(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロース系バイオマスの連続的加水分解のための方法であって、少なくとも以下のステップ：
(P) 定常状態で作動され得る少なくとも１つのリアクタを準備し；
(A) セルロース系バイオマスの所定量を前記リアクタに加え、ここで、前記セルロース系バイオマスは少なくとも10％の固体量を有する；
(A') 酵素の所定量を前記リアクタに加え；
(E) 前記セルロース系バイオマスの部分的な酵素的加水分解を前記リアクタ中で行うこと、
を含み、
定常状態は、前記方法において達成され、そこでは、セルロース系バイオマスが前記リアクタに連続的に添加され、同時に、少なくとも部分的に加水分解されたセルロース系バイオマスが連続的に前記リアクタから除かれ、ここで、連続的に除かれる前記少なくとも部分的に加水分解されたセルロース系バイオマスは、攪拌機（FL 100/6W）を備えたカップ中でPhysica MCR 101レオメータで測定される、25 Pas（パスカル秒）以下の粘度を有する、方法。
【請求項２】
少なくとも２つのリアクタのカスケードがステップ（P）で提供される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
以下のステップ：
（T）攪拌機（FL 100/6W）を備えたカップ中でPhysica MCR 101レオメータで測定される、25 Pas（パスカル秒）以下の粘度を有する、部分的に加水分解されたセルロース系バイオマスをステップ（E）から連続的に除き、そして、定常状態で作動され得る次のリアクタに、除かれたセルロース系バイオマスを移し；
(E) 前記の次のリアクタ中でステップ（E）からの部分的に加水分解されたセルロース系バイオマスに対する更なる酵素的加水分解を行うこと、
を更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記リアクタに加えられるセルロース系バイオマスの固体量が、少なくとも15％、または少なくとも20％、又は少なくとも25％、又は少なくとも30％、又は10％〜45％、又は15％〜45％、又は20％〜40％又は15％〜30％である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
攪拌機（FL 100/6W）を備えたカップ中でPhysica MCR 101レオメータで測定される、連続的に除かれた部分的に加水分解されたセルロース系バイオマスの粘度が、10 Pas（パスカル秒）以下、又は5 Pas以下、又は3 Pas以下、又は1 Pas以下である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記セルロース系バイオマスが、リグノセルロース系バイオマスである、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記セルロース系バイオマスが、20％超のセルロース、又は50％超のセルロース、又は70％超のセルロースを含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記セルロース系バイオマスが、前記加水分解の前に前処理に供される、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
当該前処理が亜硫酸塩処理（cooking）である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記リアクタがCSTR、すなわち連続的に攪拌されたタンクリアクタである、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
セルロースポリマーを溶解性グルコースモノマーに特異的に加水分解することができる、細胞外又は細胞膜関連酵素複合体が前記加水分解ステップで使用される、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記酵素がセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、及び/又はβ-グルコシダーゼを含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
リアクタから連続的に除かれる前記少なくとも部分的に加水分解されたセルロース系バイオマスの少なくとも一部分が、分離ステップに供され、非-加水分解固体が当該加水分解物の少なくとも一部分、すなわち、加水分解されたセルロース系バイオマス及び酵素を含む液相から少なくとも部分的に分離され、前記加水分解物は、セルロース系バイオマスと混合され、これは前記加水分解ステップに導入される、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
混合後に加水分解物の少なくとも一部分が、分離ステップにおいてセルロース系バイオマスから分離される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
加水分解用の２以上のリアクタのカスケードが使用され、
第１リアクタからの前記加水分解物の少なくとも一部、すなわち加水分解されたセルロース系バイオマス及び酵素を含む液相が固相から分離され、更なる方法に供され、
前記分離からの前記固相が次のリアクタに加えられる、請求項２〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
次のリアクタが、サイズ及び/又は体積が第１リアクタよりも小さい、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
追加の所定量の酵素が前記の次のリアクタに加えられる、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
加水分解用の３以上のリアクタのカスケード中の任意のペアの隣接リアクタのために反復される、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
次の各々のリアクタがそれぞれ先の各々のリアクタよりもサイズ及び/又は体積の点で小さい、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
