(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトプロガストリン（ｈＰＧ）のＣ末端領域に特異的に結合する、抗ｈＰＧモノクローナル抗体であって、
以下のＶＨ及びＶＬ  ＣＤＲ配列：
（ｉ）配列番号３７のＶＨＣＤＲ１，配列番号４１のＶＨＣＤＲ２，配列番号４５のＶＨＣＤＲ３，配列番号４９のＶＬＣＤＲ１，配列番号５２のＶＬＣＤＲ２，及び配列番号５５のＶＬＣＤＲ３；又は
（ｉｉ）配列番号３８のＶＨＣＤＲ１，配列番号４２のＶＨＣＤＲ２，配列番号４６のＶＨＣＤＲ３，配列番号５０のＶＬＣＤＲ１，配列番号５３のＶＬＣＤＲ２，及び配列番号５６のＶＬＣＤＲ３
を含む、抗ｈＰＧモノクローナル抗体。
【請求項２】
前記抗ｈＰＧモノクローナル抗体が、非特異的モノクローナル抗体を用いて処理された対照サンプルと比較して、テストサンプルのインビトロで処理後の生結腸直腸癌細胞数における統計的に有意な低下をもたらす、請求項１のモノクローナル抗体。
【請求項３】
ヒト化されている、請求項１〜２のいずれか一項記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
ＶＨ及びＶＬ配列の以下の群：
【表３３】
0005985987.tif 000033
の１つより選択される配列を有するＶＨ及びＶＬ鎖を含む、請求項３記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
１pM〜７nMの範囲内の親和性を有する、請求項１〜４のいずれか一項記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
前記結腸直腸癌細胞株がＬＳ１７４Ｔ細胞である、請求項２記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項記載のモノクローナル抗体ならびに賦形剤、担体、及び／又は希釈剤を含む、組成物。
【請求項８】
被験体に、結腸直腸癌を処置するために効果的なヒト化中和抗ｈＰＧモノクローナル抗体の量を投与することを含む、結腸直腸癌を処置する方法において使用するための、ヒト化中和抗ｈＰＧモノクローナル抗体を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項記載の抗ｈＰＧモノクローナル抗体を発現させるために適したポリヌクレオチドの対を用いて形質転換した宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１、２、５及び６のいずれか一項記載の抗ｈＰＧモノクローナル抗体を分泌することが可能なハイブリドーマ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連出願の相互参照
本願では、２００９年１０月１６日を出願された仮出願の３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．  §  １１９（ｅ）の下での利益を主張し、その全ての内容が、参照により、その全体において本明細書に組み入れられる。
【０００２】
２．連邦支援研究に関する記述
なし。
【０００３】
３．共同研究契約の当事者
なし。
【０００４】
４．配列表、表、又はコンピュータープログラムの参照
配列表が本明細書と共に含まれる。
【０００５】
５．発明の属する技術分野
本開示は、とりわけ、プロガストリンに対するモノクローナル抗体、そのような抗体を作製するための組成物及び方法、ならびに、例えば結腸直腸癌の診断及び／又は処置においてそのような抗体を使用する方法に向けられる。
【０００６】
６．背景
結腸直腸癌（ＣＲＣ）は主要な公衆衛生の問題であり、毎年１００万人を超える人々に罹患し、毎年５０万人を超える死亡の主な原因となる。ＣＲＣは、癌による第２位の死亡原因である。米国だけでも、２００９年には、およそ１４７，０００の新たな症例及び４９，９００を上回るＣＲＣによる死亡が報告された。３形態：散発性ＣＲＣ；遺伝性非ポリポーシス大腸癌（ＨＮＰＣＣ）（ＤＮＡミスマッチ修復遺伝子中の生殖系列変異を原因とする）；及び家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）（ＡＰＣ遺伝子中の生殖系列変異による）のＣＲＣがある。散発的ＣＲＣが症例の８５%近くを占め、ＨＮＰＣＣが約５%を占め、ＦＡＰが約１%を占める（Heyer et al., 1999, Oncogene 18: 5325-5333）。
【０００７】
ＣＲＣの臨床管理は、典型的には、化学療法をしばしば伴う、腫瘍の外科的切除を含む。現在、ＣＲＣ患者の約５０%が、診断の５年以内に死亡する。信頼できるスクリーニングテストの欠如及び現在利用可能な治療の無効性が、高い死亡率の主要な原因である。ＣＲＣを診断するための新たな臨床アプローチ、ならびに、本来なら健常である組織に最小限の有害作用を有する結腸直腸癌腫瘍に対して効果的な処置についての緊急の必要性がある。
【０００８】
７．要約
本願は、動物（ヒトを含む）において結腸直腸癌（ＣＲＣ）を診断及び／又は処置するために有用な組成物及び方法を提供する。本願に記載する種々の発明は、部分的には、プロガストリン（ＰＧ）、例えば、ヒトプロガストリン（ｈＰＧ）（ＣＲＣ腫瘍細胞により産生されるポリペプチド）に特異的に結合し、ＣＲＣのインビトロモデルにおいて抗増殖特性を示すモノクローナル抗体の出願人の発見に基づく。
【０００９】
プロガストリンが結腸直腸腫瘍細胞により産生され、細胞の正常な分化プロセス（細胞死に導くそれらのプロセスを含む）を遮断するシグナル伝達経路を引き起こすことにより、これらの細胞の増殖を刺激すると考えられる。プロガストリンをコードするガストリン遺伝子転写物の枯渇が、インビトロ及びインビボＣＲＣモデルにおいて腫瘍細胞の細胞分化及びプログラム細胞死を誘導し、腫瘍細胞増殖を低下させる。操作の任意の理論により拘束されることを意図しないが、ＰＧの結合を通じて、抗ｈＰＧ抗体は、そのシグナル伝達パートナーと相互作用するその能力を遮断又は阻害すると考えられる。これは、次に、本来なら増殖に導きうる、結腸直腸腫瘍細胞におけるシグナル伝達経路を阻害する。
【００１０】
したがって、一局面において、本開示は、ＰＧ、例えば、ｈＰＧに特異的に結合するが、しかし、ガストリン遺伝子の他の産物には結合しないモノクローナル抗体を提供する。図１を参照し、ガストリン遺伝子は、１０１アミノ酸ポリペプチド（プレプロガストリンと呼ばれる）に翻訳され、それは、切断され、プロガストリン（８０アミノ酸ポリペプチド）を生じるシグナル配列（下線）を含む。プロガストリンは、順に、切断され、３４アミノ酸産物（プロガストリンの残基３８〜７１に相当する）を生成し、それは、次に、そのカルボキシ末端でグリシン残基を用いて伸長され、グリシン伸長Ｇ３４（「Ｇ３４−Ｇｌｙ」）を生成する。この切断の副産物は、５アミノ酸ペプチド（Ｃ末端隣接ペプチド又はＣＴＦＰと呼ばれる）であり、プロガストリンの残基７５〜８０を含む。Ｇ３４−Ｇｌｙは次にさらに切断され、１７残基ポリペプチド（プロガストリンの残基５５〜７１に配列において相当し、Ｇ１７−Ｇｌｙとして言及される）を生成する。Ｇ３４−Ｇｌｙ及びＧ１７−ＧｌｙのＣ末端グリシンの除去、それに続くＣ末端アミド化は、それぞれＧ３４及びＧ１７をもたらし、その両方がＣ末端アミド化される。このように、プロガストリンの最初の３７残基はそれに固有であり（即ち、そのプロセシング産物、例えばＧ３４、Ｇ３４−Ｇｌｙ、Ｇ１７、Ｇ１７−Ｇｌｙ、又はＣＦＴＰなどに存在しない）、残基３８〜８０もガストリン遺伝子の翻訳後産物中に存在する。
【００１１】
出願人は、抗ＰＧモノクローナル抗体を当業者に公知の方法を使用して産生させることができ、抗原の選択が重要であることを発見している。ｈＰＧに由来する全ての抗原が、生理学的条件下でｈＰＧに特異的に結合するモノクローナル抗体の産生を刺激するわけではない。以下に記載する通り、ｈＰＧに対するポリクローナル抗体を産生するために使用される種々の抗原、例えば全長組換えヒトプロガストリン（例、Singh  ＷＯ  ０８／０７６４５４を参照のこと）及びｈＰＧのＣ末端の最後の１０アミノ酸に相当するペプチド（例、Hollande  ＷＯ  ０７／１３５５４２を参照のこと）などは、抗ｈＰＧモノクローナル抗体を生成しなかった。出願人は、しかし、ｈＰＧに特異的に結合するモノクローナル抗体を生成するために使用することができるｈＰＧ配列内の抗原性Ｎ及びＣ末端配列を発見している。非常に驚くべきことに、出願人は、ＰＧに特異的に結合するが、他のガストリン遺伝子由来産物には結合しないモノクローナル抗体を得るために、抗原配列を、それに固有であるＰＧ配列のストレッチに限定する必要がないことを発見している。ガストリン遺伝子の他の産物（例えば、Ｇ１７、Ｇ３４、及びＣＴＦＰ）と共通の配列を有するペプチド抗原は、ｈＰＧに結合するだけでなく、それに特異的に結合するモノクローナル抗体をもたらした。
【００１２】
出願人は、ｈＰＧ分子の異なる領域に由来する抗原を使用してモノクローナル抗体を生成している。ｈＰＧのＮ末端領域に相当する配列を有する、及び／又はｈＰＧのＮ末端領域に結合するペプチド抗原を使用して入手可能なモノクローナル抗ＰＧ抗体は、本明細書において「Ｎ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体」として言及される。Ｎ末端抗ＰＧモノクローナル抗体を得るために有用な免疫原を構築するために使用することができる特定の例示的な抗原性領域は、ｈＰＧの残基１〜１４：ＳＷＫＰＲＳＱＱＰＤＡＰＬＧ（配列番号２５）に相当する。Ｎ末端抗ＰＧモノクローナル抗体を得るために有用なこの抗原を含む例示的な免疫原が、表１Ａ及び実施例セクションに記載されている。
【００１３】
ｈＰＧのＣ末端領域に相当する配列を有する、及び／又はｈＰＧのＣ末端領域に結合するペプチド抗原を使用して入手可能なモノクローナル抗ＰＧ抗体は、本明細書において「Ｃ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体」として言及される。Ｃ末端抗ＰＧモノクローナル抗体を得るために有用な免疫原を構築するために使用することができる特定の例示的な抗原性領域は、ｈＰＧの残基５５〜８０：ＱＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦＧ  ＲＲＳＡＥＤＥＮ（配列番号２７）に相当する。Ｃ末端抗ＰＧモノクローナル抗体を得るために有用なこの抗原を含む例示的な免疫原が、表１Ｂ及び実施例セクションに記載されている。
【００１４】
一部の使用のために、ｈＰＧへの高親和性を伴う抗ｈＰＧモノクローナル抗体を有することが望ましい。特定の使用（例えば治療的使用など）のために、少なくとも約１００nMの親和性が望ましいが、より大きな親和性、例えば、少なくとも約９０nM、８０nM、７０nM、６０nM、５０nM、４０nM、３０nM、２５nM、２０nM、１５nM、１０nM、７nM、６nM、５nM、４nM、３nM、２nM、１nM、０．１nM、０．０１nM、又はそれより大きな親和性を有する抗体が望ましいであろう。本明細書に開示する種々の特定の例示的な抗ＰＧモノクローナル抗体は、１０−６M〜１０−１２Mの範囲の親和性を示す（表６を参照のこと）。特定の所望の適用のために特に適した親和性を有する抗ＰＧモノクローナル抗体は、これらの内から容易に選択することができる、あるいは、本明細書に記載する種々の免疫原、相補性決定領域（ＣＤＲ）配列、可変重鎖ＶＨ及び可変軽鎖ＶＬ配列ならびに方法を使用して生成又は設計することができる。任意の特定の抗ＰＧモノクローナル抗体の親和性は、当技術分野において周知である又は本明細書に記載する技術（例えば、ＥＬＩＳＡ、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、ＢＩＡｃｏｒｅ、又は蛍光偏光アッセイなど）を使用して決定することができる。
【００１５】
ｈＰＧは比較的小さなポリペプチドであり、わずか８０アミノ酸の長さである。比較的高い親和性（例、少なくとも約１０nM）でｈＰＧに特異的に結合する任意のモノクローナル抗体は、そのシグナル伝達パートナーと相互作用するＰＧの能力を妨害し、結果として、ＣＲＣ細胞の増殖を阻害しうることが期待されていたであろう。しかし、出願人は、全ての抗ＰＧモノクローナル抗体が中和するとは限らない（即ち、ＰＧに結合する全てのモノクローナル抗体が、その生物学的シグナル伝達活性を妨害又は阻害するわけではない）ことを発見している。実際に、実施例セクションにおいて詳細に考察する通り、出願人は、一部の抗ＰＧモノクローナル抗体が、ＰＧについて高い特異性及び高い親和性を示すにもかかわらず、ＰＧを中和しないことを発見している。例えば、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１４は約６pMのＫＤでｈＰＧ結合するが、しかし、以下の実施例セクションにおいて詳述する通り、インビトロでのＣＲＣ細胞の成長を阻害しない。ｈＰＧに特異的に結合する非中和モノクローナル抗体は、診断目的のために有用であるが、ＰＧを中和するそれらの抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、ＣＲＣを処置するための治療的適用に特に適している。
【００１６】
本明細書において使用する通り、「中和抗ｈＰＧモノクローナル抗体」は、非特異的モノクローナル抗体を用いて処理された対照サンプルと比較して、抗ｈＰＧモノクローナル抗体を用いて処理されたテストサンプルにおいて生ＣＲＣ細胞数の統計的に有意な低下をもたらす抗ｈＰＧモノクローナル抗体である。ｈＰＧを中和する任意の特定の抗ｈＰＧモノクローナル抗体の能力を評価するための特定のアッセイが、以下の詳細な説明のセクションに記載されている。このアッセイにおいて生細胞数において少なくとも約５０%低下を示すそれらの抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、ＣＲＣの処置において特に有用であると考えられるが、中和活性のより低いレベル（例えば、このアッセイにおける生細胞数の４０%、３０%、２０%、１５%、又はさらに１０%の統計的に有意な低下）を示す抗ｈＰＧモノクローナル抗体が治療的利益を提供することが期待される。
【００１７】
したがって、一部の実施態様において、抗ＰＧモノクローナル抗体は中和抗ＰＧモノクローナル抗体である。ＰＧを中和する抗ＰＧモノクローナル抗体の能力がエピトープ依存性ではないことが発見されている。実施例セクションにおいて例示される通り、Ｎ末端及びＣ末端抗ＰＧ抗体の両方が中和活性を有する。このように、一部の実施態様において、中和抗ＰＧモノクローナル抗体はＮ末端中和抗体であり、他の実施態様において、抗ＰＧモノクローナル抗体はＣ末端中和抗体である。
【００１８】
エピトープマッピングによって、Ｎ末端抗ＰＧモノクローナル抗体は、同じ免疫原に対して産生された場合でさえ、全てが同じエピトープに結合するわけではないことが明らかになる。同じことが、Ｃ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体にも当てはまる。例示的なＮ末端及びＣ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体により結合されるエピトープが、アラニンスキャニング及びＳＰＯＴ技術を介して同定され、実施例セクションに、表８及び表９に示される。
【００１９】
一部の実施態様において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、ｈＰＧのＮ末端部分に相当するアミノ酸配列を含むエピトープに結合する。特定の実施態様において、Ｎ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、ｈＰＧの残基１０〜１４（配列番号２８）、ｈＰＧの残基９〜１４（配列番号２９）、ｈＰＧの残基４〜１０（配列番号３０）、ｈＰＧの残基２〜１０（配列番号３１）、又はｈＰＧの残基２〜１４（配列番号３２）を含むエピトープに結合する。
【００２０】
一部の実施態様において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、ｈＰＧのＣ末端領域の部分に相当するアミノ酸配列を含むエピトープに結合する。特定の実施態様において、Ｃ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、ｈＰＧの残基７１〜７４（配列番号３３）、ｈＰＧの残基６９〜７３（配列番号３４）、ｈＰＧの残基７６〜８０（配列番号３５）、又はｈＰＧの残基６７〜７４（配列番号３６）を含むエピトープに結合する。
【００２１】
およそ同じエピトープに結合する抗ｈＰＧモノクローナル抗体の相当するＣＤＲ及び／又はＶＨ及びＶＬ鎖を交換して、新たな抗ｈＰＧモノクローナル抗体をもたらしうることが期待される。例えば、表９に記述する通り、例示的な抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ  ５及びＭＡｂ  ６は同じエピトープに結合する。そのＶＬ鎖においてこれらの２つの抗体のＶＬ  ＣＤＲの種々の組み合わせ、及び／又はそのＶＨ鎖においてこれらの２つの抗体のＶＨ  ＣＤＲの種々の組み合わせを含む抗ｈＰＧモノクローナル抗体を設計することができる。具体的な例として、種々の可能な組み合わせを例証するために、そのような抗体は、そのＶＬ鎖においてＭＡｂ５のＣＤＲ１及び２（それぞれＶＬ  ＣＤＲ１．５及びＶＬ  ＣＤＲ２．５）及びＭＡｂ６のＣＤＲ３（ＶＬ  ＣＤＲ３．６）ならびに、そのＶＨ鎖において、ＭＡｂ６のＣＤＲ１（ＶＨ  ＣＤＲ１．６）及びＭＡｂ５のＣＤＲ２及び３（それぞれＶＨ  ＣＤＲ２．５及びＶＨ  ＣＤＲ３．５）を含みうる。
【００２２】
ｈＰＧについての高い特異性及び親和性を有し、インビトロアッセイにおいて良好な抗腫瘍活性を示すいくつかの抗ｈＰＧモノクローナル抗体が同定されており、一部の例において、それらのＣＤＲの配列、それらのＶＨ及びＶＬ鎖の配列、及び／又はヒト化バージョンについての提示されたＶＨ及びＶＬ鎖が決定されている。いくつかのハイブリドーマも寄託されている。これらの例示的な抗ｈＰＧモノクローナル抗体の全て、ならびに本明細書に記載する種々のキット及び方法において有用な抗ｈＰＧモノクローナル抗体、例えば、ＰＧ結合について参照抗体と競合するモノクローナル抗体の他の特定の実施態様が、詳細な説明のセクションにより詳細に記載されている。
【００２３】
開示の抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、ｈＰＧ結合について参照抗ｈＰＧモノクローナル抗体と競合する抗体を含む。参照抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、本明細書に記載する抗ｈＰＧモノクローナル抗体のいずれでもよい。非限定的な例は以下：本明細書に記載する３つのＶＬ  ＣＤＲ及び３つのＶＨ  ＣＤＲを含む抗体；本明細書に示すアミノ酸配列を有するＶＨ鎖及びＶＬ鎖を含む抗体；本明細書に示すヒト化重鎖及び軽鎖ポリペプチドを含む抗体；本明細書に開示するハイブリドーマのいずれか１つにより産生される抗体；本明細書に開示するｈＰＧ内のエピトープに結合する抗体を含む。
【００２４】
本明細書に記載する抗ＰＧモノクローナル抗体は、全長抗体、複数鎖又は一本鎖抗体、ＰＧに選択的に結合するそのような抗体のフラグメント（限定しないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖを含む）、サロボディ（代替軽鎖コンストラクトを含む）、単一ドメイン抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体などの形態でありうる。それらは、また、任意のアイソタイプ、例えば、ＩｇＡ（例、ＩｇＡ１又はＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）、又はＩｇＭでありうる、あるいは、それに由来しうる。一部の実施態様において、抗ＰＧ抗体はＩｇＧ（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）である。
【００２５】
抗ＰＧモノクローナル抗体はヒト又は非ヒト由来でありうる。非ヒト由来の抗ＰＧ抗体の例は、しかし、限定しないが、哺乳動物（例、サル、齧歯類、ヤギ、及びウサギ）由来のものを含む。ヒトにおける治療的使用のための抗ＰＧモノクローナル抗体は、好ましくはヒト化される。
【００２６】
別の局面において、本開示は、抗ＰＧモノクローナル抗体を産生するために使用することが可能な核酸を提供する。本明細書に記載する抗ｈＰＧモノクローナル抗体についての免疫グロブリン軽鎖及び重鎖ポリペプチドをコードする核酸、ならびに、この核酸を含むベクターを提供する。加えて、そのようなベクターを用いて形質転換された原核生物及び真核生物宿主細胞を本明細書において提供し、ならびに、抗ｈＰＧモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖ポリペプチドを発現するように操作された真核生物、例えば、哺乳動物の宿主細胞を提供する。また、軽鎖及び重鎖の両方を発現し、宿主細胞が培養される培地中に本明細書に記載するモノクローナル抗体を分泌することが可能な宿主細胞も提供する。一部の実施態様において、宿主細胞はハイブリドーマである。宿主細胞を培養することにより抗ｈＰＧモノクローナル抗体を産生する方法も提供する。
【００２７】
中和抗ＰＧモノクローナル抗体（例えば抗ｈＰＧモノクローナル抗体など）は、ＰＧに結合し、ＰＧ依存性シグナル伝達を遮断し、ＣＲＣ腫瘍細胞においてＰＧ誘導性応答の阻害をもたらす。したがって、ＣＲＣ細胞のＰＧ誘導性応答（細胞分化の抑制、細胞死の抑制、及び／又は細胞増殖の刺激を含む）を阻害する方法も提供する。一般的に、この方法は、ＣＲＣ細胞の１つ又は複数のＰＧ誘導性応答を阻害するために効果的な量で、中和抗ＰＧモノクローナル抗体に、ＣＲＣ細胞を接触させる、又は細胞集団を曝露させることを含む。この方法は、ＣＲＣ細胞を含む環境（細胞培養又は腫瘍中でありうる）に中和抗ｈＰＧモノクローナル抗体を投与することにより、インビトロ又はインビボで行うことができる。
【００２８】
本明細書に記載する中和抗ＰＧモノクローナル抗体は、ＣＲＣ腫瘍細胞のＰＧ依存性増殖を阻害し、それらを結腸直腸癌の処置のための有用な治療用薬剤にする。したがって、中和抗ＰＧモノクローナル抗体を含む医薬組成物ならびに中和抗ＰＧモノクローナル抗体及び／又はＣＲＣを処置するための医薬的組成物を使用する方法も提供する。医薬的組成物は、任意の便利な投与経路（例、非経口、皮下、又は静脈内注射を含む）のために製剤化することができ、典型的には、中和抗ｈＰＧモノクローナル抗体、及び１つ又は複数の許容可能な担体、賦形剤、及び／又は所望の投与様式に適した希釈剤を含み、詳細な説明のセクションにおいてさらに記載する通り、他の任意の成分を含むことができる。治療的使用のために、組成物は、使用しやすいように単位投与形態にパッケージ化することができる。
【００２９】
処置方法は、一般的に、処置を必要とする被験体、例えば、ＣＲＣと診断された被験体に、治療的利益を提供するために効果的な中和抗ＰＧモノクローナル抗体及び／又はその医薬的組成物の量を投与することを含む。治療的利益を、以下により詳細に記載し、ＣＲＣの任意の寛解、例えば、ＣＲＣの進行を遅くする又は止めること、ＣＲＣの重症度を低下させること、ＣＲＣ腫瘍の成長又はＣＲＣ細胞の増殖を阻害すること、ＣＲＣ腫瘍のサイズを低下させること、及び／又はＣＲＣ患者においてＰＧ血清レベルを低下させることを含む。被験体は、ヒト又は非ヒト（家畜化動物（例、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ）又は非家畜化動物を含む）でありうる。好ましくは、抗ＰＧモノクローナル抗体は、処置されている種のＰＧに特異的である。例えば、抗ｈＰＧ抗体はヒト患者に投与され、抗イヌＰＧ抗体はイヌの患者に投与される、など。抗ｈＰＧモノクローナル抗体治療が有用である被験体は、以下：疾患進行の任意のステージ（例、ＣＲＣステージ０、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、又はＩＶ）の患者、ＣＲＣ治療（例、化学療法、放射線治療、外科的切除）を受けてきた患者、又はＣＲＣのための他の治療を受けている患者でありうる。
【００３０】
本明細書に記載する抗ＰＧモノクローナル抗体を用いた処置は、他の治療と組み合わせる又はそれに補助的であることができる。ＣＲＣのための他の治療の非限定的な例は、本明細書に記載する化学療法的処置、放射線治療、外科的切除、及び抗体治療を含む。具体的な例において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、化学療法剤と組み合わせて投与される。別の具体的な例において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、外科的切除に補助的に投与される。抗ＰＧモノクローナル抗体は、また、互いに組み合わせて使用することができる。
【００３１】
ＣＲＣ腫瘍を伴う個人は、頻繁に、循環ＰＧ（例、血清又は血漿中）の上昇レベルを有する。したがって、抗ｈＰＧモノクローナル抗体を使用し、ＣＲＣを診断する目的のためにＰＧレベルを検出することができる。加えて、ＣＲＣと既に診断された患者において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体を使用し、抗ＰＧ治療を受ける、又は、処置効力をモニタリングするために適した被験体を選択することができる。本明細書に開示する通り、被験体において結腸直腸癌を診断する方法は、本開示に従って抗ｈＰＧモノクローナル抗体を使用して測定された、被験体からのサンプル、例えば、血液サンプル又は血清サンプル中のプロガストリンの量が、閾値レベルを上回るか否かを決定することを含む。特定の実施態様において、閾値レベルは５０pMである。一部の実施態様において、２つの抗ＰＧ抗体：ＰＧのＣ末端領域を認識するもの及びＰＧのＮ末端領域を認識する別のものが使用される。この実施態様において、Ｎ末端又はＣ末端抗体の１つ又は両方は、本明細書に記載する抗ＰＧモノクローナル抗体である。好ましくは、Ｎ末端及びＣ末端抗ＰＧモノクローナル抗体が使用される。抗体は、中和しうるが、しかし、中和する必要はない。
【００３２】
処置効力をモニタリングする目的のために、抗ＰＧモノクローナル抗体を使用し、プロガストリンのレベルが、ＣＲＣについて処置されてきた又は処置されている被験体からのサンプル中で、異なる時間点で採取されたサンプル中でのＰＧの量と比較することにより、経時的に減少しているか否かを決定することができる。先行するパラグラフに記載する抗ＰＧ抗体の特定の実施態様を、また、このアッセイにおいて使用することができる。
【００３３】
また、本明細書に記載する種々の診断方法、モニタリング方法、及び他の方法を行うために適したキットを提供する。そのようなキットは、典型的には、本明細書に記載する抗ＰＧモノクローナル抗体、ならびに、場合により、特定のアッセイを実施するために適した追加の抗ＰＧ抗体及び／又は試薬を含む。一部の実施態様において、キットに含まれる１つ又は複数の抗ＰＧ抗体は、検出可能な標識（例えばフルオロフォアなど）を用いて標識される。特定の実施態様において、キットは、ＰＧのＮ末端領域に特異的に結合する抗ＰＧ抗体、ＰＧのＣ末端領域に特異的に結合する抗ＰＧ抗体、及び、場合により、診断アッセイを実施するために適した試薬を含み、ここで、Ｎ末端特異的抗体は、Ｎ末端抗体、本明細書に記載するＮ末端抗ＰＧモノクローナル抗体であり、及び／又は、Ｃ末端特異的抗体は、本明細書に記載するＣ末端抗ＰＧモノクローナル抗体である。
【００３４】
本明細書に記載する種々の発明の特徴及び利点が、その例示的な実施態様の以下の詳細な説明からさらに明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、プレプロガストリン、プロガストリン、及びプロガストリンプロセシングの産物（Ｇ３４、Ｇ３４−Ｇｌｙ、Ｇ１７、Ｇ１７−Ｇｌｙ、及びＣ末端隣接ペプチドＣＴＦＰを含む）のアミノ酸配列を提供する。
【図２Ａ】図２は、ポリペプチド、及び相当するポリヌクレオチド、例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＨ鎖及びＶＬ鎖の配列：抗ｈＰＧ  ＭＡｂ３（それぞれ配列番号１６、１２、１７、及び１３、出現の順番で）（図２Ａ、２Ｂ）、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ４（それぞれ配列番号１８、１４、１９、及び１５、出現の順番で）（図２Ｃ、２Ｄ）、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ８（それぞれ配列番号６７、５９、７１、及び６３、出現の順番で）（図２Ｅ、２Ｆ）、抗ｈＰＧ  Ｍａｂ１３（それぞれ配列番号６８、６０、７２、及び６４、出現の順番で）（図２Ｇ、２Ｈ）、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１６（それぞれ配列番号６９、６１、７３、及び６５、出現の順番で）（図２Ｉ、２Ｊ）、及び抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１９（それぞれ配列番号７０、６２、７４、及び６６、出現の順番で）（図２Ｋ、２Ｌ）を提供し、それにおいて、各鎖の３つのＣＤＲに下線を引いている。
【図２Ｂ】図２は、ポリペプチド、及び相当するポリヌクレオチド、例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＨ鎖及びＶＬ鎖の配列：抗ｈＰＧ  ＭＡｂ３（それぞれ配列番号１６、１２、１７、及び１３、出現の順番で）（図２Ａ、２Ｂ）、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ４（それぞれ配列番号１８、１４、１９、及び１５、出現の順番で）（図２Ｃ、２Ｄ）、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ８（それぞれ配列番号６７、５９、７１、及び６３、出現の順番で）（図２Ｅ、２Ｆ）、抗ｈＰＧ  Ｍａｂ１３（それぞれ配列番号６８、６０、７２、及び６４、出現の順番で）（図２Ｇ、２Ｈ）、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１６（それぞれ配列番号６９、６１、７３、及び６５、出現の順番で）（図２Ｉ、２Ｊ）、及び抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１９（それぞれ配列番号７０、６２、７４、及び６６、出現の順番で）（図２Ｋ、２Ｌ）を提供し、それにおいて、各鎖の３つのＣＤＲに下線を引いている。
【図２Ｃ】図２は、ポリペプチド、及び相当するポリヌクレオチド、例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＨ鎖及びＶＬ鎖の配列：抗ｈＰＧ  ＭＡｂ３（それぞれ配列番号１６、１２、１７、及び１３、出現の順番で）（図２Ａ、２Ｂ）、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ４（それぞれ配列番号１８、１４、１９、及び１５、出現の順番で）（図２Ｃ、２Ｄ）、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ８（それぞれ配列番号６７、５９、７１、及び６３、出現の順番で）（図２Ｅ、２Ｆ）、抗ｈＰＧ  Ｍａｂ１３（それぞれ配列番号６８、６０、７２、及び６４、出現の順番で）（図２Ｇ、２Ｈ）、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１６（それぞれ配列番号６９、６１、７３、及び６５、出現の順番で）（図２Ｉ、２Ｊ）、及び抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１９（それぞれ配列番号７０、６２、７４、及び６６、出現の順番で）（図２Ｋ、２Ｌ）を提供し、それにおいて、各鎖の３つのＣＤＲに下線を引いている。
【図２Ｄ】図２は、ポリペプチド、及び相当するポリヌクレオチド、例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＨ鎖及びＶＬ鎖の配列：抗ｈＰＧ  ＭＡｂ３（それぞれ配列番号１６、１２、１７、及び１３、出現の順番で）（図２Ａ、２Ｂ）、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ４（それぞれ配列番号１８、１４、１９、及び１５、出現の順番で）（図２Ｃ、２Ｄ）、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ８（それぞれ配列番号６７、５９、７１、及び６３、出現の順番で）（図２Ｅ、２Ｆ）、抗ｈＰＧ  Ｍａｂ１３（それぞれ配列番号６８、６０、７２、及び６４、出現の順番で）（図２Ｇ、２Ｈ）、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１６（それぞれ配列番号６９、６１、７３、及び６５、出現の順番で）（図２Ｉ、２Ｊ）、及び抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１９（それぞれ配列番号７０、６２、７４、及び６６、出現の順番で）（図２Ｋ、２Ｌ）を提供し、それにおいて、各鎖の３つのＣＤＲに下線を引いている。
【図２Ｅ】図２は、ポリペプチド、及び相当するポリヌクレオチド、例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＨ鎖及びＶＬ鎖の配列：抗ｈＰＧ  ＭＡｂ３（それぞれ配列番号１６、１２、１７、及び１３、出現の順番で）（図２Ａ、２Ｂ）、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ４（それぞれ配列番号１８、１４、１９、及び１５、出現の順番で）（図２Ｃ、２Ｄ）、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ８（それぞれ配列番号６７、５９、７１、及び６３、出現の順番で）（図２Ｅ、２Ｆ）、抗ｈＰＧ  Ｍａｂ１３（それぞれ配列番号６８、６０、７２、及び６４、出現の順番で）（図２Ｇ、２Ｈ）、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１６（それぞれ配列番号６９、６１、７３、及び６５、出現の順番で）（図２Ｉ、２Ｊ）、及び抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１９（それぞれ配列番号７０、６２、７４、及び６６、出現の順番で）（図２Ｋ、２Ｌ）を提供し、それにおいて、各鎖の３つのＣＤＲに下線を引いている。
