(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのエクソンが複数のｌｏｘＰ配列で挟まれた構造を有するＲｏｒ２（receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2）遺伝子をホモで有し、ここで該複数のｌｏｘＰ配列の少なくとも１つは、該Ｒｏｒ２遺伝子の非翻訳領域又はイントロン内に存在し、
且つ、ＲＡＮＫプロモーターの下流にＣｒｅ遺伝子が組み込まれた染色体を有し、
破骨細胞及び破骨細胞前駆細胞からなる群より選択される少なくとも１種の細胞で、Ｒｏｒ２遺伝子がノックアウトされた、
非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
骨吸収不全モデル動物である、請求項１に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項３】
請求項２に記載の非ヒト哺乳動物に対し、被験物質を投与し、骨吸収の程度を測定する工程を含む、骨吸収不全の予防又は治療剤のスクリーニング方法。
【請求項４】
請求項２に記載の非ヒト哺乳動物に対し、骨吸収不全予防又は治療候補物質を投与し、骨吸収の程度を測定する工程を含む、骨吸収不全の予防又は治療候補物質の効能評価方法。
【請求項５】
請求項２に記載の非ヒト哺乳動物に対し、骨吸収不全予防又は治療候補物質を投与し、骨吸収の程度を測定する工程を含む、骨吸収不全の予防又は治療物質を特定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｒｏｒ２のコンディショナルノックアウト動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｗｎｔファミリータンパク質は、発生における形態形成や癌化、癌の浸潤・転移等の様々な生理的及び病理的局面において重要な役割を担う分子である。Ｗｎｔタンパク質は、βカテニン依存的又は非依存的シグナル伝達経路を惹起するが、Ｗｎｔ５ａ（Wingless-type MMTV integration site family, member 5A）は主に細胞極性・細胞移動を制御するβカテニン非依存的シグナル伝達において中心的な役割を担うことが知られている。Ｗｎｔ５ａは、細胞表面に存在する受容体に結合することによりβカテニン非依存的シグナル伝達を活性化するが、中でもＲｏｒ２受容体チロシンキナーゼ（receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2；以下「Ｒｏｒ２」）はＷｎｔ５ａによる細胞極性・細胞移動制御において重要な機能をつかさどっていることが明らかになってきている（例えば、非特許文献１、２参照）。
【０００３】
Ｒｏｒ２は、種の壁を越えて構造のよく保存されたＲｏｒ−ファミリー受容体チロシンキナーゼの一員であり、細胞外領域にはＷｎｔ５ａやＦｚｄ（Frizzled）との結合に必要なシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）を、また、細胞内領域にはチロシンキナーゼドメイン（ＴＫＤ）やプロリンリッチドメイン（ＰＲＤ）といった、機能ドメインを有する。Ｒｏｒ２は、発生過程において、神経堤細胞や間葉系細胞を中心に、神経系、心臓、肺、骨軟骨系などに発現している。
【０００４】
Ｗｎｔ５ａノックアウトマウス及びＲｏｒ２ノックアウトマウスでは、肺及び気管の形態異常、心奇形、骨軟骨形成不全などの、多くの共通した表現型がみられることが報告されている。しかしながら、Ｒｏｒ２をノックアウトすると胎児期に死亡してしまうため、これまでに得られているこのような知見は、全て胎児を用いた動物実験で見出された知見であって、成体においてＲｏｒ２がどのような働きを有するのかは全く不明であった。また、上記のとおり、胎児におけるこれまでの解析では、Ｒｏｒ２は多種多様な機能を有しているとも考えられ、このことが成体におけるＲｏｒ２の機能の推測を一層困難としていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，２３９：１−１５，２０１０
【非特許文献２】医学のあゆみ  Ｖｏｌ．２３３  Ｎｏ．１０：９５５−９５９，  ２０１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、Ｒｏｒ２の生後（特に成体）における機能を解明するための手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、少なくとも１つのエクソンが複数のｌｏｘＰ配列で挟まれた構造を有するＲｏｒ２（receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2）遺伝子をホモで有し、ここで該複数のｌｏｘＰ配列の少なくとも１つは、該Ｒｏｒ２遺伝子の非翻訳領域又はイントロン内に存在し、且つ、体の少なくともいずれかの部位でＣｒｅタンパク質（リコンビナーゼ活性を有する。Ｃｒｅリコンビナーゼ、あるいは単にＣｒｅともいう）が発現される、非ヒト哺乳動物を作製すれば、Ｃｒｅタンパク質が発現される部位において、Ｒｏｒ２をノックアウトすることができる（すなわち、コンディショナルノックアウトが可能である）ことを見出した。
【０００８】
またさらに、上記の技術を用いて、特に破骨細胞及び破骨細胞前駆細胞からなる群より選択される少なくとも１種の細胞で、Ｒｏｒ２遺伝子がコンディショナルノックアウトされた非ヒト哺乳動物を作製すると、当該非ヒト哺乳動物は骨吸収不全を示すことを見出した。
【０００９】
そして、これらの知見を基に、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は例えば以下の項１〜１０に記載の非ヒト哺乳動物、及び当該非ヒト哺乳動物を用いた方法を包含する。
項１．
少なくとも１つのエクソンが複数のｌｏｘＰ配列で挟まれた構造を有するＲｏｒ２（receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2）遺伝子をホモで有し、ここで該複数のｌｏｘＰ配列の少なくとも１つは、該Ｒｏｒ２遺伝子の非翻訳領域又はイントロン内に存在し、
且つ、体の少なくともいずれかの部位でＣｒｅタンパク質が発現される、
非ヒト哺乳動物。
項２．
Ｃｒｅ遺伝子が組み込まれた染色体を有する、項１に記載の非ヒト哺乳動物。
項３．
部位特異的発現プロモーターの下流にＣｒｅ遺伝子が組み込まれた染色体を有する、項２に記載の非ヒト哺乳動物。
項４．
部位特異的発現プロモーターが、ＲＡＮＫプロモーター、Ｓｐｃプロモーター、Ｋ５プロモーター、ＨｏｘＢ７プロモーター、及びα−ミオシン重鎖プロモーターからなる群より選択される、少なくとも１種のプロモーターである、項３に記載の非ヒト哺乳動物。
項５．
部位特異的発現プロモーターが、ＲＡＮＫプロモーターである、項４に記載の非ヒト哺乳動物。
項６．
破骨細胞及び破骨細胞前駆細胞からなる群より選択される少なくとも１種の細胞で、Ｒｏｒ２遺伝子がノックアウトされた、項１〜６のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物。
項７．
骨吸収不全モデル動物である、項５又は６に記載の非ヒト哺乳動物。
項８．
項７に記載の非ヒト哺乳動物に対し、被験物質を投与し、骨吸収の程度を測定する工程を含む、骨吸収不全の予防又は治療剤のスクリーニング方法。
項９．
項７に記載の非ヒト哺乳動物に対し、骨吸収不全予防又は治療候補物質を投与し、骨吸収の程度を測定する工程を含む、骨吸収不全の予防又は治療候補物質の効能評価方法。
項１０．
項７に記載の非ヒト哺乳動物に対し、骨吸収不全予防又は治療候補物質を投与し、骨吸収の程度を測定する工程を含む、骨吸収不全の予防又は治療物質を特定する方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、Ｒｏｒ２遺伝子をコンディショナルノックアウトした動物を提供することができる。本発明によれば、動物を出生および成体まで成長させた上で、所望の部位でのみＲｏｒ２遺伝子をノックアウトすることが可能である。なお、“コンディショナルノックアウト”とは特定の遺伝子を任意の場所（例えば組織，細胞）、及び／又は、任意の時間（例えば胎生期，生後週齢）にノックアウトする、という意味合いである。
【００１２】
このようなＲｏｒ２遺伝子コンディショナルノックアウト動物は、成体におけるＲｏｒ２の機能の解明に好ましく用いることができる。
【００１３】
また、特に、上記技術を用いて、特に破骨細胞及び破骨細胞前駆細胞からなる群より選択される少なくとも１種の細胞で、Ｒｏｒ２遺伝子がコンディショナルノックアウトされた非ヒト哺乳動物を作製することにより、骨吸収不全モデル動物を得ることができる。当該骨吸収不全モデル動物は、骨吸収不全の予防又は治療剤のスクリーニング、骨吸収不全の予防又は治療候補物質の効能評価、骨吸収不全の予防又は治療物質の特定、等のため、好ましく用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】Ｒｏｒ２コンディショナルノックアウト（ｃＫＯ）マウス作製のための、ターゲティングベクター構築の概略を示す。
