(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルから核酸を単離するための方法であって、ここで該単離された核酸はその後の増幅のために使用され、該方法は、以下：
ａ．標的捕捉試薬をサンプルと混合する工程であって、該標的捕捉試薬が、標的捕捉プローブ、標的特異的プライマー複合体（ＴＳＵ）および固体支持体を含み、該ＴＳＵプライマー複合体が、以下：
ｉ．５’プロモーター配列、第１の内部ユニバーサル配列（Ｕ１）、標的核酸中に含まれる標的配列に特異的に結合する第１の３’標的特異的配列（ＴＳ１）、およびポリメラーゼによって伸長することができる３’末端を含む、ＴＳＵプロモータープライマーオリゴヌクレオチドであって、以下のｉｉに連結したＴＳＵプロモータープライマーオリゴヌクレオチドと；
ｉｉ．第２の５’ユニバーサル配列（Ｕ２）および該ＴＳ１と異なり、かつ、該ＴＳ１の３’末端の伸長から生成される核酸伸長産物中に含まれる標的配列に特異的に結合する第２の３’標的特異的配列（ＴＳ２）を含む、ＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチド
から構成され、該ＴＳＵプロモータープライマーオリゴヌクレオチドは、
（Ａ）ポリヌクレオチドリンカー配列によって形成されたか、もしくは、非ヌクレオチド脱塩基リンカー化合物によって形成された共有結合を介して；
（Ｂ）該ＴＳＵプロモータープライマーオリゴヌクレオチド上の第１の配列と、該ＴＳＵプロモータープライマーオリゴヌクレオチド上の該第１の配列に相補的な、該ＴＳＵ非プロモータープライマー上の第２の配列との間のハイブリッド形成複合体を介して；または
（Ｃ）該ＴＳＵプロモータープライマーオリゴヌクレオチド内の配列に相補的な第１の配列と、該ＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチド内の配列に相補的な第２の配列とを含む、Ｓ−オリゴヌクレオチドを含むハイブリッド形成複合体を介して、該ＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドに連結され、そして、該標的捕捉プローブが、５’標的特異的配列と３’結合対メンバーを含む、工程；
ｂ．該ＴＳＵプロモータープライマー中の該ＴＳ１配列を介して、該ＴＳＵプライマー複合体の該ＴＳＵプロモータープライマーオリゴヌクレオチドを該標的核酸中の標的配列とハイブリッド形成させ、かつ、該標的捕捉プローブの該標的特異的配列を介して、該標的捕捉プローブを該標的核酸中の別の標的配列とハイブリッド形成させる工程；
ｃ．該標的捕捉オリゴヌクレオチドの該３’結合対メンバーを該固体支持体に連結させることによって、該標的捕捉プローブを該固体支持体とハイブリッド形成させる工程；ならびに
ｄ．該固体支持体、標的捕捉オリゴヌクレオチド、ＴＳＵプライマー複合体および標的核酸を、該サンプルの他の成分および該標的捕捉試薬の他の成分から分離する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
サンプルから核酸を単離するための方法であって、ここで該単離された核酸はその後の増幅のために使用され、該方法は、以下：
ａ．標的捕捉試薬をサンプルと混合する工程であって、該標的捕捉試薬が、標的捕捉プローブ、標的特異的プライマー複合体（ＴＳＵ）および固体支持体を含み、該ＴＳＵプライマー複合体が、以下：
ｉ．５’プロモーター配列、第１の内部ユニバーサル配列（Ｕ１）、およびその標的配列に特異的に結合する第１の３’標的特異的配列（ＴＳ１）を含む、ＴＳＵプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドであって、該ＴＳＵプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼによって伸長することができない遮断３’末端を有するＴＳＵプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドであり、以下のｉｉに連結したＴＳＵプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドと；
ｉｉ．第２の５’ユニバーサル配列（Ｕ２）および該ＴＳ１と異なり、かつ、標的核酸中に含まれる標的配列に特異的に結合し、そして、ポリメラーゼによって伸長することができる３’末端を含む第２の３’標的特異的配列（ＴＳ２）を含む、ＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチド
から構成され、該ＴＳ１の標的配列は、該ＴＳ２の３’末端の伸長から生成される核酸伸長産物中に含まれ、該ＴＳＵプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドは、
（Ａ）ポリヌクレオチドリンカー配列によって形成されたか、もしくは、非ヌクレオチド脱塩基リンカー化合物によって形成された共有結合を介して；
（Ｂ）該ＴＳＵプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチド上の第１の配列と、該ＴＳＵプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチド上の該第１の配列に相補的な、該ＴＳＵ非プロモータープライマー上の第２の配列との間のハイブリッド形成複合体を介して；または
（Ｃ）該ＴＳＵプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチド内の配列に相補的な第１の配列と、該ＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチド内の配列に相補的な第２の配列とを含む、Ｓ−オリゴヌクレオチドを含むハイブリッド形成複合体を介して、
該ＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドに連結され、そして、該標的捕捉プローブが、５’標的特異的配列と３’結合対メンバーを含む、工程；
ｂ．該ＴＳＵ非プロモータープライマー中の該ＴＳ２配列を介して、該ＴＳＵプライマー複合体の該ＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドを該標的核酸中の標的配列とハイブリッド形成させ、かつ、該標的捕捉プローブの該標的特異的配列を介して、該標的捕捉プローブを該標的核酸中の別の標的配列とハイブリッド形成させる工程；
ｃ．該標的捕捉オリゴヌクレオチドの該３’結合対メンバーを該固体支持体に連結させることによって、該標的捕捉プローブを該固体支持体とハイブリッド形成させる工程；ならびに
ｄ．該固体支持体、標的捕捉オリゴヌクレオチド、ＴＳＵプライマー複合体および標的核酸を、該サンプルの他の成分および該標的捕捉試薬の他の成分から分離する工程
を包含する、方法。
【請求項３】
前記ＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチドが、前記ＴＳＵ非プロモーターオリゴヌクレオチドに直接連結される、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記ＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチドが、前記ＴＳＵ非プロモーターオリゴヌクレオチドと直接ハイブリッド形成される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチドが、前記ＴＳＵ非プロモーターオリゴヌクレオチドに間接的に連結される、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチドが、ハイブリッド形成複合体によって、前記ＴＳＵ非プロモーターオリゴヌクレオチドに間接的に連結される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記標的捕捉プローブの前記３’結合対メンバーが、前記固体支持体上に固定されたプローブに相補的な核酸配列である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記固定されたプローブがポリＴ核酸配列である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ハイブリッド形成工程ｂおよび前記ハイブリッド形成工程ｃが一緒に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ハイブリッド形成工程ｂおよび前記ハイブリッド形成工程ｃが一緒に行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記ハイブリッド形成工程が、６２℃にて行われる、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記分離する工程がさらに洗浄工程を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的捕捉プローブの前記５’標的特異的配列が、前記標的核酸に特異的な核酸配列を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
サンプルから標的核酸を単離するための標的捕捉反応を行うためのキットであって、該キットは、少なくとも、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の、標的捕捉プローブ、標的特異的プライマー複合体（ＴＳＵ）および固体支持体を含む、キット。
【請求項１５】
サンプルから標的核酸を単離するための標的捕捉反応混合物を調製するためのキットであって、該キットは、少なくとも、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の、標的捕捉プローブ、標的特異的プライマー複合体（ＴＳＵ）および固体支持体を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学、より具体的には、容易に検出するのに十分なコピーを得るために核酸配列のコピー数を増加させるのに有用な核酸のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅により、比較的珍しいか未知の核酸配列のコピーをより多く作製するための、核酸供給源を同定するための、または十分な核酸を作製して容易に検出可能な量を提供するための手段が得られる。増幅は、多数の用途（例えば、診断、薬品開発、法医学検査、環境分析、および食品試験）で有用である。
【０００３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの核酸配列の増幅方法は多数公知であり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、レプリカーゼ媒介増幅、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、「ローリングサークル」型の増幅、および種々の転写関連増幅方法が含まれる。これらの公知の方法は、異なる技術を使用して増幅配列を作製し、通常、増幅配列を種々の方法の使用によって検出する。ＰＣＲ増幅は、ＤＮＡポリメラーゼ、オリゴヌクレオチドプライマー、および二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）またはｃＤＮＡから作製したｄｓＤＮＡの両方の鎖の複数のコピーを合成するためのサーマルサイクリングを使用する（Ｍｕｌｌｉｓらに付与された米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号）。ＬＣＲ増幅は、連続的な標的配列とハイブリッド形成する過剰な一本鎖プローブの２つの相補対を使用し、ライゲーションして元の標的に相補的な融合プローブを形成する。それにより、融合プローブは、複数のハイブリッド形成、ライゲーション、および変性サイクルにおけるさらなる融合物のテンプレートとしての機能を果たすことが可能である（Ｂａｃｋｍａｎらに付与された米国特許第５，５１６，６６３号および欧州特許第０３２０３０８Ｂ１号）。レプリカーゼ媒介増幅は、分析配列に結合した自己複製ＲＮＡ配列およびレプリカーゼ（Ｑβ−レプリカーゼなど）を使用し、選択したレプリカーゼに特異的な自己複製配列（Ｑβウイルス配列など）のコピーを合成する（Ｋｒａｍｅｒらに付与された米国特許第４，７８６，６００号）。増幅配列を、分析配列の置換分子またはレポーター分子として検出する。ＳＤＡは、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含むプライマーを使用し、それにより、エンドヌクレアーゼが標的配列を含む半修飾（ｈｅｍｉｍｏｄｉｆｉｅｄ）ｄｓＤＮＡの一方の鎖をニッキングし、その後の一連のプライマー伸長および鎖置換工程を行うことが可能である（Ｗａｌｋｅｒらに付与された米国特許第５，４２２，２５２Ａ号およびＮａｄｅａｕらに付与された米国特許第５，５４７，８６１号）。ローリングサークル型の増幅は、テンプレートから複数の一本鎖コピーを酵素的に複製するために使用されるテンプレートとしての機能を果たす環状または連続した核酸構造に依存する（例えば、Ｋｏｏｌに付与された米国特許第５，７１４，３２０号およびＳｔｅｍｍｅｒらに付与された米国特許第５，８３４，２５２号）。転写関連増幅は、核酸テンプレートからの複数の転写物の産生によって配列を増幅する方法をいう。かかる方法は、一般に、１つ以上のオリゴヌクレオチド（その１つからプロモーター配列が得られる）ならびに標的配列付近に機能的プロモーター配列を作製するためのＲＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を使用し、その後にプロモーターから標的配列を転写する（例えば、Ｋａｃｉａｎらに付与された米国特許第５，３９９，４９１号および同第５，５５４，５１６号，Ｂｕｒｇらに付与された米国特許第５，４３７，９９０号、ＧｉｎｇｅｒａｓらのＷＯ１９８８０１０３１５  Ａ１号，Ｍａｌｅｋらに付与された米国特許第５，１３０，２３８号、Ｕｒｄｅａらに付与された米国特許第４，８���８，１０５号および同第５，１２４，２４６号、およびＢｅｃｋｅｒらの米国特許出願公開第２００６／００４６２６５（Ａ１）号）。核酸増幅方法は、特異的標的配列（例えば、遺伝子配列）、関連標的配列群、または代替配列（分析配列の代わりに増幅および検出されるタグまたはレポーター配列と呼ぶことができる）を増幅することができる。代替配列は、分析標的配列が反応中にいくつかの点で存在する場合のみに増幅される。
【０００４】
修飾核酸増幅方法は、「ユニバーサル」プライマーまたはユニバーサルプライミングの使用によって１つを超える潜在的標的配列を増幅することができる。１つのＰＣＲ増幅形態は、ＰＣＲ反応で保存された配列に結合して関連配列を増幅するためのユニバーサルプライマーを使用する（非特許文献１，非特許文献２）。ユニバーサルプライマーを使用する方法は、しばしば、種特異的プライマー、遺伝子特異的プライマー、または型特異的プライマー、あるいは種、遺伝子バリアント、またはウイルス型に固有の増幅配列を生成するためのプライマーの使用と組み合わされ、これを、増幅核酸の配列決定またはいくつかの他の特徴の検出によって同定することができる。例えば、ある方法では同一の増幅工程で１つのユニバーサルプライマーおよび１つの特異的プライマーを使用することができる。別の例として、ある方法では、「ネステッド」ＰＣＲを使用することができる。これは、最初の増幅工程でユニバーサルプライマー対を使用して多数の潜在的な標的配列を増幅し、その後の増幅工程で特異的プライマー対を使用して最初のアンプリコン中に含まれる１つ以上の特異的標的配列を増幅する。
【０００５】
アンカードＰＣＲは、部分的にしか知られていない配列を増幅するためにユニバーサルプライマーまたは「アダプター」プライマーを使用する別の修飾ＰＣＲ法である。アンカードＰＣＲは、「アダプター」または「ユニバーサル」配列をｃＤＮＡに導入し、その後の増幅工程で導入配列に結合するプライマーを使用する。一般に、アンカードＰＣＲは、既知の配列に指向するプライマーを使用してｃＤＮＡを作製し、既知の配列（例えば、ポリＧ）をｃＤＮＡに付加するかｃＤＮＡ中の共通配列（例えば、ポリＴ）を使用し、付加した配列またはｃＤＮＡ中の共通配列に結合するユニバーサルプライマーおよび下流標的特異的プライマーの使用によってＰＣＲを行う（非特許文献３；非特許文献４）。ネステッドＰＣＲは、分析標的配列と無関係のユニバーサル配列を含むプライマーを使用して反応中で未知の標的配列から核酸を増幅することができる（非特許文献５；非特許文献６）。
【０００６】
他の増幅形態は、標的特異的配列およびアダプター配列の上流および下流に存在するユニバーサルプライミング部位（分子ジップコード（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｚｉｐ−ｃｏｄｅ）と呼ぶことができる）を導入するためのプローブまたはプローブ組を使用する。上流および下流プライミング部位を使用して、通常アレイ上で検出されるアダプター配列を含む核酸を増幅し、反応物中に存在する標的を同定する（Ｆａｎらに付与された米国特許第６，８１２，００５号および同第６，８９０，７４１号）。標的配列上の極めて近接して結合する２つのプローブを共にライゲーションし、その後に上流および下流のユニバーサルプライミング部位の使用によって増幅することができる。
【０００７】
別のアッセイ方法は、プローブハイブリッド形成および種々の分析物特異的プローブ中に含まれる共通配列の使用による線形シグナル増幅（ｌｉｎｅａｒ  ｓｉｇｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を使用することができる（例えば、Ｈｕｄｓｏｎらの米国特許出願公開第２００７／０１１１２００号）。この方法は、複数の分析物を検出するための共通配列に相補的な配列を含む標識カセットを使用する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｏｋａｍｏｔｏら．，１９９２，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３（Ｐｔ．３）：６７３−９
【非特許文献２】Ｐｅｒｓｉｎｇら，１９９２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０（８）：２０９７−１０３
【非特許文献３】Ｌｏｈら，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３（４８８８）：２１７−２０
【非特許文献４】Ｌｉｎら，１９９０，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０（４）：１８１８−２１
【非特許文献５】Ｓｕｌｌｉｖａｎら，１９９１，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １２（１）：１７−２１
【非特許文献６】Ｓｕｇｉｍｏｔｏら，１９９１，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５５（１１）：２６８７−９２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
５’プロモーター配列、第１の内部ユニバーサル配列（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｆｉｒｓｔ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（Ｕ１）、および標的核酸中に含まれる標的配列に特異的に結合する第１の３’標的特異的配列（３’ｆｉｒｓｔ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＴＳ１）を含むＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチドであって、ＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼによって伸長することができる３’末端を有するＴＳＵプロモータープライマーであるか、ポリメラーゼによって伸長することができない遮断３’末端を有するＴＳＵプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチド（ＴＳＵ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｐｒｏｖｉｄｅｒ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）である、ＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチド、第２の５’ユニバーサル配列（Ｕ２）およびＴＳ１と異なる第２の３’標的特異的配列（ＴＳ２）で構成されるＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチド、およびＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチドをＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドに直接または間接的に連結し、それにより、標的特異的ユニバーサル（ＴＳＵ）プライマー複合体を形成する手段を含む、組成物を開示する。１つの実施形態では、ＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチドをＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドに直接連結する手段は共有結合である。別の実施形態では、共有結合はポリヌクレオチドリンカー配列を介して形成され、これは非ヌクレオチド脱塩基リンカー化合物を介して形成される共有結合であり得る。別の実施形態は、ＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチドおよびＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドを支持体に連結するための結合対のメンバーの非共有結合である、ＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチドをＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドに間接的に連結する手段であって、結合対の一方のメンバーがＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチド上またはＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチド上に存在し、結合対の他方のメンバーが支持体に結合する、手段を使用する。別の実施形態では、ＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチドをＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドに直接連結する手段は、ＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチド上の第１の配列とＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチド上の第１の配列と相補的なＴＳＵ非プロモータープライマー上の第２の配列との間のハイブリッド形成複合体である。ＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチドをＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドに間接的に連結する手段は、ＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチド中の配列に相補的な第１の配列およびＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチド中の配列に相補的な第２の配列を含むＳ−オリゴヌクレオチドを含むハイブリッド形成複合体であり得る。１つの実施形態では、Ｓ−オリゴヌクレオチドはＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチド中のユニバーサル配列に相補的な第１の配列を含み、Ｓ−オリゴヌクレオチドはＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチド中のユニバーサル配列に相補的な第２の配列を含む。組成物はまた、ＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチドのＴＳ配列またはＴＳＵ非プロモータープライマーのＴＳ配列とハイブリッド形成する標的核酸中の配列と異なる配列で、ＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチドおよびＴＳＵ非プロモータープライマーの標的配列中の配列と特異的にハイブリッド形成する配列を含む標的特異的捕獲オリゴヌクレオチドを含むことができ、これは、標的核酸を支持体に結合する手段を含む。組成物はまた、５’プロモーター配列およびＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチドのユニバーサル配列と同一の３’ユニバーサル配列から構成されるユニバーサルプロモータープライマーを含むことができる。別の実施形態は、ＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドのユニバーサル配列と同一のユニバーサル配列から構成されるユニバーサルプライマーをさらに含む組成物である。組成物はまた、標的核酸鎖中のＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチドのＴＳ配列またはＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドのＴＳ配列が結合する配列と異なる標的核酸鎖中の配列と特異的にハイブリッド形成するブロッカーオリゴヌクレオチド（ｂｌｏｃｋｅｒ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を含むことができ、ブロッカーオリゴヌクレオチドはポリメラーゼによって伸長することができない３’遮断末端（３’  ｂｌｏｃｋｅｄ  ｔｅｒｍｉｎｕｓ）を有する。Ｓ−オリゴヌクレオチドを含むいくつかの実施形態では、Ｓ−オリゴヌクレオチドは、（１）ＴＳＵプロモータープライマーのＵ１配列に相補的な第１の末端領域配列および（２）ＴＳＵ非プロモータープライマーのＵ２配列に相補的な第２の末端領域配列、および（３）第１および第２の末端領域配列を連結する連結部分から構成される。連結部分は、第１および第２の末端領域配列を共有結合する非核酸化合物であり得る。組成物はまた、５’プロモーター配列および３’Ｕ１配列から構成される少なくとも１つのユニバーサルプロモータープライマーならびにＴＳＵプロモータープライマーオリゴヌクレオチドの３’末端の合成伸長から作製されたｃＤＮＡ配列を含む二本鎖ＤＮＡから作製されたＲＮＡ転写物中に含まれる配列と相補的な配列から構成される少なくとも１つの標的特異的プライマー（ＴＳＰ）を含むことができる。
【００１０】
標的核酸に特異的に結合し、かつ、結合した標的核酸を、混合物から分離される支持体に結合する手段を提供する標的捕獲プローブの、標的核酸への結合、さらに、（１）５’プロモーター配列、第１の内部ユニバーサル配列（Ｕ１）、標的核酸中に含まれる標的配列に特異的に結合する第１の３’標的特異的配列（ＴＳ１）、およびポリメラーゼによって伸長することができる３’末端を含むＴＳＵプロモータープライマーオリゴヌクレオチド、（２）第２の５’ユニバーサル配列（Ｕ２）およびＴＳ１と異なる第２の３’標的特異的配列（ＴＳ２）から構成されるＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチド、および（３）ＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチドをＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドと直接または間接的に連結するための手段から構成される標的特異的ユニバーサル（ＴＳＵ）プライマー複合体の、混合物における標的核酸とのハイブリッド形成によって、混合物から標的核酸を単離する工程を含む、標的核酸を増幅する方法も開示する。本方法は、ＴＳＵプロモータープライマー中のＴＳ配列を介してＴＳＵプロモータープライマーオリゴヌクレオチドを標的核酸中の標的配列とハイブリッド形成させる工程、ポリメラーゼｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成の使用によって標的核酸とハイブリッド形成したＴＳＵプロモータープライマーオリゴヌクレオチドの３’末端を合成的に伸長させる工程であって、標的核酸が第１のｃＤＮＡ鎖を作製するためのテンプレートである、合成的に伸長させる工程、第１のｃＤＮＡ鎖中に含まれる標的配列とのＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチド中のＴＳ配列の特異的ハイブリッド形成によって第１のｃＤＮＡ鎖とＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成する工程、ポリメラーゼｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成によって第１のｃＤＮＡ鎖とハイブリッド形成したＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドの３’末端を合成的に伸長して第２のＤＮＡ鎖を作製し、それにより、機能的プロモーター配列およびＵ１配列を含む実質的に二本鎖のＤＮＡを作製する工程、実質的に二本鎖のＤＮＡの機能的プロモーター配列からＲＮＡ転写物を酵素的に転写して、５’Ｕ１領域配列、第１の標的特異的配列（ＴＳ１）、第２の標的特異的配列（ＴＳ２’）、およびＵ２配列に相補的な３’ユニバーサル配列（Ｕ２’）を含むＲＮＡ転写物を作製する工程、Ｕ２’配列でＲＮＡ転写物とユニバーサル配列Ｕ２を含むユニバーサルプライマーオリゴヌクレオチド（ＵＰ２）をハイブリッド形成させる工程、等温条件下で、酵素的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成によってＵＰ２の３’末端を合成的に伸長してｃＤＮＡ鎖を作製し、ＲＮＡ転写物の鎖を酵素的に除去する工程、Ｕ１’配列で前の工程で作製したｃＤＮＡとユニバーサル配列Ｕ１を含むユニバーサルプロモータープライマーオリゴヌクレオチド（ＵＰ１）をハイブリッド形成させる工程、等温条件下で、酵素的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成によってＵＰ１の３’末端を合成的に伸長して機能的プロモーターを含むｄｓＤＮＡを作製する工程、およびｄｓＤＮＡの機能的プロモーターから複数のＲＮＡ転写物を転写する工程であって、転写物がＵＰ２プライマー���結合および合成工程の反復による等温条件下でのさらなる酵素的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成のテンプレートとしての機能を果たすことができる増幅産物である、転写する工程を含む。本方法はまた、増幅産物を検出して標的核酸が単離された混合物中の分析物の存在を示す工程を含むことができる。
