(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された免疫原性肺炎レンサ球菌ＰｃｐＡポリペプチドと、ポリヒスチジン三連構造ファミリー（ＰｈｔＸ）のタンパク質からなる群より選択される単離された免疫原性肺炎レンサ球菌ポリペプチドと、単離された免疫原性無毒化ニューモリシンとを含む、対象において肺炎レンサ球菌に対する免疫反応を誘導するための免疫原性組成物。
【請求項２】
単離された免疫原性肺炎レンサ球菌ＰｃｐＡポリペプチドと、ポリヒスチジン三連構造ファミリー（ＰｈｔＸ）のタンパク質からなる群より選択される単離された免疫原性肺炎レンサ球菌ポリペプチドと、単離された免疫原性無毒化ニューモリシンとを含む、対象において肺炎レンサ球菌感染に起因する疾病に対する防御を与えるための免疫原性組成物。
【請求項３】
単離された免疫原性肺炎レンサ球菌ＰｃｐＡポリペプチドおよび単離された免疫原性肺炎レンサ球菌ＰｈｔＤポリペプチド、あるいはそれらの融合タンパク質を含むことを特徴とする請求項１または２記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
前記免疫原性ＰｃｐＡポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するか、または配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有することを特徴とする請求項３記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記免疫原性ＰｈｔＤポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するか、または配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有することを特徴とする請求項３または４記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記ＰｈｔＤポリペプチドが組換えにより産生されたものであることを特徴とする請求項３から５いずれか１項記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記組換えにより産生されたＰｈｔＤポリペプチドが、シグナルペプチド配列を欠くＮ末端切断体であることを特徴とする請求項６記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記ＰｃｐＡポリペプチドが組換えにより産生されたものであることを特徴とする請求項１から７いずれか１項記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
前記ＰｃｐＡポリペプチドが、シグナルペプチド配列を欠くＮ末端切断体であることを特徴とする請求項８記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
５から１００μｇ／投与量の前記ＰｈｔＤポリペプチド、および５から１００μｇ／投与量の前記ＰｃｐＡポリペプチドを含むことを特徴とする請求項３から７いずれか１項記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記無毒化ニューモリシンが、遺伝学的に無毒化されたまたは化学的に無毒化されたものであることを特徴とする請求項１から１０いずれか１項記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
前記無毒化ニューモリシンが、野生型配列の６５位、２９３位および４２８位にアミノ酸置換基を有する変異ニューモリシンタンパク質であることを特徴とする請求項１１記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
前記無毒化ニューモリシンが、Ｔ65→Ｃ、Ｇ293→Ｃ、およびＣ428→Ａを含むアミノ酸置換を有する変異ニューモリシンタンパク質であることを特徴とする請求項１２記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
５から１００μｇ／投与量の無毒化ニューモリシンを含むことを特徴とする請求項１から１３いずれか１項記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
ａ）薬学的に許容される賦形剤を含まない組成物と比較して、前記免疫原性ＰｃｐＡポリペプチドの熱安定性を増加させる、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、
ｂ）薬学的に許容される賦形剤を含まない組成物と比較して、前記免疫原性ＰｈｔＸポリペプチドの熱安定性を増加させる、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、または
ｃ）無毒化ニューモリシンポリペプチド、および薬学的に許容される賦形剤を含まない組成物と比較して、前記無毒化ニューモリシンポリペプチドの熱安定性を増加させる１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、を含み、
前記１つ以上の薬学的に許容される賦形剤が、緩衝剤、等張化剤、単炭水化物、糖、炭水化物ポリマー、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリアミノ酸、多価アルコールおよびそのエーテル、洗浄剤、脂質、界面活性剤、酸化防止剤、塩、またはそれらの組合せからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１から１４いずれか１項記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
前記１つ以上の薬学的に許容される賦形剤が、該１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含まない組成物と比較して、前記ポリペプチドの熱安定性を０．５℃以上増加させることを特徴とする請求項１５記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
前記緩衝剤が、トリス−ＨＣｌ、ＮａＣｌを含むトリスＨＣｌ、およびＨＥＰＥＳからなる群より選択され、５〜１００ｍＭの濃度であることを特徴とする請求項１５記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
前記糖が、１〜３０％の濃度の、ソルビトール、トレハロースおよびスクロースから選択されることを特徴とする請求項１５記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
ソルビトールを含むことを特徴とする請求項１５記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
ソルビトールを２〜２０％含み、ｐＨ５．５〜８．５であることを特徴とする請求項１５記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
アジュバントをさらに含むことを特徴とする請求項１から２０いずれか１項記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
前記アジュバントが、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、およびホスフェート処理された水酸化アルミニウムからなる群より選択されることを特徴とする請求項２１記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
液体形態、乾燥粉末形態、凍結乾燥、噴霧乾燥または発泡乾燥されたものである、請求項１から２２いずれか１項記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】
請求項１から１５いずれか１項記載の免疫原性組成物、および薬学的に許容される賦形剤を含むワクチン。
【請求項２５】
請求項１から１５いずれか１項記載の免疫原性組成物を薬学的に許容される賦形剤と混合する工程を含む、請求項２４記載のワクチンを製造するプロセス。
【請求項２６】
対象において肺炎レンサ球菌感染に起因する疾病の予防または重篤性の軽減に使用するためのものであり、免疫学的効果量の前記組成物が対象に投与される、請求項１から２３いずれか１項記載の免疫原性組成物または請求項２４記載のワクチン。
【請求項２７】
前記対象がヒトであり、前記疾病が、髄膜炎、菌血症、肺炎、侵襲性肺炎球菌性疾患、結膜炎、および／または中耳炎である、請求項２６記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２８】
水中油型アジュバントエマルションをさらに含み、
前記水中油型アジュバントエマルションが、少なくとも、スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤、および疎水性非イオン性界面活性剤を含み、該エマルションは熱可逆性であり、かつ油滴の９０体積％が２００ｎｍ未満のサイズを有することを特徴とする、請求項１記載の免疫原性組成物。
【請求項２９】
ＰｃｐＡ、ＰｈｔＸおよび無毒化ニューモリシンの免疫原性ポリペプチド、ならびに１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む、対象において肺炎レンサ球菌に対する免疫反応を誘導するための免疫原性組成物であって、前記１つ以上の薬学的に許容される賦形剤が、該１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含まない組成物と比較して、該組成物の熱安定性を増加させることを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項３０】
ＰｃｐＡ、ＰｈＸおよび無毒化ニューモリシンの免疫原性ポリペプチド、ならびに１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む、対象において肺炎レンサ球菌に対する免疫反応を誘導するための免疫原性組成物を製造する方法であって、前記１つ以上の薬学的に許容される賦形剤は、該１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含まない組成物と比較して、前記ポリペプチドの熱安定性を増加させるものであり、該方法は、前記ＰｃｐＡ、ＰｈＸおよび無毒化ニューモリシンの免疫原性ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドを前記１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と混合する各工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の説明】
【０００１】
本出願は、ここに引用する、２００９年１２月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／２８９２３６号、および２０１０年４月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／３２５６６０号に優先権を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、免疫学の分野に関し、特に、肺炎レンサ球菌抗原および免疫法におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
肺炎レンサ球菌(Streptococcus pneumoniae)は、健康な子供と大人の上気道によく見つかる、どちらかと言えばどこにでもあるヒト病原体である。これらの細菌は、肺、中枢神経系（ＣＮＳ）、中耳、および鼻道を含むいくつかの器官に感染し、例えば、副鼻腔感染症、中耳炎、気管支炎、肺炎、髄膜炎、および菌血症（敗血症）などの様々な疾病を生じ得る。これらの肺炎球菌疾病の最も重症な形態である肺炎球菌性髄膜炎は、抗生物質による治療にもかかわらず、深刻な死亡率および疾病率を伴う（非特許文献１）。特に、２才未満の子供と高齢者は、症候性肺炎球菌感染症に罹りやすい。
【０００４】
現在、利用できる肺炎球菌ワクチンには２種類がある。最初のものは、合わせて、肺炎球菌感染症を生じる菌株の約９０％を占める莢膜タイプである、２３タイプの肺炎レンサ球菌からの莢膜多糖体を含む。しかしながら、このワクチンは、２才になる前には多糖体抗原に対して良好な免疫反応を生じないので、肺炎球菌感染症に非常に罹りやすい年齢層である幼い子供においては、大して免疫原性ではない。大人においては、このワクチンは、菌血症性肺炎に対して約６０％の効き目があることが示されてきたが、年齢や根底にある病状のために、肺炎球菌感染症のリスクの高い大人においては、それほど効き目がない（非特許文献２から４）。
【０００５】
二番目のものは、複合体(conjugate)ワクチンである。タンパク質担体に結合した(conjugated)血清型特異的莢膜多糖体抗原を含むこれらのワクチンは、血清特異的防御を引き出す（９）。７価と１３価の複合体ワクチンが現在利用できる。７価のものは７つの多糖体抗原（血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆの莢膜に由来する）を含み、１３価のものは、１３の多糖体抗原（７価のものにより対処されるものに加え、血清型１、３、５、６Ａ、７Ｆおよび１９Ａの莢膜に由来する）を含む。９価と１１価の複合体ワクチンも開発されてきた。各々は、７価のものにより対処されない血清型に特異的な多糖体を含む（すなわち、９価のものにおいて、血清型１および５、並びに１１価のものにおいて、血清型３および７Ｆ）。
【０００６】
複合体ワクチンの製造は複雑であり、一部には、それぞれがタンパク質担体に結合する７（または９または１１）種類の異なる多糖体を製造する必要があるために、費用がかかる。そのようなワクチンは、それらの複合体ワクチンにより対処されない肺炎レンサ球菌の血清型が非常に一般的にである発展途上世界において、感染症に対処するのに良い働きをしない（非特許文献５および６）。７価の複合体ワクチンを使用すると、ワクチンに含まれる７つの多糖体により表されない莢膜タイプの菌株による疾病とコロニー形成の増加がもたらされることも示されてきた（非特許文献７から９）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Quagliarello et. al. (1992) N. Engl. J. Med. 327:864-872
【非特許文献２】Fedson, and Musher 2004, “Pneumococcal Polysaccharide Vaccine”, pp. 529-588
【非特許文献３】In Vaccines. S.A. Plotikin and W.A. Orenstein (eds.), W.B. Saunders and Co., Philadelphia, PA
【非特許文献４】Shapiro et. al., N. Engl. J. Med. 325:1453-1460 (1991)
【非特許文献５】Di Fabio et al., Pediatr. Infect. Dis. J. 20:959-967 (2001)
【非特許文献６】Mulholland, Trop. Med. Int. Health 10:497-500 (2005)
【非特許文献７】Bogaert et al., Lancet Infect. Dis. 4:144-154 (2004)
【非特許文献８】Eskola et al., N. Engl. J. Med. 344-403-409 (2001)
【非特許文献９】Mbelle et al., J. Infect. Dis. 180 :1171-1176 (1999)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
現在利用できる多糖体系ワクチンに代わるものとして、肺炎レンサ球菌に対するタンパク質系ワクチンの潜在的な候補として、数多くの肺炎レンサ球菌抗原が提案されてきた。しかしながら、これまで、そのようなワクチンは現在、市販されていない。したがって、肺炎レンサ球菌の効果的な治療法が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
レンサ球菌感染症（例えば、肺炎レンサ球菌など）に対する免疫反応を引き出すための免疫原性組成物および方法が記載される。より詳しくは、本開示は、免疫原性ＰｃｐＡポリペプチドおよび／またはポリヒスチジン三連構造ファミリー（ＰｈｔＸ：ＰｈｔＡ、Ｂ、Ｄ、Ｅ）の免疫原性ポリペプチドを含む免疫原性組成物、その製造方法およびその使用方法に関する。ＰｃｐＡおよびＰｈｔＤの断片および各々の変異株を含む免疫原性ＰｃｐＡおよびＰｈｔＸポリペプチド、並びにそのポリペプチドをコードする核酸も提供される。免疫原性ＰｃｐＡポリペプチドおよび／またはポリヒスチジン三連構造ファミリー（ＰｈｔＸ：ＰｈｔＡ、Ｂ、Ｄ、Ｅ）の免疫原性ポリペプチド、および／または無毒化(detoxified)ニューモリシンを含む免疫原性組成物。さらに、レンサ球菌ポリペプチドに対する固体を調製する方法、およびそのような抗体を使用して、レンサ球菌感染症（例えば、肺炎レンサ球菌感染症）を治療するおよび／または予防する方法も提供される。
【００１０】
また、１種類以上の免疫原性ＰｃｐＡポリペプチド、ＰｈｔＸポリペプチドおよび／または無毒化ニューモリシンタンパク質を含む、薬剤組成物（例えば、ワクチン組成物）などの組成物も提供される。その組成物は、必要に応じて、アジュバントを含んでも差し支えない。その組成物は、１種類以上の薬学的に許容される賦形剤を含まない組成物に対して、前記ポリペプチド／タンパク質の熱安定性を増加させる、１種類以上の薬学的に許容される賦形剤を含んでもよい。一例において、この１種類以上の薬学的に許容される賦形剤は、この１種類以上の薬学的に許容される賦形剤を含まない組成物に対して、０．５℃以上、ＰｃｐＡ、ＰｈｔＸおよび／または無毒化ニューモリシンタンパク質の熱安定性を増加させる。組成物は、液体形態にあっても、凍結乾燥、噴霧乾燥および／または発泡乾燥された乾燥粉末形態にあっても差し支えない。この１種類以上の薬学的に許容される賦形剤は、例えば、緩衝液、等張化剤、単純な炭水化物、糖、炭水化物ポリマー、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリアミノ酸、多価アルコールおよびそのエーテル、洗浄剤、脂質、界面活性剤、酸化防止剤、塩、ヒト血清アルブミン、ゼラチン、ホルムアルデヒド、またはそれらの組合せからなる群より選択することができる。
【００１１】
被験者において肺炎レンサ球菌に対する免疫反応を誘発させる方法であって、ここに記載した組成物を被験者に投与する工程を含む方法も提供される。被験者における肺炎レンサ球菌に対する免疫反応の誘発、またはこの目的に使用するための薬剤の調製に、本発明の組成物を使用することも提供される。
【００１２】
本発明にはいくつかの利点がある。例えば、本発明の組成物を被験者に投与すると、肺炎レンサ球菌の多数の菌株による感染症に対する免疫反応が引き出される。その上、本発明の多価組成物は、投与されたときに、抗原干渉を経験せずに、追加の効果を与えるであろう、肺炎レンサ球菌の免疫原性ポリペプチドの特別な組合せを含む。ここに記載された賦形剤を使用すると、組成物内でのポリペプチド／タンパク質の熱安定性を増加させることができる。
【００１３】
本発明の他の特徴および利点が、以下の詳細な説明、図面および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
本発明は、図面を参照して、以下の説明からさらに理解されるであろう。
【図１】図１は、様々な投与量のＰｃｐＡおよびＰｈｔＤ（実施例２）で免疫化されたマウスの血清抗タンパク質ＩｇＧ抗体力価を示す。
【図２ａ】図２ａは、５０μｇの抗原／投与量のＰｃｐＡで免疫化したラットの血清抗タンパク質ＩｇＧ抗体力価を示す。
