(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡと、少なくともＤＮＡを含む生物試料からＲＮＡを抽出するための溶液であって、
（ａ）溶液の総量に対して５３容量％以上のフェノール、
（ｂ）溶液の総量に対して３〜１０容量％の多価アルコール、
（ｃ）溶液の総量に対して０．５〜２．０Ｍ濃度のグアニジニウム塩、
（ｄ）溶液の総量に対して０．１〜０．５Ｍ濃度のチオシアン酸塩、及び
（ｅ）溶液のｐＨを４〜６に維持するための緩衝剤、
を含む溶液。
【請求項２】
フェノール濃度が、溶液の総量に対して５５〜６５容量％である、請求項１に記載の溶液。
【請求項３】
水層を分離するための有機溶媒をさらに含む、請求項１又は２に記載の溶液。
【請求項４】
生物試料が培養細胞の培養液である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の溶液。
【請求項５】
生物試料が生物の体液成分である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の溶液。
【請求項６】
生物試料が生物の血液成分である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の溶液。
【請求項７】
ＲＮＡと少なくともＤＮＡを含む生物試料を、
（ａ）溶液の総量に対して５３容量％以上のフェノール、
（ｂ）溶液の総量に対して３〜１０容量％の多価アルコール、
（ｃ）溶液の総量に対して０．５〜２．０Ｍ濃度のグアニジニウム塩、
（ｄ）溶液の総量に対して０．１〜０．５Ｍ濃度のチオシアン酸塩、及び
（ｅ）溶液のｐＨを４〜６に維持するための緩衝剤、
を含む溶液と共にホモジェナイズする工程と、
得られたホモジェネートを、水層を分離するための有機溶媒と混合する工程と、
得られた混合物を遠心分離する工程と、
遠心分離により生成した、ＲＮＡ含有水層を回収する工程と、
を含む、前記生物試料からＲＮＡを抽出する方法。
【請求項８】
ＲＮＡと少なくともＤＮＡを含む生物試料を、
（ａ）溶液の総量に対して５３容量％以上のフェノール、
（ｂ）溶液の総量に対して３〜１０容量％の多価アルコール、
（ｃ）溶液の総量に対して０．５〜２．０Ｍ濃度のグアニジニウム塩、
（ｄ）溶液の総量に対して０．１〜０．５Ｍ濃度のチオシアン酸塩、及び
（ｅ）溶液のｐＨを４〜６に維持するための緩衝剤、
（ｆ）水層を分離するための有機溶媒、
を含む溶液と共にホモジェナイズする工程と、
得られたホモジェネートを遠心分離する工程と、
遠心分離により生成した、ＲＮＡ含有水層を回収する工程と、
を含む、前記生物試料からＲＮＡを抽出する方法。
【請求項９】
フェノール濃度が、（ａ）〜（ｅ）の溶液の総量に対して５５〜６５容量％である、請求項７又は８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物試料から実質的に純粋なＲＮＡを抽出するための溶液に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡに書き込まれた遺伝情報は多種多様な組み合わせでＲＮＡに転写され、生物は複雑な表現型を示している。ＲＮＡは種類、発現量をもって生物の表現型に寄与していることが明らかとなっており、遺伝子発現分析のためには、様々な生物材料からＲＮＡを純度高く抽出することが重要である。この目標を達成するために、これまで多くのＲＮＡ抽出方法が開発されている。頻繁に使用されているＲＮＡの単離方法は、フェノール抽出、カオトロピック塩溶液からの沈殿、及びシリカメンブレンへの吸着などがある。【０００３】
特許文献１には、ＲＮＡの抽出を目的とする、２〜５Ｍのグアニジンと４０〜６０％のフェノールを含む溶液が開示されている。この溶液を用いることにより、それ以前は超遠心機を使用し２日以上を要した作業を３時間で効率的にＲＮＡ抽出を行えるようになった。この方法は、シングルステップ方法と称されている。【０００４】
特許文献２には、上記の特許文献１に記載されている方法をさらに改良したものとして、ＲＮＡとＤＮＡとタンパク質とを含む試料から、これら各成分を同時に抽出して分離するための抽出溶液が開示されている。具体的には、０．５〜２Ｍのグアニジンを含む濃度３０〜５０％のフェノール溶液を用いてＲＮＡを水層に抽出して分離することが記載されている。【０００５】
特許文献１及び２に記載の溶液は、その組成は異なるが、いずれも各溶液を用いて同様の操作でＲＮＡを抽出することができる。即ち、各溶液で生物組織をホモジナイズし、クロロホルムなどの疎水性有機溶媒を用いて、そのホモジェネートを遠心して層分離する。遠心分離後、ＲＮＡを含む最上部の水層を回収し、アルコールを用いてＲＮＡを沈殿させ、洗浄することで、ＲＮＡを抽出することができる。【０００６】
しかし、特許文献１及び２に記載の溶液及び方法を用いて単離されたＲＮＡには、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ（ＲＴ−ＰＣＲ）により検出され得る程度の量のゲノムＤＮＡがなお混入（残存）しているため、例えばＲＴ−ＰＣＲの場合にＲＮＡの定量性を失わせる等の問題がある（特許文献３、例えば段落０００５）。従って、これらの方法によって単離されたＲＮＡは、混入するＤＮＡを除くためにさらに精製されなければならない。【０００７】
抽出したＲＮＡサンプル中に不純物として混入しているＤＮＡを除去するための一般的な１つの方法は、ＲＮＡサンプルをデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）で処理することである。しかし、ＤＮａｓｅによる処理は、液層で行う場合には処理後にＤＮａｓｅを除くために再度フェノール／クロロホルム抽出やタンパク質の変性を行わなければならない。また、シリカメンブレンカラムを組み合わせて抽出する場合には、カラムの洗浄作業を重ねて行う必要がある。このＤＮａｓｅによる処理によりＤＮＡの混入は減少するが、これらの手間が増加し、さらにＲＮＡのロスが生じてＲＮＡの抽出量が減少してしまうという問題がある。【０００８】
特許文献３には、ＤＮａｓｅ処理を行うことなくＲＮＡサンプルへのＤＮＡの混入を避ける方法として、ｐＨ４未満においてＲＮＡ抽出試薬を用いる方法が報告されている。しかし、核酸は酸性下で脱プリン化され、分解してしまうことが一般によく知られており、実質的に分解されていないＲＮＡを単離することは困難である。また、酸性下におけるＤＮＡの水層／有機層への溶解平衡は有機層に分配されるように偏ることから、ｐＨ４未満においてＲＮＡ抽出試薬を用いることにより、水相へのゲノムＤＮＡの混入抑制効果はある程度期待できるが、塩基数の小さいＤＮＡ断片の混入を完全に抑制することは不可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第４８４３１５５号
【特許文献２】特開平５−３４４８８６号公報
【特許文献３】特表２００７−５３２１４０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
以上のように、生物試料からＲＮＡを抽出するための従来の溶液では、定量性が求められるような場合に、ＤＮＡが混入していない実質的に純粋なＲＮＡを抽出することができなかったという課題があった。そして、混入したＤＮＡを除くために、ＤＮａｓｅ処理などの付加工程が必要であった。本発明は、これらの課題を解決しようとするものであって、生物試料から実質的に純粋なＲＮＡを抽出するための溶液を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、今回、従来のＲＮＡ抽出用溶液の組成について検討し、特にフェノール濃度がＤＮＡの混入を防ぐ効果に関係することを見出して本発明を完成させた。【００１２】
