(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）において、以下の（Ａ１）から（Ａ４）のいずれかに示す改変を行うことにより、以下の［１］から［３］に示す計算方法により算出される温度依存性値を１．０を超えさせる方法。［１］改変前のＦＡＤＧＤＨの２５℃における活性値を３７℃における活性値で割った値を算出する。［２］改変体において［１］と同様に活性値を測定し［１］と同様の計算を行った値を算出する。［３］［２］で得られた値を［１］で得られた値で割り、［１］で得られた値を１としたときの［２］で得られた値の相対値を算出する。（Ａ１）配列番号２に記載のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列において、下記（ａ）に示されるアミノ酸置換のいずれかの改変を行う：（ａ）Ｇ５９Ａ、Ｇ５９Ｃ、Ｇ５９Ｄ、Ｇ５９Ｆ、Ｇ５９Ｈ、Ｇ５９Ｋ、Ｇ５９Ｌ、Ｇ５９Ｍ、Ｇ５９Ｎ、Ｇ５９Ｐ、Ｇ５９Ｑ、Ｇ５９Ｓ、Ｇ５９Ｔ、Ｇ５９Ｗ、Ｇ５９Ｙ、Ｒ８２Ａ、Ｒ８２Ｃ、Ｒ８２Ｈ、Ｒ８２Ｋ、Ｒ８２Ｑ、Ｒ８２Ｖ、Ｒ８２Ｙ、Ｖ１０８Ａ、Ｖ１０８Ｄ、Ｖ１０８Ｅ、Ｖ１０８Ｆ、Ｖ１０８Ｈ、Ｖ１０８Ｌ、Ｖ１０８Ｍ、Ｖ１０８Ｑ、Ｖ１０８Ｒ、Ｖ１０８Ｓ、Ｖ１０８Ｔ、Ｆ５０５Ｄ、Ｆ５０５Ｌ、Ｆ５０５Ｍ、Ｆ５０５Ｎ、Ｆ５０５Ｑ、Ｆ５０５Ｒ、Ｆ５０５Ｙ；（Ａ２）前記（Ａ１）で示される改変を行ったＦＡＤＧＤＨに、さらに１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、付加若しくは挿入による改変を行う。（Ａ３）配列番号３に記載のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列において、下記（ｂ）に示されるアミノ酸置換のいずれかの改変を行う：（ｂ）Ｇ７９Ａ、Ｇ７９Ｃ、Ｇ７９Ｄ、Ｇ７９Ｆ、Ｇ７９Ｈ、Ｇ７９Ｋ、Ｇ７９Ｌ、Ｇ７９Ｍ、Ｇ７９Ｎ、Ｇ７９Ｐ、Ｇ７９Ｑ、Ｇ７９Ｓ、Ｇ７９Ｔ、Ｇ７９Ｗ、Ｇ７９Ｙ、Ｒ１０２Ａ、Ｒ１０２Ｃ、Ｒ１０２Ｈ、Ｒ１０２Ｋ、Ｒ１０２Ｑ、Ｒ１０２Ｖ、Ｒ１０２Ｙ、Ａ１２８Ｄ、Ａ１２８Ｅ、Ａ１２８Ｆ、Ａ１２８Ｈ、Ａ１２８Ｌ、Ａ１２８Ｍ、Ａ１２８Ｑ、Ａ１２８Ｒ、Ａ１２８Ｓ、Ａ１２８Ｔ、Ｆ５２５Ｄ、Ｆ５２５Ｌ、Ｆ５２５Ｍ、Ｆ５２５Ｎ、Ｆ５２５Ｑ、Ｆ５２５Ｒ、Ｆ５２５Ｙ；（Ａ４）前記（Ａ３）で示される改変を行ったＦＡＤＧＤＨに、さらに１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、付加若しくは挿入による改変を行う。
【請求項２】
ＦＡＤＧＤＨにおいて、以下の（Ｃ１）から（Ｃ４）のいずれかに示す改変を行うことにより、以下の［１］から［３］に示す計算方法により算出される温度依存性値を１．０を超えさせ、かつ、キシロース作用性を低下させる方法。［１］改変前のＦＡＤＧＤＨの２５℃における活性値を３７℃における活性値で割った値を算出する。［２］改変体において［１］と同様に活性値を測定し［１］と同様の計算を行った値を算出する。［３］［２］で得られた値を［１］で得られた値で割り、［１］で得られた値を１としたときの［２］で得られた値の相対値を算出する。（Ｃ１）配列番号２に記載のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列において、下記（ｅ）に示されるアミノ酸置換のいずれかの改変を行う：（ｅ）Ｇ５９Ｃ、Ｇ５９Ｄ、Ｇ５９Ｋ、Ｇ５９Ｍ、Ｇ５９Ｑ、Ｇ５９Ｓ、Ｇ５９Ｔ、Ｒ８２Ｈ、Ｒ８２Ｑ、Ｖ１０８Ｍ、Ｖ１０８Ｔ、Ｆ５０５Ｙ；（Ｃ２）前記（Ｃ１）で示される改変を行ったＦＡＤＧＤＨに、さらに１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、付加若しくは挿入による改変を行う。（Ｃ３）配列番号３に記載のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列において、下記（ｆ）に示されるアミノ酸置換のいずれかの改変を行う：（ｆ）Ｇ７９Ｃ、Ｇ７９Ｄ、Ｇ７９Ｋ、Ｇ７９Ｍ、Ｇ７９Ｑ、Ｇ７９Ｓ、Ｇ７９Ｔ、Ｒ１０２Ｈ、Ｒ１０２Ｑ、Ａ１２８Ｍ、Ａ１２８Ｔ、Ｆ５２５Ｙ；（Ｃ４）前記（Ｃ３）で示される改変を行ったＦＡＤＧＤＨに、さらに１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、付加若しくは挿入による改変を行う。
【請求項３】
請求項１の（Ａ１）から（Ａ４）のいずれか、または、請求項２の（Ｃ１）から（Ｃ４）のいずれかに示す改変が施されたタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された形質転換体を培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を採取する工程を含む、ＦＡＤＧＤＨを生産する方法。
【請求項４】
以下の（Ａ１）から（Ａ４）のいずれかに記載のＦＡＤＧＤＨ（ただし、（Ａ３）におけるＲ１０２Ｈ、Ｒ１０２Ｖを除く）。（Ａ１）配列番号２に記載のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列において、下記（ａ）に示されるアミノ酸置換のいずれかが行われているＦＡＤＧＤＨ：（ａ）Ｇ５９Ａ、Ｇ５９Ｃ、Ｇ５９Ｄ、Ｇ５９Ｆ、Ｇ５９Ｈ、Ｇ５９Ｋ、Ｇ５９Ｌ、Ｇ５９Ｍ、Ｇ５９Ｎ、Ｇ５９Ｐ、Ｇ５９Ｑ、Ｇ５９Ｓ、Ｇ５９Ｔ、Ｇ５９Ｗ、Ｇ５９Ｙ、Ｒ８２Ａ、Ｒ８２Ｃ、Ｒ８２Ｈ、Ｒ８２Ｋ、Ｒ８２Ｑ、Ｒ８２Ｖ、Ｒ８２Ｙ、Ｖ１０８Ａ、Ｖ１０８Ｄ、Ｖ１０８Ｅ、Ｖ１０８Ｆ、Ｖ１０８Ｈ、Ｖ１０８Ｌ、Ｖ１０８Ｍ、Ｖ１０８Ｑ、Ｖ１０８Ｒ、Ｖ１０８Ｓ、Ｖ１０８Ｔ、Ｆ５０５Ｄ、Ｆ５０５Ｌ、Ｆ５０５Ｍ、Ｆ５０５Ｎ、Ｆ５０５Ｑ、Ｆ５０５Ｒ、Ｆ５０５Ｙ；（Ａ２）前記（Ａ１）で示されるＦＡＤＧＤＨに、さらに１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、付加若しくは挿入による改変を行ったＦＡＤＧＤＨであり、かつ、以下の［１］から［３］に示す計算方法により算出される温度依存性値が１．０を超えるＦＡＤＧＤＨ。［１］改変前のＦＡＤＧＤＨの２５℃における活性値を３７℃における活性値で割った値を算出する。［２］改変体において［１］と同様に活性値を測定し［１］と同様の計算を行った値を算出する。［３］［２］で得られた値を［１］で得られた値で割り、［１］で得られた値を１としたときの［２］で得られた値の相対値を算出する。（Ａ３）配列番号３に記載のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列において、下記（ｂ）に示されるアミノ酸置換のいずれかが行われているＦＡＤＧＤＨ：（ｂ）Ｇ７９Ａ、Ｇ７９Ｃ、Ｇ７９Ｄ、Ｇ７９Ｆ、Ｇ７９Ｈ、Ｇ７９Ｋ、Ｇ７９Ｌ、Ｇ７９Ｍ、Ｇ７９Ｎ、Ｇ７９Ｐ、Ｇ７９Ｑ、Ｇ７９Ｓ、Ｇ７９Ｔ、Ｇ７９Ｗ、Ｇ７９Ｙ、Ｒ１０２Ａ、Ｒ１０２Ｃ、Ｒ１０２Ｈ、Ｒ１０２Ｋ、Ｒ１０２Ｑ、Ｒ１０２Ｖ、Ｒ１０２Ｙ、Ａ１２８Ｄ、Ａ１２８Ｅ、Ａ１２８Ｆ、Ａ１２８Ｈ、Ａ１２８Ｌ、Ａ１２８Ｍ、Ａ１２８Ｑ、Ａ１２８Ｒ、Ａ１２８Ｓ、Ａ１２８Ｔ、Ｆ５２５Ｄ、Ｆ５２５Ｌ、Ｆ５２５Ｍ、Ｆ５２５Ｎ、Ｆ５２５Ｑ、Ｆ５２５Ｒ、Ｆ５２５Ｙ；（Ａ４）前記（Ａ３）で示されるＦＡＤＧＤＨに、さらに１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、付加若しくは挿入による改変を行ったＦＡＤＧＤＨであり、かつ、前記温度依存性値が１．０を超えるＦＡＤＧＤＨ。
【請求項５】
以下の（Ｃ１）から（Ｃ４）のいずれかに記載のＦＡＤＧＤＨ（ただし、（Ｃ３）におけるＲ１０２Ｈを除く）。（Ｃ１）配列番号２に記載のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列において、下記（ｅ）に示されるアミノ酸置換のいずれかが行われているＦＡＤＧＤＨ：（ｅ）Ｇ５９Ｃ、Ｇ５９Ｄ、Ｇ５９Ｋ、Ｇ５９Ｍ、Ｇ５９Ｑ、Ｇ５９Ｓ、Ｇ５９Ｔ、Ｒ８２Ｈ、Ｒ８２Ｑ、Ｖ１０８Ｍ、Ｖ１０８Ｔ、Ｆ５０５Ｙ；（Ｃ２）前記（Ｃ１）で示されるＦＡＤＧＤＨに、さらに１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、付加若しくは挿入による改変を行ったＦＡＤＧＤＨであり、以下の［１］から［３］に示す計算方法により算出される温度依存性値が１．０以上を超え、かつ、キシロース作用性が野生型より低下したＦＡＤＧＤＨ。［１］改変前のＦＡＤＧＤＨの２５℃における活性値を３７℃における活性値で割った値を算出する。［２］改変体において［１］と同様に活性値を測定し［１］と同様の計算を行った値を算出する。［３］［２］で得られた値を［１］で得られた値で割り、［１］で得られた値を１としたときの［２］で得られた値の相対値を算出する。（Ｃ３）配列番号３に記載のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列において、下記（ｆ）に示されるアミノ酸置換のいずれかが行われているＦＡＤＧＤＨ：（ｆ）Ｇ７９Ｃ、Ｇ７９Ｄ、Ｇ７９Ｋ、Ｇ７９Ｍ、Ｇ７９Ｑ、Ｇ７９Ｓ、Ｇ７９Ｔ、Ｒ１０２Ｈ、Ｒ１０２Ｑ、Ａ１２８Ｍ、Ａ１２８Ｔ、Ｆ５２５Ｙ；（Ｃ４）前記（Ｃ３）で示されるＦＡＤＧＤＨに、さらに１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、付加若しくは挿入による改変を行ったＦＡＤＧＤＨであり、前記温度依存性値が１．０以上を超え、かつ、キシロース作用性が野生型より低下したＦＡＤＧＤＨ。
【請求項６】
請求項４または５に記載のタンパク質を含むグルコースアッセイキット。
【請求項７】
請求項４または５に記載のタンパク質を含むグルコースセンサー。
【請求項８】
請求項４または５に記載のタンパク質の使用を含むグルコース測定法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＦＡＤＧＤＨとも表す。）の温度依存性を改善し、且つ、基質特異性を向上する方法に関するものであって、該改変型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子、該改変型ＦＡＤＧＤＨの製造法及び該改変型ＦＡＤＧＤＨのグルコース測定試薬への種々の適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、糖尿病の発生率は年々増加傾向にあり、更に糖尿病予備軍といわれる人数を合わせると、日本国内だけでも１０００万人以上の数になると推測されている。また、生活習慣病への関心が非常に高まっていることもあり、血糖値を自己管理する機会は増加している。こうした時代背景において、血糖自己測定モニターのための技術開発は、糖尿病患者が日常の血糖値を管理するための重要な技術である。血糖測定技術に関しては、多くの方法で実用化が進んでおり、検体の微量化、測定時間の短縮、装置の小型化の点で電気化学的なセンシングが有利である。
【０００３】
血糖測定技術におけるセンシングの手法としては血液中のグルコースを基質とする酵素が利用される。そのような酵素の例としてはグルコースオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．４）が挙げられる。グルコースオキシダーゼはグルコースに対する特異性や熱に対する安定性が高いという利点があった。グルコースオキシダーゼを利用した血糖センサーはグルコースを酸化してＤ−グルコノ−δ−ラクトンに変換する過程で生じる電子がメディエーターを介して電極に流れることで測定されるが、グルコースオキシダーゼは反応で生じたプロトンを溶存酸素に渡しやすいため測定値に影響してしまうという問題があった。
【０００４】
このような問題を回避するために、ピロロキノリンキノン依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＰＱＱＧＤＨとも表す。）（ＥＣ１．１．５．２（旧ＥＣ１．１．９９．１７））が血糖センサー用酵素として用いられている。ＰＱＱＧＤＨは溶存酸素の影響を受けない点で優位であるが、基質特異性に乏しく、マルトースやラクトースといったグルコース以外の糖類にも作用するため測定値の正確性を損ねてしまうという欠点がある。
【０００５】
そこで、溶存酸素の影響を受けず、なおかつ基質特異性に優れたグルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＧＤＨとも表す。）としてフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼをＦＡＤＧＤＨと記載する。）が注目されている。ＦＡＤＧＤＨは非特許文献１〜６に記載されており、古くから知られている。
また、特許文献１にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ（アスペルギルス・テレウス）由来ＦＡＤＧＤＨの遺伝子配列、アミノ酸配列が記載されている。
また、特許文献２にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来ＦＡＤＧＤＨが、特許文献３にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来ＦＡＤＧＤＨを改変し、熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨが記載されている。特許文献４にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来ＦＡＤＧＤＨおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨを改変し、熱安定性およびキシロース作用性を改善した改変型ＦＡＤＧＤＨが記載されている。
