(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
泡持ちの優れる麦芽発泡飲料用の大麦を選抜する選抜方法であって、
被検大麦について、
（ａ）ＧｒｏｕｐＩ型の大麦二量体α−アミラーゼ阻害剤−１（Ｂａｒｌｅｙ  ｄｉｍｅｒｉｃ  ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１）遺伝子座周辺領域の塩基配列と、（ｂ）ＧｒｏｕｐＩＩ型の大麦二量体α−アミラーゼ阻害剤−１遺伝子座周辺領域の塩基配列とを多重整列することにより特定されるＤＮＡマーカーの少なくとも一つについて遺伝子型を同定し、ＧｒｏｕｐＩ型の遺伝子型に一致する被検大麦を泡持ちの優れる麦芽発泡飲料用の大麦として選抜するものであり、
前記大麦二量体α−アミラーゼ阻害剤−１遺伝子座周辺領域が、開始コドンに相当するＡＴＧ配列の上流５ｃＭ以内、かつ終止コドンに相当するＴＡＧ配列の下流５ｃＭ以内の領域である、選抜方法。
【請求項２】
前記（ａ）及び（ｂ）の塩基配列が、それぞれ配列番号１及び配列番号２で特定される塩基配列である、請求項１に記載の選抜方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡマーカーが、配列番号１で特定される塩基配列の第６０番目の塩基、第１２４番目の塩基、第１６０番目の塩基、第２２０番目の塩基、第４７５番目の塩基、第４９０〜４９１番目の塩基の間、第１１８１番目の塩基又は第１２３８番目の塩基に相当する塩基部位であり、
遺伝子型の同定が、
前記被検大麦のゲノムＤＮＡを鋳型として、前記ＤＮＡマーカーの少なくとも１つを含むポリヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応法により増幅するステップと、
前記ポリヌクレオチドを、認識配列中に前記ＤＮＡマーカーの少なくとも１つを含む１種又は２種以上の制限酵素により消化するステップと、
前記制限酵素により消化して得られるＤＮＡ断片の数及び／又はサイズに基づいて、前記遺伝子型を同定するステップと、を含む方法により行われる、請求項１又は２に記載の選抜方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡマーカーが、配列番号１で特定される塩基配列の第４９０〜４９１番目の塩基の間に相当する塩基部位であり、かつ前記制限酵素が、ＡｆａＩ、ＲｓａＩ又はＴａｑＩから選択されるか、又は、
前記ＤＮＡマーカーが、配列番号１で特定される塩基配列の第１１８１番目の塩基に相当する塩基部位であり、かつ前記制限酵素が、ＡｃｃＩ、Ｂｓｔ１１０７Ｉ又はＤｄｅＩから選択される、請求項３に記載の選抜方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡマーカーが、配列番号１で特定される塩基配列の第３１９〜３２０番目の塩基の間、又は第４０２〜４２２番目の塩基に相当する塩基部位であり、
遺伝子型の同定が、
前記被検大麦のゲノムＤＮＡを鋳型として、少なくとも一方のプライマーが前記ＤＮＡマーカーの少なくとも一部にアニーリングする塩基配列を有するプライマー対により、ポリメラーゼ連鎖反応を行うステップと、
前記ポリメラーゼ連鎖反応による増幅産物の有無に基づいて、前記遺伝子型を同定するステップと、を含む方法により行われる、請求項１又は２に記載の選抜方法。
【請求項６】
前記ＤＮＡマーカーが、配列番号１で特定される塩基配列の第４０２〜４２２番目の塩基に相当する塩基部位である、請求項５に記載の選抜方法。
【請求項７】
前記プライマー対が、配列番号１３で特定される塩基配列を有するプライマーと、配列番号１４で特定される塩基配列を有するプライマーと、からなる、請求項５又は６に記載の選抜方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の選抜方法により大麦を選抜する工程と、選抜された大麦同士を交配し、泡持ちの優れる麦芽発泡飲料用の交配後代系統の大麦を得る工程とを含む方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の選抜方法により大麦を選抜する工程、又は請求項８に記載の方法により大麦を得る工程と、
当該大麦を製麦する製麦工程と、を含む麦芽製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の選抜方法により大麦を選抜する工程、又は請求項８に記載の方法により大麦を得る工程と、
当該大麦を原料の少なくとも一部として使用する仕込工程と、を備える、麦芽発泡飲料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、麦芽発泡飲料用大麦の選抜方法及び麦芽発泡飲料に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビール等の麦芽発泡飲料の泡は、薄い液体の膜に包まれた炭酸ガスの気泡の集合体であり、気が抜けたり、香味が変化したりするのを防ぐ蓋の役目をするほか、香り立ちを向上させる働きがある。このため、泡持ちはビール等の麦芽発泡飲料の品質を左右する重要な要因の一つである。
【０００３】
泡持ちには様々な要因が関与しているが、その要因の一つとしてタンパク質の関与が示唆されている。例えば、特許文献１には、ＮＩＢＥＭ値の高い泡持ちの良いビールでは、酵母チオレドキシン濃度が低く、プロテインＺ濃度及び大麦二量体α−アミラーゼ阻害剤−１（Ｂａｒｌｅｙ  ｄｉｍｅｒｉｃ  ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１。以下「ＢＤＡＩ−１」ともいう。）濃度が高いことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−２１６２０８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
麦芽発泡飲料用の大麦育種において、泡持ちの優れた大麦の当該形質を確実に後代へと伝えていくことは必須かつ重要な課題である。すなわち、泡持ちと正の相関があるタンパク質（例えば、ＢＤＡＩ−１）含有量の高い大麦を効率よく選抜できる技術は有用である。しかしながら、泡持ちに関与するタンパク質の含有量をタンパク質レベルで測定する方法は、特に大麦育種の初期段階に近いほど、数百もの大麦個体をスクリーニングする必要があるため、実用上採用することはできない。
【０００６】
近年、作物の育種において、様々な形質に関して、ＤＮＡマーカーを利用した当該形質を有する作物の選抜技術が開発されているが、これまでのところＢＤＡＩ−１含有量に関して有効なＤＮＡマーカーは報告されていない。
【０００７】