【図２Ｆ】図２は、ポリペプチド、及び相当するポリヌクレオチド、例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＨ鎖及びＶＬ鎖の配列：抗ｈＰＧ  ＭＡｂ３（それぞれ配列番号１６、１２、１７、及び１３、出現の順番で）（図２Ａ、２Ｂ）、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ４（それぞれ配列番号１８、１４、１９、及び１５、出現の順番で）（図２Ｃ、２Ｄ）、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ８（それぞれ配列番号６７、５９、７１、及び６３、出現の順番で）（図２Ｅ、２Ｆ）、抗ｈＰＧ  Ｍａｂ１３（それぞれ配列番号６８、６０、７２、及び６４、出現の順番で）（図２Ｇ、２Ｈ）、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１６（それぞれ配列番号６９、６１、７３、及び６５、出現の順番で）（図２Ｉ、２Ｊ）、及び抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１９（それぞれ配列番号７０、６２、７４、及び６６、出現の順番で）（図２Ｋ、２Ｌ）を提供し、それにおいて、各鎖の３つのＣＤＲに下線を引いている。
【図２Ｇ】図２は、ポリペプチド、及び相当するポリヌクレオチド、例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＨ鎖及びＶＬ鎖の配列：抗ｈＰＧ  ＭＡｂ３（それぞれ配列番号１６、１２、１７、及び１３、出現の順番で）（図２Ａ、２Ｂ）、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ４（それぞれ配列番号１８、１４、１９、及び１５、出現の順番で）（図２Ｃ、２Ｄ）、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ８（それぞれ配列番号６７、５９、７１、及び６３、出現の順番で）（図２Ｅ、２Ｆ）、抗ｈＰＧ  Ｍａｂ１３（それぞれ配列番号６８、６０、７２、及び６４、出現の順番で）（図２Ｇ、２Ｈ）、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１６（それぞれ配列番号６９、６１、７３、及び６５、出現の順番で）（図２Ｉ、２Ｊ）、及び抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１９（それぞれ配列番号７０、６２、７４、及び６６、出現の順番で）（図２Ｋ、２Ｌ）を提供し、それにおいて、各鎖の３つのＣＤＲに下線を引いている。
【図２Ｈ】図２は、ポリペプチド、及び相当するポリヌクレオチド、例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＨ鎖及びＶＬ鎖の配列：抗ｈＰＧ  ＭＡｂ３（それぞれ配列番号１６、１２、１７、及び１３、出現の順番で）（図２Ａ、２Ｂ）、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ４（それぞれ配列番号１８、１４、１９、及び１５、出現の順番で）（図２Ｃ、２Ｄ）、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ８（それぞれ配列番号６７、５９、７１、及び６３、出現の順番で）（図２Ｅ、２Ｆ）、抗ｈＰＧ  Ｍａｂ１３（それぞれ配列番号６８、６０、７２、及び６４、出現の順番で）（図２Ｇ、２Ｈ）、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１６（それぞれ配列番号６９、６１、７３、及び６５、出現の順番で）（図２Ｉ、２Ｊ）、及び抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１９（それぞれ配列番号７０、６２、７４、及び６６、出現の順番で）（図２Ｋ、２Ｌ）を提供し、それにおいて、各鎖の３つのＣＤＲに下線を引いている。
【図２Ｉ】図２は、ポリペプチド、及び相当するポリヌクレオチド、例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＨ鎖及びＶＬ鎖の配列：抗ｈＰＧ  ＭＡｂ３（それぞれ配列番号１６、１２、１７、及び１３、出現の順番で）（図２Ａ、２Ｂ）、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ４（それぞれ配列番号１８、１４、１９、及び１５、出現の順番で）（図２Ｃ、２Ｄ）、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ８（それぞれ配列番号６７、５９、７１、及び６３、出現の順番で）（図２Ｅ、２Ｆ）、抗ｈＰＧ  Ｍａｂ１３（それぞれ配列番号６８、６０、７２、及び６４、出現の順番で）（図２Ｇ、２Ｈ）、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１６（それぞれ配列番号６９、６１、７３、及び６５、出現の順番で）（図２Ｉ、２Ｊ）、及び抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１９（それぞれ配列番号７０、６２、７４、及び６６、出現の順番で）（図２Ｋ、２Ｌ）を提供し、それにおいて、各鎖の３つのＣＤＲに下線を引いている。
【図２Ｊ】図２は、ポリペプチド、及び相当するポリヌクレオチド、例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＨ鎖及びＶＬ鎖の配列：抗ｈＰＧ  ＭＡｂ３（それぞれ配列番号１６、１２、１７、及び１３、出現の順番で）（図２Ａ、２Ｂ）、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ４（それぞれ配列番号１８、１４、１９、及び１５、出現の順番で）（図２Ｃ、２Ｄ）、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ８（それぞれ配列番号６７、５９、７１、及び６３、出現の順番で）（図２Ｅ、２Ｆ）、抗ｈＰＧ  Ｍａｂ１３（それぞれ配列番号６８、６０、７２、及び６４、出現の順番で）（図２Ｇ、２Ｈ）、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１６（それぞれ配列番号６９、６１、７３、及び６５、出現の順番で）（図２Ｉ、２Ｊ）、及び抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１９（それぞれ配列番号７０、６２、７４、及び６６、出現の順番で）（図２Ｋ、２Ｌ）を提供し、それにおいて、各鎖の３つのＣＤＲに下線を引いている。
【図２Ｋ】図２は、ポリペプチド、及び相当するポリヌクレオチド、例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＨ鎖及びＶＬ鎖の配列：抗ｈＰＧ  ＭＡｂ３（それぞれ配列番号１６、１２、１７、及び１３、出現の順番で）（図２Ａ、２Ｂ）、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ４（それぞれ配列番号１８、１４、１９、及び１５、出現の順番で）（図２Ｃ、２Ｄ）、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ８（それぞれ配列番号６７、５９、７１、及び６３、出現の順番で）（図２Ｅ、２Ｆ）、抗ｈＰＧ  Ｍａｂ１３（それぞれ配列番号６８、６０、７２、及び６４、出現の順番で）（図２Ｇ、２Ｈ）、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１６（それぞれ配列番号６９、６１、７３、及び６５、出現の順番で）（図２Ｉ、２Ｊ）、及び抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１９（それぞれ配列番号７０、６２、７４、及び６６、出現の順番で）（図２Ｋ、２Ｌ）を提供し、それにおいて、各鎖の３つのＣＤＲに下線を引いている。
【図２Ｌ】図２は、ポリペプチド、及び相当するポリヌクレオチド、例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＨ鎖及びＶＬ鎖の配列：抗ｈＰＧ  ＭＡｂ３（それぞれ配列番号１６、１２、１７、及び１３、出現の順番で）（図２Ａ、２Ｂ）、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ４（それぞれ配列番号１８、１４、１９、及び１５、出現の順番で）（図２Ｃ、２Ｄ）、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ８（それぞれ配列番号６７、５９、７１、及び６３、出現の順番で）（図２Ｅ、２Ｆ）、抗ｈＰＧ  Ｍａｂ１３（それぞれ配列番号６８、６０、７２、及び６４、出現の順番で）（図２Ｇ、２Ｈ）、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１６（それぞれ配列番号６９、６１、７３、及び６５、出現の順番で）（図２Ｉ、２Ｊ）、及び抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１９（それぞれ配列番号７０、６２、７４、及び６６、出現の順番で）（図２Ｋ、２Ｌ）を提供し、それにおいて、各鎖の３つのＣＤＲに下線を引いている。
【図３Ａ】図３Ａ〜Ｃは、例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体、ＭＡｂ１〜４（図３Ａ）；ＭＡｂ  ５〜１４及び２０〜２３（図３Ｂ）；ならびにＭＡｂ  ３及び１５〜１９（図３Ｃ）の増加する抗体濃度（μg/ml）での相対的な結合親和性（４９２nmでの吸光度として測定）を例証するグラフを提供する。
【図３Ｂ】図３Ａ〜Ｃは、例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体、ＭＡｂ１〜４（図３Ａ）；ＭＡｂ  ５〜１４及び２０〜２３（図３Ｂ）；ならびにＭＡｂ  ３及び１５〜１９（図３Ｃ）の増加する抗体濃度（μg/ml）での相対的な結合親和性（４９２nmでの吸光度として測定）を例証するグラフを提供する。
【図３Ｃ】図３Ａ〜Ｃは、例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体、ＭＡｂ１〜４（図３Ａ）；ＭＡｂ  ５〜１４及び２０〜２３（図３Ｂ）；ならびにＭＡｂ  ３及び１５〜１９（図３Ｃ）の増加する抗体濃度（μg/ml）での相対的な結合親和性（４９２nmでの吸光度として測定）を例証するグラフを提供する。
【図４】図４は、ウシ血清アルブミン（任意単位）の対照試料と比較し、４つの異なる例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体についての２８０nM及び３３０nMでの吸光度（光学密度）の比率を例証するグラフを提供する。
【図５Ａ】図５Ａ〜Ｃは、以下と比較し、２５又は５０ngのｈＰＧに対する２３の異なる例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の結合を例証するグラフ：緩衝剤のみ（陰性対照）、２５０ngのＫＬＨ（陰性対照）、及びガストリン遺伝子に由来するペプチド（５０及び２５０ngのＣＴＦＰ、Ｇ１７、又はＧ１７−Ｇｌｙ（「Ｇ−Ｇｌｙ」として図中に言及される））（示す通り）を提供する。図５Ａは抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  １〜４の結合を示し、図５Ｂは抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ５〜１４及び２１〜２３の結合を示し、ならびに、図５Ｃは抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ３及び１５〜２０の結合を示す。
【図５Ｂ】図５Ａ〜Ｃは、以下と比較し、２５又は５０ngのｈＰＧに対する２３の異なる例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の結合を例証するグラフ：緩衝剤のみ（陰性対照）、２５０ngのＫＬＨ（陰性対照）、及びガストリン遺伝子に由来するペプチド（５０及び２５０ngのＣＴＦＰ、Ｇ１７、又はＧ１７−Ｇｌｙ（「Ｇ−Ｇｌｙ」として図中に言及される））（示す通り）を提供する。図５Ａは抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  １〜４の結合を示し、図５Ｂは抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ５〜１４及び２１〜２３の結合を示し、ならびに、図５Ｃは抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ３及び１５〜２０の結合を示す。
【図５Ｃ】図５Ａ〜Ｃは、以下と比較し、２５又は５０ngのｈＰＧに対する２３の異なる例示的なマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体の結合を例証するグラフ：緩衝剤のみ（陰性対照）、２５０ngのＫＬＨ（陰性対照）、及びガストリン遺伝子に由来するペプチド（５０及び２５０ngのＣＴＦＰ、Ｇ１７、又はＧ１７−Ｇｌｙ（「Ｇ−Ｇｌｙ」として図中に言及される））（示す通り）を提供する。図５Ａは抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  １〜４の結合を示し、図５Ｂは抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ５〜１４及び２１〜２３の結合を示し、ならびに、図５Ｃは抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ３及び１５〜２０の結合を示す。
【図６】図６は、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ３の増加濃度でのｈＰＧに対するポリクローナルＮ末端抗ｈＰＧ抗体の結合を例証するグラフを提供する。
【図７Ａ】図７は、以下の通りに、抗ｈＰＧモノクローナル抗体を用いて処理された代表的なＣＲＣ細胞株の増殖を例証するグラフ：例示的な抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ  ３及びＭＡｂ  ４（図７Ａ、７Ｂ、７Ｃは、それぞれ、抗体を用いた処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での生細胞数における変化を示す）、又は抗ｈＰＧポリクローナル抗体（図７Ｄ、７Ｅ、７Ｆは、それぞれ、抗体を用いた処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での生細胞数における変化を示す）を用いて処理されたＳＷ４８０、ＨＣＴ−１１６、ＬＳ１７４Ｔ（示す通り）；抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ５〜ＭＡｂ  ２３を用いて処理されたＣＲＣ細胞株ＳＷ６２０の増殖（図７Ｇは、処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での対照抗体で処理された細胞数のパーセンテージとしての生きた抗ｈＰＧ処理細胞を示す）；抗ｈＰＧ  ＭＡｂ８、１３、１４、１６、及び１９を用いて処理されたＬＳ１７４Ｔ細胞の増殖（図７Ｈは、処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での対照抗体で処理された細胞数のパーセンテージとしての生きた抗ｈＰＧ処理細胞を示す）；及び、抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ８、１３、１４、１６、１９を用いて処理されたＨＣＴ−１１６細胞の増殖（図７Ｉは、処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での対照抗体で処理された細胞数のパーセンテージとしての生きた抗ｈＰＧ処理細胞を示す）を提供する。
【図７Ｂ】図７は、以下の通りに、抗ｈＰＧモノクローナル抗体を用いて処理された代表的なＣＲＣ細胞株の増殖を例証するグラフ：例示的な抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ  ３及びＭＡｂ  ４（図７Ａ、７Ｂ、７Ｃは、それぞれ、抗体を用いた処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での生細胞数における変化を示す）、又は抗ｈＰＧポリクローナル抗体（図７Ｄ、７Ｅ、７Ｆは、それぞれ、抗体を用いた処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での生細胞数における変化を示す）を用いて処理されたＳＷ４８０、ＨＣＴ−１１６、ＬＳ１７４Ｔ（示す通り）；抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ５〜ＭＡｂ  ２３を用いて処理されたＣＲＣ細胞株ＳＷ６２０の増殖（図７Ｇは、処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での対照抗体で処理された細胞数のパーセンテージとしての生きた抗ｈＰＧ処理細胞を示す）；抗ｈＰＧ  ＭＡｂ８、１３、１４、１６、及び１９を用いて処理されたＬＳ１７４Ｔ細胞の増殖（図７Ｈは、処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での対照抗体で処理された細胞数のパーセンテージとしての生きた抗ｈＰＧ処理細胞を示す）；及び、抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ８、１３、１４、１６、１９を用いて処理されたＨＣＴ−１１６細胞の増殖（図７Ｉは、処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での対照抗体で処理された細胞数のパーセンテージとしての生きた抗ｈＰＧ処理細胞を示す）を提供する。
【図７Ｃ】図７は、以下の通りに、抗ｈＰＧモノクローナル抗体を用いて処理された代表的なＣＲＣ細胞株の増殖を例証するグラフ：例示的な抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ  ３及びＭＡｂ  ４（図７Ａ、７Ｂ、７Ｃは、それぞれ、抗体を用いた処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での生細胞数における変化を示す）、又は抗ｈＰＧポリクローナル抗体（図７Ｄ、７Ｅ、７Ｆは、それぞれ、抗体を用いた処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での生細胞数における変化を示す）を用いて処理されたＳＷ４８０、ＨＣＴ−１１６、ＬＳ１７４Ｔ（示す通り）；抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ５〜ＭＡｂ  ２３を用いて処理されたＣＲＣ細胞株ＳＷ６２０の増殖（図７Ｇは、処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での対照抗体で処理された細胞数のパーセンテージとしての生きた抗ｈＰＧ処理細胞を示す）；抗ｈＰＧ  ＭＡｂ８、１３、１４、１６、及び１９を用いて処理されたＬＳ１７４Ｔ細胞の増殖（図７Ｈは、処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での対照抗体で処理された細胞数のパーセンテージとしての生きた抗ｈＰＧ処理細胞を示す）；及び、抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ８、１３、１４、１６、１９を用いて処理されたＨＣＴ−１１６細胞の増殖（図７Ｉは、処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での対照抗体で処理された細胞数のパーセンテージとしての生きた抗ｈＰＧ処理細胞を示す）を提供する。
【図７Ｄ】図７は、以下の通りに、抗ｈＰＧモノクローナル抗体を用いて処理された代表的なＣＲＣ細胞株の増殖を例証するグラフ：例示的な抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ  ３及びＭＡｂ  ４（図７Ａ、７Ｂ、７Ｃは、それぞれ、抗体を用いた処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での生細胞数における変化を示す）、又は抗ｈＰＧポリクローナル抗体（図７Ｄ、７Ｅ、７Ｆは、それぞれ、抗体を用いた処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での生細胞数における変化を示す）を用いて処理されたＳＷ４８０、ＨＣＴ−１１６、ＬＳ１７４Ｔ（示す通り）；抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ５〜ＭＡｂ  ２３を用いて処理されたＣＲＣ細胞株ＳＷ６２０の増殖（図７Ｇは、処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での対照抗体で処理された細胞数のパーセンテージとしての生きた抗ｈＰＧ処理細胞を示す）；抗ｈＰＧ  ＭＡｂ８、１３、１４、１６、及び１９を用いて処理されたＬＳ１７４Ｔ細胞の増殖（図７Ｈは、処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での対照抗体で処理された細胞数のパーセンテージとしての生きた抗ｈＰＧ処理細胞を示す）；及び、抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ８、１３、１４、１６、１９を用いて処理されたＨＣＴ−１１６細胞の増殖（図７Ｉは、処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での対照抗体で処理された細胞数のパーセンテージとしての生きた抗ｈＰＧ処理細胞を示す）を提供する。
【図７Ｅ】図７は、以下の通りに、抗ｈＰＧモノクローナル抗体を用いて処理された代表的なＣＲＣ細胞株の増殖を例証するグラフ：例示的な抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ  ３及びＭＡｂ  ４（図７Ａ、７Ｂ、７Ｃは、それぞれ、抗体を用いた処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での生細胞数における変化を示す）、又は抗ｈＰＧポリクローナル抗体（図７Ｄ、７Ｅ、７Ｆは、それぞれ、抗体を用いた処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での生細胞数における変化を示す）を用いて処理されたＳＷ４８０、ＨＣＴ−１１６、ＬＳ１７４Ｔ（示す通り）；抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ５〜ＭＡｂ  ２３を用いて処理されたＣＲＣ細胞株ＳＷ６２０の増殖（図７Ｇは、処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での対照抗体で処理された細胞数のパーセンテージとしての生きた抗ｈＰＧ処理細胞を示す）；抗ｈＰＧ  ＭＡｂ８、１３、１４、１６、及び１９を用いて処理されたＬＳ１７４Ｔ細胞の増殖（図７Ｈは、処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での対照抗体で処理された細胞数のパーセンテージとしての生きた抗ｈＰＧ処理細胞を示す）；及び、抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ８、１３、１４、１６、１９を用いて処理されたＨＣＴ−１１６細胞の増殖（図７Ｉは、処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での対照抗体で処理された細胞数のパーセンテージとしての生きた抗ｈＰＧ処理細胞を示す）を提供する。
【図７Ｆ】図７は、以下の通りに、抗ｈＰＧモノクローナル抗体を用いて処理された代表的なＣＲＣ細胞株の増殖を例証するグラフ：例示的な抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ  ３及びＭＡｂ  ４（図７Ａ、７Ｂ、７Ｃは、それぞれ、抗体を用いた処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での生細胞数における変化を示す）、又は抗ｈＰＧポリクローナル抗体（図７Ｄ、７Ｅ、７Ｆは、それぞれ、抗体を用いた処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での生細胞数における変化を示す）を用いて処理されたＳＷ４８０、ＨＣＴ−１１６、ＬＳ１７４Ｔ（示す通り）；抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ５〜ＭＡｂ  ２３を用いて処理されたＣＲＣ細胞株ＳＷ６２０の増殖（図７Ｇは、処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での対照抗体で処理された細胞数のパーセンテージとしての生きた抗ｈＰＧ処理細胞を示す）；抗ｈＰＧ  ＭＡｂ８、１３、１４、１６、及び１９を用いて処理されたＬＳ１７４Ｔ細胞の増殖（図７Ｈは、処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での対照抗体で処理された細胞数のパーセンテージとしての生きた抗ｈＰＧ処理細胞を示す）；及び、抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ８、１３、１４、１６、１９を用いて処理されたＨＣＴ−１１６細胞の増殖（図７Ｉは、処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での対照抗体で処理された細胞数のパーセンテージとしての生きた抗ｈＰＧ処理細胞を示す）を提供する。
【図７Ｇ】図７は、以下の通りに、抗ｈＰＧモノクローナル抗体を用いて処理された代表的なＣＲＣ細胞株の増殖を例証するグラフ：例示的な抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ  ３及びＭＡｂ  ４（図７Ａ、７Ｂ、７Ｃは、それぞれ、抗体を用いた処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での生細胞数における変化を示す）、又は抗ｈＰＧポリクローナル抗体（図７Ｄ、７Ｅ、７Ｆは、それぞれ、抗体を用いた処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での生細胞数における変化を示す）を用いて処理されたＳＷ４８０、ＨＣＴ−１１６、ＬＳ１７４Ｔ（示す通り）；抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ５〜ＭＡｂ  ２３を用いて処理されたＣＲＣ細胞株ＳＷ６２０の増殖（図７Ｇは、処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での対照抗体で処理された細胞数のパーセンテージとしての生きた抗ｈＰＧ処理細胞を示す）；抗ｈＰＧ  ＭＡｂ８、１３、１４、１６、及び１９を用いて処理されたＬＳ１７４Ｔ細胞の増殖（図７Ｈは、処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での対照抗体で処理された細胞数のパーセンテージとしての生きた抗ｈＰＧ処理細胞を示す）；及び、抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ８、１３、１４、１６、１９を用いて処理されたＨＣＴ−１１６細胞の増殖（図７Ｉは、処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での対照抗体で処理された細胞数のパーセンテージとしての生きた抗ｈＰＧ処理細胞を示す）を提供する。
【図７Ｈ】図７は、以下の通りに、抗ｈＰＧモノクローナル抗体を用いて処理された代表的なＣＲＣ細胞株の増殖を例証するグラフ：例示的な抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ  ３及びＭＡｂ  ４（図７Ａ、７Ｂ、７Ｃは、それぞれ、抗体を用いた処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での生細胞数における変化を示す）、又は抗ｈＰＧポリクローナル抗体（図７Ｄ、７Ｅ、７Ｆは、それぞれ、抗体を用いた処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での生細胞数における変化を示す）を用いて処理されたＳＷ４８０、ＨＣＴ−１１６、ＬＳ１７４Ｔ（示す通り）；抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ５〜ＭＡｂ  ２３を用いて処理されたＣＲＣ細胞株ＳＷ６２０の増殖（図７Ｇは、処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での対照抗体で処理された細胞数のパーセンテージとしての生きた抗ｈＰＧ処理細胞を示す）；抗ｈＰＧ  ＭＡｂ８、１３、１４、１６、及び１９を用いて処理されたＬＳ１７４Ｔ細胞の増殖（図７Ｈは、処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での対照抗体で処理された細胞数のパーセンテージとしての生きた抗ｈＰＧ処理細胞を示す）；及び、抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ８、１３、１４、１６、１９を用いて処理されたＨＣＴ−１１６細胞の増殖（図７Ｉは、処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での対照抗体で処理された細胞数のパーセンテージとしての生きた抗ｈＰＧ処理細胞を示す）を提供する。
【図７Ｉ】図７は、以下の通りに、抗ｈＰＧモノクローナル抗体を用いて処理された代表的なＣＲＣ細胞株の増殖を例証するグラフ：例示的な抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ  ３及びＭＡｂ  ４（図７Ａ、７Ｂ、７Ｃは、それぞれ、抗体を用いた処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での生細胞数における変化を示す）、又は抗ｈＰＧポリクローナル抗体（図７Ｄ、７Ｅ、７Ｆは、それぞれ、抗体を用いた処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での生細胞数における変化を示す）を用いて処理されたＳＷ４８０、ＨＣＴ−１１６、ＬＳ１７４Ｔ（示す通り）；抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ５〜ＭＡｂ  ２３を用いて処理されたＣＲＣ細胞株ＳＷ６２０の増殖（図７Ｇは、処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での対照抗体で処理された細胞数のパーセンテージとしての生きた抗ｈＰＧ処理細胞を示す）；抗ｈＰＧ  ＭＡｂ８、１３、１４、１６、及び１９を用いて処理されたＬＳ１７４Ｔ細胞の増殖（図７Ｈは、処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での対照抗体で処理された細胞数のパーセンテージとしての生きた抗ｈＰＧ処理細胞を示す）；及び、抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ８、１３、１４、１６、１９を用いて処理されたＨＣＴ−１１６細胞の増殖（図７Ｉは、処理の開始（Ｔ０）と比べた、処理の終了時での対照抗体で処理された細胞数のパーセンテージとしての生きた抗ｈＰＧ処理細胞を示す）を提供する。
【図８】図８は、対照モノクローナル抗体、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ８（５μg/ml）、ｈＰＧを用いてプレインキュベートされた抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ８、ｈＰＧを用いてプレインキュベートされた対照抗体、又はｈＰＧ単独を用いた４回の処理から４８時間後での生きたＬＳ１７４Ｔ細胞数を例証するグラフを提供する。
【図９Ａ】図９は、対照ポリクローナル抗体と比較した、抗ｈＰＧ抗体を用いて処置されたマウスにおけるマウス１匹当たりの腫瘍数（図９Ａ）ならびに平均的な腫瘍の長さ及び高さ（図９Ｂ）を例証するグラフを提供する。
【図９Ｂ】図９は、対照ポリクローナル抗体と比較した、抗ｈＰＧ抗体を用いて処置されたマウスにおけるマウス１匹当たりの腫瘍数（図９Ａ）ならびに平均的な腫瘍の長さ及び高さ（図９Ｂ）を例証するグラフを提供する。
【００３６】
９．例示的な実施態様の詳細な説明
９．１．詳細な説明
プロガストリン（ＰＧ）はガストリン（胃酸分泌を刺激する腸ペプチドホルモン）の前駆体として最初に同定された。ガストリンは、プロガストリンに由来する多くの異なる分子形態（Ｇ１７、Ｇ３４、グリシン伸長Ｇ１７、グリシン伸長Ｇ３４）で存在する。図１を参照のこと。ガストリン遺伝子は１０１アミノ酸産物プレプロガストリンをコードする。最初の切断は、２１アミノ酸残基のシグナルペプチド（図１の下線部）を除去し、ＰＧ（８０個のアミノ酸ペプチド）をもたらす。理解され、公知であるヒトＰＧ（ｈＰＧ）のポリペプチド配列を、配列番号２０に提供する。図１に例証する通り、ｈＰＧのアミノ酸残基に１〜８０まで番号を付け、アミノ末端残基が位置１である。プロガストリンの最初の４０アミノ酸内の配列は「Ｎ末端」として言及され、残基４１〜８０内の該当する配列は「Ｃ末端」として言及される。
