(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型ヒトIgG1 Fc領域のFc変種を含むポリペプチドであって、
該Fc変種がPro329の位置のアミノ酸置換および少なくとも1つのさらなるアミノ酸置換を含み、ここで野生型ヒトFc領域のPro329が、グリシンで置換されており、前記少なくとも1つのさらなるアミノ酸置換が、該ヒトIgG1 Fc領域のL234AおよびL235Aであり、残基がKabatのEU指標に従って番号付けられている、
前記ポリペプチド。
【請求項２】
前記野生型ヒトIgG1ポリペプチドがADCCを誘導し、ここで前記IgG1 Fc変異体ポリペプチドによって誘導されるADCCが、野生型ヒトIgG1 Fc領域を含むポリペプチドによって誘導されるADCCの0〜20％にまで低減する、
請求項1記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記Fc変異体を含むポリペプチドが、野生型ヒトIgG1 Fc領域を含むポリペプチドと比べて、エフェクター機能に関与するFc受容体への低減または除去された親和性を示す、請求項1または2記載のポリペプチド。
【請求項４】
抗体またはFc融合タンパク質である、請求項1〜3のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記野生型ヒトIgG1ポリペプチドが栓球凝集を誘導し、ここで該IgG1 Fc変異体ポリペプチドにより誘導される該栓球凝集が、野生型ヒトIgG1 Fc領域を含むポリペプチドによって誘導される栓球凝集と比べて低減している、請求項1〜4のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記野生型ヒトIgG1ポリペプチドがCDCを誘導し、ここでIgG1 Fc変異体ポリペプチドによって誘導される該CDCが、野生型ヒトIgG1 Fc領域を含むポリペプチドによって誘導されるCDCと比べて大きく低減している、請求項1〜5のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項７】
医薬として使用するための、請求項1〜6のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項８】
該ポリペプチドが抗CD9抗体であって、重鎖可変領域としてSEQ ID NO: 9および可変軽鎖領域としてSEQ ID NO: 8を含む野生型Fc領域を含むことを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項９】
ポリペプチドのエフェクター機能が、野生型ヒトIgG Fc領域を含むポリペプチドによって誘導されるエフェクター機能と比べて大きく低減していることが望まれる疾患を治療する際に使用するための、請求項1〜8のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１０】
野生型ヒトIgG Fc領域のFc変種を含むポリペプチドのエフェクター機能が、野生型ヒトIgG Fc領域を含むポリペプチドによって誘導されるエフェクター機能と比べて大きく低減していることが望まれる疾患を治療するための医薬を製造する際の、請求項1〜9のいずれか一項記載のポリペプチドの使用。
【請求項１１】
野生型ヒトIgG Fc領域を含むポリペプチドによって誘導されるADCCの0〜20％にまでADCCを下方調整するための、および/またはADCPを下方調整するための、野生型ヒトIgG Fc領域のFc変種を含むポリペプチドのインビトロにおける使用であって、
該ポリペプチドにおいて、ヒトIgG Fc領域のPro329がグリシンで置換されており、および少なくとも1つのさらなるアミノ酸置換を含み、ここで該Fc変種がヒトIgG1 Fc領域のL234AおよびL235Aに少なくとも2つのさらなるアミノ酸置換を含み、残基がKabatのEU指標に従って番号付けられており、該ポリペプチドが、ヒトFcγRIIIAおよびヒトFcγRIIAに対して低い親和性を示す、
前記ポリペプチドの使用。
【請求項１２】
前記ポリペプチドによって誘導される栓球凝集が、野生型ヒトFc領域を含み血小板活性化抗体であるポリペプチドによって誘導される栓球凝集と比べて低減する、請求項11記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、Fc領域の変種を含むポリペプチドに関する。より具体的には、本発明は、ポリペプチドのFc領域における1つまたは複数のアミノ酸置換の結果としてエフェクター機能が変化した、Fc領域を含むポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
モノクローナル抗体は、大きな潜在的治療能力を有し、今日の医療ポートフォリオ(portfolio)において重要な役割を果たしている。この10年の間、製薬業界における重要な動向は、癌、喘息、関節炎、多発性硬化症などのいくつかの疾患を治療するための治療物質としてモノクローナル抗体(mAb)を開発することであった。モノクローナル抗体は、遺伝子操作された哺乳動物細胞の培養において組換えタンパク質として主に製造される。
【０００３】
抗体のFc領域、すなわち、抗体の長く伸びた(spanning)ドメインCH2、CH3、およびヒンジ領域の一部分の重鎖の末端は、可変性が限定されており、抗体が果たす生理学的役割の実施に関与している。抗体のFc領域に起因しうるエフェクター機能は、抗体のクラスおよびサブクラスによって様々であり、様々な生物学的応答を引き起こす、細胞上の特異的Fc受容体(「FcR」)へのFc領域を介した抗体結合が含まれる。
【０００４】
典型的には、これらの受容体は、Fcへの結合を媒介する細胞外ドメイン、膜貫通領域、および細胞内での何らかのシグナル伝達事象を媒介し得る細胞内ドメインを有する。これらの受容体は、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、肥満細胞、血小板、B細胞、大顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、およびT細胞を含む様々な免疫細胞において発現される。Fc/FcγR複合体が形成されると、結合された抗原の部位にこれらのエフェクター細胞が動員されて、典型的には、細胞内でのシグナル伝達事象ならびにそれに続く重要な免疫応答、例えば、炎症メディエーターの放出、B細胞活性化、エンドサイトーシス、食作用、および細胞障害性攻撃などが起こる。細胞障害性エフェクター機能および食作用性エフェクター機能を媒介する能力は、抗体が標的細胞を破壊するのに用いる潜在的なメカニズムである。FcγRを発現する非特異的細胞障害性細胞が、標的細胞上の結合された抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応は、抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ADCC)と呼ばれる(Ravetch, et al., Annu Rev Immunol 19 (2001) 275-290)。FcγRを発現する非特異的細胞障害性細胞が、標的細胞上の結合された抗体を認識し、続いて標的細胞の食作用を引き起こす細胞媒介性反応は、抗体依存性細胞媒介性食作用(ADCP)と呼ばれる。さらに、分子のFc領域上の重複する部位もまた、補体によって媒介される、そうでなければ補体依存性細胞障害(CDC)として公知の細胞非依存性細胞障害機能の活性化を制御する。
【０００５】
IgGクラスのAbの場合、ADCCおよびADCPは、Fc領域とFcγ受容体(FcγR)と呼ばれる受容体ファミリーとの結合によって管理されている。ヒトでは、このタンパク質ファミリーは、FcγRI(CD64);アイソフォームFcγRIIA、FcγRIIB、およびFcγRIICを含むFcγRII(CD32);ならびにアイソフォームFcγRIIIAおよびFcγRIIIBを含むFcγRIII(CD16)を含む(Raghavan, and Bjorkman, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12 (1996) 181-220; Abes, et al., Expert Reviews VOL 5(6), (2009) 735-747)。FcγRは、様々な免疫細胞上で発現され、Fc/FcγR複合体が形成されると、結合された抗原の部位にこれらの細胞が動員されて、典型的には、シグナル伝達ならびにそれに続く免疫応答、例えば、炎症メディエーターの放出、B細胞活性化、エンドサイトーシス、食作用、および細胞障害性攻撃などが起こる。さらに、FcγRI、FcγRIIA/c、およびFcγRIIIAは、細胞内の免疫受容体活性化チロシンモチーフ(ITAM)を特徴とする活性化受容体であるのに対し、FcγRIIBは抑制性モチーフ(ITIM)を有しており、したがって抑制性である。さらに、de Reys, et al., Blood, 81, (1993) 1792-1800により、例えばCD9のようなモノクローナル抗体によって誘導される血小板活性化および凝集は、抗原認識と、それに続くFcγRII受容体を伴うFcドメイン依存性段階によって開始されると結論が下された(Taylor, et al., Blood 96 (2000) 4254-4260も参照されたい)。FcγRIは高い親和性で単量体IgGに結合するが、FcγRIIIおよびFcγRIIは低親和性受容体であり、複合体を形成したIgGまたは凝集したIgGと相互作用する。
【０００６】
補体炎症カスケードは、先天性免疫応答の一部であり、個体が感染を防ぐ能力にとって極めて重要である。別の重要なFcリガンドは、補体タンパク質C1qである。C1qへのFc結合は、補体依存性細胞障害(CDC)と呼ばれるプロセスをもたらす。C1qは、6個の抗体に結合することができるが、補体カスケードを活性化するのには2個のIgGに結合するだけで十分である。C1qは、C1rセリンプロテアーゼおよびC1sセリンプロテアーゼとの複合体を形成して、補体経路のCl複合体を形成する。
【０００７】
多くの状況において、免疫グロブリンのFc領域によって媒介される結合およびエフェクター機能の刺激は、例えばCD20抗体の場合、極めて有益である。しかしながら、いくつかの場合において、エフェクター機能を低下させるか、またはさらにはなくす方が有利である場合がある。標的細胞に薬物(例えば、毒素および同位元素)を送達するように設計された抗体にこれは特に当てはまる。このような抗体の場合、Fc/FcγRによってエフェクター機能がもたらされると、健常な免疫細胞が致死的な送達物(deadly payload)に近づき、標的細胞と共に正常なリンパ組織が減少してしまうためである(Hutchins, et al., PNAS USA 92 (1995) 11980-11984; White, et al., Annu Rev Med 52 (2001) 125-145)。これらの場合、補体またはエフェクター細胞を十分に動員しない抗体の使用は、極めて有益であるはずである(Wu, et al., Cell Immunol 200 (2000) 16-26; Shields, et al., J. Biol Chem 276(9) (2001) 6591-6604; US 6,194,551;US 5,885,573、およびPCT公報WO 04/029207も参照されたい)。
【０００８】
他の場合、例えば、広範に発現される受容体とその同族リガンドとの相互作用を妨害することが目的である場合、抗体エフェクター機能のすべてを低下させるか、またはなくして、望まれない毒性を軽減させることが有利である。また、治療的抗体が、いくつかのヒト組織にわたる、相手を選ばない結合を示した場合、エフェクター機能のターゲティングを、異なる(diverse)一組の組織に限定して毒性を限定することが賢明である。最後に、重要なこととして、FcγRII受容体に対する抗体の親和性が低いことは、特に、このような抗体の重大な副作用である血小板活性化およびFcγRII受容体結合を介した凝集を誘導する抗体にとって、有利であると思われる。
【０００９】
特定のエフェクター機能を欠くいくつかのヒト免疫グロブリンサブクラスがあるが、すべてのエフェクター機能を欠く公知の天然免疫グロブリンはない。代替のアプローチは、エフェクター機能に関与しているFc領域中の不可欠な残基を操作するか、または変異させることである。例えば、PCT公報WO 2009/100309(Medimmune)、WO 2006/076594(Xencor)、WO 1999/58572(Univ. Cambridge)、US 2006/0134709(Macrogenics)、WO 2006/047350(Xencor)、WO 2006/053301(Xencor)、US 6,737,056(Genentech)、US 5,624,821(Scotgen Pharmaceuticals)、およびUS 2010/0166740(Roche)を参照されたい。
【００１０】
活性化Fcγ受容体および抑制性Fcγ受容体または補体の第1成分(C1q)へのIgGの結合は、ヒンジ領域およびCH2 ドメイン中に位置する残基に依存する。CH2ドメインの2つの領域は、FcγRおよび補体C1qの結合にとって不可欠であり、独特な配列を有する。ヒトIgG1残基およびヒトIgG2残基の233〜236位ならびにIgG4残基の327位、330位、および331位における置換により、ADCCおよびCDCが大きく低減した(Armour, et al., Eur. J. Immunol. 29(8) (1999) 2613-2624; Shields, et al., J. Biol. Chem. 276(9) (2001) 6591-6604)。Idusogie, et al., J. Immunol 166 (2000) 2571-2575では、リツキサンに対するC1q結合部位をマッピングし、C1qに結合し補体を活性化するリツキシマブの能力がPro329Alaによって低められることを示した。AlaによるPro329の置換は、FcγRI受容体、FcγRII受容体、およびFcγRIIIA受容体に対する結合の低減を招くことが報告されている(Shields, et al., J. Biol. Chem. 276(9) (2001) 6591-6604)が、この変異はまた、FcγRIおよびFcγRIIに対しては野生型に似た結合を示し、FcγRIIIA受容体に対する結合はほんの少しだけ減少させるとも説明されている(EP 1068241、Genentechの表1および表2)。
【００１１】
Oganesyan, et al., Acta Cristallographica D64 (2008) 700-704では、ヒンジ下流およびC2Hドメインに三重変異L234F/L235E/P331Sを導入し、ヒトC1q受容体、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIAに対するヒトIgG1分子の結合活性が低下することを示した。
【００１２】
依然として、ADCCおよび/もしくはADCPならびに/またはCDCが大きく低下した抗体に対するニーズはまだ満たされていない。したがって、本発明の目的は、そのような抗体を同定することであった。驚くべきことに、Pro329の位置のプロリン残基をグリシンに変異させると、FcγRIIIA受容体およびFcγRIIA受容体が予想外に強く阻害され、ADCCおよびCDCが強く抑制されることが見出された。さらに、Pro329ならびに例えばL234AおよびL235A(LALA)の組合せ変異により、C1q、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIAが予想外に強く阻害される。したがって、グリシン残基は、例えば329位におけるアラニンのような他のアミノ酸置換よりも、Fc/Fcγ受容体境界面のプロリンサンドイッチを消失させるにあたって、予想外に優れていると思われる。
【発明の概要】
【００１３】
概要
本発明は、抗体変種の分野に関し、ADCCおよび/またはC1q結合の減少のようにエフェクター機能が低下したFc変種を含むポリペプチドを提供する。
【００１４】
特に、本発明は、野生型ヒトIgG Fc領域のFc変種を含むポリペプチドを提供し、該Fc変種はPro329の位置のアミノ酸置換および少なくとも1つのさらなるアミノ酸置換を含み、残基はKabatのEU指標に従って番号付けられており、かつ該ポリペプチドは、野生型IgG Fc領域を含むポリペプチドと比べて、ヒトFcγRIIIAおよび/またはヒトFcγRIIAおよび/またはヒトFcγRIに対して低い親和性を示し、かつ該ポリペプチドによって誘導されるADCCは、野生型ヒトIgG Fc領域を含むポリペプチドによって誘導されるADCCの20％以下にまで低減する。
【００１５】
特定の態様において、前述のポリペプチド中の野生型ヒトFc領域のPro329は、グリシンもしくはアルギニン、またはFcのプロリン329とFcgRIIIのトリプトファン残基Trp87およびTrp110との間で形成されるFc/Fcγ受容体境界面内のプロリンサンドイッチを消失させるのに十分な大きさのアミノ酸残基で置換される(Sondermann et al.: Nature 406, 267-273 (20 July 2000))。本発明のさらなる局面において、Fc変種中の少なくとも1つのさらなるアミノ酸置換は、S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D、またはP331Sであり、さらに、別の態様において、該少なくとも1つのさらなるアミノ酸置換は、ヒトIgG1 Fc領域のL234AおよびL235AまたはヒトIgG4 Fc領域のS228PおよびL235Eである。
【００１６】
本発明の別の局面において、提供されるポリペプチドは、野生型ヒトIgG Fc領域を含むポリペプチドと比べて、ヒト受容体FcγI、FcγIIA、およびC1qを含む群のうちの少なくとも1つのさらなる受容体に対して低い親和性を示す。本発明のさらに別の局面において、ポリペプチドは、ヒトIgG1 Fc領域またはヒトIgG4 Fc領域を含む。本発明のさらに別の局面において、ポリペプチドは、抗体またはFc融合タンパク質である。
【００１７】
さらなる態様において、Fc変種を含むポリペプチドによって誘導される栓球凝集は、野生型ヒトIgG Fc領域を含むポリペプチドによって誘導される栓球凝集と比べて低減する。さらに別の態様において、本発明によるポリペプチドは、野生型ヒトIgG Fc領域を含むポリペプチドによって誘導されるCDCと比べて、大きく低減したCDCを示す。
【００１８】
本発明の別の態様において、前述したようにFc変種を含むポリペプチドは、医薬として使用するために提供される。特定の態様において、ポリペプチドは、野生型Fc領域を含むポリペプチドに重鎖可変領域としてSEQ ID NO: 9および可変軽鎖領域としてSEQ ID NO: 8が含まれることを特徴とする、抗CD9抗体である。
【００１９】
本発明の別の局面において、前述のポリペプチドは、Fc変種を含むポリペプチドのエフェクター機能が、野生型ヒトIgG Fc領域を含むポリペプチドによって誘導されるエフェクター機能と比べて大きく低減していることが望まれる疾患を治療する際に使用するために提供される。
【００２０】
別の態様において、前述のポリペプチドの使用は、野生型ヒトIgG Fc領域のFc変種を含むポリペプチドのエフェクター機能が、野生型ヒトIgG Fc領域を含むポリペプチドによって誘導されるエフェクター機能と比べて大きく低減していることが望まれる疾患を治療するための医薬を製造するために提供される。
【００２１】
本発明のさらに別の局面において、野生型ヒトIgG Fc領域のFc変種を含むポリペプチドのエフェクター機能が、野生型ヒトFcポリペプチドを含むポリペプチドによって誘導されるエフェクター機能と比べて大きく低減していることが望まれる疾患を有する個体を治療する方法が提供され、該方法は、有効量の前述のポリペプチドを個体に投与する段階を含む。
【００２２】
本発明のさらなる局面は、野生型ヒトIgG Fc領域を含むポリペプチドによって誘導されるADCCの20％以下にまでADCCを下方調整するための、および/またはADCPを下方調整するための、野生型ヒトIgG Fc領域のFc変種を含むポリペプチドの使用であり、該ポリペプチドは、ヒトIgG Fc領域のPro329がグリシンで置換されており、残基はKabatのEU指標に従って番号付けられており、該ポリペプチドは、ヒトFcγRIIIAおよびヒトFcγRIIAに対して低い親和性を示す。
【００２３】
本発明の別の局面は、野生型ヒトIgG Fc領域を含むポリペプチドによって誘導されるADCCの20％以下にまでADCCを下方調整するための、および/またはADCPを下方調整するための、野生型ヒトIgG Fc領域のFc変種を含むポリペプチドの使用であり、該ポリペプチドは、ヒトIgG Fc領域のPro329がグリシンで置換されており、かつFc変種はヒトIgG1 Fc領域のL234AおよびL235AまたはヒトIgG4 Fc領域のS228PおよびL235Eに少なくとも2つのさらなるアミノ酸置換を含み、残基はKabatのEU指標に従って番号付けられており、該ポリペプチドは、ヒトFcγRIIIAおよびヒトFcγRIIAに対して低い親和性を示す。