【００１１】
別の開示の標的核酸増幅方法は、標的核酸に特異的に結合し、かつ、結合した標的核酸を、混合物から分離される支持体に結合する手段を提供する標的捕獲プローブの、標的核酸への結合、さらに、（１）５’プロモーター配列、第１の内部ユニバーサル配列（Ｕ１）、および標的核酸中に含まれる標的配列に特異的に結合する第１の３’標的特異的配列（ＴＳ１）を含むＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチドであって、ＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチドがポリメラーゼによって伸長することができない遮断３’末端を有するＴＳＵプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドである、ＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチド、（２）第２の５’ユニバーサル配列（Ｕ２）およびＴＳ１と異なる第２の３’標的特異的配列（ＴＳ２）から構成されるＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチド、および（３）ＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチドをＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドと直接または間接的に連結するための手段から構成される標的特異的ユニバーサル（ＴＳＵ）プライマー複合体の、混合物における標的核酸とのハイブリッド形成によって、混合物から標的核酸を単離する工程を含む。本方法の工程はまた、ＴＳＵ非プロモータープライマー中のＴＳ配列を介して標的核酸中の標的配列とＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成させる工程、任意に、ポリメラーゼによって合成的に伸長することができない３’遮断末端を有するブロッカーオリゴヌクレオチドを標的核酸中のＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドがハイブリッド形成する位置から下流の標的核酸上の配列とハイブリッド形成させる工程、ポリメラーゼｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成の使用によって標的核酸とハイブリッド形成したＴＳＵ非プロモータープライマーの３’末端を合成的に伸長させる工程であって、標的核酸が第１のｃＤＮＡ鎖を作製するためのテンプレートである、合成的に伸長させる工程、第１のｃＤＮＡ鎖中に含まれる標的配列とのＴＳＵプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチド中のＴＳ配列の特異的ハイブリッド形成によって第１のｃＤＮＡ鎖とＴＳＵプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成させる工程、テンプレートとしてＴＳＵプロモータープロバイダー中の配列を使用することによって第１のｃＤＮＡの３’末端を合成的に伸長して、機能的プロモーター配列およびＵ１配列を含む実質的に二本鎖のＤＮＡを作製する工程、機能的プロモーター配列からＲＮＡ転写物を酵素的に転写して、５’Ｕ１領域配列、第１の標的特異的配列（ＴＳ１）、第２の標的特異的配列（ＴＳ２’）、およびＵ２配列に相補的な３’ユニバーサル配列（Ｕ２’）を含むＲＮＡ転写物を作製する工程、Ｕ２’配列でＲＮＡ転写物とユニバーサル配列Ｕ２を含むユニバーサルプライマーオリゴヌクレオチド（ＵＰ２）をハイブリッド形成させる工程、等温条件下で、酵素的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成によってＵＰ２の３’末端を合成的に伸長してｃＤＮＡ鎖を作製し、ＲＮＡ転写物の鎖を酵素的に除去する工程、Ｕ１’配列で前の工程で作製したｃＤＮＡとプロモーター配列、ユニバーサル配列Ｕ１、および３’遮断末端を含むユ��バーサルプロモーターオリゴヌクレオチド（ＵＰ１）をハイブリッド形成させる工程、等温条件下で、テンプレートとしてのＵＰ１オリゴヌクレオチドの使用によってｃＤＮＡの３’末端を合成的に伸長して機能的二本鎖プロモーターを作製し、酵素的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成によって機能的プロモーターを含むｄｓＤＮＡを作製する工程、およびｄｓＤＮＡの機能的プロモーターから複数のＲＮＡ転写物を転写する工程であって、転写物がＵＰ２プライマーの結合および合成工程の反復による等温条件下でのさらなる酵素的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成のテンプレートとしての機能を果たすことができる増幅産物である、転写する工程を含む。本方法は、増幅産物を検出して標的核酸が単離されたサンプル中の分析物の存在を示す工程をさらに含むことができる。
【００１２】
標的核酸に特異的に結合し、かつ、結合した標的核酸を、混合物から分離される支持体に結合する手段を提供する標的捕獲プローブの、標的核酸への結合、さらに、５’プロモーター配列、第１の内部ユニバーサル配列（Ｕ１）、標的核酸中に含まれる標的配列に特異的に結合する第１の３’標的特異的配列（ＴＳ１）、およびポリメラーゼによって伸長することができる３’末端を含む標的特異的ユニバーサル（ＴＳＵ）プロモータープライマーオリゴヌクレオチドの、混合物における標的核酸とのハイブリッド形成によって、混合物から標的核酸を単離する工程、ポリメラーゼｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成の使用によって標的核酸とハイブリッド形成したＴＳＵプロモータープライマーオリゴヌクレオチドの３’末端を合成的に伸長させる工程であって、標的核酸が第１のｃＤＮＡ鎖を作製するためのテンプレートである、合成的に伸長させる工程、ＴＳ１と異なる第２の標的特異的配列（ＴＳ２）を含む標的特異的（ＴＳ）非プロモータープライマーを増幅反応混合物に添加する工程、第１のｃＤＮＡ鎖中に含まれる標的配列とのＴ２配列の特異的ハイブリッド形成によって第１のｃＤＮＡ鎖とＴＳ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成させる工程、ポリメラーゼｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成によって第１のｃＤＮＡ鎖とハイブリッド形成したＴＳ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドの３’末端を合成的に伸長して第２のＤＮＡ鎖を作製し、それにより、機能的プロモーター配列およびＵ１配列を含む実質的に二本鎖のＤＮＡを作製する工程、実質的に二本鎖のＤＮＡの機能的プロモーター配列からＲＮＡ転写物を酵素的に転写して、５’Ｕ１領域配列、第１の標的特異的配列（ＴＳ１）、第２の標的特異的配列（ＴＳ２’）を含むＲＮＡ転写物を作製する工程、Ｕ１配列でＲＮＡ転写物とユニバーサル配列Ｕ１’を含むユニバーサルプロモータープライマーオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成させる工程、等温条件下で、酵素的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成によってユニバーサルプロモータープライマーの３’末端を合成的に伸長してｃＤＮＡ鎖を作製し、ＲＮＡ転写物の鎖を酵素的に除去する工程、前の工程で作製したｃＤＮＡ中の特異的配列とＴＳ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成する工程、等温条件下で、酵素的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成によってＴＳ非プロモータープライマーの３’末端を合成的に伸長して機能的プロモーターを含むｄｓＤＮＡを作製する工程、およびｄｓＤＮＡの機能的プロモーターから複数のＲＮＡ転写物を転写する工程であって、転写物が合成工程の反復による等温条件下でのさらなる酵素的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成のテンプレートとしての機能を果たすことができる増幅産物である、転写する工程を含む標的核酸を増幅する方法も開示する。本方法は、増幅産物を検出して標的核酸が単離された混合物中の分析物の存在を示す工程をさらに含むことができる。
【００１３】
別の開示の標的核酸増幅方法は、標的核酸に特異的に結合し、かつ、結合した標的核酸を、混合物から分離される支持体に結合する手段を提供する標的捕獲プローブの、標的核酸への結合、さらに、５’ユニバーサル配列（Ｕ２）および３’標的特異的配列（ＴＳ２）から構成されるＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドの、混合物における標的核酸とのハイブリッド形成によって、混合物から標的核酸を単離する工程、標的核酸中の相補配列に対するＴＳ２配列を介して、標的核酸中の標的配列とＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成させる工程、ポリメラーゼによって合成的に伸長することができない３’遮断末端を有するブロッカーオリゴヌクレオチドを標的核酸中のＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドがハイブリッド形成する位置から下流の標的核酸上の配列とハイブリッド形成させる工程、ポリメラーゼｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成の使用によって標的核酸とハイブリッド形成したＴＳＵ非プロモータープライマーの３’末端を合成的に伸長させる工程であって、標的核酸が第１のｃＤＮＡ鎖を作製するためのテンプレートである、合成的に伸長させる工程、第１のｃＤＮＡ鎖中の相補配列とのＴＳ１配列の特異的ハイブリッド形成によって、５’プロモーター配列、標的核酸中に含まれる標的配列に特異的に結合する３’標的特異的配列（ＴＳ１）、およびポリメラーゼによって伸長することができない遮断３’末端を含む標的特異的ＴＳプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドを第１のｃＤＮＡ鎖とハイブリッド形成させる工程、テンプレートとしてのＴＳプロモータープロバイダー中の配列の使用によって第１のｃＤＮＡの３’末端を合成的に伸長して、機能的プロモーター配列およびＴＳ１配列を含む実質的に二本鎖のＤＮＡを作製する工程、機能的プロモーター配列からＲＮＡ転写物を酵素的に転写して、５’標的特異的配列ＴＳ１、標的特異的配列ＴＳ２’、およびＵ２’配列を含むＲＮＡ転写物を作製する工程、Ｕ２’配列でＲＮＡ転写物とユニバーサル配列Ｕ２を含むユニバーサルプライマーオリゴヌクレオチド（ＵＰ２）をハイブリッド形成させる工程、等温条件下で、酵素的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成によってＵＰ２の３’末端を合成的に伸長してｃＤＮＡ鎖を作製し、ＲＮＡ転写物の鎖を酵素的に除去する工程、プロモーター配列および３’遮断末端を含むＴＳプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドを前の工程で作製したｃＤＮＡとハイブリッド形成させる工程、等温条件下で、テンプレートとしてのＴＳプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドの使用、および機能的プロモーターを含むｄｓＤＮＡを作製するための酵素的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成によって、機能的二本鎖プロモーターを作製するためにｃＤＮＡの３’末端を合成的に伸長する工程、およびｄｓＤＮＡの機能的プロモーターから複数のＲＮＡ転写物を転写する工程であって、転写物が合成工程の反復による等温条件下でのさらなる酵素的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成のテンプレートとしての機能を果たすことができる増幅産物である、転写する工程を含む。本方法はまた、増幅産物を検出して標的核酸が単離されたサンプル中の分析物の存在を示���工程を含むことができる。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
５’プロモーター配列、第１の内部ユニバーサル配列（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｆｉｒｓｔ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（Ｕ１）、および標的核酸中に含まれる標的配列に特異的に結合する第１の３’標的特異的配列（３’ｆｉｒｓｔ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＴＳ１）を含むＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチドであって、前記ＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼによって伸長することができる３’末端を有するＴＳＵプロモータープライマーであるか、ポリメラーゼによって伸長することができない遮断３’末端を有するＴＳＵプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチド（ＴＳＵ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｐｒｏｖｉｄｅｒ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）である、ＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチド、
第２の５’ユニバーサル配列（Ｕ２）およびＴＳ１と異なる第２の３’標的特異的配列（ＴＳ２）で構成されるＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチド、
ＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチドをＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドに直接または間接的に連結し、それにより、標的特異的ユニバーサル（ＴＳＵ）プライマー複合体を形成する手段
を含む、組成物。
（項目２）
前記ＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチドをＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドに直接連結する手段が、共有結合である、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記共有結合がポリヌクレオチドリンカー配列を介して形成される、項目２に記載の組成物。
（項目４）
前記共有結合が非ヌクレオチド脱塩基リンカー化合物を介して形成される、項目２に記載の組成物。
（項目５）
前記ＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチドをＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドに間接的に連結する手段が、前記ＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチドおよび前記ＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドを支持体に連結するための結合対のメンバーの非共有結合であり、前記結合対の一方のメンバーが前記ＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチド上または前記ＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチド上に存在し、前記結合対の他方のメンバーが支持体に結合する、項目１に記載の組成物。
（項目６）
前記ＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチドをＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドに直接連結する手段が、前記ＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチド上の第１の配列と前記ＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチド上の第１の配列と相補的なＴＳＵ非プロモータープライマー上の第２の配列との間のハイブリッド形成複合体である、項目１に記載の組成物。
（項目７）
前記ＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチドをＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドに間接的に連結する手段が、前記ＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチド中の配列に相補的な第１の配列および前記ＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチド中の配列に相補的な第２の配列を含むＳ−オリゴヌクレオチドを含むハイブリッド形成複合体である、項目１に記載の組成物。
（項目８）
前記Ｓ−オリゴヌクレオチドが前記ＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチド中のユニバーサル配列に相補的な第１の配列を含み、前記Ｓ−オリゴヌクレオチドが前記ＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチド中のユニバーサル配列に相補的な第２の配列を含む、項目７に記載の組成物。
（項目９）
ＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチドのＴＳ配列またはＴＳＵ非プロモータープライマーのＴＳ配列とハイブリッド形成する標的核酸中の配列と異なる配列において、ＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチドおよびＴＳＵ非プロモータープライマーの標的核酸中の配列と特異的にハイブリッド形成する配列を含み、かつ、標的核酸を支持体に結合する手段を含む標的特異的捕獲オリゴヌクレオチドをさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目１０）
５’プロモーター配列およびＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチドのユニバーサル配列と同一の３’ユニバーサル配列から構成されるユニバーサルプロモータープライマーをさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目１１）
ＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドのユニバーサル配列と同一のユニバーサル配列から構成されるユニバーサルプライマーをさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目１２）
標的核酸鎖中のＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチドのＴＳ配列またはＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドのＴＳ配列が結合する配列と異なる標的核酸鎖中の配列と特異的にハイブリッド形成するブロッカーオリゴヌクレオチド（ｂｌｏｃｋｅｒ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）をさらに含み、前記ブロッカーオリゴヌクレオチドがポリメラーゼによって伸長することができない３’遮断末端（３’  ｂｌｏｃｋｅｄ  ｔｅｒｍｉｎｕｓ）を有する、項目１に記載の組成物。
（項目１３）
前記Ｓ−オリゴヌクレオチドが、（１）ＴＳＵプロモータープライマーのＵ１配列に相補的な第１の末端領域配列および（２）ＴＳＵ非プロモータープライマーのＵ２配列に相補的な第２の末端領域配列、および（３）前記第１および第２の末端領域配列を連結する連結部分から構成される、項目７に記載の組成物。
（項目１４）
前記連結部分が前記第１および第２の末端領域配列を共有結合する非核酸化合物である、項目１３に記載の組成物。
（項目１５）
５’プロモーター配列および３’Ｕ１配列から構成される少なくとも１つのユニバーサルプロモータープライマーならびにＴＳＵプロモータープライマーオリゴヌクレオチドの３’末端の合成伸長から作製されたｃＤＮＡ配列を含む二本鎖ＤＮＡから作製されたＲＮＡ転写物中に含まれる配列と相補的な配列から構成される少なくとも１つの標的特異的プライマー（ＴＳＰ）をさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目１６）
標的核酸を増幅する方法であって、
標的核酸に特異的に結合し、かつ、結合した前記標的核酸を、混合物から分離される支持体に結合する手段を提供する標的捕獲プローブの、標的核酸への結合、さらに、混合物中での、以下：
５’プロモーター配列、第１の内部ユニバーサル配列（Ｕ１）、標的核酸中に含まれる標的配列に特異的に結合する第１の３’標的特異的配列（ＴＳ１）、およびポリメラーゼによって伸長することができる３’末端を含むＴＳＵプロモータープライマーオリゴヌクレオチド、
第２の５’ユニバーサル配列（Ｕ２）およびＴＳ１と異なる第２の３’標的特異的配列（ＴＳ２）から構成されるＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチド、および
ＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチドをＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドと直接または間接的に連結するための手段
から構成される標的特異的ユニバーサル（ＴＳＵ）プライマー複合体の標的核酸とのハイブリッド形成によって、混合物から標的核酸を単離する工程、
ＴＳＵプロモータープライマー中のＴＳ配列を介してＴＳＵプロモータープライマーオリゴヌクレオチドを標的核酸中の標的配列とハイブリッド形成させる工程、
ポリメラーゼｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成の使用によって標的核酸とハイブリッド形成したＴＳＵプロモータープライマーオリゴヌクレオチドの３’末端を合成的に伸長させる工程であって、前記標的核酸が第１のｃＤＮＡ鎖を作製するためのテンプレートである、合成的に伸長させる工程、
第１のｃＤＮＡ鎖中に含まれる標的配列とのＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチド中のＴＳ配列の特異的ハイブリッド形成によって第１のｃＤＮＡ鎖とＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成させる工程、
ポリメラーゼｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成によって第１のｃＤＮＡ鎖とハイブリッド形成したＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドの３’末端を合成的に伸長して第２のＤＮＡ鎖を作製し、それにより、機能的プロモーター配列およびＵ１配列を含む実質的に二本鎖のＤＮＡを作製する工程、
実質的に二本鎖のＤＮＡの機能的プロモーター配列からＲＮＡ転写物を酵素的に転写して、５’Ｕ１領域配列、第１の標的特異的配列（ＴＳ１）、第２の標的特異的配列（ＴＳ２’）、およびＵ２配列に相補的な３’ユニバーサル配列（Ｕ２’）を含むＲＮＡ転写物を作製する工程、
Ｕ２’配列でＲＮＡ転写物とユニバーサル配列Ｕ２を含むユニバーサルプライマーオリゴヌクレオチド（ＵＰ２）とをハイブリッド形成させる工程、
等温条件下で、酵素的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成によってＵＰ２の３’末端を合成的に伸長してｃＤＮＡ鎖を作製し、ＲＮＡ転写物の鎖を酵素的に除去する工程、
Ｕ１’配列で前の工程で作製したｃＤＮＡとユニバーサル配列Ｕ１を含むユニバーサルプロモータープライマーオリゴヌクレオチド（ＵＰ１）とをハイブリッド形成させる工程、
等温条件下で、酵素的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成によってＵＰ１の３’末端を合成的に伸長して機能的プロモーターを含むｄｓＤＮＡ鎖を作製する工程、および
ｄｓＤＮＡの機能的プロモーターから複数のＲＮＡ転写物を転写する工程であって、前記転写物がＵＰ２プライマーの結合および合成工程の反復による等温条件下でのさらなる酵素的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成のテンプレートとしての機能を果たすことができる増幅産物である、転写する工程
を含む、方法。
（項目１７）
増幅産物を検出して標的核酸が単離された混合物中の分析物の存在を示す工程をさらに含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
標的核酸を増幅する方法であって、
標的核酸に特異的に結合し、かつ、結合した前記標的核酸を、混合物から分離される支持体に結合する手段を提供する標的捕獲プローブの、標的核酸への結合、さらに、混合物中での、以下：
５’プロモーター配列、第１の内部ユニバーサル配列（Ｕ１）、および標的核酸中に含まれる標的配列に特異的に結合する第１の３’標的特異的配列（ＴＳ１）を含むＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチドであって、前記ＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチドがポリメラーゼによって伸長することができない遮断３’末端を有するＴＳＵプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドである、ＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチド、
第２の５’ユニバーサル配列（Ｕ２）およびＴＳ１と異なる第２の３’標的特異的配列（ＴＳ２）から構成されるＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチド、および
ＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチドをＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドと直接または間接的に連結するための手段
から構成される標的特異的ユニバーサル（ＴＳＵ）プライマー複合体の標的核酸とのハイブリッド形成によって、混合物から標的核酸を単離する工程、
ＴＳＵ非プロモータープライマー中のＴＳ配列を介して標的核酸中の標的配列とＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成させる工程、
任意に、ポリメラーゼによって合成的に伸長することができない３’遮断末端を有するブロッカーオリゴヌクレオチドを、標的核酸中のＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドがハイブリッド形成する位置から下流の標的核酸上の配列とハイブリッド形成させる工程、
ポリメラーゼｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成の使用によって標的核酸とハイブリッド形成したＴＳＵ非プロモータープライマーの３’末端を合成的に伸長させる工程であって、前記標的核酸が第１のｃＤＮＡ鎖を作製するためのテンプレートである、合成的に伸長させる工程、
第１のｃＤＮＡ鎖中に含まれる標的配列とのＴＳＵプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチド中のＴＳ配列の特異的ハイブリッド形成によって第１のｃＤＮＡ鎖とＴＳＵプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成させる工程、
テンプレートとしてＴＳＵプロモータープロバイダー中の配列を使用することによって第１のｃＤＮＡの３’末端を合成的に伸長して、機能的プロモーター配列およびＵ１配列を含む実質的に二本鎖のＤＮＡを作製する工程、
機能的プロモーター配列からＲＮＡ転写物を酵素的に転写して、５’Ｕ１領域配列、第１の標的特異的配列（ＴＳ１）、第２の標的特異的配列（ＴＳ２’）、およびＵ２配列に相補的な３’ユニバーサル配列（Ｕ２’）を含むＲＮＡ転写物を作製する工程、
Ｕ２’配列でＲＮＡ転写物とユニバーサル配列Ｕ２を含むユニバーサルプライマーオリゴヌクレオチド（ＵＰ２）とをハイブリッド形成させる工程、
