(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を含む少なくとも１つの重鎖を含むクラスＩｇＧ４の抗体であって、それぞれの重鎖中、
ａ．ＣＨ１ドメイン中でＫａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置１２７における鎖間システインが別のアミノ酸で置換されており、且つ
ｂ．上部ヒンジ領域中に位置する１つ又は複数のアミノ酸がシステインで置換されている、上記抗体。
【請求項２】
システインで置換された、上部ヒンジ領域中に位置する１つ又は複数のアミノ酸が、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングした２２７、２２８、２２９及び２３０から選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置２３０におけるグリシンがシステインで置換されている、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置２２９におけるチロシンがシステインで置換されている、請求項２に記載の抗体。
【請求項５】
Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置２２８におけるリシンがシステインで置換されている、請求項２に記載の抗体。
【請求項６】
Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置２２７におけるセリンがシステインで置換されている、請求項２に記載の抗体。
【請求項７】
重鎖中でＫａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置２３９におけるシステイン及び位置２４２におけるシステインが別のアミノ酸で置換されている、請求項１から６までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
重鎖中でＫａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置２３９におけるシステインが別のアミノ酸で置換されている、請求項１から６までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
重鎖中でＫａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置２４２におけるシステインが別のアミノ酸で置換されている、請求項１から６までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
位置２３９におけるシステイン及び／又は位置２４２におけるシステインが非チオール含有アミノ酸によって置換されている、請求項７から９までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
非チオール含有アミノ酸がセリンである、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
位置１２７におけるシステインが非チオール含有アミノ酸によって置換されている、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１３】
非チオール含有アミノ酸がセリンである、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
重鎖が突然変異して、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングしたアミノ酸２２６と２４３の間に３個のアミノ酸が挿入されている、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１５】
重鎖が突然変異してＫａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置２３８と２３９の間に３個のアミノ酸が挿入されている、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置２３８と２３９の間に３個のアラニンが挿入されている、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置２３８と２３９の間にスレオニン、ヒスチジン及びさらなるスレオニンが挿入されている、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１８】
Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置２４１におけるセリンがプロリンで置換されている、請求項１から１７までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１９】
位置２３０におけるグリシンがシステインで置換されており、位置２２７におけるセリンがプロリンで置換されており、位置２２９におけるチロシンがセリンで置換されており、位置２３７におけるプロリンがアスパラギン酸で置換されており、位置２３８におけるプロリンがリシンで置換されており、アミノ酸配列スレオニン−ヒスチジン−スレオニンが位置２３８と２３９の間に挿入されており、且つ位置２４１におけるセリンがプロリンで置換されている、請求項１から１８までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２０】
重鎖がＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む、請求項１から１９までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２１】
請求項１から２０までのいずれか一項で定義した２つの重鎖を含む、請求項１から２０までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２２】
重鎖が同一である、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２３】
重鎖又はそれぞれの重鎖が１２〜１７アミノ酸長の上部ヒンジ領域及びコア領域を含む、請求項１から２２までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２４】
上部ヒンジ領域及びコア領域が１５アミノ酸長である、請求項２３に記載の抗体。
【請求項２５】
請求項１から２４までのいずれか一項で定義した抗体をコードする配列を含む発現ベクター。
【請求項２６】
請求項２５で定義したベクターを含む宿主細胞。
【請求項２７】
治療有効量の、請求項１から２４までのいずれか一項で定義した抗体を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、野生型抗体と比較して改変されたジスルフィド結合の配置を有する改良型抗体、及び改良型抗体を生成するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えタンパク質、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）及び核酸ベースの薬剤を包含する生物製剤産業は急速に成長している。抗体の操作は、抗体断片又は別の型の設計及び生成をもたらしている。好ましい分子型、並びに生産収率、タンパク質品質及び貯蔵安定性などの他の態様が、治療剤として抗体ベースのタンパク質を選択する際に考慮される。
【０００３】
全ての免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の基本構造は、ジスルフィド結合により結合した２つの同一重鎖（ＨＣ）及び２つの同一軽鎖（ＬＣ）を含む。それぞれのＬＣは可変（ＶＬ）及び定常ドメイン（ＣＬ）からなる。ＨＣに基づいて、５つの主なＩｇクラス、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭが認識される。ＩｇＧに関しては、ＨＣは１つの可変ドメイン（ＶＨ）及び３つの定常ドメイン（ＣＨ１〜３）からなる。ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、エフェクター機能の刺激を担い、ＩｇＧ分子に柔軟性を与えるヒンジ領域によってＦａｂ断片と連結する（ＶＨＶＬ及びＣＨＣＬ）、分子のＦｃ部分を形成する。２つの抗原認識部位はＶＬ及びＶＨドメインの末端に位置する。ＩｇＧは４つの異なるアイソタイプ：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４にさらに細かく分けられる。
【０００４】
Ｆｃ仲介型エフェクター機能、即ち抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）はアイソタイプ依存性である。それぞれのアイソタイプが進化して身体内で具体的な機能を果たす。現在ＩｇＧ１アイソタイプは、その長い半減期、高度なＡＤＣＣ活性化及び補体活性化のため、治療剤として最も広く使用されている。他のアイソタイプは、標的及び所望の効果に応じて治療剤として考えられる。例えば、標的抗原が単に中和されエフェクター機能がそれほど重要ではないとき、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４などの別のアイソタイプを使用することができる。或いは、再操作Ｆｃ／エフェクター機能を有するＩｇＧを考えることができる。
【０００５】
ＩｇＧ２も最小関連エフェクター機能を有するが、完全には理解されていない二量体化の傾向がある。エフェクター機能誘導のその相対的欠如のため、ＩｇＧ４は依然として有用なアイソタイプである。しかしながらＩｇＧ４も、幾つかの特有の実用難点を有する。即ち、半抗体を形成するその傾向、半分子を置換するその能力、及びその短い血清中半減期である。
【０００６】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＩｇＧ４分子は原型ＩｇＧ構造をとるが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてそれらは、ヒンジ内の重鎖間ジスルフィド結合の形成によって引き起こされる、それぞれ一軽鎖及び一重鎖を含む半分子形成が観察されている。大部分の循環ＩｇＧ４は二重特異性であるが、機能的には一価であることが観察されている。これは、半分子が他のＩｇＧ４半分子とＩｇＧ４を形成することができるためである（Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ，Ｊ．，Ｖａｎ  Ｒｅｅ，Ｒ．，Ｐｅｒｄｏｋ，Ｇ．Ｊ．，Ｖａｎ  Ｄｏｏｒｎ，Ｈ．Ｒ．，Ｔａｎ，Ｋ．Ｙ．，Ａａｌｂｅｒｓｅ，Ｒ．Ｃ．，１９９９．「通常のヒト免疫グロブリンＧ４は二重特異性である：それは２つの異なる抗原結合部位を有する。（Ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧ４  ｉｓ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ：ｉｔ  ｈａｓ  ｔｗｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ．）」Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ９７，６９３−６９８）。
【０００７】
ＩｇＧ４の半分子の形成は、ヒンジ内の（Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングした）位置２４１におけるＳｅｒからＰｒｏへの突然変異の導入により低減することができる（Ａｎｇａｌ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９９３．「一アミノ酸置換によってキメラマウス／ヒト（ＩｇＧ４）抗体の異種性がなくなる。（Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ａｂｏｌｉｓｈｅｓ  ｔｈｅ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｍｏｕｓｅ／ｈｕｍａｎ  （ＩｇＧ４）  ａｎｔｉｂｏｄｙ．）」Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３０，１０５−１０８）。さらに、この点突然変異がＩｇＧ４の基本構造に影響を与えることはなく、したがってＩｇＧ４は補体を活性化するその低減した能力を保持した。
【０００８】
Ｓ２４１Ｐ突然変異の発見後、ＩｇＧ４に対するさらなる突然変異を調査して、ＩｇＧ４抗体における重鎖間相互作用はＩｇＧ４エフェクター機能を低減し、構造安定性を高めることが理解されている。Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，２００１．「ＩｇＧ４の重鎖間ジスルフィド結合は鎖内ジスルフィド結合と平衡状態にある。（Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒ−ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ  ｂｏｎｄｓ  ｏｆ  ＩｇＧ４  ａｒｅ  ｉｎ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｒａ−ｃｈａｉｎ  ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ  ｂｏｎｄｓ．）」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ３８，１−８）では、ＩｇＧ４の重鎖間ジスルフィド結合の観察された不安定性は、ＩｇＧ４突然変異体を使用して調査された。突然変異体Ｍ１では、重鎖−軽鎖間（ＣＬ−ＣＨ１）ジスルフィド結合に関与するＣｙｓ１３１（ＥＵのナンバリングシステムに従いナンバリングした、又はＫａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングしたＣｙｓ１２７）がセリンで置換され、この突然変異が軽鎖の二量体及び重鎖の二量体の形成をもたらしたことが分かった。突然変異体Ｍ２では、ヒンジ中の重鎖間ジスルフィド結合に関与するシステイン２２６（ＥＵのナンバリングシステムに従いナンバリングした２２６、又はＫａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングした２３９）がセリンで置換され、この突然変異がＩｇＧ４と比較してより安定した重鎖間結合を有しており、重鎖内ジスルフィド結合の形成を妨げることが分かった。
【０００９】
ＩｇＧ４抗体のＣＨ２及びＣＨ３ドメインにおける突然変異も、ＩｇＧ４抗体の凝集体の形成を減らすために調査されている。ＵＳ２００８／００６３６３５  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌは、ＣＨ３ドメイン中の位置４０９におけるアルギニン（ＥＵのナンバリングシステムに従いナンバリングした４０９、又はＫａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングした４４０）がリシン、スレオニン、メチオニン又はロイシンで置換され低ｐＨでの凝集体形成を阻害するＩｇＧ４の突然変異体を調査した。ＣＤＣ活性を弱める、Ｌ２３５、Ｄ２６５、Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９及びＰ３３１（ＥＵのナンバリングシステムに従いナンバリングしたＬ２３５、Ｄ２６５、Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９及びＰ３３１、又はＫａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングしたＬ２４８、Ｄ２７８、Ｄ２８３、Ｋ３４１、Ｐ３４８及びＰ３５０）におけるさらなる突然変異も教示される。ＷＯ２００８／１４５１４２  Ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌは、ヒンジ領域中のＳ２２８Ｐ（ＥＵのナンバリングシステムに従いナンバリングしたＳ２２８、又はＫａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングしたＳ２４１）突然変異の不在下でさえ、位置４０９におけるアルギニン残基、位置４０５におけるＰｈｅ残基又は位置３７０におけるＬｙｓ（ＥＵのナンバリングシステムに従いナンバリングしたＲ４０９、Ｆ４０５及びＫ３７０、又はＫａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングしたＲ４４０、Ｆ４３６及びＫ３９３）の置換によってＦａｂアーム交換された低い能力を有する安定したＩｇＧ４抗体を開示する。
【００１０】
抗体のヒンジ領域中に存在するシステイン残基の数の変化は、以前に調査されている。ＵＳ５６７７４２５  Ｂｏｄｍｅｒ  ｅｔ  ａｌは、ヒンジ領域中のシステイン残基の数を増大して、エフェクター又はレポーター分子の結合用に、システインチオール基の使用を容易にすることが可能であることを開示する。ＵＳ５６７７４２５は、ヒンジ領域中のシステイン残基の数を１つに減らして、抗体分子の構築を容易にすることが可能であることも教示する。１つのジスルフィド結合を形成することのみが必要であり、別のヒンジ領域又はエフェクター若しくはレポーター分子の一方とヒンジ領域の結合に関する具体的な標的を与えるからである。
【００１１】
しかしながら、それらを、治療剤としての使用により一層適したものにする改善された性質を有する、新たな抗体を提供することが依然必要である。本発明は、野生型抗体と比較して改善された生物物理的性質を含めた有利な性質を有する、新たな突然変異抗体を提供する。特に、軽鎖中のシステインとジスルフィド結合を形成するＩｇＧ４抗体の重鎖中のシステイン残基の位置の修飾は、野生型ＩｇＧ４抗体と比較して改善された安定性を有するＩｇＧ４抗体を与えることが、驚くことに分かっている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
一態様において、本発明は、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を含む少なくとも１つの重鎖を含むクラスＩｇＧ４の抗体であって、それぞれの重鎖中、
ａ．ＣＨ１ドメイン中でＫａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置１２７における鎖間システインが別のアミノ酸で置換されており、且つ
ｂ．上部ヒンジ領域中に位置する１つ又は複数のアミノ酸がシステインで置換されている抗体を提供する。
【００１３】
軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１ドメイン中のシステインは、図１ｂ中に示すようにＫａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置１２７におけるシステインである。
【００１４】
ＩｇＧ４定常領域中のジスルフィド結合の位置の変更は、Ｆａｂドメインに関して観察されるより高いＴｍをもたらす。５０％のタンパク質がアンフォールディング状態である温度をＴｍで表す。実験によってＴｍは、例えば蛍光−温度曲線の変曲点（即ち、蛍光−温度曲線が最も急勾配である温度）として決定される。
【００１５】
したがって、高いＴｍは高い耐熱性を暗示する。したがって、本開示の分子はより高い耐熱性を有する。
【００１６】
理論によって束縛されることは望まないが、これは得られたジスルフィド結合又はポリペプチド分子内の歪み又は内部張力の低減の結果であり得る。
【００１７】
耐熱性のさらなる改善は、ＩｇＧ４定常領域へのさらなる修飾の導入によって得ることもできる。
【００１８】
システインで置換される上部ヒンジ領域中に位置する１つ又は複数のアミノ酸は、図１ｂ中に示すようにＫａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングした２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３７及び２３８から選択することができる（上部ヒンジ領域中のアミノ酸に下線を引く）。
【００１９】
好ましい実施形態では、システインで置換される上部ヒンジ領域中に位置する１つ又は複数のアミノ酸は、図１ｂ及び２ａ中に示すようにＫａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングした２２７、２２８、２２９及び２３０から選択される位置における１つ又は複数のアミノ酸である。したがって、この後者の配置では、鎖間（軽鎖−重鎖）ジスルフィド結合の形成は、ＩｇＧ１定常領域中に見られるジスルフィド架橋と類似した位置内である。
【００２０】
本発明者らは、ＩｇＧ１はＦａｂ及びＦｃドメインにおいてＩｇＧ４分子より高い耐熱性を有することを立証している。しかしながら本開示は、ＡＤＣＣエフェクター機能はないが、ＩｇＧ１分子と同様の耐熱性及び／又は他の有利な性質を有するＩｇＧ４分子の提供を可能にする。
【００２１】
形成されるＩｇＧ４分子中のＦａｂドメインの安定性に影響を与える、３つの一般的な態様が存在する。第一の態様はジスルフィド架橋の位置である。第二の態様はジスルフィド架橋に隣接する環境、即ちジスルフィド結合周囲の残基の性質であり、第三の態様は上部ヒンジ領域の長さである。
【００２２】
したがって本発明は、上部ヒンジ、コア及び下部ヒンジを有する重鎖を含むＩｇＧ４抗体も提供し、前記重鎖又はそれぞれの重鎖中の上部ヒンジ及びコアは１３〜１７アミノ酸長、例えば１５アミノ酸長などである。
【００２３】
一実施形態では、ＩｇＧ４抗体は１５アミノ酸長の上部ヒンジ及びコアを有する。
【００２４】
一実施形態では、上部ヒンジ及びコアは、ＩｇＧ４ヒンジ中に見られる天然１２アミノ酸、及びさらなる３つのアミノ酸、例えば３アラニン残基、又は３グリシン残基又はそれらの組合せを含む。
【００２５】
一実施形態では、ヒンジは以下の配列の１つを有する：
ESKYGPPAAACPSCP  SEQ ID No: 72
ESKYGPPGGGCPSCP  SEQ ID No: 73
ESKYGPPTHTCPSCP  SEQ ID No: 74
ESKYGDKTHTCPSCP  SEQ ID No: 75
EPSKYGPPAAACPSCP  SEQ ID No: 76
EPSKYGPPGGGCPSCP  SEQ ID No: 77
EPSKYGPPTHTCPSCP  SEQ ID No: 78
EPSKYGDKTHTCPSCP  SEQ ID No: 79
ESKSYGPPAAACPSCP  SEQ ID No: 80
ESKSYGPPGGGCPSCP  SEQ ID No: 81
ESKSYGPPTHTCPSCP  SEQ ID No: 82
ESKSYGDKTHTCPSCP  SEQ ID No: 83
ESKYGPPAAACPPCP  SEQ ID No: 84
ESKYGPPGGGCPPCP  SEQ ID No: 85
ESKYGPPTHTCPPCP  SEQ ID No: 86
ESKYGDKTHTCPPCP  SEQ ID No: 87
EPSKYGPPAAACPPCP  SEQ ID No: 88
EPSKYGPPGGGCPPCP  SEQ ID No: 89
EPSKYGPPTHTCPPCP  SEQ ID No: 90
EPSKYGDKTHTCPPCP  SEQ ID No: 91
ESKSYGPPAAACPPCP  SEQ ID No: 92
ESKSYGPPGGGCPPCP  SEQ ID No: 93
ESKSYGPPTHTCPPCP  SEQ ID No: 94
ESKSYGDKTHTCPPCP  SEQ ID No: 95
【００２６】
一実施形態では、本開示のＩｇＧ４分子中の上部ヒンジ及びコアは、天然ＩｇＧ１ヒンジ、即ちＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣ配列番号９６又は
EPKSCDKAAACPPCP  SEQ ID No: 97
EPKSCDKGGGCPPCP  SEQ ID No: 98
EPKSCDKTHTSPPCP  SEQ ID No: 99 
EPKSCDKTHTCPPSP  SEQ ID No: 100
EPKSCDKTHTSPPSP  SEQ ID No: 101
EPKSCDKAAASPPCP  SEQ ID No: 102
EPKSCDKAAACPPSP  SEQ ID No: 103
EPKSCDKAAASPPSP  SEQ ID No: 104
EPKSCDKGGGSPPCP  SEQ ID No: 105
EPKSCDKGGGCPPSP  SEQ ID No: 106
EPKSCDKGGGSPPSP  SEQ ID No: 107
などのその誘導体からなる。
【００２７】
さらなる態様では、本発明は、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を含む少なくとも１つの重鎖を含むクラスＩｇＧ４の抗体であって、それぞれの重鎖中、
ＣＨ１ドメイン中でＫａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置１２７における鎖間システインが別のアミノ酸で置換されており、且つ
重鎖又はそれぞれの重鎖中のヒンジが１５アミノ酸長である抗体を提供する。
【００２８】
適切なヒンジは前に記載する。
【００２９】
さらなる態様では、本発明は、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を含む少なくとも１つの重鎖を含むクラスＩｇＧ４の抗体であって、それぞれの重鎖中、
ａ．Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置１２７におけるシステインが別のアミノ酸で置換されており、且つ
ｂ．Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置２３９におけるシステイン又は位置２４２におけるシステインが別のアミノ酸で置換されている抗体も提供する。
【００３０】
本発明の後の態様による一実施形態では、ＩｇＧ４分子は、例えば前に記載したようにヒンジ中に２２アミノ酸をさらに含有する。
【００３１】
本発明により提供される抗体は、野生型ＩｇＧ４抗体と比較して有利な性質を示す。本発明の抗体は、野生型ＩｇＧ４抗体と比較して特にＦａｂドメインの改善された耐熱性を示すことが、驚くことに分かっている。
【００３２】
さらなる態様では、本発明は、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を含む少なくとも１つの重鎖を含むクラスＩｇＧ３の抗体であって、それぞれの重鎖中、
ａ．軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１ドメイン中のシステインが別のアミノ酸で置換されており、且つ
ｂ．上部ヒンジ領域中に位置する１つ又は複数のアミノ酸がシステインで置換されている抗体も提供する。
【００３３】
さらなる態様では、本発明は、ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメインを含む少なくとも１つの重鎖を含むクラスＩｇＭの抗体であって、それぞれの重鎖中、
ａ．軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１ドメイン中のシステインが別のアミノ酸で置換されており、且つ
ｂ．ＣＨ１ドメイン又はＣＨ２ドメイン中に位置する１つ又は複数のアミノ酸がシステインで置換されている抗体を提供する。
【００３４】
さらなる態様では、本発明は、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を含む少なくとも１つの重鎖を含むクラスＩｇＤの抗体であって、それぞれの重鎖中、
ａ．軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１ドメイン中のシステインが別のアミノ酸で置換されており、且つ
ｂ．ヒンジ領域中に位置する１つ又は複数のアミノ酸がシステインで置換されている抗体を提供する。
【００３５】
本発明は、本発明の抗体をコードする配列を含む発現ベクター、及びその発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。
【００３６】
本発明は、疾患又は障害の治療において使用するための前に定義した抗体も提供する。治療有効量の前に定義した抗体を投与することを含む、疾患又は障害を治療するための方法をさらに提供する。
【００３７】
一実施形態では、抗体は、癌以外の疾患の治療において使用するためのものである。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１ａ】ヒンジ残基に下線を引いたＩｇＧ１野生型及びＩｇＧ４野生型のヒトＣＨ１及びヒンジ配列、及びｋａｐｐａ軽鎖定常配列を示す図である。
【図１ｂ】鎖間ＣＬ−ＣＨ１ジスルフィド結合を形成するシステイン（下線）を示すヒトｋａｐｐａ軽鎖定常配列、  鎖間ＣＬ−ＣＨ１ジスルフィド結合を形成するシステイン位置（ＩｇＧ１に関して上部ヒンジ中並びにＩｇＧ２、３及び４に関してＮ末端ＣＨ１中）を示す（下線）、ヒトＩｇＧ１、２、３及び４重鎖Ｎ末端ＣＨ１残基及びヒンジ領域配列、  鎖間ＣＬ−ＣＨ１ジスルフィド結合を形成するＮ末端ＣＨ１配列中のシステイン位置を示す（下線）、ヒトＩｇＤ重鎖Ｎ末端ＣＨ１残基及びヒンジ領域配列の一部分、  鎖間ＣＬ−ＣＨ１ジスルフィド結合を形成するＮ末端ＣＨ１中のシステイン位置を示す（下線）、ヒトＩｇＭ重鎖Ｎ末端ＣＨ１、Ｃ末端ＣＨ１残基及び選択したＮ末端ＣＨ２残基、及び  下線残基が本発明の抗体において１つ又は複数の残基をシステインと置換することができる位置を示す、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の上部ヒンジ、ＩｇＤのヒンジ中並びにＩｇＭのＣ末端ＣＨ１及びＣＨ２中の残基を示す図である。
【図２ａ】ＩｇＧ１野生型、ＩｇＧ４野生型の軽鎖並びに上部及びコアヒンジ残基中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１システイン残基（Ｃ１２７）、及び本発明のＩｇＧ４抗体中の突然変異を導入した位置を示す図である。
【図２ｂ】ＩｇＧ３野生型の軽鎖及びヒンジ残基中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１システイン残基（Ｃ１２７）、及び本発明のＩｇＧ３抗体中で１つ又は複数の残基をシステインと置換した位置を示す図である。
【図２ｃ】ＩｇＭ野生型の軽鎖並びに選択したＣＨ１及びＣＨ２残基中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１システイン残基（Ｃ１２７）、及び本発明のＩｇＭ抗体中で１つ又は複数の残基をシステインと置換した位置を示す図である。
【図２ｄ】ＩｇＤ野生型の軽鎖及びヒンジ残基中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１システイン残基（Ｃ１２８）、及び本発明のＩｇＤ抗体中で１つ又は複数の残基をシステインと置換した位置を示す図である。
【図３ａ】本発明によるＩｇＧ４抗体中に導入した突然変異を示す図である。
【図３ｂ】図３ａ中に示したＩｇＧ４抗体の突然変異重鎖中の残基の位置、及び軽鎖（ＬＣ）又は別の突然変異重鎖（ＨＣ）の一方中のシステインと形成することができる予想ジスルフィド結合を示す図である。システインがＬＣ又はＨＣ中のシステインと結合可能である場合、下線の鎖は予想される主要ジスルフィド結合配置である。
【図４ａ】本発明によるＩｇＧ４抗体中に導入した突然変異を示す図である。
【図４ｂ】図４ａ中に示したＩｇＧ４抗体中のシステイン残基の位置、及び軽鎖（ＬＣ）又は重鎖（ＨＣ）の一方中のシステインと形成することができる予想ジスルフィド結合を示す図である。システインがＬＣ又はＨＣ中のシステインと結合可能である場合、下線の鎖は予想される主要ジスルフィド結合配置である。
【図５】本発明によるＩｇＧ４抗体のＣＨ１及びヒンジ領域の配列を示す図である。
【図６】本発明によるＩｇＧ４抗体のＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３の配列を示す図である。
【図７】本発明による抗体のウエスタンブロット解析を示す図である。上部ゲルは抗ヒトＦｃ抗体を使用した結果を示し、下部ゲルは抗Ｋａｐｐａ抗体を使用した結果を示す。
【図８】本発明による抗体のウエスタンブロット解析を示す図である。上部ゲルは抗ヒトＦｃ抗体を使用した結果を示し、下部ゲルは抗ヒトＫａｐｐａ抗体を使用した結果を示す。
【図９】本発明による抗体のウエスタンブロット解析を示す図である。上部ゲルは抗ヒトＦｃ抗体を使用した結果を示し、下部ゲルは抗ヒトＫａｐｐａ抗体を使用した結果を示す。
【図１０】本発明による抗体のウエスタンブロット解析を示す図である。上部ゲルは抗ヒトＦｃ抗体を使用した結果を示し、下部ゲルは抗ヒトＫａｐｐａ抗体を使用した結果を示す。
【図１１】Ｆａｂ及びＣＨ２ドメインの耐熱性を示す、本発明の抗体のＴｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ解析の結果を示す図である。
【図１２】Ｆａｂ及びＣＨ２ドメインの耐熱性を示す、本発明の抗体のＴｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ解析の結果を示す図である。
【図１３】Ｆａｂ及びＣＨ２ドメインの耐熱性を示す、本発明の抗体のＴｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ解析の結果を示す図である。
【図１４】Ｆａｂ及びＣＨ２ドメインの耐熱性を示す、本発明の抗体のＴｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ解析の結果を示す図である。
【図１５】選択した本発明の抗体の耐熱性の順位を示す図である。
【図１６】選択した本発明の抗体及び対照抗体に関する、親和性アッセイの結果を示す図である。
【図１７】選択した本発明の抗体のＨＰＬＣ解析の結果を示す図である。
【図１８】異なるリンカーを用いた、本発明による抗体のウエスタンブロット解析を示す図である。
【図１９】異なるリンカーを用いた、本発明による抗体のウエスタンブロット解析を示す図である。
【図２０】様々な突然変異を有する本発明による抗体のウエスタンブロット解析を示す図である。
【図２１】様々な突然変異を有する本発明による抗体のウエスタンブロット解析を示す図である。
【図２２】様々な突然変異を有する本発明による抗体のウエスタンブロット解析を示す図である。
【図２３】様々な突然変異を有する本発明による抗体のウエスタンブロット解析を示す図である。
【図２４】様々な突然変異を有する本発明による抗体のウエスタンブロット解析を示す図である。
【図２５】本発明による特定の抗体を含めた、様々な抗体のＡＤＣＣエフェクター機能を示す図である。
【図２６】本発明による特定の抗体を含めた、様々な抗体のＡＤＣＣエフェクター機能を示す図である。
【図２７】本発明による様々な抗体の発現を示す図である。
【図２８】抗体Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎの様々な突然変異のウエスタンブロットを示す図である。
【図２９】抗体Ｔｙｓａｂｒｉの様々な突然変異のウエスタンブロットを示す図である。
【図３０】抗体Ａｃｔｅｍｒａの様々な突然変異のウエスタンブロットを示す図である。
【図３１】本発明による様々な抗体のＴｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ解析の結果を示す図である。
【図３２】本発明による様々な抗体のＴｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ解析の結果を示す図である。
【図３３】本発明による様々な抗体のＴｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ解析の結果を示す図である。
【図３４】本発明による様々な抗体のＴｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ解析の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
配列の簡単な説明
配列番号１は、ＩｇＧ１野生型抗体のＣＨ１及びヒンジ領域配列を示す。
【００４０】
配列番号２は、ＩｇＧ４野生型抗体のＣＨ１及びヒンジ領域配列を示す。
【００４１】
配列番号３は、ヒト野生型ｋａｐｐａ軽鎖の定常領域の一部分を示す。
【００４２】
配列番号４は、ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ１ドメインのＮ末端配列の一部分を示す。
【００４３】
配列番号５は、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジ領域を示す。
【００４４】
配列番号６は、ヒトＩｇＧ２抗体のＣＨ１ドメインのＮ末端配列の一部分を示す。
【００４５】
配列番号７は、ヒトＩｇＧ２抗体のヒンジ領域を示す。
【００４６】
配列番号８は、ヒトＩｇＧ３抗体のＣＨ１ドメインのＮ末端配列の一部分を示す。
【００４７】
配列番号９は、ヒトＩｇＧ３抗体のヒンジ領域を示す。
【００４８】
配列番号１０は、ヒトＩｇＧ４抗体のＣＨ１ドメインのＮ末端配列の一部分を示す。
