(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、及び
（ｃ）配列番号２のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
からなる群より選択される、ｍｉＲ−３１又はその５’若しくは３’イソ型若しくは変異型の拮抗剤／阻害剤を含む、対象の骨障害及び／又は心血管障害を治療又は予防するための組成物。
【請求項２】
前記拮抗される／阻害されるポリヌクレオチドである、ｍｉＲ−３１又はその５’若しくは３’イソ型若しくは変異型が、ＦＺＤ３又は生物学的に活性なその誘導体のｍＲＮＡにハイブリダイズすることが可能な、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記拮抗される／阻害されるポリヌクレオチドの長さが、１５〜１００ヌクレオチドである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記拮抗される／阻害されるポリヌクレオチドの長さが、１８〜２７ヌクレオチドである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項５】
前記拮抗される／阻害されるポリヌクレオチドの長さが、２０〜２４ヌクレオチドである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が、ポリヌクレオチド（ａ）または（ｃ）のいずれか１種以上に対する阻害剤を１種以上含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記拮抗される／阻害されるポリヌクレオチドである、ｍｉＲ−３１又はその５’若しくは３’イソ型若しくは変異型がＦＺＤ３又はその生物学的に活性な誘導体のｍＲＮＡの３’−ＵＴＲにハイブリダイズする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が体重１ｋｇ当たり１ｎｇ〜１０ｍｇの前記拮抗剤／阻害剤を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物であって、
前記ｍｉＲ−３１又はその５’若しくは３’イソ型若しくは変異型の拮抗剤／阻害剤が、脂質組成、エキソソーム又はリポソーム中に含まれている、前記組成物。
【請求項１０】
前記組成物が薬学上許容可能な担体をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物を、注入、吸入、経口、直腸、経膣、局所及び／又は局部投与用に調製する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記拮抗剤／阻害剤がｍｉＲ−３１又はその５’若しくは３’イソ型若しくは変異型にハイブリダイズすることが可能な、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記拮抗剤／阻害剤が、アンタゴｍｉＲ、miRCURY LNA（商標）マイクロＲＮＡ阻害剤、インビボＬＮＡ（商標）ｍｉＲ阻害剤、tiny LNA、又はｍｉＲ−デコイ若しくはｍｉＲ−スポンジからなる群より選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記アンタゴｍｉＲ、miRCURY LNA（商標）マイクロＲＮＡ阻害剤、インビボＬＮＡ（商標）ｍｉＲ阻害剤、tiny LNA、又はｍｉＲ−デコイ若しくはｍｉＲ−スポンジが、
（ａ）配列番号５の核酸配列又は配列番号５を含む核酸配列、
（ｂ）配列番号６の核酸配列又は配列番号６を含む核酸配列、
（ｃ）配列番号７の核酸配列又は配列番号７を含む核酸配列、及び
（ｄ）配列番号８の核酸配列又は配列番号８を含む核酸配列
からなる群より選択される核酸分子又は核酸配列を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
対象の骨障害及び／又は心血管障害を診断を補助する方法であって、
（ａ）前記対象の生体試料を、ｍｉＲ−３１又はその５’若しくは３’イソ型若しくは変異型にハイブリダイズする核酸分子と接触させる工程、又は
前記生体試料を、ｍｉＲ−３１又はその５’若しくは３’イソ型若しくは変異型と結合する薬剤に接触させる工程、
（ｂ）（ａ）の該核酸分子の該ハイブリダイゼーションシグナルを検出・評価するか、又は、（ａ）の該薬剤と前記ｍｉＲ−３１又はその５’若しくは３’イソ型若しくは変異型との該結合シグナルを検出・評価する工程、及び
（ｃ）対照試料中の対応する検出・評価されたハイブリダイゼーションシグナル又は結合シグナルと、（ｂ）の該検出・評価されたハイブリダイゼーションシグナルを比較するか、又は、（ｂ）の該検出・評価された該結合シグナルを比較する工程を含み、
前記対照試料のハイブリダイゼーションシグナル又は結合シグナルよりも、該対象の該試料中のハイブリダイゼーションシグナル又は結合シグナルが強いことが、骨障害及び／又は心血管障害を発症する又は患っている可能性の指標となる、
前記ｍｉＲ−３１又はその５’若しくは３’イソ型若しくは変異型が
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、及び
（ｃ）配列番号２のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
からなる群より選択される、
前記方法。
【請求項１６】
対象の骨障害及び／又は心血管障害を診断を補助する方法であって、
（ａ）ＰＣＲ法により、生体試験試料中のｍｉＲ−３１又はそのイソ型若しくは変異型の該発現レベル及び／又は量を検出する工程、及び
（ｂ）前記生体試料中の前記ｍｉＲ−３１又は前記イソ型及び変異型の該検出された発現レベル及び／又は量を、対照試料中の対応する前記ｍｉＲ−３１の発現レベル及び／又は量と比較する工程を含む、
前記ｍｉＲ−３１又はそのイソ型若しくは変異型が
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、及び
（ｃ）配列番号２のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
からなる群より選択される、
前記方法。
【請求項１７】
前記ハイブリダイズする核酸分子又は前記結合剤が、マーカー分子及び／又はタグ付け分子と結合されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記使用される薬剤が特定のタンパク質又はタンパク質断片である、請求項請求項１５若しくは１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記特定のタンパク質又はタンパク質断片が、前記ｍｉＲ−３１又はその５’若しくは３’イソ型若しくは変異型と結合及び／又は相互作用することが可能な、抗体若しくはその断片、又は、修飾された転写因子である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記骨障害が、骨粗鬆症、骨減少症、骨折、及び骨恒常性の不全からなる群より選択され、前記心血管障害が、心血管疾患、発作、梗塞、高血圧、血栓症、血管狭窄症、冠不全症候群、血管性認知症、心不全、腎不全、ストレス性心血管障害及びアテローム性動脈硬化症からなる群より選択される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記骨障害が、骨粗鬆症、骨減少症、骨折、及び骨恒常性の不全からなる群より選択され、前記心血管障害が、心血管疾患、発作、梗塞、高血圧、血栓症、血管狭窄症、冠不全症候群、血管性認知症、心不全、腎不全、ストレス性心血管障害及びアテローム性動脈硬化症からなる群より選択される、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はポリヌクレオチドの拮抗剤／阻害剤を含む組成物に関し、ここで、阻害されるポリヌクレオチドはＦＺＤ３（Frizzled-3）又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能であり、従って、骨障害及び／又は心血管障害の治療又は予防に使用することができる。そのような骨障害には特に、骨粗鬆症、骨減少症、骨折、骨肉腫、及び骨恒常性の不全が含まれる。本発明の化合物によって治療される心血管疾患は、梗塞、発作、高血圧、血栓症、血管狭窄症、冠不全症候群、血管性認知症、心不全、腎不全、ストレス性心血管障害、及びアテローム性動脈硬化症からなる群より選択されてもよい。これらの医学的介入に使用される好ましい化合物は核酸分子などの拮抗性化合物であり、ＦＺＤ３又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドを対象とする。拮抗される必要のあるそのようなポリヌクレオチドの一例には、ｍｉＲ−３１又はその５’若しくは３’イソ型若しくは変異型がある。本発明はまた、骨障害及び／又は心血管障害の診断に使用する方法及び組成物に関する。これらの診断方法で使用される化合物は、ＦＺＤ３又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能なそのようなポリヌクレオチドを検出することが可能な化合物（プライマーやプローブなど）であってもよい。本発明では、ｍｉＲ−３１（又はｍｉＲ−３１若しくはその５’若しくは３’イソ型若しくは変異型）が、ＦＺＤ３の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドである。
【０００２】
細胞及び組織内での損傷の蓄積が、加齢や年齢に関連した疾患の主要な原因の１つであると認識されている（Kirkwood, Cell (2005), 120: 437-474）。この機能低下を打ち消す組織レベルでの修復系の内の１つが成体幹細胞と前駆細胞である。それらの自己修復能や分化能は組織や器官の恒常性にとって必須である。高い分化能をもつヒトの成体幹細胞と前駆細胞がヒト体内の異なる組織で同定されていることから、それらは組織機能のレベルを高く維持する細胞群を表していると考えられる。しかしながら、それらの機能もまた年齢と共に低下する（Rando, Nature (2006), 441 : 1080-1086）。並体結合マウスモデルを用いた試験で、老化した全身環境が、組織再生の成功を促進できないか、或いは積極的に阻害する因子を含んでいることが確認された（Conboy, Nature (2005), 433: 760-764）。しかし幼若動物の全身環境に含まれている因子は、組織再生の成功を促進する（Matsumoto, Eur Heart J (2009), 30: 346-355）。
【０００３】
中でも内臓脂肪の蓄積がヒトの加齢の特徴であり（Huffman, Biochem Biophys Acta (2009), 1790: 1117-1123）、加齢に伴って、脂肪組織由来幹細胞（ＡＳＣ）の骨形成分化能が低下する。この低下は、骨形成前駆細胞の消失によるものではないことから（Zhu, J Tissue Eng Regen Med (2009), 3 : 290-301）、細胞動態を変化させる因子の関与が示唆されている。さらに、脂肪組織貯蔵部に含まれる脂肪前駆細胞と内皮細胞が緊密な関係を示しているため、ＡＳＣと内皮細胞は生体内で関連しており（Hausman, J Anim Sci (2004), 82: 925-934）、このことは、これらの細胞型間の傍分泌関係を支持している。
【０００４】
しかしながら、細胞動態を変化させるこれら因子の供給源は今までのところ分かっておらず、Ｗｎｔ及びＴＧＦ−βシグナル伝達が関与していると考えられる場合には、これら因子を同定するには僅かな情報しか利用できない（Carlson, Aging Cell (2009), 8: 676-689）。様々な腺に加えて、血流中への分泌物の１供給源は内皮細胞それ自体であり、高齢者では、特にアテローム性動脈硬化症の部位では、加齢に伴って生体内で蓄積される老化内皮細胞である（Erusalimsky, Handb Exp Pharmacol (2006), 213-248; Erusalimsky, Exp Physiol (2009), 94: 299-304); Minamino, Circ Res (2007), 100: 15-26）。老化に伴って増加する複数のタンパク質（Chang, Exp Cell Res (2005), 309: 121-136）が同定された。それらの中でもインターロイキン８は、老化内皮細胞の上清中に最大５０倍の高いレベルで含まれている（Hampel, Exp Gerontol (2006), 41 : 474-481）。
【０００５】
血中での輸送機序の内の１つが記述されてきた。様々な因子がエキソソーム、すなわち開口分泌を介して分泌される膜で覆われた粒子中に包まれ、標的組織の細胞と融合することにより、細胞間連絡又は器官間連絡に関与する（Caby, Int Immunol (2005), 17: 879-887）。エキソソームは大きさが４０〜１００ｎｍのエンドソーム由来の膜小胞であり、細胞外環境に放出される。それらは、タンパク質、脂質、さらにｍＲＮＡやｍｉＲＮＡの細胞間での交換を可能にすることにより、細胞間連絡に作用することができる（Valadi, Nat Cell Biol (2007), 9: 654-659; Viaud, PLoS One (2009), 4: e4942）。ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ及びタンパク質などの含まれている因子がその後、標的細胞の挙動に影響を及ぼす。例えば、取り込まれると内皮細胞で血管形成を誘導する内皮前駆細胞由来エキソソーム（Deregibus, Blood (2007), 110: 2440-2448）、肺動脈高血圧症を患っている患者の内皮由来エキソソーム（Bakouboula, Am J Respir Crit Care Med (2008), 177: 536-543）、エキソソームを放出し、腫瘍の進行を支持して組織の微小環境を変化させる卵巣癌及び膠芽腫細胞（Keller, Cancer Lett (2009), 278: 73-81 ; Skog, Nat Cell Biol (2008), 10: 1470-1476）が挙げられる。特に、Ｔ細胞によって認識される抗原分子を運ぶ腫瘍細胞から放出されるエキソソームが、抗癌ワクチンの、細胞を含まない抗原提供源であると提唱されている（Escudier, J Transl Med (2005), 3: 10; Iero, Cell Death Differ (2008), 15: 80-88; Morse, J Transl Med (2005), 3: 9; Viaud, Horm Metab Res (2008), 40: 82-88; Viaud, PLoS One (2009), 4: e49429）。
【０００６】
しかしながら、組織の再生やその阻害に関与する機構や因子は未だ十分には解明されておらず、組織の再生に関わるそのような因子に影響を及ぼすことは難しい。
この技術的な問題は、本明細書で提供する態様と請求項で提供する解決案によって解決された。
【発明の概要】
【０００７】
従って本発明は、本明細書の以下でさらに詳細に説明し、かつ例示するように、対象の骨障害及び／又は心血管障害の治療又は予防に使用する、frizzled 3（ＦＺＤ３）又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドの阻害剤を含む組成物を提供する。本発明ではまた、ポリヌクレオチドの阻害剤を含む組成物を有効量投与する工程を含む、対象の骨障害及び／又は心血管障害を治療又は予防する方法を提供する。ここで前記阻害されるポリヌクレオチドはＦＺＤ３又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能である。この医学的介入（すなわち本明細書で開示される医療利用／医薬利用）の文脈と本明細書で提供される障害の治療法／予防法で阻害されるポリヌクレオチドは、ｍｉＲ−３１又はその５’若しくは３’イソ型若しくは変異型であってよい。さらに本発明は、対象の骨障害及び／又は心血管障害の診断に使用する組成物と方法を提供する。本発明においては、そのような骨障害の例としては、骨粗鬆症、骨減少症、骨折、骨恒常性の不全が挙げられる。そのような心血管障害の例としては、発作、梗塞、高血圧、血栓症、血管狭窄症、冠不全症候群、血管性認知症、心不全及び腎不全、並びにアテローム性動脈硬化症などの心血管疾患がある（Erusalimsky, J Appl Physiol (2009), 106: 326-32）。付属の実施例に述べるように、驚くことに、ストレスで誘発された老化内皮細胞やストレスで誘発された未成熟老化内皮細胞のエキソソーム中で、ｍｉＲ−３１が特異的に上昇することを示すことができた。従って本発明においては、ｍｉＲ−３１の拮抗剤／阻害剤はまた、酸化ストレスや低酸素症／再かん流障害を原因とする心血管障害などのストレス性心血管障害の医学的介入にも使用される。
【０００８】
上記及び本明細書で提供した実験データに従って、本発明は、対象の骨障害及び／又は心血管障害を治療又は予防する、ＦＺＤ３又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドの拮抗剤／阻害剤及び／又はｍｉＲ−３１又はその５’若しくは３’イソ型若しくは変異型の拮抗剤／阻害剤を含む組成物に関する。好ましくは、前記対象はヒト対象である。ＦＺＤ３又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドの拮抗剤／阻害剤を含む組成物を有効量投与する工程、及び／又はｍｉＲ−３１又はその５’若しくは３’イソ型若しくは変異型の拮抗剤／阻害剤を含む組成物を有効量投与する工程を含む、対象の骨障害及び／又は心血管障害を治療又は予防する方法もまた提供する。この治療方法でも、最も好ましい治療される対象は、医学的介入を必要としているヒト対象である。
【０００９】
本発明においては、驚くことに、老化セクレトーム、特に老化細胞由来エキソソーム（senescent cell derived exosome）が成体幹細胞、すなわち組織再生にどのように影響を及ぼすかが発見された。この目的で本発明者らは、そのような幹細胞の２つの主要な特徴、すなわち自己再生／細胞分裂及び分化能について解析した。老化内皮セクレトームが成体幹細胞に及ぼす影響を解析するためのモデルとして、脂肪組織由来幹細胞（ＡＳＣ）を選択した。
【００１０】
さらに本発明においては、驚くことに、老化内皮細胞がエキソソーム中に包まれたｍｉＲＮＡを分泌すること、これら小胞が標的細胞によって取り込まれ、このことは傍分泌によるシグナル伝達機能を示唆していること、及び生体外では、幼若内皮細胞と老化内皮細胞に含まれる特定のｍｉＲＮＡの量が異なることが分かった。本発明で明らかになったように、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であるｍｉＲ−３１は、老化細胞の上清並びに高齢の提供者の部分集団の血液中で顕著に増加し、エキソソームによって保護・輸送される。さらに本発明においては、ｍｉＲ−３１を老化内皮細胞の上清や老化内皮細胞から精製したエキソソームに曝露すること、及び高齢者の血液由来エキソソームに曝露することによって、それらがＡＳＣに取り込まれることが分かった。
【００１１】
本発明においては、骨形成の阻害に関与するｍｉＲ−３１の標的として、frizzled-3（ＦＺＤ３）が同定された。ＦＺＤ３ノックアウトマウスで軸索の成長と誘導の欠損が見られることから、ＦＺＤ３については今までのところ、神経系の発達に重要であることのみが記述されてきた（Endo, Mol Cell Biol (2008), 28: 2368-2379; Stuebner, Dev Dyn (2010), 239: 246-260; Wang, J Neurosci (2006), 26: 2147-2156; Wang, J Neurosci (2002), 22: 8563-8573; Wang, J Neurosci (2006), 26: 366-364）。さらに本明細書では、ｍｉＲ−３１が骨形成分化を阻害し、かつ、ＡＳＣの増殖を高めることが分かった。これらの驚くべき発見は、ＦＺＤ３の発現を低下又は抑制するｍｉＲ−３１（これらには限定されないが）などのポリヌクレオチドが、生物学的年齢や年齢に関連する疾患、例えば骨粗鬆症、骨減少症、骨折、若しくは骨恒常性の不全、又は心血管疾患（例えば発作、梗塞、高血圧、血栓症、血管狭窄症、冠不全症候群、血管性認知症、心不全や腎不全若しくはアテローム性動脈硬化症など）の新規マーカーに相当することを示している。さらに、ＦＺＤ３の発現を低下又は抑制するポリヌクレオチドの拮抗剤／阻害剤（ｍｉＲ−３１及び／又はｍｉＲ−３１又はその５’若しくは３’イソ型若しくは変異型の拮抗剤／阻害剤など）は新規治療に相当する。従って、具体的にはｍｉＲ−３１及び／又はｍｉＲ−３１又はその５’若しくは３’イソ型若しくは変異型は、骨形成や骨生成を必要とする全ての疾患（骨粗鬆症、骨減少症、骨折、骨恒常性の不全、骨肉腫など）や心血管疾患（発作、梗塞、高血圧、血栓症、血管狭窄症、冠不全症候群、血管性認知症、心臓及び腎不全又はアテローム性動脈硬化症など）の新規治療の標的に相当する。ｍｉＲ−３１の３’及び５’イソ型の例を表３に示す。
【００１２】
本発明においては、ＡＳＣの増殖能及び分化能に及ぼすｍｉＲ−３１輸送の機能を試験した。本発明で明らかになったように、集団になった細胞数はより多かったが、骨形成分化は、老化エキソソームによって或いはｍｉＲ−３１単独で、部分的に阻害された。
【００１３】
さらに本発明においては、驚くことに、高齢提供者の血清中ではｍｉＲ−３１が有意に亢進されていることが分かった。このことは、細胞が老化している間のｍｉＲ−３１のエキソソームによる輸送が、生体外だけでなく血液中でも見られることを示している。さらに本発明においては、高齢者の血液由来エキソソームを用いて、骨形成の阻害が重ねて観察された。今までのところ、ｍｉＲ−３１が血清由来エキソソーム中に含まれていることは記述されていない。従って本発明においては、ｍｉＲ−３１が、例えば骨粗鬆症、骨減少症、骨折若しくは骨恒常性の不全又は心血管疾患（発作、梗塞、高血圧、血栓症、血管狭窄症、冠不全症候群、血管性認知症、心臓や腎不全若しくはアテローム性動脈硬化症など）の加齢や年齢に関連した疾患のバイオマーカーとして有用な道具である。