等温条件下で、酵素的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成によってＵＰ２の３’末端を合成的に伸長してｃＤＮＡ鎖を作製し、ＲＮＡ転写物の鎖を酵素的に除去する工程、
Ｕ１’配列で前の工程で作製したｃＤＮＡとプロモーター配列、ユニバーサル配列Ｕ１、および３’遮断末端を含むユニバーサルプロモーターオリゴヌクレオチド（ＵＰ１）とをハイブリッド形成させる工程、
等温条件下で、テンプレートとしてのＵＰ１オリゴヌクレオチドの使用によってｃＤＮＡの３’末端を合成的に伸長して機能的二本鎖プロモーターを作製し、酵素的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成によって機能的プロモーターを含むｄｓＤＮＡを作製する工程、および
ｄｓＤＮＡの機能的プロモーターから複数のＲＮＡ転写物を転写する工程であって、前記転写物がＵＰ２プライマーの結合および合成工程の反復による等温条件下でのさらなる酵素的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成のテンプレートとしての機能を果たすことができる増幅産物である、転写する工程
を含む、方法。
（項目１９）
増幅産物を検出して標的核酸が単離されたサンプル中の分析物の存在を示す工程をさらに含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
標的核酸を増幅する方法であって、
標的核酸に特異的に結合し、かつ、結合した前記標的核酸を、混合物から分離される支持体に結合する手段を提供する標的捕獲プローブの、標的核酸への結合、さらに、混合物中での、５’プロモーター配列、第１の内部ユニバーサル配列（Ｕ１）、標的核酸中に含まれる標的配列に特異的に結合する第１の３’標的特異的配列（ＴＳ１）、およびポリメラーゼによって伸長することができる３’末端を含む標的特異的ユニバーサル（ＴＳＵ）プロモータープライマーオリゴヌクレオチドと標的核酸とのハイブリッド形成によって、混合物から標的核酸を単離する工程、
ポリメラーゼｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成の使用によって標的核酸とハイブリッド形成したＴＳＵプロモータープライマーオリゴヌクレオチドの３’末端を合成的に伸長させる工程であって、前記標的核酸が第１のｃＤＮＡ鎖を作製するためのテンプレートである、合成的に伸長させる工程、
ＴＳ１と異なる第２の標的特異的配列（ＴＳ２）を含む標的特異的（ＴＳ）非プロモータープライマーを増幅反応混合物に添加する工程、
第１のｃＤＮＡ鎖中に含まれる標的配列とのＴ２配列の特異的ハイブリッド形成によって第１のｃＤＮＡ鎖とＴＳ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成させる工程、
ポリメラーゼｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成によって第１のｃＤＮＡ鎖とハイブリッド形成したＴＳ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドの３’末端を合成的に伸長して第２のＤＮＡ鎖を作製し、それにより、機能的プロモーター配列およびＵ１配列を含む実質的に二本鎖のＤＮＡを作製する工程、
実質的に二本鎖のＤＮＡの機能的プロモーター配列からＲＮＡ転写物を酵素的に転写して、５’Ｕ１領域配列、第１の標的特異的配列（ＴＳ１）、第２の標的特異的配列（ＴＳ２’）を含むＲＮＡ転写物を作製する工程、
Ｕ１配列でＲＮＡ転写物とユニバーサル配列Ｕ１’を含むユニバーサルプロモータープライマーオリゴヌクレオチドとをハイブリッド形成させる工程、
等温条件下で、酵素的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成によってユニバーサルプロモータープライマーの３’末端を合成的に伸長してｃＤＮＡ鎖を作製し、ＲＮＡ転写物の鎖を酵素的に除去する工程、
前の工程で作製したｃＤＮＡ中の特異的配列とＴＳ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成させる工程、
等温条件下で、酵素的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成によってＴＳ非プロモータープライマーの３’末端を合成的に伸長して機能的プロモーターを含むｄｓＤＮＡを作製する工程、および
ｄｓＤＮＡの機能的プロモーターから複数のＲＮＡ転写物を転写する工程であって、前記転写物が合成工程の反復による等温条件下でのさらなる酵素的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成のテンプレートとしての機能を果たすことができる増幅産物である、転写する工程
を含む、方法。
（項目２１）
増幅産物を検出して標的核酸が単離された混合物中の分析物の存在を示す工程をさらに含む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
標的核酸を増幅する方法であって、
標的核酸に特異的に結合し、かつ、結合した前記標的核酸を、混合物から分離される支持体に結合する手段を提供する標的捕獲プローブの、標的核酸への結合、さらに、混合物中での、５’ユニバーサル配列（Ｕ２）および３’標的特異的配列（ＴＳ２）から構成されるＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドと標的核酸とのハイブリッド形成によって、混合物から標的核酸を単離する工程、
標的核酸中の相補配列に対してＴＳ２配列を介して標的核酸中の標的配列とＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドとをハイブリッド形成させる工程、
ポリメラーゼによって合成的に伸長することができない３’遮断末端を有するブロッカーオリゴヌクレオチドを標的核酸中のＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドがハイブリッド形成する位置から下流の標的核酸上の配列とハイブリッド形成させる工程、
ポリメラーゼｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成の使用によって標的核酸とハイブリッド形成したＴＳＵ非プロモータープライマーの３’末端を合成的に伸長させる工程であって、前記標的核酸が第１のｃＤＮＡ鎖を作製するためのテンプレートである、合成的に伸長させる工程、
第１のｃＤＮＡ鎖中の相補配列とのＴＳ１配列の特異的ハイブリッド形成によって、５’プロモーター配列、標的核酸中に含まれる標的配列に特異的に結合する３’標的特異的配列（ＴＳ１）、およびポリメラーゼによって伸長することができない遮断３’末端を含む標的特異的ＴＳプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドを第１のｃＤＮＡ鎖とハイブリッド形成させる工程、
テンプレートとしてのＴＳプロモータープロバイダー中の配列の使用によって第１のｃＤＮＡの３’末端を合成的に伸長して、機能的プロモーター配列およびＴＳ１配列を含む実質的に二本鎖のＤＮＡを作製する工程、
機能的プロモーター配列からＲＮＡ転写物を酵素的に転写して、５’標的特異的配列ＴＳ１、標的特異的配列ＴＳ２’、およびＵ２’配列を含むＲＮＡ転写物を作製する工程、
Ｕ２’配列でＲＮＡ転写物とユニバーサル配列Ｕ２を含むユニバーサルプライマーオリゴヌクレオチド（ＵＰ２）とをハイブリッド形成させる工程、
等温条件下で、酵素的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成によってＵＰ２の３’末端を合成的に伸長してｃＤＮＡ鎖を作製し、ＲＮＡ転写物の鎖を酵素的に除去する工程、
プロモーター配列および３’遮断末端を含むＴＳプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドを前の工程で作製したｃＤＮＡとハイブリッド形成させる工程、
等温条件下で、テンプレートとしてのＴＳプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドの使用によってｃＤＮＡの３’末端を合成的に伸長して機能的二本鎖プロモーターを作製し、酵素的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成によって機能的プロモーターを含むｄｓＤＮＡを作製する工程、および
ｄｓＤＮＡの機能的プロモーターから複数のＲＮＡ転写物を転写する工程であって、前記転写物が合成工程の反復による等温条件下でのさらなる酵素的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成のテンプレートとしての機能を果たすことができる増幅産物である、転写する工程
を含む、方法。
（項目２３）
増幅産物を検出して標的核酸が単離されたサンプル中の分析物の存在を示す工程をさらに含む、項目２２に記載の方法。
【００１４】
添付の図面は、明細書の一部を構成し、本発明のいくつかの実施形態を例証する。これらの図面は、説明と共に、本発明の原理を説明および例証するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、以下を示す略図である：Ｐと記した５’プロモーター配列（実線）、Ｕ１と記したユニバーサル配列（破線）、およびＴＳ１と記した３’標的特異的配列（二重線）から構成されるＴＳＵプロモータープライマーを含む３成分標的特異的ユニバーサル（ＴＳＵ）プライマー複合体。このＴＳＵプロモータープライマーは、Ｕ１’と記した５’ユニバーサル配列およびＵ２’と記した３’ユニバーサル配列を含むＳ−オリゴヌクレオチド（Ｓ状点線）とハイブリッド形成し、Ｓ−オリゴヌクレオチドがＵ２と記した５’ユニバーサル配列（破線）およびＴＳ２と記した３’標的特異的配列（二重線）から構成されるＴＳＵ非プロモータープライマーとハイブリッド形成する；ＴＳ３と記した５’標的特異的配列（二重線）およびＢＰＭと記した３’結合対メンバー（三重線）から構成される標的特異的捕獲オリゴヌクレオチド；Ｐと記した５’プロモーター配列（実線）およびＵ１と記した３’ユニバーサル配列（破線）から構成されるユニバーサルプロモータープライマー（ＵＰ１）；およびＵ２と記したユニバーサル配列（破線）から構成されるユニバーサル非プロモータープライマー（ＵＰ２）。
【図２】図２は、以下の標的捕獲を示す略図である：（１）標的捕獲試薬（ＴＣＲ）は、３つの異なる標的に特異的な複数の３成分標的特異的ユニバーサル（ＴＳＵ）プライマー複合体（図１を参照のこと）（ＴＳＵａ、ＴＳＵｂ、ＴＳＵｃと記した）、および３つの異なる標的に特異的な捕獲プローブを含み、ここで、ＢＰＭをポリＡ配列（ＡＡＡ）として示し、標的特異的配列をＴＳａ、ＴＳｂ、およびＴＳｃと記した；（２）ＴＣＲを「標的ａ」を含むサンプルと混合し、それにより、ＴＳＵａプライマー複合体が標的ａとハイブリッド形成可能であり、ＴＳａ捕獲プローブが標的ａとハイブリッド形成可能である；（３）ＴＳａ捕獲プローブのポリＡ配列が支持体（影つきの円）に結合する固定プローブ（ＴＴＴＴと示すポリＴ配列）とハイブリッド形成し、それにより、支持体に結合した複合体を混合物から分離して、捕獲した標的およびＴＳＵプライマー複合体を回収することができる；そして（４）非結合ＴＳＵプライマー複合体を含む部分（ＴＳＵｂおよびＴＳＵｂと記した）を、不要物として破棄する。
【図３】図３は、３成分ＴＳＵプライマー複合体を示す略図である。これは、標的核酸中の相補ＴＳ１’配列とのＴＳＵプロモータープライマーのＴＳ１配列のハイブリッド形成を介して標的鎖に結合し、標的核酸の相補ＴＳ３’配列との捕捉プローブの標的特異的ＴＳ３配列のハイブリッド形成を介して支持体（影つきの円）に結合し、捕獲プローブのポリＡ部分が支持体に結合する固定ポリＴプローブとハイブリッド形成する。縦方向の接続線（ｖｅｒｔｉｃａｌ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ  ｌｉｎｅｓ）（｜｜｜｜｜）は、配列ハイブリッド形成を示す。ＴＳＵプライマー複合体は、Ｓ−オリゴヌクレオチドの相補Ｕ２’配列領域とそのＵ２配列領域でハイブリッド形成するＴＳＵ非プロモータープライマーから構成され、ここで、Ｓ−オリゴヌクレオチドは、３’遮断末端
【化２】
0005980164.tif 000002
、およびＴＳＵプロモータープライマー中の相補Ｕ１配列領域とそのＵ１’配列領域でハイブリッド形成している５’領域を有し、ＴＳＵプロモータープライマーは、５’プロモーター配列領域（実線Ｐ）および標的鎖中のＴＳ１’配列と相補的な３’標的特異的配列領域（ＴＳ１）を含む。標的鎖はまた、ＴＳＵ非プロモータープライマーのＴＳ２領域と同一の別の標的特異的配列領域（ＴＳ２）を含む。捕獲プローブは、標的鎖の一部（ＴＳ３’配列）に相補的な５’標的特異的配列（ＴＳ３）、および固定プローブのＢＰＭとしての機能を果たすポリＴ配列に相補的な３’ポリＡ配列を含む。
【図４】図４は、ＴＳＵプライマー複合体を示す略図である。これは、上の鎖が３’標的特異的領域（ＴＳ２）およびＵ２（＋）と記した５’ユニバーサル配列領域から構成されるＴＳＵ非プロモータープライマーである。ＴＳＵ非プロモータープライマーは、Ｓ−オリゴヌクレオチド（Ｓ−オリゴと記した）の相補３’Ｕ２’配列領域とハイブリッド形成する。Ｓ−オリゴヌクレオチドは、３’Ｕ２’配列を５’Ｕ１’配列領域に連結する脱塩基スペーサーを含む。５’Ｕ１’配列領域は、ＴＳＵプロモータープライマー中のＵ１（−）配列領域と相補的であり、ハイブリッド形成する。ＴＳＵプロモータープライマーは、５’プロモーター配列（Ｐ）および３’標的特異的配列領域（ＴＳ１）を含む。示したＳ−オリゴヌクレオチドは、末端塩基が３’−３’結合（３’−３’Ｃと記した）によって連結した３’遮断末端、ならびに５’Ｕ１’配列および３’Ｕ２’配列を共有結合的に連結するスペーサーである内部脱塩基化合物（例えば、（Ｃ９）２または（Ｃ９）３）を含む。
【図５】図５は、最初の増幅期の最初の合成工程に起因する産物を示す略図である。この合成工程は、ＲＮＡテンプレート鎖（細い実線）中の相補ＴＳ１’配列とそのＴＳ１配列を介してハイブリッド形成されるＴＳＵプロモータープライマーの３’末端を合成的に伸長して、逆転写酵素（ＲＴ）ポリメラーゼの使用によって第１のｃＤＮＡ鎖（幅広の実線）を作製する。ＲＮＡテンプレート鎖はまた、第１のｃＤＮＡ鎖中で作製されたＴＳ２’配列に相補的なＴＳ２配列を含む。
【図６】図６は、図５に示すＲＮＡテンプレート鎖の分解後の第１のｃＤＮＡ鎖産物（図５に示す）を示す略図である。このｃＤＮＡは、５’プロモーター配列（Ｐ）、ユニバーサル配列（Ｕ１）、標的特異的配列（ＴＳ１）、テンプレート鎖から作製され、第２の標的特異的配列（ＴＳ２’）を含むｃＤＮＡ配列を含む。
【図７】図７は、最初の増幅期の第２の合成工程に起因する産物を示す略図である。この産物は、ｃＤＮＡの相補ＴＳ２’配列とのＴＳＵ非プロモータープライマーのＴＳ２配列のハイブリッド形成による、第１のｃＤＮＡ鎖産物（図６を参照のこと）とのＴＳＵ非プロモータープライマーのハイブリッド形成、および第２のＤＮＡ相補鎖を作製するためのＤＮＡポリメラーゼ（影つきの四角）の使用によるＴＳＵ非プロモータープライマーの３’末端の伸長に起因する。第２の鎖は、プライマーの５’Ｕ２配列およびＴＳ２配列、標的特異的ＴＳ１’配列、ユニバーサル配列Ｕ１’、およびｃＤＮＡのプロモーター配列に相補的な３’配列を含む第１のｃＤＮＡ鎖に対する相補鎖を含む。したがって、機能的プロモーター配列を含む二本鎖ＤＮＡが作製される。
【図８】図８は、第１のｃＤＮＡ鎖、および第２のＤＮＡ鎖（図７を参照のこと）から構成される実質的なｄｓＤＮＡ、ならびに上記ｄｓＤＮＡの上の３つのＲＮＡ転写物（太線）を示す略図である。ＲＮＡ転写物は、その各ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡ  Ｐｏｌと記した影つきの領域）の使用による機能的二本鎖プロモーター配列（Ｐ）から開始される転写によって作製される。ＲＮＡ転写物は、５’→３’方向に、５’Ｕ１配列、ＴＳ１配列、標的鎖由来の転写物、ＴＳ２’配列、および３’Ｕ２’配列を含む。
【図９】図９は、最初の等温増幅期由来の図８に示す１つのＲＮＡ転写物（このＲＮＡ転写物は、末端ユニバーサル配列Ｕ１およびＵ２’を有し、Ｕ１およびＵ２’は標的特異的配列ＴＳ１およびＴＳ２’に隣接し、ＴＳ１およびＴＳ２’は他の標的鎖配列の転写物に隣接する）、および転写物中の配列Ｕ２’に相補的な配列Ｕ２を含むユニバーサルプライマー（ＵＰ２）を示す略図である。
【図１０】図１０は、第２の等温増幅期における工程を示す略図である。この工程では、ＲＮＡ転写物（図９に示す）が左下の系に入り、ここでＲＮＡ転写物がＵ２’およびＵ２配列の相補的対合（縦線｜｜｜｜｜によって示すハイブリッド形成）を介してユニバーサルプライマーＵＰ２とハイブリッド形成し、逆転写酵素（ＲＴと記した白抜きの円）がＵＰ２に結合し、そのＲＮＡ指向ＤＮＡポリメラーゼ活性を使用して、テンプレートとしてのＲＮＡ転写物の使用によってＵＰ２プライマーを酵素的に伸長させる。右を指す矢印の後の次の工程は、得られたｃＤＮＡ（下の鎖）のＲＮＡテンプレート（上の鎖）とのハイブリッド形成を示し、上を示す矢印の後の工程で、ＲＴ酵素のＲＮアーゼＨ活性によってこれを消化してｃＤＮＡ鎖を遊離する。次の上を示す矢印の後、ｃＤＮＡを、５’プロモーター配列（Ｐ）を含むユニバーサルプロモータープライマー（ＵＰ１）の相補Ｕ１配列とＵ１’配列を介してハイブリッド形成させ、ＵＰ１プライマーをＲＴ酵素のＤＮＡ指向ＤＮＡポリメラーゼ活性によって伸長して、円の頂点（左上を示す矢印の上）に示すｄｓＤＮＡを作製する。ｄｓＤＮＡは、鎖あたり２つのユニバーサル配列（上の鎖上のＵ１およびＵ２’ならびに下の鎖上のＵ１’およびＵ２）（標的特異的配列（上の鎖上のＴＳ１、ＴＳ２’、および介在配列ならびに下の鎖上のＴＳ１’、ＴＳ２、および介在配列）に隣接する）および機能的プロモーター（Ｐ）を含む。左下への矢印の後、機能的プロモーターは、プロモーター配列に特異的なＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡ  Ｐｏｌと記した楕円）と相互作用してｄｓＤＮＡ由来の転写物を作製し、次の下方向への矢印の後に示すように、２つのユニバーサル配列（Ｕ１およびＵ２’）および標的特異的配列（ＴＳ１、ＴＳ２’、および介在配列）を含む１００〜１０００個の転写物またはＲＮＡアンプリコンが得られる。右下への次の矢印の後、これらのＲＮＡ転写物は増幅系に入り、示すようにサイクル様式でさらなる等温増幅のためのテンプレートとして使用され、第１期のＲＮＡ転写物について上記の工程を繰り返す。
【図１１】図１１は、Ｓ−オリゴヌクレオチドを含まないが、支持体に結合したＴＳＵプライマーを使用して行う、第１の等温増幅期で使用することができるＴＳＵプライマーの２つの実施形態の略図である。その後にユニバーサルプライマー（ＵＰ１およびＵＰ２）の使用によって第２の等温増幅期を液相で行う。実施形態１では、ＴＳＵ非プロモータープライマーおよびＴＳＵプロモータープライマーを共有結合または非共有結合によって連結し、第１の結合対メンバー（ＢＰＭ１と記した影つきの矢印）を介して支持体に結合し、第１の結合対メンバーが支持体（影つきの長方形）に結合した第２の結合対メンバー（ＢＰＭ２と記した暗色の山形）に特異的に結合する。実施形態２では、ＴＳＵ非プロモータープライマーおよびＴＳＵプロモータープライマーは、各オリゴマーに結合したＢＰＭ１を介して同一の支持体に個別に結合した個別のオリゴヌクレオチドであり、ＢＰＭ１は支持体（影つきの円）に結合した個別の結合対メンバーＢＰＭ２に特異的に結合する。実施形態１および２の両方について、ユニバーサルプライマー（ＵＰ１およびＵＰ２）を液相中に準備し、支持体に結合しない。
【図１２】図１２は、実施形態１（線の上半分）および実施形態２（線の下半分）についての最初のプライマー結合（左側、Ａと記した）を使用した標的捕獲（ＴＣ）工程中で使用した構造、および第２の等温増幅期（右側、Ｂと記した）で使用したプライマーを示す略図である。実施形態１では、ＴＣ工程（上半分の左側）は、支持体に結合した標的核酸から構成される捕獲複合体を含む。この捕獲複合体は、標的特異的捕獲プローブを介して標的鎖とハイブリッド形成し（短い横線と標的鎖を示すより長い横線との間の縦線によって示す）、ポリＡ配列を介して支持体（影つきの円）に結合した固定ポリＴ配列ともハイブリッド形成する。標的核酸を、ＴＳＵプライマー複合体と、別の位置で結合させる。このＴＳＵプライマー複合体は、標的鎖中の配列およびＳ−オリゴヌクレオチドと特異的にハイブリッド形成するＴＳＵプロモータープライマーを含み、Ｓ−オリゴヌクレオチドは、ＴＳＵ非プロモータープライマーとハイブリッド形成する（図３に実質的に示す）。実施形態１では、第２の増幅期（上半分の右側）は、以下の２つのユニバーサルプライマーを使用する：ＴＳＵプライマー複合体の使用によってＲＮＡ転写物中に導入される相補配列とハイブリッド形成する、ユニバーサルプロモータープライマー（ＵＰ１）およびユニバーサル非プロモータープライマー（ＵＰ２）。実施形態２では、ＴＣ工程（下半分の左側）は、実施形態１について示す捕獲複合体、および標的特異的配列を介して標的鎖の別の位置でハイブリッド形成するＴＳＵプロモータープライマーのみを含む。第２の増幅期（下半分の右側）は、１つのユニバーサルプロモータープライマー（ＵＰ１）および１つの標的特異的プライマー（ＴＳＰ）を使用する。
【図１３】図１３は、第１期および／または第２期（左下）由来のＲＮＡ転写物を、テンプレートとしてＲＮＡ転写物を使用してｃＤＮＡ鎖（右下）を合成するために、ＲＴによって伸長する標的特異的プライマー（ＴＳＰ）とハイブリッド形成させること、およびＵ２、Ｕ２’ユニバーサル配列が存在しないこと以外は、実質的に図１０に示す第２の等温増幅期中の工程を示す略図である。
【図１４】図１４は、実施形態を示す略図である。この実施形態は、（左下）第１の増幅期で使用するＴＳＵプロモータープライマーを第１の結合対メンバー（ＢＰＭ１）を介して支持体に結合し、ＢＰＭ１は支持体（影つきの円）に結合する第２の結合対メンバー（ＢＰＭ２）に特異的に結合し、液相中のユニバーサルプロモータープライマー（ＵＰ１）および標的特異的プライマー（ＴＳＰ）の混合物を、第２の増幅期で使用する。
【図１５】図１５は、実施形態中の成分を示す略図である。この実施形態において、図の上部は、標的捕獲工程中で作製されたハイブリッド形成複合体を示す。ハイブリッド形成複合体は、非結合ポリＡテール、および標的鎖の５’部分とハイブリッド形成するＴＳ配列を有する標的捕獲（ＴＣ）プローブとハイブリッド形成する標的核酸鎖、ＴＣプローブとハイブリッド形成する位置から下流で標的鎖とハイブリッド形成するブロッカーオリゴヌクレオチド、ならびに非ハイブリッド形成ユニバーサル（Ｕ）配列を有するＴＳ配列を介して標的鎖の３’部分とハイブリッド形成するＴＳＵプライマーから構成される。図の下の部分は、１回のプライマー等温増幅中に存在する核酸が、（１）５’Ｕ配列、内部ＴＳ配列、およびＴＳＵプライマーの伸長によって標的鎖からコピーされた３’配列からなる標的アンプリコン、（２）５’プロモーター（Ｐ）配列、３’ＴＳ配列、および遮断３’末端
【化３】
0005980164.tif 000003
を含むＴＳプロモータープロバイダー、および（３）標的アンプリコンのユニバーサル配列に相補的なユニバーサル配列（Ｕ’）からなるユニバーサルプライマーを含むことを示す。
【図１６】図１６は、実施形態中の成分を示す略図である。この実施形態において、図の上部は、標的捕獲工程中で作製されたハイブリッド形成複合体を示す。ハイブリッド形成複合体は、非結合ポリＡテール、および標的鎖の５’部分とハイブリッド形成するＴＳ配列を有する標的捕獲（ＴＣ）プローブとハイブリッド形成する標的核酸鎖、ＴＣプローブとハイブリッド形成する位置から下流で標的鎖とハイブリッド形成するブロッカーオリゴヌクレオチド、ならびに（上の鎖）３’遮断末端
【化４】
0005980164.tif 000004
を有するＴＳＵプロモータープロバイダー、Ｓ−オリゴマー（中間の鎖、図３に実質的に示す）、およびＳ−オリゴマー中の相補（Ｕ２’）配列とハイブリッド形成するユニバーサル（Ｕ２）配列を有し、ＴＳを介して標的鎖の３’部分とハイブリッド形成するＴＳＵプライマー（下の鎖）から構成されるＴＳＵプライマー複合体から構成される。図の下の部分は、１回のプライマー等温増幅中に存在する核酸が、（１）そのＵ２ユニバーサル配列を含むＴＳＵプライマーのＴＳ２配列の伸長によって作製された伸長産物と、そのＴＳ１配列を介してハイブリッド形成するＴＳＵプロモータープロバイダー、（２）５’プロモーター（Ｐ）配列、３’Ｕ１’ユニバーサル配列、および遮断３’末端
【化５】
0005980164.tif 000005
を含むプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチド、および（３）Ｕ２ユニバーサル配列に相補的なユニバーサル配列（Ｕ２’）からなるユニバーサルプライマーを含むことを示す。
【図１７】図１７は、ハイブリッド形成複合体中の２つのＴＳＵオリゴヌクレオチドを示す実施形態の略図である。ハイブリッド形成複合体は、ＴＳＵプライマーのＴＳ１配列を介して標的鎖とハイブリッド形成する。ＴＳＵプライマーはＵ１配列およびプロモーター相補配列（Ｐ’）も含む。ＴＳＵプライマーは、相補Ｐ’配列とＴＳＵプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドのＰ配列とのハイブリッド形成を介してＴＳＵプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する。ＴＳＵプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドは、Ｕ２配列、ＴＳ２配列、および遮断３’末端も含む。
【図１８】図１８は、非ヌクレオチドリンカー（−Ｃ９−Ｃ９−）を介して共有結合する２つのＴＳＵオリゴヌクレオチドを示す実施形態の略図である。これは、３’→５’方向に遮断３’末端、ＴＳ２、Ｕ２、およびプロモーター（Ｐ）配列を含むＴＳＵプロモータープロバイダーに連結したＴＳＵプライマーから構成される複合体を形成し、ＴＳＵプライマーは、５’→３’方向にＵ１およびＴＳ１配列を含む。それにより、複合体中にＴＳＵプライマーのＴＳ１配列を介して標的鎖とハイブリッド形成する１つの伸長可能な３’末端が得られる。標的鎖との以下のハイブリッド形成も示す：ブロッカーオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成、およびそのＴＳ配列を介して標的とハイブリッド形成するＴＣプローブ（非ハイブリッド形成テール配列と共に示す）。
【図１９】図１９は、反応あたり１０２、１０４、および１０６コピーでサンプル中に存在する単一標的（「ＰＣＡ３単一」パネル）ならびに反応あたり１０６コピーでサンプル中に存在する２標的（「ＰＣＡ３／ＰＳＡ二重（オリゴ）」パネル）の等温増幅から得たデータを示す。ここでは、増幅産物を、蛍光標識プローブの使用によってリアルタイムで検出した。両パネルについて、ｘ軸は増幅サイクル数を示し、ｙ軸は蛍光単位を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
詳細な説明
本発明は、同一オリゴヌクレオチド中に標的特異的配列およびユニバーサル配列の両方を含む１つ以上の標的特異的ユニバーサル（ＴＳＵ）オリゴヌクレオチドプライマーを含む組成物を含む。本明細書中に記載のＴＳＵプライマーは、５’プロモーター配列、第１の内部ユニバーサル配列（Ｕ１）、および標的核酸中に含まれる標的配列に特異的に結合する第１の３’標的特異的配列（ＴＳ１）から構成される少なくとも１つのＴＳＵプロモータープライマーオリゴヌクレオチドを含む。かかる組成物は、さらに、第２の５’ユニバーサル配列（Ｕ２）およびＴＳ１と異なる第２の３’標的特異的配列（ＴＳ２）から構成される少なくとも１つのＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドを含むことができる。ＴＳＵプロモータープライマーおよびＴＳＵ非プロモータープライマーを、複合体中で、ＴＳＵプライマーのユニバーサル配列を連結するＳ−オリゴヌクレオチドの使用によって連結することができ、この連結は、Ｓ−オリゴヌクレオチドの相補末端配列へのハイブリッド形成を介する。組成物は、さらに、５’プロモーター配列および３’Ｕ１配列から構成される少なくとも１つのユニバーサルプロモータープライマーを含むことができ、第２のユニバーサル配列（Ｕ２）と実質的に同一のユニバーサル配列から構成される少なくとも１つのユニバーサルプライマーを含むこともできる。これらの組成物は、オリゴヌクレオチドの構造的態様および機能的態様がこれらの合成のために選択される選択配列中に存在する限り、オリゴヌクレオチドの任意の特定の成分のために使用される任意の特定の配列を必要としない。
【００１７】
本発明は、５’プロモーター配列、第１の内部ユニバーサル配列（Ｕ１）、および標的核酸中に含まれる標的配列に特異的に結合する第１の３’標的特異的配列（ＴＳ１）から構成される少なくとも１つのＴＳＵプロモータープライマーオリゴヌクレオチドを含む、１つ以上の本明細書中に記載のＴＳＵプライマーを使用する等温増幅方法を含む。本方法は、標的捕獲工程でＴＳＵプライマーを標的核酸に結合する工程を使用し、それにより、結合したＴＳＵプライマーを含む標的核酸が増幅開始前に他の混合成分から分離される。等温増幅は、少なくとも１つの標的特異的配列に隣接する少なくとも１つのユニバーサル配列または２つのユニバーサル配列を含むＲＮＡ転写物を作製する第１の期を含む。等温増幅は、第１の期由来のＲＮＡ転写物をテンプレートとして使用する第２の期を含む。この第２の期は、少なくとも１つのユニバーサルプライマーおよび酵素的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成を使用して機能的プロモーターを含むｄｓＤＮＡを作製し、このｄｓＤＮＡを使用して増幅産物であるさらなるＲＮＡ転写物を転写し、このＲＮＡ転写物を等温増幅反応中でさらなるサイクルに供することができるか、このｄｓＤＮＡを使用して標的核酸が試験サンプル中に存在することを示す検出可能なシグナルを得ることができる。
【００１８】
