(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体培地を受容できるチャンバー（１００）と、灌流フィルター（２１０、２１２、２１４）を備えるフィルターアセンブリ（２００）とを含み、前記フィルターアセンブリ（２００）が前記チャンバー（１００）内に配置され、前記フィルターアセンブリ（２００）が前記チャンバー（１００）内で自由に移動するバイオリアクターであって、
前記フィルターアセンブリ（２００）が、前記フィルター（２１０、２１２、２１４）を通過する回収流を連結する手段と、前記回収流とは逆方向に前記フィルターを通過する供給流を連結する手段とを備えており、前記供給流が供給ポンプ（３３０）によって前記バイオリアクターに送り込まれ、前記回収流が回収ポンプ（３４０）によって前記バイオリアクターから送り出され、前記フィルターアセンブリが２つ以上のフィルター（２１１、２１２、２１３、２１４）を備えていて、前記供給流が前記２つ以上のフィルター（２１１、２１２、２１３、２１４）の間に流れるように導かれることを特徴とするバイオリアクター。
【請求項２】
前記流れを連結する手段が前記フィルターアセンブリに取り付けられた可撓性管を備える、請求項１記載のバイオリアクター。
【請求項３】
前記フィルターアセンブリ（２００）が、前記供給流及び前記回収流をそれぞれ連結する手段を備える、請求項１又は請求項２記載のバイオリアクター。
【請求項４】
前記フィルターアセンブリ（２００）が前記供給流と前記回収流を同軸に連結する手段を備える、請求項１乃至請求項３のいずれか記載のバイオリアクター。
【請求項５】
前記供給流が前記回収流の周囲に同軸に配置される、請求項４記載のバイオリアクター。
【請求項６】
請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載のバイオリアクターを操作する方法であって、
回収ポンプ（３４０）によって回収流を前記灌流フィルター（２１０、２１２、２１４）を通して前記バイオリアクターから除去するステップと、
供給流を前記２つ以上のフィルター（２１１、２１２、２１３、２１４）の間に流れるように導くことによって供給ポンプ（３３０）で供給流を前記灌流フィルター（２１０、２１２、２１４）を通して前記バイオリアクターに供給するステップと
を含み、前記回収流が前記供給流とは逆方向に前記灌流フィルター（２１０、２１２、２１４）を通過して除去される、方法。
【請求項７】
当該方法が、先ず特定の体積の前記回収流を前記バイオリアクター（１００）から除去し、次いで実質的に同じ体積の前記供給流を前記バイオリアクター（１００）に供給する方式で実施される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記回収流の除去と前記供給流の供給が周期的な間隔で行われる、請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、灌流フィルターを備えるバイオリアクター並びに灌流フィルターを備えるバイオリアクターの操作方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子工学及びバイオテクノロジーの革新により、近年、細胞培養が多大な関心を集めている。例えば、治療、研究及び診断用のタンパク質、受容体、ワクチン及び抗体を生産するために細胞が培養されている。
【０００３】
灌流培養が、比較的経済性に優れた細胞培養法であることは長く認識されている。この操作では、細胞をバイオリアクター内に保持し、生成物を毒性代謝副産物と共に連続的に除去する。栄養素を含む供給液がバイオリアクターに連続的に添加される。灌流培養操作では、高い細胞密度を達成することができ、さらに重要なことには、細胞を数週間にわたって生産性の高い状態に維持することができる。こうして収率を高めることができ、必要とされるバイオリアクターのサイズを縮小することができる。これは、初代細胞又はその他の増殖が遅い細胞を培養するための有用な技術でもある。
【０００４】
灌流操作は、ここ数年で大幅に開発が進んだ。米国特許第６，５４４，７８８号明細書には、バイオリアクターから細胞を失わずに液体を除去できる灌流フィルターを備える従来技術のバイオリアクターが開示されている。灌流フィルターは、培地に対して中性浮遊（neutrally buoyant）であるように構成される。灌流フィルターは、バイオリアクターの揺動運動と共に自由に動くことができるように、バイオリアクター内部に配置される。フィルターの底面は、液体透過性であるが、細胞を保持する膜からなる。可撓性管によって、本質的に細胞を含まない濾液をフィルターの内側から取り出せるようにする。バイオリアクターが揺動すると、フィルターが培地中で前後に素早く動く。この前後運動は、フィルターを洗浄し、酷い目詰まりを起こさずに操作できるようにする。栄養素供給液をバイオリアクター内に送り込み、回収濾液を連続的に又は周期的な間隔で除去する。