【００４９】
配列番号１１は、ヒトＩｇＧ４抗体のヒンジ領域を示す。
【００５０】
配列番号１２〜３７は、それぞれ抗体６、７、８、１５、１６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４４、４５、４６、４７、２、３、４８、２８Ｐ及び４４ＰのＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域配列を示す。
【００５１】
配列番号３８〜６３は、それぞれ抗体６、７、８、１５、１６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４４、４５、４６、４７、２、３、４８、２８Ｐ及び４４ＰのＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン配列を示す。
【００５２】
配列番号６４は、野生型ＩｇＧ４ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列を示す。
【００５３】
配列番号６５は、野生型ＩｇＧ４ＣＨ２及び野生型ＩｇＧ１ＣＨ３ドメイン配列を示す。
【００５４】
配列番号６６は、ヒト野生型ｋａｐｐａ軽鎖の定常領域配列を示す。
【００５５】
配列番号６７は、ヒトＩｇＧＤ抗体のＣＨ１ドメインのＮ末端配列の一部分を示す。
【００５６】
配列番号６８は、ヒトＩｇＧＤ抗体のヒンジ領域の一部分を示す。
【００５７】
配列番号６９は、ヒトＩｇＧＭ抗体のＣＨ１ドメインのＮ末端配列の一部分を示す。
【００５８】
配列番号７０は、ヒトＩｇＧＭ抗体のＣＨ１ドメインのＣ末端配列の一部分を示す。
【００５９】
配列番号７１は、ヒトＩｇＧＭ抗体のＣＨ２ドメインの一部分を示す。
【００６０】
配列番号７２〜２９５は、様々なヒンジ領域を示す。
【００６１】
ここで本発明をより詳細に記載する。
【００６２】
文脈が他の事を示さない限り、用語「タンパク質」と「ポリペプチド」は本明細書中で交互に使用する。「ペプチド」は１０個以下のアミノ酸を指すものとする。
【００６３】
文脈が他の事を示さない限り、用語「ポリヌクレオチド」は遺伝子、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡなどを含む。
【００６４】
本明細書の文脈において、本明細書中で使用する用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」として解釈すべきである。
【００６５】
本発明の文脈における用語「野生型」は、天然に存在し得る、又は如何なる遺伝子操作型突然変異も含まない環境から単離することができる抗体を意味する。
【００６６】
本明細書中の置換突然変異体に関する表示は、文字、次に数字、次に文字からなる。最初の文字は、野生型タンパク質中のアミノ酸を表す。数字はアミノ酸置換が施されているアミノ酸位置を指し、二番目の文字は野生型アミノ酸との置換に使用されるアミノ酸を表す。
【００６７】
抗体の可変及び定常ドメイン中の残基は、Ｋａｂａｔらにより考案されたシステムに従い従来ナンバリングされている。このシステムは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ，ＵＳＡ中に述べられる（ここでは以後「Ｋａｂａｔら（上記）」）。
【００６８】
Ｋａｂａｔの残基表示は、アミノ酸残基の直線的ナンバリングに常に直接対応するわけではない。実際の直線アミノ酸配列は、構造要素、基本可変ドメイン構造のフレームワーク又は相補性決定領域（ＣＤＲ）の縮小、若しくはそこへの挿入に応じて厳密なＫａｂａｔのナンバリング中より少ないか又は多くのアミノ酸を含有し得る。残基の正確なＫａｂａｔのナンバリングは、「標準」Ｋａｂａｔナンバリング配列と抗体配列中の相同残基のアラインメントにより、所与の抗体に関して決定することができる。
【００６９】
或いは、アミノ酸残基のナンバリングは、（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）中にも記載された）ＥＵ−インデックス又はＥＵナンバリングシステムにより実施することができる。
【００７０】
抗体中のアミノ酸残基のさらなるナンバリングシステムはＩＭＧＴナンバリングシステムである（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２９，１８５−２０３（２００５））。
【００７１】
ＥＵナンバリングシステム又はＩＭＧＴナンバリングシステムを使用することを他に示す場合以外、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムを本明細書中で使用する。
【００７２】
４つのＩｇＧ４アイソタイプ間で、重鎖及び軽鎖中で鎖間ジスルフィド結合配置は類似しており、一方鎖間ジスルフィド結合配置はそれぞれのアイソタイプに関して特有である［（Ｗｙｐｙｃｈ，Ｊ．，Ｌｉ，Ｍ．，Ｇｕｏ，Ａ．，Ｚｈａｎｇ，Ｚ．，Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｔ．，Ａｌｌｅｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｆｏｄｏｒ，Ｓ．，Ｋｅｌｎｅｒ，Ｄ．Ｎ．，Ｆｌｙｎｎ，Ｇ．Ｃ．，Ｌｉｕ，Ｙ．Ｄ．，Ｂｏｎｄａｒｅｎｋｏ，Ｐ．Ｖ．，Ｒｉｃｃｉ，Ｍ．Ｓ．，Ｄｉｌｌｏｎ，Ｔ．Ｍ．，Ｂａｌｌａｎｄ，Ａ．，２００８．「ヒトＩｇＧ２抗体はジスルフィド仲介型構造アイソフォームを示す。（Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ２  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ．）」Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８３，１６１９４−１６２０５）により総説される］。
【００７３】
図１ｂ中に示すように、４つのＩｇＧ４アイソタイプのヒンジ領域配列は異なる。典型的に、完全又は遺伝子ヒンジ領域は（Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに基づきナンバリングした）残基２２６〜２５１からなる。図１ｂは、４つのＩｇＧ４アイソタイプのヒンジ領域の、上部、コア及び下部を示す。ＩｇＧ１アイソタイプに関しては、上部ヒンジ領域は残基２２６〜２３８であり、コアヒンジ領域は残基２３９〜２４３であり、下部ヒンジ領域は残基２４４〜２５１である。ＩｇＧ４アイソタイプに関しては、上部ヒンジ領域は残基２２６〜２３８であり、コアヒンジ領域は残基２３９〜２４３であり、下部ヒンジ領域は残基２４４〜２５１である。
【００７４】
したがって、ＩｇＧ１中の上部ヒンジ、コア及び下部ヒンジを含むヒンジは、図１ａ中に示すように２３アミノ酸長である。上部ヒンジは１０アミノ酸である。コアは５アミノ酸であり、下部ヒンジは８アミノ酸である。例えば図１ｂ参照。
【００７５】
ＩｇＧ４中の上部ヒンジ、コア及び下部ヒンジを含むヒンジは、図１ａ中に示すように２０アミノ酸長である。上部ヒンジは７アミノ酸である。コアは５アミノ酸であり、下部ヒンジは８アミノ酸である。例えば図１ｂ参照。
【００７６】
ＩｇＧ４内の鎖間ジスルフィド結合配置の修飾、具体的には軽鎖（ＬＣ）と重鎖（ＨＣ）の間のＣＬ−ＣＨ１鎖間ジスルフィド結合配置を修飾することによって、本発明による新たな突然変異ＩｇＧ４抗体を開発している。
【００７７】
図１ｂは、鎖間ＣＬ−ＣＨ１ジスルフィド結合を形成するシステイン位置（下線）を示す、ＩｇＧ１〜４アイソタイプに関するヒトＩｇＧ重鎖及び軽鎖配列の一部分を示す。ＩｇＧ１の鎖間ＣＬ−ＣＨ１ジスルフィド結合は、ＬＣＣ２１４（Ｋａｂａｔのナンバリングシステム）とヒンジ領域直前のＨＣのＣ２３３（Ｋａｂａｔのナンバリングシステム）の間で形成される。対照的に、ＩｇＧ２、３及び４に関するＣＨ１−ＣＬジスルフィド結合は、ＬＣＣ２１４とＨＣの鎖間ジスルフィド結合のＣ１２７Ｎ末端の間で形成される。ＣＬ−ＣＨ１ジスルフィド結合形成に関与するシステイン残基周囲のＬＣ及びＨＣ配列は、図１ｂ中に示し一直線に並べる。
【００７８】
本発明は、どのようにＣＬ−ＣＨ１ジスルフィド結合が、耐熱性、構造安定性、ジスルフィドアイソフォーム不均一性、及び抗体の親和性を含めたＩｇＧ４抗体の性質に影響を与えるかを調べている。
【００７９】
ＩｇＧ４の突然変異体は、別のアミノ酸と位置１２７におけるＣＨ１中のシステイン残基の置換、及び上部ヒンジ領域中の１つ又は複数のアミノ酸、好ましくはＩｇＧ４のＫａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングした２２７、２２８、２２９及び２３０から選択される位置におけるアミノ酸と、システインの置換によって作製した。位置２２７、２２８、２２９又は２３０は、ＩｇＧ１システイン２３３が位置するのと同等の構造位置又はその付近に存在する。
【００８０】
それぞれの重鎖は、ＩｇＧ４ヒンジ領域中のシステイン残基２３９と２４２の一方又は両方と別のアミノ酸の置換を含めた、さらなる突然変異を含む可能性がある。ＩｇＧ１ヒンジと同じ長さに位置２３８と２３９の間で３アミノ酸ＩｇＧ４上部ヒンジ領域を延長する突然変異も、いくつかの抗体中に含めた。Ｓ２４１Ｐ突然変異もいくつかの抗体中に導入した。
【００８１】
本発明による突然変異ＩｇＧ４抗体は、有利な性質を示すことが分かっている。
【００８２】
一実施形態では、本発明による突然変異ＩｇＧ４抗体は、野生型ＩｇＧ４抗体と比較して増大した耐熱性を示す。突然変異してＣＨ１ドメイン中の位置１２７におけるシステインが別のアミノ酸で置換されており、且つ位置２２７〜２３０の間の重鎖ヒンジ領域中にシステインが導入されている突然変異ＩｇＧ４抗体は、野生型ＩｇＧ４抗体と比較して改善された耐熱性を示すことが、驚くことに分かっている。位置１２７におけるシステインを除去する突然変異は、重鎖と軽鎖の間（ＣＬ−ＣＨ１）の鎖間ジスルフィド結合を形成する位置を変え、重鎖ヒンジ領域中の位置２２７と２３０の間に導入されるシステインとのジスルフィド結合を軽鎖に形成させる。したがって一実施形態では、システイン１２７が別のアミノ酸で置換されており、且つ軽鎖のシステインが位置２２７、２２８、２２９又は２３０における操作型システインとジスルフィド結合を介して連結したＩｇＧ４抗体を提供する。
【００８３】
ＩｇＧ４ヒンジ領域に３アミノ酸を加えてＩｇＧ４ヒンジ領域を延長することにより、耐熱性に対するさらなる改善も驚くことに分かった。
【００８４】
突然変異してＣＨ１ドメイン中の位置１２７におけるシステインが別のアミノ酸で置換されており、且つ重鎖ヒンジ領域中の位置２３９又は位置２４２におけるシステインが別のアミノ酸で置換されている突然変異ＩｇＧ４抗体は、野生型ＩｇＧ４抗体と比較して改善された耐熱性を示すことも、驚くことに分かっている。
【００８５】
一実施形態では、本発明の抗体は、いわゆる半分子の低減した形成を示す。Ｃ２３９に突然変異を含むがＣ２４２には突然変異がない本発明の抗体は、低減した半分子の形成を一般に示す。理論によって束縛されることは望まないが、これは、位置２３９におけるシステインの除去は重鎖中の鎖内ジスルフィド結合の形成を低減し、したがって、Ｃ２３９又はＣ２４２に突然変異がない抗体と比較して半分子の数を減らすことが原因であると考えられる。Ｃ２４２に突然変異があるがＣ２３９に突然変異がない抗体は、Ｃ２３９に突然変異があるがＣ２４２に突然変異がない抗体と比較して、より多くの半分子を形成するようである。理論によって束縛されることは望まないが、位置２３９におけるシステインは位置２４２におけるシステインと比較してより反応性が高く、重鎖ヒンジシステイン又は軽鎖システインのいずれかとジスルフィド結合を形成することができると考えられる。
【００８６】
Ｃ２３９とＣ２４２の両方に突然変異がある抗体は、２重鎖間に鎖間ジスルフィド結合形成がないため、多数の半分子を形成する。しかしながら、Ｃ２３９とＣ２４２の両方に突然変異を含む抗体は、非共有結合を介した重鎖の結合のため、完全抗体分子を依然として形成することができる。
【００８７】
低減した半分子の形成は、Ｓ２４１Ｐ突然変異がある抗体においても観察される。
【００８８】
一実施形態では、上部ヒンジ及びコア領域は以下の配列の１つから選択される：
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ESKSYGPPHCPPCP  SEQ ID No: 259
ESKSYGDKHCPPCP  SEQ ID No: 260
EPKSCDKTHTCPPCP  SEQ ID No: 261 
EPKSCDKTHTCPSCP  SEQ ID No: 262
ESKYCPPACPSCP  SEQ ID No: 263
ESKYCPPAACPSCP  SEQ ID No: 264
ESKYCPPAAACPSCP  SEQ ID No: 265
ESKYCPPAAASPSCP  SEQ ID No: 266
ESKYCPPAAACPSSP  SEQ ID No: 267
ESKCGPPAAACPSCP  SEQ ID No: 268
ESKYCPPAAAACPSCP  SEQ ID No: 269
ESKYCPPAAAAACPSCP  SEQ ID No: 270
ESKYCPPGGGCPSCP  SEQ ID No: 271
ESKYCPPSSSCPSCP  SEQ ID No: 272
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ESKYCPPTHCPSCP  SEQ ID No: 274
ESKYCPPTHTCPSCP  SEQ ID No: 275
ESKYCPKTHTCPSCP  SEQ ID No: 276
ESKYCDKTHTCPSCP  SEQ ID No: 277
ESKYCDKTHCPSCP  SEQ ID No: 278
ESKYCDKTCPSCP  SEQ ID No: 279
ESKYCDKAAACPSCP  SEQ ID No: 280
ESKYCDKCPSCP  SEQ ID No: 281
ESKSCDKTHTCPSCP  SEQ ID No: 282
EPKYCDKTHTCPSCP  SEQ ID No: 283
EPKSCPPCPSCP  SEQ ID No: 284
ESKSCPPCPSCP  SEQ ID No: 285
EPKYCPPCPSCP  SEQ ID No: 286
ECKYGPPCPSCP  SEQ ID No: 287
ECKYGPPSPSCP  SEQ ID No: 288
ECKYGPPCPSSP  SEQ ID No: 289
ESCYGPPCPSCP  SEQ ID No: 290
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ESCYGPPCPSSP  SEQ ID No: 292
ESKCGPPCPSCP  SEQ ID No: 293
ESKCGPPSPSCP  SEQ ID No: 294
ESKCGPPCPSSP  SEQ ID No: 295
【００８９】
本発明による抗体は、野生型ＩｇＧ４抗体と比較して、標的抗原に対して匹敵する親和性も示す。
【００９０】
本発明の抗体に対する突然変異を、ここでさらに詳細に記載する。アミノ酸を置換するための方法は、分子生物学の分野でよく知られている。このような方法は、例えば、アミノ酸の欠失及び／又は置換又は合成配列のｄｅ  ｎｏｖｏ設計のためにＰＣＲなどの方法を使用する、部位特異的突然変異誘発を含む。
【００９１】
図２ａは、ＩｇＧ１野生型、ＩｇＧ４野生型のヒンジ残基、及び本発明の抗体中の突然変異を導入した位置を示す。Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに基づくナンバリング。
【００９２】
本発明による抗体は、システイン残基が別のアミノ酸、好ましくはチオール基を含有しないアミノ酸によって置き換えられた、位置１２７における突然変異（Ｃ１２７）を含む。置き換え又は置換によって、本発明者らは、鎖間システイン１２７が抗体重鎖中に通常見られる場合、別のアミノ酸がその場所に存在することを意味する。Ｃ１２７における突然変異は、アミノ酸残基をシステインから別の適切なアミノ酸に変える、位置１２７における１、２又は３個のアミノ酸をコードするヌクレオチドに対する任意の適切な突然変異であってよい。適切なアミノ酸の例には、セリン、スレオニン、アラニン、グリシン又は任意の極性アミノ酸がある。特に好ましいアミノ酸はセリンである。
【００９３】
別のアミノ酸と位置１２７におけるシステインの置換は、野生型ＩｇＧ４において軽鎖中のシステインとジスルフィド結合を通常形成する、ＣＨ１ドメイン中のシステインを除去する。したがって、鎖間ジスルフィド結合を介して軽鎖と重鎖対を形成するため、軽鎖は、重鎖のヒンジ領域中に位置するシステインとジスルフィド結合を形成しなければならない。
【００９４】
本発明の第一の態様では、本発明による抗体は、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングした２２７、２２８、２２９及び２３０から選択される位置における１つ又は複数のアミノ酸がシステインで置換された重鎖を含む。したがって、本発明による抗体は、１つ又は複数の以下の突然変異を有し得る：
・Ｓ２２７Ｃ
・Ｋ２２８Ｃ
・Ｙ２２９Ｃ
・Ｇ２３０Ｃ
【００９５】
２２７、２２８、２２９及び２３０から選択されるただ１つの残基が、システイン残基で置換されることが好ましい。
【００９６】
本発明の特に好ましい抗体は突然変異Ｙ２２９Ｃ又はＧ２３０Ｃを有する。
【００９７】
重鎖のヒンジ領域内の２２７、２２８、２２９及び２３０から選択される位置におけるシステイン残基の封入は、重鎖と軽鎖の間の形成のための鎖間ジスルフィド結合に関する新たな位置をもたらす。本発明者らにより、この新たな鎖間ジスルフィド結合配置は、野生型ＩｇＧ４抗体と比較して改善された耐熱性を有するＩｇＧ４抗体をもたらすことが分かっている。
【００９８】
さらなる突然変異を、本発明のこの態様の抗体に導入することができる。一実施形態では、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングした重鎖中の位置２３９におけるシステイン（Ｃ２３９）及び／又は位置２４２におけるシステイン（Ｃ２４２）は別のアミノ酸、好ましくはチオール基を含有しないアミノ酸で置換されている。置き換え又は置換によって、本発明者らは、システイン２３９及び／又はシステイン２４２が抗体重鎖中に通常見られる場合、別のアミノ酸がその場所に存在することを意味する。Ｃ２３９及び／又はＣ２４２における突然変異は、アミノ酸残基をシステインから別の適切なアミノ酸に変える、１、２又は３個のアミノ酸をコードするヌクレオチドに対する任意の適切な突然変異であってよい。適切なアミノ酸の例には、セリン、スレオニン、アラニン、グリシン又は任意の極性アミノ酸がある。特に好ましいアミノ酸はセリンである。