すなわち、本発明は以下のものを提供する。
［１］ＲＮＡと、少なくともＤＮＡを含む生物試料からＲＮＡを抽出するための溶液であって、
（ａ）溶液の総量に対して５３容量％以上のフェノール、
（ｂ）溶液の総量に対して３〜１０容量％の多価アルコール、
（ｃ）溶液の総量に対して０．５〜２．０Ｍ濃度のグアニジニウム塩、
（ｄ）溶液の総量に対して０．１〜０．５Ｍ濃度のチオシアン酸塩、及び
（ｅ）溶液のｐＨを４〜６に維持するための緩衝剤、
を含む溶液。
［２］フェノール濃度が、溶液の総量に対して５５〜６５容量％である、［１］に記載の溶液。
［３］水層を分離するための有機溶媒をさらに含む、［１］又は［２］に記載の溶液。
［４］生物試料が培養細胞の培養液である、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の溶液。
［５］生物試料が生物の体液成分である、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の溶液。
［６］生物試料が生物の血液成分である、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の溶液。
【００１３】
［７］  ＲＮＡと少なくともＤＮＡを含む生物試料を、
（ａ）溶液の総量に対して５３容量％以上のフェノール、
（ｂ）溶液の総量に対して３〜１０容量％の多価アルコール、
（ｃ）溶液の総量に対して０．５〜２．０Ｍ濃度のグアニジニウム塩、
（ｄ）溶液の総量に対して０．１〜０．５Ｍ濃度のチオシアン酸塩、及び
（ｅ）溶液のｐＨを４〜６に維持するための緩衝剤、
を含む溶液と共にホモジェナイズする工程と、
得られたホモジェネートを、水層を分離するための有機溶媒と混合する工程と、
得られた混合物を遠心分離する工程と、
遠心分離により生成した、ＲＮＡ含有水層を回収する工程と、
を含む、前記生物試料からＲＮＡを抽出する方法。
【００１４】
［８］  ＲＮＡと少なくともＤＮＡを含む生物試料を、
（ａ）溶液の総量に対して５３容量％以上のフェノール、
（ｂ）溶液の総量に対して３〜１０容量％の多価アルコール、
（ｃ）溶液の総量に対して０．５〜２．０Ｍ濃度のグアニジニウム塩、
（ｄ）溶液の総量に対して０．１〜０．５Ｍ濃度のチオシアン酸塩、及び
（ｅ）溶液のｐＨを４〜６に維持するための緩衝剤、
（ｆ）水層を分離するための有機溶媒、
を含む溶液と共にホモジェナイズする工程と、
得られたホモジェネートを遠心分離する工程と、
遠心分離により生成した、ＲＮＡ含有水層を回収する工程と、
を含む、前記生物試料からＲＮＡを抽出する方法。
【００１５】
［９］  フェノール濃度が、（ａ）〜（ｅ）の溶液の総量に対して５５〜６５容量％である、請求項７又は８に記載の方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の溶液を用いることにより、生物試料から、ＤＮＡの混入がない実質的に純粋なＲＮＡを簡便に抽出することができるようになる。また、本発明によれば、回収ロスの原因となりうるＤＮａｓｅ処理などの付加処理を必要とせずに、定量性が求められる用途においてもそのまま用いることができるような純度のＲＮＡを得ることが可能となる。特に、生物試料のうち、ＲＮＡ分解酵素やその他の夾雑物が非常に多く含まれている血液等の体液においても、目的とするＲＮＡを高純度で抽出することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、実施例１において、本発明の溶液を用いて血清から抽出した核酸の電気泳動図である。
【図２】図２は、比較例１において、特許文献２に記載の溶液を用いて血清から抽出した核酸の電気泳動図である。
【図３】図３は、比較例２において、特許文献１に記載の溶液を用いて血清から抽出した核酸の電気泳動図である。
【図４】図４は、実施例２〜５において、本発明の溶液を用いて血清から抽出した核酸の電気泳動図である。
【図５】図５は、実施例６〜１２において、本発明の溶液を用いて血清から抽出した核酸の電気泳動図である。
【図６】図６は、実施例１３、比較例３において、本発明の溶液、特許文献３に記載の溶液を用いて血清から抽出した核酸の電気泳動図である。
【図７】図７は、実施例１４において、本発明の溶液を用いて培養細胞から抽出した核酸の電気泳動図である。
【図８】図８は、実施例１５、１６において、本発明の溶液を用いて血清から抽出した核酸の電気泳動図である。
【図９】図９は、比較例４において、特許文献３に記載の溶液を用いて血清から抽出した核酸の電気泳動図である。
【図１０】図１０は、実施例１７、１８において、本発明の溶液を用いて血清から抽出した核酸の電気泳動図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、生物試料からＲＮＡを抽出するための溶液であって、次の（ａ）〜（ｅ）をその成分として含む。
（ａ）溶液の総量に対して５３容量％以上のフェノール、
（ｂ）溶液の総量に対して３〜１０容量％（３容量％以上１０容量％以下）の多価アルコール、
（ｃ）溶液の総量に対して０．５〜２．０Ｍ（０．５Ｍ以上２．０Ｍ以下）濃度のグアニジニウム塩、
（ｄ）溶液の総量に対して０．１〜０．５Ｍ（０．１Ｍ以上０．５Ｍ以下）濃度のチオシアン酸塩、及び
（ｅ）溶液のｐＨを４〜６に維持するための緩衝剤。
【００１９】
本発明で用いる生物試料は、ＲＮＡと、少なくともＤＮＡを含むものである。また、本発明の溶液を用いることにより、上記生物試料から実質的に純粋なＲＮＡを抽出することができる。ここで、「実質的に純粋なＲＮＡ」とは、生物試料に当初含まれていたＤＮＡが分離されて、実質的にその混入のないＲＮＡを意味する。ＲＮＡが実質的に純粋かどうかは、電気泳動によりＤＮＡが検出されるか否かにより判断することができる。例えば、アジレント・テクノロジー株式会社製「Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ６０００ピコキット」（型番５０６７−１５１３）は推奨５０ｐｇ／μＬ〜５０００ｐｇ／μＬの核酸を検出することができるので、これを用いてＤＮＡの混入の有無を評価することができる。具体的には、抽出した核酸をＲＮａｓｅ処理してから「Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ６０００ピコキット」を用いて電気泳動した場合に、ピークが検出されないときは十分にＤＮＡの混入が抑制されており、実質的に純粋なＲＮＡが得られていると判断することができる。また、混入したＤＮＡ量を定量ＰＣＲにより分析することで、ＲＮＡの純度を評価することができる。例えば、リアルタイムＰＣＲ装置と「ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ」（蛍光色素）を用いると、６０ｐｇの２本鎖ＤＮＡを検出することができるので、これを用いて評価することができる。具体的には、プライマーとＤＮＡ合成酵素と「ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ」を含むＰＣＲ反応溶液に、抽出した核酸を加えてＰＣＲ増幅を行い、予め作成した検量線と比較することにより、混入したＤＮＡ量を定量的に分析することができる。
