(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）生弱毒化バリセラウイルス、不活弱毒化バリセラウイルス、ｇｐＩ又はｇｐＩＩであるバリセラウイルスの抗原と、
（ｂ）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来のＬＰＳ（リポ多糖）のリピドＡの脱アシル化により生じ、２，０００Ｄａ〜４，０００Ｄａの分子量を有する脱アシル化非毒性ＬＯＳ（リポオリゴ糖）と、
（ｃ）薬剤学的に許容される担体と、
を含むことを特徴とするワクチン医薬組成物（ただし、オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）をアジュバントとして含むものを除く）。
【請求項２】
前記バリセラウイルスの抗原が、生弱毒化バリセラウイルスである請求項１に記載のワクチン医薬組成物。
【請求項３】
前記ワクチン医薬組成物は、免疫補助剤を追加的に含み、前記免疫補助剤は、Ｍｇ、Ｃａ、Ｓｒ、Ｂａ及びＲａからなる群から選択される第２族元素、Ｔｉ、Ｚｒ、Ｈｆ及びＲｆからなる群から選択される第４族元素又はアルミニウムの塩又はその水和物である請求項１に記載のワクチン医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改善された免疫反応を誘導するワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近免疫補助剤が新たに注目を浴びており、子宮頸部癌ワクチン、インフルエンザワクチンなどの多様のワクチンが使用されている。このような免疫補助剤のうち、バクテリアＤＮＡは、１９６０年代から抗癌剤として注目を浴び、現在まで研究が続けられている。しかし、効能が微弱であって、単独では抗癌剤として使用することができない（非特許文献１）。しかし、このような欠点にも関わらず、バクテリアＤＮＡは、重大な副作用無しに、多様な免疫細胞を活性化させることが知られており、特に、アジュバントとして多くの長所があることが確認された（非特許文献２）。
【０００３】
バクテリアＤＮＡのこのような効果について、日本のＹａｍａｍｏｔｏらは、ＣＧを含む回文構造の配列が重要な役割をすることを主張し、米国のＫｒｉｅｇらの研究によって広く知られた（非特許文献３、４）。特に、１９９０年代中盤以後は、ＣｐＧ関連研究の結果でＤＮＡ抗癌剤の関心が非メチル化ＣＧを含む合成ＤＮＡ（ＣｐＧ−ＯＤＮ）の可能性が確認され、特に、短い合成ＤＮＡの分解を抑制するためのジエステル結合におけるＳ置換などが研究された。このような努力により、ＣｐＧ−ＯＤＮ関連製品は、アジュバントだけではなく、抗癌剤としても臨床試験できるようになった（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｌｅｙｐｈａｒｍａ．ｃｏｍ）。
【０００４】
しかし、ＣｐＧ−ＯＤＮのジエステル結合のＳ置換に対する免疫原性問題、及び依然として微弱な抗癌効果などは、解決すべき問題として残っている。現在臨床に使用中であるＣＰＧ７９０９は、ａｎｔｉ−ＤＮＡ  Ａｂを誘発するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであり（非特許文献５）、これは、ＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）など、自己免疫疾患と密接な関係がある（非特許文献６）。また、ホスホロチオエート構造は、ＴＩ  Ａｇに作用し、感染に対する免疫防衛機能に混乱を与えることが知られている（非特許文献７）。
【０００５】
１９５０年代から抗癌効果が知られたＬＰＳの場合、ｎｇレンジの汚染によっても敗血症による死亡を招き得る毒性により、使用が難しかった。特に、ＬＰＳとＤＮＡの結合は、深刻な毒性を示すという意見が一般的であって、ＤＮＡ関連医薬品において、ＬＰＳの除去は、非常に重要な過程と理解された（非特許文献８）。効能面において、ＬＰＳによる免疫増加は、ＤＮＡによるものよりずっと強力であるが、抗癌に重要なＴｈ１タイプではなく、Ｔｈ２タイプの応答であるため、抗癌剤として適していないと考えられた（非特許文献９）。特に、Ｔｈ２タイプ免疫活性は、Ｔｈ１タイプ免疫活性を抑制するため、ＬＰＳのこのような特性は、ＬＰＳを抗癌剤として利用することをさらに難しくした（非特許文献１０）。
【０００６】
ＬＰＳに対する弱毒化試みは絶えず研究されて、特に多糖鎖の除去又はリピドＡの脱アシル基化を通じて毒性を減少させることに成功することができた（非特許文献１１）。例えば、ＬＰＳの多糖鎖を除去して得たリピドＡのリン酸化を通じて得られたモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）の場合、ＬＰＳの毒性を除去した免疫抗癌剤として開発されたが、その効果が微弱であることが知られている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｒｉｘａ．ｃｏｍ）。
【０００７】
一方、本出願人は、上述の免疫補助剤の短所を補完した新規な免疫補助剤を既に開発した（特許文献１（２００７．０７．１０））。
【０００８】
本明細書全体にかけて多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。このような論文及び特許文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】大韓民国特許登録第０７４０２３７号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｇｌｉｃｋ，Ｊ．Ｌ．Ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｂｙ  ＤＮＡ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２７：２３３８，１９６７
【非特許文献２】ＭｃＣｌｕｓｋｉｅ  ＭＪ，ｅｔ  ａｌ．ＣｐＧ  ＤＮＡ  ｉｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｎｄ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｍｉｃｅ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｎｏｖ１；１６１（９）：４４６３−６．１９９８
【非特許文献３】Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｕｎｉｑｕｅ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｅ  ＩＦＮ  ａｎｄ  ａｕｇｍｅｎｔ  ＩＦＮ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：４０７２，１９９２
【非特許文献４】Ｋｒｉｅｇ  ＡＭ，Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ９  ｗｉｔｈ  ＣｐＧ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．Ｍａｒ；６（２）：８８−９５．２００４
【非特許文献５】Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１  Ａｕｇ；１００（２）：１５７−６３
【非特許文献６】Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８６  Ｊｕｌｙ；６（４）：２９２−８
【非特許文献７】Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８  Ｄｅｃ；３５（１８）：１１６１−７０
【非特許文献８】Ｇａｏ  ＪＪ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｉｎｄｕｃｅ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６６（１１）：６８５５−６０，２００１
【非特許文献９】Ｌｅｂｍａｎ  ＤＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ４  ｃａｕｓｅｓ  ｉｓｏｔｙｐｅ  ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｔｏ  ＩｇＥ  ｉｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｃｌｏｎａｌ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．Ｓｅｐ  １；１６８（３）：８５３−６２．１９８８
【非特許文献１０】Ｒｅｎｇａｒａｊａｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈ１／Ｔｈ２  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ．Ｏｃｔ；２１（１０）：４７９−８３．２０００
【非特許文献１１】Ｋａｔｚ  ＳＳ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｅａｃｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｉｎ  ｗｈｏｌｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｄｕｒｉｎｇ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ａ  ｒａｂｂｉｔ  ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｅｘｕｄａｔｅ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．Ｄｅｃ  １７；２７４（５１）：３６５７９−８４  １９９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、従来のワクチンの問題点、特にワクチンの効能を増強できる新規なワクチン組成物を開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、多様な病原体の抗原を利用する免疫化過程において、免疫補助剤として脱アシル化非毒性ＬＯＳ（Ｌｉｐｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、リポオリゴ糖）を免疫補助剤として利用する場合に、従来のワクチンより大きく改善された免疫反応を誘導し、多様な疾患の予防のための優れたワクチンになり得ることを確認することにより、本発明を完成した。
【００１２】
したがって、本発明の目的は、ワクチン医薬組成物を提供することにある。
【００１３】
本発明の他の目的は、樹状細胞の成熟化誘導用の組成物を提供することにある。