そこで、本発明は、簡易な操作で多検体を短時間で処理することができ、かつＢＤＡＩ−１含有量の高い大麦を信頼性よく選抜することができる、大麦育種への応用に適した、大麦の選抜方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、泡持ちの優れる麦芽発泡飲料用の大麦を選抜する選抜方法であって、
被検大麦について、
（ａ）ＧｒｏｕｐＩ型の大麦二量体α−アミラーゼ阻害剤−１（ＢＤＡＩ−１）遺伝子座周辺領域の塩基配列と、（ｂ）ＧｒｏｕｐＩＩ型のＢＤＡＩ−１遺伝子座周辺領域の塩基配列とを多重整列することにより特定されるＤＮＡマーカーの少なくとも一つについて遺伝子型を同定し、ＧｒｏｕｐＩ型の遺伝子型に一致する被検大麦を泡持ちの優れる麦芽発泡飲料用の大麦として選抜する選抜方法を提供する。
【０００９】
本明細書において、「ＧｒｏｕｐＩ型（以下、「グループＩ型」ともいう。）」とは、ＢＤＡＩ−１遺伝子座周辺領域に存在する上記ＤＮＡマーカーの遺伝子型が、大麦ＣＤＣ  Ｋｅｎｄａｌｌ種の遺伝子型と一致する大麦を表す。「ＧｒｏｕｐＩ型」のＢＤＡＩ−１遺伝子座周辺領域の塩基配列の一例としては、配列番号１で示される塩基配列が挙げられる。
【００１０】
同様に、本明細書において、「ＧｒｏｕｐＩＩ型（以下、「グループＩＩ型」ともいう。）」とは、ＢＤＡＩ−１遺伝子座周辺領域に存在する上記ＤＮＡマーカーの遺伝子型が、大麦りょうふう種の遺伝子型と一致する大麦を表す。「ＧｒｏｕｐＩＩ型」のＢＤＡＩ−１遺伝子座周辺領域の塩基配列の一例としては、配列番号２で示される塩基配列が挙げられる。
【００１１】
グループＩ型及びグループＩＩ型のＢＤＡＩ−１遺伝子座周辺領域の塩基配列を多重整列することにより、塩基が一致しない塩基部位をＤＮＡマーカーとして特定することができる。被検大麦において、上記ＤＮＡマーカーのうちから１つ以上について遺伝子型を同定し、同定した遺伝子型がグループＩ型の遺伝子型に一致する被検大麦を選抜することによって、ＢＤＡＩ−１含有量の高い大麦を選抜することができる。
【００１２】
上述した選抜方法は、大麦組織中のＢＤＡＩ−１含有量と相関する新規なＤＮＡマーカーを利用しているため、産地や産年度による自然環境の変動の影響を受けることなく、ＢＤＡＩ−１含有量の高い大麦を信頼性よく選抜することができる。また、遺伝子型の同定には、分子生物学的手法を採用できるため、上述した選抜方法は、簡易な操作で多検体を短時間で処理できる。これにより、大麦育種現場で採用することができ、効率よく所望の形質を有する大麦を選抜することが可能となる。また、大麦育種の初期段階（例えば、雑種第２世代）での選抜も可能となる。
【００１３】
上記（ａ）及び（ｂ）の塩基配列は、それぞれ配列番号１及び配列番号２で特定される塩基配列とすることができる。すなわち、上記ＤＮＡマーカーは、配列番号１で特定される塩基配列の第９番目の塩基（Ｍ１；図１に示した「Ｍ１」に相当する。以下同様である。）、第３２番目の塩基（Ｍ２）、第６０番目の塩基（Ｍ３）、第１２４番目の塩基（Ｍ４）、第１６０番目の塩基（Ｍ５）、第２０８番目の塩基（Ｍ６）、第２２０番目の塩基（Ｍ７）、第３１９〜３２０番目の塩基の間（Ｍ８；図１中のギャップに対応する）、第４０２〜４２２番目の塩基（Ｍ９）、第４７５番目の塩基（Ｍ１０）、第４９０〜４９１番目の塩基の間（Ｍ１１；図１中のギャップに対応する）、第５５７〜５５８番目の塩基の間（Ｍ１２；図１中のギャップに対応する）、第１０９８番目の塩基（Ｍ１３）、第１１８１番目の塩基（Ｍ１４）、第１１９７番目の塩基（Ｍ１５）、第１２２６番目の塩基（Ｍ１６）、第１２３３番目の塩基（Ｍ１７）、第１２３８番目の塩基（Ｍ１８）、又は第１２７４番目の塩基（Ｍ１９）に相当する塩基部位とすることができる。
【００１４】
上記選抜方法において、遺伝子型の同定は、Ｃｌｅａｖｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＣＡＰＳ）法、又はギャップを利用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて行うことが好ましい。ＣＡＰＳ法、又はギャップを利用したＰＣＲ法を用いて遺伝子型の同定を行うことにより、より一層簡易な操作で、かつより一層短時間で多検体を処理することができる。また、処理する検体数をより多くすることも可能となる。したがって、より一層大麦育種への応用に適した選抜方法になる。
【００１５】
ＣＡＰＳ法による遺伝子型の同定は、例えば、配列番号１で特定される塩基配列の第６０番目の塩基、第１２４番目の塩基、第１６０番目の塩基、第２２０番目の塩基、第４７５番目の塩基、第４９０〜４９１番目の塩基の間、第１１８１番目の塩基又は第１２３８番目の塩基に相当する塩基部位をＤＮＡマーカーとし、被検大麦のゲノムＤＮＡを鋳型として、上記ＤＮＡマーカーの少なくとも１つを含むポリヌクレオチドをＰＣＲ法により増幅するステップと、上記ポリヌクレオチドを、認識配列中に当該ＤＮＡマーカーの少なくとも１つを含む１種又は２種以上の制限酵素により消化するステップと、上記制限酵素により消化して得られるＤＮＡ断片の数及び／又はサイズに基づいて、遺伝子型を同定するステップと、を含む方法により行うことができる。
【００１６】
ＣＡＰＳ法による遺伝子型の同定は、配列番号１で特定される塩基配列の第４９０〜４９１番目の塩基の間に相当する塩基部位をＤＮＡマーカーとし、かつＡｆａＩ、ＲｓａＩ又はＴａｑＩから選択される制限酵素を用いる方法、又は、配列番号１で特定される塩基配列の第１１８１番目の塩基に相当する塩基部位をＤＮＡマーカーとし、かつＡｃｃＩ、Ｂｓｔ１１０７Ｉ又はＤｄｅＩから選択される制限酵素を用いる方法により行うことが好ましい。
【００１７】
ギャップを利用したＰＣＲ法による遺伝子型の同定は、例えば、配列番号１で特定される塩基配列の第３１９〜３２０番目の塩基の間、又は第４０２〜４２２番目の塩基に相当する塩基部位をＤＮＡマーカーとし、被検大麦のゲノムＤＮＡを鋳型として、少なくとも一方のプライマーが当該ＤＮＡマーカーの少なくとも一部にアニーリングする塩基配列を有するプライマー対により、ＰＣＲを行うステップと、ＰＣＲによる増幅産物の有無に基づいて、遺伝子型を同定するステップと、を含む方法により行うことができる。
【００１８】
ギャップを利用したＰＣＲ法による遺伝子型の同定は、配列番号１で特定される塩基配列の第４０２〜４２２番目の塩基に相当する塩基部位をＤＮＡマーカーとする方法で行うことが好ましい。また、上記プライマー対として、配列番号１３で特定される塩基配列を有するプライマーと、配列番号１４で特定される塩基配列を有するプライマーとからなる、プライマー対を用いることがより好ましい。
【００１９】
本発明はまた、上記選抜方法により選抜された大麦同士を交配し、泡持ちの優れる麦芽発泡飲料用の交配後代系統の大麦を得る方法、及び上記選抜方法により選抜された大麦同士を交配して得ることのできる交配後代系統の大麦を提供する。
【００２０】
