(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を活性化腫瘍細胞調製物（ＡＴＣＰ）とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程を含む方法によって産生された活性化ヒトＮＫ細胞であって、ここで、該ＡＴＣＰが完全なヒト腫瘍細胞またはその細胞膜調製物を含む、活性化ヒトＮＫ細胞。
【請求項２】
治療を必要とする被験体を治療するための、請求項１に記載の活性化ヒトＮＫ細胞を複数含む組成物。
【請求項３】
前記活性化ヒトＮＫ細胞の一部または全てが自系である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ヒトＮＫ細胞の一部または全てが同種異系である、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記ヒトＮＫ細胞がＨＬＡ不一致である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
癌を治療するための薬物の製造における、請求項２から５のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項７】
癌を治療するための、請求項２から５のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
前記被験体が侵襲性の癌治療に適していない、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記癌が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、リンパ腫、または乳癌の群から選択される、請求項７から８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
ヒト腫瘍細胞調製物（ＴＣＰ）が活性化ヒト腫瘍細胞調製物（ＡＴＣＰ）であるかどうか判定する方法であって、以下：
（ｉ）該ヒト腫瘍細胞調製物をヒトＮＫ細胞と接触させる工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）からのヒトＮＫ細胞を、活性化されていないヒトＮＫ細胞による溶解に対して抵抗性である標的細胞と接触させる工程と、
（ｉｉｉ）工程（ｉ）からのヒトＮＫ細胞によって該標的細胞が溶解されるかどうか判定する工程と
を含む方法。
【請求項１１】
前記癌が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、リンパ腫、または乳癌の群から選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項１２】
前記ＡＴＣＰが、ＣＴＶ−１骨髄性白血病細胞またはその膜調製物を含む、請求項１に記載の活性化ヒトＮＫ細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を活性化する方法に関する。詳細には、本発明は、ＮＫ抵抗性の癌細胞を溶解させる能力をＮＫ細胞が有するように、ＮＫ細胞を活性化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
いくつかの癌は現在のところ不治である。他のものでは、化学療法は部分的に有効であるのみであり、かなりの割合の患者で治療後に再発が起こる。一部の血液学的悪性腫瘍は、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）によって治療できるが、ＨＳＣＴを必要とする患者のうち、適したドナーを有し、かつ必要な年齢であるものは３０％未満である。
【０００３】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、特定の腫瘍細胞を自発的に溶解できる、末梢血リンパ球の部分集団である。養子腫瘍免疫療法におけるＮＫ細胞の使用が提案されており、腫瘍細胞を溶解させるそれらの能力を増強させるために、ＮＫ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで刺激することが関心となっている。
【０００４】
１９８０年代における、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、およびＮＫ細胞活性化でのその役割の発見によって、リンフォカイン活性化されたキラー（ＬＡＫ）細胞の、腫瘍免疫療法における使用への関心がもたらされた。しかし、これらの試みの結果の大部分は期待はずれのものであった。ＩＬ−２と共に自系ＬＡＫ細胞を患者に投与することの効果を調査した研究では、患者の２０％未満しか反応を示さなかった（非特許文献１）。化学療法および自系ＨＣＴと共に、癌患者へのＩＬ−２の毎日投与を用いた研究では、ＩＬ−２はｉｎ  ｖｉｖｏで循環しているＭＫ細胞の数を有意に増加させるが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイによれば、それらの細胞は最大限に細胞障害性になってはいないことが示された（非特許文献２）。
【０００５】
ＮＫ細胞は、正および負の両方の細胞溶解シグナルによって制御されていることが知られている。過去１０年間に、ＮＫ細胞の抑制を媒介する多くの分子がクローニングされており、それらのリガンドはほとんど例外なくクラスＩ  ＭＨＣ分子である。これらの受容体（「ＫＩＲ」）の一部は、ある種のクラスＩアレルによって共有されている決定基に特異的であり、各ＫＩＲは、ＮＫ細胞の部分集合によって発現される。したがって、ＮＫレパートリーでは、一部のＮＫ細胞が特定のクラスＩアレルを認識し、それらによって遮断される。ＮＫ細胞は、クラスＩ多型に関して限定された認識を有し、クラスＩアレルはレパートリー中のあらゆるＮＫ細胞を遮断するが、不一致を有する標的細胞がクラスＩアレルを発現していない場合、細胞がアロ反応の原因となる場合がある（「自己性喪失（ｍｉｓｓｉｎｇ−ｓｅｌｆ）」仮説）。したがって、ドナー細胞によって発現されるクラスＩアレル群のうち少なくとも１つを欠失している同種異系標的細胞は、ドナーＮＫ細胞の部分集合の表面にある抑制性クラスＩリガンドを見出さず、それらの細胞の溶解経路が活性化されるであろう。
【０００６】
したがって、ＮＫ細胞による「自己」ＭＨＣ分子の認識の結果生じる生理反応によって自系ＮＫ細胞が抑制されるのかもしれないと提案されている。また、腫瘍ＭＨＣ（すなわちＫＩＲリガンド）とＫＩＲとの不一致の程度が大きいほど、腫瘍を殺す可能性が大きいであろうということも示唆されている（非特許文献３）。自系ＮＫ細胞治療が不十分であること（自系腫瘍細胞と、ＮＫ細胞の抑制受容体との不一致がないためと考えられている）を鑑みて、同種異系ＮＫ細胞注入の使用が代替法として提案されている（Ｍｉｌｌｅｒら（２００５）Ｂｌｏｏｄ、印刷中であるが２００５年１月４日にオンラインジャーナルで事前出版されている）。
【０００７】
Ｍｉｌｌｅｒら（２００５年、同上）は、転移性黒色腫、転移性腎細胞癌、難治性ホジキン病、または予後不良ＡＭＬを患っている患者に、ＩＬ−２活性化されたハプロアイデンティカルな同種異系ＮＫ細胞を投与した。重要なことは、ＮＫ細胞がｉｎ  ｖｉｖｏで存続および増殖できることをそれらの結果が実証していることである。それらの細胞は、１９人の予後不良ＡＭＬ患者のうち５人で完全な血液学的寛解を誘導したが、他の腫瘍に対する活性はなかった。寛解に達した群では、ＫＩＲリガンド不一致ストラテジーを用いて、患者を、予測された移植を有するもの対、宿主アロ反応性を有するものに層別化した。結果は、ＫＩＲリガンド不一致を有する患者の方がはるかに寛解の可能性が高いことを示した。
したがって、非特異的に活性化されたＮＫ細胞は、腫瘍の部分集合に対する適用を有する可能性があるが、ドナー細胞は同種異系でなければならず、それらがＨＬＡ不一致である場合には、効果的である可能性がはるかに高い。正常造血細胞を標的とする、不一致を有するＮＫ細胞を使用することに伴う不都合は、それらが正常な（例えば宿主）造血細胞を標的とし、拒絶し得ることである（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（１９８７）３１６巻８８９〜８９７頁
【非特許文献２】Ｍｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．（１９９７）３巻３４〜４４頁
【非特許文献３】Ｒｕｇｇｅｒｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）２９５巻２０９７〜２１００頁
【非特許文献４】Ｙｕら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９６）４巻６７〜７６頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、「ＮＫ抵抗性」の腫瘍に対して有効であるが、正常な造血細胞に害を与えない、癌に対する代替的免疫療法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
現在の定説は、ＮＫ細胞はそれらが最終的に溶解させる標的細胞によって刺激され、「ＮＫ抵抗性」の腫瘍はこの刺激を提供しないので溶解されないというものである。
【００１１】
本発明者らは、現在の考え方とは反対に、「刺激事象」を「溶解事象」から時間的に分離できることを示した。また、本発明者らは、一部の腫瘍細胞またはそれらの膜調製物がＮＫ細胞を刺激でき、それによって次にそれらのＮＫ細胞は刺激されていない同等なＮＫ細胞による溶解に対して抵抗性を有する標的細胞の溶解へと進行できることも示した。
【００１２】
第１の態様では、本発明は、ＮＫ細胞を活性化腫瘍細胞調製物（ＡＴＣＰ）とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程を含む、ＮＫ細胞を活性化する方法を提供する。
【００１３】
上記ＮＫ細胞は、標的細胞を溶解させるように活性化されている。例えば、上記ＮＫ細胞は、以前にはＮＫ細胞による溶解に抵抗性を有した細胞を溶解させることができるように活性化されたものであり得る。したがって、本発明は、多くの「ＮＫ抵抗性」悪性疾患の治療に有用なＮＫ細胞を提供する。これらの疾患の多くは現在、不治である（骨髄腫および慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）など）。
【００１４】
「刺激事象」を「溶解事象」から分離できるという事実は、ＮＫ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激できるが、いったん刺激された後にはその細胞は、被験体に導入されるか、もしくは戻された場合、標的細胞に遭遇するまで標的細胞を溶解させる能力を保持するという利点を有する。
