(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３６、配列番号３８または配列番号４０の何れかに示されるアミノ酸配列を含むルシフェラーゼ。
【請求項２】
Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓホタルルシフェラーゼが誘起する発光およびコメツキムシ赤色ルシフェラーゼが誘起する発光のうちの少なくとも一方に比べて高い発光強度を示す発光を誘起する活性を有する請求項１に記載のルシフェラーゼ。
【請求項３】
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むルシフェラーゼにより誘起された発光の最大発光波長よりも長い最大発光波長を有する発光を誘起する請求項１に記載のルシフェラーゼ。
【請求項４】
前記発光が、赤色発光を示す請求項３に記載のルシフェラーゼ。
【請求項５】
請求項１に記載のルシフェラーゼであって、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる野生型ルシフェラーゼと比べて高い発光強度を示す発光を誘起する活性を有し、かつ赤色発光を示す、ルシフェラーゼ。
【請求項６】
610nm付近の最大発光波長を有する発光を誘起する請求項１に記載のルシフェラーゼ。
【請求項７】
請求項１から６の何れか１項に記載のルシフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸。
【請求項８】
配列番号３７、配列番号３９または配列番号４１に示される塩基配列を含む請求項７に記載の核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はホタル由来ルシフェラーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内のシグナル伝達および遺伝子発現といった細胞の機能を調べるためには、蛍光色素および蛍光タンパク質といった蛍光プローブ並びにルシフェリン・ルシフェラーゼ反応を利用する化学発光プローブが用いられている。特に遺伝子の発現調節の解析には、励起光による細胞のダメージが生じず且つ自家発光の問題が生じない、定量性に優れた発光計測が用いられる。例えば、ルシフェラーゼ遺伝子が導入された細胞を観察する場合、ルシフェラーゼ活性に因る細胞からの発光強度を測定することで、ルシフェラーゼ遺伝子の発現の強さ（具体的には発現量）を調べることができる。具体的には、最初に細胞を溶解して細胞溶解液を作製し、その後この細胞溶解液にルシフェリンおよびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）等を添加し、光電子増倍管を用いたルミノメーターで発光強度を定量し、その結果に基づいて発現量を特定する。この方法では、発光強度の測定は細胞を溶解した後に行われる。このため、ある時点でのルシフェラーゼ遺伝子の発現量は、測定に使用した全細胞の平均値として得られる。ルシフェラーゼ遺伝子等の発光遺伝子をレポーター遺伝子として導入する方法として、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクチン法またはエレクトロポレーション法等を使用でき、各方法は目的および細胞の種類の違いに応じて使い分けられている。細胞に導入するルシフェラーゼ遺伝子の上流または下流に目的のＤＮＡ断片を繋ぎ、ルシフェラーゼ遺伝子の発現量を測定することで、当該ＤＮＡ断片がルシフェラーゼ遺伝子の転写に及ぼす影響を調べることが可能となる。また、細胞に導入するルシフェラーゼ遺伝子と目的の遺伝子とを共発現させることで、当該遺伝子産物がルシフェラーゼ遺伝子の発現に及ぼす影響を調べることが可能となる。
【０００３】
時間経過に沿って発光遺伝子の発現量を分析するには、生きた細胞からの発光強度を経時的に測定する必要がある。このような測定は、ルミノメーターを備えたインキュベーターにて細胞を培養し、細胞集団全体からの発光強度を一定時間ごとに測定することで行われる。細胞集団全体における発光遺伝子の発現量の経時的な変化を捉えることにより、一定の周期性をもった発現リズム等を分析することができる。
【０００４】
近年、生物学および医学の研究において、生命現象を分子レベルで動的に捉える必要性が高まってきている。蛍光観察を利用する研究分野では、試料内のタンパク質分子機能を動的に捉えるために、タイムラプスまたは動画撮像が行われている。従来技術では、蛍光試料を用いた経時的観察（例えば、蛍光分子を付したタンパク質１分子の動画観察）が行われている。
【０００５】
一方、経時的観察のために化学発光試料を用いる場合、化学発光試料の発光強度は極めて小さいため、イメージ・インテンシファイアを装着したＣＣＤカメラを用いて観察する必要がある。また最近では、化学発光試料を観察するための光学系を有した顕微鏡も開発されている（特許文献１および２）。
一方、様々な生物種由来の各種ルシフェラーゼが知られているが、野生型が赤色を呈するルシフェラーゼは殆ど存在しない。しかし、赤色の発光は光学的に重要であり、他の発光色と組み合わせたり、赤色でしか得られない光透過性を利用したりするというメリットが考えられる。これまで、様々な生物種のルシフェラーゼにおいて、発光基質の改変、補因子の添加、ペプチドや塩基配列等の改変など、試行錯誤しながら赤色の変異体を得る試みがあったものの、赤色の変異体は発光輝度が格段に低かった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−３０１５９９号公報
【特許文献２】国際公開第０６／０８８１０９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ルシフェリンを発光させる新規ルシフェラーゼを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様に係るルシフェラーゼは、スジグロボタル（Ｐｒｉｓｔｏｌｙｃｕｓ ｓａｇｕｌａｔｕｓ）に由来する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、新規ルシフェラーゼが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】Ｄ−ルシフェリンを基質として用いた場合に野生型スジグロボタルルシフェラーゼにより誘起された発光の各ｐＨにおける発光スペクトルを示す図である。
【図２】各ルシフェラーゼのＫｍ値をプロットした図である。
【図３】Ｄ−ルシフェリンを基質として用いた場合に各種ルシフェラーゼにより誘起された発光の発光強度を比較した図である。
【図４】Ｄ−ルシフェリンを基質として用いた場合に野生型スジグロボタルルシフェラーゼにより誘起された発光の発光スペクトルを示す図である。
【図５】Ｄ−ルシフェリンを基質として用いた場合にスジグロボタル赤色変異型ルシフェラーゼにより誘起された発光の発光スペクトルを示す図である。
【図６】Ｄ−ルシフェリンを基質として用いた場合にコメツキムシ由来の赤色ルシフェラーゼ（Ｃｌｉｃｋ Ｂｅｅｔｌｅ Ｒｅｄ（ＣＢＲ） Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）により誘起された発光の発光スペクトルを示す図である。
【図７】近赤外発光ルシフェリンアナログを基質として用いた場合に各種ルシフェラーゼにより誘起された発光の発光強度を比較した図である。
【図８】近赤外発光ルシフェリンアナログを基質として用いた場合に各種ルシフェラーゼにより誘起された発光の発光スペクトルを示す図である。
【図９】Ｄ−ルシフェリンおよび近赤外発光ルシフェリンアナログを基質として用いた場合にスジグロボタルルシフェラーゼにより誘起された発光の発光スペクトルを示す図である。
【図１０】Ｄ−ルシフェリンを基質として用いた場合に各種ルシフェラーゼにより誘起された発光の発光強度を比較した図である。
【図１１】Ｄ−ルシフェリンを基質として用いた場合に赤色変異体ルシフェラーゼにより誘起された発光の発光スペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の実施形態は、スジグロボタル（Ｐｒｉｓｔｏｌｙｃｕｓ ｓａｇｕｌａｔｕｓ）に由来するルシフェラーゼに関する。
【００１２】
「ルシフェラーゼ」とは、一般に、発光が生じる化学反応を触媒する酵素を指す。当該酵素の基質となる物質はルシフェリンと呼ばれる。ＡＴＰの存在下、ルシフェラーゼの触媒作用により、ルシフェリンが化学変化を起こす際に発光する。現在、ルシフェラーゼは、ホタルに由来するものおよびバクテリアに由来するものが取得されている。実施形態に係るルシフェラーゼも、上述の通り定義されるルシフェラーゼと同義であるが、後述するホタルから初めて取得された新規のルシフェラーゼである。実施形態に関してルシフェリンとは、ホタルルシフェラーゼの基質となるルシフェリンおよびそのアナログを意味する。ルシフェリンは、例えば、ＷＯ２００９／０９６１９７及びＷＯ２０１０／１０６８９６に基質として記載されている物質である。具体的には、例えば、ジメチルアニリン−モノエン型ルシフェリン、ジメチルアニリン−ジエン型ルシフェリン、ジメチルアニリン型ルシフェリン、Ｄ−ルシフェリン及びこれらの誘導体である。
【００１３】
実施形態に係るルシフェラーゼは、スジグロボタル（Ｐｒｉｓｔｏｌｙｃｕｓ ｓａｇｕｌａｔｕｓ）に由来する。スジグロボタルとは節足動物門昆虫綱コウチュウ目ホタル科スジグロボタル属に属すホタルである。なお、ここにいう「スジグロボタルに由来するルシフェラーゼ」とは、スジグロボタルが有する野生型のルシフェラーゼに加えて、野生型のルシフェラーゼから誘導されたその変異型ルシフェラーゼをも含むことを意味する。
【００１４】
発光強度が低い化学発光試料を顕微鏡により撮像する場合、鮮明な画像を撮影するために必要な露出時間は長くなる。このような化学発光試料は、使用できる研究用途が制限される。例えば、発光強度の低さのために３０分間の露出時間が必要となる場合、３０分間の経時的撮影は可能であっても、より短い時間での撮影、さらにはリアルタイムでの撮影は不可能である。また、画像の取得に当って、発光する細胞に焦点を合わせるために複数枚の画像を取得し比較する必要があるが、発光強度の低さのために長い露出時間を必要とする場合、１枚の画像を取得するだけでも手間と時間を要することになる。
【００１５】
実施形態に係るルシフェラーゼは、既知のルシフェラーゼによる発光と比較して高い発光強度を有する発光を誘起し得る。従って、実施形態に係るルシフェラーゼは、タンパク質のイメージングのためのレポーターとして利用する場合に特に有利な効果を奏する。すなわち、実施形態に係るルシフェラーゼは、少量でも高い発光強度を提供できるため、発現量が低いタンパク質の良好な検出を可能とする。また、当該ルシフェラーゼは、得られる発光強度が高いことにより検出に必要な露出時間を短縮できる。このため、このルシフェラーゼを経時的観察のためのレポーターとして利用すれば、撮影に必要な露出時間を短くすることが可能となり、よりリアルタイムに近い観察が可能となる。すなわち、時間分解能が高い経時的観察が可能となる。
【００１６】
実施形態に係るルシフェラーゼの一例は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むルシフェラーゼである。当該ルシフェラーゼは、スジグロボタルから得られた野生型のルシフェラーゼである。この明細書および特許請求の範囲では、当該ルシフェラーゼを、野生型、野生型ルシフェラーゼ、野生型スジグロボタルルシフェラーゼまたは野生型スジグロボタル由来ルシフェラーゼ等と称する。
【００１７】
図１に、実施形態に係る野生型スジグロボタルルシフェラーゼを用いた場合に得られたルシフェリンの発光スペクトルを示す。この図に示されるとおり、実施形態に係る野生型スジグロボタルルシフェラーゼは、ｐＨ８．０において、最大発光波長が５８３ｎｍ付近にある発光を生じさせる。また、最大発光波長は、ｐＨ７．５、ｐＨ７．０、ｐＨ６．５、ｐＨ６．０およびｐＨ５．５で、それぞれ、約５９０ｎｍ、約６００ｎｍ、約６０９ｎｍ約６１４ｎｍおよび約６１３nmであり、ｐＨが下がるほど最大発光波長が長くなる傾向がみられる。ここで「最大発光波長」とは、ルシフェラーゼが誘起するルシフェリンの発光を測定することによって得られるスペクトルにおいて、発光強度が最大となる波長を意味する。
【００１８】
実施形態に係るルシフェラーゼは、例えば、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓに由来するルシフェラーゼによる発光強度の１．５倍以上、２．０倍以上、２．５倍以上、３．０倍以上、３．５倍以上または４．０倍以上の発光強度を示し得る。また、実施形態に係るルシフェラーゼは、例えば、コメツキムシ由来の赤色ルシフェラーゼ（ＣＢＲルシフェラーゼ）による発光強度の２．０倍以上、３．０倍以上、４．０倍以上、５．０倍以上、６．０倍以上、７．０倍以上、８．０倍以上または９．０倍以上の発光強度を示し得る。
【００１９】
図３は、基質としてＤ−ルシフェリンを使用した場合におけるＨｅＬａ細胞中での各種ルシフェラーゼによる発光強度を比較したグラフを示している。ここでは、Ｐ．ピラリスルシフェラーゼ（プロメガ社、Ｌｕｃ２ルシフェラーゼ）による発光強度を１としたときの相対的な値が示されている。この図から、特定の哺乳細胞内での測定条件下において、野生型スジグロボタルルシフェラーゼは、Ｐ．ピラリスルシフェラーゼにより達成される発光強度の２．６０倍の発光強度を達成していることがわかる。また、野生型ルシフェラーゼは、ＣＢＲルシフェラーゼにより達成される発光強度の７．８７倍の発光強度を達成していることがわかる。
また、図７は、基質として、近赤外ルシフェリンアナログであるジメチルアニリン−ジエン型ルシフェリン（具体的には、アカルミネ（登録商標）、和光純薬社製）を使用した場合の各ルシフェラーゼにより誘起された発光の発光強度を示す。野生型ルシフェラーゼは、ＣＢＲルシフェラーゼの約３．１倍の発光強度を達成していることがわかる。
なお、図３及び７においては、それぞれ、基質として、D−ルシフェリン及びジメチルアニリン−ジエン型ルシフェリンを使用した場合の発光強度について示したが、実施形態に係るルシフェラーゼを用いた発光反応においては、これら以外の他の基質を使用することもできる。例えば、ＷＯ２００９／０９６１９７及びＷＯ２０１０／１０６８９６に記載されている基質を使用することができる。当該基質は、例えば、ジメチルアニリン−モノエン型ルシフェリン、ジメチルアニリン型ルシフェリン、これらの誘導体、ジメチルアニリン−ジエン型ルシフェリンの誘導体及びＤ−ルシフェリンの誘導体である。
【００２０】
実施形態に係るルシフェラーゼは、既知のルシフェラーゼと比較して高い分解安定性を示し得る。「分解安定性」とは、ルシフェラーゼが使用される環境における、当該ルシフェラーゼの分解の生じにくさを意味する。また、「分解安定性」とは、タンパク質分解酵素による分解に対する安定性のみでなく、タンパク質分解酵素が関与しない分解、例えば熱や機械的刺激に起因した分解等に対する安定性をも含む。ルシフェラーゼが使用される環境とは、溶液中、培養液中、細胞外液中、細胞内等を意味する。特に、培養液、細胞外液および細胞中にはタンパク質分解酵素が多数存在する場合があり、実施形態に係るルシフェラーゼはそのような環境下であっても分解に強い。すなわち、実施形態に係るルシフェラーゼは、そのような環境下であっても分解されず、高い発光強度を維持できる。実施形態に係るルシフェラーゼは、例えば、Ｐ．ピラリスルシフェラーゼと比較して、タンパク質分解に対する安定性が高い。
【００２１】
実施形態に係るルシフェラーゼは、スジグロボタルから取得された野生型のルシフェラーゼだけでなく、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列の一部に変異が生じた変異型のルシフェラーゼを含む。ここでは、このようなルシフェラーゼを、変異型、変異型ルシフェラーゼ、変異型スジグロボタルルシフェラーゼまたは変異型スジグロボタル由来ルシフェラーゼ等と称する。
【００２２】
実施形態に係る変異型スジグロボタルルシフェラーゼは、既知のルシフェラーゼによる発光よりも高い発光強度を有する発光を誘起し得る。例えば、実施形態に係る変異型スジグロボタルルシフェラーゼを用いた場合に達成される発光強度は、例えば、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓに由来するルシフェラーゼによる発光強度の１．１倍以上、１．２倍以上、１．５倍以上、２．０倍以上または３．０倍以上の発光強度を示し得る。また、実施形態に係る変異型ルシフェラーゼは、例えば、コメツキムシ由来の赤色ルシフェラーゼ（ＣＢＲルシフェラーゼ）による発光強度の２．０倍以上、３．０倍以上、４．０倍以上、５．０倍以上、６．０倍以上または７．０倍以上の発光強度を示し得る。従って、実施形態に係る変異型ルシフェラーゼを経時的観察のためのレポーターとして利用すれば、撮影に必要な露出時間を短くすることが可能となり、時間分解能が高い経時的観察が可能となる。
【００２３】
変異の別の例は、発光スペクトルの最大発光波長がシフトする変異である。このような変異型スジグロボタルルシフェラーゼを発光反応の酵素として用いた場合、野生型を用いた場合と比較して、最大発光波長がシフトした発光スペクトルが得られる。ＨｅＬａ細胞内において野生型スジグロボタルルシフェラーゼを用いた場合、最大発光波長が５９８ｎｍ付近となる発光が生じるが、このような変異によって、最大発光波長がシフトする。この変異型ルシフェラーゼを野生型ルシフェラーゼまたはその他の変異型ルシフェラーゼとともに細胞内に発現させた場合、これらのルシフェラーゼを、最大発光波長の差異に基づいて区別することができる。したがって、マーカーとしてこれらのルシフェラーゼを利用する研究において、最大発光波長がシフトした変異型ルシフェラーゼを使用することで、マーカーの選択肢を増やすことができる。
【００２４】
