(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
−  試料（１０）を保持するための装置（４０）と、
−  単色であり前記試料（１０）を照明する入射光ビームを放射可能な照明装置（３０）と、
−  大口径対物レンズ（ｆ１）と、
−  光検出用の装置（２０）と、
を含む、前記試料（１０）の化学、生物学または生化学分析用の結像システムにおいて、前記対物レンズ（ｆ１）が、前記試料（１０）の下流で、
・  前記入射光ビームを前記試料を透過させたまたは前記入射光ビームを前記試料により鏡面的に反射させた光ビームを合焦して、前記対物レンズ（ｆ１）の焦点面（ＦＦ）に位置する点（Ｃ）において合焦された光ビームを得て、
・  前記入射光ビームを前記試料により散乱させた光ビームを、合焦されていない準平行ビームに変換する
ように構成され、
前記システムが、前記対物レンズ（ｆ１）により集光された、前記合焦された光ビームと前記合焦されていない光ビームのいずれかを選択的に遮断する装置（７０）をさらに含む、
システム。
【請求項２】
前記装置（７０）が、
−  前記焦点（Ｃ）のまわりで前記対物レンズの前記焦点面に配置された絞り（７１）と、
−  前記焦点（Ｃ）に配置されたシャッタ（７２）と、
を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記装置（７０）が、高域フィルタおよび帯域フィルタを含む群から選択される少なくとも１つのフィルタをさらに含む、請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
前記対物レンズの上流で、前記入射光ビームを前記入射光ビームの前記光源から前記試料保持装置（４０）側へ反射する手段をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記反射する手段が、光学軸（ＹＹ）の近傍に配置されたミラー（５０）、または前記光学軸（ＹＹ）に配置され、前記光学軸に対して４５°＋／−２°に向けられ、透過もしくは反射で前記試料（１０）を観察するように配置された半透明ミラーを含む、請求項４に記載のシステム。
【請求項６】
前記対物レンズ（ｆ１）により集光された、前記合焦された光ビームと前記合焦されていない光ビームのいずれかを選択的に遮断するための前記装置（７０）が、前記絞り（７１）または前記シャッタ（７２）を選択的に作動させるための電気または機械スイッチをさらに含む、請求項２に記載のシステム。
【請求項７】
前記照明装置（３０）が、モノクロメータに結合された白色光源、および／または調整可能または調整不可能な単色光源を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
前記照明装置（３０）が、少なくとも１つの光ファイバを含むセット、および調整可能な少なくとも１ユニットの光源を含むセットを有し、少なくとも１つのファイバの入力部が、少なくとも１つのユニット式光源に接続可能である、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記少なくとも１つのファイバの入力部が複数のユニット式光源に接続可能であり、前記システムが、前記ファイバの入力部と前記ファイバの入力部に接続された前記ユニット式光源との間の相対移動において、前記ファイバの入力部を前記ユニット式光源の１つに接続するためのスイッチをさらに含む、請求項８に記載のシステム。
【請求項１０】
前記システムが、少なくとも２つのファイバの入力部をそれぞれ光源に接続可能なファイババンドルをさらに含み、前記システムが、前記光源を選択的に作動させるための電気または光スイッチをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
試料ホルダ上の試料の化学、生物学または生化学分析の方法において、
−  単色の入射光ビームで試料（１０）を照明するステップと、
−  前記試料（１０）の下流にある対物レンズ（ｆ１）によって、前記入射光ビームを前記試料を透過させたまたは前記入射光ビームを前記試料により鏡面的に反射させた光ビームを合焦して、前記対物レンズ（ｆ１）の焦点面（ＦＦ）に位置する点Ｃにおいて合焦された光ビームを得るステップと、を含み、
前記方法が、
−  前記入射光ビームを前記試料により散乱させた光ビームを、合焦されていない準平行ビームに変換するステップと、
−  前記対物レンズ（ｆ１）により集光された、前記合焦された光ビームと前記合焦されていない光ビームのいずれかを選択的に遮断するステップと、
−  前記選択的な遮断に基づいて、前記試料（１０）の複数の画像をカメラ（２０）によって取得するステップと、
をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
前記画像を比較するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記合焦された光ビームの下流で前記透過または散乱された光ビームをフィルタリングするステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
−  前記単色の入射光ビームの波長を調整するステップと、
−  前記選択された調整波長に従って、異なるラマンシフトを測定するステップと、
をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料の化学、生物学および生化学分析用の結像分野に関する。
【０００２】
本発明は、ナノ構造の形態で金属堆積物を有する基板を使用することで感度を著しく向上させることが可能になる、バイオセンサの分野に特に利用されるものである。試料は、通常は既知の（あるいは分析対象の）物質の「スポット」または（微小の）液滴の形をとり、顕微鏡スライドなどのホルダに載置され、分析対象の（あるいは組成が既知である）物質に接するように試料が載置された後又は載置される間に、以下に説明する技術のいずれかを用いてスライドの画像を生成して光学的分析が行われる。
【０００３】
より具体的には、本発明は、上記目的のうちの第１の目的においては、試料の化学、生物学または生化学分析用の結像システムであって、
−  試料を保持するための装置と、
−  光検出装置と、
−  単色光ビームを放射可能な照明装置と、
−  大口径対物レンズと、
を含むシステムに関する。
【背景技術】
【０００４】
上記の顕微鏡システムは、当業者に周知である。
【０００５】
近年、特に、通常「局所表面プラズモン共鳴」を表すＬＳＰＲまたは表面プラズモン共鳴と呼ばれる、反射／透過ＵＶ／可視分光法において、蛍光（特に「金属増強蛍光」を表すＭＥＦ）において、かつラマン散乱（または「表面増強ラマン散乱」を表すＳＥＲＳ）において、結像される対象物における所定の特性を解明するコントラストを有する結像技術において、顕微鏡に関する様々な開発が行われてきた。
【０００６】
本発明は、好ましくは、バイオセンサ分野におけるこれらの技術のいくつかを用いる。
【０００７】
実際に、バイオセンサは、特にそれらが、同一ホルダ上の複数のプローブ／ターゲットペアの超並列測定が可能な構成において使用可能な場合、細胞膜に対する従来の試験に比べてより効率的な解決策となる。
【０００８】
しかし、特にタンパク質用の、しかしまたオリゴヌクレオチドなどのより低分子量の分子用の生体分子相互作用における広帯域測定は、新薬の調査のための診断やスクリーニングなど、所定の用途においては重要な課題となる。
【０００９】
これらの相互作用を測定するためには、プローブ／ターゲットペアの会合／解離速度を時間に従って測定できることが不可欠である。これらの相互作用のリアルタイム測定は、制御（特に、それが、例えば、生産ラインの生産物において製品を制御する「フロー」制御からなる場合に）または監視（例えば、有毒マーカーの環境検出）分野における用途のための有効な解決法を有するためにも必要である。これらのタイプの測定には、プローブ／ターゲットペアのイベントまたは会合／解離速度を時間に従って測定することが不可欠である。なお、プローブ／ターゲットペアには、場合によっては、例えば蛍光マーカーを用いた特定のマーキングを施されたり施されなかったりする。
【００１０】
現在利用可能な技術の中で、２種類の検出により、リアルタイムにおける分子相互作用の監視用の有効な解決法が提供される。すなわち、蛍光および表面プラズモン共鳴である。
【００１１】
現在市場で入手可能なのは、一対の生体分子（固体ホルダの表面に装着されたプローブ、および分析される試料に存在するターゲット）の会合および／または解離における現場（in situ）でのリアルタイムの監視を可能にするこの種の検出のいずれかに基づいた機器である。
【００１２】
蛍光を用いると感度が最良となるが、蛍光団でターゲットまたはプローブにマーキングしなければならないという問題がある。
【００１３】
表面プラズモン共鳴の利点は、マーキングされていないターゲットおよびプローブ間の相互作用を検出できることであるが、感度はより低くなる。従来の場合では、励起ジオメトリに関する制約によって、結像は、扱いが難しくなる。それは、ナノメートル寸法の島の形で構造化された金属層において局所表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）を励起することによって、結像モードにおいて有利に使用され得る。次に、分析は、試料と接触する層の反射または透過の変動における単純な分光分析によって実行される。
【００１４】
蛍光団でマーキングされたプローブを用いる場合に、蛍光分析と並行して行われるＬＳＰＲ分析を、センサ上の非特異的吸着の存在を検出するために用いてもよく、この非特異的吸着は、ある閾値を超えると、プローブを隠してセンサを実質的に無感応にし得る。このような制御は、制御および監視分野の用途における性能を維持するために不可欠である。マーキングされていないプローブが用いられる場合に、単独で用いられるＬＳＰＲは、化学的識別を提供しないという問題もある。
【００１５】
そのため、ラマン散乱などのマーキングのない化学的同定技術と組み合わせることが、これまでは主目的となっている。
【００１６】
しかしながら、これらの技術は、幾分矛盾する要件を有する。
【００１７】
反射／透過分光学に関して、小さな開口角での垂直またはほぼ垂直な入射で動作することが望ましく、波長を連続的に変更できることが有用である。実際には、測定条件を決定するためには、一旦測定条件が定義されるとスペクトルが固定されるというリスクの上で、全可視範囲、場合によりＵＶおよび／またはＩＲにおけるスペクトルを取得する必要がある。
【００１８】