本発明の選抜方法により選抜された大麦は、麦芽発泡飲料の泡持ちに影響を及ぼすＢＤＡＩ−１遺伝子座中のＤＮＡマーカーの遺伝子型が一致している。そして、これらの大麦同士を交配することにより得られる交配後代系統の大麦は、上記ＤＮＡマーカーに関して両親と同じ遺伝子型を有することから、ＢＤＡＩ−１含有量の高い大麦となる。
【００２１】
麦芽発泡飲料の泡持ちは、例えば、２０℃の麦芽発泡飲料を泡注ぎ出し機で標準グラスに注いで生じる泡の高さが３０ｍｍ降下するのに要する時間（秒）（ＮＩＢＥＭ値）を判定基準とすることができる。
【００２２】
本発明はまた、上記選抜方法によって選抜された大麦、又は上記交配後代系統の大麦を製麦する製麦工程を含む麦芽製造方法を提供する。また、該麦芽製造方法により得ることのできる麦芽を提供する。
【００２３】
本発明の麦芽は、上記選抜方法により選抜された大麦又は上記交配後代系統の大麦を製麦して得られるものであるため、ＢＤＡＩ−１含有量が高く、泡持ちの優れる麦芽発泡飲料の原料として有用である。
【００２４】
本発明はまた、仕込工程を少なくとも備え、上記仕込工程において、原料の少なくとも一部として、上記選抜方法により選抜された大麦、若しくは上記交配後代系統の大麦、又は上記麦芽を使用する、麦芽発泡飲料の製造方法を提供する。また、該製造方法により得ることのできる麦芽発泡飲料を提供する。
【００２５】
本発明の麦芽発泡飲料の製造方法では、原料の少なくとも一部として、上記選抜方法により選抜された大麦、上記交配後代系統の大麦又は上記麦芽を使用するため、泡持ちの優れる麦芽発泡飲料を製造することができる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の選抜方法は、簡易な操作で多検体を短時間で処理することができ、かつゲノムＤＮＡ情報に基づく選抜方法であるためＢＤＡＩ−１含有量の高い大麦を信頼性よく選抜することができる。したがって、大麦育種の初期段階での選抜に応用することができる。
【００２７】
麦芽発泡飲料用の大麦育種では、育種した品種には大麦、麦芽、麦芽発泡飲料（例えば、ビール等）の全ての面において高い品質が求められる。しかしながら、例えば、ビール品質の評価には一定量以上の試料が必要となるため、育種過程後期の段階でしか評価できないのが現状である。例えば泡持ちに関しては、醸造試験において泡持ちの良し悪しが判断されることとなるが、醸造試験に到達するまでにおよそ１０年の歳月を要するのが一般的である。そのため育種の初期段階で泡持ちに関する性質について大麦の選抜ができる本発明の選抜方法は非常に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】配列番号１及び配列番号２で特定される塩基配列の多重整列結果である。
【図２】実施例２における電気泳動の結果を示す写真である。
【図３】実施例２における電気泳動の結果を示す写真である。
【図４】グループＩ型及びグループＩＩ型の大麦のＢＤＡＩ−１含有量を測定した結果を示すグラフである。
【図５】グループＩ型及びグループＩＩ型の大麦から得られた麦芽を用いて醸造したビールのＮＩＢＥＭ値を示すグラフである。
【図６】実施例４における電気泳動の結果を示す写真である。
【図７】実施例５における電気泳動の結果を示す写真である。
【図８】実施例５における電気泳動の結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
〔大麦の選抜方法〕
本発明の選抜方法は、ＢＤＡＩ−１含有量の高い大麦を選抜することができる。上記選抜方法では、まず、グループＩ型及びグループＩＩ型のＢＤＡＩ−１遺伝子座周辺領域の塩基配列を多重整列することにより特定されるＤＮＡマーカーを得る。被検大麦において、上記ＤＮＡマーカーについて１つ以上の遺伝子型を同定し、その遺伝子型が、グループＩ型の遺伝子型と一致する被検大麦をＢＤＡＩ−１含有量の高い大麦として選抜する。グループＩＩ型の遺伝子型と一致しない被検大麦をＢＤＡＩ−１含有量の高い大麦として選抜してもよい。
【００３０】
ＢＤＡＩ−１遺伝子座周辺領域とは、ＢＤＡＩ−１遺伝子のエキソン、イントロンが存在する領域のみならず、転写制御に関わるＤＮＡ配列が存在する領域及びその周辺領域をも含むものである。具体的には、ＢＤＡＩ−１遺伝子座周辺領域として、開始コドンに相当するＡＴＧ配列の上流５ｃＭ以内の範囲とすることができ、１ｃＭ以内の範囲とすることが好ましく、０．０１ｃＭ以内の範囲とすることがより好ましく、０．０００１ｃＭ以内の範囲とすることが更に好ましい。また、終止コドンに相当するＴＡＧ配列の下流５ｃＭ以内の範囲とすることができ、１ｃＭ以内の範囲とすることが好ましく、０．０１ｃＭ以内の範囲とすることがより好ましく、０．０００１ｃＭ以内の範囲とすることが更に好ましい。
【００３１】
ここで、ｃＭ（センチモルガン）とは、遺伝学的方法によって定まる染色体上での遺伝子間の距離を表す単位である。具体的には、減数分裂１回当たり、相同染色体間に平均１回の交叉が起こる距離を１Ｍとし、その１／１００の距離を１ｃＭという。
【００３２】
すなわち、ＢＤＡＩ−１遺伝子座から５ｃＭ以内であれば、組換えが生じる確率が５％以下となり、１ｃＭ以内であればその確率が１％以下となり、０．０１ｃＭ以内であればその確率が０．０１％以下となり、更に０．０００１ｃＭ以内であればその確率が０．０００１％以下となる。したがって、この範囲内にあるＤＮＡマーカーとＢＤＡＩ−１含有量との相関関係は、高い確率で保たれることになる。すなわち、上記ＤＮＡマーカーをこの範囲内で設定することで、統計上有意に、ＢＤＡＩ−１含有量に基づいて被検大麦を選抜することができる。
【００３３】
ＢＤＡＩ−１遺伝子座周辺領域の塩基配列情報は、例えば、大麦から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法によりＢＤＡＩ−１遺伝子座周辺領域からポリヌクレオチドを増幅し、増幅したポリヌクレオチドを必要に応じて精製し、このポリヌクレオチドの塩基配列のシークエンス解析により決定することで、得ることができる。
【００３４】
ゲノムＤＮＡは大麦のどの部位から抽出されてもよく、例えば、大麦の葉、茎、根、種子等をＤＮＡソースとして利用することができる。これらの組織からのゲノムＤＮＡ抽出方法としては、植物のＤＮＡ抽出に汎用されている抽出方法を用いることができる。また、市販されているＤＮＡ抽出キット類も好適に使用することができる。
【００３５】
抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲに用いるプライマー対の塩基配列は、ＮＣＢＩ、Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ等のデータベースに登録されているＢＤＡＩ−１遺伝子座周辺領域に相当するゲノムの（部分）塩基配列を入手し、その塩基配列情報に基づいて設計することができる。各プライマーの塩基配列長、塩基配列、ＧＣ含有量等のパラメーター設定については、当業者の通常の試行錯誤の範囲内であり、適宜決定され得る。また、ＰＣＲ法、増幅したポリヌクレオチドの精製法、シークエンス解析法については、当該技術分野で汎用されている手法が適用可能であり、常法に従って実施することができる。
【００３６】
また、データベースに登録されている（部分）塩基配列を基にＢＤＡＩ−１遺伝子配列特異的プライマーを設計し、ランダムプライマーと組み合わせてＴｈｅｒｍａｌ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  Ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ（ＴＡＩＬ）ＰＣＲ法等を実施することによって、塩基配列が未知である隣接領域に対応するポリヌクレオチドを増幅することができる。増幅されたポリヌクレオチドのシークエンス解析により、データベースに登録されていない塩基配列情報の取得が可能である。塩基配列が未知の隣接領域を取得する方法としては、ＴＡＩＬ  ＰＣＲ法以外にも、例えば、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ等の方法が挙げられる。
【００３７】
上記ＤＮＡマーカーは、グループＩ型及びグループＩＩ型のＢＤＡＩ−１遺伝子座周辺領域の塩基配列を多重整列することにより特定することができる。
【００３８】
グループＩ型のＢＤＡＩ−１遺伝子座周辺領域の塩基配列は、代表的には大麦ＣＤＣ  Ｋｅｎｄａｌｌ種を用いて、上述した塩基配列情報を決定する方法により得ることができる。また、ＣＤＣ  Ｋｅｎｄａｌｌ種以外の大麦種を用いることも可能であり、そのような大麦種として、これらに限定されるものではないが、ＣＤＣ  Ｃｏｐｅｌａｎｄ、Ｓｃａｒｌｅｔｔ種等を例示できる。
【００３９】
グループＩＩ型のＢＤＡＩ−１遺伝子座周辺領域の塩基配列は、代表的には大麦りょうふう種を用いて、上述した塩基配列情報を決定する方法により得ることができる。また、りょうふう種以外の大麦種を用いることも可能であり、そのような大麦種として、これらに限定されるものではないが、ＣＤＣ  Ｒｅｓｅｒｖｅ、Ｓｃｈｏｏｎｅｒ種等を例示できる。
【００４０】
本明細書において、多重整列（マルチプルアラインメント）とは、複数の塩基配列を相互に比較可能なものにするため、一致する塩基が可能な限り多くなるように、適宜空白（ギャップ）を入れて塩基配列を整列させることをいう。多重整列は、公知の多重整列作成プログラム（Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ）を用いて行うことができる。
【００４１】
多重整列の結果、グループＩ型及びグループＩＩ型間で塩基種が一致しない塩基部位をＤＮＡマーカーとして特定する。本発明においては、上記ギャップ部分もＤＮＡマーカーとして特定する。
【００４２】
図１は、配列番号１及び配列番号２で特定される塩基配列の多重整列結果である。配列番号１で特定される塩基配列（図１中、「ＧｒｏｕｐＩ」と表示する。）はグループＩ型の塩基配列である。配列番号２で特定される塩基配列（図１中、「ＧｒｏｕｐＩＩ」と表示する。）はグループＩＩ型の塩基配列である。図１中、「＊」を付した塩基部位は、上記２つの塩基配列が一致する塩基部位を示し、「−」はギャップを表す。
【００４３】
図１より、ＤＮＡマーカーの一例として、配列番号１で特定される塩基配列（グループＩの塩基配列）の第９番目の塩基（Ｍ１）、第３２番目の塩基（Ｍ２）、第６０番目の塩基（Ｍ３）、第１２４番目の塩基（Ｍ４）、第１６０番目の塩基（Ｍ５）、第２０８番目の塩基（Ｍ６）、第２２０番目の塩基（Ｍ７）、第３１９〜３２０番目の塩基の間（Ｍ８；図１中のギャップに対応する）、第４０２〜４２２番目（Ｍ９）、第４７５番目の塩基（Ｍ１０）、第４９０〜４９１番目の塩基の間（Ｍ１１；図１中のギャップに対応する）、第５５７〜５５８番目の塩基の間（Ｍ１２；図１中のギャップに対応する）、第１０９８番目の塩基（Ｍ１３）、第１１８１番目の塩基（Ｍ１４）、第１１９７番目の塩基（Ｍ１５）、第１２２６番目の塩基（Ｍ１６）、第１２３３番目の塩基（Ｍ１７）、第１２３８番目の塩基（Ｍ１８）、又は第１２７４番目の塩基（Ｍ１９）に相当する塩基部位を特定することができる。
【００４４】
被験大麦においてＤＮＡマーカーの遺伝子型を同定する方法としては、当該ＤＮＡマーカーの塩基種を判別する方法を用いることができる。具体的には、例えば、Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＲＦＬＰ）法、シークエンス法、ＣＡＰＳ法及びギャップを利用したＰＣＲ法等が挙げられる。中でも、操作がより簡易で、より多検体を処理でき、低コストで、かつより短時間で判別できるとの観点から、ＣＡＰＳ法及びギャップを利用したＰＣＲ法が好ましい。
【００４５】
ＣＡＰＳ法による塩基種の判別は、例えば、次のように行うことができる。まず、上記ＤＮＡマーカーの少なくとも１つを含むポリヌクレオチドを増幅可能なプライマー対を用い、被検大麦のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行う。得られた増幅ＤＮＡ断片（ＰＣＲ産物）を、認識配列中に上記ＤＮＡマーカーを含む１種又は２種以上の制限酵素により消化処理する。そして、制限酵素処理ＤＮＡ断片の数及び／又はサイズを解析し、制限酵素の認識配列の有無を判定する。これにより、当該ＤＮＡマーカーの塩基種（例えば、「Ａ（アデニン）」又は「Ａ以外」）を判別でき、遺伝子型を同定することができる。
【００４６】
ＣＡＰＳ法には、例えば、上記ＤＮＡマーカーのうち、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ７、Ｍ１０、Ｍ１１、Ｍ１４及びＭ１８を用いることができる。このとき、制限酵素としては、それぞれのＤＮＡマーカーに対して、例えば、以下に示すものを使用することができる。
Ｍ３  ：ＡｆａＩ、ＢａｎＩ、ＫｐｎＩ、ＮｃｏＩ、ＲｓａＩ又はＳｔｙＩ
Ｍ４  ：ＡｃｃＩ又はＢｓｔ１１０７Ｉ
Ｍ５  ：ＡｃｃＩＩ又はＨｈａＩ
Ｍ７  ：ＭｎｌＩ
Ｍ１０：ＦｏｋＩ又はＰｓｔＩ
Ｍ１１：ＡｆａＩ、ＲｓａＩ又はＴａｑＩ
Ｍ１４：ＡｃｃＩ、Ｂｓｔ１１０７Ｉ又はＤｄｅＩ
Ｍ１８：ＡｃｃＩＩ、ＡｖｉＩＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＦｓｐＩ又はＨｈａＩ
【００４７】
被検大麦からのゲノムＤＮＡの抽出方法は、特に限定されるものではなく、常用される方法を一般に適用可能である。また、市販されているキット類も好適に使用可能である。一方、ゲノムＤＮＡは被検大麦の葉、茎、根、種子等の部位から抽出されてもよいが、育種段階での選抜を考慮すれば、葉から抽出するのが好ましい。葉から抽出することにより、早い段階で望ましい形質を有する大麦を選抜することができる。
