(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにｉＰＳ細胞を移植した後、２〜６週間飼育して、当該重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの体内で奇形腫を形成させたのち、該奇形腫を体外に取り出し、奇形腫を酵素処理して細胞を分散させ該細胞に蛍光色素結合抗マウスＣＤ１０５抗体または蛍光色素結合抗抗ヒトＣＤ２７１抗体を加えて結合させて、前記抗体の蛍光陽性細胞を分取することを特徴とする間葉系細胞の製法。
【請求項２】
重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにＰｄｘ１遺伝子の転写調節領域と赤色蛍光タンパク質ＲＦＰ遺伝子およびピューロマイシン耐性遺伝子から構成されるＰｄｘ１−ＲＦＰ遺伝子をゲノム中に含むＥＳ細胞を移植した後、２〜６週間飼育して当該重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの体内で奇形腫を形成させたのち、該奇形腫を体外に取り出し、奇形腫を酵素処理して細胞を分散させ、ＲＦＰ陽性の細胞を分取することを特徴とする膵島細胞の製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの体内において、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から奇形腫を介して組織様構造体に分化させて目的とする細胞を製造する方法である。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）といった多能性幹細胞は、体を構成する全ての細胞になることができる。そのため、再生医療の材料として大変な注目を集めている。
【０００３】
また、神経細胞や心筋細胞のような、個人からの採取が困難な細胞を分化誘導できるため、オーダーメードの調剤や創薬、あるいは薬効・安全性試験のセンサーとしても有用である。
【０００４】
上記のような多能性幹細胞の有効性を発揮するためには、目的に合致した細胞種を分化誘導する必要があるが、これまでは、ほぼ唯一の手段として、体外培養下での分化誘導方法が研究、検討されてきた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】再生医療  第８巻／増刊号［通巻３１号］日本再生医療学会総会抄録
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在までに、数多くの体外分化誘導方法が提案されてきたが、依然として有効な誘導方法が確立されている細胞種は少なく、特定の神経細胞や心筋細胞など一部の細胞を除き、確定した分化誘導方法が存在していない。さらに、体外で分化誘導された細胞の機能は、体内で発生した細胞に比して著しく劣ることが多い。
【０００７】
本発明者は、マウスｉＰＳ 細胞から間葉系細胞を体外で分化誘導し、純化する方法を発表した（非特許文献１）が、内分泌系の細胞など、周辺環境の影響を強く受けながら発生する細胞を作製するためには、本来の環境を再現する必要があり、必然的にこれを分化誘導する培養系が複雑化するという問題がある。さらに、体外での分化誘導には成長因子、分化誘導因子、細胞外マトリクスをはじめとした分化促進因子を長期間、多量に添加する必要があることが多く、現状の方法論ではベネフィット（利益）に対するコスト（費用）が過大であるという問題もあった。
【０００８】
本発明の目的は、多能性幹細胞から種々の細胞を簡便に得る方法を提供しようというものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにｉＰＳ細胞を移植した後、２〜６週間飼育して、当該重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの体内で奇形腫を形成させたのち、該奇形腫を体外に取り出し、奇形腫を酵素処理して細胞を分散させ該細胞に蛍光色素結合抗マウスＣＤ１０５抗体または蛍光色素結合抗抗ヒトＣＤ２７１抗体を加えて結合させて、前記抗体の蛍光陽性細胞を分取することを特徴とする間葉系細胞の製法である。
さらに、本発明は、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにＰｄｘ１遺伝子の転写調節領域と赤色蛍光タンパク質ＲＦＰ遺伝子およびピューロマイシン耐性遺伝子から構成されるＰｄｘ１−ＲＦＰ遺伝子をゲノム中に含むＥＳ細胞を移植した後、２〜６週間飼育して当該重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの体内で奇形腫を形成させたのち、該奇形腫を体外に取り出し、奇形腫を酵素処理して細胞を分散させ、ＲＦＰ陽性の細胞を分取することを特徴とする膵島細胞の製法である。