蛍光に関しては、感度の理由で、できるだけ広い立体角にわたって放射された光を集光することが求められ、励起は、蛍光信号を最大化するように、単色で強くなければならない。
【００１９】
蛍光の場合と同様にラマン散乱に関しても、放射光は、できるだけ広い立体角で集光されなければならず、励起はまた、単色で強くなければならないが、試料によって放射された光の波長中における分布、およびより具体的には励起放射に関する波長の変化（ラマンシフト）を分析することが必要である。通常、これは、結果として試料と検出器との間に分散素子（例えば回折格子など）を挿入することになるため、画像の直接記録に反する。代替案としては、ホログラフィック格子またはより一般的には空間フィルタリング装置、およびその後に行われる複雑な画像を処理するためのプログラムによる、各分析された波長用の再構成画像を用いることが挙げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
現在、上記技術全てに関する要件を満たす解決法は存在しない。さらに、いずれの解決法も、波長において解像されたラマン画像を、他の技術によって提供された画像と単純に比較することについて先験的に十分であるとは考えられない。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
ここでは、上述の序文にさらに従う本発明による装置は、対物レンズが、試料の下流で、
・  反射された励起光ビームを前記対物レンズの焦点面に位置する点（Ｃ）に合焦するように、かつ
・  再透過または散乱光ビームを準平行ビームに変換するように構成されることと、装置がさらに、好ましくは前記焦点面に配置された前記対物レンズによって、試料からの集光された光ビームを選択的に遮断するための装置を含み、後述する表面プラズモン共鳴、蛍光およびラマン散乱を含む群から選択された少なくとも２つの分析技術に基づいて試料の分析を選択的に可能にすることと、を特徴とする。
【００２２】
本発明によって定義されるように、上流および下流は、光源から検出器への光ビームの方向に対して定義される。
【００２３】
一実施形態において、選択的遮断装置は、
−  焦点Ｃのまわりで前記対物レンズの焦点面に配置されるように構成された絞りと、
−  焦点Ｃに配置されるように構成されたシャッタと、
を含む。
【００２４】
好ましくは、選択的遮断装置は、高域フィルタおよび帯域フィルタを含む集合からの少なくとも１つのフィルタをさらに含む。
【００２５】
一実施形態において、システムは、光ビームを前記ビームの前記光源から試料保持装置側へ反射するための手段を、前記対物レンズの上流にさらに含む。
【００２６】
好ましくは、前記反射手段は、光学軸の近傍に配置されたミラー、または光学軸に配置され、光学軸に対して４５°±２°に向けられ、最小のシェーディングで透過もしくは反射で試料を観察するように配置された半透明ミラーを含む。
【００２７】
好ましくは、集光された光ビームを選択的に遮断するための装置は、前記絞りまたは前記シャッタを選択的に作動させるための電気または機械スイッチをさらに含む。
【００２８】
一実施形態において、照明装置は、モノクロメータに結合された白色光源、および／または調整可能もしくは調整不可能な単色光源を含む。
【００２９】
一実施形態において、照明装置は、少なくとも１つの光ファイバを含むアセンブリ、および調整可能な少なくとも１ユニットの光源を含むアセンブリを有し、少なくとも１つのファイバの入力部が、少なくとも１つのユニット光源に接続可能である。
【００３０】
一実施形態において、少なくとも１つのファイバの入力部が複数のユニット光源に接続可能であり、システムが、ファイバの入力部とファイバの入力部に接続されたユニット光源との間の相対移動において、ファイバの入力部をユニット光源の１つに接続するためのスイッチをさらに含む。
【００３１】
一実施形態において、それぞれが１つまたは複数のファイバに接続される複数の単色光源が存在し、各ユニット光源からのファイバは、ファイバビームの入力部で混合され、その出力は試料の励起用に使用される。次に、光源間の切り替えは、選択されたユニット光源を電気的に作動させることによって、または各ユニット光源の出力部に配置されたシャッタによって、相対移動なしに実行することができる。かかる実施形態は、ユニット光源がＬＥＤまたは調整不可能なレーザである場合に有利になり得る。
【００３２】
本発明の目的のうちの別の目的によれば、本発明はまた、本発明によるシステムにおける試料の化学、生物学または生化学分析の方法であって、
−  単色光ビームで試料を照明するステップと、
−  試料の下流で、前記対物レンズによって、対物レンズの焦点面に位置する点Ｃにビームを合焦させるステップと、
を含む方法に関する。この方法は、
−  前記集光されたビームを選択的に遮断するステップと、
−  選択的な遮断に基づいて、前記試料の複数の画像をカメラによって取得するステップと、
をさらに含むことを実質的に特徴とする。
【００３３】
一実施形態において、上記方法は、前記画像を重ね合わせるステップをさらに含む。
【００３４】
一実施形態において、上記方法は、選択的な合焦の下流で、光ビームをフィルタリングするステップをさらに含む。
【００３５】
一実施形態において、方法は、
−  前記光ビームの単色光源を調整するステップと、
