(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
0005873604.tif 000080
式中、
ｎおよびｍは、独立して、１、２、３または４である；
Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｃ１０−１８アルキルまたはＣ１２−１８アルケニルである；
Ｘは、−ＣＨ２−、Ｓ、Ｏ、Ｎであるか、または存在しない；
Ｌは、Ｃ１−４アルキレン、−Ｓ−Ｃ１−４アルキレン、−Ｏ−Ｃ１−４アルキレン、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−４アルキレン、−Ｓ（Ｏ）２−Ｃ１−４アルキレン、または
【化２】
0005873604.tif 000081
である；
ここで、
ＸはＳである；あるいは、
Ｌは、−Ｓ−Ｃ１−４アルキレン、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−４アルキレン、−Ｓ（Ｏ）２−Ｃ１−４アルキレン、または
【化３】
0005873604.tif 000082
である；で表されるイオン化可能な脂質化合物、またはその薬学的に受容可能な塩。
【請求項２】
ｎおよびｍが１である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ｎおよびｍが２である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｘが存在しない、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
ＬがＣ１−４アルキレンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｌが、−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２ＣＨ２−および−ＣＨ２−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−からなる群より選択される、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
Ｌが、
【化４】
0005873604.tif 000083
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
Ｌが、
【化５】
0005873604.tif 000084
である、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
Ｘが−ＣＨ２−である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｌが−Ｓ−Ｃ１−４アルキレンである、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｌが−Ｓ−ＣＨ２−または−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−である、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｌが−Ｓ（Ｏ）２−Ｃ１−４アルキレンである、請求項９に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｌが−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２−ＣＨ２−である、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｌが−Ｏ−Ｃ１−４アルキレンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｌが−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−または−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｌが−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−４アルキレンである、請求項９に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｌが−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
ＸがＳである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１９】
ＸがＯである、請求項１に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｒ１およびＲ２が各々Ｃ１０−１８アルキルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項２１】
Ｒ１およびＲ２が各々Ｃ１３アルキルである、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
Ｒ１およびＲ２が各々Ｃ１２−１８アルケニルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項２３】
Ｒ１およびＲ２が各々Ｃ１３−１７アルケニルである、請求項２２に記載の化合物。
【請求項２４】
Ｒ１およびＲ２が各々オレイルまたはリノレイルである、請求項２３に記載の化合物。
【請求項２５】
脂質分子の二重層を含むリポソーム中に、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の化合物を含む、組成物。
【請求項２６】
化合物が、脂質分子のうちの５〜５０モル％である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載の２つの化合物を含み、ここで該２つの化合物のモル比が約１０：３０〜約３０：１０である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
カチオン性脂質をさらに含む、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
カチオン性脂質が、
【化６】
0005873604.tif 000085
である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
カチオン性脂質が、脂質分子のうちの５〜４０モル％である、請求項２８または２９に記載の組成物。
【請求項３１】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載の化合物とカチオン性脂質とのモル比が約５：３５〜約３５：５である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
液体媒質をさらに含む、請求項２５〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
液体媒質が、生物中への注射のために好適である、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
液体媒質が有機溶媒を含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３５】
液体媒質が水および有機溶媒を含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３６】
非水性の媒質をさらに含む、請求項２５〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
少なくとも１のリン脂質をさらに含む、請求項２５〜３６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３８】
少なくとも１のＰＥＧ抱合型脂質をさらに含む、請求項２５〜３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
請求項２５〜３８のいずれか一項に記載の組成物と、構造（レチノイド）ｎ−リンカー−（レチノイド）ｎ（ここでｎ＝０、１、２または３であり、リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＰＥＧ様分子を含む）からなる、星細胞特異的な量の標的化分子とを含む、星細胞特異的薬物キャリア。
【請求項４０】
ｓｉＲＮＡ分子をさらに含む、請求項３９に記載の薬物キャリア。
【請求項４１】
請求項３９または４０に記載の薬物キャリアと、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤とを含む、医薬処方物。
【請求項４２】
ｓｉＲＮＡがリポソームにより被包されている、請求項４１に記載の医薬処方物。
【請求項４３】
患者に薬物を送達するための、請求項４１または４２に記載の医薬処方物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２０１２年６月８日に出願された米国仮出願第６１／６５７，４８０号の利益を主張し、当該出願は、本明細書においてその全体において参考として援用される。
【０００２】
技術分野
説明は、治療剤の送達を増強するためのイオン化可能な脂質に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
多くの技術が、治療剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、核酸などを細胞中へを送達するために利用可能である。これらの技術は、ウイルス的および非ウイルス的なトランスフェクション系を含む。非ウイルス的トランスフェクション系として、例えば、ポリマー、脂質、リポソーム、ミセル、デンドリマーおよびナノ材料が挙げられる。細胞トランスフェクションのために研究されてきたポリマーとして、カチオン性ポリマー、例えばポリ（Ｌ−リジン）（「ＰＬＬ」）、ポリエチレンイミン（「ＰＥＩ」）、キトサンおよびポリ（２−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（「ｐＤＭＡＥＭＡ」）などが挙げられる。
【０００４】
しかし、ウイルス的および非ウイルス的なトランスフェクション技術は、欠点を有する。例えば、ウイルス系は、高いトランスフェクション効率をもたらすことができるが、完全に安全ではない場合がある。さらに、ウイルス系は、調製することが複雑かつ／または高価である場合がある。
【０００５】
非ウイルス的トランスフェクション系、例えばカチオン性ポリマーを使用するものは、プラスミドＤＮＡを細胞中へ輸送することが報告されている。しかし、カチオン性ポリマーは、不安定である場合があり、細胞にとって毒性であり得る。
【０００６】
したがって、細胞、組織および生体への治療剤の送達を改善するためにカチオン性組成物を用いるための、新たな化合物、組成物および方法のための必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００７】
要旨
本説明は、式Ｉ：
【化１】
0005873604.tif 000002
式中、ｎおよびｍは、独立して、１、２、３または４であり；Ｒ１およびＲ２は、独立してＣ１０−１８アルキルまたはＣ１２−１８アルケニルであり；Ｘは、−ＣＨ２−、Ｓ、Ｏ、Ｎであるか、または存在せず；Ｌは、Ｃ１−４アルキレン；−Ｓ−Ｃ１−４アルキレン；−Ｏ−Ｃ１−４アルキレン；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−４アルキレン；−Ｓ（Ｏ）２−Ｃ１−４アルキレン；または
【化２】
0005873604.tif 000003
である；
で表されるイオン化可能な脂質化合物、あるいはその薬学的に受容可能な塩形態に関する。式Ｉで表される化合物を用いる組成物、医薬処方物、薬物キャリア、および方法もまた、記載される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、イオン化可能な脂質：本説明のイオン化可能な脂質の態様のin vitroでの相乗的効力を表す。
【０００９】
【図２】図２は、イオン化可能な脂質：本説明のイオン化可能な脂質の態様のin vitroでの相乗的効力を表す。
【００１０】
【図３】図３は、イオン化可能な脂質：本説明のカチオン性脂質の態様のin vitroでの相乗的効力を表す。
【００１１】
【図４】図４は、イオン化可能な脂質：本説明のカチオン性脂質の態様のin vivoでの効力を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
例示的態様の詳細な説明
本説明は、イオン化可能な脂質化合物、ならびに、細胞、組織および生体へ治療剤を送達することにおけるそれらの使用に関する。
【００１３】
説明の範囲内にあるのは、式Ｉ：
【化３】
0005873604.tif 000004
式中、
ｎおよびｍは、独立して、１、２、３または４であり；
Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｃ１０−１８アルキルまたはＣ１２−１８アルケニルであり；
Ｘは、−ＣＨ２−、Ｓ、Ｏ、Ｎであるか、または存在せず；
Ｌは、Ｃ１−４アルキレン；−Ｓ−Ｃ１−４アルキレン；−Ｏ−Ｃ１−４アルキレン；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−４アルキレン；
−Ｓ（Ｏ）２−Ｃ１−４アルキレン；または
【化４】
0005873604.tif 000005
である；
で表されるイオン化可能な脂質化合物、あるいはその薬学的に受容可能な塩形態である。
【００１４】
説明の範囲内において、ｎおよびｍは、同じであっても異なっていてもよい。好ましい態様において、ｎおよびｍは、同じである。特に好ましいものは、ｎおよびｍがいずれも１であるか、ｎおよびｍがいずれも２である態様である。
【００１５】
説明の幾つかの態様において、Ｘは結合である。他の態様において、Ｘは−ＣＨ２−である。なお他のものにおいて、ＸはＳである。また好ましいのは、ＸがＯである態様である。ＸがＮである態様もまた、本説明の範囲内である。
【００１６】
説明の幾つかの態様において、ＬはＣ１−４アルキレンである。他の態様において、Ｌは、−Ｓ−Ｃ１−４アルキレンである。さらに他の態様において、Ｌは−Ｏ−Ｃ１−４アルキレンである。なお他の態様において、Ｌは、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−４アルキレンである。あるいは、Ｌは、−Ｓ（Ｏ）２−Ｃ１−４アルキレンである。また説明の範囲内にあるのは、Ｌが
【化５】
0005873604.tif 000006
である態様である。
【００１７】
Ｘが結合である態様において、Ｌは、好ましくはＣ１−４アルキレンである。Ｌのかかる例として、−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−および−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−が挙げられる。Ｘが結合である他の態様において、Ｌは、
【化６】
0005873604.tif 000007
である。
【００１８】
Ｘが−ＣＨ２−である態様において、Ｌは、好ましくは−Ｓ−Ｃ１−４アルキレンである。Ｌのかかる例として、−Ｓ−ＣＨ２−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−および−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−が挙げられる。
【００１９】
Ｘが−ＣＨ２−である他の態様において、Ｌは、好ましくは−Ｓ（Ｏ）２−Ｃ１−４アルキレンである。Ｌのかかる例として、−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２、−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２−ＣＨ２、−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−およびＳ（Ｏ）２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−が挙げられる。
【００２０】
Ｘが−ＣＨ２−であるさらに他の態様において、Ｌは−Ｏ−Ｃ１−４アルキレンである。Ｌのかかる例として、−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−および−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−が挙げられる。
【００２１】
ＸがＳである本説明の態様において、Ｌは、好ましくはＣ１−４アルキレンである。Ｌのかかる例として、−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−および−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−が挙げられる。
【００２２】
ＸがＯである態様において、Ｌは、好ましくはＣ１−４アルキレンである。Ｌのかかる例として、−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−および−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−が挙げられる。
【００２３】
説明の範囲内において、Ｒ１およびＲ２は、同じであっても異なっていてもよい。好ましくは、Ｒ１およびＲ２は、同じである。好ましくは、Ｒ１およびＲ２は、Ｃ１０−１８アルキルである。また好ましいものは、Ｃ１０−１８アルキルが直鎖状Ｃ１０−１８アルキルである態様である。より好ましいものは、Ｒ１およびＲ２がＣ１２−１８アルキルである態様である。また好ましいものは、Ｒ１およびＲ２がＣ１２−１５アルキルである態様である。最も好ましい態様において、Ｒ１およびＲ２はいずれもＣ１３アルキルである。
【００２４】
説明の他の態様において、Ｒ１およびＲ２はＣ１２−１８アルケニルである。好ましくは、Ｒ１およびＲ２はＣ１３−１７アルケニルである。より好ましくは、Ｒ１およびＲ２は、各々オレイルである：
【化７】
0005873604.tif 000008