【００１２】
また、本発明は、前記免疫不全動物が重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスであり、前記多能性幹細胞がマウスｉＰＳ細胞であり、分化細胞がマウス膵島細胞であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、多能性幹細胞を免疫不全動物に移植し、体内で奇形種を形成させたのち、該奇形種から目的の細胞を分取するので、体外における細胞の分化誘導に必須である特別な分化誘導因子は一切必要ないという明白な利点がある。また、奇形腫の中では、組織様の構造体として分化するため、従来の体外培養系では誘導が困難であった細胞を容易に獲得できる。
【００１４】
さらに、「すでに形成されている細胞を選択する」という単純な原理に基づくため、複雑な分化誘導方法の開発を待つことなく、即時的に必要な細胞を必要数得ることが期待できるという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の実施態様を模式的に示す図である。
【図２】未分化のマウスｉＰＳ細胞を示す写真である。
【図３】前記重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの両大腿部から回収された２つの奇形腫を示す写真である。
【図４】マウスｉＰＳ細胞から形成された奇形腫を酵素処理し、特異的な抗体で目的細胞を分離していることを示す図および写真であり、図４（１）は、細胞をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ）にて解析した結果を示す図であり、図４（２）は分離されたマウスｉＰＳ細胞に由来する間葉系細胞を示す写真である。
【図５】ヒトｉＰＳ細胞から形成された奇形腫を酵素処理し、特異的な抗体で目的細胞を分離していることを示す図および写真であり、図５（１）は細胞をフローサイトメトリーにて解析した結果を示す図であり、図５（２）は分離されたヒトｉＰＳ細胞に由来する間葉系細胞を示す写真である。
【図６】ヒトｉＰＳ細胞から奇形腫形成を介して作製した間葉系細胞の性質を解析した結果を示す図である。
【図７】マウスＥＳ細胞から形成された奇形腫中のＲＦＰ陽性の膵島細胞が、Ｐｄｘ１遺伝子発現時期依存的にＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）を発現していることを示す写真である。
【図８】マウスＥＳ細胞から形成された奇形腫を酵素処理し、膵島特異的シグナル（Ｐｄｘ１−ＲＦＰ）を利用したＰｄｘ１陽性膵島細胞の分離を示す図である。
【図９】マウスＥＳ細胞から形成され、ＦＡＣＳにて分離したＲＦＰ陽性の膵島細胞が、膵島細胞マーカーであるＧｌｕｃａｇｏｎ、ＩＡＰＰを発現していることを示す図である。
【図１０】マウスＥＳ細胞から形成され、ＲＦＰの発現を利用してＦＡＣＳにて分離したＲＦＰ陽性の膵島細胞がインスリン産生性の特異的なマーカーであるｃ−ｐｅｐｔｉｄｅを発現していることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにｉＰＳ細胞を移植した後、２〜６週間飼育して、当該重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの体内で奇形腫を形成させたのち、該奇形腫を体外に取り出し、奇形腫を酵素処理して細胞を分散させ該細胞に蛍光色素結合抗マウスＣＤ１０５抗体または蛍光色素結合抗抗ヒトＣＤ２７１抗体を加えて結合させて、前記抗体の蛍光陽性細胞を分取することを特徴とする間葉系細胞の製法である。
さらに、本発明は、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにＰｄｘ１遺伝子の転写調節領域と赤色蛍光タンパク質ＲＦＰ遺伝子およびピューロマイシン耐性遺伝子から構成されるＰｄｘ１−ＲＦＰ遺伝子をゲノム中に含むＥＳ細胞を移植した後、２〜６週間飼育して当該重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの体内で奇形腫を形成させたのち、該奇形腫を体外に取り出し、奇形腫を酵素処理して細胞を分散させ、ＲＦＰ陽性の細胞を分取することを特徴とする膵島細胞の製法である（以下では、前記ｉＰＳ細胞およびＰｄｘ１遺伝子の転写調節領域と赤色蛍光タンパク質ＲＦＰ遺伝子およびピューロマイシン耐性遺伝子から構成されるＰｄｘ１−ＲＦＰ遺伝子をゲノム中に含むＥＳ細胞を多能性幹細胞といい、前記間葉系細胞および膵島細胞を分化細胞ということがある）。
