(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト乳児に組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを経腸投与する工程を含む、ヒト乳児の発育速度を増大させる方法における使用のための、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼ（rhBSSL）を含む薬学的組成物であって、該リパーゼが1日当たり1〜100mgの該リパーゼ/Kg乳児体重、5〜50mgの該リパーゼ/Kg乳児体重、または15〜40mgの該リパーゼ/Kg乳児体重の量で投与され、組換えチャイニーズハムスター卵巣細胞株の発現産物から単離される、前記薬学的組成物。
【請求項２】
最初に前記リパーゼが乳児用調合乳または低温殺菌母乳に添加され、次いでこれが乳児に与えられ、それによって該リパーゼが経腸投与される、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項３】
ヒト乳児がヒト低体重児である、請求項1または2記載の薬学的組成物。
【請求項４】
ヒト乳児がヒト早産児である、請求項1〜3のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項５】
ヒト早産児が、第37週前に生まれたヒト早産児であるか、妊娠37週〜32週、妊娠32週〜25週、または妊娠25週〜22週に生まれたヒト早産児である、請求項4記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記リパーゼが、少なくとも4日にわたって少なくとも1日1回の授乳と共に投与されるか、少なくとも5日にわたって少なくとも1日1回の授乳と共に投与されるか、または少なくとも7日にわたって少なくとも1日1回の授乳と共に投与される、請求項1〜5のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記リパーゼが、1日当たりほとんどの授乳と共に、または全ての授乳について投与される、請求項6記載の薬学的組成物。
【請求項８】
発育速度の増大が、全脂肪吸収率の増加に伴わない、全脂肪吸収率の増加によって示されない、および/または全脂肪吸収率の増加と相関しない、請求項1〜7のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記リパーゼが、以下より選択される1つまたは複数の特徴によってさらに定義される、請求項1〜8のいずれか一項記載の薬学的組成物:
a.該リパーゼが、他の乳タンパク質または乳成分を含まないか、または乳に固有の他の夾雑物を含まない;
b.該リパーゼが、70％、80％、90％、または95％を上回る純度を有する;
c.該リパーゼが、BSSL-MAMのグリコシル化レベルより小さい、および/またはrhBSSL-OVIのグリコシル化レベルより大きなグリコシル化レベルを有する;
d.該リパーゼが、BSSL-MAMのグリコシル化パターンとは異なる、および/またはrhBSSL-OVIのグリコシル化パターンとは異なるグリコシル化パターンを有する;
e.該リパーゼが、90KDa〜75KDa、84〜86KDa、または85KDaの分子量を有する;ならびに/あるいは
f.SEQ ID NO: 1に示した配列によって示される完全長型と比較してC末端において1アミノ酸または2アミノ酸短い形態で存在するリパーゼ分子の量が、SEQ ID NO: 1に示した配列によって示される完全長型で存在するリパーゼ分子の量の50％より多く、100％〜500％、200％〜400％、または300％である。
【請求項１０】
前記リパーゼが、乳カゼインおよび乳清タンパク質を含まない、請求項9記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記乳清タンパク質が、ラクトフェリンである、請求項10記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記乳児が、発育速度を増大させるための治療的処置を医学的に必要とし、かつ、投与される前記リパーゼの量が治療的有効量である、請求項1〜11のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
少なくとも4日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、少なくとも5日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、または少なくとも7日にわたって少なくとも1日1回の授乳について乳児に経腸的に与えられた時に、ヒト乳児の発育速度を増大させるのに有効な量の組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを含む、改良された乳児用調合乳であって、該リパーゼが1日当たり1〜100mgの該リパーゼ/Kg乳児体重、5〜50mgの該リパーゼ/Kg乳児体重、または15〜40mgの該リパーゼ/Kg乳児体重の量で投与され、組換えチャイニーズハムスター卵巣細胞株の発現産物から単離される、前記乳児用調合乳。
【請求項１４】
少なくとも4日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、少なくとも5日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、または少なくとも7日にわたって少なくとも1日1回の授乳について乳児に経腸的に与えられた時に、ヒト乳児の発育速度を増大させるのに有効な量の組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを含む、改良された低温殺菌母乳であって、該リパーゼが1日当たり1〜100mgの該リパーゼ/Kg乳児体重、5〜50mgの該リパーゼ/Kg乳児体重、または15〜40mgの該リパーゼ/Kg乳児体重の量で投与され、組換えチャイニーズハムスター卵巣細胞株の発現産物から単離される、前記低温殺菌母乳。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト乳児の発育速度を増大させる方法であって、前記乳児に組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼ(rhBSSL)を経腸投与する工程を含む、方法に関する。このような方法は、ヒト低体重児または早産児、発育速度を増大させることが医学的に必要な特定のヒト低体重児または早産児に特に有用である。他の局面において、本発明は、ヒト乳児の発育速度を増大させるのに有用な、乳児用食品、キット、包装された薬学的製品、および薬学的組成物を含む組成物に関し、ヒト乳児の発育速度を増大させるのに有用な乳児用食品を調製する方法にも関する。別の局面において、本発明は、(X)損傷からヒト乳児の小腸粘膜を保護する方法;(Y)完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の有害作用からヒト乳児の未熟腸上皮を保護する方法;ならびに/または(Z)ヒト乳児の回腸における完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積を制限する方法に関する。前記方法は、それぞれの場合において、前記乳児に組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを経腸投与する工程を含む。本発明はまた、これらの保護方法または蓄積を制限する方法に有用な、乳児用食品、キット、包装された薬学的製品、および薬学的組成物を含む組成物に関し、これらの保護方法または蓄積を制限する方法に有用な乳児用食品を調製する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
体重が2,500g未満で産まれた赤ん坊は低出生体重(LBW)とみなされ、新生児として重大な健康問題、永続的な身体障害、さらには死亡のリスクが高い。ある特定のLBW児は、1,500g未満で生まれた極低出生体重(VLBW)児および1000g未満で生まれた超低出生体重(ELBW)児にさらに分類することができる。LBW新生児の割合は世界中で異なる。例えば、世界保健機関(WHO)は、2000年、開発途上地域における新生児の16.5％がLBWであったと見積もった。対照的に、2005年に米国で生まれた12人の赤ん坊のうち約1人(8.3％)がLBWで生まれ(Martin et al, 2007; National Vital Statistics Reports, 56 (6))、イングランドおよびウェールズにおいて全LBW率は7.3％と報告されている(Doyle, 2000; BMJ, 320: 941-942)。LBW児の割合は、特に、米国などの中進地域において増加しており、主に、人工妊娠による多胎妊娠の早産の増加によるものだと考えられている。
【０００３】
多くのLBW児は、(例えば、McIntire et al., 1999; N Engl J Med, 340: 1234-1238に報告されているように)、呼吸窮迫症候群(RDS)、チアノーゼ発作、脳出血(脳室内出血、IVH)、脳性麻痺、心臓問題、例えば、動脈管開存(patent ductus artiousus)(PDA)、低カルシウム血症、低血糖症、腸問題、例えば、壊死性腸炎(NEC)、黄疸、および網膜発達問題、例えば、未熟児網膜症(ROP)を含む健康問題を特に受けやすいので新生児集中治療室(NICU)において特殊な治療を必要とする。多くの研究から、出生時体重の減少とともに新生児治療費が急上昇することが分かっている。ある米国での研究は、出生時体重500〜700gの新生児の場合、新生児費用は224,400ドルであるのに対して、出生時体重3,000g超で生まれた赤ん坊の場合、わずか1000ドルと見積もっており、ある見積もりでは、米国で提供されるこのような治療の年間費用は500億ドル超である。このような急性期治療のほかに、低体重で生まれるということは、(a)乳児期における不十分な体重増加および頭部成長(Gutbrod et al, 2000; Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed, 82: 208-214);(b)幼児期における発育遅延およびその後の言語問題(Marlow et al., 2005; N Engl J Med, 352: 9-19); (c)神経学的異常;ならびに(d)聴覚消失の発生率の増加を含む、多数の中期健康問題と関連することが報告されている。いくつかの研究から、LBWで生まれた個体は、成人期において高血圧、2型糖尿病、および心臓病を含む、ある特定の慢性状態のリスクが高くなり得ることも示唆されている。
【０００４】
赤ん坊が低出生体重で生まれる可能性がある主な理由は2つある。(1)早産-正常妊娠期間は約40週(38〜42週)であり、WHOは、未熟児を、最終月経期の初日から数えて第37週前に生まれた赤ん坊と定義している。赤ん坊がこれより早く生まれるほど、体重が増える可能性は低くなる;および(2)胎児の発育制限-正期産児かもしれないが、低体重の赤ん坊。胎内発育遅延(SGA)児または不当軽量児とも知られる。これらの赤ん坊の一部は、単に親が小さいというで小さい(これらの赤ん坊は健康なことが多い)のに対して、他の赤ん坊は、何かが子宮内での赤ん坊の発育を遅延した、または止めた(すなわち、子宮内胎児発育遅延、IUGR)という理由で低出生体重である。赤ん坊の中には、未熟児であり、かつIUGRになっていた赤ん坊もおり、これらの赤ん坊は、健康問題、例えば、前記の健康問題のリスクが特に高い。
【０００５】
最近、WHOは世界中の早産発生率を系統立てて調査し(Beck et al, 2010; Bull World Health Organ, 88: 31-38)、2005年に全世界で1290万件の出産、すなわち全出産の9.6％が早産であったと見積もっている。これらの早産のうち約1100万件(85％)がアフリカおよびアジアに集中したのに対して、欧州および北アメリカ(メキシコを除く)はそれぞれ約50万件であり、ラテンアメリカおよびカリブ海上諸島では90万件であった。最も高い早産率はアフリカおよび北アメリカであり(それぞれ、全出産の11.9％および10.6％)、欧州が最も低かった(6.2％)。2005年、北アメリカについて見積もられた比較的高い早産率は480,000件の早産の絶対数推定値に匹敵し、比較的低い率にもかかわらず同年の欧州の466,000件の早産推定値に依然として匹敵する。英国、米国、および北欧諸国などのいくつかの先進国から入手可能な早産率は過去20年間にわたって劇的に上昇している(例えば、Callaghan et al., 2006; Pediatrics, 118: 1566-1573)。この上昇傾向に寄与している可能性があるが、完全に説明しない要因には、多胎出産率の増加、補助生殖法の使用の増加、34歳以上の女性間での出産割合の増加、および診療の変化、例えば、選択的帝王切開の使用頻度の増加が含まれる。
【０００６】
早産児は、一般的に、LBW児と同じ健康問題にかかりやすく、問題の重篤度は未熟さの程度と共に増大する。すなわち、36週で生まれた赤ん坊は、まず間違いなく授乳する速度がわずかに遅いだろう。第33週前に生まれた赤ん坊は、未熟な肺がある可能性を含めて、さらに重篤な問題を有するだろう。第28週前の出産は非常に大きな問題を引き起こすが、生存率は極めて注目に値する。データから、800g超で生まれた場合、生存率は90％、500g超で生まれた場合、生存率は50％、第28週前に生まれた場合、生存率は80％であることが示唆されているが、これらの数字はまた生存者における重大な身体障害を隠している場合がある。例えば、脳性麻痺、失明、および聴覚消失などの重篤な問題が10〜15％もの極めて未熟な赤ん坊に影響を及ぼす場合がある。出生時体重が1.5kg未満の4人の赤ん坊のうち約1人が末梢聴覚機能低下もしくは中枢聴覚機能低下またはその両方を有し(Jiang et al., 2001; Acta Paediatr, 90 1411-1415)、1.25kg未満の赤ん坊の66％がROPを発症する(Allin et al., 2006; Pediatrics, 117: 309-316)。
【０００７】
膵機能および肝機能は出生時に十分に発達しておらず、このことは、未熟児では特に顕著である。最近、LindquistおよびHernell(1990; Curr Opin Clin Nutr Metab Care, 13: 314-320)は人生の早期における脂質消化および脂質吸収というテーマを詳しく調べた。母乳栄養児は、脂肪(重要なことに、長鎖多価不飽和脂肪酸、LCPUFA)を、調合乳が与えられた乳児より効率的に消化および吸収する(Bernback et al., 1990; J Clin Invest, 85: 1221-1226; Carnielli et al., 1998; Am J Clin Nutr, 67: 97-103)。類似した脂肪組成の乳児用調合乳に加えて、母乳もまた、ヒト乳からの極めて効率的な脂肪吸収を促進する特異性の広いリパーゼである胆汁酸活性化リパーゼ(BSSL)(EC3.1.1.13)を含有する。
【０００８】
BSSLは、十二指腸内の胆汁酸によって活性化される天然膵臓酵素であり、他のリパーゼと一緒に脂質の加水分解に関与する。乳児期、特に、早産児では、膵臓外分泌機能は十分に発達していない(Manson & Weaver, 1997; Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed, 76: 206-211)。従って、早産児の膵臓では、膵臓リパーゼの発現は成人膵臓と比較して低い(Lombardo, 2001; Biochim Biophys Acta, 1533: 1-28; Li et al 1007; Pediatr Res, 62: 537-541)。従って、母乳に存在するBSSLは、これらの乳児にとって重要なリパーゼである。乳汁分泌乳腺においてBSSLが発現し、母乳と共に酵素が分泌されることによって、低レベルの膵臓リパーゼが補われる。ヒト乳汁分泌乳腺はBSSLを合成および分泌する。BSSLは赤ん坊の腸管下部内の一次胆汁酸によって特異的に活性化された後に、母乳栄養児の内因性の腸管脂肪消化能に寄与する。
【０００９】
BSSLは、ほとんどのリパーゼより広い基質特異性を有すると考えられている。この酵素は、トリグリセリド(トリアシルグリセロール、TG)の3つ全ての脂肪酸だけでなく、脂溶性ビタミンエステル、例えば、ビタミンAならびにコレステリルエステルも完全に加水分解することができる。従って、BSSLは腔内脂肪分解を完了させ、グリセロールおよび長鎖多価不飽和脂肪酸(LCPUFA)を含む遊離脂肪酸(FFA)を形成する。遊離脂肪酸(FFA)は発達中の中枢神経系に不可欠な基本要素である(Hernell, 1975; Eur J Clin Invest, 5: 267-272; Bernback et al, 1990; Hernell et al, 1993; J Pediat Gastro Nutr, 16: 426-431; Chen et al, 1994; Biochem Biophys Acta, 1210: 239-243)。BSSLはpH8〜8.5で最適活性を示し、酸性環境では膵臓リパーゼより安定している。BSSLは生理学的濃度でペプシンによる分解に耐性がある。BSSLは乳中の総タンパク質の約1％を占め、0.1〜0.2g/Lの濃度で存在する(Blackberg et al, 1987; FEBS Lett, 217: 37-41; Wang & Johnson, 1983; Anal Biochem, 133: 457-461; Stromqvist et al, 1997; Arch Biochem Biophys, 347: 30-36)。ヒト乳中のBSSLレベルは一日を通してほぼ同じであり(Freed et al., 1986; J Pediatr Gastroenterol Nutr, 5: 938-942)、ヒト乳中のBSSL産生は少なくとも3ヶ月間、維持されるが(Hernell et al., 1977; Am J Clin Nutr, 30: 508-511)、BSSL濃度は授乳期間と共に低下することがある(Torres et al., 2001; J Natl Med Assoc, 93: 201-207)。トリグリセリドはヒト乳または調合乳の全脂質の約98％以上を構成し、それによって、エネルギー含有率の約50％を占める。
【００１０】
ヒト乳が満期産児ならびに早産児の栄養源として優れていることは多くの研究および多くの専門家グループの勧告において示されている。従って、世界中で推奨される栄養法は母乳栄養である。しかしながら、母乳栄養も母親自身の母乳を与えることも必ずしも可能だとは限らず、医学的な理由で推奨されるとは限らない。母乳栄養は、他の多くの理由により、それぞれの場合において本明細書の他の場所に議論されるように実施されないことがある。
【００１１】
母乳栄養を開始する米国女性のパーセントは1980年代に約60％から約50％まで低下したのにもかかわらず(Foss & Southwell, 2006; Int Breastfeeding J1: 10)、1990年代から増加し、2004年には約74％と報告された(Scanlon et al, 2007, in CDC Morbidity and Mortality Weekly Report, 2rd August 2007)。しかしながら、母乳栄養を続ける女性のパーセントは分娩後初期における開始後にかなり低下するように見られる。この研究は、2004年において、6ヶ月後に42％の女性、12ヶ月後に21％の女性しか母乳栄養を続けていなかったと報告している。英国のSheffieldからのデータは、1980年代に約70％から50％まで低下したが、出産1ヶ月後に、このような女性の35％〜30％(同じ期間)しか実際に母乳栄養をしていなかったという同じ傾向を示した(Emery et al., 1990, Arch Dis Childhd, 65: 369-372)。完全母乳育児をしている女性のパーセントはさらに低く、全体的に見て、2004年に米国で生まれた乳児の場合、3ヶ月齢で約31％の女性、6ヶ月齢で11％の女性しか完全母乳育児を行っておらず、これらの女性のサブグループ間で大きな不一致があった。3ヶ月齢までの完全母乳育児率は、黒人乳児(20％)および20歳未満の母親の乳児(17％)、高校教育を受けた母親または高校教育を受けていない母親(それぞれ、23％および24％)、未婚の母親(19％)、農村部にすんでいる母親(24％)、ならびに収入対貧困(income-to-poverty)比が<100％の母親(24％)の間で最も低かった(Scanlon et al., 2007)。実際に、母乳栄養には国および文化によって大きな差がある。Emeryおよび共同研究者ら(1990)は、英国、Sheffieldにおいて、母乳育児をしようと考えているアジア人女性のパーセントは母乳育児をしようと考えている白人女性のパーセントよりかなり低いと報告した。さらに、Singh(2010; Eur J Sci Res, 40: 404-422)は、ブラジルでは完全母乳育児の平均期間が28.9日しかなく、マレーシアでは2ヶ月で乳児の25％しか完全母乳育児されておらず、ボゴタおよびナイロビでは、このパーセントはそれぞれ乳児の12％および21％だと報告している。
【００１２】
乳児が母乳栄養されていない場合、乳児用調合乳、または母乳バンクにある、および母乳バンクにない低温殺菌母乳および/もしくは冷凍母乳が用いられることが多い。しかしながら、全てのものが、いくつかの点で新生児にとって栄養的に最適ではない。
【００１３】
ウイルス感染(ヒト免疫不全症ウイルス[HIV]、サイトメガロウイルス[CMV]、肝炎)およびより少ない程度で病原性細菌伝播のリスクのために、いわゆる母乳バンクにおいて用いられるドナー乳は一般的に使用前に低温殺菌される。しかしながら、BSSLはヒト乳の低温殺菌中に不活性化される(Bjorksten et al., 1980; Br Med J, 201: 267-272)。また、BSSLは、早産児または正期産児の栄養摂取のために存在する多くの異なる調合乳のいずれにも存在しない。新鮮な母乳が与えられた乳児における脂肪吸収、体重増加、および直線的成長は低温殺菌母乳と比較して高いことが示されている(Andersson et al. 2007; Acta Paediatr, 96: 1445-1449; Williams et al., 1978; Arch Dis Child 43: 555-563)。これは、母乳を与えることができない新生児乳児、特に早産児には他の母親からの非低温殺菌乳を与えるべきだと唱えられてきた理由の1つである(Bjorksten et al., 1980)。
【００１４】
Hamosh (1983; J Ped Gastro Nutr, 2: 248-251)は、BSSL酵素活性が、26〜30週で分娩した女性の新鮮な母乳に存在すると報告した。この報告では、-20℃または-10℃で保管された乳標本はBSSL活性消失が遅いが、-10℃でたった3週間、保管された後でも活性に対する胆汁酸依存性の消失が顕著であり、このことは-20℃での母乳保管中でも乳脂質が加水分解される一因となり得るとさらに述べられた。
【００１５】
乳胆汁酸活性化リパーゼは、ある特定の種、すなわち、ヒト、ゴリラ、ネコ、およびイヌの乳の中にしか発見されていない(Freed, et al., 1986; Biochim Biophys Acta, 878: 209-215)。乳胆汁酸活性化リパーゼは、ウシ、ウマ、ラット、ウサギ、ヤギ、ブタ、アカゲザルによって産生されない(Blackberg et al., 1980; Freudenberg, 1966; Experientia, 22: 317)。
【００１６】
BlackbergおよびHernell (1981; Eur J Biochem, 116: 221-225)ならびにWang および Johnson (1983)に報告されたように、天然ヒト乳BSSL(hBSSL-MAM)が均一になるまで精製されていおり、ヒトBSSLのcDNA配列がNilsson (1990; Eur J Biochem, 192: 543-550)によって同定され、WO91/15234およびWO91/18923に開示された。いくつかの研究室からの特徴付けおよび配列研究によって、タンパク質hBSSL-MAMおよび膵臓カルボキシルエステル加水分解酵素(CEH)(膵臓BSSLとも知られる)はいずれも同じ遺伝子の産物であると結論づけられた(例えば、Baba et al., 1991; Biochem, 30: 500-510 Hui et al., 1990; FEBS Lett, 276: 131-134; Reue et al., 1991; J Lipid Res, 32: 267-276)。
【００１７】
cDNA配列が単離された後に、US5716817、WO94/20610、およびWO99/54443に記載のように、トランスジェニックヒツジ(rhBSSL-OVI)を含めて、組換えヒトBSSL(rhBSSL)ならびにその変種が産生されている。トランスジェニック動物を用いた治療用タンパク質の産生は大きな安全上、学術上、規制上、および倫理上の抵抗にあってきた。実際に、現在に至るまで米国市場でもEU市場でもトランスジェニックヒツジから産生された治療製品は認可されておらず、他のトランスジェニック動物から産生された医療製品は、トランスジェニックヤギから産生されたATRYN(組換え抗トロンビン)、およびトランスジェニックウサギから産生されたRUCONEST(組換え成分1エステラーゼ阻害剤)の2つしか今までに認可されていない。このように産生された(乳腺組織において発現され、乳の中に排出された)タンパク質は、乳清タンパク質などの、これらの動物の乳に天然に見られる成分、または非ヒトの乳タンパク質もしくは乳清タンパク質が夾雑することがあり、このようなタンパク質は、ヒト使用のために、ある個体において、例えば、乳をベースとする成分または製品に対して不耐性またはアレルギーの個体において使用される場合に安全上の問題を引き起こすことがある。
【００１８】
乳をベースとする食物に、リパーゼまたはエステラーゼを含有する組織抽出物を添加することが動物の下痢治療において有用なことは長く(少なくとも1960年代半ばまでに)知られていた(CA662815およびUS3081225)。また、US326150は、幼児を含むヒトにおけるセリアック病または吸収不良症候群の治療に外因性リパーゼを使用することを示唆している。この中に述べられている方法は、仔ウシ、仔ヤギ、および仔ヒツジの舌および他の口組織などの組織から、ほとんど特徴付けられていない酵素混合物を抽出および使用することを伴う。
【００１９】
乳児に授乳する、特に、LBW児に授乳する行為に関して、新鮮なヒト母乳がLBW児に最も適した食品であると長く奨励されてきた。これは、3週間連続して未処理ヒト乳、低温殺菌ヒト乳、および煮沸ヒト乳をそれぞれ1週間与えた、3〜6週齢の7人のVLBW早産児(1.3Kg未満)の実験研究において、ヒト乳の熱処理によって脂肪吸収が(未処理ヒト乳と比較して)約1/3になったことを示したWilliams et al (1978)による初期研究などの研究に基づいている。この研究により、熱処理ヒト乳と比較した未処理ヒト乳における脂肪吸収の改善は乳リパーゼの保存に関連し得ることが示唆された。この研究が、未処理乳が与えられた週の間に全ての乳児の体重が最も急速に増加したと述べたことに注目すべきである。この期間の間に、体重増加の平均(1週間当たりの増加g/週/摂取された乳100mLで報告された)は、低温殺菌乳または煮沸乳が投与されたほぼ同じ期間より約1/3多かった。Alemi(1980;Pediatrics.68:484-489)により報告されたさらに大規模な(しかし、短期間の)試験では、出生時体重660〜1,695gおよび在胎齢26〜33週で生まれた15人のVLBW児において脂肪排泄が研究された。この試験は生後7〜44日で開始した。ヒト乳および調合乳の混合物が72時間、与えられた乳児の脂肪排泄は、調合乳しか与えられなかった乳児と比較して少なかった。つい最近、Anderssonおよび共同研究者ら(2007)は、無作為化試験において、母乳の低温殺菌によって早産児における脂肪吸収および発育が低下したと報告し、これらの作用が、低温殺菌による乳をベースとするBSSLの不活性化によるものだったと提唱した。前記を含む多数の試験から、ヒト乳および調合乳の両方から報告された脂肪吸収率(CFA)の範囲が広いことに注目すべきである。これは、一部には、与えられた脂肪の量および組成によって、一部には、早産児における食事性脂肪を利用する能力の大きな個体間差によって説明することができるが、CFAを正確に評価することがかなり難しいことも反映している(Hernell, 1999; J Pediatr, 136: 407-409)。
【００２０】
ある動物モデル試験は、新生児用食品に外因性BSSLを添加することによって乳児発育に対する効果を調べようと試みた(Wang et al., 1989; Am J Clin Nutr, 49: 457-463)。この試験は、6匹の哺乳瓶で育てた仔ネコへの、仔ネコ用調合乳(牛乳と3:1で混合した)に精製ヒトBSSL(0.1mg/mL)への5日間の添加を伴った。この試験では、hBSSLが添加された仔ネコ用調合乳が与えられた仔ネコの発育速度は調合乳のみが与えられた仔ネコの発育速度の2倍であると報告された。調合乳に牛乳が添加され、仔ネコは早産仔でも低出生体重仔でもなく、生まれて最初の48時間は母乳栄養され、この試験は精製された天然hBSSLを用いて行われたことに注目すべきである。著者らは、仔ネコを、BSSLの機能的役割の調査における動物モデルとして利用することができたと示唆した。この試験に基づいて、(他の局面の中で)以下:胆汁酸活性化リパーゼが乏しい脂肪含有乳児用調合乳を強化するための方法であって、調合乳からの脂肪吸収および乳児発育を増大させるために、乳胆汁酸活性化リパーゼ[BSSL]および胆汁酸活性化膵臓カルボキシエステラーゼ[現在ではBSSLとも知られる]からなる群より選択される、有効量の単離された胆汁酸活性化リパーゼを調合乳に添加する工程を含む、方法;ならびに脂肪を含む第1の供給源からの食事成分を乳児に与えるための方法であって、成分中にある脂肪の乳児による消化および吸収を改善し、乳児の発育を高めるのに十分な量の、乳胆汁酸活性化リパーゼ[BSSL]および胆汁酸活性化膵臓カルボキシエステラーゼ[BSSLとも知られる]からなる群より選択される単離された胆汁酸活性化リパーゼを乳児に投与する工程からなり、リパーゼは第2の供給源に由来する、方法を開示する関連特許出願(US4944944、EP0317355、およびEP0605913を含む)が出願された。脂肪吸収の改善を裏付けるデータも、ヒト乳児が関与した試験から得られたデータも開示されなかった。Lindquist および Hernell (2010)によって別の試験(Lindquist et al., 2007; J Pediatr Gastroenterol Nutr 44: E335)が報告されており、BSSLノックアウト雌親によって育てられているBSSLノックアウトマウス仔に精製ヒトBSSLを人工的に与えると正常な脂肪吸収が回復し、腸障害の形成の形成が阻止された。
【００２１】
hBSSL cDNAのクローニングおよび多量の組換えヒトBSSL(rhBSSL)を産生する様々なアプローチの開示の後に、rhBSSLを含む様々な乳児用調合乳(例えば、US5200183、WO91/15234、WO91/18923、およびUS5716817)、ならびに乳児用サプリメントとしての、食事性脂質の利用の改善、脂肪吸収不良、ある特定の膵臓異常、および嚢胞性線維症の治療(例えば、WO91/18923、WO94/20610、およびWO99/54443)のための、このような調合乳またはrhBSSLの様々な方法または使用に対して、非常に多くの開示およびクレームがなされた。しかしながら、示唆に富む先行研究と同様に、ヒト乳児に組換え胆汁酸活性化リパーゼを与えた実験から得られた、裏付けとなるデータは開示されていない。実際に、1996年になっても、これらの示唆、共同研究および開示、この分野における主要研究者は、依然として、「調合乳を与えている乳児にヒト乳の生理活性成分[例えば、BSSL]を与えるべきなのか？」と疑問を唱え、さらには、「消化酵素[例えば、BSSL]を与えた試みに関するデータがない」と述べている(Hamosh, at Symposium: Bioactive Components in Milk and Development of the Neonate: Does Their Absence Make a Difference? Nutr, 12: 971-974; 1997において報告された)。つい最近、Anderssonおよび共同研究者ら (2007)は、低温殺菌乳に組換えヒト乳BSSLを添加すると乳の内因性脂肪分解活性が回復する可能性があると推測した。
【００２２】
722アミノ酸の天然BSSLは高度にグリコシル化され(30〜40％炭水化物)(Abouakil et al., 1989; Biochem Biophys Acta, 1002: 225-230)、この分子のC末端部分には広範囲のOグリコシル化部位があり、BSSLの最も豊富な形態ではO結合型炭水化物を有する11残基からなる16プロリンリッチリピートを含有する(Hansson et al., 1993; J Biol Chem, 268: 26692-26698)。広範囲のO-グリコシル化の役割は証明されてないが、その配列組成に基づいて、大きなC末端テールは親水性が非常に高く、到達可能であると予測されている(Wang et al, 1995; Biochemistry, 34: 10639-10644)。