【００１４】
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の一様態によると、本発明は、（ａ）結核菌抗原、炭疽菌抗原、ＨＡＶ（Ａ型肝炎ウイルス）の抗原、ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス）の抗原、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）の抗原、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）の抗原、インフルエンザウイルスの抗原、ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）の抗原、Ｈｉｂ（ヘモフィルスインフルエンザｂ菌）の抗原、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の抗原、コリネバクテリウムジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）の抗原、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の抗原、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）の抗原及びバリセラウイルスの抗原からなる群から選択される病原体由来の抗原と、（ｂ）脱アシル化非毒性ＬＯＳ（Ｌｉｐｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、リポオリゴ糖）と、（ｃ）薬剤学的に許容される担体と、を含むワクチン医薬組成物を提供する。
【００１６】
本発明者らは、従来のワクチンの問題点、特にワクチンの効能を増強できる新規なワクチン組成物を開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、多様な病原体の抗原を利用する免疫化過程において、免疫補助剤として脱アシル化非毒性ＬＯＳ（リポオリゴ糖）を免疫補助剤として利用する場合に、従来のワクチンより大きく改善された免疫反応を誘導し、多様な疾患の予防のための優れたワクチンになり得ることを確認した。
【００１７】
本発明は、結核を誘発する結核菌に対するワクチン（結核ワクチン）に有用である。
【００１８】
本発明の結核ワクチンで利用される結核菌抗原は、従来公知の多様な結核菌由来抗原を含み、好ましくは、本発明に適した結核菌抗原は、６５ｋＤ熱ショックタンパク質（ＨＳＰ６５）、抗原８５Ａ（Ａｇ８５Ａ）、抗原８５Ｂ、抗原８５Ｃ、ＥＳＡＴ−６、Ｄｅｓタンパク質、ＭＰＴ３２、ＭＰＴ５１、ＭＰＴ６３、ＭＰＴ６４、ＨｓｐＸ及びホスフェート結合タンパク質１からなる群から選択される少なくとも１種の抗原である。
【００１９】
より好ましくは、本発明の結核ワクチンで利用される結核菌抗原は、抗原８５Ａ（Ａｇ８５Ａ）、ＥＳＡＴ−６、ＨｓｐＸ及びホスフェート結合タンパク質１からなる群から選択される少なくとも１種の抗原である
【００２０】
また、本発明は、炭疽病を誘発する炭疽菌に対するワクチン（炭疽ワクチン）に有用である。
【００２１】
本発明の炭疽ワクチンで利用される炭疽菌抗原は、従来公知の多様な炭疽菌由来抗原を含み、好ましくは、本発明に適した炭疽菌抗原は、ＰＡ（感染防御抗原）、ＬＦ（致死抗原）又はＥＡ（浮腫抗原）であり、より好ましくは、ＰＡ（感染防御抗原）である。
【００２２】
また、本発明は、Ａ型肝炎を誘発するＨＡＶ（Ａ型肝炎ウイルス）に対するワクチンに有用である。本発明のＨＡＶワクチンで利用されるＨＡＶ抗原は、従来公知の多様なＨＡＶ由来抗原を含み、好ましくは、本発明に適したＨＡＶ抗原は、生弱毒化ＨＡＶ、不活弱毒化ＨＡＶ、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ及び３Ｄタンパク質からなる群から選択される抗原であり、より好ましくは、不活弱毒化ＨＡＶである。
【００２３】
本発明は、Ｂ型肝炎を誘発するＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス）に対するワクチンに有用である。本発明のＨＢＶワクチンで利用されるＨＢＶ抗原は、従来公知の多様なＨＢＶ由来抗原を含み、好ましくは、本発明に適したＨＢＶ抗原は、ＨＢｃＡｇ（ｃｏｒｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  ＨＢＶ）又はＨＢｓＡｇ（ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  ＨＢＶ）であり、より好ましくは、ＨＢｓＡｇである。
【００２４】
本発明は、Ｃ型肝炎を誘発するＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）に対するワクチンに有用である。本発明のＨＣＶワクチンで利用されるＨＣＶ抗原は、従来公知の多様なＨＣＶ由来抗原を含み、好ましくは、本発明に適したＨＣＶ抗原は、Ｅ１、Ｅ２又はＮＳ３／４ａ抗原であり、より好ましくは、ＮＳ３である。
【００２５】
本発明は、ＡＩＤＳを誘発するＨＩＶに対するワクチンに有用である。本発明のＨＩＶワクチンで利用されるＨＩＶ抗原は、従来公知の多様なＨＩＶ由来抗原を含み、好ましくは、本発明に適したＨＩＶ抗原は、Ｇａｇ（ｐ５５ｇａｇ）、Ｐｏｌ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｐｕ、Ｅｎｖ又はＮｅｆ抗原であり、より好ましくは、Ｅｎｖ抗原である。
【００２６】
本発明は、インフルエンザなどを誘発するインフルエンザに対するワクチンに有用である。本発明のインフルエンザワクチンで利用されるインフルエンザウイルスの抗原は、従来公知の多様なインフルエンザウイルス由来抗原を含み、好ましくは、本発明に適したインフルエンザウイルス抗原は、エンベロープ糖タンパク質ＨＡ又はＮＡであり、より好ましくは、エンベロープ糖タンパク質ＨＡである。
【００２７】
本発明は、単純ヘルペスなどを誘発するＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）に対するワクチンに有用である。本発明のＨＳＶワクチンで利用されるＨＳＶの抗原は、従来公知の多様なＨＳＶ由来抗原を含み、好ましくは、本発明に適したＨＳＶ抗原は、糖タンパク質ｇＢ、ｇＤ又はｇＨであり、より好ましくは、ｇＢ又はｇＤである。
【００２８】
本発明は、髄膜炎などを誘発するＨｉｂ（ヘモフィルスインフルエンザｂ菌）に対するワクチンに有用である。本発明のＨｉｂワクチンで利用されるＨｉｂの抗原は、従来公知の多様なＨｉｂ由来抗原を含み、好ましくは、本発明に適したＨｉｂ抗原は、ＰＲＰ［ヘモフィルスｂ菌カプセル多糖体（ポリリボシルリビトールリン酸）］又はそのコンジュゲートであり、より好ましくは、ＰＲＰと破傷風毒素のコンジュゲートである。
【００２９】
本発明は、脳髄膜炎などを誘発する脳髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に対するワクチンに有用である。本発明のワクチンで利用される脳髄膜炎菌の抗原は、従来公知の多様な脳髄膜炎菌由来抗原を含み、好ましくは、本発明に適した脳髄膜炎菌抗原は、ＰＩ、ＰＩＩ、ＰＩＩＩ、ピリン、脂質多糖、鉄結合タンパク質又はプロテオソームであり、より好ましくは、プロテオソームである。
【００３０】
本発明は、ジフテリアなどを誘発するコリネバクテリウムジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）に対するワクチンに有用である。本発明のワクチンで利用されるコリネバクテリウムジフテリアの抗原は、従来公知の多様なコリネバクテリウムジフテリア由来抗原を含み、好ましくは、本発明に適したコリネバクテリウムジフテリア抗原は、ジフテリア毒素である。
【００３１】
本発明は、百日咳などを誘発する百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）に対するワクチンに有用である。本発明のワクチンで利用される百日咳菌の抗原は、従来公知の多様な百日咳菌由来抗原を含み、好ましくは、本発明に適したの百日咳菌抗原は、百日咳毒素である。
【００３２】
本発明は、破傷風などを誘発する破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）に対するワクチンに有用である。本発明のワクチンで利用される破傷風菌の抗原は、従来公知の多様な破傷風菌由来抗原を含み、好ましくは、本発明に適した破傷風菌抗原は、破傷風毒素である。
【００３３】
本発明は、水痘などを誘発するバリセラウイルスに対するワクチンに有用である。本発明のワクチンで利用されるバリセラウイルスの抗原は、従来公知の多様なバリセラウイルス由来抗原を含み、好ましくは、本発明に適したバリセラウイルス抗原は、生弱毒化バリセラウイルス、不活弱毒化バリセラウイルス、ｇｐＩ又はｇｐＩＩであり、より好ましくは、生弱毒化バリセラウイルスである。
【００３４】
本発明のワクチン組成物において、最も大きい特徴は、免疫補助剤として脱アシル化非毒性ＬＯＳ（リポオリゴ糖）を利用することである。本明細書で最初に採択される用語‘ＬＯＳ（リポオリゴ糖）’は、ＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）の修飾体であって、天然（ｎａｔｕｒａｌ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ＬＰＳより短い糖鎖を有しており分子量が小さいものを意味する。脱アシル化前ＬＯＳは、好ましくは、分子量が５，０００〜１０，０００Ｄａである。用語‘脱アシル化ＬＯＳ’は、このようなＬＯＳからリピドＡのグルコサミンに−Ｃ（Ｏ）Ｏ−結合を介して結合した脂肪酸が除去され、その結果、ＬＰＯと比較して毒性が大きく減少したものを意味する。脂肪酸は、リピドＡのグルコサミンに−Ｃ（Ｏ）Ｏ−結合及び−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−結合を介して結合されている。本発明の脱アシル化ＬＯＳは、リピドＡの脱アシル化により−Ｃ（Ｏ）Ｏ−結合で結合された脂肪酸が除去されたものを示す。
【００３５】
脱アシル化非毒性ＬＯＳは、多様な方法を通じて製造できるが、本発明者らの先行特許である大韓民国特許登録第０４５６６８１号；ＷＯ２００４／０３９４１３；大韓民国特許登録第０７４０２３７号；及びＷＯ２００６／１２１２３２に開示の方法によって製造できる。例えば、ＬＰＳを強塩基（例えば、２Ｎ  ＮａＯＨ）で処理して脱アシル化し、リピドＡから一部脂肪酸を除去して脱毒素化する。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態によると、本発明で免疫補助剤として利用される脱アシル化非毒性ＬＯＳは、ＬＰＳ（リポ多糖）のアルカリ処理を介したリピドＡの脱アシル化により非毒性化されたものである。前記アルカリの好ましい例は、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｂａ（ＯＨ）２、ＣｓＯＨ、Ｓｒ（ＯＨ）２、Ｃａ（ＯＨ）２、ＬｉＯＨ、ＲｂＯＨ及びＭｇ（ＯＨ）２を含み、より好ましくは、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｂａ（ＯＨ）２、Ｃａ（ＯＨ）２、ＬｉＯＨ及びＭｇ（ＯＨ）２であって、さらに好ましくは、ＮａＯＨ、ＫＯＨ及びＭｇ（ＯＨ）２であり、最も好ましくは、ＮａＯＨである。
