(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１０００〜５０００ｋＤａの範囲内の分子量を有するヒトα−シヌクレインプロトフィブリルについての高親和性を有し、α−シヌクレインモノマー及びβ−シヌクレインモノマーそれぞれへの結合性がヒトα−シヌクレインプロトフィブリルへの結合性よりも少なくとも１００倍少ない抗体又はその断片であって、以下の組合せから選択される３種の可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ配列（ＶＨ−ＣＤＲ−１、ＶＨ−ＣＤＲ−２、及びＶＨ−ＣＤＲ−３）と３種の可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ配列（ＶＬ−ＣＤＲ−１、ＶＬ−ＣＤＲ−２、及びＶＬ−ＣＤＲ−３）との組合わせを有する抗体又はその断片：
配列番号：２２（ＶＨ−ＣＤＲ−１）、２８（ＶＨ−ＣＤＲ−２）、３５（ＶＨ−ＣＤＲ−３）、４１（ＶＬ−ＣＤＲ−１）、４７（ＶＬ−ＣＤＲ−２）及び５０（ＶＬ−ＣＤＲ−３）、
配列番号：２３（ＶＨ−ＣＤＲ−１）、２９（ＶＨ−ＣＤＲ−２）、３６（ＶＨ−ＣＤＲ−３）、４２（ＶＬ−ＣＤＲ−１）、４７（ＶＬ−ＣＤＲ−２）及び５０（ＶＬ−ＣＤＲ−３）、
配列番号：２４（ＶＨ−ＣＤＲ−１）、３０（ＶＨ−ＣＤＲ−２）、３７（ＶＨ−ＣＤＲ−３）、４３（ＶＬ−ＣＤＲ−１）、４８（ＶＬ−ＣＤＲ−２）及び５１（ＶＬ−ＣＤＲ−３）、
配列番号：２５（ＶＨ−ＣＤＲ−１）、３１（ＶＨ−ＣＤＲ−２）、３８（ＶＨ−ＣＤＲ−３）、４４（ＶＬ−ＣＤＲ−１）、４７（ＶＬ−ＣＤＲ−２）及び５２（ＶＬ−ＣＤＲ−３）、
配列番号：２６（ＶＨ−ＣＤＲ−１）、３２（ＶＨ−ＣＤＲ−２）、３９（ＶＨ−ＣＤＲ−３）、４５（ＶＬ−ＣＤＲ−１）、４７（ＶＬ−ＣＤＲ−２）及び５３（ＶＬ−ＣＤＲ−３）、
配列番号：２３（ＶＨ−ＣＤＲ−１）、３３（ＶＨ−ＣＤＲ−２）、３７（ＶＨ−ＣＤＲ−３）、４３（ＶＬ−ＣＤＲ−１）、４８（ＶＬ−ＣＤＲ−２）及び５４（ＶＬ−ＣＤＲ−３）、並びに
配列番号：２７（ＶＨ−ＣＤＲ−１）、３４（ＶＨ−ＣＤＲ−２）、４０（ＶＨ−ＣＤＲ−３）、４６（ＶＬ−ＣＤＲ−１）、４９（ＶＬ−ＣＤＲ−２）及び５５（ＶＬ−ＣＤＲ−３）。
【請求項２】
該抗体又はその断片が、配列番号：２２（ＶＨ−ＣＤＲ−１）、２８（ＶＨ−ＣＤＲ−２）、３５（ＶＨ−ＣＤＲ−３）、４１（ＶＬ−ＣＤＲ−１）、４７（ＶＬ−ＣＤＲ−２）及び５０（ＶＬ−ＣＤＲ−３）のＣＤＲ配列の組合せを有する請求項１記載の抗体又はその断片。
【請求項３】
該抗体又はその断片が、配列番号：２３（ＶＨ−ＣＤＲ−１）、２９（ＶＨ−ＣＤＲ−２）、３６（ＶＨ−ＣＤＲ−３）、４２（ＶＬ−ＣＤＲ−１）、４７（ＶＬ−ＣＤＲ−２）及び５０（ＶＬ−ＣＤＲ−３）のＣＤＲ配列の組合せを有する請求項１記載の抗体又はその断片。
【請求項４】
該抗体又はその断片が、配列番号：２４（ＶＨ−ＣＤＲ−１）、３０（ＶＨ−ＣＤＲ−２）、３７（ＶＨ−ＣＤＲ−３）、４３（ＶＬ−ＣＤＲ−１）、４８（ＶＬ−ＣＤＲ−２）及び５１（ＶＬ−ＣＤＲ−３）のＣＤＲ配列の組合せを有する請求項１記載の抗体又はその断片。
【請求項５】
該抗体又はその断片が、配列番号：２５（ＶＨ−ＣＤＲ−１）、３１（ＶＨ−ＣＤＲ−２）、３８（ＶＨ−ＣＤＲ−３）、４４（ＶＬ−ＣＤＲ−１）、４７（ＶＬ−ＣＤＲ−２）及び５２（ＶＬ−ＣＤＲ−３）のＣＤＲ配列の組合せを有する請求項１記載の抗体又はその断片。
【請求項６】
該抗体又はその断片が、配列番号：２６（ＶＨ−ＣＤＲ−１）、３２（ＶＨ−ＣＤＲ−２）、３９（ＶＨ−ＣＤＲ−３）、４５（ＶＬ−ＣＤＲ−１）、４７（ＶＬ−ＣＤＲ−２）及び５３（ＶＬ−ＣＤＲ−３）のＣＤＲ配列の組合せを有する請求項１記載の抗体又はその断片。
【請求項７】
該抗体又はその断片が、配列番号：２３（ＶＨ−ＣＤＲ−１）、３３（ＶＨ−ＣＤＲ−２）、３７（ＶＨ−ＣＤＲ−３）、４３（ＶＬ−ＣＤＲ−１）、４８（ＶＬ−ＣＤＲ−２）及び５４（ＶＬ−ＣＤＲ−３）のＣＤＲ配列の組合せを有する請求項１記載の抗体又はその断片。
【請求項８】
該抗体又はその断片が、配列番号：２７（ＶＨ−ＣＤＲ−１）、３４（ＶＨ−ＣＤＲ−２）、４０（ＶＨ−ＣＤＲ−３）、４６（ＶＬ−ＣＤＲ−１）、４９（ＶＬ−ＣＤＲ−２）及び５５（ＶＬ−ＣＤＲ−３）のＣＤＲ配列の組合せを有する請求項１記載の抗体又はその断片。
【請求項９】
該抗体が、モノクローナルである、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の抗体又はその断片。
【請求項１０】
該抗体又はその断片のα−シヌクレインフィブリルへの結合性がヒトα−シヌクレインプロトフィブリルへの結合性より少なくとも１００倍低い、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の抗体又はその断片。
【請求項１１】
請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の抗体又はその断片、及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１２】
医薬組成物が、α−シヌクレイン病変を有する神経変性障害を治療及び／又は予防するための請求項１１に記載の医薬的組成物。
【請求項１３】
該神経変性障害が、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、アルツハイマー病のレビー小体バリアント、アルツハイマー病、ダウン症候群、多系統萎縮症、精神病、統合失調症、又はクロイツフェルト・ヤコブ病である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
該神経変性障害が、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、アルツハイマー病のレビー小体バリアント、アルツハイマー病、又は多系統萎縮症である、請求項１２又は１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
該神経変性障害が、パーキンソン病（ＰＤ）である、請求項１２から１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の抗体又はその断片を、α−シヌクレインプロトフィブリルを含む、又は含む疑いのある生物試料に添加する工程；及び
α−シヌクレインプロトフィブリルと該抗体又はその断片との間で形成された複合体の存在を検出する工程；
を含むα−シヌクレインプロトフィブリルを検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトα−シヌクレインプロトフィブリル（α-synuclein protofibrils）についての高親和性およびα−シヌクレインモノマーの低結合性を有する抗体またはその断片であって、規定の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を有する抗体またはその断片を対象とする。本発明はまた、このような抗体または断片を含む組成物、およびこのような抗体または断片を使用してα−シヌクレインプロトフィブリルを検出する方法を対象とする。さらなる実施形態において、本発明は、このような抗体または断片を投与することによりα−シヌクレイン病変を有する神経変性障害を予防し、発症遅延させ、または治療する方法、およびα−シヌクレイン病変を有する神経変性障害の治療のための医薬組成物の製造におけるこのような抗体または断片の使用を対象とする。本発明はまた、α−シヌクレイン病変を有する神経変性障害の発現の診断またはモニタリングにおけるこのような抗体または断片の使用、およびこのような抗体または断片を投与することによりα−シヌクレイン凝集を低減させ、または阻害する方法を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病（ＰＤ）およびレビー小体型認知症（ＤＬＢ）は、α−シヌクレイン脳病変を有する神経変性障害の２種の最も一般的な例である。ＰＤは最も一般的な運動障害であり、硬直、運動機能低下、振せんおよび姿勢不安定を特徴とする。ＰＤは、世界中で約４百万から６百万人が患っていると考えられる。ＤＬＢは全ての認知症の５〜１５％を占める。健忘症および変動することが多い他の認知症症状に加え、ＤＬＢ患者は、典型的には転倒再発および幻視を罹患する。
【０００３】
α−シヌクレインのニューロン内蓄積は、円形の１０〜２０μｍの大型好酸性ヒアリン封入体であるレビー小体、または細長い糸状のジストロフィ軸索および樹状突起であるレビー神経突起の形成をもたらす。ＰＤ脳においては、レビー小体およびレビー神経突起の沈着は、線条体を黒質と連結させるニューロンにほとんど限定される。これらの細胞は運動および姿勢制御機能の遂行のために極めて重要であり、このことはＰＤ症状の性質を説明する。ＤＬＢ脳においては、レビー小体およびレビー神経突起の広範囲な沈着が中脳と皮質領域の両方で見出される。
【０００４】
アルファ−シヌクレインは、主としてニューロン内で見出されるタンパク質である。ニューロン内で、α−シヌクレインは主にシナプス前に局在し、したがってシナプス活動の調節を担うと推測されてきた。α−シヌクレインの３種の主要アイソフォームが同定されており、このうちで最も長く、最も一般的な形状は１４０アミノ酸を含む。このアイソフォームは使用されており、本発明による抗体のアルファ−シヌクレイン（α−シヌクレイン）関連特徴は、このα−シヌクレインのアイソフォームを指す。
【０００５】
α−シヌクレインに加え、レビー小体は広範囲にわたる分子からなり、この１種はα，β−不飽和ヒドロキシアルケナールである、４−ヒドロキシ−２−ノネナール（ＨＮＥ）である（Qin et al.,2007）。ＨＮＥはα−シヌクレインを修飾することができ、これによりα−シヌクレインのオリゴマー化を促進し得ることがインビトロで示された。特に、ＨＮＥは、プロトフィブリル、すなわち可溶性の大型オリゴマー形状のα−シヌクレインの形成を増大させ、安定化することが示された（Qin et al.,2007；ＷＯ２００９／１３３５２１、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０００６】
酸化ストレスは、誤って折りたたまれたα−シヌクレインの病理学的蓄積を特徴とする多くの神経変性障害に関係づけられてきた。種々の反応性酸素種は、脂質、例えば細胞膜またはリポタンパク質の過酸化を誘導し、多不飽和脂肪酸からの高反応性アルデヒドの発生ももたらし得る（Yoritaka et al.,1996）。
【０００７】
アルツハイマー病（ＡＤ）の兆候である脳病変、すなわちアミロイド斑および神経原線維変化は、ＤＬＢを有する症例の約５０％で認められる。パラレルな病変の存在は、２種の異なる疾患を意味するのかまたはそれぞれの各障害のバリアントを単に表すのかは不明である。同時病変を有する症例は、ＡＤのレビー小体バリアントを有すると記載されることもある（Hansen et al.,1990）。
【０００８】
近年の研究は、ＡＤおよびダウン症候群におけるα−シヌクレインの役割に関与している。それというのも、α−シヌクレインタンパク質がこれらの障害において辺縁域内で蓄積することが実証されているからである（Crews et al.,2009）。
【０００９】