【００２０】
本発明において、溶液の総量とは、上記（ａ）〜（ｅ）の全てを含む溶液の全容量を意味する。例えば、溶液の総量に対して５０容量％超過のフェノールとは、全成分を混合させた後の溶液１Ｌ中に、５００ｍＬを超過するフェノールを含んでいることを意味する。また、例えば、溶液の総量に対して０．５〜２．０Ｍ濃度のグアニジニウム塩とは、溶液の終濃度が０．５Ｍ以上２．０Ｍ以下であること、すなわち各成分を全て混合させた後の溶液１Ｌ中に、０．５ｍｏｌ以上２ｍｏｌ以下のグアニジニウム塩が含まれていることを意味する。
【００２１】
本発明の溶液は、（ａ）溶液の総量に対して５３容量％以上のフェノールを含む。フェノール濃度を従来技術と異なる５３容量％以上にすると、ＲＮＡが抽出される水層に、不純物としてのＤＮＡの混入が減少する効果のあることが明らかになった。本発明の溶液は、例えば、５４容量％以上又は５５容量％以上のフェノールを含む。好ましくは５５容量％以上のフェノールを含む。また、フェノールの濃度は、本発明の溶液の他の成分である（ｂ）の多価アルコール、（ｃ）の０．５〜２．０Ｍグアニジニウム塩、（ｄ）の０．１〜０．５Ｍチオシアン酸塩を各所定濃度において均一に混和した状態で本発明の溶液を調製する都合から、７５容量％以下であることが好ましく、またフェノールが酸化されることによる影響を減らすため、フェノールの濃度は６５容量％以下であることがより好ましい。好ましいフェノール濃度の範囲は、これらの上限と下限を任意に組み合わせた範囲であるが、好ましくは５３容量％以上６５容量％以下、特に好ましくは５５容量％以上６５容量％以下である。
【００２２】
本発明の溶液は、（ｂ）溶液の総量に対して３〜１０容量％の多価アルコールを含む。本発明における多価アルコールは、複数の水酸基を有する脂肪族アルコールであって、本発明の溶液中の（ａ）のフェノール成分及び（ｃ）や（ｄ）の水溶液を混和して均一な溶液として維持することができるものを用いることができる。多価アルコールとしては、２〜４個の水酸基を有する炭素数２〜６個の脂肪族アルコールが好ましい。例えば、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、エリスリトールなどが挙げられ、グリセロールがより好ましい。多価アルコールは、本発明の溶液を均一な溶液として維持し、フェノール成分が過度に水層に分配されないように、本発明の溶液の総量に対して３〜１０容量％を用いることができる。
【００２３】
本発明の溶液は、（ｃ）溶液の総量に対して０．５〜２．０Ｍ濃度のグアニジニウム塩を含む。グアニジニウム塩としては、具体的にはチオシアン酸グアニジニウムや塩酸グアニジニウムが好ましい。グアニジニウム塩は、ＲＮＡを分解から保護し、水性の溶液中でフェノールを溶液状態に維持する効果がある。
【００２４】
本発明の溶液は、（ｄ）溶液の総量に対して０．１〜０．５Ｍ濃度のチオシアン酸塩を含む。チオシアン酸塩としては、チオシアン酸の無機塩が好ましく用いることができ、より好ましくはチオシアン酸アンモニウム、チオシアン酸ナトリウムを用いることができる。また、複数の異なるチオシアン酸の無機塩の混合物であってもよく、例えばチオシアン酸アンモニウムとチオシアン酸ナトリウムとの混合物を好ましく用いることができる。チオシアン酸塩は、生物試料からのＲＮＡの抽出を増強すると考えられている。なお、本発明の溶液がチオシアン酸グアニジニウムを含む場合、該チオシアン酸グアニジニウムの濃度は、上記したグアニジニウム塩の濃度に含め、チオシアン酸塩の濃度には含めない。
【００２５】
本発明の溶液は、（ｅ）溶液のｐＨを４〜６に維持するための緩衝剤を含む。緩衝剤としては、ｐＨを所望の範囲に維持するために通常用いられる緩衝性を示す有機塩や無機塩を使用することができる。具体的には、ナトリウム、カリウム、リチウム又はアンモニウムの、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、フタル酸塩、酒石酸塩又は乳酸塩などの有機塩及び無機塩が含まれる。これらの組合せの中でも、酢酸ナトリウムやクエン酸ナトリウムがより好ましく用いられる。また、これらの複数の有機塩や無機塩を組み合わせて用いてもよい。この緩衝剤の濃度は、本発明の溶液を目的とするｐＨ４〜６に維持するために十分であれば特に限定されないが、本発明の溶液の総量に対して０．０２〜０．２Ｍの濃度となることが好ましい。本発明の溶液のｐＨを調整するために、緩衝剤に加えて、適当な酸又はアルカリ水溶液、例えば塩酸や水酸化ナトリウム溶液を適宜添加してもよい。
【００２６】
本発明の溶液には、生物試料中のタンパク質を変性させて目的とするＲＮＡの精製を補助するために、ポリオキシエチレンソルビタン、ドデシル硫酸ナトリウム、サルコシンなどの界面活性剤が含まれてもよい。また、本発明の溶液には、フェノールの酸化を防止するために、ヒンダードアミンフェノール、キノリンなどの酸化防止剤が含まれてもよい。
【００２７】
本発明の溶液は、例えば、生物試料が液体状態の場合、目的のＲＮＡを抽出するときには、その１倍容量以上、好ましくは３倍容量以上を用いることができる。
【００２８】
本発明の溶液を用いて目的のＲＮＡを抽出する手順の例を以下に示す。まず、生物試料を本発明の溶液中でホモジナイズしてホモジェネートを形成させる。ホモジナイズの方法は特に限定はないが、ボルテックスなどによる攪拌、注射針による破砕のほか、一般的なホモジナイザーを使用することができる。次に、水層を分離するための有機溶媒をこのホモジェネートに加えたのち、これを遠心分離する。ここで加える有機溶媒は、好ましくは、ホモジェネートの２容量％〜４０容量％程度を用いる。また遠心分離は、通常、６，０００ｘＧ〜２０，０００ｘＧで３分間〜３０分間、例えば、速度１２，０００ｘＧの条件で室温１０分間行うことができるが、液層が分離すればよく、速度、温度、時間に特に制限はない。遠心分離すると、目的とする実質的に純粋なＲＮＡは水層に抽出される。一方、ＤＮＡやタンパク質等は有機層に、又は中間層が生じた場合は有機層及び中間層に分離される。
【００２９】
水層を分離するための有機溶媒とは、本発明の溶液を用いて抽出された目的のＲＮＡが含まれる水層と、ＤＮＡ等が含まれる有機層及び／又は中間層（生じた場合）とに分離するために用いる液体の有機化合物である。この有機溶媒としては、親水性の度合いがフェノールと同じか、より疎水性であるものを用いることができる。例えば、親水性を示す指標して一般に用いられる水／オクタノール分配係数ＣＬｏｇＰの値が１．４（フェノールのＣＬｏｇＰ値）以上の有機化合物であれば使用することができ、ＣＬｏｇＰの値が１．４〜５の範囲のものを好ましく用いることができる。ここで、ＣＬｏｇＰ値は、例えば「Ｃｈｅｍ  Ｄｒａｗ」（登録商標）等のプログラムを用いて推算値を求めることができる。本発明において用いる有機溶媒としては、例えば、クロロホルム（１．９５２）、ｐ−ブロモアニソール（３．０６４）、１−ブロモ−３−クロロプロパン（１．８４７）、４−ブロモベラトロール（２．７３４５）、６−ブロモ−１，４−ベンゾジオキサン（３．０００５）、１−ブロモ−４−トリフルオロメトキシベンゼン（４．１７３）、１−ブロモ−２，４−ジメトキシベンゼン（２．８５４５）、４−フルオロアニソール（２．３４４）、４−ブロモトルエン（３．５０４）、４−ブロモ酪酸エチル（１．７７２）などが挙げられるが、これに限らない。ここで、上記の各有機溶媒の（）中の数値は「Ｃｈｅｍ  Ｄｒａｗ」で求められたＣＬｏｇＰの値である。
【００３０】
