(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の２５位から６０６位のアミノ酸配列からなるタンパク質の３４、８２、１７２、３０１、３６４および５０５番目の残基からなる群から選択される１つの位置にパラアセチルフェニルアラニンを包含し、１つ以上の膵臓ホルモンと、当該パラアセチルフェニルアラニンと当該膵臓ホルモンとの間のオキシム結合を介して連結されている、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）。
【請求項２】
上記１つ以上の膵臓ホルモンは、インスリン、アミリン、パンクレアスチンおよびグルカゴンからなる群から選択される、請求項１に記載のＨＳＡ。
【請求項３】
上記膵臓ホルモンはインスリン様ペプチドである、請求項２に記載のＨＳＡ。
【請求項４】
上記膵臓ホルモンはインスリンである、請求項２に記載のＨＳＡ。
【請求項５】
上記膵臓ホルモンはアミリンである、請求項２に記載のＨＳＡ。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
ヒトの血漿は、種々の機能を果たす種々のタンパク質から構成されている。血漿のタンパク質成分は、極めて熱心な研究の焦点である。例えば、ヒトの血漿の既知なタンパク質成分の記載に関して、Anderson et al., Molecular & Cellular Proteomics, 3.4:311-326 (2004)；およびPing et al, Proteomics, 5:3506-3519 (2005)を参照すればよい。ヒトの血漿に見られる最も通常なタンパク質は、アルブミンである。
【０００２】
血清アルブミンとも呼ばれる、ヒトアルブミンは、血漿に見られる多機能タンパク質である。それは、血漿の容積および組織の液体平衡の、血漿のコロイド浸透圧に対する寄与を介した制御に重要な因子である。また、アルブミンは、血流に見られる他の分子にとって担体としての機能を果たす。アルブミンは、血漿タンパク質の５０−６０％を、通常に構成し、かつ比較的に低い分子量（６６，５００ダルトン）のために、血液のコロイド浸透圧の８０−８５％に影響を及ぼす。アルブミンは、血管を通過する液体の流動を制御し、かつこれゆえに、血管内または血管外の液体の容積を制御し、かつ脂質および脂溶性物質を輸送する。アルブミン溶液は、特定の種類のショックまたはインペンディングショック（火傷、外科手術、出血、または他の外傷もしくは循環する容積の不足が現れる状態が挙げられる）の処置における、血漿容積の増大および心拍出量の維持にしばしば使用される。
【０００３】
アルブミンは、およそ２週間の血液循環半減期を有し、かつ他の分子（例えば、脂質、ペプチドおよび他の分子）を運ぶことを天然の性質として有している。疎水性の結合ポケットおよび空いているチオールシステイン残基（Ｃｙｓ３４）が、この機能を可能にする特徴である。低いｐＫａ（およそ７）に起因して、Ｃｙｓ３４は、ヒトの血漿におけるより反応性のあるチオール基の１つである。また、アルブミンのＣｙｓ３４は、血漿におけるチオール濃度の主要な割合を占める（８０％以上）（Kratz et al., J. Med. Chem., 45(25):5523-33 (2002)）。反応性チオールを介したアルブミンの担体として働く能力は、治療目的に利用されている。例えば、薬剤の薬学的特性を向上させるためのアルブミンに対する薬剤の付着が、説明されている（Kremer et al., Anticancer Drugs, 13:(6):615-23 (2002)；Kratz et al., J. Drug Target, 8(5):305-18 (2000)；Kratz et al., J. Med. Chem., 45(25):5523-33 (2002)；Tanaka et al., Bioconjug. Chem., 2(4):261-9 (1991)；Dosio et al., J. Control. Release, 76(1 -2): 107- 17 (2001)；Dings et al., Cancer Lett., 194(l):55-66 (2003)；Wunder et al., J. Immunol., 170(9):4793-801 (2003)；Christie et al., Biochem. Pharmacol., 36(20):3379-85 (1987)）。また、アルブミンに対するペプチドおよびタンパク質の治療薬の付着が、説明されている（Holmes et al., Bioconjug. Chem., 1 1 (4):439-44 (2000)、Leger et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 13(20):3571-5 (2003)；Paige et al., Pharm. Res., 12(12):1883-8 (1995)）。また、アルブミンおよびインターフェロン−アルファの接合物（アルブフェロン（Ａｌｂｆｅｒｏｎ（商標）））、ならびにアルブミンおよびヒト成長ホルモンの接合物（アルブトロピン（Ａｌｂｕｔｒｏｐｉｎ）（商標））、ならびにアルブミンおよびインターロイキン−２の接合物（アルブロイキン（Ａｌｂｕｌｅｕｋｉｎ）（商標））が作られている。また、技術は、アルブミン−タンパク質融合体を生成する標準的な組み換え分子生物学技術の利用を説明している（言及によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，５４８，６５３号明細書）。後者のアルブミンとの接合物を除くすべては、外因性アルブミンに対する生体外接合体形成に関する。外来起源のアルブミンを使用することに対する起こり得る障害は、汚染または免疫原性応答である。
【０００４】
また、アルブミンに対する治療薬のインビボにおける付着は、例えば、選択されるペプチドが、アルブミンの当該ペプチドに対する結合を可能にするために、投与の前に修飾される場合について、説明されている。ジペプジルペプチダーゼ  ＩＶ体制グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ１）を用いた、この方法が記載されている（Kim et al., Diabetes, 52(3):751-9 (2003)）。特定のリンカー（［２−［２−［２−マレイミド−プロピオンアミド−（エトキシ）−エトキシ］アセトアミド］は、アルブミンのシステイン残基をペプチドとの結合を可能にするために、ペプチドにおける付加されたカルボキシルリジンに対して付着された。他のものが、インビボにおけるアルブミンに対する結合を増強するための、ペプチドまたはタンパク質に対する特異的なタグの付着について調べられている（Koehler et al., Bioorg Med. Chem. Lett., 12(20):2883-6 (2002)；Dennis et al., J. Biol. Chem., 277(38):35035-35043 (2002)）；Smith et al., Bioconjug. Chem., 12:750-756 (2001) ］。類似の方法は、薬剤の誘導体が、アルブミンのシステイン残基との結合能を有するために特に設計された場合の、小分子薬剤に対して使用されている。例えば、このプロドラッグ戦略は、３４位のシステイン（Ｃｙｓ３４；Kratz et al., J Med. Chem., 45(25): 5523-33 (2002) ）において内因性のアルブミンに対して結合されているドキソルビシン誘導体に対して使用されている。アルブミンに対する治療薬のインビボにおける付着は、上述の生体外の方法と比較して、内因性のアルブミンを使用するので、汚染または外来性のアルブミンに対する免疫原性応答に関連する問題を未然に防ぐという点について、利点を有する。内因性のアルブミンを用いた薬剤接合物のインビボにおける形成の従来技術は、まだ、薬剤とアルブミンとの間における永続的な共有結合を含む。結合が切断可能であるか、または可逆的である程度にまで、接合物から放出される薬剤またはペプチドは、元の化合物の修飾される形態である。
【０００５】
ヒト血清アルブミンは、酵母宿主細胞（サッカロミセス  セレビジアエ（Etcheverry et al., (1986) BioTechnology 8:726、および欧州特許出願公開第Ａ  １２３  ５４４号明細書）、ピチア  パストリス（欧州特許出願公開第３４４  ４５９号明細書）、およびクリュイベロマイセイス（Fleer et al., (1991) BioTechnology 9:968- 975）が挙げられる）において、およびＥ．  ｃｏｌｉ（Latta et al., (1987) BioTechnology 5:1309-1314）において発現されている。これらの文献は、言及によって本明細書に組み込まれる。
【０００６】
天然に産生される抗体（Ａｂ）は、２つの同一の免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖および２つの同一の軽鎖から構成される四量体構造である。免疫グロブリンは、２つの軽鎖および２つの重鎖を典型的に有する、ジスルフィド結合によってまとまっているポリペプチド鎖を含有する分子である。鎖のそれぞれにおいて、１つのドメイン（Ｖ）は、分子の抗体特異性に依存する可変するアミノ酸配列を有する。他のドメイン（Ｃ）は、同じ分類の分子にとってむしろ通常の定常配列を有する。
【０００７】
Ａｂの重鎖および軽鎖は、異なるドメインから構成される。軽鎖のそれぞれは、１つの可変領域（ＶＬ）および１つの定常領域（ＣＬ）を有する一方において、重鎖のそれぞれは、１つの可変領域（ＶＨ）および３もしくは４つの定常領域（ＣＨ）を有する。約１１０アミノ酸残基から構成されるドメインのそれぞれは、互いに免疫グロブリンの折りたたみに包まれる２つのβ−シートから形成される特徴的なβ−サンドイッチ構造に折りたたまれる。ＶＬドメインのそれぞれは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１−３）を有し、かつＶＨドメインのそれぞれは、４つまでの相補性決定領域（ＣＤＲ１−４）を有し、当該相補鎖決定領域は、ドメインの１つの末端においてβ−鎖と接続する輪状部または屈曲部である。軽鎖および重鎖の両方の可変領域は、一般的に抗原特性に対して寄与するが、特異性に対する個々の鎖の寄与は、等しくある必要はない。抗体分子は、無作為化ＣＤＲループを用いることによって非常に多数の分子に対して結合を展開している。
【０００８】
Ａｂの機能的な基本構造は、タンパク質分解によって、および組み替え法によって調製され得る。それらは、単一の鎖内部のジスルフィド結合によって接合される重鎖のＶＨ−ＣＨ１ドメインおよび軽鎖のＶＬ−ＣＬ１ドメインを備えるＦａｂ断片、ならびにＶＨドメインおよびＶＬドメインのみを備えるＦｖ断片、ならびに分子の非抗原結合領域を備えるＦｃ部分を包含する。いくつかの場合において、単一のＶＨドメインは、抗原に対する有意なアフィニティー（ａｆｆｉｎｉｔｙ）を維持する（Ward et al., 1989, Nature 341, 554-546）。また、ある種の単量体κ軽鎖が抗原に対して特異的に結合することは、示されている（L. Masat et al., 1994, PNAS 91 :893-896）。個々の軽鎖または重鎖は、同様にある抗原結合活性を維持することを時折、見出されている（Ward et al., 1989, Nature 341, 554-546）。
【０００９】
他の機能的な基本構造は、ペプチドリンカーによって共有結合的に接続されている、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域から構成される単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である（S-z Hu et al., 1996, Cancer Research, 56, 3055-3061）。これらの小さなタンパク質（分子量２５，０００）は、単一のポリペプチドにおける抗原に対する特異性およびアフィニティーを一般的に維持しており、かつ大きな抗原特異的分子にとっての好都合な基礎単位を提供し得る。循環においてｓｃＦｖの短い半減期は、多くの場合においてこれらの治療的有用性を制限している。
【００１０】
“ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）”と呼ばれる小さいタンパク質の足場は、ＩｇのＶＨドメインの一部を鋳型として用いて設計された（Pessi et al., 1993, Nature 362, 367-369）。インターロイキン−６に対する高いアフィニティー（約１０−７Ｍの解離定数（Ｋｄ））を有するミニボディは、ＶＨのＣＤＲ１およびＣＤＲ２に対応するループの無作為化、およびそれからファージディスプレイ法を用いた変異体の選択によって同定された（Martin et al., 1994, EMBO J. 13, 5303-5309）。
【００１１】
ラクダは、それらのＩｇＧ様物質が分析される場合に、可変軽鎖領域をしばしば欠失しており、これは、十分な抗体特異性およびアフィニティーが単独のＶＨドメイン（３または４つのＣＤＲループ）から得られることを示唆している。高いアフィニティーを有する“ラクダ化された”ＶＨドメインが作製されており、かつ高い特異性がＣＤＲ３を無作為化することによって生成され得る。
【００１２】
“ミニボディ”に対する代替物は、“ディアボディ”である。ディアボディは、２つの抗原結合部位を有する、小さな２価のおよび二重特異性の断片である。断片は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）上において軽鎖の可変領域（ＶＬ）に対して接続される重鎖の可変領域（ＶＨ）を備える。ディアボディは、Ｆａｂ断片よりも大きさに関して小さい。同じ鎖上における２つのドメインの間における対合を可能にするには短すぎるリンカーを用いることによって、ドメインは、他の鎖の相補的なドメインと強制的に対合させられ、かつ２つの抗原結合部位を作りだす。これらの二量体化抗体断片、または“ディアボディ”は、２価であり、かつ二重特異的である。（P. Holliger et al., PNAS 90:6444-6448 (1993) ）を参照すればよい。
【００１３】
抗体断片は、全長の形態以外に抗体のあらゆる形態を包含する。本明細書における抗体断片は、全長の抗体内に存在するより小さな構成要素である抗体、および改変されている抗体を含む。抗体断片としては、これらに限定されないが、Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆａｂ、および（Ｆａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、二機能性混成抗体、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲの組み合わせ、可変領域、フレームワーク領域ならびに定常領域などが挙げられる（Maynard & Georgiou, 2000, Annu. Rev. Biomed. Eng. 2:339-76; Hudson, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:395-402）。
【００１４】
ＣＤＲペプチドおよび有機ＣＤＲ模倣物が、作製されている（Dougall et al., 1994,Trends Biotechnol. 12, 372-379）。ＣＤＲペプチドは、抗体のＣＤＲループのアミノ酸配列に対応する、短い、典型的に環状のペプチドである。ＣＤＲループは、抗体−抗原相互作用を引き起こす。ＣＤＲペプチドおよび有機ＣＤＲ模倣物は、いくつかの結合アフィニティーを維持することを示されている（Smyth & von Itzstein, 1994, J. Am. Chem. Soc. 116, 2725- 2733）。マウスのＣＤＲは、アフィニティーを損なうことなく、ヒトＩｇフレームワークに対してグラフトされている（Jones et al., 1986, Nature 321, 522-525; Riechmann et al., 1988）。
【００１５】
体内において、特異的なＡｂは、大きなライブラリから選択され、かつ増幅される（アフィニティー成熟）。過程は、組み合わせのライブラリ技術を用いてインビトロにおいて再現され得る。バクテリオファージの表面におけるＡｂ断片の成功した提示は、膨大な数のＣＤＲ成熟を生成し、かつふるい分けることを可能にさせている（McCafferty et al., 1990, Nature 348, 552- 554; Barbas et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,7978-7982; Winter et al., 1994, Annu. Rev. Immunol. 12, 433-455）。ＦａｂおよびＦｖ（ならびにそれらの誘導体）の数の増大は、この技術によって実現される。組み合わせの技術は、Ａｂ模倣と組み合わせられ得る。
【００１６】
タンパク質の足場として潜在的に機能することができる多くのタンパク質のドメインは、ファージのカプシドタンパク質との融合体として発現されている。Clackson & Wells, Trends Biotechnol. 12:173-184 (1994)を概観すればよい。様々なこれらのタンパク質のドメインは、無作為なペプチド配列を提示する足場（ウシすい臓トリプシン阻害剤（Roberts et al., PNAS 89:2429-2433 (1992)）、ヒト成長因子（Lowman et al., Biochemistry 30:10832-10838 (1991)））, Venturini et al., Protein Peptide Letters 1 :70-75 (1994)）、および連鎖球菌のＩｇＧ結合ドメイン（O'Neil et al., Techniques in Protein Chemistry V (Crabb, L,. ed.) pp. 517-524, Academic Press, San Diego (1994)）が挙げられる）として使用されている。これらの足場は、単一の無作為化されたループまたは領域を提示している。テンダミスタット（ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔ）は、糸状ファージＭ１３における提示足場として使用されている（McConnell and Hoess, 1995, J. MoI. Biol. 250:460- 470）。
【００１７】
免疫グロブリンのＦｃ部分としては、これに限定されないが、抗体から２つの抗原結合領域（Ｆａｂ断片）を除去することによって得られる、抗体断片が挙げられる。Ｆａｂ断片を除去する１つの方法は、パパインタンパク質分解酵素を用いて免疫グロブリンを消化することである。従って、Ｆｃ部分は、非共有結合的な相互作用およびジスルフィド結合を介して会合する両方の重鎖から得られる定常領域の、およそ等しい大きさの断片から形成される。Ｆｃ部分は、ヒンジ領域を含むことができ、かつ抗体のＣ末端領域まで、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを介して伸張することができる。ヒトおよびマウスの免疫グロブリンに関する代表的なヒンジ領域は、Antibody Engineering, A Practical Guide, Borrebaeck, C. A. K., ed., W. H. Freeman and Co., 1992に見られ得、教示は、言及によって本明細書に組み込まれる。Ｆｃ部分は、１つ以上の糖鎖付加部位を包含し得る。ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域、ならびにＮ−糖鎖付加部位を含む多くの代表的なＦｃ部分のアミノ酸配列は、当該技術において公知である。
【００１８】
異なるエフェクター機能および薬物動態特性を有する５種類のヒト免疫グロブリンＦｃ：ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥがある。ＩｇＧは、血清において最も豊富な免疫グロブリンである。また、ＩｇＧは、あらゆる免疫グロブリンの血清における最も長い半減期（２３日）を有する。他の免疫グロブリンとは異なって、ＩｇＧは、Ｆｃ受容体に対する結合に続いて効率的に再循環される。４つのＩｇＧサブクラス、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、およびＧ４があり、これらのサブクラスのそれぞれが、異なるエフェクター機能を有する。Ｇ１、Ｇ２、およびＧ３が、Ｃ１ｑを結合でき、かつ相補物を固定できる一方において、Ｇ４はできない。Ｇ３は、Ｇ１よりも効率的にＣ１ｑを結合できるにもかかわらず、Ｇ１が相補物指向の細胞溶解をより効率的に媒介する。Ｇ２は、非常に非効率に相補物を固定する。ＩｇＧにおけるＣ１ｑ結合部位は、ＣＨ２ドメインのカルボキシル末端領域に配置されている。
【００１９】
ＩｇＧサブクラスのすべては、Ｆｃ受容体（ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４）に対して、Ｇ２およびＧ４より効率的にＧ１およびＧ３が結合することができる。ＩｇＧのＦｃ受容体結合領域は、ＣＨ２ドメインのヒンジ領域およびカルボキシ末端領域の両方に配置される残基によって形成される。
【００２０】
ＩｇＡは、Ｊ鎖によって共に保持される単量体形態および二量体形態の両方において存在できる。ＩｇＡは、血清における２番目に豊富なＩｇであるが、たった６日の半減期を有する。ＩｇＡは、３つのエフェクター機能を有する。ＩｇＡは、食作用および脱顆粒のそれぞれを促進する、マクロファージおよび好中球上におけるＩｇＡ特異的受容体に対して結合する。また、ＩｇＡは、未知の代替可能な経路を介して相補物を固定できる。
【００２１】
ＩｇＭは、いずれもがＪ鎖によって共に保持される、５量体または６量体のいずれかとして発現される。ＩｇＭは、５日の血中半減期を有する。ＩｇＭは、自身のＣＨ３ドメインに配置される結合部位を介してＣ１ｑに対して弱く結合する。ＩｇＤは血清において３日の半減期を有する。どんなエフェクター機能がこのＩｇに帰されるのかは、はっきりしていない。ＩｇＥは、単量体Ｉｇであり、かつ２．５日の血中半減期を有する。ＩｇＥは、脱顆粒を促進する２つのＦｃ受容体に対して結合し、かつ炎症誘発因子の放出を結果として生じる。
【００２２】
本発明のポリペプチドは、上述のアイソタイプのあらゆるものを含有し得えるか、または変異Ｆｃ領域を含有し得、ここで、相補物結合機能および／またはＦｃ受容体結合機能が、改変されているか、修飾されているか、または取り除かれている。本発明のポリペプチドは、上述のアイソタイプのあらゆるものを含有し得るか、または変異Ｆｃ領域を含有し得、ここで、エフェクター機能が、改変されているか、修飾されているか、または取り除かれている。このようにして、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃ部分の全体、免疫グロブリンのＦｃ部分の断片、またはこれらの類似物を含有し得る。
【００２３】
本発明のポリペプチドは、単鎖タンパク質からなり得るか、または複鎖ポリペプチドとして存在し得る。２つ以上のＦｃタンパク質は、Ｆｃ領域の間において天然に形成するジスルフィド結合を介して相互作用するように、産生され得る。これらの多量体は、接合される分子に関して同種であり得るか、またはそれらは、融合タンパク質のＦｃ部分のＮ末端において異なる接合分子を含有し得る。
【００２４】
Ｆｃ領域またはＦ様領域は、自身に対して融合される化合物のインビボにおける血漿半減期の延長に役立ち得る。タンパク質分解によって産生されるＩｇＧのＦｃ領域が無傷のＩｇＧ分子と同じインビボにおける半減期を有し、かつＦａｂ断片が急速に分解されるので、半減期の延長に関連する配列が、ＣＨ２ドメインおよび／またはＣＨ３ドメインに存在すると考えられている。さらに、高いアフィニティーのＦｃ受容体またはＣ１ｑを結合しないＩｇＧバリアントの異化の割合が、親の野性体抗体のクリアランスの割合と区別できず、異化部位がＦｃ受容体またはＣ１ｑに含まれる部位と異なることを示していることは、文献［Wawrzynczak et al., (1992) Molecular Immunology 29:221］に示されている。マウスＩｇＧ１を用いた部位特異的な変異生成は、異化率を制御するＩｇＧ１のＦｃ領域の部位が、ＣＨ２−ＣＨ３ドメインの接合点に位置されることを示唆した。Ｆｃ領域は、異化部位において修飾されて、融合タンパク質の半減期を最適化し得る。本発明の融合タンパク質に使用されるＦｃ領域は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＦｃ領域から取得され得、かつヒンジ領域を含むＣＨ２領域およびＣＨ３領域の両方を含有し得る。
【００２５】
Ｆｃおよび１つ以上の他の分子（ポリペプチドが挙げられるが、これに限定されない）を包含するキメラ分子が、生成され得る。キメラ分子は、Ｆｃおよび他の（複数の）分子の特定の領域または断片を含有し得る。あらゆる当該断片は、標準的な生化学的方法によってか、または断片をコードするポリヌクレオチドを発現することによってタンパク質から調製され得る。ポリペプチド、またはこれらの断片は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、Ｆｃ、またはこれらの部分を備える、融合タンパク質として産生され得る。融合は、（ａ）免疫グロブリンのＦｃ部分；（ｂ）免疫グロブリンのＦｃ部分の類似物；および（ｃ）免疫グロブリンのＦｃ部分の断片ポリペプチドとの、融合によって作り出され得る。
【００２６】
最近、タンパク質の部位特異的修飾に関連する多くの制限の克服を可能にする、タンパク質科学における全体に新たな技術が、報告されている。特に、インビボにおけるタンパク質に対する遺伝的にコードされないアミノ酸の組み込みを可能にしている、新たな構成要素が、原核生物の大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）（例えば、L. Wang, et al., (2001), Science 292:498-500）、および真核生物の酵母（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（例えば、J. Chin et al., Science 301:964-7 (2003), Drabkin et al., (1996) Mol.Cell.Biol., 16:907）、および哺乳類細胞（Sakamoto et al., (2002) Nucleic Acids Res. 30:4692）のタンパク質生合成機構に対して加えられている。新規な化学的、物理的または生物学的特性を有する多くの新たなアミノ酸（光親和性標識し、かつ光異性化可能なアミノ酸、光架橋（ｐｈｏｔｏｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）アミノ酸（例えば、Chin, J. W., et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99:11020-11024；およびChin, J. W., et al., (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027を参照すればよい）、ケトアミノ酸、重原子含有アミノ酸、および糖鎖付加アミノ酸が挙げられる）が、この方法論を用いて、アンバーコドンＴＡＧに応じてＥ．  ｃｏｌｉおよび酵母においてタンパク質に対して効率的かつ高い忠実度を有して組み込まれている。例えば、J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027；J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 3(1 1):1135-1137；J. W. Chin, et al., (2002), PNAS United States of America 99:1 1020-1 1024；およびL. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. Comm., 1 : 1-1 1を参照すればよい。参考文献のすべては、言及によってその全体が組み込まれる。これらの研究は、タンパク質に見られず、２０の通常な遺伝的にコードされるアミノ酸に見られる官能基のすべてに対して不活性であり、かつ効率的にかつ選択的に反応して安定な共有結合を形成するために使用され得る化学官能基（例えば、ケトン基、アルキン基およびアジド部分）を、選択的に、かつ日常的に導入することが可能であることを証明している。
【００２７】
遺伝的にコードされないアミノ酸をタンパク質に組み込む能力は、天然に生じる官能基（例えば、リジンのイプシロン−ＮＨ２、システインのスルフィドリル−ＳＨ、ヒスチジンのイミノ基など）にとっての有益な代替物を提供できる化学官能基の導入を可能にする。本明細書に記載されている化学官能基（例えば、カルボリル部分、アルキン部分、アジド部分）は、２０の通常の遺伝的にコードされるアミノ酸に見られる官能基に対して不活性であるが、明確にかつ効率的に反応して安定な結合を形成することを知られている。
【００２８】
〔発明の概要〕
本発明は、ヒト血漿タンパク質（ｈＰＰ）ファミリーの一員（他の分子の担体として機能する血漿タンパク質が挙げられるが、これに限定されない）を提供する。本発明における使用に好適であり得るｈＰＰとしては、言及によってこれらの全体が本明細書に組み込まれる以下の文献：Anderson et al., Molecular & Cellular Proteomics, 3.4:31 1-326 (2004); and Ping et al, Proteomics, 5:3506-3519 (2005)に挙げられているこれらのタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの公知のｈＰＰとしては、１つ以上の非天然にコードされるアミノ酸を包含する、α１−アンチキモトリプシン、アンチトリプシン、α１−アンチトリプシン、前アルブミン、ヒトアルブミン（ヒト血清アルブミン）、α１−リポタンパク質、Ａ−ガンマグロブリン、α２−マクログロブリン、α１−ミクログロブリン、α２−ミクログロブリン、β２−ミクログロブリン、ベンスジョーンズタンパク質、胆汁分泌物構成要素、コンプリメント（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）タンパク質  ３、コレステリルエステル転移タンパク質、脂肪酸結合タンパク質、フェリチン、フェリチン  Ｈ鎖、フィブリノゲン、胃抑制ペプチド、グロブリン、ハプトグロブリン、ヘモグロビン、ヘモグロビン  Ａ、ヘモグロビン  Ａ１Ｃ、ヘモグロビン  Ｆ、糖化ヘモグロビン、パン（ｐａｎ）  ヘモグロビン、ラクトフェリン、リパーゼ、ライソザイム、ｍｕｔＹ、ミオグロビン、心筋ミオグロビン、オロスムコイド（ｏｒｏｓｍｕｃｏｉｄ）、リューマチ因子、セクレチン、セロトニン、チログロブリン、チロキシン、チロキシン結合グロブリン、トリヨードチロニン、トランスファリング（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ）、ビタミンＤ結合タンパク質、およびこれらのバリアントの形態が挙げられるが、これらに限定されない。また、本発明は、１つ以上の非天然にコードされるアミノ酸を包含するヒトＦｃ（ｈＦｃ）を提供する。
【００２９】
いくつかの実施形態において、ｈＰＰまたはｈＦｃは、１つ以上の転写後修飾を包含する。いくつかの実施形態において、ｈＰＰまたはｈＦｃは、リンカー、重合体または生物学的に活性な分子に対して連結される。いくつかの実施形態において、ｈＰＰまたはｈＦｃは、二機能性もしくは多機能性の重合体、二機能性もしくは多機能性のリンカー、または少なくとも１つの生物学的に活性な分子に対して連結される。
【００３０】
いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸は、水溶性重合体に対して連結される。いくつかの実施形態において、水溶性重合体は、ポリ（エチレングリコール）部分を包含する。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、リンカーを用いて水溶性重合体に対して連結されるか、または水溶性重合体に対して直接に結合される。いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は、二機能性または多機能性の重合体である。いくつかの実施形態において、二機能性または多機能性の重合体は、第２のポリペプチドに対して連結される。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドは、生物学的に活性な分子である。
【００３１】
いくつかの実施形態において、ｈＰＰまたはｈＦｃは、水溶性重合体、リンカーまたは生物学的に活性な分子に対して連結される少なくとも２つのアミノ酸を包含する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸は、非天然にコードされるアミノ酸である。
【００３２】
いくつかの実施形態において、１つ以上の非天然にコードされるアミノ酸を包含するｈＰＰは、当該技術においてヒト血清アルブミンとしても知られる、ヒトアルブミン（ｈＡ）である。ｈＡは、ポリペプチド配列の５８２の位置の１つ以上（以下の位置の１つ以上：１（すなわち、Ｎ末端）、１７、３４、５５、５６、６０、８１、８２、８６、９２、９４、１１１、１１４、１１６、１１９、１２９、１７０、１７２、１７３、２７６、２７７、２８０、２９７、３００、３０１、３１３、３１７、３２１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６８、３７５、３９７、４３９、４４２、４９５、４９６、４９８、５００、５０１、５０５、５１５、５３８、５４１、５４２、５６０、５６０、５６２、５６４、５７４、５８１位、および５８２位の後ろ（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）（配列番号１）が挙げられるが、これらに限定されない）において１つ以上の非天然にコードされるアミノ酸に置換され得る。
【００３３】
ｈＦｃは、ポリペプチド配列の１つ以上の位置において（１位の前（すなわち、Ｎ末端）およびＮ末端において（配列番号２２）、が挙げられるが、これらに限定されない）、１つ以上の非天然にコードされるアミノ酸に置換され得る。
【００３４】
いくつかの実施形態において、ｈＰＰまたはｈＦｃは、ｈＰＰまたはｈＦｃの受容体または結合パートナー（タンパク質、脂質、サッカライド、ポリペプチド、小分子、または核酸が挙げられるが、これらに限定されない）に対するアフィニティーを調節する置換、付加または欠失を包含する。いくつかの実施形態において、置換、付加、または欠失を有していない対応するｈＰＰまたはｈＦｃの安定性と比較した場合の、ｈＰＰまたはｈＦｃの安定性を増強する、置換、付加または欠失を包含する。いくつかの実施形態において、ｈＰＰまたはｈＦｃは、置換、付加、または欠失を有していない対応するｈＰＰまたはｈＦｃの免疫原性と比較した場合の、ｈＰＰまたはｈＦｃの免疫原性を調節する、置換、付加または欠失を包含する。いくつかの実施形態において、ｈＰＰまたはｈＦｃは、置換、付加、または欠失を有していない対応するｈＰＰまたはｈＦｃの血中半減期または循環時間と比較した場合の、ｈＰＰまたはｈＦｃの血中半減期または循環時間を調節する、置換、付加または欠失を包含する。
【００３５】
いくつかの実施形態において、ｈＰＰまたはｈＦｃは、置換、付加、または欠失を有していない対応するｈＰＰまたはｈＦｃの水溶性と比較した場合の、ｈＰＰまたはｈＦｃの水溶性を増強する、置換、付加または欠失を包含する。いくつかの実施形態において、ｈＰＰまたはｈＦｃは、置換、付加、または欠失を有していない対応するｈＰＰまたはｈＦｃの溶解性と比較した場合の、宿主細胞において産生されるｈＰＰまたはｈＦｃの溶解性を増強する、置換、付加または欠失を包含する。いくつかの実施形態において、ｈＰＰまたはｈＦｃは、置換、付加、または欠失を有していない対応するｈＰＰまたはｈＦｃの発現または合成と比較した場合の、宿主細胞におけるｈＰＰもしくはｈＦｃの発現、またはインビトロにおける合成を増強する、置換、付加または欠失を包含する。この置換を包含するｈＰＰまたはｈＦｃは、アゴニスト活性を維持し、かつ宿主細胞における発現レベルを維持するか、または向上させる。いくつかの実施形態において、ｈＰＰまたはｈＦｃは、置換、付加、または欠失を有していない対応するｈＰＰまたはｈＦｃのプロテアーゼ耐性と比較した場合の、ｈＰＰまたはｈＦｃのプロテアーゼ耐性を増強する、置換、付加または欠失を包含する。
【００３６】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸置換が非天然にコードされるアミノ酸を伴うことを条件に、ｈＰＰまたはｈＦｃにおけるアミノ酸置換は、天然に生じるアミノ酸または非天然に生じるアミノ酸を伴い得る。
【００３７】
いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸は、カルボニル基、アセチル基、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、セミカルバジド基、アジド基、アルキン基、アニリンアミノ基、またはサッカライド部分を包含する。
【００３８】
いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸は、カルボニル基を包含する。いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸は、構造：
【００３９】
【化１】
0005840345.tif 000002
【００４０】
（ここで、ｎは０−１０であり；Ｒ１はアルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり；Ｒ２はＨ、アルキル、アリール、置換アルキル、および置換アリールであり；Ｒ３はＨ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり；かつＲ４はＨ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である）
を有する。
【００４１】
いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸は、アミノオキシ基を包含する。いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸は、ヒドラジド基を包含する。いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸は、ヒドラジン基を包含する。いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸は、セミカルバジド基を包含する。
【００４２】
いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸残基は、アジド基を包含する。いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸は、構造：
【００４３】
【化２】
0005840345.tif 000003
【００４４】
（ここで、ｎは０−１０であり；Ｒ１はアルキル、アリール、置換アルキル、置換アリールであるか、または存在せず；ＸはＯ、Ｎ、Ｓであるか、または存在せず；ｍは０−１０であり；Ｒ２はＨ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、かつＲ３はＨ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である）
を有する。
【００４５】
いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸は、アルキン基を包含する。いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸は、構造：
【００４６】
【化３】
0005840345.tif 000004
【００４７】
（ここで、ｎは０−１０であり；Ｒ１はアルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり；ＸはＯ、Ｎ、Ｓであるか、または存在せず；ｍは０−１０であり、Ｒ２はＨ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、かつＲ３はＨ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である）
を有する。
【００４８】
また、本発明は、配列番号２、２０または２３に対してストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドを包含し、当該ポリヌクレオチドが少なくとも１つのセレクターコドンを包含する、単離した核酸を提供する。いくつかの実施形態において、セレクターコドンは、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン、５塩基コドン、および４塩基コドンからなる群から選択される。
【００４９】
また、本発明は、水溶性重合体に対して連結されるｈＰＰまたはｈＦｃを作製する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、非天然にコードされるアミノ酸を包含する単離されたｈＰＰを、非天然にコードされるアミノ酸と反応する部分を包含する水溶性重合体と接触させることを包含する。いくつかの実施形態において、ｈＰＰまたはｈＦｃに組み込まれる非天然にコードされるアミノ酸は、ポリペプチドにおける２０の通常のアミノ酸のあらゆるものに対して他方において非反応性である水溶性重合体に対して、反応性である。いくつかの実施形態において、ｈＰＰまたはｈＦｃに組み込まれる非天然にコードされるアミノ酸は、ポリペプチドにおける２０の通常のアミノ酸のあらゆるものに対して他方において非反応性であるリンカー、重合体または生物学的に活性な分子に対して、反応性である。
【００５０】
いくつかの実施形態において、水溶性重合体に対して連結されているｈＰＰまたはｈＦｃは、カルボニル含有アミノ酸を包含するｈＰＰまたはｈＦｃを、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基またはセミカルバジド基を包含するポリ（エチレングリコール）と反応させることによって作製される。いくつかの実施形態において、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基またはセミカルバジド基は、アミド結合を介してポリ（エチレングリコール）分子に対して連結されている。
【００５１】
いくつかの実施形態において、水溶性重合体に対して連結されているｈＰＰまたはｈＦｃは、カルボニル基を包含するポリ（エチレングリコール）を、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基またはセミカルバジド基を包含する非天然にコードされるアミノ酸を包含する、ポリペプチドと反応させることによって作製される。
【００５２】
いくつかの実施形態において、水溶性重合体に対して連結されているｈＰＰまたはｈＦｃは、アルキン含有アミノ酸を包含するｈＰＰまたはｈＦｃを、アジド部分を包含するポリ（エチレングリコール）分子と反応させることによって作製される。いくつかの実施形態において、アジド基またはアルキン基は、アミド結合を介してポリ（エチレングリコール）に対して連結される。
【００５３】
いくつかの実施形態において、水溶性重合体に対して連結されるｈＰＰまたはｈＦｃは、アジド含有アミノ酸を包含するｈＰＰまたはｈＦｃを、アルキン部分を包含するポリ（エチレングリコール）分子と反応させることによって作製される。いくつかの実施形態において、アジド基またはアルキン基は、アミド結合を介してポリ（エチレングリコール）分子に対して連結される。
【００５４】
いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は、約０．１ｋＤａから約１００ｋＤａの間の分子量を有する。いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は、０．１ｋＤａから５０ｋＤａの間の分子量を有する。
【００５５】
いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は、分枝状の重合体である。いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）の分枝状の重合体の分子のそれぞれは、１ｋＤａから１００ｋＤａの間、または１ｋＤａから５０ｋＤａの間の分子量を有する。
【００５６】
いくつかの実施形態において、ｈＰＰに対して連結される水溶性重合体は、ポリアルキレングリコール部分を包含する。いくつかの実施形態において、ｈＰＰまたはｈＦｃに組み込まれる非天然にコードされるアミノ酸残基は、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン基、セミカルバジド基、アジド基、またはアルキン基を包含する。いくつかの実施形態において、ｈＰＰまたはｈＦｃに組み込まれる非天然にコードされるアミノ酸残基は、カルボニル部分を包含し、かつ水溶性重合体は、アミノオキシ部分、ヒドラジド部分、ヒドラジン部分、またはセミカルバジド部分を包含する。いくつかの実施形態において、ｈＰＰまたはｈＦｃに組み込まれる非天然にコードされるアミノ酸残基は、アルキン部分を包含し、かつ水溶性重合体は、アジド部分を包含する。いくつかの実施形態において、ｈＰＰまたはｈＦｃに組み込まれる非天然にコードされるアミノ酸残基は、アジド部分を包含し、かつ水溶性重合体は、アルキン部分を包含する。
【００５７】
また、本発明は、非天然にコードされるアミノ酸を包含するｈＰＰまたはｈＦｃ、ならびに薬学的に受容可能な担体を包含する、組成物を提供する。いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸は、水溶性重合体に対して連結される。
【００５８】
また、本発明は、セレクターコドンを包含しかつｈＰＰまたはｈＦｃをコードするポリヌクレオチドを包含する、細胞を提供する。いくつかの実施形態において、細胞は、ｈＰＰまたはｈＦｃに非天然アミノ酸を置換するための、直交ＲＮＡシンセターゼおよび／または直交ｔＲＮＡを包含する。
【００５９】
また、本発明は、非天然にコードされるアミノ酸を包含するｈＰＰまたはｈＦｃを作製する方法を提供する。いくつかの実施形態において、当該方法は、ｈＰＰまたはｈＦｃをコードするポリヌクレオチドまたは複数のポリヌクレオチド、直交ＲＮＡシンセターゼならびに直交ｔＲＮＡを含む細胞を、非天然にコードされるアミノ酸を包含するｈＰＰまたはｈＦｃの発現を許容する条件において培養すること；ならびに細胞および／または培養培地からｈＰＰまたはｈＦｃを精製することを包含する。
【００６０】
また、本発明は、ｈＰＰまたはｈＦｃの治療的半減期、血中半減期または循環時間を増強する方法を提供する。また、本発明は、ｈＰＰまたはｈＦｃの免疫原性を調節する方法を提供する。いくつかの実施形態において、当該方法は、天然に生じるｈＰＰまたはｈＦｃにおけるあらゆる１つ以上のアミノ酸に対して非天然にコードされるアミノ酸を置換すること、および／またはリンカー、重合体、水溶性重合体、または生物学的に活性な分子に対してｈＰＰまたはｈＦｃを連結することを包含する。
【００６１】
また、本発明は、本発明のｈＰＰ分子またはｈＦｃ分子の有効量を用いて、そのような処置を必要とする患者を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態において、当該方法は、非天然にコードされるアミノ酸を包含するｈＰＰまたはｈＦｃを包含する、薬学的組成物の治療有効量、ならびに薬学的に受容可能な担体を投与することを包含する。いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸は、水溶性重合体に対して連結される。
【００６２】
また、本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列、または少なくとも１つのアミノ酸が非天然にコードされるアミノ酸によって置換されている以外には、あらゆる他のｈＰＰポリペプチド配列を包含するｈＰＰを提供する。また、本発明は、配列番号２２に示されるアミノ酸配列、または少なくとも１つのアミノ酸が非天然にコードされるアミノ酸によって置換されている以外には、あらゆる他のｈＰＰポリペプチド配列を包含するｈＰＰを提供する。いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸は、水溶性重合体に連結される。いくつかの実施形態において、水溶性重合体は、ポリ（エチレングリコール）部分を包含する。いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸は、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン基、セミカルバジド基、アジド基、またはアルキン基を包含する。
【００６３】
また、本発明は、薬学的に受容可能な担体、ならびに配列番号１に示される配列、または少なくとも１つのアミノ酸が非天然にコードされるアミノ酸によって置換されているあらゆる他のｈＰＰポリペプチド配列を包含するｈＰＰを包含する、薬学的組成物を提供する。また、本発明は、薬学的に受容可能な担体、ならびに配列番号２２に示される配列、または少なくとも１つのアミノ酸が非天然にコードされるアミノ酸によって置換されているあらゆる他のｈＦｃポリペプチド配列を包含するｈＰＰを包含する、薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸は、サッカライド部分を包含する。いくつかの実施形態において、水溶性重合体は、サッカライド部分を介してポリペプチドに対して連結される。いくつかの実施形態において、リンカー、重合体、または生物学的に活性な分子は、サッカライド部分を介してｈＰＰまたはｈＦｃに対して連結される。
【００６４】
また、本発明は、単一のアミノ酸におけるｈＰＰまたはｈＦｃに対する共結合によって連結される水溶性重合体を包含する、ｈＰＰまたはｈＦｃを提供する。いくつかの実施形態において、水溶性重合体は、ポリ（エチレングリコール）部分を包含する。いくつかの実施形態において、水溶性重合体に対して共有結合的に連結されるアミノ酸は、ポリペプチドに存在する非天然にコードされるアミノ酸である。
【００６５】
本発明は、少なくとも１つのリンカー、重合体、または生物学的に活性な分子包含し、上記リンカー、重合体、生物学的に活性な分子が、ポリペプチドにリボソーム的に組み込まれる非天然にコードされるアミノ酸の官能基を介して、ポリペプチドに付着される、ｈＰＰまたはｈＦｃを提供する。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、１つのＰＥＧが付加される。また、本発明は、１つ以上の非天然にコードされるアミノ酸に付着されるリンカー、重合体、または生物学的に活性な分子を包含し、上記非天然にコードされるアミノ酸が、あらかじめ選択される部位においてポリペプチドにリボソーム的に組み込まれる、ｈＰＰまたはｈＦｃを包含する。
【００６６】
他の実施形態において、１つ以上の非天然にコードされるアミノ酸を包含するｈＰＰまたはｈＦｃの、他の分子（ＰＥＧが挙げられるが、これに限定されない）に対する接合は、非天然アミノ酸に対する接合に利用される固有の化学反応に起因して、実質的に精製されたｈＰＰまたはｈＦｃを提供する。他の実施形態において、ｈＰＰまたはｈＦｃのアミノ酸配列に組み込まれる非天然にコードされるアミノ酸は、非天然にコードされるアミノ酸の官能基を利用したｈＰＰまたはｈＦｃの精製に対して利点を提供する。１つ以上の非天然にコードされるアミノ酸を包含するｈＰＰまたはｈＦｃの、他の分子（例えば、ＰＥＧ）に対する接合物は、接合工程の前または後に実施される他の精製技術を用いて実施されて、実質的に純粋なｈＰＰまたはｈＦｃを提供し得る。他の実施形態において、ｈＰＰまたはｈＦｃのアミノ酸配列への非天然にコードされるアミノ酸の置換は、ｈＰＰまたはｈＦｃを他の分子に対して接合するときに、接合反応条件、接合反応比または接合反応効率を同様に調節する、ポリペプチドのｐＫａを調節する。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸を包含するｈＰＰまたはｈＦｃは、調節された結合特性（例えば、結合パートナーと接触されるときに増強したか、または低下した結合強度）を示す。いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸を包含するｈＰＰまたはｈＦｃは、非天然アミノ酸を欠く同じｈＰＰまたはｈＦｃと比較される場合に、調節された組織結合特性または組織分布特性を示す。いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸を包含するｈＰＰまたはｈＦｃは、ｈＰＰまたはｈＦｃが製薬用途に調合される場合に、調節された安定性質を有する。
【００６７】
〔図面の簡単な説明〕
図１Ａおよび１Ｂ−成熟ヒトアルブミンのアミノ酸配列が図１Ａに示されており、かつヒトアルブミンをコードするヌクレオチド配列が１Ｂに示されている。
【００６８】
図２−ｈＡアミノ酸にとっての平均のＣｘ値が示されている。
【００６９】
図３−ｈＡのモデルおよびある特定のアミノ酸位置が示されている。
【００７０】
図４−非天然にコードされるアミノ酸を用いた置換に使われる、ｈＡにおいて選択されるアミノ酸位置の表が示されている。
【００７１】
図５−酵母宿主細胞における組み換えヒトアルブミンの発現が、クーマシー染色したポリアクリルアミドゲル電気泳動によって示されている。
【００７２】
図６−ポリペプチド配列に非天然にコードされるアミノ酸を含有するｈＡの発現が、クーマシー染色したポリアクリルアミドゲル電気泳動によって示されている。
【００７３】
図７、パネルＡ−５Ｋのアミノ−オキシ  ポリ（エチレン）−グリコール（ＰＥＧ）の存在下（＋）または非存在下（−）においてインキュベートされた、精製Ｆｃ（ＷＴ）およびＤ１ｐＡＦ置換したＦｃ（Ｄ１ｐＡＦ）の還元した試料が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。
【００７４】
図７、パネルＢ−５Ｋのアミノ−オキシ  ポリ（エチレン）−グリコール（ＰＥＧ）の存在下（＋）または非存在下（−）においてインキュベートされた、精製Ｆｃ（ＷＴ）およびＤ１ｐＡＦ置換したＦｃ（Ｄ１ｐＡＦ）の非還元の試料が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。
【００７５】
図８Ａ−野性体Ｆｃのポリヌクレオチド配列が示されている。
【００７６】
図８Ｂ−野性体Ｆｃのポリペプチド配列が示されている。
【００７７】
図８Ｃ−成熟Ｆｃのポリペプチド配列が示されている。
【００７８】
図８Ｄ−成熟Ｆｃをコードするポリヌクレオチド配列が示されている。
【００７９】
図９Ａ−ｔＲＮＡのポリヌクレオチド配列が示されている。
【００８０】
図９Ｂ−アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼをコードするポリヌクレオチド配列が示されている。
【００８１】
図１０Ａ−ｈＡへの非天然にコードされるアミノ酸の組み込みが、クーマシー染色したポリアクリルアミドゲルにおいて示されている。
【００８２】
図１０Ｂ−ｈＡへの非天然にコードされるアミノ酸の組み込みが、ウエスタンブロットにおいて示されている。
【００８３】
図１０Ｃ−ｈＡへの非天然にコードされるアミノ酸の組み込みが、ウエスタンブロットにおいて示されている。
【００８４】
図１０Ｃ−ｈＡへの非天然にコードされるアミノ酸の組み込みが、ウエスタンブロットにおいて示されている。
【００８５】
図１１−ＰＥＧ付加されたｈＡの産生が、ウエスタンブロットによって示されている。
【００８６】
図１２のパネルＡおよび図１２のパネルＢ−非天然にコードされるアミノ酸を包含するｈＡおよび野性体ｈＡに関する、ペプチドマッピングの結果が、それぞれ示されている。
【００８７】
図１３Ａ−非天然にコードされるアミノ酸（ｐＡＦ、またはパラアセチルフェニルアラニン）を包含するｈＡの質量分析の結果が示されている。
【００８８】
図１３Ｂ−ｈＡのアミノ酸（非天然にコードされるアミノ酸ｐＡＦ（パラアセチルフェニルアラニン）を含む）に関する予想されるイオン質量が示されている。
【００８９】
〔定義〕
本発明が本明細書に記載されている特定の方法論、手順、細胞株、構築物、および試薬に制限されず、従って変更し得ることは、理解されるべきである。また、本明細書において使用される専門用語が、特定の実施形態のみを説明ことを目的としており、かつ添付の特許請求の範囲によってのみ制限される本発明の範囲を制限することを意図しないことは、理解されるべきである。
【００９０】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるときに、単数形“ａ”、“ａｎ”、および“ｔｈｅ”は、文脈が別のものを明確に示している場合を除いて、複数を指すことを含む。従って例えば、“ｈＰＰ”または“ｈＡ”または“ｈＦｃ”に対する言及は、１つ以上の当該タンパク質に対する言及であり、かつ当業者に知られるこれらの等価物などを含む。
【００９１】
他に明示されていない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者に通常に理解されるような、同じ意味を有する。あらゆる方法、装置、および物質、本明細書に記載されているそれらの類似物または等価物が、本発明の実践または試験に使用され得るが、好ましい方法、装置および材料は、これから説明される。
【００９２】
本明細書に述べられている公報および特許は、例えば、現在、説明されている本発明と関連して使用され得る公報に説明されている構築物および方法論を説明し、かつ開示することを目的として、言及によって本明細書に組み込まれる。本明細書において議論される公報は、本願の出願日の前における開示内容を単に規定される。本明細書において、発明者が、先の発明によって当該開示に先立つために、または他のあらゆる理由によって、権利を与えられないという承認として解釈されるべきではない。
【００９３】
“実質的に精製された”という用語は、天然に生じる環境（すなわち、天然の細胞、または“ｈＰＰ”ポリペプチドまたは“ｈＡ”ポリペプチドまたは“ｈＦｃ”ポリペプチドが組み換え的に産生される場合における宿主細胞）において見られるような、当該タンパク質と付随するか、または相互作用する化合物を実質的にまたはほとんど含み得ない、“ｈＰＰ”ポリペプチドまたは“ｈＡ”ポリペプチドまたはｈＦｃポリペプチドを指す。細胞性物質を実質的に含み得ない“ｈＰＰ”ポリペプチドまたは“ｈＡ”ポリペプチドまたは“ｈＦｃ”ポリペプチドとしては、混入しているタンパク質が、（乾燥重量として）約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満である、タンパク質の調製物が挙げられる。“ｈＰＰ”ポリペプチドまたは“ｈＡ”ポリペプチドまたは“ｈＦｃ”ポリペプチドまたはこれらのバリアントが、宿主細胞において組み換え的に産生される場合に、タンパク質は、細胞の乾燥重量の約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、または約１％もしくはそれ未満において存在し得る。“ｈＰＰ”ポリペプチドまたは“ｈＡ”ポリペプチドまたは“ｈＦｃ”ポリペプチドまたはこれらのバリアントが、宿主細胞において組み換え的に産生される場合に、タンパク質は、細胞の乾燥重量の約５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約７５０ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ、または約１ｍｇ／Ｌもしくはそれ未満において培養培地に存在し得る。従って、本発明の方法によって産生されるときの、“実質的に精製された”“ｈＰＰ”ポリペプチドまたは“ｈＡ”ポリペプチドまたは“ｈＦｃ”ポリペプチドは、適切な方法（例えば、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ、およびキャピラリー電気泳動）によって決定されるときの、少なくとも約３０％、少なくとも３５約％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％の精製度合い、詳細には少なくとも約７５％、８０％、８５％の精製度合い、そしてより詳細には少なくとも約９０％の精製度合い、少なくとも約９５％の精製度合い、少なくとも約９９％またはそれ以上の精製度合いを有する。
【００９４】
“組み換え宿主細胞”または“宿主細胞”は、挿入に使用される方法（例えば、直接的な取り込み、形質導入、ｆ−交配（ｆ−ｍａｔｉｎｇ）、または組み換え宿主細胞を作り出すために使用される他の公知の方法）にかかわらず、外来性のポリヌクレオチドを含む細胞を指す。外来性のポリヌクレオチドは、組み込まれないベクター（例えば、プラスミド）として維持され得るか、または宿主のゲノムに組み込まれ得る。
【００９５】
本明細書において使用されるときに、“培地”または“培養液”という用語は、あらゆる宿主細胞（細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞、植物宿主細胞、真核生物宿主細胞、哺乳類宿主細胞、ＣＨＯ細胞、原核生物宿主細胞、Ｅ．  ｃｏｌｉ、またはシュードモナス属の宿主細胞が挙げられる）、および細胞内容物を支持し得るか、または含有し得るあらゆる培養培地、溶液、固体、半固体、または固定支持を含む。従って、上記当該用語は、宿主細胞が培養されている培地（例えば、“ｈＰＰ”ポリペプチドまたは“ｈＡ”ポリペプチドまたは“ｈＦｃ”ポリペプチドが分泌されている培地（増殖段階の前または後のいずれかにおける培地））を包含し得る。また、上記当該用語は、“ｈＰＰ”ポリペプチドまたは“ｈＡ”ポリペプチドまたは“ｈＦｃ”ポリペプチドが細胞内において産生され、かつ宿主細胞が溶解されるか、または崩壊させられて“ｈＰＰ”ポリペプチドまたは“ｈＡ”ポリペプチドまたは“ｈＦｃ”ポリペプチドを放出するといった場合に、宿主細胞溶解液を含有する緩衝液または試薬を包含し得る。
【００９６】
タンパク質の折りたたみに関して本明細書において使用されるときに、“還元剤”は、還元状態においてジスルフィド結合を維持し、かつ分子内または分子間のジスルフィド結合を還元する、あらゆる化合物または物質として定義される。好適な還元剤としては、これらに限定されないが、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、ジチオエリスリトール、システイン、システアミン（２−アミノエタンチオール）、および還元グルタチオンが挙げられる。広範な還元剤が本発明の方法および組成物における使用に好適であることは、当業者にとって直ちに明らかになる。
【００９７】
タンパク質の折りたたみに関して本明細書において使用されるときに、“酸化剤”は、酸化される化合物から電子を除去できる、あらゆる化合物または物質として定義される。好適な酸化剤としては、これらに限定されないが、酸化グルタチオン、シスチン、シスタミン、酸化ジチオスレイトール、酸化エリスレイトール、および酸素が挙げられる。広範な酸化剤が本発明の方法における使用に好適であることは、当業者にとって直ちに明らかになる。
【００９８】
本明細書において使用されるときに、“変性剤（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）”“変性剤（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ）”は、タンパク質の可逆的な変性を引き起こす、あらゆる化合物または物質として定義される。変性剤または変性剤の強さは、特定の変性剤または変性剤の性質および濃度の両方によって決定される。好適な変性剤または変性剤は、カオトロープ、界面活性剤、有機溶媒、水混和性溶媒、リン脂質、または当該試薬の２つ以上の組み合わせであり得る。好適なカオトロープとしては、これらに限定されないが、尿素、グアジニン、およびチオシアン酸ナトリウムが挙げられる。有用な界面活性剤としては、これらに限定されないが、ドデシル硫酸ナトリウム、またはポリオキシエチレンエーテル（例えば、ＴｗｅｅｎまたはＴｒｉｔｏｎ界面活性剤）といった強力な界面活性剤、サルコシル（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）、穏やかな非イオン性界面活性剤（例えば、ジギトニン）、Ｎ−＞２，３−（ジオレイオキシ）−プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムといった穏やかなカチオン性界面活性剤、穏やかなイオン性界面活性剤（例えば、コール酸ナトリウムまたはデオキシコール酸ナトリウム）または両性イオン性界面活性（これらに限定されないが、スルホベタイン（ツヴァイッタージェント）、３−（３−クロルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパン硫酸塩（ＣＨＡＰＳ）、３−（３−クロルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸塩（ＣＨＡＰＳＯ）が挙げられる）が挙げられ得る。アセトニトリル、低級アルカノール（特にエタノールまたはイソプロパノールといったＣ２−Ｃ４アルカノール）、または低級アルカンジオール（特にエチレングリコールといったＣ２−Ｃ４アルカンジオール）といった、水混和性の有機溶媒が、変性剤として使用され得る。本発明において有用なリン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、およびホスファチジルイノシトールといった天然に生じるリン脂質であり得るか、またはジヘキサノイルホスファチジルコリンもしくはジヘプタノイルホスファチジルコリンといった合成リン脂質誘導体またはバリアントであり得る。
【００９９】
本明細書において使用されるときに“リフォールディング”は、ジスルフィド結合含有ポリペプチドを、不適切に折りたたまれた状態または変性された状態から、ジスルフィド結合に関して本来の立体構造または適切に折りたたまれた立体構造に変形させる、あらゆる過程、反応または方法を説明する。
【０１００】
本明細書において使用されるときに“コフォールディング（ｃｏｆｏｌｄｉｎｇ）”は、お互いに相互作用する少なくとも２つのポリペプチドを採用し、かつ変性されたポリペプチドまたは不適切に折りたたまれたポリペプチドの、本来の適切に折りたたまれたポリペプチドへの変形を結果として生じる、リフォールディングの過程、反応、または方法を特に指す。
【０１０１】
本明細書において使用されるときに、“ヒト血漿タンパク質またはヒト血漿ポリペプチド”または“ｈＰＰ”は、ヒトの血漿に見られるこれらのポリペプチドおよびタンパク質（ｈＰＰ類似物、ｈＰＰアイソフォーム、ｈＰＰ模倣物、ｈＰＰ断片、混成ｈＰＰタンパク質、融合タンパク質、オリゴマーおよびマルチマー、相同物、糖鎖付加様式バリアント、バリアント、スプライシングバリアント、ならびに同じ生物活性であるかにかかわらず、そしてさらにこれらの合成または製造の方法（これらに限定されないが、核酸分子の微量注入、合成方法、遺伝子導入法、および遺伝子活性化法による、インビボ、インビトロにおける組み換え体（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは核酸の他の形態から産生されるかどうか）が挙げられる）にかかわらない、これらの突然変異タンパク質が挙げられる）を含む。ｈＰＰの亜種は、当該技術において公知であり、かつ言及によって本明細書に組み込まれる、Anderson et al., Molecular & Cellular Proteomics, 3.4:311-326 (2004)；およびPing et al, Proteomics, 5:3506-3519 (2005)に見出され得る。本発明において有用なｈＰＰとしては、これらに限定されないが、α１−アンチキモトリプシン、アンチトリプシン、α１−アンチトリプシン、前アルブミン、ヒトアルブミン（ヒト血清アルブミン）、α１−リポタンパク質、Ａ−ガンマグロブリン、α２−マクログロブリン、α１−ミクログロブリン、α２−ミクログロブリン、β２−ミクログロブリン、ベンスジョーンズタンパク質、胆汁分泌物構成要素、コンプリメントタンパク質  ３、コレステリルエステル転移タンパク質、脂肪酸結合タンパク質、フェリチン、フェリチン  Ｈ鎖、フィブリノゲン、胃抑制ペプチド、グロブリン、ハプトグロブリン、ヘモグロビン、ヘモグロビン  Ａ、ヘモグロビン  Ａ１Ｃ、ヘモグロビン  Ｆ、糖化ヘモグロビン、パン  ヘモグロビン、ラクトフェリン、リパーゼ、ライソザイム、ｍｕｔＹ、ミオグロビン、心筋ミオグロビン、オロスムコイド（ｏｒｏｓｍｕｃｏｉｄ）、リューマチ因子、セクレチン、セロトニン、チログロブリン、チロキシン、チロキシン結合グロブリン、トリヨードチロニン、トランスファリング（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ）、ビタミンＤ結合タンパク質、およびこれらのバリアントの形態が挙げられ得る。
【０１０２】
本明細書において使用されるときに、“アルブミン”は、アルブミンタンパク質もしくはアルブミンアミノ酸配列、またはアルブミンの１つ以上の機能的な活性（例えば、生物活性）を有する、アルブミンの断片もしくはバリアントを、総称して指す。特に“アルブミン”は、ヒトアルブミン（“ｈＡ”）もしくはこれらの断片（特に配列番号１に示されるヒトアルブミンの成熟形態、または他の脊椎動物（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、またはトリ）から得られるアルブミン、またはこれらの断片）、またはこれらの分子の類似物もしくはバリアントもしくはこれらの断片を指す。ｈＡのアミノ酸配列は、およびヌクレオチド配列は、当該技術において公知であり、かつ言及によって本明細書に組み込まれる、例えば米国特許第５，８７９，９０７号明細書；米国特許第５，７５６，３１３号明細書；米国特許第５，７０７，８２８号明細書；米国特許第５，９８６，０６２号明細書；米国特許第５，５２１，２８７号明細書；米国特許第５，６１２，１９７号明細書；米国特許第５，４４０，−１８号明細書；米国特許第５，７５９，８１９号明細書；および米国特許第５，６４８，２４３号明細書に開示されている。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、本発明に使用されるヒト血清アルブミンタンパク質は、配列番号１を参照した以下の点変異の集合：４０７番目のＬｅｕをＡｌａに、４０８番目のＬｅｕをＶａｌに、４０９番目のＶａｌをＡｌａに、そして４１０番目のＡｒｇをＡｌａに；または４１０番目のＡｒｇをＡｌａに、４１３番目のＬｙｓをＧｌｎに、４１４番目のＬｙｓをＧｌｎに（例えば、言及によってその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第９５／２３８５７号パンフレットを参照すればよい）の一方または両方を含む。他の実施形態において、上述した点変異の集合の一方または両方を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、酵母のＹａｐ３ｐタンパク質分解に対する安定性／体性を改善されており、酵母宿主細胞において発現される組み換えアルブミン融合タンパク質の向上された産生を可能にする。
【０１０４】
本明細書において使用されるときに、治療薬の治療活性、循環時間、または保管期限を延長するために十分なｈＡの部分は、タンパク質の治療活性を安定化するか、または延長するための長さまたは構造に関して、十分なｈＡの部分を指す。タンパク質のアルブミン部分は、本明細書に記載のｈＡ配列の全長を包含し得るか、または所望の活性を提供可能である１つ以上の断片を含み得る。当該ｈＡ断片は、長さに関して１０以上のアミノ酸からなり得るか、または上記ｈＡ配列から得られる約１５、２０、２５、３０、５０、１００もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を含み得るか、またはｈＡの特定のドメインの一部もしくは全部を含み得る。例えば、第１の２つの免疫グロブリン様ドメインを架橋している１つ以上の断片が使用され得る。ｈＡの切り詰められた（ｔｒａｎｃａｔｅｄ）形態の例は、言及によって本明細書に組み込まれる、米国特許第５，３８０，７１２号明細書において見出され得る。
【０１０５】
本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、通常のｈＡのバリアントであり得る。また、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分は、本明細書に記載されるような治療タンパク質のバリアントであり得る。“バリアント”という用語は、保存的または非保存的な挿入、欠失および置換を含み、ここで、そのような変化が、治療タンパク質の治療活性を与える１つ以上の、アルブミンの腫脹の有用なリガンド結合特性および非免疫原性特性、または活性部位、または活性ドメインを実質的に変更しない。
【０１０６】
特に、本発明のｈＡタンパク質は、天然に生じるｈＡの多形核白血球バリアントおよびｈＡ断片（例えば、欧州特許出願公開第３２２  ０９４号明細書に開示されているこれらの断片）を含み得る。アルブミンは、あらゆる脊椎動物、特にあらゆる哺乳類（例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、またはブタ）から取得され得る。非哺乳類のアルブミンとしては、これらに限定されないが、ニワトリおよびサケが挙げられる。アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、ｈＡに対して連結され得る分子とは異なる動物から得られるものであり得る。また、ｈＡの断片またはバリアントは、本発明に利用され得る。ｈＡバリアントは、ｈＡの少なくとも１つの完全な構造ドメイン（例えば、ドメイン  １（配列番号１の１−１９４番目のアミノ酸）、２（配列番号１の１９５−３８７の番目アミノ酸）、３（配列番号１の３８８−５８５番目のアミノ酸）、１／２（配列番号１の１−３８７）２／３（配列番号１の１９５−５８５）または１／３（配列番号１の１−１９４番目のアミノ酸および配列番号１の３８８−５８５番目のアミノ酸））からなり得るか、または代替可能に包含し得る。ドメインのそれぞれは、１０６のＬｙｓから１１９のＧｌｕ、２９２のＧｌｕから３１５のＶａｌ、４９２のＧｌｕから５１１Ａｌａの残基を包含する適応性のあるサブドメイン間リンカー領域を伴って、自身が２つの同種のサブドメイン（すなわち、１−１０５、１２０−１９４、１９５−２９１、３１６  ３８７、３８８  ４９１および５１２  ５８５）から構成されている。好ましくは、本発明のｈＡタンパク質のｈＡ部分は、ｈＡの少なくとも１つのサブドメインもしくはドメイン、またはこれらの保存的な修飾を包含する。ｈＡがサブドメインに基づく場合に、隣接するリンカーのいくつかまたはすべては、リンカー、重合体または生物学的に活性な分子といった他の分子に対して連結するために好ましく使用される。
【０１０７】
完全な全長の天然に生じるｈＡアミノ酸配列に関しては、本明細書における配列番号１を参照すればよい。いくつかの実施形態において、本発明のｈＡポリペプチドは、配列番号１と実質的に同一である。ｈＡをコードする完全な核酸配列に関しては、本明細書における配列番号２を参照すればよい。いくつかの実施形態において、本発明のｈＡポリペプチドは、配列番号２と実質的に同一である核酸配列によってコードされる。
【０１０８】
また、“ｈＡ”という用語は、薬学的に受容可能な塩およびプロドラッグ、ならびに天然に生じるｈＡの塩、多形体、水和物、溶媒和物、生物学的に活性な断片、生物学的に活性なバリアントおよび立体異性体、これらと同様に天然に生じるｈＡのアゴニスト、模倣物およびアンタゴニストバリアントおよびこれらのポリペプチド融合体を含む。アミノ末端、カルボキシル末端または両方に付加的なアミノ酸を備える融合体は、“ｈＡ”ポリペプチドという用語に包含される。
【０１０９】
抗体は、特定の抗原に対して結合特異性を示すタンパク質である。本来の抗体は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一な重（Ｈ）鎖から構成される、約１５００００ダルトンの異種四量体糖タンパク質である。軽鎖のそれぞれは、１つの共有的なジスルフィド結合によって重鎖に対して連結されている一方において、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間において変わる。また、重鎖および軽鎖のそれぞれは、規則正しく一定の間隔をおいた鎖内ジスルフィド架橋を有する。重鎖のそれぞれは、多くの定常領域に続いて、１つの末端に可変領域（ＶＨ）を有する。軽鎖のそれぞれは、１つの末端に可変領域（ＶＬ）を有し、かつ他の末端に定常領域を有し；軽鎖の定常領域は、重鎖の定常領域と共に配列され、かつ軽鎖の可変領域は、重鎖の可変領域と共に配列される。特定のアミノ酸残基が、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域との間における相互作用を形成すると考えられている。
【０１１０】
“可変”という用語は、可変領域のある特定の部分が、抗体における配列において広範にわたって異なり、かつ特定の抗原に対する特定の抗体のそれぞれの結合特異性を担っているという事実を指す。しかし、可変性は、抗体の可変領域の全体に渡って等しく配分されていない。それは、軽鎖および重鎖の可変領域の両方における、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの区分に集中させられている。可変領域のより高度に保存される部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。本来の重鎖および軽鎖の可変領域のそれぞれは、βシート構造と接続し、かつある場合にβシート構造の一部を形成するループを形成する３または４つのＣＤＲによって接続され、主にβシート立体配置をとる、４つのＦＲを備える。それぞれの鎖におけるＣＤＲは、ＦＲ領域によって密に近接して共に保持され、かつ他の鎖から得られるＣＤＲと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)を参照すればよい）。
【０１１１】
定常領域は、抗原に対する抗体の結合に、直接には関与しないが、種々のエフェクター機能を示す。これらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依存して、抗体または免疫グロブリンは、異なる分類に割り当てられる。免疫グロブリンの５つの主要な分類：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、かつこれらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４；ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）にさらに分けられ得る。免疫グロブリンのことなる分類に対応する重鎖の定常領域は、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。種々のヒト免疫グロブリン分類のうち、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＭのみが、補体を活性化することを知られている。
【０１１２】
インビボにおいて、抗体のアフィニティー成熟は、体細胞性超変異生成によって主になされる、より高いアフィニティー抗体バリアントの抗原選択によって促進される。また、２次または３次の応答の優勢な生殖細胞系列遺伝子が、１次または２次の応答とは異なって見られる、“レパートリーシフト（ｒｅｐｅｒｔｏｒｉｅ  ｓｈｉｆｔ）”が、しばしば生じる。
【０１１３】
免疫系におけるアフィニティー成熟過程は、インビトロにおいて抗体遺伝子に変異を導入すること、および向上したアフィニティーを有する変異を単離するためのアフィニティー選択を使用することによって、再現され得る。当該変異抗体は、糸状バクテリオファージまたは酵母といった微生物の表面上に提示され得、かつ抗体は、抗原に対するそれらのアフィニティーによってか、または抗原からの解離のそれらの動態（オフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ））によって選択され得る（Hawkins et al. J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)）。ＣＤＲウォーキング（ｗａｌｋｉｎｇ）変異生成は、ヒト免疫不全ウイルスのタイプ１（ＨＩＶ−１）のヒトエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０（Barbas III et al. PNAS (USA) 91: 3809-3813 (1994)；およびYang et al. J. Mol. Biol. 254:392-403 (1995) ）；および抗ｃ−ｅｒｂＢ−２単鎖Ｆｖ断片（Schier et al. J. Mol. Biol. 263:551567 (1996) ）を結合する、アフィニティー成熟ヒト抗体に対して採用され得る。抗体鎖シャッフリングおよびＣＤＲ変異生成は、ＨＩＶの３つの超可変領域に対して指向される高いアフィニティーのヒト抗体をアフィニティー成熟させるために使用された（Thompson et al. J. Mol. Biol. 256:77-88 (1996) ）。Balint and Larrick Gene 137:109-118 (1993)には、可変領域のＣＤＲのすべてが改善されたバリアントに関して同時にかつ完全に調査される、コンピュータに補助された、オリゴデオキシリボヌクレオチド有向走査変異生成について記載されている。αｖβ３−特異的なヒト化抗体は、６つのＣＤＲのすべての部分が、最も高いアフィニティーの変異体を含む組み換えライブラリの発現およびスクリーニングに続いて変異された、初期の限られた変異生成戦略を用いてアフィニティー成熟された（Wu et al. PNAS (USA) 95: 6037-6-42 (1998)）。ファージディスプレイ抗体は、Chiswell and McCafferty TIBTECH 10:80-84 (1992)；およびRader and Barbas III Current Opinion in Biotech. 8:503-508 (1997)において概説されている。親抗体と比較して向上されたアフィニティーを有する変異抗体が、上述の参考文献に報告されているそれぞれの場合において、変異抗体は、ＣＤＲにアミノ酸置換を有する。
【０１１４】
本明細書において“アフィニティー変異”によって、抗原に対する抗体のアフィニティーを増強する過程が意図される。アフィニティー変異の方法としては、これらに限定されないが、スクリーニング方法および実験的な方法が挙げられる。
【０１１５】
本明細書において“抗体”によって、抗体遺伝子のすべてまたは一部によって実質的にコードされる１つ以上のポリペプチドからなるタンパク質が意図される。免疫グロブリン遺伝子としては、これらに限定されないが、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）、デルタ、イプシロン、およびミューの定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。本明細書において抗体は、全長の抗体および抗体断片を含むこと、ならびにあらゆる生物において天然に存在するか、または改変される（例えば、バリアントである）抗体を含むことが意図される。
【０１１６】
“抗体断片”によって、全長の形態以外の抗体のあらゆる形態が意図される。本明細書において抗体断片は、全長の抗体内に存在するより小さい構成要素である抗体、および改変されている抗体を含む。抗体断片としては、これらに限定されないが、Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆａｂ、および（Ｆａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ディアボディ、トゥリアボディ、テトラボディ、二機能性混成抗体、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、複数のＣＤＲの組み合わせ、可変領域、フレームワーク領域、ならびに定常領域などが挙げられる（Maynard & Georgiou, 2000, Annu. Rev. Biomed. Eng. 2:339-76; Hudson, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:395-402）。
【０１１７】
本明細書において“Ｆｃ”によって、免疫グロブリンドメイン  Ｃγ２およびＣγ３（Ｃγ２およびＣγ３）から構成される、抗体の部分が意図される。また、Ｆｃは、Ｃγ２とＣγ１（Ｃγ１）との間のＮ末端ヒンジに存在するあらゆる残余物を含む。Ｆｃは、単離物におけるこの領域、または抗体もしくは抗体断片に関するこの領域を指し得る。また、Ｆｃは、Ｆｃのあらゆる修飾された形態（これらに限定されないが、本来の単量体、本来の二量体（ジスルフィド結合連結される）、修飾された二量体（ジスルフィド連結されるか、および／または非共有結合的に連結される）、および修飾された単量体（すなわち、誘導体）が挙げられる）を含む。“ｈＦｃ”は、ヒトのＦｃを指す。
【０１１８】
