(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
補体を媒介とした障害の治療で使用するための、少なくとも1つのT細胞エピトープを含んでなる担体タンパク質に結合したか融合した、アミノ酸シーケンス、ANISHKDMQLGR(配列番号3)、NISHKDMQLGR(配列番号4)、SHKDMQLGR(配列番号6)およびKDMQLGR(配列番号7)からなる群から選択される少なくとも1つのペプチドを含んでなるワクチン。
【請求項２】
少なくとも1つのペプチドが、そのN末端で直接又はスペーサー配列を介してそれに結合された少なくとも1つのシステイン残基を含んでなる、請求項1に記載のワクチン。
【請求項３】
担体タンパク質が、キーホールカサガイヘモシアニン(KLH)、破傷風トキソイド(TT)又はジフテリア毒素(DT)から成る群から選択される、請求項1または2に記載のワクチン。
【請求項４】
少なくとも1つのペプチドが、アジュバントと一緒に製剤される、請求項1から3のいずれか1つに記載のワクチン。
【請求項５】
少なくとも1つのペプチドが、ミョウバンに吸着される、請求項4に記載のワクチン。
【請求項６】
補体を媒介とした障害が、炎症性疾患である、請求項1から5のいずれか1つに記載のワクチン。
【請求項７】
炎症性疾患が、慢性の炎症性疾患である、請求項6に記載のワクチン。
【請求項８】
炎症性疾患が、加齢黄斑変性症(AMD)、神経変性障害、喘息、アテローム性動脈硬化症、脈管炎、皮膚炎、溶血性尿毒症症候群、リウマチ性関節炎、ギラン-バレー症候群、多発性硬化症、抗リン脂質抗体症候群、溶血性尿毒症症候群および全身性紅斑性狼瘡(SLE)から成る群から選択される、請求項6に記載のワクチン。
【請求項９】
神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病又はハンチントン病である、請求項8に記載のワクチン。
【請求項１０】
皮膚炎が、乾癬または蕁麻疹である、請求項8に記載のワクチン。
【請求項１１】
補体を媒介とした障害が、虚血/再潅流傷害、急性肺障害、急性呼吸窮迫症候群、敗血症、癌、妊娠合併症(子癇前症、再発性自然流産、子宮内成長遅延および抗リン脂質抗体症候群)並びに血液透析に関連する血栓症から成る群から選択される、請求項1に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、補体成分C5a誘発慢性炎症性疾患を予防しおよび/または治療するために医学、免疫学および分子生物学の分野で使用される医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
補体は、微生物(ウイルス、バクテリアおよび他の外来で異常な細胞など)から宿主を防御するために作用する、生得免疫系の主要なコンポーネントである。しかしながら、補体系の不適当または過度の賦活は宿主自体に対する破壊力に結びつく場合がある。抑制されない補体賦活は、多くの神経変性疾患(アルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン舞踏病など);年齢と関連する斑紋変性、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス(SLE)、反リン脂質症候群(APS)、喘息、脈管炎、アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症を含む慢性炎症性疾患、炎症性の皮膚炎(乾癬および慢性じんま疹など)、ギラン-バレー症候群および溶血尿毒症症候群に関係する。
【０００３】
抑制されない補体賦活は、さらに癌で、妊娠合併症(子癇前症およびAPSなど)で、敗血症を含む急性の病理学症状および急性肺障害、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、乏血再潅流傷害の下で、および血液透析に関連する血栓症に結びつく人工表面で生じる場合がある。
【０００４】
これらの症状で見られる毒作用の多くは、炎症反応を促進し永続させるアナフィラトキシンC5aの生産過剰に起因する。C5aの主な機能は、可溶性の免疫媒介物質を放出する顆粒球、肥満細胞およびマクロファージの走化性および賦活である。したがって、補体活性の抑制あるいは調節は長年期待される治療戦略と認められてきた。
【０００５】
ほとんどの補体蛋白質は、3つの異なる機構:すなわち、補体活性化第1経路(classical pathway)、レクチン誘発性経路、および補体活性化第2経路(alternative pathway)に応じて、蛋白質分解を生ずるカスケードで互いを引き離し活性化する不活性前駆物質として血漿に存在する。3つの賦活カスケードすべての最終結果は、アナフィラトキシンC3aおよびC5a、並びに細胞致死細胞膜傷害複合体(MAC)(細胞の溶解を引き起こす気孔)の反応および形成の大量な増幅である。
【０００６】
補体活性化第1経路(classical pathway)は、抗原抗体複合体によって主として活性化される。完全な巨大分子のC1タンパク質が少なくとも2つの抗原に拘束された抗体の露出した部位に結合する場合、C1rとC1sのサブユニットが活性化される。活性化されたC1sは、次の複雑な2つの補体成分、C4およびC2の分割の原因である。C4は2個の断片へ開裂される。小さなC4a分子が遠方に浮遊している一方、より大きなC4b分子は近くの標的メンブレンに付着している。再び、活性化されたC1sはC2分子を開裂してC2bおよびC2aを産生し、後者(C2a)はそこで遊離される。メンブレンへ付着したままであるのは、C3転化酵素として知られるC4b2aである。それは次の補体成分(C3)をその活性型に変換する。C3転化酵素はより大きなC3bおよびより小さなC3a断片へ複合性C3を分割する。その後、C5転換酵素はヘテロ三量体的複合体(C4b2a3b)の集合によって形成され、その転換酵素は、不活性に戻る前に、数百から数千のC5補体成分のC5aおよびC5b中への開裂を触媒する。C5aは遠方に浮遊し、C5b断片が細胞膜傷害複合体の形成を始める抗原表面へ結合する一方、炎症に寄与する(MAC)。
【０００７】
第2の補体活性化経路はレクチン拘束力のある経路である。この経路は、病原体表面上のマンノース残渣への拘束力のあるマンノース拘束力のあるレクチン(MBL)あるいはficolinsが引き金となって起きる。それはMBLに関連するセリンプロテアーゼ、MASP-1およびMASP-2を活性化する。その後、MASPはC4をC4aとC4bへ、およびC2をC2aとC2bへ分割することができて、補体活性化第1経路C3およびC5転換酵素の形成に結びつく。
【０００８】
代替経路は、病原体の炭水化物および脂質を含む表面分子によって直接始められる。