上記の水層を分離するための有機溶媒は、上記のように（ａ）〜（ｅ）を含む本発明の溶液を用いて形成させてホモジェネートに添加して用いることができるが、上記（ａ）〜（ｅ）を含む本発明の溶液に予め含まれていてもよい。従来のフェノール濃度が５０％以下の溶液の場合は、この有機溶媒を予め含めようとすると生物試料と混和するまえに溶液が水層と有機層の２層に分離してしまうため抽出溶液として使用困難であったが、本発明の溶液のフェノール濃度においては有機溶媒が本発明の溶液に均一に混和し、単一の溶液として保存可能である。この有機溶媒を予め含有する本発明の溶液は、生物試料を加えてホモジナイズしてホモジェネートとしたあと、直ちに遠心分離することでＲＮＡを含む水層を分離させることができる。従って、有機溶媒をホモジェネートに後から加える場合に比べ、手順を非常に単純化することができるので、好ましい。
【００３１】
水層を分離するための有機溶媒が上記（ａ）〜（ｅ）を含む本発明の溶液に予め含まれる場合の当該有機溶媒の含有量は、加える有機溶媒の種類と溶液のフェノール濃度にあわせて、有機溶媒が本発明の溶液中で均一に混和する範囲で選定することができる。例えば、本発明の溶液のフェノール濃度が６５％であるときに有機溶媒としてクロロホルムを選択する場合には、上記（ａ）〜（ｅ）を含む溶液の総量１００％に対し２７容量％までの任意の容量を含むことが好ましい。具体的には、上記（ａ）〜（ｅ）を含む溶液１００ｍＬにクロロホルムを２７ｍＬまでの任意の容量を加えることが好ましい。上記（ａ）〜（ｅ）を含む溶液の総量１００％に対し、より好ましくは５〜２５容量％、さらに好ましくは１０〜２０容量％のクロロホルムを含む。また、フェノール濃度が５８％であるときには、クロロホルムは上記（ａ）〜（ｅ）を含む溶液の総量１００％に対し１４％までの任意の容量を含むことが好ましく、より好ましくは６〜１３容量％、さらに好ましくは８〜１２容量％を含む。また、溶液のフェノール濃度が６５％であるときに有機溶媒としてｐ−ブロモアニソールを選択する場合には、上記（ａ）〜（ｅ）を含む溶液の総量１００％に対し２２容量％までの任意の容量を含むことが好ましく、より好ましくは５〜２０容量％、さらに好ましくは１０〜１８容量％を含む。また、同様にフェノール濃度が５８％であるときには、ｐ−ブロモアニソールは上記（ａ）〜（ｅ）を含む溶液の総量１００％に対し１３容量％までの任意の容量を含むことが好ましく、より好ましくは３〜１１容量％、より好ましくは５〜９容量％を含む。
【００３２】
本発明の溶液を用いて水層に抽出されたＲＮＡをさらに精製、濃縮するために、ＲＮＡが含まれる水層に低級アルコールを加えてＲＮＡを沈澱させ、沈澱したＲＮＡを回収することができる。あるいは、ＲＮＡが含まれる水層に低級アルコールを加えて沈澱させたＲＮＡを、ＲＮＡを吸着しうる担体、例えばシリカメンブレンカラムに吸着させたあと、担体（カラム）から溶出して回収しても良い。ここで用いる低級アルコールとしては、エタノール、イソプロパノールなどが挙げられる。その濃度は、一般的な核酸のエタノール沈殿、イソプロパノール沈殿の手法又はシリカメンブレンカラム等の担体のメーカー推奨濃度に準じて決めることができる。
【００３３】
本発明の溶液は、上記の（ａ）〜（ｅ）を各濃度となるように混和することで製造することができる。その混和の手順としては特に制限はない。溶液の組成によっては、予め高濃度の各溶液を調製してからそれらを混和することもできる。例えば、６Ｍのチオシアン酸グアニジン水溶液、６Ｍのチオシアン酸アンモニウム水溶液、１Ｍの酢酸ナトリウムを予め準備し、目的の濃度に混和してから、さらにグリセロール、フェノールと不足分の水を加えて調製することができる。水層を分離するための有機溶媒が上記（ａ）〜（ｅ）を含む溶液に予め含まれる本発明の溶液も、同様にして、（ａ）〜（ｅ）及び当該有機溶媒が所望の濃度となるように混和することで製造することができる。
【００３４】
本発明において用いる生物試料は、ＲＮＡと、少なくともＤＮＡを含むものであれば、特に制限はない。例えば、目的とするＲＮＡから分離したい不純物成分として、ＤＮＡのほかにタンパク質を含むものであってもよい。具体的には、培養細胞、培養細胞の培養液、手術切片や生検サンプル等の生体組織、生体細胞、血液、血液成分（血清、血漿）、尿、唾液、涙等の体液などが挙げられるが、これらに限られず、ＲＮＡの含まれる任意の試料を使用し得る。これらの生物試料に本発明の溶液を適用する場合には、生物試料が体液等の液体試料である場合には、採取後そのまま本発明の溶液と混和してもよいし、ＰＢＳや水で希釈してから本発明の溶液と混和してもよい。生物試料が細胞ペレットや組織片である場合には、採取後そのまま本発明の溶液と混和してもよいし、ＰＢＳや水で希釈してから本発明の溶液と混和してもよいが、ＲＮＡの分解を避けるため、希釈する場合にはより好ましくは生物試料のホモジェネートを作成してから水やＰＢＳで希釈することが好ましい。
【００３５】
生物試料のうち体液、特に血液には、ＲＮＡの分解酵素やその他の夾雑物が非常に多く含まれていることがあり、その場合に従来の方法では実質的に純粋なＲＮＡを抽出することが非常に困難であった。本発明の溶液は、フェノールを５３容量％以上にすることにより、タンパク質などの夾雑物を効果的に有機層に抽出することができるため、目的とするＲＮＡを純度高く得ることが可能である。また、遠心分離後に出現する中間層が減少し、明確な層分離が可能となるので、目的とするＲＮＡの含まれる水層の分離が容易である。
【００３６】
本発明の溶液を用いて抽出するＲＮＡは、複数のリボヌクレオチドがホスホジエステル結合したリボ核酸であって、その分子量、塩基数や由来によって限定されない。一般に、ＲＮＡは、機能分類上、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｎｃＲＮＡ（ノンコーディングＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ（核小体低分子ＲＮＡ）、等多くの種類に分類されているが、化学構造的には分子量（塩基数）以外に差は知られておらず、いずれも本発明におけるＲＮＡに含まれる。一般にｓｍａｌｌ ＲＮＡと呼ばれる塩基数が１５〜５００塩基程度のＲＮＡや、一般に塩基数が１８〜２５塩基程度のｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）も本発明におけるＲＮＡに含まれる。
【００３７】
一般に、ＲＮＡとＤＮＡとの一次化学構造の主な差異は、構成糖であるリボース２’−位の水酸基（−ＯＨ）の有無であり、それぞれ塩基数が小さくなるほどＲＮＡとＤＮＡとの構造的な差異が小さくなるため、両者を抽出により分離することが難しくなる。しかし、本発明の溶液を用いれば、ｓｍａｌｌ ＲＮＡといった塩基数の比較的小さいＲＮＡについても、純度高く抽出することが可能である。
【００３８】
通常、ＤＮＡとＲＮＡとが混在している状態では吸光光度計又は発光光度計を用いてそれぞれを区別して定量することは困難であるが、本発明の溶液を用いることで実質的に純粋なＲＮＡを得ることができるので、これらを用いたＲＮＡの定量が可能となる。また、本発明の溶液を用いることで、ｑＲＴ−ＰＣＲやマイクロアレイを使用したＲＮＡの解析において、ＤＮａｓｅによる処理を必要とせず、ＤＮＡの混在するによるノイズがない状態で簡便に解析することができる。
【実施例】
【００３９】
本発明は、以下の実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例に限定されないものとする。【００４０】