実質的に等温の条件下にてｉｎ  ｖｉｔｒｏで標的核酸配列を増幅してサンプル中の標的核酸の存在を示すために検出することができる増幅配列を産生するのに有用な方法および組成物を開示する。本方法および組成物は、病状の診断および／または予後診断、環境サンプルおよび／または食品サンプルの純度または質の検出、または法医学的証拠の調査のための有用な情報を得るための増幅核酸の合成に有用である。本方法および組成物により、種々の核酸の合成によって広範なダイナミックレンジにわたって高感度なアッセイを得ることが可能であり、その実施は比較的迅速且つ安価であり、これにより、高処理系および／または自動化系での使用に適切となるので、本方法および組成物は有益である。本方法および組成物は、複数の異なる遺伝子配列を同時に分析するアッセイ（すなわち、多重増幅系）に有用である。好ましい組成物を、定義したアッセイ成分を含むキット中に提供する。これらは、使用者が所望の標的を増幅するためのアッセイでこれらの成分を共に使用する方法を効率的に実施することが可能なので有用である。
【００１９】
開示の組成物および方法は、核酸の等温増幅の効率を増大させ、例えば、アレイベースのアッセイのために単一反応混合物中で複数の分析物を増幅する多重アッセイで特に有用である。多重等温転写ベースの増幅アッセイは、しばしば、１回の反応において約６個以下の分析標的の増幅に制限される。これは、プライマーの相互作用によって１つ以上の標的の増幅が非効率的になり、アッセイ感度が低下するからである。多数の異なるプライマーおよびプライマーの組み合わせのデザインおよび試験によって多重アッセイにおける増幅効率を増大させることができるが、開示の系は、最初の増幅期で標的特異的プライマーを使用し、その後に第２の増幅期で全ての標的アンプリコンを増幅するためのユニバーサルプライマーを使用することによってプライマー相互作用を最小にする。したがって、多重反応における多数の各プライマーまたはプライマーの組み合わせをデザインおよび試験する必要性を減少しながら増幅効率を増大させる。開示の組成物および方法は、系が複合体混合物中に存在する１つ以上の所望の標的を増幅し得るという利点を提供し、複合体混合物は、１つ以上の内部コントロールまたは内部キャリブレーター標的を含み、これは、アッセイが適切に実施されたという情報を提供するか、結果の定量に使用される情報を提供する。多重アッセイデザインの簡潔化に加えて、開示の組成物および方法により、アッセイ試薬の製造およびアッセイ工程の実施の両方を簡略化できるという利点が得られ、限られた数の試薬が所望の各標的について使用される。すなわち、所望の各標的のために、所望の標的に固有のたった１つまたは対の標的特異的ユニバーサル（ＴＳＵ）プライマーを、最初の増幅期で使用するためにデザインし、その後の増幅期は多数の標的の増幅に一般的に使用されるユニバーサル試薬を使用する。ＴＳＵプライマーは、同一オリゴヌクレオチド中に標的特異的（ＴＳ）配列およびユニバーサル（Ｕ）配列の両方を含むが、ＴＳＵプライマーは、プロモーター配列などのさらなる配列を含むことができる。開示の方法は多用途であり、この方法を使用してすべて１つの反応で増幅された１つの標的または複数の異なる標的を検出することができ、増幅産物を反応の終了時（終点検出）または反応中（リアルタイム検出）に検出することができる。典型的には、ＴＳＵプライマーが最初の増幅期で使用される単離標的核酸とハイブリッド形成し、ＴＳＵプライマーによって導入されたユニバーサル配列に特異的なユニバーサルプライマーがその後の増幅反応混合物中で使用されるように、標的特異的ユニバーサル（ＴＳＵ）プライマーを標的捕獲試薬（ＴＣＲ）中に準備する。
【００２０】
別途記載しない限り、本明細書中で使用される科学用語および技術用語は、技術文献（例えば、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄ．（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら，１９９４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）または分子生物学に関連する他の周知の技術刊行物に基づく分子生物学分野の当業者によって一般的に理解されている意味を有する。別途記載しない限り、本明細書中で使用するか意図される技術は、分子生物学分野で周知の標準的方法である。開示の方法および組成物の態様の理解を補助するために、いくつかの用語を、本明細書中に記載の実施形態によってより詳細に記載するか例証する。
【００２１】
核酸は、ポリヌクレオチド化合物をいう。このポリヌクレオチド化合物には、標準的なホスホジエステル結合または他の結合によって共有結合した窒素複素環塩基または塩基アナログを有するヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログを含むオリゴヌクレオチドが含まれる。核酸には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、キメラＤＮＡ−ＲＮＡポリマー、またはそのアナログが含まれる。核酸では、骨格は、種々の結合（１つ以上の糖−ホスホジエステル結合、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）結合（ＰＣＴ番号ＷＯ９５／３２３０５号）、ホスホチオアート結合、メチルホスホナート結合、またはその組み合わせが含まれる）から構成され得る。核酸中の糖部分は、リボース、デオキシリボース、または置換（例えば、２’メトキシおよび２’ハライド（例えば、２’−Ｆ）置換）を有する類似の化合物であり得る。窒素含有塩基は、従来の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、そのアナログ（例えば、イノシン；Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ５−３６，Ａｄａｍｓら，ｅｄ．，１１ｔｈ  ｅｄ．，１９９２）、プリン塩基またはピリミジン塩基の誘導体（例えば、Ｎ４−メチルデオキシグアノシン、デアザ−またはアザ−プリン、デアザ−またはアザ−ピリミジン、種々の化学的位置のいずれかに変化した基または置換基を有するピリミジンまたはプリン（例えば、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン、４−アミノ−ピリミジン、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン、およびＯ４−アルキル−ピリミジン）、またはピラゾロ化合物（非置換または３置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンなど）であり得る（例えば、米国特許第５，３７８，８２５号、同第６，９４９，３６７号、およびＰＣＴ番号ＷＯ９３／１３１２１号）。核酸は、骨格が１つ以上の位置に窒素含有塩基を持たない「脱塩基」位置を含むことができる（Ａｒｎｏｌｄらに付与された米国特許第５，５８５，４８１号）。例えば、１つ以上の脱塩基位置により、個別のオリゴヌクレオチド配列を共に連結するリンカー領域を形成することができる。核酸は、従来のＲＮＡおよびＤＮＡで見出される従来の糖、塩基、および結合のみを含むことができるか、従来の成分および置換基（例えば、２’メトキシ骨格によって連結した従来の塩基または従来の塩基および１つ以上のアナログの混合物を含むポリマー）を含むことができる。この用語には、「ロックド核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）」（ＬＮＡ）が含まれる。ＬＮＡは、ＲＮＡ模倣糖高次構造中に閉じ込められた二環式フラノース単位を有する１つ以上のＬＮＡヌクレオチド単量体を含み、ｓｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、またはｄｓＤＮＡ中の相補配列に対するハイブリッド形成親和性を増強する（Ｖｅｓｔｅｒら，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３（４２）：１３２３３−４１）。
【００２２】
交換可能な用語「オリゴヌクレオチド」および「オリゴマー」は、一般に１，０００未満のヌクレオチド（ｎｔ）でできた核酸ポリマー（下限が約２〜５ｎｔで上限が約５００〜９００ｎｔのサイズ範囲の核酸ポリマーが含まれる）をいう。好ましいオリゴマーのサイズ範囲は、下限が５〜１５ｎｔで上限が５０〜５００ｎｔであり、特に好ましい実施形態のサイズ範囲は、下限が１０〜２０ｎｔで上限が２５〜１５０ｎｔである。好ましいオリゴヌクレオチドを、任意の周知のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの化学的または酵素的方法の使用によって合成的に作製し、合成後に標準的方法（例えば、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ））の使用によって精製することができる。
【００２３】
増幅オリゴヌクレオチドには、酵素的に伸長せず、標的核酸またはその相補物とハイブリッド形成し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸増幅反応に関与するプライマーおよびオリゴヌクレオチドが含まれる。この反応では、新規の核酸鎖を合成開始点としてプライマーの末端を使用することによってテンプレート鎖から合成し、この合成は、一般に、酵素ポリメラーゼ活性によって触媒される。酵素的に伸長される増幅オリゴヌクレオチドには、プライマーおよびプロモーター−プライマーが含まれ、これらのプライマーには、分析（標的）核酸配列中に含まれる配列と同一であるか完全に相補的である標的特異的（ＴＳ）配列、および分析配列中に含まれないか相補的でないが、分析配列の代替物またはタグとしての機能を果たすために導入されるユニバーサル（Ｕ）配列を含むＴＳＵプライマーが含まれる。Ｕ配列を、分析物またはＴＳ配列に連結し、これを、分析配列の代わりに増幅および／または検出して混合物中の１つ以上の分析物の存在を示すことができる。ＴＳＵプライマーの実施形態は、プロモーター配列などのさらなる配列情報を含むことができ、これにより、ＴＳＵプロモータープライマーと呼ばれるＴＳＵプライマーが得られる。ＴＳＵプロモータープライマーと区別するために、プロモーター配列を含まないＴＳＵプライマーを、ＴＳＵ非プロモータープライマーと呼ぶことができる。一般にユニバーサルプライマー（ＵＰ）と呼ばれる増幅オリゴヌクレオチドの実施形態は、その後のアッセイ工程で分析物の代替物としての機能を果たすための分析配列に連結したユニバーサル配列またはタグ配列を増幅するために使用される配列を含む。ユニバーサルプライマー（ＵＰ）はユニバーサル配列のみを含むことができ、分析物特異的配列を含むことができないが、ＵＰはプロモーター配列などのさらなる機能配列を含むこともできる。「ユニバーサル非プロモータープライマー」または「ユニバーサルプロモータープライマー」などの用語を、異なるＵＰ型を区別するために使用することができる。酵素的に伸長されない増幅オリゴヌクレオチドは、典型的に、酵素の重合開始のための使用を阻害または防止する、化学的または構造的に遮断する３’末端を有するが、これらのオリゴヌクレオチドは機能的に増幅に関与する。酵素的に伸長されない増幅オリゴヌクレオチドの例には、ＴＳＵプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドおよびブロッカーオリゴヌクレオチドが含まれ、ブロッカーオリゴヌクレオチドは、ブロッカーオリゴヌクレオチドが結合する標的鎖上の位置を超えて、プライマーの鎖伸長が進行することを阻害または防止するために標的鎖に結合する。
【００２４】
増幅オリゴヌクレオチドのサイズを、一般に、オリゴヌクレオチド中に含まれる機能的部分によって決定する。プロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドの成分部分には、ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＰ）に特異的なプロモーター配列が含まれる。ＲＮＰおよびその対応するプロモーター配列は周知であり、種々の供給源（例えば、ウイルス、バクテリオファージ、真菌、酵母、細菌、動物、植物、またはヒトの細胞）から精製するか、これら由来の材料の使用によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成的に作製することができる。ＲＮＰおよびプロモーターの例には、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩおよびそのプロモーター（Ａｇａｍｉらに付与された米国特許第７，２４１，６１８号）、バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼおよびそのプロモーターまたはその変異体（Ｚｉｍａｎらに付与された米国特許第７，２２９，７６５号およびＨａｙｄｏｃｋに付与された同第７，０７８，１７０号）、高度好熱菌由来のＲＮＡポリメラーゼおよびプロモーター（Ｓａｋａｎｙａｎらに付与された米国特許第７，１８６，５２５号）、ＨＩＶ−１またはＨＣＶ由来のＲＮＡポリメラーゼ、および植物に指向するＲＮＰ（Ｏｄｅｌｌらに付与された米国特許第７，０６０，８１３号）が含まれる。プロモータープライマーまたはプロバイダーオリゴヌクレオチドには、選択されたＲＮＰに機能的に連結するプロモーター配列が含まれる。プロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドの好ましい実施形態には、Ｔ７  ＲＮＰと共に使用され、プロモーター配列が２５〜３０ｎｔの範囲であるＴ７プロモーター配列（配列番号６７または６８（配列番号６７、ａａｔｔｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｇａ；配列番号６８、ｇａａａｔｔａａｔａ  ｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｇａ）のプロモーター配列など）が含まれる。ユニバーサル（Ｕ）部分を含む増幅オリゴヌクレオチドには、典型的には、５〜４０ｎｔの範囲、好ましい実施形態では１０〜２５ｎｔ、１０〜３０ｎｔ、または１５〜３０ｎｔの範囲のＵ配列が含まれる。標的特異的（ＴＳ）部分を含む増幅オリゴヌクレオチドには、典型的には、１０〜４５ｎｔの範囲、好ましい実施形態では１０〜３５ｎｔまたは２０〜３０ｎｔの範囲のＴＳ配列が含まれる。複数のＵ配列および／または複数のＴＳ配列を含む増幅オリゴヌクレオチドは、各機能的配列の長さによって決定されるサイズ範囲であろう。例えば、Ｕ配列およびＴＳ配列を含むプロモータープライマーまたはプロバイダーオリゴヌクレオチドのサイズは、プロモーター、Ｕ配列、およびＴＳ配列のサイズの和であり、任意に、連結ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分（例えば、脱塩基リンカー）を含むことができる。本明細書中に記載の複数の機能的成分から構成される増幅オリゴヌクレオチドを、標準的なホスホジエステル結合、核酸アナログ結合、または異なる機能的部分の間の直接的な非核酸結合によって共有結合することができるか、機能的部分の間のスペーサーとしての機能を果たすさらなる核酸配列または非核酸（例えば、脱塩基結合）化合物の使用によって共に共有結合することができる。非共有結合の使用（オリゴヌ���レオチド間の結合対メンバーの相互作用（２つ以上のオリゴヌクレオチド中に含まれる相補配列の直接ハイブリッド形成が含まれる）の使用など）によるか、またはオリゴヌクレオチドの各結合対メンバー（例えば、支持体に結合した各オリゴヌクレオチドのための結合対メンバー）が結合する連結成分を介して増幅オリゴヌクレオチドのいくつかの実施形態を共に連結して複合体を形成することができる。
【００２５】
プライマーに加えて、他の増幅オリゴマーには、遮断オリゴヌクレオチドおよびプロモータープロバイダーオリゴマーが含まれ得る（例えば、Ｋａｃｉａｎらに付与された米国特許第５，３９９，４９１号、同第５，５５４，５１６号、および同第５，８２４，５１８号、Ｍｕｌｌｉｓらに付与された米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号、ならびにＢｅｃｋｅｒらの米国特許出願公開第２００６／００４６２６５（Ａ１）号）。遮断オリゴヌクレオチドは、通常３’末端付近または３’末端に化学的および／または構造的な修飾を含み、酵素手段によるオリゴヌクレオチドからのＤＮＡ合成の開始を防止または妨害するオリゴヌクレオチドをいう。かかる修飾の例には、３’２’−ジデオキシヌクレオチド塩基、酵素伸長を妨害する３’非ヌクレオチド部分の使用、または２つの５’末端を有する最終オリゴヌクレオチドを作製するための３’→５’方向でのオリゴヌクレオチドへの短い配列の結合（すなわち、その３’末端でのオリゴヌクレオチドの共有結合によって、第２の通常はより短い５’→３’オリゴヌクレオチドに結合した第１の５’→３’オリゴヌクレオチド）が含まれる。別の修飾例は、キャップの５’末端塩基がオリゴヌクレオチドの３’末端塩基に相補的であるような、オリゴヌクレオチドの３’末端における少なくとも３ｎｔに相補的な配列から構成される「キャップ」である。遮断オリゴヌクレオチドは合成的に伸長しないにもかかわらず、これらは、例えば、遮断オリゴヌクレオチドが結合する位置を超えた相補鎖の合成を妨害するための核酸テンプレート鎖上の特異的な位置とのハイブリッド形成によって、核酸増幅に関与し得る。プロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドは、通常はオリゴヌクレオチド上にプロモーター配列を含むオリゴヌクレオチドをいう。このオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡプライマー伸長産物（例えば、ｃＤＮＡ）の３’領域とハイブリッド形成してプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドと伸長産物との間にハイブリッド形成複合体を形成する第１の領域、および第１の領域に対して５’側に存在し、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列である第２の領域を含む。伸長産物を有するハイブリッド形成複合体の形成により、プロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドは、機能的プロモーターを含むｄｓＤＮＡを作製するためのテンプレートとしての機能を果たすことができる。伸長産物またはｃＤＮＡをさらなる鎖の合成のためのテンプレートとして使用する場合、すなわち、テンプレートとしてのｃＤＮＡの使用、およびテンプレートとしてのプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドのプロモーター配列の使用により作製された新規に合成された鎖の伸長により、機能的プロモーターを含む実質的に二本鎖の構造をｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成する。
【００２６】
核酸の増幅は、標的核酸配列または標的核酸配列の代替物としての機能を果たすユニバーサル配列もしくはタグ配列の全部または一部と同一または相補的である核酸鎖のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの作製過程をいい、これら全ては標的核酸がサンプル中に存在する場合のみ作製される。典型的には、核酸増幅は、１つ以上の核酸ポリメラーゼおよび／または転写酵素を使用して、標的ポリヌクレオチドもしくはそのフラグメント、標的ポリヌクレオチドもしくはそのフラグメントに相補的な配列、または標的ポリヌクレオチドの代替物としての機能を果たすために増幅系に導入されたユニバーサル配列もしくはタグ配列の複数のコピーを産生し、検出工程などでアッセイ中のいくつかの点で標的ポリヌクレオチドの存在を示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸増幅技術は周知であり、転写関連増幅方法（転写媒介増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＴＭＡ）または核酸配列ベースの増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＮＡＳＢＡ）など）および他の方法（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ），逆転写酵素−ＰＣＲ，レプリカーゼ媒介増幅（ｒｅｐｌｉｃａｓｅ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）など）が含まれる。
【００２７】
本明細書中に開示のいくつかの実施形態の理解を助けるために、以前に詳述されているＴＭＡ法（例えば、Ｋａｃｉａｎらに付与された米国特許第５，３９９，４９１号、同第５，５５４，５１６号、および同第５，８２４，５１８号）を簡潔にまとめる。ＴＭＡでは、増幅すべき配列を含む標的核酸を、一本鎖核酸（例えば、ｓｓＲＮＡまたはｓｓＤＮＡ）として準備する。二本鎖核酸（例えば、ｄｓＤＮＡ）を一本鎖核酸に変換する従来の方法を使用することができる。プロモータープライマーがその標的配列で標的核酸に特異的に結合し、逆転写酵素（ＲＴ）がテンプレートとして標的鎖を使用してプロモータープライマーの３’末端を伸長してｃＤＮＡコピーを作製し、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二重鎖が得られる。ＲＮアーゼ活性（例えば、ＲＴ酵素のＲＮアーゼＨ）が、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二重鎖のＲＮＡを消化し、第２のプライマーがプロモータープライマー末端から下流のｃＤＮＡ中のその標的配列に特異的に結合する。次いで、ＲＴがテンプレートとしてｃＤＮＡを使用した第２のプライマーの３’末端の伸長によって新規のＤＮＡ鎖を合成し、機能的プロモーター配列を含むｄｓＤＮＡを作製する。機能的プロモーターに特異的なＲＮＡポリメラーゼが転写を開始して、最初の標的鎖の約１００〜１０００個のＲＮＡ転写物（増幅されたコピーまたはアンプリコン）を産生する。第２のプライマーが各アンプリコン中のその標的配列に特異的に結合し、ＲＴがアンプリコンＲＮＡテンプレートからｃＤＮＡを作製して、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二重鎖を産生する。ＲＮアーゼがＲＮＡ：ｃＤＮＡ二重鎖由来のアンプリコンＲＮＡを消化し、プロモータープライマーの標的特異的配列が新規に合成されたＤＮＡ中のその相補配列に結合し、ＲＴがプロモータープライマーの３’末端を伸長して、ＲＮＡポリメラーゼが結合し、かつ標的鎖に相補的なさらなるアンプリコンを転写する、機能的プロモーターを含むｄｓＤＮＡを作製する。反応中にこれらの工程を繰り返し使用する自己触媒サイクルにより、最初の標的配列の約１０億倍に増幅される。アンプリコンを、アンプリコン中に含まれる配列に特異的に結合するプローブの使用によって、増幅中（リアルタイム検出）または反応終点（終点検出）に検出することができる。結合したプローブに起因するシグナルの検出は、サンプル中の標的核酸の存在を示す。
【００２８】
標的核酸の存在を示す転写物の作製によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで核酸を増幅するために１つのプライマーまたは１つ以上のさらなる増幅オリゴマーを使用する別の転写関連増幅形態は、以前に詳述されている（Ｂｅｃｋｅｒらの米国特許出願公開２００６／００４６２６５号）。簡潔に述べれば、この単一プライマー法は、プライミングオリゴマー、その３’末端からのＤＮＡ合成の開始を防止するように改変されたプロモーターオリゴマー（またはプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチド）、および、任意に、標的鎖由来のｃＤＮＡの伸長を終結するための結合分子（例えば、３’遮断オリゴマー）を使用する。本方法は、（ｉ）プライマー伸長反応を標的配列の３’末端から開始することができるように標的配列の３’末端とハイブリッド形成するプライミングオリゴヌクレオチド、および（ｉｉ）標的配列の５’末端の隣りまたは付近に存在する標的核酸に結合する結合分子を用いた、ＲＮＡ標的配列を含む標的核酸の処理によって標的配列の複数のコピーを合成する。プライミングオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡポリメラーゼの使用によってプライマー伸長反応中で伸長して、標的配列に相補的なＤＮＡプライマー伸長産物を得る。このＤＮＡプライマー伸長産物は、結合分子によって決定され、標的配列の５’末端に相補的な３’末端を有する。次いで、本方法は、標的配列を選択的に分解する酵素の使用によって標的配列由来のＤＮＡプライマー伸長産物を分離し、ＤＮＡプライマー伸長産物の３’領域とハイブリッド形成し、プロモーターオリゴヌクレオチド：ＤＮＡプライマー伸長産物ハイブリッドを形成する、第１の領域、および第１の領域に対して５’側に存在するＲＮＡポリメラーゼのプロモーターである第２の領域から構成されるプロモーターオリゴヌクレオチドでＤＮＡプライマー伸長産物を処理する。ここで、プロモーターオリゴヌクレオチドは、プロモーターオリゴヌクレオチドからのＤＮＡ合成の開始を防止するように改変されている。本方法は、プロモーターオリゴヌクレオチド：ＤＮＡプライマー伸長産物ハイブリッド中のＤＮＡプライマー伸長産物の３’末端を伸長してプロモーターオリゴヌクレオチドの第２の領域に相補的な配列を付加し、これを使用し、プロモーターを認識して転写を開始するＲＮＡポリメラーゼを使用して、ＤＮＡプライマー伸長産物に相補的な複数のＲＮＡ産物を転写する。この方法により、標的配列と実質的に同一のＲＮＡ転写物が産生される。
【００２９】
１プライマー転写媒介増幅方法の実施形態は、標的配列の３’部分中の位置でのプライマーおよび標的配列の５’部分中の位置での３’遮断オリゴマー（すなわち、結合分子）の標的ＲＮＡとのハイブリッド形成によってＲＮＡ標的配列の複数のコピーを合成する。次いで、ＲＴのＤＮＡポリメラーゼ活性により、プライマーの３’末端からの伸長が開始されて、テンプレート鎖を有する二重鎖（ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二重鎖）中でｃＤＮＡを産生する。結合した３’遮断オリゴマーがこの位置を超えるｃＤＮＡの伸長を妨害するので、３’遮断オリゴマーは、増幅すべき配列の意図する５’末端に隣接する位置で標的鎖に結合する。すなわち、伸長産物が標的鎖に結合した遮断分子に到達した場合に重合工程を停止するので、ｃＤＮＡの３’末端は結合分子の位置によって決定される。ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二重鎖を、ＲＮＡを分解するＲＮアーゼ活性（ＲＴのＲＮアーゼＨ）によって分離するが、当業者は任意の鎖分離形態を使用することができることを認識しているであろう。プロモータープロバイダーオリゴマーは、ＲＮＡポリメラーゼのための５’プロモーター配列およびハイブリッド形成するｃＤＮＡの３’領域中の配列に相補的な３’配列を含む。プロモータープロバイダーオリゴマーは、プロモータープロバイダーオリゴマーの３’末端からのＤＮＡ合成の開始を防止するための遮断部分を含む修飾３’末端を有する。ｃＤＮＡとハイブリッド形成するプロモータープロバイダーでできた二重鎖では、ｃＤＮＡの３’末端をＲＴのＤＮＡポリメラーゼ活性の使用によって伸長し、プロモータープロバイダーオリゴマーはｃＤＮＡの３’末端にプロモーター配列を付加するためのテンプレートとしての機能を果たし、それにより、プロモータープロバイダーオリゴマー上の配列およびプロモータープロバイダーテンプレートから作製された相補ｃＤＮＡ配列から構成される機能的二本鎖プロモーターを作製する。プロモーター配列に特異的なＲＮＡポリメラーゼは、機能的プロモーターに結合し、ｃＤＮＡに相補的であり、且つ最初の標的ＲＮＡ鎖の標的配列と実質的に同一である複数のＲＮＡ転写物を転写する。得られた増幅ＲＮＡは、プライマーの結合およびさらなるｃＤＮＡ産生のためのテンプレートとしての機能を果たすことによってこの過程を再度循環し、最終的に、サンプル中に存在する最初の標的核酸から多数のアンプリコンを産生することができる。１プライマー転写関連増幅法の実施形態は、結合分子としての機能を果たす３’遮断オリゴマーを使用する必要がなく、結合分子が含まれない場合、プライマーから作製されたｃＤＮＡ産物は、中間体３’末端を有するが、増幅は実質的に上記のように進行する。この増幅方法の性質のために、この増幅方法を、実質的に等温の条件下で行う（すなわち、ＰＣＲベースの方法で使用されるような鎖を分離するか、プライマーをハイブリッド形成させるためのインキュベーション温度の上昇および低下のサイクルを使用しない）。
【００３０】
増幅産物の検出を、任意の公知の方法の使用によって行うことができる。例えば、増幅核酸を表面に会合させて、検出可能な物理的変化（例えば、電位変化）を得ることができる。増幅核酸を、液相中で検出するか、マトリックス中またはマトリックス上での増幅核酸の濃縮および増幅核酸と会合した標識の検出（例えば、臭化エチジウムまたはサイバーグリーンなどの挿入剤）によって検出することができる。他の検出方法は、増幅産物中の配列に相補的なプローブを使用し、プローブ：産物複合体の存在を検出するか、プローブ複合体を使用して増幅産物から検出されたシグナルを増幅する（例えば、Ｈｏｇａｎらに付与された米国特許第５，４２４，４１３号および同第５，４５１，５０３号、Ｕｒｄｅａらに付与された米国特許第５，８４９，４８１号）。他の検出方法は、標識プローブが増幅産物に結合した場合に限ってシグナルが変化することによりシグナル産生が標的配列の存在に関連する、プローブを使用する（分子ビーコン、分子トーチ、ハイブリッド形成スイッチプローブなど）（例えば、Ｌｉｚａｒｄｉらに付与された米国特許第５，１１８，８０１号および同第５，３１２，７２８号，Ｔｙａｇｉらに付与された米国特許第５，９２５，５１７号および同第６，１５０，０９７号，Ｂｅｃｋｅｒらに付与された米国特許第６，８４９，４１２号、同第６，８３５，５４２号、同第６，５３４，２７４号、および同第６，３６１，９４５号、Ｂｅｃｋｅｒらの米国特許出願公開第２００６／００６８４１７（Ａ１）号、およびＡｒｎｏｌｄらの米国特許出願公開第２００６／０１９４２４０（Ａ１）号）。かかるプローブは、典型的には、プローブの一方の末端に結合している標識（例えば、フルオロフォア）、およびプローブが１つの高次構造中に存在する（「閉じている（ｃｌｏｓｅｄ）」）（増幅産物とハイブリッド形成していないことを示す）場合に標識からのシグナル産生を阻害する、プローブの別の位置に結合している相互作用化合物（例えば、クエンチャー）を使用するが、プローブが増幅産物とハイブリッド形成する（その高次構造が変化する（「開く」））場合に検出可能なシグナルが産生される。増幅産物と特異的に会合する直接または間接的に標識されたプローブ由来のシグナルの検出は、増幅した標的核酸の存在を示す。