【００３７】
最近の試験では、プロガストリンレベルがＣＲＣを伴う患者において上昇していることが示されている。正常な生理学的条件下では、プロガストリンがヒトにおける総分泌ペプチドの１０%未満を占める。結腸直腸癌において、プロガストリンレベルは、恐らくは遺伝子産物の不完全なプロセシングと共役したガストリン遺伝子の増加発現の結果として、血漿及び腫瘍組織の両方において有意に上昇している。１つの試験では、対照患者と比較して、ＣＲＣ患者における有意に高い血清プロガストリンレベルが示されたが、しかし、ガストリンのよりプロセシングされた形態についてそのような差は示されなかった（Siddheshwar et al., 2001, Gut 48: 47-52）。テストされたＣＲＣ腫瘍サンプルにおいて、サンプルの８０〜１００%が増加したＰＧレベルを示した。例えば、Ciccotosto et al., 1995, Gastroenterology 109: 1142-1153；Baldwin et al., 1998, Gut 42:581-584；Van Solinge, 1993, Gastroenterology 104: 1099-1107を参照のこと。ＣＲＣにおけるＰＧの役割は、野生型マウス又はアミド化ガストリンを発現するマウスと比較して、発癌物質アゾキシメタンを用いて処置された組換えヒトＰＧを発現するマウスが、結腸において有意に多い数の異常腺窩巣、腺腫、及び腺癌を有することを示す実験によりさらに実証されている（Singh et al.2000, Gastroenterology 119: 162-171）。
【００３８】
最近、Hollandeらは、プロガストリンが、ＩＣＡＴ（ベータ−カテニン／Ｔｃｆ４シグナル伝達の負の調節因子）を抑制することによりベータ−カテニン／Ｔｃｆ４経路を刺激すること、及び、プロガストリンを遮断することによりＩＣＡＴのデノボ発現に導くことを実証した。ＷＯ  ２００７／１３５５４２を参照のこと。操作の任意の理論により拘束されることを意図しないが、プロガストリンシグナル伝達を遮断することによって、増加したＩＣＡＴ発現の結果として、ベータ−カテニン／ＴＣＦ４誘導性増殖の抑制に導くと考えられる。継続的なＰＧ依存性シグナル伝達の非存在において、細胞増殖が阻害され、細胞分化及び／又は細胞死（アポトーシスを含む）が引き起こされる。
【００３９】
ＣＲＣの処置及び診断への新たな臨床的アプローチについての緊急の必要性、ＰＧがＣＲＣ腫瘍細胞の増殖を刺激するという証拠にもかかわらず、及び、癌の処置におけるモノクローナル抗体治療についての増加した焦点にもかかわらず、今日まで、ＰＧ依存性腫瘍細胞増殖を遮断すること、又は、さらに、ＰＧに結合することが可能な任意のモノクローナル抗体を実証する報告はない。そのような抗体は、本明細書に初めて提示され、開発が困難であることが証明された。最初の課題として、出願人は、組換えヒトプロガストリンが、ポリクローナル抗ｈＰＧ抗体を生成するために使用することができ、テストマウスにおいてモノクローナル免疫原性応答を誘導しないことを見出した。従って、ＰＧのペプチドフラグメントだけを使用して免疫原を設計し、プロガストリンに特異的であり、及び、他のガストリン遺伝子産物に特異的ではない抗体を生成することが必要であった。一旦、ハイブリドーマクローンが抗原ペプチドに結合する抗体をもたらしても、ペプチドへの結合が、ＰＧに結合する能力を特異的に又は全く予測することができないことが見出された。以下の実施例においてより詳細に示す通り、多くのハイブリドーマは、免疫原において使用されるＰＧ抗原ペプチドに結合するが、しかし、ＰＧに結合しない抗体をもたらした。本開示は、それらが産生されたペプチド抗原に結合するだけでなく、しかし、また、ｈＰＧに特異的に結合する抗ｈＰＧモノクローナル抗体を提供する。非常に驚くべきことに、そのプロセシング産物（例、Ｇ３４、Ｇ３４−Ｇｌｙ、Ｇ１７、Ｇ１７−Ｇｌｙ、ＣＴＦＰ）と比べて、ｈＰＧに高度に特異的なモノクローナル抗体が、一部の場合においてｈＰＧに固有ではないが、しかし、プロガストリンプロセシング産物の１つ又は複数に共通のアミノ酸配列の領域を含む抗原を用いて得られた。さらに、また、驚くべきことに、ｈＰＧの比較的小さなサイズ（８０アミノ酸）にもかかわらず、全ての抗ｈＰＧモノクローナル抗体が、ｈＰＧについて高い程度の親和性及び特異性を示すものでさえ、その生物学的活性を中和することが発見された。
【００４０】
抗ｈＰＧモノクローナル抗体
出願人は、抗ｈＰＧモノクローナル抗体を産生するために有用なペプチド抗原を発見している。本開示の抗ｈＰＧ抗体を産生するために有用なペプチドは、ポリペプチドのより多くのプロセシング形態（例えばグリシン伸長もしくはアミド化ガストリン又はＣＴＦＰなど）において見出されないプロガストリン特異的な配列を含むが、しかし、また、ｈＰＧのプロセシング形態において見出される配列を含むことができる。一部の実施態様において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、ｈＰＧのＮ末端領域に相当するアミノ酸配列を有するペプチド抗原に対して産生され、Ｎ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体として指定される。Ｎ末端抗ＰＧモノクローナル抗体を得るために有用な免疫原を構築するために使用することができる特定の例示的な抗原性領域は、リンカー配列に共役されたｈＰＧの残基１〜１４（ＳＷＫＰＲＳＱＱＰＤＡＰＬＧ（配列番号２５））に相当する。他の実施形態において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、ｈＰＧのＣ末端領域に相当するアミノ酸配列を有するペプチド抗原に対して産生され、Ｃ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体として指定される。Ｃ末端抗ＰＧモノクローナル抗体を得るために有用な免疫原を構築するために使用することができる特定の例示的な抗原性領域は、リンカー配列に共役されたｈＰＧの残基５５〜８０（配列番号２７）に相当する。表１を参照のこと。
【００４１】
本開示の抗ＰＧモノクローナル抗体はＰＧに結合し、複雑な混合物からＰＧを検出及び単離するために有用である。加えて、開示の抗ＰＧモノクローナル抗体は、結腸直腸癌のための治療的及び／又は診断的適用に固有に適する。種々の実施形態において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、（１）他のガストリン遺伝子産物と対比して、ＰＧに特異的に結合し、（２）ｈＰＧに高い親和性を有し、（３）結腸直腸癌細胞の増殖をインビトロ及びインビボで阻害し、（４）腫瘍のサイズ及び数をインビボで低下させ、（５）他のガストリン遺伝子由来ペプチドを含む複雑な混合物中でＰＧを検出する。
【００４２】
ガストリン遺伝子が発現され、広範にプロセシングされ、正常なホメオスタシスにおいて役割を有するいくつかのタンパク質産物をもたらす。プロガストリンは、他方で、典型的には、健常な被験体の循環において検出可能ではない。本開示のモノクローナル抗体は、プロガストリンを標的とするが、しかし、ガストリン遺伝に由来する他のペプチドは標的としないことを意図する。したがって、抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、ヒト及び他の動物からのプロガストリンに特異的に結合するが、しかし、他のガストリン遺伝子産物（例えば、限定しないが、グリシン伸長もしくはアミド化ガストリン、又はＣ末端隣接ペプチド（ＣＴＦＰ）など）には結合しない。
【００４３】
抗ｈＰＧモノクローナル抗体の特異性は、以下の通りにＥＬＩＳＡを使用して決定することができる：９６ウェルプレートは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の適切な濃度のテストポリペプチド（例、２５及び５０ngの組換えヒトＰＧ、ならびに５０及び２５０ngのＣＴＦＰ又は他のガストリン由来の遺伝子産物）を用いて４℃で一晩インキュベートし、その後、ウェルを、洗浄溶液（ＰＢＳ及び０．１%Tween-20）を用いて３回洗浄し、次に、１ウェル当たり１００μLのブロッキング溶液（ＰＢＳ、０．１%Tween-20、０．１%ウシ血清アルブミン又はカゼイン加水分解物）を用いて２２℃で２時間にわたりインキュベートする。ブロッキング後、ウェルを３回洗浄し、アッセイする抗体（テスト抗体）を加える。ＰＢＳ及び０．１%Tween-20中の１００μLのテスト抗体（０．３〜１ng/mL）を各ウェルに加える。プレートを、次に、２２℃で２時間にわたりインキュベートし、その後、テスト抗体溶液を捨て、洗浄段階（３×１００μL洗浄溶液、上に記述する通り）後、二次抗体（ホースラディッシュペルオキシダーゼに共役させたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）抗体）を含むブロッキング溶液を用いて交換する。二次抗体を用いた１時間のインキュベーション後、１００μLの基質溶液（例、Fast OPD、又はＯ−フェニレンジアミン二塩酸塩、Sigma-Aldrich Co.から入手可能、製造業者の指示に従って調製する）を各ウェルに加え、暗所で２０分間にわたり２２℃でインキュベートする。反応を、５０μLの４N硫酸を加えることにより停止させ、触媒された基質の量を４９２nmでの光学密度（ＯＤ）を測定することにより決定する。基質変換は、抗原に結合した一次（テスト）抗体の量に比例する。実験を二通りに実行し、ＯＤ測定値を抗原濃度の関数としてプロットする。テスト抗体は、測定されたＯＤがｈＰＧについて０．２〜１．５の間であり、ＣＴＦＰ又は他のガストリン遺伝子由来ペプチドのいずれかを用いたバックグラウンドを上回る統計的に有意なシグナルがなく、そこで、バックグラウンドが、ＰＢＳだけを含む対照ウェルからの平均シグナルである場合、ＰＧについて特異的としてスコアされる。
【００４４】
本開示のいくつかの抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、高度に特異的であることが見出された。一部の実施形態において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、他のガストリン遺伝子産物と比較して、プロガストリンについて１００倍大きい特異性を示す。そのような実施形態において、１００倍多い抗原（例、グリシン伸長又はアミド化ガストリン）は、抗原がプロガストリンである場合に観察されるのと同じ結合をもたらすために要求される。
【００４５】
結合を決定するための他の方法は、しかし、限定しないが、免疫蛍光方法、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性物質標識イムノアッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチＥＬＩＳＡ（モノクローナル抗体実験マニュアル（講談社サイエンティフィックにより出版、１９８７）、第二シリーズ生化学実験講座、第５巻、免疫生化学研究方法、東京化学同人により出版（１９８６））を含む。
【００４６】
ＰＧについての高い親和性を伴う抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、治療的使用及び診断的使用の両方のために望ましい。特定の使用、例えば治療的使用などのために、少なくとも約１００nMの親和性が望ましいが、より大きな親和性、例えば、少なくとも約９０nM、８０nM、７０nM、６０nM、５０nM、４０nM、３０nM、２５nM、２０nM、１５nM、１０nM、７nM、６nM、５nM、４nM、３nM、２nM、１nM、０．１nM、０．０１nM、１０pM、１pM又はそれよりさらに大きな親和性を有する抗体が望まれうる。一部の実施形態において、モノクローナル抗体は、約１pM〜約１００nMの範囲の親和性、又は前述の値のいずれかの間の範囲の親和性を用いてｈＰＧに特異的に結合する。
【００４７】
ｈＰＧについての抗ｈＰＧモノクローナル抗体の親和性は、当技術分野において周知の又は本明細書に記載する技術、例えば、しかし、限定しないが、ＥＬＩＳＡ、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、BIAcore、Proteon、又は蛍光偏光アッセイなどを使用して決定することができる。
【００４８】
ｈＰＧのＮ又はＣ末端領域からの抗原を使用して、ｈＰＧの異なるエピトープを認識する抗体を生成することができる。モノクローナル抗体により認識されるエピトープは、抗体を産生するために使用される特定の抗原に依存しうるが、当業者に公知の技術、例えばアラニンスキャニング及びＳＰＯＴ分析（以下の実施例セクションを参照のこと）などを使用してマッピングすることができる。例えば、エピトープマッピングによって、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ２及びＭＡｂ  ４が同じエピトープに結合することが明らかになる。抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  １及びＭＡｂ３は、およそ同じエピトープに結合する；ＭＡｂ  １７、ＭＡｂ  １８、ＭＡｂ１９、及びＭＡｂ  ２０は、およそ同じエピトープに結合する；ＭＡｂ  １５及びＭＡｂ１６は、およそ同じエピトープに結合する；抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ５、ＭＡｂ  ６、ＭＡｂ  ７、ＭＡｂ  ９、及びＭＡｂ１２は、同じエピトープに結合し、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  １０とおよそ同じエピトープに結合する；ならびに、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１１及びＭＡｂ  １４は、およそ同じエピトープに結合する。
【００４９】
抗ｈＰＧモノクローナル抗体が特定のエピトープを認識するか否かは、本明細書に記載する競合アッセイを使用して決定することができ、それにおいて、参照抗体により結合されるエピトープは公知である。一部の実施態様において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、ｈＰＧのＮ末端領域に相当するアミノ酸配列を有するエピトープに結合する参照抗体と競合する。特定の実施態様において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、ｈＰＧの残基１０〜１４（配列番号２８）、ｈＰＧの残基９〜１４（配列番号２９）、ｈＰＧの残基４〜１０（配列番号３０）、ｈＰＧの残基２〜１０（配列番号３１）、又はｈＰＧの残基２〜１４（配列番号３２）を含むエピトープに結合する参照抗体と競合する。一部の実施態様において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、ｈＰＧのＣ末端領域に相当するアミノ酸配列を有するエピトープに結合する参照抗体と競合する。特定の実施態様において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、ｈＰＧの残基７１〜７４（配列番号３３）、ｈＰＧの残基６９〜７３（配列番号３４）、ｈＰＧの残基７６〜８０（配列番号３５）、又はｈＰＧの残基６７〜７４（配列番号３６）を含むエピトープに結合する参照抗体と競合する。
【００５０】
抗ＰＧモノクローナル抗体は、中和することができる。操作の任意の理論により拘束されることを意図しないが、ＰＧの結合を通じて、中和抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、そのシグナル伝達パートナーと相互作用するその能力を遮断又は阻害すると考えられる。これは、順に、本来なら増殖、低下した細胞分化、及び細胞死に導く結腸直腸腫瘍細胞におけるシグナル伝達経路を阻害する。一部の実施形態において、中和抗ＰＧモノクローナル抗体は、ｈＰＧのＮ末端領域に結合する。特定の実施形態において、中和抗ＰＧモノクローナル抗体は、ＰＧと、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４、ＭＡｂ１５、ＭＡｂ  １６、ＭＡｂ  １７、ＭＡｂ  １８、ＭＡｂ１９、又はＭＡｂ  ２０の結合について競合する。他の実施形態において、中和抗ＰＧモノクローナル抗体は、ｈＰＧのＣ末端領域に結合する。特定の実施形態において、中和抗ＰＧモノクローナル抗体は、ＰＧと、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ５、ＭＡｂ  ６、ＭＡｂ  ７、ＭＡｂ８、ＭＡｂ９、ＭＡｂ１０、ＭＡｂ１１、ＭＡｂ１２、ＭＡｂ１３、ＭＡｂ２１、ＭＡｂ  ２２、又はＭＡｂ２３の結合について競合する。
【００５１】
抗ＰＧモノクローナル抗体が中和するか否かについての特定のテストは、以下の通りに実施することができる。ＣＲＣ  ＬＳ１７４Ｔ細胞を、以下の実施例７に記載する通り、１ウェル当たりおよそ５０，０００個の細胞で６ウェルプレート中に播種する。細胞を、次に、約５μg/mlの抗体濃度で、実施例７に記述する通りに、テスト抗ＰＧモノクローナル抗体又は対照モノクローナル抗体を用いて、４８時間にわたり１２時間間隔で処理する。テスト抗体は、テスト抗体を用いて処理したＣＲＣ癌細胞の数が、両側マンホイットニー検定（ｐ＜０．０５の場合、差が有意であると考えられる）を使用し、対照の非特異的抗体を用いて処理した細胞の数と比較して、生存細胞数の少なくとも１０%の統計的に有意な低下を示す場合、アッセイにおいて中和しているとして定義される。総細胞数を、処置期間の開始時での細胞数（Ｔ０として言及する）について補正する。
【００５２】
本明細書において使用する通り、抗体（Ａｂ）は、特定の抗原に特異的に結合する、又は、それと免疫学的に反応性である免疫グロブリン分子を指し、ポリクローナル、モノクローナル、遺伝子組換え、及び他の方法での改変形態の抗体（しかし、限定しないが、キメラ抗体、ヒト化抗体、及び抗体の抗原結合フラグメント（例、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒＩｇＧ、及びｓｃＦｖフラグメントを含む））を含む。種々の実施形態において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、抗体の定常領域の全部又は部分を含む。一部の実施態様において、定常領域は、以下：ＩｇＡ（例、ＩｇＡ１又はＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）、及びＩｇＭより選択されるアイソタイプである。
【００５３】
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書において使用する通り、ハイブリドーマ技術を通じて産生された抗体に限定しない。モノクローナル抗体は、利用可能な又は当技術分野において公知の任意の手段により、単一クローン（任意の真核生物、原核生物、又はファージクローンを含む）に由来する。本開示を用いて有用なモノクローナル抗体は、当技術分野において公知の多種多様の技術（ハイブリドーマ、組換え、及びファージディスプレイ技術、又はそれらの組み合わせの使用を含む）を使用して調製することができる。本開示の多くの使用（ヒトにおける及びインビトロ検出アッセイにおける抗ｈＰＧモノクローナル抗体のインビボ使用を含む）において、キメラ、霊長類化、ヒト化、又はヒト抗体を適切に使用することができる。
【００５４】
用語「ｓｃＦｖ」は、伝統的な抗体からの重鎖及び軽鎖の可変ドメインが、結合されて、１つの鎖を形成している一本鎖Ｆｖ抗体を指す。
【００５５】
「ＶＨ」への参照は、抗体の免疫グロブリン重鎖（Ｆｖ、ｓｃＦｖ、又はＦａｂの重鎖を含む）の可変領域を指す。「ＶＬ」への参照は、免疫グロブリン軽鎖（Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、又はＦａｂの軽鎖を含む）の可変領域を指す。抗体（Ａｂ）及び免疫グロブリン（Ｉｇ）は、同じ構造特徴を有する糖タンパク質である。抗体は特定のターゲットへの結合特異性を示し、免疫グロブリンは、抗体及び標的特異性を欠く他の抗体様分子の両方を含む。天然抗体及び免疫グロブリンは、普通は、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖で構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各々の重鎖は、一端に、可変ドメイン（ＶＨ）を有し、多数の定常ドメインが続く。各々の軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）及びその他端に定常ドメインを有する。
【００５６】
開示の抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。ＣＤＲは、また、軽鎖及び重鎖可変ドメインの両方における超可変領域として公知である。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。当技術分野において公知の通り、抗体の超可変領域を描写するアミノ酸位置／境界は、文脈及び当技術分野において公知の種々の定義に依存して変動しうる。可変ドメイン内の一部の位置は、これらの位置が１組の基準下で超可変領域内にあると見なすことができ、異なる組の基準下で超可変領域の外側にあるとみなされる点でハイブリッド超可変位置として見てもよい。これらの位置の１つ又は複数は、また、伸長された超可変領域において見出すことができる。開示は、これらのハイブリッド超可変位置において改変を含む抗体を提供する。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、各々が、３つのＣＤＲにより接続されたβシート配置を主に採用することにより、４つのＦＲ領域を含み、βシート構造を接続する、及び、一部の場合において、その一部を形成するループを形成する。各々の鎖中のＣＤＲは、ＦＲ領域により、他の鎖からのＣＤＲと近接して一緒に保持され、抗体の標的結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health, Bethesda, Md.1987)を参照のこと）。
【００５７】
ｈＰＧについて高い特異性及び親和性ならびに良好な抗腫瘍活性を有するいくつかの抗ｈＰＧモノクローナル抗体が同定されており、それらのＣＤＲならびに可変重鎖及び軽鎖が配列決定されている。マウスの重鎖及び軽鎖可変ドメインは本明細書においてｍＶＨ及びｍＶＬと言及され、相当するモノクローナル抗体の番号が続く（例えば、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ３についてはｍＶＨ．３及びｍＶＬ．３）。抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、３つの可変軽鎖ＣＤＲ及び３つの可変重鎖ＣＤＲ（それぞれＶＨ  ＣＤＲ１、２、又は３及びＶＬ  ＣＤＲ１、２、又は３として言及する）を有し、例示的な抗ｈＰＧモノクローナル抗体の番号が続く。例えば、ＭＡｂ  ３のＶＬ  ＣＤＲ１はＶＬ  ＣＤＲ１．３と表示され、及び、ＭＡｂ  ３のＶＨ  ＣＤＲ１はＶＨ  ＣＤＲ１．３と表記される。同様に、ヒト重鎖及び軽鎖可変ドメインは本明細書においてｈＶＨとｈＶＬとして言及され、相当するモノクローナル抗体の数が続く。
【００５８】
一部の実施態様において、ｈＰＧのＮ末端部分に対して産生された抗ｈＰＧ抗体は、３つの可変軽鎖ＣＤＲ及び３つの可変重鎖ＣＤＲを有し、それにおいて、ＶＬ  ＣＤＲ１は、ＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹ（「ＶＬ  ＣＤＲ  １．３」；配列番号４）、ＱＳＬＶＨＳＳＧＶＴＹ（「ＶＬ  ＣＤＲ  １．４」；配列番号１０）、ＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹ（「ＶＬ  ＣＤＲ  １．１６」；配列番号５０）、及にＳＱＨＲＴＹＴ（「ＶＬ  ＣＤＲ  １．１９」；配列番号５１）より選択される；ＶＬ  ＣＤＲ２は、ＫＶＳ（「ＶＬ  ＣＤＲ  ２．３」及び（「ＶＬ  ＣＤＲ  ２．４」；配列番号５）、ＬＶＳ（「ＶＬ  ＣＤＲ  ２．１６」；配列番号５３）、及びＶＫＫＤＧＳＨ（「ＶＬ  ＣＤＲ  ２．１９」；配列番号５４）より選択される；ＶＬ  ＣＤＲ３は、ＦＱＧＳＨＶＰＦＴ（「ＶＬ  ＣＤＲ  ３．３」；配列番号６）、ＳＱＳＴＨＶＰＰＴ（「ＶＬ  ＣＤＲ  ３．４」；配列番号１１）、ＷＱＧＴＨＳＰＹＴ（「ＶＬ  ＣＤＲ  ３．１６」；配列番号５７）、及びＧＶＧＤＡＩＫＧＱＳＶＦＶ（「ＶＬ  ＣＤＲ  ３．１９」；配列番号５８）より選択される；ＶＨ  ＣＤＲ１は、ＧＹＩＦＴＳＹＷ（「ＶＨ  ＣＤＲ  １．３」；配列番号１）、ＧＹＴＦＳＳＳＷ（「ＶＨ  ＣＤＲ  １．４」；配列番号７）、ＧＹＴＦＴＳＹＹ（「ＶＨ  ＣＤＲ  １．１６」；配列番号３９）、及びＧＹＳＩＴＳＤＹＡ（「ＶＨ  ＣＤＲ  １．１９」；配列番号４０）より選択される；ＶＨ  ＣＤＲ２は、ＦＹＰＧＮＳＤＳ（「ＶＨ  ＣＤＲ  ２．３」；配列番号２）、ＦＬＰＧＳＧＳＴ（「ＶＨ  ＣＤＲ  ２．４」；配列番号８）、ＩＮＰＳＮＧＧＴ（「ＶＨ  ＣＤＲ  ２．１６」；配列番号４３）、及びＩＳＦＳＧＹＴ（「ＶＨ  ＣＤＲ  ２．１９」；配列番号４４）より選択される；ならびに、ＶＨ  ＣＤＲ３は、ＴＲＲＤＳＰＱＹ（「ＶＨ  ＣＤＲ  ３．３」；配列番号３）、ＡＴＤＧＮＹＤＷＦＡＹ（「ＶＨ  ＣＤＲ  ３．４」；配列番号９）、ＴＲＧＧＹＹＰＦＤＹ（「ＶＨ  ＣＤＲ  ３．１６」；配列番号４７）、及びＡＲＥＶＮＹＧＤＳＹＨＦＤＹ（「ＶＨ  ＣＤＲ  ３．１９」；配列番号４８）より選択される。表１Ａを参照のこと。
【００５９】
一部の実施態様において、ＰＧのＣ末端部分に対して産生された抗ｈＰＧ抗体は、３つの可変軽鎖ＣＤＲ及び３つの可変重鎖ＣＤＲを有し、それにおいて、ＶＬ  ＣＤＲ１は、ＫＳＬＲＨＴＫＧＩＴＦ（「ＶＬ  ＣＤＲ  １．８」；配列番号４９）及びＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹ（「ＶＬ  ＣＤＲ  １．１３」；配列番号５０）より選択される；ＶＬ  ＣＤＲ２は、ＱＭＳ（「ＶＬ  ＣＤＲ  ２．８」；配列番号５２）及びＬＶＳ（「ＶＬ  ＣＤＲ  ２．１３」；配列番号５３）より選択される；ＶＬ  ＣＤＲ３は、ＡＱＮＬＥＬＰＬＴ（「ＶＬ  ＣＤＲ  ３．８」；配列番号５５）及びＷＱＧＴＨＦＰＱＴ（「ＶＬ  ＣＤＲ  ３．１３」；配列番号５６）より選択される；ＶＨ  ＣＤＲ１は、ＧＦＴＦＴＴＹＡ（「ＶＨ  ＣＤＲ  １．８」；配列番号３７）及びＧＦＩＦＳＳＹＧ（「ＶＨ  ＣＤＲ  １．１３」；配列番号３８）より選択される；ＶＨ  ＣＤＲ２は、ＩＳＳＧＧＴＹＴ（「ＶＨ  ＣＤＲ  ２．８」；配列番号４１）及びＩＮＴＦＧＤＲＴ（「ＶＨ  ＣＤＲ  ２．１３」；配列番号４２）より選択される；ならびに、ＶＨ  ＣＤＲ３は、ＡＴＱＧＮＹＳＬＤＦ（「ＶＨ  ＣＤＲ  ３．８」；配列番号４５）及びＡＲＧＴＧＴＹ（「ＶＨ  ＣＤＲ  ３．１３」；配列番号４６）より選択される。表１Ｂを参照のこと。
【００６０】
【表１】
0005985987.tif 000002
0005985987.tif 000003
【００６１】
【表２】
0005985987.tif 000004
0005985987.tif 000005
【００６２】
一部の実施形態において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＨ鎖のＣＤＲは、ＶＨ  ＣＤＲ１．３、ＶＨ  ＣＤＲ２．３、及びＶＨ  ＣＤＲ３．３である。特定の実施形態において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＨ鎖は、ｍＶＨ．３（配列番号１２）に相当するアミノ酸配列を有する。図２Ａを参照のこと。
【００６３】
一部の実施形態において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＬ鎖のＣＤＲは、ＶＬ  ＣＤＲ１．３、ＶＬ  ＣＤＲ２．３、及びＶＬ  ＣＤＲ３．３である。特定の実施形態において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＬ鎖は、ｍＶＬ．３（配列番号１３）に相当するアミノ酸配列を有する。図２Ｂを参照のこと。
【００６４】
一部の実施形態において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＨ鎖のＣＤＲは、ＶＨ  ＣＤＲ１．４、ＶＨ  ＣＤＲ２．４、及びＶＨ  ＣＤＲ３．４である。特定の実施形態において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＨ鎖は、ｍＶＨ．４（配列番号１４）に相当する配列を有する。図２Ｃを参照のこと。
【００６５】
一部の実施形態において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＬ鎖のＣＤＲは、ＶＬ  ＣＤＲ１．４、ＶＬ  ＣＤＲ２．４、及びＶＬ  ＣＤＲ３．４である。特定の実施形態において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＬ鎖は、ｍＶＬ．４（配列番号１５）に相当するアミノ酸配列を有する。図２Ｄを参照のこと。
【００６６】
一部の実施形態において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＨ鎖のＣＤＲは、ＶＨ  ＣＤＲ１．８、ＶＨ  ＣＤＲ２．８、及びＶＨ  ＣＤＲ３．８である。特定の実施形態において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＨ鎖は、ｍＶＨ．８（配列番号５９）に相当する配列を有する。図２Ｅを参照のこと。
【００６７】
一部の実施形態において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＬ鎖のＣＤＲは、ＶＬ  ＣＤＲ１．８、ＶＬ  ＣＤＲ２．８、及びＶＬ  ＣＤＲ３．８である。特定の実施形態において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＬ鎖は、ｍＶＬ０．８（配列番号６３）に相当するアミノ酸配列を有する。図２Ｆを参照のこと。
【００６８】
一部の実施形態において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＨ鎖のＣＤＲは、ＶＨ  ＣＤＲ１．１３、ＶＨ  ＣＤＲ２．１３、及びＶＨ  ＣＤＲ３．１３である。特定の実施形態において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＨ鎖は、ｍＶＨ．１３（配列番号６０）に相当する配列を有する。図２Ｇを参照のこと。
【００６９】
一部の実施形態において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＬ鎖のＣＤＲは、ＶＬ  ＣＤＲ１．１３、ＶＬ  ＣＤＲ２．１３、及びＶＬ  ＣＤＲ３．１３である。特定の実施形態におい、抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＬ鎖は、ｍＶＬ．１３（配列番号６４）に相当するアミノ酸配列を有する。図２Ｈを参照のこと。
【００７０】
一部の実施形態において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＨ鎖のＣＤＲは、ＶＨ  ＣＤＲ１．１６、ＶＨ  ＣＤＲ２．１６、及びＶＨ  ＣＤＲ３．１６である。特定の実施形態において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＨ鎖は、ｍＶＨ．１６（配列番号６１）に相当する配列を有する。図２Ｉを参照のこと。
【００７１】
一部の実施形態において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＬ鎖のＣＤＲは、ＶＬ  ＣＤＲ１．１６、ＶＬ  ＣＤＲ２．１６、及びＶＬ  ＣＤＲ３．１６である。特定の実施形態において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＬ鎖は、ｍＶＬ．１６（配列番号６５）に相当するアミノ酸配列を有する。図２Ｊを参照のこと。
【００７２】
一部の実施形態において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＨ鎖のＣＤＲは、ＶＨ  ＣＤＲ１．１９、ＶＨ  ＣＤＲ２．１９、及びＶＨ  ＣＤＲ３．１９である。特定の実施形態において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＨ鎖は、ｍＶＨ．１９（配列番号６２）に相当する配列を有する。図２Ｋを参照のこと。
【００７３】
一部の実施形態において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＬ鎖のＣＤＲは、ＶＬ  ＣＤＲ１．１９、ＶＬ  ＣＤＲ２．１９、及びＶＬ  ＣＤＲ３．１９である。特定の実施形態において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＬ鎖は、ｍＶＬ．１９（配列番号６６）に相当するアミノ酸配列を有する。図２Ｌを参照のこと。
【００７４】
一部の実施形態において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＨ鎖のＣＤＲは、ＶＨ  ＣＤＲ１．３、ＶＨ  ＣＤＲ２．３、及びＶＨ  ＣＤＲ３．３であり、ＶＬ鎖のＣＤＲは、ＶＬ  ＣＤＲ１．３、ＶＬ  ＣＤＲ２．３、及びＶＬ  ＣＤＲ３．３である。特定の実施形態において、抗ＰＧモノクローナル抗体のＶＨ鎖は、ｍＶＨ．３（配列番号１２）に相当するアミノ酸配列を有し、ＶＬ鎖は、ｍＶＬ．３（配列番号１３）に相当する配列を有する。
【００７５】
