(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
媒体中でコロイド安定性を有する、式（Ｉ）
0005873719.tif 000017
［上式中、
ＮＰは金、銀又は白金ナノ粒子であり；
Ｌは、硫黄原子を介してナノ粒子ＮＰに結合する式（ＩＩ）のリンカー又はその立体異性体であり；又はＬは、２つの硫黄原子を介してナノ粒子ＮＰに結合する式（ＩＩＩ）のリンカー又はその立体異性体であり、
0005873719.tif 000018
［上式中、
Ｘ及びＹは独立して（Ｃ２−Ｃ２０）炭化水素鎖を表し、ここで少なくとも一つの炭素原子は、ＣＯ基又はＯ及びＮからなる群から選択されるヘテロ原子によって置き換えられていてもよく；また（Ｃ２−Ｃ２０）炭化水素鎖は、ハロゲン、ＯＨ、ＣＯＮＨ２、ＣＯ２（Ｃ１−Ｃ６）アルキル及び−ＣＨＯからなる群から選択される一又は複数の置換基で置換されていてもよく；
ｎ及びｓは、独立して０から１の値を表し；
ｐは１から２の値を表し；及び
Ａは、カルボキシル基の単結合酸素原子を介してリンカーＬに結合しているその全ての立体異性体の任意のものを含む式（ＩＶ）、式（Ｖ）及び式（ＶＩ）からなる群から選択される白金（ＩＩ）ビラジカルであり、ここで、ビラジカルは塩の形態であってもよく
0005873719.tif 000019
但し、
式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）のリンカーにおいて、ｎ＝１又はｓ＝１の場合；白金（ＩＩ）ビラジカルは式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）のリンカーの一分子に結合し、よって同じリンカー分子と２つのＣＯＯ−Ｐｔ結合を形成し；及び
式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）のリンカーにおいて、ｎ＝０又はｓ＝０の場合；白金（ＩＩ）ビラジカルは式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）の２つの独立したリンカー分子に結合し、よってこれら２つのリンカー分子の各々とＣＯＯ−Ｐｔ結合を形成し；及び
式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）のリンカーＬのうち少なくとも４５％が遊離のカルボキシル基の形態である］
のコンジュゲート。
【請求項２】
生理的条件下で少なくとも２５ｍＶの表面静電絶対電荷を持つ請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
Ｘが−(ＣＨ２)ｍ−を表し、Ｙが−(ＣＨ２)ｒ−を表し、ここで、ｍは、ｍ＋ｎが２から１０の値を表す条件で、２から１０の値を表し；ｒは、ｒ＋ｓが２から１０の値を表す条件で、２から１０の値を表す請求項１から２の何れか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
ＮＰが金ナノ粒子である請求項１から３の何れか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
ナノ粒子が、４から２０ｎｍの直径を有するナノスフィアである請求項１から４の何れか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
生理学的な媒体中においてコロイド安定性を有する請求項１から５の何れか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
式(ＩＩ)のリンカーにおいて、ｎ＝０であり；式（ＩＩＩ）のリンカーにおいて、ｓ＝０である請求項１から６の何れか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
式（ＩＩ）のリンカーにおいて、ｎ＝０かつｍ＝１０であり；式（ＩＩＩ）のリンカーにおいて、ｐ＝２、ｓ＝０、及びｒ＝４である請求項７に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
Ａが式(ＩＶ)の白金（ＩＩ）ビラジカルである請求項１から８の何れか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
請求項１に記載の式（Ｉ）のコンジュゲートの調製方法において、次の工程：
ａ）金、銀又は白金ナノ粒子ＮＰを、式（ＩＩａ）、式（ＩＩＩａ）、立体異性体、及び式（ＩＩａ）及び式（ＩＩＩａ）の何れかの塩からなる群から選択される過剰の化合物と水溶液中で反応させて、中間体コンジュゲートを生じせしめ、
0005873719.tif 000020
ここで、Ｘ、ｎ、ｐ、Ｙ及びｓは請求項１におけるものと同じ意味を有し、コンジュゲーション後にコロイド溶液の式（ＩＩａ）又は式（ＩＩＩａ）の化合物の非反応性分子を透析によって除去し、
ｂ）工程ａ）において得られた中間体コンジュゲートを、塩基の存在下、水溶液中において、過剰の白金（ＩＩ）化合物と反応させて、コロイド安定性を有する式（Ｉ）のコンジュゲートを生じせしめ、
0005873719.tif 000021
ここで、白金（ＩＩ）化合物は、何れかの立体異性体を含む、式（ＩＶａ）、式（Ｖａ）、式（ＶＩａ）、及び式（ＩＶａ）、式（Ｖａ）、式（ＶＩａ）の何れかの塩からなる群から選択され、次いで、得られたコンジュゲート中の式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）のリンカーＬの少なくとも４５％が遊離のカルボキシル基の形態である時に、過剰の白金（ＩＩ）化合物を除去するための反応を停止させる方法。
【請求項１１】
請求項１から９の何れかに記載の式（Ｉ）のコンジュゲートを、一又は複数の薬学的に許容可能な賦形剤と共に含有する薬学的組成物。
【請求項１２】
静脈内、皮下、又は筋肉内注射によって投与される請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
癌に使用される請求項１から９の何れか一項に記載の式（Ｉ）のコンジュゲート。
【請求項１４】
ナノ粒子が、４から２０ｎｍの直径を有する金ナノスフィアである請求項１３に記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
式（ＩＩ）のリンカーにおいて、ｍ＝１０であり、式（ＩＩＩ）のリンカーにおいて、ｐ＝２及びｒ＝４である請求項１３から１４の何れか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
Ａが式（ＩＶ）の白金（ＩＩ）ビラジカルである請求項１３から１５の何れか一項に記載のコンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、白金含有化合物で被覆された金属製ナノ粒子を含有する媒体中でコロイド安定性を有するコンジュゲートに関する。本発明はまたその調製方法及びそれらを含む薬学的組成物にも関する。本発明のコンジュゲートは癌の治療に使用される。
【背景技術】
【０００２】