本明細書において“全長の抗体”は、抗体のＨ鎖および／またはＬ鎖の天然の生物学的な形態を構成する構造が意図される。ほとんどの哺乳類（ヒトおよびマウスが挙げられる）において、この形態は、四量体であり、かつ２つの免疫グロブリン鎖の２つの同一な対からなり、対のそれぞれが１つの軽鎖および１つの重鎖を有し、軽鎖のそれぞれ免疫グロブリンのドメインＶＬおよびＣＬを備え、かつ重鎖のそれぞれ免疫グロブリンのドメイン  ＶＨ、Ｃγ１、Ｃγ２、およびＣγ３を備える。それぞれの対において、軽鎖および重鎖の可変領域（ＶＬおよびＶＨ）は、抗原に対する結合を共に担っており、かつ定常領域（ＣＬ、Ｃγ１、Ｃγ２、およびＣγ３、特にＣγ２、およびＣγ３）は、抗体エフェクター機能を担っている。いくつかの哺乳類において（例えば、ラクダおよびラマにおいて）、全長の抗体は、２つの重鎖（免疫グロブリンのドメイン  ＶＨ、Ｃγ２、およびＣγ３を備えるそれぞれの重鎖）のみからなり得る。
【０１１９】
本明細書において“免疫グロブリン（Ｉｇ）”によって、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる１つ以上のポリペプチドからなるタンパク質が意図される。免疫グロブリンとしては、これに限定されないが、抗体が挙げられる。免疫グロブリンは、多くの構造的な形態（これらに限定されないが、全長の抗体、抗体断片、および個々の免疫グロブリンのドメイン（これらに限定されないが、ＶＨ、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、ＶＬ、およびＣＬが挙げられる）が挙げられる）を有し得る。
【０１２０】
本明細書において“免疫グロブリン（Ｉｇ）のドメイン”によって、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされるポリペプチドからなるタンパク質のドメインが意図される。Ｉｇのドメインとしては、これらに限定されないが、ＶＨ、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、ＶＬ、およびＣＬが挙げられる。
【０１２１】
本明細書おいて使用されるときに、“バリアントタンパク質配列”によって、他の類似のタンパク質配列とアミノ酸同一性において異なる１つ以上の残基を有するタンパク質配列が意図される。上記類似のタンパク質配列は、天然のタンパク質配列、または他の野性型配列のバリアントであり得る。一般的に、開始の配列は、“親”配列と呼ばれ、かつ野生型またはバリアントの配列のいずれかであり得る。例えば、本発明の好ましい実施形態は、コンピュータを利用する分析がバリアント作製のためになされるヒト化された親配列を利用し得る。
【０１２２】
本明細書において抗体の“可変領域”によって、ＶＨ免疫グロブリンドメイン、ＶＬ免疫グロブリンドメイン、またはＶＨおよびＶＬの免疫グロブリンドメイン（バリアントが挙げられる）から構成されるポリペプチドまたは複数のポリペプチドが意図される。可変領域は、Ｆｖ断片として、ｓｃＦｖ断片として、大きな抗体断片に関するこの領域として、全長の抗体、もしくは抗体の足場ではない分子といった代替物に関するこの領域として、単離物におけるこのまたはこれらのポリペプチドを指し得る。
【０１２３】
本発明は、広範な起源から得られる抗体に適用され得る。抗体は、あらゆる生物（これらに限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、サル、特に哺乳類、そして特にヒトならびに特にマウスおよびラットが挙げられる）から得られる抗体遺伝子または複数の抗体遺伝子によって実質的にコードされ得る。１つの実施形態において、抗体は、例えば、患者もしくは対象からか、遺伝子導入したマウスもしくは他の動物を用いることによって（Bruggemann & Taussig, 1997, Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-458）か、または選択方法と結びつけたヒト抗体ライブラリを用いることによって（Griffiths & Duncan, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:102-108）得られる、完全にヒトのものであり得る。抗体は、あらゆる起源から得られ得る（人工的に生じるか、または天然に生じることが挙げられる）。例えば、本発明は、改変した抗体（これらに限定されないが、キメラ抗体およびヒト化抗体（Clark, 2000, Immunol. Today 21:397-402）が挙げられる）を利用し得るか、またはまたは組み合わせライブラリから得られ得る。さらに、最適化されている抗体は、１つ以上の天然の抗体遺伝子によって実質的にコードされる抗体の改変されたバリアントであり得る。例えば、１つの実施形態において、最適化されている抗体は、アフィニティー成熟によって同定されている抗体である。
【０１２４】
本明細書において使用されるときに、“ｈＦｃ”または“ヒトＦｃ”または“ｈＦｃポリペプチド”は、ｈＦｃ類似物、ｈＦｃアイソフォーム、ｈＦｃ模倣物、ｈＦｃのｆ断片、混成ｈＦｃタンパク質、融合タンパク質、オリゴマーおよび多量体、相同物、糖鎖付加様式バリアント、バリアント、スプライシングバリアント、ならびに同じ生物活性であるかにかかわらず、そしてさらにこれらの合成または製造の方法（これらに限定されないが、核酸分子の微量注入、合成方法、遺伝子導入法、および遺伝子活性化法による、インビボ、インビトロにおける組み換え体（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは核酸の他の形態から産生されるかどうか）が挙げられる）にかかわらない、これらの突然変異タンパク質を含む。種々のｈＦｃは、当該技術において公知である。
【０１２５】
また、“ｈＦｃ”という用語は、薬学的に受容可能な塩およびプロドラッグ、ならびにｈＦｃの塩、多形体、水和物、溶媒和物、生物学的に活性な断片、生物学的に活性なバリアントおよび立体異性体、これらと同様にｈＦｃのアゴニスト、模倣物およびアンタゴニストバリアントならびにこれらのポリペプチド融合体を含む。アミノ末端、カルボキシル末端、または両方に付加的なアミノ酸を備える融合体は、“ｈＦｃ”ポリペプチドという用語に包含される。
【０１２６】
種々の文献に、重合体接合または糖鎖付加によるポリペプチドの修飾について開示されている。“ｈＰＰポリペプチド”または“ｈＡポリペプチド”または“ｈＦｃポリペプチド”という用語は、ＰＥＧといった重合体に対して接合されるポリペプチドを含み、かつシステイン残基、リジン残基または他の残基の１つ以上の付加的な誘導体を包含し得る。さらに、ｈＰＰポリペプチドまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、リンカーまたは重合体を備え得、ここで、リンカーまたは重合体が接合されるアミノ酸が、本発明に係る非天然アミノ酸であり得るか、またはリジンもしくはシステインに対する結合といった当該技術において公知の技術を利用して、天然にコードされるアミノ酸に対して接合され得る。
【０１２７】
また、“ｈＰＰポリペプチド”または“ｈＡポリペプチド”または“ｈＦｃポリペプチド”という用語としては、ポリペプチドの、糖鎖付加形態（例えば、これに限定されないが、あらゆるアミノ酸位置ににおいて糖鎖付加されているポリペプチド、Ｎ結合型の形態、またはＯ結合型の形態）が挙げられる。また、単一のヌクレオチド変化を含有するバリアントは、ｈＰＰポリペプチドまたはｈＡポリペプチドまたはｈＦｃポリペプチドの生物学的に活性なバリアントと見做される。さらに、またスプライシングバリアントが含まれる。また、ｈＰＰポリペプチドまたはｈＡポリペプチドまたはｈＦｃポリペプチドという用語は、１つ以上のあらゆるｈＰＰポリペプチドもしくはｈＡポリペプチドもしくはｈＦｃポリペプチドもしくは他のポリペプチド、タンパク質、炭水化物、重合体、小分子、リンカー、リガンド、またはあらゆる種類の生物学的に活性な分子、同様に例えば特定の欠失もしくは生物活性をまだ維持している他の修飾を含むポリペプチド類似物の、化学的な方法によって連結されるか、または融合タンパク質として発現される、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドの異種二量体、同種二量体、異種多量体、または同種多量体を含む。
【０１２８】
本明細書に記載されているｈＡにおけるアミノ酸位置に関するすべての言及は、特に断りがない限り、配列番号１における位置に基づいている。配列番号１またはあらゆる他のｈＡ配列における位置に対応するアミノ酸位置が、あらゆる他のｈＡ分子（例えば、融合体、バリアント、断片など）において容易に同定されることは、当業者にとって十分に理解される。例えば、ＢＬＡＳＴといった配列整列化プログラムは、配列番号１、２または他のｈＡ配列における位置と対応する、タンパク質における特定の位置を整列化および同定するために使用され得る。また、配列番号１または他のｈＡ配列に関して、本明細書において記載されているアミノ酸の置換、欠失または付加は、本明細書に記載されているか、または当該技術において公知の、ｈＡの融合体、バリアント、断片などにおける対応する位置における置換、欠失または付加を指すこと、および本発明によって明白に包含されることを意図される。
【０１２９】
本明細書に記載されているｈＦｃにおけるアミノ酸位置に関するすべての言及は、直に断りがない限り、配列番号２２における位置に基づいている。配列番号２２またはあらゆる他のｈＦｃ配列における位置に対応するアミノ酸位置が、あらゆる他のｈＦｃ分子（例えば、融合体、バリアント、断片など）において容易に同定されることは、当業者にとって十分に理解される。例えば、ＢＬＡＳＴといった配列整列化プログラムは、配列番号２０、２１、２２、２３または他のｈＦｃ配列における位置と対応する、タンパク質における特定の位置を整列化および同定するために使用され得る。また、配列番号２２または他のｈＦｃ配列に関して、本明細書において記載されているアミノ酸の置換、欠失または付加は、本明細書に記載されているか、または当該技術において公知の、ｈＦｃの融合体、バリアント、断片などにおける対応する位置における置換、欠失または付加を指すこと、および本発明によって明白に包含されることを意図される。
【０１３０】
“非天然にコードされるアミノ酸”は、２０の通常のアミノ酸の１つまたはピロールリジンまたはセレノシステインではない、アミノ酸を指す。“非天然にコードされるアミノ酸”という用語と同意語として使用される他の当該用語は、“非天然アミノ酸（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）”、“非天然アミノ酸（ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）”、“非天然に生じるアミノ酸”、ならびに種々のこれらのハイフンで結んだ様式およびハイフンで結んでいない様式である。また、“非天然にコードされるアミノ酸”という用語は、天然にコードされるアミノ酸（これらに限定されないが、２０の通常のアミノ酸またはピロールリジンまたはセレノシステインが挙げられる）の修飾（例えば、転写後修飾）によって生じるが、転写複合体によって伸張するポリペプチド鎖に天然に組み込まれないそれらであるアミノ酸を含むが、これに限定されない。当該非天然にコードされるアミノ酸の例としては、これらに限定されないが、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−スレオニン、およびＯ−ホスホチロシンが挙げられる。
【０１３１】
“アミノ末端修飾基”は、ポリペプチドアミノ末端に対して付着され得るあらゆる分子を指す。同様に、“カルボキシル末端修飾基”は、ポリペプチドのカルボキシル末端に対して付着し得るあらゆる分子を指す。末端修飾基としては、これらに限定されないが、水溶性重合体、ペプチドまたはタンパク質（例えば、血清アルブミン、またはペプチドの血中半減期を増加させる他の分子）が挙げられる。
【０１３２】
“官能基”、“活性部分”、“活性化基”、“離脱基”、“反応性部位”、“化学反応性部位”および“化学反応性部分”という用語は、分子の明確な定義できる部分または単位を指すために、当該技術および本明細書において使用される。当該用語は、化学の技術においてやや同義的であり、かつある機能または活性を果たし、かつ他の分子と反応性である分子の部分を示すために、本明細書において使用される。
【０１３３】
“連結”または“リンカー”という用語は、化学反応の結果として通常に形成され、かつ典型的に共有結合である基または結合を指すために本明細書において使用される。加水分解的に安定な連結は、連結が水中において安定であり、かつ長期間（おそらく無期限に等しい）に渡って有用なｐＨ値において（これに限定されないが、生理学的条件の下に、挙げられる）水と反応しないことを意味する。加水分解に不安定であるか、または分解される連結は、連結が、水または水性溶液（例えば、血液が挙げられる）において分解されることを意味する。酵素的に不安定であるか、または分解される連結は、連結が１つ以上の酵素によって分解されること意味する。当該技術において理解されるように、ＰＥＧおよび関連する重合体は、重合体骨格においてか、または重合体骨格と１つ以上の重合体分子の末端修飾基との間にあるリンカー基において分解される連結を含む。例えば、ＰＥＧのカルボキシル酸または活性化したＰＥＧのカルボキシル酸の、生物学的に活性な作用物質におけるアルコール基との、反応によって形成されるエステル結合は、一般的に、当該作用物質を放出する生理学的条件の下に加水分解する。他の加水分解的に分解される連結としては、これらに限定されないが、炭酸塩結合；アミンおよびアルデヒドの反応から結果として生じたイミン結合；アルコールをリン酸基と反応させることによって形成されるリン酸エステル結合；ヒドラジンおよびアルデヒドの反応産物であるヒドラゾン結合；アルデヒドおよびアルコールの反応産物であるアセタール結合；蟻酸エステルおよびアルコールの反応産物であるオルトエステル結合；アミン基（これに限定されないが、ＰＥＧといった重合体の末端におけるアミン基が挙げられる）およびペプチドのカルボキシル基によって形成されるペプチド結合；ならびにホスホラミダイト（これに限定されないが、重合体の末端におけるホスホラミダイトが挙げられる）およびオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基によって形成されるオリゴヌクレオチド結合が挙げられる。
【０１３４】
本明細書において使用される場合に、“生物学的に活性な分子”、“生物学的に活性な部分”または“生物学的に活性な作用物”という用語は、生体（これらに限定されないが、ウイルス、細菌、バクテリオファージ、トランスポゾン、プリオン、昆虫、菌類、植物、動物およびヒトが挙げられる）に関する、生物学的な系、経路、分子、または相互作用のあらゆる物理的または生化学的な特性に影響を及ぼし得る、あらゆる分子を意味する。特に、本明細書に使用されるときの、生物学的に活性な分子としては、これらに限定されないが、ヒトもしくは他の動物における疾患の診断、治療、鎮静、処置もしくは予防、またはそうでなければヒトまたは他の動物の肉体的もしくは精神的な健康を増進することを対象にしたあらゆる物質が挙げられる。生物学的に活性な分子の例としては、これらに限定されないが、ペプチド、タンパク質、酵素、小分子薬、習慣性の強い薬、習慣性の弱い薬、炭水化物、無機の原子もしくは分子、色素、脂質、ヌクレオシド、放射性核種、オリゴヌクレオチド、毒素、細胞、ウイルス、リポソーム、微小粒子、およびミセル体が挙げられる。本発明を伴う使用に好適な生物学的に活性な作用物の分類としては、これらに限定されないが、薬物、プロドラッグ、放射性核種、画像診断薬剤、重合体、抗生物質、殺真菌剤、抗ウイルス薬、抗炎症誘発因子、抗腫瘍薬、心血管作動薬、抗不安薬、ホルモン、成長因子、ステロイド剤、および微生物由来毒素などが挙げられる。生物学的に活性な分子は、種々のポリペプチド（これらに限定されないが、以下の治療の範疇：副腎皮質刺激ホルモンペプチド、副腎髄質ペプチド、アラトスタチン（ａｌｌａｔｏｓｔａｔｉｎ）ペプチド、アミリンペプチド、アミロイドベータタンパク質断片ペプチド、アンギオテンシンペプチド、抗生物質ペプチド、抗原性ポリペプチド、抗微生物ペプチド、アポトーシス関連ペプチド、心房性ナトリウム尿素ペプチド、バッグ細胞ペプチド、ボンベシンペプチド、骨ＧＬＡペプチド、バーディキニン（ｂａｒｄｙｋｉｎｉｎ）ペプチド、脳ナトリウム排泄ペプチド、Ｃ−ペプチド、Ｃ型−ナトリウム排泄ペプチド、カルシトニンペプチド、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、ＣＡＲＴペプチド、カゾモルフィンペプチド、化学走性ペプチド、コレシトキニン（ｃｈｏｌｅｓｙｔｏｋｉｎｉｎ）ペプチド、コロニー刺激因子ペプチド、コルチコトロピン放出因子ペプチド、コルチスタチンペプチド、サイトカインペプチド、デルモルフィンペプチド、ダイノルフィンペプチド、エンドルフィンペプチド、エンドセリンペプチド、ＥＴａ受容体アンタゴニストペプチド、ＥＴｂ受容体アンタゴニストペプチド、エンケファリンペプチド、フィブロネクチンペプチド、ガラニンペプチド、ガストリンペプチド、グルカゴンペプチド、Ｇｎ−ＲＨ関連ペプチド、成長因子ペプチド、成長ホルモンペプチド、ＧＴＰ−結合タンパク質断片ペプチド、グアニリンペプチド、インヒビンペプチド、インスリンペプチド、インターロイキンペプチド、ラミニンペプチド、レプチンペプチド、ロイコキニンペプチド、黄体形成ホルモン放出ホルモンペプチド、マストパランペプチド、肥満細胞脱顆粒化ペプチド、メラニン形成細胞刺激ホルモンペプチド、モルフィセプチン（ｍｏｒｐｈｉｃｅｐｔｉｎ）ペプチド、モチリンペプチド、神経ペプチド、神経ペプチドＹ  ペプチド、神経向性因子ペプチド、オレキシンペプチド、オピオイドペプチド、オキシトシンペプチド、ＰＡＣＡＰペプチド、パンクレアスタチンペプチド、膵ポリペプチド、副甲状腺ホルモンペプチド、副甲状腺ホルモン関連ペプチド、ペプチドＴ  ペプチド、プロラクチン放出ホルモンペプチド、ペプチドＹＹ  ペプチド、レニン基質ペプチド、セクレチンペプチド、ソマトスタチンペプチド、サブスタンスＰ  ペプチド、タキキニンペプチド、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンペプチド、トキシンペプチド、血管活性腸管ペプチド、バソプレシンペプチド、およびウイルス関連ペプチドに該当する本発明に有用な代表的な制限されない分類のポリペプチドが挙げられる）を包含する（米国特許第６，８５８，５８０号明細書を参照すればよい）。
【０１３５】
ポリペプチドである生物学的に活性な分子の例としては、これらに限定されないが、下垂体ホルモン（例えば、バソプレシン、オキシトシン、メラニン形成細胞刺激ホルモン、副腎皮質ホルモン、成長ホルモン）；視床下部ホルモン（例えば、成長ホルモン放出因子、コルチコトロピン放出因子、プロラクチン放出ペプチド、ゴナドトロピン放出ホルモンおよびその関連ペプチド、黄体形成ホルモン放出ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、オレキシン、およびソマトスタチン）；甲状腺ホルモン（例えば、カルシトニン、カルシトニン前駆体およびカルシトニン遺伝子関連ペプチド）；副甲状腺ホルモンおよびそれらの関連タンパク質；膵臓ホルモン（例えば、インスリンおよびインスリン様ペプチド、グルカゴン、ソマトスタチン、膵ポリペプチド、アミリン、ペプチドＹＹ、および神経ペプチドＹ；消化ホルモン（例えば、ガストリン、ガストリン放出ペプチド、ガストリン抑制ペプチド、コレシトキニン、セクレチン、モチリン、および血管活性腸管ペプチド）；ナトリウム利尿ペプチド（例えば、心房性ナトリウム尿素ペプチド、脳ナトリウム排泄ペプチド、およびＣ型ナトリウム利尿ペプチド）；ニューロキニン（例えば、ニューロキニンＡ、ニューロキニンＢ、およびサブスタンスＰ）；レニン関連ペプチド（例えば、レニン機質およびレニン阻害剤、レニンアンタゴニスト）；エンドセリン（大エンドセリン、エンドセリンＡ受容体アンタゴニスト、およびサラフォトキシンペプチドが挙げられる）；ならびに他のペプチド（例えば、副腎メドュリンペプチド、アラトスタチンペプチド、アミロイドベータタンパク質断片、抗生物質ペプチドおよび抗微生物ペプチド、アポトーシス関連ペプチド、バッグ細胞ペプチド、ボンベシン、骨Ｇｌａタンパク質ペプチド、ＣＡＲＴペプチド、化学走性ペプチド、コルチスタチンペプチド、フィブロネクチン断片およびフィブリン関連ペプチド、ＦＭＲＦペプチドおよびＦＭＲＦ類似物ペプチド、ガラニンペプチドおよびガラニン関連ペプチド、成長因子ペプチドおよび成長因子関連ペプチド、Ｇ治療ペプチド結合タンパク質断片、グアニリンおよびウログアニリン、インヒビンペプチド、インターロイキンおよびインターロイキン受容体タンパク質、ラミニン断片、レプチン断片ペプチド、ロイコキニン、肥満細胞脱顆粒化ペプチド、下垂体アデニル化シクラーゼ活性化ペプチド、パンクレアスチン、ペプチドＴ、ウイルス関連ペプチド、情報伝達作用物質、トキシン、ならびに種々雑多なペプチド（例えば、免疫賦活ペプチド類似物、アルファ交配因子、抗不整脈ペプチド、凍結防止ポリペプチド、食欲抑制ペプチド、ウシ松果体抗再生ペプチド、バルシン（ｂｕｒｓｉｎ）、Ｃ３ペプチドＰ１６、腫瘍壊死因子、カドヘリンペプチド、クロモグラニンＡ断片、避妊テトラペプチド、コナントキン（ｃｏｎａｎｔｏｋｉｎ）Ｇ、コナントキンＴ、甲殻類心作用性ペプチド、Ｃ−テロペプチド、チトクロームｂ５８８ペプチド、デコルシン（ｄｅｃｏｒｓｉｎ）、性感刺激ペプチド、デルタ睡眠誘発ペプチド、ジアゼムパン（ｄｉａｚｅｍｐａｍ）結合阻害断片、一酸化窒素シンターゼ阻害ペプチド、ＯＶＡペプチド、血小板カルパイン抑制因子（Ｐ１）、プスミノーゲン活性因子阻害因子１、リギン（ｒｉｇｉｎ）、分裂病関連ペプチド、血清胸腺因子、ナトリウムカリウムＡ治療ペプチダーゼ抑制因子−１、スペラクト、精子活性化ペプチド、システミン、トロンビン受容体アゴニスト、胸腺液性ガンマ２因子、サイモペンチン（ｔｈｙｍｏｐｅｎｔｉｎ）、チモシンアルファ１、胸腺因子、タフトシン、脂肪動員ホルモン、尿毒症ペンタペプチド、グルコース依存インスリン分泌ポリペプチド（ＧＩＰ）、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−１）、エキセンジン（ｅｘｅｎｄｉｎ）−４、および他の治療ペプチドもしくはこれらの断片））が挙げられる。ペプチドの付加的な例としては、グレリン（ｇｈｒｅｌｉｎ）、オピオイドペプチド（カゾモルフィンペプチド、デモルフィン、エンドルフィン、エンケファリン、デルトルフィン、ディノルフィン、ならびにこれらの類似物および誘導体）、胸腺ペプチド（サイモポイエチン、サイムリン、サイモペンチン、サイモシン、胸腺液性因子（ＴＨＦ））、細胞接着ペプチド、補体抑制因子、トロンビン阻害物質、トリプシン阻害物質、アルファ−１  アンチトリプシン、ウニ精子活性化ペプチド、ＳＨＵ−９１１９、ＭＣ３−Ｒ＆ＭＣ４−Ｒアンタゴニスト、グラスピモッド（ｇｌａｓｐｉｍｏｄ）（細菌感染、真菌感染、免疫不全免疫疾患、白血球減少症に対して有用な免疫賦活剤）、ＨＰ−２２８（つわり、毒性、痛み、真性糖尿病、炎症、リューマチ性関節炎、肥満に対する化学療法に有用なメラノコルチン）、アルファ２−プラスミン抑制因子（プラスミン抑制因子）、ＡＰＣ癌サプレッサ（新生物に対して有用な癌サプレッサ）、早期妊娠因子（免疫抑制因子）、エンドゼフィン結合阻害因子（受容体ペプチド）、ガンマインターフェロン（白血病に対して有用である）、腺カリクレイン−１（免疫賦活剤）、胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤、サルコレシン結合タンパク質、表面活性物質タンパク質Ｄ、ウィルムス癌サプレッサ、ＧＡＢＡＢ  １ｂ受容体ペプチド、プリオン関連ペプチド（ｉＰｒＰ１３）、コリン結合タンパク質断片（細菌関連ペプチド）、テロメラーゼ阻害因子、カルディオスタチンペプチド、エンドスタチン由来ペプチド（血管形成誘導阻害因子）、プリオン阻害ペプチド、Ｎ−メチル  Ｄ−アスパルテート受容体アンタゴニスト、Ｃ−ペプチド類似物（糖尿病合併症に対して有用である）、ＲＡＮＴＥＳ、ＮＴＹ受容体、ＮＰＹ２−Ｒ（神経ペプチドＹ  ２型−受容体）リガンド、ＮＣ４Ｒペプチド、またはこれらの断片が挙げられる。言及によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，８４９，７１４号明細書を参照すればよい。また、アルファ−１  アンチトリプシン、アンジオスタチン、抗溶血因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウムポリペプチド、心房ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン（例えば、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、Ｇｒｏ−ａ、Ｇｒｏ−ｂ、Ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ）、カルシトニン、ＣＣケモカイン（例えば、単球化学遊走物質タンパク質−１、単球化学遊走物質タンパク質−２、単球化学遊走物質タンパク質��３、単球炎症性タンパク質−１  アルファ、単球炎症性タンパク質−１  ベータ、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２）、ＣＤ４０リガンド、Ｃ−キットリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害因子、補体受容体１、サイトカイン（例えば、上皮性好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯ□／ＭＧＳＡ、ＧＲＯ、ＧＲＯ、ＭＩＰ−１、ＭＩＰ−１、ＭＣＰ−１）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン（“ＥＰＯ”）、表面剥離毒素ＡおよびＢ、因子ＩＸ、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩＩ、因子Ｘ、線維芽成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノゲン、フィブロネクチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、成長因子、ヘッジホッグタンパク質（例えば、ソニック、インディアン、デザート）、ヘモグロビン、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、ヒルジン、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２など）、ケラチン合成細胞成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニューチュリン（Ｎｅｕｔｕｒｉｎ）、好中球成長因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨原性タンパク質、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン）、プレイオトロピン（Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｎ）タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、発熱性菌体外毒素Ａ、ＢおよびＣ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インターロイキン受容体（ＩＬ−１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５）、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、超抗原（すなわち、ブドウ球菌性のエンテロトキシン（ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ））、超酸化物不均化酵素、毒素性ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ−１）、サイモシン  アルファ１、組織プラスミノゲン活性化因子、腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦベータ）、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ  アルファ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＥＦ）、ウロキナーゼ、Ｔ−２０、ＳＳ−１４、ＬＨＲＨ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＰＯ、アクソキン（ａｘｏｋｉｎｅ）、レプチンならびに多くの他のものが挙げられる。生物学的に活性な分子に対して接合されるか、結合されるか、または融合されるｈＡの例は、言及によって本明細書に組み込まれる、米国特許第７，０５６，７０１号明細書；米国特許第７，０４１，４７８号明細書；米国特許第７，０４５，３１８号明細書；米国特許第６，９９４，８５７号明細書；米国特許第６，９８７，００６号明細書；米国特許第６，９７２，３２２号明細書；米国特許第６，９４６，１３４号明細書；米国特許第６，９２６，８９８号明細書；米国特許第６，９０５，６８８号明細書；米国特許第６，６８６，１７９号明細書；米国特許第６，５４８，６５３号明細書；米国特許第６，４２３，５１２号明細書；米国特許第５，７７３，４１７号明細書；および米国特許第５，５９４，１１０号明細書に見られ得る。
【０１３６】
“二機能性重合体”または“二機能性リンカー”は、共有的または非共有的な結合を形成するために他の部分（これらに限定されないが、アミノ酸側鎖基が挙げられる）と特異的に反応することを可能にする２つの別々の官能基を備える、分子を指す。特定の生物学的に活性な構成要素における基と反応性である１つの官能基、および第２の生物学的に活性な構成要素における基と反応性であるもう１つの官能基を有する、二機能性リンカーは、第１の生物学的に活性な構成要素、二機能性リンカーおよび第２の生物学的に活性な構成要素を含む、接合物の形成に使用され得る。ペプチドに対する種々の化合物の付着に関する多くの手法およびリンカー分子は、公知である。例えば、言及によって本明細書に組み込まれる、欧州特許出願公開第１８８，２５６号明細書；米国特許第４，６７１，９５８号明細書、米国特許第４，６５９，８３９号明細書、米国特許第４，４１４，１４８号明細書、米国特許第４，６９９，７８４号明細書；米国特許第４，６８０，３３８号明細書；および米国特許第４，５６９，７８９号明細書を参照すればよい。“多機能性重合体”または“多機能性リンカー”は、共有的または非共有的な結合を形成するために他の部分（これらに限定されないが、アミノ酸側鎖基が挙げられる）と特異的に反応することを可能にする２つ以上の別々の官能基を備える、分子を指す。二機能性重合体もしくは二機能性リンカー、または多機能性重合体もしくは多機能性リンカーは、あらゆる所望の長さもしくは分子量であり得、かつｈＰＰまたはｈＦｃに対して連結される１つ以上の分子と、その結合バートナーまたはｈＰＰまたはｈＦｃとの間に特定の所望される空間または高次構造を提供するために選択され得る。
【０１３７】
置換基が左から右に書かれる従来の化学式によって特定される場合に、それらは、右から左に構造を記載することによって生じる化学的に同一な置換基を等しく包含する（例えば、構造−ＣＨ２Ｏ−は構造−ＯＣＨ２−と等価である）。
【０１３８】
“置換基”という用語は、これに限定されないが、“非干渉性の置換基”を含む。“非干渉的な置換基”は、安定な化合物を産生するこれらの基である。安定な非干渉的な置換基またはラジカルとしては、これらに限定されないが、ハロ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−１０アルケニル、Ｃ２−１０アルキニル、Ｃ１−Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１−Ｃ１２アラルキル、Ｃ１−Ｃ１２アルカリル、Ｃ３−Ｃ１２シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ１２シクロアルケニル、フェニル、置換フェニル、トルオイル、キシレニル、ビフェニル、Ｃ２−Ｃ１２アルコキシアルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルコキシアリール、Ｃ７−Ｃ１２アリールオキシアルキル、Ｃ７−Ｃ１２アリール、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルフィニル、Ｃ１−Ｃ１２アルキルスルフォニル、−−（ＣＨ２）ｍ−−Ｏ−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）（ここで、ｍは１から８までである）、アリール、置換アリール、置換アルコキシ、フルオロアルキル、ヘテロ環ラジカル、置換ヘテロ環ラジカル、ニトロアルキル、−−ＮＯ２、−−ＣＮ、−−ＮＲＣ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、−−Ｃ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、Ｃ２−Ｃ１０アルキルチオアルキル、−−Ｃ（Ｏ）Ｏ−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、−−ＯＨ、−−ＳＯ２、＝Ｓ、−−ＣＯＯＨ、−−ＮＲ２、カルボニル、−−Ｃ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）−ＣＦ３、−−Ｃ（Ｏ）−ＣＦ３、−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−−（Ｃ１−Ｃ１０アリール）−Ｓ−−（Ｃ６−Ｃ１０アリール）、−−Ｃ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０アリール）、−−（ＣＨ２）ｍ−−Ｏ−−（−−（ＣＨ２）ｍ−−Ｏ−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）（ここで、ｍのそれぞれは１から８までである）、−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−−Ｃ（Ｓ）ＮＲ２、−−ＳＯ２ＮＲ２、−−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ２、−−ＮＲＣ（Ｓ）ＮＲ２、これらの塩などが挙げられる。本明細書において使用されるときに、Ｒのそれぞれは、Ｈ、アルキルもしくは置換アルキル、アリールもしくは置換アリール、アラルキル、またはアルカリルである。
【０１３９】
“ハロゲン”という用語は、フッ素、塩素、ヨウ素、および臭素を含む。
【０１４０】
それ自身によってか、または他の置換基の一部として“アルキル”という用語は、特に断りがない限りにおいて、完全に飽和され得るか、一飽和され得るか、または多飽和され得る、直鎖状もしくは分枝状の鎖、または環状炭化水素ラジカル、またはこれらの組み合わせを意味し、かつ所望の炭素原子数（すなわち、Ｃ１−Ｃ１０は１から１０の炭素を意味する）を有する２価または多価のラジカルを含み得る。飽和炭化水素ラジカルの例としては、これらに限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、例えばｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、およびｎ−オクチルなどの、類似物および異性体といった基が挙げられる。不飽和アルキル基は１つ以上の２重結合または３重結合を有するアルキル基である。不飽和アルキル基の例としては、これらに限定されないが、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、３−ブチニル、ならびにより高級な類似物および異性体が挙げられる。また、“アルキル”という用語は、特に断りがない限りにおいて、“ヘテロアルキル”といった以下においてより詳細に定義されるアルキルの誘導体を含むことを意図される。炭化水素基に限定されるアルキル基は、“ホモアルキル”と称される。
【０１４１】
それ自身によってか、または他の置換基の一部として“アルキレン”という用語は、これらに限定されないが、構造−ＣＨ２ＣＨ２−および−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−によって例示されるような、アルカンから得られる２価のラジカルを意味し、かつ“ヘテロアルキル”として以下に記載されているこれらの基をさらに包含する。典型的に、アルキル（またはアルキレン）基は、１から２４の炭素原子を有すると共に、本明細書に記載される方法および組成物の特定の実施形態であるこれらの基は、１０以下の炭素原子を有する。“低級アルキル”または“低級アルキレン”は、８以下の炭素原子を一般的に有する、より短い鎖状のアルキル基またはアルキレン基である。
【０１４２】
“アルコキシ”、“アルキルアミノ”および“アルキルチオ”（またはチオアルコキシ）という用語は、それらの従来の意味において使用され、かつ酸素原子、アミノ基、または硫黄原子をそれぞれ介して分子の残余部分に対して付着されるこれらのアルキル基を指す。
【０１４３】
それ自身によってか、または他の用語との組み合わせにおいて、“ヘテロアルキル”という用語は、特に断りがない限りにおいて、一定の数の炭素原子、ならびにＯ、Ｎ、ＳｉおよびＳからなる群から選択される少なくとも１つの異種原子（ここで、窒素原子および硫黄原子は任意に酸化され、かつ窒素異種原子は任意に４級化される）から構成される安定な直鎖状もしくは分枝状の鎖、または環状炭化水素ラジカルを意味する。（複数の）異種原子、Ｏ、ＮおよびＳおよびＳｉは、ヘテロアルキル基のあらゆる内部位置においてか、アルキル基が分子の残余部に対して付着される位置において位置され得る。例としては、これらに限定されないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３−）ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が挙げられる。最大で２つの異種原子が、例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３および−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３といったように、連続し得る。同様に、それ自身によってか、または他の置換基の一部として、“ヘテロアルキレン”という用語は、これらに限定されないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−および−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−に例示されるような、ヘテロアルキルから得られる２価のラジカルを意味する。また、ヘテロアルキレン基に関して、同じかまたは異なる異種原子は、鎖の末端のいずれかまたは両方を占有し得る（これらに限定されないが、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノ、およびアミノオキシアルキレンなどが挙げられる）。まださらに、アルキレン連結基およびへテロアルキレン連結基に関して、連結基の方向は、連結基の式が書かれている方向によって意味されない。例えば、式−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’は、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’およびＲ’Ｃ（Ｏ）２−の両方を意味する。
【０１４４】
それら自身によってか、または他の用語との組み合わせにおいて、“シクロアルキル”および“ヘテロシクロアルキル”という用語は、特に断りがない限りにおいて、“アルキル”および“ヘテロアルキル”ぞれぞれの環状の型を表す。従って、シクロアルキルまたはへテロシクロアルキルは、飽和環結合、部分的に不飽和の環結合および完全に不飽和の環結合を包含する。付加的に、ヘテロシクロアルキルに関して、異種原子は、異種原子が分子の残余部に対して付着される位置を占めることができる。シクロアルキルの例としては、これらに限定されないが、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、およびシクロヘプチルなどが挙げられる。ヘテロシクロアルキルの例としては、これらに限定されないが、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、および２−ピペラジニルなどが挙げられる。付加的に、当該用語は、２環式環構造および３環式環構造を包含する。同様に、それ自身によってか、または他の置換基の一部として、“ヘテロシクロアルキレン”という用語は、ヘテロシクロアルキルから得られる２価のラジカルを意味し、かつそれ自身によってか、または他の置換基の一部として、“シクロアルキレン”という用語は、シクロアルキルから得られる２価のラジカルを意味する。
【０１４５】
本明細書において使用されるときに、“水溶性重合体”という用語は、水性溶媒に可溶であるあらゆる重合体を指す。ｈＰＰポリペプチドまたはＡポリペプチドまたはｈＦｃポリペプチドに対する水溶性重合体の連結は、変化（これらに限定されないが、増強されたか、もしくは調節された血中半減期、または非修飾形態と比べて増強されたか、もしくは調節された治療半減期、調節された免疫原性、調節された物理的な会合特性（例えば、凝集および多量体形成）、変更された受容体結合、１つ以上の結合パートナーに対する変更された結合、ならびに変更された二量体化もしくは多量体化が挙げられる）を結果として生じることができる。水溶性重合体は、それぞれの生物活性を有し得るか、有し得ず、かつ他の物質（これらに限定されないが、１つ以上のｈＰＰポリペプチドまたはｈＡポリペプチドまたはｈＦｃポリペプチドか、または１つ以上の生物学的に活性な分子が挙げられる）に対するｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃの付着用のリンカーとして利用され得る。好適な重合体としては、これらに限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、モノＣ１−Ｃ１０アルコキシ誘導体もしくはモノＣ１−Ｃ１０アリールオキシ誘導体（言及によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，２５２，７１４号明細書に記載されている）、モノメトキシポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、ジビニルエーテルマレイン酸無水物、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、デキストラン、デキストラン誘導体（硫化デキストランが挙げられる）、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ヘパリン、ヘパリン断片、ポリサッカライド、オリゴサッカライド、グリカン、セルロースおよびセルロース誘導体（これらに限定されないが、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースが挙げられる）、スターチおよびスターチ誘導体、ポリペプチド、ポリアルキレングリコールおよびこれらの誘導体、ポリアルキレングリコールおよびこれらの誘導体、ポリビニルエチルエーテル、ならびにアルファ−ベータ−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルトアミドなどの共重合体、またはこれらの混合物が挙げられる。当該水溶性重合体の例としては、これらに限定されないが、ポリエチレングリコールおよび血清アルブミンが挙げられる。
【０１４６】
本明細書において使用されるときに、“ポリアルキレングリコール”または“ポリ（アルキレングリコール）”という用語は、ポリエチレングリコール（ポリ（エチレングリコール））、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、およびこれらの誘導体を指す。“ポリアルキレングリコール”という用語は、直鎖状および分枝状の重合体の両方、および０．１ｋＤａから１００ｋＤａの間の平均分子量を包含する。他の例示的な実施形態は、例えば、株式会社シェアーウォーター（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ）のカタログ“Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications”（２００１）といった商業的な業者のカタログに挙げられている。
【０１４７】
“アリール”という用語は、特に断りがない限りにおいて、共に融合されるか、または共有的に結合される単環または多環（これらに限定されないが、１から３つの環が挙げられる）であり得る、多価不飽和の芳香族炭化水素置換基を意味する。“ヘテロアリール”という用語は、Ｎ、Ｏ、およびＳからなる選択される１から４つの異種原子を含有するアリール基（または環）（ここで、窒素原子および硫黄原子は任意に酸化され、かつ（複数の）窒素原子は任意に４級化されている）を指す。ヘテロアリール基は、異種原子を介して分子の残余部に対して付着され得る。アリール基またはへテロアリール基の非限定的な例としては、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−キノリル、および６−キノリルが挙げられる。上述のアリール環系およびヘテロアリール環系のそれぞれに関する置換基は、以下に記載される受容可能な置換基の群から選択される。
【０１４８】
簡潔に言うと、他の用語との組み合わせにおいて使用される場合の、“アリール”という用語（これらに限定されないが、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキルが挙げられる）は、上記において定義されるようなアリール環およびヘテロアリール環の両方を包含する。従って、“アリールアルキル”という用語は、アリール基がアルキル基に対して付着されている、これらのラジカル（これらに限定されないが、ベンジル、フェネチル、およびピリジルメチルなどが挙げられる）であって、当該アルキル基が、炭素原子が例えば、酸素原子によって置換されているこれらのアルキル基（これに限定されないが、メチレン基が挙げられる）を含むこれらのラジカル（これらに限定されないが、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、および３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなどが挙げられる）を包含することを意図される。
【０１４９】
上述の用語のそれぞれ（これらに限定されないが、“アルキル”、“ヘテロアルキル”、“アリール”および“ヘテロアリール”が挙げられる）は、示されているラジカルの置換形態および非置換形態の両方を包含することを意図される。それぞれの種類のラジカルにとっての例示的な置換基が以下に規定される。
【０１５０】
アリールラジカルおよびへテロアリールラジカル（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびへテロシクロアルケニルとしばしば呼ばれるこれらの基が挙げられる）にとっての置換基は、これらに限定されないが、０から（２ｍ’＋１）までの範囲にある数における（ここで、ｍ’は当該ラジカルにおける炭素原子の総数である）、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２から選択される多様な群の１つ以上であり得る。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’のそれぞれは、水素、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール（これに限定されないが、１−３のハロゲンに置換されるアリールが挙げられる）、置換もしくは非置換のアルキル、アルコキシもしくはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を独立して指す。本発明の化合物が１つ以上のＲ基を含む場合に、例えば、Ｒ基のそれぞれは、２つ以上のこれらの基が存在する場合に、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’基のそれぞれであるように、独立して選択される。Ｒ’およびＲ’’が、同じ窒素原子に付着される場合に、それらは、５−、６−、７−員環を形成するために窒素原子と組み合わせられ得る。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、これらに限定されないが、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを含むことを意図される。置換基の上述の議論から、当業者は、“アルキル”という用語が、水素基以外の基（例えば、ハロアルキル基（これらに限定されないが、−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３が挙げられる）およびアシル（これらに限定されないが、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、および−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３などが挙げられる））に対して結合される炭素原子を含むことを意図されることを理解する。
【０１５１】
アルキルラジカルに関して記載される置換基と同様に、アリール基およびへテロアリール基にとっての置換基は、変更され、かつこれらに限定されないが、０から芳香族環系における空いている原子価の総数までの範囲にある数において、ハロゲン、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２、−Ｒ’、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、ならびにフルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルから選択され；ここで、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’が独立して、水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリールおよびヘテロアリールから選択される。本発明の化合物が、２つ以上のＲ基を含む場合に、例えば、Ｒ基のそれぞれは、２つ以上のこれらの基が存在する場合に、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’のそれぞれであるように、独立して選択される。
【０１５２】
本明細書において使用されるときに、“調節された血中半減期”という用語は、その非修飾形態に比べて、調節されたｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃの循環半減期に関して正または負の変化を意味する。血中半減期は、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃの投与後における種々の時点に血液試料を採ること、および試料のそれぞれにおける分子の濃度を決定することによって測定される。時間と血清濃度の相関関係は、血中半減期の算出を可能にする。増強された血中半減期は、少なくとも約２倍を好ましく有するが、より小さな増強が、例えば、十分な投与計画を可能にし、かつ毒作用を避ける場合に有用であり得る。いくつかの実施形態において、増強は、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍である。
【０１５３】
本明細書において使用されるときに、“調節された治療半減期”という用語は、その非修飾形態に比べて、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃの治療有効量の半減期における正または負の変更を意味する。治療半減期は、投与後における種々の時点において分子の薬物動態特性および／または薬理学的特性を測定することによって測定される。増強された治療半減期は、特に利益をもたらす投与計画、特に利益をもたらす総投与量を好ましく可能にするか、または好ましくない影響を好ましく回避する。いくつかの実施形態において、増強された治療半減期は、増強された有効性、修飾された分子のその標的に対する増強されたかもしくは低減された結合、プロテアーゼといった酵素による分子の増強されたかもしくは低減された崩壊、または非修飾分子の作用の他の要因もしくは機序の増強もしくは減少を結果として生じる。
【０１５４】
核酸またはタンパク質に対して適用される場合に“単離された”という用語は、核酸またはタンパク質が、天然の状態において会合される少なくともいくつかの細胞性構成要素から遊離していることか、または核酸もしくはタンパク質がインビボもしくはインビトロにおける産物の濃度よりも濃縮されていることを表す。それは、均質な状態にあり得る。単離された物質は、乾燥状態もしくは半乾燥状態、または溶液（これに限定されないが、水性溶液が挙げられる）内のいずれかにあり得る。それは、付加的な薬学的に受容可能な担体および／または賦形剤を包含する薬学的組成物の構成要素であり得る。純度および均質性は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーといった分析化学的技術を用いて、典型的に決定される。調製物に存在する優勢種であるタンパク質は、実質的に精製されている。特に、単離された遺伝子は、遺伝子に隣接し、かつ所定の遺伝子以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離されている。“精製されている”という用語は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて実質的に１つのバンドに生じることを表す。特に、それは、核酸またはタンパク質が、少なくとも約８５％の純度、少なくとも約９０％の純度、少なくとも９９％かそれ以上の純度であることを意味し得る。
【０１５５】
“核酸”という用語は、１本鎖の形態または２本鎖の形態のいずれかにおける、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオチド、またはリボヌクレオシド、ならびにこれらの重合体を指す。特に断りがない限りにおいて、当該用語は、基準の核酸と同様の結合特性を有し、かつ天然に生じるヌクレオチドに同様の様式において代謝される天然ヌクレオチドの公知の類似物を含有する、核酸を包含する。また、特に断りがない限りにおいて、当該用語は、オリゴヌクレオチド類似物（ＰＮＡ（ペプチド核酸）、アンチセンス技術において使用されるＤＮＡの類似物（ホスホロチオネート、およびホスホロアミデートなど）が挙げられる）を指す。また、特に断りがない限りにおいて、特定の核酸配列は、これらの保存的に修飾されたバリアント（これに限定されないが、変性コドン置換が挙げられる）および相補的な配列、これらと同様に明確に示されている配列を暗に包含する。特に、変性コドン置換は、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの３番目の位置が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基に置換される配列を、生成することによって達成され得る（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985) ；Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。
【０１５６】
“ポリペプチド”、“ペプチド”および“タンパク質”という用語は、本明細書において交換可能に使用されて、アミノ酸残基の重合体を指す。すなわち、ポリペプチドを対象とする記載は、ペプチドの記載およびタンパク質の記載に等しく適用され、かつ逆の場合も同様である。当該用語は、天然に生じるアミノ酸重合体および１つ以上の残基が非天然にコードされるアミノ酸であるアミノ酸重合体に対して適用される。本明細書において使用されるときに、当該用語は、あらゆる長さ（全長のタンパク質が挙げられる）のアミノ酸鎖を包含し、ここでアミノ酸残基は、共有的なペプチド結合によって連結されている。
【０１５７】
“アミノ酸”という用語は、天然に生じるアミノ酸および非天然に生じるアミノ酸、ならびに天然に生じるアミノ酸と類似の様式に機能するアミノ酸類似物およびアミノ酸模倣物を指す。天然にコードされるアミノ酸は、２０の通常アミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン）およびピロールリジンおよびセレノシステインである。アミノ酸類似物は、天然に生じるアミノ酸と同じ基本の化学構造を有する化合物（すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルフォキシド、メチオニンメチルスルフォニウム）に対して結合されているα炭素）を指す。当該類似物は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に生じるアミノ酸と同じ基本の化学構造を維持している。
【０１５８】
アミノ酸は、本明細書において、国際純正および応用化学連合−国際生化学連合  生化学命名委員会によって推奨される、一般的に知られる３文字表記、または１文字表記のいずれかによって、示される。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般的に受け容れられている１文字符号によって示される。
【０１５９】
“保存的に修飾されたバリアント”は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に対して適用される。特定の核酸配列に関して、“保存的に修飾されたバリアント”は、同一もしくは本質的に同一なアミノ酸配列をコードするか、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合に実質的に同一な、それらの核酸を指す。遺伝暗号の縮重のために、非常に多数の機能的に同一な核酸が、あらゆる所定のタンパク質をコードする。実際に、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵのすべては、アミノ酸のアラニンをコードする。従って、アラニンがコドンによって特定されるあらゆる位置において、コドンは、コードされるポリペプチドを変更せずに、記載されている対応するコドンのうちのあらゆるコドンに変更され得る。このような核酸の変異は、保存的に修飾される変異の１種である、“サイレント変異である”。また、ポリペプチドをコードする本明細書におけるすべての核酸配列は、核酸のすべての見込みのあるサイレント変異について説明している。当業者は、核酸におけるコドンのそれぞれ（通常、メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常、トリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除いて）が修飾されて、機能的に同一な分子を産生し得ることを認識する。従って、ポリペプチドをコードする核酸のサイレント変異のそれぞれは、記載されている配列のそれぞれにおいて暗に示されている。
【０１６０】
アミノ酸配列については、当業者は、コードされるアミノ酸における単一のアミノ酸または低い割合のアミノ酸を変更するか、付加するか、もしくは欠失する核酸配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加が、化学的に類似のアミノ酸との、アミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、またはアミノ酸の置換を結果として生じる場合に、“保存的に修飾されるバリアント”であることを認識する。機能的に類似のアミノ酸を規定する保存的な置換の表は、当業者に公知である。当該保存的に修飾されたバリアントは、加えて、本発明の多形バリアント、種間相同物、および対立因子を除外しない。
【０１６１】
機能的に類似のアミノ酸を規定する保存的な置換の表は、当業者に公知である。以下の８つの群のそれぞれ：
（１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
（２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
（３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
（４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｌ）；
（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
（６）フェニルアラニン（Ｐ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
（７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
（８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
は、他の１つのアミノ酸に対して保存的な置換であるアミノ酸を含む（例えば、Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd edition (December 1993)を参照すればよい。
【０１６２】
２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の文脈における、“同一の”または“同一性の”割合は、同じである２つ以上の配列または部分配列を指す。配列は、以下の配列比較演算手順（または当業者に利用可能な他の演算手順）の１つを用いてか、もしくは手動の整列化および目視検査によって測定されるような比較領域または所望の領域の全体に渡って最大の一致に関して比較され、かつ整列される場合に同じである割合（すなわち、特定の領域の全体に渡って、約６０％の同一性、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％の同一性）であって、それらがアミノ酸残基またはヌクレオチドの当該割合を有する場合に、“実質的に同一”である。また、この定義は、試験配列の相補性を指す。同一性は、少なくとも約５０のアミノ酸もしくはヌクレオチドの長さである領域の全体に渡ってか、または７５−１００のアミノ酸もしくはヌクレオチドの長さである領域の全体に渡ってか、または特に特定されないが、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの全体の配列に渡って、存在し得る。
【０１６３】
配列比較に関して、１つの配列は、比較される試験配列に対して、基準配列としての役目を典型的に果たす。配列比較演算手順を用いる場合に、試験配列および基準配列はコンピュータに入力され、必要に応じて配列調整が指示され、かつ配列演算手順プログラムが指示される。初期設定のプログラム変数が使用され得るか、または代替の変数が指示され得る。それから、配列比較演算手順は、プログラム変数に基づいて基準配列と比較した、試験配列に関する配列同一性の割合を算出する。
【０１６４】
本明細書において使用されるときに、“比較領域”は、配列が、２つの配列が最適に整列化された後における連続する位置の同じ数の基準領域に対して比較され得る、２０から６００、通常には約５０から約２００、より通常には約１００から約１５０からなる群から選択される多くの連続する位置のいずれか１つの区分に対する言及を含む。比較に関する配列の整列化の方法は、当業者にとって公知である。比較に関する配列の最適な整列化は、これらに限定されないが、Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cの局部的な相同性演算手順、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443の相同性整列化演算手順、Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444の類似性に関する検索方法、これらの演算手順のコンピュータ化された実施（the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または手動の整列化および目視検査（例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement) を参照すればよい）が挙げられる演算方法によって、実施され得る。
【０１６５】
配列同一性および配列類似性の割合の決定に好適な演算手順の一例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０演算手順である（それぞれ、Altschul et al. (1997) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, and Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410に記載されている）。ＢＬＡＳＴ分析を実施するソフトウェアは、ncbi.nlm.nih.govにおけるワールドワイドウェブにおいて利用可能な全米バイオテクノロジー情報センターを通して公然に利用可能である。ＢＬＡＳＴ演算手順の変数Ｗ、ＴおよびＸは、整列化の感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド用）は、１１のワード長（Ｗ）、期待値（Ｅ）または１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４を初期設定として、かつ両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に関して、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長、および１０の期待値（Ｅ）を初期設定として、かつＢＬＯＳＵＭ６２  採点マトリクス（Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915参照すればよい）  ５０の位置合わせ（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両方の鎖の比較を使用する。ＢＬＡＳＴ演算手順は、無効にされる“低い複雑性”のフィルタを用いて典型的に実施される。
【０１６６】
また、ＢＬＡＳＴ演算手順は、２つの配列間の類似性の統計的な分析を実施する（例えば、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA  90:5873-5787を参照すればよい）。ＢＬＡＳＴ演算手順によって与えられる類似性の指標の１つは、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の適合が偶然に生じる確率の指標を提供する、最小の総和確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、核酸は、基準核酸に対する試験核酸の比較において最小の総和確率が約０．２未満、または約０．０１未満、または約０．００１未満である場合に、基準配列に対して類似であると見做される。
【０１６７】
“〜に対して選択的に（または特異的に）ハイブリダイズする”という表現は、配列が複合混合物（これらに限定されないが、全体の細胞またはライブラリのＤＮＡまたはＲＮＡが挙げられる）内に存在する場合に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件において、特定のヌクレオチド配列に対してのみ結合すること、２重鎖化すること、またはハイブリダイズすることを指す。
【０１６８】
“ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件”という表現は、当該技術において知られるように、低いイオン強度および高い温度の条件における、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、もしくは他の核酸模倣物、またはこれらの組み合わせのハイブリダイゼーションを指す。典型的に、ストリンジェントな条件において、プローブは、核酸の複合混合物（これらに限定されないが、全体の細胞またはライブラリのＤＮＡまたはＲＮＡが挙げられる）においてその標的配列に対してハイブリダイズするが、複合混合物における他の配列とはハイブリダイズしない。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、かつことなる環境において異なる。より長い配列は、より高い温度において特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範に渡る指針は、Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays” (1993)に見られる。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度  ｐＨにおいて、特定の配列に関する熱溶融点（Ｔｍ）よりも約５−１０℃低く選択される。Ｔｍは、標的に対して相補的なプローブの５０％が、平衡状態において標的配列とハイブリダイズする（標的配列がＴｍにおいて過剰に存在し、プローブの５０％が平衡状態にあるような）、温度である（規定のイオン強度、ｐＨ、および核酸の濃度の条件下）。ストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７．０において約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン濃度、典型的に約０．０１から１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、かつ温度が短いプローブ（これらに限定されないが、１０から５０のヌクレオチドが挙げられる）に関して少なくとも約３０℃、および長いプローブ（これらに限定されないが、５０を超えるヌクレオチドが挙げられる）に関して少なくとも約６０℃である条件であり得る。また、ストリンジェントな条件は、ホルムアミドといった不安定化剤の添加を伴って達成され得る。選択的または特異的なハイブリダイゼーションに関して、肯定のシグナルは、バックグラウンドの少なくとも２倍の、任意にバックグラウンドの１０倍のハイブリダイゼーションであり得る。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下の通り：６５℃において０．２×ＳＳＣ、および０．１％のＳＤＳにおける洗浄を伴う、４２℃においてインキュベートする５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％のＳＤＳか、または６５℃においてインキュベートする５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳであり得る。当該洗浄は、５、１５、３０、６０、１２０分、またはそれ以上にわたって実施され得る。
【０１６９】
本明細書において使用されるときに、“真核生物”という用語は、動物（これらに限定されないが、哺乳類、昆虫、爬虫類、鳥類などが挙げられる）、繊毛虫類、植物（これらに限定されないが、単子葉植物、双子葉植物、藻類などが挙げられる）、菌類、酵母、鞭毛虫、微胞子虫、原生生物といった、真核生物界の系統学的な領域に属する生体を指す。
【０１７０】
本明細書において使用されるときに、“非真核生物”という用語は、非真核生物の生体を指す。例えば、非真核生物の生体は、系統学的な領域の真正細菌（これらに限定されないが、大腸菌、テルムス  テルモフィルス、バチルス  ステアロテルモフィルス、シュードモナス  フルオレセンス、シュードモナス  アエルギノーザ、シュードモナス  プティダなどが挙げられる）、または系統学的な領域の古細菌（これらに限定されないが、メタノコッカス  ジャンナスキー、メタノバクテリウム  テムモアウトトゥロフィクム、ハロバクテリウム（例えば、ハロフェラックス  ボルカニーおよびハロバクテリウム種のＮＲＣ−１）、アルカエオグロブス  フルギダス、ピロコッカス  フリオスス、ピロコッカス  ホリコシー、アエウロピルム  ペルニクスなどが挙げられる）に属することができる。
【０１７１】
本明細書において使用されるときに、“対象”という用語は、処置、観察または実験の対象である動物、いくつかの実施形態において哺乳類、および他の実施形態においてヒトを指す。
【０１７２】
本明細書において使用されるときに、“有効量”という用語は、処置されるべき疾患、健康状態または不調の症状の１つ以上をある程度まで和らげる、投与される修飾された非天然アミノ酸ポリペプチドの量を指す。本明細書に記載されている修飾された非天然アミノ酸ポリペプチドは、予防処置、処置の促進および／または治療処置を目的として投与され得る。
【０１７３】
“増強”または“増強すること”は、所望の効能を、有効性または持続期間に関して向上するか、または延ばすことを意味する。従って、治療薬の効能を増強することに関して、“増強すること”という用語は、系における他の治療薬の効能を、有効性または持続期間に関して、向上するか、または延ばすことを指す。本明細書において使用されるときに、“増強有効量”は、所望の系におけるもう１つの治療薬の効能を十分に増強する量を指す。患者に使用される場合に、この使用に有効な量は、疾患、不調もしくは健康状態の重篤度および経過、以前の治療、患者の健康状態および薬物に対する応答、ならびに処置する医師の判断に依存する。
【０１７４】
本明細書において使用されるときに、“修飾された”という用語は、ポリペプチドの長さに対する変更、アミノ酸配列の長さに対する変更、ポリペプチドの化学構造に対する変更、ポリペプチドの翻訳同時修飾、またはポリペプチドの翻訳後修飾といった所定のポリペプチドに対してなされる、あらゆる変更を指す。ポリペプチドについて議論されている“（修飾された）”形態という用語は、任意に修飾されており、すなわち、議論の項目におけるポリペプチドが修飾され得るか、または修飾され得ない。
【０１７５】
“翻訳後に修飾された”という用語は、ポリペプチド鎖に組み込まれた後に当該アミノ酸に生じる、天然のまたは非天然のアミノ酸のあらゆる修飾を指す。当該用語は、ほんの一例として、インビボにおける翻訳同時修飾、インビトロにおける翻訳同時修飾（例えば、細胞外における翻訳系）、インビボにおける翻訳後修飾、およびインビトロにおける翻訳後修飾を包含する。
【０１７６】
予防的な適用において、修飾された非天然アミノ酸ポリペプチドを含有する組成物は、特定の疾患、不調または健康状態に影響を受けやすいか、またはさもなければ危険性の高い患者に対して投与される。そのような量は、“予防的な有効量”と定義される。また、この利用において、正確な量は、患者の健康状態、および体重などに依存する。日常的な実験によって当該予防的な有効量（例えば、用量の段階的増大の臨床試験）を決定することは、当業者の範囲内にあると十分に見做される。
【０１７７】
“保護された”という用語は、ある反応条件における化学的に反応性の官能基の反応を防ぐ“保護基”または保護部分の存在を指す。保護基は、保護される化学的に反応性の基の種類に依存して変わる。例えば、化学的に反応性の基がアミンまたはヒドラジドである場合に、保護基は、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）からなる群から選択され得る。化学的に反応性の基がチオールである場合に、保護基はオルトピリジルジスルフィドであり得る。化学的に反応性の基がブタン酸もしくはプロピオン酸といったカルボキシル酸、またはヒドロキシル基である場合に、保護基は、ベンジル基またはメチル、エチルもしくはｔｅｒｔ−ブチルといったアルキル基であり得る。また、当該分野において公知の他の保護基（ＮｖｏｃおよびＭｅＮｖｏｃといった感光性基が挙げられる）が、本明細書に記載される方法および組成物においてか、または共に使用され得る。また、当該技術において公知の保護基が、本明細書に記載される方法および組成物においてか、または共に使用され得る。
【０１７８】
ほんの一例として、遮断／保護基は、
【０１７９】
【化４】
0005840345.tif 000005
【０１８０】
から選択され得る。
【０１８１】
他の保護基は、言及によってその全体が本明細書に組み込まれる、Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, NY, 1999に記載されている。
【０１８２】
治療的適用において、修飾された非天然アミノ酸ポリペプチドを含有する組成物は、すでに疾患、健康状態または不調になっている患者に対して、疾患、不調または健康状態の症状を治療するか、または少なくとも部分的に進行を押さえるために十分な量において、患者に対して投与される。当該量は、“治療的有効量”であると定義され、かつ疾患、不調もしくは健康状態の重篤度および経過、以前の治療、患者の健康状態および薬物に対する応答、ならびに処置する医師の判断に依存する。日常的な実験によって当該治療有効量を（例えば、用量の段階的増大の臨床試験）を決定することは、当業者の範囲内にあると十分に見做される。
【０１８３】
“処置すること”という用語は、予防的処置および／または治療的処置のいずれかを指して使用される。
【０１８４】
本明細書に示される非天然にコードされるアミノ酸ポリペプチドは、天然に通常に見られる原子量または質量数とは異なる、原子量または質量数を有する原子によって置換された１つ以上の原子を有する同位体標識された化合物を包含し得る。本化合物に組み込まれ得る同位元素の例としては、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、３５Ｓ、１８Ｆ、３６Ｃｌのそれぞれといった、水素、炭素、窒素、酸素、フッ素および塩素の同位元素が挙げられる。例えば、３Ｈおよび１４Ｃといった放射性同位元素が組み込まれている化合物である、本明細書に記載されるある特定の同位体標識された化合物は、薬物および／または基質の組織分布アッセイにおいて有用であり得る。さらに、重水素（すなわち、２Ｈ）といった同位体との置換は、より優れた代謝安定性（例えば、インビボにおける増強された半減期または低減された要求用量）を結果として生じるある治療的利点を与えることができる。
【０１８５】
異性体のすべて（これらに限定されないが、ジアステレオ異性体、光学異体、およびこれらの混合物が挙げられる）は、本明細書において記載される組成物の一部として見做される。付加的なまたはさらなる実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸ポリペプチドは、所望の効果（所望の治療効果が挙げられる）を生じるために、それから使用される代謝物の産生を必要とする生体に対する投与の後すぐに代謝される。さらなるまたは付加的な実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸の活性な代謝物である。
【０１８６】
いくつかの状況において、非天然にコードされるアミノ酸は、互変異性体として存在し得る。さらに、本明細書に記載される非天然にコードされるアミノ酸ポリペプチドは、水、およびエタノールといった薬学的に受容可能な溶媒と溶媒和された形態だけでなく、溶媒和されていない形態に存在し得る。また、溶媒和された形態は、本明細書に開示されていると見做される。当業者は、本明細書における化合物のいくつかが、種々の互変異性体において存在できることを認識する。当該互変異性体のすべては、本明細書に記載される組成物の一部と見做される。
【０１８７】
特に断りがない限りにおいて、当業者の範囲内にある質量分析、ＮＭＲ、ＨＰＬＣ、タンパク質化学、生化学、組み換えＤＮＡ技術および薬理学の従来の方法が、採用される。
【０１８８】
〔詳細な説明〕
（Ｉ．導入）
少なくとも１つの非天然アミノ酸を備えるｈＰＰまたはｈＦｃ分子は、本発明において提供される。本発明のある特定の実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸を有するｈＰＰポリペプチドまたはｈＦｃポリペプチドは、少なくとも１つの転写後修飾を包含する。いくつかの実施形態において、ｈＰＰはｈＡである。１つの実施形態において、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃの少なくとも１つの転写後修飾は、分子（これらに限定されないが、標識、色素、重合体、水溶性重合体、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋剤、放射性核種、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、樹脂、第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似物、抗体もしくは抗体断片、金属キレート剤、補足因子、脂肪酸、含水炭素、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、抑制性リボ核酸、生体適合物質、ナノ粒子、スピン標識、蛍光団、金属含有部分、放射性部分、新規な官能基、他の分子と共有的にかもしくは非共有的に相互作用する基、光ケージド部分、化学線励起部分、光異性体化可能な部分、ビオチン、ビオチン類似物、ビオチン類似物、重元素を組み込む部分、化学的に切断可能な基、光切断可能な基、延長された側鎖、炭素結合型の糖、酸化還元的に活性な物質、アミノチオ酸、毒性部分、同位体的標識部分、生物物理学的なプローブ、リン光基、化学発光基、電子高密度基、磁性基、挿入基、発色団、エネルギー転移物質、生物学的に活性な物質、検出可能な標識、小分子、量子ドット、ナノ伝達物質、放射性ヌクレオチド、中性子捕獲物質、または上述のもののあらゆる組み合わせもしくは特定の反応性にとって好適であることが当業者に知られている化学方法論に利用される第１の反応性基を備える少なくとも１つの非天然アミノ酸に対して反応性の第２の基を備える、あらゆる他の所望の化合物もしくは物質が挙げられる）の付着を含む。例えば、第１の反応性基が、アルキニル部分（これに限定されないが、非天然アミノ酸ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン（ここでまた、プロパルギル基は、ときにアセチレン部分と呼ばれる）における、が挙げられる）であり、かつ第２の反応性基が、アジド部分であり、かつ［３＋２］環付加化学方法論が利用される。他の例において、第１の反応性基が、アジド部分（これに限定されないが、非天然アミノ酸ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンが挙げられる）であり、かつ第２の反応性基がアルキニル部分である。本発明の修飾されたｐｈｈポリペプチドまたはｈＡポリペプチドまたはｈＦｃポリペプチドのある特定の実施形態において、少なくとも１つの転写後修飾を備える、少なくとも１つの非天然アミノ酸（これに限定されないが、ケト基を含有する非天然アミノ酸が挙げられる）が、使用される（ここで、少なくとも１つの転写後修飾が、サッカライド部分を備える）。ある特定の実施形態において、転写後修飾は、真核細胞または非真核細胞のインビボにおいてなされる。リンカー重合体、水溶性重合体、または他の分子は、ポリペプチドに対して分子を付着し得る。分子は、ポリペプチドに対して直接に連結され得る。
【０１８９】
ある特定の実施形態において、タンパク質は、１つの宿主細胞によってインビボにおいてなされる少なくとも１つの転写後修飾を含み、ここで、転写後修飾は他の宿主によって通常になされない。ある特定の実施形態において、タンパク質は、真核細胞によってインビボにおいてなされる少なくとも１つの転写後修飾を含み、ここで、転写後修飾は非真核細胞によって通常になされない。転写後修飾の例としては、これらに限定されないが、糖鎖付加、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミチン酸付加、リン酸化、および糖脂質結合修飾などが挙げられる。１つの実施形態において、転写後修飾は、ＧｌｃＮＡｃ−アスパラギン酸結合によるアスパラギン酸に対するオリゴ糖（これに限定されないが、オリゴ糖が（ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ）２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃなどを包含する場合が挙げられる）の付着を包含する。他の実施形態において、転写後修飾は、ＧａｌＮＡｃ−セリン、ＧａｌＮＡｃ−スレオニン、ＧｌｃＮＡｃ−セリン、またはＧｌｃＮＡｃ−スレオニン結合による、セリンまたはスレオニンに対するオリゴ糖（これらに限定されないが、Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃなどが挙げられる）の付着を包含する。ある特定の実施形態において、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、分泌シグナル配列もしくは局在配列、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、および／またはＧＳＴ融合などを包含し得る。分泌シグナル配列の例としては、これらに限定されないが、原核生物の分泌シグナル配列、真核生物の分泌シグナル配列、細菌発現用の５’最適化された真核生物の分泌シグナル配列、新規な分泌シグナル配列、ペクチン酸塩リアーゼ分泌シグナル配列、Ｏｍｐ  Ａ分泌シグナル配列、およびファージの分泌シグナル配列が挙げられる。分泌シグナル配列の例としては、これらに限定されないが、ＳＴＩＩ（原核生物）、Ｆｄ  ＧＩＩＩおよびＭ１３（ファージ）、Ｂｇｌ２（酵母）、ならびにトランスポゾンから得られるシグナル配列ｂｌａが挙げられる。
【０１９０】