【００４８】
上記ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲに用いるプライマー対は、例えば、ＤＮＡマーカーを特定する際に決定したＢＤＡＩ−１遺伝子座周辺領域の塩基配列を基に設計すればよい。該プライマーにより増幅されるポリヌクレオチドの長さとしては、制限酵素で消化した後に、ＤＮＡ断片をサイズ分画によって検出することを考慮すれば、上限値は、５０００ｂｐとするのが好ましく、より好ましくは３０００ｂｐであり、更に好ましくは２０００ｂｐである。同様に下限値は、１００ｂｐが好ましく、より好ましくは２００ｂｐであり、更に好ましくは３００ｂｐである。ＰＣＲ法に用いるポリメラーゼの種類を当業者によく知られたものの中から適宜選択することにより、上述した長さを有するポリヌクレオチドを増幅することができる。
【００４９】
ＰＣＲに用いるプライマー及びプライマー対としては、特に制限されるものではないが、後述の実施例において例示するプライマー及びプライマー対を好適に用いることができる。
【００５０】
制限酵素による反応は、各制限酵素に至適な緩衝液を用い、至適な反応温度において実施することができる。また、制限酵素反応後のＤＮＡ断片をサイズ分画して、制限酵素処理ＤＮＡ断片の数及び／又はサイズを解析する方法としては、当業者に常用されるアガロースゲル電気泳動による方法を好適に採用することができる。また、公知の適切なカラムを用いたＨＰＬＣ法により、ＤＮＡ断片をサイズ分画して検出する方法であってもよい。
【００５１】
ギャップを利用したＰＣＲ法による塩基種の判別は、例えば、ギャップ部分として特定したＤＮＡマーカーを利用して、次のように行うことができる。少なくとも一方のプライマーが上記ＤＮＡマーカーにアニーリングする塩基配列を有するプライマー対を用い、被検大麦のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行う。上記プライマー対は、少なくとも一方のプライマーを、当該ＤＮＡマーカーとなるギャップ部分の塩基配列を含むように設計すればよい。
【００５２】
ここで「ギャップ部分の塩基配列」とは、グループＩ型が有する塩基配列をグループＩＩ型が有しない場合（グループＩＩ型にギャップがある場合）、グループＩ型が有する当該塩基配列のことをいい、グループＩＩ型が有する塩基配列をグループＩ型が有しない場合（グループＩ型にギャップがある場合）、グループＩＩ型が有する当該塩基配列のことをいう。
【００５３】
次に、例えば、ゲル電気泳動によりＰＣＲ産物の有無を判定する。これにより、当該ＤＮＡマーカーの塩基種（例えば、ギャップの有無）を判別でき、遺伝子型を同定することができる。このＰＣＲ法においては、ＰＣＲ産物が得られる陽性対照、すなわち、グループＩ型（又はＩＩ型）にギャップがある場合はグループＩＩ型（又はＩ型）の大麦種をそれぞれ陽性対照として用いることにより、判定をより簡便に行うことができる。
【００５４】
ギャップを利用したＰＣＲ法には、例えば、上記ＤＮＡマーカーのうち、Ｍ８及びＭ９の少なくとも１つを用いることができる。
【００５５】
ギャップを利用したＰＣＲ法に用いるプライマー及びプライマー対としては、上記の条件を満たすものであれば特に制限されないが、例えば、配列番号１３で特定される塩基配列を有するプライマーと、配列番号１４で特定される塩基配列を有するプライマーと、からなる、プライマー対が挙げられる。
【００５６】
〔交配後代系統の大麦〕
本発明の交配後代系統の大麦は、上記選抜方法により選抜された大麦同士を交配して得ることができる。上記選抜方法により選抜された大麦は、ＢＤＡＩ−１含有量が高いグループＩ型の大麦であることから、それらを交配して得られる交配後代系統の大麦もＢＤＡＩ−１含有量が高いグループＩ型の大麦となる。
【００５７】
〔麦芽製造方法〕
本発明の麦芽製造方法は、上記選抜方法により選抜された大麦又はその交配後代系統の大麦を用いて麦芽を得る製麦工程を含む方法である。ＢＤＡＩ−１含有量の高い大麦として選抜された大麦又はその交配後代系統の大麦を用いて製麦が行われることから、この方法により得られる麦芽はＢＤＡＩ−１含有量の高いものとなる。製麦は公知の方法で行うことができ、例えば、浸麦度が４０％〜４５％に達するまで浸麦後、１０〜２０℃で３〜６日間発芽させ、焙燥することによって麦芽を得ることができる。
【００５８】
〔麦芽発泡飲料の製造方法〕
本発明の麦芽発泡飲料の製造方法は、仕込工程を少なくとも備え、上記仕込工程において、原料の少なくとも一部として、上記選抜方法により選抜された大麦、上記交配後代系統の大麦又は上記麦芽を使用するものである。これらの大麦及び麦芽はＢＤＡＩ−１含有量が高いため、本発明の麦芽発泡飲料の製造方法により、泡持ちの優れる麦芽発泡飲料を得ることができる。
【００５９】
麦芽発泡飲料は、大麦又は麦芽を原料の一部として製造される発泡性の飲料であればよい。麦芽発泡飲料としては、例えば、仕込工程で得られた麦汁を酵母により発酵させた麦芽発酵飲料、及び仕込工程で得られた麦汁に炭酸を含ませた麦芽炭酸飲料が挙げられる。具体的には、麦芽発酵飲料としては、ビール及び発泡酒等が挙げられ、麦芽炭酸飲料としては、いわゆるノンアルコールビール及びノンアルコール発泡酒等が挙げられる。
【００６０】
麦芽発酵飲料は、例えば、仕込工程と、発酵工程とを少なくとも備える製造方法により製造することができる。
【００６１】
麦芽炭酸飲料は、例えば、仕込工程と、発泡性付与工程とを少なくとも備える製造方法により製造することができる。また、必要に応じて他の原料を混合する混合工程を更に備えていてもよい。
【００６２】
仕込工程は、麦芽を糖化させて麦汁を得る工程である。より具体的には、麦芽や大麦を含む原料と仕込用水とを混合し、得られた混合物を加温することにより麦芽や大麦を糖化させ、糖化された麦芽や大麦から麦汁を採取する工程である。
【００６３】
仕込工程で使用される麦芽としては、製麦工程において大麦に水分と空気を与えて発芽させ、乾燥して幼根を取り除いたものが好ましい。麦芽は、麦汁製造に必要な酵素源であると同時に、糖化の原料として主要なデンプン源となる。麦芽発泡飲料特有の香味と色素を与えるために、発芽させた麦芽を焙燥したものを麦汁製造に使用するのが好ましい。また、原料の一部として、麦芽以外に、大麦、コーンスターチ、コーングリッツ、米、糖類等の副原料を添加してもよい。また、原料の一部として、一般大麦より調製されたモルトエキス、大麦分解物、大麦加工物等を使用してもよい。
【００６４】
仕込用水は、製造する麦芽発泡飲料に応じて好適な水を選択すればよい。また、糖化は一般的な条件で行えばよい。こうして得られた麦芽糖化液をろ過した後、香り、苦味等を付与できる原料（ホップ、ハーブ等）を添加して煮沸を行い、それを冷却することによって冷麦汁が得られる。