【００２４】
本発明の別の局面は、前述のポリペプチドの使用であり、前述のポリペプチドによって誘導される栓球凝集は、野生型ヒトFc領域を含み血小板活性化抗体であるポリペプチドによって誘導される栓球凝集と比べて低減する。
【００２５】
本発明の別の局面において、有効量のポリペプチドを個体に投与する段階を含む、疾患を有する個体を治療する方法が提供され、該個体は、ヒトIgG Fc領域のPro329がグリシンで置換されたポリペプチドで治療され、残基はKabatのEU指標に従って番号付けられており、該ポリペプチドは、野生型ヒトIgG Fc領域を含むポリペプチドと比べてFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAへの結合が大きく低減していることを特徴とする。
【００２６】
本発明のさらに別の局面において、前記方法で使用されるポリペプチドは、ヒトIgG1 Fc領域のL234AおよびL235AまたはヒトIgG4 Fc領域のS228PおよびL235Eに少なくとも2つのさらなるアミノ酸置換を含む。
[本発明1001]
野生型ヒトIgG Fc領域のFc変種を含むポリペプチドであって、
該Fc変種がPro329の位置のアミノ酸置換および少なくとも1つのさらなるアミノ酸置換を含み、残基がKabatのEU指標に従って番号付けられており、かつ前記ポリペプチドが、野生型IgG Fc領域を含むポリペプチドと比べて、ヒトFcγRIIIAおよび/またはヒトFcγRIIAおよび/またはヒトFcγRIに対して低い親和性を示し、かつ前記ポリペプチドによって誘導されるADCCが、野生型ヒトIgG Fc領域を含むポリペプチドによって誘導されるADCCの20％以下にまで低減する、
前記ポリペプチド。
[本発明1002]
野生型ヒトFc領域のPro329が、グリシンもしくはアルギニン、またはFc/Fcγ受容体境界面内のプロリンサンドイッチを消失させるのに十分な大きさのアミノ酸残基で置換されている、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1003]
少なくとも1つのさらなるアミノ酸置換がS228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D、またはP331Sである、本発明1001または1002のポリペプチド。
[本発明1004]
少なくとも1つのさらなるアミノ酸置換が、ヒトIgG1 Fc領域のL234AおよびL235AまたはヒトIgG4 Fc領域のS228PおよびL235Eである、本発明1001〜1003のいずれかのポリペプチド。
[本発明1005]
ヒト受容体FcγI、FcγIIA、およびC1qを含む群のうちの少なくとも1つのさらなる受容体に対する親和性が、野生型ヒトIgG Fc領域を含むポリペプチドと比べて低い、本発明1001〜1004のいずれかのポリペプチド。
[本発明1006]
ヒトIgG1 Fc領域またはヒトIgG4 Fc領域を含む、本発明1001〜1005のいずれかのポリペプチド。
[本発明1007]
抗体またはFc融合タンパク質である、本発明1001〜1006のいずれかのポリペプチド。
[本発明1008]
以下である、本発明1001〜1007のいずれかのポリペプチド：
該ポリペプチドによって誘導される栓球凝集が、野生型ヒトIgG Fc領域を含むポリペプチドによって誘導される栓球凝集と比べて低減する。
[本発明1009]
以下である、本発明1001〜1008のいずれかのポリペプチド：
該ポリペプチドによって誘導されるCDCが、野生型ヒトIgG Fc領域を含むポリペプチドによって誘導されるCDCと比べて大きく低減する。
[本発明1010]
医薬として使用するための、本発明1001〜1009のいずれかのポリペプチド。
[本発明1011]
野生型Fc領域を含むポリペプチドに重鎖可変領域としてSEQ ID NO: 9および可変軽鎖領域としてSEQ ID NO: 8が含まれることを特徴とする抗CD9抗体である、本発明1001〜1010のいずれかのポリペプチド。
[本発明1012]
ポリペプチドのエフェクター機能が、野生型ヒトIgG Fc領域を含むポリペプチドによって誘導されるエフェクター機能と比べて大きく低減していることが望まれる疾患を治療する際に使用するための、本発明1001〜1011のいずれかのポリペプチド。
[本発明1013]
野生型ヒトIgG Fc領域のFc変種を含むポリペプチドのエフェクター機能が、野生型ヒトIgG Fc領域を含むポリペプチドによって誘導されるエフェクター機能と比べて大きく低減していることが望まれる疾患を治療するための医薬を製造する際の、本発明1001〜1012のいずれかのポリペプチドの使用。
[本発明1014]
野生型ヒトIgG Fc領域のFc変種を含むポリペプチドのエフェクター機能が、野生型ヒトFcポリペプチドを含むポリペプチドによって誘導されるエフェクター機能と比べて大きく低減していることが望まれる疾患を有する個体を治療する方法であって、本発明1001〜1012のいずれかのポリペプチドの有効量を個体に投与する段階を含む前記方法。
[本発明1015]
野生型ヒトIgG Fc領域を含むポリペプチドによって誘導されるADCCの20％以下にまでADCCを下方調整するための、および/またはADCPを下方調整するための、野生型ヒトIgG Fc領域のFc変種を含むポリペプチドの使用であって、
該ポリペプチドにおいて、ヒトIgG Fc領域のPro329がグリシンで置換されており、残基がKabatのEU指標に従って番号付けられており、該ポリペプチドが、ヒトFcγRIIIAおよびヒトFcγRIIAに対して低い親和性を示す、
前記ポリペプチドの使用。
[本発明1016]
Fc変種がヒトIgG1 Fc領域のL234AおよびL235AまたはヒトIgG4 Fc領域のS228PおよびL235Eに少なくとも2つのさらなるアミノ酸置換を含む、本発明1015のポリペプチドの使用。
[本発明1017]
前記ポリペプチドによって誘導される栓球凝集が、野生型ヒトFc領域を含み血小板活性化抗体であるポリペプチドによって誘導される栓球凝集と比べて低減する、本発明1015または1016の使用。
[本発明1018]
有効量のポリペプチドを個体に投与する段階を含む、疾患を有する個体をポリペプチドで治療する方法であって、
該ポリペプチドにおいて、ヒトIgG Fc領域のPro329がGlyで置換されており、残基がKabatのEU指標に従って番号付けられており、該ポリペプチドが、野生型ヒトIgG Fc領域を含むポリペプチドと比べてFcγRIIIAおよびFcγRIIAへの結合が大きく低減していることを特徴とする、
前記方法。
[本発明1019]
前記ポリペプチドが、ヒトIgG1 Fc領域のL234AおよびL235AまたはヒトIgG4 Fc領域のS228PおよびL235Eに少なくとも2つのさらなるアミノ酸置換を含む、本発明1018の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】Biacore T100機器(GE Healthcare)を25℃で用いて、表面プラズモン共鳴(SPR)により、免疫グロブリンに対する様々なFcγRの結合親和性を測定した。a) GA101(GA)抗体変種(IgG1-P329G変異、IgG4-SPLE変異、およびIgG1-LALA変異)およびP-セレクチン(PS)抗体変種(IgG1-P329G、IgG1-LALA、およびIgG4-SPLE)、ならびに野生型抗体に対するFcγRI結合親和性を試験した。b) CD9抗体変種(IgG1-野生型、IgG1-P329G、IgG1-LALA、IgG4-SPLE、IgG1-P329G/LALA、IgG4-SPLE/P329G)ならびに野生型抗体に対するFcγRI結合親和性を試験した。c) CD9抗体変種(IgG1-野生型、IgG1-P329G、IgG1-LALA、IgG4-SPLE、IgG1-P329G/LALA、IgG4-SPLE/P329G)ならびに野生型抗体に対するFcγRIIA(R131)結合親和性を試験した。正規化した応答を、受容体濃度の関数として示す。d) CD9(本明細書では「TA」と名付ける)抗体変種(IgG1-野生型、IgG4-SPLE/P329G、IgG1-LALA、IgG1-LALA/P329G)およびP-セレクチン(pSel)抗体変種(IgG4-野生型、IgG4-SPLE)、ならびに野生型抗体に対するFcγRIIB結合親和性を試験した。e) CD9抗体変種(IgG1-野生型、IgG4-SPLE、IgG1-LALA、IgG4-SPLE/P329G、IgG1-P329G、IgG1-LALA/P329G)ならびに野生型抗体に対するFcγRIIIA-V158結合親和性を試験した。正規化した応答を、受容体濃度の関数として示す。
【図２】P-セレクチン(PS)抗体変種(IgG1野生型、P329G、IgG4-SPLE)およびCD20(GA)抗体変種(IgG1-野生型、P329G、およびIgG4-SPLE)に対するC1q結合を試験した。
【図３】免疫エフェクター細胞を動員する能力は、Fc変種のタイプに応じて変わる。Fc変種をELISAプレート上に塗り、ヒトFcγRIIIAをトランスフェクトしたヒトNK92エフェクター細胞を添加した。エステラーゼアッセイ法を用いて、活性化されたNK細胞の細胞溶解活性の誘導を測定した。a) CD20(GA101)抗体変種(野生型、LALA、P329G、P329G/LALA)を解析した。b) CD20(GA101)抗体変種(P329R変異またはP329G変異を導入)を解析した。変種はすべて、任意のエフェクター細胞動員機能に対してより強いシグナルを有するように糖鎖を操作した(glycoengineered)型を作製した。
【図４】従来のADCCアッセイ法によって測定されるように、免疫エフェクター細胞を動員する能力は、Fc変種のタイプに応じて変わる。ヒトFγcRIIIAをトランスフェクトしたヒトNK92細胞株をエフェクターとして使用し、CD20陽性Raji細胞を標的細胞として使用した。糖鎖を操作した様々なCD20抗体(GA101 G(2))および糖鎖を操作していないCD20抗体(GA101)変種(P329G変異、P329A変異、またはLALA変異を導入)を試験した。a) 糖鎖を操作していないCD20抗体:それぞれP329G変異、LALA変異、およびP329G/LALA変異を抗体にそれぞれ導入した。b) 糖鎖を操作したCD20抗体:それぞれP329G変異、P329A変異、およびLALA変異を抗体にそれぞれ導入した。
【図５】補体依存性細胞障害(CDC)アッセイ法。糖鎖を操作していないCD20(GA101)抗体および糖鎖を操作したCD20(GA101)抗体の様々なFc変種を、SUDH-L4標的細胞にCDCをもたらす有効性に関して解析した。a) 糖鎖を操作していないCD20:それぞれP329G変異、LALA変異、およびP329G/LALA変異を抗体にそれぞれ導入した。b) 糖鎖を操作したCD20:それぞれP329G変異、P329A変異、およびLALA変異を抗体にそれぞれ導入した。
【図６】a) ヒトIgG1変種のFc結合グリカンの炭水化物プロファイル。LALA変異、P329G変異、P329A変異、またはP329G/LALA変異を含むhIgG1のFc結合オリゴ糖におけるガラクトシル化の比率は、野生型抗体の比率と最小限の差しかない。b) 相対的ガラクトシル化:IgG1 P329G/LALA変異を導入された4種の異なるIgG。Hek293 EBNA細胞において発現された場合のガラクトシル化の量に関して、4種の異なるVドメインを比較した。
【図７】全血における抗体誘導性血小板凝集アッセイ法。2種のドナーに関して測定した際、マウスIgG1は血小板凝集を誘導し、ドナーの応答は抗体濃度によって異なった。a) ドナーA、b) ドナーB。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
発明の詳細な説明
定義
本発明の明細書および特許請求の範囲において、免疫グロブリン重鎖中の残基の番号付与は、参照により本明細書に明確に組み入れられるKabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)で示されているようなEU指標のものである。「KabatによるEU指標」とは、ヒトIgG1 EU抗体の残基への番号付与を意味する。
【００２９】
「親和性」とは、ある分子(例えば抗体)の1つの結合部位とその結合相手(例えば、抗原またはFc受容体)の間の非共有結合性相互作用の総合計の強さを意味する。別段の定めが無い限り、本明細書において使用される場合、「結合親和性」とは、結合対(例えば、抗体/Fc受容体または抗体および抗原)のメンバー間の1:1相互作用を反映する内因性結合親和性を意味する。通常、分子Xの相手Yに対する親和性は、解離定数(Kd)によって表すことができる。親和性は、本明細書において説明するものを含む、当技術分野において公知の一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な説明的かつ例示的態様を以下に説明する。
【００３０】
「親和性成熟」抗体とは、抗原に対する抗体の親和性を向上させるような変化を有していない親抗体と比べて、1つまたは複数の超可変領域(HVR)に1つまたは複数の変化を有する抗体を意味する。
【００３１】
「アミノ酸改変」とは、所定のアミノ酸配列のアミノ酸配列中の変更を意味する。例示的な改変には、アミノ酸の置換、挿入、および/または欠失が含まれる。本明細書において好ましいアミノ酸改変は、置換である。例えばFc領域の、指定された位置「におけるアミノ酸改変」とは、指定された残基の置換もしくは欠失、または指定された残基に隣接する少なくとも1つのアミノ酸残基の挿入を意味する。指定された残基「に隣接する」挿入とは、それから残基1〜2個の範囲内の挿入を意味する。挿入は、指定された残基に対してN末端側またはC末端側でよい。
【００３２】
「アミノ酸置換」とは、所定のアミノ酸配列中の少なくとも1つの既存のアミノ酸残基を別の異なる「置換」アミノ酸残基で置換することを意味する。1つまたは複数の置換残基は、「天然に存在するアミノ酸残基」(すなわち遺伝コードにコードされる)でよく、アラニン(Ala);アルギニン(Arg);アスパラギン(Asn);アスパラギン酸(Asp);システイン(Cys);グルタミン(Gln);グルタミン酸(Glu);グリシン(Gly);ヒスチジン(His);イソロイシン(Ile):ロイシン(Leu);リジン(Lys);メチオニン(Met);フェニルアラニン(Phe);プロリン(Pro);セリン(Ser);トレオニン(Thr);トリプトファン(Trp);チロシン(Tyr);およびバリン(Val)からなる群より選択され得る。好ましくは、置換残基はシステインではない。1つまたは複数の天然に存在しないアミノ酸残基による置換もまた、本明細書におけるアミノ酸置換の定義に包含される。「天然に存在しないアミノ酸残基」とは、ポリペプチド鎖中の隣接したアミノ酸残基に共有結合することができる、上記に挙げた天然に存在するアミノ酸残基以外の残基を意味する。天然に存在しないアミノ酸残基の例には、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、およびEllman, et al., Meth. Enzym. 202 (1991) 301-336で説明されているもののような他のアミノ酸残基類似体が含まれる。このような天然に存在しないアミノ酸残基を作製するために、Noren, et al., Science 244 (1989) 182およびEllman, et al.(前記)の手順を使用することができる。簡単に説明すると、これらの手順は、天然に存在しないアミノ酸残基を用いてサプレッサーtRNAを化学的に活性化し、続いて、そのRNAをインビトロで転写および翻訳することを含む。
【００３３】
「アミノ酸挿入」とは、所定のアミノ酸配列中に少なくとも1つのアミノ酸を組み入れることを意味する。通常、挿入は、1つまたは2つのアミノ酸残基の挿入からなるが、本出願は、より大きな「ペプチド挿入」、例えば、約3個〜約5個またはさらに最高約10個のアミノ酸残基の挿入を企図する。挿入される残基は、上記に開示したように、天然に存在するものまたは天然に存在しないものでよい。
【００３４】
「アミノ酸欠失」とは、所定のアミノ酸配列から少なくとも1つのアミノ酸残基を除去することを意味する。
【００３５】
本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、限定されるわけではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、および所望の抗原結合活性を示す限りにおいて抗体断片を含む、様々な抗体構造体を包含する。
【００３６】
本明細書において使用される「抗体変種」という用語は、野生型抗体を基準として、例えば、野生型抗体の特定のアミノ酸残基の変異によって導入されるアミノ酸配列変化が抗体変種に存在することを特徴とする、野生型抗体の変種を意味する。
【００３７】
本明細書において使用される「抗体エフェクター機能」または「エフェクター機能」という用語は、IgGのFcエフェクタードメイン(例えば、免疫グロブリンのFc領域)によってもたらされる機能を意味する。このような機能は、例えば、Fcエフェクタードメインを食作用活性もしくは溶解活性を有する免疫細胞上のFc受容体に結合させることによって、またはFcエフェクタードメインを補体系の成分に結合させることによって、もたらすことができる。典型的なエフェクター機能は、ADCC、ADCP、およびCDCである。
【００３８】
「抗体断片」とは、インタクト抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体部分を含む、インタクト抗体以外の分子を意味する。抗体断片の例には、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2;ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子(例えばscFv)、および抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００３９】
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイ法において、参照抗体が抗原に結合するのを50％またはそれ以上妨害する抗体を意味し、逆に言えば、競合アッセイ法において、参照抗体は、その抗体が抗原に結合するのを50％またはそれ以上妨害する。例示的な競合アッセイ法が、本明細書において提供される。
【００４０】
「抗体依存性細胞媒介性細胞障害」および「ADCC」とは、FcRを発現する非特異的細胞障害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球、およびマクロファージ)が、標的細胞上の結合された抗体を認識し、続いて、標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性反応を意味する。ADCCを媒介する主な細胞であるNK細胞は、FcγRIIIのみを発現するが、単球は、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIを発現する。造血細胞におけるFcR発現は、Ravetch, and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9 (1991) 457-492の464頁の表3に要約されている。
【００４１】
「抗体依存性細胞性食作用」および「ADCP」という用語は、抗体で覆われた細胞の全体または一部のいずれかが、免疫グロブリンFc領域に結合する食作用性免疫細胞(例えば、マクロファージ、好中球、および樹状細胞)の内部に取り入れられるプロセスを意味する。
【００４２】
「結合ドメイン」という用語は、別の分子に結合するポリペプチド領域を意味する。FcRの場合、結合ドメインは、Fc領域に結合するのに関与している、そのポリペプチド鎖(例えば、そのα鎖)の一部分を含み得る。1つの有用な結合ドメインは、FcR α鎖の細胞外ドメインである。
【００４３】
本明細書において使用される、Fc受容体への「結合」という用語は、例えばBIAcore(登録商標)アッセイ法(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden)における、Fc受容体への抗体の結合を意味する。
【００４４】
BIAcore(登録商標)アッセイ法では、Fc受容体が表面に結合され、変種、例えば、変異が導入されている抗体変種の結合が、表面プラズモン共鳴(SPR)によって測定される。結合親和性は、ka(抗体/Fc受容体複合体に由来する抗体の結合速度定数)、kd(解離定数)、およびKD(kD/ka)という用語を用いて定義される。あるいは、SPRセンサーグラムの結合シグナルを、共鳴シグナルの高さおよび解離挙動に関して、参照物の応答シグナルと直接比較することもできる。
【００４５】
