(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において微生物障害を、全身的に処置するための組成物であって、該組成物は、有効量のＩＬ−２２を含むポリペプチドを含み、該微生物障害が炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である、組成物。
【請求項２】
微生物障害に応答して、腸上皮バリアの完全性を保護することによって、腸上皮細胞による創傷治癒を全身的に誘発するための組成物であって、該組成物は、有効量のＩＬ−２２を含むポリペプチドを含み、該微生物障害が炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である、組成物。
【請求項３】
前記微生物障害がクローン病または潰瘍性大腸炎（ＵＣ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ポリペプチドがＩＬ−２２−Ｆｃ融合ポリペプチドである、請求項１または３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＩＬ−２２のアミノ酸配列が配列番号８として示される配列を含む、請求項１、３、および、４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＩＬ−２２をコードする核酸配列が配列番号７として示される配列である、請求項１、および、３〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記腸上皮の完全性が、前記微生物病原体による全身への蔓延を防止する、請求項２に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が静脈内投与のためのものである、請求項１、および、３〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＩＬ−２２ポリペプチドが、その関連シグナルペプチドを欠失している、請求項１、および、３〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
微生物障害を全身的に処置するためのキットであって、該キットは、微生物障害の処置のための医薬組成物を含み、該医薬組成物が有効量のＩＬ−２２を含むポリペプチドを含み、該微生物障害が炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である、キット。
【請求項１１】
微生物障害に応答して、腸上皮細胞による創傷治癒を全身的に誘発するためのキットであって、該キットは、創傷治癒を誘発するための医薬組成物を含み、該医薬組成物が、有効量のＩＬ−２２を含むポリペプチドを含み、該微生物障害が炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である、キット。
【請求項１２】
前記微生物障害がクローン病または潰瘍性大腸炎（ＵＣ）である、請求項１０に記載のキット。
【請求項１３】
前記ポリペプチドがＩＬ−２２−Ｆｃ融合ポリペプチドである、請求項１０に記載のキット。
【請求項１４】
前記ＩＬ−２２のアミノ酸配列が配列番号８として示される配列を含む、請求項１０に記載のキット。
【請求項１５】
前記ＩＬ−２２をコードする核酸配列が配列番号７として示される配列である、請求項１０に記載のキット。
【請求項１６】
前記腸上皮の完全性が、前記微生物病原体による全身への蔓延を防止する、請求項１１に記載のキット。
【請求項１７】
前記医薬組成物が静脈内投与のためのものである、請求項１０に記載のキット。
【請求項１８】
前記ＩＬ−２２ポリペプチドが、その関連シグナルペプチドを欠失している、請求項１０に記載のキット。
【請求項１９】
前記微生物障害がクローン病または潰瘍性大腸炎（ＵＣ）である、請求項２に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ポリペプチドがＩＬ−２２−Ｆｃ融合ポリペプチドである、請求項２または１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ＩＬ−２２のアミノ酸配列が配列番号８として示される配列を含む、請求項２、１９、および、２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ＩＬ−２２をコードする核酸配列が配列番号７として示される配列である、請求項２、および、１９〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記組成物が静脈内投与のためのものである、請求項２、および、１９〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ＩＬ−２２ポリペプチドが、その関連シグナルペプチドを欠失している、請求項２、および、１９〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記微生物障害がクローン病または潰瘍性大腸炎（ＵＣ）である、請求項１１に記載のキット。
【請求項２６】
前記ポリペプチドがＩＬ−２２−Ｆｃ融合ポリペプチドである、請求項１１に記載のキット。
【請求項２７】
前記ＩＬ−２２のアミノ酸配列が配列番号８として示される配列を含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項２８】
前記ＩＬ−２２をコードする核酸配列が配列番号７として示される配列である、請求項１１に記載のキット。
【請求項２９】
前記医薬組成物が静脈内投与のためのものである、請求項１１に記載のキット。
【請求項３０】
前記ＩＬ−２２ポリペプチドが、その関連シグナルペプチドを欠失している、請求項１１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、宿主免疫応答の調節による微生物障害の処置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
微生物病原体による感染症は、世界中で死亡の主な原因となっており、地球規模で健康に対して重大な脅威をもたらし続けている（ＷＨＯ，Ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｐｏｒｔ（２００４））。たとえば、腸出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）および腸病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）などの腸管接着性微絨毛消滅性（attaching and effacing）（Ａ／Ｅ）細菌性病原体は、特に発展途上国の幼児および小児の間で下痢、罹患および死亡を引き起こす細菌に含まれる（２）。昨年米国では、ＥＨＥＣ株の１つである大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７によって、多数の人々が病院に収容され、３名が死亡した（ＭＭＷＲ  Ｍｏｒｂ  Ｍｏｒｔａｌ  Ｗｋｌｙ  Ｒｅｐ  ５５，１０４５（２００６年９月２６日））。先進工業国における下痢後の溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）の全症例の９０％超も大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７感染によって引き起こされたとも考えられている（Ｒ．Ｌ．Ｓｉｅｇｌｅｒ，Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ  ４２，１５０５（１９９５年１２月））。大腸菌Ｏ５５：Ｈ７などの他のＥＰＥＣ株も、世界中の幼児に腸疾病を引き起こしている（Ｔ．Ｓ．Ｗｈｉｔｔａｍら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６１，１６１９（１９９３年５月））。Ａ／Ｅ病原体の感染を宿主が制御する方法に関する我々の知識の多くは、マウスの天然病原菌であるＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｒｏｄｅｎｔｉｕｍによる感染の研究から得られる（Ｌ．Ｅｃｋｍａｎｎ，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １０７２，２８（２００６年８月１日））。ヒトにおけるＥＨＥＣまたはＥＨＰＣの病因と同様に、マウス結腸上皮細胞にＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍが密接に付着することによって、腸管接着性微絨毛消滅性（Ａ／Ｅ）病変と呼ばれる刷子縁微絨毛の消滅、および結腸過形成が生じる（Ｄ．Ｂ．Ｓｃｈａｕｅｒ，Ｓ．Ｆａｌｋｏｗ，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６１，２４８６（１９９３年６月））。
【０００３】
腸上皮細胞および免疫細胞はどちらも、Ａ／Ｅ病原体に対する宿主防御で重要な役割を果たす。腸上皮細胞の密着結合は、細菌が腸管腔を離れるのを妨げる第１の障壁となる（Ｔ．Ｔ．ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｇ．Ｍｏｎｔｅｌｅｏｎｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０７，１９２０（２００５年３月２５日））。さらに、上皮細胞は胃腸（ＧＩ）管内で病原体を制御する抗微生物ペプチドを分泌する（Ａ．Ｔａｋａｈａｓｈｉら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５０８，４８４（２００１年１１月２３日））。Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染中の免疫不全マウス系統を用いた研究により、ＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、および抗Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ特異的抗体応答が、感染を含有および根絶するための適応免疫の不可欠なすべての構成要素であることが証明された（Ｌ．Ｂｒｙ，Ｍ．Ｂ．Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２，４３３（２００４年１月１日））。感染の間にリンパ球によって産生された多くのサイトカインは、上皮細胞の生得免疫応答を上昇させることができる。しかし、Ａ／Ｅ病原体感染の間のこれらのサイトカインの特異的機能は、不明なままである。
【０００４】
ＩＬ−１０ファミリーサイトカインのＩＬ−２２は、リンパ球、特にＴｈ１７細胞によって産生される（Ｙ．Ｚｈｅｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ４４５，６４８（２００７年２月８日））。Ｔｈ１７細胞は、ＩＬ−１７の産生も行う最近発見されたＣＤ４＋Ｔヘルパーサブセットに属する。ＩＬ−１７は、細胞外細菌感染の制御に重要な機能を有する（Ｋ．Ｉ．Ｈａｐｐｅｌら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０２，７６１（２００５年９月１９日））。しかし宿主防御でのＩＬ−２２の役割は、なおほとんど知られていない。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連タンパク質は当分野では、宿主防御からアポトーシス対する免疫制御に及ぶ多様な活性を有する、タンパク質の大規模なファミリーとして認識されている。ＴＮＦは最初に、インビトロでは複数の形質転換株化細胞にとって細胞毒性であり、インビボではある腫瘍の壊死を引き起こす血清由来因子として同定された。スーパーファミリーの同様の因子は同定されて、リンホトキシン（「ＬＴ」）と呼ばれた。１９８０年代初期にＴＮＦおよびＬＴとの間に類似性が観察されたために、ＴＮＦおよびＬＴをそれぞれＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βと呼ぶことが提案された。それゆえ科学文献は、両方の命名法に言及している。本出願で使用するように、「ＴＮＦ」という用語は、ＴＮＦ−αを指す。後の研究により、ＬＴαおよびＬＴβと呼ばれる２つの形のリンホトキシンが明らかになった。特許文献１は、ＴＬ−５と呼ばれる、構造および生物学的類似性に基づくＴＮＦリガンドスーパーファミリーの別のポリペプチドメンバーについて記載している。タンパク質のＴＮＦファミリーのメンバーは、細胞間接触によって局部的に作用する膜結合形で、または分泌タンパク質として存在する。ＴＮＦ関連受容体のファミリーは、これらのタンパク質と反応して、細胞死、すなわちアポトーシス、細胞増殖、組織分化および炎症誘発応答を含む各種のシグナル伝達経路を誘発する。ＴＮＦ−αは単独で、炎症性疾患、自己免疫疾患、ウイルス性、細菌性、および寄生性感染症、悪性腫瘍、ならびに／または神経変性疾患に関与しており、ＲＡおよびクローン病などの疾患での特異的生物療法の有用な標的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／０１２９６１４号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は一般に、宿主免疫応答の調節による微生物障害の処置のための組成物および方法を提供する。たとえば、宿主における抗微生物免疫応答は、抗微生物免疫応答を媒介する１つ以上の抗微生物ポリペプチド（ＡＭＰ）の活性を上昇または低下させることによって向上させる、または抑制することができる。
【０００７】
さらに詳細には、本発明は、ＡＭＰ、その調節因子、および微生物障害の処置にそのような組成物を使用する方法を提供する。このような微生物障害は、これに限定されるわけではないが、感染性疾患、たとえばＥＨＥＣおよびＥＰＥＣ誘発下痢、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）ならびに、さらに詳細には潰瘍性大腸炎（ＵＣ）およびクローン病（ＣＤ）を含む。
【０００８】
本発明のＡＭＰは、抗微生物免疫応答を媒介するポリペプチドであり、これに限定されるわけではないが、ＬＴ、ＩＬ−６、ＩＬ−１８、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３（たとえばＩＬ−２３ｐ１９またはＩＬ−２３ｐ４０を含む）、およびＲｅｇスーパーファミリーの遺伝子によってコードされたＲｅｇまたはＲｅｇ関連タンパク質を含む。Ｒｅｇスーパーファミリーは、ヒト、ラット、およびマウスによるＲｅｇおよびＲｅｇ関連遺伝子を含み、４つのサブクラスであるタイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶに分類される。たとえばタイプＩは、ヒトＲＥＧ  Ｉα、ヒトＲＥＧ  Ｉβ、ラットＲｅｇ  Ｉ、およびマウスＲｅｇ  Ｉを含む；タイプＩＩは、Ｒｅｇ  ＩＩを含む；タイプＩＩＩは、ヒトＲＥＧ  ＩＩＩ、ヒトＨＩＰ／ＰＡＰ（肝細胞癌−小腸−膵臓で発現された遺伝子／膵炎関連タンパク質をコードする遺伝子）、ラットＰＡＰ／Ｐｅｐｔｉｄｅ２３、ラットＲｅｇ  ＩＩＩ／ＰＡＰ  ＩＩ、ラットＰＡＰ  ＩＩＩ、マウスＲｅｇ  ＩＩＩα、Ｒｅｇ  ＩＩＩβ、Ｒｅｇ  ＩＩＩγ、マウスＲｅｇ  ＩＩＩδ、およびハムスターＩＮＧＡＰ（小島新生関連タンパク質）を含む。タイプＩＶは、ヒトＲＥＧ  ＩＶを含有する。一態様において、ＲＥＧタンパク質は、これに限定されるわけではないが、ＲＥＧ  Ｉα、ＲＥＧ  Ｉβ、ＨＩＰ／ＰＡＰ、ＲＥＧ  ＩＩＩ、ＲＥＧ  ＩＶ、およびＲｅｇ関連配列（ＲＳ）を含むヒトＲＥＧ遺伝子ファミリーのメンバーによってコードされる。
【０００９】
いくつかの態様において、本発明のＡＭＰのアミノ酸配列は、次の群：配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、および配列番号５６から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１０】
他の態様において、本発明のＡＭＰをコードする核酸配列は、次の群：配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、および配列番号５５から選択される核酸配列を含む。
【００１１】
本発明のＡＭＰの活性は、別のＡＭＰまたは同じＡＭＰの活性と比較して、上昇もしくは低下させる、および／または異なって制御することができる。本発明のＡＭＰの活性の例は、これに限定されるわけではないが、ＡＭＰ発現、結合パートナーへの結合、シグナル伝達、抗微生物活性、またはその他の生物もしくは免疫活性を含む。
【００１２】
一態様において、本発明の１つ以上のＡＭＰの活性の上昇は、対象における抗微生物免疫応答の向上を生じる。
【００１３】
一態様において、本発明のＡＭＰは、これに限定されるわけではないが、ＩＬ−２２と直接または間接的に相互作用するポリペプチド、たとえば微生物病原体（たとえば細菌またはウイルス）による感染に対する宿主抵抗性を媒介するＩＬ−２２シグナル伝達経路の上流または下流であるポリペプチドを含む。このようなＡＭＰの例は、これに限定されるわけではないが、ＬＴ、ＩＬ−６、ＩＬ−１８、およびＩＬ−２３（たとえばＩＬ−２３ｐ１９またはＩＬ−２３ｐ４０を含む）を含む。
【００１４】
本発明の調節因子は、これに限定されるわけではないが、ＡＭＰの活性を直接または間接的に調節するポリペプチドおよび核酸分子（たとえばＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子）を含む。このような調節の例は、これに限定されるわけではないが、本発明のＡＭＰの活性の上昇、低下、誘導または活性化、抑制、または制御（たとえば上方または下方制御）を含む。
【００１５】
一態様において、調節因子は、ＩＬ−２２結合タンパク質（ＢＰ）活性を低下または抑制することによってＩＬ−２２活性を間接的に調節して、それによりＩＬ−２２活性を上昇させる。詳細な態様において、調節因子は、ＩＬ−２２  ＢＰのＩＬ−２２に対する結合を低下または抑制して、それによりＩＬ−２２活性を上昇させる。
【００１６】
いくつかの態様において、調節因子は、ポリペプチド、たとえばＡＭＰと結合するか、またはそうでなければＡＭＰと相互作用して、ＡＭＰの活性を上昇、誘導または制御するポリペプチドである。一態様において、調節因子は、ＡＭＰの活性を調節する融合ポリペプチドである。
【００１７】
一態様において、調節因子は、ＡＭＰに結合する抗体である。詳細な態様において、抗体はモノクローナル抗体である。別の態様において、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、または（Ｆａｂ’）２断片から選択される抗体断片である。別の態様において、抗体は融合ポリペプチド（たとえばＦｃ融合ポリペプチド）である。別の態様において、抗体はキメラ抗体である。詳細な態様において、抗体はヒト化である。別の態様において、抗体はヒト抗体である。別の態様において、抗体は、ヒト、非ヒト霊長類、または他の哺乳動物（たとえばブタ、ヒツジ、ウサギ、マーモット、ラット、またはマウス）から選択される抗体と同じエピトープに結合する。詳細な態様において、抗体はＡＭＰアゴニストである。
【００１８】
別の詳細な態様において、調節因子は、組換えＡＭＰまたはＡＭＰをコードする核酸分子（たとえばＤＮＡまたはＲＮＡ分子）である。
【００１９】
本発明は、抗微生物免疫応答を調節することによって微生物障害を処置する方法をさらに提供する。一態様において、本発明は、ＡＭＰまたはＡＭＰの調節因子を含む有効量の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、対象における微生物障害を処置する方法を提供し、ＡＭＰは：ＬＴ、ＩＬ−６、ＩＬ−１８、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＲＥＧ  Ｉα、ＲＥＧ  Ｉβ、ＨＩＰ／ＰＡＰ、ＲＥＧ  ＩＩＩ、ＲＥＧ  ＩＶおよびＲｅｇ関連配列（ＲＳ）からなる群より選択される。一態様において、障害は感染性疾患、たとえばＥＨＥＣまたはＥＰＥＣ誘発下痢、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または、さらに詳細には潰瘍性大腸炎（ＵＣ）もしくはクローン病（ＣＤ）である。
【００２０】
詳細な態様において、本発明は、ＡＭＰ媒介シグナル伝達経路および／またはＴｈＩＬ−１７細胞機能を刺激または抑制することによって抗微生物免疫応答を調節する方法を提供する。このような方法は、微生物障害の処置に有用である。たとえば、一態様において、本発明は、ＡＭＰ媒介シグナル伝達経路、たとえば、ならびにＩＬ−２２および／またはＩＬ−２３媒介シグナル伝達経路を刺激することによって抗微生物免疫応答を向上させる方法を提供する。別の態様において、本発明は、サイトカイン媒介シグナル伝達経路を刺激または抑制することによって抗微生物免疫応答を調節する方法を提供する。たとえば、一態様において、本発明は、サイトカイン媒介シグナル伝達経路、たとえばＩＬ−２２および／またはＩＬ−２３媒介シグナル伝達経路を刺激することによって抗微生物免疫応答を向上させる方法を提供する。さらに、本発明は、ＴｈＩＬ−１７細胞機能を刺激または抑制することによって抗微生物免疫応答を調節する方法を提供する。
【００２１】
一態様において、本発明は、ＡＭＰアゴニストを生物系に供給するステップを含む、生物系においてＡＭＰ媒介シグナル伝達経路を刺激する方法を提供する。このような生物系の例は、これに限定されるわけではないが、インビトロ細胞培養系またはインビボの生物における哺乳動物細胞を含む。別の態様において、本発明は、ＡＭＰアンタゴニストを生物系に供給するステップを含む、生物系においてＡＭＰ媒介シグナル伝達経路を抑制する方法を提供する。
【００２２】
詳細な態様において、本発明は、ＩＬ−２２またはＩＬ−２２アゴニストを生物系に供給するステップを含む、生物系においてＩＬ−２３および／またはＩＬ−２２媒介シグナル伝達経路を刺激することによって生物系における抗微生物免疫応答を向上させる方法を提供する。一態様において、ＩＬ−２２アゴニストはＩＬ−２２である。別の態様において、ＩＬ−２２アゴニストは、ＩＬ−２２に結合する抗体である。
別の態様において、ＩＬ−２２アンタゴニストを生物系に供給するステップを含む、生物系においてＩＬ−２３媒介シグナル伝達経路を抑制する方法を提供する。一態様において、ＩＬ−２２のアンタゴニストは抗体、たとえば中和抗ＩＬ−２２抗体および／または中和抗ＩＬ−２２Ｒ抗体である。
【００２３】
別の態様において、本発明は、ＴｈＩＬ−１７細胞を、ＩＬ−２３媒介シグナル伝達経路（たとえばＩＬ−２３、ＩＬ−６、またはＩＬ−２２）を媒介するＡＭＰのアゴニストに曝露するステップを含む、ＴｈＩＬ−１７細胞機能を刺激する方法を提供する。このような方法は、微生物障害を処置するのに有用である。一態様において、ＩＬ−２２アゴニストはＩＬ−２２である。別の態様において、ＩＬ−２２アゴニストは、ＩＬ−２２に結合する抗体である。
【００２４】
別の態様において、ＴｈＩＬ−１７細胞を、ＩＬ−２３媒介シグナル伝達経路（たとえばＩＬ−２３、ＩＬ−６、またはＩＬ−２２）を媒介するＡＭＰのアンタゴニストに曝露するステップを含む、ＴｈＩＬ−１７細胞機能を刺激する方法が提供される。一態様において、アンタゴニストはＩＬ−２２抗体、たとえば中和抗ＩＬ−２２抗体である。
【００２５】
例示的なＴｈＩＬ−１７細胞機能は、これに限定されるわけではないが、細胞媒介免疫の刺激（遅延型過敏性）；自然免疫細胞、たとえば骨髄性細胞（たとえば単球および好中球）の炎症部位への補充；および炎症性細胞浸潤の組織中への刺激を含む。一態様において、ＴｈＩＬ−１７細胞機能は、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−２２によって媒介される。
【００２６】
さらなる態様において、本発明は、ＡＭＰまたはＡＭＰの調節因子を含む有効量の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、対象における微生物病原体（たとえば細菌またはウイルス）による感染症を処置する方法を提供し、ＡＭＰは：ＬＴ、ＩＬ−６、ＩＬ−１８、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＲＥＧ  Ｉα、ＲＥＧ  Ｉβ、ＨＩＰ／ＰＡＰ、ＲＥＧ  ＩＩＩ、ＲＥＧ  ＩＶおよびＲｅｇ関連配列（ＲＳ）からなる群より選択される。
【００２７】
別の態様において、本発明は、対象の細胞にＡＭＰまたはＡＭＰの調節因子をコードする核酸分子（たとえばＤＮＡまたはＲＮＡ分子）を接触させるステップを含む、対象における微生物障害を処置する方法を提供し、ＡＭＰは：ＬＴ、ＩＬ−６、ＩＬ−１８、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＲＥＧ  Ｉα、ＲＥＧ  Ｉβ、ＨＩＰ／ＰＡＰ、ＲＥＧ  ＩＩＩ、ＲＥＧ  ＩＶおよびＲｅｇ関連配列（ＲＳ）からなる群より選択される。一態様において、障害は感染性疾患、たとえばＥＨＥＣまたはＥＰＥＣ誘発下痢、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または、さらに詳細には潰瘍性大腸炎（ＵＣ）もしくはクローン病（ＣＤ）である。
【００２８】
別の態様において、本発明は、細胞にＡＭＰまたはＡＭＰの調節因子をコードする核酸分子（たとえばＤＮＡまたはＲＮＡ分子）を接触させるステップを含む、微生物病原体（たとえば細菌またはウイルス）に感染した対象の細胞におけるＡＭＰの活性を調節する方法を提供し、ＡＭＰは：ＬＴ、ＩＬ−６、ＩＬ−１８、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＲＥＧ  Ｉα、ＲＥＧ  Ｉβ、ＨＩＰ／ＰＡＰ、ＲＥＧ  ＩＩＩ（たとえばＲＥＧ  ＩＩＩβまたはＲＥＧ  ＩＩＩγ）、ＲＥＧ  ＩＶおよびＲｅｇ関連配列（ＲＳ）からなる群より選択される。
【００２９】
微生物病原体の例は、これに限定されるわけではないが、細菌またはウイルスを含む。一態様において、微生物病原体は細菌、たとえばグラム陰性またはグラム陽性細菌である。詳細な態様において、細菌はグラム陰性細菌である。別の態様において、細菌は腸管接着性または微絨毛消滅性（Ａ／Ｅ）細菌、およびさらに詳細には、腸出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）または腸病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）である。一態様において、細菌は腸出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７または大腸菌Ｏ５５：Ｈ７である。
【００３０】
別の態様において、本発明は、本発明のＡＭＰをコードするポリヌクレオチド、またはその調節因子を提供する。別の態様において、本発明はポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。別の態様において、本発明はベクターを含む宿主細胞を提供する。一態様において、宿主細胞は真核細胞である。別の態様において、宿主細胞はＣＨＯ細胞、酵母細胞、または細菌細胞（たとえば大腸菌）である。
【００３１】
一態様において、本発明は、抗体をコードするポリヌクレオチドの発現に好適な条件下で宿主細胞を培養するステップと、抗体を単離するステップとを含む、本発明のＡＭＰに結合する抗体を作製する方法を提供する。詳細な態様において、本発明は、本発明のＡＭＰのアゴニストである抗体を作製する方法を提供する。
【００３２】
一態様において、本発明は、抗体のＡＭＰへの結合に許容される条件下で生体サンプルをＡＭＰに対する抗体と接触させるステップと、抗体とＡＭＰとの間に複合体が形成されるか否かを検出するステップとを含む、生体サンプル中のＡＭＰの存在を検出する方法を提供する。
【００３３】
別の態様において、本発明は、本発明の１つ以上のＡＭＰおよび／またはその調節因子を含むキットを提供する。別の態様において、本発明は、本発明のＡＭＰまたはその調節因子をそれぞれ含む１つ以上の医薬組成物を含むキットを提供する。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）  対象における微生物病原体による感染症を、この対象における抗微生物免疫応答を調節することによって処置する方法であって、この対象に有効量の抗微生物ポリペプチド（ＡＭＰ）を投与するステップを含み、このＡＭＰがＩＬ−２２である、方法。
（項目２）  対象における微生物病原体による感染症を、この対象における抗微生物免疫応答を調節することによって処置する方法であって、この対象に、有効量の抗微生物ポリペプチド（ＡＭＰ）またはその調節因子を投与するステップを含み、このＡＭＰが、ＩＬ−６、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＲＥＧ  Ｉα、ＲＥＧ  Ｉβ、ＨＩＰ／ＰＡＰ、ＲＥＧ  ＩＩＩ、ＲＥＧ  ＩＶ、Ｒｅｇ関連配列（ＲＳ）およびＬＴからなる群より選択される、方法。
（項目３）  微生物病原体に感染した対象の細胞中の抗微生物ポリペプチド（ＡＭＰ）の活性を調節する方法であって、この細胞を、単離ＡＭＰと接触させるステップを含み、このＡＭＰがＩＬ−２２である、方法。
（項目４）  微生物病原体に感染した対象の細胞中の抗微生物ポリペプチド（ＡＭＰ）の活性を調節する方法であって、この細胞を、単離ＡＭＰと接触させるステップを含み、このＡＭＰが、ＩＬ−６、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＲＥＧ  Ｉα、ＲＥＧ  Ｉβ、ＨＩＰ／ＰＡＰ、ＲＥＧ  ＩＩＩ、ＲＥＧ  ＩＶ、Ｒｅｇ関連配列（ＲＳ）およびＬＴからなる群より選択される、方法。
（項目５）  上記感染症が微生物障害である、項目１に記載の方法。
（項目６）  上記微生物障害が炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である、項目５に記載の方法。
（項目７）  上記微生物障害がクローン病または潰瘍性大腸炎（ＵＣ）である、項目５に記載の方法。
（項目８）  上記微生物病原体が細菌である、項目１に記載の方法。
（項目９）  上記細菌がグラム陰性である、項目８に記載の方法。
（項目１０）  上記細菌がグラム陽性である、項目８に記載の方法。
（項目１１）  上記細菌が腸管接着性または微絨毛消滅性（Ａ／Ｅ）細菌である、項目８に記載の方法。
（項目１２）  上記腸管接着性または微絨毛消滅性（Ａ／Ｅ）細菌が腸出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）または腸病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）  上記腸病原性大腸菌（ＥＨＥＣ）が大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７または大腸菌Ｏ５５：Ｈ７である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）  上記抗微生物ポリペプチド（ＡＭＰ）がＲｅｇ  ＩＩＩβおよびＲｅｇ  ＩＩＩγである、項目２に記載の方法。
（項目１５）  上記微生物病原体がウイルスである、項目１に記載の方法。
（項目１６）  対象における微生物病原体による感染症を、この対象における抗微生物免疫応答を調節することによって処置する方法であって、この対象に有効量の抗微生物ポリペプチド（ＡＭＰ）調節因子を投与するステップを含み、このＡＭＰ調節因子がＩＬ−２２アゴニストである、方法。
（項目１７）  上記アゴニストが上記ＩＬ−２２の発現および／または活性を上昇させる、項目１６に記載の方法。
（項目１８）  上記アゴニストがポリペプチドまたは核酸分子である、項目１６に記載の方法。
（項目１９）  上記アゴニストが融合ポリペプチドである、項目１６に記載の方法。
（項目２０）  上記アゴニストがＦｃ融合ポリペプチドである、項目１６に記載の方法。
（項目２１）  上記アゴニストが抗体またはその生物活性断片である、項目１６に記載の方法。
（項目２２）  上記アゴニストがモノクローナル抗体である、項目１６に記載の方法。
（項目２３）  上記アゴニストがヒト化抗体である、項目１６に記載の方法。
（項目２４）  上記ＩＬ−２２のアミノ酸配列が配列番号８として示される配列を含む、項目１または３に記載の方法。
（項目２５）  上記ＡＭＰのアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号５０、および配列番号５２から成るアミノ酸配列の群より選択される配列を含む、項目２または４に記載の方法。
（項目２６）  上記ＩＬ−２２をコードする核酸配列が配列番号７として示される配列である、項目１または３に記載の方法。
（項目２７）  上記ＡＭＰをコードする核酸配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号４９、および配列番号５１から成る核酸配列の群より選択される配列を含む、項目１または３に記載の方法。
（項目２８）  微生物障害の処置のための医薬組成物を含むキットであって、この医薬組成物が抗微生物ポリペプチド（ＡＭＰ）を含み、このＡＭＰがＩＬ−２２である、キット。
（項目２９）  微生物障害の処置のための１つ以上の医薬組成物を含むキットであって、この医薬組成物がそれぞれ異なる抗微生物ポリペプチド（ＡＭＰ）またはその調節因子を含み、このＡＭＰが、ＩＬ−６、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＲＥＧ  Ｉα、ＲＥＧ  Ｉβ、ＨＩＰ／ＰＡＰ、ＲＥＧ  ＩＩＩ、ＲＥＧ  ＩＶ、Ｒｅｇ関連配列（ＲＳ）、およびＬＴからなる群より選択される、キット。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染に対する宿主防御を表すデータを示す。図１（Ａ）は、非感染野生型マウス胃腸管内でのＩＬ−２２の受容体サブユニットに対するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す；図１（Ｂ〜Ｆ）は、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染時の野生型マウス結腸での各種のサイトカイン発現に対するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を示す；図１（Ｇ）は、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染後のＣ５７Ｂｌ／６（ｎ＝５）、ＩＬ−２３ｐ４０−／−（ｎ＝５）、およびＩＬ−６−／−（ｎ＝５）マウスの生存を示す；および図１（Ｈ）は、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染時のＣ５７Ｂｌ／６、ＩＬ−２３ｐ４０−／−、およびＩＬ−６−／−マウス結腸でのＩＬ−２２およびＩＬ−１７発現に対する経時的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染では、マウスに細菌２×１０９ＣＦＵを経口接種した。上のデータすべてが２つの独立した実験を表す。
【図２】ＩＬ−２２欠失によりマウスがＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染を被りやすくなることを表すデータを示す。６〜７週齢ＩＬ−２２−／−（図２（Ａ〜Ｃ））、ＩＬ−１７ＲＣ−／−（Ｄ）、ＩＬ−２０Ｒβ−／−マウス（図２（Ｆ））または野生型マウス（図２（Ａ〜Ｃ、Ｅ））にＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ  ２×１０９ＣＦＵを経口接種して、表示した時点に秤量した。ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を使用する、接種８日後のＩＬ−２２−／−および野生型マウスからの結腸の組織学的分析（図２（ＢおよびＣ））。矢印は、粘膜下炎症（図２（Ｂ））、および粘液腺への細菌侵入（図２（Ｃ））を示す。代表的なデータを示す（図２（Ｂ）では棒＝１００μｍおよび図２（Ｃ）では棒＝２５μｍ）。野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに抗ＩＬ−２２ｍＡｂまたはアイソタイプ対照ＩｇＧ１ｍＡｂ  １５０μｇを、接種後第０日または第８日のどちらかから開始して１日おきに腹腔内投与した（図２（Ｅ））。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。すべてのデータは２回の独立した実験を代表している。
【図３】Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染中のマウスにおけるＩＬ−２２欠失の効果を表すデータを示す。Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（図３（Ａ、Ｂ、およびＦ））、ＩＬ−２２−／−および野生型マウス（図３（Ｃ〜Ｅ、およびＧ））にＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ  ２×１０９ＣＦＵを経口接種した。マウスには、抗ＩＬ−２２ｍＡｂまたはアイソタイプ対照ＩｇＧ１ｍＡｂ  １５０μｇも、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ接種と同じ日から開始して１日おきに腹腔内投与した（図３（ＡおよびＢ））。第１０日に結腸を写真撮影して、個々の結腸の長さを測定した（図３（Ａ））。結腸の組織学的分析は、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を使用して実施した（図３（Ｂ））。感染ＩＬ−２２−／−および野生型マウスからの結腸および肝臓（第８日）の組織学的分析は、Ｈ＆Ｅ染色を使用して実施した（図３（ＣおよびＥ）。図３（Ｃ）の矢印は、結腸経壁炎症および潰瘍形成を示す。図３（Ｅ）は、ＩＬ−２２−／−マウスにおける肝臓敗血性微小膿瘍を示す。代表的なデータを、上パネルは棒＝５００μｍ、下パネルは棒＝１００μｍである図３（Ｃ）に示す。図３（Ｅ）において、棒＝２５μｍである。図３（Ｄ）は、結腸、肝臓、脾臓、および腸間膜リンパ節におけるＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍのｌｏｇ１０ＣＦＵを示す。図３（Ｆ〜Ｇ）は、ＥＬＩＳＡによる血清抗Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ  ＩｇＧレベルを示す。＊ｐ＜０．０５。上のデータすべてが２つの独立した実験を表す。
【図４】Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染時にＩＬ−２２が抗微生物Ｒｅｇ  ＩＩＩファミリータンパク質発現を誘導することを表すデータを示す。Ｃ５７Ｂｌ／６マウス結腸のインビトロ培養は、ＩＬ−２２  １０μｇによって２４時間処理して、ＲＮＡを単離し、マイクロアレイ分析（図４（Ａ））およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析（図４（Ｂ））に使用した。図４（Ｃ）において、ＩＬ−２２−／−マウスおよび野生型同腹子にＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ  ２×１０９ＣＦＵを経口接種して、表示した時点に収集した個々のマウス結腸から単離したＲＮＡに対してリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した。すべてのデータは２回の独立した実験を代表している。
【図５】マウスＩＬ−１７ＲＣ遺伝子の標的破壊を表すデータを示す。図５（Ａ）は、ＩＬ−１７ＲＣノックアウトマウスの産生方法を示す。ＩＬ−１７ＲＣコード配列を含むエキソン１−５（白ボックス）は、ネオマイシン抵抗性カセットによって置換された。図５（Ｂ）は、表示されたプライマセット（Ｐ１、Ｐ２およびＰ３）を使用して野生型（ＷＴ）およびノックアウト（ＫＯ）マウスによる子孫の遺伝子型同定を示す。ＷＴおよびＫＯマウスからの尾端線維芽細胞を産生して、各種濃度のＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆによってインビトロで２４時間刺激し、ＩＬ−６  ＥＬＩＳＡのために培養物上清を収集した（図５（Ｃ））。
【図６】Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染時の野生型マウスにおけるＩＬ−１９、ＩＬ−２０およびＩＬ−２４に対するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析のデータを経時的に示す。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ  ２×１０９ＣＦＵを経口接種した。結腸を表示された時点に収集して、単離ＲＮＡをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析に使用した。
【図７】胃腸管におけるＩＬ−２０ＲαおよびＩＬ−２０Ｒβ発現を表すデータを示す。非感染野生型マウス胃腸管におけるＩＬ−１９、ＩＬ−２０およびＩＬ−２４の受容体サブユニットに対するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析。
【図８】マウスＩＬ−２０Ｒβ遺伝子の標的破壊を表すデータを示す。図８（Ａ）は、ＩＬ−２０Ｒβノックアウトマウスの産生方法を示す。エキソン１（白ボックス）は、ネオマイシン抵抗性カセットによって置換された。図８（Ｂ）は、表示されたプライマセット（Ｐ１、Ｐ２およびＰ３）を使用して野生型（ＷＴ）、ヘテロ接合（ＨＥＴ）およびノックアウト（ＫＯ）マウスによる子孫の表現型同定を示す。図８（Ｃ）ＷＴおよびＫＯマウスの耳に、ＰＢＳ  ２０μｌ中の組換えＩＬ−２０  ５００ｎｇまたはＰＢＳ  ２０μｌのみを皮内注射した。２４時間後、ＲＮＡ単離のためにマウスの耳を収集した。単離したＲＮＡは、ＩＬ−２０シグナル伝達時に上方制御されることが公知の遺伝子についてのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析に使用した。
【図９】Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍを接種した抗ＩＬ−２２ｍＡｂ処置野生型マウスからのマウス結腸の組織学的分析のデータを示す。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ  ２×１０９ＣＦＵを経口接種した。マウスには、抗ＩＬ−２２ｍＡｂまたはアイソタイプ対照ＩｇＧ１ｍＡｂ  １５０μｇも、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ接種と同じ日から開始して１日おきに腹腔内投与した。第１０日に、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を使用して、結腸のルーチン組織学的分析を実施した。矢印は、経壁炎症を伴う粘膜潰瘍化を示す。代表的な画像を、上パネルは棒＝５００μｍ、下パネルは棒＝１００μｍで示す。
【図１０】Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染中のＩＬ−２２−／−マウスおよび野生型同腹子における血清Ｉｇレベルを表すデータを示す。ＩＬ−２２−／−および野生型同腹子マウスにＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ  ２×１０９ＣＦＵを経口接種した。表示した時点にマウスの血液を収集した。総血清ＩｇＭおよびＩｇＧ（図１０（Ａ））ならびに血清抗Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ  ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ３（図１０（Ｂ））のレベルをＥＬＩＳＡによって決定した。すべてのデータは２回の独立した実験を代表している。
【図１１】Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染後のＣ５７Ｂｌ／６、ＩＬ−２３ｐ１９−／−、およびＩＬ−６−／−マウス結腸におけるＩＬ−２２（図１１（Ａ））およびＩＬ−１７（図１１（Ｂ））発現のエクスビボ結腸培養ＥＬＩＳＡを表すデータを示す。Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染では、マウスに細菌２×１０９ＣＦＵを経口接種した。すべてのデータは少なくとも２回の独立した実験を代表している。
