(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エクソンの５０塩基対上流〜２０塩基対下流に含まれる配列中に局在している変異によって引き起こされるエクソンのスキッピングを是正できる改変ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ分子であって、野生型ヒトＵ１ｓｎＲＮＡの５’領域の一本鎖ヌクレオチド配列の部分が、エクソンスキッピングを誘発する変異が有る治療対象となる標的遺伝子から転写されるｍＲＮＡ前駆体上の標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズできる一本鎖結合ヌクレオチド配列により置きかえられており、それがエクソンの５０塩基対上流〜２０塩基対下流に含まれる配列中の変異からなる群から選択され、標的配列がエクソン／イントロン接合部位の２〜５０塩基対下流に含まれる標的遺伝子のｍＲＮＡ前駆体の領域中に位置しており、その前駆体のスプライシングが前記変異の影響を受けていることを特徴とする改変ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ分子。
【請求項２】
前記結合ヌクレオチド配列により置きかえられている前記５’領域の前記部分が、長さ９〜２０ヌクレオチドである、請求項１に記載の改変ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ分子。
【請求項３】
治療対象となる前記標的遺伝子が凝固第ＩＸ因子遺伝子、ＳＭＮ２遺伝子またはＣＦＴＲ遺伝子である、請求項１または２に記載の改変ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ分子。
【請求項４】
前記結合ヌクレオチド配列が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の改変ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ分子。
【請求項５】
エクソンスキッピングによって引き起こされるかまたはそれと関連した遺伝的疾患の治療的処置において使用するための、請求項１〜４のいずれかに記載の改変ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ分子。
【請求項６】
前記疾患が、嚢胞性線維症、血友病Ｂまたは脊髄性筋萎縮症である、請求項５に記載の改変ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ分子。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載の改変ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ分子をコードしている単離された遺伝子。
【請求項８】
プロモーター配列およびポリアデニル化シグナル配列を含む、請求項７に記載の単離された遺伝子。
【請求項９】
前記プロモーターが、ヒトＵ１ｓｎＲＮＡをコードしている前記遺伝子の内在性プロモーターである、請求項８に記載の単離された遺伝子。
【請求項１０】
エクソンスキッピングによって引き起こされる遺伝的疾患の治療的処置において使用するための、請求項７〜９のいずれかに記載の単離された遺伝子。
【請求項１１】
前記疾患が、嚢胞性線維症、血友病Ｂまたは脊髄性筋萎縮症である、請求項１０に記載の単離された遺伝子。
【請求項１２】
請求項７〜９のいずれかに記載の単離された遺伝子を含む発現ベクター。
【請求項１３】
アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項１２に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
エクソンスキッピングによって引き起こされるかまたはそれに関連した遺伝的疾患の治療的処置において使用するための、請求項１３または１４に記載の発現ベクター。
【請求項１５】
前記疾患が、嚢胞性線維症、血友病Ｂまたは脊髄性筋萎縮症である、請求項１４に記載の発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１〜４のいずれかに記載の改変ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ分子、または請求項７〜９のいずれかに記載の単離された遺伝子、または請求項１２もしくは１３に記載の発現ベクター、および医薬として許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項１７】
エクソンスキッピングを誘発する変異が有る治療対象となる標的遺伝子の正しいスプライシングを培養細胞において回復するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、前記培養細胞に請求項１２または１３に記載の発現ベクターをトランスフェクトすることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【本発明】
【０００１】
本発明は、改変ヒトｓｎＲＮＡ分子（以下エクソン特異的Ｕ１−ＥｘＳｐｅＵ１と呼ぶ）に関わり、これらは遺伝子治療の方法において使用されるのに適切である。具体的には、本発明は、遺伝的変異によって引き起こされ、しばしば非常に重篤な、異なる病歴を有するヒト疾患に関係した異常スプライシング過程を是正できるｓｎＲＮＡ分子に関する。
【０００２】
