(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヤブコウジ科（Ｍｙｒｓｉｎａｃｅａｅ）のヤブコウジ属マンリョウ（Ａｒｄｉｓｉａ ｃｒｅｎａｔａ Ｓｉｍｓ）の葉の抽出物を含有するコラーゲン産生促進剤の製造方法であって、
上記抽出物は、上記葉からエタノールの溶媒によって、７０ないし１００℃で３〜５時間かけて抽出して得たものであることを特徴とするコラーゲン産生促進剤の製造方法。
【請求項２】
ヤブコウジ科（Ｍｙｒｓｉｎａｃｅａｅ）のヤブコウジ属マンリョウ（Ａｒｄｉｓｉａ ｃｒｅｎａｔａ Ｓｉｍｓ）の葉の抽出物を含有するＭＭＰ−１阻害剤の製造方法であって、
上記抽出物は、上記葉からエタノールの溶媒によって、７０ないし１００℃で３〜５時間かけて抽出して得たものであることを特徴とするＭＭＰ−１阻害剤の製造方法。
【請求項３】
ヤブコウジ科（Ｍｙｒｓｉｎａｃｅａｅ）のヤブコウジ属マンリョウ（Ａｒｄｉｓｉａ ｃｒｅｎａｔａ Ｓｉｍｓ）の葉の抽出物を含有する皮膚外用組成物の製造方法であって、
上記抽出物は、上記葉からエタノールの溶媒によって、７０ないし１００℃で３〜５時間かけて抽出して得たものであり、
上記抽出物の成分量は、０．０００１〜１０重量％であることを特徴とする皮膚外用組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マンリョウの抽出物を有効成分として含有するコラーゲン産生促進剤の製造方法、ＭＭＰ−１阻害剤の製造方法及び皮膚外用組成物の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の老化は、シワの増加と弾力の減少、色素沈着など様々な形で現れてくる。その最も代表的な老化現象の一つがシワである。シワが発生する原因は、大きく二つに分けることができる。加齢による自然の内的要因と外的要因による老化である。内的要因としては、フリーラジカルと炎症の発生、ストレス、細胞活性低下及び突然変異、細胞の代謝の不均衡などがあり、外的要因としては、紫外線、公害、病気、飲酒、喫煙などがある（非特許文献１参照）。皮膚は大まかに表皮と真皮に分けることができる。表皮のシワの発生原因としては、表皮細胞のターン−オーバーの減少により、角質層が厚くなり、角質層の水分の含有能力が減少し、角質全体が硬化してシワが生成される。表皮と真皮の境界部位は、表皮細胞の支持、接着、栄養物質の移動、表皮の分化の調節などに関与する。様々な老化の要因として、特に紫外線（ＵＶ）によってコラーゲンＩＶ、ＶＩＩが減少し、表皮、真皮支持機能が減少し、選別透過機能が弱化して有害な成分が容易に皮膚に影響を及ぼすため、シワが生成されるのである（非特許文献２）。真皮は表皮の下にある結合組織から成り立つ組織で、細胞外間隙が広く、その間隙を細胞外マトリックス（ＥＣＭ：ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）と呼ばれる巨大分子の網状構造が占めている。ＥＣＭは、真皮内の繊維芽細胞から作られ、コラーゲン、エラスチンなどの繊維状のタンパク質とヒアルロン酸などの酸性ムコ多糖と呼ばれる多糖類で構成されている。ＥＣＭは、皮膚の弾力性、代謝、生気などに直接関与している。また、酸性ムコ多糖は、多量の水を保持し、栄養素、代謝産物、ホルモンなどを血管から組織中の細胞に浸透させる役目を果たす。したがって、ＥＣＭにおける酸性ムコ多糖の産生が促進されると、皮膚が生き生きするだけでなく、皮膚の新陳代謝が促進され、皮膚の老化防止が可能になる。
【０００３】
また、繊維性タンパク質は、組織の形を維持、あるいは皮膚に弾力を与えるなどの機能を果たしている。そのため、ＥＣＭにおける繊維性タンパク質の産生が促進されると、皮膚に弾力を与えて、シワや小ジワが抑制される。このようなＥＣＭを産生する繊維芽細胞の活性が内的、外的な老化の要因、特に、ＵＶによって低下すると、コラーゲン生合成性が減少して変性されたエラスチンが増加する。また、ＥＣＭを分解するマトリックスメタロプロテナーゼ（ＭＭＰｓ：Ｍａｔｒｉｘ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ）、特にＭＭＰ−１は、真皮の主成分であるコラーゲンＩ型を分解する。ＭＭＰ‐１の増加によってコラーゲンなどのＥＣＭ成分の分解が増加し、真皮内の紫外線によるキズが発生して、表皮−真皮の境界が破壊され、真皮の分解が加速化される。最終的には、皮膚の弾力性やみずみずしさ、生気が失われ、シワ、小ジワ、肌荒れが発生し皮膚の老化をもたらす一つの原因となる（非特許文献３）（非特許文献４）（非特許文献５）。上記のようなシワ発生の大きな要因であるコラーゲンの合成量を増加させ、ＭＭＰ−１を阻害することにより、活気のある若々しい皮膚を維持するための方法を模索する試みがなされている。シワのないみずみずしい皮膚を維持するための最も重要な役割を担うコラーゲンを生合成させる繊維芽細胞の増殖と代謝を円滑にすることはもちろん、生合成を促進する成分を発見し、ＭＭＰ−１を抑制する成分を有効成分にして、シワ、小ジワ、肌荒れなど皮膚の老化を本質的に防止し、安定性、安全性にも問題のない皮膚外用組成物を提供することである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｓｋｉｎ，Ａｌｌｕｒｅｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ ｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｅｔｅｒ Ｔ．Ｐｕｇｌｉｓｅ ＭＤ，ｐ６１−７２
【非特許文献２】Ｋｅｅｎｅ，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１０４，ｐ６１１−６１２，１９８７
【非特許文献３】Ｆｕｎｔｉｏｎａｌ Ｃｏｓｍｅｔｏｌｏｇｙ、ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ ｃｏｓｍｅｔｉｃ ｃｈｅｍｉｓｔｓ ｏｆ Ｊａｐａｎ
【非特許文献４】ＨｅｒｒｍａｎｎＧ．ｅｔ ａｌ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ、１０７ Ｎ．３、ｐ９２、１９９６）