リグノセルロース系バイオマスからスルホン化リグニンと共に、単糖、糖類系化学物質、生物燃料又は原料の製造法であって、少なくとも以下のステップ：
(i) リグノセルロース系バイオマスの前処理;
(ii) 前処理されたリグノセルロース系バイオマスのステップ（i）から、
(a) スルホン化リグニンの形態でリグノセルロース系バイオマスのリグニンの50％以上を含む液体「消費された亜硫酸塩溶液」相、
(b) パルプ、
への分離；
(iii) ステップ（ii）からのパルプ（b）の、単糖を含む糖類化学構造（platform）への加水分解、ここで、当該加水分解ステップは請求項２〜１９のいずれか１項記載の方法である；
；並びに
(v) ステップ（ii）からの液相（a）のスルホン化リグニンの、有用な化学物質、生体燃料及び/又はタンパク質への直接的変換又は更なる処理、
を含む、方法。
【請求項２１】
前記前処理が亜硫酸塩処理（cooking）である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記パルプが、リグノセルロース系バイオマスのセルロースの70％以上を含む、請求項２０〜２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
(iv) 有用な化学物質、生体燃料及び/又はタンパク質をもたらす、ステップ（iii）からの単糖の更なる処理、を更に含む、請求項２０〜２２のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロース系バイオマスの酵素的加水分解のための連続的方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景及び先行技術
一般的に認められているように、石油系化学物質のための及び（化石）燃料として使用される石油のための資源は、限られている。１つの現在使用されている別の資源は、バイオマスから得られた「生体燃料」である。様々なバイオマス資源が使用できる。
【０００３】
「第一世代生体燃料」は、慣用的な技術を用いて、糖類、デンプン、植物油又は動物脂肪から作られる生体燃料である。第一世代生体燃料の製造のための例示的な基本的な供給原料は、加水分解され、バイオエタノールに発酵されるデンプンを与える小麦等の種子又は穀物、あるいは、圧縮されてバイオディーゼルに変換され得る植物油を与えるヒマワリ種子である。しかしながら、これらの供給原料は、代わりに動物又はヒトの食物連鎖に入り得る。そのため、第一世代生体燃料は、ヒト食物連鎖から食物をそらし、食料不足及び価格増加をもたらすと批判されてきた。
【０００４】
これに対して、「第二世代生体燃料」は、作物が一度抽出された後に残る、幹、葉、バガス（サトウキビ繊維残渣）、殻等の現在の作物の残余非-食物（すなわち、非消化）部分、並びに、木材、一年草植物及びほとんど穀物を含まない穀物等の食物目的のために使用されない他の供給原料（非-食物作物）、木屑、皮、果実加工、ワイン処理等からのパルプなどの産業廃棄物、から成るバイオマスを用いることによって好適に生産できる。
【０００５】
第二世代生体燃料のための全体的なバイオマス変換における重要なステップは、より小さな単位への、非処理又は予備処理セルロース系バイオマスの加水分解である。当該加水分解ステップにおいて、セルロース鎖は、少なくとも１個のβ-1,4-グルコシド結合を切断する手段によって切断される。
【０００６】
より具体的には、セルロースは、β-1,4-グルコシド結合によって結合された繰返しグルカン単位の不溶性直鎖ポリマーである。水では、セルロースは、典型的には、水分子の求電子水素のグリコシド結合に対する攻撃によって加水分解される。セルロース鎖では、各グルコース単位は、隣接鎖においてモノマーとの３つの水素結合を形成する能力を有し、容易に加水分解されない安定な結晶構造を与える。加水分解反応の速度は、高い温度又は圧力の使用によって増加され、あるいは（本発明の場合のように）希もしくは濃酸又は酵素の使用によって触媒される。
【０００７】
工業的スケールでは、高い固体量を有するセルロース系バイオマスを加水分解することは、特に興味深い。従来、高い固体量を有するセルロース系バイオマスは、過剰な加水分解の回数を用いて加水分解され、通常、5〜7日間に渡り、時には、加水分解及び発酵が同時に行われる併せた設定を用いて加水分解される。
【０００８】
米国特許出願第2009/0209009号明細書は、セルロースの酵素的加水分解に関し、そして、酵素のコストが、セルロース分解のために必要とされる酵素成分の１つ、すなわちβ-グルコシダーゼ、にセルロース結合ドメインを導入することによって削減できることを開示している。これを達成するために、特定の結合剤が必要とされる。この結合剤は、簡便なリサイクルのためのセルロースに酵素を結合させる。更に、加水分解反応は、専用固体保持リアクタで行われる。そこでは、固体は、液体の保持時間よりも長い保持時間を有する。
【０００９】
国際公開第WO 2009/14067号パンフレットは、リアクタ中の高量の総懸濁固体（TSS）を扱うことができる、固体の分離及び基質の希釈を伴ったフィードバッチプロセスを記載している。
【００１０】
Brethauer, S.; Wyman, C. E.による文献、"Review: セルロースエタノール製造のための連続的加水分解及び発酵" Biores. Technol. 2010, 4862は、一般的用語でバッチ対連続的加水分解及び発酵プロセスを考察しているが、発酵を強調している。上記の利益は、高い容積生産性、より小さいリアクタ、低資本投資、及び定常状態でのコントロールの容易さに変わる、洗浄及び充填のための減少した容器停止時間を含む。紙で示したデータは、連続的発酵実験からのものである。
【００１１】
Fan, Z.L.; South, C; Lyford, K.; Munsie, J.; van Walsum, P.; Lynd, L. R.による文献、"Conversion of paper sludge to ethanol in a semi continuous solids-fed reactor" Biopro-cess Biosyst. Eng. 2003, 93は、紙汚泥がSSF（同時に起こる糖化及び発酵）を動かすリアクタに一定の間隔で供給される、準連続的リアクタを記載している。著者は、供給頻度（保持時間あたりの供給追加）を減少させることによって、セルロースローディングを減少させることができる。