所定のタンパク質またはポリペプチドは、少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つの、少なくとも８つの、少なくとも９つの、または１０もしくはそれ以上の非天然アミノ酸を含有できる。非天然アミノ酸は、同じであるか、または異なり得る（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なる非天然アミノ酸を備えるタンパク質における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なる部位にあり得る）。ある特定の実施形態において、タンパク質の天然に生じる型に存在する特定のアミノ酸のすべてではないが、少なくとも１つが、非天然アミノ酸に置換されている。
【０１９１】
本発明は、少なくとも１つの非天然にコードされるアミノ酸を備える、ｈＰＰファミリーの一員、特にｈＡ、またはｈＦｃを基にした方法および組成物を提供する。ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃファミリーの一員への少なくとも１つの非天然にコードされるアミノ酸の導入は、通常に生じる２０のアミノ酸と反応しないが、１つ以上の非天然にコードされるアミノ酸と反応する（限定されないが、これが挙げられる）、特定の化学反応を含む接合化学的性質の適用を可能にする。いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸を備えるｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃファミリーの一員は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）といった水溶性重合体に対して、非天然にコードされるアミノ酸の側鎖を介して連結される。本発明は、遺伝的にコードされないアミノ酸（これらに限定されないが、２０の天然に組み込まれるアミノ酸に見られない官能基または置換基（これらに限定されないが、ケトン、アジドまたはアセチレン部分が挙げられる）を含有するこれらのアミノ酸が挙げられる）のセレクターコドンに応じたタンパク質への効率的な組み込み、および好適な反応性の分子を用いたこれらのアミノ酸の一連の修飾を含む、タンパク質を他の分子（これらに限定されないが、重合体、リンカーまたは生物学的に活性な分子が挙げられる）と連結することによって、タンパク質を選択的に修飾する高効率な方法を提供する。組み込まれると、それから、アミノ酸側鎖は、非天然にコードされるアミノ酸に存在する特定の官能基または置換基にとって好適であると当業者に知られる、化学方法論を利用することによって修飾され得る。多種多様な公知の化学方法論が、タンパク質に対し分子を連結するための、本発明における使用に好適である。当該方法論としては、これに限定されないが、ヒュイゲン［３＋２］環付加反応（これらに限定されないが、アセチレン誘導体またはアジド誘導体のそれぞれとの、ヒュイゲン［３＋２］環付加反応が挙げられる）（例えば、Padwa, A. in Comprehensive Organic Synthesis, Vol. 4, (1991) Ed. Trost, B. M., Pergamon, Oxford, p. 1069-1109；およびHuisgen, R. in 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry, (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, New York, p. 1-176を参照すればよい）が挙げられる。
【０１９２】
本発明は、他の物質（これらに限定されないが、標識；色素；重合体；水溶性重合体；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；放射性核種；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似物；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；補足因子；脂肪酸；含水炭素；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド；水溶性デンドリマー；シクロデキストリン；抑制性リボ核酸；生体適合物質；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団；金属含有部分；放射性部分；新規な官能基；他の分子と共有的にかもしくは非共有的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線励起部分；光異性体化可能な部分；ビオチン；ビオチン類似物；ビオチン類似物；重元素を組み込む部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；延長された側鎖；炭素結合型の糖；酸化還元的に活性な物質；アミノチオ酸；毒性部分；同位体的標識部分；生物物理学的なプローブ；リン光基；化学発光基；電子高密度基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー転移物質；生物学的に活性な物質；検出可能な標識；小分子；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲物質；または上述のもののあらゆる組み合わせ、もしくはあらゆる他の所望の化合物もしくは物質が挙げられる）との、多種多様な官能基、置換基または部分を有する物質の接合体を提供する。また、本発明は、対応するアセチレンまたはアジド部分を有するＰＥＧ重合体誘導体との、アジドまたはアセチレン部分を有する物質の接合体を包含する。例えば、アジド部分を含有するＰＥＧ重合体は、アセチレン機能性基を有する遺伝的にコードされないアミノ酸を含有するタンパク質における位置において、生物学的に活性な分子に対いて連結され得る。ＰＥＧおよび生物学的に活性な分子が連結される結合としては、これに限定されないが、ヒュイゲン［３＋２］環付加産物が挙げられる。
【０１９３】
（ＩＩ．ヒト血漿タンパク質ファミリー）
本明細書において使用されるときに、“ヒト血漿タンパク質またはヒト血漿ポリペプチド”または“ｈＰＰ”は、ヒトの血漿に見られるこれらのポリペプチドおよびタンパク質（ｈＰＰ類似物、ｈＰＰアイソフォーム、ｈＰＰ模倣物、ｈＰＰ断片、混成ｈＰＰタンパク質、融合タンパク質、オリゴマーおよびマルチマー、相同物、糖鎖付加様式バリアント、バリアント、スプライシングバリアント、ならびに同じ生物活性であるかにかかわらず、そしてさらにこれらの合成または製造の方法（これらに限定されないが、核酸分子の微量注入、合成方法、遺伝子導入法、および遺伝子活性化法による、インビボ、インビトロにおける組み換え体（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは核酸の他の形態から産生されるかどうか）が挙げられる）にかかわらない、これらの突然変異タンパク質が挙げられる）を含む。ｈＰＰの亜種は、当該技術において公知であり、かつ言及によって本明細書に組み込まれる、Anderson et al., Molecular & Cellular Proteomics, 3.4:311-326 (2004)；およびPing et al, Proteomics, 5:3506-3519 (2005)に見出され得る。
【０１９４】
ｈＰＰの付加的な一員は、おそらく将来的に発見される。ｈＰＰの新たな一員は、予想されるタンパク質配列のコンピュータ補助の２次および３次構造分析を通して、かつ特定の標的に対して結合する分子を同定するために指定される選択技術によって、同定され得る。ｈＰＰスーパーファミリーの一員は、非らせん状のアミノ酸（ループ領域）によって接合される４または５つの両親媒性らせんを典型的に有する。タンパク質は、細胞からの分泌を促進するために、それらのＮ末端に疎水性シグナル配列を含有し得る。また、ｈＰＰスーパーファミリーの後に発見されるそのような一員は、本発明の範囲内に含まれる。
【０１９５】
従って、ｈＰＰファミリーまたはｈＡの記載は、例示的な目的のために、かつほんの一例として与えられており、かつ本明細書に記載される方法、組成物、戦略および技術の範囲を制限するものではない。さらに、本願におけるｈＰＰポリペプチドまたはｈＡポリペプチドに対する言及は、ｈＰＰファミリーのあらゆる一員の例としての総称を使用することを意図される。従って、ｈＰＰまたはｈＡポリペプチドまたはタンパク質に関して本明細書に記載される修飾および化学反応が、ｈＰＰファミリーのあらゆる一員（本明細書に特に挙げられているそれらが挙げられる）に対して等しく適用されることは理解される。
【０１９６】
（ＩＩＩ．本発明と共に使用する一般的な組み換え核酸方法）
本発明の多くの実施形態において、所定のｈＰＰポリペプチドをコードする核酸は、単離され、クローン化され、かつしばしば組み換え法を用いて変更される。当該実施形態は、これらに限定されないが、ｈＰＰまたはｈＦｃポリペプチドから得られるバリアント、誘導体、発現カセット、または他の配列の、タンパク質発現または生成の間を含めて使用される。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドをコードする配列は、異種のプロモータに対して作動可能に連結される。ｈＰＰの単離および宿主細胞におけるｈＰＰの産生については、例えば、言及によって本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６４８，２４３号明細書；米国特許第５，７０７，８２８号明細書および米国特許第５，５２１，２８７に号明細書に記載されている。
【０１９７】
非天然にコードされるアミノ酸を備えるｈＰＰポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、親ポリペプチド（これに限定されないが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、かつそれから関連する（複数の）アミノ酸残基の導入（すなわち、組み込みまたは置換）または除去（すなわち、欠失または置換）をもたらすようにヌクレオチド配列を変えている、が挙げられる）のアミノ酸配列に基づいて合成され得る。非天然にコードされるアミノ酸を備えるｈＦｃポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、親ポリペプチド（これに限定されないが、配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有し、かつそれから関連する（複数の）アミノ酸残基の導入（すなわち、組み込みまたは置換）または除去（すなわち、欠失または置換）をもたらすようにヌクレオチド配列を変えている、が挙げられる）のアミノ酸配列に基づいて合成され得る。ヌクレオチド配列は、従来の方法に従った部位特異的な変異生成によって簡便に修飾され得る。代替可能に、ヌクレオチド配列は、化学合成（これらに限定されないが、オリゴヌクレオチド合成機を用いること、および好ましくは組み換えポリペプチドが産生される宿主細胞に好まれるこれらのコドンを選択することによって、が挙げられる）によって調製され得る（ここで、オリゴヌクレオチドは、所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計される）。例えば、所望のポリペプチドの部分をコードする種々の小さなオリゴヌクレオチドが、合成され得、かつＰＣＲ、ライゲーションまたはライゲーション鎖反応によって集められ得る。例えば、言及によって本明細書に組み込まれる、Barany, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 189-193 (1991) ；米国特許第６，５２１，４２７号明細書を参照すればよい。
【０１９８】
本発明は、組み換え遺伝学の分野における日常的な技術を利用する。本発明において使用する一般的な方法を開示する基本的な教科書としては、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001)；Kriegler, Gene Transfer and Expression:  A Laboratory Manual (1990)；およびCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994))が挙げられる。
【０１９９】
分子生物学的な技術について記載している一般的な教科書としては、Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA （Ｂｅｒｇｅｒ）；Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd Ed.),  Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 （“Ｓａｍｂｒｏｏｋ”）およびCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (supplemented through 1999) （“Ａｕｓｕｂｅｌ”））が挙げられる。これらの教科書は、変異生成、ベクター、プロモータおよび他の関連性のある多くの原理（これらに限定されないが、非天然アミノ酸、直交ｔＲＮＡ、直交シンセターゼ、およびこれらの対を含むタンパク質産生用のセレクターコドンを含む、遺伝子またはポリヌクレオチドの生成と関連性のあるもの、が挙げられる）の利用について記載している。
【０２００】
多様な種類の変異生成が、本発明において種々の目的（これらに限定されないが、シンセターゼをコードするポリヌクレオチドを変異するため、ｔＲＮＡのライブラリを産生するため、シンセターゼのライブラリを産生するため、セレクターコドンを産生するため、所定のタンパク質またはポリペプチドにおける非天然アミノ酸をコードするセレクターコドンを挿入するため、が挙げられる）に使用される。変異生成としては、これらに限定されないが、部位特異的変生成、無作為点変異生成、相同性組み換え、ＤＮＡシャッフリングもしくは他の反復的な変異生成法、キメラ構築、鋳型を含有するウラシルを用いた変異生成、オリゴヌクレオチド特異的変異生成、ホスホロチオネート修飾ＤＮＡ変異生成、もしくはギャップ２本鎖ＤＮＡを用いた変異生成など、またはこれらのあらゆる組み合わせが挙げられる。付加的な好適な方法としては、点不一致対、修復欠失宿主株を用いた変異生成、制限選択および制限精製、欠失変異生成、全体の遺伝子合成による変異生成、ならびに２本鎖切断修復などが挙げられる。また、これに限定されないが、キメラ構築に関する、が挙げられる変異生成が、本発明に包含される。１つの実施形態において、変異生成は、天然に生じる分子、または変更されるかもしくは変異された天然に生じる分子の公知の情報（これらに限定されないが、配列、配列比較、物理的性質、２次、３次もしくは４次の構造、または結晶構造などが挙げられる）よって導かれ得る。
【０２０１】
本明細書に見られる教科書および例は、これらの手法について記載している。付加的な情報は、以下の公刊物および引用文献：Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem. 254(2): 157-178 (1997)；Dale et al., Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol. Biol. 57:369-374 (1996) ；Smith, In vitro mutagenesis, Ann. Rev. Genet. 19:423-462 (1985)；Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229:1193-1201 (1985)；Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem. J. 237:1-7 (1986) ；Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D.M.J. eds., Springer Verlag, Berlin) (1987)；Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985)；Kunkel et al., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987)；Bass et al., Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, Science 242:240-245 (1988)；Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res. 10:6487-6500 (1982)；Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzymol. 100:468-500 (1983)；Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, Methods in Enzymol. 154:329-350 (1987)；Taylor et al., The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764 (1985) ；Taylor et al., The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8765-8785 (1985) ；Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698 (1986) ；Sayers et al., 5’-3’ Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 16:791-802 (1988) ；Sayers et al., Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 803-814；Kramer et al., The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456 (1984) ；Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol. 154:350-367 (1987)；Kramer et al., Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucl. Acids Res. 16: 7207 (1988) ；Fritz et al., Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999 (1988) ；Kramer et al., Different base/base mismatches are corrected with different efficiencies by the methyl-directed DNA mismatch-repair system of E. coli, Cell 38:879-887 (1984) ；Carter et al., Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443 (1985) ；Carter, Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol. 154: 382-403 (1987)；Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl. Acids Res. 14: 5115 (1986) ；Wells et al., Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423 (1986)；Nambiar et al., Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (1984)；Sakmar and Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the alpha-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372 (1988) ；Wells et al., Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34:315-323 (1985) ；Grundstrom et al., Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis, Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316 (1985) ；Mandecki, Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181 (1986) ；Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4:450-455 (1993) ；Sieber, et al., Nature Biotechnology, 19:456-460 (2001) ；W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994) ；およびI. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995) に見出される。上述の方法に関する付加的な詳細は、種々の変異生成方法に伴う問題を解決する有用な管理についても記載している、Methods in Enzymology Volume 154に見出され得る。
【０２０２】
オリゴヌクレオチド（例えば、本発明の変異生成に利用（例えば、シンセターゼのライブラリを変異すること、またはｔＲＮＡを変えること）する）は、Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letts. 22(20):1859-1862, (1981) に記載されている固相ホスホラミダイトトリエステル法に従って（例えば、Needham-VanDevanter et al., Nucleic Acids Res., 12:6159-6168 (1984)に記載されているような自動化合成機を用いて）、典型的に化学合成される。
【０２０３】
また、本発明は、直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対を介した非天然アミノ酸のインビボにおける組み込み用の、真核生物宿主細胞、非真核生物宿主細胞、および生体に関する。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のポリヌクレオチドを含む構築物（これに限定されないが、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る本発明のベクターが挙げられる）を用いて、遺伝的に改変される（これらに限定されないが、形質転換されるか、形質導入されるか、またはトランスフェクトされる、が挙げられる）。例えば、直交ｔＲＮＡ、直交ｔＲＮＡシンセターゼ、および誘導体化されるタンパク質に関するコーディング領域は、所望の宿主細胞において機能的な遺伝子発現制御エレメントに対して作動可能に連結される。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド、または接合されたポリヌクレオチドの形態であり得る。ベクターは、標準的な方法（エレクトロポレーション（Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5824 (1985) ）、ウイルスベクターによる感染、および／または小さなビーズもしくは粒子のマトリクスの内部、または表面のいずれかに核酸を有する小粒子による高速弾丸侵入（ｈｉｇｈ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ  ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）（Klein et al., Nature 327, 70-73 (1987) ）などが挙げられる）によって細胞および／または微生物に導入される。
【０２０４】
改変された宿主細胞は、例えば、スクリーニング段階、プロモータの活性化または形質転換体の選択といった活性に適するように修飾された、従来の培養液において培養され得る。これらの細胞は、遺伝子導入生体において任意に培養され得る。他の有用な参考文献（これらに限定されないが、細胞の単離および培養にとって（例えば、後の核酸単離にとって）の、が挙げられる）としては、Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley- Liss, New York およびこれに引用されている参考文献；Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY；Gamborg and Phillips (eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture；Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York)ならびにAtlas and Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FLが挙げられる。
【０２０５】
標的の核酸を細胞に導入する種々のよく知られる方法が、本発明に使用される方法のあらゆるものに利用可能である。これらとしては、ＤＮＡを含有する細菌の原形質体との受容細胞の融合、エレクトロポレーション、粒子衝撃法（ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、およびウイルスベクターを用いた感染（以下にさらに論じられている）などが挙げられる。細菌細胞は、本発明のＤＮＡ構築物を含有するプラスミドの数を増幅するために使用され得る。細菌は、対数期まで増殖され、かつ細菌内におけるプラスミドは、当該技術において公知の種々の方法（例えば、実際には、Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照すればよい）によって単離され得る。さらに、細菌からのプラスミドの精製にとってのキットは、市販されている（例えば、いずれもファルマシア  バイオテック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）から得られるイージープレップ（ＥａｓｙＰｒｅｐ）（商標）、フレキシプレップ（ＦｌｅｘｉＰｒｅｐ）（商標）；ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から得られるストラタクリーン（ＳｔｒａｔａＣｌｅａｎ）（商標）；およびキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）から得られるキアプレップ（ＱＩＡｐｒｅｐ）（商標））。それから、単離されかつ精製されたプラスミドは、さらに操作されて他のプラスミドを産生するか、細胞のトランスフェクトに使用されるか、または関連するベクターに組み込まれて生体に感染させる。典型的なベクターは、特定の標的核酸の発現の制御に有用な、転写ターミネータおよび翻訳ターミネータ、転写開始配列および翻訳開始配列、ならびにプロモータを含む。ベクターは、少なくとも１つの独立したターミネータ配列を含有する遺伝的な発現カセット、真核生物もしくは原核生物もしくはこの両方におけるカセットの複製を可能にする配列（これに限定されないが、シャトルベクターが挙げられる）、および原核生物系もしくは真核生物系の両方にとっての選択マーカーを、任意に包含する。ベクターは、原核生物、真核生物または両方における複製および組み込みに好適である。例えば、Gillam & Smith, Gene 8:81 (1979)；Roberts, et al., Nature, 328:731 (1987)； Schneider, E., et al., Protein Expr. Purif. 6(1):10-14 (1995)；Ausubel, Sambrook, Berger （すべて上述されている）を参照すればよい。クローニングに有用な細菌およびバクテリオファージのカタログは、例えば、ＡＴＣＣによって提供される（例えば、ＡＴＣＣによって公開されるThe ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage (1992) Gherna et al. (eds)）。また、配列決定、クローニング、および分子生物の他の局面に関する付加的な基本的な手法ならびに基礎になる論理的な考察は、Watson et al. (1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NYに見出される。さらに、実質的にあらゆる核酸（およびほとんどあらゆる標識核酸）は、あらゆる多様な市販の出所（例えば、ザ  ミッドランド  サーティファイド  リエージェント  カンパニー（ｔｈｅ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（ミッドランド（Ｍｉｄｌａｎｄ）、ＴＸ、ワールドワイドウェブのｍｃｒｃ．ｃｏｍにおいて利用可能である）、ザ  グレート  アメリカン  ジーン  カンパニー（Ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（ロマ��ナ（Ｒａｍｏｎａ）、ＣＡ、ワールドワイドウェブのｇｅｎｃｏ．ｃｏｍにおいて利用可能である）、エクスプレスジーン  インク（ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ  Ｉｎｃ．）（シカゴ（Ｃｈｉｃａｇｏ）、ＩＬ、ワールドワイドウェブのｅｘｐｒｅｓｓｇｅｎ．ｃｏｍにおいて利用可能である）、オペロン  テクノロジーズ  インク（Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）（アラメダ（Ａｌａｍｅｄａ）、ＣＡ）および多くの他社）から、特別にまたは通常に注文され得る。
【０２０６】
セレクターコドン
本発明のセレクターコドンは、タンパク質の生合成機構の遺伝学的なコドンの枠組みを拡張する。例えば、セレクターコドンとしては、固有の３塩基コドン、ナンセンスコドン（例えば、ストップコドン（アンバーコドン（ＵＡＧ）、オーカーコドン、またはオパールコドン（ＵＧＡ）が挙げられるが、これらに限定されない））、非天然コドン、４塩基以上のコドン、またはレアコドン（ｒａｒｅ  ｃｏｄｏｎ）などが挙げられるが、これらに限定されない。所望の遺伝子またはポリヌクレオチドに導入され得るセレクターコドンの数が、広範である（少なくともｈＰＰポリペプチドの部分を少なくともコードする単一のポリヌクレオチドにおける１つ以上、２以上、３以上、４、５、６、７、８、９、１０以上が挙げられるが、これらに限定されない）ことは、当業者にとってただちに明らかである。
【０２０７】
１つの実施形態において、方法は、インビボにおける１つ以上の非天然アミノ酸の組み込みに用のストップコドンである、セレクターコドンの使用に関する。例えば、ストップコドン（ＵＡＧが挙げられるが、これに限定されない）を認識するＯ−ｔＲＮＡが産生され、かつ所望の非天然アミノ酸と共にＯ−ＲＳによってアミノアシル化される。このＯ−ｔＲＮＡは、天然に生じる宿主のアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼによって認識されない。従来の部位特異的な突然変異生成は、所定のポリペプチドにおける所定の部位に対するストップコドン（ＴＡＧが挙げられるが、これに限定されない）の導入に使用され得る。例えば、Sayers, J.R.,ら (1988), 5'-3' Exonuclease in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res. 16:791-802を参照すればよい。Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡおよび所定のポリペプチドをコードする核酸がインビボにおいて組み合わせられると、非天然アミノ酸がＵＡＧコドンに応じて組み込まれて、特定の位置に非天然アミノ酸を含有するポリペプチドを生じさせる。
【０２０８】
非天然アミノ酸のインビボにおける組み込みは、宿主細胞を大きく乱すことなくなされ得る。例えば、ＵＡＧコドンの抑制効率が、Ｏ−ｔＲＮＡ（これに限定されないが、アンバーサプレッサｔＲＮＡが挙げられる）と、（ストップコドンに対して結合し、かつリボソームからの成長しつつあるペプチドの放出を開始する）真核細胞放出因子（これに限定されないが、ｅＲＦが挙げられる）との間の競合に依存するので、抑制効率は、調節され得る（これらに限定されないが、Ｏ−ｔＲＮＡおよび／またはサプレッサｔＲＮＡの発現レベルを増強することによって、が挙げられる）。
【０２０９】
また、非天然アミノ酸は、レアコドンを用いてコードされ得る。例えば、インビボタンパク質合成反応においてアルギニン濃度が低下すると、レアアルギニンコドンであるＡＧＧは、アラニンと共にアシル化される合成ｔＲＮＡによるＡｌａの挿入に有効であることが証明されている。例えば、Ma et al., Biochemistry. 32:7939 (1993)を参照すればよい。この場合において、合成ｔＲＮＡは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて微量種として存在する天然に生じるｔＲＮＡＡｒｇと競合する。いくつかの生体は、トリプレットコドンのすべてを使用しない。ミクロコッカス  ルテウスにおける割り当てのないコドン  ＡＧＡは、インビトロの転写／翻訳の抽出物におけるアミノ酸の挿入に利用されている。例えば、owal and Oliver, Nucl. Acid. Res.. 25:4685 (1997) を参照すればよい。本発明の構成要素は、インビボにおいてこれらのレアコドンを使用するために生成され得る。
【０２１０】
また、セレクターコドンは、拡張されたコドン（４以上の塩基コドン（例えば、４、５、６以上の塩基コドン）が挙げられるが、これらに限定されない）を備える。４塩基コドンの例としては、ＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、およびＣＣＣＵなどが挙げられるが、これらに限定されない。５塩基コドンの例としては、ＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、およびＵＡＧＧＣなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法および組成物の特徴は、フレームシフト抑圧に基づいて延長されたコドンの使用を含む。４以上の塩基コドンは、同じタンパク質に１つまたは複数の非天然アミノ酸（例として挙げられるが、これらに限定されない）を挿入可能である。例えば、突然変異されたＯ−ｔＲＮＡ（特別なフレームシフトサプレッサｔＲＮＡが挙げられるが、これに限定されない）の存在下において、アンチコドンループ（少なくとも８−１０ｎｔのアンチコドンループが挙げられるが、これらに限定されない）を用いて、４以上の塩基コドンが単一のアミノ酸として読まれる。他の実施形態において、アンチコドンループは、少なくとも４塩基コドン、少なくとも５塩基コドン、または少なくとも６塩基コドン（例として挙げられるが、これらに限定されない）を翻訳可能である。見込みのある４塩基コドンが２５６あるので、複数の非天然アミノ酸は、４以上の塩基コドンを用いて、同じ細胞において翻訳され得る。Anderson et al, (2002) Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology. 9:237-244；Magliery, (2001) Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of "Shifty" Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli, J. MoI. Biol. 307: 755-769を参照すればよい。
【０２１１】
例えば、４塩基コドンは、インビトロ生合成方法を用いた、タンパク質への非天然アミノ酸の組み込みに使用されている。例えば、Ma et al, (1993) Biochemistry. 32:7939、およびHohsaka et al, (1999) L Am. Chem. Soc. 121: 34を参照すればよい。ＣＧＧＧおよびＡＧＧＵは、化学的にアシル化された２つのフレームシフトサプレッサｔＲＮＡを用いて、インビトロにおいて、ストレプトアビジンに２−ナフチルアラニンおよびリジンＮＢＤ誘導体を同時に組み込むために使用された。例えば、Hohsaka et al, (1999) J. Am. Chem. Soc. 121: 12194を参照すればよい。インビボにおける研究において、Moore et alは、ＮＣＵＡアンチコドンを有するｔＲＮＡＬｅｕ誘導体のＵＡＧＮコドン（ＮはＵ、Ａ、ＧまたはＣであり得る）を抑圧する能力を試験し、かつクワドルプレットＵＡＧＡが、０または−１フレームの状態に少なく翻訳して、１３から２６％効率において、ＵＣＵＡアンチコドンを有するｔＲＮＡＬｕｅによって翻訳され得ることを見出した。例えば、Moore et al, (2000) J. MoI. Biol., 298:195を参照すればよい。１つの実施形態において、レアコドンまたはナンセンスコドンに基づいて延長されたコドンは、読み過ごしのミスセンス、および他の不要な部位におけるフレームシフト抑圧を低減し得る本発明の方法および組成物に、使用され得る。
【０２１２】
また、所定の系に関して、内在性の系が天然塩基コドンを使用しない（またはまれにしか使用しない）場合に、セレクターコドンは、天然の３塩基コドンの１つを含むことができる。例えば、これとしては、天然の３塩基コドンを認識するｔＲＮＡを欠如している系、および／または３塩基コドンがレアコドンである系が挙げられる。
【０２１３】
セレクターコドンは、非天然塩基対を任意に含む。これらの非天然塩基対は、存在する遺伝アルファベットをさらに拡張する。追加の塩基対の１つは、６４から１２５までトリプレットの数を増加させる。第３の塩基対の性質の例としては、安定かつ選択的な塩基対形成、ポリメラーゼによる高い忠実度を伴ったＤＮＡへの効率的な酵素的組み込み、および新生の非天然塩基対の合成後における効率的な連続するプライマー伸張が挙げられる。方法および組成物に適合し得る非天然塩基対の記述の例としては、例えば、Hirao et al, (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature Biotechnology, 20:177-182が挙げられる。また、Wu, Y., et al, (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:14626-14630を参照すればよい。他の関連する刊行物は、以下に載せられている。
【０２１４】
インビボにおける使用法に関して、非天然ヌクレオシドは、膜透過性であり、かつリン酸化されて対応する３リン酸塩を形成する。その上に、増加した遺伝情報は、安定であり、かつ細胞性の酵素によって破壊されない。Bennerおよびその他によるこれまでの試みは、もっとも注目すべき例であるイソ−Ｃ：イソ−Ｇ対という、基準のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対における水素結合様式とは異なる、水素結合様式を巧く活用した。例えば、Switzer et al, (19S9) J. Am. Chem. Soc, 11 1 :8322；およびPiccirilli et al, (1990) Nature, 343:33；Kool, (2000) Curr. 0 Opin. Chem. Biol., 4:602を参照すればよい。これらの塩基は、通常、ある程度まで天然塩基と誤対合し、かつ酵素的に修復され得ない。Koolおよび共同研究者は、塩基間の疎水性パッキング相互作用（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｐａｃｋｉｎｇ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）が水素結合と入れ替わって、塩基対の形成を生じることができることを証明した。例えば、Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602、およびGuckian and Kool, (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36, 2825を参照すればよい。上述した条件のすべてを満たす非天然塩基対を開発する試みにおいて、Schultz、Romesbergおよび共同研究者は、一連の非天然疎水性塩基を体系的に合成し、かつ研究している。ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳ自己対は、天然塩基対より安定であることが見出されており、かつEscherichia coliのＤＮＡポリメラーゼ  Ｉのクレノー酵素（Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）（ＫＦ）によって、ＤＮＡに効率的に組み込まれ得る。例えば、McMinn et al, (1999) J. Am. Chem. Soc. 121: 11585-6；およびOgawa et al, (2000) J. Am. Chem. Soc. 122:3274；を参照すればよい。３ＭＮ：３ＭＮ自己対は、生物学的機能に対して十分な効率性および選択性を伴って、ＫＦによって合成され得る。例えば、Ogawa et al, (2000) J. Am. Chem. Soc, 122:8803を参照すればよい。しかし、両方の塩基は、さらなる複製に対してターミネータとして作用する。近年、突然変異体ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳ自己対の複製に使用され得るように、発展されている。その上に、７ＡＩ自己対は複製され得る。例えば、Tae et al, (2001) J. Am. Chem. Soc. 123:7439を参照すればよい。また、Ｃｕ（ＩＩ）との結合によって安定な対を形成する新規な金属塩基対であるＤｉｐｉｃ：Ｐｙが、開発されている。例えば、Meggers et al, (2000) J. Am. Chem. Soc 122:10714を参照すればよい。拡張されたコドンおよび非天然コドンが、天然コドンに対して本来的に直交であるので、本発明の非天然アミノ酸に関する方法は、この性質を活かして非天然アミノ酸用の直交化ｔＲＮＡを生成し得る。
【０２１５】
また、翻訳回避系（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｂｙｐａｓｓｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）が、所望のポリペプチドにおける非天然アミノ酸の組み込みに使用され得る。翻訳回避系において、大きな配列が遺伝子に組み込まれるが、タンパク質に翻訳されない。当該配列は、リボソームに当該配列を跳び越し、かつ挿入の下流にある翻訳を再開させる合図としての機能を果たす構造を含む。
【０２１６】
ある種の実施形態において、本発明の方法および／または組成物における所定のタンパク質またはポリペプチド（またはこれらの一部）は、核酸によってコードされている。典型的に、核酸は、少なくとも１つのセレクターコドン、少なくともつ２のセレクターコドン、少なくとも３つのセレクターコドン、少なくとも４つのセレクターコドン、少なくとも５つのセレクターコドン、少なくとも６つのセレクターコドン、少なくとも７つのセレクターコドン、少なくとも８つのセレクターコドン、少なくとも９つのセレクターコドン、少なくとも１０またはそれ以上のセレクターコドンを備える。
【０２１７】
所定のタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子は、例えば、非天然アミノ酸の組み込みための１つ以上のセレクターコドンを含めるために、当業者に公知の方法、および本明細書に記載されている方法を用いて、突然変異生成され得る。例えば、所定のあるタンパク質に関する核酸は、１つ以上の非天然アミノ酸の組み込みを提供する１つ以上のセレクターコドンを含めるために、突然変異される。本発明は、あらゆるそのようなバリアント（例えば非天然アミノ酸を含む、突然変異体、あらゆるタンパク質の型が挙げられるが、これらに限定されない）を含む。また同様に、本発明は、対応する核酸（すなわち、１つ以上の非天然アミノ酸をコードする１つ以上のセレクターコドンを有する核酸）を含む。
【０２１８】
所定のタンパク質（例えば、ｈＰＰポリペプチド）をコードする核酸分子は、ポリペプチドのあらゆる所望の位置にシステインを導入する突然変異を容易にし得る。システインは、反応性分子、水溶性ポリマー、タンパク質、または多種多様な他の分子を、所定のタンパク質に導入するために広く使用される。ポリペプチドの所望の位置へのシステインの組み込みに好適な方法は、当業者に公知であり（例えば、引用によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，６０８，１８３号明細書に記載の方法）、かつ標準的な技術である。
【０２１９】
（ＩＶ．非天然にコードされるアミノ酸）
非常に広範な非天然にコードされるアミノ酸が、本発明における使用に好適である。あらゆる多くの非天然にコードされるアミノ酸が、ｈＰＰポリペプチドに導入され得る。一般的に、導入された非天然にコードされるアミノ酸は、２０の通常の遺伝的にコードされるアミノ酸（すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン）に対して化学的に、実質的に不活性である。いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸は、２０の通常のアミノ酸に見られない官能基と効率的かつ選択的に反応して安定な接合体を形成する側鎖官能基（これらに限定されないが、アジド、ケトン、アルデヒドおよびアミノオキシ基が挙げられる）を含む。例えば、アジド官能基を含有する非天然にコードされるアミノ酸を含むｈＰＰポリペプチドは、重合体（これに限定されないが、ポリ（エチレングリコール）が挙げられる）、または代替可能に、ヒュイゲン［３＋２］環付加産物を形成するためのアジドおよびアルキン官能基の選択的な反応を結果として生じる安定な接合体を形成するための、アルキン部分を含有する第２のポリペプチドと反応し得る。
【０２２０】
アルファ−アミノ酸の一般的な構造は、以下の式Ｉ：
【０２２１】
【化５】
0005840345.tif 000006
【０２２２】
のように示される。
【０２２３】
非天然にコードされるアミノ酸は、典型的に、上述の式を有するあらゆる構造であり（ここで、Ｒ基は２０の天然アミノ酸に使用される官能基以外のあらゆる置換基である）、かつ本発明における利用に好適であり得る。本発明の非天然にコードされるアミノ酸が、側鎖の構造においてのみ天然アミノ酸と典型的に異なるので、非天然にコードされるアミノ酸は、それらが天然に生じるポリペプチドにおいて形成される同じ様式において、他のアミノ酸（これらに限定されないが、天然または非天然にコードされるアミノ酸が挙げられる）とアミド結合を形成する。しかし、非天然にコードされるアミノ酸は、これらを天然のアミノ酸と区別する側鎖基を有する。例えば、Ｒは、アルキル−、アリール−、アシル−、ケト−、アジド−、ヒドロキシル−、ヒドラジン、シアノ−、ハロ−、ヒドラジド−、アルケニル、アルキンル（ａｌｋｙｎｌ）、エーテル、チオール、セレノ−、スルフォニル−、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、ヘテロ環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、もしくはアミノ基、またはこれらの組み合わせを、任意に備える。本発明における使用に好適であり得る他の所定の非天然に生じるアミノ酸としては、これらに限定されないが、光活性化架橋を備えるアミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規な官能基を有するアミノ酸、他のと共有的または非共有的に相互作用するアミノ酸、光ケージドおよび／または光異性体化アミノ酸、ビオチンまたはビオチン誘導体を備えるアミノ酸、糖置換化セリンといった糖鎖付加アミノ酸、他の炭水化物修飾されたアミノ酸、ケト含有アミノ酸、ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを備えるアミノ酸、重元素置換アミノ酸、化学的に切断可能なおよび／または光切断可能なアミノ酸、天然アミノ酸と比べて延長された側鎖（これらに限定されないが、ポリエーテルまたは長鎖炭化水素（これらに限定されないが、約５または約１０を越える炭素が挙げられる）が挙げられる）を有するアミノ酸、炭素結合型の糖含有アミノ酸、酸化還元的に活性なアミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、ならびに１つ以上の毒性部分を備えるアミノ酸が挙げられる。
【０２２４】
本発明における使用に好適であり得、かつ水溶性重合体との反応に有用である例示的な非天然にコードされるアミノ酸としては、これらに限定されないが、カルボニル反応性基、アミノオキシ反応性基、ヒドラジン反応性基、ヒドラジド反応性基、セミカルバジド反応性基、アジド反応性基およびアルキン反応性基を有するアミノ酸が挙げられる。いくつかの実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸は、サッカライド部分を備える。そのようなアミノ酸の例としては、これらに限定されないが、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−ガラクトサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−スレオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−アスパラギンおよびＯ−マンノサミニル−Ｌ−セリンが挙げられる。また、そのようなアミノ酸の例としては、アミノ酸とサッカライドとの間に天然に生じるＮ型またはＯ型の結合が、自然には通常は見られない共有結合（これらに限定されないが、アルケン、オキシム、チオエーテルおよびアミドなどが挙げられる）によって置換されている場合の例が挙げられる。また、そのようなアミノ酸の例としては、２−デオキシ−グルコース、および２−デオキシガラクトースといった、天然に生じるタンパク質に通常は見られないサッカライドが挙げられる。
【０２２５】
本明細書に規定される非天然にコードされるアミノ酸の多くは、市販されている（例えば、シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（セント  ルイズ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、ＭＯ、ＵＳＡ）、ノババイオケム（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ部門、ダームシュタット（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）、ドイツ）、またはペプテック（Ｐｅｐｔｅｃｈ）（バーリントン（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ）、ＭＡ、ＵＳＡ）から得られる）。市販されていない非天然にコードされるアミノ酸は、本明細書に規定されているようにか、または当業者にとって公知の標準的な方法を用いて任意に合成される。有機合成技術に関しては、例えば、Organic Chemistry by Fessendon and Fessendon, (1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.)；Advanced Organic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York)；およびAdvanced Organic Chemistry by Carey and Sundberg (Third Edition, Parts A and B, 1990, Plenum Press, New York)を参照すればよい。また、言及によって本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号明細書および米国特許出願公開第２００３／０１０８８８５号明細書を参照すればよい。また、新規な側鎖を含有する非天然アミノ酸に加えて、本発明における使用に好適であり得る非天然アミノ酸は、これらに限定されないが、式ＩＩおよびＩＩＩ：
【０２２６】
【化６】
0005840345.tif 000007
【０２２７】
（ここで、Ｚは、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＮＨ−Ｒ’、またはＳ−Ｒ’を典型的に備え；同じかまたは異なり得るＸおよびＹは、ＳまたはＯを典型的に備え、かつ任意に同じであるか、または異なるＲおよびＲ’は、水素だけでなく式Ｉを有する非天然アミノ酸に関して上述したＲ基にとっての置換基の同じ一覧から任意に選択される）
の構造が挙げられる修飾された骨格構造を任意に備える。例えば、本発明非天然アミノ酸は、式ＩＩおよびＩＩＩによって示されるようなアミノ基またはカルボキシル基において置換基を任意に備える。この種の非天然アミノ酸としては、これらに限定されないが、通常の２０の天然アミノ酸または非天然アミノ酸に対応する側鎖を有する（限定されないが、これらが挙げられる）、α−ヒドロキシ酸、α−チオ酸、α−アミノチオカルボキシレートが挙げられる。さらに、α−炭素における置換基としては、これらに限定されないが、Ｄ−グルタメート、Ｄ−アラニン、Ｄ−メチル−Ｏ−チロシン、およびアミノブチル酸などといったＬ、Ｄ、またはα−α−２置換アミノ酸が任意に挙げられる。他の構造的な代替物としては、プロリン類似物ならびに３、４、５、６、７、８および９員環のプロリン類似物といった環状アミノ酸、これらと同様に置換β−アラニンおよびγ−アミノブチル酸といったβおよびγアミノ酸が挙げられる。
【０２２８】
多くの非天然アミノ酸は、チロシン、グルタミンおよびフェニルアラニンといった天然アミノ酸に基づいており、かつ本発明における使用に好適である。チロシン類似物としては、これらに限定されないが、置換チロシンが、ケト基（これに限定されないが、アセチル基が挙げられる）、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン基、ヒドロキシアミン基、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ６−Ｃ２０の直鎖状または分枝状の炭化水素、飽和もしくは不飽和の炭化水素、Ｏ−メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基、またはアルキニル基など（限定されないが、これらが挙げられる）を備える場合の、パラ位置換チロシン、オルト位置換チロシン、およびメタ位置換チロシンが挙げられる。さらにまた、多置換アリール環が意図される。本発明における利用に好適なグルタミン類似物としては、これらに限定されないが、α−ヒドロキシ誘導体、γ−置換誘導体、環状誘導体、およびアミド置換グルタミン誘導体が挙げられる。本発明における利用に好適なフェニルアラニン類似物の例としては、これらに限定されないが、置換基が、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド、アジド、ヨード、ブロモ、ケト基（これに限定されないが、アセチル基が挙げられる）、ベンゾイル、またはアルキニル基など（限定されないが、これらが挙げられる）を備える場合の、パラ位置換フェニルアラニン、オルト位置換フェニルアラニン、およびメタ位置換フェニルアラニンが挙げられる。本発明における利用に好適な非天然アミノ酸の特定の例としては、これらに限定されないが、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−ドーパ、フッ化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨード−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、およびｐ−プロパルギルオキシ−フェニルアラニンなどが挙げられる。本発明における使用に好適な非天然アミノ酸の変形の構造の例は、例えば、“In vivo incorporation of unnatural amino acids”と表題が付けられた国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレットに規定されている。また、付加的なメチオニン類似物に関しては、言及によって本明細書に組み込まれる、Kiick et al., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99:19-24を参照すればよい。
【０２２９】
１つの実施形態において、非天然アミノ酸（例えば、ｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニン）を含むｈＰＰポリペプチドの組成物が、提供される。また、ｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニンを備える種々の組成物（これらに限定されないが、タンパク質および／または細胞が挙げられる）が、提供される。１つの局面において、ｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニンを備える組成物は、直交ｔＲＮＡをさらに含む。非天然アミノ酸は、直交ｔＲＮＡに対して共有結合的に（限定されないが、これが挙げられる）結合され得る（これらに限定されないが、アミノアシル結合を介して直交ｔＲＮＡに対して共有結合的に結合される、直交ｔＲＮＡの末端リボース糖の３’ＯＨまたは２’ＯＨに対して共有結合的に結合されるなど、が挙げられる）。
【０２３０】
タンパク質に組み込まれ得る非天然アミノ酸を介する化学部分は、タンパク質の種々の利点および操作を提供する。ケト官能基の固有の反応性は、インビボおよびインビトロにおける、多くのヒドラジン含有試薬またはヒドロキシアミン含有試薬のあらゆるものを用いた、タンパク質の選択的な修飾を可能にする。非天然アミノ酸は、例えば、重水素Ｘ線構造データの位相合わせに有用であり得る。また、非天然アミノ酸を用いた重水素の部位特異的な導入は、重水素にとっての位置の選択に選択性および自由度を提供する。光反応性非天然アミノ酸（これらに限定されないが、ベンゾフェノンおよびアリールアジド（これに限定されないが、フェニルアジドが挙げられる）側鎖を有するアミノ酸が挙げられる）は、例えば、タンパク質のインビボおよびインビトロにおける効率的な光架橋を可能にする。光反応性アミノ酸の例としては、これらに限定されないが、ｐ−アジド−フェニルアラニンおよびｐ−ベンゾイル−フェニルアラニンが挙げられる。光反応性アミノ酸を有するタンパク質は、その結果、光反応性基を供給する一時的な制御の励起によって、自由自在に光架橋され得る。１つの例において、非天然アミノ酸のメチル基は、核磁気共鳴および振動顕微鏡の利用を伴う（限定されないが、これらが挙げられる）、局所的な構造および動態のプローブとして、放射線標識されたメチル基（限定されないが、これが挙げられる）に置換され得る。アルキニル官能基またはアジド官能基は、例えば、［３＋２］環付加反応を介したタンパク質の選択的な修飾を可能にする。
【０２３１】
アミノ末端においてポリペプチドに組み込まれる非天然アミノ酸は、２０の天然のアミノ酸に用いられる１つ以外のあらゆる置換基であるＲ基、およびα−アミノ酸に通常に存在するＮＨ２基と異なる第２の反応性基から構成され得（式Ｉを参照すればよい）る。類似の非天然アミノ酸が、カルボキシル末端において、α−アミノ酸に通常に存在するＣＯＯＨ基と異なる第２の反応性基を用いて、組み込まれ得る（式１を参照すればよい）。
【０２３２】
本発明の非天然アミノ酸は、２０の通常のアミノ酸において有効ではない付加的な特性を与えるために、選択され得るか、または設計され得る。例えば、非天然アミノ酸は、タンパク質（例えば、それらが組み込まれる）の生物学的特性を修飾するために、任意に設計され得るか、または選択され得る。例えば、以下の性質：毒性、体内分布、可溶性、安定性（例えば、熱、加水分解、酸化、および酵素的分解に対する耐性など）、精製および処理の容易さ、構造性質、分光性質、化学的および／または光化学的な性質、触媒活性、酸化還元電位、半減期、ならびに他の分子と反応する（例えば、共有結合的にか、または非共有結合的に）能力などは、タンパク質への非天然アミノ酸の包含によって任意に修飾され得る。
【０２３３】
非天然アミノ酸（カルボニル基、カルボニル様基、マスクされたカルボニル基、保護されたカルボニル基、およびヒドロキシルアミン基）の構造および合成
いくつかの実施形態において、本発明は、オキシム結合によって水溶性重合体（例えば、ＰＥＧ）と連結されているｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃを提供する。
【０２３４】
非天然にコードされたアミノ酸の多くの種類は、オキシム結合の形成に適切である。これらとしては、カルボニル、ジカルボニル、またはヒドロキシルアミン基を含む非天然にコードされたアミノ酸が挙げられるが、これに限定されない。そのようなアミノ酸は、その全体が言及によって本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００６／０１９４２５６号明細書、米国特許出願公開第２００６／０２１７５３２号明細書、米国特許出願公開第２００６／０２１７２８９号明細書、および”Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides”と題される国際公開第２００６／０６９２４６号パンフレットに記載されている。また、非天然にコードされたアミノ酸は、その全体が言及によって本明細書に組み込まれる、米国特許第７，０８３，９７０号明細書および米国特許第７，０４５，３３７号明細書に記載されている。
【０２３５】
本発明のいくつかの実施形態は、１つ以上の位置においてアミノ酸パラアセチルフェニルアラニンを用いて置換されている、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドを利用する。ｐ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニンおよびｍ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニンの合成は、言及によって組み込まれるZhang, Z.et al,. Biochemistry 42: 6735-6746 (2003)に記載されている。他のカルボニル含有アミノ酸またはジカルボニル含有アミノ酸は、当業者によって同様に調製され得る。さらに、本明細書に含まれる非天然アミノ酸の限定しない例示的な合成は、その全体が言及によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，０８３，９７０号明細書の図４、２４−３４および３６−３９に示されている。
【０２３６】
求電子性反応性基を有するアミノ酸は、とりわけ、求核付加反応を介して分子を連結するための多様な反応を可能にする。そのような求電子性反応性基のとしては、カルボニル基（ケト基およびジカルボニル基が挙げられる）、カルボニル様基（カルボニル基（ケト基およびジカルボニル基が挙げられる）と類似の反応性を有し、かつカルボニル基と構造的に類似している）、マスクされたカルボニル基（カルボニル基（ケト基およびジカルボニル基が挙げられる）に容易に変えられ得る）、または保護されたカルボニル基（脱保護によってカルボニル基（ケト基およびジカルボニル基が挙げられる）と同様の反応性を有する）が挙げられる。そのようなアミノ酸としては、式（ＩＶ）：
【０２３７】
【化７】
0005840345.tif 000008
【０２３８】
（ここで、
Ａは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級へテロアルキレン、置換へテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級へテロアルキレン、置換低級へテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｊは、
【０２３９】
【化８】
0005840345.tif 000009
【０２４０】
であり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ’’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、置換アルキル、または保護基であるか、または２つ以上のＲ’’基が存在する場合に、２のＲ’’はヘテロシクロアルキルを任意に形成し；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４のそれぞれは独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、または置換低級アルキルであるか、Ｒ３とＲ４と、または２のＲ３基は、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを任意に形成するか；
または−Ａ−Ｂ−Ｊ−Ｒ基は、少なくとも１つのカルボニル基（ジカルボニル基が挙げられる）、保護されたカルボニル基（保護されたジカルボニル基が挙げられる）、またはマスクされたカルボニル基（マスクされたジカルボニル基が挙げられる）を含む、２環式または３環式のシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを共に形成するか；
または−Ｊ−Ｒ基は、少なくとも１つのカルボニル基（ジカルボニル基が挙げられる）、保護されたカルボニル基（保護されたジカルボニル基が挙げられる）、またはマスクされたカルボニル基（マスクされたジカルボニル基が挙げられる）を含む、単環式または２環式のシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを共に形成し；
Ａがフェニレンであり、かつＲ３のそれぞれがＨである場合に、Ｂは存在するという条件；およびＡが−（ＣＨ２）４−であり、かつＲ３のそれぞれがＨである場合に、Ｂは−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨ２）−ではないという条件；およびＡとＢとが存在せず、かつＲ３のそれぞれがＨである場合に、Ｒはメチルではないという条件を有する）
の構造を有するアミノ酸が挙げられる。
【０２４１】
その他に、式（Ｖ）：
【０２４２】
【化９】
0005840345.tif 000010
【０２４３】
（ここで、
Ａは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級へテロアルキレン、置換へテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級へテロアルキレン、置換低級へテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−(アルキレンもしくは置換アルキレン)−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ａがフェニレンである場合に、Ｂは存在するという条件；およびＡが−（ＣＨ２）４−である場合に、Ｂは−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨ２）−ではないという条件；およびＡとＢとが存在しない場合に、Ｒはメチルでないという条件と有する）
の構造を有するものが挙げられる。
【０２４４】
その他に、式（ＶＩ）：
【０２４５】
【化１０】
0005840345.tif 000011
【０２４６】
（ここで、
Ｂは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級へテロアルキレン、置換低級へテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒａのそれぞれは独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’（ここで、Ｒのそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択される）
の構造を有するアミノ酸が挙げられる。
【０２４７】
その他に、以下のアミノ酸：
【０２４８】
【化１１】
0005840345.tif 000012
【０２４９】
（ここで、そのような化合物は、任意にアミノ保護基であるか、カルボキシル保護されているか、またはそれらの塩である。その他に、以下の非天然アミノ酸のあらゆるものが、非天然アミノ酸ポリペプチドに組み込まれ得る）
が挙げられる。
【０２５０】
その他に、式（ＶＩＩ）：
【０２５１】
【化１２】
0005840345.tif 000013
【０２５２】
（ここで、
Ｂは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級へテロアルキレン、置換へテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒａのそれぞれは独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ(Ｒ’)２、−Ｃ（Ｏ）kＲ’（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択される；かつｎは０から８であり；
Ａが−（ＣＨ２）４−である場合に、Ｂは、−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨ２）−ではないという条件を有する）
の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる。
【０２５３】
その他に、以下のアミノ酸：
【０２５４】
【化１３】
0005840345.tif 000014
【０２５５】
（ここで、そのような化合物は、任意にアミノ保護されているか、任意にカルボキシル保護されているか、任意にアミノ保護とカルボキシル保護とをされているか、またはそれらの塩である）が挙げられる。その他に、これらの非天然アミノ酸および以下の非天然アミノ酸のあらゆるものは、非天然アミノ酸ポリペプチドに組み込まれ得る。
【０２５６】
その他に、式（ＶＩＩＩ）：
【０２５７】
【化１４】
0005840345.tif 000015
【０２５８】
（ここで、
Ａは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級へテロアルキレン、置換へテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−(アルキレンまたは置換アルキレン)−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドである）
の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる。
【０２５９】
その他に、式（ＩＸ）：
【０２６０】
【化１５】
0005840345.tif 000016
【０２６１】
Ｂは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）k−（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）k（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）kＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）kＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、または置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
ここで、Ｒａのそれぞれは独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ(Ｒ’)２、、−Ｃ（Ｏ）kＲ’（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ(Ｒ’)２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）kＲ’からなる群から選択される（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）
の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる。
【０２６２】
その他に、以下のアミノ酸：
【０２６３】
【化１６】
0005840345.tif 000017
【０２６４】
（ここで、そのような化合物は、任意にアミノ保護されているか、任意にカルボキシル保護されているか、任意にアミノ保護とカルボキシル保護とをされているか、またはそれらの塩である）が挙げられる。その他に、これらの非天然アミノ酸および以下の非天然アミノ酸のあらゆるものは、非天然アミノ酸ポリペプチドに組み込まれ得る。
【０２６５】
その他に、式（Ｘ）：
【０２６６】
【化１７】
0005840345.tif 000018
【０２６７】
（ここで、Ｂは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）k−（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）k(アルキレンもしくは置換アルキレン)−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）kＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）kＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒａのそれぞれは独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ(Ｒ’)２、−Ｃ（Ｏ）kＲ’（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ(Ｒ’)２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）kＲ’（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択され；かつｎは０から８である）
の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる。
【０２６８】
その他に、以下のアミノ酸：
【０２６９】
【化１８】
0005840345.tif 000019
【０２７０】
（ここで、そのような化合物は、任意にアミノ保護されているか、任意にカルボキシル保護されているか、任意にアミノ保護とカルボキシル保護とをされているか、またはそれらの塩である）が挙げられる。その他に、これらの非天然アミノ酸および以下の非天然アミノ酸のあらゆるものは、非天然アミノ酸ポリペプチドに組み込まれ得る。
【０２７１】
モノカルボニル構造の他に、本明細書に記載の非天然アミノ酸は、ジカルボニル基、ジカルボニル様基、マスクされたジカルボニル基、および保護されたジカルボニル基といった基を含み得る。
【０２７２】
例えば、式（ＸＩ）の構造を有する以下のアミノ酸：
【０２７３】
【化１９】
0005840345.tif 000020
【０２７４】
（ここで、Ａは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換へテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）k−（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）k（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）kＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）kＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドである）
が挙げられる。
【０２７５】
その他に、式（ＸＩＩ）：
【０２７６】
【化２０】
0005840345.tif 000021
【０２７７】
Ｂは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）k−（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）k（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−(アルキレンもしくは置換アルキレン)−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）kＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）kＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
ここで、Ｒａのそれぞれは独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ(Ｒ’)２、−Ｃ（Ｏ）kＲ’（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ(Ｒ’)２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）kＲ’（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択される）
の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる。
【０２７８】
その他に、以下のアミノ酸
【０２７９】
【化２１】
0005840345.tif 000022
【０２８０】
（ここで、そのような化合物は、任意にアミノ保護されているか、任意にカルボキシル保護されているか、任意にアミノ保護とカルボキシル保護とをされているか、またはそれらの塩である）。その他に、非天然アミノ酸および以下の非天然アミノ酸のあらゆるものは、非天然アミノ酸ポリペプチドに組み込まれ得る。
【０２８１】
その他に、式（ＸＩＩＩ）の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる：
【０２８２】
【化２２】
0005840345.tif 000023
【０２８３】
（ここで、Ｂは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−(アルキレンもしくは置換アルキレン)−、−Ｓ−、−Ｓ−(アルキレンもしくは置換アルキレン)−、−Ｓ（Ｏ）k−（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）k(アルキレンもしくは置換アルキレン)−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−(アルキレンもしくは置換アルキレン)−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−(アルキレンもしくは置換アルキレン)−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−(アルキレンもしくは置換アルキレン)−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−(アルキレンもしくは置換アルキレン)−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−(アルキレンもしくは置換アルキレン)−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−(アルキレンもしくは置換アルキレン)−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）kＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）kＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり;
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒａのそれぞれは独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ(Ｒ’)２、−Ｃ(Ｏ)kＲ’（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ(Ｒ’)２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）kＲ’からなる群から選択され（ここで、Ｒ’それぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）；かつｎは０から８である）
が挙げられる：。
【０２８４】
その他に、以下のアミノ酸：
【０２８５】
【化２３】
0005840345.tif 000024
【０２８６】
（ここで、そのような化合物は、任意にアミノ保護されているか、任意にカルボキシル保護されているか、任意にアミノ保護とカルボキシル保護とをされているか、またはそれらの塩である）が挙げられる。その他に、これらの非天然アミノ酸および以下の非天然アミノ酸のあらゆるものは、非天然アミノ酸ポリペプチドに組み込まれ得る。
【０２８７】
その他に、式（ＸＩＶ）：
【０２８８】
【化２４】
0005840345.tif 000025
【０２８９】
（ここで、
Ａは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｘ１は、Ｃ、Ｓ、またはＳ（Ｏ）であり；かつＬは、アルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）またはＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）である（ここで、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである）
の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる。
【０２９０】
その他に、式（ＸＩＶ−Ａ）：
【０２９１】
【化２５】
0005840345.tif 000026
【０２９２】
（ここで、
Ａは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｌは、アルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）またはＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）である（ここで、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである）
の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる。
【０２９３】
その他に、式（ＸＩＶ−Ｂ）：
【０２９４】
【化２６】
0005840345.tif 000027
【０２９５】
（ここで、
Ａは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｌは、アルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）またはＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）である（ここで、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである）
の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる。
【０２９６】
その他に、式（ＸＶ）：
【０２９７】
【化２７】
0005840345.tif 000028
【０２９８】
（ここで、
Ａは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｘ１は、Ｃ、Ｓ、またはＳ（Ｏ）であり；かつｎは、０、１、２、３、４、または５であり；かつＣＲ８Ｒ９基のそれぞれにおけるＲ８およびＲ９のそれぞれは独立して、Ｈ、アルコキシ、アルキルアミン、ハロゲン、アルキル、アリールからなる群から選択されるか、または任意のＲ８およびＲ９が、＝Ｏもしくはシクロアルキルを共に形成し得るか、またはＲ８基に隣接する任意のものが、共にシクロアルキルを形成し得る）
の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる。
【０２９９】
その他に、式（ＸＶ−Ａ）：
【０３００】
【化２８】
0005840345.tif 000029
【０３０１】
（ここで、
Ａは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレン;
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