【図２】ターゲティングベクターが相同組換えにより組み込まれたＥＳ細胞を選択するため行ったサザンブロッティング解析の概要を示す。
【図３】ＲＡＮＫＣｒｅ／＋マウスを作製するために用いたノックインベクターの概略をａ左側に示す。ノックインベクターが組み込まれたことを確認するために行った、サザンブロッティング解析の結果をａ右側に示す。ノックインベクターが組み込まれたことが確認できる。ＲＡＮＫＣｒｅ／＋マウスが、破骨細胞前駆細胞において、EGFP-Cre融合タンパク質を発現することを確認する目的で、抗Ｃｒｅ抗体及び抗アクチン抗体により、破骨細胞前駆細胞中のＣｒｅ及びアクチン（コントロール）を検出したウエスタンブロット解析の結果をｂに示す。さらに、同様の目的で、確認破骨細胞前駆細胞をＤＡＰＩ染色した上でＥＧＦＰ（EGFP-Cre融合タンパク質のEGFPタンパク質部分）を励起して観察した結果をｃに示す。ＲＡＮＫＣｒｅ／＋マウスの破骨細胞前駆細胞において、EGFP-Cre融合タンパク質が発現していることが確認できる。
【図４】本発明の非ヒト哺乳動物のうち、ＲＡＮＫ発現特異的にＲｏｒ２遺伝子がノックアウトされるマウスのＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムの概要を示す。
【図５】骨髄由来マクロファージの調整の概要を示す。
【図６】Ｒｏｒ２ｃＫＯマウス及びコントロールマウスの、Ｒｏｒ２ｍＲＮＡの発現量及びＲｏｒ２タンパク質の発現量を検討した結果を示す。
【図７】Ｒｏｒ２ｃＫＯマウス及びコントロールマウスの大腿骨のレントゲン画像を示す。
【図８】Ｒｏｒ２ｃＫＯマウス及びコントロールマウスの大腿骨のμＣＴ解析結果を示す。
【図９】Ｒｏｒ２ｃＫＯマウス及びコントロールマウスの大腿骨をＴＲＡＰ染色した結果（画像）、及び当該染色により陽性であった破骨細胞の数及び骨芽細胞の数を定量した結果（グラフ）を示す。
【図１０】ｃＫＯマウス及びコントロールマウスの脛骨における破骨細胞マーカー遺伝子の発現解析の結果を示す。
【図１１】マウス頭蓋冠由来骨芽細胞と骨髄由来マクロファージ共存培養による破骨細胞形成実験の結果を示す。なお、図１〜１１にグラフが記載される場合において、アスタリスク等の記号は次の意味を表す。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. n.s. = not significant
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明について、さらに詳細に説明する。
【００１６】
本発明の非ヒト哺乳動物は、少なくとも１つのエクソンが複数のｌｏｘＰ配列で挟まれた構造を有するＲｏｒ２（receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2）遺伝子をホモで有し、ここで該複数のｌｏｘＰ配列の少なくとも１つは、該Ｒｏｒ２遺伝子の非翻訳領域又はイントロン内に存在し、且つ、体の少なくともいずれかの部位でＣｒｅタンパク質が発現される、非ヒト哺乳動物である。なお、当該非ヒト哺乳動物は成体である。
【００１７】
ｌｏｘＰ配列とは、バクテリオファージＰ１由来の３４ｂｐからなる塩基配列であり、具体的にはATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT（配列番号１）の塩基配列である。ｌｏｘＰ配列は、Ｃｒｅ（バクテリオファージＰ１由来のDNA recombinase）によって特異的に認識され、二つのｌｏｘＰに挟まれたＤＮＡは切り出される。当該機能を利用したコンディショナルノックアウト方法はＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムと呼ばれている。
【００１８】
本発明の非ヒト哺乳動物では、染色体上のＲｏｒ２遺伝子の少なくとも１つのエクソンが複数のｌｏｘＰ配列で挟まれている。このような構造を有することにより、Ｃｒｅが存在する場合に、ｌｏｘＰ配列で挟まれたＲｏｒ２遺伝子のエクソン領域が切り出されるため、正常なＲｏｒ２のｍＲＮＡが発現せず、従って正常なＲｏｒ２タンパク質も発現しないこととなり、Ｒｏｒ２の機能は失われる。なお、２つのｌｏｘＰ配列が同一染色体上で逆向きに存在する場合、これらのｌｏｘＰ配列で挟まれた領域は、Ｃｒｅの働きにより反転することが知られている。また、２つのｌｏｘＰ配列が同一染色体上で同じ向きに存在する場合、これらのｌｏｘＰ配列で挟まれた領域は、Ｃｒｅの働きにより欠失することが知られている。特に制限はされないが、上記のエクソンを挟むように存在するｌｏｘＰ配列は、同じ向きで存在することが好ましい。
【００１９】
本発明の非ヒト哺乳動物は、このような構造を有するＲｏｒ２遺伝子をホモで有する。このため、Ｃｒｅが存在する場合には全くＲｏｒ２の機能を発現することができず、Ｒｏｒ２はノックアウトされることになる。
【００２０】
本発明の非ヒト哺乳動物では、ｌｏｘＰ配列はＲｏｒ２遺伝子の少なくとも１つのエクソンを挟むように存在する。このため、少なくとも２以上（複数；好ましくは２〜５個、２〜４個、又は２〜３個）のｌｏｘＰ配列が染色体上に存在する。例えば、Ｒｏｒ２遺伝子の１個又は複数個（好ましくは２、３、又は４個）のエクソンを挟むように２つのｌｏｘＰ配列が存在してもよく、Ｒｏｒ２遺伝子の複数個のエクソンをそれぞれ挟むように３つ又は４つのｌｏｘＰ配列が存在してもよい。
【００２１】
また、ｌｏｘＰ配列の少なくとも１つは、Ｒｏｒ２遺伝子の非翻訳領域又はイントロン内に存在する。つまり、ｌｏｘＰ配列が存在する（置換又は挿入される）ことにより、Ｒｏｒ２遺伝子の発現に影響が無い又は小さい部位に、ｌｏｘＰ配列は存在する。ｌｏｘＰ配列の少なくとも１つが、Ｒｏｒ２遺伝子の非翻訳領域又はイントロン内に存在すれば、他のｌｏｘＰ配列は、Ｒｏｒ２遺伝子領域外に存在してもよい。好ましくは、本発明の非ヒト哺乳動物では、染色体上に存在するｌｏｘＰ配列の全てが、Ｒｏｒ２遺伝子の非翻訳領域又はイントロン内に存在する。
【００２２】
なお、上のｌｏｘＰ配列の存在位置についての説明において用いた、エクソン、イントロン、非翻訳領域との用語は、通常ｍＲＮＡの構造を示す場合に用いられることが多いが、ここでは染色体上に存在するＤＮＡの領域を説明するために広義の意味で用いている。つまり、ｍＲＮＡへ転写された場合に、エクソン、イントロン、非翻訳領域となるＤＮＡ領域を示すために、これらの用語を用いている。また、“Ｒｏｒ２遺伝子”は、“Ｒｏｒ２をコードするＤＮＡ”と言い換えてもよい。
【００２３】
本発明の非ヒト哺乳動物では、体の少なくともいずれかの部位でＣｒｅタンパク質（Ｃｒｅ）が発現される。Ｃｒｅが発現した部位でのみ、ｌｏｘＰ配列で挟まれたＲｏｒ２遺伝子のエクソン領域が切り出され、Ｒｏｒ２の機能が失われる（ノックアウトされる）。
【００２４】
Ｃｒｅを発現させるためには、発現可能な状態で組み込まれたＣｒｅ遺伝子を有することが好ましい。Ｃｒｅ遺伝子を発現可能な状態で組み込む方法としては、例えば、Ｃｒｅ遺伝子の発現を可能とするプロモーターの下流にＣｒｅ遺伝子を組み込む方法が挙げられる。このようなプロモーターとしては、哺乳動物において働く公知のプロモーターを用いることができ、例えば公知の遺伝子のプロモーターや、公知のウイルス由来のプロモーターが挙げられる。
【００２５】
例えば、発現可能な状態でＣｒｅ遺伝子が組み込まれた遺伝子構築物（例えばベクター）を公知の遺伝子導入手法により任意の部位に導入することによって、当該導入部位においてＣｒｅを発現させることができる。例えば、ウイルスベクター（例えば、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター）とＣｒｅ遺伝子を連結して用いることができる。
【００２６】
また、本発明の非ヒト哺乳動物は、好ましくは、Ｃｒｅ遺伝子が発現可能な状態で染色体に組み込まれている。この場合、Ｃｒｅ遺伝子は、部位特異的発現プロモーターの下流に組み込まれていることが好ましい。部位特異的発現プロモータの下流にＣｒｅ遺伝子をつないだコンストラクトを作製し、これを導入して染色体へ組み込むことが好ましい。このような部位特異的発現プロモーターとしては、公知の哺乳動物由来遺伝子のプロモーターを用いることができる。また、用いる部位特異的発現プロモーターによって、Ｃｒｅが発現する部位が異なるため、Ｒｏｒ２遺伝子をノックアウトできる部位も異なる。よって、用いる部位特異的発現プロモーターにより、所望の部位でＲｏｒ２遺伝子をノックアウトすることができる。
【００２７】