【００１４】
さらに本発明においては、高齢対象でのｍｉＲ−３１の亢進に加えて、初回の一連の実験で、４人の骨減少症患者の内の２人でｍｉＲ−３１が上昇していることが分かった。包含される実施例に提供されるより詳細な実験では、血清中にｍｉＲ−３１が見られる場合に、１０人の骨減少症患者の内の７人が安定した疾患若しくは骨粗鬆症への進行を示す。さらに付属の実施例で示すように、ｍｉＲ−３１を阻害すると骨形成分化が改善し、一方ｍｉＲ−３１の一過性の増加により骨形成分化は低下する。この発見は、ｍｉＲ−３１を阻害すると骨芽細胞の形成が改善することを示している。このことは、骨障害、例えば骨粗鬆症の医学的発明に非常に有用である。さらに、ｍｉＲ−３１の発現はそのような骨障害（加えて心血管障害）の指標となる。そのため本明細書では、ｍｉＲ−３１の検出に特異的な検定も提供する。そのような検出検定は、好ましくは血清及び血漿などの生体試料について行われる。骨粗鬆症は、骨の脆弱性と骨折しやすさの増大を引き起こす骨量の減少と骨組織の構造劣化によって特徴付けられる疾患と定義される。骨粗鬆症は、哺乳類、主にヒトで自然に起こる加齢に関連した全身性の症状である（Xu, Endocr Rev (2010), 31(4): 447-505）。従って本発明は、骨粗鬆症及び／又は骨減少症などの骨障害に関する、有用で正確なバイオマーカーも提供する。本明細書で提供するバイオマーカーは、心血管障害の診断にも有用である。添付の実施例はまた、ｍｉＲ−３１がストレス性の老化内皮細胞で増加していることを示している。さらに本明細書で示すように、ｍｉＲ−３１はストレス性の未成熟老化内皮細胞のエキソソーム中でも増加している。従って、ｍｉＲ−３１は心血管障害の指標でもある。
【００１５】
通常本発明では、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドについて言及する場合、前記ポリヌクレオチドは、本明細書で詳細に記述し、かつ例示するように、ＦＺＤ３又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能である。
【００１６】
本発明で示すことができたように、老化エキソソーム中に含まれ、本明細書で述べるポリヌクレオチドにより、例えばＦＺＤ３のｍＲＮＡにハイブリダイズすることによって、ＦＺＤ３の発現を低下又は抑制することができる。それにより、例えば、ＦＺＤ３のｍＲＮＡの翻訳の劣化又は抑制が誘導される可能性があり、その両方がＦＺＤ３の発現の抑制又は低下をもたらす。従って、本明細書で述べるＦＺＤ３の発現を阻害又は抑制するポリヌクレオチドを阻害すると、ＦＺＤ３の発現が上昇することになる。本発明においては、骨形成分化が起こっているＡＳＣでのＦＺＤ３の転写について試験した。実際にＦＺＤ３は４日後に、対照培地で処理した細胞と比較して亢進された（図７Ａ）。さらに、老化エキソソームで処理すると、幼若エキソソームや対照で処理した細胞と比較して、ＦＺＤ３のレベルは有意に下方制御された（図７Ｂ）。ｍｉＲ−３１を導入して２４時間後にもＦＤＺ３は下方制御されたが、有意なレベルまでは達しなかった。このことは、細胞が分化していない場合にはＦＤＺ３のｍＲＮＡレベルが非常に低いことで説明できる（図７Ｃ）。従ってＦＺＤ３は、マーカーだけでなく骨形成分化に必須の因子に相当し、ＡＳＣにおいても、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドの直接の標的となる。
【００１７】
本発明で記述・例示したように、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドの阻害は、対象の骨粗鬆症、骨減少症、骨折若しくは骨恒常性の不全又は心血管疾患（発作、梗塞、高血圧、血栓症、血管狭窄症、冠不全症候群、血管性認知症、心臓及び腎不全又はアテローム性動脈硬化症など）の治療や予防に特に有用である。
【００１８】
本発明の一態様では、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチド、すなわちＦＺＤ３又はその生物学的に活性な誘導体（例えばｍｉＲ−３１）の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドは、マイクロＲＮＡ（microRNA、本明細書ではｍｉＲＮＡ或いはｍｉＲとも略す）若しくはその前駆体、模倣マイクロＲＮＡ若しくはその前駆体、ｓｉＲＮＡ若しくはその前駆体、長鎖非コードＲＮＡ若しくはその前駆体、ｓｎＲＮＡ（小分子／短ヘアピンＲＮＡ）若しくはその前駆体、ｓｔＲＮＡ（小分子１本鎖ＲＮＡ）若しくはその前駆体、ｆＲＮＡ（機能性ＲＮＡ）若しくはその前駆体、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）若しくはその前駆体、ｓｎｏＲＮＡ（小核小体ＲＮＡ）若しくはその前駆体、ｐｉＲＮＡ（ｐｉｗｉ結合性ＲＮＡ）若しくはその前駆体、ｔａｓｉＲＮＡ（トランス作用性低分子／短鎖干渉ＲＮＡ）若しくはその前駆体、ａＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ）若しくはその前駆体、又は短鎖非コードＲＮＡ若しくはその前駆体であってよい。本発明では、上述した人工ポリヌクレオチドは、上述した生理学的なポリヌクレオチドと同様にＦＺＤ３又はその生物学的に活性な誘導体の発現に同じ効果（すなわち前記発現を低下又は抑制する効果）を有していてもよく、そのような人工ポリヌクレオチドの阻害剤は同時に、そのような生理学的なポリヌクレオチドの阻害剤であってもよい。本明細書で使用する場合、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチド（すなわちＦＺＤ３又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチド）の「前駆体」は、それぞれのポリヌクレオチドの成熟過程で生じる、それぞれのポリヌクレオチドの形態であってよい。例えば本発明においては、マイクロＲＮＡや模倣マイクロＲＮＡの前駆体は、ｍｉＲＮＡの成熟過程で生じるような一次ｍｉＲＮＡ（primary miRNA、pri-miRNA）又は前駆体ｍｉＲＮＡ（pre-miRNA）であってよい。両方とも特徴的な分子内二次構造、いわゆる「ヘアピンループ」に折り畳まれる１本鎖の転写産物（すなわちｓｓＲＮＡ）である。ヘアピンループは、約１８〜２３の一続きの塩基対を含み、ミスマッチによって分断される場合もある。本発明の文脈でｓｉＲＮＡの前駆体は、長鎖ｄｓＲＮＡ分子か或いはより短い「ヘアピンループ」のｓｓＲＮＡ分子であってよい。両型のこれらｓｉＲＮＡ前駆体は、いかなるミスマッチも含まない一続きの塩基対を含み得る。哺乳類のｍｉＲＮＡ成熟についての現在のモデルは、一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）の核内での切断であり、それによってｍｉＲＮＡの直接の前駆体或いはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡとして知られる６０〜７０ｎｔのステムループ中間体が切り出される。ステムループ前駆体のアームの１本から、約１８〜２３ｎｔの長さの成熟ｍｉＲＮＡが得られる（Bartel. Cell (2004), 116: 281-297; Lee, EMBO J (2002), 21 : 4663-4670; Zeng and Cullen, RNA (2003), 9: 112-123）。本発明の好ましい態様では、本発明に従って阻害されるポリヌクレオチドは、マイクロＲＮＡ若しくはその前駆体か又は模倣マイクロＲＮＡ若しくはその前駆体である。本発明の文脈で記述され、阻害されるポリヌクレオチドはいかなる長さであってもよい。好ましくは、ポリヌクレオチドの長さは約１５〜約１００ヌ���レオチドであり、より好ましくは約１８〜約２７ヌクレオチドであり、最も好ましくは約２０〜約２４ヌクレオチドである。
【００１９】
本発明の特定の態様では、本発明の文脈で拮抗される／阻害されるポリヌクレオチド、すなわちＦＺＤ３又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチド、及び／又は、拮抗される／阻害されるｍｉＲ−３１又はその５’若しくは３’イソ型若しくは変異型は、
（ａ）配列番号１（すなわちｍｉＲ−３１）のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドとすくなくとも８０％同一なポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号２のヌクレオチド配列（すなわちｍｉＲ−３１のシード配列：ＧＧＣＡＡＧＡＵ）を含むポリヌクレオチド、及び
（ｄ）配列番号２のヌクレオチド配列（すなわちｍｉＲ−３１のシード配列：ＧＧＣＡＡＧＡＵ）を含む（ｂ）のポリヌクレオチド、からなる群より選択されてもよい。
【００２０】
本発明では、ポリヌクレオチドの同一性レベルは、参照した配列番号のヌクレオチド配列の全長を指し、各ギャップを１つのミスマッチとして数えるペアワイズによって評価される。例えば、用語「同一性」は本明細書では、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドの文脈で用いてもよく、前記ポリヌクレオチドは、本明細書の表１にも示す配列番号１（成熟ｍｉＲ−３１）、配列番号２（ｍｉＲ−３１のシード配列）、又は配列番号３（ｐｒｅ−ｍｉＲ−３１）のヌクレオチド配列うちのいずれか１種を含む、又はそれらからなるポリヌクレオチドと、好ましくは全長にわたって、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％同一な核酸配列を含む。さらに本発明においては、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドは、それぞれのシード配列の５’末端及び／又は３’末端に、対応する成熟ｍｉＲＮＡ配列又はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列のヌクレオチドを１つ又は２つ以上含む、配列番号１又は配列番号３の配列（本明細書の表１で示す）からなるヌクレオチド配列を含む、又はそれらからなるポリヌクレオチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％同一な核酸配列も含んでいてもよい。例えば本発明においては、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列ＡＧＧＣＡＡＧＡＵＧＣ（すなわち、５’末端に対応する成熟配列のヌクレオチドを１つ、３’配列に対応する成熟配列のヌクレオチドを１つ含む配列番号１のシード配列）を含む又はそれらからなるポリヌクレオチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％同一な核酸配列を含んでいてもよい。配列比較によって比較する２つの核酸配列の同一性が異なる場合、用語「同一性」は、より短い配列と、より長い配列のうちの前記より短い配列と一致する部分を指す。そのため、比較される配列の長さが同じではない場合には、同一性の度合いは好ましくは、より短い配列中の、より長い配列に含まれる連続したヌクレオチド残基と同一のヌクレオチド残基のパーセンテージか又は、より長い配列中の、より短い配列のヌクレオチド配列と同一の、連続したヌクレオチドのパーセンテージのいずれかを指す。当然のことながら、上述したように、「連続したヌクレオチドの一部」としてのギャップは、ミスマッチと見なされる。この文脈では、当業者は容易に、より短い配列に「一致する」より長い配列の部分を決定する立場にある。また、配列比較についてのこれらの定義（例えば、「同一性の」値の確定）は、本明細書に記述・開示した全ての配列に適用される。
【００２１】
表１：ｍｉＲＮＡｓ、ｍｉＲＢａｓｅ  ＩＤ（miRBase:http://www.mirbase.org、バージョン番号１５、２０１０年４月公開）、及び成熟ｍｉＲ及びｐｒｅ−ｍｉＲ配列（下線部がシード配列）。
【００２２】
【表１】
0005894581.tif 000002
【００２３】
表２：上で同定したｍｉＲＮＡやシード配列などにハイブリダイズすることが可能な核酸分子の例。
【００２４】
【表２】
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【００２５】
本明細書で使用する場合、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）は、ポリヌクレオチドのそれぞれの型により、交換可能に使用され得る。
そのようなハイブリダイズする配列（又はその機能性断片やイソ型）を、ＦＺＤ３又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドに特異的な拮抗剤／阻害剤として、及び／又はｍｉＲ−３１又はその５’若しくは３’イソ型若しくは変異型に特異的な拮抗剤／阻害剤として使用してもよい。そのようなハイブリダイズする配列（又は機能性断片若しくはそのイソ型）は、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、模倣マイクロＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｆＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔａｓｉＲＮＡ、ａＲＮＡ及びそのようなＲＮＡの前駆体などの、本明細書で記述した、拮抗される又は阻害される全ての種のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。
表３：ｍｉＲ−３１の５’及び３’イソ型の例。
【００２６】
【表３】
0005894581.tif 000004
【００２７】
本明細書で使用する場合、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）は、ポリヌクレオチドのそれぞれの型により、交換可能に使用され得る。
同一性はさらに、好ましくは、対応するヌクレオチド配列間に、機能的等価性及び／又は構造的等価性があることを意味する。本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドの特定の核酸配列に対して所定の同一性レベルを有する核酸配列は、これら配列の誘導体／変異型を表しているかも知れず、これらの核酸配列は好ましくは同じ生物学的機能を有する。本発明においては、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドの生物学的機能は、例えば、ＦＺＤ３のｍＲＮＡにハイブリダイズし、それによってＦＺＤ３のｍＲＮＡの翻訳を劣化又は抑制することで、ＦＺＤ３又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制する能力である。ＦＺＤ３又はその生物学的に活性な誘導体の発現が低下又は抑制されたか否かは、当該分野で周知の方法やさらに本明細書で記述した方法によって、容易に試験することができる。ＦＺＤ３や生物学的に活性な誘導体の発現が低下又は抑制されたか否かを決定するのに適したそのような方法の例としては、ポリアクリルアミドゲル電気泳動や、発色色素を用いたタンパク質の検出技術（銀染色やクーマシーブルー染色など）を用いた関連するブロット技術（例えばウェスタンブロット）、又は溶液中、ゲル上、ブロット上、及びマイクロアレイ上のタンパク質を検出するための、蛍光や発光を用いた検出法（免疫染色など）、並びに免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、マイクロアレイ及び質量分析が挙げられる。所定のポリヌクレオチドがＦＺＤ３のｍＲＮＡにハイブリダイズしたか否かの決定もまた、当該分野で周知の方法やさらに本明細書で記述した方法によって試験することができる。所定のポリヌクレオチドが別の核酸（例えばＦＺＤ３のｍＲＮＡやその生物学的に活性な誘導体）にハイブリダイズしたか否かを決定するのに適したそのような方法の例としては、用いられるレポーター遺伝子が通常、蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＢＦＰ、ｅＢＦＰなど）、発光タンパク質（酵素であるウミシイタケやホタルルシフェラーゼ、及びｌａｃＺ遺伝子にコードされているβ−ガラクトシダーゼなど）である、レポーター遺伝子アッセイ（Inui, Nat Rev Mol Cell Biol (2010), 11 : 252-63）がある。ＦＺＤ３のｍＲＮＡが分解されたか或いはその翻訳が抑制されたか否かもまた、当該分野で公知の方法やさらに本明細書で記述した方法で試験することができる。ｍＲＮＡが分解されているか否かを決定するのに適したそのような方法の例としては、ｑＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ｑＰＣＲ、ライトサイクラー（Light Cycler）（登録商標）、タックマン（TaqMan）（登録商標）プラットフォームとアッセイ、又はクアンチジン（quantigene）アッセイ（Zhou, Anal Biochem (2000), 282: 46-53）、ノザンブロット、ドットブロット、ＲＮＡｓｅプロテクションアッセイ、マイクロアレイ、次世代シークエンシング（VanGuilder, Biotechniques (2008), 44(5): 619-26; Elvidge, Pharmacogenomics (2006), 7: 123-134; Metzker, Nat Rev Genet (2010), 11 : 31-46; Kafatos, NAR (1979), 7: 1541-1552）が挙げられる。
【００２８】
本明細書で記述したポリヌクレオチド、例えば本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドは、天然に生じる変異型（例えば他の亜種、種など由来の配列）又は変異体のいずれかであってもよく、かつ、前記変異は天然に生成されてもよく、或いは意図的な突然変異生成によって生産されてもよい。さらに、変異型は人工的に合成された配列であってもよい。対立遺伝子多型は、天然に生じる変異型であっても、又は人工的に生成された変異型あるいは、当該分野で公知の組換えＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＧＮＡ、ＴＮＡ又はＬＮＡ技術によって生成された変異型であってもよい。例えばヌクレオチドの欠損、置換、付加、挿入によって、及び／又は組換えによって、上述した核酸配列から逸脱したものを生成してもよい。用語「付加」は、所定の配列の片方或いは両方の末端に少なくとも１つの核酸残基を付加することを指し、「挿入」は、所定のヌクレオチド配列中に少なくとも１つの核酸残基を挿入することを指す。用語「欠損」は、所定のヌクレオチド配列から少なくとも１つの核酸残基を欠損させる又は除去することを指す。用語「置換」は、所定のヌクレオチド配列の少なくとも１つの核酸残基を置き換えることを指す。阻害されるポリヌクレオチドについての上記及び下記の定義を、拮抗剤／阻害剤として作用するものを含む、本明細書で提供・記述した全ての核酸分子とポリヌクレオチドに、必要な変更を加えて適用する。
【００２９】