【００１５】
この形態の活性化は、ＮＫ細胞による殺作用に抵抗性があると考えられている複数のタイプの腫瘍を溶解させることができる能力をＮＫ細胞に与える。さらにこれらの活性化ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞と腫瘍細胞との間のＨＬＡ一致の程度に関係なく有効である。これによって、自系またはＨＬＡ一致の同種異系ドナーＮＫ細胞を用いる可能性が開かれる。自系またはＨＬＡ一致の細胞を使用することは、ドナーまたは宿主細胞（例えば宿主正常造血細胞）の拒絶反応をもたらす可能性がより低くなるという利点を有する。
【００１６】
さらに、本発明の方法は、ＩＬ−２に媒介された活性化に依存しないので、ＩＬ−２反応に関連していたｉｎ  ｖｉｖｏの有害作用を回避する（Ｍｉｌｌｅｒら（２００５）、同上）。
【００１７】
本発明の第１の態様では、上記ＡＴＣＰが完全な腫瘍細胞の調製物であっても、それらを含くものでもよい。これらの細胞は、照射処理されたものでも、固定されたものでもよい。
【００１８】
別法では、上記ＡＴＣＰは、細胞膜調製物でも、それを含くものでもよい。細胞膜の使用は、腫瘍細胞の使用に伴う、多くの安全性に関する心配事を回避するので有利である。
【００１９】
上記ＡＴＣＰは、ＣＴＶ−１骨髄性白血病細胞および／またはその膜調製物など、ＮＫ活性化能を有する腫瘍細胞またはその調製物を含むものでよい。
【００２０】
第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様の方法によって産生された活性化ＮＫ細胞を提供する。
【００２１】
ドナーＮＫ細胞はハプロアイデンティカルなものでよい。ドナーＮＫ細胞はＨＬＡが一致したものでも、ＨＬＡが不一致なものでもよい。
【００２２】
本発明の第２の態様の活性化ＮＫ細胞は、癌を治療するのに使用できる。
【００２３】
したがって、第３の態様では、本発明は、本発明の第２の態様の活性化ＮＫ細胞を含む組成物の、癌を治療するための薬物の製造における使用を提供する。
【００２４】
このアプローチは、強力な癌治療に被験体が適していない場合に特に適している。
上記癌は、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、リンパ腫、または乳癌であり得る。
本発明は例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を活性化する方法であって、前記ＮＫ細胞を活性化腫瘍細胞調製物（ＡＴＣＰ）とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程を含む方法。
（項目２）
前記ＡＴＣＰが完全な腫瘍細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ＡＴＣＰが細胞膜調製物を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記ＡＴＣＰがＣＴＶ−１骨髄性白血病細胞またはその膜調製物を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
活性化の間に、前記ＮＫ細胞上でのＣＤ６９の発現が上方制御される、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
項目１〜５のいずれか一項に記載の方法によって産生された活性化ＮＫ細胞。
（項目７）
治療を必要とする被験体を治療するための、項目６に記載の活性化ＮＫ細胞を複数含む組成物。
（項目８）
前記活性化ＮＫ細胞の一部または全てが自系である、項目７に記載の組成物。
（項目９）
前記ＮＫ細胞の一部または全てが同種異系である、項目７に記載の組成物。
（項目１０）
前記ドナーＮＫ細胞がＨＬＡ不一致である、項目９に記載の組成物。
（項目１１）
癌を治療するための薬物の製造における、項目７から１０のいずれかに記載の組成物の使用。
（項目１２）
項目７から１０のいずれかに記載の組成物を被験体に投与する工程を含む、癌を治療する方法。
（項目１３）
前記被験体が侵襲性の癌治療に適していない、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記癌が以下の群、すなわち急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、リンパ腫、または乳癌から選択される、項目１１から１３のいずれかに記載の使用または方法。
（項目１５）
腫瘍細胞調製物（ＴＣＰ）が活性化腫瘍細胞調製物（ＡＴＣＰ）であるかどうか判定する方法であって、以下：
（ｉ）該腫瘍細胞調製物をＮＫ細胞と接触させる工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）からのＮＫ細胞を、活性化されていないＮＫ細胞による溶解に対して抵抗性である標的細胞と接触させる工程と、
（ｉｉｉ）工程（ｉ）からのＮＫ細胞によって該標的細胞が溶解されるかどうか判定する工程と
を含む方法。
（項目１６）
腫瘍細胞調製物（ＴＣＰ）が活性化腫瘍細胞調製物（ＡＴＣＰ）であるかどうか判定する方法であって、以下：
（ｉ）該腫瘍細胞調製物をＮＫ細胞と接触させる工程と、
（ｉｉ）該ＴＣＰが、該ＮＫ細胞上でのＣＤ６９の上方制御を引き起こすかどうか判定する工程と
を含む方法。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、標的細胞の溶解を測定するための分析ストラテジーを示す、フローサイトメトリーのドットプロット図である。分析領域１（Ｒ１）は、標的細胞（ＰＫＨ−２６−ｖｅ）を含むように定められており（Ａ−標的細胞のみ）、上記標的細胞からは、エフェクターＮＫ細胞およびＰＫＨ−２６で予め標識された刺激因子ＡＭＬ細胞が除去されている（Ｂ−エフェクター＋刺激因子細胞のみ）。このゲート操作ストラテジーは、混合物（Ｃ）中の標的細胞集団およびエフェクター細胞集団を効果的に排除する。混合物（Ｒ１）中の標的細胞に関するゲート操作によって、Ｔｏ−Ｐｒｏ−ｖｅ生存標的細胞（Ｄ）からの、ＦＳＣｌｏｗ／Ｔｏ−Ｐｒｏ＋「死亡」標的細胞（Ｒ２）の列挙（ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ）を可能にする。
【図２】図２Ａは、ＮＫ細胞の刺激因子細胞として様々な異なった細胞型を用いた場合における、Ｒａｊｉ細胞の溶解％を示すグラフである。図２Ｂは、ＣＴＶ−１細胞とのＮＫ細胞のプレインキュベーションが、様々な異なった細胞型の溶解％に与える影響を示す図である。
【図３】図３Ａは、ＮＫ細胞の刺激因子細胞として様々な異なった細胞型を用いた場合における、Ｒａｊｉ細胞の溶解％を示す図である。図３Ｂは、ＣＴＶ−１細胞がＮＫ細胞を活性化する能力に、固定およびブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）処理が与える影響を示す図である。
【図４−１】図４Ａは、ＮＫ細胞の刺激因子細胞として様々な異なった細胞型を用いた場合における、Ｒａｊｉ細胞およびＤａｕｄｉ細胞の溶解％を示す図である。図４Ｂは、ＮＫ細胞の刺激因子細胞として様々な異なった細胞型を用いた場合における、原発性白血病細胞の溶解％を示す図である。
【図４−２】図４Ｃは、活性化ＮＫ細胞による、原発性白血病芽球（ＡＭＬおよびＣＬＬ）および乳癌細胞株（ＭＣＦ−７）の溶解％を示すグラフである。図４Ｄは、同種異系の正常ドナーからのＴ−ａＮＫ細胞による、乳癌または卵巣癌を有する患者からの原発性腫瘍細胞の溶解％を示すグラフである。
【図５−１】図５Ａは、刺激されたＮＫ細胞が、ＫＩＲ一致（自系）またはＫＩＲ不一致（ハプロ１またはハプロ２）の正常ＰＢＭＣに与える影響を示す図である。図５Ｂは、正常ドナーからの活性化ＮＫ細胞による、同じドナー（自系）およびＫＩＲ不一致の正常ドナー（同種異系）からの正常ＰＢＭＣの溶解を示すグラフである。
【図５−２】図５Ｃは、活性化ＮＫ細胞が、正常ドナーＢＭＭＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ造血に与える影響を示す図である。
【図６】図６Ａは、ＨＬＡ−ＫＩＲ一致の活性化腫瘍細胞株の使用の影響を、ＨＬＡ−ＫＩＲ不一致のものと比較する図である。図６Ｂは、ＫＩＲ−リガンド一致または不一致のＣＴＶ−１細胞のいずれかによって活性化されたＮＫ細胞による、Ｒａｊｉ標的の溶解％を示すグラフである。
【図７−１】図７Ａは、ＡＴＣＰによって活性されたＮＫ細胞による溶解と、ＩＬ−２で刺激されたＮＫ細胞による溶解とを比較するグラフである。図７Ｂは、様々なＥ：Ｔ比における白血病芽球の溶解％を示すグラフである。
【図７−２】図７Ｃおよび７Ｄは、ＣＴＶ−１によって誘導されたＮＫ活性化に、ＫＩＲ不一致が与える影響を示すグラフである。（Ｃ）ＣＤ５６＋／ＣＤ３−  ＮＫ細胞を、培地のみで（白抜きの棒グラフ）、照射されたＣＴＶ−１細胞と共に（影付きの棒グラフ）、もしくはＣＴＶ−１細胞溶解物と共に（黒い棒グラフ）終夜インキュベートし、ＫＩＲおよびＣＤ６９の発現に関して表現型判定する（棒グラフは平均＋／−ｓｄを示す）。（Ｄ）３人の正常ドナーからの休止ＮＫ細胞を、ＣＤ１５８ａおよびＣＤ１５８ｅ１を同時発現しているものと、両分子とももたないものとの２つの集団にフロー選別する。これらを、ＣＴＶ−１細胞溶解物で終夜刺激し、ＲＡＪＩ細胞に対するそれらの細胞溶解活性を４時間のアッセイで試験する（棒グラフは平均＋／−ｓｄを示す）。
【図８】図８Ａは、ＣＴＶ１活性化ＮＫ細胞のＣＤ５６＋  ＮＫ画分中における、ＣＤ６９＋ｖｅ細胞の割合を示すグラフである。図８Ｂは、ＣＴＶ−１とのインキュベーションが、ＮＫ細胞による１パネルのリガンドの発現に与える影響を示す図である。
【図９Ａ】図９Ａは、活性化ＮＫ細胞とＲａｊｉ細胞との間の接合形成、および免疫シナプスにおけるＣＤ６９のキャッピングを示す共焦点顕微鏡写真である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、組換え体ヒトＣＤ６９のリフォールディングされたタンパク質上清のＨＰＬＣ分画を示すゲル写真である。
【図９Ｃ】図９Ｃは、ｒＣＤ６９上清からのＨＰＬＣ画分でコーティングされたナノ粒子と接触させた後における、標識されたＲａｊｉ細胞のフローサイトメトリー分析を示すヒストグラムのパネルである。
【図９Ｄ】図９Ｄは、ｒＣＤ６９陽性ＨＰＬＣ画分でコーティングされたナノ粒子との接触させた後における、標識されたＲａｊｉ細胞の共焦点顕微鏡写真である。
【図９Ｅ】図９Ｅは、ｒＣＤ６９陽性ＨＰＬＣ画分でコーティングされたナノ粒子との接触させた後における、標識された正常Ｂ細胞の共焦点顕微鏡写真である。
