(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２０１０−０３２１として識別され、かつＣＣＴＣＣ  Ｍ  ２０１１０２４の寄託参照番号を有して中国典型培養物保蔵センターにおいて寄託されているシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株。
【請求項２】
前記シゾキトリウム属株が、未処置のシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株と比較して、増加したＤＨＡ含量及び／又は向上した成長速度の特性を有する、請求項１に記載のシゾキトリウム属株。
【請求項３】
前記シゾキトリウム属株が、未処置のシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株と比較して、異なったタンパク質含量、アミノ酸組成の異なるタンパク質及び／又は異なった脂肪酸組成を有する、請求項１又は２に記載のシゾキトリウム属株。
【請求項４】
シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株の変異体を産生する方法であって、
前記シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株を紫外線照射に暴露させシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株において突然変異誘導を誘発し、突然変異株を産生すること、
前記突然変異株をアセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ阻害剤と接触させること、
未処置シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株と比較して、増加したＤＨＡ含量及び／又は向上した成長速度を有するシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株の変異体を選択すること、を含む方法。
【請求項５】
前記アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ阻害剤がキザロホップである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記キザロホップが、１０μモル／Ｌ〜９０μモル／Ｌの範囲内の濃度において使用される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記変異体が増加したＤＨＡ含量及び向上した成長速度を有する、請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記変異体が異なったタンパク質含量、アミノ酸組成の異なるタンパク質及び／又は異なった脂肪酸組成を有する、請求項４〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株が、紫外線照射に３０秒〜１００秒の間で暴露される、請求項４〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＤＨＡを産生する方法であって、
請求項１〜３のいずれか一項に記載のシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株を、ＤＨＡを産生するためのシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株を培養するのに好適な条件下で培養すること
を含む、方法。
【請求項１１】
ＤＨＡを産生する方法であって、
シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株を紫外線照射に暴露させシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株において突然変異誘導を誘発し、突然変異株を産生すること、
前記突然変異株をアセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ阻害剤と接触させること、
未処置シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株と比較して、増加したＤＨＡ含量及び／又は向上した成長速度を有するシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株の変異体を選択すること、
前記変異体をＤＨＡを産生するためのシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株を培養するのに好適な条件下で培養すること、
を含む、方法。
【請求項１２】
シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株若しくは変異体の前記培養された変異体のバイオマス、又はシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株の培養媒体からＤＨＡを収集すること、
をさらに含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記条件が、
５０〜７０ｇ／Ｌの炭素供給源、及び１０〜２０ｇ／Ｌの窒素供給源を含む培養媒体、２０℃〜２８℃の培養温度、
及び／又は
ｐＨ：３〜１０、
を含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記培養媒体が、ｇ／Ｌで
グルコースを  ５０〜７０、
酵母抽出物を  １０〜３０、
グルタミン酸ナトリウムを  １０〜２０
塩化ナトリウムを  ２．４〜４．０、
にが塩を  ３．０〜６．０、
硫酸アンモニウムを  ３．０〜６．０、
含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
バイオマスを産生する方法であって、
請求項１〜３のいずれか一項に記載のシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株を、バイオマスを産生するためのシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株を培養するのに好適な条件下で培養すること
を含む、方法。
【請求項１６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株の培養媒体における培養物又は細胞である、バイオマス。
【請求項１７】
請求項１６に記載の前記バイオマスを含む食品製品であって、前記食品製品が乳児、子供、若者及び成人に食べさせることを意図した製品を含む、又は前記食品製品が乳製品である、食品製品。
【請求項１８】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のシゾキトリウム属株であって、前記シゾキトリウム属株若しくは変異体により、３〜７日にわたる培養で産生されるＤＨＡの量が、未処置シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株によって産生されるＤＨＡの量よりも、少なくとも１０％高い、シゾキトリウム属株。