【図１２】単離マウスＩＥＬ、ＬＭＰＣおよび結腸上皮細胞に対するＩＬ−２２Ｒ発現のＦＡＣＳ分析（図１２（Ａ））、ならびに初代ヒト結腸上皮細胞に対するＩＬ−２２Ｒ発現のＦＡＣＳ分析（図１２（Ｂ））を示す。すべてのデータは少なくとも２回の独立した実験を代表している。
【図１３Ａ】樹状細胞によって産生されたＩＬ−２２がＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染に対する自然免疫応答に必須であることを表すデータを示す。図１３（Ａ）では、Ｒａｇ２−／−および野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスにＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ  ２×１０９ＣＦＵを経口接種した。図１３（ＢおよびＣ）では、マウスは、アイソタイプ対照ＩｇＧ１ｍＡｂまたは抗ＩＬ−２２ｍＡｂ  １５０μｇも細菌接種と同じ日から開始して１日おきに腹腔内投与して、表示した時点に秤量した。図１３（Ｂ）は、経時的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を示し、図（１３（Ｃ）は、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染後の野生型Ｂａｌｂ／ｃおよびＲａｇ２−／−マウスの結腸におけるＩＬ−２２およびＩＬ−１７発現のエクスビボ結腸培養ＥＬＩＳＡを示す。図１３（Ｄ）は、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染Ｒａｇ２−／−マウスによる第４日の結腸でのＩＬ−２２、ＣＤ１１ｃ、およびＤＡＰＩの免疫組織化学的染色を示す。倍率：４００×。図１３（Ｅ）は、ＥＬＩＳＡによって測定されたように、ＩＬ−２３が単離したマウスＣＤ１１ｃ＋ＤＣからＩＬ−２２をインビトロで直接誘導することを表すデータを示す。すべてのデータは２回の独立した実験を代表している。
【図１３Ｂ】樹状細胞によって産生されたＩＬ−２２がＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染に対する自然免疫応答に必須であることを表すデータを示す。図１３（Ａ）では、Ｒａｇ２−／−および野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスにＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ  ２×１０９ＣＦＵを経口接種した。図１３（ＢおよびＣ）では、マウスは、アイソタイプ対照ＩｇＧ１ｍＡｂまたは抗ＩＬ−２２ｍＡｂ  １５０μｇも細菌接種と同じ日から開始して１日おきに腹腔内投与して、表示した時点に秤量した。図１３（Ｂ）は、経時的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を示し、図（１３（Ｃ）は、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染後の野生型Ｂａｌｂ／ｃおよびＲａｇ２−／−マウスの結腸におけるＩＬ−２２およびＩＬ−１７発現のエクスビボ結腸培養ＥＬＩＳＡを示す。図１３（Ｄ）は、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染Ｒａｇ２−／−マウスによる第４日の結腸でのＩＬ−２２、ＣＤ１１ｃ、およびＤＡＰＩの免疫組織化学的染色を示す。倍率：４００×。図１３（Ｅ）は、ＥＬＩＳＡによって測定されたように、ＩＬ−２３が単離したマウスＣＤ１１ｃ＋ＤＣからＩＬ−２２をインビトロで直接誘導することを表すデータを示す。すべてのデータは２回の独立した実験を代表している。
【図１３Ｃ】樹状細胞によって産生されたＩＬ−２２がＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染に対する自然免疫応答に必須であることを表すデータを示す。図１３（Ａ）では、Ｒａｇ２−／−および野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスにＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ  ２×１０９ＣＦＵを経口接種した。図１３（ＢおよびＣ）では、マウスは、アイソタイプ対照ＩｇＧ１ｍＡｂまたは抗ＩＬ−２２ｍＡｂ  １５０μｇも細菌接種と同じ日から開始して１日おきに腹腔内投与して、表示した時点に秤量した。図１３（Ｂ）は、経時的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を示し、図（１３（Ｃ）は、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染後の野生型Ｂａｌｂ／ｃおよびＲａｇ２−／−マウスの結腸におけるＩＬ−２２およびＩＬ−１７発現のエクスビボ結腸培養ＥＬＩＳＡを示す。図１３（Ｄ）は、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染Ｒａｇ２−／−マウスによる第４日の結腸でのＩＬ−２２、ＣＤ１１ｃ、およびＤＡＰＩの免疫組織化学的染色を示す。倍率：４００×。図１３（Ｅ）は、ＥＬＩＳＡによって測定されたように、ＩＬ−２３が単離したマウスＣＤ１１ｃ＋ＤＣからＩＬ−２２をインビトロで直接誘導することを表すデータを示す。すべてのデータは２回の独立した実験を代表している。
【図１３Ｄ】樹状細胞によって産生されたＩＬ−２２がＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染に対する自然免疫応答に必須であることを表すデータを示す。図１３（Ａ）では、Ｒａｇ２−／−および野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスにＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ  ２×１０９ＣＦＵを経口接種した。図１３（ＢおよびＣ）では、マウスは、アイソタイプ対照ＩｇＧ１ｍＡｂまたは抗ＩＬ−２２ｍＡｂ  １５０μｇも細菌接種と同じ日から開始して１日おきに腹腔内投与して、表示した時点に秤量した。図１３（Ｂ）は、経時的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を示し、図（１３（Ｃ）は、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染後の野生型Ｂａｌｂ／ｃおよびＲａｇ２−／−マウスの結腸におけるＩＬ−２２およびＩＬ−１７発現のエクスビボ結腸培養ＥＬＩＳＡを示す。図１３（Ｄ）は、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染Ｒａｇ２−／−マウスによる第４日の結腸でのＩＬ−２２、ＣＤ１１ｃ、およびＤＡＰＩの免疫組織化学的染色を示す。倍率：４００×。図１３（Ｅ）は、ＥＬＩＳＡによって測定されたように、ＩＬ−２３が単離したマウスＣＤ１１ｃ＋ＤＣからＩＬ−２２をインビトロで直接誘導することを表すデータを示す。すべてのデータは２回の独立した実験を代表している。
【図１３Ｅ】樹状細胞によって産生されたＩＬ−２２がＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染に対する自然免疫応答に必須であることを表すデータを示す。図１３（Ａ）では、Ｒａｇ２−／−および野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスにＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ  ２×１０９ＣＦＵを経口接種した。図１３（ＢおよびＣ）では、マウスは、アイソタイプ対照ＩｇＧ１ｍＡｂまたは抗ＩＬ−２２ｍＡｂ  １５０μｇも細菌接種と同じ日から開始して１日おきに腹腔内投与して、表示した時点に秤量した。図１３（Ｂ）は、経時的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を示し、図（１３（Ｃ）は、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染後の野生型Ｂａｌｂ／ｃおよびＲａｇ２−／−マウスの結腸におけるＩＬ−２２およびＩＬ−１７発現のエクスビボ結腸培養ＥＬＩＳＡを示す。図１３（Ｄ）は、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染Ｒａｇ２−／−マウスによる第４日の結腸でのＩＬ−２２、ＣＤ１１ｃ、およびＤＡＰＩの免疫組織化学的染色を示す。倍率：４００×。図１３（Ｅ）は、ＥＬＩＳＡによって測定されたように、ＩＬ−２３が単離したマウスＣＤ１１ｃ＋ＤＣからＩＬ−２２をインビトロで直接誘導することを表すデータを示す。すべてのデータは２回の独立した実験を代表している。
【図１４】ＩＬ−２２がヒト結腸株化細胞においてＳＴＡＴ３活性化を誘導できることを表すデータを示す。図１４（Ａ）では、ＩＬ−２２−／−マウスおよび野生型同腹子にＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ  ２×１０９ＣＦＵを経口接種した。ＩＬ−２２−／−マウスの１群にはｍＲｅｇ  ＩＩＩγ−Ｉｇ融合タンパク質も投与した。表示された時点に動物を秤量および監視した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。図１４（Ｂ）において、ＥＬＩＳＡによって測定されたように、ＩＬ−２３は単離ヒトＤＣからＩＬ−２２産生を直接誘導する。図１４（Ｃ）は、ヒト結腸株化細胞でのＦＡＣＳによるＩＬ−２２Ｒ発現を示す。図１４（Ｄ）は、ＩＬ−２２がヒト結腸株化細胞においてＳＴＡＴ３活性化を誘導できることを表すウェスタンブロッティングを示す。図１４（Ｅ）は、ＩＬ−２２で処置したヒト結腸上皮株化細胞でのＲｅｇ  ＩＩＩβおよびＲｅｇ  ＩＩＩγ発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。すべてのデータは２回の独立した実験を代表している。
【図１５Ａ】免疫組織化学のための抗ＩＬ−２２ｍＡｂのキャラクタリゼーションを示す。図１５（Ａ）は、Ａｌｅｘａ５５５接合抗ＩＬ−２２ｍＡｂ（８Ｅ１１）またはアイソタイプ対照で染色した、第４日のＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染ＩＬ−２２−／−および野生型マウスまたは非感染野生型マウスからの結腸切片を示す。図１５（Ｂ）は、Ａｌｅｘａ５５５接合抗ＩＬ−２２ｍＡｂ（８Ｅ１１）またはアイソタイプ対照で染色した、ＩＬ−２２発現２９３細胞の細胞ペレットを示す。倍率は２００×である。
【図１５Ｂ】免疫組織化学のための抗ＩＬ−２２ｍＡｂのキャラクタリゼーションを示す。図１５（Ａ）は、Ａｌｅｘａ５５５接合抗ＩＬ−２２ｍＡｂ（８Ｅ１１）またはアイソタイプ対照で染色した、第４日のＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染ＩＬ−２２−／−および野生型マウスまたは非感染野生型マウスからの結腸切片を示す。図１５（Ｂ）は、Ａｌｅｘａ５５５接合抗ＩＬ−２２ｍＡｂ（８Ｅ１１）またはアイソタイプ対照で染色した、ＩＬ−２２発現２９３細胞の細胞ペレットを示す。倍率は２００×である。
【図１６】Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染後のＣ５７Ｂｌ／６およびＩＬ−２３ｐ１９−／−マウス結腸におけるＲｅｇ  ＩＩＩγおよびＲｅｇ  ＩＩＩβに対する経時的分析を示す。Ｃ５７Ｂｌ／６およびＩＬ−２３ｐ１９−／−マウスにＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ  ２×１０９ＣＦＵを経口接種した。表示した時点に、ＲＮＡ抽出および続いてのマウスＲｅｇ  ＩＩＩγおよびＲｅｇ  ＩＩＩβ発現についてのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析のためにマウス結腸を収集した。
【図１７】Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染後ＩＬ−２２−／−および野生型マウス結腸での他のＲｅｇファミリーメンバー発現についての経時的分析を示す。ＩＬ−２２−／−および野生型同腹子マウスにＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ  ２×１０９ＣＦＵを経口接種した。表示した時点に、ＲＮＡ抽出および続いてのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析のためにマウス結腸を収集した。
【図１８】Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染後に組換えヒトＲｅｇ  ＩＩＩ＿融合タンパク質がＩＬ−２２−／−を部分的に保護できることを表すデータを示す。ＩＬ−２２−／−マウスおよび野生型同腹子にＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ  ２×１０９ＣＦＵを経口接種した。ＩＬ−２２−／−マウスの１群にはヒトＲｅｇ  ＩＩＩ＿−ｃＦｌａｇ融合タンパク質も投与した。表示された時点に動物を秤量および監視した。＊ｐ＜０．０５。
【図１９Ａ】ＩＬ−２２処置による、結腸で異なって発現された１６１の遺伝子を示す。
【図１９Ｂ】ＩＬ−２２処置による、結腸で異なって発現された１６１の遺伝子を示す。
【図１９Ｃ】ＩＬ−２２処置による、結腸で異なって発現された１６１の遺伝子を示す。
【図２０】ＩＬ−２２処置による、結腸で異なって発現された１６１の遺伝子の２Ｄ階層的クラスタ形成を示し、選択された遺伝子はピアソン相関係数によって最も高度に関連付けられたベクターの反復凝集によってクラスタ化され、凝集ベクターのデータは群平均法によって集計した。
【図２１】ＬＴｂＲＦｃおよび抗ＩＬ−２２ｍＡｂの両方がＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染後に死亡につながることを表すデータを示す。
【図２２】ＩＬ−２２産生に関与する複数の上流態様のＬＴ経路制御を表すデータを示す。
【図２３】ＩＬ−２２がＬＴｂＲ処置マウスで見られる欠失を部分的に救助することを表すデータを示す。
【図２４】抗ＩＬ−２２ｍＡｂ処置が結腸濾胞の減少、Ｂ／Ｔ組織の損傷、ならびに結腸におけるＤＣ、Ｔ細胞およびＢ細胞の数の減少をもたらすことを表すデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は一般に、宿主免疫応答の調節による微生物障害の処置のための組成物および方法を提供する。
【００３６】
本発明者らは、感染性微生物病原体に対する哺乳動物の免疫応答および抵抗を媒介する新規サイトカイン経路を発見した。特に本発明者らは、ＩＬ−２２が、腸管接着性または微絨毛消滅性（Ａ／Ｅ）細菌性病原体の早期感染中に適応的免疫応答および生得的上皮防御を橋渡しする重要なサイトカインの１つであることを見出した。
【００３７】
本明細書に示すように、感染の早期に免疫細胞によって産生されるＩＬ−２２などのサイトカインは、病原微生物の宿主への全身的侵入を防止するために、腸上皮細胞が完全抗微生物応答および創傷治癒応答を誘発するのに必要である。本明細書の研究は、ＩＬ−２２が腸上皮バリアの完全性を保護して、全身への蔓延を伴う細菌侵入を防止することを示している。さらに、本明細書の研究は、ＩＬ−２２が早期抗菌ＩｇＧ応答の誘発に関与して、細菌感染中の結腸上皮細胞からのＲｅｇ  ＩＩＩβおよびＲｅｇ  ＩＩＩγなどの抗微生物レクチンの誘導に不可欠であることを示す。これらの機構の一方または両方が欠けることは、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染中のＩＬ−２２−／−マウスにおける全身への蔓延および死亡率の上昇を伴う、宿主防御応答の低下の原因となり得る。
【００３８】
本明細書で示すように、Ｒｅｇ  ＩＩＩβおよびＲｅｇ  ＩＩＩγの誘導は、ＩＬ−２２が各種の細菌感染を制御するのにより広範な機能を有し得ることを示す。本明細書の研究はさらに、感染性障害および自己免疫障害におけるＴｈＩＬ−１７細胞およびそのエフェクタサイトカインの役割を補助する。さらに、本明細書の研究は、ＩＬ−２２ならびにＲｅｇ  ＩＩＩβおよびＲｅｇ  ＩＩＩγなどのその下流生成物が感染性障害の処置に有利であり得ることを示す。
【００３９】
したがって、本発明は、宿主免疫応答の調節によるこのような微生物障害を処置する方法を提供する。たとえば、対象における抗微生物免疫応答は、抗微生物免疫応答を媒介する１つ以上の抗微生物ポリペプチド（ＡＭＰ）の活性を上昇または低下させることによって向上または抑制することができる。
【００４０】
さらに詳細には、本発明は、ＡＭＰ、その調節因子、および微生物障害の処置にそのような組成物を使用する方法を提供する。このような微生物障害は、これに限定されるわけではないが、感染性疾患、たとえばＥＨＥＣおよびＥＰＥＣ誘発下痢、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）ならびに、さらに詳細には潰瘍性大腸炎（ＵＣ）およびクローン病（ＣＤ）を含む。
【００４１】
本明細書で引用する、特許、特許出願、および科学文献を含むすべての参考文献は、その全体が参照により本明細書でここに組込まれている。
【００４２】
一般技法
本明細書で記載および参照する技法および手順は、当業者によって一般に十分に理解されており、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ．ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．，（２００３））；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ  ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ  ｅｄｓ．（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ），ｅｄ．，１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ  Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９９３−８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓら、ｅｄｓ．，１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら、ｅｄｓ．，１９９１）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ  ａｎｄ  Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  （Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８−１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ���，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）；およびＣａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａら、ｅｄｓ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）に記載された広く利用されている方法などの、従来の方法を用いて通常利用される。
【００４３】
Ｉ．定義
本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、適切な場合にはいつでも、単数形で使用される用語は複数形も含み、逆の場合も同じである。以下で述べるいずれかの定義が参照により本明細書に援用されるいずれかの文書と矛盾する場合には、以下で述べる定義が支配するものとする。
【００４４】
「抗微生物ポリペプチド」すなわち「ＡＭＰ」は、微生物病原体に対する抗微生物免疫応答を媒介する、またはそうでなければ生じさせるポリペプチドであり、ＡＭＰ活性、たとえば抗微生物活性、または抗微生物免疫応答を調節する活性を保持するその断片、変異体、類似体、誘導体またはミメティックを含む。これらの方法を使用して、感染性微生物病原体、たとえばウイルスもしくは細菌に感染している、または感染性微生物病原体、たとえばウイルスもしくは細菌による感染のリスクに瀕している対象を処置できる。ＡＭＰの活性は、別のＡＭＰまたは同じＡＭＰに対して調節または異なって制御（たとえ上方または下方制御）できる。
【００４５】
本発明のＡＭＰは、未変性ＡＭＰおよびその変異体（本明細書でさらに定義する）を含み、ヒト組織もしくは別の供給源からなどの多様な供給源から単離され得るか、または組換え法もしくは合成法によって調製され得る。未変性ＡＭＰは、任意の種、たとえばマウスまたはヒトに由来し得る。本発明のＡＭＰは、これに限定されるわけではないが、ＬＴ、ＩＬ−６、ＩＬ−１８、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３（たとえばＩＬ−２３  ｐ１９またはＩＬ−２３  ｐ４０を含む）およびＲｅｇスーパーファミリーの遺伝子によってコードされたＲｅｇまたはＲｅｇ関連タンパク質を含む。Ｒｅｇスーパーファミリーは、ヒト、ラット、およびマウスによるＲｅｇおよびＲｅｇ関連遺伝子を含み、４つのサブクラスであるタイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶに分類される。たとえばタイプＩは、ヒトＲＥＧ  Ｉα、ヒトＲＥＧ  Ｉβ、ラットＲｅｇ  Ｉ、およびマウスＲｅｇ  Ｉを含む；タイプＩＩは、Ｒｅｇ  ＩＩを含む；タイプＩＩＩは、ヒトＲＥＧ  ＩＩＩ、ヒトＨＩＰ／ＰＡＰ（肝細胞癌−小腸−膵臓で発現された遺伝子／膵炎関連タンパク質をコードする遺伝子）、ラットＰＡＰ／Ｐｅｐｔｉｄｅ２３、ラットＲｅｇ  ＩＩＩ／ＰＡＰ  ＩＩ、ラットＰＡＰ  ＩＩＩ、マウスＲｅｇ  ＩＩＩα、Ｒｅｇ  ＩＩＩβ、Ｒｅｇ  ＩＩＩγ、マウスＲｅｇ  ＩＩＩδ、およびハムスターＩＮＧＡＰ（小島新生関連タンパク質）を含む。タイプＩＶは、ヒトＲＥＧ  ＩＶを含有する。さらに、ヒトＲｅｇ関連配列（ＲＳ）は報告によれば、偽遺伝子である。一実施形態において、ＲＥＧタンパク質は、これに限定されるわけではないが、ＲＥＧ  Ｉα、ＲＥＧ  Ｉβ、ＨＩＰ／ＰＡＰ、ＲＥＧ  ＩＩＩ、ＲＥＧ  ＩＶ、およびＲｅｇ関連配列（ＲＳ）を含むヒトＲＥＧ遺伝子ファミリーのメンバーによってコードされる。
【００４６】
リンホトキシン（ＬＴ）は、腫瘍壊死ファミリーの３量体サイトカインであり；活性化Ｔ、Ｂ、およびＮＫ細胞によって発現され；炎症応答シグナル伝達および２次リンパ器官構造に関与する。「リンホトキシン」すなわち「ＬＴ」は本明細書では、ＵＳ  Ｐａｔ．Ｎｏ．５，８２４，５０９の図２Ａに示すアミノ酸配列を有する生物活性ポリペプチドとして定義される。「ＬＴ：は、ヒトＴＮＦαまたはその天然アミノ酸類似体を特に排除するために定義される（Ｐｅｎｎｉｃａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：２０／２７：７２４−７２９（１９８４）およびＡｇｇａｒｗａｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２３４５−２３５４（１９８５））。本明細書で使用するように、「ＬＴ」は、本明細書に記載する１個以上のＬＴサブユニットを指す。
【００４７】
「リンホトキシン−α」すなわち「ＬＴα」は、たとえばＵＳ  ５，６６１，００４で定義されているようなヒトＬＴβを特に排除するために定義される。「リンホトキシンα−３  ３量体」すなわち「ＬＴα３」は、ＬＴαモノマーのホモ３量体を指す。このホモ３量体は、ＬＴβ、膜貫通および細胞質ドメインによって細胞表面に固着される。
【００４８】
「リンホトキシン−αβ」すなわち「ＬＴαβ」または「ＬＴαβ複合体」は、ＬＴαとＬＴβとのヘテロ３量体を指す。これらのヘテロ３量体は、ＬＴαのサブユニット２個およびＬＴβのサブユニット１個（ＬＴα２β１）、またはＬＴαのサブユニット１個およびＬＴβのサブユニット２個（ＬＴα１β２）のどちらかを含有する。「ＬＴαβ」または「ＬＴａｂ」という用語は本明細書で使用するように、ＬＴαのサブユニット１個およびＬＴβ２個で構成されるヘテロ３量体（ＬＴα１β２）を指す。
【００４９】
「腫瘍壊死因子受容体−Ｉ」すなわち「ＴＮＦＲＩ」および「腫瘍壊死因子受容体−ＩＩ」すなわち「ＴＮＦＲＩＩ」は、それぞれｐ５５およびｐ７５としても公知である、ＬＴα３の細胞表面ＴＮＦ受容体を指す。
「リンホトキシン−β受容体」すなわち「ＬＴβ−Ｒ」は、ＬＴαβヘテロ３量体が結合する受容体を指す。
【００５０】
いくつかの実施形態において、本発明のＡＭＰのアミノ酸配列は、次の群：配列番号２（ヒトＩＬ−６）、配列番号４（ヒトＩＬ−１２Ｂ）、配列番号６（ヒトＩＬ−１８）、配列番号８（ヒトＩＬ−２２）、配列番号１０（ヒトＩＬ−２３  ｐ１９またはＩＬ−２３Ａ）、配列番号１２（ヒトＲＥＧ１Ａ）、配列番号１４（ヒトＲＥＧ１Ｂ）、配列番号１６（ヒトＲＥＧ３Ａ、変異体１）、配列番号１８（ヒトＲＥＧ３Ａ、変異体２）、配列番号２０（ヒトＲＥＧ３Ａ、変異体３）、配列番号２２（ヒトＲＥＧ３Ｇ、変異体２）、配列番号２４（ヒトＲＥＧ３Ｇ、変異体１）、配列番号２６（ヒトＲＥＧ４）、配列番号２８（マウスＩＬ−６）、配列番号３０（マウスＩＬ−１２Ｂ）、配列番号３２（マウスＩＬ−１８）、配列番号３４（マウスＩＬ−２２）、配列番号３６（マウスＩＬ−２３  ｐ１９またはＩＬ−２３Ａ）、配列番号３８（マウスＰＡＰ）、配列番号４０（マウスＲＥＧ１）、配列番号４２（マウスＲＥＧ２）、配列番号４４（マウスＲＥＧ３Ａ）、配列番号４６（マウスＲＥＧ３Ｄ）、配列番号４８（マウスＲＥＧ４）、配列番号５０（ヒトＬＴα）、配列番号５２（ヒトＬＴβ）、配列番号５４（マウスＬＴα）、および配列番号５６（マウスＬＴβ）から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００５１】
他の実施形態において、本発明のＡＭＰをコードする核酸配列は、次の群：配列番号１（ヒトＩＬ−６）、配列番号３（ヒトＩＬ−１２Ｂ）、配列番号５（ヒトＩＬ−１８）、配列番号７（ヒトＩＬ−２２）、配列番号９（ヒトＩＬ−２３  ｐ１９またはＩＬ−２３Ａ）、配列番号１１（ヒトＲＥＧ１Ａ）、配列番号１３（ヒトＲＥＧ１Ｂ）、配列番号１５（ヒトＲＥＧ３Ａ、変異体１）、配列番号１７（ヒトＲＥＧ３Ａ、変異体２）、配列番号１９（ヒトＲＥＧ３Ａ、変異体３）、配列番号２１（ヒトＲＥＧ３Ｇ、変異体２）、配列番号２３（ヒトＲＥＧ３Ｇ、変異体１）、配列番号２５（ヒトＲＥＧ４）、配列番号２７（マウスＩＬ−６）、配列番号２９（マウスＩＬ−１２Ｂ）、配列番号３１（マウスＩＬ−１８）、配列番号３３（マウスＩＬ−２２）、配列番号３５（マウスＩＬ−２３  ｐ１９またはＩＬ−２３Ａ）、配列番号３７（マウスＰＡＰ）、配列番号３９（マウスＲＥＧ１）、配列番号４１（マウスＲＥＧ２）、配列番号４３（マウスＲＥＧ３Ａ）、配列番号４５（マウスＲＥＧ３Ｄ）、配列番号４７（マウスＲＥＧ４）、配列番号４９（ヒトＬＴα）、配列番号５１（ヒトＬＴβ）、配列番号５３（マウスＬＴα）、および配列番号５５（マウスＬＴβ）から選択される核酸配列を含む。
【００５２】
「未変性配列ＡＭＰポリペプチド」または「未変性配列ＡＭＰポリペプチド」は、同じアミノ酸配列を天然由来の対応するＡＭＰポリペプチドとして含むポリペプチドを指す。このような未変性配列ＡＭＰポリペプチドは、天然から単離可能であるか、または組換えもしくは合成手段によって産生できる。該用語は特に、特定のＡＭＰポリペプチドの天然発生型切断または分泌型（たとえばその関連ペプチドを欠くＩＬ−２２）、ポリペプチドの天然発生型変異体形（たとえば選択的スプライス型）、および天然型対立遺伝子変異体を含む。本発明の各種の実施形態において、本明細書で開示する未変性配列ＡＭＰポリペプチドは、成熟または全長未変性配列ポリペプチドである。
【００５３】
「変異体」ポリペプチドは、全長未変性ポリペプチド配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する活性ポリペプチドを指す。本来、変異体ポリペプチドは、全長または成熟未変性ポリペプチド配列に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を、または少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性を、または少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性を、または少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性を、または少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性を、または少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を、または少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性を、または少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性を、または少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性を、または少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性を、または少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を、または少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性を、または少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性を、または少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性を、または少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性を、または少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を、または少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性を、または少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性を、または少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性を、およびまたは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するであろう。
【００５４】
「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列を比較して、最大パーセントの配列同一性を達成するために必要ならばギャップを挿入した後、いずれの保存的置換も配列同一性の一部として考慮せずに、特異的または参照ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一である候補配列内のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定することを目的とする配列比較は、たとえばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの一般に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当該技術の範囲内である各種の方法で達成できる。当業者は、比較されている配列の全長にわたって最大配列比較を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列比較を測定するのに適切なパラメータを決定できる。アミノ酸配列比較では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂに対する、Ｂによる、またはＢと比べたアミノ酸配列同一性％（または所与のアミノ酸配列Ｂに対する、Ｂによる、またはＢと比べたあるアミノ酸配列同一性％を有するまたは含む所与のアミノ酸配列Ａと表すことができる）は、次のように計算される：
１００×分数Ｘ／Ｙ
式中、Ｘは、配列決定プログラムによってＡおよびＢのそのプログラムの配列決定で完全一致として記録されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ内のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さに等しい場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％とは等しくないことが認識されるであろう。本方法を使用するアミノ酸配列同一性％計算の例として、下の表１および２は、「参照タンパク質」と呼ばれるアミノ酸配列の、「ＩＬ−２２」と呼ばれるアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性％を計算する方法を示し、ここで「ＩＬ−２２」は、興味のあるＩＬ−２２ポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「参照タンパク質」は、興味のある「ＩＬ−２２」ポリペプチドが比較されているポリペプチドのアミノ酸配列を表し、ならびに「Ｘ、「Ｙ」および「Ｚ」はそれぞれ異なるアミノ酸残基を表す。
【００５５】
【表１】
0005985150.tif 000002
【００５６】
【表２】
0005985150.tif 000003
本明細書で開示する各種のポリペプチド、ポリヌクレオチド、および抗体などの「単離」生体分子は、その天然環境の少なくとも１つの成分から同定および分離ならびに／または回収された生体サンプルを指す。
【００５７】
ポリペプチドに関して「活性の」または「活性」は、未変性ポリペプチドの生物および／または免疫活性を指し、ここで「生物」活性は、未変性ポリペプチドが有する抗原エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力以外の、未変性ポリペプチドの生物機能を指す。「免疫」活性は、未変性ポリペプチドが有する抗原エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力を指す。
【００５８】
「アンタゴニスト」という用語は、最も広い意味で使用され、ポリペプチドの生物活性を完全または部分的に遮断、抑制、または中和する任意の分子を含む。ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの転写または翻訳を完全または部分的に抑制する分子も「アンタゴニスト」に含まれる。好適なアンタゴニストはたとえば、アンタゴニスト抗体または抗体断片；未変性ポリペプチドの断片またはアミノ酸配列変異体；アンチセンスオリゴヌクレオチド；小型分子；およびポリペプチドアンタゴニストまたはアンタゴニスト抗体をコードする核酸を含む。「１つの」アンタゴニストへの言及は、単一のアンタゴニストまたは２つ以上の異なるアンタゴニストの組合せを含む。
【００５９】
「アゴニスト」という用語は、最も広い意味で使用され、ポリペプチドの生物活性を完全または部分的に模倣する任意の分子（たとえば未変性ＡＭＰ）を含む。ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの転写または翻訳を刺激する分子も「アゴニスト」に含まれる。好適なアゴニストはたとえば、アゴニスト抗体または抗体断片；未変性ポリペプチド；未変性ポリペプチドの断片またはアミノ酸配列変異体；アンチセンスオリゴヌクレオチド；小型分子；およびポリペプチドアゴニストまたは抗体をコードする核酸を含む。「１つの」アゴニストへの言及は、単一のアゴニストまたは２つ以上の異なるアゴニストの組合せを含む。
【００６０】
「抗微生物免疫応答」は、これに限定されるわけではないが、微生物病原体による感染に対する抵抗または防御を含む。このような抵抗または防御は、微生物感染性、複製、増殖または微生物病原体の他の活性の抑制または低下を生じることができる。特に、抗微生物免疫応答を生じる処置は、微生物障害または微生物障害の症状の軽減を生じることができる。
【００６１】
「軽減」、「軽減すること」またはその同等語は、処置的処置および予防または防止措置の両方を指し、ここでの目的は、標的微生物障害またはその症状を緩和、予防、減速（低減）、減少または抑制することである。処置を必要とする人々としては、すでに障害を持つ人々はもちろんのこと、障害を有しやすい人々または障害が防止される人々も含む。
【００６２】
微生物障害を処置することに関して、「処置」、「処置すること」、またはその同等語は、障害を有する対象における微生物障害または微生物障害の症状を軽減することを指す。
【００６３】
「慢性」投与は、長期間にわたって最初の処置効果を維持するために、急性方式に対立するものとしての、連続方式での薬剤の投与を指す。「間欠」投与は、中断なく連続して行われるのではなく、むしろ実際は周期的である処置である。
【００６４】
処置の目的での「哺乳動物」は、ヒト、げっ歯類（たとえばマウスおよびラット）、およびサル；ペットおよび家畜；および動物園用、スポーツ用、実験用、またはペット用動物、たとえばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどを含む、哺乳動物として分類される任意の動物を指す。いくつかの実施形態において、哺乳動物は、ヒト、げっ歯類、またはサルから選択される。同様に、処置の目的での「対象」は、哺乳動物対象を指し、ヒトおよび動物対象の両方を含む。
【００６５】
１つ以上のさらなる薬剤「と組合された」投与は、任意の順序での同時（併用）および連続投与を含む。
【００６６】
「担体」は本明細書で使用するように、利用した投薬量および濃度にてそれに曝露されている細胞または哺乳動物に非毒性である製薬的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を含む。製薬的に許容される担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。製薬的に許容される担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含むモノサッカライド、ジサッカライド、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【００６７】
「抗体（Ａｂ）」および「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、同様の構造特徴を有する糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示すのに対して、免疫グロブリンは、抗体および一般に抗原特異性を欠いた他の抗体様分子の両方を含む。後者の種類のポリペプチドはたとえば、リンパ系にて低レベルでおよび骨髄腫にて上昇したレベルで産生される。
【００６８】
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、最も広い意味で互換的に使用され、モノクローナル抗体（たとえば全長または無処置モノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、１価抗体、多価抗体、多重特異性抗体（たとえば、それらが所望の生物活性を示す限り、２重特異性抗体）を含み、（本明細書でより詳細に述べるように）ある抗体断片も含み得る。抗体は、キメラ、ヒト化および／または親和性成熟であり得る。
【００６９】
特定の抗原に特異的に結合する抗体は、抗体が抗原を標的とする際に診断および／または処置剤として有用であるような十分な親和性で抗原を結合することができる抗体を指す。好ましくは、このような抗体の非標的ポリペプチドへの結合の程度は、たとえばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定されたような標的抗原に対する抗体の結合の約１０％未満である。ある実施形態において、標的抗原に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、または≦０．１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有する。
【００７０】
抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖の可変ドメインは、「ＶＨ」と呼ばれ得る。軽鎖の可変ドメインは、「ＶＬ」と呼ばれ得る。これらのドメインは一般に、抗体の最も可変の部分であり、抗原結合部位を含有する。
【００７１】
「可変の」という用語は、可変ドメインのある部分が抗体間の配列で広範囲にわたって異なり、特定の各抗体のその特定の抗原に対する結合および特異性で使用されるという事実を指す。しかし、可変性は抗体の可変ドメインに均一に分布していない。可変性は、どちらも軽鎖および重鎖可変ドメイン内の相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントに濃縮されている。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。未変性重鎖および軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合する、ある場合にはβシート構造の一部を形成する３つのＣＤＲによって連結された、主にβ配置をとる４つのＦＲ領域をそれぞれ含む。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によって密に近接してひとまとめとされて、他の鎖のＣＤＲと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）を参照）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関わっていないが、抗体依存性細胞毒性への抗体の関与などの各種のエフェクタ機能を示す。
【００７２】
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明らかに別個の種類の一方に割当てることができる。
【００７３】
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体（免疫グロブリン）を異なるクラスに割当てることができる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらのいくつかはサブクラス（アイソタイプ）、たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分けられる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および３次元配置は周知であり、一般にたとえばＡｂｂａｓら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  ｅｄ．（２０００）に記載されている。抗体は、抗体と１つ以上の他のタンパク質またはペプチドとの共有または非共有結合によって形成された、より大型の融合分子の一部であり得る。
【００７４】
「全長抗体」、「無処置抗体」および「全抗体」という用語は本明細書では互換的に使用されて、下で定義するような抗体断片ではなく、その実質的に無処置の形の抗体を指す。該用語は特に、Ｆｃ領域を含有する重鎖を持つ抗体を指す。
【００７５】
「抗体断片」は、無処置抗体の部分のみを含み、その部分は、無処置抗体内に存在するときにその部分と通常関連する機能の少なくとも１つ、多くはほとんどまたはすべてを保持する。一実施形態において、抗体断片は、無処置抗体の抗原結合部位を含み、それゆえ抗原に結合する能力を保持する。別の実施形態において、抗体断片、たとえばＦｃ領域を含む抗体断片は、無処置抗体内に存在するときに、ＦｃＲｎ結合、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能および補体結合などのＦｃ領域と通常関連する生体機能の少なくとも１つを保持する。一実施形態において、抗体断片は、無処置抗体と実質的に同様のインビトロ半減期を有する１価抗体である。たとえば、このような抗体断片は、断片にインビボ安定性を与えることができるＦｃ配列に結合された抗原結合アームを含み得る。
【００７６】