白金化合物は癌の化学療法において重要な役割を果たしている。第一世代の白金ベース化学療法薬であるシスプラチンは、最も一般的な抗癌剤の一つであり、広い範囲の抗癌活性を有している。しかしながら、深刻な毒性作用（例えば、腎毒性、神経毒性及び聴器毒性）及び内因性又は獲得耐性を生じ、用量を増加させなければならないことになる、悪性細胞と正常細胞の間の乏しい選択性のような欠点が、重大なことにその効能を制限する。更に、シスプラチンは更なる欠点、例えば水溶液中における低い溶解度や吐き気及び嘔吐のような副作用を有している。
【０００３】
シスプラチンよりも毒性が少なく活性であり、及び／又は交差耐性を示さない新しい世代の白金誘導体を開発することによってこれらの主要な問題を克服することに多大な努力が払われているが、改善は尚かなり少ない。よって、カルボプラチン又はオキサリプラチンのような第二世代の白金ベース薬剤は、低い腎毒性及び胃腸毒性を有しているが、カルボプラチンによって引き起こされる骨髄毒性及びオキサリプラチンの神経毒性が制約要因である。その抗癌範囲及び効能はシスプラチンとは異なっている。
【０００４】
担体が化学的結合によるか又は受動的な吸着により薬剤を含むドラッグデリバリー系は、薬剤を特定の細胞まで送達させ、免疫系による排除を避けうる。理想的には、そのようなデリバリー系は腫瘍脈管構造を血管外遊出し、腫瘍環境内に蓄積する。腫瘍内に癌薬剤だけを放出することができる粒子デリバリー系はまた健常な組織中における薬剤の蓄積を低減しうる。
【０００５】
ナノ物質に基づく幾つかのドラッグデリバリー系が文献に記載されている。ある場合には、薬剤はナノ物質に吸着されるか又はナノカプセル中に被包される。他の場合には、薬剤はナノ物質の表面に共有的に結合される。
【０００６】
これに関連して、ナノ構造のシスプラチンを誘導する多くの試みが記載されており、例えばポリマーカプセル、官能化可溶性単一壁カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）、ナノホーン、Ｆｅ３Ｏ４粒子、又はポリマー、例えばＰｒｏｌｉｎｄａｃ（登録商標）、２２ｋＤのヒドロキシプロピルメタクリルアミドコポリマー骨格とついでグリシンキレーターリンカーで、ｐＨ感受性であるものである。Ren L.等, Mater. Sci. Eng. C 2003, vol. 23, pp. 113-116及び米国特許出願公開第2006/099146号には、静電相互作用を介して市販のシスプラチンが添加されたサーファクタントを含む近赤外線感受性ナノ粒子が記載されている。更に、Vazquez-Campos 等, “Gold nanoparticles as carriers of cisplatin: A new approach for cancer treatment”, Trends in nanotechnology conference-TNT2008, 1 September 2008のアブストラクトには、癌の治療のための１１−メルカプトウンデカン酸（ＭＵＡ）リンカーを介して金ナノ粒子にコンジュゲートされたシスプラチンが開示されている。Ren L. 等及びVazquez-Campos等によって開示されたものを含むその系の多くでは、作用環境におけるコロイド及びコンジュゲートの安定性が、未解決の問題である。
【０００７】
従って、従来技術の教示にもかかわらず、癌における新しいドラッグデリバリーシステムの研究は尚も発展しつつある分野であり、癌治療法の相対的な効能及び安全性を増大させるデリバリーシステムを更に探求することが必要である。特に、薬剤をその標的まで効率的に輸送することができる安定したドラッグデリバリーシステムを見出すことは興味深い。
【発明の概要】
【０００８】
発明者は、白金化合物をリンカーを介して金属ナノ粒子にコンジュゲートさせ、コンジュゲートをコロイド安定性を有するようにすると、得られるデリバリーシステムは、正常組織への毒性を増加させないで所用に１０倍以上の白金を送達させることができることを見出した。その結果、白金化合物への腫瘍耐性が減り、副作用が減少する。加えて、本発明のコンジュゲートは、溶解度が低い従来使用されている遊離の白金化合物と比較して、非常に可溶性である。
【０００９】
従来技術の項に記載した方策と比較して、本発明のコンジュゲートの調製に使用される発明者のアプローチは、治療効果を有するために必要とされる次の二つの性質を双方とも具備する：ｉ）コンジュゲートのコロイド安定性を効果的に制御して、治療薬剤負荷を最大にし、またｉｉ）薬剤がナノ粒子に結合したときに非活性化され、エンドリソソーム中におけるように酸性の環境に遭遇したときコンジュゲートから脱離した後にのみ活性になるようにするｐＨ感受性結合を同時に有するコンジュゲートを提供する。
【００１０】
従って、本発明の第一の態様は、媒体中でコロイド安定性を有する、式（Ｉ）
0005873719.tif 000002
［上式中、
ＮＰは金、銀又は白金ナノ粒子であり；
Ｌは、硫黄原子を介してナノ粒子ＮＰに結合する式（ＩＩ）のリンカー又はその立体異性体であり；又はＬは、２つの硫黄原子を介してナノ粒子ＮＰに結合する式（ＩＩＩ）のリンカー又はその立体異性体であり、
0005873719.tif 000003
［上式中、
Ｘ及びＹは独立して（Ｃ２−Ｃ２０）炭化水素鎖を表し、ここで少なくとも一つの炭素原子は、ＣＯ基又はＯ及びＮからまる群から選択されるヘテロ原子によって置き換えられていてもよく；また（Ｃ２−Ｃ２０）炭化水素鎖は、ハロゲン、ＯＨ、ＣＯＮＨ２、ＣＯ２（Ｃ１−Ｃ６）アルキル及び−ＣＨＯからなる群から選択される一又は複数の置換基で置換されていてもよく；
ｎ及びｓは、独立して０から１の値を表し；
ｐは１から２の値を表し；及び
Ａは、カルボキシル基の単結合酸素原子を介してリンカーＬに結合しているその全ての立体異性体の任意のものを含む式（ＩＶ）、式（Ｖ）及び式（ＶＩ）からなる群から選択される白金（ＩＩ）ビラジカルであり、ここで、ビラジカルは塩の形態であってもよく
0005873719.tif 000004
但し、
式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）のリンカーにおいて、ｎ＝１又はｓ＝１の場合；白金（ＩＩ）ビラジカルは式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）のリンカーの一分子に結合し、よって同じリンカー分子と２つのＣＯＯ−Ｐｔ結合を形成し；及び
式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）のリンカーにおいて、ｎ＝０又はｓ＝０の場合；白金（ＩＩ）ビラジカルは式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）の２つの独立したリンカー分子に結合し、よってこれら２つのリンカー分子の各々とＣＯＯ−Ｐｔ結合を形成し；及び
式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）のリンカーＬのうち幾つかが遊離のカルボキシル基の形態である］
のコンジュゲートである。
【００１１】
本発明の安定したコロイドコンジュゲートは、適切なコンジュゲーション法によって簡便に調製されうる。従って、本発明の他の態様は、次の工程を有する上述の式（Ｉ）のコンジュゲートの調製方法である：
ａ）金、銀又は白金ナノ粒子ＮＰを、式（ＩＩａ）、式（ＩＩＩａ）、立体異性体、及び式（ＩＩａ）及び式（ＩＩＩａ）の何れかの塩からなる群から選択される過剰の化合物と水溶液中で反応させて、中間体コンジュゲートを生じせしめ、