「C1q」は、免疫グロブリンのFc領域に対する結合部位を含むポリペプチドである。C1qは、2種のセリンプロテアーゼC1rおよびC1sと一緒になって、複合体C1を形成する。C1は、補体依存性細胞障害(CDC)経路の第1成分である。ヒトC1qは、例えばQuidel, San Diego, Califから市販されているものを購入することができる。
【００４６】
通常、ヒトIgG Fc領域の「CH2ドメイン」(「Cγ2」ドメインとも呼ばれる)は、アミノ酸231番目あたりからアミノ酸340番目あたりにまで及ぶ。CH2ドメインは、別のドメインと接近して対になっていないという点で、独特である。もっと正確に言えば、N結合型分枝状炭水化物鎖2つが、完全な天然IgG分子の2つのCH2ドメインの間に介在している。炭水化物が、ドメイン間の対形成のための代用品となり、CH2ドメインを安定化するのに寄与し得ると推測されている(Burton, Molec. Immunol. 22 (1985) 161-206)。
【００４７】
「CH3ドメイン」は、Fc領域中のC末端からCH2ドメインまでの残基のストレッチ(すなわち、IgGのアミノ酸残基341番目あたり〜アミノ酸残基447番目あたり)を含む。
【００４８】
「癌」および「癌性」という用語は、未制御の細胞増殖を典型的に特徴とする、哺乳動物の生理的状態を意味するか、または説明する。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が含まれるが、それらに限定されるわけではない。このような癌のより具体的な例には、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、消化器癌、膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、および様々なタイプの頭頸部癌が含まれる。
【００４９】
本明細書において使用される場合、「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」という表現は、同義的に使用され、このような呼称はいずれも、子孫を含む。したがって、「形質転換体」および「形質転換細胞」という単語は、初代対象細胞および(植え継ぎ(transfer)の回数に関係なく)それに由来する培養物を含む。また、意図的な変異または偶発性の変異が原因で、あらゆる子孫のDNA内容がまったく同じではない場合があることが理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたのと同じ機能または生物活性を有する変異子孫は含まれる。異なる呼称が意図される場合、文脈から明らかになると考えられる。
【００５０】
「キメラ」抗体という用語は、重鎖および/または軽鎖の一部分は特定の供給源または種に由来するが、重鎖および/または軽鎖の残りの部分は異なる供給源または種に由来する、抗体を意味する。
【００５１】
抗体の「クラス」とは、その重鎖が所有する定常ドメインまたは定常領域のタイプを意味する。抗体には5つの主要なクラス、すなわちIgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2にさらに分類され得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
【００５２】
本明細書において使用される「細胞障害性物質」という用語は、細胞機能を阻害するかもしくは妨げ、かつ/または細胞死もしくは細胞破壊を引き起こす物質を意味する。細胞障害性物質には、放射性同位元素(例えば、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212、およびLuの放射性同位元素);化学療法剤または化学療法薬(例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン(adriamicin)、ビンカアルカロイド(ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド)、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル、ダウノルビシン、または他の挿入剤);増殖抑制剤;核酸分解酵素のような酵素およびその断片;抗生物質;細菌、真菌、植物、または動物に由来する低分子毒素または酵素的に活性な毒素などの毒素(断片および/またはその変種を含む);ならびに下記に開示する様々な抗腫瘍剤または抗癌剤が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００５３】
「補体依存性細胞障害」またはCDCという用語は、標的に結合した抗体のFcエフェクタードメインが一連の酵素反応を活性化して、結果的に標的細胞の膜に穴を形成させる、細胞死を誘導するためのメカニズムを意味する。典型的には、抗体に覆われた標的細胞上のもののような抗原-抗体複合体が、補体成分C1qに結合し活性化し、次に、補体成分C1qが、補体カスケードを活性化して、標的細胞の死をもたらす。また、補体の活性化は、標的細胞の表面への補体成分の沈着ももたらす場合があり、これにより、白血球上の補体受容体(例えばCR3)に結合することによってADCCが促進される。
【００５４】
「障害」とは、Fc変種を含む抗体のようなポリペプチドを用いた治療から利益を受けると思われる任意の状態である。これは、哺乳動物を問題の障害になりやすくする病理学的状態を含む、慢性および急性の障害または疾患を含む。1つの態様において、この障害は癌である。
【００５５】
「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプによって変わる、抗体のFc領域に起因し得る生物学的活性を意味する。抗体エフェクター機能の例には、C1q結合および補体依存性細胞障害(CDC);Fc受容体結合;抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ADCC);食作用(ADCP);細胞表面受容体(例えばB細胞受容体)の下方調節;ならびにB細胞活性化が含まれる。
【００５６】
本明細書において使用される「エフェクター機能の低減」とは、例えばADCCまたはCDCのような特定のエフェクター機能が、対照(例えば、野生型Fc領域を有するポリペプチド)と比較して少なくとも20％低減していることを意味し、本明細書において使用される「エフェクター機能の大きな低減」とは、例えばADCCまたはCDCのような特定のエフェクター機能が、対照と比較して少なくとも50％低減していることを意味する。
【００５７】
作用物質、例えば薬学的製剤の「有効量」とは、必要な投薬量および期間で与えた場合に、所望の治療的結果または予防的結果を実現するのに有効な量を意味する。
【００５８】
本明細書における「Fc領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部分を含む、免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列のFc領域および変種Fc領域を含む。1つの態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域は、Cys226またはPro230から、重鎖のカルボキシル末端まで及ぶ。しかしながら、Fc領域のC末端リジン(Lys447)は、存在する場合もあれば存在しない場合もある。本明細書において別段の指定が無い限り、Fc領域中または定常領域中のアミノ酸残基の番号付与は、EU指標とも呼ばれるEU番号付与方式に従い、これは、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)において説明されている。
【００５９】
「変種Fc領域」とは、本明細書において定義する少なくとも1つの「アミノ酸改変」が原因で、「天然」または「野生型」配列のFc領域のものとは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、変種Fc領域は、天然配列Fc領域中または親ポリペプチドのFc領域中に、天然配列Fc領域または親ポリペプチドのFc領域と比べて、少なくとも1つのアミノ酸置換、例えば、約1個〜約10個のアミノ酸置換、および好ましくは、約1個〜約5個のアミノ酸置換を有する。本明細書における変種Fc領域は、天然配列Fc領域および/または親ポリペプチドのFc領域と、好ましくは少なくとも約80％の相同性、および最も好ましくは、それらと少なくとも約90％の相同性、より好ましくは、それらと少なくとも約95％の相同性を有すると考えられる。
【００６０】
本明細書において使用される「Fc変種」という用語は、Fcドメイン中に改変を含むポリペプチドを意味する。本発明のFc変種は、それらを構成するアミノ酸改変に基づいて定義される。したがって、例えば、P329Gは、親Fcポリペプチドを基準として329位のプロリンがグリシンで置換されたFc変種である(番号付与は、EU指標に従う)。野生型アミノ酸のアイデンティティが明示されない場合があり、その場合、前述の変種はP329Gと呼ばれる。本発明で考察したすべての位置に関して、番号付与はEU指標に従う。EU指標、もしくはKabatによるEU指標、またはEU番号付与スキームとは、EU抗体の番号付与を意味する(参照により全体が本明細書に組み入れられるEdelman, et al., Proc Natl Acad Sci USA 63 (1969) 78-85)。改変は、付加、欠失、または置換であってよい。置換は、天然に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸を含んでよい。変種は、非天然アミノ酸を含んでよい。例には、米国特許第6,586,207号;WO 98/48032;WO 03/073238;US 2004/0214988 A1;WO 05/35727 A2;WO 05/74524 A2; Chin, J.W., et al., Journal of the American Chemical Society 124 (2002) 9026-9027; Chin, J.W., and Schultz, P.G., ChemBioChem 11 (2002) 1135-1137; Chin, J.W., et al., PICAS United States of America 99 (2002) 11020-11024;およびWang, L., and Schultz, P.G., Chem. (2002) 1-10が含まれ、これらはすべて、参照により全体が組み入れられる。
【００６１】
「Fc領域を含むポリペプチド」という用語は、Fc領域を含む、抗体またはイムノアドヘシン(下記の定義を参照されたい)などのポリペプチドを意味する。
【００６２】
「Fc受容体」または「FcR」という用語は、抗体のFc領域に結合する受容体を説明するのに使用される。好ましいFcRは、天然配列のヒトFcRである。さらに、好ましいFcRは、IgG抗体に結合するもの(γ受容体)であり、サブクラスFcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIの受容体が含まれ、これらの受容体の対立遺伝子変種および選択的にスプライシングされた形態も含まれる。FcγRII受容体には、類似したアミノ酸配列を有し、主にその細胞質内ドメインが異なる、FcγRIIA(「活性化受容体」)およびFcγRIIB(「抑制性受容体」)が含まれる。活性化受容体FcγRIIAは、その細胞質内ドメイン中に免疫受容体活性化チロシンモチーフ(ITAM)を含む。抑制性受容体FcγRIIBは、その細胞質内ドメイン中に免疫受容体抑制性チロシンモチーフ(ITIM)を含む。(Daeron, M., Annu. Rev. Immunol. 15 (1997) 203-234の概説を参照されたい)。FcRは、Ravetch, and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9 (1991) 457-492; Capel, et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34;およびde Haas, et al., J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-41において概説されている。今後同定されるものを含む、他のFcRは、本明細書における用語「FcR」に包含される。また、この用語は、母親のIgGを胎児に移行させるのに関与している新生児型受容体FcRnも含む(Guyer, et al., J. Immunol. 117 (1976) 587およびKim, et al., J. Immunol. 24 (1994) 249)。
【００６３】
本明細書において使用される「IgG Fcリガンド」とは、IgG抗体のFc領域に結合してFc/Fcリガンド複合体を形成する、任意の生物に由来する分子、好ましくはポリペプチドを意味する。Fcリガンドには、FcγR、FcγR、FcγR、FcRn、C1q、C3、マンナン結合レクチン、マンノース受容体、ブドウ球菌プロテインA、連鎖球菌プロテインG、およびウイルスのFcγRが含まれるが、それらに限定されるわけではない。また、Fcリガンドには、FcγRに相同であるFc受容体ファミリーであるFc受容体ホモログ(FcRH)も含まれる(参照により全体が組み入れられるDavis, et al., Immunological Reviews 190 (2002) 123-136)。Fcリガンドには、Fcに結合する未発見分子が含まれてよい。具体的なIgG Fcリガンドは、FcRn受容体およびFcγ受容体である。本明細書において使用される「Fcリガンド」とは、抗体のFc領域に結合してFc/Fcリガンド複合体を形成する、任意の生物に由来する分子、好ましくはポリペプチドを意味する。
【００６４】
本明細書において使用される「Fcγ受容体」、「FcγR」、または「FcガンマR」とは、IgG抗体Fc領域に結合しFcγR遺伝子にコードされるタンパク質ファミリーの任意のメンバーを意味する。ヒトにおいて、このファミリーは、FcγRI(CD64)(アイソフォームFcγRIA、FcγRIB、およびFcγRICを含む);FcγRII(CD32)(アイソフォームFcγRIIA(アロタイプH131およびR131を含む)、FcγRIIB(FcγRIIB-1およびFcγRIIB-2を含む)、およびFcγRIIcを含む);ならびにFcγRIII(CD16)(アイソフォームFcγRIIIA(アロタイプV158およびF158を含む)およびFcγRIIIb(アロタイプFcγRIIB-NA1およびFcγRIIB-NA2を含む)(参照により全体が組み入れられるJefferis, et al., Immunol Lett 82 (2002) 57-65)、ならびに任意の未発見のヒトFcγRまたはFcγRのアイソフォームもしくはアロタイプを含むが、それらに限定されるわけではない。FcγRは、限定されるわけではないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含む、任意の生物に由来してよい。マウスFcγRには、FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)、およびFcγRIII-2(CD16-2)、ならびに任意の未発見のマウスFcγRまたはFcγRのアイソフォームもしくはアロタイプが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００６５】
本明細書において使用される「FcRn」または「新生児型Fc受容体」とは、IgG抗体Fc領域に結合し、少なくとも一部がFcRn遺伝子にコードされているタンパク質を意味する。FcRnは、限定されるわけではないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含む、任意の生物に由来してよい。当技術分野において公知であるとおり、機能的なFcRnタンパク質は、重鎖および軽鎖と呼ばれることが多い2つのポリペプチドを含む。軽鎖はβ-2-ミクログロブリンであり、重鎖はFcRn遺伝子にコードされる。本明細書において別段の注記の無い限り、FcRnまたはFcRnタンパク質とは、FcRn重鎖とβ-2-ミクログロブリンの複合体を意味する。
【００６６】
本明細書において使用される「野生型ポリペプチドまたは親ポリペプチド」とは、変種を作製するために後で改変される未改変ポリペプチドを意味する。野生型ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドまたは天然に存在するポリペプチドの変種もしくは操作された変型でよい。野生型ポリペプチドは、ポリペプチド自体、親ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を指してよい。したがって、本明細書において使用される「野生型免疫グロブリン」とは、変種を作製するために改変される未改変免疫グロブリンポリペプチドを意味し、本明細書において使用される「野生型抗体」とは、変種抗体を作製するために改変される未改変抗体を意味する。「野生型抗体」には、下記に概説する組換えによって作製された公知の市販抗体が含まれることに留意すべきである。
【００６７】
「結晶化可能断片(Fc)ポリペプチド」という用語は、エフェクター分子および細胞と相互作用する、抗体分子の部分である。これは、免疫グロブリン重鎖のC末端部分を含む。
【００６８】
「フレームワーク」または「FR」という用語は、超可変領域(HVR)残基以外の可変ドメイン残基を意味する。一般に、可変ドメインのFRは、4つのFRドメイン、すなわちFR1、FR2、FR3、およびFR4からなる。したがって、一般に、HVR配列およびFR配列はVH(またはVL)中に次の配列で現われる:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
【００６９】
「完全長抗体」、「インタクト抗体」、および「全長抗体」という用語は、本明細書において同義的に使用されて、天然抗体の構造に実質的に同様の構造を有するか、または本明細書において定義するFc領域を含む重鎖を有する抗体を意味する。
【００７０】
「機能的なFc領域」は、天然配列Fc領域の「エフェクター機能」を有する。例示的な「エフェクター機能」には、C1q結合;補体依存性細胞障害;Fc受容体結合;抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ADCC);食作用;細胞表面受容体(例えばB細胞受容体;BCR)の下方調節などが含まれる。一般に、このようなエフェクター機能は、Fc領域が結合ドメイン(例えば抗体可変ドメイン)と合体することを必要とし、例えば本明細書において開示する様々なアッセイ法を用いて評価することができる。
【００７１】
一般に、「ヒンジ領域」は、ヒトIgG1のGlu216からPro230までのストレッチと定義される(Burton, Molec. Immunol. 22 (1985) 161-206)。他のIgGアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間のS-S結合を形成する最初のシステイン残基および最後のシステイン残基を同じ位置に配置することによって、IgG1配列と整列させることができる。
【００７２】
Fc領域の「ヒンジ領域下流」とは、ヒンジ領域のC末端の後すぐの残基、すなわち、Fc領域の残基233〜239のストレッチと通常定義される。
【００７３】
「相同性」とは、配列を整列させ、必要な場合にはギャップを導入して、最大の相同性パーセントを実現させた後に同一である、アミノ酸配列変種中の残基の比率(％)と定義される。アライメントのための方法およびコンピュータープログラムは、当技術分野において周知である。1つのこのようなコンピュータープログラムはGenentech, Inc.によって開発された「Align 2」であり、これは、1991年12月10日にUnited States Copyright Office, Washington, D.C. 20559にユーザー用文書と共に提出された。
【００７４】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」という用語は同義的に使用され、外来性核酸が導入された細胞を、そのような細胞の子孫を含めて意味する。宿主細胞には、初代形質転換細胞およびそれに由来する子孫を継代の回数に関わらず含む「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれる。子孫の核酸内容は親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含んでもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたのと同じ機能または生物活性を有する変異子孫は、本明細書に含まれる。
【００７５】
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生されるか、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を使用する非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を具体的には除く。