【００２５】
説明の他の態様において、Ｒ１およびＲ２はＣ１２−１８アルケニルである。好ましくは、Ｒ１およびＲ２はＣ１３−１７アルケニルである。より好ましくは、Ｒ１およびＲ２は、各々リノレオイルである。
【化８】
0005873604.tif 000009
【００２６】
また説明の範囲内であるものは、式Ｉで表される化合物をリポソーム中に含む組成物であって、ここで、リポソームは、脂質分子の二重層を含む。式Ｉで表される化合物は、かかる組成物中の脂質分子の任意のモル％を含むことができるが、式Ｉで表される化合物が、説明の組成物における脂質分子の約５〜約５０モル％であることが好ましい。
【００２７】
式Ｉで表される化合物をリポソーム中に含む説明の組成物は、１より多くの式Ｉで表される化合物を含んでもよい。好ましい態様において、かかる説明の組成物は、２つの式Ｉで表される化合物を含む。これらの態様において、２つの式Ｉで表される化合物のモル比は、約１０：３０〜約３０：１０であることが好ましい。
【００２８】
式Ｉで表される化合物をリポソーム中に含む説明の組成物は、さらにカチオン性脂質を含んでもよい。かかる態様において、カチオン性脂質は、組成物の脂質分子の約５〜約４０モル％である。また、式Ｉで表される化合物をリポソーム中にカチオン性脂質と共に含むこれらの態様において、式Ｉで表される化合物のカチオン性脂質に対するモル比は、約５：３５〜約３５：５である。より好ましくは、比は、約１０：３０〜約３０：１０である。
【００２９】
説明の範囲内において、任意の説明の組成物は、さらに液体媒質を含んでもよい。好ましくは、液体媒質は、生物中への注射のために好適である。幾つかの態様において、液体媒質は、有機溶媒を含む。あるいは、説明のある態様において用いられる液体媒質は、水および有機溶媒を含む。説明の他の態様において、液体媒質は、さらに非水性の媒質を含んでもよい。
【００３０】
また、説明の範囲内において、説明の任意の組成物は、さらに、少なくとも１のリン脂質を含んでもよい。
【００３１】
説明の他の態様において、説明の任意の組成物は、さらに、少なくとも１のＰＥＧ抱合型脂質を含んでもよい。
【００３２】
また、説明の範囲内にあるものは、星細胞特異的薬物キャリアである。説明のこれらの態様は、上述の組成物のうちの任意のもの、ならびに、（レチノイド）ｎ−リンカー−（レチノイド）ｎからなる星細胞特異的な量の標的化分子を含み、ここで、ｎ＝０、１、２または３であり；およびここで、リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＰＥＧ様分子を含む。
【００３３】
好ましい態様において、説明の薬物キャリアは、さらにｓｉＲＮＡ分子を含む。
【００３４】
また、説明の範囲内にあるものは、医薬処方物である。説明の範囲内の医薬処方物は、上述の説明の薬物キャリアのうちの任意のもの、および薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む。かかる処方物において、ｓｉＲＮＡは、説明の組成物のリポソームにより被包されていることが好ましい。
【００３５】
また、説明の範囲内にあるものは、薬物を、処置の必要がある患者に送達する方法である。これらの方法は、説明の範囲内の医薬処方物を提供すること、および当該医薬処方物を患者に投与することを含む。
【００３６】
定義
以下の用語は、本明細書を通して用いられる。
【００３７】
本明細書において用いられる場合、「カチオン性脂質」とは、少なくとも１の脂質部分と、対イオンに結合した正に荷電した四級窒素とを含む化合物を指す。「脂質」は、当該分野において、疎水性のアルキルまたはアルケニル部分とカルボン酸またはエステル部分とからなると理解される。本説明における使用のために好ましいカチオン性脂質として、以下：
【化９】
0005873604.tif 000010
が挙げられる。
【００３８】
本明細書において用いられる場合、「イオン化可能な脂質」とは、説明の範囲内の式Ｉで表される化合物を指す。これらの化合物は、適切な対イオン種、例えばイオン化可能な水素原子を含む種と接触した場合に、荷電した種を形成することができる。
【００３９】
本明細書において用いられる場合、「アルキル」とは、直鎖状または分枝状の、完全に飽和した（二重または三重結合を含まない）炭化水素基、例えば一般式−ＣｎＨ２ｎ＋１を有する基を指す。アルキル基は、１〜５０個の炭素原子を有し得る（本明細書において現れる場合は常に、「１〜５０」などの数値範囲は、所与の範囲内の各整数を指す；例えば、「１〜５０個の炭素原子」は、アルキル基が、５０個の炭素原子まで、およびそれを含む、１個の炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子などからなってもよいことを意味するが、本定義はまた、数値範囲が指定されない場合における用語「アルキル」の出現を包含する）。アルキル基はまた、１〜３０個の炭素原子を有する中程度のサイズのアルキルであってもよい。アルキル基はまた、１〜５個の炭素原子を有する低級アルキルであってもよい。化合物のアルキル基は、「Ｃ１−４アルキル」または類似の名称として命名されてもよい。単なる例として、「Ｃ１−４アルキル」とは、アルキル鎖中に１〜４個の炭素原子が存在すること、すなわち、当該アルキル鎖がメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、sec−ブチルおよびｔ−ブチルからなる群より選択されることを示す。典型的なアルキル基として、決して限定されないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、三級ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが挙げられる。
【００４０】
本明細書において用いられる場合、「アルキレン」とは、アルカンジイル官能基、例えば、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、などを指す。
【００４１】
本明細書において用いられる場合、「アルケニル」とは、直鎖状または分枝状の炭化水素鎖中に１または２以上の二重結合を含むアルキル基を指す。アルケニル基は、不飽和であっても、置換されていてもよい。置換されている場合、置換基は、他に示されない限りにおいて、アルキル基の置換に関して上で開示された同じ基から選択することができる。オレイルは、かかるアルケニル基の一例である。
【００４２】
本明細書において用いられる場合、用語「医薬用キャリア」とは、化合物の細胞または組織中への組み込みを促進する化学化合物を指す。例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、多くの有機化合物の生物の細胞または組織中への取り込みを促進するために、一般的に利用されるキャリアである。
【００４３】
本明細書において用いられる場合、用語「希釈剤」とは、水中で希釈された化学化合物であって、目的の処方物（例えば、化合物、レチノイド、第２の脂質、安定化剤および／または治療剤を含むことができる処方物）を溶解し、ならびに、当該処方物の生物学的に活性な形態を安定化するものを指す。緩衝化された溶液中に溶解された塩は、当該分野において希釈剤として利用される。一つの一般的に用いられる緩衝化溶液は、リン酸緩衝化食塩水である。なぜならば、それはヒトの血液の塩条件を模倣するからである。緩衝化塩は、低い濃度において溶液のｐＨを制御するので、緩衝化された希釈剤は、処方物の生物学的活性を殆ど改変しない。本明細書において用いられる場合、「賦形剤」とは、限定することなく、組成物に嵩、粘度、安定性、結合能力、潤滑性、崩壊能力などを提供するために、処方物に添加される不活性な物質を指す。「希釈剤」は、賦形剤の一つの型である。
【００４４】
説明の範囲内において用いられる「有機溶媒」は、それ自体は当該分野において公知であり、例えば、Ｃ１−４アルキルアルコール、ジメチルスルホキシド（「ＤＭＳＯ」）、などが挙げられる。
【００４５】
本明細書において用いられる場合、「治療剤」とは、治療有効量において哺乳動物に投与された場合に、当該哺乳動物に対して治療的利益を提供する化合物を指す。治療剤は、本明細書において薬物としても言及され得る。当業者は、用語「治療剤」が規制当局の承認を受けた薬物に限定されないことを理解するであろう。「治療剤」は、本明細書において記載される化合物、レチノイドおよび／または第２の脂質と、作動的に結合していてもよい。例えば、本明細書において記載される第２の脂質は、リポソームを形成することができ、治療剤は、例えば本明細書において記載されるように、当該リポソームに作動的に連結していてもよい。
【００４６】
本明細書において用いられる場合、「レチノイド」とは、頭尾結合の様式において連結された４つのイソプレノイド単位からなる化合物のクラスのメンバーである：G. P. Moss、「Biochemical Nomenclature and Related Documents」、第２版、Portland Press、pp. 247-251（1992）を参照。「ビタミンＡ」は、レチノールの生物学的活性を質的に示すレチノイドについての一般的記載である。本明細書において用いられる場合、レチノイドとは、第１世代、第２世代および第３世代のレチノイドを含む、天然および合成のレチノイドを指す。天然に存在するレチノイドの例として、限定されないが、（１）１１−シス−レチナール、（２）オール−トランスレチノール、（３）パルミチン酸レチニル、（４）オール−トランスレチノイン酸、および（５）１３−シス−レチノイン酸が挙げられる。さらに、用語「レチノイド」は、レチノール、レチナール、レチノイン酸、レチノイド、およびそれらの誘導体を包含する。
【００４７】
本明細書において用いられる場合、「レチノイドコンジュゲート」とは、少なくとも１のレチノイド部分を含む分子を指す。説明の好ましい態様において、レチノイドコンジュゲートは、組成物または処方物の総重量に基づいて、約０．３〜約３０重量％の濃度において存在し、これは、約０．１〜約１０モル％と等しく、これは、約０．１〜約１０のモル比に等しい。好ましくは、レチノイドコンジュゲートは、レチノイド−リンカー−脂質分子またはレチノイド−リンカー−レチノイド分子である。
【００４８】
レチノイドコンジュゲートの一例として、式ＩＩ：
【化１０】
0005873604.tif 000011
式中、ｑ、ｒおよびｓは、各々独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である、
の化合物、ならびにその鏡像異性体およびジアステレオマーが挙げられる。
【００４９】
好ましい式ＩＩの化合物は、ｑ、ｒおよびｓが、各々独立して、１、２、３、４、５、６または７であるものを含む。より好ましいものは、ｑ、ｒおよびｓが、各々独立して、３、４または５である式ＩＩの化合物である。最も好ましいものは、ｑが３であり、ｒが５であり、およびｓが３である式ＩＩの化合物である。式ＩＩの化合物の一例は、
【化１１】
0005873604.tif 000012
である。
【００５０】
ＤｉＶＡ−ＰＥＧ−ＤｉＶＡは、立体中心を含み、全ての鏡像異性体およびジアステレオマーは、説明の範囲内であるものとみなされる。
【００５１】
本明細書において用いられる場合、「レチノイド−リンカー−脂質分子」とは、例えばＰＥＧ部分などの少なくとも１のリンカーを通して少なくとも１の脂質部分に結合した、少なくとも１のレチノイド部分を含む分子を指す。
【００５２】
本明細書において用いられる場合、「レチノイドリンカー−レチノイド分子」とは、例えばＰＥＧ部分などの少なくとも１のリンカーを通して少なくとも１の他のレチノイド部分（これは同じであっても異なっていてもよい）に結合した、少なくとも１のレチノイド部分を含む分子を指す。
【００５３】
本明細書において用いられる場合、用語「脂質」および「親油性」は、本明細書において、当業者により理解されるようなそれらの通常の意味において用いられる。脂質および親油性基の非限定的な例として、脂肪酸、ステロール、Ｃ２−Ｃ５０アルキル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルキル、Ｃ２−Ｃ５０アルケニル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルケニル、Ｃ２−Ｃ５０アリール、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアリール、Ｃ２−Ｃ５０アルキニル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルキニル、Ｃ２−Ｃ５０カルボキシアルケニル、およびＣ２−Ｃ５０カルボキシヘテロアルケニルが挙げられる。脂肪酸は、飽和または不飽和の、長鎖モノカルボン酸であって、例えば１２〜２４個の炭素原子を含むものである。脂質は、本質的に非水溶性であることにより特徴づけられ、水中で０．０１％未満（重量に基づいて）の溶解度を有する本明細書において用いられる場合、用語「脂質部分」および「親油性部分」とは、脂質またはその部分であって、別の基に結合するようになったものを指す。例えば、脂質基は、別の化合物（例えばモノマー）に対して、当該脂質の官能基（カルボン酸基など）とモノマーとの適切な官能基との間の化学反応により、結合するようになってもよい。
【００５４】
本明細書において用いられる場合、「星細胞」は肝星細胞を含む。
【００５５】
本明細書において用いられる場合、「ｓｉＲＮＡ」とは、低分子干渉ＲＮＡ（small interfering RNA）を指し、これはまた、当該分野において、短干渉ＲＮＡ（short interfering RNA）またはサイレンシングＲＮＡとしても知られる。ｓｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ分子のクラスであり、当該分野において公知の多様な効果を有し、最も顕著であるのは、特定の遺伝子の発現およびタンパク質発現に干渉することである。
【００５６】
用語「リポソーム」は、本明細書において、当業者により理解されるようなその通常の意味において用いられ、水性媒質の中で実質的に閉じた構造を形成する極性の疎水性基に結合した脂質を含む、脂質二重層構造を指す。幾つかの態様において、リポソームは、治療剤およびレチノイドなどの１または２以上の化合物と、作動的に結合していてもよい。リポソームは、単一の脂質二重層（すなわち単層）からなっても、２または３以上の脂質二重層（すなわち多重膜）からなってもよい。リポソームの内部は多様な化合物からなり得るが、リポソームの外部は、リポソームを含む水性処方物に対して接触可能である。リポソームは、適切に、球状または楕円体状の形状であってよい。
【００５７】
幾つかの態様において、ｓｉＲＮＡは、当該ｓｉＲＮＡが水性の媒質に対して接触不可能となるように、リポソームにより被包される。ｓｉＲＮＡを被包する場合、リポソームは固体のコアを有する；ｓｉＲＮＡを被包し固体のコアを有するかかるリポソームは、本明細書において「脂質ナノ粒子」と名付けられる。他の態様において、ｓｉＲＮＡは、リポソームによって被包されない。かかる態様において、ｓｉＲＮＡは、予め形成されたリポソームをＲＮＡと水溶液中で混合することにより、リポソームの外表面上に複合体化されていてもよい。これらの態様において、ｓｉＲＮＡは、水性媒質に対して接触可能である。その外表面上にのみ結合したｓｉＲＮＡを有するリポソームは、本明細書において「リポプレックス」と名付けられる。
【００５８】
本説明の処方物はまた、ＰＥＧ抱合型脂質を含んでもよい。説明の範囲内におけるＰＥＧ抱合型脂質は、それ自体は当該分野において公知である。好適なＰＥＧ−脂質として、ＰＥＧ−リン脂質およびＰＥＧ−セラミド、例えば、ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ、ＰＥＧ２０００−ＤＰＰＥ、ＰＥＧ２０００−ＤＭＰＥ、ＰＥＧ２０００−ＤＯＰＥ、ＰＥＧ１０００−ＤＳＰＥ、ＰＥＧ１０００−ＤＰＰＥ、ＰＥＧ１０００−ＤＭＰＥ、ＰＥＧ１０００−ＤＯＰＥ、ＰＥＧ５５０−ＤＳＰＥ、ＰＥＧ５５０−ＤＰＰＥ、ＰＥＧ−５５０ＤＭＰＥ、ＰＥＧ−１０００ＤＯＰＥ、ＰＥＧ−ＢＭＬ、ＰＥＧ−コレステロール、ＰＥＧ２０００−セラミド、ＰＥＧ１０００−セラミド、ＰＥＧ７５０−セラミド、ＰＥＧ５５０−セラミドなどが挙げられる。
【００５９】
前述の説明の組成物は、１または２以上のリン脂質、例えば１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（「ＤＳＰＣ」）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（「ＤＰＰＣ」）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（「ＤＰＰＥ」）、および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）などを含んでもよい。好ましくは、ヘルパー脂質はＤＯＰＥである。
【００６０】
また説明の範囲内にあるのは、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤に加えて上述の組成物のうちの任意のものを含む、医薬処方物である。本説明の医薬処方物は、少なくとも１の治療剤を含む。好ましくは、治療剤はｓｉＲＮＡである。本説明の範囲内において任意のｓｉＲＮＡ分子を用いることができることが想起される；例えば、ｓｉＲＮＡは、以下を含んでもよい：
【化１２】
0005873604.tif 000013
【００６１】
ｓｉＲＮＡを含む本説明の好ましい処方物において、ｓｉＲＮＡは、リポソームにより被包される。他の態様において、ｓｉＲＮＡは、リポソームの外側にあってもよい。それらの態様において、ｓｉＲＮＡは、リポソームの外側に対して複合体化されていてもよい。
【００６２】
また説明の範囲内にあるのは、患者に対して治療剤を送達する方法である。これらの方法は、前述の組成物のいずれかおよび薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む医薬処方物を提供すること；ならびに、当該医薬処方物を患者に投与することを含む。
【００６３】