一部の実施形態において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＨ鎖のＣＤＲは、ＶＨ  ＣＤＲ１．４、ＶＨ  ＣＤＲ２．４、及びＶＨ  ＣＤＲ３．４であり、、ＶＬ鎖のＣＤＲは、ＶＬ  ＣＤＲ１．４、ＶＬ  ＣＤＲ２．４、及びＶＬ  ＣＤＲ３．４である。特定の実施形態において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＨ鎖は、ｍＶＨ．４（配列番号１４）に相当するアミノ酸配列を有し、ＶＬ鎖は、ｍＶＬ．４（配列番号１５）に相当するアミノ酸配列を有する。
【００７６】
一部の実施形態において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＨ鎖のＣＤＲは、ＶＨ  ＣＤＲ１．８、ＶＨ  ＣＤＲ２．８、及びＶＨ  ＣＤＲ３．８であり、ＶＬ鎖のＣＤＲは、ＶＬ  ＣＤＲ１．８、ＶＬ  ＣＤＲ２．８、及びＶＬ  ＣＤＲ３．８である。特定の実施形態において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、本明細書に記載する抗ｈＰＧ  ＭＡｂ８であり、ｍＶＨ．８（配列番号５９）に相当するアミノ酸配列及びｍＶＬ．８（配列番号６３）に相当するアミノ酸配列を含む。
【００７７】
一部の実施形態において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＨ鎖のＣＤＲは、ＶＨ  ＣＤＲ１．３、ＶＨ  ＣＤＲ２．１３、及びＶＨ  ＣＤＲ３．１３であり、ＶＬ鎖のＣＤＲは、ＶＬ  ＣＤＲ１．１３、ＶＬ  ＣＤＲ２．１３、及びＶＬ  ＣＤＲ３．１３である。特定の実施形態において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、本明細書に記載する抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１３であり、ｍＶＨ．１３（配列番号６０）に相当するアミノ酸配列及びｍＶＬ．１３（配列番号６４）に相当するアミノ酸配列を含む。
【００７８】
一部の実施形態において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＨ鎖のＣＤＲは、ＶＨ  ＣＤＲ１．１６、ＶＨ  ＣＤＲ２．１６、及びＶＨ  ＣＤＲ３．１６であり、ＶＬ鎖のＣＤＲは、ＶＬ  ＣＤＲ１．１６、ＶＬ  ＣＤＲ２．１６、及びＶＬ  ＣＤＲ３．１６である。特定の実施形態において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、本明細書に記載する抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１６であり、ｍＶＨ．１６（配列番号６１）に相当するアミノ酸配列及びｍＶＬ．１６（配列番号６５）に相当するアミノ酸配列を含む。
【００７９】
一部の実施形態において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体のＶＨ鎖のＣＤＲは、ＶＨ  ＣＤＲ１．１９、ＶＨ  ＣＤＲ２．１９、及びＶＨ  ＣＤＲ３．１９であり、ＶＬ鎖のＣＤＲは、ＶＬ  ＣＤＲ１．１９、ＶＬ  ＣＤＲ２．１９、及びＶＬ  ＣＤＲ３．１９である。特定の実施形態において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、本明細書に記載する抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１９であり、ｍＶＨ．１９（配列番号６２）に相当するアミノ酸配列及びｍＶＬ．１９（配列番号６６）に相当するアミノ酸配列を含む。
【００８０】
開示の抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、ｈＰＧに特異的に結合することが可能であるインタクトな分子、及び抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントなど）の両方を含む。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントは、インタクトな抗体のＦｃフラグメントを欠き、インタクトな抗体よりも、動物及び植物の循環からより迅速に消え、より低い非特異的な組織結合を有しうる（Wahl et al., 1983, J. Nucl. Med. 24: 316）。抗体フラグメントは、従って、他の適用の間で、治療用適用において有用である。
【００８１】
用語「抗体フラグメント」は、全長抗体の部分、一般的には、標的結合領域又は可変領域を指す。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメントを含む。「Ｆｖ」フラグメントは、完全な標的認識及び結合部位を含む最小限の抗体フラグメントである。この領域は、堅固な非共有結合における１つの重鎖及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体（ＶＨ−ＶＬ二量体）からなる。この配置において、各々の可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用し、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の標的結合部位を定義する。しばしば、６つのＣＤＲが、抗体に標的結合特異性を与える。しかし、一部の例において、単一の可変ドメイン（標的について特異的な３つのＣＤＲだけを含むＦｖの半分）でさえ、標的を認識し、それに結合する能力を有することができるが、結合部位全体よりも親和性は低い。「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、それにおいて、これらのドメインは単一ポリペプチド鎖中に存在する。一般的には、Ｆｖポリペプチドは、さらに、ｓｃＦｖが標的結合のための所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨ及びＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーを含む。「単一ドメイン抗体」は、ｈＰＧに十分な親和性を示す、単一のＶＨ又はＶＬドメインで構成される。特定の実施形態において、単一ドメイン抗体はラクダ化抗体である（例、Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231: 25-38を参照のこと）。
【００８２】
Ｆａｂフラグメントは、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１つ又は複数のシステインを含む、重鎖ＣＨｌドメインのカルボキシル末端での数個の残基の付加により、Ｆａｂフラグメントとは異なる。Ｆ（ａｂ’）フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２ペプシン消化産物のヒンジシステインでのジスルフィド結合の開裂により産生される。抗体フラグメントの追加の化学共役は、当業者に公知である。
【００８３】
開示の抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、キメラ抗体でありうる。用語「キメラ」抗体は、本明細書において使用する通り、非ヒト免疫グロブリン（例えばラット又はマウス抗体など）及びヒト免疫グロブリン定常領域（典型的には、ヒト免疫グロブリン鋳型から選ばれる）に由来する可変配列を有する抗体を指す。キメラ抗体を産生するための方法は、当技術分野において公知である。例えば、Morrison, 1985, Science 229 (4719): 1202-7；Oi et al., 1986, BioTechniques 4: 214-221；Gillies et al., 1985, J. Immunol.Methods 125: 191-202；米国特許第５，８０７，７１５号；第４，８１６，５６７号；及び第４，８１６３９７号を参照のこと。それらは、参照により、その全体において本明細書に組み入れられる。
【００８４】
開示の抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、ヒト化することができる。非ヒト（例、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はそのフラグメント（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は抗体の他の標的結合部分配列など）である。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、及び、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、それにおいて、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものであり、「ＣＤＲ移植」として言及することができる。ヒト化抗体は、また、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも部分、典型的にはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものを含むことができる。抗体ヒト化の方法（ヒト化抗体を設計する方法を含む）は、当技術分野において公知である。例えば、Lefranc et al., 2003, Dev. Comp. Immunol. 27: 55-77；Lefranc et al., 2009, Nucl. Acids Res. 37: D1006-1012；Lefranc, 2008, Mol. Biotechnol. 40: 101-111；Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323-7；米国特許第５，５３０，１０１号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６１号；５，６９３，７６２；及び第６，１８０，３７０号、Queen et al.；ＥＰ２３９４００；ＰＣＴ公開ＷＯ  ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；ＥＰ５９２１０６；ＥＰ５１９５９６；Padlan, 1991, Mol. Immunol., 28: 489-498；Studnicka et al., 1994, Prot. Eng. 7: 805-814；Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 969-973；及び米国特許第５，５６５，３３２号を参照のこと。その全てが、参照により、その全体において本明細書により組み入れられる。
【００８５】
ヒト化抗ｈＰＧモノクローナル抗体についての配列は、以下の実施例に記載する通り、本開示のマウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体から設計された。ヒト化抗体の特定の実施態様は、以下：（１）本明細書に開示する任意の３つのＶＬ  ＣＤＲ及び任意の３つのＶＨ  ＣＤＲ；（２）配列番号２１に相当するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２２に相当するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（３）配列番号２３に相当するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２４に相当するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（４）配列番号７５、７７、及び７９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに配列番号７６及び７８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（５）配列番号８０及び８２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに配列番号８１及び８３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（６）配列番号８４、８６、及び８８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに配列番号８５、８７、及び８９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（７）配列番号９０、９２、及び９４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに配列番号９１、９３、及び９５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；を含む抗体を含む。
【００８６】
開示の抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、霊長類化することができる。用語「霊長類化抗体」は、サル可変領域及びヒト定常領域を含む抗体を指す。霊長類化抗体を産生するための方法は、当技術分野において公知である。例、米国特許第５，６５８，５７０号；第５，６８１，７２２号；及び第５，６９３，７８０号を参照のこと。それらは、参照により、その全体において本明細書に組み入れられる。
【００８７】
抗ｈＰＧモノクローナル抗体内には、参照抗体と競合する抗体（例えば、ポリクローナル抗ｈＰＧ抗体など）、又は本明細書に開示する抗ｈＰＧモノクローナル抗体のいずれかが含まれる。開示の抗ｈＰＧモノクローナル抗体と競合する抗体は、診断及び治療の種々のアプリケーションのために有用である。適した参照抗ｈＰＧモノクローナル抗体の特定の実施態様は、例えば、限定はしないが、本明細書に記載する抗体：本明細書に開示する任意の３つのＶＬ  ＣＤＲ及び任意の３つのＶＨ  ＣＤＲを含む抗体；ＶＨ鎖が配列番号１２に相当するアミノ酸配列（ｍＶＨ．３）を有し、ＶＬ鎖が配列番号１３に相当するアミノ酸配列（ｍＶＬ．３）を有する抗体；ＶＨ鎖が配列番号１４に相当するアミノ酸配列（ｍＶＨ．４）を有し、ＶＬ鎖が配列番号１５に相当するアミノ酸配列（ｍＶＬ．４）を有する抗体、ＶＨ鎖が配列番号５９に相当するアミノ酸配列（ｍＶＨ．８）を有し、ＶＬ鎖が配列番号６３に相当するアミノ酸配列（ｍＶＬ．８）を有する抗体；ＶＨ鎖が配列番号６０に相当するアミノ酸配列（ｍＶＨ．１３）を有し、ＶＬ鎖が配列番号６４に相当するアミノ酸配列（ｍＶＬ．１３）を有する抗体；ＶＨ鎖が配列番号６１に相当するアミノ酸配列（ｍＶＨ．１６）を有し、ＶＬ鎖が配列番号６５に相当するアミノ酸配列（ｍＶＬ．１６）を有する抗体；ＶＨ鎖が配列番号６２に相当するアミノ酸配列（ｍＶＨ．１９）を有し、ＶＬ鎖が配列番号６６に相当するアミノ酸配列（ｍＶＬ．１９）又は本明細書に開示するＶＨ及びＶＬ鎖の任意の組み合わせを有する抗体を含む。
【００８８】
適した参照抗体は、また、以下よりなる群より選択されるハイブリドーマにより産生される抗体：４３Ｂ９Ｇ１１、ＷＥ５Ｈ２Ｇ７、６Ｂ５Ｂ１１Ｃ１０、２０Ｄ２Ｃ３Ｇ２、１Ｂ４Ａ１１Ｄ１１、１Ｂ６Ａ１１Ｆ２、１Ｂ１１Ｅ４Ｂ１１、１Ｃ１０Ｄ３Ｂ９、１Ｄ８Ｆ５Ｂ３、１Ｅ１Ｃ７Ｂ４、２Ｂ４Ｃ８Ｃ８、２Ｂ１１Ｅ６Ｇ４、２Ｃ６Ｃ３Ｃ７、２Ｈ９Ｆ４Ｂ７、１Ｅ９Ａ４Ａ４、１Ｅ９Ｄ９Ｂ６、１Ｃ８Ｄ１０Ｆ５、１Ａ７Ｃ３Ｆ１１、１Ｂ３Ｂ４Ｆ１１、１Ｃ１１Ｆ５Ｅ８、１Ｆ１１Ｆ５Ｅ１０、１Ｆ１１Ｆ５Ｇ９、及び１Ａ１１Ｆ２Ｃ９；ｈＰＧの残基１０〜１４（配列番号２８）、ｈＰＧの残基９〜１４（配列番号２９）、ｈＰＧの残基４〜１０（配列番号３０）、ｈＰＧの残基２〜１０（配列番号３１）、又はｈＰＧの残基２〜１４（配列番号３２）を含むエピトープに結合する抗体；及び、ｈＰＧの残基７１〜７４（配列番号３３）、ｈＰＧの残基６９〜７３（配列番号３４）、ｈＰＧの残基７６〜８０（配列番号３５）、又はｈＰＧの残基６７〜７４（配列番号３６）を含むエピトープに結合する抗体を含む。
【００８９】
ＰＧ、例えば、ｈＰＧへの結合について本開示のモノクローナル抗体と競合する能力は、以下の通りに、競合アッセイを使用してテストすることができる。９６ウェルプレートを、捕捉抗体（参照モノクローナル抗体により認識されるエピトープとは異なる、プロガストリンのＮ又はＣ末端領域を認識するポリクローナル又はモノクローナル抗体）を用いて、１〜１０μg/mlの範囲内で選ばれる濃度で、一晩４℃でコーティングする（０．１〜１μg/ウェル）。ＰＢＳ中の０．１%  Tween-20／０．１%  ＢＳＡ（ブロッキング緩衝剤）を用いて２２℃で２時間にわたりブロッキングした後、組換えヒトプロガストリンを、１０pM〜１nM（１０〜１０００pg/ウェル）で加え、２２℃で２時間にわたりインキュベートする。その後、ビオチン化した参照抗ｈＰＧモノクローナル抗体又は参照モノクローナル抗体を含む混合物を、増加濃度の非標識テスト抗体と共に加え、２２℃で１時間にわたりインキュベートする。洗浄後、検出は、２２℃で１時間にわたりホースラディッシュペルオキシダーゼ用の蛍光発生基質を用いてインキュベートすることにより実施し、ルミノメーターにおける相対光単位（ＲＬＵ）の定量化が続く。アッセイは二通り実施する。本開示の参照抗ｈＰＧモノクローナル抗体と競合する抗体は、ｈＰＧに対する参照抗体の結合を阻害する。対照抗体と同じエピトープに結合する抗体は、結合について効果的に競合することができ、このように、結合標識における低下により証明される通り、参照抗体結合を有意に低下させうる（例えば、少なくとも５０%だけ）。完全に無関係の抗体の非存在における（標識された）参照抗体の反応性は、対照の高値になりうる。対照の低値は、非標識テスト抗体を、プロガストリンを発現する細胞とインキュベートすることにより得られ、競合が生じ、標識抗体の結合を低下させる場合、細胞／抗体混合物を、正確に同じ型の標識対照抗体とインキュベートする。テストアッセイにおいて、テスト抗体の存在における標識抗体の反応性の有意な低下は、実質的に同じエピトープを認識するテスト抗体の指標である。
【００９０】
結合阻害は、以下の式：
Ｋｉ  ＝  ＩＣ５０／（１＋  ［参照Ａｂ濃度］  ／  Ｋｄ）
に従って計算される、阻害定数、又はＫｉとして表現することができる。
ここで、テスト抗体のＩＣ５０は、参照抗体の結合における５０%低下をもたらすテスト抗体の濃度であり、Ｋｄは、参照抗体の解離定数（プロガストリンについてのその親和性の測定値）である。本明細書に開示する抗ｈＰＧモノクローナル抗体と競合する抗体は、本明細書に記載するアッセイ条件下で、１０pM〜１０nMのＫｉを有しうる。
【００９１】
種々の実施態様において、開示の非標識抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、標識した参照抗体の結合を、少なくとも４０%だけ、少なくとも５０%だけ、少なくとも６０%だけ、少なくとも７０%だけ、少なくとも８０%だけ、少なくとも９０%だけ、１００%だけ、あるいは、抗ｈＰＧモノクローナル抗体が濃度０．０１μg/ml、０．０８μg/ml、０．４μg/ml、２μg/ml、１０μg/ml、５０μg/ml、１００μg/ml又は前述の値のいずれかの間の範囲の濃度で（例、２μg/ml〜１０μg/mlの範囲の濃度で）使用される場合、前述の値（例、開示の抗ｈＰＧモノクローナル抗体が、標識された参照抗体の結合を５０%〜７０%だけ低下させる）のいずれかの間の範囲のパーセンテージだけ低下させる。
【００９２】
参照抗体と任意のテスト抗体（種又はアイソタイプに無関係）の間での抗体競争試験を行う際、人は、最初に、標識可能な標識、例えばビオチン又は酵素（又はさらには放射性）標識を用いて標識し、その後の同定を可能にしうる。この場合において、標識した参照抗体（固定又は増加濃度）を、既知量のプロガストリンとインキュベートする。非標識テスト抗体を、プロガストリンと標識抗体の事前に結合させた複合体に加える。結合標識の強度を測定する。テスト抗体が、重複するエピトープに結合することにより、標識抗体と競合する場合、強度は、テスト抗体の非存在において、対照標識抗体の結合と比べて減少する。
【００９３】
競合についてのアッセイは公知であり、適応させて、上に記載するアッセイと同程度の結果をもたらすことができる。アッセイは、抗体競合に基づく免疫学的アッセイの範囲のいずれか１つでありうる。参照抗体は、それらの標識を検出する手段により、例えば、ビオチン化抗体の場合にはストレプトアビジンを使用することにより、又は、酵素標識（例えば、ペルオキシダーゼ酵素を伴う３，３’５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質など）に関連する発色基質を使用することにより、又は、単に放射性標識もしくは蛍光標識を検出することにより、検出されうる。
【００９４】
また、診断的及び治療的適用における使用のために、誘導体化された、共有結合的に修飾された、又は他の分子に結合された抗ｈＰＧモノクローナル抗体が本明細書に含まれる。例えば、しかし、限定しないが、誘導体化された抗体は、例えば、細胞リガンド又は他のタンパク質などへの公知の保護／遮断基、タンパク質分解的切断、連結によるグリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、誘導体化により修飾されている抗体を含む。多数の化学修飾のいずれかを、公知の技術（しかし、限定しないが、特定の化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成など）により行うことができる。加えて、誘導体は、１つ又は複数の非古典的アミノ酸を含むことができる。
【００９５】
別の例において、本開示の抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に付着させることができる。特定の実施態様において、抗体は抗体フラグメントであり、ＰＥＧ部分は、抗体フラグメント中に位置付けられる利用可能な任意のアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基、例えば、任意の遊離アミノ基、イミノ基、チオール基、ヒドロキシル基、又はカルボキシル基を通じて付着される。そのようなアミノ酸は、抗体フラグメント中で自然に生じうる、又は、組換えＤＮＡ方法を使用してフラグメントに操作することができる。例えば、米国特許第５，２１９，９９６号を参照のこと。複数の部位を使用して、２つ又はそれ以上のＰＥＧ分子を結合することができる。ＰＥＧ部分は、抗体フラグメント中に位置付けられる少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を通じて共有結合的に連結することができる。チオール基を付着点として使用する場合、適切に活性化されたエフェクター部分、例えば、チオール選択的誘導体（例えばマレイミド及びシステイン誘導体など）を使用することができる。
【００９６】
具体的な例において、抗ｈＰＧモノクローナル抗体コンジュゲートは、ＰＥＧ化された、即ち、ＥＰ０９４８５４４に開示される方法に従って、それに共有結合的に付着されたＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））を有する修飾Ｆａｂ’フラグメントである。また、Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications, (J. Milton Harris (ed.), Plenum Press, New York, 1992)；Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications, (J. Milton Harris and S. Zalipsky, eds., American Chemical Society, Washington D.C., 1997)；及びBioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences, (M. Aslam and A. Dent, eds., Grove Publishers, New York, 1998)；及びChapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 54: 531-545を参照のこと。ＰＥＧを、ヒンジ領域のシステインに付着させることができる。１つの例において、ＰＥＧ修飾Ｆａｂ’フラグメントは、修飾されたヒンジ領域内の単一のチオール基に共有結合的に連結されたマレイミド基を有する。リジン残基をマレイミド基に共有結合的に連結することができ、リジン残基上のアミン基の各々に、およそ２０，０００Daの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーを付着することができる。Ｆａｂ’フラグメントに付着されているＰＥＧの総分子量は、従って、およそ４０，０００Daでありうる。
【００９７】
抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、診断的適用において有用な標識抗体を含む。抗体を診断的に使用することができ、例えば、特定の細胞、組織、又は血清における目的の標的の発現を検出する；又は、臨床テスト手順の一部として、免疫学的応答の発生又は進行をモニターし、例えば、所与の処置計画の効力を決定する。検出は、検出可能な物質又は「標識」へ抗体を共役させることにより促進することができる。標識は、開示の抗ｈＰＧモノクローナル抗体に直接的又は間接的に結合させることができる。標識はそれ自体が検出可能であり（例、放射性同位体標識、同位体標識、又は蛍光標識）、あるいは、酵素標識の場合において、基質化合物又は検出可能な組成物の化学変化を触媒することができる。検出可能な物質の例は、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々のポジトロン放出断層撮影を使用した陽電子放出金属、及び非放射性常磁性金属イオンを含む。検出可能な物質は、中間体（例えば、当技術分野において公知のリンカーなど）を通じて、当技術分野において公知の技術を使用して、抗体（又はそのフラグメント）に直接的に又は間接的に共役又は結合させることができる。酵素標識の例としては、ルシフェラーゼ（例、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４７３７４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）など、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ（例、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼなど）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどを含む。適した補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンを含む；適した蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン  フルオレセイン、ダンシルクロリド、ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリスリンなどを含む；発光物質の例は、ルミノールを含む；生物発光物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンを含む；適した同位体物質の例は、１３Ｃ、１５Ｎ、及び重水素を含む；及び、適した放射性物質の例は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、又は９９Ｔｃを含む。
【００９８】
全ての種に由来する抗ｈＰＧモノクローナル抗体が本発明に含まれる。非限定的な例示的な自然抗体は、ヒト、サル、ニワトリ、ヤギ、ウサギ、及び齧歯類（例、ラット、マウス、及びハムスター）に由来する抗体を含む（例、Lonberg et al., ＷＯ９３／１２２２７；米国特許第５，５４５，８０６号；及び、Kucherlapati, et al., ＷＯ９１／１０７４１；米国特許第６，１５０，５８４号、それらは、参照により、その全体において本明細書に組み入れられる）。自然抗体は、抗原（例えばポリペプチドなど）を用いて免疫化された後に宿主動物により産生される抗体である。
【００９９】
核酸及び発現系
本開示は、抗ｈＰＧモノクローナル抗体についての免疫グロブリン軽鎖及び重鎖遺伝子をコードする核酸分子、そのような核酸を含むベクター、及び開示の抗ｈＰＧモノクローナル抗体を産生することが可能である宿主細胞を包含する。
【０１００】
開示の抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、宿主細胞における免疫グロブリン軽鎖及び重鎖遺伝子の組換え発現により調製することができる。抗体を組換え的に発現させるために、宿主細胞を、抗体の免疫グロブリン軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡフラグメントを保有する１つ又は複数の組換え発現ベクターを用いてトランスフェクトし、軽鎖及び重鎖が宿主細胞において発現され、場合により、宿主細胞が培養される培地中に分泌され、その培地から抗体を回収することができる。標準的な組換えＤＮＡ方法論を使用して、抗体重鎖及び軽鎖遺伝子を得て、組換え発現ベクター中にこれらの遺伝子を組み込み、宿主細胞中にベクターを導入する。例えば、Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition (Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Cold Spring Harbor, N. Y., 1989), Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F. M. et al., eds., Greene Publishing Associates, 1989)及び米国特許第４，８１６，３９７号に記載されるものなどである。
【０１０１】
そのような抗ｈＰＧモノクローナル抗体をコードする核酸を生成するために、軽鎖及び重鎖可変領域をコードするＤＮＡフラグメントを最初に得る。これらのＤＮＡは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、軽鎖及び重鎖可変配列をコードする生殖系列ＤＮＡ又はｃＤＮＡの増幅及び改変により得ることができる。ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は、当技術分野において公知である（例、Lefranc et al., 2003, Dev. Comp. Immunol. 27: 55-77；Lefranc et al., 2009, Nucl. Acids Res. 37: D1006-1012；Lefranc, 2008, Mol. Biotechnol. 40: 101-111; the “VBASE” human germline sequence databaseを参照のこと；また、Kabat, E. A. et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242；Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 22T: 116-198；及びCox et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24: 827-836を参照のこと。それらの各々の内容は、参照により本明細書に組み入れられる）。
【０１０２】
一旦、抗ｈＰＧモノクローナル抗体関連ＶＨ及びＶＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントが得られれば、これらのＤＮＡフラグメントは、例えば、可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子に、Ｆａｂフラグメント遺伝子に、又はｓｃＦｖ遺伝子に変換するために、標準的な組換えＤＮＡ技術によりさらに操作することができる。これらの操作において、ＶＬ又はＶＨをコードするＤＮＡフラグメントを、別のタンパク質をコードする別のＤＮＡフラグメント（例えば抗体定常領域又はフレキシブルリンカーなど）に作動可能的に連結する。用語「作動可能に連結する」は、本文脈で使用する通り、２つのＤＮＡフラグメントが、２つのＤＮＡフラグメントによりコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように結合されていることを意味することを意図する。
【０１０３】
ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡを、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及び、場合により、ＣＨ４）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することにより全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野において公知である（例、Kabat, E.A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照のこと）。これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、又はＩｇＤ定常領域でありうるが、しかし、特定の実施形態において、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４定常領域である。Ｆａｂフラグメント重鎖遺伝子について、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖ＣＨ１定常領域だけをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することができる。
【０１０４】
ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡを、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することにより、全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野において公知である（例、Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition (U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)を参照のこと）。これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパ又はラムダ定常領域でありうるが、しかし、特定の実施形態において、カッパ定常領域である。ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、ＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡフラグメントを、フレキシブルリンカーをコードする、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４〜Ｓｅｒ）３（配列番号９９）をコードする別のフラグメントに作動可能に連結し、ＶＨ及びＶＬ配列を近接する単鎖タンパク質として発現させることができ、ＶＬ及びＶＨ領域がフレキシブルリンカーにより結合されるようにする（例、Bird et al., 1988, Science 242: 423-426；Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883；McCafferty et al., 1990, Nature 348: 552-554を参照のこと）。
【０１０５】
開示の抗ｈＰＧモノクローナル抗体を発現させるために、上に記載する通りに得られた、部分的な又は全長の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡを、遺伝子が転写及び翻訳制御配列に作動可能に連結されるように、発現ベクター中に挿入する。本文脈において、用語「作動可能に連結された」は、ベクター内の転写及び翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写及び翻訳を制御するそれらの意図した機能を果たすように、抗体遺伝子がベクター中に連結されていることを意味することを意図する。発現ベクター配列及び発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選ばれる。抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は、別々のベクター中に挿入することができる、又は、より典型的には、両方の遺伝子が同じ発現ベクター中に挿入される。
【０１０６】
抗体遺伝子は、標準的な方法により発現ベクター中に挿入される（例、抗体遺伝子フラグメント及びベクター上の相補的制限部位のライゲーション、又は、制限部位が存在しない場合には平滑末端のライゲーション）。抗ｈＰＧモノクローナル抗体関連の軽鎖又は重鎖配列の挿入に先立ち、発現ベクターは、既に抗体定常領域配列を保有しうる。例えば、抗ｈＰＧモノクローナル抗体に関連するＶＨ及びＶＬ配列を、全長抗体遺伝子に変換するための１つのアプローチは、重鎖定常領域及び軽鎖定常領域を既にコードする発現ベクター中にそれらを挿入することであり、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントに作動可能に連結され、ＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントに作動可能に連結される。加えて又は代わりに、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、ベクター中にクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド（即ち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド）でありうる。
【０１０７】
抗体鎖遺伝子に加えて、開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞において抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を保有する。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、及び抗体鎖遺伝子の転写又は翻訳を制御する他の発現制御エレメント（例、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。そのような調節配列は、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, CA, 1990)に記載されている。発現ベクターの設計（調節配列の選択を含む）が、形質転換する宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの要因に依存しうることが、当業者により理解されるであろう。哺乳動物宿主細胞での発現のための適した調節配列は、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現に向けるウイルスエレメント、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えばＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えばＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルス（例、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、及びポリオーマに由来するプロモーター及び／又はエンハンサーなどを含む。ウイルス調節エレメント及びそれらの配列のさらなる記載については、例えば、米国特許第５，１６８，０６２号（Stinskiによる）、米国特許第４，５１０，２４５号（Bell et al.による）、及び米国特許第４，９６８，６１５号（Schaffner et al.による）を参照のこと。
【０１０８】
抗体鎖遺伝子及び調節配列に加えて、開示の組換え発現ベクターは、追加配列、例えば宿主細胞においてベクターの複製を調節する配列（例、複製起点）及び選択可能なマーカー遺伝子などを保有することができる。選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を促進させる（例、米国特許第４，３９９，２１６号、第４，６３４，６６５号、及び第５，１７９，０１７号（Axel et al.））。例えば、典型的には、選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、薬物（例えばＧ４１８、ハイグロマイシン、又はメトトレキサートなど）への耐性を与える。適した選択可能なマーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メソトレキセート選択／増幅を伴うＤＨＦＲ−宿主細胞内での使用のため）及びネオ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）を含む。軽鎖及び重鎖の発現のために、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターを、標準的な技術により宿主細胞中にトランスフェクトする。用語「トランスフェクション」の種々の形態は、原核生物又は真核生物の宿主細胞中への外来ＤＮＡの導入のために一般的に使用される多種多様の技術（例、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなど）を包含することを意図する。
【０１０９】
原核生物又は真核生物のいずれかの宿主細胞において開示の抗体を発現させることが可能である。特定の実施態様において、抗体の発現は、適当に折り畳まれ、免疫学的に活性な抗体の最適な分泌が、真核細胞（例、哺乳動物宿主細胞）において実施される。開示の組換え抗体を発現させるための例示的な哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞を含む。Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220に記載され、ＤＨＦＲ選択可能マーカーと使用される。例、Kaufman and Sharp, 1982, Mol. Biol. 159: 601-621に記載される）、ＮＳＯミエローマ細胞、ＣＯＳ細胞、及びＳＰ２細胞を含む。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞中に導入する場合、抗体は、宿主細胞における抗体の発現又は宿主細胞を成長させる培養培地中への抗体の分泌を許すために十分な時間にわたり宿主細胞を培養することにより産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製法を使用して培養培地から回収することができる。宿主細胞を使用して、インタクトな抗体の部分（例えばＦａｂフラグメント又はｓｃＦｖ分子など）を産生することもできる。上の手順に関するバリエーションは、本開示の範囲内であることが理解される。例えば、宿主細胞を、本開示の抗ｈＰＧモノクローナル抗体の軽鎖又は重鎖のいずれか（しかし両方ではない）をコードするＤＮＡを用いてトランスフェクションすることが望ましい。
【０１１０】
組換えＤＮＡ技術を使用して、ｈＰＧへの結合のために必要とされない軽鎖及び重鎖のいずれか又は両方をコードするＤＮＡの一部又は全てを除去することもできる。そのような切断ＤＮＡ分子から発現される分子も、開示の抗体に包含される。
【０１１１】
開示の抗ｈＰＧモノクローナル抗体の組換え発現のために、宿主細胞を、開示の２つの発現ベクターを用いて同時トランスフェクトすることができ、第１ベクターは重鎖由来ポリペプチドをコードし、第２ベクターは軽鎖由来ポリペプチドをコードする。２つのベクターは同一の選択可能なマーカーを含むことができ、又は、それらは、各々、別々の選択可能なマーカーを含むことができる。あるいは、重鎖及び軽鎖の両方のポリペプチドをコードする単一ベクターを使用することができる。
【０１１２】
一旦、抗ｈＰＧモノクローナル抗体の１つ又は複数の部分をコードする核酸が、さらなる変化又は変異をコード配列中に導入して、例えば、異なるＣＤＲ配列を伴う抗体、Ｆｃ受容体に対する低下した親和性を伴う抗体、又は異なるサブクラスの抗体をコードする核酸を生成することができる。
【０１１３】
開示の抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、また、化学合成により（例、Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984 The Pierce Chemical Co., Rockford, Illに記載されている方法により）産生することができる。異型抗体は、また、無細胞プラットフォーム（例、Chu et al., Biochemia  No. 2, 2001 (Roche Molecular Biologicals)を参照のこと）を使用して生成することができる。
【０１１４】
一旦、開示の抗ｈＰＧモノクローナル抗体が組換え発現により産生されれば、それは、例えば、免疫グロブリン分子の精製のための当技術分野において公知の任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、及びサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差により、又は、タンパク質の精製のための他の標準的な技術により精製することができる。さらに、本開示の抗ｈＰＧモノクローナル抗体又はそのフラグメントを、本明細書に記載する、又は、そうでなければ、当技術分野において公知の異種ポリペプチド配列に融合して、精製を促進することができる。
【０１１５】
一旦、単離されれば、抗ｈＰＧモノクローナル抗体を、所望の場合、例えば、高速液体クロマトグラフィー（例、Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology (Work and Burdon, eds., Elsevier, 1980)を参照のこと）により、又は、Superdex（商標）75カラム（Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden）上でのゲル濾過クロマトグラフィーによりさらに精製することができる。
【０１１６】
本発明は、抗ｈＰＧモノクローナル抗体を産生することが可能である宿主細胞を提供する。宿主細胞は、重鎖及び軽鎖遺伝子をコードする遺伝子を発現するように組換えＤＮＡ技術を使用して操作された細胞又は適した生物に由来し、所望の抗体を産生する能力について選択されたハイブリドーマでありうる。
【０１１７】
抗ＰＧモノクローナル抗体を産生することが可能な宿主細胞は、ハイブリドーマでありうる。ハイブリドーマを生成するための方法は、当技術分野において公知であり（例、Kohler and Milstein, 1975, Nature 256: 495を参照のこと）、例を以下に提供する。一般的には、宿主動物（例えばマウスなど）を、免疫原（例えば目的のペプチドなど）を用いて免疫化し、免疫原に特異的に結合することが可能な抗体を産生する、リンパ球、例えば、脾臓細胞の発生を誘発する。あるいは、単離リンパ球（脾臓細胞、リンパ節細胞、又は末梢血リンパ球を含む）は、インビトロで免疫化することができる。リンパ球を、次に、適した融合薬剤（例、ポリエチレングリコール）を使用して、不死化細胞株（例えばミエローマ細胞株など）と融合させて、ハイブリドーマ細胞株を形成する。適した不死化細胞株は、哺乳動物（例えばマウス、ウシ、又はヒトなど）に由来しうる。ハイブリドーマ細胞を、次に、非融合、不死化細胞の成長又は生存を阻害する１つ又は複数の物質を含む任意の適した培地中で培養する。例えば、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く親細胞が使用される場合、融合体を、親の非融合細胞の成長を阻害するヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（「ＨＡＴ」培地）を含む培地中で増殖させることができる。
【０１１８】
一部の実施形態において、Ｎ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ４３Ｂ９Ｇ１１（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  １を産生する）、ＷＥ５Ｈ２Ｇ７（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ２を産生する）、６Ｂ５Ｂ１１Ｃ１０（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ３を産生する）、２０Ｄ２Ｃ３Ｇ２（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ４を産生する）、１Ｅ９Ａ４Ａ４（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  １５を産生する）、１Ｅ９Ｄ９Ｂ６（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  １６を産生する）、１Ｃ８Ｄ１０Ｆ５（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  １７を産生する）、１Ａ７Ｃ３Ｆ１１（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  １８を産生する）、１Ｂ３Ｂ４Ｆ１１（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  １９を産生する）、及び１Ｃ１１Ｆ５Ｅ８（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ２０を産生する）から入手可能なモノクローナル抗体のＶＬに相当する可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲを有する。
【０１１９】
一部の実施形態において、Ｎ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、上のハイブリドーマから入手可能なモノクローナル抗体のＶＬ及びＶＨ  ＣＤＲに相当するＶＬ及びＶＨ  ＣＤＲを有する。
【０１２０】
一部の実施形態において、Ｃ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ１Ｂ４Ａ１１Ｄ１１（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ５を産生する）、１Ｂ６Ａ１１Ｆ２（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ６を産生する）、１Ｂ１１Ｅ４Ｂ１１（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ７を産生する）、１Ｃ１０Ｄ３Ｂ９（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ８を産生する）、１Ｄ８Ｆ５Ｂ３（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ９を産生する）、１Ｅ１Ｃ７Ｂ４（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  １０を産生する）、２Ｂ４Ｃ８Ｃ８（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  １１を産生する）、２Ｂ１１Ｅ６Ｇ４（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  １２を産生する）、２Ｃ６Ｃ３Ｃ７（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  １３を産生する）、２Ｈ９Ｆ４Ｂ７（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  １４を産生する）、１Ｆ１１Ｆ５Ｅ１０（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ２１を産生する）、１Ｆ１１Ｆ５Ｇ９（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ２２を産生する）、及び１Ａ１１Ｆ２Ｃ９（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ２３を産生する）から入手可能なモノクローナル抗体のＶＬに相当するＶＬ  ＣＤＲを有する。
【０１２１】
一部の実施形態において、Ｃ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、上のハイブリドーマから入手可能なモノクローナル抗体のＶＬ及びＶＨ  ＣＤＲに相当するＶＬ及びＶＨ  ＣＤＲを有する。
【０１２２】
実施態様において、配列番号１２を含む重鎖可変領域及び配列番号１３を含む軽鎖可変領域を含む抗ｈＰＧ抗体を産生することが可能な宿主細胞を提供する。実施態様において、配列番号１４を含む重鎖可変領域及び配列番号１５を含む軽鎖可変領域を含む抗ｈＰＧ抗体を産生することが可能な宿主細胞を提供する。実施態様において、配列番号５９を含む重鎖可変領域及び配列番号６３を含む軽鎖可変領域を含む抗ｈＰＧ抗体を産生することが可能な宿主細胞を提供する。実施態様において、配列番号６０を含む重鎖可変領域及び配列番号６４を含む軽鎖可変領域を含む抗ｈＰＧ抗体を産生することが可能な宿主細胞を提供する。実施態様において、配列番号６１を含む重鎖可変領域及び配列番号６５を含む軽鎖可変領域を含む抗ｈＰＧ抗体を産生することが可能な宿主細胞を提供する。実施態様において、配列番号６２を含む重鎖可変領域及び配列番号６６を含む軽鎖可変領域を含む抗ｈＰＧ抗体を産生することが可能な宿主細胞を提供する。
【０１２３】
一部の実施態様において、開示の宿主細胞は、以下：配列番号１２、１４、５９、６０、６１、及び６２の重鎖可変領域ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ならびに、配列番号１３、１５、６３、６４、６５、及び６６の軽鎖可変領域ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列より選択される核酸より選択される核酸を含む。一部の実施態様において、重鎖可変領域は、配列番号１６、１８、６７、６８、６９、及び７０より選択される核酸配列によりコードされる。一部の実施態様において、軽鎖可変領域は、配列番号１７、１９、７１、７２、７３、及び７４より選択される核酸配列によりコードされる。
【０１２４】
一部の実施形態において、ヒト化抗ｈＰＧモノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。特定の実施態様は、配列番号２１、２３、７５、７７、７９、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、及び９４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ヒト化抗ｈＰＧモノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。特定の実施態様は、配列番号２２、２４、７６、７８、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、及び９５からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１２５】
抗ｈＰＧモノクローナル抗体の生物学的活性
ＰＧは、ＣＲＣ腫瘍細胞の生存及び／又は増殖に関与している。操作の任意の理論により拘束されることを意図しないが、ＰＧの結合を通じて、中和抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、そのシグナル伝達パートナーと相互作用するＰＧの能力を遮断又は阻害すると考えられる。これは、順に、プロガストリンへの細胞応答、例えば細胞増殖、低下した細胞分化及び／又は低下した細胞死、及び／又は腫瘍成長などを遮断又は阻害する。これらの活性の結果として、開示の中和抗ｈＰＧモノクローナル抗体を、種々のインビトロ、インビボ、及びエクスビボの文脈において使用して、ＰＧに結合し、ＰＧ依存性シグナル伝達を遮断することができる。
【０１２６】
したがって、本開示は、ＣＲＣ細胞におけるＰＧ依存性応答を阻害する方法を提供する。一般的に、この方法は、ＣＲＣ細胞の１つ又は複数のＰＧ誘導性応答（例、ＣＲＣ細胞の増殖及び／又は生存）を阻害するために効果的な量で、中和抗ＰＧモノクローナル抗体に、ＣＲＣ細胞を接触させる、又は細胞集団を曝露させることを含む。インビトロ及びインビボでのその増殖又は阻害は、細胞数、腫瘍数、又は腫瘍サイズにおける増加を経時的に測定するためのアッセイに従って決定することができる。細胞及び腫瘍の増殖の阻害のためのアッセイは、当技術分野において周知である。
【０１２７】
ＰＧ依存性シグナル伝達の遮断は、細胞死を増加させることによりＣＲＣ細胞の生存を阻害することができる。インビトロ又はインビボでのＣＲＣ細胞生存の阻害は、経時的（例、２４又は４８時間）に生癌細胞数の低下を測定することにより決定することができる。細胞死のためのアッセイは当技術分野において周知である。加えて、細胞生存アッセイの例を本明細書に提供する。
【０１２８】
試験は、さらに、ＣＲＣ腫瘍細胞におけるＰＧ依存性の阻害が、シグナル伝達プログラム細胞死又はアポトーシスを引き起こすことによりＣＲＣ細胞の生存を阻害することができることを示唆する。アポトーシスの誘導は、しかし、限定しないが、プロ又は抗アポトーシス活性を有する遺伝子の発現における変化を測定する、当技術分野において公知の任意の手段により決定することができる。例えば、プロアポトーシス遺伝子（例えばＢａｘなど）の経時的な（例、４８時間）発現増加は、アポトーシスにおける増加を示唆している。同様に、抗アポトーシス遺伝子（例えば、しかし、限定しないが、Ｂｃｌ−２など）の経時的な（例、７２又は９６時間）発現減少は、アポトーシスにおける増加を示唆している。遺伝子発現における変化を測定するための技術（例えばリアルタイム定量ＰＣＲなど）は、当技術分野において周知である。例えば、Hollande et al., ＷＯ  ２００７／１３５５４２を参照のこと。
【０１２９】
プロガストリン依存性シグナル伝達の阻害は、また、細胞分化を刺激する。したがって、ＣＲＣ細胞の増殖及び／又は生存を阻害する方法は、インビトロ又はインビボでＣＲＣ細胞の分化を誘導するために効果的な中和抗ＰＧモノクローナル抗体の量を投与することを含む。ＣＲＣ細胞の分化は、細胞分化についての遺伝子マーカー、例えば、しかし、限定しないが、Ｍｕｃ−２又は分化した腸細胞（例、杯細胞）についての他のマーカーなどの発現における経時的（例、２４又は４８時間）増加を測定することにより決定することができる。遺伝子発現における変化は、当技術分野において公知の任意の手段により測定することができる。例えば、Hollande et al., ＷＯ  ２００７／１３５５４２を参照のこと。発現又は抑制がＰＧ（例えばＩＣＡＴなど）に依存している他の遺伝子も標準的な方法を使用してアッセイすることができる。同上を参照のこと。
【０１３０】
医薬組成物
抗ＰＧモノクローナル抗体を、組成物中で製剤化することができる。場合により、組成物は、１つ又は複数の追加の治療用薬剤、例えば、以下に記載する第２の治療用薬剤などを含むことができ、本明細書において提供する。組成物は、普通は、医薬的に許容され得る担体を通常含む、無菌の医薬組成物の一部として提供する。この組成物は、任意の適切な形態にすることができる（患者へのその投与の所望の方法に依存して）。
【０１３１】
開示の抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、種々の経路により、例えば経口、経皮、皮下、鼻腔内、静脈内、筋肉内、眼内、局所、髄腔内、及び脳室内などに患者に投与することができる。任意の所与の場合における最も適した投与のための経路は、特定の抗体、被験体、ならびに疾患の性質及び重症度ならびに被験体の身体的状態に依存しうる。抗体は、水溶液として製剤化し、皮下注射により投与することができる。
【０１３２】
医薬組成物は、１用量当たりに、開示の抗ｈＰＧモノクローナル抗体の所定量を含む単位用量形態で便利に提示することができる。そのようなユニットは、例えば、限定はしないが、５mg〜５g、１０mg〜１g、又は２０〜５０mgを含むことができる。開示における使用のための医薬的に許容可能な担体は、多種多様の形態を、例えば、処置すべき状態又は投与経路に依存して取りうる。
【０１３３】
開示の医薬組成物は、所望の純度を有する抗体を、当技術分野において典型的に利用される任意の医薬的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定剤（その全てが本明細書において「担体」と言及される）、即ち、緩衝化薬剤、安定化薬剤、保存剤、等張剤、非イオン性界面活性剤、酸化防止剤、及び他の種々の添加剤と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液として保存のために調製することができる。Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed.1980)を参照のこと。そのような添加剤は、利用する投与量及び濃度でレシピエントに非毒性でなければならない。
【０１３４】
緩衝化薬剤は、生理学的条件に近似する範囲内のｐＨに維持するために役立つ。それらは約２mM〜約５０mMの範囲の濃度で存在しうる。本開示を用いた使用のための適した緩衝剤は、有機酸及び無機酸の両方ならびにその塩、例えばクエン酸緩衝剤（例、クエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合物など）、コハク酸緩衝剤（例、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物など）、酒石酸緩衝剤（例、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物など）、フマル酸緩衝剤（例、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸緩衝剤（例、グルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物など）、シュウ酸緩衝剤（例、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸緩衝剤（例、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物など）、及び酢酸緩衝剤（例、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物など）などを含む。加えて、リン酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、及びトリメチルアミン塩（例えばトリスなど）を使用することができる。
【０１３５】
保存剤を加えて、微生物の成長を遅らせることができ、０．２%〜１%（ｗ／ｖ）の範囲の量で加えることができる。本開示を用いた使用のために適する保存剤は、フェノール、ベンジルアルコール、メタ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、ベンザルコニウムハロゲン化物（例、塩化物、臭化物、ヨウ化物）、ヘキサメトニウムクロライド、及びアルキルパラベン（例えばメチル又はプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、及び３−ペンタノールなど）を含む。「安定剤」として時折公知である等張剤を加えて、本開示の液体組成物の等張性を確実にすることができ、多価糖アルコール、例えば、三価又はそれより高い糖アルコール、例えばグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及びマンニトールなどを含む。安定剤は、増量剤から、治療用薬剤を可溶化する、あるいは、変性又は容器壁への付着を予防するために有用な添加物までの機能の範囲に及びうる賦形剤の広範なカテゴリーを指す。典型的な安定剤は、多価糖アルコール（上に列挙する）；アミノ酸（例えばアルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなど）、有機糖又は糖アルコール（例えばラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール、ガラクチトール、グリセロールなど）、（シクリトール、例えばイノシトールなどを含む）；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；硫黄を含有する還元剤、例えば尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロール、及びナトリウムチオ硫酸塩など；低分子量ポリペプチド（例、１０残基又はそれより少ないペプチド）；タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなど；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン単糖類など、例えばキシロース、マンノース、フルクトース、グルコースなど；二糖類、例えばラクトース、マルトース、スクロースなど、及び、三糖類、例えばラフィノースなど；及び、多糖類、例えばデキストランなどでありうる。安定剤は、活性タンパク質重量の０．１〜１０，０００重量部の範囲で存在しうる。
【０１３６】
非イオン性サーファクタント又は界面活性剤（「湿潤剤」としても公知である）を加えて、治療用薬剤を可溶化させ、ならびに、撹拌誘導性凝集に対して治療用タンパク質を保護するために役立ちうるが、また、製剤が、タンパク質の変性を起こすことなく圧力が加えられたせん断面に曝露されることを許す。適した非イオン性サーファクタントは、ポリソルベート（２０、８０など）、ポリオキサマー（１８４、１８８など）、プルロニックポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（TWEEN（登録商標）-20、TWEEN（登録商標）-80など）を含む。非イオン性サーファクタントは、約０．０５mg/ml〜約１．０mg/ml、例えば、約０．０７mg/ml〜約０．２mg/mlの範囲で存在しうる。
【０１３７】
追加の種々の賦形剤は、増量剤（例、デンプン）、キレート剤（例、ＥＤＴＡ）、酸化防止剤（例、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）、及び共溶媒を含む。
【０１３８】
抗ＰＧモノクローナル抗体は、単独で、１つ又は複数の抗ＰＧモノクローナル抗体の混合物として、ＣＲＣを処置するために有用な他の薬剤との混合物又は組み合わせで、あるいは、ＣＲＣのための他の治療への補助として投与することができる。適した組み合わせ及び補助療法の例を、以下に提供する。
【０１３９】
開示の中和抗ｈＰＧモノクローナル抗体（抗体コンジュゲートを含む）を含む医薬的キットが、本開示により包含される。医薬的キットは、中和抗ｈＰＧモノクローナル抗体（例、凍結乾燥形態又は水溶液のいずれか）及び以下：
・第２の治療用薬剤（例えば、以下に記載する）；
・抗ｈＰＧモノクローナル抗体を投与するためのデバイス（例えば、ペン、ニードル、及び／又はシリンジ）；及び
・抗体が凍結乾燥形態である場合、抗体を再懸濁するための医薬品グレードの水又は緩衝剤
のいずれか１つ又は複数を含むパッケージである。
【０１４０】
抗ｈＰＧモノクローナル抗体の各々の単位用量を、別々にパッケージ化することができる。キットは１つ又は複数の単位用量（例、２単位用量、３単位用量、４単位用量、５単位用量、８単位用量、１０単位又はそれ以上）を含むことができる。特定の実施形態において、１つ又は複数の単位用量を、各々、シリンジ又はペンに収容する。