【００２３】
グリコシル化パターンの差は、多くのタンパク質、特に、医学において用いられるタンパク質の活性または他の特性において著しい差を有することがある。例えば、ARANESP(ダルベポエチンα)は、この分子に3つではなく5つのN結合型オリゴ糖鎖を提供し、薬物動態学的特性を大幅に変える2アミノ酸だけPROCRIT(エポエチンα)と異なる、特異的に操作されたエリスロポエチン変種である。ダルベポエチンはエポエチンと比較して血清半減期が3倍延長し、インビボ活性が増加している(Sinclair and Elliot, 2005; J Pharm Sci 94: 1626-1635)。
【００２４】
異なる組換え産生系(例えば、哺乳動物細胞、酵母、トランスジェニック動物)、および同じ発現系からの産生プロセスの一見小さな変化でさえも同じタンパク質/ポリペプチド配列のグリコシル化の変化につながることがある。例えば、組換えヒトα-ガラクトシダーゼAはファブリー病の酵素補充療法において用いられる。市販製剤は2つの手法で製造され、同じアミノ酸配列を有するが、それぞれが異なるグリコシル化パターンを有する:REPLAGAL(アガルシダーゼアルファ)およびFABRAZYME(アガルシダーゼベータ)。REPLAGALは連続したヒト線維芽細胞株において産生されるのに対して、FABRAZYMEはチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞において産生され、それぞれの製品のグリコシル化は異なる。CHO細胞から産生された他のタンパク質と同様に、FABRAZYMEはシアリル化(sialyated)糖タンパク質であり、REPLAGALと比較してシアリル化(sialyation)およびリン酸化の程度が異なる(Lee et al, 2003; Glycobiology, 13: 305-313)。天然ヒト糖タンパク質と比較して、CHO細胞において産生された糖タンパク質のシアリル化の定性的および定量的な差は、生体内分布レベルおよび免疫原性の強さが原因で生じた結果である。実際に、アガルシダーゼベータで治療されたほぼ全ての患者においてIgGの存在が報告されたのに対して、アガルシダーゼアルファで治療された患者の55％しかIgGの存在が報告されていない(Linthorst et al, 2004; Kidney Int, 66: 1589-1595)。さらに、場合によっては、アガルシダーゼベータを用いた治療に対するアレルギー型反応と、循環中のIgEの存在および/または陽性皮内反応が報告されている(Wilcox et al, 2004; Am J Hum Genet, 75: 65-74)。
【００２５】
実際に、これらのペプチドマップは非常に似ているが、天然BSSLのグリコシル化パターンは、マウスC127およびハムスターCHO細胞株において産生されたrhBSSLのグリコシル化パターンとはかなり異なり、コンカナバリン、トウゴマ(Ricinus communis)アグルチニン、およびアレウリア・アウランチア(Aleuria aurantia)アグルチニンを含む、ある特定のレクチンに結合する能力の点でも異なる。このことは、天然BSSLが、組換え型よりかなり多くのフコースおよび末端β-ガラクトース残基を含有することを示唆している(Stromqvist et al., 1995; J Chromatogr, 718: 53-58)。Landberg et al(1997; Arch Biochem Biophys 344:94-102)はこれらの2つの組換え型をさらに特徴付け、両組換え型とも総単糖のモルパーセントが低く(C127によって産生されたrhBSSLについては20％、CHOによって産生されたrhBSSLについては15％であるのに対して、天然hBSSLについては23％)、天然hBSSLが、ある特定のルイス抗原検出抗体と反応したが、C127-rhBSSLが反応しなかったと報告した。
【００２６】
前記で報告された、C127によって産生されたrhBSSLおよびCHOによって産生されたrhBSSLは、分子量、グリコシル化、およびレクチン結合の点で互いにおおむね似ていた。対照的に、トランスジェニックマウスの乳から単離されたrhBSSLはサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)において少ない見かけの分子量を示し、レクチンパネルと検出可能な相互作用を示さなかった。このことから、トランスジェニックマウスからの乳中のrhBSSLのO-グリコシル化の程度は他の組換え型で見られたものよりかなり低いことが分かる(Stromqvist et al., 1996; Transgen Res 5: 475-485)。
【００２７】
ある特定の形態のrhBSSLを用いて行われた特定の適応症における臨床研究、すなわち、慢性膵炎または嚢胞性線維症(CF)による外分泌膵機能不全(PI)の初期探索的研究が報告されている。2004年に、通常用量または25％投与量で与えられたCreonのみと比較して、補助物質として0.2gまたは1gの単回投与量のrhBSSLがCreon通常用量の25％に添加された時に、PIのあるCF患者(12〜39歳)の脂質取り込みが迅速かつ効率的になることを示した第II相試験が報告された(Strandvik et al, 2004; 18th North American Cystic Fibrosis Conference, St Louis MI; Pediatr Pulmonolに掲載されたアブストラクト, S27: 333)。2005年に、別の第II相試験の結果が報告され、rhBBSLは、PIに罹患しているスウェーデン人CF患者群の脂肪消化能力を大幅に改善した(Biovitrumからのプレスリリース、Strandvik et al, 2005; 28th European Cystic Fibrosis Society (ECFS) Conference, Creteにおいて報告)。両臨床試験において、これらの臨床結果はrhBSSL-OVIを用いて得られた。つい最近、CFおよびPIの成人患者における脂肪吸収に対する効果を評価するためにrhBSSL(この中では「ブセリパーゼ(bucelipase)アルファ」と述べられている)経口懸濁液が5〜6日間にわたって1日3回、170mgで投与された、さらなる第II相試験が完了したと発表されたが、これから効力結果は現在に至るまで公表されていない(clinicaltrials.gov識別子NCT00743483)。
【００２８】
rhBSSLを用いた2つの第II相試験が計画され、かつ進行中であることが少なくとも2008年から開示されており、それぞれ、32週在胎齢の前に生まれ、乳児用調合乳(clinicaltrials.gov識別子NCT00658905)または低温殺菌母乳(clinicaltrials.gov識別子NCT00659243)に添加された0.15g/L rhBSSLまたはプラセボで1週間、治療された早産児における脂肪吸収率ならびに身長および体重の変化の調査を目的としている。
【００２９】
従って、先行技術、および長年にわたる切実な解決の必要性を考慮して、本発明の目的は、ヒト乳児、例えば、ヒト低体重児またはヒト早産児の発育速度を増大させる方法を提供することである。前記方法は、先行技術の欠点の1つまたは複数を克服するはずであり、これには、活性成分を確実かつ/もしくは再現可能に大量に産生することができること；活性成分が学術的、規制的、および/もしくは倫理的に許容される方法によって製造されていること；ならびに/または、前記方法もしくは前記方法において用いられた活性成分が、ヒト乳児が参加した無作為化臨床試験において有効かつ安全であると証明されていること、が含まれる。
【００３０】
前記技術的問題に対する解決が、本明細書および/または特許請求の範囲において定義された、または他のやり方で開示された本発明の様々な局面および態様によって提供される。
【発明の概要】
【００３１】
概要
1つの局面において、本発明は、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼをヒト乳児に経腸投与する工程を含む、該乳児の発育速度を増大させる方法に関する。
【００３２】
別の局面において、本発明は、低体重または早産の治療を医学的に必要とする乳児に組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを経腸投与する工程を含む、低体重または早産のヒト乳児を治療するための治療方法に関する。
【００３３】
本発明の別の局面は、ヒト乳児の発育速度を増大させるための改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳を調製する方法であって、
i.第1の量の組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼおよび第2の量の改良されていない乳児用調合乳または改良されていない低温殺菌母乳を提供する工程;ならびに
ii.ある量の前記リパーゼを前記改良されていない乳児用調合乳または改良されていない低温殺菌母乳に添加して、前記改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳が少なくとも約4日にわたって少なくとも1日1回の授乳のために、少なくとも約5日にわたって少なくとも1日1回の授乳のために、または少なくとも約7日にわたって少なくとも1日1回の授乳のために前記乳児に与えられた時に、ヒト乳児の発育速度を増大させるのに有効な量のリパーゼを含む、改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳を形成する工程
を含む、方法に関する。
【００３４】
さらに他の局面において、本発明は、(a)改良された乳児用調合乳であって、前記改良された乳児用調合乳が少なくとも約4日にわたって少なくとも1日1回の授乳のために、少なくとも約5日にわたって少なくとも1日1回の授乳のために、もしくは少なくとも約7日にわたって少なくとも1日1回の授乳のためにヒト乳児に与えられた時に、ヒト乳児の発育速度を増大させるのに有効な量の組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを含む、改良された乳児用調合乳;および/または(b)改良された低温殺菌母乳であって、前記改良された低温殺菌母乳が少なくとも約4日にわたって少なくとも1日1回の授乳のために、少なくとも約5日にわたって少なくとも1日1回の授乳のために、もしくは少なくとも約7日にわたって少なくとも1日1回の授乳のためにヒト乳児に与えられた時に、ヒト乳児の発育速度を増大させるのに有効な量の組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを含む、改良された低温殺菌母乳に関する。
【００３５】
本発明のさらなる局面の1つは、ヒト乳児の発育速度を増大させるための改良された乳児用調合乳または改良された母乳を調製するためのキットであって、以下の成分:
(a)第1の量の組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼ、例えば、凍結乾燥製剤の形をした第1の量の組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを含む、少なくとも1つの第1の容器;および
(b)第2の量の改良されていない乳児用調合乳または改良されていない低温殺菌母乳を含む、第1の容器とは異なる少なくとも1つの第2の容器
を含み、
前記リパーゼおよび前記改良されていない乳児用調合乳または改良されていない低温殺菌母乳はそれぞれ、前記改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳が前記乳児に与えられた時に、例えば、少なくとも約4日にわたって少なくとも1日1回の授乳のために、少なくとも約5日にわたって少なくとも1日1回の授乳のために、または少なくとも約7日にわたって少なくとも1日1回の授乳のために前記乳児に与えられた時に、ヒト乳児の発育速度を増大させるのに有効な量の前記リパーゼを含む、改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳をそれぞれ調製するのに十分な量である、
キットに関する。
【００３６】
さらに別の局面において、本発明は、ヒト乳児の発育速度を増大させる方法であって、以下の工程;
i.本発明の改良された乳児用調合乳もしくは改良された低温殺菌母乳を調製する工程もしくは他のやり方で提供する工程、または本発明の方法に従って、もしくは本発明のキットを使用することによって、本発明の改良された乳児用調合乳もしくは改良された低温殺菌母乳を調製する工程;
ii.このように調製された、または他のやり方で提供された改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳を前記乳児に与える工程;および
iii.少なくとも約4日にわたって少なくとも1日1回の授乳のために、少なくとも約5日にわたって少なくとも1日1回の授乳のために、または少なくとも約7日にわたって少なくとも1日1回の授乳のために前記工程を繰り返す工程
を含む方法に関する。
【００３７】
なおさらなる局面において、本発明は、ある量の組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを含む薬学的組成物を含む包装された薬学的製品に関する。前記包装された薬学的製品は、以下の工程:
i.前記改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳が少なくとも約4日にわたって少なくとも1日1回の授乳のために、少なくとも約5日にわたって少なくとも1日1回の授乳のために、または少なくとも約7日にわたって少なくとも1日1回の授乳のために前記乳児に与えられた時に、ヒト乳児の発育速度を増大させるのに有効な量の前記リパーゼを含有する改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳を調製する工程;および
ii.前記改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳をヒト乳児に与えることによって、例えば、少なくとも約4日にわたって少なくとも1日1回の授乳のために、少なくとも約5日にわたって少なくとも1日1回の授乳のために、または少なくとも約7日にわたって少なくとも1日1回の授乳のために前記改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳をヒト乳児に与えることによって、前記量のリパーゼを経腸投与する工程
について説明している説明書をさらに含む。
【００３８】
特定の局面において、本発明はまた、0.1〜100mgの組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼ、例えば、1.5〜75mgの前記リパーゼ、5〜45mgの前記リパーゼ、または約20mgの前記リパーゼを含む単位用量の薬学的組成物に関する。
【００３９】
別の局面において、本発明はまた、(X)損傷からのヒト乳児の小腸粘膜の保護;(Y)完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の有害作用からのヒト乳児の未熟腸上皮の保護;ならびに/または(Z)ヒト乳児の回腸における完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積の制限のための方法;(X)損傷からのヒト乳児の小腸粘膜の保護;(Y)完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の有害作用からのヒト乳児の未熟腸上皮の保護;ならびに/または(Z)ヒト乳児の回腸における完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積の制限に有用な乳児用食品を調製する方法;(X)損傷からのヒト乳児の小腸粘膜の保護;(Y)完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の有害作用からのヒト乳児の未熟腸上皮の保護;ならびに/または(Z)ヒト乳児の回腸における完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積の制限に有用な乳児用食品;(X)損傷からのヒト乳児の小腸粘膜の保護;(Y)完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の有害作用からのヒト乳児の未熟腸上皮の保護;ならびに/または(Z)ヒト乳児の回腸における完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積の制限に有用なキット;(X)損傷からのヒト乳児の小腸粘膜の保護;(Y)完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の有害作用からのヒト乳児の未熟腸上皮の保護;ならびに/または(Z)ヒト乳児の回腸における完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積の制限のための包装された薬学的パッケージ(packaged-pharmaceutical-package);(X)損傷からのヒト乳児の小腸粘膜の保護;(Y)完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の有害作用からのヒト乳児の未熟腸上皮の保護;ならびに/または(Z)ヒト乳児の回腸における完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積の制限のための薬学的組成物;ならびに(X)損傷からのヒト乳児の小腸粘膜の保護;(Y)完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の有害作用からのヒト乳児の未熟腸上皮の保護;ならびに/または(Z)ヒト乳児の回腸における完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積の制限のためのヒト組換え胆汁酸活性化リパーゼに関し、それぞれの場合において、前記乳児に対して組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼが関与する。
[本発明1001]
ヒト乳児に組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを経腸投与する工程を含む、ヒト乳児の発育速度を増大させる方法。
[本発明1002]
前記リパーゼが、1日当たり1〜100mgの該リパーゼ/Kg乳児体重、5〜50mgの該リパーゼ/Kg乳児体重、15〜40mgの該リパーゼ/Kg乳児体重、または約22.5〜27mgの該リパーゼ/Kg乳児体重の量で投与される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
乳児に新鮮な母乳が与えられない、本発明1001または本発明1002の方法。
[本発明1004]
最初に前記リパーゼが乳児用調合乳または低温殺菌母乳に添加され、次いでこれが乳児に与えられ、それによって該リパーゼが経腸投与される、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
前記リパーゼが、乳児用調合乳または低温殺菌母乳に0.03〜0.5g/L調合乳または母乳の最終濃度まで添加される、本発明1004の方法。
[本発明1006]
前記リパーゼが、乳児用調合乳または低温殺菌母乳に0.05〜0.3g/L調合乳もしくは母乳、0.1〜0.2g/L調合乳もしくは母乳、または約0.15g/L調合乳もしくは母乳の最終濃度まで添加される、本発明1004の方法。
[本発明1007]
ヒト乳児がヒト低体重児である、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
ヒト乳児がヒト早産児である、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
ヒト早産児が、約第37週前に生まれたヒト早産児であるか、妊娠約37週〜約32週、妊娠約32週〜約25週、または妊娠約25週〜約22週に生まれたヒト早産児である、本発明1008の方法。
[本発明1010]
前記リパーゼが、少なくとも約4日にわたって少なくとも1日1回の授乳と共に投与されるか、少なくとも約5日にわたって少なくとも1日1回の授乳と共に投与されるか、または少なくとも約7日にわたって少なくとも1日1回の授乳と共に投与される、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記リパーゼが、1日当たりほとんどの授乳と共に、または全ての授乳について投与される、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記リパーゼが、少なくとも約2週間、少なくとも約3週間、または少なくとも約4週間の期間にわたって投与される、本発明1010または本発明1011の方法。
[本発明1013]
ヒト乳児の発育速度の増大が該乳児の体重増加速度の増大である、本発明1001〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
ヒト乳児の体重増加速度が、約10〜30gの体重増加/該乳児体重Kg/日(g/Kg/日)、約15〜25g/Kg/日、または約20g/Kg/日、または約18g/Kg/日である、本発明1013の方法。
[本発明1015]
発育速度の増大が、全脂肪吸収率の増加に伴わない、全脂肪吸収率の増加によって示されない、および/または全脂肪吸収率の増加と相関しない、本発明1001〜1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
前記リパーゼが、SEQ ID.NO.1を含むアミノ酸配列またはSEQ ID.NO.1によって示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含む、本発明1001〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
前記リパーゼが、SEQ ID.NO.2の位置151〜2316の配列を含む核酸から発現可能である、本発明1001〜1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記リパーゼが、組換えチャイニーズハムスター卵巣細胞株の発現産物から単離される、本発明1001〜1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
以下より選択される1つまたは複数の特徴によって前記リパーゼがさらに定義される、本発明1001〜1018のいずれかの方法：
a.該リパーゼが、他の乳タンパク質または乳成分、例えば乳カシン（casin）および乳清タンパク質、例えばラクトフェリンを含まないか、または乳に固有の他の夾雑物を含まず、特に、このような乳由来タンパク質もしくは他の夾雑物がヒト、ヒツジ、もしくはマウスの乳に由来する;
b.該リパーゼが、約70％を上回る純度、例えば約80％、90％、または95％を上回る純度を有する;
c.該リパーゼが、BSSL-MAMのグリコシル化レベルより小さな、および/またはrhBSSL-OVIのグリコシル化レベルより大きなグリコシル化レベルを有する;
d.該リパーゼが、BSSL-MAMのグリコシル化パターンとは異なる、および/またはrhBSSL-OVIのグリコシル化パターンとは異なるグリコシル化パターンを有する;
e.該リパーゼが、90KDa〜75KDa、約84〜86KDa、または約85KDaの分子量を有する;ならびに/あるいは
f.SEQ ID.NO.1に示した配列によって示される完全長型と比較してC末端において1アミノ酸または2アミノ酸短い形態で存在するリパーゼ分子の量が、SEQ ID.NO.1に示した配列によって示される完全長型で存在するリパーゼ分子の量の50％より多い、例えば、約100％〜500％、約200％〜400％、または約300％である。
[本発明1020]
前記乳児が、発育速度を増大させるための治療的処置を医学的に必要とし、かつ、投与される前記リパーゼの量が治療的有効量である、本発明1001〜1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
医学的に必要とする乳児に組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを経腸投与する工程を含む、低体重または早産のヒト乳児を治療するための治療方法。
[本発明1022]
i.第1の量の組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼおよび第2の量の改良されていない乳児用調合乳または改良されていない低温殺菌母乳を提供する工程;ならびに
ii.改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳を形成するように、ある量の該リパーゼを該改良されていない乳児用調合乳または改良されていない低温殺菌母乳に添加する工程
を含む、ヒト乳児の発育速度を増大させるための改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳を調製する方法であって、
該改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳が、少なくとも約4日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、少なくとも約5日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、または少なくとも約7日にわたって少なくとも1日1回の授乳について該乳児に与えられた時に、ヒト乳児の発育速度を増大させるのに有効な量のリパーゼを含む改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳を形成する、前記方法。
[本発明1023]
前記リパーゼが凍結乾燥製剤として提供される、本発明1022の方法。
[本発明1024]
工程(ii.)の前に、前記凍結乾燥製剤が例えば滅菌水で可溶化される、本発明1023の方法。
[本発明1025]
前記リパーゼが、1.5〜75mg、5〜45mg、または約10mg、15mg、20mg、もしくは25mgの量の該リパーゼを含む単位用量で提供される、本発明1022〜1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
前記リパーゼが、1.5〜150mg/mL、7.5〜30mg/mL、または約15mg/mLの濃度で溶液で提供される、本発明1022の方法。
[本発明1027]
改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳を、少なくとも約4日にわたって少なくとも1日1回の授乳と共に、少なくとも約5日にわたって少なくとも1日1回の授乳と共に、または少なくとも約7日にわたって少なくとも1日1回の授乳と共にヒト乳児に与える工程をさらに含む、本発明1022〜1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
前記工程が、1日当たりほとんどの授乳または全ての授乳について繰り返される、本発明1027の方法。
[本発明1029]
少なくとも約4日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、少なくとも約5日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、または少なくとも約7日にわたって少なくとも1日1回の授乳について乳児に与えられた時に、ヒト乳児の発育速度を増大させるのに有効な量の組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを含む、改良された乳児用調合乳。
[本発明1030]
少なくとも約4日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、少なくとも約5日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、または少なくとも約7日にわたって少なくとも1日1回の授乳について乳児に与えられた時に、ヒト乳児の発育速度を増大させるのに有効な量の組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを含む、改良された低温殺菌母乳。
[本発明1031]
以下の成分:
a.第1の量の組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを、例えば凍結乾燥製剤中に含む、少なくとも1つの第1の容器;および
b.第2の量の改良されていない乳児用調合乳または改良されていない低温殺菌母乳を含む、第1の容器とは異なる少なくとも1つの第2の容器
を含む、ヒト乳児の発育速度を増大させるための改良された乳児用調合乳または改良された母乳を調製するためのキットであって、
該リパーゼおよび該改良されていない乳児用調合乳または改良されていない低温殺菌母乳はそれぞれ、該改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳が該乳児に与えられた時に、例えば、少なくとも約4日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、少なくとも約5日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、または少なくとも約7日にわたって少なくとも1日1回の授乳について該乳児に与えられた時に、ヒト乳児の発育速度を増大させるのに有効な量の該リパーゼを含む、改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳をそれぞれ調製するのに十分な量である、前記キット。
[本発明1032]
i.改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳をそれぞれ形成するために、例えばある量の前記リパーゼを改良されていない乳児用調合乳または改良されていない低温殺菌母乳に添加することによって、改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳を調製する工程;および
ii.該改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳を、少なくとも約4日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、少なくとも約5日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、または少なくとも約7日にわたって少なくとも1日1回の授乳についてヒト乳児に与える工程
について説明している説明書をさらに含む、本発明1031のキット。
[本発明1033]
以下の工程を含む、ヒト乳児の発育速度を増大させる方法:
i.本発明1029の改良された乳児用調合乳もしくは本発明1030の改良された低温殺菌母乳を調製もしくは他のやり方で提供する工程、あるいは本発明1022〜1028のいずれかの方法に従って、または本発明1031もしくは1032のキットを使用することによって、改良された乳児用調合乳もしくは改良された低温殺菌母乳を調製する工程;
ii.このように調製または他のやり方で提供された、改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳を該乳児に与える工程;および
iii.少なくとも約4日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、少なくとも約5日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、または少なくとも約7日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、前記工程を繰り返す工程。
[本発明1034]
ある量の組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを含む薬学的組成物を含み、以下の工程について説明している説明書をさらに含む、包装された薬学的製品:
i.改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳が少なくとも約4日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、少なくとも約5日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、または少なくとも約7日にわたって少なくとも1日1回の授乳についてヒト乳児に与えられた時に、該乳児の発育速度を増大させるのに有効な量の該リパーゼを含有する改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳を調製する工程;ならびに
ii.該改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳を、例えば、少なくとも約4日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、少なくとも約5日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、または少なくとも約7日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、ヒト乳児に与えることによって、該量のリパーゼを経腸投与する工程。