【００３１】
特異的結合対（または結合パートナー）のメンバーは、相互に特異的に認識して結合する部分である。メンバーを、第１の結合対メンバー（ＢＰＭ１）および第２の結合対メンバー（ＢＰＭ２）と呼ぶことができ、これらは、相互に特異的に結合する種々の部分を示す。特異的結合対の例は、受容体およびそのリガンド、酵素およびその基質、補因子、または補酵素、抗体またはＦａｂフラグメントおよびその抗原またはリガンド、糖およびレクチン、ビオチンおよびストレプトアビジンまたはアビジン、リガンドおよびキレート剤、タンパク質またはアミノ酸およびその特異的結合金属（ヒスチジンおよびニッケルなど）、実質的に相補的なポリヌクレオチド配列（完全にまたは部分的に相補的な配列が含まれる）および相補的ホモポリマー配列である。特異的結合対は、天然に存在するもの（例えば、酵素および基質）、合成のもの（例えば、合成受容体および合成リガンド）、または天然に存在するＢＰＭおよび合成ＢＰＭの組み合わせであり得る。
【００３２】
標的捕獲は、サンプル混合物の他の成分（細胞フラグメント、オルガネラ、タンパク質、脂質、炭水化物、または他の核酸など）からの標的核酸の選択的分離をいう。標的捕獲系は、特異的であり、例えば、意図する標的核酸に特異的な配列の使用によって他のサンプル成分から所定の標的核酸を選択的に分離することができるか、非特異的であり、標的の他の特徴（例えば、物理的特徴を示さない他のサンプル成分と標的核酸を区別する標的核酸の他の性質）の使用によって他のサンプル成分から標的核酸を選択的に分離することができる。好ましい標的捕獲方法および組成物は、以前に詳述されている（Ｗｅｉｓｂｕｒｇらに付与された米国特許第６，１１０，６７８号および同第６，５３４，２７３号ならびにＢｅｃｋｅｒらの米国特許出願第１１／８３２，３６７号）。好ましい標的捕獲実施形態は、液相中の捕獲プローブおよび支持体に結合した固定プローブを使用し、標的核酸と複合体を形成し、他の成分から捕獲標的を分離する。
【００３３】
捕獲プローブは、相補核酸配列であり得る結合対メンバーの使用によって標的核酸および固定プローブを連結する少なくとも１つの核酸オリゴマーをいう。１つの捕獲プローブ実施形態は、非特異的に標的核酸に結合し、サンプルからの分離のための支持体と連結するのに対して、別の実施形態は、例えば、特異的結合対相互作用によって標的核酸中の配列に特異的に結合する標的特異的（ＴＳ）配列および固定プローブに結合する固定プローブ結合領域を含む。ＴＳ配列および固定プローブ結合領域の両方が核酸配列である実施形態では、これらは共有結合によって連結されていても、１つ以上のリンカーによって連結された異なるオリゴヌクレオチド上にあってもよい。固定プローブは、支持体に結合した部分をいい、この部分は、例えば、特異的結合対（非核酸結合（例えば、アビジンのビオチンとの結合）および核酸配列ハイブリッド形成が含まれる）の連結メンバーによって、支持体に捕獲プローブを直接または間接的に連結する。固定プローブには、非結合物質（標的捕獲反応混合物中の他のサンプル成分および／または他のオリゴヌクレオチドなど）からの結合標的の分離を促進するために支持体に結合したオリゴヌクレオチドが含まれる。標的捕獲（ＴＣ）複合体には、標的核酸中の配列と特異的にハイブリッド形成する捕獲プローブのＴＳ配列および支持体上の固定プローブに結合した捕獲プローブの固定プローブ結合領域が含まれる。
【００３４】
支持体は、溶液中に分散したマトリックスまたは粒子などの公知の材料をいい、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリラート、混合ポリマー、ポリスチレン、シラン、金属、またはポリプロピレンで作製され得る。好ましい支持体は、磁気的に引き付けられる粒子（例えば、一貫した結果を得るために一定サイズ±５％の単分散磁性球体）である。支持体に固定プローブを直接（共有結合、キレート化、またはイオン相互作用を介する）または間接的に（１つ以上のリンカーを介する）連結して、標的捕獲反応で使用した条件下で支持体に固定プローブを安定に結合する。
【００３５】
分離または精製は、混合物中の１つ以上の他の成分からの混合物（サンプルなど）の１つ以上の成分の取り出しである。サンプル成分には、細胞フラグメント、タンパク質、炭水化物、脂質、および他の化合物を含み得る一般に水性液相中の核酸が含まれる。好ましい実施形態は、混合物中の他の成分から標的核酸の少なくとも７０％〜８０％、より好ましくは約９５％を分離または取り出す。
【００３６】
標識は、検出することができるか検出可能な反応を導くことができる分子部分または化合物をいい、この標識を核酸プローブに直接または間接的に連結することができる。直接標識は、標識およびプローブを連結するための結合または相互作用を使用することができる。この結合または相互作用には、共有結合、非共有相互作用（水素結合、疎水性相互作用、およびイオン性相互作用）、またはキレートもしくは配位錯体が含まれる。間接標識は、直接または間接的に標識され、シグナルを増幅することができる架橋部分またはリンカー（例えば、抗体、オリゴマー、または他の化合物）を使用することができる。標識には、任意の検出可能な部分（例えば、放射性核種、リガンド（ビオチン、またはアビジン）、酵素、酵素基質、反応基、発色団（検出可能な色素、粒子、またはビーズ）、フルオロフォア、または発光性化合物（生物発光標識、リン光標識、または化学発光標識））が含まれる。好ましい化学発光標識には、アクリジニウムエステル（「ＡＥ」）およびその誘導体が含まれる（米国特許第５，６５６，２０７号、同第５，６５８，７３７号、および同第５，６３９，６０４号）。好ましい標識は、非結合形態から結合形態の物理的分離を必要とせずに、混合物中の結合標識プローブが非結合標識プローブと比較して検出可能な変化（例えば、安定性または分解の相違）を示す均一系アッセイ中で検出可能である（例えば、米国特許第５，２８３，１７４号、同第５，６５６，２０７号、および同第５，６５８，７３７号）。標識の合成方法、核酸への標識の結合方法、および標識の検出方法は周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９），Ｃｈａｐｔ．１０；米国特許第５，６５８，７３７号、同第５，６５６，２０７号、同第５，５４７，８４２号、同第５，２８３，１７４号、および同第４，５８１，３３３）。
【００３７】
アレイは、二次元形式または三次元形式に配置された複数の成分をいい、これは、類似の方法または同一の方法の工程を上記成分に対して実質的同時に実施することを可能にする。アレイの例は周知であり、所定の構成で支持体に結合した１０〜数千個のオリゴヌクレオチドを含む高密度マイクロアレイまたは遺伝子チップが含まれる。かかるアレイにより、同一条件下で異なる位置における全てのオリゴヌクレオチドに対してアッセイ工程（例えば、アレイに適用したサンプル中の核酸のハイブリッド形成または特異的配列の検出）を実施することが可能である。
【００３８】
サンプルは、目的の分析物を含み得る検体をいい、例えば、微生物、ウイルス、遺伝子などの核酸、またはその成分であり、分析物中または分析物に由来する核酸配列を含む。サンプルは、任意の供給源（生物検体または環境供給源など）に由来し得る。生物検体には、分析物または分析物中の、もしくは分析物に由来する核酸を含み得る、生きている生物または死んでいる生物に由来する任意の組織または物質が含まれる。生物サンプルの例には、呼吸組織、滲出液（例えば、気管支肺胞洗浄液）、生検、痰、末梢血、血漿、血清、リンパ節、胃腸組織、糞便、尿、または他の流動物、組織、もしくは材料が含まれる。環境サンプルの例には、水、氷、土壌、スラリー、デブリ、バイオフィルム、浮遊微小粒子、およびエアゾールが含まれる。サンプルは、濾過、遠心分離、沈殿、または媒体（マトリックスまたは支持体など）への接着の使用などによるサンプルの処理から得た処理済み検体または材料であり得る。サンプルの他の処理には、他の成分（酵素、緩衝液、塩、および界面活性剤など）を含み得る溶液中に核酸を含む細胞内成分を放出するために組織、細胞凝集体、または細胞を物理的または機械的に破壊する処理が含まれ得る。
【００３９】
「本質的に〜からなる」を、本明細書中に記載のユニバーサル配列およびＴＳ配列を使用する等温増幅方法の基本的および新規の特徴を実質的に変化させないさらなる成分、組成物、または方法工程を組成物または方法に含めることができることを意味するために使用する。かかる特徴には、ＴＳＵオリゴヌクレオチドの構造（本明細書中に記載の複数のＴＳＵオリゴヌクレオチドの複合体が含まれる）、ならびに１つ以上のユニバーサル配列の各標的配列との会合、実質的に等温のｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下での分析物または標的核酸の代替物としての機能を果たす少なくとも１つのユニバーサル配列の増幅、およびアッセイしたサンプル中の少なくとも１つの分析物の存在を示すためのユニバーサル配列の増幅に起因する応答の検出による、サンプル中の１つ以上の分析物または標的核酸を検出するための方法の能力が含まれる。特許請求の範囲に記載の組成物および／または方法の基本的特徴に実質的効果を及ぼす任意の成分、組成物、または方法工程は、この用語から外される。
【００４０】
開示の方法の好ましい実施形態は、一般に転写関連増幅法と呼ばれる等温増幅系の態様を使用し、この増幅法は以前に詳述されている（Ｋａｃｉａｎらに付与された米国特許第５，３９９，４９１号および同第５，５５４，５１６号；Ｂｕｒｇらに付与された米国特許第５，４３７，９９０号；ＧｉｎｇｅｒａｓらのＰＣＴ番号ＷＯ８８／０１３０２号およびＷＯ８８／１０３１５号；Ｍａｌｅｋらに付与された米国特許第５，１３０，２３８号；Ｕｒｄｅａらに付与された米国特許第４，８６８，１０５号および同第５，１２４，２４６号；ＲｙｄｅｒらのＰＣＴ番号ＷＯ９５／０３４３０号；およびＢｅｃｋｅｒらの米国特許出願公開第２００６／００４６２６５（Ａ１）号）。例には、転写媒介増幅（ＴＭＡ）および核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）が含まれる。典型的には、転写関連増幅は、ＲＮＡポリメラーゼを使用して、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、プロモーター配列を含むテンプレート相補増幅オリゴヌクレオチド、および任意に、プライマーとしての機能を果たし得る１つ以上の他のオリゴヌクレオチドを使用する一連の工程の使用によって核酸テンプレートから複数のＲＮＡ転写物を産生する。好ましい開示の実施形態は、ＴＭＡ（米国特許第５，３９９，４９１号および同第５，５５４，５１６号）または１プライマー転写関連増幅（米国特許出願公開第２００６／００４６２６５（Ａ１）号）に基づくが、当業者は、オリゴヌクレオチド配列のポリメラーゼ媒介伸長に基づく他の増幅方法を本明細書中に記載の組成物および／または方法工程と共に使用することができることを理解しているであろう。
【００４１】
本明細書中に開示の方法は、ユニバーサル転写関連増幅反応において３つの基本工程を使用する。第１に、標的捕獲（ＴＣ）工程は、１つ以上のＴＳＵプライマー（連結複合体で存在し得る）を標的核酸とハイブリッド形成すること、ならびに混合物から標的およびプライマーを含むハイブリッド形成複合体を捕獲し、他のサンプル成分から標的核酸を分離することを含む。標的捕獲混合物は、複数のＴＳＵプライマーを含むことができ、このプライマーの各型は、サンプル混合物中に存在し得る異なる標的核酸に特異的である。ＴＣ工程中、サンプル混合物中に存在する標的核酸に特異的なＴＳＵプライマーのみが標的に結合し、その後の増幅工程に供される。これは、サンプル中に存在しない他の標的に特異的なＴＳＵプライマーは液相に残存し、捕獲された標的核酸を使用して増幅を開始する前に破棄されるか他のサンプル成分と共に洗い流されるからである。したがって、増幅中に供給源を妨害または競合し得る外来オリゴヌクレオチドを、増幅工程の開始前に除去する。捕獲標的−ＴＳＵプライマー複合体を、増幅の第１期および第２期として記載される等温増幅反応で使用する。第１の増幅期では、最初の工程は、酵素的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成によって標的核酸鎖に結合したＴＳＵプライマーを伸長し、このことは、ＴＳＵプライマーのユニバーサル配列領域を、テンプレートとしての機能を果たす標的鎖から作製した最初のアンプリコンに連結する。例えば、標的鎖がＲＮＡである場合、ＴＳＵプライマーはＲＮＡとハイブリッド形成し、ＴＳＵプライマー上に存在するＵ配列を含むｃＤＮＡ鎖の合成のための開始部位としての機能を果たす。第２の増幅期では、反応におけるその後の合成工程は、最初の期において産物に組み込まれたＵ配列を含む最初のアンプリコンを使用し、そして、ユニバーサル配列とハイブリッド形成し、かつアンプリコンのテンプレートとしての使用によって酵素的に伸長されるユニバーサルプライマーの使用によって最初およびその後のアンプリコンを増幅する。いくつかの実施形態では、２つのユニバーサル配列を、等温増幅反応の最初の増幅産物に導入し、このユニバーサル配列は相補ユニバーサル配列を含むプライマーを使用するその後の増幅の標的であり、それにより、捕獲された標的配列からより多数のアンプリコンが作製される。他の実施形態では、１つのユニバーサル配列を最初の増幅産物に導入し、第２の増幅期工程で、プライマーは導入されたユニバーサル配列に特異的なユニバーサル配列を有するプライマー、および標的核酸鎖または相補鎖中に含まれる配列に特異的な別の標的特異的プライマー（ＴＳＰ）を含む。いくつかの実施形態では、標的鎖およびＴＳＵプライマーを含む捕獲されたハイブリッド形成複合体と混合する試薬中にユニバーサルプライマーを提供し、この試薬により、第２期のｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成で使用される１つ以上の他の成分（例えば、ヌクレオチド三リン酸、酵素、および補因子など）も得られる。
【００４２】
ユニバーサル転写関連増幅方法の好ましい実施形態で使用するオリゴヌクレオチドを開示し、これらには、以下が含まれる：（１）標的特異的捕獲オリゴマー（捕獲プローブということができる）、（２）標的特異的ユニバーサル（ＴＳＵ）プロモータープライマーまたはＴＳＵプロモータープロバイダー、（３）標的特異的ユニバーサル（ＴＳＵ）非プロモータープライマー、（４）リンカーオリゴヌクレオチド（Ｓ−オリゴヌクレオチドということができ、これは、複合体中のＴＳＵプライマーを連結するのに役立ち、１つのＴＳＵオリゴヌクレオチドの一部を介して標的鎖とハイブリッド形成する）、（５）ユニバーサルプロモータープライマー（ＵＰ１ということができる）、および（６）ユニバーサル非プロモータープライマー（ＵＰ２ということができる）。
【００４３】
いくつかの実施形態では、２つのＴＳＵプライマーを互いに複合体に連結し、次いで、標的鎖上の相補配列とのＴＳＵプライマー中のＴＳ配列のハイブリッド形成の使用によって標的鎖にハイブリッド形成する。かかるＴＳＵプライマーの連結を、連結オリゴヌクレオチドとのＴＳＵプライマーのハイブリッド形成によって媒介することができる。この連結オリゴヌクレオチドは、連結オリゴヌクレオチドが３オリゴヌクレオチド複合体中の２つのＴＳＵプライマーと非共有結合する場合に、その蛇行形態によって、時折Ｓ−オリゴヌクレオチドと呼ばれる。Ｓ−オリゴヌクレオチドの第１の末端配列は第１のＴＳＵプライマーの一部に相補的であり、これとハイブリッド形成し、Ｓ−オリゴヌクレオチドの第２の配列は第２のＴＳＵプライマーの一部に相補的であり、これとハイブリッド形成する。いくつかの実施形態では、ＴＳＵプロモータープライマー配列を、Ｓ−オリゴヌクレオチドリンカーを使用することなく、ＴＳＵ非プロモータープライマー配列に連結することができる。例えば、ＴＳＵプロモータープライマー配列およびＴＳＵ非プロモータープライマー配列を、介在スペーサーオリゴヌクレオチド配列または非ヌクレオシド共有結合リンカー化合物などの使用によって、両方の機能的配列が直接または間接的に共有結合された１つのオリゴヌクレオチドとして合成することができる。他の実施形態では、２つのＴＳＵオリゴヌクレオチド配列を、個別のオリゴヌクレオチドとして合成し、その後に、例えば、ランダムリンカー配列の使用によって直接または間接的に相互にライゲーションすることによって相互に共有結合することができる。複数のＴＳＵオリゴヌクレオチドを複合体に非共有結合する実施形態では、これらを、個別のオリゴヌクレオチドとして合成し、次いで、例えば、支持体に結合した結合対メンバーを介して１つの支持体に連結することができるか、個別のＴＳＵオリゴヌクレオチドは、直接ハイブリッド形成して２つの機能的ＴＳＵオリゴヌクレオチドを複合体に連結する相補配列を含むことができる。例えば（以下の「実施形態ａ」に示す）、第１のＴＳＵオリゴヌクレオチドを、５’→３’方向に、５’プロモーター配列（Ｐ）、中央のユニバーサル配列（Ｕ１）、および３’標的特異的配列（ＴＳ１）を含むように合成し、第２のＴＳＵオリゴヌクレオチドを、プロモーター配列に相補的な５’配列（Ｐ’）、中央のユニバーサル配列（Ｕ２）、および３’標的特異的配列（ＴＳ２）を含むように合成する。あるいは（「実施形態ｂ」に示す）、第２のＴＳＵオリゴヌクレオチドは、Ｕ２配列を含まずに、プロモーター配列に相補的な５’配列（Ｐ’）および３’標的特異的配列（ＴＳ２）を含むことができる。２つのＴＳＵオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成条件下で混合する場合、これらは、以下に図示したＴＳＵオリゴヌクレオチドの直接ハイブリッド形成（ＤＨ）複合体を形成する（式中、縦線（｜｜｜）は、相補的なＰ配列およびＰ’配列のハイブリッド形成を示す）。
【００４４】
【化１】
0005980164.tif 000006
実施形態ａバージョンを、図１７に概略的に示す。これは、ハイブリッド形成複合体中に２つのＴＳＵオリゴヌクレオチドを示し、このハイブリッド形成複合体は、第１のＴＳＵプライマーのＴＳ１配列を介して標的鎖とハイブリッド形成し、ＴＳＵプライマーが相補的なＰ’およびＰ配列を介して遮断３’末端を有するＴＳＵプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドである第２のＴＳＵオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する。
【００４５】
あるいは、２つのＴＳＵプライマーを相互に複合体に共有結合し、次いで、標的鎖上の相補配列とのＴＳＵプライマー中のＴＳ配列のハイブリッド形成の使用によって、標的鎖とハイブリッド形成する。図１８は、かかる実施形態を示す。この実施形態は、非ヌクレオチドリンカー（−Ｃ９−Ｃ９−）を介して共有結合して複合体を形成する２つのＴＳＵオリゴヌクレオチドを示す。この複合体は、３’→５’方向に遮断３’末端、ＴＳ２、Ｕ２、およびプロモーター（Ｐ）配列を含むＴＳＵプロモータープロバイダーに連結した、５’→３’方向にＵ１およびＴＳ１配列を含むＴＳＵプライマーから構成される。この複合体により、複合体中でＴＳＵプライマーのＴＳ１配列を介して標的鎖とハイブリッド形成する１つの伸長可能な３’末端が得られる。図１８はまた、標的とハイブリッド形成したブロッカーオリゴヌクレオチドおよびそのＴＳ配列を介して標的とハイブリッド形成したＴＣプローブを示す。ＴＳＵプライマー複合体を作製するための共有結合プライマーを作製する多数の方法が想定される。例えば、２つの異なるオリゴ（プライマーおよびプロモータープライマーまたはプロバイダー）の合成後、アルデヒドヒドラジンカップリング対の使用によってカップリングする。他のカップリング対（例えば、カルボキシルおよびアミン）を使用し、標準的なカルボジイミド化学を使用して縮合することができる。共有結合したＴＳＵプライマー複合体の別の作製方法は、ＤＮＡ合成機による全複合体の構築を含む。例えば、ＴＳＵプライマーの標準的３’→５’合成、スペーサー（例えば、非ヌクレオチドリンカーまたはヌクレオチドリンカー（ポリＴなど））の組み込み、逆極性ホスホルアミダイトの使用によるＴＳＵプロモータープライマーまたはプロバイダーオリゴヌクレオチドの５’→３’合成、および３’ブロッカー構造の付加（例えば、３’→５’方向で付加したＣ）による合成の終了の使用による。他の代替法は、同一の基本的ストラテジーを使用するが、ＴＳＵ  Ｔ７  プロモータープライマーまたはプロバイダーオリゴヌクレオチドから開始し、非プロモーターＴＳＵプライマーで終了する。
【００４６】
増幅オリゴヌクレオチドの実施形態を、ＴＳＵオリゴヌクレオチドがハイブリッド形成複合体または複数の機能的配列領域の共有結合複合体を形成しない方法工程で使用することができる。すなわち、増幅オリゴヌクレオチドを、各オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの混合物として液相に提供することができ、液相中で各増幅オリゴヌクレオチドは、標的核酸と無関係な複数の増幅オリゴヌクレオチドの複合体の第１の形成を行わない方法工程で機能する。
【００４７】
いくつかの実施形態では、最初の増幅期でたった１つのＴＳＵオリゴヌクレオチドを、ユニバーサル（Ｕ）配列を含まない標的特異的プライマー（ＴＳＰ）と組み合わせて使用する。例えば、ＴＳＵプロモータープライマーまたはＴＳＵプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドをＴＳプライマーと組み合わせて使用することができるか、別の例では、ＴＳＵプライマーを、Ｕ配列を含まないプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドと組み合わせて使用することができる。すなわち、最初の増幅期でたった１つのＴＳＵオリゴヌクレオチドを使用して最初の期に作製されるアンプリコンにＵ配列を導入し、ＴＳプライマーを、標的鎖から作製される最初の相補鎖の酵素合成の開始点として使用するか、またはこれは、標的鎖から作製された鎖に相補的な鎖を作製するためのプライマーとしての機能を果たす。たった１つのＴＳＵオリゴヌクレオチドを使用する１つの実施形態では、ＴＳＵオリゴヌクレオチドによって導入されたユニバーサル配列に特異的な１つのユニバーサルプライマーを、第２の増幅期で使用する。すなわち、１つのユニバーサル配列は、第２の増幅期中、標的の代替物またはタグ配列としての機能を果たす。
【００４８】
ＴＳＵプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチド中のプロモーター配列がバクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーター配列である一定の実施形態では、ＴＳＵプロモータープライマーまたはプロバイダーを、「ＴＳＵ  Ｔ７プライマー」または「ＴＳＵ  Ｔ７プロバイダー」オリゴヌクレオチドということができ、これらを、ＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチド（「ＴＳＵ非Ｔ７プライマー」という）と区別することができる。Ｔ７プロモーター配列を含むユニバーサルプライマー（ＵＰ１）を「Ｔ７−ＵＰ１プライマー」ということができ、これらは、プロモーター配列を含まないユニバーサルプライマー（ＵＰ２）（「非Ｔ７−ＵＰ２プライマー」という）と区別される。
【００４９】
表１は、本明細書中に記載および例示のユニバーサル転写関連増幅方法の一定の実施形態で使用することができるオリゴヌクレオチドの種々の組み合わせをまとめている。アンプリコンを種々の手段（例えば、挿入化合物）によって検出することができるので、標的捕獲工程および増幅工程で使用されるオリゴヌクレオチドのみを表１に列挙する。これらの手段の全てがさらなるオリゴヌクレオチド（例えば、検出プローブ）を必要とするという訳ではないが、当業者は、１つ以上の検出プローブオリゴヌクレオチドをこれらの方法によって作製されたアンプリコンを検出する完全なアッセイ（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｓｓａｙ）で使用することができることを認識するであろう。簡潔にするために、表１は、最初の増幅期で１つの標的のためのプライマーとしての機能を果たす２つの増幅オリゴヌクレオチド（すなわち、それぞれ酵素的に伸長される３’末端を有する２つのオリゴヌクレオチド）を使用する転写媒介増幅方法をいうために「ＴＭＡ」を使用する。それに対して、１プライマー転写媒介増幅方法をいうために「ｒＴＭＡ」を使用する。この方法は、最初の期で各分析物のためのプライマーとしての機能を果たす（すなわち、酵素的に伸長する３’末端を有する）たった１つの増幅オリゴヌクレオチドを使用し、反応物中に含まれる他のオリゴヌクレオチドは反応物中で酵素的に伸長されない（米国特許出願公開第２００６／００４６２６５号を参照のこと）。
【００５０】
本明細書中に記載の増幅方法に含まれる組成物および工程の実施形態を、図によって説明する。
【００５１】
図１に関して、本明細書中に開示の方法で使用されるオリゴヌクレオチドを、概略的に示す。上部は、ハイブリッド形成複合体を示す。この複合体は、Ｓ−オリゴヌクレオチドに非共有結合したＴＳＵプロモータープライマー、このＳ−オリゴヌクレオチドに非共有結合しているＴＳＵ非プロモータープライマーから構成される。この複合体では、上に、５’プロモーター配列（Ｐ、実線）、中央のユニバーサル配列（Ｕ１（破線））、および３’標的特異的配列，（ＴＳ１（二重線））を含むようにＴＳＵプロモータープライマーを図示する。Ｓ−オリゴヌクレオチドをＳ状曲線（点線）で示し、これは、ＴＳＵプロモータープライマーのユニバーサル配列Ｕ１に相補的な配列Ｕ１’を含む５’領域およびＴＳＵ非プロモータープライマーのユニバーサル配列Ｕ２に相補的な配列Ｕ２’を含む３’領域を有する。ＴＳＵ非プロモータープライマーを複合体の下に図示し、これは、５’ユニバーサル配列（Ｕ２（破線））および３’標的特異的配列（ＴＳ２（二重線））を含む。ＴＳＵプライマーのユニバーサル配列とＳ−オリゴヌクレオチドの相補配列との間のハイブリッド形成によって複合体が形成される。ＴＳＵプライマーを含む複合体の下に、５’標的特異的領域（ＴＳ３（二重線））、および特異的結合対のメンバーである３’部分（三重線）を有するように図示した標的特異的捕獲オリゴヌクレオチドを示す。いくつかの実施形態では、この３’部分は、ホモポリマー核酸配列である。次に、５’プロモーター配列領域（実線）および３’ユニバーサル配列領域（Ｕ１（破線））を有するように図示したユニバーサルプロモータープライマー（ＵＰ１）を示す。次は、ユニバーサル配列（Ｕ２（破線））として示すユニバーサル非プロモータープライマー（ＵＰ２）の図である。
【００５２】
好ましい実施形態では、アッセイの実施に必要な付加工程数を最小にするために、最低限の試薬中に標的捕獲および増幅オリゴヌクレオチドを提供する。好ましい実施形態では、２つの試薬混合物を以下のように提供する。標的捕獲試薬（ＴＣＲ）と呼ばれる第１の試薬混合物では、ＴＳＵプライマー（例えば、ＴＳＵ−Ｔ７プライマーおよびＴＳＵ非Ｔ７プライマー）および所望の標的配列への特異的結合に必要な全ての補因子（例えば、標的核酸を含むサンプルと混合した場合のハイブリッド形成に適切な塩および緩衝液）が含まれる。ＴＣＲはまた、標的捕獲工程で使用される全てのオリゴヌクレオチド、例えば、所望の各標的に特異的な捕獲プローブまたは非特異的捕獲プローブ、標的核酸に結合した捕獲プローブを捕獲するための支持体、標的捕獲で使用される任意の媒介オリゴヌクレオチド（支持体上の固定プローブなど）を含む。増幅試薬（ＡＲ）と呼ばれる第２の試薬混合物により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸合成で使用される化合物（例えば、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ、ｄＮＴＰ）、塩、緩衝剤、酵素補因子、および酵素）に加えて、たった１組のユニバーサルプライマー、ユニバーサルプロモータープライマー、およびユニバーサル非プロモータープライマーを提供する。
【００５３】
使用時に、ＴＣＲを意図する標的核酸を含むサンプルと混合する。標的捕獲オリゴヌクレオチドおよびＴＳＵプライマーを含むＴＣＲは、全ての導入されたオリゴヌクレオチドに、サンプル中の意図する各標的核酸の各相補配列と同時に特異的にハイブリッド形成させることが可能である。サンプルと混合する第１の試薬中にＴＳＵプライマーおよび標的捕獲オリゴヌクレオチドを含めることにより、標的核酸、標的核酸とハイブリッド形成したＴＳＵプライマー、および標的核酸の別個の配列とハイブリッド形成した捕獲オリゴヌクレオチドから構成される複合体を形成する。次いで、複合体を支持体に結合し、その意図する標的核酸に結合しないプライマーを含む他のサンプル成分から分離し、それにより、増幅工程に供される核酸をその特異的ＴＳＵプライマーに既に連結した所望の標的に制限する。支持体に結合したか支持体から分離された分離複合体を合成のために必要な成分（例えば、ＮＴＰ、塩、緩衝剤）およびユニバーサルプライマーを含む増幅試薬と混合する場合、標的核酸はＴＳＵプライマーと既にハイブリッド形成しており、それにより、最初の合成が行われ、ユニバーサルプライマーに相補的なユニバーサル配列（すなわち、ユニバーサルプロモータープライマーおよびユニバーサル非プロモータープライマー）を含む産物が産生される。次いで、ユニバーサルプライマーは、最初の合成産物中に存在する相補ユニバーサル配列と直ちにハイブリッド形成し、それにより、反応混合物にプライマーのユニバーサル組を導入するさらなる工程を使用することなく増幅反応を継続することができる。ユニバーサルプライマーはまた、反応混合物への標的特異的配列の導入を排除し、この標的特異的配列は、他のプライマー配列と分子間または分子内で相互作用し、これにより、増幅反応のその後の合成工程で人工産物が生じ得る。
【００５４】