【００７６】
「ヒトエフェクター細胞」は、1つまたは複数のFcRを発現し、エフェクター機能を果たす白血球である。好ましくは、これらの細胞は少なくともFcγRIIIを発現し、ADCCエフェクター機能を果たす。ADCCを媒介するヒト白血球の例には、末梢血単核球(PBMC)、ナチュラルキラー(NK)細胞、単球、細胞障害性T細胞、および好中球が含まれ、PBMC細胞およびNK細胞が好ましい。エフェクター細胞は、本明細書において説明するように、その天然供給源、例えば、血液またはPBMCから単離することができる。
【００７７】
「ヒト化」抗体とは、非ヒトHVRに由来するアミノ酸残基およびヒトFRに由来するアミノ酸残基を含むキメラ抗体を意味する。一定の態様において、ヒト化抗体は、HVR(例えばCDR)のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト抗体のものに相当し、FRのすべてまたは実質的にすべてがヒト抗体のものに相当する、少なくとも1つ、および典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含む。ヒト化抗体は、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を任意で含んでよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化型」とは、ヒト化を受けた抗体を意味する。
【００７８】
本明細書において使用される「超可変領域」または「HVR」という用語は、配列が超可変性であり、かつ/または特徴的な構造の(structurally defined)ループ(「超可変ループ」)を形成する、抗体可変ドメインの各領域を意味する。一般に、天然の4鎖抗体は6個のHVRを含む。3個はVH中にあり(H1、H2、H3)、3個はVL中にある(L1、L2、L3)。一般に、HVRは、超可変ループおよび/または「相補性決定領域」(CDR)に由来するアミノ酸残基を含み、後者は、配列の可変性が最も高く、かつ/または抗原認識に関与している。例示的な超可変ループは、アミノ酸残基26〜32(L1)、50〜52(L2)、91〜96(L3)、26〜32(H1)、53〜55(H2)、および96〜101(H3)に存在する(Chothia, and Lesk, J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917)。例示的なCDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3)は、L1のアミノ酸残基24〜34、L2のアミノ酸残基50〜56、L3のアミノ酸残基89〜97、H1のアミノ酸残基31〜35B、H2のアミノ酸残基50〜65、およびH3のアミノ酸残基95〜102に存在する(Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))。VH中のCDR1は例外として、一般に、CDRは、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。また、CDRは、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」または「SDR」も含む。SDRは、短縮CDRまたはa-CDRと呼ばれるCDR領域内に含まれる。例示的なa-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2、およびa-CDR-H3)は、L1のアミノ酸残基31〜34、L2のアミノ酸残基50〜55、L3のアミノ酸残基89〜96、H1のアミノ酸残基31〜35B、H2のアミノ酸残基50〜58、およびH3のアミノ酸残基95〜102に存在する(Almagro, and Fransson, Front.Biosci. 13 (2008) 1619-1633を参照されたい)。別段の定めが無い限り、本明細書において、可変ドメイン中のHVR残基および他の残基(例えばFR残基)は上記のKabat et al.に従って番号を付与する。
【００７９】
「免疫複合体」とは、少なくとも1つの標的分子およびFc領域を含む少なくとも1つの異種ポリペプチドが互いに結合して、分子量のより大きな複合体を形成する場合にできる、比較的安定な構造体を意味する。免疫複合体の例は、抗原-抗体凝集体および標的分子-イムノアドヘシン凝集体である。別段の定めが無い限り、本明細書において使用される「免疫複合体」という用語は、エクスビボの複合体(すなわち、自然界で存在し得る形態または設定以外のもの)を意味する。しかしながら、例えば、哺乳動物における免疫複合体のクリアランスを評価するために、免疫複合体を哺乳動物に投与してもよい。
【００８０】
「免疫結合体」とは、限定されるわけではないが細胞障害性物質を含む1種または複数種の異種分子に結合した抗体である。
【００８１】
「個体」または「対象」は哺乳動物である。哺乳動物には、飼い慣らされた動物(例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ)、霊長類(例えば、ヒトおよび非ヒト霊長類、例えばサル)、ウサギ、およびげっ歯動物(例えば、マウスおよびラット)が含まれるが、それらに限定されるわけではない。一定の態様において、個体または対象はヒトである。
【００８２】
「単離された」抗体とは、その天然環境の構成要素から分離された抗体である。いくつかの態様において、抗体は、例えば、電気泳動(例えば、SDS-PAGE、等電点電気泳動(IEF)、キャピラリー電気泳動)またはクロマトグラフィー(例えば、イオン交換もしくは逆相HPLC)によって測定した場合に95％または99％を超える純度まで精製される。抗体純度を評価するための方法に関する概要については、例えばFlatman, et al., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87を参照されたい。
【００８３】
「単離された」ポリペプチドとは、その天然環境の構成要素から同定および分離され、かつ/または回収されたポリペプチドである。その天然環境の混入物構成要素は、ポリペプチドの診断的使用または治療的使用を妨げると思われる材料であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク性溶質または非タンパク性溶質が含まれ得る。好ましい態様において、ポリペプチドは、(1)ローリー法によって決定した場合に、ポリペプチドの95重量％を上回るまで、および最も好ましくは99重量％を上回るまで、(2)スピニングカップ配列決定装置の使用によってN末端もしくは内部のアミノ酸配列の少なくとも15残基を得るのに十分な程度まで、または、(3)クーマシーブルー染色、もしくは好ましくは銀染色を用いる、還元条件もしくは非還元条件下でのSDS-PAGEによって均質になるまで、精製される。単離されたポリペプチドは、ポリペプチドの天然環境の少なくとも1種の構成要素が存在しないと考えられるため、組換え細胞内部のインサイチューのポリペプチドを含む。しかしながら、通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも1つの精製段階によって調製される。
【００８４】
「単離された」核酸とは、その天然環境の構成要素から分離された核酸分子を意味する。単離された核酸は、その核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、その核酸分子は、染色体外に存在するか、または天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【００８５】
「抗体をコードする単離された核酸」とは、抗体の重鎖および軽鎖(またはその断片)をコードする1つまたは複数の核酸分子を意味し、単一のベクターまたは別々のベクター中のこのような核酸分子、および宿主細胞中の1つまたは複数の位置に存在するこのような核酸分子を含む。
【００８６】
本明細書において使用される場合、「標識」という単語は、ポリペプチドに直接的にまたは間接的に結合する、検出可能な化合物または組成物を意味する。標識は、それ自体で検出可能でもよく(例えば、ラジオアイソトープ標識もしくは蛍光性標識)、または酵素標識の場合、検出可能である基質化合物もしくは基質組成物の化学的変化を触媒してもよい。
【００８７】
本明細書において使用される「リガンド結合ドメイン」という用語は、任意の天然の細胞表面受容体、または対応する天然受容体の少なくとも1つの質的なリガンド結合能を保持しているその任意の領域もしくは派生物を意味する。特定の態様において、受容体は、免疫グロブリン超遺伝子ファミリーのメンバーに相同である細胞外ドメインを有する細胞表面ポリペプチドに由来する。免疫グロブリン超遺伝子ファミリーのメンバーではないが、それでもなお、この定義によって具体的に包含される他の受容体は、サイトカインに対する受容体、および特に、チロシンキナーゼ活性を有する受容体(受容体型チロシンキナーゼ)、ヘマトポイエチンサブファミリーおよび神経成長因子受容体サブファミリーのメンバー、ならびに細胞接着分子、例えば(E-、L-、およびP-)セレクチンである。
【００８８】
本明細書において使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体集団から得られた抗体を意味する。すなわち、この集団を構成する個々の抗体は、存在し得る変種抗体を除いて、同一であり、かつ/または同じエピトープに結合する。例えば、天然に存在する変異を含むか、またはモノクローナル抗体調製物を作製する間に発生するこのような変種は通常、少量で存在する。様々な決定基(エピトープ)を対象とする様々な抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、1つの抗原上の単一の決定基を対象とする。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体集団から得られたものであるという抗体の特徴を示し、いずれかの特定の方法による抗体の作製を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用するためのモノクローナル抗体は、限定されるわけではないが、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部分を含むトランスジェニック動物を使用する方法を含む、様々な技術によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのこのような方法および他の例示的な方法は、本明細書において説明される。
【００８９】
「裸抗体」とは、異種部分(例えば細胞障害性部分)にも放射性標識物質にも結合していない抗体を意味する。裸抗体は、薬学的製剤中に存在してよい。
【００９０】
「天然抗体」とは、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を意味する。例えば、天然IgG抗体は、ジスルフィド結合されている2つの同一の軽鎖および2つの同一の重鎖から構成される、約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。N末端からC末端に向かって、各重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(VH)とそれに続く3つの定常ドメイン(CH1、CH2、およびCH3)を有する。同様に、N末端からC末端に向かって、各軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(VL)とそれに続く軽鎖定常(CL)ドメインを有する。抗体の軽鎖は、定常ドメインおよび可変ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)およびラムダ(λ)と呼ばれる2つのタイプのうちの1つに割り当てることができる。
【００９１】
「天然配列Fc領域」は、自然界に存在するFc領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトFc領域には、天然配列ヒトIgG1 Fc領域(非AアロタイプおよびAアロタイプ);天然配列ヒトIgG2 Fc領域;天然配列ヒトIgG3 Fc領域;および天然配列ヒトIgG4 Fc領域、ならびに天然に存在するその変種が含まれる。
【００９２】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係になるように配置されている場合、「機能的に連結」されている。例えば、プレ配列もしくは分泌リーダーのDNAは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、そのポリペプチドのDNAに機能的に連結されており;プロモーターもしくはエンハンサーは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、そのコード配列に機能的に連結されており;または、リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に機能的に連結されている。一般に、「機能的に連結される」とは、連結されるDNA配列が隣接していていること、分泌リーダーの場合、隣接し、かつリーディング相(reading phase)中にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは隣接していなくてもよい。連結は、好都合な制限部位におけるライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合には、合成のオリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の手法に従って使用される。
【００９３】
「添付文書」という用語は、治療的製品の市販用包装商品に習慣的に含まれる、適応症、用法、投薬量、投与、併用療法、禁忌、および/またはそのような治療的製品の使用に関する警告についての情報を含む取扱い説明書を意味するのに使用される。
【００９４】
本明細書において使用される「位置」とは、タンパク質の配列中の場所を意味する。位置は、順を追って、または確立された形式、例えば抗体番号付与のためのEU指標に従って、番号付与してよい。
【００９５】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、天然アミノ酸残基または非天然アミノ酸残基を含むアミノ酸残基ポリマーを意味するために同義的に使用され、最短の長さに制限されない。
【００９６】
したがって、ペプチド、オリゴペプチド、2量体、および多量体などがこの定義に含まれる。完全長タンパク質およびその断片は両方とも、この定義に包含される。また、この用語は、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、およびリン酸化を含む、ポリペプチドの翻訳後修飾も含む。
【００９７】
さらに、本明細書における「ポリペプチド」はまた、天然配列に対する単一のまたは複数のアミノ酸残基の欠失、付加、および置換などで改変されたタンパク質も、そのタンパク質が所望の活性を維持している限りにおいて、意味する。例えば、セリン残基で置換して、1つの反応性システインをなくすか、もしくはジスルフィド結合を除去してよく、または保存的アミノ酸置換を行って、切断部位をなくしてもよい。これらの改変は、部位特異的変異誘発によるなど意図的でもよく、またはそのタンパク質を産生する宿主の変異もしくはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅に起因する誤りによるなど、偶発的でもよい。
【００９８】
本明細書において使用される「野生型ポリペプチド」および「野生型(ヒト)Fc領域」という用語は、本明細書において開示するFc領域改変のうちの1つまたは複数がない(それらが導入されていないため)アミノ酸配列を含み、例えば対照として役立つポリペプチドおよびFc領域をそれぞれ意味する。野生型ポリペプチドは、天然配列Fc領域または既存のアミノ酸配列改変(例えば、付加、欠失、および/もしくは置換)を有するFc領域を含み得る。
【００９９】
「薬学的製剤」という用語は、その中に含まれる有効成分の生物活性が有効になるのを可能にするような形態で存在し、かつその製剤が投与されると思われる対象に対して許容されないほど毒性である追加成分を含まない、調製物を意味する。
【０１００】
「薬学的に許容される担体」とは、対象にとって非毒性である、薬学的製剤中の有効成分以外の成分を意味する。薬学的に許容される担体には、緩衝剤、賦形剤、安定化剤、または保存剤が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１０１】
FcR結合親和性またはADCC活性が「変化」したポリペプチドとは、親ポリペプチドまたは天然配列Fc領域を含むポリペプチドと比べて、FcR結合活性および/またはADCC活性が増大または低減しているポリペプチドである。FcRに対して「結合の増加を示す」ポリペプチド変種は、親ポリペプチドより優れた親和性で、少なくとも1つのFcRに結合する。FcRに対して「結合の減少を示す」ポリペプチド変種は、親ポリペプチドより劣る親和性で、少なくとも1つのFcRに結合する。FcRに対して結合の減少を示すこのような変種は、FcRに対して感知できる結合をほとんどまたはまったく有していない場合がある。例えば、本明細書の実施例で測定するように、例えば、天然配列IgG Fc領域と比べてFcRへの結合は0〜20％である。
【０１０２】
親ポリペプチドより「低い親和性」でFcRに結合するポリペプチドとは、結合アッセイ法におけるポリペプチド変種および親ポリペプチドの量がほぼ同じである場合に、親抗体よりも実質的に低い結合親和性で、上記に特定したFcRのうちの任意の1つまたは複数に結合するポリペプチドである。例えば、低いFcR結合親和性を有するポリペプチド変種は、例えば、本明細書の実施例で開示するようにFcR結合親和性が測定される場合、親ポリペプチドと比べて約1.15分の1〜約100分の1、例えば、約1.2分の1〜約50分の1へのFcR結合親和性の低減を示し得る。
【０１０３】
親ポリペプチドまたは野生型ポリペプチドよりも「低い効力でヒトエフェクター細胞の存在下の抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ADCC)を媒介する」Fc変種を含むポリペプチドとは、アッセイ法で使用されるポリペプチド変種および親抗体の量がほぼ同じである場合に、インビトロまたはインビボでADCCを媒介する効力が実質的に低いポリペプチドである。一般に、このような変種は、本明細書において開示するインビトロのADCCアッセイ法を用いて同定するが、例えば動物モデルなどにおけるADCC活性を測定するための他のアッセイ法または方法が企図される。好ましい変種は、例えば、本明細書において開示するインビトロのアッセイ法において、ADCCを媒介する効力が親よりも低く、約1.5分の1〜約100分の1、例えば、約2分の1〜約50分の1である。
【０１０４】
「受容体」とは、少なくとも1つのリガンドに結合することができるポリペプチドである。好ましい受容体は、細胞外リガンド結合ドメイン、および任意で他のドメイン(例えば膜貫通ドメイン、細胞内ドメイン、および/または膜アンカー)を有する細胞表面受容体である。本明細書において説明するアッセイ法で評価すべき受容体は、完全な受容体またはその断片もしくは派生物(例えば、1つもしくは複数の異種ポリペプチドに融合された受容体の結合ドメインを含む融合タンパク質)でよい。さらに、結合特性に関して評価すべき受容体は、細胞中に存在してもよく、または単離され、アッセイプレートもしくは他の何らかの固相に任意で塗られてもよい。
【０１０５】
「受容体結合ドメイン」という用語は、細胞接着分子を含む、受容体に対する任意の天然リガンド、または対応する天然リガンドの少なくとも1つの質的な受容体結合能を保持しているこのような天然リガンドの任意の領域もしくは派生物を呼ぶために使用される。特に、この定義は、前述の受容体に対するリガンドに由来する結合配列を具体的に含む。
【０１０６】
本明細書において使用される場合、「治療(treatment)」(およびその文法的変形、例えば「治療する(treat)」または「治療すること(treating)」とは、治療される個体の自然経過を変化させようとする臨床的介入を意味し、予防のため、または臨床的病状の過程のいずれかに実施され得る。治療の望ましい効果には、疾患の発生または再発の予防、症状の軽減、疾患の直接的または間接的な任意の病理学的転帰の低減、転移の予防、疾患の進行速度の低下、疾患状態の改善または緩和、および寛解または予後改善が含まれるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅らせるため、または疾患の進行を遅くするために使用される。