[本発明1035]
乳児が低体重もしくは未熟児であるか、または乳児が低体重もしくは未熟児だとすると説明書が説明している、本発明1034の包装された薬学的製品。
[本発明1036]
改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳が、(A)ヒト乳児の発育速度を増大させる;ならびに/あるいは(B)(X)損傷からヒト乳児の小腸粘膜を保護する;(Y)完全に消化されていないおよび/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の有害作用からヒト乳児の未熟腸上皮を保護する;ならびに/または(Z)ヒト乳児の回腸における完全に消化されていないおよび/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積を限定するためのものであるか、あるいはそのために有効であるか、あるいはそのために臨床試験において有効かつ安全だと示されている/証明されていると、説明書が説明している、本発明1034または1035の包装された薬学的製品。
[本発明1037]
乳児用調合乳または低温殺菌母乳をさらに含む、本発明1034〜1036のいずれかの包装された薬学的製品。
[本発明1038]
前記リパーゼが、1.5〜75mg、5〜45mg、または約10mg、15mg、20mg、もしくは25mgの量のリパーゼを含む単位用量の中にある、本発明1034〜1037のいずれかの包装された薬学的製品。
[本発明1039]
0.1〜100mgの組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼ、例えば、1.5〜75mgの該リパーゼ、5〜45mgの該リパーゼ、または約20mgの該リパーゼを含む単位用量の中にある、薬学的組成物。
[本発明1040]
単位用量が経腸投与および/またはヒト乳児への投与に適合された形態にある、本発明1039の薬学的組成物。
[本発明1041]
(X)損傷からヒト乳児の小腸粘膜を保護するための;(Y)完全に消化されていないおよび/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の有害作用からヒト乳児の未熟腸上皮を保護するための;ならびに/または(Z)ヒト乳児の回腸における完全に消化されていないおよび/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積を制限するための方法であって、それぞれの場合において、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを該乳児に経腸投与する工程を含む、方法。
[本発明1042]
前記リパーゼの投与が、完全に消化されていないまたは過剰な脂肪および/または脂質の有害作用から小腸粘膜を保護する、本発明1041の方法。
[本発明1043]
乳児に乳児用調合乳が与えられ、かつ/または完全に消化されていないもしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質が乳児用調合乳に由来する、本発明1041または本発明1042の方法。
[本発明1044]
乳児に低温殺菌母乳が与えられ、かつ/または完全に消化されていないもしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質が低温殺菌母乳に由来する、本発明1041または本発明1043の方法。
[本発明1045]
前記リパーゼの投与が、乳児の空腸および/または回腸の粘膜を損傷から保護する、本発明1041〜1044のいずれかの方法。
[本発明1046]
前記リパーゼの投与が、乳児の絨毛上皮を損傷から保護する、本発明1041〜1045のいずれかの方法。
[本発明1047]
前記リパーゼの投与が、粘膜および/または経粘膜の壊死および/または炎症から乳児の小腸粘膜を保護する、本発明1041〜1046のいずれかの方法。
[本発明1048]
前記リパーゼの投与が、壊死性腸炎および/もしくは回腸穿孔から乳児を保護する、ならびに/あるいは該乳児における壊死性腸炎および/もしくは回腸穿孔を予防する、または壊死性腸炎および/もしくは回腸穿孔の可能性、重篤度、および/もしくは有病率を小さくする、本発明1041〜1047のいずれかの方法。
[本発明1049]
経腸管または胃管によって乳児が授乳される、本発明1041〜1048のいずれかの方法。
[本発明1050]
乳児に新鮮な母乳が与えられない、本発明1041〜1049のいずれかの方法。
[本発明1051]
最初に前記リパーゼが乳児用調合乳または低温殺菌母乳に添加され、次いでこれが乳児に与えられ、それによって該リパーゼが経腸投与される、本発明1041〜1050のいずれかの方法。
[本発明1052]
前記リパーゼが、乳児用調合乳または低温殺菌母乳に0.03〜0.5g/L調合乳または母乳の最終濃度まで添加される、本発明1051の方法。
[本発明1053]
前記リパーゼが、乳児用調合乳または殺菌母乳に0.05〜0.3g/L調合乳もしくは母乳、0.1〜0.2g/L調合乳もしくは母乳、または約0.15g/L調合乳もしくは母乳の最終濃度まで添加される、本発明1051の方法。
[本発明1054]
ヒト乳児がヒト低体重児である、本発明1041〜1053のいずれかの方法。
[本発明1055]
ヒト乳児がヒト早産児である、本発明1041〜1054のいずれかの方法。
[本発明1056]
ヒト早産児が、約第37週前に生まれたヒト早産児であるか、妊娠約37週〜約32週、妊娠約32週〜約25週、または妊娠約25週〜約22週に生まれたヒト早産児である、本発明1055の方法。
[本発明1057]
前記リパーゼが少なくとも約4日にわたって少なくとも1日1回の授乳と共に、少なくとも約5日にわたって少なくとも1日1回の授乳と共に、または少なくとも約7日にわたって少なくとも1日1回の授乳と共に投与される、本発明1041〜1056のいずれかの方法。
[本発明1058]
前記リパーゼが1日当たりほとんどの授乳と共に、または全ての授乳について投与される、本発明1057の方法。
[本発明1059]
前記リパーゼが、少なくとも約2週間、少なくとも約3週間、または少なくとも約4週間の期間にわたって投与される、本発明1057または本発明1058の方法。
[本発明1060]
保護効果または蓄積を制限する効果が、ヒト乳児の発育速度の増大、例えば該乳児の体重増加速度の増大と同時に起こる、本発明1041〜1059のいずれかの方法。
[本発明1061]
ヒト乳児の体重増加速度が、約10〜30gの体重増加/該乳児体重Kg/日(g/Kg/日)、約15〜25g/Kg/日、または約20g/Kg/日、または約18g/Kg/日である、本発明1060の方法。
[本発明1062]
発育速度の増大が、全脂肪吸収率の増加と同時に起こらない、全脂肪吸収率の増加によって示されない、および/または全脂肪吸収率の増加と相関しない、本発明1060または1061の方法。
[本発明1063]
前記リパーゼが、SEQ ID.NO.1を含むアミノ酸配列またはSEQ ID.NO.1によって示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含む、本発明1041〜1062のいずれかの方法。
[本発明1064]
前記リパーゼが、SEQ ID.NO.2の位置151〜2316の配列を含む核酸から発現可能である、本発明1041〜1063のいずれかの方法。
[本発明1065]
前記リパーゼが、組換えチャイニーズハムスター卵巣細胞株の発現産物から単離される、本発明1041〜1064のいずれかの方法。
[本発明1066]
前記リパーゼが、以下より選択される1つまたは複数の特徴によってさらに定義される、本発明1041〜1065のいずれかの方法:
a.該リパーゼが、他の乳タンパク質または乳成分、例えば乳カシンおよび乳清タンパク質、例えばラクトフェリンを含まないか、または乳に固有の他の夾雑物を含まず、特に、このような乳由来タンパク質もしくは他の夾雑物がヒト、ヒツジ、もしくはマウスの乳に由来する;
b.該リパーゼが、約70％を上回る純度、例えば約80％、90％、または95％を上回る純度を有する;
c.該リパーゼが、BSSL-MAMのグリコシル化レベルより小さい、および/またはrhBSSL-OVIのグリコシル化レベルより大きなグリコシル化レベルを有する;
d.該リパーゼが、BSSL-MAMのグリコシル化パターンとは異なる、および/またはrhBSSL-OVIのグリコシル化パターンとは異なるグリコシル化パターンを有する;
e.該リパーゼが、90KDa〜75KDa、約84〜86KDa、または約85KDaの分子量を有する;ならびに/あるいは
f.SEQ ID.NO.1に示した配列によって示される完全長型と比較してC末端において1アミノ酸または2アミノ酸短い形態で存在するリパーゼ分子の量が、SEQ ID.NO.1に示した配列によって示される完全長型で存在するリパーゼ分子の量の50％より多い、例えば、約100％〜500％、約200％〜400％、または約300％である。
[本発明1067]
乳児が、(X)損傷から小腸粘膜を保護するため;(Y)完全に消化されていないおよび/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の有害作用から未熟腸上皮を保護するため;ならびに/または(Z)回腸における完全に消化されていないおよび/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積を制限するため、治療的処置を医学的に必要とし、それぞれの場合において、投与されるリパーゼの量が治療的有効量である、本発明1041〜1066のいずれかの方法。
[本発明1068]
(X)損傷からヒト乳児の小腸粘膜を保護するため;(Y)完全に消化されていないおよび/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の有害作用からヒト乳児の未熟腸上皮を保護するため;ならびに/または(Z)ヒト乳児の回腸における完全に消化されていないおよび/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積を制限するための治療方法であって、それぞれの場合において、それを医学的に必要とする乳児に組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを経腸投与する工程を含む、治療方法。
[本発明1069]
(X)損傷からヒト乳児の小腸粘膜を保護するため;(Y)完全に消化されていないおよび/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の有害作用からヒト乳児の未熟腸上皮を保護するため;ならびに/または(Z)ヒト乳児の回腸における完全に消化されていないおよび/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積を制限するための改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳を調製する方法であって、それぞれの場合において、以下の工程:
i.第1の量の組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼおよび第2の量の改良されていない乳児用調合乳または改良されていない低温殺菌母乳を提供する工程;ならびに
ii.改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳を形成するために、ある量の該リパーゼを該改良されていない乳児用調合乳または改良されていない低温殺菌母乳に添加する工程を含み、
それぞれの場合において、該改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳が少なくとも約4日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、少なくとも約5日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、または少なくとも約7日にわたって少なくとも1日1回の授乳について該乳児に与えられた時に、(X)損傷からヒト乳児の小腸粘膜を保護する;(Y)完全に消化されていないおよび/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の有害作用からヒト乳児の未熟腸上皮を保護する;ならびに/または(Z)ヒト乳児の回腸における完全に消化されていないおよび/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積を制限するのに有効な量のリパーゼを含む改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳を形成する、方法。
[本発明1070]
前記リパーゼが凍結乾燥製剤として提供される、本発明1069の方法。
[本発明1071]
工程(ii.)の前に、凍結乾燥製剤が例えば滅菌水で可溶化される、本発明1070の方法。
[本発明1072]
前記リパーゼが、1.5〜75mg、5〜45mg、または約10mg、15mg、20mg、もしくは25mgの量の該リパーゼを含む単位用量で提供される、本発明1069〜1071のいずれかの方法。
[本発明1073]
前記リパーゼが、1.5〜150mg/mL、7.5〜30mg/mL、または約15mg/mLの濃度で溶液で提供される、本発明1069の方法。
[本発明1074]
改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳を、少なくとも約4日にわたって少なくとも1日1回の授乳と共に、少なくとも約5日にわたって少なくとも1日1回の授乳と共に、または少なくとも約7日にわたって少なくとも1日1回の授乳と共にヒト乳児に与える工程をさらに含む、本発明1069〜1073のいずれかの方法。
[本発明1075]
前記工程が、1日当たりほとんどの授乳と共に、または全ての授乳について繰り返される、本発明1074の方法。
[本発明1076]
それぞれの場合において、改良された乳児用調合乳が少なくとも約4日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、少なくとも約5日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、または少なくとも約7日にわたって少なくとも1日1回の授乳について乳児に与えられた時に、(X)損傷からヒト乳児の小腸粘膜を保護する;(Y)完全に消化されていないおよび/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の有害作用からヒト乳児の未熟腸上皮を保護する;ならびに/または(Z)ヒト乳児の回腸における完全に消化されていないおよび/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積を制限するのに有効な量の組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを含む、改良された乳児用調合乳。
[本発明1077]
それぞれの場合において、改良された低温殺菌母乳が少なくとも約4日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、少なくとも約5日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、または少なくとも約7日にわたって少なくとも1日1回の授乳について乳児に与えられた時に、(X)損傷からヒト乳児の小腸粘膜を保護する;(Y)完全に消化されていないおよび/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の有害作用からヒト乳児の未熟腸上皮を保護する;ならびに/または(Z)ヒト乳児の回腸における完全に消化されていないおよび/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積を制限するのに有効な量の組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを含む、改良された低温殺菌母乳。
[本発明1078]
(X)損傷からヒト乳児の小腸粘膜を保護するため;(Y)完全に消化されていないおよび/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の有害作用からヒト乳児の未熟腸上皮を保護するため;ならびに/または(Z)ヒト乳児の回腸における完全に消化されていないおよび/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積を制限するための改良された乳児用調合乳または改良された母乳を調製するためのキットであって、以下の成分:
a.第1の量の組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを、例えば凍結乾燥製剤の形で含む、少なくとも1つの第1の容器;および
b.第2の量の改良されていない乳児用調合乳または改良されていない低温殺菌母乳を含む、第1の容器とは異なる少なくとも1つの第2の容器
を含み、
該リパーゼおよび該改良されていない乳児用調合乳または改良されていない低温殺菌母乳はそれぞれ、それぞれの場合において、該改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳が該乳児に与えられた時に、例えば、少なくとも約4日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、少なくとも約5日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、または少なくとも約7日にわたって少なくとも1日1回の授乳について該乳児に与えられた時に、(X)損傷からヒト乳児の小腸粘膜を保護する;(Y)完全に消化されていないおよび/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の有害作用からヒト乳児の未熟腸上皮を保護する;ならびに/または(Z)ヒト乳児の回腸における完全に消化されていないおよび/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積を制限するのに有効な量の該リパーゼを含む、改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳をそれぞれ調製するのに十分な量である、キット。
[本発明1079]
i.それぞれ改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳を形成するために、例えばある量のリパーゼを、改良されていない乳児用調合乳または改良されていない低温殺菌母乳に添加することによって、改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳を調製する工程;および
ii.該改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳を、少なくとも約4日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、少なくとも約5日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、または少なくとも約7日にわたって少なくとも1日1回の授乳についてヒト乳児に与える工程
について説明している説明書をさらに含む、本発明1078のキット。
[本発明1080]
(X)損傷からヒト乳児の小腸粘膜を保護する;(Y)完全に消化されていないおよび/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の有害作用からヒト乳児の未熟腸上皮を保護する;ならびに/または(Z)ヒト乳児の回腸における完全に消化されていないおよび/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積を制限する方法であって、それぞれの場合において以下の工程を含む、方法:
i.本発明1076の改良された乳児用調合乳または本発明1077の改良された低温殺菌母乳を調製または他のやり方で提供する工程、あるいは本発明1069〜1075のいずれかの方法に従って、または本発明1078または1079のキットを使用することによって、改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳を調製する工程;
ii.このように調製または他のやり方で提供された、改良された乳児用調合乳または改良された殺菌母乳を該乳児に与える工程;および
iii.少なくとも約4日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、少なくとも約5日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、または少なくとも約7日にわたって少なくとも1日1回の授乳について前記工程を繰り返す工程。
[本発明1081]
ある量の組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを含む薬学的組成物を含み、以下の工程について説明している説明書をさらに含む、包装された薬学的製品：
i.それぞれの場合において、該改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳が少なくとも約4日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、少なくとも約5日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、または少なくとも約7日にわたって少なくとも1日1回の授乳について該乳児に与えられた時に、(X)損傷からヒト乳児の小腸粘膜を保護する;(Y)完全に消化されていないおよび/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の有害作用からヒト乳児の未熟腸上皮を保護する;ならびに/または(Z)ヒト乳児の回腸における完全に消化されていないおよび/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積を制限するのに有効な量の前記リパーゼを含有する改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳を調製する工程;ならびに
ii.該改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳を、例えば、少なくとも約4日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、少なくとも約5日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、または少なくとも約7日にわたって少なくとも1日1回の授乳について、ヒト乳児に与えることによって、前記量のリパーゼを経腸投与する工程。
[本発明1082]
乳児が低体重もしくは未熟児であるか、あるいは乳児が低体重もしくは未熟児だとする、ならびに/あるいは乳児が経腸管もしくは胃管によって授乳される、または乳児が経腸管もしくは胃管によって授乳されるものとすると説明書が説明している、本発明1081の包装された薬学的製品。
[本発明1083]
改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳が、(X)損傷からヒト乳児の小腸粘膜を保護する;(Y)完全に消化されていないおよび/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の有害作用からヒト乳児の未熟腸上皮を保護する;ならびに/または(Z)ヒト乳児の回腸における完全に消化されていないおよび/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積を制限するためのものであるか、あるいはそれに効果的であるか、あるいはそのために臨床試験において有効かつ安全だと証明されていると説明書が説明している、本発明1081または1082の包装された薬学的製品。
[本発明1084]
乳児用調合乳または低温殺菌母乳をさらに含む、本発明1081〜1083のいずれかの包装された薬学的製品。
[本発明1085]
前記リパーゼが、1.5〜75mg、5〜45mg、または約10mg、15mg、20mg、もしくは25mgの量のリパーゼを含む単位用量の中にある、本発明1081〜1084のいずれかの包装された薬学的製品。
[本発明1086]
(X)損傷からのヒト乳児の小腸粘膜の保護;(Y)完全に消化されていないおよび/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の有害作用からのヒト乳児の未熟腸上皮の保護;ならびに/または(Z)ヒト乳児の回腸における完全に消化されていないおよび/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積の制限において使用するための、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを含む改良された低温殺菌母乳。
[本発明1087]
(X)損傷からのヒト乳児の小腸粘膜の保護;(Y)完全に消化されていないおよび/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の有害作用からのヒト乳児の未熟腸上皮の保護;ならびに/または(Z)ヒト乳児の回腸における完全に消化されていないおよび/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積の制限において使用するための、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを含む改良された乳児用調合乳。
[本発明1088]
(X)損傷からのヒト乳児の小腸粘膜の保護;(Y)完全に消化されていないおよび/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の有害作用からのヒト乳児の未熟腸上皮の保護;ならびに/または(Z)ヒト乳児の回腸における完全に消化されていないおよび/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積の制限において使用するための、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを含む薬学的組成物。
[本発明1089]
(X)損傷からのヒト乳児の小腸粘膜の保護;(Y)完全に消化されていないおよび/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の有害作用からのヒト乳児の未熟腸上皮の保護;ならびに/または(Z)ヒト乳児の回腸における完全に消化されていないおよび/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積の制限において使用するための、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼ。
[本発明1090]
それぞれの場合において、(V)粘膜および/または経粘膜の壊死および/または炎症からの乳児の小腸粘膜の保護において使用するための、ならびに/あるいは(W)壊死性腸炎および/または回腸穿孔からのヒト乳児の保護、ならびに/あるいは該乳児における壊死性腸炎および/もしくは回腸穿孔の予防、または壊死性腸炎および/もしくは回腸穿孔の可能性、重篤度、および/もしくは有病率の低下において使用するための、本発明1086の改良された低温殺菌母乳、本発明1087の改良された乳児用調合乳、本発明1088の薬学的組成物、または本発明1089の組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼ。
[本発明1091]
いずれの場合でも、ヒト乳児への経腸投与に適合されている、本発明1088もしくは1090の薬学的組成物または本発明1089もしくは1090の組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼ。
[本発明1092]
それぞれの場合において、乳児が経腸管もしくは胃管によって授乳される、乳児に乳児用調合乳が与えられる、および/または乳児が未熟児である、本発明1086もしくは1090の改良された低温殺菌母乳、本発明1087もしくは1090の改良された乳児用調合乳、本発明1088、1090、もしくは1091の薬学的組成物、または本発明1089、1090、もしくは1091の組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼ。
[本発明1093]
(X)損傷からヒト乳児の小腸粘膜を保護するための;(Y)完全に消化されていないおよび/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の有害作用からヒト乳児の未熟腸上皮を保護するための;ならびに/または(Z)ヒト乳児の回腸における完全に消化されていないおよび/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積を制限するための医用薬剤を製造するための、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼの使用。
[本発明1094]
(V)粘膜および/または経粘膜の壊死および/または炎症から乳児の小腸粘膜を保護するための;ならびに/あるいは(W)壊死性腸炎および/もしくは回腸穿孔から乳児を保護するための、ならびに/あるいは該乳児における壊死性腸炎および/もしくは回腸穿孔を予防するための、または該乳児における壊死性腸炎および/もしくは回腸穿孔の可能性、重篤度、および/もしくは有病率を小さくするための医用薬剤を製造するための、本発明1093の使用。
[本発明1095]
組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼが乳児への経腸投与に適合されている、本発明1093または1094の使用。
[本発明1096]
乳児が経腸管もしくは胃管によって授乳される、乳児に乳児用調合乳が与えられる、および/または乳児が未熟児である、本発明1093〜1095いずれかの使用。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】rhBSSL構造の模式図を示す。潜在的なグリコシル化の部位も示す。
【図２−１】乳児用調合乳または低温殺菌母乳に添加されるrhBSSLの臨床試験の模式化された計画を示す。
【図２−２】PP集団の発育速度(g/kg/日)の差とCFA(％)の差との相関関係、複合データを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
詳細な説明
1つの局面において、本発明は、ヒト乳児の発育速度を増大させる方法であって、前記乳児に組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを経腸投与する工程を含む、方法に関する。
【００４２】
本発明において有用な組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼ(rhBSSL)が本明細書において説明、定義、または言及される。例えば、rhBSSLは、ヒト胆汁酸活性化リパーゼだと当業者が認識可能なポリペプチドを含む。前記ヒトリパーゼは、このようなポリペプチドを産生するように(例えば、組換え遺伝子技術によって)適合もしくは改良された非ヒト供給源、例えば、非ヒト生物によって産生または単離されたものである。
【００４３】
ヒト胆汁酸活性化リパーゼ(BSSL)は、様々な識別子または別名;例えば、「カルボキシルエステルリパーゼ(CEL)」、「胆汁酸活性化リパーゼ(BAL)」、「胆汁酸依存性リパーゼ(BSDL)」、「カルボキシエステラーゼ」、「カルボキシルエステル加水分解酵素」(CEH)、および「GeneCards」(www.genecards.org)などの情報源から当業者に容易に入手可能な多数の他の別名および記述によって知られる酵素である。ヒトBSSLの多数の天然アミノ酸配列およびアイソフォームがヒト乳(および膵臓)から同定されており、多数の異なるアミノ酸配列(典型的には、cDNA配列またはゲノム配列から予測された)が記載されている。本明細書において、これらの全てが「ヒト胆汁酸活性化リパーゼ」という用語の中に含まれる。例えば、ヒト胆汁酸活性化リパーゼは、最初に、20〜26アミノ酸シグナル配列を含む前駆配列として天然に産生され、成熟完全長型タンパク質は722〜733アミノ酸を有すると記載されている(例えば、Nilsson et al., 1990; WO91/15234; WO91/18923;cDNA配列 GenBank 提出ID: X54457から予測されたポリペプチド; GenBank ID: CAA38325.1;「CEL/BSSL」のGeneCards エントリー; GenBank ID: AAH42510.1; RefSeq ID: NP_001798.2; Swiss-Prot ID: P19835を参照されたい)。さらなる例では、ヒト胆汁酸活性化リパーゼのさらに短い他のアイソフォームがVenter et al (2001;Science, 291: 1304-1351); GenBnk ID: AAC71012.1; Pasqualini et al (1998; J Biol Chem, 273: 28208-28218); GenBank ID: EAW88031.1;WO94/20610および Blackberg et al (1995; Eur J Biochem, 228: 817-821)に記載されている。
