(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えリステリア株の染色体のＤ−アラニンラセマーゼ（Ｄａｌ）遺伝子およびＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ（Ｄａｔ）遺伝子の欠失、ならびにａｃｔＡ毒性遺伝子の突然変異または欠失を有する組換えリステリア株であって、前記組換えリステリア株は、第１のオープンリーディングフレームおよび第２のオープンリーディングフレームを含む核酸分子を有し、第１のオープンリーディングフレームは、ａ）非溶血性ＬＬＯタンパク質またはそのＮ末端断片、ｂ）ＰＥＳＴ配列、およびｃ）ＡｃｔＡ断片のうちから選択されるさらなるポリペプチドに融合した配列番号２のＨｅｒ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む組換えポリペプチドをコードしており、第２のオープンリーディングフレームは、Ｄａｌ遺伝子およびＤａｔ遺伝子の前記欠失を相補するアラニンラセマーゼ酵素をコードしている、組換えリステリア株。
【請求項２】
Ｈｅｒ２／ｎｅｕキメラ抗原が配列番号１を含む配列によってコードされている、請求項１に記載の組換えリステリア株。
【請求項３】
Ｈｅｒ２／ｎｅｕキメラ抗原が、マッピングされたヒトＭＨＣクラスＩエピトープのうちの少なくとも５個を含む、請求項１または２に記載の組換えリステリア株。
【請求項４】
前記核酸分子がリステリアゲノムに組み込まれている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換えリステリア株。
【請求項５】
前記核酸分子が組換えリステリア株内のプラスミド中にある、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換えリステリア株。
【請求項６】
前記プラスミドが配列番号５３に記載の核酸を含む、請求項５に記載の組換えリステリア株。
【請求項７】
前記プラスミドが、抗生物質選択の非存在下、組換えリステリア株の中で安定に維持される、請求項５に記載の組換えリステリア株。
【請求項８】
前記プラスミドが、抗生物質に対する耐性を組換えリステリア株に付与しない、請求項５に記載の組換えリステリア株。
【請求項９】
弱毒化されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組換えリステリア株。
【請求項１０】
組換えリステリア・モノサイトゲネス株である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換えリステリア株。
【請求項１１】
ａｃｔＡ毒性遺伝子が欠失または不活化している、請求項１に記載の組換えリステリア株。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換えリステリア株を含む免疫原性組成物。
【請求項１３】
アジュバントをさらに含む、請求項１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
アジュバントが、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリル脂質Ａ、または非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む、請求項１３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
対象におけるＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現腫瘍を治療する用途で使用される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換えリステリア株または請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
前記用途は、腫瘍内のエスケープ変異を予防することを含む、請求項１５に記載の組換えリステリア株または免疫原性組成物。
【請求項１７】
対象においてＨｅｒ２／ｎｅｕ発現腫瘍に対する増強された免疫応答を誘発する用途で使用される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換えリステリア株または請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
前記用途は、腫瘍内のエスケープ変異を予防することを含む、請求項１７に記載の組換えリステリア株または免疫原性組成物。
【請求項１９】
Ｈｅｒ２／ｎｅｕ発現腫瘍に対する免疫応答が、Ｈｅｒ２／ｎｅｕタンパク質のサブドミナントエピトープに対する免疫応答を含む、請求項１７に記載の組換えリステリア株または免疫原性組成物。
【請求項２０】
対象におけるＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現腫瘍の増殖を妨げる用途で使用される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換えリステリア株または請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
前記用途は、腫瘍内のエスケープ変異を予防することを含む、請求項２０に記載の組換えリステリア株または免疫原性組成物。
【請求項２２】
対象におけるＨｅｒ２／ｎｅｕ発現腫瘍の形成を予防する用途で使用される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換えリステリア株または請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
Ｈｅｒ２／ｎｅｕ発現腫瘍を有する対象の腫瘍内Ｔ調節性細胞の頻度を減少させる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換えリステリア株または請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】
前記組換えリステリア株または免疫原性組成物は腫瘍内のエスケープ変異を予防する、請求項２３に記載の組換えリステリア株または免疫原性組成物。
【請求項２５】
Ｈｅｒ２／ｎｅｕ発現腫瘍を有する対象の骨髄由来サプレッサ細胞の頻度を減少させる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換えリステリア株または請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２６】
前記組換えリステリア株または免疫原性組成物は腫瘍内のエスケープ変異を予防する、請求項２５に記載の組換えリステリア株または免疫原性組成物。
【請求項２７】
Ｈｅｒ２／ｎｅｕ発現腫瘍を有する対象のＣＤ８＋／Ｔ調節性細胞の腫瘍内比率を増大させる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換えリステリア株または請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２８】
前記組換えリステリア株または免疫原性組成物は腫瘍内のエスケープ変異を予防する、請求項２７に記載の組換えリステリア株または免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原発現腫瘍を治療し、これに対するワクチンを接種し、ならびにこの抗原のドミナントエピトープおよびいくつかのサブドミナントエピトープに対する免疫応答を誘導するための組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
乳癌は、米国女性において２番目に致命的な形態の癌であり、年間４０，０００人を超える人々を死に至らせている。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ過剰発現は全乳癌の２５〜３０％で検出することができ、侵攻性疾患、ホルモン抵抗性および不良な予後と関連している。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ癌遺伝子は、腫瘍では過剰発現しているが、心臓を除く他の組織では存在が限られているので、免疫療法の潜在的標的である。
【０００３】
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（これ以降、「Ｈｅｒ−２」と表す）は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーのチロシンキナーゼのメンバーである１８５ｋＤａの糖タンパク質であり、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞シグナリングに関与することが知られている細胞内ドメインからなる（非特許文献１および２）。これは、全乳癌の２５〜４０％で過剰発現しており、卵巣、肺、膵臓、および消化管の多くの癌でも過剰発現している。Ｈｅｒ−２の過剰発現は、制御されない細胞増殖およびシグナル伝達と関連しており、その両方ともが腫瘍の発生の一因となっている。Ｈｅｒ−２を過剰発現する癌を有する患者は、Ｈｅｒ−２に対する検出可能な液性応答、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答、およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答にも寛容を示す。
【０００４】
リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）は、主に抗原提示細胞に感染し、これらの細胞の細胞質内での生活に適応している細胞内病原体である。マクロファージなどの宿主細胞は、Ｌ．モノサイトゲネスを活発に貪食し、これらの細菌の大部分は、ファゴリソソームで分解される。細菌の一部は、溶血素のリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）の作用を通じてファゴソーム膜に穴を開けることによって宿主細胞質中に逃げ込む。一旦細胞質に入ると、Ｌ．モノサイトゲネスは宿主のアクチンを重合させ、細胞から細胞へと直接移行し、宿主免疫系からさらに逃れることができ、結果として、Ｌ．モノサイトゲネスに対する抗体応答はほとんど生じない。
【０００５】
タンパク質の細胞外ドメインおよび細胞内ドメイン由来のヒトＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質の小断片を発現するいくつかのリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｍ）ベースのワクチンの構築および開発が報告されている。Ｈｅｒ２／ｎｅｕは大きすぎてＬｍに適合することができず、そのため、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ断片の作製が余儀なくされた。各々の断片で独立に活性が見出されたので、本発明は、各々の独立の断片由来の活性部位を全て組み込んでいる。したがって、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ受容体の既知のＭＨＣクラスＩエピトープの大半を含むタンパク質の細胞外断片のうちの２つと１つの細胞内断片を融合することによって作製されるキメラタンパク質（Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２）に基づくワクチンも作製されている。これらのワクチンは全て、免疫原性でかつＦＶＢ／Ｎマウスで予め樹立された腫瘍を退行させるのに有効であること、およびＨｅｒ２／ｎｅｕ発現トランスジェニック動物で自然発生乳腺腫瘍の発症を遅延させることが示された。これらの予備実験から得られた有望な結果から、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ自己抗原に対する寛容を破り得る組換えリステリア−Ｈｅｒ２１  ｎｅｕワクチンを作製することができることが示唆された。しかしながら、これまで開発されたリステリア−Ｈｅｒ２／ｎｅｕワクチンは、クロラムフェニコールの存在下での組換え細菌のインビトロ選択に抗生物質マーカー（ｃａｔ）を用いる、弱毒化されたリステリアプラットフォームに基づくものであった。臨床的使用のためには、高度の弱毒化だけでなく、抗生物質に対する耐性がないことも重要である。
【０００６】
エスケープ変異を介する宿主免疫応答の腫瘍回避は十分に立証されており、今なお腫瘍治療における大きな障害である。したがって、高い治療効力を有し、かつエスケープ変異を生じさせないワクチンを開発する必要がある。本発明は、明確に定義された弱毒化機構を有し、かつ抗生物質選択マーカーを持たないＬｍｄｄＡワクチンベクターを用いて作製された組換えリステリア−Ｈｅｒ２／ｎｅｕワクチン（ＡＤＸＳ３１−１６４）を提供することによって、この必要に応えている。このキメラ抗原の使用は、エスケープ変異を生じさせないが、これは、腫瘍が突然変異して、この新規抗原による処置に対する有効な治療応答を逃れることがないことを示している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂａｒｇｍａｎｎ  ＣＩ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３１９：２２６，１９８６
【非特許文献２】Ｋｉｎｇ  ＣＲ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：９７４，１９８５
【発明の概要】
【０００８】
一実施形態では、本明細書で提供される発明は、融合ポリペプチドを含む免疫原性組成物であって、該融合ポリペプチドがさらなるポリペプチドに融合したＨｅｒ２／ｎｅｕキメラ抗原を含み、かつ融合タンパク質をＨｅｒ２／ｎｅｕ発現腫瘍を有する対象に投与することにより、該腫瘍内のエスケープ変異が予防される免疫原性組成物に関する。
【０００９】
別の実施形態では、本明細書で提供される発明は、核酸分子を含む組換えリステリアワクチン株に関するものであり、この場合および別の実施形態では、この核酸分子は、ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、該ポリペプチドは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕキメラ抗原を含み、この核酸分子は、代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含み、この代謝酵素は組換えリステリア株の染色体に欠けている内在性遺伝子を相補する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＡＤＸＳ３１−１６４の構築。（Ａ）構成的リステリアｐ６０プロモーターの制御下にＬｍｄｄＡ株の染色体ｄａｌ−ｄａｔ欠失を相補するための枯草菌（ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｂｔｉｌｉｓ）ｄａｌ遺伝子を有するｐＡｄｖ１６４のプラスミドマップ。これはまた、Ｈｅｒ２／ｎｅｕの３つの断片：ＥＣ１（ａａ４０〜１７０）、ＥＣ２（ａａ３５９〜５１８）およびＩＣ１（ａａ６７９〜８０８）の直接的な融合によって構築されたキメラヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子への切断型ＬＬＯ（１〜４４１）の融合を含む。（Ｂ）ｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現および分泌は、抗ＬＬＯ抗体でブロットした、ＴＣＡ沈殿した細胞培養上清のウェスタンブロット解析により、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２（Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８）およびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２（ＡＤＸＳ３１−１６４）で検出した。約１０４ＫＤの示差バンドはｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２に対応する。内在性ＬＬＯは５８ＫＤのバンドとして検出される。リステリア対照はＣｈＨｅｒ２発現を欠いていた。
【図２】ＡＤＸＳ３１−１６４の免疫原性特性。（Ａ）ＮＴ−２細胞を刺激体として、および３Ｔ３／ｎｅｕ細胞を標的として用いて、免疫マウス由来の脾細胞でＨｅｒ２／ｎｅｕリステリアベースのワクチンによって誘発された細胞傷害性Ｔ細胞応答を試験した。Ｌｍ−対照は、無関係な抗原（ＨＰＶ１６−Ｅ７）を発現することを除いてあらゆる点で同一なＬｍｄｄＡバックグラウンドベースのものであった。（Ｂ）マイトマイシンＣ処理したＮＴ−２細胞をインビトロ刺激した２４時間後に、ＥＬＩＳＡで測定した、免疫ＦＶＢ／Ｎマウス由来の脾細胞によって細胞培養培地中に分泌されたＩＦＮ−γ。（Ｃ）タンパク質の異なる領域由来のペプチドとのインビトロでのインキュベーションに応答した、キメラワクチンで免疫したＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウス由来の脾細胞によるＩＦＮ−γ分泌。図のキャプションに記載したように、組換えＣｈＨｅｒ２タンパク質を陽性対照として用い、無関係なペプチド群またはペプチドなしの群は、陰性対照を構成した。ＩＦＮ−γ分泌は、共インキュベーションの７２時間後に回収した細胞培養上清を用いるＥＬＩＳＡアッセイにより検出した。各々のデータ点は３つ１組のデータの平均＋／−標準誤差であった。＊Ｐ値＜０．００１。
【図３】リステリア−ＣｈＨｅｒ２／ｎｅｕワクチンの腫瘍抑制研究。Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスに各々の組換えリステリア−ＣｈＨｅｒ２または対照リステリアワクチンを６回注射した。６週齢で免疫を開始し、３週間おきに２１週まで続けた。腫瘍の出現を週１回の頻度でモニタリングし、無腫瘍マウスのパーセンテージとして表した。＊ｐ＜０．０５、１群当たりＮ＝９。
【図４】脾臓内のＴｒｅｇの％に対するＡＤＸＳ３１−１６４による免疫の効果。ＦＶＢ／Ｎマウスに１×１０６個のＮＴ−２細胞を皮下接種し、１週間間隔で、各々のワクチンで３回免疫した。２回目の免疫の７日後に、脾臓を摘出した。免疫細胞を単離した後、Ｔｒｅｇを検出するために、それらを抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ２５抗体および抗ＦｏｘＰ３抗体で染色した。ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の頻度を示す代表的な実験から得られたＴｒｅｇのドットプロットを、異なる処置群にわたる全ＣＤ３＋Ｔ細胞またはＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージとして表した。
【図５】ＮＴ−２腫瘍内の腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇの％に対するＡＤＸＳ３１−１６４による免疫の効果。ＦＶＢ／Ｎマウスに１×１０６個のＮＴ−２細胞を皮下接種し、１週間間隔で、各々のワクチンで３回免疫した。２回目の免疫の７日後に、腫瘍を摘出した。免疫細胞を単離した後、Ｔｒｅｇを検出するために、それらを抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ２５抗体および抗ＦｏｘＰ３抗体で染色した。（Ａ）代表的な実験から得られたＴｒｅｇのドットプロット。（Ｂ）異なる処置群にわたる全ＣＤ３＋Ｔ細胞またはＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージ（左のパネル）および腫瘍内ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比（右のパネル）として表したＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の頻度。データは、２回の独立した実験から得られた平均±ＳＥＭとして示したものである。
【図６】ＡＤＸＳ３１−１６４のワクチン接種は、脳における乳癌細胞株の増殖を遅延させることができる。Ｂａｌｂ／ｃマウスをＡＤＸＳ３１−１６４または対照リステリアワクチンで３回免疫した。麻酔したマウスにＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞（５，０００個）を頭蓋内注射した。（Ａ）表示した日にＸｅｎｏｇｅｎ  Ｘ−１００  ＣＣＤカメラを用いてマウスのエクスビボイメージングを実施した。（Ｂ）ピクセル強度を、表面積のｃｍ２当たりの１秒間の光子数としてグラフ化した。これを平均輝度として示す。（Ｃ）ＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞、４Ｔ１−ＬｕｃおよびＮＴ−２細胞株によるＨｅｒ２／ｎｅｕの発現を、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体を用いるウェスタンブロットで検出した。マウスマクロファージ様細胞株のＪ７７４．Ａ２細胞を陰性対照として用いた。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、Ｈｅｒ２−ｎｅｕ抗原発現腫瘍のエスケープ変異を予防しながら、腫瘍を予防し、治療し、これに対するワクチンを接種し、およびＨｅｒ２−ｎｅｕ抗原のサブドミナントエピトープに対する免疫応答を誘導するための組成物および方法である。
