(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、または配列番号２で表されるアミノ酸配列においてＮ１７６Ｋ，Ｎ１７６Ｒ、Ｎ１７６Ｅ、Ｎ１７６Ｓ、Ｎ２２５Ｋ、Ｎ２２５Ｅ、Ｎ２５９Ｋ，Ｎ３０１Ｋ、Ｎ３２６Ｋ、Ｎ３２６Ｅ、Ｎ３３０Ｋ、Ｎ３３０Ｓ、Ｎ３５５Ｋ、Ｎ３５５Ｅ、Ｓ５１４ＧまたはＳ５５２Ｃ、またはこれらの組み合わせのアミノ酸変異を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有する蛋白質。
【請求項２】
さらに、Ｇ５３Ａ、Ｅ１６６Ｒ、Ｔ１６８Ｐ、Ｎ４８７Ｓ、Ｓ４９０Ｐ、Ｎ４９２Ｔ、Ａ４９６Ｅ、Ｄ５００Ｅ、Ｖ５０２ＬまたはＡ５０５Ｎ、またはこれらの組み合わせのアミノ酸変異を有する、請求項１記載の蛋白質。
【請求項３】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質において、Ｎ１７６Ｋ／Ｓ４９０Ｐ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｋ／Ａ４９６Ｅ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｋ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２ＣおよびＧ５３Ａ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃからなる群より選択されるアミノ酸変異を有する蛋白質。
【請求項４】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質において、Ｎ１７６Ｋ／Ｎ３０１Ｋ／Ｎ３３０Ｋ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｒ／Ｎ３０１Ｋ／Ｎ３３０Ｋ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｒ／Ｎ２２５Ｅ／Ｎ３０１Ｋ／Ｎ３２６Ｅ／Ｎ３３０Ｋ／Ｎ３５５Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｋ／Ｓ４９０Ｐ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、およびＥ１６６Ｒ／Ｔ１６８Ｐ／Ｎ１７６Ｒ／Ｎ３０１Ｋ／Ｎ３３０Ｋ／Ｓ４９０Ｐ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃからなる群より選択されるアミノ酸変異を有する蛋白質。
【請求項５】
配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、または配列番号４で表されるアミノ酸配列においてＶ１４９ＣおよびＧ１９０Ｃのアミノ酸変異を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有する蛋白質。
【請求項６】
真菌由来のグルコース脱水素酵素であって、配列番号２および５−９からなる群より選択されるアミノ酸配列において、配列番号４で表されるアミノ酸配列のＶ１４９およびＧ１９０に相当する位置のアミノ酸が両方ともシステインで置き換えられているアミノ酸配配列からなることを特徴とするグルコース脱水素酵素。
【請求項７】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、または配列番号２で表されるアミノ酸配列においてＡ１５０Ｃ／Ｔ１９２Ｃのアミノ酸変異を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有する蛋白質。
【請求項８】
請求項１−７のいずれかに記載の蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項９】
請求項８に記載の遺伝子を含有する組み換えベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の組み換えベクターで形質転換した形質転換体または形質導入体。
【請求項１１】
請求項１０に記載の形質転換体を培養して、該培養物からグルコース脱水素酵素を採取することを特徴とするグルコース脱水素酵素の製造方法。
【請求項１２】
請求項１−７のいずれかに記載の蛋白質を用いて試料中のグルコース濃度を測定することを特徴とするグルコース分析方法。
【請求項１３】
請求項１−７のいずれかに記載の蛋白質を含むことを特徴とするグルコースのアッセイキット。
【請求項１４】
請求項１−７のいずれかに記載の蛋白質が電極表面に固定化されている酵素電極。
【請求項１５】
作用極として請求項１４に記載の酵素電極を用いることを特徴とするグルコースセンサー。
【請求項１６】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、または配列番号２で表されるアミノ酸配列においてＮ１７６Ｋ，Ｎ１７６Ｒ、Ｎ１７６Ｅ、Ｎ１７６Ｓ、Ｎ２２５Ｋ、Ｎ２２５Ｅ、Ｎ２５９Ｋ，Ｎ３０１Ｋ、Ｎ３２６Ｋ、Ｎ３２６Ｅ、Ｎ３３０Ｋ、Ｎ３３０Ｓ、Ｎ３５５Ｋ、Ｎ３５５Ｅ、Ｓ５１４ＧまたはＳ５５２Ｃ、またはこれらの組み合わせのアミノ酸変異を有し、かつグルコース酸化酵素活性を示さずかつグルコース脱水素酵素活性を有し、キシロースに対する反応性がグルコースに対する反応性の20％以下であることを特徴とするグルコース脱水素酵素を用いる、溶存酸素の影響を受けないグルコース計測用のバイオセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願
本出願は，日本特許出願２０１０−１４７７９９（２０１０年６月２９日出願）に基づく優先権を主張しており，この内容は本明細書に参照として取り込まれる。【０００２】
技術分野
本発明はフラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素とするグルコース脱水素酵素（ＦＡＤ−ＧＤＨ）、その製造、およびグルコースの定量におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
血中グルコース濃度は、糖尿病の重要なマーカーである。これまで、グルコース濃度を測定するために、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、グルコース６リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素（ＰＱＱＧＤＨ）などを用いる酵素法が用いられてきた。しかしながら、ＧＯＤは電子受容体として酸素を必要とするため、被検試料中の溶存酸素の値が測定値に影響を及ぼすという欠点があり、Ｇ６ＰＤＨでは反応系に補酵素であるＮＡＤ（Ｐ）を添加しなければならず、検出系が複雑になるという問題点があった。また、ＰＱＱＧＤＨはグルコースに対して高い酸化活性を有しており、電子受容体として酸素を必要としないという利点をもつが、グルコースに対する選択性が低く、マルトースに対しても高い活性を示すことが問題であった。したがって、グルコースセンサーの認識素子として用いることができる新たな酵素が求められている。さらに、キシロース吸収試験の実施中であっても血糖値を正確に測定できるよう、キシロースに対する反応性が低いことが望ましい。【０００４】
真菌がグルコース脱水素酵素を有することは古くから知られている（例えば、Biochim  biophys  Acta.  139(2),  p.265-276,  1967）。また、アスペルギルス属やペニシリウム属由来のグルコース脱水素酵素およびこれを用いるグルコース濃度の測定は、例えば以下の特許文献に開示されている（特開2007-289148、特開2008-178380、特開2008-035748、特開2008-035747、WO2007/11610、WO2004/058958、WO2006/101239、WO2007/139013）。しかし、真菌由来の酵素はその多くは糖蛋白質であり、機能発現には糖鎖修飾が必要である。特にグルコース酸化酵素などの細胞外分泌酵素においては糖鎖修飾が高度に行われていることから、これらの真菌由来の糖蛋白質を大腸菌を用いて組み換え生産することは極めて困難であった。真菌由来グルコース脱水素酵素も細胞外分泌蛋白質であることから、真菌由来グルコース脱水素酵素を大腸菌で組換え発現させることが難しく、発現できたとしてもその生産性が低いために、培養物単位容量あたりの酵素の収率がきわめて低いことが問題であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2007-289148
【特許文献２】特開2008-178380
【特許文献３】特開2008-035748
【特許文献４】特開2008-035747
【特許文献５】WO2007/11610
【特許文献６】WO2004/058958
【特許文献７】WO2006/101239