【０１４１】
効果的な投与量
中和抗ＰＧモノクローナル抗体、又はその組成物は、一般的に、意図した結果を達成するために効果的な量で、例えば、それを必要とする被験体においてＣＲＣを処置するために効果的な量で使用される。中和抗ＰＧモノクローナル抗体を含む医薬的組成物は、治療的に効果的な投与量で患者（例、ヒト被験体）に投与することができる。本明細書において使用する通り、「治療的に効果的な」投与量は、治療的利益を与える量である。ＣＲＣ治療の文脈において、治療的利益は、ＣＲＣの任意の寛解を意味し、以下：ＣＲＣの進行（例、結腸直腸癌の１段階から次の段階への）を止める又は遅くすること、ＣＲＣの症状又は徴候の憎悪又は悪化を止める又は遅くすること、ＣＲＣの重症度を低下させること、ＣＲＣの緩和を誘導すること、ＣＲＣ腫瘍増殖、ＣＲＣ腫瘍サイズ、もしくはＣＲＣ腫瘍数を阻害すること、又はＰＧ血清レベルを低下させることの任意の１つ又は組み合わせを含む。
【０１４２】
投与される中和抗ＰＧモノクローナル抗体の量は、種々の因子（処置されているＣＲＣの性質及び段階、投与の形態、経路、及び部位、治療計画（例、第２の治療用薬剤が使用されているか否か）、処置されている特定の被験体の年齢及び状態、処置されている患者の抗ＰＧモノクローナル抗体への感受性を含む）に依存しうる。適切な投与量は、当業者により容易に決定されることができる。最終的には、医師が使用する適切な投与量を決定する。この投与量は、しばしば、適切な場合、反復することができる。副作用が発生した場合、投与の量及び／又は頻度は、通常の臨床診療に従って変更又は低下させることができる。適当な投与量及び治療計画は、当業者に公知の従来技術を使用して、治療の進行をモニターすることにより確立することができる。
【０１４３】
効果的な投与量は、インビトロアッセイから最初に推定することができる。例えば、動物における使用のための初期用量を製剤化し、インビトロで測定されたプロガストリンについての抗体の結合親和性である又はそれを上回る、抗ＰＧモノクローナル抗体の循環血液中又は血清中濃度を達成してもよい。特定の抗体のバイオアベイラビリティーを考慮に入れて、そのような循環血液中又は血清中濃度を達成するための投与量を算出することは、当業者の能力の範囲内である。ガイダンスについては、読者は、Fingl & Woodbury, "eneral Principles"in Goodman and Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, Chapter 1, latest edition, Pagamonon Press及びそれに引用される参考文献を参照する。
【０１４４】
初期投与量は、インビボデータ（例えば動物モデルなど）から推定することができる。ＣＲＣを処置するための化合物の効力をテストするために有用な動物モデルが、当技術分野において周知である。加えて、ＣＲＣの動物モデルが、以下の実施例に記載される。当業者は、そのような情報を日常的に適応させ、ヒトへの投与のために適した投与量を決定することができる。
【０１４５】
開示の中和抗ｈＰＧモノクローナル抗体の効果的な用量は、１回（例、ボーラス）投与、複数回投与、又は連続投与当たり約０．００１〜約７５mg/kgの範囲でありうる、あるいは、１回（例、ボーラス）投与、複数回投与、又は連続投与当たり０．０１〜５０００μg/ml血清濃度の血清濃度を達成するためであり、あるいは、処置されている状態、投与経路、ならびに被験体の年齢、体重、及び状態に依存した本明細書における任意の効果的な範囲又は値である。特定の実施形態において、各用量は、体重１kg当たり約０．５μg〜約５０μg、例えば、体重１kg当たり約３μg〜約３０μgの範囲でありうる。
【０１４６】
投与の量、頻度、及び持続時間は、種々の因子、例えば患者の年齢、体重、疾患状態などに依存しうる。投与のための治療計画は、２週間〜無期限にわたり、２週間〜６ヶ月間にわたり、３ヶ月間〜５年間、６ヶ月間〜１又は２年間、８ヶ月間〜１８ヶ月間などで継続しうる。場合により、治療計画は、反復投与（例、週１回、週２回、２日、３日、５日、１週間、２週間、又は１ヶ月に１回）を提供する。反復投与は同じ用量又は異なる用量でありうる。投与は、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回又はそれ以上反復することができる。抗ｈＰＧモノクローナル抗体の治療的に効果的な量を、単一用量として、又は、治療計画の経過にわたり、例えば、２週間、３週間、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年又はそれより長い経過にわたり投与することができる。
【０１４７】
治療方法
ＰＧ依存性応答（細胞増殖を含む）を遮断する本発明の中和抗ｈＰＧモノクローナル抗体の能力によって、それらが結腸直腸癌を処置するために有用になる。したがって、別の局面において、本開示は、それを必要とする患者においてＣＲＣを処置する方法を提供する。一般的に、方法は、治療的に効果的な量の開示の中和抗ｈＰＧモノクローナル抗体を患者に投与することを含む。
【０１４８】
開示の抗ｈＰＧモノクローナル抗体が投与される「被験体」又は「患者」は、好ましくは、哺乳動物、例えば非霊長類（例、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）又は霊長類（例、サル又はヒト）である。被験体又は患者は、ヒト、例えば成人患者又は小児患者などでありうる。
【０１４９】
抗ｈＰＧモノクローナル抗体治療に適した患者は、ＣＲＣと診断された患者である。ＣＲＣは、任意の型及び任意の臨床段階又は顕在化でありうる。適した被験体は、ＣＲＣ腫瘍（手術可能又は手術不可能）を伴う患者、腫瘍が外科的に除去又は切除されている患者、癌遺伝子（例えばＲＡＳ又はＡＰＣなど）における変異を保有する細胞を含むＣＲＣ腫瘍を伴う患者、抗ｈＰＧモノクローナル抗体治療と組み合わせた又はそれに補助的なＣＲＣのための他の治療を受けてきた又は受ける患者を含む。ＣＲＣのための他の治療は、しかし、限定しないが、化学療法的処置、放射線治療、外科的切除、及び１つ又は複数の他の治療用抗体を用いた処置（以下に詳述する）を含む。
【０１５０】
抗ｈＰＧ抗体治療は、１つ又は複数の他の治療と組み合わせる、又は補助となることができる。他の処置は、限定しないが、化学療法的処置、放射線治療、外科的切除、及び抗体治療を含む（本明細書に記載する通り）。
【０１５１】
抗ｈＰＧモノクローナル抗体治療は、他の処置（外科的切除を含む）の補助になりうる。
【０１５２】
組み合わせ治療は、本明細書に提供する通り、患者への少なくとも２つの薬剤の投与を含み、その第１は開示の中和抗ｈＰＧモノクローナル抗体であり、その第２は第２の治療用薬剤である。中和抗ｈＰＧモノクローナル抗体及び第２の治療用薬剤は、同時に、連続的に、又は別々に投与することができる。
【０１５３】
本明細書において使用する通り、中和抗ｈＰＧモノクローナル抗体及び第２の治療用薬剤は、それらが同じ日に、例えば、同じ患者来診の間に患者に投与される場合、連続的に投与されると言う。連続的投与は、１、２、３、４、５、６、７、又は８時間離して生じうる。対照的に、開示の抗ｈＰＧモノクローナル抗体及び第２の治療用薬剤は、それらが異なる日に患者に投与される場合、例えば、開示の抗ｈＰＧモノクローナル抗体及び第２の治療用薬剤が、１日、２日、又は３日、１週間、２週間、又は１ヶ月間隔で投与することができる場合、別々に投与すると言う。本開示の方法において、開示の抗ｈＰＧモノクローナル抗体の投与は、第２の治療用薬剤に先行しうる又は続きうる。
【０１５４】
非限定的な例として、中和抗ｈＰＧモノクローナル抗体及び第２の治療用薬剤を一時期にわたり同時に投与することができ、開示の抗ｈＰＧモノクローナル抗体及び第２の治療用薬剤の投与が代替される第２の時期が続く。
【０１５５】
本開示の組み合わせ治療は、相加又は相乗効果よりも大きな効果をもたらし、治療的利益を提供し、そこでは中和抗ｈＰＧモノクローナル抗体及び第２の治療用薬剤のいずれも、単独で治療的に効果的である量で投与されない。このように、そのような薬剤はより低用量で投与することができ、有害作用の可能性及び／又は重症度を低下させる。
【０１５６】
第２の治療用薬剤は、化学療法剤でありうる。化学療法剤は、しかし、限定しないが、放射性分子、毒素（細胞の生存に有害であり、任意の薬剤を含む細胞毒素又は細胞毒性薬剤とも言及される）、薬剤、及び化学療法用化合物を含むリポソーム又は他の小胞を含む。適した化学療法剤の例は、しかし、限定しないが、１−デヒドロテストステロン、５−フルオロウラシルデカルバジン（decarbazine）、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アクチノマイシンＤ、アドリアマイシン、アルデスロイキン、アルキル化剤、アロプリノールナトリウム、アルトレタミン、アミフォスチン、アナストロゾール、アントラマイシン（ＡＭＣ））、有糸分裂阻害剤、シス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、ジアミノジクロロ白金、アントラサイクリン、抗生物質、代謝拮抗剤、アスパラギナーゼ、生ＢＣＧ（膀胱内）、リン酸ベタメタゾンナトリウム及び酢酸ベタメタゾン、ビカルタミド、硫酸ブレオマイシン、ブスルファン、ロイコウオリン（leucouorin）カルシウム、カリケアマイシン、カペシタビン、カルボプラチン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、コルヒチン、抱合型エストロゲン、シクロホスファミド、シクロトスファミド（cyclothosphamide）、シタラビン、シタラビン、サイトカラシンＢ、サイトキサン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ダウニルビシンＨＣＬ（daunirubicin）、クエン酸ダウノルビシン、デニロイキンジフチトックス、デキストラゾキサン（dextrazoxane）、ジブロモマンニトール、ジヒドロキシアントラシンジオン、ドセタキセル、メシル酸ドラセトロン、ドキソルビシンＨＣＬ、ドロナビノール、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｌ−アスパラギナーゼ、エメチン、エポエチンα、エルウィニアＬ−アスパラギナーゼ、エステル型エストロゲン、エストラジオール、リン酸エストラムスチンナトリウム、エチジウムブロマイド、エチニルエストラジオール、エチドロネート、エトポシドシトロロラムファクター（citrororum factor）、リン酸エトポシド、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルコナゾール、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル、フルタミド、フォリン酸、ゲムシタビンＨＣＬ、グルココルチコイド、酢酸ゴセレリン、グラミシジンＤ、グラニセトロンＨＣＬ、ヒドロキシ尿素、イダルビシンＨＣＬ、イホスファミド、インターフェロンα−２ｂ、イリノテカンＨＣＬ、レトロゾール、ロイコボリンカルシウム、酢酸ロイプロリド、レバミソールＨＣＬ、リドカイン、ロムスチン、メイタンシノイド、メクロレタミンＨＣＬ、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、メルファランＨＣＬ、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート、メチルテストステロン、ミトラマイシン、マイトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、酢酸オクトレオチド、オンダンセトロンＨＣＬ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート二ナトリウム、ペントスタチン、ピロカルピンＨＣＬ、プリマイシン（plimycin）、カルムスチンインプラントを伴うポリフェプロザン２０、ポルフィマーナトリウム、プロカイン、プロカルバジンＨＣＬ、プロ���ラノロール、リツキシマブ、サルグラモスチン、ストレプトゾトシン、タモキシフェン、タキソール、テガフール、テニポシド、テノポシド、テストラクトン、テトラカイン、チオテパ（thioepa）クロラムブシル、チオグアニン、チオテパ、トポテカンＨＣＬ、クエン酸トレミフェン、トラスツズマブ、トレチノイン、バルルビシン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、及び酒石酸ビノレルビンを含む。
【０１５７】
本明細書に開示する中和抗モノクローナル抗体を、結腸直腸癌のための処置を必要とする、化学療法剤の組み合わせを受けている患者に投与することができる。化学療法剤の例示的な組み合わせは、ロイコボリン（フォリン酸又はＬＶ）と組み合わせた５−フルオロウラシル（５ＦＵ）；ウラシル（ＵＦＴ）及びロイコボリンと組み合わせたカペシタビン；ウラシル（ＵＦＴ）及びロイコボリンと組み合わせたテガフール；５ＦＵと組み合わせた又はカペシタビンと組み合わせたオキサリプラチン；カペシタビンと組み合わせたイリノテカン、５ＦＵ、イリノテカン、又はカペシタビンと組み合わせたマイトマイシンＣを含む。本明細書に開示する化学療法剤の他の組み合わせの使用も可能である。
【０１５８】
関連する技術分野において公知の通り、異なる化学療法剤の組み合わせを使用した結腸直腸癌の化学療法計画が、臨床試験において標準化されている。そのような計画はしばしば略語により公知であり、５ＦＵ  Ｍａｙｏ、５ＦＵ  Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ、ＬＶＦＵ２、ＦＯＬＦＯＸ、ＦＯＬＦＯＸ４、ＦＯＬＦＯＸ６、ｂＦＯＬ、ＦＵＦＯＸ、ＦＯＬＦＩＲＩ、ＩＦＬ、ＸＥＬＯＸ、ＣＡＰＯＸ、ＸＥＬＩＲＩ、ＣＡＰＩＲＩ、ＦＯＬＦＯＸＩＲＩを含む。例えば、Chau, I., et al., 2009, Br. J. Cancer 100: 1704-19及びField, K., et al., 2007, World J. Gastroenterol. 13: 3806-15を参照のこと。その両方が、参照により組み入れられる。
【０１５９】
中和抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、また、他の治療用抗体と組み合わせることができる。したがって、抗ｈＰＧモノクローナル抗体治療は、異なるモノクローナル抗体、例えば、しかし、限定しないが、抗ＥＧＦＲ（ＥＧＦ受容体）モノクローナル抗体又は抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体などと組み合わせる又は補助的に投与することができる。抗ＥＧＦＲ抗体の具体的な例は、セツキシマブ及びパニツムマブを含む。抗ＶＥＧＦ抗体の具体的な例は、ベバシズマブである。
【０１６０】
抗ｈＰＧ抗体を使用したプロガストリンの検出
抗ＰＧモノクローナル抗体は、中和又は非中和を問わず、ＰＧ検出、例えばＣＲＣを診断すること又は被験体のＣＲＣの処置の効果をモニターすることなどに依存する適用のためにも有用である。したがって、局面において、本開示は、本開示の抗ｈＰＧモノクローナル抗体を使用して患者からのサンプル中のプロガストリンの量を決定することを含む、患者において結腸直腸癌を診断する方法を提供する。一般的には、患者において結腸直腸癌を診断する方法は、開示の抗ｈＰＧモノクローナル抗体を使用して患者から得られたサンプル中のプロガストリンを測定することを含み、それにおいてサンプル中の２０pM〜４００pMプロガストリンの測定値は結腸直腸癌を示す。プロガストリンは、サンプル、例えば、血液、血清、血漿、組織、及び／又は細胞中で測定することができる。ｈＰＧ検出は、当技術分野において公知の及び／又は本明細書に記載するアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、イムノブロッティング（ウエスタンブロッティング）、免疫沈降、ＢＩＡＣＯＲＥ技術などを使用して行うことができる。
【０１６１】
本明細書に記述する通り、プロガストリンは、ガストリン遺伝子産物の翻訳後プロセシングに起因する多くの異なるポリペプチドの１つに過ぎない。本明細書に記載する診断、モニタリング、及び他の方法は、他のガストリン遺伝子産物（分解産物を含む）とは対照的に、ｈＰＧを特異的に検出する。したがって、特定の実施形態において、ｈＰＧは、本明細書に開示する通り、ＥＬＩＳＡを使用して検出され、それにおいてｈＰＧに対する２つの抗体（ｈＰＧのＮ及びＣ末端をそれぞれ標的とする）を使用する。一部の実施形態において、検出のために使用される２つの抗体の１つは、本明細書中に記載する抗ｈＰＧモノクローナル抗体である。２０pM〜４００pMの範囲のｈＰＧレベルは、結腸直腸癌を示す。
【０１６２】
一般的に、抗ｈＰＧモノクローナル抗体を使用してｈＰＧレベルを決定するための手順は、以下の通りである。表面（例えば９６ウェルプレート中のウェルなど）を調製し、それに、公知の量のｈＰＧに対する第１の「捕捉」抗体を結合させる。捕捉抗体は、例えば、ｈＰＧのＣ又はＮ末端と結合する抗ｈＰＧ抗体でありうる。ブロッキング後、テストサンプルを表面に適用し、インキュベーション期間が続く。表面を次に洗浄し、非結合抗原を除去し、ｈＰＧに対する第２の「検出」抗体を含む溶液を適用する。検出抗体は、本明細書に記載する抗ｈＰＧモノクローナル抗体のいずれかでありうる（検出抗体が、捕捉抗体と異なるエピトープに結合するという条件で）。例えば、捕捉抗体がｈＰＧのＣ末端ペプチド領域に結合する場合、次に、適した検出抗体はｈＰＧのＮ末端ペプチド領域を結合するものである。プロガストリンレベルを、次に、直接的（例えば、検出抗体が検出可能な標識に結合されている場合）又は間接的（検出抗ｈＰＧ抗体に結合する標識二次抗体を通じて）のいずれかで検出することができる。
【０１６３】
特定の実施態様において、ｈＰＧレベルを、以下の通りに、テストサンプルから測定する。９６ウェルマイクロタイタープレートを、０．５〜１０μg/mLのウサギＣ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体を用いてコーティングし、一晩インキュベートする。プレートを、次に、ＰＢＳ−Tween（０．０５%）中で３回洗浄し、ＰＢＳ−Tween（０．０５%）中の２%（ｗ／ｖ）脱脂粉乳を用いてブロッキングする。別々に、テストサンプル、対照サンプル（ブランク又はＰＧ陰性血漿又は血清サンプル）、及び、約５pM（０．５×１０−１１M）〜約０．１nM（１×１０−１０M）のｈＰＧ参照基準（ＰＧ陰性血漿又は血清中に希釈した凍結乾燥ｈＰＧ）を、適切な希釈剤（例、ＰＢＳ−Tween  ０．０５%）中に調製する。サンプルを、コーティングしたプレート上で、３７℃で２〜４時間、又は、代わりに、２１℃で１２〜１６時間インキュベートする。インキュベーション後、プレートを、ＰＢＳ−Tween（０．０５%）を用いて３回洗浄し、０．００１〜０．１μg/mLの本明細書に記載するＮ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体（ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に共役している）（Nakane et al., 1974, J. Histochem. Cytochem. 22(12): 1084-1091）と２１℃で３０分間にわたりインキュベートする。プレートを、次に、ＰＢＳ−Tween（０．０５%）中で３回洗浄し、ＨＲＰ基質を２１℃で１５分間にわたり加える。反応を、１００μLの０．５Ｍ硫酸を加えることにより停止させ、光学密度測定値を４０５nmで取得する。テストサンプルのｈＰＧレベルを、ｈＰＧ参照基準に由来する測定値から構築された標準曲線との比較により決定する。
【０１６４】
典型的には、患者は、侵襲的手順（例えば生検組織の組織学的評価など）ならびに他の侵襲的手順（例えば結腸内視鏡検査など）に基づいて診断される。ＣＲＣは、ステージ０（結腸又は直腸の最内膜に限定される癌）、ステージ１（結腸又は直腸の内壁中の癌）、ステージ２（結腸の壁に広がっているが、しかし、隣接するリンパ節では見出されない癌）、ステージ３（リンパ節及び結腸又は直腸周辺の組織で見出される癌）、及びステージ４（体の他の部位に広がっている癌）の範囲の５ステージに分けられる。組織学的観点から、直腸結腸腫瘍は、広範囲の新生物（良性の成長から浸潤癌まで及ぶ）を提示し、主に上皮由来腫瘍（即ち、腺腫又は腺癌）である。病変は３群：非新生物ポリープ、新生物ポリープ（腺腫性ポリープ、腺腫）、及び癌に分類することができる。腺腫性ポリープは、悪性形質転換を受けうる良性腫瘍であり、３つの組織型：管状、腺管絨毛、及び絨毛に分類され、悪性度が増加する。腺癌は、また、それらの組織像に従って、粘液性（コロイド）腺癌；印環腺癌；スキルス腫瘍；及び神経内分泌に分類されている。
【０１６５】
ＣＲＣを診断するための現行の手段とは対照的に、本開示は、血液サンプルから決定することができるｈＰＧレベルの測定に基づく、任意の組織学的分析又は病期分類の非存在においてＣＲＣを伴う被験体を診断するための方法を提供する。さらに、本開示の方法は、患者がどのように診断されたのかに関わらず、抗ｈＰＧモノクローナル治療に適したＣＲＣ患者を選択するのに有用である。
【０１６６】
血清ＰＧレベルは、また、ＣＲＣ処置の効力を評価するのに有用である。したがって、本開示は、ＣＲＣについて処置されている患者においてＰＧレベルを決定することを含む、結腸直腸癌治療の有効性をモニタリングするための方法を提供する。結腸直腸癌治療の有効性をモニタリングするための方法は、結腸直腸癌について処置を受けている結腸直腸癌患者において本開示の抗ＰＧモノクローナル抗体を使用してｈＰＧレベルを反復的に決定することを含み、それにおいて処置の間隔にわたる患者の循環ｈＰＧレベルにおける減少は処置効力を示す。例えば、患者の循環ｈＰＧレベルの第１の測定値を取得することができ、患者が結腸直腸癌についての処置を受けている間又はその後での第２の測定値が続く。２つの測定値を次に比較し、ｈＰＧレベルにおける減少は治療的利益を示す。
【０１６７】
局面において、本開示は、抗ｈＰＧモノクローナル抗体（抗体コンジュゲートを含む）を含む診断キットを提供する。診断キットは、開示の少なくとも１つの抗ｈＰＧモノクローナル抗体（例、凍結乾燥形態又は水溶液のいずれか）及び診断アッセイを実施するために有用な１つ又は複数の試薬（例、希釈剤、抗ｈＰＧモノクローナル抗体に結合する標識抗体、標識抗体のための適切な基質、陽性対照及び参照標準、陰性対照としての使用のために適切な形態のｈＰＧ）を含むパッケージである。特定の実施態様において、キットは２つの抗ｈＰＧ抗体を含み、それにおいて抗体の少なくとも１つが抗ｈＰＧモノクローナル抗体である。場合により、二次抗体はポリクローナル抗ｈＰＧ抗体である。一部の実施形態において、本開示のキットは、本明細書に記載するＮ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体を含む。
【０１６８】
抗ｈＰＧ抗体を、上に記載する通りに標識することができる。あるいは、キットは、抗ｈＰＧモノクローナル抗体に結合し、酵素に結合されている標識抗体を含むことができる。抗ｈＰＧモノクローナル抗体又は他の抗体が検出用酵素に結合されている場合、このキットは基質及び酵素により要求される補因子（例、検出可能な発色団又はフルオロフォアを提供する基質前駆体）を含むことができる。また、他の添加剤は、例えば安定剤、緩衝剤（例、ブロッキング緩衝剤又は溶解緩衝剤）などを含むことができる。診断キットに含まれる抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、固体表面上に固定化することができ、又は、代わりに、抗体を固定化することができる固体表面（例、スライド）がキットに含まれる。種々の試薬の相対量を広く変動させて、アッセイの感度を実質的に最適化する試薬の溶液中での濃度を提供することができる。抗体及び他の試薬は、通常凍結乾燥された乾燥粉末として、（個別に又は組み合わで）提供することができ、溶解時に適切な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含む。
【０１６９】
キットは、診断方法の実践のための指示（例、プロトコール）を含む指示資料を含みうる。指示資料は、典型的には、書面による又は印刷された資料を含むが、それらに限定しない。そのような指示を記憶し、それらをエンドユーザーに伝えることが可能である媒体が、本発明により熟慮される。そのような媒体は、しかし、限定しないが、電子記憶媒体（例、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例、ＣＤ  ＲＯＭ）などを含む。そのような媒体は、そのような指示資料を提供するインターネットサイトへのアドレスを含みうる。
【０１７０】
１０．実施例
以下の実施例は、例示的であり、限定することを意図しない。
【０１７１】
実施例１：プロガストリンに対するモノクローナル抗体の生成
ヒトプロガストリンについての免疫原
いくつかの免疫原を生成して、ヒトプロガストリンに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを開発した。ポリクローナル抗体を生成するために以前に使用された抗原、例えば全長ヒトプロガストリン及びｈＰＧの残基７０〜８０に基づく免疫原などは、モノクローナルな免疫応答に導かず、又は、ＰＧ特異的モノクローナル抗体を生じなかった。以下により詳細に記載する通り、抗原（１４アミノ酸及びそれより長い）は、タンパク質のＮ末端及びＣ末端のいずれかにｈＰＧに固有の配列を含み、動物において適切な免疫応答を誘導することが可能であり、ｈＰＧに対する２０を超える異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを生成するために使用された。驚くべきことに、ｈＰＧの残基５５〜８０を含むいくつかの免疫原は、それらの一部が他のガストリン遺伝子由来ペプチドにおいても見出されており、ｈＰＧに特異的であるモノクローナル抗体を生成するために成功裏に使用された。以下の表に、テストした免疫原をまとめる。
【０１７２】
【表３】
0005985987.tif 000006
【０１７３】
表２に列挙する免疫原は、ペプチド配列及びリンカーの化学合成を使用して、当技術分野において公知の技術に従って作製され、適切な架橋剤（例、ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロスクシンイミドエステル）、グルタルアルデヒド又はスルホ−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）を使用したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、又はジフテリア毒素（ＤＴ）担体への架橋が続いた。（Coligan JE et al., Current protocols in Immunology, Vol. 2, New York: John Wiley and Sons; 1996, p 9.0.1-9.0.15; Harlow DL. Antibodies: A Laboratory Manual.New York: Cold Spring Harbor Laboratory; 1998, p72-87）使用されたリンカーは、システイン残基に共役された１つ又は２つのアミノヘキサン酸（Ａｈｘ）残基であった。
【０１７４】
３つの実験の各々において、Ｂａｌｂ／ｃマウスに、Ｎ末端免疫原については４〜５回、及びＣ末端免疫原については２〜４回注射した。各々の注射では、Ｒｉｂｉ、Ａｌｕｎ、又はフロイントアジュバントを伴う１０μgの免疫原を投与した。
【０１７５】
細胞融合及びハイブリドーマスクリーニング
各々のマウスからの血清を、免疫原及び最も強い免疫応答を伴うマウスから収集された脾細胞に対するＥＬＩＳＡによりテストした。脾細胞を、ポリエチレングリコールを使用してＳＰ２ミエローマ細胞と融合させ、１５，０００〜３５，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート中に播種した。融合細胞は、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含む培地（ＨＡＴ培地）を使用して選択した。
【０１７６】
ハイブリドーマの上清を、免疫原及び全長プロガストリンに結合する能力についてＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。３ラウンドのスクリーニングを実施して、全長ｈＰＧ及び免疫原を認識する抗体を安定的に産生するハイブリドーマだけが選択されることを確実にした。
【０１７７】
異なるＰＧペプチドへの結合を決定するためのハイブリドーマ及びモノクローナル抗体のスクリーニングは、以下に記載する通り、ＥＬＩＳＡ技術を使用して実施した。このプロトコールを使用して、他のガストリン遺伝子由来ペプチドと比較し、融合脾細胞（第１及び第２ラウンドのサブクローン）のＰＧ結合について、ならびに、ＰＧへの抗体の特異性を検証するためにスクリーニングした。
【０１７８】
簡単には、９６ウェルプレートを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の適切な濃度のテストペプチドを用いて４℃で一晩インキュベートし、その後、ウェルを、洗浄溶液（ＰＢＳ及び０．１%Tween-20）を用いて３回洗浄し、１ウェル当たり１００μLのブロッキング溶液（ＰＢＳ、０．１%Tween-20、０．１%ウシ血清アルブミン又はカゼイン加水分解物）を用いて２２℃で２時間にわたりインキュベートした。ブロッキング後、ウェルを３回洗浄し、一次抗体（アッセイする抗体）を加えた。融合脾細胞の初期スクリーニングのために、アッセイする各々の培養からの５０μLの培養上清を、プレート中の各ウェルに加えた。モノクローナル抗体で実施されたアッセイにおいて、ＰＢＳ及び０．１%  Tween-20中の１００μLのテスト抗体を各ウェルに加えた。プレートを、次に、２２℃で２時間にわたりインキュベートし、その後、一次抗体溶液を捨て、洗浄段階（３×１００μL洗浄溶液、上に記述する通り）後、二次抗体（一次抗体に結合し、酵素に共役されている）を含むブロッキング溶液を用いて交換した。二次抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼに共役したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）抗体であった。二次抗体を用いた１時間のインキュベーション後、１００μLの基質溶液（例、Fast OPD、又はＯ−フェニレンジアミン二塩酸塩、Sigma-Aldrich Co.から入手可能、製造業者の指示に従って調製する）を各ウェルに加え、暗所で２０分間にわたり２２℃でインキュベートした。反応を、次に、５０μLの４N硫酸を加えることにより停止させ、触媒された基質の量を４９２nmでの光学密度（ＯＤ）を測定することにより決定した。基質変換は、抗原に結合した一次（テスト）抗体の量に比例する。実験を二通りに実行し、ＯＤ測定値を、実験の目的に依存して、抗原又は抗体濃度の関数としてプロットした。サンプルを、測定されたＯＤが０．２〜１．５の間であった場合、抗ＰＧ抗体について陽性としてスコア化した。同じＯＤブラケットを使用して、テスト動物に接種するために使用された免疫原ペプチドに結合する抗体を同定した。
【０１７９】
アッセイにおいて使用する例示的な材料及び試薬は、以下の通りである：
【０１８０】
【表４】
0005985987.tif 000007
【０１８１】
ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体のスクリーニングにおいて使用する例示的なペプチドは、以下の通りである：
【０１８２】
【表５】
0005985987.tif 000008
【０１８３】
組換えヒトプロガストリンを、McQueen et al, 2002, J. Protein Chem. 21: 465-471）に記載される通りに（わずかな改変を伴う）産生した。簡単には、ＢＬ２１  ＤＥ３  Ｓｔａｒ細菌細胞（InVitrogen）を、ＰＧＥＸ−ＧＳＴ−ＴＥＶ骨格（GE Healthcare）中に全長ヒトプロガストリン配列を含むベクターを用いて形質転換した。細菌を、０．５mM  ＩＰＴＧを含むＬＢ培地中で３時間にわたり３７℃で成長させた。細菌ペレットを、フレンチプレスを使用して破壊し、可溶性ならびに非可溶性画分を遠心分離により分けた。その後、ＧＳＴタグ付きｈＰＧを、グルタチオン親和性カラムを使用して単離し、ＰＧを、タバコエッチ病ウイルスＮＩａ（ＴＥＶ）プロテアーゼを用いてＧＳＴから切断した。最後に、ＰＧを、最終緩衝剤（１０mM  Ｈｅｐｅｓ、０．５%  ＢＳＡ、ｐＨ  ７．４）に対して透析した。
【０１８４】
ハイブリドーマを最初にクローン化し、次に、サブクローン化し、増殖させた。陽性ハイブリドーマを以下：（１）ＰＧ及び免疫原特異性、（２）抗体の相対的親和性、（３）ハイブリドーマ細胞の成長、（４）抗体分泌、及び（５）ハイブリドーマのモノクローナル性の基準に基づいて選択した。アッセイ及び選択基準は以下の通りであった。
【０１８５】
特異性について、テストハイブリドーマの上清を、上に記載する通りにＥＬＩＳＡによりアッセイした（アッセイ培地ＰＢＳ中への上清の２希釈中１の５０μL）。ハイブリドーマを、ＯＤ測定値が、ｈＰＧ又はテストマウスに接種するために使用された免疫原を用いたアッセイにおいて０．２〜１．５の間である場合、陽性としてスコア化した。特異性についてのさらなる基準として、クローンを、他のガストリン遺伝子由来ペプチドへの結合性の欠如に基づいて選択した。結合の欠如は、テストウェルにからのシグナルとＰＢＳだけを含む対照ウェルからの平均シグナルの間に統計的な有意差がないとして測定した。
【０１８６】
親和性の特徴付けについては、抗体の希釈系列は、上に記載する通り、ｈＰＧへの結合についてのＥＬＩＳＡによりアッセイした。Ｎ末端抗体のアッセイにおいて使用される標準的な希釈は、０、０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００ng/mLであった。Ｃ末端抗体のアッセイにおいて使用される標準的な希釈は、０、０．０３、０．１、０．３、１、３、１０、３０ng/mLであった。