先述の変異は、最大発光波長のシフトにより発光色の変化を生じさせるものであってもよい。例えば、変異により、発光反応の発光色は緑色から赤色へと変化する。
このような変異型ルシフェラーゼを使用した発光反応の観察により、細胞内の機能をより詳細に調べることが可能になる。例えば、野生型ルシフェラーゼと変異型ルシフェラーゼとを、それぞれ、異なる２つのタンパク質に融合させて同一細胞内で発現させ、発光色の差に基づき、その細胞内のそれぞれのタンパク質の挙動を識別することができる。この場合、発光色の異なる発光反応は、１種類の基質のみを使用することによって達成することができ、実験上の簡便さの点で有利である。また、異なる細胞内で目的のタンパク質を発現させ、それぞれの細胞において異なる発光色を示す発光を誘起する場合においても、使用する基質は１種類のみでよいことから、さらに、コストの観点からも有利である。
【００２５】
実施形態に係るルシフェラーゼによれば、発光観察に使用される基質と酵素とを様々に組み合わせることにより発光観察の適用範囲が拡大されることが期待される。具体的には、ルシフェリンとルシフェラーゼとの組合せを選択することにより、異なる発光波長及び／又は発光色を有する複数の発光を得て、発光波長及び／又は発光色の相違を利用して、細胞内の現象を観察することができる。このような新規のルシフェラーゼが提供されることにより、細胞の機能解析に利用される発光反応の酵素の選択肢を増やし、これにより酵素と基質との組合せのバリエーションを増やすことができる。
【００２６】
そのような変異型スジグロボタルルシフェラーゼを得るための変異とは、ルシフェラーゼの性質に変化を与えない変異であってよい。例えば、発光反応に対する寄与率の高い配列またはドメインにおいては変化がなく、発光反応に対する寄与率の低い配列またはドメインについて変化が生じる変異であってよい。具体的には、例えば、発光反応にあまり関与しない部位を削る変異、そのような部位に特定の配列を挿入する変異、末端に特定の配列を付加する変異等であってよい。
【００２７】
また、変異型スジグロボタルルシフェラーゼを得るための変異とは、ルシフェラーゼとしての発光活性以外の性質を変化させる変異であってよい。例えば、実験的な操作性を向上させる変異であってよい。具体的には、例えば、野生型ルシフェラーゼが哺乳細胞内において低い可溶性を示す場合にその可溶性を高める変異であってよい。
さらに、変異型スジグロボタルルシフェラーゼを得るための変異とは、発光反応に関する性質を向上させる変異、例えば、最適ｐＨを変更する変異、最適温度を変更する変異、分解安定性を向上させる変異等であってよい。
【００２８】
実施形態に係る変異型スジグロボタルルシフェラーゼの例は、配列番号３３に記載のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼである。配列番号３３は、野生型スジグロボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１）にＫｏｚａｋ配列を付与し、且つ１４８番目のイソロイシン（Ｉ）残基をバリン（Ｖ）残基に置換し（Ｉ１４８Ｖ）、および２８３番目のセリン（Ｓ）残基をロイシン（Ｌ）残基に置換した（Ｓ２８３Ｌ）ものである。この変異型ルシフェラーゼをコードする核酸は、例えば、配列番号３４に示される塩基配列を有する核酸である。配列番号３４に示される塩基配列は、野生型ルシフェラーゼをコードする配列番号２の塩基配列に対して、後述のような哺乳細胞における発現に対するコドン最適化を施し、更に、対応するアミノ酸配列上で上述の２つの置換が生じるような変異を入れたものである。
【００２９】
配列番号３３に記載のアミノ酸配列を有する変異型ルシフェラーゼは、野生型ルシフェラーゼと比較して、特定のｐＨにおいて最大発光波長のシフトが生じている。このように発光スペクトルに最大発光波長のシフトを生ずる変異型ルシフェラーゼは、例えば、赤色の発光を生ずる。赤色の発光を生ずる変異型ルシフェラーゼを以降、「赤色変異体ルシフェラーゼ」または「赤色変異体」という。赤色の発光は、たとえば、発光スペクトルの最大発光波長が６００〜７８０ｎｍの光をいう。
【００３０】
図３から、ホタルルシフェリンを基質として用いた場合の赤色変異体による発光強度は、例えば、特定の測定条件下において、野生型ルシフェラーゼ（配列番号１）を用いた場合に達成され得る発光強度の０．４３倍であることを示しているが、図４および５にそれぞれ示される野生型ルシフェラーゼおよび赤色変異体ルシフェラーゼにより得られる発光スペクトルの比較から、変異の導入により、最大発光波長を５９８ｎｍから６１３ｎｍにシフトさせることができることがわかる。長い波長を有する光は、生体内での透過性がより優れている。そのため、この変異型ルシフェラーゼを用いることにより、組織、胚および個体を測定の対象とする場合のように、ルシフェリンから光の検出手段までの間に遮蔽物が多く介在する場合であっても、発光強度の低下を抑えて発光を検出することができる。
また、図７から、赤色発光ルシフェリンアナログを用いた場合の赤色変異体が誘起する発光は、ＣＢＲルシフェラーゼの約２．２倍の発光強度を示すことがわかる。
なお、図３及び７においては、それぞれ、基質として、D−ルシフェリン及びジメチルアニリン−ジエン型ルシフェリンを使用した場合の発光強度について示したが、実施形態に係る変異型ルシフェラーゼを用いた発光反応においては、これら以外の他の基質を使用することもできる。例えば、ＷＯ２００９／０９６１９７及びＷＯ２０１０／１０６８９６に記載されている基質を使用することができる。当該基質は、例えば、ジメチルアニリン−モノエン型ルシフェリン、ジメチルアニリン型ルシフェリン、これらの誘導体、ジメチルアニリン−ジエン型ルシフェリンの誘導体及びＤ−ルシフェリンの誘導体である。
【００３１】
上述した２種の変異は、スジグロボタル野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１）に対して、全て同時に、または何れか一方のみ導入することができる。
【００３２】
あるいは、上記２種の変異は、配列番号１とは異なるアミノ酸配列を有するルシフェーラゼタンパク質（たとえば、上記２種の変異を有していないが、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の相同性を示す程度の変異を有するアミノ酸配列からなるルシフェラーゼ、または上記２種の変異を有していないが、１ないし数個のアミノ酸の変異を有するアミノ酸配列からなるルシフェラーゼ）に対しても導入することができる。例えば、そのようなタンパク質のアミノ酸配列と配列番号１との対応関係を考慮して変異を導入することができる。たとえば、そのようなタンパク質にＩ１４８Ｖ変異を導入したい場合、配列番号１と導入の対象とするタンパク質の配列とを比較して、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１４８番目のＩに対応するアミノ酸残基を決定し、当該アミノ酸をＶに置換することでＩ１４８Ｖ変異を導入することができる。ここにおいて「対応するアミノ酸残基」は、例えば相同性検索といった公知の技術を利用して決定することができる。
【００３３】
また、実施形態は、赤色変異体に対して更なる変異を導入した改良型赤色変異体も含む。例えば、赤色変異体に対して、さらなる発光強度の向上を目的として、さらなる変異を導入した改良型赤色変異体を含む。あるいは、別の実施形態は、赤色変異体に対して、発光強度の向上とは別の目的、例えば、可溶性の向上、分解に対する耐性の向上等を目的として、さらなる変異を導入した改良型赤色変異体を含む。具体的には、実施形態は、赤色変異体のアミノ酸配列（配列番号３３）との間で一定の相同性を示すアミノ酸配列を有し、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼと比較して、より高い強度でルシフェリンを発光させる改良型赤色変異体を含む。
【００３４】
かかる改良型赤色変異体は、たとえば、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる野生型ルシフェラーゼにおいて、下記８種類の変異から選ばれる少なくとも一つの変異を含むアミノ酸配列から構成される：
（１）配列番号１のアミノ酸配列の１４８番目のイソロイシンをバリンに置換する変異（I148V）；
（２）配列番号１のアミノ酸配列の２８３番目のセリンをロイシンに置換する変異（S283L）；
（３）配列番号１のアミノ酸配列の２３９番目のバリンをメチオニンに置換する変異（V239M）；
（４）配列番号１のアミノ酸配列の３１３番目のセリンをトレオニンに置換する変異（S313T）；
（５）配列番号１のアミノ酸配列の３５６番目のアスパラギン酸をチロシンに置換する変異（D356Y）；
（６）配列番号１のアミノ酸配列の４０１番目のバリンをメチオニンに置換する変異（V401M）；
（７）配列番号１のアミノ酸配列の４６４番目のフェニルアラニンをイソロイシンに置換する変異（F464I）；および
（８）配列番号１のアミノ酸配列の５０３番目のグリシンをアルギニンに置換する変異（G503R）。
【００３５】
より具体的には、かかる改良型赤色変異体は、配列番号３３に示されるアミノ酸配列からなる赤色変異体に、更なる変異を導入したものであり得る。すなわち、かかる改良型赤色変異体は、配列番号３３に示されるアミノ酸配列からなる赤色変異体が既に有する変異I148VおよびS283Lに加えて、V239M、S313T、D356Y、V401M、F464IおよびG503Rから選ばれる少なくとも一つの変異を含むアミノ酸配列から構成され得る。かかる改良型赤色変異体の例として、下記の３つのタイプが挙げられる（後述の実施例５を参照）：
（１）配列番号１のアミノ酸配列に、Ｉ１４８Ｖ、Ｓ２８３ＬおよびＦ４６４Ｉの３つの変異を有する変異体（配列番号３６）；
（２）配列番号１のアミノ酸配列に、Ｉ１４８Ｖ、Ｓ２８３Ｌ、Ｖ４０１Ｍ、Ｆ４６４ＩおよびＧ５０３Ｒの５つの変異を有する変異体（配列番号３８）；および
（３）配列番号１のアミノ酸配列に、Ｉ１４８Ｖ、Ｓ２８３Ｌ、Ｖ２３９Ｍ、Ｓ３１３Ｔ、Ｄ３５６ＹおよびＦ４６４Ｉの６つの変異を有する変異体（配列番号４０）。
【００３６】
改良型赤色変異体は、Ｄ−ルシフェリンを基質として用いた場合に、６１０ｎｍ付近の最大発光波長、好ましくは６１０±１０ｎｍの最大発光波長を有する光を生じさせることができる。
上記３タイプの改良型赤色変異体は、赤色発光を示すため、小動物のin vivoイメージングなど生体組織に適用した際に生体組織での透過率が高いという利点を有するとともに（図１１参照）、元の赤色変異体（配列番号３３）や既存の赤色発光のルシフェラーゼＣＢＲに比べて格段に高い発光強度を示すという利点も有する（図１０参照）。
【００３７】
実施形態に係る変異型ルシフェラーゼのその他の例は、実験的な操作性を向上させる変異が導入された変異型ルシフェラーゼである。たとえば、野生型ルシフェラーゼが哺乳細胞内において低い可溶性を示す場合、実施形態に係る変異型ルシフェラーゼは、その可溶性を高める変異が導入されたルシフェラーゼである。
【００３８】
変異型ルシフェラーゼとは、実施形態に係るルシフェラーゼの特徴、すなわちルシフェラーゼ活性が得られる限りにおいて（好ましくは従来のルシフェラーゼと比較して高い発光強度が得られる限りにおいて）、ルシフェラーゼのアミノ酸配列に任意の変異、例えば、アミノ酸の置換、欠失および／または付加等が生じたルシフェラーゼであってよい。この変異は、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列の１以上のアミノ酸の変異または１から数個のアミノ酸の変異であり、好ましくは、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列の１から２０のアミノ酸の変異、より好ましくは１から１５のアミノ酸の変異、より好ましくは１から１０のアミノ酸の変異、より好ましくは１から５のアミノ酸の変異、より好ましくは１から４のアミノ酸の変異、より好ましくは１から３のアミノ酸の変異、より好ましくは１または２のアミノ酸の変異である。好ましくは、当該変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列は、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列との間で７５％以上、８０％以上、８５%以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の相同性を有する。
【００３９】
アミノ酸の変異の導入は、公知の手法に従って、たとえば、Inverse PCR法やKunkel 法など一般的な手法に基づく部位特異的変異導入法、または、ランダムミュータジェネシス法などにより行うことができる。
【００４０】
本発明の他の実施形態は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド（すなわち、ルシフェラーゼタンパク質の断片）に関し、たとえば、配列番号１に示されるアミノ酸配列の３０アミノ酸残基以上からなるポリペプチド、４０アミノ酸残基以上からなるポリペプチド、５０アミノ酸残基以上からなるポリペプチド、６０アミノ酸残基以上からなるポリペプチド、７０アミノ酸残基以上からなるポリペプチド、８０アミノ酸残基以上からなるポリペプチド、９０アミノ酸残基以上からなるポリペプチド、１００アミノ酸残基以上からなるポリペプチド、１５０アミノ酸残基以上からなるポリペプチド、２００アミノ酸残基以上からなるポリペプチド、２５０アミノ酸残基以上からなるポリペプチド、３００アミノ酸残基以上からなるポリペプチド、３５０アミノ酸残基以上からなるポリペプチド、４００アミノ酸残基以上からなるポリペプチド、４５０アミノ酸残基以上からなるポリペプチド、または５００アミノ酸残基以上からなるポリペプチドに関する。また、本発明の他の実施形態は、上述のポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド（すなわち、ルシフェラーゼ遺伝子の断片）に関する。
【００４１】
かかるルシフェラーゼタンパク質の断片およびルシフェラーゼ遺伝子の断片は、スプリットルシフェラーゼアッセイに使用することができる。スプリットルシフェラーゼアッセイは、ルシフェラーゼを特定の位置で切断して生物発光能を失活させた２つの断片を作製し、各断片と２種類の被検タンパク質とをそれぞれ融合して２種類の融合タンパク質を作製し、これら融合タンパク質が相互作用すると、失われたルシフェラーゼ活性が回復するという原理に基づく。このアッセイにより、タンパク質間相互作用を検出したり、タンパク質の細胞内小器官への移行を検出したりすることができる。
【００４２】
本発明の他の実施形態は、上記実施形態に係るルシフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸に関する。すなわち、当該核酸は、スジグロボタルに由来するルシフェラーゼ遺伝子を含む核酸である。実施形態において、核酸とは、例えばＤＮＡまたはＲＮＡを指す。また、実施形態において、ルシフェラーゼの「遺伝子」とは、主として、ｍＲＮＡに転写される領域、すなわち構造遺伝子を意味する。
【００４３】
実施形態に係るルシフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸の一例は、配列番号２に示される塩基配列を含む核酸である。この配列を有する遺伝子は、スジグロボタルからクローニングされており、野生型スジグロボタルルシフェラーゼをコードする。
【００４４】
実施形態に係るルシフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸の別の例は、配列番号３４に示される塩基配列を含む核酸である。配列番号３４の配列を有する遺伝子は赤色変異体をコードする。配列番号３４は、スジグロボタルからクローニングされた野生型の塩基配列に対して変異を導入することで得られる配列である。
【００４５】
実施形態に係る核酸は、野生型ルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を含む核酸であっても、そこにおいて変異が生じた変異型ルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を含む核酸であってもよい。ここにおいて、変異型ルシフェラーゼ遺伝子とは、コードされたルシフェラーゼが、実施形態に係るルシフェラーゼの特徴、すなわちルシフェラーゼ活性が得られる限りにおいて（好ましくは従来のルシフェラーゼと比較して高い発光強度が得られる限りにおいて）、塩基配列中の特定の塩基、たとえば数個の塩基の置換、欠失および／または付加等を受けた遺伝子であってよい。また、塩基配列の変異には、コードされるアミノ酸配列に変化が生じない変異が含まれる。すなわち、実施形態に係る核酸には、野生型ルシフェラーゼをコードする変異型ルシフェラーゼ遺伝子を含む核酸が含まれる。
【００４６】
そのようなコードされるアミノ酸配列に変化が生じない変異の一例は、遺伝子中に存在する特定の制限酵素の認識配列を無効にする変異である。この変異によって、遺伝子を含む核酸は当該制限酵素によって切断されなくなるものの、当該遺伝子は変異前と同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードできる。このような変異は、制限酵素の認識配列を構成するコドンを、異なる塩基配列の同義コドンに変換することで達成できる。このような変異は、遺伝子組み換えに使用する制限酵素の認識配列が当該遺伝子中に存在する場合に有用である。この場合、予め遺伝子中の認識配列を無効にしておくことで、制限酵素で処理した場合に遺伝子を含む核酸が断片化することを防ぐことができ、結果として組み換えが容易になる。特定の制限酵素の認識配列を無効にした例は、配列番号３に示される塩基配列である。当該塩基配列は、スジグロボタルルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列（配列番号２）からＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩの認識配列を無効にしたものである。