ＨＮＥはシステイン、ヒスチジンおよびリジンの側鎖と反応して修飾し、これらの側鎖の構造および物理的性質を実質的に変化させる。したがって、ＨＮＥは、Ｃ−３炭素もしくはアルデヒド基と、またはこれらの組合せと反応し得る。したがって、ＨＮＥは、分子間または分子内でタンパク質を共有結合的に修飾することができる。
【００１０】
パーキンソン病およびレビー小体型認知症の遺伝学
ＰＤおよびＤＬＢのまれな優性遺伝形態は、α−シヌクレイン遺伝子の点突然変異または二重複により引き起こされ得る。病原性突然変異、Ａ３０ＰおよびＡ５３Ｔ（Kruger et al.,1998）（Polymeropoulos et al.,1998）ならびにこの遺伝子の二重複（Chartier-Harlin et al.,2004）は、家族性ＰＤを引き起こすことが記載されている一方、１種の他のα−シヌクレイン突然変異、Ｅ４６Ｋ（Zarranz et al.,2004）ならびにα−シヌクレイン遺伝子の三重複（Singleton et al.,2003）は、ＰＤまたはＤＬＢを引き起こすことが報告されている。
【００１１】
α−シヌクレイン突然変異（α-synuclein mutations）の病的結果は、部分的に理解されているにすぎない。しかしながら、インビトロデータはＡ３０ＰおよびＡ５３Ｔ突然変異が凝集の割合を増加させることを示した（Conway et al.,2000）。広範囲にわたる異なる構成のα−シヌクレイン種（モノマー、ダイマー、プロトフィブリルを含むオリゴマー）が凝集過程に関与し、この全てが異なる毒性を有し得る。どの分子種が脳内での毒性効果を与えるのかは明確ではない。しかしながら、近年の研究は、α−シヌクレインのオリゴマー形態が特に神経毒性であることを示唆している。オリゴマーの役割についての追加の証拠は、遺伝性パーキンソン病を引き起こすある種のα−シヌクレイン突然変異（Ａ３０ＰおよびＡ５３Ｔ）がオリゴマー化の割合増加を導くという観察により与えられている。
【００１２】
α−シヌクレイン凝集カスケード（α-synuclein aggregation cascade）がどのように開始するのか完全に公知であるわけではない。おそらく、モノマーα−シヌクレインのコンホメーションの変化が、ダイマーおよびトリマーの形成を開始させ、プロトフィブリルを含むより高級な可溶性オリゴマーを形成し続けてから、これらの中間的大きさの種がレビー小体内で不溶性フィブリルとして沈着される。α−シヌクレインオリゴマーは、これらが形成されると、α−シヌクレインの新たなモノマーおよび／またはより小さいマルチマーを結合させ、したがってフィブリル形成過程を加速し得ることも想定される。このような播種効果は、おそらく、細胞外空間においても起こり得る。それというのも、近年の証拠が、α−シヌクレイン病変が疾患脳内でニューロンからニューロンへ繁殖し得ることを示唆しているからである。
【００１３】
α−シヌクレイノパチー（α-synucleinopathies）の神経病理学的変化とは別に、α−シヌクレインタンパク質のレベルは、一般に患部の脳領域内で増加する（Klucken et al.,2006）。
【００１４】
α−シヌクレイノパチーにおける主要な病変は細胞内であり、このことは免疫治療アプローチに困難をもたらす。しかしながら、能動的に誘導され、または受動的に投与された抗体のフラクションは、これらの標的抗原をニューロン内でも結合させ得るという可能性が高い。さらに、血漿と脳脊髄液の両方におけるα−シヌクレインの同定（El-Agnaf et al.,2006）は、このタンパク質がもっぱらニューロン内で見出されるわけではないことを説明している。このような細胞外α−シヌクレインの低減は、細胞内タンパク質プールと細胞外タンパク質プールとの間の平衡をシフトさせ得、細胞内α−シヌクレインの減少ももたらす。証拠は、溶解状態のα−シヌクレインが細胞膜の脂質二重層を貫通し、このことにより内在化または細胞外部に輸送され得ることを示唆している。近年の知見は、α−シヌクレインが細胞外空間において毒性効果を付与することを実証し、こうしてα−シヌクレイン病変が疾患の進行につれて脳全体にいかに拡散するかについて妥当な説明を提供する。研究は、レビー病変が移植ＰＤ患者におけるグラフト化ニューロンに伝播されることを示した（Li et al.2008）。さらに、α−シヌクレインは、エンドサイトーシスを介して隣接するニューロンに伝播され、α−シヌクレイン凝集体の細胞間伝播はＰＤおよび他のα−シヌクレイノパチーにおけるニューロン性細胞死および病変進行に結びつけられている（Desplats et al.2009）。
【００１５】
ＰＤおよびＤＬＢの診断
α−シヌクレイン病変（α-synuclein pathology）を有する神経変性疾患についてのリスクを同定するための診断ツールおよび方法の改善が必要とされている。今日、脳に対してかなりの損傷が既に起こる前に疾患の早期における患者の臨床症状を臨床医が診断するのを支援し得る生物化学的方法は存在しない。
【００１６】
正確な診断アッセイの重要性は、新たな治療可能性が出現するのでよりいっそう大きくなる。今日現在、症候治療のみ（脳内の活性ドーパミンの損失を置換することによる）がＰＤ患者に利用可能である。ＤＬＢについては、利用可能な治療オプションはよりいっそう少ない。それにもかかわらず、臨床医は、ＡＤのための標準的治療、すなわちコリンエステラーゼ阻害剤を用いてＤＬＢ患者に対して考えられる有益な効果を評価していることが多い。いずれにしても、α−シヌクレイノパチーのための既存の治療方針は、根本的な疾患過程に対して向けられるものではない。さらに、疾患進行および治療効果のモニタリングも必要とされている。パーキンソン病の進行を変化させることを目的とされる異なるアプローチに関する報告については、George et al.2009を参照のこと。
【００１７】
いくつかの神経変性障害におけるα−シヌクレインの上記関与に関して、毒性α−シヌクレイン種の効果を排除し、または低減させ得る新規治療が必要とされており、さらに新たな治療介入をモニタリングし、良好な予後特異度を提供するための良好なバイオマーカーが必要とされている。
【発明の概要】
【００１８】
本発明は、ヒトα−シヌクレインプロトフィブリルについての高親和性およびα−シヌクレインモノマーの低結合性を有する改善された抗体およびその断片を対象とする。本発明はまた、このような抗体または断片を含む組成物およびこのような抗体または断片を使用してα−シヌクレインプロトフィブリルを検出する方法を対象とする。さらなる実施形態において、本発明は、このような抗体または断片を投与することによりα−シヌクレイン病変を有する神経変性障害を予防し、α−シヌクレイン病変を有する神経変性障害の発症を遅延させ、またはα−シヌクレイン病変を有する神経変性障害を治療する方法、およびα−シヌクレイン病変を有する神経変性障害の治療のための医薬組成物の製造におけるこのような抗体または断片の使用を対象とする。本発明はまた、α−シヌクレイン病変を有する神経変性障害の発現の診断またはモニタリングにおけるこのような抗体または断片の使用、およびこのような抗体または断片を投与することによりα−シヌクレイン凝集を低減させる、または阻害する方法を対象とする。
【００１９】
一実施形態において、抗体またはその断片は、ヒトα−シヌクレインプロトフィブリルについての高親和性およびα−シヌクレインモノマーの低結合性を有し、３種の可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ配列（ＶＨ−ＣＤＲ−１、ＶＨ−ＣＤＲ−２、およびＶＨ−ＣＤＲ−３）および３種の可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ配列（ＶＬ−ＣＤＲ−１、ＶＬ−ＣＤＲ−２、およびＶＬ−ＣＤＲ−３）を有し、該抗体またはその断片の６種のＣＤＲ配列は、以下の各群から選択される：
ＶＨ−ＣＤＲ−１  配列番号：２２、２３、２４、２５、２６または２７
ＶＨ−ＣＤＲ−２  配列番号：２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４
ＶＨ−ＣＤＲ−３  配列番号：３５、３６、３７、３８、３９または４０
ＶＬ−ＣＤＲ−１  配列番号：４１、４２、４３、４４、４５または４６
ＶＬ−ＣＤＲ−２  配列番号：４７、４８または４９
ＶＬ−ＣＤＲ−３  配列番号：５０、５１、５２、５３、５４または５５。
【００２０】
別の実施形態において、抗体またはその断片は、ヒトα−シヌクレインプロトフィブリルについての高親和性およびα−シヌクレインモノマーの低結合性を有し、３種の可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ配列（ＶＨ−ＣＤＲ−１、ＶＨ−ＣＤＲ−２、およびＶＨ−ＣＤＲ−３）および３種の可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ配列（ＶＬ−ＣＤＲ−１、ＶＬ−ＣＤＲ−２、およびＶＬ−ＣＤＲ−３）を有し、該抗体またはその断片の６種のＣＤＲ配列は、以下の各群、および該各群の配列のいずれかと７０、８０、９０、９５または９８％超の類似性を有する配列から選択され：
ＶＨ−ＣＤＲ−１  配列番号：２２、２３、２４、２５、２６または２７
ＶＨ−ＣＤＲ−２  配列番号：２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４
ＶＨ−ＣＤＲ−３  配列番号：３５、３６、３７、３８、３９または４０
ＶＬ−ＣＤＲ−１  配列番号：４１、４２、４３、４４、４５または４６
ＶＬ−ＣＤＲ−２  配列番号：４７、４８または４９
ＶＬ−ＣＤＲ−３  配列番号：５０、５１、５２、５３、５４または５５、
該抗体またはその断片は、１１アミノ酸オーバーラップを有する１５量体アルファ−シヌクレインペプチドを含むモデル系における固定化直鎖α−シヌクレインのアミノ酸領域１１３〜１４０、例えば１１３〜１３１内のエピトープ、特にエピトープ１２５〜１３１、１２１〜１２４、１２１〜１２７、１２１〜１３１、１１３〜１２３または１３６〜１４０に結合する。
【００２１】
本発明による抗体、断片、組成物および方法は、神経変性障害を有し、および／またはこのような障害の発現リスクのある個体におけるα−シヌクレイン病変を有する神経変性障害の診断、モニタリング、予防、発症遅延および／または治療の改善を提供する。
【００２２】
本発明の種々の実施形態の追加の態様、実施形態および利点は、詳細な説明を考慮してより明らかになる。
【００２３】
詳細な説明は、以下の図面を考慮してより十分に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、競合ＥＬＩＳＡにより決定されたプロトフィブリル特異的モノクローナル抗体の性能を示す。アッセイは、実施例４に記載のＨＮＥ−安定化α−シヌクレインプロトフィブリルを用いて実施した。
【００２５】
【図２Ａ】図２Ａは、実施例４に記載の競合ＥＬＩＳＡにより分析されたプロトフィブリル特異的抗体ｍＡｂ４９／Ｇの性能を示す。プロトフィブリル特異的モノクローナル抗体ｍＡｂ４９／ＧがＨＮＥまたはＯＮＥにより安定化されたヒトα−シヌクレインプロトフィブリルに高親和性で結合することを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、実施例４に記載の競合ＥＬＩＳＡにより分析されたプロトフィブリル特異的抗体ｍＡｂ４９／Ｇの性能を示す。このモノクローナル抗体がα−シヌクレインのヒト突然変異形態Ａ３０ＰおよびＡ５３ＴのＨＮＥ−安定化プロトフィブリルにも高親和性で結合することを示す。
【００２６】