【０００６】
一方、非特許文献７は、ＳＭＢＧ（血糖自己測定（Ｓｅｌｆ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｂｌｏｏｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅ））装置の注意点として、環境温度条件が低温度域及び高温度域である場合に、測定値がＩＳＯ１５１９７の許容範囲から外れる装置も多く、測定値が極端に低値や高値を示す場合は医療事故の要因になりうることを指摘している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０５８９５８
【特許文献２】特開２００７−２８９１４８
【特許文献３】特開２００８−２３７２１０
【特許文献４】ＷＯ２００８／０５９７７７
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９６７  Ｊｕｌ  １１；１３９（２）：２６５−７６
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９６７  Ｊｕｌ  １１；１３９（２）：２７７−９３
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１４６（２）：３１７−２７
【非特許文献４】Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１４６（２）：３２８−３５
【非特許文献５】Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  （１９６７）２４２：３６６５−３６７２
【非特許文献６】Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  （１９９６）５６：３０１−３１０
【非特許文献７】機器・試薬  ３２（６）,２００９：７０７−７１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、上述のような公知の血糖センサー用酵素と比較して、さらに実用面において有利な血糖値測定用試薬に使用可能な酵素を提供することである。
【００１０】
本発明者らは、血中のグルコース濃度が測定される環境温度の変化によって測定値のばらつきや異常に焦点をあてて考察したところ、以下のような問題点が存在する可能性を見出した。
【００１１】
開発の段階では、酵素反応条件は、特定の温度（たとえば３７℃）での検討が中心になる。これに対し、実際に糖尿病患者がグルコースセンサーを用いてグルコースの測定を行う温度は、室温で行われる。温度変化によって酵素の反応性に変動が生じれば、測定値にばらつきが生じる。
グルコースセンサーによっては、このような温度による反応性変動を見込んで、補正機能が組み込まれているものもあるが、その機能は完全なものではない。
公知のＦＡＤＧＤＨにはキシロースに対して作用するものがある。キシロースは、糖質の消化吸収試験に使用される単糖である。そのためキシロース吸収試験を実施している患者が血糖センサーを使用した場合、血中のグルコースだけではなくキシロースにも反応するため、測定値が本来のグルコース濃度よりも高値を示すことが問題となる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記の考察を基に、特許文献２又は特許文献３に開示された公知のＦＡＤＧＤＨの温度依存性を検討した。その結果、特許文献３に開示されたＦＡＤＧＤＨでは、３７℃における活性値を１００％とした場合に、２５℃における活性値が６３％、５℃における活性値が４０％であることが判明した。即ち、このＦＡＤＧＤＨはグルコース濃度を測定する際の環境温度によっては、測定精度が低下することがわかった。即ち、３７℃における活性値と２５℃における活性値との間では、３７％活性が低下する。このような活性の変動は、そのような酵素を用いてグルコース濃度を正確に測定することを妨げる要因となる。例えば、グルコースセンサーによっては、一定時間内にＧＤＨによって触媒される脱水素反応による生成物の量に基づいて、グルコース濃度が推定される為である。
本願発明において「温度依存性値」とは、改変前のＦＡＤＧＤＨの２５℃における活性値を３７℃における活性値で割った値を１としたときに、各改変体において同様に活性値を測定し同様の計算を行った値を、さらに改変前のＦＡＤＧＤＨの値で割ったものである。
温度依存性値が１．１であれば、計算上、３７℃と２５℃の間での差が約３０％となり、２５℃と３０℃での差は１２〜１３％程度に縮まると推定される。これをデータのばらつきの最大値と最小値の差と考えると、プラスマイナス６〜７％程度に収まることになり好ましい。
さらに、温度依存性が１．２であれば、３７℃と２５℃の間での差が２４％程度となり、２５℃と３０℃での差は１０％程度に縮まると推定される。これをデータのばらつきの最大値と最小値の差と考えると、プラスマイナス５％程度に収まることになり、より好ましい。
【００１３】
この環境温度による反応性の変動を小さくすることができれば、測定精度や正確性を向上することが期待できる。本願においては、この至適温度の山をなだらかにすることを温度依存性の改善と表現する。
【００１４】
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、公知のＦＡＤＧＤＨの特定のアミノ酸を他のアミノ酸に置換することで、改変前の野生型ＦＡＤＧＤＨよりも温度依存性が改善した改変型ＦＡＤＧＤＨを見出し、それを用いてグルコース測定系を組むことで、本発明を完成させた。
また、本発明者らは、特許文献１に記載のＦＡＤＧＤＨのキシロース作用性を検討し（特許文献４参照）、該ＦＡＤＧＤＨのキシロース作用性は、グルコースに対する反応性を１００％とした場合、１０％程度反応することを見出した。即ち、このＦＡＤＧＤＨを使用したグルコース濃度を測定した場合、測定値の正確性を損ねてしまうという欠点があることが判明した。
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、公知のＦＡＤＧＤＨの特定のアミノ酸を他のアミノ酸に置換することで、改変前のＦＡＤＧＤＨよりも温度依存性が改善し、且つ、キシロース作用性も低減する改変型ＦＡＤＧＤＨを見出し、本発明を完成させた。
【００１５】
以下に、代表的な本発明を例示する。
項１．
以下の（Ａ１）または（Ａ２）のタンパク質。
（Ａ１）配列番号２に記載のＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）のアミノ酸配列において、下記（ａ）に示されるアミノ酸置換のいずれかを含むアミノ酸配列を含むタンパク質：
（ａ）Ｇ５９Ａ、Ｇ５９Ｃ、Ｇ５９Ｄ、Ｇ５９Ｆ、Ｇ５９Ｈ、Ｇ５９Ｋ、Ｇ５９Ｌ、Ｇ５９Ｍ、Ｇ５９Ｎ、Ｇ５９Ｐ、Ｇ５９Ｑ、Ｇ５９Ｓ、Ｇ５９Ｔ、Ｇ５９Ｗ、Ｇ５９Ｙ、Ｒ８２Ａ、Ｒ８２Ｃ、Ｒ８２Ｈ、Ｒ８２Ｋ、Ｒ８２Ｑ、Ｒ８２Ｖ、Ｒ８２Ｙ、Ｖ１０８Ａ、Ｖ１０８Ｄ、Ｖ１０８Ｅ、Ｖ１０８Ｆ、Ｖ１０８Ｈ，Ｖ１０８Ｌ、Ｖ１０８Ｍ、Ｖ１０８Ｑ、Ｖ１０８Ｒ、Ｖ１０８Ｓ、Ｖ１０８Ｔ、Ｆ５０５Ｄ、Ｆ５０５Ｌ、Ｆ５０５Ｍ、Ｆ５０５Ｎ、Ｆ５０５Ｑ、Ｆ５０５Ｒ、Ｆ５０５Ｙ；
（Ａ２）以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）を満たすタンパク質；
（ｉ）  配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列において下記（ｂ）のアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む、
（ｂ）５９Ａ、５９Ｃ、５９Ｄ、５９Ｆ、５９Ｈ、５９Ｋ、５９Ｌ、５９Ｍ、５９Ｎ、５９Ｐ、５９Ｑ、５９Ｓ、５９Ｔ、５９Ｗ、５９Ｙ、８２Ａ、８２Ｃ、８２Ｈ、８２Ｋ、８２Ｑ、８２Ｖ、８２Ｙ、１０８Ａ、１０８Ｄ、１０８Ｅ、１０８Ｆ、１０８Ｈ，１０８Ｌ、１０８Ｍ、１０８Ｑ、１０８Ｒ、１０８Ｓ、１０８Ｔ、５０５Ｄ、５０５Ｌ、５０５Ｍ、５０５Ｎ、５０５Ｑ、５０５Ｒ、５０５Ｙ
（ｉｉ）  グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する、
（ｉｉｉ）  配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質よりも改善された温度依存性を有する。
項２．
以下の（Ｂ１）または（Ｂ２）のタンパク質。
（Ｂ１）配列番号２に記載のＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）のアミノ酸配列において、下記（ｃ）に示されるアミノ酸置換のいずれかを含むアミノ酸配列を含むタンパク質：
（ｃ）Ｇ５９Ｃ，Ｇ５９Ｄ、Ｇ５９Ｋ、Ｇ５９Ｍ、Ｇ５９Ｑ、Ｇ５９Ｓ、Ｇ５９Ｔ、Ｒ８２Ｈ、Ｒ８２Ｑ、Ｖ１０８Ｍ、Ｖ１０８Ｔ、Ｆ５０５Ｙ；
（Ｂ２）以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）を満たすタンパク質；
（ｉ）  配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列において下記（ｄ）のアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む、
（ｄ）５９Ｃ、５９Ｄ、５９Ｋ、５９Ｍ、５９Ｑ、５９Ｓ、５９Ｔ、８２Ｈ、８２Ｑ、１０８Ｍ、１０８Ｔ、５０５Ｙ
（ｉｉ）  グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する、
（ｉｉｉ）  配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質よりも低下したキシロース作用性を有する。
項３．
以下の（Ｃ１）または（Ｃ２）のタンパク質。
（Ｃ１）配列番号２に記載のＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）のアミノ酸配列において、下記（ｅ）に示されるアミノ酸置換のいずれかを含むアミノ酸配列を含むタンパク質：
（ｅ）Ｇ５９Ｃ、Ｇ５９Ｄ、Ｇ５９Ｋ、Ｇ５９Ｍ、Ｇ５９Ｑ、Ｇ５９Ｓ、Ｇ５９Ｔ、Ｒ８２Ｈ、Ｒ８２Ｑ、Ｖ１０８Ｍ、Ｖ１０８Ｔ、Ｆ５０５Ｙ；
（Ｃ２）以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）を満たすタンパク質；
（ｉ）  配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列において下記（ｆ）のアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む、
（ｆ）５９Ｃ、５９Ｄ、５９Ｋ、５９Ｍ、５９Ｑ、５９Ｓ、５９Ｔ、８２Ｈ、８２Ｑ、１０８Ｍ、１０８Ｔ、５０５Ｙ
（ｉｉ）  グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する、
（ｉｉｉ）  配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質よりも改善された温度依存性を有し、かつ、低下したキシロース作用性を有する。
項４．
項１〜３のいずれかに記載のタンパク質をコードする遺伝子。
項５．
項４に記載の遺伝子を含むベクター。
項６．
項５に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
項７．
項６に記載の形質転換体を培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を採取することを特徴とするグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を生産する方法。
項８．
項１〜３のいずれかに記載のタンパク質を含むグルコースアッセイキット。
項９．
項１〜３のいずれかに記載のタンパク質を含むグルコースセンサー。
項１０．
項１〜３のいずれかに記載のタンパク質を含むグルコース測定法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のタンパク質は、温度依存性に優れたグルコースデヒドロゲナーゼである。即ち、本発明のタンパク質は、使用環境の温度変化による活性への影響が低減されたグルコースデヒドロゲナーゼである。よって、本発明のタンパク質を用いることにより、使用環境の温度変化に左右されることなく、より正確に試料中のグルコース濃度を測定することが可能である。本発明のタンパク質は、使用環境の温度変化による酵素活性への影響が低減されているため、例えば、通常の室温よりも低い温度下又は高い温度下であってもより正確に試料中のグルコース濃度を測定することを可能にする。従って、本発明のタンパク質は、血中のグルコース濃度を測定するための臨床検査薬用酵素として有用である。
本発明のタンパク質は、温度依存性だけでなく、キシロースに対する作用性も低減されている。よって、基質特異性という観点からも本発明のタンパク質は血中のグルコース濃度測定に優れている。