【００４７】
そのようなコードされるアミノ酸配列に変化が生じない変異の別の例は、遺伝子のコドンを特定の生物種における発現に最適化させる変異である。ここにいう「最適化」とは、核酸に含まれる遺伝子のコドンを、特定の生物種においてコドン出現頻度が高いコドンに代えることを意味する。最適化を行った場合、特定の生物種における遺伝子の発現は、最適化をしない場合に比べて高まる。実施形態に係るルシフェラーゼ遺伝子はホタルから取得されたものであるため、当該遺伝子を導入しようとする生物種が分類学的にホタルから遠い程、最適化の効果はより高いと考えられる。実施形態において特定の生物種とは、例えば細菌細胞、酵母細胞および哺乳細胞である。更に哺乳細胞は、例えばマウスの細胞、サルの細胞およびヒトの細胞である。
【００４８】
実施形態に係るコドンが最適化されたルシフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸の一例は、配列番号４に示される塩基配列を含む核酸である。当該核酸は、スジグロボタルルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列（配列番号２）からＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩの認識配列が無効にされており、且つ哺乳細胞における発現にコドンが最適化されている。配列番号４に示される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を配列番号５に示す。
【００４９】
実施形態に係る核酸は、Ｋｏｚａｋ配列が付与されたルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を含む核酸を含む。Ｋｏｚａｋ配列とは、開始コドンとその前後の複数の塩基配列から成る配列であり、Ｋｏｚａｋ配列が存在することで、その遺伝子の発現量が増大することがわかっている。Ｋｏｚａｋ配列は、生物種または生物群ごとに共通配列が見出されている。実施形態に係るＫｏｚａｋ配列を含む核酸は、それを導入する生物種に対応したＫｏｚａｋ配列を有する。例えば哺乳細胞に導入される場合、核酸は、Ｋｏｚａｋ配列としてｇｃｃｒｃｃａｔｇｇ（配列番号６）（ｒはグアニンまたはアデニンを意味する）の配列を含む。Ｋｏｚａｋ配列を付与するルシフェラーゼ遺伝子は、野生型遺伝子であってもよいが、上述のようなコドンの最適化を行った変異型遺伝子であってもよい。
【００５０】
本発明のさらに他の実施形態はこれらの核酸を含むベクターに関する。当該ベクターは、ルシフェラーゼをコードする核酸以外に、プロモーター配列、発現を調節するための配列、およびマーカー遺伝子の配列を含む核酸等を含んでよい。
【００５１】
本発明のさらに他の実施形態は、先述のベクターを含んだキットに関する。このキットは、２種類以上のベクターを含んでいてもよく、そのうちの少なくとも１つは、実施形態に係るベクターである。好ましくは、２種類以上のベクターは、それぞれ、ルシフェラーゼをコードする塩基配列を含んでおり、これらのルシフェラーゼは、各々、異なる発光色及び／又は発光波長を示す発光反応を触媒する。このようなキットを使用することによって、例えば、発光色及び／又は発光波長の相違に基づき、複数のタンパク質の挙動を同時に観察することができる。
【００５２】
また、本発明のさらに他の実施形態は発光プローブに関する。当該発光プローブは、野生型のルシフェラーゼを含むものでもよいが、変異型ルシフェラーゼを含むものでもよい。特に、公知の技術によって、発光プローブとしての利用に適した改変を加えたものが好ましい。さらに実施形態は、上記発光プローブを用いた種々の試料（インビボ、インビトロ）に関する種々の使用（イメージング、測光等）に有効に適用できる。
【００５３】
本発明のさらに他の実施形態は、実施形態に係るルシフェラーゼを利用して細胞内の機能を解析する方法に関する。当該方法は、実施形態に係るルシフェラーゼを細胞内に導入する工程、および前記ルシフェラーゼが誘起するルシフェリンの発光をイメージング装置により検出する工程を含む。例えば、ＤＮＡ中の特定の発現調節領域の下流に実施形態に係るルシフェラーゼ遺伝子を導入し、ルシフェラーゼの発現を、それが誘起するルシフェリンの発光の有無によって検出することで、発現調節領域の機能を調べることが可能である。
【００５４】
本発明のさらに他の実施形態は、上記実施形態に係るルシフェラーゼを利用して細胞内タンパク質を解析する方法に関する。当該方法は、実施形態に係るルシフェラーゼと解析の対象とするタンパク質とから成る融合タンパク質を細胞内に導入する工程および前記ルシフェラーゼが誘起するルシフェリンの発光をイメージング装置により検出する工程を含む。
【００５５】
当該方法は、解析の対象とするタンパク質の細胞内の局在の観察およびその局在の時間変化の観察（タイムラプス）を含む。また、当該方法は、タンパク質の局在だけでなく、そのタンパク質が単に発現したか否かの確認をも含む。使用される細胞に特別な限定はなく、細胞のイメージングの分野において通常使用できる細胞であってよい。また、解析の対象とするタンパク質も特別に限定はなく、研究の目的に応じたタンパク質を選択することができる。当該タンパク質は、使用する細胞内に本来存在するタンパクであってよく、または細胞内に本来存在しない異種性の若しくは改変したタンパク質であってもよい。
【００５６】
融合タンパク質を細胞内に導入する場合、既知の導入方法を使用することができる。１つの方法は、細胞外で精製した融合タンパク質を細胞内に直接導入する方法である。例えば、マイクロインジェクション法によって融合タンパク質を細胞内に直接注入することができる。または、融合タンパク質を含む培養液にて細胞をインキュベートさせて、エンドサイトーシスによって融合タンパク質を細胞に取り込ませることができる。また別の方法は、まず融合タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸を導入し、その後細胞内で融合タンパク質を発現させる方法である。例えば、当該核酸を含む発現ベクターを、リン酸カルシウム法、リポフェクション法またはエレクトロポレーション法等によって細胞内に導入し、発現ベクターから融合タンパク質を発現させることができる。ここにおいて、融合タンパク質の遺伝子は、実施形態に係るルシフェラーゼ遺伝子と解析の対象とするタンパク質の遺伝子とを含む遺伝子であり、ここにおいて、ルシフェラーゼ遺伝子とタンパク質遺伝子とは、それぞれ正常に翻訳されるよう連結されている。
【００５７】
ルシフェリンの発光をイメージング装置により検出する工程は、既知の検出方法を使用することができる。例えば、ルシフェラーゼを含む融合タンパク質を発現する細胞に、ルシフェリン、ＡＴＰおよびＭｇ２＋イオン等を適宜与えてルシフェラーゼにルシフェリンの発光反応を誘起させ、発生した発光をイメージング装置により検出することができる。イメージング装置とは、例えば発光を捉えるためのフィルターを備えた顕微鏡である。顕微鏡を使用することで、細胞内における発光の位置を特定して、この情報をもとにタンパク質の局在を特定することが可能となる。また、イメージング装置として、経時的に撮像できる機能を備えた顕微鏡を使用することができ、この顕微鏡によって経時的観察も可能となる。
【実施例】
【００５８】
［実施例１：スジグロボタル由来のルシフェラーゼ遺伝子のクローニング］
１．材料
材料として東京都青梅市で採集したスジグロボタル（Ｐｒｉｓｔｏｌｙｃｕｓ ｓａｇｕｌａｔｕｓ）の幼虫を用いた。
【００５９】
２．トータルＲＮＡの抽出とｃＤＮＡの合成
ホタルの幼虫からハサミを用いて発光器を切り取った。組織および細胞のホモジナイズ用のビーズを含むチューブであるＬｙｓｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｄチューブ（ＭＰ−Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）に、採取した発光器および１ｍＬのトータルＲＮＡ抽出試薬ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社）を入れた。このチューブを組織細胞破砕装置ＦａｓｔＰｒｅｐ  ２４（ＭＰ−Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）またはＦａｓｔＰｒｅｐ  ＦＰ１００Ａ（ＭＰ−Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）に装着し、振動速度６．５ｍ／ｓおよび振動時間４５秒の条件で、ホタルの発光器を試薬中にて破砕した。完了後、チューブを破砕装置から取り出し、３０分間氷上に置いた。その後、もう一度同じ条件で破砕を実施した。
【００６０】
次に、トータルＲＮＡ抽出試薬ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔの説明書に従って、破砕した溶液からトータルＲＮＡの分離精製を行った。得られたｍＲＮＡ溶液１００μｌを、エタノール沈殿法によって沈殿濃縮した。次に、完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（インビトロジェン社）をマニュアルに従って使用して、沈殿濃縮したトータルＲＮＡから完全長ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡ溶液２０μｌをホタル完全長ｃＤＮＡライブラリーとして以下の遺伝子実験に用いた。
【００６１】
３．ホタルルシフェラーゼ遺伝子の５’末端側の同定
３−１．Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄ（ＲＡＣＥ）法に用いるプライマーの作製
スジグロボタルのルシフェラーゼ遺伝子のクローニングをＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法によって行った。このＰＣＲに使用するプライマーは、既知の近縁生物由来のルシフェラーゼ遺伝子のアミノ酸配列に基づいて、以下の通り作製した。
【００６２】
ホタルルシフェラーゼにおいてよく保存されているアミノ酸領域を確認するために、既に公開されている１０種類のホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列を、配列情報解析ソフトウェアＤＮＡＳＩＳ  Ｐｒｏ（日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社）を用いて比較した。比較に用いた近縁生物は、ラムフィリス・ノクティルカ（Ｌａｍｐｙｒｉｓ  ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）（登録番号ＣＡＡ６１６６８）、ルキオラ・クルシアタ（Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａ）（登録番号Ｐ１３１２９）、ルキオラ・ラテラリス（Ｌｕｃｉｏｌａ  ｌａｔｅｒａｌｉｓ）（登録番号Ｑ０１１５８）、ルキオラ・ミングレリカ（Ｌｕｃｉｏｌａ  ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ）（登録番号Ｑ２６３０４）、ホタリア・パルヴラ（Ｈｏｔａｒｉａ  ｐａｒｖｕｌａ）（登録番号ＡＡＣ３７２５３）、フォティヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）（登録番号ＢＡＦ４８３９０）、フォトゥリス・ペンシルヴァニカ（Ｐｈｏｔｕｒｉｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａ）（登録番号Ｑ２７７５７）、ピロコエリア・ミヤコ（Ｐｙｒｏｃｏｅｌｉａ  ｍｉｙａｋｏ）（登録番号ＡＡＣ３７２５４）、ピロコエリア・ルファ（Ｐｙｒｏｃｏｅｌｉａ  ｒｕｆａ）（登録番号ＡＡＧ４５４３９）およびラハゴフタルムス・オーバイ（Ｒｈａｇｏｐｈｔｈａｌｍｕｓ  ｏｈｂａｉ）（登録番号ＢＡＦ３４３６０）である。
【００６３】
その結果、ホタルルシフェラーゼのＣ末端側４４０残基付近に位置するＬ−Ｉ−Ｋ−Ｙ−Ｋ−Ｇ−Ｙ−Ｑ−Ｖ（配列番号７）のアミノ酸配列がよく保存されていることがわかった。この９つのアミノ酸配列をコードするコドンから塩基配列を予測し、５’末端ＲＡＣＥ  ＰＣＲに用いる１２種類のホタルルシフェラーゼ特異的混合プライマーを設計した。このプライマーの名称および配列は以下の通りである（プライマー配列中のＹ、ＲおよびＮは混合塩基を示す。すなわち、Ｙは、ＣまたはＴを示し、Ｒは、ＡまたはＧを示し、Ｎは、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴを示す）：
ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＡＴＡ（５’−ＡＣＹ  ＴＧＲ  ＴＡＮ  ＣＣＹ  ＴＴＡ  ＴＡＴ  ＴＴＡ  ＡＴ−３’：配列番号８）、
ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＡＴＧ（５’−ＡＣＹ  ＴＧＲ  ＴＡＮ  ＣＣＹ  ＴＴＡ  ＴＡＴ  ＴＴＧ  ＡＴ−３’：配列番号９）、
ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＡＴＴ（５’−ＡＣＹ  ＴＧＲ  ＴＡＮ  ＣＣＹ  ＴＴＡ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＡＴ−３’：配列番号１０）、
ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＡＣＡ（５’−ＡＣＹ  ＴＧＲ  ＴＡＮ  ＣＣＹ  ＴＴＡ  ＴＡＣ  ＴＴＡ  ＡＴ−３’：配列番号１１）、
ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＡＣＧ（５’−ＡＣＹ  ＴＧＲ  ＴＡＮ  ＣＣＹ  ＴＴＡ  ＴＡＣ  ＴＴＧ  ＡＴ−３’：配列番号１２）、
ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＡＣＴ（５’−ＡＣＹ  ＴＧＲ  ＴＡＮ  ＣＣＹ  ＴＴＡ  ＴＡＣ  ＴＴＴ  ＡＴ−３’：配列番号１３）、
ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＧＴＡ（５’−ＡＣＹ  ＴＧＲ  ＴＡＮ  ＣＣＹ  ＴＴＧ  ＴＡＴ  ＴＴＡ  ＡＴ−３’：配列番号１４）、
ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＧＴＧ（５’−ＡＣＹ  ＴＧＲ  ＴＡＮ  ＣＣＹ  ＴＴＧ  ＴＡＴ  ＴＴＧ  ＡＴ−３’：配列番号１５）、
ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＧＴＴ（５’−ＡＣＹ  ＴＧＲ  ＴＡＮ  ＣＣＹ  ＴＴＧ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＡＴ−３’：配列番号１６）、
ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＧＣＡ（５’−ＡＣＹ  ＴＧＲ  ＴＡＮ  ＣＣＹ  ＴＴＧ  ＴＡＣ  ＴＴＡ  ＡＴ−３’：配列番号１７）、
ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＧＣＧ（５’−ＡＣＹ  ＴＧＲ  ＴＡＮ  ＣＣＹ  ＴＴＧ  ＴＡＣ  ＴＴＧ  ＡＴ−３’：配列番号１８）、
ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＧＣＴ（５’−ＡＣＹ  ＴＧＲ  ＴＡＮ  ＣＣＹ  ＴＴＧ  ＴＡＣ  ＴＴＴ  ＡＴ−３’：配列番号１９）。これらのプライマーの合成はライフテクノロジーズジャパン株式会社に委託して行った。
【００６４】
３−２．５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲによる、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の５’末端側のクローニング
上述の通り作製したホタル完全長ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として用い、上述の通り作製した１２種類の特異的混合プライマーおよび５’末端特異的プライマーであるＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＧＡ  ＣＴＧ  ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＧＡＧ  ＧＡＣ  ＡＣＴ  ＧＡ−３’：配列番号２０）およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＡ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＧＡＧ  ＴＡ−３’：配列番号２１）を用いて５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲを行った。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’  ＰｒｉｍｅｒおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’  Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒは、完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（インビトロジェン社）に含まれているものを使用した。５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲによって効率的にルシフェラーゼ遺伝子を増幅させるため、一度ＰＣＲによって増幅した遺伝子を鋳型にし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。ＰＣＲにはポリメラーゼＥｘ−Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。