【００３７】
ＬＰＳの毒性程度は、当業界に公知の多様な方法を通じて分析できる。例えば、ＬＰＳで処理されたＴＨＰ−１（急性単球性白血病）に分泌されるＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子−α）の量を測定して毒性を分析することができる。本発明の脱アシル化非毒性ＬＯＳは、従来のＬＰＳと比較し、相対的に少ない量のＴＮＦ−α分泌を誘導する。
【００３８】
本発明で利用される免疫補助剤である脱アシル化非毒性ＬＯＳのまた他の特徴は、分子量が一般的に従来利用されるＬＰＳと比較して小さいということである。好ましくは、本発明で利用される脱アシル化非毒性ＬＯＳは、１，５００〜１０，０００Ｄａ、より好ましくは、２，０００〜５，０００Ｄａ、さらに好ましくは、２，０００〜４，０００Ｄａ、よりさらに好ましくは、３，０００〜４，０００Ｄａ、最も好ましくは、３，２００〜３，７００Ｄａの分子量を有するものである。このような分子量は、当業界の通常の方法、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＭＡＳＳを利用して測定できる。
【００３９】
本発明の好ましい実施形態によると、本発明の免疫補助剤脱アシル化非毒性ＬＯＳは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来であり、最も好ましくは、本発明者らが単離した菌であるＥ．ｃｏｌｉ  ＥＧ００２１（ＫＣＣＭ１０３７４）由来のものである。
【００４０】
本発明で利用される脱アシル化非毒性ＬＯＳは、免疫促進（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）効能が従来の免疫補助剤と比較して優れているだけではなく、毒性も遥かに減少しており、本発明のワクチン組成物に非常に適している。下記の実施例で立証したように、ＬＰＳの毒性を除去するためにＬＰＳの多糖鎖を除去して得たリピドＡのリン酸化を通じて得たモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）より、本発明の脱アシル化非毒性ＬＯＳは、毒性が遥かに少ない。
【００４１】
また、下記実施例に示されたように、本発明の脱アシル化非毒性ＬＯＳを種々の病原体の抗原と共に投与した場合、免疫反応が大きく増加することが分かる。
【００４２】
本発明のワクチン組成物は、その基本的な組成、病原体の抗原と脱アシル化非毒性ＬＯＳだけでも十分な免疫反応を誘導して、特定疾患に対する予防効能を奏することができる。選択的に、本発明のワクチン組成物は、他の免疫補助剤を追加的に含むことができ、例えば、Ｍｇ、Ｃａ、Ｓｒ、Ｂａ及びＲａからなる群から選択される第２族元素、Ｔｉ、Ｚｒ、Ｈｆ及びＲｆからなる群から選択される第４族元素又はアルミニウムの塩又はその水和物を含むことができる。前記塩は、好ましくは、オキシド、ペルオキシド、ヒドロキシド、カーボネート、ホスフェート、ピロホスフェート、ハイドロゲンホスフェート、ジハイドロゲンホスフェート、サルフェート、又はシリケートと共に形成される。例えば、本発明のワクチン組成物で追加的に利用できる免疫補助剤は、水酸化物マグネシウムヒドロキシド、マグネシウムカーボネートヒドロキシドペンタヒドレート、チタニウムジオキシド、カルシウムカーボネート、バリウムオキシド、バリウムヒドロキシド、バリウムペルオキシド、バリウムサルフェート、カルシウムサルフェート、カルシウムピロホスフェート、マグネシウムカーボネート、マグネシウムオキシド、アルミニウムヒドロキシド、アルミニウムホスフェート及び水和された硫酸アルミニウムカリウム（Ａｌｕｍ）を含む。最も好ましくは、本発明のワクチン組成物で追加的に利用できる免疫補助剤は、アルミニウムヒドロキシドである。
【００４３】
本発明のワクチン医薬組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に標準的に利用されるものであって、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の医薬組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適した薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ  ｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。
【００４４】
本発明の医薬組成物は、経口又は非経口で投与でき、好ましくは、非経口投与であって、非経口投与の場合は、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与などにより投与できる。
【００４５】
本発明の医薬組成物の適合した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって多様に処方することができる。一方、本発明の医薬組成物の経口投与量は、好ましくは、１日当り０．０００１〜１，０００ｍｇ／ｋｇ（体重）である。
【００４６】
本発明の医薬組成物は、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を利用して製剤化することにより、単位容量形態に製造されるか、又は多用量容器内に入れて製造できる。この際、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。
【００４７】
本発明のワクチン組成物は、病原体に対する免疫反応を大きく誘導し、特定疾患の予防効能に優れているだけではなく、免疫補助剤として利用される脱アシル化非毒性ＬＯＳの毒性がほとんどなく、安全性側面でも非常に優れている。
【００４８】
本発明で利用される脱アシル化非毒性ＬＯＳは、多様な病原体抗原のうち、結核菌抗原、炭疽菌抗原、ＨＡＶ（Ａ型肝炎ウイルス）の抗原、ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス）の抗原、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）の抗原、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）の抗原、インフルエンザウイルスの抗原、ＨＳＶ抗原、Ｈｉｂ（ヘモフィルスインフルエンザｂ菌）の抗原、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の抗原、コリネバクテリウムジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）の抗原、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の抗原、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）の抗原及びバリセラウイルスの抗原に対して特に優れた免疫反応を促進する作用をする。脱アシル化非毒性ＬＯＳのこのような優れた免疫反応促進効果は、下記実施例に立証されている。
【００４９】
本発明の他の様態によると、本発明は、脱アシル化非毒性ＬＯＳを含む樹状細胞の成熟化誘導用の組成物を提供する。
【００５０】
本発明のまた他の様態によると、本発明は、脱アシル化非毒性ＬＯＳを未成熟樹状細胞に処理する工程を含む成熟化樹状細胞の製造方法を提供する。
【００５１】
樹状細胞ワクチンの製造において、生体から分離した樹状細胞を成熟化させなければならない。このような過程で脱アシル化非毒性ＬＯＳは、非常に有用に利用できる。
【００５２】
樹状細胞ワクチンの製造方法によると、未成熟樹状細胞は、単核球又は造血母細胞由来であって、より好ましくは、単核球由来である。単核球から樹状細胞を誘導する方法がより好ましい理由は、多能性造血幹細胞／前駆細胞を使用する方法より比較的早く、均一な性質の樹状細胞を得ることができるからである。
【００５３】
本発明の好ましい実施形態によると、前記単核球は、末梢血液から採集したものである。末梢血液内の前駆細胞（例えば、単核球又は造血幹細胞）から未成熟樹状細胞を得る方法は、末梢血液における他の細胞から前記前駆細胞を分離し、樹状細胞に分化誘導させる過程で実施でき、また、末梢血液における他の細胞から分離せずに前記前駆細胞を樹状細胞に分化誘導させる過程で実施することもできる。
【００５４】
次いで、末梢血液から得た単核球を樹状細胞に分化誘導する。樹状細胞に分化させるために適したサイトカインを含む培地で単核球を培養する。利用されるサイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、ＩＬ−４（インターロイキン−４）、ＩＬ−１３又はこれらの組み合わせである。添加されるサイトカインの適した量は、樹状細胞への分化をするに十分な量であって、各研究者の実験室で実験的に選択されている量である。
【００５５】
単核球から樹状細胞の分化を目的とする第１培養の期間は、サイトカインを使用して進行する場合、標準的に５日以上であり、好ましくは、６〜７日間である。
【００５６】
上述の分化過程で採集した未成熟樹状細胞を利用して最終的に成熟化過程を実施する。即ち、本発明の脱アシル化非毒性ＬＯＳを含む培地を有する培養器で培養し、樹状細胞を成熟化させる。第２培養の期間は、標準的に１０時間以上、好ましくは、２０時間以上であり、例えば、１〜３日間である。
【００５７】
本発明は、効率的に成熟化された樹状細胞ワクチンを製造できる。
【発明の効果】
【００５８】
本発明の特徴及び利点を要約すると、下記の通りである：
（ａ）本発明のワクチン組成物は、病原体由来抗原と免疫補助剤として脱アシル化非毒性ＬＯＳを利用する。
（ｂ）免疫補助剤である脱アシル化非毒性ＬＯＳは、特定病原体に対する免疫反応で非常に優れた免疫促進効能を奏するだけではなく、毒性がほとんどなく、安全性に非常に優れている。
（ｃ）また、脱アシル化非毒性ＬＯＳは、効率的に成熟化された樹状細胞ワクチンを製造できるようにする。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、新規免疫補助剤ＣＩＡ０５が、ＭＰＬより細胞毒性（ＴＮＦ−α分泌）が低いことを示すグラフである。
【図２ａ】図２ａは、本発明の結核ワクチンの効能分析をした実験結果を示すグラフである。結核菌に対する抗原Ａｇ８５Ａを使用した。
【図２ｂ】図２ｂは、本発明の結核ワクチンの効能分析をした実験結果を示すグラフである。結核菌に対する抗原ＨｓｐＸを使用した。