本発明の方法により、上記のような優れた特性を有する新規なタンパク質を効率的に製造することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、温度の変化による、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むＦＡＤＧＤＨの活性の変化を示す。
【図２】図２は、アスペルギルス・オリゼ由来の野生型ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列（配列番号１）と、アスペルギルス・テレウス由来の野生型ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列（配列番号３）を比較した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本明細書において、アミノ酸配列を構成するアミノ酸はアルファベット１文字又は３文字で表記される。例えば、グリシンは、Ｇｌｙ又はＧと表記される。アミノ酸配列上のアミノ酸の位置は、番号を用いて特定される。例えば、５９番目のグリシンがアラニンに置換されている場合は、「Ｇ５９Ａ」と表記する。また、「５９Ａ」は、変異の有無を問わず、５９位（又は５９番目）のアミノ酸がＡｌａ（Ａ）であることを示す。配列番号１、配列番号２、配列番号３において、アミノ酸の表記は、メチオニンを１として番号付けされている。
【００１９】
本明細書において、配列番号１は、野生型のアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列を示す。配列番号２は、配列番号１のアミノ酸配列における１６３位のグリシンがアルギニン置換され、５５１位バリンがシステインに置換されたアミノ酸配列を示す。配列番号２で示されるアミノ酸配列から成るタンパク質は、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を保持している。以下、配列番号２で示されるアミノ酸配列から成るタンパク質を適宜配列番号２のＦＡＤＧＤＨと表記する。配列番号１及び２のアミノ酸配列は、例えば、特許文献２又は特許文献３に開示されている。
【００２０】
温度依存性が改善した改変型ＦＡＤＧＤＨ
本願発明の一実施形態は、以下に記載されるタンパク質である。
配列番号１または配列番号２に記載のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列において、５９位、８２位、１０８位、５０５位のうちいずれか、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換を有する、改変前よりも温度依存性が改善した改変型ＦＡＤＧＤＨ。
【００２１】
具体的には、以下の（Ａ１）または（Ａ２）のタンパク質が例示される。
（Ａ１）配列番号２に記載のＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）のアミノ酸配列において、下記（ａ）に示されるアミノ酸置換のいずれかを含むアミノ酸配列を含むタンパク質：
（ａ）Ｇ５９Ａ、Ｇ５９Ｃ、Ｇ５９Ｄ、Ｇ５９Ｆ、Ｇ５９Ｈ、Ｇ５９Ｋ、Ｇ５９Ｌ、Ｇ５９Ｍ、Ｇ５９Ｎ、Ｇ５９Ｐ、Ｇ５９Ｑ、Ｇ５９Ｓ、Ｇ５９Ｔ、Ｇ５９Ｗ、Ｇ５９Ｙ、Ｒ８２Ａ、Ｒ８２Ｃ、Ｒ８２Ｈ、Ｒ８２Ｋ、Ｒ８２Ｑ、Ｒ８２Ｖ、Ｒ８２Ｙ、Ｖ１０８Ａ、Ｖ１０８Ｄ、Ｖ１０８Ｅ、Ｖ１０８Ｆ、Ｖ１０８Ｈ，Ｖ１０８Ｌ、Ｖ１０８Ｍ、Ｖ１０８Ｑ、Ｖ１０８Ｒ、Ｖ１０８Ｓ、Ｖ１０８Ｔ、Ｆ５０５Ｄ、Ｆ５０５Ｌ、Ｆ５０５Ｍ、Ｆ５０５Ｎ、Ｆ５０５Ｑ、Ｆ５０５Ｒ、Ｆ５０５Ｙ；
（Ａ２）以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）を満たすタンパク質；
（ｉ）  配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列において下記（ｂ）のアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む、
（ｂ）５９Ａ、５９Ｃ、５９Ｄ、５９Ｆ、５９Ｈ、５９Ｋ、５９Ｌ、５９Ｍ、５９Ｎ、５９Ｐ、５９Ｑ、５９Ｓ、５９Ｔ、５９Ｗ、５９Ｙ、８２Ａ、８２Ｃ、８２Ｈ、８２Ｋ、８２Ｑ、８２Ｖ、８２Ｙ、１０８Ａ、１０８Ｄ、１０８Ｅ、１０８Ｆ、１０８Ｈ，１０８Ｌ、１０８Ｍ、１０８Ｑ、１０８Ｒ、１０８Ｓ、１０８Ｔ、５０５Ｄ、５０５Ｌ、５０５Ｍ、５０５Ｎ、５０５Ｑ、５０５Ｒ、５０５Ｙ
（ｉｉ）  グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する、
（ｉｉｉ）  配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質よりも改善された温度依存性を有する。
【００２２】
キシロース作用性が低下した改変型ＦＡＤＧＤＨ
配列番号１または配列番号２に記載のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列において、５９位、８２位、１０８位、５０５位のうちいずれか、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換を有する、改変前よりもキシロース作用性が低下した改変型ＦＡＤＧＤＨもまた
、本願発明の一実施形態である。
【００２３】
具体的には、以下の（Ｂ１）または（Ｂ２）のタンパク質が例示される。
（Ｂ１）配列番号２に記載のＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）のアミノ酸配列において、下記（ｃ）に示されるアミノ酸置換のいずれかを含むアミノ酸配列を含むタンパク質：
（ｃ）Ｇ５９Ｃ，Ｇ５９Ｄ、Ｇ５９Ｋ、Ｇ５９Ｍ、Ｇ５９Ｑ、Ｇ５９Ｓ、Ｇ５９Ｔ、Ｒ８２Ｈ、Ｒ８２Ｑ、Ｖ１０８Ｍ、Ｖ１０８Ｔ、Ｆ５０５Ｙ；
（Ｂ２）以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）を満たすタンパク質；
（ｉ）  配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列において下記（ｄ）のアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む、
（ｄ）５９Ｃ、５９Ｄ、５９Ｋ、５９Ｍ、５９Ｑ、５９Ｓ、５９Ｔ、８２Ｈ、８２Ｑ、１０８Ｍ、１０８Ｔ、５０５Ｙ
（ｉｉ）  グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する、
（ｉｉｉ）  配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質よりも低下したキシロース作用性を有する。
【００２４】
温度依存性が改善し、且つ、キシロース作用性が低下した改変型ＦＡＤＧＤＨ
配列番号１または配列番号２に記載のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列において、５９位、８２位、１０８位、５０５位のうちいずれか、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換を有する、改変前よりも温度依存性が改善し、且つ、キシロース作用性が低下した改変型ＦＡＤＧＤＨもまた、本願発明の一実施形態である。
【００２５】
具体的には、以下の（Ｃ１）または（Ｃ２）のタンパク質が例示される。
（Ｃ１）配列番号２に記載のＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）のアミノ酸配列において、下記（ｅ）に示されるアミノ酸置換のいずれかを含むアミノ酸配列を含むタンパク質：
（ｅ）Ｇ５９Ｃ、Ｇ５９Ｄ、Ｇ５９Ｋ、Ｇ５９Ｍ、Ｇ５９Ｑ、Ｇ５９Ｓ、Ｇ５９Ｔ、Ｒ８２Ｈ、Ｒ８２Ｑ、Ｖ１０８Ｍ、Ｖ１０８Ｔ、Ｆ５０５Ｙ；
（Ｃ２）以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）を満たすタンパク質；
（ｉ）  配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列において下記（ｆ）のアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む、
（ｆ）５９Ｃ、５９Ｄ、５９Ｋ、５９Ｍ、５９Ｑ、５９Ｓ、５９Ｔ、８２Ｈ、８２Ｑ、１０８Ｍ、１０８Ｔ、５０５Ｙ
（ｉｉ）  グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する、
（ｉｉｉ）  配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質よりも改善された温度依存性を有し、かつ、低下したキシロース作用性を有する。
【００２６】
温度依存性
本願において、温度依存性とは、タンパク質が存在する環境の温度変化に伴って、そのタンパク質が有するグルコースデヒドロゲナーゼ活性が変動する性質を意味する。温度依存性が改善されているとは、環境温度の変化に伴う酵素活性の変化が小さく、幅広い温度条件下で、より一定の酵素活性を保持することを意味する。
温度依存性が改善されているかどうかは、配列番号２で示されるアミノ酸配列から成るＦＡＤＧＤＨの温度依存性を基準に判断され、具体的には以下の（１）〜（５）に従って判断される。
（１）３７℃、２４時間処理後における活性値（Ｕ／ｍｌ）を測定し、これをＡとする。（２）２５℃、２４時間処理後における活性値（Ｕ／ｍｌ）を測定し、これをＢとする。（３）Ａを１００％としたときのＢの相対値（％）を計算し、これをＣとする。
（４）配列番号２のＦＡＤＧＤＨのＣの値を１とし、（Ａ１）タンパク質等の改変型タンパク質のＣの相対値を求める。これをＤとする。（Ｄを、温度依存性比、ともよぶ。）
（５）下記の実施例１に示されるように配列番号２のＦＡＤＧＤＨの２５℃における酵素活性は、３７℃における酵素活性を１００％とすると、６３％である。よって、改変型のタンパク質のＣの値が、６３％よりも大きい場合、Ｄの値は１よりも大きいことになる。即ち、改変型ＦＡＤＧＤＨのＤの値は、１を起点として１．５９に近づく程、温度依存性が低く、改善されていることになる。
本発明のタンパク質は、改善された温度依存性を有するため、少なくとも１よりも大きいＤの値を有する。好ましくは、Ｄの値は、１．０２以上であり、より好ましくは、１．０５以上、更に好ましくは、１．１以上、更に好ましくは、１．１５以上、更に好ましくは１．２以上、更に好ましくは１．２５以上、更に好ましくは１．３以上である。
【００２７】
（Ａ１）タンパク質のアミノ酸配列に含まれるアミノ酸置換は、上記（ａ）として列挙される置換のいずれであってもよい。
温度依存性の改善という観点から好ましいアミノ酸置換は、Ｇ５９Ａ、Ｇ５９Ｃ、Ｇ５９Ｄ、Ｇ５９Ｆ、Ｇ５９Ｈ、Ｇ５９Ｋ、Ｇ５９Ｌ、Ｇ５９Ｍ、Ｇ５９Ｎ、Ｇ５９Ｐ、Ｇ５９Ｑ、Ｇ５９Ｓ、Ｇ５９Ｔ、Ｇ５９Ｗ、Ｇ５９Ｙ、Ｒ８２Ａ、Ｒ８２Ｃ、Ｒ８２Ｈ、Ｒ８２Ｋ、Ｒ８２Ｑ、Ｒ８２Ｖ、Ｒ８２Ｙ、Ｖ１０８Ａ、Ｖ１０８Ｆ、Ｖ１０８Ｈ，Ｖ１０８Ｍ、Ｖ１０８Ｑ、Ｖ１０８Ｒ、Ｖ１０８Ｓ、Ｖ１０８Ｔ、Ｆ５０５Ｄ、Ｆ５０５Ｌ、Ｆ５０５Ｍ、Ｆ５０５Ｎ、Ｆ５０５Ｑ、Ｆ５０５Ｒ、及びＦ５０５Ｙのいずれかである。これらのアミノ酸置換を有する改変型ＦＡＤＧＤＨは、１．０２以上のＤの値を有する。
より好ましいアミノ酸置換は、Ｇ５９Ａ、Ｇ５９Ｃ、Ｇ５９Ｆ、Ｇ５９Ｈ、Ｇ５９Ｋ、Ｇ５９Ｌ、Ｇ５９Ｍ、Ｇ５９Ｎ、Ｇ５９Ｐ、Ｇ５９Ｑ、Ｇ５９Ｓ、Ｇ５９Ｔ、Ｇ５９Ｗ、Ｇ５９Ｙ、Ｒ８２Ａ、Ｒ８２Ｃ、Ｒ８２Ｈ、Ｒ８２Ｋ、Ｒ８２Ｑ、Ｒ８２Ｖ、Ｒ８２Ｙ、Ｖ１０８Ｒ、Ｆ５０５Ｌ、Ｆ５０５Ｑ、Ｆ５０５Ｒ、及びＦ５０５Ｙのいずれかである。これらのアミノ酸置換を有する改変型ＦＡＤＧＤＨは、１．０５以上のＤの値を有する。
より好ましいアミノ酸置換は、Ｇ５９Ｃ、Ｇ５９Ｆ、Ｇ５９Ｈ、Ｇ５９Ｋ、Ｇ５９Ｌ、Ｇ５９Ｍ、Ｇ５９Ｎ、Ｇ５９Ｑ、Ｇ５９Ｔ、Ｇ５９Ｗ、Ｇ５９Ｙ、Ｒ８２Ｃ、Ｒ８２Ｈ、Ｒ８２Ｑ、Ｒ８２Ｖ、Ｒ８２Ｙ、Ｆ５０５Ｑ、及びＦ５０５Ｒのいずれかである。これらのアミノ酸置換を有する改変型ＦＡＤＧＤＨは、１．１以上のＤの値を有する。
更に好ましいアミノ酸置換は、Ｇ５９Ｃ、Ｇ５９Ｆ、Ｇ５９Ｌ、Ｇ５９Ｍ、Ｇ５９Ｔ、Ｇ５９Ｙ、Ｒ８２Ｈ、Ｒ８２Ｙ、Ｆ５０５Ｑ及びＦ５０５Ｒのいずれかである。これらのアミノ酸置換を有する改変型ＦＡＤＧＤＨは、１．１５以上のＤの値を有する。
更に好ましいアミノ酸置換は、Ｇ５９Ｆ、Ｇ５９Ｍ、Ｇ５９Ｔ、Ｇ５９Ｙ及びＲ８２Ｙである。このアミノ酸置換を有する改変型ＦＡＤＧＤＨは、１．２以上のＤの値を有する。
上記に例示した特定のアミノ酸は、（Ａ１）タンパク質が有する温度依存性が改善されている限り、アミノ酸配列における異なる位置に複数存在してもよい。
【００２８】
キシロース作用性
一方、温度依存性の改善と併せて、キシロースに対する作用性が低減されている。
本発明において、キシロース作用性とは、グルコースを基質とした場合の反応速度とキシロースを基質とした場合の反応速度の相対比％（グルコースを１００％とする。）で表される。配列番号２に示されるアミノ酸配列から成るＦＡＤＧＤＨのキシロ−ス作用性の値を１とし、それぞれの改変型酵素の相対比％を計算する。よって、この値が小さいほど、キシロース作用性が低下していると判断される。
【００２９】
本願発明の改変型ＦＡＤＧＤＨは、好ましくは、キシロース作用性比が改変前と比べて０．９以下に低減している改変型ＦＡＤＧＤＨである。さらに好ましくは、改変前と比べて０．８以下に低減している改変型ＦＡＤＧＤＨである。
【００３０】
温度依存性およびキシロース作用性の測定方法は、後述のＦＡＤＧＤＨの活性測定法を用いて求める。