【特許文献８】WO2007/139013
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Rolke  et  al.,  Mol  Plant  Pathol.  5(1),  p.17-27,  2004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、従来のグルコース脱水素酵素と比較して、さらに高い生産性および／または高い熱安定性を有する新たな酵素を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、ボトリオチニア・フケリアナ（Botryothinia  fuckeliana）由来の新規ＦＡＤ−ＧＤＨをコードする遺伝子を単離し、さらにその特定のアミノ酸残基を置換することにより、大腸菌での組換え発現の生産性が顕著に高まることを見いだした。本発明者はまた、真菌由来フラビンアデニンジヌクレオチドグルコース脱水素酵素（ＦＡＤ−ＧＤＨ）の特定のアミノ酸残基を置換することにより、その熱安定性が顕著に高まることを見いだした。【０００９】
すなわち、本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、または配列番号２で表されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、置換または挿入されており、かつグルコース脱水素酵素活性を有する蛋白質において、Ｎ１７６Ｋ，Ｎ１７６Ｒ、Ｎ１７６Ｅ、Ｎ１７６Ｓ、Ｎ２２５Ｋ、Ｎ２２５Ｅ、Ｎ２５９Ｋ，Ｎ３０１Ｋ、Ｎ３２６Ｋ、Ｎ３２６Ｅ、Ｎ３３０Ｋ、Ｎ３３０Ｓ、Ｎ３５５Ｋ、Ｎ３５５Ｅ、Ｓ５１４ＧまたはＳ５５２Ｃ、またはこれらの組み合わせのアミノ酸変異を有する蛋白質を提供する。好ましくは、本発明の蛋白質はさらに、Ｇ５３Ａ、Ｅ１６６Ｒ、Ｔ１６８Ｐ、Ｎ４８７Ｓ、Ｓ４９０Ｐ、Ｎ４９２Ｔ、Ａ４９６Ｅ、Ｄ５００Ｅ、Ｖ５０２ＬおよびＡ５０５Ｎからなる群より選択される１またはそれ以上の変異を有する。特に好ましくは、本発明の蛋白質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質において、Ｎ１７６Ｋ／Ｓ４９０Ｐ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｋ／Ａ４９６Ｅ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｋ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｇ５３Ａ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃからなる群より選択されるアミノ酸変異を有する蛋白質である。さらに好ましくは、本発明の蛋白質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質において、Ｎ１７６Ｋ／Ｎ３０１Ｋ／Ｎ３３０Ｋ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｒ／Ｎ３０１Ｋ／Ｎ３３０Ｋ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｒ／Ｎ２２５Ｅ／Ｎ３０１Ｋ／Ｎ３２６Ｅ／Ｎ３３０Ｋ／Ｎ３５５Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｋ／Ｓ４９０Ｐ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、およびＥ１６６Ｒ／Ｔ１６８Ｐ／Ｎ１７６Ｒ／Ｎ３０１Ｋ／Ｎ３３０Ｋ／Ｓ４９０Ｐ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃからなる群より選択されるアミノ酸変異を有する蛋白質である。【００１０】
別の観点においては、本発明は、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、または配列番号４で表されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、置換または挿入されており、かつグルコース脱水素酵素活性を有する蛋白質において、Ｖ１４９ＣおよびＧ１９０Ｃのアミノ酸変異を有する蛋白質を提供する。【００１１】
また別の観点においては、本発明は、真菌由来のグルコース脱水素酵素であって、そのアミノ酸配列を配列番号４で表されるアミノ酸配列とアラインメントしたときに配列番号４で表されるアミノ酸配列のＶ１４９およびＧ１９０に相当する位置のアミノ酸が両方ともシステインで置き換えられていることを特徴とするグルコース脱水素酵素を提供する。好ましくは、本発明の真菌由来のグルコース脱水素酵素は、配列番号２および５−９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、配列番号４で表されるアミノ酸配列のＶ１４９およびＧ１９０に相当する位置のアミノ酸が両方ともシステインで置き換えられている。【００１２】
さらに別の観点においては、本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、または配列番号２で表されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、置換または挿入されており、かつグルコース脱水素酵素活性を有する蛋白質において、Ａ１５０Ｃ／Ｔ１９２Ｃのアミノ酸変異を有する蛋白質を提供する。【００１３】
また別の観点においては、本発明は、本発明のグルコース脱水素酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組み換えベクター、ならびに該組み換えベクターで形質転換した形質転換体または形質導入体を提供する。本発明はまた、本発明のグルコース脱水素酵素をコードする遺伝子を含有する組み換えベクターで形質転換した形質転換体を培養して、該培養物からグルコース脱水素酵素を採取することを特徴とする、グルコース脱水素酵素の製造方法を提供する。【００１４】
さらに別の観点においては、本発明は、本発明のグルコース脱水素酵素を用いて試料中のグルコース濃度を測定することを特徴とするグルコース分析方法を提供する。本発明はまた、本発明のグルコース脱水素酵素を含むことを特徴とするグルコースのアッセイキットを提供する。本発明はまた、本発明のグルコース脱水素酵素が電極表面に固定化されている酵素電極、ならびに該酵素電極を作用極として用いることを特徴とするグルコースセンサーを提供する。【００１５】
さらに別の観点においては、本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、または配列番号２で表されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、置換または挿入されており、かつグルコース酸化酵素活性を示さずかつグルコース脱水素酵素活性を有し、キシロースに対する反応性がグルコースに対する反応性の20％以下であることを特徴とするグルコース脱水素酵素を用いる、溶存酸素の影響を受けないグルコース計測用のバイオセンサーを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１−１】図１−１は、真菌由来グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列のアライメントを示す。図中、アスペルギルス・オリゼＴＩ株由来ＦＡＤ−ＧＤＨの１４９番目のアミノ酸残基Ｖおよび１９０番目のアミノ酸残基Ｇ、ならびにこれらのアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基は太字で示される。略号はそれぞれ次の意味である。Aspca1＿10864：Aspergillus  carbonarius  ITEM  5010;  GenBank  Aspca1＿10864、Aspca1＿33771：Aspergillus  carbonarius  ITEM  5010;  GenBank  Aspca1＿33771、Bfu  (AJ＿555871)：Botryothinia  fuckeliana  (GenBank  AJ＿555871)、Ssc(XP＿001584680)：Sclenotinia  sclerotiorum  (GenBank  XP＿001584680)、40715(XP＿001394544)：Aspergillus  niger  40715(GenBank  XP＿001394544)、39269(XP＿001391138)：Aspergillus  niger  39269(GenBank  XP＿001391138)、AoT1  FADGDH：Aspergillus  oryzae  T1  FAD-GDH。