【非特許文献５】ＢｒｅｎｎｅｉｓｅｎＰ．ｅｔ ａｌ、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ、６４、Ｎ．５、ｐ６４９、１９９６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって本発明は、皮膚の老化によるシワと密接に関係する、コラーゲン産生促進作用、ＭＭＰ−１阻害作用を有し、これらの作用を通じて、シワの予防及び改善に有用なシワ予防改善用皮膚外用組成物に関し、そのコラーゲン産生促進剤の製造方法、ＭＭＰ−１阻害剤の製造方法及び皮膚外用組成物の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するため、種々の植物抽出物について検討した結果、ヤブコウジ科（Ｍｙｒｓｉｎａｃｅａｅ）のヤブコウジ属マンリョウ（Ａｒｄｉｓｉａ ｃｒｅｎａｔａ Ｓｉｍｓ）抽出物がコラーゲン産生促進作用、ＭＭＰ−１阻害作用を有することを知見し、それらの作用を通じて、皮膚のシワを防止及び改善し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、請求項１に記載の発明は、ヤブコウジ科（Ｍｙｒｓｉｎａｃｅａｅ）のヤブコウジ属マンリョウ（Ａｒｄｉｓｉａ ｃｒｅｎａｔａ Ｓｉｍｓ）の葉の抽出物を含有するコラーゲン産生促進剤の製造方法であって、上記抽出物は、上記葉からエタノールの溶媒によって、７０ないし１００℃で３〜５時間かけて抽出して得たものであることを特徴とするコラーゲン産生促進剤の製造方法である。
また、請求項２に記載の発明は、ヤブコウジ科（Ｍｙｒｓｉｎａｃｅａｅ）のヤブコウジ属マンリョウ（Ａｒｄｉｓｉａ ｃｒｅｎａｔａ Ｓｉｍｓ）の葉の抽出物を含有するＭＭＰ−１阻害剤の製造方法であって、上記抽出物は、上記葉からエタノールの溶媒によって、７０ないし１００℃で３〜５時間かけて抽出して得たものであることを特徴とするＭＭＰ−１阻害剤の製造方法である。
更に、請求項３に記載の発明は、ヤブコウジ科（Ｍｙｒｓｉｎａｃｅａｅ）のヤブコウジ属マンリョウ（Ａｒｄｉｓｉａ ｃｒｅｎａｔａ Ｓｉｍｓ）の葉の抽出物を含有する皮膚外用組成物の製造方法であって、上記抽出物は、上記葉からエタノールの溶媒によって、７０ないし１００℃で３〜５時間かけて抽出して得たものであり、上記抽出物の成分量は、０．０００１〜１０重量％であることを特徴とする皮膚外用組成物の製造方法である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によるマンリョウ抽出物には、優れたコラーゲン産生促進作用、ＭＭＰ−１阻害作用を有し、これらを応用した本発明のシワ予防改善用皮膚外用組成物は、シワ予防及び改善に極めて顕著な効果を有する。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。本発明に用いられるマンリョウ（Ａｒｄｉｓｉａ ｃｒｅｎａｔａ Ｓｉｍｓ）は、ヤブコウジ科（Ｍｙｒｓｉｎａｃｅａｅ）のヤブコウジ属（Ｍｙｒｓｉｎａｃｅａｅ）に属する植物種である。日本、北朝鮮、韓国、台湾、中国などの暖地の山林内に生息する高さ５０〜６０ｃｍの常緑小低木である。この抽出物は、葉、樹皮、花、果実、根、いずれの部位も使用することができるが、葉を使用することが好ましい。
【０００９】
抽出溶媒としては、有機溶媒としてエタノールを使用するのが好ましい。参考となる抽出溶媒の具体例としては、水、メタノール、プロパノール、ブタノール、プロピレングリコール、グリセリン等のアルコール類、含水アルコール類、アセトン、酢酸エチル等の有機溶媒等を用いることができ、これらの溶媒は１種でも２種以上を混合しても良い。
【００１０】
マンリョウの抽出物は常法により得ることができ、例えば、マンリョウの抽出溶媒とともに浸漬または加熱還流した後、濾過して濃縮して得ることができる。
【００１１】
例えば、マンリョウの葉を乾燥させて重量の５倍から２０倍、好ましくは８〜１０倍の重量比の水、有機溶媒又はこれらの混合溶媒によって、２０〜２００℃、好ましくは５０〜１００℃で、３０分〜２０時間、好ましくは２〜５時間抽出して得る、あるいは５〜３７℃、好ましくは常温で２時間〜１５日間、さらに好ましくは１〜３日間抽出して、収得することができる。
【００１２】
以上のようにして得られる抽出物は、コラーゲン産生促進作用、ＭＭＰ−１阻害作用を有する。また、皮膚に適用した場合、上記作用により、シワ予防改善皮膚外用組成物に配合するのに好適である。
【００１３】
本発明のマンリョウ抽出物は多様な製剤に添加できる。製剤中の有効成分の量は特に限定されるものではないが、０．０００１〜９０重量％、好ましくは０．０００１〜１０重量％である。０．０００１重量％未満では本発明効果が十分に発揮され難く、一方、９０重量％を越えて配合してもさほど大きな効果の向上は認められず、また製剤化が難しくなるのであまり好ましくない。
【００１４】
製剤化の際は、効果を損なわない範囲内で、水溶性ビタミン、油溶性ビタミン、高分子ペプチド、高分子多糖、スフィンゴ脂質や海藻エキスで構成された組成物を含む。
【００１５】
水溶性ビタミンは、化粧品に配合可能なものであればどのような物でよいが、望ましいのは、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ピリドキシン、塩酸ピリドキシン、ビタミンＢ１２、パントテン酸、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、葉酸、ビタミンＣ、ビタミンＨなどが挙げられ、その塩（チアミン塩酸塩、アスコルビン酸ナトリウムなど）や誘導体（アスコルビン酸−２−リン酸ナトリウム塩、アスコルビン酸−２−リン酸マグネシウム塩など）も、本発明で使用できる水溶性ビタミンに含まれる。水溶性ビタミンは、微生物変換法、微生物の培養物からの精製法、酵素法、または化学合成法などの通常の方法によって収得することができる。
【００１６】
油溶性のビタミンは、化粧品に配合可能なものであればどのような物でもよいが、望ましいのは、ビタミンＡ、カロチン、ビタミンＤ２、ビタミンＤ３、ビタミンＥ（ｄｌ−α−トコフェロール）などが挙げられて、それらの誘導体（パルミチン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビル、ジパルミチン酸アスコルビル、酢酸ｄｌ−α−トコフェロール、ニコチン酸ｄｌ−α−トコペロルビタミンＥ、ＤＬ−パントテニルアルコール、Ｄ−パントテニルアルコール、パントテニルエチルなど）なども本発明で使用されている油溶性のビタミンに含まれている。油溶性のビタミンは、微生物変換法、微生物の培養物からの精製法、酵素や化学合成法などの通常の方法により取得することができる。
【００１７】