【請求項１９】
請求項４〜１４のいずれか一項に記載の方法であって、前記シゾキトリウム属株若しくは変異体により、３〜７日にわたる培養で産生されるＤＨＡの量が、未処置シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株によって産生されるＤＨＡの量よりも、少なくとも１０％高い、方法。
【請求項２０】
請求項１〜３及び１８のいずれか一項に記載のシゾキトリウム属株であって、３〜７日にわたる培養で、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株の前記シゾキトリウム属株若しくは変異体の前記成長速度が、未処置のシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株の前記成長速度よりも、少なくとも３％高い、シゾキトリウム属株。
【請求項２１】
請求項４〜１４及び１９のいずれか一項に記載の方法であって、３〜７日にわたる培養で、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株の前記シゾキトリウム属株若しくは変異体の前記成長速度が、未処置のシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株の前記成長速度よりも、少なくとも３％高い、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は微生物遺伝育種技術及び微生物発酵技術に関し、特にＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）を産生するための微生物藻類の変異体又は突然変異体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸、Ｃ２２：６、（ｏｍｅｇａ−３））は、必須の脂肪酸、すなわち長鎖脂肪酸であり、それは人体内で合成できず、かつ重要な生理機能を有する。ＤＨＡはヒトの脳及び網膜における主要な成分であり、全ＤＨＡの２０％が大脳皮質に存在し、網膜中に最大５０％まで存在する。従って、ＤＨＡは神経系及び視覚系の発育に、及び正常な知性機能及び視覚機能の維持に重要な役割を果たす。ＤＨＡはまた、心血管疾患、癌、肉芽種生成などの予防に生理学的機能を有する。加えてＤＨＡは種々の海洋魚の成長及び発育に必要とされる必須脂肪酸でもあり、稚魚の生存率を向上させ、色素欠乏症の発生率を低減することができる。従来、ＤＨＡは魚油から得られる。しかしながら、ポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を魚油から抽出するには、抽出量が不安定である、収率が低い、コスト高である、及びその他のω−６ＰＵＦＡの混入などの幾つかの問題点がある。漁業資源の制約が増えているために、ＤＨＡの従来の資源は、市場におけるＤＨＡの需要増加に対処できない。従って、ＤＨＡの新資源の開発に関心が寄せられている。
【０００３】
シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）は、海洋微細藻類（又は擬似真菌）であり、ＤＨＡ及びその他のポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の産生用の商業的供給源として開発されてきた。シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）の生物安全性は証明されている。Ｈａｍｍｏｎｄらはラット及び兎に対してそれを用いた一連の試験を実施し、副作用がないことを見出した。
【０００４】
しかしながら、発酵プロセスでは、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株の品質劣化が避けられず、これによりＤＨＡの収率低下がもたらされる。従って株品質（主に成長速度、特にＤＨＡ含量）の継続的な改善が、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）産業における持続的な開発を促進するために重要である。
【０００５】
アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ、（ＥＣ６．４．１．２）が、脂肪酸合成において重要な酵素であり、かつ除草剤キザロホップ（Ｑｕｉｚａｌｏｆｏｐ）｛２−［４−（６−クロロ−２−キノキサリン−オキシ）−フェノキシ］プロピオネート｝はこの酵素の阻害剤である。キザロホップの存在下では、細胞は脂肪酸の生合成の撹乱に起因して成長が遅くなりさらには死亡する。
【０００６】
最近では、一部の研究によりキザロホップを使用して、増加したＥＰＡ含量を有する株のための突然変異された微細藻類を選抜できることが示された。
【０００７】
Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉら（２００４年）は、ＭＮＮＧでナンノクロロプシス・オキュラタ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｏｃｕｌａｔａ）を突然変異させ、キザロホップ−耐性株のために選抜試験した。選抜された株からの結果は顕著に増加したＥＰＡ含量を示した。
【０００８】
更に、Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉら（２００６年）は、ＥＭＳでナンノクロロプシス・オキュラタ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｏｃｕｌａｔａ）を突然変異させ、セルレニン及びエリスロマイシンに耐性のある株のための選抜試験をした。得られた株は２９％及び１２％だけ増加したＥＰＡ収率を示した。
【０００９】
Ｃａｏ  Ｘｉａｏｈｏｎｇら（２００７年）は、珪藻植物ニツシア・レビス（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｌａｅｖｉｓ）をＤＭＳＯ及びキザロホップで処理し、藻類のＥＰＡ含量が３．００％から３．５８％に増加した結果になる。
【００１０】