0005873719.tif 000005
ここで、Ｘ、ｎ、ｐ、Ｙ及びｓは上述のものと同じ意味を有し、
ｂ）工程ａ）において得られた中間体コンジュゲートを、塩基の存在下、水溶液中において、適量の白金（ＩＩ）化合物と反応させて、式（Ｉ）のコンジュゲートを生じせしめ、ここで、白金（ＩＩ）化合物は、何れかの立体異性体を含む、式（ＩＶａ）、式（Ｖａ）、式（ＶＩａ）、及び式（ＩＶａ）、式（Ｖａ）、式（ＶＩａ）の何れかの塩からなる群から選択される。
0005873719.tif 000006
【００１２】
本発明のコンジュゲートは癌に罹患したヒトを含む哺乳類に投与されうる。よって、本発明の他の態様は、一又は複数の薬学的に許容可能な賦形剤と共に上述の式（Ｉ）のコンジュゲートを含有する薬学的組成物に関する。
【００１３】
本発明の更なる態様は、癌において使用される上述の式（Ｉ）のコンジュゲートに関する。従って、この態様は、癌の治療のための医薬の製造における上述の式（Ｉ）のコンジュゲートに関する。あるいは、この態様は、ヒトを含む哺乳動物における癌治療の方法として表すこともでき、該方法は、一又は複数の薬学的に許容可能な賦形剤と共に式（Ｉ）の先に定義したコンジュゲートの有効量を前記哺乳動物に投与することを含む。
【００１４】
本発明のこれらの態様は、続く詳細な説明のセクションにおいて更に記載される。別の定義がなされている場合を除き、ここで使用されるあらゆる技術的及び科学的用語は、この発明が属する技術分野の通常の知識を有する者が通常理解するところのものと同じ意味を有する。ここに記載されたものと同様の又は均等な方法及び材料を本発明の実施に使用することができる。本明細書及び特許請求の範囲を通して、「含む（comprise）」なる語句及びその変形語は、他の技術的な特徴、添加剤、成分、又は工程を除外することを意図していない。本発明の更なる目的、利点及び特徴は、明細書を見れば当業者には明らかになり、又は発明の実施によって知得されうる。更に、本発明はここに記載された特定の及び好ましい実施態様のあらゆる可能な組み合わせを網羅する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明に係るコンジュゲート、特に式（Ｉ）ＮＰ−Ｌ−Ａのコンジュゲートで、ＮＰが金ナノスフィアであり；Ｌがメルカプトプロパン酸（ＭＰＡ）に相当し；Ａがシスプラチンから得られた白金（ＩＩ）ビラジカルであるものの概略図である。
【図２】図２は、ナノ粒子当たりの最大白金化合物負荷の測定を示す。
【図３】図３は、リンカー被覆ナノ粒子へのシスプラチン結合の時間的な変化を示す。
【図４】図４は、コンジュゲーションによる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バンドの赤色シフトをモニタリングした紫外可視スペクトル（吸光度対波長）を示す。Ａは実施例１．１の被覆されていない金ナノスフィアを表し；Ｂは実施例２．１の中間体コンジュゲートを表し；Ｃは実施例４．１のコンジュゲートを表す。
【図５】図５は、ナノ粒子表面がコーティングされた場合のζ-電位降下（強度対ゼータ電位）を示す。−２５．９ｍＶのゼータ電位は実施例４．１のコンジュゲートに対応し；−６５．８ｍＶのゼータ電位は実施例２．１の中間体コンジュゲートに対応し；−３３．６ｍＶのゼータ電位は実施例１．１の被覆されていない金ナノスフィアに対応する。
【図６−１】図６は、実施例４．１のコンジュゲートのＣ（図６Ａ）、Ｓ（図６Ｂ）、Ａｕ（図６Ｃ）及びＰｔ（図６Ｄ）の存在を示すＣ１ｓ、Ｐｔ４ｆ，、Ａｕ４ｆ、Ｓ２ｐ及びＳ２ｓスペクトル領域の高分解能ＸＰＳ（強度対結合エネルギ）を示す。
【図６−２】図６は、実施例４．１のコンジュゲートのＣ（図６Ａ）、Ｓ（図６Ｂ）、Ａｕ（図６Ｃ）及びＰｔ（図６Ｄ）の存在を示すＣ１ｓ、Ｐｔ４ｆ，、Ａｕ４ｆ、Ｓ２ｐ及びＳ２ｓスペクトル領域の高分解能ＸＰＳ（強度対結合エネルギ）を示す。
【図７】図７は、コンジュゲートによる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バンドの赤色シフトをモニタリングした紫外可視スペクトル（吸光度対波長）を表す。Ａは実施例１．２の被覆されていない金ナノスフィアを表し；Ｂは実施例２．２の中間体コンジュゲートを表し；Ｃは実施例４．２のコンジュゲートを表す。
【図８】図８は、コンジュゲートによる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バンドの赤色シフトをモニタリングした紫外可視スペクトル（吸光度対波長）を表す。Ａは実施例１．３の被覆されていない金ナノスフィアを表し；Ｂは実施例２．３の中間体コンジュゲートを表し；Ｃは実施例４．３のコンジュゲートを表す。
【図９】図９は、コンジュゲートによる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バンドの赤色シフトをモニタリングした紫外可視スペクトル（吸光度対波長）を表す。Ａは実施例１．４の被覆されていない金ナノスフィアを表し；Ｂは実施例２．４の中間体コンジュゲートを表し；Ｃは５μＭの白金濃度での実施例４．４のコンジュゲートを表し；Ｄは５０μＭの白金濃度での実施例４．４のコンジュゲートを表す。
【図１０】図１０は、Ａ：細胞培地中における実施例４．１のコンジュゲート、Ｂ：水中における実施例５のコンジュゲート；及びＣ：細胞培地中における実施例５のコンジュゲートの原子白金の量の時間変化として測定された安定性を示す。
【図１１】図１１は、Ａ５４９腫瘍細胞（ヒト肺癌由来の細胞株）の生存率におけるコンジュゲートの効果のＭＴＴアッセイを示す。Ｂは実施例１．１の被覆されていない金ナノスフィアを表し；Ｃは実施例２．１の中間体コンジュゲートを表し；Ｄは実施例４．１のコンジュゲートに対応し；Ｅは市販のシスプラチンに対応し；Ｆは実施例３のシスプラチン誘導体に対応し；Ａ及びＧは０及び４８時間におけるコントロール値をそれぞれ表す。
【図１２】図１２は、３つの異なった群に対する時間（日数）当たりの腫瘍サイズの増加の％を示し；Ａは治療されていない群に対応し；Ｂは市販のシスプラチンで治療した群に対応し；Ｃは実施例４．１のコンジュゲートで治療した群に対応する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明によれば、「コンジュゲート」なる用語は、白金を含む他の化合物に結合している金、銀又は白金ナノ粒子を意味する。特に、ＮＰ−Ｌ−Ａとも呼ばれるコンジュゲートなる用語は、ＳとＡｕの間で生じるもの（４５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）のような疑似共有結合（pseudo-covalent bond）を介してリンカーＬに結合しており、リンカーＬがO とPt間の配位結合（約４ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を通して白金化合物に結合している、金、銀又は白金ナノ粒子を意味する。配位結合はｐＨの弱い変動には感受性ではない。よって、上記配位置結合は５より低いｐＨでのみ加水分解され、それによって白金薬剤を放出する。よって、コンジュゲートが血清中で安定である一方、腫瘍細胞のエンドリソソーム中で生じるようにｐＨが低下すると、その薬剤添加物を放出する。
【００１７】