【図２ｃ】図２ｃは、本発明の結核ワクチンの効能分析をした実験結果を示すグラフである。結核菌に対する抗原ホスフェート結合タンパク質１を使用した。
【図２ｄ】図２ｄは、本発明の結核ワクチンの効能分析をした実験結果を示すグラフである。結核菌に対する抗原ＥＳＡＴ−６を使用した。
【図２ｅ】図２ｅは、Ａｇ８５Ａ、ＨｓｐＸ、ＥＳＡＴ−６及び３８ｋＤａの免疫促進能を比較した実験結果を示すグラフである。ＣＩＡ０５（０．５μｇ）及びそれぞれの抗原（各２μｇ）を利用した。
【図３】図３は、本発明の炭疽ワクチンの効能分析をした実験結果を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明のＡ型肝炎ワクチンの効能分析をした実験結果を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明のＢ型肝炎ワクチンの効能分析をした実験結果を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明のＣ型肝炎ワクチンの効能分析をした実験結果を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明のＨＩＶワクチンの効能分析をした実験結果を示すグラフである。
【図８】図８は、本発明のインフルエンザワクチンの効能分析をした実験結果を示すグラフである。
【図９ａ】図９ａは、本発明のＨＳＶ−２（単純ヘルペスウイルス２型）ワクチンの効能分析をした実験結果を示すグラフである。抗原としてｇＤ抗原を利用した。
【図９ｂ】図９ｂは、本発明のＨＳＶ−２（単純ヘルペスウイルス２型）ワクチンの効能分析をした実験結果を示すグラフである。抗原としてｇＢ抗原を利用した。
【図９ｃ】図９ｃは、ｇＤ抗原及びｇＢ抗原の免疫促進能を比較した実験結果を示すグラフである。ＣＩＡ０５（０．５μｇ）及びそれぞれの抗原（各２μｇ）を利用した。
【図１０】図１０は、本発明のＨｉｂ（ヘモフィルスインフルエンザｂ菌）ワクチンの効能分析をした実験結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、本発明の髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ワクチンの効能分析をした実験結果を示すグラフである。
【図１２ａ】図１２ａは、本発明のＤＰＴワクチンの効能分析をした実験結果を示すグラフである。抗原としてジフテリア毒素を利用した。
【図１２ｂ】図１２ｂは、本発明のＤＰＴワクチンの効能分析をした実験結果を示すグラフである。抗原として百日咳毒素を利用した。
【図１２ｃ】図１２ｃは、本発明のＤＰＴワクチンの効能分析をした実験結果を示すグラフである。抗原として破傷風毒素を利用した。
【図１２ｄ】図１２ｄは、ジフテリア毒素、百日咳毒素及び破傷風毒素の免疫促進能を比較した実験結果を示すグラフである。ＣＩＡ０５（０．５μｇ）及びそれぞれの抗原（各２μｇ）を利用した。
【図１３】図１３は、本発明の水痘ワクチンの効能分析をした実験結果を示すグラフである。
【図１４ａ】図１４ａは、マウスＢＭＤＣｓ（骨髄由来樹状細胞）において、樹状細胞の成熟化に対するＣＩＡＯ５（実施例１で製造された免疫補助剤）の効能を分析した結果を示すグラフである。
【図１４ｂ】図１４ｂは、ヒトＭＤＤＣｓ（単球由来樹状細胞）において、樹状細胞の成熟化に対するＣＩＡＯ５（実施例１で製造された免疫補助剤）の効能を分析した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
【実施例】
【００６１】
実施例１：新規免疫補助剤としての非常に短いリポオリゴ糖（ＬＯＳ）ＣＩＡ０５の製造
本発明者らは、健康な人間の腸に住む大腸菌からリポ多糖鎖の長さが非常に短いＬＰＳを有する菌株（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＧ００２１）を既にスクリーニングし、この菌株を寄託機関韓国微生物保存センタに２００２年５月２日付にて寄託し、寄託番号ＫＣＣＭ  １０３７４を付与された（参照：大韓民国特許登録第０４５６６８１号；ＷＯ２００４／０３９４１３；大韓民国特許登録第０７４０２３７号；ＷＯ２００６／１２１２３２）。前記菌株からのＬＰＳ精製は、大韓民国特許登録第０４５６６８１号；ＷＯ２００４／０３９４１３；大韓民国特許登録第０７４０２３７号；及びＷＯ２００６／１２１２３２に開示された方法にしたがって実施した。精製されたＬＰＳの分子量をＭＡＬＤＩ−ＭＡＳＳ（Ｓｈｉｍａｄｚ社、Ａｘｉｍａ−ＬＮＲ  Ｖ  ２．３．５（Ｍｏｄｅ  Ｌｉｎｅｒ、Ｐｏｗｅｒ：１０６））で測定し、測定結果、約３，５００Ｄａの分子量を有することを確認した。精製されたＬＰＳを大韓民国特許登録第０４５６６８１号；ＷＯ２００４／０３９４１３；大韓民国特許登録第０７４０２３７号；及びＷＯ２００６／１２１２３２に開示されたプロトコールにしたがって脱毒素化した。簡単に述べると、３ｍｇ／ｍＬの前記精製されたＬＰＳに２Ｎ  ＮａＯＨを１：１容量で混ぜた後、６０℃で１０分毎に１回ずつ振って１４０分間脱アシル化させ、初期０．２Ｎ  ＮａＯＨの約１／５程度の容量の１Ｎアセト酸を入れてｐＨ７．０に調整した。ｐＨ調整後、エタノール沈殿して、非毒性リポオリゴサッカライド（ＣＩＡ０５）を得た。
【００６２】
実施例２：新規の免疫補助剤であるＣＩＡ０５と従来の免疫補助剤であるＭＰＬとの毒性比較実験
本発明のワクチンで免疫補助剤として利用される前記実施例で製造したＣＩＡ０５と、既存の子宮頸部癌ワクチンに使用しているＭＰＬ（モノホスホリルリピドＡ）の毒性を比較分析した。健康な人間の血液を提供してもらって、ＰＢＭＣ（末梢血単核球）を分離し、これを２４−ウェル培養ディッシュに５×１０５細胞／ｍＬの濃度でシーディングした。この際、培養液は、ＲＰＭＩ  １６４０（Ｇｉｂｃｏ）に１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を混合したものを使用して、一つのウェル当り容量は、１ｍＬに均等にした。用意したディッシュに下記のような条件でそれぞれ処理した：１）陰性対照群：ＢＳＳ（平衡塩類溶液）１００μＬ；２）脱アシル化非毒性ＬＯＳ（ＣＩＡ０５）１０μｇ／１００μＬ；３）ＭＰＬ（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｆ５８３  ＭＰＬ）１０μｇ／１００μＬ。
【００６３】
１２時間後、処理された培養液を集めて遠心分離し、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を利用してＴＨＰ−１（急性単球性白血病）で分泌される炎症性タンパク質であるＴＮＦ−αの量を、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ、ＤＹ２１０）を使用してそれぞれ測定した。図１から分かるように、既存のワクチン補助剤として使用しているＭＰＬより毒性が約１／３程度と小さいことを確認した。
【００６４】
実施例３：本発明の結核ワクチンの効能分析
結核ワクチン抗原と免疫補助剤ＣＩＡ０５の免疫
結核ワクチンで免疫補助剤ＣＩＡ０５の効能を確認するために結核菌株（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の４種の抗原を使用した。その４種の抗原は、Ａｇ８５Ａ（３２ｋＤａ）、ＨｓｐＸ（１６ｋＤａ）、ホスフェート結合タンパク質１（３８ｋＤａ）及びＥＳＡＴ−６（６ｋＤａ）である。抗原（各２μｇ）単独、或いはＡｌｕｍ（アルミニウムヒドロキシド；Ｂｒｅｎｎｔａｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）１００μｇ又はＣＩＡ０５（０．５μｇ）の混合物（最終容量１００μＬ）を、それぞれ６週齢Ｂａｌｂ／ｃマウス（ＳＬＣ、Ｊａｐａｎ）に、１週間隔で３回注射した。
【００６５】
結核ワクチン抗原特異抗体の力価測定
免疫後の血清における結核抗原特異抗体の力価を測定するために、エンド−ポイント希釈ＥＬＩＳＡ法（酵素結合免疫吸着測定法）を使用した。１００μＬのＡｇ８５Ａ（３２ｋＤａ）、ＨｓｐＸ（１６ｋＤａ）、ホスフェート結合タンパク質１（３８ｋＤａ）及びＥＳＡＴ−６（６ｋＤａ）をそれぞれ１μｇ／ｍＬの濃度で９６−ウェルプレートにコーティング（４℃、一晩中）した後、１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）３００μＬでブロッキングをした（室温、１時間）。ブロッキング後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、免疫後得られた血清１００μＬを反応させた（３７℃、２時間）。結核抗原特異抗体を確認するために、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ）を反応させた後、ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン、ＢＤ  Ｂｉｏ  ｓｃｉｅｎｃｅ、５５５５５２１４）を添加して、１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で反応を停止した。実験結果は、４５０ｎｍで吸光度を測定して、免疫後回収した血清における結核抗原特異抗体の量を確認した。
【００６６】
結核ワクチンにおける免疫補助剤ＣＩＡ０５の効能分析
結核菌株の４種の抗原と免疫補助剤ＣＩＡ０５の効能を分析した結果、Ａｇ８５Ａ（３２ｋＤａ）抗原の場合、Ａｌｕｍを利用した試験群では、抗原単独で使用した試験群に比べ、結核抗原特異抗体の生成が約４倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約８倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）程度増加し、ＣＩＡ０５を利用した場合は、抗原単独で使用した試験群に比べ、結核抗原特異抗体の生成が約１６倍（ＣＩＡ０５  ０．５μｇ）又は約１２８倍（ＣＩＡ０５  １μｇ）程度増加した（図２ａ）。また、ＣＩＡ０５を利用した場合は、結核抗原特異抗体の生成量が投与量に依存的に大いに増加し、ＣＩＡ０５が結核抗原Ａｇ８５Ａに非常に適した免疫補助剤であることが分かる。一方、免疫補助剤としてＣＩＡ０５とＡｌｕｍを同時に利用した場合、０．５μｇのＣＩＡ０５のみを利用した場合より、抗体生成量が約２倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約４倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）増加した。免疫補助剤としてＣＩＡ０５とＡｌｕｍを同時に利用した場合、１．０μｇのＣＩＡ０５のみを利用した場合より、抗体生成量が約２倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約４倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）増加した。
【００６７】