【００６５】
発酵工程は、仕込工程で得られた冷麦汁に酵母を添加して発酵させ、麦芽発酵飲料を得る工程である。ここで用いられる酵母としては、例えば、サッカロミセス・パトリアヌス、サッカロミセス・セレビシェ、サッカロミセス・ウバルム等が挙げられる。
【００６６】
発泡性付与工程は、仕込工程で得られた冷麦汁に炭酸を含ませ、麦芽炭酸飲料を得る工程である。炭酸を含ませる方法としては、例えば、炭酸水を冷麦汁に加える方法、炭酸ガスを冷麦汁に吹き込む方法を採用することができる。
【００６７】
混合工程は、冷麦汁に他の原料を添加し混合する工程である。混合工程は発泡性付与工程の前に実施することが好ましい。添加する他の原料としては、例えば、糖類、食物繊維、酸味料、苦味料、色素、香料及び甘味料が挙げられる。
【実施例】
【００６８】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６９】
（実施例１：ＢＤＡＩ−１遺伝子座領域の未知配列の決定及び多型解析）
大麦ＣＤＣ  Ｋｅｎｄａｌｌ種、ＣＤＣ  Ｃｏｐｅｌａｎｄ種、Ｓｃａｒｌｅｔｔ種、りょうふう種、ＣＤＣ  Ｒｅｓｅｒｖｅ種及びＳｃｈｏｏｎｅｒ種の６品種を用いた。
【００７０】
［ゲノムＤＮＡの抽出］
上述の大麦種それぞれについて、以下の方法でゲノムＤＮＡを抽出した。葉に抽出バッファー（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２５０ｍＭ  ＮａＣｌ，２５ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．５）とジルコニアボールを添加し、振とうした後、６０℃で３０分間保持した。遠心分離し、得られた上清に等量のイソプロパノールを添加してＤＮＡを析出させた。遠心分離し、得られた沈殿に７０％エタノールを添加して、再び遠心分離した。得られたＤＮＡの沈殿を滅菌水に溶解させ、このＤＮＡ溶液をＰＣＲの鋳型に用いた。
【００７１】
［ＴＡＩＬ  ＰＣＲ法］
ＢＤＡＩ−１遺伝子座領域の未知配列を取得するため、ＴＡＩＬ  ＰＣＲ法を行った。ＴＡＩＬ  ＰＣＲ法には以下のプライマーを用いた。なお、特異的プライマー１〜３はＮＣＢＩデータベースに登録されているＢＤＡＩ−１遺伝子の塩基配列情報（ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＪ００９８０１）に基づいて設計した。
【００７２】
ランダムプライマー（配列番号３）：
５’−ＧＴＮＣＧＡ（Ｇ／Ｃ）（Ａ／Ｔ）ＣＡＮＡ（Ａ／Ｔ）ＧＴＴ−３’
特異的プライマー１（配列番号４）：
５’−ＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＣＴＧＴＴＡＴＣＡＣＴＣＣＧ−３’
特異的プライマー２（配列番号５）：
５’−ＧＣＧＣＣＣＧＴＣＡＴＴＧＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＧ−３’
特異的プライマー３（配列番号６）：
５’−ＣＣＡＣＡＴＴＧＣＴＣＣＣＡＴＴＣＣＣＡＴＣＴＡＣ−３’
特異的プライマー２−１（配列番号７）：
５’−ＧＴＡＴＡＴＴＴＴＧＴＧＴＡＣＡＧＧＧＣＧＧＧＧＡ−３’
特異的プライマー２−２（配列番号８）：
５’−ＣＡＧＧＧＣＧＧＧＧＡＣＡＧＡＡＡＴＴＧＴＴＴＣ−３’
特異的プライマー２−３（配列番号９）：
５’−ＣＴＴＴＧＧＴＴＣＧＧＧＣＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡ−３’
【００７３】
まず、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ランダムプライマーと特異的プライマー１を用い、以下に示すＰＣＲプログラムに従って、１回目のＰＣＲを行った。
９４℃で１分間保持後、更に９５℃で１分間保持した。次に、９４℃で１分熱変性し、６５℃で１分間アニーリングした後、７２℃で３分間伸長反応を行うサイクルを５サイクル実施し、９４℃で１分間熱変性、３０℃で３分間アニーリング、７２℃で３分間伸長反応を行うサイクルを１サイクル実施した。次に、９４℃で３０秒間熱変性、６８℃で１分間アニーリング、７２℃で３分間伸長反応、９４℃で３０秒間熱変性、６８℃で１分間アニーリング、７２℃で３分間伸長反応、９４℃で３０秒間熱変性、４４℃で１分間アニーリング、７２℃で３分間伸長反応、という９ステップで構成されるサイクルを、１５サイクル実施した。最後に７２℃で５分間伸長反応を実施した。
【００７４】
１回目のＰＣＲで得られたＰＣＲ産物を鋳型とし、ランダムプライマーと特異的プライマー２を用い、以下に示すＰＣＲプログラムに従って、２回目のＰＣＲを行った。
９４℃で３０秒間熱変性、６８℃で１分間アニーリング、７２℃で３分間伸長反応、９４℃で３０秒間熱変性、６８℃で１分間アニーリング、７２℃で３分間伸長反応、９４℃で３０秒間熱変性、４４℃で１分間アニーリング、７２℃で３分間伸長反応、という９ステップで構成されるサイクルを、１３サイクル実施した。最後に７２℃で５分間伸長反応を実施した。
【００７５】
２回目のＰＣＲ産物を鋳型とし、ランダムプライマーと特異的プライマー３を用い、２回目のＰＣＲと同様のＰＣＲプログラムに従って、３回目のＰＣＲを行った。
【００７６】
３回目のＰＣＲで得られたＰＣＲ産物の電気泳動を行い、出現したバンドを切り出し、精製後、塩基配列を解析した。これにより、ＢＤＡＩ−１遺伝子の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）から上流約８４０ｂｐの塩基配列を新規に取得した。さらに上流の塩基配列を取得するため、この新規な塩基配列の情報に基づいて、特異的プライマー２−１、２−２及び２−３を設計した。特異的プライマー１、２及び３に代えて特異的プライマー２−１、２−２及び２−３をそれぞれ用いて、上述したＴＡＩＬ  ＰＣＲ法を再度行った。この結果、さらに約３７０ｂｐ上流の塩基配列を新規に取得した。
【００７７】
［ＢＤＡＩ−１遺伝子座領域の塩基配列の多重整列］
大麦ＣＤＣ  Ｋｅｎｄａｌｌ種、ＣＤＣ  Ｃｏｐｅｌａｎｄ種、Ｓｃａｒｌｅｔｔ種、りょうふう種、ＣＤＣ  Ｒｅｓｅｒｖｅ種及びＳｃｈｏｏｎｅｒ種の６品種について、上記で決定した塩基配列を多重整列した。多重整列の結果、これらの大麦品種は塩基配列によって２つのグループ（グループＩ型及びグループＩＩ型）に分類できることが判明した。
【００７８】
グループＩ型には、ＣＤＣ  Ｋｅｎｄａｌｌ、ＣＤＣ  Ｃｏｐｅｌａｎｄ及びＳｃａｒｌｅｔｔの３品種が分類され、グループＩＩ型には、りょうふう、ＣＤＣ  Ｒｅｓｅｒｖｅ及びＳｃｈｏｏｎｅｒの３品種が分類された。同一のグループに分類された大麦品種は、同一の塩基配列を有していた。なお、配列番号１はグループＩ型のＢＤＡＩ−１遺伝子座領域の塩基配列であり、配列番号２はグループＩＩ型のＢＤＡＩ−１遺伝子座領域の塩基配列である。