ヒト遺伝的疾患の多く（約１５％）は、メッセンジャーＲＮＡの正しい細胞内成熟が妨害されることにより、それに続く正確なタンパク質生合成が損なわれ、機能しないタンパク質の合成が誘発されるという遺伝的変異によって引き起こされる。ほとんどの場合、スプライシング不良の主な原因となる点変異は、一次転写産物のプロセシングのために定められた機構による一次転写産物の認識にとって重要な遺伝子配列に関わっている。エクソン−イントロン境界に位置しているドナーおよびアクセプター部位ならびにエクソンまたはイントロン中の遺伝子特異的調節エレメント（Ｃａｒｔｅｇｎｉ  Ｌら、２００２；Ｐａｇａｎｉら、２００４）は、最重要配列の一つである。これら変異の結果として、成熟した転写産物からの１つのエクソンの除去（いわゆるエクソンスキッピング）に最も頻繁に関わる、様々な分子的事象が誘発され得る。
【０００３】
メッセンジャーＲＮＡのプロセシングにおける分子変化（たとえばエクソンスキッピングを含む）は、様々なヒト疾患（中でも血友病Ｂ、嚢胞性線維症および脊髄性筋萎縮症）の主要な疾病原因の機序を表すことが長い間知られており、それらは臨床経過の重篤性で共通している。異なる種類の変異、具体的にはドナー部位（または５’スプライシング部位）中の変異、アクセプター部位（３’スプライシング部位）中の変異またはエクソン変異はエクソンスキッピングを誘発し得る。エクソンスキッピングを誘発する異なる種類の変異の例として、以下にヒト疾患の３つのモデルについて記載されている。
【０００４】
凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）中の不良は血友病Ｂの発症の原因となり、疾患は、時には非常に重篤であり障害性である様々な程度の出血症状を伴う。いくつかの症例において、疾患はスプライシング不良によって引き起こされる。具体的には、スプライシング過程の間のｍＲＮＡからのエクソン５の除去は、第ＩＸ因子遺伝子（Ｆ９）のエクソン５ドナー部位内の−２位における変異とアクセプター部位中のポリピリミジン配列内の−８および−９位における変異との両方によって引き起こされる。
【０００５】
組換え外来ＦＩＸまたは血漿から直接得られるＦＩＸの頻繁な点滴に主に基づく現在の血友病Ｂ療法の制約は、より高い効力および持続効果を特徴とする代替手法を開発する必要性を際立たせている。
【０００６】
嚢胞性線維症（ＣＦ）は、白色人種集団において最も頻繁な致死的な先天性遺伝病である：生きて生まれてきた乳児２５００〜２７００人に１人の新生児がその影響を受けている。
【０００７】
この疾患の病因は、上皮細胞の頂端膜中に局在しており水電解質交換を調節する機能を有するＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子）と呼ばれるタンパク質の異常による。
【０００８】
ＣＦＴＲ改変の結果として、細胞膜を通しての塩の移動が損なわれて、「脱水状態」と定義され得る分泌物（ナトリウムおよび塩素が非常に豊富な汗ならびに脈管を塞ぎがちな高密度で粘稠性の粘液）の生成が主に引き起こされて、様々な器官および系の機能が損なわれる。いくつもの研究の過程で、ＣＦＴＲ遺伝子配列中の多くの改変が嚢胞性線維症と関連していると確認されており、それらはエクソンスキッピングを誘発する。具体的には、エクソン１２のスキッピングは、エクソン自体のスプライシングドナー部位内に局在している変異とエクソン変異との両方によって引き起こされる。
【０００９】
脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ、ＯＭＩＭ  ２５３３００、２５３５５０および２５３４００）は、脊髄α運動ニューロンの変性を特徴とする劣性常染色体神経筋疾患であり、有病率は１／１０，０００出生人と推定されている。ＳＭＡは、出生時から危機的な筋緊張低下および筋力低下を伴う極めて重篤なものから、後の幼年期または青年期に発症する軽症型にまで及ぶ臨床的症候群と関連している。現在まで、病歴の重篤性に応じた年齢で一般に死に至るこの疾患の処置はまだ特定されていない。
【００１０】
症例の９５％において、疾患はＳＭＮ１遺伝子の欠損によって引き起こされる。ヒトゲノムには、ＳＭＮ２と称されるＳＭＮ１と相同な遺伝子がある。しかし、ＳＭＮ２の発現は、メッセンジャーＲＮＡの異常成熟、その結果であるエクソン７のスキッピングおよび遺伝子自体の不活化をもたらすエクソン中の同義変異によって損なわれている。したがってエクソン７を含有するＳＭＮ２転写産物の数を高めるように設計された手法により、ＳＭＡの潜在的に有効な処置に対して大きな意味を有するＳＭＮ２の正しい発現により、ＳＭＮ１遺伝子の欠損に対する補償療法を適用できるようになる。
【００１１】
スプライシング過程の間に、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）は、ｍＲＮＡの全成熟過程を仲介するよう定められた細胞機構であるスプライセオソームの重要な構成部分として中心的な役割を果たしている。具体的には、長さ１６４リボヌクレオチドの低分子Ｕ１ＲＮＡ（Ｕ１ｓｎＲＮＡ）は、ヒトゲノム内に数コピー存在する遺伝子にコードされており、核粒子Ｕ１ｓｎＲＮＰのリボ核酸構成部分を表す。Ｕ１ｓｎＲＮＡ分子は、ステムループ三次元構造を有し、相補的な塩基対合によってｍＲＮＡ前駆体分子上のスプライシングドナー部位に結合できる通常は長さ９ヌクレオチドの一本鎖配列を５’領域内に含む（Ｈｏｒｏｗｉｔｚら、１９９４）。図１は、野生型Ｕ１ｓｎＲＮＡ構造の概略図を示している。スプライシングドナー部位を認識できる５’領域中の配列が、真核生物遺伝子の一次転写産物中のスプライシングドナー部位の共通配列と対合されて示されている。そのような配列は、様々な保存度を呈し、エクソン／イントロン接合部に位置している。Ｕ１ｓｎＲＮＡ５’領域によって仲介される認識は、一次転写産物上のエクソン／イントロン接合部を明確にし、スプライセオソーム複合体を正しく組み立てるために重要である。