【００１７】
図１は、本発明の方法を模式的に示した図であり、図１（１）は培養器中で培養されている多能性幹細胞１、図１（２）は免疫不全マウス２に多能性幹細胞１を移植していること、図１（３）は移植された免疫不全マウス３の体内で奇形腫４が形成されていること、図１（４）は奇形腫４から分離された，成熟した目的の分化細胞５をそれぞれ示す図である。
【００１８】
本発明において、免疫不全動物としては、人為的または先天的にＴ細胞機能免疫またはＢ細胞機能免疫あるいはそれらの双方の機能が著しく低下しているか、欠除している哺乳動物（ヒトを除く）であれば使用することができ、取り扱いの容易なラットまたはマウスが好ましい。
【００１９】
かかる免疫不全のラットまたはマウスとしては、Ｆ３４４/ＮＪｃｌ−ｒｎｕ/ｒｎｕラットのようなＴ細胞機能欠如ラット、ＢＡＬＢ/ｃＡＪｃｌ−ｎｕ/ｎｕマウスのようなＴ細胞機能欠如マウス、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスのようなＴ細胞機能およびＢ細胞機能の双方が欠如したマウスがあげられる。
【００２０】
これらのうち、奇形腫形成の容易さ、飼育条件を考慮すると、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスやＢＡＬＢ/ｃＡＪｃｌ−ｎｕ/ｎｕマウスなどの免疫不全動物が好ましい。
【００２１】
図２は、本発明で用いられる免疫不全動物の体内で奇形種を形成しうる多能性幹細胞の１例である未分化のマウスｉＰＳ細胞６を示す写真である。
【００２２】
本発明において、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス（以下、単に免疫不全動物という）の体内で奇形種を形成しうるｉＰＳ細胞、Ｐｄｘ１遺伝子の転写調節領域と赤色蛍光タンパク質ＲＦＰ遺伝子およびピューロマイシン耐性遺伝子から構成されるＰｄｘ１−ＲＦＰ遺伝子（以下、Ｐｄｘ１−ＲＦＰ遺伝子という）をゲノム中に含むＥＳ細胞は、ヒト細胞であってもよく、マウス、ラット、ウサギ、山羊、羊その他の哺乳動物由来の細胞であってもよく、さらには公知のもののほか、市販の細胞であっても好適に使用することができ、たとえば、ｉＰＳ細胞としては、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｔｅｒｔ、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８などの転写因子を導入した細胞があげられ、ＥＳ細胞としては、ＲＦ８細胞、ＪＩ細胞、ＣＧＲ８細胞、ＭＧ１．１９細胞があげられ、市販されているマウスＥＳ細胞としては１２９ＳＶ由来、Ｃ５７／ＢＬ６由来、ＤＢＡ／１由来の細胞が挙げられる。またヒトＥＳ細胞としては、ＫｈＥＳ−１細胞、ＫｈＥＳ−２細胞、ＫｈＥＳ−３細胞が挙げられ、またサルＥＳ細胞としてはカニクイザルＥＳ細胞が挙げられる。これらのうち、胚様体を形成しうる細胞は、胚様体を経由して、より高い成功率で間葉系細胞に誘導することができるので好ましい。
【００２３】
本発明において用いられる多能性幹細胞は、未分化マーカーであるアルカリオスファターゼ活性、Ｏｃｔ―４、Ｎｏｎｏｇなどが陽性であるものが好ましく、とりわけ複数のマーカーが陽性であるものが好ましい。
【００２４】
本発明によれば、ｉＰＳ細胞またはＰｄｘ１−ＲＦＰ遺伝子をゲノム中に含むＥＳ細胞の免疫不全動物への移植、移植した免疫不全動物の体内での奇形腫形成、奇形腫の取り出し、奇形腫を酵素処理して分散させた細胞を、蛍光色素結合抗マウスＣＤ１０５抗体または蛍光色素結合抗抗ヒトＣＤ２７１抗体（以下、これら２つの蛍光抗体を総称して蛍光色素結合抗ＣＤ抗体という）を加えて結合させて、前記抗体の蛍光陽性細胞を分取するか、またはＲＦＰ陽性の細胞を分取することによって、目的とする間葉系細胞または膵島細胞を得ることができる。
【００２５】
本発明において、多能性幹細胞の免疫不全動物への移植は、多能性幹細胞を培養し、得られた培養細胞を細胞乖離液で細胞毎に乖離させ、ついで細胞を分取したのち、細胞を免疫不全動物に移植することにより実施できる。
【００２６】