別の側面において、本開示は、１または２以上の生理学的に受容可能な界面活性剤、医薬用キャリア、希釈剤、賦形剤、および懸濁剤、またはそれらの組み合わせ；ならびに、本明細書において開示される処方物（例えば、化合物、レチノイド、第２の脂質、安定化剤、および／または治療剤を含んでもよい処方物）を含む、医薬処方物に関する。受容可能なさらなる医薬用キャリアまたは治療的用途のための希釈剤は、薬学の分野において周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第１８版、Mack Publishing Co.（Easton, PA）（1990）において記載され、これは、本明細書において参考としてその全体において援用される。保存剤、安定化剤、染料などが、医薬処方物において提供されてもよい。例えば、安息香酸ナトリウム、アスコルビン酸、およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが、保存剤として添加されてもよい。さらに、抗酸化剤および懸濁剤が用いられてもよい。多様な態様において、アルコール、エステル、硫酸化脂肪族アルコールなどを、界面活性剤として用いることができる；ショ糖、ブドウ糖、乳糖、デンプン、結晶化セルロース、マンニトール、軽質無水ケイ酸、アルミン酸マグネシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、炭酸カルシウム、酸性炭酸ナトリウム、リン酸水素カルシウム、カルボキシメチルセルロースカルシウムなどを、賦形剤として用いることができる；ココナツ油、オリーヴ油、ゴマ油、ピーナツ油、大豆を、懸濁剤または潤滑剤として用いることができる；セルロースまたは糖などの炭水化物の誘導体として酢酸フタル酸セルロース、あるいは、ポリビニルの誘導体として酢酸メチル−メタクリレートコポリマーを、懸濁剤として用いることができる；ならびに、フタル酸エステルなどの可塑剤を、懸濁剤として用いることができる。
【００６４】
本明細書において記載される医薬処方物は、ヒト患者に対して、それ自体で投与しても、あるいは、併用治療におけるもののように他の活性成分と、または好適な医薬用キャリアもしくは賦形剤と混合される医薬処方物において投与してもよい。本適用の化合物の処方および投与のための技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences、第１８版、Mack Publishing Co.（Easton, PA）（1990）において見出すことができる。
【００６５】
好適な投与の経路として、例えば筋肉内、皮下、静脈内、髄内注射、ならびに髄腔内、直接脳室内、腹腔内、鼻内または眼内注射を含む非経口送達が挙げられる。処方物（例えば、化合物、レチノイド、第２の脂質、安定化剤および／または治療剤を含むことができる処方物）はまた、持続または制御放出投与形態において投与することができ、これは、予め決定された速度における長期および／または時限的なパルス投与のための、デポー注射、浸透圧ポンプなどを含む。さらに、投与の経路は、局所性であっても全身性であってもよい。
【００６６】
医薬処方物は、それ自体公知の様式において、例えば、慣用的な混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、すりつぶし（levigating）、乳化、被包、封入または打錠プロセスにより、製造することができる。
【００６７】
医薬処方物は、任意の慣用的な様式において、医薬として用いることができる製剤中への活性化合物のプロセッシングを容易にする賦形剤および助剤を含む、１または２以上の生理学的に受容可能な医薬用キャリアを用いて、処方することができる。適切な処方物は、選択された投与の経路に依存する。周知の技術、医薬用キャリアおよび賦形剤のうちの任意のものを、好適なものとして、および当該分野（例えば上記のRemington’s Pharmaceutical Sciences）において理解されるように、用いることができる。
【００６８】
注射可能物は、従来の様式において、液体の溶液もしくは懸濁液、注射の前に液体中で溶液もしくは懸濁にするために好適な固体形態、または乳液のいずれかとして、調製することができる。好適な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、マンニトール、乳糖、レシチン、アルブミン、グルタミン酸ナトリウム、塩酸システインなどである。さらに、所望される場合、注射可能な医薬処方物は、湿潤化剤、ｐＨ緩衝化剤などの微量の非毒性の補助物質を含んでもよい。生理学的に適合可能な緩衝液として、限定されないが、ハンクス溶液、リンガー溶液、または生理食塩水緩衝液が挙げられる。所望される場合、吸収を促進する調製物を利用してもよい。
【００６９】
例えばボーラス注射または持続注入による非経口投与のための医薬処方物は、水溶性形態における活性処方物（例えば、化合物、レチノイド、第２の脂質、安定化剤、および／または治療剤を含んでもよい処方物）の水溶液を含む。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油性の注射用懸濁液として調製してもよい。水性の注射用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストリンなどの懸濁液の粘性を増大する物質を含んでもよい。任意に、懸濁液はまた、化合物の可溶性を増大させて高い濃度の溶液の調製物を可能にする、好適な安定化剤を含んでもよい。注射のための処方物は、単位投与形態において、例えばアンプルにおいて、または複数用量の容器において、保存剤を添加して、提示することができる。処方物は、油性または水性のビヒクル中の懸濁液、溶液または乳液としての形態を取ることができ、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの調合剤（formulatory agent）を含んでもよい。あるいは、活性成分は、好適なビヒクル、例えば無菌のパイロジェンフリー水による使用の前の構成のための、粉末の形態であってもよい。
【００７０】
前に記載される調製物に加えて、処方物はまた、デポー調製物として処方してもよい。かかる長期作用処方物は、筋肉内注射により投与することができる。したがって、例えば、処方物（例えば化合物、レチノイド、第２の脂質、安定化剤、および／または治療剤を含んでもよい処方物）は、好適なポリマー性もしくは疎水性の材料（例えば、受容可能な油中の乳液として）またはイオン交換樹脂と共に、あるいは難溶性の誘導体として、例えば難溶性の塩として、処方してもよい。
【００７１】
説明の組成物および処方物はまた、局所送達のために処方してもよく、局所送達ビヒクルの適用のための任意の好適なプロセスを用いて対象の皮膚に適用してもよい。例えば、処方物は、手動で、アプリケーターを用いて、または両方を含むプロセスにより、適用することができる。適用の後で、処方物は、例えば摩擦することにより対象の皮膚中へ組み込まれることができる。適用は、１日複数回、または１日１回行うことができる。例えば、処方物を、１日１回、１日２回、または１日複数回、対象の皮膚に適用してもよく、あるいは、２日毎に１回、３日毎に１回、または１週間毎に１回、２週間毎に１回、または数週間毎に１回適用してもよい。
【００７２】
本明細書における幾つかの態様は、治療剤を細胞に送達する方法に関する。例えば、幾つかの態様は、ｓｉＲＮＡなどの治療剤を細胞中に送達する方法に関する。本明細書において記載される方法による使用のために好適な細胞は、原核細胞、酵母、または植物および動物細胞（例えば哺乳動物細胞）を含む高等な真核細胞を含む。幾つかの態様において、細胞は、ヒト線維肉腫細胞（例えばＨＴ１０８０細胞株）であってもよい。他の態様において、細胞は、肝星細胞（ＬＸ２細胞株）であってもよい。他の態様において、細胞は癌細胞であってよい。さらに他の態様において、細胞は、幹細胞（ｐＨＳＣ細胞株）であってもよい。癌のためのモデル系である細胞株を用いてもよく、これは、限定されないが、乳癌（ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４３８細胞株）、Ｕ８７神経膠芽腫細胞株、Ｂ１６Ｆ０細胞（黒色腫）、ＨｅＬａ細胞（子宮頚癌）、Ａ５４９細胞（肺癌）、およびラット腫瘍細胞株ＧＨ３および９Ｌを含む。これらの態様において、本明細書において記載される処方物を、細胞にトランスフェクトするために用いることができる。これらの態様は、細胞を、治療剤を含む本明細書において記載される処方物と接触させて、それにより治療剤を細胞に送達することを含んでもよい。
【００７３】
本明細書において開示されるのは、異常な線維化により特徴づけられる状態を処置するための方法であり、これは、治療有効量の本明細書において記載される処方物を投与することを含んでもよい。異常な線維化により特徴づけられる条件として、癌および／または線維性疾患が挙げられ得る。本明細書において記載される処方物により処置または寛解され得る癌の型として、限定されないが、肺癌、膵臓癌、乳癌、肝臓癌、胃癌および大腸癌が挙げられる。一態様において、処置または寛解され得る癌は、膵臓癌である。別の態様において、処置または寛解され得る癌は、肺癌である。本明細書において記載される処方物により処置または寛解され得る線維性疾患の型として、限定されないが、肝線維症、肝硬変、膵炎、膵線維症、嚢胞性線維症、声帯の瘢痕、声帯の粘膜線維症、喉頭線維症、肺線維症、特発性肺線維症、嚢胞性線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症および腎性全身性線維症が挙げられる。一態様において、処置または寛解され得る状態は、肝線維症である。
【００７４】
本明細書において記載される処方物または医薬組成物は、任意の好適な手段により対象に投与することができる。投与の方法の非限定的な例として、とりわけ、（ａ）皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内、眼窩内、関節内、脊髄内、胸骨内（intrasternally）などの、注入ポンプ送達を含む、注射を介する投与；（ｂ）腎臓または心臓領域における、例えばデポー移植物による、直接注射などによる；ならびに、活性化合物を生きている組織と接触させるために当業者により適切であるとみなされるような、局所投与が挙げられる。
【００７５】
投与のために好適な医薬組成物として、活性成分がその意図される目的を達成するために有効な量において含有される処方物（例えば、化合物、レチノイド、第２の脂質、安定化剤、および／または治療剤を含んでもよい処方物）が挙げられる。用量として必要とされる本明細書において開示される化合物の治療有効量は、投与の経路、ヒトを含む処置されている動物の型、および対象とされている特定の動物の身体的特徴に依存するであろう。用量は、所望される効果を達成するために合わせられるが、体重、食事、併用される薬物などの要因、および医学の分野における当業者が認識するであろう他の要因に依存するであろう。より具体的には、治療有効量とは、疾患の症状を緩和もしくは寛解するか、または処置されている対象の生存を延長するために有効な、化合物の量を意味する。治療有効量の決定は、本明細書において提供される詳細な開示を考慮すれば特に、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００７６】
当業者には容易に明らかとなるであろうが、投与されるべき有用なin vivoでの投与量、および投与の特定の様式は、年齢、体重および処置される哺乳動物種、使用される特定の化合物、ならびにそれらの化合物が使用される特定の用途に依存して変化するであろう。所望される結果を達成するために必要である投与量のレベルである有効な投与量のレベルの決定は、当業者により慣用的な薬理学的方法を用いて達成することができる。典型的には、生成物のヒトの臨床的適用は、より低い投与量のレベルにおいて開始され、所望される結果が達成されるまで、投与量のレベルを増大する。あるいは、受容可能なin vitroでの研究を、確立された薬理学的な方法を用いて本方法により同定される組成物の有用な用量および投与の経路を確立するために、用いることができる。
【００７７】
非ヒト動物の研究において、潜在的な生成物の適用は、より高い投与量レベルにおいて開始され、所望される効果がもはや達成されないか、または有害な副作用が消失するまで、減少させる。投与量は、所望される効果および治療指標に依存して、広い範囲をとり得る。典型的には、投与量は、体重１ｋｇあたり約１０マイクログラム〜約１００ｍｇ、好ましくは、体重１ｋｇあたり約１００マイクログラム〜約１０ｍｇであり得る。あるいは、投与量は、当業者により理解されるように、患者の表面面積に基づいて、これに対して計算することができる。
【００７８】
医薬組成物の正確な処方、投与の経路、および投与量は、個々の医師により、患者の状態を考慮して選択され得る（例えばFinglら（1975年、「The Pharmacological Basis of Therapeutics」中）を参照：これは本明細書によりその全体において参考として援用される：特に第１章、１頁を参照）。典型的には、患者に投与される組成物の用量の範囲は、患者の体重１ｋｇあたり約０．５〜約１０００ｍｇであってよい。投与量は、患者により必要とされるとおりに、単一、または、１日もしくは２日以上の経過において投与される、２もしくは３以上のシリーズであってよい。少なくとも幾つかの条件について化合物についてのヒトの投与量が確立されている例において、投与量は、確立されたヒトの投与量とほぼ同じ、またはその約０．１％〜約５００％、より好ましくは約２５％〜約２５０％である投与量となるであろう。新たに発見された医薬組成物の場合におけるように、確立されたヒトの投与量が存在しない場合、好適なヒトの投与量は、ＥＤ５０もしくはＩＤ５０値、または、動物における毒性の研究および効力の研究により認定されるような、in vitroもしくはin vivoでの研究からもたらされる他の適切な値から推量することができる。
【００７９】
主治医は、毒性または臓器の機能不全に起因して、投与を終了、中断または調整する方法および時期を知っている。逆に、主治医はまた、臨床的応答が十分でない場合、処置をより高いレベルに調整する（毒性をもたらさないように）ことも知っているであろう。目的の障害の管理において投与される用量の大きさは、処置されるべき状態の重篤度に、および投与の経路に依存して変化するであろう。状態の重篤度は、例えば、部分的に、標準的な予後評価方法により、評価することができる。さらに、用量およびおそらくは投与頻度はまた、個々の患者の年齢、体重および応答に従って変化するであろう。上記のものに比較し得るプログラムは、獣医学において用いることができる。
【００８０】
正確な投与量は、各薬物に基づいて決定されるが、殆どの場合において、投与量に関して何らかの一般化を行うことができる。成人ヒト患者のための１日の投与レジメンは、例えば、約０．１ｍｇ〜２０００ｍｇ、好ましくは約１ｍｇ〜約５００ｍｇ、例えば、５〜２００ｍｇの各活性成分の用量であり得る。他の態様において、約０．０１ｍｇ〜約１００ｍｇ、好ましくは約０．１ｍｇ〜約６０ｍｇ、例えば約１〜約４０ｍｇの各活性成分の用量の、静脈内、皮下または筋肉内投与が用いられる。薬学的に受容可能な塩の投与の場合において、投与量は、遊離塩基として計算してもよい。幾つかの態様において、処方物を、１日１〜４回投与する。あるいは、処方物は、持続的な静脈内注入により、好ましくは１日あたり約１０００ｍｇまでの各活性成分の用量において、投与してもよい。当業者により理解されるであろうが、特定の状況において、特に攻撃的な疾患または感染症を効果的にかつ攻撃的に処置するために、本明細書において開示される処方物を、上記の好ましい投与範囲を超えるか、はるかに超える量において、投与する必要がある場合がある。幾つかの態様において、処方物は、持続治療の期間にわたり、例えば１週間以上、または数か月間もしくは数年間にわたり、投与されるであろう。
【００８１】
投与の量および間隔は、調整効果を維持するために十分な活性成分の血漿レベルまたは最少有効濃度（ＭＥＣ）をもたらすために、個々に調整してもよい。ＭＥＣは、各化合物について異なるが、in vitroのデータから概算することができる。ＭＥＣを達成するために必要な投与量は、個々の特徴および投与の経路に依存するであろう。しかし、ＨＰＬＣアッセイまたはバイオアッセイを用いて、血漿濃度を決定することができる。
【００８２】
投与の間隔もまた、MEC値を用いて決定することができる。組成物は、１０〜９０％、好ましくは３０〜９０％および最も好ましくは５０〜９０％の時間にわたり、MECより上の血漿レベルを維持するレジメンを用いて投与するべきである。
【００８３】
局所投与または選択的取り込みの場合、薬物の有効な局所濃度は、血漿濃度に関連しない場合がある。
【００８４】
投与される処方物の量は、処置されている対象、対象の体重、疾患の重篤度、投与の様式、および処方医師の判断に依存してよい。
【００８５】
本明細書において開示される処方物（例えば、化合物、レチノイド、第２の脂質、安定化剤、および／または治療剤を含んでもよい処方物）は、効力および毒性について、公知の方法を用いて評価することができる。例えば、特定の化合物、または特定の化学部分を共有する化合物のサブセットの毒性学は、哺乳動物、好ましくはヒトの細胞株などの細胞株に対するin vitroでの毒性を決定することにより、確立することができる。かかる研究の結果は、しばしば、哺乳動物、ことさらにはヒトなどの動物における毒性を予測するものである。あるいは、マウス、ラット、ウサギまたはサルなどの動物モデルにおける特定の化合物の毒性を、公知の方法を用いて決定することができる。特定の化合物の効力は、in vitroの方法、動物モデル、またはヒト臨床治験などの、幾つかの認知された方法を用いて決定することができる。認知されたin vitroモデルは、限定されないが癌、循環器疾患および多様な免疫不全を含む、ほぼ全てのクラスの状態について存在する。同様に、受容可能な動物モデルを、かかる状態を処置するために化学物質の効力を確立するために用いることができる。効力を決定するためにモデルを選択する場合、当業者は、適切なモデル、用量、および投与の経路、およびレジメンを選択するために、最先端の知識により指導されることができる。無論、ヒトの臨床治験もまた、ヒトにおける化合物の効力を決定するために用いることができる。
【００８６】