これまで、キザロホップに耐性のあるシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）変異体は報告されていない。たとえそのようなシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）突然変異体が存在したとしても、ＥＰＡ又はＤＨＡの含量が、キザロホップ選抜を受ける突然変異体に対して増加されるかどうかはまだ不明である。更に、紫外線照射で誘発されたシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）変異体がキザロホップ選抜を耐えることができるか否かは明確ではない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本出願の発明者は意外にも、増加したＤＨＡ含量を有するシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）変異体又は突然変異体が、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株への紫外線照射の突然変異体誘導を適用し、次に脂肪酸合成（例えばアセチル補酵素Ａ カルボキシラーゼ）における主要酵素に対する阻害剤（キザロホップを含むがそれに限定されない）を使用して方向性選択を実施することによって得ることができることを発見した。更に、得られた変異体又は突然変異体は、高いＤＨＡ含量、並びに未処置のシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株と比較して向上した成長速度を有する。
【００１２】
従って、第一の態様において、未処置のシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株と比較して増加したＤＨＡ含量を有する変異体シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株を産生する方法が提供され、その方法には、突然変異株を産生するために紫外線照射を用いてシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株における突然変異誘導を誘発すること、その突然変異株をアセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ阻害剤と接触させること、及び未処置のシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株と比較して増加したＤＨＡ含量を有するシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株の変異体を選択すること、が含まれる。
【００１３】
本明細書に開示した実施形態では、アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼに対する阻害剤はキザロホップである。特定な実施形態では、増加したＤＨＡ含量を有する選択された変異体はまた、成長速度が未処置のシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株の成長速度と比較して増加しており、その結果ＤＨＡ産生効率は未処置のシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株のＤＨＡ産生効率と比較して増加される。
【００１４】
本明細書にて開示した別の実施形態では、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株の変異体のＤＨＡ含量は、始発株の場合又は未処置のシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株のものと比較して、より高い。典型的には、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株の変異体のＤＨＡ含量は、アセチル補酵素Ａに対する阻害剤の使用による選択を伴う又は伴わない場合の紫外線照射誘発の突然変異誘導後の始発株又は未処置株のものと比較して、より高い。
【００１５】
第二の態様では、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株の変異体が提供され、例えば、２０１１年１月２１日に中国典型培養物保蔵センター（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＣＣＴＣＣ）において寄託され、かつ、ブダペスト条約に基づく寄託への移管請求が受領された、寄託参照番号ＣＣＴＣＣ  Ｍ  ２０１１０２４である株２０１０−０３２１である。
【００１６】
一実施形態では、本明細書にて提供した変異体株は、未処置シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株の場合と比較して増加したＤＨＡ含量を有した。別の実施形態では、本明細書にて提供した変異体は本明細書に開示したような方法で得られ、その方法は、突然変異株を産生するために紫外線照射を用いてシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株における突然変異誘導を誘発し、かつ突然変異株をアセチル補酵素Ａ  カルボキシラーゼ阻害剤と接触させること、及び未処置シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株と比較して増加したＤＨＡ含量及び／又は向上した成長速度を有するシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株の変異体を選択することを含む。
【００１７】
第三の態様では、ＤＨＡを産生する方法が提供され、その方法は、培養媒体中で本明細書に開示したようなシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株の変異体を培養することを含み、かつ任意選択でシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株の培養した変異体のバイオマス、又はその培養媒体からＤＨＡを採取することを含む。一実施形態によると、本発明はまた、この方法により産生したバイオマスに関する。
【００１８】
別の態様では、食品製品が提供される。詳細には、その食品製品はバイオマス（すなわち、未処置のシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株と比較してＤＨＡの増加した濃度を有する）又は本明細書に開示した方法により産生したＤＨＡを含有する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】は、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）に関する紫外線照射の致死効果を示す。
【図２】は、キザロホップの濃度と対応するシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）の致命率との関係を示す。
【図３】は、対照株（又は未処置株）及び幾つかの変異体株の成長速度及びＤＨＡ含量を示す。
【図４】は、対照株と５０Ｌの発酵槽実験における３種の変異体との成長速度とＤＨＡ含量を示す。
【図５】は、対照株と変異体株２０１０−０３２１との間の１８Ｓ  ｒＲＮＡ配列の配列比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書に記載の用語「株」は、任意の培養物を表し、一般的には、単一細胞又は単離されたコロニーから得られたシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株を含む藻類又は微細藻類などの微生物の純粋培養物を表す。