細胞の乖離は、組織または細胞培養において使用される細胞乖離液を使用することができ、たとえば０．２５％程度のトリプシンと１ｍＭ濃度のＥＤＴＡの混合液のほか、トリプルエクスプレス（商品名）、アキュターゼ（商品名、イノベイティブセルテクノロジー社製）などの、市販のものを用いることができる。乖離させた細胞の分取はたとえば、遠心分離などにより実施することができる。
【００２７】
移植は、多能性幹細胞を生理的食塩水またはＰＢＳに懸濁させ、注射器などを用いて免疫不全動物の、筋肉組織や腹腔など適当な部位に注入することによって実施することができる。
【００２８】
多能性幹細胞の移植は、免疫不全動物の１個所に行ってもよく、両大腿部の数個所あるいは大腿部と腹腔など、同部位または部位を変えて複数個所に行ってもよい。
【００２９】
移植に際しては、多能性幹細胞の細胞数が、約１×１０６〜１×１０７個程度を用いるのが好ましい。
【００３０】
移植した免疫不全動物の体内での奇形腫形成は、当該動物を無菌下に通常の飼育を行うことによって実施することができる。
【００３１】
奇形腫形成は、用いる細胞の種類や移植した細胞数によっても異なるが、概ね２〜６週間程度であるのが好ましい。
【００３２】
図３は、重症複合免疫不全マウス（ＳＣＩＤ）の両大腿部から回収された２つの奇形腫７を示す写真である。
【００３３】
本発明において、奇形腫の取り出しは、免疫不全動物から、適当な外科的方法によって、目的の奇形腫を採取すればよく、特に制限はない。
【００３４】
本発明において、目的細胞の分取は、取り出された奇形腫を培養液中で、細胞乖離液で処理し、分散させた細胞を、蛍光色素結合抗ＣＤ抗体を加えて結合させて、前記抗体の蛍光陽性細胞を分取するか、またはＲＦＰ陽性の細胞を分取することによって実施することができる。
【００３５】
細胞乖離液としては、前記多能性幹細胞を細胞乖離液で乖離させる際に使用したものを好適に使用することができる。細胞乖離液の反応は奇形腫の大きさにもよるが、概ね３時間程度でよく、反応後、ダルベッコ変法イーグル培地に最終濃度１０％以上になるようにウシ胎児血清を添加したものを加え、酵素反応を停止させる。分化細胞の分取は、たとえば遠心チューブに移し、１，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離することにより実施することができる。
【００３７】
目的細胞が間葉系細胞の場合には、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＭＭＰ−１１などの細胞表面マーカーの発現を確認すればよい。あるいは表面抗原であるＣＤ１０５（イー・バイオサイエンス社）、ＣＤ２７１（ミルテニー・バイオテク社）、ＣＤ２９（サンタクルズ・バイオテクノロジー社）に対する抗体を使用し、免疫染色、ウェスタンブロット法、フローサイトメトリーによって目的細胞が間葉系細胞であることを確認することもできる。
【００３８】
また、目的細胞が膵島β細胞の場合には、Ｐｄｘ１−ＲＦＰ遺伝子をゲノム中に含むＥＳ細胞のＲＦＰ陽性（発現）に基づいて目的細胞を確認することができる。
かくして、分化細胞の中から目的とする細胞を得ることができる。
【００３９】
実施例１
マウスｉＰＳ細胞からの間葉系細胞の製造
京都大学で作製され、理化学研究所から譲受けたマウスｉＰＳ細胞株ｉＰＳＭＥＦＮｇ２０Ｄ１７株を培養し、コンフルエントに達したｉＰＳ細胞を細胞乖離液、トリプルエクスプレス（商品名、インビトロジェン社製）で乖離させ、等量の１０％ＦＣＳ-ＤＭＥＭを添加し、１，５００ｒｐｍにて１０分間遠心分離した後、上清を吸引除去し、沈殿した細胞を分取した。
【００４０】
分取した細胞を１×１０７個／ｍｌとなるようＰＢＳ（-）に懸濁し、２６Ｇ注射針および１ｍｌ注射筒を用いてＳＣＩＤマウスの大腿部皮下に移植した。２週間後、マウスから形成された奇形腫を回収し、Ｉ型コラゲナーゼを用いた酵素処理により細胞の分散を行った。
【００４１】
分散した細胞液をＰＢＳにて洗浄後、１０％ウシ胎児血清含ＤＭＥＭ培地にて培養を行った。培養後、生存細胞の接着を確認し、培養上清とともに死細胞や狭雑物を除去した。ついで、０．２５％トリプシン（インビトロジェン社製）―０．０２％ ＥＤＴＡ混合液で細胞を剥がし、遠心処理により生存細胞のペレットを得た。目的細胞の分離に際して、細胞ペレットを２％ウシ胎児血清およびＨＥＰＥＳを含むＤＭＥＭ培地（以下、ＦＡＣＳバッファーという）に懸濁し、ＰＥ（赤色蛍光色素）結合抗マウスＣＤ１０５ラットＩｇＧ抗体を添加して、４℃にて1時間振とう培養を行った。
【００４２】
１時間後、液量の２０倍量となる１０％ウシ胎児血清含ＤＭＥＭ培地を加え、洗浄、遠心分離と上清除去の操作を２回行った。
【００４３】