−  選択された調整波長に従って、異なるラマンシフトを測定するステップと、
をさらに含む。
【００３６】
本発明により、上記の列挙した技術の２つまたは３つによって記録された画像を容易に比較することができ、特に、上記全ての技術に共通して用いられる鏡筒およびＣＣＤセンサにより、すなわち光学軸に対して試料を移動させずに、同一装置内で異なる技術を組み合わせることにより、単純な重ね合わせによって、可能となる。
【００３７】
本発明により、ターゲットまたはプローブをマーキングしてもしなくても、化学または生化学的特性の情報を取得し、少なくとも２つの独立した技術によって取得された情報を相関させ、かつ試験用に使用されるホルダにおける試験のリアルタイム性能制御を実行するように、試験を実行することが可能である。これらは、同一装置内で異なる技術を組み合わせることを可能にすることにより、実行できるようになる。
【００３８】
本発明により、約１００μｍの直径のスポットを結像するには十分な約１０μｍの解像度で、センチメートルの領域の結像を実行することが可能である。
【００３９】
したがって、先行技術の解決法が、２つのサイズの測定を関連付けることなく、局所表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）と結合することによる蛍光励起に注目されているのに対して、本明細書で説明するように、同一条件下でＬＳＰＲの検出およびプラズモン効果によって励起された蛍光の検出を（試料を移動させずに）実行することが可能である。本発明により、この関連付けを行うことで、実験中におけるマーキングされたターゲットの検出、または同じ実験中における低分子量を備えたマーキングされたターゲットおよび高分子量を備えたマーキングされていないターゲットの同時検出の前に、例えば、マーキングされていないプローブの固定化を制御することができるようになるという興味深い結果が得
られる。
【００４０】
本発明はまた、新薬の研究用の診断またはスクリーニングなど、ある適用分野における基礎的な問題である、リアルタイムの生体分子相互作用における広帯域測定の実行を可能にする。同様に、特定のターゲットの化学認識におけるリアルタイムの測定は、制御および監視分野における適用に対して有効な解決法を提供する上でも必要である。
【００４１】
以下、本発明の他の特徴および利点を、例示的かつ非限定的な例として示し、添付の図面を参照しながら行う説明で明らかにする。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】反射における光源および／または透過における光源を用いる、ＬＳＰＲ構成における本発明によるシステムの実施形態を示す。
【図２】同様に反射における光源および／または透過における光源を用いる、ＭＥＦ形態における本発明によるシステムの実施形態を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本解決法における原理の１つは、ＬＳＰＲ、ＭＥＦおよびＳＥＲＳ（上記の定義を参照）を含む群から選択可能な分析技術用の独自の光検出装置２０を実現することである。
【００４４】
光検出装置２０は、レンズまたはレンズ群ｆ２およびＣＤＤセンサ２１（またはカメラ）などの検出器を含む。ＣＣＤの寸法および調査領域を固定すると、光学系の倍率が決定される。
【００４５】
また、試料１０から検出器２１に入射する集光された光ビームを成形するよう動作する、下記の追加レンズｆ１（レンズまたはレンズ群）を設けてもよい。
【００４６】
ｆ２レンズ群は、ズームレンズと考えられ、要求に応じて、調査領域の寸法を適合させることができる。代わりに、ズーム機能は、対物レンズｆ１によって保証することができるが、この場合は、点Ｃと対物レンズとの間の距離を調整する必要があり好適でない。測定感度を良好にするために、好ましくは、検出対象の光強度に従って積分時間を適合させることができるように、調整可能な積分時間を備えたＣＣＤカメラを用いることができる。超高感度を用いた測定（ある試料用のラマン散乱または蛍光の測定用の場合であってもよい）用に、好ましくは、各画像を記録するためにより長い測定時間を使用できるように、冷却ＣＣＤカメラを用いることもできる。
【００４７】
本解決法用に選択された分析技術が何であれ、試料１０の照明は、調査領域の表面全体にわたる、できるだけ均一な強度の準平行入射光ビームを含む。しかし、この単色照明の波長は、可変であってもなくてもよく、ビームは、ジオメトリとも呼ばれる２つの構成に従って試料を照明することができる。すなわち、
−  試料が、照明装置３０＿Ｒからの入射光ビームによって直接照明され、かつ入射光ビームを光検出装置２０に反射する、前方照明と呼ばれる反射測定の構成と、
−  試料が、試料の保持手段４０の少なくとも一部を介して、照明装置３０＿Ｔからの入射光ビームによって間接的に照明され、かつ入射光ビームを光検出装置２０側へ透過させる、後方照明とも呼ばれる透過測定の構成と、
の２つの構成に従って試料を照明することができる。
【００４８】
蛍光またはラマン散乱に関して、照明は、前方または後方によって実行することができる。しかし、前方照明の方が、幾分好ましい。なぜなら、この結果、（例えば、分析される試料が載置される基板であって、試料の照明光が透過する基板の欠陥もしくはダスト、
または蛍光もしくはラマン散乱による散乱が原因となって）実質的により低い寄生光が発生するからである。