本明細書で記述したポリヌクレオチド、例えば、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチド（すなわちＦＺＤ３の発現を低下又は抑制するポリヌクレオチド）又は拮抗剤／阻害剤として作用するポリヌクレオチドは、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、オリゴヌクレオチドチオリン酸、置換されたリボオリゴヌクレオチド、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、ＧＮＡ（グリコール核酸）分子、ＴＮＡ（トレオース核酸）分子、モルホリノポリヌクレオチド、又はアンタゴｍｉｒ（コレステロールに結合したもの；拮抗剤／阻害剤）ポリヌクレオチドなどの核酸類似物であってもよい。さらに本発明においては、用語「ポリヌクレオチド」と用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、オリゴヌクレオチドチオリン酸、置換されたリボオリゴヌクレオチド、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、ＧＮＡ（グリコール核酸）分子、ＴＮＡ（トレオース核酸）分子、モルホリノポリヌクレオチド、又はアンタゴｍｉｒ（コレステロールに結合したもの；拮抗剤／阻害剤）ポリヌクレオチドや若しくはそのハイブリッド又は当該分野で公知のそのいかなる修飾物（修飾の例については例えば、米国特許第５，５２５，７１１号、米国特許第４，７１１，９５５号、米国特許第５，７９２，６０８号又は欧州特許第３０２１７５号を参照のこと）などの核酸類似物を指す場合もある。ポリヌクレオチドからなる核酸残基は、天然の核酸残基であっても人工的に生成された核酸残基であってもよい。核酸残基の例には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、キサンチン（Ｘ）、及びヒポキサンチン（ＨＸ）がある。本発明においては、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）は、対応する型のポリヌクレオチドにより交換可能に使用され得る。例えば、当業者は分かっているように、ＤＮＡの一部としてのチミン（Ｔ）は、対応する転写されたｍＲＮＡの一部としてのウラシル（Ｕ）に相当する。ポリヌクレオチドは、そうでないことが示されていない限り、一本鎖であっても二本鎖であっても、若しくは線状であっても環状であっても、又は天然物であっても人工物であってもよく、いかなる長さであってもよい。例えば、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）若しくはその前駆体、模倣マイクロＲＮＡ若しくはその前駆体、ｓｉＲＮＡ若しくはその前駆体、長鎖非コードＲＮＡ若しくはその前駆体、ｓｎＲＮＡ（低分子／短ヘアピンＲＮＡ）若しくはその前駆体、ｓｔＲＮＡ（小分子１本鎖ＲＮＡ）若しくはその前駆体、ｆＲＮＡ（functional RNA）若しくはその前駆体、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）若しくはその前駆体、ｓｎｏＲＮＡ（小核小体ＲＮＡ）若しくはその前駆体、ｐｉＲＮＡ（ｐｉｗｉ結合性ＲＮＡ）若しくはその前駆体、ｔａｓｉＲＮＡ（トランス作用性低分子／短鎖干渉ＲＮＡ）若しくはその前駆体、ａＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ）若しくはその前駆体、又は短鎖非コードＲＮＡ若しくはその前駆体、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、リボゾーム、又は前述したＲＮＡやキメロプラスト（chimeroplast）（Gamper, Nucleic Acids Research (2000), 28, 4332 - 4339）をコードしているＤＮＡであってよい。既に記述したように、本明細書で使用する場合、本発明の文脈で阻害され���ポリヌクレオチドの「前駆体」は、成熟の際に生じる、それぞれのポリヌクレオチドの形態であってよい。例えば本発明においては、マイクロＲＮＡ又は模倣マイクロＲＮＡの前駆体は、ｍｉＲＮＡ成熟の際に生じる一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）或いは前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）であってよい。両方とも、特徴的な分子内二次構造、いわゆる「ヘアピンループ」に折り畳まれる一本鎖の転写産物（すなわちｓｓＲＮＡ）である。ヘアピンループは約１８〜２３の一続きの塩基対を含み、ミスマッチによってしばしば分断される。本発明においては、ｓｉＲＮＡの前駆体は、長いｄｓＲＮＡ分子であっても、より短い「ヘアピンループ」ｓｓＲＮＡ分子であってもよい。両種のこれらｓｉＲＮＡ前駆体は、ミスマッチを含まない一続きの塩基対を含んでいてもよい。哺乳類のｍｉＲＮＡ成熟についての現在のモデルは、一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）の核内での切断であり、それによってｍｉＲＮＡ前駆体或いはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡとして知られる６０〜７０ｎｔのステムループ中間体が切り出される。ステムループ前駆体のアームの１本から、約１８〜２３ｎｔの長さの成熟ｍｉＲＮＡが得られる（Bartel, Cell (2004), 116: 281-297; Lee, EMBO J (2002), 21 : 4663-4670; Zeng and Cullen, RNA (2003), 9: 112-123）。前記ポリヌクレオチドは、プラスミド又はウイルスＤＮＡやＲＮＡの形をとっていてもよい。本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドは、好ましくはマイクロＲＮＡ又は模倣マイクロＲＮＡである。
【００３０】
一態様では、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドは、本明細書の表１でも示す配列番号１（成熟ｍｉＲ−３１）、配列番号２（ｍｉＲ−３１のシード配列）、又は配列番号３（ｐｒｅ−ｍｉＲ−３１）のうちのいずれか１つを含むか又はそれらからなる。さらに、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドは、それぞれのシード配列の５’末端及び／又は３’末端に、対応する成熟ｍｉＲ配列又はｐｒｅ−ｍｉＲ配列のヌクレオチドを１つ、２つ、又は３つ以上含む、表１に示す配列番号１又は配列番号３のシード配列を含むか又はそれらからなる核酸配列を有していてもよい。例えば、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列［Ａ］Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｕ［ＧＣ］（すなわち、配列番号１のシード配列の５’末端に対応する成熟ｍｉＲＮＡ配列のヌクレオチドが１つ、３’末端に対応する成熟ｍｉＲＮＡ配列のヌクレオチドが２つ付いたもの）又は［Ａ］Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｕ［Ｇ］（すなわち、配列番号１のシード配列の５’末端に対応する成熟ｍｉＲＮＡ配列のヌクレオチドが１つ、３’末端に対応する成熟ｍｉＲＮＡ配列のヌクレオチドが１つ付いたもの）を含むか又はそれらからなる核酸配列を有していてもよい。本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチド（すなわちＦＺＤ３の発現を低下又は抑制するポリヌクレオチド）は、本明細書の表１でも示す配列番号１（成熟ｍｉＲ−３１）、配列番号２（ｍｉＲ−３１のシード配列）、又は配列番号３（ｐｒｅ−ｍｉＲ−３１）のいずれか１種で示したヌクレオチド配列に１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ以上のヌクレオチドが付加された、又は配列番号１〜３の配列から１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ以上のヌクレオチドを欠損若しくは置換させたヌクレオチド配列を含むか又はそれらからなっていてもよい。さらに、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドは該ヌクレオチド、すなわち、それぞれのシード配列の５’末端及び／又は３’末端に、対応する成熟ｍｉＲ配列又はｐｒｅ−ｍｉＲ配列のヌクレオチドを１つ、２つ、又は３つ以上含む、表１に示す配列番号１又は配列番号３のシード配列に、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ以上のヌクレオチドが付加されるか又は、それらの配列から１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ以上のヌクレオチドを欠損若しくは置換させたヌクレオチド配列を含むか又はそれらからなる核酸配列もまた有していてもよい。例えば、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列［Ａ］Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｕ［Ｕ］（すなわち、配列番号１のシード配列の５’末端に対応する成熟ｍｉＲＮＡ配列のヌクレオチドが１つ、３’末端に対応する成熟ｍｉＲＮＡ配列のヌクレオチドが１つ付いていて、３’末端のヌクレオチドがＵに置き換えられているもの）を含むか又はそれらからなる核酸配列を有していてもよい。好ましくは、前記１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ以上のヌクレオチドの付加、欠損又は置換は、本明細書の表１で示すポリヌクレオチドのシード配列中には行われない。さらに、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドは、本明細書の表１で示す配列番号１（成熟ｍｉＲ−３１）、配列番号２（ｍｉＲ−３１のシード配列）又は配列番号３（ｐｒｅ−ｍｉＲ−３１）のいずれか１種のヌクレオチド配列を含むか又はそれらからなるポリヌクレオチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％同一のポリヌクレオチドを含むか又はそれらからなっていてもよい。さらに、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドはまた、それぞれのシード配列の５’末端及び／又は３’末端に、対応する成熟ｍｉＲ配列又はｐｒｅ−ｍｉＲ配列のヌクレオチドを１つ、又は２つ以上含む、表１で示す配列番号１又は配列番号３のシード配列からなるヌクレオチド配列を含むか又はそれらからなるポリヌクレオチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％同一な核酸配列を含むか又はそれらからなっていてもよい。例えば、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｕ［ＧＣ］（すなわち、配列番号１のシード配列の３’末端に、対応する成熟配列のヌクレオチドが２つ付いたもの）を含むか又はそれらからなるポリヌクレオチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％同一な核酸配列を含むか又はそれらからなっていてもよい。加えて、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドはまた、本明細書の表１でも示す配列番号１（成熟ｍｉＲ−３１）又は配列番号３（ｐｒｅ−ｍｉＲ−３１）のいずれか１種のヌクレオチド配列を含むか又はそれらからなるポリヌクレオチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９１％、９８％又は９９％同一な核酸配列を含むか或いはそれらからなっていてもよく、かつ、本明細書の表１で示す配列番号２（ｍｉＲ−３１のシード配列）で示した核酸配列を含んでいてもよい。
【００３１】
通常、本明細書で使用する場合、本明細書で提供した配列の核酸配列を含むポリヌクレオチドはまた、前記核酸配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。一態様では、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドは、配列番号１に示す核酸配列を有する。
【００３２】
所定の２つの核酸分子がハイブリダイズすることができるか否かの決定においては、例えば本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドがＦＺＤ３又はその生物学的に活性な誘導体のｍＲＮＡにハイブリダイズするか否か、又は本発明で記述され、使用された阻害剤が本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするか否かの決定については、ハイブリダイゼーションさせ、生理学的条件又は人工条件下で、厳しい又は厳しくない条件で検出してもよい。前記ハイブリダイゼーション条件は、例えば、Sambrook, Russell 「Molecular Cloning, A Laboratory Manual」, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001); Ausubel, 「Current Protocols in Molecular Biology」, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), or Higgins and Hames (Eds.) 「Nucleic acid hybridization, a practical approach」 IRL Press Oxford, Washington DC, (1985)に記載されている、標準的な手順に従って確立することができる。条件設定は当業者には周知であり、当該分野で記述されている手順に従って決定することができる。従って、特異的にハイブリダイズする配列のみを検出するには一般に、厳しいハイブリダイゼーションと洗浄条件（例えば、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを使用して６５℃で行う）が要求される。同族体や厳密には相補してない配列を決定するには、厳しくないハイブリダイゼーション条件（６×ＳＳＣ、１％ＳＤＳを使用して６５℃で行う）を設定してもよい。当該分野で周知のように、プローブと検出する核酸組成物の長さが、ハイブリダイゼーション条件のさらなる指標を構成する。上述した条件の変更は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために使用する代わりのブロッキング試薬を加える及び／又は代わりのブロッキング試薬で置き換えることにより行うことができる。代表的なブロッキング試薬には、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、及び市販されている有標製剤が含まれる。特定のブロッキング試薬を加える場合には、適合性の問題により、上述したハイブリダイゼーション条件を修正する必要が生じ得る。本明細書で記述した本発明では、同族体や厳密には相補してない配列を決定するための厳しくないハイブリダイゼーション条件を、例えば６×ＳＳＣと１％ＳＤＳを使用して６５℃で行う条件に設定してもよい。当該分野で周知のように、プローブと検出する核酸組成物の長さが、ハイブリダイゼーション条件のさらなる指標を構成する。ＦＺＤ３又はその生物学的に活性な誘導体のｍＲＮＡにハイブリダイズする、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドはまた、本発明の文脈で阻害される、上述のポリヌクレオチドの断片も含む。そのような断片は好ましくは、ＦＺＤ３又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制することができるポリヌクレオチドである。そのような断片は例えば、ｓｉＲＮＡや、ダーマコン（Dharmacon）から購入することができる、ＦＺＤ３のｍＲＮＡを標的とする４つのｓｉＲＮＡからなるｓｉＲＮＡのプール（on-target plus smart-pool L-005502-00-0005、NM 017412）などのポリヌクレオチドであってよい。さらに、ハイブリダイゼーション複合体は、相補的なＧとＣの塩基の間で、及び相補的なＡとＴ（又は対応するＵ）の塩基の間で水素結合が形成されることによる、２つの���酸配列の複合体を指す。これらの水素結合は、塩基のスタッキング相互作用により、さらに安定になり得る。ハイブリダイゼーション複合体は溶液中で、（例えば、Ｃｏｔ又はＲｏｔ解析）又は溶液中に含まれる１種の核酸配列と、固体支持体（例えば、支持体が膜、フィルター、チップ、ピン又はスライドグラスであって、それらに例えば細胞が固定されている）に固定した別の核酸配列との間で形成され得る。用語「相補的な」又は「相補性」は、塩基対合による、塩と温度の許容条件下でのポリヌクレオチドの自然な結合を指す。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ（又は対応するＵ）」は相補的な配列「Ｔ（又は対応するＵ）−Ｃ−Ａ」に結合する。２種の一本鎖分子間での相補性は、「部分的」であってもよく、その場合、核酸のうちのいくつかの塩基のみが結合する。２種の一本鎖分子間に完全な相補性が存在する場合、その相補性は「完全」であってもよい。核酸鎖間の相補性の度合いは、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率と強度に有意な影響を及ぼす。
【００３３】
２種の核酸分子がハイブリダイズするか否かを決定するためには、例えば所定のポリヌクレオチドが、本明細書に記載のＦＺＤ３若しくはその生物学的に活性な誘導体のｍＲＮＡにハイブリダイズして、前記ＦＺＤ３若しくはその生物学的に活性な誘導体の前記ｍＲＮＡの分解や翻訳の抑制を誘導するか否か、又は本発明に記載され使用される阻害剤が、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするか否かを決定するためには、当該分野で知られている様々な方法と、さらに本明細書に記載の方法を利用することができる。本明細書中では、ハイブリダイゼーションを当該分野で公知であり、かつ本明細書に記載の生理学的条件又は人工条件下で起こして検出してもよい。例えば、ｍｉＲＮＡとｍＲＮＡの間のハイブリダイゼーションを決定する試験は、本明細書やプロメガ社の技報に記載のルシフェラーゼアッセイ（Ｃ８０２１（psiCHECK-2ベクター）、Ｅ１９６０（Ｄｕａｌ−ルシフェラーゼ（登録商標）レポーターアッセイシステム））であってもよい。本発明においては、ポリヌクレオチドが別の核酸（例えば、ＦＺＤ３のｍＲＮＡの３’ＵＴＲ）にハイブリダイズするか否かを決定するのに適した方法の一般例は、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＢＦＰ、又はｅＢＦＰ）、又は発光タンパク質（例えば、ウミシイタケ若しくはホタルルシフェラーゼ、又はｌａｃＺ遺伝子によってコードされているβ−ガラクトシダーゼ）などの一般的なレポーター遺伝子を用いるレポーター遺伝子アッセイである。さらに、ｍＲＮＡの分解又はそれぞれの翻訳産物のレベル（ｍＲＮＡの翻訳が低下又は抑制されたか否かを試験するため）は、当該分野で既知の方法によって容易に調べることができる。ｍＲＮＡの分解や安定化を調べるのに適した方法は、例えば、ｑＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ｑＰＣＲ、ライトサイクラー（Light Cycler）（登録商標）、タックマン（TaqMan）（登録商標）プラットフォームとアッセイ、ノザンブロット、ドットブロット、マイクロアレイ、次世代シークエンシング（VanGuilder, Biotechniques (2008), 44: 619-26; Elvidge, Pharmacogenomics (2006), 7: 123-134; Metzker, Nat Rev Genet (2010), 11 : 31-46）がある。ｍＲＮＡの翻訳が抑制又は低下しているか否かを試験するのに適した方法としては、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動や、発色色素を用いたタンパク質の検出技術（銀染色やクーマシーブルー染色など）と組み合わせた関連するブロット技術（例えばウェスタンブロット）、又は溶液中、ゲル上、ブロット上、及びマイクロアレイ上のタンパク質を検出するための蛍光や発光を用いた検出法（免疫染色など）、並びに免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、マイクロアレイ及び質量分析がある（ウェスタンブロット（Burnette, Anal Biochem (1981) 112: 195-203)又はELISA(Crowther, JA. The ELISA Guidebook. Humana Press; Totowa, NJ: 2001）。
【００３４】
本発明においては、所定のポリヌクレオチドがＦＺＤ３又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制するか否か（例えば、ＦＺＤ３のｍＲＮＡにハイブリダイズし、それによってＦＺＤ３のｍＲＮＡの翻訳の劣化又は抑制を誘導することによって）を決定するために、発現されるＦＺＤ３のレベルを容易に検出することができる。本発明においては、試験するポリヌクレオチドに接触させた試験試料中で発現し、検出されるＦＺＤ３のレベルが、該ポリヌクレオチドと接触させていない対照試料中のＦＺＤ３の発現レベルよりも、少なくとも１／１．５に、好ましくは少なくとも１／１．７５に、より好ましくは少なくとも１／２．０に、最も好ましくは少なくとも１／２．５に低くなる場合に、該ポリヌクレオチドはＦＺＤ３又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制すると評価される。ＦＺＤ３タンパク質の検出には例えば、ウェスタンブロット解析を実施することができる。
【００３５】
さらに一態様では、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドは、ＦＺＤ３若しくはその生物学的に活性な誘導体のｍＲＮＡの３’ＵＴＲ（非翻訳領域）又は前記３’ＵＴＲの断片にハイブリダイズする場合がある。本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドとＦＺＤ３又はその生物学的に活性な誘導体のｍＲＮＡの３’ＵＴＲとのハイブリダイゼーションは、上述のように容易に試験することができる。好ましくは本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドは、ＦＺＤ３若しくはその生物学的に活性な誘導体のｍＲＮＡの３’ＵＴＲ又は前記３’ＵＴＲの断片にハイブリダイズすることにより、前記ＦＺＤ３若しくはその生物学的な誘導体のｍＲＮＡの翻訳の劣化や抑制を引き起こす。通常、本発明においてＦＺＤ３について述べる場合には、ジェンバンク受託番号ＮＭ＿０１７４１２、バージョン番号１７７（２０１０年４月１５日公開）を参照する。ＦＺＤ３のｍＲＮＡの３’ＵＴＲ配列は、本明細書の配列番号４に示す。一態様では、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドは、配列番号４の３４１９番目〜３４２６番目のヌクレオチドを含む核酸配列にハイブリダイズすることができ、好ましくはそれによって、ＦＺＤ３又はその生物学的な誘導体のｍＲＮＡの翻訳の劣化や抑制を引き起こす。
【００３６】