ｎは、０、１、２、３、４、または５であり；かつＣＲ８Ｒ９基のそれぞれにおけるＲ８およびＲ９のそれぞれは独立して、Ｈ、アルコキシ、アルキルアミン、ハロゲン、アルキル、アリールからなる群から選択されるか、または任意のＲ８およびＲ９が、＝Ｏもしくはシクロアルキルを共に形成し得るか、またはＲ８基に隣接する任意のものが、共にシクロアルキルを形成し得る）
の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる。
【０３０２】
その他に、式（ＸＶ−Ｂ）：
【０３０３】
【化２９】
0005840345.tif 000030
【０３０４】
（ここで、
Ａは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
ｎは、０、１、２、３、４、または５であり；かつＣＲ８Ｒ９基のそれぞれにおけるＲ８およびＲ９のそれぞれは独立して、Ｈ、アルコキシ、アルキルアミン、ハロゲン、アルキル、アリールからなる群から選択されるか、または任意のＲ８およびＲ９が、＝Ｏもしくはシクロアルキルを共に形成し得るか、またはＲ８基に隣接する任意のものが、共にシクロアルキルを形成し得る）
の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる。
【０３０５】
その他に、式（ＸＶＩ）：
【０３０６】
【化３０】
0005840345.tif 000031
【０３０７】
（ここで、
Ａは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｘ１は、Ｃ、Ｓ、またはＳ（Ｏ）であり；かつＬは、アルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）またはＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）である（ここで、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである）
の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる。
【０３０８】
その他に、式（ＸＶＩ−Ａ）：
【０３０９】
【化３１】
0005840345.tif 000032
【０３１０】
（ここで、
Ａは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｌは、アルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）またはＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）である（ここで、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである）
の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる。
【０３１１】
その他に、式（ＸＶＩ−Ｂ）：
【０３１２】
【化３２】
0005840345.tif 000033
【０３１３】
（ここで、
Ａは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｌは、アルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）またはＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）である（ここで、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである）
の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる。
【０３１４】
その他に、式（ＸＶＩＩ）：
【０３１５】
【化３３】
0005840345.tif 000034
【０３１６】
（ここで、
Ａは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｍは、
【０３１７】
【化３４】
0005840345.tif 000035
【０３１８】
であり（ここで、（ａ）は、Ａ基との結合を表し、かつ（ｂ）は、それぞれのカルボニル基との結合を表し、Ｒ３およびＲ４は独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、もしくは置換シクロアルキルから選択されるか、またはＲ３とＲ４と、もしくは２つのＲ３基、もしくは２つのＲ４基は、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成する）；
Ｒは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｔ３は、結合、Ｃ（Ｒ）（Ｒ）、Ｏ、またはＳであり、かつＲは、Ｈ，ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドである）
の構造を有するアミノ酸が挙げられる。
【０３１９】
その他に、式（ＸＶＩＩＩ）：
【０３２０】
【化３５】
0005840345.tif 000036
【０３２１】
（ここで、
Ｍは、
【０３２２】
【化３６】
0005840345.tif 000037
【０３２３】
であり（ここで、（ａ）は、Ａ基との結合を表し、かつ（ｂ）は、それぞれのカルボニル基との結合を表し、Ｒ３およびＲ４は独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、もしくは置換シクロアルキルであるか、またはＲ３とＲ４と、もしくは２つのＲ３基、もしくは２つのＲ４基は、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成する）；
Ｒは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｔ３は、結合、Ｃ（Ｒ）（Ｒ）、Ｏ、またはＳであり、かつＲは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、かつ存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチド;であり；かつ
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒａのそれぞれは独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ(Ｒ’)２、−Ｃ（Ｏ）kＲ’（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ(Ｒ’)２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）kＲ’（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択される）
の構造を有するアミノ酸が挙げられる。
【０３２４】
その他に、式（ＸＩＸ）：
【０３２５】
【化３７】
0005840345.tif 000038
【０３２６】
（ここで、
Ｒは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；かつ
Ｔ３は、Ｏ、またはＳである）
の構造を有するアミノ酸が挙げられる。
【０３２７】
その他に、式（ＸＸ）：
【０３２８】
【化３８】
0005840345.tif 000039
【０３２９】
（ここで、
Ｒは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである）
の構造を有するアミノ酸が挙げられる。
【０３３０】
その他に、式（ＸＸＩ）：
【０３３１】
【化３９】
0005840345.tif 000040
【０３３２】
の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる。
【０３３３】
いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸を含むポリペプチドは、化学的に修飾されて、反応性のカルボニル官能基、またはジカルボニル官能基を生成する。例えば、接合反応に有用なアルデヒド機能性基は、隣接するアミノ基およびヒドロキシル基を有する機能性基から生成され得る。生物学的に活性な分子がポリペプチドである場合に、例えば、Ｎ末端セリンまたはスレオニン（通常に存在し得るか、または化学的もしくは酵素的な消化を介して露出され得る）は、過ヨウ素酸塩を用いた穏やかな酸化的切断条件下における、アルデヒド機能性基の生成に使用され得る。例えば、Gaertner, et. al., Bioconjug. Chem. 3: 262−268 (1992);Geoghegan, K. & Stroh, J., Bioconjug. Chem. 3: 138−146 (1992);Gaertner et al., J. Biol. Chem. 269:7224−7230 (1994)を参照すればよい。しかし、当該技術において公知の方法は、ペプチドまたはタンパク質のＮ末端におけるアミノ酸に対して限定される。
【０３３４】
本発明において、隣接するヒドロキシル基およびアミノ基を有する非天然アミノ酸は、“マスクされた”アルデヒド機能性基としてポリペプチドに組み込まれ得る。例えば、５−ヒドロキシリジンは、イプシロンアミンに対して隣接するヒドロキシル基を有する。アルデヒドを生成するための反応条件は、典型的に、ポリペプチド内の他の部位において酸化をさせるための穏やかな条件下において、過剰なモル濃度のメタ過ヨウ素酸ナトリウムの添加を含む。酸化反応のｐＨは、典型的に約７．０である。典型的な反応は、ポリペプチドの緩衝化溶液に対して、約１．５モル濃度過剰なメタ過ヨウ素酸ナトリウムの添加に続いて、暗所における１０分間のインキュベーションを含む。例えば、米国特許第６，４２３，６８５号明細書を参照すればよい。
【０３３５】
カルボニル機能性基またはジカルボニル機能性基は、穏やかな条件の下に水性溶液においてヒドロキシルアミン含有試薬と選択的に反応して、生理学的条件下において安定な対応するオキシム連結を形成し得る。例えば、Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475−481 (1959);Shao, J. and Tarn, J. P., J. Am. Chem. Soc. 1 17:3893− 3899 (1995)を参照すればよい。さらに、カルボニル基またはジカルボニル基の固有の反応性が、他のアミノ酸側鎖の存在下において選択的な修飾を可能にする。例えば、Cornish, V. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 118:8150−8151 (1996);Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G., Bioconjug. Chem. 3:138−146 (1992);Mahal, L. K., et al., Science 276:1125−1128 (1997)を参照すればよい。
【０３３６】
非天然アミノ酸（ヒドロキシルアミン含有アミノ酸）の構造および合成
米国仮特許出願第６０／６３８，４１８号明細書は、言及によってその全体が組み込まれる。従って、米国仮特許出願第６０／６３８，４１８号明細書におけるセクションＶ（“非天然アミノ酸”と題される）、パートＢ（“非天然アミノ酸（ヒドロキシアミン含有アミノ酸）の構造および合成”と題される）に与えられた開示内容は、当該開示内容が本明細書に示されているも同然に、本明細書に記載されている非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、および修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを作製する、精製する、性質決定する、および使用する方法、組成物（式Ｉ−ＸＸＸＶが挙げられる）、技術および戦略に対して完全に適用される。米国特許出願公開第２００６／０１９４２５６号明細書、米国特許出願公開第２００６／０２１７５３２号明細書、米国特許出願公開第２００６／０２１７２８９号明細書、および、”Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides”と題される国際公開第２００６／０６９２４６号パンフレットもまた、その全体が言及によって本明細書に組み込まれる。
【０３３７】
非天然アミノ酸の化学合成
本発明における使用に好適な非天然アミノ酸の多くは、例えば、シグマ（ＵＳＡ）またはアルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）（ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ）、ＷＩ、ＵＳＡ）から市販されている。市販されていない非天然アミノ酸は、本明細書に規定されているように、または多様な公開物に規定されているように、または当業者に公知の標準的な方法を用いて、任意に合成される。有機合成技術に関しては、例えば、Organic Chemistry by Fessendon and Fessendon, (1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.);Advanced Organic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York);およびAdvanced Organic Chemistry by Carey and Sundberg (Third Edition, Parts A and B, 1990, Plenum Press, New York)を参照すればよい。非天然アミノ酸の合成について記載している付加的な公開物としては、例えば、“In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids”と題される国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレット;Matsoukas et al, (1995) J. Med. Chem., 38, 4660-4669;King, F.E. & Kidd, D.A.A. (1949) A New Synthesis of Glutamine and of γ- Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates. J. Chem. Soc. 3315-3319;Friedman, O.M. & Chatterrji, R. (1959) Synthesis of Derivatives ofGlutamine as Model Substrates for Anti- Tumor Agents. J. Am. Chem. Soc. 81, 3750-3752;Craig, J.C. et al. (1988) Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4 [[4-(diethylamino)-l-methylbutyl]amino]quinolim (Chloroquine). J. Org. Chem. 53, 1167-1170;Azoulay, M., Vilmont, M. & Frappier, F. (1991) Glutamine analogues as Potential Antimalarials, Eur. J. Med. Chem. 26, 201-5;Koskinen, A.M.P. & Rapoport, H. (1989) Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues. J. Org. Chem. 54, 1859-1866;Christie, B.D. & Rapoport, H. (1985) Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L-Asparagine. Application to the Total Synthesis of (+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization. J. Org. Chem. 50:1239-1246;Barton et al, (1987) Synthesis of Novel alpha-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry: Synthesis of L- and D-alpha-Amino-Adipic Acids, L-alpha- aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives. Tetrahedron 43:4297-4308;およびSubasinghe et al, (1992) Quisqualic acid analogues: synthesis of bela-heterocyclic 2- aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate-senitized site. J. Med. Chem. 35:4602-7が挙げられる。また、言及によって本明細書に組み込まれる“Protein Arrays”と題される米国特許第２００４／０１９８６３７号明細書を参照すればよい。
【０３３８】
Ａ．カルボニル反応性基
カルボニル反応性基を有するアミノ酸は、求核性の付加を介して分子（ＰＥＧまたは他の水溶性分子が挙げられるが、これらに限定されない）を連結するための多様な反応、または特にアルドール縮合反応を可能にする。
【０３３９】
例示的なカルボニル含有アミノ酸は、以下のように表され得る：
【０３４０】
【化４０】
0005840345.tif 000041
【０３４１】
（ここで、ｎは０−１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり；Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、置換アルキル、および置換アリールであり；Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、かつＲ４は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である）。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、かつＲ２は単純アルキル（すなわち、メチル、エチルまたはプロピル）であり、かつケトン部分は、アルキル側鎖に対してパラ位に位置されている。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、かつＲ２は単純アルキル（すなわち、メチル、エチルまたはプロピル）であり、かつケトン部分は、アルキル側鎖に対してメタ位に位置されている。
【０３４２】
ｐ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニンおよびｍ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニンの合成は、言及によって本明細書に組み込まれる、Zhang, Z.et al, Biochemistry 42: 6735-6746 (2003)に記載されている。他のカルボニル含有アミノ酸は、当業者によって同様に調製され得る。
【０３４３】
いくつかの実施形態において、非天然にコードされたアミノ酸を含むポリペプチドは、化学的に修飾されて、反応性のカルボニル官能基を生成する。例えば、接合反応に有用なアルデヒド機能性基は、隣接するアミノ基とヒドロキシル基とを有する機能性基から生成され得る。生物学的に活性な分子がポリペプチドである場合に、例えば、Ｎ末端のセリンまたはスレオニン（通常に存在し得る、または化学的もしくは酵素的な消化を介して露出され得る）は、過ヨウ素酸塩を用いた穏やかな酸化切断条件においてアルデヒド機能性基を生成するために使用され得る。例えば、Gaertner, et ah, Bioconjug. Chem. 3: 262-268 (1992) ;Geoghegan, K. & Stroh, J., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992) ;Gaertner et al, J. Biol. Chem. 269:7224-7230 (1994) を参照すればよい。しかし、当該技術において公知の方法は、ペプチドまたはタンパク質のＮ末端におけるアミノ酸に制限される。
【０３４４】
本発明において、隣接するヒドロキシル基とアミノ基とを有する非天然にコードされたアミノ酸アミノ酸は、“マスクされた”アルデヒド機能性基としてポリペプチドに組み込まれ得る。例えば、５−ヒドロキシリジンは、イプシロンアミンと隣接するヒドロキシル基を有する。アルデヒドを生成する反応条件は、典型的に、ポリペプチド内の他の部位における酸化を回避するための穏やかな反応条件において、過剰なモル濃度のメタ過ヨウ素酸ナトリウムの添加に関する。酸化反応のｐＨは、典型的に約７．０である。典型的な反応は、ポリペプチド緩衝化溶液に対する、１．５モル濃度を超えるメタ過ヨウ素酸ナトリウムの添加に続いて、暗所における約１０分間のインキュベーションに関する。例えば、言及によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，４２３，６８５号明細書を参照すればよい。
【０３４５】
カルボニル機能性基は、水性溶液における穏やかな条件の下に、ヒドラジン含有試薬、ヒドラジド含有試薬、ヒドロキシルアミン含有試薬、またはセミカルバジド含有試薬と選択的に反応して、生理学的条件においてそれぞれに対して安定な対応するヒドラゾン、オキシム、またはセミカルバゾン連結を形成し得る。例えば、Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959) ;Shao, J. and Tarn, J. P., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995) を参照すればよい。さらに、カルボニル基の固有な反応性は、他のアミノ酸側鎖の存在下において選択的な修飾を可能にする。例えば、Cornish, V. W., et al, J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151 (1996) ;Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992) ;Mahal, L. K., et al, Science 276:1125-1128 (1997) を参照すればよい。
【０３４６】
Ｂ．ヒドラジン、ヒドラジド、またはセミカルバジド反応性基
求核性基（例えば、ヒドラジン、ヒドラジドまたはセミカルバジド）を含む非天然にコードされたアミノ酸は、ＰＥＧまたは他の水溶性重合体（限定されないが、これらが挙げられる）との接合体を形成するための多様な求電子基との反応を可能にする。
【０３４７】
例示的なヒドラジン含有アミノ酸、ヒドラジド含有アミノ酸、またはセミカルバジド含有アミノ酸は、以下のように表され得る：
【０３４８】
【化４１】
0005840345.tif 000042
【０３４９】
（ここで、ｎは０−１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであるか、または存在しないかであり；Ｘは、Ｏ、ＮまたはＳであるか、または存在しないかであり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、かつＲ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である）。
【０３５０】
いくつかの実施形態において、ｎは４であり、Ｒ１は存在せず、かつＸはＮである。いくつかの実施形態において、ｎは２であり、Ｒ１は存在せず、かつＸは存在しない。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、かつ酸素原子は、アリール環上におけるアルファティック（ａｌｐｈａｔｉｃ）基に対してパラに位置されている。
【０３５１】
ヒドラジド含有アミノ酸、ヒドラジン含有アミノ酸、またはセミカルバジド含有アミノ酸は、市販の供給源から利用可能である。例えば、Ｌ−グルタミン酸−γ−ヒドラジドは、シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）（セントルイス（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ）、ＭＯ）から入手可能である。市販されていない他のアミノ酸は、当業者によって調製され得る。例えば、言及によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，２８１，２１１号明細書を参照すればよい。
【０３５２】
ヒドラジド、ヒドラジンまたはセミカルバジド反応性基を有する非天然にコードされたアミノ酸を含む、ポリペプチドは、アルデヒドまたは類似の化学反応性を有する他の官能基を含む多様な分子と効率的かつ選択的に反応し得る。例えば、Shao, J. and Tarn, J., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995)を参照すればよい。ヒドラジド、ヒドラジンおよびセミカルバジド官能基の固有な反応性は、通常の２０のアミノ酸に存在する求核性基（セリンもしくはスレオニンのヒドロキシ基、またはリジンとＮ末端とのアミノ基が挙げられるが、これらに限定されない）と比較して、アルデヒド、ケトンおよび他の求電子性基に対してより著しい反応を起こさせる。
【０３５３】
Ｃ．アミノオキシ含有アミノ酸
アミノオキシ（ヒドロキシアミンとも呼ばれる）基を含む非天然にコードされたアミノ酸は、ＰＥＧまたは他の水溶性重合体（限定されないが、これらが挙げられる）との接合体を形成するための求電子性基との反応を可能にする。ヒドラジン、ヒドラジドおよびセミカルバジドと同様に、アミノオキシ基の増強された求核性は、アミノオキシ基がアルデヒドまたは類似の化学反応性を有する他の官能基と効率的かつ選択的に反応することを可能にする。例えば、Shao, J. and Tarn, J., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995);H. Hang and C. Bertozzi, Ace. Chem. Res. 34: 727-736 (2001) を参照すればよい。ヒドラジン基との反応の結果は、対応するヒドラゾンであるが、これに対してオキシムは、一般的にカルボニル含有基（例えば、ケトン）とアミノオキシ基の反応から生じる。
【０３５４】
例示的なアミノオキシを含むアミノ酸は、以下のように表され得る：
【０３５５】
【化４２】
0005840345.tif 000043
【０３５６】
（ここで、ｎは０−１０であり、Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであるか、または存在せず；Ｘは、Ｏ、Ｎ、またはＳであるか、または存在せず；ｍは０−１０であり；ＹはＣ（Ｏ）であるか、または存在せず；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、かつＲ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である）。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、ｍは１であり、かつＹは存在する。いくつかの実施形態において、ｎは２であり、Ｒ１およびＸは存在せず、ｍは０であり、かつＹは存在しない。
【０３５７】
アミノオキシ含有アミノ酸は、容易に入手可能なアミノ酸前駆体（ホモセリン、セリンおよびスレオニン）から容易に調製され得る。例えば、M. Carrasco and R. Brown, J. Org. Chem. 68: 8853-8858 (2003) を参照すればよい。ある種のアミノオキシ含有アミノ酸（例えば、Ｌ−２−アミノ−４−（アミノオキシ）ブチル酸）は、天然の供給源から単離されている（Rosenthal, G, Life Sci. 60: 1635-1641 (1997)）。他のアミノオキシ含有アミノ酸は、当業者によって調製され得る。
【０３５８】
Ｄ．アジドおよびアルキン反応性基
アジド官能基およびアルキン官能基の固有な反応性は、ポリペプチドおよび他の生体分子の選択的な修飾にとって、それらを極めて有効にさせる。有機アジド、特にアルファティックアジド、およびアルキンは、通常の反応性の化学的条件に対して一般的に安定である。特に、アジド官能基およびアルキン官能基の両方は、天然に生じるポリペプチドに見られる通常の２０のアミノ酸の側鎖（すなわち、Ｒ基）に対して不活性である。しかし、非常に近づくと、アジド基およびアルキン基の“ばね荷重”性質が現れ、かつそれらは、ヒュイゲン（Ｈｕｉｓｇｅｎ）［３＋２］環付加反応を介して選択的かつ効率的に反応して、対応するトリアゾールを生成する。例えば、Chin J., et al, Science 301 :964-7 (2003);Wang, Q,, et al, J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003) ;Chin, J. W., et al, J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002) を参照すればよい。
【０３５９】
ヒュイゲン環付加反応が、求核置換よりむしろ選択的な環付加反応に関与するので（例えば、Padwa, A., in COMPREHENSIVE ORGANIC SYNTHESIS, Vol. 4, (ed. Trost, B. M., 1991), p. 1069-1109;Huisgen, R. in 1,3-DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY, (ed. Padwa, A., 1984), p. 1-176を参照すればよい）、アジド含有側鎖およびアルキン含有側鎖を有する非天然にコードされたアミノ酸の組み込みは、結果として生じるポリペプチドが、非天然にコードされたアミノ酸の位置において修飾されること、を可能にする。アジド含有ポリペプチドまたはアルキン含有ポリペプチドに関する環付加反応は、室温において水性条件の下に、Ｃｕ（ＩＩ）（触媒量のＣｕＳＯ４の形態が挙げられるが、これに限定されない）の付加によって、インシチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）においてＣｕ（ＩＩ）をＣｕ（Ｉ）に還元する触媒量の還元物質の存在下において、達成され得る。例えば、Wang, Q., et al, J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003) ;Tornoe, C. W., et al, J. Org. Chem. 67:3057-3064 (2002) ;Rostovtsev, et al, Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599 (2002) を参照すればよい。例示的な還元物質としては、アスコルビン酸塩、金属銅、キニーネ、ヒドロキノン、ビタミンＫ、グルタチオン、システイン、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋および印加された電位が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３６０】
いくつかの場合において、アジドとアルキンとの間におけるヒュイゲン［３＋２］環付加反応が所望される場合に、ｈＰＰポリペプチドは、アルキン部分を含む非天然にコードされたアミノ酸を含み、かつ当該アミノ酸に付着されるべき水溶性重合体は、アジド部分を含む。また代替可能に、逆反応（すなわち、アミノ酸上におけるアジド部分および水溶性重合体上に存在するアルキン部分を用いる）が達成され得る。
【０３６１】
また、アジド官能基は、アリールエステルを含む水溶性重合体と選択的に反応し、かつアリールホスフィン部分を用いて適切に機能付与されて、アミド連結を生成する。アリールホスフィン基はインシチュにおいてアジドを還元し、かつそれから結果として生じたアミンは近接するエステル結合と効率的に反応して、対応するアミドを生成する。例えば、E. Saxon and C. Bertozzi, Science 287, 2007-2010 (2000) を参照すればよい。アジド含有アミノ酸は、アルキルアジド（２−アミノ−６−アジド−１−ヘキサン酸が挙げられるが、これに限定されない）またはアリールアジド（ｐ−アジド−フェニルアラニン）のいずれかであり得る。
【０３６２】
アリールエステルおよびホスフィン部分を含む、例示的な水溶性重合体は、以下のように示さ表され得る：
【０３６３】
【化４３】
0005840345.tif 000044
【０３６４】
（ここで、Ｘは、Ｏ、Ｎ、またはＳであり得るか、または存在し得ず、Ｐｈはフェニルであり、Ｗは水溶性重合体であり、かつＲは、Ｈ、アルキル基、アリール基、置換アルキル基および置換アリール基であり得る）。例示的なＲ基としては、−ＣＨ２、−Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＣＮ、および−ＮＯ２が挙げられるが、これらに限定されない。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’のそれぞれは独立して、水素基、置換もしくは非置換のヘテロアルキル基、置換もしくは非置換のアリール基（１−３のハロゲンと置換されたアリールが挙げられるが、これに限定されない）、置換もしくは非置換のアルキル基、アルコキシ基もしくはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を指す。本発明の化合物が２つ以上のＲ基を含む場合に、例えば、２つ以上のこれらの基が存在する場合に、Ｒ基のそれぞれは、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’のそれぞれであるように、独立して選択される。Ｒ’およびＲ’’が同じ窒素原子に結び付けられている場合に、それらは、窒素原子と組み合わさって、５員環、６員環、または７員環を形成し得る。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを含むが、これらに限定されないことが意図される。置換体の上述の議論から、当業者は、“アルキル”という用語が、水素基以外の基（例えば、ハロアルキル（−ＣＦ３および−ＣＨ２ＯＣＨ３が挙げられるが、これらに限定されない）およびアシル（−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、および−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３などが挙げられるが、これらに限定されない））と結合された炭素原子を含むことを意図されることを理解する。
【０３６５】
また、アジド官能基は、チオエステルを含む水溶性重合体と選択的に反応し、かつアリールホスフィン部分を用いて適切に機能付与されて、アミド結合を生成し得る。アリールホスフィン基は、インシチュにおいてアジドを還元し、かつそれから結果として生じるアミンは、チオエステル結合と効率的に反応して、対応するアミドを生成する。チオエステル部分およびホスフィン部分を含む例示的な水溶性重合体は、以下のように表され得る：
【０３６６】
【化４４】
0005840345.tif 000045
【０３６７】
（ここで、ｎは１−１０であり、ＸはＯ、Ｎ、またはＳであり得るか、または存在し得ず、Ｐｈはフェニルであり、かつＷは水溶性重合体である）。
【０３６８】
例示的なアルキン含有アミノ酸は、以下のように表され得る：
【０３６９】
【化４５】
0005840345.tif 000046
【０３７０】
（ここで、ｎは０−１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキルまたは置換アリールであるか、または存在せず；Ｘは、Ｏ、ＮまたはＳであるか、存在せず；ｍは０−１０であり、Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、かつＲ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である）。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、Ｘは存在せず、ｍは０であり、かつアセチレン部分はアルキル側鎖に対してパラ位に位置されている。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、ｍは１であり、かつプロパルギルオキシ基は、アルキル側鎖に対してパラ位に位置されている（すなわち、プロパルギル−チロシン）。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１およびＸは存在せず、かつｍは０である（すなわち、プロパリルグリシン）。
【０３７１】
アルキン含有アミノ酸は、市販されている。例えば、プロパルギルグリシンは、ペプテック（Ｐｅｐｔｅｃｈ）（バーリントン（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ）、ＭＡ）から市販されている。代替可能に、アルキン含有アミノ酸は、標準的な方法に従って調製され得る。例えば、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンは、例えば、Deiters, A.et al, J. Am. Chem. Soc. 125: 11782-11783 (2003) に記載されているように合成され得、かつ４−アルキニル−Ｌ−フェニルアラニンは、Kayser, B., et al, Tetrahedron 53(7): 2475-2484 (1997) に記載されているように、合成され得る。他のアルキン含有アミノ酸は、当業者によって調製され得る。
【０３７２】
例示的なアジド含有アミノ酸は、以下のように表され得る：
【０３７３】
【化４６】
0005840345.tif 000047
【０３７４】
（ここで、ｎは０−１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキルまたは置換アリールであるか、または存在せず；Ｘは、Ｏ、ＮまたはＳであるか、または存在せず；ｍは０−１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、かつＲ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチドまたはカルボキシ末端修飾基である）。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、Ｘは存在せず、ｍは０であり、かつアジド部分は、アルキル側鎖に対してパラに位置されている。いくつかの実施形態において、ｎは０−４であり、Ｒ１およびＸは存在せず、かつｍ＝０である。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、ｍは２であり、かつβ−アジドエトキシ部分は、アルキル側鎖に対してパラ位に位置されている。
【０３７５】
アジド含有アミノ酸は、商業的な供給源から入手可能である。例えば、４−アジドフェニルアラニンは、ケム−インペックスインターナショナル（Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）Ｉｎｃ．，（ウッドデール（Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ）、ＩＬ）から入手され得る。市販されていないこれらのアジド含有アミノ酸に関して、アジド基は、適切な脱離基（ハロゲン化物、メシラート、トシレートが挙げられるが、これらに限定されない）の排除を介した、または適切に保護されたラクトンの開環を介した（限定されないが、これらが挙げられる）、当業者に公知の標準的な方法を用いて、比較的容易に調製され得る。例えば、Advanced Organic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York)を参照すればよい。
【０３７６】
Ｅ．アミノチオール反応性基
ベータ置換アミノチオール官能基の固有な反応性は、チアゾリジンの形成を介した、アルデヒド基を含むポリペプチドおよび他の生体分子の選択的な修飾にとって、それらを極めて有効にする。例えば、Shao and J. Tarn, J. Am. Chem. Soc. 1995, 1 17 (14) 3893-3899を参照すればよい。いくつかの実施形態において、ベータ置換アミノチオールアミノ酸は、ｈＰＰポリペプチドに組み込まれ得、かつそれからアルデヒド機能性基を含む水溶性重合体と反応し得る。いくつかの実施形態において、水溶性重合体、薬剤接合体または他のペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）は、チアゾリジンの形成を介したベータ置換アミノチオールアミノ酸を含むポリペプチドに対して連結され得る。
【０３７７】
Ｅ．付加的な反応性基
本発明に係るｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃに組み込まれ得る、付加的な反応性基および非天然にコードされたアミノ酸（ｐ−アミノフェニルアラニンが挙げられるが、これに限定されない）は、その全体が言及によって本明細書に組み込まれる以下の特許出願：米国特許出願公開第２００６／0194256号明細書、米国特許出願公開第２００６／０２１７５３２号明細書、米国特許出願公開第２００６／０２１７２８９号明細書、米国特許仮出願第６０／７５５，３８８号明細書、米国特許仮出願第６０／７５５，７１１号明細書、米国特許仮出願第６０／７５５，０１８号明細書、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０６／４９３９７号明細書、国際公開第２００６／０６９２４６号パンフレット、米国特許仮出願第６０／７５３，０４１号明細書、米国特許仮出願第６０／７５３，０４０号明細書、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０６／４７８２２号明細書、米国特許仮出願第６０／８８２，８１９号明細書、米国特許仮出願第６０／８８２，５００号明細書、米国特許仮出願第６０／８７０，５９４号明細書において記載されている。また、これらの出願は、ＰＥＧまたは他の重合体に存在し得る反応基（連結のためのヒドロキシルアミン（アミノオキシ）基が挙げられるが、これに限定されない）について言及している。
【０３７８】
非天然アミノ酸の細胞性の取り込み
細胞による非天然アミノ酸の取り込みは、タンパク質への取り込みを目的として（限定されないが、これが挙げられる）、非天然アミノ酸を設計および選択するときに典型的に考慮される１つの課題である。例えば、α−アミノ酸の高い電荷密度は、これらの化合物が細胞透過性ではあり得ないことを示唆する。天然アミノ酸は、タンパク質に基づく輸送系の収集を介して真核細胞に取り込まれる。非天然アミノ酸が少しでも細胞によって取り込まれるならば、これを評価する急速なふるいが行われ得る。例えば、“Protein Arrays”と題される米国出願公開第２００４／１９８６３７号明細書（言及によってその全体が本明細書に組み入れられる）、およびLiu, D.R. & Schultz, P.G. (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. PNAS United States 96:4780-4785 における、例えば、毒性アッセイを参照すればよい。取り込みは、多様なアッセイを用いて容易に分析されるが、細胞性の取り込み経路に受け容れられる非天然アミノ酸の設計ための代替案は、インビボにおいてアミノ酸を作り出す生合成経路を提供することである。
【０３７９】
非天然アミノ酸の生合成）
多くの生合成経路が、アミノ酸および他の化合物を産生するために細胞にすでに存在している。特定の非天然アミノ酸用の生合成方法は、天然（細胞内が挙げられるが、これに限定されない）に存在し得ない一方において、本明細書に記載の方法および組成物は、そのような方法を提供する。例えば、非天然アミノ酸用の生合成経路は、新しい酵素の添加、または存在する宿主細胞経路の修飾によって宿主細胞において生成され得る。追加の新しい酵素は、天然に生じる酵素または人工的に発展させた酵素であり得る。例えば、ｐ−アミノフェニルアラニンの生合成（“In vivo incorporation of unnatural amino acids”と題される国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレットにおける一例に示されるように）は、他の生物に由来する公知の酵素の組み合わせの追加を基にしている。これらの酵素に関する遺伝子は、当該遺伝子を備えるプラスミドを用いた真核細胞の形質転換によって、当該細胞に導入され得る。細胞において発現される場合に、当該遺伝子は、所望の化合物を合成する酵素経路を提供する。任意に添加されるこの種の酵素の例は、以下の実施例において与えられる。追加の酵素の配列は、例えば、ジーンバンクに見出される。また、人工的に発展させた酵素は、同様の方法において細胞の中に加えられ得る。この方法において、細胞性機構、および細胞資源は、非天然アミノ酸を産生するために操作される。
【０３８０】
多様な方法が、生合成経路に使用するための新規な酵素の産生、または存在する経路の発展に利用可能である。例えば、マキシゲン（Ｍａｘｙｇｅｎ）Ｉｎｃ．（www.maxigen.comにおけるワールドワイドウェブ上において利用可能である）によって開発されたような（限定されないが、これが挙げられる）、反復的な組み換えは、新規の酵素および経路の開発に使用され得る。例えば、Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370(4):389- 391、およびStemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91:10747-10751を参照すればよい。同様に、ジェネンコア（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）（genencor.comにおけるワールドワイドウェブ上において利用可能である）によって開発されたデザインパス（ＤｅｓｉｇｎＰａｔｈ）（登録商標）は、代謝経路操作（細胞において非天然アミノ酸を作り出す経路の操作が挙げられるが、これに限定されない）に任意に使用される。この技術は、新しい遺伝子（機能的なゲノミクスを介して同定された遺伝子が挙げられるが、これに限定されない）、ならびに分子進化および設計の組み合わせを用いて、宿主生物に存在する経路を再構築する。また、ディバーサコーポレーション（Ｄｉｖｅｒｓａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（diversa.comにおけるワールドワイドウェブ上において利用可能である）は、新しい経路を作り出すための（限定されないが、これが挙げられる）、遺伝子および遺伝子経路のライブラリを迅速にスクリーニングする技術を提供する。
【０３８１】
典型的に、本発明の設計された生合成経路を用いて産生された非天然アミノ酸は、タンパク質の効率的な生合成に十分な濃度（天然の細胞における量が挙げられるが、これに限定されない）に産生されるが、他のアミノ酸の濃度に影響する、または細胞性の資源を使い果たす程ではない。この方法においてインビボにおいて生成される典型的な濃度は、約１０ｍＭから０．０５ｍＭである。特定の経路に関して所望される酵素の生成に使用される遺伝子を備えるプラスミドを用いて、細胞が形質転換され、かつ非天然アミノ酸が生成されると、インビボにおける選択は、リボソームタンパク質の合成および細胞増殖の両方に対して、非天然アミノ酸の産生をさらに最適化するために、任意に使用される。
【０３８２】
非天然アミノ酸を有するポリペプチド
非天然アミノ酸の組み込みは、多様な目的（タンパク質構造および／または機能の変化の修正、大きさの変更、酸性度の変更、求核性の変更、水素結合の変更、疎水性の変更、プロテアーゼ標的部位の接触性の変更、部分に対する標的化の変更（タンパク質アレイ用が挙げられるが、これらに限定されない）、生物学的に活性な分子の付加、重合体の付与、放射性核種の付与、血中半減期の修飾、組織透過性（例えば、腫瘍）の修飾、活性な輸送の修飾、組織、細胞もしくは器官の特徴または分布の修飾、免疫原性の修飾、プロテアーゼ耐性の修飾などが挙げられるが、これらに限定されない）のためになされ得る。非天然アミノ酸を含むタンパク質は、増強されたかもしくはまったく新しい触媒的、または生物学的な性質を有し得る。例えば、以下の性質：毒性、体内分布、構造的性質、分光性質、化学的および／または光化学的な性質、触媒能、半減期（血中半減期が挙げられるが、これに限定されない）、ならびに他の分子との共有結合的または非共有結合的な（限定されないが、これらが挙げられる）反応能などは、タンパク質への非天然アミノ酸の含有によって任意に修飾される。少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むタンパク質を含む、組成物は、新規の治療、診断、触媒酵素、産業的なタンパク質（抗体が挙げられるが、これに限定されない）、ならびにタンパク質の構造および機能に関する研究（限定されないが、これらが挙げられる）に有用である。例えば、Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology, 4:645-652を参照すればよい。
【０３８３】
本発明の１つの局面において、少なくとも１（少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０以上が挙げられるが、これらに限定されない）の非天然アミノ酸を有する、少なくとも１つのタンパク質を含む。非天然アミノ酸は、同じであり得るか、異なり得る（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくはそれ以上の異なる、または同じ非天然アミノ酸を含むポリペプチドにおける、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくはそれ以上の異なる部位があり得ることが挙げられるが、これらに限定されない）。他の局面において、タンパク質に存在する特定のアミノ酸の、すべてではないが、少なくとも１つが非天然アミノ酸と置換されているタンパク質を含む。２つ以上の非天然アミノ酸を有する所定のタンパク質に関して、当該非天然アミノ酸は同一であり得るか、異なり得る（タンパク質が２つ以上の異なる種類の非天然アミノ酸を含み得るか、２つの同じ非天然アミノ酸を含み得ることが挙げられるが、これらに限定されない）。３つ以上の非天然アミノ酸を有する所定のタンパク質に関して、当該非天然アミノ酸は、同じであり得るか、異なり得るか、または少なくとも１つの非天然アミノ酸と複数の同種の非天然アミノ酸との組み合わせであり得る。
【０３８４】
少なくとも１つの非天然アミノ酸を有する所定のタンパク質またはポリペプチドは、本発明の特徴である。また、本発明は、本発明の組成物および方法を用いて産生された少なくとも１つの非天然アミノ酸を有する、タンパク質またはポリペプチドを包含する。また、賦形剤（薬学的に受容可能な賦形剤が挙げられるが、これに限定されない）は、タンパク質と共に存在し得る。
【０３８５】
非天然アミノ酸を有する所定のタンパク質またはポリペプチドを、真核細胞において産生することによって、タンパク質またはポリペプチドは、翻訳後修飾を典型的に含む。ある特定の実施形態において、タンパク質は、少なくとも１つの非天然アミノ酸、および真核細胞によってインビボにおいてなされた少なくとも１つの翻訳後修飾を含み、ここで、当該翻訳後修飾は、原核細胞によってなされない。例えば、翻訳後修飾としては、糖鎖形成、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミチン酸付加、リン酸化、糖脂質結合修飾、および糖鎖形成などが挙げられるが、これらに限定されない。１つの局面において、翻訳後修飾としては、ＧｌｃＮＡｃ−アスパラギン連結による、アスパラギンに対するオリゴサッカライド（（ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ）２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃが挙げられるが、これに限定されない）の付加が挙げられる。真核細胞のＮ結合型オリゴサッカライドのいくつかの例を載せている表１を参照すればよい（付加的な残基が存在し得るが、示されていない）。他の局面において、翻訳後修飾としては、ＧａｌＮＡｃ−セリン連結もしくはＧａｌＮＡｃ−スレオニン連結、またはＧｌｃＮＡｃ−セリン連結もしくはＧｌｃＮＡｃスレオニン連結による、セリンまたはスレオニンに対するオリゴサッカライド（Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃなどが挙げられるが、これらに限定されない）の付加が挙げられる。
【０３８６】
【表１】
0005840345.tif 000048
【０３８７】
さらにもう１つの局面において、翻訳後修飾としては、前駆体（カルシトニン前駆体、カルシトニン遺伝子関連ペプチド前駆体、プレプロ副甲状腺ホルモン（ｐｒｅｐｒｏｐａｒａｔｈｙｒｉｏｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、プレプロインシュリン、プロインシュリン、プレプロオピオメラノコルチン、およびプロオピオメラノコルチンなどが挙げられるが、これらに限定されない）のタンパク質分解性のプロセシング、多サブユニットタンパク質への集合もしくは巨大分子への集合、細胞における他の部位への移動（細胞小器官（例えば、小胞体、ゴルジ装置、核、リソソーム、ペルオキシソーム、ミトコンドリア、葉緑体、液胞など）または分泌経路の通過が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられる。ある特定の実施形態において、タンパク質は、分泌配列または局在化配列である、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、またはＧＳＴ融合などを備える。言及によって本明細書に組み込まれる米国特許第４，９６３，４９５号明細書および米国特許第６，４３６，６７４号明細書には、ｈＰＰポリペプチドの分泌を向上し得る構築物について詳細に説明されている。
【０３８８】
非天然アミノ酸の利点１つは、非天然アミノ酸が、付加的な分子の付加に使用され得る付加的な化学部分を与えることである。これらの修飾は、真核細胞もしくは原核細胞のインビボまたはインビトロにおいてなされ得る。従って、ある特定の実施形態において、翻訳後修飾は非天然アミノ酸を介する。例えば、翻訳後修飾は、求核−求電子反応を介し得る。タンパク質の選択的な修飾に現在、使用されるほとんどの反応は、求核反応パートナーと求電子反応パートナーとの間における共有結合（α−ハロケトンのヒスチジン側鎖またはシステイン側鎖との反応が挙げられるが、これらに限定されない）の形成に関する。これらの場合における選択性は、タンパク質における求核性残基の数および接触性によって決定される。本発明のタンパク質において、より選択的な他の反応は、例えば、非天然ケトアミノ酸の、ヒドラジドまたはアミノオキシ化合物との反応に使用され得る。例えば、すべてが言及によって本明細書に組み込まれる、Cornish et al, (1996) J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151;Mahal et al, (1997) Science. 276:1125-1128;Wang et al, (2001) Science 292:498-500;Chin et al, (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027;Chin et al, (2002) Proc. Natl. Acad. ScL 99: 11020-11024;Wang et al, (2003) Proc. Natl. Acad. ScL 100:56-61;Zhang et al, (2003) Biochemistry. 42:6735-6746；およびChin et al, (2003) Science. 301:964-7を参照すればよい。これは、多くの試薬（蛍光団、架橋剤、サッカライド誘導体および細胞毒性分子が挙げられるが、これらに限定されない）を用いたほとんどあらゆるタンパク質の選択的な標識を可能にする。また、言及によって本明細書に組み込まれる、“Glycoprotein synthesis”と題される米国特許第６，９２７，０４２を参照すればよい。また、アジドアミノ酸を介した（限定されないが、これが挙げられる）翻訳後修飾は、トリアリールホスフィン試薬を用いた（限定されないが、これが挙げられる）シュタウディンガー連結を介してなされ得る。例えば、Kiick et al, (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99: 19-24を参照すればよい。
【０３８９】
本発明は、タンパク質にアジド部分またはアルキニル部分（限定されないが、これらが挙げられる）を含む非天然アミノ酸の、セレクターコドンに応じた遺伝子的組み込みに関する、タンパク質の選択的な修飾のための他の高効率な方法を提供する。それから、これらのアミノ酸側鎖は、アジド誘導体またはアルキニル誘導体（限定されないが、これらが挙げられる）を別々に用いて、ヒュイゲン［３＋２］環付加反応（限定されないが、これが挙げられる）（例えば、Padwa, A. in Comprehensive Organic Synthesis. Vol. 4. (1991) Ed. Trost, B. M., Pergamon, Oxford, p. 1069-1109；およびHuisgen, R. in 1 ,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry. (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, New York, p. 1-176を参照すればよい）によって修飾され得る。この方法は、求核性置換よりむしろ環付加に関するので、タンパク質は極めて高い選択性を有して修飾され得る。この反応は、反応混合物に対する触媒量のＣｕ（Ｉ）塩の添加によって、水性条件の下に室温において、優れた位置選択性（１，４＞１，５）を有して達成され得る。例えば、Tornoe et al, (2002) J. Org. Chem. 67:3057-3064；およびRostovtsev et al, (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41: 2596-2599を参照すればよい。使用され得る他の方法は、テトラシステインモチーフを有するビス砒素化合物におけるリガンド交換である（例えば、Griffin et al, (1998) Science 281 :269-272を参照すればよい）。
【０３９０】
［３＋２］環付加を介して本発明のタンパク質に加えられ得る分子としては、アジド誘導体またはアルキニル誘導体を有するほとんどあらゆる分子が挙げられる。分子としては、色素、蛍光団、架橋剤、サッカライド誘導体、重合体（ポリエチレングリコールの誘導体が挙げられるが、これに限定されない）、光架橋剤、細胞毒性化合物、親和性標識、ビオチンの誘導体、樹脂、ビーズ、もう１のタンパク質もしくはポリペプチド（もしくはそれ以上）、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡなどが挙げられるが、これらに限定されない）、金属キレート剤、補足因子、脂肪酸、および炭水化物などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの分子は、アルキニル基（ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンが挙げられるが、これに限定されない）またはアジド基（ｐ−アジド−フェニルアラニンが挙げられるが、これに限定されない）を別々に有する非天然アミノ酸に加えられ得る。
【０３９１】
（Ｖ．非遺伝的にコードされたアミノ酸を備えるｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃのインビボにおける生成）
本発明のｈＰＰまたはｈＦｃポリペプチドは、天然に生じる系にコードされないアミノ酸を加えるか、または置換するために、修飾ｔＲＮＡおよび修飾ｔＲＮＡシンセターゼを用いてインビボにおいて生成され得る。
【０３９２】
天然に生じる系にコードされないアミノ酸を使用するｔＲＮＡおよびｔＲＮＡシンセターゼを生成する方法は、言及によって本明細書に組み込まれる、米国特許第７，０４５，３３７号明細書および米国特許出願公開第２００３／０１０８８８５号（整理番号第１０／１２６，９３１号）明細書に記載されている。これらの方法は、翻訳系に対して内在性のシンセターゼおよびｔＲＮＡと独立して機能する（そして、このためにときに“直交”と呼ばれる）、翻訳機構の生成に関与する。典型的に、当該翻訳系は、直交化ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）および直交化アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む。典型的に、Ｏ−ＲＳは、翻訳系における少なくとも１つの非天然に生じるアミノ酸と共にＯ−ｔＲＮＡを好ましくアミノアシル化し、かつＯ−ｔＲＮＡは、当該系における他のｔＲＮＡによって認識されない、少なくとも１つのセレクターコドンを認識する。従って、当該翻訳系は、コードされたセレクターコドンに応じて、当該系において産生されるタンパク質に非天然にコードされたアミノ酸を挿入して、これによってコードされたポリペプチドにおける所定の位置にアミノ酸を“置換する”。
【０３９３】
広範な直交化ｔＲＮＡおよびアミノアシルｔＲＮＡは、ポリペプチドに特定の合成アミノ酸を挿入する当該技術において説明されており、かつ一般的に本発明における使用に好適である。例えば、ケト特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼは、Wang, L.et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:56-61 (2003) 、およびZhang, Z.et al, Biochem. 42(22):6735-6746 (2003)に記載されている。例示的なＯ−ＲＳまたはこれらの一部は、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号明細書および米国特許出願公開第２００３／０１０８８８５号明細書（それぞれ、言及によって本明細書に組み込まれる）に開示されている、ポリヌクレオチド配列にコードされ、かつアミノ酸配列を含む。また、Ｏ−ＲＳと共に使用するための対応するＯ−ｔＲＮＡ分子は、言及によって本明細書に組み込まれる、米国特許第７，０４５，３３７号明細書および米国特許出願公開第２００３／０１０８８８５号（整理番号第１０／１２６，９３１号）明細書に記載されている。
【０３９４】
アジド特異的なＯ−ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼの系の例が、Chin, J. W., et al, J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002) に記載されている。ｐ−アジド−Ｌ−Ｐｈｅ用の例示的なＯ−ＲＳ配列としては、言及によって本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００３／０１０８８８５号（整理番号第１０／１２６，９３１号）明細書に記載されているように、配列番号１４−１６および２９−３２のヌクレオチド配列、ならびに配列番号４６−４８および６１−６４のアミノ酸配列が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の使用に好適な例示的なＯ−ｔＲＮＡ配列としては、言及によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００３／０１０８８８５号（整理番号第１０／１２６，９３１号）明細書に開示されているように、配列番号１−３のヌクレオチド配列が挙げられるが、これらに限定されない。特定の非天然にコードされたアミノ酸に対して特異的なＯ−ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼの他の例が、言及によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，０４５，３３７号明細書に記載されている。Ｓ．セレビジアエにおいてケト含有アミノ酸およびアジド含有アミノ酸の両方を組み込む、Ｏ−ＲＳおよびＯ−ｔＲＮＡについて、Chin, J. W.et al, Science 301 :964-967 (2003). に記載されている。
【０３９５】
様々な他の直交化対が報告されている。Ｓ．セレビジアエのｔＲＮＡおよびシンセターゼから由来する、グルタミニル系（例えば、Liu, D. R., and Schultz, P. G. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96:4780-4785を参照すればよい）、アスパルチル系（例えば、Pastrnak, M.et al, (2000) HeIv. Chim. Acta 83:2277-2286を参照すればよい）、およびチロシル系（例えば、Ohno, S.et al, (1998) J. Biochem. (Tokyo. Jpn.) 124:1065-1068；およびKowal, A. K.et al, (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98:2268-2273を参照すればよい）が、Ｅ．  ｃｏｌｉにおける非天然アミノ酸の見込みのある組み込みについて記載されている。Ｅ．  ｃｏｌｉのグルタミニルシンセターゼ（例えば、Kowal, A. K.et al, (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98:2268-2273を参照すればよい）、およびチロシルシンセターゼ（例えば、Edwards, H., and Schimmel, P. (1990) MoI. Cell. Biol. 10:1633-1641を参照すればよい）に由来する系は、Ｓ．セレビジアエにおける使用に関して記載されている。Ｅ．  ｃｏｌｉのチロシル系は、哺乳類細胞における、３−ヨード−Ｌ−チロシンのインビボにおける組み込みに使用されている。Sakamoto, K.et al, (2002) Nucleic Acids Res. 30:4692-4699を参照すればよい。
【０３９６】
Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼの使用は、非天然にコードされたアミノ酸をコードする特異的なコドンの選択に関与する。あらゆるコドンが使用され得るが、一般的にＯ−ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼが発現されている細胞において、まれにしか使用されないか、または決して使用されないコドンを選択することが好ましい。例えば、例示的なコドンとしては、ナンセンスコドン（例えば、ストップコドン（アンバー、オーカー、およびオパール））、４以上の塩基コドン、ならびにまれにしか使用されない、または使用されない他の天然の３塩基コドンが挙げられる。
【０３９７】
特異的なセレクターコドンは、当該技術において公知の突然変異生成方法（部位特異的突然変異生成法、カセット突然変異生成法、制限選択突然変異生成法などが挙げられるが、これらに限定されない）を用いて、ｈＰＰポリヌクレオチドのコード配列における適切な位置に導入され得る。
【０３９８】
タンパク質の生合成機構の構成要素（例えば、非天然アミノ酸を組み込むために使用され得るＯ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡおよびＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対）を生成する方法は、Wang, L., et al Science 292: 498-500 (2001);Chin, J. W.et al, J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002) ;Zhang, Z.et al, Biochemistry 42: 6735-6746 (2003) に記載されている。非天然アミノ酸のインビボにおける組み込みのための方法および組成物は、言及によって本明細書に組み込まれる、米国特許第７，０４５，３３７号明細書に記載されている。また、生体のインビボにおける翻訳系に使用する、直交化ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンセターゼ対を選択する方法は、言及によって本明細書に組み込まれる、米国特許第７，０４５，３３７号明細書、および米国特許出願公開第２００３／０１０８８８５号（整理番号第１０／１２６，９３１号）明細書に記載されている。その全体が言及によって本明細書に組み込まれる、“Site Specific Incorporation of Keto Amino Acids into proteins”と題される国際公開第０４／０３５７４３号パンフレットには、ケトアミノ酸の組み込み用の直交化ＲＳおよびｔＲＮＡ対について記載されている。その全体が言及によって本明細書に組み込まれる、“Expanding the Eukaryotic Genetic Code”と題される国際公開第０４／０９４５９３号パンフレットには、真核宿主細胞における非天然にコードされたアミノ酸の組み込み用の直交化ＲＳおよびｔＲＮＡ対について記載されている。
【０３９９】
少なくとも１つの組み換え直交化アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）を産生する方法は：（ａ）第１の生物（原核生物（例えば、メタノコッカス  ジャナスキー、メタノバクテリウム  テルモアウトトゥロフィクム、ハロバクテリウム、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ａ．  フンギドゥス、Ｐ．  フリオシス、Ｐ．  ホリコシー、Ａ．  ペルニクス、またはＴ．  テルモフィルスなど）または真核生物が挙げられるが、これらに限定されない）から、少なくとも１つのアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼから誘導体化された（任意に突然変異した）ＲＳのライブラリを生成すること；（ｂ）非天然アミノ酸および天然アミノ酸の存在下において直交化ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化する構成要素のためのＲＳ（任意に突然変異したＲＳ）のライブラリを選択（および／またはスクリーニング）し、これによって活性な（任意に突然変異した）ＲＳのプールを提供すること；および／または（ｃ）非天然アミノ酸の非存在下においてＯ−ｔＲＮＡを好ましくアミノアシル化する活性なＲＳ（突然変異体ＲＳが挙げられるが、これに限定されない）のプールを、（任意にネガティブ選択を介して）選択し、これによって少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡを提供することを包含し；ここで、少なくとも１つの当該組み換えＯ−ＲＳは、非天然アミノ酸と共に当該Ｏ−ＲＳを好ましくアミノアシル化する。
【０４００】
１つの実施形態において、ＲＳは不活性ＲＳである。不活性ＲＳは、活性なＲＳを突然変異させることによって生成され得る。例えば、不活性ＲＳは、異なるアミノ酸（アラニンが挙げられるが、これに限定されない）に対して、少なくとも約１つ、少なくとも約２つ、少なくとも約３つ、少なくとも約４つ、少なくとも約５つ、少なくとも約６つ、または少なくとも約１０以上のアミノ酸を突然変異することによって生成され得る。
【０４０１】
突然変異体ＲＳのライブラリは、当該分野において公知の多様な技術（三次元のＲＳ構造に基づいた合理的な設計、または無作為のもしくは合理的な技術におけるＲＳヌクレオチドの突然変異生成法が挙げられるが、これらに限定されない）を用いて生成され得る。例えば、突然変異体ＲＳは、部位特異的突然変異生成法、無作為の突然変異生成法、多様性生成組み換え突然変異、キメラ構築、合理的な設計、ならびに本明細書に記載されているか、もしくは当該技術において公知の他の方法によって、生成され得る。
【０４０２】
１つの実施形態において、活性な構成要素（非天然アミノ酸および天然アミノ酸の存在下において直交化ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化する構成要素が挙げられるが、これに限定されない）のためのＲＳ（任意に突然変異したＲＳ）のライブラリを選択（および／またはスクリーニング）することは：スクリーニングマーカー（抗生物質耐性遺伝子などが挙げられるが、これに限定されない）、および（任意に突然変異した）ＲＳのライブラリを、複数の細胞に導入すること（ここで、ポジティブ選択および／またはスクリーニングマーカーは、少なくとも１つのセレクターコドン（アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドンが挙げられるが、これらに限定されない）を備える）；選択薬剤の存在下において複数の細胞を成長させること；ポジティブ選択またはスクリーニングマーカーにおける少なくとも１つのセレクターコドンを抑圧することによって、選択薬剤および／またはスクリーニング薬剤の存在下において、生存する（または特異的な反応を示す）細胞を同定し、これによって活性な（任意に突然変異した）ＲＳのプールを含むポジティブに選択された細胞の一部を提供すること；を含む。任意に、選択薬剤および／またはスクリーニング薬剤の濃度は、変更され得る。
【０４０３】
１つの局面において、ポジティブ選択マーカーは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子であり、かつセレクターコドンは、ＣＡＴ遺伝子におけるアンバーストップコドンである。任意に、ポジティブ選択マーカーはβ−ラクタマーゼ遺伝子であり、かつセレクターコドンはβ−ラクタマーゼ遺伝子におけるアンバーストップコドンである。他の局面において、ポジティブ選択マーカーは、蛍光もしくは発光のスクリーニングマーカー、または親和性に基づくスクリーニングマーカー（細胞表面マーカーが挙げられるが、これに限定されない）を備える。
【０４０４】
１つの実施形態において、非天然アミノ酸の非存在下においてＯ−ｔＲＮＡを好ましくアミノアシル化する活性なＲＳ（任意に突然変異した）に関するプールの、ネガティブ選択またはネガティブスクリーニングは：ポジティブ選択またはスクリーニングマーカーからの活性な（任意に突然変異した）ＲＳのプールと共に、ネガティブ選択マーカー、またはネガティブスクリーニングマーカーを、第２の生物の複数の細胞に導入すること（ここで、ネガティブ選択マーカー、またはネガティブスクリーニングマーカーは、少なくとも１つのセレクターコドン（抗生物質耐性遺伝子（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子が挙げられるが、これに限定されない）が挙げられるが、これに限定されない）を備える）；ならびに非天然アミノ酸、およびスクリーニング薬剤もしくは選択薬剤を補った第１の培地において生存するか、または特異的なスクリーニング反応を示すが、非天然アミノ酸およびスクリーニング薬剤もしくは選択薬剤を補っていない第２の培地において生存できないか、または特異的なスクリーニング反応を示さない細胞を同定し、これによって少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳを有する生存細胞または選別された細胞を提供することを含む。例えば、ＣＡＴ同定手順は、適切なＯ−ＲＳ組み換え体の決定において、ポジティブ選択および／またはネガティブ選択として任意に役割を果たす。例えば、クローンのプールは、非天然アミノ酸を有するか、または有しないＣＡＴ（少なくとも１つのセレクターコドンを備える）を含む成長プレート上において、任意に複製される。従って、非天然アミノ酸を含むプレート上において排他的に成長するコロニーは、組み換えＲＳを含んでいるとみなされる。１つの局面において、選択（および／またはスクリーニング）薬剤の濃度は、変更される。いくつかの実施形態において、第１および第２の生物は異なる。従って、第１および／または第２の生物は、原核生物、真核生物、哺乳類、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、菌類、酵母、アルカエバクテリウム、ユウバクテリウム、植物、昆虫、原生生物などを任意に含む。他の実施形態において、スクリーニングマーカーは、蛍光もしくは発光のスクリーニング、または親和性に基づくスクリーニングマーカーを含む。
【０４０５】
他の実施形態において、活性な（任意に突然変異した）ＲＳに関するプールのスクリーニングまたは選択（ネガティブ選択が挙げられるが、これに限定されない）は：ポジティブ選択の段階（ｂ）から活性な突然変異体ＲＳのプールを単離することと；ネガティブ選択マーカー、またはネガティブスクリーニングマーカー（ここで、ネガティブ選択マーカー、またはネガティブスクリーニングマーカーは、少なくとも１つのセレクターコドン（少なくとも１つのセレクターコドンを備える毒性マーカー遺伝子（リボヌクレアーゼバルナーゼ（ｂａｒｎａｓｅ）遺伝子が挙げられるが、これに限定されない）が挙げられるが、これに限定されない）を備える）、ならびに活性な（任意に突然変異した）ＲＳのプールを、第２の生物の複数の細胞に導入することと；非天然アミノ酸を補っていない第１の培地において生存するか、または特異的なスクリーニング反応を示すが、非天然アミノ酸を補った第２の培地において生存できないか、または特異的なスクリーニング反応を示さない細胞を同定し、これによって非天然アミノ酸に特異的な少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳを有する生存細胞、または選別細胞を提供することとを含み、ここで、少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳは非天然にコードされたアミノ酸に特異的である。１つの局面において、少なくとも１つのセレクターコドンは、約２つ以上のセレクターコドンを備える。そのような実施形態は、少なくとも１つのセレクターコドンが約２つ以上のセレクターコドンを備える場合、ならびに第１および第２の生物が異なる場合（それぞれの生物が、任意に原核生物、真核生物、哺乳類、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、菌類、酵母、アルカエバクテリウム、ユウバクテリウム、植物、昆虫、原生生物など（限定されないが、これらが挙げられる）である場合が挙げられるが、これらに限定されない）を任意に含むことができる。また、いくつかの局面は、ネガティブ選択マーカーが、リボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子（少なくとも１つのセレクターコドンを備える）を備える場合を含む。他の局面は、スクリーニングマーカーが蛍光もしくは発光のスクリーニングマーカー、または親和性に基づくスクリーニングマーカーを任意に備える場合を含む。本明細書における実施形態において、スクリーニングおよび／または選択は、スクリーニングおよび／または選択のストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）の変動を任意に含む。
【０４０６】
他の実施形態において、少なくとも１つの組み換え直交化アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）を産生する方法は：（ｄ）少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳを単離すること；（ｅ）少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳから誘導体化されたＯ−ＲＳ（任意に突然変異した）の第２のセットを生成すること；ならびに（ｆ）Ｏ−ｔＲＮＡを好ましくアミノアシル化する能力を備える突然変異したＯ−ＲＳが得られるまで、段階（ｂ）および（ｃ）を繰り返すことをさらに含む。段階（ｄ）−（ｆ）は、任意に繰り返される（少なくとも２回が挙げられるが、これに限定されない）。１つの局面において、少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳから誘導体化された突然変異したＯ−ＲＳの第２のセットは、突然変異生成法（無作為の突然変異生成法、部位特異的突然変異生成法、組み換え、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない）によって生成され得る。
【０４０７】
選択／スクリーニングの段階（上述した方法における、ポジティブ選択／スクリーニングの段階（ｂ）か、ネガティブ選択／スクリーニングの段階（ｃ）か、ポジティブおよびネガティブ選択／スクリーニングの段階（ｂ）および（ｃ）の両方かのいずれかが挙げられるが、これらに限定されない）のストリンジェンシーは、選択／スクリーニングのストリンジェンシーの変更を任意に含む。他の実施形態において、ポジティブ選択／スクリーニングの段階（ｂ）か、ネガティブ選択／スクリーニングの段階（ｃ）か、ポジティブおよびネガティブ選択／スクリーニングの段階（ｂ）および（ｃ）の両方かのいずれかは、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）によって検出されるか、または発光によって検出されるレポーターを使用することを含む。レポーターは、細胞表面、またはファージディスプレイなどに並び、かつ非天然アミノ酸または類似体に関する親和性、または触媒活性に基づいて選択される。１つの実施形態において、突然変異したシンセターゼは、細胞表面またはファージディスプレイなどに並ぶ。
【０４０８】
組み換え直交化ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を産生する方法は：（ａ）第１の生物に由来する少なくとも１つのｔＲＮＡ（サプレッサーｔＲＮＡが挙げられるが、これに限定されない）から誘導体化された突然変異体ｔＲＮＡのライブラリを生成すること；（ｂ）第１の生物に由来するＲＳの非存在下において、第２の生物に由来するアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（ＲＳ）によってアミノアシル化される（任意に突然変異した）ｔＲＮＡに関するライブラリを選択（ネガティブ選択が挙げられるが、これに限定されない）、またはスクリーニングし、これによってｔＲＮＡ（任意に突然変異した）のプールを提供すること；ならびに（ｃ）導入された直交化ＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によってアミノアシル化される構成要素に関するｔＲＮＡ（任意に突然変異した）のプールを選択またはスクリーニングし、これによって少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡを提供することを含み；ここで、少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡは、セレクターコドンを認識し、かつ第２の生物に由来するＲＳによって効率的に認識されず、かつＯ−ＲＳによって好ましくアミノアシル化される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのｔＲＮＡは、サプレッサーｔＲＮＡであり、および／または、天然および／または非天然の塩基の固有な３塩基コドンを備えるか、ナンセンスコドン、レアコドン、非天然コドン、少なくとも４塩基を備えるコドン、アンバーコドン、オーカーコドン、もしくはオパールストップコドンである。１つの実施形態において、組み換えＯ−ｔＲＮＡは、向上した直交性を備えている。いくつかの実施形態において、Ｏ−ｔＲＮＡが修飾を必要とせずに、第２の生物から第１の生物に任意に取り込まれることが理解される。多様な実施形態において、第１および第２の生物は、同じであるか、または異なり、かつ原核生物（メタノコッカス  ジャナスキー、メタノバクテリウム  テルモアウトトゥロフィクム、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ハロバクテリウムなどが挙げられるが、これらに限定されない）、真核生物、哺乳類、菌類、酵母、アルカエバクテリウム、ユウバクテリウム、植物、昆虫、原生生物など（限定されないが、これらが挙げられる）から任意に選択される。付加的に、組み換えｔＲＮＡは、天然にか、または遺伝子操作を介してインビボにおいて生合成される非天然アミノ酸によって、任意にアミノアシル化される。非天然アミノ酸は、少なくとも第１または第２の生物に使われる成長培地に任意に加えられる。
【０４０９】