このような部位特異的発現プロモーターとしては、公知のプロモーターを適宜選択して用いることができる。また、公知の部位特異的発現プロモーターの下流にＣｒｅ遺伝子が存在するようにデザインされたトランスジェニック哺乳動物は、種々のものが公知であり、このような公知のトランスジェニック哺乳動物を購入して、又は分与してもらって、用いることもできる。
【００２８】
公知の部位特異的発現プロモーターとしては例えば、ＲＡＮＫプロモーター、Ｓｐｃプロモーター、Ｋ５プロモーター、ＨｏｘＢ７プロモーター、α−ミオシン重鎖プロモーター等が例示される。
【００２９】
ＲＡＮＫ（receptor activator of NF-κB）は、破骨細胞前駆細胞に存在する受容体であり、ＲＡＮＫＬ（receptor activator of NF-κB ligand）をリガンドとする。骨芽細胞と破骨細胞前駆細胞がcell-cell コンタクトすることにより，RANKL／RANK 結合が起こり，RANK 細胞内ドメインにTRAF6（TNF receptor-associated factor6）が結合し，破骨細胞の分化・骨吸収活性に必要な情報伝達経路が活性化されることが知られている。そして、ＲＡＮＫプロモーターは、特に破骨細胞前駆細胞（及び破骨細胞）において遺伝子の発現を促進することが知られている。
【００３０】
Ｓｐｃ(surfactant protein C)は肺サーファクタントタンパク質の一つであり、II型肺胞上皮細胞から分泌される。肺サーファクタントは肺胞の表面張力を減少させることにより、吸息時に肺胞を伸展しやすくする。Ｓｐｃプロモーターは、特に肺において遺伝子の発現を促進することが知られている。（Ｓｐｃプロモーター−Creトランスジェニックマウスは、公知である。参考文献：Development 132: 1363-1374, 2005）
【００３１】
Ｋ５（ケラチン５）は表皮の基底層の未分化角化細胞に発現している細胞骨格の一つであり、ケラチン14と結合して存在している。Ｋ５プロモーターは、特に皮膚において遺伝子の発現を促進することが知られている。（Ｋ５プロモーター−Creトランスジェニックマウスは、入手可能である：[熊本大学生命資源開発研究・支援センター  動物資源開発研究部門 (CARD), 系統名：STOCK-Tg(K5-Cre)Jt, CARD ID: 250]）
【００３２】
ＨｏｘＢ７は動植物の発生を制御するホメオボックス遺伝子ファミリー転写因子の一つであり、腎臓の発生において細胞の運命決定に関わっている。ＨｏｘＢ７プロモーターは、特に腎臓において遺伝子の発現を促進することが知られている。（ＨｏｘＢ７プロモーター−Creトランスジェニックマウスは、入手可能である：The Jackson Laboratory, Strain Name: STOCK Tg(Hoxb7-cre)13Amc/J, Stock Number: 004692）
【００３３】
α−ミオシン重鎖は心筋を構成する主要なタンパク質であり、心筋の収縮に関与する。α−ミオシン重鎖プロモーターは、特に心臓において遺伝子の発現を促進することが知られている。（α−ミオシン重鎖プロモーター−Creトランスジェニックマウスは、入手可能である：The Jackson Laboratory, Strain Name: B6.FVB-Tg(Myh6-cre)2182Mds/J, Stock Number: 011038）
【００３４】
プロモーターは、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。つまり、例えば２種以上のプロモーターを連結した下流にＣｒｅ遺伝子を連結して用いることもできるし、また、例えば、ＡプロモーターとＣｒｅ遺伝子を連結した構造及びＢプロモーターとＣｒｅ遺伝子を連結した構造を、いずれも有する非ヒト哺乳動物も本発明に包含される。（ここでのＡプロモーター及びＢプロモーターは、任意の公知プロモーターを示す。）
【００３５】
なお、本発明の非ヒト哺乳動物は、製造時のポジティブセレクションに用いるための薬剤耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等）を有していてもよい。当該薬剤耐性遺伝子はｌｏｘＰ配列に挟まれて存在することが好ましい。Ｃｒｅの働きにより、薬剤耐性遺伝子が切り出されて機能しなくなるため、表現型に影響を与える可能性を排除できるからである。
【００３６】
本発明の非ヒト哺乳動物は、ヒト以外の哺乳動物であれば特に限定されない。実験動物、家畜、ペットとして用いられる哺乳動物が好ましい。実験動物として用いられる哺乳動物としては、特に齧歯類（例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター等）及び霊長類（例えばサル等）が好ましく例示できる。非ヒト哺乳動物としては、具体的には、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ等が例示される。
【００３７】
本発明の非ヒト哺乳動物は、通常のＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムを有する哺乳動物を製造する方法に準じて製造することができる。例えば、次のようにして製造することができる。なお、次の説明では、非ヒト哺乳動物としてマウスを例に挙げて説明するが、他の非ヒト哺乳動物でも同様にして製造し得る。
【００３８】
すなわち、マウスの遺伝子ライブラリーをスクリーニングし、Ｒｏｒ２のコーディング領域を含む陽性クローンを選抜し、制限酵素及びＰＣＲ等を用いて、少なくとも１つのエクソンを挟むように、非翻訳領域又はイントロン領域にｌｏｘＰを挿入し、５’末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子（ネガティブセレクション用）やネオマイシン耐性遺伝子（ポジティブセレクション用）等のマーカー遺伝子を連結して、ターゲティングベクターを構築し、この構築したターゲッティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によって全能性細胞（ES細胞、iPS細胞等）に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、上記ポジティブセレクション用薬剤（例えばネオマイシン、Ｇ４１８等）に抵抗性を示す全能性細胞を選択する。この選択された全能性細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。
【００３９】
さらに、上記組換え全能性細胞をマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型のマウスと交配させると、ヘテロ接合体マウス（Ｒｏｒ２ｆｌｏｘ／＋マウス）を得ることができる。また、このヘテロ接合体マウスを交配させることによって、少なくとも１つのエクソンが複数のｌｏｘＰ配列で挟まれた構造を有するＲｏｒ２遺伝子をホモで有するマウス（Ｒｏｒ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウス）を得ることができる。なお、“ｆｌｏｘ”  とは“ｆｌａｎｋｅｄ  ｂｙ  ｌｏｘＰ”の略記である。
【００４０】
また、上記マウスの製造とは別に、特定のプロモーター配列、例えばＲＡＮＫプロモーターの下流にＣｒｅ遺伝子を連結したノックインベクターを作製し、これを同様に全能性細胞に導入し、セレクションし、マウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型のマウスと交配させると、ヘテロ接合体マウス（ＲＡＮＫＣｒｅ／＋マウス）を得ることができる。また、このヘテロ接合体マウスを交配させることによって、Ｃｒｅ遺伝子をホモで有するマウス（ＲＡＮＫＣｒｅ／Ｃｒｅマウス）を得ることもできる。
【００４１】
そして、例えば、Ｒｏｒ２ｆｌｏｘ／＋マウスとＲＡＮＫＣｒｅ／＋マウスとを掛け合わせることにより、或いは、Ｒｏｒ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスとＲＡＮＫＣｒｅ／＋マウスとを掛け合わせることにより、Ｆ１としてＲｏｒ２ｆｌｏｘ／＋；ＲＡＮＫＣｒｅ／＋マウスを得ることができ、さらに当該Ｆ１同士を掛け合わせて、Ｆ２としてＲｏｒ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；ＲＡＮＫＣｒｅ／＋マウスを得ることができる。
【００４２】
当該Ｒｏｒ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；ＲＡＮＫＣｒｅ／＋マウスは、破骨細胞前駆細胞及び／又は破骨細胞において、Ｃｒｅが特異的に発現し、当該細胞においてＲｏｒ２がノックアウトされる。すなわち、本発明の非ヒト哺乳動物として用いることができる。
【００４３】
