(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
デガレリックス、Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−Ｐｈｅ（４Ｃｌ）−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）−Ｄ−４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ２、を含むデガレリックス生成物の製造方法であって、ここで、該デガレリックス生成物は、不純物として０．３重量％以下のＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−Ｐｈｅ（４Ｃｌ）−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｄ−４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ２（ここでＸは、４−（［２−（５−ヒダントイル）］アセチルアミノ）−フェニルアラニンである。）を含み、該方法は、固体支持体に結合されたアミノ酸を含む該支持体上での段階的合成を含み、そして
(i)α−アミノ基がＦｍｏｃで保護されたアミノ酸若しくはペプチドの溶液を提供し；
(ii)該支持体を該溶液と、溶解した該アミノ酸若しくは該ペプチドのカルボニル基と該支持体に結合されたアミノ基との間でペプチド結合を形成するための試薬の存在下で、該ペプチド結合を形成するのに充分な時間接触させ；
(iii)該支持体を、ピペリジン及びＣ−アルキル置換ピペリジン（ここで該アルキルは炭素数１〜６の分岐若しくは直鎖のアルキルである）から選ばれる有機塩基と有機溶媒中で接触させることによりＦｍｏｃを除去する
ステップを含む、上記の製造方法。
【請求項２】
前記デガレリックス生成物が、不純物として０．１重量％以下のＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−Ｐｈｅ（４Ｃｌ）−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｄ−４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ２（ここでＸは、前に定義した通りである。）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記デガレリックス生成物が、不純物として０．０１重量％以下のＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−Ｐｈｅ（４Ｃｌ）−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｄ−４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ２（ここでＸは、前に定義した通りである。）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記有機塩基がピペリジンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記有機溶媒がジメチルホルムアミドである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ペプチド結合を形成するための試薬がＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミドを含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記支持体に結合したアミノ基が、前記支持体に結合したデガレリックスのフラグメントのα−アミノ基である、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記Ｆｍｏｃで保護されたペプチドがデガレリックスのフラグメントである、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記支持体が、ＲｉｎｋアミドＡＭ樹脂、及びＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂から選ばれる、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
酸処理によりデガレリックスを前記支持体から放すことを含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