【０００５】
上述の灌流フィルターは、フィルターの目詰まりを十分に防ぐが、灌流フィルターの目詰まり防止を向上させ、灌流フィルターの操作耐久性を高めることが依然としてさらに望まれている。
【０００６】
米国特許第５０３２５２４号明細書、国際公開第２００７０７６８６５号パンフレット及び仏国特許第２６７９２４８号明細書は、バイオリアクターのフィルターの目詰まりの問題に対処したものである。これらの各文献には、液体培地の再循環を含むシステムが提案されている。しかし、こうしたシステムは、フィルターアセンブリがチャンバー内で自由に動くバイオリアクターで実施するのが難しい。
【０００７】
本発明の目的は、上述のタイプのバイオリアクターを改良して、バイオリアクター内の灌流フィルターの目詰まり防止を向上させることである。他の目的は、灌流フィルターの操作耐久性を高めることである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第２００３００３６１９２号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上述の目的は、添付の特許請求の範囲に記載された本発明に係るバイオリアクターによって達成される。
【００１０】
本発明では、液体培地を受容できるチャンバーと、灌流フィルターを備えるフィルターアセンブリとを含むバイオリアクターを提供する。フィルターアセンブリはチャンバー内に配置され、フィルターアセンブリはチャンバー内で自由に移動する。フィルターアセンブリは、前記フィルターを通過する回収流を連結する手段と、回収流とは逆方向に前記フィルターを通過する供給流を連結する手段とを備える。
【００１１】
上述の目的は、バイオリアクターを操作する方法によっても達成されるが、前記バイオリアクターは、液体培地を受容できるチャンバーと、灌流フィルターを備えるフィルターアセンブリとを含んでいて、フィルターアセンブリがチャンバー内に配置され、フィルターアセンブリがチャンバー内で自由に移動し、当該方法は、回収流を前記灌流フィルターを通してバイオリアクターから除去し、供給流を前記灌流フィルターを通してバイオリアクターに供給することを含む。回収流は、供給流とは逆方向に前記灌流フィルターを通過して除去される。
【００１２】
このようにして、フィルターの目詰まりの低減によって灌流細胞培養を行うことができる操作期間を延ばすことができる。本発明は、フィルターの過度の目詰まりを起こさずに灌流操作を行うことのできる低価格の細胞培養バイオリアクターを提供する。
【００１３】
流れを連結する手段は、フィルターアセンブリに取り付けられた可撓性管を備えることができる。可撓性管は、流れを効果的に供給又は回収しながら、バイオリアクター内の灌流フィルターを望ましく移動させることができる。
【００１４】
フィルターアセンブリは、それぞれ供給流及び回収流を連結するための別個の手段を備えていてもよい。システムを簡素化し、供給流と回収流とが互いに接触しないように保つため、供給流を供給ポンプによってバイオリアクターに送り込み、回収流を回収ポンプによってバイオリアクターから送り出す。こうすると、２つの流れの混合が阻止される。従って、確実に、回収流が望ましい無細胞生成物を含み、回収流中の栄養素の量が最小限に抑えられる。これは、栄養素がしばしば高価であり、栄養素損失の量を最小限に抑えなければならないために重要である。
【００１５】
フィルターアセンブリは、供給流と回収流を同軸に連結する手段を備えていてもよい。供給流を回収流の周囲に同軸に配置することができる。この構成によって、起こり得る乱流が防止される。この構成は、また、単一の同軸管接続しか必要とされないので、２つの別個の管をもつ構成よりもバイオリアクターバッグ内でのフィルターの移動に対する障害が少なく、バッグ内でフィルターが自由に移動できる。
【００１６】
フィルターアセンブリは、２つ以上のフィルターを備えていてもよく、回収液の濾過を向上させることができる。次いで、供給流を２つ以上のフィルターの間を流れるように導くことができる。この構成により、フィルターアセンブリ内に捕集できる供給液の量を最小限に抑えることができる。さらに、乱流を防止することができる。
【００１７】