【００９９】
一実施形態では、重鎖中の位置２３９におけるシステインは別のアミノ酸で置換されており、重鎖中の位置２４２におけるシステインは別のアミノ酸で置換されている。この実施形態では、Ｃ２３９とＣ２４２の両方の置換は、別の重鎖中の対応するシステインと重鎖間ジスルフィド結合を通常形成する、重鎖のヒンジ領域内の両方のシステイン残基を除去する。生成する半分子は、２重鎖間の非共有結合を介して完全抗体分子を形成することができる。
【０１００】
別の実施形態では、重鎖中の位置２３９におけるシステインは別のアミノ酸で置換されている。この実施形態では、位置２４２におけるシステインは別のアミノ酸で置換されていない。
【０１０１】
さらなる別の実施形態では、重鎖中の位置２４２におけるシステインは別のアミノ酸で置換されている。この実施形態では、位置２３９におけるシステインは別のアミノ酸で置換されていない。
【０１０２】
Ｃ２３９又はＣ２４２の一方の置換により、別の重鎖中のシステインと重鎖間ジスルフィド結合を形成することができる、重鎖中の１つのシステインが残る。理論によって束縛されることは望まないが、ヒンジ領域内の１システインの置換、特にＣ２３９の置換はヒンジ領域内の鎖内ジスルフィド結合の形成を減らし、したがって半抗体分子の形成を減らす可能性があると考えられる。
【０１０３】
位置２２７におけるセリンがシステインで置換されている本発明の一実施形態では、抗体は位置Ｃ２３９及びＣ２４２に突然変異を含まないことが好ましい。位置２２７におけるセリンがシステインで置換されている別の実施形態では、重鎖中の位置２３９におけるシステインは別のアミノ酸で置換されているが、位置２４２におけるシステインは別のアミノ酸で置換されていないことが好ましい。
【０１０４】
一実施形態では、本発明の抗体は、突然変異させてアミノ酸２２６〜２４３の間に１つ又は複数のアミノ酸を挿入したＩｇＧ４重鎖を含む。挿入するアミノ酸の数は１〜１０、１〜５、１〜３であってよく、１、２、３又は４個のアミノ酸を挿入することが好ましい。アミノ酸はアミノ酸２３８と２３９の間に挿入することが好ましい。アラニン、グリシン、セリン又はスレオニン、及びこれらの組合せなどの、任意の適切なアミノ酸をヒンジ領域中に挿入することができる。３個のアラニン（ＡＡＡ）、３個のグリシン（ＧＧＧ）、３個のセリン（ＳＳＳ）又は３個のスレオニン（ＴＴＴ）、又は１個のスレオニン、ヒスチジンと別のスレオニン（ＴＨＴ）を挿入することが好ましい。突然変異させて３個のアミノ酸をヒンジ領域中に挿入したＩｇＧ４重鎖を含む本発明の抗体は、改善された耐熱性を示すことが分かっている。
【０１０５】
本発明による抗体中に導入することができるさらなる突然変異は、突然変異Ｓ２４１Ｐである。この突然変異は、半分子の形成を減らすことが以前に示されている（Ａｎｇａｌ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９９３．「１個のアミノ酸置換がキメラマウス／ヒト（ＩｇＧ４）抗体の不均一性をなくす。（Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ａｂｏｌｉｓｈｅｓ  ｔｈｅ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｍｏｕｓｅ／ｈｕｍａｎ  （ＩｇＧ４）  ａｎｔｉｂｏｄｙ．）」Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３０，１０５−１０８）。
【０１０６】
本発明による抗体は、ヒンジ領域中に１つ又は複数のさらなる突然変異を含む可能性がある。例えば抗体は、１つ又は複数の以下の突然変異Ｓ２２７Ｐ、Ｙ２２９Ｓ、Ｐ２３７Ｄ及びＰ２３８Ｋをさらに含む可能性がある。
【０１０７】
一実施形態では、本発明による抗体は、残基２２６〜２４３（上部ヒンジ及びコアヒンジ）のＩｇＧ１ヒンジ領域を効率よく含む。したがって本発明の抗体は、位置２３０におけるグリシンがシステインで置換されており、位置２２７におけるセリンがプロリンで置換されており、位置２２９におけるチロシンがセリンで置換されており、位置２３７におけるプロリンがアスパラギン酸で置換されており、位置２３８におけるプロリンがリシンで置換されており、アミノ酸配列スレオニン−ヒスチジン−スレオニンが位置２３８と２３９の間に挿入されており、且つ位置２４１におけるセリンがプロリンで置換されているヒンジ領域を含む。図２ａ中に示すように、これらの突然変異は、Ｓ２２７Ｐ、Ｙ２２９Ｓ、Ｇ２３０Ｃ、Ｐ２３７Ｄ、Ｐ２３８ＫＴＨＴ及びＳ２４１Ｐとして表記することもできる。ＩｇＧ４ヒンジ領域への、これらのさらなる突然変異の導入は、改善された耐熱性を有する抗体をもたらすことが分かっている。
【０１０８】
本発明による抗体は、残基２４４〜２５１のＩｇＧ４下部ヒンジ（ＡＰＥＦＬＧＧＰ）を有することが好ましい。理論によって束縛されることは望まないが、ＩｇＧ４下部ヒンジ領域は、ＩｇＧ４抗体のエフェクター機能の欠如に貢献すると考えられる。
【０１０９】
本発明の第二の態様では、抗体は、前に記載したように位置１２７におけるシステインが別のアミノ酸で置換されており、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングした重鎖中の位置２３９におけるシステイン又は位置２４２におけるシステインが別のアミノ酸で置換されている、重鎖を含む。この第二の態様では、位置２２７、２２８、２２９及び２３０におけるいずれの残基もシステイン残基で置換されていない。
【０１１０】
本発明の第二の態様による抗体は、野生型ＩｇＧ４抗体と比較して、改善された耐熱性を有することが驚くことに分かっている。
【０１１１】
本発明の第二の態様では、抗体は、１つ又は複数のさらなる突然変異を含む可能性がある。一実施形態では、抗体は、前に記載したように、突然変異させてアミノ酸２２６〜２４３の間、好ましくはアミノ酸２３８と２３９の間に３個のアミノ酸を挿入したＩｇＧ４重鎖を含む。さらなる実施形態では、抗体は突然変異Ｓ２４１Ｐを含む。さらなる実施形態では、抗体は１つ又は複数の以下の突然変異Ｓ２２７Ｐ、Ｙ２２９Ｓ、Ｐ２３７Ｄ及びＰ２３８Ｋをさらに含む可能性がある。
【０１１２】
以下の表１は、本発明の例示的な抗体、及びＩｇＧ４野生型配列と比較して導入した突然変異を列挙する。表１は、野生型ＩｇＧ１及びＩｇＧ４抗体及び対照抗体も含む。
【表１−１】
0005894160.tif 000002
【表１−２】
0005894160.tif 000003
【０１１３】
図３ａ及び４ａも、本発明によるＩｇＧ４抗体に導入された突然変異を示す。図３ｂ及び４ｂは、本発明のＩｇＧ４抗体中のシステイン残基の位置を示し、軽鎖（ＬＣ）又は別の重鎖（ＨＣ）中のシステインとシステインの予想される結合も示す。（ＬＣ又はＨＣ）を示すシステイン残基に関しては、システインは軽鎖又は重鎖中のシステインと結合することが可能であるが、ＬＣ又はＨＣの一方に下線を引く場合、これは主として存在すると考えられるジスルフィド結合である。
【０１１４】
好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも１つの重鎖を含む抗体であって、それぞれの重鎖がＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を含み、且つそれぞれの重鎖が表１中に示すような２、３、６、７、８、１５、１６、２８、２８Ｐ、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４４、４４Ｐ、４５、４６、４７及び４８から選択される抗体の突然変異を含む抗体を提供する。したがって本発明は、少なくとも１つの重鎖を含む抗体であって、それぞれの重鎖がＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を含み、且つそれぞれの重鎖が以下の配列：配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７の１つを含む抗体を提供する。
【０１１５】
好ましい実施形態では、本発明の抗体は、それぞれの重鎖がＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を含み、且つ以下の配列：配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７の１つを含む、少なくとも１つの重鎖を含む。より好ましくは、本発明の抗体は、それぞれの重鎖がＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を含み、且つそれぞれの重鎖が以下の配列：配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７の１つを含む、少なくとも１つの重鎖を含む。
【０１１６】
さらなる好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも１つの重鎖を含む抗体であって、それぞれの重鎖がＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、且つそれぞれの重鎖が表１中に示すような２、３、６、７、８、１５、１６、２８、２８Ｐ、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４４、４４Ｐ、４５、４６、４７及び４８から選択される抗体の突然変異を含む抗体を提供する。したがって本発明は、少なくとも１つの重鎖を含む抗体であって、それぞれの重鎖がＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、且つそれぞれの重鎖が以下の配列：配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６３の１つを含む抗体を提供する。
【０１１７】
本発明の特に好ましい抗体は、それぞれの重鎖がＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を含み、且つ配列番号３６（抗体２８Ｐ）、配列番号３７（抗体４４Ｐ）又は配列番号３５（抗体４８）を含む少なくとも１つの重鎖を含む。本発明のさらなる特に好ましい抗体は、それぞれの重鎖がＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、且つ配列番号６２（抗体２８Ｐ）、配列番号６３（抗体４４Ｐ）又は配列番号６１（抗体４８）を含む少なくとも１つの重鎖を含む。抗体２８Ｐ、４４Ｐ及び４８が特に好ましい。それらは有意に改善された耐熱性を示し、低減した半分子形成をさらに示すからである。
【０１１８】
抗体２、３及び８は、相当量のいわゆる半分子（ＨＬ）を形成することが示されている。これらの突然変異体はｉｎ  ｖｉｔｒｏで非変性状態下において完全抗体分子（Ｈ２Ｌ２）を形成することはできるが、重鎖間及び／又は重鎖と軽鎖の間の如何なる非共有結合も非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ状態下において除去される。半分子の形成を減らすことが望ましいと教示されることは多いが、半分子を形成する高い傾向を有する抗体は特定用途に有利である可能性がある。別の重鎖と共有又は非共有結合を形成することができない抗体重鎖のため、安定した半分子（ＨＬ）を形成するが完全抗体（Ｈ２Ｌ２）はほとんど又は全く形成しない抗体が特に対象である。安定した半分子を形成する抗体は、一価抗体の生成に有利である可能性がある。半分子を形成する抗体も、それぞれの抗原に関して二重特異性及び一価であり異なる特異性を有する半分子からの完全抗体の形成のため、二重特異性抗体を生成するのに有用な方法をもたらす可能性がある。
【０１１９】
抗体３はヒンジ領域中にＣ２３９を保持するが、おそらくＣ末端軽鎖システインとヒンジＣ２３９の間のジスルフィドの効率よい形成のため、ヒンジ間重鎖ジスルフィド結合を形成することはできないようである。抗体２と３の比較は、軽鎖ジスルフィドがヒンジ領域中でＣ２４２よりＣ２３９に効率よく結合する点で、軽鎖のＣ末端システインの「到達」の程度を示す。さらに抗体３は、抗体２と比較して増大した安定性を示す。
【０１２０】
本発明による突然変異抗体をＩｇＧ４アイソタイプに関して前に記載したが、当業者は、ＩｇＧ４抗体に施す突然変異を、ＩｇＧ４抗体と同じジスルフィド結合配置を有する他の抗体アイソタイプ又はクラスに適用して、改良型抗体をもたらすことも可能であることを理解している。ＩｇＧ４抗体と同じジスルフィド結合配置を有する抗体の具体例は、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＭ抗体及びＩｇＤ抗体である。図１ｂ中に示すように、ＩｇＧ３及びＩｇＭはＣＨ１ドメイン中の位置１２７にシステインを有し、ＩｇＤはＣＨ１ドメイン中の位置１２８に、軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＩｇＧ４のＣＨ１ドメイン中のＣ１２７と等しいシステインを有する。さらに、ＩｇＧ３及びＩｇＤの上部ヒンジ領域、並びにＣＨ１ドメインのＣ末端領域、並びにＩｇＭ中のＣＨ２ドメインのＮ末端領域は、ＩｇＧ１の上部ヒンジ領域の残基と等しいシステイン残基を含有しないことも、図１ｂから見ることができる。したがって本発明は、軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１ドメイン中のシステインが別のアミノ酸で置換されており、且つＩｇＧ１又はＩｇＧ４の上部ヒンジ領域と構造上類似した位置に存在する１つ又は複数のアミノ酸がシステインで置換されている、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＤ抗体及びＩｇＭ抗体をさらに提供する。
【０１２１】
したがって本発明は、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を含む少なくとも１つの重鎖を含むクラスＩｇＧ３の抗体であって、それぞれの重鎖中、
ａ．軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１ドメイン中のシステインが別のアミノ酸で置換されており、且つ
ｂ．上部ヒンジ領域中に位置する１つ又は複数のアミノ酸がシステインで置換されている抗体も提供する。
【０１２２】
本発明のＩｇＧ３抗体態様の好ましい実施形態では、軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１ドメイン中のシステインは、図１ｂ及び２ｂ中に示すように、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置１２７におけるシステインである。
【０１２３】
本発明のＩｇＧ３抗体態様の好ましい実施形態では、システインと置換することができる上部ヒンジ領域中に位置する１つ又は複数のアミノ酸は、図１ｂ及び２ｂ中に示すように、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングした、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３２及び２３３から選択される位置における１つ又は複数のアミノ酸である。
【０１２４】
本発明は、ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメインを含む少なくとも１つの重鎖を含むクラスＩｇＭの抗体であって、それぞれの重鎖中、
ａ．軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１ドメイン中のシステインが別のアミノ酸で置換されており、且つ
ｂ．ＣＨ１ドメイン又はＣＨ２ドメイン中に位置する１つ又は複数のアミノ酸がシステインで置換されている抗体をさらに提供する。
【０１２５】
本発明のＩｇＭ抗体態様の好ましい実施形態では、軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１ドメイン中のシステインは、図１ｂ及び２ｃ中に示すように、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置１２７におけるシステインである。
【０１２６】
本発明のＩｇＭ抗体態様の好ましい実施形態では、ＣＨ１ドメインのＣ末端又はＣＨ２ドメインのＮ末端に位置する１つ又は複数のアミノ酸が、システインで置換されている。システインと置換することができるＣＨ１ドメインのＣ末端に位置する好ましいアミノ酸は、図１ｂ及び２ｃ中に示すように、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングした、２２３、２２３Ａ、２２３Ｂ及び２２３Ｃから選択される位置における１つ又は複数のアミノ酸である。システインと置換することができるＣＨ２ドメインのＮ末端に位置する好ましいアミノ酸は、図１ｂ及び２ｃ中に示すように、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングした、２４３Ｇ、２４３Ｈ及び２４３Ｉから選択される位置における１つ又は複数のアミノ酸である。したがって、任意の１つ又は複数のアミノ酸２２３〜２４３はシステインと置換することができる。
【０１２７】
本発明は、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を含む少なくとも１つの重鎖を含むクラスＩｇＤの抗体であって、それぞれの重鎖中、
ａ．軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１ドメイン中のシステインが別のアミノ酸で置換されており、且つ
ｂ．ヒンジ領域中に位置する１つ又は複数のアミノ酸がシステインで置換されている抗体をさらに提供する。
【０１２８】
本発明のＩｇＤ抗体態様の好ましい実施形態では、軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１ドメイン中のシステインは、図１ｂ及び２ｄ中に示すように、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置１２８におけるシステインである。
【０１２９】
ＩｇＤ抗体のヒンジ領域は、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに従いＲ２２４〜Ｐ２４３として定義することができる。
【０１３０】
本発明のＩｇＤ抗体態様の好ましい実施形態では、システインと置換することができるヒンジ領域中に位置する１つ又は複数のアミノ酸は、図１ｂ及び２ｄ中に示すように、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングした、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２及び２３３から選択される位置における１つ又は複数のアミノ酸である。