【００７９】
［ＤＮＡマーカーの特定］
図１に示した多重整列の結果、グループＩ型及びグループＩＩ型間で塩基種が一致しない塩基部位が合計１９ヶ所存在しており、これらをＤＮＡマーカーとして特定した。具体的には、配列番号１で特定される塩基配列（グループＩの塩基配列）の第９番目の塩基（Ｍ１）、第３２番目の塩基（Ｍ２）、第６０番目の塩基（Ｍ３）、第１２４番目の塩基（Ｍ４）、第１６０番目の塩基（Ｍ５）、第２０８番目の塩基（Ｍ６）、第２２０番目の塩基（Ｍ７）、第３１９〜３２０番目の塩基の間（Ｍ８；図１中のギャップに対応する）、第４０２〜４２２番目（Ｍ９）、第４７５番目の塩基（Ｍ１０）、第４９０〜４９１番目の塩基の間（Ｍ１１；図１中のギャップに対応する）、第５５７〜５５８番目の塩基の間（Ｍ１２；図１中のギャップに対応する）、第１０９８番目の塩基（Ｍ１３）、第１１８１番目の塩基（Ｍ１４）、第１１９７番目の塩基（Ｍ１５）、第１２２６番目の塩基（Ｍ１６）、第１２３３番目の塩基（Ｍ１７）、第１２３８番目の塩基（Ｍ１８）、又は第１２７４番目の塩基（Ｍ１９）に相当する塩基部位である。
【００８０】
（実施例２：ＣＡＰＳマーカーの構築）
ＤＮＡマーカーＭ１〜Ｍ１９のうち、グループＩ型及びグループＩＩ型のいずれかに制限酵素の認識配列が存在するものを下記表１にまとめた。
【表１】
0005989345.tif 000002
【００８１】
表１から明らかなように、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ７、Ｍ１０、Ｍ１１、Ｍ１４及びＭ１８は、制限酵素で消化して得られるＤＮＡ断片の数及びサイズのいずれか一方又は両方に基づいて、グループＩ型及びグループＩＩ型を峻別できる可能性がある。そこでＭ１１及びＭ１４について、ＣＡＰＳマーカーの構築を行った。
【００８２】
［Ｍ１１を利用したＣＡＰＳマーカー］
塩基配列情報からグループＩ型に分類された大麦とグループＩＩ型に分類された大麦を用いて、ＣＡＰＳマーカーの検証を行った。
【００８３】
ＢＤＡＩ−１遺伝子の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の上流１１８６〜１１６２ｂｐ付近の塩基配列にアニーリングするＢＤ−Ｔ１４プライマーと、終止コドン（ＴＡＧ）の下流８５〜１０６ｂｐ付近の塩基配列にアニーリングするＢＤ２−２プライマーを設計した。このプライマーセットを用い、各品種のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行った。プライマー配列及びＰＣＲ条件は以下のとおりである。
【００８４】
ＢＤ−Ｔ１４プライマー（配列番号１０）：
５’−ＣＧＴＧＡＣＧＧＡＣＣＧＣＴＡＡＡＴＣＴＡＧＡＣ−３’
ＢＤ２−２プライマー（配列番号１１）：
５’−ＣＡＴＧＡＣＧＣＡＴＧＣＧＴＣＧＣＡＴＡＧＧ−３’
【００８５】
９４℃で１分間熱変性、６２．５℃で１分間アニーリング及び７２℃で５分間伸長反応の３ステップで構成されるサイクルを、３５サイクル実施した。最後に７０℃で５分間伸長反応を実施した。
【００８６】
得られたＰＣＲ産物に制限酵素ＴａｑＩを添加して一晩反応させた。その後、電気泳動を行い、出現したバンドパターンを比較した。図２に電気泳動で得られたバンドパターンの写真を示す。図２中、「Ｉ」又は「ＩＩ］と記載したレーンは、それぞれ、グループＩ型又はグループＩＩ型の大麦に対応する。グループＩ型及びグループＩＩ型は、増幅ＤＮＡ断片中にそれぞれ３個及び２個のＴａｑＩ認識配列を有する。この違いにより、出現するバンドパターンに違いが見られた（図２）。この結果から、Ｍ１１をＣＡＰＳマーカーとして利用できることが示された。
【００８７】
［Ｍ１４を利用したＣＡＰＳマーカー］
ＢＤ−Ｔ１４プライマーに代えてＢＤ２−３プライマーを用いたこと、制限酵素ＴａｑＩに代えて制限酵素ＤｄｅＩを用いたこと以外は上記と同様にＣＡＰＳマーカーの検証を行った。
【００８８】
ＢＤ２−３プライマー（配列番号１２）：
５’−ＧＴＡＧＡＴＧＧＧＡＡＴＧＧＧＡＧＣＡＡＴＧＴＧＧ−３’
ＢＤ２−２プライマー（配列番号１１）：
５’−ＣＡＴＧＡＣＧＣＡＴＧＣＧＴＣＧＣＡＴＡＧＧ−３’
【００８９】
図３に電気泳動で得られたバンドパターンの写真を示す。図３中、レーン１及び３〜６はグループＩ型の大麦に対応しており、レーン２、７及び８はグループＩＩ型の大麦に対応している。図３に示した結果のとおり、出現するバンドパターンによってグループＩ型とグループＩＩ型を判別することができた。Ｍ１４もＣＡＰＳマーカーとして利用できることが示された。
【００９０】
（実施例３：ＤＮＡマーカーの検証）
上述のＭ１１を利用したＣＡＰＳマーカーを用いて、大麦３１品種をグループＩ型又はグループＩＩ型に分類し、ＢＤＡＩ−１含有量を比較した。また、これらの大麦を原料としてビールを製造し、その泡持ちを比較した。
【００９１】
［ＣＡＰＳマーカーによる被検大麦の分類］
大麦３１品種（はるな二条、みょうぎ二条、さきたま二条、さつき二条、新田二条２３号、ゴールデンメロン、ほしまさり、りょうふう、りょううん、ＣＤＣ  Ｋｅｎｄａｌｌ、ＡＣ  Ｍｅｔｃａｌｆ、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＣＤＣ  Ｃｏｐｅｌａｎｄ、ＣＤＣ  Ｒｅｓｅｒｖｅ、ＣＤＣ  ＰｏｌａｒＳｔａｒ、Ｂｅｔｚｅｓ、ＳｌｏｏｐＳＡ、Ｓｃｈｏｏｎｅｒ、Ｆｌａｇｓｈｉｐ、Ｇａｉｒｄｎｅｒ、Ｌｏｆｔｙ  Ｎｉｊｏ、Ｂａｒｋｅ、Ｓｃａｒｌｅｔｔ、Ｂｒａｅｍａｒ、Ｔｒｉｕｍｐｈ、Ｐｒｉｏｒ、Ａｌｅｘｉｓ、Ｏｐｔｉｃ、Ｓｅｂａｓｔｉａｎ、Ｐｏｗｅｒ、Ｃｈｅｖａｌｌｉｅｒ種）について、上述した方法と同様にして、ＢＤ−Ｔ１４プライマー及びＢＤ２−２プライマーを用いたＰＣＲ、制限酵素ＴａｑＩによるＰＣＲ産物の消化、並びに電気泳動を行い、これらの大麦をグループＩ型とグループＩＩ型に分類した。
【００９２】
［ＢＤＡＩ−１含有量］
上記大麦３１品種について、２０００年、２００４年、２００８年及び２００９年に群馬県のサッポロビール社圃場で栽培された大麦の種子をそれぞれミルで粉砕し、ＥＬＩＳＡ法でＢＤＡＩ−１含有量を定量した。
【００９３】