図２に図示した実施形態は、サンプル中の標的核酸のその各ＴＳＵプライマーおよびその各標的特異的捕獲オリゴヌクレオチドへの特異的結合を含むユニバーサル等温増幅方法の標的捕獲期を示す。図２の１．は、複数の異なるＴＳＵプライマー複合体（それぞれ、異なる標的ａ、ｂ、およびｃに特異的な標的特異的配列、ＴＳａ、ＴＳｂ、およびＴＳｃを含む）の混合物である標的捕獲試薬（ＴＣＲ）を示す。ＴＣＲはまた、ポリＡ配列として示す結合対の３’メンバーを有する各潜在的標的のための標的特異的捕獲オリゴヌクレオチドを含む。共に実質的に図１に示すように、ＴＳＵプライマー複合体を、Ｓ−オリゴヌクレオチドを介してＴＳＵ非プロモータープライマーに連結したＴＳＵプロモータープライマーとして示し、捕獲オリゴマーを実線およびポリＡ領域で示す。標的核酸に特異的なＴＳＵプライマー複合体および捕獲オリゴマーの各組について、標的特異的領域をＴＳａ、ＴＳｂ、またはＴＳｃと記す。ＴＣＲはまた、捕獲オリゴマーに特異的に結合する結合固定部分を有する支持体を含む（図２、３を参照のこと）。図２の２では、標的核酸（標的ａ）を含むサンプルをＴＣＲと混合して、ＴＳａ捕獲プローブの標的特異的配列を標的ａ中のその相補配列に結合させ、ＴＳＵプライマー複合体中のプロモータープライマーの標的特異的配列を標的ａ中のその相補配列に結合させる。ＴＳａ捕獲プローブのポリＡ配列は、支持体に結合した固定プローブのその相補ポリＴ配列に結合して、ＴＳａ  ＴＳＵプライマー複合体を有する捕獲された標的ａが支持体によって混合物から回収される（図２、３を参照のこと）。支持体上の固定複合体の分離後の標的捕獲工程の不要物は、非結合ＴＳＵプライマー複合体を含み（ＴＳＵｂおよびＴＳＵｃプライマー複合体、図２の４を参照のこと）、それにより、捕獲標的核酸が取り出され、これを次の増幅過程で使用する。
【００５５】
図３は、ＴＳＵプライマー複合体（図２（３）などに示している）を詳細に示している。標的鎖は捕獲複合体中に存在し、捕獲複合体は、標的鎖、相補標的配列（ＴＳ３’）と特異的にハイブリッド形成する５’標的特異的配列（ＴＳ３）および３’ポリＡ配列を含む捕獲プローブから構成され、３’ポリＡ配列が支持体に結合した相補ポリＴ配列である固定プローブとハイブリッド形成することを示している。縦線（｜｜｜｜｜）を使用して、いくつかの相補配列領域の間のハイブリッド形成を示す。標的鎖はまた、標的のＴＳ１’配列領域とＴＳＵプライマー複合体中のＴＳＵプロモータープライマーの相補標的特異的配列領域（ＴＳ１）との間のハイブリッド形成によってＴＳＵプライマー複合体に結合する。ＴＳＵプライマー複合体は、３’遮断末端
【化６】
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を有するＳ−オリゴヌクレオチドの相補Ｕ２’配列領域とそのＵ２配列領域でハイブリッド形成したＴＳＵ非プロモータープライマーから構成され、Ｓ−オリゴヌクレオチドの５’領域は、５’プロモーター配列領域（Ｐ）および３’ＴＳ１領域を含むＴＳＵプロモータープライマー中の相補Ｕ１配列領域とそのＵ１’配列領域でハイブリッド形成している。標的鎖は、ＴＳＵ非プロモータープライマーの標的特異的配列領域（ＴＳ２）と同一である標的特異的配列領域（ＴＳ２）を含む。標的鎖の全ての標的特異的領域（ＴＳ１’、ＴＳ２、およびＴＳ３’）は、標的鎖中の独立した配列である。
【００５６】
図４は、図３に示す実施形態に類似のＴＳＵプライマー複合体の好ましい実施形態を示す。上の鎖は、３’ＴＳ２領域および５’ユニバーサル配列領域（Ｕ２（＋））から構成されるＴＳＵ非プロモータープライマーであり、これはＳ−オリゴヌクレオチドの３’相補Ｕ２’配列領域とハイブリッド形成し、このＳ−オリゴヌクレオチドは３’−３’Ｃ結合から構成される３’遮断末端を有する。Ｓ−オリゴヌクレオチドは、脱塩基スペーサーを含む。脱塩基スペーサーは３’Ｕ２’配列領域を５’Ｕ１’配列領域に連結し、５’Ｕ１’配列領域はＴＳＵプロモータープライマー中のＵ１（−）配列領域に相補的であり、これとハイブリッド形成する。ＴＳＵプロモータープライマーは、内部Ｕ１領域に隣接する５’プロモーター配列（Ｐ）および３’標的特異的配列領域（ＴＳ１）を含む。このＳ−オリゴヌクレオチド型の好ましい実施形態は、スペーサーとして、隣接するＵ１’配列およびＵ２’配列と共有結合する脱塩基化合物（例えば、（Ｃ９）２または（Ｃ９）３）を含む。
【００５７】
図２は３つのみの異なるＴＳＵプライマー複合体および捕獲プローブ（標的ａ、ｂ、およびｃについてそれぞれＴＳＵａ、ＴＳＵｂ、およびＴＳＵｃと標識）、ならびに１つのみの標的核酸（標的ａ）を示しているが、多数の異なるＴＳＵ複合体および捕獲オリゴヌクレオチド（それぞれ、その各標的核酸に特異的）をＴＣＲ中に含むことができると認識されるであろう。サンプルは、多数の異なる標的核酸を含むことができ、その全てを、他のサンプル成分から選択的に取り出すことができる。したがって、ＴＣＲ中にさらなるＴＳＵプライマー複合体およびプローブを含めるが、実質的に同一の図２に示す工程を使用することにより、結合したＴＳＵプライマーおよびそれぞれその各標的に特異的に結合した捕獲オリゴヌクレオチドを有する１つ以上の異なる標的を、１つ以上の標的−プライマー複合体に選択的に結合する１つ以上の支持体の使用によって混合物から分離することができる。例えば、標的特異的捕獲プローブに選択的に結合する異なる固定プローブをそれぞれ含む異なるサイズの粒子を支持体として使用することができ、その結果、１つのサンプル中に存在する所望の各標的を、その結合した捕獲標的およびＴＳＵプライマー複合体を有する支持体のサイズ分離によって選択的に取り出すことができる。図２は、固定ポリＴ配列とハイブリッド形成するためのポリＡ領域を含む捕獲プローブを示すが、当業者は、任意の特異的結合対のメンバーを使用して標的核酸を支持体に捕獲することができ、異なる結合対メンバーを使用して複合体サンプル混合物から異なる標的を選択的に単離することができることを認識するであろう。例えば、図２に関して、標的ａに特異的なＴＳＵａプライマー複合体を、受容体ａのリガンドを含むＴＳａ捕獲プローブの使用によって混合物から分離することができる。この受容体ａは、固定プローブとして支持体に会合する。例えば、全て１つのサンプル中に含まれる標的ａ、ｂ、およびｃを、その各ＴＳＵプライマーと会合させ、特異的結合対パートナー（それぞれＢＰＭａ２、ＢＰＭｂ２、およびＢＰＭｃ２）を介して固定プローブに結合する捕獲プローブ上の結合対メンバー（ＢＰＭ）（それぞれ、ＢＰＭａ１、ＢＰＭｂ１、およびＢＰＭｃ１）の異なる組み合わせの使用によって他のサンプル成分から分離することができ、支持体に会合した第２の結合対パートナーによって決定された１つ以上の標的ための全ての同一の支持体またはこれらに特異的な支持体のいずれかに対して標的を個々に捕獲する。例えば、アビジンのＢＰＭａ１に会合した標的ａの捕獲プローブは、第１の支持体に結合したビオチンのＢＰＭａ２を有する固定プローブの使用によってサンプルから標的ａを選択的に取り出すのに対して、同一ＴＣＲ中で、標的ｂの捕獲プローブをＦａｂフラグメントのＢＰＭｂ１と会合させ、第２の支持体に結合したＦａｂフラグメントのリガンドのＢＰＭａ２を有する固定プローブの使用によって標的ｂを選択的に取り出す。この場合、第１および第２の支持体は、標準的な方法によって分離可能である。所望の標的核酸を含む結合複合体を有する支持体を、混合物中の他の成分（他のサンプル成分（細胞デブリ、オルガネラ、タンパク質、脂質、炭水化物、他の核酸など）が含まれる）ならびに非結合プライマーおよび捕獲プローブから分離することができる。任意の種々の周知の方法を使用して、例えば、遠心分離、濾過、重力分離、磁性物質の磁気選別（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）、および吸引などによって結合複合体を有する支持体を混合物中の他の成分から分離することができる。したがって、非結合オリゴヌクレオチドが標的捕獲期中に標的から分離されるので、標的捕獲後、その各標的に結合したＴＳＵプライマーのみをアッセイの増幅期に移行させる。さらなる洗浄工程を標的捕獲期に含めて、結合標的およびプライマー複合体を有する支持体を洗浄し、それにより、増幅期前に他のサンプル成分および非結合オリゴヌクレオチドから結合ＴＳＵプライマーを有する捕獲標的核酸をさらに精製することができる。
【００５８】
次に、意図する標的核酸に特異的なＴＳＵプライマー（すなわち、その対応するＴＳＵプライマーとのハイブリッド形成によって連結した標的核酸鎖を含む捕獲複合体を有する増幅混合物に移行されるプライマー）の使用によって増幅を開始する。いくつかの好ましい実施形態では、増幅期に移行されたＴＳＵプライマーは、意図する標的のためのＴＳＵプロモータープライマー、Ｓ−オリゴヌクレオチド、およびＴＳＵ非プロモータープライマーから構成されるＴＳＵプライマー複合体中に存在する（図１および図２を参照のこと）。サンプルに存在せず、それにより捕獲されない他の分析物に特異的な他のＴＳＵプライマーを標的捕獲段階で破棄するので、これらは増幅反応混合物に実質的に存在しない。したがって、増幅中の最初の合成工程は、最初の増幅期中に存在する意図する標的核酸に特異的に結合したＴＳＵプライマーに依存する。ＴＳＵプライマーはその意図する標的核酸配列に既に特異的に連結しているので、他の反応成分（例えば、酵素および補因子、合成基質）を捕獲標的およびその結合したＴＳＵプライマーまたはプライマー複合体と混合する場合に増幅が効率的に開始される。ＴＳＵプロモータープライマーの３’末端は、図５に示すように合成的に伸長する。この図５は、最初の増幅期の第１の合成工程に起因する産物を示す。この工程において、そのＴＳ１配列で標的鎖のＴＳ１’配列とハイブリッド形成したＴＳＵプロモータープライマーの３’末端を合成的に伸長して第１のｃＤＮＡ鎖を作製する。簡潔にするために、ＴＳＵプライマー複合体（Ｓ−オリゴヌクレオチドおよびＴＳＵ非プロモータープライマー）の他の成分を図５に示していないが、この合成工程中に全ＴＳＵプライマー複合体をＲＮＡテンプレート鎖に結合することができると理解されるであろう。ＲＮＡテンプレート鎖上のＴＳＵプロモータープライマーから開始する合成は、増幅反応混合物中に供給した逆転写（ＲＴ）酵素のＲＮＡ指向ＤＮＡポリメラーゼを使用して、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鎖を合成する。好ましいＲＴは、ＲＮＡ標的／テンプレート鎖を分解するためのＲＮアーゼＨ活性を含むＲＴであるが、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮＡ分解活性を増幅反応混合物中に異なる酵素によって供給することができる。合成されたｃＤＮＡ鎖は、標的／テンプレート鎖中のＴＳ２配列に相補的な配列ＴＳ２’を含む。ｃＤＮＡの合成後、ＲＮＡテンプレート鎖の分解は、反応混合物中のＲＮアーゼＨ活性から生じ、それにより、５’プロモーター配列、Ｕ１配列、およびＴＳ１配列（全てＴＳＵプロモータープライマーによって供給される）、ならびにＲＮＡテンプレート鎖に相補的な配列を含む３’配列（ＴＳ１、Ｕ１、およびＰ配列の３’であるＴＳ２’配列が含まれる）を含む一本鎖ＤＮＡが得られる。この得られたｃＤＮＡ鎖を、図６に示す。
【００５９】
次いで、第１のｃＤＮＡ鎖は、ｃＤＮＡのＴＳ２’配列とＴＳＵ非プロモータープライマー（これは捕獲標的核酸に結合したＴＳＵプライマー複合体の一部として増幅反応混合物に供された）の相補ＴＳ２配列との間のハイブリッド形成によってＴＳＵ非プロモータープライマーに結合する。好ましい実施形態では、等温増幅条件は、最初のｃＤＮＡ合成工程中にＴＳＵプライマー複合体中にＴＳＵ非プロモータープライマーを維持し（すなわち、Ｓ−オリゴヌクレオチドを介してＴＳＵプロモータープライマーに連結）、次いで、複合体中のＴＳＵ非プロモータープライマーの３’ＴＳ２部分がｃＤＮＡとハイブリッド形成する。かかる実施形態は分子内ハイブリッド形成として実質的に行うハイブリッド形成の効率的な動態学を使用するので有利である。これは、ｃＤＮＡに連結したＴＳＵプライマー複合体構造の保持によってＴＳ２配列およびＴＳ２’配列が極めて近接しているからである。図７に関して、ＴＳ２配列およびＴＳ２’配列のハイブリッド形成を介してｃＤＮＡ鎖とハイブリッド形成したＴＳＵ非プロモータープライマーの３’末端を、テンプレート鎖としてｃＤＮＡを使用してＤＮＡポリメラーゼによって酵素的に伸長し、第２のＤＮＡ鎖を合成する。簡潔にするために、図７は、上記のＴＳＵプライマー複合体の他の成分を含まないＴＳＵ非プロモータープライマーを示すが、これらの成分を、第２のＤＮＡ鎖の合成中に保持することができる。第２のＤＮＡ鎖は、５’ユニバーサル配列（Ｕ２）およびＴＳ２配列（その両方がＴＳＵ非プロモータープライマーに起因する）、ＴＳＵプライマーの３’末端から伸長されたＤＮＡ鎖（ＴＳ１’配列およびユニバーサル配列Ｕ１’（共に、それぞれｃＤＮＡおよびＴＳＵプロモータープライマーのＴＳ１配列およびＵ１配列に相補的である）を含む）、およびＴＳＵプロモータープライマーのプロモーター配列（Ｐ）に相補的な３’配列を含む。得られた構造は実質的にｄｓＤＮＡであり、その各ＲＮＡポリメラーゼ酵素の機能的プロモーター配列を含む。
【００６０】
図８に示すように、最初の等温増幅期の継続により、プロモーター配列に特異的なＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡ  Ｐｏｌ）は、機能的プロモーターに結合して実質的ｄｓＤＮＡから転写を開始して、複数のＲＮＡ転写物を作製する。これらの転写物は、５’Ｕ１配列、その後にＴＳ１配列、ＴＳ１配列とＴＳ２’配列との間に存在するさらなる標的特異的配列、ＴＳ２’配列、および３’Ｕ２’配列を含む。ＲＮＡ転写物は、第１のユニバーサル配列（Ｕ１）および第２のユニバーサル配列（Ｕ２’）（相互に異なる）に隣接した標的特異的配列を含む（１つのかかる転写物を図９に示す）。
【００６１】
第２の増幅期では、ユニバーサルプライマー（図１のＵＰ１およびＵＰ２）を使用して、さらなる増幅産物またはアンプリコンの合成のためのテンプレートとしてＲＮＡ転写物を使用した継続的等温増幅サイクル中でさらなるＲＮＡ転写物を作製する。好ましい実施形態は、ＴＭＡ反応またはＮＡＳＢＡ反応に類似の等温増幅反応中でユニバーサルプライマーを使用する。第２の増幅期の第１の工程では、本質的に第１の増幅期で産生されたＲＮＡ転写物の３’Ｕ２’配列に相補的なＵ２配列からなるユニバーサル非プロモータープライマー（ＵＰ２）は、最初のＲＮＡ転写物とハイブリッド形成する（図９を参照のこと）。図１０に示すように、ＵＰ２プライマーの３’末端を酵素等温反応で合成的に伸長させ、第１の増幅期由来のＲＮＡ転写物が左下の第２の期に入る。ＲＴ酵素が結合し、ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびテンプレートとしての転写物の使用によってＵＰ２プライマーの３’末端からのｃＤＮＡ合成を開始する。以下の図１０中の黒矢印は、第２の増幅期中の工程を示す。ｃＤＮＡを有する二重鎖中のＲＮＡテンプレート鎖を、ＲＮアーゼＨ活性によって分解し、ｃＤＮＡをＵ１’配列でユニバーサルプロモータープライマー（ＵＰ１）の相補性Ｕ１配列とハイブリッド形成させる。ＲＴは、ＵＰ１プライマーの３’末端に結合し、ＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびテンプレート鎖としてのｃＤＮＡ鎖の使用によって第２のＤＮＡ鎖合成を開始する。得られたｄｓＤＮＡは、機能的プロモーター配列および各鎖上に標的特異的配列に隣接した２つのユニバーサル配列を含む。プロモーター配列に特異的なＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡ  Ｐｏｌ）は、機能的プロモーターに結合し、１００〜１０００個の転写物（ＲＮＡアンプリコン）を作製する。この転写物は、第１の増幅期で作製された最初のＲＮＡ転写物と構造的に同一である。さらなる転写物は、この過程をより多く繰り返すためのテンプレートとしての機能を果たす。第２の増幅期で作製されたＲＮＡ転写物は、これらが作製された場合に増幅過程での使用が可能になり（すなわち、変性工程が必要ない）、したがって、連続する等温過程でユニバーサル配列および標的特異的配列が効率的に増幅される。等温増幅過程の第２の期中で作製されたＲＮＡ転写物を、反応中（すなわち、リアルタイムで）または指定の反応終点で（例えば、増幅反応開始後の特定の時間、または反応中に存在する基質の枯渇によって増幅が実質的に終了したとき）検出することができる。
【００６２】
ＲＮＡアンプリコンを、核酸濃度の増加を単に検出することができるか、選択された増幅配列を検出することができる周知の検出方法の使用によって検出することができる。例えば、検出は、１つ以上のユニバーサル配列またはそのサブシーケンス（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）、標的特異的配列またはそのサブシーケンス、またはユニバーサル配列および標的特異的配列の一部を組み合わせた連続配列を特異的に検出することができる。好ましくは、アンプリコン検出のためのプローブを使用する検出工程により、均一検出（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）（すなわち、混合物からの非ハイブリッド形成プローブの除去を用いないハイブリッド形成プローブの検出）が可能である（例えば、Ａｒｎｏｌｄ  Ｊｒ．らに付与された米国特許第５，６３９，６０４号および同第５，２８３，１７４号）。第２の増幅期のおよそ終了時または終了時に増幅産物を検出する好ましい実施形態では、線状プローブを使用して、増幅産物とのプローブのハイブリッド形成を示す検出可能なシグナルを得る。リアルタイムで増幅産物を検出する好ましい実施形態では、プローブは、好ましくは、シグナル産生が標的配列の存在に関連するプローブである（分子ビーコン、分子トーチ、またはハイブリッド形成スイッチプローブなど）。このプローブは、プローブが増幅産物に結合する場合に検出されるレポーター部分で標識されている。かかるプローブは、標識（例えば、プローブの一方の末端に結合したフルオロフォア）および相互作用化合物（例えば、プローブが「閉じた」高次構造にある場合に（増幅産物とハイブリッド形成しないことを示す）標識からのシグナル産生を阻害するためのプローブの別の位置に結合したクエンチャー）を含み得、プローブが「開いた」高次構造にある場合に（増幅産物とハイブリッド形成することを示す）検出可能なシグナルを産生する。種々のプローブ構造およびその使用方法は、以前に記載されている（例えば、Ｌｉｚａｒｄｉらに付与された米国特許第５，１１８，８０１号および同第５，３１２，７２８号，Ｔｙａｇｉらに付与された米国特許第５，９２５，５１７号および同第６，１５０，０９７号，Ｂｅｃｋｅｒらに付与された米国特許第６，８４９，４１２号、同第６，８３５，５４２号、同第６，５３４，２７４号、および同第６，３６１，９４５号，Ｂｅｃｋｅｒらの米国特許出願公開第１１／１７３，９１５号、およびＡｒｎｏｌｄ  Ｊｒ．の米国特許出願第６０／６５７，５２３号）。
【００６３】
本明細書中に記載の少なくとも１つのユニバーサル配列を使用する標的の捕獲および増幅方法を、種々の異なる方法で行うことができる。いくつかの好ましい実施形態では、すべての工程を実質的に液相で行う（すなわち、ほとんどまたは全ての工程を実質的に水性の媒体中に存在する反応物中で成分を使用して行う）。例えば、標的捕獲工程を、実質的に水溶液の混合物中で行うことができ、これにより、捕獲プローブを標的核酸とハイブリッド形成させ、水相中に混合または懸濁した小粒子またはビーズに結合した固定プローブの使用によって液相中で捕獲プローブを固定プローブとハイブリッド形成させることが可能である。同様に、いくつかの好ましい実施形態では、全ての増幅工程を、全反応のための液相中に全増幅成分（例えば、基質、テンプレート、酵素、および補因子）を含めることによって行う。増幅産物の存在に起因するシグナルを検出する検出工程を、実質的に水性の液相でも行うことができる（例えば、Ａｒｎｏｌｄ  Ｊｒ．らに付与された米国特許第５，６３９，６０４号および同第５，２８３，１７４号などに記載）。他の好ましい実施形態では、固相（支持体マトリックスまたは粒子など）に実質的に結合した標的捕獲工程、増幅工程、および検出工程を含むアッセイにおける１つ以上の工程を行って目的の特定の分析物の検出を区画化するか局在化することができる。サンプル中に存在する１つ以上の選択された分析物の存在に起因するシグナルの個別の検出のために、例えば、時間的または空間的に増幅産物を局在化することができるので、かかる実施形態は有利である。これは、特に、標的捕獲工程、増幅工程、および／または検出工程中で、実質的に同一の試薬混合物中で全てが処理される複数の異なる分析物をサンプルが含むことができる場合に有用であるが、各分析物の増幅産物の存在に起因するシグナルの個別の検出が望ましい。
【００６４】
図１１に関して、支持体に結合したアッセイ工程を実施することが可能な２つの好ましい実施形態を示す。両方の実施形態は、特異的結合対メンバーを介して支持体に結合するＴＳＵプライマーの組み合わせ（ＴＳＵプロモータープライマーおよびＴＳＵ非プロモータープライマー配列）を使用する。本開示において前に記載のように、両実施形態中のＴＳＵプライマーは、標的特異的配列（ＴＳ１およびＴＳ２）およびユニバーサル配列（Ｕ１およびＵ２）を備えている。本開示において前に記載のように、両実施形態は、第２の増幅期にユニバーサルプライマー（ＵＰ１およびＵＰ２）を使用する。Ｓ−オリゴヌクレオチド（例えば、図３に示す）を含むＴＳＵプライマー複合体を使用する実施形態と対照的に、これら２つの実施形態のＴＳＵプライマーを、支持体への結合によって物理的に連結する。図１１の実施形態１では、ＴＳＵプロモータープライマーおよびＴＳＵ非プロモータープライマー配列を、支持体に結合した第２の結合対メンバー（ＢＰＭ２）と特異的に結合する第１の結合対メンバー（ＢＰＭ１）を介して支持体に連結する。合成オリゴヌクレオチドと会合したＢＰＭ１エレメントと共にＴＳＵプロモータープライマーおよびＴＳＵ非プロモータープライマー配列の全構造エレメントを適切な順序で含む１つのオリゴヌクレオチド（例えば、３’−ＴＳ２−Ｕ２−５’−５’−Ｐ−Ｕ１−ＴＳ１−３’）の合成、または２つのオリゴヌクレオチド（ＴＳＵプロモータープライマー配列およびＴＳＵ非プロモータープライマー配列）を合成し、次いで上記プライマーに会合したＢＰＭ１部分を介して上記ＢＰＭ２部分に結合することによって、これを行うことができる。図１１の実施形態２では、ＴＳＵプロモータープライマーオリゴヌクレオチドおよびＴＳＵ非プロモータープライマーオリゴヌクレオチドを、支持体に結合した第２の結合対メンバー（ＢＰＭ２）と特異的であるが独立して結合する各プライマーと会合した第１の結合対メンバー（ＢＰＭ１）を介して同一の支持体に連結する。両方の実施形態は、ＴＳＵプライマーは、同一支持体に結合することによって極めて近接して維持される。ＴＳＵプロモータープライマーのＴＳ１配列が標的核酸鎖中の相補配列（ＴＳ１’）と結合するので、ＴＳＵプライマーは、他のサンプル成分からＴＳＵプライマー−標的複合体を分離するための支持体の使用によって、目的の標的核酸に選択的に結合してサンプル混合物から分離するための捕獲プローブとして機能することができる。次いで、支持体に結合させ、増幅反応成分（例えば、基質、酵素、補因子）と混合したＴＳＵプライマー−標的複合体は、最初のＴＳＵプライマー−標的複合体から合成したｃＤＮＡと極めて近接したＴＳＵ非プロモータープライマーの提供において支持体をＳ−オリゴヌクレオチドのかわりにすること以外は、実質的に本開示で前に記載の第１の増幅期でのプライマー−テンプレート複合体としての機能を果たす。次いで、実質的に本開示に記載のように、ＵＰ１およびＵＰ２ユニバーサルプライマーの使用によって、第１の増幅期由来のＲＮＡ転写物は、第２の増幅期のテンプレートとしての機能を果たす（図１０に関する）。
【００６５】
図１１に示す両実施形態中の支持体を使用して、目的の特定の分析物の増幅および検出工程を時間的または空間的またはその両方で局在化することができる。例えば、３つの異なる分析物（Ａ１、Ａ２、Ａ３）がサンプル中に存在する場合、３つの異なる標的核酸（Ｔ−Ａ１、Ｔ−Ａ２、Ｔ−Ａ３）を、異なる支持体または１つの支持体の異なる位置に結合した３つの異なるＴＳＵプライマー（それぞれ標的の１つに特異的な異なるＴＳ１配列（ＴＳ−Ａ１、ＴＳ−Ａ２、ＴＳ−Ａ３）の使用によるその各分析物に特異的な各ＴＳＵプライマー）の使用によって１つの標的捕獲工程で捕獲することができる。例えば、ＴＳＵプライマー複合体を、例えばアレイ中の異なる所定の位置に結合する１つの支持体を使用する場合、空間的に分離することができる。空間的分離を実現する他の実施形態は、所定のパターンまたは無作為なパターンでＴＳＵプライマー複合体を含む多室デバイスの異なるウェルまたは容器を含む。このパターンは、１つ以上の支持体粒子が所定の確率で懸濁される既知量の溶液の分注（例えば、平均して１つ以下の各支持体がウェルまたは室の上または中の位置に沈殿する希釈）などによって実現する。空間的分離を、それぞれの異なるＴＳＵプライマーが結合する支持体の物理的性質の使用によって増幅工程の実施前にデバイスのそれぞれの室または区分に各支持体を選択的に分離することによって実現することもできる。例えば、異なるＴＳ１配列（ＴＳ−Ａ１、ＴＳ−Ａ２、ＴＳ−Ａ３）を有するＴＳＵプライマーを、サイズ、密度、リガンド結合能力、および磁気特性などに基づいて分離可能な異なる特定の支持体に結合することができ、その結果、その結合したＴＳＵプライマー−標的複合体を有する異なる支持体を、全て同一の試薬（同一のユニバーサルプライマーが含まれる）を使用する増幅工程の実施前に空間的に分離することができる。検出工程の特定の空間的位置で検出された増幅産物は、特定の分析物がサンプル中に存在したかどうかを示し、全ての位置の累積的検出結果は１つを超える分析物がサンプル中に存在したことを示すことができ、サンプル中に存在する各分析物を定量的または比例的に測定することができる。例えば、増幅工程の実施前に３つの異なるＴＳＵプライマー−標的複合体（すなわち、ＴＳ−Ａ１、ＴＳ−Ａ２、ＴＳ−Ａ３プライマー）を空間的に分離して位置あたり平均１個のＴＳＵプライマー−標的複合体を産生し、検出工程によってＴＳ−Ａ１プライマーに陽性の１０室、ＴＳ−Ａ２プライマーに陽性の３０室、ＴＳ−Ａ３プライマーに陽性の５０室が得られる１００室のアレイを使用する場合、結果は、サンプルが３つの分析物Ａ１、Ａ２、およびＡ３の全てを、Ａ１：Ａ２：Ａ３の比率が１：３：５で含むことを示す。
【００６６】
同様に、時間的分離を使用して、異なる標的核酸から産物を増幅し、増幅産物を検出することができる。図１１のいずれかの実施形態について、サンプル中に存在する３つの異なる分析物（Ａ１、Ａ２、Ａ３）のモデル系を使用して、３つの異なる標的核酸（Ｔ−Ａ１、Ｔ−Ａ２、Ｔ−Ａ３）を、支持体に結合した３つの異なるＴＳＵプライマー複合体（異なるＴＳ１配列（ＴＳ−Ａ１、ＴＳ−Ａ２、ＴＳ−Ａ３）の使用によるその各分析物に特異的な各ＴＳＵプライマー複合体）の使用によって１つの標的捕獲工程で捕獲することができる。第１および第２の期における増幅を、増幅中の異なる時間（例えば、Ａ１産物については第１の時間（Ｔ１）、Ａ２産物については第２の時間（Ｔ２）、およびＡ３産物については第３の時間（Ｔ３））に各増幅産物の検出測定を行うこと以外は実質的に本明細書中で前に記載のように行い、各産物から異なる波長の蛍光などの異なる検出可能なシグナルが得られる。したがって、Ｔ１およびＴ３のみ検出された陽性シグナルは、サンプルが分析物Ａ１およびＡ３のみを含み、Ａ２を含まなかったことを示す。他の実施形態では、増幅反応中の延長した時間の範囲にわたる連続した時間（例えば、Ａ１についてはＴ１、Ｔ４、およびＴ７、Ａ２についてはＴ２、Ｔ５、およびＴ８、およびＡ３についてはＴ３、Ｔ６、およびＴ９）で時間的検出を行うことができ、累積した結果は、サンプル中に存在する各分析物の存在および相対量の両方を示すことができる。例えば、Ｔ１、Ｔ４、およびＴ７で陽性シグナルが検出される場合、サンプル中にＡ１が存在することを示し、Ｔ８で陽性シグナルが検出される場合、サンプル中にＡ２が存在することを示し、Ｔ６およびＴ９で陽性シグナルが検出される場合、サンプル中にＡ３が存在することを示す。各分析物の増幅は、第２の増幅期において、同一の条件およびユニバーサルプライマーの使用によってほぼ同一の速度で進行すると予想される。したがって、増幅産物の相対量および各増幅産物の得られた最も早いシグナル検出時間は、サンプル中に存在する各分析物の比例量を示す。Ａ１のシグナルがＡ３のシグナルの前に検出され、Ａ３のシグナルはＡ２のシグナル前に検出される上記のモデル系の結果に基づいて、サンプル中の各分析物の相対量は、Ａ１がＡ３より多く、Ａ３がＡ２より多い。
【００６７】
空間的分離および時間的分離の組み合わせをアッセイで使用して、反応物中の１つを超える分析物から増幅し、増幅産物を選択的に検出して、個別の位置および時間で分析物の増幅産物を検出することができる。例えば、空間的分離は、所定の位置で支持体に結合したＴＳＵプライマー複合体アレイの使用を含むことができ、これを、アレイ上で実施される増幅反応に起因する増幅産物を検出するための各位置または選択された位置の群由来の異なる時点のシグナルの検出による時間的分離と組み合わせた。別の実施形態では、粒子支持体に結合したＴＳＵプライマー複合体を、増幅反応のいくつかの部分の増幅反応混合物の液相に懸濁し、次いで、増幅反応中の他の選択された時期（時間的分離）に作製された局在化増幅産物由来のシグナルの検出のために無作為または非無作為パターン（空間的分離）において、表面に沈殿させるか誘引することができる。その結果、得られた検出可能なシグナルの一連の累積パターンから、サンプル中に存在する分析物の存在および相対量の両方に関する情報が得られる。当業者は、広範な種々の空間的分離、時間的分離、および空間的分離と時間的分離との組み合わせを使用して、複数の分析物を含む増幅反応（すなわち、多重反応）に起因する増幅産物を選択的に検出することができることを認識している。
【００６８】
当業者はまた、他の実施形態が本明細書中に開示のアッセイの一般的原理に含まれると認識するであろう。すなわち、アッセイは、サンプルから標的核酸を分離して最初のＴＳＵプライマーを選択された標的核酸に結合する標的捕獲工程、その後の２つの相によって特徴づけられる等温増幅反応を含む。２つの相のうちの第１の相は標的核酸から作製した産物にユニバーサル配列を導入し、第２の相は増幅産物のさらなる産生のためにユニバーサル配列を使用し、アッセイの最終段階で検出する。標的捕獲工程は、標的核酸に結合した第１のユニバーサル配列を含む最初のＴＳＵプライマーの結合を含む。標的捕獲工程後、最初の等温増幅期を実施し、これは、最初のＴＳＵプライマーおよび第２のユニバーサル配列を含む第２のＴＳＵプライマーを使用して、第１のユニバーサル配列および第２のユニバーサル配列の相補配列（標的特異的配列に隣接する）を含むＲＮＡ転写物を産生する。この後、第２の等温増幅期を行う。第２の等温増幅期では、第１の期で作製されたＲＮＡ転写物を、最初のＴＳＵプライマーおよび第２のＴＳＵプライマーの使用によって導入されたユニバーサル配列（またはその相補物）に特異的に結合するユニバーサルプライマーの使用による、さらなるＲＮＡ転写物の継続的作製過程の使用によって増幅する。最後の検出工程は、第２の等温増幅期中に作製された増幅産物に起因するシグナルを検出する。このシグナルは、標的捕獲工程で選択された標的核酸が試験したサンプル中に存在することを示す。これらの一般的なアッセイ工程を、異なる配列の種々の異なるプライマーと共に使用することができる。このプライマーを、分子生物学分野に属する当業者によって本明細書中に記載のプライマーの一般的な構造的特徴を考慮して容易にデザインすることができる。