補体成分C3は、低レベルで自然に開裂される。C3bコンポーネントは、多くの異なる表面、両方の外来およびホスト細胞に同様に付着することができる。C3bは、ほとんどの哺乳動物細胞表面で見出されるシアル酸によって迅速に不活性化される。微生物(それらの大部分はシアル酸を欠く)はC3b沈着に対して安定したサイトである。膜結合型のC3b断片は、次には、D因子によって開裂されるB因子によって結合される。C3bで関連して、Bbがとどまっている間に、断片Baが放出される。得られるC3bBb分子は補体活性化副経路C3転化酵素である。C3b分子はオールタネイト経路C5転換酵素、C3bBb3bを形成するために付着し続ける。この酵素はC5a及びC5bへC5を開裂する。C5b分子は引き続きメンブレンに関係していて、MACを形成するためにC9を通してC6と関連し、一方、C5aはアナフィラトキシンとして作用する。
【０００９】
補体成分C5は190のkDaタンパク質で、2つの連鎖を含んでなる(α115 kDaおよびβ75 kDa)。いずれか補体活性化経路の賦活は、C5bおよび性能が高いアナフィラトキシンC5aへC5を開裂することができるC5転換酵素酵素を発生することができる。C5の開裂に際して、C5a断片上のC末端新エピトープが形成される。
【００１０】
ヒトC5aは、12-14.5 kDaの分子量を持った74-アミノ酸糖タンパク質である。アスパラギンは、生物学的活性にとって不可欠でないが、非常に可能性高く生体内でC5a活性を規制するN-リンク炭水化物部分を有する位置64に位置する。NMR分光学は抗パラレル4重螺旋束(3つのジスルフィド結合によって安定しており、ループセグメントによって接続している4つの異なる螺旋形のセグメント)を示した。N末端基においては、短い1.5回転ヘリックスがさらに存在する。C5aは、2つの7回膜貫通ドメインレセプタ、C5aR(CD88)およびC5L2(gpr77)に結合する。それは、種々様々の細胞、だが特にマクロファージ、好中球、スト細胞およびT細胞のような免疫細胞の表面上に遍在して発現される。C5aRのリガンド結合部位は複雑で、少なくとも2つの物理的に分離可能な束縛領域から成る。1つはC5aのジスルフィドをリンクしたコア(アミノ酸15-46)を結合し、一方、第2はC5aカルボキシ端子端部(アミノ酸67-74)を結合する。その配位子C5aに対するC5aRの結合親和性は非常に高く、約1nMの解離定数(KD)を示す。しかしながら、C5aは、血清及び細胞表面のカルボキシペプチダーゼによって73のアミノ酸型(C5a desArg)へ急速に代謝され、そこでC5aRに対する結合親和性は10から100倍減少した。
【００１１】
ラビットポリクローナル抗体は、ラットC5a、N末端領域残渣1-16、中央の部位残渣17-36およびC末端部位残渣58-77の3つのペプチド部位へ開発された。しかし、抗C末端抗体は、ラット(Huber-Lang, Sarma et al. 2001, FABSEB J 15(3): 568-70)での実験的敗血症で最良の保護効果を示した(Huber-Lang, Sarma et al. 2001, FABSEB J 15(3): 568-70)。
【００１２】
更に、豚のC5aの対生物作用を中和した、豚のC5a(位置57-74)のC末端新エピトープに対する単クローン抗体が記述された(Hopken, Mohr et al. 1996, Eur J Immunol 26 (5): 1103-9))。主な疾病の病態生理学における補体の中心的な役割は、それを医薬品工業の興味をそそる目標にする。補体の臨床的な置換、抑制又は変調に対して多数のアプローチが開発されている。しかしながら、ここまでのFDAによって承認されたただ一つの補体に特有の薬物は、発作性夜間血色素尿症(PNH)適応症のためのSOLIRIS(r)(Eculizumab)である。このモノクローナル抗体は、分解産物C5aおよびC5bの生成を防ぐ補体蛋白質C5をターゲットとする。
【００１３】
他のモノクローナル抗体(それらはC5に結合し、C5a及びC5bへの分離を阻む)は、補体系の抑制されない賦活から誘導された組織損傷に関する疾病の療法で使用するために生成され示唆された(WO 95/29697、WO 2004/022096、米国2006/0115676、EP 1 878 441)。C5及びC5aに結合するが、C5bの賦活を阻害しない抗体は、抗体MAb137-26である(米国7,432,356)。特別に分解産物C5aを結合する抗体は、成人型呼吸窮迫症候群(ARDS)(WO 86/05692)および有害な血管内補体賦活の治療について研究された(EP 0 245 993)。さらに、C5aレセプター(C5aR)に反応性で、その結果として、推測上C5aRを有するC5aの結合を減じるか、阻害するモノクローナル抗体の使用は、免疫病理学的な障害を治療する際に提案された(WO 2003/062278、NZ 538384、JP 8109200)。教化された抗C5aR抗体(それはヒトC5aレセプターを結合する)の治療および診断用薬としての使用が、最近公表された(WO 2009/103113)。
【００１４】
モノクローナル抗体を使用する受動免疫戦略は、抗体製造に対する高いコスト、および繰り返された抗体適用で治療抗体(アンチ薬物抗体)に対する免疫反応を中和する開発に対する高いコストを含む異なる制限に直面する。
【００１５】
バクテリアを溶解するのに重要なC5b断片(MACに対する種子成分)の生産が阻害されるので、C5a及びC5b中へのC5の開裂を阻害する治療抗体の適用は、再発性感染に導くかもしれない。さらに、C5及びC5aの上でアクセス可能であるが、C5分子の開裂を阻害しないエピトープをターゲットとする免疫療法的戦略は、活性医薬化合物(モノクローナル抗体)のように不利である。又は、誘発された目標特異抗体は、C5の活性型および不活性型を識別しない。血清中の非常に高い抗体濃度が、活性なC5aの大部分が中和されるということを保証するのに必要になる。血清中の正常なC5タンパク濃度は約75μg/mlである。しかし、C5aは10〜100ナノグラム/mlの濃度で作用する。
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、補体成分C5aに誘発された疾病の治療のための手段及び方法を提供することを目的とする。
【００１７】
本発明は、少なくとも1つのT細胞エピトープを含有するキャリア蛋白質につながれているか融合した、アミノ酸配列LRANISHKDMQLGR(SEQ ID No. 1：以下、「SEQ 識別番号1」の様に記すことあり。)から成る少なくとも1つのペプチド又はそのペプチド断片を含有するワクチンに関する。ここで、前記ペプチド断片は、アミノ酸配列HKDMQLGR(SEQ識別番号16)およびHKDMQLG(SEQ識別番号22)からペプチド断片が成らないという前提の下で、少なくとも7つのアミノ酸残基およびアミノ酸配列KDMQLGR(SEQ識別番号7)又は、KDMQLG(SEQ識別番号23)を含有する。