【００４９】
試料１０の照明用の入射光ビームの準平行形状は、次のように実現してもよい。
【００５０】
反射測定の構成において、光ビームは、照明装置３０＿Ｒから導出される。次に、光ビームは、対物レンズｆ１より高い、光学軸ＹＹおよび焦点面ＦＦから数ミリメートルに、すなわち対物レンズｆ１の焦点Ｃの近傍に（検出列で）配置された傾斜ミラー５０上に、例えばレンズによって合焦される。例えば、ミラー５０は、直径２ｍｍのミラーであってもよく、その中心は、光学軸から３±１ｍｍに位置する。
【００５１】
この位置決めにより、対物レンズｆ２は、試料１０においてビームを準平行ビームに再変換する。
【００５２】
代替形態（図示せず）として、同様に対物レンズｆ１の焦点面ＦＦの近傍で、すなわち対物レンズｆ１の焦点Ｃの周辺で、光学軸ＹＹに半透明ミラーを配置してもよい。
【００５３】
第１の構成では、光学軸の外部で動作すること（より困難な調整、より著しい光学収差が伴う）を必要とするが、第２の構成では、集光強度における因子Ｔ（１−Ｔ）（Ｔは、半透明ミラーの透過係数）を失うという問題があり、これは、蛍光とラマン散乱において回避されるのが望ましい。
【００５４】
図１に示す実施形態において、光学軸すなわち鏡筒は垂直であり、照明装置３０＿Ｒからのビームは水平であり、その結果、ミラー５０は、約４５°（４５°±２°）傾斜される。Ｃに集束する光線が前記ミラー５０と途中で衝突するのを防ぐ必要性を考えれば、傾斜ミラー５０は、できるだけ小さく（約１ｍｍ〜数ｍｍミリの直径）、光学軸に対するビームの傾斜は、できるだけ小さいのが好ましい。
【００５５】
透過測定の構成において、光ビームは、照明装置３０＿Ｔから導出される。光ビームは、図示しない光学作用によって準平行形状にされ、ほぼ垂直入射で、後方を通って試料側へ向けられる。
【００５６】
透過測定の別の実施形態（図示せず）において、その実施形態は、約４５°（４５°±２°）で傾斜された、かつ試料の上流およびその下で光学軸に配置されたミラーによって実現することができる。
【００５７】
（準）単色光ビームを得るために、照明装置３０＿Ｒ、３０＿Ｔは、モノクロメータに結合された白色光源（例えばキセノンアークランプ、アークランプもしくは白熱ランプ）、または調整可能もしくは調整不可能な単色光源（発光ダイオード、レーザダイオードまたはレーザ）を含んでもよい。
【００５８】
両方の場合において、準平行ビームの波形成形は、光源からの光を、レンズと結合された中間開口部（好ましくは０．２以下）の光ファイバにおけるファイバまたはビームに注入することによって実行することができる。
【００５９】
全ての測定（分析技術）に関して、光ファイバを通して送信される励起照明の場合に、調査領域における照明の均一性が、光ファイバからのビームの角度分布の均一性に基づくことは注目に値する。実現可能なあらゆる均一性も、コリメートレンズ間に置かれた勾配フィルタもしくは適切なホログラフィックフィルタによって、または画像分析におけるデジタル補正によって補正することができ、これらの２つの補正技術は、組み合わせてもよ
い。最後に、平行ビームは、非円形領域、例えば正方形または長方形に対する照明を得るために、コリメートしてもよい。
【００６０】
本発明によって定義される光源は、ユニット光源、すなわち複数のユニット光源であって、各ユニット光源が、共通の単色波長にわたって、またはそれぞれの単色波長に従って放射できる複数のユニット光源を意味する。
【００６１】
対物レンズｆ１は、焦点距離ｆ１のレンズまたはレンズセットを含み、検出器２１において、１のオーダー（好ましくは０．１と１０との間に含まれる）の倍率ｆ２／ｆ１を提供する。蛍光要件を満たすために、前記対物レンズｆ１の開口部は、できるだけ大きい（好ましくは少なくとも１：１．４）。
【００６２】
対物レンズｆ１は、前記対物レンズｆ１の焦点面ＦＦ（この場合には、より高い）にある点Ｃ（単レンズの場合には、このレンズ上方の距離ｆ１に位置する）に、試料下流の励起光ビームを合焦させるように構成される。
【００６３】
大口径対物レンズｆ１は、試料の上流で、垂直またはほぼ垂直の入射の準平行ビームに従って試料を照明し、かつ一方で試料の下流で、前記対物レンズの焦点面に位置する点Ｃに反射ビームを合焦し、他方で、散乱ビームを準平行ビームに変換して、それが、大きな立体角（例えば、１：１．４の開口部に対して、頂点において２０°に近い半角、および０．１２πステラジアンの立体角）に従って光検出装置２０によって検出されるようにする。
【００６４】
したがって、図２に示すように、鏡面反射からのビームは、試料下流の点Ｃで対物レンズｆ１によって合焦されるのに対して、（試料によって再放射された）散乱ビームは、合焦されないが、準平行ビームに変換される。
【００６５】
注目すべきは、鏡面反射中に、光ビームが、入射ビームの波長と同一の波長で試料によって反射されることである。例えば蛍光またはラマン散乱における散乱中に、光ビームは、入射波長と異なる波長に基づいて、試料によって再放射または散乱される（レーリー散乱を除く）。
【００６６】
好ましくは、選択的遮断装置７０が、（対物レンズｆ１による）集光された光ビームの焦点面に配置される。
【００６７】
後で説明するように、この選択的遮断装置７０によって、表面プラズモン共鳴、蛍光およびラマン散乱を含む群から選択される少なくとも２つの分析技術に基づいて、試料を選択的に分析することが可能になる。