【００１２】
別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、免疫原性組成物であって、融合ポリペプチドを含み、該融合ポリペプチドがさらなるポリペプチドに融合したＨｅｒ２／ｎｅｕキメラ抗原を含み、この融合タンパク質をＨｅｒ２／ｎｅｕ発現腫瘍を有する対象に投与することにより、該腫瘍内のエスケープ変異が予防される免疫原性組成物である。別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、免疫原性組成物を含む組換えリステリアワクチン株である。
【００１３】
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、組換えリステリアワクチン株であって、核酸分子を含み、この核酸分子が、ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、このポリペプチドが、Ｈｅｒ２／ｎｅｕキメラ抗原を含み、この核酸分子が、代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含み、この代謝酵素が、組換えリステリア株の染色体に欠けている内在性遺伝子を相補する組換えリステリアワクチン株である。別の実施形態では、組換えリステリアワクチン株は、代謝酵素をコードする第３のオープンリーディングフレームを含む核酸分子をさらに含み、この代謝酵素は、組換えリステリア株の染色体に欠けている内在性遺伝子を含む。
【００１４】
別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、組換えリステリアワクチン株であって、核酸分子を含み、この核酸分子が、ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、このポリペプチドが、Ｈｅｒ２／ｎｅｕキメラ抗原を含み、この核酸分子が、各々代謝酵素をコードする第２および第３のオープンリーディングフレームをさらに含み、この代謝酵素が、該組換えリステリア株の染色体に欠けている内在性遺伝子を相補する組換えリステリアワクチン株である。一実施形態では、核酸分子は、リステリアゲノムに組み込まれている。別の実施形態では、核酸分子は、組換えリステリアワクチン株内のプラスミド中にある。さらに別の実施形態では、プラスミドは、抗生物質選択の非存在下、組換えリステリアワクチン株の中で安定に維持される。別の実施形態では、プラスミドは、組換えリステリアに対して抗生物質耐性を付与しない。別の実施形態では、組換えリステリア株は弱毒化されている。別の実施形態では、組換えリステリアは、弱毒化された栄養要求性株である。別の実施形態では、外来抗原の発現が、細菌（例えば、本発明のうちの１つ）にかける高い代謝負荷もまた、重要な弱毒化機構である。
【００１５】
一実施形態では、弱毒株はＬｍｄｄａである。別の実施形態では、この株は、リステリアベースのワクチンの固有の特性である強いアジュバント効果を発揮する。このアジュバント効果の１つの兆候は、無関係なリステリアワクチンまたはＡＤＸＳ−３１−１６４ワクチンのいずれかによって引き起こされる腫瘍内Ｔｒｅｇの数の５倍減少である（本明細書中の図５参照）。別の実施形態では、無関係な抗原（ＨＰＶ１６Ｅ７）を発現するＬｍｄｄＡベクターもまた、おそらくは自然免疫応答の結果としての、腫瘍内のＴｒｅｇの頻度の顕著な減少と関連する。
【００１６】
一実施形態では、弱毒化された栄養要求性リステリアワクチン株は、ＡＤＸＳ−３１−１６４株である。ＡＤＸＳ−３１−１６４は、毒性遺伝子ａｃｔＡの欠失によって弱毒化され、かつｄａｌ遺伝子の相補によってインビボおよびインビトロでＨｅｒ２／ｎｅｕを発現するプラスミドを保持しているリステリアワクチンベクターをベースにしたものである。一実施形態では、ＡＤＸＳ３１−１６４は、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）の最初の４４１アミノ酸に融合したキメラＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質を発現および分泌する。別の実施形態では、ＡＤＸＳ３１−１６４は、トランスジェニック動物でＨＥＲ２／ｎｅｕに対する寛容を破る能力を有する、強力でかつ抗原特異的な抗腫瘍応答をもたらす（実施例参照）。別の実施形態では、ＡＤＸＳ３１−１６４株は高度に弱毒化されており、免疫マウスの脾臓からより速やかに除去されるので、過去のリステリアワクチン世代よりも良好な安全性プロファイルを有する。別の実施形態では、ＡＤＸＳ３１−１６４は、トランスジェニック動物において、このワクチンの抗生物質耐性があり、より毒性の強いバージョンであるＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２よりも長い腫瘍発生の遅延をもたらす（図３参照）。別の実施形態では、ＡＤＸＳ３１−１６４株は免疫原性が高く、ＨＥＲ２／ｎｅｕ自己抗原に対する寛容を破ることができ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニック動物における腫瘍形成を予防する。別の実施形態では、ＡＤＸＳ３１−１６４は、腫瘍内Ｔ調節性細胞（Ｔｒｅｇ）の顕著な減少を引き起こす。別の実施形態では、ＬｍｄｄＡワクチンで処置した腫瘍におけるより低い頻度のＴｒｅｇは、腫瘍内ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の増大をもたらしたが、これにより、ＬｍｄｄＡワクチンによる免疫の後に、より好都合な腫瘍微小環境が得られる可能性があることが示唆される。別の実施形態では、このキメラ抗原の使用は、エスケープ変異を生じさせないが、これは、腫瘍が突然変異して、この新規抗原による処置に対する有効な治療応答を逃れることがないことを示している（実施例６参照）。別の実施形態では、ＡＤＸＳ３１−１６４による末梢免疫は、脳における転移性乳癌細胞株の増殖を遅延させる（実施例７参照）。
【００１７】
一実施形態では、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２株はＬｍ−ＬＬＯ−１３８である。
一実施形態では、キメラ抗原を発現する、弱毒化された抗生物質フリーの組換えリステリアは、本明細書で例示されているように、癌または固形腫瘍を予防し、かつ治療するのに有用である。別の実施形態では、キメラＨｅｒ２／ｎｅｕを発現する組換えリステリアは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕを過剰発現する固形腫瘍を治療するための治療ワクチンとして有用である。別の実施形態では、本明細書で提供されるＨｅｒ２／ｎｅｕキメラ抗原は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ発現腫瘍を治療し、かつそのエスケープ変異を予防するのに有用である。別の実施形態では、「エスケープ変異」という用語は、突然変異して、治療に対する有効な治療応答から逃れる腫瘍を指す。
【００１８】
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、免疫原性組成物をコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸分子であり、ここで、この核酸分子は、組換えリステリアワクチン株内に存在する。別の実施形態では、組換えリステリアを作り上げるために、本明細書で提供される核酸分子を用いて、リステリアを形質転換させる。別の実施形態では、本明細書で提供される核酸は、毒性遺伝子を欠いている。別の実施形態では、リステリアゲノムに組み込まれる核酸分子は、非機能的毒性遺伝子を担持している。別の実施形態では、毒性遺伝子は組換えリステリア内で突然変異している。さらに別の実施形態では、核酸分子を用いて、リステリアゲノムに存在する内在性遺伝子を不活化する。さらに別の実施形態では、毒性遺伝子はＡｃｔＡ遺伝子である。別の実施形態では、毒性遺伝子はＰｒｆＡ遺伝子である。当業者に理解されるように、毒性遺伝子は、組換えリステリアにおける毒性と関連することが当技術分野で知られている任意の遺伝子であることができる。
【００１９】
一実施形態では、リステリア株の染色体において、代謝遺伝子、毒性遺伝子などが欠けている。別の実施形態では、リステリア株の染色体および任意のエピソーム性遺伝因子において、代謝遺伝子、毒性遺伝子などが欠けている。別の実施形態では、毒性株のゲノムにおいて、代謝遺伝子、毒性遺伝子などが欠けている。一実施形態では、毒性遺伝子は、染色体中で突然変異している。別の実施形態では、毒性遺伝子は、染色体から欠失している。各々の候補は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００２０】
一実施形態では、リステリア株の染色体において、代謝遺伝子、毒性遺伝子などが欠けている。別の実施形態では、リステリア株の染色体および任意のエピソーム性遺伝因子において、代謝遺伝子、毒性遺伝子などが欠けている。別の実施形態では、毒性株のゲノムにおいて、代謝遺伝子、毒性遺伝子などが欠けている。一実施形態では、毒性遺伝子は、染色体中で突然変異している。別の実施形態では、毒性遺伝子は、染色体から欠失している。各々の候補は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００２１】
別の実施形態では、本明細書で提供される核酸およびプラスミドは、組換えリステリアに対して抗生物質耐性を付与しない。
「核酸分子」は、別の実施形態では、プラスミドを指す。別の実施形態では、この用語は、組込みベクターを指す。別の実施形態では、この用語は、組込みベクターを含むプラスミドを指す。別の実施形態では、組込みベクターは部位特異的組込みベクターである。別の実施形態では、本発明の方法および組成物の核酸分子は、当技術分野で公知の任意のタイプのヌクレオチドから構成されている。各々の候補は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００２２】
「代謝酵素」は、別の実施形態では、宿主細菌によって必要とされる栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態では、この用語は、宿主細菌によって必要とされる栄養素の合成に必要な酵素を指す。別の実施形態では、この用語は、宿主細菌によって利用される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態では、この用語は、宿主細菌の持続的増殖に必要とされる栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態では、酵素は、栄養素の合成に必要とされる。各々の候補は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００２３】
「安定に維持される」は、別の実施形態では、選択（例えば、抗生物質選択）の非存在下で、１０世代の間、検出可能な喪失を伴わずに、核酸分子またはプラスミドが維持されることを指す。別の実施形態では、期間は１５世代である。別の実施形態では、期間は２０世代である。別の実施形態では、期間は２５世代である。別の実施形態では、期間は３０世代である。別の実施形態では、期間は４０世代である。別の実施形態では、期間は５０世代である。別の実施形態では、期間は６０世代である。別の実施形態では、期間は８０世代である。別の実施形態では、期間は１００世代である。別の実施形態では、期間は１５０世代である。別の実施形態では、期間は２００世代である。別の実施形態では、期間は３００世代である。別の実施形態では、期間は５００世代である。別の実施形態では、期間は世代を超えたものである。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビトロで（例えば、培養物中で）安定に維持される。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビボで安定に維持される。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビトロとインビトロの両方で安定に維持される。各々の候補は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００２４】
一実施形態では、本発明は、抗原を発現する組換えリステリア株を提供する。本発明はまた、Ｈｅｒ−２キメラタンパク質またはその断片に融合したリステリオリシン（ＬＬＯ）タンパク質断片を含む組換えペプチド、それを含むワクチンおよび免疫原性組成物、ならびにそれを含む、抗Ｈｅｒ−２免疫応答を誘導し、Ｈｅｒ−２発現腫瘍を治療し、そのワクチンを接種する方法を提供する。
【００２５】
別の実施形態では、本発明の組換えリステリア株は、動物宿主を通して継代されたものである。別の実施形態では、継代は、ワクチンベクターとしての株の効力を最大化する。別の実施形態では、継代は、リステリア株の免疫原性を安定化する。別の実施形態では、継代は、リステリア株の毒性を安定化する。別の実施形態では、継代は、リステリア株の免疫原性を増大させる。別の実施形態では、継代は、リステリア株の毒性を増大させる。別の実施形態では、継代は、リステリア株を不安定な亜株を除去する。別の実施形態では、継代は、リステリア株の不安定な亜株の蔓延を減少させる。別の実施形態では、リステリア株は、抗原含有組換えペプチドをコードする遺伝子のゲノム挿入を含む。別の実施形態では、リステリア株は、抗原含有組換えペプチドをコードする遺伝子を含むプラスミドを担持する。別の実施形態では、継代は、当技術分野で公知の任意の他の方法によって実施される。
【００２６】
一実施形態では、本明細書で提供されるポリペプチドは、ａ）非溶血性ＬＬＯタンパク質もしくはＮ末端断片、ｂ）ＰＥＳＴ配列、またはｃ）ＡｃｔＡ断片からなる群から選択されるさらなるポリペプチドを含み、さらに、このさらなるポリペプチドが該Ｈｅｒ２／ｎｅｕキメラ抗原に融合している融合タンパク質である。別の実施形態では、さらなるポリペプチドは機能的である。別の実施形態では、さらなるポリペプチドの断片は免疫原性である。別の実施形態では、さらなるポリペプチドは免疫原性である。
【００２７】
別の実施形態では、本明細書で提供されるポリペプチドは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕキメラ抗原に融合した非溶血性ＬＬＯタンパク質またはＮ末端断片を含む融合タンパク質である。別の実施形態では、本発明の方法および組成物の融合タンパク質は、リステリア生物由来のＡｃｔＡ配列を含む。ＡｃｔＡタンパク質およびその断片は、ＬＬＯと同様のやり方で抗原提示および免疫を強化する。
【００２８】
本発明の方法および組成物の別の実施形態では、融合タンパク質は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原およびさらなるポリペプチドを含む。一実施形態では、さらなるポリペプチドは、非溶血性ＬＬＯタンパク質またはその断片である（本明細書中の実施例）。別の実施形態では、さらなるポリペプチドはＰＥＳＴ配列である。別の実施形態では、さらなるポリペプチドは、ＡｃｔＡタンパク質またはその断片である。ＡｃｔＡタンパク質およびその断片は、ＬＬＯと同様のやり方で抗原提示および免疫を強化する。
【００２９】
本発明の方法および組成物のさらなるポリペプチドは、別の実施形態では、リステリオリシン（ＬＬＯ）ペプチドである。別の実施形態では、さらなるポリペプチドは、ＡｃｔＡペプチドである。別の実施形態では、さらなるポリペプチドは、ＰＥＳＴ様配列ペプチドである。別の実施形態では、さらなるポリペプチドは、抗原ペプチドの免疫原性を増強することができる任意の他のペプチドである。各々の候補は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００３０】
Ｈｅｒ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合タンパク質は、例えば、クローニングおよび適当な配列の制限または以下で論じるような方法による直接的な化学合成を含む、任意の好適な方法によって調製することができる。あるいは、部分配列をクローニングし、適当な部分配列を適当な制限酵素を用いて切断することができる。その後、これらの断片を連結して、所望のＤＮＡ配列を生成させる。一実施形態では、ＤＮＡ増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、抗原をコードするＤＮＡを生成させることができる。まず、天然ＤＮＡの断片の両側に新しい末端を有するものを別々に増幅する。一方の増幅された配列の５’末端がペプチドリンカーをコードする一方で、もう一方の増幅された配列の３’末端もペプチドリンカーをコードする。第１の断片の５’末端は第２の断片の３’末端に相補的であるので、（例えば、ＬＭＰアガロース上で部分精製した後の）２つの断片を第３のＰＣＲ反応で重複する鋳型として用いることができる。増幅された配列は、コドン、開裂部位のカルボキシ側の部分（このとき、アミノ配列を形成している）、リンカー、および開裂部位のアミノ側の配列（このとき、カルボキシル配列を形成している）を含む。この抗原をプラスミドに連結する。各々の方法は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００３１】
本発明の結果により、本発明の組成物の投与が、腫瘍細胞を認識し、それを死滅させる抗原特異的Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）の形成を誘導するのに有用であることが示された（本明細書中の実施例）。
【００３２】
一実施形態では、本発明は、Ｈｅｒ−２キメラタンパク質に融合したまたはその断片に融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチドを提供する。一実施形態では、本発明は、Ｈｅｒ−２キメラタンパク質に融合したまたはその断片に融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片からなる組換えポリペプチドを提供する。
【００３３】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＨｅｒ−２キメラタンパク質は、ヒトＨｅｒ−２キメラタンパク質である。別の実施形態では、Ｈｅｒ−２タンパク質は、マウスＨｅｒ−２キメラタンパク質である。別の実施形態では、Ｈｅｒ−２タンパク質は、ラットＨｅｒ−２キメラタンパク質である。別の実施形態では、Ｈｅｒ−２タンパク質は、霊長類Ｈｅｒ−２キメラタンパク質である。別の実施形態では、Ｈｅｒ−２タンパク質は、任意の他の動物種のＨｅｒ−２キメラタンパク質、または当技術分野で公知のこれらの組合せである。各々の候補は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００３４】
別の実施形態では、Ｈｅｒ−２タンパク質は、「ＨＥＲ−２／ｎｅｕ」、「Ｅｒｂｂ２」、「ｖ−ｅｒｂ−ｂ２」、「ｃ−ｅｒｂ−ｂ２」、「ｎｅｕ」または「ｃＮｅｕ」と表されるタンパク質である。各々の候補は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００３５】
一実施形態では、Ｈｅｒ２−ｎｅｕキメラタンパク質は、癌遺伝子のＭＨＣクラスＩエピトープのクラスタを示すＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原の細胞外断片のうちの２つおよび１つの細胞内断片を有し、この場合、別の実施形態では、キメラタンパク質は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原の３つのＨ２ＤｑおよびマッピングされたヒトＭＨＣクラスＩエピトープのうちの少なくとも１７個を有する（断片ＥＣ１、ＥＣ２、およびＩＣ１）（図１参照）。別の実施形態では、キメラタンパク質は、マッピングされたヒトＭＨＣクラスＩエピトープのうちの少なくとも１３個を有する（断片ＥＣ２およびＩＣ１）。別の実施形態では、キメラタンパク質は、マッピングされたヒトＭＨＣクラスＩエピトープのうちの少なくとも１４個を有する（断片ＥＣ１およびＩＣ１）。別の実施形態では、キメラタンパク質は、マッピングされたヒトＭＨＣクラスＩエピトープのうちの少なくとも９個を有する（断片ＥＣ１およびＩＣ２）。別の実施形態では、Ｈｅｒ２−ｎｅｕキメラタンパク質は、非溶血性リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）に融合している。別の実施形態では、Ｈｅｒ２−ｎｅｕキメラタンパク質は、リステリア・モノサイトゲネスのリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質の最初の４４１アミノ酸に融合しており、リステリア・モノサイトゲネスの弱毒化された栄養要求性株ＬｍｄｄＡによって発現および分泌される。別の実施形態では、キメラＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原／ＬＬＯ融合タンパク質を発現する、本明細書で提供される弱毒化された栄養要求性株からの融合タンパク質ｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現および分泌は、インビトロ増殖の８時間後のＴＣＡ沈殿した細胞培養上清中のＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現および分泌と同程度である（図１Ｂ参照）。
【００３６】