【００６５】
一度目のＰＣＲとして、上述の通り作製した１２種類の特異的混合プライマーのいずれかとＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’  Ｐｒｉｍｅｒとから成る１２通りのプライマー対を用いてルシフェラーゼ遺伝子を増幅した。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）、最終濃度が１．０μＭの１２種類プライマーの内１つおよび最終濃度が０．３μＭのＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’  Ｐｒｉｍｅｒを含む１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへホタル完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液を０．２μｌ加えた。なお、ホタル完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液の濃度は未定量であった。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、４５℃３０秒および７２℃９０秒を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、１μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％トリス酢酸緩衝液（ＴＡＥ）アガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。１２の反応溶液の全てにおいてわずかに遺伝子増幅が認められたため、これらのＰＣＲ反応溶液を鋳型としてそれぞれｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ反応を次の通り実施した。
【００６６】
ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲとして、一度目のＰＣＲで使用した１２種類プライマーのうちの４つとＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’  Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒとから成る４通りのプライマー対を用いてルシフェラーゼ遺伝子の増幅を行った。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）、最終濃度が１．０μＭの１２種類プライマーの内１つおよび最終濃度が０．３μＭのＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’  Ｐｒｉｍｅｒを含む１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型として１度目のＰＣＲ反応溶液を滅菌水で１０倍希釈した溶液を１．０μｌ加えた。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、４５℃３０秒および７２℃９０秒を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、１μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。約１．４ｋｂｐ付近に効率よく遺伝子が増幅したプライマーの組み合わせ条件を確認した。
【００６７】
３−３．５’−ＲＡＣＥで増幅した遺伝子の塩基配列の決定
５’−ＲＡＣＥで増幅した遺伝子の塩基配列を読み取るため、ゲル抽出によるＰＣＲ産物の精製、サブクローニングおよびダイレクトシークエンスを実施した。詳細を以下に示す。
【００６８】
約１．４ｋｂｐ付近に効率よく遺伝子が増幅したプライマーの組み合わせでＰＣＲ（最終容量２０μｌ）を実施し、ゲル抽出の手法を用いて目的とする遺伝子片を回収した。ゲル抽出はＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。ＴＡクローニングの手法を用いて、ゲルから抽出したＰＣＲ産物のサブクローニングを実施した。ＴＡクローニングはｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。その後、このベクターＤＮＡを大腸菌（ＴＯＰ１０株またはＤＨ５α株）に形質転換し、青・白スクリーニングの手法を用いてインサートポジティブコロニーを選択した。選択されたコロニーをダイレクトコロニーＰＣＲに供し、遺伝子が導入されていることを確認した。ダイレクトコロニーＰＣＲには、Ｍ１３−Ｆ（−２９）  Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＡＣ  ＧＡＣ  ＧＴＴ  ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  Ｃ−３’：配列番号２２）とＭ１３  Ｒｅｖｅｒｓｅ（５’−ＧＧＡ  ＴＡＡ  ＣＡＡ  ＴＴＴ  ＣＡＣ  ＡＧＧ−３’：配列番号２３）とから成るプライマー対を用いた。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）、最終濃度がそれぞれ０．２μＭのプライマー対を含む１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型として少量の大腸菌コロニーを加えた。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃１分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃２分を２５サイクル繰り返し、最後に７２℃２分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、２μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。
【００６９】
増幅が確認できたＰＣＲ反応溶液について、ダイレクトシークエンシング法を用いてその遺伝子の塩基配列の決定を行った。ＰＣＲ産物精製キットＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いて、ＰＣＲ反応溶液に含まれる余剰なｄＮＴＰおよびプライマーを除去し、ＰＣＲダイレクトシークエンシングのための鋳型を調製した。ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）を用いて、この鋳型を含むシークエンシング反応溶液を調製し、サーマルサイクラーを用いてシークエンシング反応を行った。ＰＣＲ産物の精製およびシークエンシングはそれぞれマニュアルに従って実施した。シークエンシング反応後、反応産物の精製を次の通りに行った。反応溶液に２．５倍量の１００％エタノールを加え、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。次に、上清を取り除いた後、７０％エタノールを加えて沈殿を洗浄し、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。最後に、上清を取り除いた後、沈殿を乾燥させた。精製した沈殿にＨｉ−Ｄｉ  Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（アプライドバイオシステムズ）を１５μｌ加え、溶解させた。この溶液を９４℃で２分間熱変性させ、更に氷上で急冷して、塩基配列を決定するためのサンプルとした。このサンプルをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０ｘｌ  ジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズ）を用いて塩基配列を読み取った。塩基配列の解析方法はマニュアルに従って実施した。得られた塩基配列を、スジグロボタルルシフェラーゼ遺伝子の５’末端側非翻訳領域の塩基配列として配列番号２４に示す。
【００７０】
シークエンシングによって得られた遺伝子配列を、配列情報解析ソフトウェア  ＤＮＡＳＩＳ  Ｐｒｏの「シークエンス連結」機能を用いて解析した。この配列をＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）が提供するｂｌａｓｔｘサーチを利用して相同性検索を実施し、既知ホタルルシフェラーゼの塩基配列と高い相同性を示すことを確認した。以上の実験および解析で得られた塩基配列を新規ホタルルシフェラーゼ遺伝子の５’末端側であると決定した。
【００７１】
４．ホタルルシフェラーゼ遺伝子の３’Ｒａｃｅ  ＰＣＲおよび完全長ｃＤＮＡの取得
４−１．３’Ｒａｃｅ  ＰＣＲに用いるプライマーの設計
５’Ｒａｃｅ  ＰＣＲの実験で得られたホタルルシフェラーゼ遺伝子の５’末端側非翻訳領域の配列を基にして、３’ＲＡＣＥに用いるプライマー（配列番号２７）およびＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲに用いるプライマー（配列番号２８）を作成した。プライマーの合成はライフテクノロジーズジャパン株式会社に委託した。
【００７２】
４−２．ホタルルシフェラーゼ遺伝子の完全長ｃＤＮＡ取得のための３’Ｒａｃｅ  ＰＣＲ
上述の通り作成したホタル完全長ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として用い、目的とするホタルルシフェラーゼの５’末端側非翻訳領域の塩基配列から作製したプライマーＪＰ−Ｓｕｊｉｇｕｒｏ−Ｆｕｌｌ−Ｆ１（ＣＴＴＴＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＧＡＴＴＣＡＡＴＡＡＡＧ）：配列番号２５）、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’  Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＣＴ  ＧＴＣ  ＡＡＣ  ＧＡＴ  ＡＣＧ  ＣＴＡ  ＣＧＴ  ＡＡＣ  Ｇ−３’：配列番号２７）およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’  Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＧＣ  ＴＡＣ  ＧＴＡ  ＡＣＧ  ＧＣＡ  ＴＧＡ  ＣＡＧ  ＴＧ−３’：配列番号２８）を用いて３’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲを行った。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’  ＰｒｉｍｅｒおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’  Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒは、完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（インビトロジェン社）に含まれているものを使用した。３’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲによって効率的にルシフェラーゼ遺伝子を増幅させるため、一度ＰＣＲによって増幅した遺伝子を鋳型にし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。ＰＣＲにはポリメラーゼＥｘ−Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。
【００７３】
一度目のＰＣＲとして、５’末端側非翻訳領域の塩基配列から作製したプライマーとＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’  Ｐｒｉｍｅｒとから成るプライマー対を用いてルシフェラーゼ遺伝子の増幅を行った。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）および最終濃度がそれぞれ０．３μＭのプライマーを含む２０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへホタル完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液を０．４μｌ加えた。なお、ホタル完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液の濃度は未定量であった。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃２分を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、１μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。わずかに遺伝子増幅が認められたため、このＰＣＲ反応溶液を鋳型としてそれぞれｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ反応を実施した。
【００７４】
Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲとして、Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ用のプライマーＪＰ−Ｓｕｊｉｇｕｒｏ−Ｆｕｌｌ−Ｆ２（ＣＴＴＴＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＧＡＴＴＣＡＡＴＡＡＡＧＴＡＡＴＴＴＡＧ：配列番号２６）とＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’  Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒとから成るプライマー対を用いてルシフェラーゼ遺伝子の増幅を行った。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）および最終濃度がそれぞれ０．３μＭのプライマーを含む２０μｌのＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型として１度目のＰＣＲ反応溶液を滅菌水で１０倍希釈した溶液を１．０μｌ加えた。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃２分を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、１μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。約２ｋｂｐ付近に効率よく遺伝子が増幅していることを確認した。
【００７５】
４−３．３’−Ｒａｃｅで増幅した遺伝子の塩基配列の決定
３’−ＲＡＣＥで増幅した遺伝子の塩基配列を読み取るため、ゲル抽出によるＰＣＲ産物の精製、サブクローニングおよびダイレクトシークエンスを実施した。詳細を以下に示す。
【００７６】
約２ｋｂｐ付近に効率よく遺伝子が増幅したプライマーの組み合わせでＰＣＲ（最終容量２０μｌ）を実施し、ゲル抽出の手法を用いて目的とする遺伝子片を回収した。ゲル抽出はＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。ＴＡクローニングの手法を用いて、ゲルから抽出したＰＣＲ産物のサブクローニングを実施した。ＴＡクローニングはｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。その後、このベクターＤＮＡを大腸菌（ＴＯＰ１０株またはＤＨ５α株）に形質転換し、青・白スクリーニングの手法を用いてインサートポジティブコロニーを選択した。選択されたコロニーをダイレクトコロニーＰＣＲに供し、遺伝子が導入されていることを確認した。ダイレクトコロニーＰＣＲには、Ｍ１３−Ｆ（−２９）  Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＡＣ  ＧＡＣ  ＧＴＴ  ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  Ｃ−３’：配列番号２１）とＭ１３  Ｒｅｖｅｒｓｅ（５’−ＧＧＡ  ＴＡＡ  ＣＡＡ  ＴＴＴ  ＣＡＣ  ＡＧＧ−３’：配列番号２２）とから成るプライマー対を用いた。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）、最終濃度がそれぞれ０．２μＭのプライマー対を含む１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型として少量の大腸菌コロニーを加えた。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃１分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃２分を２５サイクル繰り返し、最後に７２℃２分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、２μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。