【００４４】
特定の態様において、ヒト胆汁酸活性化リパーゼは、SEQ ID.NO.1を含むアミノ酸配列またはSEQ ID.NO.1によって示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。他の特定の態様において、(組換え)ヒト胆汁酸活性化リパーゼは、Nilsson et al., 1990; WO91/15234、WO91/18923; RefSeq ID: NP_001798.2; GenBank ID: AAH42510.1; GenBank ID: CAA38325.1;「CEL/BSSL」のGeneCardsエントリー; Swiss-Prot ID:P19835に開示されるアミノ酸配列より選択される、成熟型BSSLまたは前駆型BSSLのアミノ酸配列を有する。さらなるこのような態様において、(組換え)ヒト胆汁酸活性化リパーゼは、前述の参考文献に開示される任意の配列の少なくとも720の連続したアミノ酸であるアミノ酸配列、またはSEQ ID.NO.1のアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。他の態様において、(組換え)ヒト胆汁酸活性化リパーゼは、少なくとも、SEQ ID.NO.1もしくはWO91/15234に開示されるアミノ配列の位置1〜101のアミノ配列、または少なくとも、SEQ ID.NO.1に開示されるアミノ配列の位置1〜535のアミノ酸配列、例えば、Hansson et al., 1993; J Biol Chem, 35: 26692-26698に開示される「変種A」を有するタンパク質を含む。ここで、このようなタンパク質は、例えば、Blackberg et al(1995; Eur J Biochem 228: 817-821)に開示される方法によって決定され得るように胆汁酸結合および/または胆汁酸依存性リパーゼ活性を有する。
【００４５】
従って、今や、本発明のある特定の態様において、説明されたこれらの形態の(組換え)ヒト胆汁酸活性化リパーゼの1つまたは複数が本発明の様々な局面において有用であり得ることは当業者に明らかであろう。さらに、(例えば、Blackberg et al., 1995に開示される方法によって決定され得るように)胆汁酸依存性脂肪分解活性を有し、本明細書において説明、定義、または言及されるポリペプチド配列とアミノ酸配列が類似する他の(組換え)タンパク質も本発明において有用性を有する可能性があり、従って、これもまた「ヒト胆汁酸活性化リパーゼ」という用語に含まれることが当業者に明らかであろう。ある特定のこのような態様において、本明細書において説明、定義、または言及される配列と少なくとも約30、50、100、250、500、600、700、711、720、722、733、または750アミノ酸にわたって90％超、95％、98％、99％、99.5％の配列同一性を示すタンパク質。他の態様において、本明細書において開示、定義、または言及されるBSSLポリペプチド配列の1つに1つまたは複数のアミノ酸置換がなされてもよい。例えば、SEQ ID.NO.1に開示される配列に、1アミノ酸、2アミノ酸、3アミノ酸、4アミノ酸、5アミノ酸、または10アミノ酸までの置換、欠失、または付加がなされてもよい。このようなアミノ酸変化は中立の変化(例えば、中立のアミノ酸置換)でもよく、および/または何らかの(望ましい)やり方でタンパク質のグリコシル化、結合、触媒活性、もしくは他の特性に影響を及ぼしてもよい。このような置換を有するタンパク質が胆汁酸依存性脂肪分解活性を有するのであれば、これもまた本発明の意味で「ヒト胆汁酸活性化リパーゼ」であると当業者が認識するであろう。
【００４６】
他の態様において、ヒト胆汁酸活性化リパーゼは、適切な核酸配列を有する核酸から発現可能であるか、または適切な核酸配列を有する核酸によって他のやり方でコードされる。限定されない例として、前記リパーゼは、SEQ ID.NO.2の位置151〜2316の配列を含む核酸またはWO94/20610もしくはNilsson et al(1990)に開示される配列を含む核酸から発現可能であるか、あるいはSEQ ID.NO.2の位置151〜2316の配列を含む核酸またはWO94/20610もしくはNilsson et al(1990)に開示される配列を含む核酸によって他のやり方でコードされる。当業者にも理解されるように、「適切な核酸配列」は前述の核酸配列の変種も含む。例えば、トリプレットコドンによってコードされるアミノ酸を変えない1つまたは複数のヌクレオチド塩基(例えば、3番目のコドン位置にあるヌクレオチド塩基)の変化も「適切」であろう。このような核酸配列の部分断片もまた、本明細書に記載のヒト胆汁酸活性化リパーゼの(短い)アイソフォームをコードするのであれば「適切」であろう。さらに、SEQ ID.NO.1によって示されるアミノ酸配列の変種を有するタンパク質をコードする核酸配列、例えば、前記の核酸配列も「適切」であろう。従って、本発明は、(組換え)ヒト胆汁酸活性化リパーゼが、SEQ ID.NO.2の位置151〜2316の配列を含む核酸もしくは位置151〜755の配列を含む核酸とハイブリダイズする核酸から発現可能である、またはSEQ ID.NO.2の位置151〜2316の配列を含む核酸もしくは位置151〜755の配列を含む核酸を含む核酸とハイブリダイズする核酸によって他のやり方でコードされ、胆汁酸依存性脂肪分解活性を有するタンパク質である態様を想定する。ある特定のこのような態様において、ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件、例えば、当業者に公知のストリンジェントな条件で行われ、一般的な教科書、例えば、Joe Sambrook and David Russellによる「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」(CSHL Press)に記載されている。
【００４７】
特定の態様において、(組換え)ヒト胆汁酸活性化リパーゼは、本明細書において説明、定義、または言及される核酸からの発現によって産生される。
【００４８】
本発明の文脈において、本明細書において説明、定義、または言及されるヒト胆汁酸活性化リパーゼは組換え胆汁酸活性化リパーゼ(rhBSSL)である。すなわち、前記ヒトリパーゼは、このようなリパーゼを産生するように(例えば、組換え遺伝子技術によって)適合もしくは改良された非ヒト供給源、例えば、非ヒト生物によって産生されている、またはこのようなリパーゼを産生するように(例えば、組換え遺伝子技術によって)適合もしくは改良された非ヒト供給源、例えば、非ヒト生物から単離される。特定の態様において、rhBSSLは、本明細書において説明、定義、または言及される単離され得た核酸分子から、無細胞転写翻訳法および/またはインビトロ転写翻訳法を用いて産生される。または、組換え非ヒト生物が用いられる。この場合、前記非ヒト生物は少なくとも1コピーのこのような核酸を含み、前記核酸は、望ましいタンパク質:rhBSSLを産生する前記非ヒト生物によって発現可能である。例えば、組換え細菌細胞、藻類細胞、酵母細胞、または他の真核細胞が用いられてもよく、rhBSSLは、ある特定の態様では、このような組換え細胞の培養物から産生される。他の態様において、rhBSSLは、改良されたまたは特異的に選択されたヒト細胞の体外培養によって、例えば、改良されたまたは特異的に選択されたヒト細胞のインビトロ培養によって産生されてもよい。さらに他の態様では、rhBSSLは、トランスジェニック動物、例えば、トランスジェニックウシ、ヒツジ、ヤギ、またはウサギの乳からrhBSSLを単離することによって産生されてもよい。当業者であれば、組換え技術を用いてヒト胆汁酸活性化リパーゼを産生するのに利用可能な非常に多くの技術を知っているだろう。
【００４９】
組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは、大腸菌(E.coli)、マウス、およびハムスター(Hansson et al., 1993)、ならびにP.パストリス(P.pastoris)(Trimple et al., 2004; Glycobiol, 14: 265-274)細胞の培養物を含む組換え細胞培養物から産生可能であることが示されている。組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼはまた、トランスジェニックマウスの乳(Stromqvist et al., 1996; Transgen Res, 5: 475-485)およびトランスジェニックヒツジの乳(WO99/54443)から産生および単離できることも示されている。本発明のある特定の態様において、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは、このような組換え細胞の培養物またはこのようなトランスジェニック動物の乳から単離される。代わりの態様において、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは、トランスジェニックヒツジまたはトランスジェニックマウスの乳から単離されたものではない。
【００５０】
本発明の特定の態様において、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは、組換えチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株の発現産物から単離される、組換えCHO細胞株によって産生される、または組換えCHO細胞株によって発現可能である、もしくは組換えCHO細胞株から単離される。このようなリパーゼを産生する組換えCHO細胞株発現系を使用すると、特定の構造特徴、活性特徴、または他の特徴、例えば、本明細書に記載の特徴の1つまたは複数を示すrhBSSLを産生することができる。非限定的な例として、本発明において有用なrhBSSLは、本明細書の例示に類似する、もしくは本明細書の例示において実質的に説明されるプロセスを用いて単離されてもよく、および/または本明細書の例示に類似する、もしくは本明細書の例示において実質的に説明される特徴を示してもよい。
【００５１】
本発明のある特定の態様において、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは、例えば、国際一般名(INN)体系(stem)「ブセリパーゼ」(WHO Drug Information, 21: 62, 2007を参照されたい)によって特定される。なぜなら、ヒト胆汁酸活性化リパーゼのアミノ酸配列がこの中に示されているからである。組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは本発明において使用される時、SEQ ID.NO.1を参照して、位置Cys64-Cys80およびCys246-Cys257において1つまたは複数のジスルフィド架橋を有してもよい、および/またはAsn-187、Thr-538、Thr-549、Thr-559、Thr-576、Thr-587、Thr-598、Thr-609、Thr-620、Thr-631、およびThr-642における可能性のあるグリコシル化部位の1つまたは複数においてグリコシル化される(1つのこのような態様では、図1.1に模式的に示した)。ある特定のこのような態様において、rhBSSLはグリコフォームであり、例えば、「ブセリパーゼアルファ」のINNを有してもよい。
【００５２】
本発明の他の特定の態様において、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは、天然のヒト胆汁酸活性化リパーゼ(BSSL-MAM)の構造特性、組成特性、および/もしくは他の特性とは異なる、ならびに/または、例えば、WO99/54443に記載のようなトランスジェニックヒツジの乳からの単離によって産生された形態の組換え胆汁酸活性化リパーゼ(rhBSSL-OVI)とは異なる構造特性、組成物特性、および/もしくは他の特性を有する。
【００５３】
従って、ある特定のこのような態様において、本発明に有用な組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは他の乳タンパク質も乳成分も(実質的に)含まない。本発明の開示の際に明らかなように、ある特定の態様において、rhBSSLはヒト乳児に投与される前に、乳をベースとする乳児用食品に添加される。従って、このような態様において、「他の乳タンパク質も乳成分も含まない」は、前記乳をベースとする乳児食品に前記リパーゼを添加するすぐ前(例えば、直前)に存在する組換え胆汁酸活性化リパーゼの形態、組成物、または製剤に適用される。例えば、このような態様において、rhBSSLを含有する本発明の薬学的組成物もしくはキット成分、または任意の乳児用調合乳および/もしくは低温殺菌母乳への添加の準備ができて提供される前記の量のrhBSSLは、このような乳をベースとする夾雑物を含まない。ある特定のこのような態様において、rhBSSLは、乳カゼインおよび乳清タンパク質、例えば、ラクトフェリンを含まない、または乳に固有の他の夾雑物を含まず、特に、このような乳由来タンパク質もしくは他の夾雑物がヒト、ヒツジ、もしくはマウスの乳に由来する場合に、乳カゼインおよび乳清タンパク質、例えば、ラクトフェリンを含まない、または乳に固有の他の夾雑物を含まない。これらの態様において、特定のこのようなタンパク質または夾雑物を「含まない」とは、日常的な検出法によって、物質的な量のこのようなタンパク質または他の夾雑物を検出できないことを意味する。または、このような特定の不純物は約5％未満、例えば、約2％、1％、0.5％、もしくは0.1％未満のレベルで存在してもよい、または本質的にもしくは有効に存在しない。または、全種類のこのような乳由来タンパク質または他の夾雑物の全てが、約5％未満、例えば、約2％、1％、0.5％、もしくは0.1％未満のレベルで存在する、または本質的にもしくは有効に存在しない。当業者により理解されるように、細胞培養物、例えば、組換えCHO細胞から産生および単離された組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは、このような乳をベースとする夾雑物を「含まない」とみなされるだろう。
【００５４】
本発明の他のある特定のこのような態様において、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは、約70％を上回る純度、約80％、90％、または95％を上回る純度を有する。特定のこのような態様において、このようなパーセント純度は総タンパク質に対するパーセント純度である。前記のように、適用可能な態様において、このような純度の尺度は、乳児用食品または他の投与媒体に添加する前の前記リパーゼを含む組成物の純度である。このような純度値は、RP-HPLC、SE-HPLC、またはSDS-PAGE(とSyproRubyまたは銀染色)法を用いて決定することができる。
【００５５】
本発明の他の態様において、特に、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼが組換えCHO細胞を用いて産生されるのであれば(組換えCHO細胞から発現されるのであれば)、rhBSSLは本発明において使用される時に、1つまたは複数の構造特性、活性特性、または他の特性、例えば、以下に記載の特性によって特徴付けることができる。
【００５６】
本発明のさらなるある特定のこのような態様において、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは、天然のヒト胆汁酸活性化リパーゼ(BSSL-MAM)のグリコシル化レベルより低いグリコシル化レベル(全体/総)を有する、および/またはトランスジェニックヒツジの乳から単離された組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼ(rhBSSL-OVI)のグリコシル化レベルより高いグリコシル化レベル(全体/総)を有する。BSSL(またはその試料)のグリコシル化レベル、例えば、単糖含含有率レベルおよび/またはシアル酸含有率レベルは、高pH陰イオン交換クロマトグラフィーとパルスアンペロメトリック検出(HPAEC-PAD)を用いて測定することができる。本発明の特定の態様において、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼの総単糖含有率(モル単糖/モルrhBSSL)は、約20〜100、約25〜65、または約25〜55、例えば、約40〜45モル/(モルrhBSSL)である。本発明のある特定の態様において、rhBSSLの総シアル酸含有率(シアル酸モル/rhBSSLモル)は、約20〜35、例えば、約25〜30モル/(rhBSSLモル)である。
【００５７】
本発明のさらに他のある特定のこのような態様において、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは、BSSL-MAMとは異なる、および/またはrhBSSL-OVIとは異なるグリコシル化パターン、例えば、O-グリカンのグリコシル化パターンを有する。このような差違は、キャピラリー電気泳動とレーザー誘起蛍光検出(CE-LIF)および/またはHPAEC-PADを用いて検出することができる。本発明の特定の態様において、rhBSSLは、約20〜50モルのN-アセチルノイラミン酸(NANA=Neu5Ac)/モルrhBSSL[モル/(モルrhBSSL)]、例えば、約25〜40モル/(モルrhBSSL)を有してもよい。本発明において用いられるrhBSSLは、約5モル未満のN-グリコシルノイラミン酸(NGNA=Neu5Gc)/モルrhBSSL、例えば、約2モル未満/(モルrhBSSL)を有してもよい、またはNGNAは本質的に検出不可能である。本発明において用いられるrhBSSLは、約20モル未満のフコース/モルrhBSSL、例えば、約10未満、約5未満、または約2モル未満/(モルrhBSSL)を有してもよく、ある特定の態様において、フコースは本質的に検出不可能である。本発明において用いられるrhBSSLは、約5〜25モルのガラクトサミン/モルrhBSSL、例えば、約10〜20または約15〜18モル/(モルrhBSSL)を有してもよい。本発明において用いられるrhBSSLは、約10モル未満のグルコサミン/モルrhBSSL、例えば、約5未満、約3未満、または約2モル未満/(モルrhBSSL)を有してもよい。本発明において用いられるrhBSSLは、約5〜25モルのガラクトース/モルrhBSSL、例えば、約10〜20または約15〜18モル/(モルrhBSSL)を有してもよい。本発明において用いられるrhBSSLは、約5モル未満のグルコース/モルrhBSSL、例えば、約2モル未満/(モルrhBSSL)を有してもよい、またはグルコースは本質的に検出不可能である。本発明において用いられるrhBSSLは、約2〜8モルのマンノース/モルrhBSSL、例えば、約4〜6モル/(モルrhBSSL)を有してもよい。本発明の特定の態様において、rhBSSLは、表1.1に示されるような、または表1.1に実質的に示されるような単糖(monosaccaride)含有率および/またはシアル酸含有率のプロファイルを有してもよい。
【００５８】
本発明の他の態様において、本発明に有用な組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは、レクチン結合試験またはルイス抗原結合試験のプロファイルまたは量、例えば、それぞれ、Blackberg et al (1995)に記載のアッセイおよびプロファイルならびにLandberg et al(1997)に記載のアッセイおよびプロファイルの点でBSSL-MAMおよびrhBSSL-OVIと異なる。このようなレクチン結合試験またはルイス抗原結合試験は、これらの異なる形態のBSSL間のグリコシル化パターンの差を示すことができる。本発明に有用な組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを同定および/または特徴付けるために、他の技法を使用することができる。例えば、rhBSSLは、エンドプロテアーゼLys-C消化の後に、逆相HPLCと定量UV検出(214nm)による、結果として生じたペプチドの解析、および結果として生じたクロマトグラムの記録/検査によって特徴付けることができる(ならびに/またはBSSL-MAMもしくはrhBSSL-OVIと区別することができる)。結果として生じたクロマトグラムの差は、保持時間に特定の差がある、rhBSSLを含む特定のペプチドのグリコシル化の独特の特徴によるものでもよく、従って、rhBSSLを含む特定のペプチドのグリコシル化の独特の特徴をさらに反映してもよい。
【００５９】
本発明のなおさらなるこのような態様において、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは90KDa〜75KDaの分子量を有する。特定のこのような態様において、前記リパーゼの分子量は約84〜86KDa、例えば、約85KDaである。分子量は、MALDI-MSを含む日常的な技法によって決定することができる。比較として、同じ検出法を用いて、BSSL-MAMの分子量はかなり大きい分子量(例えば、約100KDa)として測定され、rhBSSL-OVIの分子量はかなり小さい分子量(例えば、約78KDa)として測定される。
【００６０】
本発明の他のさらなるこのような態様において、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは、異なるアミノ酸長の配列を有する組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼ分子の集団を含んでもよい。このような態様のいくつかでは、最も長い(または予測された)完全長型(例えば、SEQ ID.NO.1によって示された分子)と比較してC末端において1アミノ酸短い、2アミノ酸短い、3アミノ酸短い、4アミノ酸短い、5アミノ酸短い、または10アミノ酸まで短い形態で存在するリパーゼ分子の量は、このような最も長いまたは(予測された)完全長型で存在するリパーゼ分子の量の50％より多い。ある特定のこのような態様において、短いリパーゼ分子、例えば、C末端から1アミノ酸または2アミノ酸短いリパーゼ分子として存在する量は、最も長い(または予測された完全長)リパーゼ分子の量の約100％〜500％である。特定のこのような態様において、短いリパーゼ分子、例えば、C末端から1アミノ酸または2アミノ酸短いリパーゼ分子として存在する量は、最も長い(または予測された完全長)分子(例えば、例えば、SEQ ID.NO.1によって示された分子)の量の200％〜400％、例えば、約300％である。特定の態様において、または前述において、2アミノ酸短いリパーゼ分子として、最も長い(または予測された完全長)前記リパーゼ分子の量の1％未満が存在する。他の態様において、このような最も長い(または予測された)分子よりC末端から1アミノ酸短い、2アミノ酸短い、3アミノ酸短い、4アミノ酸短い、5アミノ酸短い、または10アミノ酸まで短い形で、最も長い(または予測された)前記リパーゼ分子の数の2〜5倍、約3倍が存在する。
【００６１】
本発明のさらに他のさらなるこのような態様において、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは、ヒト乳から単離されるBSSLおよび/またはrhBSSL-OVIより大きな比活性を有してもよい。例えば、rhBSSLの比活性は、(質量に基づいて)BSSL-MAMおよび/またはrhBSSL-OVIの比活性より約15％〜35％高い比活性でもよく、例えば、約20％または25％高い比活性でもよい。ヒトBSSLの比活性を測定する技法は当業者に公知であり、本明細書の例示に概説されたように4-ニトロフェニルエステル酪酸(PNPB)アッセイの使用を含む。BSSLの他のインビトロアッセイは、例えば、BSSL基質としてアラビアゴムで乳化したトリオレオイルグリセロールおよび活性化胆汁酸塩としてコール酸ナトリウム(10mM)の使用によって知られている(例えば、Blackberg and Hernell, 1981; Eur J Biochem, 116: 221-225に記載)。特定の態様において、比活性を測定する前に、BSSLは、例えば、ヘパリンアフィニティクロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーの技法を用いて高純度まで精製されてもよい。
【００６２】
当業者に理解されるように、本発明において使用される組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは、本明細書において説明または定義される複数の特徴、例えば、前記の特徴によって特徴付けることができる。例えば、このような特徴の2つ以上(例えば、3、4、5以上)の組み合わせが一緒になって、本発明において使用するための組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼの特定の態様を特徴付けることができる。
【００６３】
本発明において、ヒト乳児に経腸投与される組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼの量は異なってもよい。ある特定の態様において、前記リパーゼの量は、有効量、例えば、前記リパーゼが本発明に従って乳児に投与された時に乳児の発育速度を増大させるのに効果的な量である。所定の日数で乳児に投与され得る組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼの適切な量は、1日当たり1〜100mgの前記リパーゼ/Kg乳児体重の量でもよい。特定の態様において、1日に5〜50mgの前記リパーゼ/Kg乳児体重または15〜40mgの前記リパーゼ/Kg乳児体重が投与されてもよく、例えば、1日当たり約22.5〜27mgの前記リパーゼ/Kg乳児体重が投与されてもよい。非限定的な例として、25mg/Kg/日で投与される1.5Kgの乳児には、1日当たり合計約37.5mgの組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼが投与されてもよい。本発明のある特定の態様において、本明細書において使用または言及されるrhBSSLの質量は絶対質量として与えられるのではなく、活性rhBSSL分子の質量として与えられる。rhBSSLの異なる生産バッチまたは保管バッチは酵素活性が異なる場合があるので、このような活性変化を補うために、従って、より均一な量の活性rhBSSLを提供するために、投与されるrhBSSLの絶対質量を変えてもよい。標準的な活性BSSL分子に関して、本明細書に記載のようにPNPBアッセイを用いて、rhBSSLの活性を容易に求めることができる。活性rhBSSLの適切な質量は、前記で示された質量の範囲内である。rhBSSLなどの複合タンパク質の分子量は、例えば、グリコシル化の差のために異なる場合があるので、前記リパーゼの量は、質量以外のやり方で、例えば、(活性)モル量で定義されることがある。当業者であれば、特定のmg量から対応するマイクロモル量への他の変換を容易に行うことができるだろう。または、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼの量は、例えば、BSSL活性のインビトロアッセイ、例えば、本明細書に記載のインビトロアッセイにおいて求められるように、リパーゼ活性、酵素単位(U)で表され、例えば、アッセイの条件下で1分につき1マイクロモルの生成物の形成を触媒する前記リパーゼの量として定義されてもよい。
【００６４】
当業者に理解されるように、典型的に(例えば、グルコース点滴の場合を除き)、ヒト乳児には、脂肪供給源、例えば、トリグリセリドを含有する栄養成分(nutritional base)が定期的に与えられる。乳児には、経口により、または経管栄養を介して栄養成分が与えられてもよい。栄養成分(食品または食物)は、一般的に、乳児用調合乳またはヒト母乳である。従って、本発明のある特定の態様において、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは、脂肪供給源、例えば、トリグリセリドを含有する栄養成分が与えられているヒト乳児に投与される。特定のこのような態様において、前記栄養成分は乳児用調合乳および/または低温殺菌母乳であり、両方とも、かなりの割合の脂肪をトリグリセリドの形で含有することが当業者に知られている。本発明の様々なこのような態様において、rhBSSLの経腸投与は、前記乳児に栄養成分が与えられる前、前記乳児に栄養成分が与えられた後、または前記乳児に栄養成分が与えられるのと同時でもよい。栄養成分が与えられる前または栄養成分が与えられた後に投与されるのであれば、rhBSSLは、前記乳児に栄養成分が与えられて約1時間以内、例えば、前記乳児に栄養成分が与えられて約30分以内、15分以内、もしくは5分以内、または約2分より短い期間内で投与されてもよい。栄養成分を与える間の期間がrhBSSL投与の約1分以内であれば、これは、事実上、脂肪を含有する栄養成分(例えば、乳児用調合乳および/または低温殺菌母乳)が前記乳児に与えられるのと同時にrhBSSLが投与されるとみなすことができる。このような同時発生(または同時)投与は、rhBSSLが最初に乳児用調合乳または母乳に添加され、次いで、乳児用調合乳または母乳がヒト乳児に与えられた場合に起こるだろう。
【００６５】
一般に知られているように、乳児の母親からの新鮮な母乳で完全母乳栄養することが好ましい。しかしながら、様々な理由で、他の母親からの低温殺菌母乳、例えば、母乳バンクからの低温殺菌母乳が乳児に与えられることがある。または、よくあるように、乳児には、(新鮮でない)母乳の代わりに、または(新鮮でない)母乳に加えて乳児用調合乳が与えられることがある。ヒト乳児を母乳栄養しないこと(母乳栄養をやめてしまうこと)が広く行き渡っていることは本明細書の他の場所に記載されている。ヒト乳児に新鮮な母乳が与えられないことは、これらの代替の1つを除いて、1つまたは複数の原因による場合がある。例えば、(i)既往乳房手術またはプロラクチンの欠乏などの健康上の理由のために母親から十分な母乳が出ない場合がある;(ii)母親が乳腺炎、湿疹、または乳管の詰まり(plugged milk duct)に罹患しているために、授乳に痛みが伴うことがある;(iii)口唇裂または口蓋裂など乳児の口に障害がある場合がある;(iv)例えば、文化または利便性の理由で母親に母乳栄養の十分な知識がなく、母乳が新鮮な母乳を与えないことにする場合がある;あるいは(v)感染性因子、例えば、HIVウイルス、CMVウイルス、Tリンパ球向性ウイルス、または結核菌の伝播を含む母乳の潜在的に有害な成分から乳児を守るために、危険な薬物療法または薬物(もしくはその代謝産物)、例えば、違法薬物の使用、レトロウイルス薬物療法もしくは化学療法薬物療法から乳児を守るために、あるいは母親が放射線療法を受けている場合に乳児を守るために、新鮮な母乳を与えないように母親が勧められる場合がある。最後に、乳児が虚弱すぎて乳房から母乳を飲めないことがある。このことは早産児または低体重乳児に特有の問題になり得る。
【００６６】
従って、本発明のある特定の態様において、ヒト乳児は新鮮な母乳で完全母乳栄養されない。例えば、乳児は、例えば、完全母乳栄養によって、または新鮮な搾母乳を与えることによって母親からの新鮮な乳で完全母乳栄養されない。完全母乳栄養されていない乳児、または母親からの(新鮮な)搾母乳で完全母乳栄養されていない乳児には、他の供給源からの乳、例えば、乳児用調合乳または母乳バンクからの低温殺菌母乳および/もしくは(前もって)冷凍された母乳が与えられるだろう。本発明の特定の態様において、乳児には新鮮な母乳が与えられず、例えば、乳児は、乳児用調合乳、低温殺菌母乳および/または冷凍母乳、例えば、母乳バンクの低温殺菌母乳および/または冷凍母乳で完全母乳栄養される。これは、出生してすぐに行われてもよく、すなわち、ヒト乳児には母親の新鮮な母乳が全く与えられない。または、これは、出生後、早い時期に、例えば、生後1日目以内、2日目以内、3日目以内、4日目以内、5日目以内、または6日目以内に行われてもよい。他の態様において、生後約1週間以内、2週間以内、もしくは3週間以内に、または生後約1ヶ月以内、2ヶ月以内、3ヶ月以内、もしくは6ヶ月以内までにヒト乳児に新鮮な母乳を与えるのをやめてもよい。
【００６７】
組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは、経口投与を含む様々な手段によって本発明に従って経腸投与されてもよい。例えば、投与は、リパーゼのパスタ剤、シロップ剤、舐剤、ボーラス、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、懸濁液、溶液または他の液体形態を用いて行われてもよい。経口投与はリパーゼの頬投与および舌下投与を含んでもよい。他の形態の経腸投与は、リパーゼを胃腸管に直接投与する方法、例えば、胃栄養管もしくは胃瘻管を用いて胃に直接投与する方法、または十二指腸栄養管を用いて小腸に配置される方法を含んでもよい。特に小さな乳児、早産児、または虚弱乳児の場合、本発明に従って組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを投与するために、このような管をベースとする投与形態は現実的であり得る、または必要であり得る。