一実施形態では、未感作動物または無関係なリステリアワクチンを注射したマウスではＣＴＬ活性が検出されない（図２Ａ参照）。一方、別の実施形態では、本明細書で提供される弱毒化された栄養要求性株（ＡＤＸＳ３１−１６４）は、野生型ＦＶＢ／Ｎマウス由来の脾細胞によるＩＦＮ−γの分泌を刺激することができる（図２Ｂ）。
【００３７】
別の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物の代謝酵素はアミノ酸代謝酵素であり、この場合、別の実施形態では、代謝酵素は、アラニンラセマーゼ酵素である。別の実施形態では、代謝酵素は、Ｄ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である。別の実施形態では、代謝酵素は、組換えリステリア株における細胞壁合成に用いられるアミノ酸の形成を触媒し、この場合、別の実施形態では、代謝酵素は、アラニンラセマーゼ酵素である。
【００３８】
別の実施形態では、代謝酵素をコードする遺伝子は、リステリアｐ６０プロモーターの制御下で発現される。別の実施形態では、（インターナリンをコードする）ｉｎｌＡのプロモーターが用いられる。別の実施形態では、ｈｌｙプロモーターが用いられる。別の実施形態では、ＡｃｔＡプロモーターが用いられる。別の実施形態では、インテグラーゼ遺伝子は、任意の他のグラム陽性プロモーターの制御下で発現される。別の実施形態では、代謝酵素をコードする遺伝子は、リステリアで機能する任意の他のプロモーターの制御下で発現される。当業者であれば、他のプロモーターまたはポリシストロン性発現カセットを用いて、遺伝子の発現を駆動し得ることを理解するであろう。各々の候補は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００３９】
別の実施形態では、Ｈｅｒ−２キメラタンパク質は、配列番号１に示す以下の核酸配列によってコードされている。
【００４０】
【化１】
0005985397.tif 000002
別の実施形態では、Ｈｅｒ−２キメラタンパク質は、以下の配列を有する。
【００４１】
【化２】
0005985397.tif 000003
一実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物のＨｅｒ２キメラタンパク質またはその断片は、そのシグナル配列を含まない。別の実施形態では、シグナル配列の疎水性が高いために、シグナル配列の削除によって、Ｈｅｒ２断片をリステリアでうまく発現させることができる。各々の候補は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００４２】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＨｅｒ２キメラタンパク質の断片は、その膜貫通ドメイン（ＴＭ）を含まない。一実施形態では、ＴＭの疎水性が高いために、ＴＭの削除によって、Ｈｅｒ−２断片をリステリアでうまく発現させることができる。各々の候補は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００４３】
一実施形態では、ラットＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子の核酸配列は、以下のとおりである。
【００４４】
【化３】
0005985397.tif 000004
0005985397.tif 000005
0005985397.tif 000006
一実施形態では、ラット／ｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＥＣ１断片をコードする核酸配列は、以下のとおりである。
【００４５】
【化４】
0005985397.tif 000007
別の実施形態では、ラット／ｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＥＣ２断片をコードする核酸配列は、以下のとおりである。
【００４６】
【化５】
0005985397.tif 000008
別の実施形態では、ラット／ｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＩＣ１断片をコードする核酸配列は、以下のとおりである。
【００４７】
【化６】
0005985397.tif 000009
0005985397.tif 000010
一実施形態では、ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子の核酸配列は、以下のとおりである。
【００４８】
【化７】
0005985397.tif 000011
0005985397.tif 000012
0005985397.tif 000013
別の実施形態では、キメラに組み入れられたヒトｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＥＣ１断片をコードする核酸配列は、ヒトＥＣ１領域の１２０〜５１０ｂｐにまたがり、（配列番号５０）に示されている。
【００４９】
【化８】
0005985397.tif 000014
一実施形態では、完全なＥＣ１ヒトｈｅｒ２／ｎｅｕ断片は、ヒトｈｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子の５８〜９７９ｂｐにまたがり、（配列番号５４）に示されている。
【００５０】
【化９】
0005985397.tif 000015
別の実施形態では、キメラに組み入れられたヒトｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＥＣ２断片をコードする核酸配列は、ヒトｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＥＣ２断片の１０７７〜１５５４ｂｐにまたがり、５０ｂｐの伸長を含み、（配列番号５１）に示されている。
【００５１】
【化１０】
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一実施形態では、完全なＥＣ２ヒトｈｅｒ２／ｎｅｕ断片は、ヒトｈｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子の９０７〜１５０４ｂｐにまたがり、（配列番号５５）に示されている。
【００５２】
【化１１】
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別の実施形態では、キメラに組み入れられたヒトｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＩＣ１断片をコードする核酸配列は、（配列番号５２）に示されている。
【００５３】
【化１２】
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別の実施形態では、完全なヒトｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＩＣ１断片をコードする核酸配列は、ヒトｈｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子の２０３４〜３２４３にまたがり、（配列番号５６）に示されている。
【００５４】
【化１３】
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0005985397.tif 000020
本明細書で提供される方法および組成物で利用されるＬＬＯは、一実施形態では、リステリアＬＬＯである。一実施形態では、ＬＬＯが由来するリステリアは、リステリア・モノサイトゲネス（ＬＭ）である。別の実施形態では、リステリアはリステリア・イバノビイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ）である。別の実施形態では、リステリアは、リステリア・ウェルシメリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ）である。別の実施形態では、リステリアは、リステリア・セエリゲリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）である。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は、非リステリアＬＬＯタンパク質である。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は、合成ＬＬＯタンパク質である。別の実施形態では、それは、組換えＬＬＯタンパク質である。
【００５５】
一実施形態では、ＬＬＯタンパク質は、（配列番号３）に示す以下の核酸配列によってコードされている。
【００５６】
【化１４】
0005985397.tif 000021
別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は、配列番号４の配列を有する。
【００５７】
【化１５】
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この配列に対応するプロタンパク質の最初の２５アミノ酸はシグナル配列であり、細菌によって分泌されるときにＬＬＯから切断される。したがって、この実施形態では、全長の活性型ＬＬＯタンパク質は５０４残基長である。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＤＱ０５４５８８、ＤＱ０５４５８９、ＡＹ８７８６４９、Ｕ２５４５２、またはＵ２５４５２に示される配列を有する。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は、ＬＬＯタンパク質の変異体である。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は、ＬＬＯタンパク質のホモログである。各々の候補は、本発明の別個の実施形態を表す。  
【００５８】
別の実施形態では、「切断型ＬＬＯ」または「ｔＬＬＯ」は、ＰＥＳＴ様ドメインを含むＬＬＯの断片を指す。別の実施形態では、この用語は、アミノ末端の活性化ドメインを含まず、かつシステイン４８４を含まないＬＬＯ断片を指す。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、ＰＥＳＴ配列からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、ＰＥＳＴ配列を含む。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は凡そ、５２９アミノ酸の全長ＬＬＯタンパク質の最初の４００〜４４１アミノ酸からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質の非溶血性形態である。
【００５９】
本発明の方法および組成物の別の実施形態では、本発明の方法および組成物の核酸配列によってコードされるポリペプチドは、キメラＨｅｒ−２／ｎｅｕ抗原およびさらなるポリペプチドを含む融合タンパク質であり、この場合、別の実施形態では、融合タンパク質は、とりわけ、ＬＭの非溶血性ＬＬＯタンパク質（本明細書における実施例）を含む。
【００６０】
一実施形態では、ＬＬＯ断片は凡そ残基１〜２５からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は凡そ残基１〜５０からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は凡そ残基１〜７５からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は凡そ残基１〜１００からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は凡そ残基１〜１２５からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は凡そ残基１〜１５０からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は凡そ残基１１７５からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は凡そ残基１〜２００からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は凡そ残基１〜２２５からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は凡そ残基１〜２５０からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は凡そ残基１〜２７５からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は凡そ残基１〜３００からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は凡そ、残基１〜３２５からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は凡そ残基１〜３５０からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は凡そ残基１〜３７５からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は凡そ残基１〜４００からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は凡そ残基１〜４２５からなる。各々の候補は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００６１】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物の融合タンパク質は、ＬＬＯタンパク質に由来するか、または別の生物、例えば、原核生物に由来するかのいずれかのＰＥＳＴ配列を含む。
【００６２】
ＰＥＳＴ様ＡＡ配列は、別の実施形態では、配列番号５〜９から選択される配列を有する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、ＬＭのＡｃｔＡタンパク質由来のＰＥＳＴ様配列である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、ＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲ（配列番号５）、ＫＡＳＶＴＤＴＳＥＧＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＴＰＱＰＬＫ（配列番号６）、ＫＮＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲ（配列番号７）、またはＲＧＧＩＰＴＳＥＥＦＳＳＬＮＳＧＤＦＴＤＤＥＮＳＥＴＴＥＥＥＩＤＲ（配列番号８）である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、連鎖球菌属の種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ）のストレプトリシンＯタンパク質に由来する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のストレプトリシンＯ、例えば、ＡＡ３５〜５１のＫＱＮＴＡＳＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号９）に由来する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）のストレプトリシンＯ、例えば、ＡＡ３８〜５４のＫＱＮＴＡＮＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号１０）に由来する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、原核生物に由来する別のＰＥＳＴ様ＡＡ配列である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、当技術分野で公知の任意の他のＰＥＳＴ様配列である。各々の候補は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００６３】
一実施形態では、抗原とＬＭのＰＥＳＴ様配列との融合は、抗原の細胞媒介性かつ抗腫瘍性の免疫を増強した。したがって、抗原と他の原核生物に由来する他のＰＥＳＴ様配列との融合もまた、抗原の免疫原性を増強するであろう。他の原核生物のＰＥＳＴ様配列は、例えば、ＬＭについて、Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｇｅｒｓ（１９９６，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１：２６７−２７１）によって記載されたような方法に従って同定することができる。あるいは、他の原核生物由来のＰＥＳＴ様ＡＡ配列は、この方法に基づいて同定することもできる。ＰＥＳＴ様ＡＡ配列が由来する他の原核生物は、限定するものではないが、他のリステリア種を含むと考えられる。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、抗原性タンパク質内に埋め込まれている。したがって、別の実施形態では、「融合」は、抗原と、抗原の一方の末端で連結しているかまたは抗原内に埋め込まれているかのいずれかのＰＥＳＴ様アミノ酸配列とを両方含む抗原性タンパク質を指す。
【００６４】
別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、本発明の組換えポリペプチドを含むワクチンである。別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、本発明の組換えポリペプチドからなるワクチンである。
【００６５】
別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、本発明の組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド分子である。別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、ヌクレオチド分子を含むワクチンである。
【００６６】
別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、本発明の組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド分子である。
別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、本発明のヌクレオチド分子によってコードされる組換えポリペプチドである。
【００６７】
別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、本発明のヌクレオチド分子または組換えポリペプチドを含むワクチンである。
別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、本発明のヌクレオチド分子または組換えポリペプチドを含む免疫原性組成物である。
【００６８】
別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、本発明のヌクレオチド分子または組換えポリペプチドを含むベクターである。
別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、本発明のヌクレオチド分子を含む組換え形態のリステリアである。
【００６９】
別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、本発明の組換え形態のリステリアを含むワクチンである。
別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、本発明の組換え形態のリステリアの培養物である。
【００７０】
一実施形態では、本発明の方法で使用されるワクチンは、本明細書で記載されたような任意の形態または実施形態の組換えリステリア・モノサイトゲネスを含む。一実施形態では、本発明で使用されるワクチンは、本明細書で記載されたような任意の形態または実施形態の本発明の組換えリステリア・モノサイトゲネスからなる。別の実施形態では、本発明の方法で使用されるワクチンは、本明細書で記載されたような任意の形態または実施形態の本発明の組換えリステリア・モノサイトゲネスから本質的になる。一実施形態では、「含む」という用語は、ワクチンへの組換えリステリア・モノサイトゲネスの包含、ならびに当技術分野で公知であり得る他のワクチンまたは治療の包含を指す。別の実施形態では、「から本質的になる」という用語は、その機能成分は組換えリステリア・モノサイトゲネスであるが、ワクチンの治療効果に直接関与しない他のワクチン成分が含まれ得るワクチンを指し、かつ例えば、組換えリステリア・モノサイトゲネスの効果を促進する（例えば、安定化する、持続するなど）成分を指す場合もある。別の実施形態では、「からなる」という用語は、組換えリステリア・モノサイトゲネスを含有するワクチンを指す。
【００７１】