【図１−２】図１−２は、真菌由来グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図１−３】図１−３は、真菌由来グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図２】図２は、組換えボトリオチニア・フケリアナ由来ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を有する大腸菌形質転換体の培養曲線を示す。
【図３】図３は、アスペルギルス・オリゼ由来の野生型および改変型ＦＡＤ−ＧＤＨの熱安定性を示す。
【図４】図４は、アスペルギルス・オリゼ由来の野生型および改変型ＦＡＤ−ＧＤＨの酵素活性を示す。
【図５】図５は、ボトリオチニア・フケリアナ由来の野生型および改変型ＦＡＤ−ＧＤＨの熱安定性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
ボトリオチニア・フケリアナ由来ＦＡＤ−ＧＤＨ
本発明においては、ボトリオチニア・フケリアナのもつＦＡＤ−ＧＤＨが同定された。そのアミノ酸配列は配列番号１に示される。ボトリオチニア・フケリアナのゲノム配列は公開されているが、ボトリオチニア・フケリアナがＦＡＤ−ＧＤＨを有するという報告はこれまでになく、またＦＡＤ−ＧＤＨとしてアノーテーションされた遺伝子もなかった。配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質は、従来はグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）であると推定されていたが（Rolke  et  al.,  Mol  Plant  Pathol.  5(1),  p.17-27,  2004）、本発明者は、この蛋白質はＧＯＤではなくＧＤＨであることを初めて明らかにした。ＧＤＨは、ＧＯＤと異なり、グルコース測定において溶存酸素の影響を受けないため、グルコース計測用のバイオセンサーの認識素子として有用である。配列番号１で示されるアミノ酸配列は、既知の真菌由来グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列と約３０〜６０％の配列同一性を有し、例えば、アスペルギルス・オリゼＴＩ株由来グルコース脱水素酵素（GenBank  ACW04779.1）とは約５７％のアミノ酸同一性を有する。
【００１８】
本発明においては、大腸菌で効率よく組換え発現させるために、配列番号１で示されるボトリオチニア・フケリアナ由来の天然のＦＡＤ−ＧＤＨの推定シグナル配列であるＮ末端から１７番目のSerまでを除去してMetを付加したアミノ酸配列（配列番号２）を作製した。
【００１９】
ボトリオチニア・フケリアナ由来改変型ＦＡＤ−ＧＤＨ
本発明者は、配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ１７６Ｋ,Ｓ５１４ＧまたはＳ５５２Ｃの変異、またはＳ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃの二重変異,およびＮ１７６Ｋ/Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃの三重変異を有する改変型ＦＡＤ−ＧＤＨが、野生型ＦＡＤ−ＧＤＨと比較して大腸菌における高い生産性を示し、特にＮ１７６Ｋ/Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃの三重変異を有する改変型ＦＡＤ−ＧＤＨは、高い生産性とともに高い酵素活性を示すことを見いだした。なお、本明細書においては、ボトリオチニア・フケリアナ由来ＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列中のアミノ酸変異の位置は、配列番号２のアミノ酸配列の１番目のMetを１として番号付けする。また、本明細書においては、アミノ酸の変異ないし置換は、元のアミノ酸残基とアミノ酸の位置と置換後のアミノ酸残基とをこの順序で示すことにより表記し、例えば、「Ｓ５１４Ｇ」とは、５１４番目のＳがＧに置き換えられていることを示す。二重またはそれ以上の変異の組み合わせは「／」の記号で表す。
【００２０】
本明細書において用いる場合、大腸菌における生産性が高い酵素とは、大腸菌を宿主として組換え発現させて、その培養物から酵素を単離したときに、培養液単位容量あたりに得られる酵素の単位容量あたりの活性（Ｕ/Ｌ）が高いことを特徴とする酵素分子を意味する。生産性が高ければ、より小さい培養装置でより低いコストで、酵素を組換え製造することができる。酵素の生産性には、その酵素が有するアミノ酸配列に基づき、蛋白質としての水溶性の違い、フォ-ルディング効率の違い、さらには単位蛋白質あたりの酵素活性の違い、酵素の安定性の違いなどが総合的に反映される。さらに、培養液単位容量あたりの宿主における組換え発現の速度、インクルージョンボディを形成のしやすさ菌体内および精製工程における酵素の安定性などにも当該酵素のアミノ酸配列が関与している。
【００２１】
さらに、ボトリオチニア・フケリアナ由来改変型ＦＡＤ−ＧＤＨにおいて、Ｎ１７６Ｋ，Ｎ１７６Ｒ、Ｎ１７６Ｅ、Ｎ１７６Ｓ、Ｎ２２５Ｋ、Ｎ２２５Ｅ、Ｎ２５９Ｋ，Ｎ３０１Ｋ、Ｎ３２６Ｋ、Ｎ３２６Ｅ、Ｎ３３０Ｋ、Ｎ３３０Ｓ、Ｎ３５５Ｋ、Ｎ３５５Ｅ、Ｓ５１４ＧまたはＳ５５２Ｃの変異と、Ｇ５３Ａ、Ｅ１６６Ｒ、Ｔ１６８Ｐ、Ｎ４８７Ｓ，Ｓ４９０Ｐ，Ｎ４９２Ｔ，Ａ４９６Ｅ，Ｄ５００Ｅ，Ｖ５０２ＬおよびＡ５０５Ｎからなる群より選択される１またはそれ以上の変異とを組み合わせた多重変異を有することが好ましい。これらの多重変異酵素のうち、好ましいものはＮ１７６Ｋ／Ｓ４９０Ｐ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｇ５３Ａ／Ｎ１７６Ｋ／Ｓ４９０Ｐ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｋ／Ａ４９６Ｅ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｋ／Ａ４９６Ｅ／Ｄ５００Ｅ／Ｖ５０２Ｌ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｇ５３Ａ／Ｎ１７６Ｋ／Ａ４９６Ｅ／Ｄ５００Ｅ／Ｖ５０２Ｌ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｋ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２ＣおよびＧ５３Ａ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃであり、特に好ましいものはＮ１７６Ｋ／Ｓ４９０Ｐ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｋ／Ａ４９６Ｅ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｋ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２ＣおよびＧ５３Ａ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃである。とりわけ好ましいものは、Ｎ１７６Ｋ／Ｎ３０１Ｋ／Ｎ３３０Ｋ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｒ／Ｎ３０１Ｋ／Ｎ３３０Ｋ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｒ／Ｎ２２５Ｅ／Ｎ３０１Ｋ／Ｎ３２６Ｅ／Ｎ３３０Ｋ／Ｎ３５５Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｋ／Ｓ４９０Ｐ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、およびＥ１６６Ｒ／Ｔ１６８Ｐ／Ｎ１７６Ｒ／Ｎ３０１Ｋ／Ｎ３３０Ｋ／Ｓ４９０Ｐ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃである。
【００２２】
また、これらのボトリオチニア・フケリアナ由来改変型ＦＡＤ−ＧＤＨは、アスペルギルス・オリゼＴＩ株由来のＦＡＤ−ＧＤＨと比較して、キシロースに対するグルコースの選択性がより高かった。
【００２３】
熱安定性が向上した改変型ＦＡＤ−ＧＤＨ