抗体のパパイン消化は、それぞれ単一の抗原結合部位を備えた「Ｆａｂ」断片と、その名前がただちに結晶化するその能力を反映している残りの「Ｆｃ」断片と呼ばれる、２つの同一の抗原結合断片を産生する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有して、なお抗原を架橋することが可能であるＦ（ａｂ’）２断片を生じる。
【００７７】
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。一実施形態において、２本鎖Ｆｖ種は、密接に非共有結合した１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの２量体から成る。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種では、１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインを、軽鎖および重鎖が２本鎖Ｆｖ種のものと類似した「２量体」構造で結合できるように可撓性ペプチドリンカによって共有結合させることができる。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ２量体の表面に抗原結合部位を画成するのはこの配置においてである。集合的には、６つのＣＤＲが抗体に対する抗原結合特異性を与える。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識および結合する能力を有する。
【００７８】
Ｆａｂ断片は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含有し、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に２、３の残基が付加されていることによってＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を保持するＦａｂ’の本明細書での名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は当初、その間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片対として産生された。抗体断片の他の化学結合も公知である。
【００７９】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは１つのポリペプチド鎖内に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ｓｃＦｖに抗原結合のための所望の構造を形成させることができるＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照。
【００８０】
「ダイアボディ」という用語は、２個の抗原結合部位を備えた小型抗体断片を指し、その断片は同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２個のドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカを使用することによって、ドメインは強制的に別の鎖の相補性ドメインと対形成させられて、２個の抗原結合部位を生成する。ダイアボディは２価または２重特異性であり得る。ダイアボディは、たとえばＥＰ  ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１６１；Ｈｕｄｓｏｎら、（２００３）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）においてさらに十分に記載されている。トリアボディおよびテトラボディもＨｕｄｓｏｎら、（２００３）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４に記載されている。
【００８１】
「モノクローナル抗体」という用語は本明細書で使用するように、実質的に同種の抗体の集合から得た抗体を指し、すなわち集合を構成する個々の抗体は、微量で存在し得る可能な突然変異、たとえば天然発生型変異を除いて同一である。それゆえ「モノクローナル」という修飾語句は、別個の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示す。ある実施形態において、このようなモノクローナル抗体は通例、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、ここで標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一の標的結合ポリペプチド配列の選択を含むプロセスによって得た。たとえば選択プロセスは、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、または組換えＤＮＡクローンのプールなどの複数のクローンからの唯一のクローンを選択することであり得る。選択された標的結合配列は、たとえば標的に対する親和性を改善するために、標的結合配列をヒト化するために、細胞培養でのその産生を改善するために、インビボでのその免疫原性を低下させるために、多重特異的抗体を作製するなどのためにさらに改変することが可能であることと、改変された標的結合配列を含む抗体もまた本発明のモノクローナル抗体であることとが理解されるべきである。各種の決定基（エピトープ）に向けられた各種の抗体を通例含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に向けられている。モノクローナル抗体調製物は、その特異性に加えて、それらが他の免疫グロブリンによって通例は汚染されていない点で有利である。
【００８２】
「モノクローナル」という修飾語句は、抗体の特徴が抗体の実質的に同種の集合から得られるような抗体の特徴を示し、何らかの特定の方法による抗体の産生を必要とするとして解釈されるべきでない。たとえば、本発明によって使用されるモノクローナル抗体は、たとえばハイブリドーマ法（たとえばＫｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）；Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１））、組換えＤＮＡ法（たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，８１６，５６７を参照）、ファージ提示技術（たとえばＣｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）；Ｓｉｄｈｕら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）  ２９９−３１０（２００４）；Ｌｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）；およびＬｅｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）を参照  、およびヒト免疫グロブリン座またはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部または全部を有する動物においてヒトまたはヒト様抗体を生産する技術（たとえばＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；ＷＯ９１／１０７４１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．５，５４５，８０７；５，５４５，８０６；５，５６９，８２５；５，６２５，１２６；５，６３３，４２５；５，６６１，０１６；Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２−８１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−８５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８２６（１９９６）およびＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照  を含む各種の技法によって作製され得る。
【００８３】
モノクローナル抗体は本明細書で特に、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種に由来するまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であるのに対して、鎖の残りの部分は別の種に由来するまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体はもちろんのこと、このような抗体の断片も、それらが所望の生物活性を示す限り含む（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，８１６，５６７；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。
【００８４】
非ヒト（たとえばマウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。一実施形態において、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域からの残基が所望の特異性、親和性、および／または能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基によって置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見出されない残基を含むことがある。これらの修飾は、抗体の性能をさらに高めるために行われ得る。一般にヒト化抗体は、少なくとも１つの、通例は２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、そこでは超可変ループのすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応して、ＦＲのすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のＦＲに対応する。ヒト化抗体は場合により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、通例はヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部も含むであろう。さらなる詳細事項については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照。以下の総説論文およびそこで引用した参考文献も参照：Ｖａｓｗａｎｉ  ａｎｄ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５−１１５（１９９８）；Ｈａｒｒｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ２３：１０３５−１０３８（１９９５）；Ｈｕｒｌｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８−４３３（１９９４）。
【００８５】
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する、および／または本明細書で開示するヒト抗体の作製技術のいずれかを使用して作製された抗体である。ヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【００８６】
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割当てることができる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらのいくつかはサブクラス（アイソタイプ）、たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分割できる。
【００８７】
「親和性成熟」抗体とは、その改変を有さない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改善を生じる１つ以上の改変をその１つ以上のＨＶＲ内に持つ抗体である。一実施態様において、親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモルまたはピコモルの親和性さえ有する。親和性成熟抗体は、当分野で公知の手順によって産生され得る。Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）は、ＶＨおよびＶＬドメインシャッフリングによる親和性成熟について記載している。ＨＶＲおよび／またはフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は：Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３８０９−３８１３（１９９４）；Ｓｃｈｉｅｒら、Ｇｅｎｅ  １６９：１４７−１５５（１９９５）；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４−２００４（１９９５）；Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０−９（１９９５）；およびＨａｗｋｉｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６（１９９２）に記載されている。
【００８８】
「遮断」抗体、「中和」抗体、または「アンタゴニスト」抗体は、その抗体が結合する抗原の生物活性を抑制または低下する抗体である。このような抗体は、抗原の生物活性を実質的にまたは完全に抑制し得る。
【００８９】
「アゴニスト抗体」は本明細書で使用するように、興味のあるポリペプチドの生物活性を部分的にまたは完全に模倣する抗体である。
【００９０】
抗体「エフェクタ機能」は、抗体のＦｃ領域（未変性配列Ｆｃ領域またははアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因するこのような生物活性を指し、抗体アイソタイプによって変わる。抗体エフェクタ機能の例は：Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞毒性；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）；貪食作用；細胞表面受容体（たとえばＢ細胞受容体）の下方制御；ならびにＢ細胞活性化を含む。
【００９１】
「結合親和性」は一般に、分子の単一の結合部位（たとえば抗体）とその結合パートナー（たとえば抗原）との間の非共有相互作用全体の強度を指す。別途指摘しない限り、「結合親和性」は本明細書で使用するように、結合対のメンバー（たとえば抗体および抗原）間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は一般に、解離定数（Ｋｄ）によって表される。親和性は、本明細書に記載される方法を含む、当分野で公知の一般的な方法によって測定できる。低親和性抗体は一般に、抗原に低速で結合して、ただちに解離する傾向があるのに対して、高親和性抗体は一般に、抗原により高速に結合して、より長期間結合を維持する傾向がある。結合親和性を測定する各種の方法が当分野で公知であり、そのいずれも本発明の目的に使用できる。詳細な例示的実施形態を以下に記載する。
【００９２】
一実施形態において、本発明による「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」は、以下のアッセイによって記載されるように、興味のある抗体のＦａｂバージョンおよびその抗原を用いて実施される放射性標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、未標識抗原の滴定系列の存在下でＦａｂを最小濃度の（１２５Ｉ）標識抗原によって平衡にして、次に抗Ｆａｂ抗体コートプレートによって結合された抗原を捕捉することによって測定する（Ｃｈｅｎら、（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１）。アッセイ条件を確立するために、マイクロタイタープレート（Ｄｙｎｅｘ）を５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中の５μｇ／ｍｌ捕捉抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）でコートして、次にＰＢＳ中の２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンによって室温（約２３℃）にて２〜５時間遮断する。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）で、１００ｐＭまたは２６ｐＭ［１２５Ｉ］抗原を興味のあるＦａｂの連続希釈物と混合する（たとえばＰｒｅｓｔａら、（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致）。次の興味のあるＦａｂを１晩インキュベートする；しかしインキュベーションは、平衡に達するようにするために、より長期間継続され得る（たとえば約６５時間）。その後、（たとえば１時間にわたる）室温でのインキュベーションのために、混合物を捕捉プレートに移す。次に溶液を除去して、プレートをＰＢＳ中０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０によって８回洗浄する。プレートが乾燥したときに、シンチラント（ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−２０；Ｐａｃｋａｒｄ）１５０μｌ／ウェルを添加して、プレートをＴｏｐｃｏｕｎｔガンマカウンタ（Ｐａｃｋａｒｄ）で１０分間カウントする。最大結合の２０％以下を示す各Ｆａｂの濃度を、競合結合アッセイで使用するために選択する。
【００９３】
別の実施形態により、ＫｄまたはＫｄ値は、〜１０の応答ユニット（ＲＵ）固定抗原ＣＭ５チップと共に２５℃にてＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−２０００またはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して、表面プラズモン共鳴アッセイによって測定する。簡潔には、カルボキシメチル化デキストラン・バイオセンサ・チップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．）を、供給者の説明書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドヒドロクロライド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）によって活性化する。抗原を、流量５μｌ／分での注入前に１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）まで希釈して、約１０の応答ユニット（ＲＵ）結合タンパク質を得る。抗原注入後に、１Ｍエタノールアミンを注入して未反応基を遮断する。動力学測定のために、Ｆａｂの２倍連続希釈物（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を、２５℃の０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で、約２５μｌ／分の流量で注入する。会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）は、会合および解離センサグラムを同時に当てはめることによって、簡単な１対１のラングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．２）を使用して計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）は、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算する。たとえばＣｈｅｎ，Ｙ．ら、（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１を参照。上の表面プラズモン共鳴アッセイによって会合速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を超える場合、ここで会合速度は、撹拌キュベットを用いたストップフロー装備分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または８０００シリーズＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で測定されるような、濃度が上昇する抗原の存在下での、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中の２０ｎＭ抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の２５℃における蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）の上昇または低下を測定する蛍光消光技法を使用することによって決定できる。
【００９４】
本発明による「会合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）」、「会合速度（ｒａｔｅ  ｏｆ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）」、「会合速度（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）」、または「ｋｏｎ」は、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−２０００またはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００システム（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して上述のように決定することもできる。
【００９５】
「単離」抗体は、その天然環境の成分から同定および分離ならびに／または回収された抗体である。その天然環境の汚染物質成分は、抗体の診断または処置使用を妨害するであろう物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。好ましい実施形態において、抗体は、（１）ローリー法によって決定されるように、抗体の９５重量％超、および最も好ましくは９９重量％超まで、（２）スピニング・カップ・シークエネータの使用により、Ｎ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（３）クマシーブルーもしくは、好ましくは銀染色を使用する還元または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均質まで精製されるであろう。抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないために、単離抗体は組換え細胞内にインサイチューで抗体を含む。しかし本来、単離抗体は少なくとも１回の精製ステップによって調製される。
【００９６】
「標識」という用語は、本明細書に使用されるときに、「標識」分子を生成するために分子（核酸、ポリペプチド、または抗体）に直接または間接的に接合された検出可能な化合物または組成物を指す。標識は、単独で検出可能であり得るか（たとえば放射性同位体標識または蛍光標識）、または酵素標識の場合は、基質化合物または組成物の化学改変を触媒して検出可能な生成物を生じ得る。
【００９７】
「固相」とは、分子（核酸、ポリペプチド、または抗体など）が接着可能である非水性マトリクスを意味する。本明細書に含まれる固相の例は、一部または全体がガラス（たとえば孔径制御ガラス）、ポリサッカライド（たとえばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコールおよびシリコーンで形成された固相を含む。ある実施形態において、状況に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを含むことができる；他においては、固相は精製カラム（たとえばアフィニティ・クロマトグラフィー・カラム）である。この用語は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，２７５，１４９に記載されている固相などの、別個の粒子で成る不連続固相も含む。
【００９８】
「リポソーム」は、薬物（核酸、ポリペプチド、抗体、アゴニストまたはアンタゴニストなど）の哺乳動物への送達に有用である多様な種類の脂質、リン脂質および／または界面活性剤で構成される小型ベシクルである。リポソームの成分は一般に、生体膜の脂質構成に似た２重層構造で構成されている。
【００９９】
「小型分子」または「小型有機分子」は本明細書では、約５００ダルトン以下の分子量を有する有機分子として定義される。
【０１００】
標的ポリペプチドに結合する「オリゴペプチド」は、オリゴペプチドがポリペプチドを標的とする際に診断薬および／または処置薬として有用であるように、十分な親和性で標的ポリペプチドと結合できるオリゴペプチドである。ある実施形態において、オリゴペプチドが無関係の非標的ポリペプチドに結合する程度は、たとえば表面プラズモン共鳴アッセイによって測定されるように、オリゴペプチドの標的ポリペプチドへの結合の約１０％未満である。ある実施形態において、オリゴペプチドは、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、または≦０．１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）で標的ポリペプチドに結合する。
【０１０１】
標的ポリペプチドに結合する「有機分子」は、有機分子がポリペプチドを標的とする際に診断薬および／または処置薬として有用であるように、十分な親和性で標的ポリペプチドと結合できる、本明細書で定義するようなオリゴペプチドまたは抗体以外の有機分子である。ある実施形態において、有機分子が無関係の非標的ポリペプチドに結合する程度は、たとえば表面プラズモン共鳴アッセイによって測定されるように、有機分子の標的ポリペプチドへの結合の約１０％未満である。ある実施形態において、有機分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、または≦０．１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）で標的ポリペプチドに結合する。
【０１０２】
「生物系」は、共通のシグナル伝達経路を共有する哺乳動物細胞を含むインビトロ、エクスビボ、またはインビトロの系である。
【０１０３】
「微生物障害」は、微生物病原体が疾患また状態の罹患を発生、媒介、またはそうでなければ罹患に寄与する疾患または状態を指す。また、抗微生物応答の刺激または介入が疾患の進行に対して改善効果を有する疾患も含まれる。この用語には、感染性疾患または状態、および微生物病原体による１次感染からの日和見疾患が含まれる。このような感染性疾患の例は、これに限定されるわけではないが、ＥＨＥＣおよびＥＰＥＣ誘発下痢、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）ならびに、さらに詳細には潰瘍性大腸炎（ＵＣ）およびクローン病（ＣＤ）を含む。
【０１０４】
「Ｔ細胞媒介疾患」という用語は、Ｔ細胞が哺乳動物における罹患を直接または間接的に媒介する、またはそうでなければ罹患に寄与する疾患を意味する。Ｔ細胞媒介疾患は、細胞媒介効果、リンホカイン媒介効果などと、およびたとえばＴ細胞によって分泌されたリンホカインによってＢ細胞が刺激される場合には、Ｂ細胞に関連する効果とも関連付けられ得る。
【０１０５】
「自己免疫疾患」または「自己免疫」は、体液性または細胞媒介免疫応答が体自体の組織に対して開始される任意の状態を指す。「ＩＬ−２３媒介自己免疫疾患」は、ＩＬ−２３活性によって発生、維持、または増悪される任意の自己免疫疾患である。
【０１０６】
「炎症」は、通例は疼痛、膨潤、および赤みを生じる、傷害または感染部位における白血球の蓄積および血管の膨張を指す。
【０１０７】
「慢性炎症」は、炎症原因が持続して、除去することが困難または不可能である炎症を指す。
【０１０８】
「自己免疫炎症」は、自己免疫障害に関連する炎症を指す。
【０１０９】
「関節炎症」は、関節炎に関連する炎症を指す。
【０１１０】
「炎症性腸疾患」すなわち「ＩＢＤ」は、胃腸管の炎症を特徴とする慢性障害を指す。ＩＢＤは、大腸および／または直腸に影響を及ぼす潰瘍性大腸炎と、胃腸系全体に影響を及ぼし得るが、より一般的には小腸（回腸）に、そしておそらく大腸に影響を及ぼすクローン病を含む。
【０１１１】
「有効量」という用語は、特定の明示された目的の達成をもたらす分子（たとえば核酸、ポリペプチド、アゴニスト、またはアンタゴニスト）の濃度または量である。「有効量」は経験的に決定され得る。「処置的有効量」は、明示された処置効果を達成するのに有効である分子の濃度または量である。この量も経験的に決定され得る。
【０１１２】
「細胞毒性剤」という用語は本明細書で使用するように、細胞の機能を抑制もしくは防止する、および／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。該用語は、放射性同位体（たとえばＩ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０およびＲｅ１８６）、化学療法剤、および細菌、真菌、植物または動物起源の酵素活性毒素などの毒素、またはその断片を含むことを意図する。
【０１１３】
「増殖抑制剤」は本明細書で使用するときに、細胞、特にインビトロまたはインビボのどちらかで遺伝子のいずれかを過剰発現する細胞の増殖を抑制する化合物または組成物を指す。それゆえ増殖抑制剤は、Ｓ期にこのような遺伝子を過剰発現する細胞のパーセンテージを著しく低下させる薬剤である。増殖抑制剤の例は、Ｇ１停止およびＭ期停止を誘導する薬剤などの、細胞周期進行を（Ｓ期以外の場所で）遮断する薬剤を含む。古典的なＭ期遮断薬は、ビンカ（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、タキソール、ならびにトポＩＩ阻害薬、たとえばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、およびブレオマイシンを含む。Ｇ１期停止させるこれらの薬剤、たとえばＤＮＡアルキル化剤、たとえばタモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、およびａｒａ−Ｃは、Ｓ期停止にも波及する。さらなる情報は、ＭｕｒａｋａｍｉらによるＴｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  ａｎｄ  Ｉｓｒａｅｌ，ｅｄｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １，ｅｎｔｉｔｌｅｄ“Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｏｎｃｏｇｅｎｓ，ａｎｄ  ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ”（ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９５）の特にｐ．１３に見出される。
【０１１４】
「サイトカイン」という用語は、細胞間媒介物質として別の細胞集合に作用する１つの細胞集合によって放出されるタンパク質の総称である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインには、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝臓成長因子；線維芽成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子−αおよび−β；リンホトキシン−αおよび−β、ミュラー管抑制因子；マウス生殖腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−βなどの神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β等のトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘発因子；インターフェロン−α、−β、および−γなどのインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３などのインターロイキン（ＩＬ）；ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βなどの腫瘍壊死因子；ならびにＬＩＦおよびキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子が含まれる。本明細書で使用するように、サイトカインという用語は、天然源からのまたは組換え細胞培養物からのタンパク質ならびに未変性配列サイトカインの生物活性等価物を含む。
【０１１５】
本明細書で使用するように、「炎症細胞」という用語は、単核細胞、好酸球、マクロファージ、および多形核好中球（ＰＭＮ）などの炎症反応を増強する細胞を示す。
【０１１６】
ＩＩ．本発明の組成物および方法
Ａ．抗微生物ポリペプチド（ＡＭＰ）およびその調節因子
本発明の抗微生物ポリペプチド（ＡＭＰ）は、微生物病原体に対する抗微生物免疫応答を媒介、またはそうでなければ抗微生物免疫応答に影響を及ぼすポリペプチドである。本発明のＡＭＰは、これに限定されるわけではないが、ＬＴ、ＩＬ−６、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３（たとえばＩＬ−２３ｐ１９またはＩＬ−２３ｐ４０を含む）およびＲｅｇスーパーファミリーの遺伝子によってコードされたＲｅｇまたはＲｅｇ関連タンパク質を含む。Ｒｅｇスーパーファミリーは、ヒト、ラット、およびマウスによるＲｅｇおよびＲｅｇ関連遺伝子を含み、４つのサブクラスであるタイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶに分類される。たとえばタイプＩは、ヒトＲＥＧ  Ｉα、ヒトＲＥＧ  Ｉβ、ラットＲｅｇ  Ｉ、およびマウスＲｅｇ  Ｉを含む；タイプＩＩは、Ｒｅｇ  ＩＩを含む；タイプＩＩＩは、ヒトＲＥＧ  ＩＩＩ、ヒトＨＩＰ／ＰＡＰ（肝細胞癌−小腸−膵臓で発現された遺伝子／膵炎関連タンパク質をコードする遺伝子）、ラットＰＡＰ／Ｐｅｐｔｉｄｅ２３、ラットＲｅｇ  ＩＩＩ／ＰＡＰ  ＩＩ、ラットＰＡＰ  ＩＩＩ、マウスＲｅｇ  ＩＩＩα、Ｒｅｇ  ＩＩＩβ、Ｒｅｇ  ＩＩＩγ、マウスＲｅｇ  ＩＩＩδ、およびハムスターＩＮＧＡＰ（小島新生関連タンパク質）を含む。タイプＩＶは、ヒトＲＥＧ  ＩＶを含有する。さらに、ヒトＲｅｇ関連配列（ＲＳ）は報告によれば、偽遺伝子である。一実施形態において、ＲＥＧタンパク質は、これに限定されるわけではないが、ＲＥＧ  Ｉα、ＲＥＧ  Ｉβ、ＨＩＰ／ＰＡＰ、ＲＥＧ  ＩＩＩ、ＲＥＧ  ＩＶ、およびＲｅｇ関連配列（ＲＳ）を含むヒトＲＥＧ遺伝子ファミリーのメンバーによってコードされる。
【０１１７】
いくつかの態様において、本発明のＡＭＰのアミノ酸配列は、次の群：配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、および配列番号５６から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１１８】
他の態様において、本発明のＡＭＰをコードする核酸配列は、次の群：配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、および配列番号５５から選択される核酸配列を含む。
【０１１９】
本発明のＡＭＰの活性は、別のＡＭＰまたは同じＡＭＰの活性と比較して、上昇もしくは低下させるおよび／または異なって制御することができる。本発明のＡＭＰの活性の例は、これに限定されるわけではないが、ＡＭＰ発現、シグナル伝達、結合パートナーへの結合、抗微生物応答、またはその他の生物もしくは免疫活性を含む。
【０１２０】
一実施形態において、本発明の１つ以上のＡＭＰの活性の上昇は、対象における抗微生物免疫応答の向上または誘導を生じる。
【０１２１】
一実施形態において、本発明のＡＭＰは、これに限定されるわけではないが、ＩＬ−２２と直接または間接的に相互作用するポリペプチド、たとえば微生物病原体（たとえば細菌またはウイルス）による感染に対する宿主抵抗性を媒介するＩＬ−２２シグナル伝達経路の上流または下流であるポリペプチドを含む。このようなＡＭＰの例は、これに限定されるわけではないが、ＬＴ、ＩＬ−６、ＩＬ−１８、およびＩＬ−２３（たとえばＩＬ−２３ｐ１９またはＩＬ−２３ｐ４０を含む）を含む。
【０１２２】
本発明の調節因子は、これに限定されるわけではないが、ＡＭＰの活性を直接または間接的に調節するポリペプチドおよび核酸分子（たとえばＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子）を含む。このような調節の例は、これに限定されるわけではないが、本発明のＡＭＰの活性の上昇、低下、誘導または活性化、抑制、または制御（たとえば上方または下方制御）を含む。
【０１２３】
詳細な実施形態において、調節因子は、ＩＬ−２２結合タンパク質（ＢＰ）活性を低下または抑制することによってＩＬ−２２活性を間接的に調節して、それによりＩＬ−２２活性を上昇させる。さらなる実施形態において、調節因子は、ＩＬ−２２ＢＰのＩＬ−２２に対する結合を低下または抑制して、それによりＩＬ−２２活性を上昇させる。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、調節因子は、ポリペプチド、たとえばＡＭＰと結合するか、またはそうでなければＡＭＰと相互作用して、ＡＭＰの活性を上昇、誘導または制御するポリペプチドである。一実施形態において、調節因子は、ＡＭＰの活性を調節する融合ポリペプチドである。
【０１２５】
一実施形態において、調節因子は、ＡＭＰに結合する抗体である。詳細な実施形態において、抗体はモノクローナル抗体である。別の実施形態において、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、または（Ｆａｂ’）２断片から選択される抗体断片である。別の実施形態において、抗体は融合ポリペプチド（たとえばＦｃ融合ポリペプチド）である。別の実施形態において、抗体はキメラ抗体である。詳細な実施形態において、抗体はヒト化である。別の実施形態において、抗体はヒト抗体である。別の実施形態において、抗体は、ヒト、非ヒト霊長類、または他の哺乳動物（たとえばブタ、ヒツジ、ウサギ、マーモット、ラット、またはマウス）から選択される抗体と同じエピトープに結合する。詳細な実施形態において、抗体はＡＭＰアゴニストである。
【０１２６】
別の詳細な実施形態において、調節因子は、組換えＡＭＰまたはＡＭＰをコードする核酸分子（たとえばＤＮＡまたはＲＮＡ分子）である。
【０１２７】
別の詳細な実施形態において、調節因子は、細胞内で発現可能である組換えＡＭＰまたはＡＭＰをコードする核酸分子（たとえばＤＮＡまたはＲＮＡ分子）である。
【０１２８】
本発明のＡＭＰは、未変性全長または成熟ＡＭＰはもちろんのこと、その変異体も含む。ＡＭＰ変異体は、ＡＭＰをコードするＤＮＡ中に適切なヌクレオチド変化を導入することによって、および／または所望の抗微生物ポリペプチドの合成によって調製できる。当業者は、アミノ酸変化が、グルコシル化部位の数および位置の変化または膜結合特徴の改変などの、本発明のポリペプチドの翻訳後処理を改変し得ることを認識するであろう。
【０１２９】
未変性ＡＭＰまたはＡＭＰの各種ドメインにおける変異は、本明細書に記載するように、たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，３６４，９３４で述べられている、たとえば保存的および非保存的突然変異の技法およびガイドラインのいずれかを使用して作製できる。変異は、未変性配列ＡＭＰと比較して、ＡＭＰのアミノ酸配列に変化を生じる、ＡＭＰをコードする１つ以上のコドンの置換、欠失または挿入であり得る。場合により、変異は、ＡＭＰの１つ以上のドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸の、その他のアミノ酸による置換による。所望の活性に悪影響を及ぼさずに挿入、置換または欠失され得るアミノ酸残基を決定する際の指針は、ＡＭＰの配列を相同の公知のタンパク質分子の配列と比較して、相同性の高い領域で作製されるアミノ酸配列の変化の数を最小限にすることによって見出され得る。アミノ酸置換は、１つのアミノ酸を、ロイシンのセリンによる置換、すなわち保存的アミノ酸置換などの、同様の構造および／または化学特性を有する別のアミノ酸によって置換された結果であり得る。挿入または欠失は場合により、約１〜５アミノ酸の範囲であり得る。許容される変異は、配列におけるアミノ酸の挿入、欠失または置換を系統的に行い、得られた変異体を全長または成熟未変性配列によって示される活性に関して試験することによって決定され得る。
【０１３０】
詳細な実施形態において、興味のある保存的置換を、表３で好ましい置換の見出しの下に示す。このような置換が生物活性の変化を生じる場合には、表６で例示的な置換と命名された、またはアミノ酸クラスに関連してさらに後述するような、より実質的な変化が導入され得て、生成物がスクリーニングされる。
【０１３１】
【表３】
0005985150.tif 000004
ＡＭＰポリペプチドの機能または免疫同一性の実質的な修飾は、（ａ）たとえばシートまたはらせん状立体配座としての、置換範囲のポリペプチド主鎖の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさ高性の維持に対するその効果が著しく異なる置換を選択することによって達成される。天然型アミノ酸残基は、共通の側鎖特性に基づいてグループに分けられる：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【０１３２】
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することを必要とするであろう。このような置換残基はまた、保存的置換部位へ、またはさらに好ましくは残存（非保存）部位へ導入され得る。
【０１３３】
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャニング、およびＰＣＲ突然変異誘発などの当分野で公知の方法を使用して作製できる。部位特異的突然変異誘発［Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：４３３１（１９８６）；Ｚｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１０：６４８７（１９８７）］、カセット突然変異誘発［Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ，３４：３１５（１９８５）］、制限選択突然変異誘発［Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  ＳｅｒＡ，３１７：４１５（１９８６）］または他の公知の技法がクローン化ＤＮＡに実施されて、変異体ＡＭＰをコードするＤＮＡを産生できる。
【０１３４】
本発明のＡＭＰまたは他のポリペプチドの断片も本明細書で提供される。このような断片は、Ｎ末端もしくはＣ末端で切断され得るか、またはたとえば全長未変性タンパク質と比較したときに内部残基を欠失し得る。ある断片は、本発明のＡＭＰまたはポリペプチドの所望の生物活性に必須ではないアミノ酸残基を欠失している。したがって、ある実施形態において、本発明のＡＭＰまたは他のポリペプチドの断片は、生物活性である。ある実施形態において、全長ＡＭＰの断片は、Ｎ末端シグナルペプチド配列を欠失している。ある実施形態において、全長ＡＭＰの断片は、膜結合ＡＭＰの可溶形である。たとえばＡＭＰの可溶形は、膜貫通ドメインの全部または実質的な部分を欠失し得る。
【０１３５】