【００１８】
ヒト個体にペプチドLRANISHKDMQLGR(SEQ識別番号1)(それはヒトC5aのアミノ酸残基61〜74に相当する)又は前記ペプチドの断片が哺乳動物中のC5a特異抗体の生体内生成を特に誘発することができると判明した。SEQ識別番号1のペプチド断片は少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、又は少なくとも13のアミノ酸残基を含有する。更に、N末端基でヒスチジン残基を有する前記シーケンスの断片、例えばHKDMQLGR(SEQ識別番号16)およびHKDMQLG(SEQ識別番号22)は、本発明の一部でない。本発明の好ましい実施態様によれば、本発明のワクチンのペプチド断片は最高13、12、11、10、9又は8のアミノ酸残基を含有する。
【００１９】
本発明によるワクチン(それは上記の言及されたペプチドの(少なくとも)1つ、(少なくとも)2つ、(少なくとも)3つ又は(少なくとも)4つさえも含んでもよい)は、哺乳動物、特にヒト各々の能動免疫を可能にし、ここで、ペプチド又はポリペプチド又は担体蛋白質に(T細胞エピトープを含む分子として)連結され又は融合したとき、補体蛋白質ヒトC5aへの中和抗体がC末端C5a誘導フラグメントを持った予防接種によって誘発される。ペプチド/担体組み合わせは重要である、と云うのは、本発明のペプチドが担体に連結されずに注入されたとき、適切な量の抗体を誘発する能力を有していないからである。したがって、hC5aに対する能動免疫の本発明には、C5aに基づいた疾患を治療するのにモノクローナル抗体治療を採用することに対する長所がある。大量の抗体の繰り返された注入の必要性、患者の頻繁な病院受診および教化された抗体の多量生産コストを含むモノクローナルC5a抗体療法の欠点は、したがって、回避することができる。
【００２０】
WO 2006/134125には、ウイルス様粒子(VLP)に連結された、20量体C末端のhC5aフラグメント(SEQ識別番号14であるとここに確認されたhC5a位置55-74)の使用によるhC5aに対する能動免疫が開示されている。しかしながら、本発明の化合物(表1)は、SEQ識別番号14と比較されたとき、ヒトC5aに対する明白により高い免疫反応を誘発することができるC末端hC5a誘導ペプチド（C-terminal hC5a-derived peptides）を提供する(表2)(図2および3を参照)。さらに、本発明の化合物は、SEQ識別番号14と比較されたとき、インビボモデルと同様に細胞に基づいたアッセイでも、より高い機能的活性を呈する抗体を誘発する(表1)(図4、5および6を参照)。
【００２１】
アミノ酸シーケンスKDMQLGR(SEQ識別番号7)を含んでなる本発明による化合物での哺乳動物の免疫処置は、上記の言及された20量体C末端hC5aフラグメントでの免疫処置よりはるかに高い免疫応答に帰着する。さらに、アミノ酸シーケンスCVVASQLRAN(SEQ識別番号24)から成る前記20量体のN末端部分での哺乳動物の免疫処置は、驚くほど、C5a特異抗体のインビボ形成の結果にならなかった(図1を参照)。このことは、20量体C末端のhC5aフラグメントのすべてのフラグメントが、C5a特異抗体を誘発することができるとは限らないことを明白に示す。
【００２２】
従って、表1に示されるような14から7つの範囲にわたるアミノ酸残基C末端hC5aから誘導されたフラグメントでの予防接種は、補体を媒介とした障害(例えば、C5aが決定的な役割を果たす急性または慢性の炎症性疾患)を軽減する。C5a C末端エピトープへのペプチドに誘発された抗体の特異的結合のために、C5a分子は哺乳動物内で中和される。そして、その受容体(C5aR)へのC5aの結合がブロックされる。
【００２３】
さらに、このアプローチは、宿主防御に主な役割を果たすC5bフラグメントの生成および機能を邪魔しない。なぜならば、誘発された抗体は、C5タンパク質全体ではなく分解生成物C5a上の新エピトープだけを認識するからである。
【００２４】
C5aのC末端6-8残基だけにC5aレセプターを結合する能力があること、及びより重要なことには、アゴニストとして作用することが示された。更に、C5aレセプターに拮抗する効果を現す、C5aアナフィラトキシンの多数の高親和性C末端類縁体が公表された (US 6,821,950; US 6,465,614; US 5,807,824; US 2009/0117171)。これらのアプローチとは対照的に（そこでは、ペプチド単独で(他の成分なしで)、C5aRを独力でブロックするか活性化するために適用されたが）、本発明においては、ペプチドは、補体蛋白質C5aに対する特異抗体の形成を誘発するために、投与の前に担体蛋白質(又はT細胞エピトープを含むペプチド)に連結される。
【００２５】
本発明の化合物/ペプチドは、最後の位置でアルギニンを有し又は有しない14〜7つのアミノ酸残基から構成される(表1:配列番号1-13)。N末端にアミノ酸残基ヒスチジンを有するペプチドは、クレームされる配列から除外された。なぜならば、これらのペプチド(SEQ識別番号16およびSEQ識別番号22)は、hC5aに対する機能的に活性な抗体を誘発しなかったからである(図4および5を参照)。C5aに対する特別の免疫応答および/または機能的に活性な抗体を誘発するペプチドの最小の長さは、7つのアミノ酸残基である(図2、3、4および5)。
【００２６】
本発明の化合物/ペプチドは、分離されたペプチド、又は別のペプチド又はポリペプチドの一部として当分野において周知の化学合成方法によって合成的に製造することができる。それに代えて、化合物/ペプチドは微生物(細菌、酵母又は菌類)中で、真核細胞(哺乳類または昆虫細胞)中で、又は組み替えウィルスベクター(アデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウィルス、シミリキ森林ウイルス、バキュロウイルス、バクテリオファージ、シンドビスウィルス又はセンダイ・ウイルス)中で製造することができる。それらは化合物/ペプチドを製造し、それは次いで単離されるか、所望なら、更に精製される。化合物/ペプチドの製造に適している細菌は大腸菌、枯草菌、又はペプチドを発現することができる他の細菌を含む。前記化合物/ペプチドの発現に適している酵母型はビール酵母菌、分裂酵母、カンジダ属種、ピキアパストリス又はペプチドを発現することができる他の酵母を含む。
対応する方法は当分野において周知である。さらに、組み換えで生産されたペプチドを分離する及び精製する方法は当分野において周知であり、例えば、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどとして含む。
【００２７】
