(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質生体適合性支持体を含む、バイオ人工臓器の分泌細胞を封入するためのチャンバの製造のための機能化半透膜であって、
−  前記多孔質生体適合性支持体は、その表面エネルギーが５０ｍＪ．ｍ-2以上であるように前処理され、
−  前記多孔質生体適合性支持体の細孔は、５ｎｍから１００ｎｍの間の内側サイズを有し、
−  前記機能化半透膜は、それぞれ親水性ポリマーおよび少なくとも１種の生物活性分子を含む少なくとも２つの層を備える
ことを特徴とする、機能化半透膜であって、
前記２つの層は前記孔質生体適合性支持体上に連続積層される、機能化半透膜。
【請求項２】
親水性ポリマーが、セルロース化合物、ポリアクリルアミドおよびそれらのコポリマー、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびそのコポリマー、ポリビニルアルコール、酢酸ビニルのコポリマー、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、親水性ポリ（メタ）アクリレート、多糖類、ヒアルロン酸系ポリマーならびにキトサンから選択されることを特徴とする、請求項１に記載の機能化半透膜。
【請求項３】
生物活性分子が、抗炎症剤、抗感染症剤、麻酔剤、成長因子、血管形成促進および／もしくは血管新生誘導剤、創傷治癒誘導剤、免疫抑制剤、抗凝集剤および抗凝固剤を含む抗血栓剤、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の阻害剤、またはインスリン分泌を促進する分子から選択されることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の機能化半透膜。
【請求項４】
前記２つの層のうちの第１の層は、前記支持体と第２の層との間に設置されるとともに細胞成長因子を含み、前記２つの層のうちの第２の層は、抗血栓剤を含むことを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の機能化半透膜。
【請求項５】
前記細胞成長因子がＶＥＧＦであること、および前記抗血栓剤がヘパリンであることを特徴とする、請求項４に記載の機能化半透膜。
【請求項６】
治療上有益な少なくとも１種の物質を生成する分泌細胞を封入するためのチャンバの製造のための、請求項１から５のいずれか一項に記載の膜の使用。
【請求項７】
治療上有益な少なくとも１種の物質を生成する分泌細胞を封入するためのチャンバであって、その壁は、治療上有益な少なくとも１種の物質を生成する分泌細胞を含有することができる空間を画定する、請求項１から５のいずれか一項に記載の機能化半透膜からなることを特徴とする、チャンバ。
【請求項８】
請求項７に記載の少なくとも１つの封入チャンバを備えることを特徴とする、バイオ人工臓器。
【請求項９】
膵島の細胞を含有するバイオ人工膵臓であることを特徴とする、請求項８に記載のバイオ人工臓器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、患者の体内に移植され、治療上有益な物質を分泌する細胞を封入するデバイスの形態で提供され得る、バイオ人工臓器の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療上有益な物質を体に連続的に供給することを必要とする病態の処置は、患者に移植することができ、これらの物質を効率的に、および時には長期間放出することができるデバイスの開発を必要とした。
【０００３】
この必要性を満たすために、治療上有益な１種または複数種の物質を生成する細胞を含有するバイオ人工臓器が開発されている。バイオ人工臓器内に含有される細胞は、少なくとも１つの半透膜により画定された内部空間または封入チャンバ内に閉じ込められている。そのような半透膜は、患者の免疫系の抗体および細胞に対しては不透過性でありながら、治療上有益な物質を患者の体内の標的細胞に拡散させるべきである。
【０００４】
人工臓器という表現は、少なくとも１つの半透膜からなる少なくとも１つの封入チャンバを備えるデバイスを意味するように理解され、前記封入チャンバは、治療上有益な物質を分泌する細胞を含有することが意図される。
【０００５】
治療上有益な物質は、神経伝達物質、ホルモン、成長因子またはサイトカイン、例えば、限定されないが、インスリン、成長ホルモン、カルシトニン等であってもよい。
【０００６】
この種のデバイスの一例は、活性物質を生成する細胞を封入するためのチャンバからなるバイオ人工臓器の製造のための、改善された機械的および選択的浸透特性を有する半透膜の開発をより具体的に目標とした、国際出願ＷＯ０２／０６０４０９に記載されている。患者に移植されると、そのようなバイオ人工臓器は、活性物質の放出および患者の処置を可能とする。
【０００７】
この種のデバイスの移植の間に生じる問題は、その有効性が比較的短期間であることであり、これは、封入チャンバ内に封入された細胞の酸素化の欠如、および被移植患者の免疫細胞により生成される低分子量サイトカインによるその不活性化で説明され得る。
【０００８】
Ｓｉｇｒｉｓｔらは、ポリアクリロニトリルメタリルスルホン酸ナトリウム製の半透膜（ＨＯＳＰＡＬ社製「ＡＮ６９」膜）からなる封入チャンバ内に封入された膵島の生存能力を、このチャンバ内に上皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）を添加することにより改善した。このようにして調製された封入チャンバからなるバイオ人工臓器をマウスに移植した後、インプラントの周囲の組織へのＶＥＧＦの分化により、インプラントの周囲の血管形成が誘導された（Ｊ．ｏｆ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００３、４０（４）：３５９〜６７およびＣｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２００３、第１２巻、６２７〜６３５頁）。
【０００９】
しかしながら、この技術は、チャンバ壁を介したＶＥＧＦの低い拡散性、およびバイオ人工臓器の移植後可能な限り早期に血管形成を誘導することの重要性に関連した制限を有する。
【００１０】
米国特許第５２６２０５５号は、免疫保護膜を備える封入チャンバからなり、感熱性ポリマーマトリックス内に膵島を含有する人工膵臓を提供しており、封入チャンバの内容物は、封入チャンバの内部と患者の体の外部とを接続する２つの微小管を用いて、移植後に交換され得る。半透膜の免疫保護的性質は、免疫系の細胞がデバイス内に進入するのを防止する膜の不透過性により付与される。また、この特許は、血管新生の誘導、または封入チャンバの周囲のマクロファージ活性の阻害を意図する活性薬剤の放出を可能とするポリマー微粒子の、感熱性ポリマーマトリックスへの組込みを提案している。このデバイスの二重の欠点は、封入チャンバ内のポリマー微粒子の場所（半透膜の低い拡散性）、ならびに活性薬剤の放出中の微粒子を構成するポリマーの放出およびそれに次ぐ望ましくない体内蓄積である。
【００１１】
国際出願ＷＯ９４／２６３９９は、共有結合により結合した活性薬剤を保持する半透膜を記載しているが、この種の膜は、その調製に活性薬剤の共有結合の追加的ステップが必要であることにより、また活性薬剤の量が膜の表面に存在する量に制限されることから、十分ではない。