【００７７】
増幅が確認できたＰＣＲ反応溶液について、ダイレクトシークエンシング法を用いてその遺伝子の塩基配列の決定を行った。ＰＣＲ産物精製キットＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いて、ＰＣＲ反応溶液に含まれる余剰なｄＮＴＰおよびプライマーを除去し、ＰＣＲダイレクトシークエンシングのための鋳型を調製した。ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）を用いて、この鋳型を含むシークエンシング反応溶液を調製し、サーマルサイクラーを用いてシークエンシング反応を行った。シークエンスに用いたプライマーはベクタープライマーまたは遺伝子特異的なプライマーを用いた。ＰＣＲ産物の精製およびシークエンシングはそれぞれマニュアルに従って実施した。シークエンシング反応後、反応産物の精製を次の通りに行った。反応溶液に２．５倍量の１００％エタノールを加え、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。次に、上清を取り除いた後、７０％エタノールを加えて沈殿を洗浄し、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。最後に、上清を取り除いた後、沈殿を乾燥させた。精製した沈殿にＨｉ−Ｄｉ  Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（アプライドバイオシステムズ）を１５μｌ加え、溶解させた。この溶液を９４℃２分間の熱変性させ、更に氷上で急冷して、塩基配列を決定するためのサンプルとした。このサンプルをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズ）を用いて塩基配列を読み取った。塩基配列の解析方法はマニュアルに従って実施した。得られた塩基配列を、野生型スジグロボタルルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列として配列番号２に示す。
【００７８】
シークエンシングによって完全長ホタルルシフェラーゼ遺伝子を獲得した。この塩基配列（配列番号２）もしくはアミノ酸へ翻訳した配列（配列番号１）について、ＮＣＢＩが提供するｂｌａｓｔｘまたはｂｌａｓｔｐサーチを利用して相同性検索を実施した。それぞれの検索で既知ホタルルシフェラーゼの塩基配列と高い相同性を示すことを確認した。以上の実験および解析で得られた塩基配列を新規ホタルルシフェラーゼ遺伝子の完全長ｃＤＮＡ配列であると決定した。
【００７９】
塩基配列（配列番号２）は、以下の通りである。
ATGGATAACGATAAAAATATTGTATATGGTCCCGAGCCATTTTACCCTGTTGATAAAGGATCCGCAGGAGCACAAATACACAAATATTTGCATCAATACTCAAAACTTGGAGCAATCGCGTTTACCAACGCGCTTACTGGTGTTGATATTACTTACGCCGAATACTTTGATATAACTTGCCGTTTAGGAGAAGCAATGAAAAGATATGGTATTAAAGTAGATGGAAGAATTGCTTTATGCAGTGAAAACTGTGAAGAATTTTTTTATCCTGTAATTGCTGGACTTTACATAGGTGCAGGCGTTGCTCCCACAAACGAGATTTACACCTTACGCGAGTTAGTCCACAGTTTAGGTATCTCAAAACCAACAATTGTATTTAGCTCTAAAAAAGGTTTAGATAAAGTTTTGCACGTACAAAAAACAGTGACATGCATTAAAACGATTGTTATATTAGACAGCAAAGTGGATTATAAAGGATACGACTGTGTGGAAAGTTTTATAAAAAGATACAATCCGCCAGGTTTCcAAGCTGCGAGTTTCAAAACTGTAGAGGTTGACCGCAAAGAGCAAATTGCTCTCATTATGAACTCTTCCGGTTCTACCGGTTTACCAAAAGGTGTACAACTTACTCACGAATGCGCGGTTACTAGATTCTCTCATGCCAAGGATCCCATTTACGGCAACCAAGTTTCACCAGGCACAGCCGTTTTAACTGTTGTTCCATTCCATCATGGTTTTGGTATGTTTACCACTTTAGGATATTTAGCTTGTGGATTTCGCGTCGTTATGCTAACAAGATTTGACGAAGAGATATTTTTAAAAACTATACAAGACTATAAATGTACAAGTGTCATTCTTGTACCGACTTTGTTCGGAATCCTCTCTAAAAGTAAGTTATTGGACAAATACGATCTGTCGAATCTAGTTGAAATTGCGTCTGGCGGAGCTCCATTAGCAAAAGAAGTTAGCGAAGCCGTAGCCAGACGGTTCAACCTTCCCGGAGTCCGTCAAGGTTACGGTTTGACGGAAACAACGTCTGCTATTATTATCACTCCAGAAGGTGACGATAAACCGGGTGCATCTGGAAAAGTTGTACCGTTGTTCAAAGCAAAAGTTGTTGACCTTGACACCAAAAAAACGTTGGGTCCTAACCAACGAGGTGAAGTATGCGTTAAAGGCCCTATGCTTATGAAAGGATACGTAGATAATCCGGAAGCAACCAGAGAAATTATTGACGAAGATGGCTGGTTGCACACTGGGGATATTGGATATTACGATGAGGACCAACACTTCTTTATTGTTGATCGTTTGAAGTCGTTAATAAAATACAAGGGATACCAAGTACCACCTGCAGAATTAGAATCTGTTCTTTTGCAACATCCATACATATTTGATGCTGGAGTAGCTGGTGTTCCTGATGCTGAAGCTGGTGAACTTCCTGGAGCAGTTGTTGTACTTGAAAAAGGAAAGCACGTGACTGAAAAAGAAATAATGGATTACGTTGCTGGCCAAGTCTCAAATGCAAAACGTTTGCGTGCTGGTGTTCGTTTTGTGGACGAAGTACCTAAAGGTCTTACTGGAAAAATTGATGGCAAAGCTATTAGAGAAATTCTTATGAAACCAAAATCTAAAATGTAA
【００８０】
アミノ酸へ翻訳した配列（配列番号１）は、以下の通りである。
MDNDKNIVYGPEPFYPVDKGSAGAQIHKYLHQYSKLGAIAFTNALTGVDITYAEYFDITCRLGEAMKRYGIKVDGRIALCSENCEEFFYPVIAGLYIGAGVAPTNEIYTLRELVHSLGISKPTIVFSSKKGLDKVLHVQKTVTCIKTIVILDSKVDYKGYDCVESFIKRYNPPGFQAASFKTVEVDRKEQIALIMNSSGSTGLPKGVQLTHECAVTRFSHAKDPIYGNQVSPGTAVLTVVPFHHGFGMFTTLGYLACGFRVVMLTRFDEEIFLKTIQDYKCTSVILVPTLFGILSKSKLLDKYDLSNLVEIASGGAPLAKEVSEAVARRFNLPGVRQGYGLTETTSAIIITPEGDDKPGASGKVVPLFKAKVVDLDTKKTLGPNQRGEVCVKGPMLMKGYVDNPEATREIIDEDGWLHTGDIGYYDEDQHFFIVDRLKSLIKYKGYQVPPAELESVLLQHPYIFDAGVAGVPDAEAGELPGAVVVLEKGKHVTEKEIMDYVAGQVSNAKRLRAGVRFVDEVPKGLTGKIDGKAIREILMKPKSKM
【００８１】
以下、この新規のルシフェラーゼ遺伝子にコードされるタンパク質を野生型スジグロボタルルシフェラーゼと称する。
【００８２】
［実施例２：野生型スジグロボタルルシフェラーゼの酵素学的なパラメータの測定］
１．野生型スジグロボタルルシフェラーゼ遺伝子のタンパク質発現
野生型スジグロボタルルシフェラーゼ遺伝子を大腸菌でタンパク質発現させるため、ｐＲＳＥＴ−Ｂベクター（インビトロジェン）に導入した。遺伝子発現ベクターの構築は標準的な方法に従い以下のように実験を実施した。
【００８３】
１−１．野生型スジグロボタルルシフェラーゼ遺伝子の制限酵素認識部位の改変
上述の通り決定した塩基配列によれば、野生型スジグロボタルルシフェラーゼ遺伝子はＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩの制限酵素認識配列を含む。ルシフェラーゼのアミノ酸配列を維持しつつ、これらの塩基配列におけるこれらの認識配列を除去する遺伝子改変を実施した。この処理は、後述するルシフェラーゼ遺伝子の発現ベクターへの導入を容易にするために行った。遺伝子変異の導入は、多比良和誠編「遺伝子の機能阻害実験法―簡単で確実な遺伝子機能解析から遺伝子治療への応用まで」（羊土社、２００１年発行、ｐ．１７−２５）に示される方法に従った。変異導入後の配列は、配列番号３に示される塩基配列である。
【００８４】
変異導入後の配列（配列番号３）は、以下の通りである。
ATGGATAACGATAAAAATATTGTATATGGTCCCGAGCCATTTTACCCTGTTGATAAAGGTTCCGCAGGAGCACAAATACACAAATATTTGCATCAATACTCAAAACTTGGAGCAATCGCGTTTACCAACGCGCTTACTGGTGTTGATATTACTTACGCCGAATACTTTGATATAACTTGCCGTTTAGGAGAAGCAATGAAAAGATATGGTATTAAAGTAGATGGAAGAATTGCTTTATGCAGTGAAAACTGTGAAGAATTTTTTTATCCTGTAATTGCTGGACTTTACATAGGTGCAGGCGTTGCTCCCACAAACGAGATTTACACCTTACGCGAGTTAGTCCACAGTTTAGGTATCTCAAAACCAACAATTGTATTTAGCTCTAAAAAAGGTTTAGATAAAGTTTTGCACGTACAAAAAACAGTGACATGCATTAAAACGATTGTTATATTAGACAGCAAAGTGGATTATAAAGGATACGACTGTGTGGAAAGTTTTATAAAAAGATACAATCCGCCAGGTTTCCAAGCTGCGAGTTTCAAAACTGTAGAGGTTGACCGCAAAGAGCAAATTGCTCTCATTATGAACTCTTCCGGTTCTACCGGTTTACCAAAAGGTGTACAACTTACTCACGAATGCGCGGTTACTAGATTCTCTCATGCCAAGGACCCCATTTACGGCAACCAAGTTTCACCAGGCACAGCCGTTTTAACTGTTGTTCCATTCCATCATGGTTTTGGTATGTTTACCACTTTAGGATATTTAGCTTGTGGATTTCGCGTCGTTATGCTAACAAGATTTGACGAAGAGATATTTTTAAAAACTATACAAGACTATAAATGTACAAGTGTCATTCTTGTACCGACTTTGTTCGGAATCCTCTCTAAAAGTAAGTTATTGGACAAATACGATCTGTCGAATCTAGTTGAAATTGCGTCTGGCGGAGCTCCATTAGCAAAAGAAGTTAGCGAAGCCGTAGCCAGACGGTTCAACCTTCCCGGAGTCCGTCAAGGTTACGGTTTGACGGAAACAACGTCTGCTATTATTATCACTCCAGAAGGTGACGATAAACCGGGTGCATCTGGAAAAGTTGTACCGTTGTTCAAAGCAAAAGTTGTTGACCTTGACACCAAAAAAACGTTGGGTCCTAACCAACGAGGTGAAGTATGCGTTAAAGGCCCTATGCTTATGAAAGGATACGTAGATAATCCGGAAGCAACCAGAGAAATTATTGACGAAGATGGCTGGTTGCACACTGGGGATATTGGATATTACGATGAGGACCAACACTTCTTTATTGTTGATCGTTTGAAGTCGTTAATAAAATACAAGGGATACCAAGTACCACCTGCAGAATTAGAATCTGTTCTTTTGCAACATCCATACATATTTGATGCTGGAGTAGCTGGTGTTCCTGATGCTGAAGCTGGTGAACTTCCTGGAGCAGTTGTTGTACTTGAAAAAGGAAAGCACGTGACTGAAAAAGAAATAATGGATTACGTTGCTGGCCAAGTCTCAAATGCAAAACGTTTGCGTGCTGGTGTTCGTTTTGTGGACGAAGTACCTAAAGGTCTTACTGGAAAAATTGATGGCAAAGCTATTAGAGAAATTCTTATGAAACCAAAATCTAAAATGTAA
【００８５】
１−２．野生型スジグロボタルルシフェラーゼ遺伝子の遺伝子発現ベクターへの導入
ルシフェラーゼ遺伝子を、ｐＲＳＥＴ−Ｂベクターの制限酵素サイトＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ間に導入するため、開始コドンおよびその前に制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列ＧＧＡＴＣＣを含むプライマー（配列番号２９）、並びに終止コドンおよびその後ろに制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列ＧＡＡＴＴＣを含むプライマー（配列番号３０）を作成した。このプライマー対を用いて、ルシフェラーゼ遺伝子の両端に上述の制限酵素認識部位を含んだ断片の増幅を行った。ＰＣＲは、ポリメラーゼＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。
【００８６】
最終濃度が等倍の１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が１．０ｍＭのＭｇＳＯ４、最終濃度が０．０２Ｕ／μｌのＴＯＹＯＢＯ  ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（１Ｕ／μｌ）、最終濃度がそれぞれ０．３μＭのプライマー対を含む２０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型としてＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ認識配列を持たないルシフェラーゼ遺伝子の溶液を０．４μｌ加えた。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５５℃３０秒および６８℃２分を３０サイクル繰り返し、最後に６８℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、１μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。遺伝子増幅が認められたため、このＰＣＲ反応溶液を通常のエタノール沈殿法により沈殿濃縮し、制限酵素処理用１０×Ｈ  Ｂｕｆｆｅｒを４μｌ、制限酵素ＢａｍＨＩ（東洋紡績株式会社）および制限酵素ＥｃｏＲＩ（東洋紡績株式会社）を各２μｌならびに滅菌脱イオン水３２μｌを加えて溶解し、３７℃で２時間保温して制限酵素処理した。その後、この反応溶液をエタノール沈殿法により沈殿濃縮した後、滅菌脱イオン水に溶解した。この溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色を行った。紫外線照射下において確認されるＤＮＡバンドを含むゲルを、ナイフを用いて切り出した。この切り出したゲルからＷｉｚａｒｄ（Ｒ）  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）を用いてＤＮＡを抽出した。これらの操作はマニュアルに従って実施した。その後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｐａｃｋ（ニッポンジーン）をマニュアルに従って用いて、あらかじめ同様の方法で制限酵素ＢａｍＨＩと制限酵素ＥｃｏＲＩで処理したｐＲＳＥＴ−Ｂベクターに抽出したＤＮＡを導入した。このベクターＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株に形質転換し、コロニーを形成させた。
【００８７】
得られたコロニーを鋳型としてダイレクトコロニーＰＣＲを実施し、ｐＲＳＥＴ−Ｂに導入したルシフェラーゼ遺伝子を増幅した。ダイレクトコロニーＰＣＲは、Ｔ７  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＧＧ−３’：配列番号３１）およびＴ７  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＴＡ  ＧＴＴ  ＡＴＴ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＣＧＧ  ＴＧＧ−３’：配列番号３２）のプライマー対を用いて行った。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）および最終濃度がそれぞれ０．２μＭのプライマーを含む１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型として少量の大腸菌コロニーを加えた。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃２分を２５サイクル繰り返し、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、１μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。