【００２１】
本明細書に記載の用語である、参照株Ｘの「変異体」又は「突然変異体」は、参照株Ｘから得られた任意の株を表す。本出願の関連において、用語「変異体」はより詳細には、参照株Ｘに実行された主に突然変異及び選択によって得られた株を表し、並びに用語「突然変異体」はより詳細には、参照株Ｘに適用されたランダムな又は直接的な突然変異誘導（例えば、紫外線照射）によって得られた株を表す。
【００２２】
突然変異体又は変異体が、一度本明細書に開示した種々の態様による特徴、具体的には未処置の藻類又は微細藻類種、具体的にはシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株、と比較してより高い又は増加したＤＨＡ含量という特徴を所有すると、そのことは本出願にて特許請求された保護範囲内に含まれる。
【００２３】
本明細書に記載の用語「食品製品」は、ヒト又は動物に栄養摂取を与えることを意図した任意の製品を表す。詳細には、食品製品には乳児、子供、若者及び成人に食べさせることを意図した製品が挙げられる。本明細書に開示された食品製品の全て又は一部は、本明細書に開示した方法によって得られた少なくとも１種のバイオマス又はＤＨＡを含有することができる。本明細書に開示した食品製品はまた、通常的に農業又は食品産業において使用されているその他の含有物、例えば添加物、防腐剤、果実又は果実エキス、香味剤、着色剤、増粘剤、オオムギ、チョコレートなどを含有することができる。
【００２４】
特定の実施形態では、食品製品は乳製品である。
【００２５】
本明細書に記載の用語「乳製品」は、ミルクに加えて、ミルクから誘導されるあらゆる製品、例えばミルク粉、クリーム、アイスクリーム、バター、チーズ、ヨーグルト、発酵乳など、又はミルクから誘導された副製品、例えば乳清及びカゼイン並びに主含有成分としてミルク又は乳汁成分を含有する各種調理済み食品製品を表す。ミルクは一般的に乳牛由来であるが、他の動物、例えばヤギ、雌羊、雌馬、らくだ、又は野牛などからも得られる。乳製品は本明細書に開示した方法によって産生したバイオマス又はＤＨＡを利用する。
【００２６】
本明細書に開示した、始発株又は未処置／対照株として機能を果たす、又は変異体／突然変異誘導及び／又は選択に好適な微生物には、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属のメンバーを含む、従属栄養性微細藻類（ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ）が挙げられる。シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属の具体的なメンバーは、シゾキトリウム・リマシナム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）である。好適な微生物は、自然環境からの収集を含む、多数の公的に利用可能な資源から得ることができる。例えば、本出願に使用され得るシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）には、シゾキトリウム・リマシナム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）ＳＲ２１、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）（Ｓ８）（ＡＴＣＣ  ２０８８９）、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）（ＬＣ−ＲＭ）（ＡＴＣＣ１８９１５）及びシゾキトリウム・リマシナム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）ＩＦＯ３２６９３（Ｈｏｎｄａ  ｅｔ  Ｙｏｋｏｃｈｉ、発酵研究所（ＩＦＯ：Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）、日本、大阪）が含まれる。シゾキトリウム・リマシナム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）ＳＲ２１又はシゾキトリウム・リマシナム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）ＩＦＯ３２６９３がより好適である。
【００２７】
本明細書で使用する場合、いずれの微生物又はいずれの生物体にも野生タイプの株、変異体株又は組み換え型菌株が含まれる。
【００２８】
本明細書に記載の用語「バイオマス」は、本明細書で開示したように、藻類又は微細藻類の種、例えば、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株の変異体などの培養媒体における培養物又は細胞を表す。或いは用語「バイオマス」は、少なくとも部分的に脱水された藻類又は微細藻類、又は脱水された培養物を表す。
【００２９】
本明細書に記載の用語「約」又は「近似的に」は、数字の値と連結して使用する際には参照した数字の１、５又は１０％の変動の内にある任意の値を表す。
【００３０】
本明細書に記載の動詞「含む」及びその活用は、非限定的な意味で使用され、かつ続く事項が含まれ、特別に言及されない事項は除かれないことを意味する。
【００３１】
更に、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」に従う要素は、文脈中で明確に示す／結び付けることがない限り、１つまたは複数の要素が存在する可能性を排除しない。従って、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は通常は「少なくとも１つ」を意味する。
【００３２】
シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）の突然変異の実施形態では、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株は、約１０〜１４０秒、好ましくは約２０〜１２０秒、更に好ましくは約３０〜１００秒、及び最も好ましくは約７０〜９０秒の間紫外線照射にさらされる。特定の実施形態では、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株は、約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、及び９０秒からなる群の中から選択される期間で紫外線照射にさらされる。生き延びたコロニーを収集し、例えばキザロホップなどのアセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ阻害剤による方向性選択に使用する。
【００３３】