【００６８】
光ビームを選択的に遮断するための装置７０は、例えば、
−  ビームの合焦されていない部分を遮断して合焦された部分だけが検出装置２０側へ透過されるように焦点Ｃのまわりで前記対物レンズの焦点面に配置された絞り７１と、
−  点Ｃ上およびそのまわりに不透明領域を生成してビームの合焦された部分を遮断して合焦されていない部分だけが検出装置２０に透過することで、検出装置２０が大きな立体角に基づいて検出できるように、焦点Ｃに配置された、絞り７１と好適に相補的なシャッタ７２と、を含む。
【００６９】
光ビームを選択的に遮断するための装置７０は、高域フィルタおよび帯域フィルタを含む群から選択される少なくとも１つのフィルタ（図示せず）をさらに含んでもよい。
【００７０】
高域フィルタは、蛍光の検出用に設けられ、帯域フィルタは、ラマン散乱の検出用に設けられる。
【００７１】
好ましくは、帯域フィルタは、ラマンシフトを決定するための良好な解像度を取得できる狭帯域フィルタであり、好ましくはシャッタに配置される。この理由で、狭帯域干渉フィルタを使用することができる。好ましくは、フィルタの帯域幅は、３ｎｍ以下である。例えば、Ｍｅｌｌｅｓ  Ｇｒｉｏｔによって販売されている直径５０ｍｍのフィルタ、製品番号０３  ＦＩＬ  ００８は、６３２．８ｎｍの波長を中心に１ｎｍの帯域幅を有するが、２５ｃｍ−１の解像度でラマンシフトの測定を可能にする。
【００７２】
好ましくは、蛍光の測定に関して、励起用に用いられる光の波長を遮断するフィルタをシャッタ７２に配置してもよく、これにより試料１０の表面による、または光学系の欠陥もしくはダストによる励起光の散乱に起因する寄生放射を防ぐことができる。
【００７３】
好ましくは、検出感度を最適化するために、光学フィルタの組み合わせを用いてもよい。例えば、帯域フィルタの阻止率は、高域フィルタおよび／もしくは低域フィルタを重ね合わせることによって、または寄生信号の影響に対する保護を強化できるよう蛍光の検出帯域を制限するための低域フィルタおよび高域フィルタを重ね合わせることによって、遮断される所定の波長に対して向上させることができる。
【００７４】
様々な実施形態によれば、１つまたは複数のフィルタを前記シャッタ７２に結合することができ、フィルタをシャッタ７２の移動に固定してもよい。例えば、シャッタ７２は回転運動可能とすることができ、さらに少なくとも１つのフィルタからなるセットが、前記シャッタ７２の移動に固定されて回転運動可能とすることもできる。
【００７５】
したがって、絞り７１およびシャッタ７２は、表面プラズモン共鳴、蛍光およびラマン散乱を含む群から選択される種類の分析技術をそれぞれ選択できる。
【００７６】
装置７０による光ビームの選択的な遮断は、絞り７１とシャッタ７２の切り替えによって実行される。
【００７７】
絞り７１とシャッタ７２の切り替えは、機械スイッチによって、例えば、回転ディスクにより、好ましくは光学軸ＹＹと平行な軸ＸＸ（図１）のまわりの回転運動によって行うことができる。または例えば、スライドする引き出しによって、好ましくは焦点面ＦＦと平行な平面における移動運動により行ってもよい。
【００７８】
機械スイッチを用いる場合、ディスクまたは引き出しは、他の光学機能（明視野結像：広い絞り、暗視野結像：点Ｃのまわりの領域にカバーを用いる、フィルタなし）を有してもよい。また、液晶シャッタ装置またはエレクトロクロミック素子によって電気スイッチを設けることができる。
【００７９】
好ましくは、光ビームを選択的に遮断するための装置７０およびミラー５０（設けられた場合）を含むアセンブリは、機械的に厳密なブロックの形態で構成される。
【００８０】
注目すべきは、２つのアセンブリ（絞り７１＋場合によりフィルタおよびシャッタ７２
対  傾斜ミラー５０）が、対物レンズｆ１の焦点面ＦＦに、正確にかつ同時に位置し得ないことである。実際には、対物レンズｆ１の焦点深度およびミラー５０の直径（若干大きすぎてもよい）を考えれば、数ミリメートルのズレは許容できる。
【００８１】
したがって、光ビームの選択的な遮断により、異なる分析技術、すなわちプラズモン共
鳴、蛍光およびラマン用に同一の検出装置２０を使用することが可能である。
【００８２】
選択された分析技術に基づいて、すなわち光ビームの合焦された部分または合焦されていない部分の遮断に基づいて、試料１０を照明するための特定の波長を選択するように照明装置３０を適合させることができる。
【００８３】
照明装置３０は、可変または非可変の単色光ビームを放射する必要がある。
【００８４】
この目的のために、照明装置３０は、少なくとも１つの光ファイバのアセンブリおよび少なくとも１つのユニット光源のアセンブリを含んでもよい。
【００８５】
少なくとも１つのユニット光源が調整可能であること、および／または少なくとも１つのユニット光源が、白色光源であり、照明装置３０はさらに、モノクロメータを有してもよい。
【００８６】
複数の実施形態が可能である。例えば、各ファイバの入力部は、それぞれのユニット光源に接続してもよく、または一意のファイバの入力部は、ユニット光源からユニット光源へと切り替えて移動してもよい。代替形態として、一意のファイバが固定され、ユニット光源が、一意のファイバの入力部へ切り替えられる（移動される）ように構成してもよい。上述の通り、ファイバビーム、すなわち少なくとも２つのファイバの入力部がそれぞれの光源に接続可能なファイバビームを設けることができ、システムは、前記光源を選択的に作動させるための電気または光スイッチをさらに含む。