【００１２】
米国特許出願公開第２００６／０１９８８６４号は、血中グルコースを測定するためのプローブ等の移植デバイスを被覆することを意図する生体界面のための膜を記載している。これらの膜は、２つの部分、つまり支持層と、非常に際立ったレリーフ構造（２０μｍから１０００μｍのサイズの空隙を有する蜂の巣構造）を有し、血管の発達を可能とする外層とを有する構造を有する。また、この文献は、特に炎症の徴候を制限し、血管新生を促進するために、これらの膜に活性薬剤を添加する可能性を記載しており、これらの薬剤は、次いで、膜のマトリックス（ポリカーボネート、ＰＶＡまたはセルロースポリマーで構成される）中に組み込まれるか、または膜の表面で吸収もしくは共有結合により連結される。体内のグルコース等の物質の検出を意図したプローブの製造のためのこれらの膜の使用は、膜の特定のレリーフ構造および高い透過性を必要とし、本発明者らは、これらの膜の特定の構造、特に、細孔が相互接続され（これは、細胞による細孔の閉塞をもたらし、したがって生物活性分子および治療上有益な物質の循環を妨げる）、支持層が、選択的透過性を確実とするために特定的に選択されるカットオフを有さず、またこれらの膜の外層の製造に疎水性材料が使用されるという事実は、これらの支持体がバイオ人工臓器の調製のため、および個人への移植後の動作のための使用に適合しないことを意味していることを観察した。
【００１３】
したがって、被移植患者におけるバイオ人工臓器の移植の間にいくつかの問題が生じ、まず、（ｉ）バイオ人工臓器の取付けによりもたらされる患者の組織の炎症反応、および（ｉｉ）分泌細胞を破壊するサイトカインおよびケモカインの反応チャンバへの導入を回避または制限することが必要となる。さらに、バイオ人工臓器内に封入される分泌細胞の酸素化および治療上有益な物質の体内への最適な拡散は、バイオ人工臓器の周囲の組織の血管新生を必要とする。したがって、さらに、患者の体内におけるバイオ人工臓器の移植および動作の開始（治療上有益な物質の分泌）を迅速化するためには、前記バイオ人工臓器の製造のために使用される膜の特性を改善することが必要である。
【００１４】
本発明者らは、少なくとも２種の生物活性分子で機能化された新しい種類の半透膜を開発したが、前記膜は、バイオ人工臓器の製造に有用である。
【００１５】
半透膜は、その生体内放出が移植を容易化しバイオ人工臓器の動作を改善する生物活性分子を含有する場合、機能化されていると言われる。
【００１６】
本発明者らは、生物活性分子としてのヘパリンおよびＶＥＧＦで機能化された半透膜で構成されるバイオ人工臓器の移植が、バイオ人工臓器の周囲での炎症反応を回避することを可能にし、わずか２週間後にバイオ人工臓器の周囲の血管の発達をもたらすことを示したが、そのような血管新生は、半透膜が機能化されていないバイオ人工臓器においては、２カ月後にのみ観察される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】ＷＯ０２／０６０４０９
【特許文献２】米国特許第５２６２０５５号
【特許文献３】ＷＯ９４／２６３９９
【特許文献４】米国特許出願公開第２００６／０１９８８６４号
【特許文献５】米国特許第４９５６２１９号
【特許文献６】ＷＯ９４／０２１２９
【特許文献７】ＷＯ９３／０３７６８
【特許文献８】ＷＯ９０／１５８６３
【特許文献９】米国特許第５９８１２１１号
【特許文献１０】米国特許第４５７８１９１号
【特許文献１１】米国特許第５８３７２３４号
【特許文献１２】米国特許第６０２３００９号
【特許文献１３】米国特許第５６０５８３５号
【特許文献１４】米国特許第４３２３４５７号
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｊ．ｏｆ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００３、４０（４）：３５９〜６７
【非特許文献２】Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２００３、第１２巻、６２７〜６３５頁
【非特許文献３】「Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｌａｓｍａｓ」、ＳＶＦ版、１９９５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
したがって、本発明は、その表面エネルギーを増加させるように前処理された多孔質生体適合性支持体で構成され、また、それぞれ親水性ポリマーおよび少なくとも１種の生物活性分子を含む少なくとも２つの層も備えることを特徴とする、機能化半透膜に関する。
【００２０】
より具体的には、これは、多孔質生体適合性支持体で構成される機能化半透膜であって、
−  前記多孔質生体適合性支持体は、その表面エネルギーが５０ｍＪ．ｍ−２以上であるように前処理され、
−  前記多孔質生体適合性支持体の細孔は、５ｎｍから１００ｎｍの間の内側サイズを有し、
−  前記機能化半透膜は、それぞれ親水性ポリマーおよび少なくとも１種の生物活性分子を含む少なくとも２つの層を備える
ことを特徴とする、機能化半透膜である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
生体適合性支持体の調製は、国際出願ＷＯ０２／０６０４０９に記載の方法に従って行われてもよい。
【００２２】
生体適合性支持体は、多孔質ポリカーボネートまたはポリエステルまたはポリエチレンイミンからなり、その厚さは５μｍから１００μｍの間、好ましくは１０μｍから６０μｍの間である。細孔の形成は、電子衝撃により、または重イオン衝撃により行われてもよく、この２番目の方法は、特に、米国特許第４９５６２１９号に記載されている。重イオン衝撃の場合、生体適合性支持体の表面に衝突させる重イオンの密度が細孔の密度を決定付け、一方化学的腐食処理時間が細孔のサイズを決定付ける。
【００２３】
本発明に関連して、生体適合性支持体上に形成される細孔は、５ナノメートルから１００ナノメートルの間、好ましくは５ナノメートルから５０ナノメートルの間の内側サイズを有する。
【００２４】
次いで、多孔質生体適合性支持体の表面は、その表面エネルギーを増加させるように処理される。支持体の処理は、多孔質生体適合性支持体の表面における極性部位の形成をもたらし、特に、処理は、カルボニル、ヒドロキシまたはアミン基の、およびフリーラジカルの割合の増加をもたらす。フリーラジカルは、互いに、または大気酸素と結合し、そのようにして極性部位を形成する。
【００２５】
十分な表面エネルギーは、支持体上に置かれた水滴の接線と膜表面との間で測定される接触角が４０°未満であるような表面エネルギーであると考えられ、これは、少なくとも５０ｍＪ．ｍ−２の表面エネルギーに相当する。したがって、支持体の処理の目的は、５０ｍＪ．ｍ−２以上の表面エネルギーを得ることである。
【００２６】
以下の濡れおよび表面エネルギーの値は、例として示される。
１）未処理ポリカーボネート支持体：
濡れ角（水）：６０°、
表面エネルギー：４１Ｊ．ｍ−２から４４ｍＪ．ｍ−２（極性成分：１５ｍＪ．ｍ−２）
２）プラズマ処理ポリカーボネート支持体：
濡れ角（水）：２５°、
表面エネルギー：６６ｍＪ．ｍ−２（極性成分：３７．２ｍＪ．ｍ−２）
３）親水性層で被覆されたプラズマ処理ポリカーボネート支持体：
濡れ角（水）：２０°、