【０１０７】
本明細書において使用される「変種タンパク質」もしくは「タンパク質変種」、または「変種」とは、少なくとも1つのアミノ酸改変によって、親タンパク質のものとは異なるタンパク質を意味する。タンパク質変種とは、タンパク質自体、タンパク質を含む組成物、またはそれをコードするアミノ配列を意味してよい。好ましくは、タンパク質変種は、親タンパク質と比べて少なくとも1つのアミノ酸改変、例えば、親と比べて、約1個〜約70個のアミノ酸改変、および好ましくは、約1個〜約5個のアミノ酸改変を有する。本明細書におけるタンパク質変種配列は、親タンパク質配列と好ましくは少なくとも約80％の相同性、および最も好ましくは、少なくとも約90％の相同性、より好ましくは、少なくとも約95％の相同性を有すると考えられる。変種タンパク質とは、変種タンパク質自体、タンパク質変種を含む組成物、またはそれをコードするDNA配列を意味してよい。したがって、本明細書において使用される「抗体変種」または「変種抗体」とは、少なくとも1つのアミノ酸改変によって親抗体と異なる抗体を意味し、本明細書において使用される「IgG変種」または「変種IgG」とは、少なくとも1つのアミノ酸改変によって親IgGと異なる抗体を意味し、本明細書において使用される「免疫グロブリン変種」または「変種免疫グロブリン」とは、少なくとも1つのアミノ酸改変によって親免疫グロブリン配列のものと異なる免疫グロブリン配列を意味する。
【０１０８】
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体が抗原に結合するのに関与している抗体重鎖または抗体軽鎖のドメインを意味する。一般に、天然抗体の重鎖および軽鎖(それぞれVHおよびVL)の可変ドメインは、4つの保存されているフレームワーク領域(FR)および3つの超可変領域(HVR)を各ドメインが含む、類似した構造を有する。(例えば、Kindt, et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co. (2007) page 91を参照されたい)。1つのVHドメインまたはVLドメインは、抗原結合特異性を与えるのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、その抗原に結合する抗体に由来するVHドメインまたはVLドメインを用いて、相補的なVLドメインまたはVHドメインのライブラリーをそれぞれスクリーニングして、単離することができる。例えば、Portolano, et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, et al., Nature 352 (1991) 624-628を参照されたい。
【０１０９】
本明細書において使用される「ベクター」という用語は、連結されている別の核酸を増殖させることができる核酸分子を意味する。この用語は、自己複製する核酸構造体としてのベクター、ならびに導入された先の宿主細胞のゲノム中に組み入れられるベクターを含む。ある種のベクターは、機能的に連結されている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。
【０１１０】
本出願は、Fc受容体、特にFcγ受容体への結合を調節するアミノ酸改変を含むポリペプチドを対象とする。
【０１１１】
詳細な説明
本明細書において、本発明は、Fc変種を含むポリペプチドを作製するための方法に関する。「親」、「出発」、「非変種」、または野生型のポリペプチドは、Fc領域を含むポリペプチドまたは抗体を作製するための当技術分野において利用可能な技術を用いて調製される。本発明の好ましい態様において、親ポリペプチドは抗体であり、抗体を作製するための例示的な方法は、以下のセクションでより詳細に説明する。しかしながら、親ポリペプチドは、Fc領域を含む他の任意のポリペプチド、例えばイムノアドヘシンでよい。イムノアドヘシンを作製するための方法は、本明細書において下記により詳細に述べる。
【０１１２】
代替の態様において、変種Fc領域(Fc変種)は、本明細書において開示する方法に従って作製してよく、このFc変種は、最適な異種ポリペプチド、例えば、抗体可変ドメインまたは受容体もしくはリガンドの結合ドメインに融合されてよい。
【０１１３】
野生型ポリペプチドは、Fc領域を含む。一般に、野生型ポリペプチドのFc領域は、天然配列Fc領域または野生型配列Fc領域、および好ましくは、ヒト天然配列Fc領域(ヒトFc領域)を含む。しかしながら、野生型ポリペプチドのFc領域は、天然配列Fc領域からの1つまたは複数の既存のアミノ酸配列変化またはアミノ酸配列改変を有し得る。例えば、Fc領域のC1q結合活性またはFcγ結合活性は、あらかじめ変化していてよい(他のタイプのFc領域改変は、下記により詳細に説明する)。さらなる態様において、親ポリペプチドFc領域は、「概念上」のものであり物理的には存在しないものの、抗体設計によって、所望の変種Fc領域アミノ酸配列を決定し、その配列を含むポリペプチドまたは所望の変種Fc領域アミノ酸配列をコードするDNAを作製することができる。
【０１１４】
しかしながら、本発明の好ましい態様において、野生型ポリペプチドのFc領域をコードする核酸は利用可能であり、この核酸配列を変化させて、Fc領域変種をコードする変種核酸配列を作製する。
【０１１５】
出発ポリペプチドのアミノ酸配列変種をコードするDNAは、当技術分野において公知の様々な方法によって調製される。これらの方法には、部位特異的(またはオリゴヌクレオチドを媒介とした)変異誘発、PCR変異誘発、およびそのポリペプチドをコードする前もって調製されたDNAのカセット変異誘発による調製が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１１６】
部位特異的変異誘発は、置換変種を調製するための好ましい方法である。この技術は、当技術分野において周知である(例えば、Carter, et al., Nucleic Acids Res. 13 (1985) 4431-4443およびKunkel, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 488を参照されたい)。簡単に説明すると、DNAの部位特異的変異誘発を実施する際、出発DNAの1本の鎖に、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドを最初にハイブリダイズさせることによって、出発DNAを変化させる。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、かつ出発DNAの1本の鎖を鋳型として用いて、DNAポリメラーゼを使用して完全な第2の鎖を合成する。したがって、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドが、結果として生じる二本鎖DNAに組み入れられる。
【０１１７】
また、PCR変異誘発も、出発ポリペプチドのアミノ酸配列変種を作製するのに適している。Higuchi, in PCR Protocols, Academic Press (1990) pp. 177-183;およびVallette, et al., Nuc. Acids Res. 17 (1989) 723-733を参照されたい。簡単に説明すると、少量の鋳型DNAがPCRの出発材料として使用される場合、鋳型DNAの対応する領域と配列がわずかに異なるプライマーを用いて、プライマーが鋳型と異なる位置のみが鋳型配列と異なる特定のDNA断片を比較的多量作製することができる。
【０１１８】
変種を調製するための別の方法であるカセット変異誘発は、Wells, et al., Gene 34 (1985) 315-323によって説明されている技術に基づいている。
【０１１９】
本発明の1つの態様は、Fc領域に対して少なくとも1つのアミノ酸残基の付加、置換、または欠失を含み、その結果、すくなくとも1つのFc受容体に対する親和性が低減するか、または消失している(ablated)、抗体Fc領域を含むポリペプチドを包含する。Fc領域は、限定されるわけではないが、Fc受容体(例えば、FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA)、補体タンパク質CIq、ならびにプロテインAおよびプロテインGなどの他の分子を含むいくつかの受容体またはリガンドと相互作用する。これらの相互作用は、限定されるわけではないが、抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ADCC)、抗体依存性細胞性食作用(ADCP)、および補体依存性細胞障害(CDC)を含む、様々なエフェクター機能および下流のシグナル伝達事象のために不可欠である。したがって、一定の態様において、本発明の変種は、本発明のFc変種を含むが、Fc領域に対して少なくとも1つのアミノ酸残基の付加も置換も欠失も含まないポリペプチド(本明細書において「野生型ポリペプチド」とも呼ばれる)と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドと比べて、エフェクター機能に関与しているFc受容体に対する親和性が低減するか、または消失している。一定の態様において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、次の特性のうちの少なくとも1つまたは複数を含む:低減もしくは消失したエフェクター(ADCCおよび/もしくはCDCならびに/またはADCP)機能、Fc受容体への低減もしくは消失した結合、C1qへの低減もしくは消失した結合、または低減もしくは消失した毒性。より具体的には、本発明の態様は、Fc受容体(例えば、FcγRI、FcγRII、FcγRIIIA)および/または補体タンパク質C1qに対する親和性が低減した抗CD20(GA101またはGAと同じ)抗体、抗CD9(TAと同じ)抗体、および抗セレクチン(pSel)抗体を提供する。
【０１２０】
1つの態様において、本発明の抗体は、P329の位置のアミノ酸残基の少なくとも1つの付加、置換、または欠失を含むFc領域を含む。ここで、定常領域の番号付与の方式は、Kabat, et al., NIH Publication 91 (1991) 3242, National Technical Information Service, Springfield, VAにおいて説明されているEU指標のものである。
【０１２１】
特定の態様において、本発明のポリペプチドは、野生型ヒトFcポリペプチドのFc変種を含み、該Fc変種はPro329の位置のアミノ酸置換を含む。ここで、IgG Fc領域中の残基の番号付与は、KabatによるEU指標のものである。さらに別の態様において、前記変種は、少なくとも1つのさらなるアミノ酸置換を含む。
【０１２２】
さらに別の態様において、野生型ヒトFcポリペプチドのFc変種を含むポリペプチドは、FcポリペプチドとFcγ受容体の領域および/または境界面のプロリンサンドイッチの機能を消失させるか、または低減させる、アミノ酸の置換、欠失、または付加を有する。
【０１２３】
別の態様において、Pro329は、プロリンより小さいまたは大きいアミノ酸で置換される。さらに別の態様において、置換に使われるアミノ酸は、Gly、Ala、またはArgである。本発明のさらなる局面において、FcポリペプチドのPro329は、グリシンで置換される。
【０１２４】
さらに別の態様において、Fc変種を含む前記ポリペプチドは、少なくとも1つのさらなるアミノ酸置換、付加、または欠失を有する。さらに別の態様において、前記変種は、野生型Fcポリペプチドを含むポリペプチドと比べて、ヒトFc受容体(FcγR)および/またはヒト補体受容体に対して低い親和性を示す。
【０１２５】
別の態様において、Fc変種を含む前記ポリペプチドは、野生型ヒトFc領域を含むポリペプチドと比べて、ヒトFc受容体(FcγR)および/またはヒト補体受容体に対して低い親和性を示す。さらなる態様において、FcγRI、FcγRII、FcγRIIIAのうちの少なくとも1つに対する親和性は低減しており、さらに別の態様において、FcγRIおよびFcγRIIIAに対する親和性は低減しており、さらに別の態様において、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIAに対する親和性は低減しており、本発明のさらに別の局面において、FcγRI受容体、FcγRIIIA受容体、およびC1qに対する親和性は低減しており、本発明のさらに別の局面において、FcγRI、FcγRII、FcγRIIIA、およびC1q受容体に対する親和性は低減している。
【０１２６】
さらに別の態様において、Fc変種を含む前記ポリペプチドによって誘導されるADCCは低減しており、好ましい態様において、ADCCは、野生型Fcポリペプチドを含むポリペプチドによって誘導されるADCCの20％以下にまで低減している。本発明のさらに別の局面において、野生型Fcポリペプチドを含むポリペプチドによって誘導されるADCCおよびCDCは、低減しているかまたは消失しており、さらに別の局面において、前述のFc変種を含むポリペプチドは、野生型Fcポリペプチドを含むポリペプチドと比べて、低減したADCC、CDC、およびADCPを示す。
【０１２７】
1つの態様において、Fc変種を含むポリペプチド中の少なくとも1つのさらなるアミノ酸置換は、次の群:S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D、またはP331Sより選択される。
【０１２８】
本発明の特定の局面において、Fc変種を含むポリペプチドは、抗体を含む。本発明のさらに別の局面において、Fc変種を含むポリペプチドは、ヒトIgG1 Fc領域またはヒトIgG4 Fc領域を含む。本発明のさらに別の局面において、変種は、IgG1抗体またはIgG4抗体である。
【０１２９】
本発明の別の態様において、Pro329 Fc変種を含むポリペプチドは、抗体の安定性上昇と相関関係があるFc領域中のアミノ酸残基の少なくとも1つの付加、置換、または欠失をさらに含む。本発明のさらに別の局面において、Fcn受容体に対する、Fc変種を含む前述のポリペプチドの親和性は、ごくわずか、例えば、野生型Fcポリペプチドを含むポリペプチドの親和性の10〜20％以下、変化している。
【０１３０】
1つの態様において、Fc変種を含むポリペプチド中のアミノ酸残基の付加、置換、または欠失は、Fc領域の228位および/または235位に存在する。ここで、定常領域の番号付与の方式は、Kabat, et al.において説明されているEU指標のものである。
【０１３１】
特定の態様において、Fc変種を含む前記ポリペプチド中の228位のセリンおよび/または235位のロイシンは、別のアミノ酸によって置換される。
【０１３２】
特定の態様において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、228位のアミノ酸置換を含むFc領域であって、セリン残基がプロリンで置換されている、Fc領域を含む。
【０１３３】
特定の態様において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、235位のアミノ酸置換を含むFc領域であって、ロイシン残基がグルタミン酸で置換されている、Fc領域を含む。
【０１３４】
特定の態様において、Fc変種を含むポリペプチドは、三重変異:P329の位置のアミノ酸置換、S228P変異、およびL235E変異(P329/SPLE)を含む。
【０１３５】
別の特定の態様において、Fc変種を含むポリペプチドは、ヒトIgG4領域を含む。
【０１３６】
1つの態様において、アミノ酸残基の付加、置換、または欠失は、Fc領域の234位および/または235位に存在する。ここで、定常領域の番号付与の方式は、Kabat, et al.において説明されているEU指標のものである。
【０１３７】
特定の態様において、Fc変種を含むポリペプチド中の234位のロイシンおよび/または235位のロイシンは、別のアミノ酸によって置換される。
【０１３８】
特定の態様において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、234位のアミノ酸置換を含むFc領域であって、ロイシン残基がアラニンで置換されている、Fc領域を含む。
【０１３９】
特定の態様において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、235位のアミノ酸置換を含むFc領域であって、ロイシン残基がセリンで置換されている、Fc領域を含む。
【０１４０】
特定の態様において、野生型ヒトFcポリペプチドのFc変種を含むポリペプチドは、三重変異:Pro329の位置のアミノ酸置換、L234A変異、およびL235A変異(P329/LALA)を含む。
【０１４１】
別の特定の態様において、前述のポリペプチドは、ヒトIgG1領域を含む。
【０１４２】
FcγRに対する結合を変化させることが好ましいが、新生児型受容体(FcRn)に対する結合親和性が変化しているFc領域変種もまた、本明細書において企図される。FcRnに対する親和性が向上しているFc領域変種は、より長い血清半減期を有することが予期されており、このような分子は、例えば、慢性的な疾患または障害を治療するために、投与されるポリペプチドの半減期が長いことが望ましい場合、哺乳動物を治療する方法において有用な用途があると考えられる。これに反して、FcRn結合親和性が低下しているFc領域変種は、より短い血清半減期を有すると予想されており、このような分子は、例えば、短縮された循環時間が有利となり得る場合、例えば、インビボの画像診断法の場合、または長期間に渡って血流中に循環するままにしておいた場合に毒性の副作用をもたらすポリペプチドの場合などに、哺乳動物に投与され得る。FcRn結合親和性が低下したFc領域変種は、胎盤を通過する可能性が低いことが予期され、したがって、妊婦の疾患または障害の治療において利用され得る。
【０１４３】
FcRnに対する結合親和性が変化したFc領域変種には、アミノ酸位置238、252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439、または447のうちの任意の1つまたは複数におけるFc領域アミノ酸改変を含むものが含まれる。FcRnへの結合の低減を示すものは、一般に、アミノ酸位置252、253、254、255、288、309、386、388、400、415、433、435、436、439、または447のうちの任意の1つまたは複数におけるFc領域アミノ酸改変を含むと考えられ;FcRnへの結合の増加を示すものは、通常、アミノ酸位置238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、または434のうちの任意の1つまたは複数におけるFc領域アミノ酸改変を含むと考えられる。
【０１４４】
別の態様において、本発明の抗体は、任意のクラスのいずれかでよい(例えば、限定されるわけではないが、IgG、IgM、およびIgE)。一定の態様において、本発明の抗体は、IgGクラスの抗体のメンバーである。特定の態様において、本発明の抗体は、IgG1、IgG2、またはIgG4サブクラスのものである。別の特定の態様において、本発明の抗体は、IgG1サブクラスのものであり、次のアミノ酸置換:Fc領域のP329Gならびに/またはL234AおよびL235Aを含む。代替の態様において、本発明の抗体は、IgG4サブクラスのものである。特定の態様において、本発明の抗体は、IgG4サブクラスのものであり、次のアミノ酸置換:Fc領域のP329Gならびに/またはS228PおよびL235Eを含む。一定の態様において、本発明の改変された抗体は、可変ドメインまたはその断片を、本明細書において開示するアミノ酸置換のうちの1つまたは複数を含むFcドメインと合体させることによって作製することができる。他の態様において、本発明の改変抗体は、Fcドメイン中に1つまたは複数のアミノ酸置換残基を導入することによりFcドメインを含む抗体を改変することによって、作製することができる。
【０１４５】
Fcリガンドに対する結合の低減
