(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子中の標的配列に相補的な塩基配列からなるアンチセンス鎖RNA、及び該アンチセンス鎖RNAに相補的な塩基配列を有するセンス鎖RNAを有し、且つ前記標的遺伝子の発現を抑制できる2本鎖RNAであって、該センス鎖RNAの５’末端から１〜６番目のヌクレオチドの少なくとも１つに直接又はリンカーを介して2本鎖脂質が結合しており、該2本鎖脂質がホスファチジルエタノールアミンであることを特徴とする、2本鎖脂質修飾RNA。
【請求項２】
前記センス鎖RNAの５’末端側が平滑末端であり、且つ前記センス鎖RNAの３’末端側が平滑末端又はダングリングエンドを有している、請求項１に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
【請求項３】
前記センス鎖RNAの５’末端側及び３’末端側が共にダングリングエンドを有している、請求項１に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
【請求項４】
前記センス鎖RNAを構成するヌクレオチドの数が２１〜２７である、請求項１乃至３のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNA。
【請求項５】
前記センス鎖RNAの５’末端側及び３’末端側が共に平滑末端であり、前記センス鎖RNA及び前記アンチセンス鎖がそれぞれ２７個のヌクレオチドから構成されている、請求項２に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
【請求項６】
前記センス鎖RNAの５’末端側及び３’末端側が共に平滑末端であり、前記センス鎖RNA及び前記アンチセンス鎖がそれぞれ２３個のヌクレオチドから構成されている、請求項２に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
【請求項７】
前記センス鎖RNAの５’末端側が平滑末端であり、前記センス鎖RNAが２５個のヌクレオチドから構成され、且つ前記アンチセンス鎖が２３個のヌクレオチドから構成されている、請求項２に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
【請求項８】
前記センス鎖RNA及び前記アンチセンス鎖がそれぞれ２１個のヌクレオチドから構成されている、請求項３に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
【請求項９】
前記2本鎖脂質を構成する２つの疎水基が、同一又は異なって、炭素数6〜50の飽和脂肪酸残基又は不飽和脂肪酸残基である、請求項１乃至８のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNA。
【請求項１０】
前記2本鎖脂質が、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、１−パルミトイル−２−オレイル−ホスファチジルエタノールアミン、及びジオレイルホスファチジルエタノールアミンよりなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１乃至９のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNA。
【請求項１１】
前記センス鎖RNAの５’末端から１〜６番目のヌクレオチドの少なくとも１つに、下記一般式（L-27）で表される構造のリンカーを介して脂質が結合している、請求項１乃至１０のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNA。
【化１】
0005906508.tif 000008
［式中、n3及びn4は、同一又は異なって、１〜20の整数を示す。］
【請求項１２】
請求項１乃至１１のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNAと、薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
標的遺伝子の発現を抑制するための医薬を製造するための、請求項１乃至１１のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNAの使用。
【請求項１４】
請求項１乃至１１のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNAを細胞内に導入する工程を含む、標的遺伝子の発現抑制方法（但し、ヒトに対する医療行為を除く）。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的遺伝子の発現を効率的に抑制できる2本鎖脂質修飾RNAに関する。より具体的には、ヌクレアーゼ耐性及び細胞内導入率が高く、優れたRNA干渉効果を奏することができる2本鎖脂質修飾RNAに関する。更に、本発明は、該2本鎖脂質修飾RNAを利用した医薬組成物、及び標的遺伝子の発現抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガンやエイズなどの難病を効率的に治療する医薬の開発は、ライフサイエンス分野における大きな一つの課題である。この課題を克服できる可能性がある有力な方法の一つとして、特定の遺伝子にのみ作用する遺伝子医薬がある。この遺伝子医薬の中でも特に最近21塩基の短い2本鎖RNA (small interfering RNA：siRNA )を利用するRNA干渉(RNA interference：RNAi)法が注目されている。このRNAi法は、1998年にFireらにより初めて報告された（非特許文献１参照）。Fireらの報告によると、機能阻害したい遺伝子の特定領域と相同な100塩基対程度の2本鎖ＲＮＡを細胞内へ導入させることにより、細胞質内でDicerの働きにより20〜25塩基対程度の2本鎖RNAへと分解され、その後複数のタンパク質とRNA/タンパク質複合体を形成し（この複合体をRICS:RNA-induced silencing complexと呼ぶ）、標的遺伝子から産出されたmRNAの相同部位と結合し強力に遺伝子発現を抑制するというものである。しかしながら、哺乳細胞では、約30塩基対以上の長い2本鎖RNAを導入させると、ウィルス応答反応であるインターフェロン反応が誘導され結果的に細胞が死んでしまうという現象が報告され、哺乳動物細胞系ではRNAi法は適用し難いと考えられた。そこでTuschlらは、2本鎖RNAの両3’末端にダングリングエンドをもつ21塩基長の2本鎖RNAを化学的に合成し、哺乳動物細胞へ直接導入させることにより、インターフェロン応答を回避し配列特異的に高い遺伝子発現抑制能を示すことを報告した（非特許文献２参照）。また彼らは、2本鎖領域が19塩基対で、3’末端又は5’末端に様々な長さのダングリングエンド鎖をもつ短い2本鎖RNAを合成しRNA干渉効果を検討した。その結果、両3’末端に2塩基のダングリングエンドをもつ21塩基長のsiRNAは非常に高いRNA干渉効果が観測されたが、それ以外のあらゆるタイプの短い2 本鎖RNAにおいては顕著なRNA干渉効果が観測されなかった。この報告により、今日では21塩基長であり、両3’末端に2塩基のダングリングエンドをもつ2本鎖RNAを用いたRNA干渉法が一般的となっている。ここでは21塩基長の短い2本鎖RNAを用いて標的遺伝子発現を阻害する方法を、RNAi法と区別してsiRNA法と呼ぶ。【０００３】
このsiRNA法は合成RNAを用いるのでサンプル調整も比較的容易であり、取り扱い操作も簡便で、かつ、非常に強力な効果を示す為、ライフサイエンス分野のみならずバイオビジネス分野においても大きな注目を浴びている。【０００４】
しかしながら、この優れたsiRNA法にも解決しなければならない問題点がある。上記したようにsiRNAはRNA分子から構成されており、細胞内および培地中に含まれるヌクレアーゼの働きにより速やかに分解される。また2本鎖RNA領域は1本鎖RNAに比べ比較的高いヌクレアーゼ耐性を示すが、19塩基対からなる2本鎖RNAは殆ど従来のRNA干渉効果を示さない。そのため合成siRNAは、標的遺伝子配列をもつ細胞への導入後、2日〜4日間程度までは高い遺伝子発現抑制効果を示すが、その後はRNA干渉効果が急激に弱まり、7日程度でRNA干渉効果が殆ど無くなると報告されている。【０００５】
最近、合成siRNAにおいて細胞導入性に優れ長時間高活性なRNA干渉効果を獲得するために、様々な化学修飾型siRNAが報告されている。例えば、エキソヌクレアーゼからの分解耐性を獲得する為に、siRNAの末端をアミノ基やチオール基、アベーシックなどに修飾したsiRNAが合成されている。しかしながら、末端を修飾した21塩基長のsiRNAのほとんどの場合で、RNA干渉効果が著しく減少すると既に報告されている。【０００６】
一方、近年、J. Rossiらの報告により、27塩基対からなる2本鎖RNAが21塩基長からなるsiRNAに比べ100倍程度高いRNA干渉効果を示すことが明らかとなった（非特許文献３参照）。これは、27塩基対からなるRNAがRNase III様の酵素であるDicerによって21塩基長のsiRNAに切断された後、タンパク複合体であるRISCにそのまま認識され、高効率にsiRNA効果を発揮できる為だと考えられている。【０００７】
このように、27塩基長のRNAは、優れたRNA干渉効果を奏し得るため、今後、遺伝子医薬としての応用が益々期待されている。しかしながら、27塩基長のRNAによるRNA干渉効果をより増強させるためには、どのような技術的手段が有効であるかについては一切分かっていない。更に、RNA干渉効果を奏する2本鎖RNAに関して、27塩基長のRNAのみならず、他の塩基長のRNAについても、RNA干渉効果を高めるための技術的手段については明らかにされていない。【０００８】