本発明のＡＭＰまたは他のポリペプチドの共有修飾は、本発明の範囲内に含まれる。共有修飾の１つの種類は、本発明のポリペプチドの標的化アミノ酸残基を、ポリペプチドの選択された側鎖あるいはＮまたはＣ末端残基と反応可能である有機誘導体化剤と反応させるステップを含む。２官能性薬剤による誘導体化は、たとえばポリペプチドに対して抗体を精製する方法に使用する際に、ポリペプチドを非水溶性支持マトリクスまたは表面に架橋するために、および逆の場合に有用である。よく使用される架橋剤はたとえば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、たとえば４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステルを含むホモ２官能性イミドエステル、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの２官能性マレイミドおよびメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの薬剤を含む。
【０１３６】
他の修飾としては、グルタミニル残基およびアスパラギニル残基の、それぞれ対応するグルタミル残基およびアスパルチル残基への脱アミド化、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のホスホリル化、リジン、アルギニン、ならびにヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化［Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３）］、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【０１３７】
本発明の範囲内に含まれる本発明のポリペプチドの別の種類の共有修飾は、ポリペプチドの未変性グリコシル化パターンを改変することを含む。「未変性グリコシル化パターンを改変すること」は、本明細書の目的では、本発明のポリペプチドの未変性配列に見出される１つ以上の炭水化物部分を欠失させること（たとえば内在するグリコシル化部位を欠失させること、または化学的および／もしくは酵素的手段によってグリコシル化を欠失させることのどちらかによって）、および／またはポリペプチドの未変性配列には存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加することを意図する。さらに、該句は、存在する各種の炭水化物部分の性質および割合の変化を含む、未変性タンパク質のグリコシル化の定性的変化を含む。
【０１３８】
本発明のポリペプチドは、別の異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合されたポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法でも修飾され得る。一実施形態において、キメラ分子は、ポリペプチドと、抗タグ抗体が選択的に結合可能であるエピトープを提供するタグポリペプチドとの融合物を含む。エピトープタグは一般に、ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に位置する。ポリペプチドのこのようなエピトープ標識形の存在は、標識ポリペプチドに対する抗体を使用して検出できる。またエピトープタグの供給によって、ＡＭＰは、抗タグ抗体またはエピトープタグに結合する他の種類のアフィニティーマトリクスを使用するアフィニティー精製によって容易に精製できる。各種のタグポリペプチドおよびその各抗体が当分野で周知である。例は、ポリ−ヒスチジン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ）またはポリ−ヒスチジン−グリシン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；ｆｌｕ  ＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５［Ｆｉｅｌｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：２１５９−２１６５（１９８８）］；ｃ−ｍｙｃタグおよびこれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体［Ｅｖａｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：３６１０−３６１６（１９８５）］；ならびに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体［Ｐａｂｏｒｓｋｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３（６）：５４７−５５３（１９９０）］を含む。他のタグポリペプチドは、Ｆｌａｇペプチド［Ｈｏｐｐら、Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１２０４−１２１０（１９８８）］；ＫＴ３エピトープペプチド［Ｍａｒｔｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：１９２−１９４（１９９２）］；チューブリンエピトープペプチド［Ｓｋｉｎｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１５１６３−１５１６６（１９９１）］；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３９３−６３９７（１９９０）］を含む。
【０１３９】
別の実施形態において、キメラ分子は、本発明のポリペプチドと免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定の領域との融合物を含み得る。キメラ分子の２価形（「イムノアドヘシン」とも呼ばれる）では、このような融合物はＩｇＧ分子のＦｃ領域に対してであり得る。Ｉｇ融合物は好ましくは、Ｉｇ分子内の少なくとも１つの可変領域の代わりに、本発明のポリペプチド（たとえばＡＭＰまたはそのポリペプチド調節因子）の可溶形の置換を含む。特に好ましい実施形態において、免疫グロブリン融合物は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３、またはヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合物の産生については、１９９５年６月２７日に発行されたＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，４２８，１３０も参照。
【０１４０】
１．ポリペプチドの調製
本発明のポリペプチドは、通常の組換え方法、たとえばＡＭＰまたはそのポリペプチド調節因子をコードする核酸を含有するベクターによって形質転換またはトランスフェクトされた細胞を培養することによって調製され得る。任意のこのようなベクターを含む宿主細胞も提供する。一例として、宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌、または酵母である。本明細書に記載したポリペプチドのいずれかを産生するプロセスがさらに提供され、所望のポリペプチドの発現に好適な条件下で宿主細胞を培養するステップと、細胞培養物から所望のポリペプチドを回収するステップとを含む。
【０１４１】
他の実施形態において、本発明は、異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合された本明細書に記載したポリペプチドのいずれかを含むキメラ分子を提供する。このようなキメラ分子の例は、これに限定されるわけではないが、エピトープタグ配列または免疫グロブリンのＦｃ領域に融合された本明細書に記載したポリペプチドのいずれかを含む。
【０１４２】
当分野で周知の代わりの方法を利用して、本発明のポリペプチドが調製され得る。たとえばポリペプチドまたはその一部をコードする配列は、固相技法を使用する直接ペプチド合成によって産生され得る［たとえばＳｔｅｗａｒｔら、Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ（１９６９）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５４（１９６３）を参照］。インビトロタンパク質合成は、手動技法を使用して、または自動化によって実施され得る。自動化合成はたとえば、製造者の説明書を用いてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して達成され得る。本発明のポリペプチドの各種の部分またはその一部は、個別に化学的に合成され、全長ポリペプチドまたはその一部を産生する化学的または酵素的方法を使用して組合され得る。
【０１４３】
本発明の組換え発現ポリペプチドは、培養培地からまたは宿主細胞溶解液から回収され得る。次の手順：イオン交換カラムの分画による；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカまたはＤＥＡＥなどのカチオン交換樹脂によるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；たとえばＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を使用するゲル濾過；ＩｇＧなどの汚染物質を除去するタンパク質Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム；および本発明のポリペプチドのエピトープ標識形を結合するメタキレーティングカラムは、好適な精製手順の例である。タンパク質精製の各種の方法が利用されることがあり、このような方法は当分野で公知であり、たとえばＤｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８２（１９９０）；Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）に記載されている。選択する精製ステップは、たとえば使用する産生プロセスの性質および産生する特定のポリペプチドによって変わるであろう。ＬＴポリペプチドは、たとえばＬＴα標識ポリペプチド（配列番号６１）などの標識ＬＴポリペプチドを発現することによって精製され得る。
【０１４４】
２．遺伝子発現の検出
本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、当分野の各種の方法によって、たとえばポリペプチドをコードするｍＲＮＡの発現を検出することによって検出できる。本明細書で使用するように、「検出すること」という用語は、定量的または定性的検出を含む。本発明のポリペプチドの遺伝子発現を検出することによって、たとえばこの遺伝子を発現する組織を同定できる。遺伝子発現は、当業者に公知のある方法、たとえば本明細書で提供される配列に基づいて、適切に標識されたプローブを使用する、ノザンブロッティング（Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：５２０１  ５２０５［１９８０］）；定量的ＰＣＲ；またはインサイチューハイブリダイゼーションを使用して測定され得る。または遺伝子発現は、遺伝子産物の発現を直接定量するために、免疫学的方法、たとえば組織切片の免疫組織化学的染色および細胞培養物または体液のアッセイによって測定され得る。免疫組織化学的染色およびサンプル液のアッセイに有用な抗体は、本明細書で提供する抗体のいずれも含む。好都合には、抗体は、たとえば本発明のＡＭＰをコードする未変性配列に対して；ＡＭＰ配列の断片を含む合成ペプチドに対して；または（合成ペプチドを含む）ＡＭＰポリペプチドまたはその断片に融合される外因性配列に対して調製され得る。
【０１４５】
Ｂ．抗体
上述および後述のポリペプチドのいずれかに結合する抗体が提供される。一実施形態において、単離抗体は、本発明のＡＭＰに結合して、それによりＡＭＰ活性を調節する、たとえばＡＭＰの活性を上昇させる。例示的な抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、ヒト、２重特異性、およびヘテロ接合抗体を含む。抗体は、抗体断片、たとえばＦａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、または（Ｆａｂ’）２断片であり得る。一実施形態において、ＩＬ−２２に結合する単離抗体が提供される。このような一実施形態において、抗体は、本発明のＡＭＰの活性を部分的にまたは完全に上昇させる。
【０１４６】
本発明のＡＭＰを結合する例示的なモノクローナル抗体は、本明細書に記載する。これらの抗体は、３Ｆ１１．３（「３Ｆ１１」）、１１Ｈ４．４（「１１Ｈ４」）、および８Ｅ１１．９（「８Ｅ１１」）と呼ばれる抗ＩＬ−２２抗体、ならびに７Ｅ９．１０．８（「７Ｅ９」）、８Ａ１２．３２（「８Ａ１２」）、８Ｈ１１．３２．２８（「８Ｈ１１」）、および１２Ｈ５と呼ばれる抗Ｉｌ−２２Ｒ抗体を含む。一実施形態において、これらの抗体のいずれかを産生するハイブリドーマが提供される。一実施形態において、ＩＬ−２２への結合で３Ｆ１１．３、１１Ｈ４．４、または８Ｅ１１．９と競合するモノクローナル抗体が提供される。別の実施形態において、３Ｆ１１．３、１１Ｈ４．４、または８Ｅ１１．９と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体が提供される。別の実施形態において、ＩＬ−２２Ｒへの結合で７Ｅ９、８Ａ１２、８Ｈ１１、または１２Ｈ５と競合するモノクローナル抗体が提供される。一実施形態において、７Ｅ９、８Ａ１２、８Ｈ１１、または１２Ｈ５と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体が提供される。抗体の各種の実施形態は下に与える：
１．ポリクローナル抗体
抗体は、ポリクローナル抗体を含み得る。ポリクローナル抗体を調製する方法は当業者に公知である。ポリクローナル抗体は、たとえば免疫剤、および所望ならばアジュバントの１回以上の注射によって哺乳動物にて産生できる。通例、免疫剤および／またはアジュバントは、複数回の皮下または腹腔内注射によって哺乳動物に注射されるであろう。免疫剤は、興味のあるポリペプチドまたはその融合タンパク質を含み得る。免疫化される哺乳動物において免疫原性であることが公知のタンパク質に、免疫剤を接合することが有用であり得る。このような免疫原性タンパク質の例は、これに限定されるわけではないが、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、およびダイズトリプシン阻害薬を含む。利用され得るアジュバントの例としては、フロイント完全アジュバントおよびＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピッドＡ、合成トレハロースジコリノミコレート）が挙げられる。免疫プロトコルは、過度の実験をすることなく、当業者によって選択され得る。
【０１４７】
２．モノクローナル抗体
抗体はまたは、モノクローナル抗体であり得る。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって記載されるようなハイブリドーマ法を使用して調製され得る。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物は通例、免疫剤に特異的に結合する抗体を産生する、または産生可能であるリンパ球を誘発するために免疫剤によって免疫化される。またはリンパ球はインビトロで免疫化され得る。
【０１４８】
免疫剤は、興味のあるポリペプチドまたはその融合タンパク質を含むであろう。一般に、ヒト起源の細胞が所望の場合は、末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）は使用されるか、または非ヒト哺乳動物起源が所望の場合に、脾臓細胞もしくはリンパ節細胞が使用されるかのどちらかである。リンパ球は次に、ハイブリドーマ細胞を形成するために、適切な融合剤、たとえポリエチレングリコールを使用して不死化細胞株と融合される［Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）ｐｐ．５９−１０３］。不死化細胞株は通常、形質転換された哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウス骨髄腫株化細胞が利用される。ハイブリドーマ細胞は、未融合の不死化細胞の増殖または生存を抑制する１つ以上の物質を好ましくは含有する適切な培養培地中で培養され得る。たとえば親細胞に酵素ヒポキサンチングアニンホスホリルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）が欠乏している場合、ハイブリドーマの培養培地は通例、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（「ＨＡＴ培地」）を含み、この物質は、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を防止する。
【０１４９】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合して、選択した抗体産生細胞によって抗体の安定な高レベル発現を支援し、ＨＡＴ培地などの培地に感受性である細胞である。さらに好ましい不死化株化細胞は、たとえばｔｈｅ  Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａおよびｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａから入手できる、マウス骨髄腫株である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒト異種骨髄腫株化細胞も、ヒトモノクローナル抗体の産生に関して記載されている［Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８７）ｐｐ．５１−６３］。
【０１５０】
ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地は次に、興味のあるポリペプチドに結合するモノクローナル抗体の存在についてアッセイできる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、またはインビトロ結合アッセイ、たとえばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定される。このような技法およびアッセイは当分野で公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、たとえばＳｃａｔｃｈａｒｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｕｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）によって決定できる。
【０１５１】
所望のハイブリドーマ細胞を同定した後に、クローンは限界希釈手順によってサブクローニングして、標準方法によって培養され得る［Ｇｏｄｉｎｇ，同上］。この目的での好適な培地はたとえば、ダルベッコ変法イーグル培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。またはハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として増殖され得る。
【０１５２】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、培養培地または腹水液から、慣習的な免疫グロブリン精製手順、たとえばタンパク質Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィーによって単離または精製され得る。
【０１５３】
モノクローナル抗体は、所望の１つまたは複数の活性を備えた抗体をスクリーニングするためにコンビナトリアルライブラリを使用して作製できる。たとえば、ファージ提示ライブラリを生成して、このようなライブラリで所望の結合特徴を有する抗体をスクリーニングする各種の方法が当分野で公知である。このような方法は一般に、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（２００１）ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら、ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）に、およびある実施形態では、Ｌｅｅら（２００４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０：１０７３−１０９３に記載されている。
【０１５４】
原則として、合成抗体クローンは、ファージコートタンパク質に融合した抗体可変領域（Ｆｖ）の各種の断片を提示するファージを含有するファージライブラリをスクリーニングすることによって選択される。このようなファージライブラリは、所望の抗原に対するアフィニティクロマトグラフィーによってパニングされる。所望の抗原に結合可能であるＦｖ断片を発現するクローンは、抗原に吸着され、それゆえライブラリ内の非結合クローンから分離される。結合クローンは次に抗原から溶離されて、抗原吸着／溶離のさらなるサイクルによってさらに濃縮することができる。本発明の抗体のいずれも、興味のあるファージクローンについて選択するための好適な抗原スクリーニング手順の設計と、続いての、興味のあるファージクローンのＦｖ配列およびＫａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１−３に記載されている好適な定常領域（Ｆｃ）配列を使用する全長抗体クローンの構築とによって得ることができる。
【０１５５】
モノクローナル抗体は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，８１６，５６７に記載されている方法などの、組換えＤＮＡ法によっても作製され得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、慣習的な手順を使用して（たとえばマウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、ただちに単離および配列決定できる。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として作用する。ＤＮＡはいったん単離されると発現ベクター内に配置されて、発現ベクターは次に、トランスフェクトされなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない、シミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトされて、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を行う。ＤＮＡは、たとえば相同マウス配列をヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列で置換することによっても［Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，８１６，５６７；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、同上］、または免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部または一部を共有結合することによっても修飾され得る。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに対して置換できるか、またはキメラ２価抗体を生成するために本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに対して置換できる。
【０１５６】
３．１価抗体
１価抗体も提供される。１価抗体を調製する方法は当分野で周知である。たとえば１つの方法は、免疫グロブリン軽鎖および修飾された重鎖の組換え発現を含む。重鎖は、重鎖架橋を防止するために、一般にＦｃ領域内の任意の箇所で切断される。または関連するシステイン残基は、架橋を防止するために、別のアミノ酸残基によって置換されるか、または除去される。
【０１５７】
１価抗体を調製するには、インビトロ法も好適である。その断片、特にＦａｂ断片を産生するための抗体の消化は、当分野で公知の通常の技法を使用して達成できる。
【０１５８】
４．抗体断片
抗体断片も提供される。抗体断片は、酵素消化などの慣習的な手順によって、または組換え技法によって生成され得る。ある状況では、抗体全体よりも、抗体断片を使用することに利点がある。断片のサイズがより小さいと、迅速なクリアランスが可能となり、固形腫瘍へのアクセス改善がもたらされ得る。ある抗体断片の総説については、Ｈｕｄｓｏｎら（２００３）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４を参照。
【０１５９】
抗体断片の産生のために各種の技法が開発されてきた。慣習的には、これらの断片は、無処置抗体のタンパク質分解消化によって得られる（たとえばＭｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９２）；およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照）。しかしこれらの断片は今や、組換え宿主細胞によって直接産生できる。Ｆａｂ，ＦｖおよびＳｃＦｖ抗体断片はすべて、大腸菌において発現および分泌されることが可能であり、それによりこれらの断片を大量に産生することが容易となる。抗体断片は、上述の抗体ファージライブラリから単離できる。またはＦａｂ’−ＳＨ断片を大腸菌から直接回収して、化学的に結合してＦ（ａｂ’）２断片を形成することができる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２））。別の手法により、Ｆ（ａｂ’）２断片は、組換え宿主細胞培養物から直接単離できる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含む、インビボ半減期が延長されたＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，８６９，０４６に記載されている。抗体断片産生の他の技法は、熟練開業医に明らかとなるであろう。ある実施形態において、抗体は単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ  ９３／１６１８５；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，５７１，８９４；および５，５８７，４５８を参照。ＦｖおよびｓｃＦｖは、定常領域のない無処置結合部位を備えた唯一の種である；それゆえそれらは、インビボ使用中に低下した非特異的結合に好適であり得る。ｓｃＦｖ融合タンパク質は、ｓｃＦｖのアミノ末端またはカルボキシ末端のどちらかにおいて、エフェクタタンパク質の融合を生じるために構築され得る。Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｅｄ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ、同上を参照。抗体断片は、たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，６４１，８７０に記載されているように、「線形抗体」でもあり得る。このような線形抗体は、単一特異性または２重特異性であり得る。
【０１６０】
５．ヒト化抗体
ヒト化抗体も提供される。非ヒト抗体をヒト化する各種の方法が当分野で公知である。たとえばヒト化抗体は、非ヒトである供給源からその中に導入された１つ以上のアミノ酸残基を有することができる。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「インポート」残基と呼ばれることが多く、通例、「インポート」可変領域から得られる。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６）に従って、超可変領域配列でヒト抗体の対応する配列を置換することにより本質的に実施できる。したがって、このような「ヒト化」抗体はキメラ抗体であり（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，８１６，５６７）、ここで実質的に無処置ヒト可変ドメイン未満が非ヒト種からの対応する配列によって置換されている。実際に、ヒト化抗体は通例、一部の超可変領域残基およびおそらく一部のＦＲ残基がげっ歯類抗体中の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
【０１６１】
ヒト化抗体を作製するために使用される、軽鎖および重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低下させるために重要であり得る。いわゆる「ベストフィット」法に従って、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列は、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングされる。げっ歯類の配列に最も近いヒト配列は次に、ヒト化抗体のヒトフレームワークとして受入れられる（Ｓｉｍｓら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１。別の方法は、軽鎖および重鎖の特定のサブグループのヒト抗体すべてのコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークが、いくつかの異なるヒト化抗体に使用され得る（Ｃａｒｔｅｒら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５；Ｐｒｅｓｔａら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３。
【０１６２】
抗体が抗原に対する高い親和性および他の好ましい生物特性の保持によってヒト化されることが、さらに一般に望ましい。１つの方法によってこの目標を達成するために、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の３次元モデルを使用する、親配列および各種の概念的ヒト化生成物の分析のプロセスによって調製される。３次元免疫グロブリンモデルは、一般に利用可能であり、当業者が精通している。選択した候補免疫グロブリン配列の考えられる３次元立体配座構造を図解および表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示を検討することによって、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の見込まれる役割の分析、すなわち候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。このようにして、ＦＲ残基は、標的抗原への親和性上昇などの所望の抗原特徴が達成されるように、レシピエントおよびインポート配列から選択されて組合されることができる。一般に、超可変領域残基は、抗原結合に直接および最も実質的に関与する。
【０１６３】
６．ヒト抗体
ヒト抗体も提供される。ヒト抗体は、ヒト由来ファージ提示ライブラリから選択したＦｖクローン可変ドメイン配列を上述の公知のヒト定常ドメイン配列と組合せることによって構築できる。または本発明のヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法によって作製できる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫およびマウス−ヒト異種骨髄腫株化細胞はたとえば、Ｋｏｚｂｏｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）；およびＢｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）に記載されている。
【０１６４】
免疫化時に内因性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の全レパートリーを産生できるトランスジェニック動物（たとえばマウス）を産生することが、今や可能である。たとえば、キメラおよび生殖系列ミュータントマウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合欠失は、内因性抗体産生の完全な抑制を生じることが記載されている。このような生殖系列ミュータントマウスへのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生を引き起こすであろう。たとえばＪａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：３３（１９９３）を参照。
【０１６５】
ヒト抗体が開始非ヒト抗体と同様の親和性および特異性を有する遺伝子シャッフリングも、非ヒト、たとえばげっ歯類抗体からヒト抗体を誘導するために使用できる。「エピトープインプリンティング」とも呼ばれるこの方法により、本明細書に記載されるようなファージ提示技法によって得た非ヒト抗体断片の重鎖または軽鎖可変領域のどちらかが、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーと置換され、非ヒト鎖／ヒト鎖ｓｃＦｖまたはＦａｂキメラの集合を生成する。抗原を用いた選択によって、ヒト鎖が１次ファージ提示クローンにおける対応する非ヒト鎖の除去時に破壊された抗原結合部位を回復させる、非ヒト鎖／ヒト鎖キメラｓｃＦｖまたはＦａｂの単離が行われ、すなわちエピトープはヒト鎖パートナーの選択を支配（インプリント）する。残存する非ヒト鎖を置換するためにプロセスが反復されるときに、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日に公開されたＰＣＴ  ＷＯ  ９３／０６２１３を参照）。ＣＤＲグラフト法による非ヒト抗体の慣習的なヒト化とは異なり、この技法によって、非ヒト起源のＦＲまたはＣＤＲ残基を有さない完全なヒト抗体が得られる。
【０１６６】
７．２重特異性抗体
２重特異性抗体も提供される。２重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗体に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある実施形態において、２重特異性抗体はヒト抗体またはヒト化抗体である。ある実施形態において、結合特異性の一方は興味のあるポリペプチドに対してであり、他方はその他の抗原に対してである。ある実施形態において、２重特異性抗体は、興味のあるポリペプチドの２つの異なるエピトープに結合し得る。細胞表面ポリペプチドなどの興味のあるポリペプチドを発現する細胞に対する細胞毒性剤を局在化させるためにも、２重特異性抗体が使用され得る。このような抗体は、ＴＡＴ２２６結合アームと、たとえばサポニン、抗インターフェロンα、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサートまたは放射性同位体ハプテンなどの細胞毒性剤を結合するアームとを所有する。２重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片（たとえばＦ（ａｂ’）２  ２重特異性抗体）として調製できる。
【０１６７】
２重特異性抗体を作製する方法は当分野で公知である。慣習的に、２重特異性抗体の組換え産生は、２つの重鎖が異なる特異性を有する、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づく（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７（１９８３））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな組合せのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）によって、１０の異なる抗体分子の潜在的な混合物が産生され、その１つのみが正しい２重特異性構造を有する。通常はアフィニティクロマトグラフィーで実施される正しい分子の精製は、どちらかと言えば煩雑であり、生成物の収率は低い。同様の手順は、１９９３年５月１３日に公開されたＷＯ  ９３／０８８２９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：３６５５（１９９１）に開示されている。
【０１６８】
異なる手法により、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を持つ抗体可変領域が免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。融合はたとえば、少なくともヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の部分を含む、免疫グロブリン重鎖定常ドメインによる。ある実施形態において、軽鎖結合に必要な部位を含有する第１重鎖定常領域（ＣＨ１）は、融合の少なくとも１つに存在する。免疫重鎖融合および、所望ならば免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別の発現ベクター内に挿入されて、好適な宿主生物中へ同時トランスフェクトされる。このことによって、構造内で使用された３つのポリペプチド鎖の比が等しくないことにより最適収率が得られる実施形態において、３つのポリペプチド断片の相互割合を調整する際に高い柔軟性が与えられる。しかし、同じ比の少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現によって高い収率が生じるとき、または比が特に重要でないときには、２つまたは３つすべてのポリペプチド鎖に対するコード配列を１つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【０１６９】
この手法の一実施形態において、２重特異性抗体は、一方のアームにおける第１の結合特異性を備えたハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームにおける（第２の結合特異性を備えた）ハイブリッド免疫グロブリン軽鎖とで構成される。２重特異性分子の半分のみに免疫グロブリン軽鎖が存在することで容易な分離方法が提供されるため、この非対称構造によって、望ましくない免疫グロブリン鎖組合せからの所望の２重特異性化合物の分離が促進される。この手法はＷＯ  ９４／０４６９０に開示されている。２重特異性抗体生成のさらなる詳細事項については、たとえばＳｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照。
【０１７０】
別の手法により、抗体分子の対の間の界面は、組み換え細胞培養物から回収されるヘテロ２量体のパーセンテージを最大にするように設計できる。界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子からの１個以上の小型アミノ酸側鎖がより大型の側鎖（たとえばチロシンまたはトリプトファン）によって置換される。大型側鎖に対する同じまたは同様のサイズの代償性「空洞」が、大型アミノ酸側鎖をより小型の側鎖（たとえばアラニンまたはトレオニン）と置換することによって、第２の抗体分子の界面上に作製される。これはホモ２量体などの他の望ましくない最終生成物よりもヘテロ２量体の収率を向上させるための機構を提供する。
【０１７１】
２重特異性抗体は、架橋または「ヘテロ接合」抗体を含む。たとえばヘテロ接合体における抗体の一方をアビジンに、他方をビオチンに結合させることができる。このような抗体はたとえば、望ましくない細胞に対する免疫系細胞を標的にするために（ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，６７６，９８０）、およびＨＩＶ感染症の処置のために（ＷＯ  ９１／００３６０、ＷＯ  ９２／００３７３、およびＥＰ  ０３０８９）提案されている。ヘテロ接合抗体は、任意の好都合な架橋法を使用して作製され得る。好適な架橋剤は当分野で公知であり、いくつかの架橋技法と共にＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，６７６，９８０に開示されている。
【０１７２】
抗体断片から２重特異性抗体を生成するための技法も文献に記載されている。たとえば二重特異性抗体は、化学結合を使用して調製できる。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）は、無処置抗体をタンパク質分解により切断してＦ（ａｂ’）断片を産生する手順について記載している。このような断片は、近接するジチオールを安定化させて、分子間ジスルフィド形成を防止するために、ジチオール錯化剤の亜ヒ酸ナトリウムの存在化で還元される。産生されたＦａｂ’断片は次に、チオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）に変換される。Ｆａｂ−ＴＮＢ誘導体の１つは次に、メルカプトエチルアミンによる還元によってＦａｂ’−チオールに再変換され、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合されて２重特異性抗体が形成される。産生された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用され得る。
【０１７３】
最近の進歩によって、化学的に結合して２重特異性抗体を形成することができるＦａｂ’−ＳＨ断片の、大腸菌からの直接回収が容易になっている。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２）は、完全ヒト化２重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生について記載している。各Ｆａｂ’断片は、大腸菌から個別に分泌され、試験管内での定方向化学カップリングを受けて、２重特異性抗体を形成する。このように形成された二重特異性抗体は、ＨＥＲ２レセプタを過剰発現する細胞および正常ヒトＴ細胞に結合するのはもちろんのこと、ヒト乳房腫瘍標的に対してヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を誘発させることも可能であった。
【０１７４】
組み換え細胞培養物から２重特異性抗体断片を直接作製および単離する各種の技法も記載されている。たとえば２重特異性抗体は、ロイシンジッパーを使用して産生されてきた。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質によるロイシンジッパーペプチドは、２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に遺伝子融合によって連結された。抗体ホモ２量体はヒンジ領域にて還元されてモノマーを形成し、次に再酸化されて抗体へテロ２量体を形成した。この方法は、抗体ホモ２量体の産生にも利用できる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）によって記載された「ダイアボディ」技術は、２重特異性抗体断片を作製するための代わりの機構を提供している。断片は、同じ鎖上の２個のドメイン間の対形成を可能にするには短いリンカによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合された、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって１つの断片のＶＨドメインおよびＶＬドメインは、別の断片の相補的ＶＨドメインおよびＶＬドメインと強制的に対形成させられて、それにより２個の抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）２量体の使用により２重特異性抗体断片を作製する別の方法も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照。
【０１７５】
２を超える価数を持つ抗体が考慮される。たとえば３重特異性抗体を調製できる。Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０１７６】
８．多価抗体