【発明の概要】
【００１２】
発明の概要
本発明の改善された加水分解は、セルロースの全体的なバイオマス変換における特定の用途、すなわち、セルロース系バイオマスを有用な化学物質又は消耗品、例えば生体燃料に変換する方法、である。
【００１３】
１つの実施態様では、本発明は、セルロース系バイオマスの連続的加水分解のための方法であって、少なくとも以下のステップ：
（P）定常状態で作動され得る少なくとも１つのリアクタを準備し；
（A）前記リアクタに所定量のセルロース系バイオマスを加え、前記セルロース系バイオマスが、少なくとも15％、好ましくは少なくとも20％、好ましくは少なくとも25％、更に好ましくは少なくとも30％、更に好ましくは10％〜45％、更に好ましくは15％〜45％、更に好ましくは20％〜40％又は15％〜30％の固体量を有する、
(A') 酵素の所定量を前記リアクタに加え；
(E) 前記セルロース系バイオマスの部分的な酵素的加水分解を前記リアクタ中で行うこと、
を含む、方法に関する。
【００１４】
前記方法において、定常状態が達成され、そこでは、セルロース系バイオマスが連続的に前記リアクタに添加され、同時に、少なくとも部分的に加水分解されたセルロース系バイオマスが連続的に前記リアクタから除かれ、ここで、連続的に除かれる前記少なくとも部分的に加水分解されたセルロース系バイオマスは、攪拌機（FL 100/6W）を備えたカップ中でPhysica MCR 101レオメータで測定される、25 Pas（パスカル秒）以下、好ましくは10 Pas以下、好ましくは5 Pas以下、更に好ましくは3 Pas以下、更に好ましくは1 Pas以下の粘度を有する。
【００１５】
粘度は、標準的な条件（20℃、1バール）で測定される。当業者は、本願の実施例から前記粘度の測定方法についての更なる情報を得るだろう。
【００１６】
好ましくは、前記定常状態では、前記粘度は、長期間、例えば2時間、4時間、6時間、12時間以上に渡って、粘度について、本質的に一定であるか、あるいは本質的に上に開示された任意の値未満を維持する。
【００１７】
前記リアクタ中で定常状態を確立する目的は、比較的高い固体量を有するセルロース系バイオマスの加水分解を可能にすることである。特に環境的及び経済的な観点から、高い固体ローディング、好ましくは10％以上の総固体量（「TS」）で酵素的加水分解を行うことが望ましい。このことは水及びエネルギー消費並びに機器コストを減少させるからである。しかしながら、高い固体量のセルロース系バイオマスを加水分解するチャレンジの１つは、高い固体量を有するスラリーの高粘性を与えるような十分な混合を行うことである。慣用的に、特に、当該分野で公知のバッチ方法では、混合は、エネルギー需要及び複雑な設計機械装置を用いてのみ可能である。
【００１８】
本発明によれば、前記リアクタにおいて、定常状態での加水分解反応は行われる。そこでは、高い総固体量（好ましくは10％以上、更に好ましくは15〜40％）のセルロース系バイオマスが連続的に前記リアクタに加えられ、少なくとも部分的に加水分解されたセルロース系バイオマスは連続的に前記リアクタから除かれる。リアクタ中でセルロース系バイオマスの平均保持時間が各々の平均「液化時間」、すなわち、加水分解中に、固体スラリーをポンプで汲み上げ可能な（pumpable）液体に転換するために必要とされる時間、すなわち、スラリーの粘性を更なる処理のために許容される値まで下げるために必要とされる時間、よりも長いように、定常状態は、調整される。すなわち、加えられたセルロース系バイオマスの量、及び除かれた少なくとも部分的に加水分解されたセルロース系バイオマスの量が調整される。
【００１９】
本発明によれば、この「液化時間」は、リアクタから連続的に除かれる少なくとも部分的に加水分解されたセルロース系バイオマスの粘性によって、好適に記載される。攪拌機（FL 100/6W）を備えたカップ中でPhysica MCR 101レオメータで測定される、前記粘度は、25 Pas（パスカル秒）以下、好ましくは10 Pas（パスカル秒）以下、好ましくは5 Pas（パスカル秒）以下、更に好ましくは3 Pas（パスカル秒）以下、更に好ましくは1 Pas（パスカル秒）以下、である。
【００２０】
好ましい実施態様では、全体的なプロセスのグルコース収量が増加されるに従って、セルロース系バイオマスの連続的加水分解のプロセスは、少なくとも２つのリアクタのカスケード、すなわちステップ（P）：定常状態で作動され得る少なくとも２つのリアクタのカスケードを提供すること、で実施される。
【００２１】
好ましい実施態様では、セルロース系バイオマスの連続的加水分解の前記プロセスは、少なくとも、以下のステップ：
(P) 定常状態で作動され得る少なくとも２つのリアクタを準備し；
(A) 第１のリアクタに所定量のセルロース系バイオマスを加え、前記セルロース系バイオマスは、少なくとも10％、好ましくは少なくとも15％、好ましくは少なくとも20％、好ましくは少なくとも25％、更に好ましくは少なくとも30％、更に好ましくは10％〜45％、更に好ましくは15％〜45％、更に好ましくは20％〜40％又は15％〜30％の固体量を有する、
(A') 酵素の所定量を前記第１のリアクタに加え；
(E') 前記セルロース系バイオマスの部分的な酵素的加水分解を前記第１のリアクタ中で行い；
(T) 攪拌機（FL 100/6W）を備えたカップ中でPhysica MCR 101レオメータで測定される、25 Pas（パスカル秒）以下、好ましくは10 Pas以下、好ましくは5 Pas以下、更に好ましくは3 Pas以下、更に好ましくは1 Pas以下の粘度を有する、部分的に加水分解されたセルロース系バイオマスをステップ（E1）から連続的に除き、次いで、定常状態で作動され得る第２のリアクタにそれを移し；
(E) 前記第２のリアクタ中でステップ（E）からの部分的に加水分解されたセルロース系バイオマスに対する更なる酵素的加水分解を行うこと、
を含む。
【００２２】