【図３】図３Ａ〜３Ｃは、実施例４に記載の競合ＥＬＩＳＡにより分析されたプロトフィブリル特異的抗体の性能を示す。プロトフィブリル特異的モノクローナル抗体は、ＨＮＥ（ＰＦ−ＨＮＥ）またはＯＮＥ（ＰＦ−ＯＮＥ）により安定化された野性型ヒトα−シヌクレインプロトフィブリルに高親和性で結合する。このモノクローナル抗体は、α−シヌクレインのヒト突然変異形態Ａ３０Ｐ（Ａ３０Ｐ−ＨＮＥ）およびＡ５３Ｔ（Ａ３０Ｐ−ＨＮＥ）のＨＮＥ−安定化プロトフィブリルにも高親和性で結合する。
【００２７】
【図４Ａ】図４Ａは、実施例５に記載のサンドイッチＥＬＩＳＡによるα−シヌクレインプロトフィブリルの定量を対象とする。捕捉抗体と検出抗体の両方として使用されるプロトフィブリル特異的抗体ｍＡｂ４９／Ｇの概要を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、実施例５に記載のサンドイッチＥＬＩＳＡによるα−シヌクレインプロトフィブリルの定量を対象とする。図４Ｂは、ＨＮＥ−安定化α−シヌクレインプロトフィブリルを用いて作成した標準曲線を示す。アッセイ性能は、定量限界ＬＯＱ＝９ｐＭに達した。
【００２８】
【図５Ａ】図５Ａは、実施例６に記載のα−シヌクレインプロトフィブリル特異的サンドイッチＥＬＩＳＡを用いる疾患（ＤＬＢ）および対照ヒト脳抽出物の分析の結果を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、実施例６に記載のα−シヌクレインプロトフィブリル特異的サンドイッチＥＬＩＳＡを用いる疾患（ＤＬＢ）および対照ヒト脳抽出物の分析の結果を示す。
【００２９】
【図６】図６は、実施例７に記載の対照マウス（ｎｔｇ、非トランスジェニック）およびＫｈａｌｅトランスジェニック（ｔｇ）マウスＰＤモデルからの５ヵ月齢マウスの脳抽出物の分析を示す。脳組織は、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）およびＴｒｉｔｏｎの存在下でＴＢＳを用いて抽出した。分析は、実施例５に記載のα−シヌクレインプロトフィブリルサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて実施した。プロトフィブリル特異的抗体ｍＡｂ４９／Ｇを捕捉抗体と検出抗体の両方として使用した。グラフにおいて、ｙ軸はＯＤ４５０における吸光度を表す。
【００３０】
【図７Ａ】図７Ａは、実施例８に記載の組織の免疫組織化学（ＩＨＣ）分析を示す。ＰＤ黒質内のレビー小体および神経突起の３８Ｅ２／７結合性ならびに陽性α−α−シヌクレイン対照を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、実施例８に記載の組織の免疫組織化学（ＩＨＣ）分析を示す。ＤＬＢ皮質および黒質内のレビー小体および神経突起の３８Ｅ２／７結合ならびに陽性α−α−シヌクレイン対照を示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、実施例８に記載の組織の免疫組織化学（ＩＨＣ）分析を示す。ＤＬＢ皮質および黒質内のレビー小体および神経突起を結合させる種々の抗体ならびに陰性対照を示す。
【図７Ｄ】図７Ｄは、実施例８に記載の組織の免疫組織化学（ＩＨＣ）分析を示す。ＰＤ黒質内のレビー小体および神経突起を結合させる種々の抗体ならびに陰性対照を示す。
【図７Ｅ】図７Ｅは、実施例８に記載の組織の免疫組織化学（ＩＨＣ）分析を示す。非疾患関連黒質における３８Ｅ２／７非結合および陽性α−α−シヌクレイン対照を示す。
【図７Ｆ】図７Ｆは、実施例８に記載の組織の免疫組織化学（ＩＨＣ）分析を示す。アルツハイマー病患者の皮質における３８Ｅ２／７結合性および陽性α−Ａβ対照の比較を示す。
【００３１】
【図８Ａ】図８Ａは、実施例９に記載の脳抽出プロトコルを使用する、プロトフィブリル選択的モノクローナル抗体３８Ｅ２／７を用いるヒト脳抽出物の免疫沈降を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、実施例９に記載の脳抽出プロトコルを使用する、プロトフィブリル選択的モノクローナル抗体３８Ｅ２／７を用いるヒト脳抽出物の免疫沈降を示す。
【００３２】
【図９Ａ】図９Ａは、実施例１０に記載のＦＩＴＣ落射蛍光フィルタを備えるＡｘｉｏｖｅｒｔ２００顕微鏡を使用して計測された蛍光データを示す。処理細胞を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、実施例１０に記載のＦＩＴＣ落射蛍光フィルタを備えるＡｘｉｏｖｅｒｔ２００顕微鏡を使用して計測された蛍光データを示す。１００％に設定する抗体未処理アルファ−シヌクレイン過剰発現細胞と比較した蛍光強度の相対減少％として計算されたデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
種々の図面は、以下に説明する実施例を考慮してより十分に理解される。
【００３４】
第１の実施形態において、本発明は、ヒトα−シヌクレインプロトフィブリルについての高親和性およびα−シヌクレインモノマーの低結合性を有する改善された抗体およびその断片を対象とする。具体的な実施形態において、抗体は、ＩｇＧクラスまたはこの突然変異の抗体である。本開示の範囲内では、ヒトα−シヌクレインプロトフィブリルについての高親和性は、抗体または断片がヒトα−シヌクレインプロトフィブリルについて１０−７Ｍ未満の解離定数Ｋｄを示すことを意味する。当分野において公知のとおり、プロトフィブリルは、α−シヌクレインの可溶性オリゴマーである。典型的なプロトフィブリルは、参照として使用される球状タンパク質を用いるサイズ排除クロマトグラフィーを使用して適切に計測される約１０００から約５０００ｋＤａの範囲内の分子量を有するが、本発明はこのような典型的なプロトフィブリルに限定されるものではない。さらに、本開示の範囲内では、α−シヌクレインモノマーの低結合性は、α−シヌクレインモノマーへの本発明による抗体または断片の結合性がα−シヌクレインプロトフィブリルへの結合性よりも少なくとも１００倍少ないことを意味する。具体的な実施形態において、これらの結合親和性は、例えば実施例４に記載の競合ＥＬＩＳＡに従って計測される。
【００３５】
本発明はさらに、限定されるものではないが、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、アルツハイマー病のレビー小体バリアント、多系統萎縮症、精神病、統合失調症、およびクロイツフェルト・ヤコブ病を含むα−シヌクレイン病変を有する神経変性障害の予防、発症遅延、治療、モニタリングおよび／または診断の改善のための方法ならびにこのような抗体および断片の使用に関する。α−シヌクレイノパチーにおいて、レビー小体およびレビー神経突起として凝集したα−シヌクレインは脳内に蓄積し、一部の兆候においては他の器官内にも蓄積する。
【００３６】
本発明による抗体の例は、古典的なハイブリドーマ技術により開発した。抗体は、ポリクローナルでもモノクローナルでもよい。具体的な実施形態において、抗体はモノクローナルである。本開示は、多くの例において抗体およびその断片を指す一方、便宜上の目的のため、本開示における用語「抗体」は、この活性断片、すなわち本発明による抗体の定義に使用される同一の特徴、すなわちα−シヌクレインオリゴマー／プロトフィブリルについての高親和性およびα−シヌクレインモノマーの低結合性を有する断片を意味するその断片を含む。抗体およびその断片は、病原型のα−シヌクレインのクリアランスの高い効率を示す。
【００３７】
本発明の抗体は、非修飾またはコンジュゲート化された、例えば４−ヒドロキシ−２−ノネナール（ＨＮＥ）もしくは４−オキソ−２−ノネナール（ＯＮＥ）、または病原性プロトフィブリル／オリゴマーα−シヌクレインエピトープを安定化させる他のα，β−不飽和ヒドロキシアルケナール、またはポリ不飽和脂肪酸にコンジュゲート化されたα−シヌクレインを含む凝集型、特にプロトフィブリルを結合させる。前記１種以上のエピトープは、α−シヌクレイノパチー、例えば、限定されるものではないが、パーキンソン病、ＤＬＢなどの患者からのヒト脳内に存在するコンホメーション変化または修飾されたα−シヌクレイン、すなわち、α−シヌクレインプロトフィブリルおよびオリゴマー上に存在する。本発明の抗体は、家族性ＰＤを引き起こすと記載されているα−シヌクレイン突然変異体、例えばＡ３０ＰおよびＡ３５Ｔ（Kruger et al.,1998）（Polymeropoulos et al.,1997）により形成された病原性プロトフィブリル／オリゴマー構造も結合させる。本発明の抗体についてのこのような標的の別の例は、ＰＤまたはＤＬＢを引き起こす突然変異体α−シヌクレインＥ４６Ｋにより形成されたプロトフィブリルである。
【００３８】
本発明の１つの具体的な実施形態において、限定されるものではないが、例えばパーキンソン病、レビー小体型認知症、アルツハイマー病のレビー小体バリアント、アルツハイマー病、ダウン症候群、多系統萎縮症、精神病、統合失調症、クロイツフェルト・ヤコブ病および他の神経変性障害を含むα−シヌクレイノパチー関連障害の区別、診断、発現リスク同定、および／または治療のためのモノクローナル抗体が提供される。
【００３９】
本発明の抗体および断片は、「ＰＤおよびまたはＤＬＢ疾患エピトープ」を含有する可溶性α−シヌクレインプロトフィブリルについての高親和性を有する抗体からの可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）上のＣＤＲ１〜３領域の定義されたアミノ酸配列を含む。具体的な実施形態において、ＣＤＲ領域は、Ｆｃ領域の修飾部と組み合わせてエフェクター機能、例えば、限定されるものではないが、Ｆｃ受容体結合、補体因子Ｃ１ｑ結合、実効半減期、補体活性化および炎症過程をモジュレートする。抗体の定常領域は、特にＦｃ受容体および補体因子Ｃ１ｑを結合させる多くの重要な機能を有する。このＣ１ｑ結合機能を不活性化させて炎症反応を回避することができる。
【００４０】
α−シヌクレインプロトフィブリルについての高親和性およびα−シヌクレインモノマーへの低結合性を有する本発明の抗体および断片は、他の公知の免疫療法治療モダリティと比較すると以下の区別される利点を有する。
１）本発明の抗体および断片は、疾患を引き起こすα−シヌクレインプロトフィブリルを、例えばオリゴマー化を阻害することにより（実施例１０を参照のこと）、または他の機序により標的とし、不活性化または少なくとも低減させる。
２）本発明の抗体および断片により示されるα−シヌクレインプロトフィブリルについての高親和性は、有効な治療に必要とされる臨床用量を低減させる。
３）本発明の抗体および断片は、活性免疫化方針、例えばワクチンと比較して高齢患者における正確な投与のためのモダリティを提供する。
４）末梢／全身におけるα−シヌクレインモノマーへの低結合性により、こうしてより多くの抗体／断片が脳内のα−シヌクレインオリゴマー形態の結合および排除に利用可能となる。
５）抗体および断片は、補体因子Ｃ１ｑへの低結合性または非結合性により炎症副作用、例えば髄膜脳炎のリスクを低減させる。
【００４１】
本発明の一態様は、ヒト野性型および突然変異体α−シヌクレインプロトフィブリルの結合について重要な役割を担うＣＤＲ領域の抗体アミノ酸配列の発見である。本発明による結合部位（ＣＤＲ領域）を有する抗体は、野性型ヒトα−シヌクレインオリゴマー／プロトフィブリルについての高親和性を特徴とし、治療または診断薬として使用される。