別の実施形態では、本発明の方法は、本明細書で記載されたような任意の形態または実施形態の組換えリステリア・モノサイトゲネスを投与する工程を含む。一実施形態では、本発明の方法は、本明細書で記載されたような任意の形態または実施形態の本発明の組換えリステリア・モノサイトゲネスを投与する工程からなる。別の実施形態では、本発明の方法は、本明細書で記載されたような任意の形態または実施形態の本発明の組換えリステリア・モノサイトゲネスを投与する工程から本質的になる。一実施形態では、「含む」という用語は、本方法への組換えリステリア・モノサイトゲネスを投与する工程の包含、ならびに当技術分野で公知であり得る他の方法または治療の包含を指す。別の実施形態では、「から本質的になる」という用語は、その機能成分は組換えリステリア・モノサイトゲネスの投与であるが、本方法の治療効果に直接関与しない本方法の他の工程が含まれ得る方法を指し、かつ例えば、組換えリステリア・モノサイトゲネスの投与の効果を促進する工程を指す場合もある。一実施形態では、「からなる」という用語は、さらなる工程を伴わずに組換えリステリア・モノサイトゲネスを投与する方法を指す。
【００７２】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物のリステリアは、リステリア・モノサイトゲネスである。別の実施形態では、リステリアは、リステリア・イバノビイである。別の実施形態では、リステリアは、リステリア・ウェルシメリである。別の実施形態では、リステリアは、リステリア・セエリゲリである。各々のタイプのリステリアは、本発明の別個の実施形態を表す。
【００７３】
一実施形態では、本発明の方法および組成物のリステリア株は、ＡＤＸＳ３１−１６４株である。別の実施形態では、ＡＤＸＳ３１−１６４は、野生型ＦＶＢ／Ｎマウス由来の脾細胞によるＩＦＮ−γの分泌を刺激する。さらに、本明細書で示したデータは、ＡＤＸＳ３１−１６４が、標的とされる抗原の異なるドメインに位置するヒトエピトープに対する抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ特異的免疫応答を誘発することができることを示す。
【００７４】
別の実施形態では、本発明は、Ｈｅｒ−２キメラタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド分子を含む組換え形態のリステリアを提供する。
一実施形態では、本発明は、対象の抗Ｈｅｒ−２免疫応答を誘導する方法であって、対象にＨｅｒ−２キメラタンパク質に融合したまたはその断片に融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチドを投与し、それにより、対象の抗Ｈｅｒ−２免疫応答を誘導する方法を提供する。
【００７５】
一実施形態では、本発明の方法および組成物の融合タンパク質は、ＬＬＯ由来のＬＬＯシグナル配列を含む。別の実施形態では、２つのタンパク質分子（ＬＬＯ断片および抗原）は直接結合している。別の実施形態では、２つの分子は、１以上のアミノ酸からなる短いスペーサーペプチドによって結合している。一実施形態では、スペーサーは、タンパク質を結合させること、またはその２つの分子間でいくらかの最小距離もしくは他の空間的関係を維持すること以外は、特定の生物活性を持たない。別の実施形態では、スペーサーの構成アミノ酸は、フォールディング、正味の電荷、または疎水性などの、分子のある特性に影響を与えるように選択される。別の実施形態では、２つのタンパク質分子（ＬＬＯ断片および抗原）は別々に合成されるかまたは融合されない。別の実施形態では、２つのタンパク質分子は、同じ核酸から別々に合成される。さらに別の実施形態では、２つの分子は、別々の核酸から個々に合成される。各々の候補は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００７６】
別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、対象の抗Ｈｅｒ−２免疫応答を誘導する方法であって、対象にＨｅｒ−２キメラタンパク質に融合したまたはその断片に融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを投与し、それにより、対象の抗Ｈｅｒ−２免疫応答を誘導することを含む方法である。
【００７７】
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、対象のＨｅｒ２／ｎｅｕ発現腫瘍に対する増強された免疫応答を誘発させる方法であり、この場合、別の実施形態では、本方法は、対象に本明細書で提供される組換えリステリアワクチン株を含む組成物を投与することを含む。別の実施形態では、Ｈｅｒ−２発現腫瘍に対する免疫応答は、Ｈｅｒ−２タンパク質のサブドミナントエピトープに対する免疫応答を含む。別の実施形態では、Ｈｅｒ−２発現腫瘍に対する免疫応答は、Ｈｅｒ−２タンパク質のいくつかのサブドミナントエピトープに対する免疫応答を含む。別の実施形態では、Ｈｅｒ−２発現腫瘍に対する免疫応答は、Ｈｅｒ−２タンパク質の少なくとも１〜５個のサブドミナントエピトープに対する免疫応答を含む。別の実施形態では、Ｈｅｒ−２発現腫瘍に対する免疫応答は、Ｈｅｒ−２タンパク質の少なくとも１〜１０個のサブドミナントエピトープに対する免疫応答を含む。別の実施形態では、Ｈｅｒ−２発現腫瘍に対する免疫応答は、Ｈｅｒ−２タンパク質の少なくとも１〜１７個のサブドミナントエピトープに対する免疫応答を含む。別の実施形態では、Ｈｅｒ−２発現腫瘍に対する免疫応答は、Ｈｅｒ−２タンパク質の少なくとも１７個のサブドミナントエピトープに対する免疫応答を含む。
【００７８】
発癌タンパク質Ｈｅｒ２／ｎｅｕにおける点突然変異またはアミノ酸欠失は、これらの腫瘍が、小断片のリステリアベースのワクチンまたはトラスツズマブ（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原の細胞外ドメインにあるエピトープに対するモノクローナル抗体）によって標的とされたときに、耐性腫瘍細胞の治療を仲介することが報告されている。本明細書で記載されるのは、癌遺伝子のＭＨＣクラスＩエピトープのクラスタを示す、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原の細胞外断片のうちの２つおよび１つの細胞内断片を有するキメラＨｅｒ２／ｎｅｕベースの組成物である。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原の３つのＨ２ＤｑおよびマッピングされたヒトＭＨＣクラスＩエピトープのうちの少なくとも１７個を有するこのキメラタンパク質を、リステリア・モノサイトゲネスのリステリオリシンＯタンパク質の最初の４４１アミノ酸に融合し、リステリア・モノサイトゲネスの弱毒株ＬｍｄｄＡによって発現および分泌させた。
【００７９】
以前の報告は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原の小断片を別々に発現および分泌するリステリアベースのワクチン（その各々は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ癌遺伝子のＨ２Ｄｑエピトープの１つだけを有する）でＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスを免疫したとき、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ過剰発現腫瘍は、各々のワクチンによって標的とされるＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原のそれらのエピトープにおける突然変異のためにエスケープすることができることを示した（Ｓｉｎｇｈ  Ｒ，Ｐａｔｅｒｓｏｎ  Ｙ．  Ｉｍｍｕｎｏｅｄｉｔｉｎｇ  ｓｃｕｌｐｔｓ  ｔｕｍｏｒ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００７；６７：１８８７−９２を参照されたい）。本明細書で示されるのは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕタンパク質の３つ以上のエピトープをキメラワクチンに組み入れると、それは、エスケープ変異によるこれらの腫瘍の選択およびエスケープを消失させることができるという予想外の結果である。新規のＨｅｒ２／ｎｅｕキメラリステリアワクチンによる免疫は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原における点突然変異またはアミノ酸欠失と関連し得るいかなるエスケープ変異も生じさせなかった（本明細書の実施例４を参照されたい）。
【００８０】
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、Ｈｅｒ−２キメラタンパク質またはキメラタンパク質を発現する組換えポリペプチドを発現するように、リステリアワクチン株を改変する方法であって、リステリア株を核酸分子で形質転換することを含む方法である。別の実施形態では、核酸分子は、ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、このポリペプチドは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む。別の実施形態では、核酸分子は、代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含み、該代謝酵素は、組換えリステリア株の染色体に欠けている内在性遺伝子を相補し、それにより、Ｈｅｒ−２キメラタンパク質を発現するようにリステリアワクチン株を改変する。
【００８１】
一実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物は、アジュバントをさらに含み、この場合、別の実施形態では、このアジュバントは、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリル脂質Ａ、または非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む。
【００８２】
一実施形態では、弱毒化されたリステリア株、例えば、ＬＭのｄｅｌｔａ−ａｃｔＡ突然変異体（Ｂｒｕｎｄａｇｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９０：１１８９０−１１８９４）、Ｌ．モノサイトゲネスのｄｅｌｔａ−ｐｌｃＡ（Ｃａｍｉｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９１，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７３：７５１−７５４）、またはｄｅｌｔａ−ＡｃｔＡ、ｄｅｌｔａ  ＩＮＬ−ｂ（Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ５  ａｌ，２００４，ＰＮＡＳ，１０１：１３８３２−１３８３７）を本発明で用いる。別の実施形態では、本明細書における開示を実践したときに当業者に理解されるように、弱毒化されたリステリア株は、１つ以上の弱毒化突然変異を導入することによって構築される。そのような株の例としては、芳香族アミノ酸に対して栄養要求性を有するリステリア株（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９３，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０  ６１：２２４５−２２４８）およびリポタイコ酸の形成の突然変異体（Ａｂａｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：１−１４）および毒性遺伝子の欠如によって弱毒化されたものが挙げられるが、これらに限定されない（本明細書の実施例を参照されたい）。
【００８３】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物の核酸分子は、プロモーター／調節配列に機能的に連結されている。別の実施形態では、本発明の方法および組成物の第１のオープンリーディングフレームは、プロモーター／調節配列に機能的に連結されている。別の実施形態では、本発明の方法および組成物の第２のオープンリーディングフレームは、プロモーター／調節配列に機能的に連結されている。別の実施形態では、オープンリーディングフレームの各々は、プロモーター／調節配列に機能的に連結されている。各々の候補は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００８４】
当業者であれば、本明細書における開示および本明細書で提供される方法を実践したときに、様々な転写プロモーター、ターミネーター、キャリアベクターまたは特定の遺伝子配列（例えば、市販のクローニングベクター中にあるもの）を本発明の方法および組成物でうまく用いることができることを容易に理解するであろう。本発明で想定されているように、これらの機能性は、例えば、ｐＵＣシリーズとして知られる市販ベクター中に提供されている。別の実施形態では、必須でないＤＮＡ配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子）を除去する。各々の候補は、本発明の別個の実施形態を表す。別の実施形態では、市販プラスミドが本発明で用いられる。そのようなプラスミドは、種々の供給源、例えば、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（カリフォルニア州ラ・ホーヤ）、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（カリフォルニア州ラ・ホーヤ）、クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（カリフォルニア州パロアルト）から入手可能であるか、または当技術分野で周知の方法を用いて構築することができる。
【００８５】
別の実施形態は、ｐＣＲ２．１（インビトロジェン、カリフォルニア州ラ・ホーヤ）などのプラスミドである。これは、原核生物での発現を促進する原核生物の複製起点およびプロモーター／調節因子を有する原核生物発現ベクターである。別の実施形態では、プラスミドのサイズを小さくし、その中に入れることができるカセットのサイズを大きくするために、無関係なヌクレオチド配列を除去する。
【００８６】
そのような方法は当技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）およびＡｕｓｕｂｅｉら（１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  ＆  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載されている。
【００８７】
抗生物質耐性遺伝子は、分子生物学およびワクチン調製において一般に利用される従来の選択およびクローニング過程で用いられる。本発明で想定される抗生物質耐性遺伝子としては、アンピシリン、ペニシリン、メチシリン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール（ＣＡＴ）、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ジェネティシンおよび当技術分野で周知の他の抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子産物が挙げられるが、これらに限定されない。各々の遺伝子は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００８８】
細菌を形質転換するための方法は周知であり、これには、塩化カルシウムによるコンピテントセルに基づく方法、エレクトロポレーション法、バクテリオファージによる形質導入、化学的、および物理的形質転換技術が含まれる（ｄｅ  Ｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９８９，Ｃｅｌｌ  ５６：６４１−６４９；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９５，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，９：１９０−１９９；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｇｅｒｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．；Ｍｉｌｌｅｒ，１９９２，Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）。別の実施形態では、本発明のリステリアワクチン株をエレクトロポレーションによって形質転換する。各々の方法は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００８９】
別の実施形態では、コンジュゲーションを用いて、遺伝物質および／またはプラスミドを細菌に導入する。コンジュゲーションのための方法は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｎｉｋｏｄｉｎｏｖｉｃ  Ｊら（Ａ  ｓｅｃｏｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｎｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｈｕｔｔｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｌｅ  ｂｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．Ｐｌａｓｍｉｄ．２００６  Ｎｏｖ；５６（３）：２２３−７）およびＡｕｃｈｔｕｎｇ  ＪＭら（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｍｏｂｉｌｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｌｏｂａｌ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００５  Ａｕｇ  ３０；１０２（３５）：１２５５４−９）に記載されている。各々の方法は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００９０】
「形質転換する」は、一実施形態では、「トランスフェクションする」という用語と同じように用いられ、細菌細胞を操作してプラスミドまたは他の異種ＤＮＡ分子を取り込ませることを指す。別の実施形態では、「形質転換する」は、細菌細胞を操作してプラスミドまたは他の異種ＤＮＡ分子の遺伝子を発現させることを指す。各々の候補は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００９１】
本発明で有用なプラスミドおよび他の発現ベクターは、本明細書の他の場所に記載されており、プロモーター／調節配列、グラム陰性およびグラム陽性細菌用の複製起点、融合タンパク質をコードする単離された核酸ならびにアミノ酸代謝遺伝子をコードする単離された核酸のような特徴を含むことができる。さらに、融合タンパク質およびアミノ酸代謝遺伝子をコードする単離された核酸は、そのような単離された核酸の発現を駆動するのに好適なプロモーターを有する。細菌系で発現を駆動するのに有用なプロモーターは、当技術分野で周知であり、これには、バクテリオファージλ、ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモーター、ｐＢＲ３２５のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモーターが含まれる。原核生物プロモーターのさらなる例としては、５つのバクテリオファージλの主要な右プロモーターおよび左プロモーター（ＰＬおよびＰＲ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ｌａｃＺ、ｌａｃＩ、およびｇａｌプロモーター、α−アミラーゼ（Ｕｌｍａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８５．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６２：１７６−１８２）ならびに枯草菌のＳ２８特異的プロモーター（Ｇｉｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８４  Ｇｅｎｅ  ３２：１１−２０）、バチルス属のバクテリオファージのプロモーター（Ｇｒｙｃｚａｎ，１９８２，Ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、およびストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）のプロモーター（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，１９８６，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３：４６８−４７８）が挙げられる。本発明で想定されるさらなる原核生物プロモーターは、例えば、Ｇｌｉｃｋ（１９８７，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：２７７−２８２）；Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｏ（１９８６，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，６８：５０５−５１６）；およびＧｏｔｔｅｓｍａｎ（１９８４，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：４１５−４４２）に概説されている。本発明で想定されるプロモーター／調節因子のさらなる例としては、リステリアのｐｒｆＡプロモーター、リステリアのｈｌｙプロモーター、リステリアのｐ６０プロモーターおよびリステリアのＡｃｔＡプロモーター（ジェンバンク受託番号ＮＣ＿００３２１０）またはそれらの断片が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物のプラスミドは、融合タンパク質をコードする遺伝子を含む。別の実施形態では、部分配列をクローニングし、適当な部分配列を適当な制限酵素を用いて切断する。その後、別の実施形態では、これらの断片を連結して、所望のＤＮＡ配列を生じさせる。別の実施形態では、ＤＮＡ増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、抗原をコードするＤＮＡを生じさせる。まず、天然ＤＮＡの断片の両側に新しい末端を有するものを別々に増幅する。一方の増幅された配列の５’末端がペプチドリンカーをコードする一方で、もう一方の増幅された配列の３’末端もペプチドリンカーをコードする。第１の断片の５’末端は第２の断片の３’末端に相補的であるので、（例えば、ＬＭＰアガロースで部分精製した後の）２つの断片は、第３のＰＣＲ反応で重複する鋳型として用いることができる。増幅された配列は、コドン、開裂部位のカルボキシ側の部分（このとき、アミノ配列を形成している）、リンカー、および開裂部位のアミノ側の配列（このとき、カルボキシル配列を形成している）を含む。この抗原をプラスミドに連結する。各々の方法は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００９３】