本発明のコンジュゲートは媒体中においてコロイド安定性を有している。これは、本発明のコンジュゲートは、他の媒体に分散せしめられたときに、凝集（つまり、沈殿）に対して抵抗できることを意味する。よって、得られる分散物は長い有効期間を示し、溶液の外観を有している。
【００１８】
本発明のコンジュゲートのコロイド安定性は、コンジュゲートが安定ではないならば、遊離の薬剤に対してインビボでもインビトロでも有益性を示さないので、必須である。
【００１９】
好ましい実施態様では、コンジュゲートは、中性（７）に近いｐＨと高い生理食塩水濃度を含む身体又は身体機能の条件又は状態である生理的条件においてコロイド安定性を示す。
【００２０】
紫外可視分光法はコンジュゲートのコロイド安定性を決定するための有用な技術である。
【００２１】
図２は、０．０４ｍＭから０．３ｍＭの範囲の異なった負荷の白金化合物をそれぞれ含有する幾つかのコンジュゲート（ＮＰ：２０ｎｍの金ナノスフィア、Ｌ：１１−メルカプトウンデカン酸（ＭＵＡ）、Ａ：シスプラチン）に対する紫外可視スペクトルを示す。不可逆的な凝集（つまり、表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）ピークの赤色シフト及び広幅化）が、白金化合物の濃度がリンカーシェルによって与えられる全ての負の電荷をクエンチするのに十分に高い場合に見ることができる。よって、０．１０ｍＭのシスプラチンから、凝集物の形成が観察され、０．２０ｍＭから、凝集が不可逆的であり、試料の沈殿に至る。
【００２２】
以下に詳細に記載されるように、コロイド安定性を有するコンジュゲートの調製において、十分な量のリンカー分子が脱プロトン化されたままであるように、リンカー分子に結合される白金化合物分子の数を制御することが重要である。よって、コンジュゲートが支持できる白金化合物の濃度は表面電荷に関連する。作用ｐＨでリンカー分子は脱プロトン化され、従って荷電される。一般には、作用ｐＨは、生理的条件下のｐＨに対応する。白金配位錯体の添加はその電荷の一部をクエンチする。これは、与えられたｐＨにおけるζ電位値の減少によって測定されうる。コロイド粒子が凝集に対して安定であるには一般に約３０ｍＶ（正又は負）を必要とすることがよく知られている。この値は、ｐＨ及びイオン強度に依存する。少なくとも２５ｍＶの表面静電絶対電荷を有する本発明のコンジュゲートはまた安定であり、本発明の一部をまた形成する。よって、特定の実施態様では、本発明は、生理的条件下で少なくとも２５ｍＶのゼータ電位絶対値である少なくとも２５ｍＶの表面静電絶対電荷を有する式（Ｉ）のコンジュゲートに関する。他の実施態様では、式（Ｉ）のコンジュゲートは、生理的条件下で少なくとも３０ｍＶのゼータ電位絶対値である少なくとも３０ｍＶの表面静電絶対電荷を有する。
【００２３】
本発明のコンジュゲートは、金、銀又は白金製のナノ粒子（ここではＮＰとも称される）を含有する。これらの金属は、式（ＩＩａ）又は式（ＩＩＩａ）
0005873719.tif 000007
（ここで、Ｘ、ｎ、ｐ、Ｙ及びｓは上述の意味を有する）
の化合物の硫黄基のような、硫黄基（ＳＨ及びジスルフィドＳ−Ｓ基の双方を含む）に対して高い親和性を示す。
【００２４】
よって、遊離のＳＨ基又はジスルフィド基は金属ナノ粒子と自然に反応して疑似共有結合金属−Ｓを形成する傾向が強い。リンカーとナノ粒子との間の強い結合はリンカー分子の脱離を避けるために必要とされる。
【００２５】
加えて、無機ナノ粒子は、例えばガンマ線、Ｘ線、近赤外線（ＮＩＲ）又は紫外可視及びマイクロ波を含む電磁場に対する良好なアンテナである。
【００２６】
本発明の好ましい実施態様では、金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）が使用される。ＡｕＮＰは強い表面プラズモン亢進吸収と散乱性を有し、画像標識及び造影剤としてそれらを理想的にする。それらは光退色を受けにくく、生体適合性があり、非細胞傷害性である。更に、それらはその共鳴周波数で光を吸収するとき加熱され得、癌の光熱療法を可能にする。
【００２７】
本発明の目的において、「ナノ粒子」なる用語は、異なった形状及びサイズを有しうるナノメートルサイズの粒子を意味する。ここに記載されたナノ粒子の形状に関しては、球状体及び平坦な面及び真っ直ぐな縁部を含む多面体が本発明の範囲に含まれる。このような多面体の例は、限定しないが、立方体、角柱体及び棒状体を含む。多面体は、それらが近赤外線（ＮＩＲ）感受性でありうるという利点を有しており、よってナノ粒子は局所的に加熱されうる。好ましい実施態様では、ナノ粒子は球状である。好ましい実施態様では、ナノ粒子は金ナノ粒子である。
【００２８】
ナノ粒子のサイズは、延長した血漿寿命を可能にする、つまりコンジュゲートが、超透過性腫瘍毛管に遭遇するまで全身性循環中に残るようなものでなければならない。
【００２９】
ナノ球状体の場合、直径は３から１００ｎｍの範囲、好ましくは４から２０ｎｍの範囲からなる。
【００３０】
ナノ立方体及びナノ角柱体の場合、サイズは、ナノ立方体又はナノ角柱に内接し、可能な最大の直径を有する球体によって定義される。双方の場合、上記球体の直径は３から１００ｎｍの範囲、好ましくは４から２０ｎｍの範囲からなる。
【００３１】
更に、棒状体の場合、サイズは１００ｎｍ長で１５ｎｍ幅、好ましくは４５ｎｍ長×１５ｎｍ幅である。
【００３２】
上述のサイズ値は、腎臓を避けるのに十分に大きく、細網内皮系、細網結合組織に位置する食細胞、主に単球及びマクロファージからなる免疫系の一部を避けるのに十分に小さいコンジュゲートを生じる。更に、（アミノ酸又は小ペプチドのような必須の小分子のものを越える）本発明のコンジュゲートのこのサイズはエンドサイトーシスを促進する。
【００３３】
より好ましい実施態様では、本発明のナノスフィアは、約１０ｎｍの直径を有する。他のより好ましい実施態様では、本発明は、その内接球が約１０ｎｍの直径を有しているナノ立方体及びナノ角柱体に関する。最も好ましい実施態様では、本発明のナノ粒子は、４から２０ｎｍの直径を有する金ナノスフィアである。
【００３４】
既に述べたように、本発明のコンジュゲートは、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）、及び式（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の何れかの立体異性体からなる群から選択されるリンカーＬを含み、
0005873719.tif 000008
ここで、Ｘ、ｎ、ｐ、Ｙ及びｓは先に記載された意味を有する。
【００３５】
上述したように、式（Ｉ）ＮＰ−Ｌ−Ａの表面荷電コンジュゲートにおいて、必ずしも全てのリンカーＬが白金化合物に結合しているものではないが、遊離のカルボキシル基の形態にある、つまり、式（Ｉ）ＮＰ−Ｌ−Ａのコンジュゲートにおいて、白金ビラジカルＡの幾つかは存在してない。一般に、これらの遊離のカルボキシル基は中性又は塩基性条件下で脱プロトン化される。特定の実施態様では、式（Ｉ）ＮＰ−Ｌ−Ａの表面荷電コンジュゲートにおいて、リンカーＬの少なくとも４５％が遊離のカルボキシル基の形態にある、つまり、式（Ｉ）ＮＰ−Ｌ−Ａの表面荷電コンジュゲートにおいて、白金ビラジカルの少なくとも４５％が存在していない。
【００３６】