【０１８７】
複数ラウンドの連続培養を通じたハイブリドーマ細胞の成長を、播種から２日後に顕微鏡観察により評価した。細胞が増殖し、播種後４８時間までにウェルを満たすと予測される。連続希釈（典型的には、１：５での最初の希釈、少なくとも２回の１：１０でのさらなる希釈が続く）を実施し、４８時間目での顕微鏡観察が続き、適切な成長を確認した。この基準を満たすハイブリドーマからの細胞を希釈し、再び播種し、４８時間後に顕微鏡下で観察した。そのようなラウンドの「希釈−播種−観察」を、ハイブリドーマが「成長」基準を満たすとしてスコア化される前に３回反復した。
【０１８８】
抗体分泌を、無細胞上清の希釈系列（１／２、１／２０、１／２００、１／５００、１／１０００、１／２０００）で、上に記載する通りに、ｈＰＧを使用したＥＬＩＳＡを実施することによりテストした。
【０１８９】
モノクローン性を、０．６細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート中にクローン又はハイブリドーマを播種し、２週間にわたりインキュベートすることにより決定した。２週間目に、上清を、ｈＰＧ結合について、ＥＬＩＳＡによりアッセイし、集団のクローン性質を、生細胞を含むウェルの少なくとも９０%にわたり一貫したＯＤ値を有することに基づいて決定した。
【０１９０】
全長プロガストリンに対するモノクローナル抗体
３匹のマウスの各々に、組換えヒトプロガストリン（上に記載する）を用いて接種した。免疫原は、マウスにおいて任意の検出可能な免疫応答を誘発しなかった：ＰＧへの結合は、上に記載する通り、ＥＬＩＳＡを使用して検出することができなかった。融合は実施しなかった。
【０１９１】
プロガストリンに対するＮ末端モノクローナル抗体
上に記述する通り、Ｎ末端モノクローナル抗体を、１４残基抗原のＣ末端上のＡｈｘ−Ｃｙｓリンカー（ＳＷＫＰＲＳＱＱＰＤＡＰＬＧ−Ａｈｘ−Ｃｙｓ（配列番号２６））によって、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＨＬ）のいずれかに連結された、ｈＰＧの残基１〜１４を含む抗原に対して生成した。
【０１９２】
第１の実験において、３匹のマウスに、ＢＳＡ連結Ｎ末端ペプチドを用いて接種した。３匹のマウスの２匹からの脾細胞を用いて実施した３つの融合から、１つの融合は、ＰＧまたは免疫原への結合を示すクローンはもたらされなかった。９６ウェルプレート中に播種された２つの他の融合体の内、１つが４つのＰＧ結合及びＰＧ特異的ハイブリドーマを生成し、そこから単一の安定なＩｇＧ産生サブクローンが回収された。第２の融合体は、また、単一の安定なＩｇＧ１産生、ＰＧ結合及びＰＧ特異的ハイブリドーマサブクローンをもたらした。全体として、３匹のマウスから、１７の第１ラウンドのハイブリドーマ、又はスクリーニングされたハイブリドーマの０．７４%が、ＰＧ及び免疫原結合について陽性であり、そこから９つの陽性細胞株がサブクローン化され、その内の２つが陽性のＩｇＧ産生細胞株であった。このように、第１の実験では、２〜３ラウンドのサブクローニング後、免疫原及びｈＰＧに対して強い陽性シグナルを保持し（「ＰＧ結合」について陽性）、他のガストリン遺伝子由来ペプチドには結合しない（「ＰＧ特異性」について陽性）２つのクローン：抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１及び抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ２をそれぞれ産生するハイブリドーマ４３Ｂ９Ｇ１１及びＷＥ５Ｈ２Ｇ７を生成した。
【０１９３】
第２の実験において、マウスに、ＫＬＨ連結Ｎ末端ペプチドを用いて接種する。２つの融合を、Ｓｐ２ミエローマ細胞を用いて実施した。これらの内、１つの融合体だけが、ＰＧ及び免疫原陽性クローンを生成し、それらはＰＧ特異的でもあった。これから、１９２０のハイブリドーマを播種した。多くのハイブリドーマが、免疫化ペプチドを用いて陽性とテストされたが、プロガストリンではされず、又は、ＰＧ特異的ではなかった。具体的には、２９７のハイブリドーマが、免疫化ペプチドについて強い陽性を示し（１９２０のおよそ１５．５%）、その内の１２４がプロガストリン結合についても陽性であった（６．５%）。プロガストリンについて陽性であるが、しかし、使用した免疫原については陽性ではない３６のハイブリドーマ（又は１．８%）があった。播種した１９２０の内の１２のハイブリドーマだけが、プロガストリンに特異的に結合するが、しかし、他のガストリン遺伝子産物にはしない抗体をもたらした（全ハイブリドーマの０．６%、第１スクリーニングでペプチド及び／又はプロガストリンについて陽性であったクローンの３．６%）。１２の選択したクローンの内、２つだけが、永久クローンとして樹立し、長期保存のために凍結させるために十分に安定であった。このように、この第２の実験において、播種したほぼ２０００のハイブリドーマの内、ｈＰＧ及び免疫化ペプチドに結合することが可能であるモノクローナル抗体を発現する２クローン６Ｂ５Ｂ１１Ｃ１０（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ３を産生する）及び２０Ｄ２Ｃ３Ｇ２（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ４を産生する）（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ３及びＭＡｂ４をそれぞれ産生し、及び、他のガストリン遺伝子産物を上回るプロガストリンへの特異性及びｈＰＧへの高い親和性を有する）だけが回収された。両方の例示的な抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプである。
【０１９４】
第３の実験において、マウスを、第２の実験と同じ免疫原を用いて接種した。Ｓｐ２ミエローマ細胞への融合を、最も強い免疫応答を伴う２匹のマウスからの脾細胞を用いて実施した。融合からのハイブリドーマを播種し（マウス１匹当たり、１つの融合の各々からの３８４０のハイブリドーマ）、上清を、ＰＧ及び免疫原結合、ならびにＰＧ特異性についてテストした。各々の融合から、６つのハイブリドーマがＰＧ特異性を示し、そこから、成長、モノクローン性、抗体分泌、相対的親和性についてのさらなる選択を満たす３つのサブクローンが選択された。このように、全体で、播種後にテストされたハイブリドーマの２．９%（２２０／７６８０）が、ＰＧ及び免疫原陽性であり、その内の０．１５%が陽性クローンであり（１２／７６８０）、回収された最終的なサブクローンは、播種された最初のハイブリドーマの０．１５%を構成した（６／７６８０）。この実験では、ハイブリドーマ１Ｅ９Ａ４Ａ４（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  １５を産生する）、１Ｅ９Ｄ９Ｂ６（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  １６を産生する）、１Ｃ８Ｄ１０Ｆ５（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  １７を産生する）、１Ａ７Ｃ３Ｆ１１（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  １８を産生する）、１Ｂ３Ｂ４Ｆ１１（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  １９を産生する）、及び１Ｃ１１Ｆ５Ｅ８（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ２０を産生する）が生成された。
【０１９５】
以下の表は、各々の実験のために播種したクローンの数、使用した免疫原、及び免疫原及び全長プロガストリンの両方を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの数及びパーセンテージを示す。
【０１９６】
【表６】
0005985987.tif 000009
【０１９７】
プロガストリンに対するＣ末端モノクローナル抗体
Ｃ末端モノクローナル抗体を、２６残基抗原のＮ末端上のＣｙｓ−Ａｈｘ−Ａｈｘリンカー（Ｃｙｓ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ＱＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦＧＲＲＳＡＥＤＥＮ（配列番号９６））によりＫＬＨ又はＤＴのいずれかに連結されたｈＰＧの残基５５〜８０を含む抗原に対して生成した。ｈＰＧの残基７０〜８０だけを含むより小さな抗原を用いてハイブリドーマを生成する試みで、ＢＳＡ又はＫＬＨのいずれかに結合したＣｙｓ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ＦＧＲＲＳＡＥＤＥＮ（配列番号９７）は、任意のクローンを生成しなかった。
【０１９８】
３つの実験を実施した。最初の２つの実験において、それにおいてより短いペプチドを使用し、ゼロのサブクローンを回収した。具体的には、第１の実験において、４匹のマウスに、ＢＳＡに連結された、配列番号９７に相当するＣ末端ペプチドを用いて注射した。融合のいずれも、任意のＩｇＧ産生ハイブリドーマを生成しなかった。第２の実験において、６匹のマウスに注射し、３匹の各々に、そのＮ末端でＫＬＨに連結された、配列番号９７に相当するペプチド、又は、そのＣ末端でＫＬＨに連結された、配列番号９７に相当するペプチドを用いた。第１の免疫原について、融合を実施し、ハイブリドーマを回収したが、しかし、ＰＧ結合及びＰＧ特異性について陽性であるサブクローンは単離されなかった。第２の免疫原について、マウスのいずれも免疫応答を発生せず、融合は実施しなかった。
【０１９９】
第３の実験において、ｈＰＧに固有ではないＣ末端配列を含む２６アミノ酸ペプチドを使用した。免疫原（ＫＬＨ又はＤＴのいずれかに連結された、配列番号９６に相当するペプチドを含む）をマウスに注射した。Ｓｐ２ミエローマ細胞への融合を、最も強い応答を有する２匹のマウスからの脾細胞を用いて実施した。３８４０のハイブリドーマを、マウス１匹あたり１つの融合から播種した。全体では、スクリーニングした７６８０のハイブリドーマから、その内の３８２（５%）がＰＧ陽性及びＰＧ特異的であり、１３（０．１７%）の安定な陽性サブクローン：１Ｂ４Ａ１１Ｄ１１（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ５を産生する）、１Ｂ６Ａ１１Ｆ２（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ６を産生する）、１Ｂ１１Ｅ４Ｂ１１（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ７を産生する）、１Ｃ１０Ｄ３Ｂ９（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ８を産生する）、Ｄ８Ｆ５Ｂ３（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ９を産生する）、１Ｅ１Ｃ７Ｂ４（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  １０を産生する）、２Ｂ４Ｃ８Ｃ８（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  １１を産生する）、２Ｂ１１Ｅ６Ｇ４（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  １２を産生する）、２Ｃ６Ｃ３Ｃ７（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  １３を産生する）、２Ｈ９Ｆ４Ｂ７（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  １４を産生する）、１Ｆ１１Ｆ５Ｅ１０（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ２１を産生する）、１Ｆ１１Ｆ５Ｇ９（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ２２を産生する）、及び１Ａ１１Ｆ２Ｃ９（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ２３を産生する）が回収された。
【０２００】
以下の表は、各々の実験のために播種したクローンの数、使用した免疫原、スクリーニングしたハイブリドーマの数、ＰＧ及び免疫原結合モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ（ＰＧ特異的であり、３ラウンドのサブクローン化後に選択基準（成長、モノクローン性、相対的親和性など）を満たしている）の数及びパーセンテージを示す。
【０２０１】
【表７】
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【０２０２】
モノクローナル抗体、及びそれらを産生する安定なハイブリドーマを、以下の表に詳述する：
【０２０３】
【表８】
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【０２０４】
ハイブリドーマ細胞株１Ｂ４Ａ１１Ｄ１１（ＭＡｂ  ５、登録番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４３７１）、１Ｂ６Ａ１１Ｆ２（ＭＡｂ  ６、登録番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４３７２）、１Ｂ１１Ｅ４Ｂ１１（ＭＡｂ  ７、登録番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４３７３）、２Ｂ４Ｃ８Ｃ８（ＭＡｂ  １１、登録番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４３７４）、２Ｂ１１Ｅ６Ｇ４（ＭＡｂ  １２、登録番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４３７５）、及び１Ｅ９Ａ４Ａ４（ＭＡｂ  １５、登録番号及びＣＮＣＭ  Ｉ−４３７６）を、Treaty of Budapestに従って寄託し、Collection Nationale de Cultures de Microorganisms (CNCM), Institut Pasteur, Paris, Franceにより２０１０年１０月６日に受理された。
【０２０５】
抗ｈＰＧモノクローナル抗体のクローニング及び配列決定
ハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体は、当業者に公知の技術を使用して、クローン化及び配列決定することができる。上の表５に列挙するハイブリドーマからのモノクローナル抗体を、下に記載する通りに配列決定した。
【０２０６】
ハイブリドーマ６Ｂ５Ｂ１１Ｃ１０及び２０Ｄ２Ｃ３Ｇ２により産生されるモノクローナル抗体をコードする配列を、標準的な技術を使用して、クローン化及び配列決定した。簡単には、全ＲＮＡを、製造業者の指示に従って使用したRNABee試薬、AMSBioカタログｎｏ．ＣＳ−１０４Ｂを使用して、凍結細胞ペレットから単離した。Ｖ領域についてのｃＤＮＡを、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用してｍＲＮＡから調製し、ｃＤＮＡ末端の５’迅速増幅（ＲＡＣＥ）が続いた。ｃＤＮＡ合成を、定常領域特異的プライマーを使用して行い、その後、第１鎖産物を精製し、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを使用し、ｃＤＮＡの３’末端にホモポリマーテールを加えた。「テール付き」ｃＤＮＡ配列を、次に、プライマー対（ホモポリマーテール及びＶＨ又はＶＬ領域のいずれかのそれぞれについて各々１つのプライマー）を使用したＰＣＲにより増幅させた。重鎖及び軽鎖可変領域のＰＣＲ産物を、次に、標準的な手順を使用して、「ＴＡ」クローニングベクター（p-GEM-T easy, Promega cat. no A 1360）中にクローン化し、配列決定した。図２Ａ−Ｂ（ＭＡｂ  ３）、図２Ｃ−Ｄ（ＭＡｂ  ４）を参照のこと。
【０２０７】
ハイブリドーマ１Ｃ１０Ｄ３Ｂ９、２Ｃ６Ｃ３Ｃ７、１Ｂ３Ｂ４Ｆ１、及び１Ｅ９Ｄ９Ｂ６１により産生されるモノクローナル抗体をコードする配列を、以下の通りに決定した。全ＲＮＡを、製造業者の指示に従って使用したRNAqueous（登録商標）−４ＰＣＲキット（Ambion cat. No. AM1914）を使用して、凍結細胞ペレットから単離した。重鎖Ｖ領域のｍＲＮＡを、６つの縮重プライマープールのセット（ＨＡからＨＦ）を使用して増幅し、軽鎖Ｖ領域のｍＲＮＡを、８つの縮重プライマープールのセット（κクラスター用の７つ（ＫＡからＫＧ）及びλクラスター用の１つ（ＬＡ））を使用して増幅した。可変領域についてのｃＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲを使用してｍＲＮＡから調製した。ｃＤＮＡ合成を、定常領域特異的プライマーを使用して行い、ＩｇＧＶＨ、ＩｇκＶＬ、及びＩｇλＶＬの各々についての５’マウスシグナル配列についての縮重プライマー及び３’定常領域へのプライマーのプールを使用したＰＣＲが続いた（Jones et al., 1991, Rapid PCR cloning of full-length mouse immunoglobulin variable regions, Bio/Technology 9: 88-89）。重鎖及び軽鎖可変領域のＰＣＲ産物を、次に、標準的な手順を使用して、「ＴＡ」クローニングベクター（p-GEM-T easy, Promega cat. no A 1360）中にクローン化し、配列決定した。図２Ｅ−Ｆ（ＭＡｂ  ８）、２Ｇ−Ｈ（ＭＡｂ  １３）、２Ｉ−Ｊ（Ｍａｂ  １６）、及び２Ｋ−Ｌ（Ｍａｂ  １９）を参照のこと。
【０２０８】
実施例２：抗ｈＰＧ抗体の結合親和性
Ａ．相対的親和性
例示的なモノクローナル抗体の相対的親和性を、上に記載するＥＬＩＳＡ方法を使用して測定し、それにおいて、ウェルを、５０ngのプロガストリンを含むペプチド溶液を用いてコーティングし、次に、増加濃度の各モノクローナル抗体の存在においてインキュベートした（以下の通り）：
【０２０９】
【表９】
0005985987.tif 000012
【０２１０】
図３Ａは、１ng/mLから１μg/mlの濃度でテストした、４つの抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ  １〜４の相対的親和性を示す。図３Ｂは、０．１〜１００ng/mLの抗体濃度でテストした、Ｎ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ  ３及び１５〜２０の相対的親和性を示す。図３Ｃは、０．０３〜３０ng/mLの抗体濃度でテストした、Ｃ末端抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ  ５〜１４及び２１〜２３の相対的親和性を示す。
【０２１１】
Ｂ．親和性定数の測定
モノクローナル抗体についての親和性のより絶対的な定量化を提供するために、親和性定数を、Proteon Technique（BioRad）を使用し、Nahshol et al., 2008, Analytical Biochemistry 383: 52-60（その全体において本明細書により組み入れられる）に従い測定した。簡単には、抗マウスＩｇＧ抗体（５０μg/ml）を最初にセンサーチップ上にコーティングし、抗体の注射後にチップにより検出されるシグナルが１０，０００〜１１，５００RU（応答単位）の間にあることを確実にした。テストするマウスモノクローナル抗体を次に注射した（典型的な濃度：３０μg/ml）。テストする抗体の十分な結合を、センサーチップ上の少なくとも５００RUのさらなるシグナルに基づいて決定した。モノクローナル抗プロガストリン抗体とプロガストリンの間での相互作用の時間経過を、次に、例えば、２００、１００、５０、２５、及び１２．５nMの変動濃度のプロガストリンを注射することにより測定し、会合のレベルを検出した。典型的には、いくつかのチャンネルが、単一の実験において並行して複数の抗体をテストするために利用可能であり、ＰＧの変動濃度で並行してテスト抗体の結合をアッセイすることが可能になる。典型的には、１つのチャネルが、ＰＧに特異的ではないマウスモノクローナル抗体について、非特異的結合についての対照として確保され、別のチャネルには、バックグラウンドシグナルについてのベースラインとしての希釈緩衝剤単独を用いて注射する。一般的には、結合は、非特異的マウス抗体を用いて注射したチャンネルにおいて検出可能ではない。この設定において高レベルの会合を示す抗体は、プロガストリンにより捕捉モノクローナル抗体の飽和をもたらしうるが、より低いプロガストリン濃度（５０、２５、１２．５、６．２５、及び３．１２５nM）に対してテストすることができ、より緻密な測定を可能にする。
【０２１２】
親和性定数（ＫＤ）を、解離定数（ｋｄ）と会合定数（ｋａ）の間の比率として算出した。実験値を、結合測定値に基づく実験曲線と理論上のプロファイルの間での統計的に関連する類似性を分析することにより確証した。実験曲線が理論モデルに適合するか否かを選択するためにＰｒｏｔｅｏｎ実験において使用される数学的モデルは、プロガストリン分子と抗プロガストリンモノクローナル抗体の間での１：１の相互作用に基づくラングミュアモデルであった。
【０２１３】
【表１０】
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【０２１４】
実施例３：抗ｈＰＧ抗体の凝集
抗体の凝集は、標的タンパク質に結合するために利用可能な抗体の量を低下させることにより治療効力を低下させることができる。非常に低レベルの凝集を伴う抗体は、治療適用のために好ましい。抗体の各バッチは、同じモノクローナル抗体の他のバッチと比較して変動しうる。一般的に、低凝集を伴うバッチを使用することが望ましい。抗体凝集を定量化するために、抗体溶液を分光蛍光光度計（Photon Technology International）中に置き、２８０nMで照射した。拡散を２８０nMで測定し、芳香族アミノ酸（大部分がトリプトファン）に起因する発光を３３０nMで測定した。凝集のレベルを、次に、２８０nM対３３０nMでのＯＤ測定値間の比率を算出することにより定量化した（Nomine et al., 2003, Biochemistry 42: 4909-4917に記載する通り）。より高い２８０／３３０nM比率は、より高い量の凝集を示す。使用した抗体の濃度は、１５μg/ml（インビトロでの処置のために使用される５〜１５倍を上回る）であった。
【０２１５】
結果を以下の表及び図４に示す。
【０２１６】
【表１１】
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【０２１７】
実施例４：抗ｈＰＧモノクローナル抗体の結合特異性
ＰＧは、ガストリン遺伝子のペプチド産物の一つに過ぎない。他のガストリン遺伝子産物は、通常のホメオスタシスにおいて役割を有するが、しかし、それは、それを治療及び診断目的のために有用な標的とする、ＣＲＣにおけるＰＧの役割である。本明細書に記載するモノクローナル抗体は、ガストリン遺伝子の発現及びプロセシングに起因する全ての他のペプチド、例えばグリシン伸長（Ｇ１７−ｇｌｙ）、アミド化（ガストリン１７）ガストリンなど、及びＣ末端隣接ペプチド（ＣＴＦＰ）を上回り、全長プロガストリンに特異的である。これらのペプチドは、循環中に存在する。抗ｈＰＧモノクローナル抗体の結合特異性は、実施例１において上に記載するＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ヒトプロガストリン及び他のガストリン遺伝子由来ペプチドに対する抗体をアッセイすることにより決定した。
【０２１８】
具体的には、ウェルを、以下：プロガストリン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、アミド化ガストリン１７（Ｇ１７）、グリシン伸長ガストリン１７（Ｇｇｌｙ）、又はＣ末端隣接ペプチド（ＣＴＦＰ）のペプチドの１つを示した量で含む溶液を用いてコーティングした：
【０２１９】
【表１２】
0005985987.tif 000015
【０２２０】
第１の実験において、３ng/mL（０．３ng）の抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ３及び１μg/ml（０．１μg）の各々の抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  １、２、及び４を使用した。図５Ａを参照のこと。第２の実験において、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ５〜１４及び２１〜２３の結合特異性を０．３ng/mLでテストし（図５Ｂを参照のこと）、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ３、１５〜２０の結合特異性を１ng/mLでテストした（図５Ｃを参照のこと）。
【０２２１】
抗体は、上の実施例１においてマウスを免疫化するために免疫原の一部において使用した抗原ペプチドに共役させた高い量のＫＬＨに弱い反応を示した。任意の抗体（担体としてＢＳＡを含む免疫原に対して産生されたものを含む）のＰＧ結合に対するＢＳＡの検出可能な効果はなかった。
【０２２２】
全ての抗体は、他のガストリン遺伝子由来ペプチド（例えばアミド化ガストリン１７、グリシン伸長ガストリン１７、Ｃ末端隣接ペプチド、ガストリンを形成するポリペプチドの通常のプロセシングの間にプロガストリンから切断される５アミノ酸ペプチドなど）と比較し、全長ｈＰＧ（２５ng、次に５０ngでテストした）への結合についての高い特異性を示した。例示的な抗体は、ｈＰＧ以外の任意のガストリン遺伝子由来ペプチドへの検出可能な結合（「ＰＢＳ単独」バックグラウンドを上回るシグナル）を示さなかった。
【０２２３】
実施例５：競合アッセイ
プロガストリンへの結合について抗ｈＰＧポリクローナル抗体と競合する抗ｈＰＧモノクローナル抗体の能力を、「捕捉」抗ｈＰＧ抗体及び「検出」抗ｈＰＧ抗体を用いたＥＬＩＳＡを使用して決定した。抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ３を以下の通りにアッセイした：９６ウェルプレートを、ｈＰＧの残基７１から８０からなるペプチドに対して産生されたＣ末端プロガストリンポリクローナル抗体を用いてプレコーティングした。プレートを、次に、１００pMプロガストリンを用いてインキュベートし、１０μg/mlのビオチン化Ｎ末端抗ｈＰＧポリクローナル抗体（配列番号２５のアミノ酸配列からなるペプチドに対して産生された）、及び増加濃度の抗ｈＰＧ  ＭＡｂ３モノクローナル抗体の添加が続いた。ビオチン化Ｎ末端抗ｈＰＧポリクローナル抗体の結合を、標準的なプロトコールに従って、ストレプトアビジン−ＨＲＰ、それに続くＯＰＤを用いてプレートをインキュベートすることにより検出した。結合を、発光を定量化することにより測定した。
【０２２４】
結果は、増加濃度（μg/ml）の抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ３が、プロガストリンに結合するポリクローナル抗ｈＰＧ抗体の能力を減少させることを示し、モノクローナル抗体がポリクローナル抗体と競合することを示している。図６を参照のこと。
【０２２５】
実施例６：エピトープマッピング
例示的なモノクローナル抗体により結合された特定のエピトープを、ＳＰＯＴ技術及びアラニンスキャニング（それぞれLaune, D., et al., 2002, J. Immunol. Methods 267: 53-70及びLaune, D., 1997, J. Biol. Chem. 272: 30937-30944を参照のこと）を使用してマッピングした。ＳＰＯＴ技術において、推定エピトープにわたる１５アミノ酸ペプチド配列が生成され、ニトロセルロース膜上にスポットし、それを、次に、抗体により認識される最小エピトープ配列を決定するためのテスト抗体を用いてプローブする。アラニンスキャンを使用して、抗体結合のために重要であるエピトープ内の残基を決定する：推定エピトープ内の各残基を、１つずつアラニンに変異させ、アラニン含有ペプチドを、次に、テスト抗体を用いてプローブする。
【０２２６】
エピトープのファミリーを、本開示の例示的な抗体について同定した。ｈＰＧ  ＭＡｂ  １〜４及び１５〜２０へのＮ末端モノクローナル抗体については、エピトープは、少なくとも以下の配列：ＤＡＰＬＧ（配列番号２８）、ＰＤＡＰＬＧ（配列番号２９）、ＰＲＳＱＱＰＤ（配列番号３０）、ＷＫＰＲＳＱＱＰＤ（配列番号３１）、又はＷＫＰＲＳＱＱＰＤＡＰＬＧ（配列番号３２）（以下の表８に示す通り）を含む。
【０２２７】
【表１３】
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【０２２８】
ｈＰＧ  ＭＡｂ  ５〜７、９〜１２、１４、及び２１〜２３へのＣ末端モノクローナル抗体について、エピトープは少なくとも以下の配列：ＦＧＲＲ（配列番号３３）、ＭＤＦＧＲ（配列番号３４）、ＡＥＤＥＮ（配列番号３５）、及びＧＷＭＤＦＧＲＲ（配列番号３６）（以下の表９に示す通り）を含む。
【０２２９】
【表１４】
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【０２３０】
実施例７：癌細胞株に対する抗ｈＰＧ抗体の中和活性
（Ａ）抗ｈＰＧモノクローナル抗体の中和活性
抗ｈＰＧモノクローナル抗体は、代表的な結腸直腸癌細胞株において細胞生存率を減少させる。適した結腸直腸癌細胞株は、当技術分野において公知である。例えば、ＨＣＴ１１６、ＬＳ１７４Ｔ、ＳＷ４８０、及びＳＷ６２０は、結腸癌を試験するために一般的に使用される細胞株であり、プロガストリンを産生及び分泌する。ＰＧに対するモノクローナル抗体を、これらの異なる細胞株において増殖を阻害するそれらの能力についてテストした。各ＨＣＴ１１６、ＬＳＴ１７４Ｔ、ＳＷ４８０、及びＳＷ６２０からの細胞の生存率を、異なる抗ｈＰＧモノクローナル抗体を使用してテストした。
【０２３１】
各々の実験について、５０，０００個の細胞を、６ウェルプレート中にウシ胎児血清を含む培地中に播種し、８時間インキュベートした。細胞を一晩血清飢餓状態にし、播種後２４時間目（時間「Ｔ０」）に開始し、細胞を、４８時間にわたり１２時間毎に、ウシ胎児血清の非存在において、１μg/mlのモノクローナル対照抗体（マウス抗ヒトＩｇＧ１、Calbiochem、Ref #411451）（ＣＴ  ｍＡｂ）を用いて、又は、１μg/mlの抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１−４を用いて二通りに処理した。モノクローナル抗体のさらなる定量化時に、抗体が、およそ３〜５μg/mlの濃度で使用されたと決定した。Ｔ０での細胞の数を、各実験について、対照ウェル中でカウントした。ＨＣＴ１１６細胞について、実験を、０．５%ウシ胎児血清の存在において行った。処置の開始から４８時間後、各ウェル中の生存細胞の数を、盲検実験において３回カウントした。ＣＲＣ細胞の増殖又は生存率における低下は、対照ＭＡｂで処理した細胞のパーセンテージとして、生存している抗ｈＰＧ  ＭＡＢ処理した細胞を算出することにより決定した。処理の開始時（Ｔ０）での細胞数を、４８時間目に測定したテスト細胞数及び対照細胞数から減算した。具体的には、対照ウェル及び抗ｈＰＧ  ＭＡｂ処理ウェルの両方における生細胞の数を、４８時間目にカウントし、次に、各々の細胞数とＴ０に決定された細胞数の間の差を算出した。結果として得られた抗ｈＰＧ  ＭＡＢ処理細胞の数を、次に、対照ＭＡｂ処理細胞の数のパーセンテージとして表した。
【０２３２】
図７Ａ〜Ｃは、代表的な実験からのＳＷ４８０細胞、ＬＳ１７４Ｔ細胞、及びＨＣＴ１１６細胞の生存に対する抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ３及び抗ｈＰＧ  ＭＡｂ４の効果を示す。結果は、２つの独立した実験から得られた４ウェルからの平均±Ｓ．Ｅ．である。抗ｈＰＧモノクローナル抗体を用いた処理は、対照抗体を用いた処理と比較して、細胞数を有意に低下させた。統計的有意性を、スチューデントのｔ検定を使用して決定した：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、及び＊＊＊＝ｐ＜０．００１。各細胞株において、抗ｈＰＧ抗体は細胞の生存率を低下させた。１つの細胞株（ＬＳＴ１７４Ｔ）において、抗ｈＰＧ抗体を用いた４８時間の処理の終了時での細胞数は、実験の開始時での細胞数よりも低く、抗体が、細胞増殖の阻害に加えて、細胞死の原因となったことを示唆する。
【０２３３】
表１０は、対照モノクローナル抗体（マウス抗ヒトＩｇＧ１、Calbiochem、Ref #411451）（ＣＴ  ｍＡｂ）と比較した、４つのモノクローナル抗ｈＰＧ抗体の各々を用いて処理されたＳＷ４８０結腸直腸癌細胞の生存率を示す。
【０２３４】
【表１５】
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【０２３５】
対照と比較して、抗ｈＰＧモノクローナル抗体を用いた処置は、８３．２%（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ３）、５１．３%（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ４）、１９．８%（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ２）、及び１５．６%（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ１）だけ癌細胞の生存率を低下させた。
【０２３６】
以下の表は、対照モノクローナル抗体に比較した、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ３及び４を用いて処理したＬＳ１７４Ｔ及びＨＣＴ−１１６細胞の生存率を示す。データを、図７の相当パネル中にグラフィカルに示す。