処方物は、所望される場合、パックまたはディスペンサーデバイスにおいて提示されてもよく、これは、活性成分を含む１または２以上の単位投与形態を含んでもよい。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチック箔を含んでもよい。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が付随していてもよい。パックまたはディスペンサーデバイスにはまた、医薬の製造、使用または販売を規制する政府当局により処方された形式における、容器に関する通知が付随していてもよく、この通知は、ヒトへのまたは獣医学的投与のための薬物の形態の当局による認可を反映するものである。かかる通知は、例えば、処方薬についての連邦食品医薬品局により認可されたラベル、または認可された製品挿入物であってよい。適合性の医薬用キャリア中で処方された化合物を含む組成物もまた、調製し、適切な容器中に配置し、示された状態の処置のためにラベルすることができる。
【００８７】
１または２以上の立体中心を有する本明細書において記載される任意の化合物において、絶対的な立体化学が明示的に示されない場合、各々の中心は、独立して、Ｒ−立体配置のもの、またはＳ−立体配置のもの、またはそれらの混合物であってよいことが理解される。したがって、本明細書において提供される化合物は、鏡像異性体に関して純粋であっても、立体異性体の混合物であってもよい。さらに、ＥまたはＺとして定義することができる幾何異性体を生ずる１または２以上の二重結合を有する任意の化合物において、各々の二重結合は、独立して、ＥまたはＺまたはそれらの混合物であってよい。同様に、全ての互変異性体形態もまた、含まれることが意図される。
【００８８】
説明の範囲内の好ましい式Ｉで表される化合物を、表１において記載する。in vitroおよびin vivoのデータ（以下を参照）もまた、表１において記載する。
【表１−１】
0005873604.tif 000014
【表１−２】
0005873604.tif 000015
【表１−３】
0005873604.tif 000016
【００８９】
説明はさらに、以下の例を参照して例示することができる。これらの例は、単に例示的なものであり、説明を限定することを意図しない。
【００９０】
実験セクション
（（２−（ジメチルアミノ）アセチル）アザンジイル）ビス（プロパン−３，１−ジイル）ジテトラデカノアート（i-Pr-DC）の調製
【化１３】
0005873604.tif 000017
【００９１】
ステップ１：中間体１：３，３’−アザンジイルビス（プロパン−１−オール）の調製
【化１４】
0005873604.tif 000018
３−アミノ−１−プロパノール（１４．５ｍＬ、１９．０ｍｍｏｌ）、１−クロロ−３−ヒドロキシプロパン（８．００ｍＬ、９５．６ｍｍｏｌ）およびＨ２Ｏ（〜５０ｍＬ）の混合物を、２４時間にわたり還流した。水酸化カリウム（５．４０ｇ）を次いで添加した。溶解後に、水の全てを蒸発させて、粘調なオイルおよび大量の塩化カリウムを残した。これらを濾過し、乾燥アセトンおよびジクロロメタンで洗浄した。有機相を、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、オイルを残す。ＤＣＭ／ＭｅＯＨ勾配で溶離させるシリカゲルクロマトグラフィーによる精製は、３，３’−アザンジイルビス（プロパン−１−オール）（１２．５ｇ）を生じた。
【００９２】
ステップ２：中間体２：ｔｅｒｔ−ブチルビス（３−ヒドロキシプロピル）カルバメートの調製
【化１５】
0005873604.tif 000019
３，３’−アザンジイルビス（プロパン−１−オール）（１２．５ｇ、９５．４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２５ｍＬ）中で希釈した。ＤＣＭ（２５ｍＬ）中のジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボナート（２６．０ｇ、１１９ｍｍｏｌ）の溶液を、アルゴンガスのブランケット下において、撹拌しながらゆっくりと添加した。反応を、一晩撹拌させた。反応混合物を濃縮した。ＤＣＭ／ＭｅＯＨ勾配で溶離させるシリカゲルクロマトグラフィーによる精製は、ｔｅｒｔ−ブチルビス（３−ヒドロキシプロピル）カルバメートを生じた。
【００９３】
ステップ３：中間体３：（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アザンジイル）ビス（プロパン−３，１−ジイル）ジテトラデカノアートの調製
【化１６】
0005873604.tif 000020
ｔｅｒｔ−ブチルビス（３−ヒドロキシプロピル）カルバメート（４．００ｇ、１７．３ｍｍｏｌ）、Ｅｔ３Ｎ（４．８ｍＬ、３４．６ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（５２９ｍｇ、４．３３ｍｍｏｌ）を、クロロホルム（５０ｍＬ）中に溶解した。氷槽中で撹拌しながら、塩化ミリストイルの溶液を、１５分間かけて添加した。添加は、反応の温度が３０℃を超えないように行った。反応を、室温で一晩撹拌させた。翌日、ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）および０．９％の食塩水溶液（５０ｍＬ）を添加して、反応をクエンチした。有機層を分離し、１ＭのＮａＨＣＯ３で洗浄した。溶媒をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮して、（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アザンジイル）ビス（プロパン−３,１−ジイル）ジテトラデカノアートをオイルとして得、それを、さらなる精製なしに先へ進めた。
【００９４】
ステップ４：中間体４：アザンジイルビス（プロパン−３，１−ジイル）ジテトラデカノアートＴＦＡ塩の調製
【化１７】
0005873604.tif 000021
（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アザンジイル）ビス（プロパン−３，１−ジイル）ジテトラデカノアート（１１．３ｇ、１７．３ｍｍｏｌ）をＴＦＡ／ＣＨＣｌ３（１：１、２０ｍＬ）中で溶解し、混合物を、室温で１５分間撹拌させた。材料を、次いで真空中で濃縮した。これを、２回繰り返した。材料を、次いでＤＣＭ中に溶解し、Ｈ２Ｏで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空中で濃縮し、一晩、完全に乾燥させた。反応混合物を濃縮した。ＤＣＭ／ＭｅＯＨ勾配で溶離させるシリカゲルクロマトグラフィーによる精製は、アザンジイルビス（プロパン−３，１−ジイル）ジテトラデカノアートＴＦＡ塩（７．５ｇ）を生じた。
【００９５】
ステップ５：i-Pr-DC：（（２−（ジメチルアミノ）アセチル）アザンジイル）ビス（プロパン−３,１−ジイル）ジテトラデカノアートの調製
【化１８】
0005873604.tif 000022
アザンジイルビス（プロパン−３,１−ジイル）ジテトラデカノアートＴＦＡ塩（７５０ｍｇ、１．３５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（５ｍＬ）中のＮ，Ｎ−ジメチルグリシン（１５４ｍｇ、１．４９ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（６１６ｍｇ、１．６２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（４９５ｕＬ、２．８４ｍｍｏｌ）の予め活性化させた混合物に添加した。フラスコにアルゴンを流し、室温で一晩撹拌させた。反応混合物を濃縮した。ＤＣＭ／ＭｅＯＨ勾配で溶離させるシリカゲルクロマトグラフィーによる精製は、（（２−（ジメチルアミノ）アセチル）アザンジイル）ビス（プロパン−３,１−ジイル）ジテトラデカノアート（４６５ｍｇ）を生じた。QTOF MS ESI＋：m/z 639.6（Ｍ＋Ｈ）。
【００９６】
（Ｚ）−（（２−（ジメチルアミノ）アセチル）アザンジイル）ビス（プロパン−３,１−ジイル）ジオレアートの調製
(i-Pr-DODC)
【化１９】
0005873604.tif 000023
【００９７】
ステップ１：中間体１：３，３’−アザンジイルビス（プロパン−１−オールの調製
【化２０】
0005873604.tif 000024
３−アミノ−１−プロパノール（１４．５ｍＬ、１９．０ｍｍｏｌ）、１−クロロ−３−ヒドロキシプロパン（８．００ｍＬ、９５．６ｍｍｏｌ）および水（５０ｍＬ）の混合物を、２４時間にわたり還流した。水酸化カリウム（５．４０ｇ）を次いで添加した。溶解後に、水の全てを蒸発させて、粘調なオイルおよび大量の塩化カリウムを残した。これらを濾過し、乾燥アセトンおよびジクロロメタンで洗浄した。有機相を、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、オイルを残す。ＤＣＭ／ＭｅＯＨ勾配で溶離させるシリカゲルクロマトグラフィーによる精製は、３，３’−アザンジイルビス（プロパン−１−オール）（１２．５ｇ）を生じた。
【００９８】
ステップ２：中間体２：ｔｅｒｔ−ブチルビス（３−ヒドロキシプロピル）カルバメートの調製
【化２１】
0005873604.tif 000025
３，３’−アザンジイルビス（プロパン−１−オール）（１２．５ｇ、９５．４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２５ｍＬ）中で希釈した。ＤＣＭ（２５ｍＬ）中のジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボナート（２６．０ｇ、１１９ｍｍｏｌ）の溶液を、Ａｒガスのブランケット下において、撹拌しながらゆっくりと添加した。反応を、一晩撹拌させた。反応混合物を濃縮した。ＤＣＭ／ＭｅＯＨ勾配で溶離させるシリカゲルクロマトグラフィーによる精製は、ｔｅｒｔ−ブチルビス（３−ヒドロキシプロピル）カルバメートを生じた。
【００９９】
ステップ３：中間体３：（Ｚ）−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アザンジイル）ビス（プロパン−３,１−ジイル）ジオレアートの調製
【化２２】
0005873604.tif 000026
ｔｅｒｔ−ブチルビス（３−ヒドロキシプロピル）カルバメート、トリエチルアミンおよびＤＭＡＰを、クロロホルム中に溶解した。氷槽中で撹拌しながら、塩化オレイルの溶液を、１５分間かけて添加した。添加は、反応の温度が３０℃を超えないように行った。反応を、室温で一晩撹拌させた。翌日、ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）および０．９％の食塩水溶液（５０ｍＬ）を添加して、反応をクエンチした。有機層を分離し、１ＭのＮａＨＣＯ３で洗浄した。溶媒をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮して、（Ｚ）−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アザンジイル）ビス（プロパン−３,１−ジイル）ジオレアートを、オイルとして得、それを、さらなる精製なしに先へ進めた。
【０１００】
ステップ４：中間体４：（Ｚ）−アザンジイルビス（プロパン−３,１−ジイル）ジオレアートＴＦＡ塩の調製
【化２３】
0005873604.tif 000027
（Ｚ）−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アザンジイル）ビス（プロパン−３,１−ジイル）ジオレアート（１３．２ｇ、１７．３ｍｍｏｌ）を、ＴＦＡ／ＣＨＣｌ３（１：１、２０ｍＬ）中に溶解し、混合物を、室温で１５分間撹拌させた。材料を、次いで真空中で濃縮した。これを、２回繰り返した。材料を、次いでＤＣＭ中に溶解し、Ｈ２Ｏで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空中で濃縮した。ＤＣＭ／ＭｅＯＨ勾配で溶離させるシリカゲルクロマトグラフィーによる精製は、（Ｚ）−アザンジイルビス（プロパン−３,１−ジイル）ジオレアートＴＦＡ塩を生じた。
【０１０１】
ステップ５：i-Pr-DODC：（Ｚ）−（（２−（ジメチルアミノ）アセチル）アザンジイル）ビス（プロパン−３,１−ジイル）ジオレアートの調製
【化２４】
0005873604.tif 000028
（Ｚ）−アザンジイルビス（プロパン−３,１−ジイル）ジオレアートＴＦＡ塩（７５０ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（５ｍＬ）中のＮ，Ｎ−ジメチルグリシン（１２８ｍｇ、１．２４ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（５１７ｍｇ、１．３６ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（４１３ｕＬ、２．３７ｍｍｏｌ）の予め活性化させた混合物に添加した。フラスコにアルゴンを流し、室温で一晩撹拌させた。反応混合物を濃縮した。ＤＣＭ／ＭｅＯＨ勾配で溶離させるシリカゲルクロマトグラフィーによる精製は、（Ｚ）−（（２−（ジメチルアミノ）アセチル）アザンジイル）ビス（プロパン−３,１−ジイル）ジオレアート（４５０ｍｇ）を生じた。QTOF MS ESI＋：m/z 747.7（Ｍ＋Ｈ）。
【０１０２】
（（２−（ジメチルアミノ）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアート、（i-DC）の調製
【化２５】
0005873604.tif 000029
【０１０３】
ステップ１：中間体１：（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートの調製
【化２６】
0005873604.tif 000030
Ｎ−Ｂｏｃジエタノールアミン（ＭＷ２０５．２５；８．４ｇ、０．０４１モル）、トリエチルアミン（ＭＷ１０１．１９；１１．５ｍｌ、０．０８３ｍｏｌ）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＭＷ１２２．１７；１．３ｇ、０．０１１モル）を、クロロホルム（１７０ｍＬ）中に溶解した。氷／水槽中で撹拌しながら、１００ｍＬのクロロホルム中の塩化ミリストイル（ＭＷ２４６．８２；２２ｍＬ、８０．９ｍｍｏｌ）の溶液を一滴ずつ添加した。反応混合物を、次いで冷槽から取り出し、室温で２時間、撹拌を続けた。２００ｍＬのメタノールおよび２００ｍｌの０．９％の食塩水の混合物を添加して、反応をクエンチした。撹拌を停止して、有機層を単離した。回転式蒸発により溶媒を取り除き、（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートを無色のオイル（２５．７ｇ）として得、それを、さらなる精製なしに先へ進めた。
【０１０４】
ステップ２：中間体２の調製：アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートＴＦＡ塩
【化２７】
0005873604.tif 000031
１００ｍｌのクロロホルム中の（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアート（３３．０ｇ、０．０５３モル）の溶液に、トリフルオロ酢酸（１５０ｍＬ、２．０２ｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、室温で一晩撹拌した。回転式蒸発により溶媒を取り除いた後で、生じた固体を、８０ｍｌのメタノールから再結晶化し、アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートＴＦＡ塩（１６．６ｇ）を白色固体として得た。
【０１０５】
ステップ３：i-DC：（（２−（ジメチルアミノ）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートの調製
【化２８】
0005873604.tif 000032
アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートＴＦＡ塩（１０ｇ、１６ｍｍｏｌ）を、ピリジン（２０ｍＬ）中のジメチルグリシン（４２．５ｇ、２５ｍｍｏｌ）、DCC（４．７ｇ、２３ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（６．３３ｍＬ、４０ｍｍｏｌ）で希釈した。丸底フラスコにアルゴンガスを流し、反応混合物を、５５℃で一晩加熱した。翌日、反応混合物を濃縮した。ＤＣＭ／ＭｅＯＨで溶離するシリカゲルクロマトグラフィーによる精製の後で、プールした画分を濃縮して、（（２−（ジメチルアミノ）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートを得た。
【０１０６】
（（３−（ジメチルアミノ）プロパノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアート（i-Et-DC、本明細書においてまたEt104としても言及される）の調製
【化２９】
0005873604.tif 000033
【０１０７】
i-Et-DC：（（３−（ジメチルアミノ）プロパノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートの調製
【化３０】
0005873604.tif 000034
【０１０８】
アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートＴＦＡ塩の合成は、先に記載される。アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートＴＦＡ塩（１．５０ｇ、２．８５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１０ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（１０ｍＬ）中の３−（ジメチルアミノ）プロピオン酸のＨＣｌ塩（４８２ｍｇ、３．１４ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１．３０ｇ、３．４２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（1.04ｍＬ、5.98mmol）の予め活性化させた混合物に添加した。丸底フラスコにアルゴンガスを流し、反応混合物を、室温で一晩撹拌させた。反応混合物を濃縮した。ＤＣＭ／ＭｅＯＨで溶離するシリカゲルクロマトグラフィーによる精製の後で、プールした画分を濃縮して、ＤＣＭ（２０ｍＬ）および１０％のＫ２ＣＯ３（２０ｍＬ）中で、０〜５℃で３０分間、撹拌した。有機層を単離し、水層を、ＤＣＭ（２×１０ｍＬ）でさらに抽出した。組み合わせた有機物を、ＭｇＳＯ４と共に３０分間、０〜５℃で撹拌し、濾過し、ＤＣＭで洗浄し、濃縮して、（（３−（ジメチルアミノ）プロパノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアート（１．０１ｇ）を得た。QTOF MS ESI＋：m/z 625.6（Ｍ＋Ｈ）。