なお、全能性細胞としては、ＥＳ（embryonic stem）細胞、ＥＧ（embryonic germ）細胞等を例示することができ、ＥＳ細胞はマウス、ラット、サル、ウサギ等で、また、ＥＧ細胞はブタ等で確立している。さらには、iPS（induced pluripotent stem）細胞も例示できる。iPS細胞は、ヒト、マウス、サル等で確立している。
【００４４】
特に、本発明の非ヒト哺乳動物が、ＲＡＮＫプロモーターの下流にＣｒｅ遺伝子が組み込まれた染色体を有する場合、上述のようにＣｒｅが破骨細胞前駆細胞及び／又は破骨細胞において特異的に発現することとなり、これらの細胞においてのみＲｏｒ２がノックアウトされる。当該非ヒト哺乳動物は、骨吸収が不全となり、異常に骨量が増加する。よって、当該非ヒト哺乳動物は、骨吸収不全モデル動物（特に低骨（代謝）回転を伴う骨吸収不全モデル動物）として好ましく用いることができる。本発明は、当該骨吸収不全モデル動物も包含する。
【００４５】
なお、骨吸収の程度は、具体的には、（１）（骨量／組織容量）値（％）（Bone volume/tissue bolume）、（２）骨梁数（ｍｍ−１）(Trabecular number)、（３）骨梁厚さ（μｍ）（Trabecular thickness）、（４）骨梁距離間隔（μｍ）（Trabecular separation）、を正常マウスと比較することで判断できる。これら（１）（２）（３）及び（４）からなる群より選択される少なくとも１種の項目、好ましくは少なくとも２種の項目、さらに好ましくは少なくとも３種の項目、よりさらに好ましくは全ての項目、で正常マウスに比べて骨が増加していると判断される場合に、骨吸収不全であると判断できる。これらの項目の測定には、μＣＴ解析を用いる。μＣＴ解析にはScanXmate-A080（Comscan Tecno）を用いることができる。より具体的には、これらの項目の値は、μＣＴ解析により大腿骨のＣＴ画像を取得し、成長板から０．５〜１．５ｍｍ地点の骨梁を画像解析ソフトTRI/3D-BON（Ratoc System）を用いて解析して求める値である。
【００４６】
本発明の骨吸収不全モデル動物は、骨吸収不全が原因で起こる疾病（以下「骨吸収不全症」ともいう）のメカニズム解明や、骨吸収不全の予防又は治療剤のスクリーニング、骨吸収不全の予防又は治療候補物質の効能評価、骨吸収不全の予防又は治療物質の特定等に有用である。
【００４７】
骨吸収不全症としては、例えば、大理石骨病、歯槽骨吸収不全、等を挙げることができる。大理石骨病(osteopetrosis)は、骨吸収不全のため、骨が異常に成長し硬くなり、結果的に、血液細胞の形成が減少し、貧血をおこしやすく感染症にかかりやすくなる病気である。また、歯槽骨吸収不全は、歯欠損後に顎骨が徐々にやせ細る際、部分的に骨がやせずに残り表面に凸凹が生じた状態をいい、入れ歯（義歯）を使用して噛もうとすると入れ歯が骨の飛び出した部分に当たって痛み、潰瘍ができるなどする。
【００４８】
本発明の骨吸収不全の予防又は治療剤のスクリーニング方法は、本発明の骨吸収不全モデル動物に対し、被検物質を投与し、骨吸収の程度を測定する工程を含む。被験物質の投与により骨吸収が促進される場合、投与被験物質は骨吸収不全の予防又は治療剤の有効成分になり得ると判断できる。被験物質の投与は、出生前及び／又は出生後に行い得る。また、骨吸収の程度を測定する時期は、特に制限はされず、適宜設定可能である。例えばマウスであれば６〜１０週齢程度が例示される。骨吸収の程度の測定は、詳細には、上述した通りに、μＣＴを用いて行う。上述した（１）（２）（３）及び（４）からなる群より選択される少なくとも１種の項目、好ましくは少なくとも２種の項目、さらに好ましくは少なくとも３種の項目、よりさらに好ましくは全ての項目、で、被験物質の投与がされていない本発明の骨吸収不全モデル動物に比べ、被験物質が投与された本発明の骨吸収不全モデル動物の方が、骨が減少していると判断される場合に、投与した被験物質は骨吸収不全の予防又は治療剤の有効成分になり得ると判断できる。
【００４９】
本発明の骨吸収不全の予防又は治療候補物質の効能評価方法は、本発明の骨吸収不全モデル動物に対し、骨吸収不全予防又は治療候補物質を投与し、骨吸収の程度を測定する工程を含む。各候補物質の投与により起こる骨吸収の程度の変動を比較することにより、各候補物質の骨吸収不全予防又は治療効果を評価することができる。候補物質の投与は、出生前及び／又は出生後に行い得る。また、骨吸収の程度を測定する時期は、特に制限はされず、適宜設定可能である。例えばマウスであれば６〜１０週齢程度が例示される。骨吸収の程度の測定は、詳細には、上述した通りに、μＣＴを用いて行うことができる。上述した（１）（２）（３）及び（４）からなる群より選択される少なくとも１種の項目、好ましくは少なくとも２種の項目、さらに好ましくは少なくとも３種の項目、よりさらに好ましくは全ての項目、において測定を行い、候補物質の投与がされていない本発明の骨吸収不全モデル動物及び、各候補物質が投与された、それぞれの本発明の骨吸収不全モデル動物、について、骨が減少している程度（又は骨吸収の程度）を比較することにより、各候補物質の骨吸収不全予防又は治療効果を評価することができる。
【００５０】
本発明の骨吸収不全の予防又は治療物質を特定する方法は、本発明の骨吸収不全モデル動物に対し、骨吸収不全予防又は治療候補物質を投与し、骨吸収の程度を測定する工程を含む。候補物質の投与は、出生前及び／又は出生後に行い得る。また、骨吸収の程度を測定する時期は、特に制限はされず、適宜設定可能である。例えばマウスであれば６〜１０週齢程度が例示される。骨吸収の程度の測定は、上述した通りに、μＣＴを用いて行うことができる。上述した（１）（２）（３）及び（４）からなる群より選択される少なくとも１種の項目、好ましくは少なくとも２種の項目、さらに好ましくは少なくとも３種の項目、よりさらに好ましくは全ての項目、において測定を行い、ある候補物質（物質Ａ）が投与された本発明の骨吸収不全モデル動物に比べ、他の候補物質（物質Ｂ）が投与された本発明の骨吸収不全モデル動物の方が、骨が減少していると判断される場合に、物質Ａよりも物質Ｂの方が、骨吸収不全の予防又は治療効果が高いと判断することができ、用いた候補物質の中で、最適の予防又は治療物質を特定することができる。
【００５１】
なお、これらの方法において、投与方法は特に限定されず、経口投与、皮下投与、経静脈投与等が例示される。また、投与量は適宜設定することができる。また、これらの方法においては、上記（１）〜（４）の項目を指標とすることができる、ともいえる。
【実施例】
【００５２】
以下、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。なお、実験に際して、当該技術分野の教科書等（例えばMolecular Cloning: A Laboratory Mnual(3 Vol.Set);Cold Spring Harbor Laboratory Press）を適宜参照してもよい。
【００５３】
ターゲティングベクターの構築
マウスＲｏｒ２遺伝子を含む約１０ｋｂのフラグメントをゲノムライブラリーから単離し、pBlueScriptSK(+)（Stratagene）Not Iサイトに組み込んだ。ネオマイシン耐性遺伝子の上流と下流をｌｏｘＰで挟んだカセットを用い第２エクソン上流のSal I/Kpn Iサイトに導入した。さらにもう一つのｌｏｘＰサイトを第３エクソン下流Eco RI/Sma I-Pvu I（Sma I, Pvu Iサイトはブラントエンドでライゲーション）サイトに導入した。
DT-A (diphtheria toxin fragment A) pA (Rabbit beta globin pA signal)は第２exonの上流３．８Kbの、Kpn I/Hid IIIサイトに導入し、ターゲティングベクターを得た。当該ターゲティングベクター構築の概略を、図１に示す。図１に示されるように、当該ターゲティングベクターでは、−［ｌｏｘＰ］−［ネオマイシン耐性遺伝子］−［ｌｏｘＰ］−［エクソン２］−［エクソン３］−［ｌｏｘＰ］−との構造を有する。
【００５４】
ネオマイシン耐性遺伝子は、ポジティブセレクションのために挿入した。つまり、ネオマイシン（又はＧ４１８）添加培地で培養して、ターゲティングベクターにより相同組換えが起こった細胞を選別できるようにするため挿入した。また、ＤＴ−ＡｐＡは、ネガティブセレクションのために挿入した。つまり、ターゲティングベクターがランダムに挿入された細胞は、毒素であるＤＴ−Ａ（ジフテリアトキシンのＡフラグメント）が産出されることで除去されるようにするため、挿入した。
【００５５】
なお、マウスＲｏｒ２遺伝子のアクセッションＮｏ．はNM_013846である。
【００５６】
ＥＳ細胞の培養及び相同組換え
検討には、以下の２種のＥＳ細胞を用いた。
EB3/5細胞: E14tg2a ES cells carrying IRES-BSD in one of Oct-3/4 locus, which allow selection of Oct-positive undifferentiated stem cells.