【００４２】
免疫グロブリン（ＩｇＧ）分子の基本構造は、ジスルフィド架橋により一緒に結合している２本の同一の軽鎖および２本の同一の重鎖を含む。軽鎖は、ラムダまたはカッパであるが、それぞれ約１１０アミノ酸残基の可変領域（ＶＬ）および定常領域（ＣＬ）を有する。重鎖は、約１１０アミノ酸残基の可変領域（ＶＨ）を有するが、ＣＨγ１、ＣＨγ２およびＣＨγ３領域またはドメインを含む３００〜４００アミノ酸残基のかなり大きい定常領域（ＣＨ）を有する。
【００４３】
定常領域（Ｆｃ）は、補体系を活性化させ、感染微生物または外来／非自己抗原を捕食し、破壊するマクロファージ、小膠細胞および好中球上のＦｃ受容体に結合する。この機能は重要である。それというのも、この機能は、抗体の治療原理、すなわち、Ｆｃ受容体介在性小膠細胞食作用およびα−シヌクレインプロトフィブリルのクリアランスの一部であるからである。リソソーム分解経路を介するα−シヌクレインオリゴマー中間体のクリアランスが実証されている（Lee et al.,2004）。この過程は、抗体／プロトフィブリル複合体の受容体依存性または受容体非依存性エンドサイトーシスに続く、α−シヌクレインプロトフィブリルが分解されるリソソームとの融合を含む（Masliah et al.,2005）。この過程を制御することが示唆されている受容体としては、Ｔｈｙ１．１受容体およびリポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＰＲ）が挙げられる。
【００４４】
他の抗α−シヌクレインクリアランス機序もまた作動する可能性が高い。可溶性α−シヌクレインプロトフィブリルのクリアランスは、本発明による治療の中心的機序である。α−シヌクレインプロトフィブリルは、高度に神経毒性であり、疾患過程を開始させ、進行させるものとみなされる。脳内のα−シヌクレインプロトフィブリルのクリアランスは、臨床的にかなり価値がある。α−シヌクレインプロトフィブリルのクリアランスに加え、α−シヌクレインフィブリルを含む他のα−シヌクレイン凝集形態は、α−シヌクレインフィブリルに対する前駆形態、例えばα−シヌクレインプロトフィブリル、ダイマー、トリマー、テトラマーおよびより高級なオリゴマー形態の除去を介して間接的に低減される。プロトフィブリルおよびフィブリルを含む異なるα−シヌクレイン形態は、平衡状態にある。高親和性プロトフィブリル結合抗体を用いる処理および前記抗体によるα−シヌクレインプロトフィブリルのクリアランスは、他の凝集α−シヌクレインまたはオリゴマー形態を間接的に低減させるという利点も有する。抗体の作用のさらに別の機序は、毒性α−シヌクレイン種に結合することによりα−シヌクレイン毒性を遮断または阻害し、ニューロンとのこれらの相互作用を妨げることである。
【００４５】
重鎖および軽鎖の各可変領域は、相補性決定領域またはＣＤＲと呼ばれる３種の超可変領域を含有する。ＣＤＲ領域は、ＶＬおよびＶＨ領域内に局在している約７〜２３、例えば１３〜２３アミノ酸の短い伸長部である。抗体の１本の「アーム」上の６種のＣＤＲ領域は、抗原を結合させる「ポケット」を形成する。ＣＤＲ配列のいくつかの定義が文献において使用される。配列番号１〜２１は、第１の同定系を使用して本発明のＣＤＲ配列を定義し、こうして同定されたＣＤＲ配列を表１（実施例２を参照のこと）のヒト野性型および突然変異体α−シヌクレインプロトフィブリルに特異的なモノクローナル抗体中のＶＬおよびＶＨ中に下線領域により示す。配列番号２２〜５５は、公知のＫａｂａｔ系を使用して本発明のＣＤＲ配列を同定し、こうして同定されたＫａｂａｔＣＤＲ配列を表２（実施例２を参照のこと）のヒト野性型および突然変異体α−シヌクレインプロトフィブリルに特異的な抗体中のＶＬおよびＶＨ中に下線領域により示す。Ｋａｂａｔによる本発明のＣＤＲ配列の同定（配列番号２２〜５５）を本開示において使用する。
【００４６】
したがって、一実施形態において、本発明による抗体は、ＣＤＲ配列の以下の各群のそれぞれから任意の組合せで選択される６種のＣＤＲ配列（ＶＨ−ＣＤＲ−１、ＶＨ−ＣＤＲ−２、ＶＨ−ＣＤＲ−３、ＶＬ−ＣＤＲ−１、ＶＬ−ＣＤＲ−２、およびＶＬ−ＣＤＲ−３）を有することを特徴とする。
【００４７】
ＶＨ  ＣＤＲ−１
ＧＦＴＦＮＴＹＡＭ  配列番号：１        ＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮ  配列番号：２２
ＧＦＴＦＳＮＹＡＭ  配列番号：２        ＧＦＴＦＳＮＹＡＭＳ  配列番号：２３
ＧＦＴＦＳＳＹＡＭ  配列番号：３        ＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳ  配列番号：２４
ＧＤＳＦＴＳＧＹＷ  配列番号：４        ＧＤＳＦＴＳＧＹＷＮ  配列番号：２５
ＧＦＳＬＴＳＹＧＶＨ  配列番号：２６
ＧＦＴＦＴＤＹＹＭＳ  配列番号：２７
【００４８】
ＶＨ  ＣＤＲ−２
ＲＩＲＴＫＳＮＤＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧ        配列番号：５
ＲＩＲＴＫＳＮＤＹＡＴＹＹＡＤＳＶ            配列番号：２８
ＴＶＴＳＧＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＲＧ            配列番号：６
ＴＶＴＳＧＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶ                配列番号：２９
ＴＩＳＮＧＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧ            配列番号：７
ＴＩＳＮＧＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶ                配列番号：３０
ＹＩＲＹＳＧＮＴＹＹＮＰＳＬＫＳ              配列番号：８
ＹＩＲＹＳＧＮＴＹＹＮＰＳＬ                  配列番号：３１
ＶＩＷＲＧＧＳＴＤＹＳＡＡＦ                  配列番号：３２
ＴＩＳＴＧＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶ                配列番号：３３
ＦＩＲＮＫＡＮＧＹＴＴＥＹＳＡＳＶ            配列番号：３４
【００４９】
ＶＨ  ＣＤＲ−３
ＶＧＹＲＰＹＡＭＤＹ                          配列番号：９（配列番号：３５）
ＱＮＦＧＳＲＧＷＹＦＤＶ                      配列番号：１０（配列番号：３６）
ＨＳＤＹＳＧＡＷＦＡＹ                        配列番号：１１（配列番号：３７）
ＳＹＹＤＹＤＲＡＷＦＡＹ                      配列番号：１２（配列番号：３８）
ＬＬＲＳＶＧＧＦＡＤ                          配列番号：３９
ＤＹＧＮＹＡＭＤＹ                            配列番号：４０
【００５０】
ＶＬ  ＣＤＲ−１
ＲＳＳＱＮＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ              配列番号：１３（配列番号：４１）
ＲＳＳＱＳＩＶＮＳＮＧＮＴＹＬＥ              配列番号：１４（配列番号：４２）
ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹ                          配列番号：１５（配列番号：４３）
ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ              配列番号：１６（配列番号：４４）
ＲＳＳＱＴＩＶＨＮＮＧＮＴＹＬＥ              配列番号：４５
ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡ            配列番号：４６
【００５１】
ＶＬ  ＣＤＲ−２
ＫＶＳＮＲＦＳ                                配列番号：１７（配列番号：４７）
ＲＴＳＮＬＡＳ                                配列番号：１８（配列番号：４８）
ＷＡＳＴＲＥＳ                                配列番号：４９
【００５２】
ＶＬ  ＣＤＲ−３
ＦＱＧＳＨＶＰＬＴ                            配列番号：１９（配列番号：５０）
ＱＱＹＨＳＹＰＹＴ                            配列番号：２０（配列番号：５１）
ＳＱＳＴＨＶＰＷＴ                            配列番号：２１（配列番号：５２）
ＦＱＧＳＨＶＰＦＴ                            配列番号：５３
ＱＱＦＨＳＹＰＹＴ                            配列番号：５４
ＱＱＹＹＳＹＰＹＴ                            配列番号：５５
【００５３】
ある興味深い特徴について最初に選択された抗体の１種は、排斥した。それというのも、この抗体は本発明による抗体を定義する基準を満たさなかったからである。この排斥についての重要なパラメータは、この抗体により曝露された５アミノ酸を有する比較的短いＶＨ  ＣＤＲ−３配列であった。したがって、ＶＨ  ＣＤＲ−３配列は５超のアミノ酸である必要があると結論付けられる。具体的な実施形態において、ＶＨ  ＣＤＲ−３配列は９、１０、１１または１２アミノ酸である。
【００５４】
具体的な実施形態において、本発明による抗体および断片は、以下の組合せから選択される６種のＣＤＲ配列を有する。
配列番号：２２、２８、３５、４１、４７及び５０、
配列番号：２３、２９、３６、４２、４７及び５０、
配列番号：２４、３０、３７、４３、４８及び５１、
配列番号：２５、３１、３８、４４、４７及び５２、
配列番号：２６、３２、３９、４５、４７及び５３、
配列番号：２３、３３、３７、４３、４８及び５４、並びに
配列番号：２７、３４、４０、４６、４９及び５５。
【００５５】
追加の具体的な実施形態において、α−シヌクレインプロトフィブリルについての所望の特異性を提供する一方、本明細書に定義の他の重要な特徴を満たす抗体は、以下の各群から選択される抗体または断片の６種のＣＤＲ配列：
ＶＨ  ＣＤＲ−１    配列番号：２３、２４、２５または２６
ＶＨ  ＣＤＲ−２    配列番号：２９、３０、３１または３２
ＶＨ  ＣＤＲ−３    配列番号：３６
ＶＬ  ＣＤＲ−１    配列番号：４２、４３、４４または４５
ＶＬ  ＣＤＲ−２    配列番号：４７または４８
ＶＬ  ＣＤＲ−３    配列番号：５０、５１、５２または５３、
または以下の各群から選択される抗体または断片の６種のＣＤＲ配列：
ＶＨ  ＣＤＲ−１    配列番号：２３、２４、２５または２６
ＶＨ  ＣＤＲ−２    配列番号：２９、３０、３１または３２
ＶＨ  ＣＤＲ−３    配列番号：３７
ＶＬ  ＣＤＲ−１    配列番号：４２、４３、４４または４５
ＶＬ  ＣＤＲ−２    配列番号：４７または４８
ＶＬ  ＣＤＲ−３    配列番号：５０、５１、５２または５３、
