(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下（１）および（２）を含む、人工細胞の培養系：
（１）以下の特性を有する、人工細胞：
（ａ）癌細胞に由来する；
（ｂ）外来の癌遺伝子を発現し、かつ該外来の癌遺伝子に依存して増殖する能力を有する；および
（ｃ）前記癌細胞に固有の癌遺伝子を発現する能力、および該固有の癌遺伝子に依存して増殖する能力を保持する；ならびに
（２）該固有の癌遺伝子の阻害剤。
【請求項２】
人工細胞が細胞株である、請求項１記載の培養系。
【請求項３】
人工細胞がヒト由来である、請求項１または２記載の培養系。
【請求項４】
人工細胞が接着細胞である、請求項１〜３のいずれか一項記載の培養系。
【請求項５】
人工細胞が肺由来である、請求項１〜４のいずれか一項記載の培養系。
【請求項６】
固有の癌遺伝子が固有のチロシンキナーゼ遺伝子である、請求項１〜５のいずれか一項記載の培養系。
【請求項７】
固有のチロシンキナーゼ遺伝子がＥＧＦＲ変異遺伝子である、請求項６記載の培養系。
【請求項８】
外来の癌遺伝子が外来のチロシンキナーゼ遺伝子である、請求項１〜７のいずれか一項記載の培養系。
【請求項９】
外来のチロシンキナーゼ遺伝子がＥＭＬ４−ＡＬＫ遺伝子である、請求項８記載の培養系。
【請求項１０】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、人工細胞の樹立方法：
（ａ）癌細胞を、外来の癌遺伝子の発現ベクターで処理する工程；
（ｂ）該発現ベクターで処理された癌細胞を、該癌細胞に固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件下で培養する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）において増殖した癌細胞を、外来の癌遺伝子を発現し、かつ外来の癌遺伝子に依存して増殖する能力を有する人工細胞として得る工程。
【請求項１１】
さらに以下（ｄ）の工程を含む、請求項１０記載の方法：
（ｄ）工程（ｃ）で得られた人工細胞をクローニングする工程。
【請求項１２】
以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、抗癌作用を有する物質のスクリーニング方法：
（ａ）試験物質が外来の癌遺伝子の発現ベクターで処理された癌細胞の増殖を阻害するか否かを、該癌細胞に固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件下で評価する工程；および
（ｂ）該癌細胞に固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件下において、該癌細胞の増殖を阻害する試験物質を、抗癌作用を有する物質として選択する工程。
【請求項１３】
外来の癌遺伝子の発現ベクターで癌細胞を処理することにより、工程（ａ）で用いられる、外来の癌遺伝子の発現ベクターで処理された癌細胞を調製する工程をさらに含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、癌遺伝子の同定方法：
（ａ）癌細胞を、試験遺伝子の発現ベクターで処理する工程；
（ｂ）該発現ベクターで処理された癌細胞を、該癌細胞に固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件下で培養する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）において培養された癌細胞が試験遺伝子に依存して増殖するか否かを確認する工程。
【請求項１５】
試験遺伝子が単一の遺伝子である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
試験遺伝子が複数の遺伝子であり、さらに以下の工程を含む、請求項１４記載の方法：
（ｄ）工程（ｃ）で増殖した癌細胞をクローニングする工程；および
（ｅ）クローニングされた癌細胞中に導入された試験遺伝子を、癌遺伝子として同定する工程。
【請求項１７】
試験遺伝子が複数の遺伝子であり、さらに以下の工程を含む、請求項１４記載の方法：
（ｆ）工程（ｃ）で増殖した癌細胞から癌細胞中に導入された試験遺伝子を取得する工程；
（ｇ）取得した試験遺伝子をクローニングし、癌遺伝子として同定する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌遺伝子の同定方法、癌遺伝子発現細胞の樹立方法、および癌遺伝子標的薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、抗癌剤の研究開発が活発に行なわれている。抗癌剤の研究開発に有効な手法としては、（１）癌遺伝子の同定、（２）癌遺伝子発現細胞の樹立、および（３）癌遺伝子標的薬のスクリーニングが挙げられる。【０００３】
（１）癌遺伝子の同定
特定の癌遺伝子をターゲットとした分子標的薬（例、ゲフィチニブ）の抗腫瘍効果が注目されており、抗腫瘍効果を奏する分子標的薬が開発されている。このような分子標的薬の開発において、新規標的分子として有望である癌遺伝子の同定方法が利用されている。このような同定方法の例は、癌遺伝子が含まれると期待される遺伝子ライブラリーを細胞中に導入し、形質転換能を示した細胞中に導入された遺伝子を癌遺伝子として選択する方法（以下、従来の同定方法１）である。例えば、非特許文献１は、マウス由来３Ｔ３細胞（非癌細胞）を利用した形質転換実験により新規癌遺伝子ＥＭＬ４−ＡＬＫが見出されたことを開示している。
癌遺伝子の同定方法の別の例は、ＤＮＡチップや二次元電気泳動法により癌細胞または癌組織サンプルと正常細胞または正常組織サンプルの遺伝子発現を網羅的に解析し、両サンプル間における発現に差異が認められる遺伝子から癌遺伝子を選択する方法（以下、従来の同定方法２）である。【０００４】
（２）癌遺伝子発現細胞の樹立
癌遺伝子発現細胞の樹立方法としては、癌遺伝子を天然に発現する細胞株を被験体から単離する方法、ならびに癌遺伝子と共に薬剤耐性遺伝子（例、Ｇ４１８耐性遺伝子）を細胞に導入し、次いで癌遺伝子が導入された細胞を薬剤（例、Ｇ４１８）で選択する方法が挙げられる。
また、癌遺伝子発現細胞の樹立に焦点を当てたものではないが、特許文献１は、サイトカイン依存性細胞株（非癌細胞）に対してリガンド受容体遺伝子および薬剤耐性遺伝子を導入することにより、リガンドまたはリガンド様物質、および薬剤耐性遺伝子に対する薬剤の存在下で増殖し得る細胞株を樹立できることを開示している。【０００５】
（３）癌遺伝子標的薬のスクリーニング
細胞を用いる癌遺伝子標的薬のスクリーニング方法の例は、癌遺伝子を天然に発現する癌細胞株を用いる方法（以下、従来のスクリーニング方法１）である。
細胞を用いる癌遺伝子標的薬のスクリーニング方法の別の例は、癌遺伝子を導入した細胞を用いる方法（以下、従来のスクリーニング方法２）である。例えば、非特許文献１は、マウス由来ＩＬ−３依存性細胞株（非癌細胞であるＢａ／Ｆ３細胞）にＥＭＬ４−ＡＬＫ遺伝子を導入し、ＥＭＬ４−ＡＬＫ遺伝子をターゲットとした分子標的薬の効果を検証することを開示している。
また、癌遺伝子標的薬のスクリーニングに焦点を当てたものではないが、特許文献１は、サイトカイン依存性細胞株（非癌細胞）に由来する上述の細胞株を用いることにより、リガンドまたはリガンド様物質をスクリーニングできることを開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００３／０１２０８７
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ，２００７，ｖｏｌ．４４８，ｐ５６１−５６６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、従来の手法は、抗癌剤の研究開発において利用する場合、以下のような問題点がある。
（１）癌遺伝子の同定
従来の同定方法１は、癌遺伝子としての形質転換能を直接的に試験することにより行なわれることから、この方法により同定される遺伝子が癌遺伝子である確率は高い。しかしながら、この方法はヒトへの応用および汎用性に問題がある。この方法に用いられる正常培養細胞としては、げっ歯類由来の繊維芽細胞のみが一般的に利用できるものであり、ヒト由来の細胞や癌細胞、あるいは多くの癌の起源となる上皮細胞、血球細胞を用いた実験方法は確立されていない。また、従来の同定方法１に用いられるげっ歯類由来の繊維芽細胞は、初期の性質を長期間維持したまま継代するのが難しく、継代中に自然発生的に起こる形質転換により目的とする癌遺伝子の同定を困難にするリスクがある。
従来の同定方法２は、癌遺伝子以外にも癌遺伝子の遺伝子発現によって誘導または抑制される多くの遺伝子を候補遺伝子として選択してしまうという問題がある。また、従来の同定方法２は、選択された多くの候補遺伝子のなかから癌遺伝子を最終的に同定するために、多くの候補遺伝子をさらに詳細に解析することを必要とする。【０００９】