【００６８】
特定の経腸投与法に応じて、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼの投与に用いられる製剤は異なってもよい。rhBSSLを経腸投与するための液体剤形には、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ剤、およびエリキシル剤が含まれる。rhBSSLに加えて、液体剤形は、当技術分野において一般的に用いられる不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、ならびにその混合物を含有してもよい。不活性希釈剤に加えて、経腸投与するための組成物は、添加物、例えば、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、増量剤および安定剤を含んでもよい。本発明の活性阻害剤に加えて、懸濁液は懸濁剤を含有してもよい。
【００６９】
特定の状況のためにヒト乳児に経腸投与するための最も適切な手段および製剤は異なってもよいが、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを投与する特に適切な手段は、前記ヒト乳児への定期的な授乳の一部として経口によりまたは経管栄養によって前記リパーゼを投与することである。従って、本発明の特定の態様において、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは、最初に、乳児用調合乳または新鮮でない(例えば、[前もって]低温殺菌された)母乳に添加され、次いで、これらが前記乳児に与えられる。この改良された乳児用調合乳または改良された新鮮でない母乳を乳児に与えることによって、前記リパーゼが経腸投与される。この投与手段は、乳をベースとする食品に含まれる脂質が(同時)投与されたrhBSSLと同じ時間および胃腸管内の位置に存在することを提供するので特に関連している。本発明のある特定の態様において、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは、例えば、前記乳児に与えられる前に最初に調合乳に添加されることによって乳児用調合乳と(同時)投与される。乳児用調合乳は、本明細書の他の場所に開示された組成物に類似した、または実質的に似ている組成物を有してもよい。
【００７０】
当業者に理解されるように、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼの添加によって改良された乳児用調合乳または(前もって)低温殺菌された母乳は、一般的に、自然の乳頭をまねた、従って、より効果的な授乳を提供する適切な乳首または乳頭が備わっている哺乳瓶を用いて前記乳児に与えられる。または、改良された乳児用調合乳または改良された新鮮でない母乳は他の手段を用いて与えられてもよく、例えば、乳児の口に奇形がある場合に必要とされ得るように、点滴注入器、注射器、スプーン、または浸漬された布を用いて与えられてもよい。超低出生体重児、早産児、または虚弱乳児などの、ある特定の態様において、授乳は、胃管、胃瘻管、または十二指腸管を介して胃腸管に直接なされてもよい。
【００７１】
本発明のある特定の態様において、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼが低温殺菌母乳に添加された、新鮮でない母乳である。他の態様において、母乳は冷凍されており、例えば、低温殺菌後に冷凍されている。特定の態様において、本発明において使用される母乳は母乳バンクに由来する。母乳バンクは、寄付されたヒト乳を収集し、乳の安全性および品質の徹底を図り、必要としている乳児に利用可能にする全国組織であるナショナルミルクバンク(National Milk Bank)(NMB)、または北米における母乳バンクの設立および運営のための標準を設けるために、ならびにその設立および運営を容易にするために1985年に設立されたドナーヒト母乳バンクの非営利団体であるヒューマンミルクアソシエーションオブノースアメリカ(Human Milk Banking Association of North America)(HMBANA)を含んでもよい。
【００７２】
当業者により理解されるように、本発明において使用される母乳はヒト母乳であることが特に適している。しかしながら、代わりの態様において、特に後期乳児の場合、母乳は、大型家畜、例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、またはウマから得られる。このような態様は、ヒト乳または乳児用調合乳が常に与えられるとは限らないが、このような動物から得られた乳をヒト乳児に(少なくとも部分的に)与えることがある、ある特定の文化または国で実施することができる。このような乳は低温殺菌されているかどうかに関係なく、ヒト乳児におけるリパーゼ消化を助ける十分な動物BSSLを含んでいない場合があり、間違いなくヒトBSSLを含有しないだろう。従って、母乳が本発明のこのような態様において用いられる時、新鮮な動物母乳、すなわち、加熱処理および/または冷凍されていない乳を含んでもよい。
【００７３】
本発明のさらに別の代わりの態様において、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは乳児用調合乳に添加される。当業者であれば、多くの市販の乳児用調合乳を知っているだろう。市販の乳児用調合乳には、Enfamil(商標)、Pregestimil(商標)、Nutramigen(商標)、およびNutramigen AA(商標)(全てMead Johnsonにより販売または製造されている);Similac(商標)、Isomil(商標)、Alimentum(商標)、およびEleCare(商標)(全てAbbott Laboratories, Ross部門により販売または製造されている);Nestle:12％、世界で最大の調合乳製造業者はGoodStart(商標)を製造している(Nestle/Gerber Products Companyにより販売または製造されている);Farexl(商標)およびFarex2(商標)(Wockhardt Nutritionにより販売または製造されている)が含まれる。早産児の場合、Similac Neosure、Entramil Premature、Similac Special Care、Cow & Gate Nutriprem 2、およびEntramil Enfacareなどの他の乳児用調合乳も入手可能である。rhBSSLなどのリパーゼの基質である脂質源を含有することが全ての乳児用調合乳に共通する。特定の態様において、乳児用調合乳は、証拠物件Aに示した仕様書、もしくはESPGHANがコーディネートした国際専門家グループ(ESPGHAN Coordinated International Expert Group)により推奨される仕様書(Koletzko et al., 2005; J Ped Gastro Nutr 41: 584-599)におおむね準拠する、または実質的に、証拠物件Aに示した仕様書、もしくはESPGHANがコーディネートした国際専門家グループ(ESPGHAN Coordinated International Expert Group)により推奨される仕様書(Koletzko et al., 2005; J Ped Gastro Nutr 41: 584-599)として組成(rhBSSL添加前)を有する。ある特定の態様において、乳児用調合乳は、証拠物件Bに示した成分の1つまたは複数を、ほぼ、証拠物件Bに示したレベルで含有する。特に有利な態様では、乳児用調合乳は、(総脂肪に対して)少なくとも0.5％のDHAおよび/またはAAを含有し、さらなるこのような態様では、AAの濃度は、少なくともDHAの濃度に達しなければならない、および/またはエイコサペンタエノン酸(eicosapentaenonic acid)(C20:5 n-3)が添加されるのであれば、その濃度はDHAの含有率を超えない。
【００７４】
利便性、安全性、および効率的な配布などの特定の理由のために、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは、ある特定の場所(例えば、母乳バンク)において多量の(新鮮でない)母乳に添加され、次いで、保管および/または乳児に配布されてもよい。同様に、rhBSSLは、例えば、乳児用調合乳の製造業者によって、ある特定の場所において多量の乳児用調合乳に添加され、次いで、包装され、ヒト乳児の親または介護者に(例えば、販売することによって)配布されてもよい。この特定の態様は、改良された調合乳(rhBSSLを含む)を乾燥粉末として保管および配送できる時に特に有用である。または、および特に、乳児に特有の用量が望ましいのであれば、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは、授乳の直前に、かつこのような授乳に十分な量で、またはこの特定の乳児に特有の比および量で乳児用調合乳または母乳に添加されてもよい。例えば、適量のrhBSSLが、授乳サイズの分量の新鮮でない母乳または乳児用調合乳に添加されてもよい。
【００７５】
本発明のための乳児食品中の組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼの量と他の成分の量の適切な比があり、前記リパーゼは、乳児用調合乳または(前もって)低温殺菌および/もしくは冷凍された母乳に約0.03〜0.5g/L調合乳または母乳の最終濃度まで添加される。例えば、前記リパーゼは、乳児用調合乳または新鮮でない母乳に約0.05〜0.3g/L調合乳または母乳の最終濃度まで添加されてもよい。特定の態様において、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは、約0.1〜0.2g/L調合乳または母乳、例えば、約0.15g/L調合乳または母乳の最終濃度まで添加される。ある特定の前記態様の説明から理解されるように、所定の濃度の活性rhBSSLを提供するように適切な(絶対)濃度が合わせられてもよく(適切な量は、前記で示された範囲内にある)、および/またはこのような濃度は、(活性)モル(またはマイクロモル)量のrhBSSL/乳の単位体積、例えば、前記乳中にある結果として生じたモル濃度(M)のrhBSSL、または酵素活性(U)/乳の単位体積(例えば、U/mL)で表されてもよい。本発明の特定の態様において、rhBSSLは、約15〜300単位、約50〜150単位rhBSSL/mL乳児用調合乳または乳(U/mL)、約80〜90U/mLまたは約87U/mLの乳児用調合乳または乳として投与される。
【００７６】
本発明の特定の態様において、ヒト乳児はヒト低体重児である。ヒト乳児は出生時に低体重でもよく、例えば、体重が2,500g未満で生まれた低出生体重(LBW)児、体重が1,500g未満で生まれた極低出生体重(VLBW)児、または1000g未満で生まれた超低出生体重(ELBW)児でもよい。または、低体重乳児は、少ない出生質量(birth mass)(所定の在胎齢の平均出生時体重より少ない質量)を有することがある、または胎内発育遅延(SGA)である(質量が、所定の在胎齢の出生時体重の第10百分位数より少ない)。または、乳児は、成長障害(FTT)の乳児など、典型的な速度で成長していない時に低体重になることがある。
【００７７】
乳児が低体重になると考えられる様々な原因および低体重になる乳児が増えていることは本明細書の他の場所に記載される。特に、乳児は、早産で生まれたために低体重になることが多い。全ての早産児が低体重になるとは限らないが、早産児は膵機能および肝機能が完全に発達しておらず、多くの場合、正期産児と同じくらいよく育たないことがある。従って、本発明の別の特定の態様において、前記ヒト乳児はヒト早産児、すなわち、約40週間の正常妊娠期間の前に生まれた乳児であるか、または、特に、妊娠約第37週前に生まれた乳児である。ある特定のこのような態様において、前記ヒト早産児は、妊娠約37週〜約32週に生まれた乳児である。特定のこのような態様において、前記ヒト早産児は、妊娠約32〜25週に生まれた乳児または妊娠約25〜22週に生まれた乳児である。他の特定のこのような態様において、前記早産児は、約第37週前に生まれたが、妊娠約21週後、妊娠22週後、または妊娠23週後に生まれた乳児である。
【００７８】
当業者により理解されるように、在胎齢は、一般的に、母親の最終月経期(LMP)の初日から数え始めることによって計算されるが、インビトロ受精などのある特定の状況では、在胎齢は、受精齢(fertilization age)、胚齢(embryonic age)、受胎齢(conceptional age)、または子宮内発育(intrauterine developmental)(IUD)齢として知られる方法を用いて受胎日から計算することができる。この方法により、乳児は、妊娠が一般的なLMP法によって計算された場合より約2週間若いように見える。
【００７９】
本発明の特定の態様において、前記ヒト乳児は産後0〜200日である。例えば、最初の組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼの投与は、出生日に、または生後1日以内、2日以内、3日以内、4日以内、5日以内、もしくは6日以内に、または生後約6ヶ月まで行われてもよい。ある特定のこのような態様において、本発明による最初の組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼ投与の際に、前記ヒト乳児は、産後4週未満、例えば、約3週未満、2週未満、または1週未満である。他のこのような態様において、本発明による最初の組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼ投与の際に、前記ヒト乳児は約1〜2ヶ月であるか、または約2〜4ヶ月、例えば、約5ヶ月である。
【００８０】
本発明のある特定の態様において、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは最初に投与されたら、複数日にわたって少なくとも1日1回(例えば、少なくとも1回の授乳と共に)投与される。例えば、rhBSSLは、少なくとも約4日続く期間にわたって、本発明に従って少なくとも1日1回投与されてもよい。ある特定のこのような態様において、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは、少なくとも約5日間、例えば、少なくとも約7日続く期間にわたって少なくとも1日1回(例えば、少なくとも1回の授乳と共に)投与される。特定のこのような態様において、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは、所定の日において前記乳児に与えられるほとんどの授乳と共に(またはその一部として)、例えば、1日約4回または12回の授乳、例えば、1日約4〜10回の授乳、例えば、1日約6回、7回、または8回の授乳において投与される。別の非限定的な態様では、時として、乳児は、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼの(同時)投与なく、(例えば、1日1回、2回、または3回)授乳されることがある。このような代わりの態様において、授乳が前記乳児に与えられるごとに、乳児に組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼが(同時)投与される。すなわち、1日全ての授乳のために乳児にrhBSSLが投与される。
【００８１】
ある特定の態様において、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼの投与レジメンは少なくとも約1週間または2週間の期間にわたって続く。特定のこのような態様において、この期間は、少なくとも約3週間、例えば、少なくとも約4週間である。本発明の代わりの態様において、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは、例えば、医学療法の過程の一部として、ヒト乳児が集中治療室から移されるまで、病院から退院するまで、医療の下もしくは監督下ではなくなるまで、または前記乳児が医学的に許容される体重になるまで投与される。
【００８２】
当業者により理解されるように、発育速度の増大または他の点では発育速度の改善もしくは強化を調査、モニタリング、追跡、および/またはチェックするために、任意の一般的な方法または許容される方法によってヒト乳児の発育をモニタリングすることができる。例えば、ヒト乳児の発育速度は、本発明の目的では、頭囲、身体質量(体重)、身長または脚長(例えば、膝から踵までの長さ)を定期的に(例えば、毎日)測定および記録することによってモニタリングされるか、またはモニタリングされてもよい。ヒト乳児の大きさおよび/または発育を測定する他の方法は一般に知られている。このような定期的な測定は発育速度、すなわち、単位期間での(例えば、1日当たりの)発育量に容易に変換することができる。本発明のある特定の態様において、ヒト乳児の発育速度の前記増大は、グラム/日として表される発育速度、グラム/Kg体重/日として表される発育速度(g/Kg/日)、グラム/日/100Kcalの消費エネルギー(g/日/100kcal)として表される発育速度、またはグラム/日/100mLの摂取される乳/調合乳(g/日/100mL)として表される発育速度などの前記乳児の体重増加速度の増大であるか、または前記乳児の体重増加速度の増大として測定される(もしくは他のやり方でモニタリングされる)。身体質量(体重)の測定は、乳児の発育をモニタリングする特に便利な方法である。発育速度を表すこのような2番目の方法(g/Kg/日)は、典型的には、大きな乳児の体重が同じ期間に小さな乳児より大きな絶対量分だけ増加するので、異なる大きさの乳児の絶対発育速度を標準化しようとする時に特に有用である。従って、ある特定のこのような態様において、rhBSSLが投与された時、前記ヒト乳児によって達成される、前記ヒト乳児において観察される、または前記ヒト乳児から望まれる体重増加速度は、約10〜30gの体重増加/Kg前記乳児の体重/日(g/Kg/日)である。特定のこのような態様において、このような体重増加速度は、約15〜25g/Kg/日、例えば、約20g/Kg/日、または約18g/Kg/日である。
【００８３】
本発明の他の態様において、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼが投与されたヒト乳児における発育速度の増大は、rhBSSLが投与されていないヒト乳児より1g/Kg/日〜8g/Kg/日多い、例えば、約2g/Kg/日、3g/Kg/日、4g/Kg/日、または5g/Kg/日多い体重増加である。本発明の代わりの態様において、発育速度の増大は、rhBSSLが投与されていないヒト乳児の発育速度の値より約5％〜40％大きな体重増加、例えば、約20％大きな体重増加を含めて、約10％〜30％大きな体重増加または15％〜25％大きな体重増加である。
【００８４】
理解されるように、ヒト乳児の体重は、rhBSSL投与に関連しない理由を含めて様々な理由で日々変化することがある。従って、1日当たりの量(または相対またはパーセント)として本明細書において述べられた発育速度は、日々または毎日、前記ヒト乳児によって達成されなくてもよく、前記ヒト乳児において観察されなくてもよく、または前記ヒト乳児から望まれなくてもよく、複数日にわたって、例えば、3日、5日、もしくは7日にわたって、またはさらに長期間、例えば、2週間、3週間、もしくは4週間、または、例えば、乳児にrhBSSLが投与されている期間にわたって、もしくは乳児が医療、例えば、NICU内で医療を受けている期間にわたって測定および評価される場合にしか、このように達成されない、観察されない、または望まれないことがある。
【００８５】
本発明の他の態様において、発育増大は、脚の長さの増加として測定される(または他のやり方でモニタリングされる)。例えば、膝から踵までの長さの増加は、単位期間、例えば、1週間での発育mmとして表すことができる。本発明のさらに別の態様において、ヒト乳児の発育速度は、ヒト乳児自身の大きさを基準にして、例えば、WHOの子供の発育および栄養不良に関する世界データベース(Global Database on Child Growth and Malnutrition of the WHO)を参照して乳児発育をモニタリングすることができる、乳児の体重身長パーセント(W/H％)または標準偏差(SD)スコア(Zスコアとも知られる)を用いてモニタリングされる。
【００８６】
本明細書の他の場所に記載のように、本発明者らは、2つの対照臨床試験およびこれらの2つの試験からの複合データの解析により例示されるように、本発明が組換え胆汁酸活性化リパーゼが投与されたヒト乳児の発育速度を増大させたことを観察したのに対して、全CFA(脂肪吸収率)により測定されるような脂肪酸の全吸収率(すなわち、全てのまたは最も豊富な脂肪酸の吸収率)の限られた増加しか観察しなかった。以下の例示に詳述するように、パー・プロトコルデータセット(PP)の乳児は、rhBSSLの投与の際にプラセボと比較して統計的に有意な発育速度の増大を示したが(2.08g/Kg/日のLS平均差;p=0.019)、顕著かつ有意な全CFA増加を示さなかった(3.56％のLS平均差;p=0.069)。(PPデータセットにおける)プラセボのLS平均効果と比較した効果の相対(％)増加に関して、rhBSSL投与は発育速度を13.8％増大させたが(15.06g/Kg/日と比較して17.15g/Kg/日)、全CFAを5.4％しか増加させなかった(65.50％CFAと比較して69.06％CFA)。このような観察は、乳児用調合乳が与えられた乳児のサブセット(PP)において顕著であり、プラセボと比較してrhBSSL投与の際に高く、かつ統計的に有意な発育速度の増大を示したが(2.30g/Kg/日のLS平均差;p=0.038)、全CFA増加は同時に生じなかった(有意でなかった)(2.08％のLS平均差;p=0.462)。プラセボのLS平均効果と比較した、調合乳が与えられた乳児へのrhBSSL投与の際の相対(％)増加は発育速度を14.9％増大させたが(15.45g/Kg/日と比較して17.75g/Kg/日)、全CFAを3.1％しか増加させなかった(67.38％CFAと比較して69.46％CFA)。
【００８７】
さらに、本明細書の例示にも詳述されたように、乳児一人一人の発育速度の個体内差(rhBSSL-プラセボ)と乳児一人一人の対応する全CFA差との間には相関関係はほとんどなかった(有意でなかった)(R2線形=0.041;p=0.177)。発育速度の個体内差において観察された分散が小さいことは、対応する個体の全CFA値増加の分散によって説明される(線形回帰後のANOVA)。組換え胆汁酸活性化リパーゼが投与された乳児の発育速度の増大と全CFA増加がほとんど同時に生じないことに関連した結果を調査および/または提示する解析アプローチまたは方法を含めて、他の解析アプローチまたは方法を用いて、本明細書において開示された2つの臨床試験からの結果をさらに調査および/または提示することができる。
【００８８】
発育速度を測定する方法は本明細書の他の場所に開示される。脂肪吸収は、当技術分野において公知の様々な手段によって、例えば、脂肪酸の重量分析、例えば、Anderssonおよび共同研究者ら(2007)により用いられた脂肪酸の重量分析を用いて定量された全脂肪酸の脂肪投入量と脂肪排泄量との脂肪平衡を調べることによって調査、モニタリング、または観察することができる。または、個々の脂肪酸の定量は、ガスクロマトグラフィー法、例えば、本明細書の例示に記載のガスクロマトグラフィー法を用いて行うことができる。Sidiskyおよび共同研究者ら(1996; The Reporter[Supelco/Sigma-Aldrich], 15(1): 1-4)は、重要な脂肪酸メチルエステルを分離する、従って、検出する適切なカラムの選択を助けるために様々なキャピラリーカラムの特性について説明している。脂肪吸収の程度は、以下の例示に詳述されるように、類似するもしくは関連する脂肪酸の任意の個々のサブグループの脂肪吸収率(CFA)として、または個々の脂肪酸の値を適切に合計することにより全ての/全体の脂肪酸の脂肪吸収率(CFA)として量的に表すことができる。方法のさらなる例として、ヒト乳児一人一人(またはそのグループ)について、脂肪酸吸収、例えば、DHAまたはAAの吸収の改善は、個々の脂肪酸のクロマトグラフィー(GC)分離の使用の後に同定/定量、例えば、質量分析を用いた同定/定量を行うことを含む、例えば、経時的にまたは治療中に血漿または赤血球の膜リン脂質の絶対的または相対的な脂肪酸含有率を解析すること(Carlson et al, 1996; Pediatr Res, 39: 882-888; Boehm et al, 1996; Eur J Pediatr 155: 410-416)によって調査、モニタリング、追跡、および/またはチェックすることができる。
【００８９】
本明細書において開示された臨床試験から、他の乳児発育研究(例えば、Andersson et al., 2007を参照されたい)に匹敵する発育速度の増大の平均にもかかわらず、観察された全CFA値の平均は、他の乳児CFA研究において一般的に観察されてきた全CFA値の平均より少ないこと(PPデータセットにおける全CFA平均:rhBSSLについては69.08％およびプラセボについては65.66％)にも注目すべきである(総説については、Lindquist and Hernell,2010を参照されたい)。しかしながら、乳児一人一人における全CFA値のばらつき(PPにおいてrhBSSLについては14.68％、プラセボについては16.13％、個体内差については13.19％の標準偏差)は、他の乳児CFA研究において一般的に観察された値(Williamson et al., 1978; Morgan et al., 1998; Acta Paediatr 87: 318-324; Andersson et al., 2007)におおむね一致した。BSSLは、多くの種類の脂質および 脂質様分子を加水分解することができる広域リパーゼとして知られる(総説については、Lindquist and Hernell, 2010を参照されたい)。乳児に利用可能なエネルギーの半分以上が、乳に含まれる加水分解された脂質に由来するので、最も興味を引く結果が全CFAの増加であり、発育速度の増大が(全CFAの増加に強く依存すると予想されていたので)全CFAの増加ほど興味を引くものではなかったと当業者は予想したかもしれない。
【００９０】
従って、本発明のある特定の態様において、前記ヒト乳児において達成される、観察される、または望まれる発育速度の増大は、前記乳児において、同時に生じる全脂肪吸収率(すなわち、全ての脂肪酸または最も豊富な脂肪酸の吸収率)の増加が観察および/または達成されることなく達成される、観察される、または望まれる。本発明の特定のこのような態様において、前記発育速度の増大は、全脂肪吸収率(すなわち、全ての脂肪酸または最も豊富な脂肪酸の吸収率)の増加と同時に生じない、全脂肪吸収率の増加によって示されない、および/または全脂肪吸収率の増加と相関しない。他の特定のこのような態様において、発育速度の増大は、全CFAの増加によって完全に説明できない(または全CFAの増加によって引き起こされない)。例えば、全CFAの増加は、発育速度の増大を説明することができる、例えば、エネルギー的、カロリー的、数的(例えば、パーセント増加によって)、または統計学的に説明することができる増加より少ない可能性がある。
【００９１】
本発明の他の態様において、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼが投与されたヒト乳児の全CFA(すなわち、全ての脂肪酸または最も豊富な脂肪酸のCFA)の差は、rhBSSLが投与されていないヒト乳児の絶対全CFAの増加より約5％パーセント点大きい値より少ない、例えば、約4％、3％、2％または1％パーセント点大きい値より少ない。本発明の代わりの態様において、rhBSSLが投与されたヒト乳児の全CFAの相対的増加は、rhBSSLが投与されていないヒト乳児のCFA値の約106％より少ない値、例えば、rhBSSLが投与されていないヒト乳児の絶対CFA値の約105％、104％、103％、102％、または101％より少ない値である。
【００９２】
本発明の別の特定の態様では、rhBSSLが投与されていないヒト乳児の発育速度と比較した、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼが投与されたヒト乳児の発育速度の相対的増大(例えば、パーセント増加)は、rhBSSLが投与されていないヒト乳児の全CFAと比較した、rhBSSLが投与されたヒト乳児の全CFA(すなわち、全ての脂肪酸または最も豊富な脂肪酸のCFA)の相対的増加(例えば、パーセント増加)より大きい。このような態様のいくつかにおいて、(rhBSSLが投与されていない乳児の発育速度と比較した)rhBSSLが投与されたヒト乳児の発育速度の相対的増大は、(rhBSSLが投与されていない乳児の全CFA(すなわち、全ての脂肪酸または最も豊富な脂肪酸のCFA)の相対的増加と比較した)rhBSSLが投与されたヒト乳児の全CFAの相対的増加の約10倍、例えば、約5倍、3倍、または2倍である。例えば、特定の非限定的な例において、rhBSSLが投与されたヒト乳児の発育速度の相対的増大は(rhBSSLが投与されていない乳児の絶対的発育速度と比較して)約15％でもよいが、rhBSSLが投与された乳児における全CFAの相対的増加は(rhBSSLが投与されていない乳児の絶対的CFAと比較して)約3％しかなくてもよい。
【００９３】
本明細書の他の場所に記載のように、早産児および/またはLBW児が罹患する一般的な病理学的状態は経粘膜壊死(NEC)である。経粘膜壊死(NEC)は、通常、回腸末端部または結腸が関与する、粘膜および経粘膜の壊死および炎症を特徴とする。炎症および粘膜完全性の消失は腸壁の破裂および敗血症が伴うことが多い。この疾患の診断および治療の進歩にもかかわらず、NECは、依然として、未熟児およびLBW児を看護する保育室での罹患および死亡の主な原因である(Foglia et al, 1995; Curr Probl Surg, 32: 757-823; Grosfeld et al, 1996; Surgery, 120: 650-656; Uceda et al, J Pediatr Surg, 30: 1314-1316)。
【００９４】
乳児における乳-BSSLの重要性は単に脂肪酸吸収を助けることができるだけではないという実験上の示唆がある。例えば、Miller & Lowe(2008; J Nutr 138: 927-930)は、CEL-(BSSL)欠乏マウスにおいて、母乳および膵臓CEL(BSSL)が両方とも存在しないだけで吸収不良が起こり、母乳CEL(BSSL)だけが存在しなくても食事性脂肪吸収の効力は影響を受けず、糞便中脂肪が増加してもCEL-(BSSL)欠乏マウスの仔が正常に体重増加したことを観察した。また、および特に、Howlesおよび共同研究者ら(1999; Am J Physiol, 277: G653-G661)は、CEL-(BSSL)欠乏マウスを用いた実験後に、CEL(BSSL)が新生仔マウスにおいて脂肪由来腸損傷、特に、遠位小腸の上皮における過剰な脂質の蓄積による損傷を阻止し得ると推測した(Lindquist & Hernell, 2010により報告された、Lindquist et al., 2007; J Pediatr Gastroenterol Nutr 44: E335も参照されたい)。
【００９５】
食事性脂肪は、腸上皮の形態および機能に影響を及ぼすことが知られている。数人の研究者は、調合乳および乳の中にある脂質のタイプおよび量が新生児腸上皮の輸送特性および透過性ならびに新生児腸上皮の増殖速度および成熟速度に重大な影響を及ぼすことを発見した(Neu et al., 1987; Pediatr Res 22: 330-334; Udall et al., 1981; Pediatr Res. 15: 245-249; Weaver et al., 1987; Pediatr Res, 22: 675-678)。経粘膜壊死の新生仔ブタモデルにおいて、Crissingerおよび共同研究者ら(Crissinger et al., 1994; Gastroenterology, 106: 1215-1222)は、透過性および腸損傷の程度が様々な新生仔用調合乳の中にある脂肪の存在およびタイプに直接関連することを示した。管腔脂質はNECラットモデルにおける腸損傷を悪化させることも見出された(Bhatia et al., 1996; J Surg Res 63: 152-156)。
【００９６】
実際に、本明細書において開示された臨床試験では、(PPデータセットにおける)乳児用調合乳が与えられた乳児は、それぞれの治療期間の食品追跡マーカー間に、母乳が与えられた乳児(rhBSSLについては19.00gの脂肪およびプラセボについては20.51gの脂肪)と比較して多量の総脂肪に曝露された(糞便中に多量の脂肪を排泄した)ことが観察された(総脂肪曝露の平均:rhBSSLについては29.12gの脂肪およびプラセボについては28.50gの脂肪)[数字は、体重の違いに対する補正がなされていない]。
【００９７】