別の実施形態では、本発明はさらに、臨床応用されるファージベースの染色体組込み系を含む。限定するものではないが、ｄ−アラニンラセマーゼをはじめとする必須酵素に対して栄養要求性を有する宿主株、例えば、Ｌｍｄａｌ（−）ｄａｔ（−）を用いる。別の実施形態では、「ファージ除去段階（ｐｈａｇｅ  ｃｕｒｉｎｇ  ｓｔｅｐ）」を防ぐために、ＰＳＡに基づくファージ組込み系を用いる（Ｌａｕｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，２００２  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１８４：４１７７−４１８６）。これは、別の実施形態では、組み込まれた遺伝子を維持するために抗生物質による持続的な選択を必要とする。したがって、別の実施形態では、本発明は、抗生物質を用いた選択を必要としない、ファージベースの染色体組込み系の確立を可能にする。その代わり、栄養要求性宿主株は相補される。
【００９４】
本発明の組換えタンパク質は、別の実施形態では、組換えＤＮＡ法を用いて合成される。これは、一実施形態では、融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を作製し、このＤＮＡを特定のプロモーター／調節因子の制御下で発現カセット（例えば、本発明のプラスミド）に置き、タンパク質を発現させることを含む。本発明の融合タンパク質（例えば、非溶血性ＬＬＯ／抗原）をコードするＤＮＡを、別の実施形態では、例えば、適当な配列のクローニングおよび制限処理またはＮａｒａｎｇらのホスホトリエステル法（１９７９，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９９）；Ｂｒｏｗｎらのホスホジエステル法（１９７９，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ  ６８：１０９−１５１）；Ｂｅａｕｃａｇｅらのジエチルホスホロアミダイト法（１９８１，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．，２２：１５  １８５９−１８６２）；および米国特許第４，４５８，０６６号の固相支持体法などの直接的な化学合成をはじめとする、任意の好適な方法によって調製することができる。
【００９５】
別の実施形態では、化学合成を用いて、一本鎖オリゴヌクレオチドを生成させる。この一本鎖オリゴヌクレオチドは、様々な実施形態では、相補配列とのハイブリダイゼーションによって、または一本鎖を鋳型として用いるＤＮＡポリメラーゼとの重合によって、二本鎖ＤＮＡに変換される。当業者であれば、ＤＮＡの化学合成は約１００塩基の配列に限定されるが、より長い配列はより短い配列の連結によって得ることができることを認識するであろう。別の実施形態では、部分配列をクローニングし、適当な部分配列を適当な制限酵素を用いて切断する。その後、これらの断片を連結して、所望のＤＮＡ配列を生成させる。
【００９６】
別の実施形態では、本発明の融合タンパク質または組換えタンパク質をコードするＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などのＤＮＡ増幅法を用いてクローニングされる。したがって、非溶血性ＬＬＯの遺伝子は、好適な制限酵素部位を含むセンスプライマーと別の制限部位（例えば、クローニングを容易にするための同一でない制限部位）を含むアンチセンスプライマーとを用いてＰＣＲ増幅される。抗原をコードする単離された核酸についても同じことを繰り返す。非溶血性ＬＬＯ配列と抗原配列の連結、およびプラスミドまたはベクターへの挿入により、抗原の末端に結合した非溶血性ＬＬＯをコードするベクターが生成される。２つの分子は、直接的に、または制限部位によって導入される短いスペーサーによって結合される。
【００９７】
別の実施形態では、これらの分子は、１つ以上のアミノ酸からなるペプチドスペーサーによって隔てられており、通常、スペーサーは、タンパク質を結合させること、またはこれらの分子間でいくらかの最小距離もしくは他の空間的関係を維持すること以外は、特定の生物活性を持たない。別の実施形態では、スペーサーの構成成分ＡＡは、フォールディング、正味の電荷、または疎水性などの、分子のある特性に影響を与えるように選択される。別の実施形態では、融合タンパク質または組換えタンパクをコードする核酸配列は、大腸菌、他の細菌宿主（例えば、リステリア）、酵母、ならびに様々な高等真核細胞（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯおよびＨｅＬａ細胞株、ならびに骨髄腫細胞株）をはじめとする、種々の宿主細胞に形質転換される。組換え融合タンパク質遺伝子は、各宿主用の適切な発現制御配列に機能的に連結される。プロモーター／調節配列は、本明細書の他の場所で詳細に記載されている。別の実施形態では、プラスミドはさらに、さらなるプロモーター調節因子、ならびにリボソーム結合部位および転写終結シグナルを含む。真核細胞については、制御配列は、例えば、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、サイトメガロウイルスなどに由来するプロモーターおよびエンハンサー、ならびにポリアデニル化配列を含む。別の実施形態では、配列は、スプライスドナーおよびアクセプター配列を含む。
【００９８】
一実施形態では、「機能的に連結された」という用語は、そのように記載された構成要素が、その意図された様式で機能することを可能にする関係にある並置を指す。コード配列に「機能的に連結された」制御配列は、コード配列の発現が制御配列と適合する条件下で達成されるように連結されている。
【００９９】
別の実施形態では、プラスミドを含む栄養要求性細菌について選択するために、形質転換した栄養要求性細菌を、アミノ酸代謝遺伝子の発現について選択する培地上で増殖させる。別の実施形態では、Ｄ−グルタミン酸合成に対して栄養要求性を有する細菌がＤ−グルタミン酸合成のための遺伝子を含むプラスミドで形質転換され、栄養要求性細菌は、Ｄ−グルタミン酸の非存在下で増殖するのに対し、プラスミドで形質転換されていないか、またはＤ−グルタミン酸合成のためのタンパク質をコードするプラスミドを発現していない栄養要求性細菌は増殖しない。別の実施形態では、Ｄ−アラニン合成に対する栄養要求性を有する細菌は、形質転換されて、本発明のプラスミドを発現しているとき、そのプラスミドがＤ−アラニン合成のためのアミノ酸代謝酵素をコードする単離された核酸を含むならば、Ｄ−アラニンの非存在下で増殖する。必要な増殖因子、補助因子、アミノ酸、ビタミン、抗生物質などを含むかまたはこれらを欠く適切な培地を作製するためのそのような方法は当技術分野で周知であり、かつ市販されている（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ニュージャージー州フランクリン・レイクス）。各々の方法は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１００】
別の実施形態では、本発明のプラスミドを含む栄養要求性細菌が適当な培地上で選択されれば、細菌は、選択圧の存在下で繁殖する。そのような繁殖は、栄養要求性因子を含まない培地中で細菌を増殖させることを含む。栄養要求性細菌におけるアミノ酸代謝酵素を発現するプラスミドの存在は、プラスミドが細菌とともに複製すること、したがって、プラスミドを有する細菌について絶えず選択することを保証する。当業者であれば、本開示および本明細書における方法を身に付けたときに、プラスミドを含む栄養要求性細菌が増殖している培地の容量を調整することによって、リステリアワクチンベクターの産生を容易にスケールアップすることができるであろう。
【０１０１】
当業者であれば、別の実施形態では、本発明とともに用いるために、他の栄養要求性株および相補系が採用されることを理解するであろう。
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、対象におけるＨｅｒ−２発現腫瘍の増殖を妨げる方法であり、この場合および別の実施形態では、本方法は、対象に本明細書で記載される組換えリステリアワクチン株を含む組成物を投与する工程を含む。
【０１０２】
別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、対象におけるＨｅｒ−２発現腫瘍の増殖を妨げる方法であり、この場合および別の実施形態では、本方法は、対象に本明細書で記載される組換えリステリアワクチン株を含む組成物を投与する工程を含む。
【０１０３】
別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、対象のＨｅｒ２／ｎｅｕ発現腫瘍に対する増強された免疫応答を誘発させる方法であり、この場合および別の実施形態では、本方法は、対象に本明細書で記載した組換えリステリアワクチン株を含む組成物を投与する工程を含む。さらに別の実施形態では、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ発現腫瘍に対する免疫応答は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕタンパク質の少なくとも１つのサブドミナントエピトープに対する免疫応答を含む。
【０１０４】
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ過剰発現腫瘍の治療におけるエスケープ変異を予防する方法であり、この場合および別の実施形態では、本方法は、該対象に本明細書で提供される組換えリステリアワクチン株を含む組成物を投与する工程を含む。
【０１０５】
別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、対象におけるＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原発現腫瘍の発症を予防する方法であり、この場合および別の実施形態では、本方法は、対象に本明細書で提供される組換えリステリアワクチン株を含む組成物を投与する工程を含む。
【０１０６】
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、腫瘍内Ｔ調節性細胞の頻度を低下させる方法であり、この場合および別の実施形態では、本方法は、対象に本明細書で提供される組換えリステリアワクチン株を含む組成物を投与する工程を含む。
【０１０７】
別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、腫瘍内Ｔ調節性細胞の頻度を低下させる方法であり、この場合および別の実施形態では、本方法は、対象に本明細書で提供される組換えリステリアワクチン株を含む組成物を投与する工程を含む。
【０１０８】
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、腫瘍内骨髄由来サプレッサ細胞の頻度を低下させる方法であり、この場合および別の実施形態では、本方法は、対象に本明細書で提供される組換えリステリアワクチン株を含む組成物を投与する工程を含む。
【０１０９】
別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、骨髄由来サプレッサ細胞の頻度を低下させる方法であり、この場合および別の実施形態では、本方法は、対象に本明細書で提供される組換えリステリアワクチン株を含む組成物を投与する工程を含む。
【０１１０】
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、対象におけるＨｅｒ２／ｎｅｕ発現腫瘍の形成を予防する方法であり、この場合および別の実施形態では、本方法は、対象に本明細書で提供される組換えリステリアワクチン株を含む組成物を投与する工程を含む。
【０１１１】
別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、対象におけるＨｅｒ２／ｎｅｕ発現腫瘍の形成を予防する方法であり、この場合および別の実施形態では、本方法は、対象に本明細書で提供される組換えリステリアワクチン株を含む組成物を投与する工程を含む。
【０１１２】
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、対象のＨｅｒ２／ｎｅｕ発現腫瘍を治療する方法であり、この場合および別の実施形態では、本方法は、対象に本明細書で提供される組換えリステリアワクチン株を含む組成物を投与する工程を含む。
【０１１３】
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、本発明の組成物を投与する方法である。別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、本発明のワクチンを投与する方法である。別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、本発明の組換えポリペプチドまたは組換えヌクレオチドを投与する方法である。別の実施形態では、本発明の組成物、ワクチン、組換えポリペプチドまたは組換えヌクレオチドを投与する工程は、組成物、ワクチン、組換えヌクレオチドを含むかまたは組換えポリペプチドを発現する弱毒化された組換え形態のリステリアを用いて、各々がそれ独自の個別の実施形態で実施される。別の実施形態では、投与は、異なる弱毒化細菌ベクターを用いて実施される。別の実施形態では、投与は、ＤＮＡワクチン（例えば、裸のＤＮＡワクチン）を用いて実施される。別の実施形態では、本発明の組換えポリペプチドの投与は、タンパク質を組換えによって産生した後、組換えタンパク質を対象に投与することによって実施される。各々の候補は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１１４】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物によって誘発される免疫応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性応答を含む。別の実施形態では、免疫応答は、主にＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性応答からなる。別の実施形態では、免疫応答の唯一の検出可能成分は、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性応答である。
【０１１５】
別の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物によって誘発される免疫応答は、ＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性応答を含む。別の実施形態では、免疫応答は、主にＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性応答からなる。別の実施形態では、免疫応答の唯一の検出可能成分は、ＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性応答である。別の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性応答は、抗原に対する測定可能な抗体応答を伴う。別の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性応答は、抗原に対する測定可能な抗体応答を伴わない。
【０１１６】
別の実施形態では、本発明は、抗原のサブドミナントＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに対する対象におけるＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性免疫応答を誘導する方法であって、（ａ）Ｈｅｒ２−ｎｅｕキメラ抗原またはその断片をコードするヌクレオチド分子を、ＬＬＯタンパク質のＮ末端断片をコードするヌクレオチド分子と融合し、それにより、ＬＬＯ−抗原融合タンパク質をコードする組換えヌクレオチドを生成させる工程；および（ｂ）組換えヌクレオチドまたはＬＬＯ−抗原融合体を対象に投与し、それにより、抗原のサブドミナントＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに対するＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性免疫応答を誘導する工程を含む方法を提供する。
【０１１７】
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、ＣＤ８＋／Ｔ調節性細胞の腫瘍内比率を増大させる方法であり、この場合および別の実施形態では、本方法は、対象に本発明の組換えポリペプチド、組換えリステリア、または組換えベクターを含む組成物を投与する工程を含む。
【０１１８】
別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、ＣＤ８＋／Ｔ調節性細胞の腫瘍内比率を増大させる方法であり、この場合および別の実施形態では、本方法は、対象に本発明の組換えポリペプチド、組換えリステリア、または組換えベクターを含む組成物を投与する工程を含む。
【０１１９】
別の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物によって誘発される免疫応答は、抗原の少なくとも１つのサブドミナントエピトープに対する免疫応答を含む。別の実施形態では、免疫応答は、サブドミナントエピトープに対する免疫応答を含まない。別の実施形態では、免疫応答は、主に少なくとも１つのサブドミナントエピトープに対する免疫応答からなる。別の実施形態では、免疫応答の唯一の測定可能な成分は、少なくとも１つのサブドミナントエピトープに対する免疫応答である。各々のタイプの免疫応答は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１２０】
免疫応答を測定する方法は当技術分野で周知であり、例えば、腫瘍増殖の抑制の測定、フローサイトメトリー、標的細胞溶解アッセイ（例えば、クロム遊離アッセイ）、テトラマーの使用などを含む。各々の方法は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１２１】
別の実施形態では、本発明は、対象におけるＨｅｒ−２発現腫瘍の増殖を妨げる方法を提供するものであり、この場合および別の実施形態では、本方法は、対象にＨｅｒ−２キメラタンパク質もしくはその断片に融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチドまたは組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを投与することを含み、この対象は、Ｈｅｒ−２発現腫瘍に対する免疫応答を起こし、それにより、対象におけるＨｅｒ−２発現腫瘍の増殖を妨げる。
【０１２２】
別の実施形態では、本発明は、Ｈｅｒ−２キメラタンパク質の抗原性を向上させる方法を提供するものであり、この場合および別の実施形態では、本方法は、ＬＬＯタンパク質のＮ末端断片をコードするヌクレオチドをＨｅｒ−２タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチドに融合させて、組換えヌクレオチドを生成させ、それにより、Ｈｅｒ−２キメラタンパク質の抗原性を向上させる工程を含む。
【０１２３】
別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、Ｈｅｒ−２キメラタンパク質の抗原性を向上させる方法であり、この場合および別の実施形態では、本方法は、組換えヌクレオチドを発現するようにリステリア株を操作することを含む。別の実施形態では、異なる細菌ベクターを用いて、組換えヌクレオチドを発現させる。別の実施形態では、細菌ベクターを弱毒化する。別の実施形態では、ＤＮＡワクチン（例えば、裸のＤＮＡワクチン）を用いて、組換えヌクレオチドを発現させる。別の実施形態では、ヌクレオチドによってコードされるＬＬＯ−Ｈｅｒ−２キメラ融合ペプチドの投与は、タンパク質を組換えによって産生した後、組換えタンパク質を対象に投与することによって実施される。各々の候補は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１２４】
