(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
C末端α-アミド化ポリペプチドの製造方法であって、
a)非機能性KEX1遺伝子を有し、かつ、C末端Glyを有するポリペプチドをコードするDNA配列を含む酵母菌株を、前記酵母菌株中で前記ポリペプチドを発現するための条件下で培養するステップと、
b)ステップa)由来の発現ポリペプチドをα-アミド化するステップと、
c)前記α-アミド化ポリペプチドを単離するステップと
を含む方法。
【請求項２】
ステップb)をin vitroで実施する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記α-アミド化ポリペプチドが培養培地から単離される、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記C末端Glyに結合しているアミノ酸残基が、Tyr、Phe、Met、Leu、Trp、Ala、IleおよびArgからなる群から選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記C末端Glyに結合しているアミノ酸残基がVal、Leu、IleまたはMetである、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記C末端Glyに結合しているアミノ酸残基がTyr、TrpまたはPheである、請求項4に記載の方法。
【請求項７】
前記酵母菌株が、PEP4、YPS1、MKC7、YPS3、YPS5、YPS6、YPS7、PRB1、STE13およびKEX2からなる群から選択される少なくとも1種のさらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有する、請求項1から6のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記酵母菌株が、PEP4およびYPS1からなる群から選択されるさらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有する、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記酵母菌株が、PEP4およびYPS3からなる群から選択されるさらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有する、請求項7に記載の方法。
【請求項１０】
前記酵母菌株が、PEP4およびMKC7からなる群から選択されるさらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有する、請求項7に記載の方法。
【請求項１１】
前記酵母菌株が、YPS3およびYPS1からなる群から選択されるさらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有する、請求項7に記載の方法。
【請求項１２】
前記酵母菌株が、YPS3およびMKC7からなる群から選択されるさらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有する、請求項7に記載の方法。
【請求項１３】
前記α-アミド化ポリペプチドが、アミリン、アミリン類似体、PPおよびPP類似体、PYYおよびPYY類似体、GLP-1およびGLP1類似体、オキシトシン、バソプレシン、カルシトニン、ガストリン、NPY、FMRFアミド、セクレチン、GFHR、CRF、ニューロキニンA、ガストリン放出ペプチドおよびα-MSHからなる群から選択される、請求項1から12のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記α-アミド化ポリペプチドが、PP、PYYおよびアミリンからなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記α-アミド化ポリペプチドがアミリンである、請求項13に記載の方法。
【請求項１６】
前記α-アミド化ポリペプチドがPPである、請求項13に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子改変酵母菌株中でのポリペプチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
異種タンパク質をコードするDNA配列を含む適当な発現ベクターによる酵母細胞の形質転換後の酵母中での前記タンパク質の発現は、多種のポリペプチド、例えば、インスリン前駆体、グルカゴン、グルカゴン様ペプチドおよびそれらの機能的類似体について成功している。
【０００３】
しかし、多くの場合、発現産物は、種々のアミノ酸鎖長を有する目的ポリペプチド前駆体種の不均一混合物であることがわかっている。これは、酵母が、より大きな前駆体分子のプロセシングによる成熟ポリペプチドの放出に関与する多くのタンパク質分解酵素を産生するためである。PEP4およびKEX1遺伝子産物を含む多くのプロテアーゼが、このような酵母タンパク質分解に関与している。
【０００４】
組換えタンパク質の発現にKEX1破壊菌株を使用することは、以前に記載されている。例えば、EP341215およびUS6,103,515は、塩基性のC末端アミノ酸を有さないペプチド、例えば、hANP、EGF、結合組織活性化ペプチド-IIIヒルジンおよびヒルジン変異体の産生に、KEX1を欠いている酵母菌株を使用することを記載している。
【０００５】
既知の神経および内分泌ペプチドの過半数はα-アミド化されており、ほとんどの場合、この構造的特徴が受容体認識、シグナル伝達、ひいては生物学的機能に不可欠である。α-アミド化は、C末端グリシンが酵素的にアミドに変換されることによる。
【０００６】
細胞がインビボα-アミド化に必要な機構を有する場合には、α-アミド化ペプチドは産生細胞中で直接産生され得る。しかし、酵母を含む一部の生物は、インビボα-アミド化に必要な酵素を発現しないのでα-アミド化を行うことができず、したがって、細胞によって産生されたペプチドはその後のインビトロステップによってα-アミド化される必要がある。
【０００７】
酵母を組換え産生細胞として使用する場合には、1つの解決法は、C末端グリシンを有する前駆体ポリペプチドを産生させ、次いでそれをその後のインビトロプロセスにおいてα-アミド化酵素を使用してα-アミド化ペプチドに変換させることである(D.J.Merkler(1994)、Enzyme Microb. Technol.:16(450〜456)、C-Terminal amidated peptides:Production by the in vitro enzymatic amidation of glycine extended peptides and the importance of the amide to bioactivity)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】EP341215
【特許文献２】US6,103,515
【特許文献３】WO95/23857
【特許文献４】US6,110,703
【特許文献５】WO92/11378
【特許文献６】WO90/10075
【特許文献７】WO95/34666
【特許文献８】WO95/35384
【特許文献９】US4,683,202
【特許文献１０】US4,882,279
【特許文献１１】US4,599,311
【特許文献１２】US4,931,373
【特許文献１３】US4,870,008
【特許文献１４】US5,037,743
【特許文献１５】US4,845,075
【特許文献１６】EP171,142
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】D.J.Merkler(1994)、Enzyme Microb. Technol.:16(450〜456)、C-Terminal amidated peptides:Production by the in vitro enzymatic amidation of glycine extended peptides and the importance of the amide to bioactivity
【非特許文献２】Shilton BH、Thomas DY、Cygler M(1997)、Biochemistry 36:9002〜9012、Crystal structure of Kex1 deltap, a prohormone-processing carboxypeptidase from Saccharomyces cerevisiae
【非特許文献３】Heimら、Eur. J. Biochem 226:341〜353(1994)
【非特許文献４】Rothstein R.、Methods Enzymol. 194:281〜301、1991:Targeting, disruption, replacement, and allele rescue:integrative DNA transformation in yeast
【非特許文献５】Atkinsら、Antisense and Development 5:295〜305、1995
【非特許文献６】Nasrら、Mol. Gen Genet 249:51〜57、1995
【非特許文献７】Jones & Prakash、Yeast 6:363、1990
【非特許文献８】Fleigら、Gene 46:237、1986
【非特許文献９】Creggら、Bio/Technol. 11:905〜910、1993
【非特許文献１０】Kjeldsenら、Gene 170:107〜112、1996
【非特許文献１１】RoseおよびBroach、Methods in Enzymol. 185:234〜279、1990
【非特許文献１２】Schenaら、Methods in Enzymol. 194:289〜398、1991
【非特許文献１３】Methods in Enzymol.第194巻(1991)
【非特許文献１４】Sambrook,J、Fritsch,EFおよびManiatis,T、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1989
【非特許文献１５】BeaucageおよびCaruthers、Tetrahedron Letters 22(1981)、1859〜1869
【非特許文献１６】Matthesら、EMBO Journal 3(1984)、801〜805
【非特許文献１７】Saikiら、Science 239(1988)、487〜491
【非特許文献１８】Gleesonら、J. Gen.Microbiol. 132、1986、3459〜3465頁
【非特許文献１９】Shermanら(1982)、Methods in Yeast Genetics、Cold Spring Harbor Laboratory
【非特許文献２０】Horecka J、Jigami Y(1999)、Yeast.:15(1769〜74)、The trp1-ΔFA designer deletion for PCR-based gene functional analysis in Saccharomyces cerevisiae.
【非特許文献２１】Longtine,M.S.、McKenzie,A.、Demarini,D.、Shah,N.G.、Wach,A.、Brachat,A.、Philippsen,P.およびPringle,J.R.(1998)、Yeast:14.(953〜961)、Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae.