【図２ｂ】図２ｂは、５０μｇの抗原／投与量のＰｃｐＡで免疫化したラットの血清抗タンパク質ＩｇＧ抗体力価を示す。
【図２ｃ】図２ｃは、５０μｇの抗原／投与量のＰｈｔＤで免疫化したラットの血清抗タンパク質ＩｇＧ抗体力価を示す。
【図２ｄ】図２ｄは、５０μｇの抗原／投与量のＰｈｔＤで免疫化したラットの血清抗タンパク質ＩｇＧ抗体力価を示す。
【図３】図３は、免疫化したマウスの各グループについての生存率を示す（実施例５）。
【図４ａ】図４ａは、各グループについて、エンドポイント希釈ＥＬＩＳＡによって測定した全抗原特異的ＩｇＧ力価および相乗平均力価（±ＳＤ）を示す。
【図４ｂ】図４ｂは、定量ＥＬＩＳＡにより測定された全抗原特異的力価を示す。
【図５】図５は、各グループについての生存率を示す。
【図６】図６は、Ｍｎ2+欠乏培地中で増殖させた様々な肺炎球菌株への対応するウサギ抗血清による、細菌表面上のＰｃｐＡおよびＰｈｔＤの認識を示す。
【図７】図７は、菌株ＷＵ２の細菌細胞表面上のタンパク質（ＰｃｐＡ、ＰｈｔＤ）への精製ヒト抗ＰｃｐＡおよび抗ＰｈｔＤ抗体の結合を示す（実施例９）。
【図８】図８は、投与した血清の対数希釈当たりの観察された生存％を示す（実施例１０）。
【図９】図９は、ＥＬＩＳＡにより測定した全ＩｇＧ力価の要約を示す（実施例１１）。
【図１０ａ】図１０ａは、１価および２価配合物（ＡｌＯ（ＯＨ）またはリン酸処理ＡｌＯ（ＯＨ）（ＰＴＨ）が配合された）中のＰｃｐＡの安定性を示す。
【図１０ｂ】図１０ｂは、１価および２価配合物（ＡｌＯ（ＯＨ）またはリン酸処理ＡｌＯ（ＯＨ）（ＰＴＨ）が配合された）中のＰｃｐＡの安定性を示す。
【図１０ｃ】図１０ｃは、１価および２価配合物（ＡｌＯ（ＯＨ）またはリン酸処理ＡｌＯ（ＯＨ）（ＰＴＨ）が配合された）中のＰｈｔＤの安定性を示す。
【図１０ｄ】図１０ｄは、１価および２価配合物（ＡｌＯ（ＯＨ）またはリン酸処理ＡｌＯ（ＯＨ）（ＰＴＨ）が配合された）中のＰｈｔＤの安定性を示す。
【図１０ｅ】図１０ｅは、１価および２価配合物（ＡｌＯ（ＯＨ）またはリン酸処理ＡｌＯ（ＯＨ）（ＰＴＨ）が配合された）中のＰｃｐＡの安定性を示す。
【図１０ｆ】図１０ｆは、１価および２価配合物（ＡｌＯ（ＯＨ）またはリン酸処理ＡｌＯ（ＯＨ）（ＰＴＨ）が配合された）中のＰｃｐＡの安定性を示す。
【図１１】図１１は、ＥＬＩＳＡにより評価した、ストレス条件下でのＰｈｔＤおよびＰｃｐＡの安定性を示す。
【図１２】図１２Ａは、ＲＰ−ＨＰＬＣによる、１０％のソルビトール（■）、１０％のトレハロース（●）、１０％のスクロース（△）、ＴＢＳｐＨ９．０（◆）、およびＴＢＳｐＨ７．４（○）の存在下でのＰｃｐＡ（３日間に亘り５０℃で貯蔵した）の安定性への賦形剤の影響の研究を示す。図１２Ｂは、定量ＥＬＩＳＡサンドイッチ法による、１０％のソルビトール、１０％のトレハロース、１０％のスクロース、ＴＢＳｐＨ９．０、およびＴＢＳｐＨ７．４の存在下でのＰｃｐＡ（３日間に亘り５０℃で貯蔵した）の安定性への賦形剤の影響の研究を示す。
【図１３】図１３は、アジュバント入りタンパク質の物理的安定性へのｐＨの影響を示す。
【図１４】図１４は、各グループについて、エンドポイント希釈ＥＬＩＳＡによって測定した全抗原特異的ＩｇＧ力価および相乗平均力価（±ＳＤ）を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、マウスに投与された抗原投与量当たりのＥＬＩＳＡにより測定された、誘発された全抗原特異的ＩｇＧを示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、マウスに投与された抗原投与量当たりのＥＬＩＳＡにより測定された、誘発された全抗原特異的ＩｇＧを示す。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、マウスに投与された抗原投与量当たりのＥＬＩＳＡにより測定された、誘発された全抗原特異的ＩｇＧを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
図１は、様々な投与量のＰｃｐＡおよびＰｈｔＤ（実施例２）で免疫化されたマウスの血清抗タンパク質ＩｇＧ抗体力価を示す。この研究において、組換えＰｈｔＤおよびＰｃｐＡを、１価または２価の配合物としてＡｌＯＯＨアジュバントと組み合わせた。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、３週間間隔で３回、皮下で免疫化し、最初の免疫化前と、最初と２回目と３回目の免疫化後に採血した。ＩｇＧ力価をエンドポイントＥＬＩＳＡによって評価した。ＰｃｐＡおよびＰｈｔＤタンパク質が接種された全てのマウスは、免疫化後に抗原特異的抗体反応を生じた。
【００１６】
図２ａからｄは、５０μｇの抗原／投与量のＰｃｐＡおよび／またはＰｈｔＤで免疫化したラットの血清抗タンパク質ＩｇＧ抗体力価を示す。この研究において、トリス緩衝生理食塩水の対照（１０ｍＭのトリスｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ）、５０μｇの抗原／投与量を使用した、水酸化アルミニウムアジュバント入り２価ＰｈｔＤおよびＰｃｐＡ、アジュバントなし２価ＰｈｔＤおよびＰｃｐＡまたは水酸化アルミニウムアジュバント入りＰｃｐＡのいずれかでラットを０日目、２１日目および４２日目に免疫化した。予備試験からの血清、４４日目と５７日目の採血を、ＥＬＩＳＡによって、ＰｈｔＤおよびＰｃｐＡ特異的ＩｇＧ抗体力価に対する抗体力価について試験した。
【００１７】
図３は、免疫化したマウスの各グループについての生存率を示す（実施例５）。この研究において、鼻腔内接種モデルを使用して、組換えＰｈｔＤおよびＰｃｐＡの２価配合物を評価した。免疫化した動物に、致死量の肺炎レンサ球菌株（ＭＤ、１４４５３または９４１１９２）を接種した。
【００１８】
図４ａ，ｂは、各グループについて、エンドポイント希釈ＥＬＩＳＡによって測定した全抗原特異的ＩｇＧ力価および相乗平均力価（±ＳＤ）を示す。この研究（実施例７）において、ＰｈｔＤおよびＰｃｐＡの２価組成物を調製し（ＰｈｔＤおよびＰｃｐＡの各々の２つの異なるロットを使用して）、リン酸処理ＡｌＯＯＨ（２ｍＭ）を配合した。６匹の雌のＣＢＡ／ｊマウスのグループを、適用できる配合物により、３週間間隔で筋肉内または皮下に３回、免疫化した。３回目（最後）の採血後、マウスに致死量の肺炎レンサ球菌株ＭＤを接種した。
【００１９】
図５は、各グループについての生存率を示す。この研究（実施例６）において、ＰｈｔＤおよびＰｃｐＡの２価組成物を調製し（ＰｈｔＤおよびＰｃｐＡの各々の２つの異なるロットを使用して）、リン酸処理ＡｌＯＯＨ（２ｍＭ）を配合した。６匹の雌のＣＢＡ／ｊマウスのグループを、適用できる配合物により、３週間間隔で筋肉内または皮下に３回、免疫化した。３回目（最後）の採血後、マウスに致死量の肺炎レンサ球菌株ＭＤを接種した。
【００２０】
図６は、Ｍｎ2+欠乏培地中で増殖させた様々な肺炎球菌株への対応するウサギ抗血清による、細菌表面上のＰｃｐＡおよびＰｈｔＤの認識を示す（実施例９）。
【００２１】
図７は、菌株ＷＵ２の細菌細胞表面上のタンパク質（ＰｃｐＡ、ＰｈｔＤ）への精製ヒト抗ＰｃｐＡおよび抗ＰｈｔＤ抗体の結合を示す（実施例９）。
【００２２】
図８は、投与した血清の対数希釈当たりの観察された生存％を示す（実施例１０）。
【００２３】
図９は、ＥＬＩＳＡにより測定した全ＩｇＧ力価の要約を示す（実施例１１）。
【００２４】
図１０ａからｆは、１価および２価配合物（ＡｌＯ（ＯＨ）またはリン酸処理ＡｌＯ（ＯＨ）（ＰＴＨ）が配合された）中のＰｃｐＡおよびＰｈｔＤの安定性を示す。ＡｌＯ（ＯＨ）または最終濃度が２ｍＭのリン酸となるＰＴＨを使用して、配合物を調製し、次いで、様々な温度（すなわち、５℃、２５℃、３７℃または４５℃）でインキュベーションした。次いで、そのままの抗原濃度をＲＰ−ＨＰＬＣによって評価した。
【００２５】
図１１は、ＥＬＩＳＡにより評価した、ストレス条件下でのＰｈｔＤおよびＰｃｐＡの安定性を示す。１００μｇ／ｍＬでの２価配合物を１２週間に亘り３７℃でインキュベーションし、抗原性をＥＬＩＳＡにより評価した。
【００２６】
図１２Ａは、ＲＰ−ＨＰＬＣによる、１０％のソルビトール（■）、１０％のトレハロース（●）、１０％のスクロース（△）、ＴＢＳｐＨ９．０（◆）、およびＴＢＳｐＨ７．４（○）の存在下でのＰｃｐＡ（３日間に亘り５０℃で貯蔵した）の安定性への賦形剤の影響の研究を示す。
【００２７】
図１２Ｂは、定量ＥＬＩＳＡサンドイッチ法による、１０％のソルビトール、１０％のトレハロース、１０％のスクロース、ＴＢＳｐＨ９．０、およびＴＢＳｐＨ７．４の存在下でのＰｃｐＡ（３日間に亘り５０℃で貯蔵した）の安定性への賦形剤の影響の研究を示す。配合物を３日間に亘り５０℃で貯蔵した。時間ゼロ（白い棒）および３日間の貯蔵後（黒い棒）に、各配合物について抗原性を評価した。
【００２８】
図１３は、アジュバント入りタンパク質の物理的安定性へのｐＨの影響を示す。ＰｃｐＡ（Ａ）、ＰｈｔＤ（Ｂ）およびＰｌｙＤ１（Ｃ）に、異なるｐＨ値で水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムのアジュバントを添加し、Ｔｍ値を、蛍光トレースの微分分析によって得た。
【００２９】
図１４は、各グループについて、エンドポイント希釈ＥＬＩＳＡによって測定した全抗原特異的ＩｇＧ力価および相乗平均力価（±ＳＤ）を示す。
【００３０】
図１５Ａ，Ｂ，Ｃは、マウスに投与された抗原投与量当たりのＥＬＩＳＡにより測定された、誘発された全抗原特異的ＩｇＧを示す。
【００３１】
肺炎レンサ球菌に対する免疫反応を誘発するための組成物および方法、並びに例えば、ヒトなどの哺乳類における肺炎レンサ球菌により生じる疾病を治療および予防するための組成物および方法が記載されている。免疫原性ＰｃｐＡポリペプチドおよび／またはポリヒスチジン三連構造ファミリー（ＰｈｔＸ：ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ）の免疫原性ポリペプチドを含む免疫原性組成物、その製造方法およびその使用方法に関する。その組成物は、無毒化ニューモリシンまたはその免疫原性断片を含んでもよい。方法は、受動的および能動的な免疫化手法を含み、これは、１種類以上の実質的に精製されたレンサ球菌（例えば、肺炎レンサ球菌）ポリペプチド、そのポリペプチド自体に対する抗体、またはその組合せを含む免疫原性組成物の投与（例えば、皮下、筋肉内）を含む。本発明は、レンサ球菌属全般（例えば、肺炎レンサ球菌）のポリペプチド、レンサ球菌ポリペプチドを含む免疫原性組成物（例えば、ワクチン）、そのような組成物を製造する方法、およびレンサ球菌（例えば、肺炎レンサ球菌）抗体を産生する方法も含む。これらの方法と組成物を以下にさらに説明する。
【００３２】
本発明の組成物は、１つ、２つ、３つまたはそれより多くの免疫原性ポリペプチドを含む。その組成物は、例えば、ＰｃｐＡの免疫原性ポリペプチド；タンパク質のポリヒスチジン三連構造ファミリー（例えば、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ、およびＰｈｔＥ、ここでは、ＰｈｔＸタンパク質と称する）の一員の免疫原性ポリペプチド；無毒化ニューモリシンポリペプチドを、個々にまたは組合せで含んでもよい。これらのポリペプチドの免疫原性断片および融合物も、組成物に含まれてよい（例えば、ＰｈｔＢおよびＰｈｔＥの融合物）。これの免疫原性ポリペプチドは、必要に応じて、肺炎球菌糖体また他の肺炎球菌ポリペプチドと組み合わせて使用してもよい。
【００３３】
ある多成分の例において、免疫原性組成物は、免疫原性ＰｃｐＡポリペプチドおよび１種類以上の免疫原性ＰｈｔＸポリペプチドを含む。そのような組成物の好ましい実施の形態は、免疫原性ＰｈｔＤポリペプチドおよび免疫原性ＰｃｐＡポリペプチドを含む。別の例において、その組成物は、免疫原性ＰｃｐＡポリペプチド、免疫原性ＰｈｔＸポリペプチド（例えば、ＰｈｔＤ）および無毒化ニューモリシンを含む。免疫原性組成物のある実施の形態（例えば、２価または３価の形態）が、ここの実施例に記載されている。
【００３４】
ポリペプチド
免疫原性ＰｃｐＡポリペプチドは、全長のＰｃｐＡアミノ酸配列（シグナル配列の存在下または不在下で）、その断片、およびその変異体を含む。ここに記載された組成物に使用するのに適したＰｃｐＡポリペプチドの例としては、肺炎レンサ球菌株Ｂ６からのＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＢ０４７５８、肺炎レンサ球菌株ＴＩＧＲ４からのＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿および肺炎レンサ球菌株Ｒ６からのＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿３５９５３６のもの、並びに肺炎レンサ球菌株１４４５３からのものが挙げられる。
【００３５】
肺炎レンサ球菌１４４５３ゲノムにおける全長ＰｃｐＡのアミノ酸配列は配列番号２である。本発明に使用するのに好ましいＰｃｐＡポリペプチドは、配列番号２または配列番号７に対して５０％以上（例えば、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５％またはそれ以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明に使用するのに好ましいポリペプチドは、配列番号２の少なくとも８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上の連続したアミノ酸の断片を含む。好ましい断片は配列番号２からのエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号２のエピトープを少なくとも１つ維持しながら、配列番号２のＮ末端からの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれ以上）のアミノ酸および／または配列番号２のＣ末端からの１つ以上のアミノ酸を欠如している。さらに好ましい断片は、配列番号２のＮ末端からのシグナル配列を欠如している。好ましいＰｃｐＡポリペプチドは配列番号７である。
【００３６】
必要に応じて、ＰｃｐＡの免疫原性ポリペプチドは、１つ以上のロイシンの豊富な領域（ＬＲＲ）を含む。これらのＬＲＲは、天然に生じるＰｃｐＡ中に存在するか、または例えば、天然に生じるＬＲＲに対して８０％、８５％、９０％または９５％の配列同一性を含む、約６０から約９９％の配列同一性を有する。成熟ＰｃｐＡタンパク質（すなわち、シグナルペプチドを欠如したタンパク質）中のＬＲＲは、国際公開第２００８／０２２３０２号パンフレットに開示された特定の配列（例えば、国際公開第２００８／０２２３０２号パンフレットの配列番号１、２、４１および４５）中に見つけられる。
【００３７】
ＰｃｐＡの免疫原性ポリペプチドは、必要に応じて、天然に生じる成熟ＰｃｐＡタンパク質中に一般に存在するコリン結合ドメインアンカー配列が欠如している。成熟ＰｃｐＡタンパク質のコリン結合アンカーの天然に生じる配列が、配列番号５２として、国際公開第２００８／０２２３０２号パンフレットに開示されている。より詳しくは、免疫原性ポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸置換基を有する天然に生じるＰｃｐＡのＮ末端領域および天然に生じるＰｃｐＡに対して、約６０から約９９％の配列同一性またはその間の任意の同一性、例えば、８０、８５、９０および９５％の同一性を含む。このＮ末端領域は、１つ以上の同類アミノ酸置換基の存在するまたは存在しない、かつシグナル配列の存在するまたは存在しない、配列番号２（または国際公開第２００８／０２２３０２号パンフレットの配列番号１、２、３、４、４１および４５）のアミノ酸配列を含んでもよい。このＮ末端領域は、配列番号１または７（ここに含まれる配列リストに列記された）もしくは国際公開第２００８／０２２３０２号パンフレットの配列番号１、２、３、４、または４１に対して約６０から約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
【００３８】
配列番号２および７の免疫原性断片は、配列番号２および７の５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０および１９１のアミノ酸残基または５と１９１の間の任意の数のアミノ酸残基を含む。ＰｃｐＡの免疫原性断片の例が、国際公開第２００８／０２２３０２号パンフレットに開示されている。
【００３９】
必要に応じて、ＰｃｐＡの免疫原性ポリペプチドはＬＲＲを欠如している。ＬＲＲを欠如している免疫原性ポリペプチドの例が、配列番号２９、配列番号３０、および配列番号３１として国際公開第２００８／０２２３０２号パンフレットに開示されている。
【００４０】
本発明の組成物に適した免疫原性ＰｈｔＸポリペプチドは、全長のＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤまたはＰｈｔＥアミノ酸配列（シグナル配列の存在下と不在下で）、その免疫原性断片、その変異株およびその融合タンパク質を含む。ここに記載された組成物に使用するのに適したＰｈｔＤポリペプチドの例としては、特に、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＫ０６７６０、ＹＰ８１６３７０およびＮＰ３５８５１が挙げられる。肺炎レンサ球菌１４４５３ゲノム中の全長のＰｈｔＤのアミノ酸配列は、配列番号１である。ＰｈｔＤの好ましいポリペプチド（肺炎レンサ球菌１４４５３ゲノムから由来の）は、配列番号５である。
【００４１】
本発明のＰｈｔＸポリペプチドの免疫原性断片は、対応する全長の成熟アミノ酸配列に特異的な免疫反応を誘発することができる。
【００４２】
免疫原性ＰｈｔＸ（例えば、ＰｈｔＤ）ポリペプチドとしては、シグナル配列が結合した全長のタンパク質、シグナルペプチド（例えば、Ｎ末端にある２０のアミノ酸）が除去された成熟した全長のタンパク質、ＰｈｔＸの変異株（天然に生じるか、そうでなければ、例えば、合成由来の）およびＰｈｔＸの免疫原性断片（例えば、天然に生じる成熟ＰｈｔＸタンパク質中に存在する少なくとも１５または２０の連続アミノ酸を含む断片）が挙げられる。
【００４３】
ＰｈｔＤの免疫原性断片の例が、国際公開第２００９／０１２５８８号パンフレットに開示されている。
【００４４】
本発明に使用するのに好ましいＰｈｔＤポリペプチドは、配列番号１または配列番号５に対して５０％以上（例えば、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５％またはそれ以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明に使用するのに好ましいポリペプチドは、配列番号１の少なくとも８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上の連続したアミノ酸の断片を含む。好ましい断片は配列番号１または配列番号５からのエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号１のエピトープを少なくとも１つ維持しながら、配列番号１のＮ末端からの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれ以上）のアミノ酸および／または配列番号１のＣ末端からの１つ以上のアミノ酸を欠如している。さらに好ましい断片は、配列番号１のＮ末端からのシグナル配列を欠如している。好ましいＰｈｔＤポリペプチドは配列番号５である。
【００４５】
ニューモリシン（Ｐｌｙ）は、繊毛運動の阻害および上皮細胞間の密着結合の破壊を含む、肺炎球菌病原の多段階に関わる細胞溶解活性化毒素である（Hirst et al. Clinical and Experimental Immunology (2004)）。例えば、特に、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｑ０４ＩＮ８、Ｐ０Ｃ２Ｊ９、Ｑ７ＺＡＫ５、およびＡＢＯ２１３８１を含む、いくつかのニューモリシンが公知であり、（その後の無毒化）が、ここに記載された組成物に使用するのに適しているであろう。ある実施の形態において、Ｐｌｙは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有する。