（２）癌遺伝子発現細胞の樹立
従来の樹立方法は、多くの場合に癌遺伝子を癌細胞に導入し得ず、また、一度導入された癌遺伝子が細胞の継代により欠落し得るため、非効率的である。【００１０】
（３）癌遺伝子標的薬のスクリーニング
従来のスクリーニング方法１は、特定の癌遺伝子を天然に発現する特定の癌細胞株が入手可能である場合に可能であるが、任意の癌遺伝子を天然に発現する種々の癌細胞株を入手することは困難であるため、任意の癌遺伝子に対する標的薬のスクリーニングを行なうことは現実的に可能でない。
従来のスクリーニング方法２は、汎用される培養細胞を用いて既知の癌遺伝子の阻害剤の効果を検証し得るが、上述したような癌遺伝子の同定および癌遺伝子発現細胞株の樹立に関する問題点のため、種々の培養細胞（例、ヒト細胞、癌細胞）を用いて種々の癌遺伝子の阻害剤の効果を効率的に検証することは依然として困難である。【００１１】
したがって、本発明の目的は、癌遺伝子の同定、癌遺伝子発現細胞株の樹立、および癌遺伝子標的薬のスクリーニングにおいて、これらの問題点を解消し得る新規方法論を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
ところで、癌遺伝子中毒（ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ａｄｄｉｃｔｉｏｎ）または中毒（ａｄｄｉｃｔｉｏｎ）とは、癌細胞が特定の遺伝子に増殖を依存している状態である。特定の遺伝子に依存して増殖する癌細胞を、その遺伝子の阻害剤で処理すると、癌細胞の増殖が抑制され得ることが知られている。【００１３】
本願発明者らは、鋭意検討した結果、癌細胞における特定の癌遺伝子に対する依存が、別の癌遺伝子の導入により置換可能であることを見出した。本願発明者らはまた、本知見に基づき、癌細胞を、外来の癌遺伝子の発現ベクターで処理し、次いで、発現ベクターで処理された癌細胞を、癌細胞に固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件下で培養するという方法論により、選択的に増殖した人工細胞が得られること、およびこの選択的に増殖した人工細胞を癌細胞モデルとして使用できることを見出した。本願発明者らはまた、本方法論を利用することにより、癌遺伝子を同定できること、および本方法論で得られる選択的に増殖した癌細胞を利用することにより、抗癌剤を開発できることを見出し、本願発明を完成するに至った。特許文献１および非特許文献１は、癌遺伝子を導入するための細胞として、癌細胞を利用すること、および癌遺伝子が導入された癌細胞を、当該癌細胞に固有の癌遺伝子を阻害する条件下で培養することにより選択することを記載も示唆もしていない。【００１４】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下（ａ）および（ｂ）の特性を有する、人工細胞：
（ａ）癌細胞に由来する；および
（ｂ）外来の癌遺伝子を発現し、かつ該外来の癌遺伝子に依存して増殖する能力を有する。
〔２〕さらに以下（ｃ）の特性を有する、上記〔１〕の人工細胞：
（ｃ）前記癌細胞に固有の癌遺伝子を発現する能力、および該固有の癌遺伝子に依存して増殖する能力を保持する。
〔３〕人工細胞が細胞株である、上記〔１〕または〔２〕の人工細胞。
〔４〕人工細胞がヒト由来である、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかの人工細胞。
〔５〕人工細胞が接着細胞である、上記〔１〕〜〔４〕のいずれかの人工細胞。
〔６〕人工細胞が肺由来である、上記〔１〕〜〔５〕のいずれかの人工細胞。
〔７〕固有の癌遺伝子が固有のチロシンキナーゼ遺伝子である、上記〔２〕〜〔６〕のいずれかの人工細胞。
〔８〕固有のチロシンキナーゼ遺伝子がＥＧＦＲ変異遺伝子である、上記〔７〕の人工細胞。
〔９〕外来の癌遺伝子が外来のチロシンキナーゼ遺伝子である、上記〔１〕〜〔８〕のいずれかの人工細胞。
〔１０〕外来のチロシンキナーゼ遺伝子がＥＭＬ４−ＡＬＫ遺伝子である、上記〔９〕の人工細胞。
〔１１〕以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、人工細胞の樹立方法：
（ａ）癌細胞を、外来の癌遺伝子の発現ベクターで処理する工程；
（ｂ）該発現ベクターで処理された癌細胞を、該癌細胞に固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件下で培養する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）において増殖した癌細胞を、外来の癌遺伝子を発現し、かつ外来の癌遺伝子に依存して増殖する能力を有する人工細胞として得る工程。
〔１２〕さらに以下（ｄ）の工程を含む、上記〔１１〕の方法：
（ｄ）工程（ｃ）で得られた人工細胞をクローニングする工程。
〔１３〕以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、抗癌作用を有する物質のスクリーニング方法：
（ａ）試験物質が上記〔１〕〜〔１０〕のいずれかの人工細胞の増殖を阻害するか否かを評価する工程；および
（ｂ）人工細胞の増殖を阻害する試験物質を、抗癌作用を有する物質として選択する工程。
〔１４〕工程（ａ）が固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件下で行なわれる、上記〔１３〕の方法。
〔１５〕以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、癌遺伝子の同定方法：
（ａ）癌細胞を、試験遺伝子の発現ベクターで処理する工程；
（ｂ）該発現ベクターで処理された癌細胞を、該癌細胞に固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件下で培養する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）において培養された癌細胞が試験遺伝子に依存して増殖するか否かを確認する工程。
〔１６〕試験遺伝子が単一の遺伝子である、上記〔１５〕の方法。
〔１７〕試験遺伝子が複数の遺伝子であり、さらに以下の工程を含む、上記〔１５〕の方法：
（ｄ）工程（ｃ）で増殖した癌細胞をクローニングする工程；および
（ｅ）クローニングされた癌細胞中に導入された試験遺伝子を、癌遺伝子として同定する工程。
〔１８〕試験遺伝子が複数の遺伝子であり、さらに以下の工程を含む、上記〔１５〕の方法：
（ｆ）工程（ｃ）で増殖した癌細胞から癌細胞中に導入された試験遺伝子を取得する工程。
（ｇ）取得した試験遺伝子をクローニングし、癌遺伝子として同定する工程。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の人工細胞は、例えば、種々の癌に対して優れた抗癌剤の開発を可能とする。
本発明の樹立方法は、例えば、外来の癌遺伝子を発現する細胞の樹立効率に優れる。
本発明のスクリーニング方法は、例えば、任意の癌遺伝子を発現する任意の癌細胞を用いた抗癌剤の開発を可能にする。
本発明の同定方法は、外来の癌遺伝子を発現する細胞の樹立効率に優れる本発明の樹立方法と方法論が同様であることから、例えば、癌遺伝子同定の感度および精度に優れる。
また、本発明のこれらの方法は、汎用される培養細胞（例、癌細胞株）を用いて、簡便かつ慣用的な手法により行うことができるという利点を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、Ｇ４１８含有培養液（Ｇ４１８）またはゲフィチニブ含有培養液（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）中で増殖したＥＭＬ４−ＡＬＫｖａｒｉａｎｔ３ａ遺伝子導入ＰＣ−９細胞における、ＥＭＬ４−ＡＬＫｖａｒｉａｎｔ３ａタンパク質の発現を示す図である。
【図２】図２は、ゲフィチニブ含有培養液中で選択的に増殖したＥＭＬ４−ＡＬＫｖａｒｉａｎｔ３ａ遺伝子導入ＰＣ−９細胞の１０個のクローンにおける、ＥＭＬ４−ＡＬＫｖａｒｉａｎｔ３ａタンパク質の発現を示す図である。
【図３】図３は、ゲフィチニブ含有培養液中で増殖したＥＭＬ４−ＡＬＫｖａｒｉａｎｔ３ａ遺伝子導入ＰＣ−９細胞（ＰＣ−９−ＥＭＬ４−ＡＬＫｖａｒ３ａ）、ＥＭＬ４−ＡＬＫｖａｒｉａｎｔ１遺伝子導入ＰＣ−９細胞（ＰＣ−９−ＥＭＬ４−ＡＬＫｖａｒ１）およびＥＭＬ４−ＡＬＫｖａｒｉａｎｔ３ａ遺伝子導入ＨＣＣ８２７細胞（ＨＣＣ８２７−ＥＭＬ４−ＡＬＫｖａｒ３ａ）における、ＥＭＬ４−ＡＬＫｖａｒｉａｎｔ３ａまたはＥＭＬ４−ＡＬＫｖａｒｉａｎｔ１タンパク質の発現を示す図である。
【図４】図４は、ゲフィチニブ含有培養液中で増殖したＰＤＧＦＲα  Ｖ５６１Ｄ遺伝子導入ＰＣ−９細胞における、ＰＤＧＦＲα  Ｖ５６１Ｄタンパク質の発現を示す図である。