１つの局面において、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼによってアミノアシル化される（任意に突然変異した）ｔＲＮＡに関するライブラリの選択（ネガティブ選択が挙げられるが、これに限定されない）またはスクリーニング（段階（ｂ））は：毒性マーカー遺伝子（ここで、毒性マーカー遺伝子が、少なくとも１つのセレクターコドンを備える（または少なくとも１つのセレクターコドンを備える毒性マーカー遺伝子が、毒性薬剤もしくは静止薬剤の産生を導く遺伝子か、生物に必須の遺伝子を備える））、および（任意に突然変異した）ｔＲＮＡのライブラリを、第２の生物に由来する複数の細胞に導入すること；ならびに生存細胞を選択すること（ここで、生存細胞は、少なくとも１つの直交化ｔＲＮＡまたは非機能的ｔＲＮＡを備える（任意に突然変異した）ｔＲＮＡのプールを含む）を含む。例えば、生存細胞は、比較比率細胞密度アッセイ（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｒａｔｉｏ  ｃｅｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ａｓｓａｙ）を用いることによって選択され得る。
【０４１０】
他の局面において、毒性マーカー遺伝子は、２つ以上のセレクターコドンを含み得る。当該方法の他の実施形態において、毒性マーカー遺伝子は、少なくとも１つのアンバーコドンを備えるリボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子である。任意に、リボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子は、２つ以上のアンバーコドンを含み得る。
【０４１１】
１つの実施形態において、導入された直交化ＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によってアミノアシル化される構成要素に関する（任意に突然変異した）ｔＲＮＡのプールの選択またはスクリーニングは：ポジティブ選択マーカー遺伝子またはポジティブスクリーニングマーカー遺伝子（ここで、ポジティブマーカー遺伝子は、薬剤耐性遺伝子（少なくとも１つのセレクターコドン（例えば、少なくとも１つのアンバーストップコドン）を備えるβ−ラクタマーゼ遺伝子が挙げられるが、これに限定されない）、または生物に必須の遺伝子、またはＯ−ＲＳと共に毒性薬剤の無毒化を導く遺伝子を備える）、および（任意に突然変異した）ｔＲＮＡのプールを、第２の生物に由来する複数の細胞に導入すること；ならびに選択薬剤またはスクリーニング薬剤（抗生物質が挙げられるが、これに限定されない）の存在下において成長された、生存細胞または選択細胞を同定し、これによって少なくとも１つの組み換えｔＲＮＡを備える細胞のプールを提供すること（ここで、少なくとも組み換えｔＲＮＡは、Ｏ−ＲＳによってアミノアシル化され、かつ少なくとも１つのセレクターコドンに応じて、ポジティブマーカー遺伝子によってコードされる転写産物にアミノ酸を挿入する）を含むことができる。他の実施形態において、選択薬剤および／またはスクリーニング薬剤の濃度は、変更される。
【０４１２】
特定のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を生成する方法が提供される。方法は：（ａ）第１の生物に由来する少なくとも１つのｔＲＮＡから誘導体化された突然変異体ｔＲＮＡのライブラリを生成すること；（ｂ）第２の生物に由来するアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（ＲＳ）によってアミノアシル化される（任意に突然変異した）ｔＲＮＡに関するライブラリを、第１の生物に由来するＲＳの非存在下において、ネガティブ選択またはネガティブスクリーニングし、これによって（任意に突然変異した）ｔＲＮＡのプールを提供すること；（ｃ）導入された直交化ＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によってアミノアシル化される構成要素に関する（任意に突然変異した）ｔＲＮＡのプールを選択またはスクリーニングし、これによって少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡを提供することを含む。少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡは、セレクターコドンを認識し、かつ第２の生物に由来するＲＳによって効率的に認識されず、かつＯ−ＲＳによって好ましくアミノアシル化される。また、当該方法は、（ｄ）第３の生物に由来する少なくとも１つのアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（ＲＳ）から誘導体化された（任意に突然変異した）ＲＳのライブラリを生成すること；（ｅ）少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡを好ましくアミノアシル化する構成要素に関する突然変異体ＲＳのライブラリを、非天然にコードされたアミノ酸および天然アミノ酸の存在下において選択またはスクリーニングし、これによって活性な（任意に突然変異した）ＲＳのプールを提供すること；ならびに（ｆ）少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡを好ましくアミノアシル化する活性な（任意に突然変異した）ＲＳに関するプールを、非天然にコードされたアミノ酸の非存在下において、ネガティブ選択またはネガティブスクリーニングし、これによって少なくとも１つの特異的なＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を提供すること（ここで、少なくとも１つのＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対は、非天然にコードされたアミノ酸および少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡに対して特異的な、少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳを備える）を含む。当該方法によって産生される特異的なＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対が包含される。例えば、特異的なＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対としては、ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ−ｍｕｔＴｙｒＲＳ対（例えば、ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ−ＳＳ１２ＴｙｒＲＳ対）、ｍｕｔＲＮＡＬｅｕ−ｍｕｔＬｅｕＲＳ対、ｍｕｔＲＮＡＴｈｒ−ｍｕｔＴｈｒＲＳ対、またはｍｕｔＲＮＡＧｌｕ−ｍｕｔＧｌｕＲＳ対などが挙げることができるが、これらに限定されない。付加的に、そのような方法は、第１および第３の生物が同じ生物（メタノコッカス  ジャナスキーが挙げられるが、これに限定されない）である場合を含む。
【０４１３】
また、第２の生物のインビボにおける翻訳系に使用するための直交化ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンセターゼ対を選択する方法は、本発明に含まれる。当該方法は：マーカー遺伝子、第１の生物から単離されたか、誘導体化されたｔＲＮＡおよびアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（ＲＳ）を、第２の生物に由来する第１の細胞のセットに導入すること；第２の生物に由来する二重の細胞セットにマーカー遺伝子およびｔＲＮＡを導入すること；ならびに二重の細胞セットにおいて生存することができない第１のセットにおける生存細胞を選択すること、または二重の細胞セットにおいて特異的なスクリーニング反応を示すことができないそのような反応を示す細胞を選択すること（ここで、第１のセットおよび二重の細胞セットは、選択薬剤またはスクリーニング薬剤の存在下において成長され、ここで、生存細胞または選択細胞は、第２の生物のインビボにおける翻訳系に使用するための直交化ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンセターゼ対を備える）を含む。１つの実施形態において、比較、および選択もしくはスクリーニングは、インビボ相補的アッセイを含む。選択薬剤またはスクリーニング薬剤の濃度は、変更され得る。
【０４１４】
本発明の生物は、多様な生物および多様な組み合わせを含む。例えば、本発明の方法の第１および第２の生物は、同じであり得るか、または異なり得る。１つの実施形態において、生物は、任意に原核生物（メタノコッカス  ジャナスキー、メタノバクテリウム  テルモアウトトゥロフィクム、ハロバクテリウム、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ａ．フンギドゥス、Ｐ．  フリオスス、Ｐ．  ホリコシー、Ａ．  ペルニクス、またはＴ．  テルモフィルスなどが挙げられるが、これらに限定されない）である。代替可能に、生物は、任意に真核生物（植物（複合体植物（例えば、単子葉植物または双子葉植物）が挙げられるが、これらに限定されない）、藻類、原生生物、菌類（酵母が挙げられるが、これに限定されない）、または動物（哺乳類、昆虫、節足動物などが挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない）などである。他の実施形態において、第２の生物は、原核生物（メタノコッカス  ジャナスキー、メタノバクテリウム  テルモアウトトゥロフィクム、ハロバクテリウム、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ａ．  フンギドゥス、ハロバクテリウム、Ａ．フンギドゥス、Ｐ．  フリオスス、Ｐ．  ホリコシー、Ａ．  ペルニクス、またはＴ．  テルモフィルスなどが挙げられるが、これらに限定されない）である。代替可能に、第２の生物は、真核生物（酵母、動物細胞、植物細胞、菌類、または哺乳類細胞などが挙げられるが、これらに限定されない）であり得る。多様な実施形態において、第１および第２の生物は異なる。
【０４１５】
（ＶＩ．ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃにおける非天然アミノ酸の位置）
本発明は、ｈＰＰまたはｈＦｃポリペプチドへの１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸の組み込みを意図する。１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸は、ポリペプチドの活性を破壊しない特定の位置に組み込まれ得る。これは、“保存的な”置換（疎水性のアミノ酸を用いた疎水性アミノ酸の置換、大きなアミノ酸を用いた大きなアミノ酸の置換、親水性のアミノ酸を用いた親水性アミノ酸の置換が挙げられるが、これらに限定されない）、および／または活性に不要な位置に非天然アミノ酸の挿入することによって達成され得る。
【０４１６】
広範な生化学的および構造的な手法は、ｈＰＰまたはｈＦｃポリペプチド内における非天然にコードされたアミノ酸を用いた置換を目的とする、所望の部位の選択に採用され得る。ポリペプチド鎖のあらゆる部位が、非天然にコードされたアミノ酸を組み込むための選択に好適であり、かつ選択は、あらゆる目的もしくは特に所望ではない目的に関して、合理的な設計、または無作為の選択に基づき得ることは、当業者にとって容易に理解される。所望の部位の選択は、あらゆる所望の性質、または活性を有するｈＰＰまたはｈＦｃ分子を産生するためであり得る。当該あらゆる所望の性質または活性としては、アゴニスト、スーパーアゴニスト、インバースアゴニスト、アンタゴニスト、受容体結合修飾物質、受容体活性修飾物質、結合パートナー対する結合の修飾物質、結合パートナー活性修飾物質、結合パートナー高次構造修飾物質、ニ量体形成もしくはマルチマー形成、本来の分子と比較して活性もしくは性質に対して変化がないこと、またはポリペプチドの物理的もしくは化学的な性質（例えば、可溶性、凝集または安定性）を操作することなどが挙げられる。例えば、ｈＰＰまたはｈＦｃポリペプチドの生物活性に必要なポリペプチドにおける位置は、当該分野において公知の点突然変異分析、アラニン走査、または相同物スキャニング法を用いて同定され得る。言及によって本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５８０，７２３号明細書；米国特許第５，８３４，２５０号明細書；米国特許第６，０１３，４７８号明細書；米国特許第６，４２８，９５４号明細書；および米国特許第６，４５４，５６１号明細書には、標的物質と共にポリペプチドの活性に影響する活性ドメインの同定によって、ポリペプチド（例えば、ｈＧＨ）の構造および機能を体系的に解析する方法について記載されている。アラニン走査突然変異生成法、または相同物スキャニング突然変異生成法によって、生物活性に重要であるとして同定されたもの以外の残基は、ポリペプチドに求められる所望の活性に依存して、非天然にコードされたアミノ酸を用いた置換にとって、良好な候補物であり得る。また代替可能に、生物活性に重要であるとして同定された部位は、この場合もやはり、ポリペプチドに求められる所望の活性に依存して、非天然にコードされたアミノ酸を用いた置換にとって、良好な候補物であり得る。他の代替可能物は、ポリペプチド鎖の各位置における、非天然にコードされたアミノ酸を用いた連続する置換を簡単に行い、かつポリペプチドの活性に関する影響を観察するためのものである。非天然にコードされたアミノ酸を用いたあらゆるポリペプチドへの置換に関する位置を選択する、あらゆる手段、技術または方法が、本発明における使用に好適であることは、当業者にとってたやすく理解される。
【０４１７】
また、欠失を含む、ｈＰＰポリペプチドの天然に生じる突然変異体の構造および活性が、非天然にコードされたアミノ酸を用いた置換の耐性があると思われるタンパク質の領域を決定するために調査され得る。非天然にコードされたアミノ酸を用いた置換に耐性がないと思われる残基が排除されていると、残りのそれぞれの位置における提案された置換の影響は、ｈＰＰまたはｈＦｃポリペプチドおよびその結合タンパク質の３次元結晶構造から調査され得る。３次元構造データが利用できない場合には、モデルによって、ポリペプチドの２次または３次の構造を調べる状態になり得る。従って、当業者は、非天然にコードされたアミノ酸を用いて置換され得るアミノ酸の位置を、容易に同定し得る。
【０４１８】
いくつかの実施形態において、本発明のｈＰＰまたはｈＦｃポリペプチドは、ポリペプチドの２次構造を破壊しないタンパク質の領域に位置される、１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸を含む。
【０４１９】
いくつかの実施形態において、ｈＡの２次構造に対応する以下の領域：１位より前（すなわち、Ｎ末端において）、１７位、３４位、５５位、５６位、５８位、６０位、８１位、８２位、８６位、９２位、９４位、１１１位、１１４位、１１６位、１１９位、１２９位、１７０位、１７２位、１７３位、２７６位、２７７位、２８０位、２９７位、３００位、３０１位、３１３位、３１７位、３２１位、３６２位、３６３位、３６４位、３６５位、３６８位、３７５位、３９７位、４３９位、４４２位、４９５位、４９６位、４９８位、５００位、５０１位、５０５位、５１５位、５３８位、５４１位、５４２位、５６０位、５６２位、５６４位、５７４位、５８１位、および５８２位の後（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端において）（配列番号１）のうちの１つかそれ以上の領域内の任意の位置に、１つかそれ以上の非天然にコードされたアミノ酸が組み込まれる。
【０４２０】
広範な非天然にコードされたアミノ酸は、ｈＰＰまたはｈＦｃポリペプチドの所定の位置に対して置換され得るか、またはｈＰＰまたはｈＦｃポリペプチドの所定の位置に組み込まれ得る。一般的に、特定の非天然にコードされたアミノ酸は、自らの受容体または結合パートナーを伴うｈＰＰまたはｈＦｃポリペプチドの３次元結晶構造の調査、非天然にコードされたアミノ酸に基づく保存的な置換（すなわち、Ｐｈｅ、ＴｙｓまたはＴｒｐに対するアリールに基づく非天然にコードされたアミノ酸（例えば、ｐ−アセチルフェニルアラニンまたはＯ−プロパルギルチロシン）の置換）に対する好ましさ、およびｈＰＰまたはｈＦｃポリペプチドへ導入するために所望する特定の接合化学的性質（例えば、アルキル部分を有する水溶性重合体とのヒュイゲン［３＋２］環付加をもたらすこと、またはホスフィン部分を順番に組み込むアリールエステルを有する水溶性重合体とのアミド結合形成を望む場合には、４−アジドフェニルアラニンの導入）に基づいて、組み込みに関して選択される。
【０４２１】
１つの実施形態において、方法は、非天然アミノ酸をポリペプチドに組み込むことをさらに含み、ここで、非天然アミノ酸は、第１の反応性基；および第２の反応性基を含む分子（標識、色素、重合体、水溶性重合体、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋剤、放射性核種、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、樹脂、もう１のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似物、抗体もしくは抗体断片、金属キレート剤、補足因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、抑制性リボ核酸、生体材料、ナノ粒子、スピン標識、蛍光団、金属含有部分、放射性部分、新規な官能基、他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基、光ケージド（ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ）部分、化学線励起可能な部分、光異性化可能な部分、ビオチン、ビオチンの誘導体、ビオチン類似物、重原子組み込み部分、化学切断可能な基、光切断可能な部分、延長された側鎖、炭素結合型の糖、酸化還元反応活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学プローブ、燐光基、化学発光基、電子密度基、磁性基、挿入基、発色団、エネルギー転移剤、生物学的に活性な薬剤、検出可能な標識、小分子、量子ドット、ナノトランスミッター、放射性ヌクレオチド、放射性伝達物質、中性子捕獲物質、または上述のもののあらゆる組み合わせ、または他の所望の化合物もしくは物質が挙げられるが、これらに限定されない）とのタンパク質の接続を含む。第１の反応性基は、第２の反応性基と反応して、［３＋２］環付加を介して非天然アミノ酸に分子を付与する。１つの実施形態において、第１の反応性基はアルキニル部分またはアジド部分であり、かつ第２の反応性基はアジド部分またはアルキニル部分である。例えば、第１の反応性基がアルキニル部分（ｐ−プロパルギルフェニルアラニンが挙げられるが、これに限定されない）であり、かつ第２の反応性基はアジド部分である。他の例において、第１の反応性基はアジド部分（ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンが挙げられるが、これに限定されない）であり、かつ第２の反応性基はアルキニル部分である。
【０４２２】
いくつかの場合において、非天然にコードされたアミノ酸置換は、ｈＰＰポリペプチド内の他の付加、置換または欠失と組み合わせられて、ｈＰＰまたはｈＦｃポリペプチドの他の生物学的特色に影響を及ぼす。いくつかの場合において、他の付加、置換または欠失は、ｈＰＰまたはｈＦｃポリペプチドの安定性（タンパク質分解性の消化に対する耐性が挙げられるが、これに限定されない）を増強し得るか、またはその受容体または結合パートナーに対するｈＰＰまたはｈＦｃポリペプチドの親和性を増強し得る。いくつかの場合において、他の付加、置換または欠失は、ｈＰＰまたはｈＦｃポリペプチドの可溶性（Ｅ．  ｃｏｌｉまたは他の宿主細胞において発現される場合が挙げられるが、これらに限定されない）を増強し得る。いくつかの実施形態において、付加、置換または欠失は、Ｅ．  ｃｏｌｉまたは他の組み換え宿主細胞における発現の後における、ポリペプチドの可溶性を増強し得る。いくつかの実施形態において、部位は、Ｅ．  ｃｏｌｉまたは他の組み換え宿主細胞における発現の後における、ポリペプチドの可溶性の増強を生じる非天然アミノ酸の組み込みに関する他の部位に加えて、天然にコードされるアミノ酸、または非天然アミノ酸を用いた置換に関して選択される。いくつかの実施形態において、ｈＰＰまたはｈＦｃポリペプチドは、ｈＰＰまたはｈＦｃポリペプチドの受容体、結合タンパク質、関連リガンドに対する親和性を調節するか、受容体ニ量体形成を調節（低減または増強が挙げられるが、これらに限定されない）するか、受容体ニ量体を安定化するか、循環半減期を調節するか、放出もしくは生物学的利用性を調節するか、精製を容易にするか、または特定の投与経路を改善もしくは変更する、他の付加、置換または欠失を含む。同様に、ｈＰＰまたはｈＦｃポリペプチドは、化学的もしくは酵素的な切断配列、プロテアーゼ切断配列、反応性基、抗体結合ドメイン（ＦＬＡＧまたはポリ−Ｈｉｓが挙げられるが、これらに限定されない）または他の親和性に基づく配列、または検出（ＧＦＰが挙げられるが、これに限定されない）か、精製、組織もしくは細胞膜を介した輸送、プロドラッグの放出もしくは活性化、ｈＰＰまたはｈＦｃポリペプチドの大きさの低下またはポリペプチドの他の特色を向上する連結分子か、を含み得る。
【０４２３】
いくつかの場合において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のアミノ酸が、１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸を用いて置換される。いくつかの場合において、ｈＰＰまたはｈＦｃポリペプチドは、天然アミノ酸に対する１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の置換を、さらに含む。例えば、いくつかの実施形態において、ｈＡの以下の領域：１位より前（すなわち、Ｎ末端において）、１７位、３４位、５５位、５６位、５８位、６０位、８１位、８２位、８６位、９２位、９４位、１１１位、１１４位、１１６位、１１９位、１２９位、１７０位、１７２位、１７３位、２７６位、２７７位、２８０位、２９７位、３００位、３０１位、３１３位、３１７位、３２１位、３６２位、３６３位、３６４位、３６５位、３６８位、３７５位、３９７位、４３９位、４４２位、４９５位、４９６位、４９８位、５００位、５０１位、５０５位、５１５位、５３８位、５４１位、５４２位、５６０位、５６２位、５６４位、５７４位、５８１位、および５８２位の後（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端において）（配列番号１）のうちの１つ以上の残基が、１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸によって置換される。
【０４２４】
いくつかの場合において、１つ以上の非天然にコードされた残基は、１つ以上の低分子量の直鎖状または分枝状のＰＥＧ（総量においておよそ〜５−２０ｋＤａまたはそれ未満）と連結されており、これによって単一の高分子量のＰＥＧに付与された種と比較して、結合親和性および比較的な血中半減期を増強される。
【０４２５】
２つ以上の非天然にコードされたアミノ酸のｈＡ内への組み込みに適した位置としては、以下の残基：１位より前（すなわち、Ｎ末端において）、１７位、３４位、５５位、５６位、５８位、６０位、８１位、８２位、８６位、９２位、９４位、１１１位、１１４位、１１６位、１１９位、１２９位、１７０位、１７２位、１７３位、２７６位、２７７位、２８０位、２９７位、３００位、３０１位、３１３位、３１７位、３２１位、３６２位、３６３位、３６４位、３６５位、３６８位、３７５位、３９７位、４３９位、４４２位、４９５位、４９６位、４９８位、５００位、５０１位、５０５位、５１５位、５３８位、５４１位、５４２位、５６０位、５６２位、５６４位、５７４位、５８１位、および５８２位の後（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端において）（配列番号１）の組み合わせが挙げられる。
【０４２６】
（ＶＩＩ．非真核生物および真核生物における発現）
クローニングされたｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリヌクレオチドを高レベルで発現させるために、一般的に、本発明のｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、直接転写にとっての強力なプロモータ、転写／翻訳ターミネータ、さらにタンパク質をコードする核酸用であれば、翻訳開始用のリボソーム結合部位を含む発現ベクターにサブクローニングする。適切な細菌プロモータは、当業者に公知であり、かつSambrook et alおよびAusubel et alに説明されている。
【０４２７】
本発明のｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドの発現を目的とした細菌発現系は、例えば、Ｅ．  ｃｏｌｉ、バチルス種、およびサルモネラ（Palva et al, Gene 22:229- 235 (1983)、Mosbach et al, Nature 302:543-545 (1983)）において、利用可能であるが、これらに限定されない。そのような発現系用のキットは市販されている。また、哺乳類細胞、酵母、および昆虫細胞にとっての真核発現系は、当業者に公知であり、かつ市販もされている。直交化ｔＲＮＡおよびアミノアシル化ｔＲＮＡシンセターゼ（上述されている）を使用して、本発明のポリペプチドが発現される場合において、発現用の宿主細胞は、直交型の構成要素を使用する該宿主細胞の能力に基づいて選択される。例示的な宿主細胞としては、グラム陽性細菌（例えば、Ｂ．  ブレビス、Ｂ．  サブチリス、またはストレプトミセスが挙げられるが、これらに限定されない）、およびグラム陰性細菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ、シュードモナス  フルオレセンス、シュードモナス  アエルギノーザ、シュードモナス  プティダ）だけでなく、酵母および他の真核細胞が挙げられる。Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対を含む細胞は、本明細書に記載されているように使用され得る。
【０４２８】
本発明の真核生物の宿主細胞、または非真核生物の宿主細胞は、非常に有用な量の非天然アミノ酸を含むタンパク質を合成する能力を提供する。１つの局面において、組成物は、例えば、非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質の、少なくとも１０マイクログラム、少なくとも５０マイクログラム、少なくとも７５マイクログラム、少なくとも１００マイクログラム、少なくとも２００マイクログラム、少なくとも２５０マイクログラム、少なくとも５００マイクログラム、少なくとも１ミリグラム、少なくとも１０ミリグラム、少なくとも１００ミリグラム、少なくとも１グラム、もしくはそれ以上を含んでいるか、またはインビボタンパク質産生方法（組み換えタンパク質の産生および精製についての詳細が本明細書に与えられている）を用いて達成され得る量を任意に含んでいるが、これらに限定されない。他の局面において、タンパク質は、例えば、細胞溶解液、緩衝液、薬学的緩衝液または他の液体懸濁液（例えば、１ｎｌから１００Ｌまでの任意の量などであるが、これらに限定されない）の中に、例えば、１リットルごとに少なくとも１０マイクログラムのタンパク質、１リットルごとに少なくとも５０マイクログラムのタンパク質、１リットルごとに少なくとも７５マイクログラムのタンパク質、１リットルごとに少なくとも１００マイクログラムのタンパク質、１リットルごとに少なくとも２００マイクログラムのタンパク質、１リットルごとに少なくとも２５０マイクログラムのタンパク質、１リットルごとに少なくとも５００マイクログラムのタンパク質、１リットルごとに少なくとも１ミリグラムのタンパク質、１リットルごとに少なくとも１０ミリグラムのタンパク質、またはそれ以上の濃度において任意に組成物に存在するが、これらに限定されない。少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む真核細胞におけるタンパク質の大量（例えば、通常に、例えば、インビボ翻訳が挙げられる他の方法を用いて可能な量よりも多いが、これに限定されない）の産生は、本発明の１つの特徴である。
【０４２９】
本発明の真核生物の宿主細胞、または非真核生物の宿主細胞は、非常に有用な量に非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質を生合成する能力を提供する。例えば、非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質は、細胞抽出物、細胞溶解液、培地、および／または緩衝液などの中に、例えば、少なくとも１０μｇ／リットル、少なくとも５０μｇ／リットル、少なくとも７５μｇ／リットル、少なくとも１００μｇ／リットル、少なくとも２００μｇ／リットル、少なくとも２５０μｇ／リットル、少なくとも５００μｇ／リットル、少なくとも１ｍｇ／リットル、少なくとも２ｍｇ／リットル、少なくとも３ｍｇ／リットル、少なくとも４ｍｇ／リットル、少なくとも５ｍｇ／リットル、少なくとも６ｍｇ／リットル、少なくとも７ｍｇ／リットル、少なくとも８ｍｇ／リットル、少なくとも９ｍｇ／リットル、少なくとも１０ｍｇ／リットル、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００ｍｇ／リットル、１ｇ／リットル、５ｇ／リットル、１０ｇ／リットル、またはそれ以上の濃度において、産生され得る。
【０４３０】
ｈＰＰまたはｈＦｃの発現に好適な多数のベクターが商業的に入手可能である。真核生物の宿主のための有用な発現ベクターとしては、これに限定されないが、ＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウイルス、アデノウイルスおよびサイトメガロウイルス由来の発現調節配列を含むベクターが挙げられる。このようなベクターとしては、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）／Ｈｙｇ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、チャールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）、カリフォルニア、ＵＳＡ）およびｐＣＩ−ｎｅｏ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ）、ラジョラ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）、カリフォルニア、ＵＳＡ）が挙げられる。Ｅ．Ｃｏｌｉ由来のプラスミドのような、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ３ａおよびｐＥＴ１２ａを含む細菌プラスミド、ＲＰ４のような宿主がより広範囲なプラスミド、ラムダファージ（例えば、ＮＭ９８９）ならびにＭ１３および糸状単鎖ＤＮＡファージのような他のＤＮＡファージの多数の派生物などのファージＤＮＡが、用いられ得る。２μプラスミドおよびその派生物、ＰＯＴ１ベクター（言及によって組み込まれる米国特許第４，９３１，３７３号明細書）、（Okkels, Ann. New York Aced. Sci. 782, 202 207, 1996）に記載のｐＪＳＯ３７ベクター、ならびに、ｐＰＩＣＺ  Ａ、ＢまたはＣ（インビトロジェン）が、酵母宿主細胞と共に用いられ得る。昆虫細胞に対しては、これに限定されないが、ｐＶＬ９４１、ｐＢＧ３１１（Cate et al., "Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance And Expression of the Human Gene In Animal Cells", Cell, 45, pp.685 98(1986)）、ｐＢｌｕｅｂａｃ  ４．５、およびｐＭｅｌｂａｃ（インビトロジェン、チャールズバッド、カリフォルニア）が挙げられる。
【０４３１】
ｈＰＰまたはｈＦｃポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、シグナル配列をさらに含むことも、含まないこともできる。ポリペプチドが、それが発現される細胞から分泌されるべきである場合に、シグナルペプチドは存在する。シグナルペプチドは、原核生物起源または真核生物起源であり得る。Coloma, M(1992)J.Imm,Methods 152:89(104)は、哺乳動物細胞において利用するためのシグナルペプチド（マウスＩｇカッパー軽鎖シグナルペプチド）について記述している。他のシグナルペプチドとしては、これに限定されないが、Ｓ．  セレビジアエ由来のα因子シグナルペプチド（言及によって本明細書に組み込まれる米国特許第４，８７０，００８号明細書）、マウス唾液アミラーゼのシグナル配列（O.Hagenbuchle et al., Nature 289, 1981, pp.643-646）、改変されたカルボキシペプチダーゼシグナルペプチド（L.A.Valls et al., Cell 48, 1987, pp.887-897）、酵母ＢＡＲ１シグナルペプチド（言及によって本願明細書に組み込まれる国際公開８７／０２６７０号パンフレット）、およびアスパラギン酸プロテアーゼ３（ＹＡＰ３）シグナルペプチド（M.Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, pp.127-137参照）が挙げられる。
【０４３２】
好適な哺乳動物宿主細胞の例は、当業者において周知である。そのような宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、ミドリザル細胞（ＣＯＳ）（例えば、ＣＯＳ  １（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）、ＣＯＳ  ７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５１））、マウス細胞（例えば、ＮＳ／Ｏ）、ハムスター乳幼児腎臓（ＢＨＫ）細胞系列（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６３２またはＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０）、ヒト細胞（例えば、ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３））、および組織培養中の植物細胞であり得る。これらおよびその他の細胞系列は、American Type Culture Collection, Rockville, Mdのような公衆利用可能な受託施設から入手することができる。ｈＰＰポリペプチドの向上した糖鎖形成のために、例えば、言及によって本願明細書に組み込まれる米国特許第５，０４７，３３５号明細書に記載のように、哺乳動物宿主細胞が、シアル酸転移酵素（例えば、１，６−シアル酸転移酵素）を発現するように改変され得る。
【０４３３】
外因性のＤＮＡを哺乳動物宿主細胞に導入する方法としては、これらに限定されないが、リン酸カルシウム法、電気穿孔法、ＤＥＡＥデキストラン法、リポソーム法、ウイルスベクター、ならびにリポフェクタミン２０００を用いるLife Technologies Ltd, Paisley, UKに記載の遺伝子導入法、およびＦｕＧＥＮＥ６を用いるRoche Diagnostics Corporation, Indianapolis, USAに記載の遺伝子導入法が挙げられる。これらの方法は、周知であり、かつAusbel et al. (eds), 1996, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, USAに記載されている。哺乳動物細胞の培養は、例えば、（Animal Cell Biotechnology, Method and Protocols, Edited by Nigel Jenkins, 1999, Human Press Inc. Totowa, N.J., USA、およびHarrison Mass. and Rae IF, Gneral Techniques of Cell Culture, Cambridge University Press 1997）に記載されているような確立された方法に基づいて行うことができる。
【０４３４】
Ｉ．発現系、培養および単離
任意の数の適切な発現系において、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドを発現させ得る。該発現系としては、例えば、酵母、昆虫、哺乳類、および細菌などが挙げられる。典型的な発現系の例を以下に示す。
【０４３５】
（酵母）
本明細書で用いられるときに、“酵母”という用語は、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能な、様々な酵母のあらゆるものを含む。当該酵母としては、子嚢胞子を生じる（ａｓｃｏｓｐｏｒｏｇｅｎｏｕｓ）酵母（エンドミセタレス）、担子胞子を生じる（ｂａｓｉｄｉｏｓｐｏｒｏｇｅｎｏｕｓ）酵母、および不完全真菌（ブラストミセス）の群に属する酵母などが挙げられるが、これらに限定されない。子嚢胞子を生じる酵母は、２のファミリー（スペルモフトラセアエおよびサッカロミセタセアエ）に分けられる。後者は、４のサブファミリー（シゾサッカロミコイデアエ（シゾサッカロミセス属など）、ナドソニオイデアエ、リポミコイダエ、およびサッカロミコイデアエ（ピチア属、クリュイベロミセス属、およびサッカロミセス属など）から構成されている。担子胞子を生じる酵母には、ロイコスポリディウム属、ロードスポリディウム属、スポリディオボルス属、フィロバシディウム属、およびフィロバシディエラ属が含まれる。不完全真菌（ブラストミセテス）の群に属する酵母は、２のファミリースポロボロミセタセアエ（スポロボロミセス属およびブレラ属など）、およびクリプトコッカセアエ（カンディダ属など）に分けられる。
【０４３６】
本発明と一緒に使用するための特に所定のものとして、ピチア属、クリュイベロミセス属、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、ハンセヌラ属、トルロプシス属、およびカンディダ属に含まれる種であり、例えば、Ｐ．  パストリス、Ｐ．  グイレリモンディー、Ｓ．セレビジアエ、Ｓ．カルスベルジェニス、Ｓ．ディアスタティクス、Ｓ．  ドウグラシイ、Ｓ．  クリュイベリ、Ｓ．  ノルベンシス、Ｓ．  オビフォルミス、Ｋ．  ラクティス、Ｋ．  フラジリス、Ｃ．  アルビカンス、Ｃ．  マルトーサ、およびＨ．  ポリモルファが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４３７】
ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドの発現に好適な酵母の選択は、当業者の技術範囲にある。発現用の酵母宿主の選択において、好適な宿主は、例えば、良好な分泌能、低いタンパク質分解活性、良好な分泌能、良好な可溶化タンパク質産生、および総合的な強健さを有することが示されている酵母であり得る。酵母は、一般的に様々な供給源から入手でき、例えば、カリフォルニア大学生物物理学および医学物理学分野（Department of Biophysics and Medical Physics, University of California）のYeast Genetic Stock Center （バークレイ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）、ＣＡ）、およびthe American Type Culture Collection（“ＡＴＣＣ”）（マナッサ（Ｍａｎａｓｓａｓ）ＶＡ）などから入手できる。
【０４３８】
“酵母宿主”または“酵母宿主細胞”という用語は、組み換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡの受容物として使用し得るか、または使用されている酵母を含む。この用語は、組み換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡを受け容れている元々の酵母宿主細胞の子孫を含んでいる。１つの親細胞の子孫が、形態、ゲノムＤＮＡまたは全ＤＮＡの補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）において、偶発的な突然変異、または計画的な突然変異に起因して、元々の親細胞と必ずしも完全に一致しなくてもよいことは理解される。関連する性質（例えば、ｈＰＰまたはｈＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在）により特徴付けられる親細胞と十分に類似する、親細胞の子孫は、この定義によって意図される子孫に含まれる。
【０４３９】
発現ベクターおよび形質転換ベクター（染色体外レプリコンまたは組み込みベクターなど）は、多くの酵母宿主を形質転換するために開発された。例えば、発現ベクターは、Ｓ．セレビジアエ （Sikorski et al, GENETICS (1989) 122:19、Ito et al, J. BACTERIOL. (1983) 153:163、Hinnen et al, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1978) 75:1929）、Ｃ．  アルビカンス（Kurtz et al, MOL. CELL. BIOL. (1986) 6:142）、Ｃ．  マルトーサ（Kunze et al, J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25:141）、Ｈ．  ポリモルファ（Gleeson et al, J. GEN. MICROBIOL. (1986) 132:3459、Roggenkamp et al, MOL. GENETICS AND GENOMICS (1986) 202:302）、Ｋ．  フラジリス（Das et al, J. BACTERIOL. (1984) 158:1165）、Ｋ．  ラクティス（De Louvencourt et al, J. BACTERIOL. (1983) 154:737、Van den Berg et al, BIOTECHNOLOGY (NY) (1990) 8:135）、Ｐ．  グイレリモンディー（Kunze et al, J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25:141）、Ｐ．  パストリス（米国特許第５，３２４，６３９号明細書、米国特許第４，９２９，５５５号明細書、および米国特許第４，８３７，１４８号明細書、Cregg et al, MOL. CELL. BIOL. (1985) 5:3376、シゾサッカロミセス  ポンベ（Beach et al, NATURE (1982) 300:706）、およびＹ．  リポリティカ（Davidow et al, CURR. GENET. (1985) 10:380 (1985)、Gaillardin et al, CURR. GENET. (1986) 10:49）、Ａ．  ニドゥランス（Balance et al, BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN. (1983) 112:284-89、Tilburn et al, GENE (1983) 26:205-221、およびYelton et al, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1984) 81:1470-74）、Ａ．  ニガー（Kelly and Hynes, EMBO J. (1985) 4:475-479）、T. reesia （欧州特許出願公開第０２４４２３４号明細書）、および糸状菌（例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラディウム（国際公開第９１／００３５７号パンフレット）など）に対して開発された。なお、各文献は、言及によって本明細書に組み込まれる。
【０４４０】
酵母ベクターの制御配列は、当業者に公知であり、かつアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（欧州特許出願公開第０２８４０４４号明細書）、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰまたはＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）（欧州特許出願公開第０３２９２０３号明細書）といった遺伝子に由来するプロモータ領域などが挙げられるが、これに限定されない。また、酸性ホスファターゼをコードしている酵母のＰＨＯ５遺伝子は、有用なプロモータ配列を提供し得る（Miyanohara et al, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1983) 80:1）。酵母宿主との使用に適切な他のプロモータ配列には、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Hitzeman et al, J. BIOL. CHEM. (1980) 255:12073）、および他の解糖系の酵素（例えば、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、およびホスホグルコースイソメラーゼ（例えば、Holland et al, BIOCHEMISTRY (1978) 17:4900、Hess et al, J. ADV. ENZYME REG. (1969) 7:149）が含まれ得る。増殖条件によって制御される転写の付加的な利点を有する、酵母の誘導性プロモータは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、ならびにマルトースおよびガラクトースの利用を担う酵素にとってのプロモータ領域を含んでいてもよい。酵母発現への使用に適切なベクターおよびプロモータが、欧州特許出願公開第００７３６５７号明細書に、さらに記載されている。
【０４４１】
また、酵母エンハンサーを、酵母プロモータと共に用い得る。さらに、合成プロモータもまた、酵母プロモータとして機能し得る。例えば、酵母プロモータの上流活性化配列（ＵＡＳ）を、別の酵母プロモータの転写活性化領域につなぎ、合成混成プロモータを作製してもよい。混成プロモータとしては、例えば、ＧＡＰの転写活性化領域に連結されたＡＤＨ調節配列が挙げられる。米国特許第４，８８０，７３４号明細書、および米国特許第４，８７６，１９７号明細書を参照すればよく、これらの文献は言及によって本明細書に組み込まれる。混成プロモータの他の例としては、解糖系酵素の遺伝子（例えば、ＧＡＰまたはＰｙＫ）の転写活性化領域と組み合わせたＡＤＨ２、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、またはＰＨＯ５遺伝子の調節配列から成るプロモータが挙げられる。欧州特許出願公開０１６４５５６号明細書を参照すればよい。さらに、酵母プロモータは、酵母のＲＮＡポリメラーゼとの結合能および転写開始能を有する、非酵母由来の天然に存在するプロモータを含んでいてもよい。
【０４４２】
酵母発現ベクターの一部を構成し得る他の制御要素としては、例えば、ＧＡＰＤＨまたはエノラーゼ遺伝子に由来するターミネータ（Holland et al, J. BlOL. CHEM. (1981) 256:1385）が挙げられる。さらに、２μプラスミドの起点に由来する複製起点は、酵母に適切である。酵母に使用する適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドに存在するｔｒｐ１遺伝子である。Tschumper et al, GENE (1980) 10:157、Kingsman et al, GENE (1979) 7:141を参照すればよい。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン存在下において増殖能を欠如している酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。同様にＬｅｕ２欠損酵母株（ＡＴＣＣ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する公知のプラスミドにより補完される。
【０４４３】
外因性ＤＮＡを酵母宿主に導入する方法は、当業者に公知の技術であり、かつ通常、アルカリ性陽イオンを用いて処理されたスフェロプラスト、または無処置の酵母宿主細胞のいずれかの形質転換が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、酵母の形質転換は、Hsiao et al, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1979) 76:3829およびVan Solingen et al, J. BACT. (1977) 130:946に記載の方法に従って、実施され得る。しかし、また、例えば、核注入、エレクトロポレーション、または原形質融合によってＤＮＡを細胞に導入する他の方法も、SAMBROOK et al, MOLECULAR CLONING: A LAB. MANUAL (2001)に通常に記載されているように、使用され得る。それから、酵母宿主細胞を当業者に公知の標準技術を用いて培養してもよい。
【０４４４】
酵母宿主細胞において異種タンパク質を発現させる他の方法は、当業者に公知の技術である。一般的に、米国特許出願公開第２００２／００５５１６９号明細書、米国特許第６，３６１，９６９号明細書、米国特許第６，３１２，９２３号明細書、米国特許第６，１８３，９８５号明細書、米国特許第６，０８３，７２３号明細書、米国特許第６，０１７，７３１号明細書、米国特許第５，６７４，７０６号明細書、米国特許第５，６２９，２０３号明細書、米国特許第５，６０２，０３４号明細書、および米国特許第５，０８９，３９８号明細書、米国再発行特許発明第ＲＥ３７，３４３号明細書、および米国再発行特許発明第ＲＥ３５，７４９号明細書、国際公開第９９／０７８６２号パンフレット、国際公開第９８／３７２０８号パンフレット、および国際公開第９８／２６０８０号パンフレット、欧州特許出願公開第０９４６７３６号明細書、欧州特許出願公開第０７３２４０３号明細書、欧州特許出願公開第０４８０４８０号明細書、欧州特許出願公開第０４６００７１号明細書、欧州特許出願公開第０３４０９８６号明細書、欧州特許出願公開第０３２９２０３号明細書、欧州特許出願公開第０３２４２７４号明細書、および欧州特許出願公開第０１６４５５６明細書を参照すればよい。また、Gellissen et al, ANTONIE VAN LEEUWENHOEK (1992) 62(l-2):79-93、Romanos et al, YEAST (1992) 8(6):423-488、Goeddel, METHODS IN ENZYMOLOGY (1990) 185:3-7を参照すればよい。上記文献は、言及によって本明細書に組み込まれる。
【０４４５】
酵母宿主株は、当業者に公知である標準の給飼バッチ発酵方法（feed batch fermentation method）を用いて、増幅段階の間に酵母宿主株を発酵槽において成長させてもよい。上記発酵方法は、特定の酵母宿主の炭素利用経路、または発現制御の様式の差異に原因して、適合されてもよい。例えば、サッカロミセス酵母宿主の発酵は、１つのグルコース飼料、複合的な窒素源（カゼイン加水分解物など）、および複数のビタミン補助物を必要としてもよい。これに対し、メチロトローフ酵母であるＰ．  パストリスは、グリセロール、メタノール、および微量の無機化合物飼料を必要としてもよく、最適な成長および発現については単純なアンモニウム（窒素）塩だけを必要とする。例えば、米国特許第５，３２４，６３９号明細書、Elliott et al, J. PROTEIN CHEM. (1990) 9:95、およびFieschko et al, BIOTECH. BIOENG. (1987) 29:1113を参照すればよい。なお、これら文献は、言及によって本明細書に組み込まれる。
【０４４６】
しかし、上記発酵方法は、用いられる酵母宿主株とは無関係な特定の共通の特徴を有していてもよい。例えば、成長限界栄養素（通常は炭素）を、発酵槽に増幅段階の間に添加して、最大限の成長を可能にしてもよい。さらに、発酵方法は、一般的に、十分な量の炭素、窒素、基本塩、リン、および他の微量栄養素（ビタミン、微量無機物、および塩など）を含むように調製された発酵培地を用いてもよい。ピチアを伴ったに使用に適切な発酵培地の例が、米国特許第５，３２４，６３９号明細書、および米国特許第５，２３１，１７８号明細書に記載されている。なお、これら文献は、言及によって本明細書に組み込まれる。
【０４４７】
バキュロウイルス感染昆虫細胞
“昆虫宿主”または“昆虫宿主細胞”という用語は、組み換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡの受容物として使用し得るか、または使用されている昆虫をいう。この用語は、トランスフェクトされた元々の昆虫宿主細胞の子孫を含む。１つの親細胞の子孫が、形態、ゲノムＤＮＡまたは全ＤＮＡの補体において、偶発的な突然変異、または計画的な突然変異に起因して、元々の親細胞と必ずしも完全に一致していなくてもよいことは理解される。関連する性質（例えば、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の存在）により特徴付けられる親細胞と十分に類似する、親細胞の子孫は、この定義によって意図される子孫に含まれる。
【０４４８】
ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドの発現に好適な昆虫細胞の選択は、当業者に公知である。いくつかの昆虫種は、当該分野において十分に説明されており、かつアエデス  アエジプティ、ボンビックス  モリ、ドロソフィラ  メラノガスター、スポドプテラ  フルギペルダ、およびトリコプルシア  ニを含めて、市販されている。発現用の昆虫宿主の選択において、適切な宿主は、特に、良好な分泌能、低いタンパク質分解活性、および総合的な強健さを有することが示されている宿主であり得る。昆虫は、一般的に、Insect Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, University of California（バークレイ、ＣＡ）、およびthe American Type Culture Collection （“ＡＴＣＣ”）（マナッサ、ＶＡ）を含む、様々な供給源から入手することができるが、これらに限定されない。
【０４４９】
一般的に、バキュロウイルス−感染昆虫の発現系の構成要素は、バキュロウイルスのゲノム断片、および発現される異種遺伝子の挿入に便利な制限酵素認識部位の両方を含むトランスファーベクター（普通は細菌のプラスミド）；当該トランスファーベクターにおけるバキュロウイルスに特異的な断片に対して、相同な配列を有する（これにより、バキュロウイルスゲノムに対する異種遺伝子の相同組み換えが可能になる）野生型バキュロウイルス；ならびに適切な昆虫宿主細胞および成長培地を含んでいる。ベクターの構築、細胞のトランスフェクション、プラークの選択、または培養における細胞の成長などに用いられる材料、方法および技術は公知であり、かつこれらの技術が記載されている手引書が利用可能である。
【０４５０】
異種遺伝子をトランスファーベクターに挿入した後に、当該ベクターおよび野生型ウイルスゲノムを、当該ベクターと当該ウイルスゲノムとが組み換えを起こす昆虫宿主細胞に、トランスフェクションする。パッケージングされた組み換えウイルスが発現され、かつ組み換え体プラークが同定および精製される。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系にとっての材料および方法は、例えば、インビトロジェン  Ｃｏｒｐ（チャールズバッド、ＣＡ）が提供している、キットの様式において市販されている。これらの技術は、一般的に当業者に公知であり、かつSUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987)に十分に記載されている。なお、この文献は、言及によって本明細書に組み込まれる。また、RICHARDSON, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY: BACULOVIRUS EXPRESSION PROTOCOLS (1995)、AUSUBEL et al, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 16.9-16.11 (1994)、KLNG AND POSSEE, THE BACULOVIRUS SYSTEM: A LABORATORY GUIDE (1992)およびO’REILLY et al, BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992)を参照すればよい。
【０４５１】
バキュロウイルス／昆虫細胞発現系を用いた、様々な異種タンパク質の製造は、実際に、当業者に公知である。例えば、米国特許第６，３６８，８２５号明細書、米国特許第６，３４２，２１６号明細書、米国特許第６，３３８，８４６号明細書、米国特許第６，２６１，８０５号明細書、米国特許第６，２４５，５２８号明細書、米国特許第６，２２５，０６０号明細書、米国特許第６，１８３，９８７号明細書、米国特許第６，１６８，９３２号明細書、米国特許第６，１２６，９４４号明細書、米国特許第６，０９６，３０４号明細書、米国特許第６，０１３，４３３号明細書、米国特許第５，９６５，３９３号明細書、米国特許第５，９３９，２８５号明細書、米国特許第５，８９１，６７６号明細書、米国特許第５，８７１，９８６号明細書、米国特許第５，８６１，２７９号明細書、米国特許第５，８５８，３６８号明細書、米国特許第５，８４３，７３３号明細書、米国特許第５，７６２，９３９号明細書、米国特許第５，７５３，２２０号明細書、米国特許第５，６０５，８２７号明細書、米国特許第５，５８３，０２３号明細書、米国特許第５，５７１，７０９号明細書、米国特許第５，５１６，６５７号明細書、米国特許第５，２９０，６８６号明細書、国際公開第０２／０６３０５号パンフレット、国際公開第０１／９０３９０号パンフレット、国際公開第０１／２７３０１号パンフレット、国際公開第０１／０５９５６号パンフレット、国際公開第００／５５３４５号パンフレット、国際公開第００／２００３２号パンフレット、国際公開第９９／５１７２１号パンフレット、国際公開第９９／４５１３０号パンフレット、国際公開第９９／３１２５７号パンフレット、国際公開第９９／１０５１５号パンフレット、国際公開第９９／０９１９３号パンフレット、国際公開第９７／２６３３２号パンフレット、国際公開第９６／２９４００号パンフレット、国際公開第９６／２５４９６号パンフレット、国際公開第９６／０６１６１号パンフレット、国際公開第９５／２０６７２号パンフレット、国際公開第９３／０３１７３号パンフレット、国際公開第９２／１６６１９号パンフレット、国際公開第９２／０３６２８号パンフレット、国際公開第９２／０１８０１号パンフレット、国際公開第９０／１４４２８号パンフレット、国際公開第９０／１００７８号パンフレット、国際公開第９０／０２５６６号パンフレット、国際公開第９０／０２１８６号パンフレット、国際公開第９０／０１５５６号パンフレット、国際公開第８９／０１０３８号パンフレット、国際公開第８９／０１０３７号パンフレット、国際公開第８８／０７０８２号パンフレットを参照すればよい。なお、各文献は、言及によって本明細書に組み込まれる。
【０４５２】
バキュロウイルス／昆虫細胞発現系に有用なベクターは、公知であり、かつ例えば、バキュロウイルスのオートグラファカリフォルニカ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）に由来する、ヘルパー非依存性のウイルスベクターである昆虫の発現およびトランスファーベクターを含む。この系に由来するウイルス発現ベクターは、一般的に、異種遺伝子の発現を誘導するために、ウイルスの強力なポリへドリン遺伝子プロモータを利用する。一般的には、O’Reilly et al, BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992)を参照すればよい。
【０４５３】
外来の遺伝子をバキュロウイルスのゲノムに挿入する前に、上記構成要素（プロモータ、リーダー（必要に応じて）、所定のコード配列、および転写終結配列を含んでいる）は、通常、中間置換コンストラクト（Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｔｒａｎｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）（トランスファーベクター）に集められる。中間置換コンストラクトは、細菌などの宿主において安定な維持が可能な染色体外エレメント（例えば、プラスミド）といった、レプリコンにおいてしばしば維持される。レプリコンは１つの複製系を有し、このため、クローニングおよび増幅に適切な宿主における当該レプリコンの維持を可能にする。より具体的には、プラスミドは、ポリヘドリンポリアデニル化シグナル（Miller, ANN. REV. MICROBIOL. (1988) 42:177）と、Ｅ．  ｃｏｌｉにおける選択および増殖に関する、原核生物のアンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子と複製起点と、を含有する。
【０４５４】
ＡｃＮＰＶへ外来遺伝子を導入するために一般的に使用されるトランスファーベクターの１つは、ｐＡｃ３７３である。当業者に公知である他の多くのベクターもまた設計されており、例えば、ｐＶＬ９８５が挙げられる。ｐＶＬ９８５では、ポリヘドリン開始コドンがＡＴＧからＡＴＴに変えられ、かつＡＴＴの下流の３２塩基対にＢａｍＨＩクローニング部位が導入されている（Luckow and Summers, VIROLOGY 170:31 (1989)を参照すればよい）。他の市販されているベクターとしては、例えば、PBlueBac4.5/V5-His、pBlueBacHis2、pMelBac、pBlueBac4.5(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)が挙げられる。
【０４５５】
異種遺伝子を挿入した後に、トランスファーベクターおよび野生型バキュロウイルスのゲノムを、昆虫細胞宿主に同時トランスフェクションする。異種ＤＮＡをバキュロウイルスの所望の部位に導入するための方法は、当該分野において公知である。例えば、SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987)、Smith et al, MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156、Luckow and Summers, VIROLOGY (1989) 170:31を参照すればよい。例えば、挿入は、２重交差型相同組み換えによって、ポリへドリン遺伝子などの遺伝子の中にあり得る。また、挿入は、所望のバキュロウイルス遺伝子中に設けられた、制限酵素認識部位の中にあり得る。例えば、Miller et al, BIOESSAYS (1989) 11(4):91を参照すればよい。
【０４５６】
トランスフェクションを、エレクトロポレーションにより達成してもよい。TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995)、Mann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70:3501を参照すればよい。代替可能に、リポソームを使用して、組み換え発現ベクターとバキュロウイルスとを用いて昆虫細胞をトランスフェクションしてもよい。例えば、Liebman et al., BIOTECHNIQUES (1999) 26(1):36、Graves et al, BIOCHEMISTRY (1998) 37:6050、Nomura et al, J. BIOL. CHEM. (1998) 273(22): 13570、Schmidt et al, PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1998) 12:323、Siffert et al, NATURE GENETICS (1998) 18:45、TILKINS et al, CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK 145-154 (1998) 、Cai et al, PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1997) 10:263、Dolphin et al, NATURE GENETICS (1997) 17:491、Kost et al, GENE (1997) 190:139、Jakobsson et al, J. BlOL. CHEM. (1996) 271:22203、Rowles et al, J. BIOL. CHEM. (1996) 271(37): 22376、Reverey et al, J. BIOL. CHEM. (1996) 271(39) :23607- 10、Stanley et al, J. BlOL. CHEM. (1995) 270:4121、Sisk et al, J. VlROL. (1994) 68(2):766、およびPeng et al, BIOTECHNIQUES (1993) 14(2):274を参照すればよい。市販されているリポソームとしては、例えば、セルフェクチン（Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ）（登録商標）、およびリポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）（登録商標）（インビトロジェン  Ｃｏｒｐ、チャールズバッド、ＣＡ）が挙げられる。また、リン酸カルシウムトランスフェクションを用いてもよい。TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995)、Kitts, NAR (1990) 18(19):5667、およびMann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70:3501を参照すればよい。
【０４５７】
バキュロウイルス発現ベクターは、たいていは、バキュロウイルスプロモータを含んでいる。バキュロウイルスプロモータは、バキュロウイルスのＲＮＡポリメラーゼが結合でき、コード配列（例えば、構造遺伝子）をｍＲＮＡへと下流（３’）へ転写開始する任意のＤＮＡ配列である。プロモータは、コード配列の５’末端近傍にたいてい配置される、転写開始領域を有している。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位と転写開始部位とを含んでいる。また、バキュロウイルスのプロモータは、エンハンサーと呼ばれる２次ドメインを有していてもよい。この２次ドメインは、存在する場合は、構造遺伝子から遠位に存在する。また、発現は、調節されてもよいし、恒常的であってもよい。
【０４５８】
ウイルス感染サイクルの後期に多量に転写される構造遺伝子は、特に有用なプロモータ配列を提供する。例としては、ウイルスポリヘドリンタンパク質をコードする遺伝子由来の配列（FRIESEN et al, The Regulation of Baculovirus Gene Expression in THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES (1986)、欧州特許出願公開第０１２７８３９号明細書、および欧州特許出願公開第０１５５４７６号明細書）、およびｐ１０タンパク質をコードする遺伝子由来の配列（Vlak et al, J. GEN. VlROL. (1988) 69:765）が挙げられる。
【０４５９】
新しく形成されたバキュロウイルス発現ベクターは、感染性の組み換えバキュロウイルスにパッケージングされる。その後、成長したプラークが当業者に公知の方法により精製されもよい。Miller et al, BIOESSAYS (1989) 11(4):91、SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987)を参照すればよい。
【０４６０】
組み換えバキュロウイルス発現ベクターは、いくつかの昆虫細胞へ感染させるために開発されている。例えば、取り分け、アエデス  アエジプティ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１２５）、ボンビックス  モリ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−８９１０）、ドロソフィラ  メラノガスター（ＡＴＣＣ番号１９６３）、スポドプテラ  フルギペルダ、およびトリコプルシア  ニのための組み換えバキュロウイルスが開発されている。国際公開第８９／０４６，６９９号パンフレット、Wright, NATURE (1986) 321:718、Carbonell et al, J. VlROL. (1985) 56:153、Smith et al, MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156を参照すればよい。一般的には、Fraser et al, IN VITRO CELL. DEV. BIOL (1989) 25:225を参照すればよい。より具体的には、バキュロウイルス発現ベクターの系に用いられる細胞株としては、通常、Ｓｆ９（スポドプテラ  フルギペルダ）（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１７１１）、Ｓｆ２１（スポドプテラ  フルギペルダ）（インビトロジェン  Ｃｏｒｐ、カタログ番号11497-013 （チャールズバッド、ＣＡ））、Ｔｒｉ−３６８（トリコプルシア  ニ）、およびハイ−ファイブ（Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ）（登録商標）ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（トリコプルシア  ニ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４６１】
バキュロウイルス／発現における異種ポリペプチドの直接発現および融合発現の両方にとっての細胞および培地は、市販されている。また、細胞培養技術は、当業者に公知である。
【０４６２】
Ｅ．  Ｃｏｌｉ、シュードモナス種、および他の原核生物
細菌における発現技術は、当業者に公知である。様々なベクターが、細菌宿主における使用に利用可能である。これらベクターは、１コピーベクター、またはコピー数が少ない多コピー型ベクターもしくはコピー数が多い多コピー型ベクター（ｌｏｗ  ｏｒ  ｈｉｇｈ  ｍｕｌｔｉｃｏｐｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ）であってもよい。ベクターは、クローニングおよび／または発現に役立ち得る。ベクター、ベクターに関する豊富な文献、多くの市販のベクター、ならびにベクターとその制限酵素地図とその特徴とについて記載している手引書も同等に考慮して、本明細書では、これ以上論じる必要は無い。よく知られているように、ベクターは、通常は選択を可能にするマーカーを含んでいる。このマーカーは、細胞毒性剤への耐性、原栄養性、または免疫を提供し得るものである。しばしば、異なる特徴を提供する複数のマーカーが存在する。
【０４６３】
細菌プロモータは、細菌のＲＮＡポリメラーゼと結合可能な、およびコード配列（例えば、構造遺伝子）をｍＲＮＡへと下流（３’）へ転写開始できる任意のＤＮＡ配列である。プロモータは、コード配列の５’末端近傍にたいてい配置される転写開始領域を有している。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位と転写開始部位とを含んでいる。また、細菌プロモータは、オペレーターと呼ばれる２次ドメインを有していてもよい。この２次ドメインは、ＲＮＡ合成が始まる隣接したＲＮＡポリメラーゼ結合部位と重複してもよい。遺伝子リプレッサータンパク質が、オペレーターに結合することにより、特定の遺伝子の転写を阻害し得るように、オペレーターは、負に調節される（誘導性の）転写を可能にする。恒常的発現は、負の調節エレメント（オペレーターなど）が無いときに起こり得る。さらに、正の調節が、遺伝子アクチベータータンパク質の結合配列によりもたらされてもよい。該結合配列は、存在する場合は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列よりも遠位（５’）に存在する。遺伝子アクチベータータンパク質としては、例えば、カタボライト活性化タンパク質（ＣＡＰ）が挙げられる。このＣＡＰは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）のｌａｃオペロンの転写開始を助ける（Raibaud et al, ANNU. REV. GENET. (1984) 18:173）。したがって、制御された発現は、正または負のいずれかであってもよく、これによって転写を増強または低減させてもよい。
【０４６４】
代謝経路の酵素をコードしている配列は、特に有用なプロモータを提供する。この配列としては、例えば、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）（Chang et al, NATURE (1977) 198:1056）、およびマルトースなどの糖代謝酵素に由来するプロモータ配列が挙げられる。例としては、トリプトファン（ｔｒｐ）などの生合成酵素に由来するプロモータ配列が挙げられる（Goeddel et al, Nuc. ACIDS RES. (1980) 8:4057、Yelverton et al, NUCL. ACIDS RES. (1981) 9:731、米国特許第４，７３８，９２１号明細書、欧州公開第０３６７７６号明細書、欧州公開第１２１７７５号明細書）。なお、これら文献は、言及によって本明細書に組み込まれる。また、β−ガラクトシダーゼ（ｂｌａ）のプロモータ系（Weissmann (1981) The cloning of interferon and other mistakes. In Interferon 3 (Ed. I. Gresser) ）、バクテリオファージ  ラムダのＰＬ（Shimatake et al, NATURE (1981) 292:128）、およびＴ５（米国特許第４，６８９，４０６号明細書）のプロモータ系も、有用なプロモータ配列を提供する（なお、これら文献は、言及によって本明細書に組み込まれる）。本発明の好ましい方法は、ｈＰＰまたはｈＡポリペプチドを高レベルに誘導するためのＴ７プロモータなどの強力なプロモータを利用する。そのようなベクターの例は、当業者に公知であり、ｐＥＴ２９のシリーズ（ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ））、および国際公開第９９／０５２９７号明細書に記載のｐＰＯＰベクターなどが挙げられる（なお、上記文献は、言及によって本明細書に組み込まれる）。そのような発現系は、宿主細胞の生存能力または成長パラメーターに支障をきたすことなく、宿主において、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドを高レベルに産生する。ｐＥＴ１９（ノバゲン）は、他の公知のベクターである。
【０４６５】
また、天然に生じない合成プロモータも、細菌プロモータとして機能する。例えば、１つの細菌またはバクテリオファージのプロモータの転写活性化配列を、別の細菌またはバクテリオファージのプロモータのオペロン配列に結合して、合成混成プロモータを作製してもよい（米国特許第４，５５１，４３３号明細書（なお、この文献は、言及によって本明細書に組み込まれる））。例えば、ｔａｃプロモータは、ｔｒｐプロモータ配列と、ｌａｃリプレッサーにより調節されるｌａｃオペロン配列とを含む混成ｔｒｐ−ｌａｃプロモータである（Amann et al, GENE (1983) 25:167、de Boer et al, PROC. NATL. ACAD. SCI. (1983) 80:21）。さらに、細菌プロモータは、細菌のＲＮＡポリメラーゼとの結合能、および転写開始能を有する非細菌起源の天然に生じるプロモータを含んでいてもよい。また、非細菌起源の天然に生じるプロモータを、適合するＲＮＡポリメラーゼに結合させることによって、原核生物におけるいくつかの遺伝子を高レベルに発現させることができる。バクテリオファージのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ／プロモータ系は、共役型プロモータ系の例である（Studier et al, J. MOL. BIOL. (1986) 189:113、Tabor et al, Proc Natl. Acad. Sci. (1985) 82:1074）。さらに、混成プロモータは、バクテリオファージプロモータと、Ｅ．  ｃｏｌｉのオペレーター領域とを含んでいてもよい（欧州公開第２６７８５１号明細書）。
【０４６６】
また、機能性プロモータ配列に加えて、効率的なリボソーム結合部位が、外来遺伝子を原核細胞において発現させるために有効である。Ｅ．  ｃｏｌｉにおいて、リボソーム結合部位は、シャイン−ダルガルノ（ＳＤ）配列と呼ばれ、開始コドン（ＡＴＧ）と、該開始コドンから３〜１１ヌクレオチド上流に位置した、長さ３〜９ヌクレオチドの配列とを含んでいる（Shine et al, NATURE (1975) 254:34）。ＳＤ配列は、ＳＤ配列とＥ．  ｃｏｌｉの１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’との間において塩基対を形成することにより、ｍＲＮＡとリボソームとの結合を促進すると考えられている（Steitz et al Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA, In Biological Regulation and Development: Gene Expression (Ed. R. F. Goldberger, 1979) ）。真核性遺伝子および原核性遺伝子を、弱いリボソーム結合部位により発現すること（Sambrook et al Expression of cloned genes in Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989）。
【０４６７】
“細菌宿主”または“細菌宿主細胞”という用語は、組み換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡにとっての受容物として使用され得るか、または使用されている細菌のことをいう。この用語は、トランスフェクションされている元々の細菌宿主細胞の子孫を含む。１つの親細胞の子孫が、形態、ゲノムＤＮＡまたは全ＤＮＡの補体において、偶発的な突然変異、または計画的な突然変異に起因して、元々の親細胞と必ずしも完全に一致していなくてもよいことは理解される。関連する性質（例えば、ｈＰＰまたはｈＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在）により特徴付けられる親細胞と十分に類似する、親細胞の子孫は、この定義によって意図される子孫に含まれる。
【０４６８】
ｈＰＰまたはｈＡポリペプチドの発現に適切な細菌宿主の選択は、当業者に公知である。発現のための細菌宿主の選択において、適切な宿主は、取り分け、良好な封入体形成能、低いタンパク質分解活性、および全体的に強健さを有することが示されている宿主であってもよい。細菌宿主は、一般的に、様々な供給源から入手することができ、例えば、Bacterial Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, University of California（バークレイ、ＣＡ）、およびthe American Type Culture Collection（“ＡＴＣＣ”）（マナッサ、ＶＡ）から入手することができるが、これらに限定されない。Ｋ株に由来する細菌（Ｗ３１１０など）、またはＢ株に由来する細菌（ＢＬ２１など）が、一般的に産業的／製薬的な発酵に用いられる。これらの株は、成長パラメーターが、極めてよく知られており、かつ強健であるから特に有用である。さらに、これらの株は、安全性および環境的理由にとって商業的に重要な、非病原性である。好適なＥ．  ｃｏｌｉ宿主の他の例としては、ＢＬ２１、ＤＨ１０Ｂまたはこれらの派生物が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法のもう１つ別の実施形態では、Ｅ．  ｃｏｌｉ宿主は、プロテアーゼが欠失した株（ＯＭＰ−、およびＬＯＮ−が挙げられるが、これらに限定されない）である。本発明の方法のもう１つ別の実施形態では、宿主細胞株は、シュードモナス種（シュードモナス  フルオレセンス、シュードモナス  アエルギノーザ、およびシュードモナス  プティダが挙げられるが、これらに限定されない）である。ＭＢ１０１株と命名されたシュードモナス  フルオレセンスの１つの次亜種は、組み換え体の製造に有用であることが知られており、治療用タンパク質の製造過程に利用可能である。シュードモナスの発現系の例としては、宿主株としてThe Dow Chemical Companyから入手可能な系が挙げられる（ミッドランド、ＭＩ（ワールドワイドウェブのdow.comにおいて利用できる））。
【０４６９】
組み換え宿主細胞株が、確立されれば（すなわち、発現コンストラクトが、宿主細胞に導入され、かつ適切な発現コンストラクトを有する宿主細胞が単離されれば）、当該組み換え宿主細胞株が、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドの産生に適切な条件下において培養される。当業者にとって明らかなように、組み換え宿主細胞株の培養方法は、利用される発現コンストラクトの性質、および宿主細胞の個性に依存する。組み換え宿主株は、当業者に公知の方法を用いて培養される。組み換え宿主細胞は、通常、炭素、窒素および無機塩の吸収可能な供給源、ならびに任意に、ビタミン、アミノ酸、成長因子、および当業者にとって公知の他のタンパク質性の培養補助物を含む液体培養基において一般的に培養される。また、宿主細胞の培養のための液体培養基は、望ましくない微生物および／または化合物の成長を阻害するための抗生物質、または抗真菌剤（発現ベクターを含む宿主細胞を選択するための抗生物質が挙げられるが、これに限定されない）を、任意に含み得る。
【０４７０】
組み換え宿主細胞は、バッチ式もしくは連続式のいずれかにおいて、細胞の回収（ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドが細胞内に蓄積する場合に）、または培養上清の回収のいずれかを伴う、バッチ式または連続式において培養され得る。原核生物の宿主細胞における産生にとって、バッチ式培養および細胞収集が好ましい。
【０４７１】
本発明のｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、組み換え系における発現の後に、普通は、精製される。ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、技術にとって公知の様々な方法によって、宿主細胞または培地から精製され得る。細菌宿主細胞において産生されたｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、（封入体の形態において）可溶性に乏しいか、または不溶性であり得る。本発明の１つの実施形態において、当該技術において公知の方法だけでなく、本明細書に記載された方法を利用して、アミノ酸の置換が、組み換えによって製造されたタンパク質の可溶性の増加を目的として、選択されるｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドにおいて容易に行われ得る。不溶性のタンパク質の場合に、当該タンパク質は、宿主細胞溶解液から遠心分離によって回収され得、さらに続く細胞のホモジナイゼーション（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）が行われ得る。可溶性に乏しいタンパク質の場合、化合物（ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）が挙げられるが、これに限定されない）は、部分的に可溶性のタンパク質の沈殿を引き起こすために加えられ得る。それから、沈殿したタンパク質は、遠心分離によって好都合に回収され得る。当業者にとって公知の様々な方法により、組み換え宿主細胞が崩壊またはホモジナイズされて、当該細胞内から封入体が放出され得る。宿主細胞の崩壊またはホモジナイゼーションは、よく知られる技術（酵素的細胞崩壊、超音波処理、ダウンス型ホモジナイゼーション（ｄｏｕｎｃｅ  ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）、または高圧放出崩壊が挙げられるが、これらに限定されない）を用いて実施され得る。本発明の方法の１つの実施形態では、高圧放出技術を、Ｅ．  ｃｏｌｉ宿主細胞の崩壊に使用することによって、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドの封入体を放出させる。ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドの封入体を取り扱うときに、繰り返しのホモジナイゼーション時間を最小化することが好都合である。これにより、可溶化、器械的なせん断またはタンパク質分解などの要因による損失を無くし、封入体の収量が最大になる。