処理後の細胞を０．５ｍｌのＦＡＣＳバッファーに懸濁し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ）にて解析し、赤色蛍光陽性かつ緑色蛍光陰性の画分を分離することによって本発明方法による間葉系細胞を得た。
得られた細胞は、間葉系細胞の形体を示し、優れた増殖能力を示した。
【００４４】
図４は、マウスｉＰＳ細胞から形成された奇形腫を酵素処理し、特異的な抗体で目的細胞を分離していることを示す図および写真である。図４（１）は、酵素処理した奇形種の細胞をＦＡＣＳバッファーに懸濁し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ）にて解析した結果を示すヒストグラム８であり、図４（１）中、Ｐ２領域は赤色蛍光陽性の存在領域を示す。図４（２）は赤色蛍光陽性の画分として分離された、マウスｉＰＳ細胞由来の間葉系細胞９を示す写真である。
【００４５】
また、得られた間葉系細胞を検体として、ＲＴ−ＰＣＲを行ったところ、間葉系細胞マーカーであるＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎの発現を認めた。
【００４６】
なお、ＲＴ-ＰＣＲに際しては、予め作成したマウスβ―ａｃｔｉｎ、Ｆｌｋ−１、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ遺伝子の配列に特異的なプライマーを用いて行った。マウスβ―ａｃｔｉｎ、Ｆｌｋ−１、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ遺伝子の配列は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ）に公開されている。
【００４７】
ＲＴ−ＰＣＲについて、細胞をＴＲＩｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）で処理し、クロロホルムと混合して１５，０００回転で１０分間遠心することによりＲＮＡを含む水層を分離した。ＲＮＡを含む水層を同量のイソプロパノールと混合し、再度１５，０００回転で１０分間遠心することでＲＮＡの沈殿物を得た。沈殿物は氷冷した８０％エタノールで洗浄し、ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ水に溶解した後に逆転写反応に使用した。逆転写反応はＨｉｇｈ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を使用して実施した。ＰＣＲ反応液は、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（登録商標、タカラバイオ社製）を用いて作成し、ＲＴ-ＰＣＲ定量用チューブ（ミクロアンプ  オプチカル８−チューブストリップ、商品名、アプライド、バイオシステムズ社製）に分注した。ＰＣＲ反応はＴＡＫＡＲＡ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ（タカラバイオ社製）を使用し、９４℃で２分間の変性反応の後、９４℃で２０秒間、５８℃で２０秒間のアニーリング、７２℃で２０秒間の増幅反応を３５回繰り返し、ＴＡＥバッファーを用いたアガロース電気泳動にて結果を解析した。
【００４８】
実施例２
ヒトｉＰＳ細胞からの間葉系細胞の製造
京都大学で作製され、理化学研究所から譲受けたヒトｉＰＳ細胞株２５３Ｇ１株を培養し、コンフルエントに達したｉＰＳ細胞をＣｅｌｌ  Ｌｉｆｔｅｒ (コーニング社製)で乖離させ、１，５００ｒｐｍにて１０分間遠心分離した後、上清を吸引除去し、沈殿した細胞を分取した。
【００４９】
分取した細胞を約１×１０７個／ｍｌとなるよう５００μｌのマトリゲル（ＢＤファルコン株式会社製）に懸濁し、２６Ｇ注射針および１ｍｌ注射筒を用いてＳＣＩＤマウスの大腿部皮下に移植した。１ヶ月後、マウスから形成された奇形腫を回収し、Ｉ型コラゲナーゼを用いた酵素処理により細胞の分散を行った。
【００５０】
分散した細胞液をＰＢＳにて洗浄後、１０％ウシ胎児血清含ＤＭＥＭ培地にて培養を行った。培養後、生存細胞の接着を確認し、培養上清とともに死細胞や狭雑物を除去した。ついで、０．２５％トリプシン（インビトロジェン社製）―０．０２％ ＥＤＴＡ混合液で細胞を剥がし、遠心処理により生存細胞のペレットを得た。目的細胞の分離に際して、細胞ペレットをＦＡＣＳバッファーに懸濁し、ＡＰＣ（橙色蛍光色素）結合抗ヒトＣＤ２１７ウサギＩｇＧ抗体を添加して、４℃にて１時間振とう培養を行った。