【００４６】
本発明に使用するための免疫原性ニューモリシンポリペプチドとしては、シグナル配列が結合した全長のタンパク質、シグナルペプチドが除去された成熟した全長のタンパク質、ニューモリシンの変異株（天然に生じるか、そうでなければ、例えば、合成由来の）およびニューモリシンの免疫原性断片（例えば、天然に生じる成熟ニューモリシンタンパク質中に存在する少なくとも１５または２０の連続アミノ酸を含む断片）が挙げられる。
【００４７】
本発明の免疫原性ニューモリシンポリペプチドの免疫原性変異株および断片は、対応する全長の成熟アミノ酸配列に特異的な免疫反応を誘発することができる。本発明の免疫原性ニューモリシンポリペプチドは無害化されている。すなわち、それらのポリペプチドは、肺炎レンサ球菌により産生され放出される成熟した野生型ニューモリシンタンパク質と比べて毒性が減少しているか、または毒性がない。本発明の免疫原性ニューモリシンポリペプチドは、例えば、化学的に（例えば、ホルムアルデヒド処理を使用して）、または遺伝学的に（例えば、成熟形態で組換えにより産生された）、無毒化されていてよい。
【００４８】
本発明に使用される免疫原性無毒化ニューモリシンの好ましい例が、国際公開第２０１０／０７１９８６号パンフレットに開示されている。その出願に開示されているように、無毒化ニューモリシンは、野生型配列の６５、２９３および４２８位でアミノ酸置換基を含む変異ニューモリシンタンパク質であってもよい。好ましい無毒化ニューモリシンタンパク質において、３つのアミノ酸置換基は、Ｔ65→Ｃ、ＧＧ293→Ｃ、およびＣ428→Ａを含む。好ましい免疫原性の無毒化ニューモリシンポリペプチドは、配列番号９である。
【００４９】
本発明に使用するのに好ましいニューモリシンポリペプチドは、配列番号９または配列番号１０に対して５０％以上（例えば、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５％またはそれ以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明に使用するのに好ましいポリペプチドは、配列番号９または１０の少なくとも８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上の連続したアミノ酸の断片を含む。好ましい断片は配列番号９または配列番号１０からのエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号９または１０のエピトープを少なくとも１つ維持しながら、配列番号９または１０のＮ末端からの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれ以上）のアミノ酸および／または配列番号９または１０のＣ末端からの１つ以上のアミノ酸を欠如している。さらに好ましい断片は、配列番号１０のＮ末端からのシグナル配列を欠如している。
【００５０】
ＰｃｐＡ、ＰｈｔＸ（例えば、ＰｈｔＤ）の免疫原性ポリペプチド、およびここに記載されたニューモリシン、並びにその断片は、変異株を含む。ここに記載された免疫原性ポリペプチドのそのような変異株は、当該技術分野においてよく知られた方法を使用して、その免疫原性能力について選択され、１つ以上の同類アミノ酸修飾を含んでもよい。免疫原性ポリペプチド（ＰｃｐＡ、ＰｈｔＤ、ニューモリシンの）の変異株は、開示された配列（すなわち、配列番号２または７（ＰｃｐＡ）；配列番号１または５（ＰｈｔＤ）；配列番号９または１０（Ｐｌｙ））に対して約６０から約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。アミノ酸配列修飾としては、置換、挿入または欠失変化が挙げられる。置換、欠失、挿入またはその任意の組合せは、その変異株が免疫原性ポリペプチドである限り、単一の変異株において組み合わされてもよい。挿入は、アミノおよび／またはカルボキシル末端融合並びに単一または多数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。挿入は、通常、例えば、１から４の残基ほどの、アミノまたはカルボキシル末端融合のものよりも小さい挿入である。欠失は、タンパク質配列からの１つ以上のアミノ酸残基の除去により特徴付けられる。典型的に、約２から６以下の残基が、タンパク質分子内の任意の１つの部位で欠失している。これらの変異株は、通常、タンパク質をコードするＤＮＡ中のヌクレオチドの部位特異的突然変異により調製され、それによって、その変異株をコードするＤＮＡが産生され、その後、組換え細胞培養においてＤＮＡを発現する。公知の配列を有するＤＮＡにおいて所定の部位で置換変異を生じさせるための技法は、よく知られており、以下に限られないが、Ｍ１３プライマー変異誘発およびＰＣＲ変異誘発が挙げられる。アミノ酸置換は、典型的に単一残基のものであるが、同時に多数の異なる位置で生じ得る。置換変異株は、少なくとも１つの残基が除去され、異なる残基がその場所に挿入されたものである。そのような置換は、一般に、以下の表にしたがって行われ、同類置換と称される。他のものも、当業者によく知られている。
【００５１】
ここに用いたように、アミノ酸置換は、同類であっても、非同類であってもよい。同類アミノ酸置換は、その位置でのアミノ酸残基のサイズ、極性、電荷、疎水性、または親水性に影響がほとんどまたは全くなく、特に、免疫原性を減少させないような、天然のアミノ酸残基の非天然のアミノ酸残基による置換を含んでよい。適切な同類アミノ酸置換が、以下の表１に示されている。
【表１】
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【００５２】
選択した特定のアミノ酸置換基は、選択した部位の位置に依存するであろう。ある実施の形態において、ポリペプチドおよび／または断片をコードするヌクレオチドは、遺伝コードの縮重（すなわち、「ゆらぎ(Wobble)」仮説に一致する）に基づいて置換される。核酸が、細胞（例えば、発現ベクター）中でポリペプチドを発現するのに有用な組換えＤＮＡ分子である場合、ゆらぎ型置換によって、ＤＮＡ分子により元々コードされたものと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドが発現される。しかしながら、上述したように、置換基は、同類、非同類、またはそれらの任意の組合せであってよい。当業者は、公知の技法を使用して、ここに提供されたポリペプチドおよび／または断片の適切な変異株を決定することができる。
【００５３】
類似体は、アミノ酸配列において天然に生じる肺炎レンサ球菌ポリペプチドから、および／または非配列修飾によって、異なり得る。非配列修飾としては、アセチル化、メチル化、ホスホリル化、カルボキシル化、またはグリコシル化における変化が挙げられる。本発明のポリペプチドの「修飾」としては、１つ以上の構成アミノ酸で化学的または酵素的に由来したポリペプチド（または例えば、その断片などのその類似体）が挙げられる。そのような修飾の例としては、側鎖修飾、主鎖修飾、および例えば、アセチル化、ヒドロキシル化、メチル化、アミド化、および炭水化物または脂質部分の結合、補因子などのＮ末端とＣ末端修飾、並びにそれらの組合せが挙げられる。本発明の修飾ポリペプチドは、未修飾ポリペプチドの生物活性を維持しても、減少または増加した生物活性を示してもよい。
【００５４】
２つのポリペプチドの構造的類似性は、それらの配列の長さに沿って同一のアミノ酸の数を最適化するように２つのポリペプチド（例えば、候補のポリペプチドと例えば、配列番号２のポリペプチド）の残基をアライメントすることによって決定できる；同一のアミノ酸の数を最適化させるために、アライメントする上で、一方または両方の配列におけるギャップが許されるが、それでもなお、各配列におけるアミノ酸は、適切な順序のままでなければならない。候補のポリペプチドは、基準ポリペプチドと比べられているポリペプチドである。候補のポリペプチドは、例えば、微生物から単離しても、もしくは組換え技法を使用して産生されても、もしくは化学的または酵素的に合成されても差し支えない。
【００５５】
アミノ酸配列の一対比較分析は、例えば、ニードルマン・ヴンシュ(Needleman-Wunsch)のグローバル・アルゴリズムを使用して行うことができる。あるいは、Tatiana等（FEMS Microbiol. Lett, 174  247-250 (1999)）により記載され、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイトで入手できるような、ＢＬＡＳＴ２サーチアルゴリズムのＢｌａｓｔｐプログラムなどの局所的アライメントアルゴリズムを使用して、ポリペプチドを比較してもよい。マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２：ギャップ開始ペナルティー＝１１、ギャップ伸張ペナルティー＝１、ギャップｘドロップオフ＝５０、１０を予測、ワードサイズ＝３、およびフィルータオンを含む、全てのＢＬＡＳＴ２サーチパラメータのデフォルト値を使用してよい。スミス・ウォーターマンアルゴリズムが、使用できる別の局所的アライメントツールである(1988)。
【００５６】
２つのアミノ酸配列の比較において、構造的類似性は、「同一性(identity)」パーセントにより称しても、「類似性(similarity)」パーセントにより称してもよい。「同一性」は、同一のアミノ酸の存在を称する。「類似性」は、同一のアミノ酸の存在だけでなく、同類置換の存在も称する。本発明のポリペプチドにおけるアミノ酸の同類置換は、表１に示されている、アミノ酸が属する部類の他の構成員から選択してもよい。
【００５７】
前記免疫原性ポリペプチドをコードする核酸は、例えば、限定するものではないが、野生型または変異肺炎レンサ球菌細胞から単離してもよく、あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することによって、または当業者が認識している代わりの標準技法を使用することによって、適用できるＤＮＡ遺伝子（例えば、ｐｃｐＡ、ｐｈｔＤ、ｐｌｙ）を担持する肺炎レンサ球菌株のＤＮＡから直接得てもよい。使用の可能性のある菌株の例としては、肺炎レンサ球菌株ＴＩＧＲ４および１４４５３が挙げられる。好ましい実施の形態において、ポリペプチドは、肺炎レンサ球菌株１４４５３から組換え的に由来する。本発明の単離された核酸分子の好ましい例は、配列番号３、４、６および８に列記された核酸配列を有する。これらの配列の配列同類変異株および融合同類変異株は、本発明により包含される。
【００５８】
本発明のポリペプチドは、標準分子生物学技法および発現システムを使用して産生できる（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition by Sambrook et. al., Cold Spring Harbor Press, 2001を参照のこと）。例えば、免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子の断片を単離し、その免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、任意の市販の発現ベクター（例えば、ｐＢＲ３２２、およびｐＵＣベクター（マサチューセッツ州、イプスウィッチ所在のニュー・イングランド・バイオラブス社(New England Biolabs, Inc.）などの）または発現／精製ベクター（例えば、ＧＴＳ融合ベクター（ニュージャージー州、ピスカタウェイ所在のファイザー社(Pfizer, Inc.）などの）中にクローニングし、次いで、適切な原核、ウイルスまたは真核宿主中に発現してもよい。次いで、従来の手段によって、または市販の発現／精製システムの場合には、製造業者の指示にしたがって、精製を行ってよい。
【００５９】
あるいは、変異株を含む、本発明の免疫原性ポリペプチドは、例えば、限定するものではないが、野生型または変異肺炎レンサ球菌細胞から単離してもよく、また、例えば、排他的固相合成、部分固相法、断片縮合または溶液合成などの、工業的自動化手法を使用した化学合成によって、合成してもよい。
【００６０】
本発明のポリペプチドは免疫原性活性を有することが好ましい。「免疫原性活性」は、被験者において免疫反応を誘発するポリペプチドの能力を称する。ポリペプチドに対する免疫反応は、被験者における、ポリペプチドに対する細胞および／または抗体媒介免疫反応の発生である。通常、免疫反応は、以下に限られないが、以下の効果の内の１つ以上を含む：ポリペプチドのエピトープに対する抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサＴ細胞および／または細胞傷害性Ｔ細胞の産生。「エピトープ」という用語は、抗体が産生されるように特異的Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原の部位を称する。免疫原性活性は防御的であってもよい。「防御的免疫原性活性」という用語は、肺炎レンサ球菌による感染（疾病を生じる）を防ぐまたは阻害する免疫反応を被験者において誘発するポリペプチドの能力を称する。
【００６１】
組成物
開示された免疫原性肺炎レンサ球菌ポリペプチドを使用して、例えば、ワクチン組成物などの免疫原性組成物を製造する。免疫原性組成物は、被験者（例えば、哺乳類）に投与した際に、組成物内に含まれる抗原に対して向けられた免疫反応を誘発するまたは向上させるものである。この反応は、抗体の産生（例えば、Ｂ細胞の刺激により）またはＴ細胞に基づく反応（例えば、細胞溶解反応）を含むであろう。これらの反応は、防御的または中和的であっても、なくてもよい。防御的または中和的免疫反応は、抗原に対応する感染性微生物（例えば、抗原が由来する）に対して有害であり、被験者に対して有益である（例えば、感染を減少させるかまたは防ぐことによって）ものである。ここに用いたように、防御的または中和的抗体は、対応する野生型肺炎レンサ球菌ポリペプチド（またはその断片）に対して反応性であり、動物において試験した場合、対応する野生型肺炎レンサ球菌ポリペプチドの致死率を減少させるかまたは抑制するであろう。宿主に投与した際に、防御的または中和的免疫反応を生じる免疫原性組成物は、ワクチンと考えられるであろう。
【００６２】
前記組成物は、被験者に投与したときに、免疫反応を誘発するのに十分な量で免疫原性ポリペプチドを含む。ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的に効果的な量の免疫原性ポリペプチド、並びに必要に応じて、任意の他の成分を含む。「免疫学的に効果的な量」とは、一回の服用または一連の服用の一部のいずれかで、被験者へのその量の投与が、治療または予防に効果的であることを意味する。
【００６３】
２、３またはそれより多くの免疫原性ポリペプチド（例えば、ＰｃｐＡ、ＰｈｔＤ、および／または無毒化ニューモリシン）を含む組成物において、そのポリペプチド成分は、相溶性であることが好ましく、抗原干渉を防ぎ、任意の可能性のある相乗効果を最適化するのに適した比率で組み合わされる。例えば、各成分の量は、投与量当たり約５μｇから約５００μｇ、投与量当たり約５μｇから約１００μｇ、または投与量当たり約２５μｇから約５０μｇの範囲にあり得る。その範囲が、投与量当たりの抗原成分当たり５または６μｇから５０μｇであり得ることが好ましい。一例において、組成物は、２５μｇのＰｈｔＸ（例えば、ＰｈｔＤ）の免疫原性ポリペプチドおよび２５μｇのＰｃｐＡの免疫原性ポリペプチドを含む。前記組成物は、別の例において、２５μｇのニューモリシン（例えば、無毒化ニューモリシン；ＰｌｙＤ１（配列番号９））も含む。
【００６４】
下記に述べる実施例では、動物モデルにおいて、ＰｈｔＸ（例えば、ＰｈｔＤ）およびＰｃｐＡの二成分ワクチン組成物についてと、ＰｃｐＡ、ＰｈｔＸ（例えば、ＰｈｔＤ）および無毒化ニューモリシン（例えば、ＰｌｙＤ１）の三成分ワクチン組成物について、様々な抗原比を比べた。意外なことに、試験した抗原比では、統計的に有意である抗原干渉は観察されなかった。また、意外なことに、２価組成物（または３価組成物）による免疫化に対する反応において誘発された抗原特異的抗体が、ウサギ血清を使用したマウスにおける受動免疫化の研究において、加法様式で働くことが分かった。それゆえ、多成分組成物において、これらの成分は、等量（例えば、１：１、１：１：１）で存在してよい。これらの成分は、各抗原についての推測の最小抗原投与量に関して他の比率で存在してもよい（例えば、ＰｃｐＡ：ＰｈｔＸ（ＰｈｔＤ）：ニューモリシン、約１：１：１から約１：５：２５）。一例において、３価組成物は、１：４：８のＰｃｐＡ：ＰｈｔＤ：ニューモリシンの比率にある量（μｇ／投与量）のＰｃｐＡ：ＰｈｔＤ：ニューモリシン（例えば、ＰｌｙＤ１）を含む。別の例において、ＰｃｐＡ：ＰｈｔＤ：ニューモリシンの比率は、１：１：１である。
【００６５】
本発明の組成物は、当業者により適切であると決定された量と処方計画で、例えば、注射などの経皮的(percutaneous)（例えば、筋肉内、静脈内、腹腔内または皮下）、経皮的(transderml)、粘膜（例えば、鼻腔内）または局所などの適切な経路により投与することができる。例えば、１〜２５０μｇまたは１０〜１００μｇの組成物を投与することができる。予防法または療法の目的のために、前記組成物を１、２、３、４回以上投与して差し支えない。一例において、１回以上の投与は、「プライム・ブースト」法の一部として行ってもよい。複数回の投与を行う場合、投与は、例えば、１週間、１ヶ月または数ヶ月、互いに間隔を空けても差し支えない。
【００６６】
本発明の組成物（例えば、ワクチン組成物）は、アジュバントの有無にかかわらずに投与してよい。アジュバントは、一般に、抗原の免疫原性を向上させられる物質である。アジュバントは、後天的および先天的免疫の両方において役割を果たし（例えば、Ｔｏｌｌ様受容体）、全てが理解されているわけではないが、様々な様式で機能するであろう。
【００６７】
天然と合成の両方の多くの物質が、アジュバントとして機能することが示されてきた。例えば、アジュバントとしては、以下に限られないが、鉱物塩、スクアレン混合物、ムラミールペプチド、サポニン誘導体、マイコバクテリウム細胞壁調製物、特定のエマルション、モノホスホリルリピッドＡ、ミコール酸誘導体、非イオン性ブロックコポリマー界面活性剤、Ｑｕｉｌ−Ａ、コレラ毒素Ｂサブユニット、ポリホスファゼンおよび誘導体、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、サイトカインアジュバント、ＭＦ５９アジュバント、リピッドアジュバント、粘膜アジュバント、特定の細菌外毒素および他の成分、特定のオリゴヌクレオチド、ＰＬＧなどが挙げられる。これのアジュバントを、ここに記載された組成物および方法に使用してよい。
【００６８】
ある実施の形態において、前記組成物は、少なくともスクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤、疎水性非イオン性界面活性剤を含む水中油エマルションを含むアジュバントの存在下で投与され、ここで、この水中油エマルションは転相温度プロセスにより得られ、油滴の個体群の９０体積％が２００ｎｍ未満、必要に応じて、１５０ｎｍ未満のサイズを有する。そのようなアジュバントが、ここに全てを引用する国際公開第２００７／００６９３９号パンフレット（Vaccine Composition Compising a Thermoinversable Emulsion）に記載されている。その組成物は、上述したスクアレン水中油エマルションに加え、またはその代わりに、製品Ｅ６０２０（ＣＡＳ番号２８７１８０−６３−６を有する）を含んでもよい。製品Ｅ６０２０は、米国特許出願公開第２００７／００８２８７５号明細書（ここに全てを引用する）に記載されている。
【００６９】