固相合成において、不純物として０．３重量％以下のＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−Ｐｈｅ（４Ｃｌ）−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｄ−４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ２（ここでＸは４−（［２−（５−ヒダントイル）］アセチルアミノ）−フェニルアラニンである。）を含む請求項１の製造方法によるデガレリックス生成物の調製のための、α−アミノ基の保護基としてのＦｍｏｃの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、合成ペプチドの製造方法、特にデカペプチドであるデガレリックス（ｄｅｇａｒｅｌｉｘ）の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペプチド合成に使用可能な多くの公知の方法がある。古典的接近法は液相ペプチド合成（ＬＰＰＳ）であり、それは多量のペプチドの製造に好ましい方法であった。別の現在のそして通常使用されているペプチド合成の接近法は固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）であり、ここでは、生長するペプチド鎖を固体支持体上の樹脂に、所望の長さと配列が一旦達成されると該樹脂から開裂されるまで、共有結合される。これらの方法では、生長するペプチド内の新たなペプチド結合の望ましい形成とは別の他の反応を回避するために、混入されたアミノ酸の反応性側鎖を保護する必要がある。加えて、加えられたアミノ酸の間の副反応、並びに各ステップにおける多数のアミノ酸の混入を回避するために、加えたアミノ酸は通常α−アミノ保護されている。従って合成は、固相結合ペプチドのα−アミンの脱保護の繰り返しサイクルの一つ、次いで単一のα−アミノ保護アミノ酸単位へのカップリングとなる。
【０００３】
デガレリックスは、前立腺ガンの治療に使用するためのＧｎＲＨ拮抗薬である。デガレリックスは作用開始が即時で、ゴナドトロピン、テストステロン、及び前立腺特異性抗原（ＰＳＡ）を抑制する。デガレリックスは式：Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−Ｐｈｅ（４Ｃｌ）−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）−Ｄ−４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ２の合成デカペプチドである。
【０００４】
デガレリックスのアミノ末端から５番目のアミノ酸部分(moiety)は非天然アミノ酸Ａｐｈ（Ｌ−ｈｏｒ）に相当する。Ａｐｈ（Ｌ−Ｈｏｒ）は（Ｌ−ヒドロオロチル）−４−アミノ−フェニルアラニンを示す。当業界で（非特許文献１、２）、塩基性条件下で、ジヒドロウラシル部分を含む化合物はヒダントイン部分を含む化合物に再配列することが知られている。Ａｐｈ（Ｌ−Ｈｏｒ）の対応する再配列を以下に示す（上左：ジヒドロウラシル部分Ｎ−４−（Ｌ−ヒドロオロチルアミノ）−フェニルアラニンＩ，Ｒ＝−ＣＨ２ＣＨＮＨ２ＣＯＯＨ；下右：ヒダントイン部分ＩＩ，Ｎ−４−［２−（５−ヒダントイル）アセチル）−フェニルアラニン）。
【化１】
0005850458.tif 000002
【０００５】
再配列で、ジヒドロウラシル部分Ｉはヒダントイン部分ＩＩに変換する。４Ａｐｈ（Ｌ−Ｈｏｒ）のＬ−Ｈｏｒ部分はジヒドロウラシルの種類であるので、かかる再配列が、塩基性条件を使用するデガレリックスの製造工程中に起こると予想される。これは本出願人によって、α−アミノ基Ｆｍｏｃ−保護末端４Ａｐｈ（Ｌ−Ｈｏｒ）を含むペプチド合成中間体を、ＮａＯＨ又は有機塩基ジシクロヘキシルアミン（ＤＣＨＡ）のいずれかと 接触させることにより確認された。得られた脱保護生成物は、数重量％までの対応するヒダントイン再配列生成物が混入していることが見出された。デガレリックスの合成において、中間体Ｆｍｏｃ−４Ａｐｈ（Ｌ−Ｈｏｒ）−４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ−樹脂が、このように部分的にＦｍｏｃ−Ｘ−４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ−樹脂に再配列することが予想でき、ここでＸは、塩基性条件下で脱保護された時に、４−（［２−（５−ヒダントイル）］アセチルアミノ）−フェニルアラニンである。結局、Ｆｍｏｃ−４Ａｐｈ（Ｌ−Ｈｏｒ）−４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ−樹脂を経て得られたデガレリックス生成物は、対応する量のＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−Ｐｈｅ（４Ｃｌ）−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｄ−４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ２で汚染されていることが予想できる。デガレリックスは、ヒトに投与する薬物の活性成分である。従って、それは、生成物の０．３重量％を越えるいかなる不純物によっても汚染されてはならない。このように、ヒトの消費に適したデガレリックスにおいては、ヒダントイン副生物は０．３重量％を越える量では許容できない。ヒダントイン部分含有副生物は構造的にデガレリックスに非常に類似するので、それらの分離は難しい。試みても、分離はかなりの量の生成物を失う結果となると予想される。従って、保護基Ｆｍｏｃを使用した薬学等級のデガレリックスの製造工程において、塩基性条件は避けるべきである。
【０００６】