高分子ペプチドは、化粧品に配合可能なものであればどのような物でもよいが、望ましいのは、コラーゲン、加水分解コラーゲン、ゼラチン、エラスチン、加水分解エラスチン、ケラチンなどを挙げることができる。高分子ペプチドは、微生物の培養液からの精製法、酵素法または化学合成法などの通常の方法により精製取得することができ、または通常の豚や牛などの真皮、蚕の繊維などの天然物から精製して使用することができる。
【００１８】
高分子多糖は、化粧品に配合可能なものであればどのような物でもできるが、 望ましいのは、ヒドロキシエチルセルロース、キサンタンガム、ヒアルロン酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸またはその塩（ナトリウム塩など）などを挙げることができる。例えば、コンドロイチン硫酸またはその塩などは、通常、哺乳動物や魚から精製して使用することができる。
【００１９】
スフィンゴ脂質としては、化粧品に配合可能なものであればどのような物でもよいが、望ましいのは、セラミド、スフィンゴ糖脂質などを挙げることができる。スフィンゴ脂質は通常、哺乳類、魚類、貝類、酵母あるいは植物などから通常の方法で錠剤または化学合成法によって得ることができる。
【００２０】
海藻エキスは、化粧品に配合可能なものであればどのような物でもよいが、望ましいのは、褐藻エキス、紅藻エキス、緑藻エキスなどを挙げることができ、また、これらの海藻エキスから精製されたカラギーナン、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウムなども本発明で使用される海藻エキスに含まれている。海藻エキスは、海藻から通常の方法により精製して得ることができる。
【００２１】
これ以外に添加してもよい配合成分としては、油脂成分、保湿剤、エモリアント剤、界面活性剤、有機及び無機顔料、有機粉体、紫外線吸収剤、防腐剤、殺菌剤、酸化防止剤、植物抽出物、ｐＨ調整剤、アルコール、色素、香料、血行促進剤、冷感剤、制汗製、精製水などを挙げることができる。
【００２２】
油脂成分としてはエステル系の油脂、炭化水素系の油脂、シリコン系の油脂、フッ素系の油脂、動物油脂、植物油脂などを挙げることができる。
【００２３】
エステル系油脂としては、トリ２−エチルヘキサン酸グリセリル、２−エチルヘキサン酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ブチル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸エチル、パルミチン酸オクチル、イソステアリン酸イソセチル、ステアリン酸ブチル、リノール酸エチル、リノレイン酸イソプロピル、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソセチル、ミリスチン酸イソステアリル、パルミチン酸イソステアリル、ミリスチン酸オクチルドデシル、イソステアリン酸イソセチル、セバシン酸ジエチル、アジピン酸ジイソプロピル、ネオペンタン酸イソアルキル、トリ（カプリル／カプリン酸）グリセリル、トリ２−エチルヘキサン酸トリメチロールプロパン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、テトラ２−エチルヘキサン酸ペンタエリスリトール、カプリル酸セチル、ラウリン酸デシル、ラウリン酸ヘキシル、ミリスチン酸デシル、ミリスチン酸ミリスチル、ミリスチン酸セチル、ステアリン酸ステアリル、オレイン酸デシル、リシノレイン酸セチル、ラウリン酸イソステアリル、ミリスチン酸イソトリデシル、パルミチン酸イソセチル、ステアリン酸オクチル、ステアリン酸イソセチル、オレイン酸イソデシル、オレイン酸オクチルドデシル、リノレイン酸オクチルドデシル、イソステアリン酸イソプロピル、２−エチルヘキサン酸セトステアリル、２−エチルヘキサン酸ステアリル、イソステアリン酸ヘキシル、ジオクタン酸エチレングリコール、ジオレイン酸エチレングリコール、ジカプリン酸プロピレングリコール、ジ（カプリル／カプリン酸）プロピレングリコール、ジカプリル酸プロピレングリコール、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、ジオクタン酸ネオペンチルグリコール、トリカプリル酸グリセリル、トリウンデシル酸グリセリル、トリイソパルミチン酸グリセリル、トリイソステアリン酸グリセリル、ネオペンタン酸オクチルドデシル、オクタン酸イソステアリル、イソノナン酸オクチル、ネオデカン酸オクチルデシル、ネオデカン酸オクチルドデシル、イソステアリン酸イソセチル、イソステアリン酸イソステアリル、イソステアリン酸オクチルデシル、ポリグリセリンオレイン酸エステル、ポリグリセリンイソステアリン酸エステル、シトル酸トリイソセチル、シトル酸トリイソアルキル、シトル酸トリイソオクチル、ラクト酸ラウリル、ラクト酸ミリスチル、ラクト酸セチル、ラクト酸オクチルデシル、シトル酸トリエチル、シトル酸アセチルトリエチル、シトル酸アセチルトリブチル、シトル酸トリオクチル、マル酸ジイソステアリル、ヒドロキシステアリン酸２−エチルヘキシル、アジピン酸ジイソブチル、セバシン酸ジイソプロピル、セバシン酸ジオクチル、ステアリン酸コルレステリル、イソステアリン酸コレステリル、ヒドロキシステアリン酸コレステリル、オレイン酸コルレステリル、オレイン酸ジヒドロコレステリル、イソステアリン酸フィトステリル、オレイン酸フィトステリル、１２−ステアロイルヒドロキシステアリン酸イソセチル、１２−ステアルロイルヒドロキシステアリン酸ステアリル、１２−ステアロイルヒドロキシステアリン酸イソステアリルなどのエステル系を挙げることができる。
【００２４】
炭化水素系としては、スクワラン、流動パラフィン、アルファ−オレフィンのオリゴマー、イソパラフィン、セレシン、パラフィン、流動イソパラフィン、ポリブテン、マイクロクリスタリンワックス、ワセリンなどの炭化水素系油脂などを挙げられる。
【００２５】
シリコーン系としては、ポリメチルシリコン、メチルフェニルシリコン、メチルシクロポリシロキサン、オクタメチルポリシロキサン、デカメチルポリシロキサン、ドデカメチルシクロシロキサン、ジメチルシロキサン・メチルセチルオキシシロキサン共重合体、ジメチルシロキシサン・メチルステアロキシシロキサン共重合体、アルキル変性シリコン油、アミノ変性シリコン油など挙げることができる。
【００２６】
フッ素系としてはパーフルオロポリエーテルなどを挙げられる。
【００２７】
動物或いは植物油脂としては、アボガド油、アーモンド油、オリーブオイル、ゴマ油、米ぬか油、サフラワー油、大豆油、コーン油、アブラナ油、杏仁油、パーム核油、パーム油、ヒマシ油、ひまわり油、ブドウ種子油、綿実油、椰子油、ククイナッツ油、小麦胚芽油、米胚芽油、シアバター、月見草油、マカダミアナッツ油、メドウフォーム油、卵黄油、牛脂、麻油、ミンク油、オレンジラピ油、ホホバ油、キャンデリラワックス、カルナバワックス、液状ラノリン、硬化ヒマシ油などの動物或いは植物を挙げることができる。