本発明者は、配列番号４で示されるアスペルギルス・オリゼＴＩ株由来ＦＡＤ−ＧＤＨの１４９番目のアミノ酸残基Ｖおよび１９０番目のアミノ酸残基Ｇの両方をＣで置き換えることにより、野生型ＦＡＤ−ＧＤＨと比較して熱安定性が顕著に高くなることを見いだした。アスペルギルス・オリゼＴＩ株由来ＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列は配列番号３に示される。本発明においては、大腸菌で効率よく組換え発現させるために、配列番号３で示されるアスペルギルス・オリゼ由来の天然のＦＡＤ−ＧＤＨの推定シグナル配列であるＮ末端から２３番目のLysまでを除去してMetを付加したアミノ酸配列（配列番号４）を作製した。本明細書においては、アスペルギルス・オリゼ由来ＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列中のアミノ酸変異の位置は、配列番号４のアミノ酸配列の１番目のMetを１として番号付けする。
【００２４】
本明細書において用いる場合、熱安定性とは、酵素を高温（例えば、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃など）で所定時間インキュベーションした後に酵素活性を測定したときに、経時的な酵素活性の低減が少ないことをいう。熱安定性は、例えば、所定温度で所定時間インキュベーションしたときの残存活性により、あるいは、インキュベーション時間に対して酵素活性をプロットして得られる曲線（失活曲線）の傾きから求めた失活の速度定数および／または酵素活性の半減期により表すことができる。
【００２５】
本発明の改変型ＦＡＤ−ＧＤＨは、グルコース脱水素酵素活性を有する限り、配列番号４の１４９番目および１９０番目のアミノ酸残基の変異に加えて、さらに別の変異を有していてもよい。例えば、配列番号４のアミノ酸残基の１またはそれ以上、例えば１〜１０個が任意に他のアミノ酸残基で置き換えられていてもよい。
【００２６】
本発明者はさらに、ボトリオチニア・フケリアナならびに他の真菌に由来するＦＡＤ−ＧＤＨについても、アスペルギルス・オリゼＴＩ株由来ＦＡＤ−ＧＤＨの１４９番目および１９０番目のアミノ酸残基に相当する位置のアミノ酸残基を両方ともシステインに置換することにより、同様に熱安定性が高まることを見いだした。
【００２７】
真菌由来のいくつかのＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列のアライメントを図１に示す。この図では、各酵素のアミノ酸配列からＮ末端のシグナルペプチドであると推定される領域を除去して、Ｎ末端にメチオニンが付加された配列が示される。アスペルギルス・オリゼＴＩ株由来ＦＡＤ−ＧＤＨの１４９番目のアミノ酸残基Ｖおよび１９０番目のアミノ酸残基Ｇに相当するアミノ酸残基は太字で示される。本発明においては、これらの酵素すべてについて、記載されるアミノ酸配列をコードする遺伝子を全合成し、大腸菌で組換え発現させて、ＧＤＨ活性があることを確認した。また、下記の実施例８に示されるように、これらの酵素についても、アスペルギルス・オリゼＴＩ株由来ＦＡＤ−ＧＤＨの１４９番目のアミノ酸残基Ｖおよび１９０番目のアミノ酸残基Ｇに相当するアミノ酸残基を両方ともＣで置き換えることにより、熱安定性が向上した。これらの改変型ＦＡＤ−ＧＤＨの中には、野生型の酵素と比較して酵素活性が低下したものもあるが、熱安定性が高まることにより酵素の精製や保存の間の失活が少なくなるため、工業的規模での生産性の観点からみてなお有益である。さらに、酵素活性や大腸菌における生産性を高める別の変異と組み合わせることにより、工業的規模での生産性の高い改変型ＦＡＤ−ＧＤＨを開発することも可能である。
【００２８】
当業者であれば、図１に例示される真菌以外の真菌に由来するＦＡＤ−ＧＤＨにおいても、定法にしたがってアミノ酸配列のアライメントを作製することにより、アスペルギルス・オリゼＴＩ株由来ＦＡＤ−ＧＤＨの１４９番目のアミノ酸残基Ｖおよび１９０番目のアミノ酸残基Ｇに相当する位置のアミノ酸残基を理解し、これらの残基をＣで置き換えることにより、熱安定性が向上したＦＡＤ−ＧＤＨを得ることができる。本明細書において用いる場合、「・・・に相当する位置のアミノ酸残基」との表現は、目的とする蛋白質のアミノ酸配列を参照蛋白質のアミノ酸配列とアライメントさせたときに、参照蛋白質の特定のアミノ酸残基に対応する位置に存在するアミノ酸残基を意味する。アライメントは、当該技術分野において知られる多くのソフトウエアのいずれを用いてもよく、例えば、Vector  NTI  により提供されるAlignX  ソフトウエア  (Invitrogen;  ,  Lu,  G.,  and  Moriyama,  E.  N.  (2004)  Vector  NTI,  a  balanced  all-in-one  sequence  analysis  suite.  Brief  Bioinform  5,  378-88)をデフォルトのパラメータで用いることができる。
【００２９】
ＦＡＤ−ＧＤＨの製造方法
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは、当該技術分野においてよく知られる手法を用いて組換え発現により製造することができる。ボトリオチニア・フケリアナ由来の天然のＦＡＤ−ＧＤＨおよびアスペルギルス・オリゼＴＩ由来のＦＡＤ−ＧＤＨをコードする遺伝子の配列は、それぞれ配列番号２および４に記載されるアミノ酸配列に基づいて容易に決定することができる。ＦＡＤ−ＧＤＨをコードする遺伝子は、ボトリオチニア・フケリアナまたはアスペルギルス・オリゼのゲノムからクローニングしてもよく、一連の化学合成されたオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲにより製造してもよく、または自動化DNA合成機などを用いて全合成してもよい。遺伝子配列は、用いる宿主生物においてより高い発現レベルが達成されるようにコドンを選択して、適宜設計または改変することが望ましい。特定の宿主生物におけるコドン使用の特徴は、当該技術分野においてよく知られている。
【００３０】
本発明の改変型ＦＡＤ−ＧＤＨをコードする遺伝子は、天然のＦＡＤ−ＧＤＨをコードする遺伝子において、置換すべきアミノ酸残基をコードする塩基配列を、所望のアミノ酸残基をコードする塩基配列に置換することにより構築することができる。このような部位特異的塩基配列置換のための種々の方法は、当該技術分野においてよく知られており、例えば適切に設計されたプライマーを用いるＰＣＲによって行うことができる。あるいは、改変型のアミノ酸配列をコードする遺伝子を全合成してもよい。
【００３１】
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨにおいては、所望のグルコース脱水素酵素活性を有する限り、さらに他のアミノ酸残基の一部またはそれ以上が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていてもよい。さらに、そのような改変型ＦＡＤ−ＧＤＨは好ましくは天然のＦＡＤ−ＧＤＨと少なくとも８０％の配列同一性を有する。好ましくは、配列同一性は少なくとも８５％であり、より好ましくは少なくとも９０％であり、さらに好ましくは少なくとも９５％である。
【００３２】
このようにして得た遺伝子を適当な発現のベクターに挿入し、これを適当な宿主（例えば大腸菌）に形質転換する。外来性蛋白質を発現させるための多くのベクター・宿主系が当該技術分野において知られており、宿主としては例えば、細菌、酵母、培養細胞などの種々のものを用いることができる。糖鎖が結合したグルコース脱水素酵素の製造が望ましい場合には、真核生物細胞を宿主として用いる。得られた形質転換体を定法にしたがって培養し、細胞または培養液からＦＡＤ−ＧＤＨを回収することができる。
【００３３】
本発明の１つの好ましい態様においては、大腸菌の形質転換体をF.  William  Studier  et.al.,  Protein  Expression  and  Purification  (2005)にZYP  brothとして記載されている培地（以下Ａ培地）にて培養する。すなわち、一般的に大腸菌の培地に用いられるLB培地にさらに0.5%  グリセロール、0.05%  グルコース、0.2%  アルファ−ラクトース、２５ｍＭ  (NH4)2SO4、１００ｍＭ  KH2PO4、１００ｍＭ  NaHPO4、1  mM  MgSO4を加えた培地である。
Ａ培地で、１５℃から２５℃、好ましくは約２０℃で培養して、組換え蛋白質を発現させる。このことにより、慣用のIPTG誘導法を用いた場合よりも、高い生産性を得ることができる。さらに、本発明の変異酵素を、蛋白質のフォールディングを促進することが知られているシャペロンGroELおよびGroESと共発現させることにより、さらに高い生産性を得ることができる。シャペロンとの共発現は、例えば、本発明の変異酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクターを、GroELおよびGroES遺伝子をアラビノース誘導下に発現するベクター（例えば市販のシャペロンベクターpGro7、TaKaRa）とともに大腸菌に導入して培養し、形質転換体がある程度増殖した後にアラビノースを加えてシャペロンの発現を誘導することにより行うことができる。
【００３４】