上で考察した先行技術の点から、本発明の１つの目的は、セルロース系バイオマスの酵素的加水分解のプロセス、そこでは、比較的高い固体量のセルロース系バイオマスが工業的スケールの条件下で加水分解し、同時に（出資及び運転）コストを減少させることができる、を提供することである。
【００２３】
この目的（及び他の目的）は、少なくとも以下のステップを含む、セルロース系バイオマスの連続的加水分解のための以下の方法によって解決される：
(P) 定常状態で作動され得る少なくとも１つのリアクタを準備し；
(A) 前記リアクタに所定量のセルロース系バイオマスを加え、前記セルロース系バイオマスは、少なくとも10％、好ましくは少なくとも15％、好ましくは少なくとも20％、好ましくは少なくとも25％、更に好ましくは少なくとも30％、更に好ましくは10％〜45％、更に好ましくは15％〜45％、更に好ましくは20％〜40％又は15％〜30％の固体量を有する、
(A') 酵素の所定量を前記リアクタに加え；
(E) 前記セルロース系バイオマスの部分的な酵素的加水分解を前記リアクタ中で行うこと、
ここで、定常状態が達成され、そこでは、セルロース系バイオマスが前記リアクタに連続的に添加され、同時に、少なくとも部分的に加水分解されたセルロース系バイオマスが連続的に前記リアクタから除かれ、ここで、連続的に除かれる前記少なくとも部分的に加水分解されたセルロース系バイオマスは、攪拌機（FL 100/6W）を備えたカップ中でPhysica MCR 101レオメータで測定される、25 Pas（パスカル秒）以下、好ましくは10 Pas以下、好ましくは5 Pas以下、更に好ましくは3 Pas以下、更に好ましくは1 Pas以下の粘度を有する。
【００２４】
本明細書において、及び本願の全体的な記載において、用語「固体量」（当業者には「TS」又は「総固体」としても知られている）は、105℃で16時間、乾燥されたサンプル後のサンプルの重量と、前記乾燥の前の同一サンプルの重量との比を言う。
【００２５】
したがって、本明細書で使用される用語「TDS」又は「総溶解固体」は、濾過後のサンプルから得られる乾燥（105℃で16時間）濾過物の重量と、前記濾過及び乾燥の前の同一サンプルの重量との比を言う。
【００２６】
用語「TSS」又は「総懸濁固体」は、濾過後のサンプルから得られる乾燥（105℃で16時間）フィルタケーキの重量と、前記濾過及び乾燥の前の同一サンプルの重量との比を言う。したがって、これらの測定値間の関係は、TS = TDS + TSSである。
【００２７】
本発明の連続的プロセスを実施することによって、すなわち、定常状態及び定義された粘性レジメを確立する方法によって、高い初期粘性及び複雑なリアクタ設計に基づく問題が解決される。特に、本発明は、高い固体ローディングでの商業的に実行可能な酵素的加水分解を行い、同時に、リアクタ中の粘性を低く維持するという問題を解決する。本発明は、酵素のリサイクル有り又は無しの連続的プロセスとして、高い総固体量及び低総懸濁固体（「TSS」）量での酵素的加水分解を行うことを可能にする。
【００２８】
高TSSを有する問題がないので、リアクタの特定の攪拌は必要とされない。結果として、従来のCSTR（連続的攪拌タンクリアクタ）は、本発明のプロセスにおいて使用できる。そのため、好ましくは、本発明のプロセスにおいて使用される（少なくとも１つの）リアクタは、連続攪拌リアクタであり、更に好ましくは連続攪拌タンクリアクタである。
【００２９】
上記の目的（複数）を解決する更なる態様は、全体的なプロセスのグルコース収量も増加させる。そこでは、本発明のセルロース系バイオマスの連続的加水分解のためのプロセス、特に、ステップ（P）は、少なくとも２つのリアクタのカスケードで実施される。
【００３０】
リアクタの最大数に関して制限はない。カスケードで作動される（すなわち、連続して作動される）リアクタの数は、本質的には、所望のグルコース収量に依拠する。
【００３１】
本発明の好ましい局面では、全体的なプロセスに必要とされる酵素の量は、酵素がリサイクルされるリサイクルループを含む手段によって、少なくとも30％、好ましくは少なくとも40％、減少される。そこでは、（最後の）リアクタからの、加水分解物、すなわち、加水分解されたセルロース及び酵素を含む液体相は、分離ステップに供され、そこでは、非-加水分解された固体が酵素を依然として含む加水分解物から分離される。次いで、前記液状加水分解物は、非-加水分解された（「新鮮な」）セルロース系バイオマスと混合され、次いで（第１の）加水分解リアクタに導入される。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、更なるリアクタの任意の次のカスケードを有する、本発明のプロセスに従って作動された連続的リアクタを示す。
【図２】図２は、少なくとも２つのリアクタのカスケードにおけるセルロース系バイオマスの連続的酵素的加水分解であって、リアクタに加えられた酵素の少なくとも一部分はリサイクルされる、加水分解のフローチャートを示す。
【図３】図３は、少なくとも２つのリアクタのカスケードにおけるセルロース系バイオマスの連続的酵素的加水分解であって、高糖類ロードによる加水分解の阻害が、連続して体積を減少させるリアクタのカスケード中で最小限度に抑えられる、加水分解のフローチャートを示す。
【図４】図４は、定常状態での予測された最小保持時間に関する情報を与える、時間に伴う酵素的加水分解に供されたセルロース系バイオマスの粘性の拡大を示す。
【図５】図５は、本発明の実施態様に従うバイオリファイナリーの全体的な概念のフローチャートを示す。
【図６】図６は、実施例２及び３に従って３つのリアクタのカスケードにおけるセルロース系バイオマスの連続的酵素的加水分解のフローチャートを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
発明の詳細な説明
本発明は、セルロース系バイオマスの加水分解に関する。前記バイオマスがセルロースを含む以外、セルロース系バイオマスの種類又は組成に関して何ら制限はない。１つの好適な定義によれば、「バイオマス」は、環境的領域、好ましくは植物性の素材、植物、又は燃料又はエネルギー源として使用された農業廃棄物の所定の単位内で、（従来の）生物、特に有機生物の総質量である。「従来の」生物バイオマスも「セルロース系バイオマス」として含まれるという事実は、リサイクルされたセルロース原料、特にリサイクルされた綿原料及び/又はリサイクルされた紙ベースの製品もしくは他の想像できるセルロース系リサイクル原料も包含されることを伴う。リサイクルされたセルロース原料の任意の混合物、例えばリサイクルされた紙製品も、任意の他の種類のセルロース系バイオマスと共に含まれる。