保湿剤としては、水溶性低分子の保湿剤、脂溶性分子の保湿剤、水溶性高分子、脂溶性高分子などを挙げることができる。
【００２８】
水溶性低分子の保湿剤としては、セリン、グルタミン、ソルビトール、マンニトール、ピロリドンカルボン酸ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール（重合度ｎ＝２以上）、ポリプロピレングリコール（重合度ｎ＝２以上）、ポリグリセリン（重合度ｎ＝２以上）、ラクト酸、ラクト酸塩などを挙げることができる。
【００２９】
脂溶性の低分子保湿剤としては、コレステロール、コレステロールエステルなどを挙げることができる。
【００３０】
水溶性の高分子としては、カルボキシビニルポリマー、ポリアスパラギン酸塩、トラガカント、キサンタンガム，メチルセルロース，ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、水溶性キチン、キトサン、デキストリンなどを挙げることができる。
【００３１】
油溶性高分子としては、ポリビニルピロリドン・エイコセン共重合体、ポリビニルピロリドン・ヘキサデセン共重合体、ニトロセルロース、デキストリン脂肪酸エステル、高分子シリコンなどを挙げることができる。
【００３２】
エモリエント剤としては、長鎖アシルグルタミン酸コレステリルエステル、ヒドロキシステアリン酸コレステリル、１２−ヒドロキシステアリン酸ステアリン酸、ロジン酸、ラノリン脂肪酸コレステリルエステルなどを挙げることができる。
【００３３】
界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤などを挙げることができる。
【００３４】
非イオン性界面活性剤としては、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン、プロピレングリコール脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ＰＯＥ（ポリオキシエチレン）ソルビタン脂肪酸エステル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル、ＰＯＥグリセリン脂肪酸エステル、ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥ脂肪酸エステル、ＰＯＥ硬化ヒマシ油、ＰＯＥヒマシ油、ＰＯＥ・ＰＯＰ（ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン）共重合体、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテル、ポリエーテル変性シリコーン、ラウリン酸アルカノルアミド、アルキルアミンオキシ、水素添加大豆リン脂質などを挙げられる。
【００３５】
陰イオン性界面活性剤としては、脂肪酸石鹸、α−アスルホン酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、ＰＯＥアルキルエーテル硫酸塩、アルキルリン酸塩、ＰＯＥアルキルリン酸塩、アルキルアミドリン酸塩、アルキルロイルアルキルタウリン塩、Ｎ−アシルアミノ酸塩、ＰＯＥアルキルエーテルカルボン酸塩、アルキルスルフォサクシン酸塩、アルキルスルホアセト酸ナトリウム、アシル化加水分解コラーゲンペプチド塩、パーフルオロアルキルアルキルリン酸エステルなどを挙げることができる。
【００３６】
陽イオン性界面活性剤としては、塩化アルキルトリメチルアンモニウム、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、ブロム化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化セトステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム、塩化ステアリルジメチルベンジルアンモニウム、ブロム化ベヘニルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ステアリン酸ジエチルアミノエチルアミド、ステアリン酸ジメチルアミノプロピルアミド、ラノリン誘導体第４級アンモニウム塩などを挙げることができる。
【００３７】
両性界面活性剤としては、カルボキシベタイン型、アミドベタイン型、スルホベタイン型、ヒドロキシスルホベタイン型、アミドスルホベタイン型、ポスポベタイン型、アミノカルボキシル酸塩型、イミダゾリン誘導体型、アミドアミン型などの両性界面活性剤などを挙げることができる。
【００３８】
有機及び無機顔料としては、ケイ酸、無水ケイ酸、ケイ酸マグネシウム、タルク、セリサイト、マイカ、カオリン、ベンガラ、クレー、ベントナイト、チタン皮膜雲母、オキシ塩化ビスマス、酸化ジルコニウム、酸化マグネシウム、酸化亜鉛、酸化チタン、酸化アルミニウム、硫酸カルシウム、硫酸バリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、酸化鉄、群青、酸化クロム、水酸化クロム、カラミン及びこれらの複合体などの無機顔料；ポリアミド、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリウレタン、ビニル樹脂、尿素樹脂、フェノール樹脂、フッ素樹脂、ケイ酸樹脂、アクリル樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、ポリカーボネート樹脂、ジビニルベンゼン・スチレン共重合体、シルクパウダー、セルロース、ＣＩピグメントイエロー、ＣＩピグメントオレンジなどの有機顔料、及びこれらの無機顔料と有機顔料の複合顔料などを挙げることができる。
【００３９】
有機粉体としては、ステアリン酸カルシウムなどの金属石鹸；セチルリン酸亜鉛ナトリウム、ラウリルリン酸亜鉛、ラウリルリン酸カルシウムなどのアルキルリン酸金属塩；Ｎ−ラウロイル−β−アラニンカルシウム、Ｎ−ラウロイル−β−アラニン亜鉛、Ｎ−ラウロイルグリシンカルシウムなどのアシルアミノ酸多価金属塩；Ｎ−ラウロイル−タウリンカルシウム、Ｎ−パルミトイル−タウリンカルシウムなどのアミドスルホン酸多価金属塩；Ｎ−イプシロン−ラウロイル−Ｌ−リジン、Ｎ−イプシロン−パルミトイルリジン、Ｎ−α−パリトイルオルニチン、Ｎ−α−ラウロイルアルギニン、Ｎ−α−硬化牛脂脂肪酸アシルアルギニンなどのＮ−アシル塩基性アミノ酸；Ｎ−ラウロイルグリシルグリシンなどのＮ−アシルポリペプチド；α−アミノカプリル酸、α−アミノラウリン酸などのα−アミノ脂肪酸；ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリメチルメタクリルレート、ポリスチレン、ジビニルベンゼン・スチレン共重合体、四フッ化エチレンなどを挙げることができる。