多価抗体も提供される。多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、２価抗体よりも早く内部移行（および／または異化）され得る。本発明の抗体は、２つ以上の抗原結合部位を有する（ＩｇＭクラス以外である）多価抗体（たとえば４価抗体）であり、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現によってただちに産生できる。多価抗体は、２量体化ドメインおよび３つ以上の抗原結合部位を含むことができる。ある実施形態において、２量体化ドメインは、Ｆｃ領域またはヒンジ領域を含む（またはから成る）。このシナリオでは、抗体は、Ｆｃ領域およびＦｃ領域に対してアミノ末端側の３つ以上の抗原結合部位を含むであろう。ある実施形態において、多価抗体は３〜８つの抗原結合部位を含む（またはから成る）。このような一実施形態において、多価抗体は４つの抗原結合部位を含む（またはから成る）。多価抗体は、２つ以上の可変ドメインを含む、少なくとも１つのポリペプチド鎖（たとえば２つのポリペプチド鎖）を含む。たとえばポリペプチド鎖はＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃを含むことがあり、式中、ＶＤ１は第１可変領域であり、ＶＤ２は第２可変領域であり、ＦｃはＦｃ領域の１つのポリペプチド鎖であり、Ｘ１およびＸ２はアミノ酸またはポリペプチドを表し、ｎは０または１である。たとえば、ポリペプチド鎖は：ＶＨ−ＣＨ１−可撓性リンカ−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖；またはＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖を含み得る。本明細書の多価抗体は、少なくとも２つ（たとえば４つ）の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに含み得る。本明細書の多価抗体はたとえば、約２〜約８つの軽鎖可変ドメインポリペプチドを含み得る。本明細書で検討する軽鎖可変領域ポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、場合によりＣＬドメインをさらに含む。
【０１７７】
９．単一ドメイン抗体
単一ドメイン抗体も提供される。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む単一ポリペプチドである。ある実施形態において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，２４８，５１６  Ｂ１を参照）。一実施形態において、単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部または一部から成る。
【０１７８】
１０．抗体変異体
いくつかの実施形態において、本明細書に記載する抗体のアミノ酸配列修飾が検討される。たとえば、抗体の結合親和性および／または他の生物特性が改善されることが所望であり得る。抗体のアミノ酸変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な変化を導入することによって、またはペプチド合成によって調製され得る。このような修飾はたとえば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失および・または挿入および／または置換を含む。最終構築物が所望の特徴を有するという条件で、最終構築物を達成するために欠失、挿入、および置換の任意の組合せを行うことができる。アミノ酸改変は、対象の抗体アミノ酸配列にその配列が作製されるときに導入され得る。
【０１７９】
突然変異誘発に好ましい位置である抗体のある残基または領域の同定に有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５によって記載されたように、「アラニン走査突然変異誘発」と呼ばれる。ここで標的残基の残基または群は、同定され（たとえばａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕなどの荷電残基）、中性または負に荷電したアミノ酸（たとえばアラニンまたはポリアラニン）によって置換されて、アミノ酸と抗原との相互作用に影響を及ぼす。置換に対して機能的感受性を示すこれらのアミノ酸位置は次に、置換部位にて、または置換部位に対してさらなるまたは他の変異体を導入することによって改良される。それゆえ、アミノ酸配列変異を導入するための部位は予定されるのに対して、突然変異自体の性質は予定される必要がない。たとえば、所与の部位における突然変異の性能を分析するために、ａｌａ走査またはランダム突然変異誘発を標的コドンまたは領域で実施して、発現された免疫グロブリンを所望の活性についてスクリーニングする。
【０１８０】
アミノ酸配列挿入は、長さが１つの残基から１００以上の残基を含有するポリペプチドに及ぶアミノ末端および／またはカルボキシル末端融合はもちろんのこと、単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入も含む。末端挿入の例は、Ｎ末端メチオニル残基を持つ抗体を含む。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を延長する酵素（たとえばＡＤＥＰＴの場合）またはポリペプチドに対する抗体のＮ末端またはＣ末端への融合を含む。
【０１８１】
ある実施形態において、本発明の抗体は、抗体がグリコシル化される程度を上昇または低下させるように改変される。ポリペプチドのグリコシル化は通例、Ｎ結合またはＯ結合のどちらかである。Ｎ結合は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合である。Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸である、トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニンは、炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素結合のための認識配列である。それゆえ、これらのトリペプチド配列のどちらかがポリペプチド中に存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作製される。Ｏ結合グリコシル化は、糖のＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンへの結合を指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンも使用され得る。
【０１８２】
抗体に対するグリコシル化部位の付加または欠失は、上述のトリペプチド配列（Ｎ結合グリコシル化部位の場合）が作製または除去されるようにアミノ酸配列を改変することによって好都合に達成される。改変は、（Ｏ連結グリコシル化部位に対する）元の抗体の配列への１つ以上のセリンまたはトレオニン残基の付加、欠失、または置換によっても実施され得る。
【０１８３】
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合された炭水化物が改変され得る。たとえば、抗体のＦｃ領域に結合したフコースを欠失した成熟炭水化物構造を持つ抗体は、ＵＳ  Ｐａｔ  Ａｐｐｌ  Ｎｏ  ＵＳ  ２００３／０１５７１０８（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）に記載されている。ＵＳ  ２００４／００９３６２１（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）も参照。抗体のＦｃ領域に結合した炭水化物にバイセクティングＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を持つ抗体は、ＷＯ  ２００３／０１１８７８、Ｊｅａｎ−ＭａｉｒｅｔらおよびＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，６０２，６８４、Ｕｍａｎａらで言及されている。抗体のＦｃ領域に結合されたオリゴサッカライド中に少なくとも１つのガラクトース残基を持つ抗体は、ＷＯ  １９９７／３００８７，Ｐａｔｅｌらで報告されている。そのＦｃ領域に結合された改変炭水化物を持つ抗体に関連するＷＯ  １９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）およびＷＯ  １９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）も参照。修飾グリコシル化のある抗原結合分子に関するＵＳ  ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａら）も参照。
【０１８４】
ある実施形態において、グリコシル化変異体はＦｃ領域を含み、Ｆｃ領域に結合された炭水化物構造はフコースを欠失している。このような変異体は改善されたＡＤＣＣ機能を有する。場合により、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＣをさらに改善する１つ以上のアミノ酸置換、たとえばＦｃ領域の位置２９８、３３３、および／または３３４（残基のＥＵナンバリング）での置換をその中にさらに含む。「脱フコシル化」またはフコシル欠失抗体に関連する文献の例は：ＵＳ  ２００３／０１５７１０８；ＷＯ  ２０００／６１７３９；ＷＯ  ２００１／２９２４６；ＵＳ  ２００３／０１１５６１４；ＵＳ  ２００２／０１６４３２８；ＵＳ  ２００４／００９３６２１；ＵＳ  ２００４／０１３２１４０；ＵＳ  ２００４／０１１０７０４；ＵＳ  ２００４／０１１０２８２；ＵＳ  ２００４／０１０９８６５；ＷＯ  ２００３／０８５１１９；ＷＯ  ２００３／０８４５７０；ＷＯ  ２００５／０３５５８６；ＷＯ  ２００５／０３５７７８；ＷＯ２００５／０５３７４２；Ｏｋａｚａｋｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９（２００４）；Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）を含む。脱フコシル化抗体を産生する株化細胞の例は、タンパク質フコシル化が欠失したＬｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３−５４５（１９８６）；ＵＳ  Ｐａｔ  Ａｐｐｌ  Ｎｏ  ＵＳ  ２００３／０１５７１０８  Ａ１，Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ；およびＷＯ  ２００４／０５６３１２  Ａ１、Ａｄａｍｓら、特に実施例１１）、およびノックアウト株化細胞、たとえばアルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４））を含む。
【０１８５】
別の種類の変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、異なる残基によって置換された少なくとも１つのアミノ酸残基を抗体分子中に有する。置換突然変異誘発のための興味のある部位は超可変領域を含むが、ＦＲ改変も検討される。保存的置換は、上の表３の「好ましい置換」の見出しの下に示す。このような置換が生物活性の所望の変化を生じる場合には、表３で「例示的な置換」と命名された、またはアミノ酸クラスに関連してさらに上述された、より実質的な変化が導入され得て、得られた抗体が所望の結合特性についてスクリーニングされる。
【０１８６】
１つの種類の置換変異体は、親抗体（たとえばヒト化またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを含む。一般に、さらなる開発のために選択される、得られた変異体は、変異体が生成される親抗体に関連する修飾（たとえば改善）生物特性を有するであろう。このような置換変異体を生成する好都合な方法は、ファージ提示を用いる親和性突然変異誘発を含む。簡潔には、いくつかの超可変領域部位（たとえば６〜７部位）が突然変異されて、各部位に考えられるすべてのアミノ酸置換を生成する。このように生成された抗体は繊維状ファージ粒子から、各粒子内にパッケージされたファージコートタンパク質の少なくとも一部（たとえばＭ１３の遺伝子ＩＩＩ生成物）への融合物として提示される。ファージ提示変異体は次に、その生物活性（たとえば結合親和性）についてスクリーニングされる。修飾の候補超可変領域部位を同定するために、走査突然変異誘発（たとえばアラニン走査）を実施して抗原結合に著しく寄与する超可変領域残基を同定できる。代わりにまたは加えて、抗体と抗原との間の接触点を同定するために抗原−抗体複合体の結晶構造を分析することが有利であり得る。このような接触残基および隣接残基は、本明細書で産生されたものを含む、当分野で公知である技法による置換の候補である。このような変異体が生成されると、本明細書に記載されたものを含む、変異体のパネルが当分野の技法を使用するスクリーニングを受け、１つ以上の関連アッセイにおいて優れた特性を有する抗体がさらなる開発のために選択され得る。
【０１８７】
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当分野で公知の各種の方法によって調製される。これらの方法は、これに限定されるわけではないが、天然源からの単離（天然発生型アミノ酸配列変異体の場合）または抗体の早期に調製された変異体もしくは非変異体バージョンのオリゴヌクレオチド媒介（または部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、およびカセット突然変異誘発による調製を含む。
【０１８８】
本発明の抗体のＦｃ領域に１つ以上のアミノ酸修飾を導入して、それによりＦｃ領域変異体を生成することが所望であり得る。Ｆｃ領域変異体は、ヒンジシステインの位置を含む１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（たとえば置換）を含むヒトＦｃ領域配列（たとえばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含み得る。
【０１８９】
本説明および当分野の教示に従って、いくつかの実施形態において、本発明の抗体がたとえばＦｃ領域に、野生型の対応する抗体と比べて１つ以上の改変を含み得ることが検討される。これらの抗体はそれにもかかわらず、その野生型の対応する抗体と比較して、処置有用性に必要な、実質的に同じ特徴を保持している。たとえば、改変（すなわち改善または減弱のどちらかがなされた）Ｃ１ｑ結合および／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を生じるであろうある改変が、たとえばＷＯ９９／５１６４２に記載されているように、Ｆｃ領域に作製できることが考えられる。Ｆｃ領域変異体の他の例に関しては、Ｄｕｎｃａｎ  ＆  Ｗｉｎｔｅｒ  Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：７３８−４０（１９８８）；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，６４８，２６０；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，６２４，８２１；およびＷＯ９４／２９３５１も参照。ＷＯ００／４２０７２（Ｐｒｅｓｔａ）およびＷＯ  ２００４／０５６３１２（Ｌｏｗｍａｎ）は、ＦｃＲに対する改善または減弱された結合を持つ抗体変異体について記載している。これらの特許文献の内容は、参照により本明細書に特に組入れられている。ＳｈｉｅｌｄｓらＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）も参照。母性ＩｇＧの胎児への転移に関与する、半減期が延長され、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））は、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載されている。これらの抗体は、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合を改善する１つ以上の置換をその中に持つＦｃ領域を含む。改変Ｆｃ領域アミノ酸配列およびＣ１ｑ結合能力の上昇または低下を有するポリペプチド変異体は、ＵＳ  ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，１９４，５５１Ｂ１、ＷＯ９９／５１６４２に記載されている。これらの特許公報の内容は、参照により本明細書に特に組入れられている。Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）も参照。
【０１９０】
一実施形態において、本発明は、ヘテロ２量体化を容易にする、および／または促進する修飾を、Ｆｃ領域を含むＦｃポリペプチドの界面に含む抗体を提供する。これらの修飾は、第１のＦｃポリペプチドへの隆起の、および第２のＦｃポリペプチドへの空腔の導入を含み、第１および第２のＦｃポリペプチドの複合体化を促進するために、隆起を空腔内に位置決めすることができる。これらの修飾を備えた抗体を生成する方法は、たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，７３１，１６８に記載されているように当分野で公知である。
【０１９１】
１１．抗体誘導体
抗体は、当分野で公知であり、ただちに入手できるさらなる非タンパク質性部分を含有するようにさらに修飾できる。好ましくは、抗体の誘導体化に好適な部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非制限的な例は、これに限定されるわけではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのどちらか）、およびデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（たとえばグリセロール）、ポリビニルアルコール、およびその混合物を含む。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、その水中での安全性により製造時に利点を有し得る。ポリマーはいずれの分子量でもよく、分枝または非分枝であり得る。抗体に結合するポリマーの数は変化することがあり、１つを超えるポリマーが結合される場合、それらは同じまたは異なる分子であることが可能である。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数および／または種類は、これに限定されるわけではないが、改善される抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が定義された条件下の療法で使用されるか否かなどを含む考慮事項に基づいて決定できる。
【０１９２】
別の実施形態において、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る抗体および非タンパク質性部分の接合体が提供される。一実施形態において、非タンパク質性部分はカーボンナノチューブである（Ｋａｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０２：１１６００−１１６０５（２００５））。放射線は、いずれの波長でもよく、これに限定されるわけではないが、通常細胞に損傷を与えないが、非タンパク質性部分を抗体−非タンパク質性部分に近位にある細胞が死滅する温度まで加熱する波長を含む。
【０１９３】
一実施形態において、抗体は標識され得るか、および／または固体担持体に固定され得る。さらなる実施形態において、抗体は抗イディオタイプ抗体である。
【０１９４】
１２．ヘテロ接合抗体
ヘテロ接合抗体も提供される。ヘテロ接合抗体は、２つの共有結合された抗体で構成されている。このような抗体はたとえば、望ましくない細胞に対する免疫系細胞を標的にするために［Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，６７６，９８０］、およびＨＩＶ感染症の処置のために［ＷＯ  ９１／００３６０；ＷＯ  ９２／００３７３；ＥＰ  ０３０８９］提案されている。架橋剤を含むものを含む、合成タンパク質化学において公知の方法を使用してインビトロで抗体が調製され得ることが検討される。たとえばイムノトキシンは、ジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエーテル結合を形成することによって構築され得る。この目的に好適な試薬の例は、イミノチオラートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートならびにたとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，６７６，９８０に開示された試薬を含む。
【０１９５】
１３．エフェクタ機能設計
微生物障害を処置する際にたとえば抗体の有効性を向上させるために、エフェクタ機能に関して抗体を修飾することが所望であり得る。たとえば、システイン残基はＦｃ領域に導入されて、それによりこの領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能にし得る。抗抗微生物活性が向上したヘテロ２量体抗体も、ヘテロ２官能性架橋剤を使用して調製され得る。またはデュアルＦｃ領域を有し、それにより活性の向上を有し得る抗体を設計できる。
【０１９６】
１４．ベクター、宿主細胞、および組換え方法
一実施形態において、抗体の組換え産生では、抗体をコードする核酸が単離されて、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために、複製可能なベクター内に挿入される。抗体をコードするＤＮＡは、慣習的な手順を使用して（たとえば抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、ただちに単離および配列決定できる。多くのベクターが利用できる。ベクターの選択は一部は、使用される宿主細胞によって代わる。一般に、原核または真核（一般に哺乳動物）のどちらかの起源である。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ定常領域を含む任意のアイソタイプの定常領域はこの目的で使用可能であることと、このような定常領域が任意のヒトまたは動物種から取得できることとが認識されるであろう。
【０１９７】
ａ）原核宿主細胞を使用する抗体の生成：
（１）ベクター構築
抗体のポリペプチド成分をコードするポリペプチド配列は、標準組換え技法を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列は、ハイブリドーマ細胞などの細胞を産生する抗体から単離および配列決定され得る。またはポリヌクレオチドはヌクレオチド合成装置またはＰＣＲ技法を使用して合成できる。ポリペプチドをコードする配列は、いったん得られると、原核宿主内で異種ポリヌクレオチドを複製および発現することができる組換えベクター内に挿入される。入手可能であり、当分野で公知である多くのベクターは、本発明の目的に使用できる。適切なベクターの選択は主に、ベクター中に挿入される核酸のサイズおよびベクターによって形質転換される特定の宿主細胞によって変わるであろう。各ベクターは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅もしくは発現、または両方）およびベクターが存在する特定の宿主細胞とのその適合性に応じて、各種の成分を含有する。ベクター成分は一般に、これに限定されるわけではないが：複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸インサートおよび転写終結配列を含む。
【０１９８】
一般に、宿主細胞と適合する種に由来するレプリコンおよび制御配列を含有するプラスミドベクターが、これらの宿主と関連して使用され得る。ベクターは普通、複製配列はもちろんのこと、形質転換細胞において表現型選択を提供することができるマーキング配列も保持している。たとえば大腸菌は通例、大腸菌種に由来するプラスミドであるｐＢＲ３２２を使用して形質転換される。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン（Ａｍｐ）およびテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性をコードする遺伝子を含有し、それゆえ形質転換細胞を容易に同定する手段を提供する。ｐＢＲ３２２、その誘導体、または他の微生物プラスミドもしくはバクテリオファージも、内因性タンパク質の発現のために微生物が使用できるプロモーターを含有し得る、または含有するように修飾され得る。特定の抗体の発現に使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例は、Ｃａｒｔｅｒら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，６４８，２３７に詳細に記載されている。
【０１９９】
さらに、宿主微生物と適合するレプリコンおよび制御配列を含有するファージベクターは、これらの宿主と関連して形質転換ベクターとして使用できる。たとえばλＧＥＭ（商標）１１などのバクテリオファージは、大腸菌ＬＥ３９２などの感受性の宿主細胞を形質転換するのに使用できる組換えベクターを作製するのに利用され得る。
【０２００】
本発明の発現ベクターは、ポリペプチド成分それぞれをコードする、２つ以上のプロモーターシストロン対を含み得る。プロモーターは、その発現を調節するシストロンの上流（５’）に位置する未翻訳制御配列である。原核生物プロモーターは通例、誘導性および構成性の２つのクラスに分類される。誘導性プロモーターは、培養条件の変化、たとえば栄養素の存在もしくは非存在または温度変化に応答してその制御下でシストロンの転写レベルの上昇を開始するプロモーターである。
【０２０１】
各種の潜在的な宿主細胞によって認識された多数のプロモーターが周知である。選択されたプロモーターは、制限酵素消化によってソースＤＮＡからプロモーターを除去して、単離されたプロモーター配列を本発明のベクター内に挿入することにより、軽鎖または重鎖をコードするシストロンＤＮＡに作動的に連結することができる。未変性プロモーター配列および多くの異種プロモーターのどちらも、標的遺伝子の増幅および／発現を指示するのに使用され得る。いくつかの実施形態において、異種プロモーターが利用されるのは、それらが一般に、未変性標的ポリペプチドプロモーターと比較して、発現された標的遺伝子のより高い転写およびより高い収率を可能にするためである。
【０２０２】
原核宿主との使用に好適なプロモーターは、ＰｈｏＡプロモーター、β−ガラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系およびｔａｃまたはｔｒｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターを含む。しかし、細菌内で機能性である他のプロモーター（他の公知の細菌またはファージプロモーターなど）も同様に好適である。そのヌクレオチド配列は公開されており、それにより当業者は、任意の必要な制限部位を供給するためのリンカまたはアダプタを使用して、それらを標的軽鎖および重鎖をコードするシストロンに作動的に結合させることができる（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔら（１９８０）Ｃｅｌｌ  ２０：２６９）。
【０２０３】
本発明の一実施形態において、組換えベクター内の各シストロンは、発現されたポリペプチドの膜での転位を指示する分泌シグナル配列成分を含む。一般に、シグナル配列はベクターの成分であり得るか、またはベクター内に挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部であり得る。本発明の目的のために選択されたシグナル配列は、宿主細胞によって認識および処理（すなわちシグナルペプチドによって切断）されるシグナル配列であるべきである。異種ポリペプチドに由来するシグナル配列を認識および処理しない原核生物宿主細胞の場合、シグナル配列は、たとえばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダ、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡおよびＭＢＰからなる群より選択される原核生物シグナル配列によって置換される。本発明の一実施形態において、発現系の両方のシストロンで使用されるシグナル配列は、ＳＴＩＩシグナル配列またはその変異体である。
【０２０４】
別の実施形態において、本発明による免疫グロブリンの産生は宿主細胞の細胞質で起こることが可能であり、したがって各シストロン内に分泌シグナル配列が存在する必要はない。この点で、免疫グロブリン軽鎖および重鎖は発現され、折畳まれ、そして集められて、細胞質内で機能性免疫グロブリンを形成する。ある宿主株（たとえば大腸菌ｔｒｘＢ株）は、ジスルフィド結合形成に好ましい細胞質状態を与えて、それにより発現されたタンパク質サブユニットの適正な折畳みおよび集合が可能となる。Ｐｒｏｂａ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ｇｅｎｅ，１５９：２０３（１９９５）。
【０２０５】
本発明の抗体は、本発明の分泌されて、適正に集められた抗体の収率を最大限にするために、発現されたポリペプチド成分の量比を調節できる発現系を使用することによっても産生できる。このような調節は少なくとも一部は、ポリペプチド成分の翻訳強度を同時に調節することによって達成される。
【０２０６】
翻訳強度を調節する１つの技法は、Ｓｉｍｍｏｎｓら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，８４０，５２３に開示されている。その技法は、シストロン内で翻訳開始領域（ＴＩＲ）の変異体を利用する。所与のＴＩＲでは、ある範囲の翻訳強度を用いて一連のアミノ酸または核酸配列変異体を作製することが可能であり、それにより特定の鎖の所望の発現レベルにこの因子を調整する好都合な手段が与えられる。ＴＩＲ変異体は、アミノ酸配列を改変できるコドン変化を生じる慣習的な突然変異誘発技法によって産生できる。ある実施形態において、ヌクレオチド配列の変化はサイレントである。ＴＩＲの改変はたとえば、シグナル配列の改変と共に、シャイン−ダルガノ配列の数またはスペーシングの改変を含むことができる。突然変異体シグナル配列を生成する１つの方法は、シグナル配列のアミノ酸を変化させない（すなわち変化はサイレントである）、コード配列の始めにおいての「コドンバンク」の生成である。このことは、各コドンの第３のヌクレオチドの位置を変化させることによって達成できる；さらに、ロイシン、セリン、およびアルギニンなどのいくつかのアミノ酸は、バンクの作製をさらに複雑にし得る複数の第１および第２の位置を有する。突然変異誘発のこの方法は、Ｙａｎｓｕｒａら（１９９２）ＭＥＴＨＯＤＳ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．４：１５１−１５８に詳細に記載されている。
【０２０７】
一実施形態において、ベクターのセットは、その中のシストロンに対するある範囲のＴＩＲ翻訳強度を用いて生成される。この制限されたセットによって、各鎖の発現レベルの比較はもちろんのこと、各種のＴＩＲ強度の組合せでの所望の抗体生成物の収率も得られる。ＴＩＲ強度は、Ｓｉｍｍｏｎｓら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，８４０，５２３で詳細に記載されているように、レポータ遺伝子の発現レベルを定量することによって決定できる。翻訳強度の比較に基づいて、本発明の発現ベクター構築物で組合される所望の個々のＴＩＲが選択される。
【０２０８】
本発明の抗体を発現させるのに好適な原核生物宿主細胞は、グラム陰性またはグラム陽性生物などの古細菌および真正細菌を含む。有用な細菌の例は、エシェキリア（たとえば大腸菌）、バチルス（たとえば枯草菌）、腸内細菌、シュードモナス種（たとえば緑膿菌）、ネズミチフス菌、セラチア・マルセッセンス、クレブシエラ、プロテウス、赤痢菌、根粒菌、ビトレオシラ、またはパラコッカスを含む。一実施形態において、グラム陰性細胞が使用される。一実施形態において、大腸菌細胞は本発明の宿主として使用される。大腸菌株の例は、Ｗ３１１０株（Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７），ｐｐ．１１９０−１２１９；ＡＴＣＣ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  Ｎｏ．２７，３２５）および遺伝子型Ｗ３１１０  ΔｆｈｕＡ（ΔｔｏｎＡ）ｐｔｒ３  ｌａｃ  Ｉｑ  ｌａｃＬ８  ΔｏｍｐＴΔ（ｎｍｐｃ−ｆｅｐＥ）ｄｅｇＰ４１  ｋａｎＲを有する３３Ｄ３株（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，６３９，６３５）を含むその誘導体を含む。大腸菌２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）、大腸菌Ｂ、大腸菌１７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）および大腸菌ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ  ３１，６０８）などの他の株および誘導体も好適である。このような例は、制限的というよりも例証的である。定義された遺伝子型を有する上述の細菌のいずれかの誘導体を構築する方法は、当分野で公知であり、たとえばＢａｓｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，８：３０９−３１４（１９９０）に記載されている。一般に、細菌の細胞中でのレプリコンの複製可能性を考慮して、適切な細菌を選択することが必要である。たとえば大腸菌、セラチア、またはサルモネラ種は、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、またはｐＫＮ４１０などの周知のプラスミドがレプリコンを供給するために使用されるときに、好適に使用できる。通例、宿主細胞は最小限の量のタンパク質分解酵素を分泌すべきであり、さらなるプロテアーゼ阻害薬が望ましくは細胞培養物中に包含され得る。
【０２０９】
（２）抗体産生
宿主細胞は、上述の発現ベクターを用いて形質転換され、プロモーターを誘導する、形質転換体を選択する、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために必要に応じて修飾された慣習的な栄養培地中で培養される。
【０２１０】
形質転換とは、ＤＮＡが染色体外要素として、または染色体組込体によって複製可能であるように、ＤＮＡを原核生物宿主内に導入することを意味する。使用した宿主細胞に応じて、形質転換は、このような細胞に適切な標準技法を使用して実施される。塩化カルシウムを利用するカルシウム処理は、実質的な細胞壁障壁を含有する細菌細胞に一般に使用される。形質転換の別の方法は、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを利用する。使用されるなお別の技法は電気穿孔である。
【０２１１】
本発明のポリペプチドを産生するために使用される原核生物細胞は、当分野で公知であり、選択した宿主細胞の培養に好適である培地中で培養される。好適な培地の例は、必要な栄養素サプリメントが追加されたルリアブロス（ＬＢ）を含む。いくつかの実施形態において、培地は、発現ベクターを含有する原核生物細胞の増殖を選択的に可能にするために、発現ベクターの構築に基づく選択剤も含有する。たとえば、アンピシリンは、アンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖のために培地に添加される。
【０２１２】
単独でまたは複合窒素源などの別のサプリメントもしくは培地との混合物として導入された、炭素、窒素、および無機リン酸塩源以外の任意の必要なサプリメントも、適切な濃度で含まれ得る。場合により培養培地は、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコラート、ジチオエリスリトールおよびジチオスレイトールからなる群より選択される１つ以上の還元剤を含有し得る。
【０２１３】
原核生物宿主細胞は、好適な温度において培養される。ある実施形態において、大腸菌増殖では、増殖温度は、約２０℃〜約３９℃に；約２５℃〜約３７℃に；または約３０℃に及ぶ。培地のｐＨは、主に宿主生物に応じて、約５〜約９に及ぶ任意のｐＨであり得る。ある実施形態において、大腸菌では、ｐＨは約６．８〜約７．４、または約７．０である。
【０２１４】
本発明の発現ベクターで誘導性プロモーターが使用される場合、タンパク質発現は、プロモーターの活性化に好適な条件下で誘導される。本発明の一実施形態において、ＰｈｏＡプロモーターは、ポリペプチドの転写を制御するために使用される。したがって、形質転換された宿主細胞は、誘導のためにリン酸塩制限培地で培養される。ある実施形態において、リン酸塩制限培地はＣ．Ｒ．Ａ．Ｐ．培地である（たとえばＳｉｍｍｏｎｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００２），２６３：１３３−１４７を参照）。当分野で公知であるように、利用されるベクター構築物に従って各種の他の誘導物質が使用され得る。
【０２１５】
一実施形態において、本発明の発現されたポリペプチドは、宿主細胞のペリプラズムに分泌されて、そこから回収される。タンパク質回収は通例、一般に浸透圧衝撃、音波処理または溶解などの手段によって、微生物を破壊することを含む。細胞が破壊されたら、遠心分離または濾過によって細胞破片または全細胞が除去され得る。タンパク質は、たとえばアフィニティー樹脂クロマトグラフィーによってさらに精製され得る。またはタンパク質を培地中に輸送して、その中で分離することができる。細胞を培地から除去して、産生されたタンパク質のさらなる精製のために培養上清を濾過および濃縮してもよい。発現されたポリペプチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）およびウェスタンブロットアッセイなどの一般に公知の方法を使用して、さらに単離および同定できる。
【０２１６】
本発明の一実施形態において、抗体産生は発酵プロセスによって大量で実施される。組換えタンパク質の産生には、各種の大規模流加発酵手順が利用できる。大規模発酵は、少なくとも１０００リットルの容量を、およびある実施形態においては、約１，０００〜１００，０００リットルの容量を有する。これらの発酵槽は、酸素および栄養素、特にグルコース（好ましい炭素／エネルギー源）を分布させるために撹拌インペラを使用する。小規模発酵は一般に、容積が約１００リットルを超えない発酵槽での発酵を指し、約１リットル〜約１００リットルに及ぶことが可能である。
【０２１７】
発酵プロセスでは、タンパク質発現の誘導は通例、細胞が好適な条件下で所望の密度、たとえば約１８０〜２２０のＯＤ５５０まで増殖した後に開始され、この段階で細胞は初期静止期にある。当分野で公知であり、上述したように、利用されるベクター構築物に従って各種の他の誘導物質が使用され得る。細胞は、誘導の前に短期間にわたって増殖され得る。細胞は通常、約１２〜５０時間誘導されるが、より長いまたは短い誘導時間が使用され得る。
【０２１８】
本発明のポリペプチドの産生収率および品質を改善するために、各種の発酵条件を修飾できる。たとえば、分泌抗体ポリペプチドの適正な集合および折畳みを改善するために、シャペロンタンパク質、たとえばＤｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤおよびまたはＤｓｂＧ）またはＦｋｐＡ（シャペロン活性を有するペプチジルプロピル、シス、トランス−イソメラーゼ）を過剰発現するさらなるベクターを使用して、宿主原核生物細胞を同時形質転換させることができる。シャペロンタンパク質は、細菌宿主細胞内で産生された異種タンパク質の適切な折畳みおよび溶解性を助長することが証明されている。Ｃｈｅｎら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１９６０１−１９６０５；Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，０８３，７１５；Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，０２７，８８８；Ｂｏｔｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１００−１７１０５；Ｒａｍｍ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１０６−１７１１３；Ａｒｉｅら（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：１９９−２１０。
【０２１９】
発現された異種タンパク質（特にタンパク質分解に感受性である異種タンパク質）のタンパク質分解を最小限にするために、本発明ではタンパク質分解酵素が欠失したある宿主株が使用できる。たとえば宿主細胞株は、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩおよびその組合せなどの公知の細菌プロテアーゼをコードする遺伝子にて遺伝子突然変異を生じるように修飾され得る。一部の大腸菌プロテアーゼ欠失株が入手可能であり、たとえばＪｏｌｙら（１９９８）、同上；Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，２６４，３６５；Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，５０８，１９２；Ｈａｒａら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，２：６３−７２（１９９６）に記載されている。
【０２２０】
一実施形態において、タンパク質酵素を欠失しており、１つ以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドによって形質転換された大腸菌株は、本発明の発現系において宿主細胞として使用される。
【０２２１】
（３）抗体精製
一実施形態において、本明細書で産生された抗体をさらに精製して、さらなるアッセイおよび使用のために実質的に同種である調製物を得る。当分野で公知の標準タンパク質精製方法が利用できる。次の手順は、好適な精製手順の例である：イムノアフィニティまたはイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカまたはＤＥＡＥなどのカチオン交換樹脂によるクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、およびたとえばＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を使用するゲル濾過。
【０２２２】
一実施形態において、固相に固定されたタンパク質Ａは、本発明の抗体生成物のイムノアフィニティ精製に使用される。タンパク質Ａは、抗体のＦｃ領域に高い親和性で結合する、黄色ブドウ球菌からの４１ｋＤ細胞壁タンパク質である。Ｌｉｎｄｍａｒｋら（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３。タンパク質Ａが固定される固相は、ガラスもしくはシリカ表面を含むカラム、または孔径制御カラムもしくはケイ酸カラムであり得る。いくつかの用途において、カラムは、汚染物質の非特異的付着をおそらく防止するために、グリセロールなどの試薬によってコートする。
【０２２３】
精製の第１ステップとして、上述の細胞培養物に由来する調製物をタンパク質Ａ固定固相に塗布して、興味のある抗体をタンパク質Ａに特異的に結合させることができる。固相を次に洗浄して、固相に非特異的に結合した汚染物質を除去する。最後に、興味のある抗体を固相から溶離によって回収する。
【０２２４】
ｂ）真核生物宿主細胞を使用する抗体の生成：
真核生物宿主細胞で使用するためのベクターは一般に、次の非制限的成分の１つ以上を含む：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終結配列。
【０２２５】
（１）シグナル配列成分
真核生物宿主細胞で使用するためのベクターは、シグナル配列または興味のある成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドも含有し得る。選択された異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識および処理される（すなわちシグナルペプチドによって切断される）シグナル配列である。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列は、ウイルス分泌リーダ、たとえば単純ヘルペスｇＤシグナルと同様に利用できる。このような前駆体領域のＤＮＡは、読み枠内で抗体をコードするＤＮＡに結合される。
【０２２６】
（２）複製起点
一般に、複製起点成分は哺乳動物発現ベクターには不要である。たとえばＳＶ４０起点は、初期プロモーターを含有しているために、通例使用され得る。