当業者は、本発明の抗体が、(未改変抗体と比べて)変化したFcγR結合特性および/またはC1q結合特性(結合特性の例には、結合特異性、平衡解離定数(KD)、解離速度および結合速度(それぞれkoffおよびkon)、結合親和性、および/または結合活性が含まれるがそれらに限定されるわけではない)を有し得ること、ならびに特定の変化がより望ましいか、または望ましくないことを理解するであろう。平衡解離定数(KD)が、koff/konと定義されることは、当技術分野において公知である。当業者は、どの動態パラメータが、所与の抗体用途にとって最も重要であるかを特定することができる。例えば、1つもしくは複数の正の調節因子(例えばFcγRIIIA)への結合を低減する、かつ/または抑制性Fc受容体(例えばFcγRIIB)への結合を増大する改変が、ADCC活性を低減させるのに適切であると考えられる。したがって、結合親和性の比(例えば平衡解離定数(KD))は、本発明の抗体のADCC活性が上昇しているか、または低下しているかを示唆することができる。さらに、C1qへの結合を低減させる改変は、CDC活性を低減するか、またはなくすのに適していると考えられる。リガンドに対するFc領域の親和性および結合特性は、Fc-FcγR相互作用、すなわち、FcγRに対するFc領域の特異的結合を測定するための当技術分野において公知の様々なインビトロアッセイ法(生化学または免疫学に基づくアッセイ法)(限定されるわけではないが、平衡法(例えば、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)もしくはラジオイムノアッセイ法(RIA))、または動態(例えば、BIACORE(登録商標)解析を含む)、ならびに他の方法、例えば、間接的結合アッセイ法、競合阻害アッセイ法、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)、ゲル電気泳動、およびクロマトグラフィー(例えばゲルろ過)によって測定することができる。これらの方法および他の方法は、検査される1種もしくは複数種の構成要素に関する標識を利用することができ、かつ/または発色性標識、蛍光標識、発光標識、もしくは同位元素標識を非限定的に含む様々な検出方法を使用することができる。結合親和性および動態に関する詳細な説明は、Paul, W.E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)において確認することができる。
【０１４６】
本発明の1つの局面において、野生型ヒトFc領域のFc変種を含むポリペプチドであって、該変種がPro329の位置のアミノ酸置換および少なくとも1つのさらなるアミノ酸置換を含む該ポリペプチドは、野生型Fcポリペプチドを含むポリペプチドと比べて、ヒトFc受容体(FcγR)および/またはヒト補体受容体に対して低い親和性を示す。1つの局面において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、野生型Fcポリペプチドの場合の2分の1以下、または3分の1以下、または5分の1以下、または7分の1以下、または10分の1以下、または20分の1以下、または30分の1以下、または40分の1以下、または50分の1以下、または60分の1以下、または70分の1以下、または80分の1以下、または90分の1以下、または100分の1以下、または200分の1以下である低い親和性をFc受容体に対して示す。
【０１４７】
1つの局面において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、未改変抗体と比べて、限定されるわけではないが、FcγRI(CD64)(アイソフォームFcγRIAを含む）、FcγRII、およびFcγRIII（CD16、アイソフォームFcγRIIIAを含む)を含む1種または複数種のFc受容体に対して低い結合親和性を示す。
【０１４８】
1つの局面において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、未改変抗体と比べて、FcγRI(CD64)、FcγRIIA、およびFcγRIIIAに対して低い結合親和性を示す。
【０１４９】
1つの局面において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、未改変抗体と比べて、FcγRIIAおよびFcγRIIIAに対して低い結合親和性を示す。
【０１５０】
1つの局面において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、未改変抗体と比べて、FcγRI(CD64)およびFcγRIIIAに対して低い結合親和性を示す。
【０１５１】
本発明の1つの局面において、Fc受容体に対して低い結合親和性を示す本発明のFc変種を含むポリペプチドはまた、C1q受容体に対しても低い親和性を示す。
【０１５２】
一定の局面において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、野生型ポリペプチドと比べて、FcγRIIB受容体に対する結合の付随的増加を含まない。本発明の一定の局面において、Fc変種を含むポリペプチドは、野生型Fcポリペプチドを含むポリペプチドと比べて、ヒト受容体FcγIIIAに対して、ならびにヒト受容体FcγIIA、FcγIIIB、およびC1qを含む群のうちの少なくとも1つのさらなる受容体に対して、低い親和性を有する。本発明のさらなる局面において、Fc変種を含むポリペプチドは、野生型Fcポリペプチドを含むポリペプチドと比べて、ヒト受容体FcγIIIAに対して、ならびにヒト受容体FcγIIA、FcγIIIB、およびC1qを含む群のうちの2つのさらなる受容体に対して、低い親和性を有する。本発明のさらなる局面において、Fc変種を含むポリペプチドは、野生型Fcポリペプチドを含むポリペプチドと比べて、ヒトFcγRIA、FcγIIIA、FcγIIA、FcγIIIB、およびC1qに対して低い親和性を有する。本発明のさらに別の局面において、Fc変種を含むポリペプチドは、野生型Fcポリペプチドを含むポリペプチドと比べて、ヒト受容体FcγRIA、FcγIIIA、FcγIIA、FcγIIIB、およびC1qに対して低い親和性を有する。
【０１５３】
本発明の1つの局面において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、未改変抗体と比べて、FcγRIまたはFcγRIIAに対して低い結合親和性を示す。本発明の1つの局面において、Fc変種を含むポリペプチドは、野生型ポリペプチドの親和性の2分の1以下、または3分の1以下、または5分の1以下、または7分の1以下、または10分の1以下、または20分の1以下、または30分の1以下、または40分の1以下、または50分の1以下、または60分の1以下、または70分の1以下、または80分の1以下、または90分の1以下、または100分の1以下、または200分の1以下である低い親和性をFcγRIまたはFcγRIIAに対して示す。本発明の1つの局面において、Fc変種を含むポリペプチドは、野生型ポリペプチドの親和性より少なくとも90％、少なくとも80％、少なくとも70％、少なくとも60％、少なくとも50％、少なくとも40％、少なくとも30％、少なくとも20％、少なくとも10％、または少なくとも5％低い親和性をFcγRIまたはFcγRIIAに対して示す。
【０１５４】
本発明の1つの局面において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、未改変抗体と比べて、FcγRIIIAに対して低い親和性を示す。1つの局面において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、野生型ポリペプチドの親和性の2分の1以下、または3分の1以下、または5分の1以下、または7分の1以下、または10分の1以下、または20分の1以下、または30分の1以下、または40分の1以下、または50分の1以下、または60分の1以下、または70分の1以下、または80分の1以下、または90分の1以下、または100分の1以下、または200分の1以下である低い親和性をFcγRIIIAに対して示す。
【０１５５】
本発明の1つの局面において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、野生型ポリペプチドの親和性より少なくとも90％、少なくとも80％、少なくとも70％、少なくとも60％、少なくとも50％、少なくとも40％、少なくとも30％、少なくとも20％、少なくとも10％、または少なくとも5％低い親和性をFcγRIIIAに対して示す。
【０１５６】
FcγRIIIAのF1-58V対立遺伝子変種は抗体に対する結合特徴が変化していることが、当技術分野において理解されている。1つの態様において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、野生型ポリペプチドと比べて低い親和性で、FcγRIIIA受容体に結合する。1つの局面において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、野生型ポリペプチドの親和性の2分の1以下、または3分の1以下、または5分の1以下、または7分の1以下、または10分の1以下、または20分の1以下、または30分の1以下、または40分の1、または50分の1以下、または60分の1以下、または70分の1以下、または80分の1以下、または90分の1以下、または100分の1以下、または200分の1以下である低い親和性をFcγRIIIA(F1 58V)に対して示す。
【０１５７】
本発明の1つの局面において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、未改変抗体と比べて、C1q受容体に対して低い親和性を示す。1つの局面において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、野生型ポリペプチドの親和性の2分の1以下、または3分の1以下、または5分の1以下、または7分の1以下、または10分の1以下、または20分の1以下、または30分の1以下、または40分の1以下、または50分の1以下、または60分の1以下、または70分の1以下、または80分の1以下、または90分の1以下、または100分の1以下、または200分の1以下である低い親和性をC1q受容体に対して示す。
【０１５８】
本発明の1つの局面において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、野生型ポリペプチドの親和性より少なくとも90％、少なくとも80％、少なくとも70％、少なくとも60％、少なくとも50％、少なくとも40％、少なくとも30％、少なくとも20％、少なくとも10％、または少なくとも5％低い親和性をC1qに対して示す。
【０１５９】
本発明の1つの局面において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、野生型ポリペプチドより少なくとも90％、少なくとも80％、少なくとも70％、少なくとも60％、少なくとも50％、少なくとも40％、少なくとも30％、少なくとも20％、少なくとも10％、または少なくとも5％低い親和性をヒトFcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA、FcγRIIIA(F1 58V)、またはC1q受容体に対して示す。
【０１６０】
本発明の別の局面において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、約10nM〜100nM、10nM〜1μM、100nM〜約100μM、または約100nM〜約10μM、または約100nM〜約1μM、または約1nM〜約100μM、または約10nM〜約100μM、または約1μM〜約100μM、または約10μM〜約100μMの間である親和性を、FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA、FcγRIIIA(F1 58V)、および/またはC1q受容体に対してそれぞれ示す。一定の態様において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、100nM、500nM、1μMを上回るか、5μMを上回るか、10μMを上回るか、25μMを上回るか、50μMを上回る、または100μMを上回る親和性を、FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA、FcγRIIIA(F1-58V)、またはC1q受容体に対して示す。
【０１６１】
本発明の別の局面において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、野生型ポリペプチドと比べて、FcγRIIBに対して高い親和性を示す。別の局面において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、未変化であるか、または未改変抗体の親和性の少なくとも2倍、もしくは少なくとも3倍、もしくは少なくとも5倍、もしくは少なくとも7倍、もしくは少なくとも10倍、もしくは少なくとも20倍、もしくは少なくとも30倍、もしくは少なくとも40倍、もしくは少なくとも50倍、もしくは少なくとも60倍、もしくは少なくとも70倍、もしくは少なくとも80倍、もしくは少なくとも90倍、もしくは少なくとも100倍、もしくは少なくとも200倍に増大した親和性をFcγRIIBに対して示す。別の局面において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、野生型ポリペプチドより少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、または少なくとも95％増大した親和性をFcγRIIB受容体に対して示す。
【０１６２】
本発明の別の局面において、本発明の変種は、100μM未満、50μM未満、10μM未満、5μM未満、2.5μM未満、1μM未満、または100nM未満、もしくは10nM未満である親和性を、FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA、もしくはFcγRIIIA(F1 58V)、またはC1q受容体に対して示す。
【０１６３】
エフェクター機能の低減
発明の一定の局面において、本発明によるFc変種を含むポリペプチドは、野生型Fcポリペプチドを含むポリペプチドと比べて、エフェクター機能を調節する。
【０１６４】
本発明のさらに別の局面において、この調節は、ADCCおよび/もしくはADCPならびに/またはCDCの調節である。本発明のさらなる局面において、この調整は、効果の下方調節または減少である。本発明のさらに別の局面において、これはADCCの調節であり、本発明のさらに別の局面において、この調節はADCCの下方調節である。さらに別の局面において、この調節は、ADCCおよびCDCの下方調節であり、さらに別の態様において、これは、ADCCのみの下方調節であり、さらに別の態様において、これは、ADCCおよびCDCならびに/またはADCPの下方調節である。本発明のさらに別の局面において、本発明によるFc変種を含むポリペプチドは、ADCC/CDCおよびADCPを下方調節するか、または低減させる。
【０１６５】
本発明のさらなる局面において、Fc変種を含むポリペプチドによって誘導されるADCCもしくはCDCまたはADCPの低減または下方調節は、野生型Fc領域を含むポリペプチドによるADCC、またはCDCもしくはADCPそれぞれの誘導に関して観察される値の0％、2.5％、5％、10％、20％、50％、または75％への低減である。
【０１６６】
本発明のさらに別の局面において、本発明によるFc変種を含むポリペプチドによって誘導されるADCCの調節は、能力の低下であり、その結果、該Fc変種のEC50は、野生型Fcポリペプチドを含むポリペプチドと比べて、約10分の1未満に減少する。
【０１６７】
さらに別の局面において、本発明による変種には、野生型Fcポリペプチドを含むポリペプチドと比べて、ヒトエフェクター細胞の存在下の実質的なADCCおよび/もしくはCDCならびに/またはADCPがまったくない。
【０１６８】
本発明のさらに別の局面において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、エフェクター機能の低減、例えば少なくとも20％の低減、または大きな低減、例えば少なくとも50％の低減を示し、この低減は、ADCC(下方調節)、CDC、および/またはADCPの低減であってよい。
【０１６９】
ADCC活性の低減
インビトロおよび/またはインビボの細胞障害性アッセイ法を行って、CDC活性および/またはADCC活性の低減/減少を確認することができる。例えば、Fc受容体(FcR)結合アッセイ法を行って、抗体はFcγR結合を欠く(したがって、ADCC活性を欠く可能性が高い)がFcRn結合能を保持していることを確実にすることができる。ADCCを媒介する主な細胞であるNK細胞は、FcγRIIIのみを発現するが、単球は、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIを発現する。造血細胞におけるFcR発現は、Ravetch, and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9 (1991) 457-492の464頁の表3に要約されている。関心対象の分子のADCC 活性を評価するためのインビトロのアッセイ法の非限定的な例は、米国特許第5,500,362号(例えば、Hellstrom, I., et al., Proc. Nat'l Acad. Sci.USA 83 (1986) 7059-7063を参照されたい)およびHellstrom, I., et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502; US 5,821,337 (Bruggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361を参照されたい)において説明されている。あるいは、非放射性アッセイ方法を使用してもよい(例えば、フローサイトメトリー用のACTI(商標)非放射性細胞障害性アッセイ法(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA);およびCytoTox 96(登録商標)非放射性細胞障害性アッセイ法(Promega, Madison, WI)を参照されたい)。このようなアッセイ法に有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞(PBMC)およびナチュラルキラー(NK)細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、関心対象の分子のADCC活性は、インビボで、例えば、Clynes, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656で開示されているもののような動物モデルにおいて評価してもよい。また、C1q結合アッセイ法を実施して、抗体はC1qに結合することができず、したがって、CDC活性を欠くことを確認することもできる。例えば、WO 2006/029879およびWO 2005/100402におけるC1qおよびC3c結合ELISAを参照されたい。補体活性化を評価するために、CDCアッセイ法を実施してもよい(例えば、Gazzano-Santoro, et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163; Cragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045-1052;およびCragg, M.S., and Glennie, M.J., Blood 103 (2004) 2738-2743を参照されたい)。FcRn結合およびインビボのクリアランス/半減期の測定はまた、当技術分野において公知の方法を用いて実施することもできる(例えば、Petkova, S.B., et al., Int'l. Immunol. 18(12) (2006) 1759-1769を参照されたい)。
【０１７０】
本発明のFc変種を含むポリペプチドは、FcγRに媒介される1つまたは複数のエフェクター細胞機能を測定するためのインビトロの機能アッセイ法によって特徴付けられることが予期される。一定の態様において、本発明の抗体は、インビトロベースのアッセイ法におけるものと同様の結合特性およびエフェクター細胞機能を(本明細書において説明し開示するもののような)インビボモデルにおいて有する。しかしながら、本発明は、インビトロベースのアッセイ法において所望の表現型を示さないがインビボでは所望の表現型を示す本発明の変種を、除外しない。1つの態様において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、未改変野生型Fcポリペプチドと比べて低いADCC活性を示す。別の局面において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、未改変抗体のADCC活性の2分の1以下、または3分の1以下、または5分の1以下、または10分の1以下、または50分の1以下、または100分の1以下である低いADCC活性を示す。さらに別の態様において、本発明の抗体は、未改変抗体と比べて、少なくとも10％、または少なくとも20％、または少なくとも30％、または少なくとも40％、または少なくとも50％、または少なくとも60％、または少なくとも70％、または少なくとも80％、または少なくとも90％、または少なくとも100％低減しているADCC活性を示す。本発明のさらなる局面において、Fc変種を含むポリペプチドによって誘導されるADCCの低減または下方調節は、野生型Fc領域を含むポリペプチドによるADCC、またはCDCもしくはADCPそれぞれの誘導に関して観察される値の0％、2.5％、5％、10％、20％、50％、または75％への低減である。一定の態様において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、検出可能なADCC活性を有していない。特定の態様において、ADCC活性の低減および/または消失は、本発明のFc変種を含むポリペプチドのFcリガンドおよび/またはFc受容体に対する親和性の低減に帰することができる。本発明の特定の態様において、ADCCの下方調節は、能力の低下であり、その結果、Fc変種を含む該ポリペプチドのEC50は、野生型Fcポリペプチドと比べて約10分の1またはそれ以下に減少する。