本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドは、脂質組成、エキソソーム、小胞体、リポソーム、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）又はアテロコラーゲン中に含まれていてもよい。さらに本発明では、阻害されるポリヌクレオチド（すなわちＦＺＤ３やその生物学的な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチド）の拮抗剤／阻害剤は、脂質組成、エキソソーム又はリポソーム中に含まれていてもよい。例えば、拮抗剤／阻害剤は、本明細書に記載のｍｉＲ−３１又はその３’若しくは５’イソ型若しくは変異型の拮抗剤／阻害剤であってよい。ｍｉＲ−３１の３’及び５’イソ型の例を表３に示す。本発明はまた、本明細書に記載の医学的介入で使用する、例えば、対象の骨障害（骨粗鬆症、骨減少症、骨折、骨恒常性の不全など）及び／又は心血管障害（発作、梗塞、高血圧、血栓症、血管狭窄症、冠不全症候群、血管性認知症、心臓及び腎不全又はアテローム性動脈硬化症などの心血管疾患）の治療又は予防に使用する、そのような脂質組成、エキソソーム及びリポソームに関する。
【００３７】
本明細書で使用する場合、ＦＺＤ３の生物学的に活性な誘導体は、それらがＦＺＤ３と同じ生物学的機能を有すること、すなわちそれらがＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ経路を介してシグナルを伝達することができること（Kawasaki, Cell Signal (2007), 19: 2498-506）を意味する。本発明においては、所定の化合物がＦＺＤ３の生物学的な誘導体であるか否かを確認するため、その下流の標的であるＡＫＴのリン酸化状態を試験することができる。この目的では、ＡＳＣ、骨髄由来幹細胞、又は骨形成分化能を有する他のいずれの細胞型を、ＦＺＤ３活性について試験する化合物で異なる時間、異なる用量で処理することができる。又はそれらの細胞に、ＦＺＤ３活性について試験する化合物をコードしたプラスミドを導入してもよい。その後、当該分野で公知の方法により、細胞溶解物を調製することができる。これは例えば、細胞溶解緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１２ｍＭのβ−グリセロリン酸、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＧＴＡ、１０ｍＭのフッ化ナトリウム、１％のトリトンＸ−１００、１％のデオキシコール酸ナトリウム、１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュ、スイス）、ホスファターゼ阻害剤カクテル１及び２（シグマ、セントルイス、ミズーリ））を使用して行うことができる。続いて、リン酸化したタンパク質の解析を当該分野で公知の方法、例えば免疫ブロット解析により実施することができる。免疫ブロット解析を実施するための実例としては、３０μｇの総タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ポリフッ化ビニリデン膜（例えばＰＶＤＦ）にブロットすることができる。次に膜を抗ホスホ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）抗体（Cell Signaling、ダンヴァーズ、９２７１）（１：５００）、及び抗ホスホ−Ａｋｔ（Ｔｈｒ３０８）抗体（Cell Signaling、ダンヴァーズ、９２７２）（１：５００）で探査してもよい。陽性対照としては、ＦＺＤ３の過剰発現体を用いることができる。陰性対照としては、ＡＫＴのリン酸化を阻害することが知られている、ウォルトマンニン（Wortmannin）やＬＹ２９４００２などのＰＩ３Ｋ特異的阻害剤を使用することができる。本発明においては、未処理の細胞対照と比較してＡＫＴがリン酸化される度合いが４０％を上回る、又は５０％を上回る場合に、この試験化合物を、ＦＺＤ３の生物学的に活性な誘導体であると見なすことができる。ＦＺＤ３誘導体ｍＲＮＡの３’ＵＴＲの核酸配列は、本発明においては、配列番号４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％同一であってもよい。
【００３８】
既に述べたように、本発明は、ポリヌクレオチド又は阻害されるポリヌクレオチド（すなわちＦＺＤ３又はその生物学的な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチド）の阻害剤を含み、対象の骨障害（骨粗鬆症、骨減少症、骨折、骨恒常性の不全など）及び／又は心血管障害（発作、梗塞、高血圧、血栓症、血管狭窄症、冠不全症候群、血管性認知症、心臓及び腎不全若しくはアテローム性動脈硬化症などの心血管疾患）の治療又は予防に使用する組成物に関する。該組成物はまた、ＦＺＤ３若しくはその生物学的な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドの拮抗剤／阻害剤及び／又はｍｉＲ−３１又はその３’若しくは５’イソ型若しくは変異型の拮抗剤／阻害剤を含む、エキソソーム及び／又はリポソームを含んでいてもよい。
【００３９】
本発明では、骨障害（骨粗鬆症、骨減少症、骨折、骨恒常性の不全など）及び／又は心血管障害（発作、梗塞、高血圧、血栓症、血管狭窄症、冠不全症候群、血管性認知症、心臓及び腎不全又はアテローム性動脈硬化症などの心血管疾患）が治療されるか又は予防される対象は、哺乳類であってよい。本発明の好ましい態様では、対象はヒトである。
【００４０】
通常、本発明の文脈で使用される組成物は、拮抗剤／阻害剤又はエキソソーム／リポソームを含んでいてもよく、ここでエキソソーム／リポソームは、１種、２種、又は３種以上の本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドを阻害する前記拮抗剤／阻害剤を含む。さらに、該組成物は、２種、又は３種以上の拮抗剤／阻害剤又はエキソソーム／リポソームを含んでいてもよく、ここで各拮抗剤／阻害剤は、１種、２種、又は３種以上の本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドを阻害することができる。
【００４１】
本明細書に記載され、本発明の文脈で使用される組成物は、本明細書に記載の拮抗剤／阻害剤又はエキソソーム／リポソームを、対象の体重１ｋｇ当たり、約１ｎｇ〜約１００ｍｇの量で含んでいてもよい。対象は、骨障害（骨粗鬆症、骨減少症、骨折、骨恒常性の不全など）及び／又は心血管障害（発作、梗塞、高血圧、血栓症、血管狭窄症、冠不全症候群、血管性認知症、心臓及び腎不全又はアテローム性動脈硬化症などの心血管疾患）が治療されるか又は予防される対象である。本発明の好ましい態様では、組成物は、体重１ｋｇ当たり約１μｇ〜約２０ｍｇ、より好ましくは体重１ｋｇ当たり１ｍｇ〜約１０ｍｇの量の阻害剤を含む。
【００４２】
本明細書に記載され、本発明の文脈で使用される組成物は、薬学上許容可能な担体をさらに含んでいてもよい。従って本発明はまた、ポリヌクレオチド若しくは本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドの拮抗剤／阻害剤、ｍｉＲ−３１又はその３’若しくは５’イソ型若しくは変異型の拮抗剤／阻害剤、及び／又は前記拮抗剤／阻害剤を含むエキソソーム若しくはリポソームを含み、薬学上許容可能な担体、賦形剤及び／又は希釈剤をさらに含む医薬組成物に関する。通常、適した医薬担体の例は当該分野で周知であり、それらには、リン酸緩衝生理食塩溶液、水、乳剤（水中油型乳剤など）、様々な型の湿潤剤、滅菌溶液などが含まれる。そのような担体を含む組成物は、周知の標準的な方法によって調製することができる。これらの医薬組成物を適した用量で、すなわち対象の体重１ｋｇ当たり約１ｎｇ〜約１００ｍｇの用量で、対象に投与することができる。対象は、骨障害（骨粗鬆症、骨減少症、骨折、骨恒常性の不全など）及び／又は心血管障害（発作、梗塞、高血圧、血栓症、血管狭窄症、冠不全症候群、血管性認知症、心臓及び腎不全又はアテローム性動脈硬化症などの心血管疾患）が治療されるか又は予防される対象である。本発明の好ましい態様では、ポリヌクレオチド又は本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドの阻害剤を含む組成物は、体重１ｋｇ当たり約１μｇ〜約２０ｍｇの量の、より好ましくは体重１ｋｇ当たり１ｍｇ〜約１０ｍｇの量の阻害剤を含む。組成物の投与は、様々な経路で、例えば経腸経路、経口経路（例えば、丸薬、錠剤（口腔錠、舌下錠、経口錠、崩壊錠）、カプセル、薄膜、液体溶液又は懸濁液、粉末、固体結晶又は液体）、直腸内経路（例えば、座薬、浣腸）、注入（例えば静脈注入、皮下注入、筋内注入、腹膜内注入、皮内注入）、吸入（例えば、気管支内投与）、局所経路、経膣経路、皮膚上投与、又は鼻腔内投与によって行われるか又は投与される。本発明においては、ＦＺＤ３若しくはその生物学的な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドの拮抗剤／阻害剤及び／又はｍｉＲ−３１又はその３’若しくは５’イソ型若しくは変異型の拮抗剤／阻害剤を含むエキソソーム又はリポソームを含む組成物を、局所に又は全身に使用してもよい。局所で使用する場合、例えば骨の欠損部位に直接使用する場合には、エキソソーム／リポソームを含む組成物は特に、骨粗鬆症、骨減少症、骨折又は骨恒常性の不全などの骨障害の治療に用いられる。そのような組成物を骨に直接使用する方法は当該分野で知られている（Takeshita, Mol Ther (2010), 18: 181-187）。全身に使用する場合（例えば、非経口で、経口で又は本明細書に記載の他の経路で）には、前記組成物は、本明細書で述べるように、骨障害及び／又は心血管障害の治療又は予防に用いられ得る。当然のことながら、本明細書に記載の拮抗剤／阻害剤を、直接であっても他の手段で、局所的に又は全身に投与することもできる。投与計画は、主治医や臨床因子によって決定される。医学分野で周知のように、各患者の用量は多くの因子に依存し、それら因子には、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間と投与経路、総体的な健康、及び、同時に投与される他の���剤が含まれる。本明細書に記載の組成物は、局所に又は全身に投与することができる。全身投与は好ましくは、非経口投与、例えば静脈内投与である。組成物はまた、例えば、内部標的や外部標的への微粒子銃を用いた送達により、或いは動脈内の部位へカテーテルで投与することにより、標的部位に直接投与してもよい。非経口投与用の製剤としては、滅菌水溶液又は非水性溶液、懸濁液、及び乳剤が挙げられる。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（オリーブ油など）、ポリエチレンイミン及び注入可能な有機エステル（オレイン酸エチルなど）がある。水性担体としては、水、アルコール／水性溶液、乳剤又は懸濁液があり、食塩水や緩衝培地を含む。非経口媒体には、塩化ナトリウム溶液、ブドウ糖リンゲル液、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、又は固定油が含まれる。静脈内媒体には例えば、水分補給剤や栄養補給剤、電解質補給剤（ブドウ糖リンゲル液を用いたものなど）が含まれる。保存剤や他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスなどもまた含まれ得る。さらに、上述の因子を考慮すると、上述の例の範囲を下回る又は上回る用量もまた想定される。
【００４３】
既に述べたように、ポリヌクレオチド又は本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチド（すなわちＦＺＤ３又はその生物学的な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチド）の拮抗剤／阻害剤、ｍｉＲ−３１又はその３’若しくは５’イソ型若しくは変異型の拮抗剤／阻害剤、及び／又は前記拮抗剤／阻害剤を含むエキソソーム／リポソームを含む、本明細書に記載の組成物は、対象の骨障害及び／又は心血管障害、例えば骨粗鬆症、骨減少症、骨折、骨恒常性の不全、又は心血管疾患（発作、梗塞、高血圧、血栓症、血管狭窄症、冠不全症候群、血管性認知症、心臓及び腎不全又はアテローム性動脈硬化症など）の治療又は予防に使用することができる。
【００４４】
本発明においては、ポリヌクレオチド又は本発明で阻害されるポリヌクレオチドの拮抗剤／阻害剤は、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドを拮抗する／阻害することができる核酸分子、ポリペプチド又は他のいかなる化合物であってもよい。例えば、本発明の文脈で使用される拮抗剤／阻害剤は、ｍｉＲ−３１又はその５’若しくは３’イソ型若しくは変異型の拮抗剤／阻害剤である。本発明の文脈で使用される拮抗剤／阻害剤は、阻害されるポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる核酸分子であってもよい。本明細書で述べるように、核酸分子は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、オリゴヌクレオチドチオリン酸、置換されたリボオリゴヌクレオチド、ＬＮＡ分子（Orom, Gene (2006), 10(372), 137-141）、ＰＮＡ分子、ＧＮＡ（グリコール核酸）分子、ＴＮＡ（トレオース核酸）分子、モルホリノポリヌクレオチド、又はアンタゴｍｉｒ（コレステロールに結合している）ポリヌクレオチド並びにその修飾物などの、全ての種のヌクレオチド分子を含む。拮抗剤／阻害剤は、本明細書に記載の厳しい又は厳しくない条件（短い配列のハイブリダイゼーション条件については以下を参照のこと）で前記阻害されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする可能性があり、好ましくは厳しい条件でハイブリダイズする。核酸分子間のハイブリダイゼーションを確認、評価する方法は当該分野で周知であり、かつ、本明細書の上記及び下記でも記載されている。好ましくは本発明では、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドにハイブリダイズすることによって、拮抗剤／阻害剤は、前記阻害されるポリヌクレオチドがＦＺＤ３又はその生物学的な誘導体の発現を低下又は抑制する（例えば前記ポリヌクレオチドとＦＺＤ３又はその生物学的な誘導体のｍＲＮＡ（例えばその３’ＵＴＲ）とのハイブリダイゼーションによる）のを防ぐ。ポリヌクレオチドがＦＺＤ３又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制する能力を決定・評価する方法、並びにＦＺＤ３の発現レベルが低下又は抑制されているか否かを決定・評価する方法は、本明細書に記載されている。従って、所定の化合物が本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドとＦＺＤ３又はその生物学的な誘導体のｍＲＮＡ（例えばその３’ＵＴＲ）とのハイブリダイゼーションを妨げることができる場合に、その化合物が本発明の文脈で使用される拮抗剤／阻害剤であると評価することができる。従って本発明においては、拮抗剤／阻害剤は、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドがＦＺＤ３又はその生物学的に活性な誘導体の発現に及ぼす影響を少なくとも部分的に反転させることができるだろう。例えば、本発明の文脈で使用される拮抗剤／阻害剤は、阻害されるポリヌクレオチドがＦＺＤ３の発現に及ぼす効果を５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、及び最も好ましくは９９％以上反転させることができるだろう。すなわち、例えば本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドが、ＦＺＤ３又はその生物学的な誘導体の発現を、例えばＦＺＤ３又はその生物学的な誘導体の発現が通常の発現レベル（すな���ち前記ポリヌクレオチドがない場合の発現レベル）の５０％の量になるまで低下又は抑制することが可能で、かつ、本明細書に記載の阻害剤の使用によって、ＦＺＤ３又はその生物学的な誘導体の発現レベルが通常の発現レベル（すなわち前記ポリヌクレオチドがない場合の発現レベル）の７５％の量まで上昇する場合、前記ポリヌクレオチドの効果は前記阻害剤によって５０％反転される。
【００４５】
本発明の一態様では、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドの拮抗剤／阻害剤は、前記阻害されるポリヌクレオチドに、好ましくは本明細書に記載の厳しい条件でハイブリダイズすることができ、それによって、前記ポリヌクレオチドがＦＺＤ３又はその生物学的に活性な誘導体のｍＲＮＡ（例えば、その３’ＵＴＲ）にハイブリダイズすることを防ぐ核酸分子である。本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドの拮抗剤／阻害剤として使用される前記核酸のハイブリダイゼーションは、前記阻害されるポリヌクレオチドの全長にわたってもよく、又は前記阻害されるポリヌクレオチドの配列の一部分、例えば、前記阻害されるポリヌクレオチドの配列の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％だけにわたってもよい。本発明の一態様では、本発明の文脈で使用される拮抗剤／阻害剤は、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。好ましくは本発明では、本発明の文脈で使用される拮抗剤／阻害剤は、上述の表１に示す配列のいずれか１種、例えば、配列番号１〜３のいずれか１種に相補的な配列を有する核酸分子を含むか又はそれらからなるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。例えば、そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５〜８のいずれか１種のヌクレオチド配列を含むか又はそれらからなっていてもよい。通常、ｍｉＲＮＡやｓｉＲＮＡの拮抗剤／阻害剤は当該分野で周知であり、かつ、特注のｍｉＲＮＡ阻害剤やｓｉＲＮＡ阻害剤は商業的に入手可能である。例えば、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドの拮抗剤／阻害剤は、アンタゴｍｉＲ（Krutzfeldt, Nature (2005), 438: 685-689）やホスホロチオアート結合とコレステロール尾部を有する他のいずれものＴ−Ｏ−メチル−ＲＮＡオリゴヌクレオチド、miRCURY LNA（商標）マイクロＲＮＡ阻害剤（エキシコン）、インビボＬＮＡ（商標）ｍｉＲ阻害剤（エキシコン）、tiny LNA（Obad, Nat Genet (2011), 43(4): 371-378）、ｍｉＲ−デコイ（miR-decoy）又はｍｉＲ−スポンジ（miR-sponge）（Ebert, Nat Methods (2007), 4: 721-726; Bonci, Nat Med (2008), 14: 1271-1277）又は、例えば、上述のように前記ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることによって、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドを拮抗する／阻害することができる同様のものなどの核酸分子であってよい。拮抗剤／阻害剤はまた、Chatterjee, Nature (2009), 461 : 546-9に記載されているようなｍｉＲＮＡ分解酵素由来、Tedeschi, Drug Discov Today (2009), 14: 776-783に記載されているようなハンマーヘッドリボザイム（hammerhead ribozyme）、又はJadhav, Angew Chem Int Ed Engl (2009), 48(14): 2557-2560に記載されているようなアンタゴｍｉｒザイム（antogomirzyme）であってもよい。miRCURY LNA（商標）マイクロＲＮＡ阻害剤の一例としては、本発明においては、配列番号５に示す抗miR-31 LNAがある。本発明においては、アンタゴｍｉＲ、miRCURY LNA（商標）マイクロＲＮＡ阻害剤、インビボＬＮＡ（商標）ｍｉＲ阻害剤、tiny LNA、ｍｉＲデコイ又はｍｉＲスポンジは、
（ａ）配列番号５の核酸配列又は配列番号５を含む核酸配列；
（ｂ）配列番号６の核酸配列又は配列番号６を含む核酸配列；
（ｃ）配列番号７の核酸配列又は配列番号７を含む核酸配列；
（ｄ）配列番号８の核酸配列又は配列番号８を含む核酸配列；及び
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１種の核酸配列と少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一の核酸配列、
からなる群より選択される核酸分子又は核酸配列を含んでいてもよい。
【００４６】
既に述べたように、そのような拮抗剤／阻害剤は、本明細書に記載の全ての種の阻害されるポリヌクレオチド（マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、模倣マイクロＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｆＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、tasi RNA、ａＲＮＡ及びそれらポリヌクレオチドの前駆体を含む）とハイブリダイズする又はそれらに結合する場合がある。
【００４７】
本発明は、配列番号１で示す配列からなるポリヌクレオチドと厳しい条件下でハイブリダイズし、それによって前記ポリヌクレオチドとＦＺＤ３のｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションを妨げる核酸分子を含み、ヒト対象の骨障害（例えば骨粗鬆症）又は心血管疾患（例えばアテローム性動脈硬化症）の治療又は予防に使用する組成物に関する。