バイオリアクターの操作方法は、先ず特定の体積の回収流をバイオリアクターから除去し、次いで実質的に同じ体積の供給流をバイオリアクターに供給する方式で実施することができ、回収流中の栄養素量を最小限に抑えることができる。回収流の除去及び供給流の供給は周期的な間隔で行うことができる。
【００１８】
以下の詳細な説明及び本発明を実施する方法の例を示す図から、本発明のさらなる態様及び利点が明らかになるであろう。
【００１９】
本発明を示すために、バイオリアクターの従来技術の構成及び本発明の好ましい実施形態を図面に示したが、理解されるように、本発明は図面に示した正確な形態に限定されないものである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】従来技術の灌流バイオリアクターを示す断面図である。
【図１ａ】従来技術のフィルターアセンブリを示す断面図である。
【図２】流れ制御回路を有する本発明に係るバイオリアクターの一実施形態を示す概略図である。
【図３】回収流及び供給流のための同軸連結部を有する灌流フィルターアセンブリの一実施形態を示す概略図である。
【図４】供給流のための縁部連結部を有する灌流フィルターアセンブリの一実施形態を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
波動式撹拌に基づく灌流バイオリアクターとしては、限定されるものではないが、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製のＷＡＶＥ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（商標）システムが挙げられる。こうしたバイオリアクターは、培地で部分的に充填され、堅くなるまで膨らませたプラスチックバッグなどのチャンバーを備える。本明細書でバイオリアクターバッグとも呼ばれるチャンバーは、揺動プラットホーム上に配置され、揺動プラットホームは、所定の角度及び所定の揺動速度でチャンバーを前後に動かす。揺動運動は、培地中に波を惹起し、いずれも良好なバイオリアクター性能に不可欠な撹拌及び酸素移動を促進する。
【００２２】
灌流フィルターは、培地に対して中性浮遊となるように構成され、例えば、米国特許第６，５４４，７８８号に記載されているように設計することができる。
【００２３】
図１に従来技術のバイオリアクターを示す。バイオリアクターは、培地及び細胞１１で部分的に（１０％〜８０％）充填したプラスチックバッグ１０を備える。チャンバーの残りは膨らませて、ガスで充填されたヘッドスペース１２からなる。細胞代謝に必要とされる酸素は、滅菌入口フィルター１３を通して導入される空気（又は他の酸素富化ガス）によって供給される。排気は、チャンバーから排出フィルター１４を通して通気される。バッグ１０は、回転軸１６を中心に前後に移動する揺動プラットホーム１５に取り付けられる。通常の揺動速度は、水平面から２〜２０度の角度で毎分１０〜３０回の揺動である。灌流フィルター２０は液体表面１７上に浮揚する。図１ａから分かるように、灌流フィルター２０の下面は液体透過性膜２１からなり、浸漬される。この膜２１は、細胞が通過できないポロシティを有する。フィルター膜２１は、平均孔径７ミクロンの焼結多孔質ポリエチレンシート（Ｐｏｒｅｘ  Ｔ３）でもよい。ナイロン及びポリエチレンなど、他の適したプラスチックも使用できる。濾過膜２１は、非多孔質上層２６に熱融着される。濾液管２２を簡単に取り付けることができるように、ホースバルブポート２７が上層２６に取り付けられる。この従来技術の解決法では、可撓性の濾液管２２に吸引力を加えて、無細胞濾液２３をフィルター２０内に吸い込んで、バイオリアクターから除去する。可撓性管２２はフィルター２０の唯一の取り付け点である。濾過膜２１が上層２６にべったりと吸引されて流れが詰まるのを防ぐため、ポリエチレンメッシュ２４をフィルター２０内部に配置してもよい。フィルターアセンブリ２０全体を熱融着継目２５でシールしてもよい。栄養素は別の入口ポート３０を介してバイオリアクターに供給される。
【００２４】
本発明では、図２に示すように、灌流フィルター２１０はフィルターアセンブリ２００に内蔵され、フィルターアセンブリ２００は、回収流管２２０（本明細書では濾液管ともいう。）及び供給流管３００をフィルターアセンブリ２００に連結する手段をさらに備えていて、回収流と栄養素を含む供給流とが灌流フィルター２１０を通して反対方向に流れることができるようにする。揺動プラットホーム１５０、バイオリアクターバッグ１００、可撓性管２２０、３００の材料、及び灌流フィルター２１０のタイプは、上述の従来技術のバイオリアクターに関連して説明するとともに図１及び１ａに示したものと同様であっても或いは対応する特徴を有するものであってもよい。