【０４７２】
不溶性のまたは沈殿したｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、当該技術にとって公知の、適切な多くの可溶化試薬のいずれかを用いて可溶化され得る。好ましくは、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、尿素またはグアジニン塩酸塩を用いて可溶化され得る。バッチの大きさが都合よく扱いやすいものを用いて、大規模なバッチが産生され得るように、可溶化されたｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドの容積は、最小化されるべきである。組み換え宿主細胞が一度に数千リットルの容積であるバッチにおいて成長され得るとき、この要因は、大規模な工業的設定において重要であり得る。また、特にヒトへの製薬利用のために大規模な工業的設定においてｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドを製造するとき、機械および容器か、またはタンパク質産物自体かのいずれかを損傷するおそれのある過酷な化学物質の回避は、可能であれば、避けられるべきである。穏やかな変性試薬である尿素を、過酷な変性試薬であるグアニジン塩酸塩の代わりに、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチド封入体の可溶化に使用できることが、本発明の方法に示されている。尿素の使用は、ポリペプチドの製造過程および精製過程に利用されるステンレス鋼の設備に対する損傷の危険度を有為に低減すると同時に、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチド封入体を効率的に可溶化する。
【０４７３】
可溶性ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃタンパク質の場合、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃは、細胞膜周辺腔、または培地に分泌され得る。また、可溶性ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃは、宿主細胞の細胞質に存在し得る。精製段階を実施する前に、可溶性のｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃを濃縮することが望ましいことがある。当業者に公知の標準的な技術は、細胞溶解液または培地などからの可溶性ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃの濃縮に使用され得る。また、当業者に公知の標準的な技術は、宿主細胞の崩壊、および宿主細胞の細胞質もしくは細胞膜周辺腔からの可溶性ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃの放出に使用され得る。
【０４７４】
ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドが融合タンパク質として産生されるとき、融合配列は除去され得る。融合配列の除去は、酵素的切断または化学的切断によって果たされ得る。融合配列の酵素的除去は、当業者に公知の方法を用いて果たされ得る。融合配列の除去にふさわしい酵素の選択は、融合の個性によって決定され、かつ反応条件は、当業者にとって明らかなような酵素の選択によって特定される。化学的切断は、当業者に公知の試薬（臭化シアン、ＴＥＶプロテアーゼ、および他の試薬が挙げられるが、これらに限定されない）を用いて果たされ得る。切断されたｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、当業者に公知の方法によって、切断された融合配列から精製され得る。そのような方法は、当業者にとって明らかなように、融合配列およびｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドの個性および性質によって決定される。精製方法としては、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、もしくは透析、またはこれらのあらゆる組み合わせが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０４７５】
また、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃは、タンパク質溶液からＤＮＡを除去するために、精製され得る。ＤＮＡは、当業者に公知のあらゆる適切な方法（例えば、沈殿またはイオン交換クロマトグラフィー）によって除去され得るが、核酸沈殿試薬（例えば、硫酸プロタミンが挙げられるが、これに限定されない）を用いた沈殿によって除去され得る。ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、標準的なよく知られた方法（遠心分離またはろ過が挙げられるが、これらに限定されない）を用いて、沈殿されたＤＮＡから分離され得る。ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドがヒトの治療に用いられる設定、および本発明の方法が薬学的に許容可能なレベルまで宿主細胞のＤＮＡを低減する設定において、宿主核酸分子の除去は重要な要因である。
【０４７６】
また、小規模または大規模な発酵方法は、タンパク質発現（発酵槽、振とうフラスコ、流動床バイオリアクター、中空糸バイオリアクター、ローラーボトル培養系、および攪拌タンクバイオリアクター系が挙げられるが、これらに限定されない）に使用され得る。これらの方法のそれぞれは、バッチ処理、給飼バッチ処理、連続様式処理において実施され得る。
【０４７７】
本発明のヒトｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、当該分野における標準的な方法を用いて、通常に回収され得る。例えば、培地または細胞溶解液は、細胞破片を除去するために遠心分離またはろ過され得る。上清は、濃縮され得るか、またはさらなる精製用の調製物を適当な状態にする適切な緩衝液において、所望の容積に希釈もしくは透析され得る。本発明のｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドのさらなる精製としては、原型の形態から脱アミド化され、かつ短縮されたｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドバリアントの形態の分離が挙げられる。
【０４７８】
以下の例示的な手法のいずれかは、本発明のｈＰＰまたはｈＡポリペプチドの精製に採用され得る。当該手法は、アフィニティークロマトグラフィー；陰イオン交換クロマトグラフィーもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥを用いたものが挙げられるが、これに限定されない）；シリカ上におけるクロマトグラフィー；高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）；逆相ＨＰＬＣ；ゲルろ過（ＳＥＰＨＡＤＥＸ  Ｇ−７５を用いたものが挙げられるが、これに限定されない）；疎水性相互作用クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；金属キレートクロマトグラフィー；限外ろ過／ダイアフィルトレーション；エタノール沈殿；硫酸アンモニウム沈殿；等電点電気泳動（ｃｈｒｏｍａｔｏｆｏｃｕｓｉｎｇ）；置換クロマトグラフィー；電気泳動的手法（分離用の等電点電気泳動（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ）が挙げられるが、これに限定されない）、差別的可溶性（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）（硫酸アンモニウム沈殿が挙げられるが、これに限定されない）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは抽出である。
【０４７９】
本発明のタンパク質（非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質、非天然アミノ酸を含んでいるペプチド、非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質に対する抗体、非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質にとっての結合パートナーなどが挙げられるが、これらに限定されない）は、当業者に公知の、かつ使用される標準的な手法に従って、部分的または実質的に均質に精製される。従って、本発明のポリペプチドは、当業者に公知の任意の多くの方法（硫酸アンモニウム沈殿もしくはエタノール沈殿、酸抽出もしくは塩基抽出、カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、およびゲル電気泳動などが挙げられるが、これらに限定されない）によって、回収および精製され得る。タンパク質をリフォールディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）する工程は、必要に応じて、正確に折りたたまれた成熟タンパク質を作製するときに、使用され得る。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、アフィニティークロマトグラフィー、または他の適切な方法は、高い純度が所望される場合に、最終的な精製工程において採用され得る。１つの実施形態において、非天然アミノ酸（または非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質もしくはペプチド）に対して作製された抗体は、１つ以上の非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質またはペプチドの親和性に基づく精製などのための精製試薬として使用され得る。必要に応じて、部分的にまたは均質にまで精製されると、ポリペプチドは、多種多様な有用物（例えば、アッセイの構成要素、治療学、予防法、診断学、研究試薬として、および／または抗体生成用の抗原としてであるが、これらに限定されない）に関して、任意に使用される。
【０４８０】
本明細書に言及されている他の参考文献に加えて、様々な精製／タンパク質折りたたみ方法は、当業者に公知である（例えば、R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982)、Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification. Academic Press, Inc. N.Y. (1990) 、Sandana, (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.、Bollag et al (1996) Protein Methods, 2nd Edition Wiley-Liss, NY、Walker, (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris and Angal, (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England、Harris and Angal, Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England、Scopes, (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3rd Edition Springer Verlag, NY、Janson and Ryden, (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley-VCH, NY、およびWalker (1998), Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJならびにこれらに引用されている参考文献に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない）。
【０４８１】
真核生物の宿主細胞または非真核生物の宿主細胞において、非天然アミノ酸を用いて所定のタンパク質またはポリペプチドを産生することの１つの利点は、通常、該タンパク質または該ポリペプチドが、それらの本来の立体構造に折りたたまれることである。しかし、本発明のある特定の実施形態において、当業者は、合成、発現および／または精製の後に、タンパク質またはポリペプチドが、関連するポリペプチドの所望の立体構造とは異なる立体構造を有することが可能であることを認識している。本発明の１つの局面において、発現されたタンパク質またはポリペプチドは、任意に変性され、かつそれから復元される。これは、当該分野において公知の方法を利用して（所定のタンパク質またはポリペプチドに対するシャペロニンの添加によってか、カオトロピック剤（例えば、グアニジンＨＣｌ）にタンパク質を可溶化することによってか、またはタンパク質二硫化物異性化酵素を用いてなどが挙げられるが、これらに限定されない）果たされ得る。
【０４８２】
一般的には、発現したポリペプチドを変性または還元して、その後に当該ポリペプチドを好ましい立体構造へとリフォールディングさせることが望ましいことがある。例えば、グアニジン、尿素、ＤＴＴ、ＤＴＥ、および／またはシャペロニンは、所定の転写産物に加えられ得る。タンパク質の還元、変性および復元の方法は、当業者に公知である（Debinski,et al, (1993) J. Biol. Chem., 268: 14065- 14070）、Kreitman and Pastan (1993) Bioconiug. Chem.. 4: 581-585、およびBuchner,et al, (1992) Anal. Biochem., 205: 263-270を参照すればよい）。Debinski, et alは、例えば、グアニジン−ＤＴＥにおける封入体タンパク質の変性および還元を記載している。タンパク質は、還元剤（酸化型グルタチオンおよびＬ−アルギニンを含有する還元剤が挙げられるが、これらに限定されない）においてリフォールディングされ得る。リフォールディング剤は、流されるか、またはそうでなければ、移動されて、１つ以上のポリペプチドもしくは他の発現産物と接触させられ得る。また、その逆もあり得る。
【０４８３】
ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドを原核生物において産生する場合、そのように産生されるｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、誤って折りたたまれることがある。このため、ポリペプチドの生物活性が、欠如または低減されていることがあり得る。タンパク質の生物活性は、“リフォールディング”によって復帰され得る。通常、誤って折りたたまれたｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、例えば、１つ以上のカオトロピック剤（例えば、尿素および／またはグアニジン）およびジスルフィド結合を還元可能な還元剤（例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、または２メルカプトエタノール（２−ＭＥ））を用いて、ポリペプチド鎖が可溶化（ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドも不溶性である場合に）、アンフォールディング（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）および還元されることによってリフォールディングされ得る。それから、穏やかな濃度のカオトロープ（ｃｈａｏｔｏｒｏｐｅ）において、ジスルフィド結合の強化を可能にする酸化剤（例えば、酸素、シスチンまたはシスタミン）が添加される。ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、当該分野において公知の標準的な方法（例えば、米国特許第４，５１１，５０２号明細書、米国特許第４，５１１，５０３号明細書、および米国特許第４，５１２，９２２号明細書に記載の方法、これらの文献は、言及によって本明細書に組み込まれる）を用いてリフォールディングされ得る。また、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、他のタンパク質と共同して折りたたまれて、異種ニ量体または異種多量体を形成し得る。
【０４８４】
リフォールディングまたは共同折りたたみの後に、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、さらに精製され得る。ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドの精製は、当業者に公知の多様な技術（疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、および親和性クロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない）を用いて果たされ得る。また、付加的な精製は、精製されたタンパク質の乾燥または沈殿の段階を含み得る。
【０４８５】
精製の後に、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃは、当該分野において公知のあらゆる多様な方法（ダイアフィルトレーションおよび透析が挙げられるが、これらに限定されない）によって、異なる緩衝液に交換され得る、および／または濃縮され得る。単一の精製タンパク質として与えられるｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃは、凝集および沈殿に供され得る。
【０４８６】
精製ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃは、少なくとも９０％の純度（逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、またはドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって測定されるような）、または少なくとも９５％の純度、または少なくとも９８％の純度、または少なくとも９９％の純度、またはそれ以上の純度であり得る。ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃの正確な数値的な純度に関係なく、当該ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃは、薬学的産物としての使用、またはさらなる処理（例えば、水溶性重合体（例えば、ＰＥＧ）との接合）にとって十分な純度であり得る。
【０４８７】
ある種のｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃ分子は、（賦形剤、担体および安定剤、ならびに血清アルブミンなど以外の）他の活性成分もしくはタンパク質の非存在下において治療薬として使用され得るか、またはそれらは、他のタンパク質もしくは重合体と共に複合化され得る。
【０４８８】
（通常の精製方法）
様々な単離工程のいずれか１つは、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃを含むか、またはあらゆる単離工程から結果として生じるｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチド混合物における、細胞溶解液、抽出物、培地、封入体、宿主細胞の細胞膜周辺腔、宿主細胞の細胞質、または他の材料に対して実施され得る。当該あらゆる単離工程としては、アフィニティークロマトグラフィーか、イオン交換クロマトグラフィーか、疎水性相互作用クロマトグラフィーか、ゲルろ過クロマトグラフィーか、高速液体クロマトグラフィー（“ＨＰＬＣ”）か、逆相ＨＰＬＣ（“ＰＲ−ＨＰＬＣ”）か、発泡床吸着（expanded bed adsorption）か、それらの任意の組み合わせおよび／または繰り返し、ならびに任意の適切な順序でのそれらの任意の組み合わせおよび／または繰り返しが挙げられる。
【０４８９】
本明細書に記載されている技術の実施に使用される設備、および他の必要な材料は、市販されている。ポンプ、フラクションコレクター、モニター、記録器、および全体のシステムが、例えば、アプライド  バイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（フォスターシティー（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）、ＣＡ）、バイオラッドラボラトリー  Ｉｎｃ．（ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）、ＣＡ）、およびアマシャムバイオサイエンス  Ｉｎｃ.（ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ＮＪ）から市販されている。また、クロマトグラフィーの材料（交換基質材料、溶剤および緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない）は、そのようは企業から入手可能である。
【０４９０】
本明細書に記載されているカラムクロマトグラフィー手法における平衡および他の工程（例えば、洗浄および溶出）は、特殊な設備（例えば、ポンプ）を用いてより速く実施され得る。市販のポンプとしては、ハイロードポンプ（ＨＩＬＯＡＤ（登録商標）  Ｐｕｍｐ）Ｐ−５０、ペリスタルティックポンプ（Ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ  Ｐｕｍｐ）、ポンプＰ−９０１、およびポンプＰ−９０３（アマシャムバイオサイエンス、ピスカタウェイ、ＮＪ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４９１】
フラクションコレクターの例としては、レディフラック  フラクションコレクター（ＲＥＤＩＦＲＡＣ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ）、ＦＲＡＣ−１００およびＦＲＡＣ−２００フラクションコレクター、ならびにスーパーフラック  フラクションコレクター（ＳＵＰＥＲＦＲＡＣ（登録商標）  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ）（アマシャムバイオサイエンス、ピスカタウェイ、ＮＪ）が挙げられるが、これらに限定されない。また、混合器は、ｐＨ勾配および直線的な濃度勾配の形成に利用可能である。市販の混合器としては、グラジエントミキサー（Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｍｉｘｅｒ）ＧＭ−１およびインラインミキサーズ（Ｉｎ−Ｌｉｎｅ  Ｍｉｘｅｒｓ）（アマシャムバイオサイエンス、ピスカタウェイ、ＮＪ）が挙げられる。
【０４９２】
クロマトグラフィー過程は、あらゆる市販のモニターを用いて監視され得る。そのようなモニターは、ＵＶ、ｐＨおよび導電率のような情報の収集に使用され得る。検出器の例としては、モニター（Ｍｏｎｉｔｏｒ）  ＵＶ−１、ユビコード（ＵＶＩＣＯＲＤ（登録商標））  Ｓ  ＩＩ、モニター  ＵＶ−Ｍ  ＩＩ、モニター  ＵＶ−９００、モニター  ＵＰＣ−９００、モニター  ｐＨ／Ｃ−９００、およびコンダクティヴィティーモニター（Ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍｏｎｉｔｏｒ）（アマシャムバイオサイエンス、ピスカタウェイ、ＮＪ）が挙げられる。実際に、全体のシステムは、市販されている（例えば、アマシャムバイオサイエンス（ピスカタウェイ、ＮＪ）から提供されているアクタ（ＡＫＴＡ（登録商標））システムズが挙げられる）。
【０４９３】
本発明の１つの実施形態において、例えば、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、尿素において精製されたｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチド結果物の第１の変性によって、還元および変性され、続いて適切なｐＨにおいて還元剤（例えば、ＤＴＴ）を含む緩衝液に希釈され得る。他の実施形態において、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、約２Ｍから約９Ｍの範囲にある濃度の尿素において変性され、続いて約５．０から約８．０の範囲にあるｐＨのＴＲＩＳ緩衝液に希釈される。それから、この実施形態のリフォールディング混合物は、インキュベートされ得る。１つの実施形態において、リフォールディング混合物は、室温において４から２４時間、インキュベートされる。還元されかつ変性されたｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチド混合物は、それからさらに単離または精製され得る。
【０４９４】
本明細書に述べられているように、第１のｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチド混合物のｐＨは、次のあらゆる単離工程を実施する前に調整され得る。また、第１のｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチド混合物、またはあらゆるこれらの後の混合物は、当該分野において公知の技術を用いて濃縮され得る。さらに、第１のポリペプチド混合物、またはあらゆるこれらの続きの混合物を含む溶出緩衝液は、当業者に公知の技術を用いて、次の単離工程に好適な緩衝液に交換され得る。
【０４９５】
イオン交換クロマトグラフィー
イオン交換クロマトグラフィーが、１つの実施形態において、そして任意の付加的な工程として、第１のｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチド混合物に対して実施され得る。一般的に、ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY: PRINCIPLES AND METHODS（カタログ番号１８−１１１４−２１、アマシャムバイオサイエンス（ピスカタウェイ、ＮＪ））を参照すればよい。市販のイオン交換カラムとしては、ハイトラップ（ＨＩＴＲＡＰ（登録商標））カラム、ハイプレップ（ＨＩＰＲＥＰ（登録商標））カラム、およびハイロード（ＨＩＬＯＡＤ（登録商標））カラム（（アマシャムバイオサイエンス、ピスカタウェイ、ＮＪ））が挙げられる。そのようなカラムは、強い陰イオン交換体（例えば、Ｑセファロースファストフロウ（Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）、Ｑセファロースハイパフォーマンス（Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）、およびＱセファロース（Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標））ＸＬ）；強い陽イオン交換体（例えば、ＳＰセファロースハイパフォーマンス（ＳＰ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）、ＳＰセファロースファストフロウ（ＳＰ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）、およびＳＰセファロース（ＳＰ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標））ＸＬ）；弱い陰イオン交換体（例えば、デアエセファロースファストフロウ（ＤＥＡＥ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ））；および弱い陽イオン交換体（例えば、ＣＭセファロースファストフロウ（ＣＭ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ））（アマシャムバイオサイエンス、ピスカタウェイ、ＮＪ）を利用している。陰イオン交換カラムクロマトグラフィーまたは陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、実質的に精製されたｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドを単離するために、精製過程のあらゆる工程において、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドに対して実施され得る。陽イオン交換クロマトグラフィー工程は、あらゆる適切な陽イオン交換基質を用いて実施され得る。有用な陽イオン交換基質としては、繊維状の、多孔質の、非多孔質の、微粒子状の、ビーズ状の、または架橋された陽イオン交換基質材料が挙げられるが、これらに限定されない。当該陽イオン交換基質材料としては、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリレート、ポリビニル、ポリスチレン、シリカ、ポリエーテル、または上述のものの何れかの混合材料が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４９６】
陽イオン交換基質は、強いまたは弱い陽イオン交換体を含む、あらゆる適切な陽イオン交換体であり得る。強い陽イオン交換体は、広いｐＨ範囲に渡ってイオン化を維持し得、かつこのようにして、広いｐＨ範囲に渡ってｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドと結合可能であり得る。しかし、弱い陽イオン交換体は、ｐＨに応じてイオン化を失い得る。例えば、弱い陽イオン交換体は、ｐＨが約ｐＨ４またはｐＨ５より下に低下すると、電荷を失い得る。適切な陽イオン交換体としては、荷電した官能基（例えば、スルホプロピル（ＳＰ）、メチルスルホネート（Ｓ）、またはスルホエチル（ＳＥ））が挙げられるが、これに限定されない。陽イオン交換基質は、好ましくは約２．５から約６．０のｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃ結合ｐＨ範囲を有する、強い陽イオン交換体であり得る。代替可能に、強い陽イオン交換体は、約２．５から約５．５のｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃ結合ｐＨ範囲を有し得る。陽イオン交換基質は、約３．０のｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃ結合ｐＨを有する強い陽イオン交換体であり得る。代替可能に、陽イオン交換基質は、好ましくは約６．０から約８．０のｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃ結合ｐＨ範囲を有する、強い陽イオン交換体であり得る。陽イオン交換基質は、好ましくは約８．０から約１２．５のｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃ結合ｐＨ範囲を有する強い陽イオン交換体であり得る。代替可能に、陽イオン交換体は、好ましくは約８．０から約１２．０のｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃ結合ｐＨ範囲を有する強い陽イオン交換体であり得る。
【０４９７】
ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃを装填する前に、陽イオン交換基質は、例えば、カラム容積の数倍の希釈液、弱酸（例えば、カラム容積の４倍のｐＨ３、２０ｍＭの酢酸）を用いて、平衡化され得る。平衡化に続いて、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃが加えられてもよく、かつカラムは、やはり弱酸（例えば、弱い酢酸溶液またはリン酸溶液）を用いた実質的に精製されたｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃの溶出前に、１回から数回ほど洗浄されてもよい。例えば、カラム容積のおよそ２−４倍のｐＨ３、２０ｍＭの酢酸は、カラムの洗浄に使用され得る。また、例えば、カラム容積の２−４倍の、ｐＨ５．５、０．０５Ｍの酢酸ナトリウム、または０．１Ｍの塩化ナトリウムと混合されたｐＨ５．５、０．０５Ｍの酢酸ナトリウムを用いた付加的な洗浄が、使用され得る。代替可能に、当該分野において公知の方法を用いて、陽イオン交換基質は、カラム容積の数倍の希釈液、弱塩基を用いて平衡化され得る。
【０４９８】
代替可能に、実質的に精製されたｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃは、基質からｈＰＰまたはｈＡポリペプチドを移動させるほど十分に低いｐＨまたはイオン強度を有する緩衝液と、陽イオン交換基質とを接触させることによって、溶出され得る。溶出緩衝液のｐＨは、約ｐＨ２．５から約ｐＨ６．０までの範囲であり得る。より詳細には、溶出緩衝液のｐＨは、約ｐＨ２．５から約ｐＨ５．５、約ｐＨ２．５から約ｐＨ５．０までの範囲であり得る。溶出緩衝液は約３．０のｐＨを有し得る。また、溶出緩衝液の量は、広範に変化してもよく、かつ通常、カラム容積の約２倍から約１０倍の範囲にある。
【０４９９】
陽イオン交換基質に対するｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドの吸着に続いて、実質的に精製されたｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、当該基質からｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドを移動させるほど十分に高いｐＨまたはイオン強度を有する緩衝液と、基質を接触させることによって溶出され得る。実質的に精製されたｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドの高ｐＨ溶出における使用に適した緩衝液としては、少なくとも約５ｍＭから少なくとも約１００ｍＭの濃度範囲にある、クエン酸塩、リン酸塩、蟻酸塩、酢酸塩、ＨＥＰＥＳおよびＭＥＳ緩衝液が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０５００】
逆相クロマトグラフィー
ＲＰ−ＨＰＬＣは、当業者に公知の適切なプロトコールに従って、タンパク質を精製するために、実施され得る。例えば、Pearson et al, ANAL BIOCHEM. (1982) 124:217-230 (1982)、Rivier et al, J. CHROM. (1983) 268:112-119、Kunitani et al, J. CHROM. (1986) 359:391-402を参照すればよい。ＲＰ−ＨＰＬをｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドに対して実施して、実質的に精製されたｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドを単離し得る。この点に関して、多種多様な長さ（少なくともＣ３から少なくともＣ３０まで、少なくともＣ３から少なくともＣ２０まで、または少なくともＣ３から少なくともＣ１８までの長さが挙げられるが、これらに限定されない）を有するアルキル官能基を用いた、シリカ誘導体化樹脂が使用され得る。代替可能に、重合体化樹脂が使用され得る。例えば、スチレン重合体樹脂である、トソハースアンバークローム（ＴｏｓｏＨａａｓ  Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍｅ）ＣＧ１０００ｓｄ樹脂が使用され得る。また、多種多様なアルキル鎖を有するシアノ樹脂または重合体化樹脂が、使用され得る。さらに、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムは、溶媒（例えば、エタノール）を用いて洗浄され得る。ソース（Ｓｏｕｒｃｅ）ＲＰカラムは、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムの他の例である。
【０５０１】
イオン対化剤および有機緩和剤（例えば、メタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、またはエタノール）を含む適切な溶出緩衝液が、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドをＰＲ−ＨＰＬＣカラムから溶出するために、使用され得る。最も一般的に使用されるイオン対化剤の例としては、酢酸、蟻酸、過塩素酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、ヘプタフルオロブチル酸、トリエチルアミン、テトラメチルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム、酢酸トリエチルアンモニウムが挙げられるが、これらに限定されない。溶出は、分離時間の短縮、およびピーク幅の縮小に好ましい勾配条件を有する、１つ以上の勾配条件または定組成条件を用いて実施され得る。他の方法は、異なる溶媒濃度範囲を有する２の勾配の使用に関する。本明細書における使用に適した溶出緩衝液の例としては、酢酸アンモニウム溶液およびアセトニトリル溶液が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５０２】
疎水性相互作用クロマトグラフィー精製技術
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、ｈＰＰまたはｈＡポリペプチドに対して実施されてもよい。一般的に、HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK: PRINCIPLES AND METHODS （カタログ番号１８−１０２０−９０、アマシャムバイオサイエンス、（ピスカタウェイ、ＮＪ））を参照すればよく、これは言及によって本明細書に組み込まれる。適切なＨＩＣ基質としては、アルキル置換基質もしくはアリール置換基質（例えば、ブチル置換基質、ヘキシル置換基質、オクチル置換基質、またはフェニル置換基質（アガロース基質、架橋アガロース基質、セファロース基質、セルロース基質、シリカ基質、デキストラン基質、ポリスチレン基質、ポリ（メタクリレート）基質が挙げられる））、および混合形式基質（ポリエチレンアミン樹脂基質、またはブチル置換ポリ（メタクリレート）基質もしくはフェニル置換ポリ（メタクリレート）基質が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。疎水性相互作用クロマトグラフィーに関する市販の原料としては、ハイトラップ（登録商標）、ハイプレップ（登録商標）およびハイロード（登録商標）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５０３】
簡単に説明すると、装填の前に、ＨＩＣカラムは、当業者に公知の標準的な緩衝液（例えば、酢酸溶液／塩化ナトリウム溶液、または硫酸アンモニウムを含むＨＥＰＥＳ）を用いて、平衡化され得る。硫酸アンモニウムは、ＨＩＣカラム装填用の緩衝液として使用され得る。それから、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドの装填した後に、カラムは、不要な物質を取り除くための標準的な緩衝液と条件とを用いて洗浄され得るが、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドはカラムに保持されている。ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、カラム容積の約３倍から約１０倍の標準的な緩衝液（例えば、とりわけ、ＥＤＴＡと平衡化緩衝液より低濃度の硫酸アンモニウムとを含むＨＥＰＥＳ緩衝液、または酢酸／塩化ナトリウム緩衝液）を用いて溶出され得る。また、例えば、リン酸カルシウムを用いた減少直線塩勾配は、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃ分子の溶出に使用され得る。それから、この溶出物は、例えば、ダイアフィルトレーション、または限外ろ過といったろ過によって濃縮されてもよい。ダイアフィルトレーションは、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドの溶出に使用される塩を除くために利用され得る。
【０５０４】
他の精製技術
例えば、ゲルろ過（言及によって本明細書に組み込まれるGEL FILTRATION: PRINCIPLES AND METHODS（カタログ番号１８−１０２２−１８、アマシャムバイオサイエンス（ピスカタウェイ、ＮＪ））、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（好適な基質としては、ＨＡウルトロゲル（ＨＡ−Ｕｌｔｒｏｇｅｌ）、ハイリソリューション（Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）（カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））、ＣＨＴ  セラミックヒドロキシアパタイト（Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ（バイオラッド））、バイオ−ゲルＨＴＰヒドロキシアパタイト（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  ＨＴＰ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ（バイオラッド））が挙げられるが、これらに限定されない）、ＨＰＬＣ、発泡床吸着、限外ろ過、ダイアフィルトレーション、および凍結乾燥などを用いたさらに他の単離工程は、あらゆる過剰の塩を除去するために、および次の単離工程もしくは最終的な製剤の調合でさえ好適な緩衝液に交換するために、第１のｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチド混合物、またはあらゆる続くこれらの混合物に対して実施され得る。
【０５０５】
また、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃ分子内に存在する非天然にコードされたアミノ酸が、上記非天然にコードされたアミノ酸を含まない他の細胞性タンパク質からの分離を提供するために利用され得る。非天然にコードされたアミノ酸は、固有の化学機能性基を備えているため、上記固有の機能性基と、他の分子とのカップリングにより、実質的な精製過程を提供することができる。例えば、非天然にコードされたアミノ酸は、他の分子とカップリングして、他のタンパク質からの分離状態を確立する。非天然にコードされたアミノ酸とのカップリングのための上記のような分子としては、これらに限定されないが、ＰＥＧおよび他の重合体、ビーズ、および他の固体基材が挙げられる。
【０５０６】
ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチド（実質的に精製されたｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドを含む）の収率は、当業者に公知の技術を用いて、本明細書に記載されている各工程において、観察されてもよい。また、そのような技術は、最後の単離工程の後に、実質的に精製されたｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドの収率を評価するために使用され得る。例えば、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドの収率は、陽イオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過だけでなく、様々なアルキル鎖長を有する様々な逆相高圧液体クロマトグラフィーのあらゆるもの（例えば、シアノＰＲ−ＨＰＬＣ、Ｃ１８ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いて、観察されてもよい。
【０５０７】
本発明の特定の実施形態において、各精製工程の後におけるｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃの収率は、各精製工程にとっての開始物質におけるｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃの、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９％、または少なくとも約９９．９９％であり得る。
【０５０８】
精製は、標準的な技術（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いてか、ウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡアッセイを用いた、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドの測定によって、判定され得る。例えば、ポリクローナル抗体は、陰性対照酵母発酵および陽イオン交換回収から単離されたタンパク質に対して生成され得る。また、抗体は、宿主細胞タンパク質の汚染の存在に対するプローブに使用され得る。
【０５０９】
ＰＲ−ＨＰＣＬ材料であるＶｙｄａｃ  Ｃ４（ビダック（Ｖｙｄａｃ））は、シリカゲル粒子、Ｃ４−アルキル鎖を支持する表面からなる。タンパク質性不純物からのｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドの分離は、疎水性相互作用の強度における差に基づいている。溶出は、希釈されたトリフルオロ酢酸におけるアセトニトリル勾配を用いて実施される。調製用ＨＰＬＣは、ステンレス鋼カラム（２．８から３．２リットルのＶｙｄａｃ  Ｃ４シリカゲルを用いて充填されている）を用いて実施される。ヒドロキシアパタイトウルトロゲルの溶出物は、トリフルオロ酢酸を加えることによって酸性化され、かつＶｙｄａｃ  Ｃ４カラム上に装填される。洗浄および溶出について、希釈されたトリフルオロ酢酸におけるアセトニトリル勾配が使用される。画分は、回収され、かつただちにリン酸緩衝液を用いて中性化される。ＩＰＣ限界内にあるｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチド画分は、プールされる。
【０５１０】
デアエセファロース（ファルマシア）材料は、セファロースビーズの表面と共有的に結合されるジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基からなる。ＤＥＡＥ基に対するｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドの結合は、イオン性相互作用によって媒介される。アセトニトリルおよびトリフルオロ酢酸は、保持されることなくカラムを通過する。これらの物質が洗い流された後に、微量の不純物は、低ｐＨの酢酸緩衝液を用いてカラムを洗浄することによって除去される。それから、カラムは、中性のリン酸緩衝液を用いて洗浄され、かつｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、向上されたイオン強度を有する緩衝液を用いて溶出される。カラムは、デアエセファロースファストフロウを用いて充填されている。カラム容積は、３−１０ｍｇのｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチド／１ｍｌのゲルの範囲におけるｈＰＰまたはｈＡポリペプチドの装填を保障するために調節される。カラムは、水および平衡化緩衝液（リン酸ナトリウム／カリウム）を用いて洗浄される。ＨＰＬＣ溶出物のプールされた画分は装填され、かつカラムは平衡化緩衝液を用いて洗浄される。それから、カラムは、洗浄緩衝液（酢酸ナトリウム緩衝液）により洗浄された後に、平衡化緩衝液により洗浄される。続いて、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、溶出緩衝液（塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム／カリウム）を用いてカラムから溶出され、主要な溶出プロファイルに従って、単一の画分に回収される。デアエセファロースカラムの溶出物は、特定の伝導性に調節される。結果として生じる製剤原料は、テフロン（登録商標）（Ｔｅｆｌｏｎ）ボトルの中に無菌的にろ過され、かつ−７０℃において保存される。
【０５１１】
採用され得る付加的な方法としては、エンドトキシンを除去する工程が挙げられるが、これに限定されない。エンドトキシンは、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉといったグラム陰性の宿主細胞の外膜に見られるリポ多糖（ＬＰＳｓ）である。エンドトキシンレベルを低減する方法は、当業者に公知であり、当該方法としては、シリカ支持体、ガラス粉末、またはヒドロキシアパタイトを用いた精製技術、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ならびにこれらの方法の組み合わせなどが挙げられるが、これらに限定されない。修飾および付加的な方法は、汚染物（例えば、所定のポリペプチドからの共遊走タンパク質）を除去するために要求され得る。エンドトキシンレベルを測定する方法は、当業者に公知であり、かつカブトガニ血球抽出液（ＬＡＬ）アッセイを含むが、これに限定されない。エンドセーフ（Ｅｎｄｏｓａｆｅ（商標））−ＰＴＳアッセイは、ＬＡＬ試薬、発色体基質、および対照標準エンドトキシンを用いて前装填されたカートリッジを利用する、手持ち式の分光光度計を伴う比色分析の単一チューブ系である。代替可能な方法としては、比濁法であり、かつ９６ウェル形式を使用する動力学的（Ｋｉｎｅｔｉｃ）ＬＡＬ法が挙げられる。
【０５１２】
多種多様な方法および手法は、１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるｈＰＰまたはｈＡポリペプチドの収率および純度を評価するために使用されてもよく、当該方法および手法としては、ブラッドフォードアッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、質量分析（ＭＬＤＩ−ＴＯＦが挙げられるが、これに限定されない）、および当業者に公知のタンパク質性質決定に関する他の方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５１３】
付加的な方法としては、タンパク質染色法と伴った、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫ブロッティング、マトリックス支援レーザ脱離／イオン化−質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）、液体クロマトグラフィー／質量分析、等電点電気泳動、分析陰イオン交換、等電点電気泳動、および円偏光二色性が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５１４】
種々の戦略が、非組み換え宿主細胞、変異された宿主細胞、または無細胞系においてタンパク質に非天然アミノ酸を導入するために使用されている。また、これらの系は、本発明のｈＰＰポリペプチド、ｈＡポリペプチドまたはｈＦｃポリペプチドの作製における使用に好適である。Ｌｙｓ、ＣｙｓおよびＴｙｒといった反応性の側鎖を有するアミノ酸誘導体化は、リジンのＮ２−アセチル−リジンへの転換を生じる。また、化学合成は、非天然アミノ酸を組み込むための簡単な方法を提供する。酵素的ライゲーションおよび化学的ライゲーションの最近の発展に伴って、巨大タンパク質の作製が可能である。例えば、P. E. Dawson and S. B. H. Kent, Annu. Rev. Biochem, 69:923 (2000) を参照すればよい。化学的なペプチドライゲーションおよび本来の化学的ライゲーションは、言及によって本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１８４，３４４号明細書、米国特許出願公開第２００４／０１３８４１２号明細書、米国特許出願公開第２００３／０２０８０４６号明細書、国際公開第０２／０９８９０２号パンフレット、および国際公開第０３／０４２２３５号パンフレットに記載されている。所望の非天然アミノ酸をと共に化学的にアシル化されたサプレッサｔＲＮＡが、タンパク質生合成を支持することができるインビトロ抽出物に添加される、通常のインビトロ生合成方法は、ほとんどあらゆる大きさの種々のタンパク質に１００を越える非天然アミノ酸を部位特異的に組み込むために、使用されている。例えば、V. W. Cornish, D. Mendel and P. G. Schultz, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1995, 34:621 (1995); C.J. Noren, S.J. Anthony-Cahill, M.C. Griffith, P.G. Schultz, A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science 244:182-188 (1989); and, J.D. Bain, C.G. Glabe, T.A. Dix, A.R. Chamberlin, E.S. Diala, Biosynthetic site-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am. Chem. Soc. 111:8013-8014 (1989)を参照すればよい。広範な官能基が、タンパク質の安定性、タンパク質の折りたたみ、酵素機序、およびシグナル伝達の研究を目的として、タンパク質に組み込まれている。
【０５１５】
選択圧（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）組み込みと呼ばれる、インビボの方法が、野性体シンセターゼの乱交雑を活用するために開発された。例えば、N. Budisa, C. Minks, S. Alefelder, W. Wenger, F. M. Dong, L. Moroder and R. Huber, FASEB J., 13:41 (1999) を参照すればよい。特定の天然アミノ酸を供給する関連代謝経路が断たれている栄養要求株は、天然アミノ酸の制限された濃度を含有する最小培地において増殖される一方において、標的遺伝子の転写が抑制されている。増殖定常期に入ると、天然アミノ酸が、使い果たされ、かつ非天然アミノ酸類似物と置き換えられる。組み換えタンパク質の発現の誘導は、非天然なる維持物を含有するタンパク質の蓄積を生じる。例えば、この戦略を用いて、ｏ、ｍおよびｐ−フルオロフェニルアラニンが、タンパク質に組み込まれており、かつ容易に同定され得るＵＶスペクトルにおける２つの特性の肩を示し（例えば、C. Minks, R. Huber, L. Moroder and N. Budisa, Anal. Biochem., 284:29 (2000)を参照すればよい）；トリフルオロメチオニンは、１９Ｆ  ＮＭＲによってチトオリゴサッカライドとの相互作用を研究するための、バクテリオファージのＴ４ライソザイムにおいてメチオニンを置換するために使用されており（例えば、H. Duewel, E. Daub, V. Robinson and J. F. Honek, Biochemistry, 36:3404 (1997) を参照すればよい）；かつトリフルオロロイシンは、ロイシンの代わりに組み込まれて、ロイシンジッパータンパク質の増強された熱的および化学的な安定性を生じている。例えば、Y. Tang, G. Ghirlanda, W. A. Petka, T. Nakajima, W. F. DeGrado and D. A. Tirrell, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 40:1494 (2001)を参照すればよい。さらに、セレノメチオニンおよびテルルメチオニンが、種々の組み換えタンパク質に組み込まれて、Ｘ線結晶解析における位相の解像を容易にしている。例えば、W. A. Hendrickson, J. R. Horton and D. M. Lemaster, EMBO J., 9:1665 (1990) ；J. O. Boles, K. Lewinski, M. Kunkle, J. D. Odom, B. Dunlap, L. Lebioda and M. Hatada, Nat. Struct. Biol., 1:283 (1994) ；N. Budisa, B. Steipe, P. Demange, C. Eckerskorn, J. Kellermann and R. Huber, Eur. J. Biochem., 230:788 (1995)；およびN. Budisa, W. Karnbrock, S. Steinbacher, A. Humm, L. Prade, T. Neuefeind, L. Moroder and R. Huber, J. Mol. Biol., 270:616 (1997)を参照すればよい。また、アルケンまたはアルキン官能基を有するメチオニン類似物は、効率的に組み込まれて、化学的手段によるタンパク質の付加的な修飾を可能にしている。例えば、J. C. van Hest and D. A. Tirrell, FEBS Lett., 428:68 (1998)；J. C.. van Hest, K. L. Kiick and D. A. Tirrell, J. Am. Chem. Soc., 122:1282 (2000)；およびK. L. Kiick and D. A. Tirrell, Tetrahedron, 56:9487 (2000) ；言及によって本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５８６，２０７号明細書；米国特許出願公開第２００２／００４２０９７号明細書を参照すればよい。
【０５１６】
この方法の成功は、タンパク質翻訳の忠実度を保証するために一般的に必要とする、非天然アミノ酸類似物のアミノアシルｔＲＮＡによる認識に依存する。この方法の有効範囲を拡張するための１つの方法は、制限された数の場合に達成されている、アミノアシルｔＲＮＡの基質特異性を緩和することである。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフェニルアラニルシンセターゼ（ＰｈｅＲＳ）におけるＧｌｙによるＡｌａ２９４の置換が、基質結合ポケットの大きさを増し、かつｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン（ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ）によるｔＲＮＡＰｈｅのアシル化を生じる。M. Ibba, P. Kast and H. Hennecke, Biochemistry, 33:7107 (1994) を参照すればよい。この変異ＰｈｅＲＳを内部に有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株は、フェニルアラニンの代わりに、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニンまたはｐ−Ｂｒ−フェニルアラニンの組み込みを可能にする。例えば、M. Ibba and H. Hennecke, FEBS Lett., 364:272 (1995)；およびN. Sharma, R. Furter, P. Kast and D. A. Tirrell, FEBS Lett., 467:37 (2000)を参照すればよい。同様に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのチロシル−ｔＲＮＡシンセターゼのアミノ酸結合部位付近の点変異Ｐｈｅ１３０Ｓｅｒは、アザチロシンがチロシンよりも効率的に組み込まれることを可能にすることを、示された。F. Hamano-Takaku, T. Iwama, S. Saito-Yano, K. Takaku, Y. Monden, M. Kitabatake, D. Soll and S. Nishimura, J. Biol. Chem., 275:40324 (2000) を参照すればよい。
【０５１７】
インビボにおける非天然アミノ酸を組み込むための他の戦略は、校正機序を有するシンセターゼを修飾することである。これらのシンセターゼは、同種のアミノ酸と構造的に類似するアミノ酸を、区別できず、かつそれゆえ当該類似するアミノ酸を活性化する。この誤りは、ｔＲＮＡから誤って荷電されたアミノ酸を脱アシル化する別の部位において補正されて、タンパク質翻訳の忠実度を維持している。シンセターゼの校正活性が無効にされると、誤って活性化される構造的類似物が、編集機能を免れ得、かつ組み込まれ得る。この方法は、バリル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＶａｌＲＳ）を用いて最近に証明されている。V. Doring, H. D. Mootz, L. A. Nangle, T. L. Hendrickson, V. de Crecy-Lagard, P. Schimmel and P. Marliere, Science, 292:501 (2001) を参照すればよい。ＶａｌＲＳは、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、アミノブチレート（Ａｂｕ）と共にｔＲＮＡＶａｌを誤ってアシル化でき；その後に、これらの非同種のアミノ酸が編集ドメインによって加水分解される。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの染色体の無作為変異生成の後に、ＶａｌＲＳの編集部位に変異を有している変異体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株が、選択された。この編集欠損ＶａｌＲＳは、Ｃｙｓと共にｔＲＮＡＶａｌを不正確に荷電する。また、ＡｂｕがＣｙｓ（Ｃｙｓの−ＳＨ基がＡｂｕにおいて−ＣＨ３に置換される）を立体的に集合させるので、変異体ＶａｌＲＳは、この変異体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株がＡｂｕの存在下において増殖されると、タンパク質にＡｂｕを組み込む。質量分析解析は、バリンのやく２４％が本来のタンパク質におけるバリンの位置のそれぞれにおいて、Ａｂｕに置換されることを示している。
【０５１８】
また、固相合成法および固相半合成法は、新規のアミノ酸を含有する多くの他の合成を可能にしている。例えば、以下の刊行物および引用される参考文献：Crick, F.H.C., Barrett, L. Brenner, S. Watts-Tobin, R. General nature of the genetic code for proteins. Nature, 192:1227-1232 (1961); Hofmann, K., Bohn, H. Studies on polypeptides.  XXXVI.  The effect of pyrazole-imidazole replacements on the S-protein activating potency of an S-peptide fragment, J. Am Chem, 88(24):5914-5919 (1966); Kaiser, E.T. Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins including enyzmes, Acc Chem Res, 22:47-54 (1989); Nakatsuka, T., Sasaki, T., Kaiser, E.T. Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin, J Am Chem Soc, 109:3808-3810 (1987); Schnolzer, M., Kent, S B H. Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides:  backbone-engineered HIV protease, Science, 256(5054):221-225 (1992); Chaiken, I.M. Semisynthetic peptides and proteins, CRC Crit Rev Biochem, 11(3):255-301 (1981); Offord, R.E. Protein engineering by chemical means? Protein Eng., 1(3):151-157 (1987); and, Jackson, D.Y., Burnier, J., Quan, C., Stanley, M., Tom, J., Wells, J.A. A Designed Peptide Ligase for Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues, Science, 266(5183):243 (1994)を参照すればよい。
【０５１９】
化学的修飾は、インビトロにおいてタンパク質に種々の非天然な側鎖（補足因子、スピン標識およびオリゴヌクレオチドが挙げられる）を導入するために、使用されている。例えば、Corey, D.R., Schultz, P.G. Generation of a hybrid sequence-specific single-stranded deoxyribonuclease, Science, 238(4832):1401-1403 (1987); Kaiser, E.T., Lawrence D.S., Rokita, S.E. The chemical modification of enzymatic specificity, Annu Rev Biochem, 54:565-595 (1985); Kaiser, E.T., Lawrence, D.S. Chemical mutation of enyzme active sites, Science, 226(4674):505-511 (1984); Neet, K.E., Nanci A, Koshland, D.E. Properties of thiol-subtilisin, J Biol. Chem, 243(24):6392-6401 (1968); Polgar, L. et M.L. Bender. A new enzyme containing a synthetically formed active site.  Thiol-subtilisin. J. Am Chem Soc, 88:3153-3154 (1966); and, Pollack, S.J., Nakayama, G. Schultz, P.G. Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites, Science, 242(4881):1038-1040 (1988)を参照すればよい。
【０５２０】
代替可能に、化学的に修飾されたアミノアシル−ｔＲＮＡを採用する生合成方法は、インビトロにおいて合成されるタンパク質に種々の生物物理的なプローブを組み込むために使用されている。以下の刊行物および引用される参考文献：Brunner, J. New Photolabeling and crosslinking methods, Annu. Rev Biochem, 62:483-514 (1993); and, Krieg, U.C., Walter, P., Hohnson, A.E. Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of the signal recognition particle, Proc. Natl. Acad. Sci, 83(22):8604-8608 (1986)を参照すればよい。
【０５２１】
これまでに、所望のアンバーナンセンス変異を含有する遺伝子を用いて計画されたタンパク質合成反応に対して、化学的にアミノアシル化されたサプレッサｔＲＮＡを加えることによって、非天然アミノ酸がインビトロにおいて部位特異的に組み込まれ得ることは、示されている。これらの方法を用いて、特定のアミノ酸に対して栄養要求性株を用いて、通常の２０のアミノ酸の多くを構造的に近い相同物（例えば、フェニルアラニンに対するフルオロフェニルアラニン）に置換することができる。例えば、Noren, C.J., Anthony-Cahill, Griffith, M.C., Schultz, P.G.  A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science, 244: 182-188 (1989); M.W. Nowak, et al., Science 268:439-42 (1995); Bain, J.D., Glabe, C.G., Dix, T.A., Chamberlin, A.R., Diala, E.S. Biosynthetic site-specific Incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am Chem Soc, 111:8013-8014 (1989); N. Budisa et al., FASEB J. 13:41-51 (1999); Ellman, J.A., Mendel, D., Anthony-Cahill, S., Noren, C.J., Schultz, P.G. Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids site-specifically into proteins, Methods in Enz., vol. 202, 301-336 (1992); and, Mendel, D., Cornish, V.W. & Schultz, P.G. Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code, Annu Rev Biophys. Biomol Struct. 24, 435-62 (1995)を参照すればよい。
【０５２２】
例えば、ＵＡＧストップコドンを認識するサプレッサｔＲＮＡが、調製され、かつ非天然アミノ酸と共に化学的にアミノアシル化された。従来の部位特異的変異生成が、タンパク質遺伝子における所定の部位に、ストップコドンＴＡＧを導入するために使用された。例えば、Sayers, J.R., Schmidt, W. Eckstein, F. 5'-3' Exonucleases in phosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutagensis, Nucleic Acids Res, 16(3):791-802 (1988)を参照すればよい。アミノアシル化サプレッサｔＲＮＡおよび変異体遺伝子が、インビトロの転写／翻訳系において組み合わせられる場合に、特定の位置においてアミノ酸を含有するタンパク質を生じさせる、非天然アミノ酸がＵＡＧコドンに応じて組み込まれた。［３Ｈ］−Ｐｈｅを用いた実験およびα−ヒドロキシ酸を用いた実験は、所望のアミノ酸のみがＵＡＧコドンによって特定される位置に組み込まれ、かつこのアミノ酸が、タンパク質における他のあらゆる部位に組み込まれないことを証明した。例えば、Noren, et al, supra; Kobayashi et al., (2003) Nature Structural Biology 10(6):425-432; and, Ellman, J.A., Mendel, D., Schultz, P.G. Site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins, Science, 255(5041):197-200 (1992)を参照すればよい。
【０５２３】
ｔＲＮＡは、あらゆる方法または技術（これらに限定されないが、化学的または酵素的なアミノアシル化が挙げられる）よって所望のアミノ酸と共にアミノアシル化され得る。
【０５２４】
アミノアシル化は、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼによってか、または他の酵素的分子（これに限定されないが、リボザイムが挙げられる）によって達成され得る。“リボザイム”という用語は、“触媒ＲＮＡ”と交換可能である。Ｃｅｃｈおよび共同研究者（Cech, 1987, Science, 236:1532-1539; McCorkle et al., 1987, Concepts Biochem. 64:221-226）は、触媒としての役割を果たす天然に生じるＲＮＡ（リボザイム）の存在を証明した。しかし、これらの天然ＲＮＡ触媒は、切断およびスプライシングに関してリボ核酸基質に対してのみ役割を果たすことを示されているが、リボザイムの人工的発展の最近の成果は、種々の化学反応に対する触媒の能力範囲を拡張している。研究によって、それら自身の（２’）３’末端におけるアミノアシル−ＲＮＡを触媒することができるＲＮＡ分子（Illangakekare et al., 1995 Science 267:643-647）、および１つのＲＮＡ分子から他のＲＮＡ分子までアミノ酸を運ぶことができるＲＮＡ分子（Lohse et al., 1996, Nature 381:442-444）が同定されている。
【０５２５】
言及によって本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００３／０２２８５９３号明細書は、リボザイムの構築方法、ならびに天然にコードされるアミノ酸および非天然にコードされるアミノ酸を伴うｔＲＮＡのアミノアシル化における、それらの利用に関して記載している。ｔＲＮＡをアミノアシル化できる酵素分子（これに限定されないが、リボザイムが挙げられる）の基材に固定化された形態は、アミノアシル化産物の効率的な親和性精製を可能にし得る。好適な基材の例としては、アガロースビーズ、セファロースビーズ、および磁性ビーズが挙げられる。アミノアシル化用の基材固定化形態の製造および利用について、言及によって本明細書に組み込まれる、Chemistry and Biology 2003, 10:1077-1084および米国特許出願公開第２００３／０２２８５９３号明細書に記載されている。
【０５２６】
化学的アミノアシル化法としては、これらに限定されないが、アミノアシル化においてシンセターゼの利用を避けるために、Ｈｅｃｈｔおよび共同研究者（Hecht, S. M. Acc. Chem. Res. 1992, 25, 545; Heckler, T. G.; Roesser, J. R.; Xu, C.; Chang, P.; Hecht, S. M. Biochemistry 1988, 27, 7254; Hecht, S. M.; Alford, B. L.; Kuroda, Y.; Kitano, S. J. Biol. Chem. 1978, 253, 4517）によって、かつSchultz, Chamberlin, Dougherty and others （Cornish, V. W.; Mendel, D.; Schultz, P. G. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34, 621; Robertson, S. A.; Ellman, J. A.; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 2722; Noren, C. J.; Anthony-Cahill, S. J.; Griffith, M. C.; Schultz, P. G. Science 1989, 244, 182; Bain, J. D.; Glabe, C. G.; Dix, T. A.; Chamberlin, A. R. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8013; Bain, J. D. et al. Nature 1992, 356, 537; Gallivan, J. P.; Lester, H. A.; Dougherty, D. A. Chem. Biol. 1997, 4, 740; Turcatti, et al. J. Biol. Chem. 1996, 271, 19991; Nowak, M. W. et al. Science, 1995, 268, 439; Saks, M. E. et al. J. Biol. Chem. 1996, 271, 23169; Hohsaka, T. et al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 34）によって紹介された方法が挙げられる。当該方法または他の化学的アミノアシル化方法が、ｔＲＮＡ分子をアミノアシル化するために使用され得る。
【０５２７】
触媒ＲＮＡを生成する方法は、無作為化されたリボザイム配列の別々のプールを生成すること、定方向の進化を実施すること、所望のアミノアシル化活性に関してプールをスクリーニングすること、および所望のアミノアシル化活性を示すこれらのリボザイムの配列を選択することを含み得る。
【０５２８】
リボザイムは、アシル化活性を容易にするモチーフおよび／または領域（例えば、ＧＧＵモチーフおよびＵが豊富な領域）を備えることができる。例えば、Ｕが豊富な領域がアミノ酸基質の認識を容易にできること、およびＧＧＵモチーフがｔＲＮＡの３’末端と塩基対を形成できることは、報告されている。組み合わせて、ＧＧＵモチーフおよびＵが豊富な領域は、アミノ酸およびｔＲＮＡの両方の同時認識を容易にし、かつ同時にこれによって、ｔＲＮＡの３’末端のアミノアシル化を容易にする。
【０５２９】
リボザイムは、ｔＲＮＡＡｓｎＣＣＣＧと接合され、部分的に無作為化されたｒ２４ｍｉｎｉを用いたインビトロにおける選択に続いて、活性なクローンに見出されるコンセンサス配列の体系的な改変によって生成され得る。この方法によって得られる例示的なリボザイムは、“Ｆｘ３  リボザイム”と呼ばれ、かつその内容が言及によって本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００３／０２２８５９３号明細書に記載されており、同種の非天然アミノ酸と共に荷電される、種々のアミノアシルｔＲＮＡの合成にとっての多方面な触媒としての機能を果たす。
【０５３０】
基板上に対する固定化は、ｔＲＮＡの効率的な親和性精製を可能にするために使用され得る。好適な基盤の例としては、アガロース、セファロース、および磁性ビーズが挙げられる。リボザイムは、ＲＮＡのリボソーム上における３’シス−ジオールが対応するジアルデヒドを産生するために過ヨウ素酸塩を用いて酸化されて、樹脂上のＲＮＡの固定化を容易にし得るように、ＲＮＡの化学構造を利用することによって樹脂上に固定され得る。多様な種類の樹脂（安価なヒドラジド樹脂が挙げられる）が、使用され得、ここで、還元的なアミノ化が、還元的アミン化が樹脂とリボザイムとの間における相互作用を不可逆的な結合にさせる。アミノアシルｔＲＮＡは、このカラム上（ｏｎ−ｃｏｌｕｍｎ）の技術によって非常に容易にされ得る。Kourouklis et al. Methods 2005; 36:239-4には、カラムに基づいたアミノアシル化系について記載されている。
【０５３１】
アミノアシル化ｔＲＮＡの単離は、種々の方によって達成され得る。１つの好適な方法は、緩衝液（例えば、１０ｍＭのＥＤＴＡを有する酢酸ナトリウム、５０ｍＭのＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（３−プロパンスルホン酸）、１２．５ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．０、１０ｍＭＥＤＴＡを含有する緩衝液、または単にＥＤＴＡ緩衝化水（ｐＨ７．０））を用いてカラムからアミノアシル化ｔＲＮＡを溶出することである。
【０５３２】
アミノアシル化ｔＲＮＡは、ｔＲＮＡが翻訳反応によって作製されるポリペプチドにおける最適な位置においてアミノアシル化されるアミノ酸を組み込むために、翻訳反応に加えられ得る。本発明のアミノアシル化ｔＲＮＡが使用され得る翻訳系の例としては、これに限定されないが、細胞溶解液が挙げられる。細胞溶解液は、投入するｍＲＮＡから得られるポリペプチドのインビボ翻訳に必要な反応成分を提供する。当該反応成分の例としては、これらに限定されないが、ｒＲＮＡ、アミノ酸、ｔＲＮＡ、ＧＴＰ、ＡＴＰ、翻訳開始因子および延長因子、ならびに翻訳に関連する付加的な因子が挙げられる。付加的に、翻訳系は、処理単位（ｂａｔｃｈ）翻訳または区画化翻訳であり得る。処理単位翻訳の系は、単一の区画において反応成分を組み合わせる一方において、区画化翻訳の系は、翻訳効率を抑制し得る反応産物から翻訳反応成分を分ける。当該翻訳系は、市販されている。
【０５３３】
さらに、複合された転写／翻訳系が、使用され得る。複合された転写／翻訳系は、反応成分によって次々に翻訳される対応するｍＲＮＡへの、投入するＤＮＡの転写の両方を可能にする。市販の複合された転写／翻訳の例は、ラピッドトランスレーションシステム（Ｒａｐｉｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）（ＲＴＳ、Ｒｃｈｅ（ロシュ）  Ｉｎｃ．）である。系としては、リボソームおよび翻訳因子といった翻訳の成分を供給するＥ．  ｃｏｌｉの溶菌液を含有する混合物が挙げられる。付加的に、ＲＮＡポリメラーゼは、翻訳において使用するｍＲＮＡ鋳型への、挿入するＤＮＡの転写に含められる。ＲＴＳは、反応区画（供給／排泄区画および転写／翻訳区画が挙げられる）の間に挿入される膜を用いて反応成分の区画化を使用できる。
【０５３４】
ｔＲＮＡのアミノアシル化は、他の物質（これらに限定されないが、トランスフェラーゼ、ポリメラーゼ、触媒抗体、および多機能タンパク質などが挙げられる）によって実施され得る。
【０５３５】
Stephan in Scientist 2005 Oct 10; pages 30-33 には、タンパク質に非天然にコードされるアミノ酸を組み込む方法について記載されている。Lu et al. in Mol Cell. 2001 Oct;8(4):759-69には、タンパク質が、非天然アミノ酸を含有する合成ペプチドに対して化学的に連結される方法（タンパク質連結と言われる）について記載されている。
【０５３６】
また、微量注入技術は、タンパク質への非天然アミノ酸の組み込みに使用されている。例えば、M. W. Nowak, P. C. Kearney, J. R. Sampson, M. E. Saks, C. G. Labarca, S. K. Silverman, W. G. Zhong, J. Thorson, J. N. Abelson, N. Davidson, P. G. Schultz, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Science, 268:439 (1995) ；およびD. A. Dougherty, Curr. Opin. Chem. Biol., 4:645 (2000) を参照すればよい。アフリカツメガエルの卵母細胞は、インビトロにおいて作製された２つのＲＮＡ種：所定のアミノ酸位置にＵＡＧストップコドンを有する標的タンパク質をコードするｍＲＮＡ、および所望の非天然アミノ酸と共にアミノアシル化されたアンバーサプレッサｔＲＮＡを用いて共注入された。それから、卵母細胞の翻訳機構は、ＵＡＧによって特定される位置に非天然アミノ酸を挿入する。この方法は、一般的にインビトロの系に受け容れられない、内在性膜タンパク質（ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の構造−機能研究を可能にしている。例としては、蛍光共鳴エネルギー転移によって距離を測定するための、タキキニン  ニューロキニン−２受容体への蛍光アミノ酸の組み込み（例えば、G. Turcatti, K. Nemeth, M. D. Edgerton, U. Meseth, F. Talabot, M. Peitsch, J. Knowles, H. Vogel and A. Chollet, J. Biol. Chem., 271:19991 (1996) を参照すればよい）；イオンチャネルにおける表面露出残基を同定するための、ビオチン化アミノ酸の使用（例えば、J. P. Gallivan, H. A. Lester and D. A. Dougherty, Chem. Biol., 4:739 (1997) を参照すればよい）；実時間におけるイオンチャネルの立体配置の変化を観察するための、閉じ込めたチロシン類似物の使用（例えば、J. C. Miller, S. K. Silverman, P. M. England, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Neuron, 20:619 (1998) を参照すればよい）；およびそれらのゲート機構を調べるためにイオンチャネル骨格を変更するための、αヒドロキシアミノ酸の使用が挙げられる。例えば、P. M. England, Y. Zhang, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Cell, 96:89 (1999) ；およびT. Lu, A. Y. Ting, J. Mainland, L. Y. Jan, P. G. Schultz and J. Yang, Nat. Neurosci., 4:239 (2001)を参照すればよい。