【００４０】
紫外線吸収剤としては、パラアミノベンゾ酸、パラアミノベンゾ酸エチル、パラアミノベンゾ酸アミル、パラアミノベンゾ酸オクチル、サリチル酸エチレングリコール、サリチル酸フェニル、サリチル酸オクチル、サリチル酸ベンジル、サリチル酸ブチルフェニル、サリチル酸ホモメンチル、ケイ皮酸ベンジル、パラメトキシケイ皮酸−２−エトキシエチル、パラメトキシケイ皮酸オクチル、ジパラメトキシケイ皮酸モノ−２−エチルヘキ酸グリセリル、パラメトキシケイ皮酸イソプロピル、ジイソプロピル・ジイソプロピルケイ皮酸エステルの混合物、ウロカニン酸、ウロカニン酸エチル、ヒドロキシメトキシベンゾフェノン、ヒドロキシメトキシベンゾフェノンスルホン酸及びその塩、ジヒドロキシメトキシベンゾフェノン、ジヒドロキシメトキシベンゾフェノンデスルホン酸ナトリウム、ジヒドロキシベンゾフェノン、テトラヒドロキシベンゾフェノン、４−ｔｅｒｔ−ブチル−４’−メトキシジベンゾイルメタン、２，４，６−トリアニリノ−ｐ−（カルボ−２’−エチルヘキシル−１’−オキシ）−１，３，５−トリアジン、２−（２−ヒドロキシ−５−メチルフェニル）ベンゾトリアゾルなどを挙げることができる。
【００４１】
殺菌剤としてはヒノキチオル、トリクロサン、トリクロロヒドロキシジフェニルエーテル、クロルヘキシジングルコン酸塩、フェノキシエタノール、レジョルシン、イソプロピルメチルフェノール、アズレン、サリチル酸、ジンクピリチオン、塩化ベンザルコニウム、感光素３０１号、ウンデシレン酸などを挙げることができる。
【００４２】
酸化防止剤としては、ブチルヒドロキシアニソール、ガーリック酸プロピル、エリソルビン酸などを挙げることができる。
【００４３】
ＰＨ調整剤としては、シトリン酸、シトリン酸ナトリウム、マル酸、マル酸ナトリウム、フマル酸、フマル酸ナトリウム、スクシン酸、スクシン酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、リン酸一水素ナトリウムなどを挙げることができる。
【００４４】
アルコールとしては、セチルアルコールなどの高級アルコールを挙げることができる。
【００４５】
またこれ以外に、添加してもよい配合成分は、これに限定されるわけではなく、また、上記のどの成分も、本発明の目的や効果を損なわない範囲で配合可能である。
【００４６】
本発明の化粧料は、溶液、乳化物、粘性型混合物などの形状をとることができる。
【００４７】
本発明の化粧料組成物に含まれる成分は、有効成分として、上記の抽出物以外に化粧料組成物に通常使用される成分を含むことができ、例えば、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料及び香料などの通常使用される補助剤及び担体を含む。
【００４８】
本発明の化粧料組成物は、通常的に製造されているどのような剤形でも製造することができ、例えば乳液、クリーム、化粧水、パック、ファンデーション、ローション、美容液、毛髪化粧料などを挙げることができる。
【００４９】
具体的には、本発明の化粧料組成物は、スキンローション、スキンソープナー、スキントナー、アストリンゼント、ローション、ミルクローション、モイスチャーローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、ファンデーション、エッセンス、栄養エッセンス、パック、石鹸、クレンジング・フォーム、クレンジングクローション、クレンジングクリーム、ボディーローション、ボディークレンザーの剤型を含む。
【００５０】
本発明の剤形がペースト、クリームまたはゲルの場合、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコ−ン、ベントナイト、シリカ、タルクや酸化亜鉛などを使用することができる。
【００５１】
本発明の剤形がパウダーやスプレーである場合、ラクトーゼ、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシード、カルシウムシリケートまたはポリアミドパウダーを使用することができ、特にスプレーの場合は追加的にクロロフルオロハイドロカーボン、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルなどを含むことができる。
【００５２】
本発明の剤形が溶液または乳濁液の場合には、溶媒が利用され、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエイト、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコール、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタンの脂肪酸エステルがある。
【００５３】
本発明の剤形が懸濁液の場合には、水、エタノール、またはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトルエステル、及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシード、ベントナイトなどに使用することができる。
【００５４】
本発明の剤形が界面活性剤含有のクレンジングの場合は、脂肪族アルコールソルベイト、脂肪族アルコールエーテルソルベイト、イセチオネート、イミダゾリウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルソルベイト、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリード、脂肪酸ジエタノールアミド、植物油、リノリン誘導体またはエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが使用できる。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例、参考例、実験例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例、参考例、実験例によってなんら限定されるものではない。
【参考例１】
【００５６】