【図５】図５は、種々の濃度のゲフィチニブの存在下における、ＰＣ−９細胞またはＰＤＧＦＲα  Ｖ５６１Ｄ遺伝子導入ＰＣ−９細胞の増殖百分率（％）を示す図である。
【図６】図６は、種々の濃度のＰＤＧＦＲα阻害剤イマチニブ（Ｉｍａｔｉｎｉｂ）の存在下における、ＰＤＧＦＲα  Ｖ５６１Ｄ遺伝子導入ＰＣ−９細胞（１μＭ  ゲフィチニブの存在下または非存在下）の増殖百分率（％）を示す図である。
【図７】図７は、ＰＣ−９細胞における変異ＥＧＦＲ依存性増殖を補完し得る新規の癌遺伝子候補のアガロースゲル電気泳動を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（１．人工細胞）
本発明は、特定の人工細胞を提供する。本明細書中で用いられる場合、用語「人工細胞」とは、人為的に作製される細胞を意味する。
【００１８】
本発明の人工細胞は、単離または精製された細胞であってもよい。細胞の単離または精製は、ＦＡＣＳ等の自体公知の方法により行うことができる。
【００１９】
本発明の人工細胞は、癌細胞に由来し得る。したがって、本発明の人工細胞は、癌細胞により保持される細胞学的特性を引き継ぎ得る。例えば、癌細胞がヒト細胞である場合、本発明の人工細胞はヒト細胞であり得る。また、癌細胞が肺細胞である場合、本発明の人工細胞は肺細胞であり得る。
【００２０】
本明細書中で用いられる場合、用語「癌細胞」とは、当該癌細胞により発現される特定の癌遺伝子に依存して増殖する能力を有する腫瘍細胞を意味する。癌細胞としては、初代培養細胞、細胞株または癌幹細胞が挙げられる。
【００２１】
本明細書中で用いられる場合、細胞の増殖についての用語「依存」とは、細胞が特定の癌遺伝子に増殖を依拠している、癌遺伝子中毒（ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ａｄｄｉｃｔｉｏｎ）または中毒（ａｄｄｉｃｔｉｏｎ）の状態をいう。細胞が特定の癌遺伝子に増殖を依拠しているか否かは、特定の癌遺伝子の阻害剤で細胞を処理し、次いで、処理された細胞の増殖能を評価することにより、確認できる。増殖能は、例えば、ＭＴＴアッセイ、ＭＴＳアッセイにより評価できる。また、特定の癌遺伝子に対して癌遺伝子中毒の細胞を、当該癌遺伝子の阻害剤で処理すると、アポトーシスによる細胞死が誘導され得ることが知られている。したがって、特定の癌遺伝子に対する細胞の癌遺伝子中毒は、例えば、当該癌遺伝子の阻害によりアポトーシスが誘導され得るか否かを評価することにより、確認してもよい。アポトーシス誘導は、例えば、ＴＵＮＥＬアッセイ、活性型カスパーゼの検出、ＡＮＮＥＸＩＮ  Ｖの検出により評価できる。
【００２２】
癌細胞は、任意の組織に由来し得る。このような組織としては、例えば、呼吸器系組織（例、肺、気管、気管支、咽頭、鼻腔、副鼻腔）、消化器系組織（例、胃、小腸、大腸、直腸）、膵臓、腎臓、肝臓、胸腺、脾臓、心臓、甲状腺、副腎、前立腺、卵巣、子宮、脳、皮膚、ならびに血液組織（例、骨髄、末梢血）が挙げられる。別の観点では、癌細胞は、接着細胞または非接着細胞（すなわち、血球細胞）であり得るが、接着細胞が好ましい。さらに別の観点では、癌細胞は、上記組織又は上記組織以外の組織に存在する細胞であり得る。このような細胞としては、例えば、腺細胞（例、肺腺細胞、乳腺細胞）、上皮細胞、内皮細胞、表皮細胞、間質細胞、繊維芽細胞、脂肪細胞、メサンギウム細胞、膵β細胞、神経細胞、グリア細胞、血球細胞が挙げられる。癌細胞は、好ましくは肺腺癌細胞である。
【００２３】
本明細書中で用いられる場合、用語「癌」とは、上述の組織及び細胞種における任意の悪性腫瘍をいう。癌としては、例えば、接着細胞の異常を原因とし得る癌、血球細胞の異常を原因とし得る癌（例、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫）が挙げられるが、接着細胞の異常を原因とし得る癌が好ましい。具体的には、接着細胞の異常を原因とし得る癌としては、肺癌（例、扁平上皮がん、腺がんおよび大細胞がん等の非小細胞癌、ならびに小細胞癌）、消化器系癌（例、胃癌、小腸癌、大腸癌、直腸癌）、膵臓癌、腎臓癌、肝臓癌、胸腺癌、脾臓癌、甲状腺癌、副腎癌、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌（例、子宮内膜癌、子宮頚癌）、骨癌、皮膚癌、脳腫瘍、肉腫、黒色腫、芽細胞腫（例、神経芽細胞腫）、腺癌、扁平細胞癌、固形癌、上皮性癌、中皮腫が挙げられる。用語「癌細胞」、「癌遺伝子」等の癌関連用語における「癌」もまた、同様の意味を示し得る。
【００２４】
癌細胞は、任意の哺乳動物種に由来し得る。このような哺乳動物種としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ブタ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギが挙げられる。臨床応用という観点から、哺乳動物種は、好ましくはヒトである。したがって、癌細胞は、癌患者から単離された癌細胞、またはそれに由来する癌細胞であってもよい。
【００２５】
癌細胞は、ウイルス非感染細胞であっても、ウイルス感染細胞であってもよい。細胞に感染し得る発癌性ウイルスとしては、例えば、エプスタインバーウイルス、肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスが挙げられる。癌細胞はまた、胚性幹細胞、体性幹細胞、または正常細胞から作製された人工の幹細胞（例、ｉＰＳ細胞）に由来する癌細胞であってもよい。
【００２６】
本発明の人工細胞が由来する癌細胞は、固有の癌遺伝子を発現し得る。本明細書中で用いられる場合、用語「固有の癌遺伝子」とは、本発明の人工細胞の樹立において材料として用いられ得る癌細胞により発現される、癌細胞の増殖を担う癌遺伝子を意味する。癌遺伝子は、癌細胞において過剰発現している（例、遺伝子のコピー数の増加に伴う過剰発現）、過剰の増殖シグナルを伝達する遺伝子、または癌細胞において増殖シグナルを伝達し続けるような変異を生じる遺伝子であり得る。変異としては、例えば、点突然変異（例、置換）、欠失、付加、挿入、融合を引き起こす変異（例、逆位、転座）が挙げられる。本明細書中で用いられる場合、用語「遺伝子」は、変異遺伝子を意図していることがある。
【００２７】
本明細書中で用いられる場合、用語「固有」とは、用語「外来」と対立する概念を意味する。したがって、癌細胞を材料として用いる本発明の人工細胞の樹立過程において、癌細胞に遺伝子が導入される場合、当該遺伝子は、癌細胞に対して外来である。一方、本発明の人工細胞の樹立過程において材料として用いられ得る癌細胞が保有している遺伝子は、たとえ癌細胞自体の樹立過程において導入または変異された遺伝子であっても、癌細胞に対して固有であるものとする。
【００２８】
固有の癌遺伝子としては、例えば、哺乳動物またはウイルスに由来する癌遺伝子が挙げられる。哺乳動物種としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ブタ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギが挙げられる。臨床応用という観点から、哺乳動物種は、好ましくはヒトである。ウイルスとしては、例えば、エプスタインバーウイルス、肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、カポジ肉腫ヘルペスウイルスが挙げられる。
【００２９】
また、固有の癌遺伝子としては、例えば、チロシンキナーゼ（受容体型、非受容体型）、セリン・スレオニンキナーゼ等のキナーゼ、低分子量Ｇタンパク質、転写因子が挙げられるが、チロシンキナーゼが好ましい。癌細胞の増殖を担い得るチロシンキナーゼとしては、例えば、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーに属する分子（例、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）遺伝子ファミリーに属する分子（例、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ）、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）、肝細胞増殖因子受容体（ｃ−ＭＥＴ）、幹細胞因子受容体（ｃ−ＫＩＴ）が挙げられる。
【００３０】
一実施形態では、固有の癌遺伝子は、ＥＧＦＲ遺伝子ファミリーに属する分子（例、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４）のシグナル伝達経路において、増殖シグナルを伝達し得る癌遺伝子であり得る。このような癌遺伝子としては、例えば、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＭＹＣ、ＡＫＴ、ＭＡＰキナーゼ、ＰＩ３キナーゼ、ＰＫＣが挙げられる。