一実施形態では、キザロホップ−耐性の株を選択するために、キザロホップを特定の濃度で培養媒体へ添加する。選択に使用されるキザロホップの濃度は、培養媒体の中で約５μモル／Ｌ〜約１００μモル／Ｌ、又は約１０μモル／Ｌ〜約９０μモル／Ｌ、又は約５０μモル／Ｌ〜８０μモル／Ｌの範囲である。特定の実施形態では、キザロホップの濃度は、培養媒体の中で約５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９及び８０μモル／Ｌからなる群から選択される。特定の実施形態ではキザロホップは、キザロホップ−ｐ｛（Ｒ）−２−［４−（６−クロロ−２−キノキサリニル）オキシ］フェノキシ｝プロパノエート｝、例えばキザロホップエチルである。
【００３４】
特定の実施形態では、キザロホップ−耐性のシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）コロニーの選択は、キザロホップを含有する固体の培養媒体中で実施される。次に生き延びたコロニーを固体の培養媒体から選び出し、続いてキザロホップ耐性を確認するためにキザロホップを含有する、液体又は半固体の培養媒体中で培養する。
【００３５】
選択されたキザロホップ−耐性のコロニーは、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株などの未処置の株と比較して成長速度の増加及びＤＨＡ含量の増加に対する選抜を更に受ける。
【００３６】
それ故に、紫外線照射及びキザロホップ選択を含む本明細書に開示した方法によって得られる、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）変異体は、始発株又は未処置シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株と比較してより高い又は増加した量のＤＨＡを産生することができる。特定の実施形態では、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）変異体は、始発株又は未処置株によって産生される量よりも高い量のＤＨＡを、３〜７日又は５日の培養物又はバイオマスにおいて、少なくとも約１０、２０、２５、３０、３５、４０％、又は少なくとも約２０、２５、３０、３５、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０％、より高いＤＨＡの量を産生できる。一実施形態では、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）変異体によって産生されるＤＨＡの量は、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）変異体のバイオマスの乾燥重量に基づいて、少なくとも１．０％（ｗ／ｗ）、２．０％（ｗ／ｗ）、３．０％（ｗ／ｗ）、３．５％（ｗ／ｗ）、４．０％（ｗ／ｗ）、４．５％（ｗ／ｗ）、５．０％（ｗ／ｗ）、５．５％（ｗ／ｗ）、６．０％（ｗ／ｗ）、又は６．５％（ｗ／ｗ）、又は３．０〜６．５％（ｗ／ｗ）である。
【００３７】
別の実施形態では、選択したシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）変異体の成長速度は、好ましくは３〜７日にわたる培養物、更に好ましくは５日にわたる培養物において、始発株又は未処置株の成長速度よりも、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９又は１０％高い。
【００３８】
その他の実施形態では、選択したシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）変異体は、始発株又は未処置株と比較して異なった培養条件、例えば異なったグルコース濃度、異なった窒素供給源及び異なったｐＨ値の下において、安定した成長速度で及び高い量でＤＨＡを産生する能力を有する。
【００３９】
任意選択的な実施形態では、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）変異体の１８Ｓ  ＲＮＡを分析し、始発株又は未処理株と比較して遺伝的変異を識別することができる。
【００４０】
一実施例では、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）変異体の例は、３２１−１、２０１０−０３２１、及び３０３−１１、とりわけ２０１０−０３２１を含むがそれに限定されない。
【００４１】
一実施形態では、より高いＤＨＡの量を有するバイオマスを産生するために、本明細書に開示したシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）変異体、とりわけ、株３２１―１、２０１０−０３２１、３０３−１１、からなる群から選択される株、及びそれらの任意の組み合わせ、又は株２０１０−０３２１は、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）を培養するのに好適な培養条件の下で培養される。
【００４２】
実施形態において、培養条件は、本明細書にその全体が参照として組み込まれる米国特許第５、１３０、２４２号明細書及び同第７、０２２、５１２号明細書に開示される方法を含む当技術分野で周知の培養方法に従って確立することができ、最適な培養条件は当業者によって容易に決定できる。その他の実施形態では、培養は、撹拌タンク発酵槽又は酸素源が供給されるエアリフト発酵槽などの任意の好適な発酵槽で実施できる。微生物を所定濃度で撹拌することができ、その結果溶解酸素の濃度は培養物の成長及びＤＨＡの産生を支持するに十分であり、かつ同時にその撹拌は微生物をせん断することがないか損傷することがない。溶解酸素の好適な濃度は空気の飽和濃度の少なくとも１０％である。より詳細には溶解酸素濃度は空気の飽和濃度の約１０％〜約５０％に維持される。本明細書に開示した方法で使用される代表的発酵槽は、約７０〜１００ｒｐｍの回転速度を用いて１ＶＶＭの通気速度が与えられる。
【００４３】
一実施形態では、発酵槽の容量は少なくとも１０〜６０Ｌ、例えば１０、２０、３０、４０、５０又は６０Ｌである。最大で１００又はさらに１５０Ｌの容量の発酵槽が使用できる。
【００４４】
培養は微生物の生存を維持する任意の好適な温度で実施できる。具体的には微生物は約１５℃〜約３４℃の温度で培養され得る。好ましくは培養温度は約２０℃〜約２８℃に維持され、より好ましくは約２２℃〜約２７℃である。
【００４５】
一実施形態では、発酵中の培養媒体のｐＨは４〜１０、例えば５〜８、好ましくは６〜７であることができる。
【００４６】
一般的には、発酵は１０日間以内、又は９日間以内、又は８日間以内で継続される。一部の実施形態では、発酵継続期間は少なくとも３、４、５、６、又は７日であってもよい。
【００４７】
任意選択で、発酵継続期間は１５０〜２００時間、例えば１６０〜１９０時間又は１７０〜１８０時間であってもよい。
【００４８】
実施形態では、本明細書に開示したシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）変異体を培養する方法に使用される媒体は液体媒体であり、そのものは商業的に実施できる規模において成長及びＤＨＡの産生を促進できる成分を含むことができ、それらの成分には、その全てが参照として本明細書にそれらの全体が組み込まれる米国特許第５、１３０、２４２号明細書及び同第７、０２２、５１２号明細書の中に開示されているそれら成分が挙げられる。