マンリョウ葉熱水抽出物
乾燥させたマンリョウの葉５００ｇを蒸留水５ｋｇに入れて、冷却コンデンサー付きの抽出機を使用して、７０℃で３時間加温して抽出した後、４００メッシュろ過布でろ過し、常温で冷却した後、５〜１５℃で７日間放置して熟成させ、０．４５フィルターでろ過した。
余液を減圧回転蒸発器にかけて溶媒を完全に除去し、マンリョウ葉の熱水抽出物１５．１ｇを収得して、下記の実験の試料として使用した。
【実施例１】
【００５７】
マンリョウ葉エタノール抽出物
抽出溶媒としてエタノールを使用することを除いては、上記の参考例１と同じ方法を実行し、マンリョウ葉のエタノール抽出物１７．２ｇを収得して、下記の実験の試料として使用した。
【参考例２】
【００５８】
マンリョウ葉メタノール抽出物
抽出溶媒としてメタノールを使用することを除いては、上記の参考例１と同じ方法を実行し、マンリョウ葉のメタノール抽出物１６．９ｇ収得して、下記の実験の試料として使用した。
【参考例３】
【００５９】
マンリョウ葉ブチレングリコール抽出物
抽出溶媒としてブチレングリコールを使用することを除いては、上記の参考例１と同じ方法を実行し、マンリョウ葉のブチレングリコール抽出物１７．３ｇを収得して、下記の実験の試料として使用した。
【参考例４】
【００６０】
マンリョウ葉プロピレングリコール抽出物
抽出溶媒としてプロピレングリコールを使用することを除いては、上記の参考例１と同じ方法を実行し、マンリョウ葉のプロピレングリコール抽出物６．２ｇを収得して、下記の実験の試料として使用した。
【参考例５】
【００６１】
マンリョウ葉含水エタノール抽出物
抽出溶媒として３０％の含水エタノールを使用することを除いては、上記の参考例１と同じ方法を実行し マンリョウ葉の含水エタノール抽出物１４．７ｇを収得して、実験の試料として使用した。
【参考例６】
【００６２】
マンリョウ葉含水ブチレングリコール抽出物
抽出溶媒として３０％の含水ブチレングリコールを使用することを除いては、上記の参考例１と同じ方法を実行して、マンリョウ葉の含水ブチレングリコール抽出物１４．５ｇを収得して下記の実験の試料として使用した。
【参考例７】
【００６３】
マンリョウ葉含水プロピレングリコール抽出物
抽出溶媒として３０％の含水プロピレングリコールを使用することを除いては、上記の参考例１と同じ方法を実行し、マンリョウ葉の含水プロピレングリコール抽出物１７．７ｇを収得して、下記の実験の試料として使用した。
【参考例８】
【００６４】
マンリョウ葉熱水抽出物
乾燥させたマンリョウの葉５００ｇを蒸留水５ｋｇに入れ、常温で１日間抽出した後、４００メッシュろ過布でろ過し、常温で冷却した後、５〜１５℃で７日間放置して熟成させ、０．４５フィルターでろ過した。余液を減圧回転蒸発器にかけて溶媒を完全に除去して、マンリョウの熱水抽出物１５．１ｇを収得し、下記の実験の試料として使用した。
【実施例２】
【００６５】
マンリョウ葉エタノール抽出物
抽出溶媒としてエタノールを使用することを除いて、上記の参考例８と同じ方法を実行し、マンリョウ葉のエタノール抽出物１２．３ｇを収得して、下記の実験の試料として使用した。
【参考例９】
【００６６】
マンリョウ葉メタノール抽出物
抽出溶媒としてメタノールを使用することを除いては、上記の参考例８と同じ方法を実行し、マンリョウメタノール抽出物１１．０ｇを収得して、下記の実験の試料として使用した。
【参考例１０】
【００６７】
マンリョウ葉ブチレングリコール抽出物
抽出溶媒としてブチレングリコールを使用することを除いては、上記の参考例８と同じ方法を実行し、マンリョウ葉のブチレングリコール抽出物１３．５ｇを収得して、下記の実験の試料として使用した。
【参考例１１】
【００６８】
マンリョウ葉プロピレングリコール抽出物
抽出溶媒としてプロピレングリコールを使用することを除いては、上記の参考例８と同じ方法を実行し、マンリョウ葉のプロピレングリコール抽出物１２．８ｇを収得して、下記の実験の試料として使用した。
【参考例１２】
【００６９】
マンリョウ葉含水エタノール抽出物
抽出溶媒として３０％の含水エタノールを使用することを除いては、上記の参考例８と同じ方法を実行して、カラタチバナの含水エタノール抽出物１２．９ｇを収得して、下記の実験の試料として使用した。
【参考例１３】
【００７０】
マンリョウ葉含水ブチレングリコール抽出物
抽出溶媒として３０％の含水ブチレングリコールを使用することを除いては、上記の参考例８と同じ方法を実行して、カラタチバナの含水ブチレングリコール抽出物１３．５ｇを収得して、下記の実験の試料として使用した。
【参考例１４】
【００７１】
マンリョウ葉含水プロピレングリコール抽出物
抽出溶媒として３０％の含水プロピレングリコールを使用することを除いて、上記の参考例８と同じ方法を実行して、マンリョウ葉の含水プロピレングリコール抽出物１０．７ｇを収得して、下記の実験の試料として使用した。
【００７２】
（剤形試料１）剤形例１及び比較剤形例１の製造
マンリョウ葉エタノール抽出物を含んだ剤形例１及び比較剤形例１を下記の表１に記載されている配合成分で製造して、臨床例１の試料として使用した。比較剤形例１はマンリョウ葉エタノール抽出物の代わりに、同量のシトステロールを追加で添加した。
【００７３】
【表１】
0005926506.tif 000002
【００７４】
（剤形試料２）剤形例２及び比較剤形例２の製造
マンリョウ葉エタノール抽出物を含有した剤形例２及び比較剤形例２を下記の表２に記載されている配合成分で製造して、臨床例２の試料として使用した。比較剤形例２はマンリョウ葉エタノール抽出物の代わりに、同量のシトステロールを追加で添加した。
【００７５】
【表２】
0005926506.tif 000003
【００７６】
（実験例１）細胞毒性試験
実施例１、２及び参考例１〜１４で得られた抽出物について、細胞毒性試験を行った、具体的には以下のように試験を行った。
【００７７】
正常ヒト繊維芽細胞株（ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ：ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−２０７６）を１×１０４個／ｍｌで、２４ウェルプレートに播種した。培地はウシ胎児血清１０％を含有するダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用した。２４時間後にウシ胎児血清２％を含有するダルベッコ改変イーグル培地に置換して、試験試料を５０μｇ／ｍｌの濃度で１μｌ添加した後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。３日間培養後、上清液を除去して５％リン酸緩衝生理食塩水を２００μｌずつ加えて洗浄し、ＭＴＴ（３−［４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｅ−２−ｙｌ］−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）溶液を１ウェル当たり１．０ｍｌずつ加えた後、４時間後にＭＴＴを除去した。ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を１ウェル当たり１．０ｍｌずつ加えた後、一晩３７℃でインキュベーションし、５７０ｎｍの吸光度を測定した。