本発明の目的に対して、（Ｃ２−Ｃ２０）炭化水素鎖なる用語は、２から２０炭素原子を含む直鎖状又は分枝状の炭化水素鎖に関し、ここで、少なくとも一つの炭素原子はＣＯ基又はＯとＮからなる群から選択されるヘテロ原子によって場合によっては置き換えられていてもよく、またこれは場合によっては二重結合及び／又は三重結合の形態の一又は複数の不飽和を含みうる。（Ｃ２−Ｃ２０）炭化水素鎖は、ハロゲン、ＯＨ、ＣＯＮＨ２、ＣＯ２（Ｃ１−Ｃ６）アルキル及び−ＣＨＯからなる群から選択される一又は複数の置換基で置換されていてもよい。
【００３７】
更に、Ｌが式（ＩＩ）のリンカーである場合、それは唯一の利用可能な硫黄原子を通してナノ粒子ＮＰに結合している一方；Ｌが式（ＩＩＩ）のリンカーである場合、それは二つの硫黄原子を通してナノ粒子ＮＰに結合している。
【００３８】
特定の実施態様では、Ｘ及びＹは独立して上述の未置換の（Ｃ２−Ｃ２０）炭化水素鎖を表す。
【００３９】
好ましい実施態様では、式（ＩＩ）のリンカーにおいて、Ｘは−（ＣＨ２）ｍ−を表し、式（ＩＩＩ）のリンカーにおいて、Ｙは−（ＣＨ２）ｒ−を表し、ここで、ｍは、ｍ＋ｎが２から１０の値を表す条件で、２から１０の値を表し；ｒは、ｒ＋ｓが２から１０の値を表す条件で、２から１０の値を表す。
【００４０】
より好ましい実施態様では、式（ＩＩ）のリンカーにおいて、ｎ＝０であり、式（ＩＩＩ）のリンカーにおいて、ｓ＝０である。この特定の場合では、リンカー分子は直鎖状であり、より多くの分子がナノ粒子に結合されうる。
【００４１】
更により好ましい実施態様では、式（ＩＩ）のリンカーにおいて、ｎ＝０かつｍ＝０であり；式（ＩＩＩ）のリンカーにおいて、ｐ＝２、ｓ＝０及びｒ＝４である。
【００４２】
式（Ｉ）のコンジュゲートにおいて、リンカーＬは、上述のように白金（ＩＩ）ビラジカルに更に結合している。よって、Ｌが式（ＩＩ）のリンカーで、ｎ＝１であるか、又は式（ＩＩＩ）のリンカーで、ｓ＝１である場合；白金（ＩＩ）ビラジカルはリンカーの一分子に結合し、よって同じリンカー分子と２つのＣＯＯ−Ｐｔ結合を形成する。次のスキームにおいては、Ｌが式（ＩＩ）のリンカーで、ｎ＝１であり、Ａが式（ＩＶ）、（Ｖ）及び（ＶＩ）からなる群から選択される白金（ＩＩ）ビラジカルである３つのコンジュゲートが示される。
0005873719.tif 000009
【００４３】
更に、Ｌが式（ＩＩ）のリンカーで、ｎ＝０であるか、又は式（ＩＩＩ）のリンカーで、ｓ＝０である場合；白金（ＩＩ）ビラジカルは二つの独立したリンカー分子に結合し、よってこれらの二つのリンカー分子の各々とCOO-Pt 結合を形成する。次のスキームにおいて、Ｌが式（ＩＩ）のリンカーで、ｎ＝０であり、Ａが式（ＩＶ）、（Ｖ）及び（ＶＩ）からなる群から選択される白金（ＩＩ）ビラジカルである３つのコンジュゲートが示される。
0005873719.tif 000010
【００４４】
好ましい実施態様では、式（Ｉ）のコンジュゲートは、Ｘが−（ＣＨ２）ｍ−を表す式（ＩＩ）のリンカー、又はＹが−（ＣＨ２）ｒ−を表す式（ＩＩＩ）のリンカーを含み、ここで、ｍは、ｍ＋ｎが２から１０の値を表す条件で、２から１０の値を表し；ｒは、ｒ＋ｓが２から１０の値を表す条件で、２から１０の値を表す。
【００４５】
より好ましい実施態様では、式（Ｉ）のコンジュゲートは、Ｘ  が−（ＣＨ２）ｍ−を表し、ｎ＝０である式（ＩＩ）のリンカー、又はＹが−（ＣＨ２）ｒ−を表し、ｓ＝０である式（ＩＩＩ）のリンカーを含む。更により好ましい実施態様では、式（Ｉ）のコンジュゲートは、Ｘが−（ＣＨ２）ｍ−を表し、ｎ＝０である式（ＩＩ）のリンカーを含む。
【００４６】
本発明の他の好ましい実施態様では、Ａは式（ＩＶ）の白金（ＩＩ）ビラジカルを表す。
【００４７】
最も好ましい実施態様では、式（Ｉ）のコンジュゲートは、Ｘが−（ＣＨ２）ｍ−を表し、ｎ＝０である式（ＩＩ）のリンカー、及び式（ＩＶ）の白金（ＩＩ）ビラジカルを含む。
【００４８】
式（ＩＶ）、（Ｖ）及び（ＶＩ）の白金ビラジカルの立体異性体がまた本発明の一部を形成する。
式（ＩＶ）、（Ｖ）及び（ＶＩ）の白金ビラジカルは、アニオンと共に塩を形成しうる。塩の形態のビラジカルにおいて存在しうるアニオンの非限定的な例は、塩化物、硝酸塩又は水酸化物である。
【００４９】
式（Ｉ）のコンジュゲートにおいて、Ａはシス立体配置を実質的に有する白金（ＩＩ）ビラジカルである。これは、白金（ＩＩ）化合物の少なくとも８０％がシス立体配置を示していることを意味している。
【００５０】
本発明の白金化合物は、次のスキームに示されるように、二つの異なった側を有しており、左側（反応性側）は癌細胞のＤＮＡに結合するように設計される。Ｎ原子を含む右側（不活性側）は薬剤の生体内分布を担う。
0005873719.tif 000011
【００５１】
一般に、白金化合物での式（Ｉ）のコンジュゲートの部分的な官能化は表面の混乱を生じる。特にその反応性端部による、ナノ粒子への白金含有薬剤の分子の充填は、分子を、それらが放出されるまで生分解から保護する。この事実は、ＣＯＯ−基の高度の疎水性と共にオプソニン化、つまりオプソニンと呼ばれる特別なタンパク質での粒子の被覆と、続く食細胞による認識と肝臓中への輸送を防止する。よって、コンジュゲートが標的細胞に達すると、多量の白金含有薬剤が投与されうる。よって、本発明のコンジュゲートは、上で述べられたように、それらが媒体中において沈殿しないという意味で、また白金含有薬剤が作用環境中においてナノ粒子から離脱しないという意味で、安定である。
【００５２】
ＮＰが金ナノスフィアであり；Ｌが、Ｘが−（ＣＨ２）ｍ−を表し、ｎ＝０で、ｍ＝２である式（ＩＩ）のリンカーであり；Ａが式（ＩＶ）の白金（ＩＩ）ビラジカルである式（Ｉ）ＮＰ−Ｌ−Ａのコンジュゲートの概略図を図１に示す。
【００５３】
上述のように、式（Ｉ）のコンジュゲートは、第一に中間体コンジュゲートＮＰ−Ｌ’を調製し、第二に白金含有化合物をこの中間体コンジュゲートに結合させることによる、二工程プロセスによって簡便に調製されうる。
【００５４】
該方法の第一工程においては、水溶液中の過剰の式（ＩＩａ）又は式（ＩＩＩａ）の化合物、又はこれらの式の何れかの立体異性体又は塩が、Ｌ’が式（ＩＩｂ）又は式（ＩＩＩｂ）のリンカー
0005873719.tif 000012
又はこれらリンカーの何れかの立体異性体又は塩、例えばナトリウム塩である上述の式ＮＰ−Ｌ’の中間体コンジュゲートを生じせしめるために使用される。この第一工程を次のスキームに示す：
0005873719.tif 000013
【００５５】
一般に、過剰の式（ＩＩａ）又は式（ＩＩＩａ）の化合物、又はこれらの式の何れかの立体異性体又は塩の存在下でのこの反応は、全表面がリンカーＬ’で被覆された中間体コンジュゲートＮＰ−Ｌ’を生じることが仮定される。
【００５６】
好ましい実施態様では、式（ＩＩａ）の化合物が使用され、これは、１１−メルカプトンデカン酸（ＭＵＡ）又は３−メルカプトプロパン酸（ＭＰＡ）である。他の好ましい実施態様では、（またαリポ酸又はチオクト酸とも命名されている）ペンタン酸である式（ＩＩＩａ）の化合物が使用される。
【００５７】
小ナノ粒子は遠心分離によって精製するのが困難であるので、式（ＩＩａ）又は式（ＩＩＩａ）の化合物の非反応性分子及び還元剤は、コンジュゲーション後に溶液中に存在するコロイド液の透析によって除去されうる。
【００５８】