【００８８】
増幅が確認できたＰＣＲ反応溶液について、ダイレクトシークエンシング法を用いてその遺伝子の塩基配列の決定を行った。ＰＣＲ産物精製キットＥｘｏＳＡＰ−ＩＴを用いて、ＰＣＲ反応溶液に含まれる余剰なｄＮＴＰおよびプライマーを除去し、ＰＣＲダイレクトシークエンシングのための鋳型を調製した。ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて、この鋳型を含むシークエンシング反応溶液を調製し、サーマルサイクラーを用いてシークエンシング反応を行った。シークエンスには、ベクタープライマーまたは遺伝子特異的なプライマーを用いた。ＰＣＲ産物の精製およびシークエンシングはそれぞれマニュアルに従って実施した。シークエンシング反応後、反応産物の精製を次の通りに行った。反応溶液に２．５倍量の１００％エタノールを加え、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。次に、上清を取り除いた後、７０％エタノールを加えて沈殿を洗浄し、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。最後に、を取り除いた後、沈殿を乾燥させた。精製した沈殿にＨｉ−Ｄｉ  Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（アプライドバイオシステムズ）を１５μｌ加え、溶解させた。この溶液を９４℃２分間の熱変性させ、更に氷上で急冷して、塩基配列を決定するためのサンプルとした。このサンプルをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０ｘｌ  ジェネティックアナライザを用いて塩基配列を読み取り、配列番号３の塩基配列が、正常に遺伝子発現ベクターｐＲＳＥＴ−Ｂに導入されていることを確認した。
【００８９】
２．発光タンパク質の精製
ＪＭ１０９（ＤＥ３）を含む大腸菌溶液５０μｌにルシフェラーゼ発現ベクター０．５μｌを添加し、氷上で１０分、その後４２℃で１分、最後に氷上で２分インキュベートした。その後、大腸菌溶液５０μｌをＳＯＣ培地２００μｌに加えた。その大腸菌／ＳＯＣ培地混合溶液を３７℃で２０分間振とうしながらインキュベートした。インキュベート後のサンプル１００μｌをＬＢ培地プレート（１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）にストリークし、３７℃で一晩インキュベートした。翌日得られたコロニーをピックアップし、５００ｍｌスケールのＬＢ培地で培養した。培養は３７℃で２４時間、１８℃で２４時間行った。合計４８時間の培養の後、遠心分離で菌体を回収し、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．０）に再度懸濁して超音波破砕した。菌体破砕液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分）し、沈査を除去して上清を回収した。ベッドボリューム２ｍｌのカラムにＮｉ−Ａｇａｒ懸濁液５００μｌと０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２ｍｌを加え、カラムを平衡化した。回収した上清をカラムに添加し、自然落下させた。上清の全量がカラムを通過するまでの間の操作は全て４℃の条件で行った。２５ｍＭイミダゾール／０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液２ｍｌでカラムを洗浄した。洗浄後のカラムに５００ｍＭイミダゾール／０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液を２ｍｌ加え、ルシフェラーゼを溶出した。溶出されたサンプルをゲルろ過カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア）でろ過し、脱塩した。脱塩後のサンプルをＶｉｖａｓｐｉｎ６（ザルトリウス）で限界ろ過し、濃縮されたサンプルにグリセリンを添加して、５０％グリセリン溶液とした。保存は−２０℃で行った。
【００９０】
３．発光スペクトルの測定
測定のための装置としてＬｕｍｉＦｌＳｐｅｃｔｒｏＣａｐｔｕｒｅ（ＡＴＴＯ）を用い、０．１Ｍクエン酸／０．１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０−８．０）に１ｍＭ  Ｄ−ルシフェリン、２ｍＭ  ＡＴＰおよび４ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む溶液に、精製酵素を１μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌの間の最終濃度で添加し、酵素添加後１５秒経過時点で発光スペクトルを測定した。測定結果を図１に示す。
【００９１】
図１より、取得された野生型スジグロボタルルシフェラーゼは、ｐＨ８．０の環境において、５８３ｎｍ付近に最大発光波長を示している。また、また、最大発光波長は、ｐＨ７．５、ｐＨ７．０、ｐＨ６．５、ｐＨ６．０およびｐH５．５で、それぞれ、約５９０ｎｍ、約６００ｎｍ、約６０９ｎｍ、約６１４ｎｍおよび約６１３nm、であり、ｐＨが下がるほど最大波長は長くなる傾向がみられる。
【００９２】
４．速度論的解析
４−１．Ｄ−ルシフェリンおよびＡＴＰの濃度の決定
Ｄ−ルシフェリン溶液中のＤ−ルシフェリン濃度およびＡＴＰ溶液中のＡＴＰ濃度を以下の通りに決定した。
【００９３】
ＵＶ−Ｖｉｓｉｂｌｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｈｉｔａｃｈｉ）を用いて、Ｄ−ルシフェリン溶液およびＡＴＰ溶液の紫外可視吸収スペクトルを測定し、この測定結果と以下のε値とから濃度を算出した。  
Ｄ−ルシフェリン：λｍａｘ  ３２８ｎｍ、ε１８２００、ｐＨ５．０
ＡＴＰ：λｍａｘ  ２５９ｎｍ、ε１５４００、ｐＨ７．０。
【００９４】
測定はそれぞれ１０回ずつ行い、吸光度の平均値を濃度算出に用いた。このように濃度を決定したＤ−ルシフェリン溶液およびＡＴＰ溶液を用いて、以下のＫｍ値算出を行った。
【００９５】
４−２．Ｄ−ルシフェリンに対するＫｍ値の測定
様々なＤ−ルシフェリン濃度の環境下において、得られたルシフェラーゼによる発光の強度を測定した。測定結果に基づいて、Ｄ−ルシフェリンに対するＫｍ値を決定した。
【００９６】
Ｄ−ルシフェリンを０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に添加して、異なる濃度の１２種類のＤ−ルシフェリン溶液を作製した。これらの溶液は、Ｄ−ルシフェリンの終濃度がそれぞれ０．６２５、１．２５、２．５、５、１０、２０、４０、８０、１６０、３２０、４８０および６４０μＭとなるようにＤ−ルシフェリンを含む。これらのＤ−ルシフェリン溶液を９６穴マイクロプレートに５０μｌずつ分注した。各種精製ルシフェラーゼ、４ｍＭ  ＡＴＰおよび８ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液をルミノメーターの標準ポンプに接続し、当該溶液をウェルに５０μｌ添加すると同時に測定を行った。測定にはＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｏｒ（ＡＴＴＯ）を使用した。測定は各ルシフェリン濃度について３回ずつ行った。
【００９７】
得られたフォトンカウント値のピーク強度を初速度Ｖとして、ルシフェリン濃度Ｓに対してプロットした。このプロットにミカエリス・メンテン型のカーブフィッティングを行い、Ｋｍ値を算出した。カーブフィッティングは非線形の最小二乗法で行い、パラメータの探索にはニュートン法を用いた。
【００９８】
４−３．ＡＴＰに対するＫｍ値の測定
様々なＡＴＰ濃度の環境下において、得られたルシフェラーゼによる発光の強度を測定した。測定結果に基づいて、ＡＴＰに対するＫｍ値を決定した。
【００９９】
ＡＴＰを０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に添加して、異なる濃度の１２種類のＡＴＰ溶液を作製した。これらの溶液は、ＡＴＰの終濃度がそれぞれ５、１０、２０、４０、８０、１６０、３２０、４８０、６４０、８００、１２８０、１６００および１９２０μＭとなるようにＡＴＰを含む。これらのＡＴＰ溶液をそれぞれ９６穴マイクロプレートに５０μｌずつ分注した。各種精製ルシフェラーゼ、１ｍＭ  Ｄ−ルシフェリン、８ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液をルミノメーターの標準ポンプに接続し、当該溶液をウェルに５０μｌ添加すると同時に測定を行った。測定は各ＡＴＰ濃度について３回ずつ行った。
【０１００】
得られたフォトンカウント値のピーク強度を初速度Ｖとして、ＡＴＰ濃度Ｓに対してプロットした。このプロットにミカエリス・メンテン型のカーブフィッティングを行い、Ｋｍ値を算出した。カーブフィッティングは非線形の最小二乗法で行い、パラメータの探索にはニュートン法を用いた。
【０１０１】
上記のようにして決定されたＤ−ルシフェリンに対するＫｍ値およびＡＴＰに対するＫｍ値を表１に示す。表１には、同様に測定した既知のルシフェラーゼの各Ｋｍ値も示される。Ｐ．ピラリスとは既知のホタル由来のルシフェラーゼである。また、ＥＬｕｃ、ＣＢＧおよびＣＢＲとは既知のコメツキムシ由来のルシフェラーゼである。これらの既知のルシフェラーゼは市販されるものを使用した。
【０１０２】
【表１】
0005980608.tif 000002
【０１０３】
さらに、これらの結果について、縦軸をＡＴＰに対するＫｍ値とし、横軸をＤ−ルシフェリンに対するＫｍ値としてプロットした図を、図２として示す。
【０１０４】
［実施例３：変異型スジグロボタルルシフェラーゼの作製とＨｅＬａ細胞内における発光強度および発光スペクトルの比較］
１．変異型スジグロボタルルシフェラーゼの作製
下記のとおり、変異型スジグロボタルルシフェラーゼを発現する変異型遺伝子を作製した。
【０１０５】
哺乳細胞における発現に最適化したルシフェラーゼ遺伝子（配列番号４）に対し、配列番号４によりコードされるアミノ酸配列上２８３番目のセリンをロイシンに置換する変異（Ｓ２８３Ｌ）を導入した。
【０１０６】
なお、哺乳細胞における発現に最適化したルシフェラーゼ遺伝子（配列番号４）は、以下の通りである。
ATGGACAACGACAAGAACATCGTGTACGGCCCCGAGCCCTTCTACCCCGTGGATAAGGGATCTGCCGGCGCTCAGATCCACAAGTACCTGCACCAGTACAGCAAGCTGGGCGCCATTGCCTTCACCAATGCCCTGACCGGCGTGGACATCACCTACGCCGAGTACTTCGACATCACCTGTCGGCTGGGCGAGGCCATGAAGAGATACGGCATCAAGGTGGACGGCCGGATCGCCCTGTGCAGCGAGAACTGCGAAGAGTTCTTCTACCCTGTGATCGCCGGCCTGTACATCGGAGCTGGCGTGGCCCCCACCAACGAGATCTACACCCTGCGGGAACTGGTGCACAGCCTGGGCATCAGCAAGCCCACCATCGTGTTCAGCAGCAAGAAAGGCCTGGACAAGGTGCTGCATGTGCAGAAAACCGTGACCTGCATCAAGACCATCGTGATCCTGGACAGCAAGGTGGACTACAAGGGCTACGACTGCGTGGAATCCTTCATCAAGCGGTACAACCCCCCAGGCTTCCAGGCCGCCAGCTTCAAGACCGTGGAAGTGGACCGGAAAGAGCAGATCGCCCTGATCATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCTAAAGGCGTGCAGCTGACACACGAGTGCGCCGTGACCAGATTCAGCCACGCCAAGGACCCCATCTACGGCAACCAGGTGTCCCCTGGAACCGCCGTGCTGACCGTGGTGCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTATCTGGCCTGCGGCTTCAGAGTGGTCATGCTGACCCGCTTCGACGAGGAAATCTTCCTGAAAACCATCCAGGACTACAAGTGCACCTCTGTGATCCTGGTGCCCACCCTGTTCGGCATCCTGAGCAAGAGCAAGCTGCTGGATAAGTACGACCTGAGCAACCTGGTGGAAATCGCCTCTGGCGGAGCCCCCCTGGCCAAAGAAGTGTCTGAAGCCGTCGCCAGACGGTTCAACCTGCCTGGCGTGCGGCAGGGCTACGGACTGACAGAGACAACCAGCGCCATCATCATCACCCCCGAGGGCGACGATAAGCCTGGCGCCTCTGGAAAGGTGGTGCCCCTGTTCAAGGCCAAGGTGGTGGACCTGGACACCAAGAAAACCCTGGGCCCCAACCAGCGGGGCGAAGTCTGTGTGAAGGGCCCCATGCTGATGAAGGGCTACGTGGACAACCCCGAGGCCACCAGAGAGATCATCGACGAGGACGGCTGGCTGCACACAGGCGACATCGGCTACTACGACGAGGACCAGCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGATCAAGTATAAGGGCTACCAGGTGCCCCCAGCCGAGCTGGAATCTGTGCTGCTGCAGCATCCCTACATCTTCGATGCCGGCGTGGCCGGGGTGCCAGATGCTGAAGCAGGCGAACTGCCTGGGGCTGTCGTGGTGCTGGAAAAGGGCAAGCACGTGACCGAGAAAGAAATCATGGACTACGTGGCCGGACAGGTGTCCAACGCCAAGAGACTGAGAGCCGGCGTGCGCTTCGTGGATGAAGTGCCTAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACGGCAAGGCCATCCGCGAGATCCTGATGAAGCCCAAGAGCAAGATGTGA
【０１０７】
上記変異の導入のために、以下のプライマーを用いた。
Ｓ２８３Ｌ変異：（ＧＡＣＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣｎｎｎＧＴＧＡＴＣＣＴＧＧＴＧＣＣＣ：配列番号３５）（ｎｎｎは、任意の塩基からなる配列を表す。）
このプライマーを用いて、２８３番目のアミノ酸に任意の改変を有し、高輝度の発光を誘起する活性を有し、かつ、発光色が長波長側にシフトした変異型ルシフェラーゼをコードする遺伝子を作成した。
【０１０８】
変異の導入は文献の記載に基づいて行った（Ａｓａｋｏ  Ｓａｗａｎｏ  ａｎｄ  Ａｔｓｕｓｈｉ  Ｍｉｙａｗａｋｉ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，  Ｖｏｌ．２８，  Ｎｏ．１６）。変異導入後にシーケンサーを用いて配列を読み取り、目的とする変異がスジグロボタルルシフェラーゼ遺伝子に導入されていること及び更にＩ１４８Ｖの変異が導入されていることを確認した。Ｉ１４８Ｖの変異は、当初意図していなかった変異であり、ＰＣＲにおいて偶然に置換されたものである。
【０１０９】
作製したスジグロボタル変異型ルシフェラーゼを赤色変異体１と称する。これは、Ｉ１４８ＶおよびＳ２８３Ｌの変異を有する。この赤色変異体１は、更にＫｏｚａｋ配列の付与による変異を有する。
赤色変異体１のアミノ酸配列は配列番号３３に記載され、この赤色変異体１をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号３４に記載される。
【０１１０】
赤色変異体１のアミノ酸配列（配列番号３３）は、以下の通りである。変異アミノ酸に下線を付す。
MDNDKNIVYGPEPFYPVDKGSAGAQIHKYLHQYSKLGAIAFTNALTGVDITYAEYFDITCRLGEAMKRYGIKVDGRIALCSENCEEFFYPVIAGLYIGAGVAPTNEIYTLRELVHSLGISKPTIVFSSKKGLDKVLHVQKTVTCIKTVVILDSKVDYKGYDCVESFIKRYNPPGFQAASFKTVEVDRKEQIALIMNSSGSTGLPKGVQLTHECAVTRFSHAKDPIYGNQVSPGTAVLTVVPFHHGFGMFTTLGYLACGFRVVMLTRFDEEIFLKTIQDYKCTLVILVPTLFGILSKSKLLDKYDLSNLVEIASGGAPLAKEVSEAVARRFNLPGVRQGYGLTETTSAIIITPEGDDKPGASGKVVPLFKAKVVDLDTKKTLGPNQRGEVCVKGPMLMKGYVDNPEATREIIDEDGWLHTGDIGYYDEDQHFFIVDRLKSLIKYKGYQVPPAELESVLLQHPYIFDAGVAGVPDAEAGELPGAVVVLEKGKHVTEKEIMDYVAGQVSNAKRLRAGVRFVDEVPKGLTGKIDGKAIREILMKPKSKM
【０１１１】
赤色変異体１をコードする遺伝子の塩基配列（配列番号３４）は、以下の通りである。