表面エネルギー：６６．７ｍＪ．ｍ−２（極性成分：４０ｍＪ．ｍ−２）
特に、ポリカーボネート製の生体適合性支持体の場合、本発明の半透膜を構成する生体適合性支持体の表面に存在する極性部位は、以下の部位を含む：ＣＨ３Ｏ、Ｃ２Ｈ３Ｏ、Ｃ３Ｈ３Ｏ、Ｃ３Ｈ７Ｏ、Ｏ、ＯＨ、Ｃ２ＯＨ、Ｃ８Ｈ５Ｏ、ＮＨ４＋、Ｃ２Ｈ８Ｎ＋、Ｒ−ＯＨ（アルコール）、（Ｒ）３−ＮＨ（アミン）およびＲ−ＣＯ−ＮＨ（アミド）（式中、置換基Ｒは、生体適合性支持体のポリカーボネートポリマーの構成基を表す）。これらの極性部位は、生体適合性支持体の表面エネルギーを増加させ、したがって親水性ポリマーの層の付着を可能にする。
【００２７】
好ましくは、生体適合性支持体の表面における極性部位の形成は、プラズマ処理、コロナ放電または大気圧もしくは真空下での電磁放電により行われる。
【００２８】
例えば、支持体は、アルゴン高周波プラズマ処理される。支持体は、反応器容量の１リットルあたり２ワットから１０ワットの間のプラズマ反応器放射出力で、１分から３０分の間処理されてもよい。また、処理は、同じ出力であるが５秒から２０秒間のマイクロ波プラズマにより行われてもよい。
【００２９】
好ましくは、プラズマ処理は、真空下で行われる。
【００３０】
プラズマ処理方法の実践に関しては、当業者により、Ａ．Ｒｉｃａｒｄによるマニュアル（「Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｌａｓｍａｓ」、ＳＶＦ版、１９９５）が有利に参照され得る。
【００３１】
また、処理は、コロナ放電により行われてもよい。処理電圧は、有利には５０ボルトから５００ボルトの間であり、強度は、処理デバイスおよび処理される支持体に基づき変動する。
【００３２】
コロナ放電処理は、反対の平行電極を有するデバイスを利用して、隣接平行電極（高さ約５ｍｍの電極アーク）または吹付アーク（間にガス流が存在する隣接平行電極であり、これにより高さ約１０ｃｍの電気アークが形成される）により行われてもよい。
【００３３】
コロナ放電または電磁放電処理方法の実践に関しては、当業者により、Ａ．Ｒｉｃａｒｄ（１９９５）によるマニュアルが有利に参照され得る。
【００３４】
処理時間は、１０分の数秒程度、好ましくは０．１秒から１秒の間である。連続的処理の場合、暴露時間は、処理される材料が、１秒当たり数センチメートルから数デシメートルの速度で処理デバイスを通過するような時間である。
【００３５】
さらに、生体適合性支持体は、処理の効率を増加させるために、数回処理されてもよい。
【００３６】
最も好ましくは、およびポリカーボネート製の生体適合性支持体の場合、極性部位の形成は、２０リットルのＢｒａｎｓｏｎ  ＲＦ型反応器において、５０ワットの出力で１０分間のアルゴンプラズマ処理により行われる。この具体的実施形態において、２次イオン質量分析法による測定によって、ポリカーボネート製の生体適合性支持体の表面において、極性部位として、以下の質量／電荷（ｍ／ｚ）比において検出される２次イオンの強度により定量化される以下の組成物が観察された。
−  ポジティブモードにおいて：３１（ＣＨ３Ｏ）、４３（Ｃ２Ｈ３Ｏ）、５５（Ｃ３Ｈ３Ｏ）、５９（Ｃ３Ｈ７Ｏ）、１８（ＮＨ４＋）および４６（Ｃ２Ｈ８Ｎ＋）、ならびに
−  ネガティブモードにおいて：１６（Ｏ）、１７（ＯＨ）、４１（Ｃ２ＯＨ）、１１７（Ｃ８Ｈ５Ｏ）
本発明によれば、少なくとも１種の生物活性分子を含む親水性ポリマーの各層は、１０ナノメートルから１０００ナノメートルの間、好ましくは１０ナノメートルから１００ナノメートルの間、最も好ましくは１０ナノメートルから５０ナノメートルの間の厚さを有する。
【００３７】
本発明に関連して、親水性ポリマーという表現は、多孔質生体適合性支持体に塗布された場合に、前記ポリマー上に滴下された水滴が、国際出願ＷＯ０２／０６０４０９に記載のような「液滴」試験に従う測定後に、２５°未満、好ましくは２２°未満の角度値を有するようなポリマーを意味するように理解される。
【００３８】
好ましくは、親水性ポリマーは、水に可溶である。実際、宿主生物の体内へのバイオ人工臓器の移植のために、有機溶媒の使用は、その完全除去が困難であり、その存在は、たとえ微量であっても、人間または動物における治療的または外科的使用に適合しないことから、推奨されない。
【００３９】
親水性ポリマーは、好ましくは、以下のポリマーから選択される。
−  セルロース化合物、例えばエチルセルロース（ＥＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、例えばＤＯＷ  ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ社から販売されているＨＰＭＣ  Ｅ４ＭもしくはＨｅｒｃｕｌｅｓ社から販売されているＡｑｕａｌｏｎと呼ばれるもの、またはＨｅｒｃｕｌｅｓ社から販売されているカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、
−  ポリアクリルアミドおよびそのコポリマー、例えばＳＩＧＭＡ社（ＵＰＳＡＬＡ、Ｓｗｅｄｅｎ）から販売されているもの、
−  ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびそのコポリマー、例えばＢＡＳＦ社により販売されているもの、例えばＫｏｌｌｉｄｏｎ（Ｋ３０、Ｋ９０）、
−  ポリビニルアルコール、
−  酢酸ビニルのコポリマー、例えばＨＯＥＣＨＳＴ社からＭｏｗｉｏｌの商品名で販売されているポリ酢酸ビニルおよびポリビニルアルコールのコポリマー、
−  ポリエチレングリコール、例えばＳＩＧＭＡ社から販売されているもの、
−  ポリプロピレングリコール、
−  親水性ポリ（メタ）アクリレート、例えばＤＥＧＡＬＡＮまたはＤＥＧＵＳＳＡ社から販売されているもの、
−  多糖類、
−  ヒアルロン酸系ポリマー、
−  キトサン、例えばＳＩＧＭＡ社から販売されているもの。
【００４０】
好ましくは、親水性ポリマーは、セルロース化合物、特にＨＰＭＣ、ＥＣもしくはＣＭＣ、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールおよびいくつかのポリアクリレート、例えばポリ（ヒドロキシエチルアクリレート）（ＨＥＭＡ）、またはアクリル酸のコポリマーから選択される。
【００４１】
また、本発明に従い使用することができる親水性ポリマーは、上述の２種以上の親水性ポリマーの混合物、例えばＨＰＭＣおよびＣＭＣ、ＨＰＭＣおよびＥＣ等で構成されてもよい。
【００４２】
生物活性分子は、親水性ポリマーと混合され、バイオ人工臓器を受け入れる患者の組織（複数可）の応答を誘導するように、半透膜の周囲の媒体内に放出されることを意図する。
【００４３】
誘導することが望ましい組織の応答は、いくつかの種類の応答であってもよく、一般に、本発明による機能化半透膜中に導入され得る生物活性分子は、抗炎症剤、抗感染症剤、麻酔剤、成長因子、血管形成促進および／もしくは血管新生誘導剤、創傷治癒剤、免疫抑制剤、抗凝集剤および抗凝固剤を含む抗血栓剤、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の阻害剤、またはインスリン分泌を促進する分子（ＩＧＦ、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）もしくはその誘導体、インクレチン模倣剤）から選択される。