従って、別の局面において、本発明はまた、損傷からヒト乳児の小腸粘膜を保護する方法であって、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを前記乳児に経腸投与する工程を含む、方法に関する。関連する局面において、本発明はまた、完全に消化されていない、および/または過剰な脂肪および/または脂質の有害作用からヒト乳児の未熟腸上皮を保護する方法であって、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを前記乳児に経腸投与する工程を含む、方法に関する。別の関連する局面において、本発明は、ヒト乳児の回腸における完全に消化されていない、および/または過剰な脂肪および/または脂質の蓄積を制限する方法であって、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを前記乳児に経腸投与する工程を含む、方法に関する。これらの局面のある特定の態様において、前記ヒト乳児は早産児であり、経腸管もしくは胃管によって授乳される、および/または乳児用調合乳が与えられる。
【００９８】
本発明のこれらの局面の文脈において「保護する」という用語は当業者によって理解され、前記リパーゼの投与が、前記乳児において望ましくない効果を予防する、または望ましくない効果の可能性、重篤度、および/もしくは有病率を低減する本発明のこれらの局面の態様を含む。組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼの投与の保護効果、または完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積を制限する組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼの効果はヒト乳児におけるさらなる臨床研究の結果からさらに裏付けることができる。例えば、乳児への腸損傷によって引き起こされる有病率または死亡率、例えば、壊死性腸炎または回腸穿孔によって引き起こされる有病率または死亡率は、rhBSSLをヒト乳児に投与する臨床試験からの安全性データを解析することによって調査することができる。他の臨床研究では、rhBSSL投与の際のこのような効果は、ヒト乳児の内視鏡分析、生検分析、または死後分析によってさらに調査することができる。代わりの、かつ侵襲的でない方法では、rhBSSLのこれらの有利な効果は、指標バイオマーカー、例えば、ヒト乳児の血液または血漿に存在し得る指標バイオマーカーを追跡することによって調査することができる。前記バイオマーカーの存在/非存在またはレベル/濃度は、本明細書において列挙された有害作用の1つまたは複数の開始、診断、存在、または重篤度と相関関係にある。このような有害作用の開始、診断、存在、および/または重篤度はまた、他の医学的技法、例えば、乳児の腹部領域の操作、乳児の体温および/または挙動/睡眠パターンを用いてモニタリングすることもできる。特に、壊死性腸炎を、臨床試験の一部として、もしくは検診の一部として、腹部X線写真によって、またはベルの壊死性腸炎病期分類システム(Bell et al., 1978; Ann Surg, 187:1-7)を用いて診断および/または評価することができる。または、糞便パターン、潜血の存在、または特定の病原体の存在をNECリスクの指標として使用してもよく、胃残留物を壊死性腸炎の予測因子として使用してもよい。
【００９９】
本明細書における本発明者らによる開示-組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼをヒト乳児に投与した臨床試験において、前記乳児の発育速度が全脂肪吸収率(すなわち、全てのまたは最も豊富な脂肪酸の吸収率)の増加より顕著であった-から、rhBSSLによる脂質消化の機構に加えた機構が、このような結果を説明する要因となり得ることが示唆された。乳児用調合乳が与えられたヒト乳児は、母乳が与えられた乳児と比較して多量の総脂肪に曝露された。rhBSSL投与の際の乳児の発育速度の増大と全CFAの増加との不一致は顕著であった。臨床試験の(特に、乳児用調合乳から多量の脂肪を摂取した乳児における)これらのデータから得られた間接的な証拠により支持され得るように、ヒト乳児に組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを投与すると、さらに多くの脂質を消化することができ、その結果、完全に消化されていない、および/または過剰な脂肪/脂質が少なくなり、従って、完全に消化されていない、および/または過剰な脂肪/脂質によって引き起こされる乳児の腸管下部への損傷、例えば、腸管下部の微絨毛への損傷が小さくなる可能性がある。損傷を受けていない腸は、脂肪酸以外の乳児食品からの栄養分、例えば、炭水化物、タンパク質、ならびに単糖およびアミノ酸を含む栄養分の消化産物を良好に吸収することができるだろう。従って、脂肪と同程度にエネルギー要求値のかなりの部分をヒト乳児に提供する炭水化物およびタンパク質もまた消化後にさらに容易に吸収される可能性があり、従って、このような乳児は、rhBSSLによるTG消化の増加および結果として生じる脂肪酸の吸収の増加だけでは説明することができない(例えば、概してより健康な腸管下部のために)発育増加を示す可能性がある。
【０１００】
本発明のこれらの局面のある特定の態様では、前記乳児への組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼの投与は、完全に消化されていない、および/または過剰な脂肪および/または脂質、例えば、乳児用調合乳および/または低温殺菌母乳に由来する完全に消化されていない、および/または過剰な脂肪および/または脂質の有害作用から小腸粘膜を保護する。
【０１０１】
本発明の他のある特定の態様では、前記ヒト乳児に乳児用調合乳および/または低温殺菌母乳が与えられ、ある特定のこのような態様では、乳児に新鮮な母乳が与えられない。
【０１０２】
本発明のこれらの局面の特定の態様において、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼの投与は損傷から前記乳児の空腸および/または回腸の粘膜を保護する、特に、乳児の絨毛上皮を保護する。
【０１０３】
本発明のさらに具体的な態様において、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼの投与は、粘膜および/または経粘膜の壊死および/または炎症から前記乳児の小腸粘膜を保護する。
【０１０４】
さらに特定の態様において、前記リパーゼの投与は、壊死性腸炎および/または回腸穿孔などのある特定の病理学的状態から前記乳児を保護する。このような態様のいくつかにおいて、rhBSSLの投与は前記乳児における壊死性腸炎および/もしくは回腸穿孔を予防する、または壊死性腸炎および/もしくは回腸穿孔の可能性、重篤度、および/もしくは有病率を下げる。
【０１０５】
NECの首尾一貫した素因は、早産、LBW、および経腸栄養である。このことは、これらの乳児の未熟腸粘膜が複合食(complex diet)の処理に関連するストレスに耐えられないことを示唆している(Kliegman et al., 1993; Pediatr Res 34: 701-708)。従って、本発明のこれらの局面のある特定の態様において(本発明の他の局面のある特定の態様についても)、ヒト乳児は経腸管(または胃管)によって授乳される。特に、経腸管(または胃管)によって授乳される乳児は未熟児および/またはLBW児でもよい。
【０１０６】
今や当業者に容易に明らかなように、前記の任意の態様、例えば、様々な組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼ、投与量、投与方法および/またはレジメン、乳児の部分母集団について述べている態様、ならびにrhBSSL投与によって発育速度の増大および全CFAの限定的な増加をもたらすことができると述べている態様の1つまたは複数はまた、本発明のこれらの保護(または蓄積を制限する)方法をさらに特徴付けることができる。例えば、このような保護(または蓄積を制限する)方法は、組換えハムスター卵巣細胞の発現産物から単離されたrhBSSLを使用してもよく、および/または1日当たり1〜100mgの前記リパーゼ/Kg乳児体重の量で投与されてもよく、例えば、乳児用調合乳に入れて妊娠約第37週前に生まれた早産児に投与されてもよい。
【０１０７】
本発明の様々な局面のある特定の態様において、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは、少なくとも1種類の他の栄養補助食品および/もしくは乳強化剤(milk fortifier)の前、後、または同時に投与される。いくつかのこのような栄養補助食品または乳強化剤は、ヒト乳児の発育の向上を助ける、または他のやり方でヒト乳児に利益を与えるために認可され、販売され、または他のやり方で使用され、当業者に周知であろう。非限定的な例として、このような栄養補助食品および/または乳強化剤には、Nutriprem、Milupa、Eoprotin、Enfamil Human Milk Fortifier、およびSimilac Human Milk Fortifierが含まれる。本発明のある特定の他の態様において、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは、少なくとも1種類の他のリパーゼ、例えば、別の組換えヒトリパーゼの前、後、または同時に投与される。
【０１０８】
代わりの態様において、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは、追加の栄養補助食品および/もしくは乳強化剤(例えば、本明細書において説明および定義された栄養補助食品および/もしくは乳強化剤)が投与されることなく、または他のリパーゼが投与されることなく投与される。
【０１０９】
理解されるように、本発明を実施することができる相対的な容易さのために、1つの態様では、ヒト乳児に経口授乳するために組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを乳児用調合乳に単に添加することによって投与できるために、医学的介入、監督、支援、または助言なく乳児の家で本発明が実施される。例えば、一般的に、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは、小腸粘膜に対する損傷から保護するために、または完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪/脂質の蓄積を制限するために、乳児が発育能力に到達することが文化的に望ましい場合、赤ん坊の発育または身体全体の健康を助ける栄養補助食品として、例えば、乳児の発育速度を増大させる栄養補助食品として販売されることがある。本発明の態様のさらなる非限定的な例として、乳児用調合乳は、適量のrhBSSLを既に含む国内での使用のために製造および配布されてもよい。従って、ある特定の局面において、本発明は、ヒト乳児の発育速度を増大させるための非医学的方法に関する、または前記の保護(または蓄積を制限する)方法の1つに関する。
【０１１０】
または、本発明は、資格のある医療スタッフによって、または他のやり方で、例えば、病院または診療所において、例えば、ヒト低体重児、LBW児、および/または早産児を看護している集中治療室において、医学的介入、監督、もしくは助言の下で、または医学的介入、監督、もしくは助言と共に実施することができる、または実施するように指導することができる。従って、このような代わりの局面において、前記方法は、ヒト乳児の発育速度を増大させるための医学的方法に関する、または前記の保護(または蓄積を制限する)方法の1つの医学的方法に関する。このような局面において、乳児は、体重など発育速度を増大させることが医学的に必要とされていてもよく、小腸粘膜に対する損傷からの保護が必要とされていてもよく、完全に消化されていないまたは過剰な脂肪/脂質の蓄積の制限が必要とされていてもよく、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼの量は治療的有効量でもよい。
【０１１１】
従って、前記に関連するさらなる局面において、本発明はまた、低体重または早産のヒト乳児を治療するための治療方法であって、低体重または早産の治療を医学的に必要とする乳児に組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを経腸投与する工程を含む、方法に関する。このような医学的介入を特に必要とする乳児は、胎内発育遅延(SGA)児、低出生体重(LBW)児、成長障害(FTT)児、および/または妊娠約第37週前に生まれた乳児でもよい。それぞれの場合において、本明細書の他の場所において説明または定義される。または、本発明のさらなる局面はまた、(X)損傷からヒト乳児の小腸粘膜を保護するための;(Y)完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の有害作用からヒト乳児の未熟腸上皮を保護するための;ならびに/または(Z)ヒト乳児の回腸における完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積を制限するための治療方法の1つまたは複数に関する。それぞれの場合において、前記方法は、低体重または早産の治療を医学的に必要とする乳児に組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを経腸投与する工程を含む。
【０１１２】
本発明のある特定の態様を実施するために、最初に、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを含有する乳児用食品を調製することが有用な場合がある。従って、別の局面において、本発明は、ヒト乳児の発育速度を増大させるのに有用な、rhBSSLを含む改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳を調製する方法に関する。特定の態様において、このような方法は、以下の工程:
i.第1の量の組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼおよび第2の量の改良されていない乳児用調合乳または改良されていない低温殺菌母乳を提供する工程;ならびに
ii.ある量の前記リパーゼを、前記改良されていない乳児用調合乳または改良されていない低温殺菌母乳に添加して、改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳を形成して、本明細書の他の場所において説明または定義された投与レジメンにわたって、前記改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳が前記乳児に与えられた時に、ヒト乳児の発育速度を増大させるのに有効な量のリパーゼを含む、改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳を形成する工程
を含む。
【０１１３】
別の局面において、本発明はまた、改良された乳児用調合乳または改良された母乳が、(X)損傷からヒト乳児の小腸粘膜を保護する;(Y)完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の有害作用からヒト乳児の未熟腸上皮を保護する;ならびに/または(Z)ヒト乳児の回腸における完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積を制限するのに有用であり、改良された乳児用調合乳または改良された母乳の中にあるrhBSSLの量が、(X)損傷からヒト乳児の小腸粘膜を保護する;(Y)完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の有害作用からヒト乳児の未熟腸上皮を保護する;ならびに/または(Z)ヒト乳児の回腸における完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積を制限するのに効果的である、前記方法に類似した方法に関する。
【０１１４】
本発明のある特定の態様において、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは、保管、配布、および/または本発明の改良された乳児用調合乳もしくは改良された乳への組み込みに適した形態で提供される。例えば、ある特定の態様において、前記リパーゼは凍結乾燥製剤として提供される。典型的に、前記リパーゼの凍結乾燥製剤は、都合よいサイズの容器、例えば、バイアルに入れて提供され、適切な量の組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを含んでもよい。ある特定のこのような態様において、容器は、滅菌バイアルを含む滅菌容器である。凍結乾燥製剤として提供される時、rhBSSLは乳児用調合乳または乳に添加される前に可溶化されてもよく、例えば、滅菌水で可溶化されてもよい。または、rhBSSLの凍結乾燥製剤は前記乳児用調合乳または乳で直接可溶化されてもよい。
【０１１５】
利便性または無菌性もしくは安全性などの他の理由のために、本発明のある特定の態様において、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは単位用量として提供される。単位用量は、別々のユニットまたは容器に入れられて単回投与するのに必要とされる十分な(またはわずかに多い)rhBSSLを提供してもよい。または、小数のこのような別々のユニットまたは容器、例えば、2〜5個のこのような別々のユニットまたは容器が一緒になって、単回投与するのに必要とされる十分な(またはわずかに多い)rhBSSLを提供する。ある特定のこのような態様において、単位剤形は、1.5〜75mgリパーゼの量の組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを含む。特定のこのような態様において、rhBSSLの量は5〜45mgまたは約20mgの前記リパーゼである。
【０１１６】
別の態様において、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは溶液として提供される。このような溶液中のrhBSSL濃度は1.5〜150mg/mLでもよく、ある特定のこのような態様において、7.5〜30mg/mLの濃度、例えば、約15mg/mLの濃度でもよい。
【０１１７】
本発明の特定の態様において、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは、1つまたは複数の薬学的に許容される担体ならびにrhBSSLを含む、組成物として、または薬学的製剤、例えば、凍結乾燥組成物もしくは溶液組成物として提供される。適切な薬学的に許容される担体は必要とされるのであれば当業者に公知であり、本明細書の他の場所に記載の薬学的に許容される担体を含む。
【０１１８】
本発明のこの局面の特定の態様において、rhBSSLを含む改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳を調製するこの方法は、(前記方法によってこのように調製された)前記改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳をヒト乳児に与え、それによって、経腸投与によってrhBSSLを前記乳児に投与する工程をさらに含む。ある特定のこのような態様において、前記乳児には、本明細書の他の場所において説明または定義された投与レジメンにわたって、改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳が与えられる。
【０１１９】
本発明者らは、rhBSSLを含む乳児用食品(調合乳または低温殺菌母乳)が対照臨床試験条件下ではヒト乳児の発育速度を増大させる効果を示すことを本明細書において開示した。従って、別の局面において、本発明は、ヒト乳児の発育速度を増大させるのに有効な量の組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを含む改良された乳児用調合乳に関し、例えば、前記改良された乳児用調合乳が、本明細書の他の場所において説明または定義された投与レジメンにわたって前記乳児に与えられた時に、ヒト乳児の発育速度を増大させるのに有効な量の組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを含む、改良された乳児用調合乳に関する。
【０１２０】
このような局面のある特定の態様において、改良された乳児用調合乳は、授乳のために既に調製されている。他の態様において、改良された乳児用調合乳は、前記乳児に与えられる前に処理に供される。例えば、調合乳は水に溶解されてもよく、授乳に適した温度、例えば、37℃まで温められてもよい。特定のこのような態様において、改良された乳児用調合乳は、粉末もしくは顆粒として、または使いやすい液体として、または濃縮懸濁液もしくは濃縮溶液として提供される。
【０１２１】
類似した局面において、本発明はまた、例えば、前記改良された低温殺菌母乳が少なくとも約4日にわたって少なくとも1日1回の授乳のために、本明細書の他の場所において説明または定義された投与レジメンにわたって少なくとも1日1回の授乳のために前記乳児に与えられた時に、ヒト乳児の発育速度を増大させるのに有効な量の組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを含む改良された低温殺菌母乳に関する。
【０１２２】
このような局面のある特定の態様において、改良された母乳は授乳のために既に調製されている。他の態様において、改良された母乳は、前記乳児に与えられる前に処理に供される。例えば、改良された母乳は冷凍状態から解凍されてもよく、および/または37℃などの授乳に適した温度まで温められてもよい。
【０１２３】
他の局面において、本発明はまた、それぞれの場合において、(X)損傷からのヒト乳児の小腸粘膜の保護;(Y)完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の有害作用からのヒト乳児の未熟腸上皮の保護において使用するための;ならびに/または(Z)ヒト乳児の回腸における完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積の制限において使用するための、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを含む改良された低温殺菌母乳;組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを含む、改良された乳児用調合乳;組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを含む薬学的組成物;または組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼそれ自体に関する。このような局面の特定の態様は、それぞれの場合において、(V)粘膜および/または経粘膜の壊死および/または炎症からの前記乳児の小腸粘膜の保護において使用するための、ならびに/あるいは(W)壊死性腸炎および/もしくは回腸穿孔からのヒト乳児の保護、ならびに/あるいは前記乳児における壊死性腸炎および/もしくは回腸穿孔の予防、または壊死性腸炎および/もしくは回腸穿孔の可能性、重篤度、および/もしくは有病率の低下において使用するためのものである。このような局面のある特定の態様において、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは前記乳児への経腸投与に適合されている。全てのこのような局面のさらなるある特定の態様において、ヒト乳児は経腸管(もしくは胃管)によって授乳される、および/または未熟児である。
【０１２４】
別の局面において、本発明はまた、(X)損傷からヒト乳児の小腸粘膜を保護するための;(Y)完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の有害作用からヒト乳児の未熟腸上皮を保護するための;ならびに/または(Z)ヒト乳児の回腸における完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積を制限するための医用薬剤を製造するための組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼの使用に関する。このような局面の特定の態様は、それぞれの場合において、(V)粘膜および/または経粘膜の壊死および/または炎症からの前記乳児の小腸粘膜の保護のための、ならびに/あるいは(W)壊死性腸炎および/もしくは回腸穿孔からのヒト乳児の保護、ならびに/あるいは前記乳児における壊死性腸炎および/もしくは回腸穿孔の予防、または壊死性腸炎および/もしくは回腸穿孔の可能性、重篤度、および/もしくは有病率の低下のためのものである。このような使用局面のある特定の態様において、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは前記乳児への経腸投与に適合されている。全てのこのような局面のさらなるある特定の態様において、ヒト乳児は経腸管(胃管)によって授乳されている、および/または未熟児である。
【０１２５】
今や前記の開示から当業者に容易に明らかなように、前記の任意の態様、例えば、様々な組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼ、投与量、投与方法および/またはレジメン、乳児の部分母集団について述べている態様、ならびにrhBSSL投与によって発育速度の増大および全CFAの限定的な増加をもたらすことができると述べている態様の1つまたは複数はまた、本発明のこれらの組成物および/または使用局面をさらに特徴付けることができる。例えば、このような組成物および/または使用は、組換えハムスター卵巣細胞の発現産物から単離されたrhBSSLを使用してもよく、および/または1日当たり1〜100mgの前記リパーゼ/Kg乳児体重の量で投与されてもよく、例えば、乳児用調合乳に入れて妊娠約第37週前に生まれた早産児に投与されてもよい。
【０１２６】
本発明の特に現実的な局面は、ヒト乳児の発育速度を増大させるのに有用な、rhBSSLを含む改良された乳児用調合乳または改良された母乳を調製するためのキットに関する。ある特定の態様において、前記キットは、以下の成分:
a.第1の量の組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼ、例えば、凍結乾燥製剤または溶液製剤の形をした第1の量の組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを含む、少なくとも1つの第1の容器;および
b.第2の量の改良されていない乳児用調合乳または改良されていない低温殺菌母乳を含む、第1の容器とは異なる少なくとも1つの第2の容器
を含み、前記リパーゼおよび前記改良されていない乳児用調合乳または改良されていない低温殺菌母乳はそれぞれ、例えば、前記改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳が、本明細書の他の場所において説明または定義された投与レジメンにわたって前記乳児に与えられた時に、ヒト乳児の発育速度を増大させるのに有効な量の前記リパーゼを含む、改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳をそれぞれ調製するのに十分な量である。
【０１２７】
別の局面において、本発明はまた、改良された乳児用調合乳または改良された母乳が、(X)損傷からヒト乳児の小腸粘膜を保護する;(Y)完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の有害作用からヒト乳児の未熟腸上皮を保護する;ならびに/または(Z)ヒト乳児の回腸における完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積を制限するのに有用であり、改良された乳児用調合乳または改良された母乳の中にあるrhBSSLの量が、(X)損傷からヒト乳児の小腸粘膜を保護する;(Y)完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の有害作用からヒト乳児の未熟腸上皮を保護する;ならびに/または(Z)ヒト乳児の回腸における完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積を制限するのに効果的である、前記キットに類似したキットに関する。
【０１２８】
ある特定の態様において、キットは説明書をさらに含む。このような説明書は、キットまたは前記キットの特定の成分を使用する方法について説明してもよい。例えば、前記説明書は、以下:
i.改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳を調製する工程、例えば、ある量の組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを改良されていない乳児用調合乳または改良されていない低温殺菌母乳を添加して、それぞれ、改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳を形成することによって、改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳を調製する工程;
ii.前記改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳をヒト乳児に与える工程、例えば、本明細書の他の場所において説明または定義された投与レジメンにわたって前記改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳をヒト乳児に与える工程について説明してもよい。
【０１２９】
この局面の他の態様において、前記説明書は、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼが投与されるヒト乳児が、低体重児もしくはLBW児、未熟児、および/または経腸管(もしくは胃管)によって授乳されている乳児であることをさらに説明している。例えば、乳児は、本明細書の他の場所において説明または定義された低体重クラスまたは未熟児クラスのいずれかに入る乳児でもよい。
【０１３０】
別の局面において、本発明は、ヒト乳児の発育速度を増大させる方法であって、以下の工程:
i.改良された乳児用調合乳もしくは改良された低温殺菌母乳を調製する工程もしくは他のやり方で提供する工程であって、それぞれの場合において、改良された乳児用調合乳もしくは改良された低温殺菌母乳がrhBSSLを含むか、または前記方法によって、もしくは前記キットを使用することによって調製されている、工程;
ii.このように調製された、または他のやり方で提供された改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳を前記乳児に与える工程;および
iii.本明細書において説明または定義された投与レジメンにわたって前述の工程を繰り返す工程
を含む、方法に関する。
【０１３１】
別の局面において、本発明はまた、(X)損傷からヒト乳児の小腸粘膜を保護するための;(Y)完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の有害作用からヒト乳児の未熟腸上皮を保護するための;ならびに/または(Z)ヒト乳児の回腸における完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積を制限するための方法であって、それぞれの場合において、前述の方法において示された3つの工程を含む、方法に関する。
【０１３２】
0.1〜100mgの組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを含む単位用量の中にある薬学的組成物に関するなおさらなる局面は、本発明によって本明細書において提供される医学的用途または治療用途のために特に有用である。単位用量は当業者に容易に理解され、例えば、本明細書の他の場所において説明または定義された単位用量を含む。このような局面のある特定の態様において、単位用量は1.5〜75mgのrhBSSLを含む。特定のこのような態様において、単位用量は、5〜45mgの前記rhBSSL、例えば、約10mg、15mg、20mg、または25mgの前記リパーゼを含む。
【０１３３】
前記の酵素量に関する議論から理解されるように、本発明のある特定の態様において、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼの単位用量は、rhBSSLの絶対質量または活性rhBSSLの質量を含む様々なやり方で表すことができる。または(もしくはさらに)、rhBSSL量は酵素の単位(U)で表すことができる。従って、特定の態様において、単位用量は、約2,000〜20,000単位のrhBSSL(U)、約5,000〜約15,000単位、例えば、約7,000〜10,000単位の量のrhBSSLを含む。
【０１３４】
本発明のある特定の態様において、薬学的組成物は経腸投与および/またはヒト乳児への投与に適合されており、例えば、前記単位用量はヒト乳児への経腸投与に特に適合されている。例えば、前記単位用量は、乳児用調合乳もしくは母乳食品に添加するのに適した、または乳児用調合乳もしくは母乳食品として調製するのに適した量のおよび/または製剤の中にある、凍結乾燥された、可溶化された、または冷凍された量の組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼである。他の態様において、単位用量は、本明細書の他の場所において説明または定義された形態、容器、または量のrhBSSLで提供されてもよい。