【００６９】
ユニバーサル配列を使用する等温増幅方法の他の実施形態は、上記実施形態と比較してより少ないＴＳＵプライマーおよびユニバーサルプライマーの使用でよく、標的捕獲工程中の標的核酸へのＴＳＵプライマーの結合などの方法の特徴が保持される一方で、ユニバーサルプライマーおよび標的特異的プライマーの組み合わせの使用によって等温増幅工程を行う。例えば、実施形態は、標的捕獲工程中に標的核酸とハイブリッド形成するたった１つのＴＳＵプロモータープライマーを使用することができ、合成的に伸長して、１つのユニバーサル配列をｃＤＮＡに導入し、その後に第１の等温増幅期中に作製されたＲＮＡ転写物に導入する。その結果、第２の増幅期は、１つ以上の標的特異的プライマーと組み合わせたたった１つのユニバーサルプライマーを使用して増幅産物を作製し、これを検出して試験サンプル中の分析物の存在を示す。図１２は、（Ａ．）第１のプライマー結合を使用する標的捕獲（ＴＣ）工程および（Ｂ．）第２の増幅期で使用したプライマーの相違を比較するための２つの実施形態（実施形態１（上）、実施形態２（下））を示す。図１２に関して、ＴＣ工程中の実施形態１は、前述のようにＳ−オリゴヌクレオチドによって連結されたＴＳＵプロモータープライマーおよびＴＳＵ非プロモータープライマーを含むＴＳＵプライマー複合体に標的鎖を結合し、ここで、前述のように、ＴＳＵプロモータープライマーの標的特異的部分が標的鎖中の相補配列に結合して、第１の等温増幅期でのＴＳＵプロモータープライマーの３’末端の伸長によって作製されるｃＤＮＡとユニバーサル配列（Ｕ１）が連結する。対照的に、前述のように、ＴＣ工程中の実施形態２は、標的鎖にＴＳＵプロモータープライマーのみが結合し、このＴＳＵプロモータープライマーが標的特異的部分を介して標的鎖中の相補配列とハイブリッド形成して、ＴＳＵプロモータープライマーの３’末端の伸長によって作製されるｃＤＮＡとＵ１が連結する。実施形態１では、図５〜８に関して前述のように、そのユニバーサル配列を有するＴＳＵ非プロモータープライマーを使用して第２のＤＮＡ鎖を作製する第１の増幅期を継続し、その結果、第１の増幅期で作製されたＲＮＡ転写物は２つのユニバーサル配列を含むであろう。実施形態２では、ＴＳＵ非プロモータープライマーを使用する代わりに、標的特異的非プロモータープライマーを、ｃＤＮＡ中の相補配列とハイブリッド形成させ、合成的に伸長して、第２のＤＮＡ鎖を作製し、その結果、第１の増幅期で作製したＲＮＡ転写物は、たった１つのユニバーサル配列を含む。図１２のＢに関して、図１０に関して前述のように、実施形態１の第２の等温増幅期では（上の部分）、２つのユニバーサルプライマー（ユニバーサルプロモータープライマー（ＵＰ１）およびユニバーサル非プロモータープライマー（ＵＰ２））を使用して、ＲＮＡアンプリコンを作製する。対照的に、図１２のＢの第２の実施形態では、第２の等温増幅期は、標的特異的プライマー（ＴＳＰ）と組み合わせたたった１つのユニバーサルプロモータープライマー（ＵＰ１）を使用する。図１３に関して、第２の等温増幅期では、ＲＮＡアンプリコンを作製する。上述の合成工程に類似の合成工程を使用するが、テンプレートとしてＲＮＡ転写物を使用したｃＤＮＡの合成の開始（図１３の左下から開始）のためにＴＳＰ（ＵＰ２の代わり）を使用することによってＲＮＡアンプリコンを作製する。すなわち、この実施形態では、反応中にＵ２ユニバーサル配列やＵ２’ユニバーサル配列は存在しない。
【００７０】
１つのＴＳＵプライマーおよび標的特異的プライマーを使用する１つの実施形態を、図１１に関して上記の実施形態に類似の、支持体に結合したＴＳＵプライマーを使用するアッセイで使用することができる。図１４は、プロモーター配列（Ｐ）、ユニバーサル配列（Ｕ１）、および標的特異的配列（ＴＳ１）から構成されるＴＳＵプロモータープライマーオリゴヌクレオチドを概略的に示す。このヌクレオチドは、支持体に結合した第２の結合対メンバー（ＢＰＭ２）に特異的に結合する第１の結合対メンバー（ＢＰＭ１）を介して支持体に結合する。図１２（実施形態２）に関して実質的に上記のように、ＴＳＵプロモータープライマーを、第１の増幅期で使用する。第２の増幅期について、図１４に示すように、ユニバーサルプロモータープライマー（ＵＰ１）および標的特異的プライマー（ＴＳＰ）を含む混合物を使用し、上記および図１３に図示する工程を使用して、ＲＮＡ転写物を増幅する。１つの好ましい実施形態では、支持体に結合したＴＳＵプロモータープライマー（図１４などの場合）を使用して、標的核酸鎖を捕獲することができる。このＴＳＵプロモータープライマーは、標的鎖中の配列（ＴＳ１’）に相補的なそのＴＳ１配列の使用によってハイブリッド形成する。あるいは、前に詳述するように、支持体に結合した１つのＴＳＵプライマーを使用する１つの実施形態を、支持体、固定プローブ、および標的特異的捕獲プローブを含む捕獲複合体（図１２のＡなどの場合）を使用するＴＣ工程と組み合わせて使用することができる。他のサンプル成分から標的核酸を分離するための手段として支持体に結合したＴＳＵプロモータープライマーを使用する１つの実施形態では、支持体および標的鎖とハイブリッド形成したＴＳＵプロモータープライマーを含む複合体を他の増幅試薬と混合する場合、ＴＳＵプロモータープライマーは、本質的に、捕獲プローブおよびｃＤＮＡ合成の開始のためのプライマーとしての機能を果たす。標的鎖とハイブリッド形成し、かつ支持体に結合した固定プローブに結合している捕獲プローブから構成される捕獲複合体を使用するＴＣ工程を実施する１つの実施形態では、複合体が他の増幅試薬と混合する場合、標的鎖とハイブリッド形成し、別の支持体と結合したＴＳＵプロモータープライマーは、ｃＤＮＡ合成開始のプライマーとして作用する。両方の実施形態では、第２の等温増幅期がユニバーサルプライマー（ＵＰ２）の代わりにＴＳＰを使用することに依存すること以外は、図１１に関して上記のように、支持体に結合したＴＳＵプライマーを使用して、増幅産物を、空間的または時間的に分離するか、空間的分離と時間的分離との組み合わせとして分離することができる。
【００７１】
標的特異的プライマー（ＴＳＰ）と組み合わせてＴＳＵプロモータープライマーを使用する図１２（実施形態２）、１３、および１４に関して記載の実施形態などの実施形態は、多数の用途で有利である。例えば、異なる標的間で保存される共通の標的配列（ＴＳ１’）を共有する１つ以上の種または単離物の検出アッセイでは、各標的に特異的なＴＳＰ配列の作製によって異なる各標的のためのＴＳＰを含むことができる。例えば、属の多数のメンバー（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の１６Ｓまたは２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列中に生じるＴＳ１’配列を使用して、属における意図する全標的由来の標的１６Ｓまたは２３Ｓ  ｒＲＮＡに結合するＴＳ１配列を含むＴＳＵプロモータープライマーをデザインすることができる。次いで、属標的（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ａｓｉａｔｉｃｕｍ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ｃｅｌａｔｕｍ、Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ、Ｍ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ、Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、Ｍ．ｇａｓｔｒｉ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ、Ｍ．ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｉｎｔｅｒｊｅｃｔｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ．ｍａｌｍｏｅｎｓｅ、Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍ．ｎｏｎ−ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｕｍ、Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｐｈｌｅｉ、Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ、Ｍ．ｓｈｉｍｏｄｅｉ、Ｍ．ｓｉｍｉａｅ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ、Ｍ．ｔｅｒｒａｅ、Ｍ．ｔｒｉｖｉａｌｅ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ、またはＭ．ｘｅｎｏｐｉ）中に含まれる意図する各標的種のために、各メンバーに特異的なＴＳＰをデザインし、等温増幅反応で使用して、各標的種に特異的な増幅産物を作製し、増幅産物を標準的なプローブハイブリッド形成またはサイズ分離法の使用によって個別に検出することができる。別の例では、異なるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）型などの関連ウイルス標的を、そのＴＳ１配列を介して検出すべき全ての所望のＨＰＶ型（例えば、ＨＰＶ１６型、１８型、３１型、３３型、３５型、４５型、５１型、５６型、５８型、５９型、および６８型）に存在する共通配列（ＴＳ１’）に結合するＴＳＵプロモータープライマーをデザインし、１つの反応混合物中で検出することができる。したがって、Ｅ６／Ｅ７遺伝子標的配列中のＨＰＶ  ｍＲＮＡを使用して、サンプル中に存在する意図する各標的ＨＰＶ型のためのＴＳＵプロモータープライマーから作製される最初のｃＤＮＡを合成するであろう。次いで、目的の各ＨＰＶ型の増幅および検出のために、ＴＳＰを、各標的（例えば、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の各標的）または関連する標的の組み合わせ（例えば、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の両方に特異的な標的）のためにデザインする（すなわち、各ＴＳＰは、その意図するＨＰＶ型の配列のみに特異的に結合する）。その標的型に特異的な各ＴＳＰを、等温増幅反応で使用して選択した標的型に特異的な増幅産物を作製し、増幅産物を標準的な方法（ハイブリッド形成、サイズ分離、配列決定）の使用によって個別に検出して、試験サンプル中に存在するＨＰＶ型を同定する。これらなどの実施形態は、１つを超える選択された標的がサンプル中に存在し、これらの標的を増幅して他の増幅産物と区別することができる検出可能な増幅産物を産生する多重反応に特に有用であり、その結果、反応混合物中に存在する各増幅産物由来のシグナルは、試験したサンプル中に存在した標的分析物を示す。
【００７２】
複数の標的特異的プライマー（ＴＳＰ）と組み合わせたＴＳＵプライマーによって得られる１つのユニバーサル配列を使用する実施形態が有用な別の適用は、関連する遺伝子配列または産物の異なる形態の検出のための適用である。例えば、癌を、一定の遺伝子転座または転座切断点（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ）の存在（例えば、ヒト９番染色体と２２番染色体との間の転座に関連する慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（９番染色体のａｂｌ遺伝子と２２番染色体の「切断点クラスター領域（ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ｒｅｇｉｏｎ）」またはｂｃｒ遺伝子との間））と相関させることができる。異なる転座型を検出するために、本明細書中に記載の方法の実施形態はＴＳＵプライマーを使用し、そのＴＳ１配列は、多数の異なる癌関連転座に共通する転座メンバーの１つ（例えば、ａｂｉ遺伝子）の遺伝子配列またはｍＲＮＡ中の標的配列に特異的であるので、切断点に非依存性に、多数の異なる転座由来の配列を増幅することができる。癌に関連するか特定の予後値を有する特異的転座を増幅および検出するために、種々の異なるＴＳＰをデザインし（例えば、異なるｂｃｒ配列）（癌関連転座に関連する特定の配列の増幅に特異的な各ＴＳＰ）、増幅配列を、標準的方法（例えば、プローブハイブリッド形成、配列決定、またはアンプリコンのサイズ）を使用して特異的に検出することができる。次いで、診断転座配列を有する核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含むことが疑われるサンプルを、好ましくは１つまたはいくつかの多重反応で標的中の多数の転座を増幅するＴＳＵプロモータープライマーおよび多数の異なるＴＳＰを使用して増幅し、増幅産物を特異的に検出して、増幅および検出される特定の転座配列に基づいた診断情報または予後情報を得る。
【００７３】
同様に、ＴＳＵプライマーおよび複数の標的特異的プライマー（ＴＰＳ）によって得られる１つのユニバーサル配列を使用する実施形態は、遺伝子（例えば、前立腺癌に関連するＰＣＡ３遺伝子；Ｂｕｓｓｅｍａｋｅｒｓらに付与される米国特許第７，００８，７６５号を参照のこと）の異なる発現産物に生じる異なる関連遺伝子配列型の検出に有用である。かかる異なる発現産物は、ＲＮＡ転写物における異なるスプライシング事象に起因し得、いくつかのスプライシングしたＲＮＡは、疾患の診断に用いられるか、予後値（癌組織が良性または悪性のいずれであるかなど）が得られる。かかる実施形態では、全てまたは多数の差分的にスプライシングされるＲＮＡ形態に含まれるＴＳ１’配列に特異的なＴＳ１配列を含むようにＴＳＵプロモータープライマーをデザインし、たった１つの差分的にスプライシングされるＲＮＡ形態をそれぞれ増幅するように複数のＴＳＰをデザインする。好ましくは１つの多重反応混合物中でＴＳＵプロモータープライマーおよびＴＳＰを使用した増幅後、増幅産物を、増幅産物を区別する方法で検出し、試験サンプル中に存在する特定のスプライシングＲＮＡ形態に関する情報を得る。
【００７４】
ＴＳＵプライマーおよび複数の標的特異的プライマー（ＴＰＳ）によって得られる１つのユニバーサル配列を使用する他の実施形態は、薬物耐性が得られる１つ以上の配列の存在の検出などによって、遺伝子配列中の変異を検出して診断情報または予後情報を得るのに有用である。例えば、多数のＨＩＶ−１変異は、特定の薬物での治療に耐性を示すウイルス感染と関連する（例えば、Ｙａｎｇらに付与された米国特許第６，５８２，９２０号を参照のこと）。１つの反応中で１つ以上の薬物耐性変異を検出するために、株または分離株が薬物耐性変異を含むかどうかと無関係に、ＨＩＶ−１株および分離株に共通のＨＩＶ−１  ｍＲＮＡに相補的なＴＳ１配列を含むようにＴＳＵプライマーをデザインする。薬物耐性に関連する変異を含む特定の配列を増幅するように複数のＴＳＰをデザインする。いくつかの実施形態では、ＴＳＰは薬物耐性変異自体に特異的であるのに対して、他の実施形態では、ＴＳＰは薬物耐性変異自体を含まない配列に特異的であるが、薬物耐性変異を含む産物を増幅する。ＴＳＵプロモータープライマーを、好ましくは１つの多重反応中で複数のＴＳＰと共に使用して産物を増幅し、薬物耐性変異が試験サンプルの核酸中に存在したかどうかに関する情報を得る。例えば、ＴＳＰが検出すべき各薬物耐性変異に特異的である実施形態に関して、区別可能な増幅産物の有無は、どの変異が試験サンプル中に存在するかを示す。ＴＳＰが薬物耐性変異自体を含まない配列に特異的であるが、薬物耐性変異を含む産物を増幅する他の実施形態では、標準的な変異の検出方法を使用する（例えば、アレイを含むプローブハイブリッド形成、配列決定、またはサイズ分離（質量分析が含まれる））。
【００７５】
本明細書中に記載の等温増幅方法でＴＳＵプライマー、ＴＳＵプライマー複合体、およびユニバーサルプライマーを使用する実施形態の試験が実施され、ウイルス標的および癌マーカーに関連する遺伝子配列（前立腺特異抗原（ＰＳＡ；Ｈａｒｖｅｙらに付与された米国特許第６，５５１，７７８号）およびＰＣＡ３配列など）の増幅産物が首尾よく検出されている。
【００７６】
分子生物学の当業者は、選択した配列がＴＳＵオリゴヌクレオチドの機能的要件を満たす限り、本明細書中に記載のＴＳＵオリゴヌクレオチドは機能するためにいかなる特異的配列も必要としないと認識するであろう。すなわち、ＴＳＵオリゴヌクレオチドが本明細書中に開示の意図する実施形態のその機能に必要な全ての機能的部分の配列を含む限り、ＴＳＵオリゴヌクレオチドのいかなる機能的部分にも単一の配列を必要としない（例えば、ＴＳＵプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーには特定のプライマーを必要としない）。同様に、ＴＳＵプライマーが本明細書中に開示の意図する実施形態のために機能することができるＵ配列およびＴＳ配列を含む限り、プロモーター配列を含まないＴＳＵプライマーは、いかなる特定の配列も必要としない。同様に、本明細書中に開示の実施形態について記載のように各機能的部分に適切な配列を含む限り、Ｓ−オリゴヌクレオチド、２つのＴＳＵオリゴヌクレオチド配列から構成される共有結合オリゴヌクレオチド、または相補配列を介して互いに直接ハイブリッド形成する２つのＴＳＵオリゴヌクレオチドに特定の配列は必要ない。同様に、ユニバーサルプライマーは特定の配列を必要としないが、その代わりに、本明細書中に記載のＴＳＵオリゴヌクレオチドのために選択されるＵ配列を使用して実施する配列を含むように選択する。例えば、ユニバーサルプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドは、本明細書中に記載の方法で機能するプロモーター配列およびＵ配列を含み、ユニバーサルプライマーのＵ配列およびＴＳＵプロモーターオリゴヌクレオチドのＵ配列は通常は同一であるにもかかわらず、ユニバーサルプライマー中のＵ配列は、１〜３ｎｔ位でＴＳＵオリゴヌクレオチドのＵ配列と異なり得、本明細書中に開示の方法で依然として役割を果たす。同様に、ユニバーサルプライマーは、任意の特定の配列に依存しないが、使用されるＴＳＵ非プロモータープライマーのユニバーサル配列と同一であるように選択される。しかし、ユニバーサルプライマー中のＵ配列は、１〜３ｎｔ位でＴＳＵプライマーのＵ配列と異なり得、開示の方法で依然として機能する。他の反応成分を簡潔にするので（すなわち、１つのＲＮＡポリメラーゼを使用する）、プロモーター配列は、典型的には、複数の標的のためのアッセイで使用される全てのＴＳＵプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーで同一であるが、同一または異なるＲＮＡポリメラーゼと共に機能する異なるプロモーター配列を使用することができる。当業者は、多数の異なる配列を、本明細書中に記載の組成物の範囲内であるＴＳＵオリゴヌクレオチド、Ｓ−オリゴヌクレオチド、およびユニバーサルプライマーに組み込むことができ、核酸増幅の当業者が本明細書中に記載のオリゴヌクレオチドの構造的および機能的特徴の説明に基づいて選択することができ、日常的な試験方法の使用によって機能性を証明することができることを認識するであろう。
【００７７】
本明細書中に記載の組成物および方法の実施形態を、以下の実施例によってさらに理解することができる。実施例で使用した方法の工程を本明細書中に記載し、以下の情報は、本方法で使用した典型的な試薬および条件をより具体的に記載している。核酸増幅の当業者は、上記説明中に示したガイダンスに従う限り、他の試薬および条件を使用することができ、過程または結果に実質的に影響を及ぼさないことを理解するであろう。例えば、最初の増幅期でプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドおよび非プロモータープライマーを使用する転写媒介増幅（ＴＭＡ）方法が記載されているが、プライマー伸長に依存するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの他の転写関連核酸増幅方法を、本明細書中に記載のＴＳＵオリゴヌクレオチドを使用するように改変して、ユニバーサルプライマーの使用によって増幅産物を作製することができる（すなわち、方法は、ＴＭＡベースの実施形態に制限されない）。分子生物学の当業者はまた、開示の方法および組成物を、手作業で行うか、自動化デバイスで１つ以上の工程（例えば、ピペッティング、混合、およびインキュベーションなど）を行うシステムで行うか、任意のタイプの公知のデバイス（例えば、試験管、多管ユニットデバイス、多ウェルデバイス（９６ウェルマイクロタイタープレートなど）など）で使用することができることを理解するであろう。
【００７８】
実施例中に記載の方法で典型的に使用される試薬には、以下が含まれる。サンプル輸送媒体（「ＳＴＭ」）は、１５ｍＭ第一リン酸ナトリウム、１５ｍＭ第二リン酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、および３％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）（ｐＨ６．７）を含んでいた。検体希釈緩衝液は、３００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、３％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ、４４ｍＭ  ＬｉＣｌ、１２０ｍＭ  ＬｉＯＨ、４０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）を含んでいた。標的捕獲試薬（ＴＣＲ）は、２５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、３１０ｍＭ水酸化リチウム、１．８８Ｍ塩化リチウム、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ６．４）、ならびに２５０μｇ／ｍｌの磁性粒子（１ミクロンＳＥＲＡ−ＭＡＧ（商標）ＭＧ−ＣＭ粒子、Ｓｅｒａｄｙｎ、Ｉｎｃ．Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）およびこれに共有結合した（ｄＴ）１４オリゴマーを含んでいた。ＴＣ洗浄液は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、６．５ｍＭ水酸化ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３％（ｖ／ｖ）エタノール、０．０２％（ｗ／ｖ）メチルパラベン、０．０１％（ｗ／ｖ）プロピルパラベン、および０．１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸ナトリウム（ｐＨ７．５）を含んでいた。プローブ試薬は、以下のいずれかから構成される溶液に１つ以上の標識検出プローブを含んでいた：（１）１００ｍＭコハク酸リチウム、３％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ、１０ｍＭ  メルカプトエタンスルホナート、および３％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン、または（２）１００ｍＭコハク酸リチウム、０．１％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ、および１０ｍＭ  メルカプトエタンスルホナート。ハイブリッド形成試薬は、以下のいずれかであった：（１）１９０ｍＭ  コハク酸、１７％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ、１００ｍＭ水酸化リチウム、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、および３ｍＭ  ＥＧＴＡ（ｐＨ５．１）または（２）１００ｍＭコハク酸、２％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ、１００ｍＭ水酸化リチウム、１５ｍＭ  アルドリチオール−２、１．２Ｍ  塩化リチウム、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、および３．０％（ｖ／ｖ）エタノール（ｐＨ４．７）。ＡＥ標識検出プローブを使用する混合物を処理するために使用される選択試薬は、６００ｍＭホウ酸、１８２．５ｍＭ水酸化ナトリウム、１％（ｖ／ｖ）オクトキシノール（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００）（ｐＨ８．５）を含み、ＡＥ標識プローブ由来の化学発光シグナルを発生するために使用される検出試薬は、以下を含んでいた（１）１ｍＭ硝酸および３２ｍＭ過酸化水素から構成される検出試薬Ｉおよび（２）１．５Ｍ  ＮａＯＨである検出試薬ＩＩ（ｐＨ中和用）。増幅試薬は、他の反応成分（標的、オリゴヌクレオチド）と混合して以下を含む混合物を生成する濃縮混合物であった：４７．６ｍＭ  Ｎａ−ＨＥＰＥＳ、１２．５ｍＭ  Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、２．５％  ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００、５４．８ｍＭ  ＫＣｌ、２３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３ｍＭ  ＮａＯＨ、０．３５ｍＭの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、７．０６ｍＭ  ｒＡＴＰ、１．３５ｍＭ  ｒＣＴＰ、１．３５ｍＭ  ＵＴＰ、８．８５ｍＭ  ｒＧＴＰ、０．２６ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、５％ｖ／ｖグリセロール、２．９％トレハロース、０．２２５％エ���ノール、０．０７５％メチルパラベン、０．０１５％プロピルパラベン、および０．００２％フェノールレッド（ｐＨ７．５〜７．６）。プライマーおよび／またはプローブを増幅試薬中の反応混合物に添加するか、増幅試薬から分離することができる。増幅反応混合物中で使用される酵素は、反応あたり約９０Ｕ／μｌのＭＭＬＶ逆転写酵素（ＲＴ）および２０Ｕ／μｌのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼであった（１ＵのＲＴは、２００〜４００マイクロモルのオリゴｄＴプライミングポリＡテンプレートを使用して、３７℃で１０分間に１ｎｍｏｌのｄＴＴＰを組み込み、１ＵのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡテンプレート中のＴ７プロモーターを使用して、３７℃で１時間に、１ｎｍｏｌのＡＴＰをＲＮＡに組み込む）。
【００７９】
増幅反応の終了時に標識プローブの使用によって結果を検出する典型的なＴＭＡ反応プロトコールを以下に示す。ＴＭＡ反応は、以前に詳述された手順を実質的に使用する（Ｋａｃｉａｎらに付与された米国特許第５，３９９，４９１号および同第５，５５４，５１６号）。簡潔に述べれば、増幅試薬、標的核酸、および増幅オリゴマー（例えば、反応あたり１５ｐｍｏｌの各オリゴマー）を含む反応混合物（例えば、０．０８ｍｌ）を混合し、シリコンオイル（０．２ｍｌ）で覆って蒸発を防止し、６２℃で１０分間、その後に４２℃で５分間インキュベートし、酵素試薬（０．０２５ｍｌ、逆転写酵素およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを含む）を添加し、反応混合物を４２℃で６０分間インキュベートした。増幅後、増幅産物の検出は、増幅産物に特異的なアクリジニウムエステル（ＡＥ）標識検出プローブオリゴマーと増幅混合物を混合する工程を含んでいた（例えば、０．１ｐｍｏｌ／反応を含む０．１ｍｌのプローブ試薬、すなわち、ハイブリッド形成標識プローブから許容可能な範囲（２，０００，０００相対発光量（「ＲＬＵ」）までなど）で最大の検出可能なシグナルを生成するために以前に決定された量）。実質的に記載のように、プローブおよび増幅配列の混合物をインキュベートして、プローブを増幅産物に結合させ、次いで、処理して、ハイブリッド形成プローブから化学発光シグナルを生成した（米国特許第５，２８３，１７４号および同第５，６３９，６０４号）。簡潔に述べれば、プローブおよび増幅産物混合物を、６２℃で２０分間インキュベートし、次いで、室温で約５分間冷却し、選択試薬（０．２５ｍｌ）を添加し、混合し、６２℃で１０分間、室温で１５分間インキュベートし、非結合プローブ上のＡＥ標識を加水分解した。結合プローブ上のＡＥの化学発光を、検出試薬Ｉの添加、インキュベーション、検出試薬ＩＩの添加、および照度計（例えば、ＬＥＡＤＥＲ（Ｒ），Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）での化学発光の測定によって得た。
【００８０】