化合物/ペプチドの単離を促進するために、アフィニティークロマトグラフィーによる単離を可能にする様な、異種のポリペプチドに化合物/ペプチドが翻訳融合された(共有結合で連結された)融合ポリペプチドが生成されてもよい。典型的な異種のポリペプチドは、Hisタグ(例えばHis6; 6つのヒスチジン残基)およびGSTタグ(グルタチオン-S-転移酵素)などである。融合ポリペプチドは化合物/ペプチドの精製を促進するだけでなく、さらに精製中に前記化合物/ペプチドの分解を予防し得る。もし、精製の後に異種ポリペプチドを除去することが望まれる場合、融合ポリペプチドは、化合物/ペプチド及び異種ポリペプチドの間の継目で切断部位を含んでもよい。切断部位は、サイトでのアミノ酸シーケンスにとって特別の酵素(例えばプロテアーゼ)で開裂されるアミノ酸シーケンスから成る。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態によれば、ペプチド断片は、RANISHKDMQLGR(配列番号2)、ANISHKDMQLGR(配列番号3)、NISHKDMQLGR(配列番号4)、ISHKDMQLGR(配列番号5)、SHKDMQLGR(配列番号6)、KDMQLGR(配列番号7)、LRANISHKDMQLG(配列番号8)、RANISHKDMQLG(配列番号9)、ANISHKDMQLG(配列番号10)、NISHKDMQLG(配列番号11)、ISHKDMQLG(配列番号12)およびSHKDMQLG(配列番号13)から成る群から選択される。
【００２９】
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、KDMQLGR(配列番号7)を含んでなるLRANISHKDMQLGR(配列番号1)のペプチド断片は、ANISHKDMQLGR(配列番号3)、RANISHKDMQLGR(配列番号2)、NISHKDMQLGR(配列番号4)、ISHKDMQLGR(配列番号5)、SHKDMQLGR(配列番号6)、KDMQLGR(配列番号7)から成る群から選択される。
【００３０】
特に好ましい実施態様によれば、アミノ酸シーケンスLRANISHKDMQLGR(配列番号1)又はそのペプチド断片から成る少なくとも1つのペプチドは、そのN-および/またはC末端で直接又はスペーサー配列を介してそれに結合された少なくとも1つのシステイン残基を含んでなる。
【００３１】
このシステイン残基はペプチドを別の分子又は担体に結合するために反応性基として役立ってもよい。例えば、この基はペプチドを担体蛋白質に結合するために使用されてもよい。システイン残基は、本発明のペプチドに、直接又はスペーサー配列を介して結合することができる。スペーサー配列は、好ましくは少なくとも1つの、好ましくは少なくとも2つの、より好ましくは少なくとも3つの、より好ましくは少なくとも4つさえ、及び随意に最大10まで、好ましくは最低5つの、小さな無極性のアミノ酸残基(例えばグリシン)を含んでなる。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態によれば、担体は、キーホールカサガイヘモシアニン(KLH)、破傷風トキソイド(TT)、ジフテリア毒素(DT)又はT細胞エピトープを含む他のタンパク質又はペプチドから成る群から選択される。
【００３３】
本発明によれば、ペプチドは、薬学的に許容できるキャリアー、好ましくはKLH(キーホールカサガイヘモシアニン)、破傷風トキソイド、アルブミン結合蛋白質ウシ血清アルブミン、デンドリマー(MAP; Biol. Chem. 358: 581)、Singhら(Singh et al. 1999, Nat. Biotech. 17: 1075-1081(特に、その文献のテーブル1におけるもの))、O'Haganら(O'Hagan and Valiante, 2003, Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9): 727-735(特に、内因的な免疫を強化する化合物))に記述された補助の物質と同様にペプチドリンカーにも(またはフランキング領域)、およびそこに記述された運搬システム、またはその混合物に連結されるか融合される。この文脈における接合化学(例えば、ヘテロな二官能性化合物(GMBSおよびもちろん同様に、「バイオ接合技術」、Greg T.Hermansonに記述されている様な他のものを介して)は、当業者に既知の反応から選択することができる。さらに、ワクチン組成物は、アジュバント、好ましくは低溶解性のアルミニウム組成物(特に、水酸化アルミニウム)で調剤されてもよい。もちろん、同様にMF59およびリン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、サイトカイン(例えばIL-2、IL-12、GM-CSF)、サポニン(例えばQS21)、MDP誘導体、CpG oligos、LPS、MPL、ポリホスファゼン、乳剤(例えばFreundの、SAF)、リポソーム、ビロソーム、イスコム、コクリエート、PLG微粒子、ポロキサマー粒子状物質、ウイルス様粒子、易熱性毒素(LT)、コレラ毒素(CT)、突然変異体毒素(例えばLTK63およびLTR72)、微粒子および(または)重合されたリポソームのようなアジュバントが使用されてもよい。
【００３４】
本発明の好ましい実施態様によれば、ペプチドはアジュバントで、好ましくはミョウバンに吸着されて、調剤される。
【００３５】
本発明のワクチンは皮下に、筋肉内に、皮内に、静脈内に、投与されてもよい(例えば"Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formula-tions", Sarfaraz Niazi, CRC Press Inc, 2004を参照)。投与ルートによって、薬物はそれぞれのキャリアー、アジュバントおよび(または)添加剤を含んでなってもよい。
【００３６】
本発明によるワクチンは、0.1 ng〜10 mg, 好ましくは 10 ng〜1 mg, 特に100 ng〜100 μg, または, それに代えて, 例えば、100 fmol〜10 μmol, 好ましくは10 pmol〜1 μmol, 特に100 pmol〜100 nmolの量で本発明による化合物を含んでいる。本発明の化合物またはペプチドは、投与量当たり、好ましくは100 ng〜1 mg、より好ましくは、1 μg〜500 μg、さらに好ましくは、10 μg〜100 μg、特に、20〜40または30 μgの量で哺乳動物に投与される。典型的には、ワクチンは同様に補助物質(例えばバッファー、安定剤など)を含んでいてもよい。本発明によるワクチンは、2週から2か月以内の時間間隔で3〜6回適用される。既存の抗C5a抗体の存在に際して、ワクチンはおよそ6か月の一定間隔で適用される。
【００３７】
本発明の好ましい実施態様によれば、ワクチンは補体を媒介とした病気の治療の中で使用される。したがって、本発明は、同様に本発明に従ってワクチンを接種することにより補体を媒介とした病気に苦しむ個体を治療する方法に関する。