デガレリックスの合成は特許文献１に開示されている。この合成で好ましくそして全実施例で使用されたα−アミノ保護基はｔｅｒｔ−ブチルオキシ−カルボニル基（Ｂｏｃ）である。更に、広範囲の他の周知の保護基、例えばフルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）がこの目的に開示されている。Ｂｏｃ基を用いる利点は、それで保護されたαーアミノ基は、酸性条件下で、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いた標準的処理によりブロック解除することができることである。ＴＦＡを用いる欠点は、それが高ヒト毒性であることであり、そのことは製造者を危険な状態に置く。ＴＦＡを用いる別の欠点はその環境毒性にあり、そのことは廃棄を費用がかかるものにするか、或いは、不適正に廃棄した場合は、環境を汚染する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国５９２５７３０Ａ
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Koedjikv, A. H.外, J. Chem. Soc. Perkin, Trans. 2, 1984年, 1077-1081頁
【非特許文献２】Kaneti, J.外, Org. Biomol. Chem., 2004年. 1098-1103頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、デガレリックスの製造方法であって、ヒトの健康を危険状態に置かない、特に米国５９２５７３０Ａに開示された方法よりもヒトの健康に有害でない製造方法を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、デガレリックスの製造方法であって、環境を危険状態に置かない、特に米国５９２５７３０Ａに開示された方法よりも環境に有害でない製造方法を提供することである。
【００１１】
本発明の追加の目的は、デガレリックスの製造方法であって、当業界で知られた方法よりも費用がかからない製造方法を提供することである。
【００１２】
本発明の更なる目的は、下記の発明の概要、実施例の形態で開示された多くの好ましい態様、及び添付の特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は驚くべきことに、薬学的に純粋なデガレリックスが、Ｆｍｏｃをα−アミノ保護基として使用した固相合成により製造できることを見出した。「薬学的に純粋」とは、生成物がいかなる単一の不純物を０．３重量％を越えて含まないことを示す。予想外にＡｐｈ（Ｌ−Ｈｏｒ）部分は、Ｆｍｏｃ保護とＦｍｏｃ脱保護の数回のサイクルに塩基性条件下で付しても、固相合成中に再配列を蒙らない。
【００１４】
Ｆｍｏｃでα−アミノ保護されたアミノ酸は樹脂にカップリングされ、そして次に段階的にサイクル的及び配列依存的方法で互いにカップリングする。アミノ酸のカップリングの各ステップの次ぎに脱保護のステップが続いて、Ｆｍｏｃ保護基を除きそして次のアミノ酸をカップリングさせる。脱保護は塩基により達成される。好ましくは、有機媒体中の塩基ピペリジン又はアルキル置換ピペリジンが脱保護に使用される。
【００１５】
特に反応性又は不安定なアミノ酸の側鎖を保護して、副反応及び／又は生長する分子の分岐を回避するために、側鎖保護が好ましくは含まれる。側鎖保護基は、一旦生長するペプチドの完全長さが達成されたら、除去する。
【００１６】
従って、本発明により、デガレリックス、Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−Ｐｈｅ（４Ｃｌ）−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）−Ｄ−４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ２、の製造方法が開示され、ここで、該デガレリックスは０．３重量％以下、特に０．１重量％以下、最も特別に０．０１重量％以下のＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−Ｐｈｅ（４Ｃｌ）−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｄ−４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ２（ここでＸは、４−（［２−（５−ヒダントイル）］アセチルアミノ）−フェニルアラニンである。）を含み、該方法は、固体支持体に結合されたアミノ酸を含む該支持体上での段階的合成を含み、ここで、ステップは、α−アミノ基がＦｍｏｃで保護されたアミノ酸若しくはペプチドの溶液を提供し；該支持体を該溶液と、溶解したアミノ酸若しくはペプチドのカルボニル基と該支持体に結合されたアミノ基との間でペプチド結合を形成させるための試薬の存在下で、該ペプチド結合を形成するのに充分な時間接触させ；該支持体を、有機溶媒中の有機塩基と接触させることによりＦｍｏｃを除去することを含む。好ましい有機塩基はピペリジンである。他の好ましい有機塩基は、Ｃ−アルキル置換ピペリジン、特に２−アルキルピペリジン、３−アルキルピペリジン、２，４−ジアルキルピペリジン、２，５−ジアルキルピペリジン、２，６−ジアルキルピペリジンであり、ここでアルキルは炭素数１〜６の分岐若しくは直鎖であり、特にメチル又はエチル、最も特にメチルである。好ましい溶媒は、ジメチルホルムアミドである。別の好ましい溶媒はジエチルホルムアミドである。他の好ましい溶媒はＮＭＰ又はＤＭＡである。ペプチド結合を形成するための好ましい試薬はＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミドを含む。支持体に結合したアミノ基は、該支持体に結合したデガレリックスのフラグメントのα−アミノ基であるのが好ましい。Ｆｍｏｃで保護されたペプチドもデガレリックスのフラグメントであるのが好ましい。好ましい支持体は、ＲｉｎｋアミドＡＭ樹脂、及びＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂から選ばれる樹脂である。デガレリックスを該支持体から放すための好ましい方法は、酸処理による。