【００１２】
ｍＲＮＡ前駆体のスプライシング不良と関連したヒト遺伝的疾患の数の増加および同疾患の臨床経過の頻繁な重篤性により、分子レベルでスプライシング不良を是正することを目指した治療用分子の研究がここ数年で促された。
【００１３】
５’ｓｓ部位に位置している変異の場合に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでエクソンの正しい包含を誘発し、凝固第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡの正しいスプライシングを回復できる改変Ｕ１ｓｎＲＮＡ分子の使用について、Ｐｉｎｏｔｔｉ  Ｍら、２００８およびＰｉｎｏｔｔｉ  Ｍら、２００９に記載されている。示された機序は、改変Ｕ１ｓｎＲＮＡが５’変異したスプライシング部位を直接的に認識しその上に結合することに基づいている。しかし、５’ｓｓ部位が相対的に保存されており、その結果として他の機能的な野生型遺伝子から作製された転写産物の成熟に干渉する恐れがあるため、この方法は治療用ｓｎＲＮＡ分子の標的遺伝子に対する作用に、ある程度の非特異性を提示する。さらに、それは５’ｓｓ中の各変異に対して改変されたＵ１ｓｎＲＮＡを使用する必要がある。
【００１４】
本発明は、５’スプライシング部位（および本明細書においてエクソン特異的Ｕ１、ＥｘＳｐｅＵ１と定義されている）の下流のイントロン配列と相補的な改変Ｕ１ｓｎＲＮＡ分子が、異なる種類の変異によって損なわれたエクソンの包含を、スプライシング過程の間に回復できることを実証している。治療対象となる３つの異なるヒト遺伝的疾患モデル（脊髄性筋萎縮症、血友病および嚢胞性線維症）において、本発明は、単一のＥｘＳｐｅＵ１またはＥｘＳｐｅＵ１の群が各疾患モデルに対応するエクソンの包含を誘発できることを実証している。単一のＥｘＳｐｅＵ１またはＥｘＳｐｅＵ１の群は、ドナー部位中の変異、アクセプター部位のポリピリミジン領域中の変異および調節エクソン配列中の変異によって引き起こされるエクソンスキッピングを是正する。ＥｘＳｐｅＵ１で得られる是正の有効性は、先行技術に記載されているそれと同じであるが、治療対象となる標的遺伝子転写産物に対する作用のより高い選択性を保証し得る。ＥｘＳｐｅＵ１手法によって、エクソンスキッピングを引き起こす異なる遺伝子変異のパネルを是正するために、単一の改変Ｕ１−ｓｎＲＮＡを使用できるようになる。
【００１５】
これらおよび他の目的は、請求項１に記載の改変ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ分子によって達成される。改変ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ分子は、野生型ヒトＵ１ｓｎＲＮＡの５’領域中の一本鎖ヌクレオチド配列の部分が、異常スプライシングを誘発する変異が有る治療対象となる標的遺伝子の一次転写産物上の標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズできる結合一本鎖ヌクレオチド配列により置きかえられていることを特徴とする。Ｕ１ｓｎＲＮＡ分子の標的ヌクレオチド配列は、エクソン／イントロン接合部位（５’ｓｓ）の２〜５０塩基対下流に含まれるｍＲＮＡ前駆体の領域中に位置しており、ただし標的ヌクレオチド配列は前記エクソン／イントロン接合部位を含まない。好ましくは、標的ヌクレオチド配列は長さ５〜５０ヌクレオチド、より好ましくは９〜３０ヌクレオチドである。
【００１６】
先行技術と比較して、本発明の主題であるＵ１ｓｎＲＮＡ分子は、エクソン／イントロン接合部位の配列と比較して低い保存度を示す、スプライシングドナー部位に隣接するイントロン領域内に局在している一次転写産物上の標的ヌクレオチド配列に結合するとき、標的された選択的（エクソン特異的）な作用を及ぼすという利点を有する。しかし、本発明のＵ１ｓｎＲＮＡ分子が、エクソン／イントロン接合部位を含まない標的配列上で動作するにもかかわらず、エクソン変異またはアクセプター部位上の変異を含む異なる種類の変異の存在下で全く同様にエクソンの包含を誘発できることは驚くべきことである。
【００１７】
本発明のさらなる特徴は添付の特許請求の範囲に定義されており、特許請求の範囲は本明細書の技術的な教示の不可欠な部分である。
【００１８】
好ましい態様において、結合ヌクレオチド配列により置きかえられている野生型Ｕ１ｓｎＲＮＡの一本鎖５’領域の部分は、長さ９〜１２ヌクレオチドである。
【００１９】
好ましくは、ＥｘＳｐｅＵ１によって是正されエクソンスキッピングを引き起こす変異は、イントロン／エクソン接合部位（３’スプライス部位）の３〜５０塩基対上流に含まれる配列、エクソン変異およびスプライシングドナー部位の共通配列内の変異に位置している。
【００２０】
凝固第ＩＸ因子、ＳＭＮ２およびＣＦＴＲ遺伝子は、治療対象である遺伝子、すなわち、本発明のＥｘＳｐｅＵ１を用いる処置に適する疾患に関係した変異が有るもののうちの一例として言及されている。
【００２１】
好ましい態様において、本発明の改変ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ分子は、配列番号１〜１１、より好ましくは、１〜１０からなる群から選択される結合ヌクレオチド配列を含む。
【００２２】