このようにして得られた組換えＦＡＤ−ＧＤＨは、例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、濾過、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、免疫沈殿、ゲル電気泳動、等電点電気泳動、透析などの当該技術分野において知られる精製手法の任意のものを用いて精製することができる。
【００３５】
酵素活性の測定方法
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは、ＦＡＤを補酵素として、グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒する作用を有する。本発明のＦＡＤ−ＧＤＨのグルコース脱水素酵素活性は、脱水素酵素によるグルコースの酸化に伴って還元されるＦＡＤの量を、酸化還元色素の呈色反応により定量することができる。呈色試薬としては、例えば、ＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート）、ＤＣＩＰ（２，６−ジクロロフェノールインドフェノール）、フェリシアン化カリウム、フェロセンなどを用いることができる。また、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨのグルコース酸化活性測定は、脱水素酵素と基質の反応により生成する過酸化水素を定量することにより行うことができる。過酸化水素の測定は、例えば、ペルオキシダーゼ及びトリンダー試薬(TODB)、4-アミノアンチピリンを用いて、生成する色素の吸光度の経時変化を測定することにより行うことができる。
【００３６】
グルコースに対する選択性
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨのグルコースに対する選択性は、基質として、マンノース、ガラクトース、キシロース、ラクトースおよびマルトース等の各種の糖を用いて上述のように酵素活性を測定し、グルコースを基質としたときの活性に対する相対活性を調べることにより評価することができる。
【００３７】
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨはグルコースに対する選択性が高く、特にマルトースおよびガラクトースに対する反応性は測定限界以下であった。したがって、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを用いて作成されたアッセイキットあるいは酵素センサーはグルコース測定に関して選択性が高く、被検試料にマルトース等の他の糖が含まれているかその可能性がある場合にも、高感度でグルコースが検出できるという利点を有する。
【００３８】
さらに、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨはキシロースに対して反応性が低いという特徴を有する。このことは、キシロース吸収試験を実施している場合においても血糖値が正確に測定できるという利点を提供する。
【００３９】
グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従うＦＡＤ−ＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従うＦＡＤ−ＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従うＦＡＤ−ＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
【００４０】
グルコースセンサー
本発明はまた、本発明に従うＦＡＤ−ＧＤＨがその表面に固定化されている酵素電極、ならびにこの酵素電極を用いるグルコースセンサーを提供する。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。これらの電極はカーボン電極であればスクリーンプリント印刷等によって作成される電極、および金、白金電極であればスパッタリングにより作成される電極でもよい。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のＦＡＤ−ＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００４１】
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、メディエーターを加えて一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェート、ルテニウム錯体、などを用いることができる。作用電極として本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および必要に応じて参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【００４２】
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは、血糖値のアッセイ装置において用いるのに特に有用である。アッセイ装置は、一般に市販されている血糖値測定用のアンペロメトリーバイオセンサーテストストリップと同様の構造とすることができる。一例として、アッセイ装置は、絶縁体上に装着された２つの電極（作用極および参照極）、試薬ポートおよびサンプル受容部を有する。試薬ポートには、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨおよびメディエーターを入れる。血液サンプルなどのサンプルをサンプル受容部に加えると、サンプル中に含まれるグルコースがＦＡＤ−ＧＤＨと反応して電流が生じ、この電流の値から血中グルコース濃度（血糖値）を求めることができる。電気化学的検出の他、光学センサーを用いてグルコースを測定することもできる。
【００４３】
本明細書において用いる場合、「・・・を含む（comprising）」との表現により表される態様は、「本質的に・・・からなる（essentially  consisting  of）」との表現により表される態様、ならびに「・・・からなる（consisting  of）」との表現により表される態様を包含する。
【００４４】
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書に参照として取り込まれる。
【００４５】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが，これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００４７】
実施例１
ボトリオチニア・フケリアナ由来グルコース脱水素酵素(Bfu-GDH)およびアスペルギルス・オリゼ由来グルコース脱水素酵素(Ao-GDH)の組換え遺伝子の調製
ボトリオチニア・フケリアナ由来グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列は配列番号１に示される。Ｎ末端から１７番目のSerまではシグナルペプチドであると推定できる。例えば、シグナル配列切断部位を予測するための方法としてフリーアクセスサーバSignalP  3.0  Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）を活用できる。このサーバは,The  Center  for  Biological  Sequence  Analysis  at  the  Technical  University  of  Denmark  において運営されており、以下に記す論文に記載された方法論に基づき、任意のアミノ酸配列に対して、シグナル配列の存在の可能性を検索し、その切断部位を予想する。Identification  of  prokaryotic  and  eukaryotic  signal  peptides  and  prediction  of  their  cleavage  sites.  Henrik  Nielsen,  Jacob  Engelbrecht,  Soren  Brunak  and  Gunnar  von  Heijne.  Protein  Engineering,  10:1-6,  1997。SignalP  3.0  Serverを用いる予測にしたがえば、Ｎ末端から１７番目のSerまではシグナルペプチドであると推定されるので、開始メチオニンの下流に１８番目のThr以降の配列を有するアミノ酸配列をコードし、大腸菌による組み換え生産に適したコドンをもつ遺伝子配列を設計して、全合成した。この遺伝子によりコードされる蛋白質（以下Bfu-GDHと称する）のアミノ酸配列を配列番号２に示す。【００４８】