【０５３７】
インビボにおいてタンパク質に非天然アミノ酸を組み込む能力は、広範な利点（これらに限定されないが、変異タンパク質の高い収率、技術的な容易さ、細胞またはおそらくは生体における変異タンパク質を研究する見込み、ならびに治療的な処置および診断的な利用におけるこれらのタンパク質の利用が挙げられる）を提供する。種々の大きさ、酸性度、求核性、疎水性および他の特性を有する非天然アミノ酸をタンパク質に含める能力は、タンパク質の機能を調べること、および新規の性質を有する新たなタンパク質もしくは生体を作り出すことの両方を目的として、タンパク質の構造を合理的かつ体系的に操作するわれわれの能力を非常に拡張できる。
【０５３８】
パラ−Ｆ−Ｐｈｅを部位特異的に組み込むための１つの試みにおいて、酵母アンバーサプレッサｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡ／フェニルアラニル−ｔＲＮＡ対は、ｐ−Ｆ−Ｐｈｅ耐性の、Ｐｈｅ要求性のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株において使用された。例えば、R. Furter, Protein Sci., 7:419 (1998) を参照すればよい。
【０５３９】
また、無細胞（インビトロ）翻訳系を用いて、本発明のｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドの発現を得ることは、可能であり得る。翻訳系は、細胞性および無細胞であり得、かつ原核生物および真核生物であり得る。細胞性翻訳系としては、これに限定されないが、所望の核酸配列が、ｍＲＮＡに転写され得、かつｍＲＮＡが翻訳され得る透過処理された細胞および培養細胞といった、全細胞調製物が挙げられる。無細胞翻訳系は、市販されており、かつ多くの異なる種類および系がよく知られている。無細胞翻訳系の例としては、これらに限定されないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの溶菌液といった原核生物溶菌液、ならびに大麦抽出物、昆虫細胞溶解液、ウサギの網赤血球溶解液、ウサギの卵母細胞溶解液およびヒト細胞溶解液といった真核生物溶解液が挙げられる。真核細胞の抽出物または溶解液は、結果タンパク質が糖鎖付加されるか、リン酸化されるか、またはそれとは別に修飾される場合に、当該修飾が真核生物の系においてのみ可能であるため、好ましくあり得る。これらの抽出物および溶解液のいくつかは、市販されている（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、Ｗｉｓ．；ストラタジーン、ラ  ジョラ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）、  Ｃａｌｉｆ．；アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、アーリントン  ハイト（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ）、Ｉｌｌ．；ギブコ（ＧＩＢＣＯ）／ＢＲＬ、グランド  アイランド（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ）、Ｎ．Ｙ）。また、ミクロソーム膜を含有するイヌの膵臓抽出物といった膜性抽出物は、分泌型タンパク質の翻訳にとって有用に、利用可能である。鋳型としてｍＲＮＡ（インビトロ翻訳）または鋳型としてＤＮＡ（インビトロ転写および翻訳を組み合わせた）のいずれかを含み得るこれらの系において、インビトロ合成は、リボソームによって指揮される。相当な努力が、無細胞タンパク質発現系の発展に対して注がれている。例えば、言及によって本明細書に組み込まれる、Kim, D.M. and J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 74 :309-316 (2001)；Kim, D.M. and J.R. Swartz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542, (2000)；Kim, D.M., and J.R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390, (2000)；Kim, D.M., and J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 66, 180-188, (1999)；およびPatnaik, R. and J.R. Swartz, Biotechniques 24, 862-868, (1998)；米国特許第６，３３７，１９１号明細書；米国特許出願公開第２００２／００８１６６０号明細書；国際公開第００／５５３５３号パンフレット国際公開第９０／０５７８５号パンフレットを参照すればよい。非天然にコードされるアミノ酸を備えるｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドの発現に適用され得る他の方法としては、ｍＲＮＡ−ペプチド融合技術が挙げられる。例えば、R. Roberts and J. Szostak, Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 94:12297-12302 (1997) ；A. Frankel, et al., Chemistry & Biology 10:1043-1050 (2003) を参照すればよい。この方法において、ピューロマイシンに対して連結されたｍＲＮＡの鋳型は、リボソーム上において翻訳される。１つ以上のｔＲＮＡ分子が修飾されると、非天然アミノ酸が、同様にペプチドに組み込まれ得る。最後のｍＲＮＡコドンが読まれた後に、ピューロマイシンは、ペプチドのＣ末端を捕捉する。結果のｍＲＮＡ−ペプチド接合物は、インビト��アッセイにおいて興味深い性質を有することを見出されている場合に、その同一性は、ｍＲＮＡ配列から容易に明らかにされ得る。この方法において、所望の性質を有するポリペプチドを同定するために、１つ以上の非天然にコードされるアミノ酸を備えるｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドのライブラリをスクリーニングし得る。より最近に、精製成分を用いたインビトロリボソーム翻訳は、非天然にコードされるアミノ酸に置換されたペプチドの合成を可能にすることを、報告されている。例えば、A. Forster et al., Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 100:6353 (2003)を参照すればよい。
【０５４０】
また、再生翻訳系が使用され得る。また、精製翻訳因子の混合物だけでなく、溶解液の組み合わせ、または開始因子−１（ＩＦ−１）、ＩＦ−２、ＩＦ−３（αまたはβ）、伸張因子  Ｔ（ＥＦ−Ｔｕ）、もしくは終結因子といった精製翻訳因子を補った溶解液が、ｍＲＮＡをタンパク質に翻訳するために上手く使用されている。また、無細胞系は、転写／翻訳系と組み合わせら得る（ここで、言及によって本明細書によって特に組み込まれる、Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. editors, Wiley Interscience, 1993) に記載されているように、ＤＮＡが系に導入され、ｍＲＮＡに転写され、かつｍＲＮＡが翻訳される）。真核生物転写系において転写されるＲＮＡは、ある特定の翻訳系において有利であり得る、異核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）の形態であり得るか、または５’末端キャップ（７−メチルグアノシン）および３’末端ポリＡを尾部につないだＲＮＡの形態であり得る。例えば、キャップつきのｍＲＮＡは、網赤血球溶解液の系において高い効率を有して翻訳される。
【０５４１】
（ＩＸ．ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドに対して連結される巨大分子重合体）
本明細書に記載されている非天然アミノ酸ポリペプチドの種々の修飾は、本明細書に記載されている組成物、方法、技術および戦略を用いてもたらされ得る。これらの修飾は、ポリペプチドに対する非天然アミノ酸に対するさらなる機能性（これらに限定されないが、標識；色素；重合体；水溶性重合体；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；放射性核種；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似物；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；補足因子；脂肪酸；含水炭素；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド；水溶性デンドリマー；シクロデキストリン；抑制性リボ核酸；生体適合物質；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団；金属含有部分；放射性部分；新規な官能基；他の分子と共有的にかもしくは非共有的に相互作用する基；光ケージド部分；化学線励起部分；光異性体化可能な部分；ビオチン；ビオチン類似物；ビオチン類似物；重元素を組み込む部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；延長された側鎖；炭素結合型の糖；酸化還元的に活性な物質；アミノチオ酸；毒性部分；同位体的標識部分；生物物理学的なプローブ；リン光基；化学発光基；電子高密度基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー転移物質；生物学的に活性な物質；検出可能な標識；小分子；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲物質；または上述のもののあらゆる組み合わせ、もしくはあらゆる他の所望の化合物もしくは物質が挙げられる）の組み込みを含む。本明細書に記載されている組成物、方法、技術および戦略の具体的な、非限定的な例として、以下の記載は、それらに関して本明細書に記載されている組成物、方法、技術および戦略が、他の機能性（これらに限定されないが、上記に挙げたそれらが挙げられる）を加えることにも適用可能である（必要に応じて、当業者が本明細書における開示を用いてなし得る適切な改変を伴って）という理解を含めて、非天然アミノ酸ポリペプチドに対する巨大分子を加えることを中心に扱う。
【０５４２】
広範な巨大分子重合体および他の分子は、ｈＰＰまたはｈＡポリペプチドの生物学的な性質を調節するためか、および／またはｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃ分子に対して新たな生物学的な性質を与えるために、本発明のｈＰＰまたはｈＡポリペプチドに対して連結され得る。これらの巨大分子重合体は、天然にコードされるアミノ酸を介してか、非天然にコードされるアミノ酸、または天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸のあらゆる置換基、または天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸に対して加えられるあらゆる置換基もしくは官能基を介して、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドに対して連結され得る。重合体の分子量は、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａまたはそれ以上の間の広い範囲（限定されないが、これらが挙げられる）であり得る。重合体の分子量は、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａの間（これらに限定されないが、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ，５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ、および１００Ｄａが挙げられる）であり得る。いくつかの実施形態において、重合体の分子量は、約１００Ｄａから５０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態において、重合体の分子量は、約１００Ｄａから４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態において、重合体の分子量は、約１，０００Ｄａから４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態において、重合体の分子量は、約５，０００Ｄａから４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態において、重合体の分子量は、約１０，０００Ｄａから４０，０００Ｄａの間である。
【０５４３】
本発明は、重合体：タンパク質の接合物の実質的に均質な調整物を提供する。本明細書において使用されるときに、“実質的に均質な”は、重合体：ポリペプチドの接合物がタンパク質の総量の半分より多く観察されることを意味する。重合体：タンパク質の接合物は、生物活性を有し、かつ本明細書において規定される“実質的に同質な”ＰＥＧ付加ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチド調整物は、均質な調整物の利点（例えば、１組の薬物動態に対する１組の予想における臨床的な適用における容易さ）を示すために十分に均質であるそれらである。
【０５４４】
また、重合体：タンパク質の接合物分子の混合物を調製するために選択し得、かつ本明細書に規定されている利点は、混合物に含まれるモノ−重合体：タンパク質の接合物の比率を選択し得ることである。従って、必要に応じて、種々の数（すなわち、ジ−、トリ−、テトラ−など）の重合体部分と付着した状態の様々なタンパク質の混合物を調製し得、かつ本発明の方法を用いて調製されたモノ−重合体：タンパク質の接合物と上記接合物を組み合わせ得、かつ所定の割合のモノ−重合体：タンパク質の接合物を有する混合物を有し得る。
【０５４５】
選択される重合体は、重合体が付着されるタンパク質が水性環境（例えば、生理学的環境）において沈殿しないように、水溶性重合体であり得る。重合体は、分枝状であり得るか、または非分枝状であり得る。最終産物の調製物の治療的利用に関して、重合体は薬学的に受容可能である。
【０５４６】
重合体の例としては、これらに限定されないが、ポリエーテルおよびアルコキシキャップしたこれらの類似物（例えば、ポリオキシエチレン  グリコール、ポリオキシエチレン／プロピレン  グリコール、およびメトキシもしくはエトキシキャップしたこれらの類似物、特にポリオキシエチレン  グリコール、また後者は、ポリエチレングリコールまたはＰＥＧとして知られる）；ポリビニルピロリドン；ポリビニルアルキル  エーテル；ポリオキサゾリン、ポリアルキル  オキサゾリンおよびポリヒドロキシアルキル  オキサゾリン；ポリアクリルアミド、ポリアルキル  アクリルアミド、およびポリヒドロキシアルキル  アクリルアミド（例えば、ポリヒドロキシアルキルメタクリルアミドおよびこれらの誘導体）；疎水性ペプチド配列；ポリサッカライドおよびこれらの誘導体（これらに限定されないが、デキストランおよびデキストラン誘導体（例えば、カルボキシメチルデキストラン、硫酸デキストラン、アミノデキストラン）が挙げられる）；セルロースおよびその誘導体（例えば、カルボキシメチル  セルロース、ヒドロキシアルキル  セルロース）；キチンおよびその誘導体（例えば、キトサン、スクシニル  キトサン、カルボキシメチルキチン、カルボキシメチルキトサン）；ヒアルロン酸およびその誘導体；スターチ；アルギン酸塩；硫酸コンドロイチン；アルブミン；プルランおよびカルボキシメチル  プルラン；ポリアミノ酸およびこれらの誘導体（例えば、ポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリアスパラギン酸、ポリアスパルトアミド）；マレイン酸無水物共重合体（例えば、スチレン  マレイン酸無水物共重合体、ジビニルエチルエーテル  マレイン酸無水物共重合体）；ポリビニル  アルコール；これらの共重合体；これらの三元重合体；これらの混合物；ならびに上述の誘導体が挙げられる。
【０５４７】
タンパク質分子に対するポリエチレングリコールの比率は、反応混合物におけるそれらの濃度のように、変化する。一般的に、最適な比率（余剰の未反応のタンパク質または重合体が最小である反応の効率に関する）は、選択されるポリエチレングリコールの分子量によって、かつ有用な反応性基の利用可能な数に基づいて決定され得る。分子量に関連するときに、タンパク質に対して付着されるのは、典型的により分子量の高い重合体、より少ない数の重合体分子である。同様に、重合体の分枝は、これらの要素を最適化する場合に、計算に入れられるべきである。一般的に、分子量が高いほど（分枝が多いほど）、重合体：タンパク質の割合が高くなる。
【０５４８】
本明細書において使用されるとき、およびＰＥＧ：ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドの接合物について検討される場合に、“治療有効量”は、患者に対して所望の利益を与える量を指す。当該量は、個体間において変わり、かつ要素（これらに限定されないが、患者の全体的な体調および処置されるべき健康状態の根本的な原因が挙げられる）の数に依存する。ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドの治療に使用する量は、受容可能な変化の割合を示し、かつ有益な水準において所望の応答を維持する。本組成物の治療有効量は、公然に利用可能な材料および手法を用いて当業者によって容易に確かめられ得る。
【０５４９】
水溶性重合体は、あらゆる構造的な形態（これらに限定されないが、直鎖、分岐鎖または分枝鎖が挙げられる）であり得る。水溶性重合体は、典型的にポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）といったポリ（アルキレングリコール）であるが、他の水溶性重合体もまた採用され得る。ほんの一例として、ＰＥＧは、本発明のある特定の実施形態を説明するために使用される。
【０５５０】
ＰＥＧは、市販されているか、または当業者に公知の方法（Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138-161）に従って、エチレングリコールの開環重合によって調製され得る、よく知られている水溶性重合体である。“ＰＥＧ”という用語は、ＰＥＧの大きさまたは末端における修飾に関係なく、あらゆるポリエチレングリコール分子を包含するために広く使用され、かつｈＰＰまたはＡまたはｈＦｃポリペプチドに対して連結されるときに、式：
ＸＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｙ
（ここで、ｎは２から１０，０００であり、Ｘは、Ｈまたは末端修飾（これらに限定されないが、Ｃ１−４アルキル、保護基、または末端官能基が挙げられる）である）
によって表され得る。
【０５５１】
いくつかの場合において、本発明において使用されるＰＥＧは、ヒドロキシまたはメトキシを有する末端において終結する（すなわち、ＸはＨかＣＨ３である（“メトキシＰＥＧ”））。代替可能に、ＰＥＧは、これによって二機能性重合体を形成する、反応性基を有して終結できる。典型的な反応性基は、２０の通常に見られるアミノ酸における官能基と反応するために通常に使用されるこれらの反応性基（これらに限定されないが、マレイミド基、活性化カルボン酸塩（これに限定されないが、ｐ−ニトロフェニルエステルが挙げられる）、活性化エステル（これらに限定されないが、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド、ｐ−ニトロフェニルエステルが挙げられる）、およびアルデヒドが挙げられる）だけでなく、２０の通常のアミノ酸に対して不活性であるが、非天然にコードされるアミノ酸に存在する補完的な官能基と特に反応する官能基（これらに限定されないが、アジド基、アルキン基が挙げられる）を含むことができる。ここで留意すべきは、上記式においてＹによって示されているＰＥＧの他の末端が、天然に生じるアミノ酸または非天然にコードされるアミノ酸を介してｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドに対して直接にかまたは間接的に付着していることである。実際に、Ｙは、ポリペプチドのアミン基（これらに限定されないが、リジンまたはＮ末端のイプシロンアミンが挙げられる）に対する、アミド結合、カルバメート結合または尿素結合であり得る。代替可能に、Ｙは、チオール基（これに限定されないが、システインのチオール基が挙げられる）に対するマレイミド結合であり得る。代替可能に、Ｙは、２０の通常のアミノ酸を介して通常には接近できない残基に対する結合であり得る。例えば、ＰＥＧにおけるアジド基は、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドのけるアルキン基と反応して、ヒュイゲン［３＋２］環付加産物を形成し得る。代替可能に、ＰＥＧにおけるアルキン基は、非天然にコードされるアミノ酸に存在するアジド基と反応して、同様の産物を形成し得る。いくつかの実施形態において、強い求核基（これらに限定されないが、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシアミン、セミカルバジドが挙げられる）は、非天然にコードされるアミノ酸に存在するアルデヒド基またはケトン基と反応して、必要に応じていくつかの場合において適切な還元剤を用いた処理によってさらに還元される、ヒドラゾン、オキシムまたはセミカルバゾンを形成し得る。代替可能に、強い求核基は、非天然にコードされるアミノ酸を介してｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドに組み込まれ得、かつ水溶性重合体に存在するケトン基またはアルデヒド基と好適に反応するために使用され得る。
【０５５２】
ＰＥＧにとってのあらゆる分子量が、実際に所望されるように、約１００ダルトン（Ｄａ）から１００，０００Ｄａまたは必要に応じてそれ以上（これらに限定されないが、０．１−５０ｋＤａまたは１０−４０ｋＤａが挙げられる）まで（これらが挙げられるが、限定されない）、使用され得る。ＰＥＧの分子量は、広範（これらに限定されないが、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａの間が挙げられる）であり得る。ＰＥＧは、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａの間（これらに限定されないが、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ、および１００Ｄａが挙げられる）であり得る。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、約１００Ｄａから５０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、約１００Ｄａから４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、約１，０００Ｄａから４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、約５，０００Ｄａから４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、約１０，０００Ｄａから４０，０００Ｄａの間である。また、分枝鎖のＰＥＧ（これに限定されないが、１−１００ｋＤａ（これらに限定されないが、１−５０ｋＤａまたは５−２０ｋＤａが挙げられる）の範囲の分子量を有する鎖のそれぞれを有するＰＥＧ分子が挙げられる）が、使用され得る。分枝鎖のＰＥＧの鎖のそれぞれの分子量は、約１，０００Ｄａから約１００，０００Ｄａまたはそれ以上の間（これらが挙げられるが、限定されない）であり得る。分枝鎖のＰＥＧの鎖のそれぞれの分子量は、約１，０００Ｄａから約１００，０００Ｄａの間（これらに限定されないが、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、および１，０００Ｄａが挙げられる）であり得る。いくつかの実施形態において、分枝鎖のＰＥＧの鎖のそれぞれの分子量は、約１，０００Ｄａから５０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態において、分枝鎖のＰＥＧの鎖のそれぞれの分子量は、約１，０００Ｄａから４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態において、分枝鎖のＰＥＧの鎖のそれぞれの分子量は、約５，０００Ｄａから４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態において、分枝鎖のＰＥＧの鎖のそれぞれの分子量は、約５，０００Ｄａから２０，０００Ｄａの間である。広範なＰＥＧが、言及によって本明細書に組み込まれる、Shearwater Polymers, Inc. catalog, Nektar Therapeutics catalog（これが挙げられるが、限定されない）に記載されている。
【０５５３】
一般的に、ＰＥＧの少なくとも１つの末端は、非天然にコードされるアミノ酸との反応に利用可能である。例えば、アミノ酸側鎖との反応にとってのアルキン部分およびアジド部分は、本明細書に記載されるような非天然にコードされるアミノ酸に対してＰＥＧを付着させるために使用され得る。非天然にコードされるアミノ酸がアジドを備える場合に、そのときＰＥＧは、ヒュイゲン［３＋２］環付加産物の形成をもたらすためのアルキン部分、またはアミド結合の形成をもたらすための活性化ＰＥＧ種（すなわち、エステル、カルボン酸塩）のいずれかを典型的に含有する。代替可能に、非天然にコードされるアミノ酸がアルキンを備える場合に、そのときＰＥＧは、［３＋２］ヒュイゲン環付加産物の形成をもたらすためのアジド部分を典型的に含有する。非天然にコードされるアミノ酸がカルボニル基を備える場合に、ＰＥＧは、対応するヒドラゾン、ヒドロキシアミン、またはセミカルバゾン結合のそれぞれをもたらすために、強力な求核基（これらに限定されないが、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシアミン、またはセミカルバジド基能性基が挙げられる）を典型的に備える。他の代替物において、上記において説明される反応性基の逆の方向性が、使用され得る（すなわち、非天然にコードされるアミノ酸におけるアジド基が、アルキンを含有するＰＥＧ誘導体と反応され得る）。
【０５５４】
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ誘導体を有するｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドバリアントは、非天然にコードされるアミノ酸の側鎖に存在する化学的な機能性基と反応性である、化学的な機能性基を含有する。
【０５５５】
本発明は、いくつかの実施形態において、約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａまでの平均分子量を有する水溶性重合体骨格を備える、アジド含有重合体およびアセチレン含有重合体を提供する。水溶性重合体の重合体骨格は、ポリ（エチレングリコール）であり得る。しかし、広範な水溶性重合体（これらに限定されないが、ポリ（エチレン）グリコールおよび他の関連する重合体（ポリ（デキストラン）およびポリ（プロピレングリコール））が挙げられる）がまた、本発明の実践における使用に好適であること、ＰＥＧまたはポリ（エチレングリコール）という用語が、そのような分子のすべてを包含しかつ含むことを意図されることは、理解されるべきである。ＰＥＧという用語としては、これに限定されないが、その形態のあらゆるもの（これらに限定されないが、二機能性のＰＥＧ、多腕のＰＥＧ、誘導体化ＰＥＧ、分岐状のＰＥＧ、分枝状のＰＥＧ、ぶら下がりのＰＥＧ（すなわち、重合体骨格に対してぶら下がっている１つ以上の官能基を有するＰＥＧまたは関連重合体）、またはこれらに分解可能な結合を有するＰＥＧが挙げられる）であるポリ（エチレングリコール）が挙げられる。
【０５５６】
ＰＥＧは、典型的に、透明であり、無色であり、無臭であり、水溶性であり、熱に安定であり、多くの化学物質に対して不活性であり、加水分解されないかまたは劣化されず、かつ一般的に無毒である。ポリ（エチレングリコール）は、生体適合性である（ＰＥＧが、損傷の原因になることなく、生きている組織または生体と共存可能であることを意味する）と見做される。より詳細には、ＰＥＧは、実質的に非免疫原性である（ＰＥＧが身体に免疫応答を生じさせる傾向を示さないことを意味する）。身体においていくつかの所望の機能を有する分子（例えば、生物学的に活性な分子）に対して付着される場合に、ＰＥＧは、物質をマスクする傾向にあり、かつ生体が物質の存在に寛容であり得るようにあらゆる免疫応答を低減可能か、または除去できる。ＰＥＧ接合物は、実質的な免疫応答を生じないか、または凝固もしくは他の好ましくない影響の原因にならない傾向を示す。式−−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−−（ここでｎは約３から４０００、典型的に約２０から約２０００である）を有するＰＥＧは、本発明における使用に好適である。約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａまでの分子量を有するＰＥＧは、本発明のいくつかの実施形態において、重合体骨格として特に有用である。ＰＥＧの分子量は、広範（これに限定されないが、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａまたはそれ以上の間が挙げられる）であり得る。ＰＥＧの分子量は、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａの間（これらに限定されないが、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ、および１００Ｄａが挙げられる）であり得る。いくつかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１００Ｄａから約５０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約５，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１０，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。
【０５５７】
重合体骨格は、直鎖状または分枝状であり得る。分枝状の重合体骨格は、一般的に当該技術において公知である。典型的に、分枝状の重合体は、中心の分枝核部分および中心の分枝核に対して連結された複数の直鎖状の重合体鎖を有する。ＰＥＧは、種々のポリオール（例えば、グリセロール、グリセロールオリゴマー、ペンタエリスリトールおよびソルビトール）に対するエチレンオキシドの付加によって調製され得る、分枝状の形態において通常に使用される。また、中心の分枝核部分は、リジンといった種々のアミノ酸から誘導体化され得る。分枝状のポリ（エチレングリコール）は、Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｍ（Ｒは、グリセロール、グリセロールオリゴマー、またはペンタエリスリトールといった核部分から誘導体化され、かつｍは腕の数を表す）として通常の形態において表され得る。また、多腕のＰＥＧ分子（例えば、言及によってその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９３２，４６２号明細書；米国特許第５，６４３，５７５号明細書；米国特許第５，２２９，４９０号明細書；米国特許第４，２８９，８７２号明細書；米国特許出願公開第２００３／０１４３５９６号明細書；国際公開第９６／２１４６９号パンフレット；および国際公開第９３／２１２５９に号パンフレットに記載されるようなそれら）は、重合体骨格として使用され得る。
【０５５８】
また、分枝状のＰＥＧは、ＰＥＧ（−−ＹＣＨＺ２）ｎ（ここで、Ｙは結合基であり、かつＺは所定の長さの原子の鎖によってＣＨに対して連結される活性化末端基である）によって表される分岐状のＰＥＧの形態であり得る。
【０５５９】
まださらなる分枝状の形態、ぶら下がりのＰＥＧは、ＰＥＧ鎖の末端ではなくＰＥＧ骨格に沿ってある、カルボキシルといった反応性基を有する。
【０５６０】
またＰＥＧのこれらの形態に加えて、重合体は、骨格において弱い結合または分解可能な結合を有して、調製され得る。例えば、ＰＥＧは、重合体骨格に加水分解を受けやすいエステル結合を有して調製され得る。以下に示すように：
−ＰＥＧ−ＣＯ２−ＰＥＧ−＋Ｈ２Ｏ  →  ＰＥＧ−ＣＯ２Ｈ＋ＨＯ−ＰＥＧ−
この加水分解は、重合体のより低い分子量の断片への切断を結果として生じる。
ポリ（エチレングリコール）またはＰＥＧという用語が、当該技術において公知の形態のすべて（これらに限定されないが、本明細書に開示されるそれらが挙げられる）を表すか、または含むことは、当業者によって理解される。
【０５６１】
また、他の重合体は、本発明における使用にとって好適である。いくつかの実施形態において、水溶性重合体であり、２から約３００の末端を有する重合体骨格は、本発明において特に有用である。好適な重合体の例としては、これらに限定されないが、ポリ（プロピレングリコール）（“ＰＰＧ”）、これらの共重合体（これに限定されないが、エチレングリコールおよびプロピレングリコールの共重合体が挙げられる）、これらの三元重合体、およびこれらの混合物などといった、他のポリ（アルキレングリコール）が挙げられる。重合体骨格のそれぞれの鎖の分子量は、変えることができるが、典型的に約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａまで、しばしば約６，０００Ｄａから約８０，０００Ｄａまでの範囲である。重合体骨格のそれぞれの鎖の分子量は、約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａまでの間（これらに限定されないが、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ、および１００Ｄａが挙げられる）であり得る。いくつかの実施形態において、重合体骨格のそれぞれの鎖の分子量は、約１００Ｄａから約５０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態において、重合体骨格のそれぞれの鎖の分子量は、約１００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態において、重合体骨格のそれぞれの鎖の分子量は、約１，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態において、重合体骨格のそれぞれの鎖の分子量は、約５，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態において、重合体骨格のそれぞれの鎖の分子量は、約１０，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。
【０５６２】
当業者は、水溶性重合体に関して上記に挙げたものが、決して網羅的なものではなく、かつ単に例示であること、および上述のような品質を有する重合体材料のすべてが、本発明における使用に好適であると考えらえることを認識する。
【０５６３】
本発明のいくつかの実施形態において、重合体誘導体は、重合体骨格が、官能基を用いて機能性化されたか、または活性化された少なくとも２つの末端、おそらく約３００もの末端を有することを意味する、“多機能性”である。多機能性重合体誘導体としては、これに限定されないが、２つの末端（末端のそれぞれが、同じであり得るか、または異なり得る官能基に対して結合されている）を有する直鎖状の重合体が挙げられる。
【０５６４】
１つの実施形態において、重合体誘導体は、構造：
Ｘ−Ａ−ＰＯＬＹ−Ｂ−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
（ここで、
Ｎ＝Ｎ＝Ｎはアジド部分であり；
Ｂは、存在し得るかまたは存在し得ない連結部分であり；
ＰＯＬＹは、水溶性の非抗原性の重合体であり；
Ａは、存在し得るかまたは存在し得ず、かつＢと同じであり得るか、または異なり得る連結部分であり；かつ
Ｘは第２の官能基である）
を有する。
ＡおよびＢに関する連結部分の例は、これらに限定されないが、１８まで含有する多重機能性化アルキル基を含み、かつ１−１０の間の炭素原子を含有し得る。窒素、酸素または硫黄といった異種原子は、アルキル鎖に含まれ得る。また、アルキル鎖は、異種原子において枝分かれされ得る。ＡおよびＢに関する結合部分の他の例は、これに限定されないが、１０まで含有する多重機能性化アリール基を含み、かつ５−６の間の炭素原子を含有し得る。アリール基は、１つ以上の炭素原子、窒素原子、酸素原子または硫黄原子を用いて置換され得る。好適な連結基の他の例としては、言及によって本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９３２，４６２号明細書；米国特許第５，６４３，５７５号明細書；および米国特許出願公開第２００３／０１４３５９６号明細書に記載されているこれらの連結基が挙げられる。当業者は、連結部分に関して上記に挙げたものが、決して網羅的ではなく、かつ単に例示であること、および上述の品質を有する結合部分のすべてが、本発明における使用に好適であると考えらえることを認識する。
【０５６５】
Ｘとしての使用に好適な官能基の例としては、これらに限定されないが、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、アルコキシル、活性化エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルエステルおよび１−ベンゾトリアゾリルエステル）、活性化カルボネート（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルカルボネートおよび１−ベンゾトリアゾリルカルボネート）、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性化スルホン、アミン、アミノオキシ、保護されたアミン、ヒドラジド、保護されたヒドラジド、保護されたチオール、カルボキシル酸、保護されたカルボキシル酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレート、トレシレート、アルケン、ケトンおよびアジドなどが挙げられる。当業者によって理解されるように、選択されるＸ部分は、アジド基との反応が生じないように、アジド基とコンパティブル（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）であるべきである。アジド含有重合体誘導体は、第２の官能基（すなわち、Ｘ）がまた、アジド部分であることを意味する同種二機能性であり得るか、または第２の官能基が異なる官能基であることを意味する異種二機能性であり得る。
【０５６６】
“保護された”という用語は、特定の反応条件下における化学的に反応性の官能基の反応を妨げる保護基または保護部分の存在を指す。保護基は、保護される化学的に反応性の基の種類に依存して変わる。例えば、化学的に反応性の基がアミンまたはヒドラジドである場合に、保護基は、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）の群から選択され得る。化学的に反応性の基がチオールである場合に、保護基は、オルトピリジルジスルフィドであり得る。化学的に反応性の基がカルボキシル酸（例えば、ブタン酸またはプロピオン酸）またはヒドロキシル基である場合に、保護基は、ベンジル基またはメチル、エチルもしくはｔｅｒｔ−ブチルといったアルキル基であり得る。また、当該技術において公知の他の保護基は、本発明に使用され得る。
【０５６７】
文献における特定の末端官能基の例としては、これらに限定されないが、Ｎ−スクシニミジルカルボネート（例えば、米国特許第５，２８１，６９８号明細書、米国特許第５，４６８，４７８号明細書を参照すればよい）、アミン（例えば、Buckmann et al. Makromol. Chem. 182:1379 (1981), Zalipsky et al. Eur. Polym. J. 19:1177 (1983)を参照すればよい）、ヒドラジド（例えば、Andresz et al. Makromol. Chem. 179:301 (1978) を参照すればよい）、スクシニミジルプロピオネートおよびスクシニミジルブタノエート（例えば、Olson et al. in Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, pp 170-181, Harris & Zalipsky Eds., ACS, Washington, D.C., 1997を参照すればよく；また、米国特許第５，６７２，６６２号明細書を参照すればよい）、スクシニミジルスクシネート（例えば、Abuchowski et al. Cancer Biochem. Biophys. 7:175 (1984)およびJoppich et al. Makromol. Chem. 180:1381 (1979)を参照すればよい）、スクシニミジルエステル（例えば、米国特許第４，６７０，４１７号明細書を参照すればよい）、ベンゾトリアゾールカルボネート（例えば、米国特許第５，６５０，２３４号明細書を参照すればよい）、グリシジルエステル（例えば、Pitha et al. Eur. J Biochem. 94:11 (1979)、Elling et al., Biotech. Appl. Biochem. 13:354 (1991)を参照すればよい）、オキシカルボニルイミダゾール（例えば、Beauchamp, et al., Anal. Biochem. 131:25 (1983), Tondelli et al. J. Controlled Release 1:251 (1985) を参照すればよい）、ｐ−ニトロフェニルカルボネート（例えば、Veronese, et al., Appl. Biochem. Biotech., 11: 141 (1985)；およびSartore et al., Appl. Biochem. Biotech., 27:45 (1991)を参照すればよい）、アルデヒド（例えば、Harris et al. J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22:341 (1984) 、米国特許第５，８２４，７８４号明細書、米国特許第５，２５２，７１４号明細書を参照すればよい）、マレイミド（例えば、Goodson et al. Biotechnology (NY) 8:343 (1990) 、Romani et al. in Chemistry of Peptides and Proteins 2:29 (1984) を参照すればよい）、オルトピリジル−ジスルフィド（例えば、Woghiren, et al. Bioconj. Chem. 4:314(1993) を参照すればよい）、アクリロール（例えば、Sawhney et al., Macromolecules, 26:581 (1993) を参照すればよい）、ビニルスルホン（例えば、米国特許第５，９００，４６１号明細書を参照すればよい）が挙げられる。上述の参考文献および特許文献のすべては、言及によって本明細書に組み込まれる。
【０５６８】
本発明のある特定の実施形態において、本発明の重合体誘導体は、構造：
Ｘ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
（ここで、
Ｘは上述のような官能基であり；かつ
ｎは約２０から約４０００までである）
を有する重合体骨格を備える。
他の実施形態において、本発明の重合体誘導体は、構造：
Ｘ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｗ−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
（ここで、
Ｗは１−１０の炭素原子を備える脂肪族または芳香族の連結部分であり；
ｎあは約２０から約４０００までであり；かつ
Ｘは上述のような官能基である）
を有する重合体骨格を備える。ｍは１から１０の間である。
【０５６９】
本発明のアジド含有ＰＥＧ誘導体は、当該技術において公知の種々の方法および／または本明細書に開示されている種々の方法によって調製され得る。以下に示されている１つの方法において、約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａまでの平均分子量を有する水溶性重合体骨格であり、第１の官能基に対して結合される第１の末端および好適な脱離基に対して結合される第２の末端を有する重合体骨格は、アジドアニオン（好適な対イオン（ナトリウム、カリウム、およびｔｅｒｔブチルアンモニウムなどが挙げられる）と一対にされ得る）と反応させられる。脱離基は、求核置換を受け、かつアジド部分によって置換され、所望のアジド含有ＰＥＧ重合体を生じる。
【０５７０】
Ｘ−ＰＥＧ−Ｌ＋Ｎ３−  →  Ｘ−ＰＥＧ−Ｎ３
示されているように、本発明における使用に好適な重合体骨格は、式Ｘ−ＰＥＧ−Ｌ（ここで、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）であり、かつＸはアジド基と反応しない官能基であり、かつＬは好適な脱離基である）を有する。好適な官能基の例としては、これらに限定されないが、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、アセタール、アルケニル、アミン、アミノオキシ、保護されたアミン、保護されたヒドラジド、保護されたチオール、カルボキシル酸、保護されたカルボキシル酸、マレイミド、ジチオピリジン、およびビニルピリジン、およびケトンが挙げられる。好適な脱離基の例としては、これらに限定されないが、塩化物、臭化物、ヨウ化物、メシレート、トレシレート、およびトシレートが挙げられる。
【０５７１】
本発明のアジド含有重合体誘導体を調製する他の方法において、アジド機能性基をを有する結合剤は、約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａまでの平均分子量を有する水溶性重合体骨格と接触され、ここで、上記結合剤は、ＰＥＧ重合体における化学的な機能性基と選択的に反応してアジド含有重合体誘導体産物を形成する化学的な機能性基を有し、ここで、アジドは、結合剤よって重合体骨格から離されている。
【０５７２】
例示的な反応手順が、以下に示されている：
Ｘ−ＰＥＧ−Ｍ＋Ｎ−リンカー−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ  →  ＰＧ−Ｘ−ＰＥＧ−リンカー−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
（ここで、
ＰＥＧは、ポリ（エチレングリコール）であり、かつＸはアルコキシまたは上述のような官能基といったキャップ形成基であり；かつ
Ｍはアジド機能性基と反応しないが、Ｎの官能基と効率的かつ選択的に反応する官能基である）。
【０５７３】
好適な官能基の例としては、これらに限定されないが、Ｎがアミンである場合にカルボキシル酸、カルボネートまたは活性エステルであるＭ；Ｎがヒドラジドまたはアミノオキシ部分である場合にケトンであるＭ；Ｎが求核基である場合に脱離基であるＭが挙げられる。
【０５７４】
粗製産物の精製は、公知の方法（これに限定されないが、必要に応じてクロマトグラフィーに続く産物の沈殿が挙げられる）によって達成され得る。
【０５７５】
より詳細な例は、アミンの１つがｔｅｒｔ−ブチル−Ｂｏｃといった保護基部分によって保護され、かつ結果として生じる１保護されたＰＥＧジアミンがアジド機能性基を有する連結部分と反応される、ＰＥＧジアミンの場合に関して、以下に示されている：
ＢｏｃＨＮ−ＰＥＧ−ＮＨ２＋ＨＯ２Ｃ−（ＣＨ２）３−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ。
【０５７６】
この場合には、アミン基は、チオニル塩化物もしくはカルボジイミド試薬、およびＮ−ヒドロキシスクシニミドもしくはＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールといった種々の活性剤を用いて、カルボキシル酸基に対して結合されて、モノアミンＰＥＧ誘導体とアジド担持連結部分との間にアミド結合を作り出し得る。アミド結合の形成が上手く行った後に、結果として生じるＮ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｂｏｃ−保護されたアジド含有の誘導体は、生体活性分子を修飾するために直接に使用され得るか、または他の有用な官能基を組み込むために、さらに合成され得る。例えば、Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ基は、強酸を用いた処理によて加水分解されて、オメガ−アミノ−ＰＥＧ−アジドを生成する。結果として生じるアミンは、合成の手がかりとして使用されて、有益な異種二機能性試薬にとっての、マレイミド基、活性化ジスルフィド、および活性化エステルなどといった他の有用な機能性基を組み込み得る。
【０５７７】
異種二機能性誘導体は、重合体の末端のそれぞれに対して異なる分子を付着させることが所望される場合に、特に有用である。例えば、オメガ−Ｎ−アミノ−Ｎ−アジドＰＥＧは、活性化された求核基（例えば、アルデヒド、ケトン、および活性化カルボネートなど）を有する分子の、ＰＥＧの１つの末端に対する付着、およびアセチレン基を有する分子の、ＰＥＧの他の末端に対する付着を可能にする。
【０５７８】
本発明の他の実施形態において、重合体誘導体は、構造：
Ｘ−Ａ−ＰＯＬＹ−Ｂ−Ｃ≡Ｃ−Ｒ
（ここで、
ＲはＨもしくはアルキル、アルキレン、アルコキシ、またはアリールもしくは置換アリールであり得；
Ｂは、存在し得るか、または存在し得ない連結部分であり；
ＰＯＬＹは、水溶性の非抗原性重合体であり；
Ａは、存在し得るか、または存在し得ず、かつＢと同じであり得るか、または異なり得る連結部分であり；かつ
Ｘは第２の官能基である）
を有する。
【０５７９】
ＡおよびＢに関する連結部分の例は、これらに限定されないが、１８まで含有する多機能化アルキル基を含み、かつ１−１０の間の炭素原子を含有し得る。窒素、酸素または硫黄といった異種原子は、アルキル鎖と共に含まれ得る。また、アルキル鎖は、異種原子において分岐され得る。ＡおよびＢに関する連結部分の例は、これらに限定されないが、１０まで含有する多機能化アルキル基を含み、かつ５−６の間の炭素原子を含有し得る。アリール基は、１つ以上の炭素原子、窒素原子、酸素原子、または硫黄原子を用いて置換され得る。好適な連結基の他の例としては、言及によって本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９３２，４６２号明細書および米国特許第５，６４３，５７５号明細書および米国特許出願公開第２００３／０１４３５９６号明細書に記載されているそれらが挙げられる。当業者は、連結部分に関して上記に挙げたものが、決して網羅的なものではなく、かつ単に例示であること、および上述のような品質を有する連結部材料のすべてが、本発明における使用に好適であると考えらえることを認識する。
【０５８０】
Ｘとしての利用に好適な官能基の例としては、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、アルコキシル、活性化エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルエステルおよび１−ベンゾトリアゾリルエステル）、活性なカルボネート（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルカルボネートおよび１−ベンゾトリアゾリルカルボネート）、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性化スルホン、アミン、アミノオキシ、保護されたアミン、ヒドラジド、保護されたヒドラジド、保護されたチオール、カルボキシル酸、保護されたカルボキシル酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレート、およびトレシレート、アルケン、ケトン、およびアセチレンが挙げられる。理解されるように、選択されるＸ部分は、アセチレン基との反応が生じないように、アセチレン基とコンパティブルであるべきである。アセチレン含有重合体誘導体は、第２の官能基（すなわち、Ｘ）がまた、アセチレン部分であることを意味する同種二機能性であり得るか、または第２の官能基が異なる官能基であることを意味する異種二機能性であり得る。
【０５８１】
本発明の他の実施形態において、重合体誘導体は、構造：
Ｘ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡ＣＨ
（ここで、
Ｘは上述のような官能基であり；
ｎは約２０から約４０００であり；かつ
ｍは１から１０の間である）
を有する重合体骨格を備える。
異種二機能性ＰＥＧ重合体のそれぞれの詳細な例が以下に示される。
【０５８２】
本発明のアセチレン含有ＰＥＧ誘導体は、当業者に公知の方法および／または本明細書に開示されている方法を用いて調製され得る。１つの方法において、約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａまでの平均分子量を有する水溶性重合体骨格であり、第１の官能基に対して結合される第１の末端および好適な求核基に対して結合される第２の末端を有する重合体骨格は、ＰＥＧにおける求核基との反応に好適であるアセチレン基および脱離基の両方を有する化合物と反応される。求核部分を有するＰＥＧ重合体および脱離基を有する分子が組み合わせられると、脱離基は、求核置換を受け、かつ求核部分によって置換され、所望のアセチレン含有重合体を生じる。
【０５８３】
Ｘ−ＰＥＧ−Ｎｕ＋Ｌ−Ａ−Ｃ  →  Ｘ−ＰＥＧ−Ｎｕ−Ａ−Ｃ≡ＣＲ’
示されるように、反応における使用に好ましい重合体骨格は、式Ｘ−ＰＥＧ−Ｎｕ（ここで、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）であり、Ｎｕは求核部分であり、かつＸはＮｕ、Ｌまたはアセチレン機能性基と反応しない官能基である）を有する。
【０５８４】
Ｎｕの例としては、これらに限定されないが、ＳＮ２−型機序を介して主に反応する、アミン、アルコキシ、アリールオキシ、スルフィドリル、イミノ、カルボキシレート、ヒドラジド、アミノオキシ基が挙げられる。Ｎｕの付加的な例としては、求核付加反応を介して主に反応する、これらの官能基が挙げられる。Ｌ基の例としては、塩化物、臭化物、ヨウ化物、メシレート、トレシレート、およびトシレートおよび求核置換を受けると予想される他の基、これらと同様にケトン、アルデヒド、チオエステル、オレフィン、アルファ−ベータ不飽和カルボニル基、カルボネートおよび求核基によって付加を受けると予想される他の求核性基が挙げられる。
【０５８５】
本発明の他の実施形態において、Ａは、１−１０の間の炭素原子の脂肪酸リンカー、または６−１４の間の炭素原子の置換アリール環である。Ｘはアジド基と反応しない官能基であり、かつＬは好適な脱離基である。
【０５８６】
本発明のアセチレン含有重合体誘導体を調製する他の方法において、約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａまでの平均分子量を有し、１つの末端に保護された官能基もしくはキャップ形成剤のいずれかを有し、かつもう一方の末端に好適な脱離基を有するＰＥＧ重合体は、アセチレンアニオンによって接触される。
【０５８７】
例示的な反応手順は、以下に示される：
Ｘ−ＰＥＧ−Ｌ＋−Ｃ≡ＣＲ’  →  Ｘ−ＰＥＧ−Ｃ≡ＣＲ’
（ここで、
ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）であり、かつＸはキャップ形成基（例えば、アルコキシまたは上述のような官能基）であり；かつ
Ｒ’はＨ、アルキル、アルコキシ、アリールもしくはアリールオキシ基、または置換アルキル、置換アルコキシル、置換アリールもしくは置換アリールオキシ基のいずれかである）。
【０５８８】
上述の例において、脱離基Ｌは、十分な濃度のアセチレンアニオンと接触されれる場合に、ＳＮ２−型置換を受けるために十分に反応性でなければならない。アセチレンアニオンによる脱離基のＳＮ２置換の達成に要求される反応条件は、当業者に公知である。
【０５８９】
粗製産物の精製は、当該分野に公知の方法（これに限定されないが、必要に応じて、クロマトグラフィーに続く沈殿が挙げられる）によって通常に達成され得る。
【０５９０】
水溶性重合体は、本発明のｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドに対して連結され得る。水溶性重合体は、ｈＰＰもしくはｈＡもしくはｈＦｃポリペプチドに組み込まれた非天然にコードされるアミノ酸、もしくは非天然にコードされるアミノ酸もしくは天然にコードされるアミノ酸のあらゆる官能基もしくは置換基か、または非天然にコードされるアミノ酸もしくは天然にコードされるアミノ酸に付加されたあらゆる官能基もしくは置換基、を介して連結され得る。代替可能に、水溶性重合体は、天然に生じるアミノ酸（これらに限定されないが、システイン、リジンまたはＮ末端残基のアミノ酸が挙げられる）を介して、非天然にコードされるアミノ酸を組み込んでいる、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドに対して連結され得る。いくつかの場合において、本発明のｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の非天然アミノ酸を備え、ここで、１つ以上の非天然にコードされるアミノ酸は、（複数の）水溶性重合体（これらに限定されないが、ＰＥＧおよび／またはオリゴサッカライドが挙げられる）に対して連結される。いくつかの場合において、本発明のｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、水溶性重合体に対して連結された１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の非天然にコードされるアミノ酸を、さらに備える。いくつかの場合において、本発明のｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、水溶性重合体に対して連結された１つ以上の非天然にコードされるアミノ酸、および水溶性重合体に対して連結された１つ以上の天然に生じるアミノ酸を備える。いくつかの場合において、本発明に使用される水溶性重合体は、その非接合形態と比べて、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドの半減期を増強する。
【０５９１】
本発明のｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドに対して連結される水溶性重合体の数（すなわち、ＰＥＧ付加または糖鎖付加の程度）は、変更された（これらに限定されないが、増強されたか、または低減された、が挙げられる）薬理的特性、薬物動態的特性、または薬力学特性（例えば、インビボにおける半減期）を与えるために、調節され得る。いくつかの実施形態において、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃの半減期は、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０パーセント、２倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、５０倍、または少なくとも約１００倍に、非修飾のポリペプチドを超えて増強される。
【０５９２】
強い求核基（すなわち、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシアミンまたはセミカルバジド）を含有するＰＥＧ誘導体
本発明の１つの実施形態において、カルボニル含有の非天然にコードされるアミノ酸を備えるｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、ＰＥＧ骨格に対して直接に連結されている末端のヒドラジン、ヒドロキシアミン、ヒドラジドまたはセミカルバジド部分を含有するＰＥＧ誘導体を用いて修飾される。
【０５９３】
いくつかの実施形態において、ヒドロキシルアミン末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２
（ここで、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、かつｎは１００−１，０００である（すなわち、平均分子量は５−４０ｋＤａの間である））
を有する。
【０５９４】
いくつかの実施形態において、ヒドラジン含有ＰＥＧ誘導体またはヒドラジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
（ここで、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、ｎは１００−１，０００であり、かつＸは任意に、存在し得るかまたはし得ないカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）である）
を有する。
【０５９５】
いくつかの実施形態において、セミカルバジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２
（ここで、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、かつｎは１００−１，０００である）
を有する。
【０５９６】
本発明の他の実施形態において、カルボニル含有アミノ酸を備えるｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、アミド結合を用いてＰＥＧ骨格に連結される、末端のヒドロキシアミン、ヒドラジド、ヒドラジン、またはセミカルバジド部分を含有するＰＥＧ誘導体を用いて修飾される。
【０５９７】
いくつかの実施形態において、ヒドロキシアミン末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２
（ここで、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、かつｎは１００−１，０００である（すなわち、平均分子量は５−４０ｋＤａの間である））
を有する。
【０５９８】
いくつかの実施形態において、ヒドラジン含有ＰＥＧ誘導体またはヒドラジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
（ここで、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、ｎは１００−１，０００であり、かつＸは任意に、存在し得るかまたはし得ないカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）である）
を有する。
【０５９９】
いくつかの実施形態において、セミカルバジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２
（ここで、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、かつｎは１００−１，０００である）
を有する。
【０６００】
本発明の他の実施形態において、カルボニル含有アミノ酸を備えるｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、末端のヒドラジン、ヒドロキシアミン、ヒドラジドまたはセミカルバジド部分を含有する分枝状のＰＥＧ（１０−４０ｋＤａ（そして５−２０ｋＤａであり得る）の範囲にある分子量を有する分枝状のＰＥＧのそれぞれの鎖を伴う）を用いて修飾される。
【０６０１】
本発明の他の実施形態において、非天然にコードされるアミノ酸を備えるｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、分枝状構造を有するＰＥＧ誘導体を用いて修飾される。例えば、いくつかの実施形態において、ヒドラジン末端ＰＥＧ誘導体またはヒドラジド末端ＰＥＧ誘導体は、以下の構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
（ここで、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、ｎは１００−１，０００であり、かつＸは任意に、存在し得るかまたはし得ないカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）である）
を有する。
【０６０２】
いくつかの実施形態において、セミカルバジド基を含有するＰＥＧ誘導体は、構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２］２ＣＨ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２
（ここで、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、Ｘは任意にＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）であるか、または存在せず、ｍは２−１０であり、かつｎは１００−１，０００である）
を有する。
【０６０３】
いくつかの実施形態において、ヒドロキシアミン基を含有するＰＥＧ誘導体は、構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２］２ＣＨ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２
（ここで、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、Ｘは任意にＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）であるか、または存在せず、ｍは２−１０であり、かつｎは１００−１，０００である）
を有する。
【０６０４】
水溶性重合体がｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドに対して連結される程度および部位は、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチド受容体結合パートナーに対するｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドの結合を調節できる。いくつかの実施形態において、連結は、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドが、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチド受容体または結合パートナーを、平衡化結合アッセイ（例えば、Spencer et al., J. Biol. Chem., 263:7862-7867 (1988) に記載されている通りである）によって測定されるときに約４００ｎＭ以下のＫｄを有して、１５０ｎＭ以下のＫｄを有して、そしていくつかの場合において１００ｎＭ以下のＫｄを有して、結合するように配置される。
【０６０５】
重合体の活性化およびペプチドの接合に関する、方法および化学反応は、文献に記載され、かつ当該技術において公知である。重合体の活性化に通常に使用される方法としては、これらに限定されないが、シアン、臭化物、過ヨウ素酸塩、グルタルアルデヒド、ビエポキシド、エピクロロヒドリン、ジビニルスルホン、カルボジイミド、ハロゲン化スルホニル、トリクロロトリアジンなどを有する官能基の活性化が挙げられる（R. F. Taylor, (1991), Protein Immobilisation. Fundamental and Applications, Marcel Dekker, N.Y.; S. S. Wong, (1992), Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking, CRC Press, Boca Raton; G. T. Hermanson et al., (1993), Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press, N.Y.; Dunn, R.L., et al., Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991を参照すればよい）。
【０６０６】
ＰＥＧの機能性化および接合に関する種々の概説および研究論文が利用可能である。例えば、Harris, Macromol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong et al., Enzyme Microb. Technol. 14: 866-874 (1992); Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995) を参照すればよい。
【０６０７】
また、重合体を活性化する方法は、国際公開第９４／１７０３９号パンフレット、米国特許第５，３２４，８４４号明細書、国際公開第９４／１８２４７号パンフレット、国際公開第９４／０４１９３号パンフレット、米国特許第５，２１９，５６４号明細書、米国特許第５，１２２，６１４号明細書、国際公開第９０／１３５４０号パンフレット、米国特許第５，２８１，６９８号明細書、および国際公開第９３／１５１８９号パンフレットに見出され得、かつ活性化重合体と酵素（これらに限定されないが、凝結因子ＶＩＩＩ（国際公開第９４／１５６２５号パンフレット）、ヘモグロビン（国際公開第９４／０９０２７号パンフレット）、酸素運搬タンパク質（米国特許第４，４１２，９８９号明細書）、リボヌクレアーゼおよび超酸化物不均化酵素（Veronese at al., App. Biochem. Biotech. 11: 141-52 (1985)）が挙げられる）との間における接合に関して見出され得る。引用された参考文献および特許文献のすべては、言及によって本明細書に組み込まれる。
【０６０８】
非天然にコードされるアミノ酸（例えば、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン）を含有するｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドのＰＥＧ付加（すなわち、あらゆる水溶性重合体の付加）は、あらゆる従来の方法によって実施される。例えば、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、アルキン末端化ｍＰＥＧ誘導体を用いて修飾される。簡単に言うと、過剰のｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨが、室温において攪拌しながら、ｐ−アジド−Ｌ−Ｐｈｅ含有ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドの水性溶液に対して加えられる。典型的に、水性溶液は、反応が実施されるべきｐＨ（一般的に約ｐＨ４−１０）に近いｐＫａを有する緩衝液を用いて、緩衝化される。ｐＨ７．５におけるＰＥＧ付加に好適な緩衝液の例としては、例えば、これらに限定されないが、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩、ホウ酸塩、ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ＥＰＰＳ、およびＴＥＳが挙げられる。ｐＨは、継続的に観察され、かつ必要に応じて調節される。反応は放置されて、１−４８時間に渡って典型的に続けられる。
【０６０９】
反応産物は、続いて疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけられて、遊離ｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ、ならびにブロックされていないＰＥＧが分子の両方の末端において活性化される場合に形成し、これによってｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃバリアント分子を架橋し得る、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドバリアントのあらゆる高分子量複合体から、ＰＥＧ付加ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドを分離する。疎水性相互作用クロマトグラフィーの条件は、遊離ｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨがカラムを通り抜ける一方において、ＰＥＧ付加ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドバリアント複合体が、１つ以上のＰＥＧ基に対して接合された１つのｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドバリアント分子を含有する所望の形態の後に、溶出するような条件である。好適な条件は、所望の接合物に対する架橋化複合体の相対的な大きさに依存して変わり、かつ当業者によって容易に決定される。所望の接合物を含有する溶出物は、限外ろ過によって濃縮され、かつダイアフィルトレーションによって脱塩化される。
【０６１０】
必要に応じて、疎水性相互作用クロマトグラフィーから得られたｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、当業者に公知の１つ以上の手法（これらに限定されないが、アフィニティークロマトグラフィー；アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー（これに限定されないが、デアエ  セファロース（ＤＥＡＥ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ）を用いる、が挙げられる）；シリカ上におけるクロマトグラフィー；逆相ＨＰＬＣ；ゲルろ過（これに限定されないが、セファデックス（ＳＥＰＨＡＤＥＸ）  Ｇ−７５を用いる、が挙げられる）；疎水性相互作用クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー、金属キレートクロマトグラフィー；限外ろ過／ダイアフィルトレーション；エタノール沈殿；硫酸アンモニウム沈殿；等電点電気泳動；置換クロマトグラフィー；電気泳動手法（これに限定されないが、分離用の等電点電気泳動が挙げられる）、差異的可溶性（これに限定されないが、硫酸アンモニウム沈殿が挙げられる）、または抽出が挙げられる）によってさらに精製され得る。見かけの分子量は、球状タンパク質標準との比較によるＧＰＣによって、見積モル濃度れ得る（Preneta, AZ in Protein purification methods, a practical approach (Harris & Angal, Eds.) IRL Press 1989, 293-306）。ｈＰＰ−ＰＥＧ接合物またはｈＡ−ＰＥＧ接合物は、タンパク質分解（これに限定されないが、トリプシン切断が挙げられる）に続く質量分析によって評価され得る。Pepinsky RB., et al., J. Pharmcol. & Exp. Ther. 297(3):1059-66 (2001)。
【０６１１】
本発明のｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドのアミノ酸に対して連結された水溶性重合体は、制限されることなく、さらに誘導体化され得るか、または置換され得る。
【０６１２】
アジド含有ＰＥＧ誘導体
本発明の他の実施形態において、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、非天然にコードされるアミノ酸の側鎖に存在するアルキン部分と反応するアジド部分を含有するＰＥＧ誘導体を用いて、修飾される。一般的に、ＰＥＧ誘導体は、１−１００ｋＤａを有し、かついくつかの実施形態において１０−４０ｋＤａの範囲にある平均分子量を有する。
【０６１３】
いくつかの実施形態において、アジド末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｎ３
（ここで、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、かつｎは１００−１，０００である（すなわち、平均分子量は５−４０ｋＤａの間である））
を有する。
【０６１４】
他の実施形態において、アジド末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｐ−Ｎ３
（ここで、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、ｐは２−１０であり、かつｎは１００−１，０００である（すなわち、平均分子量は５−４０ｋＤａの間である））
を有する。
【０６１５】
本発明の他の実施形態において、アルキン含有アミノ酸を備えるｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、末端アジド部分を含有する分枝状のＰＥＧ誘導体（１０−４０ｋＤａ（そして５−２０ｋＤａであり得る）の範囲にある分子量を有する分枝状のＰＥＧのそれぞれの鎖を伴う）を用いて修飾される。例えば、いくつかの実施形態において、アジド末端ＰＥＧ誘導体は、以下の構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−（ＣＨ２）ｐＮ３
（ここで、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、ｐは２−１０であり、ｎは１００−１，０００であり、かつＸは任意に、いずれの場合においても存在し得るかまたは存在し得ない、Ｏ、Ｎ、Ｓまたはカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）である）
を有する。
【０６１６】
アルキン含有ＰＥＧ誘導体
本発明の他の実施形態において、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、非天然にコードされるアミノ酸の側鎖に存在するアジド部分と反応するアルキン部分を含有する、ＰＥＧ誘導体を用いて修飾される。
【０６１７】
いくつかの実施形態において、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は、以下の構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡ＣＨ
（ここで、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、かつｎは１００−１，０００である（すなわち、平均分子量は５−４０ｋＤａの間である））
を有する。
【０６１８】
本発明の他の実施形態において、アルキン含有の非天然にコードされるアミノ酸を備えるｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、アミド結合を用いてＰＥＧに対して連結される末端のアジドまたは末端のアルキン部分を含有する、ＰＥＧ誘導体を用いて修飾される。
【０６１９】
いくつかの実施形態において、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は、以下の構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｐ−Ｃ≡ＣＨ
（ここで、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、ｐは２−１０であり、かつｎは１００−１，０００である）
を有する。
【０６２０】
本発明の他の実施形態において、アジド含有アミノ酸を備えるｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、末端のアルキン部分を含有する分枝状のＰＥＧ誘導体（１０−４０ｋＤａ（そして５−２０ｋＤａであり得る）の範囲にある分子量を有する分枝状のＰＥＧのそれぞれの鎖を伴う）を用いて修飾される。例えば、いくつかの実施形態において、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は、以下の構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−（ＣＨ２）ｐＣ≡ＣＨ
（ここで、Ｒは単純なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、ｐは２−１０であり、ｎは１００−１，０００であり、かつＸはＯ、Ｎ、Ｓまたはカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）であるか、または存在しない）
を有する。
【０６２１】
ホスフィン含有ＰＥＧ誘導体
本発明の他の実施形態において、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、活性化官能基（これらに限定されないが、エステル、カルボネートが挙げられる）を含有し、非天然にコードされるアミノ酸の側鎖に存在するアジド部分と反応するアリールホスフィン基をさらに備える、ＰＥＧ誘導体を用いて修飾される。一般的に、ＰＥＧ誘導体は、１−１００ｋＤａ、そしていくつかの実施形態において１０−４０ｋＤａの範囲の平均分子量を有する。
【０６２２】
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ誘導体は、構造：
【０６２３】
【化４７】
0005840345.tif 000049
【０６２４】
（ここで、ｎは１−１０であり、ＸはＯ、ＮまたはＳであり得るか、または存在し得ず、Ｐｈはフェニルであり、かつＷは水溶性重合体である）
を有する。
【０６２５】
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ誘導体は、構造：
【０６２６】
【化４８】
0005840345.tif 000050
【０６２７】
（ここで、ＸはＯ、ＮまたはＳであるか、または存在せず、Ｐｈはフェニルであり、Ｗは水溶性重合体であり、かつＲはＨ、アルキル、アリール、置換アルキル、および置換アリール基であり得る）。例示的なＲ基としては、これらに限定されないが、−ＣＨ２、−Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＲ’，−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＣＮおよび−ＮＯ２が挙げられる。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’は互いに独立して、水素、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール（これらに限定されないが、１−３のハロゲンを用いて置換されているアリールが挙げられる）、置換もしくは非置換のアルキル、アルコキシもしくはチオアルコキシ、またはアルキルアリール基を指す。本発明の化合物が１つ以上のＲ基を含む場合に、例えば、Ｒ基のそれぞれは独立して、２つ以上のこれらの基が存在する場合に、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’のそれぞれであるように選択される。Ｒ’およびＲ’’が同じ窒素原子に付着される場合に、それらは、窒素原子と組み合わさって、５−、６−または７−員環を形成し得る。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、これらに限定されないが、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニル含むことを意図される。置換基の上述の議論から、当業者は、“アルキル”という用語が、水素基以外の基（例えば、ハロアルキル（これらに限定されないが、−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３が挙げられる）およびアシル（これらに限定されないが、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、および−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３などが挙げられる））に対して結合される炭素原子を含めた基を包含することを意図される。