【０１３１】
本発明によって提供されるＩｇＧ３、ＩｇＤ又はＩｇＭ抗体は、ＩｇＧ４抗体に関して前に論じたように、ヒンジ領域に対する１つ又は複数のさらなる突然変異を含むことができる。
【０１３２】
本明細書で使用する用語「抗体」は、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を含む少なくとも１つの重鎖を含む、完全（全）抗体及び機能活性断片を含む。本発明による抗体は、少なくとも１つの軽鎖を含むことが好ましい。したがって、本発明中の用語「抗体」は、二価、三価又は四価抗体、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片、１つの軽鎖と重鎖対を含む半抗体分子又は半分子、並びに２つの軽鎖と重鎖対を含む完全抗体分子を包含する。
【０１３３】
当技術分野でよく知られるように、典型的なＦａｂ’分子は、重鎖が可変領域ＶＨ、定常ドメインＣＨ１及びヒンジ領域を含み、軽鎖が可変領域ＶＬ及び定常ドメインＣＬを含む、１つの重鎖と軽鎖対を含む。
【０１３４】
一実施形態では、本開示によるＦａｂ’の二量体を提供し、例えば二量体化はヒンジを介したものであってよい。
【０１３５】
一実施形態では、重鎖はＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、及び場合によってはＣＨ４ドメインを含む。一実施形態では、抗体は２つの重鎖を含み、その各々は本発明の第一又は第二の態様で前に定義したものである。本発明による抗体は、２つの軽鎖をさらに含むことが好ましい。抗体が２つの重鎖を含むこの実施形態では、両方の重鎖配列が、本発明の第一又は第二の態様で前に定義したように同一であることが好ましい。
【０１３６】
好ましい実施形態では、本発明の抗体は、２つの軽鎖及び２つの重鎖を含む完全抗体であり、それぞれの重鎖は、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに従いナンバリングした位置１２７におけるシステインが別のアミノ酸で置換されているＩｇＧ４ＣＨ１、ＩｇＧ１上部及び中央ヒンジ領域、ＩｇＧ４下部ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。
【０１３７】
ＩｇＧ４抗体の完全ヒンジ領域は、典型的には（Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに基づきナンバリングした）残基２２６〜２５１からなる。しかしながら、ヒンジ領域は必要に応じて縮小又は延長することができる。例えば、本発明の第一の態様による抗体では、野生型アミノ酸は位置２２７、２２８、２２９又は２３０でシステイン残基で置換されており、ヒンジ領域は位置２２７、２２８、２２９又は２３０における新たなシステイン残基の後で終わる可能性がある。本発明による抗体は、ヒンジ領域のＮ末端及び／又はＣ末端に位置する１つ又は複数のさらなるアミノ酸も含むことができる。さらに、柔軟性などのヒンジの性質に影響を与える可能性がある、軽鎖の鎖間システインからのヒンジシステイン（単数又は複数）の距離、ヒンジのシステイン間の距離、及びヒンジ中の他のアミノ酸の組成などの、ヒンジの他の特性を調節することができる。例えば、グリシンをヒンジ中に取り込ませ旋回柔軟性を増大することができ、又はプロリンをヒンジ中に取り込ませ柔軟性を低減することができる。或いは、荷電残基又は疎水性残基の組合せをヒンジ中に取り込ませ、多量体化又は精製特性をもたらすことができる。他の修飾ヒンジ領域は完全に合成であってよく、長さ、組成及び柔軟性などの望ましい性質を有するように設計することができる。
【０１３８】
存在する場合、本発明中で利用する、特にＦｃドメイン中の定常領域ドメインは、抗体エフェクター機能が必要とされないＩｇＧ４アイソタイプであることが好ましい。したがって、それぞれの重鎖は、配列番号６４中に示すように、ＩｇＧ４ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むことが好ましい。
【０１３９】
Ｆｃ定常領域ドメインの配列変形も使用可能であることは理解されよう。
【０１４０】
一実施形態では、それぞれの重鎖は、位置４０９（ＥＵナンバリング）におけるアルギニンがリシン、スレオニン、メチオニン又はロイシンで置換されて低ｐＨでの凝集体形成が阻害される（ＵＳ２００８／００６３６３５  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．）、ＩｇＧ４ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。ＣＤＣ活性を弱めるための（ＵＳ２００８／００６３６３５  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．）、（ＥＵナンバリングシステムに従いナンバリングした）Ｌ２３５、Ｄ２６５、Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３３１及びＰ３２９における突然変異も教示される。
【０１４１】
（ＥＵナンバリングシステムに従いナンバリングした）位置４０９におけるアルギニン残基、位置４０５におけるＰｈｅ残基又は位置３７０におけるＬｙｓの置換によりＦａｂアーム交換する低い能力を有する安定ＩｇＧ４抗体を開示するＷＯ２００８／１４５１４２  Ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．中に教示されたような突然変異を、それぞれの重鎖は含み得る。
【０１４２】
一実施形態では、それぞれの重鎖は、配列番号６５中に示すように、ＩｇＧ４ＣＨ２ドメイン及びＩｇＧ１ＣＨ３ドメインを含む。
【０１４３】
抗体が突然変異ＩｇＧ３、ＩｇＤ又はＩｇＭ抗体である本発明の実施形態では、それぞれの重鎖は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、及び場合によってはＣＨ４ドメインを含むことが好ましい。ＩｇＧ３抗体では、それぞれの重鎖はＩｇＧ３ＣＨ２ドメイン及びＩｇＧ３ＣＨ３ドメインを含むことが好ましい。ＩｇＤ抗体では、それぞれの重鎖はＩｇＤＣＨ２ドメイン及びＩｇＤＣＨ３ドメインを含むことが好ましい。ＩｇＭ抗体では、それぞれの重鎖はＩｇＭＣＨ２ドメイン、ＩｇＭＣＨ３ドメイン及びＩｇＭＣＨ４ドメインを含むことが好ましい。
【０１４４】
一実施形態では、抗体はモノクローナル、完全ヒト、ヒト化又はキメラ抗体断片である。一実施形態では、抗体は完全ヒト又はヒト化である。
【０１４５】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技法（Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，１９７５，２５６，４９５−４９７）、トリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，１９８３，４，７２）及びＥＢＶハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，「モノクローナル抗体と癌治療（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ）」，ｐｐ．７７−９６，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）などの、当技術分野で知られている任意の方法により調製することができる。
【０１４６】
本発明中で使用するための抗体は、例えばＢａｂｃｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９６，９３（１５），７８４３−７８４８，ＷＯ９２／０２５５１，ＷＯ２００４／０５１２６８及びＷＯ２００４／１０６３７７により記載された方法によって、特異的抗体の生成用に選択した単一リンパ球から作製した免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡのクローニング及び発現により、単一リンパ球抗体法を使用して作製することもできる。
【０１４７】
ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び非ヒト種由来の１つ又は複数のドナー残基を場合によっては含むヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する、非ヒト種由来の抗体分子である（例えば、ＵＳ５，５８５，０８９参照）。
【０１４８】
本発明中で使用するための抗体は、当技術分野で知られている様々なファージディスプレイ法を使用して作製することもでき、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９５，１８２，４１−５０；Ａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９５，１８４，１７７−１８６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９４，２４，９５２−９５８；Ｐｅｒｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１９９７  １８７，  ９−１８；及びＢｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，「免疫学の進歩（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」，１９９４，５７，１９１−２８０；ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；及びＷＯ９５／２０４０１；及びＵＳ５，６９８，４２６、５，２２３，４０９、５，４０３，４８４、５，５８０，７１７、５，４２７，９０８、５，７５０，７５３、５，８２１，０４７、５，５７１，６９８、５，４２７，９０８、５，５１６，６３７、５，７８０，２２５、５，６５８，７２７、５，７３３，７４３、及び５，９６９，１０８により開示されたものを含む。さらに、トランスジェニックマウス、又は他の哺乳動物を含めた他の生物を使用して、ヒト化抗体を作製することができる。
【０１４９】
完全ヒト抗体は、重鎖と軽鎖の両方の可変領域と定常領域（存在する場合）がいずれもヒト起源である、又は必ずしも同じ抗体に由来するわけではないが、ヒト起源の配列と実質的に同一である抗体である。完全ヒト抗体の例は、例えば前に記載したファージディスプレイ法によって生成される抗体、及び例えば、ＥＰ０５４６０７３Ｂ１、ＵＳ５，５４５，８０６、ＵＳ５，５６９，８２５、ＵＳ５，６２５，１２６、ＵＳ５，６３３，４２５、ＵＳ５，６６１，０１６、ＵＳ５，７７０，４２９号、ＥＰ０４３８４７４Ｂ１及びＥＰ０４６３１５１Ｂ１中に一般的に記載された、マウス免疫グロブリン可変及び／又は定常領域遺伝子がそれらのヒト相当物によって置換されているマウスによって生成される抗体を含むことができる。
【０１５０】
本発明中で使用するための抗体出発物質は、抗体の可変及び定常領域（単数又は複数）をコードするＤＮＡの操作及び再発現を含む、組換えＤＮＡ技法の使用によって調製することができる。標準的な分子生物学の技法を使用して、望む場合アミノ酸又はドメインを修飾、付加又は欠失することができる。可変又は定常領域に対する任意の改変が、本明細書で使用する用語「可変」及び「定常」領域により依然として包含される。
【０１５１】
抗体出発物質は、例えばマウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ラクダ、ラマ、ヤギ又はヒトを含めた任意の種から得ることができる。抗体の一部分は２つ以上の種から得ることができる。例えば抗体はキメラであってよい。一例では、定常領域は一種に由来し、可変領域は他種に由来する。抗体出発物質は修飾することもできる。別の例では、組換えＤＮＡ操作技法を使用して抗体の可変領域を作製している。このような操作型は、例えば天然抗体のアミノ酸配列の挿入、欠失又は変更によって天然抗体可変領域から作製されたものを含む。このタイプの具体例には、一抗体由来の少なくとも１つのＣＤＲ、及び場合によっては１つ又は複数のフレームワークアミノ酸を含有する操作型可変領域ドメイン、及び第二の抗体由来の残りの可変領域ドメインがある。これらの抗体を作製及び製造するための方法は、当技術分野でよく知られている（例えば、Ｂｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ４，８１６，３９７；Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ６，３３１，４１５；Ｓｈｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９２／０２５５１；Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ，３４１，５４４；Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，３８３３；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３２２，３２３；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ５，５８５，０８９；Ａｄａｉｒ，ＷＯ９１／０９９６７；Ｍｏｕｎｔａｉｎ  ａｎｄ  Ａｄａｉｒ，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ，１０，１−１４２；Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１６，１６５−１８１を参照）。
【０１５２】
一実施形態では、抗体は、同族対である結合ドメインを形成する可変ドメイン対を含む。本明細書で利用する同族対は、即ち単一抗体又は抗体発現細胞から単離した、可変ドメインの本来の対を指すものとする。
【０１５３】
可変ドメインは最適化及び／又はヒト化されている可能性がある。
【０１５４】
同族対に由来する最適化／ヒト化可変ドメインは、最適化／ヒト化後、同族対と依然考えられる。
【０１５５】
したがって本発明は、ヒト、ヒト化又はキメラ分子に及ぶ。
【０１５６】
一実施形態では、分子は標的抗原と特異的に結合する。本明細書で利用する特異的結合は、（それが特異的である）標的抗原に対する高い親和性を有し、低い若しくは一層低い親和性で、それが特異的でない抗原と結合する（又は全く結合しない）分子を指すものとする。親和性を測定するための方法は当業者に知られており、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）などのアッセイを含む。
【０１５７】
本発明の抗体分子は、特にナノモル又はピコモルで、高い結合親和性を適切に有する。ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）を含めた当技術分野で知られている任意の適切な方法を使用して、親和性を測定することができる。一実施形態では、本発明の分子は約１００ｐＭ以上の結合親和性を有する。一実施形態では、本発明の分子は約５０ｐＭ以上の結合親和性を有する。一実施形態では、本発明の分子は約４０ｐＭ以上の結合親和性を有する。一実施形態では、本発明の分子は約３０ｐＭ以上の結合親和性を有する。一実施形態では、本発明の分子は完全ヒト又はヒト化であり、約１００ｐＭ以上の結合親和性を有する。
【０１５８】
本明細書で利用する本来存在するドメインの誘導体は、本来存在する配列中の１、２、３、４又は５アミノ酸が例えば置換又は欠失して、望ましくない性質の排除などによりドメインの性質が最適化したが、ドメインの特徴的な性質（単数又は複数）は保持される誘導体を指すものとする。
【０１５９】
一実施形態では、本発明の抗体分子は１つ又は複数のアルブミン結合ペプチドを含む。ｉｎ  ｖｉｖｏではペプチドはアルブミンと結合し、それによって分子の半減期は増大する。
【０１６０】
アルブミン結合ペプチドは、１つ又は複数の可変領域、分子のヒンジ又はＣ末端、又は分子の抗原結合性に干渉しない任意の位置から付加し得る。
【０１６１】
アルブミン結合ペプチドの例はＷＯ２００７／１０６１２０中に提供される。
【０１６２】
抗体が様々な翻訳後修飾を経る可能性があることも、当業者によって理解されよう。これらの修飾のタイプ及び程度は、分子を発現させるために使用する宿主細胞系、及び培養条件に依存することが多い。このような修飾は、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸異性化及びアスパラギン脱アミド化の変形を含むことができる。（Ｈａｒｒｉｓ，ＲＪ．「クロマトグラフィージャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）」７０５：１２９−１３４，１９９５中に記載されたように）、頻繁な修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用により（リシン又はアルギニンなどの）カルボキシ末端塩基性残基の消失となる。
【０１６３】
望む場合、本発明中で使用するための分子は１つ又は複数のエフェクター分子（単数又は複数）と結合させることが可能である。エフェクター分子が、本発明の抗体分子と結合することができる一成分を形成するように連結した、１個のエフェクター分子又は２個以上のこのような分子を含むことができることは理解されよう。エフェクター分子と連結した本発明による抗体を得ることを望む場合、抗体を直接的に、又はカップリング剤を介してエフェクター分子に連結させる、標準的化学手順又は組換えＤＮＡ手順によりこれを調製することができる。このようなエフェクター分子を抗体と結合させるための技法は、当技術分野でよく知られている（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，「徐放型薬剤送達（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７，ｐｐ．６２３−５３；Ｔｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，「薬理学及び治療学（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」８３，６７−１２３を参照）。個々の化学手順には、例えば、ＷＯ９３／０６２３１、ＷＯ９２／２２５８３、ＷＯ８９／００１９５、ＷＯ８９／０１４７６及びＷＯ０３０３１５８１中に記載された手順がある。或いは、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、例えばＷＯ８６／０１５３３及びＥＰ０３９２７４５中に記載されたような組換えＤＮＡ手順を使用して、連結を得ることができる。
【０１６４】