【図９Ｆ】図９Ｆは、２６０μｇ〜１ｍｇのｒＣＤ６９  ＨＰＬＣ画分と共に（ナノ粒子の非存在下で）プレインキュベーションした後における、Ｒａｊｉ細胞の溶解％を示すグラフである。
【図９Ｇ】図９Ｇは、ｒＣＤ６９（影付きのヒストグラム）または変性されたｒＣＤ６９（白抜きのヒストグラム）でコーティングされたナノ粒子で標識化された後における、Ｒａｊｉ細胞のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。
【図９Ｈ】図９Ｈは、ｒＣＤ６９（影付きのヒストグラム）または変性されたｒＣＤ６９（白抜きのヒストグラム）でコーティングされたナノ粒子で標識化された後における、Ｋ５６２細胞のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。
【図９Ｉ】図９Ｉは、ｒＣＤ６９（影付きのヒストグラム）または変性されたｒＣＤ６９（白抜きのヒストグラム）でコーティングされたナノ粒子で標識化された後における、正常Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。
【図９Ｊ】図９Ｊは、ｒＣＤ６９（影付きのヒストグラム）または変性されたｒＣＤ６９（白抜きのヒストグラム）でコーティングされたナノ粒子で標識化された後における、正常Ｂ細胞のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。
【図９Ｋ】図９Ｋは、ｒＣＤ６９（影付きのヒストグラム）または変性されたｒＣＤ６９（白抜きのヒストグラム）でコーティングされたナノ粒子で標識化された後における、正常ＮＫ細胞のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。
【図９Ｌ】図９Ｌは、様々な細胞株で観測された相対蛍光強度を示すグラフである。
【図９Ｍ】図９Ｍは、２通りの密度のｒＣＤ６９の存在下における、Ｔ−ａＮＫに媒介されたＲＡＪＩ細胞の溶解を示す図である。
【図９Ｎ】図９Ｎは、ｒＣＤ６９、変性されたｒＣＤ６９、またはＢＳＡの存在下における、Ｔ−ａＮＫに媒介されたＲＡＪＩ細胞溶解を比較する図である。
【図９Ｏ】図９Ｏは、休止ＮＫ細胞またはＴ−ａＮＫ細胞によるＫ５６２の溶解に、ｒＣＤ６９が与える影響を示す図である。
【図１０】図１０は、ＣＴＶ−１細胞株からの細胞膜形成の例を示す散乱図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
（詳細な説明）
（ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）
本発明は、ＮＫ細胞を活性化する方法と、そのような方法によって活性化されたＮＫ細胞とに関する。
【００２７】
ＮＫ細胞は、ＣＤ５６またはＣＤ１６の発現と、Ｔ細胞受容体（ＣＤ３）の不在とによって定義される、末梢血リンパ球の部分集合である。これらの細胞は、ＭＨＣに制限されない様式で、プライミングなしに、形質転換細胞株を認識して殺す。
【００２８】
ＮＫ細胞は、同種異系または自系幹細胞移植の後、何ヶ月にもわたって末梢血中で支配的なリンパ系細胞に相当し、この期間における病原体に対する免疫で主要な役割を有する（Ｒｅｉｔｔｉｅら（１９８９）Ｂｌｏｏｄ  ７３巻１３５１〜１３５８頁；Ｌｏｗｄｅｌｌら（１９９８）Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２１巻６７９〜６８６頁）。移植、移植片対宿主疾患、抗白血病活性、および移植後の感染におけるＮＫ細胞の役割については、Ｌｏｗｄｅｌｌ（２００３）Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １３巻３９９〜４０４頁に概説されている。
【００２９】
ヒトＮＫ細胞は、自然細胞障害および抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を介して、腫瘍細胞およびウイルス感染細胞の溶解を媒介する。
【００３０】
ヒトＮＫ細胞は、正および負の細胞溶解シグナルによって制御されている。負（抑制性）のシグナルは、Ｃ−レクチンドメイン含有受容体であるＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａによって、そして一部のキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）によって伝達される。抑制性シグナルによるＮＫ溶解の調節は、「自己性喪失」仮説として知られており、この説では、標的細胞の表面に発現されている特定のＨＬＡクラスＩアレルがＮＫ細胞上の抑制性受容体の会合を引き起こす。腫瘍細胞および一部のウイルス感染細胞（例えばＣＭＶ）の表面でのＨＬＡ分子の下方制御は、この抑制を標的閾値下まで低下させ、標的細胞は、ＮＫ細胞によって媒介された溶解を受けるようになる。
【００３１】
抑制性受容体は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）と呼ばれるＩｇスーパーファミリーのグループと、レクチンファミリーであるＮＫＧ２ファミリーのグループとの２つのグループに分かれる。ＮＫＧ２ファミリーのレクチンは、細胞表面でＣＤ９４と２量体を形成する。ＫｌＲは、２ドメインまたは３ドメインの細胞外構造を有し、ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、または−Ｃに結合する。ＮＫＧ２／ＣＤ９４複合体は、ＨＬＡ−Ｅの会合を引き起こす。
【００３２】
抑制性ＫＩＲは、ＩＴＩＭを含有する最大４つまでの細胞内ドメインを有し、最も詳細に特徴付けられているのは、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、およびＫＩＲ２ＤＬ３である。これらは、ＨＬＡ−Ｃ分子に結合することが知られている。ＫＩＲ２ＤＬ２およびとＫＩＲ２ＤＬ３は、グループ１のＨＬＡ−Ｃアレルに結合し、一方、ＫＩＲ２ＤＬ１はグループ２のアレルに結合する。ある種の白血病／リンパ腫細胞はグループ１および２両方のＨＬＡ−Ｃアレルを発現し、ＮＫ媒介の細胞溶解に抵抗性があることが知られている。
【００３３】
正の活性化シグナルに関しては、ＡＤＣＣは、ＣＤ１６を介して媒介されると考えられており、ＣＤ２、ＣＤ３８、ＣＤ６９、ＮＫＲＰ−１、ＣＤ４０、Ｂ７−２、ＮＫ−ＴＲ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、およびＮＫｐ４４を含めた、自然細胞障害を引き起こす多数の受容体が同定されている。加えて、短い細胞質内テールを有するいくつかのＫＩＲ分子も刺激性である。これらのＫＩＲ（ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、およびＫＩＲ２ＤＳ４）は、ＨＬＡ−Ｃに結合することが知られており、それらの細胞外ドメインは、それらに近縁の抑制性ＫＩＲと同一である。活性化性のＫＩＲは、ＩＴＩＭをもたず、代わりにＤＡＰ１２と結合してＮＫ細胞の活性化を引き起こす。抑制性ＫＩＲ対活性化性ＫＩＲの発現を制御する機構は未だに知られていない。
【００３４】
本発明のＮＫ細胞は、自系のＮＫ細胞でも、同種異系のＮＫ細胞でもよい。
【００３５】
「自系」のＮＫ細胞は、その患者に由来する細胞である。「同種異系」のＮＫ細胞は、１箇所または複数の遺伝子座に同一でない遺伝子を有する別の個体に由来する。ＮＫ細胞が一卵性双生児に由来する場合、それらを「同系」と呼ぶことができる。
【００３６】
ドナーＮＫ細胞は、ＨＬＡ−ＫＩＲが一致したものでも、不一致なものでもよい。本発明者らは、ＮＫ細胞と標的腫瘍細胞との間での一致の度合いが重要でないことを示している。
【００３７】
（活性化腫瘍細胞調製物（ＡＴＣＰ））
「活性化」という用語は、このセクション中、および本明細書を通して、「刺激性」という用語と同義的に用いられる。
【００３８】
本発明者らは、ある種の腫瘍細胞がＮＫ細胞を刺激して、腫瘍細胞を溶解させるそれらの能力を増強する能力を有することを見出した。刺激されたＮＫ細胞は、「ＮＫ抵抗性」の腫瘍細胞（すなわち、刺激されていないＮＫ細胞を用いた溶解に抵抗性の腫瘍細胞）を溶解できることが示されている。
【００３９】
この様にＮＫ細胞を活性化できる腫瘍細胞には、ＣＴＶ−１細胞が含まれる。この細胞株は、例えばＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から購入可能である。
【００４０】
他の腫瘍細胞もＮＫ細胞を活性化する能力を有するであろうと予測される。本発明は、腫瘍細胞調製物が活性化腫瘍細胞調製物であるかどうか判定する方法も提供し、この方法は、
（ｉ）上記腫瘍細胞調製物をＮＫ細胞と接触させる工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）からのＮＫ細胞を、活性化されていないＮＫ細胞による溶解に対して抵抗性である標的細胞と接触させる工程と、
（ｉｉｉ）工程（ｉ）からのＮＫ細胞によって上記標的細胞が溶解されるかどうか判定する工程と
を有する。
【００４１】
したがって、当業者ならば、所与の腫瘍細胞が活性化腫瘍細胞調製物として働く能力を有するかどうか確定すること、およびこの活性を有するものを得るために既知な腫瘍細胞をスクリーニングすることが可能である。
【００４２】
本発明者らは、ＮＫ細胞をＡＴＣＰ（ＣＴＶ−１  ＡＭＬ芽球など）と共にプレインキュベーションすることによってＮＫ細胞上でのＣＤ６９の急速な上方制御が引き起こされることを示した。本発明者らは、活性化ＮＫ細胞によって溶解可能な腫瘍細胞がＣＤ６９リガンド（ＣＤ６９Ｌ）を発現しているが、この発現は溶解されない細胞（Ｂ細胞など）には存在しないことも（標識されたＣＤ６９を用いて）示した。組換え体ＣＤ６９の存在は、おそらく腫瘍細胞がＣＤ６９Ｌと相互作用するのを遮断するため、活性化ＮＫ細胞が腫瘍細胞を溶解させる能力を抑制する。
【００４３】
理論に拘泥するものではないが、本発明者らは、刺激されたＮＫ細胞上のＣＤ６９が、それらの細胞障害活性の引き金となる支配的な分子であると考えている。
【００４４】
好ましい実施形態では、本発明の方法で使用されるＡＴＣＰがＮＫ細胞上でのＣＤ６９発現の上方制御を引き起こす。
【００４５】
ＣＤ６９リガンドの性質は現在のところ知られていないが、候補腫瘍標的細胞上での発現を標準的な技法によって測定することは可能である。例えば、蛍光色素で標識されたＣＤ６９を使用し、フローサイトメトリーまたは共焦点顕微鏡などの技法によってＣＤ６９Ｌの発現を測定することが可能である。
【００４６】
したがって、本発明は、腫瘍細胞調製物が活性化腫瘍細胞調製物であるかどうか判定する方法を提供し、この方法は、
（ｉ）上記腫瘍細胞調製物をＮＫ細胞と接触させる工程と、