ある実施の形態において、前記組成物は、単独で、またはアジュバントとの組合せで一緒に、ＴＬＲアゴニスト（例えば、ＴＬＲ４アゴニスト）を含む。例えば、アジュバントは、ＴＬＲ４アゴニスト（例えば、ＴＬＡ４）、スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル化学群に属する非イオン性親水性界面活性剤、非イオン性疎水性界面活性剤を含み、熱可逆性である。そのようなアジュバントの例が、ここに全てを引用する国際公開第２００７／０８０３０８号パンフレット（Thermoreversible Oil-in-Water Emulsion）に記載されている。ある実施の形態において、組成物は、ＣｐＧおよびアルミニウム塩アジュバント（例えば、Ａｌｕｍ）の組合せによりアジュバントが添加されている。
【００７０】
アルミニウム塩アジュバント（または化合物）は、本発明の実施に使用するアジュバントの内である。使用されるアルミニウム塩アジュバントの例としては、水酸化アルミニウム（例えば、結晶質オキシ水酸化アルミニウムＡｌＯ（ＯＨ）、および水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）3）が挙げられる。水酸化アルミニウムは、Ａｌ3+イオンおよびヒドロキシル基（−ＯＨ）を含むアルミニウム化合物である。水酸化アルミニウムと他のアルミニウム化合物（例えば、水酸化リン酸塩または水酸化硫酸塩）との混合物を使用してもよく、その場合、結果として生じる混合物は、ヒドロキシル基を含むアルミニウム化合物である。特別な実施の形態において、アルミニウムアジュバントはオキシ水酸化アルミニウム（例えば、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標））である。アルミニウム塩アジュバントを含む組成物は、極端な温度、すなわち、氷点（０℃）未満または非常な暑さ（例えば、≧７０℃）に曝露すべきではないことがよく知られている。何故ならば、そのような曝露は、吸着される抗原とアジュバントの両方の安定性と免疫原性に悪影響を及ぼすことがあるからである。
【００７１】
発明者等は、水酸化アルミニウムアジュバント（ＡｌＯ（ＯＨ））でアジュバントを添加した場合、ＰｃｐＡおよびＰｈｔＤポリペプチドの劣化速度が速い（以下の実施例において論じられている）ことに気が付いた。発明者等は、ホスフェート、カーボネート、サルフェート、カルボキシレート、ジホスホネートまたはこれらの化合物２種類以上の混合物で前処理された、水酸化物基を含むアルミニウム化合物（例えば、水酸化アルミニウムアジュバント）でＰｃｐＡおよびＰｈｔＤポリペプチドにアジュバントを添加すると、これらのポリペプチドの安定性が増加することを発見した。それゆえ、免疫原性ＰｃｐＡポリペプチドまたは免疫原性ＰｈｔＸポリペプチド（例えば、ＰｈｔＤ）と、ホスフェート、カーボネート、サルフェート、カルボキシレート、ジホスホネートまたはこれらの化合物２種類以上の混合物で処理された、水酸化物基を含むアルミニウム化合物とを含む組成物の配合物であって、前記処理によって、前記ポリペプチドが未処理のアルミニウム化合物に吸着している組成物に対して、免疫原性ポリペプチドの安定性が増加している配合物がここに提供される。好ましい実施の形態において、前記アルミニウム化合物は、ホスフェートにより処理されている。ＰｃｐＡおよびＰｈｔＸ（例えば、ＰｈｔＤ）の両方の免疫原性ポリペプチドと、ホスフェート、カーボネート、サルフェート、カルボキシレート、ジホスホネートまたはこれらの化合物２種類以上の混合物で処理された、水酸化物基を含むアルミニウム化合物とを含む多価組成物であって、前記処理によって、前記ポリペプチドが未処理のアルミニウム化合物に吸着している組成物に対して、免疫原性ポリペプチドの安定性が増加している組成物も提供される。
【００７２】
本発明の特別な実施の形態において、アルミニウム化合物（例えば、水酸化アルミニウムアジュバント）は、ホスフェート、カーボネート、サルフェート、カルボキシレート、ジホスホネート、またはこれらの化合物２種類以上の混合物で処理される。このようにしてアルミニウム化合物を処理することによって、アルミニウム化合物中の多数のヒドロキシル基（−ＯＨ）が、このアルミニウム化合物を処理する対応するイオン（例えば、ホスフェート（ＰＯ4））と置換される。この置換により、アルミニウム化合物のＰＺＣとこの化合物の微環境のｐＨが低下する。ホスフェート、カーボネート、サルフェート、カルボキシレート、またはジホスホネートイオンは、微環境のｐＨを、抗原が安定化される（すなわち、抗原の加水分解の速度が減少する）レベルまで低下させるのに十分な量で加えられる。その必要な量は、例えば、関与する抗原、抗原の等電点、抗原の濃度、使用されるアジュバント添加方法、および配合物中に存在する任意の追加の抗原の量と性質などの数多くの要因に依存する。ワクチンの分野の当業者は、関連する要因を評価し、抗原の安定性を増加させるためにアルミニウム化合物に加えられるホスフェート、カーボネート、サルフェート、カルボキシレート、ジホスホネートの濃度を決定することができる（したがって、対応する配合物および組成物を調製できる）。例えば、滴定研究（すなわち、増加する濃度のホスホネートなどをアルミニウム化合物に添加する）を行ってもよい。
【００７３】
使用するのに適したホスフェート化合物としては、リン酸に関連する化合物（例えば、リン酸の無機塩および有機エステルなど）のいずれも含まれる。リン酸塩は、任意の陽イオンと共に、リン酸イオン（ＰＯ43-）、リン酸水素イオン（ＨＰＯ42-）またはリン酸二水素イオン（Ｈ2ＰＯ4-）を含有する無機化合物である。リン酸エステルは、リン酸の水素が有機基により置換された有機化合物である。リン酸塩の代わりに使用してよい化合物の例としては、陰イオンアミノ酸（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸）およびリン脂質が挙げられる。
【００７４】
使用するのに適したカルボキシレート化合物としては、カルボン酸（例えば、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、グルタル酸、ＥＤＴＡ、およびＥＧＴＡ）の有機エステル、塩および陰イオンのいずれもが挙げられる。使用するのに適した硫黄陰イオンとしては、硫酸の塩またはエステル（例えば、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、サルファイト、メタ重亜硫酸塩、チオサルフェート）などのサルフェート（ＳＯ4ラジカル）を含有するどのような化合物もが挙げられる。使用するのに適したジホスホネート化合物の例としては、クロドロネート、パミドロネート、チルドロネート、およびアレンドロネートが挙げられる。
【００７５】
本発明の好ましい実施の形態において、ホスフェートは塩の形態で水酸化アルミニウムアジュバントに加えられる。リン酸イオンは、リン酸二ナトリウム一ナトリウムを含む緩衝液により提供されることが好ましい。
【００７６】
ここに実証するような、本発明の好ましい実施において、アルミニウム化合物（例えば、オキシ水酸化アルミニウム）はホスフェートにより処理される（例えば、実施例に記載されたようなプロセスによって）。このプロセスにおいて、オキシ水酸化アルミニウムの水性懸濁液（約２０ｍｇ／ｍＬ）は、リン酸緩衝液（例えば、約４００モル／Ｌ）と混合される。好ましい最終ホスフェート濃度は、約２ｍＭから２０ｍＭまでである。次いで、この混合物は、緩衝液（例えば、トリス−ＨＣｌ、生理食塩水を含むトリス−ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳ）で希釈されて、オキシ水酸化アルミニウムとホスフェート（ＰＯ4）の懸濁液が調製される。緩衝液は、約７．４のｐＨでの１０ｍＭのトリス−ＨＣｌおよび１５０ｍＭのＮａＣｌであることが好ましい。次いで、この懸濁液は室温で約２４時間に亘り混合される。最終懸濁液中の元素のアルミニウムの濃度は、約０．２８ｍｇ／ｍＬから１．６８ｍｇ／ｍＬの範囲内にあることが好ましい。元素のアルミニウムの濃度が約０．５６ｍｇ／ｍＬであることがより好ましい。
【００７７】
次いで、ＰｃｐＡ、ＰｈｔＤおよび無毒化ニューモリシンの免疫原性ポリペプチド（個別にまたは組合せで）を、処理済みの水酸化アルミニウムに吸着させてもよい。約０．２〜０．４ｍｇ／ｍＬの抗原を、処理済みの水酸化アルミニウムアジュバントの懸濁液と混合する（例えば、約３０分間、または約１２〜１５時間、もしくは約２４時間に亘り、オービタルミキサ内において、室温または２〜８℃で）ことが好ましい。
【００７８】
抗原吸着の割合を、当該技術分野に公知の標準方法を使用して評価してもよい。例えば、抗原／アジュバント調製品のアリコートを取り出し、遠心分離して（例えば、１０，０００ｒｐｍで）、アジュバント懸濁液（上清）から未吸着のタンパク質（ペレット）を分離してもよい。上清中のタンパク質の濃度は、ビシンコニン酸タンパク質アッセイ（ＢＣＡ）または逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用して決定してよい。吸着の割合は、以下のように計算される：％Ａ＝１００−（［ＰｒＳＮ］×１００／［ＰｒＣｔｒ］）、式中［ＰｒＳＮ］は上清中のタンパク質濃度であり、［ＰｒＣｔｒ］は対応するアジュバントを未添加の対照中の濃度である。好ましい実施の形態において、吸着％は、約７０％から約１００％に及ぶ。より好ましい実施の形態において、吸着％は少なくとも約７０％である。
【００７９】
アジュバントを添加した免疫化のある実施の形態において、免疫原性ポリペプチドおよび／またはその断片は、細菌多糖体に共有結合して、多糖体複合体を形成するであろう。そのような複合体は、前記ポリペプチドおよび／またはその断片に結合した細菌多糖体に対して向けられたＴ細胞依存性免疫反応を誘発するための免疫原として有用であろう。
【００８０】
開示された配合物は、従来の冷蔵庫の温度、例えば、約２℃から約８℃で長期間貯蔵した場合に安定である。その配合物は、粒子の凝集をほとんどまたは全く示さず、抗原濃度の著しい減少を示さず、少なくとも６ヶ月または１２ヶ月、好ましくは１８ヶ月に亘り著しいレベルの免疫原性および／または抗原性を維持する。「抗原濃度の著しい減少」という句は、組成物が、最初に配合されたときに存在する、元の抗原濃度の少なくとも５０％、６０％、または７０％、より好ましくは、元の抗原濃度の少なくとも８０％、８５％、または９０％、より好ましくは、元の抗原濃度の少なくとも約９１％、９２％、９８％、９９％またはそれより多くを維持することを意味することが意図されている。抗原濃度は、例えば、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはＥＬＩＳＡに基づく方法によって測定してよい。
【００８１】
安定な配合物または安定な配合物を含む免疫原性組成物は、相当な度合いの構造的健全性を維持する（例えば、元の抗原濃度の相当な量などを維持する）。
【００８２】
安定性は、例えば、存在する抗原の濃度を測定することにより（例えば、ＲＰ−ＨＰＬＣにより）、または例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、抗原の劣化を評価することによって、評価してもよい。配合物中の抗原濃度を、未処理である（すなわち、リン酸または炭酸イオンにより処理されていない）が同じアルミニウム化合物により調製した配合物のものと比較してもよい。安定性予測および／または比較ツールの例としては、Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（SocienTek Software, Inc.による）が挙げられ、これは、貯蔵温度（２℃〜８℃）での速度定数を予測するためにアレニウス処理を使用する。抗原濃度、および免疫原性を測定するための標準アッセイが、当該技術分野において公知であり、実施例に記載されている。予防効果は、例えば、配合物中に存在する特定の抗原に対応する疾病を発症する病原または毒素の接種後の、免疫化した被験者と、免疫化していない被験者の生存率を評価することによって、判断してもよい。
【００８３】
本発明の免疫原性組成物は、液体形態にあることが好ましいが、それらは、凍結乾燥（標準方法による）されていても、または発泡乾燥（国際公開第２００９／０１２６０１号パンフレットに記載されているような、Antigen-Adjuvant Composition and Methods）されていてもよい。本発明のある実施の形態による組成物は液体形態にある。免疫化投与量は、０．５と１．０ｍＬの間の容積で配合してよい。液体配合物は、例えば、溶液、または懸濁液を含む、投与に適したどのような形態であってもよい。それゆえ、組成物は、緩衝されていてよい、液体媒質（例えば、生理食塩水または水）を含み得る。
【００８４】
配合物（および組成物）のｐＨは、約６．４と約８．４の間にあることが好ましい。ｐＨが約７．４であることがより好ましい。組成物の例示のｐＨ範囲は、５〜１０、例えば、５〜９、５〜８、５．５〜９、６〜７．５、または６．５〜７である。ｐＨは、緩衝液の使用によって維持してよい。
【００８５】
本発明の免疫原性組成物の薬剤配合物は、必要に応じて、当該技術分野によく知られている賦形剤（例えば、希釈剤、増粘剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤、アジュバント、洗浄剤および／または免疫賦活剤）を１種類以上含んでもよい。適切な賦形剤は、当該技術分野に公知なように、アルミニウムアジュバントおよび抗原と相溶性である。希釈剤の例としては、結合剤、崩壊剤、もしくはデンプン、セルロース誘導体、フェノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールまたはグリセリンなどの分散剤が挙げられる。薬剤配合物は、抗菌剤、抗炎症剤および麻酔薬などの活性成分を１種類以上含んでもよい。洗浄剤の例としては、Ｔｗｅｅｎ  ８０などのＴｗｅｅｎ（ポリソルベート）が挙げられる。本発明の組成物に含むのに適した賦形剤は当該技術分野において公知である。
【００８６】
本発明は、ＰｃｐＡ、ＰｈｔＸ（例えば、ＰｈｔＤ）および／または無毒化ニューモリシンタンパク質および組成物に有益な特性を与える（例えば、組成物のタンパク質の１種類以上の安定性を増加させる）薬学的に許容される賦形剤を１種類以上含む組成物を提供する。本発明の組成物に含むことのできる化合物または賦形剤の例としては、緩衝剤（例えば、グリシン、ヒスチジン）；張性剤（例えば、マンニトール）；糖または糖アルコールなどの炭水化物（例えば、ソルビトール、トレハロース、またはスクロース；１〜３０％）または炭水化物ポリマー（例えば、デキストラン）；アミノ酸、オリゴペプチドまたはポリアミノ酸（１００ｍＭまで）；多価アルコール（例えば、グリセロール、および２０％までの濃度）；洗浄剤、脂質、または界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ８０、またはＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）、０．５％までの濃度）；酸化防止剤；塩類（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、または酢酸マグネシウム、１５０ｍＭまで）；またはそれらの組合せが挙げられる。
【００８７】
本発明の組成物に使用できる賦形剤の例としては、表１１に列記されたもの、および以下の実施例が挙げられる。様々な実施例において、賦形剤は、例えば、以下に記載されたアッセイ（例えば、ＳＹＰＲＯオレンジの外因性蛍光）によって測定される、熱安定性を増加させる（例えば、少なくとも０．５だけ、例えば、０．５〜５、１〜４、または２〜３だけ）ものであってよい。
【００８８】
例示の賦形剤および緩衝剤としては、ソルビトール（例えば、４〜２０％、５〜１０％）（表１１参照）が挙げられる。これらの賦形剤は、表１１に列記された濃度で本発明に使用できる。あるいは、量は、当該技術分野に理解されるように、例えば、０．１〜１０倍、変動しても差し支えない。当該技術分野に公知の他の炭水化物、糖アルコール、界面活性剤およびアミノ酸を本発明の組成物に含ませても差し支えない。
【００８９】
賦形剤および緩衝剤は、個々にまたは組合せで使用して差し支えない。そのような組成物のｐＨは、例えば、５．５〜８．０であって差し支えなく、組成物は、液体または凍結乾燥形態において、例えば、２〜８℃で貯蔵することができる。組成物の変種において、ソルビトールをスクロース（例えば、４〜２０％、または５〜１０％）、またはトレハロース（例えば、４〜２０％、または５〜１０％）で置き換えても差し支えない。組成物の他の変種は、本発明に含まれ、ここに列記された他の成分の使用を含む。先に基づいて、本発明の例示の組成物は、１０％のソルビトール、ｐＨ７．４を含む。
【００９０】
ある実施の形態において、１価ＰｌｙＤ１組成物は、投与量当たり、５から５０μｇの範囲の抗原において、約７．４のｐＨで、約１０ｍＭのトリス−ＨＣｌおよび約１５０ｍＭのＮａＣｌ中に、ＰＴＨアジュバント（約７．５のｐＨで、約０．５６ｍｇ／ｍＬの元素のアルミニウムを含有する、２ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液）を含んでもよい。
【００９１】
別の実施の形態において、１価ＰｈｔＤ組成物は、投与量当たり、５から５０μｇの範囲の抗原において、約７．４のｐＨで、約１０ｍＭのトリス−ＨＣｌおよび約１５０ｍＭのＮａＣｌ中に、ＰＴＨアジュバント（約７．５のｐＨで、約０．５６ｍｇ／ｍＬの元素のアルミニウムを含有する、２ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液）を含んでもよい。
【００９２】
さらに別の実施の形態において、１価ＰｃｐＡ組成物は、投与量当たり、５から５０μｇの範囲の抗原において、約７．４のｐＨで、約１０ｍＭのトリス−ＨＣｌおよび約１５０ｍＭのＮａＣｌ中に、ＰＴＨアジュバント（約７．５のｐＨで、約０．５６ｍｇ／ｍＬの元素のアルミニウムを含有する、２ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液）を含んでもよい。
【００９３】
別の実施の形態において、２価配合物の組成物は、投与量当たり、各々５から５０μｇ／投与量の範囲で２種類のタンパク質（以下：ＰｈｔＤ、ＰｌｙＤ１またはＰｃｐＡから選択される）、約７．４のｐＨで、約１０ｍＭのトリス−ＨＣｌおよび約１５０ｍＭのＮａＣｌ中に、ＰＴＨアジュバント（約７．５のｐＨで、約０．５６ｍｇ／ｍＬの元素のアルミニウムを含有する、２ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液）を含んでもよい。
【００９４】
さらに別の実施の形態において、３価配合物の組成物は、投与量当たり、各々５から５０μｇ／投与量の範囲で３種類のタンパク質（ＰｈｔＤ、ＰｌｙＤ１、ＰｃｐＡ）、約７．４のｐＨで、約１０ｍＭのトリス−ＨＣｌおよび約１５０ｍＭのＮａＣｌ中に、ＰＴＨアジュバント（約７．５のｐＨで、約０．５６ｍｇ／ｍＬの元素のアルミニウムを含有する、２ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液）を含んでもよい。
【００９５】
別の例において、前記組成物は、安定性に対して利益を提供することが示されてきた、ソルビトール、またはスクロースを含む（下記参照）。これらの成分の量は、例えば、５〜１５％、８〜１２％または１０％のソルビトールまたはスクロースであって差し支えない。これらの成分が１０％で存在する特別な実施例が、下記に記載されている。好ましい実施の形態において、組成物は、１０％のソルビトールまたは１０％のスクロースを含む。
【００９６】
本発明は、改善された性質を有する肺炎レンサ球菌タンパク質（例えば、ＰｃｐＡ、ＰｈｔＸ（例えば、ＰｈｔＤ）、無毒化ニューモリシン）を含む組成物を生成するために使用できる賦形剤を特定する方法も含む。これらの方法は、以下にさらに記載されているものなどのスクリーニングアッセイを含み、これは、組成物の１種類以上のタンパク質成分の安定性を増加させる条件の特定を容易にする。これらの方法は、以下にさらに記載されているような安定性アッセイを含む。さらに、本発明は、溶解度、免疫原性および粘度アッセイを含む、所望の配合物を特定するための他のアッセイの使用を含む。
【００９７】