【非特許文献２２】Toyn,J.H.、Gunyuzlu,P.L.、White,H.、Thompson,L.A.およびG.F.Hollis(2000)、Yeast:16(553〜560)、A counterselection for the tryptophan pathway in yeast:5-fluoroanthranilic acid resistance.
【非特許文献２３】Gietz,R.D.およびWood,R.(2002)、Methods in Enzymology:350、(87〜96)、Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.
【非特許文献２４】Wach,A.、Brachat,A.、Poelmann,R.およびPhilippsen,P.(1994)、Yeast:10 (1793〜808)、New heterologous modules for classical or PCR-based gene disruptions in Saccharomyces cerevisiae.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、驚くべきことに、本発明の発明者らは、C末端グリシンが、サッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)から発現される多くのペプチドから切断され、α-アミド化ペプチドへのその後の変換が不可能になることを発見した。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、C末端グリシン残基を切断しない遺伝子改変酵母菌株の使用による、この問題の解決法を提供する。
【００１２】
一態様において、本発明は、酵母中でのC末端Glyを有するポリペプチドの製造方法であって、前記酵母菌株が非機能性KEX1遺伝子を有する方法に関する。
【００１３】
KEX1遺伝子は、周知の技術を用いて非機能性にすることができる。したがって、一実施形態において、KEX1遺伝子を単純に欠失させ、別の実施形態において、KEX1遺伝子を、例えば、部位特異的変異または相同組換えによって非機能性にする。
【００１４】
一実施形態において、本発明は、非機能性KEX1遺伝子を有する酵母菌株中でのポリペプチドの製造方法であって、前記ポリペプチドがC末端アミノ酸残基としてグリシンを有し、
a)前記ポリペプチドをコードするDNA配列を含む前記酵母菌株を、前記酵母菌株中で前記ポリペプチドを発現するための条件下で培養するステップと、
b)発現された前記ポリペプチドを単離するステップと
を含む方法に関する。
【００１５】
発現ポリペプチドは、発現ポリペプチドが酵母細胞から分泌されるか否かに応じて、細胞培養物からまたは酵母細胞から単離できる。
【００１６】
C末端から2番目のアミノ酸が以下のアミノ酸残基:Tyr、Phe、Met、Leu、Trp、Ala、IleおよびArgのうちの1つである場合には、C末端グリシンは特に不安定である。したがって、一実施形態において、C末端から2番目のアミノ酸は、Tyr、Phe、Met、Leu、Trp、Ala、IleまたはArgである。
【００１７】
「C末端から2番目のアミノ酸」は、この場合にはグリシン残基であるC末端アミノ酸残基のN末端に結合しているアミノ酸残基を意味する。
【００１８】
特に、C末端から2番目のアミノ酸が疎水性アミノ酸残基、および特に芳香族アミノ酸残基である場合には、C末端グリシンはより不安定である。したがって、さらなる実施形態において、C末端Glyの隣のアミノ酸残基は、Tyr、Trp、Phe、Val、Leu、IleまたはMetであり、さらなる実施形態において、C末端Glyに結合しているアミノ酸残基はVal、Leu、IleまたはMetであり、さらなる実施形態において、C末端Glyに結合しているアミノ酸残基はTyr、PheまたはTrpである。
【００１９】
さらなる実施形態において、C末端Glyに結合しているアミノ酸残基はTyrである。
【００２０】
酵母菌株は、非機能性KEX1遺伝子に加えて、さらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有することができる。したがって、一実施形態において、酵母菌株は、PEP4、YPS1、MKC7、YPS3、YPS5、YPS6、YPS7、PRB1、STE13およびKEX2からなる群から選択される少なくとも1種のさらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有することができる。
【００２１】
当該ポリペプチドの大きさが関連する場合もあり、さらなる実施形態において、ポリペプチドは主鎖に約25〜約75個のアミノ酸残基を有する。さらなる実施形態において、ポリペプチドは主鎖に約25〜約60個のアミノ酸残基を有し、さらなる実施形態において、ポリペプチドは主鎖に約25〜約45個のアミノ酸残基を有する。
【００２２】
酵母菌株は、外来性DNAを発現および分泌できる任意の酵母菌株とすることができる。しかし、一実施形態において、酵母菌株は、サッカロミセス・セレビジエ菌株である。
【００２３】
本発明の方法は、発現および分泌されたポリペプチドの追加の酵素変換を含むことができる。したがって、本発明の一実施形態において、C末端Glyを有する発現および分泌されたポリペプチドを、さらなるインビトロステップにおいてα-アミド化酵素による酵素変換によってアミドに変換する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】pSA281を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
C末端から2番目のアミノ酸がPP(膵臓ポリペプチド)、PYYおよびアミリンのようにチロシンである場合には特にグリシンが効率的に切断されるので、S.cerevisiae菌株における、C末端グリシンを有するペプチドの発現は前述のように問題となることが立証されている。本発明に従って、酵母菌株において、C末端グリシンの切断に関与するプロテアーゼがKex1pプロテアーゼであることが発見された。
【００２６】
「Kex1」または「Kex1p」とは、C末端リジルおよび/またはアルギニル残基の除去を優先的に触媒するセリンカルボキシペプチダーゼを意味する(Shilton BH、Thomas DY、Cygler M(1997)、Biochemistry 36:9002〜9012、Crystal structure of Kex1 deltap, a prohormone-processing carboxypeptidase from Saccharomyces cerevisiae)。Kex1pまたはカルボキシペプチダーゼyscαは、膜結合エキソペプチダーゼであり、酵母においてキラー因子および接合因子αの成熟に重要な役割を担っている。この酵素は、C末端の塩基性アミノ酸残基(ArgおよびLys)に対して特異性が高い。KEX1酵素の特異性は、a.o.Heimら(Eur. J. Biochem 226:341〜353(1994))により、デスルファト-ヒルジンおよびその変異体をモデル基質として更に検討されている。
【００２７】
本発明は、C末端グリシンアミノ酸残基を有する小ペプチドの発現に、非機能性KEX1遺伝子を有する酵母菌株を使用することについて記載している。このグリシンは、Kex1pによる切断に対して非常に不安定であるため、これらのペプチドを酵母中で効率的に発現させるのは困難であることが示されている。
【００２８】
これに関連する「小ペプチド」は、約75個以下のアミノ酸残基を有するペプチドを意味する。一実施形態において、ペプチドは約60個以下のアミノ酸残基を有し、さらなる実施形態において、ペプチドは約50個以下のアミノ酸残基を有する。さらなる実施形態において、ペプチドは約25〜約45個の間のアミノ酸残基を有する。
【００２９】
本発明に従って産生させることができるペプチドの、説明のための非限定的な例は、アミリン、アミリン類似体、PPおよびPP類似体、PYYおよびPYY類似体、GLP-1およびGLP1類似体、オキシトシン、バソプレシン、カルシトニン、ガストリン、NPY、FMRFアミド、セクレチン、GFHR、CRF、ニューロキニンA、ガストリン放出ペプチドおよびα-MSHである。
【００３０】
一実施形態において、産生させることができるペプチドは、芳香族アミノ酸残基がグリシン残基に連結されているペプチドの群から選択される。したがって、一実施形態において、ペプチドは、ガストリン、NPY、FMRFアミドおよびアミリン並びにそれらの類似体からなる群から選択される。
【００３１】
「ポリペプチド」という表現は、「ペプチド」および「タンパク質」を同様に網羅するものである。本明細書中で使用する「類似体」とは、天然起源のポリペプチド中に存在する少なくとも1個のアミノ酸残基の欠失および/または交換による、天然起源のポリペプチドの構造に形式的に由来し得る分子構造を有するポリペプチドを意味する。付加および/または交換されるアミノ酸残基は、コード可能なアミノ酸残基若しくは他の天然起源の残基または純合成アミノ酸残基とすることができる。
【００３２】