【０２３７】
【表１６】
0005985987.tif 000019
【０２３８】
【表１７】
0005985987.tif 000020
【０２３９】
インビトロアッセイ条件下で、細胞成長の完全な阻害は予測されない。細胞培養において、プロガストリンは、癌細胞により継続的に分泌され、細胞培養培地中に蓄積する。プロガストリンレベルは、体内の循環において生じうるより多く経時的に増加すると予想され、抗体に対する標的タンパク質の比率を増加させ、抗体の中和効果を希釈する。このように、インビトロで抗体を用いて観察された中和効果は、インビボで強くなると予測され、そこで、腫瘍細胞により分泌されるプロガストリンが血流中で運び去られ、インサイツでのその蓄積を少なくする。
【０２４０】
抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ５〜２３による細胞増殖の阻害を、ＣＲＣ細胞株ＳＷ６２０、ＨＣＴ１１６、及びＬＳ４７Ｔの１つ又は複数において決定した。アッセイを、６ウェルプレート中で、上に記載する通り、５μg/mlの対照及びテスト（抗ｈＰＧ）モノクローナル抗体を使用して実施した。５０，０００個の細胞を、ＨＣＴ１１６及びＬＳ１７４Ｔについて１ウェル当たりに、ＳＷ６２０細胞については１００，０００個播種した。以下の表は、代表的な実験からの対照処理と比べた、処理細胞の生存率を提供する。平均的な結果を、細胞株ＳＷ６２０、ＬＳ１７４Ｔ、及びＨＣＴ−１１６について、それぞれ図７Ｇ〜Ｉにグラフ化する。
【０２４１】
【表１８】
0005985987.tif 000021
【０２４２】
【表１９】
0005985987.tif 000022
【０２４３】
【表２０】
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【０２４４】
（Ｂ）抗ｈＰＧポリクローナル抗体の中和活性
アッセイを、以下の改変を伴い、上に記載する通りに行った。Ｎ末端抗ｈＰＧポリクローナル抗体（実施例５に記載する通り）を使用した。対照として、３μg/mlのポリクローナル（ポリクローナルウサギ抗ヒトＩｇＧ、Affinity BioReagents、Ref #SA1-600）（ＣＴ  ｐＡＢ）を使用した。抗ＰＧ処理のために、３μg/mlの抗ｈＰＧポリクローナル抗体を、全ての細胞株について使用した。ＳＷ４８０及びＬＳ１７４Ｔを、対照又はＮ末端抗ｈＰＧポリクローナル抗体を用いて、２４〜４８時間にわたり、ＦＣＳを伴わないＤＭＥＭ中で処理し、ＨＣＴ１１６を、抗ｈＰＧポリクローナル抗体を用いて、４８時間にわたり、０．５%ＦＣＳを伴うＤＭＥＭ中で処理した。生存細胞を、次に、トリプシン処理及びカウントし、等しい濃度の対照（抗ヒトＩｇＧ）ポリクローナル抗体を用いて処理した細胞と比較した。
【０２４５】
代表的な実験の結果を、以下の表及び図７Ｄ〜Ｆに示す。抗ｈＰＧポリクローナル抗体を用いた処理は、対照抗体を用いた処理と比較して、細胞数を有意に低下させた。統計的有意性をスチューデントのｔ検定を使用して決定した：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。細胞数を、実験の開始時（Ｔ０）に、培養中の細胞数と比べて表現する。各実験について、４ウェルの各々の細胞を３回カウントした。抗ｈＰＧモノクローナル抗体と同様に、結腸直腸癌細胞の増殖は抗ｈＰＧポリクローナル抗体により阻害され、プロガストリンに対するポリクローナル抗体を用いて見られた抗腫瘍効果が、癌細胞に対するプロガストリンの遮断効果においてモノクローナル抗体活性を合理的に予測することを実証している。
【０２４６】
【表２１】
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【０２４７】
実施例８：抗ｈＰＧモノクローナル抗体の中和効果は、抗体を、精製ｈＰＧを用いてプレインキュベートした場合に除去される。
抗ｈＰＧモノクローナル抗体の中和効果がｈＰＧへの結合により媒介されることを実証するために、ＬＳ１７４Ｔ細胞を、ｈＰＧを伴わずにプレインキュベートした例示的な抗体（抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ８）の存在において培養した。陽性対照及び陰性対照として、細胞を、ｈＰＧ単独、対照抗体単独、及びｈＰＧを用いてプレインキュベートした対照抗体を用いて培養した。
【０２４８】
具体的には、３３．３nM（５μg/ml）抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ８を、２０倍モル過剰の組換えｈＰＧ、又は６６７nM（６．６７μg/ml）を用いて室温で１時間にわたりプレインキュベートした。組換えヒトガストを、実施例１に記載する通りに調製し、使用した。並行して、３３．３nM（５μg/ml）のマウス抗ヒトＩｇＧ１（General BioScience、reference no.AB23420）を、同様に、ｈＰＧの有無でプレインキュベートした。
【０２４９】
５０００個のＬＳ１７４Ｔ細胞を、９６ウェルプレート中の各ウェル中に、１０%ウシ胎児血清を含む培地中に播種し、８時間にわたりインキュベートし、その後、細胞を無血清培地に切り替え、さらに１２時間にわたり培養した。無血清培地中での１２時間にわたる成長後、細胞を、以下：対照抗体、ｈＰＧを用いてプレインキュベートした対照抗体、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ８単独、ｈＰＧを用いてプレインキュベートした抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ８、及びｈＰＧ単独の１つを用いて、１２時間毎に処理した。最初の処理から４８時間後、残りの生細胞を、Promega CellTiter 96 Aqueous One Solutionを用いてプレートをインキュベートし、４９０nMで吸光度を記録することにより定量化した。対照モノクローナル抗体（「対照ｍＡｂ」）を用いて処理した細胞について測定した吸光度を１００%に設定し、全ての他の実験条件を、対照ｍＡｂを用いて処理した細胞の吸光度に対して測定した。結果を以下の表及び図８に示す。
【０２５０】
【表２２】
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【０２５１】
ｈＰＧの添加、又はｈＰＧを用いた抗体のインキュベーションは、培養中の生細胞数を増加させる。対照的に、抗ｈＰＧ  ＭＡｂ  ８単独を用いた細胞の処理は、生存細胞数の有意な低下を起こす。このように、ＰＧ活性を中和する抗ｈＰＧモノクローナル抗体の能力は、抗体に結合し、それを飽和すると考えられるｈＰＧの添加により無効になる。この結果によって、抗ｈＰＧモノクローナル抗体の中和活性の特異性が確認される。
【０２５２】
実施例９：抗ｈＰＧ抗体のインビボでの抗腫瘍活性
多くの実験的インビボモデルが、結腸直腸癌の試験のために開発されてきた。マウス異種移植片試験（それにおいて腫瘍組織又はヒト癌細胞株からの細胞を免疫不全（いわゆる「ヌード」）マウス中に移植する）が開発されてきた。Pocard M., et al., In vivo (1996) 10(5): 463-469.いくつかのトランスジェニックマウスモデルも開発されてきた。マウスモデルは、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）遺伝子におけるヘテロ接合変異（例えばＡｐｃＭｉｎ、Ａｐｃ１６３８Ｎ、Ａｐｃ７１６、又はＡｐｃΔ１４など）を含む。ＡＰＣ腫瘍抑制遺伝子は、細胞質タンパク質ＡＰＣをコードし、それは、インタクトである場合、分解のためにプロテアソームにβカテニンを標的化する多タンパク質複合体内のサイトゾルにおいてβカテニンに結合及び捕捉し、それにより、核においてβカテニンが核内転写因子Ｔｃｆ−４を活性化することを妨げる。Heyer et al., Oncogene 18:5325-5333 (1999).ＡＰＣΔ１４マウスは、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）遺伝子内のエクソン１４のヘテロ接合欠失を保有する。散発性結腸直腸癌を伴う患者の７０%超において生じるものと同様に、第２のＡＰＣ対立遺伝子における体細胞性のヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）が腸細胞において生じ、βカテニン／Ｔｃｆ−４転写複合体の構成的活性化、及びこれらの動物における腸腫瘍の自然発生に導く。これらの腺腫及び癌腫の分子起源、ならびに腫瘍の形態（血管新生、炎症応答、及び免疫細胞の存在を含む）は、マウス異種移植モデルと比較して、ヒト腫瘍のものとずっと大きな類似性を伴い、ＡＰＣΔ１４を、ヒト結腸直腸癌治療試験のための高度に関連するモデルにする。Colnot et al., 2004, Lab. Invest. 84: 1619-1630.他のトランスジェニックマウスモデルは、遺伝子（例えばＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＣＤＸ２、Ｋ−ＲＡＳなど）における変異、ならびにＡＰＣにおける変異と他の癌遺伝子における変異との組み合わせた系統に基づく。Heyer et al., 1999, Oncogene 18:5325-5333, Janssen KP et al., 2002, Gastroenterology 123: 492-504．これらのモデルを広く使用して、結腸直腸癌を試験し、結腸直腸癌の処置に関する仮説をテストする。
【０２５３】
大腸腺腫性ポリポーシス遺伝子を伴うエクソン１４のヘテロ接合欠失を保有するトランスジェニックマウス（ＡＰＣΔ１４）は、結腸直腸癌についてのモデルとしての役割を果たし、ヒト結腸癌において見出されるものと類似の腫瘍を発生する。第１の実験において、ＡＰＣΔ１４マウスを、（１）配列番号２５に相当するペプチド及び（２）Hollande et al., ＷＯ  ０７／１３５５４２に記載されるＣ末端ペプチドに対して産生された等量の抗ｈＰＧポリクローナル抗体を含む調製物を用いて処置した。３．５ヶ月齢のマウスを、対照ポリクローナル抗体又は抗ｈＰＧポリクローナル抗体のいずれかを用いて５週間にわたり処置した（１処置当たり２匹のマウス）。抗体を、１０mg/kg（１５０μL注射容積）の用量で週２回腹腔内注射により投与した。処置の終了時に、マウスを屠殺し、腸を、ＰＢＳを用いて洗浄し、デジタル画像のために切開し、免疫組織化学的分析のために４%パラホルムアルデヒド中で固定した。腫瘍数及び結腸直腸組織の画像を記録した。
【０２５４】
腸組織の形態学的評価は、抗ｈＰＧ抗体が健常マウスの腸管上皮の再生に影響を与えないことを示した。腫瘍を、処置群及び対照群においてカウントした。対照抗体を用いて処置したマウスについての腫瘍の総数は、抗ｈＰＧ抗体を用いて処置したマウスにおける４個と比較して、２７個であった。このように、抗ｈＰＧ抗体は、対照抗体と比較して、６．５倍超だけ腫瘍数を低下させ、マウス腸における健常上皮の再生に影響を与えない。
【０２５５】
第２の実験において、ＡＰＣΔ１４マウス及び正常（対照）マウス（Ｃ５７ＢＬ６Ｊ）における抗ｈＰＧ抗体の効果を検討した。４ヶ月齢のマウスを、６週間にわたり週２回、対照ポリクローナル抗体（ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗血清（Jackson Immuno Research(reference no. 309-005-0089)）又は抗ｈＰＧポリクローナル抗体のいずれかを用いて、９mg/kg（１５０μL注射容積）の用量で週２回の腹腔内注射により処置した。処置の６週間後、屠殺の２時間前に、マウスに、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を用いて注射した（マウス１匹当たり２mg、腹腔内注射）。６匹のＡＰＣΔ１４マウスを、抗ｈＰＧポリクローナル抗体を用いて処置し、４匹を、対照ポリクローナル抗体を用いて処置した。対照抗体及び抗ｈＰＧ抗体を、６匹の正常（Ｃ５７ＢＬ６Ｊ）マウスの各々に投与した。腸の異常はどちらの群からのマウスのいずれでも検出されず、正常腸組織に対する抗ｈＰＧ抗体の安全性及び有害作用の欠如をさらに実証した。
【０２５６】
腫瘍の数及びサイズ（高さ及び長さ）を、ＡＰＣΔ１４マウスの処置群対対照群において検討した。腫瘍のサイズは、以下の通りに調製した各動物の腸から撮った画像の測定により決定した。腸を、上に記載する通りにリンスし、縦方向に切開し、パラフィン中に包埋し、「スイスロール」技術を使用して免疫組織化学のために処理した。腫瘍の長さと高さの測定は、Image Jソフトウェアを使用して実施した。
【０２５７】
結果を表１８ならびに図８Ａ及びＢに示す。腫瘍サイズについての結果は、対照処置群と抗ｈＰＧ投与群の間での統計的有意差を示す。統計的有意性を、マンホイットニー検定を使用して決定した：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、及び＊＊＊＝ｐ＜０．００１。対照抗体を用いて処置したマウスは、合計１２５個の腫瘍を示し、マウス１匹当たりの平均で３１．２５個の腫瘍を伴った。抗ｈＰＧ処置マウスは４６個の腫瘍を示し、又はマウス１匹当たり平均７．６個の腫瘍であった。この差は統計的に有意であり（マンホイットニー検定、Ｐ＝０．００９５）、抗ｈＰＧ抗体がインビボでの結腸直腸癌腫瘍の数を有意に低下させることを示す。
【０２５８】
【表２３】
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【０２５９】
抗ｈＰＧ抗体は、結腸直腸癌のマウスモデルにおける腫瘍数及び腫瘍サイズの両方における低下により測定される通り、インビボでの結腸直腸癌腫瘍を、正常結腸直腸上皮に対する任意の明かな有害作用を伴わず、有意に低下させる。このように、抗ｈＰＧを用いた結腸直腸癌腫瘍の処置は、インビボで治療効果を提供する。
【０２６０】
実施例１０：ヒト化抗ｈＰＧ抗体の設計
ヒト化抗体を、マウス抗ｈＰＧモノクローナル抗体ＭＡｂ  ３、４、８、１３、１６、及び１９から「インシリコ」で設計した。ヒト化抗体の設計は、Lefranc et al., 2003, Dev. Comp. Immunol. 27: 55-77；Lefranc et al., 2009, Nucl. Acids Res. 37: D1006-1012；Lefranc, 2008, Mol. Biotechnol. 40: 101-111に記載される方法論に従って行った。マウスモノクローナル抗体の各々について、相当するヒト化ＶＨ及びＶＬペプチド配列を以下：IMGT-ONTOLOGYデータベース（Duroux et al., 2008, Biochimie, 90: 570-583；Giudicelli and Lefranc, 1999, Bioinformatics, 15: 1047-1054）ならびにＩＭＧＴ（登録商標）データベース及びツール（Ehrenmann et al., 2010, Nucl. Acids. Res., 38: D301-307；Brochet et al., 2008, Nucl. Acids. Res., 36: W503-508）を使用してマウス配列におけるＣＤＲ及びフレームワーク領域を同定すること、それに続くＩＭＧＴ／ＧＥＮＥ−ＤＢ（Giudicelli et al., 2005, Nucl. Acids. Res., 33: D256-261）における最も近いヒトフレームワーク領域配列のアミノ酸配列の同定、及びヒトフレームワーク領域上へのマウスＣＤＲ配列の移植により決定した。特に、マウスＶＨ及びＶＬドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を、ＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴ及びＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎを使用して分析し、マウスＣＤＲ及びフレームワーク領域を区切り、ＣＤＲの長さを定め、アンカーアミノ酸を同定した。アンカーアミノ酸はＣＤＲ１−ＩＭＧＴ、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ、ＣＤＲ３−ＩＭＧＴを支持するＩＭＧＴ「Collier de Perles」の位置２６、３９、５５、６６、１０４、及び１１８の残基である（Kaas and Lefranc, 2007, Current Bioinformatics, 2: 21-30；Kaas et al., Brief. Funct. Genomic Proteomic, 2007, 6: 253-264）。マウス配列に最も近いヒトＶ（可変）及びＪ（連結）遺伝子が同定され、最も適した遺伝子が選ばれた。マウスフレームワーク領域中の個々のアミノ酸は、２層に対してIMGT Collier de Perlesを使用し、それらが、公知の３次元構造（Kaas et al., 2004, Nucl. Acids. Res. 32: 208-210）と比較して、抗体の特異性に恐らくは寄与すると考えられる場合、維持された。
【０２６１】
ＭＡｂ  ３についてのＶＨ  ＣＤＲを、ＣＤＲ１、２、及び３についてそれぞれ８、８、及び８アミノ酸長であると決定した。マウスＭＡｂ３  ＶＨ、ＩＧＨＶ１−５＊０１の配列に最も近い生殖系列マウス遺伝子は、１０残基で異なり、その内の３つがＣＤＲにマッピングされ、ヒト化抗ｈＰＧモノクローナル抗体の設計において保存された（ＣＤＲ１中のＩ２９、ＣＤＲ２中のＦ５６及びＳ６５）。また、Ｖ３９、Ｇ５５、及びＲ６６が、特異性を保存するために潜在的に重要と考えられ、設計において保持された。最も近いヒト生殖系列遺伝子はＩＧＨＶ１−３＊０１であった（ＩＧＭＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎに基づいて、アミノ酸レベルで６３．３%同一である）。フレームワーク領域１〜３における２７の配列差が、マウスとヒトの生殖系列遺伝子の間で見出された。フレームワーク領域４において、スレオニン１２３及びロイシン１２４をロイシン１２３及びバリン１２４に変えて、ヒトＩＧＨＪ１＊０１遺伝子と一致させた。全体的に、ＭＡｂ  ３についてのヒト化ＶＨは、ＩＧＨＶ１−４６＊０３についての可変領域と８７．８%同一であり、４つのフレームワーク領域における９１アミノ酸中８８が同一である。
【０２６２】
ＭＡｂ  ３についてのＶＬ  ＣＤＲを、ＣＤＲ１、２、及び３についてそれぞれ１１、３、及び９アミノ酸長であると決定した。マウスＭＡｂ  ３  ＶＬ、ＩＧＫＶ１−１１７＊０１の配列に最も近い生殖系列マウス遺伝子は、フレームワーク領域にマッピングされる単一残基で異なった。最も近いヒト生殖系列遺伝子はＩＧＫＶ２−３０＊０２であった（ＩＧＭＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎに基づいて、アミノ酸レベルで８１%同一である）。フレームワーク領域１〜３における１４の配列差が、マウスとヒトの生殖系列遺伝子の間で見出された。残基Ｅ４０及びＦ６８は、投影ヒト化配列中で維持される。フレームワーク領域４において、ロイシン１２４をバリン１２４に変えて、ヒトＩＧＫＪ４＊０１遺伝子と一致させた。全体的に、ＭＡｂ  ３についてのヒト化Ｖκ配列は、ＩＧＫＶ２Ｄ−２９＊０２と９３%同一であり、４つのフレームワーク領域における８９アミノ酸中８７が同一である。
【０２６３】
予測されるＶＨ及びＶκ配列を以下の表に提供する。
【０２６４】
【表２４】
0005985987.tif 000027
【０２６５】
ＭＡｂ  ４についてのＶＨ  ＣＤＲを、ＣＤＲ１、２、及び３についてそれぞれ８、８、及び１１アミノ酸長であると決定した。マウスＭＡｂ  ４  ＶＨ、ＩＧＨＶ１−９＊０１の配列に最も近い生殖系列マウス遺伝子は、１１残基で異なり、その内の４つがＣＤＲにマッピングされ、ヒト化抗ｈＰＧモノクローナル抗体の設計において保存された（ＣＤＲ１中のＳ３５、Ｓ３６、及びＳ３７、ＣＤＲ２中のＦ５６）。また、Ｄ６６が、特異性を保存するために潜在的に重要と考えられ、設計において保持された。最も近いヒト生殖系列遺伝子はＩＧＨＶ１−４６＊０３であった（ＩＧＭＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎに基づいて、アミノ酸レベルで６４．９%同一である）。フレームワーク領域１〜３における２７の配列差が、マウスとヒトの生殖系列遺伝子の間で見出された。フレームワーク領域４において、アラニン１２８をセリン１２８に変えて、ヒトＩＧＨＪ５＊０１遺伝子と一致させた。全体的に、ＭＡｂ  ４についてのヒト化ＶＨは、ＩＧＨＶ１−４６＊０３についての可変領域と９１．８%同一であり、４つのフレームワーク領域における９１アミノ酸中９０が同一である。
【０２６６】
ＭＡｂ  ４についてのＶＬ  ＣＤＲを、ＣＤＲ１、２、及び３についてそれぞれ１１、３、及び９アミノ酸長であると決定した。マウスＭＡｂ  ４  ＶＬ、ＩＧＫＶ１−１１０＊０１の配列に最も近い生殖系列マウス遺伝子は、３残基で異なり、その内の２つがＣＤＲ１にマッピングされ（セリン３４及びバリン３６）、ヒト化抗ｈＰＧモノクローナル抗体の設計において保存された。最も近いヒト生殖系列遺伝子はＩＧＫＶ２Ｄ−２９＊０２であった（ＩＧＭＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎに基づいて、アミノ酸レベルで８１%同一である）。フレームワーク領域１〜３における１１の配列差が、マウスとヒトの生殖系列遺伝子の間で見出された。フレームワーク領域４において、セリン１２０をグルタミン１２０に変えて、ヒトＩＧＫＪ２＊０１遺伝子と一致させた。全体的に、ＭＡｂ  ４についてのヒト化Ｖκ配列は、ＩＧＫＶ２Ｄ−２９＊０２と９２%、４つのフレームワーク領域について１００%同一である。
【０２６７】
予測されるＶＨ及びＶκ配列を以下の表に提供する。
【０２６８】
【表２５】
0005985987.tif 000028
【０２６９】
ＭＡｂ  ８についてのＶＨ  ＣＤＲを、ＣＤＲ１、２、及び３についてそれぞれ８、８、及び１０アミノ酸長であると決定した。マウスＭＡｂ８  ＶＨ、ＩＧＨＶ５−９−３＊０１の配列に最も近い生殖系列マウス遺伝子は、５残基で異なり、その内の４つがＣＤＲにマッピングされ、ヒト化抗ｈＰＧモノクローナル抗体の設計において保存された。最も近いヒト生殖系列遺伝子はＩＧＨＶ３−２１＊０１及び＊０２であった（ＩＧＭＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎに基づいて、アミノ酸レベルで８０．４%同一である）。フレームワーク領域１〜３における１２の配列差が、マウスとヒトの生殖系列遺伝子の間で見出された。フレームワーク領域４において、セリン１２３及びロイシン１２４を、それぞれ、スレオニン１２３及びバリン１２４に変えて、ヒトＩＧＨＪ６＊０１遺伝子と一致させた。全体的に、ＭＡｂ  ８についてのヒト化ＶＨは、ＩＧＨＶ３−２１＊０１及び＊０２についての可変領域と９２．８%、４つのフレームワーク領域について１００%同一である。ＭＡｂ８についてのマウスＶＨ  ＣＤＲ３中に潜在的なＮグリコシル化部位がある。
【０２７０】
ＭＡｂ  ８についてのＶＬ  ＣＤＲを、ＣＤＲ１、２、及び３についてそれぞれ１１、３、及び９アミノ酸長であると決定した。マウスＭＡｂ  ８  ＶＬ、ＩＧＫＶ２−１０９＊０１の配列に最も近い生殖系列マウス遺伝子は、６残基で異なり、その内の４つがＣＤＲ１にマッピングされ、ヒト化抗ｈＰＧモノクローナル抗体の設計において保存された。最も近いヒト生殖系列遺伝子はＩＧＫＶ２−２８＊０１及びＩＧＫＶ２Ｄ−２８＊０１であった（ＩＧＭＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎに基づいて、アミノ酸レベルで７５%同一である）。フレームワーク領域１〜３における１２の配列差が、マウスとヒトの生殖系列遺伝子の間で見出された。フレームワーク領域４において、アラニン１２０、ロイシン１２４、及びロイシン１２６を、それぞれ、グリシン１２０、バリン１２４、及びイソロイシン１２６に変えて、ヒトＩＧＫＪ４＊０１遺伝子と一致させた。全体的に、ＭＡｂ  ８についてのヒト化Ｖκ配列は、ＩＧＫＶ２−２８＊０１及びＩＧＫＶ２Ｄ−２８＊０１と８７%、４つのフレームワーク領域について１００%同一である。
【０２７１】
予測されるＶＨ及びＶκ配列を以下の表に提供する。
【０２７２】
【表２６】
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【０２７３】
ＭＡｂ  １３についてのＶＨ  ＣＤＲを、ＣＤＲ１、２、及び３についてそれぞれ８、８、及び７アミノ酸長であると決定した。マウスＭＡｂ  １３  ＶＨ、ＩＧＨＶ５−６−３＊０１の配列に最も近い生殖系列マウス遺伝子は、１０残基で異なり、その内の５つがＣＤＲにマッピングされ、ヒト化抗ｈＰＧモノクローナル抗体の設計において保存された。最も近いヒト生殖系列遺伝子はＩＧＨＶ３−７＊０１及び＊０２であった（ＩＧＭＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎに基づいて、アミノ酸レベルで７８．６%同一である）。フレームワーク領域１〜３における１３の配列差が、マウスとヒトの生殖系列遺伝子の間で見出された。フレームワーク領域４において、スレオニン１２３及びロイシン１２４を、それぞれ、ロイシン１２３及びバリン１２４に変えて、ヒトＩＧＨＪ４＊０１遺伝子と一致させた。全体的に、ＭＡｂ  １３についてのヒト化ＶＨは、ＩＧＨＶ３−７＊０１及び＊０２についての可変領域と９１．８%、４つのフレームワーク領域について１００%同一である。
【０２７４】
ＭＡｂ  １３についてのＶＬ  ＣＤＲを、ＣＤＲ１、２、及び３についてそれぞれ１１、３、及び９アミノ酸長であると決定した。マウスＭＡｂ  １３  ＶＬ、ＩＧＫＶ１−１３５＊０１の配列に最も近い生殖系列マウス遺伝子は、フレームワーク領域中に位置づけられる単一残基で異なった。最も近いヒト生殖系列遺伝子はＩＧＫＶ２−３０＊０１及び＊０２であった（ＩＧＭＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎに基づいて、アミノ酸レベルで８１%同一である）。フレームワーク領域１〜３における１３の配列差が、マウスとヒトの生殖系列遺伝子の間で見出された。フレームワーク領域４において、ロイシン１２４をバリン１２４に変えて、ヒトＩＧＫＪ４＊０１遺伝子と一致させた。全体的に、ＭＡｂ  １３についてのヒト化Ｖκ配列は、ＩＧＫＶ２−３０＊０１及び＊０２と９４%、４つのフレームワーク領域について１００%同一である。
【０２７５】
予測されるＶＨ及びＶκ配列を以下の表に提供する。
【０２７６】
【表２７】
0005985987.tif 000030
【０２７７】
ＭＡｂ  １６についてのＶＨ  ＣＤＲを、ＣＤＲ１、２、及び３についてそれぞれ８、８、及び１０アミノ酸長であると決定した。マウスＭＡｂ  １６、ＶＨ、ＩＧＨＶ１−５３＊０１の配列に最も近い生殖系列マウス遺伝子は、７残基で異なり、その内の２つがＣＤＲにマッピングされ、ヒト化抗ｈＰＧモノクローナル抗体の設計において保存された。最も近いヒト生殖系列遺伝子はＩＧＨＶ１−４６＊０１及び＊０３であった（ＩＧＭＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎに基づいて、アミノ酸レベルで７１．４%同一である）。フレームワーク領域１〜３における２５の配列差が、マウスとヒトの生殖系列遺伝子の間で見出された。フレームワーク領域４において、ロイシン１２４をバリン１２４に変えて、ヒトＩＧＨＪ６＊０１遺伝子と一致させた。全体的に、ＭＡｂ  １６についてのヒト化ＶＨは、ＩＧＨＶ１−４６＊０１及び＊０３についての可変領域と９６．９%、４つのフレームワーク領域について１００%同一である。
【０２７８】
ＭＡｂ  １６についてのＶＬ  ＣＤＲを、ＣＤＲ１、２、及び３についてそれぞれ１１、３、及び９アミノ酸長であると決定した。マウスＭＡｂ  １６、ＶＬ、ＩＧＫＶ１−１３５＊０１の配列に最も近い生殖系列マウス遺伝子は、フレームワーク領域中に位置づけられる４残基で異なった。最も近いヒト生殖系列遺伝子はＩＧＫＶ２−３０＊０１及び＊０２であり（ＩＧＭＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎに基づいて、アミノ酸レベルで７９%同一である）、それらはＣＤＲ１中の１アミノ酸だけ異なった。フレームワーク領域１〜３における１５の配列差が、マウスとヒトの生殖系列遺伝子の間で見出された。フレームワーク領域４において、グリシン１２０をグルタミン１２０に変えて、ヒトＩＧＫＪ２＊０１遺伝子と一致させた。全体的に、ＭＡｂ  １６についてのヒト化Ｖκ配列は、ＩＧＫＶ２−３０＊０１及び＊０２と９４%、４つのフレームワーク領域について１００%同一である。
【０２７９】
予測されるＶＨ及びＶκ配列を以下の表に提供する。
【０２８０】
【表２８】
0005985987.tif 000031
【０２８１】
ＭＡｂ  １９についてのＶＨ  ＣＤＲを、ＣＤＲ１、２、及び３についてそれぞれ９、７、及び１４アミノ酸長であると決定した。マウスＭＡｂ  １９  ＶＨ、ＩＧＨＶ３−２＊０１の配列に最も近い生殖系列マウス遺伝子は、５残基で異なり、その内の２つがＣＤＲにマッピングされ、ヒト化抗ｈＰＧモノクローナル抗体の設計において保存された。最も近いヒト生殖系列遺伝子はＩＧＨＶ４−３０−４＊０１であった（ＩＧＭＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎに基づいて、アミノ酸レベルで７２．４%同一である）。しかし、この遺伝子は多型性であるため、ＩＧＨＶ４−３１＊０２及び＊０３（ＩＧＭＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎに基づいて、アミノ酸レベルで７１．４%同一である）を選択した。フレームワーク領域１〜３における２１の配列差が、マウスとヒトの生殖系列遺伝子の間で見出された。フレームワーク領域４において、イソロイシン１２３をロイシン１２３に変えて、ヒトＩＧＨＪ４＊０１遺伝子と一致させた。全体的に、ＭＡｂ  １９についてのヒト化ＶＨは、ＩＧＨＶ４−３１＊０２及び＊０３についての可変領域と９１．９%、４つのフレームワーク領域について１００%同一である。
【０２８２】
ＭＡｂ  １９についてのＶＬ  ＣＤＲを、ＣＤＲ１、２、及び３についてそれぞれ７、７、及び１３アミノ酸長であると決定した。マウスＭＡｂ  １９  ＶＬ、ＩＧＬＶ３＊０１の配列に最も近い生殖系列マウス遺伝子は、８残基で異なり、その内の５つがＣＤＲ中に位置づけられた。最も近いヒト生殖系列遺伝子はＩＧＬＶ４−６９＊０１及び＊０２であった（ＩＧＭＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎに基づいて、アミノ酸レベルで６９．９%同一である）。フレームワーク領域１〜３における２３の配列差が、マウスとヒトの生殖系列遺伝子の間で見出された。フレームワーク領域４において、バリン１２４をロイシン１２４に変えて、ヒトＩＧＬＪ３＊０１遺伝子と一致させた。あるいは、ＩＧＪＫ４＊０１遺伝子をフレームワーク４領域について使用することができる。全体的に、ＭＡｂ  １９についてのヒト化Ｖκ配列は、ＩＧＬＶ４−６９＊０１及び＊０２と９２．４%、４つのフレームワーク領域について１００%同一である。
【０２８３】
予測されるＶＨ及びＶκ配列を以下の表に提供する。
【０２８４】
【表２９】
0005985987.tif 000032
【０２８５】
本願において引用される全ての刊行物、特許、特許出願が、各々の個々の刊行物、特許、特許出願、又は他の文書が、全ての目的のために参照により組み入れられることが個々に示される場合と同じ範囲で、全ての目的のために、それらの全体において参照により本明細書により組み入れられる。種々の特定の実施態様が例証及び記載されており、種々の変化を、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく作製することができることが理解されるであろう。
【図２Ａ】
0005985987.tif 000034
【図２Ｂ】
0005985987.tif 000035
【図２Ｃ】
0005985987.tif 000036
【図２Ｄ】
0005985987.tif 000037
【図２Ｅ】
0005985987.tif 000038
【図２Ｆ】
0005985987.tif 000039
【図２Ｇ】
0005985987.tif 000040
【図２Ｈ】
0005985987.tif 000041
【図２Ｉ】
0005985987.tif 000042
【図２Ｊ】
0005985987.tif 000043
【図２Ｋ】
0005985987.tif 000044
【図２Ｌ】
0005985987.tif 000045
【図５Ｂ】
0005985987.tif 000046
【図５Ｃ】
0005985987.tif 000047
【図８】
0005985987.tif 000048
【図１】
0005985987.tif 000049
【図３Ａ】
0005985987.tif 000050
【図３Ｂ】
0005985987.tif 000051
【図３Ｃ】
0005985987.tif 000052
【図４】
0005985987.tif 000053
【図５Ａ】
0005985987.tif 000054
【図６】
0005985987.tif 000055
【図７Ａ】
0005985987.tif 000056
【図７Ｂ】
0005985987.tif 000057
【図７Ｃ】
0005985987.tif 000058
【図７Ｄ】
0005985987.tif 000059
【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
0005985987.tif 000061
【図７Ｇ】
0005985987.tif 000062
【図７Ｈ】
0005985987.tif 000063
【図７Ｉ】
0005985987.tif 000064
【図９Ａ】
0005985987.tif 000065
【図９Ｂ】
0005985987.tif 000066
【配列表】
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