【００３１】
別の実施形態では、固有の癌遺伝子は、ＰＤＧＦＲ遺伝子ファミリーに属する分子（例、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ）のシグナル伝達経路において、増殖シグナルを伝達し得る癌遺伝子であり得る。このような癌遺伝子としては、例えば、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＭＹＣ、ＡＫＴ、ＭＡＰキナーゼ、ＰＩ３キナーゼ、ＰＫＣが挙げられる。
【００３２】
さらに別の実施形態では、固有の癌遺伝子は、ＡＬＫ遺伝子（例、後述するＡＬＫ変異遺伝子）のシグナル伝達経路において、増殖シグナルを伝達し得る癌遺伝子であり得る。このような癌遺伝子としては、例えば、ＲＡＳ、ＭＡＰキナーゼ、ＡＫＴ、ＰＩ３キナーゼ、ＳＴＡＴ３が挙げられる。
【００３３】
固有の癌遺伝子はまた、後述する外来の癌遺伝子において説明した種類の癌遺伝子であってもよい。
【００３４】
本発明の人工細胞が由来する癌細胞は、固有の癌遺伝子に依存して増殖する能力を有し得る。本明細書中で用いられる場合、癌細胞についての用語「固有の癌遺伝子に依存して増殖する能力」とは、固有の癌遺伝子を発現する癌細胞が、当該固有の癌遺伝子に起因する増殖シグナルにより増殖し得ることを意味する。したがって、固有の癌遺伝子を発現する癌細胞は、固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害した場合、当該固有の癌遺伝子に依存して増殖し得ない。癌細胞が固有の癌遺伝子に依存して増殖するか否かは、例えば、固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件下（例、固有の癌遺伝子の阻害剤の存在下）で、癌細胞の増殖能が低下し得るか否かを評価することにより、確認できる。
【００３５】
癌細胞における固有の癌遺伝子の機能の阻害は、例えば、固有の癌遺伝子の阻害剤または遺伝子破壊により達成することができる。本明細書中で用いられる場合、用語「固有の癌遺伝子の阻害剤」とは、上述した固有の癌遺伝子のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現または機能の阻害により、上述した癌細胞の増殖を阻害し得る物質を意味する。
【００３６】
一実施形態では、固有の癌遺伝子の阻害剤としては、例えば、固有の癌遺伝子から発現するｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ等の人工核酸）、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例、ｓｉＲＮＡ：二本鎖ＲＮＡまたはステムループ構造を有する一本鎖ＲＮＡのいずれでもよい）およびアプタマー、ならびに固有の癌遺伝子から発現するタンパク質に対する抗体（例、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ｓｃＦｖ等の単鎖抗体）、ならびにこれらの発現ベクターが挙げられる。固有の癌遺伝子の阻害剤はまた、低分子化合物であり得る。固有の癌遺伝子の阻害剤は、アポトーシスに起因する細胞死により、細胞増殖を阻害する物質であってもよい。固有の癌遺伝子の破壊は、固有の癌遺伝子に対するターゲティングベクターにより行うことができる。当業者は、標的遺伝子の情報（例、配列情報）を入手することにより、このような阻害剤の作製および遺伝子破壊を容易に行うことができる。
【００３７】
別の実施形態では、固有の癌遺伝子の阻害剤は、癌遺伝子を標的とする分子標的薬である。分子標的薬としては、例えば、以下が知られている。
１）上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に対する、ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）およびセツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）
２）ＨＥＲ２に対するトラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｍａｂ）
３）ＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質、ｃ−ＫＩＴおよびＰＤＧＦＲαに対する、イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）
４）ｃ−ＭＥＴに対する、ＰＨＡ−６６５７５２およびＳＵ−１１２７４（例、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７，ｖｏｌ．３１６，ｐ１０３９−１０４３、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５，ｖｏｌ．６５，ｐ１４７９−１４８８を参照）
５）ＡＬＫに対する、ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４およびＰＦ−０２３４１０６６（例、ＰＮＡＳ，２００７，ｖｏｌ．１０４，ｐ２７０−２７５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２００７、Ｖｏｌ．６，ｐ３３１４−３３２２を参照）
【００３８】
本発明の人工細胞が由来する癌細胞は、既存の癌細胞および既存の分子標的薬を利用して本発明の人工細胞を容易に樹立するという観点からは、既存の分子標的薬が標的とし得る癌遺伝子を固有の癌遺伝子として発現している癌細胞が好ましい。このような癌細胞としては、例えば、ＥＧＦＲ遺伝子発現細胞、ＨＥＲ２遺伝子発現細胞、ＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子発現細胞、ＥＭＬ４−ＡＬＫ遺伝子発現細胞、ＰＤＧＦＲα遺伝子発現細胞、ｃ−ＭＥＴ遺伝子遺伝子発現細胞が挙げられる。ＥＧＦＲ遺伝子発現細胞としては、例えば、ＰＣ−９細胞（ヒト非小細胞肺癌由来）、ＨＣＣ８２７細胞（ヒト非小細胞肺癌由来）、ＨＣＣ４００６（ヒト非小細胞肺癌由来）が挙げられる。ＨＥＲ２遺伝子発現細胞としては、例えば、ＮＣＩ−Ｈ２１７０（ヒト非小細胞肺癌由来）、ＢＴ４７４（ヒト乳癌由来）、ＨＣＣ１４１９（ヒト乳癌由来）、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１（ヒト乳癌由来）が挙げられる。ＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子発現細胞としては、例えば、Ｋ５６２（ヒト白血病由来）、ＫＣＬ２２（ヒト白血病由来）、ＫＵ８１２（ヒト白血病由来）、ＡＲ２３０（ヒト白血病由来）が挙げられる。ＰＤＧＦＲα遺伝子発現細胞としては、例えば、ＮＣＩ−Ｈ１７０３（ヒト非小細胞肺癌由来）が挙げられる。ＥＭＬ４−ＡＬＫ遺伝子発現細胞としては、例えば、ＮＣＩ−Ｈ２２２８（ヒト非小細胞肺癌由来）、ＮＣＩ−Ｈ３１２２（ヒト非小細胞肺癌由来）、ＤＦＣＩ０３２（ヒト非小細胞肺癌由来）が挙げられる。ｃ−ＭＥＴ遺伝子発現細胞としては、例えば、ＮＣＩ−Ｈ１９９３（ヒト非小細胞肺癌由来）、ＮＣＩ−Ｈ８２０（ヒト非小細胞肺癌由来）、ＭＫＮ４５（ヒト胃癌由来）が挙げられる。
【００３９】
本発明の人工細胞はまた、外来の癌遺伝子を発現し得る。本明細書中で用いられる場合、用語「外来の癌遺伝子」とは、上述した癌細胞を材料として用いる本発明の人工細胞の樹立過程において、癌細胞に対して導入される癌遺伝子を意味する。外来の癌遺伝子は、固有の癌遺伝子と種類が異なる癌遺伝子である。外来の癌遺伝子は、単一の遺伝子であっても、複数の遺伝子であってもよい。本明細書中で用いられる場合、用語「外来」とは、上述したように、用語「固有」と対立する概念を意味する。
【００４０】
外来の癌遺伝子としては、例えば、哺乳動物に由来する癌遺伝子が挙げられる。哺乳動物種としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ブタ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギが挙げられる。臨床応用という観点から、哺乳動物種は、好ましくはヒトである。
【００４１】
外来の癌遺伝子としては、例えば、チロシンキナーゼ（受容体型、非受容体型）、セリン・スレオニンキナーゼ等のキナーゼ、低分子量Ｇタンパク質、転写因子が挙げられるが、チロシンキナーゼが好ましい。癌細胞の増殖を担い得るチロシンキナーゼは、固有の癌遺伝子において上述したものと同様である。
【００４２】