または以下の各群から選択される抗体または断片の６種のＣＤＲ配列：
ＶＨ  ＣＤＲ−１    配列番号：２３、２４、２５または２６
ＶＨ  ＣＤＲ−２    配列番号：２９、３０、３１または３２
ＶＨ  ＣＤＲ−３    配列番号：３８
ＶＬ  ＣＤＲ−１    配列番号：４２、４３、４４または４５
ＶＬ  ＣＤＲ−２    配列番号：４７または４８
ＶＬ  ＣＤＲ−３    配列番号：５０、５１、５２または５３、
または以下の各群から選択される抗体または断片の６種のＣＤＲ配列を有する：
ＶＨ  ＣＤＲ−１    配列番号：２３、２４、２５または２６
ＶＨ  ＣＤＲ−２    配列番号：２９、３０、３１または３２
ＶＨ  ＣＤＲ−３    配列番号：３９
ＶＬ  ＣＤＲ−１    配列番号：４２、４３、４４または４５
ＶＬ  ＣＤＲ−２    配列番号：４７または４８
ＶＬ  ＣＤＲ−３    配列番号：５０、５１、５２または５３。
【００５６】
上記のとおり、本発明によるα−シヌクレインプロトフィブリル結合抗体および断片は、標的についての高親和性を特徴とする。解離定数Ｋｄとして表現される高親和性は、１０−７Ｍ未満である。追加の実施形態において、ヒトα−シヌクレインプロトフィブリルについての解離定数Ｋｄは、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、またはさらには１０−１１Ｍ未満である。これらの抗体および断片は、これらを約１０−６Ｍ以上の親和性を有する抗体と比較して低い用量において投与することができるという利点を有する。このことは、顕著な臨床的利点を有する。それというのも、これらの高親和性抗体は、注射により投与することができ、皮下的に与えることができる。それというのも、低い量のみの抗体が効力を達成するのに必要とされるからである。投与モダリティは、皮下または静脈内注射に限定されるものではない。さらに、効力に必要とされるより低い用量は、抗体の生成のための物品のコストを低減させる。
【００５７】
α−シヌクレインプロトフィブリルについての抗体の高親和性に加え、抗体および断片は、α−シヌクレインモノマーへの低結合性および場合によりα−シヌクレインフィブリルへの低結合性を示す。上記のとおり、α−シヌクレインモノマーへの低結合性は、α−シヌクレインモノマーへの本発明による抗体または断片の結合性がα−シヌクレインプロトフィブリルへの結合性よりも少なくとも１００倍小さいことを意味する。より具体的な実施形態において、α−シヌクレインプロトフィブリルへの本発明による抗体または断片の結合性は、α−シヌクレインモノマーへの結合性よりも５００倍超またはさらには１０００倍超大きい。
【００５８】
別の実施形態において、抗体および断片は、α−シヌクレインフィブリルへの低結合性を示す。より具体的な実施形態において、α−シヌクレインプロトフィブリルへの本発明による抗体または断片の結合性は、α−シヌクレインフィブリルへの結合性よりも１００倍超、５００倍超、またはさらには１０００倍超大きい。
【００５９】
本発明のさらに別の実施形態において、抗体および断片は、ベータアミロイド（Ａβ）プロトフィブリル（例えば、Ｋｄ＞１０−５Ｍ）およびベータアミロイドモノマー（例えば、Ｋｄ＞１０−５Ｍ）への低結合性を示す。
【００６０】
本発明のさらに別の実施形態において、抗体および断片は、β−シヌクレインモノマー、γ−シヌクレインモノマー、ＩＡＰＰ（膵島アミロイドポリペプチド）、および／またはメディン（Ｍｅｄｉｎ）ポリペプチドへの低結合性を示し、例えば、これらのペプチド／タンパク質の１種以上への抗体および断片の結合性は、ヒトα−シヌクレインプロトフィブリルへの結合性よりも少なくとも１００倍小さい。
【００６１】
本発明の別の実施形態によれば、本発明による抗体または断片は、モデル系におけるアミノ酸（ａａ）領域１１３〜１４０、例えばａａ領域１１３〜１３１の範囲内の、具体的なエピトープの例としてａａ１２５〜１３１、１２１〜１２４、１２１〜１２７、１２１〜１３１、１１３〜１２３および１３６〜１４０を有するα−シヌクレイン中の直鎖エピトープへの結合性により定義することができる。このモデル系においては、１１アミノ酸配列オーバーラップを有する１５量体α−シヌクレインペプチドが使用される（以下の実施例３を参照のこと）。
【００６２】
本発明の追加の実施形態によれば、ヒトα−シヌクレインプロトフィブリルについての高親和性およびα−シヌクレインモノマーの低結合性を有し、配列番号２２〜２７、２８〜３４、３５〜４０、４１〜４６、４７〜４９および５０〜５２の６種のＣＤＲ配列群のそれぞれならびにそれぞれの各群の前記配列のいずれかと７０、８０、９０、９５または９８％超の類似性を有する配列から選択される１種のＣＤＲ配列の組合せを含む抗体または断片が提供される。抗体または断片は、１１アミノ酸オーバーラップを含む１５量体α−シヌクレインペプチドを含むモデル系において固定化された直鎖α−シヌクレインのアミノ酸（ａａ）領域１１３〜１４０、例えばａａ領域１１３〜１３１の範囲内のエピトープ、特にエピトープａａ１２５〜１３１、１２１〜１２４、１２１〜１２７、１２１〜１３１、１１３〜１２３または１３６〜１４０に結合する。
【００６３】
本発明の別の具体的な実施形態によれば、高親和性α−シヌクレインプロトフィブリル結合抗体は、α−シヌクレイン凝集を低減させ、または阻害し、これにより脳内の可溶性オリゴマーα−シヌクレイン形態のレベルを低減させることができる。
【００６４】
本発明の別の具体的な実施形態によれば、高親和性α−シヌクレインプロトフィブリル結合抗体は、ＣＮＳ外側のα−シヌクレインオリゴマー／プロトフィブリルも結合させ、これにより前記α−シヌクレイン形態のＣＮＳレベルを低下させるように血液脳関門にわたる前記α−シヌクレイン形態の平衡をシフトさせることができる（ドレナージ）。
【００６５】
本発明の別の具体的な実施形態によれば、抗体は、血液脳関門を通過することができる治療的使用に好適なＩｇＧクラスの抗体である。高親和性α−シヌクレインプロトフィブリル結合ＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ１のＣＨ２ドメインに結合する補体因子Ｃ１ｑを低減させ、補体活性化および炎症のリスクを低減させるようにエンジニアリングすることができる。この修飾は、いくつかの異なる手法において行うことができる。１つの手法は、ＩｇＧ１定常領域のＣＨγ２ドメインが欠失しており、Ｃ１ｑ結合性を付与するＩｇＧ４からの対応するドメインまたはこのドメインの一部に交換されたキメラ抗体を作製することである。ＩｇＧ４がＣ１ｑを結合させず、したがって補体カスケードを活性化しないことは十分証明されている。これを達成するため、重鎖の定常領域（ＣＨ）は、ＩｇＧ１上の高親和性Ｆｃ受容体ドメイン（ＣＨγ３）を、補体因子Ｃ１ｑについての結合性を有しないＩｇＧ４ドメイン（ＣＨγ２）と組み合わせるようにエンジニアリングされる。キメラ定常重鎖を含有するこの新たな抗体（ＩｇＧ１：ＣＨγ１、ＣＨγ２：ＩｇＧ４、ＣＨγ３：ＩｇＧ１）は、Ｆｃ受容体介在性食作用を介するα−シヌクレインプロトフィブリルの効率的なクリアランスと副作用、すなわち炎症、例えば髄膜脳炎のリスク低減の両方の重要な特性を有する。
【００６６】
炎症のリスクを低減させるさらに別の手法は、補体因子Ｃ１ｑ結合性および補体活性化を低減させる抗体のオリゴ糖構造を変化させることである。ヒトＩｇＧ１のＡｓｎ−２９７における複合二分岐オリゴ糖の３０種の異なる構造が記載されている。ＣＨ２会合炭水化物の不存在は、抗体の「ヒンジ」領域のコンホメーション変化を引き起こし、エフェクター分子との相互作用効力ならびに補体活性化機能およびＣ１ｑ結合性の損失を低減させると考えられている。
【００６７】
任意の他のアミノ酸へのＡｓｎ−２９７の部位特異的突然変異誘発による高親和性ヒトα−シヌクレインプロトフィブリル結合抗体の修飾は、Ｆｃ受容体結合性を保持しつつＣ１ｑ結合性の低く、したがって特に血液脳関門における炎症リスクが低減する抗体を生成する。抗体上でグリコシル化を修飾する代替例は、酵素Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩが不活化された細胞型内で抗体を発現させることである。このことは、Ａｓｎ−２９７の炭水化物構造が変化した抗体を生じさせる。限定されるものではないが、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の構造が形成される。この炭水化物修飾は、補体因子Ｃ１ｑ結合性を低減させ、炎症を阻害するものである（Wright et al.1998）。あるいは、非グリコシル化プロトフィブリル結合抗体は、グリコシル化を阻害するツニカマイシンの存在下で抗体を発現する細胞を培養することにより達成することができる。これらの抗体は、変化した補体活性化活性および変化したＦｃ受容体機能を有する（Leatherbarrow et al.1985）。低い補体活性化および高いＦｃ受容体結合性を有する抗体を発現するクローンのスクリーニングは、α−シヌクレインプロトフィブリルの高いＦｃ介在性クリアランスおよび低いＣ１ｑ結合性を示すプロトフィブリル結合抗体を生成する。
【００６８】
別の実施形態において、高親和性ヒトα−シヌクレインプロトフィブリル結合抗体は、補体因子Ｃ１ｑの結合を低減させ、または阻害するように補体因子Ｃ１ｑ結合部位が修飾された、すなわちＰｒｏ３３１＞Ｓｅｒ３３１（Xu et al.1994）のＩｇＧサブクラスの抗体、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４である。このような抗体は、α−シヌクレイン病変を有する神経変性障害の個体またはこのような障害の発現リスクのある個体、例えば、限定されるものではないが、ＰＤを罹患する個体または発現リスクのある個体における投与、すなわち、α−シヌクレイン病変を有する神経変性障害の治療、予防または発症遅延に特に好適である。ヒトＩｇＧ１の３３１位におけるプロリン残基は、トレオニンまたはグリシンまたは任意の他の極性アミノ酸に変更することもできる。この修飾は、標準的な分子生物学技術、例えば部位特異的突然変異誘発またはＤＮＡ欠失により達成することができる。
【００６９】
本発明のさらに別の態様は、ヒトまたは動物組織、例えば脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液、尿、唾液、または脳組織中のプロトフィブリルレベルを特異的に測定するための、α−シヌクレイン病変を有する神経変性障害のための診断ツールまたはバイオマーカーとしての、または該神経変性障害をモニタリングするための高親和性ヒトα−シヌクレインプロトフィブリル結合抗体の使用である。パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、アルツハイマー病のレビー小体バリアント、多系統萎縮症、精神病、統合失調症、およびクロイツフェルト・ヤコブ病は、α−シヌクレイン病変を有するこのような神経変性障害の例示にすぎない。例えば、ＰＤ患者のＣＳＦまたは血液中のヒトα−シヌクレインプロトフィブリルのレベルは、パーキンソン病または任意の他のα−シヌクレイノパチーを罹患していない対応高齢者対照群と比較して異なる可能性が高い。パーキンソン病または任意の他のα−シヌクレイノパチーを発現している者は、対照対象と比較してＣＳＦまたは血液中のα−シヌクレインプロトフィブリルレベルの変化したレベルを有する可能性が高い。したがって、ＣＳＦまたは血液中のα−シヌクレインプロトフィブリルレベルの測定は、疾患の早期診断を提供することができる。このことは、本発明による新たな高親和性α−シヌクレインプロトフィブリル結合抗体を用いて達成することが可能であり、具体的な実施形態においては、α−シヌクレインプロトフィブリルが９ｐＭレベルに至るまで測定されたサンドイッチＥＬＩＳＡ法（実施例５を参照のこと）との組合せにおいて達成することができる。アッセイにおける他のα−シヌクレイン形態、特にα−シヌクレインモノマー、および場合によりα−シヌクレインフィブリルおよびα−シヌクレイン断片の干渉は無視可能である。