被覆されていない金属ナノ粒子は、サイズと形状の制御と共に単分散ナノ粒子の簡単でスケール変更可能な生産を可能にするナノ粒子の合成プロトコルを使用して調製することができる。特に、ナノ粒子は、還元剤中におけるＡｕ、Ａｇ及びＰｔの塩から選択される金属塩の迅速な注入によって調製することができ、よって、単分散金属ナノ粒子の生産に用いられる一時的に分散した均質な核形成を生じる。還元剤は、例えば高温でのシトレート（古典的なTurkevitch法）、水素化ホウ素ナトリウム又は水素化ホウ素ナトリウムとアスコルビン酸の混合物であり得、場合によっては臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）を伴う。
【００５９】
金属ナノ粒子の形成は、反応媒質中の色の変化によって観察することができる。使用される方法に応じて、得られたナノ粒子は、ＣＴＡＢのような正しい界面活性剤の存在下で異なったサイズと形状を有するであろう。
【００６０】
第二工程では、式ＮＰ−Ｌ’の中間体コンジュゲートを、その全ての立体異性体を含む式（ＩＶａ）、式（Ｖａ）及び式（ＶＩａ）からなる群から選択される白金化合物と更に反応させ、
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Ａがそれぞれ式（ＩＶ）、式（Ｖ）及び式（ＶＩ）からなる群から選択される白金（ＩＩ）ビラジカルであり、式（ＩＶ）、（Ｖ）及び（ＶＩ）のビラジカルが塩の形態であってもよい式（Ｉ）のコンジュゲートを生じせしめる。この反応は、式（ＩＩｂ）又は式（ＩＩＩｂ）のリンカーＬ’のカルボン酸基を脱プロトン化させるために塩基の存在下、水溶液中で実施されうる。
【００６１】
それらの全ての立体異性体を含む化合物（ＩＶａ）、（Ｖａ）及び（ＶＩａ）は、例えば塩化物又は硝酸塩のようなアニオンの存在下で塩を形成しうる。
【００６２】
上述のように、式（Ｉ）の可溶性コンジュゲート、つまり媒体中でコロイド安定性を有するコンジュゲートを得るためには、幾らかの電荷が表面に維持され、凝集と沈殿を避けるためにＮＰｓに十分な静電電荷と反発性を与えなければならない。よって、表面は、カルボキシル基（ＣＯＯ−）で終端するリンカー分子で被覆され、生理的ｐＨで脱プロトン化され、負の表面電荷をもたらす。  ついで、白金薬剤分子がカルボキシル末端の一部に結合し、表面電荷の幾らかが打ち消されるが、静電気的反発には十分な電荷を残す。
【００６３】
所望の度合いの薬剤充填（つまり、不安定化と凝集を避けるのに十分な表面電荷を維持しながら最も高い可能な治療効果）に達するために、二つの異なったアプローチを採ることができる：ａ）上記の要求に合致する先に計算した量の白金化合物を、ＮＰ−Ｌ’中間体コンジュゲートと混合させることができ、又は別法ではｂ）過剰の白金化合物をＮＰ−Ｌ’中間体コンジュゲートと混合させることができる。
【００６４】
第一の場合では、白金（ＩＩ）化合物の量を先に計算しなければならない。この量は常套的な仕事として容易に決定することができる。特に、様々な量の白金（ＩＩ）化合物を使用する較正曲線を使用することができる。この背後の考えは、様々な量の白金（ＩＩ）化合物を中間体コンジュゲートと反応させ、得られるコンジュゲートを紫外可視分光法によって分析することである。白金化合物の量が、コロイド安定性を有するコンジュゲートに導くには高すぎ、よって凝集体が形成される場合、これは、得られたコンジュゲートと対応する中間体コンジュゲートの紫外可視スペクトルを比較した場合の紫外可視ピークの赤色シフトによって検出することができる。よって、白金化合物の量は、凝集が観察されなくなるまで、引き続き低減される。
【００６５】
第二の場合では、過剰の白金化合物が使用される場合、あまりに多くの白金化合物分子がリンカー分子に結合する前にコンジュゲーションが停止される。発明者は、リンカー被覆ナノ粒子への白金化合物の接合をモニターする場合、プロセスが効果的に停止されないと、白金化合物がリンカー層を被覆し続け、ナノ粒子が不安定になることを見出した。図３は、１０分毎に採った反応ありコートの紫外可視分光分析を示す（ＮＰ：２０ｎｍの金ナノスフィア，Ｌ：１１−メルカプトウンデカン酸（ＭＵＡ），Ａ：シスプラチン）。実線で初期段階が表されている。ナノ粒子の安定性はこの段階では維持されているが、後の時間では幾らかの集塊物が観察されうる。破線では、安定性の喪失（ＭＵＡ層によって与えられる安定性をシスプラチンがクエンチする）のため粒子の凝集がナノ粒子の沈殿を生じる最終段階が示されている。
【００６６】
従って、過剰の白金化合物を用いて作業をする場合、リンカー分子への白金化合物の結合は、白金薬剤の電荷が最大であり、生じるコンジュゲートが尚も安定であるときに停止されなければならない。これは、自然に達成することはできない。コンジュゲーションを停止させるために、コンジュゲーション溶液を、例えば、そこから遊離の白金化合物分子が迅速に逃げて、白金化合物で部分的に被覆されたコンジュゲートＮＰ−Ｌ’を残す透析バッグ中に配する。反応が停止されなければならない時間は、図３に示されるものに類似した実験において先に計算することができる。この最後の手順は、より速くより制御されるという利点を有している。
【００６７】
コンジュゲーションは、動的光散乱（ＤＬＳ）、紫外可視分光法、ゼータ電位、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、光学顕微鏡、ゲル電気泳動及び定量分析のためのＩＣＰ−ＭＳを含む一連の実験の組み合わせによってモニターすることができる。
【００６８】
式（ＩＶａ）の化合物は、式（ＶＩＩ）（シスプラチン）又は  式（ＶＩＩＩ）（カルボプラチン）の化合物から出発して合成することができ；式（Ｖａ）の化合物は、式（ＩＸ）（オキサリプラチン）の化合物から出発して合成することができ；また式（ＶＩａ）の化合物は、式（Ｘ）の化合物から出発して合成することができる。
0005873719.tif 000015
【００６９】
シスプラチンの場合、シスプラチン分子からＣｌを除去し、水和種を得るために、ＡｇＮＯ３のようなＡｇカチオン源を用いて化合物を処理することによって転換を実施する。カルボプラチンの場合は、当該分野でよく知られた標準法によるＣＯＯ結合の加水分解により式（ＩＶａ）の化合物に化合物を転換させる。同様に、式（ＶＩＩ）の化合物は類似の方法によって式（Ｖ）の化合物に転換させることができる。
【００７０】
別法では、式（Ｖａ）及び（ＶＩａ）の化合物は、１）ＰｔＣｌ４を対応するアミン：シクロヘキサン−１，２−ジアミン又はアンモニア／シクロヘキシルアミンと反応させて、中間体（Ｖｂ）及び（ＶＩｂ）を得、
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２）工程１）で得られた中間体を、Ａｇカチオン源、例えばＡｇＮＯ３で処理して、Ｃｌを除去し、水和種（Ｖａ）及び（ＶＩａ）をそれぞれ得る
工程を含む２工程合成によって、得ることができる。
所望されない副産物、特にトランス白金化合物はクロマトグラフィーによって除去することができる。
【００７１】
式（ＶＩＩ）から（Ｘ）の白金化合物の代わりに式（ＩＶａ）、（Ｖａ）又は（ＶＩａ）の白金化合物が中間体コンジュゲートＮＰ−Ｌ’にコンジュゲートされるという事実は、重要な結果を有している。よって、本発明のコンジュゲートでは、リンカーと白金化合物の間で配位結合が形成される。これらの結合は、既に述べたように強く、特に生理的条件下で媒体中において、分子の安定性をもたらす。これらの結合は、エンドソーム及びエンドリソソームにおけるもののような低ｐＨでのみ加水分解される。