【００３８】
補体を媒介とした疾患には、炎症性疾患(好ましくは慢性の炎症性疾患)が好適である。
【００３９】
炎症性疾患は、加齢黄斑変性(AMD)、神経変性障害、好ましくはアルツハイマー病、パーキンソン病またはハンチントン舞踏病、アレルギー喘息、アテローム性動脈硬化、ギラン‐バレー症候群、脈管炎、炎症性の皮膚炎、好ましくは乾癬および蕁麻疹、慢性関節リウマチ、抗リン脂質抗体症候群(APS)、多発性硬化症、溶血尿毒症症候群および全身性紅斑性狼瘡(SLE)から成るグループから好ましくは選択される。
【００４０】
補体を媒介とした障害には、虚血再潅流障害、急性肺損傷、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、敗血症、癌、妊娠合併症(子癇前症)、再発性自然流産、子宮内成長遅延およびAPSが好適である。
【００４１】
本発明による補体を媒介とした疾患は、同様に望ましくないか不適当な補体活性(血液透析に関連する血栓症など)を含む疾患である。この活性は当分野で既知の方法により決定することができる。発明によるワクチンで治療することができる病気は、増加したC5a活性が特徴である。
【００４２】
AMDは、通常高齢者を冒し、網膜への損害のために視野(斑紋)の中心で視力喪失に帰着する病状である。それが「乾燥して」、「湿った」形態で生じる。しかし、乾燥型は、すべてのAMD事例の90%を占める。湿ったおよび萎縮型AMDの最も早い臨床の極印のうちの1つは、網膜色素上皮に近いエリアで細胞外に蓄積する無定形のリポタンパク性沈澱物の出現である。これらの病原性成分は晶洞と呼ばれる。最近の研究は、晶洞、萎縮型AMDの極印の形成における補体活性化経路の局所的な炎症と活性化とを関係づけた。これは他の分子に加えて、補体成分C5はこれらの晶洞内に蓄積することを示す他の研究に一致する。
【００４３】
さらに、VEGF(C5aは、VEGFの遊離に関係する)に加えて、C5aが脈絡膜血管新生(それはAMDの湿った形態で起こる)の誘導に重要な役割を果たすことが示された。最も重要なことには、C5aに対する中和抗体は、動物モデルにおける病気の悪化を止めることができることを示すことができた。
【００４４】
総合すれば、AMDの湿ったおよび乾燥型における補体を媒介とした疾病の強い支援があり、したがって、C5aは、AMDの両方の形態の治療の最適な目標であるように見える。
【００４５】
C5aによって大部分は引き起こされた、補体を媒介とした炎症は、アルツハイマー病の加速または進展において役割を果たすことが提案されている。長引いた補体活性化は、アルツハイマー病脳中の原繊維性のAβプラークが引き金となって起きる。そして、炎症性のイベントを促進するC5aが補充されおよび活性化されたグリアはその病気の多くの発現に寄与することができる。同様のイベントはパーキンソン病およびハンチントン舞踏病に当てはまってもよい。更に、予備データは、運動ニューロン疾患における補体C5(C5a)の活性化断片のための具体的な病原性の役割、最終的な麻痺に結びつく進行性の運動性ニューロン死を引き起こす退行性疾患グループおよび死を示す。
【００４６】
C5aRの遮断は、明白に試験的なアレルギー喘息における気道炎症および気道超反応性を軽減する。しかしながら、喘息における補体成分C5の役割は論争の的になっているままである。C5は、試験的なアレルギー喘息における気道超反応性に対して促進するか防御すると記述され、アレルギー喘息におけるC5aに対する2重の役割を示唆している。1つの仮説は、アレルゲン感作中にシグナル伝達するC5aRが肺性アレルギーの進行から防御するが、エフェクター段階中に炎症を起こした肺性の環境でアレルギーの表現型を増強するということである。したがって、C5aR遮断は定着した喘息治療のための治療上の有益性かもしれない。
【００４７】
C5aはアテローム性動脈硬化においても役割を果たす。C3aおよびC5aはヒト冠状動脈のプラークで発現される。さらに、C5aが重度のアテローム性動脈硬化を持った患者の心血管系イベントを予言し、C5aの高い血中濃度が、表面的な大腿動脈のバルーン血管形成の後に再狭窄の発生に関係していることが最近示された。
【００４８】
脈管炎は、血管壁の炎症および線維素壊死で組織病理学的に特徴付けられる、血管の炎症過程である。脈管炎のこの形態の臨床的スペクトルは紫斑病から重症の増殖性糸球体腎炎まで多様にわたり、および補体系が臨界的にこれらの工程に関係すると思われる。
例えば、C5aは抗好中球細胞質抗体(ANCA)-関連の脈管炎、比較的珍しいが潜在的に生命に危険のある全身性自己免疫疾患、において重要な役割を果たす。ANCAに誘発された壊死性半月形糸球体腎炎は、その病因への補体の関与を必要とする。C5aおよび好中球のC5aRは、ANCAを媒介とした好中球の活性化のための増幅ループを構成してもよい。C5aRは、ANCAに誘発された壊死性半月形糸球体腎炎の新しい治療上の目標を提供し得る。
【００４９】
補体活性化は、水疱性類天疱瘡(BP)、尋常性乾癬および慢性じんま疹を含む自己免疫の皮膚炎における炎症性変化の病因に関係する。天疱瘡補体において、表皮における天疱瘡抗体による活性化は、好酸球性海綿状態と名付けられた特有の炎症性変化の発生の原因に見える。乾癬の鱗屑において、ハイレベルのC5aが見つかり、補体活性化がこの疾病に関係することを示している。乾癬はT細胞を媒介とした病気であると知られている。しかし、好中球および肥満細胞も、その病気の病因に関係しているかもしれない。T細胞および好中球はC5aによって化学的に引きつけられる。したがって、C5aは乾癬の治療の重要な治療上の目標でありえる。
【００５０】
補体活性化は同様に自己免疫の炎症性疾患、慢性関節リウマチの一因となる。同様に、C3bの断片でのオプソニン作用と同様に膜侵襲複合体の堆積物も重要であるが、アナフィラトキシンC5aが慢性関節リウマチにおける組織損傷の原因である補体活性化の主産物であるように見える。
【００５１】
全身性エリテマトーデス(SLE)の病因における補体の役割は、論争の的になっているままである。一方、補体成分は、自己抗体で始められた組織損傷を媒介するように見える。
他方では、補体系は、いくつかの補体の遺伝的な欠失がSLEのための増加危険に関係しているとともに、防衛的特徴を持つように見える。SLEを持った患者が低補体血症をしばしば持っていることが知られている。さらに、血液脳関門の完全性の調節により、中枢神経系狼瘡の病因においてC5a/C5aR信号が重要な役割を果たすことが実証された。C5a/C5aR遮断の可能性が、SLE中の見込みある治療上の戦略として強調された。
【００５２】
虚血(I)ではなく、組織再灌流(R)が、補体を活性化し、炎症に誘発された障害に結びつく様に見える。たとえI/R障害への補体活性化の正確な関与がまだ不明瞭でも、いくつかの実証研究は補体およびI/R障害の病因間の関連を示し、有力な療法として補体抑制を示唆した。例えば、ネズミ科の心筋のI/R障害モデルにおいて、全身性のC5抑制は、再灌流の30分に先立って、心筋のI/R障害からマウスを著しく保護した。