【００３４】
好ましい態様によれば、前記セルロース系バイオマスは、セルロースの30％超（質量全体を基準に、重量％）、好ましくは50％超セルロース、好ましくは70％超セルロースを含む。本明細書では、用語「セルロース」は、用語「ヘミセルロース」も含む。本発明の好ましいセルロース系バイオマスは、綿、綿糸屑及びリグノセルロース系バイオマス、すなわち、リグニン成分及びセルロース及び/又はヘミセルロース成分の両方を含むバイオマスを含む。
【００３５】
本発明のプロセスに特に適している好ましいセルロース系バイオマスは、エネルギー作物、一年草植物、農業残渣及び木材に基づく。
【００３６】
商業的エネルギー作物は、典型的には、好ましくは食物としての価値がないか又は制限されている、密集して植えられた高い収量の作物種である。例えば、サリックス（Salix）、ミスカンサズ（Miscanthus）、ウィロウ（Willow）又はポプラ（Poplar）等の木材作物は、好ましいエネルギー作物である。
【００３７】
一年草植物の好ましい例は、麦わら、サトウキビ及びキャッサバである。
【００３８】
農業残渣は、食物、食餌又は繊維、例えば使用済みの動物床敷き及びフェザーを製造する一次的目的のために使用されない耕作に適した作物の一部を含む。これらの残渣は、サトウキビ及びトウモロコシの茎由来のバガスによって例示される。
【００３９】
特に好ましいサトウキビの出発物質は、バガス、糖類及び麦わらに分けられる。バガスは、セルロース、ヘキセルロース、リグニン、抽出物、無機塩及び他の有機物質、例えばタンパク質及び有機酸から成る繊維性材料である。
【００４０】
バガス及び硬材は多くの類似性を有する、すなわち、柔材と比較して、高いキシラン量、短い繊維長、及び低いリグニン及びセルロース量を有する。しかしながら、バガスは、僅かに高い灰分を有する。灰分は、植物形態学及び収穫法の差によって説明できる。バガスの短繊維長は、主にその高いピッチ量（約30％）に因る。
【００４１】
概して、機械的サイズの減少が必要とされ、より高い加水分解収量が得られるという事実に基づいて、セルロース系バイオマスとしての、非-木材農業残渣、特にバガスを用いて、本願発明の方法を行うことが特に好ましい。
【００４２】
木材はまた、本方法には好適な材料である。本方法では、全ての種類の木材が好適である。
【００４３】
本方法によれば、セルロース系バイオマスパルプは、酵素的に加水分解される。セルロースは、β-1,4-グルコシド結合によって結合された繰返しグルカン単位の不溶性直鎖ポリマーである。水中では、セルロースは、グリコシド結合に対する水分子の求電子的水素の攻撃によって加水分解される。セルロース鎖では、各々のグルコース単位は、隣接鎖中のモノマーとの３つの水素結合を形成する能力を有し、これは、容易に加水分解されない安定な結晶構造をもたらす。加水分解反応の速度は、高い温度及び圧力の使用によって増加でき、あるいは希もしくは濃酸又は酵素、好ましくは本願のように酵素によって、触媒化することができる。
【００４４】
本発明の好ましい態様によれば、セルロースポリマーを溶解性グルコースモノマーに特異的に加水分解することができる細胞外又は細胞-膜関連酵素複合体（セルラーゼ）が、加水分解ステップで使用される。セルラーゼは、エキソ-及びエンド-セルラーゼ（グルカナーゼ）及びβ-グルコシダーゼ（セロビアーゼ）に分割される異なった特定の活性を有する相乗的酵素から成る複数のタンパク質複合体である。加えて、セルビオースバイオマスの他の主な成分を分解することができる、酵素（ヘミセルラーゼ、ラッカーゼ、リグニン分解ペルオキシダーゼ等）がある。すべてのこれらの酵素及びその任意の組合せは、本発明の酵素的加水分解に使用できる好ましい酵素である。
【００４５】
セロビオースは、公知の、グルカナーゼの最終生成物阻害剤であり、β-グルコシダーゼは、セロビオースをグルコースに変換することによってこの阻害を軽減することが知られている（速度限定ステップ）。工業的方法、すなわち酵母によるエタノール発酵では、セルロース糖化効率は、同時に起こる糖化及び発酵（SSF）によって改善され得る。SSFに対する最大のチャレンジは、一般的な加水分解酵素及び発酵生物の最適な異なった温度に関する。最終生成物阻害に加えて、リグニンは、セルラーゼに非特異的に結合することによって酵素能力を減ずることが知られている。
【００４６】
セルロース系バイオマスが加水分解の前の少なくとも１種の予備処理に供されることが好ましい。その処理では、セルロース系バイオマスの少なくとも一部のリグニンを水溶性形態にさせ、それによって、それを、本発明の加水分解ステップに非常に適したものにする。
【００４７】
したがって、好ましい態様によれば、セルロースの予備処理は、セルロースの特定の表面積を増加するために行われる。正確な予備処理は、より利用し易い基質によって、及び可能性のある阻害物質を除くことによって、酵素加水分解速度を増加する利益を有する。
【００４８】
本発明のプロセスは、セルロース材料の全ての種類に適用可能であるが、当該材料は、加水分解ステップに先立つ分離ステップで予備処理されることが好ましい。前記予備処理は、酵素的加水分解の効率を増加させることがわかった。
【００４９】
前記予備処理は、機械的又は化学的、好ましくは化学的である。機械的（予備）処理において、例えばバイオマスをより小さな粒子に分割、切断又は砕く手段によって、モーメント又はエネルギーがセルロース系バイオマスに移される。そこでは、化学試薬は加えられず、材料の成分の化学構造は本質的に影響されない。
【００５０】
化学的（予備）処理では、少なくとも１つの化学試薬が加えられ、バイオマス中の成分の少なくとも１つの成分の化学構造が改変される。以下でより詳細に議論するように、「亜硫酸塩処理（cooking）」は、化学的予備処理であり、実際に好ましい予備処理である。
【００５１】