【０１０９】
（Ｚ）−（（３−（ジメチルアミノ）プロパノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレアートの調製
i-Et-DODC
【化３１】
0005873604.tif 000035
【０１１０】
ステップ１：中間体１：（Ｚ）−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレアートの調製
【化３２】
0005873604.tif 000036
Ｎ−Ｂｏｃジエタノールアミン（１７．８ｇ、０．０８７モル）、トリエチルアミン（２４．４ｍＬ、０．１７６モル）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（２．７６ｇ、０．０２３モル）を、３５０ｍｌのクロロホルム中に溶解した。撹拌しながら、１００ｍｌのクロロホルム中の塩化オレイルの溶液（６１．６ｇ、０．１７４モル）を、１０分間かけて添加した（あるいは、Ｎ−Ｂｏｃジエタノールアミンのクロロホルム溶液を氷／水槽中に浸漬しつつ、塩化オレイルを添加した）。添加は、反応の温度混合物が５０℃を超えないように行った。反応混合物を、室温で２時間撹拌した。２００ｍｌのメタノールおよび２００ｍｌの０．９％の食塩水の混合物を添加して、反応をクエンチした。有機層を分離し、２×１００ｍｌの炭酸水素ナトリウムの希水溶液で洗浄した。回転式蒸発により溶媒を取り除き、（Ｚ）−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレアートを、淡黄色のオイル（５９．５ｇ）として得た。この材料を、さらなる精製なしに、次のステップのために用いた。
【数１】
0005873604.tif 000037
【０１１１】
ステップ２：中間体２：（Ｚ）−アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレアートＴＦＡ塩の調製
【化３３】
0005873604.tif 000038
（Ｚ）−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレアート（５９．５ｇ、０．０８１モル）を、１００ｍｌのトリフルオロ酢酸（１００ｍＬ、１．３５ｍｏｌ）および１００ｍｌのクロロホルムで２回処理した。各々は、室温での１０分間にわたる撹拌からなり、各処理の終了時において、回転式蒸発により、溶媒を取り除いた。残渣を、２００ｍｌの塩化メチレン中で溶解し、混合物を、１００ｍｌの水中で２回洗浄した。残渣を、メタノールと塩化メチレンとの混合物を溶離液として用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、（Ｚ）−アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレアートＴＦＡ塩（４４．０ｇ）を得た。
【数２】
0005873604.tif 000039
【０１１２】
ステップ３：i-Et-DODC：（Ｚ）−（（３−（ジメチルアミノ）プロパノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレアートの調製
【化３４】
0005873604.tif 000040
（Ｚ）−アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレアートＴＦＡ塩（１．５０ｇ、２．３７ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１０ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（１０ｍＬ）中の３−（ジメチルアミノ）プロピオン酸 ＨＣｌ塩（３８３ｍｇ、２．４９ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１．０３ｇ、２．７２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（８３１ｕＬ、４．７７ｍｍｏｌ）の予め活性化させた混合物に添加した。丸底フラスコにアルゴンガスを流し、反応混合物を、室温で一晩撹拌させた。反応混合物を濃縮した。ＤＣＭ／ＭｅＯＨで溶離するシリカゲルクロマトグラフィーによる精製の後で、プールした画分を濃縮して、ＤＣＭ（２０ｍＬ）および１０％のＫ２ＣＯ３（２０ｍＬ）中で、０〜５℃で３０分間撹拌した。有機層を単離し、水層を、ＤＣＭ（２×１０ｍＬ）でさらに抽出した。組み合わせた有機物を、ＭｇＳＯ４と共に、３０分間、０〜５℃で撹拌し、濾過し、ＤＣＭで洗浄し、濃縮して、（Ｚ）−（（３−（ジメチルアミノ）プロパノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレアートを得た。QTOF MS ESI＋：m/z 733.6（Ｍ＋Ｈ）。
【０１１３】
（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアート［i-Prop-DC（本明細書においてまたPr104としても言及される）］の調製
【化３５】
0005873604.tif 000041
【０１１４】
アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートＴＦＡ塩の合成は、先に記載される。アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートＴＦＡ塩（１．００ｇ、１．９０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（５ｍＬ）中の４−（ジメチルアミノ）ブタン酸ＨＣｌ塩（３８２ｍｇ、２．２８ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（８６７ｍｇ、２．２８ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（７２８ｕＬ、４．１８ｍｍｏｌ）の予め活性化させた混合物に添加した。丸底フラスコにアルゴンガスを流し、反応混合物を、室温で一晩撹拌させた。反応混合物を濃縮した。ＤＣＭ／ＭｅＯＨで溶離するシリカゲルクロマトグラフィーによる精製の後で、プールした画分を濃縮して、ＤＣＭ（２０ｍＬ）および１０％のＫ２ＣＯ３（２０ｍＬ）中で、０〜５℃で３０分間撹拌した。有機層を単離し、水層を、ＤＣＭ（２×１０ｍＬ）でさらに抽出した。組み合わせた有機物を、ＭｇＳＯ４と共に、３０分間、０〜５℃で撹拌し、濾過し、ＤＣＭで洗浄し、濃縮して、（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートを得た。LCMS ESI＋：m/z 639.6（Ｍ＋Ｈ）。
【０１１５】
（Ｚ）−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレアートの調製
［i-Prop-DODC（本明細書においてまたPr104-DOとしても言及される）］
【化３６】
0005873604.tif 000042
【０１１６】
（Ｚ）−アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレアートＴＦＡ塩の合成は、先に記載される。（Ｚ）−アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレアートＴＦＡ塩（１．００ｇ、１．５８ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（５ｍＬ）中の４−（ジメチルアミノ）ブタン酸ＨＣｌ塩（３１７ｍｇ、１．８９ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（７１９ｍｇ、１．８９ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（６０６ｕＬ、３．４８ｍｍｏｌ）の予め活性化させた混合物に添加した。丸底フラスコにアルゴンガスを流し、反応混合物を、室温で一晩撹拌させた。反応混合物を濃縮した。ＤＣＭ／ＭｅＯＨで溶離するシリカゲルクロマトグラフィーによる精製の後で、プールした画分を濃縮して、ＤＣＭ（２０ｍＬ）および１０％のＫ２ＣＯ３（２０ｍＬ）中で、０〜５℃で３０分間撹拌した。有機層を単離し、水層を、ＤＣＭ（２×１０ｍＬ）でさらに抽出した。組み合わせた有機物を、ＭｇＳＯ４と共に、３０分間、０〜５℃で撹拌し、濾過し、ＤＣＭで洗浄し、濃縮して、（Ｚ）−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレアートを得た。LCMS ESI＋：m/z 747.7（Ｍ＋Ｈ）。
【０１１７】
（Ｚ）−（（２−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレアート（S104-DO）の調製
【化３７】
0005873604.tif 000043
【０１１８】
（Ｚ）−アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレアートＴＦＡ塩の合成は、先に記載される。（Ｚ）−アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレアートＴＦＡ塩（４．０６ｇ、６．４１ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（６０ｍＬ）中で１０％のＫ２ＣＯ３（３０ｍＬ）と共に、０〜５℃で撹拌した。３０分後、有機相を分離し、水相をＤＣＭ（３０ｍＬ）でさらに抽出した。組み合わせた有機相を、ＭｇＳＯ４と共に、３０分間の期間にわたり０〜５℃で撹拌し、濾過し、ＤＣＭ（〜３０ｍＬ）で洗浄した。組み合わせた濾過物に、２−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）酢酸（１．２６ｇ、７．７０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣのＨＣｌ塩（１．８４ｇ、９．６２ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（７８．３ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）を添加し、薄い懸濁液を、一晩、室温で撹拌した。翌日、Ｈ２Ｏ（６０ｍＬ）およびＭｅＯＨ（３０ｍＬ）を添加し、１０分間撹拌した後、透明な有機相を単離した。濁った水相をＤＣＭで抽出した。組み合わせた有機抽出物を濃縮した。粗材料を、シリカの栓を通して濾過し、ＤＣＭ（４０ｍＬ）中に取り込み、ＰＢＳ（ｐＨ＝１１、５０ｍＬ）を添加した。混合物を、室温で約１０分間撹拌した。その後、有機相を分離し、水相をＤＣＭ（１５ｍＬ）で再度抽出した。組み合わせた有機物を、３０分間乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、ＤＣＭで洗浄し、濃縮して、（Ｚ）−（（２−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレアート（３．４４ｇ）を得た。LCMS ESI＋：m/z 780.2（Ｍ＋Ｈ）。
【０１１９】
（（５−（ジメチルアミノ）ペンタノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアート（C104）の調製
【化３８】
0005873604.tif 000044
【０１２０】
アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートＴＦＡ塩の合成は、先に記載される。アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートＴＦＡ塩（７３０ｍｇ、１．１４ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（２０ｍＬ）中で１０％のＫ２ＣＯ３（１０ｍＬ）と共に０〜５℃で撹拌した。３０分後、有機相を分離し、水相をＤＣＭ（１０ｍＬ）でさらに抽出した。組み合わせた有機相を、ＭｇＳＯ４と共に３０分間の期間にわたり０〜５℃で撹拌し、濾過し、ＤＣＭ（１０ｍＬ）で洗浄する。組み合わせた濾過物に、５−（ジメチルアミノ）ペンタン酸（２４８ｍｇ、１．３７ｍｍｏｌ）、ＥＤＣのＨＣｌ塩（３２８ｍｇ、１．７１ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（１４ｍｇ、０．１１４ｍｍｏｌ）を添加し、薄い懸濁液を、一晩、室温で撹拌し、その後、溶液は透明となる。翌日、Ｈ２Ｏ（２０ｍＬ）およびＭｅＯＨ（１０ｍＬ）を添加し、１０分間撹拌した後、透明な有機相を単離した。濁った水相をＤＣＭで抽出した。組み合わせた有機抽出物を濃縮した。１００％の酢酸エチルによる溶離と、その後の１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭによる溶離による、シリカゲルクロマトグラフィーによる精製の後で、精製された残渣を、ＤＣＭ（２５ｍＬ）およびＰＢＳ（ｐＨ＝１１、２５ｍＬ）中に取り込ませた。混合物を、室温で１５分間撹拌した。その後、有機相を分離し、水相をＤＣＭ（１５ｍＬ）で再度抽出した。組み合わせた有機物を、３０分間乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、ＤＣＭで洗浄し、濃縮して、（（５−（ジメチルアミノ）ペンタノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアート（４０５ｍｇ）を得る。LCMS ESI＋：m/z 654.1（Ｍ＋Ｈ）。
【０１２１】
（（２−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）スルホニル）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアート（SO2−S104）の調製
【化３９】
0005873604.tif 000045
【０１２２】
（（２−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアート（別名S104）の合成は、記載された。アルゴンを流した丸底フラスコ中の（（２−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートに、ＤＣＭ（１０ｍＬ）を添加した。溶液を氷槽により冷却した。これに、ｍＣＰＢＡ（ＤＣＭ中の溶液）を、ゆっくりと５分間かけて添加した。添加後、氷槽を取り除き、反応を、一晩、室温で撹拌させた。３．５時間後、２ＭのＤＭＡ／ＴＨＦ（４．５５ｍＬ）をゆっくりと添加し、反応混合物を一晩撹拌させた。反応混合物を、次いでＤＣＭで７５ｍＬまで希釈した。Ｈ２Ｏ（２×５０ｍＬ）および１０％のＫ２ＣＯ３（５０ｍＬ）で洗浄した。全ての水性の洗浄物を、ＤＣＭ（４０ｍＬ）で戻し抽出した。組み合わせた有機物を、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮して、無色のオイルを得た。反応混合物を濃縮した。酢酸エチル／ＭｅＯＨ勾配で溶離するシリカゲルクロマトグラフィーによる精製は、（（２−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）スルホニル)アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアート（５４０ｍｇ）を生じた。LCMS ESI＋：m/z 704.0（Ｍ＋Ｈ）。
【０１２３】
（（（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）カルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアート（TU104）の調製
【化４０】
0005873604.tif 000046
【０１２４】
ステップ１：中間体１：アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートの調製
【化４１】
0005873604.tif 000047
アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートＴＦＡ塩の合成は、先に記載される。アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートＴＦＡ塩を、ＤＣＭ（５０ｍＬ）中に溶解し、ＰＢＳ（ｐＨ＝１１、５０ｍＬ）を添加した。混合物を、室温で１５分間撹拌した。その後、有機相を分離し、水相をＤＣＭ（２５ｍＬ）で再抽出した。組み合わせた有機物を、３０分間乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、ＤＣＭで洗浄し、濃縮して、アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートを、遊離塩基として得た。
【０１２５】
ステップ２：TU104：（（（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）カルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートの調製
【化４２】
0005873604.tif 000048