また、RNA干渉効果を奏する2本鎖RNAでは、末端にダングリングエンドを有する構造が一般的に採用されているが、末端にダングリングエンドを有していない構造（即ち、平滑末端を有する構造）についても、RNA干渉効果の検討が行われている。しかしながら、センス鎖RNAの５’末端側を平滑末端にした構造では、センス鎖RNAの５’末端側にダングリングエンドがある場合に比して、RNA干渉効果が殆ど変わらない、或いはRNA干渉効果が低減することが示唆されている（非特許文献４参照）。【０００９】
一方、脂質は、細胞膜に対する親和性および透過性が高く、細胞内に薬物を送達するのに有用であることが分かっている。このような脂質を、RNA干渉効果を奏する2本鎖RNAに結合させることによって、細胞内導入率を高めて、RNA干渉効果をより一層有効に奏させることが期待される。しかしながら、RNA干渉効果を奏する2本鎖RNAに、単に脂質を結合させると、RNA干渉効果の顕著な減弱化を招くことが分かっており、従来技術では、優れたRNA干渉効果と脂質に基づく有用効果とを兼ね備えた脂質修飾RNAを構築できていないのが現状である。
【非特許文献１】Fire et. al, Nature, 391, 806-811 (1998)
【非特許文献２】Tuschl et. al., EMBO Journal, 20, 6877-6888 (2001)
【非特許文献３】J. Rossi et. al. Nature Biotech., 23, 222-226 (2005)
【非特許文献４】J. T. Marques et. al., Nature Biotech., 24, 559-565 (2006)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ヌクレアーゼ耐性及び細胞内導入率が高く、且つ優れたRNA干渉効果を奏し得る新規な二本鎖RNAを提供することを目的とする。更に、本発明は、該新規な2本鎖RNAを利用した医薬組成物、及び標的遺伝子の発現抑制方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねたところ、標的遺伝子中の標的配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖RNA、及び該アンチセンス鎖RNAに相補的な塩基配列を含むセンス鎖RNAを有し、標的遺伝子の発現を抑制できる2本鎖RNAにおいて、該センス鎖RNAの５’末端側から１〜６番目のヌクレオチドの少なくとも１つに直接又はリンカーを介して２本鎖の脂質を結合させることによって、ヌクレアーゼ耐性、細胞内導入率、及びRNA干渉効果を格段に向上させたRNAを構築できることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて、更に改良を重ねることにより完成したものである。
【００１２】
即ち、本発明は、下記に掲げる2本鎖脂質修飾RNA、医薬組成物、使用、及び標的遺伝子の発現抑制方法を提供する。
項１．  標的遺伝子中の標的配列に相補的な塩基配列からなるアンチセンス鎖RNA、及び該アンチセンス鎖RNAに相補的な塩基配列を有するセンス鎖RNAを有し、且つ前記標的遺伝子の発現を抑制できる2本鎖RNAであって、該センス鎖RNAの５’末端から１〜６番目のヌクレオチドの少なくとも１つに直接又はリンカーを介して2本鎖脂質が結合していることを特徴とする、2本鎖脂質修飾RNA。
項２．  前記センス鎖RNAの５’末端側が平滑末端であり、且つ前記センス鎖RNAの３’末端側が平滑末端又はダングリングエンドを有している、項１に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
項３．  前記センス鎖RNAの５’末端側及び３’末端側が共にダングリングエンドを有している、項１に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
項４．  前記センス鎖RNAを構成するヌクレオチドの数が２１〜２７である、項１乃至３のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNA。
項５．  前記センス鎖RNAの５’末端側及び３’末端側が共に平滑末端であり、前記センス鎖RNA及び前記アンチセンス鎖がそれぞれ２７個のヌクレオチドから構成されている、項２に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
項６．  前記センス鎖RNAの５’末端側及び３’末端側が共に平滑末端であり、前記センス鎖RNA及び前記アンチセンス鎖がそれぞれ２３個のヌクレオチドから構成されている、項２に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
項７．  前記センス鎖RNAの５’末端側が平滑末端であり、前記センス鎖RNAが２５個のヌクレオチドから構成され、且つ前記アンチセンス鎖が２３個のヌクレオチドから構成されている、項２に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
項８．  前記センス鎖RNA及び前記アンチセンス鎖がそれぞれ２１個のヌクレオチドから構成されている、項３に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
項９．  前記2本鎖脂質を構成する２つの疎水基が、同一又は異なって、炭素数6〜50の飽和脂肪酸残基又は不飽和脂肪酸残基である、項１乃至８のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNA。
項１０．  前記2本鎖脂質が、グリセロリン脂質、グリセロ糖脂質、ジアシルグリセロール、又はセラミドである、項１乃至９のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNA。
項１１．  前記2本鎖脂質が、グリセロリン脂質である、項１乃至９のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNA。
項１２．  前記2本鎖脂質が、ホスファチジルエタノールアミンである、項１１に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
項１３．  前記2本鎖脂質が、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、１−パルミトイル−２−オレイル−ホスファチジルエタノールアミン、及びジオレイルホスファチジルエタノールアミンよりなる群から選択される少なくとも１種である、項１２に記載の2本鎖脂質修飾RNA。
項１４．  前記センス鎖RNAの５’末端から１〜６番目のヌクレオチドの少なくとも１つに、下記一般式（L-27）で表される構造のリンカーを介して脂質が結合している、項１乃至１３のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNA。
【００１３】
【化１】
0005906508.tif 000002
【００１４】
［式中、n3及びn4は、同一又は異なって、１〜20の整数を示す。］
項１５．  項１乃至１４のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNAと、薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
項１６．  標的遺伝子の発現を抑制するための医薬を製造するための、項１乃至１４のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNAの使用。
項１７．  項１乃至１４のいずれかに記載の2本鎖脂質修飾RNAを細胞内に導入する工程を含む、標的遺伝子の発現抑制方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の2本鎖脂質修飾RNAは、センス鎖RNAの5’末端側が2本鎖脂質で修飾されており、これによって飛躍的にRNA干渉効果が向上している。特に、本発明の2本鎖脂質修飾RNAは、特定の部位に対して2本鎖脂質が結合することにより、DicerによるプロセシングやRISCとの複合体形成能を妨げることなく、しかもヌクレアーゼ耐性及びRNA干渉効果が格段顕著に向上しているので、医薬用途への応用に大きく貢献できる。【００１６】
更に、本発明の2本鎖脂質修飾RNAは、単独でも格段に優れた細胞内移行能を示すので、従来の遺伝子導入試薬を別途用いずに、或いは従来の遺伝子導入試薬の使用量を低減して、細胞内に導入することも可能である。故に、本発明の2本鎖脂質修飾RNAは、従来の遺伝子導入試薬の使用によって懸念される細胞毒性の発現を抑制でき、臨床的な応用において高い安全性が確保できる。【００１７】
このため、本発明の2本鎖脂質修飾RNAを利用した医薬組成物又は標的遺伝子の発現抑制方法によれば、より効果的に標的遺伝子の発現を抑制又は阻害することが臨床上可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例１において、2本鎖脂質修飾センス鎖RNAをＨＰＬＣ解析した結果を示す図である。
【図２】実施例１において、2本鎖脂質修飾RNAの２本鎖RNAの形成を確認した結果を示す図である。図２のＡ中、(1)は21nt siRNA、(2)はDPPE L21A/L21BのRNA、(3)はPOPE L21A/L21BのRNA、(4)はDOPE L21A/L21BのRNA、(5)はDMPE L21A/L21BのRNAの結果を示す。図２のＢ中、(1)は27nt dsRNA、(2)はDPPE L27A/L27BのRNA、(3)はPOPE L27A/L27BのRNA、(4)はDOPE L27A/L27BのRNA、(5)はDMPE L27A/L27BのRNAの結果を示す。
【図３】実施例１において、2本鎖脂質修飾RNAのヌクレアーゼ耐性結果を示す図である。
【図４】実施例１において、2本鎖脂質修飾RNAのDicerによるプロセシングを検討した結果を示す図である。
【図５】実施例１において、2 nM濃度のときの2本鎖脂質修飾27nt dsRNAのRNA干渉効果の結果を示す図である。