ＨｓｐＸ（１６ｋＤａ）抗原では、Ａｌｕｍを利用した試験群では、抗原単独で使用した試験群に比べ、結核抗原特異抗体の生成が約４倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約８倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）程度増加し、ＣＩＡ０５を利用した場合は、抗原単独で使用した試験群に比べ、結核抗原特異抗体の生成が約１６倍（ＣＩＡ０５  ０．５μｇ）又は約１２８倍（ＣＩＡ０５  １μｇ）程度増加した（図２ｂ）。また、ＣＩＡ０５を利用した場合は、結核抗原特異抗体の生成量が投与量に依存的に大いに増加し、ＣＩＡ０５が結核抗原ＨｓｐＸ（１６ｋＤａ）に非常に適した免疫補助剤であることが分かる。一方、免疫補助剤としてＣＩＡ０５とＡｌｕｍを同時に利用した場合、０．５μｇのＣＩＡ０５のみを利用した場合より、抗体生成量が約２倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約４倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）増加した。免疫補助剤としてＣＩＡ０５とＡｌｕｍを同時に利用した場合、１．０μｇのＣＩＡ０５のみを利用した場合より、抗体生成量が約２倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約４倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）増加した。
【００６８】
ホスフェート結合タンパク質１（３８ｋＤａ）抗原に対しては、Ａｌｕｍを利用した試験群では、抗原単独で使用した試験群に比べ、結核抗原特異抗体の生成が約４倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約８倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）程度増加し、ＣＩＡ０５を利用した場合は、抗原単独で使用した試験群に比べ、結核抗原特異抗体の生成が約８倍（ＣＩＡ０５  ０．５μｇ）又は約６４倍（ＣＩＡ０５  １μｇ）程度増加した（図２ｃ）。また、ＣＩＡ０５を利用した場合は、結核抗原特異抗体の生成量が投与量に依存的に大いに増加し、ＣＩＡ０５が結核抗原ホスフェート結合タンパク質１（３８ｋＤａ）に非常に適した免疫補助剤であることが分かる。一方、免疫補助剤としてＣＩＡ０５とＡｌｕｍを同時に利用した場合、０．５μｇのＣＩＡ０５のみを利用した場合より、抗体生成量が約２倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約４倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）増加した。免疫補助剤としてＣＩＡ０５とＡｌｕｍを同時に利用した場合、１．０μｇのＣＩＡ０５のみを利用した場合より、抗体生成量が約２倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約４倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）増加した。
【００６９】
ＥＳＡＴ−６（６ｋＤａ）抗原に対しては、Ａｌｕｍを利用した試験群では、抗原単独で使用した試験群に比べ、結核抗原特異抗体の生成が約４倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約８倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）程度増加し、ＣＩＡ０５を利用した場合は、抗原単独で使用した試験群に比べ、結核抗原特異抗体の生成が約１６倍（ＣＩＡ０５  ０．５μｇ）又は約１２８倍（ＣＩＡ０５  １μｇ）程度増加した（図２ｄ）。また、ＣＩＡ０５を利用した場合は、結核抗原特異抗体の生成量が投与量に依存的に大いに増加し、ＣＩＡ０５が結核抗原ＥＳＡＴ−６（６ｋＤａ）に非常に適した免疫補助剤であることが分かる。一方、免疫補助剤としてＣＩＡ０５とＡｌｕｍを同時に利用した場合、０．５μｇのＣＩＡ０５のみを利用した場合より、抗体生成量が約２倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約４倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）増加した。免疫補助剤としてＣＩＡ０５とＡｌｕｍを同時に利用した場合、１．０μｇのＣＩＡ０５のみを利用した場合より、抗体生成量が約２倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約４倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）増加した。
【００７０】
結核抗原のうち、免疫促進能に最も優れた抗原を選択するための分析を実施した（図２ｅ）。実験結果、結核菌抗原のうち、Ａｇ８５Ａ、ＨｓｐＸ、ＥＳＡＴ−６及び３８ｋＤａの順に免疫促進能があって、これにより、本発明のＣＩＡ０５と最も適した抗原は、Ａｇ８５Ａであることが分かった。
【００７１】
結論的に、免疫補助剤としてＣＩＡ０５を含む本発明の結核ワクチンは、免疫効能、即ち、ワクチン効能に非常に優れており、従来の免疫補助剤であるＡｌｕｍと比較し、結核抗原に対して著しく優れた免疫促進能を有していることが分かる。
【００７２】
実施例４：本発明の炭疽ワクチンの効能分析
炭疽ワクチン抗原であるＰＡと免疫補助剤ＣＩＡ０５の免疫
炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）は、３種のタンパク質で２種の毒素を生成するが、ここで３種のタンパク質は、ＰＡ（感染防御抗原）、ＬＦ（致死抗原）及びＥＡ（浮腫抗原）から構成される。このうち、ＰＡが炭疽ワクチンに使用されており、本試験では、組み換え全長ＰＡ抗原を使用した。炭疽菌のＰＡ抗原１０μｇを６週齢雄性Ｂａｌｂ／ｃマウスに２週間隔で３回腹腔注射した。最終容量１００μＬに含まれる１０μｇのＰＡ抗原を投与した。最終容量１００μＬに含まれる０．５μｇ又は１μｇのＣＩＡ０５を投与した。最終容量１００μＬに含まれる５０μｇ又は１００μｇのＡｌｕｍを投与した。陰性対照群は、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．３）を毎回１００μＬずつ注射した。マウスに３回注射後、マウスから全血を採取して、遠心分離を通じて血清を得た。免疫後、血清内ＰＡ特異抗体力価を測定するために、実施例３のようにエンドポイントＥＬＩＳＡ方法を使用した。
【００７３】
免疫化後、血清におけるＰＡ特異抗原を分析した結果、ＰＡ抗原を単独で免疫化した場合より、免疫補助剤としてＣＩＡ０５を０．５μｇ投与した時、１０倍、１μｇ投与した時、２１倍、ＰＡ特異抗原が増加した（図３）。これは、炭疽ワクチンにおいて、ＣＩＡ０５が炭疽抗原のＰＡと共に免疫補助剤として役割をすることを示している。また、ＣＩＡ０５とＡｌｕｍ（アルミニウムヒドロキシド）を混合して免疫補助剤として使用した時、ＰＡ特異免疫反応を増進させることを確認することができた（図３）。
【００７４】
結論的に、免疫補助剤としてＣＩＡ０５を含む本発明の炭疽ワクチン、特にＰＡ抗原とＣＩＡ０５の組み合わせを利用した炭疽ワクチンは、免疫効能、即ち、ワクチン効能に非常に優れている。
【００７５】
実施例５：本発明のＡ型肝炎（Ａ型肝炎ウイルス；ＨＡＶ）ワクチンの効能分析
抗原としては、ＭＲＣ−５細胞株で培養された不活化されたＨＡＶを使用した。６週齢Ｂａｌｂ／ｃマウスに不活化されたＨＡＶを１週間隔で３回注射した。この際、ＨＡＶ単独又はＣＩＡ０５を含めて注射した。３回注射１週間後、実施例３のように血清を分離して、ＨＡＶ特異抗体をエンドポイントＥＬＩＳＡ方法で測定した。
【００７６】
ＨＡＶ抗原に対してＡｌｕｍを利用した試験群では、抗原単独で使用した試験群に比べ、ＨＡＶ抗原特異抗体の生成が約２倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約４倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）程度増加し、ＣＩＡ０５を利用した場合は、抗原単独で使用した試験群に比べ、ＨＡＶ抗原特異抗体の生成が約８倍（ＣＩＡ０５  ０．５μｇ）又は約３２倍（ＣＩＡ０５  １μｇ）程度増加した（図４）。また、ＣＩＡ０５を利用した場合は、ＨＡＶ抗原特異抗体の生成量が投与量に依存的に大いに増加し、ＣＩＡ０５がＨＡＶ抗原（不活化されたＨＡＶ）に非常に適した免疫補助剤であることが分かる。一方、免疫補助剤としてＣＩＡ０５とＡｌｕｍを同時に利用した場合、０．５μｇのＣＩＡ０５のみを利用した場合より、抗体生成量が約２倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約４倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）増加した。免疫補助剤としてＣＩＡ０５とＡｌｕｍを同時に利用した場合、１．０μｇのＣＩＡ０５のみを利用した場合より、抗体生成量が約２倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約４倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）増加した。
【００７７】
結論的に、免疫補助剤としてＣＩＡ０５を含む本発明のＨＡＶワクチン、特に不活化されたＨＡＶとＣＩＡ０５の組み合わせを利用したＨＡＶワクチンは、免疫効能、即ち、ワクチン効能に非常に優れている。
【００７８】
実施例６：本発明のＢ型肝炎（Ｂ型肝炎ウイルス；ＨＢＶ）ワクチンの効能分析
ＨＢＶ予防ワクチンにおいて、ＨＢＶの表面抗原であるＨＢｓＡｇ（ａｄｒサブタイプ）を、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａで組み換えＨＢｓＡｇを発現、精製し、抗原として使用した。Ｂａｌｂ／ｃマウスにＨＢＶ抗原であるＨＢｓＡｇ  ２μｇを１週間隔で３回注射した。この際、抗原単独又はＡｌｕｍやＣＩＡ０５を含めて注射した。３回注射１週間後、実施例３のように血清を分離してＨＢｓＡｇ特異抗体をエンドポイントＥＬＩＳＡ方法で測定した。
【００７９】