【００４９】
特に、ＤＨＡを産生するために本明細書に開示したシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）変異体を培養するのに使用される媒体は、炭素供給源、及び有機又は無機の窒素供給源を含む。
【００５０】
一実施形態では炭素供給源には、グルコース、各種澱粉、糖蜜、粉砕トウモロコシ、又はそれらの組み合わせが含まれる。別の実施形態では、窒素供給源には、硝酸塩、尿素、アンモニウム塩、アミノ酸、酵母抽出物などが挙げられるがこれらに限定されない。同化性リン化合物（例えばリン酸塩）及び／又は硫黄（例えば、硫酸塩）の供給源もその媒体中に供給されてもよい。
【００５１】
媒体は、発酵を促進するためにその他の物質、例えばキレート化剤（例えば、クエン酸）、消泡剤（例えば、ダイズ油）、ビタミン（例えば、チアミン／リボフラビン）重要な触媒金属（例えば、マグネシウムまたはカルシウムなどのアルカリ土類、または亜鉛又は鉄及び／又はコバルト及び銅等のその他の金属）をさらに含有してもよい。
【００５２】
その他の実施形態では、媒体はまた、単細胞微生物の従属栄養性の増殖を増進することができる、特定化されていない又は特定化されている化合物である微生物増殖因子の供給源を含有することができる。
【００５３】
シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）を培養するための代表的媒体は、Ｊｉａｎｇ及びＣｈｅｎによるＰｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３５（２０００）１２０５−１２０９；Ｊｉａｎｇ及びＣｈｅｎによるＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、（１９９９）Ｖｏｌ．２３、５０８−５１３；Ｖａｚｈａｐｐｉｌｌｙ及びＣｈｅｎによるＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、（１９９８）Ｖｏｌ．７５、Ｎｏ．３ｐ３９３−３９７、に見出すことができる。
【００５４】
一例としては、本明細書に開示した方法の中で使用される媒体は、グルコース４０〜６０、酵母抽出物１０〜１５、グルタミン酸４〜８、食塩２．４〜４．０、にが塩３．０〜６．０、及び硫酸アンモニウム３．０〜６．０（ｇ／Ｌ媒体）を含有する。一実施形態では、本明細書に開示した方法に使用される媒体は、グルコース４０〜６０、酵母抽出物１０〜１５、グルタミン酸ナトリウム４〜８、食塩２．４〜４．０、にが塩３．０〜６．０、及び硫酸アンモニウム３．０〜６．０（ｇ／Ｌ媒体）からなる。本明細書に使用される媒体の一例は、グルコース６０．０、酵母抽出物１５．０、グルタミン酸ナトリウム４．０、食塩３．０、にが塩５．０、及び硫酸アンモニウム５．０（ｇ／Ｌ媒体）からなる。
【００５５】
生物体又はバイオマスは、例えば、遠心分離、凝集沈殿、又はろ過などの手段によって採取でき、直ちに加工することも将来の加工用に乾燥することもできる。任意選択で、脂質を抽出することができる。本明細書で使用する用語「脂質」には、ホスホリピド；遊離脂肪酸；脂肪酸エステル；トリアシルグリセロール；ジアシルグリセライド；モノアシルグリセリド；リゾホスホリド；石鹸；ホスファチド；ステロール及びステロールエステル；カロチノイド；キサントフィル（例えばオキシカロチノイド）；炭化水素；及び当分野における当業者に公知のその他の脂質が挙げられる。当業者により十分理解されるように、本明細書に開示したＤＨＡはこれら各種脂質の形態で存在することができ、かつ本明細書に開示した食品製品中の形態であってもよい遊離脂肪酸に限定されない。脂質の異なった形態又は分画物は、使用される抽出技術に依存するが、抽出可能である。
【００５６】
脂質は有効的な量の溶媒を用いて抽出できる。抽出に使用される好適な溶媒の中で、極性脂質（例えば、ホスホリピド）は一般的に極性溶媒（例えば、クロロホルム／メタノール）で抽出され、中性脂質（例えば、トリアシルグリセロール）は一般的に非極性の溶媒（例えば、ヘキサン）で抽出される。特別な溶媒は純粋ヘキサンである。ヘキサンと乾燥バイオマスとの好適な比率は、１ｋｇの乾燥バイオマス当たり約４リットル（Ｌ）のヘキサンである。特別な実施形態では、ヘキサンは約５０℃の温度で約２時間撹拌反応器中でバイオマスと混合される。混合後、バイオマスはろ過され、油分含有ヘキサンから分離される。ヘキサンは蒸留技術によって油分から除去される。通常の脂肪種子加工装置が、ろ過、分離及び蒸留を実施するのに好適である。特定の用途向けに必要又は所望であれば、追加の処理工程が実施できる。脂質の回収のための別の方法は以下の参照文献に記載され、それら文献は参照として本明細書にそれら全体が組み込まれる。文献は、国際公開第０１／７６７１５号パンフレット、名称「油分及び極性脂質を含有する天然原材料の分画方法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｉｌ  ａｎｄ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｒａｗ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）」；国際公開第０１／７６３８５号パンフレット、名称「油分及び極性脂質を含有する天然原材料のアルコール及び遠心分離の使用による分画方法（Ｍｅｔｈｏｄ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ＯｆＯｉｌ  Ａｎｄ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｒａｗ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｌｃｏｈｏｌ  Ａｎｄ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）」；国際公開第００／１５３５１２号パンフレット、名称「無溶媒抽出方法（Ｓｏｌｖｅｎｔｌｅｓｓ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ）」、である。
【００５７】
本出願は、特定の生物体及び方法を使用して実証してきたが、本明細書に開示した教示に照らして得られる方法及び生物体の全てを包含することを意図している。当業界の当業者であれば、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、任意の置換、変更および最適化が容易に分かるであろう。加えて本明細書に関与する任意の要素、例えば工程、条件、又は菌株などは、本発明の目的を達成するために必要に応じて任意の方式で組み合わせできるであろう。
【００５８】
以下の実施例は単に例示する目的のために提供し、特許請求したような対象の範囲を制限することを意図していない。