E14tg2a細胞: 129/Ola-derived HPRT-negative ES cells. HPRT-minigene can be used as an additional option of selectable marker by combination with HAT selection.
【００５７】
Ｅ１４ｔｇ２ａ細胞（ATCC (CRL-1821TM)）は、１２９／ｏｌａ由来の細胞であり、ＨＰＲＴ陰性のＥＳ細胞株である。ＥＢ３／５細胞は、丹羽仁史博士（理研発生・再生科学総合研究センター）から供与して頂いたもので、ＨＰＲＴ（−）ＢＳＤ（＋）のため、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ  ♀  ×  Ｒｏｒ２  キメラ  ♂  の仔（Ｆ１）のうちＢＳＤ  （−）  の♂を選択し、その後の繁殖に用いることができる。
【００５８】
なお、HPRTは、hypoxanthine phosphoribosyl transferase遺伝子の略で、その遺伝子産物はプリン代謝（サルベージ経路）酵素の１つで、ヒポキサンチンからイノシン酸を、グアニンからグアニン酸を、キサンチンからキサンチル酸を合成する。HAT selection（選択）のための遺伝子（産物）である。また、BSDはblasticidin（ブラストサイジン）resistant遺伝子（産物）の略で、放線菌由来のblasticidin（タンパク合成阻害剤）に対する耐性を付与する遺伝子（産物）である。EB3/5細胞では、BSD遺伝子をOct-3/4遺伝子座に挿入してあり、Oct-3/4遺伝子がヘテロのES細胞（つまり、未分化のES細胞）をブラストサイジンで選別することができる。Oct-3の発現量を制限することにより、未分化状態を維持できるということが報告されている。
【００５９】
ＥＢ３／５細胞は、以下の組成の培地で培養することができる。
〔ES culture mediumの組成〕
GMEM (Sodium bicarbonate 2.75 g/ L添加)
10% FCS
1 x NEAA
1 x sodium pyruvate
10-4 M 2-ME
1000 U/ml LIF
【００６０】
上記ターゲティングベクターを直鎖上として、ＥＳ細胞（ＥＢ３／５細胞）にエレクトロポレーションにより導入し、Ｇ４１８存在下で生存・増殖するＥＳ細胞を単離した。具体的には、次のようにして行った。
Day 1 ：
ES細胞凍結ストック(2.4 x 106 cells/本)を融解後、10 ml ES medium/90 mm dish x 2にまいた。
Day 3 ：
継代した。  (5 x 105 cells/ 10 ml/90 mm dish)
Day 5：
Targeting vector 100 μｇ in 50 μｌ of dH2Oに350 μｌのPBSを加えた。
細胞を回収してPBSで2回洗った。
cell count して3.2 x 107 cellsを回収した。＊
PBS 400 μｌでけん濁 し、targeting vector 液400 μｌを加えよくまぜた。
15 min氷上に静置した。
0.4 cm distanceのelectroporation cubetteに移した。
Bio-RadのGene pulserで0.8 kV/3 μＦのpulseを与えた。
ES mediumでけん濁し、2 x 106 cells/10 ml/90 mm dishでまいた。(16 枚)
（＊4 x 106 cells  も回収し、800 μｌのPBSでけん濁し、electroporation後、90 mm dish 2枚にまいた: この細胞がすべてG418で死滅することを確認した後、pick upを開始した）
Day 6：
培地交換した。
Day 7：
Selection開始  
175 μｇ/ml G418入り ES medium（Selection medium）で培地交換した。
(150 μｇ/ml 8枚 + 1枚、175 μｇ/ml 8枚 + 1枚)
Day 9：
Selection mediumへと培地交換した
Day 11：
Selection mediumへと培地交換した。
Day 12-13：
colony pick up 48 well plate へうつした。
Day 14：
48 wellから24 wellへ継代  (細胞液の大部分をinjection用、一部をDNA回収用とした)
Day 16：
injection用 24 well plateを凍結した。
Day 17-19：
DNA回収用 24 well plateを培地交換した(当該培地はLIFを含まない)。
Day 20：
DNA回収用  24 well plateを凍結した。
【００６１】
Ｒｏｒ２ｆｌｏｘ／＋マウスの作成
ＥＳ細胞をＧ４１８含有培地で培養し、形質転換体を選抜してセルライン化し、ターゲティングベクターが相同組換えにより染色体上に組み込まれたかを、サザンブロッティングによって確認し、選抜した。
【００６２】
サザンブロッティングに用いる制限酵素としては、５’側の解析には、５’ａｒｍを含み切断する制限酵素（Ｅｃｏ  ＲＩ）を、３’側の解析には、３’ａｒｍを含み切断する制限酵素（Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ）を選択した。５’プローブには他の染色体上と相同性の低い５’ａｒｍ内の約１Ｋｂを選択した。組換えが行なわれていれば、約５．２Ｋｂのバンドが、起きていなければ約１０Ｋｂのバンドが検出される。３’プローブには他の染色体上と相同性の低い３’ａｒｍ内の約１．２Ｋｂを選択した。組換えが行なわれていれば、約８．９Ｋｂのバンドが、起きていなければ約１０Ｋｂのバンドが検出される。当該サザンブロッティング解析の概要を図２に示す。
【００６３】
ターゲティングベクターが染色体上に組み込まれたＥＳ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの胚盤胞に注入した。擬制妊娠させた仮親マウスに、ＥＳ細胞を注入した胚盤胞を移植し、出産させてキメラマウスを得た。そして、このキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６マウスと交配してヘテロ接合体（Ｒｏｒ２ｆｌｏｘ／＋）を得た。
【００６４】
ＲＡＮＫＣｒｅ／＋マウスの作製
破骨細胞前駆細胞に発現するＲＡＮＫ（receptor activator of NF-κB）のプロモーター配列をＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子につなぎ、これを染色体上へ相同組換えさせたＲＡＮＫＣｒｅ／＋マウスを作製した。
【００６５】
具体的には、図３ａに示すように、ノックインベクターを作製し（pBlueScriptSK(+)を用いた）、これをＥＳ細胞に導入し、相同組換えにより染色体上へ組み込んで、キメラマウスを得、これをＣ５７ＢＬ／６マウスと交配してヘテロ接合体ＲＡＮＫＣｒｅ／＋マウスを作製した。（ノックインベクターのＥＳ細胞への導入及び確認は、上記Ｒｏｒ２ｆｌｏｘ／＋マウスの場合と同様に行った。概要は図３ａを参照。）なお、ノックインベクターは、Ｅ１０（Ｔｎｆｒｓｆ１１ａ〔ＲＡＮＫの同義語〕のエクソン１０）のストップコドン後にＩＲＥＳ配列をつなぎ、これにＥＧＦＰとＣｒｅの融合タンパク質をコードする配列をつなぎ、さらにｌｏｘＰで挟んだネオマイシン耐性遺伝子をつないで作製した。ＩＲＥＳ配列は、internal ribosomal entry site（リボソーム内部進入部位）であり、この後ろにレポーター遺伝子（本ケースではEGFP-Cre融合タンパク質をコードする遺伝子）を連結することで、目的遺伝子が発現している細胞を簡便に検出することが可能となる。
【００６６】