（ｉｉ）上記ＴＣＰが、ＮＫ細胞上でのＣＤ６９の上方制御を引き起こすかどうか判定する工程と
を有する。
【００４７】
本発明は、ＴＣＰがＣＤ６９Ｌを含むどうか、あるいは発現するかどうか判定する工程を含む、腫瘍細胞調製物が活性化腫瘍細胞調製物であるかどうか判定する方法も提供する。
【００４８】
ＡＴＣＰは、完全な腫瘍細胞の集団からなるものでも、それを含むものでもよい。例えば、上記活性化腫瘍細胞調製物は腫瘍細胞株であり得る。
【００４９】
ＡＴＣＰは、細胞膜調製物からなるものでも、それを含むものでもよい。例えば、細胞膜調製物は、標準的な固定技法（パラホルムアルデヒドを用いるものなど）によって作製できる。固定には、調製物が安定化され、はるかに長い「貯蔵寿命」を有し、そしてその保存がより簡単であるという利点がある。適した細胞膜調製物は、ＤＮＡｓｅ処理と併せた、凍結融解の繰り返しサイクルによっても作製できる。そのような調製物は、プリオンなどに関連した汚染の可能性を低下させるので、安全性が増大していると考えることができる。
【００５０】
刺激因子細胞は、使用する前に標準的な技法による照射を施すことができる。
【００５１】
膜調製物は、潜在的な悪性腫瘍細胞を患者に導入する危険性を回避するので、完全な腫瘍細胞を含む調製物を上回る利点を有する。
【００５２】
ＡＴＣＰは、腫瘍細胞から派生しうる実体（タンパク質など）でも、それを含むものでもよい。例えば、ＡＴＣＰは、組換え体タンパク質を含むものであり得る。上記タンパク質は、ＣＴＶ−１細胞から得ることができる。
【００５３】
ＡＴＣＰおよびＮＫ細胞調製物は、例えば共培養によって共存下に置くことができる（完全な腫瘍細胞が使用される場合）。「活性化時間」は、細胞調製物の性質と接触条件とによるだろうが、通常１２〜２４時間、おそらく２０時間であろう。
【００５４】
（組成物）
本発明は、複数のそのような活性化ＮＫ細胞を含む組成物も提供する。
【００５５】
上記組成物は、自系および／または同種異系のＮＫ細胞を含むものでも、本質的にはそれらからなるものでもよい。
【００５６】
同種異系のＮＫ細胞はＨＬＡ不一致でよい。
【００５７】
同種異系のＮＫは、ドナー個体からの末梢血から得ることができる。同種異系末梢血単核細胞は、標準的な技法（例えば従来のアフェレーシス）によって収集できる。移植片宿主相関病および免疫介在性形成不全の可能性を最小限にするために、同種異系細胞からＴ細胞を除いてもよい。例えば、モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ３抗体と結合したマイクロビーズおよび細胞選別装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）細胞選別装置など）を用いて、上記細胞調製物からＣＤ３＋  Ｔ細胞を除くことができる。
【００５８】
しかし、そのような「ネガティブ選択」手順のみで産生されたＮＫ細胞は高純度にはならず、Ｔ細胞およびＢ細胞が混入している可能性がある。
【００５９】
混入を低減するために、例えばＣＤ５６発現に基づいて、直接的な免疫磁気分離によって、ＮＫ細胞調製物を得ることが可能である。Ｔ細胞の混入をさらに低減するために、産物からＣＤ３＋細胞を除くことができる（例えば、ＣＤ３  ＦＩＴＣおよび抗ＦＩＴＣビーズを用いて）。
【００６０】
上記ＮＫ細胞調製物は、活性化腫瘍細胞調製物による活性化の前に、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％のＣＤ５６＋細胞を含むものでよい。
【００６１】
上記ＮＫ細胞調製物は、活性化腫瘍細胞調製物による活性化の前に、１５％未満、１０％未満、５％未満、または３％未満のＣＤ３＋細胞を含むものでよい。
【００６２】
上記組成物は、活性化腫瘍細胞調製物のすべてもしくは部分（すなわち活性化腫瘍細胞および／またはその膜調製物）またはその産物を含むものでもよい。
【００６３】
ＡＴＣＰによって媒介された活性化は、ＮＫ細胞が受ける唯一の活性化であってもよく、あるいはさらに別の活性化工程があってもよい。上記ＮＫ細胞は、ＩＬ−２による非特異的な活性化も受けていてもよい（例えば、ＩＬ−２で補足された培地中での細胞のインキュベーションによって）。別法として、上記細胞をＩＬ−２の非存在下で活性化してもよいが、ＩＬ−２は、ｅｘ  ｖｉｖｏでの、刺激された細胞の増殖に使用され得る。
【００６４】
（薬物）
本発明の組成物は、医療で使用できる。例えば、被験体の癌を治療または予防するのに上記組成物を使用できる。
【００６５】
活性化ＮＫ細胞を含む組成物は、癌治療用薬物の製品となり得る。
【００６６】
上記組成物は、当技術分野で知られている任意の適した方法、例えば静脈注入によって被験体に投与できる。
【００６７】
上記組成物は、治療を必要とする被験体を治療するのに使用できる。この手順は、危険性が低く、強力な癌治療を行うのが除外されている癌患者（例えば高齢の患者）に特に適している。この手順は、同種異系幹細胞移植用の適当なドナーがいない患者（例えば、リンパ腫、骨髄腫、またはＡＭＬを有する患者）への代替手段も提供する。
【００６８】
上記組成物による治療の前に、例えば、腫瘍を減量するため、および患者を免疫抑制するために、何らかの前治療を患者が受けてもよい。これは、例えば化学療法によって実現できる。
【００６９】
診断時に患者から原発性腫瘍細胞を得ること、そしてこれらを生存単細胞懸濁液として凍結保存することが可能である。したがって、本発明による組成物を、患者の芽球に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験することが可能である。これは、このアプローチの適合性を評価するために治療計画を開始する前に行うことができるであろう。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ検査の結果と、治療に対する対応する臨床反応との相関関係も調査できる。
【００７０】
（疾患）
上記組成物は、疾患または医学的状態を治療または予防するのに使用できる。
【００７１】
上記疾患は癌でもよい。約２００の異なったタイプの癌が存在する。癌のタイプのリストが利用可能である（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｏｒ．ｏｒｇ／ｔｙｐｅｓ．ｈｔｍｌ、またはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒｒｅｓｅａｒｃｈ  ｕｋ．ｏｒｇを参照）。
【００７２】
一部のより一般的な癌には、白血病（急性および慢性）、膀胱癌、骨の癌（骨肉腫）、腸の癌（結腸直腸癌）、脳腫瘍、乳癌、子宮頚部癌、食道癌、ホジキンリンパ腫、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、中皮腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、前立腺癌、皮膚癌（黒色腫および非黒色腫）、軟部組織癌腫、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、および子宮体癌が含まれる。
【００７３】
本発明の組成物は、ＮＫ細胞が接近できる癌を治療するのに有用であり得る。
【００７４】
より詳細には、上記癌は、白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、およびリンパ腫などの血液学的悪性疾患であり得る。
【００７５】
骨髄腫は、不治でありかつ致命的な悪性疾患である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、骨髄腫プラズマ細胞に対するＮＫ活性が記述されており、自系骨髄腫細胞に対する強化されたＮＫ活性は、サリドマイド誘導体を用いた治療に対する反応と相関していることが示されている。骨髄腫患者は、概ね若く、自系造血性幹細胞移植を行うのに十分によい健康状態にあり、本発明によって提供される手順など、より非侵襲的な手順は容易に行うことができよう。
【００７６】
移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）は、実体臓器移植の後に起こる、重度でありかつ比較的に一般的な合併症であり、Ｔ細胞免疫療法が現在試験中であるが、ほとんど成果がない。本発明の治療に従って活性化されたＮＫ細胞を用いる治療は、このグループの患者で、容易かつ安全であろう。
【００７７】
加えて、上記組成物は、乳癌などの固形腫瘍を治療するのにも使用できる。
【００７８】
この手順は、「ＮＫ抵抗性」の腫瘍を治療するのに特に適している。正常な、ＡＴＣＰによって刺激されていないＮＫ細胞は、一部のヒト腫瘍を自発的に溶解させることができるが、他の多くの腫瘍はＮＫ抵抗性である。したがって、本明細書で使用される場合、「ＮＫ抵抗性」は、正常な、非ＡＴＣＰによって刺激されていないＮＫ細胞による溶解に抵抗性である腫瘍細胞を指す。
【００７９】
上記に説明した通り、ＮＫに媒介された溶解の抑制は標的細胞の表面における特定のＭＨＣクラスＩ分子（特にＨＬＡ−Ｃ）の発現によって制御されている。ＮＫ細胞の認識に関して、２つの異なった、ＨＬＡ−Ｃアレルの群が存在する。一部の腫瘍は両方のタイプのＨＬＡ−Ｃアレルを発現し、それらアレルが、それらの腫瘍を、ＮＫで媒介された溶解に対して抵抗性にしていると考えられている。したがって、「ＮＫ抵抗性」の細胞は、両グループのクラスＩアレルを発現しているものであり得る。ＲａｊｉおよびＤａｕｄｉなど、白血病／リンパ腫由来の一部の細胞株は、両方のタイプＨＬＡ−Ｃアレルを発現し、それによって、それらの細胞株はｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＮＫ抵抗性腫瘍細胞の有用なモデルとなっている。
【００８０】
これより実施例を示して本発明をさらに説明する。実施例は、本発明を実施する際に当業者の補助となるように意図されており、いかなる意味においても本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００８１】
（実施例１：ある種の腫瘍細胞株と共にＮＫ細胞をプレインキュベーションするとＮＫ抵抗性細胞の溶解の程度が有意に増大する）
正常なドナーＮＫ細胞をＣＴＶ−１細胞と共にプレインキュベーションすると、Ｒａｊｉ細胞の溶解％が顕著に増大する（ｐ＜０．００１）（図２Ａ、３Ａ、および４Ａ）。ＣＴＶ−１細胞は「活性化腫瘍細胞」である。
【００８２】