プロテアーゼの活性の除去は、プロテアーゼをコードする宿主遺伝子を破壊し、結果として調節領域および/またはコード領域を含むプロテアーゼの遺伝子を全てまたは一部欠損している非復帰菌株を作製することによって行うことができる。あるいは、プロテアーゼの活性は、古典的突然変異誘発手順によってまたは特異点突然変異の導入によって減少させるかまたはなくすことができる。古典的技術を用いる、Kex1pプロテアーゼをコードする遺伝子の破壊は、相同組換えに依拠し、DNAの2つの類似または同一鎖がヌクレオチド配列を交換する。これにより、KEX1遺伝子座に対して特異的に組換え現象を行うことができ、それによって、KEX1オープンリーディングフレームが、正確な欠失の選択に使用されるマーカー遺伝子と交換される(Rothstein R.、Methods Enzymol. 194:281〜301、1991:Targeting, disruption, replacement, and allele rescue:integrative DNA transformation in yeast)。これの1つの様式において、酵母菌株を、KEX1遺伝子に隣接するDNA配列と相同のDNA配列に隣接するマーカー遺伝子からなる直鎖DNA断片(プラスミドに由来するかまたはPCRによって作製される)によって、形質転換する。組込みが成功すると、KEX1遺伝子は、それに対して選択され得るマーカー遺伝子で置き換えられるであろう。適当なマーカーは、栄養素要求性マーカー、例えば、URA3、HIS3、LEU2、TRP1、またはG418、ハイグロマイシンなどに対する耐性を与えるドミナント抗生物質マーカー(dominant antibiotic marker)である。
【００３３】
プロテアーゼ活性の下方調節に適当と考えられる他の方法としては、酵母へのアンチセンスおよび/またはリボザイムコンストラクトの導入が挙げられる(例えば、Atkinsら、Antisense and Development 5:295〜305、1995およびNasrら、Mol. Gen Genet 249:51〜57、1995)。酵母菌株におけるKEX1遺伝子の有用な破壊方法の1つは、Rothsteinによって記載されている(Method in Enzymol、194:281〜301、1991)。
【００３４】
目的とする最終産物によっては、酵母宿主細胞は更に遺伝子操作することができる。一例として、1種または複数のさらなるプロテアーゼ遺伝子を非機能性にすることができる。このようなプロテアーゼ遺伝子の例は、PEP4、YPS1、MKC7(YPS2)、YPS3(YPS4)、YPS5、YPS6、YPS7、PRB1、STE13およびKEX2である。これは、発現ペプチドのさらなる分解を回避するのに必要な場合がある。
【００３５】
一実施形態において、酵母菌株は、KEX1遺伝子並びに以下の群:PEP4、YPS1、MKC7(YPS2)、YPS3(YPS4)、YPS5、YPS6、YPS7、PRB1、STE13およびKEX2から選択されるプロテアーゼ遺伝子のうちの1つのノックアウトを有する。
【００３６】
別の実施形態において、酵母菌株は、KEX1遺伝子並びに以下の群:PEP4、YPS1、MKC7(YPS2)、YPS3(YPS4)、YPS5、YPS6、YPS7、PRB1、STE13およびKEX2から選択されるプロテアーゼ遺伝子のうちの2つのノックアウトを有する。
【００３７】
別の実施形態において、酵母菌株は、KEX1遺伝子並びに以下の群:PEP4、YPS1、MKC7(YPS2)、YPS3(YPS4)、YPS5、YPS6、YPS7、PRB1、STE13およびKEX2から選択されるプロテアーゼ遺伝子のうちの3つのノックアウトを有する。
【００３８】
別の実施形態において、酵母菌株は、KEX1遺伝子並びに以下の群:PEP4、YPS1、MKC7(YPS2)、YPS3(YPS4)、YPS5、YPS6、YPS7、PRB1、STE13およびKEX2から選択されるプロテアーゼ遺伝子のうちの4つのノックアウトを有する。
【００３９】
一実施形態において、KEX1およびPEP4遺伝子を非機能性にする。このような酵母菌株は、C末端グリシンを有するPPおよびPYY並びにそれらの類似体におけるアミルの発現に特に適当である。
【００４０】
別の実施形態において、酵母菌株は、破壊されたKEX1遺伝子および破壊された酵母アスパルチルプロテアーゼ3(Yap3p)遺伝子(YPS1)を有する。酵母アスパルチルプロテアーゼ3(Yap3p)遺伝子の破壊については、組換えヒトアルブミン(rHA)の産生に関するWO95/23857および短鎖ポリペプチドの産生を記載するUS6,110,703に記載されている。
【００４１】
したがって、本発明のさらなる実施形態は、KEX1およびYAP3/YPS1両遺伝子のノックアウトを有する酵母菌株を含む。
【００４２】
「ノックアウト」という表現は、その遺伝子が完全に欠失しているか、または前述のように非機能性にされていることを意味する。
【００４３】
本発明による方法は、インタクトなC末端を有する非分解ペプチドを生じる。均一な産物の産生は精製コストを著しく減少させるので、これは商業的価値が高い。
【００４４】
さらなる態様において、本発明は、C末端アミド化ペプチドの製造方法であって、a)非機能性KEX1遺伝子を有し且つC末端Glyを有するポリペプチドをコードするDNA配列を含む酵母菌株を、前記酵母菌株中で前記ポリペプチドを発現する条件下で培養するステップと、b)ステップa)の発現ポリペプチドをインビトロでα-アミド化するステップと、c)前記C末端アミド化ペプチドを単離および精製するステップとを含む方法に関する。
【００４５】
別の態様において、本発明は、C末端Gly残基を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む非機能性KEX1遺伝子を有する酵母細胞の培養物であって、前記ポリヌクレオチド配列またはDNA配列が、酵母プロモーターをコードするポリヌクレオチド配列若しくはDNA配列、およびリーダー配列(プロ配列またはプレプロ配列)、並びに/または酵母中の前記ポリペプチドの発現および酵母からの前記ポリペプチドの分泌に必要な他のポリヌクレオチド配列若しくはDNA配列に作動可能に連結されている培養物を提供する。
【００４６】
当該ポリペプチドをコードするDNAは、適切な宿主に導入するために種々の他のDNA配列に接続することができる。対となるDNA(companion DNA)は、宿主の性質、宿主へのDNAの導入方法、およびエピソームの保持または宿主染色体への組込みが望ましいか否かによって異なるであろう。
【００４７】
一般に、DNAは、プラスミドなどの発現ベクター中に、発現に適正な方向付けおよび正しいリーディングフレームで挿入する。次に、ベクターを、標準的な技術によって宿主に導入する。一般に、これは、形質転換宿主細胞の選択に必要である。
【００４８】
ベクター中で、ポリヌクレオチド配列またはDNA配列は、酵母プロモーターをコードするポリヌクレオチド配列若しくはDNA配列およびリーダー配列(プロ配列またはプレプロ配列)、並びに/または酵母中の前記ポリペプチドの発現および酵母からの前記ポリペプチドの分泌に必要な他のポリヌクレオチド配列若しくはDNA配列に作動可能に連結されている。
【００４９】
組込みが望ましい場合には、DNAは、酵母組込みプラスミドベクター、例えば、pJJ215、pJJ250、pJJ236、pJJ248、pJJ242(Jones & Prakash、Yeast 6:363、1990)またはpDP6(Fleigら、Gene 46:237、1986)中に、発現に適正な方向付けおよび正しいリーディングフレーム(任意の非必須酵母遺伝子、トランスポゾン配列またはリボゾーム遺伝子の相同配列に隣接する)で挿入する。好ましくは、隣接配列は、酵母プロテアーゼ遺伝子または選択マーカーとして使用される遺伝子である。次いで、Rothstein(Method in Enzymol、194:281〜301、1991)およびCreggら(Bio/Technol. 11:905〜910、1993)に示されている標準的な技術を用いて、隣接配列中に存在する相同組換えにより、DNAを宿主染色体に組み込む。
【００５０】
次に、本発明の組換えDNAによって形質転換された宿主細胞を十分な時間培養して、本明細書中に開示された教示に鑑みて、当業者に知られている適切な条件下で、本発明の方法に従って製造されるポリペプチドを発現および分泌させる。
【００５１】
有用な酵母プラスミドベクターとしては、POT(Kjeldsenら、Gene 170:107〜112、1996)並びにYEp13、YEp24(RoseおよびBroach、Methods in Enzymol. 185:234〜279、1990)およびpGプラスミド(Schenaら、Methods in Enzymol. 194:289〜398、1991)が挙げられる。
【００５２】
S.セレビジエ(S.cerevisiae)の形質転換方法としては、スフェロプラスト形質転換、酢酸リチウム形質転換およびエレクトロポレーションが挙げられる(Methods in Enzymol.第194巻(1991)を参照されたい)。好ましくは、形質転換は、本明細書中の実施例に記載したものである。