【００１７】
本発明の好ましい側面によると、０．３重量％以下、特に０．１重量％以下、最も特別に０．０１重量％以下のＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−Ｐｈｅ（４Ｃｌ）−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｄ−４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ２（ここでＸは、４−（［２−（５−ヒダントイル）］アセチルアミノ）−フェニルアラニンである。）を含む、本発明の方法により調製されたデガレリックスが開示される。
【００１８】
本発明の別の好ましい側面によると、０．３重量％以下、更に好ましくは０．１重量％以下、最も好ましくは０．０１重量％以下のＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−Ｐｈｅ（４Ｃｌ）−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｄ−４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ２（ここでＸは、４−（［２−（５−ヒダントイル）］アセチルアミノ）−フェニルアラニンである。）を含む、デガレリックスを調製するための固相合成におけるＦｍｏｃの使用が開示される。
【００１９】
本発明を、図面及び実施例に記載された多くの好ましい態様を参照して、より更に詳しく記述する。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
略語
４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）−フェノキシアセトアミドメチル  ポリスチレン樹脂：［Ｆｍｏｃ−ＲｉｎｋアミドＡＭ−樹脂］
４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）−フェノキシアセトアミド−４−メチルベンズヒドリルアミン  ポリスチレン樹脂：［Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド−ＭＢＨＡ樹脂］
９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｄ−４−クロロフェニルアラニン：［Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−（４Ｃｌ）−ＯＨ］
９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｄ−２−ナフチルアラニン：［Ｆｍｏｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−ＯＨ］
９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｄ−３−ピリジルアラニン：［Ｆｍｏｃ−Ｄ−３Ｐａｌ−ＯＨ］
９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎ（４）−（ｔ−ブチルカルバモイル）−Ｄ−４−アミノフェニルアラニン：［Ｆｍｏｃ−Ｄ−４Ａｐｈ（ｔＢｕＣｂｍ）−ＯＨ］
９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎ（４）−（Ｌ−ヒドロオロチル）−４−アミノフェニルアラニン：［Ｆｍｏｃ−Ａｐｈ（Ｌ−Ｈｏｒ）−ＯＨ］
９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−ロイシン−ＯＨ：［Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ］
９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｏ−ｔ−ブチル−セリン：［Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ］
９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｌ−プロリン：［Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ］
９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｄ−アラニン：［Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ］