【０２２７】
（３）選択遺伝子成分
発現およびクローニングベクターは、選択可能マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有し得る。代表的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、たとえばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、またはテトラサイクリンに対する耐性を与える、（ｂ）関連する場合には、栄養要求性欠失を補う、または（ｃ）複合培地から入手できない必須栄養素を供給する、タンパク質をコードする。
【０２２８】
選択スキームの一例は、宿主細胞の増殖を停止する薬物を利用する。異種遺伝子によって正しく形質転換されるこのような細胞は、薬物耐性を与え、それゆえ選択レジメンを生き抜くタンパク質を産生する。このような有力な選択の例は、ネオマイシン、ミコフェノール酸およびハイグロマイシンなどの薬物を使用する。
【０２２９】
哺乳動物細胞の好適な選択可能マーカーの別の例は、抗体核酸、たとえばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉおよび−ＩＩ、好ましくは霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどを取込む能力のある細胞の同定を可能にする選択可能マーカーである。
【０２３０】
たとえば、いくつかの実施形態において、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、ＤＨＦＲの競合アンタゴニストである、メトトレキセート（Ｍｔｘ）を含有する培養培地においてすべての形質転換体を培養することによって最初に同定される。いくつかの実施形態において、野生型ＤＨＦＲが利用されるときの適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性を欠失したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）株化細胞（たとえばＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）である。
【０２３１】
または抗体、野生型ＤＨＦＲタンパク質、およびアミノグリコシド−３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）などの別の選択可能マーカーによって形質転換または同時形質転換された宿主細胞（特に内因性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）は、アミノグリコシド系抗生物質、たとえばカナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８などの選択可能マーカーのための選択剤を含有する培地での細胞増殖によって選択できる。Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，９６５，１９９を参照。
【０２３２】
（４）プロモーター成分
発現およびクローニングベクターは通常、宿主生物によって認識され、興味のあるポリペプチド（たとえば抗体）をコードする核酸に操作可能に連結されたプロモーターを含有する。真核生物では、プロモーター配列は公知である。たとえば、実質的にすべての真核生物遺伝子は、転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始から７０〜８０塩基上流に見出された別の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであり得るＣＮＣＡＡＴ領域である。大半の真核生物遺伝子の３’末端は、コード配列の３’末端へのポリＡ尾部の付加のシグナルであり得る、ＡＡＴＡＡＡ配列であろう。ある実施形態において、これらの配列のいずれも真核生物発現ベクター内に好適に挿入され得る。
【０２３３】
哺乳動物宿主細胞中のベクターからの転写は、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得たプロモーターによって、異種哺乳動物プロモーター、たとえばアクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから、このようなプロモーターが宿主細胞系と適合性であるという条件で制御される。
【０２３４】
ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限断片として好都合に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限断片として好都合に得られる。ウシパピローマウイルスをベクターとして使用して哺乳動物宿主でＤＮＡを発現する系はＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，４１９，４４６に開示されている。この系の修飾は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，６０１，９７８に記載されている。単純ヘルペスウイルスからのチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞におけるヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現について記載している、Ｒｅｙｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：５９８−６０１（１９８２）も参照。またはラウス肉腫ウイルス長端末反復は、プロモーターとして使用できる。
【０２３５】
（５）エンハンサー要素成分
より高等な真核生物による本発明の抗体をコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をベクター内に挿入することによって上昇することが多い。哺乳動物遺伝子（グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトタンパク質、およびインスリン）からの多くのエンハンサー配列が今や公知である。しかし、通例、真核生物細胞ウイルスからのエンハンサーが使用される。例は、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ  １００−２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを含む。真核生物プロモーターの活性化のためのエンハンサー要素について記載しているＹａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：１７−１８（１９８２）も参照。エンハンサーは、抗体ポリペプチドコード配列の５’または３’側の位置でベクター内にスプライスされるが、一般にプロモーターの５’部位に配置される。
【０２３６】
（６）転写終結成分
真核生物宿主細胞で使用する発現ベクターは、転写終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有し得る。このような配列は、真核生物またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’、および場合により３’未翻訳領域から一般に入手できる。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの未翻訳部分において、ポリアデニル化断片として転写されたヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６および本明細書で開示する発現ベクターを参照。
【０２３７】
（７）宿主細胞の選択および形質転換
本明細書においてベクター中でＤＮＡをクローニングまたは発現するために好適な宿主細胞は、脊椎動物宿主細胞を含めた、本明細書に記載するより高等な真核細胞を含む。培養物（組織培養物）中での脊椎動物細胞の増殖は、日常的な手順となっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系統（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚腎臓系統（懸濁培養物中での増殖のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット腎臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト腎臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳腺癌（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞系（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０２３８】
宿主細胞は、抗体産生のための上述の発現またはクローニングベクターを用いて形質転換され、プロモーターを誘導する、形質転換体を選択する、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために必要に応じて修飾された慣習的な栄養培地中で培養される。
【０２３９】
（８）宿主細胞の培養
本発明の抗体を産生するために使用する宿主細胞は、各種の培地で培養され得る。Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ変法イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地は、宿主細胞を培養するのに好適である。さらにＨａｍら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９），Ｂａｒｎｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．４，７６７，７０４；４，６５７，８６６；４，９２７，７６２；４，５６０，６５５；または５，１２２，４６９；ＷＯ  ９０／０３４３０；ＷＯ  ８７／００１９５；またはＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｒｅ．３０，９８５に記載された培地のいずれも、宿主細胞の培養培地として使用され得る。これらの培地のいずれも、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩など）、緩衝剤（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン（商標）薬など）、微量元素（マイクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）、およびグルコースまたは同等のエネルギー源を添加され得る。その他のサプリメントも、当業者に公知であろう適切な濃度にて含まれ得る。たとえば温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択した宿主細胞で先に使用した培養条件であり、当業者に明らかになるであろう。
【０２４０】
（９）抗体の精製
組換え技法を使用するときに、抗体は細胞内で産生できるか、または培地中に直接分泌できる。第１ステップとして抗体が細胞内で産生される場合、宿主細胞または溶解断片のどちらかである粒子状破片が、たとえば遠心分離または限外濾過によって除去され得る。抗体が培地中に分泌される場合、このような発現系からの上清は最初に、市販のタンパク質濃縮フィルタ、たとえばＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して濃縮され得る。タンパク質分解を抑制するために、上述のステップのいずれにおいてもＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害薬を包含することができ、外来汚染物質の増殖を防止するために、抗生物質は包含することができる。
【０２４１】
細胞から調製された抗体組成物は、たとえばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、およびアフィニティクロマトグラフィーを使用して精製可能であり、アフィニティクロマトグラフィーは好都合な技法である。タンパク質Ａの親和性リガンドとしての適合性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプによって変わる。タンパク質Ａは、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づく抗体を精製するために使用できる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６２：１−１３（１９８３））。タンパク質Ｇは、すべてのマウスアイソタイプおよびヒトγ３に推奨される（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。親和性リガンドが結合するマトリクスは、アガロースであり得るが、他のマトリクスも利用できる。孔径制御ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリクスによって、アガロースによって達成されるよりも高い流量および短い処理時間が可能となる。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、精製にはＢａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）が有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（たとえばポリアスパラギン酸カラム）でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿などのタンパク質精製の他の技法も、回収される抗体に応じて利用可能である。
【０２４２】
任意の予備精製ステップの後に、興味のある抗体および汚染物質を含有する混合物をさらなる精製、たとえば、好ましくは低塩濃度（たとえば約０〜０．２５Ｍ塩）で実施される、約２．５〜４．５のｐＨの溶離緩衝剤を使用する低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけてもよい。
【０２４３】
一般に、研究、検査、および臨床用途に使用するための抗体を調製する各種の方法は、当分野で確立されている上述の方法と一致している、および／または特定の興味のある抗体について当業者によって適切と見なされている。
【０２４４】
Ｃ．アゴニストおよびアンタゴニスト
本発明のＡＭＰのアゴニストおよびアンタゴニストが提供される。このようなＡＭＰ調節因子は、本発明に含まれ、本明細書で与えられるような微生物障害を処置するのに有用である。
【０２４５】
一実施形態において、本発明のＡＭＰのアゴニストおよびアンタゴニストは、抗体、たとえばＩＬ−２２抗体または抗ＩＬ−２２Ｒ抗体である。ある実施形態において、抗ＩＬ−２２抗体は、ＩＬ−２２のＩＬ−２２Ｒとの相互作用を促進するアゴニスト抗体である。別の実施形態において、抗ＩＬ−２２抗体は、ＩＬ−２２のＩＬ−２２Ｒとの相互作用を完全または部分的に遮断するアンタゴニスト抗体である。ある実施形態において、抗ＩＬ−２２Ｒ抗体は、ＩＬ−２２Ｒの細胞外リガンド結合ドメインに結合する。たとえば、抗ＩＬ−２２Ｒ抗体は、約アミノ酸１８−２２８からの配列番号３に見出される、ヒトＩＬ−２２Ｒの細胞外リガンド結合ドメインに結合し得る。
【０２４６】
詳細な実施形態において、ＩＬ−２２アゴニストは、ＩＬ−２２ＢＰを結合して、ＩＬ−２２ＢＰのＩＬ−２２への結合を遮断または抑制し、それによりＩＬ−２２活性（たとえばＩＬ−２２Ｒへの結合）を誘導するまたは上昇させる、抗体である。
【０２４７】
さらなる実施形態において、本発明のＡＭＰのアゴニストまたはアンタゴニストは、ＡＭＰに結合するオリゴペプチドである。一実施形態において、オリゴペプチドは、ＩＬ−２２Ｒの細胞外リガンド結合ドメインに結合する。オリゴペプチドは、公知のオリゴペプチド合成方法を使用して化学的に合成され得るか、または組換え技術を使用して調製および精製され得る。このようなオリゴペプチドは通常、長さが少なくとも約５アミノ酸、または長さが少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００アミノ酸である。このようなオリゴペプチドは、周知の技法を使用して、過度の実験なしに同定され得る。この点で、ポリペプチド標的に特異的に結合できるオリゴペプチドについてオリゴペプチドライブラリをスクリーニングする技法が、当分野で周知であることに注目する（たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．５，５５６，７６２、５，７５０，３７３、４，７０８，８７１、４，８３３，０９２、５，２２３，４０９、５，４０３，４８４、５，５７１，６８９、５，６６３，１４３；ＰＣＴ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏｓ．ＷＯ  ８４／０３５０６およびＷＯ８４／０３５６４；Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：３９９８−４００２（１９８４）；Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：１７８−１８２（１９８５）；Ｇｅｙｓｅｎら、ｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，１３０−１４９（１９８６）；Ｇｅｙｓｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１０２：２５９−２７４（１９８７）；Ｓｃｈｏｏｆｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４０：６１１−６１６（１９８８），Ｃｗｉｒｌａ，Ｓ．Ｅ．ら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３７８；Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．ら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０８３２；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら（１９９１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１；Ｋａｎｇ，Ａ．Ｓ．ら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８３６３、およびＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２：６６８を参照）。
【０２４８】
なお別の実施形態において、本発明のＡＭＰのアゴニストまたはアンタゴニストは、本明細書に記載するオリゴペプチドまたは抗体以外の、ＡＭＰに結合する有機分子である。有機分子はたとえば、小型分子であり得る。一実施形態において、有機分子は、ＩＬ−２２Ｒの細胞外ドメインに結合する。本発明のＡＭＰに結合する有機分子は、公知の方法を使用して同定および化学的に合成され得る（たとえばＰＣＴ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏｓ．ＷＯ００／００８２３およびＷＯ００／３９５８５）。このような有機分子は通常、サイズが約２０００ダルトン未満、またはサイズが約１５００、７５０、５００、２５０もしくは２００ダルトン未満であり、本発明のＡＭＰに結合できるこのような有機分子は、周知の技法を使用する過度の実験なしに同定され得る。この点で、ポリペプチド標的に結合できる分子について有機分子ライブラリをスクリーニングする技法が当分野で周知であることに注目する（たとえばＰＣＴ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏｓ．ＷＯ００／００８２３およびＷＯ００／３９５８５を参照）。
【０２４９】
詳細な実施形態において、ＩＬ−２２アゴニストは、ＩＬ−２２ＢＰを結合して、ＩＬ−２２ＢＰのＩＬ−２２への結合を遮断または抑制し、それによりＩＬ−２２活性（たとえばＩＬ−２２Ｒへの結合）を誘導するまたは上昇させる、有機分子である。
【０２５０】
詳細な実施形態において、ＩＬ−２２アンタゴニストは可溶性ＩＬ−２２受容体、たとえば膜結合していないＩＬ−２２Ｒの形である。ＩＬ−２２Ｒのこのような可溶形は、ＩＬ−２２への結合で膜結合ＩＬ−２２Ｒと競合し得る。ある実施形態において、ＩＬ−２２Ｒの可溶形は、ＩＬ−２２Ｒの細胞外ドメインのすべてまたはリガンド結合部分、たとえば配列番号３のアミノ酸１８−２２８を含むポリペプチドのすべてまたはリガンド結合部分を含み得る。ある実施形態において、ＩＬ−２２Ｒの可溶形は膜貫通ドメインを欠失している。たとえば、ヒトＩＬ−２２Ｒの可溶形は、配列番号３の約アミノ酸２２９−２５１からの膜貫通ドメインのすべてまたは実質的な部分を欠失し得る。
【０２５１】
ＩＬ−２２の天然型可溶性受容体が報告されている。Ｄｕｍｏｕｔｉｅｒ  Ｌ．ら、“Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−２２  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ａ  ｎａｔｕｒａｌ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｏｆ  ＩＬ−１０−ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒ／ＩＬ−２２，”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：７０９０−７０９５（２００１）；およびＸｕ  Ｗ．ら、“Ａ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＩＬ−２２ＲＡ２，ｉｓ  ａ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ＩＬ−２２  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：９５１１−９５１６（２００１）を参照。その受容体は、当分野では様々に「ＩＬ−２２ＢＰ」または「ＩＬ−２２ＲＡ２」と呼ばれる。ヒトＩＬ−２２ＢＰの配列を図４に示す。「ＩＬ−２２ＢＰ」または「ＩＬ−２２結合タンパク質」という用語は、本明細書に記載するように、別途指摘しない限り、霊長類（たとえばヒトおよびサル）およびげっ歯類（マウスおよびラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源からの任意の未変性ＩＬ−２２ＢＰを指す。
【０２５２】
また別の実施形態において、ＩＬ−２２のアンタゴニストは、ＩＬ−２２またはＩＬ−２２Ｒ遺伝子の発現を低下させる（すなわちＩＬ−２２またはＩＬ−２２Ｒ遺伝子の転写および／またはＩＬ−２２またはＩＬ−２２Ｒ  ｍＲＮＡの翻訳を低下させる）アンチセンス核酸である。ある実施形態において、アンチセンス核酸は、ＩＬ−２２またはＩＬ−２２Ｒをコードする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に結合する。ある実施形態において、アンチセンス核酸は、長さが約１０〜３０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドである（それらの終点間のすべての点を含む）。ある実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖−ホスホジエステル主鎖（または、ホスホロチオアート結合およびＷＯ  ９１／０６６２９に記載された結合を含む、他の糖結合）を含み、このような修飾糖−ホスホジエステル主鎖は内因性ヌクレアーゼに耐性である。一実施形態において、アンチセンス核酸はオリゴデオキシリボヌクレオチドであり、これはＩＬ−２２またはＩＬ−２２ＲをコードするｍＲＮＡの分解および／または転写もしくは翻訳の低下を引き起こす。ある実施形態において、アンチセンス核酸は、「ＲＮＡ干渉」（「ＲＮＡｉ」）によって標的核酸の発現を低下させるＲＮＡである。ＲＮＡｉの総説については、たとえばＮｏｖｉｎａら、（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  ４３０：１６１−１６４を参照。このようなＲＮＡは、たとえば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡｓ）およびマイクロＲＮＡに由来する。ｓｉＲＮＡはたとえば、長さが約１８〜２６ヌクレオチドの２重鎖オリゴリボヌクレオチドとして合成され得る。同上。
【０２５３】
また別の実施形態において、ＩＬ−２２のアゴニストが提供される。例示的なアゴニストは、これに限定されるわけではないが、未変性ＩＬ−２２もしくはＩＬ−２２Ｒ；未変性ポリペプチドの少なくとも１つの活性を保持するＩＬ−２２もしくはＩＬ−２２Ｒの断片、変異体、もしくは修飾形；ＩＬ−２２Ｒに結合して活性化することができる薬剤；およびＩＬ−２２もしくはＩＬ−２２Ｒの過剰発現を誘導する薬剤またはＩＬ−２２もしくはＩＬ−２２Ｒをコードする核酸を含む。
【０２５４】
Ｄ．医薬製剤
本発明は医薬製剤を提供する。一実施形態において、医薬製剤は１）活性剤、たとえば上述のポリペプチド、抗体、アゴニスト、またはアンタゴニストのいずれか；および２）製薬的に許容される担体を含む。さらなる実施形態において、医薬製剤は、少なくとも１つの処置剤をさらに含む。
【０２５５】
医薬製剤は、所望の純度を有する薬剤を任意の製薬的に許容される担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．［１９８０］）と混合することによって、凍結乾燥製剤または水性液剤の形で貯蔵用に調製される。許容される担体、賦形剤および安定剤は、利用される投薬量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、緩衝剤、たとえばリン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化薬；保存料（たとえばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメチオニウムクロライド；ベンザルコニウムクロライド、ベンゼトニウムクロライド；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、たとえばメチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、たとえば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、たとえばポリビニルピロリドン；アミノ酸、たとえばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン；グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む、単糖類、２糖類および他の炭水化物；キレート剤、たとえばＥＤＴＡ；糖類、たとえばスクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成対イオン、たとえばナトリウム；金属錯体（たとえばＺｎ−タンパク質錯体）；および／または非イオン性界面活性剤、たとえばＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
【０２５６】
薬剤を細胞中に送達するために、リポフェクションまたはリポソームも使用できる。薬剤が抗体断片である場合、標的タンパク質に特異的に結合する最小阻害断片が好ましい。たとえば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持するペプチド分子を設計できる。このようなペプチドは、組換えＤＮＡ技術によって化学的に合成および／または産生することができる（たとえばＭａｒａｓｃｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，７８８９−７８９３［１９９３］を参照）。本明細書に開示する抗体は、免疫リポソームとしても製剤され得る。抗体を含有するリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）；およびＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．４，４８５，０４５および４，５４４，５４５に記載されているような、当分野で公知の方法によって調製される。循環時間が延長されたリポソームは、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，０１３，５５６に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法により生成できる。リポソームを所定の孔径のフィルタを通して押出して、所望の直径を有するリポソームを得る。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載されたように、ジスルフィド交換反応によってリポソームに接合できる。化学療法剤（ドキソルビシンなど）は場合によりリポソーム内に含有される。Ｇａｂｉｚｏｎら、Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，８１（１９）：１４８４（１９８９）を参照。
【０２５７】
薬剤は、たとえばコアセルベーション技法によって、または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、たとえばヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルにそれぞれ、コロイド薬物送達系（たとえばリポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）に、またはマクロエマルジョンにも捕捉され得る。このような技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【０２５８】
薬剤の持続放出調製物が調製され得る。持続放出調製物の好適な例は、薬剤を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、マトリクスは成形品、たとえばフィルム、またはマイクロカプセルの形である。持続放出マトリクスの例は、ポリエステル、ハイドロゲル（たとえばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．３，７７３，９１９）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、たとえばＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドより構成される注射用マイクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーは１００日間にわたる分子の放出を可能にするが、あるハイドロゲルは、より短い期間にわたってタンパク質を放出する。カプセル化抗体が体内に長期間残存するとき、それらは３７℃における水分への曝露の結果として、変性または凝集することがあり、生物活性の消失および免疫原性の起こり得る変化を引き起こす。関与する機構に応じて、安定化のための合理的な方法を考案できる。たとえば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換による分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが見いだされた場合、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾すること、酸性溶液から凍結乾燥すること、水分含有量を制御すること、適切な添加剤を使用すること、および特異的なポリマーマトリクス組成物を開発することによって達成され得る。
【０２５９】
本明細書の医薬製剤は、処置される特定の適応症のための１つを超える活性成分も、必要に応じて含有し得る。たとえば、一実施形態において、１つを超える活性化合物を含有する医薬製剤は、１）ＩＬ−２２の少なくとも１つのアゴニスト、たとえばＩＬ−２２に結合する抗体および／またはＩＬ−２２Ｒに結合する抗体；ならびに２）ＩＬ−６またはＩＬ−２３に結合する少なくとも１つの抗体（ここで２）に挙げた任意の抗体は、任意の組合せで選択され得る）を含む。別の実施形態において、医薬製剤は、相補活性を有する２つ以上の化合物を含有する。
【０２６０】
Ｅ．処置方法
本発明は、微生物障害を処置する方法をさらに提供する。別の実施形態において、本発明は、ＡＭＰまたはＡＭＰの調節因子を含む有効量の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、対象における微生物障害を処置する方法を提供し、ＡＭＰは：ＬＴ、ＩＬ−６、ＩＬ−１８、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＲＥＧ  Ｉα、ＲＥＧ  Ｉβ、ＨＩＰ／ＰＡＰ、ＲＥＧ  ＩＩＩ、ＲＥＧ  ＩＶおよびＲｅｇ関連配列（ＲＳ）からなる群より選択される。一実施形態において、障害は、ＥＨＥＣまたはＥＰＥＣ誘発下痢、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または、さらに詳細には潰瘍性大腸炎（ＵＣ）およびクローン病（ＣＤ）である。
【０２６１】
一実施形態において、本発明は、ＡＭＰまたはＡＭＰの調節因子を含む有効量の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、対象における微生物病原体（たとえば細菌またはウイルス）による感染症を処置する方法を提供し、ＡＭＰは：ＬＴ、ＩＬ−６、ＩＬ−１８、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＲＥＧ  Ｉα、ＲＥＧ  Ｉβ、ＨＩＰ／ＰＡＰ、ＲＥＧ  ＩＩＩ、ＲＥＧ  ＩＶおよびＲｅｇ関連配列（ＲＳ）からなる群より選択される。
【０２６２】
別の実施形態において、本発明は、細胞にＡＭＰまたはＡＭＰの調節因子を接触させるステップを含む、微生物病原体（たとえば細菌またはウイルス）に罹患した対象の細胞におけるＡＭＰの活性を調節する方法を提供し、ＡＭＰは：ＬＴ、ＩＬ−６、ＩＬ−１８、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＲＥＧ  Ｉα、ＲＥＧ  Ｉβ、ＨＩＰ／ＰＡＰ、ＲＥＧ  ＩＩＩ（たとえばＲＥＧ  ＩＩＩβまたはＲＥＧ  ＩＩＩγ）、ＲＥＧ  ＩＶおよびＲｅｇ関連配列（ＲＳ）からなる群より選択される。
【０２６３】
別の実施形態において、本発明は、対象の細胞にＡＭＰまたはＡＭＰの調節因子をコードする核酸分子（たとえばＤＮＡまたはＲＮＡ分子）を接触させるステップを含む、対象における微生物障害を処置する方法を提供し、ＡＭＰは：ＬＴ、ＩＬ−６、ＩＬ−１８、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＲＥＧ  Ｉα、ＲＥＧ  Ｉβ、ＨＩＰ／ＰＡＰ、ＲＥＧ  ＩＩＩ、ＲＥＧ  ＩＶおよびＲｅｇ関連配列（ＲＳ）からなる群より選択される。一実施形態において、障害は、ＥＨＥＣまたはＥＰＥＣ誘発下痢、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または、さらに詳細には潰瘍性大腸炎（ＵＣ）またはクローン病（ＣＤ）である。
【０２６４】
別の実施形態において、本発明は、細胞にＡＭＰまたはＡＭＰの調節因子をコードする核酸分子（たとえばＤＮＡまたはＲＮＡ分子）を接触させるステップを含む、微生物病原体（たとえば細菌またはウイルス）に罹患した対象の細胞におけるＡＭＰの活性を調節する方法を提供し、ＡＭＰは：ＬＴ、ＩＬ−６、ＩＬ−１８、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＲＥＧ  Ｉα、ＲＥＧ  Ｉβ、ＨＩＰ／ＰＡＰ、ＲＥＧ  ＩＩＩ（たとえばＲＥＧ  ＩＩＩβまたはＲＥＧ  ＩＩＩγ）、ＲＥＧ  ＩＶおよびＲｅｇ関連配列（ＲＳ）からなる群より選択される。
【０２６５】
微生物病原体の例は、これに限定されるわけではないが、細菌またはウイルスを含む。一実施形態において、微生物病原体は細菌、たとえばグラム陰性またはグラム陽性細菌である。詳細な実施形態において、細菌はグラム陰性細菌である。別の実施形態において、細菌は腸管接着性または微絨毛消滅性（Ａ／Ｅ）細菌、およびさらに詳細には、腸出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）または腸病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）である。一実施形態において、細菌は腸出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７または大腸菌Ｏ５５：Ｈ７である。
【０２６６】
本発明の処置方法は、本発明の１つ以上の組成物または医薬製剤を含む。このような方法は、別途指摘しない限り、インビトロ、エクスビボ、およびインビボ処置方法を含む。
【０２６７】
各種の実施形態において、本発明は、ＡＭＰ媒介シグナル伝達経路および／またはＴｈＩＬ−１７細胞機能を刺激または抑制することによって抗微生物免疫応答を調節する方法を提供する。このような方法は、微生物障害の処置に有用である。たとえば、一実施形態において、本発明は、ＡＭＰ媒介シグナル伝達経路たとえば、ならびにＩＬ−２２および／またはＩＬ−２３媒介シグナル伝達経路を刺激することによって抗微生物免疫応答を向上させる方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、サイトカイン媒介シグナル伝達経路を刺激または抑制することによって抗微生物免疫応答を調節する方法を提供する。たとえば、一実施形態において、本発明は、サイトカイン媒介シグナル伝達経路、たとえばＩＬ−２２および／またはＩＬ−２３媒介シグナル伝達経路を刺激することによって抗微生物免疫応答を向上させる方法を提供する。さらに、本発明は、ＴｈＩＬ−１７細胞機能を刺激または抑制することによって抗微生物免疫応答を調節する方法を提供する。
【０２６８】
一実施形態において、本発明は、ＡＭＰアゴニストを生物系に供給するステップを含む、生物系においてＡＭＰ媒介シグナル伝達経路を刺激する方法を提供する。このような生物系の例は、これに限定されるわけではないが、インビトロ細胞培養系またはインビボの生物における哺乳動物細胞を含む。別の実施形態において、本発明は、ＡＭＰアンタゴニストを生物系に供給するステップを含む、生物系においてＡＭＰ媒介シグナル伝達経路を抑制する方法を提供する。
【０２６９】
詳細な実施形態において、本発明は、ＩＬ−２２またはＩＬ−２２アゴニストを生物系に供給するステップを含む、生物系でＩＬ−２３および／またはＩＬ−２２媒介シグナル伝達経路を刺激することによって生物系における抗微生物免疫応答を向上させる方法を提供する。一実施形態において、ＩＬ−２２アゴニストはＩＬ−２２である。別の実施形態において、ＩＬ−２２アゴニストは、ＩＬ−２２に結合する抗体である。
【０２７０】
別の実施形態において、ＩＬ−２２アンタゴニストを生物系に供給するステップを含む、生物系においてＩＬ−２３媒介シグナル伝達経路を抑制する方法を提供する。一実施形態において、ＩＬ−２２のアンタゴニストは抗体、たとえば中和抗ＩＬ−２２抗体および／または中和抗ＩＬ−２２抗体である。
【０２７１】
別の実施形態において、本発明は、ＴｈＩＬ−１７細胞を、ＩＬ−２３媒介シグナル伝達経路（たとえばＩＬ−２３、ＩＬ−６、またはＩＬ−２２）を媒介するＡＭＰのアゴニストに曝露するステップを含む、ＴｈＩＬ−１７細胞機能を刺激する方法を提供する。このような方法は、微生物障害を処置するのに有用である。一実施形態において、ＩＬ−２２アゴニストはＩＬ−２２である。別の実施形態において、ＩＬ−２２アゴニストは、ＩＬ−２２に結合する抗体である。
【０２７２】
別の実施形態において、ＴｈＩＬ−１７細胞を、ＩＬ−２３媒介シグナル伝達経路（たとえばＩＬ−２３、ＩＬ−６、またはＩＬ−２２）を媒介するＡＭＰのアンタゴニストに曝露するステップを含む、ＴｈＩＬ−１７細胞機能を刺激する方法が提供される。一実施形態において、アンタゴニストはＩＬ−２２抗体、たとえば中和抗ＩＬ−２２抗体である。
【０２７３】
例示的なＴｈＩＬ−１７細胞機能は、これに限定されるわけではないが、細胞媒介免疫の刺激（遅延型過敏性）；自然免疫細胞、たとえば骨髄性細胞（たとえば単球および好中球）の炎症部位への補充；および炎症性細胞浸潤の組織中への刺激を含む。一実施形態において、ＴｈＩＬ−１７細胞機能は、ＩＬ−２３および／またはＩＬ−２２によって媒介される。
【０２７４】
本発明の組成物は、哺乳動物、好ましくはヒトに、公知の方法、たとえばボーラスとしてまたはある期間にわたる持続注入としての静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液包内、くも膜下腔内、経口、局所、または吸入（鼻内、肺内）経路によって投与される。ポリペプチドおよび抗体の静脈内または吸入投与が好ましい。
【０２７５】
微生物障害の処置またはその重症度の低下のために、本発明の組成物の適切な投薬量は、上で定義したような、処置される障害の種類、障害の重症度および経過、薬剤の投与が予防目的か処置目的か、以前の処置、患者の臨床暦および化合物に対する応答、および担当医の判断によって変わるであろう。化合物は、患者に１回または一連の処置にわたって好適に投与される。
【０２７６】
たとえば、障害の種類および重症度に応じて、ポリペプチドまたは抗体約１ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（たとえば０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）が、たとえば１回以上の個別の投与、または持続注入にかかわらず、患者への投与の初期候補投薬量である。代表的な１日投薬量は、上述の因子に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上に及ぶことがある。数日以上にわたる反復投与の場合、状態に応じて、処置は疾患症状の所望の抑制が生じるまで維持される。しかし、他の投薬計画も有用であり得る。この処置の進捗は、慣習的な技法およびアッセイによって容易に監視される。
【０２７７】
Ｆ．診断方法および検出方法
一実施形態において、本発明は、抗体のＡＭＰへの結合に許容される条件下で生体サンプルをＡＭＰに対する抗体と接触させるステップと、抗体とＡＭＰとの間に複合体が形成されるか否かを検出するステップとを含む、生体サンプル中のＡＭＰの存在を検出する方法を提供する。
【０２７８】
一実施形態において、本発明は、処置が必要な対象から得た組織細胞の試験サンプル中でのＡＭＰをコードする遺伝子の発現レベルを検出するステップを含み、試験サンプル中の発現レベルが検出される、対象における微生物障害の処置を監視する方法を提供する。検出は定性的または定量的であり得る。一実施形態において、試験サンプルは血液または血清を含む。一実施形態において、ＡＭＰをコードする遺伝子の発現レベルを検出することは、（ａ）抗ＡＭＰ抗体を哺乳動物から得た試験サンプルと接触させるステップと、（ｂ）抗体と試験サンプル中のＡＭＰとの複合体の形成を検出するステップとを含む。抗体は検出可能な標識に結合され得る。複合体の形成は、たとえば光学顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光分析、または当分野で公知の他の技法によって監視できる。試験サンプルは、微生物障害を有することが疑われる個体から得られる。
【０２７９】
一実施形態において、ＡＭＰをコードする遺伝子の発現レベルを検出することは、遺伝子からｍＲＮＡ転写のレベルを検出するステップを含む。ｍＲＮＡ転写のレベルは、当業者に公知の各種の方法によって、定量的または定性的のどちらかで検出され得る。ｍＲＮＡ転写のレベルはまた、直接またはｍＲＮＡから生成されたｃＤＮＡのレベルを検出することによって間接的に検出され得る。ｍＲＮＡ転写のレベルを検出する例示的な方法は、これに限定されるわけではないが、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲならびにマイクロアレイ・ベース・アッセイおよびノザンブロットなどのフィルタ・ベース・アッセイを含むハイブリダイゼーション・ベース・アッセイを含む。
【０２８０】