【００５１】
１時間後、液量の２０倍量となる１０％ウシ胎児血清含ＤＭＥＭ培地を加え、洗浄、遠心分離と上清除去の操作を２回行った。
【００５２】
処理後の細胞を０．５ｍｌのＦＡＣＳバッファーに懸濁し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ）にて解析し、赤色蛍光陽性の画分を分離することによって本発明方法による間葉系細胞を得た。得られた細胞は、間葉系細胞の形体を示し、優れた増殖能力を示した。
【００５３】
図５は、細胞分離時のＦＡＣＳパターンを示す図であり、ヒトｉＰＳ細胞から奇形腫形成を介して作製した間葉系細胞を分離する際に見られたＦＡＣＳの結果を示す図および写真である。図５（１）は橙色蛍光陽性の存在領域を示すヒストグラム１０である。図５（２）は分離した細胞１１の形体を表す写真である。得られた細胞は、間葉系幹細胞の形体を示し、優れた増殖能力を示した。また、得られた間葉系細胞が間葉系幹細胞であることを示すためにｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ解析を行った。
【００５４】
図６は、ヒトｉＰＳ細胞から奇形腫形成を介して作製した間葉系細胞の性質を解析した結果を示す図である。解析結果には、未分化のヒトｉＰＳ細胞とヒトｉＰＳ細胞から奇形腫形成を介した間葉系細胞が発現しているマーカー１２が示されている。図中、Ａは未分化のヒトｉＰＳ細胞を解析した結果を示し、ＢはＦＡＣＳにて分離した間葉系細胞を解析した結果を示す図である。Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ解析には、定法により作成したアクリルアミドゲル、泳動バッファー、転写バッファーを使用し、Ｅｘｔｒａ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｐａｐｅｒ（バイオラッド社製）、ＰＶＤＦメンブレン（ＧＥヘルスケア社製）を用いて荷電装置（Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｔｅａｎ ｔｅｔｒａ ｃｅｌｌ、バイオラッド社製）にて電気泳動および転写を行い、抗ＰＤＧＦＲα抗体（サンタクルズバイオテクノロジー社製）、抗Ｖｉｍｅｎｔｉｎ抗体（サンタクルズバイオテクノロジー社製）、抗Ｉｎｔｅｇｌｉｎβ１抗体（サンタクルズバイオテクノロジー社製）、抗ＣＤ１０５抗体（サンタクルズバイオテクノロジー社製）、抗Ｅｃａｄｈｅｒｉｎ抗体（サンタクルズバイオテクノロジー社製）、抗Ｎａｎｏｇ抗体（リプロセル社製）、抗Ｓｏｘ２抗体（サンタクルズバイオテクノロジー社製）、抗Ａｃｔｉｎ抗体（サンタクルズバイオテクノロジー社製）、イムノエンハンサー（東洋紡株式会社製）、およびＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧ−ウシＩｇＧ抗体、ＨＲＰ結合抗ヤギＩｇＧ−ウシＩｇＧ抗体、ＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ−ヤギＩｇＧ抗体を使用し、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍにて発光処理を行い、イメージアナライザー（Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ  ＬＡＳ４０００、ＧＥヘルスケア社製）にて検出を行った。
【００５５】
図６に示すとおり、同法により作成したヒトｉＰＳ細胞由来細胞（図中ではＢとして示している）は、間葉系幹細胞マーカーであるＰＤＧＦＲα、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、Ｉｎｔｅｇｌｉｎβ１、ＣＤ１０５を発現しており、間葉系幹細胞に分化していることが確認された。
【００５６】
実施例３
マウスＥＳ細胞からの膵島細胞の製造
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの受精卵から、定法によって、近畿大学にて作成したマウスＥＳ細胞株（ＥＬ−１株）を培養し、コンフルエントに達したところで細胞乖離液、トリプルエクスプレス（商品名、インビトロジェン社製）で乖離させ、等量の１０％ＦＣＳ-ＤＭＥＭを添加し、１，５００ｒｐｍにて１０分間遠心分離した後、上清を吸引除去し、沈殿した細胞を分取した。
【００５７】