本発明のある実施の形態による組成物は、（ｉ）水酸化アルミニウムアジュバントを、ホスフェート、カーボネート、サルフェート、カルボキシレート、ジホスホネートまたはこれらの化合物２種類以上の混合物で処理し、（ｉｉ）処理された水酸化アルミニウムアジュバントを、免疫原性ＰｃｐＡポリペプチドおよび／または免疫原性ＰｈｔＸポリペプチドと混合することによって調製してもよい。好ましい実施の形態において、免疫原性ＰｈｔＸポリペプチドはＰｈｔＤである。
【００９８】
本発明の肺炎レンサ球菌ポリペプチドを１種類以上含有する免疫原性組成物（例えば、ワクチン）を使用して、肺炎レンサ球菌感染症を予防および／または治療してもよい。本発明の予防法および治療法は、例えば、治療自体の実施、その後の感染症の予防、または受動免疫化にその後使用するための抗体の産生において、開示された免疫原性ポリペプチド１種類以上によるワクチン接種を含む。
【００９９】
本発明の免疫原性組成物には、疾病、疾患、肺炎レンサ球菌感染症に関連するまたはそれから生じる症状または症候を予防または治療する方法に用途が見出されている。疾病、疾患および症状という用語は、ここでは交換可能に使用される。詳しくは、予防法および治療法は、治療上効果的な量の薬剤組成物を被験者に投与することを含む。特別な実施の形態において、肺炎レンサ球菌を予防または治療する方法が提供される。
【０１００】
ここに用いたように、疾病または疾患の予防は、肺炎レンサ球菌に関連する特定の疾病または疾患の発症から被験者を防御するために、本発明の薬剤組成物を治療上効果的な量で被験者に投与することを意味することが意図されている。
【０１０１】
疾病または疾患の治療により、肺炎レンサ球菌により発症する疾病に罹患した、または肺炎レンサ球菌に曝露された被験者に、本発明の薬剤組成物を治療上効果的な量投与することであって、その目的が、その疾病の症状または症候を治す、癒す、緩和する、軽減する、変える、治癒する、改良する、改善する、または影響を与えることである投与が意図されている。
【０１０２】
治療上効果的な量は、所定の症状または投与計画にとって治療効果を提供する量を称する。治療上効果的な量は、患者の特徴（年齢、体重、性別、症状、他の疾病との合併症など）に基づいて、医療従事者により決定できる。この治療上効果的な量は、前記組成物の投与経路によってもさらに影響を受ける。
【０１０３】
被験者における肺炎球菌疾病のリスクを減少させる方法であって、被験者に、開示された免疫原性ポリペプチド１種類以上を含む免疫原性組成物を投与する工程を含む方法も開示される。肺炎球菌疾病（すなわち、症候性感染症）の例としては、副鼻腔感染症、中耳炎、気管支炎、肺炎、髄膜炎、溶血性尿毒症および菌血症（敗血症）が挙げられる。これらの感染症の内の任意の１つ以上のリスクは、ここに記載された方法によって減少するであろう。好ましい方法は、被験者に侵襲性肺炎球菌感染症および／または肺炎のリスクを減少させる方法であって、被験者に、免疫原性ＰｃｐＡポリペプチドおよび免疫原性ＰｈｔＸ（例えば、ＰｈｔＤ）ポリペプチドを含む免疫原性組成物を投与する工程を含む方法を含む。他の好ましい方法において、前記組成物は、無毒化ニューモリシン（例えば、ＰｌｙＤ１）も含む。
【０１０４】
本開示は、免疫原性組成物またはその配合物を被験者に投与することによって、哺乳類において免疫反応を誘発させる方法も提供する。これは、被験者に前記組成物の薬学的に許容される配合物を投与して、被験者の免疫系に免疫原性ポリペプチドおよび／またはアジュバントを曝露することによって行われるであろう。その投与は、一度で行っても、多数回行ってもよい。一例において、１回以上の投与は、いわゆる「プライム・ブースト」法の一部として行ってもよい。他の投与システムは、徐放性、遅延解除性または持効性送達システムを含んでよい。
【０１０５】
免疫原性組成物は、免疫原性組成物およびアジュバントまたは、従来のまたは他の装置を使用して哺乳類に投与するために組成物を溶液に容易に溶解させるために１種類以上の薬学的に許容される希釈剤を含むもどし溶液を含むキット形態で提示してもよい。そのようなキットは、必要に応じて、組成物の液体形態の投与のための装置（例えば、（皮下）注射器、マイクロニードルアレイ）および／または使用のための説明書を含むであろう。
【０１０６】
ここに開示された組成物およびワクチンは、様々な送達システムに含ませてもよい。一例において、その組成物は、投与のための「マイクロニードルアレイ」または「マイクロニードルパッチ」送達システムに適用してもよい。これのマイクロニードルアレイまたはパッチは、一般に、基材に取り付けられ、乾燥形態のワクチンが塗布された複数の針状突起を含む。哺乳類の皮膚に施用するときに、針状突起は、皮膚を突き刺し、ワクチンを送達して、被験哺乳類の免疫化を行う。
【０１０７】
定義
ここに用いた「抗原」という用語は、哺乳類に導入されたときに、対応する免疫体（抗体）の形成を開始し、媒介できるか、または主要組織適合複合体（ＭＨＣ）によって結合され、Ｔ細胞に提示され得る物質を称する。抗原は、哺乳類の抗原への曝露により、異なる特異性を有する複数の対応する抗体を産生するように、多数の抗原決定基を有するであろう。抗原としては、以下に限られないが、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、核酸およびそれらの断片、変異株および組合せが挙げられるであろう。
【０１０８】
「免疫原」という用語は、適応的免疫反応を誘発できる物質である。
【０１０９】
ペプチド、タンパク質およびポリペプチドという用語は、ここでは交換可能に使用される。
【０１１０】
「単離された」ポリペプチドは、天然の環境から除去されたものである。例えば、単離されたポリペプチドは、細胞質から、または細胞膜から、除去されたポリペプチドであり、天然の環境のポリペプチド、核酸、および他の細胞物質の多くは、もはや存在しない。「単離可能な」ポリペプチドは、特定の供給源から単離できるポリペプチドである。「精製された」ポリペプチドは、元々関連付けられる他の成分を少なくとも６０％含まない、好ましくは少なくとも７５％含まない、最も好ましくは少なくとも９０％含まないものである。それらが天然に生じる微生物の外部で、例えば、化学的または組換え手段によって、産生されるポリペプチドは、天然の環境中に決して存在しないので、定義により、単離され、精製されたと考えられる。
【０１１１】
ここに用いたように、ポリペプチドの「断片」は、長さで、好ましくは少なくとも約４０の残基、または６０の残基、好ましくは少なくとも約１００の残基を有する。肺炎レンサ球菌ポリペプチドの断片は、当該技術分野に公知の方法によって産生できる。
【０１１２】
「抗体」という用語は、未精製または部分精製形態（すなわち、ハイブリドーマ上清、腹水、ポリクローナル抗血清）または精製形態の全抗体または断片化抗体を含む。「精製」抗体は、最初に共に見つけられた（すなわち、ハイブリドーマ上清または腹水調製品の一部として）タンパク質の少なくとも５０％から分離されたものである。
【０１１３】
明細書および添付の特許請求の範囲に用いられるように、単数形は、明らかにそうではないと文脈に記載されていない限り、複数の対象を含む。それゆえ、例えば、断片の言及は、断片の混合物を含んでよく、薬剤担体またはアジュバントの言及は、そのような担体またはアジュバント２種類以上の混合物を含んでよい。
【０１１４】
ここに用いたように、被験者または宿主は、個体を意味する。
【０１１５】
随意的なまたは必要に応じては、その後に記載された事象または状況が、起こり得るまたは起こり得ないこと、並びにその記載が、当該事象または状況が起こる例と、起こらない例を含むことを意味する。例えば、「必要に応じて組成物が組合せを含み得る」という句は、その組成物が、異なる分子の組合せを含んでもよく、またはその記載がその組合せとその組合せの不在の両方（すなわち、その組合せの個々の構成員）を含むように組合せを含まなくてもよいことを意味する。
【０１１６】
範囲は、約ある特定の値から、および／または約別の特定の値までと、ここに表してよい。そのような範囲が表された場合、別の態様は、そのある特定の値から、および／または他の特定の値までを含む。同様に、値が、約またはおおよそという先行詞の使用によって、近似として表現されている場合、その特定の値は、別の態様を形成すると理解されよう。さらに、範囲の各々の端点は、他の端点に関連して、他の端点とは関係なくの両方で有意であると理解されよう。
【０１１７】
防ぐ、予防する、および予防という用語は、ここで、所定の症状に関する所定の治療に関連する（例えば、肺炎レンサ球菌感染症の予防）場合、治療される被験者は、臨床的に観察可能なレベルの症状を全く発症しないか、またはその治療が行われなかったであろうよりも遅くおよび／または少ない程度で発症することを意味する。これらの用語は、被験者がその症状の態様をなんであれ経験しない状況のみに限定されない。例えば、治療は、症状の所定の徴候を生じることが予測されたであろう刺激への患者の曝露中に与えられ、そうでなければ予測された症状より少ないおよび／または穏やかな症候を被験者が経験することになった場合、その症状を防いだと言われる。治療は、被験者が、感染の穏やかな明白な症候のみしか示さないことによって、感染症を「予防」できる。これは、感染する微生物が、どの細胞にも侵入しなかったに違いないことを意味するものではない。
【０１１８】
同様に、所定の治療による感染症のリスクに関連してここに使用される減少する、減少している、および減少（例えば、肺炎レンサ球菌感染症のリスクの減少）は、治療（例えば、免疫原性ポリペプチドの投与）を行わずに感染症を発症した対象または基準レベルと比べて、より遅いまたはより低い程度で感染症を被験者が発症することを意味する。感染症のリスクの減少により、被験者は、感染症の穏やかな明白な症候または感染症の遅い症候しか示さないであろう。これは、感染する微生物がどの細胞にも侵入しなかったはずであることを意味するものではない。
【０１１９】
本開示に列記した全ての文献をここに引用する。
【実施例】
【０１２０】
先の開示は、本発明を一般的に説明している。より完全な理解は、以下の特別な実施例を参照することにより得られる。これらの実施例は、説明の目的のためだけに記載されており、本発明の範囲を制限することを意図していない。形態の変化および同等物の置換は、状況が示唆するまたは便宜にするように、考えられる。特定の用語がここに使用されているが、そのような用語は、説明の意味であって、制限を目的とするものではない。
【０１２１】
使用されているが、本開示およびこれらの実施例に明白に記載されていない、分子遺伝学、タンパク質生化学、免疫学および発酵技法の方法は、科学文献に十分に報告されており、十分に、当業者の能力の範囲内である。
【０１２２】
実施例１Ａ
組換えＰｃｐＡおよびＰｈｔＤポリペプチド
この実施例は、ＰｃｐＡタンパク質およびＰｈｔＤタンパク質の組換えによる調製を記載する。手短に言うと、肺炎レンサ球菌（ＡＴＣＣ  ５５９８７として１９９７年６月２７日に寄託された菌株１４４５３（マウス毒性莢膜血清型６Ｂ菌株））からの２種類の組換え由来タンパク質抗原であるＰｈｔＤ（国際公開第２００９／０１２５８８号パンフレット）およびＰｃｐＡ（国際公開第２００８／０２２３０２号パンフレット）を大腸菌中で組換え発現し、単離し、従来の精製プロトコルにしたがって、連続カラムクロマトグラフィーによって精製した。
【０１２３】
ＰｈｔＤ遺伝子（天然のシグナルペプチドは除く）を、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ（Invitrogen）およびプライマーのＳｐｎ０２１１とＳｐｎ０２１３を使用して、肺炎レンサ球菌１４４５３ゲノムからＰＣＲ増幅した。Ｓｐｎ０２１１とＳｐｎ０２１３は、ＮｏｃＩおよびＸｈｏＩ制限部位をそれぞれ、５’末端と３’末端に導入した（表２参照）。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Qiagen）を使用して精製し、アガロースゲル上で泳動させてサイズを確認した。ＰＣＲ産物とｐＥＴ２８ａ（＋）ベクター（Novagen）を両方ともＮｃｏＩとＸｈｏＩで消化し、その後、ＱＩＡＥＸゲル抽出キット（Qiagen）を使用してアガロースゲルから精製した。消化されたベクターおよび遺伝子を、ＴＡ  ＤＮＡリガーゼ（Invitrogen）を使用して、一緒にライゲーションした。ライゲーション混合物を化学的コンピテントな大腸菌ＤＨ５α中に形質転換させ、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬｕｒｉａ寒天上に播種することにより、平板培養することによって、陽性クローンを選択した。プラスミドクローンｐＢＡＣ２７からＤＮＡを単離し、塩基配列決定法によって正確であると確認した。
【０１２４】
次いで、プラスミド（ｐＢＡＣ２７）をエレクトロポレーションによって大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中に導入した。形質転換された菌株を約３７℃で増殖させ、１ｍＭのＩＰＴＧの添加によって、タンパク質発現を誘発した。遺伝子産物の発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によって、正確なサイズ（すなわち、約９１．９ｋＤａ）の誘発タンパク質バンドの存在より確認した。
【表２】
0005894083.tif 000003
【０１２５】
ｐＢＡＣ２７のポリペプチドの予測したアミノ酸配列は以下のとおりである：
【化１】
0005894083.tif 000004
【０１２６】
ＰｃｐＡ遺伝子（シグナル配列およびコリン結合ドメインを除く）を、クローニングの簡素化のために設計された制限エンドヌクレアーゼ部位を含むＰＣＲプライマー（表３参照）およびＡｃｃｕｐｒｉｍｅ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen）を使用して、肺炎レンサ球菌１４４５３ゲノムからＰＣＲ増幅した。ｐＥＴ−３０ａ（＋）（Novagen）のプラスミドＤＮＡを低コピー数プラスミドとして精製し、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩにより消化し、その後ゲル精製を行うことによって、クローニングベクターとして使用するために調製した。その結果得られた１３３５塩基対断片は、ＸｈｏＩ（３’末端）およびＮｄｅＩ（５’末端）制限部位に挟まれたＰｃｐＡ（シグナル配列およびコリン結合ドメインを除く）であった。増幅された断片を清浄にし、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩにより消化し、次いで、ゲル精製し、ｐＥＴ−３０ａ（＋）ベクター中にライゲーションした。この挿入断片を塩基配列決定法により確認し、新たなプラスミドをｐＪＭＳ８７と指定した。
【表３】
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【０１２７】
ｐＪＭＳ８７のポリペプチドの予測したアミノ酸配列は以下のとおりである：
【化２】
0005894083.tif 000006
【０１２８】
化学的コンピテントな大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞をプラスミドｐＪＭＳ８７のＤＮＡで形質転換した。遺伝子産物の発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によって、正確なサイズ（すなわち、約４９．４ｋＤａ）の誘発タンパク質バンドの存在より確認した。
【０１２９】
クローニングされたＰｃｐＡポリペプチドはシグナル配列およびコリン結合ドメインを欠如しているので、そのアミノ酸配列は、全長のＰｃｐＡタンパク質のアミノ酸２７から４７０に対応している。この領域は、８つの可変位置しか有さず、調査した菌株全ての中で極めて保存されている。配列の最も相違する対は、９８．７％の同一性を有する。
【０１３０】
組換えＰｃｐＡタンパク質および組換えＰｈｔＤタンパク質に関するベクターＮＴｉにより予測される等電点は、それぞれ、７．１９および５．１６であった。
【０１３１】
ＰｃｐＡ遺伝子およびＰｈｔＤ遺伝子の各々は、以下の血清型において検出された：１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、７、７Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１１Ａ／Ｂ、１１Ａ／Ｄ／Ｆ、１２Ｆ／Ｂ、１４、１５Ｂ、１５Ｂ／Ｃ、１６、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２、２３、２３Ｂ、２３Ｆ、３３Ｆ、３４、３５Ｂ。数多くのこれらの血清型は、現在市販されている肺炎球菌複合体ワクチンＰＣＶ７により対処されない。
【０１３２】
これらの組換えタンパク質産物は、標準方法を使用して、発現させ、単離し、精製した。
【０１３３】
いずれかの組換えタンパク質のアジュバントを添加した１価組成物を、標準方法を使用して、トリス緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中で、単離され精製されたタンパク質にアジュバント（例えば、水酸化アルミニウムアジュバント（例えば、「Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ」８５、２％）またはＡｌＰＯ4）を配合することによって、調製した。配合された材料をガラスバイアルに移し、２℃から８℃で貯蔵した。ＰｈｔＤおよびＰｃｐＡ両方のアジュバントを添加した２価組成物を、各アジュバントを添加した所望の濃度の１価配合物のアリコートを容器に分取し、室温で約０．５時間に亘りＮｕｔａｔｏｒ（転頭運動式ミキサ）により混合することによって調製した。次いで、所望の容積の配合物を、ゴム栓とアルミニウム蓋を備えた、殺菌済みの３ｍＬのガラスバイアルに分取した。あるいは、所望の濃度の各単離し精製したタンパク質を一緒に混合し、次いで、トリス緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中でその混合物にアジュバントを配合することによって、２価組成物を調製した。
【０１３４】
実施例１Ｂ
この実施例は、表面修飾したアジュバントおよびこのアジュバントを含む配合物の調製を記載する。表面修飾アジュバントは、水酸化アルミニウムアジュバント（「Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ」、Brenntag）をホスフェートで処理することによって調製した。使用した水酸化アルミニウムアジュバントは、製造業者によれば、再度の加圧滅菌処理に耐えるが、凍結した場合には破壊される、湿潤ゲル懸濁液であった。製造業者によれば、ｐＨが５〜７に維持された場合、アジュバントは、正の電荷を有し、負に帯電した抗原（例えば、中性ｐＨに維持された場合、酸性等電点を有するタンパク質）を吸着できる。
【０１３５】
ａ）  ＡｌＯ（ＯＨ）のホスフェート処理−ＡｌＯ（ＯＨ）の水性懸濁液（約２０ｍｇ／ｍＬ）をリン酸緩衝原液（約４００モル／Ｌ）と混合し、約ｐＨ７．４の１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（Sigma Aldrich）で希釈して、約１３ｍｇ／ｍＬのＡｌＯＯＨ／２００ｍＭのＰＯ4を有するホスフェート処理済みＡｌＯ（ＯＨ）懸濁液（ここで「ＰＴＨ」と称する）を調製した。次いで、この懸濁液を室温で約３０分間から２４時間に亘り混合した。
【０１３６】
ｂ）  抗原の吸着−組換え由来のＰｃｐＡおよびＰｈｔＤ抗原（実施例１Ａに記載したように、発現し、単離し、精製した）を個別にホスフェート処理ＡｌＯ（ＯＨ）に吸着させた。
【０１３７】