【００４４】
抗炎症剤のうち、アセトアミノフェン、アミノサリチル酸、アスピリン、セレコキシブ、トリサリチル酸コリンマグネシウム、デクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、インターロイキンＩＬ−１０、ＩＬ−６突然変異タンパク質、抗ＩＬ−６、ＮＯシンターゼ阻害剤（例えばＬ−ＮＡＭＥもしくはＬ−ＮＭＤＡ）、インターフェロン、ケトプロフェン、ケトロラク、レフルノミド、メフェナム酸、ミコフェノール酸、ミゾリビン、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、ロフェコキシブ、サルサレート、スリンダク、およびトルメチン等の非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ならびにコルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、ブデソニド、リン酸デキサメタゾンナトリウム、フルニソリド、プロピオン酸フルチカゾン、パクリタキセル、タクロリムス、トラニラスト、トリアムシノロンアセトニド、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、デソニド、デスオキシメタゾン、フルオシノロン、トリアムシノロン、トリアムシノロン、プロピオン酸クロベタゾール、およびデキサメタゾン等のコルチコイドを挙げることができる。
【００４５】
抗凝集剤（アセチルサリチル酸、クロピドグレル、チクロピジン、ジピリダモール、アブシキシマブ、エプチフィバチドおよびチロフィバン）、抗凝固剤（ヘパリン、ビバリルジン、ダビガトラン、レピルジン、フォンダパリヌクス、リバロキサバン、エポプロステノール、ワルファリン、フェンプロクモン、プロテインＣ、ドロトレコギンアルファ、抗トロンビン、ペントサン）ならびに血栓溶解剤（アルテプラーゼ、ウロキナーゼ、テネクテプラーゼおよびレテプラーゼ）等の抗血栓剤の使用が好ましい。
【００４６】
好ましい抗血栓剤は、ヘパリンである。
【００４７】
さらに、生物活性分子として、バイオ人工臓器の周囲の組織の十分な血管新生を可能とする分子を使用することが有利であり、これは、特に、以下のような成長因子であってもよい。
−  ＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）ファミリーの成長因子：ＰＤＧＦ１、ＰＤＧＦ２、ＶＥＧＦ（血管成長因子）、ＶＰＦ（血管透過性因子）、
−  ＥＧＦ（上皮細胞成長因子）ファミリーの成長因子：ＥＧＦ、ウロガストロン（ＵＲＯ）ＴＧＦα（形質転換成長因子α）、アンフィレグリン、
−  ＦＧＦ（線維芽細胞成長因子）ファミリーの成長因子：１から６まで番号付けられ、ヘパリンと複合化していてもよい、
−  インスリンファミリーの成長因子：ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２、
−  神経栄養因子（ＮＧＦ）、
−  結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、
−  肝細胞成長因子（ＨＧＦ）。
【００４８】
好ましくは、成長因子は、血管形成の誘導により血管新生を促進する細胞成長因子、例えば塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤＧＦ１もしくは２）、または肝細胞成長因子（ＨＧＦ）である。
【００４９】
親水性ポリマーおよび生物活性分子の層の調製のために、親水性ポリマーまたは親水性ポリマーの混合物を水に溶解させる。
【００５０】
使用される親水性ポリマー、または親水性ポリマーの混合物とは無関係に、溶液の総重量によるその量は、好ましくは、１センチポアズから１０センチポアズの間の粘度を有する親水性ポリマーの水溶液が得られるように調節される。
【００５１】
例えば、約５センチポアズから１０センチポアズ（ｃＰｓ）の粘度値は、１質量％のＰＶＰ（ＢＡＳＦ社から販売されているＫｏｌｌｉｄｏｎ  Ｋ９０）の濃度を有する水溶液、または０．２質量％のＨＰＭＣ（ＤＯＷ  ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ社から販売されているＥ４Ｍ）の濃度を有する水溶液において得られる。粘度の測定は、ＤＩＮ  ３０Ｄ型ニードルを利用して、室温で、および３００ｒｐｍから５００ｒｐｍの回転速度で行われる。
【００５２】
したがって、例示を目的として、親水性ポリマーがヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）またはこれら２種のポリマーの混合物である場合、ポリマーの水溶液の総重量に対する親水性ポリマーの質量パーセントは、有利には０．１％から１％の間である。
【００５３】
次いで、生物活性分子は、この親水性ポリマーの水溶液に添加され、次いで、２５／１００から７５／１００の間の生物活性分子／親水性ポリマーの重量比で撹拌することにより可溶化または懸濁されるが、好ましくはこの比は２５／１００から５０／１００の間であり、好ましくは、生物活性分子および親水性ポリマーとは無関係に、比は２５／１００である。
【００５４】
生体適合性支持体上への親水性ポリマーおよび生物活性分子の層の塗布は、浸漬により行われてもよい。
【００５５】
最も好ましくは、浸漬ステップの期間は、５秒から１０分の間である。
【００５６】
有利には、浸漬ステップは、１５℃から２５℃の間の温度で行われる。
【００５７】
親水性ポリマーの溶液に生体適合性支持体を浸漬するためのステップの期間は、１０ナノメートルから１０００ナノメートルの間、好ましくは１０ナノメートルから１００ナノメートルの間、最も好ましくは１０ナノメートルから５０ナノメートルの間の厚さを有するポリマー層が得られるように調節される。
【００５８】
親水性ポリマーおよび生物活性分子の次の層のそれぞれは、前の層を完全に乾燥させた後に、この同じ方法に従って調製される。また、生物活性分子の量を増加させるために、機能化層の連続的積層を調製することも可能であり、機能化層の数は、２から１０の間、好ましくは２から５の間であってもよい。
【００５９】
本発明の好ましい変形実施形態によれば、親水性ポリマーおよび生物活性分子の２つの層が生体適合性支持体上に塗布され、第１の層（支持体と第２の層との間に設置される）は、細胞成長因子、例えばＥＣ中のＶＥＧＦを含み、第２の（外側の）層は、抗血栓剤、例えばＨＰＭＣ中のヘパリンを含むが、これは好ましい変形例であり、これらの２つの機能化層の積層は、逆であってもよい（すなわち、第１の層がＨＰＭＣ中のＶＥＧＦを含み、第２の層がＥＣ中のヘパリンを含む）。
【００６０】
有利には、本発明の半透膜は、バイオ人工臓器内で生成される興味深い治療物質に対する非常に良好な透過特性、およびバイオ人工臓器内に含有される細胞の生存能力に必要な生物のための栄養物に対する良好な透過性を有する。
【００６１】
同じく非常に有利には、細胞は、本発明による半透膜の表面に非常に弱く付着する。
【００６２】
すなわち、本発明による機能化半透膜は、以下の特徴を有する。
−  機能化半透膜は、１００００ダルトンから５００００ダルトンの間、好ましくは１００００ダルトンから３００００ダルトンの間、最も好ましくは１００００ダルトンから１５０００ダルトンの間のカットオフを有する。