アスペルギルス・オリゼＴＩ株由来のグルコース脱水素酵素のアミノ酸配列は配列番号３に示される。SignalP  3.0  Serverを用いる予測にしたがえば、Ｎ末端から２３番目のLysまではシグナルペプチドであると推定されるので、開始メチオニンの下流に２４番目のAsn以降の配列を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を設計して、全合成した。この遺伝子によりコードされる蛋白質（以下Ao-GDHと称する）のアミノ酸配列を配列番号４に示す。組換え生産の宿主としては大腸菌BL21(DE3)［F−,  ompT,  hsdSB(rB−  mB−),  gal(λcI  857,  ind1,  Sam7,  nin5,  lacUV5-T7gene1),  dcm(DE3)；Novagen］を用いた。遺伝子発現ベクターとしてはpET30c［kan,  lacI；Novagen］を、シャペロン共発現用ベクターとしてはpGro7［GroEL,  GroES；TaKaRa］  をそれぞれ用いた。【００４９】
実施例２
酵素活性の測定
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨのグルコース脱水素酵素活性は、脱水素酵素と基質の反応により還元されるDCIP（２，２’−ジクロルジイソプロピルエーテル）の退色を600  nmでの吸光度の経時変化を定量することにより行った。反応条件は断りの無い限り以下の条件で行った。酵素溶液を含む反応溶液(10  mM  リン酸カリウム(pH7.0)＋0.6  mM  PMS＋0.06  mM  DCIP濃度は全て終濃度)に基質を加えることで反応を開始し、600  nmの吸光度変化を測定した。基質には終濃度50  mMグルコースを用い、1μmolのDCIPを還元させる酵素量を1Unitとし、以下の式より活性値を算出した。DCIPのpH  7.0におけるモル吸光係数は16.3  mM-1cm-1とした。
ユニット/ml  ＝  ΔABS/min  ×  1/  16.3  ×10【００５０】
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨのグルコース酸化活性測定は、脱水素酵素と基質の反応により生成する過酸化水素を、ペルオキシダーゼ及びトリンダー試薬(TODB)、4-アミノアンチピリンを用いて、生成する色素の546  nmにおける吸光度の経時変化を測定することにより行った。反応条件は断りの無い限り以下の条件で行った。酵素溶液を含む反応溶液(10  mM  リン酸カリウム  (pH7.0)＋1.5  mM  4-アミノアンチピリン＋1.5  mM  TODB＋2  U/ml  ペルオキシダーゼ、濃度は全て終濃度)に基質を加えることで反応を開始し、546  nmの吸光度変化を測定した。基質には終濃度50  mMグルコースを用い、1分間に１μmolの過酸化水素を生成する酵素量を1  Unitとした。TODBのpH7.0におけるモル吸光定数には38  mM-1cm-1を用いた。以下に吸光度変化から活性値を算出する式を示す。
ユニット/ml  ＝  ΔABS／min  ×  2  /  38  ×10
ユニット/mg  ＝  Unit／ml／蛋白質mg/ml【００５１】
実施例３
培養条件の検討及び粗精製酵素標品の調製
１．  IPTG誘導を用いたBfu-GDHの生産:  
Bfu-GDHをコードする遺伝子を挿入した発現ベクターpET30cを用いて、大腸菌BL21(DE3)を形質転換した。得られた形質転換体BL21(DE3)/pET30c(Bfu-GDH)を3  mL  LB培地に植菌し、一晩37℃で振とう培養した。その後、LB培地（カナマイシン（Km）50  μg/mL）100  mLに前培養液1  mlを植菌し、37  ℃でバッフル付三角フラスコを用いて、180  rpmで振とう培養を行なった。培養液のOD660が0.6付近になった時点でIPTG(イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド；終濃度1  mM)を添加して、Bfu-GDHの発現誘導を行った。添加後は20  ℃で培養を行い、培養開始後14時間で培養を終えた。培養中、数時間ごとに培養液300  μlを回収し、集菌した菌体に60  μlのバグバスター試薬（BugBuster  Reagent）を加え、20分間、4  ℃で振盪し、菌体を溶菌させた。その後、10  mM  リン酸カリウムを60  μl加え、遠心(16,000×g、4℃、20  分間)して上清を回収し、その上清を粗精製酵素標品として、酵素活性を測定した。酵素活性は菌体の濃度とともに上昇し、培養終了時には培養液1  Lあたり65  Uとなった。このとき、比活性は0.15  U/mgであり、菌体濃度はOD660＝4.0であった。【００５２】
２．  Ａ培地を用いるBfu-GDHの生産:
Ａ培地を用いるBfu-GDHの生産を行った。Bfu-GDHをコードする遺伝子を挿入した発現ベクターpET30cを用いて大腸菌BL21(DE3)を形質転換した。得られた形質転換体BL21(DE3)/pET30c(Bfu-GDH)を3  mL  LB培地に植菌し、一晩37℃で振とう培養した。その後、下記Ａ培地（Km  50  μg/mL）100  mLに前培養液1  mlを植菌し、20℃で坂口フラスコを用いて、120  rpmで振とう培養を行なった。
Ａ培地:  LB培地＋0.5%  グリセロール、0.05%  グルコース、0.2%  α-ラクトース、２５ｍＭ  (NH4)2SO4、１００ｍＭ  KH2PO4、１００ｍＭ  NaHPO4、1  mM  MgSO4  （ZYP培地；F.  William  Studier  et.al.,  Protein  Expression  and  Purification  (2005）を改変）。【００５３】
培養中、任意の時間ごとに培養液300  μlを回収し、集菌した菌体に60  μlのBugBuster  Reagentを加え、20分間、4  ℃で振盪し、菌体を溶菌させた。10  mM  リン酸カリウムを60  μl加え、遠心(16,000×g、4℃、20  分間)して上清を回収し、その上清を粗精製酵素標品としてその活性を測定した。【００５４】
Bfu-GDHはGDH活性を有する水溶性酵素として発現された。培養、酵素生産曲線を図２に示す。培養開始から24時間後にOD660が大幅に増加し、28時間を過ぎたころには約21で増加は止まった。酵素活性は24時間ごろから増加し、32時間後には培養液1  Lあたり約2200Uとなり、増加は止まった。タンパク質濃度は24時間後には2.2  mg/mlであり、36時間後には約3.0  mg/mlとなり、増加は止まった。【００５５】
Ａ培地で培養することにより得られたボトリオチニア・フケリアナ由来グルコース脱水素酵素(Bfu-GDH)の粗精製酵素標品の酵素活性を測定した結果、グルコース脱水素酵素活性のみが確認され、グルコース酸化酵素活性は検出されなかった。これまで、ボトリオチニア・フケリアナ由来の当該遺伝子は既報の学術論文においてグルコース酸化酵素として報告されているが、本結果により、同遺伝子がコードしている蛋白質はグルコース脱水素酵素であることが初めて示され、実施例４に記されるように、キシロースに対する反応性が低い新しいグルコース脱水素酵素を調製する方法が開示される。培養開始後40時間において菌体量の増加だけではなく、単位タンパク質あたりの酵素の生産性が1.8U/mg  タンパク質となり、IPTG系の12倍に達していた。その結果として培養液１Lあたり2200Uの酵素生産量が得られ、IPTG系の34倍であった。すなわち、Ａ培地を用いるとIPTG系よりさらに効率的にBfu-GDHを組み換え生産できることがわかった。【００５６】
３．Ａ培地ならびにシャペロンとの共発現によるBfu-GDHの生産:
Bfu-GDHのコドン修正遺伝子を挿入したpET30cを用いて、シャペロンベクターpGro7が既に導入されている大腸菌BL21(DE3)/pGro7を形質転換した。pGro7は、蛋白質のフォールディングを促進することが知られているシャペロンGroELおよびGroESをアラビノース誘導下に発現するベクターである。得られた形質転換体BL21(DE3)/pET30c(Bfu-GDH)・pGro7を3  mL  LB培地に植菌し、一晩37℃で振とう培養した。その後、Km  50  μg/mL、クロラムフェニコール（Cm）50  μg/mLを含むA培地100  mLに前培養液1  mlを植菌し、20℃で坂口フラスコを用いて、120  rpmで振とう培養を行なった。pGro7の発現誘導はアラビノース(終濃度2  mM)の添加により行った。アラビノースの添加は培養開始時、培養開始12時間後、培養開始24時間後と添加時間を変えて検討を行った。培養中、任意の時間ごとに培養液300  μlを回収し、上記と同様の方法で粗精製酵素標品を調製した。【００５７】