【図６】実施例２において、2本鎖脂質修飾センス鎖RNAのＨＰＬＣ解析結果を示す図である。
【図７】実施例２において、2本鎖脂質修飾RNAの２本鎖形成を確認した結果を示す図である。図７のＡ中、A-1の(1)は21nt siRNA、(2)はDPPE v21A/v21BのRNAの結果を示し、A-2の(1)は21nt siRNA、(2)はPOPE v27A/v27BのRNA、(3)はDOPE v27A/v27BのRNA、(4)はDMPE v27A/v27BのRNAの結果を示す。図７のＢ中、(1)は27nt dsRNA、(2)はDPPE v27A/v27BのRNA、(3)はPOPE v27A/v27BのRNA、(4)はDOPE v27A/v27BのRNA、(5)はDMPE v27A/v27BのRNAの結果を示す。
【図８】実施例２において、2本鎖脂質修飾RNAのヌクレアーゼ耐性結果を示す図である。
【図９】実施例２において、2本鎖脂質修飾RNAのDicerによるプロセシングを検討した結果を示す図である。
【図１０】実施例２において、2本鎖脂質修飾RNAのHeLa, A549細胞中VEGF遺伝子に対するRNA干渉効果の結果を示す図である。
【図１１−１】実施例２において、2本鎖脂質修飾RNAのHeLa細胞中VEGF遺伝子に対する細胞導入性の結果を示す図である。図中、FLには蛍光顕微鏡にて撮影した像、transは、上記FLと同一視野を位相差顕微鏡にて撮影した像、mergeは上記FLとtransを重ね合わせた像を示す。
【図１１−２】実施例２において、2本鎖脂質修飾RNAのA549細胞中VEGF遺伝子に対する細胞導入性の結果を示す図である。図中、FLには蛍光顕微鏡にて撮影した像、transは、上記FLと同一視野を位相差顕微鏡にて撮影した像、mergeは上記FLとtransを重ね合わせた像を示す。
【図１２】実施例３において、2本鎖脂質修飾RNAをＨＰＬＣ解析した結果を示す図である。
【図１３】実施例３において、2本鎖脂質修飾RNAの合成を確認した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本明細書において、「平滑末端」とは、2本鎖RNAの末端部分において、センス鎖の末端領域とそれに対合するアンチセンス鎖の末端領域が、1本鎖部分を形成することなく（即ち、突出部を形成することなく）対合している構造のことである。また、「ダングリングエンド」とは、オーバーハングとも称される構造を指し、2本鎖RNAの末端部分のセンス鎖の末端領域又はそれに対合するアンチセンス鎖の末端領域において、対合する塩基が存在しないために2本鎖を形成できず、一本鎖が存在している塩基配列部分（突出部）を意味する。また、本明細書において、「2本鎖脂質修飾RNA」とは、２本鎖脂質が結合している2本鎖（ダブルストランド）のRNA分子を指す。【００２０】
本発明の2本鎖脂質修飾RNAは、標的遺伝子中の標的配列に相補的な塩基配列であるアンチセンス鎖RNAを含む。
【００２１】
ここで、標的遺伝子とは、RNA干渉効果によって遺伝子発現の抑制対象となる遺伝子である。本発明の2本鎖脂質修飾RNAにおいて、標的対象遺伝子については、特に制限されず、該2本鎖脂質修飾RNAの用途に基づいて適宜選択することができる。【００２２】
標的遺伝子中の標的配列については、RNA干渉効果によって遺伝子発現を抑制可能な配列である限り特に制限されず、公知の方法で、具体的には、NCBIのBLASTサーチ等を用いて適宜決定することができる。例えば、標的遺伝子のコード領域(ORF)の開始コドンから５０〜１００塩基下流のエキソン部分にある塩基"AA"に続く１９〜３０塩基からなる領域であって、GC含有量が50%前後の領域を標的配列とすればよい。このような標的配列に対する相補鎖を採用することで、優れたRNA干渉効果を獲得することが、当業界で経験的に明らかにされている。また、例えば、上記標的配列は、IDT社（Integrated DNA Technologies, INC）のマニュアル（Dicer Substrate RNAi Design）に従って設定することが出来る。また最近では、（i）アンチセンス鎖RNAの5’末端がA/Uペアであり、（ii）センス鎖RNAの5’末端がG/Cペアであり、（iii）アンチセンス鎖RNAの5’末端側に5つ程度のA/Uペアがあり、且つ（vi）2本鎖中に9つ以上のG/Cペアが無い2本鎖RNAを設計することで高いRNA干渉効果をもつ2本鎖RNAをデザインできると報告されている（Ui-Tei et. al, Nucleic Acids Res., 32, 936-948 (2004)）。【００２３】
本発明の2本鎖脂質修飾RNAにおいて、アンチセンス鎖にダングリングエンドが存在しない場合、該アンチセンス鎖は標的配列に相補的な塩基配列からなるものである。また、ダングリングエンドがアンチセンス鎖の5'末端及び／又は3'末端に存在している場合、該アンチセンス鎖は、標的配列に相補的な塩基配列の5'末端及び／又は3'末端に、ダングリングエンドを構成する塩基配列が連結した塩基配列からなるものである。
【００２４】
本発明の2本鎖脂質修飾RNAにおいて、前記アンチセンス鎖RNAを構成するヌクレオチドの数についてはRNA干渉効果を奏し得る限り特に制限されず、該2本鎖脂質修飾RNAに備えさせる構造等に応じて適宜設定されるが、通常２１〜２７個、好ましくは２１、２３、２５、又は２７個、更に好ましくは２１又は２７個が挙げられる。なお、ここでいうアンチセンス鎖RNAを構成するヌクレオチドの数とは、該アンチセンス鎖にダングリングエンドが存在していない場合には標的配列に相補的な塩基配列を構成するヌクレオチドの総数を意味し、該アンチセンス鎖にダングリングエンドが存在している場合には該ダングリングエンドを構成するヌクレオチドの数と標的配列に相補的な塩基配列を構成するヌクレオチドの数の総和を意味する。
【００２５】
また、2本鎖脂質修飾RNAは、前記アンチセンス鎖に相補的な塩基配列を含むセンス鎖を有する。
【００２６】
本発明の2本鎖脂質修飾RNAにおいて、センス鎖にダングリングエンドが存在しない場合、該センス鎖は、前記アンチセンス鎖の「標的配列に相補的な塩基配列」の一部又は全部に対して相補的である塩基配列からなるものである。また、ダングリングエンドがセンス鎖の5'末端及び／又は3'末端に存在している場合、該センス鎖は、前記アンチセンス鎖の「標的配列に相補的な塩基配列」の一部又は全部に対して相補的である塩基配列の5'末端及び／又は3'末端に、ダングリングエンドを構成する塩基配列が連結した塩基配列からなるものである。
【００２７】
本発明の2本鎖脂質修飾RNAにおいて、前記センス鎖RNAを構成するヌクレオチドの数についてはRNA干渉効果を奏し得る限り特に制限されず、該2本鎖RNAに備えさせる2本鎖RNA構造等に応じて適宜設定されるが、通常２１〜２７個、好ましくは２１、２３、２５、又は２７個、更に好ましくは２１、２３、又は２７個が挙げられる。なお、ここでいうセンス鎖RNAを構成するヌクレオチドの数とは、該センス鎖にダングリングエンドが存在していない場合には標的配列に相補的な塩基配列を構成するヌクレオチドの総数を意味し、該センス鎖にダングリングエンドが存在している場合には該ダングリングエンドを構成するヌクレオチドの数と標的配列に相補的な塩基配列を構成するヌクレオチドの数の総和を意味する。
【００２８】
本発明の2本鎖脂質修飾RNAにおいて、前記センス鎖RNAと前記アンチセンス鎖RNAを構成するヌクレオチドは、基本的にはリボヌクレオチドであるが、分解酵素耐性の向上を目的として2’−O−メチル修飾型や2’−F修飾型、LNA（Locked Nucleic Acid）等の各種化学修飾型ヌクレオチド、或いはデオキシリボヌクレオチド等をRNA配列中に含んでいてもよい。特に、本発明の2本鎖脂質修飾RNAがダングリングエンドを有する構造の場合には、前記センス鎖RNA及び／又は前記アンチセンス鎖RNAにおける当該ダングリングエンドの構成部分は、デオキシリボヌクレオチドで構成されていてもよい。このような化学修飾型ヌクレオチドとしては、具体的には、ホスホロチオエート型、ボラノフォスフェート型DNA/RNA等のリン酸骨格を修飾したもの；2’−0Me修飾RNA、2’−F修飾RNA等の2’修飾ヌクレオチド；LNA（Locked Nucleic Acid）やENA（2'-O,4'-C-Ethylene-bridged nucleic acids）等のヌクレオチドの糖分子を架橋した修飾ヌクレオチド；PNA（ペプチド核酸）、モリフォリノヌクレオチド等の基本骨格が異なる修飾ヌクレオチド；５−フルオロウリジンや５−プロピルウリジンなどといった塩基修飾型ヌクレオチド等が例示される。【００２９】
本発明の2本鎖脂質修飾RNAにおいて、前記センス鎖RNAと前記アンチセンス鎖RNAがハイブリダイズして2本鎖を形成している限り、その構造については特に制限されないが、好ましい構造として、(A)前記センス鎖RNAの5'末端側が平滑末端（ブランドエンド）であり、且つ前記センス鎖RNAの3'末端側が平滑末端又はダングリングエンド（一本鎖領域、突出部）を有している構造、並びに(B)前記センス鎖RNAの5'末端側及び3'末端側の双方にダングリングエンドを有している構造が例示される。このように、上記(A)又は(B)の構造をとることによって、2本鎖脂質で修飾していながらも、RNA干渉効果の減弱化を招くことなく、細胞内導入効率を一層顕著に向上させることが可能になる。ここで、センス鎖RNAの3'末端側にダングリングエンドを有する構造には、センス鎖RNAの3'末端領域がダングリングエンドを構成している場合と、アンチセンス鎖RNAの5'末端領域がダングリングエンドを構成している場合の双方の場合が含まれる。また、センス鎖RNAの5'末端側にダングリングエンドを有する構造には、センス鎖RNAの5'末端領域がダングリングエンドを構成している場合と、アンチセンス鎖RNAの3'末端領域がダングリングエンドを構成していている場合の双方の場合が含まれる。【００３０】