ＨＢｓＡｇ抗原に対してＡｌｕｍを利用した試験群では、抗原単独で使用した試験群に比べ、ＨＢｓＡｇ抗原特異抗体の生成が約２倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約４倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）程度増加し、ＣＩＡ０５を利用した場合は、抗原単独で使用した試験群に比べ、ＨＢｓＡｇ抗原特異抗体の生成が約８倍（ＣＩＡ０５  ０．５μｇ）又は約１６倍（ＣＩＡ０５  １μｇ）程度増加した（図５）。また、ＣＩＡ０５を利用した場合は、ＨＢｓＡｇ抗原特異抗体の生成量が投与量に依存的に大いに増加し、ＣＩＡ０５がＨＢｓＡｇ抗原に非常に適した免疫補助剤であることが分かる。一方、免疫補助剤としてＣＩＡ０５とＡｌｕｍを同時に利用した場合、０．５μｇのＣＩＡ０５のみを利用した場合より、抗体生成量が約２倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約４倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）増加した。免疫補助剤としてＣＩＡ０５とＡｌｕｍを同時に利用した場合、１．０μｇのＣＩＡ０５のみを利用した場合より、抗体生成量が約４倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約８倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）増加した。
【００８０】
結論的に、免疫補助剤としてＣＩＡ０５を含む本発明のＨＢＶワクチン、特にＨＢｓＡｇ抗原とＣＩＡ０５の組み合わせを利用したＨＢＶワクチンは、免疫効能、即ち、ワクチン効能に非常に優れている。
【００８１】
実施例７：本発明のＣ型肝炎（Ｃ型肝炎ウイルス；ＨＣＶ）ワクチンの効能分析
ＨＣＶワクチンにおいて、免疫補助剤ＣＩＡ０５の効能を確認するために、抗原としてはＨＣＶの組み換えＮＳ３（Ｚ０００４２、ＧｅｎＳｃｒｐｔ）を購入して使用した。
【００８２】
６週齢Ｂａｌｂ／ｃマウスにＮＳ３抗原２μｇを１週間隔で３回注射し、抗原単独又はＡｌｕｍやＣＩＡ０５を含めて注射した。３回注射１週間後、実施例１のように血清を分離してＮＳ３特異抗体をエンドポイントＥＬＩＳＡ方法で測定した。
【００８３】
ＮＳ３抗原に対してＡｌｕｍを利用した試験群では、抗原単独で使用した試験群に比べ、ＮＳ３抗原特異抗体の生成が約２倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約４倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）程度増加し、ＣＩＡ０５を利用した場合は、抗原単独で使用した試験群に比べ、ＮＳ３抗原特異抗体の生成が約４倍（ＣＩＡ０５  ０．５μｇ）又は約１６倍（ＣＩＡ０５  １μｇ）程度増加した（図６）。また、ＣＩＡ０５を利用した場合は、ＮＳ３抗原特異抗体の生成量が投与量に依存的に大いに増加し、ＣＩＡ０５がＮＳ３抗原に非常に適した免疫補助剤であることが分かる。一方、免疫補助剤としてＣＩＡ０５とＡｌｕｍを同時に利用した場合、０．５μｇのＣＩＡ０５のみを利用した場合より、抗体生成量が約２倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約４倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）増加した。免疫補助剤としてＣＩＡ０５とＡｌｕｍを同時に利用した場合、１．０μｇのＣＩＡ０５のみを利用した場合より、抗体生成量が約２倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約４倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）増加した。
【００８４】
結論的に、免疫補助剤としてＣＩＡ０５を含む本発明のＨＣＶワクチン、特にＮＳ３抗原とＣＩＡ０５の組み合わせを利用したＨＣＶワクチンは、免疫効能、即ち、ワクチン効能に非常に優れている。
【００８５】
実施例８：本発明のＨＩＶワクチンの効能分析
ＨＩＶワクチンにおいて、免疫補助剤ＣＩＡ０５の効能を確認するために、抗原としてはＨＩＶ−１エンベロープ（Ｅｎｖ）抗原（Ｈ９９０９、Ｓｉｇｍａ）を購入して使用した。６週齢Ｂａｌｂ／ｃマウスにＨＩＶ−１エンベロープ抗原２μｇを１週間隔で３回注射し、抗原単独又はＡｌｕｍやＣＩＡ０５を含めて注射した。３回注射１週間後、実施例１のように血清を分離してＨＩＶ−１エンベロープ抗原特異抗体をエンドポイントＥＬＩＳＡ方法で測定した。
【００８６】
ＨＩＶ−１エンベロープ抗原に対してＡｌｕｍを利用した試験群では、抗原単独で使用した試験群に比べ、ＨＩＶ−１エンベロープ抗原特異抗体の生成が約４倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約８倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）程度増加し、ＣＩＡ０５を利用した場合は、抗原単独で使用した試験群に比べ、ＨＩＶ−１エンベロープ抗原特異抗体の生成が約１６倍（ＣＩＡ０５  ０．５μｇ）又は約６４倍（ＣＩＡ０５  １μｇ）程度増加した（図７）。また、ＣＩＡ０５を利用した場合は、ＨＩＶ−１エンベロープ抗原特異抗体の生成量が投与量に依存的に大いに増加し、ＣＩＡ０５がＨＩＶ−１エンベロープ抗原に非常に適した免疫補助剤であることが分かる。一方、免疫補助剤としてＣＩＡ０５とＡｌｕｍを同時に利用した場合、０．５μｇのＣＩＡ０５のみを利用した場合より、抗体生成量が約４倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約８倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）増加した。免疫補助剤としてＣＩＡ０５とＡｌｕｍを同時に利用した場合、１．０μｇのＣＩＡ０５のみを利用した場合より、抗体生成量が約４倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約８倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）増加した。
【００８７】
結論的に、免疫補助剤としてＣＩＡ０５を含む本発明のＨＩＶワクチン、特にＨＩＶ−１エンベロープ抗原とＣＩＡ０５の組み合わせを利用したＨＩＶワクチンは、免疫効能、即ち、ワクチン効能に非常に優れている。
【００８８】
実施例９：本発明のインフルエンザワクチンの効能分析
インフルエンザワクチンにおいて免疫補助剤ＣＩＡ０５の効能を確認するために、３種のインフルエンザウイルス株から得たＨＡサブユニット（ＣＪ  Ｃｏ．、Ｉｎｃｈｅｏｎ、Ｋｏｒｅａ）を使用した。３種のインフルエンザウイルス株は、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（ＨＩＮ１）、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／７／９７である。６週齢Ｂａｌｂ／ｃマウスに上記３種のインフルエンザウイルス株由来のＨＡサブユニット１．５μｇを４週間隔で２回注射した。この際、抗原単独又はＡｌｕｍ  ２５μｇやＣＩＡ０５  ２５μｇを含めて注射した。２回注射４週間後、実施例１のように、注射したマウスから血清を分離して、インフルエンザＨＡサブユニット特異抗体をエンドポイントＥＬＩＳＡ方法で測定した。
【００８９】
インフルエンザＨＡサブユニット抗原に対してＡｌｕｍを利用した試験群では、抗原単独で使用した試験群に比べ、インフルエンザＨＡサブユニット抗原特異抗体の生成が約２倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約４倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）程度増加し、ＣＩＡ０５を利用した場合は、抗原単独で使用した試験群に比べ、インフルエンザＨＡサブユニット抗原特異抗体の生成が約４倍（ＣＩＡ０５  ０．５μｇ）又は約８倍（ＣＩＡ０５  １μｇ）程度増加した（図８）。また、ＣＩＡ０５を利用した場合は、インフルエンザＨＡサブユニット抗原特異抗体の生成量が投与量に依存的に大いに増加し、ＣＩＡ０５がインフルエンザＨＡサブユニット抗原に非常に適した免疫補助剤であることが分かる。一方、免疫補助剤としてＣＩＡ０５とＡｌｕｍを同時に利用した場合、０．５μｇのＣＩＡ０５のみを利用した場合より、抗体生成量が約２倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約８倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）増加した。免疫補助剤としてＣＩＡ０５とＡｌｕｍを同時に利用した場合、１．０μｇのＣＩＡ０５のみを利用した場合より、抗体生成量が約２倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約８倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）増加した。
【００９０】
結論的に、免疫補助剤としてＣＩＡ０５を含む本発明のインフルエンザワクチン、特にインフルエンザＨＡサブユニット抗原とＣＩＡ０５の組み合わせを利用したインフルエンザワクチンは、免疫効能、即ち、ワクチン効能に非常に優れている。
【００９１】
実施例１０：本発明のＨＳＶ−２（単純ヘルペスウイルス２型）ワクチンの効能分析
ＨＳＶ−２ワクチンにおいて免疫補助剤ＣＩＡ０５の効能を確認するために、抗原としては、ＨＳＶ−２の糖タンパク質ｇＤとｇＢを使用した。この２種の抗原は、糖化が重要であるため、正確な糖化のために、動物細胞であるＣＨＯ細胞株から発現及び精製した（Ｂｏｕｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ２  ｗｉｔｈ  ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｇＧ−２．Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｖｉｒｏｌ．１（１）：２９−３８（１９９３））。ＣＨＯ細胞株で発現、精製した２種の抗原を６週齢Ｂａｌｂ／ｃマウスにそれぞれ２μｇずつ１週間隔で３回注射し、試験群は、抗原単独又はＡｌｕｍやＣＩＡ０５を含めて注射した。３回注射１週間後、実施例１のように血清を分離して、ＨＳＶ−２抗原であるｇＤとｇＢ特異抗体をエンドポイントＥＬＩＳＡ方法で測定した。
【００９２】
ｇＤ抗原に対してＡｌｕｍを利用した試験群では、抗原単独で使用した試験群に比べ、ｇＤ抗原特異抗体の生成が約８倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約３２倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）程度増加し、ＣＩＡ０５を利用した場合は、抗原単独で使用した試験群に比べ、ｇＤ抗原特異抗体の生成が約２４倍（ＣＩＡ０５  ０．５μｇ）又は約１２８倍（ＣＩＡ０５  １μｇ）程度増加した（図９ａ）。また、ＣＩＡ０５を利用した場合は、ｇＤ抗原特異抗体の生成量が投与量に依存的に大いに増加し、ＣＩＡ０５がｇＤ抗原に非常に適した免疫補助剤であることが分かる。一方、免疫補助剤としてＣＩＡ０５とＡｌｕｍを同時に利用した場合、０．５μｇのＣＩＡ０５のみを利用した場合より、抗体生成量が約４倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約１６倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）増加した。免疫補助剤としてＣＩＡ０５とＡｌｕｍを同時に利用した場合、１．０μｇのＣＩＡ０５のみを利用した場合より、抗体生成量が約２倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約１６倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）増加した。