【００５３】
補体活性化は急性肺損傷の多くの形態で実証された。C5a濃度は酸点滴注入によって誘発された急性肺損傷において気管支肺胞洗浄液(BALF)中で増加される。また、C5a濃度もヒトの移植された肺で高められる。C5aは肺へ好中球を引きつけて、直接、好中球、マクロファージおよび内皮細胞を活性化する。抗C5aの防衛的役割は、肺血管細胞間接着分子ICAM-1表現の深遠な減少と同様に、TNF-αのBALFレベルの激烈な減少にも関連していた。このことは、C5aが炎症性ネットワークの構築、炎症伝達物質の発現および接着分子の発現の調節において不可欠であることを示唆している。
【００５４】
急性肺損傷および急性呼吸窮迫症候群(ARDS)は、肺胞内のスペースのフィブリンに富んだ炎症性滲出液の存在、および肺の肺胞の中への好中球の広範囲な移住が特徴である。健康なボランティアからの好中球におけるTNF -αおよびC5a信号伝達の薬理学的な遮断は、これらのそうでなければ正常な細胞のBALFに誘発された前凝固剤活性を著しく減らし、および組織因子(TF)発現の付随する損失を引き起こすことができた。これらの結果は、C5aおよびTNF-α信号伝達は、ARDSによって影響を受けた肺の肺胞中に蓄積する好中球におけるTF発現の誘導に寄与することを示す。
【００５５】
敗血症の発症中に、炎症性のシステムは活動亢進になり、セルおよび体液の防衛機制を含む。ヒト敗血症中にその補体活性化が、C5aの高いレベルにおいて反映されるように特に、それほど厳しくない敗血症の患者および生存者と比較するとき、多臓器不全と一緒に、著しく縮小された生存率に関連していることが示された。さらに、C5aまたはC5aRのいずれかの遮断は、げっ歯動物中の実験的な敗血症中に劇的に生存を改善する。したがって、C5aは、敗血症の進行のためのキープレーヤーであるように見える。また、C5a/C5aR接合の妨害は、敗血症を発症させる高い危険にある患者の予防的治療のための有力な臨床的アプローチを提示し得る。
【００５６】
心肺バイパスおよび血液透析において、ヒト血液が人工心肺または腎臓透析機械の人工表面と接触するとき、C5aは補体活性化第2経路の活性化の結果生成される。C5aは、組織(特に、肺)に、増加した毛細管透過性および浮腫、気管支収縮および肺性の血管収縮、白血球および血小板活性化並びに浸潤をもたらす。抗C5aモノクローナル抗体の投与は、心肺バイパスおよび心臓麻痺に誘発された冠状動脈の内皮細胞機能不全を縮小することが示された。
【００５７】
腫瘍で駆動される補体活性化は、腫瘍成長利点を備えることができる。
腫瘍微小環境における補体C5aの生成は、抗腫瘍性CD8+ T細胞を媒介とした反応を抑えることにより、腫瘍成長を強める。腫瘍成長のマウスモデルの使用は、C5aRの欠失または遮断が腫瘍成長の遅延に関連していることを明らかにした。したがって、補体抑制は抗癌療法での有効で有望なアプローチと見なされる。
【００５８】
補体活性化の著しい増加は異なる異常妊娠結果(すなわち子癇前症、再発性自然流産、子宮内成長遅延、抗リン脂質抗体症候群(APS))に関連していた。子癇前症を持った女性は、正常な妊婦と比較して、C5aの増加した血漿濃度を示した。APSに関して、抗リン脂質抗体および補体活性化(C3a、C5aおよびMACを介しての)は、胎盤血栓症、低酸素症および好中球の浸潤に結局結びついて、局所的な炎症過程を引き起こすことに協力してもよい。組織因子(TF)は、抗リン脂質抗体に誘発された胎児の障害においてC5aおよび好中球の活性化の間のリンクを表わす。
【００５９】
C5aに対するペプチドに誘発された免疫反応を要約すると、以下の様な、C5aを媒介とした(慢性、炎症性)疾病のための有効な療法に帰着する：神経変性病(アルツハイマー病（例えばFonseca, M.I. et al. (2009), J Immunol "Treatment with a C5aR Antagonist Decreases Pathology and Enhances Behavioral Performance in Murine Models of Alzheimer's Disease."、Klos, A. et al. (2009), Mol Immunol "The role of the anaphylatoxins in health and disease."))、パーキンソン病(例えばMcGeer, P. L. et al. (2004), Parkinsonism Relat Disord "Inflammation and neurodegeneration in Parkinson's disease.")、ハンチントン舞踏病(例えばSinghrao, S. K. et al. (1999), Exp Neurol "Increased complement biosynthesis by microglia and complement activation on neurons in Huntington's disease.")および年齢関連の斑紋退化(例えばNozaki, M. et al. (2006), Proc Natl Acad Sci "Drusen complement components C3a and C5a promote choroidal neovascularization.")、慢性関節リウマチ、(例えばOkroj, M. et al. (2007), Ann Med "Rheumatoid arthritis and the complement system.")、全身性エリテマトーデス(SLE)(参例えばChen, M. et al. (2009), J Autoimmun "The complement system in systemic autoimmune disease.")Jacob, A. et al. (2010), J Neuroimmunol "Inhibition of C5a receptor alleviates experimental CNS lupus."およびJacob, A, et al. (2010), FASEB J "C5a alters blood-brain barrier integrity in experimental lupus."、喘息(例えばKohl, J. et al. (2006), J Clin Invest "A regulatory role for the C5a anaphylatoxin in type 2 immunity in asthma.")、脈管炎、抗リン脂質抗体症候群(APS)、アテローム性動脈硬化、炎症性の皮膚炎(乾癬および慢性じんま疹)、ギラン‐バレー症候群、溶血尿毒症症候群および多発性硬化症。抑制されないhC5a遊離が他の病理学の症状、例えば、虚血および再潅流障害、敗血症、急性肺損傷、血液透析に関連した合併症、癌、妊娠併発症(子癇前症など)およびAPSに寄与するので、能動免疫処置によるC5aの中和はこれらの病理学の合併症に同様に有効な療法を提供して得る。
