に関してＨ４４、Ｐ４８、Ａ５２、Ｄ５３、Ｌ５５、Ｓ５７、Ｎ６８、Ｓ６９、Ｖ７０、Ｎ７１の後での単一アミノ酸の挿入、Ｓ７２、Ｋ７３、Ｉ７４、Ａ７７、およびＶ８０での突然変異からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異である、Ｉ型結合ドメイン内の突然変異、ならびに
ｆ．配列番号１の配列に関してＨ４４Ｄ、Ｐ４８Ｓ、Ａ５２Ｎ、Ｄ５３Ａ、Ｌ５５Ｍ、Ｓ５７Ａ、Ｎ６８Ｈ、Ｓ６９Ｌ、Ｖ７０Ｍ、Ｎ７１の後でのＰの挿入、Ｓ７２Ｅ、Ｋ７３Ｙ、Ｉ７４Ｖ、Ａ７７Ｐ、およびＶ８０Ａからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異である、Ｉ型結合ドメイン内の突然変異
からなる群から選択される、前記〔４〕に記載のタンパク質。
〔６〕ａ．配列番号１の配列に関してアミノ酸Ｈ４４、Ｐ４８、Ａ５２、Ｄ５３、Ｌ５５、Ｓ５７、Ｎ６８、Ｓ６９、Ｖ７０、Ｎ７１の後での単一アミノ酸の挿入、Ｓ７２、Ｋ７３、Ｉ７４、Ａ７７、およびＶ８０のそれぞれでの突然変異、
ｂ．突然変異が、Ｈ４４Ｄ、Ｐ４８Ｓ、Ａ５２Ｎ、Ｄ５３Ａ、Ｌ５５Ｍ、Ｓ５７Ａ、Ｎ６８Ｈ、Ｓ６９Ｌ、Ｖ７０Ｍ、Ｎ７１の後でのＰの挿入、Ｓ７２Ｅ、Ｋ７３Ｙ、Ｉ７４Ｖ、Ａ７７Ｐ、およびＶ８０Ａである、（ａ）のタンパク質、
ｃ．配列番号１の配列に関してアミノ酸Ｖ３３、Ｐ３６、Ｈ３９、Ｓ８５、Ｍ８９、Ｌ９２、Ｅ９４、Ｅ９６、Ｋ９７、およびＶ９９のそれぞれでの突然変異、
ｄ．突然変異が、Ｖ３３Ｉ、Ｐ３６Ｋ、Ｈ３９Ａ、Ｓ８５Ｎ、Ｍ８９、Ｌ９２Ｆ、Ｅ９４Ｄ、Ｅ９６Ｓ、Ｋ９７Ｎ、およびＶ９９Ｉである、（ｃ）のタンパク質、
ｅ．配列番号１の配列に関してアミノ酸Ｖ３３、Ｐ３６、Ｈ３９、Ｈ４４、Ｐ４８、Ａ５２、Ｄ５３、Ｌ５５、Ｓ５７、Ｎ６８、Ｓ６９、Ｖ７０、Ｎ７１の後での単一アミノ酸の挿入、Ｓ７２、Ｋ７３、Ｉ７４、Ａ７７、およびＶ８０、Ｓ８５、Ｍ８９、Ｌ９２、Ｅ９４、Ｅ９６、Ｋ９７、およびＶ９９のそれぞれでの突然変異、ならびに
ｆ．突然変異が、Ｖ３３Ｉ、Ｐ３６Ｋ、Ｈ３９Ａ、Ｈ４４Ｄ、Ｐ４８Ｓ、Ａ５２Ｎ、Ｄ５３Ａ、Ｌ５５Ｍ、Ｓ５７Ａ、Ｎ６８Ｈ、Ｓ６９Ｌ、Ｖ７０Ｍ、Ｎ７１の後でのＰの挿入、Ｓ７２Ｅ、Ｋ７３Ｙ、Ｉ７４Ｖ、Ａ７７Ｐ、およびＶ８０Ａ、Ｓ８５Ｎ、Ｍ８９、Ｌ９２Ｆ、Ｅ９４Ｄ、Ｅ９６Ｓ、Ｋ９７Ｎ、およびＶ９９Ｉである、（ｅ）のタンパク質、ならびに
ｇ．突然変異が、Ｖ３３Ｉ、Ｐ３６Ｒ、Ｈ３９Ａ、Ｈ４４Ｄ、Ｐ４８Ｓ、Ａ５２Ｎ、Ｄ５３Ａ、Ｌ５５Ｍ、Ｓ５７Ａ、Ｎ６８Ｈ、Ｓ６９Ｌ、Ｖ７０Ｍ、Ｎ７１の後でのＰの挿入、Ｓ７２Ｅ、Ｋ７３Ｙ、Ｉ７４Ｖ、Ａ７７Ｐ、およびＶ８０Ａ、Ｓ８５Ｎ、Ｍ８９、Ｌ９２Ｆ、Ｅ９４Ｄ、Ｅ９６Ｓ、Ｋ９７Ｎ、およびＶ９９Ｉである、（ｅ）のタンパク質
からなる群から選択される突然変異を含む、前記〔４〕に記載のタンパク質。
〔７〕ＡＬＫ２受容体に約２ｎＭ以下のＫＤで結合し、ＡＬＫ３受容体に約２ｎＭ以下のＫＤで結合し、ＡＬＫ６受容体に約１ｎＭ以下のＫＤで結合し、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体に約２ｎＭ以下のＫＤで結合し、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体に約０．５ｎＭ以下のＫＤで結合し、ＢＭＰＲＩＩＡ受容体に約３．５ｎＭ以下のＫＤで結合する、前記〔１〕に記載のタンパク質。
〔８〕Ｉ型またはＩＩ型の結合領域内に位置しない、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸突然変異をさらに含む、前記〔１〕に記載のタンパク質。
〔９〕配列番号８〜７３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むタンパク質から選択されるデザイナー骨形成タンパク質。
〔１０〕配列番号１２のアミノ酸配列を含む、デザイナー骨形成タンパク質。
〔１１〕配列番号１４のアミノ酸配列を含む、デザイナー骨形成タンパク質。
〔１２〕配列番号３６のアミノ酸配列を含む、デザイナー骨形成タンパク質。
〔１３〕配列番号３７のアミノ酸配列を含む、デザイナー骨形成タンパク質。
〔１４〕前記〔１〕に記載のタンパク質を産生する方法であって、タンパク質をコードする核酸を宿主細胞内に導入すること、細胞をタンパク質が産生される条件下で培養すること、およびタンパク質を精製することを含む方法。