一実施形態では、外来の癌遺伝子は、ＥＧＦＲ遺伝子ファミリーに属する分子のシグナル伝達経路において、増殖シグナルを伝達し得る癌遺伝子であり得る。このような癌遺伝子は、固有の癌遺伝子において上述したものと同様である。
【００４３】
別の実施形態では、外来の癌遺伝子は、ＰＤＧＦＲ遺伝子ファミリーに属する分子のシグナル伝達経路において、増殖シグナルを伝達し得る癌遺伝子であり得る。このような癌遺伝子は、固有の癌遺伝子において上述したものと同様である。
【００４４】
さらに別の実施形態では、固有の癌遺伝子は、ＡＬＫ遺伝子（例、後述するＥＭＬ４−ＡＬＫ等のＡＬＫ変異遺伝子）のシグナル伝達経路において、増殖シグナルを伝達し得る癌遺伝子であり得る。このような癌遺伝子は、固有の癌遺伝子において上述したものと同様である。
【００４５】
特定の実施形態では、外来の癌遺伝子は、ＰＤＧＦＲα変異遺伝子またはＡＬＫ変異遺伝子であり得る。このような変異遺伝子としては、例えば、上述したような変異により生じた遺伝子が挙げられる。癌遺伝子であるＰＤＧＦＲα変異遺伝子の代表的な例としては、ＰＤＧＦＲαに点突然変異が生じた遺伝子（例、Ｖ５６１Ｄ、Ｄ８４２Ｖ）が挙げられる。癌遺伝子であるＡＬＫ変異遺伝子の代表的な例としては、ＡＬＫ融合遺伝子、ＡＬＫに点突然変異が生じた遺伝子が挙げられる。ＡＬＫ融合遺伝子としては、例えば、ＥＭＬ４−ＡＬＫ遺伝子、ＮＰＭ−ＡＬＫ遺伝子、ＴＰＭ３−ＡＬＫ遺伝子、ＴＰＭ４−ＡＬＫ遺伝子、ＡＴＩＣ−ＡＬＫ遺伝子、ＴＦＧ−ＡＬＫ遺伝子、ＣＬＴＣ−ＡＬＫ遺伝子、ＭＳＮ−ＡＬＫ遺伝子、ＭＹＨ９−ＡＬＫ遺伝子、ＡＬＯ１７−ＡＬＫ遺伝子、ＣＡＲＳ−ＡＬＫ遺伝子、ＲＡＮＢＤ２−ＡＬＫ遺伝子、ＳＦＣ３１Ｌ１−ＡＬＫ遺伝子が挙げられる。ＥＭＬ４−ＡＬＫ遺伝子において、ＡＬＫとしては、種々のバリアントが知られている。このようなバリアントとしては、例えば、バリアント１、バリアント２、バリアント３（例、３ａ、３ｂ）、バリアント４、バリアント５（例、５ａ、５ｂ）、バリアント６、バリアント７が挙げられる（例、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２００９  Ｓｅｐ  １０；２７（２６）：４２３２−５を参照）。
【００４６】
外来の癌遺伝子の発現は、外来の遺伝子と共にその遺伝子の発現を誘導するプロモーターが組み込まれた人工の発現ベクター（例、プラスミド、アデノウイルス、レトロウイルス）を細胞に導入することにより達成できる。発現は、一過的発現または恒常的（すなわち、安定的）発現であり得る。例えば、外来の癌遺伝子の一過的発現は、外来の癌遺伝子の発現ベクターを癌細胞に導入し、その遺伝子の発現が開始される直後の癌細胞により達成できる。外来の癌遺伝子の恒常的発現は、外来の癌遺伝子を癌細胞に導入し、ゲノム中にインサートが組み込まれた細胞を選択することにより達成できる。
【００４７】
本発明の人工細胞はまた、外来の癌遺伝子に依存して増殖する能力を有し得る。本明細書中で用いられる場合、人工細胞についての用語「外来の癌遺伝子に依存して増殖する能力」とは、外来の癌遺伝子を発現する人工細胞が、該外来の癌遺伝子に起因する増殖シグナルにより増殖し得ることを意味する。したがって、外来の癌遺伝子を発現する人工細胞は、固有の癌遺伝子をさらに発現している場合、固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害した場合であっても、該外来の癌遺伝子に依存して増殖し得る。人工細胞が外来の癌遺伝子に依存して増殖するか否かは、例えば、外来の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件下で、人工細胞の増殖能が低下し得るか否かを評価することにより、確認できる。また、人工細胞が外来の癌遺伝子に依存して増殖するか否かは、固有の癌遺伝子を阻害する条件下で、人工細胞の増殖能が保持され得るか否かを評価することにより、確認できる。
【００４８】
人工細胞における外来の癌遺伝子の機能の阻害は、例えば、外来の癌遺伝子の阻害剤により達成することができる。本明細書中で用いられる場合、用語「外来の癌遺伝子の阻害剤」とは、上述した外来の癌遺伝子のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現または機能の阻害により、上述した癌細胞の増殖を阻害し得る物質を意味する。
【００４９】
一実施形態では、外来の癌遺伝子の阻害剤としては、例えば、外来の癌遺伝子から発現するｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ等の人工核酸）、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例、ｓｉＲＮＡ：二本鎖ＲＮＡまたはステムループ構造を有する一本鎖ＲＮＡのいずれでもよい）およびアプタマー、ならびに外来の癌遺伝子から発現するタンパク質に対する抗体（例、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ｓｃＦｖ等の単鎖抗体）、ならびにこれらの発現ベクターが挙げられる。外来の癌遺伝子の阻害剤はまた、低分子化合物であり得る。固有の癌遺伝子の阻害剤は、アポトーシスに起因する細胞死により、細胞増殖を阻害する物質であってもよい。当業者は、標的遺伝子の情報（例、配列情報）を入手することにより、このような阻害剤の作製を容易に行なうことができる。
【００５０】
別の実施形態では、外来の癌遺伝子の阻害剤は、癌遺伝子を標的とする分子標的薬である。このような分子標的薬としては、例えば、上述した固有の癌遺伝子の阻害剤において説明した分子標的薬が挙げられる。
【００５１】
本発明の人工細胞はまた、癌細胞に固有の癌遺伝子を発現する能力、および固有の癌遺伝子に依存して増殖する能力（人工細胞の樹立に用いられ得る癌細胞の能力）を保持し得る。本明細書中で用いられる場合、人工細胞についての用語「固有の癌遺伝子に依存して増殖する能力」とは、外来の癌遺伝子および固有の癌遺伝子を発現する人工細胞が、該固有の癌遺伝子に起因する増殖シグナルにより増殖し得ることを意味する。したがって、外来の癌遺伝子および固有の癌遺伝子を発現する人工細胞は、外来の癌遺伝子の発現または機能を阻害した場合であっても、該固有の癌遺伝子に依存して増殖し得る。人工細胞が固有の癌遺伝子に依存して増殖するか否かは、例えば、固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件下で、人工細胞の増殖能が低下し得るか否かを評価することにより、確認できる。また、人工細胞が固有の癌遺伝子に依存して増殖するか否かは、外来の癌遺伝子を阻害する条件下で、人工細胞の増殖能が保持され得るか否かを評価することにより、確認できる。
【００５２】
本発明の人工細胞は、天然の癌細胞をより模倣することが所望され得る。したがって、癌細胞、固有の癌遺伝子および外来の癌遺伝子は、同一の哺乳動物種に由来していてもよい。臨床応用の観点から、癌細胞、固有の癌遺伝子および外来の癌遺伝子は、好ましくはヒト由来である。しかしながら、癌遺伝子はウイルス由来である場合があるため、固有の癌遺伝子および／または外来の癌遺伝子は、ウイルス由来であってもよい。
【００５３】
本発明の人工細胞は、外来の癌遺伝子に加えて、１以上の他の外来の遺伝子を発現していてもよい。このような外来の遺伝子としては、外来の癌遺伝子の活性化因子（例、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ等の分泌タンパク質）が挙げられる。
【００５４】
本発明の人工細胞はまた、以下（Ａ）および（Ｂ）のように特徴付けることができる。
（Ａ）外来の癌遺伝子および固有の癌遺伝子を発現する人工細胞：
（Ａ１）外来の癌遺伝子を一過的に発現し、かつ固有の癌遺伝子を発現する人工細胞（例、外来の癌遺伝子の発現ベクターがトランスフェクトされた癌細胞）；および
（Ａ２）外来の癌遺伝子を恒常的に発現し、かつ固有の癌遺伝子を発現する人工細胞（例、外来の癌遺伝子をゲノム中に組み込んでいる癌細胞）。
【００５５】
（Ｂ）外来の癌遺伝子を発現し、かつ固有の癌遺伝子を発現し得ない人工細胞：
（Ｂ１）外来の癌遺伝子を一過的に発現し、かつ固有の癌遺伝子を一過的に発現し得ない人工細胞（例、固有の癌遺伝子の阻害剤で処理された、外来の癌遺伝子の発現ベクターがトランスフェクトされた癌細胞）；
（Ｂ２）外来の癌遺伝子を一過的に発現し、かつ固有の癌遺伝子を恒常的に発現し得ない人工細胞（例、固有の癌遺伝子が破壊された、外来の癌遺伝子の発現ベクターがトランスフェクトされた癌細胞）；
（Ｂ３）外来の癌遺伝子を恒常的に発現し、かつ固有の癌遺伝子を一過的に発現し得ない人工細胞（例、固有の癌遺伝子の阻害剤で処理された、外来の癌遺伝子をゲノム中に組み込んでいる癌細胞）；および
（Ｂ４）外来の癌遺伝子を恒常的に発現し、かつ固有の癌遺伝子を恒常的に発現し得ない人工細胞（例、固有の癌遺伝子が破壊された、外来の癌遺伝子をゲノム中に組み込んでいる癌細胞）。
【００５６】