好ましい態様において、遺伝子はプロモーター配列およびポリアデニル化シグナル配列を含む。本発明者らは、ヒトＵ１ｓｎＲＮＡをコードしている遺伝子の内在性プロモーターが特に適切であることを検証したが、他のそれ自体公知のプロモーターも使用でき、それらのプロモーターは当業者によって容易に選択することができる。
【００２３】
野生型ヒトＵ１ｓｎＲＮＡをコードしている遺伝子の順鎖の配列（配列リストにおいて配列番号１２と呼ばれる）が一例として以下に報告されており、ここで、改変Ｕ１ｓｎＲＮＡ分子において結合配列により置きかえられている一本鎖５’領域の部分は太字である。結合配列を挿入するために使用される１つしかないＢｇｌＩＩおよびＢｃｌＩ制限部位の配列には、下線が引かれている。ＲＮＡコード領域（大文字で示されている）に加えて、配列番号１２の遺伝子配列も、その発現に必要ないくつかの調節エレメント、たとえばプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む。
【００２４】
5’-
taaggaccagcttctttgggagagaacagacgcaggggcgggagggaaaaagggagaggcagacgtcacttccccttggcggctctggcagcagattggtcggttgagtggcagaaaggcagacggggactgggcaaggcactgtcggtgacatcacggacagggcgacttctatgtagatgaggcagcgcagaggctgacgtcttcgccacttgctgcttcaccacgaaggagttcccgtgccctgggagcgggttcaggaccgctgatcggaagtgagaatcccagctgtgtgtcagggctggaaagggctcgggagtgcgcggggcaagtgaccgtgtgtgtaaagagtgaggcgtatgaggctgtgtcggggcagaggcccaagatctgATACTTACCTGGCAGGGGAGATACCATGATCACGAAGGTGGTTTTCCCAGGGCGAGGCTTATCCATTGCACTCCGGATGTGCTGACCCCTGCGATTTCCCCAAATGTGGGAAACTCGACTGCATAATTTGTGGTAGTGGGGGACTGCGTTCGCGCTTTCCCCTGactttctggagtttcaaaagtagactgtacgctaa-3'（配列番号：１２）
言うまでもなく、上記の遺伝子配列は単なる一例として提供されている。別法として、本発明の改変Ｕ１ｓｎＲＮＡをコードしている遺伝子を構築するために、配列番号１２と相同ないずれかの遺伝子配列、すなわちスプライシングドナー部位の認識を有効に仲介できるＵ１ｓｎＲＮＡをコードすることができるものを使用することができる。
【００２５】
異なる結合配列を含有する本発明の主題である異なる改変Ｕ１ｓｎＲＮＡ分子の調製方法は、例の欄に詳細に記載されている。
【００２６】
本発明のさらに別の目的は、上で定義された単離された遺伝子を含む発現ベクターである。最も好ましい発現ベクターはアデノ随伴ウイルスベクターであるが、当業者にそれ自体公知の他の種類の発現ベクターも使用することができる。
【００２７】
前述した通り、改変ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ分子、そのようなＲＮＡ分子をコードしている遺伝子および前記遺伝子を含むベクターは、異常スプライシングによって引き起こされるかまたはそれと関連しており、エクソンスキッピングを特徴とする遺伝的疾患の治療的処置のために使用されるのに適切である。好ましくは、限定するものではないが、疾患は嚢胞性線維症、血友病Ｂまたは脊髄性筋萎縮症である。
【００２８】
これを受けて、改変Ｕ１ｓｎＲＮＡ分子、遺伝子および／またはベクターは、治療上活性がある分子に加えて医薬として許容できる担体を含む医薬組成物へと処方される。担体および任意の医薬品賦形剤の選択は、十分に当業者の技術の範囲内のことである。
【００２９】
本発明の別の局面は、培養細胞に上で定義された発現ベクターをトランスフェクトすることによって、異常スプライシングを誘発する変異が有る治療対象となる標的遺伝子の正しいスプライシングを培養細胞において回復するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法である。
【００３０】
本発明の主題である改変Ｕ１ｓｎＲＮＡ分子は、当業者に周知である従前通りの分子生物学的方法を使用することによって作製された。異常スプライシング過程の是正に対する本発明の主題であるＵ１ｓｎＲＮＡの効果を評価し最も効率的なものを同定するために、本発明者らは、その適用が科学文献に広く記録されているミニ遺伝子法を広範に使用した。そのような方法は、スプライシング不良を引き起こす変異が有る遺伝子部分を発現ベクターにクローニングすること、および次いで組換えベクターをｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養細胞にトランスフェクトすることを含む。対象遺伝子の部分から生じる転写産物の分析はＲＴ−ＰＣＲによって実施され、こうして異常スプライシング過程から得られる正常でない長さのｍＲＮＡ分子を同定できる。改変Ｕ１ｓｎＲＮＡとミニ遺伝子の同時トランスフェクション後の正常な長さの対象転写産物の外観およびそれらの配列決定は、Ｕ１ｓｎＲＮＡ分子が正しいスプライシング過程を回復させる能力の明示を表す。
【００３１】
しかし、正しいメッセンジャーＲＮＡプロセシングの回復と、実際に治療的意義を有する最終的なタンパク質レベルの回復との間の類似性は明らかでない。
【００３２】