【００６０】
本発明のさらなる側面は、LRANISHKDMQLGR(SEQ識別番号1)を含んでなるワクチンまたはその少なくとも1つのT細胞エピトープを含んでなる担体蛋白質に連結されたか融合したペプチド断片に関する。ここで、前記ペプチド断片は少なくとも7つのアミノ酸、アミノ酸配列順序KDMQLGR(SEQ識別番号7)またはKDMQLG(SEQ識別番号23)を含んでなり、但しペプチド断片はアミノ酸配列順序HKDMQLGR(SEQ識別番号16)からならないとの条件下である。
【００６１】
本発明の別の側面は、以下のグループから選択されるアミノ酸配列順序を有するペプチドに関する：LRANISHKDMQCGR (_SEQ_ID_No._ 1), RANISHKDMQLGR (SEQ ID No. 2), ANISHKDMQLGR (SEQ ID No. 3), NISHKDMQLGR (SEQ ID No. 4), ISHKDMQLGR (SEQ ID No. 5), SHKDMQLGR (SEQ ID No. 6), KDMQLGR (SEQ ID No. 7), LRANISHKDMQLG (SEQ ID No. 8), RANISHKDMQLG (SEQ ID No. 9), ANISHKDMQLG (SEQ ID No. 10), NISHKDMQLG (SEQ ID No. 11), ISHKDMQLG (SEQ ID No. 12)およびSHKDMQLG (SEQ ID No. 13)。
【００６２】
しかしながら、本発明は、それに制限されずに、次の図および実施例においてさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図1は、hC5a(SEQ識別番号14)の以前に記述された20アミノ酸長の免疫原性C末端断片、およびそのN-およびC-末端部(SEQ識別番号7および24)の免疫原性試験を示す。
【図２】図2は、hC5aのC末端の20〜4つのアミノ酸をカバーするペプチド(SEQ識別番号1-7およびSEQ識別番号14-19)によって誘発されたhC5aへの免疫応答を示す。
【図３】図3は、hC5aのC末端の19〜6個のアミノ酸をカバーする、位置74のアルギニンを欠損するペプチド(SEQ識別番号8-13およびSEQ識別番号20-23)によって誘発されたhC5aへの免疫応答を示す。
【図４】図4は、SEQ識別番号1-7およびSEQ識別番号14-17での免疫化によって誘発された抗体の機能的な活性のアセスメントを示す。
【図５】図5は、SEQ識別番号8-13およびSEQ識別番号20-23での免疫化によって誘発された抗体の機能的な活性のアセスメントを示す。
【図６】図6は、本発明のSEQ識別番号3およびSEQ識別番号7での免疫化によって、ウサギ中でのヒトC5a-誘発された好中球減少症の防止を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
〈実施例〉
本発明の目的は、その病理学的活性を回避するために、過度のヒトC5aに対して中和する有効な免疫応答を開発することである。記述されたアプローチにおいて、C末端新エピトープ(それはC5転化酵素によってC5タンパク質の開裂で入手可能になる)がターゲットとされる。したがって、予防接種によって、宿主防御におけるC5bの役割は維持されるだろう。しかし、アナフィラトキシンC5aの過度の活性は遮断されると思われる。
【００６５】
材料および方法:
マウスの免疫化
【００６６】
雌のBALB/cマウス(6-8週齢)を、KLHを結合したペプチドワクチンで(リン酸塩のpH 7.4バッファー中の200μlで皮下に)初回免疫し、二週一回の間隔で4回追加免疫した。水酸化アルミニウムをアジュバントとして使用した。5〜6匹のマウスを、それぞれのKLHを結合したペプチドワクチンでの注射に使用した。実験を繰り返し、その代表を下に示す。
【００６７】
マウス血清の抗体価は酵素をリンクした免疫吸着剤分析(ELISA)によって分析した。
滴定量は、最大半分結合(すなわちODmax/2)を与える血清稀釈として計算された。そして、1つのグループ当たり5〜6匹のマウスの中央の滴定量が提示される。誘発された抗体の機能的な活性はグルクロニダーゼ酵素遊離分析によって評価された。
【００６８】
実施例1：以前に記述されたhC5aの20アミノ酸長の免疫原のC末端断片、そのN-およびC末端部分の免疫原性試験。
【００６９】
この実施例においては、ヒトC5aの20アミノ酸長のC末端断片(SEQ識別番号14)が、そのN末端(SEQ識別番号24)およびC末端部分(SEQ識別番号7)と同様に、免疫原性に関してテストされた。マウスは示されたペプチドで免疫された。また、hC5aに対する誘発された抗体の中央の滴定量は図1中に示される。
【００７０】
hC5a断片位置55-74(SEQ識別番号14)も、そのC末端部分(SEQ識別番号7)と同様に、そのN末端部分(SEQ識別番号24)ではなく、hC5aに対する滴定量を誘発することができた(図1)。したがって、20量体ペプチドのC末端部分(SEQ識別番号7)は、hC5aへの体液性免疫反応の誘導には決定的である。しかし、N末端断片(SEQ識別番号24)は無視できる。
【００７１】
実施例2：hC5aのC末端の20〜4つのアミノ酸をカバーするペプチド(SEQ識別番号1-7およびSEQ識別番号14-19)によって誘発されたhC5aへの免疫応答。
【００７２】
20〜4個のアミノ酸残基(表2中に示されるようなSEQ識別番号1-7およびSEQ識別番号14-19)である13のC末端hC5aから派生したペプチドが、hC5aに対する体液性免疫応答を誘発するそれらの能力に関してテストされた。
【００７３】
マウスは示されたペプチドで免疫された。また、hC5aに対する誘発された抗体の中央の滴定量は図2中に示される。全ての試験されたC末端ペプチドは、注入されたペプチドに結合する抗体を誘発することができたが(データは示されていない)、図2(黒枠部分)に示されるように、7つのペプチドだけがタンパク質hC5aに対する高い滴定量を誘発した。7つのアミノ酸より短いC末端ペプチド(SEQ識別番号17-19)は、hC5aへの適切な体液性免疫反応を誘発しない(図2)。すべての事例で、開裂されていないC5タンパク質に対する免疫応答は観察されなかった(データは示されず)。
【００７４】
実施例3：最終位置にアルギニンを持たないhC5aのC末端の19〜5個のアミノ酸をカバーするペプチド(SEQ識別番号8-13およびSEQ識別番号20-23)によって誘発されたhC5aへの免疫応答。