【００７８】
【表３】
0005926506.tif 000004
【００７９】
表３の結果より、実施例１、２及び参考例１〜１４に関して細胞毒性がほとんどないことが確認できた。
【００８０】
（実験例２）コラーゲン産生促進試験
実施例１、２及び参考例１〜１４で得られた抽出物について、コラーゲン産生量を測定した。具体的には、以下のように試験を行った。
【００８１】
正常ヒト繊維芽細胞株（ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ：ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−２０７６）を１×１０４個／ｍｌで２４ウェルプレートに播種した。培地はウシ胎児血清１０％を含有したダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用した。播種してから２４時間後に、試験試料を５０μｇ／ｍｌの濃度で１０μｌ添加し、１晩、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。培養上清を回収し、１５，０００ｒｐｍで３０秒間、遠心分離した。この培養上清を試験試料として、プロコラーゲンタイプＩＣ−ペプチドＥＬＡキット（ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ Ｉ Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ ＥＬＡ ｋｉｔ、ＴａＫａＲａ社）を用いて４５０ｎｍにおける吸光度からプロコラーゲンＩ型の産生量を算出した。
【００８２】
試験試料の代わりにビタミンＣを添加した場合を陽性対照群にとった。その実験結果を表４に示す。
【００８３】
【表４】
0005926506.tif 000005
【００８４】
表４の結果、実施例１、２及び参考例１〜１４で得られた抽出物は、無処理群と比較して高く、優れたコラーゲン産生促進効果があることが確認できた。
【００８５】
（実験例３）ＭＭＰ−１阻害試験
実施例１、２及び参考例１〜１４で得られた抽出物について、ＭＭＰ−１阻害試験を行った。具体的には、以下のように試験を行った。
【００８６】
正常ヒト繊維芽細胞株（ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ：ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−２０７６）を１００ｍｍ培養皿に１×１０６個播種した。培地は、１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。翌日、培地を除去したのち、上記の実施例等で得られたマンリョウ抽出物を添加した無血清培地で６〜２４時間培養し、グアニジウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出方法で細胞から全ＲＮＡを抽出した。上記の方法で得られたＲＮＡにＤＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ‐ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を３７℃で３０分間処理し、フェノール／クロロホルム抽出法とエタノール沈殿法により、純粋なＲＮＡを得て、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を実施した。ＭＭＰ−１の反応条件は、９５℃１分、４８℃１分、７２℃１分を１セットとして、２９サイクル行い、β−アクチンの反応条件は、９５℃１分、６２℃１分、７２℃１分を１セットとして、２２サイクル行った。ＰＣＲ産物は、１．５％（ｗ／ｖ）アガロース（Ｓｉｇｍａ社）ゲルに電気泳動し、ゲルイメージアナライザー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）で定量した。対照群にβ−アクチンを使用し、ＲＴ−ＰＣＲに使用されたプライマーは、下記表５の序列番号に示した塩基配列のものを使用した。
【００８７】
試験試料の代わりにＥＧＣＧ（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ）を添加した場合を陽性対照群とした。発現量の結果は、表６に示す。
【００８８】
【表５】
0005926506.tif 000006
【００８９】
【表６】
0005926506.tif 000007
【００９０】
（実験例４）コラーゲンＩ型ｍＲＮＡ発現促進試験
実施例１、２及び参考例１〜１４で得られた抽出物について、コラーゲンＩ型ｍＲＮＡ発現促進試験を行った。具体的には、以下のように試験を行った。
【００９１】
正常ヒト繊維芽細胞株（ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ：ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−２０７６）を６０ｍｍ培養皿に１×１０６個播種した。培地は、１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。翌日、培地を除去したのち、上記の実施例等で得られたマンリョウ抽出物を添加した無血清培地で６〜２４時間培養し、グアニジウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出方法で細胞から全ＲＮＡを抽出した。上記の方法で得られたＲＮＡにＤＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ‐ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を３７℃で３０分間処理し、フェノール／クロロホルム抽出法とエタノール沈殿法により、純粋なＲＮＡを得て、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を実施した。コラーゲンＩ型の反応条件は、９４℃１分、６２℃１分、７２℃１分を１セットとして、３０サイクル行い、β−アクチンの反応条件は、９５℃１分、６２℃１分、７２℃１分を１セットとして、２２サイクル行った。ＰＣＲ産物は、１．５％（ｗ／ｖ）アガロース（Ｓｉｇｍａ社）ゲルに電気泳動し、ゲルイメージアナライザー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）で定量した。対照群にβ−アクチンを使用し、ＲＴ−ＰＣＲに使用されたプライマーは、下記表７の序列番号に示した塩基配列のものを使用した。