クロロギ酸トリクロロメチル（別名ジホスゲン）（２５７ｕＬ、２．１３ｍｍｏｌ）を、乾燥ＤＣＭ（２０ｍＬ）中の２−（ジメチルアミノ）エタンチオールＨＣｌ塩（３０２ｍｇ、２．１３ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、アルゴンのブランケット下において、室温で４時間撹拌した。その後、ＤＣＭおよび過剰のジホスゲンを、真空中で除去した。アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアート遊離塩基（１０６８ｍｇ、２．０３ｍｍｏｌ）、ＤＣＭ（２０ｍＬ）およびトリエチルアミン（５８０ｕＬ、４．１６ｍｍｏｌ）を、次いで添加した。室温で１６時間後、反応混合物をＤＣＭで希釈し、１ＭのＨＣｌ（７５ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（７５ｍＬ）およびＰＢＳ（ｐＨ＝１１、７５ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮した。酢酸エチルにより溶離し、その後ＤＣＭ／ＭｅＯＨ勾配により溶離するシリカゲルクロマトグラフィーによる精製は、（（（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）カルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアート（１２０ｍｇ）を生じた。LCMS ESI＋：m/z 657.5（Ｍ＋Ｈ）。
【０１２６】
（（２−（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアート（O104）の調製
【化４３】
0005873604.tif 000049
【０１２７】
ステップ１：中間体１：（（２−ブロモアセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートの調製
【化４４】
0005873604.tif 000050
アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートＴＦＡ塩の合成は、先に記載される。アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートＴＦＡ塩（１５００ｍｇ、２．３４ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（２０ｍＬ）中で溶解し、氷槽中に置いた。臭化ブロモアセチル（２１４ｕＬ、２．４６ｍｍｏｌ）を添加し、その後トリエチルアミン（６８５ｕＬ、４．９１ｍｍｏｌ）を添加した。氷槽を取り除き、反応を、一晩室温で不活性ガスのブランケット下において撹拌させた。翌日、ＤＣＭで１００ｍＬまで希釈した。１ＭのＨＣｌ（７５ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（７５ｍｌ）、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（７５ｍＬ）および飽和鹹水溶液（７５ｍＬ）で洗浄した。全ての水性の洗浄物を、ＤＣＭ（２５ｍＬ）で戻し抽出した。有機物を、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーおよび１００％の酢酸エチルによる溶離により精製した。画分をプールして濃縮し、（（２−ブロモアセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアート（１２２０ｍｇ）を得た。
【０１２８】
ステップ２：O104：（（２−（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートの調製
【化４５】
0005873604.tif 000051
スタラーバーを備えた丸底フラスコに、（（２−ブロモアセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアート（１．２２ｇ、１．８７ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン（１９７ｕＬ、１．９６ｍｍｏｌ）、ヨウ化カリウム（６．２ｍｇ、０．０３７４ｍｍｏｌ）および乾燥THF（２５ｍＬ）を添加した。生じた溶液を、−４０℃まで冷却した。ＤＢＵ（５８８ｕＬ、３．９３ｍｍｏｌ）を一滴ずつ５分間かけて添加し、反応を、０℃まで２時間かけて加温した。反応混合物を濃縮した。残渣を、ＤＣＭで取り込ませ、１ＭのＨＣｌ（１２ｍＬ）を添加し、二相性の混合物を、１５分間撹拌した。次いで、ＰＢＳ（ｐＨ＝１１）を用いて塩基性化した。有機層を単離し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮した。１００％の酢酸エチルと、その後のＤＣＭ／ＭｅＯＨ勾配により溶離するシリカゲルクロマトグラフィーによる精製は、（（２−（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアート（５３ｍｇ）を生じた。LCMS ESI＋：m/z 655.6（Ｍ＋Ｈ）。
【０１２９】
（（２−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアート（HＥＤＣ-M1）の調製
【化４６】
0005873604.tif 000052
【０１３０】
ステップ１：中間体１：（（２−（ベンジルオキシ）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートの調製
【化４７】
0005873604.tif 000053
アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートＴＦＡ塩の合成は、先に記載される。アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートＴＦＡ塩を、ＤＣＭ（２５ｍＬ）中で、１０％のＫ２ＣＯ３（１２．５ｍＬ）と共に、０〜５℃で撹拌した。３０分後、有機層を単離し、水層を、ＤＣＭ（１２ｍＬ）でさらに抽出した。組み合わせた有機相を、ＭｇＳＯ４と共に、３０分間、０〜５℃で撹拌し、濾過し、ＤＣＭ（１２ｍＬ）で洗浄した。組み合わせた濾過物に、ベンジルオキシ酢酸（４０２ｕＬ、２．８１ｍｍｏｌ）、ＥＤＣのＨＣｌ塩（６７３ｍｇ、３．５１ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（２９ｍｇ、０．２３４ｍｍｏｌ）を添加した。懸濁液を、室温で一晩撹拌させた。翌日、H2O（２５ｍＬ）およびＭｅＯＨ（１２ｍＬ）を添加し、１０分間撹拌した後、透明な有機相を単離した。濁った水相をＤＣＭ（２５ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機抽出物をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。ヘキサン／酢酸エチル勾配で溶離させるシリカゲルクロマトグラフィーによる精製は、（（２−（ベンジルオキシ）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートを生じた（１．２８ｇ）。
【０１３１】
ステップ２：中間体２：（（２−ヒドロキシアセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートの調製
【化４８】
0005873604.tif 000054
（（２−（ベンジルオキシ）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアート（１．２８ｇ、１．８０ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコ中で、ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）で溶解した。フラスコにキャップをし、アルゴンを流した。１０％のＰｄ／Ｃ（１３５ｍｇ）を添加し、フラスコに再度アルゴンを流した。真空ポンプを介して全ての空気を取り除き、次いで、Ｈ２ガスを充填した８’’のバルーンを添加した。反応を、室温で強く撹拌させた。３０分後、反応混合物を濾過し（セライト）、メタノールで洗浄し、残渣まで濃縮し、ＤＣＭ（２５ｍＬ）および１０％のＫ２ＣＯ３（２５ｍＬ）中に取り込ませた。混合物を１５分間撹拌し、次いで有機層を単離した。水性物を、ＤＣＭ（１５ｍＬ）で戻し抽出した。組み合わせた有機物を、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮して、（（２−ヒドロキシアセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアート（９９０ｍｇ）を得た。
【０１３２】
ステップ３：ＨＥＤＣ-Ｍ１：（（２−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジ−テトラデカノアートの調製
【化４９】
0005873604.tif 000055
（（２−ヒドロキシアセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアート（９９０ｍｇ、１．７０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２０ｍＬ）中で撹拌し、４−ジメチルアミノ−ブタン酸（２６８ｍｇ）、ＥＤＣのＨＣｌ塩（４８７ｍｇ）およびＤＭＡＰ（２１ｍｇ）を添加した。懸濁液を、室温で一晩撹拌させた。翌日、Ｈ２Ｏ（２０ｍＬ）およびＭｅＯＨ（１０ｍＬ）を添加し、１０分間撹拌した後、透明な有機相を単離した。濁った水相をＤＣＭ（２０ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機抽出物を、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗材料を、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ勾配で溶離させるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。プールして濃縮した画分を濃縮して、ＤＣＭ（２５ｍＬ）およびＰＢＳ（ｐＨ＝１１、２５ｍＬ）で取り込ませた。混合物を、室温で１５分間撹拌した。その後、有機相を単離し、水相をＤＣＭ（２５ｍＬ）で再度抽出した。組み合わせた有機物を、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮して、（（２−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアート（６７２ｍｇ）を得た。LCMS ESI＋：m/z 697.6（Ｍ＋Ｈ）。
【０１３３】
（Ｚ）−（（５−（ジメチルアミノ）ペンタノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレアート（C104-DO）の調製
【化５０】
0005873604.tif 000056
【０１３４】
（Ｚ）−アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレアートＴＦＡ塩の合成は、先に記載される。（Ｚ）−アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレアートＴＦＡ塩（１．５０ｇ、２．３７ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（２０ｍＬ）中で、１０％のＫ２ＣＯ３（１０ｍＬ）と共に、０〜５℃で撹拌する。３０分後、有機相を単離し、水相をＤＣＭ（１０ｍＬ）でさらに抽出する。組み合わせた有機相を、ＭｇＳＯ４と共に、３０分間の期間にわたり０〜５℃で撹拌し、濾過し、ＤＣＭ（１５ｍＬ）で洗浄する。組み合わせた濾過物に、５−（ジメチルアミノ）ペンタン酸（５１６ｍｇ、２．８４ｍｍｏｌ）、ＥＤＣのＨＣｌ塩（６８１ｍｇ、３．５５ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（２９ｍｇ、０．２３７ｍｍｏｌ）を添加し、懸濁液を、一晩、室温で撹拌し、その期間の後、透明な溶液が形成された。翌日、Ｈ２Ｏ（２０ｍＬ）およびＭｅＯＨ（１０ｍＬ）を添加し、１０分間撹拌した後、透明な有機相を単離した。濁った水相をＤＣＭで抽出した。組み合わせた有機物を、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮する。ＤＣＭ／ＭｅＯＨ勾配で溶離させるシリカゲルクロマトグラフィーによる精製の後で、プールして濃縮した画分を、ＤＣＭ（２５ｍＬ）およびＰＢＳ（ｐＨ＝１１、２５ｍＬ）で取り込ませる。混合物を、室温で約１０分間撹拌した。その後、有機相を単離して、水相をＤＣＭ（１５ｍＬ）で再度抽出する。組み合わせた有機物を、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮して、（Ｚ）−（（５−（ジメチルアミノ）ペンタノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレアート（１．１０ｇ）を得た。LCMS ESI＋：m/z 761.7（Ｍ＋Ｈ）。
【０１３５】
（（５−（（ジメチルアミノ）メチル)チオフェン−２−カルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジ−テトラデカノアート（T104）の調製
【化５１】
0005873604.tif 000057
【０１３６】
アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートＴＦＡ塩の合成は、先に記載される。アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートＴＦＡ塩（１００４ｍｇ、１．５７ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（２０ｍＬ）中で、１０％のＫ２ＣＯ３（２０ｍＬ）と共に、０〜５℃で撹拌した。３０分後、有機相を単離し、水相をＤＣＭ（１０ｍＬ）でさらに抽出した。組み合わせた有機物を、ＭｇＳＯ４で３０分間、０〜５℃で乾燥させ、濾過し、ＤＣＭ（１０ｍＬ）で洗浄する。組み合わせた濾過物に、（（ジメチルアミノ）メチル）チオフェン−２−カルボン酸（３５０ｍｇ、１．８９ｍｍｏｌ）、ＥＤＣのＨＣｌ塩（４５２ｍｇ、２．３６ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ（１９．２ｍｇ、０．１５７ｍｍｏｌ）を添加した。懸濁液を、室温で一晩撹拌させた。翌日、Ｈ２Ｏ（２０ｍＬ）およびＭｅＯＨ（１０ｍＬ）を添加し、１０分間撹拌した後、透明な有機相を単離した。濁った水相をＤＣＭ（２５ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機物を、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮した。ヘキサン／酢酸エチル勾配で溶離させるシリカゲルクロマトグラフィーによる精製の後で、プールして濃縮した画分を、ＤＣＭ（２０ｍＬ）およびＰＢＳ（ｐＨ＝１１、２０ｍＬ）で取り込ませた。混合物を、室温で約１０分間撹拌した。その後、有機相を単離し、水相を再度、ＤＣＭ（１５ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機物を、３０分間の期間にわたり乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、ＤＣＭで洗浄し、濃縮して、（（５−（（ジメチルアミノ）メチル)チオフェン−２−カルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアート（４８２ｍｇ）を得た。LCMS ESI＋：m/z 693.6（Ｍ＋Ｈ）。
【０１３７】
（Ｚ）−（（（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）カルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレアート（TU104-DO）の調製
【化５２】
0005873604.tif 000058
【０１３８】
（Ｚ）−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレアートの合成は、先に記載される。（Ｚ）−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレアート（４．２０ｇ、５．７２ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（２０ｍＬ）中で溶解し、氷槽中で０℃まで冷却した。ＴＦＡ（２０ｍＬ）を添加し、 混合物を、不活性ガスのブランケット下において２０分間撹拌させた。その後、反応混合物を真空中で濃縮した。残渣を、１０％のＫ２ＣＯ３（２０ｍＬ）とＤＣＭ（２０ｍＬ）との間で分割し、氷槽中で２０分間撹拌した。有機層を単離し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過した。ジホスゲン（１．３８ｍＬ、１１．４ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ中の（Ｚ）−アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレアート材料に添加し、不活性ガスのブランケット下において室温で撹拌した。翌日、ＤＣＭおよび過剰のジホスゲンを、真空中で除去した。２−（ジメチルアミノ）エタンチオールＨＣｌ塩（４．０５ｇ、２８．６ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（５０ｍＬ）およびトリエチルアミン（５．２ｍＬ、３７．２ｍｍｏｌ）中に取り込み、（Ｚ）−（（クロロカルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレアート残渣に添加した。材料を一晩、室温で撹拌させた。翌日、ＤＣＭで希釈し、０．３ＭのＨＣｌ（７５ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（７５ｍＬ）および１０％のＫ２ＣＯ３（７５ｍＬ）で洗浄した。全ての水性の洗浄物を、ＤＣＭ（２５ｍＬ）で戻し抽出した。組み合わせた有機物を、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。ＤＣＭ／ＭｅＯＨ勾配により溶離させるシリカゲルクロマトグラフィーによる精製は、（Ｚ）−（（（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）カルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレアート（１．９０ｇ）を生じた。LCMS ESI＋：m/z 765.7（Ｍ＋Ｈ）。