【００７５】
最後の位置でのアルギニンなしに10個のC末端hC5a誘導ペプチド(表2中に示されるようなSEQ ID No: 8-13 および_SEQ_ID_NO_ 20-23)が、hC5aに対する抗体を育てるために使用された。マウスは示されたペプチドで免疫された。また、hC5aに対する誘発された抗体の中央の滴定量は図3中に示される。テストされたペプチドはすべて、注入されたペプチドに結合する抗体を誘発することができた(データは示されず)。しかし、SEQ識別番号8-13およびSEQ識別番号22-23だけが、hC5aに対する高い応答を示した(図3、黒枠部分)。開裂されていないC5タンパク質に対する免疫応答は観察されなかった(データは示されず)。
【００７６】
実施例4：最後の位置でアルギニンを持った(SEQ識別番号1-7およびSEQ識別番号14-17)、およびアルギニンなし(SEQ識別番号8-13およびSEQ識別番号20-23)のC末端ペプチドでの免疫化によって誘発された抗体の機能的な活性のアセスメント。
【００７７】
タンパク質で誘発されたhC5aに対する抗体の阻害的な活性が、グルクロニダーゼ酵素遊離分析によって試験された。β-グルクロニダーゼはhC5aでの刺激上で分化したヒトU937セルから遊離される。この結果は、図4および5で示される、ペプチドに誘発された抗hC5a免疫血清の添加によって遮断することができる。
【００７８】
簡潔には、U937セルは、RPMI、10%FCS中の0.5mMサイクリックアデノシン3':5'-一燐酸(cAMP)で5日間分化させた。
5日目に、セルは37 ℃で10分間、サイトカラシンB(2.5μg/ml)で予備処理した。各アプローチについては、1.8×105個の予備処理されたセルは、25 nMのhC5aで単独で、または、25 nMのhC5aおよび異なるペプチド(表2中に示されるようなSEQ識別番号1-17およびSEQ識別番号20-23)で免疫されたマウスに由来した4%の血清で、最終体積120 μlのHAG-CMバッファー(20 mM HEPES pH= 7.4、125 mM NaCl、5 mM KCl、0.5 mMグルコース、1 mM CaCl2、1 mM MgCl2、0.25% BSA)の中で刺激された。37℃で10分の培養の後、セルをペレットにし、上澄みは96穴微量定量プレートに移し、150μlの全容積中の0.01MのP-ニトロフェニル-β-D-グルクロニド(0.1Mの酢酸ナトリウムpH=4.0中に溶解された)で1:1に希釈した。微量定量プレートを、暗やみの中、37℃で1h間培養した。その後、その反応を、0.4Mのグリシンバッファー(pH= 10.0)の添加によって停止した。β-グルクロニダーゼはP-ニトロフェニル-β-D-グルクロニドを405nmで読み取られる帯黄色の色に変換する。
【００７９】
図4および5には、ペプチドに誘発された免疫血清(6〜5匹の動物のプール)の添加で、およびその添加なしで、hC5aに刺激されたセルのグルクロニダーゼ遊離(405nmで吸収として示される)を示す。最良の抑制性の活性、SEQ識別番号1-7およびSEQ識別番号8-13での免疫血清は、本発明によって包含される(図4および5、黒枠部分)。
【００８０】
一般に、滴定量およびペプチドに誘発された血清の機能的な活性の良好な相関が観察された(図2、3、4および5)。しかしながら、SEQ識別番号16、22および23の免疫血清は、hC5aに対する良好な滴定量を誘発することができたが(図2および3)、グルクロニダーゼ分析において単に限りある機能的な活性を呈した(図4および5)。N末端でヒスチジン残基を持つか、または7つのアミノ酸残基より短いこれらのペプチドは、hC5aに対する機能的な有効な抗体を誘発せず、したがって、本発明のペプチドパネルから除外された。
【００８１】
実施例5：本発明(hC5aに対するペプチドに誘発された能動免疫処置)の生体内の評価。
【００８２】
補体活性化は、動物モデルにおける一時的な好中球減少/好中球増加症の誘発でよく知られている。ウサギにおける精製されたヒトC5aの注射は即時の好中球減少を示し、数分だけ継続し、4時間持続する重要な好中球増加症がそれに続いた。循環した好中球は、C5aによって活性化され、それによって変形され、および付着し、好中球減少、循環からのセルの隔離および消耗に結びつく。好中球減少のイベントの後、即時の好中球のレスポンスが、特にこの細胞集団の置換、およびホメオスタシスを再建することが必要とされる。
【００８３】
hC5aに対するペプチドに誘発された能動免疫処置の効果を、ウサギにおけるヒトC5aに誘発された好中球減少モデルの生体内モデルにおいてテストした。
【００８４】
ウサギの免疫化
ウサギ、オスのニュージーランドホワイトウサギ(6-8週齢)の免疫化は、KLHを結合したペプチドワクチンで皮下注射(下背での200μlおよびももの上の200μl)によって初回免疫し、二週に一回の4回追加免疫した。水酸化アルミニウムをアジュバントとして使用した。
4匹のウサギを、それぞれKLHを結合したペプチドワクチンでの注射に使用した。
【００８５】
SEQ識別番号14(表2);
本発明で請求したhC5aのC末端から誘導したペプチドの両方の代表、SEQ識別番号3およびSEQ識別番号7(表1);および担体蛋白質KLHだけを、上述の免疫法に使用した。3度めの追加免疫の後、ウサギはすべて、右耳の周縁の静脈に2μg/kg hC5aを注入した。また、血液は注射の6分後に左耳の中心動脈から採血した。顆粒球の数を決定し、hC5aの注射の2分前に採血した血液の顆粒球数と比較した。各グループのメジアン値を図6に示す。
【００８６】
この実施例は、KLHと共役したSEQ識別番号14ワクチンまたはKLHで単独で免疫されたウサギにおいてではなく、本発明の化合物の代表(SEQ識別番号3およびSEQ識別番号7 KLH-と共役したペプチドワクチン)で免疫されたウサギのhC5aに誘発された好中球減少症の明瞭な削減を明らかにした。
【００８７】
表1：本発明において活性ペプチドで誘発されたhC5aへの免疫反応に使用されたhC5aのC末端フラグメント。
【表１】
0006016803.tif 000002
【００８８】
表2：実施例1、2および3に記載されているような免疫原性試験に使用されたペプチド。
【表２】
0006016803.tif 000003
【図１】
0006016803.tif 000004
【図２】
0006016803.tif 000005
【図３】
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【図４】
0006016803.tif 000007
【図５】
0006016803.tif 000008
【図６】
0006016803.tif 000009
【配列表】
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