このため、本発明者らは、スプライシングだけでなく発現されたタンパク質の研究も可能なハイブリッドミニ遺伝子法を使用した。本発明者らによってこの方法が導入されて、凝固ＦＶＩＩにおけるスプライシング変異が研究された（Ｐｉｎｏｔｔｉら、２００９）。そのような方法は、全コード配列（「スプライシング能力があるｃＤＮＡ構築物」）内でスプライシング不良を引き起こす変異が有る領域中にいくつかのイントロンを含有する遺伝子の部分を発現ベクターにクローニングすること、およびその後組換えベクターをｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養細胞にトランスフェクトすることを含む。ＲＴ−ＰＣＲによる対象遺伝子の部分から生じる転写産物の分析ならびに合成されたタンパク質のレベルおよび活性の測定により、生物学的機能の回復を評価できるようになる。
【００３３】
以下の例は、説明のため提供されており、添付の特許請求の範囲に定義された本発明の範囲を限定しない。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】野生型Ｕ１ｓｎＲＮＡの構造
【図２】プラスミドベクターｐＧＥＭに挿入されたＵ１ｓｎＲＮＡ遺伝子エレメントの概略
【図３】構築物ｐＴＢ  ＦＩＸ  ｅｘ５の中央部の概略
【図４】真核生物細胞中でのミニ遺伝子の発現と、変異によるエクソンスキッピングの誘発
【図５】凝固第ＩＸ因子遺伝子のエクソン５スプライシング不良の是正のために利用された改変Ｕ１ｓｎＲＮＡ上の結合部位の局在
【図６】異なる改変Ｕ１ｓｎＲＮＡの、−２Ｃ位変異についてのエクソン５包含パーセンテージに対する効果
【図７】−２Ｃ、−８Ｔ、−９Ｔ位の変異とｆｉｘ９によるスプライシングの回復
【図８】ベクターｐＢｓｋＦＩＸにクローニングされた構築物の概略
【図９】ｆｉｘ９によるスプライシング回復による機能的なタンパク質への翻訳
【図１０】ｐＣＩ−ＳＭＮ２ミニ遺伝子の概略
【図１１】ＳＭＮ２遺伝子のスプライシング不良を是正するために利用された改変ＳＭＮ  Ｕ１ｓｎＲＮＡの局在
【図１２】ＳＭＮ２スプライシングに対する改変ＳＭＮ  Ｕ１の効果
【図１３】ｐＴＢ  ＣＦｅｘ１２ミニ遺伝子の概略
【図１４】ＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１２のスプライシング不良を是正するために使用されたＥｘＳｐｅＵ１  ｃｆ１１の局在
【図１５】５’ｓｓおよびエクソン中に局在している異なる種類の変異によって誘発される異常スプライシングに対するＥｘＳＰｅＵ１  ｃｆ１１の効果
【例】
【００３５】
例１：改変Ｕ１ｓｎＲＮＡの作製
改変Ｕ１ｓｎＲＮＡは以下の手順によって作製された：野生型Ｕ１−ｓｎＲＮＡ遺伝子（すなわち改変されていないＵ１−ｓｎＲＮＡ）の配列を含有するプラスミドは、ＢｇｌＩＩおよびＢｃｌＩ制限酵素で消化された。これら２つの制限部位の間に含まれる配列は、結合配列を含む二本鎖オリゴヌクレオチドで置きかえられた。各オリゴヌクレオチドの順向きおよび逆向き配列が下の表１に記載されており、得られた改変Ｕ１−ｓｎＲＮＡは利用されたオリゴヌクレオチドの後に命名されている。
【００３６】
さらに、図２はＵ１ｓｎＲＮＡ遺伝子エレメントの概略図を示している。異なる改変Ｕ１ｓｎＲＮＡを調製したクローニング戦略が示されている。図２はプラスミドベクター（ｐＧＥＭ）に挿入されたプロモーターエレメントＤＳＥおよびＰＳＥ、（中央に）Ｕ１ｓｎＲＮＡをコードしている領域、ならびに３’プロセシングボックスを有するＵ１ｓｎＲＮＡ遺伝子を示している。転写開始点は、矢印によって示されている。ＢｇｌＩＩおよびＢｃｌＩ制限部位の間の配列は、表１に示された改変Ｕ１ｓｎＲＮＡを作製するのに特異的なオリゴヌクレオチドにより置きかえられた一本鎖Ｕ１ｓｎＲＮＡ尾部をコードしている領域を含む。
【表１】
0005985487.tif 000002
【００３７】
0005985487.tif 000003
【００３８】
0005985487.tif 000004
【００３９】
例２：培養細胞へのミニ遺伝子のトランスフェクションおよびスプライシング産物の分析
含有するベクターは、リポフェクタミン（リポソーム）を用いる一過性のトランスフェクションによって細胞に挿入された。Ｔｒｉｚｏｌを用いて細胞の全ＲＮＡを抽出した後に、特異的プライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲによってＲＮＡが分析された。
【００４０】
反応は２つのステップで起こる：鋳型としてランダムプライマーを使用する逆転写酵素によるｃＤＮＡ鎖へのＲＮＡの逆転写、およびＤＮＡポリメラーゼによる得られたｃＤＮＡの増幅。
【００４１】
ＰＣＲ反応は、
−前述した両方の酵素が正しく機能するのに適切なＡＭＶ／Ｔｆｌ  ５ｘ緩衝液５μｌ；
−１０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス１μｌ；
−５０ｐｍｏｌフォワードプライマーおよび５０ｐｍｏｌリバースプライマー；
−２５ｍＭ  ＭｇＳＯ4  ２μｌ； 
−細胞抽出ＲＮＡ  ２μｌ；
−ＡＭＶ−ＲＴ（０．１μ／μｌ）１μｌ、Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ１μｌ；
−超純水適量
を含有する最終容量２５μＬの混合物中で実施された。
【００４２】
逆転写ステップは、４５℃で４５分間実施された。ＰＣＲミックスが９４℃の温度に２分間調整されるステップを次いで実施し、続いて４０回のＰＣＲ、続いて最後に６８℃で７秒間の伸長ステップを実施した。
【００４３】