（２．人工細胞の樹立方法）
本発明は、本発明の人工細胞の樹立方法（即ち、作製方法）を提供する。本発明の樹立方法は、以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含み得る：
（ａ）癌細胞を、外来の癌遺伝子の発現ベクターで処理する工程；
（ｂ）該発現ベクターで処理された癌細胞を、該癌細胞に固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件下で培養する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）において増殖した癌細胞を、外来の癌遺伝子を発現し、かつ外来の癌遺伝子に依存して増殖する能力を有する人工細胞として得る工程。
【００５７】
樹立方法の工程（ａ）では、癌細胞を、培養培地において、外来の癌遺伝子の発現ベクターで処理することにより、外来の癌遺伝子の発現ベクターが、癌細胞に導入され得る。発現ベクターを癌細胞に導入するための処理としては、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポソーム法が挙げられる。
【００５８】
培養培地は、哺乳動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、およびこれらの混合培地が挙げられる。培養培地は、例えば、血清（例、ＦＣＳ）、血清代替物（例、ＫＳＲ）、脂肪酸または脂質、アミノ酸、ビタミン、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含むことができる。培養における細胞数、各種因子の濃度等のその他の条件は、適宜設定できる。
【００５９】
癌細胞は、自体公知の方法により入手することができる。例えば、癌細胞は、癌に罹患した哺乳動物種から単離することができ、また、単離後、細胞株を樹立することにより入手してもよい。また、既存の細胞株を、癌細胞として利用することもできる。当業者は、入手した癌細胞に固有の癌遺伝子を同定することができ、また、癌細胞が固有の細胞増殖因子遺伝子に依存して増殖する能力を有するか否かを、容易に決定することができる。
【００６０】
発現ベクターで用いられるプロモーターは、導入される細胞で機能し得るものであれば特に制限されず、例えば、ウイルスプロモーター（例、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来ＬＴＲ、アデノウイルス由来初期プロモーター）、哺乳動物由来の構成遺伝子プロモーター（例、β−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター）が挙げられる。
【００６１】
発現ベクターは、好ましくは核酸分子をコードするオリゴ（ポリ）ヌクレオチドの下流に転写終結シグナル（すなわち、ターミネーター領域）を含む。さらに、発現ベクターは、薬剤（例、Ｇ４１８）に対する耐性遺伝子を含んでいてもよいが、本発明の樹立方法では、このような耐性遺伝子は本質的に不要であるため、このような耐性遺伝子を含んでいなくてもよい。
【００６２】
外来の遺伝子を癌細胞に導入するために用いられる発現ベクターの基本ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルスベクター（例、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、レンチウイルス等のウイルス由来ベクター）であり得る。
【００６３】
樹立方法の工程（ｂ）では、工程（ａ）において発現ベクターで処理された癌細胞を、固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件下で培養することにより、導入された外来の癌遺伝子に対する依存性を獲得した癌細胞が、選択的に増殖し得る。固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件は、固有の癌遺伝子の阻害剤の存在下（および外来の癌遺伝子の阻害剤の非存在下）で培養することにより達成され得る。本工程は、発現ベクターが特定の薬剤に対する薬剤耐性遺伝子を含む場合であっても、当該薬剤の非存在下で行うことができる。培養温度は、例えば約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。また、ＣＯ２濃度は、例えば約１〜１０％、好ましくは約５％である。
【００６４】
樹立方法の工程（ｃ）では、工程（ｂ）において増殖した細胞を回収することにより、外来の癌遺伝子を発現し、かつ外来の癌遺伝子に依存して増殖する能力を有する人工細胞が得られる。
【００６５】
本発明の樹立方法は、人工細胞の細胞株を樹立するために、工程（ｃ）で得られた人工細胞をクローニングする工程をさらに含んでいてもよい。人工細胞のクローニングは、例えば、限界希釈法等の自体公知の方法により行うことができる。
【００６６】
本発明の樹立方法は、人工細胞についての外来の癌遺伝子の発現を確認する工程、および／または人工細胞についての外来の癌遺伝子に依存して増殖する能力を確認する工程をさらに含んでいてもよい。このような工程は、例えば、癌細胞が外来の癌遺伝子に依存して増殖するか否かを評価する上述した方法と同様にして行うことができる。
【００６７】
本発明の樹立方法はまた、人工細胞が固有の癌遺伝子に依存して増殖する能力を保持するか否かを確認する工程をさらに含んでいてもよい。このような工程は、例えば、癌細胞が固有の癌遺伝子に依存して増殖するか否かを評価する上述した方法と同様にして行うことができる。
【００６８】
本発明の樹立方法は、上記（Ｂ１）および（Ｂ３）のような人工細胞の樹立のために、導入された外来の癌遺伝子に対する依存性を獲得した癌細胞を、固有の癌遺伝子の阻害剤により処理する工程をさらに含んでいてもよい。本発明の樹立方法はまた、上記（Ｂ２）および（Ｂ４）のような人工細胞の樹立のために、導入された外来の癌遺伝子に対する依存性を獲得した癌細胞において、固有の癌遺伝子を破壊する工程をさらに含んでいてもよい。外来の癌遺伝子に対する依存性を獲得した癌細胞は、固有の癌遺伝子を要することなく、増殖し得る。固有の癌遺伝子の破壊は、例えば、当該遺伝子に対するターゲティングベクターを用いる遺伝子ノックアウト技術を利用することにより行うことができる。固有の癌遺伝子が破壊された人工細胞は、外来の癌遺伝子に対する特異的な抗癌作用を有する物質の開発に有用である。
【００６９】
本発明の樹立方法はまた、工程（ａ）において用いられる癌細胞を提供する工程をさらに含んでいてもよい。癌細胞を提供する工程は、癌細胞を入手し、次いで、癌細胞が発現する固有の癌遺伝子を同定すること、および同定された固有の癌遺伝子に依存して癌細胞が増殖し得るか否かを確認することを含んでいてもよい。一方、入手した細胞がこのような特性を有することが明らかである場合（例、入手した細胞が、キャラクタライズされている癌細胞である場合）、癌細胞を提供する工程は、癌細胞を入手することのみを含んでいてもよい。癌細胞は、癌に罹患した哺乳動物種から単離することができ、また、単離後、細胞株を樹立することにより入手してもよい。また、既存の細胞株を、癌細胞として利用することもできる。
【００７０】
（３．抗癌作用を有する物質のスクリーニング方法）
本発明は、抗癌作用を有する物質のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、以下の工程（ａ）および（ｂ）を含み得る：
（ａ）試験物質が人工細胞の増殖を阻害するか否かを評価する工程；および
（ｂ）人工細胞の増殖を阻害する試験物質を、抗癌作用を有する物質として選択する工程。
【００７１】
スクリーニング方法の工程（ａ）では、評価は、試験物質の存在下で人工細胞を培養し、次いで、試験物質が人工細胞の増殖を阻害するか否かを判定することにより行うことができる。培養培地、培養条件は、本発明の樹立方法で説明したものと同様である。試験物質が人工細胞の増殖を阻害するか否かの判定は、例えば、試験物質の非存在下で培養した細胞数に対して、試験物質の存在下で培養した細胞数を比較することにより行うことができる。判定はまた、細胞増殖の指標（例、特定のタンパク質の活性、リン酸化タンパク質の量）を測定することにより行うことができる。判定はまた、試験物質がアポトーシスを誘導し得るか否かに基づいて行われてもよい。
【００７２】
試験物質は、任意の化合物であり得、例えば、低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、核酸（例、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）、糖質（例、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖）、脂質（例、飽和または不飽和の直鎖、分岐鎖および／または環を含む脂肪酸）、アミノ酸、蛋白質（例、オリゴペプチド、ポリペプチド）、固相合成またはファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