【００７０】
抗α−シヌクレインプロトフィブリル抗体を使用してこれらの組織中および細胞培養物中のα−シヌクレインプロトフィブリルをアッセイする好適な方法の例は、免疫アッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウエスタンブロッティングまたはドットブロッティングを含む。これらの方法は、臨床試験および／または診断試験におけるプロトフィブリル低減により計測される治療効力を追跡するために好適である。α−シヌクレインプロトフィブリルレベルはＣＳＦおよび血液中で極めて低いので、本発明の高親和性α−シヌクレインプロトフィブリル結合抗体は、例えば低レベルのα−シヌクレインプロトフィブリルの計測を可能とするＥＬＩＳＡ法に基づく診断試験に有利である。
【００７１】
このような方法によれば、本発明による抗体または断片を、α−シヌクレインプロトフィブリルを含み、または含む疑いのある生物試料に添加し、α−シヌクレインプロトフィブリルと抗体または断片との間で形成された複合体の存在を検出する。複合体は、定性的に検出することができ、すなわち、複合体の存在が検出され、または定量的に検出することができ、すなわち、複合体の濃度または複合体の閾値濃度を所望により検出することができる。
【００７２】
追加の実施形態において、本発明は、ヒトおよび動物組織中でのα−シヌクレインプロトフィブリルの検出、局在化および定量のためのイメージングにおける高親和性プロトフィブリル特異的抗体および断片の使用を含む。抗体または断片は、検出可能な標識、例えば放射性リガンド、例えばＩ１３１、Ｃ１４、Ｈ３またはガリウム６８（これらの放射性同位体に限定されるものではない）を用いて標識することができ、試料と接触させ、または検出目的のために投与することができる。このような方法は、限定されるものではないが、パーキンソン病、レビー小体型認知症および他のα−シヌクレイン関連神経変性障害を含むα−シヌクレイン病変を有する神経変性障害のための診断ツールとして好適である。具体的な実施形態において、このような方法は、投薬または他の考えられる治療を受けていない、または受けている対象におけるα−シヌクレイン関連疾患の発現をモニタリングするために実施することができる。
【００７３】
したがって、本発明の一態様において、抗体は、α−シヌクレインプロトフィブリルを含み、または含む疑いのある生物試料に添加し、前記プロトフィブリルと前記抗体との間で形成された複合体の濃度を試料中のプロトフィブリルの検出および／または定量のために計測する。具体的な実施形態において、検出法は、免疫アッセイおよび近接ライゲーションアッセイを含む。生物試料は、対象から採取されたインビトロ試料およびインビボ液体容量であり得る。
【００７４】
本発明のさらに別の態様は、獣医薬において使用される特異的な抗体種を作製することである。概説される診断法は、獣医学的使用にも好適である。
【００７５】
本発明の別の態様は、副作用を回避するため、すなわち、前記抗体を治療剤または診断剤として使用した場合にヒトにおける抗体に対する免疫応答を回避するための前記抗体のヒト化である。このようなヒト化技術は、当業者の能力の範囲内である。
【００７６】
本発明による医薬組成物は、本明細書に記載の抗体または断片、および医薬的に許容される担体を含む。治療的使用のための具体的な実施形態において、組成物は、治療活性量の本発明による抗体または断片を、ヒトおよび／または動物への投与に好適な生理緩衝液、例えば、限定されるものではないが、ＰＢＳ中に含む生理学的に許容される配合物である。抗体または断片は、より良好な安定性のために凍結乾燥させることができる。凍結乾燥配合物は、凍結乾燥および／または後続の貯蔵の間および／またはこの後に生成物を保護および／または安定化するための安定剤、リオプロテクタント、緩衝液など、例えば、限定されるものではないが、マンニトールを含む任意の好適な慣用の賦形剤を含有することができる。
【００７７】
場合により、抗体配合物は、プロトフィブリル結合抗体または断片の機能または効力を干渉しない抗菌剤または他の保存剤または添加剤を含有することができる。
【実施例】
【００７８】
以下の実施例は説明のために提供し、これらの具体的な実施例に本発明を限定するものではない。
【００７９】
（実施例１）
α−シヌクレインプロトフィブリル抗体
免疫化／ポリクローナル抗体
免疫化スキームにおいて、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを利用する。抗原として、ＨＮＥ安定化α−シヌクレインプロトフィブリルを使用する。これらは、既に記載のとおり（ＷＯ２００９／１３３５２１、参照により本明細書に組み込まれる）生成させ、例外は以下のとおりである：ＨＮＥとα−シヌクレインとの６０：１の比を使用する。免疫化のため、マウスにＨＮＥ安定化α−シヌクレインプロトフィブリルおよびアジュバントを注射する（例えば、３〜６回）。ＨＮＥ修飾α−シヌクレインプロトフィブリルを含有する１回のブースター注射を実施してからマウスを屠殺した。免疫化マウスからの血液を、α−シヌクレインプロトフィブリルおよびα−シヌクレインモノマーに関する反応性について分析した。ポリクローナル抗体応答の特異性を、ダイレクトＥＬＩＳＡにより分析した。典型的な実験において、平底高結合９６ウェルポリスチレンマイクロタイタープレートをモノマーα−シヌクレイン（未修飾またはＨＮＥもしくは他のアルデヒドを用いて修飾）、プロトフィブリル／オリゴマーα−シヌクレイン（未修飾またはＨＮＥもしくは他のアルデヒドを用いて修飾）または繊維状α−シヌクレインを４００ｎｇ／ウェルの最終濃度において用いてコーティングする。ウェルを２％ＢＳＡを用いてブロッキングし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳを用いて洗浄し、調査されるポリクローナル抗体からの細胞培地上清（未希釈またはリン酸緩衝生理食塩水を用いて１：１に希釈）を一次抗体としてウェルに添加する。アルカリホスファターゼコンジュゲート化ヤギ抗マウスマウスＩｇＧ／ＩｇＭ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を二次抗体として１／１０００の希釈において使用する。免疫反応性は、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ，ＵＳＡ）を使用して可視化する。
【００８０】
血清中で、α−シヌクレインプロトフィブリル／オリゴマーを特異的に認識する抗体を検出する。さらに、α−シヌクレインモノマーを認識する抗体を見出すことができる。陰性対照は、非免疫化マウスを表す。
【００８１】
ハイブリドーマ／モノクローナル抗体
モノクローナルα−シヌクレインプロトフィブリル結合抗体を生成させるためにマウスＢ細胞ハイブリドーマを使用した。脾細胞を単離し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で粉砕し、１２００ｘｇにおいて１０分間遠心分離して細胞リッチペレットを回収する。細胞をＰＢＳを用いてさらに洗浄し、１２００ｘｇにおいて１０分間遠心分離する。細胞ペレットを、１％抗生物質が補給されたダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）中で再懸濁させる。脾細胞を１：１の比においてＳｐ２／０細胞（マウスミエローマ細胞系）とＤＭＥＭ中で混合する。細胞融合を促進するため、１ｍｌのポリエチレングリコール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を細胞混合物に添加し、反応をＤＭＥＭの添加により停止させる。細胞をハーベストし、ペレットを１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｃｉｔｙ，ＩＡ，ＵＳＡ）が補給され、１％（ｖ／ｖ）ピルビン酸ナトリウム（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｃｉｔｙ，ＩＡ，ＵＳＡ）、１％（ｖ／ｖ）抗生物質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）および１％（ｖ／ｖ）Ｌ−グルタミン（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｃｉｔｙ，ＩＡ，ＵＳＡ）も含有するＤＭＥＭ、５％（ｖ／ｖ）ＢＭ条件培地（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａ，Ｂｒｏｍｍａ，Ｓｗｅｄｅｎ）および２％（ｖ／ｖ）ＨＡＴ培地サプリメント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）中で再懸濁させる。細胞を９６ウェル細胞培養プレート上でプレーティングし、２週間静置および増殖させる。
【００８２】
ハイブリドーマ細胞上清を、ダイレクトＥＬＩＳＡにより分析する。典型的な実験において、平底高結合９６ウェルポリスチレンマイクロタイタープレートを、平底高結合９６ウェルポリスチレンマイクロタイタープレートをモノマーα−シヌクレイン（未修飾またはＨＮＥもしくは他のアルデヒドを用いて修飾）、オリゴマー／プロトフィブリルα−シヌクレイン（未修飾またはＨＮＥもしくは他のアルデヒドを用いて修飾）または繊維状α−シヌクレインを用いてコーティングする。ウェルを１％ＢＳＡを用いてブロッキングし、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）を用いて洗浄し、調査されるハイブリドーマからの細胞培地上清（未希釈またはＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）を用いて１：２または１：５に希釈）を一次抗体としてウェルに添加する。セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート化ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，製品番号１０１０−０５）を二次抗体として１／５０００の希釈において使用する。免疫反応性は、Ｋ−Ｂｌｕｅ  Ａｑｕｅｏｕｓ  ＴＭＢ基質（Ｎｅｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．製品番号３３１１７７）を使用して可視化する。
【００８３】
（実施例２）
α−シヌクレインプロトフィブリルに特異的な重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ／Ｖカッパ）モノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配列