【０１３９】
（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアート（CB104）の調製
【化５３】
0005873604.tif 000059
【０１４０】
アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートの合成は、先に記載される。ジホスゲン（２６６ｕＬ、２．２ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（１０ｍＬ）中のジメチルアミノプロパノール（４１３ｍｇ、４．００ｍｍｏｌ）に添加し、不活性ガスのブランケット下において、室温で四時間撹拌した。ＤＣＭおよび過剰のジホスゲンを真空中で除去し、アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートを添加した。丸底フラスコにアルゴンを流し、ＤＣＭ（１０ｍＬ）およびトリエチルアミン（８５９ｕＬ、６．１６ｍｍｏｌ）を添加した。材料を一晩、室温で撹拌させた。反応混合物を、次いでＤＣＭで希釈し、０．３ＭのＨＣｌ（７５ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（７５ｍＬ）および１０％のＫ２ＣＯ３（７５ｍＬ）で洗浄した。全ての水性の洗浄物を、ＤＣＭ（２５ｍＬ）で戻し抽出した。組み合わせた有機物を、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。ＤＣＭ／ＭｅＯＨ勾配により溶離させるシリカゲルクロマトグラフィーによる精製は、（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアート（８７ｍｇ）を生じた。LCMS ESI＋：m/z 655.59（Ｍ＋Ｈ）。
【０１４１】
（（（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）カルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアート（CA104）の調製
【化５４】
0005873604.tif 000060
【０１４２】
ステップ１：中間体１：（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートの調製
【化５５】
0005873604.tif 000061
アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートＴＦＡ塩の合成は、先に記載される。アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートＴＦＡ塩を、乾燥ＤＣＭ（１０ｍＬ）中に溶解し、トリエチルアミン（６５４ｕＬ、４．６９ｍｍｏｌ）を添加した。反応容器に不活性ガスを流し、４−ニトロフェニルクロロギ酸エステルを添加した。材料を、ＲＴで一晩撹拌させた。反応混合物を、水（５０ｍＬ）およびＤＣＭ（５０ｍＬ）でクエンチした。有機層を単離し、水層をＤＣＭ（２×５０ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機物を、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。ヘキサン／酢酸エチル勾配で溶離させるシリカゲルクロマトグラフィーによる精製は、（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートを生じた。
【０１４３】
ステップ２：CA104：（（（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）カルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートの調製
【化５６】
0005873604.tif 000062
（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートに、、２−ジメチルアミノエタノール（２ｍＬ）を添加し、濃縮カラムを用いて２０分間、１４０℃まで加熱した。その後、粗材料を、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ勾配で溶離させるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、（（（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）カルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアート（３８ｍｇ）を得た。LCMS ESI＋：m/z 641.7（Ｍ＋Ｈ）。
【０１４４】
（（２−（ジメチルアミノ）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアート（INT-4）の調製
【化５７】
0005873604.tif 000063
（Ｚ）−（（２−（ジメチルアミノ）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジオレアートの合成は、i-Prop-DODCと同様の様式において、３−（ジメチルアミノ）プロピオン酸をジメチルグリシンで置換して、調製した。QTOF MS ESI＋：m/z 720.1（Ｍ＋Ｈ）。
【０１４５】
（（２−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアート（S104）の調製
【化５８】
0005873604.tif 000064
【０１４６】
ステップ１：中間体１：２−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）酢酸塩酸塩の調製：
【化５９】
0005873604.tif 000065
エタノール（５００ｍＬ）を、３回の６０ｍＢａｒまでの１〜２分間の排気により脱気し、窒素により再加圧した。クロロ酢酸（３６．９ｇ、０．３９１ｍｏｌ）を添加し、５分間、１７〜２０℃撹拌した後で、透明な溶液が形成された。２−（ジメチルアミノ）−エタンチオール塩酸塩（５２．７ｇ、０．３７２ｍｏｌ）を添加し、２０分間、２５℃で撹拌した後で、透明な溶液が形成された。固体の水酸化ナトリウム（４７．７ｇ、１．１９ｍｏｌ）を、温度を３５℃未満に保つために冷却しながら、２０分間かけて少しずつ添加し、短期間４４℃を観察した。ほぼすみやかな沈澱が観察された。反応混合物を、最終的に加熱して、４０℃において２時間の期間にわたり撹拌し、その時点において、ＴＬＣは反応の完了を示した。セライト５４５（７４ｇ）を添加し、混合物を、Ｇ３ガラス焼結プレートを通して６分間かけて濾過し、エタノール（２×１０５ｍＬ）で洗浄した。組み合わせた濁った濾過物を、５０℃槽から蒸発させて、１１０ｇの白色固体を得た。固体を水（２５０ｍＬ）中で溶解し、次いで、濃ＨＣｌ（５．５ｍＬ）を用いてｐＨを１３．１（温度３０℃）から１０．５（温度３１℃）まで調整して、非常に淡い黄色の溶液を得た。水相をＤＣＭ（３×１００ｍＬ）で洗浄して、ジスルフィド不純物を除去した（全３回の洗浄が必要であった）。濃ＨＣｌを、水相（ｐＨ１０．７、温度２２℃）に、ｐＨが１．４になるまで添加した（５７．５ｍＬを添加し、温度は３５℃であった）。水相をＤＣＭ（１００ｍＬ）で洗浄し、次いで、乾燥状態まで濃縮した（槽温度５５℃）。トルエン（２５０ｍＬ）を添加し、混合物を乾燥状態まで濃縮し（槽温度５５℃）、これを１回繰り返して、湿潤な白色固体（９８ｇ）を得た。アセトニトリル（７５０ｍＬ）を固体に添加し、混合物を、５５℃で４５分間の期間にわたり撹拌し、次いでG3ガラス焼結プレートを通して濾過した。濾過ケークにアセトニトリル（２５０ｍＬ）を添加し、混合物を、５５℃で２５分間の期間にわたり撹拌し、次いでＧ３ガラス焼結プレートを通して濾過し、アセトニトリル（５０ｍＬ）で洗浄した。組み合わせた濾過物を、３００ｍＬまで濃縮し、重い白色の沈澱を生じた。混合物を窒素下において冷却し、０℃で３０分間の期間にわたり撹拌した。Ｇ３ガラス焼結プレートを通した濾過により沈澱を単離し、濾過ケークを冷たいアセトニトリル（１００ｍＬ）で洗浄した。減圧下において３日間乾燥させ、４７．０ｇ（６３％）の２−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）酢酸塩酸塩を得た。
【０１４７】
ステップ２：S104：（（２−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートの調製
【化６０】
0005873604.tif 000066
アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートＴＦＡ塩の合成は、先に記載される。アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートＴＦＡ塩（１５２ｇ、２３８ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（２．３Ｌ）および１０％の炭酸水素カリウム（１．１５Ｌ）と共に、０〜５℃で撹拌した。有機相を分離し、水相をＤＣＭ（１．１５Ｌ）でさらに抽出した。組み合わせた有機相を、硫酸マグネシウム水和物（２３６ｇ）と共に、３０分間の期間にわたり０〜５℃で撹拌し、濾過し、ＤＣＭ（１．１５Ｌ）で洗浄した。組み合わせた濾過物に、２−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）酢酸塩酸塩（５７．０ｇ、２８５ｍｍｏｌ）、ＥＤＣの塩酸塩（６８．４ｇ、３５７ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（２．９１ｇ、２３．８ｍｍｏｌ）を添加し、薄い懸濁液を、一晩、環境温度で撹拌し、その期間の後、透明な溶液が形成された。水（２．３Ｌ）およびメタノール（４６０ｍＬ）を添加し、１０分間の期間にわたり撹拌した後で、透明な有機相を分離した。濁った水相（ｐＨ３．０）を、ＤＣＭ（５７５ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機抽出物を濃縮して、１４３ｇの粗材料を塩酸塩として得た。粗材料（１４２．６ｇ）を、蒸留フラスコにＤＣＭ（５００ｍＬ）と共に移し、酢酸エチル（１Ｌ）を添加した。溶液を大気圧において加熱して蒸留し、残渣の温度を７６℃にするために、７０分間の期間にわたり蒸留を続けた。酢酸エチル（８００ｍＬ）の添加により１．４Ｌの全容積を得、エタノール（７０ｍＬ）を添加した。５０℃における透明な溶液を、３７℃まで冷却し、種結晶を添加した。３７〜３５℃において１０分間の期間にわたり顕著な結晶化の開始を観察した後で、懸濁液を冷却し、０℃で一晩撹拌し、沈澱を濾過により単離し、冷たい酢酸エチル（２１０ｍＬ）で洗浄した。環境温度で真空オイルポンプにおいて４．５時間の期間にわたり恒量まで乾燥させ、１３４ｇの再結晶化した材料を、塩酸塩、白色の結晶固体として得た。
【０１４８】
リン酸三カリウム（８５ｇ、０．４０ｍｏｌ）およびリン酸水素二カリウム（２２６ｇ、１．３０ｍｏｌ）を、精製水（１．７Ｌ）に添加し、ｐＨ１０．９で形成された溶液を、１８〜２０℃まで冷却した。ＤＣＭ（１．３Ｌ）および再結晶化されたS104の塩酸塩（１３３．０ｇ、０．１８８ｍｏｌ）を添加し、混合物を、１０分間の期間にわたり撹拌した。透明な有機相を、中程度の速度において（３５分間かけて）分離し、濁った水相をさらにＤＣＭ（６５０ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機相を、硫酸マグネシウム水和物（６５ｇ）と共に、４０分間の期間にわたり撹拌し、混合物を濾過し、ＤＣＭ（２００ｍＬ）で洗浄した。組み合わせた濾過物を、５０℃の水槽から、減圧下において蒸発させた（２０ｍＢａｒまで低下させ、この圧力において、蒸発を１時間続けた）。１５〜２０℃の水槽からの、真空オイルポンプにおけるさらなる蒸発により、１２６ｇの部分的に凝固したオイルが生じた。−２０℃の冷却槽における冷却により、完全な凝固がもたらされ、−２０℃における真空化における２日間の乾燥の後で、本発明者らは、１２６ｇの（（２−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアート、別名S104を得た。ＨＰＬＣは、９８．１％の純度を示した。QTOF MS ESI＋：m/z 671.6（Ｍ＋Ｈ）。
【０１４９】
（９Ｚ，９’Ｚ）−（（２−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（テトラデカ−９−エン酸）（S104-DMO）の調製
【化６１】
0005873604.tif 000067
【０１５０】
ステップ１：中間体１：（９Ｚ，９’Ｚ）−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（テトラデカ−９−エン酸）の調製
【化６２】
0005873604.tif 000068
Ｎ−Ｂｏｃ−ジエタノールアミン（４５４ｍｇ、２．２１ｍｍｏｌ）、ミリストレイン酸（１０００ｍｇ、４．４２ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（５４ｍｇ、０．４４２ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（２５ｍＬ）中に溶解し、環境温度で、不活性ガスを流した丸底フラスコ中で、水槽中に置いた。ＥＤＣのＨＣｌ塩（９３２ｍｇ、４．８６ｍｍｏｌ）を、３回に分けて、５分間かけて添加した。反応を一晩、室温で、不活性ガスのブランケット下において撹拌させた。翌日、Ｈ２Ｏ（２５ｍＬ）を添加し、１０分間撹拌した。有機層を単離し、水層を、ＤＣＭ（５０ｍＬ）でさらに抽出した。組み合わせた有機物を、１０分間乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮した。ヘキサン／酢酸エチル勾配で溶離させるシリカゲルクロマトグラフィーによる精製は、（９Ｚ，９’Ｚ）−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（テトラデカ−９−エン酸）（１．１０ｇ）を生じた。
【０１５１】
ステップ２：中間体２：（９Ｚ，９’Ｚ）−アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（テトラデカ−９−エン酸）の調製
【化６３】
0005873604.tif 000069
丸底フラスコ中の（９Ｚ，９’Ｚ）−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（テトラデカ−９−エン酸）（１１００ｍｇ、１．７７ｍｍｏｌ）に、ＤＣＭ（１０ｍＬ）を添加し、氷槽中に置いた。ＴＦＡ（１０ｍＬ）を添加し、混合物を２０分間撹拌させた。反応混合物を、次いで濃縮した。残渣にトルエンを添加して、過剰のＴＦＡを共沸（azeotroping off）することを補助した。残渣を、氷槽中に戻し、ＰＢＳ（ｐＨ＝１１、２５ｍＬ）およびＤＣＭ（２５ｍＬ）を添加した。混合物を１５分間撹拌し、有機層を次いで単離した。濁った水層を、ＤＣＭ（１０ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機物を、０℃で１５分間乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮して、（９Ｚ，９’Ｚ）−アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（テトラデカ−９−エン酸）（９２３ｍｇ）を得た。
【０１５２】
ステップ３：S104-DMO：（９Ｚ，９’Ｚ）−（（２−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（テトラデカ−９−エン酸）の調製
【化６４】
0005873604.tif 000070
（９Ｚ，９’Ｚ）−アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（テトラデカ−９−エン酸）（９２３ｍｇ、１．７７ｍｍｏｌ）、２−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）酢酸（３４６ｍｇ、２．１２ｍｍｏｌ）およびＥＤＣのＨＣｌ塩（５０９ｍｇ、２．６６ｍｍｏｌ）の混合物を、ＤＣＭ（１０ｍＬ）中に懸濁した。ＤＭＡＰ（２１．６ｍｇ、０．１７７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を、室温で一晩撹拌させた。翌日、Ｈ２Ｏ（１０ｍＬ）およびＭｅＯＨ（１０ｍＬ）を添加し、１０分間撹拌した後、透明な有機相を単離した。濁った水相をＤＣＭ（２×２０ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機抽出物を、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。ＤＣＭ／ＭｅＯＨで溶離するシリカゲルクロマトグラフィーによる精製の後で、プールして濃縮した画分を、ＤＣＭ（２５ｍＬ）およびＰＢＳ（ｐＨ＝１１、２５ｍＬ）中に取り込ませた。混合物を、室温で約１０分間撹拌した。その後、有機相を単離し、水相を再度、ＤＣＭ（２×１５ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機物相を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮して、（９Ｚ，９’Ｚ）−（（２−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（テトラデカ−９−エン酸）（５８９ｍｇ）を得た。LCMS ESI＋：m/z 667.6（Ｍ＋Ｈ）。
【０１５３】
（Ｒ）−（（１−メチルピロリジン−２−カルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアート（Pro-DC）の調製
【化６５】
0005873604.tif 000071
【０１５４】
