(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳神経疾患治療、脳神経疾患予防または脳機能改善のための医薬組成物であって、
ヘプタメトキシフラボンを有効成分とする医薬組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の医薬組成物を製造する方法であって、
河内晩柑の果皮より有機溶媒にて抽出する工程を含む医薬組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、医薬組成物及び医薬組成物の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、日本をはじめとする先進諸国では、脳梗塞や頭部外傷、アルツハイマー病やパーキンソン病などの認知・記憶障害、さまざまなストレスに起因するうつ病や不安症など、脳機能が低下した患者が増加し、社会問題となっている。
【０００３】
特許文献１には、柑橘類の全果の粉砕搾汁液やその抽出物により、学習記憶障害を改善することが記載されている。
【０００４】
特許文献２には、ポリメトキシフラボノイドのノビレチンまたはタンゲレチンを含む神経突起伸長剤が記載されている。すなわち、ノビレチンまたはタンゲレチンを含有する培地で未分化神経細胞のモデル細胞であるラット由来ＰＣ１２細胞を培養したところ、神経突起の伸びている細胞の割合が増加することが報告されている。また、非特許文献１には、生薬の陳皮(熟したみかんの皮を干したもの)に含まれるノビレチンが、痴呆症モデル動物に投与すると抗認知症作用を示すと報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−６１０２８号公報
【特許文献２】特開２００２−６０３４０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｍａｔｓｕｚａｋｉ  Ｋ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２００８）５７８：１９４−２００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１で使用された柑橘はポンカンであるが、同文献０００８段落には２４種類の柑橘類が列記されている。しかし、それらに共通の有効成分は特定されていない。柑橘類の種類によって、含有成分は大きく異なり、たとえば、ポンカンの抽出物に関する作用が、他の柑橘でも得られるとは限らない。
【０００８】
特許文献２では、神経突起の伸びている細胞の割合の増加が報告されているが、神経細胞がなんらかの要因で損傷されるのを防止することは記載されておらず、また、減少した神経細胞を再生することについても記載はない。神経突起の伸長を促進するのみでは、脳神経疾患、脳機能異常の治療あるいは予防の効力は限定されると思われる。
【０００９】
この発明は、脳神経疾患治療、脳神経疾患予防または脳機能改善のための医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の課題を解決するために、この発明の医薬組成物は、脳神経疾患治療、脳神経疾患予防または脳機能改善のための医薬組成物であって、ヘプタメトキシフラボンを有効成分とする。また、この発明の医薬組成物は、柑橘類でも特に河内晩柑の果皮より、有機溶媒による抽出やカラムクロマトグラフィーにて分画することができる。
【発明の効果】
【００１１】
この発明の医薬組成物は、脳神経疾患治療、脳神経疾患予防または脳機能改善の効果を有し、特に、脳神経細胞の遅発性細胞死抑制作用／新生促進作用、脳における神経栄養因子産生促進作用／抗炎症作用を有する。この発明の医薬組成物は、柑橘類にも含有される物質を有効成分としており、副作用が少なく、長期にわたって服用しても安全性が高い。 