９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎ（ε）−イソプロピル−Ｎ（ε）−Ｂｏｃ−リシン：［Ｆｍｏｃ−Ｌ−ＩＬｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ］
アセトニトリル
２−プロパノール（イソプロパノール）    （ＩＰＡ）
エタノール、９９．９％                    （ＥｔＯＨ）
メタノール                                （ＭｅＯＨ）
精製水                                    （水）
酢酸エチル                                （ＡｃＯＥｔ）
酢酸                                      （ＡｃＯＨ）
水性水酸化アンモニウム                    （Ａｑ．ＮＨ３）
酢酸アンモニウム                          （ＡｃＯＮＨ４）
アセチルイミダゾール                        −−−
Ｎ−メチルモルホリン                      （ＮＭＭ）
Ｎ−メチルピロリドン                      （ＮＭＰ）
Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド    （ＤＩＣ）
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド              （ＤＭＦ）
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド              （ＤＭＡ）
ジメチルスルホキシド                      （ＤＭＳＯ）
ジシクロヘキシルアミン                    （ＤＣＨＡ）
１−ヒドロキシベンゾトリアゾール          （ＨＯＢｔ）
水酸化ナトリウム溶液，水性                （Ａｑ．ＮａＯＨ）
塩酸，水性                                （Ａｑ．ＨＣｌ）
リン酸                                    （Ｈ３ＰＯ４）
トリフルオロ酢酸                          （ＴＦＡ）
ジイソプロピルエチルアミン                （ＤＩＥＡ）
エタンジチオール                          （ＥＤＴ）
イソプロピルエチルエーテル                （ＩＰＥ）
プロセス内コントロール                    （ＩＰＣ）
ベンジル−オキシカルボニル                （Ｚ）
１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−ウンデカ−７−エン  （ＤＢＵ）
【実施例】
【００２１】
実施例１
デガレリックスの合成におけるヒダントイン形成。デガレリックスの製造におけるヒドロオロチン(hydroorotic)基のヒダントインアセチル基への再配列は、２段階で２組の塩基性条件で見られた。
【００２２】
最初の再配列は、セグメントＺ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）−Ｄ−４Ａｐｈ（ｔＢｕ−Ｃｂｍ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ２の塩基性抽出中に現れた。有機／水性２相系中で濃ＮａＯＨ溶液を用いて、ｐＨを９．１に調整すると、４．５重量％のヒダントイン類似体が形成した。機構は２つのステップを含むようであった：（ａ）６−員ヒドロオロチン部分の塩基性条件下での加水分解、次いで酸性条件下で開環して５−員ヒダントイン類似体になる。
【００２３】
第２の再配列はセグメントＺ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）−Ｄ−４Ａｐｈ（ｔＢｕ−Ｃｂｍ）−Ｌｅｕ−ＯＨ・ＤＣＨＡの蒸発中に観察された。前の抽出の後、Ｚ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）−Ｄ−４Ａｐｈ（ｔＢｕ−Ｃｂｍ）−Ｌｅｕ−ＯＨを酢酸エチルと２−ブタノールの混合物中に溶解した。該セグメントは溶媒の蒸発と、それに続く沈殿ステップの後にＤＣＨＡ塩として単離されるので、ＤＣＨＡ（２．５当量）を加えた。特定のバッチに、ヒダントイン類似体と加水分解された形態（上述した）の両方が確認された。ヒダントインの定量は不可能であった。何故なら、ＨＰＬＣによる他の生成物からの分離が悪いからであった。加水分解された形態は、合わせた生成物の１．３４重量％の量で形成された。実験的証拠は、再配列／加水分解の量は、該方法に使用したＤＣＨＡの量に関係することを示した。
【００２４】
下記の実験は、ヒドロオロチル部分が塩基性条件下で不安定であることの更なる証拠を与えた。Ｚ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）−Ｄ−４Ａｐｈ（ｔＢｕ−Ｃｂｍ）−Ｌｅｕ−ＯＨ・ＤＣＨＡ（６７ｍＭ）を、１６７ｍＭ（２．５当量）のＤＣＨＡを有する湿った２−ＢｕＯＨに３１℃で溶解させた。２５時間後、ヒダントイン類似体１．３％及び加水分解された中間体０．３％が形成された。