【０１３５】
別の特定の局面において、本発明はまた、0.1〜100mgの組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを含む薬学的組成物であって、前記リパーゼは乳からもトランスジェニックヒツジからも単離されていない、薬学的組成物に関する。
【０１３６】
今や当業者に理解されるように、任意のキットもしくは薬学的組成物を構成する、または任意の方法において用いられる組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼは、本明細書の他の場所において説明または定義された任意の組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼでよい。
【０１３７】
関連する局面において、さらに、本発明は、ある量の組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを含む薬学的組成物を含み、以下の工程:
i.前記改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳が少なくとも約4日にわたって少なくとも1日1回の授乳のために、少なくとも約5日にわたって少なくとも1日1回の授乳のために、または少なくとも約7日にわたって少なくとも1日1回の授乳のために前記乳児に与えられた時に、ヒト乳児の発育速度を増大させるのに有効な量のrhBSSLを含有する改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳を調製する工程;ならびに
ii.本明細書において説明または定義された投与レジメンにわたって前記改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳をヒト乳児に与えることによって、前記量のrhBSSLを経腸投与する工程
について説明している説明書をさらに含む、包装された薬学的製品に関する。
【０１３８】
別の局面において、本発明はまた、類似した包装された薬学的製品であって、包装された薬学的製品の中に入っている説明書が、それぞれの場合において、前記改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳が少なくとも約4日にわたって少なくとも1日1回の授乳のために、少なくとも約5日にわたって少なくとも1日1回の授乳のために、または少なくとも約7日にわたって少なくとも1日1回の授乳のために前記乳児に与えられた時に、工程(i.)(X)損傷からヒト乳児の小腸粘膜を保護する;(Y)完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の有害作用からヒト乳児の未熟腸上皮を保護する;ならびに/または(Z)ヒト乳児の回腸における完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積を制限するのに有効な量のrhBSSLを含有する改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳を調製する工程について説明している、類似した包装された薬学的製品に関する。
【０１３９】
本発明の他の態様において、包装された薬学的製品は乳児用調合乳または低温殺菌母乳をさらに含む。前記乳児用調合乳または低温殺菌母乳は、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼに対して別個の成分として包装された薬学的製品の中に含まれてもよい。すなわち、前記乳児用調合乳または低温殺菌母乳は、改良されていない乳児用調合乳または改良されていない低温殺菌母乳でもよい。代わりのこのような態様において、包装された薬学的製品は、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼを既に含んでいる乳児用調合乳または低温殺菌母乳を含んでもよい。すなわち、前記乳児用調合乳または低温殺菌母乳は、改良された乳児用調合乳または改良されていない低温殺菌母乳でもよい。このような態様のいずれにおいても、乳児用調合乳は、可溶化するために乾燥した顆粒または粉末として提供されてもよく、適切な容器に入れた液体として(適切な濃度の液体として、もしくは濃縮物として)提供されてもよく、または冷凍試料として提供されてもよい。
【０１４０】
これらの包装された薬学的製品のある特定の態様において、薬学的組成物は、本明細書の他の場所に定義された薬学的組成物である。
【０１４１】
他のある特定の態様において、包装された薬学的製品の説明書は、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼが投与されるヒト乳児が低体重である、LBWである、早産で生まれている、および/または経腸管(もしくは胃管)によって授乳されている、あるいは低体重でなければならない、LBWでなければならない、早産で生まれていなければならない、および/または経腸管(もしくは胃管)によって授乳されていなければならないと説明している。例えば、前記乳児は、本明細書の他の場所に記載の体重または早産の栄養物(aliment)または適応症の1つまたは複数に罹患していてもよい。
【０１４２】
本発明の特定の態様において、包装された薬学的製品またはキットの説明書は、改良された乳児用調合乳もしくは改良された低温殺菌母乳または組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼが、(A)ヒト乳児の発育速度を増大させる;ならびに/あるいは(B)(X)損傷からヒト乳児の小腸粘膜を保護する;(Y)完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の有害作用からヒト乳児の未熟腸上皮を保護する;ならびに/または(Z)ヒト乳児の回腸における完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積を限定するためのものであるか、あるいは(A)ヒト乳児の発育速度を増大させる;ならびに/あるいは(B)(X)損傷からヒト乳児の小腸粘膜を保護する;(Y)完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の有害作用からヒト乳児の未熟腸上皮を保護する;ならびに/または(Z)ヒト乳児の回腸における完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積を限定するのに効果的であるか、あるいは(A)ヒト乳児の発育速度を増大させる;ならびに/あるいは(B)(X)損傷からヒト乳児の小腸粘膜を保護する;(Y)完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の有害作用からヒト乳児の未熟腸上皮を保護する;ならびに/または(Z)ヒト乳児の回腸における完全に消化されていない、および/もしくは過剰な脂肪および/もしくは脂質の蓄積を限定するために臨床試験において有効かつ安全だと示されている/証明されていると述べている。
【０１４３】
本発明に関して、改良された乳児用調合乳もしくは改良された低温殺菌母乳の調製もしくは提供を必要とする任意の前記方法、またはこのような調製もしくは提供について説明している説明書を含むそのキットもしくは包装された薬学的製品において、このような局面のある特定の態様において、改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳が調製される前に、組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼおよび/または改良されていない乳児用調合乳もしくは改良されていない低温殺菌母乳が解凍および/または可溶化されることが必要な場合がある。このような調製または提供は、改良されていない乳児用調合乳(例えば、乾燥プレミックスとして提供される)または改良されていない冷凍した低温殺菌母乳に組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼが添加されることを含んでもよい。他の態様において、このような調製または提供は、最初に、改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳が解凍される、および/またはヒト乳児への授乳に適した温度、例えば、37℃まで温められることを含んでもよい。他の態様において、最初に、改良されていない冷凍母乳は解凍され、次いで、rhBSSLが添加され、次いで、例えば、前記リパーゼが凍結乾燥粉末または顆粒の形として提供されるのであれば可溶化される。
【０１４４】
本明細書における本発明の開示の際に当業者により理解されるように、本発明の改良された乳児用調合乳もしくは改良された低温殺菌母乳、またはキット、包装された薬学的製品、rhBSSL、または薬学的組成物は、治療レジメン全体の必要を満たす分量、サイズ、または量である必要はない。例えば、新鮮な分量の改良された乳児用調合乳または改良された低温殺菌母乳は、例えば、複数のキットまたは薬学的組成物が治療レジメンの間に用いられるように、ヒト乳児に投与されるたびに本発明のキットまたは薬学的組成物から調製されてもよい。
【０１４５】
本明細書に含まれる開示を考慮すれば、特定の問題または環境への本発明の開示の適用は当業者の能力の範囲内であることが理解されるはずである。本発明の生成物、組成物、包装容器、またはキット、およびこれらを調製または使用するための代表的な方法またはプロセスの例を以下に示す。
【０１４６】
本明細書において引用された全ての参考文献、特許、および刊行物はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１４７】
例示
実施された実験および達成された結果を含む以下の例示は本発明における特定の様々な本発明の態様も例示し、例示のためだけに提供され、本発明を限定すると解釈してはならない。
【０１４８】
セクション1:原薬、その特徴付け、および治験薬製品の調製
標準的な手順に従って、SEQ ID.NO.1に示した予測アミノ酸配列を有する原薬であるヒト胆汁酸活性化リパーゼを、ヒトBSSLをコードするヌクレオチド配列を含む核酸発現系を含有する組換えチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞から発現させることによって産生した。簡単に述べると、(Nilsson et al., 1990; Eur J Biochem, 192: 543-550に記載のように)リーダー配列を含む完全長hBSSLをコードする2.3Kb cDNA配列を、pS146(Hansson et al., 1993; J Biol Chem, 268: 26692-26698)から入手し、遺伝子発現用のCMVプロモーター/SV40ポリAシグナルおよび選択/増幅用のdhfr遺伝子を含むpBRベースのプラスミドである発現ベクターpAD-CMV1(Boehringer Ingelheim)にクローニングして、pAD-CMV-BSSLを形成した。次いで、DHFR陰性CHOss細胞(Boehringer Ingelheim)のトランスフェクションと、ジェネティシン(G418)耐性を選択するネオマイシン耐性をコードするプラスミドpBR3127SV/Neo pAのコトランスフェクションのためにpAD-CMV-BSSLを用いて、DHFR陽性BSSL産生CHO細胞を作製した。結果として生じたCHO細胞を、多量のrhBSSLを発現する条件およびスケールで培養した。例えば、マスター細胞バンク(MCB)からの細胞を解凍し、グルタミンおよびグルコースを含まないEx-Cell 302培地(SAFC)を使用し、後でグルタミンおよびグルコースを添加したEx-Cell 302培地を使用して振盪フラスコの中で増やし、15Lおよび100Lバイオリアクターに入れて増殖させた後に、BSSLが流加培養プロセスで構成的に発現および産生される700L製造用バイオリアクターに接種した。培養物をシングルバッチとして収集し、陰イオン交換クロマトグラフィー工程を含む多数の下流工程を介して、成熟rhBSSLポリペプチド(すなわち、リーダー配列を含まない)を細胞、細胞破片、および他の夾雑物から精製した。夾雑ウイルスを低pH処理および乾熱処理工程によって不活化してもよい。rhBSSL原薬(DS)バルクを適切な製剤になるまでダイアフィルター(diafilter)に供し、濃縮した。処方後、凍結乾燥および熱処理のために材料を1〜3つのバッチに分けて、1〜3つのDSバッチを作製した。
【０１４９】
この哺乳動物細胞発現系においてrhBSSLを産生すると、SEQ ID.NO.1に示した予測アミノ酸配列および図1.1に模式的に示した構造を有するrhBSSLが産生される。図1.1には潜在的なグリコシル化の部位も示す。
【０１５０】
この形態のrhBSSLは、ヒト乳において見られる天然hBSSL(BSSL-MAM)とは異なり、rhBSSL-OVI(トランスジェニックヒツジから産生される)とも異なるグリコシル化を示すように見える。例えば、高pH陰イオン交換クロマトグラフィーとパルスアンペロメトリック検出(HPAEC-PAD)を使用して、本明細書に記載の臨床試験のために産生および使用されたCHO由来rhBSSL(rhBSSL-CHO)の単糖およびシアル酸グリコシル化レベルが求められ、BSSL-MAMより低いが、rhBSSL-OVIより高い総グリコシル化レベルを有することが見出された(表1.1を参照されたい)。これらの全グリコシル化レベルは、それぞれの形態のBSSLの全分子量と相関関係にあった。それぞれの形態のBSSLの全分子量はMALDI-MSによって求められ、rhBSSL-CHOについては約85KDaであったのに対して、BSSL-MAMについては100KDa、rhBSSL-OVIについては78KDaであることが見出された。表1.1に示したように、rhBSSL-CHOの可能性のあるグリコシル化部位におけるグリコシル化(単糖およびシアル酸)のパターンまたはプロファイル、特に、O-グリカンのグリコシル化(単糖およびシアル酸)のパターンまたはプロファイルはrhBSSL-MAMおよびrhBSSL-OVIと比較して異なる(キャピラリー電気泳動とレーザー誘起蛍光検出[CE-LIF]および/またはHPAEC-PADを用いた検出)。
【０１５１】
(表1.1)rhBSSL-CHO、rhBSSL-OVI、およびhBSSL-MAMの単糖含有量およびシアル酸含有量[モル/(モルBSSL)]
0005850940.tif 000002
*rhBSSL-OVI材料中のグルコサミンを分析した時に、クロマトグラムに小さなピークが見られた。しかしながら、較正曲線の交点の方が大きく、交点が差し引かれたために、このような少ない量はマイナス値として計算されたので、値を報告しなかった。絶対/未修正の推定値は1.8モルのグルコセアミン(glucoseamine)/モルBSSLであった。
** (絶対/未修正)グルコサミンを含む合計は12モル/モルBSSLであった。
【０１５２】
rhBSSL-CHOのグリコシル化の程度および分布がBSSL-MAMのグリコシル化の程度および分布ならびにrhBSSL-OVIのグリコシル化の程度および分布と異なるだけでなく、C末端アミノ酸配列(例えば、エンドプロテインGlu-Cペプチドマッピング、および液体クロマトグラフィーとエレクトロスプレーイオン化質量分析[LC-ESI-MS-MS]を用いた配列特定によって決定された)によって、リパーゼ分子の大部分は、(予測)完全長ポリペプチド分子と比較して1アミノ酸(時として、2アミノ酸)短いことが見出された。完全長C末端が配列決定された分子1つにつき、C末端の最後のアミノ酸が切断された分子が約3つ検出された。最後の2アミノ酸が切断された小さな割合のC末端配列が検出された。例えば、(完全に近い長さの)リパーゼ分子のこの集団のうち、約25％が完全長であり、約75％が1アミノ酸短く、1％未満が2アミノ酸短い。
【０１５３】
rhBSSL-CHOとBSSL-MAMとrhBSSL-OVIとの間で機能特性の違いが観察された。rhBSSL-CHOの比活性は他の形態のBSSLの比活性より高いことが観察された。BSSL-MAMおよびrhBSSL-OVIの比活性は質量ベースでrhBSSL-CHOの比活性の80％しかない。それぞれの試料をHA-HPLCおよびSE-HPLCによって特異的に精製した後に、比活性を求める。比活性は、BSSL基質として4-ニトロフェニルエステル酪酸(PNPB)および4-ニトロフェノール放出の検出を用いて求められる。簡単に述べると、rhBSSLの希釈系列(例えば、20〜160ng活性/mL)を、0.1％BSAを含むPBSで調製する。これらのrhBSSL溶液200μlを、0.1％BSAを含むPBSで溶解した20mMコール酸ナトリウム(胆汁酸活性化剤)を含有する活性化溶液25μlに添加する。これらの溶液を分光光度計に入れて27℃で5分間プレインキュベートする。測定直前に、PBS-Tween中に5mM PNPBを含有する、よく混ぜた基質溶液25μlを添加する。4-ニトロフェノール形成を、400nmでの4-ニトロフェノール吸光度によって検出することができ、90秒間の吸光度増加を測定する。rhBSSL標準品の検量線を用いてBSSL活性量を求める。
【０１５４】
注射用水に溶解した凍結乾燥原薬から治験薬製品を調製した。溶液を予め濾過し(10μl)、注射用水で最終(活性)濃度まで調節した。生成物を0.22μmフィルターで濾過し、予め滅菌した10mLガラスバイアルに詰めた。バイアルに、滅菌した栓を付け、アルミニウムキャップで密封した。
【０１５５】
セクション2:rhBSSLを用いた2つの第II相試験からの複合データに関する簡略データ
プロトコル番号:BVT.BSSL-020
EUDRACT番号:2007-002423-33
Clinicaltrials.gov識別子:NCT00658905
在胎齢32週前に生まれた早産児における1週間の治療中に、乳児用調合乳に添加された0.15g/L rhBSSLとプラセボを比較する、前向き無作為化二重盲式クロスオーバー試験
および
プロトコル番号:BVT.BSSL-021
EUDRACT番号:2007-002434-10
Clinicaltrials.gov識別子:NCT00659243
在胎齢32週前に生まれた早産児における1週間の治療中に、低温殺菌母乳に添加された0.15g/L rhBSSLとプラセボを比較する、前向き無作為化二重盲式クロスオーバー試験
【０１５６】
略語表
0005850940.tif 000003
【０１５７】
1序論
早産児においてrhBSSLを用いた2つの第II相試験、試験BVT.BSSL-020および-021が実施された。両試験の主要目的は、調合乳(試験-020)または低温殺菌母乳(試験-021)に入れて投与された時の、rhBSSLを用いた治療後の早産児における脂肪吸収(脂肪吸収率、CFA)を、プラセボを用いた治療後の早産児における脂肪吸収(脂肪吸収率、CFA)と比較することであった。副次的目的は、乳児用調合乳/低温殺菌母乳に入れて投与された時の、rhBSSLを用いた治療後の早産児における身長および体重を、プラセボを用いた治療後の早産児における身長および体重と比較すること、ならびに乳児用調合乳/低温殺菌母乳に入れて投与された時のrhBSSLの安全性を試験することであった。
【０１５８】
それぞれの試験における標本サイズの評価は、90％の検出力および5％の有意水準での治療期間の間の推定された10％CFA単位差および15％標準偏差に基づいた。10％のCFA差は発育速度において2g/kg/日の差をもたらすと予測された。しかしながら、どの試験も、それぞれの試験において患者数(32人)が少なく、治療期間(1週間)が短いために、発育の改善を証明するのに十分な検出力を有すると予測されなかった。従って、乳児用調合乳または低温殺菌母乳に入れて投与された時の、プラセボと比較したrhBSSLを用いた治療後の発育の改善を証明するという主要目的をもつ、2つの試験の予め定義された複合解析を、別の統計解析計画(SAP)に記載した。複合データのSAPを開発および完成した後に、2つの試験のいずれかにおいてデータベースのロックおよび臨床データベースの盲検解除を行った。
【０１５９】
さらに、SAPに記載されていない、いくつかの事後解析も実施されており、ここに報告する。
【０１６０】
本報告は、2つの試験からのデザインおよび結果をまとめたものであり、複合解析に焦点を当てているが、多くの場合において試験による結果を示している。本報告は、個々の試験報告に示された情報、複合解析の統計報告、および事後解析の統計報告に基づく。
【０１６１】
両試験ともICH GCPガイドラインおよびヘルシンキ宣言に則って実施された。両試験とも適切な独立倫理委員会(Independent Ethics Committees)によって認可され、組み入れられた全ての患者の保護者からインフォームドコンセントが得られた。
【０１６２】
2複合解析の解析目的
2.1主要目的
複合解析の主要目的は、乳児用調合乳または低温殺菌母乳に入れて投与された時の、プラセボと比較した組換えヒト胆汁酸活性化リパーゼ(rhBSSL)を用いた治療後の発育の改善を証明することであった。
【０１６３】
2.2副次的目的
副次的目的は以下の通りであった。
・乳児用調合乳または低温殺菌母乳に入れて投与された時の、プラセボと比較したrhBSSLを用いた治療後の早産児における脂肪吸収の改善を証明する。
・乳児用調合乳または低温殺菌母乳に入れて投与された時の、rhBSSLを用いた治療後の早産児における膝から踵までの長さを、プラセボを用いた治療後の早産児における膝から踵までの長さと比較する。
・乳児用調合乳または低温殺菌母乳に入れて投与された時の、早産児におけるrhBSSLの安全性および忍容性を評価する。
【０１６４】
3試験デザイン
2つの試験の試験デザインおよび手順は授乳法以外は同一であった(試験BVT.BSSL-020では調合乳を使用し、試験BVT.BSSL-021では低温殺菌乳を使用した)。従って、2つの試験からのデータの複合は適切である。それぞれの試験は、評価可能な26人の患者を得るために32人の患者を登録する計画を立てた。
【０１６５】
最初の7日間、患者を、最終濃度0.15g/LのrhBSSLが添加された乳児用調合乳/低温殺菌母乳または滅菌注射用水が「添加された」乳児用調合乳/低温殺菌母乳(プラセボ)に無作為化した。2日間のウォッシュアウト期間後、次の7日間の治療期間、患者を他の治療レジメンに「クロスオーバー」した。CFA評価のために、それぞれの治療期間の最後の3日間(72時間)、糞便試料を収集した。
【０１６６】
全ての組み入れ基準が満たされ、除外基準がどれも満たされなかった後、患者を登録し、新生児集中治療室においてこれらの試験に無作為化した。020試験に登録する前に他の乳児用調合乳が与えられた乳児は、登録日に、その時に使用していた調合乳から試験調合乳に切り替えられた。Eoprotin以外の乳強化剤が与えられていた021試験の患者については、乳強化剤を中断する。および/または初回投与の少なくとも2日前にEoprotinに切り替えることが必要であった。
【０１６７】
試験デザインを図2.1に示した。
【０１６８】
試験評価計画を以下の表2.1に示した。
【０１６９】
(表2.1.)試験評価計画
0005850940.tif 000004
*来診1および来診2は同時に行うことができた。全てのベースライン評価は試験薬物投与前に実施され、CRFに記録された。
**糞便の収集は第1の色素が現れてから、第2の色素が現れるまで続けた。第2のマーカーを含有する糞便は収集しなかった。
***試験用調合乳または乳の摂取は、第2の色素が糞便中に現れるまで続けた。
#通常の看護の中で入手可能な時だけ記録した。試験のために、余分な血液試料もECGも採取しなかった。
##来診17は、第2の追跡色素が現れるまで、必要であれば16日目を過ぎて延長した。
###生命徴候は、第2の追跡色素が現れるまで毎日収集した。
【０１７０】
4患者の選択
これらの試験ために選択された患者は、在胎齢32週前に生まれ、かつ登録時に妊娠32週間6日(推定年齢)以下であった乳児であった。これらの試験に登録した乳児には、非経口栄養(グルコースを除く)を与えなかった。
【０１７１】
4.1組み入れ規準
試験に組み入れるために、患者は以下の基準を満たさなければならない。
1.妊娠32週前に生まれ、かつ登録時に妊娠32週6日(推定年齢)以下であった早産児
2.在胎齢に適した早産児(それぞれの実施施設は、その実施施設の発育曲線または手順を使用し、使用された発育曲線または手順のコピーを試験責任者のファイルに保管しなければならない。1箇所の実施施設にいる全ての患者に同じ発育曲線を使用しなければならない)
3.母乳を与えようと考えていない母親をもつ、乳児用調合乳が与えられている早産児
4.経口栄養または経腸栄養(哺乳瓶または経鼻チューブ)が与えられている早産児
【０１７２】
4.2除外基準
以下が存在すれば、試験への組み入れから患者が排除される:
1.非経口栄養(グルコースを除く)が与えられている乳児
2.BVT.BSSL-020の場合:乳強化剤(例えば、Enfamil、Nutriprem、Milupa Eoprotin(商標登録))が与えられている乳児
・初回投与の2日前に強化剤の使用が中断されるのであれば、乳強化剤が与えられている他の点で資格のある乳児が登録されることがある。
BVT.BSSL-021の場合:Eoprotin(登録商標)(例えば、Enfamil、Nutriprem)以外の乳強化剤が与えられている乳児
・初回投与の2日前に強化剤の使用が中断されるのであれば、Eoprotin(登録商標)以外の乳強化剤が与えられた他の点で資格のある乳児が登録されることがある。
3.機械的換気を必要とする乳児
4.胎内発育遅延(SGA)児
5.>30％O2を必要とする乳児
6.光線療法を受けている乳児(光線療法を完了し、他の点で試験資格のある赤ん坊が登録されることがある)
7.グレードIIIもしくはIVの脳室周囲出血もしくは脳室内出血、髄膜炎または水頭症、グレードIIIもしくはIVの頭蓋内出血、脳室周囲白質軟化症を含む重篤な脳疾患をもつ乳児
8.発育および発達に影響を及ぼす可能性のある重大な異形症または先天性異常
9.血行力学的に重大な動脈管遺残(PDA)をもつ乳児
10.敗血症の臨床エビデンス(少量もしくは多量の白血球数および/または少量の血小板数、ならびに細菌学的に証明された全身感染エビデンスを含む)
11.先天性感染症(例えば、CMV)の記録
12.壊死性腸炎の存在
13.出血性肺事象
14.ヒドロコルチゾン以外のコルチコステロイドを用いた前治療または併用治療
15.試験責任者の意見によって患者が組み入れに不適切になる任意の状態
16.スクリーニング来診の2日以内から追跡調査来診が完了するまで、同時に行われている別の臨床研究に登録していること
【０１７３】
4.3療法または評価からの対象の除去
試験責任者の意見で医学的に必要であれば、または患者の親もしくは法的な保護者の希望があれば、患者は試験薬物から脱落した。
治療からの脱落の他の理由は以下を含んでもよい。
・試験への不正確な組み入れ
・重大なプロトコル違反
・有害事象
【０１７４】
5治療
5.1投与された治療
投与された調合乳または乳の量は、毎朝、CRFに記録された時の患者の体重に基づいた。調合乳または低温殺菌母乳の中のrhBSSL濃度は0.15g/Lで一定していた。無作為化計画に応じて、rhBSSLを含む、rhBSSLを含まない調合乳(試験020)または低温殺菌母乳(試験021)を7日間、患者に与えた。患者がプラセボに割り当てられた時に、対応する量の滅菌注射用水(WFI)を、rhBSSLを含まない低温殺菌母乳に添加した。毎朝、投与された調合乳/乳の量をCRFに記録した。
0005850940.tif 000005
*乳児には約150〜180mLの乳/kg体重/日を与えた。特定の乳児に対するmL/kg単位での授乳量は両期間とも一定であった。
【０１７５】
5.2治験薬の情報
例示のセクション1(前記)に記載のように、組換えヒトBSSL原薬および治験薬製品(IMP)を調製した。
【０１７６】
組換えヒトBSSLを、10mLガラスバイアルに入っている冷凍経口溶液として与えた。濃度は15mg/mLであり、充填体積は1.3mLであった。試験薬物は、部外者が近づけない試験センターの場所に冷凍保管(-25℃〜-15℃)しなければならなかった。
【０１７７】
投与前に、冷凍溶液を解凍し、食品中に最終濃度0.15g/Lとなるように、0.9mLアリコートのrhBSSL溶液を90mLの調合乳(試験020)または低温殺菌母乳(試験021)に移した。プラセボ調合乳/乳を、rhBSSL溶液の代わりに0.9mLの滅菌水を使用して同じように調製した。
【０１７８】
これらの両試験において2つのIMPロットを使用した。
【０１７９】
サプリメントとしての強化剤Eoprotin(登録商標)の添加は試験021(母乳)全体を通じてしか許可されなかった。しかしながら、Eoprotin(登録商標)の量は治療期間中に一定でなければならなかった。
【０１８０】
5.3濃度の選択
低温殺菌乳および調合乳に添加されるrhBSSLの濃度は、母乳に通常存在する0.1〜0.2g/Lのレベルに基づいて選択された。
【０１８１】
5.4盲検化
無作為化計画は、Biovitrumの委任された者によって安全で施錠された場所において維持され、データベースのロックがなされるまで病院職員にも、試験責任者にも、Biovitrum従業員にも、親にも明らかにされなかった。調合乳または低温殺菌母乳へのrhBSSL/プラセボの添加は、治療の割り付けを知っており、患者の評価に関与しない薬剤師または委任された者によって行われた。
【０１８２】
5.5前療法および併用療法
試験責任者の自由裁量で、患者の幸福に必要とみなされた他の療法を与えることができた。このような全ての療法をCRFに記録した。非経口栄養(グルコースを除く)、最初の治験薬投与の2日以内から最後の投与の2日後までの乳強化剤(前記の試験021におけるEoprotinを除く)、およびヒドロコルチゾンを除くコルチコステロイドの併用投与が試験中に禁止された。試験中の他の薬物は試験薬物と併用されなかった。患者は、別の臨床研究に同時参加することが許されなかった。
【０１８３】
早産児は、治療介入を必要とする合併症を経験することが多い。これは、薬物療法が授乳を妨げない限り許容することができた。併用薬物療法によって非経口栄養が必要とされた場合、患者は試験から脱落した。同様に、壊死性腸炎または腹部閉塞などの経腸栄養の吸収に影響を及ぼす合併症が発症した場合は、患者は試験への参加を中断する必要があった。
【０１８４】
72時間の糞便収集中に、皮膚刺激治療のための軟膏を使用することは禁止された。皮膚を乾燥した状態に保つために、72時間の収集期間中に、おむつを頻繁に交換した。糞便収集の中断につながる、発疹が重篤な患者は試験から脱落した。
【０１８５】
6複合データに関する解析のための試験評価
6.1それぞれの試験における効力評価
6.1.1体重
患者の体重を、秤を用いてグラム単位で少なくとも+/-5グラムの正確度で毎日記録し、CRFに入力した。可能な限り、毎日、ほぼ同じ時間に体重を測定した。
【０１８６】
6.1.2試料の収集
試験BVT.BSSL-021では4〜7日目および13〜16日目に、母乳のアリコートを採取した後にrhBSSLまたはプラセボを添加した。
【０１８７】
CFAを求めるために、脂肪、すなわち、調合乳または乳の摂取に対応する期間にわたり、それぞれの治療期間が終わるまで72時間、糞便の収集を行った。それぞれの実施施設に支給されたおむつを糞便収集に使用した。2つの治療期間中に、カルミン赤色追跡色素をマーカーとして食事(正午ごろ)と一緒に4日目および13日目にそれぞれ与えた。糞便収集は、糞便中に第1のカルミン赤色マーカーが現れるのと同時に開始した。第1のマーカーを含有する糞便を収集し、収集された第1の糞便の日時をCRFに記録した。第1の赤色マーカーを投与して72時間後に、第2のカルミンマーカーを与え、第2のカルミンマーカーが現れるまで糞便収集を続けた。第2のマーカーを含有する糞便を収集しなかったが、第2のマーカーが現れた日時をCRFに記録した。おむつをあてる前、取り外した後に秤量し、重量の差をCRFに記録した。それぞれの収集の時間および収集期間全体の経過期間もCRFに記録した。糞便収集期間中に皮膚刺激治療のための軟膏を使用することは禁止された。皮膚を乾燥した状態に保つために、収集期間中に、おむつを頻繁に交換した。糞便収集の中断につながる、発疹が重篤な患者は試験から脱落した。具体的な収集方法を別の実験マニュアルに示した。該当する場合には、両治療期間の糞便収集期間からの吐瀉物を秤量した。小さな布/リネンを秤量し、各乳児の頭の下に置いた。布/リネンが吐瀉物で汚れた時、布/リネンを取り外し、再秤量した。乳児から吐瀉物を取り除くために追加の布が用いられた場合には、その布も使用前後に秤量した。吐瀉物の重量(総重量-布/リネンの重量)をCRFに記録した。他の全ての食品の損失、例えば、哺乳瓶に残っている調合乳または乳を測定し、授乳ごとに摂取された調合乳の体積の計算において、その量を考慮に入れた。
【０１８８】
それぞれの収集期間中に使用した全てのおむつおよび紙ナプキンを収集した。これらを密封式バックに入れ、患者IDおよび日時を付け、分析検査室に発送するまで-20℃で保管した。
【０１８９】
6.1.3試料分析