アラビノース(終濃度2  mM)を培養開始時、12時間後、24時間後に添加し、それぞれ培養した結果、培養開始から24時間後にOD660が大幅に増加し、32時間を過ぎたころにはOD660はそれぞれ約27、約28、約26となり増加は止まった。また、酵素活性は24時間ごろから増加し、40時間後にはそれぞれ培養液1  Lあたり約2500  U/L、2600  U/L、1300  U/Lとなり、増加は止まった。タンパク質濃度は24時間後でそれぞれ1.8  mg/ml、2.0  mg/ml、1.9  mg/mlであった。アラビノースを培養開始時に添加した場合、36時間後には約3.2  mg/ml  で増加は止まったが、アラビノースを12時間後、24時間後に添加した場合、タンパク質濃度は48時間後まで徐々に増加していた。これらの結果は、シャペロンとの共発現によりBfu-GDHの生産性が向上したことを示す。【００５８】
実施例４
基質特異性の評価
上記実施例３のＡ培地を用いて得られた酵素について、グルコース、マルトース、キシロースおよびガラクトースを基質として基質特異性を測定した。その結果、基質濃度5  mMにおいてグルコースを100％とした時のBfu-GDHの脱水素酵素活性はマルトース、ガラクトースでは検出できず、キシロースでは13％であった。同じ条件でのAo-GDHのグルコースを100％とした時のキシロースの脱水素酵素活性は21％であった。よってBfu-GDHは既に報告されているAo-GDHよりキシロースに対する酵素活性が低いことが示された。【００５９】
実施例５
Bfu-GDHへの変異導入
部位特異的変異導入はQuikChange（登録商標）法により行った。QuikChange（登録商標）法では、実施例１で作製したpET30c-Bfu-GDHをテンプレートとし、変異導入用プライマーによりPCR増幅を行った。続いてPCR後の試料にDpnIを加え37℃、60分間インキュベートすることでテンプレートDNAのみを消化し、この試料を用いて大腸菌DH5αを形質転換した。LB寒天培地(50  μg/mlカナマイシン)により一晩培養後、任意に選んだクローンからプラスミドを抽出し、シークエンス解析により目的の変異が導入されていることを確認した。得られたPCR断片をNdeI、HindIII消化(37  ℃,2時間)し、同制限酵素消化したpET30cとライゲーションし、この試料を用いて大腸菌BL21(DE3)を形質転換した。LB寒天培地(50  μg/mlカナマイシン)により一晩培養後、任意に選んだクローンからプラスミドを抽出し、シークエンス解析により変異導入を確認した。【００６０】
このようにして、以下の変異酵素を発現する形質転換体を得た：Ｂｆｕ−ＧＤＨ（Ｇ５３Ａ）、（Ｎ１７６Ｋ）、Ｎ１７６Ｒ、Ｎ１７６Ｅ、Ｎ１７６Ｓ、（Ｓ５１４Ｇ）、（Ｓ５５２Ｃ）、（Ｇ５３Ａ／Ｓ５１４Ｇ）、（Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ）、（Ｇ５３Ａ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ）。さらに、Ｓ５１４Ｇ、Ｓ５５２Ｃ、またはこれらの二重変異Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃと、（Ｎ１７６Ｋ）、Ｎ１７６Ｒ、Ｎ１７６Ｅ、Ｎ１７６Ｓ、Ｎ２２５Ｋ、Ｎ２５９Ｋ、Ｎ３０１Ｋ、Ｎ３２６Ｋ、Ｎ３３０Ｋ、Ｎ３５５Ｋ、Ｎ４８７Ｓ、Ｔ４８８Ｅ、Ｖ４８９Ｉ、Ｓ４９０Ｐ、Ｎ４９２Ｔ、Ｔ４９４Ａ、Ｅ４９５Ｄ、Ａ４９６Ｅ、Ｅ４９７Ｋ、Ｆ４９９Ｖ、Ｄ５００Ｅ、Ｖ５０２Ｌ、Ｔ５０４Ａ、Ａ５０５Ｎの変異とを種々に組み合わせた多重変異を設計し、これらの変異酵素を発現する形質転換体を作製した：Ｎ１７６Ｋ／Ｓ４９０Ｐ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｋ／Ａ４９６Ｅ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｋ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｇ５３Ａ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ。【００６１】
実施例６
変異酵素の生産および活性測定
各変異酵素を発現する形質転換体BL21(DE3)を前培養した。300mlバッフル付きフラスコを用いＡ培地60ml  に対し1％量殖菌し、20℃、28時間、125rpmの条件で振とう培養を行った。培地50mlを集菌後、湿菌体1ｇに5mlの割合でBugBuster（登録商標）蛋白質抽出試薬（Novagen）を加え懸濁し、ゆるやかに振とうしながら室温で15分間インキュベートを行った。遠心（15K  rpm/4℃/20分間）により不溶性分画を除去後、得られた上清を20mM  リン酸カリウム緩衝液  (pH6.5)で4℃で一晩透析した。透析終了後に遠心を行い、その上清を粗精製酵素標品とした。不溶性分画は、懸濁液2ml分の不溶性分画に対し20mM  リン酸カリウム緩衝液  (pH6.5)を1mの割合で懸濁した。【００６２】
いくつかの多重変異酵素については、小スケールの発現系を用いた。各変異酵素を発現する形質転換体BL21(DE3)を前培養し、Ａ培地3ml  に1vol%量を殖菌した。37℃で4時間振とう培養後、20℃で20時間振とう培養を行った。培養後2mlの培地を集菌し400μlのBugBuster（登録商標）を加え懸濁後に室温で15分間振とうした。その後、遠心（15000rpm/4℃/20分間）を行い、得られた上清を粗精製酵素標品とした。【００６３】
GDH活性測定はDCIP(0.3ｍM)/PMS(0.6mM)系で緩衝液は20mM  リン酸カリウム緩衝液  (pH6.5)を使用し、基質としてグルコース（Glc；1,2,4,10,20,40mM),  キシロース（Xyl；4,40mM)を使用した。【００６４】
結果を表１に示す。表中の数値は、比活性（Ｕ／ｍg）および生産性（Ｕ／Ｌ）は40mMのグルコースを基質として、同一条件で行った数回分のデータの平均値である。また得られた粗精製酵素を用いて、基質（グルコース；1,2,4,10,20,40mM）濃度と活性との相関を観察し、そこから求められる飽和曲線から得られるミカエルリス・メンテン定数（Ｋｍ値）およびみかけの最大活性（Ｖｍax）を求めた。なお、本件の優先権基礎出願の表１および表２に記載される活性の値は吸光度のデータから活性値を求める計算において誤りがあった。下記の表１および２では正しい値が示される。
【表１】
0005873796.tif 000002
【００６５】
Ｎ１７６Ｋ、Ｎ１７６Ｒ、Ｎ１７６Ｅ、Ｎ１７６Ｓ、Ｓ５１４ＧおよびＳ５５２Ｃの変異体は、対照（Ｂｆｕ−ＧＤＨ）と比較して、生産性、酵素活性ともに増加していた。Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃの二重変異体では、さらに高い生産量および酵素活性が得られた。Ｎ１７６Ｋ、Ｎ１７６Ｒ、Ｎ１７６Ｅ、Ｎ１７６Ｓ、変異体はＳ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃとの複合変異体では非常に高い生産性が得られた。Ｇ５３Ａ変異体は、単独変異体およびＧ５３Ａ／Ｓ５１４Ｇの二重変異体では対照と同等の生産性を示したが、Ｇ５３Ａ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ複合変異体では非常に高い生産性が得られた。【００６６】
Ｓ５１４ＧおよびＳ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃとさらに別の変異を組み合わせた多重変異体についての結果を表２に示す。表中の数値は、比活性（Ｕ／ｍｇ）および生産性（Ｕ／Ｌ）は４０ｍＭのグルコースを基質として、同一条件で行った数回分のデータの平均値である。また得られた粗精製酵素を用いて、基質（グルコース；１，２，４，１０，２０，４０ｍＭ）濃度と活性との相関を観察し、そこから求められる飽和曲線から得られるミカエルリス・メンテン定数（Ｋｍ値）およびみかけの最大活性（Ｖｍａｘ）を求めた。
【表２】
0005873796.tif 000003
【００６７】
表２に示されるように、多くの多重変異体においてＳ５１４Ｇ単独変異およびＳ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃよりも高い生産性が得られた。特に、Ｎ１７６Ｋ／Ｓ４９０Ｐ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｋ／Ａ４９６Ｅ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｋ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｇ５３Ａ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃについては、非常に高い生産性ならびに酵素活性が認められた。【００６８】