【００２５】
実施例２
ＤＢＵ／ＤＭＦ及びピペリジン／ＤＭＦ中でのデガレリックスの安定性。
デガレリックスの安定性を、ＳＰＰＳ中のＦｍｏｃ基の除去に使用した条件に相当する条件下で試験した。４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）、デガレリックスの配列のアミノ酸残基ｎｏ．５、の側鎖のヒドロオロチル基は、塩基に感受性でありそしてヒダントインアセチル基に再配列することが知られている。発明者に知られた全ＳＰＰＳ手順はＢｏｃ−化学に基づいた。
【００２６】
デガレリックスのサンプルをそれぞれ、２０％ピペリジン／ＤＭＦ；ＤＭＦ中の２％ＤＢＵ、及びＤＭＦ中の２％ＤＢＵ＋５％水に溶解させた。該サンプルを２０時間後にＨＰＬＣにより分析し、ヒダントイン類似体の量を決定した。
【００２７】
２％ＤＢＵ／ＤＭＦは１．８％のヒダントインを形成した。５％の水もまた存在すると（湿ったＤＭＦを真似る）、該量は７％に増加した。驚くべきことに、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンはヒダントイン類似体を形成しない結果となり、この混合物はデガレリックスのＦｍｏｃに基づくＳＰＰＳに有用であろうことを示す。
【００２８】
実施例３
Ｆｍｏｃ−ＲｉｎｋアミドＡＭ樹脂を用いたデガレリックスの合成及び精製
ステップ１：Ｆｍｏｃ−ＲｉｎｋアミドＡＭ樹脂（６４ｇ，置換度０．６７ｍｍｏｌ／ｇ）を反応器に入れ、そして１．９ＬのＤＭＦで洗った。膨潤した該樹脂にＤＭＦ中の２０％ピペリジン２５０ｍｌを加え、そして２０分間撹拌する。該反応器を底のフィルターを介して、該反応器に減圧をかけることにより空にし、そしてＤＭＦ中の２０％ピペリジン２５０ｍｌを用いた２回目の処理を２０分間行う。該反応器を再びそれに減圧をかけることにより空にし、次いで２ＬのＤＭＦを用いてペプチド樹脂を洗う。次ぎに該反応器を、減圧をかけることにより空にする。該ペプチド樹脂は今、ステップ２への準備ができている。
【００２９】
ステップ２：２７．０ｇのＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ（２当量）、１４．３ｇのＨＯＢｔ及び１３．２ｍｌのＤＩＣの溶液を２５０ｍｌのＤＭＦに溶解させ、そして１５分間活性化させ、その後、それをペプチド樹脂を含む反応器に注ぐ。１時間の反応時間後、２．２ｍｌのＮＭＭを該溶液に加え、そして反応を更に１時間進行させる。次ぎに３０ｍｌの無水酢酸及び２ｍｌのＮＭＭを該混合物に加え、それを撹拌下に１５分間放置する。次ぎに該反応器を減圧を使用して空にする。該ペプチド樹脂を２ＬのＤＭＦで洗う。該反応器に減圧を適用し、ＤＭＦを除去した後、該ペプチド樹脂をＤＭＦ中の２０％ピペリジン２５０ｍｌで２０分間処理する。該反応器に減圧をかけることにより空にし、そしてＤＭＦ中の２０％ピペリジン２５０ｍｌを用いた２回目の処理を２０分間行う。該反応器を再びそれに減圧をかけることにより空にし、そして２ＬのＤＭＦを用いて該ペプチド樹脂を洗う。該ペプチド樹脂は今、ステップ３への準備ができている。
【００３０】
ステップ３：２９ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ（２当量）、１４．３ｇのＨＯＢｔ及び１３．２ｍｌのＤＩＣの溶液を２５０ｍｌのＤＭＦに溶解させ、そして２５分間活性化させ、その後、それをペプチド樹脂を含む反応器に注ぐ。７５分の反応時間後、２．２ｍｌのＮＭＭを該溶液に加え、そして反応を更に１時間進行させる。次ぎに３０ｍｌの無水酢酸及び２ｍｌのＮＭＭを該混合物に加え、それを撹拌下に１５分間放置する。次ぎに該反応器を減圧を使用して空にする。該ペプチド樹脂を洗うのにＤＭＦ（２．６Ｌ）を使用する。該反応器に減圧を適用して、ＤＭＦを除去した後、該ペプチド樹脂をＤＭＦ中の２０％ピペリジン２５０ｍｌで２０分間処理する。該反応器を、減圧をかけることにより空にし、そしてＤＭＦ中の２０％ピペリジン２５０ｍｌを用いた２回目の処理を２０分間行う。該反応器を再び、減圧をかけることにより空にし、そして２ＬのＤＭＦを用いて該ペプチド樹脂を洗う。該ペプチド樹脂は今、ステップ４への準備ができている。
【００３１】
ステップ４：３３ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−ＩＬｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（１．５当量）、１０．７ｇのＨＯＢｔ及び１０．１ｍｌのＤＩＣの溶液を２５０ｍｌのＤＭＦに溶解させ、そして０．５時間活性化させ、その後、それをペプチド樹脂を含む反応器に注ぐ。２時間の反応時間後、２．２ｍｌのＮＭＭを該溶液に加え、そして反応を更に１時間進行させる。次ぎに３０ｍｌの無水酢酸及び２．２ｍｌのＮＭＭを該混合物に加え、それを撹拌下に１５分間放置し、次ぎに該反応器を減圧を使用して空にする。該ペプチド樹脂をＤＭＦ（３Ｌ）で洗う。該反応器に減圧を適用してＤＭＦを除去した後、該ペプチド樹脂をＤＭＦ中の２０％ピペリジン２５０ｍｌで２０分間処理する。該反応器を、減圧をかけることにより空にし、そしてＤＭＦ中の２０％ピペリジン２５０ｍｌを用いた２回目の処理を２０分間行う。該反応器を再び、減圧をかけることにより空にし、そして３．５ＬのＤＭＦを用いて該ペプチド樹脂を洗う。該ペプチド樹脂は今、ステップ５への準備ができている。