【００５３】
S.セレビジエに適当なプロモーターとしては、MFα1プロモーター、ガラクトース誘導性プロモーター、例えば、GAL1、GAL7およびGAL10プロモーター、糖分解酵素プロモーター、例えば、TPIおよびPGKプロモーター、TRP1プロモーター、CYCIプロモーター、CUP1プロモーター、PHO5プロモーター、ADH1プロモーター並びにHSPプロモーターが挙げられる。ピキア属(Pichia)の適当なプロモーターは、AOXI(メタノール利用)プロモーターである。
【００５４】
転写末端シグナルは好ましくは、転写終結およびポリアデニル化に適正なシグナルを含有する真核生物遺伝子の3'隣接配列である。適当な3'隣接配列は、例えば、使用される発現制御配列に自然に連結されている遺伝子の配列、即ち、プロモーターに対応する遺伝子の配列とすることができる。
【００５５】
目的とするポリペプチドの分泌発現を生じるのに使用するDNAコンストラクトは、酵母プロセシングシグナルによってポリペプチドに連結されるリーダー配列を含むDNA配列を含む。リーダー配列は、小胞体を横切るタンパク質トランスロケーションのためのシグナルペプチド(「プレ配列」)を含有し、場合によっては、周囲媒体中へのポリペプチドの放出前に酵母細胞内で切断されていてもされていなくてもよい追加配列(「プロ配列」)を含有する。有用なリーダーは、マウスα-アミラーゼのシグナルペプチド、S.セレビジエ MFα1、YAP3、BAR1、HSP150およびS.クルイベリ(S.kluyveri)MFαのシグナルペプチド、並びにS.セレビジエMFα1、YAP3、PRC、HSP150およびS.クルイベリMFαのプレプロ配列、更にWO92/11378、WO90/10075およびWO95/34666に記載された合成リーダー配列である。更に、本発明の方法に従って産生されるポリペプチドには、WO95/35384に記載されるようにN末端伸長を施すことができる。
【００５６】
目的とするペプチドをコードするDNA配列は、ゲノムまたはcDNA起源のものとすることができ、例えば、ゲノムまたはcDNAライブラリを作製し、標準的な技術に従って合成オリゴヌクレオチドプローブを用いてハイブリッド形成によって、ポリペプチドの全てまたは一部をコードしているDNA配列をスクリーニングすることによって得ることができる(例えば、Sambrook,J、Fritsch,EFおよびManiatis,T、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1989を参照されたい)。ポリペプチドをコードするDNA配列は、確立されている標準的な方法、例えば、BeaucageおよびCaruthers(Tetrahedron Letters 22(1981)、1859〜1869)によって記載されたホスホアミダイト法、またはMatthesら(EMBO Journal 3(1984)、801〜805)によって記載された方法によって合成により作製することもできる。DNA配列は、例えば、US4,683,202またはSaikiら、Science 239(1988)、487〜491に記載されたような、特異的プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応によっても作製できる。
【００５７】
DNA配列または組換えベクターを導入する酵母宿主細胞は、ポリペプチドを発現できる任意の酵母細胞とすることができ、サッカロミセス(Saccharomyces)属菌種またはシゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)属菌種、特にサッカロミセス・セレビジエまたはサッカロミセス・クルイベリ(Saccharomyces kluyveri)の菌株などである。適当な酵母細胞のさらなる例は、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)、例えば、K.ラクティス(K.lactis)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、例えばH.ポリモルファ(H.polymorpha)またはピキア属、例えば、P.パストリス(P.pastoris)の菌株である(Gleesonら、J. Gen. Microbiol. 132、1986、3459〜3465頁;US4,882,279を参照されたい)。
【００５８】
異種DNAによって酵母細胞を形質転換し、それから異種ポリペプチドを産生させる方法は、例えば、US4,599,311、US4,931,373、US4,870,008、US5,037,743およびUS4,845,075に記載されている。形質転換細胞は、選択可能なマーカーによって測定される表現型、一般に薬剤耐性または特定栄養素(例えば、ロイシン)の非存在下で成長する能力によって選択される。酵母への使用に好ましいベクターは、US4,931,373に開示されているPOT1ベクターである。「POT」は、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)のトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子であり、「TPI1」は、S.セレビジエのトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子である。
【００５９】
「コード可能なアミノ酸」または「コード可能なアミノ酸残基」という表現は、ヌクレオチドのトリプレット(「コドン」)によってコードされ得るアミノ酸またはアミノ酸残基を示すのに用いる。
【００６０】
本文脈では、アミノ酸の3文字または1文字表示は、下記表中に示すようなそれらの従来の意味で使用している。明確に示されない限り、本明細書中に記載したアミノ酸は、L-アミノ酸である。更に、特に明記しない限り、ペプチドのアミノ酸配列の左右の末端はそれぞれ、N末端およびC末端である。
【００６１】
本発明を、以下の実施例において更に詳述するが、これらの実施例は、特許請求の範囲に記載した本発明の範囲を決して限定するものではない。添付した図は、本明細書および本発明の説明の不可欠な部分とみなすものである。全ての引用文献は、参照によって、その中に記載されている全てが明確に本明細書中に組み込まれる。
【００６２】
以下の実施形態は、本発明の範囲に含まれる:
【００６３】
実施形態1:非機能性KEX1遺伝子を有する酵母菌株中でのポリペプチドの製造方法であって、前記ポリペプチドがC末端アミノ酸残基としてグリシンを有し、
a)前記ポリペプチドをコードするDNA配列を含む酵母菌株を、前記酵母菌株中で前記ポリペプチドを発現する条件下で培養するステップと、
b)発現された前記ポリペプチドを単離するステップと
を含む方法;
【００６４】
実施形態2:前記ポリペプチドが培養培地から単離される、実施形態1に記載の方法;
【００６５】
実施形態3:C末端Glyに結合しているアミノ酸残基が、Tyr、Phe、Met、Leu、Trp、Ala、IleおよびArgからなる群から選択される、実施形態1〜2に記載の方法;
【００６６】
実施形態4:C末端Glyに結合しているアミノ酸残基がTyr、Trp、Phe、Val、Leu、IleおよびMetである、実施形態3に記載の方法;
【００６７】
実施形態5:C末端Glyに結合しているアミノ酸残基がVal、Leu、IleおよびMetである、実施形態3に記載の方法;
【００６８】
実施形態6:C末端Glyに結合しているアミノ酸残基がTyr、TrpおよびPheである、実施形態3に記載の方法;
【００６９】
実施形態7:C末端Glyに結合しているアミノ酸残基がTyrである、実施形態6に記載の方法;
【００７０】
実施形態8:前記酵母菌株が、PEP4、YPS1、MKC7、YPS3、YPS5、YPS6、YPS7、PRB1、STE13およびKEX2からなる群から選択される少なくとも1種のさらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有する、実施形態1〜7のいずれかに記載の方法;
【００７１】
実施形態9:前記酵母菌株が、PEP4、YPS1およびMKC7からなる群から選択されるさらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有する、実施形態8に記載の方法;
【００７２】
実施形態10:前記酵母菌株が、PEP4、YPS1およびYPS3からなる群から選択されるさらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有する、実施形態8に記載の方法;
【００７３】
実施形態11:前記酵母菌株が、PEP4、YPS3およびMKC7からなる群から選択されるさらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有する、実施形態8に記載の方法;
【００７４】
実施形態12:前記酵母菌株が、PEP4およびYPS1からなる群から選択されるさらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有する、実施形態8に記載の方法;