【０６２８】
他のＰＥＧ誘導体および一般的なＰＥＧ付加技術
ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドに対して連結され得る他の例示的なＰＥＧ分子だけでなく、ＰＥＧ付加方法としては、例えば、言及によって本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００４／０００１８３８号明細書；米国特許出願公開第２００２／００５２００９号明細書；米国特許出願公開第２００３／０１６２９４９号明細書；米国特許出願公開第２００４／００１３６３７号明細書；米国特許出願公開第２００３／０２２８２７４号明細書；米国特許出願公開第２００３／０２２０４４７号明細書；米国特許出願公開第２００３／０１５８３３３号明細書；米国特許出願公開第２００３／０１４３５９６号明細書；米国特許出願公開第２００３／０１１４６４７号明細書；米国特許出願公開第２００３／０１０５２７５号明細書；米国特許出願公開第２００３／０１０５２２４号明細書；米国特許出願公開第２００３／００２３０２３号明細書；米国特許出願公開第２００２／０１５６０４７号明細書；米国特許出願公開第２００２／００９９１３３号明細書；米国特許出願公開第２００２／００８６９３９号明細書；米国特許出願公開第２００２／００８２３４５号明細書；米国特許出願公開第２００２／００７２５７３号明細書；米国特許出願公開第２００２／００５２４３０号明細書；米国特許出願公開第２００２／００４００７６号明細書；米国特許出願公開第２００２／００３７９４９号明細書；米国特許出願公開第２００２／０００２２５０号明細書；米国特許出願公開第２００１／００５６１７１号明細書；米国特許出願公開第２００１／００４４５２６号明細書；米国特許出願公開第２００１／００２１７６３号明細書；米国特許第６，６４６，１１０号明細書；米国特許第５，８２４，７７８号明細書；米国特許第５，４７６，６５３号明細書；米国特許第５，２１９，５６４号明細書；米国特許第５，６２９，３８４号明細書；米国特許第５，７３６，６２５号明細書；米国特許第４，９０２，５０２号明細書；米国特許第５，２８１，６９８号明細書；米国特許第５，１２２，６１４号明細書；米国特許第５，４７３，０３４号明細書；米国特許第５，５１６，６７３号明細書；米国特許第５，３８２，６５７号明細書；米国特許第６，５５２，１６７号明細書；米国特許第６，６１０，２８１号明細書；米国特許第６，５１５，１００号明細書；米国特許第６，４６１，６０３号明細書；米国特許第６，４３６，３８６号明細書；米国特許第６，２１４，９６６号明細書；米国特許第５，９９０，２３７号明細書；米国特許第５，９００，４６１号明細書；米国特許第５，７３９，２０８号明細書；米国特許第５，６７２，６６２号明細書；米国特許第５，４４６，０９０号明細書；米国特許第５，８０８，０９６号明細書；米国特許第５，６１２，４６０号明細書；米国特許第５，３２４，８４４号明細書；米国特許第５，２５２，７１４号明細書；米国特許第６，４２０，３３９号明細書；米国特許第６，２０１，０７２号明細書；米国特許第６，４５１，３４６号明細書；米国特許第６，３０６，８２１号明細書；米国特許第５，５５９，２１３号明細書；米国特許第５，７４７，６４６号明細書；米国特許第５，８３４，５９４号明細書；米国特許第５，８４９，８６０号明細書；米国特許第５，９８０，９４８号明細書；米国特許第６，００４，５７３号明細書；米国特許第６，１２９，９１２号明細書；国際公開第９７／３２６０７号パンフレット、欧州特許出願公開第２２９，１０８号明細書、欧州特許出願公開第４０２，３７８号明細書、国際公開第９２／１６５５５号パンフレット、国際公開第９４／０４１９３号パンフレット、国際公開第９４／１４７５８号パンフレット、国際公開第９４／１７０３９号パンフレット、国際公開第９４／１８２４７号パンフレット、国際公開第９４／２８０２４号パンフレット、国際公開第９５／００１６２号パンフレット、国際公開第９５／１１９２４， ＷＯ９５／１３０９０号パンフレット、国際公開第９５／３３４９０号パンフレット、国際公開第９６／０００８０号パンフレット、国際公開第９７／１８８３２号パンフレット、国際公開第９８／４１５６２号パンフレット、国際公開第９８／４８８３７号パンフレット、国際公開第９９／３２１３４号パンフレット、国際公開第９９／３２１３９号パンフレット、国際公開第９９／３２１４０号パンフレット、国際公開第９６／４０７９１号パンフレット、国際公開第９８／３２４６６号パンフレット、国際公開第９５／０６０５８号パンフレット、欧州特許出願公開第４３９  ５０８号明細書、国際公開第９７／０３１０６号パンフレット、国際公開第９６／２１４６９号パンフレット、国際公開第９５／１３３１２号パンフレット、欧州特許出願公開第９２１  １３１号明細書、国際公開第９８／０５３６３号パンフレット、欧州特許出願公開第８０９  ９９６号明細書、国際公開第９６／４１８１３号パンフレット、国際公開第９６／０７６７０号パンフレット、欧州特許出願公開第６０５  ９６３号明細書、欧州特許出願公開第５１０  ３５６号明細書、欧州特許出願公開第４００  ４７２号明細書、欧州特許出願公開第１８３  ５０３号明細書および欧州特許出願公開第１５４  ３１６号明細書に記載されているそれらが挙げられる。本明細書に記載されているＰＥＧ分子のあらゆるものは、あらゆる形態（これらに限定されないが、単鎖、分枝状鎖、多腕鎖、単機能性、二機能性、多機能性、またはこれらの組み合わせが挙げられる）において使用され得る。
【０６２９】
ｈＡにとっての生物学的に活性な分子の親和性の増強
また、種々の生物学的に活性な分子本発明のｈＡポリペプチドに対して融合されて、生物学的に活性な分子の半減期を調節し得るか、または生物学的に活性な分子の他の性質を調節し得る。いくつかの実施形態において、生物学的に活性な分子は、本発明のｈＡポリペプチドに対して連結されるか、または融合されて、内因性の結合パートナーとの親和性を増強し得る。
【０６３０】
例えば、いくつかの場合において、生物学的に活性な分子およびｈＡの組み換え融合体が作製される。例示的なアルブミン結合配列としては、これらに限定されないが、ストレプトコッカスのタンパク質Ｇから得られるアルブミン結合ドメイン（例えば、Makrides et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 277:534-542 (1996)およびSjolander et al., J, Immunol. Methods 201:115-123 (1997)を参照すればよい）、または例えば、Dennis, et al., J. Biol. Chem. 277:35035-35043 (2002) に記載されているそれらといったアルブミン結合ペプチドが挙げられる。
【０６３１】
他の実施形態において、本発明の生物学的に活性な分子は、脂肪酸を用いてアシル化される。いくつかの場合において、脂肪酸はｈＡに対する結合を促進する。例えば、Kurtzhals, et al., Biochem. J. 312:725-731 (1995) を参照すればよい。
【０６３２】
他の実施形態において、本発明の生物学的に活性な分子ポリペプチドは、ｈＡと直接に融合される。当業者は、広範な生物学的に活性な分子がまた、本発明における他のｈＰＰに対して連結されて、結合パートナーに対する結合を調節し得ることを認識する。
【０６３３】
（Ｘ．ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドの糖鎖付加）
本発明は、サッカライド残基を有する１つ以上の非天然にコードされるアミノ酸を組み込んでいる、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドを包含する。サッカライド残基は、天然（これに限定されないが、Ｎ−アセチルグルコサミンが挙げられる）、または非天然（これに限定されないが、３−フルオロガラクトースが挙げられる）であり得る。サッカライドは、Ｎ型もしくはＯ型の糖鎖結合（これに限定されないが、Ｎ−アセチルガラクトース−Ｌ−セリンが挙げられる）によってか、または非天然の結合（これらに限定されないが、オキシムまたは対応するＣ型−またはＳ型のグリコシドが挙げられる）によってのいずれかによって、非天然にコードされるアミノ酸に対して連結され得る。
【０６３４】
サッカライド（これに限定されないが、グリコシルが挙げられる）部分は、インビボまたはインビトロにおいて、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドに対して付加され得る。本発明のいくつかの実施形態において、カルボニル含有の非天然にコードされるアミノ酸を備えるｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、オキシム結合を介して対応する糖鎖付加ポリペプチドを生成するためのアミノオキシ基を有する、サッカライド誘導体を用いて修飾される。非天然にコードされるアミノ酸に対して付着されると、サッカライドは、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドに対して結合されるオリゴサッカライドを生成するための糖転移酵素および他の酵素を用いた処理によって、さらに合成され得る。例えば、H. Liu, et al. J. Am. Chem. Soc. 125: 1702-1703 (2003) を参照すればよい。
【０６３５】
本発明のいくつかの実施形態において、カルボニル含有の非天然にコードされるアミノ酸を備えるｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、アミノオキシ誘導体として調製される所定の構造を有するグリカンを用いて、直接に修飾される。当業者は、他の機能性基（これらに限定されないが、アジド、ヒドラジド、ヒドラジン、およびセミカルバジドが挙げられる）が、非天然にコードされるアミノ酸に対するサッカライドの連結に対して使用され得ることを認識する。
【０６３６】
本発明のいくつかの実施形態において、アジド含有またはアルキニル含有の非天然にコードされるアミノ酸を備えるｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、それから、アルキニルまたはアジド誘導体のそれぞれ（これらに限定されないが、が挙げられる）を用いた、ヒュイゲン［３＋２］環付加反応によって（限定されないが、これが挙げられる）、修飾される。この方法は、タンパク質が非常に高い選択性を有して修飾されることを可能にする。
【０６３７】
（ＸＩ．生物学的に活性な分子の活性の測定）
ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃを作り出すために使用される方法にかかわらず、それらは、生物活性に関するアッセイにかけられる。トリチウム化チミジンアッセイは、適切な場合に、細胞分裂の程度を確かめるために実施され得る。しかし、他の生物学的アッセイは、所望の活性を確かめるために使用され得る。また、他の生物学的アッセイ（例えば、抗原の生物活性（例えば、酵素活性、増殖活性、代謝活性）を抑制する能力を測定すること）は、ｈＰＰまたはｈＦｃの活性の指標を提供する。他のインビボにおけるアッセイは、生物活性を確かめるために使用され得る。一般的に、生物活性に関する試験は、所望の結果（例えば、生物活性の増加もしくは低下（変更されていないｈＰＰまたはｈＦｃと比較されるときの）、異なる生物活性（変更されていないｈＰＰまたはｈＦｃと比較されるときの）、受容体もしくは結合パートナーの親和性分析、ｈＰＰ自身もしくはｈＦｃ自身もしくは結合パートナーの立体配置もしくは構造の変化（変更されていないｈＰＰまたはｈＦｃと比較されるときの）、または抗原の生物活性に応じた血中半減期分析）に関する分析を提供すべきである。
【０６３８】
アッセイ方法論に関する言及の集まりは、網羅的なものではなく、かつ当業者は、所望の最終結果に関する試験に有用な他のアッセイを認識する。
【０６３９】
（ＸＩＩＩ．有効性、機能的なインビボにおける半減期、および薬物動態要素の測定）
本発明の重要な局面は、水溶性重合体部分に対するポリペプチドの接合を有するか、または有しないｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドの構築によって得られる、延長された生物学的半減期である。ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドの血中濃度の急速な減少は、接合および非接合のｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドおよびこれらのバリアントを用いた処置に対する生物学的応答を評価することを重要にさせている。本発明の接合および非接合のｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドおよびこれらのバリアントは、皮下投与または静脈内投与の後においても血中半減期を延長し得ており、例えば、ＥＬＩＳＡ法および一次スクリーニングアッセイによる測定を可能にしている。バイオソースインターナショナル（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）（カマリロ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ）、ＣＡ）またはディアグノスティックシステムラボラトリー（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ウェブスター（Ｗｅｂｓｔｅｒ）、ＴＸ）のいずれかから得られる、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡキットが使用され得る。インビボにおける生物学的半減期の測定は、本明細書に記載されているように実施される。
【０６４０】
非天然にコードされるアミノ酸を備えるｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドの有効性およびインビボにおける機能性は、Clark, R., et al., J. Biol. Chem. 271(36): 21969-21977 (1996) に記載されている手順に従って決定され得る。
【０６４１】
非天然にコードされるアミノ酸を備えるｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドに関する薬物動態要素は、通常のオスのスピローグダウリーマウス（処理群ごとにＮ＝５の動物）において評価され得る。動物は、静脈内に２５μｇ／ラットまたは皮下に５０μｇ／ラットの単回用量のいずれかを受け、かつおよそ５−７の血液試料が、水溶性重合体に対して接合されていない、非天然にコードされるアミノ酸を備えるｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドに関して約６時間、および非天然にコードされるアミノ酸を備え、かつ水溶性重合体に対して接合されているｈＰＰまたはｈＡポリペプチドに関して約４日の範囲に一般的に及ぶ、予め決められた時間経過に従って採られる。ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドに関する薬物動態のデータは、多様な種においてよく研究されており、かつ非天然にコードされるアミノ酸を備えるｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドについて得られたデータに対して直接に比較され得る。Mordenti J., et al., Pharm. Res. 8(11):1351-59 (1991)を参照すればよい。
【０６４２】
また、薬物動態の要素は、霊長類（例えば、カニクイザル）において評価され得る。典型的に、単回の注入は、皮下または静脈内かのいずれかに投与され得、かつ血中のｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃの濃度は、長期間に渡って観察され得る。
【０６４３】
本発明に係るｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドの特定の活性は、当該技術において公知の方法によって決定され得る。本発明に従って得られ、かつ精製されたｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチド変異体、またはこれらの断片の生物活性は、本明細書に記載されているか、もしくは言及されている方法または当業者に公知の方法によって試験され得る。
【０６４４】
（ＸＩＶ．投与および薬学的組成物）
本発明のポリペプチド（これらに限定されないが、ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃ、シンセターゼ、１つ以上の非天然アミノ酸タンパク質などが挙げられる）は、好適な薬学的担体と組み合わせて（限定されないが、これが挙げられる）、治療的使用に任意に採用される。当該組成物は、例えば、治療有効量の化合物、および薬学的に受容可能な担体もしくは賦形剤を備える。当該担体または賦形剤としては、これらに限定されないが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、および／またはこれらの組み合わせが挙げられる。調合物は、投与形態に合わせて作製される。一般的に、タンパク質を投与する方法は、当業者に公知であり、かつ本発明のポリペプチドの投与に適用され得る。
【０６４５】
本発明の１つ以上のポリペプチドを備える治療組成物は、当業者に公知の方法に従って、有効性を確かめ、かつ用量を評価するために、疾患の１つ以上のインビトロおよび／またはインビボにおける動物モデルにおいて、任意に試験され得る。特に、用量は、天然アミノ酸相同物に対する本明細書における非天然アミノ酸の活性、安定性またはたの好適な測定（１つ以上の非天然アミノ酸を含めるために修飾されたｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドの、天然アミノ酸のｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドに対する比較）（すなわち、比較アッセイ）によって最初に決定され得る。
【０６４６】
投与は、血液または組織細胞と最終的に接触する分子の導入に通常に使用されるあらゆる経路による。本発明の非天然アミノ酸ポリペプチドは、１つ以上の薬学的に受容可能な担体を任意に伴って、あらゆる好適な様式において投与される。本発明に関する当該ポリペプチドの患者に対する投与の好適な方法が利用可能であり、そして、２つ以上の経路が特定の組成物を投与するために使用されるが、特定の経路は、他の経路よりも即時のかつ効果的な作用または反応をしばしば提供できる。
【０６４７】
薬学的に受容可能な担体は、投与される特定の組成物よって、これと同様に組成物を投与するために使用される方法によって、部分的に決定される。従って、本発明の薬学的組成物の広範な好適な調合物がある。
【０６４８】
本発明のｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、タンパク質またはペプチドにとって好適な従来のあらゆる経路（これに限定されないが、非経口的（例えば、注入（これらに限定されないが、皮下的、静脈内的、または注入もしくは点滴のあらゆる他の形態が挙げられる））が挙げられる）によって投与され得る。ポリペプチド組成物は、多くの経路（これらに限定されないが、経口、腹腔内、筋肉内、点眼、眼内、頭蓋内、硬膜下、ＣＦＳ内、経皮、皮下、局所、舌下、または直腸の手段が挙げられる）によって投与され得る。また、修飾されたか、または非修飾の非天然アミノ酸ポリペプチドの組成物は、リポソームを介して投与され得る。当該投与経路および調合物は、当業者にとって公知である。非天然にコードされるアミノ酸を備えるｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、単独にか、または他の好適な組成物（例えば、薬学的単体）と組み合わせて使用され得る。また、非天然にコードされるアミノ酸を備えるｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、活性薬剤の調節された放出または有効性に関して生分解性であるか、または生体可溶性である薬学的担体と組み合わせて使用され得る。
【０６４９】
また、単独の、または他の好適な組成物との組み合わせの、非天然アミノ酸を備えるｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、吸入を介して投与されるためのエアロゾル調合物（すなわち、それらは“霧状化”され得る）に作製され得る。エアロゾル調合物は、圧縮化可能な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、および窒素など）に配合され得る。
【０６５０】
例えば、関節内（関節における）、血管内、筋肉内、皮内、腹腔内、眼内、頭蓋内、および皮下の経路といった、非経口投与に好適な調合物としては、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および意図される受容物の血液と等張な調合物にさせる溶液を含有できる、水性および非水性の等張無菌注入溶液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および防腐剤を含むことができる、水性および非水性の無菌懸濁液が挙げられる。ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃの調合物は、容器（例えば、アンプルおよびバイアル）に密封された単回用量または多回用量において提供され得る。
【０６５１】
非経口投与および血管内投与は、投与の好ましい方法である。特に、天然アミノ酸相同物治療に関してすでに使用中の投与の経路（これらに限定されないが、アルブミン、他のポリペプチドとのアルブミンの融合物、ＥＰＯ、ＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＦＳ、ＩＦＮ、インターロイキン、抗体、抗体断片、および／またはあらゆる他の薬学的送達タンパク質にとって使用されるそれらが挙げられる）が、現在使用中の調合物と共に、本発明のポリペプチドにとっての投与および調合物の好適な経路を提供する。
【０６５２】
患者に投与される用量は、本発明に照らして、用途に依存する、長期間に渡って患者に有益な治療応答を示すに十分な量である。用量は、特定のベクターもしくは調合物の有効性、および採用される非天然アミノ酸ポリペプチドの安定性もしくは血中半減期、および患者の状態、これらと同様に処置される患者の体重または表面積によって決定される。また、用量の大きさは、特定の患者における特定のベクター、または調合物などの投与に付随するあらゆる副作用の存在、性質、および程度によって決定される。
【０６５３】
疾患（これらに限定されないが、がん、遺伝疾患、糖尿病、またはＡＩＤＳなどが挙げられる）の処置または予防において投与されるベクターまたは調合物の有効量の決定において、医師は、循環血漿濃度、調合物の毒性、疾患の進行、および／または該当する場合に、抗非天然アミノ酸ポリペプチド抗体の産生を評価する。
【０６５４】
例えば７０キログラムの患者に投与される用量は、現在使用されている治療タンパク質の用量と同等な範囲において、関連組成物の変更された活性または血中半減期に関して典型的に調節される。本発明のベクターまたは調合物は、あらゆる従来公知の治療（抗体投与、ワクチン投与、細胞毒性物質の投与、天然アミノ酸ポリペプチドの投与、核酸の投与、ヌクレオチド類似物の投与、および生体反応修飾因子の投与が挙げられる）による処置条件を補うことができる。
【０６５５】
投与に関して、本発明の調合物は、関連調合物のＬＤ−５０もしくはＥＤ−５０よって、および／または患者の集団および全体的な健康状態に対して適用されるような（これが挙げられるが、限定されない）、種々の条件における非天然アミノ酸ポリペプチドのあらゆる副作用の観察によって、決定される割合において投与される。投与は、単回用量または分けられた用量を介して達成され得る。
【０６５６】
調合物の注入を受ける患者が熱を出すか、寒気を覚えるか、または筋肉痛を覚える場合には、彼／彼女は、適量のアスピリン、イブプロフェン、アセトアミノフェン、または他の痛覚／熱制御薬を受ける。注入に対する反作用（例えば、熱、筋肉痛、および悪寒）を経験する患者は、さらなる注入の３０分前に、アスピリン、アセトアミノフェン、または（これが挙げられるが、限定されない）ジフェンヒドラミンのいずれかを用いて前投与される。メペリジンは、解熱剤および抗ヒスタミン剤にすぐに反応しないひどい悪寒および筋肉痛に対して使用される。細胞注入は、反作用の重篤度に依存して速度を落とされるか、または中断される。
【０６５７】
本発明のｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、哺乳類の対象に対して直接に投与され得る。投与は、対象に対するｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドの導入に通常に使用される経路のうちのあらゆるものによる。本発明の実施形態に係るｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチド組成物としては、経口、直腸、局所、吸入（これに限定されないが、エアロゾルを介した吸入が挙げられる）、頬側（これに限定されないが、舌下が挙げられる）、膣、非経口（これらに限定されないが、皮下、筋肉内、皮内、間接内、胸膜内、腹腔内、大脳内、動脈内、または静脈内が挙げられる）、局所（すなわち、皮膚および気道の表面を含む粘膜の表面の両方）および経皮の投与に好適なそれらが挙げられるが、あらゆる所定の場合における最も好適な経路は、処置される性質および重篤度に依存する。投与は、局所的であるか、または全身性であるかのいずれかであり得る。化合物の調合物は、容器（例えば、アンプルおよびバイアル）に密閉された単回用量または多回用量に存在し得る。本発明のｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、薬学的に受容可能な担体を伴った、単回用量の形態（これらに限定されないが、溶液、懸濁液、または乳液が挙げられる）における混合物に調製され得る。また、本発明のｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、連続的な注入（これに限定されないが、浸透圧ポンプといったミニポンプを用いた注入が挙げられる）、単回の大量瞬時投与、または緩徐に放出する徐放性製剤調合物によって投与され得る。
【０６５８】
投与に好適な調合物としては、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および調合物に等張性を与える溶液を含有できる、水性および非水性の溶液、等張無菌溶液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤および防腐剤を含むことができる、水性および非水性の無菌懸濁液が挙げられる。溶液および懸濁液は、これまでに記載したような、無菌の粉末、顆粒、および錠剤から調製され得る。
【０６５９】
凍結乾燥は、所定のタンパク質調製物から水を取り除く役割を果たす、タンパク質を提供する技術に通常に採用される。凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ）、または凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）は、乾燥される物質がまず凍結され、かつそれから氷または凍結した溶媒が真空条件における昇華によって除去される過程である。賦形剤が、凍結乾燥過程における安定性の上昇および／または保存状態における凍結乾燥産物の安定性の向上を目的として、凍結乾燥前の調合物に含められ得る。Pikal, M. Biopharm. 3(9)26-30 (1990)およびArakawa et al. Pharm. Res. 8(3):285-291 (1991)。
【０６６０】
また、製薬の噴霧乾燥は、当業者に公知である。例えば、Broadhead, J. et al., "The Spray Drying of Pharmaceuticals," in Drug Dev. Ind. Pharm, 18 (11 & 12), 1169-1206 (1992)を参照すればよい。小分子製薬に加えて、種々の生体物質は、噴霧乾燥されており、かつこれらとしては、酵素、血清、血漿、微生物および酵母が挙げられる。噴霧乾燥は、１段階の過程において液体の製薬調製物を高純度の粉末、ほこりのない粉末、または凝集粉に転換できるので、有用な技術である。基本的な技術は、以下の４つの段階：（ａ）供給溶液の水煙への霧状化；（ｂ）水煙−空気接触；（ｃ）水煙の乾燥；および（ｄ）乾燥空気からの乾燥産物の分離を包含する。言及によって本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２３５，７１０号明細書および米国特許第６，００１，８００号明細書には、噴霧乾燥による組み換えエリスロポエチンの調製物に関して記載されている。
【０６６１】
本発明の薬学的組成物および調合物は、薬学的に受容可能な担体、賦形剤、または安定化剤を備え得る。薬学的に受容可能な担体は、投与される特定の組成物によって、これと同様に、組成物の投与に使用される特定の方法によって、部分的に決定される。従って、本発明の薬学的組成物の広範な好適な調合物（薬学的に受容可能な担体、賦形剤、または安定化剤を任意に含む）がある（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17thed. 1985）を参照すればよい）。
【０６６２】
好適的な担体としては、これらに限定されないが、コハク酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ＨＥＰＥＳ、クエン酸塩、ヒスチジン、イミダゾール、酢酸塩、重炭酸塩および他の有機酸を含有する緩衝液；抗酸化剤（これに限定されないが、アスコルビン酸が挙げられる）；低分子量ポリペプチド（これらに限定されないが、１０残基未満のそれらが挙げられる）；タンパク質（これらに限定されないが、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンが挙げられる）；親水性重合体（これに限定されないが、ポリビニルピロリドンが挙げられる）；アミノ酸（これらに限定されないが、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、ヒスチジンもしくはヒスチジン誘導体、メチオニン、グルタミン酸塩、またはリジンが挙げられる）；単糖類、２糖類、他のサッカライド（これらに限定されないが、トレハロース、スクロース、グルコース、マンノース、またはデキストリンが挙げられる）；キレート剤（これらに限定されないが、ＥＤＴＡおよびエデンテート（ｅｄｅｎｔａｔｅ）２ナトリウムが挙げられる）；２価の金属イオン（これらに限定されないが、亜鉛、コバルト、または銅が挙げられる）；糖アルコール（これらに限定されないが、マンニトールまたはソルビトールが挙げられる）；塩形成対イオン（これらに限定されないが、ナトリウムおよび塩化ナトリウムが挙げられる）；および／または非イオン性界面活性剤（これに限定されないが、Ｔｗｅｅｎ（商標）（これらに限定されないが、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリソルベート  ８０）およびＴｗｅｅｎ２０（ポリソルベート  ２０）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）および他のプルロン酸（これに限定されないが、および他のプルロン酸（これに限定されないが、プルロン酸  Ｆ８６（ポロオキサマー（ｐｏｌｏｘａｍａｅｒ）１８８）が挙げられる）が挙げられる）が挙げられる）、またはＰＥＧが挙げられる）が挙げられる。好適な界面活性剤としては、これらに限定されないが、例えば、ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（すなわち、（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ））、またはポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）（すなわち、（ＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯ））、またはこれらの組み合わせに基づいたポリエーテルが挙げられる。ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯおよびＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯは、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）、Ｒ−Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）、Ｔｅｔｒｏｎｉｃｓ（商標）およびＲ−Ｔｅｔｒｏｎｉｃｓ（商標）（ＢＡＳＦ  Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ  Ｃｏｒｐ．、Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ、Ｍｉｃｈ．）という商品名において市販されており、かつ言及によってその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第４，８２０，３５２号明細書にさらに記載されている。他のエチレン／プロピレンブロック重合体は、好適な界面活性剤であり得る。界面活性剤または界面活性剤の組み合わせは、１つ以上の負荷（これに限定されないが、攪拌から生じる負荷が挙げられる）に対してＰＥＧ付加ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃを安定化させるために、使用され得る。上述のうちのいくつかは、“充填剤”と呼ばれ得る。また、いくつかは、“強直性変更剤（ｔ��ｎｉｃｉｔｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）”と呼ばれ得る。また、抗菌性防腐剤が、産物の安定性および抗菌有効性を目的として適用され得；防腐剤としては、これらに限定されないが、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、メタクレゾール、メチル／プロピル  パラベン、クレゾール、およびフェノール、またはこれらの組み合わせが挙げられる。
【０６６３】
また、本発明のｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチド（これらに限定されないが、ＰＥＧといった水溶性重合体に対して連結されるそれらが挙げられる）は、徐放性の系の一部によってか、または一部として投与され得る。徐放性組成物としては、これに限定されないが、成形された品の形態（これらに限定されないが、フィルム、またはマイクロカプセルが挙げられる）における半透過性の重合体マトリクスが挙げられる。徐放性のマトリクスとしては、生体適合性材料から得られるもの（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 267-277 (1981); Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982) ）、エチレンビニルアセテート（上述のLanger et al）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチル酸（欧州特許出願公開第１３３，９８８号明細書）、ポリラクチド（ポリ酪酸）（米国特許第３，７７３，９１９号明細書；欧州特許出願公開第５８，４８１号明細書）、ポリグリコリド（グリコール酸の重合体）、ポリラクチド−コ−グリコリド（酪酸およびグリコリドの共重合体）のポリ無水物、Ｌ−グルタミン酸およびガンマ−エチル−Ｌ−グルタミン酸塩の共重合体（Sidman et al., Biopolymers, 22, 547-556 (1983) ）、ポリ（オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、硫酸コンドロイチン、カルボキシル酸、脂肪酸、リン脂質、ポリサッカライド、核酸、ポリアミノ酸、アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシン）、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドンならびにシリコン）が挙げられる。また、徐放性組成物は、リポソームに取り込まれる化合物が挙げられる。化合物を含有するリポソームは、それ自体が公知の方法によって調製される（独国特許出願公開第３，２１８，１２１号明細書；Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985)；Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030-4034 (1980)；欧州特許出願公開第５２，３２２号明細書；欧州特許出願公開第３６，６７６号明細書；米国特許第４，６１９，７９４号明細書；欧州特許出願公開第１４３，９４９号明細書；米国特許第５，０２１，２３４号明細書；日本国出願公開第８３−１１８００８号明細書；米国特許第４，４８５，０４５号明細書および米国特許第４，５４４，５４５号明細書；および欧州特許出願公開第１０２，３２４号明細書）。引用された参考文献および特許文献のすべては、言及によって本明細書に組み込まれる。
【０６６４】
リポソームに取り込まれたｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、例えば、独国特許出願公開第３，２１８，１２１号明細書；Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985)；Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030-4034 (1980)；欧州特許出願公開第５２，３２２号明細書；欧州特許出願公開第３６，６７６号明細書；米国特許第４，６１９，７９４号明細書；欧州特許出願公開第１４３，９４９号明細書；米国特許第５，０２１，２３４号明細書；日本国出願第８３−１１８００８号明細書；米国特許第４，４８５，０４５号明細書および米国特許第４，５４４，５４５号明細書；および欧州特許出願公開第１０２，３２４号明細書に記載されている方法によって調製され得る。組成物およびリポソームの大きさは、公知であるか、または経験的に当業者によって容易に決定され得る。リポソームのいくつかの例が、例えば、Park JW, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1327-1331 (1995) ；Lasic D and Papahadjopoulos D (eds): Medical Applications of Liposomes (1998)；Drummond DC, et al., Liposomal drug delivery systems for cancer therapy, in Teicher B (ed): Cancer Drug Discovery and Development (2002)；Park JW, et al., Clin. Cancer Res. 8:1172-1181 (2002); Nielsen UB, et al., Biochim. Biophys. Acta 1591(1-3):109-118 (2002)；Mamot C, et al., Cancer Res. 63: 3154-3161 (2003)に記載されている。引用された参考文献および特許文献のすべてが、言及によって本明細書に組み込まれる。
【０６６５】
本発明に照らして、患者に対して投与される用量は、長期間に渡って対象において有益な応答を引き起こすに十分な量であるべきである。一般的に、投与ごとに非経口的に投与される、本発明のｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドの治療有効量の総計は、患者の体重の約０．０１μｇ／ｋｇ／日から約１００μｇ／ｋｇ／日まで。または約０．０５ｍｇ／ｋｇ／日から約１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であるが、これは治療の自由裁量に従う。また、投与の頻度は、治療の自由裁量に従い、かつヒトにおける利用を承認されている、市販のｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチド産物よりも、高い頻度であり得るか、または低い頻度であり得る。一般的に、本発明のＰＥＧ付加ｈＰＰまたはｈＡまたはｈＦｃポリペプチドは、上述の投与経路のうちのあらゆるものによって投与され得る。
【０６６６】
〔実施例〕
以下の実施例は、例証のために与えられているが、請求の範囲に記載されている発明を制限しない。
【０６６７】
（実施例１）
この実施例は、ｈＡに対する非天然にコードされるアミノ酸の組み込みの好ましい部位の選択に関する、多くの見込みのある基準の集合の１つを説明している。以下に記載されている基準を用いて、ｐ−アセチル−フェニルアラニン（ｐＡＦ）のＨＳＡへの部位特異的な組み込みに利用される、アミノ酸位置は、３４、８２、１７２、３０１、３６４、５０５番目である。種々のＨＳＡの結晶構造が、１つ以上の非天然にコードされるアミノ酸が導入される好ましい位置を決定するために使用された（これらの構造に関する同等物は、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓを介して、ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ（ＰＤＢ  ＩＤ  １Ａ０６、１Ｅ７８および１ＢＭＯ）におけるプロテインデータバンク（ＰＤＢ）から利用可能である）。Ｘ線結晶構造の情報は、Ｃｘプログラム（Pintar et al. Bioinformatics, 2002, Vol.18, p 980）を利用して、ＨＳＡ分子の溶媒可触性の算出を実施するために使用された。すべての原子の溶媒可触性が算出され、かつアミノ酸残基のそれぞれに関するＣｘ値が決定され、かつ図２に示されている。アミノ酸は、Ｃｘ値によって序列化され、かつＨＳＡ構造におけるそれらの３次元位置と関連付けられ、かつこれらの部位のあるものは、図３に示されている。ＨＳＡは、合計５８２アミノ酸を含有し：上位から５１番目までのＣｘ値がｐＡＦ置換に関して調べられた。部位は、共有的な接合が最も実現可能なＨＳＡ構造の溶媒露出領域へのｐＡＦの配置するために選択された。以下の基準は、非天然にコードされるアミノ酸の組み込みにとってのＨＳＡの上位から５１番目までのＣｘ位置を評価するために使用された：選択される（複数の）残基は、（ａ）溶媒可触性、および最小のファンデルワールス力もしくは周囲の残基との水素結合相互作用を証明する、最大のＣｘ値を有すべきであり、（ｂ）タンパク質の異なる表面露出領域に属すべきであり、かつ（ｃ）タンパク質の厳格な領域および柔軟な領域の両方にあるべきである。ｈＡへの非天然にコードされるアミノ酸の組み込みに好適なアミノ酸位置の部分的な列挙は、図４に示される。
【０６６８】
（実施例２）
この実施例は、非天然にコードされるアミノ酸を有するか、または有しないｈＡの、酵母におけるクローニングおよび発現を詳述する。［発現ベクターへのアルブミンＤＮＡのクローニング、酵母の形質転換］。
【０６６９】
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）および直交アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）を備える、導入翻訳系が、非天然にコードされるアミノ酸を含有するｈＡを発現するために使用された。Ｏ−ＲＳは、非天然にコードされるアミノ酸と共にＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。翻訳系は、コードするセレクターコドンに応じて、ｈＡに非天然にコードされるアミノ酸を順番に挿入する。
【０６７０】
【表２】
0005840345.tif 000051
【０６７１】
修飾ｈＡ遺伝子および直交ｔＲＮＡシンセターゼ／ｔＲＮＡ対（所望の非天然にコードされるアミノ酸に特異的である）を含有するプラスミドを用いた、酵母の形質転換は、ｈＡポリペプチドへの非天然にコードされるアミノ酸の部位特異的な組み込み可能にする。特定の非天然にコードされるアミノ酸を０．０１−１００ｍＭの間において含有する培地において、３７℃において培養された、形質転換酵母は、高い忠実度および効率を有して、修飾ｈＡを発現する。
【０６７２】
ｐＧＡＤＨＳＡまたはｐＧＡＤＧＡＬ４（対照）を保有する、サッカロミセス  セレビジアエ株のＭａＶ２０３は、ＹＰＤにおいて２３時間、培養された。細胞および培養上清は、４℃において５分間、４０００ｇにおける遠心分離によって回収された。細胞抽出物は、約１０ｍｇの湿った細胞ペレットの溶解によって生成された。上清は、１０ｋＤａのＭＷＣＯスピンカラムによっておよそ３０倍に濃縮された。還元された試料は、４−１２％のＢｉｓ−ＴｒｉｓＰＡＧＥゲルのウェルのそれぞれに載せられ、２００Ｖにおいて５０分間、実行され、かつそれぞれが、クーマシーブルーを用いて染色されるか、またはニトロセルロース膜上に転写された（２５Ｖ、７０分）。ブロットは、まず抗ＨＳＡ  ＩｇＹ  ｐＡｂ（２００ｎｇ／ｍｌ）およびＨＲＰ−接合ヤギ抗ＩｇＹ  ＩｇＧ（１０ｎｇ／ｍｌ）を用いて調べられ、それからＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  ＥＣＬ基質（シグマ（Ｓｉｇｍａ））およびバイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ）のＦｌｕｏｒ−Ｓ画像処理システムを用いて検出された。結果は、図５に示されている。
【０６７３】
ｈＡの精製に関する方法は、当業者に公知であり、かつＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット分析、およびエレクトロスプレー−イオン化  イオントラップ質量分析などによって確認される。
【０６７４】
発現ベクターへのアルブミンＤＮＡのクローニング、酵母の形質転換
野性体ｈＡのコーディング配列（ＣＤＳ）は、以下のように、酵母のシャトル／発現ベクターであるｐＧＡＤＧＡＬ４にクローン化された。市販のｈＡのｃＤＮＡが、取得され、かつｈＡのＣＤＳの５’末端および３’末端に対して特異的なプライマーを用いたＰＣＲによって増幅された：ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位は、プライマー末端に組み込まれた。ＰＣＲに続いて、正しい断片が、ＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化され（３７℃、６０分）、精製され、かつＨｉｎｄＩＩＩ切断ｐＧＡＤＧＡＬ４にライゲーションされた。ライゲーション産物は、ＴＯＰ１０の化学的に形質転換受容性のＥ．  ｃｏｌｉに形質転換され；プラスミドＤＮＡが、ミニプレップキットを用いて選択された形質転換体から単離された。所望のプラスミド産物に関するスクリーニングは、選択されたプラスミドクローンの独立のＥｃｏＲＶおよびＰｓｔＩ制限酵素消化によって実施され；アガロースゲル電気泳動（１３０Ｖ、３０分）、およびＥｔＢｔ染色の後の予想されるバンドパターンを示す、これらのクローンが、配列決定によって確認された。クローンは、それらがｐＧＡＤＧＡＬ４のＧＡＬ４を置換しているｈＡのＣＤＳのコピーを有した場合に、‘陽性’と見做された；さらなる実験に使用されるための特定のベクターは、‘ｐＧＡＤＧＡＬ４’と名付けられた。
【０６７５】
アンバー変異は、部位特異的な変異生成のＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ法（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、  ＣＡ）によってｈＡのＣＤＳ内に特定のコドンに対して作製された。簡単に言うと、変異される領域に特異的なプライマーを重ねること、およびそれを生成するために必要なヌクレオチドに基づく変更を含むことが、半変異化ハイブリッドＤＮＡ分子を生成するためのＰＣＲ反応に使用された。親のメチル化ＤＮＡを切断し、かつ壊すためのＤｐｎＩ制限酵素消化に続いて、産物が、ＴＯＰ１０の化学的に形質転換受容性Ｅ．  ｃｏｌｉに形質転換された。形質転換体は、選択され；プラスミドＤＮＡが単離され、かつ所望の変異を含むプラスミドＤＮＡは、核酸配列決定によって確認された。
【０６７６】
サッカロミセス  セレビジアエの形質転換は、Ｒ．Ｄ．  Ｇｅｉｔｚ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｍａｎｉｔｏｂａ．ｃａ／ｆａｃｕｌｔｉｅｓ／ｍｅｄｉｃｉｎｅ／ｂｉｏｃｈｅｍ／ｇｉｅｔｚ／Ｔｒａｆｏ．ｈｔｍｌ）によって詳述されている手順に従って実施された。簡単に言うと、新たに培養された酵母は、およそ５０マイクロリットルの等分においてＹＰＤアガロースから掻き取られ、無菌水を用いて洗浄され、かつ３３％のポリ（エチレングリコール）−３３５０、１００ｍＭのＬｉｏＡｃ、３００マイクログラム／ｍｌの一本鎖のサケ精子のＤＮＡ、および５−１０マイクログラムの形質転換プラスミドＤＮＡ）を含有する、形質転換混合物に懸濁された。細胞は、４２℃において４０−６０分間、熱ショックされ、洗浄されかつ０．１ｍｌの無菌水に懸濁され、かつ選択的なアガロースプレート上に希釈物を配置した。それから、形質転換体は、続く発現および抑制実験に使用された。
【０６７７】
非天然アミノ酸を有するＨＳＡタンパク質の発現および性質決定
サッカロミセス  セレビジアエ株のＩｖｎＳｃ１は、以下の：
（１．）ｐＧＡＤＨＳＡ（アンバー）単独、
（２．）ｐＧＡＤＨＳＡ（アンバー）、ならびにＥ．  ｃｏｌｉのｔＲＮＡシンセターゼ遺伝子およびｔＲＮＡＣＵＡ遺伝子を含むプラスミド、
（３．）ｐＧＡＤＨＳＡ（アンバー）ならびにＥ．  ｃｏｌｉのパラ−アセチルフェニルアラニンｔＲＮＡシンセターゼ遺伝子およびｔＲＮＡＣＵＡ遺伝子を含むプラスミド
を用いて形質転換された。
【０６７８】
形質転換体は、５０ｍｌのＳＤ培地（ロイシン欠乏、トリプトファン欠乏）において、上記（３）の場合に、１ｍＭのパラ−アセチルフェニルアラニンの存在下において、３０℃において、１．０のＯＤ６００になるまで、振とうしながら培養された。この時点において、それぞれの培地からＯＤ６００等価物の３０が５分間、３０００ｇにおいて遠心分離によってペレット化され、３０ｍｌのＹＰＤに再懸濁された（同様に、上記（３）の場合には、１ｍＭのパラ−アセチルフェニルアラニンの存在下において）。培養物は、さらに２４時間に渡って、２５０ｒｐｍ、３０℃において振とうしながら培養するために、再び放置された。それから、それぞれの培養からのＯＤ６００等価物の５０が上述のようにペレット化され；培養上清が単離され、かつその画分が１０−ｋＤａ  ＭＷＣＯスピンカラムを用いておよそ３０倍に濃縮された。
【０６７９】
ｈＡタンパク質の存在が、以下に説明されているように、免疫ブロットによって評価された。１６μｌの還元された試料のそれぞれが、４−１２％のＢｉｓ−ＴｒｉｓＰＡＧＥゲルの各ウェルに載せられ、２００Ｖにおいて５０分間、実行され、かつそれぞれが、クーマシーブルーを用いて染色されるか、またはニトロセルロース膜上に転写された（２５Ｖ、７０分）。ブロットは、まず抗ＨＳＡ  ＩｇＹ  ｐＡｂ（２００ｎｇ／ｍｌ）およびＨＲＰ−接合ヤギ抗ＩｇＹ  ＩｇＧ（１０ｎｇ／ｍｌ）を用いて調べられ、それからＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  ＥＣＬ基質（シグマ）およびバイオラッドのＦｌｕｏｒ−Ｓ画像処理システムを用いて検出された。結果は、図６に示されており、かつｈＡポリペプチドへの非天然にコードされるアミノ酸の組み込みを証明している。
【０６８０】
ＨＳＡ−Ｃ３４の非天然にコードされるアミノ酸の抑制
野性体のＨＳＡをコードするプラスミド、ＨＳＡ−Ｃ３４をコードするプラスミド、またはＨＳＡをコードするプラスミド＋ｔＲＮＡシンセターゼ（ＲＳ）／ｔＲＮＡ対［チロシン（Ｙ）ＲＳ、ｐＡＦＲＳ、ｐＡｚＲＳ、ｐＢｚＲＳ、ＯＭｅＲＳ］を用いて形質転換されたＳ．  セレビジアエのＹ１８７株は、ＨＣ  Ｌｕｅ−（マイナス）培地またはＨＣ  Ｌｕｅマイナス  Ｔｒｐマイナス培地において一晩中、培養された（３０℃、２００ｒｐｍ）。細胞は、５分間、４℃、５０００×ｇにおいてペレット化され、かつ０．５のＯＤ６００までＹＰＡＤに再懸濁された。外来性のｔＲＮＡ／ＲＳ対を含有する株は、適切な新規のアミノ酸（１ｍＭのｐＡＦ、ｐＡＺ−Ｐｈｅ、ｐＢｚ−Ｐｈｅ、ＯＭｅ−Ｔｙｒ）の存在下（＋）または非存在下（−）においてインキュベートされた。ｐＡＦ＝パラ−アセチルフェニルアラニン；ｐＡＺ−Ｐｈｅ−パラ−アジドフェニルアラニン；ｐＢｚ−Ｐｈｅ＝パラ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン；ＯＭｅ−Ｔｙｒ＝Ｏ−メチルチロシン。２４時間のインキュベーション（３０℃、２００ｒｐｍ）に続いて、培養物のすべては、遠心分離によって回収され；１５ｍＬの還元された上清は、４−１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析され、かつクーマシー（図１０Ａ）および抗ＨＳＡのウエスタンブロット（図１０ＢおよびＣ）によって可視化された。ＨＳＡ  Ｓｔｄは、ヒト血清から精製された２００ｎｇのＨＳＡである。
【０６８１】
ＨＳＡ−Ｃ３４−ｐＡＦの５Ｋ  アミノ−オキシＰＥＧに対する接合
精製された野性体ＨＳＡまたはＨＳＡ  Ｃ３４−ｐＡＦは、〜２ｍｇ／ｍｌの最終濃度における反応緩衝液（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、２０ｇ／Ｌのグリシン、５ｇ／Ｌのマンニトール、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ４．０）に、緩衝液交換された。ＨＳＡ−Ｃ３４−ｐＡＦにおける反応は、２０モル濃度の等価なＰＥＧ誘導体化５Ｋ  アミノ−オキシ（＋）の添加と共にか、または反応緩衝液（−）の添加と共に開始され；酢酸ヒドラジド（触媒：最終濃度５０ｍＭ）がすべての反応に加えられた。反応は、放置されて４８時間、２８度において攪拌せずに進められた。それから、レーンごとに１μｌの反応混合物が、４−１２％のｂｉｓ−ｔｒｉｓポリアクリルアミドゲルにおいて分離され、かつα−ＨＳＡウエスタンブロットによって分析された。図１１を参照すればよい。
【０６８２】
ＨＳＡの分析方法
試料のトリプシン処理
野性体ＨＳＡ（シグマ−アルドリッチ、２ｍｇ／ｍｌ）または精製したｐＡＦ抑制ＨＳＡ（〜２ｍｇ／ｍｌ）が、６Ｍのグアニジン−ＨＣｌおよび５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．５に希釈された（最終濃度）。試料は、２０ｍＭのＤＴＴを用いて３７℃において１時間還元され、続いて４０ｍｍのヨード酢酸（ＩＡＡ）を用いて４０分間、室温において暗所においてアルキル化された。反応は４０ｍｍのＤＴＴを用いて停止され、かつ試料は、５０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５において透析され、かつ１：２０（酵素：タンパク質）のトリプシンを用いて３７℃において４時間、処理された。反応は、０．１％までのＴＦＡの添加して停止された。
【０６８３】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ
トリプシン処理した１００μＬの試料は、ゾルバックス（Ｚｏｒｂａｘ）  ＳＢ−Ｃ１８カラム（２．１×１５０ｍｍ、３．５μｍ、４０℃）に、０．２ｍＬ／分においてかけられた。ペプチドは、０から１００％までのアセトニトリルの１．３８％／分における勾配と共に０．０５％のＴＦＡにおいて６０分の間、溶出された。溶出されたペプチドは、１５Ｖのキャピラリー電圧および４．５ｋＶのスプレー電圧を用いたサーモエレクトロン（ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ）のＬＣＱ  デカ（Ｄｅｃａ）において、直接にエレクトロスプレーされた。データ依存直列質量分析スペクトルの取得に続く、最大走査の質量スペクトル（３００−２０００ｍ／ｚ）のサイクルは、ペプチド溶出物の全体に対して、３５％の標準化された衝突エネルギーにおいて実施された。
【０６８４】
ＨＳＡ−Ｃ３４ｐＡＦのペプチド質量分析マップ
精製された野生体ＨＳＡおよびＨＳＡ−Ｃ３４ｐＡＦ（およそ６０μｇ）が、トリプシンを用いたタンパク質分解消化にかけられ、かつＬＣ−ＭＳ／ＭＳがペプチド質量マップを取得するためにＬＣＱ  デカ（サーモエレクトロン）を用いて試料に対して実施された。配列分析に基づいて、野性体ＨＳＡにおけるＮ末端から５番目のトリプシン処理ペプチド（Ｔ５）は、Ｃｙｓ３４を含有しており；ｐＡＦ抑制ＨＳＡにおけるＴ５は、Ｃｙｓ３４アミノ酸置換に対応して異なる質量を示すはずである。野性体のＴ５ペプチド（Ｍ２Ｈ＋  ｍ／ｚ＝１２４６．９５と見積モル濃度れた）は、逆相カラムから３７．３分において、１２４６．４の観察されたｍ／ｚを有して溶出され；３７．３分におけるＨＳＡ−Ｃ３４ｐＡＦのトリプシン処理質量マップは、１２４６＋／−２のｍ／ｚのペプチドをもたらさなかった。これとは逆に、ｐＡＦ置換Ｔ５（Ｍ２Ｈ＋  ｍ／ｚ１２６０．６３と見積モル濃度れた）は、３９．１分において、１２６０．４の観察されたｍ／ｚを有して溶出された（図１２Ａ）。ｍ／ｚ＝１２４６＋／−２を有するペプチドは、野性体のＨＳＡのトリプシン処理質量マップにおいて観察されなかった（図１２Ｂ）。（Ａ）における３９．１分のピークは、予想されるｐＡＦ置換Ｔ５ペプチドと整合性のあるＭＳ／ＭＳスペクトルを有する（図１３）。
【０６８５】
ｐＡＦ含有ＨＳＡポリペプチドのＭＳ／ＭＳ
ｐＡＦ−Ｔ５親イオンのＭＳ／ＭＳスペクトル（ｍ／ｚ＝１２６０．４）。１価のイオン断片が、２価の親イオンの衝突誘発解離によって生成された。予想されるｍ／ｚ間隔（ｙ’’系列）に対応するピークは、スペクトルにおいて示された。ピーク間隔は、Ｃｙｓ３４−ｐＡＦ置換を含むＨＳＡのＴ５ペプチドと整合性を有する。図１３を参照すればよい。
【０６８６】
（実施例３）
この実施例は、カルボニル含有アミノ酸、およびアミノオキシ含有ＰＥＧとの後の反応について詳述する。
【０６８７】
この実施例は、ケトン含有の非天然にコードされるアミノ酸（およそ５，０００の分子量を有するアミノオキシ含有ＰＥＧと後に反応する）を組み込む、ｈＡポリペプチドを生成する方法を証明する。実施例１の基準に従って特定された、１７、３４、５５、５６、５８、６０、８１、８２、８６、９２、９４、１１１、１１４、１１６、１１９、１２９、１７０、１７２、１７３、２７６、２７７、２８０、２９７、３００、３０１、３１３、３１７、３２１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６８、３７５、３９７、４３９、４４２、４９５、４９６、４９８、５００、５０１、５０５、５１５、５３８、５４１、５４２、５６０、５６２、５６４、５７４、５８１番目の残基のそれぞれ（ｈＡ）は、以下の構造：
【０６８８】
【化４９】
0005840345.tif 000052
【０６８９】
を有する非天然にコードされるアミノ酸に個々に置換される。
【０６９０】
ｐ−アセチル−フェニルアラニンのｈＡに対する部位特異的な組み込みに利用された配位列は、配列番号１である。
【０６９１】
カルボニル含有アミノ酸を備えるｈＡポリペプチドバリアントは、形態：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２
（ここで、Ｒはメチルであり、ｎは３であり、かつＮはおよそ５，０００の分子量である）
のアミノオキシ含有ＰＥＧと反応される。ｈＡに対して接合される他のＰＥＧ誘導体は、３０，０００の分子量を有する。ｐＨ６．０の２５ｍＭのＭＥＳ（シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、Ｓｔ．  Ｌｕｉｓ、ＭＯ）、ｐＨ７．０の２５ｍＭのＨｅｐｅｓ（シグマケミカル、Ｓｔ．  Ｌｕｉｓ、ＭＯ）、またはｐＨ４．５の酢酸ナトリウム（シグマケミカル、Ｓｔ．  Ｌｕｉｓ、ＭＯ）において１０ｍｇ／ｍＬに溶解されたｐ−アセチルフェニルアラニンを含有する精製ｈＡは、１０−１００倍の過剰量のアミノオキシ含有ＰＥＧと反応され、かつそれから、１０−１６時間、室温において攪拌された（Jencks, W. J. Am. Chem. Soc. 1959, 81, pp 475）。それから、ＰＥＧ−ｈＡは、即時の精製および分析に適する緩衝液に希釈された。
【０６９２】
（実施例４）
アミド結合を介してＰＥＧに対して連結されたヒドロキシアミン基からなるＰＥＧとの接合。
【０６９３】
以下の構造：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２
（ここで、Ｒ＝メチル、ｎ＝４、Ｎはおよそ２０，０００の分子量である）
を有するＰＥＧ試薬は、実施例３に記載されている手法を用いて、ケトン含有の非天然にコードされるアミノ酸に対して連結される。反応、精製、および分析条件は、実施例３に記載されている通りである。
【０６９４】
（実施例５）
この実施例は、２つの異なる非天然にコードされるアミノ酸の、ｈＡポリペプチドへの組み込みについて詳述する。
【０６９５】
この実施例は、以下の残基：Ｅ３０、Ｅ７４、Ｙ１０３、Ｋ３８、Ｋ４１、Ｋ１４０、およびＫ１４５のうちから２つの位置において、ケトン機能性基を備える非天然にコードされるアミノ酸を組み込んでいる、ｈＡポリペプチドの生成方法を証明する。ｈＡポリペプチドは、セレクターコドンが核酸内の２つの異なる部位に導入されていることを除いて、実施例１および２に記載されている通りに調製される。
【０６９６】
（実施例６）
この実施例は、ヒドラジド含有ＰＥＧに対するｈＡポリペプチドの接合、および続くインシチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）還元について詳述する。
【０６９７】
カルボニル含有アミノ酸を組み込んでいるｈＡポリペプチドは、実施例２および２に記載されている手法に従って調製される。修飾されると、以下の構造：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
（ここで、Ｒ＝メチル、ｎ＝２およびＮ＝１０，０００の分子量、かつＸはカルボニル（Ｃ＝Ｏ）基である）
を有するヒドラジド含有ＰＥＧは、ｈＡポリペプチドに対して接合される。ｐ−アセチルフェニルアラニンは、ｐＨ６．０の２５ｍＭのＭＥＳ（シグマケミカル、Ｓｔ．  Ｌｕｉｓ、ＭＯ）、ｐＨ７．０の２５ｍＭのＨｅｐｅｓ（シグマケミカル、Ｓｔ．  Ｌｕｉｓ、ＭＯ）、またはｐＨ４．５の１０ｍＭの酢酸ナトリウム（シグマケミカル、Ｓｔ．  Ｌｕｉｓ、ＭＯ）において、０．１−１０ｍｇ／ｍＬの間において溶解され、１から１００倍までの過剰量のヒドラジド含有ＰＥＧと反応させられ、かつ１０−５０ｍＭの最終濃度にまでＨ２Ｏに溶解される、１ＭのストックＮａＣＮＢＨ３（シグマケミカル、Ｓｔ．  Ｌｕｉｓ、ＭＯ）の添加によって、インシチュにおいて還元される。反応は、暗所において、４℃から室温において、１８−２４時間、実施される。反応は、Ｔｒｉｓの最終濃度が５０ｍＭになるまでの、約ｐＨ７．６の１ＭのＴｒｉｓ（シグマケミカル、Ｓｔ．  Ｌｕｉｓ、ＭＯ）の添加によって、停止されるか、または即時の精製に適した緩衝液内に希釈される。
【０６９８】
（実施例７）
この実施例は、ｈＡポリペプチドへのアルキン含有アミノ酸の導入およびｍＰＥＧアジドとの誘導体化について詳述する。
【０６９９】
以下の１７、３４、５５、５６、５８、６０、８１、８２、８６、９２、９４、１１１、１１４、１１６、１１９、１２９、１７０、１７２、１７３、２７６、２７７、２８０、２９７、３００、３０１、３１３、３１７、３２１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６８、３７５、３９７、４３９、４４２、４９５、４９６、４９８、５００、５０１、５０５、５１５、５３８、５４１、５４２、５６０、５６２、５６４、５７４、５８１番目の残基（ｈＡ；配列番号１）は、以下の非天然にコードされるアミノ酸：
【０７００】
【化５０】
0005840345.tif 000053
【０７０１】
に置換される。
【０７０２】
ｐ−プロパルギル−チロシンのｈＡへの部位特異的な組み込みに利用される配列は、配列番号２（ｈＡ）、配列番号３（ｍｕｔｔＲＮＡ、Ｍ．  ジャナスキーのｍｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡ）、ならびに上述の実施例２に記載されている、８、９または１０である。プロパルギルチロシンを含むｈＡポリペプチドは、Ｅ．  ｃｏｌｉにおいて発現され、かつ実施例３に記載されている条件を用いて精製される。
【０７０３】
プロパルギルチロシンを含有する精製ｈＡ（ＰＢ緩衝液（１００ｍＭのリン酸ナトリウム、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝８）において０．１−１０ｍｇ／ｍＬの間において溶解されている）および１０から１０００倍の過剰量のアジド含有ＰＥＧが、反応混合物に添加される。それから触媒量のＣｕＳＯ４およびＣｕ線が反応混合物に添加される。混合物がインキュベーションされた（これらに限定されないが、室温または３７℃において約４時間、または４℃において一晩中が挙げられる）後に、Ｈ２Ｏが加えられ、かつ混合物は、透析膜を通してろ過される。試料は、実施例３に記載されている同様の手法によって（限定されないが、これが挙げられる）、付加に関して分析され得る。
【０７０４】
この実施例において、ＰＥＧは、以下の構造：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−Ｎ３
（ここで、Ｒはメチルであり、ｎは４であり、かつＮは１０，０００の分子量である）
を有する。
【０７０５】
（実施例８）
この実施例は、ｈＡポリペプチドにおける大きな疎水性アミノ酸の、プロパルギルチロシンを用いた置換について詳述する。
【０７０６】
ｈＡの以下の位置：１７、３４、５５、５６、５８、６０、８１、８２、８６、９２、９４、１１１、１１４、１１６、１１９、１２９、１７０、１７２、１７３、２７６、２７７、２８０、２９７、３００、３０１、３１３、３１７、３２１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６８、３７５、３９７、４３９、４４２、４９５、４９６、４９８、５００、５０１、５０５、５１５、５３８、５４１、５４２、５６０、５６２、５６４、５７４、５８１（配列番号１）の１つに存在するＰｈｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒは、実施例７に記載されているような以下の非天然にコードされるアミノ酸：
【０７０７】
【化５１】
0005840345.tif 000054
【０７０８】
に置換されている。
【０７０９】
修飾されると、ＰＥＧは、アルキン含有アミノ酸を備えるｈＡポリペプチドに付着される。ＰＥＧは、以下の構造：
Ｍｅ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｎ３
を有し、かつ連結手法は実施例７におけるそれらに従う。これは、天然に生じる大きな疎水性アミノ酸の１つとおそらく等配電子性である非天然にコードされるアミノ酸を備え、かつポリペプチド内の異なる部位においてＰＥＧを用いて修飾される、ｈＡポリペプチドバリアントを生成する。
【０７１０】
（実施例９）
この実施例は、１つ以上のＰＥＧリンカーによって分けられている、ｈＡポリペプチドの同種二量体、異種二量体、同種多量体、または異種多量体の生成について詳述する。
【０７１１】
実施例７において産生されたアルキン含有ｈＡポリペプチドは、形態：
Ｎ３−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ３
（ここで、ｎは４であり、対応するポリペプチド同種二量体（２つのｈＡ分子はＰＥＧによって物理的に離されている）を生成するためのＰＥＧは、およそ５，０００の平均分子量を有する）
の二機能性ＰＥＧ誘導体と反応させられる。類似の様式において、ｈＡポリペプチドは、１つ以上のポリペプチドと連結されて、異種二量体、同種多量体、または異種他量体を形成し得る。連結、精製、および分析は、実施例７および３の通りに実施される。
【０７１２】
（実施例１０）
この実施例は、サッカライド部分のｈＡポリペプチドに対する結合について詳述する。
【０７１３】
以下の残基：実施例３に記載される通りの、１７、３４、５５、５６、５８、６０、８１、８２、８６、９２、９４、１１１、１１４、１１６、１１９、１２９、１７０、１７２、１７３、２７６、２７７、２８０、２９７、３００、３０１、３１３、３１７、３２１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６８、３７５、３９７、４３９、４４２、４９５、４９６、４９８、５００、５０１、５０５、５１５、５３８、５４１、５４２、５６０、５６２、５６４、５７４、５８１（ｈＡ、配列番号１）の１つが、以下の非天然にコードされるアミノ酸：
【０７１４】
【化５２】
0005840345.tif 000055
【０７１５】
に置換される。
【０７１６】
修飾されると、カルボニル含有アミノ酸を備えるｈＡポリペプチドバリアントは、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）のβ結合型類似物と反応させられる。ｈＡポリペプチドバリアント（１０ｍｇ／ｍＬ）およびアミノオキシサッカライド（２１ｍＭ）は、１００ｍＭの酢酸ナトリウム水溶液緩衝液（ｐＨ５．５）において混合され、かつ７から２６時間、３７℃においてインキュベートされる。第２のサッカライドは、１５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）におけるＵＤＰ−ガラクトース（１６ｍＭ）およびβ−１，４−ガラシトシルトランスフェラーゼ（０．４ユニット／ｍＬ）と共に、サッカライド接合化ｈＡポリペプチド（５ｍｇ／ｍＬ）を、環境温度において４８時間、インキュベートすることによって、第１のサッカライドに対して酵素学的に結合される（Schanbacher et al. J. Biol. Chem. 1970, 245, 5057-5061）。
【０７１７】
（実施例１１）
ｈＡ分子が直接に連結されている、ｈＡポリペプチドの同種二量体、異種二量体、同種多量体または異種多量体の生成
アルキン含有アミノ酸を備えるｈＡポリペプチドバリアントは、アジド含有アミノ酸を備えるｈＡポリペプチドバリアントと直接に結合され、これらのｈＡポリペプチドバリアントのそれぞれは、実施例１０に記載されているような部位（これらに限定されないが）において非天然にコードされるアミノ酸置換基を備える。これは、対応するｈＡポリペプチド同種二量体を生成し、ここで、２つのｈＡポリペプチドバリアントは、サイトＩＩ結合表面において物理的に連結されている。類似の様式において、ｈＡポリペプチドポリペプチドは、１つ以上の他のポリペプチドに対して結合されて、異種二量体、同種多量体、または異種多量体を形成する。結合、精製、および分析は、実施例３、６、および７のように実施される。
【０７１８】
（実施例１２）
この実施例は、非天然にコードされるアミノ酸を備えるｈＡの、他の生物学的に活性な分子との接合について記載する。本明細書の実施例２において産生されるｈＡは、所望の生物学的に活性な分子（例えば、合成ペプチド、小さな有機分子、重合体、ｈＡもしくは他の生物学的に活性な分子に対する結合に利用可能な１つ、２つ、３つもしくはそれ以上の官能基を有する、リンカー、ｈＡ以外のタンパク質もしくはポリペプチド、他のｈＡ分子、または生物学的に活性な分子の非天然アミノ酸に対する接合物および配列番号１の３４位におけるシステインに対して付着される他の生物学的に活性な分子の活性な分子の接合物）と反応させられる。所望の生物学的に活性な分子は、ｈＡの非天然にコードされるアミノ酸の官能基と、生物学的に活性な分子における相補的な官能基との間における共有結合の形成を可能にする条件において、非天然にコードされるアミノ酸を備えるｈＡと反応させられる。共有的に結合されたｈＡおよび所望の生物学的に活性な分子は、当該技術に公知の方法または本明細書に記載されている方法を利用して、必要に応じてさらに、精製される。
【０７１９】
（実施例１３）
この実施例は、非天然にコードされるアミノ酸を有するＦｃおよび非天然にコードされるアミノ酸を有していないＦｃの、哺乳類細胞におけるクローニングおよび発現について詳述する。［発現ベクターへのＦｃＤＮＡのクローニング、哺乳類細胞の形質転換］。配列番号２０は、野性体Ｆｃのポリヌクレオチド配列を示している。このポリヌクレオチド配列は、精製タンパク質に存在しないシグナル配列を有する、ヒトＩｇＧ−Ｆｃをコードする。この配列において下線が付されているコドンは、変異タンパク質を得るためのセレクタードンであるアンバーコドンに置換されている。下線が付されたコドンは、成熟タンパク質の１番目のアミノ酸である、アスパラギン酸（ＡＳＰ；Ｄ）アミノ酸をコードする。配列番号２１は、シグナル配列を有するＦｃのポリペプチド配列を示す。配列番号２２は、成熟Ｆｃタンパク質の配列を示す。配列番号２３は、成熟Ｆｃタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を示す。図８Ａ−Ｄを参照すればよい。
【０７２０】
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）および直交アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）を備える導入された翻訳系は、非天然にコードされるアミノ酸を備えるＦｃを発現するために使用される。Ｏ−ＲＳは、非天然にコードされるアミノ酸と共にＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。翻訳系は、コードされるセレクターコドンに応じて、非天然にコードされるアミノ酸をＦｃに、次々と挿入する。
【０７２１】
野性体およびＤ１ｐＡＦ−Ｆｃの一過性産生
ＣＨＯ−Ｓ  フリースタイル（Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ）（商標）細胞（継代数１０；インビトロジェン、チャールズバッド、ＣＡ）は、トランスフェクションの前に２４時間、５×１０５細胞／ｍＬにおいて、３００ｍＬフリースタイル（商標）ＣＨＯ培地に播かれた。トランスフェクションは、製造者の手引書に従って実施された。簡単に言うと、３７５ｍＬのフリースタイルマックス（Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ＭＡＸ）（商標）試薬（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）は、野性体（ＷＴ）Ｆｃをコードするプラスミド（４１５μｇ）と共にか、または直交ｔＲＮＡ（配列番号２４）、直交ｔＲＮＡシンセターゼ（５μｇ）（配列番号２５に示されるコーディングポリヌクレオチド配列）、およびＦｃ−Ｄ１ＴＡＧ（１４０μｇ）をコードする複数のプラスミドと共に、１５分間インキュベートされた。ｔＲＮＡおよびＲＳ配列に関しては、図９ＡおよびＢを参照すればよい。非天然にコードされるアミノ酸は、Ｆｃ配列の１位に存在するアスパラギン（Ａｓｐ；Ｄ）アミノ酸を置換する。ＤＮＡトランスフェクション混合物は、総量３００ｍＬの３．２×１０８細胞に対して加えられた。Ｆｃ−Ｄ１ＴＡＧからのタンパク質の細胞性発現に関して、パラ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ）は、１ｍＭの最終濃度にまで加えられた。細胞は、８％のＣＯ２および１００ｒｐｍにおいて、３４℃においてインキュベートされた。トランスフェクション後の２４時間において、セレクトフィトン（Ｓｅｌｅｃｔ  Ｐｈｙｔｏｎｅ）ＵＦ加水分解物（ベクトン、ディッキンソンアンドカンパニー（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）が、０．１％の最終濃度にまで加えられた。培養物は、トランスフェクション後７２時間に遠心分離（１０分、４，０００ｒｐｍ）によって回収され、かつ上清は、０．２２μｍのフィルタを用いてろ過滅菌された。
【０７２２】
ＣＨＯ−Ｓの培養上清からの野性体およびＤ１ｐＡＦ−Ｆｃの精製
透明にした培養上清は、５ｍＬのハイトラップ（Ｈｉｔｒａｐ）  ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ  ＦＦ前充填カラム（ＧＥ  ヘルスケア、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）にかけられた。カラムは、ｐＨ３．０の０．１Ｍのグリシンを用いて溶出する前に、カラムの１０倍容積のｐＨ７．４のＰＢＳを用いて洗浄された。Ｆｃを含む画分は、０．０３量の０．５ＭのＴｒｉｓ塩基を用いておよそｐＨ７まで中和された。画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づいてプールされ、かつプールは、分子量１０，０００のカットオフスピン（ｃｕｔ  ｏｆｆ  ｓｐｉｎ）装置（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ））を用いて濃縮され、かつｐＨ７．４のＰＢＳ＋１０％グリセロールに対して、４℃において一晩中、透析された。Ｆｃ濃度は、２８０ｎｍにおける吸収を用いて決定された。パラ−アセチルフェニルアラニンの組み込みを有するＦｃ、Ｄ１ｐＡＦに対して使用された吸光係数は、１．３５であった。ＷＴのＦｃに使用された吸光係数は、１．４０であった。Ｎ末端配列決定および質量分析スペクトルは、Ｄ１ＴＡＧのＮ末端におけるｐＡＦの適切な組み込みを証明した。このタンパク質は、Ｄ１ｐＡＦ（１位において置換されたｐＡＦを有するＦｃ）と呼ばれる。
【０７２３】
５Ｋ  アミノ−オキシＰＥＧのＤ１ｐＡＦ−Ｆｃに対する接合
精製ＷＴ−ＦｃおよびＤ１ｐＡＦは、接合緩衝液（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、２０ｇ／Ｌのグリシン、５ｇ／Ｌのマンニトール、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ４．０）に緩衝液交換され、かつおよそ１．５ｍｇ／ｍＬまで濃縮された。試料は、接合緩衝液単独においてインキュベートされるか、または１５ｇ／Ｌの最終濃度（Ｆｃ単量体の５０倍のモル濃度の過剰量）における５Ｋ  アミノ−オキシポリ（エチレン）−グリコール（ＰＥＧ）と共にインキュベートされた。酢酸ヒドラジドは、接合反応を触媒するために、５０ｍＭの最終濃度においてすべての反応に加えられた。反応が放置されて、２８℃において４８時間、続けられた。５μｌの分取分が２４時間において取られた。３μｇの試料のそれぞれが、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分析された。４−１２％のｂｉｓ−ｔｒｉｓ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥが、還元条件および非還元条件において実施され、かつクーマシー染色された。還元試料は、ＭＥＳ緩衝液系を用いて分離され、かつ非還元試料は、ＭＯＰＳ緩衝液系において分離された。
【０７２４】
図７は、ヒトＩｇＧ−Ｆｃのアミノ末端ｐＡＦ残基に対する５Ｋ  ＰＥＧ接合を示している。精製Ｆｃ（ＷＴ）およびＤ１ｐＡＦ置換Ｆｃ（Ｄ１ｐＡＦ）は、２８℃において２４または４８時間、５Ｋ  アミノ−オキシ  ポリ（エチレン）−グリコール（ＰＥＧ）の存在（＋）または非存在（−）において、インキュベートされた。還元されたか（図７Ａ）、または非還元（図７Ｂ）の試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されたタンパク質のクーマシーブルー染色によって分析された。
【０７２５】
図７Ａは、ＰＥＧなしの状態においてインキュベートされたＤ１ｐＡＦと比べて質量シフトを示した、Ｄ１ｐＡＦ＋ＰＥＧを示している（レーン７対５のそれぞれ）。これとは逆に、ＷＴ  Ｆｃが５Ｋ  ＰＥＧと共にインキュベートされた後には、質量シフトが観察されず（レーン３および６）、質量シフトがｐＡＦ依存的であることを証明している。非還元試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、完全な−Ｆｃ二量体が、分子の１つ（ＰＥＧ−Ｄ１ｐＡＦ＋Ｄ１ｐＡＦ）または２つ（ＰＥＧ−Ｄ１ｐＡＦ＋ＰＥＧ−Ｄ１ｐＡＦ）の腕に対して接合されたことを証明した（図７Ｂ）。染色強度は、材料の大部分が２重にＰＥＧ付加されたＦｃ二量体であったことを示した（レーン７）。パネル（図７Ｂ）に存在する下側のバンドは、ＰＥＧ付加および非ＰＥＧ付加のＦｃ単量体の還元化形態である。
【０７２６】
本明細書に記載されている組成物、方法、技術および戦略の例示的な非限定的な実施例として、明細書本文において、これらに記載されている組成物、方法、技術および戦略がまた、他の機能性基（これらに限定されないが、上記に挙げられているこれらおよび／または他のＦｃ分子が挙げられる）を付加することに対して適用可能である（必要に応じて適切な改変を有して、かつ当業者は本明細書における開示を用いることができる）という理解と共に、非天然にコードされるアミノ酸を備えるＦｃに対して巨大分子を付加することについて議論した。
【０７２７】
本明細書に記載されている実施例および実施形態が、単に例示を目的としていること、ならびにこれらに照らして種々の改変または変更が、当業者に示唆され、かつ本願の精神および範囲、および添付の特許請求の範囲の範囲に含まれることは、理解される。本願に引用される公開物、特許、特許出願、および／または他の文献は、個々の公開物、特許、特許出願、および／または他の文献のそれぞれが、すべての目的において言及によって組み込まれることを、あたかも示されているのと同じ程度に、すべての目的において言及によってその全体が組み込まれる。
【０７２８】
【表３】
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【０７２９】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【０７３０】
【図１Ａ】成熟ヒトアルブミンのアミノ酸配列が示されている。
【図１Ｂ】ヒトアルブミンをコードするヌクレオチド配列が示されている。
【図２】図２−ｈＡアミノ酸にとっての平均のＣｘ値が示されている。
【図３】図３−ｈＡのモデルおよび特定のアミノ酸位置が示されている。
【図４】非天然にコードされるアミノ酸を用いた置換に使われる、ｈＡにおいて選択されるアミノ酸位置の表が示されている。
【図５】酵母宿主細胞における組み換えヒトアルブミンの発現が、クーマシー染色したポリアクリルアミドゲル電気泳動によって示されている。
【図６】ポリペプチド配列に非天然にコードされるアミノ酸を含有するｈＡの発現が、クーマシー染色したポリアクリルアミドゲル電気泳動によって示されている。
【図７】パネルＡは、５Ｋのアミノ−オキシ  ポリ（エチレン）−グリコール（ＰＥＧ）の存在下（＋）または非存在下（−）においてインキュベートされた、精製Ｆｃ（ＷＴ）およびＤ１ｐＡＦ置換したＦｃ（Ｄ１ｐＡＦ）の還元した試料が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された結果を示し、パネルＢ−５Ｋのアミノ−オキシ  ポリ（エチレン）−グリコール（ＰＥＧ）の存在下（＋）または非存在下（−）においてインキュベートされた、精製Ｆｃ（ＷＴ）およびＤ１ｐＡＦ置換したＦｃ（Ｄ１ｐＡＦ）の非還元の試料が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された結果を示す。
【図８Ａ】野性体Ｆｃのポリヌクレオチド配列が示されている。
【図８Ｂ】野性体Ｆｃのポリペプチド配列が示されている。
【図８Ｃ】成熟Ｆｃのポリペプチド配列が示されている。
【図８Ｄ】成熟Ｆｃをコードするポリヌクレオチド配列が示されている。
【図９Ａ】ｔＲＮＡのポリヌクレオチド配列が示されている。
【図９Ｂ】アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼをコードするポリヌクレオチド配列が示されている。
【図１０Ａ】図１０Ａ−ｈＡへの非天然にコードされるアミノ酸の組み込みが、クーマシー染色したポリアクリルアミドゲルにおいて示されている。
【図１０Ｂ】ｈＡへの非天然にコードされるアミノ酸の組み込みが、ウエスタンブロットにおいて示されている。
【図１０Ｃ】ｈＡへの非天然にコードされるアミノ酸の組み込みが、ウエスタンブロットにおいて示されている。
【図１１】ＰＥＧ付加されたｈＡの産生が、ウエスタンブロットによって示されている。
【図１２】パネルＡおよびパネルＢには、非天然にコードされるアミノ酸を包含するｈＡおよび野性体ｈＡに関する、ペプチドマッピングの結果が示されている。
【図１３Ａ】非天然にコードされるアミノ酸（ｐＡＦ、またはパラアセチルフェニルアラニン）を包含するｈＡの質量分析の結果が示されている。
【図１３Ｂ】非天然にコードされるアミノ酸ｐＡＦ（パラアセチルフェニルアラニン）を含むｈＡに関する予想されるイオン質量が示されている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【配列表】
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