本発明の2本鎖脂質修飾RNAを構成する2本鎖RNAの内、特に優れたRNA干渉効果を発現させるという観点から、特に好ましい構造として、上記(A)の構造に含まれるものとして以下の(A-1)〜(A-3)の構造が例示され、上記(B)の構造に含まれるものとして以下の(B-1)の構造が例示される：（A-1）前記センス鎖RNAの５’末端側及び３’末端側が共に平滑末端であり、該センス鎖RNA及び該アンチセンス鎖RNAがそれぞれ２７個のヌクレオチドから構成されている構造；(A-2)前記センス鎖RNAの５’末端側及び３’末端側が共に平滑末端であり、該センス鎖RNA及び該アンチセンス鎖RNAがそれぞれ２３個のヌクレオチドから構成されている構造；(A-3)前記センス鎖RNAの５’末端側が平滑末端であり、該センス鎖RNAが２５個のヌクレオチドから構成され、且つ前記アンチセンス鎖RNAが２３個のヌクレオチドから構成されている構造；(B-1)前記センス鎖RNAの3'末端及び前記アンチセンス鎖RNAの3'末端の双方に２個のヌクレオチドからなるダングリングエンドがそれぞれ形成されており、該センス鎖RNA及び該アンチセンス鎖がそれぞれ２１個のヌクレオチドから構成されている構造。【００３１】
即ち、上記(A-1)及び(A-2)の構造は、センス鎖RNAとアンチセンス鎖RNAが、両末端にダングリングエンドを形成させることなく、ハイブリダイズしている構造である。また、上記(A-3)の構造は、センス鎖RNAの5’末端側が平滑末端であり、且つセンス鎖RNAの3’末端から１〜２番目のヌクレオチドがダングリングエンドを形成するように、センス鎖RNAとアンチセンス鎖RNAがハイブリダイズしている構造である。また、上記(B-1)の構造は、センス鎖の5'末端から１〜１９番目のヌクレオチドとアンチセンス鎖RNAの3'末端から３〜２１番目のヌクレオチドがハイブチダイズしており、センス鎖RNAの3'末端から１〜２番目のヌクレオチドとアンチセンス鎖RNAの3'末端から１〜２番目のヌクレオチドがぞれぞれダングリングエンドを形成している構造である。【００３２】
本発明の2本鎖脂質修飾RNAは、上記センス鎖RNAの5'末端側から１〜６番目のヌクレオチドの少なくとも１つに脂質が結合している。本発明の2本鎖脂質修飾RNAは、上記センス鎖RNAの5'末端側以外の部位には、他の置換基は結合していない。即ち、上記センス鎖RNAの5'末端側以外の部分、及びアンチセンス鎖RNA部分は他の置換基によって置換されておらず、ヌクレオチドのみから構成される。このように、上記センス鎖RNAの5'末端側にのみ2本鎖脂質が結合していることによって、細胞内導入率を高め、且つ格段に優れたRNA干渉効果を発現させることが可能になる。即ち、本発明の2本鎖脂質修飾RNAでは、2本鎖RNAの構造、修飾する脂質として2本鎖脂質を選択すること、及び該2本鎖脂質の結合部位等の構造上の特徴が一体不可分の関係となって、高い細胞内導入率を備えさせつつ、ヌクレアーゼ耐性を備え、更には格段に優れたRNA干渉効果をも奏させることが可能になっている。【００３３】
本発明の2本鎖脂質修飾RNAにおいて、上記センス鎖RNAに結合している2本鎖脂質としては、２つの疎水基を有する脂質である限り、特に制限されないが、一例として、炭素数6〜50の飽和脂肪酸残基及び不飽和脂肪酸残基よりなる群から選択される少なくとも２つの疎水基を有する脂質が例示される。上記飽和脂肪酸残基及び不飽和脂肪酸残基の炭素数として、好ましくは8〜30、更に好ましくは10〜24が例示される。より具体的には、脂質を構成する疎水基として、例えば、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、エルカ酸、ガドレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸等の脂肪酸の残基が例示される。前記する本発明の効果を一層顕著に奏させるという観点から、本発明に使用される2本鎖脂質の２つの疎水基は、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、及びオレイン酸よりなる群から選択される少なくとも１種の脂肪酸の残基であることが望ましい。【００３４】
本発明に使用される2本鎖脂質の具体例として、グリセロリン脂質、グリセロ糖脂質、ジアシルグリセロール、セラミド等が例示される。これらの中でも、ヌクレアーゼ耐性、細胞内導入率、及びRNA干渉効果を一層向上させるという観点から、好ましくはグリセロリン脂質が挙げられる。【００３５】
本発明に使用されるグリセロリン脂質としては、特に制限されず、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール等を任意に使用できる。【００３６】
本発明に使用されるリン脂質の具体例として、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、１−パルミトイル−２−オレイル−ホスファチジルエタノールアミン、１−オレイル−２−パルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン、ジエルコイルホスファチジルエタノールアミン等のホスファチジルエタノールアミン；ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレイルホスファチジルグリセロール、１−パルミトイル−２−オレイル−ホスファチジルグリセロール、１−オレイル−２−パルミトイル−ホスファチジルグリセロール、ジエルコイルホスファチジルグリセロール等のホスファチジルグリセロール；ジラウロイルホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジステアロイルホスファチジルセリン、ジオレイルホスファチジルセリン、１−パルミトイル−２−オレイル−ホスファチジルセリン、１−オレイル−２−パルミトイル−ホスファチジルセリン、ジエルコイルホスファチジルセリン等のホスファチジルセリン；ジラウロイルホスファチジン酸、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン酸、ジオレイルホスファチジン酸、１−パルミトイル−２−オレイル−ホスファチジン酸、１−オレイル−２−パルミトイル−ホスファチジン酸、ジエルコイルホスファチジン酸等のホスファチジン酸；ジラウロイルホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルイノシトール、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール、ジステアロイルホスファチジルセリン、ジオレイルホスファチジルイノシトール、１−パルミトイル−２−オレイル−ホスファチジルイノシトール、１−オレイル−２−パルミトイル−ホスファチジルイノシトール、ジエルコイルホスファチジルイノシトール等のホスファチジルイノシトールが例示される。これらの中でも、ヌクレアーゼ耐性、細胞内導入率、及びRNA干渉効果をより一層顕著ならしめるという観点から、好ましくは、ホスファチジルエタノールアミン、更に好ましくは、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、１−パルミトイル−２−オレイル−ホスファチジルエタノールアミン、及びジオレイルホスファチジルエタノールアミンが挙げられる。【００３７】
本発明の2本鎖脂質修飾RNAにおいて、上記2本鎖脂質と上記センス鎖の結合様式については特に制限されず、これらが直接結合していてもよく、またこれらがリンカー（連結領域）を介して結合していてもよい。但し、本発明において、上記2本鎖脂質と上記センス鎖とを連結するリンカーには、核酸から構成されるものは含まれない。【００３８】
ここで、リンカーとしては、上記脂質と上記センス鎖とを連結可能な限り、特に制限されないが、具体的には、上記リンカーとして、下記の構造のものが例示される。【００３９】
【化２】
0005906508.tif 000003
【００４０】
ここで、前記一般式(L-4)〜（L-21）において、ｎ１は、１〜40の整数、好ましくは2〜20の整数、更に好ましくは2〜12の整数を示す。【００４１】
また、前記一般式（L-22）〜(L-24)において、ｎ２は、１〜20の整数、好ましくは１〜10の整数、更に好ましくは1〜6の整数を示す。【００４２】
また、前記一般式（L-25）〜(L-27)において、ｎ３及びｎ４は、同一又は異なって、１〜20の整数、好ましくは１〜10の整数、更に好ましくは1〜6の整数を示す。【００４３】
前記一般式(L-1)〜（L-27）に示すリンカーは、その右側又は左側のいずれに１本鎖DNAが結合していてもよい。好ましくは、左側に2本鎖脂質が結合しており、右側に前記２本鎖RNAのセンス鎖RNA5’末端領域が結合するように構成されているものである。【００４４】
また、上記2本鎖脂質に対する上記リンカーの結合部位については、2本鎖脂質の種類やリンカーの種類に応じて適宜設定されるが、2本鎖脂質の疎水基以外の部位が上記リンカーと化学的に結合することによって連結されていればよい。例えば、ホスファチジルエタノールアミンを使用する場合であれば、そのアミノ基が、上記リンカーとアミド結合等を形成することによって連結されていればよい。また、ホスファチジルグリセロールを使用する場合であれば、そのグリセロール残基中の水酸基が、上記リンカーとエステル結合又はエーテル結合等を形成することによって連結されていればよい。また、ホスファチジルセリンを使用する場合であれば、そのセリン残基中のアミノ基又はカルボキシル基が、上記リンカーとアミド結合又はエステル結合等を形成することによって連結されていればよい。更に、ホスファチジン酸を使用する場合であれば、そのリン酸残基が、上記リンカーとリン酸エステル結合等を形成することによって連結されていればよい。そして更に、ホスファチジルイノシトールを使用する場合であれば、そのイノシトール残基中の水酸基が、上記リンカーとエステル結合又はエーテル結合等を形成することによって連結されていればよい。【００４５】