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】柑橘類１１種でのノビレチン、ヘプタメトキシフラボン、タンゲレチンおよびオーラプテンの含有割合を示すグラフである。
【図２】実施例１の試験方法のプロトコールを示すチャート図である。
【図３】実施例１における「Ｍｏｒｒｉｓ水迷路試験」での逃避時間の試験結果を示すグラフである。
【図４】実施例１における「Ｍｏｒｒｉｓ水迷路試験」でのＰｒｏｂｅ  ｔｅｓｔの結果を示すグラフである。
【図５】実施例２における「オープンフィールドテスト」でのフィールド中央部分への侵入回数の試験結果を示すグラフである。
【図６】実施例３におけるマウスの生存率の時間変化を示すグラフである。
【図７】実施例４の試験方法のプロトコールを示すチャート図である。
【図８】実施例４におけるＤＣＸ陽性細胞数を示すグラフである。
【図９】実施例４におけるＢＤＮＦ陽性細胞数を示すグラフである。
【図１０】実施例５におけるマウスの生存率の時間変化を示すグラフである。
【図１１】実施例５におけるＩＢＡ１陽性細胞数を示すグラフである。
【図１２】実施例５におけるＮｉｓｓｌ染色陽性細胞数を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明を実施するための形態について説明する。本発明に係る組成物は、ヘプタメトキシフラボンまたはオーラプテンを有効成分とする。ヘプタメトキシフラボンまたはオーラプテンのいずれかを含むものでもよく、双方を含むものでもよい。
【００１４】
柑橘類特有の機能性成分としてポリメトキシフラボン類がある。ポリメトキシフラボンはメトキシ基（−ＯＣＨ3）を多数有するフラボンである。メトキシ基が５個つくとタンゲレチン、６個つくとノビレチンであり、７個ついたものが化１に示すヘプタメトキシフラボンである。
【化１】
0005945861.tif 000002
【００１５】
柑橘類は、ヘプタメトキシフラボンを多く含む系統と、ノビレチンとタンゲレチンを多く含む系統に大別される。ヘプタメトキシフラボンは温州ミカン、伊予柑、バレンシアオレンジ、八朔、カボスなどに存在する。ノビレチンとタンゲレチンを多く含む系統には、無核紀州やシークワーシャーなどがある。
【００１６】
オーラプテンもまた柑橘類特有の機能性成分であり、夏ミカン、八朔、グレープフルーツ、ユズなどに多く含まれる。オーラプテンはクマリン系化合物で、化２に示す構造をもつ。
【化２】
0005945861.tif 000003
【００１７】
図１は、愛媛県産を中心とする柑橘類１１種（みかん・ポンカン・伊予柑・カラ・モロ・タロッコ・河内晩柑・文旦・グレープフルーツ・じゃばら・シークワーシャー、タロッコと河内晩柑については未熟果も検討）の果皮エタノール抽出物について、機能性成分として報告が知られている柑橘特有フラボノイド３種（ノビレチン、ヘプタメトキシフラボン、タンゲレチン）およびオーラプテンの割合を示すグラフである。
【００１８】
図１より、柑橘類であっても、種類によって成分構成が著しく相違することがわかる。したがって、ある種のものが生体に有用な作用を有することが見られても、他の柑橘類において同じ作用が得られるとは限らない。
【００１９】
ここで、ザボン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｍａｘｉｍａ、Ｃｉｔｒｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）の一種である河内晩柑の成分はヘプタメトキシフラボンおよびオーラプテンが多量であるという、他の柑橘類には見られない特徴的な構成を示した。この河内晩柑は、実を初夏まで木にならせておく（実が１５ヶ月も木になっている）、すなわち１本の木に今期と来期の実が同時になっているという、他の品種では見られない特徴を持つ。
【実施例１】
【００２０】
実施例１について説明する。この実施例１は、河内晩柑を有機溶媒にて抽出した組成物に関する。
【００２１】