【００３１】
（Ｂ１）タンパク質のアミノ酸配列に含まれるアミノ酸置換は、上記（ｃ）として列挙される置換のいずれであってもよい。
キシロースに対する作用性が低減されているという観点から好ましいアミノ酸の置換は、Ｇ５９Ｃ，Ｇ５９Ｄ、Ｇ５９Ｋ、Ｇ５９Ｍ、Ｇ５９Ｑ、Ｇ５９Ｓ、Ｇ５９Ｔ、Ｒ８２Ｈ、Ｒ８２Ｑ、Ｖ１０８Ｍ、Ｖ１０８Ｔ、Ｆ５０５Ｙから成る群から選択されるいずれかである。これらのアミノ酸置換を有する改変型ＦＡＤＧＤＨは、キシロース作用性比が改変前と比べて０．９７以下である。
より好ましいアミノ酸置換は、Ｇ５９Ｍ、Ｇ５９Ｑ、Ｒ８２Ｈ、Ｒ８２Ｑ、Ｆ５０５Ｙのいずれかである。これらのアミノ酸置換を有する改変型ＦＡＤＧＤＨは、キシロース作用性比が改変前と比べて０．９以下である。
より好ましいアミノ酸置換は、Ｇ５９Ｍである。これらのアミノ酸置換を有する改変型ＦＡＤＧＤＨは、キシロース作用性比が改変前と比べて０．８以下である。
上記に例示した特定のアミノ酸は、（Ｂ１）タンパク質のキシロースに対する作用性が低減されている限り、アミノ酸配列における異なる位置に複数存在してもよい。
【００３２】
（Ｃ１）タンパク質のアミノ酸配列に含まれるアミノ酸置換は、上記（ｅ）として列挙される置換のいずれであってもよい。
上記に例示した特定のアミノ酸は、（Ｃ１）タンパク質が有する温度依存性が改善されており、かつ、（Ｃ１）タンパク質のキシロースに対する作用性が低減されている限り、アミノ酸配列における異なる位置に複数存在してもよい。
【００３３】
上記（Ａ１）（Ｂ１）（Ｃ１）のアミノ酸置換は、置換されるアミノ酸の位置が異なる限り２つ又はそれ以上存在しても良く、いずれの組合せであっても良い。
【００３４】
（Ａ１）タンパク質は、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有し、温度依存性が改善されている限り、そのアミノ酸配列において更なる変異（アミノ酸の置換、付加、欠失、挿入）を有していてもよい。例えば、上記（ａ）より選択されるアミノ酸置換を異なる部位において２箇所以上有していてもよい。
また、配列番号２のアミノ酸配列において、１６３位のアルギニンがグリシンに置換され、５５１位のシステインがバリンに置換されたアミノ酸配列は野生型のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列（配列番号１）である。よって、（Ａ１）のタンパク質は、上記特定のアミノ酸置換に加え、１６３番目のアミノ酸がグリシンに置換され、５５１番目のアミノ酸がバリンに置換されていてもよい。
【００３５】
（Ａ２）タンパク質は、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の要件を満たす。
（ｉ）  配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の相同性を含むアミノ酸配列において下記（ｂ）に示されるアミノ酸置換のいずれかを含むアミノ酸配列を含む、
（ｂ）  ５９Ａ、５９Ｃ、５９Ｄ、５９Ｆ、５９Ｈ、５９Ｋ、５９Ｌ、５９Ｍ、５９Ｎ、５９Ｐ、５９Ｑ、５９Ｓ、５９Ｔ、５９Ｗ、５９Ｙ、８２Ａ、８２Ｃ、８２Ｈ、８２Ｋ、８２Ｑ、８２Ｖ、８２Ｙ、１０８Ａ、１０８Ｄ、１０８Ｅ、１０８Ｆ、１０８Ｈ，１０８Ｌ、１０８Ｍ、１０８Ｑ、１０８Ｒ、１０８Ｓ、１０８Ｔ、５０５Ｄ、５０５Ｌ、５０５Ｍ、５０５Ｎ、５０５Ｑ、５０５Ｒ、５０５Ｙ；
（ｉｉ）  グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する、
（ｉｉｉ）  配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質よりも改善された温度依存性を有する。
即ち、（Ａ２）タンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％のアミノ酸の相同性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、上記（ｂ）で示される少なくとも一つのアミノ酸を含む。更に、（Ａ２）タンパク質は、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を保持し、配列番号２のＦＡＤＧＤＨと比較して改善された温度依存性を有する。
【００３６】
（Ｂ２）タンパク質は、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の要件を満たす。
（ｉ）  配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列において下記（ｄ）のアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む、
（ｄ）  ５９Ｃ、５９Ｄ、５９Ｋ、５９Ｍ、５９Ｑ、５９Ｓ、５９Ｔ、８２Ｈ、８２Ｑ、１０８Ｍ、１０８Ｔ、５０５Ｙ
（ｉｉ）  グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する、
（ｉｉｉ）  配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質よりも低下したキシロース作用性を有する。
即ち、（Ｂ２）タンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％のアミノ酸の相同性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、上記（ｄ）で示される少なくとも一つのアミノ酸を含む。更に、（Ｂ２）タンパク質は、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を保持し、配列番号２のＦＡＤＧＤＨと比較して低下したキシロース作用性を有する。
【００３７】
（Ｃ２）タンパク質は、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の要件を満たす。
（ｉ）  配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列において下記（ｆ）のアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む、
（ｆ）  ５９Ｃ、５９Ｄ、５９Ｋ、５９Ｍ、５９Ｑ、５９Ｓ、５９Ｔ、８２Ｈ、８２Ｑ、１０８Ｍ、１０８Ｔ、５０５Ｙ
（ｉｉ）  グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する、
（ｉｉｉ）  配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質よりも改善された温度依存性を有し、かつ、低下したキシロース作用性を有する。
即ち、（Ｃ２）タンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％のアミノ酸の相同性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、上記（ｆ）で示される少なくとも一つのアミノ酸を含む。更に、（Ｃ２）タンパク質は、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を保持し、配列番号２のＦＡＤＧＤＨと比較して改善された温度依存性を有し、かつ、低下したキシロース作用性を有する。
【００３８】
配列番号２の少なくともいずれかと６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列としては、例えば配列番号３に示される、アスペルギルス・テレウス由来の野生型ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列が挙げられる。そのアミノ酸配列は、特許文献５に開示されている。
【００３９】
本願明細書において、アミノ酸配列の相同性とは、ＧＥＮＥＴＹＸソフトで比較した値を意味する。例えば、アスペルギルス・オリゼ由来の野生型ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列（配列番号１）と、アスペルギルス・テレウス由来の野生型ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列（配列番号３）を、ＧＥＮＥＴＹＸソフトにて比較分析したところ、６３．５％の相同性がある（図２参照）。また、配列番号２に示されるアミノ酸配列と配列番号３に示されるアミノ酸配列との相同性は、６３．４％である。
【００４０】
グルコースデヒドロゲナーゼ活性及び改善された温度依存性を保持した、配列番号２のアミノ酸配列と６０％の相同性を有するアミノ酸を含むタンパク質は、例えば、配列番号１又は２と配列番号３とについてアライメント作成し、保存性のある領域以外の領域について変異を加えることによって作製することが可能である。
【００４１】
アミノ酸配列に変異を加えても酵素活性及び温度依存性に影響を与えないと推測される領域としては、Ｘ線結晶構造からタンパク質表面に位置する領域があげられる。例えば、１位〜４０位、１１１位〜１９０位、２１３位〜３１０位、３４０位〜３９７位、４２０位〜４３５位、４５５位〜４９２位、５１４位〜５３８位、５５２位〜５７２位である。
【００４２】
（Ａ２）タンパク質、（Ｂ２）タンパク質および（Ｃ２）タンパク質がそれぞれ含むアミノ酸配列は、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の要件を満たす限り特に制限されないが、好ましくは配列番号２で示されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、より好ましくは８０％以上の相同性を有し、更に好ましくは９０％以上の相同性を有し、特に好ましくは９５％以上の相同性を有する。尚、本明細書におけるアミノ酸の相同性とは、アミノ酸の同一性を意味する。
【００４３】
上記（ｂ）に列挙される特定のアミノ酸のいずれかを有することにより、（Ａ２）タンパク質は、配列番号２のＦＡＤＧＤＨよりも優れた温度依存性を有する。上記（ｂ）に列挙される特定のアミノ酸の中でも、好ましいアミノ酸は、５９Ａ、５９Ｃ、５９Ｄ、５９Ｆ、５９Ｈ、５９Ｋ、５９Ｌ、５９Ｍ、５９Ｎ、５９Ｐ、５９Ｑ、５９Ｓ、５９Ｔ、５９Ｗ、５９Ｙ、８２Ａ、８２Ｃ、８２Ｈ、８２Ｋ、８２Ｑ、８２Ｖ、８２Ｙ、１０８Ａ、１０８Ｆ、１０８Ｈ、１０８Ｍ、１０８Ｑ、１０８Ｒ、１０８Ｓ、１０８Ｔ、５０５Ｄ、５０５Ｌ、５０５Ｍ、５０５Ｎ、５０５Ｑ、５０５Ｒ、及び５０５Ｙから成る群から選択されるいずれかである。
より好ましい特定のアミノ酸は、５９Ａ、５９Ｃ、５９Ｆ、５９Ｈ、５９Ｋ、５９Ｌ、５９Ｍ、５９Ｎ、５９Ｐ、５９Ｑ、５９Ｓ、５９Ｔ、５９Ｗ、５９Ｙ、８２Ａ、８２Ｃ、８２Ｈ、８２Ｋ、８２Ｑ、８２Ｖ、８２Ｙ、１０８Ｒ、５０５Ｌ、５０５Ｑ、５０５Ｒ及び５０５Ｙから成る群より選択されるいずれかである。
より好ましい特定のアミノ酸は、５９Ｃ、５９Ｆ、５９Ｈ、５９Ｋ、５９Ｌ、５９Ｍ、５９Ｎ、５９Ｑ、５９Ｔ、５９Ｗ、５９Ｙ、８２Ｃ、８２Ｈ、８２Ｑ、８２Ｖ、８２Ｙ、５０５Ｑ、及び５０５Ｒから成る群より選択されるいずれかである。
更に好ましい特定のアミノ酸は、５９Ｃ、５９Ｆ、５９Ｌ、５９Ｍ、５９Ｔ、５９Ｙ、８２Ｈ、８２Ｙ、５０５Ｑ及び５０５Ｒから成る群より選択されるいずれかである。
更に好ましい特定のアミノ酸は、５９Ｆ、５９Ｍ、５９Ｔ、５９Ｙ及び８２Ｙから成る群より選択されるいずれかである。
上記に例示した特定のアミノ酸は、（Ａ２）タンパク質が有する温度依存性が改善されている限り、アミノ酸配列における異なる位置に複数存在してもよい。
【００４４】
上記（ｄ）に列挙される特定のアミノ酸のいずれかを有することにより、（Ｂ２）タンパク質は、配列番号２のＦＡＤＧＤＨよりもキシロースに対する作用性が低減されている。
上記（ｄ）に列挙される特定のアミノ酸の中でも、好ましいアミノ酸は、５９Ｃ、５９Ｄ、５９Ｋ、５９Ｍ、５９Ｑ、５９Ｓ、５９Ｔ、８２Ｈ、８２Ｑ、１０８Ｍ、１０８Ｔ、５０５Ｙから成る群から選択されるいずれかである。
更に好ましい特定のアミノ酸は、５９Ｍ、５９Ｑ、８２Ｈ、８２Ｑ、５０５Ｙのいずれかである。
更に好ましいアミノ酸置換は、５９Ｍである。
上記に例示した特定のアミノ酸は、（Ｂ２）タンパク質が有する温度依存性が改善されている限り、アミノ酸配列における異なる位置に複数存在してもよい。
【００４５】
上記（ｆ）に列挙される特定のアミノ酸のいずれかを有することにより、（Ｃ２）タンパク質は、配列番号２のＦＡＤＧＤＨよりもキシロースに対する作用性が低減されている。
上記に例示した特定のアミノ酸は、（Ｃ２）タンパク質が改善された温度依存性を有し、かつ、低下したキシロース作用性を有する限り、アミノ酸配列における異なる位置に複数存在してもよい。
【００４６】
なお、上記の変換位置は、アスペルギルス・オリゼ由来のもの（配列番号１）、または、それを改変したもの（配列番号２）以外の起源（たとえば、アスペルギルス・テレウス）に由来するＦＡＤＧＤＨ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列における同等の位置であっても良い。この同等の位置は、そのアミノ酸配列の一次構造（例えばアラインメント）、立体構造の知見を基に判断することができる。アラインメントは、ＧＥＮＥＴＹＸ  ＷＩＮ（株式会社ゼネティックス製）を用いて比較することができる。
【００４７】