上記リンカーは、連結させる脂質の種類に応じて適宜選択されるが、例えば、２本鎖脂質として、アミノ基を有するリン脂質（即ち、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン等）又は水酸基を有するリン脂質（即ち、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール等）を使用する場合であれば、上記リンカーとして、一般式(L-6)、(L-7)、(L-9)、(L-10)、(L-18)、(L-26)、及び(L-27)のリンカーが好適である。【００４６】
また、上記リンカー以外にも、例えば、N-スクシニミジル＝3-(2-ピリジルジチオ)プロピナート、N-4-マレイミド酪酸、S-(2-ピリジルジチオ)システアミン、ヨードアセトキシスクシンイミド、N-(4-マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミド、N-[5-(3’-マレイミドプロピルアミド)−１−カルボキシペンチル]イミノジアセティクアシッド、N-(5-アミノペンチル)-イミノジアセテックアシッド等の二官能性リンカー（官能基を２つ含むリンカー）を使用することもできる。【００４７】
上記センス鎖RNAにおいて、２本鎖脂質又は２本鎖脂質を連結するリンカーの結合対象となるヌクレオチドは、上記センス鎖RNAの5'末端側から１〜６番目のヌクレオチドであれば特に制限されないが、好ましくは5'末端側から１〜４番目のヌクレオチド、更に好ましくは5'末端側から１及び/又は２番目のヌクレオチド、特に好ましくは5'末端（5'末端側から１番目）のヌクレオチドである。【００４８】
また、上記センス鎖RNAにおける、2本鎖脂質又は2本鎖脂質を連結するリンカーの結合部位については、特に限定されるものではないが、2本鎖脂質又は2本鎖脂質を連結したリンカーが、上記センス鎖RNAの所定のヌクレオチドのリン酸部分の水酸基を構成する水素原子と置換されて結合していることが好ましい。【００４９】
本発明の2本鎖脂質修飾RNAに結合されている2本鎖脂質の数としては、特に制限されないが、例えば１〜３個、好ましくは１又は２個、更に好ましくは１個が例示される。【００５０】
本発明の2本鎖脂質修飾RNAは、2本鎖脂質が連結された上記センス鎖RNA、及び上記アンチセンス鎖RNAをそれぞれ合成し、これらのセンス鎖RNA及びアンチセンス鎖RNAを公知の方法に従ってハイブリダイズさせることにより、製造される。なお、2本鎖脂質が連結された上記センス鎖RNAについても、公知の合成技術を用いて製造することができる。【００５１】
更に、本発明の2本鎖脂質修飾RNAは、上記センス鎖RNA及び上記アンチセンス鎖RNAを公知の方法に従って合成して、これらをハイブリダイズさせて2本鎖RNAを作成した後に、この2本鎖RNAのセンス鎖RNAの５’末端に2本鎖脂質公知の合成技術を用いて2本鎖脂質を連結させることによっても、製造することができる。【００５２】
本発明の2本鎖脂質修飾RNAは、細胞内に導入されることにより、標的遺伝子の発現を抑制又は阻害することができるので、標的遺伝子の発現抑制を目的とした医薬又は遺伝子治療用の医薬として、或いは標的遺伝子の発現抑制効果を評価するための実験材料として使用できる。【００５３】
本発明の2本鎖脂質修飾RNAが導入される対象となる細胞については、ヒト、非ヒト哺乳動物、鳥類、昆虫等のいずれに由来するものであってもよいが、好ましくは、ヒト及び非ヒト哺乳動物由来のものが挙げられる。【００５４】
本発明の2本鎖脂質修飾RNAの細胞内への導入方法については、従来siRNAの場合と同様であり、該2本鎖脂質修飾RNAの有効量を導入対象となる細胞に接触させればよい。本発明の2本鎖脂質修飾RNAの細胞内への導入は、in vivo、in vitro及びex vivoのいずれで実施してもよい。【００５５】
例えば、本発明の2本鎖脂質修飾RNAをin vitroで細胞内に導入させる場合、該細胞の培養時にあらかじめ適当量の該2本鎖脂質修飾RNAを存在させた状態で細胞を培養する方法が例示される。また、培養細胞、生体から取り出した細胞、生体から取り出した組織に対して、本発明の2本鎖脂質修飾RNAをin vitro又はex vivoで導入させる場合には、該2本鎖脂質修飾RNAの存在下で、培養細胞、生体から取り出した細胞、又は生体から取り出した組織をインキュベートすればよい。更に、本発明の2本鎖脂質修飾RNAをin vivoで細胞内に導入させる場合には、組織への直接注入；静脈、皮下、筋肉、腹腔、眼内、消化器官内、歯内等への注射；鼻腔、口腔、肺等への吸入投与；経口投与；皮膚を介した経皮投与；及び口腔粘膜、膣粘膜、眼粘膜、直腸粘膜、子宮粘膜を介した経粘膜投与等により、本発明の2本鎖脂質修飾RNAを投与すればよい。【００５６】
また、本発明の2本鎖脂質修飾RNAを細胞内に導入する場合、導入対象となる細胞に対する該2本鎖脂質修飾RNAの適用量については、細胞内に導入するための有効な量であればよいが、具体的には、細胞１個当たり、該2本鎖脂質修飾RNAの適用量が0.001〜10pmol（ピコモル）、好ましくは0.001〜1pmol、更に好ましくは0.01〜0.1pmolとなる範囲が例示される。【００５７】
本発明の2本鎖脂質修飾RNAは、単独でも優れた細胞内移行能を示すので、siRNAの細胞内への導入に使用されている従来の遺伝子導入試薬を用いずに、或いは従来の遺伝子導入試薬の使用量を低減して、細胞内に導入することも可能である。【００５８】
本発明の2本鎖脂質修飾RNAは、細胞内に導入されることによって、標的遺伝子の発現を抑制又は阻害することができるので、該2本鎖脂質修飾RNAは、例えば、医薬の分野において、該標的遺伝子の発現に起因する疾患を予防、軽減又は治療するために使用することができる。本発明の2本鎖脂質修飾RNAを医薬分野で使用する場合、該2本鎖脂質修飾RNAは、薬学的に許容される担体と共に配合され、医薬組成物として提供される。【００５９】
該医薬組成物に使用される薬学的に許容される担体としては、医薬組成物の使用形態に応じて適宜選択すればよく、特に制限されるものではないが、例えば、精製水、糖水溶液、緩衝液、生理食塩水、高分子水溶液、RNase free水等の水性担体、賦形剤等が挙げられる。【００６０】
該医薬組成物における2本鎖脂質修飾RNAの配合割合については、前述する該2本鎖脂質修飾RNAの適用量を充足できるように適宜設定すればよいが、例えば、該医薬組成物の総量当たり、該2本鎖脂質修飾RNAが0.001〜50重量％、好ましくは0.01〜10重量％、更に好ましくは0.1〜１重量％となる割合が例示される。【００６１】
また、該医薬組成物の製剤形態については、2本鎖脂質修飾RNAが細胞内に導入可能であることを限度として特に制限されるものではないが、例えば、液剤（シロップ等を含む）、点滴剤、注射剤等の液状製剤；凍結乾燥製剤、ドライシロップ剤、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤（ソフトカプセルを含む）等の固形状製剤が挙げられる。また、本発明の医薬組成物が固形製剤である場合は、使用時に注射用蒸留水、滅菌水等を加え、再度溶解して使用してもよい。【００６２】
また、該医薬組成物が適用される疾患又は症状は、標的遺伝子の発現が関与しているものである限り、特に制限されるものではない。標的遺伝子と疾患の関係については当該技術分野において公知である。【００６３】
また、該医薬組成物は、ヒトの治療を目的として、ヒト由来細胞に対して使用してもよく、また、ヒト以外の動物（特に、ヒト以外の哺乳動物）の治療目的で使用してもよい。
【実施例】
【００６４】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。【００６５】
実施例１  5’2本鎖脂質修飾RNAのルシフェラーゼ遺伝子発現阻害効果
１．ルシフェラーゼ遺伝子をターゲットとした2本鎖脂質修飾RNAの合成
１−１．センス鎖RNA及びアンチセンス鎖RNAの配列
ウミシイタケルシフェラーゼと相同配列を持ち、ウミシイタケルシフェラーゼの遺伝子発現を抑制できる21及び27塩基長のセンス鎖RNAと21及び27塩基長のアンチセンス鎖RNAの2本鎖RNAをデザインした。該2本鎖RNAは21塩基長のアンチセンス鎖とセンス鎖を用いた場合は3’末端に2塩基のダングリングエンドを持つ21塩基長の2本鎖RNAを、27塩基長のアンチセンス鎖とセンス鎖を用いた場合は両末端が平滑末端である27塩基長の2本鎖をそれぞれ形成できる。使用したRNAの配列は、以下の通りである。
27nt dsRNA  センス鎖      L27A：5’-CUGGCCUUUCACUACUCCUACGAGCAC-3’（配列番号１）
アンチセンス鎖 L27B：3’-GACCGGAAAGUGAUGAGGAUGCUCGUG-5’（配列番号２）
21nt siRNA  センス鎖       L21A：5’-GGCCUUUCACUACUCCUACGA-3’（配列番号３）
アンチセンス鎖 L21B：3’-GACCGGAAAGUGAUGAGGAUG−5’（配列番号４）【００６６】
これら上記センス鎖RNA及びアンチセンス鎖を用いて2本鎖RNAを作成した。2本鎖RNAの作成は、universal buffer（林化成株式会社）中、同モルのセンス鎖およびアンチセンス鎖１本鎖RNAを混合し、92℃で２分間加熱した後、4℃まで徐々に温度を下げることで作成した。合成した各種2本鎖RNAは、20％ ポリアクリルアミドゲルを用い、250Vの条件化で60分間電気泳動し、その後、銀染色キット（GEヘルスケア バイオサイエンス）で2本鎖RNAを染色することにより確認した。【００６７】
該2本鎖RNAにおいて、3’末端に2塩基のダングリングエンドを持つ21塩基長の2本鎖RNAをsi L21A/L21B、平滑末端である27塩基長の2本鎖RNAをDs L27A/L27Bとした。【００６８】
１−２．ルシフェラーゼ遺伝子をターゲットとした2本鎖脂質修飾RNAの合成