リアルタイムで結果を検出するＴＭＡ反応の一般的なプロトコールを以下に示す。アッセイは、増幅前の標的核酸の精製、増幅、および増幅中の増幅産物の検出を含む。標的捕獲を、実質的に以前に詳述するように行う（Ｗｅｉｓｂｕｒｇらに付与された米国特許第６，１１０，６７８号、同第６，２８０，９５２号、および同第６，５３４，２７３号）。簡潔に述べれば、既知量の標的ＲＮＡを含むようにサンプルを調製した（総体積が０．２ｍｌの水およびサンプル輸送媒体の１：１（ｖ：ｖ）混合物中のサンプルあたりの所定のコピーレベルで存在するｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物（「ＩＶＴ」））。各サンプルを、捕獲すべき分析核酸に特異的で（すなわち、３’標的特異的結合領域）、固定プローブ（例えば、常磁性粒子に結合したポリＴオリゴマー；反応あたり結合したオリゴマーを有する１２．５μｇの粒子）への結合のための５’テール領域（例えば、ｄＴ３Ａ３０配列）を有する５〜１５ｐｍｏｌの標的捕獲オリゴマー（ＴＣＯ）、各分析物のためのＴＳＵプライマーおよびＴＳＵプロモータープライマーまたはプロバイダー配列を含む５〜１５ｐｍｏｌのＴＳＵプライマーおよび／または複合体（最初の増幅期用）、ならびに任意に２〜５ｐｍｏｌのブロッカーオリゴマー（ｒＴＭＡ増幅反応用）を典型的に含む０．０５ｍｌのＴＣＲと混合した。混合物を、６０℃±１℃で２５〜３０分間、次いで、室温（２０〜２５℃）で２５〜３０分間インキュベートして、ハイブリッド形成複合体を形成する。得られた標的核酸を常磁性粒子に結合し、これを磁気選別（例えば、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ９６（ＴＭ）磁性粒子プロセッサー、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）の使用によって単離し、ＴＣ洗浄液を使用して１回洗浄した。粒子を、第２の増幅期で使用する増幅オリゴヌクレオチド（例えば、ＴＳプライマー、ユニバーサルプライマー、３’遮断ユニバーサルプロモータープロバイダー）と共に０．０６〜０．１ｍｌの増幅試薬中に再懸濁した。検出プローブ（例えば、蛍光標識化合物で標識した分子ビーコンまたは分子トーチプローブ）を、増幅オリゴヌクレオチドと共に添加するか、酵素添加時または酵素添加後に添加することができる。反応混合物を覆って蒸発を防止し、４２±０．５℃で１〜２分間インキュベートした。４２±０．５℃に保持しながら混合物の覆いを取り、混合物あたり０．０２ｍｌの酵素試薬と混合し、再度覆い、４２±０．５℃で３０〜９０分間インキュベートし、その間にデータ収集および表示のために「サイクル」と呼ばれる規則的な間隔（例えば、毎分）で蛍光を測定する。このデータ表示は、典型的には、検出された蛍光単位対時間（サイクル）のグラフであり、このグラフからシグナル出現時間（すなわち、サンプルの蛍光シグナルがバックグラウンドレベル（通常は、アッセイのために予め決定する）を超えて陽性になる時間）を決定した。
【実施例】
【００８１】
（実施例１）
複数のＨＰＶ型の検出のためのユニバーサルＴＭＡ（ｕＴＭＡ）系
本実施例は、高リスクの子宮頸癌発症に関連する少なくとも１２のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）型（高リスクＨＰＶ型）を検出するための系における「ハーフｕＴＭＡ（ｈａｌｆ  ｕＴＭＡ）」と呼ばれるユニバーサル等温増幅の実施形態の能力を示す。標的は、２００または１，０００コピー／反応（ｃ／ｒｘｎ）の指定のＨＰＶ型の１つのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物であった。標的捕獲、増幅、およびハイブリッド形成防御アッセイ（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）（ＨＰＡ）の使用によるプローブ検出の全てを、実質的に以前に記載のように行った（標的捕獲についての米国特許第６，１１０，６７８号および同第６，５３４，２７３号、ＴＭＡについての米国特許第５，３９９，４９１号および同第５，５５４，５１６号、ならびにＨＰＶについての米国特許第５，２８３，１７４号および同第５，６３９，６０４号）。標的捕獲混合物は、ＴＣ試薬中に、２ｐｍｏｌの配列番号２８〜３２の各標的捕獲オリゴヌクレオチドを含んでいた。標的捕獲混合物は、５ｐｍｏｌの配列番号１〜９の各ＨＰＶ  ＴＳＵ  Ｔ７  プロモータープライマーをさらに含んでいた。これらの各プライマーは、標的特異的領域、ユニバーサルＴ７プライマー配列、およびＴ７プロモーター領域を含んでいた。増幅緩衝液は、ＴＭＡ実施のための試薬＋各１５ｐｍｏｌの配列番号３３のユニバーサルＴ７プライマーおよび配列番号１０〜１３のＴＳ（標的特異的）非Ｔ７プロモーターを含んでいた。
【００８２】
６２℃でのハイブリッド形成を含む標的捕獲工程中、捕獲オリゴヌクレオチドおよびＴＳＵ  Ｔ７プロモータープライマーはその特異的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物とハイブリッド形成し、全てのハイブリッド非形成プライマーを、洗浄工程中に除去した。標的捕獲後、標的鎖およびハイブリッド形成ＴＳＵプライマーを含む結合複合体を有する磁性ビーズを、プライマー、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、およびＮＴＰを含む増幅試薬と混合し、次いで、４２℃で６０分間インキュベートした。第１の反応工程（最初の増幅期）では、ユニバーサルＴ７プライマー領域およびＨＰＶ標的特異的結合領域を組み込んだｃＤＮＡ転写テンプレートを作製する。反応中でのユニバーサルＴ７プロモータープライマーおよび標的に特異的な非Ｔ７プライマーの使用によって、（第２の増幅期で）増幅を進行させる。配列番号２０〜２７の標的特異的アクリジニウムエステル（ＡＥ）標識プローブ混合物の使用により、ＨＰＡによってＲＮＡアンプリコンを検出した。アンプリコン標的とハイブリッド形成しない全てのプローブを、ＨＰＡ手順中の選択試薬の使用によって加水分解し、非化学発光性にした。プローブをアンプリコン標的に結合し、加水分解から保護した。ＨＰＡ検出を、検出試薬の使用によって行い、得られた化学発光シグナルを測定し、相対発光量（ＲＬＵ）で示した。
【００８３】
表１は、１２の高リスクＨＰＶ型、４つの低リスクＨＰＶ型、および標的を添加しなかった陰性反応物について得たＲＬＵシグナル（平均３回反復）を示す。陽性反応を、２０，０００より高いＲＬＵについてスコアリングした。本実施形態では、１，０００ｃ／ｒｘｎで陽性であったＨＰＶ４５以外の全ての高リスクＨＰＶ型を、２００ｃ／ｒｘｎで首尾よく検出した。試験した低リスクＨＰＶ型から、陽性シグナルは得られなかった。
【００８４】
【表１】
0005980164.tif 000008
（実施例２）
高リスクＨＰＶ型の検出のためのユニバーサルＴＭＡ系の感度
本実施例は、１２の高リスクＨＰＶウイルス型を検出するための２つのユニバーサル配列を含む系における「全ｕＴＭＡ（ｆｕｌｌ  ｕＴＭＡ）」と呼ばれるユニバーサル等温増幅の実施形態の能力を示す。標的は、２００または２，０００コピー／反応の指定のＨＰＶ型の１つのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物であった。標的捕獲、増幅、およびＨＰＡ検出工程の全てを、異なるＴＳＵプライマーの組み合わせを使用すること以外は実施例１に実質的に記載のように行った。標的捕獲混合物は、２ｐｍｏｌの配列番号２８、２９、３０、３１、および３２の各ＴＣオリゴヌクレオチドを含んでいた。標的捕獲混合物は、１２の高リスクＨＰＶ型を検出するためにデザインされたＳ−オリゴヌクレオチドＴＳＵプライマー複合体をさらに含んでいた。ＴＳＵプライマー複合体を、５ｐｍｏｌのＴＳＵ  Ｔ７プロモータープライマーと１０ｐｍｏｌの配列番号３５のＳ−オリゴヌクレオチドおよび１５ｐｍｏｌの対応するＴＳＵ非Ｔ７プライマーとのハイブリッド形成によって形成した。Ｓ−オリゴヌクレオチドプライマー複合体は、以下のＴＳＵ  Ｔ７プロモータープライマーおよびＴＳＵ非Ｔ７プライマーの組み合わせを有するハイブリッド形成複合体中の配列番号３５のＳ−オリゴヌクレオチドからなる：配列番号１および１４、配列番号２および１４、配列番号３および１４（ＨＰＶ型の関連群に指向する３つのＴＳＵ  Ｔ７プライマーのために同一のＴＳＵ非Ｔ７プライマーを使用した）、配列番号４および１５、配列番号５および１６、配列番号６および１７、配列番号７および１８、配列番号８および１５、および配列番号９および１５（ＨＰＶ型の関連群に指向する両方のＴＳＵ  Ｔ７プライマーのために同一のＴＳＵ非Ｔ７プライマーを使用した）。各ＴＳＵ  Ｔ７プロモータープライマーは、標的特異的領域、ユニバーサルＴ７プライマー配列、およびＴ７プロモーター領域を含んでいた。各ＴＳＵ非Ｔ７プライマーは、標的特異的領域およびユニバーサル非Ｔ７プライマー配列を含んでいた。各Ｓ−オリゴヌクレオチドプライマー複合体を個別に形成した後、これらを標的捕獲混合物中で組み合わせた。増幅緩衝液は、１５ｐｍｏｌの配列番号３３のユニバーサルＴ７プロモータープライマーおよび配列番号３４のユニバーサル非Ｔ７プライマーを含んでいた。
【００８５】
６２℃での標的捕獲ハイブリッド形成中、捕獲オリゴヌクレオチドおよびＳ−オリゴヌクレオチドプライマー複合体のＴＳＵ  Ｔ７プロモータープライマーをその特異的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物とハイブリッド形成させ、全ての非ハイブリッド形成プライマーおよびＳ−オリゴヌクレオチドプライマー複合体を、洗浄工程で除去した。標的捕獲後、結合した標的プライマー複合体を有する磁性ビーズを、ユニバーサルプライマー、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、およびＮＴＰを含む増幅試薬と混合し、４２℃で６０分間インキュベートした。増幅反応の第１の工程では、ユニバーサルＴ７プライマー領域およびユニバーサル非Ｔ７プライマー結合領域を組み込んだｃＤＮＡ転写テンプレートを作製し、ユニバーサルＴ７および非Ｔ７プライマーの使用によって増幅を進行させた。上記のように、配列番号２０〜２７の標的特異的ＡＥ標識プローブの混合物の使用により、ＨＰＡによってＲＮＡアンプリコンを検出した。アンプリコン標的とハイブリッド形成しない全てのプローブを、ＨＰＡ手順中に加水分解し、非化学発光性にした。プローブをアンプリコン標的に結合し、加水分解から保護した。ＨＰＡ検出を上記のように行い、得られた化学発光シグナルを測定し、相対発光量（ＲＬＵ）で示した。
【００８６】
表２は、１２の高リスクＨＰＶ型および標的を添加しなかった陰性反応物について得たシグナル（平均３回反復）を示す。陽性反応を、２０，０００より高いＲＬＵについてスコアリングした。本実施形態では、２，０００コピー／反応で陽性であったＨＰＶ  ３１以外の全ての高リスクＨＰＶ型を、２００ｃ／ｒｘｎで首尾よく検出した。他の実験（データ示さず）では、低リスクＨＰＶ型は検出されなかった。
【００８７】
【表２】
0005980164.tif 000009
（実施例３）
ｕＴＭＡ系を使用した臨床サンプル由来のＨＰＶ  ＲＮＡの検出
本実施例は、実施例２に記載の「全ｕＴＭＡ」系がアルコールベースの液体媒体（ＣＹＴＹＣ（商標））中に保存された頸部スワブまたは擦過サンプル由来のＨＰＶ  ＲＮＡを検出することができることを示す。標的捕獲反応中で１００μｌの液体媒体サンプルを５００μｌの標的捕獲混合物に添加すること以外は、実施例２に記載のように手順を行った。
【００８８】
高リスクＨＰＶおよび低リスクＨＰＶの両方の存在をＨＰＶ  ＤＮＡ  ＰＣＲによって決定し、アガロースゲル電気泳動による分離後にバンドとして視覚化した。サンプル中に存在する任意のＨＰＶウイルスＲＮＡの同一性を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。全ｕＴＭＡ系を使用して２０，０００ＲＬＵを超えて産生されたサンプルを、陽性としてスコアリングした。表３は、ＨＰＶ型と全ｕＴＭＡ増幅の結果との間の相関を示す。高度に視覚可能なバンドが得られた陽性ＰＣＲを、「＋」とスコアリングし、弱いバンドを「＋／−」とスコアリングし、陰性の結果（視覚可能なバンドなし）を「−」とスコアリングした（「ｎｄ」は、測定せずを意味する）。本実施例で使用した全ｕＴＭＡ  ＨＰＶ系を、感度または特異性について至適化しなかったが、本研究で、３４個の頸部サンプルのうちの２９個が正確にスコアリングされた。サンプル６および２６は、おそらく、ＨＰＶ  ＲＮＡ量が低かったので、検出されなかった。
【００８９】
【表３】
0005980164.tif 000010
（実施例４）
逆標準ＴＭＡを使用した単一または多重様式でのＰＣＡ３  ＲＮＡの検出
本実施例では、標準的な（すなわち、非ユニバーサルの）形式で逆ＴＭＡ（ＲＳ−ＴＭＡ）を行った。アッセイを、ＰＣＡ３の標的捕獲、増幅および検出に必要なオリゴヌクレオチドのみを含む単一様式、またはＰＣＡ３およびＰＳＡの両方の標的捕獲、増幅および検出に必要なオリゴヌクレオチドを含む多重様式のいずれかで行った。アッセイを、上記の一般的なプロトコールと実質的に同等に行った。具体的には、ＰＣＡ３  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物（ＩＶＴ；配列番号６２）を、反応あたり１０６、１０４、または１０２コピーで水／ＳＴＭ（１：１）に加えた。単一様式で実施したサンプルについて、５ｐｍｏｌ  ＰＣＡ３  ＴＣプローブ（配列番号５３）、２ｐｍｏｌ  ＰＣＡ３ブロッカー（配列番号５１）、および５ｐｍｏｌのＰＣＡ３非Ｔ７（ＮＴ７）プライマー（配列番号４９）をＴＣＲに添加し、１５ｐｍｏｌのＰＣＡ３非Ｔ７（ＮＴ７）プライマー（配列番号４９）、１０ｐｍｏｌのＰＣＡ３  Ｔ７プロモータープロバイダー（配列番号５０）、および１２ｐｍｏｌ  ＰＣＡ３分子トーチ（配列番号５２）を増幅試薬に添加した（本実施例および他の実施例においてここでおよび後に示す量は、別途示さない限り、反応あたりの量である）。多重様式で実施したサンプルについて、上記列挙のＰＣＡ３オリゴマーに加えて、５ｐｍｏｌ  ＰＳＡ  ＴＣプローブ（配列番号６０）、２ｐｍｏｌ  ＰＳＡブロッカー（配列番号５８）、および５ｐｍｏｌのＰＳＡ  ＮＴ７プライマー（配列番号５６）もＴＣＲに添加し、１５ｐｍｏｌのＰＳＡ  ＮＴ７プライマー（配列番号５６）、１０ｐｍｏｌのＰＳＡ  Ｔ７プロモータープロバイダー（配列番号５７）、および１２ｐｍｏｌ  ＰＳＡ分子トーチ（配列番号５９）を増幅試薬に添加した。各サンプルについて、３または４回繰り返した。
【００９０】
アッセイ完了後、各条件についての蛍光対時間のプロットを準備し（図１９）、平均出現時間を決定した（表４）。
【００９１】
【表４】
0005980164.tif 000011
これらの結果は、単一様式でＲＳ−ＴＭＡがＰＣＡ３  ＲＮＡを容易に検出したことを証明する。しかし、多重様式（単一様式で存在するＰＣＡ３特異的オリゴヌクレオチドに加えて存在するＰＳＡ特異的オリゴヌクレオチド）では、ＰＣＡ３の検出は深刻に妨害された。事実上、１０２および１０４コピーのＰＣＡ３は、このアッセイ条件下で検出不可能であった。これは、当該分野で公知の多重増幅反応に伴う問題を証明している。
【００９２】
ＰＣＡ３量が出現時間に直接関連するので、これらの結果は、ＲＳ−ＴＭＡが標的レベルを定量する能力をさらに証明する。ＲＳ−ＴＭＡ法の１つの欠点は、ＰＣＡ３の比較的大きなコピーレベルの相違において、出現時間の差がわずかであることである（すなわち、１００倍異なるＰＣＡ３コピーレベルの間で、出現時間の差は３分である）。これにより、ＲＳ−ＴＭＡ法がコピーレベルの小さな差異（例えば、３倍）を正確に区別する能力が低下する。
（実施例５）
逆ユニバーサル（ハーフ）ＴＭＡを使用した単一様式および多重様式でのＰＣＡ３  ＲＮＡの検出
本実施例では、ユニバーサル（ハーフ）ＴＭＡ形式で逆ＴＭＡを行った（ＲＵｈ−ＴＭＡ）。本形式では、特異的標的結合領域およびオリゴヌクレオチドの５’末端のユニバーサル領域を含む標的特異的ユニバーサルＮＴ７プライマー（ＴＳＵ  ＮＴ７）を、標的捕獲工程で標的に結合する。過剰なＴＳＵ−ＮＴ７を、洗い流す。ＴＳＵ−ＮＴ７は、多重アッセイで検出すべき各分析物のための標的捕獲工程に含まれる。増幅反応では、ユニバーサルＮＴ７プライマー（全ＴＳＵ−ＮＴ７プライマーのユニバーサル配列と同一の配列）を添加し、これを、多重反応で検出すべき全分析物の増幅におけるＮＴ７プライマーとして使用する。増幅反応でも、標的特異的Ｔ７プロモータープロバイダー（ＴＳ−Ｔ７）を、多重アッセイで検出すべき各標的のために添加する。この形式の略図を図１５に示す。
【００９３】
下記以外は上記実施例４に記載のプロトコールと実質的に同等にアッセイを行った。具体的には、ＰＣＡ３  ＴＳＵ−ＮＴ７プライマー（５ｐｍｏｌ；配列番号４８）およびＰＳＡ  ＴＳＵ−ＮＴ７プライマー（５ｐｍｏｌ：配列番号５５）を、それぞれ実施例４で引用したＰＣＡ３およびＰＳＡ  ＴＳ−ＮＴ７プライマーの代わりにＴＣＲに添加した。さらに、ユニバーサルＮＴ７プライマー（１５ｐｍｏｌ；配列番号６４）を、単一様式ではＰＣＡ３  ＴＳ−ＮＴ７プライマーの代わりに増幅反応物に添加し、多重様式ではＰＣＡ３およびＰＳＡ  ＴＳ−ＮＴ７プライマーの両方の代わりに添加した。全ての他の条件は、実施例５に示す条件と同一であった。アッセイ完了後、平均出現時間を決定した（表５）。
【００９４】
【表５】
0005980164.tif 000012
これらの結果は、ＲＵｈ−ＴＭＡ形式がＰＣＡ３  ＲＮＡを容易に検出したことを証明する。単一様式では、出現時間は、ＲＳ−ＴＭＡ形式を使用して得た対応する出現時間よりいくらか遅い。これは、定量に関して好ましく、実施例４で引用したＲＳ−ＴＭＡに伴う問題の解決に役立つ（すなわち、ＲＳ−ＴＭＡ法における、コピーレベルの小さな差異（例えば、３倍）を正確に区別する能力の低さ）。多重様式では、ＲＳ−ＴＭＡ系で認められる妨害の大部分が克服され、試験した全レベルのＰＣＡ３  ＲＮＡが容易に検出される。
（実施例６）
Ｓ−オリゴ形式で逆ユニバーサル（全）ＴＭＡ（ＲＵｆ−ＴＭＡ）を使用した単一様式および多重様式でのＰＣＡ３  ＲＮＡの検出
本実施形態では、ユニバーサル（全）ＴＭＡ形式で逆ＴＭＡを行った（ＲＵｈ−ＴＭＡ）。ユニバーサル（全）ＴＭＡでは、ＴＳＵ−ＮＴ７およびＴＳＵ−Ｔ７プロバイダーから増幅を開始し、その後の増幅ラウンドを、ユニバーサルＮＴ７プライマーおよびユニバーサルＴ７プロバイダーによって駆動する。開始に必要なプライマーおよびプロバイダーを有する各標的を準備し、依然として増幅反応ではユニバーサルプライマーおよびプロバイダーのみを含むように、ＴＳＵ  ＮＴ７プライマーおよびＴＳＵ  Ｔ７プロバイダーを合わせ、この複合体を標的捕獲工程で（ＴＳＵ−ＮＴ７の標的特異的領域の標的とのハイブリッド形成を介して）標的に結合し、過剰な複合体を洗い流す。増幅では、ＴＳＵ−ＮＴ７プライマーを伸長し、ＲＮアーゼＨを介した標的の消化後、ＴＳＵ−ＮＴ７プライマーに連結したＴＳＵ−Ｔ７プロバイダーの標的特異的領域はｃＤＮＡに結合し、増幅を開始する。増幅試薬中に存在するユニバーサルＮＴ７プライマーおよびＴ７プロバイダーを使用して、増幅を継続する。
【００９５】
本実施例に記載のＲＵｆ−ＴＭＡのＳ−オリゴ様式では、ＴＳＵ−ＮＴ７プライマーおよびＴＳＵ−Ｔ７プロバイダーを、図１６に概略的に示す介在「Ｓ−オリゴ」とのその両方のハイブリッド形成によって連結する。このＳ−オリゴ複合体を、多重アッセイ中に含まれるように各分析物について予め形成し、次いで、その全てを、ＮＴ７プライマーを上記のＲＳ−およびＲＵｈ−ＴＭＡ形式中に添加する様式でＴＣＲに添加する。
【００９６】
下記以外は上記実施例４に記載のプロトコールと実質的に同等に本実施例中のアッセイを行った。具体的には、アッセイの多重部分は、ＰＣＡ３およびＰＳＡだけでなくＡＭＡＣＲの標的捕獲、ユニバーサル増幅およびリアルタイムに必要なオリゴヌクレオチド検出を含んでいた。ＰＣＡ３  Ｓ−オリゴ複合体を、５ｐｍｏｌのＰＣＡ３  ＴＳＵ−ＮＴ７プライマー（配列番号４８）、７．５ｐｍｏｌ  Ｓ−オリゴ（配列番号６６）、および１０ｐｍｏｌ  ＰＣＡ３  ＴＳＵ−Ｔ７プロバイダー（配列番号５０）の混合によって調製し、この場合、ＴＳ−およびＴＳＵ−Ｔ７プロバイダーは、水／ＳＴＭ／ＴＣＲ（１／１／０．５）中の同一物である。さらに、ＰＳＡ  Ｓ−オリゴ複合体を、５ｐｍｏｌのＰＳＡ  ＴＳＵ−ＮＴ７プライマー（配列番号５５）、７．５ｐｍｏｌ  Ｓ−オリゴ（配列番号６６）、および１０ｐｍｏｌ  ＰＳＡ  ＴＳＵ−Ｔ７プロバイダー（配列番号５７）の混合によって調製した。ＡＭＡＣＲ  Ｓ−オリゴ複合体を、５ｐｍｏｌのＡＭＡＣＲ  ＴＳＵ−ＮＴ７プライマー（配列番号３６）、７．５ｐｍｏｌ  Ｓ−オリゴ（配列番号６６）、および１０ｐｍｏｌ  ＡＭＡＣＲ  ＴＳＵ−Ｔ７プロバイダー（配列番号３７）の混合によって調製した。混合物を室温で３０分間インキュベートして、複合体を形成させた。ＰＣＡ３およびＰＳＡ  ＴＣプローブおよびブロッカーを、実施例５と同様にＴＣＲに添加した。さらに、ＡＭＡＣＲ  ＴＣプローブ（５ｐｍｏｌ；配列番号４０）およびＡＭＡＣＲブロッカー（２ｐｍｏｌ；配列番号３８）もＴＣＲに添加した。ＰＣＡ３およびＰＳＡ  Ｓ−オリゴ複合体（それぞれ５ｐｍｏｌ）を、それぞれＰＣＡ３およびＰＳＡ  ＴＳ−ＮＴ７プライマーの代わりにＴＣＲに添加した。ＡＭＡＣＲ  Ｓ−オリゴ複合体（５ｐｍｏｌ）もＴＣＲに添加した。ＰＣＡ３およびＰＳＡ分子トーチを、実施例５と同様に増幅試薬に添加した。さらに、ＡＭＡＣＲ分子トーチ（１２ｐｍｏｌ；配列番号３９）を、増幅試薬に添加した。ＴＳ−ＮＴ７プライマーおよびＴＳ−Ｔ７プロバイダーの代わりに、ユニバーサルＮＴ７プライマー（１５ｐｍｏｌ；配列番号６４）およびユニバーサルＴ７プロバイダー（１０ｐｍｏｌ；配列番号６５）を増幅試薬に添加した。全ての他の条件は、実施例４と同一であった。
【００９７】
アッセイ完了後、平均出現時間を決定した（表６）。
【００９８】
【表６】
0005980164.tif 000013
これらの結果は、Ｓ−オリゴ様式におけるＲＵｆ−ＴＭＡ形式がＰＣＡ３  ＲＮＡを容易に検出したことを証明する。単一様式では、出現時間は、ＲＳ−ＴＭＡ形式を使用して得た対応する値より有意に遅く、異なるコピーレベル間の時間は有意により長い。これらの特徴は定量に関して好ましく、実施例５で引用したＲＳ−ＴＭＡに伴う問題（すなわち、ＲＳ−ＴＭＡ法では、コピーレベルの小さな差異（例えば、３倍）を正確に区別する能力が低いこと）の解決に役立つ。多重様式では、ＲＳ−ＴＭＡ系で認められる妨害の大部分が克服され、試験した全レベルのＰＣＡ３  ＲＮＡが容易に検出される。
（実施例７）
単一様式および多重様式でのＰＣＡ３  ＲＮＡの検出
本実施形態では、実施例６と非常に類似したユニバーサル（全）ＴＭＡ形式で逆ＴＭＡ（ＲＵｈ−ＴＭＡ）を行った。しかし、Ｓ−オリゴ複合体を介する代わりに、直接ハイブリッド形成オリゴ（ＤＨ−オリゴ）複合体を使用してＴＳＵ  ＮＴ７プライマーおよびＴＳＵ  Ｔ７プロバイダーを相互に連結した。この様式では、ＴＳＵ  ＮＴ７プライマーおよびＴＳＵ  Ｔ７プロバイダーを、Ｓ−オリゴ複合体のような介在配列を使用せずに相互に直接ハイブリッド形成する。図１７は、ＤＨ−オリゴ複合体の例を示し、この場合、Ｔ７プロバイダーのＴ７プロモーター領域を介して生じる結合を有する。
【００９９】
下記以外は上記実施例６に記載のプロトコールと実質的に同等に本実施例のアッセイを行った。具体的には、ＰＣＡ３  ＤＨ−オリゴ複合体を、水／ＳＴＭ／ＴＣＲ（１／１／０．５）中での５ｐｍｏｌのＰＣＡ３  ＤＨ−ＴＳＵ−ＮＴ７プライマー（配列番号５４）および５ｐｍｏｌ  ＰＣＡ３  ＴＳＵ−Ｔ７プロバイダー（配列番号５０）の混合によって調製した。さらに、ＰＳＡ  ＤＨ−オリゴ複合体を、５ｐｍｏｌのＰＳＡ  ＤＨ−ＴＳＵ−ＮＴ７プライマー（配列番号６１）および５ｐｍｏｌ  ＰＳＡ  ＴＳＵ−Ｔ７プロバイダー（配列番号５７）の混合によって調製した。混合物を室温で３０分間インキュベートして、複合体を形成させた。ＴＣプローブおよびブロッカーを、実施例６と同様にＴＣＲに添加するが、ＰＣＡ３およびＰＳＡ  ＤＨ−オリゴ複合体（各５ｐｍｏｌ）を、それぞれＰＣＡ３およびＰＳＡ  Ｓ−オリゴ複合体の代わりにＴＣＲに添加した。総増幅体積が０．０８ｍＬの代わりに０．０４ｍＬ（０．０３ｍＬ増幅試薬および０．０１ｍＬ  酵素試薬）であること以外は、全ての他の条件は実施例６と同一であった。アッセイ完了後、平均出現時間を決定した（表７）。
【０１００】
【表７】
0005980164.tif 000014
これらの結果は、ＤＨ−オリゴ様式におけるＲＵｆ−ＴＭＡ形式がＰＣＡ３  ＲＮＡを容易に検出したことを証明する。単一様式では、出現時間は、ＲＳ−ＴＭＡ形式を使用して得た対応する値より有意に遅く、異なるコピーレベル間の時間は有意により長い。これらの特徴は定量に関して好ましく、実施例４で引用したＲＳ−ＴＭＡに伴う問題（すなわち、ＲＳ−ＴＭＡ法ではコピーレベルの小さな差異（例えば、３倍）を正確に区別する能力が低いこと）の解決に役立つ。多重様式では、ＲＳ−ＴＭＡ系で認められる妨害の大部分が克服され、試験した全レベルのＰＣＡ３  ＲＮＡが容易に検出される。単一アッセイおよび多重アッセイの両方についての出現時間対ＰＣＡ３コピーレベルのプロットは、優れた相関係数が得られ（単一Ｒ２＝１．０００；多重Ｒ２＝１．０００）、これらのアッセイの定量性が証明された。
（実施例８）
ＣＬ−オリゴ形式で逆ユニバーサル（全）ＴＭＡ（ＲＵｆ−ＴＭＡ）を使用した単一様式および多重様式でのＰＣＡ３  ＲＮＡの検出
本実施形態では、実施例６の記載と非常に類似したユニバーサル（全）ＴＭＡ形式で逆ＴＭＡ（ＲＵｆ−ＴＭＡ）を行った。しかし、Ｓ−オリゴ複合体を介する代わりに、共有結合オリゴ（ＣＬ−オリゴ）複合体を使用してＴＳＵ  ＮＴ７プライマーおよびＴＳＵ  Ｔ７プロバイダーを相互に連結した。この様式では、ＴＳＵ  ＮＴ７プライマーおよびＴＳＵ  Ｔ７プロバイダーを、各オリゴマーの５’末端で相互に共有結合する。種々の方法を使用して、かかる結合を行うことができる。１つの可能なスキームの例を、図１８に概略的に示す。この場合、ＮＴ７プライマーおよびＴ７プロバイダーを、２オリゴマー間の２つのＣ９リンカーを使用して、５’−５’で連結する。
【０１０１】
下記以外は上記実施例６に記載のプロトコールと実質的に同等に本実施例のアッセイを行った。具体的には、アッセイの多重部分は、ＰＣＡ３およびＰＳＡだけでなくＡＭＡＣＲおよびＣＡＰ２の標的捕獲、ユニバーサル増幅、およびリアルタイム検出に必要なオリゴヌクレオチドを含んでいた。各分析物のためのＣＬ−オリゴを、一般に、以下のように調製した：ＮＴ７プライマーおよびＴ７プロバイダーを、以下に列挙のもの以外は標準的なホスホルアミダイト試薬（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用し、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して合成した。Ｔ７プロバイダーを、５’−アルデヒド（特に、ＳｏｌｕＬｉｎｋ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａのホスホルアミダイト）および逆極性ｄＣ（特に、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＣｏｎｔｒｏｌ  Ｐｏｒｅ  Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）試薬）を使用して合成した。ＮＴ７プライマーを、５’Ｃ６  アミノリンカー（Ｇｌｅｎ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して合成した。両オリゴに、標準的条件を使用して、切断および脱保護を行った。次いで、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４０）中での室温で２時間のヒドラジン−ＮＨＳエステル（ＳｏｌｕＬｉｎｋ）とのインキュベーションによって、二官能性スペーサーをＮＴ７プライマーに結合した。次いで、反応混合物を、酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５．１）を使用して沈殿させ、ペレットを、１０％過剰の５’アルデヒド修飾Ｔ７プロバイダーを含む１００ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ  ４．８）中に溶解した。この混合物を、室温で一晩静置し、その後に脱塩し、ＰＡＧＥによって精製した。
【０１０２】
ＣＬ−オリゴ複合体を構築するために使用したオリゴヌクレオチドの配列番号を表８に示す。
【０１０３】
【表８】
0005980164.tif 000015
ＰＣＡ３およびＰＳＡ  ＴＣプローブおよびブロッカーを、実施例７と同様にＴＣＲに添加するが、ＰＣＡ３およびＰＳＡ  ＤＨ−オリゴ複合体を、ＰＣＡ３およびＰＳＡ  ＣＬ−オリゴ複合体（各５ｐｍｏｌ）とそれぞれ置換した。さらに、ＡＭＡＣＲ  ＴＣプローブ（５ｐｍｏｌ；配列番号４０）、ＡＭＡＣＲブロッカー（２ｐｍｏｌ、配列番号３８）、ＣＡＰ２  ＴＣプローブ（５ｐｍｏｌ；配列番号４６）、およびＣＡＰ２ブロッカー（２ｐｍｏｌ、配列番号４４）もＴＣＲに添加した。さらに、実施例７に列挙したオリゴヌクレオチドに加えて、ＡＭＡＣＲ分子トーチ（１２ｐｍｏｌ；配列番号３９）およびＣＡＰ２  分子トーチ（１２ｐｍｏｌ；配列番号４５）も増幅試薬に添加した。全ての他の条件は、実施例７に示す条件と同一であった。アッセイ完了後、平均出現時間を決定した（表９）。
【０１０４】
【表９】
0005980164.tif 000016
これらの結果は、ＣＬ−オリゴ様式におけるＲＵｆ−ＴＭＡ形式がＰＣＡ３  ＲＮＡを容易に検出したことを証明する。単一様式では、出現時間は、ＲＳ−ＴＭＡ形式を使用して得た対応する値より有意に遅く、異なるコピーレベル間の時間は有意により長い。これらの特徴は定量に関して好ましく、実施例５で引用したＲＳ−ＴＭＡに伴う問題（すなわち、ＲＳ−ＴＭＡ法ではコピーレベルの小さな差異（例えば、３倍）を正確に区別する能力が低いこと）の解決に役立つ。多重様式（本実施例では四重）では、ＲＳ−ＴＭＡ系で認められる妨害の大部分が克服され、試験した全レベルのＰＣＡ３  ＲＮＡが容易に検出される。
【図１】
0005980164.tif 000017
【図２】
0005980164.tif 000018
【図３】
0005980164.tif 000019
【図４】
0005980164.tif 000020
【図５】
0005980164.tif 000021
【図６】
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【図７】
0005980164.tif 000023
【図８】
0005980164.tif 000024
【図９】
0005980164.tif 000025
【図１０】
0005980164.tif 000026
【図１１】
0005980164.tif 000027
【図１２】
0005980164.tif 000028
【図１３】
0005980164.tif 000029
【図１４】
0005980164.tif 000030
【図１５】
0005980164.tif 000031
【図１６】
0005980164.tif 000032
【図１７】
0005980164.tif 000033
【図１８】
0005980164.tif 000034
【図１９】
0005980164.tif 000035
【配列表】
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