本願明細書において、アミノ酸配列の相同性は、ＧＥＮＥＴＹＸソフトで比較した値を意味する。
また、本願明細書において、あるアミノ酸配列における配列番号１の５４位と同等の位置は、ＧＥＮＥＴＹＸソフトで配列を比較したとき、配列番号１の５４位と対応する位置をもって同等と判断する。同様に、アミノ酸配列における配列番号１の５８位と同等の位置は、ＧＥＮＥＴＹＸソフトで配列の一次構造（例えばアラインメント）を比較したとき、配列番号１の５８位と対応する位置をもって同等と判断する。必要に応じてさらに立体構造の知見などを参照しても良い。
具体的には、アスペルギルス・オリゼ野生株由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列とアスペルギルス・テレウス野生株由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列とのアライメントの比較データより、本発明の５９位と同等の位置とは、アスペルギルス・テレウス野生株由来のＦＡＤＧＤＨの５５位のグリシンに相当する。また、本発明の８２位と同等の位置とは、アスペルギルス・テレウス野生株由来のＦＡＤＧＤＨの７８位のアルギニンに相当する。また、本発明の１０８位と同等の位置とは、アスペルギルス・テレウス野生株由来のＦＡＤＧＤＨの１０４位のアラニンに相当する。また、本発明の５０５位と同等の位置とは、アスペルギルス・テレウス野生株由来のＦＡＤＧＤＨの５０１位のフェニルアラニンに相当する。
上記（ｃ）において、配列番号１または配列番号２の少なくともいずれかとのアミノ酸配列の相同性は、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。
上記Ｆ〜Ｈの（ａ）〜（ｃ）のいずれかで表されるタンパク質において、アミノ酸が置換された位置以外の位置において、さらに、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質もまた、本願発明の一実施形態である。
なお、ＧＥＮＥＴＹＸソフトは、ＧＥＮＥＴＹＸ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮから販売されているＶｅｒｓｉｏｎ ６．１のものを使用した。
【００４８】
本願発明のＦＡＤＧＤＨ改変体は、種々の公知の手段で作製することが出来る。
以下に、配列番号１で示される野生型のアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨを改変したＦＡＤＧＤＨ改変体の製造法を例示する。製造法は、特に限定されないが、以下に示すような手順で製造することが可能である。
ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを構成するアミノ酸配列を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社，  ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，  Ｑｕｉｃｋ
Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。
【００４９】
作製されたＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体の遺伝情報を有するＤＮＡは、プラスミドと連結された状態にて宿主微生物に移入され、ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を生産する形質転換体となる。この際のプラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５α、エシェリヒア・コリーＷ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００などが利用できる。宿主微生物に組み換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリーに属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組み換えＤＮＡの移入を行う方法などを採用することができる、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には市販のコンピテントセル（例えばコンピテントハイＪＭ１０９；東洋紡績製）を用いても良い。
【００５０】
なお、これらの過程で得られた、ＦＡＤＧＤＨ改変体をコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体も、本発明の実施形態として含まれる。
【００５１】
本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨの改変の基になる遺伝子は、特に限定されるものではないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来のＦＡＤＧＤＨを用いることが望ましい。さらに好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来あるいはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨであることが望ましい。
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のＦＡＤＧＤＨとしては、配列番号１または配列番号２で表されるタンパク質が例示できる。
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨとしては、配列番号３で表されるタンパク質が例示できる。
【００５２】
本願発明の一実施形態は、上記のいずれかに記載のタンパク質をコードする遺伝子であ
る。
【００５３】
改変前のタンパク質をコードする遺伝子として、たとえば、上記の配列番号１で表されるタンパク質をコードする遺伝子としては、配列番号４で表される塩基配列が例示できる。また、上記の配列番号２で表されるタンパク質をコードする遺伝子としては、配列番号５で表される塩基配列が例示できる。また、上記の配列番号３で表されるタンパク質（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨ）をコードする遺伝子としては、配列番号６で表される塩基配列が例示できる。
本願発明の遺伝子は、上記改変前のタンパク質をコードする遺伝子の配列において、５９位、８２位、１０８位、５０５位のうちいずれかのアミノ酸、あるいはそれと同等の位置のアミノ酸をコードする部分が、他のアミノ酸をコードするように置換されている。
【００５４】
本発明のＦＡＤＧＤＨ改変体をコードする遺伝子は、配列番号４、５または６に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＦＡＤＧＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡである。ここでストリンジェントな条件とは、相同性が高い核酸同士、例えば完全にマッチしたハイブリッドのＴｍから該Ｔｍより１５℃、好ましくは１０℃低い温度までの範囲の温度でハイブリダイズする条件をいう。具体的には、例えば一般的なハイブリダイゼーション用緩衝液中で、６８℃、２０時間の条件でハイブリダイズする条件をいう。本発明において、配列番号４、５または６に記載の塩基配列がコードするアミノ酸配列と５０％以上の相同性、好ましくは８０％以上の相同性、さらに好ましくは９０％以上の相同性、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ配列をコードする塩基配列がストリンジェントな条件に相当すると考えられる。
【００５５】
本願発明の遺伝子は、たとえばＧＤＨの発現を向上させる目的などで、コドンユーセージ（Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ）を変更したものを含みうる。
【００５６】
本願発明の一実施形態は、上記の遺伝子を含むベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体、該形質転換体を培養し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を採取するグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を生産する方法である。
【００５７】
例えば、上記のＧＤＨ遺伝子を発現用ベクター（プラスミド等多くのものが当該技術分野において知られている）に挿入し、適当な宿主（大腸菌等多くのものが当該技術分野において知られている）を形質転換する。得られた形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じてＥＤＴＡなどのキレート剤や界面活性剤等を添加して可溶化し、ＧＤＨを含む水溶性画分を得ることができる。または適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現したＧＤＨを直接培養液中に分泌させることが出来る。
【００５８】
上記のようにして得られたＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。また、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＧＤＨを得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００５９】
これらは、例えば、以下の文献に従って進めることができる。
（ａ）タンパク質実験プロトコール第１巻  機能解析編，第２巻  構造解析編  （秀潤社）  西村善文，大野茂男  監修
（ｂ）改訂  タンパク質実験ノート  上  抽出と分離精製  （洋土社）  岡田雅人，宮崎香  編集
また、以下に例示する方法によって進めることもできる。
【００６０】
作製されたタンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡは、ベクターと連結された状態にて宿主微生物中に移入される。
【００６１】
ベクターとしては、宿主微生物内で自立的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ファージとしては、例えばエシェリヒア・コリーを宿主微生物とする場合にはＬａｍｂｄａ  ｇｔ１０、Ｌａｍｂｄａ  ｇｔ１１などが例示される。また、プラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリーを宿主微生物とする場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＫＫ２２３−３、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなどが例示される。なかでも、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなど、クローニングサイト上流にエシェリヒア・コリー内で認識されうるプロモーターを保持するものが好ましい。
また、適当な宿主微生物としては、組換えベクターが安定であり、かつ自立増殖可能で外来遺伝子の形質発現できるものであれば特に制限されない。エシェリヒア・コリーではエシェリヒア・コリーＷ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００、エシェリヒア・コリーＨＢ１０１、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５αなどを用いることができる。
【００６２】
宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの移入を行なう方法などを採用することができ、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には、市販のコンピテントセル（例えば、コンピテントハイＤＨ５α；東洋紡績製）を用いても良い。宿主として、酵母が用いられる場合にリチウム法、エレクトロポレーション法が、また、糸状菌が用いられ場合にはプロトプラスト法などが用いられる。
【００６３】
本発明において、ＧＤＨをコードする遺伝子を得る方法としては、次のような方法が挙げられる。アスペルギルス・オリゼのゲノム配列情報を用い、予測ＧＤＨ遺伝子を見出すことができる。ついで、アスペルギルス・オリゼの菌体よりｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成する。こうして得られたｃＤＮＡをテンペレートとして、ＰＣＲ法によりＧＬＤ遺伝子を増幅させ、本遺伝子をベクターと両ＤＮＡの平滑末端または付着末端においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築する。該組換えベクターを複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーを利用してＧＤＨをコードする遺伝子を含有する組換え微生物を得る。
【００６４】