【００４８】
本発明は、ｍｉＲ−３１又はその３’若しくは５’イソ型若しくは変異型と厳しい条件下でハイブリダイズすることによって、ｍｉＲ−３１又はその３’若しくは５’イソ型若しくは変異型とＦＺＤ３のｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションを妨げる核酸分子を含み、ヒト対象の骨粗鬆症又はアテローム性動脈硬化症の治療又は予防に使用する組成物に関する。前記核酸分子は、本明細書に記載の通り、アンタゴｍｉｒ、miRCURY LNA（商標）マイクロＲＮＡ阻害剤、インビボＬＮＡ（商標）ｍｉＲ阻害剤、ｍｉＲデコイ又はｍｉＲスポンジである場合がある。
【００４９】
本発明は、配列番号２に示す配列からなるポリヌクレオチドと厳しい条件下でハイブリダイズすることによって前記ポリヌクレオチドとＦＺＤ３のｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションを妨げる核酸分子を含み、ヒト対象の骨粗鬆症又は心血管疾患（アテローム性動脈硬化症など）の治療又は予防に使用する組成物に関する。
【００５０】
本発明は、配列番号３に示す配列からなるポリヌクレオチドと厳しい条件下でハイブリダイズすることによって前記ポリヌクレオチドとＦＺＤ３のｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションを妨げる核酸分子を含み、ヒト対象の骨粗鬆症又は心血管疾患（アテローム性動脈硬化症など）の治療又は予防に使用する組成物に関する。
【００５１】
前項の組成物の文脈では、配列番号１〜３のいずれか１種で示す核酸配列からなるポリヌクレオチドと厳しい条件下でハイブリダイズする核酸分子は、アンタゴｍｉｒである。
前項の組成物の文脈では、配列番号１〜３のいずれか１種で示す核酸配列からなるポリヌクレオチドと厳しい条件下でハイブリダイズする核酸分子は、ホスホロチオアート結合とコレステロール尾部を有する２’−０−メチル−ＲＮＡオリゴヌクレオチドである。
【００５２】
前項の組成物の文脈では、配列番号１〜３のいずれか１種で示す核酸配列からなるポリヌクレオチドと厳しい条件下でハイブリダイズする核酸分子は、miRCURY LNA（商標）マイクロＲＮＡ阻害剤（エキシコン）である。
【００５３】
前項の組成物の文脈では、配列番号１〜３のいずれか１種で示す核酸配列からなるポリヌクレオチドと厳しい条件下でハイブリダイズする核酸分子は、インビボＬＮＡ（商標）ｍｉＲ阻害剤（エキシコン）である。
【００５４】
前項の組成物の文脈では、配列番号１〜３のいずれか１種で示す核酸配列からなるポリヌクレオチドと厳しい条件下でハイブリダイズする核酸分子は、ｍｉＲ−デコイ又はｍｉＲ−スポンジである。
【００５５】
さらに本発明では、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドの拮抗剤／阻害剤（すなわち核酸拮抗剤／阻害剤の例では）を、ベクター中にクローニングしてもよい。本明細書で使用する場合、用語「ベクター」は特に、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ及び、遺伝子工学で一般的に用いられる他のベクターを指す。好ましい態様では、これらのベクターは、細胞（例えば真菌細胞、酵母などの微生物の細胞、又は原核細胞）の形質転換に適したものである。特に好ましい態様では、そのようなベクターは例えば、本発明のポリヌクレオチドを転写するための、細菌細胞の安定な形質転換に適している。
【００５６】
従って、本発明の一側面では、提供されるベクターは発現ベクターである。一般に、発現ベクターは文献中に広く記載されている。通常それらは、選択マーカー遺伝子や選択した宿主中での複製を確保する複製起点だけでなく、プロモーターや、ほとんどの場合には転写の終結シグナルを含む場合がある。プロモーターと終結シグナルの間には、好ましくは、少なくとも１つの制限部位か或いは発現が所望される核酸配列／分子を挿入することができるポリリンカーがある。
【００５７】
当然のことながら、本発明の文脈で使用するのに適したプロモーター、例えば上述のポリヌクレオチドの阻害剤（すなわち核酸阻害剤の場合）の発現に適したプロモーターを既に含んでいる、先行技術で公知の発現ベクターの利点を活かして本明細書で提供するベクターを生成する場合、本発明の文脈で使用するのに適したプロモーターを１つだけ含むベクターを生じる方法で、核酸構築物をそのベクター中に挿入する。当業者は、どのようにそのような挿入を実践できるか分かっている。例えば、連結反応の前に、核酸構築物か或いは発現ベクターのいずれかからプロモーターを切り出すことができる。
【００５８】
非限定的な例として、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチド（すなわちＦＺＤ３の発現を低下又は抑制するポリヌクレオチド）の拮抗剤／阻害剤（すなわち核酸拮抗剤／阻害剤の場合）をクローニングするベクターは、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、又は非ウイルス小環状（minicircle）ベクターである。本明細書に記載のベクターを形成するために、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドの阻害剤（すなわち核酸阻害剤の場合）を挿入するのに適したベクターのさらなる例は、当該分野で知られている。例えば、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドの阻害剤（すなわち核酸阻害剤の場合）をクローニングしたベクターは、miR-Vec、レトロウイルス発現ベクター（Voorhoeve, Cell (2006), 124: 1169-1181）であってもよい。
【００５９】
さらなる態様では、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドの阻害剤（核酸阻害剤又はペプチド阻害剤をコードしている核酸配列の場合）及び／又は本明細書に記載のポリヌクレオチドをクローニングするベクターを、宿主細胞に形質導入、形質転換、又は移入、さもなければ導入することができる。例えば、宿主細胞は真核細胞又は原核細胞、例えば細菌細胞である。非限定的な例では、宿主細胞は好ましくは哺乳類細胞である。本明細書に記載の宿主細胞は、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドの阻害剤を生成するのに特に有用なものである。
【００６０】
一般に上述の宿主細胞は、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドの阻害剤若しくは本明細書に記載のベクターを含む原核細胞若しくは真核細胞、又は本明細書に記載の核酸構築物又はベクターを含む、そのような細胞由来の細胞であってもよい。好ましい態様では、宿主細胞は、ゲノム中に組み込まれる本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドの阻害剤の核酸配列を含むように、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドの阻害剤又は本明細書に記載のベクターの核酸配列で遺伝子操作されている。すなわち宿主細胞は、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドの阻害剤又は本明細書に記載のベクターの核酸配列によって遺伝的に変更される。例えば、そのような本明細書に記載の宿主細胞は、細菌、酵母、又は真菌細胞であってよい。特定の一側面では、宿主細胞は、本発明においてＦＺＤ３又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制するポリヌクレオチドの阻害剤の核酸配列を転写することができる。本明細書に記載の宿主細胞の生成に使用される、別の相当する発現系の例の概要は、例えば、Methods in Enzymology 153 (1987), 385-516、Bitter (Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544)、Sawers (Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996), 1-9）、Billman-Jacobe (Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 500-4）、Hockney (Trends in Biotechnology 12 (1994), 456-463）、及びGriffiths, (Methods in Molecular Biology 75 (1997), 427-440）に包含されている。本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドや本明細書に記載のベクターを用いた宿主細胞の形質転換又は遺伝的改変は、例えば、Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA; Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990に記載されている、標準的な方法によって行うことができる。
【００６１】
さらに、既に述べたように、かつ、本発明においては、驚くことに、ｍｉＲ−３１が加齢及び年齢に関連した疾患（例えば骨粗鬆症、骨減少症、骨折、骨恒常性の不全、又は、発作、梗塞、高血圧、血栓症、血管狭窄症、冠不全症候群、血管性認知症、心臓及び腎不全若しくはアテローム性動脈硬化症などの心血管疾患）のバイオマーカーとして有用な道具であることが分かった。すなわち、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドは、診断マーカーや予後マーカーそのものとして役立つ可能性があり、かつ、例えば前記ポリヌクレオチドに結合する化合物を使用した前記ポリヌクレオチドの検出は、対象の疾患や障害（例えば骨粗鬆症、骨減少症、骨折、骨恒常性の不全や、発作、梗塞、高血圧、血栓症、血管狭窄症、冠不全症候群、血管性認知症、心臓及び腎不全又はアテローム性動脈硬化症などの心血管疾患）の進行の診断や予測に有用である。従って本発明は、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドに、すなわち本明細書に記載のＦＺＤ３又はその生物学的な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドに結合し、対象の骨障害及び／又は心血管障害（例えば骨粗鬆症、骨減少症、骨折、骨恒常性の不全、又は発作、梗塞、高血圧、血栓症、血管狭窄症、冠不全症候群、血管性認知症、心臓及び腎不全又はアテローム性動脈硬化症などの心血管疾患）の進行の診断や予測に使用する化合物に関する。
【００６２】
従って本発明はさらに、
（ａ）上述のＦＺＤ３又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチド、及び／又は
（ｂ）上述のＦＺＤ３又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子、及び／又は
（ｃ）上述のＦＺＤ３又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドに結合する薬剤を含み、
対象の骨障害及び／又は心血管障害（例えば骨粗鬆症、骨減少症、骨折、骨恒常性の不全、又は発作、梗塞、高血圧、血栓症、血管狭窄症、冠不全症候群、血管性認知症、心臓及び腎不全又はアテローム性動脈硬化症などの心血管疾患）の診断に使用する組成物に関する。
【００６３】
本発明はまた、
（ａ）ＦＺＤ３又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドと特異的に相互作用する（例えば結合する）ことが可能な薬剤、及び／又は
（ｂ）ＦＺＤ３又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドと、好ましくは厳しい条件下でハイブリダイズする核酸分子を含み、
本明細書に記載の対象の骨障害及び／又は心血管障害の診断、又は骨障害及び／又は心血管障害の治療成功の生体外での監視に使用する組成物に関する。
【００６４】
本明細書で使用する場合、用語「薬剤」は、特に「ＦＺＤ３又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドと相互作用する薬剤」又は「ＦＺＤ３又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドに結合する薬剤」の文脈では、特定のタンパク質又はタンパク質断片を含む。そのようなタンパク質又はタンパク質断片は例えば、抗体若しくはその断片、低分子阻害剤若しくは転写因子又は修飾された転写因子であってもよい。そのような（修飾された）転写因子の例としては、（修飾された）亜鉛フィンガータンパク質がある。ポリヌクレオチドの低分子阻害剤を生成する方法は、当該分野で公知である（Davis, Antivir Chem Chemother(2011), 21(3): 117-128）。本明細書では、用語「抗体」及び「抗体断片」は広義で用いられ、本明細書に記載の阻害されるポリヌクレオチドと特異的に相互作用する又は結合することができる、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、一本鎖抗体並びに抗体断片や断片構築物、例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、二重特異性ｓｃＦｖ、二機能性抗体（diabody）、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）及び低分子抗体（minibody）を含むがこれらには限定されない。抗ポリヌクレオチド抗体の生産方法は当該分野で周知である（例えば、Ye, Proc Nat Acad Sci USA (2008), 105: 82-87を参照のこと）。
【００６５】
さらに、本発明は、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドに結合する化合物（例えば核酸分子又は抗体）を含み、対象の骨障害及び／又は心血管障害（例えば骨粗鬆症、骨減少症、骨折、骨恒常性の不全、又は発作、梗塞、高血圧、血栓症、血管狭窄症、冠不全症候群、血管性認知症、心臓及び腎不全又はアテローム性動脈硬化症などの心血管疾患）の診断に使用する医薬組成物に関する。本発明の一態様では、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドに結合する化合物は、上述の前記ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能な阻害剤の文脈で記載した核酸分子である。当業者は、そのような結合する核酸分子と前記本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを当該分野で周知の方法やさらに本明細書に記載の方法により、容易に検出することができる。一態様では、前記結合する化合物は、前記本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチド、すなわちＦＺＤ３若しくはその生物学的な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドに特異的に結合する抗体又はその断片（例えばＦ（ａｂ）又はＦ（ａｂ）２断片）などの結合剤である。当業者は、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ又は同様の方法などの当該分野で周知の方法を用いて、抗体又はその断片とポリヌクレオチドとの結合を容易に検出することができる。
【００６６】
本明細書に記載しているものは、対象の骨障害及び／又は心血管障害（例えば骨粗鬆症、骨減少症、骨折、骨恒常性の不全又は、発作、梗塞、高血圧、血栓症、血管狭窄症、冠不全症候群、血管性認知症、心臓及び腎不全又はアテローム性動脈硬化症などの心血管疾患）の診断方法であり、前記方法は、
（ａ）前記対象から、上述のＦＺＤ３又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドを含む生体試料を得る工程、
（ｂ）前記試料を、（ａ）のポリヌクレオチドとハイブリダイズする核酸分子又は（ａ）のポリヌクレオチドと結合する薬剤に接触させる工程、
（ｃ）（ｂ）の核酸分子又は（ｂ）の薬剤と（ａ）のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション又は結合シグナルを検出・評価する工程、及び
（ｄ）（ｃ）の検出・評価されたハイブリダイゼーション又は結合シグナルと、対照試料中の対応する検出・評価されたハイブリダイゼーション又は結合シグナルを比較する工程を含み、前記対照試料中のハイブリダイゼーション又は結合シグナルよりも、対象の試料中のハイブリダイゼーション又は結合シグナルが強いことが、骨障害及び／又は心血管障害を発症する又は患っている可能性の指標となる。
【００６７】
本発明は、対象の骨障害及び／又は心血管障害（例えば骨粗鬆症、骨減少症、骨折、骨恒常性の不全、又は発作、梗塞、高血圧、血栓症、血管狭窄症、冠不全症候群、血管性認知症、心臓及び腎不全又はアテローム性動脈硬化症などの心血管疾患）の診断方法に関し、前記方法は、
（ａ）（ｉ）前記対象由来の生体試料を、ＦＺＤ３の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドと（好ましくは厳しい条件下で）でハイブリダイズする核酸分子、及び／又はｍｉＲ−３１又はその５’若しくは３’イソ型若しくは変異型と（好ましくは厳しい条件下で）でハイブリダイズする核酸分子と接触させる工程、又は
（ｉｉ）前記生体試料を、ＦＺＤ３の発現を低下又は抑制することが可能な前記ポリヌクレオチドに結合する薬剤及び／又はｍｉＲ−３１又はその５’若しくは３’イソ型若しくは変異型に結合する薬剤と接触させる工程、
（ｂ）（ａ）（ｉ）の核酸分子と前記ポリヌクレオチド及び／又は前記ｍｉＲ−３１又はその５’若しくは３’イソ型若しくは変異型とのハイブリダイゼーションシグナルを検出・評価する工程、又は（ａ）（ｉｉ）の薬剤と前記ポリヌクレオチド及び／又は前記ｍｉＲ−３１又はその５’若しくは３’イソ型若しくは変異型との結合シグナルを検出・評価する工程、及び
（ｃ）（ｂ）（ａ）（ｉ）の検出・評価されたハイブリダイゼーションシグナル又は（ｂ）（ａ）（ｉｉ）の検出・評価された結合シグナルと、対照試料中の対応する検出・評価されたハイブリダイゼーション又は結合シグナルを比較する工程を含み、前記対照試料中のハイブリダイゼーション又は結合シグナルよりも、対象の試料中のハイブリダイゼーション又は結合シグナルが強いことが、骨障害及び／又は心血管障害を発症する又は患っている可能性の指標となる。
【００６８】
一態様では、対象の骨障害及び／又は心血管障害（例えば骨粗鬆症、骨減少症、骨折、骨恒常性の不全、又は発作、梗塞、高血圧、血栓症、血管狭窄症、冠不全症候群、血管性認知症、心臓及び腎不全又はアテローム性動脈硬化症などの心血管疾患）の診断方法は、
（ａ）前記対象由来の生体試料を、ＦＺＤ３の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドと（好ましくは厳しい条件下で）ハイブリダイズする核酸分子及び／又はｍｉＲ−３１又はその５’若しくは３’イソ型若しくは変異型と（好ましくは厳しい条件下で）ハイブリダイズする核酸分子と接触させる工程、
（ｂ）（ａ）の核酸分子と前記ポリヌクレオチド及び／又は前記ｍｉＲ−３１又はその５’若しくは３’イソ型若しくは変異型のハイブリダイゼーションシグナルを検出・評価する工程、及び
（ｃ）（ｂ）の検出・評価されたハイブリダイゼーションシグナルと、対照試料中の対応する検出・評価されたハイブリダイゼーションシグナルを比較する工程を含み、前記対照試料中のハイブリダイゼーションよりも、対象の試料中のハイブリダイゼーションが強いことが、骨障害及び／又は心血管障害を発症する又は患っている可能性の指標となる。
【００６９】
本発明の診断方法に使用される核酸分子（すなわちＦＺＤ３の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子）は、本明細書に記載のいかなる種の核酸分子であってもよい。例えばこれらの核酸分子は、プライマー（例えば、ＰＣＲ技術のためのもの）又はプローブ（例えば、マイクロアレイ又はドットブロット、サザンブロット若しくはノザンブロットなどのブロットアッセイ用のもの）であってもよい。プライマーは、本明細書で記載・例示しているＰＣＲ技術で特に用いることができる。好ましくは、当該分野で知られているように、１本のプライマーは検出するポリヌクレオチドの５’末端の配列に相補的であり（「フォワードプライマー」）、もう１本のプライマーは、検出するポリヌクレオチドの３’末端の配列に相補的（「リバースプライマー」）である。ＰＣＲ技術などのプライマーの長さは一般に約１２〜３０ヌクレオチドであるが、適宜、より多くの又はより少ないヌクレオチドを含んでいてもよい。プライマーは、検出するポリヌクレオチドに、好ましくは厳しい条件下で、又は本明細書の下記に述べるような所定のプライマーに応じた適切な条件でなおもハイブリダイズする限り、検出するポリヌクレオチドの対応する配列と１００％相補的でなくてもよい。さらにプライマーは、本明細書に記載のマーカー分子又はタグ付け分子、例えばＵＶ／ＶＩＳ又は赤外線波長で励起され、発光する蛍光色素（ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、テキサスレッド、Ｃｙ−色素、アレクサ色素（バイオプローブ）など）に結合されていてもよい。プローブは、当該分野で知られている方法で生成することができ、通常は検出するポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。プローブは、本明細書で記載・例示しているマイクロアレイ又はブロットアッセイ（例えば、ドットブロット、サザンブロット、ノザンブロット）などの試験に特に有用である。プローブの配列は、好ましくは厳しい条件下で、検出するポリヌクレオチドとなおもハイブリダイズすることが可能な限り、検出するポリヌクレオチドの対応する配列と１００％相補的である必要はない。さらにプローブは、本明細書に記載のマーカー分子又はタグ付け分子、例えばＵＶ／ＶＩＳ又は赤外線波長で励起され、発光する蛍光色素（ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、テキサスレッド、Ｃｙ−色素、アレクサ色素（バイオプローブ）など）に結合されていてもよい。