別の実施形態において、本発明は、抗体のＡＭＰへの結合に許容される条件下で生体サンプルをＡＭＰに対する抗体と接触させるステップと、抗体とＡＭＰとの間に複合体が形成されるか否かを検出するステップとを含む、生体サンプル中のＡＭＰの存在を検出する方法を提供する。
【０２８１】
別の実施形態において、本発明は、好適なパッケージに抗ＡＭＰを含有する診断キットに関する。キットは好ましくは、ＡＭＰを検出するための抗体を使用する説明書を含有する。一実施形態において、診断キットは、微生物障害を診断するためである。一実施形態において、診断キットは、微生物感染を診断するためである。
【０２８２】
別の実施形態において、本発明は、本発明の１つ以上のＡＭＰおよび／またはその調節因子を含むキットを提供する。別の実施形態において、本発明は、本発明のＡＭＰまたはその調節因子をそれぞれ含む１つ以上の医薬組成物を含むキットを提供する。
【０２８３】
Ｇ．アッセイ
１．細胞ベースアッセイおよび動物モデル
免疫疾患のための細胞ベースアッセイおよび動物モデルは、本発明のある実施形態を実施するのに有用である。下の実施例に与えたある細胞ベースアッセイは、たとえばＩＬ−２２アンタゴニストまたはアゴニストの有効性を試験するのに有用である。
【０２８４】
本発明のある実施形態を実施するのに、インビボ動物モデルも有用である。下の実施例には、例示的な動物モデルも記載されている。このようなモデルのインビボ特性によって、ヒト患者における応答を予測することができる。免疫関連疾患の動物モデルは、非組換え動物および組換え（トランスジェニック）動物の両方を含む。非組換え動物モデルはたとえば、げっ歯類、たとえばマウスモデルを含む。このようなモデルは、標準技法、たとえば皮下注射、尾静脈注射、脾臓移植、腹腔内移植、腎被膜下移植などを使用して同系マウスに細胞を導入することによって生成できる。
【０２８５】
対宿主性移植片病モデルによって、ＭＨＣ抗原およびマイナー移植抗原に対するＴ細胞反応性を評価する手段が与えられる。対宿主性移植片病は、免疫担当細胞が免疫抑制または寛容患者に移植されるときに発生する。ドナー細胞は、宿主抗原を認識して、宿主抗原に応答する。応答は、生命を脅かす重症の炎症から下痢および体重減少の軽症まで多様である可能性がある。対宿主性移植片病を評価する好適な手順は、上述のＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ｕｎｉｔ  ４．３に詳細に記載されている。
【０２８６】
皮膚同種移植拒絶の動物モデルは、Ｔ細胞がインビボ組織破壊を媒介する能力を試験する手段および移植拒絶でのその役割の尺度である。最も一般的で認められたモデルは、マウス尾皮膚移植片を使用する。反復実験により、皮膚同種移植拒絶は抗体ではなく、Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞およびキラー−エフェクタＴ細胞によって媒介されることが示されている。Ａｕｃｈｉｎｃｌｏｓｓ，Ｈ．Ｊｒ．ａｎｄ  Ｓａｃｈｓ，Ｄ．Ｈ．，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ  ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９，８８９−９９２。好適な手順は、上のＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ｕｎｉｔ  ４．４に詳細に記載されている。本発明の化合物を試験するために使用できる他の移植拒絶モデルは、Ｔａｎａｂｅ，Ｍ．ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（１９９４）５８：２３およびＴｉｎｕｂｕ，Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）４３３０−４３３８によって記載された同種心臓移植モデルである。
【０２８７】
接触過敏症は、細胞媒介免疫機能（遅延型過敏症）の簡単なインビボアッセイである。この手順では、外因性ハプテンへの皮膚曝露によって遅延型過敏症反応が引き起され、これが測定および定量される。接触過敏症は、初期感作期と、それに続く誘発期とを含む。誘発期は、Ｔリンパ球が以前に接触したことのある抗原に遭遇したときに起こる。膨張および炎症が起こることにより、これがヒトアレルギー接触皮膚炎の優れたモデルとなる。好適な手順は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｏｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ  ａｎｄ  Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９４，ｕｎｉｔ  ４．２に詳細に記載されている。Ｇｒａｂｂｅ，Ｓ．ａｎｄ  Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｔ，Ｉｍｍｕｎ．Ｔｏｄａｙ  １９（１）：３７−４４（１９９８）も参照。
【０２８８】
さらに、本発明の組成物は、乾癬様疾患の動物モデルに対して試験できる。たとえば本発明の組成物は、マウスが乾癬に似た組織病理学的皮膚病変を示す、Ｓｃｈｏｎ，Ｍ．Ｐ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（１９９７）３：１８３によって記載されたｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスモデルで試験できる。別の好適なモデルは、Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ，Ｂ．Ｊ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．（１９９５）１４６：５８０によって記載されたように調製したヒト皮膚／ｓｃｉｄマウスキメラである。ヒト乾癬前皮膚をＡＧＲ１２９マウスに移植して、乾癬皮膚病変の発症を引き起こす別の好適なモデルは、Ｂｏｙｍａｎら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．（２００４）１９９（５）：７３１−６に記載されている。
【０２８９】
ポリペプチドをコードする内因性遺伝子とその遺伝子が改変されているＤＮＡ分子との間の相同組換えの結果として、本明細書で同定したポリペプチドをコードする欠陥または改変遺伝子を有する、ノックアウト動物を構築することができる。たとえば、特定のポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、確立された技法に従ってそのポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡをクローニングするために使用できる。特定のポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの一部は、欠失させることができるか、または別の遺伝子、たとえば組込みを監視するために使用できる選択可能なマーカーをコードする遺伝子によって置換することができる。通例、数キロベースの未改変フランキングＤＮＡ（５’および３’末端の両方にて）がベクターに含まれる［相同組換えベクターの説明については、たとえばＴｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ，５１：５０３（１９８７）を参照］。ベクターは胚性幹細胞株（たとえば電気穿孔によって）内に導入され、導入されたＤＮＡが内因性ＤＮＡと相同組換えされた細胞が選択される［たとえばＬｉら、Ｃｅｌｌ，６９：９１５（１９９２）を参照］。選択された細胞を次に動物（たとえばマウスまたはラット）の胚盤胞に注入して、凝集キメラを形成する［たとえばＢｒａｄｌｅｙ，ｉｎ  Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，ｅｄ．（ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７），ｐｐ．１１３−１５２を参照］。キメラ胚を次に好適な偽妊娠メス養育動物に移植し、胚を出産予定日まで到達させて、「ノックアウト」動物を作製する。その生殖細胞中に相同組換えＤＮＡを持つ子孫は、標準技法によって同定可能であり、動物のすべての細胞が相同組換えＤＮＡを含有する動物を繁殖させるために使用できる。ノックアウト動物は、たとえばある病的状態を防ぐその能力およびポリペプチドの非存在による病的状態のその発生を特徴とすることが可能である。
【０２９０】
２．薬物候補のスクリーニングアッセイ
薬物候補のスクリーニングアッセイは、本明細書で同定されたポリペプチドまたはその生物活性断片に結合するもしくはそれと複合体を形成する、またはそうでなければポリペプチドと他の細胞タンパク質との相互作用を妨害する化合物を同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、化学ライブラリの高スループットスクリーニングに適したアッセイを含み、これによりアッセイは小型細胞薬物候補を同定するのに特に好適となる。検討される小型分子は、ペプチド、好ましくは可溶性ペプチド、（ポリ）ペプチド−免疫グロブリン融合体を含む合成有機または無機化合物、および特に、制限なく、ポリ−およびモノクローナル抗体および抗体断片、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体を含む抗体、ならびにこのような抗体または断片のキメラまたはヒト化バージョンはもちろんのこと、ヒト抗体および抗体断片も含む。アッセイは、当分野で十分に特徴付けられている、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学スクリーニングアッセイ、イムノアッセイおよび細胞ベースアッセイを含む各種の形式で実施できる。すべてのアッセイは、ポリペプチドを試験化合物と相互作用させるのに十分な条件および時間で、試験化合物を本明細書で同定されたポリペプチドと接触させることをそれらが必要するという点で共通している。
【０２９１】
結合アッセイでは、相互作用は結合であり、形成された複合体は反応混合物中で単離または検出できる。詳細な実施形態において、ポリペプチドまたは試験化合物は固相、たとえばマイクロタイタープレートに共有または非供給結合によって固定される。非共有結合は一般に、固体表面をポリペプチドまたは試験化合物の溶液でコーティングして、乾燥させることによって得られる。または固定抗体、たとえば固定されるポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を使用してポリペプチドを固体表面に固着させることができる。アッセイは、検出可能な標識によって標識され得る非固定成分を固定成分、たとえば固着成分を含有するコート表面に添加することによって実施する。反応が完了したときに、未反応成分はたとえば洗浄によって除去され、固体表面に固着した複合体が検出される。最初に固定されていない成分が検出可能な標識を保持している場合、表面に固定された標識の検出によって、複合体化が起こったことが示される。最初に固定されていない成分が検出可能な標識を保持していない場合、複合体化はたとえば、固定された複合体を特異的に結合する標識抗体を使用することによって検出できる。
【０２９２】
試験化合物が本明細書で同定された特定のポリペプチドと相互作用するが、結合しない場合、そのタンパク質とのその相互作用は、タンパク質間相互作用を検出するための周知の方法によってアッセイできる。このようなアッセイは、慣習的な手法、たとえば架橋、同時免疫沈降、および勾配またはクロマトグラフィーカラムによる同時精製を含む。さらに、タンパク質間相互作用は、Ｃｈｅｖｒａｙ  ａｎｄ  Ｎａｔｈａｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，５７８９−５７９３（１９９１）によって開示されたような、Ｆｉｅｌｄｓおよび共同研究者［Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｓｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３４０，２４５−２４６（１９８９）；Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８，９５７８−９５８２（１９９１）］によって記載された酵母ベース遺伝子系を使用することによって監視できる。多くの転写活性化因子、たとえば酵母ＧＡＬ４は、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用するのに対して、他方は転写活性化ドメインとして機能する、２つの物理的に別個のモジュラードメインより成る。上述の公報に記載された酵母発現系（一般に「２ハイブリッド系」と呼ばれる）は、こと特性を利用しており、２つのハイブリッドタンパク質を利用し、その一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合しており、他方では候補活性化タンパク質が活性化ドメインに結合している。ＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下でのＧＡＬ１−ｌａｃＺレポータ遺伝子の発現は、タンパク質間相互作用を介したＧＡＬ４活性化の再構成によって変わる。相互作用ポリペプチドを含有するコロニーは、β−ガラクトシダーゼの色素形成基質によって検出される。２ハイブリッド技法を使用して２つの特異的タンパク質間のタンパク質間相互作用を同定するための完成キット（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ（商標））は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから市販されている。本系は、特異的タンパク質相互作用に関与するタンパク質ドメインをマッピングすることにはもちろんのこと、これらの相互作用に不可欠であるアミノ酸残基を特定することにも拡張できる。
【０２９３】
本明細書で同定したポリペプチドと他の細胞内または細胞外成分との間の相互作用を妨害する化合物を同定するために、ポリペプチドおよび成分を含有する反応混合物がポリペプチドと成分との相互作用を可能にする条件下で調製され得る。試験化合物が相互作用を抑制する能力を試験するために、反応混合物を試験化合物の存在下および非存在下で調製する。試験化合物の存在下でポリペプチドと成分との相互作用の低下がある場合には、試験化合物はポリペプチドと成分との相互作用を抑制すると言われる。
【０２９４】
ある実施形態において、ＡＭＰのアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法は、ＡＭＰを候補アゴニストまたはアンタゴニスト分子と接触させるステップと、ＡＭＰと通常関連する１つ以上の生物活性の検出可能な変化を測定するステップとを含む。このような活性は、これに限定されるわけではないが、下の実施例に記載されている活性を含む。
【０２９５】
一実施形態において、本発明は、ＩＬ−２２ポリペプチドを候補アゴニスト分子と接触させるステップと、ＩＬ−２２ポリペプチドと通常関連する１つ以上の生物活性の検出可能な変化を測定するステップとを含む、ＩＬ−２２ポリペプチドのアゴニストを同定する方法を提供する。このような活性は、これに限定されるわけではないが、下の実施例に記載されている活性を含む。
【０２９６】
３．抗体結合アッセイ
抗体結合研究は、任意の公知のアッセイ方法、たとえば競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、および免疫沈降アッセイで実施され得る。Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）。
【０２９７】
競合結合アッセイは、限定量の抗体との結合について標識標準が試験サンプル検体と競合する能力に依存している。試験サンプル中の標的タンパク質の量は、抗体に結合されるようになる標準の量に反比例する。結合されるようになる標準の量の決定を容易にするために、抗体に結合された標準および検体が結合しないままである標準および検体から好都合に分離され得るように、抗体は好ましくは競合の前後に不溶化される。
【０２９８】
サンドイッチアッセイは、検出されるタンパク質の異なる免疫原性部分、またはエピトープにそれぞれ結合可能である、２つの抗体の使用を含む。サンドイッチアッセイにおいて、試験サンプル検体は、固体担持体に固定された第１の抗体によって結合され、その後、第２の抗体が検体に結合して、それゆえ不溶性３部複合体が形成される。たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔ  Ｎｏ．４，３７６，１１０を参照。第２の抗体は、検出可能な部分によってそれ自体標識され得るか（直接サンドイッチアッセイ）、または検出可能な部分によって標識された抗免疫グロブリン抗体を使用して測定され得る（間接サンドイッチアッセイ）。たとえば、サンドイッチアッセイの１種はＥＬＩＳＡアッセイであり、その場合、検出可能な部分は酵素である。
【０２９９】
免疫組織化学も、抗体が結合する抗原の細胞位置を決定するために使用され得る。免疫組織化学では、組織サンプルは、新鮮であるかもしくは凍結されることもあり、またはパラフィン包埋されて、たとえばホルマリンなどの保存料によって固定されることもある。
【０３００】
製品
別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載する微生物障害の診断または処置に有用な組成物を含む製品を提供する。製品は、容器および説明書を含む。好適な容器は、たとえば瓶、バイアル、注射器、および試験管を含む。容器はガラスまたはプラスチックなどの各種の材料から形成され得る。容器は、状態を診断または処置するのに有効である組成物を保持して、滅菌アクセスポートを有し得る（たとえば容器は、皮下注射針によって貫通できるストッパを有する静脈内液剤バッグまたはバイアルであり得る）。組成物中の活性剤は通常、本発明のポリペプチド、抗体、アゴニスト、またはアンタゴニストである。容器に貼付け、または添付された説明書またはラベルは、組成物が選択した状態の診断または処置に使用されることを示す。製品は、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液などの製薬的に許容される緩衝剤を含む第２の容器をさらに含み得る。製品は、他の緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、注射器、および添付文書を使用説明書と共に含む、商業的視点およびユーザの視点から望ましい他の物質をさらに含み得る。
【０３０１】
一実施形態において、本発明は：
（ａ）ＡＭＰまたはその調節因子（たとえばＩＬ−２２アゴニスト）を含む物質の組成物と；
（ｂ）前記組成物を含有する容器と；
（ｃ）微生物障害の処置における前記アゴニストの使用に言及する、前記容器に貼付けられたラベル、または前記容器に含まれる添付文書と；
を含む、製品を提供する。組成物は、有効量のアゴニストを含み得る。
【実施例】
【０３０２】
以下は本発明の方法および組成物の例であり、例示目的のみで本明細書で提供され、本発明の範囲を制限することを意図していない。本明細書で提供される一般的な記載を考慮すれば、各種の他の実施形態が実施され得ることが理解される。
【０３０３】
実施例で言及される市販の試薬は、別途指摘しない限り、製造者の説明書に従って使用した。ＡＴＣＣアクセション番号によって以下の実施例、および明細書を通じて示されたこのような細胞の供給源は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡである。
【０３０４】
本明細書に示したデータによって、ＩＬ−２２が、Ａ／Ｅ細菌性病原体の早期感染中に適応的免疫応答および生得的上皮防御を橋渡しする重要なサイトカインの１つであることが初めて示されている。本明細書で示すように、Ｒｅｇ  ＩＩＩβおよびＲｅｇ  ＩＩＩγの誘導によって、ＩＬ−２２が各種の細菌感染を制御するのにより広範な機能を有し得ることも示される。データは、感染性疾患および自己免疫疾患におけるＴｈ１７細胞およびそのエフェクタサイトカインの役割をさらに裏付けている。最後に、本研究によって、ＩＬ−２２ならびにＲｅｇ  ＩＩＩβおよびＲｅｇ  ＩＩＩγなどのその下流生成物が、ある感染性疾患の処置に有利であり得ることが示される。
【０３０５】
（実施例１）
ＩＬ−２３は、感染性疾患プロセスの間のＩＬ−２２制御に不可欠である。
【０３０６】
本明細書のデータによって、ＩＬ−２３は、感染性疾患プロセスの間のＩＬ−２２制御に不可欠であることが示されている。
【０３０７】
ＩＬ−２２受容体対の両方である、ＩＬ−２２ＲおよびＩＬ−１０Ｒβ鎖は、野生型Ｃ５７Ｂｌ／５マウスの胃腸管内で発現される（図１Ａ）。十二指腸、空腸、回腸、および結腸におけるその発現は、ＩＬ−２２が過形成を誘導することが示された組織である皮膚にそれらが存在するときよりも高い。常に結腸上皮細胞および上皮下筋線維芽細胞の両方が、ＩＬ−２２に応答することが報告されている。Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染の間、ＩＬ−２３のｐ１９およびｐ４０サブユニット（図１Ｃ−Ｄ）、ならびにＩＬ−６（図１Ｅ）を含むＴｈ１７細胞分化を促進するサイトカインと同様に、ＩＬ−２２は野生型マウスの結腸内で誘導される（図１Ｂ）。これらのサイトカインすべては迅速に誘導され、ピーク発現は接種４日後ごろであった。対照的に、ＩＬ−１７誘導は、より低速の動態を有し、接種１２日後にその最高レベルに到達した（図１Ｆ）。
【０３０８】
ＩＬ−２３またはＩＬ−６のどちらかがインビトロでＴ細胞からのＩＬ−２２産生を促進するため、本発明者らは、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染の間のＩＬ−２２産生の制御におけるその役割を最初に定義しようとした。Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染後の野生型ｐ１９−／−、ｐ４０−／−、およびＩＬ−６−／−マウスの生存率を比較したときに、ｐ４０−／−群（図１Ｇ）またはｐ１９−／−群（データは示さず）の両方からのすべてのマウスが接種１０日後に死亡することを常に見出した。興味深いことに、第１２日ごろにＩＬ−６−／−群で６０％の死亡率も観察され（図１Ｇ）、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染の完全な制御のためにはＩＬ−６がある程度まで必要であることが示されている。次に我々は、ｐ１９−／−およびＩＬ−６−／−マウスにおけるＩＬ−２２およびＩＬ−１８発現を調査した（図１Ｈ）。ＩＬ−１７発現はｐ１９−／−マウスでは改変されなかったが（１５）、ＩＬ−２２の誘導は野生型マウスと比較してｐ１９−／−マウスでは減少した。しかしＩＬ−６−／−マウスにおいて、ＩＬ−２２ピークレベルは野生型マウスのＩＬ−２２ピークレベルに匹敵していたが、その誘発は著しく遅延された（図１Ｈ）。さらにＩＬ−６−／−マウスにおいて、ＩＬ−１７に対するＩＬ−６の必須の役割と一致して、ＩＬ−１７の誘発は著しく低下した。
【０３０９】
感染マウスによる結腸のエクスビボ培養物中のＩＬ−２２／ＩＬ−１７タンパク質をＥＬＩＳＡによって直接測定することによって、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染中のＩＬ−２２／ＩＬ−１７産生の動態およびｐ１９−／−マウスからのＩＬ−２２誘導の非存在が確認された（図１１）。これらのデータによって、ＩＬ−２３が感染性疾患プロセスの間のＩＬ−２２制御に不可欠であることが初めて示されている。
【０３１０】
これらのデータによって、ＩＬ−２３が感染性疾患プロセスの間のＩＬ−２２制御に不可欠であることが初めて示されている。
（実施例２）
ＩＬ−２２は、微生物感染の制御におけるＩＬ−２３の生物学に寄与する主要な下流エフェクタサイトカインである。
【０３１１】
ＩＬ−２３欠失マウスおよびＩＬ−６−／−マウスの両方におけるＩＬ−２２制御の改変により、ＩＬ−２２がＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染に対する宿主防御で重要な役割を果たし得ることが示された。ＩＬ−２２の役割をさらに調査するために、ＩＬ−２２−／−マウスにＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍを接種した。野生型同腹子は一時的に体重が減少したが、第６日以降に完全に回復できたのに対して、ＩＬ−２２−／−マウスはＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染後に体重減少が続いた（図２Ａ）。ＩＬ−２２−／−マウスの約８０％が、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ接種１２日後に瀕死となるか、または死亡した（図２Ａ）。第８日の感染ＩＬ−２２−／−マウスからの結腸の組織学的分析によって、ＷＴマウスの粘膜厚と比較したときに粘膜厚の増大が示された（図２Ｂ）。同時に、粘膜下炎症の増加もあった（矢印、図２Ｂ）。さらに、対照マウスにおいてＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染は主に表面的であるのに対して、ＩＬ−２２−／−マウスでは多数の細菌が結腸陰窩まで深く侵入した（矢印、図２Ｃ）。抗ＩＬ−２２Ｒ抗体を用いたＦＡＣＳ分析（図１２）によって、ＩＬ−２２Ｒは、Ｅ−カドヘリン陽性初代マウス結腸上皮細胞によって発現されるが、ＣＤ４５＋上皮内リンパ球（ＩＥＬ）または固有層単核細胞（ＬＰＭＣ）によっては発現されないこと（図１２Ａ）が明らかになった。同様に、初代ヒト結腸上皮細胞もＩＬ−２２Ｒを発現した（図１２Ｂ）。これらのデータによって、結腸上皮細胞はＩＬ−２２によって直接標的とされたことが示される。
【０３１２】
これらのデータは、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染に対する宿主防御におけるＩＬ−２２の重要性を裏付けて、ＩＬ−２２が微生物感染を制御する際にＩＬ−２３の生物学に寄与する主要な下流エフェクタサイトカインの１つであり得ることを示している。
（実施例３）
ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆ経路は、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染に対する宿主防御には不要である。
【０３１３】
Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍに対するＩＬ−６−／−マウスにおける宿主防御の部分的欠陥も、これらのマウスにおけるＩＬ−２２の誘導遅延によって説明できる（図１Ｈ、左パネル）。しかし、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染ＩＬ−６−／−マウスの致死性は、それらがＩＬ−１７を上方制御できないことが原因であったかもしれないことも考えられる（図１Ｈ、右パネル）。ＩＬ−１７経路は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅなどの多くの細胞外細菌感染の制御に不可欠である。ＩＬ−１７は、ＩＬ−１７ＲおよびＩＬ−１７ＲＣを介してシグナル伝達して（Ｄ．Ｔｏｙら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７７，３６（２００６年７月１日））、上皮細胞を含む多くの細胞の種類から炎症誘発応答を誘導する（Ｊ．Ｗｉｔｏｗｓｋｉ，Ｋ．Ｋｓｉａｚｅｋ，Ａ．Ｊｏｒｒｅｓ，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ６１，５６７（２００４年３月））。Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染中のＩＬ−１７経路の役割を分析するために、ＩＬ−１７ＲＣ−／−マウスを生成した（図５）。野生型同腹子と比較して、ＩＬ−１７ＲＣ−／−マウスには、Ｔ細胞、Ｂ細胞および他の免疫細胞の発生または組成に関して明白な欠陥はなかった（図は示さず）。しかし、ＩＬ−１７ＲＣ−／−マウスの尾端（図５Ｃ）または肺組織（データを示さず）から生成した線維芽細胞は、ＩＬ−１７ＡまたはＩＬ−１７Ｆのいずれかによって刺激したときにＩＬ−６を全く産生できず、ＩＬ−１７ＲＣがＩＬ−１７ＡまたはＩＬ−１７Ｆの両方の媒介機能に不可欠な受容体であることが示されている。Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ接種後、ＩＬ−１７ＲＣ−／−マウスおよび野生型同腹子の両方が何らかの著しい体重減少（図２Ｄ）または結腸の何らかの組織学的相違（データを示さず）を伴わずに、感染の過程で生き残った。
【０３１４】
これらの結果によって、ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆ経路がＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染に対する宿主防御には必要ないことが示され、ＩＬ−１７産生の欠陥がＩＬ−６−／−マウスの観察された死亡率の主な原因であるという可能性はすぐに除外される。それゆえ、ＩＬ−６−／−マウスで観察されたＩＬ−２２の誘導遅延は、これらのマウスが感染で生き残れない理由であるかもしれない。しかし、ＩＬ−６の下流の他の因子も重要であり得る。ＩＬ−６−／−マウスからの結果によって、致死性を防止するために宿主がＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染に対する十分な応答を起こすには、ＩＬ−２２の早期誘導が重要であるかもしれないことが示唆される。
【０３１５】
（実施例３）
ＩＬ−２２は、細菌感染の早期に重要な役割を果たす。
【０３１６】
致死性を防止するために宿主がＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染に対する十分な応答を起こすのにＩＬ−２２の早期誘発が重要か否かを判定するために、抗ＩＬ−２２中和抗体を接種後０日および８日のどちらかから開始して１日おきに投与した。予想したように、抗ＩＬ−２２ｍＡｂを細菌接種と同時に投与されたマウスは、引き続き体重が減少して、接種後１２日にはすべて瀕死となるかまたは死亡した。対照的に、すべてのアイソタイプ対照抗体処置動物は生き残った（図２Ｅ）。接種後８日から開始して抗ＩＬ−２２ｍＡｂを投与されたマウスは、アイソタイプｍＡｂ処置マウスと同様の結果を得て、感染から完全に回復した。
【０３１７】
したがって、これらのデータによって、ＩＬ−２２がＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染の早期には重要な役割を果たすが、細菌が根絶されている宿主防御の後期の間には何の役割も果たさないことが示された。
【０３１８】
（実施例４）
ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、およびＩＬ−２４は、細菌感染に対する宿主防御に必要でない。
【０３１９】
他のＩＬ−１０ファミリーのサイトカイン、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、およびＩＬ−２４はすべて、表皮角化細胞においてＩＬ−２２によって誘導されたのと同様の生物機能を誘導する（Ｓ．Ｍ．Ｓａら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７８，２２２９（２００７年２月１５日））。ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、およびＩＬ−２４はすべて、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染の間に野生型マウス結腸において上方制御された（図６）。したがってそれらは、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染の間にＩＬ−２２が行うのと同様の役割を果たす。ＩＬ−１９はＩＬ−２０ＲαおよびＩＬ−２０Ｒβ鎖を通じてシグナル伝達する。ＩＬ−２０およびＩＬ−２４は、２つの異なる受容体対、ＩＬ−２０Ｒα／ＩＬ−２０ＲβおよびＩＬ−２２Ｒ／ＩＬ−２０Ｒβを通じてシグナル伝達できる（Ｊ．−Ｃ．Ｒｅｎａｕｌｄ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３，６６７（２００３））。したがってＩＬ−２０Ｒβは、これらの３つのサイトカインに共通の受容体である。胃腸管において、ＩＬ−２０ＲαおよびＩＬ−２０Ｒβ鎖の発現は、皮膚におけるこれらの鎖の発現よりも著しく低かった（図７）。
【０３２０】
Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染中のこれら３つのサイトカインの役割に十分に対処するために、ＩＬ−２０Ｒβ−／−マウスを生成した（図８）。これらのマウスは、野生型マウスと比較したときにすべての主要なリンパ器官における同様のリンパ球組成および発生で、正常な発生を示した（データは示さず）。これらのマウスの耳皮膚は、組換えＩＬ−２０によって処理したときにＳ１００ファミリータンパク質を上方制御することができず、インビボでのＩＬ−２０シグナル伝達の欠陥が示された（図８Ｃ）。
【０３２１】
ＩＬ−２０Ｒβ−／−マウスは野生型マウスと同様にＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染で生き残り（図２Ｆ）、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、およびＩＬ−２４は、細菌感染に対する宿主防御に必要でないことが証明された。
【０３２２】
（実施例５）
ＩＬ−２２欠失は、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染早期における上皮完全性を損なうことがある。
【０３２３】
本発明者らは、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染の間にＩＬ−２２の下流機構を調査した。０日に抗ＩＬ−２２ｍＡｂで処置したＩＬ−２２−／−マウスおよび野生型マウスはどちらも、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ接種８日後に対照マウスと比較して、より重篤な出血性下痢および直腸脱の発生率上昇を来たした。ＩＬ−２２−／−マウス（データを示さず）または０日の抗ＩＬ−２２ｍＡｂ処置マウスの結腸は、接種１０日後には対照マウスと比較して、肥厚して短くなっているのはもちろんのこと（図３Ａ）、盲腸も小さくなっていた。組織学的分析によって、ＩＬ−２２シグナル伝達がない結腸での炎症の増加がさらに明らかになった（図３Ｂ）。ＩＬ−２２−／−および抗ＩＬ−２２ｍＡｂ処置マウスの両方に、顕著な多病巣性粘膜潰瘍および経壁炎症の複数の病巣もあった（図３Ｃ、および図９）。さらに、ＩＬ−２２−／−マウスの腸間膜リンパ節、脾臓、および肝臓における細菌負荷は、野生型マウスと比較して著しく上昇した。興味深いことに、野生型マウスおよびＩＬ−２２−／−マウスの結腸における細菌負荷の差は無視できるほどだった（図３Ｄ）。これらの結果と一致して、塞栓性微小膿瘍を伴う多病巣性肝細胞壊死が明らかであるＩＬ−２２−／−マウスの肝臓では特に、細菌が全身へ蔓延した証拠もあった（図３Ｅ）。
【０３２４】
結論として、これらのデータによって、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染早期のＩＬ−２２−／−マウスでは上皮完全性が損なわれることが示される。
【０３２５】
（実施例６）
ＩＬ−２２欠失は抗細菌ＩｇＧ力価の低下につながる
以前の研究によって、細菌のクリアランスにおける抗Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ抗体の本質的な役割が確立された。感染後の野生型マウスからの血清の移入によって、ＣＤ４−／−マウスはＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ接種後の死から完全に救出された（Ｂｒｙら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２，４３３−４４１（２００４））。我々の研究では、ＩＬ−２２欠失マウスは、抗体応答が野生型マウスで十分に発現されていないときに、第８日ごろから始まって瀕死となるか、または死亡した（図３Ｆ）。第８日に、抗Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ力価は、野生型マウスにおける第１６日の力価の５０分の１未満であった。しかし、我々が野生型およびＩＬ−２２−／−マウスからの第８日の抗Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ抗体の力価を比較したときに、野生型マウスと比較してＩＬ−２２−／−マウスの抗Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ  ＩｇＧ力価に予想外の著しい低下があった（図３Ｇ）。対照的に、ＩＬ−２２−／−マウスの総ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡまたは抗Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ  ＩｇおよびＩｇＡ力価の低下はなかった（図１０Ａおよびデータは示さず）。さらなるＩｇＧサブタイプ分析によって、接種８日後には野生型にもＩＬ−２２−／−マウスにも抗Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ  ＩｇＧ１はなかったが、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ３を含む他の抗Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ  ＩｇＧサブタイプはすべてにおいて著しく低下することが明らかになった（図１０Ｂ）。特にＩｇＧは結腸粘膜管腔に標的化されておらず、野生型マウスとＩＬ−２２−／−マウスの両方での結腸細菌負荷は同様であるので、抗菌特異的ＩｇＧの違いはこの時点での結腸からのＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍのクリアランスには寄与しそうもない（図３Ｄ）。しかし、最近の研究によって、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍの全身クリアランスには分泌性ＩｇＡまたはＩｇＭではなく、循環ＩｇＧが必要であることが証明されたため、抗Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ  ＩｇＧを循環させることが腸上皮バリアを通じたＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍの侵入の制御と、全身への蔓延の防止とに重要であり得る可能性がある（Ｃ．Ｍａａｓｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７２，３３１５（２００４年６月１日））。ＩＬ−２２欠失が抗細菌ＩｇＧ力価の低下をもたらす方法は不明である。ＩＬ−２２Ｒの発現はＢ細胞では検出できないため、ＩＬ−２２はＢ細胞に直接作用しそうもない（Ｓ．Ｌｅｃａｒｔら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４，１３５１（２００２年１１月１日））。それにもかかわらず、抗Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ  ＩｇＧの低下は、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染の間のＩＬ−２２−／−マウスにおける宿主防御応答不全に寄与する因子の１つかもしれない。
【０３２６】
（実施例７）
ＩＬ−２２は、細菌感染の間の結腸上皮細胞からのＲｅｇ  ＩＩＩβおよびＲｅｇ  ＩＩＩγなどの抗微生物レクチンの誘導に不可欠であった。
【０３２７】
エクスビボでの未感染野生型マウスからの結腸組織のＩＬ−２２処置は、マイクロアレイ分析により、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｒｅｇ  ＩＩＩβ、Ｒｅｇ  ＩＩＩγ、ハプトグロビン、ＳＡＡ３、およびラクトトランスフェリンを含む多くの抗微生物タンパク質を上方制御した（図４Ａ、１９、および２０）。これらのタンパク質の誘導は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって確認された（図４Ｂおよびデータは示さず）。しかし、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染の間、野生型マウスと比較してＩＬ−２２−／−マウスでは、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｒｅｇ  ＩＩＩβおよびＲｅｇ  ＩＩＩγのみが異なって発現された（図４Ｃ）。他のすべての遺伝子は、誘導されないか、または野生型対ＩＬ−２２−／−マウスの結腸で違いがないかのどちらかであった（データは図示せず）。Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の発現はどちらも第４日および第６日に、野生型結腸よりもＩＬ−２２−／−マウスの結腸でわずかに高く、これらのタンパク質の発現差は、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染中にＩＬ−２２−／−マウスで観察された死亡率の上昇に関与に最も関与しそうにないことが示唆されている。感染した上皮の宿主防御に重要であるタンパク質のディフェンシンの発現は、野生型マウスとＩＬ−２２−／−マウスとの間で差が見られなかった（Ｔ．Ｇａｎｚ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６，４２０（１９９９年１０月１５日））（データは示さず）。興味深いことに、野生型マウスで観察されたＲｅｇ  ＩＩＩβおよびＲｅｇ  ＩＩＩγの上方制御は、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ接種後のＩＬ−２２−／−マウスで完全に無効となり（図４Ｃ）、これらの２つのタンパク質がＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染の制御に潜在的な機能を有することが示された。Ｒｅｇ  ＩＩＩβおよびＲｅｇ  ＩＩＩγはどちらも、分泌Ｃ型レクチンタンパク質のファミリーに属する（Ｈ．Ｌ．Ｃａｓｈ，Ｃ．Ｖ．Ｗｈｉｔｈａｍ，Ｌ．Ｖ．Ｈｏｏｐｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ４８，１５１（２００６））。Ｒｅｇ  ＩＩＩβおよびＲｅｇ  ＩＩＩγの発現レベルは、細菌コロニー化に応答してはもちろんのこと、マウスにおける他の炎症刺激の後にも劇的に上昇する（Ｓ．Ａ．Ｋｅｉｌｂａｕｇｈら、Ｇｕｔ  ５４，６２３（２００５年５月１日）Ｈ．Ｏｇａｗａら、Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ９，１６２（２００３）Ｈ．Ｏｇａｗａ，Ｋ．Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ，Ｉ．Ｓａｓａｋｉ，Ｓ．Ｍａｔｓｕｎｏ，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７９，Ｇ４９２（２０００年９月））。
【０３２８】
ＩＬ−２２−／−対野生型マウスの結腸からの細菌負荷に差が見られなかったので、Ｒｅｇ  ＩＩＩβおよびＲｅｇ  ＩＩＩγは、結腸陰窩までの深い侵入を防止し得る（図３Ｄ）。または、Ｒｅｇ  ＩＩＩβおよびＲｅｇ  ＩＩＩγタンパク質は、上皮修復および／または腸炎環境での保護で役割を果たす自己分泌成長因子として作用し得る（Ｈ．Ｏｇａｗａら、Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ９，１６２（２００３）；Ｓ．Ｌ．Ｐｕｌｌ，Ｊ．Ｍ．Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｊ．Ｃ．Ｍｉｌｌｓ，Ｊ．Ｉ．Ｇｏｒｄｏｎ，Ｔ．Ｓ．Ｓｔａｐｐｅｎｂｅｃｋ，ＰＮＡＳ  １０２，９９（２００５年１月４日）；Ｖ．Ｍｏｕｃａｄｅｌら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ８０，１５６（２００１年２月））。
【０３２９】
（実施例８）
適応免疫は、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染に対するＩＬ−２２媒介早期宿主防御に必須ではない。