【０１７１】
さらに別の局面において、本発明によるFc変種を含むポリペプチドは、ADCCおよび/もしくはCDCならびに/またはADCPを調節する。特定の局面において、本発明による変種は、低いCDC活性およびADCC活性ならびに/またはADCP活性を示す。
【０１７２】
CDC活性の低減
補体活性化経路は、補体系の第1成分(C1q)が分子、例えば、同族抗原と複合体を形成した抗体に結合することによって開始される。補体活性化を評価するために、例えばGazzano-Santoro, et al, J. Immunol. Methods 202 (1996) 163において説明されているようなCDCアッセイ法を実施することができる。
【０１７３】
C1qに対する様々な変種の結合特性は、ELISAサンドイッチ型イムノアッセイ法によって解析することができる。最大反応の半分を示す抗体濃度が、EC50値を決定する。この測定値は、試料および参照の変動係数と共に、同じプレート上で測定される参照標準品に対する相対的差異として報告される。
【０１７４】
1つの態様において、本発明によるFc変種を含むポリペプチドは、野生型ポリペプチドと比べて低い親和性をC1qに対して示す。別の態様において、本発明によるFc変種を含むポリペプチドは、野生型ポリペプチドの2分の1以下、または3分の1以下、または5分の1以下、または7分の1以下、または10分の1以下、または20分の1以下、または30分の1以下、または40分の1以下、または50分の1以下、または60分の1以下、または70分の1以下、または80分の1以下、または90分の1以下、または100分の1以下、または200分の1以下である低い親和性をC1q受容体に対して示す。
【０１７５】
別の態様において、本発明によるFc変種を含むポリペプチドは、野生型ポリペプチドの親和性より少なくとも90％、少なくとも80％、少なくとも70％、少なくとも60％、少なくとも50％、少なくとも40％、少なくとも30％、少なくとも20％、少なくとも10％、または少なくとも5％低い親和性をC1qに対して示す。別の態様において、本発明による変種は、約100nM〜約100μM、または約100nM〜約10μM、または約100nM〜約1μM、または約1nM〜約100μM、または約10nM〜約100μM、または約1μM〜約100μM、または約10μM〜約100μMの間である親和性をC1qに対して示す。一定の態様において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、1μMを上回る、5μMを上回る、10μMを上回る、25μMを上回る、50μMを上回る、または100μMを上回る親和性をCIqに対して示す。
【０１７６】
1つの態様において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、野生型Fcポリペプチドと比べて低いCDC活性を示す。別の態様において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、野生型ポリペプチドのCDC活性の2分の1以下、または3分の1以下、または5分の1以下、または10分の1以下、または50分の1以下、または100分の1以下である低いCDC活性を示す。さらに別の態様において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、野生型ポリペプチドと比べて、少なくとも10％、または少なくとも20％、または少なくとも30％、または少なくとも40％、または少なくとも50％、または少なくとも60％、または少なくとも70％、または少なくとも80％、または少なくとも90％、または少なくとも100％、または少なくとも200％、または少なくとも300％、または少なくとも400％、または少なくとも500％低減しているCDC活性を示す。一定の局面において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、検出可能なCDC活性を示さない。特定の態様において、CDC活性の低減および/または消失は、Fc変種を含むポリペプチドのFcリガンドおよび/またはFc受容体に対する親和性の低減に帰することができる。
【０１７７】
抗体に関連した毒性の低減
生物学的療法には、望まれない細胞および/または標的を認識し攻撃するように免疫系に指示する複雑な性質に関連した有害な毒性の問題があり得ることが当技術分野において理解されている。認識および/または攻撃のためのターゲティングが、治療が必要とされる場所で起こらない場合、有害な毒性のような結果が生じ得る。例えば、非標的組織の抗体染色は、潜在的毒性という問題を示唆し得る。
【０１７８】
1つの局面において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、野生型ポリペプチドと比べて低減した、非標的組織の染色を示す。別の局面において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、野生型Fcポリペプチドの非標的組織の染色の2分の1以下、または3分の1以下、または5分の1以下、または7分の1以下、または10分の1以下、または20分の1以下、または30分の1以下、または40分の1以下、または50分の1以下、または60分の1以下、または70分の1以下、または80分の1以下、または90分の1以下、または100分の1以下、または200分の1以下である、低減した非標的組織の染色を示す。別の態様において、本発明の変種は、野生型Fcポリペプチドと比べて、少なくとも10％、または少なくとも20％、または少なくとも30％、または少なくとも40％、または少なくとも50％、または少なくとも60％、または少なくとも70％、または少なくとも80％、または少なくとも90％、または少なくとも100％、または少なくとも200％、または少なくとも300％、または少なくとも400％、または少なくとも500％低減している、低減した非標的組織の染色を示す。
【０１７９】
1つの態様において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、野生型ポリペプチドと比べて低減した、抗体に関連した毒性を示す。別の態様において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、野生型ポリペプチドの毒性の2分の1以下、または3分の1以下、または5分の1以下、または7分の1以下、または10分の1以下、または20分の1以下、または30分の1以下、または40分の1以下、または50分の1以下、または60分の1以下、または70分の1以下、または80分の1以下、または90分の1以下、または100分の1以下、または200分の1以下である低い毒性を示す。別の局面において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、野生型ポリペプチドと比べて、少なくとも10％、または少なくとも20％、または少なくとも30％、または少なくとも40％、または少なくとも50％、または少なくとも60％、または少なくとも70％、または少なくとも80％、または少なくとも90％、または少なくとも100％、または少なくとも200％、または少なくとも300％、または少なくとも400％、または少なくとも500％低減している毒性を示す。
【０１８０】
栓球凝集
本発明の1つの局面において、野生型ポリペプチドは、血小板活性化および/または血小板凝集を誘導し、その変種、すなわち、Fc変種を含むポリペプチドは、栓球活性化および/または栓球凝集の減少またはさらには消失さえも示す。本発明のさらに別の局面において、これらの野生型ポリペプチドは、血小板タンパク質を標的とする抗体である。さらに別の局面において、抗体はCD9抗体である。さらに別の態様において、このCD9抗体は、P329Gの位置および/またはL234A/L235AもしくはS228P/L235Eの位置に変異を有する(P329G/LALA、P329G/SPLE)。別の特定の態様において、抗体は、SEQ ID NO: 8〜14によって特徴付けられる。
【０１８１】
生物学的療法は有害作用として栓球凝集を有し得ることが、当技術分野において理解されている。栓球凝集を測定するために、インビトロアッセイ法およびインビボアッセイ法が使用され得る。インビトロアッセイ法は、インビボ状況を反映すると想定される。
【０１８２】
1つの局面において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、野生型ポリペプチドと比べて少ない栓球凝集をインビトロアッセイ法において示す。別の局面において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、野生型ポリペプチドの栓球凝集の2分の1以下、または3分の1以下、または5分の1以下、または7分の1以下、または10分の1以下、または20分の1以下、または30分の1以下、または40分の1以下、または50分の1以下、または60分の1以下、または70分の1以下、または80分の1以下、または90分の1以下、または100分の1以下、または200分の1以下である、少ない栓球凝集をインビトロアッセイ法において示す。別の態様において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、野生型ポリペプチドと比べて、少なくとも10％、または少なくとも20％、または少なくとも30％、または少なくとも40％、または少なくとも50％、または少なくとも60％、または少なくとも70％、または少なくとも80％、または少なくとも90％、または少なくとも100％、または少なくとも200％、または少なくとも300％、または少なくとも400％、または少なくとも500％低減している、少ない栓球凝集をインビトロアッセイ法において示す。
【０１８３】
さらに別の局面において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、野生型ポリペプチドと比べて少ない、インビボの栓球凝集を示す。別の局面において、本発明の変種は、野生型Fcポリペプチドの栓球凝集の2分の1以下、または3分の1以下、または5分の1以下、または7分の1以下、または10分の1以下、または20分の1以下、または30分の1以下、または40分の1以下、または50分の1以下、または60分の1以下、または70分の1以下、または80分の1以下、または90分の1以下、または100分の1以下、または200分の1以下である、少ない栓球凝集をインビボアッセイ法において示す。別の態様において、本発明のFc変種を含むポリペプチドは、野生型ポリペプチドと比べて、少なくとも10％、または少なくとも20％、または少なくとも30％、または少なくとも40％、または少なくとも50％、または少なくとも60％、または少なくとも70％、または少なくとも80％、または少なくとも90％、または少なくとも100％、または少なくとも200％、または少なくとも300％、または少なくとも400％、または少なくとも500％低減している、少ない栓球凝集をインビボアッセイ法において示す。
【０１８４】
抗体の内部移行
本発明の変種は、内部移行して、さらに抗体を細胞中に運び得る細胞表面抗原に結合することができる。細胞内部に入った後、変種は、細胞質中に放出されるか、特定の区画に導かれるか、または細胞表面で再利用され得る。いくつかの態様において、本発明の変種は、内部移行する細胞表面抗原に結合する。他の態様において、本発明の抗体は、細胞の特定の細胞小器官または区画を標的とし得る。さらに別の態様において、本発明の変種は、内部移行後に細胞表面または末梢で再利用され得る。
【０１８５】
特定の態様において、本発明の抗体は、p-セレクチン、CD9、CD19、CD81、CCR5、もしくはCXCR5、IL17a、またはIl-33に対して特異的である。
【０１８６】
抗体調製
本発明の好ましい態様において、本明細書の教示に従って改変される、Fc領域を含むポリペプチドは、抗体である。抗体を作製するための技術は下記のとおりである。
【０１８７】
抗原の選択および調製
ポリペプチドが抗体である場合、それは、関心対象の抗原を対象とする。好ましくは、抗原は、生物学的に重要なポリペプチドであり、疾患または障害を患っている哺乳動物に抗体を投与すると、その哺乳動物に治療的利益が生じ得る。しかしながら、非ポリペプチド抗原(例えば、腫瘍関連糖脂質抗原;米国特許第5,091,178号を参照されたい)を対象とする抗体もまた、企図される。
【０１８８】
抗原がポリペプチドである場合、それは、膜貫通分子(例えば受容体)、または増殖因子のようなリガンドでよい。例示的な抗原には、レニン;成長ホルモン(ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンを含む);成長ホルモン放出因子;副甲状腺ホルモン;甲状腺刺激ホルモン;リポタンパク質;α-1-抗トリプシン;インスリンA鎖;インスリンB鎖;プロインスリン;卵胞刺激ホルモン;カルシトニン;黄体形成ホルモン;グルカゴン;凝固因子(例えば、第VIIIC因子、第IX因子、組織因子(TF)、およびフォンビルブランド因子など);プロテインCのような抗凝固因子;心房性ナトリウム利尿因子;肺表面活性物質;プラスミノーゲンアクチベーター(例えば、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターまたはヒト尿型プラスミノーゲンアクチベーターもしくは組織型プラスミノーゲンアクチベーター(t-PA)など);ボンベシン;トロンビン;造血増殖因子;腫瘍壊死因子αおよび腫瘍壊死因子β;エンケファリナーゼ;RANTES(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted);ヒトマクロファージ炎症性タンパク質(MIP-1-α);ヒト血清アルブミンのような血清アルブミン;ミュラー管抑制物質;リラキシンA鎖;リラキシンB鎖;プロリラキシン;マウスゴナドトロピン関連ペプチド;β−ラクタマーゼのような微生物タンパク質;DNアーゼ;IgE;CTLA-4のような細胞障害性Tリンパ球関連抗原(CTLA);インヒビン;アクチビン;血管内皮増殖因子(VEGF);ホルモンまたは増殖因子に対する受容体;プロテインAまたはプロテインD;リウマチ因子;骨由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィン-3、ニューロトロフィン-4、ニューロトロフィン-5、もしくはニューロトロフィン-6(NT-3、NT-4、NT-5、もしくはNT-6)などの神経栄養因子またはNGF-βのような神経成長因子;血小板由来増殖因子(PDGF);aFGFおよびbFGFなどの線維芽細胞増殖因子;上皮成長因子(EGF);TGF-αおよびTGF-β(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、またはTGF-β5を含む)などのトランスフォーミング増殖因子(TGF);インスリン様増殖因子-Iおよびインスリン様増殖因子-II(IGF-IおよびIGF-II);des(1-3)-IGF-I(脳IGF-I)、インスリン様増殖因子結合タンパク質;CD4、CD8、CD19、およびCD20などのCDタンパク質;エリスロポエチン;骨誘導因子;免疫毒素;骨形成タンパク質(BMP);インターフェロン-α、インターフェロン-β、およびインターフェロン-γなどのインターフェロン;コロニー刺激因子(CSF)、例えば、M-CSF、GM-CSF、およびG-CSF;インターロイキン(IL)、例えば、IL-1〜IL-10;スーパーオキシドジスムターゼ;表面膜タンパク質;崩壊促進因子;例えば、AIDSエンベロープの一部分のようなウイルス抗原;輸送タンパク質;ホーミング受容体;アドレシン;調節タンパク質;CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4、およびVCAMなどのインテグリン;HER2受容体、HER3受容体、またはHER4受容体などの腫瘍関連抗原;ならびに上記に挙げたポリペプチドのいずれかの断片などの分子が含まれる。
【０１８９】
本発明に包含される抗体に対する好ましい分子標的には、CD4、CD8、CD19、CD20、およびCD34などのCDタンパク質;EGF受容体、HER2受容体、HER3受容体、またはHER4受容体などErbB受容体ファミリーのメンバー;LFA-1、Mac1、p150.95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、α4/β7インテグリン、およびαv/β3インテグリン(そのαサブユニットまたはβサブユニットのいずれかを含む)などの細胞接着分子(例えば、抗CD11a抗体、抗CD18抗体、または抗CD11b抗体);VEGFのような増殖因子;組織因子(TF);αインターフェロン(α-IFN);IL-8のようなインターロイキン;IgE;血液型抗原;flk2/flt3受容体;肥満(OB)受容体;mpl受容体;CTLA-4;プロテインCなどが含まれる。
【０１９０】
任意で他の分子に結合されている可溶性抗原またはその断片は、抗体を作製するための免疫原として使用することができる。受容体のような膜貫通分子の場合、これらの断片(例えば、受容体の細胞外ドメイン)を免疫原として使用することができる。あるいは、膜貫通分子を発現する細胞を免疫原として使用することもできる。このような細胞は、天然供給源(例えば癌細胞株)に由来してもよく、または膜貫通分子を発現するように組換え技術によって形質転換させた細胞でもよい。抗体を調製するのに有用な他の抗原およびその形態は、当業者に明らかになると考えられる。
【０１９１】
ポリクローナル抗体
好ましくは、ポリクローナル抗体は、関連する抗原およびアジュバントを複数回皮下(sc)注射または腹腔内(ip)注射することによって、動物において産生させる。二官能性物質または誘導体化物質、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介した結合)、N-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、SOCl2、またはカルボジイミド(RおよびR1が異なるアルキル基である)を用いて、免疫化しようとする種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、またはダイズトリプシンインヒビターに、関連する抗原を結合させることが有用である場合がある。
【０１９２】
例えば、100μgまたは5μgのタンパク質または結合体(それぞれ、ウサギまたはマウスに対する)を3倍体積量の完全フロイントアジュバントと混合し、その溶液を複数の部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性結合体、または免疫原性誘導体に対する免疫性を動物に与える。1ヶ月後、例えば、完全フロイントアジュバントに溶かした最初の量の1/10のペプチドまたは結合体を複数の部位に皮下注射することによって、動物に追加免疫する。7〜14日後、動物から採血し、血清の抗体力価を検査する。力価が頭うちになるまで、動物に追加免疫する。好ましくは、同じ抗原の、ただし異なるタンパク質に結合されているか、かつ/または異なる架橋試薬によって結合されている結合体を用いて、動物に追加免疫する。また、結合体は、組換え細胞培養によってタンパク質融合物として作製することもできる。また、ミョウバンのような凝集剤を適切に使用して、免疫応答を増強する。
【０１９３】
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohler, et al., Nature, 256 (1975) 495によって最初に説明されたハイブリドーマ法を用いて作製することができ、または組換えDNA法(米国特許第4,816,567号)によって作製することができる。
【０１９４】
ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えば、ハムスターもしくはマカクサルを本明細書において前述したようにして免疫化して、免疫化のために使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生することができるリンパ球を誘発する。あるいは、インビトロでリンパ球を免疫化してもよい。次いで、ポリエチレングリコールのような適切な融合剤を用いて、リンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986) pp. 59-103)。