好ましい態様では、セルロース系バイオマスは、機械的（予備）処理を必要とせず、亜硫酸塩処理が（予備）処理のみである本方法、特にリグノセルロース系バイオマスで使用される。亜硫酸塩処理は、４つの主な群：酸、亜硫酸水素塩、弱アルカリ及びアルカリ亜硫酸塩でのパルプ化、に分かれることがある。
【００５２】
本発明の好ましい予備処理では、セルロース系バイオマスは、亜硫酸塩、好ましくは亜硫酸ナトリウム、カルシウム、アンモニウム又はマグネシウムで、酸性、中性又は塩基性条件下で処理される。この予備処理ステップは、ヘミセルロースの一部と一緒に、スルホン化リグニン（リグノスルホン酸）としてのリグニンのほとんどを溶解する。
【００５３】
驚くべきことに、本方法では、発酵性糖からの燃料又は化学物質の製造における予備処理ステップとして亜硫酸塩処理の使用は、化学物質のより高い全体的な収量をもたらすので、非常に効率的であることがわかった。本質的に、任意の他の公知の糖化学プラットフォームバイオリファイナリー技術においてよりも、有用な化学物質のより高い生産量（>80％）が達成される。
【００５４】
１ステップ予備処理から得られるセルロースパルプが、特にリグニンにおいて、特に不純度の点で低いという事実は、加水分解用の酵素を開発又は適合させ易くする。
【００５５】
亜硫酸塩処理は、好ましくは、以下の態様の１つにしたがって行われる。本明細書及び本開示において、「亜硫酸塩予備処理」は、「処理（cook）」とも呼ばれる：
酸性処理（好ましくは水酸化物と共に、更に好ましくはCa(OH)2、NaOH、NH4OH又はMg(OH)2S02と共に、S02）、
亜硫酸水素塩処理（好ましくは水酸化物と共に、更に好ましくはNaOH、NH4OH又はMg(OH)2）と共に、S02）、
弱アルカリ処理（好ましくは、Na2S03、更に好ましくはNa2C03と共に)、及び
アルカリ処理（好ましくは水酸化物と共に、更に好ましくはNaOHと共に、Na2S03)。
【００５６】
本発明の酵素的加水分解の前に行われる好ましい予備処理である、亜硫酸塩処理ステップ（亜硫酸塩処理）に関して、2009年12月16日に出願された"リグノセルロース系バイオマス変換"との標題の国際公開第WO 2010/078930号の各々の開示は、本開示に参考として組み込まれている。
【００５７】
本発明は、リグノセルロース系バイオマス由来のスルホン化リグニンと一緒に、単糖、糖系化学物質、生体燃料又は原料の総合的な製造方法であって、少なくとも以下のステップ：
(i) 好ましくは亜硫酸塩処理ステップにおけるリグノセルロース系バイオマスの予備処理；
(ii) 予備処理されたリグノセルロース系バイオマスの、ステップ（i）から、
(a) 好ましくはスルホン化リグニンの形態でリグノセルロース系バイオマスのリグニンの50％以上を含む、液状「消費された亜硫酸塩リカー」相、及び
(b) 好ましくはリグノセルロース系バイオマスのセルロースの70％以上を含む、パルプ
への分離;
(iii) ステップ（ii）から、単糖を含む糖化学プラットホームへの、パルプ（b）の加水分解；前記加水分解ステップは、上記のリグノセルロース系バイオマスの連続的加水分解の方法である、
(iv) 場合により、有用な化学物質、生体燃料及び/又はタンパク質を生じる、ステップ（iii）からの単糖の更なる処理；並びに
(v) 有用な化学物質、生体燃料及び/又は原料へのステップ（ii）から液相（a）のスルホン化リグニンの、直接的変換又は更なる処理、
を含む、方法にも関する。
【００５８】
この全体的な方法は、図５に図示する。前記方法ンステップ（iv）は、バイオマスタンパク質を製造するための、単糖、特にヘキソース及びペントースのエタノール又は他の糖系化学物質への発酵に関する。
【００５９】
発酵は、糖放出エネルギーを下げる微生物を含み、同時に、本方法は、アルコール又は酸のような生成物をもたらす。サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）（パン酵母）は、ヘキソースをエタノールに発酵するために最も頻繁に使用される。1モルのグルコースは、2モルのエタノール及び2モルの二酸化炭素を化学量論的に与えるだろう。バガスパルプは、相当大量のペントースを含む。これらの糖類も、発酵又は代謝されて、バイオマスタンパク質を生成する。
【００６０】
上記の単糖の総合的な製造方法を参考に又は参考にせずに、本発明は、上記のセルロース系バイオマスの加水分解に関する。前記加水分解に関して、以下の態様が好ましい。好ましい態様では、本発明の連続的プロセスでは、液状及び固体成分のスラリー全体は、同一の速度でリアクタを移動する、すなわち、非加水分解繊維固体及びスラリーの水相は、前記リアクタ中で、同一の時間間隔、維持される。第１の態様によれば、図１に例示するように、基質、すなわちセルロース系バイオマスはリアクタに供給され、酵素が加えられる。本プロセスは、連続的、すなわち定常状態で運転される。前記リアクタ中で、基質、すなわちセルロース系バイオマスは加水分解される。本発明に従って作動されるリアクタ中の、25% TS（10% TSS及び15% TDSから成る）を有する部分的に加水分解されたセルロース系バイオマスの粘性は、16時間の反応後の対応するバッチ実験での粘性によって概算できる。
【００６１】
CSTR（連続的攪拌タンクリアクタ）が好ましいが、本プロセスを実施するために必要とされるリアクタに関して制限はない。
【００６２】
好ましい態様によれば、図１に示すように、リアクタのカスケードは、グルコース収量を改善するために提供される。更なるリアクタ（上記の第１のリアクタの次に来る）において、基質は、更に加水分解され、このことは高い糖濃度（= 高い総溶解固体、「TDS」）を有する加水分解物及び加水分解されない原料（リグニン、無機材料等）から成る固体残渣をもたらす。
【００６３】
リアクタが高固体量、例えば25% TSを有する基質で供給されるとしても、リアクタ中の総懸濁量（「TSS」）は、定常状態で約10％にすぎない（48時間の総反応時間を有するシリーズでの３つのリアクタと推定すると、各リアクタでは１６時間である）。本発明の定常状態リアクタ中の25% TS（10% TSS及び15% TDSから成る）の溶液の粘性は、16時間以下の反応時間後のバッチリアクタ中の粘性に相当する。加水分解リアクタに添加されたセルロース系バイオマスのためのリアクタ中の平均保持時間は、良好な攪拌を有するバッチリアクタ中の液化のために必要とされる時間よりも、好ましくは、いくらか長いはずである。