一実施形態では、本発明は、腫瘍の「エピトープ拡大」のための方法を提供する。別の実施形態では、本明細書で提供される組成物および方法を用いた免疫は、本発明のワクチン中に担持されている抗原以外の抗原を有する他の腫瘍に対するエピトープ拡大を誘導する。
【０１２５】
別の実施形態では、ドミナントエピトープまたはサブドミナントエピトープは、治療を受けている対象において、それぞれ、ドミナントまたはサブドミナントである。別の実施形態では、ドミナントエピトープまたはサブドミナントエピトープは、治療を受けている集団において、ドミナントまたはサブドミナントである。
【０１２６】
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、エピトープ拡大によって対象における癌または腫瘍増殖を治療、抑制、または阻害する方法であり、この場合および別の実施形態では、癌は、本発明の組成物に含まれる抗原またはその断片の発現と関連している。別の実施形態では、本方法は、該対象に本発明の組換えポリペプチド、組換えリステリア、または組換えベクターを含む組成物を投与することを含む。さらに別の実施形態では、対象は、抗原発現癌または抗原発現腫瘍に対する免疫応答を起こし、それにより、対象における癌または腫瘍増殖を治療、抑制、または阻害する。
【０１２７】
「ドミナントＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ」は、一実施形態では、タンパク質またはこのタンパク質を含有する病原体もしくは癌細胞によるワクチン接種、感染、または悪性増殖によって誘発される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の３０％以上によって認識されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、それによって誘発される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の３５％以上によって認識されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の４０％以上によって認識されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の４５％以上によって認識されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の５０％以上によって認識されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の５５％以上によって認識されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の６０％以上によって認識されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の６５％以上によって認識されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の７０％以上によって認識されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の７５％以上によって認識されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の８０％以上によって認識されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の８５％以上によって認識されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の９０％以上によって認識されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の９５％以上によって認識されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の９６％以上によって認識されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の９７％以上によって認識されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の９８％以上によって認識されるエピトープを指す。
【０１２８】
「サブドミナントＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ」は、一実施形態では、タンパク質またはこのタンパク質を含有する病原体もしくは癌細胞によるワクチン接種、感染、または悪性増殖によって誘発される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の３０％未満によって認識されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の２８％未満によって認識されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の２６％以上によって認識されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の２４％未満によって認識されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の２２％以上によって認識されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の２０％未満によって認識されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の１８％以上によって認識されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の１６％未満によって認識されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の１４％以上によって認識されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の１２％以上によって認識されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の１０％未満によって認識されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の８％以上によって認識されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の６％未満によって認識されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の５％未満によって認識されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の４％以上によって認識されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の３％未満によって認識されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の２％未満によって認識されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の１％未満によって認識されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の０．５％未満によって認識されるエピトープを指す。
【０１２９】
各々のタイプのドミナントエピトープおよびサブドミナントエピトープは、本発明の別個の実施形態を表す。
本発明の方法および組成物における抗原は、一実施形態では、対象の非腫瘍細胞表面に検出可能なレベルで発現される。別の実施形態では、抗原は、対象の非腫瘍細胞の少なくとも一定のパーセンテージ（例えば、０．０１％、０．０３％、０．１％、０．３％、１％、２％、３％、または５％）で、検出可能なレベルで発現される。一実施形態では、「非腫瘍細胞」は、腫瘍本体の外側にある細胞を指す。別の実施形態では、「非腫瘍細胞」は、非悪性細胞を指す。別の実施形態では、「非腫瘍細胞」は、非形質転換細胞を指す。別の実施形態では、非腫瘍細胞は体細胞である。別の実施形態では、非腫瘍細胞は生殖細胞である。各々の候補は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１３０】
「検出可能なレベル」は、一実施形態では、標準的なアッセイで検出可能なレベルを指す。一実施形態では、アッセイは免疫学的アッセイである。一実施形態では、アッセイは酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。別の実施形態では、アッセイはウェスタンブロットである。別の実施形態では、アッセイはＦＡＣＳである。当技術分野で利用可能な任意の他のアッセイを本明細書で提供される方法で用いることができることが当業者に理解されるべきである。別の実施形態では、検出可能なレベルは、特定のアッセイのバックグラウンドレベルと比べて決定される。これらの手法の各々を実施するための方法は、当業者に周知であり、各々の手法は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１３１】
一実施形態では、組換え抗原を発現するＬＭのワクチン接種は、エピトープ拡大を誘導する。別の実施形態では、ＬＬＯ−抗原融合体のワクチン接種は、Ｈｅｒ２との関係以外でも、同様にエピトープ拡大を誘導する。各々の候補は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１３２】
別の実施形態では、本発明は、対象におけるＨｅｒ−２発現腫瘍の増殖を妨げる方法であって、対象にＨｅｒ−２キメラ抗原に融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチドを投与することを含む方法を提供するものであり、ここで、抗原は、１つ以上のサブドミナントＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを有し、対象は、抗原発現腫瘍に対する免疫応答を起こし、それにより、対象におけるＨｅｒ−２発現腫瘍の増殖を妨げる。別の実施形態では、抗原は、どのドミナントＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープも含まない。別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、対象におけるＨｅｒ−２発現腫瘍の増殖を妨げる方法であって、対象に本明細書で提供される組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを含む組換え形態のリステリアを投与することを含む方法である。
【０１３３】
別の実施形態では、本発明は、癌を有する宿主において細胞傷害性Ｔ細胞の形成を誘導するための方法であって、宿主に本発明の組成物を投与し、それにより、癌を有する宿主において細胞傷害性Ｔ細胞の形成を誘導する方法を提供する。
【０１３４】
別の実施形態では、本発明は、癌の発生率を低下させる方法であって、本発明の組成物を投与することを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、癌を改善する方法であって、本発明の組成物を投与することを含む方法を提供する。各々の候補は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１３５】
一実施形態では、組成物をエクスビボで対象の細胞に投与し、別の実施形態では、組成物をエクスビボでドナーの細胞に投与し、別の実施形態では、組成物をインビボでドナーの細胞に投与し、その後、対象に移す。各々の候補は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１３６】
一実施形態では、本発明の方法によって治療される癌は乳癌である。別の実施形態では、癌は、Ｈｅｒ２を含む癌である。別の実施形態では、癌は、メラノーマである。別の実施形態では、癌は、膵癌である。別の実施形態では、癌は、卵巣癌である。別の実施形態では、癌は、胃癌である。別の実施形態では、癌は、膵臓の癌病巣である。別の実施形態では、癌は、肺腺癌である。別の実施形態では、癌は、結腸直腸腺癌である。別の実施形態では、癌は、肺扁平上皮腺癌である。別の実施形態では、癌は、胃腺癌である。別の実施形態では、癌は、卵巣表面の上皮新生物（例えば、その良性の増殖性種または悪性種）である。別の実施形態では、癌は、口腔扁平上皮癌である。別の実施形態では、癌は、非小細胞肺癌である。別の実施形態では、癌は、ＣＮＳ癌である。別の実施形態では、癌は、子宮内膜癌である。別の実施形態では、癌は、膀胱癌である。別の実施形態では、癌は、頭頸部癌である。別の実施形態では、癌は、前立腺癌である。各々の候補は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１３７】
本発明の方法の別の実施形態では、対象は、抗原発現腫瘍または標的抗原に対する免疫応答を起こし、それにより、抗腫瘍効果を仲介する。
別の実施形態では、本発明は、癌を治療するための免疫原性組成物であって、切断ＬＬＯとＨｅｒ−２キメラタンパク質との融合体を含む免疫原性組成物を提供する。別の実施形態では、免疫原性組成物は、この融合体を発現するリステリア株をさらに含む。各々の候補は、本発明の別個の実施形態を表す。別の実施形態では、本発明は、癌を治療するための免疫原性組成物であって、Ｈｅｒ−２キメラタンパク質を発現するリステリア株を含む免疫原性組成物を提供する。
【０１３８】
一実施形態では、本発明の治療プロトコルは治療的なものである。別の実施形態では、プロトコルは予防的なものである。別の実施形態では、当業者によって理解されるように、本発明のワクチンを用いて、癌、例えば、乳癌またはＨｅｒ２を含む他の種類の腫瘍に罹りやすくする家族性遺伝または他の状況のために、これらの種類の病気のリスクがある人を保護する。別の実施形態では、ワクチンを、手術、従来の化学療法または放射線治療による腫瘍増殖のデバルキング（ｄｅｂｕｌｋｉｎｇ）後の癌免疫療法として用いる。そのような処置の後、ワクチンの腫瘍抗原に対するＣＴＬ応答が、残っている転移を破壊し、癌からの緩解を延長するように、本発明のワクチンを投与する。別の実施形態では、本発明のワクチンを用いて、それまでに定着した腫瘍の増殖を誘起し、既存の腫瘍細胞を死滅させる。各々の候補は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１３９】
別の実施形態では、上記の方法のいずれかで利用されるワクチンおよび免疫原性組成物は、本発明のワクチンおよび免疫原性組成物の特徴のいずれかを有する。各々の特徴は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１４０】
投薬量範囲の様々な実施形態が本発明によって想定されている。一実施形態では、ワクチンベクターの場合、投薬量は、０．４ＬＤ５０／用量の範囲である。別の実施形態では、投薬量は、約０．４〜４．９ＬＤ５０／用量である。別の実施形態では、投薬量は、約０．５〜０．５９ＬＤ５０／用量である。  別の実施形態では、投薬量は、約０．６〜０．６９ＬＤ５０／用量である。別の実施形態では、投薬量は、約０．７〜０．７９ＬＤ５０／用量である。別の実施形態では、投薬量は、約０．８ＬＤ５０／用量である。別の実施形態では、投薬量は、０．４ＬＤ５０／用量〜０．８ＬＤ５０／用量である。
【０１４１】
別の実施形態では、投薬量は、１０７細菌／用量である。別の実施形態では、投薬量は、１．５×１０７細菌／用量である。別の実施形態では、投薬量は、２×１０７細菌／用量である。別の実施形態では、投薬量は、３×１０７細菌／用量である。別の実施形態では、投薬量は、４×１０７細菌／用量である。別の実施形態では、投薬量は、６×１０７細菌／用量である。別の実施形態では、投薬量は、８×１０７細菌／用量である。別の実施形態では、投薬量は、１×１０８細菌／用量である。別の実施形態では、投薬量は、１．５×１０８細菌／用量である。別の実施形態では、投薬量は、２×１０８細菌／用量である。別の実施形態では、投薬量は、３×１０８細菌／用量である。別の実施形態では、投薬量は、４×１０８細菌／用量である。別の実施形態では、投薬量は、６×１０８細菌／用量である。別の実施形態では、投薬量は、８×１０８細菌／用量である。別の実施形態では、投薬量は、１×１０９細菌／用量である。別の実施形態では、投薬量は、１．５×１０９細菌／用量である。別の実施形態では、投薬量は、２×１０９細菌／用量である。別の実施形態では、投薬量は、３×１０９細菌／用量である。別の実施形態では、投薬量は、５×１０９細菌／用量である。別の実施形態では、投薬量は、６×１０９細菌／用量である。別の実施形態では、投薬量は、８×１０９細菌／用量である。別の実施形態では、投薬量は、１×１０１０細菌／用量である。別の実施形態では、投薬量は、１．５×１０１０細菌／用量である。別の実施形態では、投薬量は、２×１０１０細菌／用量である。別の実施形態では、投薬量は、３×１０１０細菌／用量である。別の実施形態では、投薬量は、５×１０１０細菌／用量である。別の実施形態では、投薬量は、６×１０１０細菌／用量である。別の実施形態では、投薬量は、８×１０１０細菌／用量である。別の実施形態では、投薬量は、８×１０９細菌／用量である。別の実施形態では、投薬量は、１×１０１１細菌／用量である。別の実施形態では、投薬量は、１．５×１０１１細菌／用量である。別の実施形態では、投薬量は、２×１０１１細菌／用量である。別の実施形態では、投薬量は、３×１０１１細菌／用量である。別の実施形態では、投薬量は、５×１０１１細菌／用量である。別の実施形態では、投薬量は、６×１０１１細菌／用量である。別の実施形態では、投薬量は、８×１０１１細菌／用量である。各々の候補は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１４２】
一実施形態では、本発明のワクチンまたは免疫原性組成物は、対象に単独で投与される。別の実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、別の癌療法と一緒に投与される。各々の候補は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１４３】
本発明の方法および組成物の組換えリステリアは、一実施形態では、Ｈｅｒ−２キメラ抗原またはＬＬＯ−Ｈｅｒ−２キメラ抗原融合体をコードするコンストラクトで安定に形質転換される。一実施形態では、コンストラクトは、さらなるサブクローニングをしやすくするためのポリリンカーを含む。組換えリステリアを産生するためのいくつかの技術が公知である。
【０１４４】
一実施形態では、コンストラクトまたは核酸分子を相同組換えを用いてリステリア染色体に組み込む。相同組換えのための技術は当技術分野で周知であり、例えば、Ｂａｌｏｇｌｕ  Ｓ，Ｂｏｙｌｅ  ＳＭら（Ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｔｏ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｅｉｔｈｅｒ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｐａｒｔｉａｌ  ｌｉｓｔｅｒｉｏｌｙｓｉｎ  ｏｒ  Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｌ７／Ｌ１２  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００５，１０９（１−２）：１１−７）；およびＪｉａｎｇ  ＬＬ，Ｓｏｎｇ  ＨＨら（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｕｔａｎｔ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｓｔｒａｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｓｉｎ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）  ２００５，３７（１）：１９−２４）に記載されている。別の実施形態では、相同組換えは、米国特許第６，８５５，３２０号に記載されているように実施される。この場合、Ｅ７を発現する組換えＬＭ株は、ｈｌｙプロモーターの制御下のＥ７遺伝子の染色体への組込みにより、遺伝子産物の分泌を保証するｈｌｙシグナル配列の包含を伴って作製され、Ｌｍ−ＡＺ／Ｅ７と表される組換え体が得られた。別の実施形態では、温度感受性プラスミドを用いて、組換え体を選択する。各々の手法は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１４５】
別の実施形態では、コンストラクトまたは核酸分子をトランスポゾン挿入を用いてリステリア染色体に組み込む。トランスポゾン挿入のための技術は当技術分野で周知であり、とりわけ、ＤＰ−Ｌ９６７の構築において、Ｓｕｎら（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９９０，５８：３７７０−３７７８）によって記載されている。トランスポゾン突然変異誘発は、別の実施形態では、安定なゲノム挿入突然変異体を形成することができるという利点を有するが、外来遺伝子が挿入されたゲノム中の位置が不明であるという欠点を有する。