分取した細胞を１×１０７個／ｍｌとなるようＰＢＳに懸濁し、制限酵素ＮｓｓＨＩＩ（タカラバイオ社製）で切断処理した１０μｇのＰｄｘ１−ＲＦＰプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社製：同社は米国の非営利団体であり、学術機関向けに遺伝子のバンク事業を行っている。）を混合した。これを電気付荷用容器（Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｃｕｖｅｔｔｅ、バイオラッド社製）に入れ、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（バイオラッド社製）にて２５０Ｖ、９５０μＦの電気を一度印加した。この操作により、Ｐｄｘ１−ＲＦＰプラスミドをＥＬ−１細胞のゲノムＤＮＡ中に取り込ませた。Ｐｄｘ１遺伝子は膵臓で特異的に発現する遺伝子であり、Ｐｄｘ１遺伝子の転写調節領域と赤色蛍光タンパク質ＲＦＰ遺伝子およびピューロマイシン耐性遺伝子から構成されるＰｄｘ１−ＲＦＰ遺伝子を有する細胞は、膵島細胞と同様の形質を獲得した時に赤色蛍光を発するという特徴と、ピューロマイシンに対して耐性を示すという特徴を有する。
【００５８】
上記のとおり遺伝子を導入したＥＬ−１細胞を、ゼラチンコートを施したプラスチックシャーレ上で４８時間培養した。培養液には、通常のマウスＥＳ細胞用培地を使用した。
【００５９】
４８時間後に新しい培養液に交換し、１．５μｇ／ｍｌの濃度でピューロマイシンを加え引き続き培養を行った。以降１週間、２４時間毎にＥＳ培養液を交換し、ピューロマイシン添加を継続した。この培養操作により、ピューロマイシンに耐性を示す、即ちＰｄｘ１−ＲＦＰ遺伝子を有する細胞のみが増殖した。
【００６０】
Ｐｄｘ１−ＲＦＰ導入ＥＬ−１細胞がコンフルエントに達した時点でトリプルエクスプレス（商品名、インビトロジェン社製）にて乖離させ、等量の１０％ＦＣＳ-ＤＭＥＭを添加し、１，５００ｒｐｍにて１０分間遠心分離した後、上清を吸引除去し、沈殿した細胞を分取した。５００μｌのＰＢＳ（−）に懸濁後、２６Ｇ注射針および１ｍｌ注射筒を用いてＳＣＩＤマウスの大腿部皮下に移植した。２週間後、マウスから形成された奇形腫を回収し、Ｉ型コラゲナーゲを用いた酵素処理により細胞の分散を行った。
【００６１】
マウスＥＳ細胞から形成された奇形腫中のＲＦＰ陽性の膵島細胞が、Ｐｄｘ１遺伝子発現時期依存的にＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）を発現していることを示す図である。図７（１）はマウス奇形腫内でＰｄｘ１−ＲＦＰ陽性細胞が形成されていることを示す写真であり、倍率２００倍で観察された像１３である。および図７（２）および図７（３）は同じくマウス奇形腫内でＰｄｘ１−ＲＦＰ陽性細胞が形成されていることを示す図であり、倍率４００倍で観察された像１４，１５である。
【００６２】
分散した細胞液をＰＢＳにて洗浄後、１０％ウシ胎児血清含ＤＭＥＭ培地にて培養を行った。培養後、生存細胞の接着を確認し、培養上清とともに死細胞や狭雑物を除去した。目的細胞の分離に際して、細胞ペレットをＦＡＣＳバッファーに懸濁した。
【００６３】
処理後の細胞をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ）にて解析し、赤色蛍光陽性の画分を分離することによって本発明方法による膵島細胞を得た。
【００６４】
図８は、マウスＥＳ細胞から形成された奇形腫を酵素処理し、膵島特異的シグナル（Ｐｄｘ１−ＲＦＰ）を利用してＰｄｘ１陽性膵島細胞を分離していることを示すヒストグラム１６であり、Ｐ１の領域がＰｄｘ１陽性細胞の存在する領域である。
【００６５】
得られたＲＦＰ陽性の膵島細胞を検体として、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行ったところ、膵島細胞マーカーであるＧｌｕｃａｇｏｎ、ＩＡＰＰの発現を認めた。
【００６６】
図９は、マウスＥＳ細胞から形成されたＲＦＰ陽性の膵島細胞が、膵島細胞マーカーであるＧｌｕｃａｇｏｎ、ＩＡＰＰを発現するが、もとのマウスＥＳ細胞は、膵島マーカーを発現していないことを示す図である。図９（１）において、Ｇｌｕｃａｇｏｎの相対発現量は、分化ＥＳ細胞での発現量を１としたときの相対発現量を示し、グラフ１７が、マウスＥＳ細胞のＧｌｕｃａｇｏｎ相対発現量を示し、グラフ１８が、マウスＥＳ細胞から奇形腫を介して形成され、ＦＡＣＳにて分離したＲＦＰ陽性膵島細胞のＧｌｕｃａｇｏｎ相対発現量を示す。
【００６７】