ATGGACAACGACAAGAACATCGTGTACGGCCCCGAGCCCTTCTACCCCGTGGATAAGGGATCTGCCGGCGCTCAGATCCACAAGTACCTGCACCAGTACAGCAAGCTGGGCGCCATTGCCTTCACCAATGCCCTGACCGGCGTGGACATCACCTACGCCGAGTACTTCGACATCACCTGTCGGCTGGGCGAGGCCATGAAGAGATACGGCATCAAGGTGGACGGCCGGATCGCCCTGTGCAGCGAGAACTGCGAAGAGTTCTTCTACCCTGTGATCGCCGGCCTGTACATCGGAGCTGGCGTGGCCCCCACCAACGAGATCTACACCCTGCGGGAACTGGTGCACAGCCTGGGCATCAGCAAGCCCACCATCGTGTTCAGCAGCAAGAAAGGCCTGGACAAGGTGCTGCATGTGCAGAAAACCGTGACCTGCATCAAGACCGTCGTGATCCTGGACAGCAAGGTGGACTACAAGGGCTACGACTGCGTGGAATCCTTCATCAAGCGGTACAACCCCCCAGGCTTCCAGGCCGCCAGCTTCAAGACCGTGGAAGTGGACCGGAAAGAGCAGATCGCCCTGATCATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCTAAAGGCGTGCAGCTGACACACGAGTGCGCCGTGACCAGATTCAGCCACGCCAAGGACCCCATCTACGGCAACCAGGTGTCCCCTGGAACCGCCGTGCTGACCGTGGTGCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTATCTGGCCTGCGGCTTCAGAGTGGTCATGCTGACCCGCTTCGACGAGGAAATCTTCCTGAAAACCATCCAGGACTACAAGTGCACCCTAGTGATCCTGGTGCCCACCCTGTTCGGCATCCTGAGCAAGAGCAAGCTGCTGGATAAGTACGACCTGAGCAACCTGGTGGAAATCGCCTCTGGCGGAGCCCCCCTGGCCAAAGAAGTGTCTGAAGCCGTCGCCAGACGGTTCAACCTGCCTGGCGTGCGGCAGGGCTACGGACTGACAGAGACAACCAGCGCCATCATCATCACCCCCGAGGGCGACGATAAGCCTGGCGCCTCTGGAAAGGTGGTGCCCCTGTTCAAGGCCAAGGTGGTGGACCTGGACACCAAGAAAACCCTGGGCCCCAACCAGCGGGGCGAAGTCTGTGTGAAGGGCCCCATGCTGATGAAGGGCTACGTGGACAACCCCGAGGCCACCAGAGAGATCATCGACGAGGACGGCTGGCTGCACACAGGCGACATCGGCTACTACGACGAGGACCAGCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGATCAAGTATAAGGGCTACCAGGTGCCCCCAGCCGAGCTGGAATCTGTGCTGCTGCAGCATCCCTACATCTTCGATGCCGGCGTGGCCGGGGTGCCAGATGCTGAAGCAGGCGAACTGCCTGGGGCTGTCGTGGTGCTGGAAAAGGGCAAGCACGTGACCGAGAAAGAAATCATGGACTACGTGGCCGGACAGGTGTCCAACGCCAAGAGACTGAGAGCCGGCGTGCGCTTCGTGGATGAAGTGCCTAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACGGCAAGGCCATCCGCGAGATCCTGATGAAGCCCAAGAGCAAGATGTGA
【０１１２】
２．ＨｅＬａ細胞内における発光強度および発光スペクトルの比較
次に、スジグロボタル野生型および赤色変異体１ルシフェラーゼによるＨｅＬａ細胞内での発光強度を測定し、これらを、フォティヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼ（プロメガ社のＬｕｃ２ルシフェラーゼ）およびコメツキムシ由来の赤色発光のルシフェラーゼＣＢＲ（プロメガ社のＣＢＲルシフェラーゼ）と比較した。
【０１１３】
スジグロボタル野生型ルシフェラーゼの遺伝子を含む核酸および赤色変異体１の遺伝子を含む核酸に対してＫｏｚａｋ配列を付与した。なお、これら２種の配列（配列番号４および配列番号３４）とも哺乳細胞における発現に対してコドン最適化されている。その後、これら配列を、それぞれ、ｐＦ９Ａ  ＣＭＶ  ｈＲＬｕｃ  ｎｅｏ  Ｆｌｅｘｉ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のマルチクローニングサイトのＳｇｆＩおよびＰｍｅＩのサイト間に挿入した。ｐＦ９Ａベクターは内部コントロールとしてウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子（ｈＲＬｕｃ）をベクター配列に含んでおり、マルチクローニングサイトに挿入された発光遺伝子による発光強度をウミシイタケルシフェラーゼによる発光強度との比として算出することが可能である。
同様の手順に従って、フォティヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼおよびＣＢＲルシフェラーゼの遺伝子を含む核酸をｐＦ９Ａベクターのマルチクローニングサイトに挿入した。
【０１１４】
発光強度の比較は、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ(登録商標)Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（米国プロメガ社製、製品番号Ｅ２９４０）を用いて実施した。得られた４種のプラスミドを、４８穴のプレートに播種したＨｅＬａ細胞にそれぞれリポフェクション法で遺伝子導入し、２４時間後ＰＢＳで細胞を洗浄した。４８穴プレートの各ウェルに２ｍＭ  Ｄ−ルシフェリン／ＣＯ２  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２００μｌずつ添加し、３７℃、各ウェルあたり１秒間測定の条件でＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｏｒ（ＡＴＴＯ）を用いて９０分間発光強度を測定した。９０分経過時点の発光強度を４種ルシフェラーゼの発光強度とした。その後、マニュアルに従ってセレンテラジンを添加し、内部コントロールであるウミシイタケルシフェラーゼによる発光強度を３７℃、各ウェルあたり１秒間測定の条件でＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｏｒを用いて１５分間発光強度を測定した。スジグロボタル野生型ルシフェラーゼ、赤色変異体１、Ｐ．ピラリスルシフェラーゼ（Ｌｕｃ２  ルシフェラーゼ、プロメガ社）およびＣＢＲルシフェラーゼ（プロメガ社）による発光強度をウミシイタケルシフェラーゼによる発光強度でそれぞれ除算した値を算出し、その値を各ルシフェラーゼの発光強度としてグラフ化した。その結果を図３に示す。図３において、発光強度は、Ｐ．ピラリスルシフェラーゼによる発光強度を１としたときの比で表している。
【０１１５】
図３に示されるように、ＨｅＬａ細胞におけるスジグロボタル野生型ルシフェラーゼよって得られた発光強度は、Ｐ．ピラリスルシフェラーゼによる発光強度の２．６０倍であった。赤色変異体１によって得られた発光強度は、Ｐ．ピラリスルシフェラーゼによる発光強度の１．１３倍であった。
また、ＨｅＬａ細胞で発現させた各種ルシフェラーゼ（スジグロボタル野生型、赤色変異体１およびＣＢＲ）の発光スペクトルを実施例２と同様に測定した。ルシフェリン濃度は２ｍMで、温度は２５℃と３７℃の２点で測定した。その結果を図４〜６に示す。図４は、野生型の測定結果、図５は赤色変異体１の測定結果、図６はＣＢＲの測定結果を示す。
【０１１６】
図４より、温度が２５℃から３７℃へと上がるに連れて、野生型では最大発光波長が５９８nmから６０９nmへと長波長側にシフトしていることがわかる。これは、図１に示した高ｐHから低ｐHへ変化したときのスペクトル変化と同様の結果である。
また、図５に示す赤色変異体１による発光スペクトルでは、温度が２５℃から３７℃に上昇しても、最大発光波長の明確なシフトはみられなかった。図４、５及び６により、ＨｅＬａ細胞内において、赤色変異体１は、野生型とは異なる最大発光波長（６１６nm）を示し、この発光波長は、市販されている赤色発光ルシフェラーゼＣＢＲの最大発光波長（６２０nm）と同程度であることが示された。さらに、図３により、このスジグロボタル赤色変異体１による発光強度は、ＣＢＲの３．４２倍であることが示された。
【０１１７】
［実施例４：近赤外発光ルシフェリンアナログを基質として用いた場合のＨｅＬａ細胞におけるスジグロボタルルシフェラーゼによる発光強度およびスペクトルの比較]
実施例３にて作製したルシフェラーゼ遺伝子を含む４種類（スジグロボタル野生型、赤色変異体１、Ｐ．ピラリスおよびコメツキ由来ＣＢＲ）のプラスミドを、実施例３と同様にＨｅＬａ細胞に導入し、近赤外発光ルシフェリンアナログ（ジメチルアニリン−ジエン型ルシフェリン、和光社製、アカルミネ（登録商標））を発光基質として使用し、各々のルシフェラーゼによる発光スペクトルを測定した。近赤外発光ルシフェリンアナログの濃度は１ｍM、温度は３７℃で測定した。図７および８は、それぞれ、測定した発光強度の比較および発光スペクトルを示す。
【０１１８】
図８は、近赤外発光ルシフェリンアナログを使用した場合、スジグロボタルの野生型および赤色変異型ルシフェラーゼによる発光スペクトルの最大発光波長が、共に、６６４nmであることを示している。
また、図７より、Ｐ．ピラリスに対して、スジグロボタル野生型では０．９４倍、赤色変異体１では０．６５倍の発光強度を示すことがわかる。一方で、コメツキ由来の赤色ルシフェラーゼ（ＣＢＲ）に対しては、スジグロボタル野生型は３．１３倍、赤色変異体１で２．１６倍の発光強度を示すことがわかる
【０１１９】
図９は、Ｄ−ルシフェリンおよび近赤外発光ルシフェリンアナログを基質として使用した場合にスジグロボタルルシフェラーゼにより得られた発光スペクトルを示している。
図９より、近赤外発光ルシフェリンアナログを基質として使用した場合、Ｄ−ルシフェリンを基質として使用した場合に比べ、野生型スジグロボタルルシフェラーゼでは、最大発光波長が、６０９ｎｍから６６４ｎｍへと、赤色変異体１では、６１３ｎｍから６６４ｎｍへと、長波長側にシフトしていることが分かる。
【０１２０】
［実施例５：改良型赤色変異体ルシフェラーゼの作製とＨｅＬａ細胞内における発光強度および発光スペクトルの比較］
１．改良型赤色変異体ルシフェラーゼの作製
下記のとおり、実施例３で作製された赤色変異体１に更なる変異を導入することにより、改良型赤色変異体ルシフェラーゼを発現する変異型遺伝子を作製した。
【０１２１】
（i）赤色変異体２
実施例３で作製された赤色変異体１（配列番号３３）をコードする遺伝子（配列番号３４）に対し、配列番号３３のアミノ酸配列の４６４番目のフェニルアラニンをイソロイシンに置換する変異（Ｆ４６４Ｉ）を更に導入した。得られた変異型ルシフェラーゼ遺伝子によりコードされる変異型ルシフェラーゼを赤色変異体２と称する。赤色変異体２は、Ｉ１４８Ｖ、Ｓ２８３ＬおよびＦ４６４Ｉの３つの変異を有する。この赤色変異体をコードする遺伝子は、更にＫｏｚａｋ配列の付与による変異を有する。
【０１２２】
（ii）赤色変異体３
また、実施例３で作製された赤色変異体（配列番号３３）をコードする遺伝子（配列番号３４）に対し、下記（a）〜（c）の変異を更に導入した：
（a）配列番号３３のアミノ酸配列の４０１番目のバリンをメチオニンに置換する変異（Ｖ４０１Ｍ）；
（b）配列番号３３のアミノ酸配列の４６４番目のフェニルアラニンをイソロイシンに置換する変異（Ｆ４６４Ｉ）；および
（c）配列番号３３のアミノ酸配列の５０３番目のグリシンをアルギニンに置換する変異（Ｇ５０３Ｒ）。
【０１２３】
得られた変異型ルシフェラーゼ遺伝子によりコードされる変異型ルシフェラーゼを赤色変異体３と称する。赤色変異体３は、Ｉ１４８Ｖ、Ｓ２８３Ｌ、Ｖ４０１Ｍ、Ｆ４６４ＩおよびＧ５０３Ｒの５つの変異を有する。この赤色変異体をコードする遺伝子は、更にＫｏｚａｋ配列の付与による変異を有する。
【０１２４】
（iii）赤色変異体４
また、実施例３で作製された赤色変異体（配列番号３３）をコードする遺伝子（配列番号３４）に対し、下記（d）〜（g）の変異を更に導入した：
（d）配列番号３３のアミノ酸配列の２３９番目のバリンをメチオニンに置換する変異（Ｖ２３９Ｍ）；
（e）配列番号３３のアミノ酸配列の３１３番目のセリンをトレオニンに置換する変異（Ｓ３１３Ｔ）；
（f）配列番号３３のアミノ酸配列の３５６番目のアスパラギン酸をチロシンに置換する変異（Ｄ３５６Ｙ）；および
（g）配列番号３３のアミノ酸配列の４６４番目のフェニルアラニンをイソロイシンに置換する変異（Ｆ４６４Ｉ）。
【０１２５】
得られた変異型ルシフェラーゼ遺伝子によりコードされる変異型ルシフェラーゼを赤色変異体４と称する。赤色変異体４は、Ｉ１４８Ｖ、Ｓ２８３Ｌ、Ｖ２３９Ｍ、Ｓ３１３Ｔ、Ｄ３５６ＹおよびＦ４６４Ｉの６つの変異を有する。この赤色変異体をコードする遺伝子は、更にＫｏｚａｋ配列の付与による変異を有する。
【０１２６】
それぞれの変異の導入は、GeneMorph II Random Mutagenesis kit（商標登録）（アジレント・テクノロジー株式会社）を用いて、マニュアルにしたがって実施した。
変異導入後、エレクトロポレーション法を用いて大腸菌JM１０９（DE3）株に形質転換して寒天培地上にコロニーを形成させた。このコロニーに対して最終濃度２mＭのD-Luciferinを噴霧後、CCDカメラDP-70（オリンパス）にて発光を撮像した。他のコロニーよりも明るく、赤い発光を呈するコロニーを拾い上げ、シーケンサーを用いて配列を確認した。
【０１２７】
赤色変異体１〜４の変異を下記の表２にまとめて示す。表２において、“〇”は、赤色変異体が、該当する変異を有することを意味する。
【０１２８】
【表２】
0005980608.tif 000003
【０１２９】
赤色変異体２のアミノ酸配列は配列番号３６に記載され、赤色変異体２をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号３７に記載される。
【０１３０】
赤色変異体２のアミノ酸配列（配列番号３６）は、以下の通りである。変異アミノ酸に下線を付す。
MDNDKNIVYGPEPFYPVDKGSAGAQIHKYLHQYSKLGAIAFTNALTGVDITYAEYFDITCRLGEAMKRYGIKVDGRIALCSENCEEFFYPVIAGLYIGAGVAPTNEIYTLRELVHSLGISKPTIVFSSKKGLDKVLHVQKTVTCIKTVVILDSKVDYKGYDCVESFIKRYNPPGFQAASFKTVEVDRKEQIALIMNSSGSTGLPKGVQLTHECAVTRFSHAKDPIYGNQVSPGTAVLTVVPFHHGFGMFTTLGYLACGFRVVMLTRFDEEIFLKTIQDYKCTLVILVPTLFGILSKSKLLDKYDLSNLVEIASGGAPLAKEVSEAVARRFNLPGVRQGYGLTETTSAIIITPEGDDKPGASGKVVPLFKAKVVDLDTKKTLGPNQRGEVCVKGPMLMKGYVDNPEATREIIDEDGWLHTGDIGYYDEDQHFFIVDRLKSLIKYKGYQVPPAELESVLLQHPYIIDAGVAGVPDAEAGELPGAVVVLEKGKHVTEKEIMDYVAGQVSNAKRLRAGVRFVDEVPKGLTGKIDGKAIREILMKPKSKM
【０１３１】
赤色変異体２をコードする遺伝子の塩基配列（配列番号３７）は、以下の通りである。
ATGGACAACGACAAGAACATCGTGTACGGCCCCGAGCCCTTCTACCCCGTGGATAAGGGATCTGCCGGCGCTCAGATCCACAAGTACCTGCACCAGTACAGCAAGCTGGGCGCCATTGCCTTCACCAATGCCCTGACCGGCGTGGACATCACCTACGCCGAGTACTTCGACATCACCTGTCGGCTGGGCGAGGCCATGAAGAGATACGGCATCAAGGTGGACGGCCGGATCGCCCTGTGCAGCGAGAACTGCGAAGAGTTCTTCTACCCTGTGATCGCCGGCCTGTACATCGGAGCTGGCGTGGCCCCCACCAACGAGATCTACACCCTGCGGGAACTGGTGCACAGCCTGGGCATCAGCAAGCCCACCATCGTGTTCAGCAGCAAGAAAGGCCTGGACAAGGTGCTGCATGTGCAGAAAACCGTGACCTGCATCAAGACCGTCGTGATCCTGGACAGCAAGGTGGACTACAAGGGCTACGACTGCGTGGAATCCTTCATCAAGCGGTACAACCCCCCAGGCTTCCAGGCCGCCAGCTTCAAGACCGTGGAAGTGGACCGGAAAGAGCAGATCGCCCTGATCATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCTAAAGGCGTGCAGCTGACACACGAGTGCGCCGTGACCAGATTCAGCCACGCCAAGGACCCCATCTACGGCAACCAGGTGTCCCCTGGAACCGCCGTGCTGACCGTGGTGCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTATCTGGCCTGCGGCTTCAGAGTGGTCATGCTGACCCGCTTCGACGAGGAAATCTTCCTGAAAACCATCCAGGACTACAAGTGCACCCTAGTGATCCTGGTGCCCACCCTGTTCGGCATCCTGAGCAAGAGCAAGCTGCTGGATAAGTACGACCTGAGCAACCTGGTGGAAATCGCCTCTGGCGGAGCCCCCCTGGCCAAAGAAGTGTCTGAAGCCGTCGCCAGACGGTTCAACCTGCCTGGCGTGCGGCAGGGCTACGGACTGACAGAGACAACCAGCGCCATCATCATCACCCCCGAGGGCGACGATAAGCCTGGCGCCTCTGGAAAGGTGGTGCCCCTGTTCAAGGCCAAGGTGGTGGACCTGGACACCAAGAAAACCCTGGGCCCCAACCAGCGGGGCGAAGTCTGTGTGAAGGGCCCCATGCTGATGAAGGGCTACGTGGACAACCCCGAGGCCACCAGAGAGATCATCGACGAGGACGGCTGGCTGCACACAGGCGACATCGGCTACTACGACGAGGACCAGCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGATCAAGTATAAGGGGTACCAGGTGCCCCCAGCCGAGCTGGAATCTGTGCTGCTGCAGCATCCCTACATCATCGATGCCGGCGTGGCCGGGGTGCCAGATGCTGAAGCAGGCGAACTGCCTGGGGCTGTCGTGGTGCTGGAAAAAGGCAAGCACGTGACCGAGAAAGAAATCATGGACTACGTGGCCGGACAGGTGTCCAACGCCAAGAGACTGAGAGCCGGCGTGCGCTTCGTGGATGAAGTGCCTAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACGGCAAGGCCATCCGCGAGATCCTGATGAAGCCCAAGAGCAAGATGTGA