増幅産物は、アガロースゲル電気泳動によって分離されおよび／またはキャピラリー電気泳動によって流された。
【００４４】
例３：血友病Ｂと関連した凝固第ＩＸ因子のドナー部位近くのエクソン変異およびエクソン５アクセプター部位の上流のポリピリミジン配列中の変異
第ＩＸ因子遺伝子（Ｆ９）において、エクソン５のドナー部位内の−２位におけるエクソン変異ならびにアクセプター部位内の−８および−９位における変異は、血友病Ｂと関連している。興味深いことに、エクソン中の−２位における変異は同義であり、コード配列を改変しないがエクソンスキッピングを誘発し、したがってそれらをスプライシング変異として分類できることに留意されたい。アクセプター部位内の−８および−９位における変異も、エクソン５のスキッピングを誘発する。
【００４５】
表２は、血友病Ｂに罹患した患者において同定された論議中の変異を示している（血友病Ｂ国際データベース）。エクソン５に属しているヌクレオチドは大文字で示されており、イントロンに属しているそれらは小文字で示されている。図の一番下に示されている各位置は、１つ以上の変異の影響を受けており、そのヌクレオチド変化が太字で示されている。
【表２】
0005985487.tif 000005
【００４６】
ｐＴＢ  ＮｄｅＩ  ＦＩＸと呼ばれるミニ遺伝子構築物の発現のベクターが構築されて、正常なおよび変異したＦＩＸのスプライシングが研究された。これを行うために、エクソン５の３０８ｂｐ上流および変異の影響を受けた領域の２８３ｂｐ下流のゲノムＤＮＡの部分が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏスプライシングの研究のために広く使用されているベクター、ｐＴＢＮｄｅＩプラスミドに挿入された（Ｐａｇａｎｉら、２０００；Ｐａｇａｎｉら、２００２；Ｐａｇａｎｉら、２００３）。
【００４７】
図３において、スプライシング研究のために使用される構築物ｐＴＢ  ＦＩＸ  ｅｘ５の中央部分が概略的に表されている。長方形はαグロビンの構築物およびＦＩＸエクソン５の中間領域を表し、イントロンは線で表されている。エクソン５および隣接するイントロン領域（ＩＶＳ４およびＩＶＳ５）がプラスミドｐＴＢにクローニングされた。転写は、αグロビンプロモーターおよびＳＶ４０エンハンサーの制御下にある。可能性がある２つのスプライシングアイソフォームが示されている。
【００４８】
変異を挿入した後、本発明者らは次いで、ＨｅｐＧ２真核生物細胞（肝臓由来タンパク質、たとえばＦＩＸを研究する際に理想的な細胞モデルである）中で作製されたミニ遺伝子の発現によって、それらの原因となる効果を実証した。具体的には、ベクターは一過性のトランスフェクションによって細胞に挿入され、ＲＮＡは添付の方法に示すように、オリゴヌクレオチドａｌｆａ２−３およびＢＲＡ２をプライマーとして使用することによって分析された。具体的には、全ての変異がエクソンスキッピングを誘発する（図４）。
【００４９】
作り出された改変Ｕ１−ｓｎＲＮＡのリスト、それらの標的配列およびドナー部位の周りのそれらの局在が表３に報告されている。
【表３】
0005985487.tif 000006
【００５０】
凝固第ＩＸ因子遺伝子のエクソン５スプライシング不良の是正のために利用される改変Ｕ１ｓｎＲＮＡ上の結合部位の局在が、図５に示されている。エクソン５の配列は大文字で示されており、残りの配列はイントロンを示している。
【００５１】
異なる改変Ｕ１ｓｎＲＮＡが−２Ｃ位における変異について試験され、エクソン５包含のパーセンテージに対するそれらの効果が図６に示されている。観察できるように、多くの改変Ｕ１ｓｎＲＮＡがエクソン５包含のパーセンテージを著しく増加させることができ、それによって−２Ｃ位における変異の影響が補償される。これは、ドナー部位または近くへのＵ１ｓｎＲＮＡの結合（ＥｘＳｐｅＵ１）がエクソン５の明確化に有利に働くことを示している。効率は位置によって決まり、Ｕ１−ＦＩＸ１、ＦＩＸ９、ＦＩＸ１０はより高い活性を示す。効率は、５’ｓｓスプライシング部位からの距離の増加に伴って減少する。重要なことに、スプライシング部位に隣接する保存されていないイントロン配列とのＵ１ｓｎＲＮＡの相補性は、その特異性を増加させるために重要であることに留意されたい。さらに、ＦＩＸの小さな増加（正常の＞２％）であっても、患者の出血傾向に著しい改善をもたらし得ることに注目しなければならない。この理由により、効率が低いＥｘＳｐｅＵ１分子でさえ、血友病Ｂならびに他の凝固不良において治療的意義を有することができる。改変Ｕ１ｓｎＲＮＡ分子を用いると、類似の効果がドナー部位（−２Ａ＞Ｇ、−２Ａ＞Ｔ）およびアクセプター部位（−８Ｔ＞Ｇ、−９Ｔ＞Ｇ）内の他の変異で達成された。
【００５２】
１つの単一の改変Ｕ１ｓｎＲＮＡ、特に９位（ＦＩＸ９）において対合するものが、調査された全ての異なる変異の存在下でスプライシングを著しく回復できるという実証は特に注目に値する。
【００５３】
これまで全く報告されていないこの所見に関したデータが、図７に示されている。
【００５４】
いかなる治療手法の有効性もタンパク質合成を誘発するその能力によって証明され、そのレベルは病態を受けて減少する。
【００５５】
メッセンジャーＲＮＡレベルで観察された是正によって合成の増加および分泌されたＦＩＸの機能が得られるかどうかを検証するために、エクソン５およびそれに隣接するイントロン配列がＦＩＸ全長をコードしている配列に挿入されたミニ遺伝子が、作り出された。図８は、この研究のために作製されたベクターｐＢｓｋＦＩＸにクローニングされた構築物を概略的に報告している。長方形はＡＴＧ開始コドンおよびＴＡＡ停止コドンを有するコード配列を示しており、イントロンは線として報告されている。