ルシフェラーゼ遺伝子の発現を抑制できる２本鎖RNAのセンス鎖の5’末端に、2本鎖脂質を結合させた2本鎖脂質修飾センス鎖RNAを合成した。当該2本鎖脂質修飾センス鎖RNAにおいて、2本鎖脂質は、上記センス鎖RNAの5’末端に連結されているアミノアルキル基（Amino Modifier C6; Glen Research）を介して共有結合で結合している。2本鎖脂質修飾センス鎖RNAは、活性エステル基もつ脂質化合物（以下、活性エステル化脂質化合物と表記する）と5’末端をアミノ化修飾したセンス鎖RNAとを液相中で反応させることで合成した（下記反応式１）。【００６９】
【化３】
0005906508.tif 000004
【００７０】
R1及びR2は、同一又は異なって脂肪酸残基を示す。【００７１】
具体的な合成法を以下に示す。RNAの5’末端をアミノ化するために、RNA固相合成上で5’-Amino-Modifier C6 (Glen Research)を用いて通常の方法(ホスホロアミダイト合成法)により5’末端アミノアルキル基修飾センス鎖RNAを合成した。なお、上記5’末端アミノアルキル基センス鎖RNAはHPLC精製、MALDI-TOF MS解析済みのものを林化成株式会社より購入した。合成された5’末端アミノアルキル基センス鎖RNAは、該末端（５’末端側から１番目のヌクレオチドのリン酸残基）に−(CH2)6−NH2が結合されている。合成した1本鎖RNAは、UVスペクトル検出器を用い、260nmの吸光度を測定することにより濃度を算出した。このアミノアルキル基修飾１本鎖RNAと、クロロホルムに溶解した活性エステル化2本鎖脂質誘導体［DPPE-NHS (N-(Succinimidyl-glutaryl)-L-α-Phosphatidylethanolamine, Dipalmitoyl), POPE-NHS (N-(Succinimidyl-glutaryl)-L-α-Phosphatidylethanolamine, 1-Palmitoyl-2oleoyl), DOPE-NHS (N-(Succinimidyl-glutaryl)-L-α-Phosphatidylethanolamine, Dioleoyl), DMPE-NHS (N-(Succinimidyl-glutaryl)-L-α-Phosphatidylethanolamine, Dimyristoyl)； (日本油脂社製)］と、縮合反応条件下で混合して、2本鎖脂質修飾センス鎖RNAを合成した。反応後、2本鎖脂質修飾センス鎖RNAが含まれる反応液中の不要な試薬を取り除くため、反応液をＨＰＬＣで精製した。ＨＰＬＣ精製は、緩衝液としてＡ：100% 20mM TEAA(pH 7.0), Ｂ：80% CH3CN/20mM TEAA (pH 7.0)を用い、10％ Ｂ緩衝液から100％ Ｂ緩衝液を50分のリニアーグラジェントになるよう設定し精製を行った。また、精製用カラムはCAP CELL (4.6 x 150 mm, 5μｍ；SHISEIDO)を使用した。HPLC解析結果の一例を図１に示す。ＨＰＬＣにおいて精製された2本鎖脂質修飾センス鎖RNAは凍結乾燥し、精製水に溶解させた後、ＵＶスペクトル解析により濃度及び合成収率を算出した。【００７２】
以下に、合成した2本鎖脂質修飾センス鎖RNAの構造及び収率を示す。【００７３】
【化４】
0005906508.tif 000005
【００７４】
合成した2本鎖脂質修飾センス鎖RNAは、アンチセンスRNAと2本鎖を形成させ、2本鎖脂質修飾RNAを得た。RNAの２本鎖の形成は、上記と同様の方法で行い、20％ ポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認した（図２参照）。【００７５】
２．2本鎖脂質修飾RNAの分解酵素耐性
2本鎖脂質修飾si L21A/L21B及びDs L27A/L27Bのヌクレアーゼ耐性を検討した。実験は、最終濃度が2 μMになるよう調整したセンス鎖5’-末端2本鎖脂質修飾RNA(si L21A/L21B及びDs L27A/L27B)を10％FBS（三光純薬株式会社）を含むRPMI-1640培地（インビトロジェン）中 (最終量110μl)、37℃でインキュベートし、0h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h後にそれぞれ10μl取り、2μlのローディングダイを含むサンプルチューブに添加した。分解反応を停止させる為、サンプル採取後すばやく液体窒素中にて凍結し、−20℃にて保存した。得られた産物を20％ ポリアクリルアミドゲルを用い250Vで70分間サンプルを電気泳動した。その後、銀染色キット（GEヘルスケア バイオサイエンス）で産物を染色し（染色条件は製品マニュアル参照）、ChemiImager 4000(Alpha Innotech corporation)でゲル解析を行った。また比較として未修飾のsi L21A/L21B及びDs L27A/L27Bのヌクレアーゼ耐性結果も同様に評価した。ゲル電気泳動の結果を図３に示す。【００７６】
その結果、未修飾のsi L21A/L21Bは血清を含む培地中において速やかに分解されており、１〜２時間程度でサンプルRNAの消失が確認された。一方、2本鎖脂質修飾si L21A/L21B(si DPPE-L21A/L21B)は、si L21A/L21Bに比べ非常に高いヌクレアーゼ耐性を示し、48時間後においてもRNAは生存していた。また、未修飾のDs L27A/L27Bも高いヌクレアーゼ耐性を示したが、2本鎖脂質修飾Ds L27A/L27B (Ds DPPE-L27A/L27B)の方がより高いヌクレアーゼ耐性を示した。さらに、2本鎖脂質修飾RNAは血清中タンパク質と結合し、RNAの分解酵素耐性を向上させている知見も得られた。【００７７】
これらの結果から、2本鎖脂質修飾RNAは一般に広く使用されている21siRNAに比べ格段に高い生体内安定性を保有しているという新たな知見が得られた。【００７８】
３．ルシフェラーゼ遺伝子をターゲットとした2本鎖脂質修飾RNAのDicerによるプロセシング
合成したRNA及び2本鎖脂質修飾RNAのリコンビナントDicerによるプロセシングを検討した。Dicerによる切断実験は、20mM Tris-HCl(pH 8.0), 15 mM NaCl, 2.5mM Mg2Cl溶液中、0.5 UのリコンビナントDicer（Gene Therapy Systems）と最終濃度2 μMになるよう調整した未修飾RNAおよび2本鎖脂質修飾RNAをサンプルチューブに10μl準備し、37℃に設定したインキュベーター中、12時間インキュベートした。その後、Dicerによる切断反応を停止させる為に、2μlのDicer Stop Solution (Gene Therapy Systems)を反応溶液に加え、更に2μlのローディングダイを加えた。得られた産物を20％ ポリアクリルアミドゲルを用い250Vで70分間サンプルを電気泳動した。その後、銀染色キット（GEヘルスケア バイオサイエンス）で産物を染色し（染色条件は製品マニュアル参照）、ChemiImager 4000(Alpha Innotech corporation)でゲル解析を行った。また、コントロールとして未修飾の21siRNもゲル電気泳動にて解析した。その結果を図４に示す。【００７９】
得られた結果から、未修飾のDs L27A/L27BはDicerの働きにより21塩基長のRNAにプロセシングされていることが分かり、また、27塩基長の2本鎖脂質修飾RNA (Ds Lipid-L27A/L27B)もDicerの働きにより、21塩基長のRNA及びその他のRNAにプロセシングされていることが明らかとなった。この結果より、27塩基長のRNAは脂質が結合していてもDicerにより認識され、プロセシングを受けることが分かった。【００８０】
一方、未修飾のsi L21A/L21BはDicerによるプロセシングを受けておらず、21塩基長のRNAに2本鎖脂質を修飾した2本鎖RNA(si Lipid-L21A/L21BもDicerによるプロセシングを受けていないことが分かった。また、Dicerタンパクと共存させた2本鎖脂質修飾si L21A/L21Bでは、分子量の増大が認められたことから、2本鎖脂質修飾si L21A/L21BはDicerタンパクとの間で複合体を形成していることも確認された。【００８１】
４．2本鎖RNA脂質修飾RNAのルシフェラーゼ遺伝子発現抑制
合成した未修飾RNA及び2本鎖脂質修飾RNAのRNA干渉効果をウミシイタケルシフェラーゼをターゲットとして評価した。実験前に1x105cell/mlに調整したHeLa細胞（ヒト子宮頸ガン細胞、東北大学加齢医学研究所）を９６wellプレート上にそれぞれ100μl撒き、37℃で一晩インキュベートした。翌日、ウェル上の古い培地を取り除き、抗生物質を含ない新しい培地をウェルにそれぞれ80 μl加え、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼを発現するベクター(psiCHECKTM-2 Vector: プロメガ)とLipofectamineTM  2000 (商品名、インビトロジェン)の複合溶液を10μlずつHeLa細胞が入ったそれぞれのウェルに加えた。ここで発現ベクターは１ウェルあたり0.02μgになるように、またLipofectamineTM  2000は１ウェルあたり0.2μlになるよう設定し、OptiMem(インビトロジェン)で必要量を調整した。また、複合体を形成させる為に、発現ベクターとLipofectamineTM  2000をOptiMemを用いて混合した後、室温で30分間インキュベートした。複合溶液を加えた後、細胞を5％ CO2 存在下、37℃で4時間インキュベートした。その後、ウミシイタケルシフェラーゼの遺伝配列と相同的なアンチセンス配列を含む未修飾の2本鎖RNA及び末端2本鎖脂質修飾RNAを最終濃度が0nM, 0.2nM, 0.5nM, 1nM, 2nM, 5nM, 10nMになるようLipofectamineTM  2000 (インビトロジェン)と複合体を形成させ、10μlの複合体溶液を発現ベクターを導入したHeLa細胞に加えた。ここで、1ウェルあたりの最終量は100 μlとなる。RNAとLipofectamineTM  2000の複合溶液は、1ウェルあたり5 μlのRNA水溶液と5 μlのLipofectamineTM  2000 (0.2μl) OptiMem溶液を混合し、30分間室温でインキュベートすることにより作成した。RNAを導入させた後、48時間インキュベートしDula-GloTM  Luciferase Assay System（プロメガ）を用いてホタ及びウミシイタケルシフェラーゼの発現量をルミノメータ（MicroLumat LB96p: BERTHOLD）で測定し、ホタルルシフェラーゼの発現量をコントロールとしてウミシイタケルシフェラーゼの発現抑制効果を算出した。【００８２】