ＲＡＮＫＣｒｅ／＋マウスは、破骨細胞前駆細胞において、EGFP-Cre融合タンパク質を発現する。このことは、抗Ｃｒｅ抗体及び抗アクチン抗体により、破骨細胞前駆細胞中のＣｒｅ及びアクチン（コントロール）を検出したウエスタンブロット解析により確認した（図３ｂ）。また、破骨細胞前駆細胞をＤＡＰＩ染色した上でＥＧＦＰ（EGFP-Cre融合タンパク質のEGFPタンパク質部分）を励起して観察することによっても、破骨細胞前駆細胞においてＥＧＦＰが発現していることが確認できた（図３ｃ）。
【００６７】
Ｃｒｅ−ｌｏｘＰを用いた遺伝子組換えによるＲｏｒ２コンディショナルノックアウト（ｃＫＯ）マウスの作製
上述のようにして作製したＲｏｒ２ｆｌｏｘ／＋マウス及びＲＡＮＫＣｒｅ／＋マウスを掛け合わせて、コンディショナルノックアウトマウス（ｃＫＯマウス〔Ｒｏｒ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；ＲＡＮＫＣｒｅ／＋マウス〕）を得た。より詳細には、Ｒｏｒ２ｆｌｏｘ／＋マウス及びＲＡＮＫＣｒｅ／＋マウスを掛け合わせて、まず、Ｆ１としてＲｏｒ２ｆｌｏｘ／＋；ＲＡＮＫＣｒｅ／＋マウスを得て、当該Ｆ１同士を掛け合わせて、Ｆ２としてＲｏｒ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；ＲＡＮＫＣｒｅ／＋マウスを得た。当該ｃＫＯマウスは、Ｒｏｒ２遺伝子のエクソン２及び３がｌｏｘＰに挟まれており、ＲＡＮＫの発現と同時にＣｒｅも発現することで、Ｒｏｒ２遺伝子のエクソン２及び３が切り出されて、Ｒｏｒ２遺伝子がノックアウトされるマウスである。すなわち、ＲＡＮＫ発現特異的にＲｏｒ２遺伝子がノックアウトされるマウスである。当該概略を、図４に示す。
【００６８】
ｃＫＯマウスにおけるＲｏｒ２の発現
ｃＫＯマウスにおける、Ｒｏｒ２の発現量を検討した。具体的には、骨髄由来マクロファージ（Bone marrow macrophage；ＢＭＭ）における、Ｒｏｒ２のｍＲＮＡ及びタンパク質の発現量を検討した。具体的には、Ｒｏｒ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；ＲＡＮＫＣｒｅ／＋マウス（ｃＫＯマウス）及びＲｏｒ２＋／＋；ＲＡＮＫＣｒｅ／＋マウス（コントロールマウス）の骨髄液を採取し、リアルタイムＰＣＲ及びウエスタンブロッティングにより検討を行った。手順の詳細を以下に示す。
【００６９】
Ｉ．骨髄由来マクロファージの調整
１．Ｃｏｎｔｒｏｌ  及び  Ｒｏｒ２ｃＫＯマウスから脛骨を無菌的に取り出し、両端部分（１ｍｍ）を切断した。
２．  １  ｍｌ  注射筒（２７Ｇ）を用いて、α−ＭＥＭ  ＦＢＳ  （−）  にて脛骨の骨髄腔から、骨髄細胞を５０ｍｌチューブに押し出した（脛骨２本を処理した）。当該処理の概略を図５に示す。
３．  α−ＭＥＭ  ＦＢＳ（−）で３０ｍｌにメスアップした。
４．  得られた液体サンプルを遠心した（１２００ｒｐｍ、４℃、１０ｍｉｎ）。
５．  上清をアスピレートして除去した。
６．  ３ｍｌのα−ＭＥＭ  １０％  ＦＢＳを加え、ピペッティングし十分に細胞をサスペンジョンした。
７．  Ｍ‐ＣＳＦを終濃度５０ｎｇ／ｍｌになるように加え、６ｃｍディッシュに播種後、３７℃、  ５％ＣＯ２、  条件下で１７〜１８時間培養した。
８．  浮遊細胞を、ピペットを用いて５０ｍｌチューブに回収した。
９．  ５ｍｌのα−ＭＥＭ  ＦＢＳ  （−）  にてディッシュを一度軽く洗い、その液を５０ｍｌチューブに回収した（浮遊細胞をより多く回収するため）。
１０．得られた回収サンプルを遠心した（１２００ｒｐｍ、４℃、１０ｍｉｎ）。
１１．回収した細胞を６ｍｌのα−ＭＥＭ  １０％  ＦＢＳにサスペンジョンし、６ｃｍディッシュ２枚に播種した。
１２．Ｍ−ＣＳＦ（終濃度５０ｎｇ／ｍｌ）を添加したα−ＭＥＭ  １０％  ＦＢＳで約３日間培養を行った。骨髄由来マクロファージが約８０％コンフルエントの状態に増殖した後、細胞からｔｏｔａｌ  ＲＮＡ及び細胞抽出液を調整した。
【００７０】
II．  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの調製
培養液を捨て、細胞培養ディッシュをＰＢＳで一回洗浄した。そして、１ｍｌのＴｒｉｚｏｌ（インビトロジェン社）を加え、細胞を溶解させた。得られた溶解液に２００μｌのクロロホルムを加え、ボルテックスミキサーを使い、十分に混和した。２分間静置し、フェノール層と水層が分離し始めたら、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心し、水層を回収した。回収した水層をＲＮＡ精製用カラム（ＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＲＮＡ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ，  Ｉｎｖｉｔｒoｇｅｎ）を使い、マニュアルにしたがってＴｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した。
【００７１】
III．逆転写反応
精製したＲＮＡ  ２μｇを逆転写反応に供しｃＤＮＡを作製した。逆転写反応には、ｏｌｉｇｏ  ｄＴ  ｐｒｉｍｅｒ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  および  逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｔｒａ  Ａｃｅ，  ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。具体的には、次の通り行った。
【００７２】
１．Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ（２０  ｐｍｏｌ／μｌ）、５×ＲＴ  ｂｕｆｆｅｒ、１０  ｍＭ  ｅａｃｈ  ｄＮＴＰ、を室温で溶解させた。
２．ＰＣＲマシーン（ＡＳＴＥＣ，  ＰＣ８０２）  を起動させ、７０℃に設定した。
３．ＲＮＡ抽出後の吸光度測定結果よりＲＮＡを２μｇとなるように計算し、以下のとおりサンプル（合計２５μｌ）を調製した。
ＲＮＡ（２μｇ分）：ｘμｌ
Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ１２−１８  （２０ｐｍｏｌ／μｌ）：２μｌ  
ＤＥＰＣ水：（２３−ｘ）μｌ                
４．調製したサンプルを、ＰＣＲマシーン  （ＰＣ８０２）にかけた。（条件：７０℃  １０分  →  ０℃  １分）
５．ＲＴ  ｍｉｘ（合計２５μｌ）を作製し、サンプル（２５μｌ）に加えた。
た。組成は次の通りとした。
５×ＲＴ  ｂｕｆｆｅｒ            １０μｌ  
１０  ｍＭ  ｅａｃｈ  ｄＮＴＰ      ５μｌ
ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ      ０．５μｌ
Ｒｅｖｅｒ  ＴｒａＡｓｅ            ０．２μｌ
ＤＥＰＣ水                          ９．３μｌ  
６．ＰＣＲマシーン（ＡＳＴＥＣ，  ＰＣ８０２）を用いて、以下の条件で逆転写を行った。
４２℃  ６０分
９９℃  ５分
０℃    で保存
７．反応産物１μｌをテンプレートとしてＧＡＰＤＨのＰＣＲ（１８〜２６サイクル）  を行い、増幅がみられることを確認して、ｃＤＮＡ合成が成功したと判断した。
【００７３】
ＩＶ．  Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ
使用機械
ＰＣ  （ＩＢＭ  Ｎｅｔ  Ｖｉｓｔａ）  、ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  ＯＰＴＩＣＯＮＴＭ
使用試薬
ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  Ｋｉｔｓ  （ＦＩＮＮＺＹＮＭＥＳ社）  （２×ＭＭ）
方法（ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  Ｋｉｔｓのプロトコールに準じてリアルタイムＰＣＲを行った。）