【００７０】
本明細書で提供される診断方法において、特に上述のＰＣＲ技術のためのハイブリダイゼーション条件は以下の通りであってよい。ＳＳＣは、３ＭのＮａＣｌと３００ｍＭのクエン酸三ナトリウムであり、ｐＨを塩酸で７．０に調整する。厳しい条件では、０．１又は０．２×ＳＳＣを６５℃で、好ましくは１％のＳＤＳを加えて使用する。中等度の条件では、１×又は２×ＳＳＣを使用し、厳しくない条件では４×又は６×ＳＳＣを、好ましくは１％のＳＤＳを加えて使用する。温度は通常６５℃以下であり、プローブと標的の複合体の融解温度に依存する。既に述べたように、本明細書で提供される診断方法においては、核酸分子は検出するポリヌクレオチド（すなわちＦＺＤ３の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチド）に厳しい条件下でハイブリダイズする可能性がある。
【００７１】
本発明において核酸二本鎖の融解温度（Ｔｍ）の決定は、通常、ＰＣＲ、結合アッセイ、ハイブリダイゼーションなどの多くの応用に有用である。Ｔｍは、所定のヌクレオチド（マイクロＲＮＡなど）の５０％が、その相補的な逆向きの（すなわち二重らせんを形成するのに正確に一致している）配列と二本鎖になる温度として定義される場合がある。Ｔｍは、ポリヌクレオチドの長さ、塩基組成、配列、二次構造（例えばマイクロＲＮＡの前駆分子に典型的なヘアピン構造）を形成する可能性、及び環境条件、例えば、塩（一般的には一価の陽イオン）濃度、二価の陽イオン（Ｍｇ２＋）濃度、ｐＨ、及びホルムアミドなどの変性剤の有無などの当業者に周知の多数の因子によって影響される。
【００７２】
ヌクレオチドと二重らせんを形成するその標的の結合を必要とするＰＣＲや他の任意の試験でハイブリダイゼーションを行うために、ヌクレオチドのＴｍを決定してもよい。多数のＴｍの決定方法が当業者に知られている。例えば、試験するヌクレオチドとその正確な逆向きの相補鎖を緩衝液に入れ、その後温度を、完全にアニーリングしている低温（例えば室温以下）から、アニーリングがもう起こることができず、ヌクレオチドの大部分が一本鎖で、かつ、アニーリングしない高温（例えば９５℃以上）に上昇させることによって、実験的に決定することができる。ヌクレオチドの一本鎖から二本鎖形態への変化は、ＵＶ分光法によって監視することができる。例えば、ヌクレオチドとその正確に適合する逆向きの相補鎖を、緩衝液、例えば０．１×ＳＳＣ（１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、ｐＨ７．０）に溶解してもよい。ＵＶの吸光度（Ａｂ）を２６０ｎｍで測定し、その後温度（ｔ）を徐々に低温から高温に変化させ、変性を観察することができる。任意に、再アニーリングを観察するために、逆向きの反応を行ってもよい。得られた温度対吸光度をプロットすると、吸光度の２つの安定状態を有するＳ字型の曲線が観察される。その後、上側の安定状態と下側の安定状態の正確に中間の温度として、あるいは、一次微分（ｄＡｂ／ｄｔ）の最大値としてＴｍを決定することができる（例えば、ＵＶ／可視分光分析を用いたＤＮＡの熱解析（Thermal Analysis of DNA by UV/Visible Spectrometry） Moore, GBC application note, GBC Scientific Equipment Pty, Ltd、ブレサイド、オーストラリア、http://www.gbcscientific.com/appnotes/uv_app_note_002.pdfを参照のこと）。また、シグマ−アルドリッチ（セントルイス、ミズーリ、米国）による、「オリゴ融解温度（Oligo melting temperature）」（http://www.sigmaaldrich.com/life-science/custom-oligos/custom-dna/learning-center/oligos-melting-temp.html）も参照のこと。
【００７３】
当然のことながら、当業者に周知のように、完全には一致していないヌクレオチド、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖、修飾された塩基や標準的でない塩基（通常、標準的な４種類のヌクレオチド塩基、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ又はＵのいずれともほぼ同等に結合させる目的で、ヌクレオチドとして使用されるイノシンなど）を組み込んだヌクレオチド、又は変化させた骨格をもつヌクレオチド分子（例えば、固定核酸であるＬＮＡ、又はホスホロジアミダートモルホリノヌクレオチドについても同じ方法によって、Ｔｍを実験的に決定することができる。例えば、Summerton, Antisense Nucleic Acid Drug Dev (1997), 7(3): 187-195）を参照のこと。
【００７４】
実験的に決定されたＴｍは、測定された条件でのみ有効である。他の条件（例えば、塩（一価の陽イオン）濃度、二価の陽イオン濃度）については、異なる条件下でのＴｍを予測することができる式を用いてもよい（下記を参照のこと）。
【００７５】
あるいは、所定のヌクレオチド配列のおよそのＴｍを計算することができる。多数の方法が当業者に知られており、例えば、ＧＣ含量法、最近傍法などがある。一般的に、最近傍法ではより正確な予測が得られるが、これらのどの方法を用いても、絶対的に正確な所定のヌクレオチド配列のＴｍを予測することはできない。そのため、数度のずれ（一般的には５〜１０℃と仮定される）を考慮する必要がある。従って、ヌクレオチド二本鎖の形成に依存する大部分のハイブリダイゼーション、アニーリング、プライマー伸長や他の方法では、完全な二本鎖を確実に形成させるために、実験を実施する温度には、論理的に計算された温度Ｔｍを約５〜１０℃下回る温度が選択される。当然のことながら、分子生物学の分野では周知の通り、ハイブリダイゼーション条件を、例えば、ヌクレオチド二本鎖の形成に依存するハイブリダイゼーション／プライマーのアニーリング／ＰＣＲ又は他の実験を、様々な温度条件や他の条件で試験して、最も良い結果が得られる条件を決定することによって最適化してもよい。
【００７６】
予測Ｔｍ値を計算するための単純な方法はヌクレオチド配列のＧＣ含量に基づいている（例えば、短いヌクレオチド配列については、「ウォレス則（Wallace rule）」、Wallace, Nucleic Acids Res (1979), 6: 3543を参照のこと。より長いヌクレオチドについては下記を参照のこと）。簡単に説明すると、ＤＮＡとＲＮＡを含む二本鎖の予測Ｔｍを計算するには、別の式が用いられる。なぜならば、ＲＮＡ塩基はより強く対合し、同じ配列のＤＮＡ−ＤＮＡ二本鎖と比較してより高いＴｍ値を生じる傾向にあるからである（通常同じヌクレオチド配列では、ＲＮＡ−ＲＮＡ二本鎖が最も安定であり、ＲＮＡとＤＮＡのハイブリッドの安定性が中程度でありＤＮＡ−ＤＮＡ二本鎖の安定性が最も低い）。単純な式の１つが「ウォレス則」であり、式中、融解温度は、配列中の各Ａ／Ｔ対を２℃、各Ｇ／Ｃ対を４℃として決定される（Ｔｄ＝２（＃Ａ／Ｔ）＋４（＃Ｃ／Ｇ））。この式からは、１本のヌクレオチドが、０．９Ｍの塩濃度で膜に結合している場合の融解温度の予測が得られる。二本鎖を形成している両方のヌクレオチドが溶液中にある場合、Ｔｍはこの式で計算されたものよりやや低くなる（約７〜８℃低い）。約１４〜２０塩基よりも長いヌクレオチドには、Howley, J Biol Chem (1979), 254: 4876に記載されている方法を使用してもよい。簡単に説明すると、ＤＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＴｍは、Ｔｍ＝８１．５＋１６．６ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋４１（ＧＣ％）−５００／Ｌ−０．６２Ｆとして計算され、式中、Ｎａ＋は一価の陽イオンのモル濃度であり、ＧＣ％はヌクレオチドの総数に対するＧＣヌクレオチド部分（０〜１の間の値）であり、Ｌはヌクレオチドの長さであり、かつ、Ｆはホルムアミドが溶液中に含まれている場合の百分率（０〜１００の間の値）である。ＲＮＡとＤＮＡのハイブリッド又はＲＮＡ−ＲＮＡ二本鎖の予測値を計算する場合には、若干異なる式を用いる（ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッド（ＲＮＡは溶液中の分子）に対する式がＴｍ＝７９．８＋１８．５ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋５８．４（％ＧＣ）＋１１．８（％ＧＣ）２−８２０／Ｌ−０．３５Ｆ）であるのに対し、ＲＮＡ−ＲＮＡ二本鎖についての式は、Ｔｍ＝７９．８＋１８．５ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋５８．４（％ＧＣ）＋１１．８（％ＧＣ）２−８２０／Ｌ−０．５０Ｆである。
【００７７】
Ｔｍ値を予測するための改良法に最近傍法がある。この方法は二本鎖中のＧ／Ｃ相互作用の百分率だけでなく、配列中の各ジヌクレオチドの結合エネルギーを事実上加算することで各ヌクレオチドの最近傍をも考慮に入れるため、こう呼ばれている。この方法では、上述のＧＣ含量法よりも正確なＴｍの予測が得られ、Ｇ含量が同じであっても配列が異なるヌクレオチドについては異なるＴｍの予測を生じる（概要については例えば、SantaLucia, Proc Natl Acad Sci USA (1998), 95: 1460-1465を参照のこと；ＤＮＡについては例えば、Breslauer, Proc Natl Acad Sci USA (1986), 83, 3746-3750を参照のこと；ＲＮＡについては例えば、Freier, Proc Natl Acad Sci (1986), 83, 9373-9377）を参照のこと。例えば、式、Ｔｍ＝（１０００ΔΗ／Α＋ＡＳ＋Ｒ＊ｌｎ（Ｃ／４））−２７３．１５＋１６．６ｌｏｇ［Ｎａ＋］を用いることができる。式中、ΔΗ(Kcal/mol)はハイブリッドの最近傍エンタルピー変化の合計であり、Ａはらせん開始についての補正を含む小さい定数（small constant）であり、ＡＳは最近傍エントロピー変化の合計であり、Ｒは気体定数（1.99 cal/(K*mol)）であり、Ｃはヌクレオチドの濃度であり、かつ、Ｎａ＋は溶液中の一価の陽イオンの濃度である。ＤＮＡとＲＮＡの二本鎖についてのこの計算に用いられるΔΗ値とＡＳ値を表中に示す（式例と値はシグマ−アルドリッチからのものである。上記参考文献を参照のこと）。
【００７８】
【表４】
0005894581.tif 000005
【００７９】
一般的に、これらの方法は、予測値であって、絶対的に正確ではない値を生じる。さらに、固定化（上記を参照のこと）、不純物、及びヌクレオチドの修飾などの条件は全て、所定の二本鎖又はハイブリッドの実際のＴｍ値に影響を及ぼす可能性がある。
【００８０】
いくつかの例では、実験的な方法を必ず行わなければならないが、他の例では、実験的な確認は、計算から得られた予測値を改善するために用いられる場合がある。一般的に、ビオチン、蛍光色素などの修飾はより低いＴｍを生じる傾向にあるが、いくつかの修飾（ＬＮＡに用いられる骨格の修飾など）はより高いＴｍを生じる可能性がある。ＬＮＡ骨格については、そのような骨格を含むヌクレオチドを、近似値としてＲＮＡヌクレオチド（より安定な結合と、その結果より高いＴｍ値を生じている）と見なすことができる。そのため、ＬＮＡとＲＮＡのハイブリッドは、対応するＲＮＡとＲＮＡのハイブリッドと同様に計算することができ、複数のＬＮＡヌクレオチドと複数のＤＮＡヌクレオチドを含むヌクレオチドは混合したエネルギー値に基づいて計算することができる（ＬＮＡヌクレオチドにはＲＮＡの値を使用することができ、ＤＮＡヌクレオチドにはＤＮＡの値を用いる）。
【００８１】
分子生物学で使用しやすいように、上述の方法は、http://biophysics.idtdna.com/やhttp://www.biophp.org/minitools/melting_temperature/demo.phpなどの、公共の多数のサーバーにも実装されている。
【００８２】
従って当業者は、所定のヌクレオチド配列の融解温度の予測値を容易に決定することができる。例えば配列番号１については、５０〜５４．４℃の間のＴｍが得られると考えられ、配列番号３（ｍｉＲＮＡ３１前駆配列）については、６７．４〜７６．２℃の間のＴｍが得られるだろう。これらの値は、一価の陽イオン（塩）濃度が１５ｍＭの場合（およそ０．１×ＳＳＣ緩衝液、すなわち厳しいハイブリダイゼーション条件（さらに上記を参照のこと）に相当する）について、計算されるものである。ただし温度はそれに合うように調整する必要があり、前駆体については、この例では６５℃の温度条件を試すことができるが、より短い成熟ｍｉＲＮＡについての温度は、ｐＨ、二価の陽イオン、目的とする濃度などの因子に依存して、約４５℃まで下げる必要がある。それに応じて、所定の配列の変異型についての予測値を得ることができる（標的が配列に適合する場合）。
【００８３】
ｍｉＲＮＡの検出は、様々な方法によって遂行することができる。例えば、大規模シークエンス法（deep sequencing method）によってｍｉＲＮＡを検出・定量することができる。この方法は、より豊富に存在するｍｉＲＮＡ分子からより多くの配列の読み込み（ｒｅａｄ）が得られるという事実に依存している。そのような方法は当業者に周知であり、かつ例えば、Friedlander., Nat Biotechnol (2008), 26(4): 407-415; Koh, BMC Genomics (2010), 10(11) Suppl 1: S6; Creighton, Brief Bioinform (2009), 10 (5): 490-497によって記載されている。ｍｉＲＮＡ量をさらに、アレイ技術によって決定してもよい。例えば、インビトロジェン（カールズバッド、カリフォルニア、米国）から入手可能なＮｃｏｄｅヒトｍｉＲＮＡアレイを使用して、試料中の多数のヒトｍｉＲＮＡの相対量を決定することができる。ｍｉＲＮＡの相対量を検出・決定するためのチップアレイ、例えば、Ｕ１３３プラス２．０．アフィメトリクス発現アレイもまた、アフィメトリクス（サンタクララ、カリフォルニア、米国）から入手可能である（例えば、Ivanov, J Biol Chem (2010), 285: 22809-22817を参照のこと）。ＬＮＡ骨格プローブに基づくアレイ（miRCURY LNA（商標）アレイ）は例えば、エキシコン（ヴェドベック、デンマーク）から入手可能である。
【００８４】
さらに、試料中のｍｉＲＮＡの有無と相対量を、その場検出により試験することができる。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のその場検出には、それらの長さが短いことによるいくつかの技術的な課題があるが、これらは例えば、検出にジゴキシゲニンで標識した固定核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチドプローブを用いて克服することができる（例えば、Sweetman, Methods Mol Biol (2011), 732: 1-8を参照のこと）。この方法を用いることで、ｍｉＲＮＡの細胞レベル下の分布を検出することができる。その場での方法はまた、組織及び器官レベルでのｍｉＲＮＡの分布を解明するのにも有用である（例えば、Diez-Roux, PLoS Biol (2011),18;9(1): el000582を参照のこと）。別の研究者らによるさらなる研究から、ｍｉＲＮＡの検出及び相対量を決定するための、その場ハイブリダイゼーションと蛍光を用いた検出の実行可能性が示された（Lu J, Methods Mol Biol (2011), 680: 77-88; Mansfield, Methods. (2010), 52(4): 271-280; Gupta, Methods Mol Biol (2011), 676: 73-83; Debernardi, Methods Mol Biol (2010), 667: 33-45; Silahtaroglu, Methods Mol Biol (2010), 659: 165-171、これらはＬＮＡヌクレオチドをプローブとして試験している；及びNuovo, Methods (2010),52(4): 307-315、これはパラフィン包埋した試料についての方法も示している）。
【００８５】
既に述べたように、本明細書で提供される診断方法において使用することができる、ｍｉＲＮＡを検出・定量する別の方法には例えば、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）がある。ｍｉＲＮＡが比較的短い分子であるため、逆転写と増幅の前にまず、アデノシン単量体を鎖に付加する（ポリアデニル化として知られている技術）ことにより、その長さを伸長することができる。簡単に説明すると、適切な試薬（例えば、上述のインビトロジェンから入手可能なトリゾール試薬）を用いて試料からＲＮＡを抽出し、ＡＴＰ及びポリ（Ａ）ポリメラーゼの存在下でポリアデニル化し、ポリ（Ｔ）アダプター及び５’ＲＡＣＥ配列を用いてＤＮＡへと逆転写し、その後、ｍｉＲＮＡの３’末端由来のフォワードプライマーと逆向きのＲＡＣＥプライマーを用いて増幅することができる（プライマーの設計、例えばＲＡＣＥ配列を検討するために詳細は例えば、Shi, BioTechniques (2005), 39: 519-525を参照のこと）。この技術の改良には、その３’末端にヌクレオチドを有するＲＡＣＥプライマー（ポリＡ配列のどこかへのプライミングを排除し、ｍｉＲＮＡ配列へのプライミングを有効にするように、Ａ、Ｃ、又はＧを構成しているが、Ｔを構成していない）の設計が含まれる（Reichenstein., J Virol Methods (2010), 163(2): 323-328もまた参照のこと）。
【００８６】
一例として、ｍｉＲ−３１（配列番号１）の検出・定量に以下のプライマーを用いることができる。フォワードプライマー：５’−ＡＣＧＣＧＧＣＡＡＧＡＴＧＣＴＧＧＣＡ−３’（配列番号２９）、リバースプライマー：５’−ＣＡＧＴＧＣＴＧＧＧＴＣＣＧＡＧＴＧＡ−３’（配列番号３０）（Wang., Dis Markers (2009), 26(1): 27-34を参照のこと）。ｍｉＲＮＡ３１のＰＣＲを用いた定量のさらなる例としては、Liu, J Clin Invest (2010), 120(4): 1298-1309（ｍｉＲＮＡ３１のマイクロアレイを用いた試験についても詳述している）が挙げられる。さらに、本明細書に付属の実施例に記載・例示したように、タックマンシステム（Taqman system）を用いたｍｉＲＮＡの検出・定量も、Applied Biosystems/Life technologies（カールズバッド、カリフォルニア、米国）から用意に入手可能である（例えば、http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_marketing/documents/generaldocumen ts/cms_042142.pdfを参照のこと）。ｍｉｒ３１の定量ＰＣＲによる決定の別の例では、逆転写用のステムループプライマーと、ｍｉＲ−３１のｃＤＮＡをＰＣＲ増幅するためのリバースプライマーが用いられる。そのようなプライマーの例としては、ステムループプライマー：ｇｔｃｇｔａｔｃｃａｇｔｇｃａｇｇｇｔｃｃｇａｇｇｔａｔｔｃｇｃａｃｔｇｇａｔａｃｇａｃａｇｃｔａｔｇｃｃｔｇ（配列番号３１）、フォワードプライマー：ｔｇａｃｃｇａｇｇｃａａｇａｔｇｃ（配列番号３２）、及びリバースプライマー：ｇｔｇｃａｇｇｇｔｃｃｇａｇｇｔ（配列番号３３）が挙げられる。ｍｉＲ−３１配列では、フォワードプライマーとリバースプライマーには１ヌクレオチドの重複がある。しかしながらこのことは、プライマー二量体を生じるのに十分ではない（ＰＣＲ条件及びさらなる詳細については、Ivanov, J Biol Chem (2010), 285: 22809-22817を参照のこと）。
【００８７】
別の態様では、対象の骨障害及び／又は心血管障害（例えば骨粗鬆症、骨減少症、骨折、骨恒常性の不全、又は発作、梗塞、高血圧、血栓症、血管狭窄症、冠不全症候群、血管性認知症、心臓及び腎不全又はアテローム性動脈硬化症などの心血管疾患）の診断方法は、
（ａ）前記対象由来の生体試料を、前記ＦＺＤ３の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドに結合する薬剤及び／又はｍｉＲ−３１又はその５’若しくは３’イソ型若しくは変異型と結合する薬剤と接触させる工程、
（ｂ）（ａ）の、薬剤と前記ポリヌクレオチド及び／又は前記ｍｉＲ−３１又はその５’若しくは３’イソ型若しくは変異型との結合シグナルを検出・評価する工程、及び
（ｃ）（ｂ）の検出・評価された結合シグナルと、対照試料中の対応する検出・評価された結合シグナルを比較する工程を含み、前記対照試料中の結合シグナルよりも、対象の試料中の結合シグナルが強いことが、骨障害及び／又は心血管障害を発症する又は患っている可能性の指標となる。
【００８８】
本明細書で提供される診断方法の一態様では、対象の骨障害及び／又は心血管障害を診断する方法である方法が提供され、前記方法は、