したがって、第１リアクタの平均保持時間は、スラリーの汲み上げのために十分な液化が達成されるように選択されるべきである。
【００６４】
第２の態様によれば、酵素コストは、酵素リサイクルを採用することによって削減される。本プロセスを図２に図示する。本発明の好ましい局面では、プロセス全体に必要とされる酵素の量は、酵素がリサイクルされるリサイクルループを含む手段によって、少なくとも30％、好ましくは少なくとも40％減少される。
【００６５】
好ましい態様によれば、加水分解物、すなわち、（最後の）リアクタ由来の加水分解されたセルロース及び酵素を含む液相は、分離ステップに供される。そこでは、非-加水分解固体が加水分解物を依然として含む酵素から少なくとも部分的に分離される。前記液状加水分解物は、次いで、非-加水分解（「新鮮な」）セルロース系バイオマスと混合され、次いで、加水分解用リアクタに導入される。
【００６６】
このことは図２に示す。図２では、３つの加水分解リアクタのカスケードのうちの加水分解タンク３の後、加水分解物（酵素を含む）は、非-加水分解固体残渣から分離される。前記加水分解物は、混合タンクによってシステムにリサイクルされる（図２の最左タンク）。前記の混合タンクにおいて、一部（残りの）加水分解が起こるが、前記リアクタは、酵素を含むリサイクルされた加水分解物を添加されたセルロース系バイオマス（「基質」）と混合することを主に意味する。前記の専用混合タンクの後の任意の分離ステップにおいて、加水分解物の一部、特に糖類の最終生成物の一部は、更なる処理のために分離されてよい。
【００６７】
したがって、好ましい態様によれば、リアクタ、好ましくは２以上のリアクタのカスケードの最後のリアクタから連続的に除かれる、少なくとも部分的に加水分解されたセルロース系バイオマスの少なくとも一部は、分離ステップに供される。そこでは、非-加水分解固体は、加水分解物、すなわち加水分解されたセルロース系バイオマス及び酵素を含む液相、から分離された少なくとも部分的に分離され、次いで、前記液状加水分解物は、好ましくは専用リアクタ又はタンク中でセルロース系バイオマスと混合され、これは、次いで、本発明のプロセスに導入される。
【００６８】
この処理溶液に関する更なる利点は、（第１の）反応タンクの前に、（非加水分解材料の分離後の）加水分解物/糖溶液が基質と混合されることである。このことは、（パルプ中の液相の置換に起因して）、必要とされる酵素の量を劇的に、少なくとも40％、減少するだろう。
【００６９】
加水分解物（非加水分解固体の分離後）を遊離の基質（すなわち、セルロース系バイオマス）と混合することによって、糖類結合部分を有する酵素は、第１の加水分解リアクタに供給する前に、基質（セルロース）に結合することがある。このことは、上記の40％の減少に加えて、酵素消費の更なる減少を可能にするだろう。
【００７０】
更なる好ましい態様にしたがって、非常に高い（高TDS）である糖含量に基づく加水分解阻害が取り組まれる。そこでは、加水分解の任意の可能性のある誘導された阻害は、好ましくは、糖類の連続的な分離によって解消される。
【００７１】
図３で説明されるこの好ましい態様によれば、懸濁固体は、加水分解反応が起こる第１のリアクタ後の液体から分離される。
【００７２】
典型的には、セルロース/ヘミセルロースの単糖への約60％変換は、本発明の定常状態で作動される加水分解リアクタで達成される。次いで、非-加水分解繊維の残りの40％は、第２のリアクタに移される。糖類結合部分を有する酵素は非-加水分解繊維に結合することになると予想される。更に、繊維中に混入された液体中に溶解された酵素も、第２のリアクタに移されることになる。第１のリアクタから回収される酵素に加えて、少量の酵素は、好ましくは第２のリアクタに添加される。
【００７３】
好ましくは、第２の加水分解リアクタのサイズは、第１のリアクタと同一又は少なくとも同様のTSSを達成するように、非加水分解繊維の量に適合するようにスケールダウンされる。
【００７４】
プロセス全体は、次いで比例的にスケールダインされる、任意の次の加水分解リアクタについて、同一の方法で繰り返される。概して、この好ましい態様にしたがって、本発明のプロセスにおいて、加水分解のための２以上のリアクタのカスケードが使用され、そこでは、加水分解物の少なくとも一部、すなわち第１のリアクタからの加水分解されたセルロース系バイオマス及び酵素を含む液相は、固相から分離され、任意の次のリアクタでの更なる処理に供され、前記固相は、好ましくは第１のリアクタよりもサイズ及び/又は体積が小さい、次のリアクタに添加され、酵素の更なる所定量が前記次のリアクタに添加されてよい。
【実施例】
【００７５】
明細書全体にも適用される以下の約束事は、実施例に当てはまる：
温度は℃で示す
％は、他の事項を特定しない限り、重量％をいう
グルコース等量 = 基質中のセルロースから得られるグルコース量
キシロース等量 = 基質中のキシランから得られるキシロース量。
【００７６】
実施例１
第１のリアクタのおおよその平均保持時間を決定するために、国際公開第WO 2010/078930号の実施例１に記載の条件と同様に調製されたアルカリ亜硫酸塩処理バガス基質の１つのサンプルを加水分解した。当該加水分解は、攪拌機（FL 100/6W）を備えたカップ中でPhysica MCR 101レオメータ中で行った。回転速度は30 rpmであり、温度は50℃であった。セルロース系バイオマス濃度は10％であり、酵素添加は40％ V/wのAccellerase Duet (Genencor, CA, USA) であった。粘性は連続的にモニターし、時間の関数としての粘性は図４に示す。
【００７７】
加水分解は、粘性の初期の急速な減少をもたらし、短時間後に、粘性曲線はフラットになり、サンプルが液体又は液体様に見えるレベルまで到達した。この粘性は基質（本実施例ではセルロース系バイオマス）及び実験条件に依拠するが、加水分解された原料は、粘性が3 Pas（パスカル秒）未満、すなわち3,000センチポイズ未満である時に液化されると考えられる。
【００７８】
（第１）リアクタの最小平均保持時間は、次に、基質、基質濃度、及び酵素の量及び種類等の数個のパラメータに依拠する、液化のための時間によって決定される。