ステップ１：Pro-DC：（Ｒ）−（（１−メチルピロリジン−２−カルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートの調製
【化６６】
0005873604.tif 000072
アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートＴＦＡ塩の合成は、先に記載される。アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートＴＦＡ塩（１０００ｍｇ、１．５６ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（１０ｍＬ）と共に撹拌し、Ｎ−メチル−Ｌ−プロリン（２２８ｍｇ、１．７７ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（２３９ｍｇ、１．７７ｍｍｏｌ）を添加した。ＮＭＭ（３６５ｕＬ、３．３２ｍｍｏｌ）を添加すると、溶液はほぼ透明となった。ＤＣＭ（１０ｍＬ）中のＥＤＣの塩酸塩（５１８ｍｇ、２．７０ｍｍｏｌ）、ＮＭＭ（２５７ｕＬ、２．３４ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（１９ｍｇ、０．１５６ｍｍｏｌ）の懸濁液を添加し、混合物を、約１２時間、環境温度で撹拌し、その期間の後、透明な溶液が形成された。その後、混合物をＤＣＭ（５０ｍＬ）で希釈し、１０％のＫ２ＣＯ３水溶液（６０ｍＬ）で洗浄した。有機物を、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。生じた化合物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより粗く精製し、ＤＣＭ勾配中の（０〜１０）％のメタノールで溶離させて、（Ｒ）−（（１−メチルピロリジン-２−カルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ジテトラデカノアートを得た。LCMS ESI＋：m/z 637.6（Ｍ＋Ｈ）。
【０１５５】
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−（（２−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（オクタデカ−９，１２−ジエノアート）（S104-DLin）の調製
【化６７】
0005873604.tif 000073
【０１５６】
ステップ１：中間体１：（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（オクタデカ−９，１２−ジエノアート）の調製
【化６８】
0005873604.tif 000074
Ｎ−Ｂｏｃ−ジエタノールアミン（５ｇ、２４．４ｍｍｏｌ）、リノール酸（１４．４ｇ、５１．２ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（１００ｍＬ）中に溶解した。ＥＤＣのＨＣｌ塩（１０．３ｇ、５３．７ｍｍｏｌ）と、その後にＤＭＡＰ（５９６ｍｇ、４．８８ｍｍｏｌ）を添加した。反応を、約１２時間、室温で、不活性ガスのブランケット下において撹拌させた。その後、５０ｍＬの水および５０ｍＬのメタノールを添加し、混合物を１０分間撹拌した。有機層を単離し、水層を、ＤＣＭ（１５０ｍＬ）でさらに抽出した。組み合わせた有機物を、１０分間乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮した。精製は、シリカゲルクロマトグラフィーにより行い、ヘキサン／酢酸エチル勾配で溶離させると、（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（オクタデカ−９，１２−ジエノアート）（１５．９ｇ）を生じた。
【０１５７】
ステップ２：中間体２：（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（オクタデカ−９，１２−ジエノアート）の調製
【化６９】
0005873604.tif 000075
丸底フラスコ中の（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（オクタデカ−９，１２−ジエノアート）（５．３３ｇ、７．３０ｍｍｏｌ）に、ＤＣＭ（５０ｍＬ）を添加し、氷槽中に置いた。ＴＦＡ（５０ｍＬ）を添加し、混合物を、３０分間撹拌させた。反応混合物を、次いで濃縮した。残渣にトルエンを添加して、過剰のＴＦＡを共沸することを補助した。残渣を氷槽中に戻し、１０％のＫ２ＣＯ３（５０ｍＬ）およびＤＣＭ（５０ｍＬ）を添加した。混合物を１５分間撹拌し、有機層を単離した。濁った水層を、ＤＣＭ（２０ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機物を、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮して、（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（オクタデカ−９，１２−ジエノアート）を得た（定量的）。
【０１５８】
ステップ３：S104-DLin：（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−（（２−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（オクタデカ−９，１２−ジエノアート）の調製
【化７０】
0005873604.tif 000076
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（オクタデカ−９，１２−ジエノアート）（４．６８ｇ、７．３０ｍｍｏｌ）、２−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）酢酸（１．４３ｇ、８．７６ｍｍｏｌ）およびＥＤＣのＨＣｌ塩（２．１０ｇ、１０．９５ｍｍｏｌ）の混合物を、ＤＣＭ（１００ｍＬ）中に懸濁した。ＤＭＡＰ（８９ｍｇ、０．７３ｍｍｏｌ）を添加し、室温で12時間撹拌した。各々５０ｍＬの水およびメタノールを添加し、１０分間撹拌した後、透明な有機相を単離した。濁った水相をＤＣＭ（２×２０ｍＬ）で抽出し、組み合わせた有機抽出物をＰＢＳ（ｐＨ＝１１、１００ｍＬ）で洗浄した。生成物をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。精製は、ＤＣＭ勾配中のＭｅＯＨで溶離させるシリカゲルクロマトグラフィーにより行った。画分をプールして濃縮し、（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−（（２−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（オクタデカ−９，１２−ジエノアート）（４．３ｇ）を生じた。LCMS ESI＋：m/z 775.9（Ｍ＋Ｈ）。
【０１５９】
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−（（２−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（オクタデカ−９，１２−ジエノアート）（TU104-DLin）の調製
【化７１】
0005873604.tif 000077
【０１６０】
ステップ１：TU104-Dlin：（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−（（２−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（オクタデカ−９，１２−ジエノアート）の調製
【化７２】
0005873604.tif 000078
（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（オクタデカ−９，１２−ジエノアート）の合成は、先に記載される。クロロギ酸トリクロロメチル(別名ジホスゲン）（７４０ｕＬ）を、乾燥ＤＣＭ（４０ｍＬ）中の（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−アザンジイルビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（オクタデカ−９，１２−ジエノアート）（２．６ｇ）の溶液に添加し、アルゴンのブランケット下において、室温で１２時間撹拌した。ＤＣＭおよび過剰のジホスゲンを、真空中で除去した。２−（ジメチルアミノ）エタンチオールＨＣｌ塩（２．９ｇ）、ＤＣＭ（４０ｍＬ）およびトリエチルアミン（３．７ｍＬ）を、次いで添加した。室温で１６時間後、反応混合物をＤＣＭで希釈し、１０％のＫ２ＣＯ３（７５ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮した。精製は、酢酸エチルと、その後のＤＣＭ／ＭｅＯＨ勾配により溶離させるシリカゲルクロマトグラフィーにより行い、（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−（（２−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）アセチル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（オクタデカ−９，１２−ジエノアート）（８５０ｍｇ）を得た。LCMS ESI＋：m/z 761.9（Ｍ＋Ｈ）。
【０１６１】
リポソームを含む非diVA ｓｉＲＮＡの形成。イオン化可能な脂質、DOPE、コレステロール、およびＰＥＧ抱合型脂質を、無水ＥｔＯＨ（２００プルーフ）中で、〜４．４ｍｇ／ｍＬの最終重量濃度において可溶化した。ｓｉＲＮＡを、クエン酸バッファー中で、〜０．２６ｍｇ／ｍＬの濃度において可溶化し、温度を３５〜４０℃まで調整した。エタノール／脂質混合物を、次いで、ｓｉＲＮＡ含有バッファー中に撹拌しながら添加することにより、ｓｉＲＮＡをロードしたリポソームを自然に形成させた。脂質を、ｓｉＲＮＡと、最終的な合計の脂質対ｓｉＲＮＡ比が７：１〜１４：１（ｗｔ：ｗｔ）を達成するように組み合わせた。ｓｉＲＮＡをロードしたリポソームを、１０×容積のＰＢＳに対して透析濾過し、エタノールを除去してバッファーを交換した。最終生成物を、０．２２μｍの、無菌グレードの、バイオバーデンを減少させるためのフィルターを通して濾過した。このプロセスにより、４０〜１００ｎｍの平均粒子直径、ＰＤＩ＜０．２、および＞８５％のＲＮＡ被包（捕捉）効率を有するリポソームを得た。
【０１６２】
ｄｉＶＡと共可溶化されたｓｉＲＮＡ含有リポソームの形成。ｓｉＲＮＡ−ｄｉＶＡ−リポソーム処方物を、上記の方法を用いて調製した。ｄｉＶＡ−ＰＥＧ−ｄｉＶＡを、無水エタノール中で、他の脂質（イオン化可能な脂質、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＰＥＧ抱合型脂質）と共に共可溶化し、その後、ｓｉＲＮＡを含有するバッファーを添加した。ｄｉＶＡ−ＰＥＧ−ｄｉＶＡの含有物モル濃度は、０．１〜５ｍｏｌ％の範囲であった。このプロセスにより、４０〜１００ｎｍの平均粒子直径、ＰＤＩ＜０．２、および＞８５％の捕捉効率を有するリポソームを得た。
【０１６３】
イオン化可能なカチオン性脂質を有するｓｉＲＮＡ含有リポソームの形成。ｓｉＲＮＡ−ｄｉＶＡ−リポソーム処方物およびｓｉＲＮＡ−リポソーム処方物を、上記の方法を用いて調製した。カチオン性脂質を、無水エタノール中で、他の脂質（イオン化可能な脂質、ＤＯＰＥ、コレステロール、ＰＥＧ抱合型脂質、およびｄｉＶＡ−ＰＥＧ−ｄｉＶＡ）と共に共可溶化し、その後、ｓｉＲＮＡを含有するバッファーを添加した。カチオン性脂質の含有物モル濃度は、５〜４０ｍｏｌ％の範囲であった。このプロセスにより、４０〜１００ｎｍの平均粒子直径、ＰＤＩ＜０．２、および＞８５％の捕捉効率を有するリポソームを得た。
【０１６４】
In vitro（pHSC、gp46 KD＠２０ｎＭ）での効力
９６ウェルプレート中のＰＨＳＣを、イオン化可能な脂質処方物Ｃ１０４、イオン化可能な脂質処方物Ｔｕ１０４、または異なる比のイオン化可能な脂質（Ｃ１０４：Ｔｕ１０４）を有する組み合わせ処方物のいずれかからなる処方物と共にインキュベートした。３０分後、培地をフレッシュな増殖培地で置き換えた。４８時間後、細胞を溶解し、ＧＰ４６およびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを、定量ＲＴ−ＰＣＲ（TaqMan（登録商標））アッセイにより測定し、ＧＰ４６レベルを、ＧＡＰＤＨレベルに対して正規化した。正規化されたＧＰ４６レベルを、モック対照細胞の％として表わした。エラーバーは、標準偏差を示す（ｎ＝３）。結果を、図１において表わす。結果が示すとおり、２つの本説明のイオン化可能な脂質の組み合わせは、相乗的な遺伝子発現の低下をもたらすことが観察された。
【０１６５】
他のイオン化可能な脂質：イオン化可能な脂質、およびイオン化可能な脂質：カチオン性脂質の組み合わせにより、類似の実験を行った。Ｓ１０４−ＤＯ：Ｔｕ１０４−ＤＯの組み合わせについての結果を、図２において表わす。ＨＥＤＯＤＣ：Ｔｕ１０４の組み合わせについての結果を、図３において表わす。イオン化可能な脂質と不溶性：カチオン性脂質の組み合わせはいずれも、やはり、相乗的な遺伝子発現の低下をもたらした。
【０１６６】
In vivo（ＤＭＮＱ）での効力：
標的処方物のin vivoでの活性を、短期肝臓傷害モデル（Quick ModelまたはＤＭＮＱとして言及される）において評価した。このモデルにおいて、ジメチルニトロソアミン（ＤＭＮ）などの肝臓傷害剤による処置により誘導される短期間の肝臓の傷害は、ｇｐ４６のｍＲＮＡレベルの上昇を伴う。これらの変化を誘導するために、オスのSprague-Dawleyラットに、６日間連続して、腹腔内でＤＭＮを注射した。ＤＭＮ処置期間の終了時に、動物を、個々の動物の体重に基づいて、群に無作為化した。最後のＤＭＮの注射の１時間後に、処方物を単一のＩＶ用量として投与した。２４時間後、肝葉を切除し、ｇｐ４６およびＭＲＰＬ１９の両方のｍＲＮＡレベルを、定量ＲＴ−ＰＣＲ（TaqMan）アッセイにより決定した。ｇｐ４６についてのｍＲＮＡレベルを、ＭＲＰＬ１９のレベルに対して正規化した。結果を、図４において表わす。イオン化可能：カチオン性脂質の幾つかの組み合わせは、単一の、動物の体重１ｋｇあたり０．５ｍｇの、被包されたｓｉＲＮＡの用量について、５０％の遺伝子発現の低下を達成した。
【０１６７】
In vitro毒性学データ、in vitroでの細胞傷害性（ＨｅｐＧ２＠２００ｎＭ）
本説明の処方物中への２０モル％のＳ１０４の添加は、ＨｅｐＧ２細胞傷害性アッセイにおいて、細胞の生存率を２７％から５２％へと改善した。
【表２】
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【０１６８】
ＨｅｐＧ２細胞傷害性アッセイの説明：
ヒト肝細胞癌に由来する接着細胞株であるＨｅｐＧ２細胞を、１０％のＦＢＳ（Hyclone, Logan, Utah Cat# SH30910）を補充したＭＥＭ／ＥＢＳＳ（Hyclone, Logan, Utah, Cat# SH30024.01）中で培養した。ＨｅｐＧ２細胞を、９６ウェルＯｐｔｉｌｕｘブラックプレート（BD Falcon, Cat # BD353220）中に、５０００細胞／ウェルにおいて、一晩播種した。各ウェルに、最終の示されたｓｉＲＮＡ濃度まで、処方物を添加した（ｎ＝３）。処方物添加の４８時間後において、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存率アッセイキット（Promega, Cat #G7572）を製造者の指示に従って用いて、細胞の生存率を決定した。化学発光シグナルを、Ｃｌａｒｉｔｙ発光マイクロプレートリーダー（502-Biotek, Winooski, Vermont）において測定した。モック処置されたウェルに対して正規化された、処方物で処置したウェル中の化学発光シグナルの％に基づいて、生存率を計算した。
【０１６９】
In vivo毒性学データ
本説明のＨＥＤＣ：Ｓ１０４（２０：２０）の処方物は、毒性学研究において示されるとおり、極めて良好に耐容された。処方物を、ラットおよびサルにおいて、それぞれ２５ｍｇ／ｋｇおよび１２ｍｇ／ｋｇまでの用量において静脈内注射した場合、毒性は観察されなかった。これは、当業者により、優れたものと考えられる。
【０１７０】
本方法の処方物のトランスフェクション：
トランスフェクション方法は、ＬＸ−２およびｐＨＳＣについて同じである。本方法のリポソーム処方物またはリポプレックス処方物を、所望される濃度において、増殖培地と混合する。１００μｌの混合物を、９６ウェルプレート中の細胞に添加し、細胞を３０分間、３７℃で、インキュベーター中で、５％のＣＯ２と共に、インキュベートした。３０分後、培地をフレッシュな増殖培地で置き換えた。トランスフェクションの４８時間後、Cell-to-Ct溶解試薬（Applied Biosystems）を、製造者の指示に従って用いて、細胞を処理した。
【０１７１】
ＨＳＰ４７のｍＲＮＡ発現を測定するための定量（ｑ）ＲＴ−ＰＣＲ 
ＨＳＰ４７およびGAPDH TaqMan（登録商標）アッセイ、ならびにOne-Step RT-PCRマスターミックスを、Applied Biosystemsから購入した。各々のＰＣＲ反応は、以下の組成物を含んだ：One-step RT-PCRミックス５μｌ、TaqMan（登録商標）ＲＴ酵素ミックス０．２５μｌ、TaqMan（登録商標）遺伝子発現アッセイプローブ（ＨＳＰ４７）０．２５μｌ、TaqMan（登録商標）遺伝子発現アッセイプローブ（ＧＡＰＤＨ）０．５μｌ、ＲＮａｓｅフリー水３．２５μｌ、細胞ライセート０．７５μｌ、１０μｌの合計容積。ＧＡＰＤＨを、ＨＳＰ４７のｍＲＮＡレベルの相対的定量化のための内在対照として用いた。定量ＲＴ−ＰＣＲは、Ｖｉｉａ  ７リアルタイムＰＣＲシステム（Applied Biosciences）において行った。全ての値を、モックトランスフェクトされた細胞の平均ＨＳＰ４７発現に対して正規化し、モックと比較したＨＳＰ４７発現の％として表わした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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