ＨＬ−６０（図２Ａ、３Ａ、および４Ａ）またはＲａｊｉ細胞（図３Ａおよび４Ａ）とのプレインキュベーションは、ＮＫ細胞がＲａｊｉ細胞を溶解するのを活性化する効果がより弱いか、あるいは全く無かった。ＨＬＡ−ＫＩＲ不一致の正常な同種異系ＰＢＭＣとのプレインキュベーションは、ＮＫ活性化を誘導しない（図４Ａ）。これらの実験において、腫瘍細胞は、Ｄａｕｄｉ細胞株およびＲａｊｉ細胞株と同様に、正常レベルのＭＨＣクラスＩ抗原を発現している。Ｄａｕｄｉ細胞およびＲａｊｉ細胞は両方とも、クラス１およびクラス２両方のＫＩＲの会合を引き起こすＨＬＡ−Ｃ分子を発現する。
【００８３】
ＣＴＶ−１とのプレインキュベーションは、Ｒａｊｉ、Ｄａｕｄｉ、ＪＯＳＫ、およびＨＬ−６０など、様々な腫瘍細胞株の溶解の程度の増大を引き起こす（図２Ｂ）。
【００８４】
（実施例２：ＮＫ細胞活性化のための必要条件の調査）
ＣＴＶ−１細胞によるＮＫ活性化への、固定およびブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）の影響を、複数の正常ドナーを用いて調査する。図３Ｂに示す通り、腫瘍細胞の固定によって反応が停止されないので、ＮＫ活性化の誘導は、腫瘍細胞株との接触を必要とするが、サイトカインの分泌を必要としない。プレインキュベーション中のブレフェルジンＡの添加によって活性化された状態の誘導が阻止されるので、ＮＫ細胞は、腫瘍細胞の結合に反応するのにタンパク質を合成する必要がある。
【００８５】
（実施例３：ＫＩＲ会合の影響の調査）
刺激フェーズ中におけるＫＩＲ会合（ＫＩＲ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）の影響を調査するために、ＨＬＡ−ＫＩＲが一致した刺激性腫瘍細胞株の使用と、不一致な刺激性腫瘍細胞株の使用とを、ＮＫ細胞がＲａｊｉ細胞を溶解することへの刺激に関して比較する。上記刺激性腫瘍細胞株によるＮＫ活性化の閾値はＫＩＲ会合の非存在下の方が低いようであるが、上記腫瘍細胞株は、ドナーＮＫ細胞に対してＨＬＡ−ＫＩＲが一致している必要はない（図６Ａ）。
【００８６】
別の実験では、正常なドナーから精製されたＮＫ細胞を、それらのＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、および−Ｃ型がＣＴＶ−１細胞とＫＩＲ−リガンド一致であるか、不一致であるかに基づいて選択する。ＣＴＶ−１細胞は、ＨＬＡ−Ｃタイプ２ホモ接合型であり、ＨＬＡ−Ｂｗ４アレルを発現する。したがって、それらはＮＫ細胞上のＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ３ＤＬＩの会合を引き起こす。ＫＩＲ２ＤＬ１を発現するＮＫ細胞、ＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ３ＤＬ１を発現するＮＫ細胞、ならびにＫＩＲ２ＤＬ２／３のみを発現する細胞を用いたＮＫ：ＣＴＶ−１共培養が確立されている。ＫＩＲ２ＤＬ２／３のリガンドは、ＣＴＶ−１刺激因子細胞には存在しない。したがって、ＮＫ活性化工程への、「自己性喪失」の貢献を評価することが可能である。ＨＬＡ−／ＫＩＲが一致しているドナーと、不一致なドナーとの両方からのＣＴＶ−１によってＡＭＬＡＮＫ（ＡＭＬ活性化ＮＫ細胞）が生成されており、一致しているドナーからのＡＭＬＡＮＫの方が、より大きな不均一性を示すが、特異的な溶解の程度には有意な相違がない（図６Ｂ）。溶解の程度は、ＩＬ−２での非特異的な活性化によって得られたものと同程度である（図７Ａ）。
【００８７】
末梢血ＮＫ細胞のＫＩＲ表現型は、個体のＨＬＡによって完全に限定されているわけではなく、ＮＫ細胞が、自己ＭＨＣに適したＫＩＲをもたないことも、さらにはその個体に存在しないＨＬＡアレルに特異的なＫｌＲを発現することさえもよくある。別の実験では、正常なドナーからのＮＫ細胞を、ＣＴＶ−１と共に終夜、共インキュベーションし、ＫＩＲの発現およびＣＤ６９の発現に関して表現型判定を行う。ＣＤ１５８ｂのリガンドはＣＴＶ−１には存在しないが、ＣＤ１５８ａおよびＣＤ１５８ｅ１を発現する細胞も、ＣＤ１５８ａまたはＣＤ１５８ｅ１が不在であるけれどもＣＤ１５８ｂを発現する同じドナーからのＮＫ細胞と同等なレベルの活性化を示すので、ＣＴＶ−１によって誘導されるＮＫ活性化がＫＩＲ不一致を有するＮＫ細胞に限定されないことは直ちに明らかである（図７ｃ）。ＣＴＶ−１によって媒介される活性化、およびＲａｊｉの溶解におけるＫＩＲの役割をより正確に調査するために、ＮＫ細胞を、ＣＴＶ−１刺激因子細胞のＨＬＡへのそれらのＫＩＲ適合性に関して、フローサイトメトリー選別によって表現型判定し、選別する。フロー選別されたＮＫ細胞の部分集合は、直接ＣＴＶ−１細胞と共にインキュベートするか、あるいはＮＫ細胞から抗ＫＩＲ抗体を排除してＫＩＲ：ＨＬＡ相互作用を遮断できないようにして終夜インキュベートする。いずれの場合も、ＣＤ１５８ａおよびＣＤ１５８ｅ１を発現するＮＫ細胞は、同じドナーからのＣＤ１５８ａ／ｅ１−ｖｅ  ＮＫと比較して同程度なＲａｊｉ細胞の溶解を示す（図７ｄ）。
【００８８】
（実施例４：原発性白血病細胞の溶解）
ＣＴＶ−１活性化ＮＫ細胞は、ＨＬＡ−ＫＩＲが一致しているＡＭＬ細胞またはＲａｊｉ細胞と共にプレインキュベートされたＮＫ細胞と比較した場合、ＮＫ抵抗性の腫瘍細胞株を溶解させる能力に加えて、原発性白血病細胞を溶解させる能力が大幅に増大していることも示されている（図４ＢおよびＣ）。
【００８９】
同種異系ドナーからのＡＭＬＡＮＫ細胞は、すべてのＦＡＢ型の原発性ＡＭＬ細胞を溶解できる（図４Ｃ）。これらの細胞は、原発性ＣＬＬ細胞も、１：１のエフェクター：標的細胞比で、殺作用のレベルは低いながら溶解させる。比較的にＮＫ抵抗性の乳癌細胞株であるＭＣＦ−７（実施例５）、ならびに乳癌および卵巣癌の患者からの切除組織から単離された原発性腫瘍細胞（図４Ｄ）がＡＭＬＡＮＫ細胞に対して極めて感受性であることが注意を引いた。
【００９０】
２人のＨＬＡ同一ドナーおよび彼らそれぞれの白血病を有する同胞群の研究において、ＨＬＡ不一致の必要条件がないことが確認されている。患者０１００のＨＬＡ同一同胞群ドナーからのＡＭＬＡＮＫ細胞は、疾患を呈しているこの患者から採取された凍結保存ＣＭＬ芽球を効果的に溶解させる。この溶解は、１：１のＥ：Ｔ比で明らかであり、Ｅ：Ｔ比を増大させると強化された。対照的に、同じドナーからのＮＫ細胞は、１０：１という最も高いＥ：Ｔ比でさえ、ＣＭＬ芽球を溶解させることができなかった。同じことが、ＡＭＬ  Ｍ２を発症していた患者０３５９のＨＬＡ同一同胞群ドナーからのＡＭＬＡＮＫ細胞を用いて観測された。この患者の発症芽球は凍結保存されていた。
【００９１】
（実施例５：ＣａＢｒ細胞株の溶解）
乳癌細胞株ＭＣＦ−７は、４時間のインキュベーション時間の後、Ｅ：Ｔ比５：１でのＡＭＬＡＮＫ溶解に極めて感受性であった（図４Ｃ）。
【００９２】
（実施例６：正常な造血細胞への影響の調査）
上記２種類の腫瘍細胞株で、ハプロミスマッチ（ｈａｐｌｏ−ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ）の正常ドナーＮＫ細胞を刺激しても、ＫＩＲ一致（自系）またはＫＩＲ不一致（ハプロ１またはハプロ２）の正常ＰＢＭＣに対する溶解反応を開始しない（図５Ａ）。
【００９３】
同種異系ＡＭＬＡＮＫ細胞の腫瘍特異性を調査するために、正常なドナーからＮＫ細胞を単離し、終夜、ＣＴＶ−１細胞で活性化するか、あるいは培地中に維持する。その後、正常な自系ＰＢＭＣおよび同種異系ＰＢＭＣの溶解に関して、これらのＡＭＬＡＮＫ細胞を、一致しているＮＫ細胞と比較する。ＮＫ細胞もＡＭＬＡＮＫ細胞も自系ＰＢＭＣを溶解せず、また、それらの細胞がＨＬＡ−Ｃ不一致な正常ドナーからのＰＢＭＣを溶解することもない（図５Ｂ）。ＡＭＬＡＮＫ細胞による骨髄抑制の可能性を判定するために、５人の正常ドナーからの骨髄を用いて造血性コロニー形成アッセイを確立し、ＨＬＡ−Ｃ不一致ドナーからのＡＭＬＡＮＫを、比率を増大させながら添加する。ＣＦＵ−ＧＭ、ＢＦＵ−Ｅ、およびＣＦＵ−ＧＥＭＭは、ＨＬＡ不一致ＡＭＬＡＮＫとの共インキュベーションによる影響を受けない（図５Ｃ）。
【００９４】
（実施例７：ＡＭＬＡＮＫ細胞による溶解の調査）
ＡＭＬＡＮＫ細胞と、同じドナーからの休止ＮＫ細胞との比較およびＩＬ−２で刺激されたＮＫ細胞（リンフォカイン活性化キラー細胞−ＬＡＫ）との比較は、同程度なＲａｊｉの溶解を示す（図７Ａ）。
【００９５】
高Ｅ：Ｔ比（１０：１）の休止ＮＫ細胞と対照的に、ＡＭＬＡＮＫ細胞は、１：１の比率でさえ、検出可能な発症白血病芽球の溶解を行える（図７Ｂ）。波線（図７Ｂ中）は、ＡＭＬ芽球の特異的溶解の程度を表す。これは、化学療法後のＡＭＬ患者における継続的な再発に関連しているものとして、本発明者らが以前に報告しているものである（Ｌｏｗｄｅｌｌら（２００２）Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１１７巻８２１〜７頁）。
【００９６】
（実施例８：ＣＤ６９の重要性の調査）
正常なドナーＮＫ細胞を等しい数の照射されたＣＴＶ−１細胞と共インキュベーションすると、ＮＫ細胞上のＣＤ６９の急速かつ持続的な発現が誘導される（図８Ａ）。精製されたＮＫ細胞を、ＰＫＨ−２６で標識された等しい数の照射されたＣＴＶ−１細胞と混合する。指示されている時点でアリコートを取り出し、抗ＣＤ５６  ＦＩＴＣおよび抗ＣＤ６９  ＡＰＣで標識し、洗浄し、フローサイトメトリーによって分析する。前方角光散乱（ｆｏｒｗａｒｄ  ａｎｇｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒ）（ＦＳＣ）およびＰＫＨ−２６発現に基づいて、ＣＴＶ−１細胞を分析から除外し、ＦＳＣおよびＣＤ５６発現に基づいて、ＮＫ細胞を積極的に含める。結果は、１０人の正常ドナーからのものを提示し、ＣＤ５６＋  ＮＫ画分中のＣＤ６９＋ｖｅ細胞の割合として表す。
【００９７】
照射されたＣＴＶ−１の存在下または非存在下で正常なドナーＮＫ細胞（ｎ＝１０）を終夜インキュベートした場合、フローサイトメトリーによる、さまざまな活性化リガンド候補および抑制リガンド候補の発現に関する、一致している対の比較は、ＣＤ６９発現には有意な増大があるが（ｐ＜０．００１）、検査された他の刺激性リガンドにはいずれにも増大がない（図８Ｂ）ことを示している。ＣＤ１６の発現は減少する。ＣＤ６９の上方制御は、ブレフェルジンＡの存在下で阻止される（データは示されていない）。
【００９８】