【００７５】
実施形態13:前記酵母菌株が、PEP4およびYPS3からなる群から選択されるさらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有する、実施形態8に記載の方法;
【００７６】
実施形態14:前記酵母菌株が、PEP4およびMKC7からなる群から選択されるさらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有する、実施形態8に記載の方法;
【００７７】
実施形態15:前記酵母菌株が、YPS3、YPS1およびMKC7からなる群から選択されるさらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有する、実施形態8に記載の方法;
【００７８】
実施形態16:前記酵母菌株が、YPS3およびYPS1からなる群から選択されるさらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有する、実施形態8に記載の方法;
【００７９】
実施形態17:前記酵母菌株が、YPS3およびMKC7からなる群から選択されるさらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有する、実施形態8に記載の方法;
【００８０】
実施形態18:前記酵母菌株が、PEP4およびYPS5からなる群から選択されるさらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有する、実施形態8に記載の方法;
【００８１】
実施形態19:前記酵母菌株が、PEP4およびYPS6からなる群から選択されるさらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有する、実施形態8に記載の方法;
【００８２】
実施形態20:前記酵母菌株が、PEP4およびYPS7からなる群から選択されるさらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有する、実施形態8に記載の方法;
【００８３】
実施形態21:前記酵母菌株が、PEP4およびPBR1からなる群から選択されるさらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有する、実施形態8に記載の方法;
【００８４】
実施形態22:前記酵母菌株が、PEP4およびSTE13からなる群から選択されるさらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有する、実施形態8に記載の方法;
【００８５】
実施形態23:前記酵母菌株が、PEP4およびKEX2からなる群から選択されるさらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有する、実施形態8に記載の方法;
【００８６】
実施形態24:前記酵母菌株が、YPS3およびYPS5からなる群から選択されるさらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有する、実施形態8に記載の方法;
【００８７】
実施形態25:前記酵母菌株が、YPS3およびYPS6からなる群から選択されるさらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有する、実施形態8に記載の方法;
【００８８】
実施形態26:前記酵母菌株が、YPS3およびYPS7からなる群から選択されるさらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有する、実施形態8に記載の方法;
【００８９】
実施形態27:前記酵母菌株が、YPS3およびPBR1からなる群から選択されるさらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有する、実施形態8に記載の方法;
【００９０】
実施形態28:前記酵母菌株が、YPS3およびSTE13からなる群から選択されるさらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有する、実施形態8に記載の方法;
【００９１】
実施形態29:前記酵母菌株が、YPS3およびKEX2からなる群から選択されるさらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有する、実施形態8に記載の方法;
【００９２】
実施形態30:前記酵母菌株が、YPS1およびPBR1からなる群から選択されるさらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有する、実施形態8に記載の方法;
【００９３】
実施形態31:前記酵母菌株が、YPS1およびSTE13からなる群から選択されるさらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有する、実施形態8に記載の方法;
【００９４】
実施形態32:前記酵母菌株が、YPS1およびKEX2からなる群から選択されるさらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有する、実施形態8に記載の方法;
【００９５】
実施形態33:前記酵母菌株が非機能性KEX1遺伝子および非機能性PEP4遺伝子を有する、実施形態1に記載の方法;
【００９６】
実施形態34:前記酵母菌株が非機能性KEX1遺伝子および非機能性YPS1遺伝子を有する、実施形態1に記載の方法;
【００９７】
実施形態35:前記酵母菌株が非機能性KEX1遺伝子および非機能性MKC7遺伝子を有する、実施形態1に記載の方法;
【００９８】
実施形態36:前記酵母菌株が非機能性KEX1遺伝子および非機能性YPS3遺伝子を有する、実施形態1に記載の方法;
【００９９】
実施形態37:前記酵母菌株が非機能性KEX1遺伝子および非機能性YPS5遺伝子を有する、実施形態1に記載の方法;
【０１００】
実施形態38:前記酵母菌株が非機能性KEX1遺伝子および非機能性YPS6遺伝子を有する、実施形態1に記載の方法;
【０１０１】
実施形態39:前記酵母菌株が非機能性KEX1遺伝子および非機能性YPS7遺伝子を有する、実施形態1に記載の方法;
【０１０２】
実施形態40:前記酵母菌株が非機能性KEX1遺伝子および非機能性PBR1遺伝子を有する、実施形態1に記載の方法;
【０１０３】
実施形態41:前記酵母菌株が非機能性KEX1遺伝子および非機能性STE13遺伝子を有する、実施形態1に記載の方法;
【０１０４】
実施形態42:前記酵母菌株が非機能性KEX1遺伝子および非機能性KEX2遺伝子を有する、実施形態1に記載の方法;
【０１０５】
実施形態43:前記酵母菌株が、KEX1遺伝子並びに以下の群:PEP4、YPS1、MKC7(YPS2)、YPS3(YPS4)、YPS5、YPS6、YPS7、PRB1、STE13およびKEX2から選択されるプロテアーゼ遺伝子のうちの1つのノックアウトを有する、実施形態1に記載の方法;
【０１０６】
実施形態44:前記酵母菌株が、KEX1遺伝子並びに以下の群:PEP4、YPS1、MKC7(YPS2)、YPS3(YPS4)、YPS5、YPS6、YPS7、PRB1、STE13およびKEX2から選択されるプロテアーゼ遺伝子のうちの2つのノックアウトを有する、実施形態1に記載の方法;
【０１０７】
実施形態45:前記酵母菌株が、KEX1遺伝子並びに以下の群:PEP4、YPS1、MKC7(YPS2)、YPS3(YPS4)、YPS5、YPS6、YPS7、PRB1、STE13およびKEXから選択されるプロテアーゼ遺伝子のうちの3つのノックアウトを有する、実施形態1に記載の方法;
【０１０８】
実施形態46:前記酵母菌株が、KEX1遺伝子並びに以下の群:PEP4、YPS1、MKC7(YPS2)、YPS3(YPS4)、YPS5、YPS6、YPS7、PRB1、STE13およびKEX2から選択されるプロテアーゼ遺伝子のうちの4つのノックアウトを有する、実施形態1に記載の方法;
【０１０９】
実施形態47:前記KEX1遺伝子が欠失している、実施形態1〜46のいずれかに記載の方法;
【０１１０】
実施形態48:前記KEX1遺伝子が、変異によって、例えば、相同組換えによって非機能性にされている、実施形態1〜47のいずれかに記載の方法;
【０１１１】
実施形態49:ポリペプチドが主鎖に25〜約45個のアミノ酸残基を有する、実施形態1〜48のいずれかに記載の方法;
【０１１２】
実施形態50:ポリペプチドが、アミリン、アミリン類似体、PPおよびPP類似体、PYYおよびPYY類似体、GLP-1およびGLP1類似体、オキシトシン、バソプレシン、カルシトニン、ガストリン、NPY、FMRFアミド、セクレチン、GFHR、CRF、ニューロキニンA、ガストリン放出ペプチドおよびα-MSHからなる群から選択される、実施形態1〜49のいずれかに記載の方法;
【０１１３】
実施形態51:ポリペプチドがPP、PYYおよびアミリンからなる群から選択される、実施形態50に記載の方法;
【０１１４】
実施形態52:ポリペプチドがアミリンである、実施形態50に記載の方法;