【００２５】
流管２２０、３００をフィルターアセンブリに取り付ける手段は、例えば、可撓性管２２０、３００を連結するホースバルブポートを含むことができる。当業者には明らかなように、液密且つ／又はガス密連結部を提供する任意の他の適した取り付け手段を使用することもできる。
【００２６】
可撓性管２２０、３００は、バイオリアクターバッグ１００の壁を通して連結される。可撓性管２２０、３００は、フィルターアセンブリ２００が液体表面１７０上で自由に移動できるように十分な可撓性をもつ。必要に応じて、バイオリアクターの壁に対する可撓性管２２０、３００の長さ及び位置は、灌流フィルターアセンブリ２００の運動を幾分制限して、例えば、フィルターアセンブリ２００がバイオリアクター１００の壁に衝突するのを防ぐように構成してもよい。そうすると、灌流フィルターの操作耐久性をさらに高めることができる。
【００２７】
灌流フィルター２００及びバイオリアクターバッグ１００はγ線照射によってその場で滅菌することができる。使用に際して、バッグ１００に増殖促進無菌栄養培地が充填される。細胞を加えて、バッグ１００を揺動プラットホーム１５０上に配置する。バイオリアクターを揺動し、通気して細胞の増殖を促進する。
【００２８】
本発明に係るバイオリアクターは、さらに図２に示すように、操作することができる。バイオリアクターから回収する。すなわち、回収ポンプ３４０のスイッチを入れて、回収流（無細胞濾液）をフィルター２１０内に取り込んで、バイオリアクターから除去する。このポンプは、所望の量の濾液を灌流フィルター２１０を通して吸引し、回収槽３５０内に送る。回収槽は、回収槽３５０の重量を測定するための重量センサーなど手段３１０を備えるフックによってつり下げられる。制御装置５００は、回収槽３５０の重量の増加の測定によって、所定及び／又は所望の重量の回収液が回収槽３５０に送られるまでポンプ３４０のスイッチを入れた状態にする。次に、供給ポンプ３３０のスイッチを入れる。栄養素が回収槽３５０と同じフックにつり下げられた供給容器３２０から供給される。供給速度は供給ポンプ３３０によって制御される。この供給ポンプ３３０は、制御装置５００によって断続的に操作され、フィルターアセンブリ２００に連結された可撓性管３００を介して供給液をバイオリアクターバッグ１００に送り込む。制御装置５００は、供給容器３２０の重量の減少の測定によって、所定の重量の供給液がバイオリアクターバッグ１００に送られるまで供給ポンプ３３０に電源を入れて作動させる。供給量がバイオリアクターバッグ１００から回収された回収量と等しくなる。次いで、このサイクルを繰り返す。サイクルの頻度は、所望の全体的灌流速度が得られるように調整できる。供給液の累積添加量と回収液の累積除去量は重量センサー３１０のサイクリングから容易に計算することができる。
【００２９】
本発明の他の変形形態では、先ず栄養素の供給流をバイオリアクターバッグ１００に添加し、次いで回収液を回収することによって、バイオリアクターバッグ１００を操作することもできる。制御システム５００は、上記と同様に機能する。先ず供給液を添加する場合、供給容器３２０の重量の減少を測定し、次いで回収液の量がリアクター１００への供給液の添加量と等しくなるようにする。この構成によって、培養中の栄養素のレベルを比較的高く保持することができる。
【００３０】
本発明の一変形形態では、それぞれ供給容器３２０及び回収槽３５０は、それぞれ重量センサーのような重量測定手段を含む。こうした構成では、制御システム５００は、それぞれ各センサーから情報を受けるように適合され、その後、回収量と供給量が等しくなるように適合させる。この構成により、システムの正確さをさらに向上させることができる。
【００３１】
本発明の他の実施形態では、重量センサー又は計量機構などの重量測定手段は、バイオリアクターの揺動プラットホーム１５０内に組み込まれる。制御システム５００は、上記と同様に機能する、すなわち、制御システムは回収液量がリアクター１００への供給液の添加量と等しくなるようにする。こうした構成により、システムをよりコンパクトに構成することができる。
【００３２】
灌流操作では、細胞がバイオリアクターから流出しないことが重要である。さもなければ、細胞が洗い流されることによって、バイオリアクター内の細胞濃度が低下する。実際には、少量の細胞損失（＜１０％）は、死細胞、又は瀕死細胞を除去し、低レベルの細胞の再増殖を向上させるために許容される。ポンプ又はフィルターの故障を警告するように警報をプログラミングして、価値のある細胞の損失を防ぐことができる。