〔１５〕前記核酸が、配列番号７４〜１３９のいずれか１つの核酸配列からなる群から選択される配列を含む、前記〔１４〕に記載の方法。
〔１６〕少なくとも１つのＩ型またはＩＩ型受容体結合ドメインにおいて少なくとも１つの突然変異を含むアミノ酸配列を含むデザイナーＢＭＰ６タンパク質であって、突然変異が、野生型ＢＭＰ６によるＩ型またはＩＩ型受容体に対する結合と比較してＩ型またはＩＩ型ＢＭＰ受容体に対する結合の変化を付与するデザイナーＢＭＰ６タンパク質。
〔１７〕突然変異が、
ａ．配列番号４の配列に関してＩ５７、Ｋ６０、Ｇ６１、Ａ６３、Ｎ６５、Ｙ６６、およびＤ６８での突然変異からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異である、ＩＩ型結合ドメインＡ内の突然変異、
ｂ．配列番号４の配列に関してＫ１０８、Ｎ１１０、Ａ１１１、Ｖ１１４、Ｆ１１７、Ｄ１１９、Ｎ１２０、Ｓ１２１、Ｎ１２２、Ｖ１２３、およびＩ１２４からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異である、ＩＩ型結合ドメインＢ内の突然変異、
ｃ．配列番号４の配列に関してＳ７２、Ｎ７６、Ａ７７、Ｈ７８、Ｍ７９、Ｎ８０、Ａ８１、Ｎ８３、Ｖ８７、Ｔ８９、Ｈ９２、Ｌ９３、Ｍ９４、Ｎ９５、Ｐ９６、Ｅ９７、Ｙ９８、Ｖ９９、およびＰ１００での突然変異からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異である、Ｉ型結合ドメイン内の突然変異、
ｄ．配列番号４の配列に関してアミノ酸残基Ｉ５７、Ｋ６０、Ｇ６１、Ａ６３、Ｎ６５、Ｙ６６、およびＤ６８のそれぞれでの突然変異、
ｅ．配列番号４のアミノ酸配列に関してアミノ酸残基Ｋ１０８、Ｎ１１０、Ａ１１１、Ｖ１１４、Ｆ１１７、Ｄ１１９、Ｎ１２０、Ｓ１２１、Ｎ１２２、Ｖ１２３、およびＩ１２４のそれぞれでの突然変異、ならびに
ｆ．配列番号４のアミノ酸配列に関してアミノ酸残基Ｓ７２、Ｎ７６、Ａ７７、Ｈ７８、Ｍ７９、Ｎ８０、Ａ８１、Ｎ８３、Ｖ８７、Ｔ８９、Ｈ９２、Ｌ９３、Ｍ９４、Ｎ９５、Ｐ９６、Ｅ９７、Ｙ９８、Ｖ９９、またはＰ１００のそれぞれでの突然変異、
からなる群から選択される、前記〔１６〕に記載のタンパク質。
〔１８〕Ｉ型またはＩＩ型の結合ドメイン内に位置しない、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸突然変異をさらに含む、前記〔１６〕に記載のタンパク質。
〔１９〕配列番号８〜７３からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
〔２０〕配列番号１２、配列番号１４、配列番号３６、および配列番号３７の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、前記〔１９〕に記載の核酸。
〔２１〕配列番号７４〜１３９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
〔２２〕配列番号７８、配列番号８０、配列番号１０２、および配列番号１０３の配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、前記〔２１〕に記載の核酸。
〔２３〕前記〔１６〕に記載のタンパク質を産生する方法であって、前記タンパク質をコードする核酸を宿主細胞内に導入すること、前記細胞を前記タンパク質が産生される条件下で培養すること、および前記タンパク質を精製することを含む方法。
〔２４〕その必要がある患者における骨量減少を伴う骨疾患を治療する方法であって、有効量の、前記〔１〕に記載のデザイナー骨形成タンパク質を前記患者に投与し、それによって前記患者における骨疾患を治療することを含む方法。
〔２５〕その必要がある患者における線維症を治療する方法であって、有効量の、前記〔１〕に記載のデザイナー骨形成タンパク質を前記患者に投与し、それによって線維症を治療することを含む方法。
〔２６〕組織における骨形成を誘発する方法であって、前記組織を、前記〔１〕に記載のデザイナー骨形成タンパク質と接触させ、それによって前記組織における骨形成を誘発することを含む方法。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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