（ａ）生体試験試料中のｍｉＲ−３１（並びに本明細書に記載のそのイソ型及び変異型）の発現レベル及び／又は量をＰＣＲ法によって検出する工程、及び
（ｂ）前記生体試料中の前記ｍｉＲ−３１（並びに本明細書で定義しているイソ型及び変異型）の検出された発現レベル及び／又は量を、対照試料中の対応する前記ｍｉＲ−３１の発現レベル及び／又は量と比較する工程を含む。
【００８９】
また、対照試料は、疾患陰性（又は健康な）対照患者由来の試料であってもよく、これは「陰性対照」となる。しかしながら、例えば第二の或いはさらなる対照として、そのような対照試料が、前記骨疾患及び／又は前記心血管障害を患っている患者由来の試料を対照であることもまた考えられる。これは陽性対照となる。試料は、血液、血液血清、血漿又は別の体液であってよい。付属の実施例に示すように、血漿と血清は非常に有用である。核酸分子やさらにマイクロＲＮＡの評価方法は当該分野で公知である。そのような方法としては、例えばＰＣＲ、さらに具体的には定量ＰＣＲ並びにリアルタイムｑＰＣＲが挙げられる。例えばChen (2011) Methods Mol. Biol. 687, 113-134, 又は Mestdagh (2008) Nuc. Acid Res. 36(21): el43を参照のこと。
【００９０】
一態様では（かつ実施例で示すように）、本発明で評価又は診断される障害は、骨障害、すなわち骨減少症や骨粗鬆症などである。
本発明はまた、ＦＺＤ３の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチド及び／又はｍｉＲ−３１又はその５’若しくは３’イソ型若しくは変異型にハイブリダイズするポリヌクレオチドの検出方法を提供する。簡便な方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく方法である。なぜならば、この方法は迅速で、特異的、かつ、感度が高いためである。ＰＣＲには、標的核酸に特異的にハイブリダイズするプライマーが必要とされる。さらに、プライマーのアニーリング、プライマーの伸長、及びプライマーの変性工程を繰り返すことによってＰＣＲ産物を生成するための、第二のプライマーも必要とされる。プライマーは、標的核酸へのハイブリダイゼーションが最大になり、試料中に含まれる他の核酸への交差ハイブリダイゼーションが最小になるように選択される。プライマー配列の例と、選択された任意のプライマーについて、最適なハイブリダイゼーション温度や他の条件を計算する例を以下に示す。
【００９１】
従って本発明は、対象の骨障害及び／又は心血管障害を診断する方法を提供し、前記方法は、
（ａ）前記対象由来の生体試料を、ＦＺＤ３の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドとハイブリダイズする第一のプライマー分子及び／又はｍｉＲ−３１又はその５’若しくは３’イソ型若しくは変異型とハイブリダイズする第一のプライマー分子と接触させ、ハイブリダイゼーション複合体を形成させる工程、
（ｂ）工程（ａ）のハイブリダイゼーション複合体を、第二のプライマーと該プライマーを伸長させることが可能なポリメラーゼと接触させる工程、
（ｃ）ポリメラーゼによって伸長されるプライマー、変性する産物、及び変性したポリメラーゼ伸長の産物にハイブリダイズするプライマーを繰り返し生じさせる工程、
（ｄ）工程（ｃ）の産物を検出・評価し、第一のプライマー核酸がハイブリダイズした、ＦＺＤ３の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドの量及び／又はｍｉＲ−３１又はその５’若しくは３’イソ型若しくは変異型にハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を反映している値を得る工程、
（ｅ）（ｄ）で検出・評価された値を、対照試料の対応する検出・評価された値と比較する工程を含み、前記対照試料から得られた値よりも、対象の試料から得られた値が高いことが、骨障害及び／又は心血管障害を発症する又は患っている可能性の指標となる。
【００９２】
ＦＺＤ３の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチド及び／又はｍｉＲ−３１又はその５’若しくは３’イソ型若しくは変異型にハイブリダイズするポリヌクレオチド（標的ヌクレオチド）がＲＮＡ分子の場合、方法は好ましくは、標的ヌクレオチドを逆転写する工程を含む。逆転写は、標的分子の十分な部分と重複している、好ましくは３’末端が重複しているプライマーを用いて行うことができる。逆転写の前に、標的分子の長さをポリアデニル化工程によって伸長してもよい。この例では、逆転写プライマーはポリ（ｔ）配列と標的配列に相補的なヌクレオチドを少なくとも１つ含む。好ましくは、前記ヌクレオチドはＴではない。より好ましくは、プライマーは標的配列の２つのヌクレオチドの相補鎖を含み、ここで第一のヌクレオチド（プライマーの３’末端から２番目のヌクレオチド）はＴではない。
【００９３】
別の好ましい態様では、リバースプライマーはステムループプライマーであり、以下に記載・例示するように、標的配列と重複（相補）する短い配列とステムループ構造を含む。
【００９４】
原則として本明細書に記載の診断方法では、ＰＣＲ技術（例えば、ｑＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ｑＣＲ若しくはLight Cycler（登録商標））や、ポリヌクレオチドの有無及び／又は量を検出するのに適した他の方法を用いることができる。本発明の診断方法では、対象の試料に含まれる、ＦＺＤ３若しくはその生物学的な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチド及び／又はｍｉＲ−３１又はその３’若しくは５’イソ型若しくは変異型の有無及び／又は量が評価される。ＰＣＲ技術やこの目的に適切な他の方法は当該分野で公知であり、かつ、本明細書にも記載・例示されている。前記ポリヌクレオチド及び／又はｍｉＲ−３１又はその３’若しくは５’イソ型又は変異型の量が対照試料よりも上昇している場合、骨障害及び／又は心血管障害を発症する又は患っている可能性が上昇する。例えば、ｑＰＣＲ技術を用いた場合、対象の生体試料の総ＲＮＡをｃＤＮＡに転写することができる。その後、前記ポリヌクレオチド及び／又はｍｉＲ−３１又はその３’若しくは５’イソ型若しくは変異型にハイブリダイズする特異的プライマーを検出に用いることができる。対象の試料で検出されたポリヌクレオチド及び／又はｍｉＲ−３１又はその３’若しくは５’イソ型若しくは変異型の量を次に、対照試料のポリヌクレオチド及び／又はｍｉＲ−３１又はその３’若しくは５’イソ型若しくは変異型の量と比較することができる。対照試料の量と比較して、対象の試料での量が高いほど、骨障害及び／又は心血管障害を発症する又は患っている可能性が上昇する。
【００９５】
本明細書に記載の診断法においては、対照試料のハイブリダイゼーション又は結合シグナルよりも、少なくとも５０％、６０％、７０％又は７５％高い（ａ）の対象試料のハイブリダイゼーション又は結合シグナルが、骨障害及び／又は心血管障害（例えば骨粗鬆症、骨減少症、骨折、骨恒常性の不全、又は発作、梗塞、高血圧、血栓症、血管狭窄症、冠不全症候群、血管性認知症、心臓及び腎不全又はアテローム性動脈硬化症などの心血管疾患）を発症する又は患っている可能性の指標となる場合がある。ＦＺＤ３又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドは好ましくは、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドである。本発明においては、生体試料の例には、血液、血清、血漿、他の血液由来産物、唾液、精液、膣液、尿、髄液、などがある。一態様では、方法は、生体外での方法である。本発明においては、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子又は薬剤、例えば上述のポリヌクレオチドに結合する抗体はさらに、マーカー又はタグ付け分子に結合されていてもよい。そのような核酸用のマーカー分子としては例えば、ＵＶ／ＶＩＳ又は赤外線波長で励起され、発光する蛍光色素、例えばＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、テキサスレッド、Ｃｙ−色素、アレクサ色素（バイオプローブ）などがある。抗体用のそのようなマーカー／タグ付け分子としては例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどの酵素や、ＵＶ／ＶＩＳ又は赤外線波長で励起され、発光する蛍光色素、例えばＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、テキサスレッド、Ｃｙ−色素、アレクサ色素などがある。
【００９６】
付属の配列表は明細書の一部である。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】本研究で用いた細胞と上清（ＳＮ）の特性評価。（Ａ）老化前の内皮細胞（ＰＤ１３）と老化内皮細胞（ＰＤ５３）での老化関連β−ガラクトシダーゼ活性を染色した。（Ｂ）ＡＳＣ又はＨＵＶＥＣ培地に分泌されて４８時間後のＨＵＶＥＣのアポトーシス細胞死を、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ及びＰＩ染色によって測定した（Ｎ＝３）。（Ｃ）２種類の異なるＡＳＣ株の代表的な顕微鏡写真である。（Ｄ）フローサイトメトリーを用いて、細胞表面マーカーの発現についてＡＳＣを染色した。略語ＡＳＣは脂肪由来幹細胞を示す。
【図２】ＡＳＣの増殖能と分化能に及ぼすＨＵＶＥＣ上清の効果。（Ａ）ＡＳＣを、老化前の細胞（ＰＤ１３）及び老化細胞（ＰＤ５３）由来の馴化培地存在下で、並びに対照培地中で培養した。血球計数機及びトリパンブルー染色により、生存細胞の数を解析した。エラーバーは３回の独立した測定の標準偏差を示す。（Ｂ）処理細胞は骨形成系統へと分化した。アリザリンレッド染色により検出した。３回の独立した実験の代表的な写真を示す。略語Ｕｎｄｉｆｆ．Ｃｔｒｌは未分化対照、Ｓは老化、Ｙは幼若、Ｃは対照を示す。
【図３−１】老化ＨＵＶＥＣのエキソソームは、ＡＳＣの増殖能を向上させ、分化能を低下させる。（Ａ）ＨＵＶＥＣ由来エキソソームの電子顕微鏡像。画像は、直径が５０〜１００ｎｍの典型的な茶碗型の小胞を示している。（Ｂ）ウェスタンブロット解析は、エキソソームマーカータンパク質であるＣＤ６３を示している。
【図３−２】図３続き。（Ｃ）エキソソームを抗ＣＤ６３抗体で標識し、電子顕微鏡により可視化した。（Ｄ）ＡＳＣを、老化前の細胞（ＰＤ１３）及び老化細胞（ＰＤ５３）由来のエキソソーム存在下で、並びに対照培地中で培養した。血球計数機及びトリパンブルー染色によって、細胞数を検出した。エラーバーは、３回の独立した測定の標準
【図３−３】図３続き。（Ｅ）処理細胞は骨形成系統へと分化した。骨形成マーカーとして、Ｃａの沈着をアリザリンレッド染色により検出した。３回の独立した実験の代表的な写真を示す。略語Ｕｎｄｉｆｆ．Ｃｔｒｌは未分化対照、Ｓは老化、Ｙは幼若、Ｃは対照を示す。
【図４Ａ】ＭｉＲ−３１は、老化内皮細胞から多く分泌される。（Ａ）ＭｉＲ−３１は老化ＨＵＶＥＣで亢進している。
【図４Ｂ】図４続き。（Ｂ）ＭｉＲ−３１は老化ＨＵＶＥＣ由来ＳＮで亢進している。
【図４Ｃ】図４続き。（Ｃ）ＭｉＲ−３１は老化ＨＵＶＥＣ由来エキソソームで亢進している。
【図４Ｄ】図４続き。（Ｄ）電子顕微鏡を用いたその場ハイブリダイゼーション（ＥＭ−ＩＳＨ）による、エキソソーム中でのｍｉＲ−３１の局在。略語Ｓは老化、Ｙは幼若、ＳＮは上清を示す。
【図５−１】ＡＳＣはＨＵＶＥＣ由来エキソソームを取り込む。（Ａ）老化前及び老化したＨＵＶＥＣ由来の上清又はエキソソームで処理した後のＡＳＣでのｍｉＲ−３１の細胞内レベル。
【図５−２】図５続き。（Ｂ）ＧＦＰを発現している、安定に形質転換した老化内皮細胞の代表的な画像。（Ｃ）ＧＦＰ陽性のエキソソームを取り込んで４８時間インキュベートした後のＡＳＣの代表的な画像。
【図５−３】図５続き。（Ｄ）優勢阻害のダイナミン構築物（Ｋ４４Ａ）で形質転換し、エキソソームで処理した後、ＡＳＣは細胞内ｍｉＲ−３１レベルの低下を示す。略語ＳＮは上清、Ｓは老化、Ｙは幼若、Ｃは対照、ＷＴは野生型を示す。
【図６】ｍｉＲ−３１は単独でＡＳＣの骨形成分化を低下させる。（Ａ）タックマン（ＴａｑＭａｎ）試験により、一過的に形質転換した後のｍｉＲ−３１レベルの上昇を確認した。（Ｂ）ＭｉＲ−３１で形質転換した細胞は骨形成系統へと分化した（Ｎ＝３）。アリザリンレッド染色で分化を検出した。３回の独立した実験の代表的な写真を示す。略語Ｕｎｄｉｆｆ．Ｃｔｒｌは未分化対照、Ｃは対照を示す。
【図７−１】ＡＳＣにおいて、ＦＤＺ３はｍｉＲ−３１の標的である。（Ａ）骨形成分化が開始して４日後、ＦＤＺ３のｍＲＮＡは有意に亢進されている。（Ｂ）幼若エキソソームで処理したＡＳＣに対する、老化エキソソームで処理したＡＳＣでのＦＤＺ３のｍＲＮＡの有意な下方制御。
【図７−２】図７続き。（Ｃ）ＡＳＣをΙΟｎΜのｍｉＲ−３１前駆体で一過的に形質転換した後のＦＤＺ３のｍＲＮＡの下方制御。略語ＯＤは骨形成分化、Ｓは老化、Ｙは幼若、Ｃは対照、Ｃｔｒｌは対照を示す。
【図８−１】高齢者の血漿由来エキソソームはＡＳＣの骨形成分化を低下させる。（Ａ）血清由来エキソソームの電子顕微鏡像。画像は、直径が約５０〜１００ｎｍの典型的な茶碗型の小胞を示している。（Ｂ）健康な高齢提供者（Ｎ＝２７）由来の血清試料では、若年健康対照群（Ｎ＝２１）と比較して、ｍｉＲ−３１レベルが有意に亢進している。
【図８−２】図８続き。（Ｃ）高齢提供者及び若年提供者由来のエキソソームで処理したＡＳＣは骨形成系統へと分化した。アリザリンレッド染色で分化を検出した。２回の独立した実験の代表的な写真を示す。
【図８−３】図８続き。（Ｄ）骨減少症患者由来の血漿では、年齢を適合させた健康対照と比較して、ＭｉＲ−３１レベルが有意に上昇した。
【図９】結果をまとめた提唱モデル。老化内皮細胞由来上清／エキソソームは、ｍｉＲＮＡの送達を介して、ＡＳＣの増殖能及び分化能に影響を及ぼす。それによって、「老化」環境が組織再生を阻害し、癌の発症の危険因子の１つである細胞成長を促進する。
【図１０】未処理のＨＵＶＥＣに対して老化由来エキソソームでは、ＭｉＲ−３１はＨ２Ｏ２によっても誘導される。Ｈ２Ｏ２を一過的に適用した内皮細胞から、１４日後（７５μΜのｔＢＨＰで処理した細胞でさらなる細胞増殖が観察されない時点）に、エキソソームを回収した。一方、３５μΜのｔＢＨＰに曝露させると細胞は完全に回復し、成長を再開した。
【図１１】ｍｉＲ−３１、抗ｍｉＲ−３１、標的をもたない対照ｍｉＲＮＡで形質転換した後のＡＳＣ及び形質転換しなかった細胞での骨形成分化レベル。アリザリンレッド染色で解析されたように、ｍｉＲ−３１が有意に骨形成を阻害するのに対し、抗ｍｉＲ−３１は骨形成を有意に向上させる。
【図１２】ｍｉＲ−３１の血漿レベル。骨減少症と診断された１０人の男性患者のｍｉＲ−３１の血漿レベルを、年齢を適合させた健康対照群と比較した。１０人中７人の患者が、U6B snRNAを基準として標準化したｍｉＲ−３１をより高レベルで示し、スチューデントの検定によって計算されるように、高い有意差を生じた。
【００９８】
以下の実施例は本発明を説明する。
【実施例１】
【００９９】
実施例１：細胞培養
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）
内皮細胞をヒトの臍帯から、以下の文献に記載されている通りに単離した（Chang, Exp Cell Res (2005), 309: 121-136; Jaffe, J Clin Invest (1973), 52: 2745-2756）。ゼラチンで予めコーティングしたフラスコに、４ｍＭのグルタミン、１５％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）及び１７０Ｕ／ｍｌのヘパリン含有１０％内皮細胞増殖サプリメント（ＥＣＧＳ）を補填した、アール塩を含むＭ１９９培地を入れ、ＨＵＶＥＣを３７℃、湿潤環境、５％ＣＯ２で培養した。細胞を週に１回か２回継代した。継代時の分割比は、成長速度に応じて１：２〜１：４とした。ＨＵＶＥＣを老化するまで培養し、老化関連βガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−ｇａｌ）活性を、既に記載されている通りに染色した（Chang、上記）。上清の回収には、接触阻止した（静止した、ＰＤ１９）細胞と老化した（ＰＤ５３、９５％ＳＡ−β−ｇａｌ陽性）細胞を、実験によって、ＡＳＣ培地又はＨＵＶＥＣ培地中で４８時間分泌させた。その後上清を回収し、１９００ｇ、４℃で遠心分離し、直ちにエキソソームの調製に用いるか或いは−８０℃で保存した。上清の容積は、上清を回収した時点で１本のフラスコに分泌されたＨＵＶＥＣの数に基づいて標準化した。３７℃で４８時間インキュベートした細胞培地をさらなる対照として用いた。
【０１００】
ヒト脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）
腫脹部脂肪吸引の外来患者から、局所麻酔をして皮下の脂肪組織を得た。ＡＳＣをこれまでに記述されているように単離し（Wolbank, Tissue Eng (2007), 13: 1173-1183; Wolbank, Tissue Eng Part A (2009)）、４ｍＭのＬ−グルタミン、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ、ＰＡＡ）と１ｎｇ／ｍＬの組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｒｈＦＧＦ、Ｒ＆Ｄシステムズ）を補填したＤＭＥＭ−低グルコース／ハムＦ−１２培地中で、３７℃、５％ＣＯ２、９５％大気湿度で培養した。細胞を週に１回か２回継代した。継代時の分割比は、成長速度に応じて１：２とした。特異的表面マーカー（ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、HLA ABC、HLA DR）の発現に基づき、フローサイトメトリー（FACS Calibur、ベクトン・ディッキンソン）を標準的な手順で使用して、ＡＳＣの特性を評価した。
【０１０１】
骨形成系統への分化
全ての分化手順は２４穴の細胞培養プレートで行った。骨形成分化のために、ＡＳＣを１穴当たり２×１０３個の細胞密度で播種した。播種後７２時間目から最大４週間、細胞を骨形成分化培地（ＤＭＥＭ−低グルコース、１０％のＦＣＳ、４ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｎΜのデキサメタゾン、１５０μΜのアスコルビン酸−２−リン酸、１０ｍＭのβ−グリセロールリン酸及び１０ｎΜのビタミンＤ３）でインキュベートした。
【０１０２】
アリザリンレッド染色
石灰化した構造をアリザリンレッドで染色するために、細胞を１時間、７０％エタノール中、−２０℃で固定した。簡単に濯いだあと、細胞を４０ｍＭアリザリンレッド溶液（シグマ）で２０分間染色し、その後ＰＢＳで洗浄した。定量するために、２００μｌのＨＣｌ（０．１Ｍ）／ＳＤＳ（０．５％）溶液で３０分間、アリザリンレッドを抽出した。抽出した色素を４２５ｎｍで測定した。
【実施例２】
【０１０３】
実施例２：形質転換
ＡＳＣを、ｓｉＰＯＲＴ（商標）ＮｅｏＦＸ（商標）形質転換試薬（アプライドバイオシステムズ）を用いて形質転換した。細胞を、１０ｎＭの前駆ｈｓａ−ｍｉＲ−３１、１００ｎＭの抗ｍｉＲ−３１又は１０ｎＭの陰性対照２＃（アンビオン）で、製造業者によるプロトコールに従って形質転換した。細胞を、２４時間後、４８時間後、又は、前述したように形質転換して３日後の分化が始まった時点で回収した。
【０１０４】
さらに、ＡＳＣを、０．５μｇの優性阻害ダイナミン構築物（Ｋ４４Ａ）又はダイナミンの野生型構築物（Mark A. McNiven Department of Biochemistry and Molecular Biology & Center for Basic Research in Digestive Diseases, Mayo Clinic and Graduate School、ロチェスター、ミネソタ５５９０５、米国から提供された）で、Metafectene Pro（ビオンテックスラボラトリー有限責任会社）を使用して、製造業者の手順に従って形質転換した。
【実施例３】
【０１０５】
実施例３：アポトーシス細胞死の評価
ＨＵＶＥＣを１２穴の細胞培養プレートに播種し、ＡＳＣ培地中で４８時間分泌させた。その後細胞を５０ｍＭのＥＤＴＡで分離し、製造業者の説明に従ってアネキシンＶ−ＦＩＴＣとＰＩ（ロシュ）で染色した。FACS-CaliburとCellQuestソフトウェア（ベクトン・ディッキンソン）により、アポトーシス細胞とネクローシス細胞／アポトーシスの進行した細胞の百分率を解析した。
【実施例４】
【０１０６】
実施例４：定量リアルタイムＰＣＲ
別の骨形成分化マーカー遺伝子によってアリザリンレッド染色を確認した。そのため、骨形成が起こる前及び骨形成の最中の様々な時点のＡＳＣから、総ＲＮＡをトリゾール（インビトロジェン）を用いて単離した。DyNAmo cDNA合成キット（バイオザイム）で逆転写し、RotorGene2000（コーベット）でｑＰＣＲを行った。ｍｉＲＮＡの解析には、特定のタックマン（TaqMan）アッセイ（アプライドバイオシステムズ）を製造業者の手順に従って行った。
【０１０７】
血液試料からのＲＮＡの単離には、２５０〜５００μｌの血清から、トリゾールＬＳ試薬（インビトロジェン）を使用して総ＲＮＡを単離した。ＲＮＡの単離工程での試料間の変動を標準化するために、２５ｆｍｏｌの人工センチュウ（C. elegans）ｍｉＲＮＡであるｃｅｌ−ｍｉＲ−３９を単離の前に加えた。血清試料（２７人の健康高齢提供者と２１人の健康若年提供者）は、Department of Gerontology & Geriatrics C2-R, Leiden University Medical Center、オランダ、のR. Westendorpから得た。さらに４人の骨減少症血清試料を、Department of Pathophysiology, General hospital、ウィーンのP. Pietschmannから得た。本試験は組織の倫理委員会で承認され、書面による同意書を各対象から得た。