抗体のＣＤＲ領域を含む重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域のアミノ酸配列を、ｍＲＮＡテンプレートのＲＴ  ＰＣＲに続くＤＮＡシーケンシングにより決定した。選択される抗体についての可変重鎖領域（ＶＨ）および可変軽鎖領域（ＶＬ）のアミノ酸配列を表１に示す。ＣＤＲ領域１〜３の位置に下線を引き、この位置を示す。ＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、α−シヌクレインプロトフィブリルの「病原性エピトープ」を構成するヒト野性型および突然変異体α−シヌクレインプロトフィブリルを結合させるための構造的基礎を形成する。
【００８４】
本発明によるプロトフィブリル特異的抗体についての各ＶＬおよびＶＨ鎖のＣＤＲ領域１〜３のアミノ酸配列を表１に示す。表２に本発明による一連の追加の抗体のＣＤＲ配列を含める。
【００８５】
ＶＨおよびＶＬ鎖のＣＤＲ１〜３領域の合わせたアミノ酸配列は、ヒトα−シヌクレイン野性型プロトフィブリルを高親和性および特異性で結合させる分子「ポケット」を作出する。この「ポケット」は、「ＰＤ／ＤＬＢエピトープ」の構造的基礎を形成する。ＣＤＲアミノ酸配列長のバリエーションがＶＨ鎖とＶＬ鎖の両方において観察され、ヒトα−シヌクレインプロトフィブリルへの結合と適合性である。より短いＣＤＲ領域は、抗体の結合ポケットのより制限された３次元構造を提供する一方、より長いＣＤＲ領域はよりフレキシブルである。
【００８６】
表１および２に示すＣＤＲ配列は、本発明の実施形態であり、プロトフィブリル特異的抗体についてのＶＨおよびＶＬ鎖の「マウスフレームワーク」領域、すなわちＣＤＲ領域外側ならびにヒトＶＬおよびＶＨフレームワーク領域におけるアミノ酸配列であるが、これらに限定されるものではない。
【００８７】
表１および２に示すもの以外のＣＤＲ領域における他のアミノ酸置換は、ヒトα−シヌクレインプロトフィブリルへの高親和性および高特異性結合と適合性である。極性アミノ酸がＣＤＲ領域の特定の位置に存在する場合、その特定のアミノ酸は、α−シヌクレインプロトフィブリルへの高親和性および特異性結合を保持または改善しつつ別の極性アミノ酸により置換することができる。同様に、非極性または負もしくは正に荷電したアミノ酸がある位置に存在する場合、そのアミノ酸は同一の極性群からの類似アミノ酸により置換することができる。
【００８８】
特定の１種以上のアミノ酸は、α−シヌクレインプロトフィブリルについての親和性に関して実質的に同一の機能および構造を抗体に付与する機能的等価物により、ＣＤＲ領域の任意の位置において交換することができるので、このような構築物は、無論、本発明の範囲内である。これに関して、本明細書に記載のエピトープ結合性が維持された、各群の上記ＶＨ  ＣＤＲおよびＶＬ  ＣＤＲ配列の１種と７０、８０、９０、９５または９８％超の類似性を有する抗体および断片は本発明の範囲内である。
【００８９】
【表１】
0005894939.tif 000002
【００９０】
【表２】
0005894939.tif 000003
【００９１】
（実施例３）
α−シヌクレインプロトフィブリル特異的モノクローナル抗体のエピトープマッピング
抗体のエピトープマッピングを、ＰｅｐＳｐｏｔｓ膜上での免疫ブロッティングにより実施した。ヒトα−シヌクレインの配列全体（アミノ酸１〜１４０）に及ぶ合成ペプチドを、ＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈの小会社、ＵＫ）によりカスタム合成し、ＰｅｐＳｐｏｔｓ膜上で固定化した。１１アミノ酸配列オーバーラップを有する３３種の合成１５量体ペプチドを設計した。ペプチドをＷｈａｔｍａｎ５０セルロース膜（Ｗｈａｔｍａｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）にＣ末端により共有結合させ、通常、より高い分解安定性に起因するアセチル化Ｎ末端を有する。未荷電Ｎ−ａｃは、ネイティブ抗原の領域、次いで荷電ＮＨ３＋基をより良好に表す。結果を表３に説明する。
【００９２】
【表３】
0005894939.tif 000004
【００９３】
あるいは、抗体のエピトープマッピングを、ＰｅｐＳｐｏｔｓ膜（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）上での免疫ブロッティングにより、以下のとおり実施した：アミノ酸１００から１４０からのヒトα−シヌクレインのＣ末端配列に及ぶ合成ペプチドをカスタム合成し、ＰｅｐＳｐｏｔｓ膜（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）に固定化した。９アミノ酸配列オーバーラップを有する３０種の合成１０量体ペプチドを設計した。結果を表４に示す。
【００９４】
【表４】
0005894939.tif 000005
【００９５】
したがって、エピトープの長さおよび正確な位置は、決定に使用される方法に依存する。
【００９６】
（実施例４）
競合ＥＬＩＳＡによる高親和性ヒトα−シヌクレインプロトフィブリル結合モノクローナル抗体の特性決定
本実施例は、４種の抗体（ｍＡｂ４９／Ｇ、ｍＡｂ３８Ｅ２／７、ｍＡｂ３８Ｆ１１／２＿８およびｍＡｂ４８Ｂ１１／８）を示す。これらの抗体は、下記の競合ＥＬＩＳＡアッセイにより計測されるとおりα−シヌクレインプロトフィブリルへの高親和性およびα−シヌクレインモノマーへの低交差反応性（結合性）を示す。手短に述べると、試験すべき抗α−シヌクレイン抗体を溶解状態でα−シヌクレインモノマーまたはプロトフィブリルと相互作用させ、次いで混合物を、α−シヌクレインプロトフィブリルを用いて予備コーティングされたマイクロタイタープレートに添加する。抗体が予備インキュベーション工程において抗原に結合する場合、より少ない抗体がマイクロタイタープレート上に固定化された抗原に結合する。固定化された抗原に結合した抗原は、アルカリホスフェート酵素（ＡＬＰ）コンジュゲート化二次抗体により検出する。コンジュゲートは、マイクロタイタープレートリーダー中で４０５ｎｍにおいて検出することができる黄色を生じさせるＡＬＰ基質（ｐＮＰＰ）とインキュベートする。結果的に、低いＯＤ値は、溶解状態の抗原への抗体の高親和性を反映する。
【００９７】
具体的には、高結合ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートを、１ｘＰＢＳ中で希釈した１００μｌ／ウェルの１μｇ／ｍｌのα−シヌクレインプロトフィブリルを用いてコーティングし、接着密封剤を用いて密封し、＋４℃において一晩インキュベートした。次いで、コーティング溶液を廃棄し、プレートの残留結合能を、２００μｌ／ウェルのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）を添加することによりブロッキングした。密封したプレートを、９００ｒｐｍにおいて振とうさせることにより室温（Ｒ．Ｔ．）において６０分間インキュベートした。
【００９８】
その一方で、ペプチド溶液を１ｘＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）中で、α−シヌクレインモノマーまたはプロトフィブリルを１４０ｎＭの濃度に希釈することにより調製した。α−シヌクレインモノマーおよびプロトフィブリルの１０工程３回段階希釈を、丸底低タンパク質結合マイクロタイタープレート中で５０μｌの容量において実施した。この溶液に、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）中で１００ｎｇ／ｍｌの濃度に希釈した５０μｌの試験抗体を添加し、９００ｒｐｍにおいて振とうさせることにより室温において６０分間相互作用させた。続いて、これらの予備インキュベートした試料を洗浄（３回洗浄）したコーティング高結合プレートに添加し、振とうなしで室温において１５分間インキュベートさせた。次いで、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄して未結合抗体を除去した。結合抗体を、９００ｒｐｍにおいて振とうさせることにより室温において６０分間インキュベートしたＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）中で１／１０００希釈した１００μｌのＡＬＰ結合抗マウスＩｇＧ（Ｍａｂｔｅｃｈ，Ｓｗｅｄｅｎ  ３３１０−４）を用いて検出した。
【００９９】
最後に、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄して未結合抗体を除去し、１００μｌのＡＬＰ基質をそれぞれのウェルに添加した。プレートを、黄色が発色するまで室温におけるインキュベーションの間、暗所で保持した。吸光度値を連続モードで４０５ｎｍの波長において１５分毎に１２０分まで計測した。計測値を、時間と吸光度との間に線形性が存在する場合にのみＩＣ５０決定に使用した。
【０１００】
ＩＣ５０値は、ＥＬＩＳＡにおけるシグナルの半分をクエンチするのに必要とされるモノマーまたはプロトフィブリルの濃度として計算した。本方法において使用するα−シヌクレインモノマーまたはプロトフィブリルの濃度は、参照としての市販のα−シヌクレインスタンダード（カタログＳ−１００１−１、ｒＰｅｐｔｉｄｅ，ＵＳＡ，ＢＣＡを用いて決定された０．５ｍｇ）を使用するＵＶ−ＳＥＣにより決定した。図１は、上記の競合ＥＬＩＳＡにより決定した４種のプロトフィブリル特異的モノクローナル抗体についての４５０ｎｍにおける吸光度を示す。アッセイは、ＨＮＥ安定化α−シヌクレインプロトフィブリルを用いて実施した。
【０１０１】
さらなるＥＬＩＳＡ実験は、候補抗体がＨＮＥまたはＯＮＥにより安定化されたヒトα−シヌクレインプロトフィブリルについての同一の親和性を示すことを示す。抗体は、競合ＥＬＩＳＡにより実証されるとおりＨＮＥにより安定化されたＡ３０ＰまたはＡ５３Ｔα−シヌクレイン突然変異体から構成されるα−シヌクレインプロトフィブリル／凝集体も結合させる。
【０１０２】
具体的には、図２Ａおよび２Ｂは、競合ＥＬＩＳＡにより分析したプロトフィブリル特異的抗体ｍＡｂ４９／Ｇの結果を示す。プロトフィブリル特異的モノクローナル抗体ｍＡｂ４９／Ｇは、ＨＮＥまたはＯＮＥにより安定化されたヒトα−シヌクレインプロトフィブリルに高親和性で結合する（図２Ａ）。モノクローナル抗体は、α−シヌクレインのヒト突然変異形態Ａ３０ＰおよびＡ５３ＴのＨＮＥ安定化プロトフィブリルにも高親和性で結合する（図２Ｂ）。ＯＮＥとのα−シヌクレインモノマーの凝集は、サイズ排除クロマトグラフィーにより定義されるとおり２種の区別される複合体の集団を生じさせる。これらの２種の区別されるピークを別個に溶出させ、ＦＰ−ＯＮＥ＿ｌａｒｇｅおよびＦＰ−ＯＮＥ＿ｓｍａｌｌと命名した。
【０１０３】
さらに、図３Ａ〜３Ｃは、競合ＥＬＩＳＡにより分析した追加のプロトフィブリル特異的抗体３８Ｅ２／７、３８Ｆ１１／２＿８および４８Ｂ１１／８の結果を示す。これらのプロトフィブリル特異的モノクローナル抗体は、ＨＮＥ（ＰＦ−ＨＮＥ）またはＯＮＥ（ＰＦ−ＯＮＥ）により安定化された野性型ヒトα−シヌクレインプロトフィブリルに高親和性で結合する。これらのモノクローナル抗体は、アルファシヌクレインのヒト突然変異形態Ａ３０Ｐ（Ａ３０Ｐ−ＨＮＥ）およびＡ５３Ｔ（Ａ３０Ｐ−ＨＮＥ）のＨＮＥ安定化プロトフィブリルにも高親和性で結合する。
【０１０４】
（実施例５）
α−シヌクレインプロトフィブリル特異的サンドイッチＥＬＩＳＡの確立