【００７３】
試験物質はまた、癌抑制遺伝子の変異体であり得る。この場合、癌抑制遺伝子の変異体の発現ベクターが人工細胞に導入され得る。癌抑制遺伝子の変異体が本発明の人工細胞の増殖を阻害するか否かを評価することにより、癌抑制遺伝子の機能を喪失させ得るような変異が同定され得る。
【００７４】
工程（ａ）は、固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件下で行なわれてもよい。固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件は、例えば、固有の癌遺伝子の阻害剤の存在下で細胞を培養することにより達成され得る。外来の癌遺伝子に対して特異的な抗癌作用を有する物質をスクリーニングするという観点からは、工程（ａ）は、固有の癌遺伝子の阻害剤の存在下および外来の癌遺伝子に対する阻害剤の非存在下で行なうことが好ましい。本工程は、本発明の人工細胞の樹立に用いられた発現ベクターが特定の薬剤に対する薬剤耐性遺伝子を含む場合であっても、当該薬剤の非存在下で行うことができる。
【００７５】
スクリーニング方法の工程（ｂ）では、人工細胞の増殖を阻害する試験物質が、抗癌作用を有する物質として選択される。例えば、試験物質の存在下で培養された細胞数が、試験物質の非存在下で培養された細胞に比して少ない場合、当該試験物質が、抗癌作用を有する物質として選択され得る。また、細胞増殖の指標（例、特定のタンパク質の活性、リン酸化タンパク質の量）またはアポトーシス誘導に基づいて、人工細胞の増殖を阻害する試験物質を選択してもよい。
【００７６】
（４．癌遺伝子の同定方法）
本発明は、癌遺伝子の同定方法を提供する。本発明の同定方法は、以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含み得る：
（ａ）癌細胞を、試験遺伝子の発現ベクターで処理する工程；
（ｂ）該発現ベクターで処理された癌細胞を、該癌細胞に固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件下で培養する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）において培養された癌細胞が試験遺伝子に依存して増殖するか否かを確認する工程。
【００７７】
同定方法の工程（ａ）では、上述した癌細胞を、培養培地において、試験遺伝子の発現ベクターで処理することにより、試験遺伝子の発現ベクターが、当該癌細胞に導入され得る。発現ベクターを癌細胞に導入するための処理としては、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポソーム法が挙げられる。本工程で用いられる癌細胞、発現ベクターおよび培養培地は、本発明の樹立方法における工程（ａ）で説明したものと同様である。
【００７８】
試験遺伝子は、哺乳動物種または癌を引き起こし得る病原体（例、ウイルス）に由来する任意の遺伝子であり特に限定されないが、例えば、癌細胞において見出される過剰発現遺伝子または変異遺伝子が挙げられる。本発明の同定方法によれば、このような過剰発現遺伝子または変異遺伝子が、癌細胞の癌化の結果として生じているに過ぎないのか、または癌化の原因因子（即ち、癌遺伝子）であるのかが判明し得る。
【００７９】
試験遺伝子はまた、単一の遺伝子または複数の遺伝子であり得る。複数の遺伝子として、多数の遺伝子を含む遺伝子ライブラリーを使用してもよい。遺伝子ライブラリーの例は、培養癌細胞から調製された、または癌患者から採取された癌組織サンプルから調製されたｃＤＮＡライブラリーである。遺伝子ライブラリーの別の例は、幹細胞または生殖細胞、あるいは正常細胞から調製されたｃＤＮＡライブラリーである。
【００８０】
同定方法の工程（ｂ）では、工程（ａ）において発現ベクターで処理された癌細胞を、固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件下で培養することにより、導入された試験遺伝子が癌遺伝子である場合に当該試験遺伝子に対する依存性を獲得した癌細胞が、選択的に増殖し得る。固有の癌遺伝子の発現または機能を阻害する条件は、固有の癌遺伝子の阻害剤の存在下で培養することにより達成され得る。培養条件は、本発明の樹立方法における工程（ｂ）で説明したものと同様である。本工程は、本発明の人工細胞の樹立に含まれ得る発現ベクターが特定の薬剤に対する薬剤耐性遺伝子を含む場合であっても、当該薬剤の非存在下で行うことができる。
【００８１】
同定方法の工程（ｃ）では、工程（ｂ）において培養された癌細胞が、試験遺伝子に依存して増殖するか否かが確認される。具体的には、試験遺伝子が単一の遺伝子であり、かつ癌細胞の増殖が確認された場合、試験遺伝子が癌遺伝子であると同定され得る。また、試験遺伝子が複数の遺伝子（例、遺伝子ライブラリー）であり、かつ癌細胞の増殖が確認された場合、複数の試験遺伝子のなかに癌遺伝子が含まれると判定され得る。
【００８２】
試験遺伝子が複数の遺伝子であり、かつ癌細胞の増殖が確認された場合、複数の試験遺伝子のなかに含まれる癌遺伝子を同定するために、本発明の同定方法は、さらに以下の工程を含んでいてもよい：
（ｄ）増殖した癌細胞をクローニングする工程；および
（ｅ）クローニングされた癌細胞中に導入された試験遺伝子を、癌遺伝子として同定する工程。
【００８３】
同定方法の工程（ｄ）では、癌遺伝子である試験遺伝子が導入された癌細胞が、クローニングされる。クローニングは、上述した人工細胞のクローニングと同様に行うことができる。
【００８４】
同定方法の工程（ｅ）では、クローニングされた癌細胞中に導入された試験遺伝子が、癌遺伝子として同定される。例えば、癌細胞中に導入された試験遺伝子の同定は、使用された発現ベクターの相同組換え単位（試験遺伝子、ならびに試験遺伝子に対して５’側および３’側に存在する発現ベクター由来の隣接部位を含む）中の隣接部位のヌクレオチド配列を利用して、癌遺伝子をコードするＤＮＡを増幅し（例、ＰＣＲ）、次いで、増幅されたＤＮＡのヌクレオチド配列を決定することにより、行うことができる。試験遺伝子の同定はまた、ＤＮＡチップ等の発現解析により行うことができる。
【００８５】
また、試験遺伝子が複数の遺伝子である場合、本発明の同定方法は、さらに以下の工程を含んでいてもよい：
（ｆ）工程（ｃ）で増殖した癌細胞から癌細胞中に導入された試験遺伝子を取得する工程。
（ｇ）取得した試験遺伝子をクローニングし、癌遺伝子として同定する工程。
【００８６】
同定方法の工程（ｆ）では、増殖した癌細胞から、癌細胞中に導入された試験遺伝子がＤＮＡ断片として取得される。例えば、癌細胞中に導入された試験遺伝子の取得は、使用された発現ベクターの相同組換え単位（試験遺伝子、ならびに試験遺伝子に対して５’側および３’側に存在する発現ベクター由来の隣接部位を含む）中の隣接部位のヌクレオチド配列を利用して、癌遺伝子をコードするＤＮＡを増幅（例、ＰＣＲ）することにより、行うことができる。
【００８７】
同定方法の工程（ｇ）では、取得した試験遺伝子がクローニングされ、癌遺伝子が同定される。試験遺伝子のクローニングは、例えば、（ｆ）の工程で取得した試験遺伝子のＤＮＡ断片を大腸菌において増幅し得るプラスミドに組み込み、試験遺伝子が組み込まれたプラスミドを大腸菌に導入し、次いで、プラスミドが導入された大腸菌をクローニングすることにより行うことができる。癌遺伝子の同定は、例えば、クローニングされた大腸菌からプラスミドを回収し、プラスミド中に組み込まれた癌遺伝子をコードするＤＮＡを増幅し（例、ＰＣＲ）、次いで、増幅されたＤＮＡのヌクレオチド配列を決定することにより、行うことができる。
【実施例】
【００８８】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。【００８９】
（実施例１）