−  機能化半透膜は、１０９ｐｏｒｅｓ／ｃｍ２から１０１１ｐｏｒｅｓ／ｃｍ２の細孔密度を有する。
−  機能化半透膜は、５μｍから１００μｍの間、好ましくは１０μｍから６０μｍの間の厚さを有する。
【００６３】
第１の実施形態によれば、親水性ポリマーおよび生物活性分子の層は、生体適合性支持体の両面を被覆してもよい。
【００６４】
第２の好ましい実施形態において、親水性ポリマーおよび生物活性分子の層は、生体適合性支持体の２つの面のうち１つのみを被覆し、この実施形態によれば、親水性ポリマーおよび生物活性分子で被覆された生体適合性支持体の面は、バイオ人工臓器の外側に位置し、この臓器の移植部位の周囲の媒体と接触する面である。
【００６５】
また、本発明の主題は、治療上有益な少なくとも１種の物質を生成する分泌細胞を封入するためのチャンバの製造のための、本発明による機能化膜の使用である。
【００６６】
また、本発明の主題は、治療上有益な少なくとも１種の物質を生成する分泌細胞を封入するためのチャンバであって、その壁は、治療上有益な少なくとも１種の物質を生成する分泌細胞を含有することができる空間を画定する、上に定義されたような機能化半透膜からなることを特徴とするチャンバ、および、治療上有益な少なくとも１種の物質を生成する分泌細胞を封入するためのチャンバを備えるバイオ人工臓器であって、封入チャンバの壁は、上に定義されたような機能化半透膜からなることを特徴とするバイオ人工臓器である。
【００６７】
バイオ人工臓器の製造のための本発明による半透膜の使用は、移植中の抗血栓剤の放出およびデバイスの周囲の血管の形成により移植性が向上される前記デバイスをもたらす。
【００６８】
本発明による封入チャンバは、従来技術において説明されたバイオ人工臓器の構成チャンバの特徴を有し得る。
【００６９】
バイオ人工臓器の一実施形態の制限されない例は、本発明による封入チャンバを備え、そのようなバイオ人工臓器は、図１（上面図）および図２（断面図）に示される。
【００７０】
この具体的実施形態によれば、封入チャンバ（１）は、平行六面体形状を有し、親水性ポリマーおよび生物活性分子の層（３）が設置される生体適合性支持体（２）からなる、１つは頂部、１つは底部にある２つの機能化半透膜を備え、これらの２つの半透膜は、その外縁部（４１）に沿って、およびその表面上の様々な点（４２）に沿って溶接されている。
【００７１】
２つの機能化膜は、治療上有益な少なくとも１種の物質を生成する細胞を含有する、封入チャンバのチャンバ（５）を画定する。チャンバは、有利には、内側マトリックス（６）でコーティングされている。封入チャンバの内側の高さは、細胞または分泌細胞の群の高さに相当し（例えば膵島の場合）、例えば、この高さは５μｍから９００μｍの間である。
【００７２】
膜の表面に位置する溶接点（４２）は、封入チャンバの充填中の分泌細胞のより良好な分布を可能とし、特に、分泌細胞の凝集を回避することを可能にする。
【００７３】
最後に、好ましい変形例によれば、バイオ人工臓器は、バイオ人工臓器を充填する、または空にすることを可能にする２つの可撓管（７）をさらに備え、これは、バイオ人工臓器が患者に移植される時に、外植を行うことなくバイオ人工臓器の内容物を交換する上で特に有利である。
【００７４】
治療上有益な少なくとも１種の物質を生成する細胞は、例えば、封入チャンバがバイオ人工膵臓の製造用に意図される場合、インスリンを生成する膵島（もしくはランゲルハンス島）の細胞、またはＭＩＮ−６、ＲＩＮ−ｍ５ｆおよびＩＮＳ−１等の細胞株から得られたインスリン細胞であってもよい。
【００７５】
また、細胞は、封入チャンバがバイオ人工肝臓の製造用に意図される場合、肝細胞であってもよい。
【００７６】
具体的実施形態において、細胞は、治療上有益な物質の発現を可能とする少なくとも１種の核酸でトランスフェクトまたは形質転換される。治療上有益な物質のうち、例示を目的として、インスリン、サイトカイン、ペプチドホルモン、成長ホルモンおよびカルシトニンを挙げることができる。
【００７７】
一般に、治療上有益な物質という表現は、本発明の目的において、それを生成する細胞により放出または分泌され、宿主生物における標的細胞または標的分子に対して効果を示す物質、例えば神経伝達物質、ホルモン、成長因子またはサイトカイン等を意味するように理解される。
【００７８】
分化初代細胞培養等の不死化細胞株を含む、非常に多様な細胞を使用することができる。
【００７９】
細胞は、例えば、中胚葉の幹細胞の集団から誘導される筋細胞の前駆細胞であり、治療上有益な物質の発現を可能とする核酸で容易に形質転換され得る、筋芽細胞であってもよい。当業者により、例えば、ＷＯ９４／０２１２９、ＷＯ９３／０３７６８およびＷＯ９０／１５８６３の番号で公開されているＰＣＴ出願が有利に参照され得る。
【００８０】
また、細胞は、好ましくはヒト起源の膵臓のランゲルハンス島のβ細胞または肝細胞であってもよい。
【００８１】
本発明による封入チャンバ内に含有される細胞は、適切な場合には、Ｍａｔｒｉｇｅｌの商品名で販売されているマトリックスとして、ラミニン、エンタクチンおよびヘパラン硫酸と組み合わせて、ＩＶ型コラーゲンマトリックス等のマトリックス中に組み込まれてもよい。
【００８２】
本発明による封入チャンバ内に含有される細胞は、一般に、生存能力のある形態でのそれらの細胞の固定を可能とする任意の生成物または生成物の組合せで構成されるマトリックス中に組み込まれてもよい。
【００８３】
別の態様によれば、本発明はまた、上に定義されたような少なくとも１つの封入チャンバを備えることを特徴とするバイオ人工臓器に関する。
【００８４】
本発明によるバイオ人工臓器の特徴は、本質的に従来技術において知られている任意の種類のものであってもよい。
【００８５】
本質的な特徴が細胞を封入するための少なくとも１つのチャンバを備えるという特徴である、本発明による機能化半透膜を備える本発明のバイオ人工臓器の調製に関して、当業者により、米国特許第５９８１２１１号、米国特許第４５７８１９１号、米国特許第５８３７２３４号、米国特許第６０２３００９号、米国特許第５６０５８３５号および米国特許第４３２３４５７号が有利に参照され得る。
【００８６】
本発明の具体的実施形態によれば、バイオ人工臓器は、ランゲルハンス島の細胞を含有するバイオ人工膵臓である。
【００８７】
本発明の第２の具体的実施形態によれば、バイオ人工臓器は、肝細胞を含有する人工肝臓である。
【００８８】
例示を目的として、本発明によるバイオ人工臓器は、腹腔内に、または腎被膜上に移植されてもよく、少なくとも５年間移植されたままであってもよく、必要に応じて、その内容物（分泌細胞）が交換されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】本発明によるバイオ人工臓器の実施形態の一例の上面図である。
【図２】この同じバイオ人工臓器の断面図であり、このバイオ人工臓器は、平行六面体形状、ならびに親水性ポリマーおよび生物活性分子の層（３）が設置される生体適合性支持体（２）からなる、１つは頂部、１つは底部にある２つの機能化半透膜を有する封入チャンバ（１）を備え、これらの２つの半透膜は、その外縁部（４１）に沿って、およびその表面上の様々な点（４２）に沿って溶接されており、２つの機能化膜は、治療上有益な少なくとも１種の物質を生成する細胞を含有する封入チャンバの空間（５）を画定し、空間には内側マトリックス（６）が提供されている。