図９（２）において、ＩＡＰＰの場合は、ＥＳ細胞では全く発現が検出されなかったため、発現量は、Ａｃｔｉｎ遺伝子に対する相対発現量を示したものである。グラフ１９は、マウスＥＳ細胞のＩＡＰＰ相対発現量を示し、グラフ２０は、マウスＥＳ細胞から奇形腫を介して形成され、ＦＡＣＳにて分離したＲＦＰ陽性膵島細胞のＩＡＰＰ相対発現量を示す。
【００６８】
なお、定量的ＲＴ-ＰＣＲに際しては、予め作成したマウスβ―ａｃｔｉｎ、Ｇｌｕｃａｇｏｎ、ＩＡＰＰ遺伝子の配列に特異的なプライマーを用いて行った。マウスβ―ａｃｔｉｎ、Ｇｌｕｃａｇｏｎ、ＩＡＰＰ遺伝子の配列は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ）に公開されている。
【００６９】
定量的ＲＴ−ＰＣＲについて、細胞をＴＲＩｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）で処理し、クロロホルムと混合して１５，０００回転で１０分間遠心することによりＲＮＡを含む水層を分離した。ＲＮＡを含む水層を同量のイソプロパノールと混合し、再度１５，０００回転で１０分間遠心することでＲＮＡの沈殿物を得た。沈殿物は氷冷した８０％エタノールで洗浄し、ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ水に溶解した後に逆転写反応に使用した。逆転写反応はＨｉｇｈ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を使用して実施した。ＰＣＲ反応液は、ＳＹＢＲ II Ｐｒｅｍｉｘ  ＥＸ  Ｔａｑ（登録商標、タカラバイオ社製）を用いて作成し、ＲＴ−ＰＣＲ定量用チューブ（ミクロアンプ  オプチカル８−チューブストリップ、商品名、アプライド、バイオシステムズ社製）に分注した。ＰＣＲ反応はＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ装置（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００、アプライド  バイオシステムズ社製）を使用し、９５℃で２０秒間の変性反応の後、９５℃で５秒間、６０℃で３０秒間のアニーリングおよび伸張増幅反応を４０回繰り返し、市販の表計算ソフトにて結果を解析した。
【００７０】
また、得られたＲＦＰ陽性膵島細胞を検体として、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔを行ったところ、ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅの発現を認めた。ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅはインスリンが産生される際に放出される副産物であり、インスリン産生性の特異的なマーカーとして知られている。
【００７１】
図１０は、マウスＥＳ細胞から形成されたＲＦＰ陽性の膵島細胞がインスリン産生性の特異的なマーカーであるｃ−ｐｅｐｔｉｄｅを発現するが、もとのマウスＥＳ細胞はｃ−ｐｅｐｔｉｄｅを発現していないことを示す図である。
【００７２】
Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ解析は実施例２と同様の方法で行い、抗ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ抗体（ミリポア社製）およびＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ−ウシＩｇＧ抗体を使用し、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍにて発光処理を行い、イメージアナライザー（Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ  ＬＡＳ４０００、ＧＥヘルスケア社製）にて検出を行った。解析結果では、マウスＥＳ細胞から奇形腫を介して形成され、ＦＡＣＳにて分離したＲＦＰ陽性膵島細胞のｃ−ｐｅｐｔｉｄｅの発現像２１が見られた。
【符号の説明】
【００７３】
１  培養器中で培養された多能性幹細胞
２  免疫不全マウス
３  多能性幹細胞を移植された免疫不全マウス
４  免疫不全マウスの体内で形成された奇形種
５  奇形腫から分離された，成熟した目的の分化細胞
６  未分化のマウスｉＰＳ細胞
【図９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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