（１）使用ｔｅｍｐｌａｔｅ及びｐｒｉｍｅｒ
ｔｅｍｐｌａｔｅ  （ｃＤＮＡ）：１０ｎｇ／μｌ
ｐｒｉｍｅｒ：１０μＭ      
検量線用ｔｅｍｐｌａｔｅ：２５０ｎｇ／μｌ、２５ｎｇ／μｌ、２．５ｎｇ／μｌ、０．２５ｎｇ／μｌ
（２）ｐｒｉｍｅｒのアニール温度の決定
ＰＣＲチューブに以下の試薬を調製した。
白い８連チューブ：８−ｓｔｒｉｐ  ｌｏｗ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｔｕｂｅｓ  （ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｉｎｃ．社）
白い９６穴チューブ：Ｌｏｗ  ９６−ｗｅｌｌ  Ｗｈｉｔｅ  （ＢＩＯ  ＲＡＤ社）
透明なキャップ：Ｆｌａｔ  Ｃａｐ  Ｓｔｒｉｐｓ  （ＢＩＯ  ＲＡＤ社）
【００７４】
（終濃度）
２×ＭＭ：                    １０μｌ
ｐｒｉｍｅｒＦ  （１０μＭ）：  ０．５μｌ  （０．５μＭ）
ｐｒｉｍｅｒＲ  （１０μＭ）：  ０．５μｌ  （０．５μＭ）        
ｔｅｍｐｌａｔｅ：              ２μｌ      （１ｎｇ／μｌ）
ＭｉｌｌｉＱ  ：                ７μｌ
ｔｏｔａｌ：                  ２０μｌ      
【００７５】
ＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒ
Ｆ（Ｒｏｒ２  ｅｘ３  Ｆｗｄ）  ５’ｔｔｔｃｔｇｇａｇｃｃａｇｔｃａａｃａａ３’
Ｒ（Ｒｏｒ２  ｅｘ３  Ｒｅｖ）  ５’ｃｔｇｔｃｔｔｃｃｇｇａｔｇａｔｇａｃｃ３’
【００７６】
以上の条件で、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  Ｋｉｔｓのプロトコールに準じてリアルタイムＰＣＲを行った。結果を図６のブラフに示す。
【００７７】
Ｖ．  イムノブロッティング（ウエスタンブロッティング）
培養液を捨て、細胞培養ディッシュをＰＢＳで一回洗浄した。
細胞培養ディッシュに細胞抽出液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７．４），  ２００ｍＭ  NaＣｌ，  ２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ，  ０．０５％  （ｗ／ｖ）  ＮＰ−４０  （Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０）  を５０μｌ  加え、スクレイパーを用い細胞をかき集めた。
【００７８】
不溶物を除去した後のタンパク質濃度をＢｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  Ａｃｉｄ（ＢＣＡ）法で求めた。
【００７９】
２０μｇ  ｐｒｏｔｅｉｎのサンプルをＬａｅｍｍｌｉのバッファー系を用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。分離した蛋白質を、Ｂｌｏｔｔｉｎｇ装置  （アトー社）を用いて、ＰＶＤＦ膜（Ｃｌｅａｒ  Ｂｌｏｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ−Ｐ、アトー社）に転写した後、Ｒｏｒ２タンパク質を抗体を用いて検出した。
【００８０】
ブロッキングは、２．５  ％  ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ，  ０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００  ＴＢＳ溶液中に室温で１時間浸することで行った。
【００８１】
１次抗体（Ｒｏｒ２抗体：大腸菌に発現させたＧＳＴ−ｍｏｕｓｅ  Ｒｏｒ２融合蛋白質をグルタチオンセファロースビーズを用いて精製したものを抗原としてウサギに免疫し得られた抗体。Ｋａｎｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７９：５０１０２−５０１０９，２００４参照）、及び２次抗体（ペルオキシダ−ゼ結合抗ウサギ抗体、バイオラッド）は、免疫反応増強試薬（Ｃａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ，  ＴＯＹＯＢＯ）を用いてそれぞれ１０００倍希釈、１００００倍希釈の濃度で用いた。１次抗体反応は、４℃で１２〜１６時間行った。
【００８２】
２次抗体反応は、室温で１時間行った。抗体の検出は、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケア）を用いた。結果を図６の画像に示す。
【００８３】
以上の結果から、ｃＫＯマウスでは、骨髄由来マクロファージ（Bone marrow macrophage；ＢＭＭ）において、Ｒｏｒ２のｍＲＮＡ及びタンパク質の発現が、コントロールマウス（Ｒｏｒ２＋／＋；ＲＡＮＫＣｒｅ／＋マウス）に比べ、低下していることが確認できた。
【００８４】
ｃＫＯマウスの大腿骨の解析
＜Ｘ線解析＞
８週齢のＣｏｎｔｒｏｌ及びＲｏｒ２ｃＫＯマウスから大腿骨を取り出し、７０％エタノールで固定した。軟Ｘ線発生装置（ＳＯＦＴＥＸ  Ｍ−１００５Ｗ）を用いて、固定した大腿骨のレントゲン像を撮影した。得られたレントゲン画像を図７に示す。Ｒｏｒ２ｃＫＯマウスの方が骨量が多く、特に図７の三角で示す部分は、明らかに骨密度が高くなっていた。
＜μＣＴ解析＞
また、μＣＴ（micro-computed tomography）により、各マウスの大腿骨の３次元断面画像を取得した。図８（左側）に示す。さらに、μＣＴ解析により、（１）（骨量／組織容量）値（％）（Bone volume/tissue bolume）、（２）骨梁数（ｍｍ−１）(Trabecular number)、（３）骨梁厚さ（μｍ）（Trabecular thickness）、（４）骨梁距離間隔（μｍ）（Trabecular separation）、についてもデータを収集し、結果をグラフにまとめた。これらのグラフを図８（右側）に示す。これらの結果からも、Ｒｏｒ２ｃＫＯマウスの方が、骨量が増え、骨密度が高くなったことが確認できた。このことから、Ｒｏｒ２ｃＫＯマウスでは、骨吸収不全が起きていることが明らかとなった。
【００８５】
なお、当該μＣＴ解析には、ScanXmate-A080（Comscan Tecno）を用いた。また、上記（１）〜（４）の解析結果は、成長板から０．５〜１．５ｍｍ地点の骨梁を画像解析ソフトTRI/3D-BON（Ratoc System）を用いて解析した結果である。
【００８６】
＜組織染色＞
固定した大腿骨をVillanueva bone stain液[0.5%(w/v）in 70% エタノール溶液、Maruto Instruments Co.Ltd］に室温で２週間浸漬し、骨を染色した。次に７０％−１００％エタノールを用いて、大腿骨を脱水し、グリコールメタクリレート樹脂に包埋した。ミクロトームを用いて樹脂ブッロクを厚さ3-4 μｍの薄切切片を作製した。切片を酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）染色に供した。ＴＲＡＰ染色の方法は以下に示す方法で行った。
【００８７】
TRAP 染色緩衝液の作製 （pH 5.0）
Sodium Acetate trihydrate （junsei chemical 31215-0301）4.84 g （終濃度 0.1 M）
Acetic Acid （nacalai tesque 00212-85）                 0.82 ml （終濃度 0.1 M）
Sodium Tartrate （wako 190-03455）                       5.75 g （終濃度 50 mM）