【００７２】
他方、従来技術に記載されているように、シスプラチンが式ＮＰ−Ｌ’の中間体コンジュゲートに直接コンジュゲートされる場合、リンカーと白金化合物の間に静電結合が形成される。一般に、静電結合は配位結合ほど強くない（電解質を含む水溶液中で約０．４Ｋｃａｌ／ｍｏｌ）。特に、これらの結合は、本発明のコンジュゲートとは異なり、コロイド不安定性（凝集及び沈殿）を示すコンジュゲートを生じる。これは実施例においてより詳細に示す。
【００７３】
本発明の薬学的組成物は固体又は液体組成物として製剤化されうる。好ましい実施態様では、薬学的組成物の投与は、筋肉内、静脈内、腹腔内又は腫瘍内である。一般に、適切な製剤は、例えば抗酸化剤、バッファー及び静菌剤を含みうる適切なｐＨ及び安定性を有する水性及び非水性、等張性滅菌注射溶液；及び懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び保存料を含みうる水性及び非水性滅菌懸濁液を含む。
【００７４】
既に述べたように、本発明のコンジュゲートは、癌に罹患している患者において、特に外科手術が実施できない症例で、癌を治療するために有用でありうる。
【００７５】
対象とされる代表的な癌は、限定しないが、頭部、頸部及び肺組織；胃腸管及び膵臓、例えば胃癌、結腸直腸腺腫、結腸直腸癌及び膵臓癌；肝臓組織、例えば肝細胞癌；腎臓及び尿管、例えば膀胱癌、腎臓癌；乳房組織、例えば乳癌；神経組織、例えば神経芽細胞腫及び悪性髄膜腫；皮膚組織、例えばメラノーマ；及び血液組織、例えばリンパ腫及び白血病を含む。
【００７６】
当業者であれば、用量レベルが、とりわけ、特定の化合物、デリバリービヒクルの性質、及び治療される腫瘍の性質の関数として変動しうることは分かるであろう。特定の実施態様では、本発明のインビボ適用のための現実的な用量を得るには、コンジュゲートの濃度が約５０倍増加される。この目的を達成するために、ナノ粒子を遠心分離によって沈殿させ、ペレットを回収し、如何なる安定性も失わせないで漸次減少する量の溶媒に再溶解させる。
【００７７】
本発明のコンジュゲートは、シスプラチン及びアナログを用いた現在使用されている治療法と比較してそれらが副作用を低減するという利点を有している。
【００７８】
本発明のコンジュゲートは、亢進された透過及び保持効果（ＥＰＲ）の結果として腫瘍上に集中しうる。簡単に言えば、ＥＰＲ効果は、腫瘍における欠陥のある組織完全性、透過メディエータの変化及び損なわれたリンパ性ドレナージの結果である。よって、腫瘍の血管内皮は、２００ｎｍまでのより大きな分子種が健常な組織におけるよりも組織を透過することを可能にする比較的大きな間隙を有する傾向がある。ついで、変化した透過メディエータ及び損なわれたリンパ性ドレナージの機序が、腫瘍に浸透した分子がそこに留まることを担保する。よって、本発明のコンジュゲートは、腫瘍中に受動的に蓄積し、そこからエンドサイトーシスによって内部移行する。投与が必要な白金薬剤の量を低下させるこのＩＤの利点は、少ない副作用を伴う。
【００７９】
更に、コンジュゲーションのため、コンジュゲートは全身性循環中においては不活性であり、腫瘍に到達した後にのみ活性化されうるか、又は肝臓では、粒状物質がそうであるように、毒性が観察されない。腫瘍組織に入るとき、一度エンドソームにおいて、細胞の消化器（エンドソームとリソソームの融合から生じるエンドリソソーム）によって使用される低いｐＨが、リンカーと白金薬剤との間の配位結合の加水分解を生じせしめ、その結果、白金薬剤が核の近くまで放出される。
【００８０】
既に述べたように、本発明は、一又は複数の薬学的に許容可能な賦形剤と共に式（Ｉ）のコンジュゲートの治療的に有効な量を、それを必要とするヒトを含む哺乳動物に投与することを含む、癌の治療のために方法にも関する。特定の実施態様では、後者の方法は、白金薬剤がより効果的になるために、任意の頻度で放射線療法（ガンマからＸＲ、ＮＩＲ及びＭＷ）を用いて腫瘍に局所的に照射することを更に含む。
【実施例】
【００８１】
以下の実施例は例証手段として提供されるもので、本発明の範囲を限定することを意味するものではない。
【００８２】
特徴付け技術
１）紫外可視分光法
紫外可視スペクトルを、シマズUV-2400分光光度計で獲得した。１ｍＬのナノ粒子又はコンジュゲートをセルに入れ、３００ｎｍから８００ｎｍの範囲で分光分析を実施した。
【００８３】
２）ゼータ電位
ナノ粒子及びコンジュゲートのゼータ電位を、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＺｅｔａＳｉｚｅｒアナライザー(Malvern Instruments, UK)を使用して決定した。この測定は、ｐＨ（７．０）の制御で実施した。
【００８４】
３）Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）
ＸＰＳでは、１０μＬのナノ粒子又はコンジュゲートの溶液をシリコン窒化物表面に配し、ＰＨＩ ＥＳＣＡ−５５００装置を使用して分析した。単色光Ａｌ Ｋ＿Ｘ線源を用いて、チャンバーを２×１０−９Ｔｏｒｒ以下に維持した。スペクトルは、Ｍｕｌｔｉｐａｋソフトウェアを使用して解析した。
【００８５】
実施例１：金ナノスフィアの合成（ＡｕＮＰ）
実施例１．１：４ｎｍの直径を有する金ナノスフィア
ＮａＢＨ４（０．１Ｍ、０．６ｍＬ）の氷冷した新鮮に調製した水溶液を、室温で攪拌しながら、ＨＡｕＣｌ４（０．２５ｍＭ）とクエン酸三ナトリウム（０．２５ｍＭ）の２０ｍＬの水溶液に加えた。ＮａＢＨ４の添加直後に溶液はピンク色に変化し、粒子形成を示した。この方法に従って、４ｎｍの直径を有する金ナノスフィアが得られた。コロイド溶液の特徴付けは、λｍａｘ＝５１２．５ｎｍ（図４、Ａ）及びζ−電位（−３３．６ｍＶ、図５、Ａ）を得た紫外可視分光法によって実施した。
【００８６】
同様の手順（Ｔｕｒｋｅｖｉｃｈ法）に従って、次のナノ粒子を得た：
実施例１．２：１３ｎｍの直径を有する金ナノスフィア（図７、Ａ）。
実施例１．３：２０ｎｍの直径を有する金ナノスフィア（図８、Ａ）。
【００８７】
実施例２：中間体コンジュゲート（ＡｕＮＰ−Ｌ’）
実施例２．１：中間体コンジュゲートＡｕＮＰ（ＮＰ：１３ｎｍ）−ＭＵＡ
実施例１．１）において得られたＡｕＮＰ溶液に、メルカプトウンデカン酸（ＭＵＡ、１０ｍＭ、５０μＬ／ｍＬ ＮＰｓ）の水溶液を加えることによって、コンジュゲーションを実施した。反応は室温で起こり、チオール化した分子の添加時にコロイド溶液の瞬時の色変化が観察された。最適なコンジュゲーションに到達するために少なくとも３０分、反応を実施した。精製は、中性ｐＨにおいて２日間、ミリＱ Ｈ２Ｏ（１０ｍＬのＮＰｓ／５ＬのＨ２Ｏ）に対して透析によって行った。ＡｕＮＰ（ＮＰ：４ｎｍ）−ＭＵＡ中間体コンジュゲートは、紫外可視分光法（λｍａｘ＝５１９ｎｍ，図４，Ｂ）、ζ−電位（−６５．８ｍＶ，図５，Ｂ）及びコンジュゲーション工程を確認するＸＰＳ（Ｓ２ｐ １６４．８ｅＶ）によって特徴付けした。
【００８８】
上述のものと同じ手順に従って、次の中間体コンジュゲートを得た：
実施例２．２：ＡｕＮＰ（ＮＰ：１３ｎｍ）−ＭＵＡ中間体コンジュゲート（図７，Ｂ）。
実施例２．３：ＡｕＮＰ（ＮＰ：２０ｎｍ）−ＭＵＡ中間体コンジュゲート（図８，Ｂ）。