ここで、河内晩柑よりヘプタメトキシフラボンおよびオーラプテンを抽出して組成物を製造する方法の例について説明する。河内晩柑の新鮮果皮約５００ｇにヘキサン３リットルを加えてホモジナイズし、室温下一晩静置後、ろ取したろ液を減圧濃縮して得られたエキスを河内晩柑果皮へキサン抽出物とする。得られたサンプルについて、ヘプタメトキシフラボンおよびオーラプテンをＨＰＬＣ分析により定量分析した結果、サンプル当りの組成比が、へプラメトキシフラボン２９％、オーラプテン２２％で、これを調製したのが以下に使用する組成物である。
【００２２】
被検動物として、ＭＫ−８０１を腹腔内に単回投与（０．０５ｍｇ／ｋｇ）して一過性健忘症状を起こしたＩＣＲマウス（６週齢、オス）を用いた。ＭＫ−８０１は、記憶や学習などに深く関わるとされるグルタミン酸受容体サブタイプのＮＭＤＡ受容体に対する拮抗薬で、健忘症を誘発し、行動異常を引き起こすことが知られている。本実施例の組成物である河内晩柑果皮ヘキサン抽出物は、浸透圧ポンプにいれて皮下に埋め込み、投与した（１００ｍｇ／ｋｇ／日）。
【００２３】
学習記憶能に及ぼす作用は「Ｍｏｒｒｉｓ水迷路試験」により解析した。本試験は空間情報を手がかりとした退避行動の観察を利用するもので、水を張ったプールに入れられたマウスが、空間記憶をもとに水面下に隠れたプラットホームを探索し逃避するまでの時間などを評価するものである。ＭＫ−８０１は、毎回水迷路試験開始３０分前に腹腔内投与した。
【００２４】
図２は実施例１の試験方法のプロトコールを示す概念図である。被検試料投与（すなわち浸透圧ポンプ埋め込み）３〜６日目に水面下のプラットホームを探索する訓練試行（Ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｐｅｒｉｏｄ）を１日５回行い、逃避時間（プラットホームに到達するまでに要する時間）を測定した。
【００２５】
図３は実施例１の試験結果、すなわち「Ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｐｅｒｉｏｄ」における逃避時間を示すグラフである。学習試験４日目（ポンプ埋め込みから６日目）における試験結果を示す。図３のグラフの縦軸は水面下に隠れたプラットホームを探索し逃避するまでの時間を示し、値が小さいほど学習内容の記憶が良好であることを示す。河内晩柑果皮ヘキサン抽出物投与群の逃避時間はＭＫ−８０１投与群に比べて顕著に短縮しており、前日までの訓練試行で学習したプラットホームの場所を次の日でもより覚えている結果となった。
【００２６】
学習試験５日目（ポンプ埋め込みから７日目）には避難場所であるプラットホームをプールから取り除き、プラットホームがあった場所を何回横切ったかを測定した（Ｐｒｏｂｅ  ｔｅｓｔ）。図４にその試験結果を示す。縦軸は横切った回数を示し、その値が大きいほど学習内容の記憶が良好であることを示す。河内晩柑果皮ヘキサン抽出物投与群は、前日までの訓練試行で学習したプラットホームの場所を次の日でもより覚えている結果となった。
【実施例２】
【００２７】
この実施例２では、ヘプタメトキシフラボン（ＨＭＦ）投与が統合失調症様陽性症状のモデル動物に及ぼす作用について示す。ＭＫ−８０１は、低用量を投与すると健忘症モデル動物を作成できる（実施例１）が、高用量投与で過活動を生じること、すなわち統合失調症様陽性症状を引き起こすが知られている。そこで、被検動物のＩＣＲマウスに被検試料のＨＭＦを１日１回、８日間連続で皮下投与し（５０ｍｇ／ｋｇ／日）、８日目のＨＭＦ投与３０分後に高用量のＭＫ−８０１（０．２ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。さらにその３０分後にマウスを７０×７０×５０ｃｍの箱に入れて１０分間自由に探索させ、自発行動に及ぼす影響を観察した (オープンフィールドテスト)。オープンフィールドテストでは歩行量、立ち上がり回数、脱糞数などを測定することで新規の環境における適応性をみることができ、活動性や情動性の指標とすることができる。
【００２８】