【００５６】
機能的なＦＩＸを合成し分泌するそれらの能力が元で選択されたＢＨＫハムスター腎臓細胞へのこのミニ遺伝子のトランスフェクションは、メッセンジャーＲＮＡが正しくプロセシングされタンパク質へと翻訳されていることを実証した（図９）。現実に、多量の機能的なタンパク質が培地中で測定される。対照的に、ドナー部位（−２Ａ＞Ｇ、−２Ａ＞Ｔ）またはアクセプター部位（−８Ｔ＞Ｇ、−９Ｔ＞Ｇ）中の変異は、エクソン５の除去および正常な凝固アッセイにおいて機能しない切断タンパク質バリアントの合成を引き起こす。ウェスタンブロッティング（上のパネル）によって、コード配列におけるエクソン５の欠損により、変異が低分子量のＦＩＸバリアントの合成を引き起こすと実際に判明した。感知できるほどの凝固活性は、この形態に対応していない（下のパネル）。
【００５７】
イントロンＥｘＳｐｅＵ１  ｆｉｘ９の発現はスプライシングを回復し、機能的な分泌されたＦＩＸのレベルを、患者に投与した場合に治療閾値を大きく上回るレベルまで増加させることができる。これらの結果は、ＥｘＳｐｅＵ１法の有効性を確認するものである。
【００５８】
例４：脊髄性筋萎縮症
ＳＭＮ１（ｐＣＩ−ＳＭＮ１）およびＳＭＮ２（ｐＣＩ−ＳＭＮ２）ミニ遺伝子を発現するベクターを使用して研究した（Ｈｕａら、２００７）。そのようなミニ遺伝子は、ＳＭＮ２遺伝子中のスプライシング不良を是正できる治療用分子の効果を確認するために、広く使用されている（Ｈｕａら、２００７；Ｈｕａら、２００８）。
【００５９】
２つのミニ遺伝子は、ＣＭＶプロモーターの制御下に、エクソン６の１１１ヌクレオチド、イントロン６の２００ヌクレオチド、エクソン７の５４ヌクレオチド、イントロン７の４４４ヌクレオチドおよびエクソン８の最初の７５ヌクレオチドから構成されている。２つのミニ遺伝子は、エクソン７中の６位において１ヌクレオチドの置換が存在することで異なる。ｐＣＩ−ＳＭＮ１にはＣがあり、ｐＣＩ−ＳＭＮ２にはＴがある。そのような同義置換は、成熟した転写産物中のエクソン７のスキッピングを伴うｐＣＩ−ＳＭＮ２中のスプライシング不良を誘発する。ｐＣＩ−ＳＭＮ２ミニ遺伝子が図１０に概略的に表されている。エクソンスキッピングを誘発するエクソン中の＋６Ｔ位における同義バリアントが示されている。
【００６０】
多くの実験的証拠が、ＳＭＮ２遺伝子中のスプライシングの是正がＳＭＡの有効な治療戦略を表していることを実証してきた（Ｈｕａら、２００７；Ｈｕａら、２００８；Ｌｏｒｓｏｎら、２０１０）。表５は、作製された改変Ｕ１−ｓｎＲＮＡのリスト、それらの標的配列およびドナー部位の周りのそれらの局在を示している。異なる改変Ｕ１−ｓｎＲＮＡおよびエクソン７包含のパーセンテージに対するそれらの効果が、ＳＭＮ２ミニ遺伝子中で、および対照としてＳＭＮ１ミニ遺伝子中で試験された。
【表４】
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【００６１】
図１１は、ＳＭＮ２遺伝子のスプライシング不良を是正するために利用された改変ＳＭＮ  Ｕ１ｓｎＲＮＡの局在を示している。
【００６２】
ミニ遺伝子は、リポフェクタミン（リポソーム）を用いる一過性のトランスフェクションによってＨｅＬａ細胞に挿入された。ＲＮＡは実施例２に示された通りＲＴ−ＰＣＲによって分析された。細胞から抽出されたＲＮＡは、次いでプライマーｐＣＩＦｗｄＢおよびＥ８−７５Ｒを用いるＲＴ−ＰＣＲに供されて、スプライシング産物が評価された。
【００６３】
図１２で観察できるように、培養細胞へのｐＣＩ  ＳＭＮ２プラスミドのトランスフェクションは、エクソン７のスキッピングを主に示している。Ｕ１−Ｗｔ対照プラスミド（ウェル２）との同時トランスフェクションは効果がない。Ｕ１ｅｘ７ＳＭＮ−１Ｇ−２Ｇ−３Ａ（ウェル３）、Ｕ１ｅｘ７ＳＭＮ  ｓｈ２（ウェル４）およびＵ１ｅｘ７ＳＭＮ  ｓｈ１７（ウェル５）プラスミドの同時トランスフェクションは、エクソン７の包含のパーセンテージに著しい増加を誘発する。ＳＭＮ１対照プラスミド中の異なる改変ＳＭＮ  Ｕ１  ｓｎＲＮＡの同時トランスフェクションは効果を示さなかった。
【００６４】
具体的には、図１２はＳＭＮ２スプライシングに対する改変ＳＭＮ  Ｕ１の効果を示している。ＳＭＮ２遺伝子（ウェル１）のエクソン７のスプライシングプロファイルおよび改変Ｕ１  ｓｎＲＮＡ（ウェル２〜５）の共発現の効果が、図の上部分に示されている。２つのエクソン７包含（＋）および除去（−）アイソフォームが示されている。下のパネルにおいて、ヒストグラムは、エクソン７の包含の、したがって正しいスプライシングのパーセンテージを示している。データは、３回の独立した実験の平均である。
【００６５】
例５：嚢胞性線維症と関連したエクソンおよびＣＦＴＲエクソン１２ドナー部位中の変異
嚢胞性線維症は、ＣＦＴＲ遺伝子中の変異によって引き起こされる。異常なエクソンスキッピングを誘発する、重篤な疾患形態と関連したエクソン１２スプライシング部位中に局在している変異が、表６に示されている。エクソン１２中に局在しているいくつかの変異は、エクソンスキッピングを誘発する（Ｐａｇａｎｉら、２００３）。エクソン１２の除去を誘発するエクソン変異が表７に示されている。
【表５】
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【表６】
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【００６６】