【実施例】
【００５９】
実施例１  シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）に対する紫外線照射の突然変異効果
シゾキトリウム・リマシナム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）ＳＲ２１（これは以降の実施例において対照株又は未処置株としても使用される）を皿の上で平板培養し、紫外線照射にそれぞれ、０秒（対照）、３０秒、４０秒、５０秒、６０秒、７０秒、８０秒、９０秒、及び１００秒（実験群）間暴露した。照射後、皿を暗所に２４時間保持し、各皿上のコロニーの数を数えた。対照群におけるコロニーの数を１００％と規定し、かつそれに基づいて各実験群における致死率を計算した（図１）。図１に見られるように、照射期間が延びるにつれてシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）においてより高い致死率が観測され、容量依存性の効果が示された。具体的には、７０〜９０秒の照射継続は（結果的にシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）における致死率は６０％〜８０％であり）、それはシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）における突然変異誘導を誘発するために使用された。
【００６０】
培養条件は、
Ａ．培養媒体であって、
グルコース  ５５ｇ／Ｌ
酵母抽出物  １０ｇ／Ｌ
グルタミン酸ナトリウム  ５ｇ／Ｌ
塩化ナトリウム  ２．４ｇ／Ｌ
にが塩  ４．０ｇ／Ｌ
硫酸アンモニウム  ４．０ｇ／Ｌ
水    残部
からなる培養媒体、
Ｂ．培養温度：２２〜２７℃、及び
Ｃ．初期ｐＨ：５．０〜７．０
である。
【００６１】
実施例２  シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）に対するキザロホップ選定
キザロホップエチルをシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）を培養する媒体の中に濃度０μモル／Ｌ、１０μモル／Ｌ、３０μモル／Ｌ、５０μモル／Ｌ、７０μモル／Ｌ、８０μモル／Ｌ、及び９０μモル／Ｌで添加した。対照群（０μモル／Ｌ）におけるコロニーの数を１００％として規定した。各群におけるコロニーを数え、かつ対照群におけるコロニーの数に基いて致死率を計算した（図２）。図２に見られるように、実験の範囲内でシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）致死率とキザロホップの濃度との間に正の相関関係が観察された。耐性株を選択するために使用したキザロホップの濃度は、５０μモル／Ｌ〜８０μモル／Ｌに設定した。
【００６２】
操作を容易にするため、クザロホップを媒体の中に添加し、かつ紫外線照射を生き延びた株を更なる方向性選択のために平板培養した。
【００６３】
選択された株は、液体又は半固体のキザロホップを含有する媒体中で培養し、それらのキザロホップ耐性を実証することができる。
【００６４】
培養条件は、
Ａ．培養媒体であって、
グルコース  ６０ｇ／Ｌ
酵母抽出物  １５ｇ／Ｌ
グルタミン酸ナトリウム  ４ｇ／Ｌ
塩化ナトリウム  ３ｇ／Ｌ
にが塩  ５．０ｇ／Ｌ
硫酸アンモニウム  ５．０ｇ／Ｌ
水    残部
からなる培養媒体、
Ｂ．培養温度：２２〜２７℃、及び
Ｃ．初期ｐＨ：５．０〜７．０
である。
【００６５】
実施例３  未処置株と変異体株との間における成長速度とＤＨＡ含量との相違
実施例２における選定及び実証の後に、２００種を超えるキザロホップ耐性のシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株を得た。次にこれらのキザロホップ耐性のシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）株をより高い成長速度及びＤＨＡ含量に関して２つの巡回に対して選抜した。第１の巡回後で２０〜５０種の株を選別し、かつ第２の巡回後では３種の株を選別した。その３種の株の各々の成長速度及びＤＨＡ含量は、対照の（未処置の）株よりも１０％を超えて高かった。
【００６６】
培養条件は、
Ａ．培養媒体であって、
グルコース  ６０ｇ／Ｌ
酵母抽出物  １５ｇ／Ｌ
グルタミン酸ナトリウム  ４ｇ／Ｌ
塩化ナトリウム  ３ｇ／Ｌ
にが塩  ５．０ｇ／Ｌ
硫酸アンモニウム  ５．０ｇ／Ｌ
水    残部
からなる培養媒体、
Ｂ．培養温度：２２〜２７℃、
Ｃ．初期ｐＨ：５．０〜７．０
である。
【００６７】
図３は、対照株（最も左）と、紫外線照射突然変異誘導に続いてキザロホップ選択を受けた変異体の幾つかとのバイオマス及びＤＨＡ含量を示す。図３に示すように、突然変異株の一部（例えば３２１−６、３２１−７及び３２１−８）の成長速度及びＤＨＡ含量は対照株のそれよりも低く、かつ一部（例えば３２１−４、３２１−５及び３２１−１９）の成長速度及びＤＨＡ含量は対照の株のそれとは顕著に異なってはいない。突然変異体の中で、それらの多くは増加したＤＨＡ含量を有した（例えば、３２１−１、２０１０−０３２１、３２１−１２、３２１−１３、３２１−１４、３２１−１５、３２１−１６、３２１−１７及び３２１−１８）。目立った株は、３２１−１及び２０１０−０３２１であり、それらはそれぞれ、１０．５％及び３１．５％増加した成長速度を有し、かつそれぞれ６４．５％及び６６．４％増加したＤＨＡ含量を有した。
【００６８】
これら２種の突然変異株に加えて、突然変異株３０３−１１もまた、良好な成長速度及びＤＨＡ含量を示した。
【００６９】
３種の変異体株、すなわち２０１０−０３２１、３２１−１及び３２１−１１は、実施例４〜７に記載の試験用に選択され、本出願の方法によって得られた変異体が高いＤＨＡ含量と成長速度との特性を有し、かつ上記特性が異なった培養条件下で安定的に維持できるということを実証した。
【００７０】
実施例４〜７における実験に使用された一般的な培養条件は、
Ａ．培養媒体であって、
グルコース  ６０ｇ／Ｌ
酵母抽出物  １５ｇ／Ｌ
グルタミン酸ナトリウム  ４ｇ／Ｌ
塩化ナトリウム  ３ｇ／Ｌ
にが塩  ５．０ｇ／Ｌ
硫酸アンモニウム  ５．０ｇ／Ｌ
水    残部
からなる培養媒体、
Ｂ．培養温度：２２〜２７℃、
Ｃ．初期ｐＨ：５．０〜７．０、
Ｄ．１ＶＶＭの通気速度及び７０〜１００ｒｐｍの回転速度を有した５０Ｌの発酵槽、
Ｅ．培養期間：４〜７日
である。
【００７１】
実施例４  異なった濃度のグルコースの下で培養された、対照株及び３２１−１、２０１０−０３２１並びに３０３−１１についての成長速度及びＤＨＡ含量
グルコースの濃度以外は、培養条件は上記の一般的な条件のものと同一である。
【００７２】