同様に、上述のものと同じ手順に従い、ＭＵＡの代わりにチオクト酸（ＴＡ）を使用して、次の中間体コンジュゲートを得た：
実施例２．４：ＡｕＮＰ（ＮＰ：４ｎｍ）−ＴＡ中間コンジュゲート（図９，Ｂ）。
【００８９】
実施例３：白金誘導体の合成：シス-[Ｐｔ(ＮＨ３)２(Ｈ２Ｏ)２](ＮＯ３)２（式（ＩＶａ）の化合物）
２．５ｍＬのＨ２Ｏ中のＡｇＮＯ３（１６９ｍｇ、１ｍｍｏｌ）溶液を、２．５ｍＬのＨ２Ｏ中のシスプラチン（１５０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）の懸濁液に滴下して加えた。白色固形物（ＡｇＣｌ）が沈殿し、添加の完了後に最初の混合物の黄色が消滅した。生じた懸濁液を５０℃で１時間加熱し、ついで遠心分離によってＡｇＣｌを分離した。上清を蒸発乾固させ、エタノール／水混合物から残留物を再結晶させた。収率：１７４ｍｇ（８９％）。
【００９０】
実施例４：コンジュゲートＡｕＮＰ−Ｌ−Ａの合成
実施例４．１：ＡｕＮＰ（ＮＰ：４ｎｍ）−ＭＵＡ−Ｐｔコンジュゲート
【００９１】
実施例２．１（１０ｍＬ、約７．１２×１０１３ＮＰ／ｍＬ）のコロイド溶液を、ＮａＯＨ（０．１Ｍ）の水溶液で塩基性ｐＨ（９−１４）にした。室温で攪拌しながら、溶液に工程３（添加した過剰のＭＵＡに対して０．５当量）で得られた過剰の式（ＩＶａ）の化合物を加えた。少なくとも３０分間反応させ、コンジュゲートしたコロイド溶液（５ｍＬのＡｕＮＰ（ＮＰ：４ｎｍ）−ＭＵＡ−Ｐｔコンジュゲート／５ＬのＭｉｌｌｉＱ水）の透析によって中性ｐＨで２日間、精製を実施した。紫外可視分析法によって、１．５ｎｍ（λｍａｘ＝５２０．５ｎｍ）の表面プラスモン共鳴における赤色シフトを観察することによって、特徴付けした。加えて、ＸＰＳによる特徴付けによって、ナノ粒子上のＰｔ誘導体の存在を確認した（Ｐｔ４ｆ７４．１及び７７．６ｅＶ）。ＡｕＮＰ溶液上の薬剤の定量はＩＣＰ−ＭＳ（１．９ｍｇ／Ｌ）によって測定した。
得られたコンジュゲートは、紫外可視分光分析法（図４，Ｃ）、ζ−電位（−２５．９ｍＶ、図．５）及びコンジュゲーション工程を確認するＸＰＳ（図６）により、特徴付けした。
【００９２】
上述のものと同じ手順に従って、しかし実施例２．２、２．３及び２．４の中間体コンジュゲートから出発して、それぞれ次のコンジュゲートを得た：
実施例４．２：ＡｕＮＰ（ＮＰ：１３ｎｍ）−ＭＵＡ−Ｐｔ（図７、Ｃ）。
実施例４．３：ＡｕＮＰ（ＮＰ：２０ｎｍ）−ＭＵＡ−Ｐｔ（図８、Ｃ）。
実施例４．４：ＡｕＮＰ（ＮＰ：４ｎｍ）−ＴＡ−Ｐｔ（図９、Ｃ及びＤ）。
【００９３】
実施例５：コンジュゲートＡｕＮＰ（ＮＰ：４ｎｍ）−ＭＵＡ−シスプラチンの合成（比例）
この実施例は、静電気相互作用を通して得られるコンジュゲートの効果を比較することが狙いである。この目的のため、ナノスフィアが工程２で得られた４ｎｍの直径を有する中間コンジュゲートＡｕＮＰ−ＭＵＡを、次のようにしてシスプラチンで更に官能化した：
コンジュゲートＡｕＮＰ−ＭＵＡ（実施例２．１、５ｍＬの１０１２ＮＰ／ｍＬ）を少なくとも三回洗浄した後、市販の１ｍｇ／ｍＬのシスプラチン水溶液５ｍＬ中に分散させた。被覆されたナノ粒子上へのシスプラチンの吸収は２日以上かけて行われた。過剰のシスプラチンは遠心分離によって取り除いた。薬剤が添加されたコンジュゲートを少なくとも三回洗浄し、水に分散させた。
【００９４】
これらコンジュゲートの安定性を本発明のコンジュゲートの安定性と比較した。図１０は、Ａ：細胞培地中の実施例４．１のコンジュゲート；Ｂ：水中の実施例５のコンジュゲート；及びＣ：細胞培地中の実施例５のコンジュゲート、の白金原子の量の時間変化として測定した安定性を示している。３７℃における細胞培地と共に４８時間インキュベーションした後、ナノ粒子からの白金薬剤の放出は、静電気的相互作用を介して形成されたコンジュゲートの場合のみで観察された。安定性試験は、双方の系のインキュベーション後の白金薬剤放出の誘導結合型のプラズマ質量分光法ＩＣＰ−ＭＳ定量に基づいた。
【００９５】
腫瘍細胞におけるコンジュゲートのＭＴＴアッセイ
細胞を４×１０３細胞／ウェルでマルチウェル−９６プレート（Iwaki）に播き、２４時間後に培地を処理のために変更した。テトラゾリウム塩３-(４,５-ジメチルチアゾール-２-イル)-２，５-ジフェニルテトラゾリウム臭化物(MTT、Acros Organics)を、処理後２４時間及び４８時間での細胞生存率試験でのミトコンドリア活性の評価に使用した。プレートをマイクロプレート・リーダー・モデル５５０（ＢＩＯ−ＲＡＤ）で測定し、データをエクセル及びＳＰＳＳソフトウェアで処理した。吸光度測定［時間ゼロ，（Ａｚ），コントロール増殖，（Ｃ），及び試験増殖で、様々な濃度レベルの薬剤の存在下（Ａｉ）］を使用し、増殖パーセントをそれぞれの薬剤濃度レベルで計算した。アッセイは３種の細胞癌株：ＨｅＬａ，Ａ５４９及びＨＥＫで行った。異なった癌細胞（ＨｅＬａ，Ａ５４９及びＨＥＫ）での試験は、本発明のコンジュゲート、特に実施例４．１のコンジュゲートが、遊離のシスプラチンがこれらの細胞に投与されたときよりも高い細胞内薬剤レベルを達成したことを示している。
【００９６】
図１１は、実施例１．１（Ａ）の被覆されていない金ナノスフィア；実施例２．１（Ｃ）の中間体コンジュゲート；実施例４．１（Ｄ）のコンジュゲート；市販のシスプラチン（Ｅ）；及び実施例３（Ｆ）のシスプラチン誘導体に細胞を暴露した場合のＡ５４９肺癌細胞生存率の％を示す。Ａ及びＧはそれぞれ０及び４８時間におけるコントロール値を表す。分かるように、本発明のコンジュゲート（Ｄ）に細胞を暴露するときに有意な増殖抑止が観察され、該コンジュゲートの細胞増殖抑制性が示される。これとは反対に、被覆されていないナノ粒子、中間体コンジュゲート、又は水和シスプラチン誘導体は何も応答を誘発しなかった。
【００９７】
動物アッセイ
インビボ実験のため１５匹のＳＣＩＤマウスを選択した。マウスに２０ １０６ Ａ５４９肺腫瘍細胞を側腹部から注射した。５匹のマウスの３つのランダムな群をそれぞれ用意した。ついで、腫瘍が測定が容易なサイズになるまで待った。第１群（Ａ）には処置を施さなかった。第２群（Ｂ）には中程度の用量の市販のシスプラチン（動物体重Ｋｇ当たり３０ｍｇ）を与えた。第３群（Ｃ）には１回の腹腔内投与で１００ｍＬの白金製剤１．９ｍｇ／リットルと共に実施例４．１のコンジュゲートで処置した。腫瘍サイズ（治療の成功の徴候として）及び動物体重（二次的効果の徴候として）を３日ごとに測定した。１５日後に実験を終了した。図１２に示されるように、第一の場合（Ａ）では、腫瘍増殖は予想通りであった。第二の場合（Ｂ）では、予想されたように腫瘍サイズの減少があり、処置の二次効果として体重の緩み（示さず）があった。第三の場合（Ｃ）では、遊離のシスプラチンよりも５倍低い用量で大きな腫瘍減少が観察され、体重の緩みは観察されず（示さず）、ナノ粒子又は双方に結合された白金薬剤の改変された体内分布又は低い用量と一致していた。予備的な生化学的測定は、何れの場合にも如何なる腎臓及び肝臓の有意な機能障害を示さず、これは各々の場合において使用された低用量のものと一致している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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