【０１１５】
実施形態53:ポリペプチドがPPである、実施形態50に記載の方法;
【０１１６】
実施形態54:ポリペプチドがPYYである、実施形態50に記載の方法;
【０１１７】
本発明は、本明細書中に記載した実施形態および態様の任意の組み合わせを範囲に含む。
【０１１８】
(実施例)
一般的手順
発現プラスミドは全て、EP171,142に記載されているのと同様なC-POT型である。これらは、S.セレビジエにおけるプラスミド選択および安定化のためにシゾサッカロミセス・ポンベトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子(POT)を含有していることを特徴とする、2μベースの発現ベクターである。プラスミドはまた、S.セレビジエトリオースリン酸イソメラーゼのプロモーターおよびターミネーターを含有している。これらの配列は、プラスミドpKFN1003中の対応配列(WO9010075に記載)と類似している。種々の融合タンパク質のクローニングを容易にするために、MFα1プレ-プロリーダーをコードするDNA配列を、NcoI部位を組み入れるように変化させた。これを、MFα1*プレ-プロリーダーと称する。したがって、NcoI-XbaI断片を、当該インスリンコンストラクトをコードするNcoI-XbaI断片に単に置き換える。このようなNcoI-XbaI断片は、合成オリゴヌクレオチドおよびPCRを用いて標準的な技術に従って合成できる。α-リーダーに加えて、他のリーダーを使用することもできる。
【０１１９】
宿主菌株S.セレビジエ菌株の形質転換によって、酵母形質転換体およびその派生物を作製した。酵母菌株は、YPGaL(1%Bacto酵母エキス、2%Bactoペプトン、2%ガラクトース、1%ラクテート)上で、600nmのO.D.が0.6となるまで成長させた。培養物100mlを遠心分離によって収集し、水10mlで洗浄し、再遠心分離し、1.2Mソルビトール、25mM Na2EDTA、pH=8.0および6.7mg/mlジチオスレイトールを含有する溶液10ml中に再懸濁させた。この懸濁液を30℃において15分間インキュベートし、遠心分離し、1.2Mソルビトール、10mM Na2EDTA、0.1Mクエン酸ナトリウム、pH=5.8およびNovozymC3234 2mgを含有する溶液10ml中に細胞を再懸濁させた。懸濁液を30℃において30分間インキュベートし、細胞を遠心分離によって収集し、1.2Mソルビトール10mlおよびCAS(1.2Mソルビトール、10mM CaCl2、10mM Tris HCl(Tris=トリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン)pH=7.5)10ml中で洗浄し、CAS 2ml中に再懸濁させた。形質転換のために、CAS懸濁細胞1mlをプラスミドDNA約0.1mgと混合し、室温に15分間放置した。(20%ポリエチレングリコール4000、10mM CaCl2、10mM Tris HCl、pH=7.5)1mlを加え、混合物を更に30分間、室温に放置した。混合物を遠心分離し、ペレットをSOS(1.2Mソルビトール、33%v/v YPD、6.7mM CaCl2)0.1ml中に再懸濁させ、30℃において2時間インキュベートした。次いで、懸濁液を遠心分離し、ペレットを1.2Mソルビトール0.5ml中に再懸濁させた。次に、52℃のトップアガー(1.2Mソルビトール+2.5%寒天を含有するSC培地(Shermanら(1982)Methods in Yeast Genetics、Cold Spring Harbor Laboratory))6mlを加え、懸濁液を、同じ寒天凝固ソルビトール含有培地を含有するプレート上に注いだ。
【０１２０】
(実施例1)
Δkex1::TRP1-ΔFA遺伝子破壊
trp1-ΔFA欠失対立遺伝子変異を以下のようにして構築した:
trp1-ΔFA対立遺伝子をコードする合成DNA断片を、合成オリゴヌクレオチド(Horecka J、Jigami Y(1999)、Yeast.:15(1769〜74)、The trp1-ΔFA designer deletion for PCR-based gene functional analysis in Saccharomyces cerevisiae.)および標準的な技術を用いてPCRによって合成した。
【０１２１】
trp1-ΔFA断片は、KEX1 3'UTR領域の525bp断片に直接融合したKEX1 5'UTR領域の476bp断片から構成され、したがってpFA6a-TRP1プラスミド中で選択可能なマーカーとして使用するTRP1-FAカセットとの相同DNA配列重複を回避する(Longtine,M.S.、McKenzie,A.、Demarini,D.、Shah,N.G.、Wach,A.、Brachat,A.、Philippsen,P.およびPringle,J.R.(1998)、Yeast:14.(953〜961)、Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae.)。trp1-ΔFA PCR断片を、製造業者(Invitrogen)によって記載されたようにしてTOPO-CR2.1ベクターにクローニングして、プラスミドpFI379を得た。
【０１２２】
trp1-ΔFA欠失酵母菌株を、以下のようにして得た:
TRP1遺伝子破壊の選択に使用する方法は、5-フルオロアントラニル酸を含有する培地上での成長がトリプトファン生合成経路の酵素によって代謝拮抗を引き起こす対抗選択手順を含む。アントラニル酸のトリプトファンへの変換に必要な酵素を欠く酵母細胞は、5-フルオロアントラニル酸に耐性を示す(Toyn,J.H.、Gunyuzlu,P.L.、White,H.、Thompson,L.A.およびG.F.Hollis(2000)、Yeast:16(553〜560)、A counterselection for the tryptophan pathway in yeast:5-fluoroanthranilic acid resistance.)。
【０１２３】
酵母宿主菌株NNY574 (MATα ura3-D0 leu2-D0 his3-D0 tpi1::URA3 yps1::HIS3 pep4::LEU2)を、アミリン類似体前駆体の分泌発現のための酵母発現ベクターであるプラスミドpSA281、EEAEK(SEQ ID NO:1)-アミリン(1〜37)-K1E、S28P、S29P、G38で形質転換して、yFI754を作製した。pSA281のプラスミド主鎖は、cPOT型ベクターをベースとし、グルコースを単一炭素源として含有する富栄養培地中での成長を宿主菌株のδ-tpi1変異の相補性によって容易にする。
【０１２４】
trp1-ΔFA断片を、鋳型としてのpFI379および合成オリゴヌクレオチド並びに標準的方法を用いてPCRによって増幅した。trp1-ΔFA PCR断片を、LiAc法(GietzおよびWood、2002)によるyFI754の形質転換に直接使用した。形質転換後、酵母細胞をYEPD寒天上に蒔き、30℃において一夜インキュベートし、続いて5-フルオロアントラニル酸を含有する最少培地上にレプリカプレーティングを行った。trp1-ΔFA欠失対立遺伝子がゲノムに組み込まれた酵母細胞の選択を、5-フルオロアントラニル酸を用いるTRP1遺伝子の存在の対抗選択(Toynら、2000)によって行い、trp1-ΔFA酵母菌株yFI810を得た。
【０１２５】
Δkex1::TRP1-FA遺伝子破壊対立遺伝子を以下のようにして構築した:
518bpのKEX1 5'UTR DNA配列、続いてSphI制限エンドヌクレアーゼ部位、続いてSbf1制限エンドヌクレアーゼ部位、続いて304bpのKEX1 3'UTR DNA配列から構成されるΔkex1-D0対立遺伝子の合成DNA断片を、商業的供給源からインビトロDNA合成によって構築し、得られたものをpMAベクターにクローニングした(Geneart AG、BioPark、Josef-Engert-Str. 11、D-93053 Regensburg、Germany)。このプラスミドを、pFI472と名付けた。SphIおよびSbf1制限エンドヌクレアーゼ部位が隣接するTRP1-FAカセットを含有する合成DNA断片を、商業的供給源からインビトロDNA合成によって構築し、得られたものをpMA-RQベクター(GeneArt ag)にクローニングした。このプラスミドを、pFI468と名付けた。Δkex1::TRP1-FA遺伝子破壊対立遺伝子を含有するプラスミドpFI473を、2つのDNA断片、即ち、SphIおよびSbf1によるpFI472の消化後に得られた3163bp断片並びにSphIおよびSbfIによるpFI468の消化後に得られた872bp断片のライゲーションによって構築した。最後に、pFI473を、XhoIおよびHincIIによって消化させ、Δkex1::TRP1-FA対立遺伝子を含有する1707bp DNA断片を単離し、LiAc手順によるyFI810の形質転換に用いた(Gietz,R.D.およびWood,R.(2002)、Methods in Enzymology:350,(87〜96)、Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.)。形質転換後、Δkex1::TRP1-FA欠失変異体を選択するために、酵母細胞を、トリプトファンを含まない最少培地プレートに蒔いた。KEX1遺伝子座へのΔkex1::TRP1-FA対立遺伝子の正確な組込みを確認するために、TRP+形質転換体をPCRによって特性決定した。酵母菌株yFI815を、Δkex1::TRP1-FA欠失変異体(MATα ura3-D0 leu2-D0 his3-D0 trp1-δ-FA tpi1::URA3 yps1::HIS3 pep4::LEU2 kex1::TRP1-FA,pSA281)として単離した。