対照（未処置）株と突然変異株３２１−１、２０１０−０３２１及び３０３−１１の異なった培養条件に対する反応を比較するため、かつ選択した株の対照株に勝る利点を更に確証するために、一連の試験及び比較を実施した。この実施例では、炭素供給源の異なった濃度下で培養された対照株と突然変異株との成長速度及びＤＨＡ含量を比較し（表１）、ここで、初期の媒体における炭素供給源を異なった試験濃度の炭素供給源で置換した。表１に示したように、異なった濃度のグルコース（５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ及び７０ｇ／Ｌの下で培養した場合、全ての３種の突然変異体において観察された結果は、対照株における結果よりも優れていて、その中で２０１０−０３２１がベストであり、続いて３２１−１及び３０３−１１であった。
【００７３】
【表１】
0005894666.tif 000002
【００７４】
実施例５  異なった窒素供給源中で培養した対照株と株３２１−１、２０１０−０３２１及び３０３−１１との成長速度及びＤＨＡ含量
窒素供給源以外は、培養条件は上記の一般的な条件と同一である。
【００７５】
異なった窒素供給源中で培養した、対照（未処置）株と突然変異株３２１−１、２０１０−０３２１及び３０３−１１の成長速度及びＤＨＡ含量を比較するために本実施例を実施した。初期媒体中における窒素供給源を以下の窒素供給源と置換した：（ａ）酵母抽出物（２０ｇ／Ｌ）；（ｂ）酵母抽出物（２０ｇ／Ｌ）＋グルタミン酸ナトリウム（１０ｇ／Ｌ）；（ｃ）酵母抽出物（４０ｇ／Ｌ）＋グルタミン酸ナトリウム（１０ｇ／Ｌ）、及び（ｄ）コーンシロップ（４０ｇ／Ｌ）＋グルタミン酸ナトリウム（１０ｇ／Ｌ）。表２に示したように、異なった窒素供給源中で培養した場合、突然変異株３２１−１と２０１０−０３２１との成長速度及びＤＨＡ含量は対照株のそれらを上回り、その中で株２０１０−０３２１がＤＨＡ含量において株３２１−１より優れ、一方株３０３−１１は対照株と比較してより高いＤＨＡ含量を示した。
【００７６】
【表２】
0005894666.tif 000003
【００７７】
実施例６  異なったｐＨ値の下で培養した対照株と株３２１−１、２０１０−０３２１及び３０３−１１の成長速度及びＤＨＡ含量
ｐＨ値以外は、培養条件は上記の一般的な条件のものと同一である。
【００７８】
異なったｐＨの下で培養した対照（未処置）株と３種の突然変異株との成長速度及びＤＨＡ含量を評価するために本実施例を実施した（表３）。表３に示したように、株２０１０−０３２１及び３２１−１では、成長速度及びＤＨＡの蓄積は対照株のものよりも高いことを示し、一方突然変異株３０３−１１は対照株と比較して、ＤＨＡの蓄積において僅かの利点を示し、成長速度においては利点がないことを示した。
【００７９】
【表３】
0005894666.tif 000004
【００８０】
実施例７  ５０Ｌ発酵槽において培養して対照株と株３２１−１、２０１０−０３２１及び３０３−１１との成長速度及びＤＨＡ含量
５０Ｌ発酵槽において培養した対照（未処置）株と株３２１−１、２０１０−０３２１、及び３０３−１１との成長速度及びＤＨＡの蓄積を評価するために実施例７を実施した（図４）。株は上記で説明したような一般的条件下で培養した。対照株と比較して、株３２１−１では９．５％増加したバイオマス、及び１６．７％増加したＤＨＡ含量を、それぞれ示した。株２０１０−０３２１に関しては、バイオマス及びＤＨＡ含量はそれぞれ、６．７％及び４８．１％増加した。株３０３−１１については、バイオマスは対照株とほぼ同じであり、ＤＨＡ含量は僅か７．９％増加した。３種の突然変異株の間で総合的に比較すると、２０１０−０３２１が最も優れ、特にＤＨＡ含量に関して最も優れていた。
【００８１】
実施例８  生化学的組成における対照株と株２０１０−０３２１との間の相違
表４及び表５は、タンパク質、アミノ酸及び脂肪酸の組成を含む生化学的組成における、対照（未処置）株と株２０１０−０３２１との間の相違を示した。タンパク質の含量はケルダール法によって決定した。アミノ酸の含量は、アミノ酸分析装置によって定量した。脂肪の含量は脂質分析装置によって分析した。
【００８２】
表４に示したように、株２０１０−０３２１でのタンパク質含量（２３．８％）は、対照株のもの（２２．３％）よりも高かった。継続して、株２０１０−０３２１は、大部分のアミノ酸含量に関して対照株よりも高い濃度を示した。
【００８３】
表５に示したように、株２０１０−０３２１では脂肪酸の組成が対照株とは顕著に異なった。第１に、株２０１０−０３２１ではＣ１６：０含量（８．２％）が対照株のそれ（７．７％）よりも高かった。第２に、２０１０−０３２１ではＣ１６：１は存在せず、一方対照株のＣ１６：１含量は１．０％であった。第３に、株２０１０−０３２１ではＤＨＡ（Ｃ２２：６）含量は対照株のそれよりも顕著に高かった。
【００８４】
【表４】
0005894666.tif 000005
【００８５】
【表５】
0005894666.tif 000006
【００８６】
実施例９  対照株と株２０１０−０３２１との間における１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列の比較
全ＲＮＡを溶解法によって試験株から抽出した。ｃＤＮＡに逆転写した後で、１８Ｓ  ＲＮＡ遺伝子を順方向プライマー５’−ＣＣＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＡＴＣＣＴＧＣＣＡＧＴＡ−３’（配列番号３）及び逆方向プライマー５’−ＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＣＴＣＴ−３’（配列番号４）で増幅した。単位複製配列（アンプリコン）を回収し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α  コンピテント細胞を形質転換するために使用した。陽性のコロニーを配列決定用に選択した。対照（未処置）と株２０１０−０３２１との１８ＳＲＮＡ遺伝子の配列をＢｌａｓｔソフトウエアで整列化及び比較した。結果を図５に示した。
【００８７】
図５には、対照株と株２０１０−０３２１との相同性比較のために１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の整列配置を示した。図に示されるように、対照株（配列番号１）の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子は１７５７ｂｐ長さであり、一方株２０１０−０３２１（配列番号２）の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子は１７５１ｂｐ長さでありその中の９個の塩基対が変化していた。対照株の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子と株２０１０−０３２１の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子との間の％相同性は９９％であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【配列表】
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