これらをミリＱで500 mlにメスアップして作製した。
【００８８】
TRAP染色液の作製
1. 基質: Naphthol AS-MX Phosphate （SIGMA N-4875）を 5 mgをN-N-dimethyl formamide （Wako 045-02916） 500μｌに溶かした。
2. TRAP染色緩衝液を50 ml加えた。
3. Fast Red Violet salt （SIGMA F-1625） 30 mgを溶かした。
4. チューブをアルミホイルで遮光し、4℃ に保存した。
【００８９】
スライドガラスを湿箱に並べた。切片上に、ＴＲＡＰ染色液を５０−１００μｌ加え（のせ）、３７℃で１５分から３０分間インキュベートした。顕微鏡で赤く染色されたことを確認後、水道水で洗浄し、反応をとめた。スライドガラスを風乾し、樹脂封入した。
【００９０】
大腿骨遠位部海綿骨部分の画像をAxiocam (デジタルカメラ)付きAxioplan2 (顕微鏡)で撮影し、ＪＰＥＧファイルとして保存した。保存した画像は、画像解析ソフト（NIH image）を用いて、ＴＲＡＰ陽性破骨細胞数および骨芽細胞数を定量した。海綿骨周囲長あたりの細胞数を計測した。１匹につき、３〜５枚の切片を解析し、計算した値の平均を個体の値とした。コントロール、ｃＫＯマウス、それぞれ６匹、１０匹を解析に供し、グループの平均値と標準偏差を求めた。有意差検定は、ｔ検定により行った。結果を図９に示す。
【００９１】
図９に示されるように、ｃＫＯマウスでは、破骨細胞の数が減少し、骨芽細胞の数が増加していた。このことからも、ｃＫＯマウスでは、骨吸収不全が起こっていることが裏付けられた。
【００９２】
脛骨における破骨細胞マーカー遺伝子の発現解析
８週齢のマウスの脛骨を取り出した。１．５ｍｌチューブにジルコニアボール（直径約５ｍｍ）、0.5 ｍｌのＴｒｉｚｏｌ（インビトロジェン社）と脛骨を入れ、Tissue Lyser II (キアゲン社)を用いて、骨を粉砕しながらＲＮＡを抽出した。Total RNAの精製、逆転写反応、real time PCRは上記「ｃＫＯマウスにおけるＲｏｒ２の発現」で行った方法と同様に行った。Csf1r, Tnfrs11a, Ctsk, Acp5, Gapdhの検出には、Takara Bio 社製  Real time -PCR primerを用い、Calcrのプライマーは、Invitorgenに外注して合成した。すなわち、用いたプライマーは以下の通りである。なお、これらの遺伝子のうち、ＧＡＰＤＨはコントロールとして用いたものである。また、それ以外の遺伝子は、公知の破骨細胞マーカーである。
【００９３】
Calcr(calcitonin receptor)…5 ctgctcctagtgagcccaa 3’/5 gcggttgcagtacagacctt 3’
Csf1r (CSF1 receptor)…MA072804 (Primer set ID, Takara Bio)
Tnfrs11a (RANK)…MA075536 (Primer set ID, Takara Bio)
Ctsk (cathepsin K)…MA025136 (Primer set ID, Takara Bio)
Acp5 (TRAP)…MA092518 (Primer set ID, Takara Bio)
Gapdh (GAPDH)…MA050371 (Primer set ID, Takara Bio)
【００９４】
結果を図１０に示す。図１０からも、ｃＫＯマウスでは破骨細胞の数が減少しており、骨吸収不全が起こっていることが強く示唆された。
【００９５】
マウス頭蓋冠由来骨芽細胞と骨髄由来マクロファージ共存培養による破骨細胞形成実験
上記「ｃＫＯマウスにおけるＲｏｒ２の発現」のＩの方法に従い、あらかじめ骨髄由来マクロファージを調製した。そして、マウス脛骨より採取した骨髄細胞をＭ−ＣＳＦで１６時間培養した後の浮遊細胞（1-1.5x105 cells/well）とマウス骨芽細胞（下記の野生型骨芽細胞）（3x104 cells/well）を４８穴プレートに播種した。活性型ビタミンＤ３（1,25D3）を最終濃度10-8 Ｍとなるように添加した。２日毎に培地を交換した。位相差顕微鏡で観察し、多核巨細胞が形成した時点で、細胞を４％パラホルムアルデヒド含ＰＢＳで固定した（500 μｌ/well, 室温、１０−１５分間）。固定液を捨て、0.1% Triton X-100含有ＰＢＳを入れ、室温で１−２分インキュベートした。0.1% Triton X-100含有ＰＢＳを捨て、上記「ｃＫＯマウスの大腿骨の解析」で作製したＴＲＡＰ染色液を加えた。顕微鏡で観察しながら、室温で５分から１０分間インキュベートする。細胞が赤く染まったら、細胞を水道水で洗い、反応を停止した。
【００９６】
上記の方法で、野生型骨芽細胞とコントロールあるいはｃＫＯ骨髄細胞（骨髄マクロファージ）の共存培養を各4 wellずつ行った。各wellにおいて形成された破骨細胞（細胞核を３核以上有し、ＴＲＡＰ染色陽性）数をカウントした。結果を図１１に示す。
【００９７】
なお、野生型骨芽細胞は、マクロファージ実験マニュアル（講談社）６４頁〜に記載される方法に準じてCalvaria（頭蓋冠）から単離培養し、−８０℃にストックしておいたものを使用した。具体的には、以下のようにして単離し、培養した。以下の方法は、マウス（１日齢）のｃａｌｖａｒｉａからコラゲナーゼ、およびディスパーゼを用いて骨芽細胞様ストローマ細胞を単離する方法である。これより得られた骨芽細胞と、マウス脛骨より得られた骨髄細胞との共存培養により破骨細胞の形成を誘導することができる。
【００９８】
＜使用動物及び試薬＞
ddy mouse 1日齢 （40匹）
コラゲナーゼ  （Wako 034−10533）
ディスパーゼ  （三光純薬 GD81020）
セルバンカー  （日本全薬工業 ZBC-101）
70%エタノール
【００９９】
〔0.1 % コラゲナーゼ、0.2 % ディスパーゼ溶液の作成〕      
コラゲナーゼ   0.05 g（終濃度 0.1%）
ディスパーゼ    0.1 g（終濃度 0.2%）
これらを50 mlの α-MEM FBS（−）に溶かし、フィルター滅菌を行い、これをＡ液とした。
【０１００】
＜単離方法＞
1. 70 % エタノール入りのビーカーにマウスを5匹ずつ入れ、屠殺した。
2. シャーレの上でマウスのcalvariaを切り取り、α-MEM FBS（−）の入ったシャーレに入れた。
3. シャーレの中で calvariaをきれいにした（すなわち、ピンセットで肉片および血管を取る）。
4. A液10 mlが入った50 mlチューブに calvariaを入れ撹拌し、その後上清をアスピレートして除去した。
5. 再びA液を10 ml入れてチューブにテープを巻いてウォーターバスでインキュベートした（37 ℃、 シェイカー 130 rpm、 10 min）。
6. 5〜10 mlの α-MEM 10% FBS入りの50 mlチューブに上清を回収した。
7. (5. 6.) の行程をさらに3回繰り返した（50 mlチューブに2本に回収）。
8. 1200 rpm、4 ℃、7 minの条件でチューブを遠心した。 
9. 上清をアスピレートして除去し、チューブ1本につきα-MEM 10% FBSを20 mlずつ入れ、ピペッティングした。
10. (9.) の懸濁液を10 cmシャーレ 4枚に各10 mlまき、さらにα-MEM 10% FBSを
各シャーレに10 ml加え、インキュベートした（37 ℃、 5% CO２）。 
【０１０１】
図１１に示される通り、骨芽細胞及び活性型ビタミンＤ３で破骨細胞の形成誘導をかけたとしても、Ｒｏｒ２ｃＫＯマウスでは、誘導が起こりにくいことが分かった。この点からも、当該ｃＫＯマウスの骨吸収不全が裏付けられた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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