【０１２６】
(実施例2)
Δkex1::KanMX4遺伝子破壊
KEX1遺伝子が欠失し、遺伝子型がMatα his3D1 leu2D0 lys2D0 ura3D0 kex1 D0::kanMX4である酵母菌株を、Euroscarf欠失菌株コレクション(deletion strain collection)から購入した(Acc. no.Y14570)。この酵母菌株において、KEX1オープンリーディングフレームをコードするDNA断片は、抗生物質G418/ジェネテシンに対する耐性を与えるKanMX4ドミナント選択可能マーカーで置き換えられている(Wach,A.、Brachat,A.、Poelmann,R.およびPhilippsen,P.(1994)、Yeast:10(1793〜808)、New heterologous modules for classical or PCR-based gene disruptions in Saccharomyces cerevisiae.)。
【０１２７】
Δkex1::KANMX4欠失対立遺伝子カセットを含有する合成DNA断片を増幅させるために、ゲノムDNAをY14570から単離し、合成オリゴヌクレオチドoTKLH68(cccggaaccgaaaaacaatgtgga)(SEQ ID NO:2)およびolLLa482(agttcagtagtgtgaattaaataaaacagtcagttcttgatggattgtaccctttaaagaatttatctttatg)(SEQ ID NO:3)との標準的なPCR反応において鋳型として用いた。このDNA断片を、LiAc法によるyFI650(cPOTプラスミドpSA082を有する宿主菌株NNY574)の形質転換に直接使用した(Gietz,R.D.およびWood,R.(2002). Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in Enzymology: 350,(87〜96))。形質転換後、酵母細胞をYEPD寒天上に蒔き、30℃において一夜インキュベートし、続いて選択的YEPD寒天+200mg/L G418上にレプリカプレーティングを行った。30℃で更に3日間インキュベート後に出現した酵母コロニーを単離し、KEX1遺伝子座へのΔkex1::KanMX4対立遺伝子の正確な組込みを確認するために、PCRによって特性決定した。酵母菌株yFI750を、Δkex1::KanMX4欠失変異体(MATα ura3-D0 leu2-D0 his3-D0 trp1-δ-FA tpi1::URA3 yps1::HIS3 pep4::LEU2 kex1::KanMX4,pSA082)として単離した。グルコース選択を行わずに多世代にわたって成長させることによって、yFI750からのcPOTプラスミドの除去を誘導した。得られた酵母菌株、yFI751(MATα ura3-D0 leu2-D0 his3-D0 trp1-δ-FA tpi1::URA3 yps1::HIS3 pep4::LEU2 kex1::KanMX4)を新しい宿主菌株として、cPOT型の酵母発現ベクターによる形質転換に使用した。
【０１２８】
(実施例3)
LC/MSD TOF機器(Agilent)を用いるLC-MS分析を使用して、製造業者が推奨する設定に従って、酵母上清中の分泌ペプチドの分子量を測定した。添付ソフトウェアを用いて、TICクロマトグラムのデコンボリューションを行った。多数の完全長グリシン欠失菌種が、デコンボリューション処理されたスペクトルから得られ、これを、完全長ペプチドvs完全長グリシン欠失ペプチドのプールの割合の評価に用いた(table 1(表1))。
【０１２９】
【表１】
0005850848.tif 000002
【０１３０】
Table 1(表1)から、欠失(非機能性)KEX1遺伝子を有する菌株におけるC末端グリシンを有するポリペプチドの発現は、完全長産物の発現を約2倍にすると思われる。
【０１３１】
(実施例4)
酵母発現系の構築およびEEAEK-アミリン(1〜37)K1E、S28P、S29P、G38の産生
発現プラスミドは、EP171,142に記載されているのと同様なC-POT型のものである。これらは、S.セレビジエにおけるプラスミド選択および安定化のためのシゾサッカロミセス・ポンベトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子(POT)を含有することを特徴とする、2μ-ベースの発現ベクターである。プラスミドはまた、S.セレビジエトリオースリン酸イソメラーゼのプロモーターおよびターミネーターを含有する。これらの配列は、他の全ての配列と同様に、以下を除いてプラスミドpKFN1003中の対応配列(WO9010075に記載)と類似している:1)リーダーおよびインスリン産物の融合タンパク質をコードするEcoRI-XbaI断片の配列。2)サイレント変異が導入されており、結果として発現ベクター中の2μ-領域のNcoI部位が除去されている。種々の融合タンパク質のクローニングを容易にするために、MFα1プレ-プロリーダーをコードするDNA配列を、NcoI部位を組み入れるように変化させた(図1を参照)。これを、MFα1*プレ-プロリーダーと称する。したがって、NcoI-XbaI断片は、当該前駆体分子をコードするNcoI-XbaI断片によって単に置き換えられている。このようなNcoI-XbaI断片は、合成により構築することもできるし、または合成オリゴヌクレオチドおよびPCRを用いて標準的な技術に従って合成することもできる。α-リーダーに加えて、他のリーダーも使用できる。EEAEAK-アミリン(1〜37)K1E、S28P、S29P、G38をコードする配列を含有する合成DNA断片は、Geneart AG、BioPark、Josef-Engert-Str. 11、D-93053 Regensburg、Germanyから入手した。酵母中での発現を容易にするために、合成アミリン(1〜37)K1E、S28P、S29P、G38に、N末端伸長EEAEKをコードする5'DNA配列(SEQ ID NO:1)を付け加えた。合成DNAをNcoIおよびXbaIで消化し、改変cPOT型発現ベクターのNcoI-XbaIベクター断片につなぎ合わせた(図1)。これにより、配列EEAEKCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTYG (SEQ ID NO:4)を有するEEAEK-アミリン(1〜37)K1E、S28P、S29P、G38をコードする発現プラスミドpSA281を得た。このDNA配列は、以下の配列を有する:
gaagaagctgaaaaagaatgtaatactgctacttgtgctactcaaagattggctaattttttggttcattcttctaataattttggtccaat tttgccaccaactaatgttggttctaatacttatggt(SEQ ID NO:5)。
【０１３２】
発現プラスミドを、大腸菌(E. coli)中で増殖させ、アンピシリンの存在下で成長させ、標準的な技術(Sambrookら、1989)を使用して単離した。プラスミドDNAを、適切な制限ヌクレアーゼ(例えば、EcoRI、NcoI、XbaI)によってインサートについて調べ、これは、配列解析によってExt_アミリン(1〜37)K1E、S28P、S29P、G38の適正な配列を含有することが示された。
【０１３３】
このプラスミドを、S. cerevisiae菌株NNY547およびyFI751に形質転換させた。YPD(1%酵母エキス、2%ペプトン、2%グルコース)寒天(2%)プレート上で炭素源としてのグルコース利用によって、プラスミドを持っている酵母形質転換体を選択した。得られた酵母菌株を、グルコースを単一炭素源として含有する成長培地5mlに接種した。培養は、30℃において3日間実施した。遠心分離後、上清をLC/MS分析のために除去し、この方法によって前述のようにして分泌分子の同一性を確認した。
【０１３４】
(実施例5)
酵母発現系の構築およびPP類似体前駆体分子PP(1〜36)K26 G37の産生
PP(1〜36)K26、G37をコードする配列を含有する合成DNA断片を、Geneart AG、BioPark、Josef-Engert-Str. 11、D-93053 Regensburg、Germanyから入手した。合成DNAをNcoIおよびXbaIで消化し、改変cPOT型発現ベクターのNcoI-XbaIベクター断片につなぎ合わせた(図1)。これにより、以下のアミノ酸配列