＜実施例１＞
（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
溶液の各成分の終濃度が以下になるように、それぞれを混合してＲＮＡ抽出用の溶液を調製した。
・５８容量％フェノール
・５容量％グリセロール
・０．８Ｍチオシアン酸グアニジニウム（水溶液にて混合）
・０．４Ｍチオシアン酸アンモニウム（水溶液にて混合）
・０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（水溶液にて混合）、ｐＨが５になるように調整。【００４１】
（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
ＲＮＡと、ＤＮＡ及びタンパク質を含む生物試料として血清を用いてＲＮＡ抽出を行った。上記（１）で調製した溶液９００μＬと血清３００μＬをボルテックスで混和し、ホモジナイズした。ホモジェネートに６０μＬのｐ−ブロモアニソールを加えて混和し、室温で１２，０００ｘＧで１０分間遠心した。遠心により、ＲＮＡを含有する水層と、ＤＮＡ及びタンパク質を含有する有機層と中間層が形成された。このうち、水層４００μＬを別のチューブに分離した。【００４２】
（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮−酵素処理なし−
（２）で分離したＲＮＡを含む水層に１．５倍容量の１００％エタノールを加え、核酸の精製カラムである「ｍｉＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ」（株式会社キアゲン製）の「ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ」に７００μＬ加え、８０００ｘＧで１５秒遠心してカラムに核酸を吸着させ、カラムを通過した液は廃棄した。エタノール混和ＲＮＡサンプルがなくなるまで同作業を繰り返し、水層に含まれていた核酸をすべてカラムに吸着させた。その後「ｍｉＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ」のプロトコルに従い、Ｂｕｆｆｅｒ ＲＷＴ ７００μＬ、Ｂｕｆｆｅｒ ＲＰＥ ５００μＬで２回カラムを洗浄し、カラムを乾燥させた後、３０μＬのＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水で溶出し、精製、濃縮したＲＮＡサンプルを得た。【００４３】
（３ｂ）水層からのＲＮＡの精製、濃縮−ＲＮａｓｅ処理有り−
抽出された核酸がＲＮＡであることを確認するために、（２）で分離したサンプルに対してＲＮａｓｅ処理を行った。（２）で分離したＲＮＡを含む水層に１．５倍容量の１００％エタノールを加え、（３ａ）と同様に核酸をカラムに吸着させた。Ｂｕｆｆｅｒ ＲＷＴ ３５０μＬで洗浄した後、希釈したＲＮａｓｅを加えてカラムに吸着した核酸をＲＮａｓｅ処理し、Ｂｕｆｆｅｒ ＲＷＴ ３５０μＬ、Ｂｕｆｆｅｒ ＲＰＥ ５００μＬで２回カラムを洗浄して、カラムを乾燥させた後、３０μＬのＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水で溶出し、精製、濃縮したＲＮＡサンプルを得た。【００４４】
（４）電気泳動による純度評価
（３ａ）、（３ｂ）で得た各ＲＮＡサンプル１μＬを７０℃で２分熱変性したあと、急冷した。アジレント・テクノロジー株式会社製「Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ６０００ピコキット」（型番５０６７−１５１３）を用いて、電気泳動を行った。その結果を図１に示した。また、「Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００」のＳｍｅａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ機能により、２５−５００ｎｔのピークエリアの面積を算出してピークのサイズと検出された核酸量（濃度）を確認した。【００４５】
（３ａ）の酵素処理なしサンプルでは、２００ｂａｓｅより小さいサイズのピークが１本のみ確認された（レーン１）。また、このときに算出された核酸量は８１６ｐｇ／μＬであった。一方、（３ｂ）のＲＮａｓｅ処理したサンプルの電気泳動パターンを確認すると、ピークは全く検出されなかった（レーン２）。また、このときの核酸量は６１ｐｇ／μＬと算出された。血清の代わりに核酸を含まないＰＢＳを用いて実施例１と同様に操作して検出系のノイズを確認する（レーン３：ＢＬＡＮＫ）と、このときの核酸量は６３ｐｇ／μＬであったことから、レーン２で算出された核酸量はノイズであると考えられた。以上のことから、抽出された核酸はＤＮＡを含まないＲＮＡのみであったことが確認された。なお、別途合成した２２〜２５塩基のＲＮＡを電気泳動して得られた泳動距離と本実施例で得られたピークの泳動距離は同等であったことから、レーン１で確認されたＲＮＡは２２〜２５塩基であると考えられた。
以上の結果を表１にまとめた。【００４６】
＜比較例１＞
（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
溶液の終濃度は、フェノール濃度を５０容量％とし、これ以外は実施例１と同じ組成になるように調製して、特許文献２に記載の溶液を調製した。【００４７】
（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
実施例１と同様に生物試料として血清を用いて行った。
（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例１と同様に行った。
（３ｂ）水層からのＲＮＡの精製、濃縮−ＲＮａｓｅ処理有り−
実施例１と同様に行った。
（３ｃ）水層からのＲＮＡの精製、濃縮−ＤＮａｓｅ処理有り−
実施例１の（３ｂ）において、ＲＮＡを含む水層を（３ｂ）のＲＮａｓｅに代えてＤＮａｓｅで処理して精製、濃縮したサンプルを得た。以上のほかは、実施例１と同様に行った。【００４８】
（４）電気泳動による純度評価
実施例１と同様に行った。その結果を図２に示した。
酵素処理していないサンプルからは２本の強いピーク（塩基数が２００塩基と５００塩基付近）と１本の弱いピーク（実施例１と同塩基数）が検出された（レーン１）。ＲＮａｓｅ処理有りサンプルでは、２００塩基と５００塩基のピークにはほとんど変化がなかったことから、２本のピークはＲＮＡではないことが明らかとなった（レーン２）。一方、レーン１で見られた、１本の弱いピークは消失したことから、実施例１と同様にこのピークはＲＮＡであったことが確認された。ＤＮａｓｅ処理したサンプルでは、２本の強いピークが消失し、非常に短く分解された断片が検出された（レーン３）ことから、この２本の強いピークは、混入したＤＮＡ断片であったことがわかった。【００４９】
以上のように、フェノール濃度が５０容量％の溶液を用いた場合は、ＤＮＡの混入が確認され、純粋なＲＮＡが抽出されなかった。
以上の結果を表３にまとめた。【００５０】
＜比較例２＞
（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
フェノール濃度が６０容量％である以外は、特許文献１に記載の抽出用溶液と同様の溶液を調製した。即ち、終濃度が６０容量％フェノール、２Ｍチオシアン酸グアニジニウム、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．２容量％２−メルカプトエタノールとし、ｐＨは４とした。【００５１】