【実施例５】
【０１０８】
実施例５：レンチウイルスの形質導入
老化したＨＵＶＥＣに、ＧＦＰタンパク質を含むレンチウイルスベクターを形質導入した。ベクターは、Institute for Biomedical Aging Research,インスブルック、オーストリアのPidder Jansen-Durrから好意により提供された（Muck, Rejuvenation Res (2008), 11 : 449-453）。簡単に説明すると、老化したＨＵＶＥＣと老化前のＨＵＶＥＣを用いて、レンチウイルスの形質導入を行った。一般的に、１０００００〜１５００００個の老化したＨＵＶＥＣと５００００個の老化前のＨＵＶＥＣを６穴プレートに薄く広げ、一晩インキュベートした。安定に形質導入された細胞を生成するために、２〜８の感染多重（ＭＯＩ）を、感染効率を上昇させる８μｇ／ｍｌのポリブレンを加えて行った。選択圧として、１０μｇ／ｍｌのブラストサイジンを培地に添加した。６〜８日後、クローンは安定し、レンチウイルス粒子の混入を、ヒーラ細胞とＳＮを４日間インキュベートすることで試験した。その後ＳＮを回収し、前述のようにエキソソームの精製に用いた。
【実施例６】
【０１０９】
実施例６：エキソソームの精製
エキソソームを、ろ過及び分画遠心法により、既に記載されているように精製した（Lehmann, Cancer Res (2008), 68: 7864-7871）。簡単に説明すると、４８時間インキュベートした後に上清を回収した。この馴化培地を、細胞を沈殿させるために５００ｇで１０分間、残渣を除去するために１４０００ｇで１５分間遠心分離し、その後、アポトーシス小体の画分を除去しながら、０．２２μｍフィルターを通す。その後、１０００００ｇで６０分間超遠心してエキソソームを沈降させ、得られたペレットをＰＢＳで洗浄する。エキソソームを新鮮な標本として電子顕微鏡法に用いるか、或いはその後の解析用に−８０℃で保存する。分化試験用には、１ウェルのＡＳＣにつき、５０μｌのＰＢＳに溶解した２×１０４個のＨＵＶＥＣ由来エキソソームを加えた。
【実施例７】
【０１１０】
実施例７：電子顕微鏡法
精製したエキソソームをニッケルのカバーグラス（２００メッシュ、六法晶形、ピオロフォームでコーティングされたアテネ銅グリッド）上で安定するまで放置した。４％のホルムアルデヒドで固定した後、エキソソームを２％の酢酸ウラニルで３０秒間染色し、乾燥させるためにカバーグラスを取り、その後、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、フィリップスモデルＣＭ１２電子顕微鏡（フィリップス、アイントホーフェン、オランダ）で可視化した。
【０１１１】
電子顕微鏡を用いたその場ハイブリダイゼーション（ＥＭ−ＩＳＨ）用に、エキソソームのペレットを０．１％のトリトン−Ｘで５分間、室温で透過処理した。ＰＢＳで洗浄した後、エキソソームを既に記載されているように、ハイブリダイゼーション緩衝液と少なくとも４時間インキュベートした（Obernosterer, Nat Protoc (2007), 2: 1508-1514）。各試料につき１ｐＭのＬＮＡ  ＤＩＧ標識一本鎖プローブ（エキシコン、デンマーク）を、変性ハイブリダイゼーション緩衝液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．１％ツイーン、０．２５％ＣＨＡＰＳ、２００μｇ／ｍｌ酵母ＲＮＡ、５００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む）中、８０℃で５分間インキュベートすることによって変性させた。直ちにプローブを氷上に置いた。エキソソームをプローブと混合し、５０℃で一晩ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、試料を厳しく、０．２×ＳＳＣ、６０℃で１時間洗浄した。その後、エキソソームを抗ＤＩＧ抗体（ロシュ）と３０分間インキュベートし、５ｎｍの金粒子で標識した二次抗体（シグマ）とさらに１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、エキソソームをエポンに包埋し、平均およそ８０ｎｍの切片をウルトラミクロトームで切り出し、その後透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、フィリップスモデルＣＭ１２電子顕微鏡（フィリップス、アイントホーフェン、オランダ）で解析した。
【実施例８】
【０１１２】
実施例８：ウェスタンブロット
総タンパク質を抽出し、ポリアクリルアミドゲル状で分離し、その後ＰＶＤＦ膜（ロス、ドイツ）に移した。膜を５％の脱脂粉乳でブロッキングし、ＣＤ６３抗体（Ｈ−１９３、サンタクルズ）、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体とインキュベートし、その後Chemidoc（バイオラッド）で行う、ＥＣＬウェスタンブロット基質（ピアス）を用いた増強化学発光（enhanced chemiluminescence）にかけた。
【実施例９】
【０１１３】
実施例９：ＡＳＣの増殖能と分化能に及ぼすＨＵＶＥＣ上清の効果
幹細胞の全身環境の阻害（Conboy, Nature (2005), 433: 760-764）に老化内皮細胞が寄与する可能性があるかについて試験するために、十分に特性が評価された老化前のＨＵＶＥＣと老化したＨＵＶＥＣ（ＰＤＬがＰＤ１３〜ＰＤ５３）を、既に確立されたものとして用いた（Chang, Exp Cell Res (2005), 309: 121-136）。老化細胞は大きくて扁平な形態を示し、ＳＡ−β−ｇａｌ活性陽性に染色された（図１Ａ）。内皮から分布される因子をＡＳＣ培地中で生成するために、内皮細胞をＡＳＣ培地に４８時間曝露した。過剰な細胞死が「セクレトーム」に及ぼす影響を排除するために、アネキシンＶ染色とＰＩ染色で、「回収」している間の内皮細胞の細胞死の基礎レベルを試験した。老化前のＨＵＶＥＣと老化したＨＵＶＥＣの間に有意差は見られなかった（図１Ｂ）。
【０１１４】
さらに、６人の異なる提供者由来の、典型的な形態を示しているＡＳＣ（図１Ｃに例を示す）を用いて、それらの同一性を、既に記載されているように（Wolbank, 2009、上記; Yanez. Stem Cells (2006), 24: 2582-2591）、それらの表面マーカーのプロファイル（図１Ｄ）の特性評価によって確認した。
【０１１５】
老化前のＨＵＶＥＣと老化したＨＵＶＥＣ由来の馴化培地がＡＳＣの成長の特性に及ぼす影響を試験・比較するために、細胞をそれぞれの上清と５日間インキュベートした。試験の全期間を通じて、各試験環境で細胞の生存率は変化しなかったが（データは示さない）、老化上清存在下で培養したＡＳＣの細胞数は、老化前の上清又は対照培地存在下で培養した細胞と比較して有意に高くなった（図２Ａ）。加えて、老化細胞由来の上清は２１日後に、分化培地とインキュベートした場合と比較して、アリザリンレッドで染色されるＡＳＣの骨形成分化能を有意に低下させた（図２Ｂ）。
【実施例１０】
【０１１６】
実施例１０：老化ＨＵＶＥＣ上清のエキソソームはＡＳＣの増殖能と分化能を高める
エキソソームは膜で覆われた小胞であり、その直径は４０〜１００ｎｍで、細胞内の多小胞体に由来する（Pap, Inflamm Res (2009), 58: 1-8）。近年になって、エキソソームが様々な環境での傍分泌のシグナル伝達分子として記載されてきたため（Deregibus, Blood (2007), 110: 2440-2448; Hunter, PLoS ONE (2008), 3 : e3694; Lehmann、上記; Pap、上記）、エキソソームがＡＳＣの挙動の変化に寄与する可能性があるか否かを試験した。そのために、連続遠心分離工程（Deregibus、上記）によって、エキソソームをＨＵＶＥＣ上清から単離した。エキソソームの同一性を確認するために電子顕微鏡法を行った。粒度分布は、我々のエキソソーム調整物中にアポトーシス小胞が見られないことを強く示している（図３Ａ）。なぜならば、アポトーシス小体の大きさは５００ｎｍを上回るためである（Reich, Exp Cell Res (2009), 315: 760-768）。さらに、エキソソームのマーカーとして一般的に用いられるＣＤ６３表面タンパク質（Valadi, Nat Cell Biol (2007), 9: 654-9）に対する抗体を用いたウェスタンブロット解析（図３Ｂ）と免疫金標識（図３Ｃ）は、エキソソームの単離が成功したことを示唆している（図３Ａ〜３Ｃ）。
【０１１７】
ＡＳＣを老化ＨＵＶＥＣ由来エキソソームで処理すると、老化前の内皮細胞由来エキソソームで処理した幹細胞と比較して、増殖速度は再び有意に上昇した（図３Ｄ）。さらに、細胞を老化エキソソームで処理すると骨形成分化能は有意におよそ５０％低下したが（図３Ｅ）、脂質生成の分化は影響を受けなかった（データは示さない）。
【実施例１１】
【０１１８】
実施例１１：ｍｉＲ−３１は内皮細胞から分泌される
種々のタンパク質に加えて、ｍｉＲＮＡもエキソソーム中に詰め込まれることが示された（Valadi、上記）。ｍｉＲ−３１が老化ＨＵＶＥＣで亢進することが示された（図４Ａ）。さらに、ＨＵＶＥＣの培養上清（図４Ｂ）及び老化前の内皮細胞由来のエキソソームに対して、老化内皮細胞由来のエキソソーム（図４Ｃ）中にもそれらが存在しているか否かについて試験した。ｑＰＣＲで最大１２倍の変化が検出されたため、電子顕微鏡を用いたその場ハイブリダイゼーション（ＥＭ−ＩＳＨ）によりエキソソーム内でのｍｉＲＮＡの局在を確認した。これまでは、生化学的な試験だけがｍｉＲＮＡがエキソソーム内にあることを示唆していたが、本発明において、ｍｉＲＮＡが実際にエキソソーム内に詰め込まれていることの顕微鏡による初めての証拠が提供される（図４Ｄ）。
【実施例１２】
【０１１９】
実施例１２：ＡＳＣはＨＵＶＥＣ由来エキソソームを取り込む
内皮由来ｍｉＲ−３１がＡＳＣによって取り込まれるか否かを試験するために、ＡＳＣをＨＵＶＥＣ由来のＳＮやエキソソームと共にインキュベートした。確かに４８時間後のＡＳＣ内で、ｍｉＲ−３１の４〜５倍の上昇が観察された（図５Ａ）。これらのデータからは、エキソソームがＡＳＣによって取り込まれるのか、又はエキソソーム調整物に含まれる他の成分がＡＳＣ内でのｍｉＲ−３１の新規の転写を誘導するのかは分からなかった。そこで、近年ＧＦＰがエキソソーム内に詰め込まれることが発表されたことから（Deregibus、上記）、ＧＦＰを発現している安定な形質転換老化内皮細胞（図５Ｂ）を準備した。ＧＦＰ陽性のエキソソームとインキュベートして２日後のＡＳＣでは細胞質内がＧＦＰのシグナルで強調されたが、ＧＦＰ−エキソソームが枯渇した上清で処理したＡＳＣではシグナルは示されなかった（図５Ｃ）。エキソソームの取り込みをさらに確認するために、ＡＳＣを優性阻害ダイナミン構築物（Ｋ４４Ａ）と対照としてダイナミンの野生型構築物（Cao, Mol Biol Cell (1998), 9: 2595-2609; Cao, J Cell Sci (2000), 113 (Pt 11): 1993-2002）で形質転換した。ダイナミンが真核細胞でのエンドサイトーシスに関与していること（Cao, 1998、上記; Cao, 2000、上記）、及びエンドサイトーシスがエキソソームの取り込みに関与していること（Valadi、上記）が示された。実際に、図５Ｄで示すように、ｍｉＲ−３１レベルは優性阻害ダイナミン構築物（Ｋ４４Ａ）で形質転換したＡＳＣで低下した。
【０１２０】
これらの結果は、ｍｉＲ−３１が膜を介したシグナル伝達の結果の誘導によってではなく、実際にエキソソームを介して取り込まれることを示しており、この取り込みは、脂質含有ＤＮＡやＲＮＡがそれらの積荷を細胞内に送達する、生体外での形質転換に類似しているように見える。
【実施例１３】
【０１２１】
実施例１３：ｍｉＲ−３１は単独でＡＳＣの骨形成分化を低下させる
ｍｉＲ−３１が単独で分化に及ぼす影響を研究するために、ＡＳＣをｍｉＲ−３１で一過的に形質転換した。タックマン（TaqMan）アッセイにより、ｍｉＲ−３１レベルの上昇を確認した（図６Ａ）。ＡＳＣの分化能に及ぼすｍｉＲ−３１の影響を研究し、ＡＳＣをｍｉＲ３１で一過的に形質転換すると、骨形成分化はおよそ１／２に有意に阻害された（図６Ｂ）。これはエキソソーム単独で見られたのと同様の範囲である。これらのデータは、ｍｉＲ−３１が、内皮細胞、特に老化した内皮細胞から分泌される可能性のある、骨形成分化の阻害剤であることを示している。
【実施例１４】
【０１２２】
実施例１４：ｍｉＲ−３１の標的
骨形成条件では、ＦＺＤ３のｍＲＮＡレベルがＭＳＣで上昇することが示された（Baksh, J Cell Biochem (2007), 101 : 1 109-1124）。本発明においては、ＦＺＤ３のｍＲＮＡレベルは対照培地で処理した細胞と比較して４日後に亢進した（図７Ａ）。さらにＦＺＤ３レベルは、幼若エキソソームや対照で処理した細胞と比較して、老化エキソソームでの処理後に有意に下方制御された（図７Ｂ）。ｍｉＲ−３１を形質転換して２４時間後にも、ＦＤＺ３は下方制御されたが、有意なレベルには達しなかった。このことは、細胞が分化していない時点では、ＦＤＺ３のｍＲＮＡレベルが非常に低い（図７Ｃ）ことで説明できると考えられる。従って、ＦＺＤ３はマーカーのみでなく、骨形成分化に必須の因子に相当し、ＡＳＣでもｍｉＲ−３１の直接の標的である可能性がある。
【実施例１５】
【０１２３】
実施例１５：ＡＳＣに及ぼす血漿由来エキソソームの効果
電子顕微鏡法によって、エキソソームが血漿中に存在することを確認した（図８Ａ）。次に、２１人の健康な若年提供者（１９〜４７才）と２７人の高齢提供者（５０〜９１才）の血清からＲＮＡを単離し、ｍｉＲ−３１レベルを解析した。本発明において明らかになったように、ｍｉＲ−３１レベルは高齢者で有意に上昇し、かつ、若年提供者に比べて変動が大きかった（図８Ｂ）。さらに、１ｍｌの培地に、１ｍｌの血漿由来エキソソームを加えて細胞を７２時間処理すると分化が始まった。異なる４人の提供者からの「高齢」エキソソームで処理したＡＳＣでは、骨形成分化が約１／３に有意に低下したことが分かった（図８Ｃ）。対照試料で分化が非常に少ないことは、血清由来エキソソームで処理した細胞での分化が非常に早いことで説明できる。加えて本明細書では、骨減少症患者由来の血漿でのｍｉＲ−３１レベルが、健康な年齢を適合させた対照と比較して高かったことが示された（図８Ｄ）。
【実施例１６】
【０１２４】
実施例１６：酸化ストレスは老化を誘導する
酸化ストレスが内皮の老化と機能不全に関係があることが知られている（Seals, Clin Sci (Lond) (2011), 120(9): 357-375）。酸化ストレスがｍｉＲ−３１の分泌を誘導するか否かを試験するために、ＨＵＶＥＣを連続して５日間、１日当たり１時間、培地中のｔＢＨＰを最終濃度が７５μΜ、５０μΜ又は３５μＭになるまで加えるｔＢＨＰ処理で、ＳＩＰＳ（ストレス誘導未成熟老化）を誘導した。永久的な成長停止は７５μΜのｔＢＨＰによって誘導された。Unterluggauer, Exp Gerontol (2003), 38: 1149-1160に記載されている手順に従って、顕微鏡法によって１４日間評価した。
【０１２５】
その結果、ｍｉＲ−３１がストレスを誘導した未成熟老化内皮細胞のエキソソーム中で増加していることが分かった。Ｈ２Ｏ２の量を増やすことにより（３５μＭ、５０μΜ及び７５μＭのｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ｔＢＨＰ））、未処理のＨＵＶＥＣに比べて、ストレスを誘導した老化ＨＵＶＥＣでは、複製によって老化したＨＵＶＥＣでのレベルと同様の、最大５倍のｍｉＲ−３１の誘導が観察された（図１０）。
【０１２６】
さらに、老化内皮細胞の上清でのｍｉＲ−３１の増加は、ヒト臍帯静脈内皮細胞由来のＨＵＶＥＣには限定されず、老化したヒト網膜内皮細胞や老化したヒト肝臓由来内皮細胞でも、初期継代対照細胞に比べてｍｉＲ−３１の増加が見られた（データは示さない）。
【実施例１７】
【０１２７】
実施例１７：ｍｉＲ−３１拮抗剤は骨形成分化を阻害する
ｍｉＲ−３１の阻害が骨形成分化を改善するか否かを試験するために、ｍｉＲ−３１を拮抗する固定核酸（ＬＮＡ）（アンビオン、製品ＩＤ：AM11465; P/N AM17000）を解析した。ＡＳＣの形質転換の実験手順は、上述した実施例２で行ったのと同様に実施した。
【０１２８】
既に明かになったように、アリザリンレッド染色によって解析されたＣａ沈着の有意な増加が観察され、ｍｉＲ−３１の一過性の増加は骨形成分化の低下を生じた（図１１）。これらのデータは、ｍｉＲ−３１を全身で又は局所的に阻害又は除去すると、例えば骨粗鬆症で、或いは骨折後の骨芽細胞の形成が改善されることを示している。
【実施例１８】
【０１２９】
実施例１８：ｍｉＲ−３はマウスモデル系での骨形成を阻害する
ｍｉＲ−３１がヒトの系においてだけでなく、骨形成の一般的な制御因子であることを確認するために、C3Ht10 1/2細胞株、すなわちＢＭＰ２の添加で骨形成分化を誘導することができるマウス間葉多能性細胞株（Richard, PLoS Genetic (2005), 1(6): e74）を用いた。読出しとして、オステオカルシンプロモーターの制御下でルシフェラーゼをコードしているレポーター構築物（Feichtinger, Tissue Eng Part C Methods (2010), 17(4): 401-410）と共に、細胞を形質転換した。
【０１３０】
ｍｉＲＮＡ−３１の形質転換が骨形成分化に及ぼす影響を、(C2C12) C3Ht10 1/2細胞株とオステオカルシン特異的レポーター遺伝子試験（Feichtinger, Tissue Eng Part C Methods (2010), 17(4): 401-410）を組み合わせることによってさらに解析した。(C2C12) C3Ht10 1/2細胞は組換えＢＭＰで処理すると骨形成系統に分化することができ、それをアルカリホスファターゼ、オステオカルシン及び他の骨芽細胞特異的遺伝子を誘導することで観察することができる。細胞をＴ１７５フラスコに播種し、最初に９９μｇのオステオカルシンレポーターシステムで形質転換した。２４時間後に、アンビオンのsiPORT NeoFXを使用して、３０ｎＭのｍｉＲＮＡ−３１又は対照のスクランブルｍｉＲＮＡ対照＃２で逆形質転換した。骨形成分化を３００ｎｇ／ｍｌの組換えＢＭＰ２（InductOS、ファイザー）で誘導し、対照では成長因子による誘導は行わなかった。分化の６日後にReady-To-Glow Secreted Luciferase System Kit（クロンテック）で細胞培養上清のメトリディアルシフェラーゼの活性を決定することにより、オステオカルシンのレポーター活性を評価した。
【０１３１】
その結果、マウスモデルでも一過性のｍｉＲ−３１の過剰発現による骨形成の阻害が確認された。さらに、若年対高齢の健康なヒトと同様に、高齢のマウスの血清には、対照とした同系の若いマウスの血清と比較して３〜１０倍高い濃度のｍｉＲ−３１が含まれていることが分かった（データは示さない）。
【実施例１９】
【０１３２】
実施例１９：骨減少症患者の血漿でのｍｉＲ−３１の解析
骨減少症と診断された１０人の男性患者の血漿を、年齢を適合させた対照（P. Pietschmann, Department of Pathophysiology, General hospital、ウィーンから提供された）と比較した。本試験は組織の倫理委員会によって承認され、かつ、書面による同意書を各対象から得た。
【０１３３】
血漿を、ｍｉＲＮＡの解析に推奨されている標準の臨床的な手法により調製した（Taylor, Methods Mol Biol (2011), 728: 235-246; Kroh, Methods (2010), 50: 298-301）。トリゾールＬＳを用いて総ＲＮＡを単離した。その後、タックマン（商標）のプロトコールに従ってｑＰＣＲを実施した。この方法では、第一の工程は特異的な逆転写であり、その後増幅を行う。ｍｉＲ−３１特異的な単位複製配列（アンプリコン）の増幅を、増幅によって蛍光標識されるプローブを表示することによって監視する。試験を３回行い、ｍｉＲ−３１の差次的発現を、small U6 snRNAに基づいて標準化した。加えて、ＲＮＡの単離・定量工程全体を通じたｍｉＲＮＡの回収を標準化するために、対照としてC. elegansに特異的なｍｉＲＮＡを添加した。ＰＣＲは以下に詳述したように行った。
【０１３４】
タックマンプロトコール（hsa-miR-31）
アプライドバイオシステムズ
ｃＤＮＡ合成：
【０１３５】
【表５】
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【０１３６】
プログラム：
１６℃：３０分
４２℃：６０分
８５℃：５分
４℃：一時停止
タックマンプライマー：
アプライドバイオシステムズ
【０１３７】
【表６】
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【０１３８】
【表７】
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【０１３９】
装置及びソフトウェア：
Rotor-Gene 6000;Rotor-Gene Software 6000、Series Software 1.7
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−３】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４Ｄ】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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