【００３３】
図３に、フィルターアセンブリ２００’が供給流３００’及び回収流２２０’のための同軸に配置された可撓性管を備える一実施形態を示す。可撓性管は単一の同軸連結手段２７０’を介してフィルターアセンブリ２００’に連結される。この連結手段は、回収流と供給流の両方に入口を設ける任意の適した構成でよく、前記フィルターアセンブリ２００’に取り付けることができるものであるが、図面にはそれ以上の詳細は示していない。図３に示すように、供給流３００’は、回収流２２０’の周囲に配置され、フィルターアセンブリ２００’の周囲から第２の灌流フィルター２１２に移動するように導かれる。回収流２２０’は、濾液の除去に関連して、フィルター２１１と２１２の両方を通って移動する。それによって、回収流２２０’は、供給流３００’と逆方向に灌流フィルター２１２を通ってバイオリアクターバッグから除去され、回収流の濾過の向上が得られる。この構成により、フィルターアセンブリ内に捕集できる供給流の量を最小限に抑えることができる。また、乱流を回避することもできる。同軸に配置された供給流及び回収流を、単一の灌流フィルターを通してバイオリアクターバッグに、すなわち、図２に関連して示したのと同様の方法で向けることもできる。
【００３４】
他の変形形態（図示せず）では、回収流管と供給流管を隣り合わせに、又はフィルターアセンブリ上で平行に互いに接近するように取り付けることができる。次いで、供給流を、図３に関連して示したのと同様の方法で、フィルターアセンブリの周囲を流れ、第２の灌流フィルターを通過してバイオリアクターバッグに供給されるように配置することができる。供給流を、図２に示すものと同様の方法で、単一灌流フィルターを通過して流れるように配置することもできる。供給流と回収流を隣り合わせに、且つ／又は平行に連結する手段を配置することによって、バイオリアクター内のフィルターアセンブリの自由な動きを確保することができる。
【００３５】
図４に本発明の他の実施形態を示す。フィルターアセンブリ２００”は、２つの灌流フィルター２１３及び２１４を備える。フィルターアセンブリ２００”は、供給流用の可撓性管３００”及び回収流用の管２２０”を備える。供給流管３００”はフィルターアセンブリ２００の縁部に取り付けられ、供給流は２つの灌流フィルター２１３と２１４の間に導かれる。この構成によっても、フィルターアセンブリ内部に捕集できる供給流の量を最小限に抑えることができる。また、乱流を回避することもできる。
【００３６】
上述のように、本発明によれば、灌流フィルターの表面上に発生させる逆流により、長期間にわたり、灌流フィルターを目詰まりしないように保持することができる。目詰まりが、容易に、経済的に、且つ有効に防止される。
【００３７】
本発明を特定の実施形態及び用途に関して記載してきたが、当業者は、この教示を踏まえて、特許請求する本発明の範囲を超えることなく、又はその精神から逸脱することなく、追加の実施形態を作製することができる。例えば、灌流バイオリアクターシステムの様々な要素の特定の組成物は、限定要因であると考えられるべきではない。従って、理解されるように、本開示の図面及び記載は、本発明の理解を容易にするために提案されるものであり、本開示の範囲を限定するもと解釈すべきではない。
【符号の説明】
【００３８】
１０、１００  バッグ
１１  培地及び細胞
１２  ヘッドスペース
１３  入口フィルター
１４  排出フィルター
１５、１５０  揺動プラットホーム
１６  回転軸
１７、１７０  液体表面
２０、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４  灌流フィルター
２１  膜
２２  濾液管
２３  濾液
２４  メッシュ
２５  継目
２６  上層
２７  ホースバルブポート
３０  入口ポート
２００、２００’、２００”  フィルターアセンブリ
２２０、２２０”  回収流管
２２０’  回収流
２７０、２７０’  連結手段
３００、３００”  供給流管
３００’  供給流
３１０  重量センサー
３２０  供給容器
３３０  供給ポンプ
３４０  回収ポンプ
３５０  回収槽
５００  制御装置
【図１】
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【図１ａ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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