癌遺伝子である変異ＥＧＦＲを発現し、かつＥＧＦＲ阻害剤であるゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）によってアポトーシスによる細胞死が誘導され、その増殖が阻害されるＰＣ−９細胞（ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）由来細胞株）に、別の癌遺伝子ＥＭＬ４−ＡＬＫｖａｒｉａｎｔ３ａ（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２００９  Ｓｅｐ  １０；２７（２６）：４２３２−５を参照）及びＧ４１８耐性遺伝子が組み込まれたプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（−）を、トランスフェクション試薬を用いて導入した。その後、プラスミドを導入した細胞を、１０％のウシ胎児血清及び抗生物質カナマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培養液から調製したＧ４１８含有培養液（１ｍｇ／ｍＬ  Ｇ４１８）、あるいはゲフィチニブ含有培養液（１μＭ  ゲフィチニブ）において、３週間、３７℃で選択培養した。それぞれの選択培養液で増殖した細胞の抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開し、ＰＶＤＦ膜に転写したものをＡＬＫに対するモノクローナル抗体によるウェスタンブロッティングに供した。その結果、Ｇ４１８含有培養液で選択された細胞の抽出液中にＥＭＬ４−ＡＬＫｖａｒｉａｎｔ３ａの発現が認められなかったが、ゲフィチニブ含有培養液で選択された細胞の抽出液中にＥＭＬ４−ＡＬＫｖａｒｉａｎｔ３ａの発現が認められた（図１）。これらの結果は、細胞株ＰＣ−９に癌遺伝子ＥＭＬ４−ＡＬＫｖａｒｉａｎｔ３ａを導入することにより作製された細胞が、当該細胞に固有の癌遺伝子（癌遺伝子である変異ＥＧＦＲ）を阻害する条件下で、増殖し得ることを示す。【００９０】
（実施例２）
実施例１においてゲフィチニブ含有培養液で選択的に増殖した細胞を、９６ウェルプレートに限界希釈した。ゲフィチニブ含有培地中でクローンとして増殖した細胞を選択し、それぞれのクローン細胞の抽出液を、ＡＬＫに対するモノクローナル抗体によるウェスタンブロッティングに供した。その結果、得られた１０クローン全ての細胞抽出液中にＥＭＬ４−ＡＬＫｖａｒｉａｎｔ３ａの発現が確認された（図２）。このことは、本方法論が癌遺伝子発現細胞の樹立効率に非常に優れることを示す。【００９１】
（実施例３）
ＰＣ−９細胞以外のゲフィチニブ感受性細胞ＨＣＣ８２７（ヒト非小細胞肺癌（肺腺癌）細胞株）を用いて実施例１と同様の実験をし、ＥＭＬ４−ＡＬＫｖａｒｉａｎｔ３ａ遺伝子の導入細胞を樹立した。また、ＰＣ−９細胞にＥＭＬ４−ＡＬＫｖａｒｉａｎｔ３ａと異なるバリアントのＥＭＬ４−ＡＬＫｖａｒｉａｎｔ１遺伝子（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２００９  Ｓｅｐ  １０；２７（２６）：４２３２−５）を同様の方法で導入し発現細胞を樹立した。細胞抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜に転写したものを抗ＡＬＫ抗体によりウェスタンブロットしたところ、各目的遺伝子産物が認められた（図３）。この結果は、任意のＡＬＫ変異遺伝子が任意の癌細胞の増殖を補完し得ることを示す。【００９２】
（実施例４）
ＰＣ−９細胞を用いて実施例１と同様の実験をし、ＥＭＬ４−ＡＬＫ遺伝子以外の癌遺伝子ＰＤＧＦＲα  Ｖ５６１Ｄ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９（５６０７），７０８−１０（２００３））遺伝子の導入細胞を樹立した。細胞抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜に転写したものを抗ＰＤＧＦＲα抗体によりウェスタンブロットしたところ、目的遺伝子産物が認められた（図４）。【００９３】
（実施例５）
ＰＣ−９細胞、あるいは実施例４で得た、ＰＣ−９細胞に癌遺伝子ＰＤＧＦＲα  Ｖ５６１Ｄ遺伝子を導入した細胞を、９６ウェルプレートに播種した。濃度の異なるゲフィチニブを含有する培養液で細胞を７２時間培養した後、ＭＴＳアッセイにより生細胞を定量した。その結果、ＰＣ−９細胞の増殖はゲフィチニブ濃度依存的に阻害されたが、ＰＤＧＦＲα  Ｖ５６１Ｄ遺伝子の導入細胞の増殖は阻害されなかった（図５）。この結果は、ＰＤＧＦＲα  Ｖ５６１Ｄが、ＰＣ−９細胞における変異ＥＧＦＲ依存性増殖を補完し得ることを示す。また、この結果は、実施例１〜４の結果もまた考慮すると、任意の外来の癌遺伝子が任意の癌細胞の増殖を補完し得ることを示す。【００９４】
（実施例６）
実施例４で得た、ＰＣ−９細胞にＰＤＧＦＲα  Ｖ５６１Ｄ遺伝子を導入した細胞を、９６ウェルプレートに播種した。濃度の異なるＰＤＧＦＲα阻害剤イマチニブを含有する培養液、あるいは１μＭのゲフィチニブと濃度の異なるイマチニブを含有する培養液中で７２時間培養した後、ＭＴＳアッセイにより生細胞を定量した。
その結果、１μＭのゲフィチニブ存在下において、ＰＤＧＦＲα  Ｖ５６１Ｄ遺伝子の導入細胞の増殖は、ＰＤＧＦＲα阻害剤イマチニブの濃度依存的に阻害されることが確認された（図６）。この結果は、外来の癌遺伝子ＰＤＧＦＲα  Ｖ５６１Ｄを発現する細胞株ＰＣ−９の増殖能が、当該癌遺伝子の機能レベルに依存することを示す。
また、ＰＤＧＦＲα  Ｖ５６１Ｄ遺伝子の導入細胞の増殖が１μＭのゲフィチニブ存在下において阻害されることが確認された（図６）。この結果は、癌細胞（ＰＣ−９細胞）が、固有の癌遺伝子（変異ＥＧＦＲ）を発現する能力、および固有の癌遺伝子に依存して増殖する能力を保持することを示す。
さらに、この結果は、癌細胞の増殖において、変異ＥＧＦＲ遺伝子（固有の癌遺伝子）およびＰＤＧＦＲα  Ｖ５６１Ｄ遺伝子（外来の癌遺伝子）が互いに補完的に作用し得ることを示す。したがって、固有の癌遺伝子として機能する癌遺伝子は、外来の癌遺伝子としても機能し得ること、および外来の癌遺伝子として機能する癌遺伝子は、固有の癌遺伝子としても機能し得ることが示された。【００９５】
（実施例７）
既知の癌遺伝子発現プラスミドのかわりにヒト胚性幹細胞由来遺伝子を発現可能なプラスミド群からなる遺伝子ライブラリーＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、実施例１と同様の手順にてＰＣ−９細胞に導入した。プラスミドを導入した細胞を、１０％のウシ胎児血清および抗生物質カナマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培養液から調製したゲフィチニブ含有培養液（１μＭ  ゲフィチニブ）において、３週間、３７℃で選択培養した。ゲフィチニブ含有培養液で選択的に増殖した細胞からＲＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて全ＲＮＡを抽出し、抽出した全ＲＮＡを鋳型としてオリゴ（ｄＴ）２０プライマー及び逆転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩを用いてファーストストランドｃＤＮＡを合成した。上記遺伝子ライブラリーを構成するプラスミド群に共通して存在する配列でありプラスミドに挿入されているヒト胚性幹細胞由来遺伝子の５’端上流近傍に位置するａＴＴＢ１配列をセンスプライマー（ａＴＴＢ１プライマー）、ヒト胚性幹細胞由来遺伝子の３’端下流近傍に位置するａＴＴＢ２配列をアンチセンスプライマー（ａＴＴＢ２プライマー）として、合成したファーストストランドｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応により、増殖したＰＣ−９細胞に導入された遺伝子を増幅した。増幅した遺伝子をＴＡクローニングによりｐＧＥＭ−Ｔプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に挿入し、遺伝子挿入プラスミドで大腸菌株ＤＨ５αを形質転換した。形質転換ＤＨ５αをアンピシリン含有ＬＢ寒天培地に播種し３７℃で一昼夜インキュベートした。寒天培地上でコロニーを形成したクローンをアンピシリン含有ＬＢ液体培地１ｍＬ中で培養した。増殖した大腸菌を回収し、プラスミドＭｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）によりプラスミドを回収し、回収したプラスミドを、鋳型としてａＴＴＢ１プライマー及びａＴＴＢ２プライマーを用いることによりＰＣＲで増幅した。アガロースゲル電気泳動で増幅遺伝子が確認されたクローン（図７に結果の一部を示す）に関しては、回収したプラスミドを鋳型としてｐＧＥＭ−Ｔ由来配列Ｔ７及びＳｐ６部位をプライマーとして用いることにより、ｐＧＥＭ−Ｔプラスミドに挿入されたＤＮＡ配列を解析した。その結果、ａＴＴＢ１プライマーとａＴＴＢ２プライマーにより増幅され得る遺伝子ライブラリー由来遺伝子配列およびそれらに挟まれた形で完全長コード配列（ＣＤＳ）が解読されたものとして６種の遺伝子が見つかった。これらの遺伝子はＰＣ−９細胞における変異ＥＧＦＲ依存性増殖を補完し得る新規の癌遺伝子候補と考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本発明は、例えば、抗癌剤の開発に有用である。
【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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