【００８７】
したがって、光ファイバ（入力部が一光源から別の光源に移動される一意のファイバ、もしくはそれぞれの光源にそれぞれ接続されるファイバであって、それらの１つにおける出力部が、試料１０を照明するように選ばれる（選択される）ファイバ）の端部を移動させることによる可動式に行うか、または例えば可変波長を備えた光源を用いたりモノクロメータに結合された白色光源を用いたりして非可動式に行うかで、光源の切替を行うことができる。
【００８８】
システムの動作は、以下の通りである。
【００８９】
ＬＳＰＲ構成における表面プラズモン共鳴の技術分析に関して、試料１０によって透過された（反射された）光ビームは、対物レンズｆ１の収束点Ｃに配置された絞り７１を通って集光され、絞りは、光ビームにおける合焦された部分だけが、検出装置２０に達するように、対物レンズｆ１の出力部において、ビームの合焦されていない部分をフィルタリングできるようにする。
【００９０】
測定技術、蛍光分析（ＦＥＡ）またはラマン散乱（ＳＥＲＳ）に関して、試料１０によって透過された（反射された）光ビームは、シャッタ７２（好ましくは絞り７１と相補的）によって遮断されるが、シャッタ７２は、光ビームにおける合焦されていない部分だけが検出装置２０に達するように、対物レンズｆ１の出力部において、ビームの合焦された部分をフィルタリングできるようにする。したがって、光は、大きな立体角にわたって検出器によって集光される。
【００９１】
標準ラマン結像の実現のためには、分子的同定（ラマンシフト）を可能にするラマン特徴を決定するために、単色励起によって非弾性的に散乱された光を分析する必要があることから、これまで設計者は、試料と検出器との間にスペクトル分析装置（分散素子、および／または遅延素子の組み合わせ）を挿入していた。この制約があると、ＬＳＰＲ分析用の反射測定との直接比較を可能にするシステムを作製することが困難になる。
【００９２】
他方、この制約を解決するために、本解決法では、決定された波長におけるラマン散乱の検出を達成すること、および励起波長を変更することによってラマンシフトの測定を実行することを提案するが、それは、ＬＳＰＲ画像、ラマンおよび蛍光の単純で直接的な比較を可能するものであり、正に革新的であると考えられる。特に、画像処理を行わずに画像を比較でき、また異なるコントラストを有し、異なる技術によって記録された画像を画素ごとに比較できる可能性がある点で有用である。
【００９３】
さらに、本解決法に従ってラマン散乱を測定または分析するための技術に関して、光源は、励起用に異なる波長を選択することによって異なるラマンシフトを測定できるように、単色で調整可能である。したがって、ラマン画像は、光源からの励起波長λ＿ｅｘｃに対して、検出に使用される狭帯域フィルタによって選択された波長λ＿ｄｅｔで散乱された光に対応して直接記録される。ラマンシフトは、取得画像と全ての点で同じであり、その値Δν（波数で表される）は、Δν＝（１／λ＿ｅｘｃ）−（１／λ＿ｄｅｔ）によって与えられる。
【００９４】
λ＿ｅｘｃの異なる値に対する画像を連続的に記録することにより、他の技術によって記録された画像と直接的かつ容易に比較可能な異なるラマンシフト用の画像が得られる。
【００９５】
放射は、励起放射の波長と異なる波長で検出されるので、上記の原理を保持しつつさらに、試料１０または光学系のレーリー散乱に起因するあらゆる寄生寄与の発生が抑制されるという利点が得られる。
【００９６】
したがって、ラマン散乱の測定に関して、十分に強い光源であって、正確に定義された波長を有する光源を用いることは有用である。
【００９７】
この点に関して、レーザまたはレーザダイオードが用いられ、発光ダイオードより好ましい。
【００９８】
例えば、調整可能な固体レーザ（例えば、チタン型のレーザ：励起に必要な波長領域に依存して周波数二倍システムを装備可能としたサファイア）または光パラメトリック発振器（ＯＰＯ）に基づいた光源を、光源として設けてもよい。
【００９９】
これらの光源は、連続光源またはパルスとすることができる。パルス光源を用いる場合は、光源の単色特性およびできるだけ高い繰り返し率を維持するように、１００ｆｓ以上のパルス持続時間を有することが有用である。例えば、１０Ｈｚ以上の繰り返し率を備え、数十ｍＪを伝える数ｎｓのパルスの形態で照明を提供するＯＰＯに基づいた商用光源を用いてもよい。かかる光源は、ラマン効果の観察に好適な高い瞬時電力を供給する。しかし、周知のラマンの信号の存在または不在を測定することが求められている場合に、調整可能な励起源を用いないこと、および１つもしくは２つまたは非常に少数の単色光源（好ましくは、複数の光源が存在することによって、ラマン散乱が予想されない基準測定を提供することが可能になる）だけを用いると経済的となる場合もある。
【０１００】
したがって、高解像度を用いたおよび／または広範囲のラマンシフトにおける分光測定を好適に行うことができる。
【０１０１】
ここでも注目すべきは、ラマン散乱測定に関して、検出信号における寄生放射の存在を回避するために、検出用に選択された波長にストップバンドが集中する（遮断用）阻止フィルタによって、励起光ビームをフィルタリングすることが有用であることである。このフィルタストップバンドの幅は、システムによって測定できる最も低いラマンシフトを決