図５は実施例２の試験結果を示すグラフであり、縦軸はフィールド(７０×７０ｃｍ)の中央部分（３５×３５ｃｍ）への進入頻度（所定時間内の進入回数）を示す。ＭＫ−８０１投与により行動量の上昇(過活動)が認められたが、ＭＫ−８０１＋ＨＭＦ投与群では行動量の上昇は認められず、ＨＭＦ投与により正常な行動が保たれることが明らかになった。特に、フィールドの中央部分への進入は「行動の活発化」「新規環境に対する馴化の阻害」を示すが、ＭＫ−８０１投与群では対照群よりも有意にその回数が高かった（＊、ｐ＜０．０５）のに対し、ＭＫ−８０１＋ＨＭＦ投与群（#、ｐ＜０．０５）は対照群と同じレベルであった。この結果から、ＭＫ−８０１が引き起こす海馬機能の異常（＝新規環境に対する馴化の阻害）が、ＨＭＦ投与により正常に保たれることが示された。
【実施例３】
【００２９】
この実施例３では、ヘプタメトキシフラボン（ＨＭＦ）投与が脳虚血モデル動物に及ぼす作用について示す。脳虚血モデル動物として、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（９週齢、オス）を麻酔下において１２分間の両側総頸動脈の遮断を行い、一過性脳虚血症状を起こした。被験試料のＨＭＦは、浸透圧ポンプにいれて手術直後に背中の皮下に埋め込み、徐放的に連続投与した（２５ｍｇ／ｋｇ／日）。
【００３０】
図６は、マウスの生存率の時間変化を示すグラフである。脳虚血群の一部は手術３日目に死亡し、５日目の死亡率は５０％に達した。しかし、ＨＭＦ投与群では、４日目に一部のマウスが死亡し始めたものの、５日目の死亡率は２０％にとどまった。
【実施例４】
【００３１】
この実施例４でも、ヘプタメトキシフラボン（ＨＭＦ）投与が脳虚血モデル動物に及ぼす作用について示す。虚血の刺激により、脳内で脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の増加ならびに神経再生がおこることが知られている。そこで、脳虚血モデル動物として、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（９週齢、オス）を麻酔下において１２分間の両側総頸動脈の遮断を行い、一過性脳虚血症状を起こした。被験試料であるＨＭＦを連続投与（２５ｍｇ／ｋｇ／日あるいは５０ｍｇ／ｋｇ／日）するため、脳虚血手術５日前に背中の皮下に浸透圧ポンプを埋め込んだ。手術３日目（サンプル投与開始から８日目）に脳組織を摘出して凍結組織片を調製し、免疫組織染色法に供した。図７は実施例４の試験方法のプロトコールを示すチャート図である。
【００３２】
神経再生に及ぼす作用について説明する。虚血の刺激による脳内での神経再生を調べるため、海馬組織片を用い、新生神経細胞をそのマーカーである微小管結合タンパク質ダブルコルチン（ＤＣＸ）で免疫染色して観察した。図８は、ＤＣＸ陽性細胞数、すなわち新生神経細胞数を示すグラフである。図８より陽性細胞は脳虚血群では偽手術群に比べて増えているが、ＨＭＦ投与群では脳虚血群よりもさらに増加していることが認められた。
【００３３】
次に、ＢＤＮＦ産生に及ぼす作用について説明する。虚血の刺激により、脳内でＢＤＮＦの増加のおこること、その際のＢＤＮＦ産生細胞はアストロサイト（神経細胞の周囲にあり、神経細胞を養っていると考えられている細胞）であることが知られている。そこで、海馬組織片を用いてＢＤＮＦを免疫染色して観察した。図９は、ＢＤＮＦ産生細胞数を示すグラフである。陽性細胞は脳虚血群では偽手術群に比べて増えているが、ＨＭＦ投与群では偽手術群に比べて（＊、ｐ＜０．０５）、あるいは脳虚血群に比べて（#、ｐ＜０．０５）有意に増加していることが認められた。しかも、ＢＤＮＦ陽性細胞はグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）陽性細胞すなわちアストロサイト陽性細胞と一致していた。
【００３４】