上記のように得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のＧＤＨを安定に生産し得る。組換え体の選択は、ベクターのマーカーとＧＤＨ活性を同時に発現する微生物を検索すればよい。例えば、薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつＧＤＨを生成する微生物を選択すればよい。
【００６５】
ＧＤＨ遺伝子の塩基配列は、Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２１４巻，１２０５（１９８１）に記載されたジデオキシ法により解読した。また、ＧＤＨのアミノ酸配列は上記のように決定された塩基配列より推定した。
【００６６】
上記のようにして、一度選択されたＧＤＨ遺伝子を保有する組換えベクターより、他の微生物にて複製できる組換えベクターへの移入は、ＧＤＨ遺伝子を保持する組換えベクタ
ーから制限酵素やＰＣＲ法によりＧＤＨ遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクター断片と結合させることにより容易に実施できる。また、これらのベクターによる他の微生物の形質転換は、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポレーション法、プロトプラスト法などを用いることができる。
【００６７】
なお、本発明のＧＤＨ遺伝子は、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、該遺伝子の翻訳後のアミノ酸配列の各アミノ酸残基の一部が欠失または置換されるようなＤＮＡ配列をもつものでもよく、また他のアミノ酸残基が付加または置換されるようなＤＮＡ配列をもつものでもよい。
【００６８】
野生型ＧＤＨをコードする遺伝子を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製，ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。
【００６９】
形質転換体である宿主微生物の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよい。多くの場合は液体培養で行い、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。ただし、生産性を考えた場合に、宿主として糸状菌を使用し、固体培養で行った方が有利な場合もある。
【００７０】
培地の栄養源としては，微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００７１】
培養温度は菌が成育し、ＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくは２０〜３７℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、ＧＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を完了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地のｐＨは菌が発育し、ＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度の範囲である。
【００７２】
培養物中のＧＤＨを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般には、常法に従って、ＧＤＨが培養液中に存在する場合はろ過、遠心分離などにより、ＧＤＨ含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。ＧＤＨが菌体内に存在する場合には、得られた培養物からろ過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いで、この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤及び界面活性剤を添加してＧＤＨを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００７３】
上記のようにして得られたＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱
処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＧＤＨを得ることができる。
【００７４】
例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ゲル（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ  （ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）、オクチルセファロースＣＬ−６Ｂ  （ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）等のカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００７５】
本発明において、ＦＡＤＧＤＨの活性測定は以下の条件で行う。
［試験例］
＜試薬＞
５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ６．５（０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）
２４ｍＭ  ＰＭＳ溶液
２．０ｍＭ  ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
１Ｍ  Ｄ−グルコース溶液
上記ＰＩＰＥＳ緩衝液２１．９ｍｌ、ＤＣＰＩＰ溶液１．０ｍｌ、ＰＭＳ溶液２．０ｍｌ、Ｄ―グルコース溶液４．５ｍｌを混合して反応試薬とする。
【００７６】
＜測定条件＞
反応試薬３ｍｌを３７℃で５分間予備加温する。ＧＤＨ溶液０．１ｍｌを添加しゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、６００ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＧＤＨ溶液の代わりにＧＤＨを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から次の式に従ってＧＤＨ活性を求める。ここでＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量として定義している。また、２５℃での活性値を測定する場合は、上記の３７℃と表記した操作を２５℃に変更して測定する。キシロースに対する反応性を測定する際は、上記の１Ｍ  Ｄ−グルコース溶液の代わりに１Ｍ  Ｄ−キシロースを使用すればよい。
活性（Ｕ／ｍｌ）＝
｛−（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×３．０×希釈倍率｝／｛１６．３×０．１×１．０｝
なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍｌ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍｌ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。
【００７７】
グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従う改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従う改変型ＦＡＤＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う改変型ＦＡＤＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
【００７８】
グルコースセンサー
本発明はまた、本発明に従う改変型ＦＡＤＧＤＨを用いるグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００７９】
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【００８０】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
【実施例１】
【００８１】
実施例１  ＦＡＤＧＤＨの温度依存性評価
配列番号２のＦＡＤＧＤＨを使用した。上述した方法によりＦＡＤＧＤＨ精製標品を調製し、３８ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）中で、所定の温度条件における活性測定を行った。図１に酵素活性の温度依存性曲線を示した。縦軸は、３７℃における活性値を１００％として、各温度における相対的な活性値を示している。３７℃における活性値を１００％とする場合に、２５℃における活性値が約６３％、５℃における活性値が約４０％を示している。
【実施例２】
【００８２】
実施例２  改変型ＦＡＤＧＤＨの遺伝子の作製
ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子（配列番号２）を含む組み換えプラスミドｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６で市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５ａ；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換し、アンピシリンを含んだ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天；ｐＨ７．３）に塗布した後、３０℃で一晩培養した。得られた形質転換体をアンピシリン（５０ｍｇ／ｍｌ；ナカライテスク社製）を含んだ液体培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ；ｐＨ７．３）を摂取し、３０℃で一晩振とう培養した。得られた菌体から常法によりプラスミドを調整した。
該プラスミドを鋳型として、５９番目のグリシンをアラニンに置換するよう設計した配列番号７の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、８２番目のアルギニンをアラニンに置換するよう設計した配列番号８の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１０８番目のバリンをアラニンに置換するよう設計した配列番号９の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、５０５番目のフェニルアラニンをアラニンに置換するよう設計した配列番号１０の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドをＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて改変型ＦＡＤＧＤＨを作製した。
【実施例３】
【００８３】
実施例３  アラニン改変型ＦＡＤＧＤＨのプラスミドの調整
得られた改変型ＦＡＤＧＤＨで市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５ａ；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換し、アンピシリンを含んだＬＢ寒天培地で３７℃、１６時間培養した。その後、改変型ＦＡＤＧＤＨのシングルコロニーを、アンピシリンを含んだＬＢ液体培地に摂取し、３０℃で一晩振とう培養した。得られた菌体から常法によりプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドの当該部位をＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ３７００ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用いて特定し、アラニンに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨを取得した。その後、５９番目のグリシンをアラニンに置換したプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｇ５９Ａ、８２番目のアルギニンをアラニンに置換したプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｒ８２Ａ、１０８番目のバリンをアラニンに置換したプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｖ１０８Ａ、５０５番目のフェニルアラニンをアラニンに置換したプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｆ５０５Ａと命名した。
【実施例４】
【００８４】
実施例４  改変型ＦＡＤＧＤＨを含む粗酵素液の調製および温度依存性とキシロース作用性の比較