定する。例えば、このフィルタは、高い阻止力を備えたホログラフィックフィルタとすることができる。例えば、Ｏｒｉｅｌによって販売されている製品番号５３６８４のフィルタは、２８ｎｍの遮断帯域幅で、１０６より高い係数だけ、６３２．８ｎｍにおける放射の強度を低減し、かつ３５０ｃｍ−１を超えるラマンシフトを検出できる。しかし、このフィルタは、励起時に透過で用いられるので、より小さい遮断パワーを備えるが、高励起強度に対してより抵抗性のシステムを有するように、遮断帯域の外側の優れた透過性を有するフィルタを用いることが有用になり得る。例えば、Ｅｄｍｕｎｄ  Ｏｐｔｉｃｓによって販売されている製品番号Ｂ４６−５６６の連続インデックス変化を備えた多層フィルタは、３２ｎｍよりわずかに小さい遮断帯域幅で、１０３より高い係数だけ、６３２．８ｎｍに対する放射強度を低減し、それによって、４００ｃｍ−１より高いラマンシフトを検出できるようにする。これらの遮断帯域外の高透過性を考えると、阻止力を向上させるために、これらのフィルタの２つまたはそれ以上を直列で使用することが可能である。好ましくは、光源が、ＯＰＯに基づいたレーザまたはレーザ光源である場合に、阻止フィルタは、光源出力部に配置される。
【０１０２】
対物レンズｆ１の焦点面において鏡筒に挿入されたフィルタおよび絞りのセットの単純な取り替えによって、反射測定の配置から蛍光測定またはラマン散乱の配置に切り替えることが可能になる。
【０１０３】
また、本システムでは、追加の絞りのセットを付加することで、基本的な結像機能（明視野／暗視野）を維持できるようにすることができる。これにより、速度測定を達成するために、空気中で、または液体培地に接してリアルタイムで試験を実行することが可能になる。同じテスト内で異なる技術を組み合わせることによって、ターゲットまたはプローブのマーキングがあってもなくても、化学または生化学特性の情報を取得し、少なくとも２つの独立した技術による取得情報を相関させ、試験に使用されるホルダにおける試験の動作制御をリアルタイムに実行することが可能になる。
【０１０４】
したがって、本システムは、試料１０の化学、生物学または生化学分析の方法を実行することができ、前記試料は、単色光ビームで照明され、前記試料の複数の画像が、表面プラズモン共鳴、蛍光およびラマン散乱を含む群から選択される少なくとも２つの分析技術間における切り替えによって取得され、前記画像は、重ね合わされる。
【０１０５】
ラマン散乱測定に関するＵＶ−可視の透過／反射測定に関して、必要なスペクトル分析は、複数の励起波長に対応する複数の画像を記録することによって実行される。この場合、調整可能な光源を使用すると有用である場合がある。
【０１０６】
本発明により、透過または鏡面的に反射されたビームを合焦させて、そのビームに絞り（反射／透過）を通過させるか、またはそのビームをシャッタによってマスク（蛍光、ラマン散乱）することによってそのビームを選択しつつ、検査対象の表面を結像できるようにすることが可能である。ラマン分析に関して、異なるモードで記録された画像を容易に比較するために、分散分析装置も空間フィルタリング装置も、本検出システムでは使用されず、一方フィルタによって選択された波長の狭帯域で放射された光だけが検出される。
【０１０７】
以上より、本解決法により、ＬＳＰＲ、ＳＥＲＳおよび蛍光による検出／分析モードの利点を同一装置において組み合わせることが可能になる。したがって、本装置によって、異なる種類のコントラストで同一試料の画像を複数枚重ね合わせた画像を取得することができ、２つの異なる物理的影響を強め、プローブの化学的固定に関連する通常の限界を超えた検査を可能にする高いＬＳＰＲ活性を備えた層を有するホルダに対して特に有用である。装置の組み合わせ、すなわち上記のホルダを用いる本発明の目的は、複合技術を用いたリアルタイムの検出を用い、生理的溶液における通常の試験条件下で、高性能の化学お
よび生化学試験を可能にすることである。
【０１０８】
本発明は、上記の実施形態に限定されない。本発明は、他の条件においても適用することができる。例えば、約１００μｍのサイズの粒子に特定の光学構造を与えることによって、当該粒子をコード化する可能性を利用すると、バイオチップとは異なる態様で、超並列生物学的認識試験を実行することが可能である。コード化された粒子を用いれば、１０６個を超える多数の異なるコードを低コストで作成できる。これらのコードは、粒子の反射スペクトルを測定することで読み取られる。この試験を実行するには、同一のプローブが、同一コードの全ての粒子上にグラフトされ、次に全粒子が、蛍光団によってマーキングされたターゲットを含有する分析対象の試料と接するように載置される。次いで、粒子は、顕微鏡スライドの表面で（堆積の後、蒸発によって）分散され、光学顕微鏡の下で各粒子の反射スペクトルおよび蛍光を測定することによって分子認識が分析される。本発明は、多数の粒子に帯する結像モードにおいて上記の測定を同時に実行するための解決法を提供することで、これまで達成されなかった、広帯域における上記種類の試験を実行可能とする解決法を提供する。
【図１】
0005985502.tif 000002
【図２】
0005985502.tif 000003