本明細書で使用する用語エフェクター分子は、例えば抗新生物薬、薬剤、毒素、生物活性タンパク質、例えば酵素、他の抗体若しくは抗体断片、合成若しくは天然に存在するポリマー、核酸及びその断片、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ及びその断片、放射性核種、特に放射性ヨウ素、放射性同位体、キレート金属、ナノ粒子、及び蛍光化合物などのレポーター群、又はＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光法により検出可能な化合物を含む。
【０１６５】
エフェクター分子の例は、細胞に有害である（例えば殺傷する）任意の作用物質を含めた、サイトトキシン又は細胞毒性物質を含むことができる。例には、コンブレスタチン（ｃｏｍｂｒｅｓｔａｔｉｎｓ）、ドラスタチン、エポチロン、スタウロスポリン、メイタンシノイド、スポンジスタチン、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン、ヘミアステルリン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルチシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン、並びにこれらのアナログ又はホモログがある。
【０１６６】
エフェクター分子には、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ベロマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリケアマイシン又はデュオカルマイシン）、及び抗分裂剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）もあるが、これらだけには限られない。
【０１６７】
他のエフェクター分子は、１１１Ｉｎ及び９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリフォルニウム２５２、イリジウム１９２及びタングステン１８８／レニウム１８８などのキレート化放射性核種、又はアルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイド及びスラミンなどだけには限られないが、これらの薬剤を含むことができる。
【０１６８】
他のエフェクター分子には、タンパク質、ペプチド及び酵素がある。対象の酵素には、タンパク質分解酵素、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼがあるが、これらだけには限られない。対象のタンパク質、ポリペプチド及びペプチドには、免疫グロブリン、アブリン、リシンＡ、シュードモナスエキソトキシン、又はジフテリア毒素などの毒素、インスリン、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経増殖因子、血小板由来増殖因子又は組織プラスミノゲンアクチベータなどのタンパク質、抗血栓薬、又は抗血管新生薬、例えばアンギオスタチン若しくはエンドスタチン、又はリンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）又は他の増殖因子及び免疫グロブリンなどの生物反応修飾物質があるが、これらだけには限られない。
【０１６９】
他のエフェクター分子は、例えば診断において有用な検出可能な物質を含むことができる。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性核種、（ポジトロンエミッショントモグラフィーにおいて使用するための）ポジトロン放出金属、及び非放射性常磁性金属イオンがある。診断剤として使用するための抗体と結合可能な金属イオンに関する、米国特許第４，７４１，９００号を一般に参照。適切な酵素にはホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼがあり、適切な補欠分子団にはストレプトアビジン、アビジン及びビオチンがあり、適切な蛍光物質にはウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド及びフィコエリスリンがあり、適切な発光物質にはルミノールがあり、適切な生物発光物質にはルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンがあり、且つ適切な放射性核種には１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ及び９９Ｔｃがある。
【０１７０】
別の例では、エフェクター分子はｉｎ  ｖｉｖｏで抗体の半減期を増大することができ、及び／又は抗体の免疫原性を低減することができ、及び／又は免疫系への上皮壁を介した抗体の送達を高めることができる。このタイプの適切なエフェクター分子の例には、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質又はアルブミン結合化合物、ＷＯ０５／１１７９８４中に記載されたものなどがある。
【０１７１】
エフェクター分子がポリマーである場合、それは一般に、合成又は天然に存在するポリマー、例えば場合によっては置換された直鎖状若しくは分岐鎖状ポリアルキレン、ポリアルケニレン若しくはポリオキシアルキレンポリマー、又は分岐鎖状若しくは非分岐鎖状多糖、例えばホモ−若しくはヘテロ−多糖であり得る。
【０１７２】
前述の合成ポリマー上に存在し得る具体的な任意選択の置換基には、１つ又は複数のヒドロキシ、メチル若しくはメトキシ基がある。
【０１７３】
合成ポリマーの具体例には、場合によっては置換された直鎖状若しくは分岐鎖状ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）ポリ（ビニルアルコール）又はそれらの誘導体、特に場合によっては置換されたメトキシポリ（エチレングリコール）などのポリ（エチレングリコール）又はそれらの誘導体がある。
【０１７４】
具体的な天然に存在するポリマーには、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン又はそれらの誘導体がある。
【０１７５】
本明細書で使用する「誘導体」は、反応性誘導体、例えばチオール選択的反応基、例えばマレイミドなどを含むものとする。反応基はポリマーと直接、又はリンカーセグメントを介してポリマーと連結することができる。幾つかの場合このような基は、本開示の抗体とポリマーの間の連結基として生成物の一部を形成することは理解されよう。
【０１７６】
ポリマーの大きさは必要に応じて変えることはできるが、一般に５００Ｄａ〜５００００Ｄａ、例えば５０００〜４００００Ｄａ、２００００〜４００００Ｄａなどの平均分子量範囲である。特にポリマーの大きさは、生成物の目的用途、例えば腫瘍などの特定組織に局在する能力、又は長い循環半減期に基づいて選択することができる（総説に関しては、Ｃｈａｐｍａｎ，２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，５４，５３１−５４５を参照）。したがって、例えば生成物を、例えば腫瘍の治療において使用するために、循環中に放置し組織に浸透させることを目的とする場合、低分子量ポリマー、例えば約５０００Ｄａの分子量を有するポリマーを使用することが有利である可能性がある。生成物を循環中に放置する場合の適用例に関しては、高分子量ポリマー、例えば２００００Ｄａ〜４００００Ｄａの範囲の分子量を有するポリマーを使用することが有利である可能性がある。
【０１７７】
適切なポリマーには、ポリアルキレンポリマー、ポリ（エチレングリコール）又は、特に、メトキシポリ（エチレングリコール）又はそれらの誘導体など、及び特に約１５０００Ｄａ〜約４００００Ｄａの範囲の分子量を有するポリマーがある。
【０１７８】
一例では、本発明中で使用するための抗体をポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分と結合させる。１つの具体例では、抗体中に位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基、例えば任意の遊離アミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシル若しくはカルボキシル基を介して、ＰＥＧ分子を結合させることが可能である。このようなアミノ酸は抗体中に本来存在する可能性があり、又は組換えＤＮＡ法を使用して抗体中に操作することができる（例えば、ＵＳ５，２１９，９９６、ＵＳ５，６６７，４２５、ＷＯ９８／２５９７１を参照）。一例では本発明の分子は、その修飾がエフェクター分子の結合を可能にするためのその重鎖の１つ又は複数のアミノ酸のＣ末端への付加である、修飾抗体である。多数の部位を使用して２つ以上のＰＥＧ分子を結合させることが可能である。
【０１７９】
一実施形態では、ＰＥＧ分子を軽鎖中のシステイン１７１と連結させる。例えば、参照として本明細書に組み込まれるＷＯ２００８／０３８０２４を参照。
【０１８０】
ＰＥＧ分子は、抗体中に位置する少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して共有結合させることが適切である。修飾抗体と結合するそれぞれのポリマー分子は、抗体中に位置するシステイン残基のイオウ原子に共有結合させることが可能である。一般に共有結合は、ジスルフィド結合又は、特に、イオウ−炭素結合である。適切に活性化したエフェクター分子の結合地点としてチオール基を使用する場合、例えば、マレイミド及びシステイン誘導体などのチオール選択的誘導体を使用することができる。前に記載したポリマー修飾抗体の調製中の出発物質として、活性化ポリマーを使用することができる。活性化ポリマーは、チオール反応基、例えばα−ハロカルボン酸又はエステル、例えばヨードアセトアミド、イミド、例えばマレイミド、ビニルスルホン又はジスルフィドなどを含有する任意のポリマーであってよい。このような出発物質は（例えばＮｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｉｎｃ．、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ、ＵＳＡから）市販されているものを得ることができ、又は従来の化学的手順を使用して市販の出発物質から調製することができる。特定のＰＥＧ分子は、２０Ｋメトキシ−ＰＥＧ−アミン（Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ；Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ；ａｎｄ  ＳｕｎＢｉｏから入手可能）及びＭ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒから入手可能）を含む。
【０１８１】
本発明は、本明細書に記載する抗体分子をコードする単離ＤＮＡも提供する。
【０１８２】
さらなる態様では、前記ＤＮＡを含むベクターを提供する。
【０１８３】
それによってベクターを構築することができる一般的な方法、トランスフェクション法及び培養法は当業者によく知られている。この点に関しては、「分子生物学における現代のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、１９９９、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ）、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、及びＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇによって作成されたＭａｎｉａｔｉｓ  Ｍａｎｕａｌを参照。
【０１８４】
さらなる態様では、前記ベクター及び／又はＤＮＡを含む宿主細胞を提供する。
【０１８５】
任意の適切な宿主細胞／ベクター系を、本発明の分子をコードするＤＮＡ配列の発現に使用することができる。細菌、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、及び他の微生物系を使用することができ、又は真核生物、例えば哺乳動物、宿主細胞発現系も使用することができる。適切な哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ、ミエローマ又はハイブリドーマ細胞がある。
【０１８６】
本発明は、本明細書に記載する抗体分子を生成するための方法であって、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡからタンパク質の発現をもたらすのに適した条件下で本発明のベクター（及び／又はＤＮＡ）を含有する宿主細胞を培養すること、及び抗体分子を単離することを含む方法も提供する。
【０１８７】
重鎖と軽鎖の両方を含む産物を生成するために、２つのベクター、軽鎖ポリペプチドをコードする第一のベクター及び重鎖ポリペプチドをコードする第二のベクターで細胞系をトランスフェクトすることができる。或いは、１つのベクター、軽鎖及び重鎖ポリペプチドをコードする配列を含むベクターを使用することができる。
【０１８８】
本開示による抗体分子は、それらを商業的処理に施すのに適切なレベルで宿主細胞から発現される。
【０１８９】
抗体は任意の標的抗原に対して特異的であってよい。抗原は、細胞結合タンパク質、例えば細菌細胞、酵母細胞、Ｔ細胞、内皮細胞又は腫瘍細胞などの細胞上の細胞表面タンパク質であってよく、又はそれは可溶性タンパク質であってよい。対象の抗原は、疾患又は感染中に上方制御されるタンパク質などの何らかの医学的関連があるタンパク質、例えば受容体及び／又はそれらの対応するリガンドであってもよい。細胞表面タンパク質の具体例には、接着性分子、例えばβ１インテグリンなどのインテグリン、例えばＶＬＡ−４、Ｅ−セレクチン、Ｐセレクチン又はＬ−セレクチン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤＷ５２、ＣＤ６９、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＩＣＯＳ、ＢＣＭＰ７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤＣＰ１、ＣＳＦ１又はＣＳＦ１−受容体、ＤＰＣＲ１、ＤＰＣＲ１、ジュジュリン２、ＦＬＪ２０５８４、ＦＬＪ４０７８７、ＨＥＫ２、ＫＩＡＡ０６３４、ＫＩＡＡ０６５９、ＫＩＡＡ１２４６、ＫＩＡＡ１４５５、ＬＴＢＰ２、ＬＴＫ、ＭＡＬ２、ＭＲＰ２、ネクチン様２、ＮＫＣＣ１、ＰＴＫ７、ＲＡＩＧ１、ＴＣＡＭ１、ＳＣ６、ＢＣＭＰ１０１、ＢＣＭＰ８４、ＢＣＭＰ１１、ＤＴＤ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ヒト乳脂肪グロブリン（ＨＭＦＧ１及び２）、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ抗原、ＫＤＲ及びＶＥＧＦ、ＰＤ−１、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＴＬ１Ａ、ＤＲ３、ＩＬ−７受容体Ａ、及び適切な場合、これらの受容体がある。
【０１９０】
可溶性抗原には、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１６、又はＩＬ−１７、例えばＩＬ１７Ａ及び／又はＩＬ１７Ｆなどのインターロイキン、ウイルス抗原、例えば呼吸器合胞体ウイルス又はサイトメガロウイルス抗原、ＩｇＥなどの免疫グロブリン、インターフェロンα、インターフェロンβ若しくはインターフェロンγなどのインターフェロン、腫瘍壊死因子ＴＮＦ（以前は腫瘍壊死因子−αとして知られ、本明細書ではＴＮＦ又はＴＮＦαと呼ぶ）、腫瘍壊死因子−β、Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子、及びＰＤＧＦ−α、及びＰＤＧＦ−β、ＷＩＳＰ−１などの血小板由来増殖因子、及び適切な場合、これらの受容体がある。他の抗原には、細菌細胞表面抗原、細菌毒素、インフルエンザ、ＥＢＶ、ＨｅｐＡ、Ｂ及びＣなどのウイルス、バイオテロ物質、放射性核種及び重金属、並びにヘビ及びクモ毒及び毒素がある。
【０１９１】
一実施形態では、抗体を使用して対象の抗原の活性を機能的に改変することができる。例えば抗体は、直接的又は間接的に、前記抗原の活性を中和、アンタゴナイズ又はアゴナイズすることができる。
【０１９２】
本発明の抗体分子は、病状の治療及び／又は予防において有用である。
【０１９３】
したがって、例えば医薬製剤中にその治療有効量を投与することにより、治療において使用するための本発明による抗体を提供する。一実施形態では、本発明による抗体を、例えば吸引により肺に局所投与する。
【０１９４】
本発明により提供される抗体は、炎症疾患及び障害、免疫疾患及び障害、線維形成障害及び癌を含めた疾患又は障害の治療において有用である。
【０１９５】
用語「炎症疾患」又は「障害」及び「免疫疾患又は障害」には、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、スティル病、Ｍｕｃｋｌｅ  Ｗｅｌｌｓ病、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、ＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、血管炎、Ｉ型糖尿病、移植及び移植片対宿主病がある。
【０１９６】
用語「線維形成障害」は、突発性肺線維症（ＩＰＦ）、全身性硬化症（又は硬皮症）、腎線維症、糖尿病性ネフロパシー、ＩｇＡネフロパシー、高血圧、末期腎疾患、腹膜線維症（持続的外来腹膜透析）、肝硬変、加齢黄斑変性（ＡＲＭＤ）、網膜症、反応性心筋線維化、瘢痕、ケロイド、火傷、皮膚潰瘍、血管形成術、冠動脈バイパス手術、関節形成術及び白内障手術を含む。
【０１９７】
用語「癌」は、皮膚又は、より一般的には、身体器官、例えば乳房、卵巣、前立腺、肺、腎臓、膵臓、胃、膀胱又は腸の内膜中で見られる、上皮から生じる悪性の新たな増殖を含む。癌は隣接組織に浸潤し、遠位器官、例えば骨、肝臓、肺又は脳に拡散（転移）する傾向がある。
【０１９８】
本発明は、１つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と組合せて、本発明の抗体を含む医薬又は診断組成物も提供する。したがって、医薬品を製造するための、本発明の抗体の使用を提供する。通常組成物は、薬学的に許容される担体を通常含む滅菌医薬組成物の一部として供給される。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容されるアジュバントを追加的に含むことができる。
【０１９９】