【図３】実施例１において調製された膜のグルコースに対する透過性を表すグラフである。
【図４】生物活性分子がない場合、ヘパリンを用いた場合、ＶＥＧＦを用いた場合、ならびにヘパリンおよびＶＥＧＦを用いた場合の、ラットにおける７日後（図４）または１ヵ月後（図５）の膜の周囲の腹膜組織の組織切片の画像である（４００倍）。  移植から７日後、１４日後および１カ月後に生成された画像に基づき、インプラントの周囲の組織の血管新生の進行を特徴付ける、以下のいくつかのパラメータを評価した。
【図５】生物活性分子がない場合、ヘパリンを用いた場合、ＶＥＧＦを用いた場合、ならびにヘパリンおよびＶＥＧＦを用いた場合の、ラットにおける７日後（図４）または１ヵ月後（図５）の膜の周囲の腹膜組織の組織切片の画像である（４００倍）。  移植から７日後、１４日後および１カ月後に生成された画像に基づき、インプラントの周囲の組織の血管新生の進行を特徴付ける、以下のいくつかのパラメータを評価した。
【図６】試験された様々な膜に対して、移植から７日後、１４日後および１ヵ月後に切片の５つの領域において計測された領域あたりの血管の数の平均を示すグラフである。
【図７】試験された様々な膜に対して、移植から７日後または１ヵ月後に切片の５つの領域において計測された半透膜と第１の血管との間の平均距離を示すグラフである。
【図８】試験された様々な膜に対して、移植から７日後または１ヵ月後に切片の５つの領域において測定された血管の平均直径を示すグラフである。
【実施例】
【００９０】
［実施例１］
半透膜の製造
Ｉ．ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）のみで被覆されたポリカーボネート製の支持体を備える膜（対照膜）
Ｉ．Ａ．ＨＰＭＣ溶液の調製
処理の少なくとも前日に、０．２％ＨＰＭＣの濃度を得るために、２ｇのＨＰＭＣ（Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製Ｅ４Ｍ）を１ｌの注射用水に、または同等の比率で溶解することにより、以下の溶液を調製する。溶液を室温で一晩撹拌下（磁気撹拌器）に置く。
Ｉ．Ｂ．ポリカーボネート支持体およびコーティングのプラズマ処理
ポリカーボネートＰｏｋａｌｏｎ（Ｌｏｎｚａ社製）製の支持体膜を、注射用水で事前に清浄化する。
【００９１】
ポリカーボネート支持体膜の処理は、クリーンルームにおいてＢｒａｎｓｏｎプラズマ機で行い、以下の処理を適用する：Ａｒ−５０Ｗ−１０分。
【００９２】
このようにして処理されたポリカーボネート支持体膜を、すぐにＨＰＭＣ溶液に浸漬し、次いで炉内で４５℃で乾燥させる。
ＩＩ．ＨＰＭＣ中のＶＥＧＦで機能化された本発明による膜
ＩＩ．Ａ  ＨＰＭＣおよびＶＥＧＦの溶液の調製
注射用水中０．１％ＨＰＭＣ溶液（１ｇ／ｌ）を調製する。
【００９３】
このＨＰＭＣ溶液１ｍｌを１００ｍｌのＤＰＢＳリン酸緩衝液中に希釈し、０．００１％のＨＰＭＣ濃度を得る。
【００９４】
１０μｇのＶＥＧＦを含有するバイアルに１ｍｌのＤＰＢＳを添加することにより、１０μｇ／ｍｌ（すなわち１０ｍｇ／ｌ）のＶＥＧＦ溶液（Ｔｅｂｕ−ｂｉｏ  ＳＡＳ）の調製を行う。
【００９５】
ＨＰＭＣ１００部当たり２５部のＶＥＧＦを含む溶液を調製するために、このＶＥＧＦ溶液の全体（すなわち１ｍｌ、したがって１０μｇのＶＥＧＦを含む）を、４ｍｌのＨＰＭＣ溶液（４０μｇのＨＰＭＣを含む）と混合する。
【００９６】
混合物を５０ｍｌのフラスコに導入し、ＶＥＧＦについては０．２μｇ／ｍｌ、ＨＰＭＣについては０．８μｇ／ｍｌの最終濃度を得るために希釈する。
【００９７】
同じ原理に従って、１００／５０および１００／１０のＨＰＭＣ／ＶＥＧＦ比を有する溶液を調製する。
ＩＩ．Ｂ  プラズマ処理およびコーティング
これらのステップは、ポイントＩ．Ｂに記載のように行うが、ただし乾燥は室温で行う。
ＩＩＩ．エチルセルロース（ＥＣ）中のヘパリンにおいて１００／２５のＥＣ／ヘパリン比で機能化された、本発明による膜
ＩＩＩ．Ａ  溶液の調製
ＥＣ溶液を以下のように調製する。ＥＣは、ペーストの形態（Ｃｏｌｏｒｃｏｎ社製Ｓｕｒｅｌｅａｓｅ、２５％すなわち２５ｍｇ／１００ｍｇ）で存在するが、これを注射用水中に１ｇ／ｌに希釈し、すなわち２５０ｍｇ／ｌのＥＣとする。
【００９８】
１０ｍｇ／ｌのＥＣの溶液を得るために、この溶液を再び注射用水中に希釈する。
【００９９】
市販のヘパリン溶液（ヘパリンＣｈｏａｙ  ２５０００  ＩＵ、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ社製）は、２００ｍｇ／５ｍｌのヘパリン濃度を有するが、１０μｇ／ｍｌのヘパリン濃度が得られるまで、これを注射用水中に希釈する。
【０１００】
１ｍｌのヘパリン溶液（１０μｇのヘパリンを含有する）を、４ｍｌのＥＣ溶液（４０μｇのＥＣを含有する）と混合し、ＥＣ１００部当たり２５部のヘパリン比を有する溶液を得る。
【０１０１】
この溶液を５０ｍｌのフラスコに導入し、再び濃度をヘパリンについては０．２μｇ／ｍｌ、ＥＣについては０．８μｇ／ｍｌとするために希釈する。
ＩＩＩ．Ｂ  プラズマ処理およびコーティング
これらのステップは、ポイントＩ．Ｂに記載のように行うが、ただし乾燥は室温で行う。
ＩＶ．ＥＣ中のヘパリンおよびＨＭＰＣ中のＶＥＧＦで機能化された、本発明による膜
ＩＶ．Ａ  溶液の調製
ＥＣ中のヘパリンおよびＨＰＭＣ中のＶＥＧＦの溶液を、それぞれポイントＩＩＩ．ＡおよびＩＩ．Ａで示された通りに調製する。
ＩＶ．Ｂ  プラズマ処理およびコーティング
ポイントＩ．Ｂに記載のようにプラズマ処理を行う。
【０１０２】
以下の順番でコーティングを行う。
−  ＥＣ／ヘパリン溶液へのポリカーボネート支持体の浸漬、次いで室温での乾燥。
−  次いでＨＰＭＣ／ＶＥＧＦ溶液へのヘパリンで機能化された支持体の浸漬、次いで室温での乾燥。
Ｖ．シリコーン支持体を用いた本発明によるデバイスの調製
シリコーン支持体を用いて、本発明によるデバイスを調製することができる。これらの支持体は、本発明による半透膜の補完的部分を構成する。
【０１０３】
シリコーン支持体（Ｎｕｓｉｌ社製）を、以下の条件下で事前にプラズマ処理する：Ａｒ−１００Ｗ−７．５分
次に、ＩＩ部、ＩＩＩ部およびＩＶ部のプロトコルに記載のように機能化層の塗布を行うが、注射用水を蒸留水と置き換えることができる。
［実施例２］
【０１０４】
半透膜の透過性の特性決定
調製された膜のグルコースおよび免疫グロブリン（ＩｇＧ）に対する透過性に関する試験を、以下のように行う。
【０１０５】
材料：透過性を試験しようとしている膜により隔てられた、頂部区画および底部区画からなる拡散チャンバ（２つの区画間の不透過性はシールにより提供される）、グルコース（Ｐｒｏｌａｂｏ社製）、ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ社製、参照番号Ｓ３０１４）、ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社製、参照番号Ｉ９６６４０）、蒸留水。
溶液の調製
−  生理食塩水、１リットル当たり：
ＮａＣｌ  ９ｇ
蒸留水  １ｌ
−  グルコース溶液、１リットル当たり：
グルコース  ４ｇ
生理食塩水  １ｌ
−ＩｇＧ溶液（最終濃度５．７５μｇ／ｍｌ）、１００ｍｌ当たり：
ストックＩｇＧ（１０ｍｇ／ｍｌ）  ５７５μｌ
生理食塩水  ９９．４２５ｍｌ
プロトコル：