【００３２】
ステップ５：３８ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ（２．５当量）、１８ｇのＨＯＢｔ及び１６．８ｍｌのＤＩＣの溶液を２５０ｍｌのＤＭＦに溶解させ、そして０．５時間活性化させ、その後、それをペプチド樹脂を含む反応器に注ぐ。２時間の反応時間後、２．２ｍｌのＮＭＭを該溶液に加え、そして反応を更に５０分間進行させる。次ぎに３０ｍｌの無水酢酸及び２ｍｌのＮＭＭを該混合物に加え、それを撹拌下に１５分間放置する。次ぎに該反応器を減圧を使用して空にする。該ペプチド樹脂を洗うのにＤＭＦ（２．６Ｌ）を使用する。該反応器に減圧を適用してＤＭＦを除去した後、該ペプチド樹脂をＤＭＦ中の２０％ピペリジン２５０ｍｌで２０分間処理する。該反応器を、減圧をかけることにより空にし、そしてＤＭＦ中の２０％ピペリジン２５０ｍｌを用いた２回目の処理を２０分間行う。該反応器を再び、減圧をかけることにより空にし、そして２．５ＬのＤＭＦを用いて該ペプチド樹脂を洗う。該ペプチド樹脂は今、ステップ６への準備ができている。
【００３３】
ステップ６：３２ｇのＦｍｏｃ−Ｄ−４Ａｐｈ（ｔＢｕ−Ｃｂｍ）−ＯＨ（１．５当量）、１０．７ｇのＨＯＢｔ及び１０．１ｍｌのＤＩＣの溶液を２５０ｍｌのＤＭＦに溶解させ、そして１時間活性化させ、その後、それをペプチド樹脂を含む反応器に注ぐ。２０分の反応時間後、２２ｍｌのＮＭＭを該溶液に加え、そして反応を更に２０時間進行させる。次ぎに３０ｍｌの無水酢酸及び２ｍｌのＮＭＭを該混合物に加え、それを撹拌下に１５分間放置する。次ぎに該反応器を減圧を使用して空にする。該ペプチド樹脂を４ＬのＤＭＦで洗う。該反応器に減圧を適用してＤＭＦを除去した後、該ペプチド樹脂をＤＭＦ中の２０％ピペリジン２５０ｍｌで２０分間処理する。該反応器を、減圧をかけることにより空にし、そしてＤＭＦ中の２０％ピペリジン２５０ｍｌを用いた２回目の２０分間処理を行う。該反応器を再び、減圧をかけることにより空にし、そして３．４ＬのＤＭＦを用いて該ペプチド樹脂を洗う。該ペプチド樹脂は今、ステップ７への準備ができている。
【００３４】
ステップ７：３５ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−４Ａｐｈ（Ｌ−Ｈｏｒ）−ＯＨ（１．５当量）、１１ｇのＨＯＢｔ及び１０．１ｍｌのＤＩＣの溶液を３５０ｍｌのＤＭＦに溶解させ、そして１時間活性化させ、その後、それをペプチド樹脂を含む反応器に注ぐ。５０分の反応後、２．２ｍｌのＮＭＭを該溶液に加え、そして反応を更に２１．５時間進行させる。該反応器を減圧を使用して空にする。該ペプチド樹脂を４．４ＬのＤＭＦで洗う。該反応器に減圧を適用してＤＭＦを除去した後、該ペプチド樹脂をＤＭＦ中の２０％ピペリジン３５０ｍｌで２０分間処理する。該反応器を、減圧をかけることにより空にし、そしてＤＭＦ中の２０％ピペリジン３５０ｍｌを用いた２回目の２０分間処理を行う。該反応器を再び、減圧をかけることにより空にし、そして４．４ＬのＤＭＦを用いて該ペプチド樹脂を洗う。該ペプチド樹脂は今、ステップ８への準備ができている。
【００３５】
ステップ８：Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（２．５当量）（４１ｇ）、１７．９ｇのＨＯＢｔ，１６．８ｍｌのＤＩＣ及び４．９ｍｌのＮＭＭを５００ｍｌのＤＭＦに溶解させ、そしてペプチド樹脂を含む反応器に注ぐ。反応を３．５時間進行させる。次ぎに該反応器を減圧を使用して空にする。該ペプチド樹脂を４．２ＬのＤＭＦで洗う。該反応器に減圧を適用してＤＭＦを除去した後、該ペプチド樹脂をＤＭＦ中の２０％ピペリジン３７５ｍｌで２０分間処理する。該反応器を、減圧をかけることにより空にし、そしてＤＭＦ中の２０％ピペリジン３７５ｍｌを用いた２回目の２０分間処理を行う。該反応器を再び、減圧をかけることにより空にし、そして４．２ＬのＤＭＦを用いて該ペプチド樹脂を洗う。該ペプチド樹脂は今、ステップ９への準備ができている。
【００３６】
ステップ９：２５ｇのＦｍｏｃ−Ｄ−３Ｐａｌ−ＯＨ（１．５当量）、１０．７ｇのＨＯＢｔ，１０．１ｍｌのＤＩＣ及び４．９ｍｌのＮＭＭを４００ｍｌのＤＭＦに溶解させ、そしてペプチド樹脂を含む反応器に注ぐ。反応を４．５時間進行させる。次ぎに該反応器を減圧を使用して空にする。該ペプチド樹脂を４．２ＬのＤＭＦで洗う。該反応器に減圧を適用してＤＭＦを除去した後、該ペプチド樹脂をＤＭＦ中の２０％ピペリジン３７５ｍｌで２０分間処理する。該反応器を、減圧をかけることにより空にし、そしてＤＭＦ中の２０％ピペリジン３７５ｍｌを用いた２回目の２０分間処理を行う。該反応器を再び、減圧をかけることにより空にし、そして４．２ＬのＤＭＦを用いて該ペプチド樹脂を洗う。該ペプチド樹脂は今、ステップ１０への準備ができている。
【００３７】