【００９３】
ｇＢ抗原に対しては、Ａｌｕｍを利用した試験群では、抗原単独で使用した試験群に比べ、ｇＢ抗原特異抗体の生成が約８倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約３２倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）程度増加し、ＣＩＡ０５を利用した場合は、抗原単独で使用した試験群に比べ、ｇＢ抗原特異抗体の生成が約１６倍（ＣＩＡ０５  ０．５μｇ）又は約３２倍（ＣＩＡ０５  １μｇ）程度増加した（図９ｂ）。また、ＣＩＡ０５を利用した場合は、ｇＢ抗原特異抗体の生成量が投与量に依存的に大いに増加し、ＣＩＡ０５がｇＢ抗原に非常に適した免疫補助剤であることが分かる。一方、免疫補助剤としてＣＩＡ０５とＡｌｕｍを同時に利用した場合、０．５μｇのＣＩＡ０５のみを利用した場合より、抗体生成量が約４倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約１６倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）増加した。免疫補助剤としてＣＩＡ０５とＡｌｕｍを同時に利用した場合、１．０μｇのＣＩＡ０５のみを利用した場合より、抗体生成量が約４倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約１６倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）増加した。
【００９４】
ＨＳＶ−２抗原のうち、免疫促進能に最も優れた抗原を選択するための分析を実施した（図９ｃ）。実験結果、ＨＳＶ−２抗原のうち、ｇＤ抗原がｇＢ抗原より免疫促進能に優れており、これにより、本発明のＣＩＡ０５と最も適した抗原は、ｇＤ抗原であることが分かった。
【００９５】
結論的に、免疫補助剤としてＣＩＡ０５を含む本発明のＨＳＶ−２ワクチン、特にｇＤ抗原とＣＩＡ０５の組み合わせを利用したＨＳＶ−２ワクチンは、免疫効能、即ち、ワクチン効能に非常に優れている。
【００９６】
実施例１１：本発明のＨｉｂ（ヘモフィルスインフルエンザｂ菌）ワクチンの効能分析
Ｈｉｂ抗原としては、ＡｃｔＨＩＢ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｂ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅ、Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｔｏｘｏｉｄ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒ  ＳＡ）を購入して使用した。Ｂａｌｂ／ｃマウスにＡｃｔＨＩＢを２週間隔で２回注射した。この際、ワクチン単独又はＡｌｕｍやＣＩＡ０５を含めて注射した。２回注射１週間後、実施例１のように、注射したマウスから血清を分離して、Ｈｉｂ特異抗体をエンドポイントＥＬＩＳＡ方法で測定した。
【００９７】
ＡｃｔＨＩＢ抗原に対してＡｌｕｍを利用した試験群では、抗原単独で使用した試験群に比べ、ＡｃｔＨＩＢ抗原特異抗体の生成が約４倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約１６倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）程度増加し、ＣＩＡ０５を利用した場合は、抗原単独で使用した試験群に比べ、ＡｃｔＨＩＢ抗原特異抗体の生成が約１６倍（ＣＩＡ０５  ０．５μｇ）又は約３２倍（ＣＩＡ０５  １μｇ）程度増加した（図１０）。また、ＣＩＡ０５を利用した場合は、ＡｃｔＨＩＢ特異抗体の生成量が投与量に依存的に大いに増加し、ＣＩＡ０５がＡｃｔＨＩＢに非常に適した免疫補助剤であることが分かる。一方、免疫補助剤としてＣＩＡ０５とＡｌｕｍを同時に利用した場合、０．５μｇのＣＩＡ０５のみを利用した場合より、抗体生成量が約８倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約１６倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）増加した。免疫補助剤としてＣＩＡ０５とＡｌｕｍを同時に利用した場合、１．０μｇのＣＩＡ０５のみを利用した場合より、抗体生成量が約４倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約２４倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）増加した。
【００９８】
結論的に、免疫補助剤としてＣＩＡ０５を含む本発明のＨｉｂワクチン、特にＡｃｔＨＩＢとＣＩＡ０５の組み合わせを利用したＨｉｂワクチンは、免疫効能、即ち、ワクチン効能に非常に優れている。
【００９９】
実施例１２：本発明の髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ワクチンの効能分析
髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ワクチンで免疫補助剤ＣＩＡ０５の効能を確認するために、弱毒化された髄膜炎菌からプロテオソームを分離して抗原として使用した（Ｌｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ−ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ：ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｆｏｒ  ｍａｌａｒｉａ  ＣＳ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：８００−８０２（１９８０））。６週齢Ｂａｌｂ／ｃマウスに抗原を２週間隔で２回注射し、試験群は、ワクチン単独又はＣＩＡ０５を含む二つの試験群を構成した。２回注射１週間後、実施例１のように血清を分離して、抗原として使用した髄膜炎菌プロテオソーム特異抗体をエンドポイントＥＬＩＳＡ方法で測定した。
【０１００】
髄膜炎菌プロテオソーム抗原に対してＡｌｕｍを利用した試験群では、抗原単独で使用した試験群に比べ、抗原特異抗体の生成が約４倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約８倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）程度増加し、ＣＩＡ０５を利用した場合は、抗原単独で使用した試験群に比べ、抗原特異抗体の生成が約８倍（ＣＩＡ０５  ０．５μｇ）又は約１６倍（ＣＩＡ０５  １μｇ）程度増加した（図１１）。また、ＣＩＡ０５を利用した場合は、抗原特異抗体の生成量が投与量に依存的に大いに増加し、ＣＩＡ０５が髄膜炎菌プロテオソーム抗原に非常に適した免疫補助剤であることが分かる。一方、免疫補助剤としてＣＩＡ０５とＡｌｕｍを同時に利用した場合、０．５μｇのＣＩＡ０５のみを利用した場合より、抗体生成量が約４倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約１６倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）増加した。免疫補助剤としてＣＩＡ０５とＡｌｕｍを同時に利用した場合、１．０μｇのＣＩＡ０５のみを利用した場合より、抗体生成量が約４倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約１６倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）増加した。
【０１０１】
結論的に、免疫補助剤としてＣＩＡ０５を含む本発明の髄膜炎菌ワクチン、特に髄膜炎菌プロテオソームとＣＩＡ０５の組み合わせを利用した髄膜炎菌ワクチンは、免疫効能、即ち、ワクチン効能に非常に優れている。
【０１０２】
実施例１３：本発明のジフテリア、破傷風、百日咳（ＤＰＴ）ワクチンの効能分析
ＤＰＴは、ジフテリア、百日咳菌、破傷風菌により誘発される疾病を予防するワクチンである。
【０１０３】
これら疾病のワクチンに対してＣＩＡ０５の免疫補助剤効能を確認するために、ジフテリアは、コリネバクテリウムジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）由来のジフテリア毒素（Ｄ０５６４、Ｓｉｇｍａ）を、百日咳は、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）由来の百日咳毒素（Ｐ７２０８、Ｓｉｇｍａ）を、破傷風は、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）由来の破傷風毒素（Ｔ３１９４、Ｓｉｇｍａ）を購入して使用した。３種の毒素を６週齢Ｂａｌｂ／ｃマウスにそれぞれ２μｇずつを混合して２週間隔で２回注射した。この際、抗原単独又はＡｌｕｍやＣＩＡ０５を含めて注射した。２回注射１週間後、実施例１のように血清を分離して、３種の毒素に対する特異抗体をエンドポイントＥＬＩＳＡ方法で測定した。
【０１０４】
ジフテリア毒素抗原に対してＡｌｕｍを利用した試験群では、抗原単独で使用した試験群に比べ、抗原特異抗体の生成が約３２倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約６４倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）程度増加し、ＣＩＡ０５を利用した場合は、抗原単独で使用した試験群に比べ、抗原特異抗体の生成が約３２倍（ＣＩＡ０５  ０．５μｇ）又は約１２８倍（ＣＩＡ０５  １μｇ）程度増加した（図１２ａ）。また、ＣＩＡ０５を利用した場合は、抗原特異抗体の生成量が投与量に依存的に大いに増加し、ＣＩＡ０５がジフテリア毒素に非常に適した免疫補助剤であることが分かる。一方、免疫補助剤としてＣＩＡ０５とＡｌｕｍを同時に利用した場合、０．５μｇのＣＩＡ０５のみを利用した場合より、抗体生成量が約８倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約１６倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）増加した。免疫補助剤としてＣＩＡ０５とＡｌｕｍを同時に利用した場合、１．０μｇのＣＩＡ０５のみを利用した場合より、抗体生成量が約４倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約８倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）増加した。