表８はＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１２中のスプライシング不良を是正するために改変されたＵ１−ｓｎＲＮＡ遺伝子中の認識配列を示しており、認識配列は改変Ｕ１  ｓｎＲＮＡのより大きなパネルから選択された。
【表７】
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【００６７】
利用されたｐＴＢ  ＣＦｅｘ１２ミニ遺伝子が、図１３に概略的に表されている（Ｐａｇａｎｉら、２００３）。長方形はαグロビン構築物およびＣＦＴＲエクソン１２の中間領域を表し、イントロンは線で表されている。エクソン１２および隣接するイントロン領域は、プラスミドｐＴＢにクローニングされた。転写は、αグロビンプロモーターおよびＳＶ４０エンハンサーの制御下にある。可能性がある２つのスプライシングアイソフォームが示されている。
【００６８】
図１４は、ＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１２のスプライシング不良を是正するために使用されたＥｘＳｐｅＵ１  ｃｆ１１の局在を示している。
【００６９】
ＲＮＡは実施例２に示された通りＲＴ−ＰＣＲによって分析された：培養細胞へのミニ遺伝子のトランスフェクション、ならびにａｌｆａ２−３およびＢＲＡ２をプライマーとして使用しミニ遺伝子を使用することによるスプライシング産物の分析。
【００７０】
図１５は、５’ｓｓおよびエクソン中に局在している異なる種類の変異によって誘発される異常スプライシングに対するＥｘＳＰｅＵ１  ｃｆ１１の効果を示している。ＥｘＳＰｅＵ１  ｃｆ１１は、分析された全ての変異体においてエクソン１２の包含のパーセンテージに著しい増加を誘発する。
【００７１】
異なるバリアント（奇数ウェル）のスプライシングプロファイルおよびＥｘＳＰｅＵ１  ｃｆ１１（偶数ウェル）の共発現の効果が、図１５の上部分に示されている。２つのエクソン１２包含（＋）および除去（−）アイソフォームが示されている。下のパネルにおいて、ヒストグラムは、エクソン１２を含むパーセンテージ、したがって正しいスプライシングのパーセンテージを示している。データは、３回の独立した実験の平均である。
【００７２】
細胞に、各特異的バリアントを発現する０．５μｇのベクターをトランスフェクトした。スプライシングプロファイルは、プライマーＡＬＰＨＡ２，３およびＢＲＡ２を用いるＲＴ−ＰＣＲによって評価した。増幅された断片は、２％のアガロースゲルで分離された。エクソン１２包含（＋）または除去（−）転写産物の素性はゲルの右側に示されており、配列決定によって確認された。
【００７３】
参照文献
-Cartegni, L., S. L. Chew, and A. R. Krainer. 2002. Listening to silence and understanding nonsense: exonic mutations that affect splicing. Nat Rev Genet 3:285-98.
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-Hua, Y., T. A. Vickers, B. F. Baker, C. F. Bennett, and A. R. Krainer. 2007. Enhancement of SMN2 exon 7 inclusion by antisense oligonucleotides targeting the exon. PLoS Biol 5:e73.
-Hua, Y., T. A. Vickers, H. L. Okunola, C. F. Bennett, and A. R. Krainer. 2008. Antisense masking of an hnRNP A1/A2 intronic splicing silencer corrects SMN2 splicing in transgenic mice. Am J Hum Genet 82:834-48.
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-Pagani, F., and F. E. Baralle. 2004. Genomic variants in exons and introns: identifying the splicing spoilers. Nat Rev Genet 5:389-96.
-Pinotti, M., L. Rizzotto, D. Balestra, M. A. Lewandowska, N. Cavallari, G. Marchetti, F. Bernardi and F. PaganiI. Maestri, F. Pagani, and F. Bernardi. 2008. U1-snRNA  mediated rescue of mRNA processing in severe factor VII deficiency. Blood 111:2681-2684
-Pinotti, M., D. Balestra, L. Rizzotto, I. Maestri, F. Pagani, and F. Bernardi. 2009. Rescue of coagulation factor VII function by the U1+5A snRNA. Blood 113:6461:6464
【配列表のフリーテキスト】
【００７４】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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