実施例３で取得したｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｇ５９Ａ、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｒ８２Ａ、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｖ１０８ＡおよびｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｆ５０５Ａで市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５ａ；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換し、アンピシリンを含んだＬＢ寒天培地で３７℃、１６時間培養した。その後、アラニン改変型ＦＡＤＧＤＨのシングルコロニーをアンピシリンを含んだＬＢ液体培地に摂取し、３０℃で一晩振とう培養した。その培養液の一部から遠心分離によって得られた菌体を回収し、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中でガラスビーズを用いて該菌体を破砕することにより粗酵素液を調製した。
【００８５】
調製した粗酵素液を用いて、上述した活性測定法により２５℃および３７℃でのＧＤＨ活性と３７℃でのキシロース作用性を測定した。表１にその結果を示す。
表１は、５ｍｌ  ＬＢ培地／試験管，３０℃，２４時間培養した時のＧ５９Ａ、Ｒ８２Ａ、Ｖ１０８ＡおよびＦ５０５Ａの温度依存性を比較した結果である。
改変部位と温度依存性を比較し、５９部位、８２部位、１０８部位をアラニンに置換することで改変前のＦＡＤＧＤＨよりも温度依存性が改善する効果が確認されたことから５９部位、８２部位および１０８部位を候補とした。また、５０５部位については、アラニンに置換することで失活したが、アラニン以外の他のアミノ酸に置換することで温度依存性が改善する可能性があったため候補とした。
【００８６】
【表１】
0005850291.tif 000002
【実施例５】
【００８７】
実施例５  ５９部位のアミノ酸の至適化
実施例２で使用したｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６を鋳型として、５９番目のチロシンを他の１９種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１１の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドをＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて改変型ＦＡＤＧＤＨを作製した。改変型ＦＡＤＧＤＨで市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５ａ；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換し、アンピシリンを含んだＬＢ寒天培地で３７℃、１６時間培養した。その後、改変型ＦＡＤＧＤＨを有したシングルコロニーを、アンピシリンを含んだＬＢ液体培地に摂取し、３０℃で一晩振とう培養した。その後、１ｍｌの培養液を摂取し、常法によりプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドの当該部位をＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ３７００ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用いて特定した。５９部位をＡに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｇ５９Ａ、５９部位をＣに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｇ５９Ｃ、５９部位をＤに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｇ５９Ｄ、５９部位をＥに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｇ５９Ｅ、５９部位をＧに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｇ５９Ｆ、５９部位をＨに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｇ５９Ｈ、５９部位をＩに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｇ５９Ｉ、５９部位をＫに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｇ５９Ｋ、５９部位をＬに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｇ５９Ｌ、５９部位をＭに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｇ５９Ｍ、５９部位をＮに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｇ５９Ｎ、５９部位をＰに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｇ５９Ｐ、５９部位をＱに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｇ５９Ｑ、５９部位をＲに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｇ５９Ｒ、５９部位をＳに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｇ５９Ｓ、５９部位をＴに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｇ５９Ｔ、５９部位をＶに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｇ５９Ｖ、５９部位をＷに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｇ５９Ｗ、５９部位をＹに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｇ５９Ｙと命名した。
【実施例６】
【００８８】
実施例６  ５９部位のアミノ酸を至適化した改変型ＦＡＤＧＤＨの温度依存性とキシロース作用性の比較
実施例５と同様の方法で５９部位を１９種のアミノ酸に置換した改変型ＦＡＤＧＤＨの温度依存性とキシロース作用性を測定した。表２に改変型ＦＡＤＧＤＨの温度依存性とキシロース作用性の結果を示す。
表２は、５ｍｌ  ＬＢ培地／試験管，３０℃，２４時間培養した時のＧ５９部位を改変した改変型ＦＡＤＧＤＨの温度依存性及びキシロース作用性を比較した結果である。
５９部位をＡに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、５９部位をＣに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、５９部位をＤに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、５９部位をＦに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、５９部位をＨに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、５９部位をＫに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、５９部位をＬに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、５９部位をＭに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、５９部位をＮに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、５９部位をＰに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、５９部位をＱに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、５９部位をＳに置
換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、５９部位をＴに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、５９部位をＷに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、５９部位をＹに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨで改変前のＦＡＤＧＤＨより温度依存性が改善した。また、５９部位をＣに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、５９部位をＤに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、５９部位をＫに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、５９部位をＭに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、５９部位をＱに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、５９部位をＳに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、５９部位をＴに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨは温度依存性が改善しただけではなく、改変前のＦＡＤＧＤＨよりキシロース作用性も低下した。
【００８９】
【表２】
0005850291.tif 000003
【実施例７】
【００９０】
実施例７  ８２部位のアミノ酸の至適化
実施例５と同様の方法で８２部位を他の１９種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１２の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いてのアミノ酸の至適化を行った。８２部位をＡに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｒ８２Ａ、８２部位をＣに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｒ８２Ｃ、８２部位をＤに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｒ８２Ｄ、８２部位をＥに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｒ８２Ｅ、８２部位をＧに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｒ８２Ｇ、８２部位をＨに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｒ８２Ｈ、８２部位をＩに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｒ８２Ｉ、８２部位をＫに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｒ８２Ｋ、８２部位をＬに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｒ８２Ｌ、８２部位をＭに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｒ８２Ｍ、８２部位をＮに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｒ８２Ｎ、８２部位をＰに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｒ８２Ｐ、８２部位をＱに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｒ８２Ｑ、８２部位をＦに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｒ８２Ｆ、８２部位をＳに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｒ８２Ｓ、８２部位をＴに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｒ８２Ｔ、８２部位をＶに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｒ８２Ｖ、８２部位をＷに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｒ８２Ｗ、８２部位をＹに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｒ８２Ｙと命名した。
【実施例８】
【００９１】
実施例８  ８２部位のアミノ酸を至適化した改変型ＦＡＤＧＤＨの温度依存性とキシロース作用性の比較
実施例６と同様の方法で８２部位を１９種のアミノ酸に置換した改変型ＦＡＤＧＤＨの温度依存性とキシロース作用性を測定した。表３に改変型ＦＡＤＧＤＨの温度依存性とキシロース作用性の結果を示す。