APLEPVYPGDNATPEQMAQYAADLRKYINMLTRPRYG(SEQ ID NO:6)を有するPP(1〜36)K26 G37をコードする発現プラスミドpSA228を得た。対応するDNA配列は以下の通りである:
gcaccattggaaccagtttacccaggtgataacgcaactccagagcagatggctcagtatgctgcagatttaagaaagtatataa atatgttaacaagaccaagatatggt(SEQ ID NO:7)。
【０１３５】
前述のようにして、発現ベクターの同一性を確認し、プラスミドをS. cerevisiaeに形質転換し、酵母菌株を成長させ、分泌タンパク質を収集した。
【０１３６】
(実施例6)
酵母発現系の構築およびEEAEK-アミリン(1〜37)K1E、S28P、S29P、X37、G38の産生
C末端グリシン残基の隣のアミノ酸の同一性の効果を調べるために、C末端Glyに結合しているアミノ酸残基(アミノ酸残基No.37)がA、G、F、I、M、S、P、T、W、R、L、QまたはNであるEEAEK-アミリン(1〜37)K1E、S28P、S29P、X37、G38をコードする配列を含有する合成DNA断片を、Geneart AG、BioPark、Josef-Engert-Str. 11、D-93053 Regensburg、Germanyから入手した。合成DNAをNcoIおよびXbaIで消化し、改変cPOT型発現ベクターのNcoI-XbaIベクター断片につなぎ合わせた(図1)。
【０１３７】
これにより、
EEAEKCNTATCATQR-LANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTAG (配列番号:8)、EEAEKCNTATCATQR-LANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTGG (配列番号:9)、EEAEKCNTATCATQR-LANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTFG (配列番号:10)、EEAEKCNTATCATQR-LANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTIG (配列番号:11)、EEAEKCNTATCATQR-LANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTMG (配列番号:12)、EEAEKCNTATCATQR-LANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTSG (配列番号:13)、EEAEKCNTATCATQR-LANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTPG (配列番号:14)、EEAEKCNTATCATQR-LANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTTG (配列番号:15)、EEAEKCNTATCATQR-LANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTWG (配列番号:16)、EEAEKCNTATCATQR-LANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTRG (配列番号:17)、EEAEKCNTATCATQR-LANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTLG (配列番号:18)、EEAEKCNTATCATQR-LANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTQG (配列番号:19)およびEEAEKCNTATCATQR-LANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTNG (配列番号:20)、
をコードする発現プラスミドを得た。
【０１３８】
対応するDNA配列は以下の通りである:
gaagaagctgaaaaagaatgtaatactgctacttgtgctactcaaagattggctaattttttggttcattcttctaataattttggtccaattttgccaccaactaatgttggttctaatactgctggt (配列番号:21);
gaagaagctgaaaaagaatgtaatactgctacttgtgctactcaaagattggctaattttttggttcattcttctaataattttggtccaattttgccaccaactaatgttggttctaatactggtggt (配列番号:22);
gaagaagctgaaaaagaatgtaatactgctacttgtgctactcaaagattggctaattttttggttcattcttctaataattttggtccaattttgccaccaactaatgttggttctaatacttttggt (配列番号:23);
gaagaagctgaaaaagaatgtaatactgctacttgtgctactcaaagattggctaattttttggttcattcttctaataattttggtccaattttgccaccaactaatgttggttctaatactattggt (配列番号:24);
gaagaagctgaaaaagaatgtaatactgctacttgtgctactcaaagattggctaattttttggttcattcttctaataattttggtccaattttgccaccaactaatgttggttctaatactatgggt (配列番号:25);
gaagaagctgaaaaagaatgtaatactgctacttgtgctactcaaagattggctaattttttggttcattcttctaataattttggtccaattttgccaccaactaatgttggttctaatacttctggt (配列番号:26);
gaagaagctgaaaaagaatgtaatactgctacttgtgctactcaaagattggctaattttttggttcattcttctaataattttggtccaattttgccaccaactaatgttggttctaatactcctggt (配列番号:27);
gaagaagctgaaaaagaatgtaatactgctacttgtgctactcaaagattggctaattttttggttcattcttctaataattttggtccaattttgccaccaactaatgttggttctaatactactggt (配列番号:28);
gaagaagctgaaaaagaatgtaatactgctacttgtgctactcaaagattggctaattttttggttcattcttctaataattttggtccaattttgccaccaactaatgttggttctaatacttggggt (配列番号:29);
gaagaagctgaaaaagaatgtaatactgctacttgtgctactcaaagattggctaattttttggttcattcttctaataattttggtccaattttgccaccaactaatgttggttctaatactagaggt (配列番号:30);
gaagaagctgaaaaagaatgtaatactgctacttgtgctactcaaagattggctaattttttggttcattcttctaataattttggtccaattttgccaccaactaatgttggttctaatactcttggt (配列番号:31);
gaagaagctgaaaaagaatgtaatactgctacttgtgctactcaaagattggctaattttttggttcattcttctaataattttggtccaattttgccaccaactaatgttggttctaatactcaaggt (配列番号:32)および
gaagaagctgaaaaagaatgtaatactgctacttgtgctactcaaagattggctaattttttggttcattcttctaataattttggtccaattttgccaccaactaatgttggttctaatactaatggt (配列番号:33)。
【０１３９】
上記実施例3および4に記載されたようにして、発現ベクターの同一性を確認し、プラスミドをS.セレビジエに形質転換し、酵母菌株を成長させ、分泌タンパク質を収集し、解析した。多数の完全長グリシン欠失菌種が、デコンボリューション処理されたスペクトルから得られ、これを完全長ペプチドvs完全長グリシン欠失ペプチドのプールの割合の評価に用いた。結果をTable 2(表2)に示す。Table 2(表2)から、Glyに結合しているアミノ酸残基がTyr、Phe、Met、Leu、Trp、Ala、IleおよびArgのうちの1つである場合には、アミリン分子のC末端Glyは切断されると思われる。
【０１４０】
【表２】
0005850848.tif 000003
【図１】
0005850848.tif 000004
【配列表】
0005850848000001.app