【０１４６】
別の実施形態では、コンストラクトまたは核酸分子をファージ組込み部位を用いてリステリア染色体に組み込む（Ｌａｕｅｒ  Ｐ，Ｃｈｏｗ  ＭＹ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｈａｇｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ２００２；１８４（１５）：４１７７−８６）。この方法の特定の実施形態では、インテグラーゼ遺伝子とバクテリオファージ（例えば、Ｕ１５３またはＰＳＡリステリオファージ）の付着部位とを用いて、異種遺伝子を対応する付着部位に挿入する。この付着部位は、ゲノム中の任意の適当な部位（例えば、ｃｏｍＫまたはａｒｇ  ｔＲＮＡ遺伝子の３’末端）であってもよい。別の実施形態では、コンストラクトまたは異種遺伝子の組込み前に、内在性プロファージを利用される付着部位から除去する（ｃｕｒｅｄ）。別の実施形態では、この方法は、単一コピー組込み体を生じさせる。各々の候補は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１４７】
別の実施形態では、様々なプロモーターのうちの１つを用いて、抗原またはそれを含む融合タンパク質を発現させる。一実施形態では、ＬＭプロモーター、例えば、ｈｌｙ、ａｃｔＡ、ｐｌｃａ、ｐｌｃＢおよびｍｐｌ遺伝子のプロモーターを用い、これらは、それぞれ、リステリアタンパク質溶血素、ａｃｔＡ、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼ、ホスホリパーゼＣ、およびメタロプロテアーゼをコードする。各々の候補は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１４８】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物は、本発明のＨｅｒ−２キメラタンパク質またはＬＬＯ配列のホモログを利用する。別の実施形態では、本発明の方法および組成物は、非ヒト哺乳動物由来のＨｅｒ−２キメラタンパク質を利用する。任意のタンパク質またはペプチドに関して用いられるときの、「相同性」、「相同」などの用語は、一実施形態では、必要な場合、最大パーセント相同性を達成するために、かついかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮しないで、配列を整列させて、ギャップを導入した後、対応する天然ポリペプチドの残基と同一な候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージを指す。アラインメントのための方法およびコンピュータプログラムは、当技術分野で周知である。
【０１４９】
別の実施形態では、任意の核酸に関するときの「相同性」という用語は、同様に、対応する天然核酸配列のヌクレオチドと同一の候補配列中のヌクレオチドのパーセンテージを示す。
【０１５０】
相同性は、一実施形態では、当技術分野で十分に記載されている方法によって、配列アラインメント用のコンピュータアルゴリズムにより決定される。例えば、核酸配列相同性のコンピュータアルゴリズム解析は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＤＯＭＡＩＮ、ＢＥＡＵＴＹ（ＢＬＡＳＴ増強アラインメントユーティリティ）、ＧＥＮＰＥＰＴおよびＴＲＥＭＢＬパッケージなどの、利用可能なソフトウェアパッケージをいくらでも利用することを含むことができる。
【０１５１】
別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１〜４から選択される配列との７０％を上回る同一性を指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号１〜４から選択される配列との７２％を上回る同一性を指す。別の実施形態では、同一性は７５％を上回る。別の実施形態では、同一性は７８％を上回る。別の実施形態では、同一性は８０％を上回る。別の実施形態では、同一性は８２％を上回る。別の実施形態では、同一性は８３％を上回る。別の実施形態では、同一性は８５％を上回る。別の実施形態では、同一性は８７％を上回る。別の実施形態では、同一性は８８％を上回る。別の実施形態では、同一性は９０％を上回る。別の実施形態では、同一性は９２％を上回る。別の実施形態では、同一性は９３％を上回る。別の実施形態では、同一性は９５％を上回る。別の実施形態では、同一性は９６％を上回る。別の実施形態では、同一性は９７％を上回る。別の実施形態では、同一性は９８％を上回る。別の実施形態では、同一性は９９％を上回る。別の実施形態では、同一性は１００％である。各々の候補は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１５２】
別の実施形態では、相同性は、候補配列のハイブリダイゼーションの測定によって決定され、その方法は、当技術分野で十分に記載されている（例えば、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」  Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，編（１９８５）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙを参照されたい）。例えば、ハイブリダイゼーションの方法は、中程度からストリンジェントな条件下で、天然カスパーゼペプチドをコードするＤＮＡの相補体に対して実施することができる。ハイブリダイゼーション条件は、例えば、１０〜２０％ホルムアルデヒド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中、４２℃で一晩のインキュベーションである。
【０１５３】
本発明の一実施形態では、「核酸」は、一連の少なくとも２つの塩基−糖−リン酸の組合せを指す。この用語は、一実施形態では、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。「ヌクレオチド」は、一実施形態では、核酸ポリマーのモノマーユニットを指す。ＲＮＡは、一実施形態では、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（小核ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、小阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）およびリボザイムの形態であることができる。ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの使用が記載されている（Ｃａｕｄｙ  ＡＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌ  １６：２４９１−９６およびその中で引用された参考文献）。ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、線状ＤＮＡ、もしくは染色体ＤＮＡまたはこれらの群の誘導体の形態であることができる。さらに、これらの形態のＤＮＡおよびＲＮＡは、一本鎖、二本鎖、三本鎖または四本鎖であることができる。この用語は、別の実施形態では、他の種類の骨格を含み得るが、同じ塩基を含む人工核酸も含む。一実施形態では、人工核酸は、ＰＮＡ（ペプチド核酸）である。ＰＮＡは、ペプチド骨格とヌクレオチド塩基を含み、一実施形態では、ＤＮＡ分子とＲＮＡ分子の両方に結合することができる。別の実施形態では、ヌクレオチドは、修飾されたオキセタンである。別の実施形態では、ヌクレオチドは、１つ以上のホスホジエステル結合のホスホロチオエート結合との置換により修飾される。別の実施形態では、人工核酸は、当技術分野で公知の天然核酸のリン酸骨格の任意の他の変異体を含む。ホスホロチオエート核酸およびＰＮＡの使用は当業者に公知であり、例えば、Ｎｅｉｌｓｅｎ  Ｐ  Ｅ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ９：３５３−５７；およびＲａｚ  Ｎ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２９７：１０７５−８４に記載されている。核酸の産生および使用は当業者に公知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，（２００１），Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ編、およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ（２００３）  Ｐｕｒｃｈｉｏ  ａｎｄ  Ｇ．Ｃ．Ｆａｒｅｅｄに記載されている。各々の核酸誘導体は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１５４】
本明細書に記載された任意のアミノ酸配列のタンパク質および／またはペプチドの相同性は、一実施形態では、イムノブロット解析をはじめとする当技術分野で十分に記載されている方法によるか、または確立された方法で、利用可能ないくつかのソフトウェアパッケージのいずれかを利用する、アミノ酸配列のコンピュータアルゴリズムによる解析によって決定される。これらのパッケージのいくつかは、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＭＰｓｒｃｈまたはＳｃａｎｐｓパッケージを含んでいてもよく、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、ならびに／または解析用の全体／局所アラインメントもしくはＢＬＯＣＫＳアラインメントの使用を利用してもよい。相同性を決定するための各々の方法は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１５５】
別の実施形態では、本発明は、本発明の方法を実施するのに利用される試薬を含むキットを提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明の組成物、ツール、または装置を含むキットを提供する。
【０１５６】
「接触させる」または「投与する」という用語は、一実施形態では、癌細胞または腫瘍を本発明の組成物と直接的に接触させることを指す。別の実施形態では、この用語は、癌細胞または腫瘍を本発明の組成物と間接的に接触させることを指す。別の実施形態では、本発明の方法は、対象を本発明の組成物と接触させ、その後、拡散によるか、または化合物を体内循環させる当技術分野で公知の他の任意の能動的輸送プロセスもしくは受動的輸送プロセスによって、組成物が癌細胞または腫瘍と接触するようになる方法を含む。各々の候補は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１５７】
別の実施形態では、「遺伝子」および「組換え遺伝子」という用語は、本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子を指す。そのような天然のアレル変異は、通常、所与の遺伝子のヌクレオチド配列に１〜５％の変動をもたらすことがある。別のアレルは、いくつかの異なる個体または生物における目的の遺伝子をシークエンシングすることによって同定することができる。これは、ハイブリダイゼーションプローブを用いて、種々の個体または生物において同じ遺伝子座を同定することによって容易に実施することができる。天然のアレル変異の結果であり、かつ機能的活性を変化させないありとあらゆるそのようなヌクレオチドの変異および結果として生じるアミノ酸の多型または変異が本発明の範囲内にあることが意図される。
医薬組成物
本発明のワクチンおよび組成物を含む医薬組成物は、別の実施形態では、当業者に公知の任意の方法によって、対象に、例えば、非経口、癌近傍（ｐａｒａｃａｎｃｅｒａｌｌｙ）、経粘膜、経皮、筋肉内、静脈内、皮内、皮下、腹腔内、心室内、頭蓋内、膣内、または腫瘍内に投与される。
【０１５８】
本明細書で提供された方法および組成物の別の実施形態では、ワクチンまたは組成物は経口投与され、したがって、経口投与に好適な形態、すなわち、固体または液体調製物として処方される。好適な固体経口製剤としては、錠剤、カプセル、丸薬、顆粒、ペレットなどが挙げられる。好適な液体経口製剤としては、溶液、懸濁液、分散液、エマルジョン、オイルなどが挙げられる。本発明の別の実施形態では、活性成分は、カプセル中に処方される。この実施形態によれば、本発明の組成物は、活性化合物および不活性担体または希釈剤に加えて、硬質ゼラチンカプセルを含む。
【０１５９】
別の実施形態では、ワクチンまたは組成物は、液体調製物の静脈内、動脈内、または筋肉内注射によって投与される。好適な液体製剤としては、溶液、懸濁液、分散液、エマルジョン、オイルなどが挙げられる。一実施形態では、医薬組成物は静脈内投与され、したがって、静脈内投与に好適な形態で処方される。別の実施形態では、医薬組成物は動脈内投与され、したがって、動脈内投与に好適な形態で処方される。別の実施形態では、医薬組成物は筋肉内投与され、したがって、筋肉内投与に好適な形態で処方される。
【０１６０】
一実施形態では、「治療する」という用語は、疾患を治癒させることを指す。別の実施形態では、「治療する」は、疾患を予防することを指す。別の実施形態では、「治療する」は、疾患の発生率を低下させることを指す。別の実施形態では、「治療する」は、疾患の症状を改善することを指す。別の実施形態では、「治療する」は、寛解を誘導することを指す。別の実施形態では、「治療する」は、疾患の進行を緩徐化することを指す。「低下させる」、「抑制する」および「阻害する」という用語は、別の実施形態では、軽減することまたは減少させることを指す。各々の候補は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１６１】
本明細書で使用される「約」という用語は、数量的に、プラスマイナス５％、または別の実施形態では、プラスマイナス１０％、または別の実施形態では、プラスマイナス１５％、または別の実施形態では、プラスマイナス２０％を意味する。
【０１６２】
「対象」という用語は、一実施形態では、病気もしくはその後遺症の治療を必要とするか、または病気もしくはその後遺症に罹りやすい、ヒトを含む哺乳動物を指す。対象としては、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、およびマウスならびにヒトを挙げることができる。「対象」という用語は、あらゆる点で正常な個体を排除するものではない。
【０１６３】
本発明の好ましい実施形態をより完全に説明するために、以下の実施例を示す。しかしながら、これらは、決して、本発明の広い範囲を限定するものとみなされるべきではない。
実施例
材料および方法
オリゴヌクレオチドは、インビトロジェン（カリフォルニア州カールスバッド）により合成され、ＤＮＡシークエンシングは、ジーンウィズ社（Ｇｅｎｅｗｉｚ  Ｉｎｃ）、ニュージャージー州サウス・プレインフィールドにより行なわれた。フローサイトメトリー試薬は、ベクトン・ディッキンソン・バイオサイエンシズ（ＢＤ、カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。細胞培養培地、補助因子および他の全ての試薬は、指示しない限り、シグマ（Ｓｉｇｍａ）（ミズーリ州セントルイス）製であった。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＨＬＡ−Ａ２ペプチドは、ＥＺバイオラブス（ＥＺｂｉｏｌａｂｓ）（インディアナ州ウェストフィールド）により合成された。完全ＲＰＭＩ  １６４０（Ｃ−ＲＰＭＩ）培地は、２ｍＭのグルタミン、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、および１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０％の胎仔ウシ血清、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｈｅｐｅｓ（２５ｍＭ）を含んでいた。ポリクローナル抗ＬＬＯ抗体は以前に記載されており、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体はシグマから購入した。
マウスおよび細胞株
動物実験は全て、ペンシルバニア大学またはラトガーズ大学のＩＡＣＵＣによって承認されたプロトコルに従って実施された。ＦＶＢ／Ｎマウスは、ジャクソン・ラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（メイン州バーハーバー）から購入した。ラットＨｅｒ２／ｎｅｕ発癌タンパク質を過剰発現するＦＶＢ／Ｎ  Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスは、ペンシルバニア大学の動物コア施設で飼育し、繁殖させた。高レベルのラットＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質を発現するＮＴ−２腫瘍細胞株は、これらのマウスの自然発生乳腺腫瘍に由来するものであり、これを以前に記載されている通りに増殖させた。ＤＨＦＲ−Ｇ８（３Ｔ３／ｎｅｕ）細胞をＡＴＣＣから入手し、ＡＴＣＣの推奨に従って増殖させた。ＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞株は、Ｊｏｈｎ  Ｏｈｌｆｅｓｔ博士（ミネソタ大学、ミネソタ州）から惜しみなく提供されたものであり、これを完全Ｃ−ＲＰＭＩ培地中で増殖させた。生物発光に関する作業は、ペンシルバニア大学（ペンシルバニア州フィラデルフィア）の小動物イメージング施設（ＳＡＩＦ）による指導の下で行なわれた。
リステリアコンストラクトおよび抗原発現
Ｈｅｒ２／ｎｅｕ−ｐＧＥＭ７Ｚは、ペンシルバニア大学のＭａｒｋ  Ｇｒｅｅｎｅ博士から親切に提供されたものであり、これは、ｐＧＥＭ７Ｚプラスミド（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州マディソン）にクローニングされた全長ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ（ｈＨｅｒ２）遺伝子を含んでいた。このプラスミドを鋳型として用いて、ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン）および表１に示したオリゴを用いるＰＣＲによって、ｈＨｅｒ−２／ｎｅｕの３つの部分、すなわち、ＥＣ１、ＥＣ２、およびＩＣ１を増幅した。
【０１６４】
【表１】
0005985397.tif 000023
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕキメラコンストラクトを、ＳＯＥｉｎｇ  ＰＣＲ法による直接融合により、各々別々のｈＨｅｒ−２／ｎｅｕ断片を鋳型として作製した。プライマーを表２に示す。
【０１６５】
【表２】
0005985397.tif 000024
ＣｈＨｅｒ２遺伝子を、ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ制限酵素を用いてｐＡｄｖ１３８から切り出し、ＬＬＯの切断された非溶血性断片とともにＬｍｄｄシャトルベクターｐＡｄｖ１３４にインフレームでクローニングした。インサート、ＬＬＯおよびｈｌｙプロモーターの配列をＤＮＡシークエンシング解析により確認した。このプラスミドをエレクトロコンピテントなａｃｔＡ、ｄａｌ、ｄａｔ突然変異体リステリア・モノサイトゲネス株であるＬｍｄｄＡにエレクトロポレートし、ストレプトマイシン（２５０μｇ／ｍｌ）を含む脳心臓浸出物（ＢＨＩ）寒天プレート上で陽性クローンを選択した。いくつかの実験では、ｈＨｅｒ２／ｎｅｕ（Ｌｍ−ｈＨｅｒ２）断片を発現する同様のリステリア株を比較目的で用いた。これらは先に記載されている。どの研究においても、免疫系に対するリステリアの抗原非依存的効果を明らかにするために、無関係なリステリアコンストラクト（Ｌｍ−対照）を含めた。Ｌｍ−対照は、ＡＤＸＳ３１−１６４と同じリステリアプラットフォームをベースにしたものであったが、ＨＰＶ１６−Ｅ７またはＮＹ−ＥＳＯ−１などの異なる抗原を発現した。リステリアからの融合タンパク質の発現および分泌を試験した。各コンストラクトをインビボで２回継代した。
細胞傷害性アッセイ
３〜５匹のＦＶＢ／Ｎマウスの群に１×１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）のＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２、ＡＤＸＳ３１−１６４、Ｌｍ−ｈＨｅｒ２ＩＣ１もしくは（無関係な抗原を発現する）Ｌｍ−対照を１週間間隔で３回免疫したか、または感作しないでおいた。ＮＴ−２細胞をインビトロで増殖させ、トリプシンで剥離し、３７℃で４５分間、マイトマイシンＣ（無血清Ｃ−ＲＰＭＩ培地中２５０μｇ／ｍｌ）で処理した。５回の洗浄の後、それらを、免疫動物または未感作動物から回収した脾細胞とともに１：５（刺激体：応答体）の比率で、３７℃および５％ＣＯ２で５日間、共インキュベートした。標準的な細胞傷害性アッセイを、ユーロピウム標識した３Ｔ３／ｎｅｕ（ＤＨＦＲ−Ｇ８）細胞を標的として用いて、先に記載した方法に従って実施した。４時間のインキュベーションの後、５９０ｎｍで分光光度計（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、Ｖｉｃｔｏｒ２）を用いて、死滅した標的細胞からの放出されたユーロピウムを測定した。パーセント比溶解を（実験群における溶解−自然発生的溶解）／（最大溶解−自然発生的溶解）と定義した。