Ｅ：Ｔ比１：１でＲａｊｉ細胞と共に共インキュベートされたＡＭＬＡＮＫ細胞は、免疫シナプスにおける共焦点顕微鏡法およびＣＤ６９のキャッピングによると、６０分のときに接合形成を示す。図９Ａは、単一のＲａｊｉ細胞に接合した、正常ドナーからの単一のＡＭＬＡＮＫ細胞を示す。接合体は、抗ＣＤ６９  ＦＩＴＣと、核染色用のＤａｐｉとで標識されている。組換体ヒトＣＤ６９を記載されている通りに生成し、リフォールディングされたタンパク質の上清をＨＰＬＣによって分画する。還元条件下でのウェスタンブロットによって評価した場合、画分Ｆ２およびＦ３が単量体ｒＣＤ６９を含有している。画分４は、かなり高濃度のｒＣＤ６９を含有しており、これは、ＤＴＴの存在下では単量体として、また、非還元条件では単量体および２量体の両方として検出可能である（図９Ｂ）。ｒＣＤ６９は、親の細菌株（レーンＰ）にも、試験された他のすべてのＨＰＬＣ画分にも存在しない（データは示されていない）。標識されたＲａｊｉ細胞のフローサイトメトリー分析は、ｒＣＤ６９を含有しているＨＰＬＣ画分でコーティングされたナノ粒子のみと陽性結合することを示す（図９Ｃでは影付きのヒストグラム）。この結合は、共焦点顕微鏡法（Ｄ）およびフローサイトメトリー（Ｇ）で確認される。悪性Ｂ細胞株と対照的に、正常Ｂ細胞はビーズに結合しない（Ｅ）。ＣＤ６９Ｌ発現も、すべての健康なドナー（ｎ＝３）からのＮＫ感受性Ｋ５６２細胞（図９Ｈ）、正常Ｔ細胞（図９Ｉ）、正常Ｂ細胞（図９Ｊ）、および正常ＮＫ細胞（図９Ｋ）で欠失している。ＣＤ６９Ｌ発現も、Ｄａｕｄｉ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＭＣＦ−７細胞、およびＡＲＨ７７細胞を含めた、Ｔ−ＡＮＫに媒介された溶解に感受性の他の細胞株で検出された（表１）。
【００９９】
【表１】
0005906168.tif 000002
２６０μｇ〜１ｍｇの画分２または４と共にプレインキュベーションされたＲａｊｉ細胞（ナノ粒子の非存在下）は、ｒＣＤ６９を含有しない画分１とのプレインキュベーションと対照的に、ＡＭＬＡＮＫによるＲａｊｉ細胞の溶解を有意に抑制する（Ｆ）。
【０１００】
要約すると、本発明者らは、活性化ＮＫ細胞上に発現されたＣＤ６９が、自系ＡＭＬ細胞との免疫シナプスでキャッピングすることを以前に示しており（Ｌｏｗｄｅｌｌら（２００２）、同上）、さらに現在では、ＡＭＬＡＮＫとＲａｊｉ細胞との間のシナプスでもこれを確認している（図９Ａ）。
【０１０１】
理論に拘泥するものではないが、これらの新知見は、ＣＤ６９リガンド（ＣＤ６９Ｌ）がＡＭＬＡＮＫ感受性の腫瘍細胞で発現されていることを含意する。ＣＤ６９Ｌは現在、未知である。
【０１０２】
（ＣＤ６９はＴ−ＡＮＫによる腫瘍限定殺作用に重要である）
Ｔ−ＡＮＫ活性におけるＣＤ６９：ＣＤ６９Ｌ相互作用の役割を確定するために、ＲＡＪＩ溶解アッセイ前に、ＣＴＶ−１で刺激した後、ＣＤ６９＋  Ｔ−ＡＮＫ細胞をＣＤ６９−ｖｅ細胞から選別する。ＣＤ６９＋ｖｅ画分は、未分画のＴ−ＡＮＫ細胞の活性の８３．７％を媒介し、一方、ＣＤ６９−ｖｅ  ＮＫ細胞は５．５％を示す（図９Ｍ）。ＣＤ６９がＴ−ＡＮＫ誘導で重要な役割を有することは、ｒＣＤ６９の存在下におけるＲＡＪＩ細胞溶解の抑制によって確認される。ＲＡＪＩ細胞をｒＣＤ６９と共にプレインキュベーションすると、ＲＡＪＩ細胞の溶解の程度が有意に低下し、ほとんど休止ＮＫ細胞による溶解のレベルにまでなる。この効果は、ＲＡＪＩ細胞をＢＳＡまたは熱変性されたｒＣＤ６９と共にプレインキュベートした場合には観測されない（図９Ｎ）。
【０１０３】
予測された通り、ｒＣＤ６９は、休止ＮＫ細胞によるＫ５６２の溶解も、Ｔ−ＡＮＫ細胞によるものも阻止しない（図９Ｏ）。
【０１０４】
ＫＩＲを会合させる関連のＨＬＡが存在しないときでさえ、ＡＭＬＡＮＫ細胞による溶解に対する抵抗性を正常造血細胞が有することは、これらの腫瘍細胞が、ＮＫ溶解の原因となる腫瘍限定のリガンドを発現していることを含意する。ブレフェルジンＡの存在下でＡＭＬＡＮＫ産生が存在しないことは、ＡＭＬＡＮＫによって媒介される溶解のためのシグナル伝達物質が、刺激性腫瘍細胞との共インキュベーションで新たに合成されることを確認する。既知なＮＫ誘導分子の中で、ＣＤ６９のみがプレインキュベーション中に上方制御されている。
【０１０５】
ＣＤ６９は、多くの造血細胞で活性化の際に発現されるホモ２量体糖タンパク質である。ＣＤ６９  ＫＯマウスは増強された抗腫瘍活性を示し（Ｅｓｐｌｕｇｕｅｓら（２００３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７巻１０９３〜１１０６頁）、マウスＮＫ細胞におけるモノクローナル抗体によるＣＤ６９の遮断はそれらの細胞の溶解活性を増強する（Ｅｓｐｌｕｇｕｅｓら（２００５）１０５巻４３９９〜４４０６頁）ので、マウスでのデータはＣＤ６９会合はＮＫ媒介の溶解に対して抑制的であることを含意するが、ヒトＮＫ細胞では、ＣＤ６９は会合が引き起こされた際に腫瘍細胞の溶解を惹起することが示されている（Ｄｅｍａｎｅｔら（２００４）Ｂｌｏｏｄ  １０３巻３１２２〜３１３０頁）。組換え体の２量体ヒトＣＤ６９分子を産生させることによって、本発明者らは、腫瘍細胞は、正常な造血細胞には存在しないＣＤ６９リガンドを発現することを示した。さらに、ＣＤ６９Ｌを用いた遮断実験は、活性化ＮＫ細胞上のＣＤ６９が、ＡＭＬＡＮＫの細胞障害性を誘導する主要な誘導分子であることを確認する。これは、ＡＭＬＡＮＫ：Ｒａｊｉ細胞接合によって、ＡＭＬＡＮＫ細胞内でのＳｙｋ活性化が引き起こされるという証拠によって支持される（データは示されていない）。このＳｙｋ活性化は、ＣＤ６９によって媒介されるシグナル伝達に関連していることが知られている現象である（Ｐｉｓｅｇｎａら（２００２）１６９巻６８〜７４頁）。
【０１０６】
（実施例１〜８のための材料および方法）
（細胞株および初代細胞）
すべての細胞株は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手し、１０％ＦＣＳ、１００ｉ．ｕ．ペニシリン、および１００ｉ．ｕ．ストレプトマイシンが補足されたＲＰＭＩ  １６４０（すべてＧｉｂｃｏ社（英国スコットランド、Ｐａｉｓｌｅｙ）販売）からなる「完全培地」（ＣＭ）中で連続浮遊培養で維持する。新規の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、正常な健康なドナーからのヘパリン化静脈血から、不連続密度勾配分離によって単離されたものであり（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ社（英国、Ｎｙｃｏｍｅｄ））、瀉血の４時間以内に使用する。
【０１０７】
（免疫表現型判定）
細胞表面の抗原発現を分析するために、１００μｌのＨＢＳＳ中にある１０５の細胞を、製造会社が推奨する濃度の蛍光色素結合ＭＡｂと、室温で１５分間インキュベートする。洗浄の後、細胞をフローサイトメトリー（ＣｅｌｉＱｕｅｓｔソフトウェアを備えたＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社（英国））によって分析する。前方および側方光散乱特性を用いて、生存リンパ球集団を分別した後、各試料から少なくとも１００００の細胞を取得する。すべての蛍光色素結合ｍＡｂは、ＢＤ社（英国、Ｃｏｗｌｅｙ）またはＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社（英国、Ｈｉｇｈ  Ｗｙｃｏｍｂｅ）から購入されている。
【０１０８】
（ヒトＮＫ細胞および標的細胞の精製）
新規のヘパリン化末梢血液試料は、インフォームドコンセントの後に、正常な健康ドナーと、診断において急性白血病を有する患者および慢性白血病を有する患者（表１）と、同種異系幹細胞移植に選択された患者のＨＬＡ同一ＰＢＳＣ同胞群ドナー２人とから入手されている。同種異系幹細胞移植に選択された患者は、彼らの疾患発症時に骨髄試料を寄贈した。この骨髄試料からの白血病芽球が複数のアリコート中に凍結保存された。
【０１０９】
単核細胞（ＰＢＭＣ）は、静脈血から不連続密度勾配分離によって単離され（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ社（英国、Ｎｙｃｏｍｅｄ））、ＨＬＡクラスＩ  ＡおよびＢアレルに関しては低分解能の技法によって、ＨＬＡ−Ｃｗに関しては高分解能でタイプ判定されている。ＣＤ５６＋  ＣＤ３−細胞は、ＣＤ５６  Ｍｕｌｔｉｓｏｒｔキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社（独国））を用いた直接的免疫磁気分離、およびＣＤ３  ＦＩＴＣおよび抗ＦＩＴＣビーズを用いたその後の除去によって、ＰＢＭＣから精製する。選択されたすべての細胞について、ＣＤ５６＋が＞９８％、ＣＤ３＋が＜３％であることを確認し、ＣＭ中に再懸濁する。
【０１１０】
【表２】
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（ＮＫ細胞の腫瘍特異的活性化）
新たに単離されたＮＫ細胞は、ＣＭ中に密度１０６／ｍｌに懸濁し、等しい数の照射（３０Ｇｙ）された腫瘍細胞と共に３７℃／５％ＣＯ２で２０時間インキュベートする。刺激因子腫瘍細胞は、詳細に特徴付けている骨髄性白血病細胞株である、Ｕ９３７、ＨＬ−６０、およびＣＴＶ−１に限定される。これらの細胞株は、ＤＴＭＺ貯蔵所から入手した。細胞障害性アッセイでの標的細胞には、ＮＫ抵抗性のＲＡＪＩ細胞株（ＤＴＭＺ細胞バンクから入手）、乳癌細胞株ＭＣＦ−７（ＡＴＣＣから入手）、およびＲｏｙａｌ  Ｆｒｅｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌに通院する患者からの原発性白血病細胞が含まれる。各骨髄性白血病細胞株および標的細胞は、上述の通りＨＬＡ判定する。
【０１１１】
（細胞障害性アッセイ）
標的細胞を培養物または冷凍保存物から回収し、ＨＢＳＳ中で洗浄し、その後、１．０ｍｌのＰＨＫ−２６標識化希釈剤中に、密度４×１０６／ｍｌに再懸濁する。４μｌアリコートのＰＫＨ−２６を１．０ｍｌの標識化希釈剤中に添加し、その後、細胞懸濁液に室温で２分間、添加する。無希釈のウシ胎仔血清１．０ｍｌを１分間添加して、標識化反応を停止させる。最後に、標識された細胞をＣＭで２回洗浄し、ＣＭ中に１０６／ｍｌに再懸濁する。ＲＰＭＩ  １６４０（１０％ＦＣＳ）１００μｌ中にある、ＰＫＨ−２６で標識された５００００の標的細胞を４００μｌのエフェクター細胞に添加し、２００ｇ、１分間でペレットにする。
【０１１２】
細胞障害性は、３７℃、４時間の細胞障害性アッセイを用いて、３つ組の試料で測定する。インキュベーション時間の後に、細胞をＴｏ−Ｐｒｏ−３ヨウ化物（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社（米国、Ｏｒｅｇｏｎ））のＰＢＳ溶液（１μＭ）中に再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析する。赤色蛍光に関する電気的ゲート操作の後に、１０２４チャネル分解能で少なくとも１００００の標的細胞を取得し、３つ組の試料から得られたＴｏ−Ｐｒｏヨウ化物陽性細胞の平均比率を測定する。エフェクター細胞の非存在下でインキュベートされた細胞から、バックグランドの標的細胞死を測定する。細胞によって媒介された細胞障害性は、３つの試料から平均された、バックグランド細胞死を超えた殺作用のパーセント、すなわち、