（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
実施例１と同様に生物試料として血清を用いて行った。
（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例１と同様に行った。【００５２】
（４）電気泳動による純度評価
実施例１と同様に行った。その結果を図３に示した。
比較例１と同様の３本のピークが確認された。このことから、ＤＮＡ断片が混入していることが確認された。
以上の結果を表３にまとめた。【００５３】
＜実施例２＞
（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
溶液の終濃度は、フェノール濃度を５５容量％とし、これ以外は実施例１と同じ組成になるように溶液を調製した。
（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
実施例１と同様に生物試料として血清を用いて行った。
（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例１と同様に行った。
（３ｂ）水層からのＲＮＡの精製、濃縮−ＲＮａｓｅ処理有り−
実施例１と同様に行った。
（４）電気泳動による純度評価
実施例１と同様に行った。その結果を図４に示した。【００５４】
実施例１と同様のピークが検出され（レーン１）、ＲＮＡのみが純度高く抽出されたことが確認された。ＲＮａｓｅ処理を行ったサンプル（レーン５；ＲＮａｓｅ（＋））ではＢＬＡＮＫと同レベルまで減少していることから、抽出された核酸がＲＮＡのみであることが確認できた。
以上の結果を表１にまとめた。【００５５】
＜実施例３＞
（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
溶液の終濃度は、フェノール濃度を６５容量％とし、これ以外は実施例１と同じ組成になるように溶液を調製した。
（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
実施例１と同様に生物試料として血清を用いて行った。
（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例１と同様に行った。
（４）電気泳動による純度評価
実施例１と同様に行った。その結果を図４のレーン２に示した。
実施例１と同様のピークが検出され、ＲＮＡのみが純度高く抽出されたことが確認された。
以上の結果を表１にまとめた。【００５６】
＜実施例４＞
（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
溶液の終濃度は、フェノール濃度を５３容量％とし、これ以外は実施例１と同じ組成になるように溶液を調製した。
（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
実施例１と同様に生物試料として血清を用いて行った。
（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例１と同様に行った。
（４）電気泳動による純度評価
実施例１と同様に行った。その結果を図４のレーン３に示した。
実施例１と同様のピークが検出され、ＲＮＡのみが純度高く抽出されたことが確認された。
以上の結果を表１にまとめた。【００５７】
＜実施例５＞
（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
実施例１と同じ組成の溶液を調製した。
（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
ホモジェネートに６０μＬのｐ−ブロモアニソールを加える代わりに、２４０μＬのクロロホルムを加え、これ以外は実施例１と同様に生物試料として血清を用いて行った。
（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例１と同様に行った。
（４）電気泳動による純度評価
実施例１と同様に行った。その結果を、図４のレーン４に示した。
実施例１と同様のピークが検出され、ＲＮＡのみが純度高く抽出されたことが確認された。
以上の結果を表１にまとめた。【００５８】
＜実施例６＞
（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
実施例１と同じ組成の溶液を調製した。
（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
ホモジェネートに６０μＬのｐ−ブロモアニソールを加える代わりに、１００μＬの４−ブロモベラトロールを加え、これ以外は実施例１と同様に生物試料として血清を用いて行った。
（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例１と同様に行った。
（４）電気泳動による純度評価
実施例１と同様に行った。その結果を図５のレーン１に示した。
実施例１と同様のピークが検出され、ＲＮＡのみが純度高く抽出されたことが確認された。
以上の結果を表１にまとめた。【００５９】
＜実施例７＞
（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
実施例１と同じ組成の溶液を調製した。
（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
ホモジェネートに６０μＬのｐ−ブロモアニソールを加える代わりに、１００μＬの６−ブロモ−１，４−ベンゾジオキサンを加え、これ以外は実施例１と同様に生物試料として血清を用いて行った。
（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例１と同様に行った。
（４）電気泳動による純度評価
実施例１と同様に行った。その結果を図５のレーン２に示した。
実施例１と同様のピークが検出され、ＲＮＡのみが純度高く抽出されたことが確認された。
以上の結果を表１にまとめた。【００６０】
＜実施例８＞
（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
実施例１と同じ組成の溶液を調製した。
（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
ホモジェネートに６０μＬのｐ−ブロモアニソールを加える代わりに、１００μＬの１−ブロモ−４−トリフルオロメトキシベンゼンを加え、これ以外は実施例１と同様に生物試料として血清を用いて行った。
（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例１と同様に行った。
（４）電気泳動による純度評価
実施例１と同様に行った。その結果を図５のレーン３に示した。
実施例１と同様のピークが検出され、ＲＮＡのみが純度高く抽出されたことが確認された。
以上の結果を表１にまとめた。【００６１】
＜実施例９＞
（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
実施例１と同じ組成の溶液を調製した。
（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