本発明は、１つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と一緒に本発明の抗体を添加し混合することを含む、医薬又は診断組成物を調製するための方法も提供する。
【０２００】
本開示の抗体は医薬若しくは診断組成物中の唯一の活性成分であってよく、又は他の抗体成分、例えば抗ＴＮＦ、抗ＩＬ−１β、抗Ｔ細胞、抗ＩＦＮγ若しくは抗ＬＰＳ抗体、又はキサンチンなどの非抗体成分を含めた他の活性成分を伴ってよい。他の適切な活性成分には、耐性を誘導することができる抗体、例えば抗ＣＤ３又は抗ＣＤ４抗体がある。
【０２０１】
さらなる実施形態では、本開示による抗体又は組成物は、さらなる薬学的活性物質、例えばコルチコステロイド（フルチカゾンプロピオネートなど）及び／又はβ−２−アゴニスト（サルブタモール、サルメテロール又はフォルモテロールなど）、又は細胞の成長及び増殖の阻害剤（ラパマイシン、シクロホスファミド、メトトレキサートなど）、又は別のＣＤ２８及び／又はＣＤ４０阻害剤と組合せて利用する。一実施形態では、阻害剤は小分子である。別の実施形態では、阻害剤は標的に特異的な抗体である。
【０２０２】
医薬組成物は、治療有効量の本発明の抗体を適切に含む。本明細書で使用する用語「治療有効量」は、標的疾患若しくは状態を治療、改善若しくは予防するのに必要な、又は検出可能な治療若しくは予防効果を示す治療剤の量を指す。細胞培養アッセイ又は動物モデルのいずれかにおいて、通常げっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタ又は霊長類において、治療有効量を最初に推定することができる。動物モデルを使用して、適切な濃度範囲及び投与の経路を決定することもできる。したがって、このような情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量及び投与経路を決定することができる。
【０２０３】
ヒト対象に関する正確な治療有効量は、疾患状態の重度、対象の一般的な健康状態、対象の年齢、体重及び性別、食生活、投与の時間及び頻度、薬剤の組合せ（単数又は複数）、療法に対する反応感度及び耐性／応答に依存する。この量は通常の実験によって決定することができ、臨床医の判断の範囲内にある。一般に、治療有効量は０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。医薬組成物は、用量当たり所定量の本発明の活性剤を含有する単位剤形で、好都合に存在することができる。
【０２０４】
組成物は患者に個別に投与することができ、又は他の作用物質、薬剤若しくはホルモンと併用して（例えば同時、逐次若しくは別々に）投与することができる。
【０２０５】
本発明の抗体を投与する用量は、治療する状態の性質、例えば存在する疾患／炎症の程度、及び分子を予防的に使用するか又は既存の疾患を治療するために使用するかに依存する。
【０２０６】
投与の頻度は、抗体の半減期及びその影響期間に依存する。抗体が短い半減期（例えば、２〜１０時間）を有する場合、一日当たり一回又は複数回の投与を与えることが必要であり得る。或いは、抗体が長い半減期（例えば、２〜１５日間）を有する場合、一日当たり一回、一週間当たり一回、又はさらに１ヶ月若しくは２ヶ月毎に一回のみ投与を与えることが必要であり得る。
【０２０７】
薬学的に許容される担体自体は、組成物を与える個体に有害な抗体の生成を誘導することはないはずであり、毒性であってはならない。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー及び不活性ウイルス粒子などの、高分子の、ゆっくり代謝されるマクロ分子であってよい。
【０２０８】
薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩及び硫酸塩などの無機酸塩、又は酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩及び安息香酸塩などの有機酸塩を使用することができる。
【０２０９】
治療用組成物中の薬学的に許容される担体は、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールなどの液体を追加的に含有することができる。追加的に、湿潤剤若しくは乳化剤若しくはｐＨ緩衝物質などの補助物質が、このような組成物中に存在してよい。このような担体は、患者により摂取される、錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー及び縣濁液として医薬組成物を製剤化するのを可能にする。
【０２１０】
投与に適した形には、非経口投与に適した形、例えば注射又は注入による投与、例えばボーラス注射又は連続注入による投与がある。製品が注射又は注入用である場合、それは油性又は水性媒体中の縣濁液、溶液又はエマルジョンの形をとってよく、それは縣濁剤、防腐剤、安定剤及び／又は分散剤などの調節物質を含有することができる。或いは、本開示の分子は、適切な滅菌液で使用前に元に戻すための乾燥形であってよい。
【０２１１】
製剤化後、本発明の組成物は対象に直接投与することができる。治療する対象は動物であってよい。しかしながら、１つ又は複数の実施形態では、ヒト対象への投与に組成物を適合させる。
【０２１２】
本開示による製剤において、最終製剤のｐＨが抗体の等電点の値と類似していないことが適切である。例えば製剤のｐＨが７である場合、したがって８〜９以上のｐＩが適切であり得る。理論によって束縛されることは望まないが、これは改善された安定性を有する最終製剤を最終的にもたらす可能性があり、例えば抗体が溶液中に残存すると考えられる。
【０２１３】
本発明の医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、くも膜下内、心室内、経真皮、経皮（例えば、ＷＯ９８／２０７３４参照）、皮下、腹膜内、鼻腔内、腸溶性、局所、舌下、膣内又は直腸経路だけには限られないが、これらを含めた任意の数の経路によって投与することができる。皮下スプレーを使用して、本発明の医薬組成物を投与することもできる。典型的には、治療用組成物は注射可能な物質として、液体溶液又は縣濁液のいずれかとして調製することができる。注射前に液体媒体中の溶液又は縣濁液に適した固体形も調製することができる。
【０２１４】
組成物の直接送達は一般に皮下、腹膜内、静脈内又は筋肉内注射によって実施することができ、又は組織の間質空間に送達することができる。組成物は病変に投与することもできる。投与治療は、一回投与スケジュール又は複数回投与スケジュールであってよい。
【０２１５】
組成物中の活性成分は抗体であろうことは理解されよう。このように、それは胃腸管中で分解を受けやすい。したがって、胃腸管を使用した経路によって組成物を投与する場合、組成物は分解から抗体を保護するが、胃腸管から吸収された後に抗体を放出する作用物質を含有する必要がある。
【０２１６】
薬学的に許容される担体の徹底的な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．１９９１）において入手可能である。
【０２１７】
一実施形態では、吸引を含めた局所投与用の製剤として製剤を提供する。
【０２１８】
適切で吸引可能な調製物には、吸引可能な粉末、プロペラントガスを含有する調節エアロゾル、又はプロペラントガスを含まない吸引可能な溶液がある。活性物質を含有する本開示による吸引可能な粉末は前述の活性物質のみから、又は前述の活性物質と生理的に許容される賦形剤の混合物からなる可能性がある。
【０２１９】
これらの吸引可能な粉末は、単糖（例えば、グルコース又はアラビノース）、二糖（例えば、ラクトース、サッカロース、マルトース）、オリゴ−及び多糖（例えば、デキストラン）、ポリアルコール（例えば、ソルビトール、マンニトール、キシリトール）、塩（例えば、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム）又はこれらの互いの混合物を含むことができる。単糖又は二糖の使用、特にラクトース又はグルコースの使用が適切であるが、ただしそれらの水和物の形のみではない。
【０２２０】
肺中に沈着する粒子は、１０ミクロン未満、１〜９ミクロンなど、例えば０．１〜５μｍ、特に１〜５μｍの粒径を必要とする。活性成分（抗体など）の粒径が最も重要である。
【０２２１】
吸引可能なエアロゾルを調製するために使用することができるプロペラントガスは、当技術分野で知られている。適切なプロペラントガスは、ｎ−プロパン、ｎ−ブタン又はイソブタンなどの炭化水素、及びメタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパン若しくはシクロブタンの塩素化誘導体及び／又はフッ素化誘導体などのハロ炭化水素中から選択される。前述のプロペラントガスは単独で、又はそれらの混合物で使用することができる。
【０２２２】
特に適切なプロペラントガスは、ＴＧ１１、ＴＧ１２、ＴＧ１３４ａ及びＴＧ２２７中から選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。前述のハロゲン化炭化水素の中では、ＴＧ１３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）及びＴＧ２２７（１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン）及びこれらの混合物が特に適している。
【０２２３】
プロペラントガスを含有する吸引可能なエアロゾルは、共溶媒、安定剤、表面活性物質（界面活性剤）、抗酸化剤、潤滑剤、及びｐＨを調節するための手段などの、他の成分も含有し得る。全てのこれらの成分は当技術分野で知られている。
【０２２４】
本発明によるプロペラントガスを含有する吸引可能なエアロゾルは、最大５重量％の活性物質を含有し得る。本発明によるエアロゾルは、例えば０．００２〜５重量％、０．０１〜３重量％、０．０１５〜２重量％、０．１〜２重量％、０．５〜２重量％、又は０．５〜１重量％の活性成分を含有する。
【０２２５】
或いは、肺への局所投与は、例えばネブライザー、例えばコンプレッサーと接続したネブライザー（例えば、Ｐａｒｉ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ、Ｉｎｃ．、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｖａによって製造されたＰａｒｉ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒ）コンプレッサーと接続したＰａｒｉ  ＬＣ−Ｊｅｔ  Ｐｌｕｓ（Ｒ）ネブライザー）などのデバイスを利用した、液体溶液又は縣濁液製剤の投与による投与であってもよい。
【０２２６】
本発明の抗体は、溶媒中に分散させて、例えば溶液又は縣濁液の形で送達することができる。本発明の抗体は、適切な生理溶液、例えば、生理食塩水又は他の薬理的に許容される溶媒又は緩衝溶液中に縣濁することができる。当技術分野で知られる緩衝溶液は、約４．０〜５．０のｐＨを得るために、水１ｍＬ当たり０．０５ｍｇ〜０．１５ｍｇのエデト酸二ナトリウム、８．０ｍｇ〜９．０ｍｇのＮａＣｌ、０．１５ｍｇ〜０．２５ｍｇのポリソルベート、０．２５ｍｇ〜０．３０ｍｇの無水クエン酸、及び０．４５ｍｇ〜０．５５ｍｇのクエン酸ナトリウムを含有することができる。縣濁物質、例えば凍結乾燥分子を利用することができる。
【０２２７】
治療用縣濁液又は溶液製剤は、１つ又は複数の賦形剤も含有し得る。賦形剤は当技術分野でよく知られており、バッファー（例えば、クエン酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー及び重炭酸塩バッファー）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、及びグリセロールを含む。溶液又は縣濁液は、リポソーム又は生分解性ミクロスフェア中に封入することができる。一般に製剤は、滅菌製造プロセスを利用して実質的に滅菌状態の形で提供される。
【０２２８】
これは、当業者が精通している方法による、製剤に使用する緩衝溶媒／溶液、滅菌緩衝溶媒溶液中の分子の無菌縣濁液の濾過、及び滅菌容器中への製剤の分散による、生成及び滅菌を含むことができる。
【０２２９】
本開示による噴霧可能な製剤は、例えば、ホイルエンベロープに包まれた一回用量単位（例えば、密閉プラスチック容器又はバイアル）として提供することができる。それぞれのバイアルは、体積、例えば２ｍＬの溶媒／溶液バッファー中に単位用量を含有する。
【０２３０】
本開示の抗体は、噴霧による送達に特に適していると考えられる。
【０２３１】
本明細書の文脈における含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）は、含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）を意味するものとする。
【０２３２】
技術的に適切である場合、本発明の実施形態は組合せることができる。
【０２３３】
本発明はここで以下の実施例を参照しながら記載し、これらの実施例は単なる例示的なものであり、決して本発明の範囲を制限するとして解釈すべきではない。
【実施例】
【０２３４】
１．ＩｇＧ４重鎖の突然変異誘発及び突然変異型ＩｇＧ４重鎖一遺伝子ベクターの作製
アミノ酸の突然変異を、Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ（登録商標）Ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（ＳＤＭ）キット又はＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ（登録商標）ＩＩＤＳＭキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標）から入手）（それぞれカタログ番号２１０５１６及び２００５２１）を使用して実施し、製造者の説明書に従い実施した。
【０２３５】
突然変異はＤＮＡ配列決定によって確認した。以下の表中の少なくとも抗体１〜４７のＩｇＧ４重鎖を生成した：
【表２】
0005894160.tif 000004
【０２３６】
抗体４８の重鎖（配列番号３５）をＰＣＲ及び制限酵素クローニングによって作製した。ＰＣＲ産物は、ＩｇＧ１上部及びコアヒンジ領域配列及び制限部位ＢｇｌＩＩをコードするフォワードオリゴ、並びに制限酵素ＤｒａＩＩＩをコードするリバースオリゴによって作製した。次いでＰＣＲ断片を前述の酵素で消化し、適切な可変領域を含有するｈＧ４一遺伝子ベクターに連結させた。
【０２３７】
２．突然変異型ＩｇＧ４抗体の発現
全ての突然変異ＤＮＡをＣＨＯＫ１細胞又はＣＨＯ−ＳＸＥ細胞にトランスフェクトした。細胞（２×１０８個の細胞／ｍｌ）は１ｍｌのアール平衡塩類溶液（Ｓｉｇｍａ）中に再縣濁し、４００μｇのＤＮＡ（２００μｇの重鎖ＤＮＡ及び２００μｇのｋａｐｐａ軽鎖ＤＮＡ）と混合した。８００μｌのアリコートを０．４ｃｍのキュベット（Ｂｉｏｒａｄ）に移した。５００ｍｌの培養用に、６つのキュベットを以下のパラメーターの下でエレクトロポレーション処理した。１ｍｓ、９．６Ａｍｐｓ、１０ｍｓ、０Ａｍｐｓ、４０ｍｓ、３．２Ａｍｐｓ。トランスフェクトした細胞は、３７ｏＣで５％ＣＯ２湿度環境において１４０ｒｐｍで攪拌しながら２４時間インキュベートし、１０〜１３日間３２ｏＣでトランスフェクション後第２日から続けた。トランスフェクション後第４日に、１．６ｍｌの１Ｍ酪酸ナトリウムを培養物に加えた。細胞が４０％の生存率に達した後、又は第１３日までに、上清を採取した。培養物は４０００ｒｐｍで４５分間遠心分離した。上清は０．２２μＭのＳｔｅｒｉｃｕｐフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通して精製した。図２８中のデータは、操作型突然変異体によってコードされるＩｇＧ４の耐熱性の変化は、ＣＨＯ−Ｋ１又はＣＨＯ−ＳＸＥ細胞の一方からタンパク質が生成されたときと同じであったことを示す。
【０２３８】
３．突然変異型ＩｇＧ４抗体の精製
上清（２００〜５００ｍｌ）を、プロテインＡ５ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＵＫ）を使用して精製した。２Ｍトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．５の上清体積の５０分の１を加えることによりサンプルを調製した。サンプルは１ｍｌ／分でカラムに充填した。カラムはＰＢＳ  ｐＨ７．４で洗浄した。サンプルを溶出するため、０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．４を１ｍｌ／分でカラムに通し、０．５ｍｌ分画を回収した。０．１２５ｍｌの２Ｍトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．５をそれぞれに加えることにより、ピーク分画を中和した。ＵＶ検出は２８０ｎｍで設定した。
【０２３９】
例４．精製した突然変異型ＩｇＧ４抗体の特徴付け
ＳＤＳＰＡＧＥ解析：
粗製上清を１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＯＣＴＥＴで定量化した。適量の抗体、４×ローディングバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び２μｌの１００ｍＭ  ＮＥＭを加えることにより、抗体サンプル（２５〜３０ｎｇ）を調製した。ｄＨ２Ｏを使用して２０μｌの合計体積を作製した。次いでサンプルを１００℃で３分間煮沸し、１５ウエル１．５ｍｍの４〜２０％トリス−グリシンゲル上に載せた。１×タンクバッファー中で１．５時間１５０Ｖをゲルに施した。８分間の移動に設定したｉＢｌｏｔ乾燥移動システムを使用して、抗体をニトロセルロース膜に移した。膜は攪拌プラットフォームでＰＢＳ−ＴＭにおいて室温（ＲＴ）で１時間インキュベートし、次に室温で攪拌しながら１時間、ウサギ抗ヒトＩｇＧＦｃＨＲＰ結合抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）又はヤギ抗ヒトＫａｐｐａ軽鎖ＨＲＰ結合抗体（Ｂｅｔｈｙｌ）とインキュベートした。これに、それぞれＰＢＳ−Ｔで５分間３回の洗浄を続けた。製造者の説明書に従い（Ｐｉｅｒｃｅ）金属増感型ＤＡＢ基質キットを使用して、ブロットを解明した。
【０２４０】
ウエスタンブロット解析の結果を図７、８、９及び１０中に示す。図７〜１０中、Ｈは重鎖を表し、Ｌは軽鎖を表し、Ｈ２Ｌ２は２重鎖及び２軽鎖を含む完全抗体分子であり、ＨＬは１重鎖及び１軽鎖を含む半分子である。
【０２４１】