【００７９】
実施例２
国際公開第WO 2010/078930号の実施例２に記載されたものと同じ条件下で調製した、亜硫酸水素塩処理されたバガス基質のサンプル（バガスパルプ）を、図６に記載のシリーズの３つのリアクタを備えた実験装置中での連続的加水分解に供した。この装置の総体積を約6.6リッルと測定した。リアクタを静置し、温度コントロールのために水浴に接続し、リアクタからの蒸発を最小限に抑えるために蓋をして冷却水を循環させた。
【００８０】
酵素（Genencor, CA, USA製のAccellerase DUET）、バッファ（酢酸ナトリウムバッファ, 定常状態でのリアクタ中で50 mM濃度）及びバガスパルプを、連続的にリアクタ１に加えた。リアクタ１〜３中で50℃に反応温度を維持した。約5℃に水冷した生成物タンク中で加水分解物を回収した。
【００８１】
装置への平均総投入（input）は144.2 g/hであった。投入物中の平均乾燥基質濃度は17.1 %であり、平均酵素ロードは0.273 g Accellerase DUET/g 乾燥基質であった。平均加水分解（保持）時間は、反応混合物密度を1.0 g/ mlと推定して、46時間と計算した。
【００８２】
装置から生成物タンクまでの生産（output）を定期的に秤量した。生産は装置への投入よりも平均5.1%低かった。この損失の主な理由は、３つのリアクタからの水の蒸発及び/又は当該リアクタ中の原料の蓄積であると推定される。グルコース及びキシロース収量を測定するために、１日に２回、３つのリアクタのすべてからサンプルを採取した。４〜５日後に、３つのリアクタ中のグルコース及びキシロース値が安定化した、これは定常状態条件に到達したことを示している。グルコース収量は、（グルコース生産/h）/（グルコース当量投入/h）として計算した。定常状態での３日間の平均値として計算した３つのリアクタ中のグルコース収量は、24.6%（(リアクタ１)、40.2%（リアクタ２）及び49.6%（リアクタ３）であった。キシロース収量は、（キシロース生産/h）/（キシロース当量投入/h）として計算した。定常状態での３日間の平均値として計算した３つのリアクタ中のキシロース収量は、33.7%（リアクタ１)、56.0%（リアクタ２）及び66.0%（リアクタ３）であった。粘性は、攪拌機（FL 100/6W）を備えたカップ中でPhysica MCR 101レオメータを用いて測定し、回転速度は1 rpmであり、温度は50℃であった。定常状態でのリアクタ１の粘性の平均値は、82.2 Pasと測定された投入（17.1 %の基質懸濁液）の粘性に比べて、1.7 Pas（パスカル秒）であった。
【００８３】
本実施例は、定常状態での高い固体ロードでの連続的加水分解プロセスが、従来の攪拌のみを用いて、非常に高いグルコース及びキシロース収量で、加水分解物を生成することを示している。第１のリアクタ中の粘性は、定常状態での供給の粘性よりも実質的に（substancially）低かった。
【００８４】
実施例３
国際公開第WO 2010/078930号の実施例１に記載の条件と同じ条件下で調製したアルカリ亜硫酸塩処理バガス基質（バガスパルプ）のサンプルを、図６に示すシリーズの３つのリアクタを備えた実験装置中での加水分解に供した。装置の総体積は、約6.6リットルと測定した。リアクタを静置し、温度コントロールのための水浴に接続し、リアクタからの蒸発を最小限度に抑えるために蓋をして冷却水を循環させた。
【００８５】
酵素（Genencor, CA, USA製のAccellerase DUET）、バッファ（酢酸ナトリウムバッファ, 定常状態でのリアクタ中で50 mM濃度）及びバガスパルプを、連続的にリアクタ１に加えた。リアクタ１〜３中で50℃に反応温度を維持した。約5℃に水冷した生成物タンク中で加水分解物を回収した。
【００８６】
装置への平均総投入（input）は144.1 g/hであった。投入中の平均乾燥基質濃度は18.8 %であり、平均酵素ロードは0.173 g Accellerase DUET/g 乾燥基質であった。平均加水分解（保持）時間は、反応混合物密度を1.0 g/ mlと推定して、46時間と計算した。
【００８７】
装置から生成物タンクまでの生産を定期的に秤量した。生産は装置への投入よりも平均1 %低かった。この損失の主な理由は、３つのリアクタからの水の蒸発及び/又は当該リアクタ中の原料の蓄積であると推定される。グルコース及びキシロース収量を測定するために、１日に２回、３つのリアクタのすべてからサンプルを採取した。４〜５日後に、３つのリアクタ中のグルコース及びキシロース値が安定化した、これは定常状態条件に到達したことを示している。グルコース収量は、（グルコース生産/h）/（グルコース当量投入/h）として計算した。定常状態での３日間の平均値として計算した３つのリアクタ中のグルコース収量は、39.8%（(リアクタ１)、55.0%（リアクタ２）及び58.8%（リアクタ３）であった。キシロース収量は、（キシロース生産/h）/（キシロース当量投入/h）として計算した。定常状態での３日間の平均値として計算した３つのリアクタ中のキシロース収量は、75.0%（リアクタ１)、93.2%（リアクタ２）及び89.6%（リアクタ３）であった。粘性は、攪拌機（FL 100/6W）を備えたカップ中でPhysica MCR 101レオメータを用いて測定し、回転速度は30 rpmであり、温度は50℃であった。定常状態でのリアクタ１の粘性の平均値は、249 Pasと測定された模倣投入物の粘性（非常に高い粘性のために、18.8%の基質懸濁液の代わりの10 %の基質懸濁液を使用しなければならなかった）に比べて、1.5 Pas（パスカル秒）であった。
【００８８】
本実施例は、定常状態での高い固体ロードでの異なった基質に基づく連続的加水分解プロセスが、従来の攪拌のみを用いて、非常に高いグルコース及びキシロース収量で、加水分解物を生成することを示している。第１のリアクタ中の粘性は、定常状態での供給の粘性よりも実質的に低かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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