３ｍｌの生理食塩水を拡散チャンバの底部区画に導入し、透過性を試験しようとしている膜を、気泡の存在を回避しながら生理食塩水の上に設置する。
【０１０６】
３ｍｌのグルコース溶液を頂部区画に導入し、拡散チャンバをパラフィルムで封止し、次いで３７℃でインキュベートする。
【０１０７】
グルコースの場合：拡散チャンバの頂部区画内に存在する溶液１ｍｌを、穏やかに均質化した後に回収する。次いで、膜を取り外してペトリ皿内に置き、底部区画内の溶液１ｍｌを、均質化した後に回収する。
【０１０８】
Ｇｌｕｃｏｓｅ  ＲＴＵキット（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社製、参照番号６１２６９）を利用して、グルコースの酵素アッセイを行う。
【０１０９】
結果（時間の関数としての底部区画内のグルコース含量として表現される）を、図３のグラフに示す。
【０１１０】
実施例１のポイントＩにその調製が記載される最新の膜（１２６．１および１２６．２）に対する、本発明による機能化膜（１２６．３、１２６．４および１２６．５）のグルコースに対する透過性は、膜を機能化することを意図する処理が、グルコースに対する透過性を低減しないことを示している。
【０１１１】
ＩｇＧの場合：拡散チャンバの頂部区画内に存在する溶液１ｍｌを、穏やかに均質化した後に回収する。次いで、膜を取り外してペトリ皿内に置き、１ｍｌの蒸留水で洗浄する。洗浄水を保存する。底部区画内の溶液１ｍｌを、均質化した後に回収する。
【０１１２】
Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、１９７６およびＷｒｉｇｈｔら、１９９６）により、ＩｇＧのアッセイを行う。
【０１１３】
本発明による半透膜は、ＩｇＧに対して完全に不透過性であり、したがって、サイトカインおよびケモカインの封止チャンバの透過を有利に防止する。
［実施例３］
【０１１４】
半透膜の移植試験
実施例１に記載のように調製された膜を、健康なＷｉｓｔａｒラットの腹腔内に移植する。
【０１１５】
残りの実験部分において、膜を以下のように符号化する。
−  １２６．１および１２６．２：「対照」膜（実施例１のＩ部に記載のように調製される）、
−  １２６．３：「ＶＥＧＦ／ＨＰＭＣ」膜（比：２５／１００、実施例１のＩＩ部に記載のように調製される）、
−  １２６．４：「ヘパリン／ＥＣ」膜（比：２５／１００、実施例１のＩＩＩ部に記載のように調製される）、
−  １２６．５：「ＶＥＧＦ／ＨＭＰＣ＋ヘパリン／ＥＣ」膜（両方の層に対して、比は２５／１００、膜は実施例１のＩＶ部に記載のように調製される）。
【０１１６】
２３０〜２５０ｇの雄のＷｉｓｔａｒラットを、ガス（イソフルラン）で麻酔する。左腸骨窩において３ｃｍの開腹を行うと、膜を移植することができる。次いで、切開部を閉鎖する。次いで、ラットをケージ内に入れ、任意に食物および水を与える（各膜を３匹のラットに移植する）。
【０１１７】
１週間後、ラットをＩｍａｌｇｅｎｅ／Ｒｕｍｐｕｎ混合物で麻酔し、膜およびその周囲の腹膜組織を回収するために切開する。次いで、膜を２．５％グルタルアルデヒド中に入れ、一方組織をＰＢＳ緩衝液中で調製された３％パラホルムアルデヒド中で３時間固定する。
【０１１８】
回収した腹膜組織を、以下のプロトコルに従い、組織学的分析のためにパラフィン内に包埋する。
Ｉ．サンプリング
Ｉ．１．材料
溶液
−  ５００ｍｌの３６％ホルムアルデヒド（参照番号：ＳＩＧＭＡ−Ｆ８７７５−５００ｍＬ）のフラスコ１個。
−  ５００ｇの粉末パラホルムアルデヒド（参照番号：ＳＩＧＭＡ−３０５２５−８９−４）のフラスコ１個、冷蔵庫内で保存する必要がある。
−  １０ｍｌの２５％グルタルアルデヒド（参照番号：ＳＩＧＭＡ−Ｇ５８８２−１０×１０ｍＬ）のフラスコ１個。
−  ５００ｍＬのＰＢＳ（参照番号：ＧＩＢＣＯ−１４１９０−０９４）のフラスコ１個。
−  ５００ｍＬのＰＢＳ×１０（参照番号：ＧＩＢＣＯ−１４２００−０６７）のフラスコ１個。
Ｉ．２．溶液の調製
使用される生成物の毒性のため、安全キャビネット内でグローブを着用して以下のステップを行う。
Ｉ．２．１．３％のホルムアルデヒド溶液
ホルムアルデヒドは、回収の間最大４時間の膜の周囲の組織の保存を可能とし、またエオシン／ヘマトキシン染色にも使用される。
−  １００ｍＬのフラスコ内に、１００ｍＬのＰＢＳを入れる。
−  ８．３ｍｌの３６％ホルムアルデヒドを添加する。
−  混合する。
Ｉ．２．２．８％のパラホルムアルデヒド溶液
ホルムアルデヒド溶液の代わりに、４％のパラホルムアルデヒド溶液を使用することができ、パラホルムアルデヒド溶液は、２４時間までの組織の固定を可能とし、また免疫細胞化学的染色に使用される。
−  ２ｍＬから３ｍＬの蒸留水中に水酸化ナトリウムペレット１個を溶解することにより、アルカリ溶液を調製する。
−  １００ｍＬの蒸留水中の懸濁液として８ｇのパラホルムアルデヒドを添加する。
−  安全キャビネット内で、加熱磁気撹拌器上で懸濁液を加熱する。
−  懸濁液が沸騰してきたら（約８０℃）、混合物が完全に透明となるまでアルカリ溶液を数滴添加する。
−  氷で急冷する。
【０１１９】
この溶液は、速やかに使用するか、すぐに使用可能な２０ｍＬずつの分量で−２０℃で保存する必要がある。
【０１２０】
ＰＢＳでの希釈により４％パラホルムアルデヒド溶液を調製する（２０ｍｌの８％パラホルムアルデヒド溶液を２０ｍｌのＰＢＳに導入し、次いで混合する）。
Ｉ．２．３．２．５％のグルタルアルデヒド溶液
−  １００ｍＬのフラスコ内に、１００ｍＬの蒸留水を入れる。
−  １０ｍＬの２５％グルタルアルデヒドを添加する。
【０１２１】
グルタルアルデヒドにより、回収した膜を保存することができる。
ＩＩ．パラフィンへの組込み
ＩＩ．１．材料
−  ５００ｍＬのＰＢＳ（参照番号：ＧＩＢＣＯ−１４１９０−０９４）のフラスコ１個。
−  ５００ｍＬのＰＢＳ×１０（参照番号：ＧＩＢＣＯ−１４２００−０６７）のフラスコ１個。
−  １Ｌのトルエン（参照番号：ＦＩＳＨＥＲ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ−コード：Ｔ／２２５０／１７）の瓶１個、トルエンは非常に毒性であり揮発性であるため、安全キャビネット内で保存および取扱う必要がある。
−  １Ｌの７０％エタノールの瓶１個。
−  １Ｌの９５％エタノールの瓶１個。
−  １Ｌの１００％エタノールの瓶１個。
−  パラフィン（参照番号：ＴＹＣＯ／ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ−参照番号：８８８９５０１００６）。
−  組込み用標準カセットＨＩＳＴＯＳＥＴＴＥ  ２（参照番号：Ｍ．４９２、参照番号０３９７５３またはＭ．４８５、参照番号０３９７７５、Ｄｕｔｓｃｈｅｒ社カタログ）１個。
−  組込み用の皿１個、３７×２４ｍｍ（参照番号：ＲＩＣＨＡＲＤ  ＡＬＬＡＮ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ−カタログ番号５８９５３）
−  ５０ｍＬのビーカー３個。
−  ６００ｍＬのビーカー２個。
−  鉗子１組。
−  アルミニウム。
−  ゴム手袋。
ＩＩ．２．溶液
ＩＩ．２．１．ＰＢＳ
−  空のＰＢＳフラスコ（５００ｍＬ）に、５０ｍＬのＰＢＳ×１０を入れる。
−  ４５０ｍＬの蒸留水で調節する。
−  混合する。