結果を図５に示す。図５において「A」は2本鎖脂質修飾21nt siRNA、「B」は2本鎖脂質修飾27nt dsRNAを用いたときのルシフェラーゼ遺伝子発現抑制の結果である。また、未修飾の21nt siRNA及び27nt dsRNAも同時に評価した。その結果、2本鎖脂質を結合させた21nt siRNA及び27nt dsRNAは未修飾の21nt siRNA及び27nt dsRNAよりも、格段に高いRNA干渉効果を奏することが確認された。【００８３】
実施例２  5’2本鎖脂質修飾RNAによるVEGF遺伝子発現阻害効果
１．VEGF遺伝子をターゲットとした2本鎖脂質修飾RNAの合成
１−１．センス鎖RNA及びアンチセンス鎖RNAの配列
VEGF(vascular endothelial growth factor: 血管内皮成長因子)と相同配列を持ち、VEGFの遺伝子発現を抑制できる27及び21塩基長のセンス鎖RNAと27及び21塩基長のアンチセンス鎖RNAの2本鎖RNAをデザインした。これらの2本鎖RNAを用いて、以下の実験を行った。なお、21siRNAはセンス鎖RNA及びアンチセンス鎖RNAの双方の3’末端に２塩基のダングリングエンドを持つ２本鎖RNAであり、27nt dsRNAは、ダングリングエンド（１本鎖領域）を持たない完全２本鎖RNA（センス鎖RNAの５’末端側及び３’末端側が共に平滑末端である2本鎖RNA）である。使用した27nt dsRNA及び21siRNAの配列は、以下の通りである。
27nt dsRNA  センス鎖     v27A：5’- CUUCCUACAGCACAACAAAUGUGAAUG-3’（配列番号５）
アンチセンス鎖 v27B：3’- GAAGGAUGUCGUGUUGUUUACACUUAC-5’（配列番号６）
21nt siRNA  センス鎖      v21A：5’-UCCUACAGCACAACAAAUGUG-3’（配列番号７）
アンチセンス鎖  v21B：3’-GAAGGAUGUCGUGUUGUUUAC-5’（配列番号８）【００８４】
これら上記センス鎖RNA及びアンチセンス鎖用いて実施例１と同様の方法でアニーリングし2本鎖を形成させ、2本鎖脂質未修飾RNAを得た。２本鎖形成確認は実施例１の同様の方法で20% アクリルアミドゲル電気泳動で確認した。【００８５】
１−２．VEGF遺伝子をターゲットとした2本鎖脂質修飾RNAの合成
VEGF遺伝子の発現を抑制できる上記２本鎖RNAのセンス鎖の5’末端に脂質を結合させた2本鎖脂質修飾RNAを合成した。当該2本鎖脂質修飾RNAにおいて、2本鎖脂質は上記センス鎖RNAの5’末端に修飾されたアミノアルキル基（Amino Modifier C6; Glen Research）を介して共有結合で結合している。2本鎖脂質修飾の１本鎖RNA（センス鎖）は、実施例１と同様の方法で合成した。合成した2本鎖脂質修飾のセンス鎖RNAのHPLC結果を図６に示す。なお、VEGF遺伝子をターゲットとした2本鎖脂質修飾のセンス鎖RNAにおいても、実施例１とほぼ同様の溶出時間であった。【００８６】
また、以下にVEGF遺伝子をターゲットとした2本鎖脂質修飾RNAの構造モデル及び収率を示す。【００８７】
【化５】
0005906508.tif 000006
【００８８】
合成した2本鎖脂質修飾センス鎖RNAは、アンチセンス鎖RNAと2本鎖を形成させることにより、2本鎖脂質修飾RNAを得た。RNAの２本鎖の形成は、実施例１と同様の方法で行い、20％ ポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認した（図７参照）。【００８９】
２．2本鎖脂質修飾RNAの分解酵素耐性
2本鎖脂質修飾si v21A/v21B及びDs v27A/v27Bのヌクレアーゼ耐性を検討した。また比較として未修飾のsi L21A/L21B及びDs L27A/L27Bのヌクレアーゼ耐性結果も評価した。実験は、上記実施例１と同様の方法で実施した。ゲル電気泳動の結果を図８に示す。【００９０】
その結果、未修飾のsi v21A/v21Bは血清を含む培地中において速やかに分解されており、１〜２時間程度でサンプルRNAの消失が確認された。一方、2本鎖脂質修飾si v21A/v21B(si DPPE-v21A/v21B)は、si v21A/v21Bに比べ非常に高いヌクレアーゼ耐性を示し、48時間後においてもRNAは生存していた。また、未修飾のDs v27A/v27Bも高いヌクレアーゼ耐性を示したが、2本鎖脂質修飾Ds v27A/v27B (Ds DPPE-v27A/v27B)の方がより高いヌクレアーゼ耐性を示した。さらに、2本鎖脂質修飾RNAは血清中タンパク質と結合し、RNAの分解酵素耐性を向上させている知見も得られた。【００９１】
これらの結果からも、2本鎖脂質修飾RNAは一般に広く使用されている21siRNAに比べ格段に高い生体内安定性を保有していることが明らかとなった。【００９２】
３．VEGF遺伝子をターゲットとした2本鎖脂質修飾RNAのDicerによるプロセシング
合成した2本鎖脂質未修飾RNAおよび2本鎖脂質修飾RNAのリコンビナントDicerによるプロセシングを検討した。Dicerによる切断実験は、実施例１と同様の方法で行った。その結果を図９に示す。【００９３】
得られた結果から、未修飾のDs v27A/v27BはDicerの働きにより21塩基長の2本鎖RNAにプロセシングされていることが分かり、また、27塩基長の2本鎖脂質修飾RNA(Lipid-Ds v27A/v27B)もDicerの働きにより、21塩基長のRNA及びその他のRNAにプロセシングされていることが明らかとなった。この結果より、27塩基長のRNAは脂質が結合していてもDicerにより認識され、プロセシングを受けることが分かった。【００９４】
一方、未修飾のsi v21A/v21BはDicerによるプロセシングを受けておらず、21塩基長の2本鎖RNAに2本鎖脂質を修飾したRNAもDicerによるプロセシングを受けていないことが分かった。また、Dicerタンパクと共存させた2本鎖脂質修飾si v21A/v21Bでは、分子量の増大が認められたことから、2本鎖脂質修飾si v21A/v21BはDicerタンパクとの間で複合体を形成していることも確認された。【００９５】
４．2本鎖脂質修飾RNAのVEGF遺伝子発現抑制
末端を修飾していないsi v21A/v21B、末端を修飾していないDs v27A/v27B、センス鎖RNAの5’末端を2本鎖脂質修飾したsi v21A/v21B（si Lipid-v21A/v21B）及びセンス鎖RNAの5’末端を2本鎖脂質修飾したDs v27A/v27B（Ds Lipid-v27A/v27B）のVEGF遺伝子発現阻害効果をHeLa細胞（ヒト子宮頸ガン細胞、東北大学加齢医学研究所）、A549細胞（ヒト肺ガン細胞、東北大学加齢医学研究所）を用いて評価した。また、VEGF遺伝子と相同な遺伝子配列を持たないRNA(27nt dsRNA(Random)、21nt siRNA(Random))についても同様の評価を行った。【００９６】
実験は以下の操作で行った。実験前に1x105 cell/mlに調整したHeLa細胞、A549細胞を24wellプレート上にそれぞれ500μl撒き、37℃で一晩インキュベートした。翌日、ウェル上の古い培地を取り除き、抗生物質を含ない新しい培地をウェルにそれぞれ450 μl加えた。ここで、HeLa細胞はMEM培地、その他の細胞はPRMI-1640培地を用いた。VEGFの遺伝配列と相同的なアンチセンス配列を含む未修飾又は2本鎖脂質修飾RNA(25μl)とLipofectamineTM  2000 (インビトロジェン)溶液(25μl)との複合体を形成させ、50μlのRNA溶液を450μlの上記細胞に加えた。ここで、1ウェルあたりの最終量は500 μlとなる。RNAとLipofectamineTM  2000の複合溶液は、1ウェルあたり25 μlのRNA水溶液と25 μlのLipofectamineTM  2000 (2μl) OptiMem溶液を混合し、30分間室温でインキュベートすることにより作成した。RNAを導入させた後、37℃で48時間、５％CO2存在下インキュベートした。インキュベート後、細胞をPBS(-)で３回洗浄し、RNeasy Plus Mini Kit （キアゲン）で細胞中のTotal-RNAを抽出した。その後、VEGFのmRNA量を測定するためにRT-PCR反応を行った。RT-PCR反応用としてQiagen OneStep RT-PCR Kit (キアゲン)を用い行い、VEGF用PCRプライマーとして、5’-CCC TGA TGA GAT CGA GTA CAT CTT-3’（配列番号９）及び5’-ACC GCC TCG GCT TGT CAC-3’ （配列番号１０）を用いた。またコントロールとしてGAPDH遺伝子を同様の方法で測定した。GAPDH用プライマーとして5’-GGAAAGCTGTGGCGTGATG-3’（配列番号１１）及び5’-CTGTTGCTGTAGCCGTATTC-3’（配列番号１２）を用いた。RT-PCR反応は、50℃で30分間RT（Reverse Transcripratase）反応を行い、PCR反応として92℃で30秒間2本鎖解離反応、55℃で30秒間アニーリング反応、68℃で45秒間伸長反応を25回〜28回（使用する細胞により異なる）繰り返し行い、最後に68℃で10分間インキュベートし、4℃まで温度を下げ反応を終了した。RT-PCRに用いた試薬、Total-RNA、プライマー等はQiagen OneStep RT-PCR Kit (キアゲン)の反応条件に従い作成した。RT-PCR反応後、ローディングダイを2μl加え、２％アガロースゲルでVEGF及びGAPDHのmRNAからのRT-PCR産物を確認した。遺伝子発現抑制効果の評価は、コントロール細胞（2本鎖RNAを導入していない細胞）のVEGF遺伝子発現量を100％としたときの、RNA（未修飾、2本鎖脂質修飾を含む）を導入した細胞のVEGF発現量を測定することにより行った。また、各細胞間の発現量の誤差はコントロール遺伝子（GAPDH）の遺伝子発現量で補正した。【００９７】