ホモジェネートに６０μＬのｐ−ブロモアニソールを加える代わりに、１００μＬの１−ブロモ−２，４，−ジメトキシベンゼンを加え、これ以外は実施例１と同様に生物試料として血清を用いて行った。
（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例１と同様に行った。
（４）電気泳動による純度評価
実施例１と同様に行った。その結果を図５のレーン４に示した。
実施例１と同様のピークが検出され、ＲＮＡのみが純度高く抽出されたことが確認された。
以上の結果を表１にまとめた。【００６２】
＜実施例１０＞
（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
実施例１と同じ組成の溶液を調製した。
（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
ホモジェネートに６０μＬのｐ−ブロモアニソールを加える代わりに、１００μＬの４−フルオロアニソールを加え、これ以外は実施例１と同様に生物試料として血清を用いて行った。
（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例１と同様に行った。
（４）電気泳動による純度評価
実施例１と同様に行った。その結果を図５のレーン５に示した。
実施例１と同様のピークが検出され、ＲＮＡのみが純度高く抽出されたことが確認された。
以上の結果を表２にまとめた。【００６３】
＜実施例１１＞
（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
実施例１と同じ組成の溶液を調製した。
（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
ホモジェネートに６０μＬのｐ−ブロモアニソールを加える代わりに、１００μＬの４−ブロモトルエンを加え、これ以外は実施例１と同様に生物試料として血清を用いて行った。
（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例１と同様に行った。
（４）電気泳動による純度評価
実施例１と同様に行った。その結果を図５のレーン６に示した
実施例１と同様のピークが検出され、ＲＮＡのみが純度高く抽出されたことが確認された。
以上の結果を表２にまとめた。【００６４】
＜実施例１２＞
（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
実施例１と同じ組成の溶液を調製した。
（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
ホモジェネートに６０μＬのｐ−ブロモアニソールを加える代わりに、１００μＬの４−ブロモ酪酸エチルを加え、これ以外は実施例１と同様に生物試料として血清を用いて行った。
（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例１と同様に行った。
（４）電気泳動による純度評価
実施例１と同様に行った。その結果を図５のレーン７に示した。
実施例１と同様のピークが検出され、ＲＮＡのみが純度高く抽出されたことが確認された。
以上の結果を表２にまとめた。【００６５】
＜実施例１３＞
（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
実施例１で調製した溶液に塩酸を加えて、溶液のｐＨを４．２に調整した溶液を調製した。
（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
実施例１と同様に生物試料として血清を用いて行った。
（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例１と同様に行った。
（４）電気泳動による純度評価
実施例１と同様に行った。その結果を図６のレーン１に示した。
溶液のｐＨが４．２においても実施例１と同様のピークが検出され、ＲＮＡのみが純度高く抽出されたことがわかった。
以上の結果を表２にまとめた。【００６６】
＜比較例３＞
（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
比較例１で調製した溶液に塩酸を加えて、溶液のｐＨを３．６に調整した溶液を調製した。
（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
実施例１と同様に生物試料として血清を用いて行った。
（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例１と同様に行った。
（４）電気泳動による純度評価
実施例１と同様に行った。その結果を図６のレーン２に示した比較例１と同様の３本のピークが確認された。このことから、フェノール濃度が５０容量％の溶液を用いた場合は、ｐＨを３．６としてもＤＮＡ断片が混入していることが確認された。
以上の結果を表３にまとめた。【００６７】
＜実施例１４＞
（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
実施例１と同じ組成の溶液を調製した。
（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
実施例１の３００μＬの血清の代わりに、生物試料としてＰＢＳ３００μＬに懸濁した培養細胞（ＨＥＫ２９３細胞）を使用した以外は、実施例１と同様に行った。
（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮−酵素処理なし−
水層に加えるエタノール量を１．５倍容量ではなく、１．２５倍容量にした以外は、実施例１と同様に行った。
（３ｂ）水層からのＲＮＡの精製、濃縮−ＲＮａｓｅ処理有り−
水層に加えるエタノール量を１．５倍容量ではなく、１．２５倍容量にした以外は、実施例１と同様に行った。
（４）電気泳動による純度評価
使用するキットを「Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ６０００ピコキット」の代わりに、「Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ６０００ナノキット」（型番５０６７−１５１１）（アジレント・テクノロジー社製）を用いた以外は実施例１と同様に行った。その結果を図７に示した。【００６８】
（３ａ）の酵素処理なしサンプルでは、１８Ｓ、２８ＳリボソームＲＮＡがほとんど分解されることなく（ＲＩＮ値：２．３）抽出されていることが確認された（レーン１）。このときの核酸量は、７９ｎｇ／μＬと算出された。また、（３ｂ）のＲＮａｓｅで処理したサンプルでの結果、実施例１と同様ピークは全く検出されなかった（レーン２）。このときの核酸量は、４ｎｇ／μＬと算出された。また、サンプルを何も流さないときの検出系のノイズを確認する（レーン３）と、このときの核酸量は２ｎｇ／μＬであったことから、レーン２の核酸量はノイズであると考えられた。以上のことから、抽出された核酸はすべてＲＮＡであったことが確認された。
以上の結果を表２にまとめた。【００６９】
＜実施例１５＞
（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
溶液の各成分の終濃度が以下になるように、それぞれを混合してＲＮＡ抽出用の溶液を調製した。すなわち、実施例１と同じ組成の溶液９００μＬに対しさらに６０μＬのｐ−ブロモアニソールを加えて溶液を調製した。
・５８容量％フェノール