【０１０５】
百日咳毒素抗原に対してＡｌｕｍを利用した試験群では、抗原単独で使用した試験群に比べ、抗原特異抗体の生成が約４倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約１６倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）程度増加し、ＣＩＡ０５を利用した場合は、抗原単独で使用した試験群に比べ、抗原特異抗体の生成が約１６倍（ＣＩＡ０５  ０．５μｇ）又は約２４倍（ＣＩＡ０５  １μｇ）程度増加した（図１２ｂ）。また、ＣＩＡ０５を利用した場合は、抗原特異抗体の生成量が投与量に依存的に大いに増加し、ＣＩＡ０５が百日咳毒素抗原に非常に適した免疫補助剤であることが分かる。一方、免疫補助剤としてＣＩＡ０５とＡｌｕｍを同時に利用した場合、０．５μｇのＣＩＡ０５のみを利用した場合より、抗体生成量が約４倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約３２倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）増加した。免疫補助剤としてＣＩＡ０５とＡｌｕｍを同時に利用した場合、１．０μｇのＣＩＡ０５のみを利用した場合より、抗体生成量が約８倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約３２倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）増加した。
【０１０６】
破傷風毒素抗原に対してＡｌｕｍを利用した試験群では、抗原単独で使用した試験群に比べ、抗原特異抗体の生成が約４倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約８倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）程度増加し、ＣＩＡ０５を利用した場合は、抗原単独で使用した試験群に比べ、抗原特異抗体の生成が約１６倍（ＣＩＡ０５  ０．５μｇ）又は約３２倍（ＣＩＡ０５  １μｇ）程度増加した（図１２ｃ）。また、ＣＩＡ０５を利用した場合は、抗原特異抗体の生成量が投与量に依存的に大いに増加し、ＣＩＡ０５が破傷風毒素抗原に非常に適した免疫補助剤であることが分かる。一方、免疫補助剤としてＣＩＡ０５とＡｌｕｍを同時に利用した場合、０．５μｇのＣＩＡ０５のみを利用した場合より、抗体生成量が約４倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約８倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）増加した。免疫補助剤としてＣＩＡ０５とＡｌｕｍを同時に利用した場合、１．０μｇのＣＩＡ０５のみを利用した場合より、抗体生成量が約４倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約８倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）増加した。
【０１０７】
ＤＰＴ抗原のうち、免疫促進能に最も優れた抗原を選択するための分析を実施した（図１２ｄ）。実験結果、ジフテリア毒素、百日咳毒素及び破傷風毒素の順に免疫促進能に優れており、これにより、本発明のＣＩＡ０５と最も適した抗原は、ジフテリア毒素であることが分かった。
【０１０８】
結論的に、免疫補助剤としてＣＩＡ０５を含む本発明のＤＰＴ、特にジフテリア毒素とＣＩＡ０５の組み合わせを利用したＤＰＴワクチンは、免疫効能、即ち、ワクチン効能に非常に優れている。
【０１０９】
実施例１４：本発明の水痘ワクチンの効能分析
水痘ワクチンにおいて、免疫補助剤ＣＩＡ０５の効能を確認するために、抗原として１ＶＩＡ  Ｓｕｄｕｖａｘ株（１ＶＩＡ  Ｓｕｄｕｖａｘ  ｉｎｊ、ミドリ十字（株））を使用した。前記Ｓｕｄｕｖａｘ株は、水痘の弱毒生ワクチン（ｌｉｖｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ）形態の水痘ワクチンである。Ｓｕｄｕｖａｘ株を６週齢のＢａｌｂ／ｃマウスに２週間隔で２回注射した。この際、ワクチン単独又はＣＩＡ０５を含めて注射した。２回注射１週間後、実施例１のように血清を分離して、水痘菌株特異抗体をエンドポイントＥＬＩＳＡ方法で測定した。
【０１１０】
水痘菌株抗原に対してＡｌｕｍを利用した試験群では、抗原単独で使用した試験群に比べ、抗原特異抗体の生成が約４倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約８倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）程度増加し、ＣＩＡ０５を利用した場合は、抗原単独で使用した試験群に比べ、抗原特異抗体の生成が約１６倍（ＣＩＡ０５  ０．５μｇ）又は約６４倍（ＣＩＡ０５  １μｇ）程度増加した（図１３）。また、ＣＩＡ０５を利用した場合は、抗原特異抗体の生成量が投与量に依存的に大いに増加し、ＣＩＡ０５が水痘菌株抗原（弱毒化水痘菌株）に非常に適した免疫補助剤であることが分かる。一方、免疫補助剤としてＣＩＡ０５とＡｌｕｍを同時に利用した場合、０．５μｇのＣＩＡ０５のみを利用した場合より、抗体生成量が約４倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約８倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）増加した。免疫補助剤としてＣＩＡ０５とＡｌｕｍを同時に利用した場合、１．０μｇのＣＩＡ０５のみを利用した場合より、抗体生成量が約４倍（Ａｌｕｍ  ５０μｇ）又は約３２倍（Ａｌｕｍ  １００μｇ）増加した。
【０１１１】
結論的に、免疫補助剤としてＣＩＡ０５を含む本発明の水痘ワクチン、特に弱毒化水痘菌株とＣＩＡ０５の組み合わせを利用した水痘ワクチンは、免疫効能、即ち、ワクチン効能に非常に優れている。
【０１１２】
実施例１５：樹状細胞の成熟化に対するＣＩＡ０５の効能分析
ヒトＭＤＤＣ（単球由来樹状細胞）とマウスＢＭＤＣ（骨髄樹状細胞）の分離
健康なヒトから約８０ｍＬの血液を採取した後、Ｆｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＴＭ  ｇｒａｄｉｅｎｔ分離法で末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）を分離した。単核球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）は、末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）からａｎｔｉ−ＣＤ１４マイクロビーズ（ＭＡＣＳ  ｓｙｓｔｅｍ）を利用して分離し、２４ウェルプレートに１ｘ１０８細胞／ウェルの濃度で１０％ＦＢＳ、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦを含むＲＰＭＩ１６４０培地に希釈して培養し、ヒトＭＤＤＣを得た。ＢＭＤＣは、雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスから骨髄細胞をＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦを含む培地で６日間培養して、７日目にａｎｔｉ−ＣＤ１１ｃコートされた磁気ビーズを利用してＣＤ１１ｃ＋細胞を分離した。
【０１１３】
免疫補助剤ＣＩＡ０５によるＤＣ（樹状細胞）表面マーカー発現増加分析
上述の方法でヒトＭＤＤＣとマウスのＢＭＤＣを分離した後、ＬＰＳ、ＭＰＬ、ＣＩＡ０５をそれぞれ１μｇ／ｍＬの濃度で処理し、３７℃で２４時間反応した。反応後、マウスＢＭＤＣ表面では、ＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６を、ヒトＭＤＤＣでは、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０及びＣＤ８６をそれぞれフローサイトメトリーで確認した。マウスＢＭＤＣの場合は、ＬＰＳ、ＭＰＬ、ＣＩＡ０５の全てで、ＤＣ表面マーカーであるＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現がほぼ類似の分布を示すことが分かる（図１４ａ）。しかし、ヒトＭＤＤＣでは、現在ワクチン免疫補助剤としてよく使用されているＭＰＬと比較してＣＩＡ０５では、ＭＤＤＣの表面マーカーであるＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０及びＣＤ８６の３つともがさらに多く発現することを確認できた（図１４ｂ）。これは、ＭＰＬが、マウスではＬＰＳレベルの効能を維持するが、ヒトではその効能が制限されていることを示し、ＣＩＡ０５がこのような問題を解決できることを示す。
【０１１４】
結論的に、前記実験の結果、免疫補助剤ＣＩＡ０５は、種々のワクチンにおいて免疫効能、即ち、ワクチン効能を大いに増加させる作用を有し、特に、ヒト樹状細胞の成熟化にも大きい効果を示す。
【０１１５】
本発明の好ましい実施形態を示したが、当業者にとって、実施形態の等価物及び変形物が本願発明の精神に該当することが明らかであることが理解されるであろう。また、本願発明の範囲は、以下の請求項の範囲及びその等価物により判断されるべきである。
【図１】
0005894604.tif 000002
【図２ａ】
0005894604.tif 000003
【図２ｂ】
0005894604.tif 000004
【図２ｃ】
0005894604.tif 000005
【図２ｄ】
0005894604.tif 000006
【図２ｅ】
0005894604.tif 000007
【図３】
0005894604.tif 000008
【図４】
0005894604.tif 000009
【図５】
0005894604.tif 000010
【図６】
0005894604.tif 000011
【図７】
0005894604.tif 000012
【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１２ｄ】
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【図１３】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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