ＩＩ．２．２．７０％のエタノール
−  １Ｌの瓶に、７００ｍＬのエタノールを入れる。
−  ３００ｍＬの蒸留水で調節する。
−  混合する。
ＩＩ．２．３．９５％のエタノール
−  １Ｌの瓶に、９５０ｍＬのエタノールを入れる。
−  ５０ｍｌの蒸留水で調節する。
−  混合する。
ＩＩ．２．４．パラフィン
−  ２個の６００ｍＬのビーカーに、パラフィンペレットを流し込む。
−  組織学室で、２個のビーカーを炉内に６２℃〜６５℃で設置する。
−  ビーカーを炉内に維持する。
ＩＩ．３．作業場の準備
作業台上に、溶液を含む９個の容器を、以下の順番に置く：ＰＢＳ容器２個およびエタノール容器７個。
【０１２２】
化学安全キャビネット内に５０ｍＬのトルエンのビーカー３個を置き、炉内にパラフィン容器３個を置く。
ＩＩ．４．浴
回収した組織を、以下のステップに従って処理する。
【０１２３】
【表１】
0005894589.tif 000002
【０１２４】
ＩＩ．５．パラフィンへの組織の組込み
−  組込み用の皿に、液体パラフィンを流し込む。
−  組み込む組織を皿に入れる。
−  組込み用カセットを置き、その上にパラフィンを流して均一な被覆を形成する。
−  室温で数分冷却し、次いで冷蔵庫内に最低２４時間置く。
ＩＩＩ．切片の調製
ＩＩＩ．１．材料
−  組込み用カセット
−  ミクロトーム
−  Ｐｅｒｍａｆｒｏｓｔスライド７５×２５ｍｍ（参照番号：０４５７９６、Ｄｕｔｓｃｈｅｒ社カタログ）。
−  使い捨て移植用ピペット１個
−  蒸留水を含有する容器１個
−  刷毛２個：大型刷毛１個＋小型刷毛１個
−  切片採取用ツール２個
−  スライド加熱器
−  １Ｌの９５％エタノールの瓶１個
−  １Ｌの１００％エタノールの瓶１個
−  トルエンの瓶１個（参照番号：ＦＩＳＨＥＲ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ−コード：Ｔ／２２５０／７
−  Ｈｅｌｌｅｎｄａｈｌ型染色槽５個
−  ゴム手袋。
ＩＩＩ．３．ミクロトーム切片
Ｌｅｉｃａ  ＲＭ２２６５ミクロトームを利用して、製造者の推奨に従い切片を形成した。
ＩＩＩ．４．パラフィン除去
このステップにより、組織を保存しながらスライド上に存在するパラフィンを除去することができ、スライドは、以下の浴で処理する。
【０１２５】
【表２】
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【０１２６】
ＩＶ．染色
ＩＶ．１．材料
−  Ｐｅｒｍａｆｒｏｓｔスライド７６×２６ｍｍ、固定切片あり。
−  １Ｌのエオシンの瓶１個。
−  １Ｌのアルコール−酸の瓶１個。
−  １Ｌのアンモニア水の瓶１個。
−  ハリスヘマトキシリン（参照番号：ＳＵＲＧＩＰＡＴＨ−０１５６２Σ）のフラスコ１個。
−  ５００ｍＬの１００％エタノールの瓶１個。
−  トルエン浴１個。
−  接着剤（参照番号：ＥＵＫＩＴＴ）１個。
−  カバーガラス２５×７５ｍｍ（参照番号：ＥＳＣＯ  Ｎｏ．２９５１）。
−  蓋付きの槽１３個（参照番号：０６８５０６、Ｄｕｔｓｃｈｅｒ社カタログ１８７頁）。
−  バスケット２個（参照番号：０６８５０７、Ｄｕｔｓｃｈｅｒ社カタログ１８７頁）。
−  吸収紙。
−  ゴム手袋。
−  コーヒーフィルタ１個。
ＩＶ．２．溶液の調製
ＩＶ．２．１．エオシン溶液（１ｌ）
１Ｌの瓶に、以下を入れる。
−  エオシン２２５ＲＡ２：３．１２５ｇ（参照番号：ＲＥＡＣＴＩＦ  ＲＡＬ−３１２７３０−０１００）、
−  エリスロシンＲＡ２：１．８７５ｇ（参照番号：ＲＥＡＣＴＩＦ  ＲＡＬ−３１２８２０−０１００）、
−  蒸留水：１Ｌ
混合し、コーヒーフィルタを利用して濾過する。
ＩＶ．２．２．アルコール−酸の溶液（１ｌ）
１Ｌの瓶に、以下を入れる。
−  ９６％アルコール：９９０ｍＬ、
−  塩酸（ＨＣｌ）：１０ｍＬ（参照番号：ＰＲＯＬＡＢＯ−２０．２４６．２９８）（グローブおよび安全メガネを着用して取り扱う必要がある）
ＩＶ．２．３．９６％エタノールの溶液（１ｌ）
−  １Ｌの瓶に、９６０ｍＬの純エタノールを入れる。
−  ４０ｍＬの蒸留水で調節し、混合する。
ＩＶ．２．４．０．２０％アンモニア水の溶液（１ｌ）
１Ｌの瓶に、以下を入れる。
−  ２０％水酸化アンモニウム２．５ｍＬ（参照番号：ＦＩＳＨＥＲ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ−コード；Ａ／３３６７／１７）
−  蒸留水：１Ｌ
次いで混合する。
ＩＶ．３．染色プロトコル
以下の連続浴を使用して組織の染色を行う。
−  ハリスヘマトキシリンへの１分３０秒間の浸漬、
−  ２回の水浴、
−  ２回から３回の、撹拌下でのアルコール−酸溶液への浸漬、
−  ２回の水浴、
−  組織が青色になるまでの、アンモニア水への浸漬、
−  １回の水浴、
−  エオシンへの１０秒間の浸漬、
−  １回のアンモニア水浴、
−  ３回の連続的な９６％エタノール浴、
−  最終的なトルエン浴
水浴およびエタノール浴は、２〜３回の急速撹拌からなる。
【０１２７】
浴の後、
−  損傷しないように注意しながら、組織に接着剤を塗布する。
−  カバーガラスを置き、いかなる気泡も除去するために十分に押す。
−  過剰の接着剤を大まかに除去する。
−  スライドをトルエン中に速やかに浸し、すぐに取り出す。
−  カバーガラスを動かさないよう注意しながら、吸収紙で拭き取る。
−  接着剤残渣の完全除去が達成されるまで、操作を２回から３回繰り返す。
ＩＶ．４．各種溶液の役割
ハリスヘマトキシリンにより、組織の好塩基性成分を赤紫色に染色することができる。
【０１２８】
アルコール−酸により、穏やかに脱染し、橙色の色合いを生成することができる。
【０１２９】
０．２０％ＮＨ４アンモニア水により、細胞核を紫色に染色することができる。
【０１３０】
エオシンにより、組織の好酸性成分を橙色−ピンク色に染色することができる。
【０１３１】
３回の９６％エタノール浴により、脱染を行うことができる。
【０１３２】
トルエン浴により、組織を固定し、過剰の染料を除去することができる。
【０１３３】
血管数の計測、その直径の測定、およびモジュールと第１の血管との間の距離の決定は、マイクロメータを利用して双眼レンズ下で行い、組織当たり３つの切片の割合で、各切片に対して５つの領域を計測する。
Ｖ．結果
膜の移植から７日後または１カ月後に調製された切片の画像は、図４および図５に複写されている。
【０１３４】
図６は、試験された様々な膜に対して、７日後、１４日後または１ヵ月後に切片の５つの領域において計測された血管の数の平均を表す。
【０１３５】
図７は、試験された様々な膜に対して、７日後または１ヵ月後に切片の５つの領域において計測された半透膜と第１の血管との間の平均距離を表す。
【０１３６】
図８は、試験された様々な膜に対して、７日後または１ヵ月後に切片の５つの領域において測定された血管の平均直径を表す。
【０１３７】
これらの試験は、ＶＥＧＦが血管の長期形成を誘導することを示している。ヘパリンはまた、血管新生誘導効果を示す。
【０１３８】
これらの２種の化合物が相乗効果を有することが分かるのが興味深い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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