ＢＤＡＩ−Ｉの特異的抗体は、ＢＤＡＩ−１タンパク質の一部のアミノ酸配列（ＧＣＱＫＤＶＭＫＬＬＶＡＧＶ）のペプチドを合成し、ウサギを感作して作製した。９６  ｗｅｌｌ  ＥＩＡ／ＲＩＡ  Ｐｌａｔｅ  Ｆｌａｔ  Ｂｏｔｔｏｍ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）に適宜希釈したサンプル溶液１００μＬを添加し、４℃で一晩静置した。サンプルを破棄後、２００μＬのブロッキングバッファー（カゼイン  １０ｇ，ＮａＣｌ  ８ｇ，Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ  ２．９ｇ，ＫＨ２ＰＯ４  ０．２ｇ（／Ｌ））を添加しブロッキングした。２回洗浄後、精製抗体（５００倍希釈）１００μＬを添加し、室温で２時間反応させた。３回洗浄後、１０００倍希釈した二次抗体（ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ−ＡＰ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））１００μＬを添加し、室温で２時間反応させた。３回洗浄後、ｐ−ニトロフェニルリン酸１ｍｇ／ｍＬ（１０％（ｖ／ｖ）ジエタノールアミン）１５０μＬを添加し、十分な発色が得られた時点で３Ｍ  ＮａＯＨ  ５０μＬを添加し反応を停止させ、４０５ｎｍの吸光度を測定した。各タンパク質の定量は抗体作成時に用いたペプチドを標準とした検量線を作成して行った。
【００９４】
図４に、ＢＤＡＩ−１含有量の測定結果を示した。図４に示した測定結果は、（Ａ）から（Ｄ）それぞれに示した各年産のグループＩ型の大麦の平均値、及びグループＩＩ型の大麦のＢＤＡＩ−１含有量の平均値である。調査した全ての産年度のサンプルにおいて、グループＩ型の大麦の方が、危険率１％又は５％で有意にＢＤＡＩ−１含有量が高かった。「＊」及び「＊＊」は、有意差（危険率：それぞれ５％及び１％）があることを示す。有意差の有無は、ｔ−検定を用いて判定した。以上の結果から、本ＣＡＰＳマーカーで判別したＢＤＡＩ−１遺伝子型（グループＩ及びグループＩＩ）は種子中ＢＤＡＩ−１含有量を判別するのに有効なＤＮＡマーカーであることが示された。
【００９５】
［泡持ち］
４００Ｌパイロットスケールでの大麦品種単用醸造試験のＮＩＢＥＭ値から、ＢＤＡＩ−１遺伝子型と泡持ちの関係を調査した（図５）。ＮＩＢＥＭ値の解析にはグループＩ型の大麦としてＣＤＣ  Ｋｅｎｄａｌｌ（ｎ＝４）、ＣＤＣ  Ｃｏｐｅｌａｎｄ（ｎ＝３）、ＡＣ  Ｍｅｔｃａｌｆｅ（ｎ＝１）及びミカモゴールデン（ｎ＝１）の４品種、グループＩＩ型の大麦としてあまぎ二条（ｎ＝２）、りょうふう（ｎ＝４）北育３９号（ｎ＝２）、北育４１号（ｎ＝２）、ＣＤＣ  Ｒｅｓｅｒｖｅ（ｎ＝２）及び新田二条２３号（ｎ＝１）の６品種を用いた。解析の結果、グループＩ型の大麦は危険率５％で有意にＮＩＢＥＭ値が高いことが示された。このことから、本ＣＡＰＳマーカーで判別したＢＤＡＩ−１の遺伝子型は泡持ちを判別するのに有効なＤＮＡマーカーであることが示された。
【００９６】
（実施例４：ＰＣＲマーカーの構築）
図１に示した多重整列におけるギャップに位置するＤＮＡマーカーＭ９を利用し、ＰＣＲ産物の有無のみによって、ＢＤＡＩ−１の遺伝子型の判別を試みた。ＰＣＲ用プライマーとして、ＢＤ−ｐａｔ１プライマー及びＢＤ−Ｔ１プライマーを設計した。ＢＤ−ｐａｔ１プライマーは、３’末端の６塩基を除いてＭ９のギャップ（グループＩＩが欠損している塩基配列）にアニーリングするように設計されている。
【００９７】
ＢＤ−ｐａｔ１プライマー（配列番号１３）：
５’−ＧＣＣＣＡＣＡＡＧＡＣＡＣＴＣＡＴＧＣＡＡＧＣＣＣ−３’
ＢＤ−Ｔ１プライマー（配列番号１４）：
５’−ＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＣＴＧＴＴＡＴＣＡＣＴＣＣＧ−３’
【００９８】
図６に電気泳動で得られたバンドパターンの写真を示す。レーン１のサンプルはＣＤＣ  Ｋｅｎｄａｌｌ種（グループＩ型）、レーン２のサンプルはりょうふう種（グループＩＩ型）に対応する。グループＩ型でのみＰＣＲ産物の増幅が確認できた。このことから、本ＰＣＲマーカーによってＢＤＡＩ−１の遺伝子型を判別できることが示された。ＰＣＲマーカーは制限酵素処理工程が不要であるため、より迅速かつ簡易に遺伝子型の判別が可能である。同様に、図１に示した多重整列におけるギャップに位置するＤＮＡマーカーＭ８を利用したＰＣＲマーカーの構築が可能である。
【００９９】
（実施例５：プライマー対の検証）
上記のＣＡＰＳマーカー（Ｍ１１）を用い、種々のプライマー及びプライマー対を用いて検証を行なった。使用したプライマーの配列は以下のとおりである。
【０１００】
ＢＤ−Ｔ１プライマー（配列番号１４）：
５’−ＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＣＴＧＴＴＡＴＣＡＣＴＣＣＧ−３’
ＢＤ−Ｔ３プライマー（配列番号１５）：
５’−ＣＣＡＣＡＴＴＧＣＴＣＣＡＴＴＣＣＣＡＴＣＴ−３’
ＢＤ−Ｔ５プライマー（配列番号１６）：
５’−ＣＣＴＴＴＣＣＴＣＡＣＧＣＡＴＴＧＣＴＡＡＴＴ−３’
ＢＤ−Ｔ６プライマー（配列番号１７）：
５’−ＧＴＧＧＧＧＴＴＣＡＣＴＣＡＡＣＡＣＴＣＧＧ−３’
ＢＤ−Ｔ１３プライマー（配列番号１８）：
５’−ＡＣＧＧＧＧＡＣＧＧＧＧＣＧＴＧＡＣＧＧ−３’
ＢＤ−Ｔ１４プライマー（配列番号１０）：
５’−ＣＧＴＧＡＣＧＧＡＣＣＧＣＴＡＡＡＴＣＴＡＧＡＣ−３’
【０１０１】
図７及び８に、ＰＣＲ産物を制限酵素ＴａｑＩで消化した後、電気泳動して得られたバンドパターンの写真を示す。図７及び８の双方において、奇数レーン（レーン１、３、５及び７）のサンプルはＣＤＣ  Ｋｅｎｄａｌｌ種（グループＩ型）、偶数レーン（レーン２、４、６及び８）のサンプルはりょうふう種（グループＩＩ型）に対応する。また、図７及び８の双方において、フォワードプライマーとして、レーン１及び２はＢＤ−Ｔ１４プライマー、レーン３及び４はＢＤ−Ｔ１３プライマー、レーン５及び６はＢＤ−Ｔ５プライマー、並びにレーン７及び８はＢＤ−Ｔ６プライマーを用いた。さらに、リバースプライマーとして、図７においてはＢＤ−Ｔ３プライマー、及び図８においてはＢＤ−Ｔ１プライマーを用いた。図７及び８に示した結果のとおり、いずれのプライマー及びプライマー対を用いた場合であっても、出現するバンドパターンによってグループＩ型とグループＩＩ型を判別することができた。
【０１０２】
以上の結果より、本発明の選抜方法における遺伝子型の同定には、例えば、下記表２に示すプライマー対と、ＣＡＰＳマーカー又はＰＣＲマーカーの組み合わせを好適に用いることができる。
【表２】
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表２中、「ＢＤ−Ｔ１４」等はプライマーの名前を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１０３】
配列番号３〜１８；合成プライマー
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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