【０１３２】
赤色変異体３のアミノ酸配列は配列番号３８に記載され、赤色変異体３をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号３９に記載される。
【０１３３】
赤色変異体３のアミノ酸配列（配列番号３８）は、以下の通りである。変異アミノ酸に下線を付す。
MDNDKNIVYGPEPFYPVDKGSAGAQIHKYLHQYSKLGAIAFTNALTGVDITYAEYFDITCRLGEAMKRYGIKVDGRIALCSENCEEFFYPVIAGLYIGAGVAPTNEIYTLRELVHSLGISKPTIVFSSKKGLDKVLHVQKTVTCIKTVVILDSKVDYKGYDCVESFIKRYNPPGFQAASFKTVEVDRKEQIALIMNSSGSTGLPKGVQLTHECAVTRFSHAKDPIYGNQVSPGTAVLTVVPFHHGFGMFTTLGYLACGFRVVMLTRFDEEIFLKTIQDYKCTLVILVPTLFGILSKSKLLDKYDLSNLVEIASGGAPLAKEVSEAVARRFNLPGVRQGYGLTETTSAIIITPEGDDKPGASGKVVPLFKAKVVDLDTKKTLGPNQRGEVCVKGPMLMKGYMDNPEATREIIDEDGWLHTGDIGYYDEDQHFFIVDRLKSLIKYKGYQVPPAELESVLLQHPYIIDAGVAGVPDAEAGELPGAVVVLEKGKHVTEKEIMDYVARQVSNAKRLRAGVRFVDEVPKGLTGKIDGKAIREILMKPKSKM
【０１３４】
赤色変異体３をコードする遺伝子の塩基配列（配列番号３９）は、以下の通りである。
ATGGACAACGACAAGAACATCGTGTACGGCCCCGAGCCCTTCTACCCCGTGGATAAGGGATCTGCCGGCGCTCAGATCCACAAGTACCTGCACCAGTACAGCAAGCTGGGCGCCATTGCCTTCACCAATGCCCTGACCGGCGTGGACATCACCTACGCCGAGTACTTCGACATCACCTGTCGGCTGGGCGAGGCCATGAAGAGATACGGCATCAAGGTGGACGGCCGGATCGCCCTGTGCAGCGAGAACTGCGAAGAGTTCTTCTACCCTGTGATCGCCGGCCTGTACATCGGAGCTGGCGTGGCCCCCACCAACGAGATCTACACCCTGCGGGAACTGGTGCACAGCCTGGGCATCAGCAAGCCCACCATCGTGTTCAGCAGCAAGAAAGGCCTGGACAAGGTGCTGCATGTGCAGAAAACCGTGACCTGCATCAAGACCGTCGTGATCCTGGACAGCAAGGTGGACTACAAGGGCTACGACTGCGTGGAATCCTTCATCAAGCGGTACAACCCCCCAGGCTTCCAGGCCGCCAGCTTCAAGACCGTGGAAGTGGACCGGAAAGAGCAGATCGCCCTGATCATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCTAAAGGCGTGCAGCTGACACACGAGTGCGCCGTGACCAGATTCAGCCACGCCAAGGACCCCATCTACGGCAACCAGGTGTCCCCTGGAACCGCCGTGCTGACCGTGGTGCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTATCTGGCCTGCGGCTTCAGAGTGGTCATGCTGACCCGCTTCGACGAGGAAATCTTCCTGAAAACCATCCAGGACTACAAGTGCACCCTAGTGATCCTGGTGCCCACCCTGTTCGGCATCCTGAGCAAGAGCAAGCTGCTGGATAAGTACGACCTGAGCAACCTGGTGGAAATCGCCTCTGGCGGAGCCCCCCTGGCCAAAGAAGTGTCTGAAGCCGTCGCCAGACGGTTCAACCTGCCTGGCGTGCGGCAGGGCTACGGACTGACAGAGACAACCAGCGCCATCATCATCACCCCCGAGGGCGACGATAAGCCTGGCGCCTCTGGAAAGGTGGTGCCCCTGTTCAAGGCCAAGGTGGTGGACCTGGACACCAAGAAAACCCTGGGCCCCAACCAGCGGGGCGAGGTCTGTGTGAAGGGCCCCATGCTGATGAAGGGCTACATGGACAACCCCGAGGCCACCAGAGAGATCATCGACGAGGACGGCTGGCTGCACACAGGCGACATCGGCTACTACGACGAGGACCAGCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGATCAAGTATAAGGGCTACCAGGTGCCCCCAGCCGAGCTGGAATCTGTGCTGCTGCAGCATCCCTACATCATCGATGCCGGCGTGGCCGGGGTGCCAGATGCTGAAGCAGGCGAACTGCCTGGGGCTGTCGTGGTGCTGGAAAAGGGCAAGCACGTGACCGAGAAAGAAATCATGGACTACGTGGCCAGACAGGTGTCCAACGCCAAGAGACTGAGAGCCGGCGTGCGCTTCGTGGATGAAGTGCCTAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACGGCAAGGCCATCCGCGAGATCCTGATGAAGCCCAAGAGCAAGATGTGA
【０１３５】
赤色変異体４のアミノ酸配列は配列番号４０に記載され、赤色変異体４をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号４１に記載される。
【０１３６】
赤色変異体４のアミノ酸配列（配列番号４０）は、以下の通りである。変異アミノ酸に下線を付す。
MDNDKNIVYGPEPFYPVDKGSAGAQIHKYLHQYSKLGAIAFTNALTGVDITYAEYFDITCRLGEAMKRYGIKVDGRIALCSENCEEFFYPVIAGLYIGAGVAPTNEIYTLRELVHSLGISKPTIVFSSKKGLDKVLHVQKTVTCIKTVVILDSKVDYKGYDCVESFIKRYNPPGFQAASFKTVEVDRKEQIALIMNSSGSTGLPKGVQLTHECAVTRFSHAKDPIYGNQVSPGTAVLTMVPFHHGFGMFTTLGYLACGFRVVMLTRFDEEIFLRTIQDYKCTLVILVPTLFGILSKSKLLDKYDLSNLVEIATGGAPLAKEVSEAVARRFNLPGVRQGYGLTETTSAIIITPEGDYKPGASGKVVPLFKAKVVDLDTKKTLGPNQRGEVCVKGPMLMKGYVDNPEATREIIDEDGWLHTGDIGYYDEDQHFFIVDRLKSLIKYKGYQVPPAELESVLLQHPYIIDAGVAGVPDAEAGELPGAVVVLEKGKHVTEKEIMDYVAGQVSNAKRLRAGVRFVDEVPKGLTGKIDGKAIREILMKPKSKM
【０１３７】
赤色変異体４をコードする遺伝子の塩基配列（配列番号４１）は、以下の通りである。ATGGACAACGACAAGAACATCGTGTACGGCCCCGAGCCCTTCTACCCCGTGGATAAGGGATCTGCCGGCGCTCAGATCCACAAGTACCTGCACCAGTACAGCAAGCTGGGCGCCATTGCCTTCACCAATGCCCTGACCGGCGTGGACATCACCTACGCCGAGTACTTCGACATCACCTGTCGGCTGGGCGAGGCCATGAAGAGATACGGCATCAAGGTGGACGGCCGGATCGCCCTGTGCAGCGAGAACTGCGAAGAGTTCTTCTACCCTGTGATCGCCGGCCTGTACATCGGAGCTGGCGTGGCCCCCACCAACGAGATCTACACCCTGCGGGAACTGGTGCACAGCCTGGGCATCAGCAAGCCCACCATCGTGTTCAGCAGCAAGAAAGGCCTGGACAAGGTGCTGCATGTGCAGAAAACCGTGACCTGCATCAAGACCGTCGTGATCCTGGACAGCAAGGTGGACTACAAGGGCTACGACTGCGTGGAATCCTTCATCAAGCGGTACAACCCCCCAGGCTTCCAGGCCGCCAGCTTCAAGACCGTGGAAGTGGACCGGAAAGAGCAGATCGCCCTGATCATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCTAAAGGCGTGCAGCTGACACATGAGTGCGCCGTGACCAGATTCAGCCACGCCAAGGACCCCATCTACGGCAACCAGGTGTCCCCTGGAACCGCCGTGCTGACCATGGTGCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTATCTGGCCTGCGGCTTCAGAGTGGTCATGCTGACCCGCTTCGACGAGGAAATCTTCCTGAGAACCATCCAGGATTACAAGTGCACCCTAGTGATCCTTGTGCCCACCCTGTTCGGCATCCTGAGCAAGAGCAAGCTGTTGGATAAGTACGACCTGAGCAACCTGGTGGAAATTGCCACTGGTGGAGCCCCCCTGGCCAAAGAAGTGTCTGAAGCCGTCGCCAGACGGTTCAACCTGCCTGGCGTGCGGCAGGGCTACGGACTGACAGAGACAACCAGCGCCATCATCATCACCCCCGAGGGCGACTATAAGCCTGGCGCCTCTGGAAAGGTGGTGCCCCTGTTCAAGGCCAAGGTGGTGGACCTGGACACCAAGAAAACCCTGGGCCCCAACCAGCGGGGCGAAGTCTGTGTGAAGGGCCCCATGCTGATGAAGGGCTACGTGGACAACCCCGAGGCCACCAGAGAGATCATCGACGAGGACGGCTGGCTGCACACAGGCGACATCGGCTACTACGACGAGGACCAGCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGATCAAGTATAAGGGGTACCAGGTGCCCCCAGCCGAGCTGGAATCTGTGCTGCTGCAGCATCCCTACATCATCGATGCCGGCGTGGCCGGGGTGCCAGATGCTGAAGCAGGCGAACTGCCTGGGGCTGTCGTGGTGCTGGAAAAGGGCAAGCACGTGACCGAGAAAGAAATCATGGACTACGTGGCCGGACAGGTGTCCAACGCCAAGAGACTGAGAGCCGGCGTGCGCTTCGTGGATGAAGTGCCTAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACGGCAAGGCCATCCGCGAGATCCTGATGAAGCCCAAGAGCAAGATGTGA
【０１３８】
２．ＨｅＬａ細胞内における発光強度および発光スペクトルの比較
次に、赤色変異体１〜４によるＨｅＬａ細胞内での発光強度を測定し、これらを、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ由来のルシフェラーゼLuc2（プロメガ社より入手）およびコメツキムシ由来の赤色発光のルシフェラーゼＣＢＲ（プロメガ社のＣＢＲルシフェラーゼ）と比較した。
【０１３９】
赤色変異体２〜４をコードする変異型遺伝子は、赤色変異体１と同様、Ｋｏｚａｋ配列が付与されている上に、哺乳細胞における発現に対してコドン最適化されている。赤色変異体２〜４をコードする変異型遺伝子を、それぞれ、ｐＦ９Ａ  ＣＭＶ  ｈＲＬｕｃ  ｎｅｏ  Ｆｌｅｘｉ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のマルチクローニングサイトのＳｇｆＩおよびＰｍｅＩのサイト間に挿入した。ｐＦ９Ａベクターは内部コントロールとしてウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子（ｈＲＬｕｃ）をベクター配列に含んでおり、マルチクローニングサイトに挿入された発光遺伝子による発光強度をウミシイタケルシフェラーゼによる発光強度との比として算出することが可能である。
【０１４０】
同様の手順に従って、ホタル由来ルシフェラーゼLuc2（プロメガ株式会社）の遺伝子およびＣＢＲルシフェラーゼ（プロメガ株式会社）の遺伝子を、それぞれｐＦ９Ａベクターのマルチクローニングサイトに挿入した。
【０１４１】
発光強度の比較は、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ(登録商標)Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（米国プロメガ社製、製品番号Ｅ２９４０）を用いて実施した。得られた６種のプラスミドを、４８穴のプレートに播種したＨｅＬａ細胞にそれぞれリポフェクション法で遺伝子導入し、２４時間後ＰＢＳで細胞を洗浄した。４８穴プレートの各ウェルに２ｍＭ  Ｄ−ルシフェリン／ＣＯ２  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２００μｌずつ添加し、３７℃、各ウェルあたり１秒間測定の条件でＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｏｒ（ＡＴＴＯ）を用いて９０分間発光強度を測定した。９０分経過時点の発光強度を６種ルシフェラーゼの発光強度とした。その後、マニュアルに従ってセレンテラジンを添加し、内部コントロールであるウミシイタケルシフェラーゼによる発光強度を３７℃、各ウェルあたり１秒間測定の条件でＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｏｒを用いて１５分間発光強度を測定した。
【０１４２】
赤色変異体１〜４、ホタル由来ルシフェラーゼLuc2およびＣＢＲルシフェラーゼによる発光強度を、ウミシイタケルシフェラーゼによる発光強度でそれぞれ除算した値を算出し、その値を各ルシフェラーゼの発光強度としてグラフ化した。その結果を図１０に示す。図１０において、発光強度は、ホタル由来ルシフェラーゼLuc2（プロメガ株式会社）による発光強度を１としたときの比で表している。
【０１４３】
図１０に示されるように、赤色変異体１〜４によって得られた発光強度は、ホタル由来ルシフェラーゼLuc2による発光強度に対して、それぞれ約１．１倍、約３．２倍、約３．３倍および約３．２倍であった。さらに、図１０により、赤色変異体１〜４による発光強度は、それぞれ、ＣＢＲルシフェラーゼの約８．３倍、約２３．１倍、約２４．２倍、約２３．１倍であることが示された。
【０１４４】
また、ＨｅＬａ細胞で発現させた赤色変異体１〜４の発光スペクトルを実施例２と同様に測定した。ルシフェリン濃度は２ｍＭで、温度は３７℃で測定した。その結果を図１１に示す。
【０１４５】
図１１より、赤色変異体１〜４は、いずれも、野生型とは異なる最大発光波長を示し、赤色変異体１は約６１６nm、赤色変異体２は６１０nm、赤色変異体３は６０９nm、赤色変異体４は約６０９nmの最大発光波長を示した。図１１は、最大発光波長における発光強度を１として、それぞれの赤色変異体の発光スペクトルを示す。このため、赤色変異体１は、スペクトルデータの揺れが大きい。図１１の結果から、赤色変異体１〜４の最大発光波長は、市販されている赤色発光ルシフェラーゼＣＢＲの最大発光波長（６２０nm）と同程度であることが示された。
【図１】
0005980608.tif 000004
【図２】
0005980608.tif 000005
【図３】
0005980608.tif 000006
【図４】
0005980608.tif 000007
【図５】
0005980608.tif 000008
【図６】
0005980608.tif 000009
【図７】
0005980608.tif 000010
【図８】
0005980608.tif 000011
【図９】
0005980608.tif 000012
【図１０】
0005980608.tif 000013
【図１１】
0005980608.tif 000014
【配列表】
0005980608000001.app