生物試料中のα−シヌクレインプロトフィブリルの計測を可能とするため、捕捉抗体と検出抗体の両方としてのｍＡｂ４９／Ｇを用いるサンドイッチＥＬＩＳＡを確立した。このアッセイは、α−シヌクレインプロトフィブリルを定量限界ＬＯＱ＝９ｐＭで計測する（図４Ｂを参照のこと）。標準曲線において使用するα−シヌクレインプロトフィブリルのサイズに関する不確実性に起因して、ｐＭにおける濃度は１個のα−シヌクレインモノマー（１４，０００ｇ／ｍｏｌ）の分子量に基づく。プロトフィブリルの分子量はサイズ排除クロマトグラフィーにより少なくとも１，０００，０００ｇ／ｍｏｌと推定されているので、モル濃度α−シヌクレインプロトフィブリルとして計算される検出限界は、０．１３ｐＭほど低くあり得る。
【０１０５】
ＨＮＥにより安定化されたα−シヌクレインプロトフィブリルおよびモノマーα−シヌクレインを使用してＥＬＩＳＡのコンホメーション特異性をバリデートした。
【０１０６】
２個の同一の抗体から構成されるＥＬＩＳＡは、シグナルを生成するために少なくともタンパク質のダイマーを要求する。しかしながら、生物試料中に天然に生じ得る大過剰のモノマーα−シヌクレインが、捕捉抗体コートの結合部位を占有することによりα−シヌクレインプロトフィブリル分析を干渉し、こうしてプロトフィブリルの結合を阻害し得る。この問題は、増加過剰のα−シヌクレインモノマーを固定濃度のα−シヌクレインプロトフィブリル（モノマー単位として表現して５００ｐＭ）に添加し、これをｍＡｂ４９／ＧＥＬＩＳＡを用いて分析することにより調査した。α−シヌクレインプロトフィブリル（５００ｐＭ）と比較して３００００倍モル濃度過剰のα−シヌクレインモノマー（１５μＭ）は、予想とおりｍＡｂ４９／ＧサンドイッチＥＬＩＳＡを用いる計測を妨害しなかった。それというのも、α−シヌクレインモノマーは捕捉抗体にほとんど結合しないからである。
【０１０７】
図４Ａは、サンドイッチＥＬＩＳＡによるα−シヌクレインプロトフィブリルの定量についてのＥＬＩＳＡ結合の概略説明を示す。図４Ｂは、ＨＮＥ安定化α−シヌクレインプロトフィブリルを用いて作成した標準曲線を示す。アッセイ性能は、定量限界ＬＯＱ＝９ｐＭに達した。
【０１０８】
（実施例６）
α−シヌクレインプロトフィブリル特異的サンドイッチＥＬＩＳＡを用いる疾患および対照ヒト脳抽出物の分析
異なる洗浄剤を使用する脳抽出プロトコルを実施し、３種の異なる抽出物を生じさせた。細胞外および細胞質α−シヌクレイン種を含むＴＢＳ抽出物（図５、白色のバー）；膜会合性α−シヌクレイン種を含むＴｒｉｔｏｎ抽出物（図５Ａ、縞模様のバー）およびＳＤＳ可溶性α−シヌクレイン種を含むＳＤＳ抽出物（図５Ｂ、黒色のバー）。α−シヌクレイノパチーのレビー小体型認知症（ＤＬＢ）と診断された患者からの脳抽出物を分析した。皮質および黒質からの脳組織を分析した。対照として、検出可能な免疫組織化学レビー小体病変を有しない対照の皮質からの脳組織も分析した。サンドイッチＥＬＩＳＡは、捕捉抗体と検出抗体の両方としてのα−シヌクレインプロトフィブリル特異的ｍＡｂ４９／Ｇに基づいた。図５Ａおよび５Ｂは、α−シヌクレインプロトフィブリル特異的サンドイッチＥＬＩＳＡを用いる疾患および対照ヒト脳抽出物の分析の結果を示す。このアッセイは、プロトフィブリルの定量を＞９ｐＭ（定量限界；ＬＯＱ＝９ｐＭ）のレベルにおいて可能とする。
【０１０９】
（実施例７）
ＰＤトランスジェニックマウスモデルからの脳抽出物中のα−シヌクレインプロトフィブリルの計測
細胞およびマウスモデル中のα−シヌクレインプロトフィブリルの存在が示唆されているが、生物試料中のα−シヌクレインプロトフィブリルを直接アッセイする方法はこれまで存在しない。したがって、ｍＡｂ４９／ＧサンドイッチＥＬＩＳＡは、生物試料および凝集したα−シヌクレインの蓄積を特徴とするα−シヌクレイノパチーのマウスモデル中のα−シヌクレインプロトフィブリルレベルを計測する最初の機会を提供する。
【０１１０】
ヒトα−シヌクレインＡ５３Ｔ突然変異体を過剰発現するトランスジェニックマウスからの脳抽出物試料を、野性型マウスからの試料と比較した。脳をＴＢＳまたはＴＢＳ＋ｔｗｅｅｎ中でホモジナイズし、遠心分離してから分析して可溶性α−シヌクレインフラクションを回収した。非トランスジェニックマウス脳ホモジネートのＴＢＳ可溶性フラクション中のα−シヌクレインプロトフィブリルレベルの計測を、トランスジェニックマウス（Ｋａｈｌｅモデル）と比較した（図６）。本アッセイにおいて計測される全てのα−シヌクレインが溶解状態であることを確保するため、全ての試料を分析前に１６０００ｘｇにおいて５分間遠心分離した。α−シヌクレインプロトフィブリルのレベルを、α−シヌクレイン病変を有する５ヵ月齢トランスジェニックマウスからの脳中で計測した。
【０１１１】
図６は、対照マウス（ｎｔｇ、非トランスジェニック）およびＫｈａｌｅトランスジェニック（ｔｇ）マウスＰＤモデルからの５ヵ月齢マウスの脳抽出物の分析の結果を示し、ｙ軸はＯＤ４５０における吸光度を表す。
【０１１２】
（実施例８）
ヒト脳組織の免疫組織化学（ＩＨＣ）分析
ＰＤおよびＤＬＢ患者からの皮質および黒質を使用して記載のとおり（Oinas et al.2010）免疫組織化学（ＩＨＣ）分析を実施した。対照として、同齢非疾患患者からの皮質および黒質を使用した。α−シヌクレインについての陽性抗体対照は、マウス抗α−シヌクレインｍＡｂ（ＢＤ６１０７８７）であった。
【０１１３】
Ａβ斑への結合は、以下のとおり評価した。ＡＤ患者の皮質からの２枚の連続するスライドを抗原をディスプレイするように処理し、陽性抗ＡβｍＡｂ（ｍＡｂ１５８、ＢｉｏＡｒｃｔｉｃ）または候補抗体のそれぞれの１種とインキュベートした。結合抗体を、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合している二次抗種特異的抗体により検出した。次いで、コンジュゲートをＨＲＰ基質ＤＡＢとインキュベートし、発色沈殿物を生じさせ、光学顕微鏡検査により検出した。Ａβ斑が陽性対照において発色沈殿により検出される領域を、候補抗体を用いて処理したスライド中の共通の各領域で分析した。発色沈殿の欠損を可視的に評価し、候補抗体によるＡβ斑への結合の欠損と解釈した。
【０１１４】
図７Ａは、ＰＤ黒質内のレビー小体および神経突起の３８Ｅ２／７結合性ならびに陽性α−α−シヌクレイン対照を示す。図７Ｂは、ＤＬＢ皮質および黒質内のレビー小体および神経突起の３８Ｅ２／７結合性ならびに陽性α−α−シヌクレイン対照を示す。図７Ｃは、ＤＬＢ皮質および黒質内のレビー小体および神経突起を結合させる種々の抗体ならびに陰性対照を示す。図７Ｄは、ＰＤ黒質内のレビー小体および神経突起を結合させる種々の抗体ならびに陰性対照を示す。図７Ｅは、非疾患関連黒質における３８Ｅ２／７の非結合性および陽性α−α−シヌクレイン対照を示す。図７Ｆは、アルツハイマー病患者の皮質における３８Ｅ２／７結合性および陽性α−Ａβ対照の比較を示す。
【０１１５】
（実施例９）
免疫沈降（ＩＰ）およびウエスタンブロットを用いるヒト脳抽出物の分析
プロトフィブリル結合モノクローナル抗体３８Ｅ２／７を用いるヒト脳抽出物の免疫沈降を、ウエスタンブロットを使用して実施した。異なる洗浄剤を使用する脳抽出プロトコルを実施し、４種の異なる抽出物を生じさせた。細胞外および細胞質α−シヌクレイン種を含むＴＢＳ抽出物；膜会合性α−シヌクレイン種を含むＴｒｉｔｏｎ抽出物、ＳＤＳ可溶性α−シヌクレイン種を含むＳＤＳ抽出物および不溶性α−シヌクレインを含むＦＡ抽出物。これらの抽出物を、抗体３８Ｅ２／７または対照抗体１５Ｐが結合している磁気ビーズを用いて免疫沈降させた。抗体１５Ｐは、α−シヌクレインプロトフィブリルおよびモノマーに十分等しく結合することができ、存在する全ての種をプルダウンすることが予想される。図８ＡはＤＬＢ患者の黒質のＳＤＳ抽出物を示す一方、図８ＢはＤＬＢ患者の黒質のＴｒｉｔｏｎ抽出物を示す。図８Ａおよび８Ｂにおいて把握されるとおり、ｍＡｂ３８Ｅ／２７はＴｒｉｔｏｎ抽出物とＳＤＳ抽出物の両方におけるＤＬＢ黒質からのα−シヌクレインプロトフィブリルのみを捕捉する一方、ｍＡｂ１５は全ての抽出物中のα−シヌクレインモノマーを捕捉する。
【０１１６】
（実施例１０）
α−シヌクレインオリゴマー化阻害の分析
本実施例は、抗体ｍＡｂ４９／Ｇがα−シヌクレインモノマーのオリゴマー化を阻害することを、ＧＦＰのＮ末端またはＣ末端断片と融合しているα−シヌクレイン（ａａ１〜１４０）の１コピーを両方含有する２種のベクターを神経細胞に形質移入させるインビトロ法を使用して示す。α−シヌクレインがオリゴマー化し、ＧＦＰの両方の断片を一緒にもたらすこれらの細胞のみ、蛍光顕微鏡検査により検出することができる緑蛍光色を生じさせる。オリゴマー化を阻害および／または妨害することができる抗体の存在は、抗体を添加していない対照と比較してこれらの培養物中の蛍光を比較することにより評価することができる。
【０１１７】
具体的には、Ｈ４神経膠腫細胞に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のＮ末端断片（ａａ１〜１５５）と融合しているα−シヌクレイン（ａａ１〜１４０）またはＧＦＰのＣ末端断片（ａａ１５６〜２３８）と融合しているα−シヌクレイン（ａａ１〜１４０）を含有する等モル比のＤＮＡ構築物を、ＦｕＧＥＮＥ６形質移入試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して形質移入した。同時に、対照抗α−シヌクレインモノクローナル抗体（ｍＡｂ５Ｃ２，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏ）およびｍＡｂ４９／Ｇを、１μｇ／ｍｌの最終濃度で細胞に細胞外で添加した。細胞を３７℃において５％ＣＯ２中で２４時間インキュベートした。２４時間後、細胞をＧＦＰ蛍光団の完全な再構成のために３０℃に移し、２４時間の追加時間インキュベートした。蛍光は、ＦＩＴＣ落射蛍光フィルタを備えるＡｘｉｏｖｅｒｔ２００顕微鏡を使用して計測した。全てのデータを、１００％と設定する抗体未処理α−シヌクレイン過剰発現細胞と比較した相対蛍光強度％として計算した。
【０１１８】
図９Ａにおいて把握されるとおり、ｍＡｂ４９／Ｇを用いる処理は、α−シヌクレインオリゴマー化の有意（＊ｐ＜０．０５）な低減（未処理細胞と比較して蛍光強度の４２％減少）を示した。図９Ｂは、１００％に設定した未処理α−シヌクレイン過剰発現細胞と比較したパーセント蛍光強度としての結果をグラフとして示す。
【０１１９】
本明細書に記載の具体的な実施例および実施形態は、事実上例示であるにすぎず、特許請求の範囲により定義される本発明を限定するものではない。さらなる実施形態および実施例、ならびにこれらの利点は、本明細書を考慮して当業者に明らかであり、特許請求される本発明の範囲内である。
【０１２０】
参考文献
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
0005894939.tif 000013
【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
0005894939.tif 000016
【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
0005894939.tif 000018
【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【配列表】
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