約０．２〜０．４ｍｇ／ｍＬの精製抗原（すなわち、ｒＰｃｐＡまたはｒＰｈｔＤ）および０．５６ｍｇの元素のアルミニウム／ｍｌ／ＰＴＨ懸濁液ＰＯ4ｍＭを含有する混合物を調製した。あるいは、標準方法を使用して、トリス緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中に水酸化アルミニウムアジュバント（「Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ」８５、２％）またはＡｌＰＯ4と共に精製抗原を含有する混合物を調製した。混合物を室温で約３０分間から２４時間に亘りオービタルシェーカー内で混合して、抗原とアジュバントの会合を促進した。類似の吸着体をいくつも調製し、典型的な予備吸着組成物は：タンパク質（ＰｈｔＤまたはＰｃｐＡ）：０．２〜０．４ｍｇ／ｍｌ、ホスフェート：２から８０ｍＭ（好ましくは、２から２０ｍＭ）およびＡｌＯ（ＯＨ）：１．２５ｍｇ／ｍｌ（０．５６ｍｇの元素のＡｌ／ｍｌ）。調製した抗原吸着サンプルを、使用するまで、約２℃〜８℃で貯蔵した。あるいは、ホスフェート処理した水酸化アルミニウムアジュバントの原液を使用することによって、抗原に一緒にアジュバントを添加した（２価配合物を調製するために）。
【０１３８】
ｃ）  ２価配合物の調製−ＰＴＨに吸着されたＰｈｔＤおよびＰＴＨに吸着されたＰｃｐＡの中間体バルクロット（１価配合物）をブレンドし、オービタルシェーカー内において室温で約３０分間に亘り一緒に混合して、２価配合物を調製した。典型的な予備吸着組成物は：０．０５ｍｇ／ｍｌの各タンパク質（ＰｈｔＤまたはＰｃｐＡ）；ホスフェート：２から２０ｍＭおよび１．２５ｍｇ／ｍＬのＡｌＯ（ＯＨ）（０．５６ｍｇの元素のＡｌ／ｍｌ）。
【０１３９】
実施例２
様々な投与量のＰｃｐＡおよびＰｈｔＤが配合された２価組成物による抗原干渉および体液反応の評価
この実施例は、動物における多成分組成物の免疫原性の分析を記載する。精製したＰｈｔＤおよびＰｃｐＡタンパク質、水酸化アルミニウムアジュバント（「Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ」８５、２％、２５．５２ｍｇ／ｍＬ）、トリス緩衝生理食塩水（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．４／１５０ｍＭのＮａＣｌ）を使用して、配合物を調製した（実施例１に記載したように）。配合物を約３０分間に亘りＮｕｔａｔｏｒで混合し、ガラスバイアルに分配した。
【０１４０】
６から８週間の年齢の１０匹の雌のネズミＢａｌｂ／ｃＫ−７２（Charles River）のグループを、適用可能な配合物で３週間間隔で３回、皮下（ＳＣ）で免疫化した：
Ａ．  トリス緩衝生理食塩水ｐＨ＝７．４中（５μｇ／ｍＬのＰｃｐＡ＋１．３ｍｇ／ｍＬのＡｌＯＯＨ）
Ｂ．  トリス緩衝生理食塩水ｐＨ＝７．４中（１２．５μｇ／ｍＬのＰｃｐＡ＋１．３ｍｇ／ｍＬのＡｌＯＯＨ）
Ｃ．  トリス緩衝生理食塩水ｐＨ＝７．４中（２５μｇ／ｍＬのＰｃｐＡ＋１．３ｍｇ／ｍＬのＡｌＯＯＨ）
Ｄ．  トリス緩衝生理食塩水ｐＨ＝７．４中（５μｇ／ｍＬのＰｈｔＤ＋１．３ｍｇ／ｍＬのＡｌＯＯＨ）
Ｅ．  トリス緩衝生理食塩水ｐＨ＝７．４中（１２．５μｇ／ｍＬのＰｈｔＤ＋１．３ｍｇ／ｍＬのＡｌＯＯＨ）
Ｆ．  トリス緩衝生理食塩水ｐＨ＝７．４中（２５μｇ／ｍＬのＰｈｔＤ＋１．３ｍｇ／ｍＬのＡｌＯＯＨ）
Ｇ．  トリス緩衝生理食塩水ｐＨ＝７．４中（５μｇ／ｍＬのＰｃｐＡ＋５μｇ／ｍＬのＰｈｔＤ＋１．３ｍｇ／ｍＬのＡｌＯＯＨ）
Ｈ．  トリス緩衝生理食塩水ｐＨ＝７．４中（５μｇ／ｍＬのＰｃｐＡ＋１２．５μｇ／ｍＬのＰｈｔＤ＋１．３ｍｇ／ｍＬのＡｌＯＯＨ）
Ｉ．  トリス緩衝生理食塩水ｐＨ＝７．４中（５μｇ／ｍＬのＰｃｐＡ＋２５μｇ／ｍＬのＰｈｔＤ＋１．３ｍｇ／ｍＬのＡｌＯＯＨ）
Ｊ．  トリス緩衝生理食塩水ｐＨ＝７．４中（１２．５μｇ／ｍＬのＰｃｐＡ＋５μｇ／ｍＬのＰｈｔＤ＋１．３ｍｇ／ｍＬのＡｌＯＯＨ）
Ｋ．  トリス緩衝生理食塩水ｐＨ＝７．４中（１２．５μｇ／ｍＬのＰｃｐＡ＋１２．５μｇ／ｍＬのＰｈｔＤ＋１．３ｍｇ／ｍＬのＡｌＯＯＨ）
Ｌ．  トリス緩衝生理食塩水ｐＨ＝７．４中（１２．５μｇ／ｍＬのＰｃｐＡ＋２５μｇ／ｍＬのＰｈｔＤ＋１．３ｍｇ／ｍＬのＡｌＯＯＨ）
Ｍ．  トリス緩衝生理食塩水ｐＨ＝７．４中（２５μｇ／ｍＬのＰｃｐＡ＋５μｇ／ｍＬのＰｈｔＤ＋１．３ｍｇ／ｍＬのＡｌＯＯＨ）
Ｎ．  トリス緩衝生理食塩水ｐＨ＝７．４中（２５μｇ／ｍＬのＰｃｐＡ＋１２．５μｇ／ｍＬのＰｈｔＤ＋１．３ｍｇ／ｍＬのＡｌＯＯＨ）
Ｏ．  トリス緩衝生理食塩水ｐＨ＝７．４中（２５μｇ／ｍＬのＰｃｐＡ＋２５μｇ／ｍＬのＰｈｔＤ＋１．３ｍｇ／ｍＬのＡｌＯＯＨ）
【０１４１】
サンプル血液を、最初の免疫化の２日前、および最初と二回目と三回目の免疫化後に全ての動物から採血した。個々のネズミからの血液サンプルを５分間に亘り９，０００ｒｐｍで遠心分離し、回収した血清を−２０℃で貯蔵した。
【０１４２】
プールした処理前血液と、最初と二回目と三回目の免疫化後に採集した血清において、エンドポイント希釈ＥＬＩＳＡによって、全抗原特異的ＩｇＧ力価を測定し、各グループの相乗平均力価が図１に示されている。未処理血液中の抗体力価は検出限界未満（＜１００）であったのに対し、ＰｈｔＤおよびＰｃｐＡ両方の１価配合物に関する最終的な血液力価は、先の研究から観察したものと一致するように、全てのグループにおいて両方の抗原について高かった。ＰｈｔＤおよびＰｃｐＡ特異的抗体のＥＬＩＳＡ力価が表４に要約されている。
【表４】
0005894083.tif 000007
【０１４３】
ＥＬＩＳＡデータの統計分析で、１価ＰｈｔＤ配合物により誘発された抗ＰｈｔＤ反応と比較した、２価配合物により誘発された（三回目の免疫化後）抗ＰｈｔＤ反応へのＰｃｐＡ濃度の影響を調査した。同様に、１価ＰｃｐＡ配合物により誘発された抗ＰｃｐＡ反応と比較した、２価配合物により誘発された（三回目の免疫化後）抗ＰｃｐＡ反応へのＰｈｔＤ濃度の影響も評価した。抗ＰｃｐＡ  ＩｇＧ力価について、１価ＰｃＰＡ配合物により誘発された反応を、２価配合物により誘発されたものと比較した場合（９／９グループ）、統計的な有意差は観察されなかった。したがって、ＰｈｔＤについて、統計的に有意な相互作用は、陽性でも陰性でも、調査したどの投与量において、観察されなかった。抗ＰｈｔＤ力価に関して、２価配合物により誘発された抗ＰｈｔＤ力価（すなわち、反応）と対応する１価のＰｈｔＤ配合物による誘発された力価との間のほとんどの比較において、統計的に有意な阻害には気付かなかった（７／９グループ）。２つの例外が観察された：各々、抗ＰｈｔＤ力価において二分の一の減少が観察された：（ｉ）２．５μｇ／投与量でのＰｈｔＤの１価配合物と比べた２．５μｇ／投与量でのＰｈｔＤおよび１μｇ／投与量でのＰｃｐＡを含有する２価配合物（ｐ＝０．０３４）；および（ｉｉ）５．０μｇ／投与量でのＰｈｔＤの１価配合物と比べた５．０μｇ／投与量でのＰｈｔＤおよび１μｇ／投与量でのＰｃｐＡを含有する２価配合物（ｐ＝０．０２７）。１μｇ／投与量のＰｈｔＤでも、より多い投与量のＰｃｐＡ（すなわち、２．５μｇおよび５μｇ）でも、統計的な差は観察されなかった。しかしながら、この二分の一の減少は、モデルの変動性の範囲内であり、それゆえ、有意なレベルの干渉は反映していない。
【０１４４】
統計分析により決定された、２価組成物における各抗原（ＰｃｐＡ、ＰｈｔＤ）の最適濃度は、２５μｇ／ｍＬ（すなわち、５μｇ／投与量）であった。この濃度の抗原を含む１価組成物（すなわち、２５μｇ／ｍＬのＰｃｐＡまたはＰｈｔＤ）も、最高の抗原特異的ＩｇＧ力価を誘発した。
【０１４５】
実施例３
２価ワクチンの３回の筋肉注射後のラットにおける免疫原性研究
この実施例は、別の動物種（すなわち、ラット）における多成分ワクチンの安全性および免疫原性の分析を記載する。
【０１４６】
（性別当たり２０匹）Ｗｉｓｔａｒ  Ｃｒ：ＷＩ（Han）ラットの４つのグループに、０日目、２１日目および４２日目の３週間間隔で、対照、アジュバントを含むものと含まない２価ワクチン組成物またはアジュバントを添加した１価ＰｃｐＡワクチン組成物いずれかを３回筋肉注射した（下記の表５の研究設計を参照）。最後の投与から２日目または１５日目に、動物の検死を行った。組成物は、実施例１に記載したように調製した。アジュバントが添加された組成物を調製するために使用したアジュバントは水酸化アルミニウム（「Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ」、Brenntag）であった。研究設計の概要については表５を参照のこと。
【表５】
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【０１４７】
疾病率／死亡率チェックを少なくとも毎日二回行い、臨床検査を毎日行った。治療関連と考えられる、時期尚早の死、悪い臨床的症状、体重への影響、食物消費、臨床化学または眼科の特徴はなかった。
【０１４８】
血清を、ＥＬＩＳＡによって、ＰｈｔＤおよびＰｃｐＡ特異的ＩｇＧ抗体力価について分析した。結果が、図２ａからｄに示されている。全ての治療動物は、健全な抗ＰｃｐＡおよび抗ＰｔｈＤ反応を示したが、アジュバントを添加していないグループにおける反応は、むらが大きかった。アジュバントを添加した１価ＰｃｐＡワクチンは、アジュバントを添加した２価ワクチンと同等の免疫反応を誘発し、２価配合物におけるＰｈｔＤによる免疫干渉のないことを示す。
【０１４９】
２価とＰｃｐＡの１価のワクチン組成物の各々は、全ての動物において免疫反応を誘発した。ここでの結果によれば、２価とＰｃｐＡの１価のワクチン組成物はラットにおいて免疫原性である。アジュバントを添加した組成物は、未添加の組成物よりも免疫原性が強かった。
【０１５０】
実施例４
異なるアルミニウム系アジュバントが配合された２価組成物の免疫原性の評価
この実施例は、異なるアルミニウム系アジュバントが配合された多成分組成物の免疫原性の分析を記載する。
【０１５１】
ある研究において、組換えＰｈｔＤおよびＰｃｐＡ（実施例１に記載したように調製し、精製した）に、新しい水酸化アルミニウムアジュバント（「Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ」）、約６ヶ月間に亘り２〜８℃でインキュベーションしたねかせた(aged)水酸化アルミニウムアジュバント（「Ａｌｈｄｒｏｇｅｌ」、Brenntag）、様々な濃度のホスフェートＰＯ4（２ｍＭ、１０ｍＭおよび２０ｍＭ）で処理した水酸化アルミニウムアジュバント（「Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ」、Brenntag）またはＡｌＰＯ4（Ａｄｊｕｐｈｏｓ（登録商標）、Brenntag）いずれかを配合した。配合物は、実施例１に記載したように調製した。到着したときに６〜８週間の年齢の５（または４）匹の雌のＢａｌｂ／ｃマウス（Charles River）のグループを、適用可能な配合物により、３週間間隔で筋肉内（ＩＭ）に３回、免疫化した。各グループに投与した具体的な配合物が、表６に列記されている。
【０１５２】
最後の採血後のＰｈｔＤおよびＰｃｐＡ特異的抗体ＥＬＩＳＡ力価が表６に要約されている。ＰｃｐＡおよび／またはＰｈｔＤタンパク質で免疫化したマウスは、免疫化後に抗原特異的抗体反応を生じた。新しいまたはねかせたＡｌＯＯＨまたはホスフェートで前処理した（使用した３つの濃度のいずれかで）ものいずれかを含む２価配合物で免疫化した動物において、抗ＰｈｔＤおよび抗ＰｃｐＡの力価に有意な差は見られなかった。ＡｌＰＯ4（ＡｌＯＯＨよりも免疫原性が低い）を配合した２価組成物による免疫化で、ＡｌＯＯＨまたはＰＯ4含有ＡｌＯＯＨアジュバントを含む配合物と比べたときに、著しく低い抗ＰｈｔＤ  ＩｇＧ力価が生じた。これらの結果は、水酸化アルミニウムアジュバントおよびＡｌＰＯ4アジュバントを配合した２価組成物を比較した他の研究においても確認にされた。
【０１５３】
全体で、アルミニウム系アジュバント（水酸化アルミニウムアジュバント、様々な濃度のＰＯ4で処理した水酸化アルミニウムアジュバント、ＡｌＰＯ4）を配合した、免疫原としての組換えＰｃｐＡおよびＰｈｔＤの両方を使用して、４種類の研究を完了した。両方の抗原は、１〜５μｇ／投与量に及ぶ様々な投与量で与えられた。プールした予め採血した血液および３回のＩＭまたはＳＣ免疫化後に採集した血清において、特異的ＰｃｐＡおよびＰｈｔＤ抗原力価を測定した。予め採血した血液中の抗体力価は検出限界未満（＜１００）であったのに対し、最後の採血の力価は、抗ＰｃｐＡについて、１２４８２７から２０４８００まで、抗ＰｈｔＤについて、３６２０４から９７４５４までに及んだ。
【０１５４】
要するに、ここでの結果によれば、試験したアジュバントのいずれかを配合した組成物は免疫原性であった。水酸化アルミニウムアジュバント（すなわち、水酸化アルミニウムアジュバントおよびホスフェート処理した水酸化アルミニウムアジュバント）を配合した組換えＰｈｔＤおよびＰｃｐＡタンパク質による免疫化で、ＡｌＰＯ4配合物による免疫化と比べると、ＰｃｐＡおよびＰｈｔＤの両方に対して、著しく高い抗原特異的抗体反応（ＩｇＧ力価）が生じた。
【表６】
0005894083.tif 000009
【０１５５】
実施例５
肺炎レンサ球菌株１４４５３、ＭＤまたは９４１１９２の接種後の生存
この実施例は、マウスの鼻腔内接種モデルにおける致死肺炎球菌接種に対する多成分ワクチンの防御能力を記載する。
【０１５６】
鼻腔内（ＩＮ）接種モデルを使用して、組換えＰｈｔＤおよびＰｃｐＡの２価配合物を評価した。このモデルにおいて、雌のＣＢＡ／ｊマウス（グループ当たりＮ＝１５）のグループを、アジュバント（２ｍＭのＰＯ4で処理したＡｌＯＯＨ（６５μｇ／投与量））を含むＴＢＳ中に配合した、精製した組換えＰｈｔＤおよびＰｃｐＡタンパク質の各々を５μｇ／投与量含有する２価組成物により筋肉内（ＩＭ）で免疫化した。注射容積は、投与量当たり５０μＬであった。陰性の対照として、ＰＢＳプラシーボ含有アルミニウムアジュバントを注射した。動物を、研究の開始後の０週間、３週間、および６週間でＩＭにより免疫化した。９週間目に、動物に、ＰＢＳ懸濁液（マウス当たり４０μＬの抗原投与容積）中、致死量（約１０6ＣＦＵ）の肺炎レンサ球菌株ＭＤ、株１４４５３または９４１１９２を鼻腔内に投与した。サンプル血液を、最初の注射の４日前（０週間での免疫化前）および接種の４日前に全ての動物から採取した。抗体ＥＬＩＳＡアッセイによって、全ＰｈｔＤおよびＰｃｐＡ特異的ＩｇＧ反応について、血清を分析した。
【０１５７】
接種後、死亡率について、マウスを毎日モニタした。全ての生存するマウスは、接種の１１日後に安楽死させた。免疫化したグループにおける生存率をプラシーボ対照と比較することによって（０．０５未満のｐ値を有意であると考えた）、フィッシャーの片側正確確率検定を使用して防御を決定した。この研究の結果（生存率％で示されている）が図３および下記の表７に示されている。
【表７】
0005894083.tif 000010
【０１５８】
組み合わせた組換えＰｈｔＤおよびＰｃｐＡタンパク質による免疫化により、ＩＮ接種モデルにおいて、肺炎レンサ球菌の３種類の異なる菌株による致死ＩＮ接種に対する防御が生じた。１４４５３株またはＭＤ株のいずれかが接種されたグループにおいて示された防御は、統計的に有意であった。９４１１９２株を接種したグループも高い生存率％を有したが、陰性対照グループ（アジュバントのみで免疫化した）において示された生存率百分率に鑑みて、この防御は統計的に有意であるとは考えられなかった。
【０１５９】
実施例６
異なる投与経路（皮下または筋肉内）を使用した接種後の体液反応および生存率
この実施例は、マウスの鼻腔内接種モデルにおける致死肺炎球菌接種に対する多成分ワクチンの防御能力を記載する。
【０１６０】
ＰｈｔＤおよびＰｃｐＡの２価組成物を調製し（ｒＰｈｔＤおよびｒＰｃｐＡの各々に２種類の異なるロットを使用して）、２ｍＭのホスフェートで前処理した水酸化アルミニウムアジュバント（ＡｌＯＯＨ）を配合した（本出願と同時に出願された特許出願に記載されたプロセスにしたがう）。調製した配合物を、マウスの活性免疫化鼻腔内接種モデル（Zhang Y.A. et. al., Infect. Immunol. 69:3827-3836に記載されたモデルに基づく）において評価した。より詳しくは、到着した際に６〜８週間の年齢である、６匹の雌のＣＢＡ／ｊマウス（Charles River）の１６のグループを、適用可能な配合物により３週間間隔で３回、筋肉内または皮下により免疫化した：
Ａ．  ＰｃｐＡロットＡ、ＰｈｔＤロットＣ、アジュバントなし、皮下（２５μｇ／ｍｌ／タンパク質）
Ｂ．  ＰｃｐＡロットＢ、ＰｈｔＤロットＣ、アジュバントなし、皮下（２５μｇ／ｍｌ／タンパク質）
Ｃ．  ＰｃｐＡロットＡ、ＰｈｔＤロットＤ、アジュバントなし、皮下（２５μｇ／ｍｌ／タンパク質）
Ｄ．  ＰｃｐＡロットＢ、ＰｈｔＤロットＤ、アジュバントなし、皮下（２５μｇ／ｍｌ／タンパク質）
Ｅ．  ＰｃｐＡロットＡ、ＰｈｔＤロットＣ＋２ｍＭのホスフェート処理ＡｌＯＯＨ、皮下（２５μｇ／ｍｌ／タンパク質）
Ｆ．  ＰｃｐＡロットＢ、ＰｈｔＤロットＣ＋２ｍＭのホスフェート処理ＡｌＯＯＨ、皮下（２５μｇ／ｍｌ／タンパク質）
Ｇ．  ＰｃｐＡロットＡ、ＰｈｔＤロットＤ＋２ｍＭのホスフェート処理ＡｌＯＯＨ、皮下（２５μｇ／ｍｌ／タンパク質）
Ｈ．  ＰｃｐＡロットＢ、ＰｈｔＤロットＤ＋２ｍＭのホスフェート処理ＡｌＯＯＨ、皮下（２５μｇ／ｍｌ／タンパク質）
Ｉ．  ＰｃｐＡロットＡ、ＰｈｔＤロットＣ、アジュバントなし、筋肉内（１００μｇ／ｍｌ／タンパク質）
Ｊ．  ＰｃｐＡロットＢ、ＰｈｔＤロットＣ、アジュバントなし、筋肉内（１００μｇ／ｍｌ／タンパク質）
Ｋ．  ＰｃｐＡロットＡ、ＰｈｔＤロットＤ、アジュバントなし、筋肉内（１００μｇ／ｍｌ／タンパク質）
Ｌ．  ＰｃｐＡロットＢ、ＰｈｔＤロットＤ、アジュバントなし、筋肉内（１００μｇ／ｍｌ／タンパク質）
Ｍ．  ＰｃｐＡロットＡ、ＰｈｔＤロットＣ＋２ｍＭのホスフェート処理ＡｌＯＯＨ、筋肉内（１００μｇ／ｍｌ／タンパク質）
Ｎ．  ＰｃｐＡロットＢ、ＰｈｔＤロットＣ＋２ｍＭのホスフェート処理ＡｌＯＯＨ、筋肉内（１００μｇ／ｍｌ／タンパク質）
Ｏ．  ＰｃｐＡロットＡ、ＰｈｔＤロットＤ＋２ｍＭのホスフェート処理ＡｌＯＯＨ、筋肉内（１００μｇ／ｍｌ／タンパク質）
Ｐ．  ＰｃｐＡロットＢ、ＰｈｔＤロットＤ＋２ｍＭのホスフェート処理ＡｌＯＯＨ、筋肉内（１００μｇ／ｍｌ／タンパク質）
【０１６１】
投与された２価配合物の各々は、５μｇ／投与量の各抗原（すなわち、ＰｈｔＤおよびＰｃｐＡ）を含み、ＴＢＳ  ｐＨ７．４中のアジュバント（１．３ｍｇ／ｍＬの２ｍＭのホスフェートで前処理されたＡｌＯ（ＯＨ））が配合された。マウスに、三回目（最後）の採血から４日後に、致死量（１×１０6ＣＦＵ）の肺炎レンサ球菌株ＭＤを投与した。
【０１６２】
最初と二回目と三回目の免疫化の一日前、および三回目の免疫化の３週間後、全ての動物からサンプル血液を採取した。個々のマウスからの血液サンプルを、５分間に亘り９，０００ｒｐｍで遠心分離し、回収した血清を−２０℃で貯蔵した。
【０１６３】
エンドポイントＥＬＩＳＡおよび定量ＥＬＩＳＡにより全抗原特異的ＩｇＧ力価を測定し、各グループの相乗平均力価が図４ａから４ｂに示されている。生存率結果が図５に要約されている。
【０１６４】
異なるロットのＰｃｐＡおよびＰｈｔＤにより誘発された抗ＰｃｐＡおよび抗ＰｈｔＤのＩｇＧ力価の間には、統計的差はなかった。アジュバントが添加された配合物を皮下により投与することには、利点が認められた。より詳しくは、筋肉内投与された配合物は、皮下投与されたものより免疫原性が弱かった。その上、アジュバントなしの配合物は、アジュバントが添加された配合物よりも免疫原性が弱かった。
【０１６５】
生存率に関して、試験した配合物は、致死肺炎レンサ球菌接種に対して防御を与えた（１００μｇ／ｍＬの各ＰｈｔＤとＰｃｐＡおよび前処理したＡｌＯ（ＯＨ）の配合物で免疫化されたグループにおいて、１００％の生存率が見られた）。筋肉内で免疫化されたグループと皮下で免疫化されたグループとの間で、生存率％の著しい差はなかった。２つのＰｔｈＤのロットで免疫化されたグループの生存率％は著しく違わなかったのに対し、２つのＰｃｐＡのロットで免疫化されたグループの生存率％は著しく違った（ロットＢのほうが著しく高い生存率を与えた）。ＰｃｐＡのロットＢは、アジュバントなしの配合物に対して、アジュバントを添加した配合物のほうが、著しく高い生存率％を与えた。アジュバントを添加した配合物対アジュバントなしの配合物において、他の統計的な利点は認められなかった。
【０１６６】