（試験中の細胞溶解％−自発的溶解％）の平均
として報告する。
【０１１３】
これらの実験では、標的細胞の５％未満で自発的溶解は観測されている。一部の実験では、標識化のストラテジーを逆にし、エフェクター細胞をＰＫＨ−２６で標識し、細胞溶解の分析をＰＫＨ−ｖｅ画分に限定する。この反転によって、本発明者らの初期の発見が細胞の標識化による人工産物によるものではないことが確認された。
【０１１４】
（遮断アッセイ）
上述の通りにＴ−ＡＮＫ細胞障害性アッセイを準備する前に、ＰＫＨで標識されたＲＡＪＩおよびＫ５６２標的細胞を、ｒＣＤ６９または対照試薬（１０５の細胞あたり６μｇ）と共に４℃で３０分間プレインキュベートする。
【０１１５】
（組換え体２量体ヒトＣＤ６９の産生および精製）
ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位ならびに終止コドンを導入するプライマー（ＣＤ６９  Ｆｏｒ  ５’ＧＣＧ  ＣＣＴ  ＣＧＡ  ＧＣＡ  ＡＴＡ  ＣＡＡ  ＴＴＧ  ＴＣＣ  ＡＧＧ  ＣＣＡ  ３’；ＣＤ６９  Ｒｅｖ  ５’ＣＧＣ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＴＡＴ  ＴＡＴ  ＴＴＧ  ＴＡＡ  ＧＧＴ  ＴＴＧ  ＴＴＡ  ＣＡ  ３’）を用いて、ＣＤ６９の細胞外ドメイン（残基６５〜１９９）をｃＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する。標準的な技法を用いて、ＰＣＲ産物をｐＥＴ−１９ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位にサブクローニングして、ｐＥＴ−１９ｂ／６９を構築する。ｐＥＴ−１９ｂ／６９のＮｄｅＩ部位とＸｈｏＩ部位との間に、下記のプライマー、すなわち、５’  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＣＡＴ  ＧＣＧ  ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＣＴＧ
ＡＡＴ  ＧＡＡ  ＡＴＴ  ＣＴＧ  ＧＡＴ  ＧＧＣ  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＡＴＧ  ＣＴＧ
ＴＡＴ  ＣＡＴ  ＧＡＡ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ３’  および５’  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＴＴＣ  ＡＴＧ  ＡＴＡ  ＣＡＧ  ＣＡＴ  ＴＴＴ  ＣＡＴ  ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＣＡＧ  ＡＡＴ  ＴＴＣ  ＡＴＴ  ＣＡＧ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＣＧＣ  ＡＴＧ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ３’を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢｉｒＡビオチンタンパク質リガーゼのアミノ酸アクセプター配列をコードするＤＮＡ配列を添加する。ＤＮＡ配列は、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７７  ＤＮＡシークエンサーを用いて、自動配列決定によって確認する。
【０１１６】
Ｈｉｓタグ付きの組換え体ヒトＣＤ６９を、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）中で３７℃で発現させる。１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有する１リットルバッチの２×ＴＹ培地中で培養物を成長させる。培養物のＯＤ６００が約０．６に達した後で、１ｍＭのイソプロピル−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して、ＣＤ６９の発現を誘導する。細胞をさらに４〜５時間増殖させ、その後、４℃、５０００ｇで２０分間の遠心分離によって採取する。細胞ペレットは−８０℃で保存する。
【０１１７】
２５０ｍｌの培養物から得た細胞ペレットを１５ｍｌの氷冷再懸濁緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０）中に再懸濁する。細胞を、１６ゲージの針に複数回、通過させることによって破砕し、その後、４℃、１２０００ｇで１５分間、遠心分離する。ペレットを単離緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２％  Ｔｒｉｔｉｏｎ−Ｘ１００、２Ｍ尿素）で洗浄し、その後、再度、遠心分離する。この過程をもう一度反復する。最後に、ペレットを再懸濁緩衝液で洗浄し、その後−８０℃で保存する。
【０１１８】
精製およびリフォールディングの前に、ペレットを可溶化緩衝液（６Ｍグアニジン塩酸、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール）中に再懸濁し、０．４５μｍのフィルターに通し、その後、リフォールディング緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、６Ｍ尿素、１０ｍＭイミダゾール）で事前に平衡化された、５ｍｌのニッケル付きＨｉＴｒａｐキレートカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＧＥ  Ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ社（英国））に添加する。１００％リフォールディング緩衝液から１００％洗浄緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール）にまで希釈する線形勾配を介して、徐々に尿素を除去することによって、タンパク質をリフォールディングさせる。これは、ＨＰＬＣシステム（Ｖａｒｉａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、５ｍｌ／分間の緩衝液２５０ｍｌを用いて行う。リフォールディングの後、タンパク質を溶出緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール）で溶出する。
【０１１９】
ＰＤ１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＧＥ  Ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ社（英国））を用いて、画分を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０に緩衝液交換し、製造会社の指示に従って、基質１０ｎｍｏｌあたり２．５μｇのＢｉｒＡ酵素（Ａｖｉｄｉｔｙ  Ｄｅｎｖｅｒ社（米国））と共に３０℃で終夜インキュベートする余分なビオチンを除去し、タンパク質を、カットオフ分子量１００００ダルトンの遠心管（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ社（英国））中の５０ｍｌのＨＢＳＳで洗浄することによって濃縮し、ＥＬＩＳＡによってｒＣＤ６９含有量を評価する。
【０１２０】
フローサイトメトリーによってＣＤ６９Ｌの発現をアッセイするために、以前の記載されている通り（Ｂｒｏｗｎら（１９８８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８巻２０８３〜２０９０頁）、４℃、４０分間の回転インキュベーションによって、５μｇのビオチン化ｒＣＤ６９を、アビジンコーティングされた黄色蛍光ビーズ（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ社）に結合させる。凝集を防止するために、タンパク質ビーズ結合体を短時間、超音波処理し、１０５の標的細胞と共に、氷上で６０分間インキュベートする。結合した細胞をＨＢＳＳで洗浄する。同時事象による取得を防止するために、フローサイトメトリーでの取得は最大でも１秒あたり４０事象で行う。各実験の陰性対照として、５μｇの熱変性されたｒＣＤ６９の結合を用いる。
【０１２１】
（実施例９：活性化ＮＫ細胞の、予後不良ＡＭＬ患者を治療するための使用）
上記の通り、Ｍｉｌｌｅｒら（２００５）は、ＨＬＡのハプロアイデンティカルな健康ドナーからのＮＫ細胞を、シクロホスファミドおよびフルダラビンの化学療法の後で再発したＡＭＬと有する患者に与える方法を最近記述した。これらの患者は、ＮＫ細胞の移植、増殖、および存続をｉｎ  ｖｉｖｏで示した。
【０１２２】
Ｍｉｌｌｅｒによって記述された方法を、本発明で使用するために、以下の変化を導入することによって適合させる。すなわち、
（ｉ）本発明による注入および以下に記載する過程の使用前に、同種異系ＮＫ細胞を予め活性化し、
（ｉｉ）ＮＫ細胞は、ハプロアイデンティカルである近縁の正常ドナーから、直接的免疫磁気分離（ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標））によって選択されるであろう。
【０１２３】
Ｍｉｌｌｅｒの研究で注入されたＮＫ産物は、純粋ではなく（ＮＫは約４０％）、Ｔ細胞およびＢ細胞が混入していた。１つの症例ではドナー産物中のＢ細胞クローンに由来するＥＢＶリンパ腫が原因で患者が死亡した。このＢ細胞クローンは、注入後のリンパ球減少期間中にｉｎ  ｖｉｖｏで形質転換した。
【０１２４】
ＮＫ細胞がハプロアイデンティカルである近縁の正常ドナーから、直接的免疫磁気分離（ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ）によって選択される場合、純度９５％超のＣＤ５６＋細胞が得られる。混入ＮＫＴ細胞の程度は、ドナー依存的であるが、Ｍｉｌｌｅｒの研究で注入されたＴ細胞の用量を超える可能性は低い。ＮＫＴの混入が大きいという不測の事態では、Ｍｉｌｌｅｒによって投与されたＴ細胞の用量を超えないことを確実にするために、注入されるＮＫの用量を低減することができる。アロ反応性のＮＫ細胞は、ＭＬＲ中のＣＤ６９発現によって同定することができ、そのような細胞を、注入前の培養前後に、ＫＩＲ発現に関して表現型判定を行う。本発明者らは、移植片対宿主疾患を予測するための皮膚外植体モデルも確立している。このｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、ＮＫ細胞注入の品質保証に用いることができる。