図７は、抗体１５、１６、６、７、８、１７、１８、１９、１、２、３、１２及び１３に関するウエスタンブロット解析を示す。ヒンジ突然変異体Ｃ２３９ＳとＣ２４２Ｓの両方の存在のためＨ２Ｌ２を全く又はほとんど示さない抗体８以外、抗体が優れたレベルのＨ２Ｌ２を示すことを図７から見ることができる。しかしながら、抗体８は重鎖間の非共有結合によりＨ２Ｌ２を形成することができる。突然変異体３もＨ２Ｌ２をほとんど示さず、この突然変異体はＣ２３９を保持するが、おそらくＣ末端軽鎖（ＬＣ）システインとヒンジＣ２３９の間の効率よいジスルフィド形成のため、ヒンジ中で鎖間ジスルフィド結合を形成することはできない。突然変異体Ｃ２３９Ｓを含むがＣ２４２Ｓは含まない抗体（抗体２、６及び１２）は、Ｃ２３９ＳもＣ２４２Ｓも含まない抗体又はＣ２４２Ｓを含むがＣ２３９Ｓは含まない抗体と比較して、ＨＬの形成の低減を示すことを見ることもできる。Ｓ２４１Ｐ突然変異体を含む抗体１６もＨＬの形成の低減を示す。突然変異体２と３の比較は重鎖とジスルフィド結合を形成する軽鎖のＣ末端システインの「到達」の程度を示し、軽鎖システインは、重鎖中のＣ２４２よりＣ２３９と効率よく結合するようである。
【０２４２】
図８は、抗体１５、６、７、８、２８、２９、３０、３１、１７、１９、３２、３３、３３、３４、３５、３６、３７、３８及び３９に関するウエスタンブロット解析を示す。ヒンジ領域中の突然変異体Ｃ２３９ＳとＣ２４２Ｓの存在のためＨ２Ｌ２を全く又はほとんど示さない抗体８、３１、３５及び３９以外、抗体が優れたレベルのＨ２Ｌ２を示し、したがって２重鎖間でジスルフィド結合が形成されないことを図８から見ることができる。しかしながら、抗体８、３１、３５及び３９は重鎖間の非共有結合によりＨ２Ｌ２を形成することができる。突然変異体Ｃ２３９Ｓを含むがＣ２４２Ｓは含まない抗体（抗体６、２９、３３及び３７）は、Ｃ２３９ＳもＣ２４２Ｓも含まない抗体又はＣ２４２Ｓを含むがＣ２３９Ｓは含まない抗体と比較して、ＨＬの形成の低減を示すことを見ることもできる。突然変異体１５は、ＣＨ１及び重鎖間ジスルフィドにおいて軽鎖とＧ２３０Ｃの間でジスルフィド結合を形成することができ、したがって完全構築及びジスルフィド結合タンパク質をもたらす。さらに、突然変異体１５（Ｃ１２７Ｓ  Ｇ２３０Ｃ）、２８（Ｃ１２７Ｓ  Ｙ２２９Ｃ）、３２（Ｃ１２７Ｓ  Ｋ２２８Ｃ）及び３６（Ｃ１２７Ｓ  Ｓ２２７Ｃ）の比較は、上部ヒンジ中に導入するシステインの位置によって、ＬＣ−ＨＣ間のジスルフィド結合形成が改善することを示す。Ｇ２３０及びＹ２２９は、システインを導入するのに特に好ましい位置である。突然変異体２８（Ｃ１２７Ｓ  Ｙ２２９Ｃ）は低レベルのＨＬ及びＨ２を示し、したがって低いジスルフィド結合不均一性を有する。
【０２４３】
図９は、抗体１５、６、７、８、４４、４５、４６、４７、１７及び１９に関するウエスタンブロット解析を示す。ヒンジ領域中の突然変異体Ｃ２３９ＳとＣ２４２Ｓの存在のためＨ２Ｌ２を全く又はほとんど示さない抗体８及び４７以外、抗体が優れたレベルのＨ２Ｌ２を示し、したがって２重鎖間でジスルフィド結合が形成されないことを図９から見ることができる。しかしながら、抗体８及び４７は重鎖間の非共有結合によりＨ２Ｌ２を形成することができる。突然変異体Ｃ２３９Ｓを含むがＣ２４２Ｓは含まない抗体（抗体６及び４５）は、Ｃ２３９ＳもＣ２４２Ｓも含まない抗体又はＣ２４２Ｓを含むがＣ２３９Ｓは含まない抗体と比較して、ＨＬの形成の低減を示すことを見ることもできる。特に突然変異体４４は、上部ヒンジ中の３アミノ酸の挿入もＨＬ及びＨ２の形成を減らすことができ、したがって比較可能な突然変異体１５より低レベルのジスルフィド不均一性を有することを示す。
【０２４４】
図１０は、抗体４８、１７、１８及び１９に関するウエスタンブロット解析を示す。抗体４８が優れたレベルのＨ２Ｌ２を示しＨＬはほとんど示さないことを、図１０から見ることができる。突然変異体４８は、ＩｇＧ４上部ヒンジ配列の代わりに、コアヒンジＳ２４１Ｐ突然変異と共にＩｇＧ１上部ヒンジ配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴを含有する。したがって突然変異体４８は、上部及びコアヒンジ配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰを有する。突然変異体４８は、野生型ＩｇＧ４抗体１７と比較して低レベルのジスルフィド結合不均一性、並びにＩｇＧ４Ｓ２４１Ｐ突然変異体１８及び野生型ＩｇＧ１抗体１９と比較してほぼ等しい低レベルのジスルフィド結合不均一性を示す。
【０２４５】
Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒアッセイ：
ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅを使用しｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒアッセイにおいて、精製モノクローナル抗体の耐熱性を解析し、タンパク質の熱アンフォールディング過程をモニタリングした。５μｌのモノクローナル抗体、１ｍｇ／ｍｌ、５μｌの３０ｘｄｙｅ、及び４０μｌのＰＢＳを一緒に加えた。１０μｌの混合物を３８４ＰＣＲ光学ウエルプレートに四連で分配し、７９００ＨＴ  ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＵＫ  Ｌｔｄ、Ｗｏｋｉｎｇｈａｍ  ＵＫ）に施した。このＰＣＲシステムは、２０℃〜９９℃に設定した正確な温度調節のための加熱用デバイスを含有し、電荷結合素子はウエル中の蛍光変化を同時にモニタリングする。
【０２４６】
図１１、１２、１３、１４及び１５は、野生型ＩｇＧ１及びＩｇＧ４抗体と比較した、ＩｇＧ４抗体突然変異体の耐熱性分析の結果を示す。
【０２４７】
野生型ＩｇＧ４（突然変異体１７）と突然変異体１５の比較は、改変されたジスルフィド配置のためＦａｂＴｍの増大を示す。突然変異体１５と２８の比較は、Ｇ２３０Ｃ突然変異を含む突然変異体１５と比較して、Ｙ２２９Ｃ突然変異を含む突然変異体２８に関するＦａｂＴｍのさらなる改善を示す。突然変異体１５と４４の比較は、Ｇ２３０Ｃ突然変異体のＦａｂＴｍは、上部ヒンジ中に３アミノ酸をさらに挿入することによって、さらに増大することができることを示す。突然変異体１７と１８の比較は、Ｓ２４１Ｐ中央ヒンジ突然変異によって、それはＨＬ形成を有意に減らすが、ＦａｂＴｍが増大することはないことを示す。突然変異体４８も、野生型ＩｇＧ４（突然変異体１７）と突然変異体１５の両方と比較して、有意に改善されたＦａｂＴｍを示す。
【０２４８】
図１５は、本発明による選択ＩｇＧ４突然変異体の耐熱性の全体順位を示す。突然変異体４８、４４、４４Ｐ、４６、４５、６、２９、３０、２８、２８Ｐ、３１、８、４７及び１５は全て、野生型ＩｇＧ４（突然変異体１７）及び野生型ＩｇＧ４Ｓ２４１Ｐ（突然変異体１８）と比較して、有意に高いＦａｂＴｍ値を示す。
【０２４９】
抗体の親和性：
標的可溶性サイトカインに対して選択した本発明の突然変異ＩｇＧ４抗体の親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）によって測定した。アッセイ形式は、抗Ｆｃ表面上のＩｇＧの捕捉、次に可溶性サイトカインの滴定であった。
【０２５０】
これらの結果は図１６中に示し、この場合、突然変異抗体が、対照のＩｇＧ１及びＩｇＧ４野生型抗体と比較して、可溶性サイトカインに匹敵する親和性を示したことを見ることができる。
【０２５１】
用語「ｋｄ」（ｓ−１）は、抗体−抗原相互作用の解離速度定数を指す。前記値はｋｏｆｆ値とも呼ばれる。
【０２５２】
本明細書で使用する用語「ｋａ」（Ｍ−１ｓ−１）は、抗体−抗原相互作用の結合速度定数を指す。
【０２５３】
本明細書で使用する用語「ＫＤ」（Ｍ）又は「ＫＤ」（ｐＭ）は、抗体−抗原相互作用の解離平衡定数を指す。
【０２５４】
サイズ排除（ＳＥＣ）ＨＰＬＣ分析：
約５０ｕｇの精製抗体を、Ｓ２００カラムを使用してＨＰＬＣに施した。抗体１〜１９を分析に使用した。この結果は、ヒトＩｇＧ４分子のＤＳＢ配置に対する改変にもかかわらず、非共有結合Ｈ２Ｌ２が形成されることを示す。
【０２５５】
ＨＰＬＣ分析の結果は図１７中に示す。
【０２５６】
他の上部ヒンジスペーサーの長さ
１〜５アミノ酸長のポリ−アラニンスペーサーを、ＰＰとＣＰＳＰの間、即ち「＾」によって示す位置、ＥＳＫＹＣＰＰ＾ＣＰＳＰＡに挿入した。図１８は、任意の長さのスペーサーの挿入は、突然変異体１５におけるＨ２又はＬ２形成の量を減らすのに十分であることを示す。しかしながら、３アミノ酸以上の挿入長は耐熱性の最大の増大をもたらすようであった。３アミノ酸挿入が、ＩｇＧ１とＩｇＧ４の間の上部ヒンジ長の違いに最も酷似していることに留意されたい。
【０２５７】
他の上部ヒンジスペーサーのアミノ酸組成
ＥＳＫＹＣＰＰ＾ＣＰＳＰＡにおける３アラニン挿入に特別な性質があったかどうか調べるため、上部ヒンジスペーサーとして、２つの他の３アミノ酸挿入、ＧＧＧ及びＴＨＴを試験した。図１９は、ＧＧＧとＴＨＴの両方がスペーサー領域として機能的であったことを示すが、結果はそれらが同一ではなかったことを示唆した。ＧＧＧは、ＡＡＡ又はＴＨＴよりＨ２及びＬ２形成を減らす能力が低いようであった。ＧＧＧ及びＴＨＴに関する耐熱性の増大は、ＡＡＡに関して観察した増大ほど大きくなかった。
【０２５８】
他の上部ヒンジスペーサーのアミノ酸長及び組成
ＩｇＧ４はＣＨ１鎖間システインと第一のコアヒンジシステインの間に２アミノ酸（ＰＰ）「スペーサー」を有し、一方ＩｇＧ１は５アミノ酸ＤＫＴＨＴスペーサーを有する。４個の突然変異体（６８、６７、６６及び５６）を構築して突然変異体１５（ＥＳＫＹＣＰＰＣＰＳＣＰ）との比較を可能にした。最初に、ＩｇＧ４のＰＰスペーサーをＩｇＧ１において見られる等しい長さのＤＫスペーサーで置換し、突然変異体６８（ＥＳＫＹＣＤＫＣＰＳＣＰ）、次いでアミノ酸を１個増やしてＩｇＧ１上部ヒンジスペーサーを模倣した：
突然変異体６７（ＥＳＫＹＣＤＫＴＣＰＳＣＰ）
突然変異体６６（ＥＳＫＹＣＤＫＴＨＣＰＳＣＰ）
突然変異体５６（ＥＳＫＹＣＤＫＴＨＴＣＰＳＣＰ）。
【０２５９】
図２１中のデータは、１つの最も重要な変化は、突然変異体１５と比較してＨ２、Ｈ及びＬ形成の低減をもたらしたＰＰからＤＫへの変化であることを示唆する。スペーサー挿入（Ｔ、ＴＨ及びＴＨＴ）のような追加的ＩｇＧ１の長さの増大はＨ２の最小の漸増的低減に影響を与えたようであるが、ＨＬ形成の追加的漸増をもたらした可能性がある。突然変異体６８、６７、６６及び５６はＣＰＳＣコアヒンジ配列を含有するので、ＨＬ形成の増大は、分子内ジスルフィド結合を形成する傾向をそれ故有するコアヒンジシステインからのＬＣ−ＨＣ鎖間ジスルフィド結合システインの単離において、スペーサーがより有効である証拠となり得る。
【０２６０】
図２２中のデータは、突然変異体１５（ＥＳＫＹＣＰＰＣＰＳＣＰ）及び６８（ＥＳＫＹＣＤＫＣＰＳＣＰ）及び突然変異体５５（ＥＳＫＹＣＰＰＴＨＴＣＰＳＣＰ）及び５６（ＥＳＫＹＣＤＫＴＨＴＣＰＳＣＰ）と比較して、ジスルフィドアイソフォーム不均一性を低減する点で２アミノ酸スペーサーの選択肢として、ＤＫはＰＰより好ましいことを示唆する。ＰＰなどの短いポリ−プロリンモチーフは一定レベルのヘリックスターンポテンシャルをコード可能であることが知られており、これはＬＣ−ＨＣとコアヒンジシステインの局所隣接をもたらす可能性がある。この局所的影響は、突然変異体４４（ＥＳＫＹＣＰＰＡＡＡＣＰＳＣＰ）において見られたように追加的ＡＡＡによって十分克服されるようである。突然変異体６８、５５、５６、４４又は６９はいずれも、有意に異なる耐熱性を有していないようであった。
【０２６１】
非スペーサー上部ヒンジ配列組成の影響
ＬＣ−ＨＣ間ＣＨ１システインの上部ヒンジ配列Ｎ末端の配列組成の影響を理解するために（ＩｇＧ４中のＥＳＫＹ及びＩｇＧ１中のＥＰＫＳ）、突然変異体の全ての置換は突然変異体１５（ＥＳＫＹＣＰＰＣＰＳＣＰ）の状況で行った。図２３中のデータは、ＰＰスペーサーの状況では、上部ヒンジ組成の置換はいずれも、ジスルフィドアイソフォーム不均一性に有意に影響を与えないようであったことを示す。前に示したデータは、この影響の欠如は主に、分子内ジスルフィド結合形成を可能にする短いＰＰスペーサー及びコアヒンジモチーフを、タンパク質が含有することが原因であることを示唆する。しかしながら、耐熱性の有意な違いを観察した。自然に進化した配列；ＥＳＫＰ（８３．８℃）とＥＰＫＳ（８０．６℃）の両方は、ハイブリッド配列；ＥＰＫＹ（７６．３℃）とＥＰＫＳ（７９．０℃）のいずれか一方より安定していた。このデータは、ＩｇＧ１ＥＰＫＳ配列が最も好ましいことを示す。
【０２６２】
より好ましいＤＫＴＨＴスペーサー領域の状況でＥＳＫＹ又はＥＰＫＳ上部ヒンジモチーフの重要性を理解するために、全ての置換を実施した。図２４中のデータは、天然ＩｇＧ４ＥＳＫＹモチーフ（突然変異体５６ＥＳＫＹＣＤＫＴＨＴＣＰＳＣＰ）が、ジスルフィドアイソフォーム不均一性の影響を最も受けやすいことを示す。図２４中のデータによって、天然ＩｇＧ１上部ヒンジ配列（突然変異体６５（ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＳＣＰ）はジスルフィドアイソフォーム不均一性に関して最小の可能性を有し、高い耐熱性を有することを確認する。
【０２６３】
コアヒンジＳｅｒからＰｒｏへの交換の影響
最も好ましい突然変異体４８（ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ）を突然変異させて、天然ＩｇＧ４コアヒンジＳｅｒ（ＫａｂａｔのナンバリングによりＳｅｒ２４１）を再導入し、突然変異体６５（ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＳＣＰ）を生成した。図２０中のデータによって、突然変異体４８が、突然変異体１５（ＥＳＫＹＣＰＰＣＰＳＣＰ）と比較して非常に有意に低減したレベルのＨ２、ＨＬ、Ｈ及びＬ、及び非常に有意に増大した耐熱性を有することを確認する。コアヒンジＳｅｒ２４１の再導入（突然変異体６５）は突然変異体４８と比較して耐熱性に影響を与えることはなかったが、有意なレベルのＨＬの再出現をもたらした。突然変異体６５は突然変異体１５より少量のＨ２、Ｈ及びＬを依然有しており、ジスルフィドアイソフォーム均一性に関する上部ヒンジ配列の長さ及び組成の重要性を示すことに留意されたい。
【０２６４】
細胞溶解による抗体エフェクター機能アッセイ
細胞表面抗原を発現する標的細胞は、蛍光増大リガンドＢＡＤＴＡとのインキュベーションにより標識した、その細胞内含有物を有していた。ＢＡＤＴＡは細胞内で親水性リガンド、ＴＤＡに変換される。標識細胞は、抗体及びＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）及び溶解剤とインキュベートする。細胞溶解時に、ユーロピウムを細胞培養物に加えると、この実施例ではＡＤＣＣにより、ＴＤＡが放出され蛍光で安定したキレートＥｕＴＤＡを形成する。本質的に、細胞含有物のＢＡＤＴＡ標識は細胞溶解の定量化を可能にする。したがって細胞溶解は、ＩｇＧにおけるエフェクター機能の存在の指標となる。図２５及び２６では、ＡＤＣＣによる細胞及びＩｇＧ４の溶解を試みる。ＩｇＧ１野生型とＩｇＧ４野生型の両方に関して、ヘルセプチン抗体のアナログ（トラスツズマブ）を作製した。ヘルセプチンのＨｅｒ−２抗原はＭＣＦ７及びＳＫＢＲ３細胞上で発現される。ＩｇＧヘルセプチンアナログの突然変異体も作製し、ＡＤＣＣアッセイ中で使用するためＩｇＧを精製した。対照ＩｇＧ１野生型（ｗｔ）とＩｇＧ４野生型（ｗｔ）の間の違いにより確認されるように、ＩｇＧ４はＡＤＣＣを実施する非常に低い能力を有することが知られている。先天的ＡＤＣＣ能力のこの欠如は、試験した４つのＩｇＧ４突然変異体の如何なる１つによっても影響を受けることはなかった。特にこれらは、改変された鎖間ＬＣ−ＨＣジスルフィド結合配置を有する突然変異体２８、４４及び４８、及び最も顕著にはＩｇＧ１上部及びコアヒンジモチーフを含有する突然変異体４８（ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ）を含む。したがってこれらのデータは、ＩｇＧ１上部及びコアヒンジ配列の使用により、記載する突然変異体はエフェクター機能を得られないことを示す。
【０２６５】
ＩｇＧ４抗体に対する突然変異体の広範囲の適用例。
これまで記載したすべてのデータは、具体的なＵＣＢ所有のＩｇＧ４抗体、抗体４１０に関するものである。ジスルフィドアイソフォーム均一性及び耐熱性の改善が、このＩｇＧの可変領域コード構造／安定性に特有でなかったことを実証するために、幾つかの型の他のＩｇＧ４を作製した。公に入手可能な配列情報を使用して、３個の工業的関連があるＩｇＧのＩｇＧ４アナログ、トラスツズマブ（ヘルセプチン）、ナタリズマブ（タイサブリ）及びトシリズマブ（アクテムラ）を作製した。集合的に、図２８〜３３中に示すデータは、ＩｇＧ４の主要突然変異体の相対的性能は、ジスルフィドアイソフォーム均一性と相対的耐熱性の両方の点で、全てのＩｇＧ４型において非常に類似していることを示す。それぞれの型の絶対的安定性は、ＩｇＧの異なる独自の安定性に関して以前に公開された観察結果から予想されるように互いに異なる。これらのデータは、記載する突然変異体は、すべてのＩｇＧ４分子において、ジスルフィドアイソフォーム均一性を改善し、耐熱性を増大することができることを示唆する。
【０２６６】
実用的考察に関するＩｇＧ４突然変異体の影響：発現及び宿主細胞
記載する突然変異体は、ＩｇＧ４分子の範囲内で、ジスルフィドアイソフォーム均一性を改善し耐熱性を増大している。図２７中のデータは、これらの突然変異体はＩｇＧ４発現にマイナスの影響を与えないことを示す。示した発現データは、記載する４抗原特異性の各々、Ａｂ４１０、並びにトラスツズマブ、ナタリズマブ及びトシリズマブのアナログに関するＣＨＯ細胞から一時的に発現された各突然変異体に関する平均的な発現である。これらのデータは、Ｆａｂアーム鎖間ジスルフィド構造並びに上部及びコアヒンジ配列は、ＣＨＯ細胞からの収率の主要決定要因ではないことを示唆する。図３１中のデータは、突然変異体がＣＨＯ−Ｋ１細胞中又はＣＨＯ−ＳＸＥ細胞中で発現されようと、Ａｂ４１０の耐熱性は同じであることを示す。これらのデータは、ＩｇＧＦａｂアーム鎖間ジスルフィド構造並びに上部及びコアヒンジ配列に対する突然変異が、改善された耐熱性の主要決定要因であることを支持する。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３ａ】
0005894160.tif 000011
【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５−１】
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【図５−２】
0005894160.tif 000016
【図５−３】
0005894160.tif 000017
【図５−４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【配列表】
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