以上の結果より、虚血の刺激による脳内ＢＤＮＦ増加ならびに神経再生はＨＭＦ投与により増強されること、これが虚血障害による死亡率低下に影響している可能性が示される。
【実施例５】
【００３５】
この実施例５では、オーラプテン（ＡＵＲ）投与が脳虚血モデル動物に及ぼす作用について示す。被検動物として、実施例３と同様、麻酔下において１２分間の両側総頸動脈の遮断を行い、一過性脳虚血症状を起こしたＣ５７ＢＬ／６マウス（９週齢、オス）を用いた。被験試料のＡＵＲは浸透圧ポンプにいれて手術直後に背中の皮下に埋め込むことで、１週間、徐放的に連続投与した（２５ｍｇ／ｋｇ／日）。８日目に脳組織を摘出して凍結組織片を調製し、免疫組織染色法に供した。
【００３６】
個体死亡に及ぼす作用について説明する。図１０はマウスの生存率の時間変化を示すグラフである。脳虚血群では手術３日目に死亡するマウスが現れ、５日目には５０％が死亡した。しかし、ＡＵＲ投与群では、４日目に一部のマウスが死亡し始めたものの、５日目の死亡率は１１％にとどまった。
【００３７】
つぎに、マイクログリア発現に及ぼす作用について説明する。脳内で免疫を担当しているマイクログリア(ＩＢＡ１陽性細胞)の発現について、海馬組織を免疫染色法で調べた。図１１はＩＢＡ１陽性細胞数を示すグラフである。その結果、偽手術群ではマイクログリアの活性化（＝炎症反応誘発）がほとんど認められないのに対し、脳虚血群でのマイクログリアの活性化が海馬において顕著におこっていた（＊、ｐ＜０．０５）。しかしＡＵＲ投与群では、脳虚血群で認められるマイクログリアの強い発現は抑制されていた（＃、ｐ＜０．０５）。
【００３８】
神経細胞脱落に及ぼす作用について説明する。神経細胞の脱落については、神経細胞の核をＮｉｓｓｌ染色することで調べた。図１２はＮｉｓｓｌ染色陽性細胞数を示すグラフである。その結果、ＣＡ１領域（＃、ｐ＜０．０５）、ＣＡ２領域（＃＃＃、ｐ＜０．００１）、ＣＡ３領域（＃＃、ｐ＜０．０１）で、有意にＡＵＲ投与により神経細胞の脱落が抑制されていた。
【００３９】
以上の結果から、脳虚血および虚血後の再灌流により誘発される炎症がＡＵＲ投与により抑制されること、したがって、遅発性細胞死を抑制できる可能性のあることが示される。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明者らは、柑橘類特有の機能性成分を見出す目的で、培養神経細胞のＭＡＰキナーゼ（神経細胞の機能を高め、記憶・学習や認知機能など幅広い高次脳機能に不可欠と解明されつつあるシグナル伝達分子）のリン酸化を促進する作用を指標としてスクリーニングし、候補化合物としてヘプタメトキシフラボンとオーラプテンを得た。このヘプタメトキシフラボンとオーラプテンについて、脳疾患病態モデルマウスに投与して組織化学的手法などを用いて解析し、本発明を完成させるに至った。
【００４１】
対象となる脳神経疾患としては、たとえば、炎症性病変を伴う脳関連疾患、すなわち脳梗塞、頭部外傷、アルツハイマー病、パーキンソン病などから成る群から選ばれる１以上、およびＮＭＤＡ受容体など伝達物質受容体の関与が示唆されている脳関連疾患、すなわち統合失調症、うつ病、不安症などから成る群から選ばれる１以上が挙げられる。また対象となる脳機能としては、たとえば、記憶学習能低下、運動障害、うつ症状、不安症状などから成る群から選ばれる１以上が挙げられる。また、本発明は、上記組成物が添加されている食品にも適用できる。本発明の組成物は、医薬、食品、食品添加物、飼料、ペットフードなど広く適用することができる。
【図１】
0005945861.tif 000004
【図２】
0005945861.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
0005945861.tif 000012
【図１０】
0005945861.tif 000013
【図１１】
0005945861.tif 000014
【図１２】
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