【０１２５】
白血病芽球は、ＡＭＬ患者からの生存細胞として凍結保存する。したがって、患者のＡＭＬ芽球に対する溶解活性に関してｉｎ  ｖｉｔｒｏでドナーＮＫ産物を試験し、その結果を治療に対する臨床反応と相関させる。
【０１２６】
患者は以下の判定規準で選択される。
【０１２７】
すなわち、インフォームドコンセントを与えることができ、かつＣＲ１を超えるＨＬＡハプロアイデンティカルなドナー急性骨髄性白血病細胞を有する成人であること、
ＨＬＡが一致している同胞群または無関係のドナーからの同種異系ＨＳＣＴとして不適格であること、
シクロホスファミドおよびフルダラビンを用いた高用量化学療法に適していることである。
【０１２８】
患者は、５日間連続した毎日の注入によって６０ｍｇ／ｍ２シクロホスファミドおよび２５ｍｇ／ｍ２フルダラビンを受容した。５日目に、同意のあるドナーに１回のアフェレーシスを行い、２〜３×１０１０の単核細胞を得る。ＮＫ細胞は、抗ＣＤ５６マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）およびＣｌｉｎｉＭＡＣＳ装置を用いて、免疫磁気選択によって単離し、等しい数の照射されたＣＴＶ−１骨髄性白血病細胞と共に終夜インキュベートして、腫瘍特異的な刺激を与える。
【０１２９】
終夜のインキュベーションの後に、遠心分離によって細胞を洗浄し、生存しているＮＫ細胞を計数する。最初の５人の患者用には、用量５×１０６  ＮＫ／ｋｇを調製し、次の５人の患者用には１×１０７／ｋｇそして、最後の群の５人の患者用には２×１０７／ｋｇを調製する。ドナーＮＫ細胞のアリコートは、上述の通り、試験用に維持する。６日目に、１回のｉ．ｖ注入で患者に彼らのドナーＮＫ細胞を投与する。臨床的なＧｖＨＤに関して患者をモニターし、細胞特異的なキメラ化検査を最初の７日間は毎日、次の３カ月毎週、その後は１２カ月目まで毎月行う。
【０１３０】
（実施例１０：臨床用腫瘍活性化ＮＫ細胞（Ｔ−ａＮＫ）の産生計画）
（ｉ）Ｔ−ａＮＫのｅｘ  ｖｉｖｏ産生のためのプロトコル
造血幹細胞ドナーと同じ判定規準で、正常かつ健康な近縁ドナーを選択する。インフォームドコンセントを条件として、ＪＡＣＩＥ基準に従って感染症マーカーに関してドナーをスクリーニングし、アフェレーシス実施の適合性に関して医学的に評価する。追加に、各ドナーをアフェレーシス姉妹（ａｐｈｅｒｅｓｉｓ  ｓｉｓｔｅｒ）によって独立に評価する。
【０１３１】
同意したドナーに２時間のアフェレーシスを１回行い、２５×１０９の単核細胞をＡＣＤ抗凝血剤中に採取する。アフェレーシス収集バッグは、ドナー名、ドナー病院番号、ドナーの生年月日、レシピエント名、レシピエント病院番号、アフェレーシスの日時、および産物の容積で標識する。アフェレーシス収集物は、ＬＣＴスタッフのメンバーがユニットから収集し、承認されている容器に入れて、直接ＬＣＴに輸送する。
【０１３２】
ＬＣＴによって承認された際に、ＬＣＴ産物データベースにアフェレーシス収集物を登録し、特有の産物番号を割り振る。データベースには、産物バッグ上に記載された詳細のすべてを再録し、さらにレシピエントの生年月日、レシピエントの体重、および、検査への受け入れおよび同意の際に患者に割り振った特有の検査番号を記録する。
【０１３３】
通常のＳＯＰを用い、密度勾配分離によってアフェレーシス収集物を純粋な単核細胞画分にまで減少させる。単核細胞数およびフローサイトメトリーによるＣＤ５６＋細胞の列挙を得るために１ｍｌの試料を取り出す。２×１０７  ＮＫ／ｋｇ患者体重を得るのに必要な単核細胞画分の容積を２５０ｍｌの無菌バッグ中に回収し、遠心法によって洗浄し、１０％ウシ胎児血清で補足されたＲＰＭＩ  １６４０培地（製薬使用用に承認されているバッチ−すべて培地はＧｉｂｃｏ社（英国、Ｐａｉｓｅｌｙ）の販売）中に５×１０６／ｍｌに再懸濁する。
【０１３４】
（ｉｉ）ＣＴＶ−１細胞株からの細胞膜の調製
ＣＴＶ−１細胞（ＤＳＭＺ組織バンク（独国、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）から直接入手−マスター細胞バンク記録付き）は、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＲＦＵＣＭＳにおけるＰａｕｌ  Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ研究室（ＭＨＲＡ公認組織バンク００２９／００／００／０−０３）において、密閉培養系（Ｌｉｆｅｃｅｌｌバッグ、Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）内のＲＰＭＩ  １６４０培地／１０％ＦＣＳ中、密度０．５〜１×１０６／ｍｌの連続的な指数関数増殖で維持する。生産記録はすべてのバッチに関して保守し、これには、使用されたすべての試薬および使い捨て用品のバッチ番号と、個々の手順を行った全スタッフのイニシャルと、それらの手順の日付とが含まれる。生産過程で使用されたすべての機器の製造番号も記録する。
【０１３５】
細胞膜を調製するには、閉鎖式手順によって８ｍｌアリコートを１０ｍｌの無菌Ｃｒｙｏｃｙｔｅバッグ（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に移し、−８０℃の冷凍庫内に１５分間置く。３７℃のウォーターバス中で迅速に細胞を解凍し、その後、さらに１５分間−８０℃の冷凍庫内に戻す。細胞を再度ウォーターバス中で迅速に解凍する。４０μｌのパルモザイム（１０００Ｕ／ｍｌストック）を各培養バッグに添加し、その後３７℃で３０分間インキュベートする。
【０１３６】
ＤＮＡｓｅを除去するために、２５００×ｇで１０分間の遠心分離によって洗浄した後に、膜調製物を４ｍｌの無菌食塩水（注入用グレード）中に再懸濁し、１２１℃で５分間オートクレーブする。２１℃まで冷却した後に、バッグを超音波処理水槽中に２５秒間置き、オートクレーブ中に形成されている可能性のある凝集体を破砕する。
【０１３７】
手順の様々な段階における試料を採取することによって細胞膜の形成をモニターし、フローサイトメトリーによって、それらをＣＴＶ−１全細胞の前方角光散乱（ＦＳＣ）および９０°光散乱（ＳＳＣ）と比較する。一例を図１０に示す。
【０１３８】
無菌性に関して、通常のＳＯＰに従って膜調製物のバッチ検査を行い、無菌食塩水（注射用）中に総タンパク質濃度５ｍｇ／ｍｌとして、バッチ番号、生産日、および有効期限の日付（製造日から６カ月）と共に、「ＣＴＶ−１膜調製物−臨床グレード。−４０℃より低温で保存すること」と標識された制御装置付き冷凍庫の中に−８０℃で保存する。
【０１３９】
（ｉｉｉ）ＣＴＶ−１膜調製物を用いたドナーＮＫの活性化
５×１０６／ｍｌの選択されたドナー単核細胞を含有するＬｉｆｅｃｅｌｌ培養バッグを、最終濃度１０７ドナーＮＫ細胞あたり５ｍｇの解凍されたＣＴＶ−１膜調製物で補足する。最大細胞用量である１０７  ＮＫ／ｋｇ患者体重を得るのに十分な数の単核細胞を培養する。細胞培養は、ＬＣＴ内にある、Ｈｅｐａフィルター濾過およびモニター付きのインキュベーター内で、３７℃／５％ＣＯ２で、最短１６時間かつ最長２６時間維持する。
【０１４０】
終夜のインキュベーションの後に、単核細胞を遠心法によって回収し、標識化緩衝液（詳細）中に再懸濁し、臨床グレードの抗ＣＤ５６マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）と共に２１℃で４５分間インキュベートする。ＣＤ５６＋  ＮＫ細胞は、ＣｉｉｎｉＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）による免疫磁気選択によって単離する。ＣＤ５６−ｖｅ細胞および残留ＣＴＶ１膜調製物を除去するために何度も洗浄した後にカラムからＮＫ＋画分を回収する（細胞濃縮手順ｖ３．０２、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ
Ｂｉｏｔｅｃ社）。ＣＤ５６＋細胞を回収し、ＲＰＭＩ１６４０中に１０８／ｍｌで懸濁する。細胞は、通常のＳＯＰに従って、必要な用量の単一アリコートで凍結保存する。冷凍保存の前に、品質保証検査用にアリコートを取り分けておく。
【０１４１】
（細胞数）
ＣＤ５６＋細胞の純度（７５％超）
ＣＤ３＋／ＣＤ５６Ｔ細胞の混入（１０５／ｋｇ患者体重未満）
嫌気的／好気的細菌培養（製品出荷前には「陰性」）
４時間の細胞障害性アッセイで、ＮＫ抵抗性細胞株Ｒａｊｉに対して検出可能なＴａＮＫ活性（同じドナーからの一致しているＮＫ細胞と比較して、＞２５％のＲａｊｉ溶解の増大によって判定する）。
【０１４２】
上記明細書中で参照されたすべての出版物を、参照により本明細書に組み込む。本発明の範囲および趣旨から逸脱していない、記載した本発明の方法およびシステムの様々な改変および変形が当業者には明らかであろう。特定の好ましい実施形態に関して本発明を説明したが、特許請求の範囲に記載した通りの本発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定するべきでないことを理解するべきである。実際、本発明を実行するための記載の形態の様々な改変形態が当業者には明らかであり、そのような改変形態も、添付されている特許請求項の範囲に包含されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図９Ｉ】
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【図９Ｊ】
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【図９Ｋ】
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【図９Ｌ】
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【図９Ｍ】
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【図９Ｎ】
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【図９Ｏ】
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【図１０】
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【配列表】
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