この研究において、マウスに接種するために使用した細菌の特定のロットが、この細菌の菌株の先に使用したロットよりも毒性が少ないことが分かった。別の研究（鼻腔内接種モデルを使用した）において、ｐＨ＝７．４でのトリス−ＨＣｌ、生理食塩水、１５０ｍＭ中の１００μｇ／ｍＬの各ＰｔｈＤおよびＰｃｐＡ＋１．３ｍｇ／ｍＬのＡｌＯ（ＯＨ）（「Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ」「８５」２％、２５．０８ｍｇ／ｍＬ）を含む配合物で免疫化されたマウスの約８０％（ｐ値０．０１１）が、致死肺炎レンサ球菌接種に生存した。
【０１６７】
実施例７
この実施例は、ウサギＰｈｔＤおよびＰｃｐＡ抗血清の調製を記載する。標準方法論によって、Ｈｉｓタグ付きＰｈｔＤ、Ｈｉｓタグ付きＰｃｐＡおよび組換えＰｈｔＤおよびＰｃｐＡの両方を使用して、ウサギにおいて抗血清を生成させた。血清中のＰｈｔＤおよびＰｃｐＡ特異的抗体の測定は、ＥＬＩＳＡによって決定した。ＰｔｈＤの例として、表８に示されるように、ＰｈｔＤ特異的抗体の高い力価が、全ての免疫化したウサギの血清中に検出されたが、予め採血した（ワクチン接種前）血清中には検出されなかった。Ｈｉｓタグ付きＰｈｔＤおよびＰｈｔＤタンパク質の両方は、ウサギにおいて免疫原性であり、抗血清は、高い力価のＰｈｔＤ特異的抗体を有した。Ｈｉｓ−ＰｃｐＡおよびＰｃｐＡタンパク質についても、同様に結果が観察された（データは示さず）。
【表８】
0005894083.tif 000011
【０１６８】
実施例８
この実施例は、ヒトＰｈｔＤおよびＰｃｐＡ特異的抗体の調製を記載する。アフィニティークロマトグラフィーを使用して、正常プールした成人血清から、ヒトポリクローナル抗体を精製した。精製した組換え抗原タンパク質（ＰｈｔＤまたはＰｃｐＡ）に共有結合したＣＮＢｒ−活性化セファロース樹脂を使用して、アフィニティークロマトグラフィーカラムを調製した。ヒトＡＢ血清（Sigma）をこのアフィニティーカラムに結合させ、次いで、これを洗浄し、特異的抗体をグリシン−ＨＣｌ緩衝液により溶離させた。
【０１６９】
最終的な精製抗体は、プールした溶離分画を限外濾過により濃縮し、ＰＢＳ中に緩衝液交換することによって得た。抗体溶液は、０．２２μｍのシリンジフィルタに通す濾過によって殺菌した。全タンパク質濃度は、ＵＶ分光法を使用して決定した。最終抗体調製品の内毒素レベルは、Charles River LaboratoriesからのＥｎｄｏｓａｆｅ  ＰＴＳ  Ｒｅａｄｅｒを使用して決定した。精製抗体の純度、特異性および交差反応性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット法および抗体ＥＬＩＳＡ分析によって決定した。別記しない限り、各ロットは、１００ｍＬのヒトＡＢ血清から精製した。
【０１７０】
実施例９
抗ＰｈｔＤおよび抗ＰｃｐＡ抗体による表面接触性(surface accessibility)ＦＡＣＳアッセイ
この実施例は、抗ＰｈｔＤおよび抗ＰｃｐＡ抗体の結合能力の分析を記載する。完全培地またはＭｎ2+欠乏培地いずれかにおいて、凍結菌株から培養物をＯＤ４５０  ０．４〜０．６まで成長させた。細菌を洗浄し、ＰＢＳ中において様々な濃度のヒトアフィニティー精製抗体と共にインキュベーションした。ＰｃｐＡに対するヒト精製モノクローナル抗体を陽性対照として使用した。細菌への抗体結合は、二次抗体であるＦＩＴＣ−結合(conjugated)抗ヒトＩｇＧを使用して検出し、フローサイトメトリーを使用して評価した。同様に、抗ＰｈｔＤおよび抗ＰｃｐＡ特異的ウサギ血清を使用した。細菌への抗体結合を、二次抗体であるＦＩＴＣ−結合抗ウサギＩｇＧを使用して検出し、フローサイトメトリーを使用して評価した。
【０１７１】
蛍光信号が検出されたときに、定性的アッセイ読み出しとして、細菌を陽性であると記録した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、細菌の表面に結合した抗体の量を測定する手段として分析した。
【０１７２】
表面接触性アッセイ（「ＳＡＳＳＹ」）を行って、抗原特異的ウサギ血清および精製ヒト抗体の、生きている無傷な肺炎レンサ球菌に結合する能力を決定した。
【０１７３】
精製ヒト抗体およびウサギＰｈｔｄ−およびＰｃｐＡ−抗血清（実施例７および８に記載されたように調製した）は、生きている肺炎レンサ球菌の表面上のタンパク質に結合した。ＰｃｐＡに陰性であった菌株Ｄ３９を除いて、研究室および臨床単離体を含む、ＰｈｔＤおよびＰｃｐＡ両方の抗血清が、試験した肺炎レンサ球菌の全ての菌株に結合した。しかしながら、このことは、菌株Ｄ３９（研究室菌株）が、ＰｃｐＡ遺伝子のＰＣＲ増幅によりＰｃｐＡ陰性であったという発見に一致した。ＰｃｐＡの場合、特に、Ｍｎ2+が欠乏し、Ｚｎ2+が増加した条件下で、細菌が増殖したときに、認識が生じた。同時に、このデータは、組換えタンパク質に対して高められた、または自然感染により生じた抗体が、天然タンパク質を認識し、様々な臨床単離体上のエピトープが保存されているという証拠を提供する。このデータは、ＰｃｐＡおよびＰｈｔＤの両方が極めて表面接触性であることを示唆する（図６、およびデータは示さず）。陰性対照として、ウサギ免疫前血清を使用した。
【０１７４】
ヒト精製ＰｈｔＤおよびＰｃｐＡ抗血清が、肺炎レンサ球菌への結合に追加の効果を有するか否かを決定するために、１０ＥＵ／ｍｌの抗ＰｈｔＤ抗体を、増える量の抗ＰｃｐＡ抗血清を含有する各サンプルに加えた。細菌に結合した全抗体の量をＭＦＩにより測定した（図７）。抗ＰｃｐＡ抗体は、用量依存様式で生きている肺炎レンサ球菌に結合できた。抗ＰｈｔＤ抗体の添加は、サンプルのＭＦＩにおける一貫した増加をもたらし、多数の表面タンパク質に対する抗体が同時に結合でき、これにより、細菌の表面上に結合した抗体の総量が増加することが確認された。
【０１７５】
精製ヒト抗ＰｈｔＤ抗体の有無にかからわず、精製ヒト抗ＰｃｐＡ抗体を、Ｍｎ2+欠乏培地中で培養した生きた肺炎レンサ球菌株ＷＵ２と共に様々な濃度でインキュベーションした。細菌の表面に結合した抗体は、ＦＩＴＣヤギ抗ヒトＩｇＧを使用して検出した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）が図７に示されている。抗体力価は、抗ＰｃｐＡ  ＥＵ／ｍｌ（抗ＰｃｐＡおよび抗ＰｃｐＡ＋抗ＰｈｔＤサンプル）または抗ＰｈｔＤ  ＥＵ／ｍｌ（抗ＰｈｔＤサンプル）において示されている。
【０１７６】
抗ＰｈｔＤおよび抗ＰｃｐＡウサギ血清および精製ヒト抗体に関する表面接触性実験は、ＰｃｐＡおよびＰｈｔＤの両方とも表面接触性であることを示した。さらに、ヒト抗ＰｃｐＡおよび抗ＰｈｔＤ抗体は同時に結合でき、したがって、細菌に結合する抗体の総量を増加させられた。
【０１７７】
実施例１０
この実施例は、多価組成物により提供される受動的防御の分析を記載する。
【０１７８】
この研究において、２匹のニュージーランドホワイト種ウサギ（Charles River）を筋肉内（ｉ．ｍ．）で免疫化して、抗ＰｃｐＡ／抗ＰｈｔＤポリクローナル血清を得るために、ＡｌＰＯ4が配合された組換えＰｈｔＤおよびＰｃｐＡの２価組成物を使用した。各ウサギに、ＡｌＰＯ4（３ｍｇ／ｍｌ）中の１０μｇ／投与量のｒＰｃｐＡおよび１０μｇ／投与量のｒＰｈｔＤを筋肉注射した（２０μｇの総タンパク質、５００μｌの総用量の注射／ウサギ）。その後の２回の免疫化で、、ＡｌＰＯ4中の１０μｇ／投与量のｒＰｃｐＡおよび１０μｇ／投与量のｒＰｈｔＤを、３週間間隔で与えた。最初と二回目の免疫化後に、サンプル血液を採取した。最後の血液は、最後の免疫化から３週間後に採取した。血液をゲル状分離剤中で収集し、凝固させ、血清を遠心分離により得、プールし、約−２０℃で貯蔵した。両方のウサギについて、ＰｈｔＤおよびＰｃｐＡ特異的総ＩｇＧ抗体力価を評価した。実験に使用したウサギの一方からの血清は、ＥＬＩＳＡにより以下の力価を有した：ＰｈｔＤ  ２０４，８００およびＰｃｐＡ  １０２，４００。
【０１７９】
組換えＰｈｔＤタンパク質および／または組換えＰｃｐＡタンパク質を特定の血清サンプルに加えて、血清中に存在する対応する抗体を競合的に阻害（遮断）した。対照として、特定の血清サンプルには、どちらの組換えタンパク質も加えなかった。次いで、先に発行された文献（Briles DE et. al., J. Infect Dis. 2000 Dec.）に基づく受動的防御のマウスモデルを使用して、血清サンプルの様々な希釈物を、肺炎レンサ球菌を接種したマウスに投与した。プロビット用量反応曲線を特定するために、投与した血清の対数希釈当たりに観察された生存率％をグラフ化した（図８参照）。各血清サンプルについて、ＥＤ５０（生存率５０％に効果的な対数希釈）を計算した。統計モデルを使用して、遮断血清サンプルと未遮断血清サンプルとの間のＥＤ５０での差を評価した（下記の表９参照）。
【表９】
0005894083.tif 000012
【０１８０】
ＰｃｐＡおよびＰｈｔＤ両方の特異的抗体を含有する血清中でＰｃｐＡ抗体を競合的に阻害すると、ＥＤ５０（すなわち、生存率５０％に効果的な血清の対数希釈）が著しく減少し、この差は、未遮断血清のＥＤ５０と比べると、統計的に有意であった。ＰｃｐＡおよびＰｈｔＤ両方の特異的抗体を含有する血清中でＰｈｔＤ抗体を競合的に阻害しても、ＥＤ５０が減少した（統計的に有意ではないが）。ＰｃｐＡおよびＰｈｔＤ両方の抗体が競合的に阻害されている（血清に、１：１０のタンパク質対血清比で、ＰｈｔＤおよびＰｃｐＡタンパク質の各々を添加することにより）血清サンプルに関して、フィッシャーの正確確率検定により、使用した最高希釈のみで、低い生存率％が統計的に有意に得られ、したがって、ＥＤ５０は確定できなかった。
【０１８１】
要約すれば、ＰｈｔＤおよびＰｃｐＡ両方の抗体は、２価配合物に対して高められ血清により誘発された受動的防御に寄与した。２価配合物に対して高められた血清により提供される防御は、ＰｈｔＤおよびＰｃｐＡ両方の抗体を競合的に阻害することによって遮断され、この結果は、抗体の内の一方のみ（ＰｈｔＤまたはＰｃｐＡ）が競合的に阻害されたときに得られた結果とは著しく異なっていた。同様の結果が、同じ受動的防御モデルにおいてウサギ３価超免疫血清（ＰｈｔＤ、ＰｃｐＡおよびＰｌｙＤ１を含む３価組成物を使用して高められた）と共にＰｈｔＤおよびＰｃｐＡタンパク質を使用して得られた。その研究において、ＰｈｔＤおよびＰｃｐＡタンパク質と共に、３価超免疫血清の防御能力を遮断できた。この受動的防御からのこれらの結果は、各タンパク質特異的抗体の寄与は付加的であることを示す。
【０１８２】
実施例１１
ワクチン配合物の免疫原性へのアルミニウム濃度の影響
この実施例は、ホスフェート前処理したＡｌＯ（ＯＨ）および様々な濃度の元素のアルミニウムを配合した多成分組成物の免疫原性の分析を記載する。
【０１８３】
雌のＢａｌｂ／ｃマウスを使用して、アジュバントを添加した３価配合物により誘発された免疫反応を評価した。３価配合物を調製するために、組換えＰｈｔＤ、ＰｃｐＡおよび酵素的に不活性なニューモリシン変異株（ＰｌｙＤ１、ＰＣＴ出願第ＣＡ／２００９／００１８４３号公報に配列番号４４として記載され、ここに配列番号９として記載されている）に、実施例１に記載したように、ＡｌＯ（ＯＨ）含有ＰＯ4（２ｍＭ）を配合した。調製した配合物のサンプルを、研究の開始前に２から８℃で貯蔵した。Ｂａｌｂ／ｃマウスのグループを、適用可能な配合物により３週間間隔で３回、筋肉内（ＩＭ）で免疫化した：
Ａ．  アジュバントなし（ＴＢＳ  ｐＨ＝７．４中の３価の５０μｇ／ｍＬのＰｃｐＡおよびＰｈｔＤ並びに１００μｇ／ｍＬのＰｌｙ変異株）
Ｂ．  トリス生理食塩水  ｐＨ＝７．４中の３価の５０μｇ／ｍＬのＰｃｐＡおよびＰｈｔＤ並びに１００μｇ／ｍＬのＰｌｙ変異株＋０．５６ｍｇのＡｌ／ｍＬ  ＰＴＨ、Ｐ：Ａｌモル比＝０．１（０．５６ｍｇのＡｌ／ｍＬ  ２ｍＭのＰＯ4で処理したＡｌＯ（ＯＨ））
Ｃ．  トリス生理食塩水  ｐＨ＝７．４中の３価の５０μｇ／ｍＬのＰｃｐＡおよびＰｈｔＤ並びに１００μｇ／ｍＬのＰｌｙ変異株＋０．２８ｍｇのＡｌ／ｍＬ  ＰＴＨ、Ｐ：Ａｌモル比＝０．１（０．２８ｍｇのＡｌ／ｍＬ  １ｍＭのＰＯ4で処理したＡｌＯ（ＯＨ））
Ｄ．  トリス生理食塩水  ｐＨ＝７．４中の３価の５０μｇ／ｍＬのＰｃｐＡおよびＰｈｔＤ並びに１００μｇ／ｍＬのＰｌｙ変異株＋１．１２ｍｇのＡｌ／ｍＬ  ＰＴＨ、Ｐ：Ａｌモル比＝０．１（１．１２ｍｇのＡｌ／ｍＬ  ４ｍＭのＰＯ4で処理したＡｌＯ（ＯＨ））
Ｅ．  トリス生理食塩水  ｐＨ＝７．４中の３価の５０μｇ／ｍＬのＰｃｐＡおよびＰｈｔＤ並びに１００μｇ／ｍＬのＰｌｙ変異株＋１．６８ｍｇのＡｌ／ｍＬ  ＰＴＨ、Ｐ：Ａｌモル比＝０．１（１．６８ｍｇのＡｌ／ｍＬ  ６ｍＭのＰＯ4で処理したＡｌＯ（ＯＨ））
【０１８４】
最初と二回目と三回目の免疫化後に、血清を採取した。定量的ＥＬＩＳＡによって、全抗原特異的ＩｇＧ力価を測定し、各グループについて、相乗平均力価（±ＳＤ）を計算した。得られた全ＩｇＧ力価の要約が図９に示されている。
【０１８５】
全てのアジュバント添加グループ（Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ）が、アジュバントなしのグループ（Ａ）よりも、全ての３種類の抗体に対して、著しく高い力価を生じた（ｐ＜０．００１）。各抗原について、０．５６ｍｇの元素のアルミニウム／ｍＬをＰＴＨに加えたときに、力価レベルはピークとなった（ＰｈｔＤの場合、０．５６ｍｇ／ｍＬのアルミニウムで誘発された力価と、２つのそれより高い濃度によるものとの間の差は統計的に有意であった）。同様に、各抗原について、０．２８ｍｇの元素のアルミニウム／ｍＬをＰＴＨに加えたときに、力価レベルはより低くなった（ＰｃｐＡの場合、その差は統計的に有意であった）。これらの発見は意外であった。抗体（ＩｇＧ）力価は、アルミニウムの濃度に比例して増加すると予測された（Little S.F. et. al., Vaccine, 25:2771-2777 (2007)に報告されているように）。意外なことに、抗原の各々の濃度が一定に維持されていても、力価は、アルミニウム濃度を増加させると、安定水準に達するというよりもむしろ減少した（ＰｈｔＤについて、これは統計的に有意であった）。
【０１８６】
実施例１２
この実施例は、様々な条件下でのアジュバントを添加したワクチン配合物の安定性の評価を記載する。ＰＴＨ吸着された数多くのワクチン組成物を５℃、２５℃、３７℃（すなわち、熱加速条件下）で５日間に亘りインキュベーションした。
【０１８７】
ＰｃｐＡの４種類の異なるワクチン配合物（ＡｌＯ（ＯＨ）またはＰＴＨ中に配合された）の安定性を評価するために、配合物の各々を３７℃で６週間に亘りインキュベーションし、次いで、ＲＰ−ＨＰＬＣにより評価した。得られた安定性の結果が表１０に要約されている。未処理のＡｌＯ（ＯＨ）からの回収は、インキュベーション期間（３７℃）後にほぼ５０％減少したのに対し、ＰＴＨ含有配合物においては、ほとんどから全く劣化は観察されなかった。
【表１０】
0005894083.tif 000013
【０１８８】
１価および２価の配合物（ＡｌＯ（ＯＨ）またはＰＴＨが配合された）におけるＰｃｐＡおよびＰｈｔＤの安定性を評価するために、ＡｌＯ（ＯＨ）または２ｍＭのホスフェートで処理されたＡｌＯ（ＯＨ）を使用して、配合物を実施例１に記載されたように調製し、次いで、サンプルを様々な温度（すなわち、５℃、２５℃、３７℃または４５℃）で約１６週間に亘りインキュベーションした。次いで、抗原濃度をＲＰ−ＨＰＬＣにより評価した。得られた安定性の結果が、図１０ａからｆに示されている。図面に示されるように、未処理のＡｌＯ（ＯＨ）が添加された配合物と比べて、ホスフェート処理されたＡｌＯ（ＯＨ）が添加された配合物において、ＰｃｐＡおよびＰｈｔＤの劣化速度は、特に加速（ストレス）条件下（例えば、２５、３７、４５℃）で、著しく減少した。
【０１８９】
多価配合物（ＡｌＯ（ＯＨ）またはＰＴＨが配合された）におけるＰｃｐＡおよびＰｈｔＤの抗原性安定性を評価するために、２価配合物（１００μｇ／ｍＬ）を実施例１に記載されたように調製し、次いで、サンプルを約３７℃で約１２週間に亘りインキュベーションした。各配合物の抗原性を、時間ゼロと１２週間のインキュベーション期間後に、定量ＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイによって評価した。結果が図１１に示されている。３７℃での１２週間のインキュベーション期間後のＰｃｐＡおよびＰｈｔＤの両方の抗原性は、ＡｌＯ（ＯＨ）を含む配合物と比べて、ＰＴＨを配合したもののほうが著しく高かった。
【０１９０】
実施例１３
この実施例は、数多くの配合物の安定性への様々な賦形剤の影響の評価を記載する。
【０１９１】
様々な濃度での１８のＧＲＡＳ（一般に安全と認められる）化合物のスクリーニングを行った。アッセイを使用して、評価される各タンパク質（すなわち、ＰｃｐＡ、ＰｈｔＤおよび無毒化ニューモリシン変異株（ＰｌｙＤ１、ＰＣＴ出願第ＣＡ／２００９／００１８４３号公報「Modified PLY Nucleic Acids adn Polypeptides」に配列番号４４として記載されている））の熱安定性を増加させる化合物をスクリーニングした。
【０１９２】
タンパク質抗原の各々を大腸菌中で組換え発現させ、ＰｈｔＤおよびＰｃｐＡについては、実施例１に実質的に記載されたように、ＰｌｙＤ１（ここでは配列番号９と示される配列）については、ＰＣＴ出願第ＣＡ／２００９／００１８４３号公報（配列番号４４として）に実質的に記載されたように、従来の精製プロトコルにしたがって、連続カラムクロマトグラフィーによって精製した。３種類の抗原全てに関するタンパク質純度は、ＰＲ−ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価されるように、典型的に、９０％より高かった。タンパク質のバルクを、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含有する１０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４中に約１ｍｇ／ｍＬで供給した。各タンパク質を、１０ｍＭのトリス緩衝液生理食塩水、ｐＨ７．５（ＴＢＳ）中の適切な賦形剤溶液（表１１に示された濃度）で所望の濃度（１００μｇ／ｍＬのＰｃｐＡ；１００μｇ／ｍＬのＰｈｔＤ；２００μｇ／ｍＬのＰｌｙＤ１）に希釈し、このタンパク質溶液にＰＴＨを加えて、０．６ｍｇの元素のＡｌ／ｍＬの最終濃度を達成した。対照サンプル（適用可能な賦形剤を含まない）も検定した。ＳＹＰＲＯ（登録商標）オレンジ、５０００倍（カリフォルニア州、カールズバッド所在のInvitrogen, Inc.）をＤＭＳＯ（Sigma）で５００倍に希釈し、次いで、アジュバントを含むタンパク質溶液に加えた。全ての場合、「ＳＹＰＲＯ」オレンジの最適希釈は、５０００倍の市販の原液からの１０倍であった。
【０１９３】
リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）装置（Ｍｘ３００５ｐ  ＱＰＣＲシステム、カリフォルニア州、ラ・ホーヤ所在のStratagene）を使用して、９６ウェルのポリプロピレンプレート（カリフォルニア州、ラ・ホーヤ所在のStratagene）においてアッセイを行った。約１００μＬのサンプル容積を各ウェルに加え、次いで、プレートに光学的キャップストリップ（カリフォルニア州、ラ・ホーヤ所在のStratagene）で蓋をして、サンプルの蒸発を防いだ。９６ウェルプレートのロータを備えたＣｏｎｔｉｆｕｇｅ  Ｓｔｒａｔｏｓ遠心分離機（英国、Heraeus Instruments）内において、室温で１分間に亘り２００ｇでプレートを遠心分離した。次いで、プレートを２５℃から９６℃まで、毎分１℃で加熱した。蛍光励起および発光フィルタを、それぞれ、４９２ｎｍおよび６１０ｎｍに設定した。蛍光読み取り値（６１０ｎｍで発光、４９２ｎｍで励起）を、２５℃で、次いで、１℃ずつ上昇させながら、各サンプルについて収集した。
【０１９４】
最小の蛍光の一次導関数の対応温度を使用して、熱転移（溶融温度Ｔｍ）を得た。ＲＴ−ＰＣＲに提供されたＭｘＰｒｏソフトウェアを使用して、溶融曲線（または解離曲線）から負の一次導関数トレースの最小を計算した。Ｔｍは、熱溶融における中点と定義され、タンパク質の天然と非天然の形態の自由エネルギーが等しい温度を表す。各賦形剤の影響は、ΔＴｍ＝Ｔｍ（タンパク質＋化合物のサンプル）−Ｔｍ（タンパク質の対照サンプル）として評価した。得られた結果の要約が、表１１に示されている。このアッセイの感度は、±０．５℃であった。