【０３３０】
上のデータは、自然免疫および適応免疫の両方でＩＬ−２２の役割を示した。したがって、我々は組換え活性化遺伝子２欠失（Ｒａｇ２−／−）マウスを使用して、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染中の自然免疫対適応免疫でのＩＬ−２２の機能を十分に調査した。Ｒａｇ２−／−マウスは、マウスにＢおよびＴ細胞が欠失していることと、結果としてマウスが抗Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ抗体応答を開始できないこととによって、徐々に体重が減少して、第３０日ごろに最終的に瀕死となるか、または死亡した（図１３Ａ）。ｐ１９−／−またはＩＬ−２２−／−マウスとは対照的に、いずれのＲａｇ２−／−マウスも感染の最初の２週間の間には、その体重が１０％を超えて減少したり、または死亡したりしなかった。さらに、抗ＩＬ−２２ｍＡｂで処置したＲａｇ２−／−マウスは、抗ＩＬ−２２ｍＡｂによって処置したマウス（図２Ｅ）と同様に、非常に迅速に体重が減少した（図１３Ａ）。抗ＩＬ−２２ｍＡｂで処置したＲａｇ２−／−マウスはすべて、第１０日ごろに瀕死となるか、または死亡した（図１３）。これらのデータは、ＩＬ−２２経路がＲａｇ２−／−マウスにおいてなお活性であることと、ＩＬ−２２が適応免疫の非存在下でＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染の早期の間にマウスの死を防止するのに不可欠であることとを示している。Ｒａｇ２−／−マウスで抗体が産生されないことだけが感染後に迅速な体重減少および早期の死を引き起こしたわけではないため、これらのデータは、抗Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ  ＩｇＧ力価の低下がＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染後にＩＬ−２２−／−マウスで観察された罹患および死亡の原因として不十分であることを示している。
【０３３１】
Ｒａｇ２−／−マウスでのＩＬ−２２産生は、感染後のＷＴマウスのＩＬ−２２産生と匹敵していた（図１３Ｂ）。対照的に、ＩＬ−１７Ａの誘導はＲａｇ２−／−マウスでは著しく低下した（図１３ＢおよびＣ）。したがってＴ細胞およびＢ細胞は、このモデルでのＩＬ−２２の供給源ではなかった。抗ＩＬ−２２ｍＡｂを用いた免疫組織化学的染色（図１５）によって、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍに感染したＷＴマウスの結腸内でＩＬ−２２陽性細胞が検出されたが、未感染結腸または感染ＩＬ−２２−／−マウスからの結腸では検出されなかった。ＩＬ−２２陽性細胞は、Ｒａｇ２−／−マウスの結腸内で主にＣＤ１１ｃ＋細胞クラスタと同時局在化したが（図１３Ｄ）、Ｆ４／８０、Ｇｒ−１、またはＤＸ５陽性細胞とは同時局在化しなかった（データは示さず）。さらに、ＩＬ−２３は、インビトロでＣＤ１１ｃ＋ＤＣから直接、ＩＬ−２２産生を誘導する（図１３Ｅ）。まとめると、我々のデータによって、ＤＣがＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染の間にＩＬ−２２産生の主な供給源の１つであることと、ＩＬ−２３がＤＣからのＩＬ−２３産生を直接促進できることとが示される。
【０３３２】
（実施例９）
Ｒｅｇ  ＩＩＩは、細菌感染の間に重要な役割を果たす。
【０３３３】
興味深いことに、野生型マウスで観察されたＲｅｇ  ＩＩＩβおよびＲｅｇ  ＩＩＩγの上方制御は、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ接種後のｐ１９−／−マウスと同様に（図１６）、ＩＬ−２２−／−マウスで完全に無効となった（図４Ｃ）。Ｒｅｇ  ＩＩＩβおよびＲｅｇ  ＩＩＩγは、分泌Ｃ型レクチンタンパク質のファミリーに属する。我々は、Ｒｅｇ  ＩＶを除いて（データは示さず）、Ｒｅｇ  Ｉ、Ｒｅｇ  ＩＩ、Ｒｅｇ  ＩＩＩα、およびＲｅｇ  ＩＩＩδを含む他のファミリーメンバー（図１７）もＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染結腸で上方制御されることと、その誘導がＩＬ−２２−／−マウスで完全に無効であることとを見出した。外因性マウスＲｅｇ  ＩＩＩγ融合タンパク質（ｒｍＲｅｇ  ＩＩＩγ）は、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染によって誘導された体重減少からＩＬ−２２−／−マウスを著しく保護して、ｒｍＲｅｇ  ＩＩＩγ融合タンパク質処置動物の約５０％が感染を生き抜いたのに対して、対照処置ＩＬ−２２−／−マウスの１００％が瀕死となるか、または死亡した（図１４Ａ）。これらのデータは、Ｒｅｇ  ＩＩＩγなどのＲｅｇファミリータンパク質がＩＬ−２２の下流でＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染を制御する必須の機能を媒介するという仮説を裏付けている。
【０３３４】
最後に、ヒト系でのＩＬ−２３／ＩＬ−２２／Ｒｅｇ軸の存在も検証された。ヒトＩＬ−２３は、ヒトＤＣからのｈＩＬ−２２産生を誘導する（図１４Ｂ）。初代ヒト結腸上皮細胞（図１２Ｂ）およびヒト結腸上皮株化細胞、ＨＴ２９およびＨＣＴ１５は、ＩＬ−２２Ｒを発現する（図１４Ｃ）。インビトロでは、初代ヒト結腸上皮細胞はゆっくりと増殖して、膨張の間にそのＩＬ−２２Ｒの発現を徐々に消失した（データは示さず）。したがって、我々は結腸上皮株化細胞を使用して、ヒトＩＬ−２２に対するその応答を試験した。ＩＬ−２２はこれらの結腸上皮株化細胞でのＳＴＡＴ３活性化を誘導して（図１４Ｄ）、Ｒｅｇ  ＩＩＩβおよびＲｅｇ  ＩＩＩγの両方がＩＬ−２２によって著しく誘導された（図１４Ｄ）。重要なことに、ｒｍＲｅｇ  ＩＩＩγ融合タンパク質などのヒトＲｅｇ  ＩＩＩγ融合タンパク質（ｒｈＲｅｇ  ＩＩＩγ）はまた、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染後のＩＬ−２２−／−マウスの死亡率を、対照ＩＬ−２２−／−マウスの１００％死亡率と比較して、４０％に低下させた（図１８）。結論として、我々のデータによって、ＩＬ−２２経路が、ヒト胃腸管における細菌感染、特にＡ／Ｅ細菌感染を制御するのに不可欠な役割を果たし得ることが示される。
【０３３５】
概要
本発明は、ＩＬ−２２が腸管接着性微絨毛消滅性（Ａ／Ｅ）細菌性病原体に対する早期宿主防御で不可欠の役割を果たすことを本明細書で示す。
【０３３６】
本明細書のデータによって、ＩＬ−２２が腸上皮バリアの完全性を保護して、２つの機構によって全身への蔓延を伴う細菌侵入を防止することが指摘される。第１に、ＩＬ−２２は早期抗菌ＩｇＧ応答の誘発に関与する。第２に、ＩＬ−２２は、細菌感染の間の結腸上皮細胞からのＲｅｇ  ＩＩＩβおよびＲｅｇ  ＩＩＩγなどの抗微生物レクチンの誘導に不可欠である。これらの機構の一方または両方が欠けることは、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染中のＩＬ−２２−／−マウスにおける全身への蔓延および死亡率の上昇を伴う、宿主防御応答の低下の原因となり得る。
【０３３７】
これらの病原体のクリアランスには適応免疫応答が必須であるが（Ｌ．Ｂｒｙ，Ｍ．Ｂ．Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２，４３３（２００４年１月１日））、感染の早期に免疫細胞によって産生されるＩＬ−２２などのサイトカインも、病原性細菌の宿主への全身的侵入を防止するために、腸上皮細胞が十分な抗微生物応答および創傷治癒応答を誘発するのに必要である。本明細書で示すように、Ｒｅｇ  ＩＩＩβおよびＲｅｇ  ＩＩＩγの誘導によって、ＩＬ−２２が各種の細菌感染を制御するのにより広範な機能を有し得ることも示される。データは、感染性疾患および自己免疫疾患におけるＴｈ１７細胞およびそのエフェクタサイトカインの役割をさらに裏付けている。最後に、本研究によって、ＩＬ−２２ならびにＲｅｇ  ＩＩＩβおよびＲｅｇ  ＩＩＩγなどのその下流生成物が、ある感染性疾患の処置に有利であり得ることが示される。
【０３３８】
物質および方法
マウス
Ｃ５７Ｂｌ／６、ＩＬ−１２ｐ４０−／−、およびＩＬ−６−／−マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。ＩＬ−２２−／−マウスおよびＩＬ−１２ｐ１９−／−は、上述のように生成した（１１、図５）。ＩＬ−１７ＲＣ−／−およびＩＬ−２０Ｒβ−／−マウスは、上述の方法を使用してＬｅｘｉｃｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）が生成した（図５および図８）。簡潔には、ノックアウトマウスは、表示した標的化ベクターを使用して標準相同組換えによって作製した。標的ベクターは１２９系統ＥＳ細胞に電気穿孔して、標的クローンを同定した。標的クローンを宿主胚盤胞に微量注入して、キメラを産生する。キメラをＣ５７Ｂｌ／６動物と交配して、Ｆ１ヘテロ接合体を産生する。ヘテロ接合体を交雑させて、Ｆ２野生型ヘテロ接合体およびホモ接合体コホートを産生する。これらの研究で使用したマウスは、３つのプライマのプールを使用するＰＣＲによって尾ＤＮＡによって遺伝子型を同定した。ＩＬ−２０Ｒβ−／−マウスの野生型対立遺伝子の増幅に使用したプライマは、５’−ＧＴＧ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＡＣＴ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＧＴＡ  ＧＧＧ−３’（ｐ１）および５’−ＡＧＡ  ＴＧＣ  ＧＡＡ  ＡＡＴ  ＧＧＡ  ＧＡＴ  ＴＡＡ  ＡＡＧ−３’（ｐ２）であり、５９５ｂｐ生成物が得られた。ＩＬ−２０Ｒβ−／−マウスの突然変異対立遺伝子増幅に使用したプライマは、５’−ＣＴＡ  ＣＣＣ  ＧＴＧ  ＡＴＡ  ＴＴＧ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＡＧ−３’（ｐ３）およびｐ２であり、３５１ｂｐ生成物が得られた。ＩＬ−１７ＲＣ−／−マウスの野生型対立遺伝子の増幅に使用したプライマは、５’−ＧＡＧ  ＣＣＴ  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＧＧＡ  ＡＡ−３’（Ｐ３）および５’−ＣＡＡ  ＧＴＧ  ＴＴＧ  ＧＣＡ  ＧＡＧ  ＡＴＧ  ＧＡ−３’（Ｐ２）であり、５３４ｂｐ生成物が得られた。ＩＬ−１７ＲＣ−／−マウスの突然変異対立遺伝子増幅に使用したプライマは、５’−ＴＣＧ  ＣＣＴ  ＴＣＴ  ＴＧＡ  ＣＧＡ  ＧＴＴ  ＣＴ−３’（Ｐ１）およびｐ２であり、４０４ｂｐ生成物が得られた。
【０３３９】
細菌株およびマウスの感染
６〜８週齢マウスを８時間絶食させてから、マウス当り総体積２００μｌの２×１０９  Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ株ＤＢＳ１００（ＡＴＣＣ  ５１４５９；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を経口接種した。絶食の間、マウスは水を自由に飲めた。接種およびその後の操作すべては、ＢＬ−２バイオセイフティキャビネット内で実施した。動物は接種後には自由に食物を与えた。細菌はＬＢブロス中で３７℃にて一晩振とうしながらのインキュベーションによって調製した。細菌の相対濃度はＯＤ６００での吸収を測定することによって評価し、各接種培養物は段階希釈およびプレーティングして、投与したＣＦＵを確認した。
【０３４０】
組織収集、組織学およびＣＦＵカウント
対照または感染マウスには、記載したように接種した。全血、脾臓、肝臓、腸間膜リンパ節、および結腸のサンプルを無菌条件下で除去した。結腸を肛門管まで切開して、末端の０．５ｃｍ片をＣＦＵ分析に使用した。近位分節を１０％中性緩衝ホルマリンで固定した。切片をＨ＆Ｅで染色して、組織病態を評価した。脾臓、肝臓、腸間膜リンパ節、および結腸を秤量およびホモジナイズした。ホモジネートを段階希釈して、ＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天（Ｒｅｍｅｌ）にトリプリケートでプレーティングした。Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍコロニーは、ピンク色コロニーとして同定された。コロニーは、３７℃での２４時間のインキュベーションの後にカウントして、組織１グラム当りのｌｏｇ１０ＣＦＵを決定した。
【０３４１】
ＲＮＡ単離およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
細胞および組織のＲＮＡは、製造者の指示に従ってＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）によって単離した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、プライマおよびプローブを用いてＡＢＩ  ７５００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、ＴａｑＭａｎ  ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施した。プライマおよびプローブの配列は次の通りである：ｍＩＬ−２２、フォワード、５’−ＴＣＣ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＴＣＡ  ＧＴＧ  ＣＴＡ  ＡＡ−３’、リバース、５’−ＡＧＡ  ＡＣＧ  ＴＣＴ  ＴＣＣ  ＡＧＧ  ＧＴＧ  ＡＡ−３’、およびプローブ、５’−ＴＧＡ  ＧＣＡ  ＣＣＴ  ＧＣＴ  ＴＣＡ  ＴＣＡ  ＧＧＴ  ＡＧＣ  Ａ−３’（ＦＡＭ，ＴＡＭＲＡ）；ｍＩＬ−１７Ａ、フォワード、５’−ＧＣＴ  ＣＣＡ  ＧＡＡ  ＧＧＣ  ＣＣＴ  ＣＡＧ  Ａ−３’、リバース、５’−ＣＴＴ  ＴＣＣ  ＣＴＣ  ＣＧＣ  ＡＴＴ  ＧＡＣ  Ａ−３’、およびプローブ、５’−ＡＣＣ  ＴＣＡ  ＡＣＣ  ＧＴＴ  ＣＣＡ  ＣＧＴ  ＣＡＣ−３’（ＦＡＭ，ＴＡＭＲＡ）；マウス・リボソーム・ハウスキーピング遺伝子ＲＰＬ−１９、フォワード、５’−ＧＣＡ  ＴＣＣ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＡＧＣ  ＡＣＡ  Ｔ−３’、リバース、５’−ＣＴＧ  ＧＴＣ  ＡＧＣ  ＣＡＧ  ＧＡＧ  ＣＴＴ−３’、およびプローブ、５’−ＣＴＴ  ＧＣＧ  ＧＧＣ  ＣＴＴ  ＧＴＣ  ＴＧＣ  ＣＴＴ−３’（ＦＡＭ，ＴＡＭＲＡ）；ｍＩＬ−１９、フォワード、５’−ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＧＡＴ  ＴＧＡ  ＣＡＧ  ＧＡＡ  ＴＣ−３’、リバース、５’−ＧＡＴ  ＡＡＴ  ＣＡＧ  ＡＣＧ  ＡＧＧ  ＣＧＴ  ＴＴＣ−３’、およびプローブ、５’−ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＡＡＣ  ＴＣＣ  ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＡＣＡ  Ｃ−３’（ＦＡＭ，ＴＡＭＲＡ）；ｍＩＬ−２０、フォワード、５’−ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＡＧＡ  ＡＣＴ  ＡＧＧ  ＣＡＴ  ＴＣＴ  Ｔ−３’、リバース、５’−ＴＣＴ  ＴＧＧ  ＡＣＡ  ＧＧＡ  ＧＴＧ  ＴＴＣ  ＴＣＡ−３’、およびプローブ、５’−ＣＡＧ  ＣＣＴ  ＣＴＣ  ＣＡＣ  ＴＴＴ  ＣＡＴ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＣＡＴ  ＣＴＣ  Ｃ−３’（ＦＡＭ，ＴＡＭＲＡ）；ｍＩＬ−２４、フォワード、５’−ＧＣＴ  ＣＴＣ  ＣＡＴ  ＧＣＣ  ＡＴＴ  ＴＣＡ  Ａ−３’、リバース、５’−ＴＧＧ  ＣＣＡ  ＡＧＧ  ＧＴＣ  ＴＧＡ  ＡＧＴ−３’、およびプローブ、５’−ＴＧＴ  ＡＣＡ  ＴＣＣ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＴＣＣ  ＴＣＡ  ＡＧＧ  Ｃ−３’（ＦＡＭ，ＴＡＭＲＡ）；ｍＩＬ−６、フォワード、５’−ＴＣＣ  ＡＡＴ  ＧＣＴ  ＣＴＣ  ＣＴＡ  ＡＣＡ  ＧＡＴ  ＡＡＧ−３’、リバース、５’−ＣＡＡ  ＧＡＴ  ＧＡＡ  ＴＴＧ  ＧＡＴ  ＧＧＴ  ＣＴＴ  Ｇ−３’、およびプローブ、５’−ＴＣＣ  ＴＴＡ  ＧＣＣ  ＡＣＴ  ＣＣＴ  ＴＣＴ  ＧＴＧ  ＡＣＴ  ＣＣＡ−３’（ＦＡＭ，ＴＡＭＲＡ）；ｍＳ１００Ａ８、フォワード、５’−ＴＧＴ  ＣＣＴ  ＣＡＧ  ＴＴＴ  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＡＡＴ  ＡＴＡ  ＡＡ−３’、リバース、５’−ＴＣＡ  ＣＣＡ  ＴＣＧ  ＣＡＡ  ＧＧＡ  ＡＣＴ  ＣＣ−３’、およびプローブ、５’−ＣＧＡ  ＡＡＡ  ＣＴＴ  ＧＴＴ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＡＴＴ  ＧＧＡ  ＣＡＴ  ＣＡＡ  ＴＡＧ  ＴＧＡ−３’（ＦＡＭ，ＴＡＭＲＡ）；ｍＳ１００Ａ９、フォワード、���’−ＧＧＴ  ＧＧＡ  ＡＧＣ  ＡＣＡ  ＧＴＴ  ＧＧＣ  Ａ−３’、リバース、５’−ＧＴＧ  ＴＣＣ  ＡＧＧ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＡＴＧ−３’、およびプローブ、５’−ＴＧＡ  ＡＧＡ  ＡＡＧ  ＡＧＡ  ＡＧＡ  ＧＡＡ  ＡＴＧ  ＡＡＧ  ＣＣＣ  ＴＣＡ  ＴＡＡ  ＡＴＧ−３’（ＦＡＭ，ＴＡＭＲＡ）；ｍＲｅｇＩＩＩγ、フォワード、５’−ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＣＣＴ  ＡＴＴ  ＧＣＴ  ＡＴＧ  ＣＣ−３’、リバース、５’−ＧＡＴ  ＧＴＣ  ＣＴＧ  ＡＧＧ  ＧＣＣ  ＴＣＴ  Ｔ−３’、およびプローブ、５’−ＴＧＧ  ＣＡＧ  ＧＣＣ  ＡＴＡ  ＴＣＴ  ＧＣＡ  ＴＣＡ  ＴＡＣ  Ｃ−３’（ＦＡＭ，ＴＡＭＲＡ）；ｍＰＡＰ／ＨＩＰ／ＲｅｇＩＩＩβ、フォワード、５’−ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＣＣＴ  ＡＣＴ  ＧＣＴ  ＡＴＧ  ＣＣ−３’、リバース、５’−ＧＴＧ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＡＧＧ  ＣＣＴ  ＣＴＴ  Ｔ−３’、およびプローブ、５’−ＴＧＡ  ＴＧＣ  ＡＧＡ  ＡＣＴ  ＧＧＣ  ＣＴＧ  ＣＣＡ−３’（ＦＡＭ，ＴＡＭＲＡ）；ｍＩＬ−１２ｐ４０、フォワード、５’−ＡＣＡ  ＴＣＴ  ＡＣＣ  ＧＡＡ  ＧＴＣ  ＣＡＡ  ＴＧＣ  Ａ−３’、リバース、５’−ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＧＴＡ  ＡＴＡ  ＧＣＧ  ＡＴＣ  ＣＴＧ  ＡＧＣ−３’、およびプローブ、５’−ＴＧＣ  ＡＣＧ  ＣＡＧ  ＡＣＡ  ＴＴＣ  ＣＣＧ  ＣＣＴ−３’（ＦＡＭ，ＴＡＭＲＡ）；  ｍＩＬ−２３ｐ１９、フォワード、５’−ＧＧＴ  ＧＧＣ  ＴＣＡ  ＧＧＧ  ＡＡＡ  ＴＧＴ−３’、リバース、５’−ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＧＣＡ  ＧＧＣ  ＡＧＧ  ＴＡＣ  ＡＧ−３’、およびプローブ、５’−ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＣＡＣ  ＡＧＴ  ＡＣＴ  ＣＣＡ  ＧＡＣ  ＡＧＣ  ＡＧＣ−３’（ＦＡＭ，ＴＡＭＲＡ）；ｍＩＬ−２０Ｒβ、フォワード、５’−ＣＡＧ  ＧＴＧ  ＣＴＴ  ＣＣＡ  ＧＴＣ  ＣＧＴ  ＣＴ−３’、リバース、５’−ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＴＧＧ  ＡＡＴ  ＣＣＣ  ＣＡＡ  ＡＧＴ−３’、およびプローブ、５’−ＣＡＧ  ＣＡＣ  ＡＧＡ  ＴＧＣ  ＣＡＡ  ＣＧＧ  ＣＣＴ  ＣＡＴ−３’（ＦＡＭ，  ＴＡＭＲＡ）；ｍＩＬ−２０Ｒα、フォワード、５’−ＣＴＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＴＣＧ  ＧＧＡ  ＣＧＣ−３’、リバース、５’−ＡＡＣ  ＣＡＣ  ＡＧＡ  ＡＧＡ  ＣＡＣ  ＡＡＧ  ＧＡＡ  ＣＴＧ−３’、およびプローブ、５’−ＴＣＴ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＴＴＣ  ＧＧ−３’（ＦＡＭ，ＴＡＭＲＡ）；ｍＩＬ−２２Ｒ、フォワード、５’−ＧＣＴ  ＧＧＡ  ＣＴＣ  ＣＣＴ  ＴＧＴ  ＧＴＧ  Ｔ−３’、リバース、５’−ＣＡＣ  ＡＴＧ  ＧＣＣ  ＴＣＡ  ＧＴＣ  ＴＣＡ  Ａ−３’、およびプローブ、５’−ＣＧＣ  ＧＧＧ  ＡＣＣ  ＣＴＣ  ＡＴＣ  ＣＴＴ  ＴＧ−３’（ＦＡＭ，ＴＡＭＲＡ）；ｍＩＬ−１０Ｒβ、フォワード、５’−ＴＣＣ  ＡＣＡ  ＧＣＡ  ＣＣＴ  ＧＡＡ  ＧＧＡ  ＧＴＴ−３’、リバース、５’−ＧＧＡ  ＧＧＧ  ＡＡＧ  ＧＡＧ  ＡＡＣ  ＡＧＣ  ＡＧＡ−３’、およびプローブ、５’−ＴＧＧ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＣＣＣ  ＡＴＣ  ＡＣＡ  ＧＣ−３’（ＦＡＭ，ＴＡＭＲＡ）。反応はデュプリケートで実施して、サンプルを対照ハウスキーピング遺伝子ＲＰＬ−１９に対して正規化し、ΔΔＣｔ法：ΔΔＣｔ＝ΔＣｔサンプル−ΔＣｔ参照に従って報告した。
【０３４２】
Ｉｇ  ＥＬＩＳＡ
収集した全血からの血清に対する分析は、先に記載されたように実施した（１０）。簡潔には、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を、ＰＢＳ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）で１／１０００に希釈した加熱殺滅Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍまたは抗ヤギ−マウスＩｇ捕捉Ａｂでコーティングした。コーティングしたプレートは、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を添加したＰＢＳ中で洗浄して、遮断緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％  ＢＳＡ＋１０ＰＰＭ  Ｐｒｏｃｌｉｎ）３００μｌで１時間遮断し、段階希釈標準（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈからのマウスモノクローナルＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＧ３、およびＩｇＭ；Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈからのＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、およびＩｇＧ２ｂアイソタイプ；Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手したマウスＩｇＧ２ｃ）または不明物を添加する前に洗浄した。サンプルを室温で４時間インキュベートした。プレートを５回洗浄して、Ｉｇアイソタイプをホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に接合されたヤギ抗マウスＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、およびＩｇＧ３（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）によって検出して、アッセイ希釈液（ＰＢＳ＋０．５％  ＢＳＡ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０＋１０ＰＰＭ  Ｐｒｏｃｌｉｎ、ｐＨ７．４）で１／４，０００に希釈して、室温にて１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質を各ウェルに添加して、１５分間展開させて、次に停止溶液（１Ｍリン酸）を各ウェルに添加した。４５０ｎｍの吸収を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）プレートリーダでＯＤ４５０にて読み取った。
【０３４３】
インビトロ結腸培養
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスから結腸を除去した。冷ＰＢＳで洗浄した後に、結腸を縦に切断した。結腸は、１００ｍｍペトリ皿に２．５μｇ／ｍｌファンギゾン−アムホテリシンＢ、１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（すべてＧＩＢＣＯ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより）を含有するＨＢＳＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）緩衝液１０ｍｌと共に入れた。結腸を静かに掻き取り、ペトリ皿の縁で粘液を除去して、新しいＨＢＳＳ緩衝液を含む新しいペトリ皿に移した。結腸を１〜２ｍｍ片に切断して、２４ウェルプレートに結腸５０ｍｇ／１ｍｌ／ウェルで、１０％熱不活性化ＦＣＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、２．５μｇ／ｍｌファンギゾン−アムホテリシンＢ、１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ緩衝液中に移した。１０μｇ／ｍｌ  ＩＬ−２２（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を培養物に添加して、３７℃にて２４時間インキュベートした。
【０３４４】
マイクロアレイ分析
全ＲＮＡサンプルの量および品質は、ＮＤ−１０００分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してそれぞれ決定した。Ｃｙ染料標識ｃＲＮＡの調製およびアレイハイブリダイゼーションの方法は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって提供された。簡潔には、ＡｇｉｌｅｎｔのＬｏｗ  ＲＮＡ  Ｉｎｐｕｔ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｌｉｎｅａｒ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して、全ＲＮＡサンプルを２本鎖ｃＤＮＡに、そして次にＣｙ染料標識ｃＲＮＡに変化した。標識ｃＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。ｃＲＮＡ収率およびＣｙ−ｄｙｅ含有量はＮＤ−１０００分光光度計を使用して決定した。標識ｃＲＮＡ  ７５０ｎｇを断片化して、ＡｇｉｌｅｎｔのＷｈｏｌｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅアレイに、製造者のＩｎ  ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｋｉｔ−ｐｌｕｓに記載されているようにハイブリダイズした。すべてのサンプルはＣｙ５で標識して、Ｃｙ３標識共通マウス参照（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に対してハイブリダイズした。ハイブリダイズ後に、アレイを洗浄して、乾燥させ、ＡｇｉｌｅｎｔのＤＮＡマイクロアレイスキャナでスキャンした。ＡｇｉｌｅｎｔのＦｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェア８．５を使用して、取り込まれたアレイ画像を解析した。マイクロアレイのデータクラスタリングでは（図２０）、標準方法によって発現データをＡｇｉｌｅｎｔ対数比データに処理した。選択した遺伝子をピアソン相関係数によって最も高度に関連付けられたベクターの反復凝集によってクラスタ化して、凝集したベクターのデータを群平均法によって集計した。
【０３４５】
インビトロマウス尾端線維芽細胞培養物および刺激
尾端線維芽細胞（ＴＴＦ）を樹立するために、ＩＬ−１７ＲＣ−／−成マウスおよび野生型同腹子を剥皮して、１ｃｍ片に刻み、培養皿に置いて、高グルコースＤＭＥＭ（１０％  ＦＣＳ、２ｎｍグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有）中で５日間インキュベートした。移植片から遊走した細胞を新たなプレートに移動して（継代２）、同じ培地で維持した。我々は刺激実験のために、継代３でＴＴＦを使用した。ＴＴＦを２４ウェルプレートに、ウェル当り１．２×１０５の密度で播種した。播種の２４時間後、組換えマウスＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を培養培地に各種濃度で添加した。培養培地上清をサイトカイン添加の２４時間後に収集して、マウスＩＬ−６  ＥＬＩＳＡセット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によるマウスＩＬ−６のレベルを酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって、製造者の説明書に従って測定した。
【０３４６】
インビボでのマウスＩＬ−２２の遮断
遮断抗マウスＩＬ−２２（クローン８Ｅ１１、アイソタイプマウスＩｇＧ１）ｍＡｂ（１１）を、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染の前（第０日）または８日後（第８日）に１５０μｇ／マウスの用量で１日おきに腹腔内注射した。ある対照群にもアイソタイプＩｇＧ１  ｍＡｂを投与した。
【０３４７】
統計
統計的有意性は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して一元または二元ＡＮＯＶＡによって計算した。０．０５以下のｐ値はすべて有意と見なして、本文で示す。別途規定しない限り、データが示された試験はすべて、少なくとも２回の独立した実験を表す。
【０３４８】
上の発明は、理解を明瞭にする目的で例証および例示のためにやや詳細に記載されているが、明細書および実施例は、本発明の範囲を制限するとして解釈されるべきではない。本明細書で引用したすべての特許および科学文献の開示、参照によりその全体が明示的に組入れられている。
【０３４９】
（実施例１０）
ＬＴ経路は、Ｃｉｔｒｏｂａｃｅｒ  ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染の間にＩＬ−２２が媒介する。
【０３５０】
ＩＬ−２２がＬＴ遮断によって生じる死亡率にとって重要か否かを判定するのを補助するために、我々は、マウスにおいてＬＴｂＲ−Ｆｃ処置と同時にＩＬ−２２を発現させるレスキュー実験を実施した。我々がＩＬ−２２発現に使用した方法は、マウスＩＬ−２２をコードするプラスミドＤＮＡの流体力学的尾静脈送達であった。ヒトＬＴｂＲ−Ｉｇは、次のように構築した：細胞外ドメイン（位置１〜位置２２４；配列番号５７）を含むヒトＬＴｂＲを、ＬＴｂＲ配列下流のヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を（配列番号５８）コードする修飾ｐＲＫ５発現ベクター内にクローニングした。タンパク質をＣＨＯ細胞中で過剰発現させて、タンパク質Ａアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。マウスＬＴｂＲ−Ｉｇは次のように構築した：細胞外ドメイン（位置１〜位置２２２；配列番号５９）を含むマウスＬＴｂＲを、ＬＴｂＲ配列下流のマウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃ領域（配列番号６０）をコードする修飾ｐＲＫ５発現ベクター内にクローニングした。
【０３５１】
図２１において、我々は、ＬＴｂＲ−ＦｃによってＩＬ−２２遮断と同様の体重減少曲線（図２１右パネル）および死亡曲線（図２１左パネル）が作成されることを見出し、このことによって我々はＬＴとＩＬ−２２との間の関係を調査した。Ｃ．ｒｏｄｅｔｉｕｍ感染は、結腸でのＩＬ−２２の早期発現を引き起こす。
【０３５２】
図２１は、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｒｏｄｅｎｔｉｕｍを接種したマウスの生存パーセントを示す。６〜８週齢Ｂａｌｂ／ｃマウスを８時間絶食させてから、マウス当り総体積２００μｌの２×１０９  Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ株ＤＢＳ１００（ＡＴＣＣ  ５１４５９；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を経口接種した。絶食の間、マウスは水を自由に飲めた。接種およびその後の操作すべては、ＢＬ−２バイオセイフティキャビネット内で実施した。動物は接種後には自由に食物を与えた。細菌はＬＢブロス中で３７℃にて一晩振とうしながらのインキュベーションによって調製した。細菌の相対濃度はＯＤ６００での吸収を測定することによって評価し、各接種培養物は段階希釈およびプレーティングして、投与したＣＦＵを確認した。接種日には、マウスに抗ｇｐ１２０ｍＡｂ、抗ＩＬ−２２  ８Ｅ１１ｍＡｂ、またはＬＴｂＲ−Ｆｃ  １５０ｕｇも週３回接種した。
【０３５３】
ＬＴ経路は、ＩＬ−２２産生に重要な複数の上流態様を制御する。
【０３５４】
図２２は、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染後のＬＴ経路に関するデータを与える。Ａ、Ｃ、Ｅ。結腸は、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ接種後の異なる時点で収集した。マウスには、抗ｇｐ１２０またはＬＴｂＲ−Ｆｃ  １５０ｕｇを１日おきに注射した。ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙキットを使用して抽出した。Ｔａｑｍａｎを実施して、第０日時点に対するＩＬ−２２、Ｒｅｇ  ＩＩｇ、ｐ１９、またはｐ４０の発現を決定した。Ｂ．注射後の第４日に、結腸を収集した。冷ＰＢＳで洗浄した後に、結腸を縦に切断した。結腸は、１００ｍｍペトリ皿に２．５μｇ／ｍｌファンギゾン−アムホテリシンＢ、１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（すべてＧＩＢＣＯ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより）を含有するＨＢＳＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）緩衝液１０ｍｌと共に入れた。結腸を静かに掻き取り、ペトリ皿の縁で粘液を除去して、新しいＨＢＳＳ緩衝液を含む新しいペトリ皿に移した。結腸を１〜２ｍｍ片に切断して、２４ウェルプレートに結腸５０ｍｇ／１ｍｌ／ウェルで、１０％熱不活性化ＦＣＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、２．５μｇ／ｍｌファンギゾン−アムホテリシンＢ、１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ緩衝液中に移した。１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−２２（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を培養物に添加して、３７℃にて２４時間インキュベートした。ＩＬ−２２  ＥＬＩＳＡ用に上清を収集した。Ｄ．第６日の結腸固有層細胞。ＤＣは、ＣＤ１１ｃ＋およびＭＨＣ  ＩＩ＋によって決定した。結腸を収集して、２％  ＦＢＳおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含む、カルシウムおよびマグネシウム不含有ＨＢＳＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗い流した。結腸を縦に切り、次に２〜４ｃｍ片に切断して、カルシウムおよびマグネシウム不含有ＨＢＳＳ、２％  ＦＢＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ならびに１ｍＭ  ＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む１０ｃｍ皿に結腸片を移した。ＩＥＬ画分を収集して、２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で４５分間インキュベーションした後に廃棄した。ＬＰＭＣ単離では、残存する上皮層を剥離して、結腸片をサイコロ大に切り、１０％  ＦＣＳ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、および０．５ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ／ディスパーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含有するＲＰＭＩ中に入れた。結腸片は、振とうしながら３７℃にて１時間インキュベートした。単離した上皮細胞を洗浄して、ＦＡＣＳ分析に使用した。
【０３５５】
図２２において、我々は、ＩＬ−２２によって誘導されることが示されたＲｅｇ  ＩＩＩｇと同様に、ＬＴｂＲ−ＦｃがＩＬ−２２の誘導を遮断することを見出した（図２２Ａ〜Ｃ）。樹状細胞がＩＬ−２２を産生することが以前に示されており、我々は、感染６日後に結腸固有層におけるＤＣ数のわずかな減少を見出している（図２２Ｄ）。ＬＴｂＲ−Ｆｃによって引き起こされたＩＬ−２２の減少はＩＬ−２３の消失による可能性が最も高いのは、ｐ１９およびｐ４０の両方の発現が感染中のＬＴｂＲ−Ｆｃ処置後に抑制されるためである（図２２Ｅ）。
【０３５６】
ＩＬ−２２は、ＬＴｂＲ処置マウスで見られる欠陥を一部救助する。図２３は、ＩＴｂＲ処置マウスに対するＩＬ−２２の効果に関するデータを与える。Ａ．ＩＬ−２２プラスミドの尾静脈注射後の血清中のＩＬ−２２および結腸でのＲｅｇ  ＩＩＩｇの発現の試験。Ｂ．ＩＬ−２２プラスミドによるＬＴｂＲＦｃ効果の救助。
【０３５７】
第１日に、動物を秤量およびグループ分けして、余分なマウスは安楽死させた。秤量後、動物すべてを１４時間絶食させた。翌朝（第０日）、すべてのマウスにＰＢＳ  ２００ｕｌ中のＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ  ２〜４×１０ｅ９ＣＦＵを経口接種した。ＰＢＳ  ２００ｕｌ中のＣ対照ｍＡｂまたはＦｃ融合タンパク質１５０ｕｇを、細菌接種と同じ日から開始して、週３回、２週間にわたって腹腔内注射した。接種後に研究者によって食物が再び置かれた。６時間後、プラスミドＤＮＡを尾静脈によって注射した。尾静脈注射実験：１）ＤＮＡ構築物（ｐＲＫベクターまたはｐＲＫ−ｍＩＬ−２２）をリンゲル液で、１０マイクログラム／マウス／注射の最終用量が得られる濃度まで希釈した。２）各マウスの尾静脈に、リンゲル液中にＤＮＡを含有する溶液約１．６ｍｌを静脈内注射した。３）用量をボーラス静脈内注射（尾静脈）として、ＤＮＡの最大接種のために４〜５秒（最大８秒）の期間にわたって投与した。マウスは麻酔なしで、体温を上昇させて、血管を拡張させるための発熱体を備えた円筒状アクリル製固定器で固定した。４）各動物には使い捨て滅菌注射器を使用した。動物は臨床的に正常になるまで、引き続き監視した。５）動物は、投薬後少なくとも２０分間にわたって、なんらかの有害な臨床徴候について観察した。動物が投薬１時間後までに臨床的に正常でならない場合、動物を安楽死させるか、または動物が臨床的に正常になるまで監視した。瀕死の動物は安楽死させた。すべての操作は、ＢＬ−２バイオセイフティキャビネット内で実施した。感染の間、瀕死の動物または障害の軽減を示さないもしくは直腸脱を示す動物は安楽死させた。
【０３５８】
マウスは４週間にわたって毎日監視した。ＬＴｂＲ−Ｆｃ処置マウスが瀕死になり得る第５日〜第１７日の間、マウスを週末を含めて１日２回監視した。糞粒を毎週収集して、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍのＣＦＵを測定した。マウスは試験の間、週１回秤量した。マウスが１５％以上の体重減少を示した場合、毎日秤量した。体重減少が２０％を超える場合、マウスを安楽死させた。試験終了時に、すべてのマウスを安楽死させて、脾臓、および結腸を組織学的、ＲＮＡまたはＦＡＣＳ分析のために収集した。
【０３５９】
図２３Ａに示すように、我々は、注射２時間後から開始してマウス血清中のＩＬ−２２の発現を検出することが可能であり、発現は７２時間で低下する。我々が結腸でＲｅｇ  ＩＩＩｇの発現も検出できる場合、この方法で発現されたときに活性ＩＬ−２２が結腸に作用できることが示唆される。ＩＬ−２２は、感染中にＩＴｂ−Ｆｃ処置によって誘導された死亡率および体重減少を医一部救助できた（図２３Ｂ）。
【０３６０】
マウスのＩＬ−２２ｍＡｂ（８Ｅ１１）による処置。図２４は、抗ＩＬ−２２ｍＡｂ  ８Ｅ１１による処置が結腸濾胞の減少、Ｂ／Ｔ細胞組織の損傷、ならびに結腸におけるＤＣ、Ｔ細胞およびＢ細胞の数の減少をもたらすことを表すデータを示す。Ａ．注射６日後、結腸を収集して、縦方向に切った。カルシウムおよびマグネシウム不含有ＨＢＳＳ、２％  ＦＢＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ならびに１ｍＭ  ＤＴＴ中での３０分間のインキュベーションの後、結腸を静かに掻いて、上皮細胞を除去した。濾胞は白色の円形塊として同定された。群当りのマウスは５匹であり、各結腸を見出された総濾胞数および発見された１ｍｍを超える総濾胞数としてカウントおよびプロットした。Ｂ．感染６日後、結腸を冷ＰＢＳで洗い、ＯＣＴ中で急速凍結させた。６ミクロンの切片を切断、乾燥させて、次にアセトン中で固定した。切片を１０％血清で遮断して、それぞれ１０ｕｇ／ｍｌの抗ＣＤ５  ＦＩＴＣおよび抗Ｂ２２０  ＡＰＣでインキュベートした。画像はＮＩＫＯＮ  ＢＸ６１顕微鏡で取り込んだ。Ｃ．感染６日後、結腸固定層を上述のように単離した。ＦＡＣ分析を実施して、８Ｅ１１処置後の樹状細胞、ＣＤ３  Ｔ細胞、およびＢ細胞の数を決定した。
【０３６１】
図２４に示すように、我々は、結腸リンパ構造の形成においてＩＬ−２２が役割を有し得るか否かを判定するために、マウスをＩＬ−２２遮断抗体またはＬＴｂＲ−Ｆｃのどちらかによって処置して、感染６日後に結腸内のリンパ濾胞をカウントした。我々は１ｍｍを超える濾胞の減少を見出し、ＩＬ−２２およびＬＴが感染後の濾胞サイズの増大に重要であり得ることが示唆された（図２４Ａ）。組織学的分析によって、遮断ＩＬ−２２は濾胞のＴおよびＢ細胞帯を破壊して、同時にＬＴ遮断は同様の効果を有したことが示されている（図２４Ｂ）。我々は次に、ＩＬ−２２の遮断が結腸固定層の細胞数の変化をもたらすか否かを判定した。我々は、ＩＬ−２２遮断が感染中にＤＣ、Ｔ細胞、およびＢ細胞の数の減少をもたらすことを見出した。結論として、ＩＬ−２２はリンパ濾胞形成に重要であると思われ、結腸におけるリンホトキシン経路の重要な下流成分であり得る。
【図１】
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【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図９】
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【図１２】
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【図１３Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図２０】
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【図２４】
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【配列表】
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