図１０に、VEGFをターゲットとし、RNA濃度が50nMの際の未修飾RNA及び2本鎖脂質修飾RNAのRNA干渉効果の結果を示す。図１０中、A及びBはHeLa細胞、C及びDはA549細胞に対する未修飾RNA及び2本鎖脂質修飾RNAのVEGF遺伝子発現抑制効果を示すグラフで、A及びCは21塩基長の2本鎖RNAを用いた場合、B及びDは27塩基長の2本鎖RNAを用いた場合である。【００９８】
その結果、2本鎖脂質修飾si v21A/v21Bを用いてHeLa細胞に対する遺伝子発現抑制能を観察した場合（A）、全ての2本鎖脂質修飾RNAにおいて未修飾RNAよりも高い遺伝子発現抑制能が観察された。特にsi DPPE-v21A/v21Bにおいて非常に高い遺伝子発現抑制能が観測された。また、2本鎖脂質修飾Ds v27A/v27を用いてHeLa細胞に対する遺伝子発現抑制能を観察した場合（B）においても、全ての2本鎖脂質修飾RNAにおいて未修飾RNAよりも優れた遺伝子発現抑制能が観測された。またDs DPPE-v27A/v27Bにおいて非常に優れた遺伝子発現抑制能が確認された。【００９９】
A549細胞に対するVEGF遺伝子発現抑制能を観察した場合において、脂質修飾si v21A/v21Bを用いて場合(C)、全ての2本鎖脂質修飾RNAにおいて未修飾RNAよりも高い遺伝子発現抑制能が観察された。特にsi DPPE-v21A/v21Bにおいて、非常に高い遺伝子発現抑制能が観測された。また、2本鎖脂質修飾Ds v27A/v27を用いてA549細胞に対する遺伝子発現抑制能を観察した場合（D）、DPPEやDMPEを結合させたRNAにおいて、未修飾RNAよりも高い遺伝子発現抑制能が観測された。【０１００】
これらの結果より、2本鎖のRNAのセンス鎖RNAの5’末端に2本鎖脂質を共有結合させた21塩基長及び27塩基長のsiRNA及びdsRNAは、未修飾の各2本鎖RNAに比べ高い遺伝子発現抑制能を示していることが明らかとなった。特に、DPPEを結合させた2本鎖RNAにおいて非常に優れた遺伝子発現抑制能が確認できた。また、DMPE又はDOPEを結合させたRNAにおいても、未修飾RNAに比して高い遺伝子発現抑制能が観測された。【０１０１】
今回使用したVEGFをターゲットとした2本鎖のRNAは配列特異性高く標的遺伝子の発現を抑制していることが明らかとなった。また、本試験結果から、2本鎖のRNAに2本鎖脂質を結合させることによって細胞に対する副作用をも低減されていることも示唆された。【０１０２】
５．2本鎖脂質修飾RNAの細胞導入性の検討
実験前に1x105 cell/mlに調整したHeLa細胞（ヒト子宮頸ガン細胞、東北大学加齢医学研究所）、A549細胞（ヒト肺ガン細胞、東北大学加齢医学研究所）、を24ウェルプレートにそれぞれ1ml撒き10 ％ ウシ胎児血清 (FBS：三光純薬株式会社製)及び抗生物質含む培地中、5 ％ CO2存在下、37 ℃で培養した。ここで用いた抗生物質および培地は、HeLa細胞はMEM培地（インビトロジェン社）を、その他の細胞はRPMI-1640（インビトロジェン社）を培地として用いた。蛍光ラベル化2本鎖脂質修飾RNA導入前に、抗生物質を含まない培地(450μl)へ交換した。蛍光ラベル化2本鎖脂質修飾RNAは、21nt 及び27nt アンチセンス鎖RNAの5’末端を6-FAMラベル化したものを使用し、未修飾の21nt 及び27nt センス鎖RNA及び5’末端を2本鎖脂質で修飾した21nt 及び27ntセンス鎖RNAと2本鎖を形成させた。細胞導入実験は、蛍光ラベル化2本鎖脂質修飾RNAとLipofectamineTM  2000 (インビトロジェン社製)と複合体を形成させる為に、10μM の蛍光ラベル化オリゴヌクレオチド水溶液10μlとOptiMem溶液15μlの混合溶液25μlと、LipofectamineTM  2000 (インビトロジェン社製)溶液2μlとOptiMem溶液23μlの混合溶液25μlそれぞれ混ぜ合わせた50μlの混合溶液を室温で30分間インキュベートした。調整した50μlの蛍光ラベル化オリゴヌクレオチド複合体は、上記で準備した450μlの細胞へ添加し(2本鎖RNAの終濃度：200 nM)、5 ％ CO2存在下、37 ℃で4時間インキュベートした。その後、細胞をPBS(-)又は培地で3回洗浄し、共焦点蛍光レーザー顕微鏡、及びフローサイトメトリーにて細胞導入を評価した。【０１０３】
共焦点蛍光レーザー顕微鏡は、Radiance 2000システム(Bio Rad社)を用い、アルゴンレーザーを用いて蛍光を観察した。フローサイトメトリーは、coulter EPICS XL cytometer(Beckman coulter) を用い、細胞10000カウントあたりの細胞導入性について測定した。フローサイトメトリー解析はXL EXPO32TM software (Beckman coulter) を用いた。【０１０４】
結果を図１１に示す。図１１−１中のA及びBは、蛍光ラベルした21塩基長(si v21A/v21B)及び27塩基長のRNA((si v21A/v21B及びsi v27A/v27B)、及びセンス鎖の5’末端を2本鎖脂質修飾したRNAをLipofectamineTM  2000を導入剤として使用した場合のHaLa細胞に対する細胞導入性の結果である。また、図１１−２中のC及びDは、蛍光ラベルした21塩基長(si v21A/v21B)及び27塩基長のRNA((si v21A/v21B及びsi v27A/v27B)、及びセンス鎖の5’末端を2本鎖脂質修飾したRNAをLipofectamineTM  2000を導入剤として使用した場合のA549細胞に対する細胞導入性の結果である。【０１０５】
その結果、LipofectamineTM  2000存在下において未修飾RNA及び2本鎖脂質修飾RNAは、全ての細胞（HeLa細胞、A549細胞）への導入が確認された。特に2本鎖脂質をセンス鎖の5’末端に修飾した27塩基長のRNAは未修飾のRNAに比べ、非常に高い細胞導入性が共焦点蛍光顕微鏡及びフローサイトメトリーにおいて観測された。また、この2本鎖脂質修飾RNAは細胞内において積極的に細胞質へ局在化していることが共焦点蛍光顕微鏡観察により示唆された。特に2本鎖脂質としてDPPEやDMPEを結合させた27塩基長の2本鎖RNAにおいて優れた細胞導入性が観測された。【０１０６】
また、21塩基長のRNAに2本鎖脂質を結合させた2本鎖脂質修飾RNAもLipofectamineTM  2000存在下において高い細胞導入性が確認された。特に、2本鎖脂質としてDMPEを結合させた21塩基長のRNAおいて優れた細胞導入性が確認された。【０１０７】
この結果より、2本鎖のRNAのセンス鎖RNAの5’末端に脂質を共有結合させることにより飛躍的に細胞導入性を向上させ、且つ、細胞内において細胞質へ局在化させることが可能であるという知見が得られた。【０１０８】
実施例３  WT1遺伝子をターゲットとした2本鎖脂質修飾RNAの合成
上記実施例１及び２とは異なる手法を用いて、WT1遺伝子の発現を抑制できる２本鎖RNAのセンス鎖RNAの5’末端に、2本鎖脂質を結合させた2本鎖脂質修飾センス鎖RNAを合成した。【０１０９】
先ず、センス鎖RNA及びアンチセンス鎖RNAをそれぞれ公知の方法に従って合成した。次いで、センス鎖RNAの5’末端に対するアミノアルキル化を、5’-Amino-Modifier C6 (Glen Research)を用いて通常の方法(ホスホロアミダイト合成法)により行って、5’末端アミノアルキル修飾センス鎖RNAを合成した。合成された5’末端アミノアルキル修飾センス鎖RNAは、５’末端側から１番目のヌクレオチドのリン酸残基に酸素原子を介して−(CH2)6−NH2が結合されている。合成された5’末端アミノアルキル修飾センス鎖RNAは、アンチセンス鎖RNAと2本鎖を形成させ、2本鎖RNA（以下、アミノアルキル修飾２本鎖RNAと表記する）を得た。なお、RNAの２本鎖の形成は、上記と同様の方法で行った。斯くして得られたアミノアルキル修飾２本鎖RNAと、クロロホルムに溶解した活性エステル化2本鎖脂質誘導体［DPPE-NHS (N-(Succinimidyl-glutaryl)-L-・-Phosphatidylethanolamine, Dipalmitoyl), (日本油脂社製)］とを、縮合反応条件下で混合して、2本鎖脂質修飾RNA（DPPE修飾2本鎖RNA）を合成した。反応後、2本鎖脂質修飾RNAが含まれる反応液中の不要な試薬を取り除くため、反応液をHPLCで精製した。HPLC精製は、緩衝液としてＡ：100% 20mM TEAA(pH 7.0), Ｂ：80% CH3CN/20mM TEAA (pH 7.0)を用い、10％ Ｂ緩衝液から100％ Ｂ緩衝液を50分のリニアーグラジェントになるよう設定し精製を行った。また、精製用カラムはCAP CELL (4.6 x 150 mm, 5μｍ；SHISEIDO)を使用した。HPLC解析結果の一例を図１２に示す。HPLCにおいて精製された2本鎖脂質修飾RNAは凍結乾燥し、精製水に溶解させた後、ＵＶスペクトル解析により濃度及び合成収率を算出した。2本鎖脂質修飾RNAは、20％ ポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認した（図１３）。【０１１０】
以下に、合成した2本鎖RNAの構造及び収率を示す。【０１１１】
【化６】
0005906508.tif 000007
【図１】
0005906508.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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