ステップ１０：２７ｇのＦｍｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ（４Ｃｌ）−ＯＨ（１．５当量）、１０．７ｇのＨＯＢｔ，１０．１ｍｌのＤＩＣ及び４．９ｍｌのＮＭＭの溶液を４００ｍｌのＤＭＦに溶解させ、そしてペプチド樹脂を含む反応器に注ぐ。反応を１０時間進行させる。該反応器を減圧を使用して空にする。該ペプチド樹脂を５．５ＬのＤＭＦで洗う。該反応器に減圧を適用してＤＭＦを除去した後、該ペプチド樹脂をＤＭＦ中の２０％ピペリジン３７５ｍｌで２０分間処理する。該反応器を、減圧をかけることにより空にし、そしてＤＭＦ中の２０％ピペリジン３７５ｍｌを用いた２回目の２０分間処理を行う。該反応器を再び、減圧をかけることにより空にし、そして５ＬのＤＭＦで該ペプチド樹脂を洗う。該ペプチド樹脂は今、ステップ１１への準備ができている。
【００３８】
ステップ１１：２８ｇのＦｍｏｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−ＯＨ（１．５当量）、１０．７ｇのＨＯＢｔ、１０．１ｍｌのＤＩＣ及び４．９ｍｌのＮＭＭの溶液を４００ｍｌのＤＭＦに溶解させ、そしてペプチド樹脂を含む反応器に注ぐ。反応を２．５時間進行させる。該反応器を減圧を使用して空にする。該ペプチド樹脂を５．２ＬのＤＭＦで洗う。該反応器に減圧を適用しそしてＤＭＦを除去した後、該ペプチド樹脂をＤＭＦ中の２０％ピペリジン３７５ｍｌで２０分間処理する。該反応器を、減圧をかけることにより空にし、そしてＤＭＦ中の２０％ピペリジン３７５ｍｌを用いた２回目の２０分間処理を行う。該反応器を再び、減圧をかけることにより空にし、そして５ＬのＤＭＦで該ペプチド樹脂を洗う。該ペプチド樹脂は今、ステップ１２への準備ができている。
【００３９】
ステップ１２：アセチルイミダゾール（３当量）（１４．５ｇ）、及び４．９ｍｌのＮＭＭを４００ｍｌのＤＭＦに溶解させ、そして反応器に注ぐ。１．５時間後、該反応器に減圧を適用して該反応器を空にする。該ペプチド樹脂を５ＬのＤＭＦで洗い、そして該反応器を、減圧を用いて空にする。
【００４０】
ステップ１３：該ペプチド樹脂をＩＰＡで洗い、そして減圧下で乾燥する。ペプチド樹脂（１２９．８ｇ；収率９６％）が単離された。
【００４１】
ステップ１４：乾燥ペプチド樹脂（６０ｇ）を６００ｍｌのＴＦＡに２５時間、室温で懸濁させる。それを次ぎに水２．４Ｌ、酢酸アンモニウム６２０ｇ、エタノール６００ｍｌ及び酢酸６００ｍｌの混合物に注いだ。該混合物を、ＴＦＡを用いて３と４の間のｐＨに調整し、そして濾過する。
【００４２】
ステップ１５：生成物を、２ステップ精製プロトコルを用いて精製する。第１ステップで、逆相Ｃ−１８材料を詰めたカラム（２．５ｃｍｘ３４ｃｍ）を、バッファＡ（０．１２％水性ＴＦＡ）及びバッファＢ（９９．９％エタノール）からなるバッファ系と共に使用する。生成物１．６ｇに相当するステップ１４からの濾過溶液からの容量を、該カラムに適用する。精製を、２−３カラム容量に１０％Ｂ、５−７カラム容量に２９％Ｂで出発するステップ勾配を用い、そして流速７０ｍｌ／分で３カラム容量にわたって２９％Ｂから５０％Ｂへの勾配を用いて行う。この手順を、ステップ１４からの濾過溶液の全てが加工されるまで行う。収集した全フラクションを分析ＨＰＬＣにより分析する。純度９４％を越える生成物を含むフラクションをプールする。第２の精製ステップは、逆相Ｃ−１８材料を詰めたカラム（２．５ｃｍｘ３４ｃｍ）と、バッファＡ（１％水性酢酸）、バッファＢ（９９．９％エタノール）、及びバッファＣ（０．５Ｍ水性酢酸アンモニウム）からなるバッファとを使用して行う。生成物を含むプールしたフラクションから、１．３ｇの生成物に等価な量を該カラムに適用し、そして精製を、ステップ勾配を適用して、２−３カラム容量に１０％Ｂ＋９０％Ｃで出発して、次いで２−３カラム容量に９０％Ａ＋１０％Ｂを用いて行う。生成物を２４％Ｂ＋７６％Ａで溶出する。許容可能な純度を有する生成物を含むフラクションをプールし、同じカラムを使用して脱塩する。脱塩は、バッファＡ（１％水性酢酸）及びバッファＢ（９９．９％エタノール）を使用して行う。生成物１．６ｇに相当するプールされた精製フラクションからの容量を、該カラムに適用し、２−３カラム容量バッファＡを、生成物中のあらゆる酢酸アンモニウムを洗い出すのに使用する。次いで生成物を５０％バッファＡ＋５０％バッファＢを用いて溶出する。５０％のエタノールを含む精製生成物の溶液を、回転蒸発器で濃縮する。全エタノールが除去された時、該生成物を含む残る溶液を親油化する。合計１１．８ｇ（全体収率３７％）のデガレリックスがフワフワした固体として得られる。４−（［２−（５−ヒダントイル）］アセチルアミノ）−フェニルアラニンは該生成物中に検出できなかった（ＨＰＬＣ）。
【００４３】
実施例４
Ｆｍｏｃ−ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡを用いたデガレリックスの合成及び精製
実質的に実施例１の合成及び精製を行った。実施例１の方法からの逸脱：
ａ）Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｐｈ（ｔＢｕ−Ｃｂｍ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｐｈ（Ｃｂｍ）−ＯＨを使用した；
ｂ）Ｈ−Ｄ−２−Ｎａｌ−ペプチド樹脂のＮ−末端のアセチル化を、アセチルイミダゾールの代わりに無水酢酸を用いて行った；
ｃ）エタノールの代わりにアセトニトリルを精製に使用した。
４−（［２−（５−ヒダントイル）］アセチルアミノ）−フェニルアラニンはＨＰＬＣで該生成物中に検出できなかった。
【配列表】
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