・５容量％グリセロール
・０．８Ｍチオシアン酸グアニジニウム（水溶液にて混合）
・０．４Ｍチオシアン酸アンモニウム（水溶液にて混合）
・０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（水溶液にて混合）、ｐＨが５になるように調整
・上記の全量１００％に対し６．６容量％のｐ−ブロモアニソール【００７０】
（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
上記（１）で調製した溶液９００μＬと血清３００μＬをボルテックスで混和し、ホモジナイズした。室温で１２，０００ｘＧで１０分間遠心した。遠心により、ＲＮＡを含有する水層と、ＤＮＡ及びタンパク質を含有する有機層と中間層が形成された。このうち、水層３５０μＬを別のチューブに分離した。
（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例１と同様に行った。
（３ｂ）水層からのＲＮＡの精製、濃縮−ＲＮａｓｅ処理有り−
実施例１と同様に行った。
（４）電気泳動による純度評価
実施例１と同様に行った。その結果を図８のレーン１、３、５に示した。【００７１】
実施例１と同様のピークが検出され、ＲＮＡのみが純度高く抽出されたことがわかった（レーン１）。ＲＮａｓｅ処理有り（レーン３；ＲＮａｓｅ（＋））ではＢＬＡＮＫ（レーン５）と同レベルまで減少していることから、抽出された核酸がＲＮＡのみであることが確認できた。
以上の結果を表２にまとめた。【００７２】
＜実施例１６＞
（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
溶液の各成分の終濃度が以下になるように、それぞれを混合してＲＮＡ抽出用の溶液を調製した。すなわち、実施例１と同じ組成の溶液９００μＬに対しさらに９０μＬのクロロホルムを加えて溶液を調製した。
・５８容量％フェノール
・５容量％グリセロール
・０．８Ｍチオシアン酸グアニジニウム（水溶液にて混合）
・０．４Ｍチオシアン酸アンモニウム（水溶液にて混合）
・０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（水溶液にて混合）、ｐＨが５になるように調整
・上記の全量１００％に対し１０容量％クロロホルム
（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
上記（１）で調製した溶液９００μＬと血清３００μＬをボルテックスで混和し、ホモジナイズした。室温で１２，０００ｘＧで１０分間遠心した。遠心により、ＲＮＡを含有する水層と、ＤＮＡ及びタンパク質を含有する有機層と中間層が形成された。このうち、水層３５０μＬを別のチューブに分離した。
（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例１と同様に行った。
（３ｂ）水層からのＲＮＡの精製、濃縮−ＲＮａｓｅ処理有り−
実施例１と同様に行った。
（４）電気泳動による純度評価
実施例１と同様に行った。その結果を図８のレーン２、４、５に示した。【００７３】
実施例１と同様のピークが検出され、ＲＮＡのみが純度高く抽出されたことがわかった（レーン２）。ＲＮａｓｅ処理有り（レーン４；ＲＮａｓｅ（＋））ではＢＬＡＮＫ（レーン５）と同レベルまで減少していることから、抽出された核酸がＲＮＡのみであることが確認できた。
以上の結果を表２にまとめた。【００７４】
＜比較例４＞
（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
フェノール濃度が５５容量％である以外は比較例３と同じ組成の溶液を調製した。
（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
実施例１と同様に生物試料として血清を用いて行った。
（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例１と同様に行った。
（３ｂ）水層からのＲＮＡの精製、濃縮−ＲＮａｓｅ処理有り−
実施例１と同様に行った。
（４）電気泳動による純度評価
実施例１と同様に行った。その結果を図９に示した。【００７５】
（３ａ）の酵素処理なしサンプルでは、実施例１と比較してややブロードなピークが検出され（レーン１）、また（３ｂ）のＲＮａｓｅ処理したサンプルにおいてもピークが検出された（レーン２）。ＲＮａｓｅ処理有り（ＲＮａｓｅ（＋））においてもＢＬＡＮＫ（レーン２）より大きなピークが得られていることから、ＲＮＡ以外の核酸（ＤＮＡ）の混入が確認できた。
以上の結果を表３にまとめた。【００７６】
＜実施例１７＞
（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
溶液の終濃度は、ｐＨ４とし、これ以外は実施例１と同じ組成になるように溶液を調製した。
（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
実施例１と同様に生物試料として血清を用いて行った。
（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例１と同様に行った。
（３ｂ）水層からのＲＮＡの精製、濃縮−ＲＮａｓｅ処理有り−
実施例１と同様に行った。
（４）電気泳動による純度評価
実施例１と同様に行った。その結果を図１０（レーン１、２、５）に示した。【００７７】
実施例１と同様のピークが検出され、ＲＮＡのみが純度高く抽出されたことが確認された（レーン１）。ＲＮａｓｅ処理有り（レーン２；ＲＮａｓｅ（＋））ではＢＬＡＮＫ（レーン５）と同レベルまで減少していることから、抽出された核酸がＲＮＡのみであることが確認できた。
以上の結果を表２にまとめた。【００７８】
＜実施例１８＞
（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
溶液の終濃度は、ｐＨ６とし、これ以外は実施例１と同じ組成になるように溶液を調製した。
（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
実施例１と同様に生物試料として血清を用いて行った。
（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮−酵素処理なし−
実施例１と同様に行った。
（３ｂ）水層からのＲＮＡの精製、濃縮−ＲＮａｓｅ処理有り−
実施例１と同様に行った。
（４）電気泳動による純度評価
実施例１と同様に行った。その結果を図１０（レーン３、４、５）に示した。【００７９】
実施例１と同様のピークが検出され、ＲＮＡのみが純度高く抽出されたことが確認された（レーン３）。ＲＮａｓｅ処理有り（レーン４；ＲＮａｓｅ（＋））ではＢＬＡＮＫ（レーン５）と同レベルまで減少していることから、抽出された核酸がＲＮＡのみであることが確認できた。
以上の結果を表２にまとめた。【００８０】
【表１】
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【００８１】
【表２】
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【００８２】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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