【００９２】
試験試料の代わりにビタミンＣを添加した場合を陽性対照群にとった。その実験結果を表８に示す。
【００９３】
【表７】
0005926506.tif 000008
【００９４】
【表８】
0005926506.tif 000009
【００９５】
表８の結果、実施例１、２及び参考例１〜１４で得られた抽出物は、無処理群と比較して高く、優れたコラーゲン産生促進効果があることが確認できた。
【００９６】
（実験例５）コラーゲンＩ型産生促進試験
実施例１、２及び参考例１〜１４で得られた抽出物について、コラーゲンＩ型産生促進試験を行った。具体的には、以下のように試験を行った。
【００９７】
正常ヒト繊維芽細胞株（ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ：ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−２０７６）を６０ｍｍ培養皿に１×１０６個播種した。培地は、１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。翌日、培地を除去したのち、試験試料を添加した２％ウシ胎児血清含有ダルベッコ改変イーグル培地に交換して、試料を濃度別に添加し、１晩、３７℃で培養した。その後、培養上清を回収し、タンパク質量をＢＣＡ法にて決定した。その試料のタンパク質量をそろえて非還元条件下でポリアクリルアミドゲルにアプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動後、ゲル内のタンパク質をＰＶＤＦ膜にセミドライ法により転写した。そのＰＶＤＦ膜を抗コラーゲンＩ型抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ社）と抗ウサギ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社）で処理し、ＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ、Ｉｎｔｒｏｎ社）反応後、Ｘ線フィルムに感光させて確認した。コラーゲンＩ型の発現量は、フィルムに感光させたバンドをイメージアナライザー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）で定量した。
【００９８】
試験試料の代わりにビタミンＣを添加した場合を陽性対照群にとした。その実験結果を表９に示す。
【００９９】
【表９】
0005926506.tif 000010
【０１００】
表９の結果、実施例１、２及び参考例１〜１４で得られた抽出物は、無処理群と比較して高く、優れたコラーゲン産生促進効果があることが確認できた。
【０１０１】
剤形例１について使用試験を行い、肌の弾力性を評価した。その際、比較剤形例１と同時に使用試験を行い、評価した。具体的には、以下のように試験を行った。
【０１０２】
剤形例１と比較剤形例１を女性２０人ずつ２グループに分け、朝、夕の洗顔後の１日２回を適用した。比較剤形１は、右目の回りに処理し、剤形例１は、左目の回りに塗布した。適用１５日、３０日後の肌の表面のシワの深さをキュートメーターＳＥＭ４７４によって測定した。
【０１０３】
肌の弾力性の測定は、シワの深さを測定するもので、数字が小さいほど、弾力性がよい。弾力度の値は対照群に比べて減少した値を％で示し、被験者２０人の平均値を表１０に示した。
【０１０４】
【表１０】
0005926506.tif 000011
【０１０５】
剤形例２について使用試験を行い、肌の弾力性を評価した。その際、比較剤形例２と同時に使用試験を行い、評価した。具体的には、以下のように試験を行った。
【０１０６】
剤形例２と比較剤形例２のエッセンスに関する皮膚塗布時の肌の状態の改善効果を確認するために、次のような臨床確認実験を行った。３６〜６９歳の健康な女性層として、３０人ずつ２グループに分け、顔面の左側の部分には剤形例２のエッセンスを、顔面右側の部分には比較剤形例２のエッセンスを、毎日朝晩洗顔後の肌に１日２回４週間塗布した後、肌の状態の改善を確認するために皮膚の状態の改善の程度を測定した。
【０１０７】
（ア）肌のハリ、たるみの改善効果、及び（イ）シワ、小ジワの改善効果に関しては、以下の評点で判定し、３０人の平均点で評価した。その実験結果を表１１に示す。
【０１０８】
（ア）肌のハリ、たるみの改善効果の評点
非常に改善された  ３点
改善された  ２点
若干改善された  １点
改善効果がない  ０点
悪化した  −１点
（イ）シワ、小ジワの改善効果の評点
非常に改善された  ３点
改善された  ２点
若干改善された  １点
改善効果がない  ０点
悪化した  −１点
【０１０９】
【表１１】
0005926506.tif 000012
【０１１０】
実験の結果、剤形例２を使用した群では（ア）と（イ）の両方で比較剤形例２を使用した群に比べて、シワ対して極めて顕著な効果を有することが確認できた。また、皮膚トラブルもなく、安全であった。
【０１１１】
以下、本発明に係わるシワ予防改善用皮膚外用組成物の製造例を示す。
【０１１２】
【表１２】
0005926506.tif 000013
【０１１３】
【表１３】
0005926506.tif 000014
【０１１４】
【表１４】
0005926506.tif 000015
【０１１５】
【表１５】
0005926506.tif 000016
【０１１６】
【表１６】
0005926506.tif 000017
【０１１７】
【表１７】
0005926506.tif 000018
【産業上の利用可能性】
【０１１８】
本発明によるマンリョウ抽出物には、優れたコラーゲン産生促進作用、ＭＭＰ−１阻害作用を有し、これらを応用した本発明のシワ予防改善用皮膚外用組成物は、シワ予防及び改善に極めて顕著な効果を有する。