【０１９５】
ポリオール、単糖および二糖が、濃度依存様式で、アジュバントが添加されたＰｌｙＤ１のＴｍを増加させ、最大の安定化（すなわち、約４℃のＴｍの増加）は高濃度の糖で観察された。約２℃、ＰｈｔＤのＴｍを減少させたアルギニンを除いて、同様の結果が、ＰｃｐＡおよびＰｈｔＤの各々で検出された。以下の賦形剤が、３種類のタンパク質全ての熱安定性を効率的に増加させることが分かった：ソルビトール（２０％、１０％）、トレハロース（２０％）、デキストロース（２０％、１０％）、スクロース（１０％、５％）、および１０％のラクトース。
【０１９６】
ストレス条件下で貯蔵されたＰｃｐＡの物理的安定性および抗原性への、スクリーニングアッセイにおいて特定されたいくつかの賦形剤の影響も研究して、先に留意した熱安定性の影響との相関関係に気付いた。ＰｃｐＡタンパク質を、図に記載した適切な賦形剤溶液（１０ｍＭのトリス緩衝液ｐＨ７．４中の、１０％のソルビトール、１０％のスクロース、１０％のトレハロース）により所望の濃度（例えば、約１００μｇ／ｍＬ）に希釈し、このタンパク質溶液にＰＴＨを加えて、０．６ｍｇの元素のＡｌ／ｍＬの最終濃度を達成した。対照サンプル（賦形剤を含まない）もこの研究に含めた。サンプルを３日間に亘り５０℃で貯蔵した。タンパク質の劣化をＲＰ−ＨＰＬＣにより評価し、抗原性は、定量性サンドイッチＥＬＩＳＡにより評価した。結果が、図１２Ａおよび１２Ｂに示されている。
【０１９７】
無傷のタンパク質の濃度を、ダイオードアレイＵＶ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣシステムにおいてＲＰ−ＨＰＬＣにより測定した。サンプルを、３７℃で５時間に亘りＰＢＳ／Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）緩衝液中でアジュバントから脱離させ、ＡＣＥ  Ｃ４カラム（英国、アバディーン所在のAdvanced Chromatography Technologies）および緩衝液Ａ（水中０．１％のＴＦＡ）と緩衝液Ｂ（ＣＡＮ中０．１％のＴＦＡ）の移動相勾配を使用し、１ｍｌ／分の流量で３０分間に亘る毎分０．７５％の緩衝液Ｂの勾配を使用して、分離した。タンパク質を２１０ｎｍでのＵＶ吸収度によりモニタし、外部標準により作成した５点直線較正曲線に対して定量化した。
【０１９８】
定量性抗原ＥＬＩＳＡサンドイッチ法を使用して、時間ゼロおよび５０℃での３日間のインキュベーション後のＰｃｐＡ配合物の抗原性を評価した。抗原の捕捉にはウサギＩｇＧ抗ＰｃｐＡ血清を使用し、検出には十分に特徴付けられたモノクローナル抗ＰｃｐＡを使用した。手短に言えば、９６ウェルプレートを、室温（ＲＴ）で１８時間に亘り、０．０５ＭのＮａ2ＣＯ3／ＮａＨＣＯ3緩衝液中２μｇ／ｍＬの濃度でウサギ抗ＰｈｔＤ  ＩｇＧで被覆し、室温で１時間に亘り、１％のＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングし、その後、ＰＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ２０（ＷＢ）の洗浄緩衝液で２回洗浄した。試験サンプルの２倍希釈物、内部対照および公知の濃度の精製ＰｃｐＡの参照標準を０．１％のＮＳＡ／ＰＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ２０（ＳＢ）内に調製し、ウェルに加え、室温で１時間に亘りインキュベーションし、その後、ＷＢ中で５回洗浄した。検出用一次ｍＡｂをＳＢ中で０．１μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、室温で１時間に亘りインキュベーションし、ＷＢ中で５回洗浄し、ＳＢ中の１／４０Ｋ希釈で特異的なＦ（ａｂ’）２ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を添加した。ＷＢ中の５回の洗浄後、ウェルにＴＭＢ／Ｈ2Ｏ2基質を加え、室温で１０分間に亘りインキュベーションした。１ＭのＨ2ＳＯ4の添加により、反応を停止させた。ＥＬＩＳＡプレートをＡ４５０／５４０ｎｍでプレートリーダ（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ、Ｍ５、カリフォルニア州、サニーベール所在のMolecular Devices）内で読み取り、試験サンプルデータを、ソフトウェアＳｏｆｔＭａｘ  ＰＲＯを使用して、４パラメータ・ロジスティックを使用した標準曲線からの外挿により計算する。
【０１９９】
図１２Ａに示されるように、ＲＰ−ＨＰＬＣから導かれたデータは、アジュバントを添加したＰｃｐＡのＴｍを増加させた賦形剤は、３日間に亘る５０℃でのタンパク質の劣化速度を減少させたことも示した。長期に亘るＰｃｐＡタンパク質の回収パーセントにより決定される最高の安定性は、１０％のソルビトールにより与えられた（図１２Ａに示されている）。アジュバントを添加したＰｃｐＡの抗原性も、これらの賦形剤によって維持された（図１２Ｂ参照）。ＲＰ−ＨＰＬＣの結果と良好な相関関係で、ソルビトールは、スクロースやトレハロースよりも高い程度で抗原性を維持すると思われた。
【０２００】
１０％のソルビトール、１０％のスクロースまたは１０％のトレハロースの添加により、賦形剤を含まない対照サンプルのものと比べると、５０℃での速度定数が著しく減少し、ＰｃｐＡの半減期が増加した（表１２）。９．０の緩衝液のｐＨは、対照のものと比べて、タンパク質のＴｍを減少させたが、５０℃での劣化を加速させた（すなわち、速度定数を増加させた）（表１２）。要するに、これらの結果は、アッセイにより検出された熱安定性、ＲＰ−ＨＰＬＣにより検出された物理的安定性、およびＥＬＩＳＡにより検出された抗原性の間の良好な相関関係を示唆する。
【０２０１】
これらの研究において得られた結果を考えると、ソルビトール、スクロース、デキストロース、ラクトースおよび／またはトレハロースは、物理的安定性を増加させるための、ＰｃｐＡ、ＰｈｔＤおよび無毒化ニューモリシンタンパク質（ＰｌｙＤ１などの）の１価または多価（例えば、２価、３価）配合物中に含んでもよい賦形剤の例である。
【表１１−１】
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【表１１−２】
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【表１２】
0005894083.tif 000016
【０２０２】
実施例１４
アルミニウムアジュバントが配合されたか、されていない３種類の異なる抗原の安定性へのｐＨの影響を調査した。アッセイを使用して、評価される各タンパク質の熱安定性へのｐＨの影響を評価した（すなわち、ＰｃｐＡ、ＰｈｔＤおよび無毒化ニューモリシンタンパク質（ＰｌｙＤ１、ＰＣＴ出願第ＣＡ／２００９／００１８４３号公報「Modified PLY Nucleic Acids adn Polypeptides」に配列番号４４として記載され、ここでの配列リストでは配列番号９として示された））。
【０２０３】
タンパク質抗原の各々を大腸菌中で組換え発現させ、ＰｈｔＤおよびＰｃｐＡについては、実施例１に実質的に記載されたように、ＰｌｙＤ１については、ＰＣＴ出願第ＣＡ／２００９／００１８４３号公報に実質的に記載されたように、従来の精製プロトコルにしたがって、連続カラムクロマトグラフィーによって精製した。３種類の抗原全てに関するタンパク質純度は、ＰＲ−ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価されるように、典型的に、９０％より高かった。タンパク質のバルクを、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含有する１０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４中に約１ｍｇ／ｍＬで供給した。各タンパク質を、適切な緩衝液（すなわち、１０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５〜９．０）、１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０〜７．０）および１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０〜５．５））で所望の濃度（１００μｇ／ｍＬのＰｃｐＡ；１００μｇ／ｍＬのＰｈｔＤ；２００μｇ／ｍＬのＰｌｙＤ１）に希釈し、このタンパク質溶液にアルミニウムアジュバント（すなわち、水酸化アルミニウム（「Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ」、デンマーク国、Brenntag Biosector）、またはリン酸アルミニウム（Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ、デンマーク国、Brenntag Biosector）、または２ｍＭのホスフェート（ＰＴＨ）で前処理した水酸化アルミニウム）を加えて、０．６ｍｇの元素のＡｌ／ｍＬの最終濃度を達成した。対照サンプル（適用可能な賦形剤を含まない）も検定した。「ＳＹＰＲＯ」オレンジ、５０００倍（カリフォルニア州、カールズバッド所在のInvitrogen, Inc.）をＤＭＳＯ（Sigma）で５００倍に希釈し、次いで、アジュバントを含むタンパク質溶液に加えた。全ての場合、「ＳＹＰＲＯ」オレンジの最適希釈は、５０００倍の市販の原液からの１０倍であった。
【０２０４】
リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）装置（Ｍｘ３００５ｐ  ＱＰＣＲシステム、カリフォルニア州、ラ・ホーヤ所在のStratagene）を使用して、９６ウェルのポリプロピレンプレート（カリフォルニア州、ラ・ホーヤ所在のStratagene）においてアッセイを行った。約１００μＬのサンプル容積を各ウェルに加え、次いで、プレートに光学的キャップストリップ（カリフォルニア州、ラ・ホーヤ所在のStratagene）で蓋をして、サンプルの蒸発を防いだ。９６ウェルプレートのロータを備えたＣｏｎｔｉｆｕｇｅ  Ｓｔｒａｔｏｓ遠心分離機（英国、Heraeus Instruments）内において、室温で１分間に亘り２００ｇでプレートを遠心分離した。次いで、プレートを２５℃から９６℃まで、毎分１℃で加熱した。蛍光励起および発光フィルタを、それぞれ、４９２ｎｍおよび６１０ｎｍに設定した。蛍光読み取り値（６１０ｎｍで発光、４９２ｎｍで励起）を、２５℃で、次いで、１℃ずつ上昇させながら、各サンプルについて採集した。
【０２０５】
最小の蛍光の一次導関数の対応温度を使用して、熱転移（溶融温度Ｔｍ）を得た。ＲＴ−ＰＣＲに提供されたＭｘＰｒｏソフトウェアを使用して、溶融曲線（または解離曲線）から負の一次導関数トレースの最小を計算した。Ｔｍは、熱溶融における中点と定義され、タンパク質の天然と非天然の形態の自由エネルギーが等しい温度を表す。得られた結果の要約が、図１３に示されている。このアッセイの感度は、±０．５℃であった。
【０２０６】
ほとんどのタンパク質にとって、溶液のｐＨは、タンパク質へのタイプと総電荷を決定し、それゆえ、静電相互作用および全体的な安定性に影響するであろう。アジュバントが添加されたタンパク質にとって、溶液のｐＨと緩衝剤の種類は、アルミニウムアジュバントの表面での微環境のｐＨに強い影響力を有し、このことは、最終的に、アルミニウムアジュバントに吸着されるタンパク質の劣化速度に影響し得る。
【０２０７】
３種類のタンパク質全ては、研究したｐＨ範囲で水酸化アルミニウムに９０から１００％吸着された。リン酸アルミニウムにおいて、ＰｃｐＡの吸着率は８０％超であったのに対し、ＰｈｔＤおよびＰｌｙＤ１（各々酸性タンパク質）は、ｐＨ５より上では、アジュバントに極わずかしか吸着されなかった（データは示さず）。
【０２０８】
図１３は、アジュバントが配合された場合と、アジュバントを含まない対照の、３種類の抗原各々へのｐＨの影響を示している。アジュバントを含まない抗原は、特殊なｐＨ安定性プロファイルを示した。ＰｃｐＡは、６．０から９．０の広いｐＨ範囲で安定なＴｍ値を示し、ｐＨが６．０から５．０に低下するにつれて、Ｔｍ値が減少した。他方で、アジュバントを含まないＰｈｔＤおよびＰｌｙＤ１の熱安定性は、酸性ｐＨで最大化されるようであった（図１３参照）。アジュバントを含まないタンパク質の熱安定性プロファイルは、アルミニウムアジュバントを添加した結果として、著しく変えられた。アジュバントを含まない対照と比べると、水酸化アルミニウムは、比較的高いｐＨ値と低いｐＨ値で、３種類のタンパク質全ての安定性を減少させるようであり、ｐＨが５から９まで増加したときに、ベル形曲線を示し、最大の安定性は中性ｐＨに近かった。これらのデータは、２ｍＭのホスフェートによるＡｌＯＯＨの前処理により、未処理のＡｌＯＯＨと比べると、高いｐＨと低いｐＨで３種類の抗原全ての安定性を著しく改善したことを示す（図１３Ａ〜Ｃ）。この方法によって、ｐＨ６．０〜７．５の範囲において、著しい変化は観察されなかった。
【０２０９】
アジュバントを含まない対照と比べると、リン酸アルミニウムをアジュバントとして使用した場合、ＰｃｐＡおよびＰｌｙＤ１のＴｍ対ｐＨプロファイルに重大な変化は観察されなかった（図１３Ａおよび１３Ｃ）。ＡＰが添加されたＰｈｔＤの場合、アジュバントを含まない対照と比べると、６未満のｐＨで、Ｔｍの著しい低下が観察された。
【０２１０】
実施例１５
この実施例は、多成分配合物中の様々な抗原組成物の影響の評価を記載する。
【０２１１】
３種類の別々の肺炎レンサ球菌抗原を、１価、２価および３価の形態で配合し、ＩＮ接種モデルを使用して評価した（先の実施例において実質的に記載したように）。１価、２価および３価の配合物を、アジュバント（２ｍＭのＰＯ4により処理されたＡｌＯＯＨ（０．５６μｇのＡｌ／投与量））を含むＴＢＳ、ｐＨ７．４中の最適未満の投与量の精製された組換えＰｃｐＡ、ＰｈｔＤおよびＰｌｙＤ１（無毒化ニューモリシン）を使用して調製した。追加の影響を検出するように、限られた防御しか誘発しないか、全く誘発しないことが示された各抗原の最適未満の投与量を選択した。タンパク質抗原の各々を大腸菌中で組換え発現させ、先に実質的に記載したような従来の精製プロトコルにしたがって、連続カラムクロマトグラフィーによって精製した。３種類の抗原全てに関するタンパク質純度は、ＰＲ−ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価されるように、典型的に、９０％より高かった。雌のＣＢＡ／Ｊマウス（ｎ＝１５／グループ）のグループ（ｎ＝２６）を、適用可能な配合物（５０μＬ）で各免疫化間に３週間の間隔で３回、筋肉内で免疫化した。
【０２１２】
マウスに、最後の免疫化の３週間後に致死量の肺炎レンサ球菌株１４４５３、血清型６Ｂ（１．５×１０6ｃｆｕ／マウス）を投与し、２週間に亘り生存と健康について観察した。生存率結果（下記の表１３に要約されている）を計算し、フィッシャーの正確確率検定法によって、統計的に分析した。全抗原特異的ＩｇＧ力価（各免疫化後に採取した血清からの）を定量ＥＬＩＳＡによって測定し、各グループについて相乗平均力価（±ＳＤ）を計算した。得られた全ＩｇＧ力価の要約が図１４に示されている。
【表１３】
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【０２１３】
ＰｃｐＡ１価配合物は、非常に低い投与量でさえも（低い抗体力価にもかかわらず）、防御的であった。ＰｃｐＡ１価配合物と比べると、３価配合物は、同様のレベルの防御を提供した。ＰｈｔＤおよびＰｌｙＤ１の１価配合物と比べると、３価配合物は著しく高い防御を提供した。３価配合物は、２価配合物と比べて高い生存率を誘発した（２価配合物（０．００６７：０．０２７；ＰｃｐＡ：ＰｈｔＤ）と比べて、２種類の３価配合物（０．０６７：０．０２７：０．５；０．００６７：０．０２７：０．１１６；ＰｃｐＡ：ＰｈｔＤ：ＰｌｙＤ１）に関して、差は統計的に有意であった、ｐ＝０．０４３）。２価の配合物は、それぞれ、ＰｃｐＡおよびＰｈｔＤについて、０．００６７および０．０２７で防御的ではなく、これは、ＰｃｐＡにとって１価配合物として投与されたときに、防御的投与量であった。しかしながら、これら２つのグループ間での生存率の差は統計的に有意ではないので、１価／２価配合物の間に観察された差は、アッセイの変動性によるものであった。
【０２１４】
２価配合物（０．００６７：０．０２７；ＰｃｐＡ：ＰｈｔＤ）および３価配合物における致死接種から少なくとも６０％のマウスを防御する（ＥＤ６０）上でのＰｃｐＡおよびＰｈｔＤの各々の平均効果的投与量を計算した（下記の表１４）。ＰｃｐＡおよびＰｈｔＤの各々について、対応する２価配合物と比べると、３価配合物において、ＥＤ６０は減少した。これらの結果により、ＰｌｙＤ１の添加は、２価配合物（すなわち、ＰｃｐＡ＋ＰｈｔＤ）に平均で２倍の投与量節約効果があった。
【０２１５】
これらのデータは、３価配合物による免疫化で、２価配合物と比べて良好な防御を誘発することを示す。３価配合物中にＰｌｙＤ１を含むことには、防御全体に阻害効果はない。
【表１４】
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【０２１６】
実施例１６
この実施例は、最高レベルの抗体反応を誘発する最小の効果的な抗原投与量の評価を記載する。
【０２１７】
実施した１価研究から、抗原投与量当たりの全抗原特異的ＩｇＧ力価（ＥＬＩＳＡにより測定した）をグラフにプロットして、最高の力価を誘発する最小の効果的な抗原投与量を評価した。代表的なグラフが図１５Ａ、Ｂ、Ｃに示されている。ＰｃｐＡについて、予測した最小の抗原投与量は、０．１９６μｇ／マウス（０．１４７、９５％低；０．２４５、９５％高）と算定され、ＰｈｔＤについて、予測した最小抗原投与量は、０．９３５μｇ／マウス（０．５３３、９５％低；１．３３７、９５％高）と算定された。ＰｌｙＤ１の最小抗原投与量は、＞５μｇ／マウスと予測された。抗原の間の免疫干渉は、実施した２価と３価の研究（例えば、実施例１５におけるような）において評価した比率のいずれでも検出されなかったので、多成分組成物において、１：１：１の比率のＰｃｐＡ：ＰｈｔＤ：ＰｌｙＤ１を使用してよい。
【０２１８】
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【図１】
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【図２ａ】
0005894083.tif 000021
【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３】
0005894083.tif 000025
【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
0005894083.tif 000033
【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１０ｄ】
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【図１０ｅ】
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【図１０ｆ】
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【図１４】
0005894083.tif 000039
【図１５Ａ】
0005894083.tif 000040
【図１５Ｂ】
0005894083.tif 000041
【図１５Ｃ】
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【図１１】
0005894083.tif 000043
【図１２】
0005894083.tif 000044
【図１３】
0005894083.tif 000045
【配列表】
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