免疫マウス由来の脾細胞によるインターフェロン−γ分泌
３〜５匹のＦＶＢ／ＮまたはＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスの群に１×１０８ＣＦＵのＡＤＸＳ３１−１６４、（無関係な抗原を発現する）陰性リステリア対照を１週間間隔で３回免疫したか、または感作しないでおいた。ＦＶＢ／Ｎマウス由来の脾細胞を最後の免疫の１週間後に単離し、Ｃ−ＲＰＭＩ培地中で、マイトマイシンＣ処理したＮＴ−２細胞の存在下、５×１０６細胞／ウェルで２４ウェルプレートにて共培養した。ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウス由来の脾細胞を、１μＭのＨＬＡ−Ａ２特異的ペプチドまたは大腸菌で産生し、ニッケルに基づく親和性クロマトグラフィーシステムで精製した１μｇ／ｍｌの組換えＨｉｓタグ化ＣｈＨｅｒ２タンパク質の存在下でインキュベートした。２４または７２時間後に上清由来の試料を得て、製造元の推奨に従ってマウスＩＦＮ−γ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを用いて、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の存在について試験した。
Ｈｅｒ２トランスジェニック動物における腫瘍研究
６週齢のＦＶＢ／ＮラットＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウス（９〜１４匹／群）に５×１０８ＣＦＵのＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２、ＡＤＸＳ３１−１６４またはＬｍ−対照を６回免疫した。それらを自然発生乳腺腫瘍の出現について週に２回観察した。自然発生乳腺腫瘍は、電子キャリパーを用いて、最長５２週まで測定した。エスケープした腫瘍を平均直径１ｃｍ２のサイズに達したときに摘出し、ＲＮＡｌａｔｅｒ中−２０℃で保存した。これらの腫瘍のエスケープに対するＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質における突然変異の効果を明らかにするために、ゲノムＤＮＡ単離キットを用いてゲノムＤＮＡを抽出し、シークエンシングした。
脾臓および腫瘍内の調節性Ｔ細胞に対するＡＤＸＳ３１−１６４の効果
マウスに１×１０６個のＮＴ−２細胞を皮下（ｓ．ｃ．）移植した。７、１４および２１日目に、それらに１×１０８ＣＦＵのＡＤＸＳ３１−１６４、ＬｍｄｄＡ−対照を免疫したかまたはまたは感作しないでおいた。２８日目に腫瘍および脾臓を抽出し、ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの存在についてＦＡＣＳ解析で検討した。簡潔に述べると、脾臓を、Ｃ−ＲＰＭＩ培地中、２枚のスライドガラスの間でホモジナイズすることによって、脾細胞を単離した。滅菌したカミソリの刃を用いて腫瘍を細かく切り、ＰＢＳ中にＤＮアーゼ（１２Ｕ／ｍｌ）、およびコラゲナーゼ（２ｍｇ／ｍｌ）を含む緩衝液を用いて消化した。撹拌しながら室温で６０分間インキュベートした後、激しいピペッティングにより細胞を分離した。赤血球をＲＢＣ溶解緩衝液で溶解し、その後、１０％ＦＢＳを含む完全ＲＰＭＩ−１６４０培地で数回洗浄した。ナイロンメッシュに通して濾過した後、腫瘍細胞および脾細胞をＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳ／ＰＢＳ）に再懸濁し、抗ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５抗体、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ抗体、抗ＣＤ２５−ＡＰＣ抗体で染色し、次いで、透過処理し、抗Ｆｏｘｐ３−ＰＥで染色した。４色ＦＡＣＳキャリバー（ＢＤ）を用いてフローサイトメトリー解析を実施し、セルクエストソフトウェア（ＢＤ）を用いてデータを解析した。
統計解析
ログランクカイ二乗検定を生存率データに用い、スチューデントのｔ検定をＣＴＬおよびＥＬＩＳＡアッセイに用いた。これらの検定は３つの複製を作って行なった。０．０５未満のｐ値（＊と印を付けた）は、これらの解析において統計的に有意であると考えられた。統計解析は全て、Ｐｒｉｓｍソフトウェア、Ｖ．４．０ａ（２００６）またはＳＰＳＳソフトウェア、Ｖ．１５．０（２００６）のいずれかを用いて行なわれた。別途記載しない限り、全てのＦＶＢ／ＮラットＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニック研究のために、本発明者らは、１群当たり８〜１４匹のマウスを用い、全ての野生型ＦＶＢ／Ｎ研究のために、本発明者らは、１群当たり少なくとも８匹のマウスを用いた。Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスモデルでの長期の腫瘍研究を除き、全ての研究を少なくとも１回繰り返した。
実施例１
Ｈｅｒ−２断片に融合したＬＬＯ断片を分泌するリステリア・モノサイトゲネス株の作製：ＡＤＸＳ３１−１６４の構築
キメラＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子（ＣｈＨｅｒ２）の構築は以前に記載されている。簡潔に述べると、ＣｈＨｅｒ２遺伝子を、ＳＯＥｉｎｇ  ＰＣＲ法による、Ｈｅｒ２／ｎｅｕタンパク質の２つの細胞外断片（ａａ４０〜１７０およびａａ３５９〜４３３）と１つの細胞内断片（ａａ６７８〜８０８）の直接的な融合によって作製した。キメラタンパク質は、このタンパク質の既知のヒトＭＨＣクラスＩエピトープの大半を有する。ＣｈＨｅｒ２遺伝子をプラスミドｐＡｄｖ１３８（これは、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２を構築するために用いられた）から切り出して、ＬｍｄｄＡシャトルプラスミドにクローニングし、プラスミドｐＡｄｖ１６４が得られた（図１Ａ）。これら２つのプラスミド骨格には２つの大きな違いがある。１）ｐＡｄｖ１３８が、組換え細菌のインビトロ選択のためにクロラムフェニコール耐性マーカー（ｃａｔ）を用いるのに対し、ｐＡｄｖ１６４は、枯草菌由来のＤ−アラニンラセマーゼ遺伝子（ｄａｌ）を有する。枯草菌は、ｄａｌ−ｄａｔ遺伝子を欠くＬｍｄｄＡ株でのインビトロ選択およびインビボプラスミド保持のために代謝相補経路を用いる。このワクチンプラットフォームは、人工リステリアワクチン株の抗生物質耐性についてのＦＤＡの懸念に対処するようにデザインされ、開発された。２）ｐＡｄｖ１３８とは異なり、ｐＡｄｖ１６４は、プラスミド中にｐｒｆＡ遺伝子のコピーを有さない（下記の配列および図１Ａを参照されたい）。というのは、これは、Ｌｍｄｄ株のインビボ相補に必要ないからである。ＬｍｄｄＡワクチン株は、（リステリアの細胞内移動および細胞間拡散に関与する）ａｃｔＡ遺伝子も欠くので、この骨格に由来する組換えワクチン株は、その親株のＬｍｄｄから派生したものよりも毒性が１００倍低い。ＬｍｄｄＡベースのワクチンはまた、Ｌｍｄｄベースのワクチンよりもはるかに速く（４８時間足らずで）免疫マウスの脾臓から除去される。ウェスタンブロット解析を用いて抗ＬＬＯ抗体で約１０４ＫＤのバンドを検出したとき、この株からの融合タンパク質ｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現および分泌は、インビトロ増殖の８時間後のＴＣＡ沈殿した細胞培養上清におけるＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現および分泌と同程度であった（図１Ｂ）。ｔＬＬＯだけを発現するリステリア骨格株を陰性対照として用いた。
ｐＡｄｖ１６４配列（７０７５塩基対）（図１参照）：
【０１６６】
【化１６】
0005985397.tif 000025
0005985397.tif 000026
0005985397.tif 000027
実施例２
ＡＤＸＳ３１−１６４はＬＭ−ＬＬＯ−ＣｈＨＥＲ２と同程度の免疫原性である
抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ特異的細胞傷害性Ｔ細胞を生成させる際のＡＤＸＳ３１−１６４の免疫原性特性を、標準的なＣＴＬアッセイでＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２ワクチンの免疫原性特性と比較した。両ワクチンとも、３Ｔ３／ｎｅｕ標的細胞によって発現されたＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原に対する、強力ではあるが、同程度の細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘発した。したがって、ＬＬＯに融合したＨｅｒ２の細胞内断片だけを発現するリステリアで免疫したマウスは、より多くのＭＨＣクラスＩエピトープを含むキメラよりも低い溶解活性を示した。ＣＴＬ活性は、未感作動物または無関係なリステリアワクチンを注射したマウスでは検出されなかった（図２Ａ）。ＡＤＸＳ３１−１６４は、野生型ＦＶＢ／Ｎマウス由来の脾細胞によるＩＦＮ−γの分泌を刺激することもできた（図２Ｂ）。これは、高レベルのＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原を発現する、マイトマイシンＣ処理したＮＴ−２細胞と共培養したこれらの細胞の培養上清で検出された（図５Ｃ）。
【０１６７】
ＡＤＸＳ３１−１６４で免疫した後のヒトＭＨＣクラスＩエピトープの適切なプロセッシングおよび提示をＨＬＡ−Ａ２マウスで試験した。免疫したＨＬＡ−Ａ２トランスジェニック体由来の脾細胞を、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ分子の細胞外ドメイン（ＨＬＹＱＧＣＱＶＶ、配列番号１１もしくはＫＩＦＧＳＬＡＦＬ、配列番号１２）または細胞内ドメイン（ＲＬＬＱＥＴＥＬＶ、配列番号１３）にあるマッピングされたＨＬＡ−Ａ２制限エピトープに対応するペプチドとともに７２時間共インキュベートした（図２Ｃ）。組換えＣｈＨｅｒ２タンパク質を陽性対照として用い、無関係なペプチドまたはペプチドなしを陰性対照として用いた。この実験のデータは、ＡＤＸＳ３１−１６４が、標的化抗原の異なるドメインにあるヒトエピトープに対する抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ特異的免疫応答を誘発することができることを示している。
実施例３
ＡＤＸＳ３１−１６４は、自然発生乳腺腫瘍の発症の予防においてＬＭ−ＬＬＯ−ＣｈＨＥＲ２よりも有効であった
ゆっくりと増殖する自然発生乳腺腫瘍を発症する、２０〜２５週齢のＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニック動物で、ＡＤＸＳ３１−１６４の抗腫瘍効果をＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の抗腫瘍効果と比較した。無関係なリステリア−対照ワクチンで免疫した動物は全て、２１〜２５週以内に乳房腫瘍を発症し、３３週の前に屠殺された。対照的に、リステリア−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ組換えワクチンは、乳腺腫瘍の形成を顕著に遅延させた。４５週目で、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２で免疫したマウスの２５％と比較して、ＡＤＸＳ３１−１６４ワクチンを接種したマウスの５０％強（９匹中５匹）に依然として腫瘍がなかった。５２週で、ＡＤＸＳ３１−１６４で免疫したマウスの８匹中２匹には依然として腫瘍がない状態であったのに対し、他の実験群のマウスは全て、その疾患で死んでいた（図３）。これらの結果は、より弱毒化されているにもかかわらず、ＡＤＸＳ３１−１６４は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニック動物での自然発生乳腺腫瘍の発症の予防においてＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２よりも有効であることを示している。
実施例４
ＡＤＸＳ３１−１６４で免疫したときのＨＥＲ２／ＮＥＵ遺伝子における突然変異
Ｈｅｒ２／ｎｅｕのＭＨＣクラスＩエピトープにおける突然変異は、小断片ワクチンまたはＨｅｒ２／ｎｅｕの細胞外ドメインのエピトープを標的とするモノクローナル抗体であるトラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））で免疫したときの腫瘍エスケープの原因であると考えられている。これを評価するために、ゲノム物質をトランスジェニック動物のエスケープした腫瘍から抽出し、キメラまたは対照ワクチンで免疫した腫瘍内のｎｅｕ遺伝子の対応する断片とともにシークエンシングした。突然変異は、ワクチン接種したどの腫瘍試料のＨｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子にも認められず、別のエスケープ機構が示唆された（データは示さない）。
実施例５
ＡＤＸＳ３１−１６４は腫瘍内Ｔ調節性細胞の顕著な減少を引き起こす
脾臓および腫瘍における調節性Ｔ細胞の頻度に対するＡＤＸＳ３１−１６４の効果を解明するために、マウスにＮＴ−２腫瘍細胞を移植した。３回の免疫の後、脾細胞および腫瘍内リンパ球を単離し、Ｔｒｅｇについて染色した。Ｔｒｅｇは、ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋細胞と定義されたが、個別に解析した場合、ＦｏｘＰ３またはＣＤ２５マーカーのどちらかでも同等の結果が得られた。これらの結果は、ＡＤＸＳ３１−１６４による免疫が、無関係なリステリアワクチンまたは未感作動物と比較して、脾臓におけるＴｒｅｇの頻度に対して効果がないことを示した（図４を参照されたい）。対照的に、リステリアワクチンによる免疫は、腫瘍におけるＴｒｅｇの存在にかなりの影響をもたらした（図５Ａ）。Ｔｒｅｇは、未処置の腫瘍における全ＣＤ３＋Ｔ細胞で平均１９．０％であったが、この頻度は、無関係なワクチンについては４．２％、ＡＤＸＳ３１−１６４については３．４％にまで低下し、腫瘍内Ｔｒｅｇの頻度は５倍低下した（図５Ｂ）。どちらかのＬｍｄｄＡワクチンで処置したマウスにおける腫瘍内Ｔｒｅｇの頻度の減少は、腫瘍のサイズの違いに起因するものではあり得なかった。代表的な実験において、ＡＤＸＳ３１−１６４で免疫したマウス由来の腫瘍は、未処置のマウス由来の腫瘍（８．６９±０．９８、ｎ＝５、ｐ＜０．０１）または無関係なワクチンで処置したマウス由来の腫瘍（８．４１±１．４７、ｎ＝５、ｐ＝０．０４）よりも有意に小さかった［平均直径（ｍｍ）±ＳＤ、６．７１±０．４３、ｎ＝５］が、これらの後者２つの群の比較は、腫瘍サイズの統計的有意差を示さなかった（ｐ＝０．７３）。ＬｍｄｄＡワクチンで処置した腫瘍におけるＴｒｅｇのより低い頻度は、腫瘍内ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の増大をもたらしたが、これは、ＬｍｄｄＡワクチンによる免疫の後に、より好都合な腫瘍微小環境が得られる可能性があることを示唆している。しかしながら、標的抗原ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ＡＤＸＳ３１−１６４）を発現するワクチンだけが腫瘍増殖を低下させることができ、これは、Ｔｒｅｇの減少は、腫瘍における抗原特異的応答が存在するときにのみ効果を有することを示している。
実施例６
エスケープ変異はＨＥＲ−２キメラを発現するリステリアワクチンによって誘導されない
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８、ＬｍｄｄＡ１６４および無関係なワクチンＬｍ−ＬＬＯ−ＮＹなどの様々なワクチンで免疫したマウスの腫瘍試料を回収した。これらの試料からＤＮＡを精製し、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ領域ＩＣ１、ＥＣ１およびＥＣ２に対応するＤＮＡ断片を増幅し、シークエンシングして、免疫エスケープ変異があるかどうかを明らかにした。ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて各ＤＮＡの配列のアラインメントを実施した。解析の結果は、腫瘍から回収したＤＮＡ配列中に突然変異がないことを示した。これらの配列の詳細な解析を以下に示す。
ＥＣ２（Ｈｅｒ−２−ｎｅｕの９７５〜１０２９ｂｐ）のアラインメント
【０１６８】
【化１７】
0005985397.tif 000028
【０１６９】
【化１８】
0005985397.tif 000029
【０１７０】
【化１９】
0005985397.tif 000030
【０１７１】
【化２０】
0005985397.tif 000031
【０１７２】
【化２１】
0005985397.tif 000032
【０１７３】
【化２２】
0005985397.tif 000033
【０１７４】
【化２３】
0005985397.tif 000034
【０１７５】
【化２４】
0005985397.tif 000035
【０１７６】
【化２５】
0005985397.tif 000036
【０１７７】
【化２６】
0005985397.tif 000037
【０１７８】
【化２７】
0005985397.tif 000038
ＩＣ１（Ｈｅｒ−２−ｎｅｕの２１１４〜３０４２ｂｐ）のアラインメント
【０１７９】
【化２８】
0005985397.tif 000039
【０１８０】
【化２９】
0005985397.tif 000040
0005985397.tif 000041
【０１８１】
【化３０】
0005985397.tif 000042
【０１８２】
【化３１】
0005985397.tif 000043
【０１８３】
【化３２】
0005985397.tif 000044
0005985397.tif 000045
【０１８４】
【化３３】
0005985397.tif 000046
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【０１８５】
【化３４】
0005985397.tif 000048
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【０１８６】
【化３５】
0005985397.tif 000050
【０１８７】
【化３６】
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【０１８８】
【化３７】
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【０１８９】
【化３８】
0005985397.tif 000053
【０１９０】
【化３９】
0005985397.tif 000054
【０１９１】
【化４０】
0005985397.tif 000055
【０１９２】
【化４１】
0005985397.tif 000056
【０１９３】
【化４２】
0005985397.tif 000057
ＥＣ１（Ｈｅｒ−２−ｎｅｕの３９９〜７５８ｂｐ）のアラインメント
【０１９４】
【化４３】
0005985397.tif 000058
【０１９５】
【化４４】
0005985397.tif 000059
【０１９６】
【化４５】
0005985397.tif 000060
【０１９７】
【化４６】
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【０１９８】
【化４７】
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実施例７
ＡＤＸＳ３１−１６４による末梢免疫は脳における転移性乳癌細胞株の増殖を遅延させることができる
マウスにＡＤＸＳ３１−１６４または無関係なＬｍ−対照ワクチンをＩＰ免疫し、その後、ルシフェラーゼおよび低レベルのＨｅｒ２／ｎｅｕを発現する５，０００個のＥＭＴ６−Ｌｕｃ腫瘍細胞を頭蓋内に移植した（図６Ｃ）。麻酔したマウスのエクスビボイメージングにより、腫瘍を接種後の様々な時点でモニタリングした。腫瘍接種後８日目、腫瘍は全ての対照動物で検出されたが、ＡＤＸＳ３１−１６４群のマウスはどれも、検出可能な腫瘍を示さなかった（図６ＡおよびＢ）。ＡＤＸＳ３１−１６４は、これらの腫瘍の発症を明らかに遅延させることができた。なぜなら、腫瘍接種後１１日目に、陰性対照群のマウスは全て、その腫瘍で既に死んでいたが、ＡＤＸＳ３１−１６４群のマウスは全てまだ生きており、腫瘍増殖のわずかな兆候しか示さなかったからである。これらの結果は、ＡＤＸＳ３１−１６４の末梢投与で得られた免疫応答が中枢神経系に達する可能性があること、およびＬｍｄｄＡベースのワクチンがＣＮＳ腫瘍の治療に使用可能であることを強く示唆する。
【０１９９】
本発明の特定の特徴が本明細書で例示され、記載されているが、多くの修正、代替物、変更および等価物が当業者に思い浮かぶであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の趣旨に含まれるような全ての修正および変更に及ぶことが意図されることが理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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