糞便試料、調合乳(試験020)および乳アリコート(試験021)は中央研究所によって分析された。糞便および食品中にある長鎖多価不飽和脂肪酸DHAおよびAAを含む個々の脂肪酸を、Folch法による抽出後にガスクロマトグラフィー法によって定量した。両試験とも、脂肪酸分離のためにOmegawax 250カラム(Supelco)を使用した。しかしながら、DHAと、母乳にしか存在しないネルボン酸(C24:1)が共溶出するので、試験021からの試料のDHAを定量するために、試験021からのパー・プロトコル解析対象集団の患者からの試料をSP-2380カラム(Supelco)を用いて分析もした。このカラムを用いるとDHAおよびC24:1は良好に分離されるが、調合乳および乳の中にある他の脂肪酸を全て分離するには適していない。従って、試験021(母乳)からのこれらの試料からの個々の脂肪酸を、SP-2380カラム(DHA用)およびOmegawax 250カラム(他の全ての脂肪酸用)を(別々に)使用して分離および分析した。総脂質は個々の脂肪酸の合計として計算した(セクション7.5.1を参照されたい)。同じ分析原理を用いて、試験に使用した調合乳バッチおよび母乳アリコートのそれぞれにある脂質を測定した。
【０１９０】
6.1.4膝から踵までの長さ
患者の脚の長さを膝から踵まで、これらの部位に提供された膝高計(knemometer)を用いて測定した。膝から踵までの長さをミリメートル単位でCRFに記録した。可能な限り、毎日、ほぼ同じ時間に、同じ人間によって長さを測定した。測定を3回行い、平均値をCRFに入力した。
【０１９１】
6.2安全性評価:有害事象
それぞれの試験における有害事象(AE)報告期間は治験薬の初回投与時(1日目)から開始し、追跡調査来診(試験薬物摂取量を最後に投与して1週間±3日後)に終了した。有害事象報告期間中に患者において生じた全てのAEは、事象が薬物療法/製品に関連するとみなされたかどうかに関係なく報告された。さらに、AE報告期間後に発生し、治験製品に関連する可能性が低い、治験製品に関連する可能性が高い、または治験製品に確実に関連すると試験責任者が評価した既知の不都合な事象もAEとして報告された。
【０１９２】
7統計法
7.1解析集団
・安全性解析対象集団:無作為化治験薬(rhBSSLまたはプラセボ)が少なくとも1回投与された全ての無作為化患者。安全性変数の解析は、安全性解析対象集団を用いて実施された。
・最大の解析対象集団(FAS):無作為化治験薬が少なくとも1回投与され、両治療期間においてベースラインおよび少なくとも1回のベースライン後の体重評価を受けた、全ての無作為化患者。
・パー・プロトコル解析対象集団(PP):妥当なコンプライアンスを有し、他の重大なプロトコル違反のない、FASに組み入れられた全ての患者。
【０１９３】
それぞれの試験の中でPP解析対象集団の資格のある患者の評価を、それぞれの試験のデータベースのロックおよび盲検解除の前に実施した。FASおよびPPの両方について、複合データセットは個々の試験と正確に同じ患者を組み入れた。
【０１９４】
7.2複合解析の統計目的
7.2.1主要効力目的および仮説
2つの試験からの複合データに対する解析の主要目的は、乳児用調合乳または低温殺菌母乳に入れて投与された時の、プラセボと比較したrhBSSLを用いた治療後の発育の改善を証明することであった。
【０１９５】
発育速度に関して治療間に差はないという帰無仮説を立てた。対立仮説は、以下:rhBSSLは、乳児用調合乳または低温殺菌母乳に入れて投与された時にプラセボと比較して発育速度を改善する、であった。
【０１９６】
7.2.2副次的効力目的
2つの試験からの複合データに対する解析の副次的効力目的は以下の通りであった。
・乳児用調合乳または低温殺菌母乳に入れて投与された時の、プラセボと比較したrhBSSLを用いた治療後の早産児における脂肪吸収の改善を証明する。
・乳児用調合乳または低温殺菌母乳に入れて投与された時の、rhBSSLを用いた治療後の早産児における膝から踵までの長さを、プラセボを用いた治療後の早産児における膝から踵までの長さと比較する。
【０１９７】
CFAに関して治療間に差はないという帰無仮説を立てた。対立仮説は、以下:rhBSSLは、乳児用調合乳または低温殺菌母乳に入れて投与された時にプラセボと比較して脂肪吸収を改善する、であった。
【０１９８】
膝から踵までの長さに関して統計仮説検定は実施されなかった。
【０１９９】
7.2.3安全性目的
2つの試験からの複合データに対する解析の安全性目的は、乳児用調合乳または低温殺菌母乳に入れて投与された時の早産児におけるrhBSSLの安全性および忍容性を評価することであった。
【０２００】
7.3患者の内訳
患者の内訳は治療シークエンス(treatment sequence)によってまとめられ、両試験において無作為化された全ての患者に基づいた。要約表には、無作為化された患者の数、それぞれの試験を完了した患者の数(％)、それぞれの試験から中断した患者の数(％)、および中断のそれぞれの理由の患者の数(％)が含まれた。要約表はまた、安全性、FAS、およびPP解析対象集団に組み入れられた患者の数(％)、ならびにそれぞれの治療期間を完了した患者の数(％)も報告した。
【０２０１】
7.4患者の人口統計学的特性およびベースライン特性
人口統計学的特性には、治験薬の初回投与時の実際の年齢および推定在胎齢、出生時の在胎齢、性別、人種、ならびに民族が含まれた。ベースライン特性には膝から踵までの長さおよび体重が含まれた。人口統計学的特性およびベースライン特性について2つの概要表を示した。最初の表は治療シークエンスによる複合データの要約を示し、第2の表は、試験による人口統計学的特性およびベースライン特性の要約を示す。連続変数を、患者の数、平均、標準偏差(SD)、中央値、最小値、および最大値によってまとめた。カテゴリカル変数を、それぞれのカテゴリーにおける患者の数およびパーセントによってまとめた。
【０２０２】
7.5効力解析
これらの2つの試験において収集された全ての効力データを、それぞれの試験および複合解析について記述統計学を用いてまとめた。序論で述べたように効力目的に従って個々の試験の効力解析を行った(これらの解析の結果は本報告に示さない)。
【０２０３】
2つの試験からの複合データに対する解析の主要解析は、0.05のα有意水準を用いた両側検定に基づいた。ステップワイズ逐次検定法(stepwise sequential testing procedure)を用いて、0.05の多重有意水準(multiple level of significance)を確実にした。
・第1段階:0.05のα有意水準を用いて、発育速度に関して治療間に差はないという帰無仮説を検定した。帰無仮説が棄却されたら、逐次検定法の第2段階を行った。
・第2段階:0.05のα有意水準を用いて、CFAに関して治療間に差はないという帰無仮説を検定した。帰無仮説が棄却されたら、CFAに関して確認主張(confirmatory claim)も行った。
【０２０４】
この多重比較法は多重有意水準が5％以下になることを確認する。
【０２０５】
主要効力解析および副次的効力解析は、それぞれの治療の点推定値および推定値の周囲にある95％信頼区間ならびに対応する95％信頼区間に付随する治療間の差の推定値を報告する。前述の発育速度およびCFA以外の変数について仮説検定は実施されなかった。
【０２０６】
連続変数を、n、平均、SD、中央値、最小値、および最大値を用いてまとめた。カテゴリカル変数を、それぞれのカテゴリーにおける患者の数およびパーセントを用いてまとめた。
【０２０７】
期間中の発育速度の計算時に最終評価が得られなければ、発育速度は最後の入手可能な評価において計算され、最終日に繰り越された。他のやり方で、欠測データの補定(imputation)は実施されなかった。
【０２０８】
7.5.1解析のための効力変数
主要効力変数は以下であった。
・発育速度(g/kg/日):発育速度を、第1の期間については、(第1の期間における最終評価時の体重-1日目の体重)を[1日目および(第1の期間における最終評価の日-1)の体重]で割ったものと定義し、第2の期間については、(第2の期間における最終評価時の体重-10日目の体重)を[10日目および(第2の期間における最終評価の日-10)の体重]で割ったものと定義した。
【０２０９】
副次的効力変数は、以下:
・それぞれの治療期間の最後の3日(72時間)の間、追跡マーカー間に収集された食物試料および糞便試料において測定されたCFA
であった。
【０２１０】
CFAを、[食物中の脂肪(g/期間)の-糞便中の脂肪(g/期間)]/[食物中の脂肪(g/期間)] *100として計算した。
【０２１１】
食物中の脂肪を、([食物(mL)-吐瀉物(mL)] * [食物中の脂肪含有率(g/100mL)]/100として計算した。この式は、以下:(a)吐瀉物中の脂肪含有率は食物中の脂肪含有率と同じである;(b)吐瀉物の密度は食物の密度と同じである、という仮定に基づいた。
【０２１２】
食物(調合乳または低温殺菌母乳)の脂肪含有率を、糞便解析と同じ方法を用いて決定し、同じ検査室によって実施した。食物(mL)および吐瀉物(mL)を、第1の追跡摂取時または第1の追跡摂取後および第2の追跡摂取前に記録された食物または吐瀉物の総量として計算した。吐瀉物をCRFにグラム単位で記録した。従って、吐瀉物(mL)を吐瀉物(g)/密度として記録した。
【０２１３】
2つの試験間の糞便中の脂肪(g/期間)および食物中の脂肪含有率(g/100mL)の計算には違いが1つあった。この違いは、以下に記載のように、乳および調合乳の中の異なる脂肪酸含有率に関する。
【０２１４】
BVT.BSSL-020:
それぞれの脂肪酸が検査室によってmg単位で示されたので、糞便中の脂肪(g/期間)を、以下の脂肪酸:C12:0、C14:0、C16:0、C18:0、C18:1、C18:2n-6、C18:3n-3、C20:4n-6、およびC22:6n-3の合計を1000で割ったものとして計算した。
【０２１５】
食物中のそれぞれの脂肪酸をg/100mLの単位で示した。食物中の脂肪含有率(g/100mL)を糞便と同じ脂肪酸の合計として計算した。
【０２１６】
BVT.BSSL-021:
それぞれの脂肪酸が検査室によってmg単位で示されたので、糞便中の脂肪(g/期間)を、以下の脂肪酸:C12:0、C14:0、C16:0、C16:1、C18:0、C18:1、C18:2n-6、C18:3n-3、C18:3n-6、C20:1、C20:2n-3、C20:3n-6、C20:4n-6、C22:6n-3、およびC24:1の合計を1000で割ったものとして計算した。
【０２１７】
食物中のそれぞれの脂肪酸をg/100mLの単位で示した。食物中の脂肪含有率(g/100mL)を糞便と同じ脂肪酸の合計として計算した。
【０２１８】
複合解析:
CFAデータの複合統計解析には、2つの個々の試験のそれぞれからの、それぞれの乳児/治療期間について計算された全CFA値が用いられた。
・長さの変化(mm):長さの変化を、第1の期間における1日目〜7日目および第2の期間における10日目〜16日目の膝から踵までの長さの変化と定義した。
【０２１９】
7.5.2効力解析法
主要効力解析および副次的効力解析は、2つの試験からの複合データのFASに基づいた。補助的な効力解析は、2つの試験からの複合データのPP解析対象集団に基づいた。さらに、それぞれの効力変数を、FAS解析対象集団およびPP解析対象集団に対する試験によって解析した。
【０２２０】
主要効力アウトカムである発育速度を、分散分析(ANOVA)によって、因子として治療、レジメン(低温殺菌母乳または乳児用調合乳)、期間、シークエンス、ならびにレジメンおよびシークエンスの中で入れ子にされた患者を用いて解析した。全ての主効果を、ANOVAモデルからの残差平均平方に対して検定した。
【０２２１】
シャピロ-ウィルク検定を用いて、複合データに基づく発育速度分布の正規性仮定(normality assumption)を検定した。正規性仮定に従わなければ、順位値(ranked value)をANOVAに使用した。
【０２２２】
副次的効力アウトカムである、それぞれの治療期間の最後の3日間からのCFAを、発育速度と同じように分散分析(ANOVA)によって、因子として治療、レジメン(低温殺菌母乳または乳児用調合乳)、期間、シークエンス、ならびにレジメンおよびシークエンスの中で入れ子にされた患者を用いて解析した。
【０２２３】
治療による食物中の総脂肪量および糞便中の総脂肪量の記述統計学を示した。
【０２２４】
別の副次的効力アウトカムである膝から踵までの長さの変化を、共分散分析(ANCOVA)によって、因子として治療、レジメン、期間、シークエンス、ならびにレジメンおよびシークエンスの中で入れ子にされた患者を用いて、共変量(covariate)としてベースライン値を用いて解析した。
【０２２５】
7.6安全性解析:有害事象
全ての有害事象(AE)解析は、両試験からの複合データの安全性解析対象集団に基づく。記述統計学を用いて結果を示した。仮説検定は実施しなかった。
【０２２６】
いずれかの試験の間に報告された全てのAEを器官別大分類(SOC)および優先使用語(PT)によって分類するために、MedDRA用語集バージョン10.0が用いられた。全ての要約表には、治療下で発現した有害事象(TEAE)のある患者の数が含まれた。それぞれの個々の試験においてTEAEの評価がなされた。TEAEは、試験薬物の開始時または開始後に発症し、かつ試験薬物の最後の投与後14日以内(重大なAEの場合は30日以内)に発症したAE、または試験薬物開始時に進行中であり、重篤度が増大したか、もしくは治療期間中に試験薬物との関連が密接になったAEと定義された。全てのTEAE、治療に関連するTEAE(確実、可能性が高い、および可能性が低い)、SAE、ならびに試験薬物の脱落につながるTEAEを、MedDRA SOC、PT、および治療によってまとめた。発生率(患者の割合)およびそれぞれのTEAEの数をまとめた。さらに、TEAEを、最大重篤度(軽度、中程度、または重度)によってまとめた。TEAEを全てまとめたものを治療シークエンスによって示し、(1)BSSLのみ;(2)プラセボのみ;(3)BSSLおよびプラセボ;ならびに(4)治療なしに割り振られた、それぞれの治療シークエンスのTEAE患者の合計および数(％)によって示した。
【０２２７】
8結果
8.1患者の内訳
治療シークエンスによる2つの試験における患者の内訳をまとめたものを表2.2に示した。試験による患者の内訳も収集し、まとめた(本報告には示していない)。
【０２２８】
(表2.2)患者の内訳
0005850940.tif 000006
a安全性解析対象集団は、無作為化治験薬が少なくとも1回投与された全ての患者を含む。
b最大の解析対象集団は、無作為化治験薬が少なくとも1回投与され、両治療期間においてベースラインおよび少なくとも1回のベースライン後の体重評価を受けた全ての無作為化患者を含む。
cパー・プロトコル解析対象集団は、妥当なコンプライアンスを有し、他の重大なプロトコル違反のない、FASの中の患者を含む。
d期間完了とは、治療期間において治験薬が7日間投与された患者と定義した。
【０２２９】
両試験全体にわたって合計65人の患者を無作為化した:BVT.BSSL-020では33人の患者、BVT.BSSL-021では32人の患者。合計63人の患者は、無作為化治験薬が少なくとも1回投与され、安全性解析対象集団に組み入れられた:BVT.BSSL-020では33人の患者、BVT.BSSL-021では30人の患者。FASは、安全性解析対象集団内にあり、かつ両治療期間中にベースラインおよび少なくとも1回のベースライン後の体重評価を受けた合計60人の患者を組み入れた:BVT.BSSL-020では33人の患者、BVT.BSSL-021では27人の患者。合計46人の患者をPP解析対象集団に組み入れた:BVT.BSSL-020では26人の患者、BVT.BSSL-021では20人の患者。不完全または不正確な糞便収集のためにPP解析対象集団に組み入れられなかった14人の患者がいた。
【０２３０】
安全性解析対象集団の63人の患者のうち、31人の患者をrhBSSL/プラセボ治療シークエンスに無作為化し、32人の患者をプラセボ/rhBSSLに無作為化した。合計61人の患者が期間1を完了し、合計59人の患者が期間2を完了した。4人の患者を除く全員が試験を完了した。これらの4人の患者はAEにより中断した。
【０２３１】
8.2人口統計学的特性およびベースライン特性
治療シークエンスによる2つの試験における複合データの人口統計学的特性およびベースライン特性を以下の表2.3に示した。試験による人口統計学的特性およびベースライン特性も収集し、まとめた(本報告には示していない)。
【０２３２】
(表2.3) 人口統計学的特性およびベースライン特性
0005850940.tif 000007
a初回投与日の齢
b膝高計を用いて測定した
【０２３３】
複合解析において、rhBSSL/プラセボに無作為化された患者の初回投与日の平均年齢(4.14週間)は、プラセボ/rhBSSLに無作為化された患者の平均年齢(3.60週間)と比較して高かった。他の人口統計学的特性およびベースライン特性は治療シークエンス間で同等であった。
【０２３４】
2つの試験間の初回投与日の平均年齢の差も注目に値した。BVT.BSSL-020における患者の平均年齢(3.39週)はBVT.BSSL-021における平均年齢(4.39週)と比較して低かった。BVT.BSSL-020における出生時の平均在胎齢(29.18週)はBVT.BSSL-021(28.13週)より約1週間長かった。しかしながら、初回投与日の在胎齢は2つの試験において類似していた。民族の違いも2つの試験間で観察された。BVT.BSSL-020におけるヒスパニック患者またはラティーノ患者のパーセント(63.6％)はBVT.BSSL-021(16.7％)と比較して高かった。他の人口統計学的特性およびベースライン特性は試験間で同等であった。
【０２３５】
8.3治療コンプライアンス
試験BVT.BSSL-020における治療コンプライアンスを以下の表2.4にまとめ、試験BVT.BSSL-021については表2.5にまとめた。
【０２３６】
(表2.4)治療試験BVT.BSSL.020による治療コンプライアンス
0005850940.tif 000008
【０２３７】
(表2.5)治療試験BVT.BSSL.021による治療コンプライアンス
0005850940.tif 000009
【０２３８】
8.4効力解析
8.4.1主要効力変数
複合解析における主要効力変数は発育速度であった。FAS解析対象集団およびPP解析対象集団における2つの臨床研究の複合解析に基づく発育速度の複合結果を表2.6に示した。FAS解析対象集団およびPP解析対象集団に基づく試験による発育速度解析結果を、それぞれ、表2.7aおよび表2.7bに示した。
【０２３９】
(表2.6)FAS解析対象集団およびPP解析対象集団における発育速度(g/kg/日)の解析
0005850940.tif 000010
【０２４０】
FAS解析対象集団およびPP解析対象集団において、2つの臨床研究の複合結果は、プラセボ治療と比較してrhBSSL治療中に有意な発育速度の増大を示した。FASでは、発育速度LS平均は、rhBSSLでは16.86g/kg/日、プラセボでは13.93g/kg/日であった。rhBSSLとプラセボとの発育速度の差は統計的に有意であった。LS平均差(rhBSSL-プラセボ)は2.93g/kg/日(p<0.001)であった。PP解析対象集団において、2.08g/kg/日のLS平均差(rhBSSL-プラセボ)も統計的に有意であった(p=0.019)。
【０２４１】
以下の表2.7aは、FAS解析対象集団における2つの臨床研究それぞれの発育速度結果を示す。表2.7bはPP解析対象集団の発育速度結果を示す。
【０２４２】
(表2.7a)FAS解析対象集団における試験による発育速度(g/kg/日)の解析
0005850940.tif 000011
【０２４３】
プラセボと比較したrhBSSL治療中の発育速度の改善は、試験BVT.BSSL-021より試験BVT.BSSL-020において顕著であった。FASに基づいて、BVT.BSSL-020試験では、LS平均差(rhBSSL-プラセボ)は3.74g/kg/日(p=0.001)であったのに対して、BVT.BSSL-021試験では1.95g/kg/日(p=0.119)であった。試験による類似結果がPP解析対象集団において観察された(表2.7bを参照されたい)。
【０２４４】
表2.7aからの別の観察は、調合乳が与えられた患者の体重が、低温殺菌母乳が与えられた患者より急速に増加したことであった。FASにおいて、rhBSSL治療中の平均発育速度はBVT.BSSL-020では18.06g/kg/日、BVT.BSSL-021では15.54g/kg/日であり、プラセボ治療中では、それぞれの試験において14.29g/kg/日および13.63g/kg/日であった。類似結果がPP解析対象集団において観察された(表2.7bを参照されたい)。
【０２４５】
シャピロ-ウィルク検定を用いて、複合データに基づく発育速度分布の正規性仮定を検定した。正規性の検定はFASにおいて有意であった(p値<0.001)。このことから、正規性仮定に従わなかったことが分かる(PP解析対象集団について類似結果が見られた)。従って、順位値を用いた発育速度の解析も行った。この感度分析の結果は、結果として生じた<0.001のp値を用いた主要解析と一致した。このことは、プラセボと比較してrhBSSL治療中に発育が有意に改善したことを証明している。
【０２４６】
(表2.7b)PP解析対象集団における試験による発育速度(g/kg/日)の解析
0005850940.tif 000012
【０２４７】
8.4.2副次的効力変数
副次的効力変数は、それぞれの治療期間の開始から終了までのCFAおよび膝から踵までの長さの変化であった。
【０２４８】
CFA
PP解析対象集団の患者しか、CFAの決定に必須の完全/正確な糞便収集が行われなかった。従って、本報告における提示は、FAS解析対象集団およびPP解析対象集団を対象とした2つの臨床研究の複合解析のCFA結果を示した以下の表2.8aを除いて、PP解析対象集団のデータに限定される。PP解析対象集団に基づく試験によるCFA解析結果を表2.8bに示した。
【０２４９】
(表2.8a)FAS解析対象集団およびPP解析対象集団におけるCFA(％)の解析
0005850940.tif 000013
*試験020において1人の患者が糞便収集期間前に脱落した。
【０２５０】
FAS解析対象集団およびPP解析対象集団において、2つの臨床研究の複合結果は、プラセボと比較してrhBSSLにおけるCFAの数値増加を示した。PP解析対象集団において、LS平均CFAはrhBSSL治療中は69.1％、プラセボについては65.5％であった。LS平均差(rhBSSL-プラセボ)は3.56％(p=0.069)であった。
【０２５１】
BVT.BSSL-021におけるプラセボと比較したrhBSSL治療中のCFAの改善はBVT.BSSL-020と比較して大きかった。PPにおいて、LS平均差(rhBSSL-プラセボ)はBVT.BSSL-021では4.86％(p=0.073)、BVT.BSSL-020では2.08％(p=0.462)であった。試験による類似結果がFAS解析対象集団において観察された(表2.8bを参照されたい)。
【０２５２】
(表2.8b)PP解析対象集団における試験によるCFA(％)の解析
0005850940.tif 000014
【０２５３】
表2.9aは、複合解析(PP解析対象集団)における試験による、食物追跡マーカー間に摂取された食物中の総脂肪量、および糞便中の追跡マーカー間に収集された糞便試料からの糞便中の総脂肪量を示す。複合解析のための治療によるデータを表2.9bに示した。
【０２５４】
(表2.9a)PP解析対象集団における試験による食物中の総脂肪量および糞便中の総脂肪量
0005850940.tif 000015
【０２５５】
調合乳が与えられた患者は、低温殺菌母乳が与えられた患者より多くの脂肪を食物から摂取した。PPにおいて、rhBSSL治療(72時間収集期間)中に摂取された食物中の総脂肪量の平均はBVT.BSSL-020において29.12g、BVT.BSSL-021において19.00gであり、プラセボ治療中では、それぞれの試験において28.50gおよび20.51gであった。調合乳が与えられた患者はまた、低温殺菌母乳が与えられた患者より多くの脂肪を糞便中に排泄した。rhBSSL治療中に糞便中に排泄された総脂肪量の平均はBVT.BSSL-020では8.53g、BVT.BSSL-021では6.16gであり、プラセボ中にはそれぞれの試験において8.97gおよび7.56gであった。
【０２５６】
表2.9bは、PP解析対象集団における複合結果について、72時間収集間隔中の食物中の総脂肪量および糞便中の総脂肪量をまとめたものである。脂肪の摂取および脂肪の排泄は2つの治療について同等であった。PPにおける2つの試験からの複合データにおいて、rhBSSL治療中に摂取された食物中の脂肪量の平均は24.72gであり、プラセボ中に摂取された平均量は25.03gであった。糞便中に排泄された脂肪の量は、それぞれ、7.50gおよび8.36gであった。
【０２５７】
(表2.9b)PP解析対象集団における食物中の総脂肪量および糞便中の総脂肪量、複合データ
0005850940.tif 000016
【０２５８】
異なる試験間での摂取された乳児用調合乳または母乳の平均体積間の差、またはrhBSSLを用いた治療期間の間もしくはプラセボを用いた治療期間の間での摂取された体積間の差はほとんどなかった。
【０２５９】
発育速度と脂肪吸収との相関関係
図2.2は、2つの試験からのPP解析対象集団からのデータの複合解析における発育速度の差(rhBSSL-プラセボ)対CFAの差(rhBSSL-プラセボ)を示す。
【０２６０】
このグラフにおいて見られるように、発育速度に対するrhBSSLの効果と脂肪吸収(CFA)に対するrhBSSLの効果との間には統計的に有意な相関関係は無かった(p値0.177)。
【０２６１】
膝から踵までの長さの変化の変化
FAS解析およびPP解析における2つの試験からの複合解析のために膝から踵までの長さの変化の結果を収集し、まとめた(本報告には示していない)。
【０２６２】
FAS解析対象集団またはPP解析対象集団において、両試験からの複合データにおける、または試験による、膝から踵までの長さの変化の測定値の平均に関して治療間で注目に値する差は観察されなかった。
【０２６３】
8.5安全性解析:有害事象
8.5.1曝露の程度
治療曝露を治療時の日数としてまとめたものを以下の表2.19に示した。
【０２６４】
(表2.19)治療曝露の程度-安全性解析対象集団
0005850940.tif 000017
[1]治療時の日数=治療期間の最後の日-治療期間の最初の日+1
【０２６５】
治療曝露の程度は治療間で同等であった。患者の98.4％は7日間のrhBSSL治療を受け、患者の96.8％は7日間のプラセボ治療を受けた。1人の患者が、第2の期間中の3日間のプラセボ治療後にBVT.BSSL-020から中断した。BVT.BSSL-021における3(3)人の患者が第1の治療期間中に中断した:2人の患者が、それぞれ、6日間および7日間のプラセボ治療後に中断し、1人の患者が3日間のrhBSSL治療後に中断した。
【０２６６】
rhBSSLへの曝露をまとめたものを以下の表2.20に示した。
【０２６７】
(表2.20)rhBSSLへの曝露の程度-安全性解析対象集団
0005850940.tif 000018
[1]rhBSSLの総量(g)=0.15g/L* (rhBSSL治療期間中に摂取された食物の総量(L)-rhBSSL治療期間中の吐瀉物の総量(L))。吐瀉物を1日目、2日目、3日目、10日目、11日目、および12日目に収集しなかった。
注:食物中のrhBSSL濃度はプロトコルに従って0.15g/Lである。
【０２６８】
複合解析結果において、摂取されたrhBSSLの平均(SD)量は0.27g(0.052g)であった。
【０２６９】
8.5.2有害事象の概要
TEAEの全発生率を以下の表2.21に示した。
【０２７０】
(表2.21)治療下で発現した有害事象の全体的な概要-安全性解析対象集団
0005850940.tif 000019
関連するとは、確実に試験薬に関連する、試験薬に関連する可能性が高い、または試験薬に関連する可能性があることを含む。
【０２７１】
これらの2つの試験において、63人の患者のうち45人(71.4％)が、合計134件の治療下で発現した有害事象(TEAE)を経験した。治療間で、TEAE患者の割合において観察された注目に値する差はなかった。TEAE患者の割合は試験管で同等であった。BVT.BSSL-020において23人(69.7％)の患者がAEを経験し、BVT.BSSL-021において22人(73.3％)がAEを経験した。しかしながら、BVT.BSSL.021におけるTEAEの総数(81事象)は、BVT.BSSL.020(53事象)と比較して多かった(試験による表形式データは本報告には示していない)。
【０２７２】
2つの試験全体にわたって、2人(3.2％)の患者がプラセボ治療中に1つの重大なTEAEを報告した。4人(6.3％)の患者が、試験からの中断につながる1つのTEAEを報告し(rhBSSL治療中に1人の患者およびプラセボ治療中に3人の患者)、8人(12.7％)の患者が、治療に関連するとみなされた少なくとも1つのTEAEを報告し(rhBSSL治療中に5人の患者、プラセボ治療中に4人の患者。これらの患者のうち1人に、両期間中に関連するTEAEがあった)、1人の患者がプラセボ治療中に死亡した。
【０２７３】
8.5.3有害事象の表示
最も一般的に報告されたTEAE(患者の>=4％において報告された)をまとめたものを以下の表2.22に示した。報告された全てのTEAEをまとめたものを収集し、まとめた(本報告には示していない)。
【０２７４】
(表2.22)最も一般的に報告された治療下で発現した有害事象-安全性解析対象集団
0005850940.tif 000020
注:この表は、患者の>=4％において報告されたAEを含む。患者が特定の優先使用語について2回以上カウントされた場合、その優先使用語について1回カウントされる。
【０２７５】
2つの試験の複合結果における最も一般的なTEAEは、21人(33.3％)の患者によって報告された、おむつかぶれであった。この事象の発生率は治療間で同等であった。最も一般的に報告された他のTEAEは、8人(12.7％)の患者における貧血、6人(9.5％)の患者における心雑音、それぞれ5人(7.9％)の患者によって報告された徐脈および低カリウム血症、ならびにそれぞれ3人(4.8％)の患者によって報告された新生児貧血、血小板血症、および尿路感染であった。プラセボのみで報告された血小板血症を除いて、最も一般的なTEAEが全て両治療において報告された。さらに、BVT.BSSL-020のみで報告された尿路感染およびBVS.BSSL-021のみで報告された低カリウム血症を除いて、最も一般的なTEAEが全て両試験において報告された。
【０２７６】
9結論
複合解析の結果は、以下の結論を裏付ける個々の試験の結果と一致する。
・rhBSSLは、プラセボと比較して、低温殺菌母乳または乳児用調合乳が与えられた早産児において発育を有意に改善する。
・プラセボと比較して、rhBSSL治療後、脂肪吸収の数値改善はあるが、有意な改善はない。
・プラセボと比較して、1週間のrhBSSL治療後、膝から踵までの長さの変化に関して差は観察されなかった。
・乳児用調合乳または低温殺菌母乳に添加されたrhBSSLの忍容性は高かった。
・プラセボと比較して、rhBSSL治療中に安全性プロファイルの明らかな差は観察されなかった。
・調合乳が与えられた患者は、低温殺菌母乳が与えられた患者より多くの脂肪を摂取し、体重が増加した。
【０２７７】
証拠物件A
乳児用調合乳の提案された組成要件-ESPGHANにより推奨された標準(Koletzko et al 2005から改訂した):
0005850940.tif 000021
*非加水分解牛乳タンパク質とタンパク質を基本とする調合乳のタンパク質含有率の決定は、1.8〜2.0g/100kcalの真のタンパク質含有率の測定に基づかなければならない([総N-NPN]x6.25)
†タンパク質含有率が2.25g/100kcal未満の加水分解乳タンパク質を基本とする調合乳を臨床試験しなければならない。
‡スクロース(サッカロース)およびフルクトースは乳児用調合乳に添加してはならない。
§1mg RE(レチノール当量)=1mgオールトランスレチノール=3.33IUビタミンA。レチノール含有率はプリフォームドレチノールとして示されるものとする。これに対して、カロテノイド含有率はビタミンA活性の計算および表示に含めない。
&1mg a-TE(a-トコフェロール当量)=1mg d-a-トコフェロール。
{ビタミンE含有率を少なくともPUFA 1g当たり0.5mg a-TEとする。調合乳中の脂肪酸二重結合数に最小ビタミンE含有率を合わせるために以下の当量係数を使用する:0.5mg a-TE/g リノール酸(18:2n-6);0.75mg a-TE/g a-リノレン酸(18:3n-3);1.0 mg a-TE/gアラキドン酸(20:4n-6);1.25mg a-TE/gエイコサペンタエン酸(20:5n-3);1.5mg a-TE/gドコサヘキサエン酸(22:6n-3)。
#ナイアシンはプリフォームドナイアシンを指す。
**乳児に鉄欠乏リスクがある集団では、最小レベル0.3mg/100kcalを超える鉄含有率が適切な場合があり、これは国の水準で推奨される。
NS、特定せず。
【０２７８】
証拠物件B
任意成分の提案されたレベル-ESPGHANにより推奨された標準(Koletzko et al 2005から改訂した):
0005850940.tif 000022
*ドコサヘキサエン酸(22:6n-3)を乳児用調合乳に添加する場合は、アラキドン酸(20:4n-6)含有率がDHAと少なくとも同濃度に達していなければならない。エイコサペンタエン酸(20:5n-3)含有率はドコサヘキサエン酸含有率を超えてはならない。
【図１】
0005850940.tif 000023
【図２−１】
0005850940.tif 000024
【図２−２】
0005850940.tif 000025
【配列表】
0005850940000001.app