野性型の酵素、ならびにこれらの変異体のグルコースに対する活性とキシロースに対する活性を調べたところ、キシロースへの反応性はグルコースの２０％以下、あるいは１５％以下であり、グルコースに対して基質特異性の高い酵素であった。また、これらの酵素のマルトースならびにガラクトースに対する活性は検出されなかった。【００６９】
同様にして、さらなる多重変異体を作成して、その活性を測定した。また、これらの酵素を含む溶液を40℃で10分放置した後の残存活性を測定することにより、熱安定性を評価した。【００７０】
【表３】
0005873796.tif 000004
【００７１】
表３に示されるように、Ｎ１７６Ｋ／Ｒ，Ｎ２２５Ｅ，Ｎ３２６Ｅ，Ｎ３３０Ｋ／Ｓ，Ｎ３５５Ｋ／Ｅと、Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃとの複合変異体が高い生産性および活性を有することが確認された。熱安定性については、Ｎ１７６Ｋ／Ｒでは６〜８％程度、Ｎ２２５Ｅでは4％程度の残存活性が観察された。
次にこれらの活性向上に効果があった変異を組み合わせた変異酵素を構築し、生産性・活性ならびに安定性について検討した。結果を表４に示す。
【００７２】
【表４】
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【００７３】
これらの変異の組み合わせの中で特に、Ｎ１７６Ｋ／Ｎ３０１Ｋ／Ｎ３３０Ｋ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ、Ｎ１７６Ｒ／Ｎ３０１Ｋ／Ｎ３３０Ｋ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２ＣおよびＮ１７６Ｒ／Ｎ２２５Ｅ／Ｎ３０１Ｋ／Ｎ３２６Ｅ／Ｎ３３０Ｋ／Ｎ３５５Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃの３種が生産性・活性も高く、また安定性にも相乗効果が現れていることが確認できた。生産性はいずれの酵素も30.000U/L程度が達成され、みかけのVmax/Km値も向上している。安定性についても40℃溶液中10分放置後の残存活性は10〜13%程度まで向上していた。
【００７４】
さらに、種々の変異の組み合わせを作成して、生産性・活性および安定性を調べたところ、下記の表５に示す複合変異体が特に高い生産性・活性および安定性を持っていた。中でも、Ｅ１６６Ｒ／Ｔ１６８Ｐ／Ｎ１７６Ｒ／Ｎ３０１Ｋ／Ｎ３３０Ｋ／Ｓ４９０Ｐ／Ｄ５００Ｅ／Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃが高いＶｍａｘ／Ｋｍ値を示し、かつ高い熱安定性を示した。この酵素は40℃溶液中での10分インキュベーション後の残存活性が100％であり、失活が観察されなかった。45℃、10分後でも40％弱の残存活性が観察された。
【００７５】
【表５】
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【００７６】
実施例７
Ao-GDHへの分子内S-S結合の導入
酵素の熱安定性の向上を目的として、Ao-GDHの種々のアミノ酸をシステインに変異させた各種変異体を作製し、その酵素活性および熱安定性を調べた。変異の導入および酵素活性の測定は実施例５と同様にして行った。【００７７】
熱安定性試験は次のようにして行った。45℃にした20mM  リン酸カリウム緩衝液  (pH6.5)  800μlに上記粗精製酵素標品を200μl  加え混和し、すぐに、予め45℃に加熱しておいた20mM  リン酸カリウム緩衝液  (pH6.5)  100μl  に対して100μlを加えた（終濃度10倍希釈）。添加後、45℃で2,  5,  10,  15,  20,  25,  または30分間のインキュベーションを行った。所定時間経過後、速やかに氷中で冷却した。GDH活性測定は、DCIP(0.3ｍM)/PMS(0.6mM)系で緩衝液は20mM  リン酸カリウム緩衝液  (pH6.5)を使用し、基質はGlc（40mＭ）を使用した。【００７８】
その結果、配列番号４で示されるアスペルギルス・オリゼＴＩ株由来ＦＡＤ−ＧＤＨの１４９番目のアミノ酸残基Ｖおよび１９０番目のアミノ酸残基Ｇが両方ともＣで置き換えられている改変型酵素が、特に高い熱安定性ならびに生産性を示すことが見いだされた。図３に示されるように、Ao-GDHの場合には時間とともに活性が低下していったが、Ｖ１４９Ｃ／Ｇ１９０Ｃは急速に３０％程度に低下したのち１５％程度で一定になった。Ｖ１４９ＣまたはＧ１９０Ｃの単独変異では生産性・活性の上昇には寄与しないことから、かかる熱安定性の向上は、分子内でＳ−Ｓ結合が形成されているためであると推定される。【００７９】
図４に、野生型酵素およびＶ１４９Ｃ／Ｇ１９０Ｃ変異酵素ならびに参考としてＧ１９０Ｃ変異酵素のＳ−Ｖ曲線を示す。また、Ｋｍ値およびＶｍａｘ値を下記の表６に示す。
【表６】
0005873796.tif 000007
【００８０】
これらの結果から、Ｖ１４９Ｃ／Ｇ１９０Ｃ変異酵素は野生型と比較して酵素活性も高いことがわかる。分子内S-S結合の形成により基質ポケットの状態が変わって活性が上昇したのか、あるいは熱安定性が向上したことにより酵素の見かけ上の残存活性が向上したのかは、現在のところ不明である。【００８１】
実施例８
Bfu-GDHおよび他の真菌由来GDHへの分子内S-S結合の導入
実施例７の結果に基づいて、配列番号２で示されるボトリオチニア・フケリアナ由来ＦＡＤ−ＧＤＨの１５０番目のアミノ酸残基Ａおよび１９２番目のアミノ酸残基Ｔが両方ともＣで置き換えられている改変型酵素（A150C/T192C）を作製したところ、高い熱安定性を示すことが見いだされた。さらに、かかる変異と、実施例６で高い生産性を示したいくつかの変異とを組み合わせた多重変異体を作製し、これらの変異体についても同様にして酵素活性および熱安定性を評価した。【００８２】
図５にBfu-GDHのA150C/T192C変異体の熱安定性を示す。Bfu-GDHにA150C/T192Cおよびこの変異を含む多重変異を導入すると、酵素活性は同等もしくは低下していたが、熱安定性の向上が認められた。４５℃で熱処理すると、直後にはすべて活性が下がったが、その後活性低下速度が遅くなった。なお、これらの変異の導入によりグルコース／キシロースの選択性には影響が見られなかった。【００８３】
さらに、図１に示す配列を有するスクレノチニア・スクレロチオラム（Sclenotinia  sclerotiorum）およびアスペルギルス・ニガー（Aspergillus  nigar）40715のグルコース脱水素酵素をコードする遺伝子を合成し（それぞれ配列番号７および８）、大腸菌で発現させた。また、それぞれA150C/T191CおよびY150C/G191Cの変異を導入した変異酵素も作製し、同様にして酵素活性および熱安定性を評価した。【００８４】
作製した各変異体の熱安定性を、所定の測定時間における失活曲線から導き出される失活の速度定数（k  (min-1)）およびそこから計算される半減期（t1/2  (min)）で表した結果を表７に示す。
【表７】
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【００８５】
実施例９
酵素センサーの作製および評価
アスペルギルス・オリゼＴＩ株由来Ｖ１４９Ｃ／Ｇ１９０Ｃ変異酵素およびボトリオチニア・フケリアナ由来Ｓ５１４Ｇ／Ｓ５５２Ｃ変異酵素を用いて酵素電極を作製した。５ユニットの本発明の改変型ＦＡＤ−ＧＤＨにカーボンペースト２０ｍｇを加えて凍結乾燥させた。これをよく混合した後、既にカーボンペーストが約４０ｍｇ充填されたカーボンペースト電極の表面だけに充填し、濾紙上で研磨した。この電極を１％のグルタルアルデヒドを含む１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で３０分間処理した後、２０ｍＭリジンを含む１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で２０分間処理してグルタルアルデヒドをブロッキングした。この電極を１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で１時間以上平衡化させた。電極は４℃で保存した。
【００８６】
作製した酵素センサーを用いてグルコース濃度の測定を行った。本発明の改変型ＦＡＤ−ＧＤＨを固定化した酵素センサーを用いて、０．１ｍＭ−５ｍＭの範囲でグルコースの定量を行うことができた。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明は、グルコース濃度の測定、特に血糖値の測定に有用である。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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