表３は、５ｍｌ  ＬＢ培地／試験管，３０℃，２４時間培養した時のＲ８２部位を改変した改変型ＦＡＤＧＤＨの温度依存性及びキシロース作用性を比較した結果である。
８２部位をＡに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、８２部位をＣに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、８２部位をＨに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、８２部位をＫに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、８２部位をＱに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、８２部位をＶに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、８２部位をＹに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨで改変前のＦＡＤＧＤＨより温度依存性が改善した。また、８２部位をＨに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、８２部位をＱに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨは温度依存性が改善しただけではなく、改変前のＦＡＤＧＤＨよりキシロース作用性も低下した。
【００９２】
【表３】
0005850291.tif 000004
【実施例９】
【００９３】
実施例９  １０８部位のアミノ酸の至適化
実施例５と同様の方法で１０８部位を他の１９種のアミノ酸に置換するよう設計した配
列番号１３の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いてのアミノ酸の至適化を行った。１０８部位をＡに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｖ１０８Ａ、１０８部位をＣに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｖ１０８Ｃ、１０８部位をＤに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｖ１０８Ｄ、１０８部位をＥに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｖ１０８Ｅ、１０８部位をＧに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｖ１０８Ｇ、１０８部位をＨに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｖ１０８Ｈ、１０８部位をＩに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｖ１０８Ｉ、１０８部位をＫに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｖ１０８Ｋ、１０８部位をＬに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｖ１０８Ｌ、１０８部位をＭに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｖ１０８Ｍ、１０８部位をＮに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｖ１０８Ｎ、１０８部位をＰに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｖ１０８Ｐ、１０８部位をＱに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｖ１０８Ｑ、１０８部位をＲに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｖ１０８Ｒ、１０８部位をＳに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｖ１０８Ｓ、１０８部位をＴに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｖ１０８Ｔ、１０８部位をＦに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｖ１０８Ｆ、１０８部位をＷに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｖ１０８Ｗ、１０８部位をＹに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｖ１０８Ｙと命名した。
【実施例１０】
【００９４】
実施例１０  １０８部位のアミノ酸を至適化した改変型ＦＡＤＧＤＨの温度依存性とキシロース作用性の比較
実施例６と同様の方法で１０８部位を１９種のアミノ酸に置換した改変型ＦＡＤＧＤＨの温度依存性とキシロース作用性を測定した。表４に改変型ＦＡＤＧＤＨの温度依存性とキシロース作用性の結果を示す。
表４は、５ｍｌ  ＬＢ培地／試験管，３０℃，２４時間培養した時のＶ１０８部位を改変した改変型ＦＡＤＧＤＨの温度依存性及びキシロース作用性を比較した結果である。
１０８部位をＡに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、１０８部位をＤに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、１０８部位をＥに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、１０８部位をＦに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、１０８部位をＦに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、１０８部位をＨに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、１０８部位をＬに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、１０８部位をＭに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、１０８部位をＱに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、１０８部位をＲに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、１０８部位をＳに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、１０８部位をＴに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨで改変前のＦＡＤＧＤＨより温度依存性が改善した。また、１０８部位をＭに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、１０８部位をＴに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨは温度依存性が改善しただけではなく、改変前のＦＡＤＧＤＨよりキシロース作用性も低下した。
【００９５】
【表４】
0005850291.tif 000005
【実施例１１】
【００９６】
実施例１１  ５０５部位のアミノ酸の至適化
実施例５と同様の方法で５０５部位を他の１９種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１４の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いてのアミノ酸の至適化を行った。５０５部位をＡに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｆ５０５Ａ、５０５部位をＣに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｆ５０５Ｃ、５０５部位をＤに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｆ５０５Ｄ、５０５部位をＥに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｆ５０５Ｅ、５０５部位をＧに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｆ５０５Ｇ、５０５部位をＨに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｆ５０５Ｈ、５０５部位をＩに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｆ５０５Ｉ、５０５部位をＫに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｆ５０５Ｋ、５０５部位をＬに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｆ５０５Ｌ、５０５部位をＭに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｆ５０５Ｍ、５０５部位をＮに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｆ５０５Ｎ、５０５部位をＰに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｆ５０５Ｐ、５０５部位をＱに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｆ５０５Ｑ、５０５部位をＲに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｆ５０５Ｒ、５０５部位をＳに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｆ５０５Ｓ、５０５部位をＴに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｆ５０５Ｔ、５０５部位をＶに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｆ５０５Ｖ、５０５部位をＷに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｆ５０５Ｗ、５０５部位をＹに置換した改変型ＦＡＤＧＬＤを有するプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６−Ｆ５０５Ｙと命名した。
【実施例１２】
【００９７】
実施例１２  ５０５部位のアミノ酸を至適化した改変型ＦＡＤＧＤＨの温度依存性とキシロース作用性の比較
実施例６と同様の方法で５０５部位を１９種のアミノ酸に置換した改変型ＦＡＤＧＤＨの温度依存性とキシロース作用性を測定した。表５に改変型ＦＡＤＧＤＨの温度依存性とキシロース作用性の結果を示す。
表５は、５ｍｌ  ＬＢ培地／試験管，３０℃，２４時間培養した時のＦ５０５部位を改変した改変型ＦＡＤＧＤＨの温度依存性及びキシロース作用性を比較した結果である。
５０５部位をＤに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、５０５部位をＬに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、５０５部位をＭに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、５０５部位をＮに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、５０５部位をＱに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、５０５部位をＲに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨ、５０５部位をＹに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨで改変前のＦＡＤＧＤＨより温度依存性が改善した。また、５０５部位をＹに置換した改変型ＦＡＤＧＤＨは温度依存性が改善しただけではなく、改変前のＦＡＤＧＤＨよりキシロース作用性も低下した。
【００９８】
【表５】
0005850291.tif 000006
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明による温度依存性が改善し、且つ、基質特異性が向上したＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを利用することにより、グルコース測定の精度向上を可能にし、医療関連分野などの産業に貢献するところ大である。
【図２】
0005850291.tif 000007
【図１】
0005850291.tif 000008
【配列表】
0005850291000001.app