【０１９５】
このようにして調製したハイブリドーマ細胞を、融合していない親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する1種または複数種の物質を好ましくは含む適切な培地に播種し、増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRTまたはHPRT)を欠く場合、ハイブリドーマ用の培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含み(HAT培地)、これらの物質はHGPRT欠損細胞の増殖を妨害する。
【０１９６】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定な高レベルの抗体産生を支援し、HAT培地のような培地に感受性であるものである。これらのうちで、好ましい骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫株、例えば、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USAから入手可能なMOPC-21マウス腫瘍およびMPC-11マウス腫瘍に由来するもの、ならびにAmerican Type Culture Collection, Rockville, Md. USAから入手可能なSP-2細胞またはX63-Ag8-653細胞である。ヒト骨髄腫細胞株およびマウス-ヒト異種骨髄腫(heteromyeloma)細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の作製のために説明されている(Kozbor, J., Immunol. 133 (1984) 3001; Brodeur, et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987) pp. 51-63)。
【０１９７】
ハイブリドーマ細胞が増殖している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の作製に関して分析する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法またはインビトロ結合アッセイ法、例えばラジオイムノアッセイ法(RIA)もしくは酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によって測定される。
【０１９８】
所望の特異性、親和性、および/または活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、限界希釈処置によってクローンをサブクローニングし、標準的な方法(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986) pp. 59-103)によって増殖させてよい。この目的に適した培地には、例えば、D-MEM培地またはRPMI-1640培地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させてよい。
【０１９９】
従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、プロテインA-セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどによって、サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体を培地、腹水、または血清から適切に分離する。
【０２００】
従来の手順を用いて(例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって)、モノクローナル抗体をコードするDNAは、容易に単離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなDNAの好ましい供給源として役立つ。単離した後、DNAを発現ベクター(その後、宿主細胞、例えば、大腸菌(E.coli)細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、または免疫グロブリンタンパク質をさもなければ産生しない骨髄腫細胞にトランスフェクトされる)中に配置して、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を実現することができる。抗体の組換え作製は、下記により詳細に説明する。
【０２０１】
さらなる態様において、抗体または抗体断片は、McCafferty, J., et al., Nature 348 (1990) 552-554で説明されている技術を用いて作製した抗体ファージライブラリーから単離することができる。Clackson, et al., Nature 352 (1991) 624-628および Marks, et al., J.Mol.Biol. 222 (1991) 581-597は、ファージライブラリーを用いた、マウス抗体およびヒト抗体の単離をそれぞれ説明している。その後の出版物では、チェーンシャッフリングによる高親和性(nM範囲)ヒト抗体の作製(Marks, et al., Bio/Technology 10 (1992) 779-783)、ならびに非常に大規模なファージライブラリーを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染およびインビボ組換え(Waterhouse, et al., Nuc.Acids.Res. 21 (1993) 2265-2266)が説明されている。したがって、これらの技術は、モノクローナル抗体を単離するための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術の実用的な代替案である。
【０２０２】
また、DNAは、例えば、同種のマウス配列の代わりにヒトの重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメインのコード配列を用いることによって(米国特許第4,816,567号; Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 (1984) 6851-6855)、または免疫グロブリンではないポリペプチドのコード配列のすべてもしくは一部分を免疫グロブリンコード配列に共有結合させることによって、改変することができる。
【０２０３】
典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドを抗体の定常ドメインの代わりに用いるか、またはそれらを抗体の1つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに用いて、ある抗原に対する特異性を有する1つの抗原結合部位および異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原結合部位を含む、キメラの二価抗体を作り出す。
【０２０４】
抗体の親和性
一定の態様において、本明細書において提供される抗体の解離定数(Kd)は、1μM以下、100nM以下、10nM以下、1nM以下、0.1nM以下、0.01nM以下、または0.001nM以下(例えば、10-8Mまたはそれ以下、例えば10-8M〜10-13M、例えば10-9M〜10-13M)である。
【０２０５】
1つの態様において、Kdは、以下のアッセイ法によって説明するように、関心対象の抗体のFab型およびその抗原を用いて実施される放射性標識した抗原またはFc受容体の結合アッセイ法(RIA)によって測定される。抗原に対するFabの溶液結合親和性は、非標識抗原の濃度変化系列の存在下で最小限の濃度の(125I)標識抗原を用いてFabを平衡化し、次いで、抗Fab抗体でコーティングしたプレートを用いて結合抗原を捕捉することによって、測定される(例えば、Chen, et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881を参照されたい)。アッセイ法の条件を確立するために、MICROTITER(登録商標)マルチウェルプレート(Thermo Scientific)を、50mM炭酸ナトリウム(pH9.6)に溶かした5μg/ml捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)で一晩コーティングし、続いて、室温(約23℃)で2〜5時間、PBSに溶かした2％(w/v)ウシ血清アルブミンでブロックする。非吸着性プレート(Nunc 269620番)中で、100pMまたは26pMの[125I]抗原を、(例えば、Presta, et al., Cancer Res. 57 (1997) 4593-4599の抗VEGF抗体、Fab-12の評価と一致する)関心対象のFabの段階希釈物と混合する。次いで、関心対象のFabを一晩インキュベートする;しかしながら、インキュベートをより長い期間(例えば、約65時間)続けて、確実に平衡状態に到達するようにしてもよい。
【０２０６】
その後、室温で(例えば1時間)インキュベーションするために、混合物を捕捉プレートに移す。次いで、溶液を除去し、0.1％ポリソルベート20(TWEEN-20(登録商標))含有PBSでプレートを8回洗浄する。プレートが乾いたら、150μl/ウェルの閃光物質(MICROSCINT-20(商標);Packard)を添加し、プレートをTOPCOUNT(商標)γ線計数器(Packard)にて10分間計測する。最大結合の20％未満または20％を与える各Fab濃度を、競合的結合アッセイ法で使用するために選択する。
【０２０７】
別の態様によれば、約10応答単位(RU)の抗原またはFc受容体を固定したCM5チップを用いた25℃でのBIACORE(登録商標)-2000またはBIACORE(登録商標)-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)によって表面プラズモン共鳴アッセイ法を行って、Kdを測定する。簡単に説明すると、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIACORE, Inc.)を、供給業者の取扱い説明書に従ってN-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(EDC)およびN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)で活性化する。抗原を10mM酢酸ナトリウム(pH4.8)で5μg/ml(約0.2μM)に希釈した後、結合タンパク質の応答単位(RU)が約10に達するように流速5μl/分で注入する。抗原の注入後、未反応基をブロックするために1Mエタノールアミンを注入する。動態測定のために、25℃、流速約25μl/分で、Fabの2倍段階希釈物(0.78nM〜500nM)を0.05％ポリソルベート20(TWEEN-20(商標))界面活性剤含有PBS(PBST)に注入する。結合センサーグラムおよび解離センサーグラムを同時にフィッティングすることにより、平易な1対1ラングミュア結合モデル(BIACORE(登録商標)Evaluation Softwareバージョン3.2)を用いて、結合速度(kon)および解離速度(koff)を算出する。平衡解離定数(Kd)は、比koff/konとして算出される。例えば、Chen, et al., J.Mol.Biol. 293 (1999) 865-881を参照されたい。上記の表面プラズモン共鳴アッセイ法による結合速度が106 M-1 s-1を上回る場合、ストップフロー機能を備えた分光光度計(Aviv Instruments)または撹拌機能付きキュベットを用いる8000シリーズSLM-AMINCO(商標)分光光度計(ThermoSpectronic)などの分光計で測定されるように、漸増濃度の抗原の存在下にて、PBS(pH7.2)中20nM抗抗原抗体(Fab形態)の25℃での蛍光発光強度(励起=295nm;発光=340nm、帯域16nm)の増加または減少を測定する蛍光消光技術を用いることによって、結合速度を測定することができる。
【０２０８】
特定の態様において、本明細書において提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片には、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv、およびscFv断片、ならびに後述する他の断片が含まれるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの抗体断片の概要については、Hudson, et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134を参照されたい。scFv断片の概要については、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照されたい。また、WO 93/16185ならびに米国特許第5,571,894号および同第5,587,458号を参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボ半減期が長くなっているFab断片およびF(ab')2断片の考察については、米国特許第5,869,046号を参照されたい。
【０２０９】
ダイアボディとは、二価または二重特異性であり得る、2つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、EP 0404097; WO 1993/01161; Hudson, et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134;およびHollinger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照されたい。トリアボディおよびテトラボディはまた、Hudson, et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134においても説明されている。
【０２１０】
単一ドメイン抗体とは、抗体の重鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分または軽鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分を含む抗体断片である。一定の態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である(Domantis, Inc., Waltham, MA;例えば、米国特許US 6,248,516 B1を参照されたい)。
【０２１１】
抗体断片は、本明細書において説明するように、インタクト抗体のタンパク質分解消化ならびに組換え宿主細胞(例えば、大腸菌またはファージ)による作製を非限定的に含む様々な技術によって作製することができる。
【０２１２】
キメラ抗体およびヒト化抗体
一定の態様において、本明細書において提供される抗体は、キメラ抗体である。いくつかのキメラ抗体が、例えば、米国特許第4,816,567号;およびMorrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 (1984) 6851-6855において説明されている。1つの例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはヒト以外の霊長類、例えばサルに由来する可変領域)およびヒト定常領域を含む。別の例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変更された、「クラススイッチされた」抗体である。キメラ抗体には、その抗原結合断片が含まれる。
【０２１３】
一定の態様において、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体をヒト化して、非ヒト親抗体の特異性および親和性を保持しつつ、ヒトに対する免疫原性を低下させる。通常、ヒト化抗体は、HVR、例えばCDR(またはその一部分)が非ヒト抗体に由来し、FR(またはその一部分)がヒト抗体配列に由来する、1つまたは複数の可変ドメインを含む。また、ヒト化抗体は、ヒト定常領域の少なくとも一部分も任意で含む。いくつかの態様において、ヒト化抗体中のいくつかのFR残基は、例えば、抗体の特異性または親和性を回復させるか、または向上させるために、非ヒト抗体(例えば、HVR残基の由来元である抗体)に由来する対応する残基で置換されている。
【０２１４】
ヒト化抗体およびそれらを作製する方法は、例えば、Almagro, and Fransson, Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633において概説されており、例えば、Riechmann, et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033;米国特許第5,821,337号、同第7,527,791号、同第6,982,321号、および同第7,087,409号; Kashmiri, et al., Methods 36 (2005) 25-34 (SDR (a-CDR)グラフティングを説明);Padlan, Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498(「リサーフェシング」を説明); Dall'Acqua, et al., Methods 36 (2005) 43-60(「FRシャッフリング」を説明);ならびにOsbourn, et al., Methods 36 (2005)61-68およびKlimka, et al., Br. J. Cancer, 83 (2000) 252-260(「FRシャッフリング」に取り組む「導かれた選択」アプローチを説明)においてさらに説明されている。
【０２１５】
ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域には、「ベストフィット」法(例えば、Sims, et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296を参照されたい)を用いて選択されたフレームワーク領域;特定のサブグループの軽鎖可変領域または重鎖可変領域のヒト抗体コンセンサス配列に由来するフレームワーク領域(例えば、Carter, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 (1992) 4285;およびPresta, et al., J. Immunol., 151 (1993) 2623を参照されたい);ヒト成熟(体細胞性に変異した)フレームワーク領域またはヒト生殖系列フレームワーク領域 (例えば、Almagro, and Fransson, Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633を参照されたい)ならびにFR ライブラリーをスクリーニングして得られたフレームワーク領域(例えば、Baca, et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684およびRosok, et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 22611-22618を参照されたい)が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０２１６】
ヒト抗体
一定の態様において、本明細書において提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野において公知の様々な技術を用いて作製することができる。ヒト抗体は、van Dijk, and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-74およびLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459において一般的に説明されている。
【０２１７】
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してインタクトヒト抗体またはヒト可変領域を有するインタクト抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって、調製することができる。典型的には、このような動物は、内在性の免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、または染色体外に存在するか、もしくは動物の染色体中にランダムに組み込まれる、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部分を含む。このようなトランスジェニックマウスにおいて、通常、内在性の免疫グロブリン遺伝子座は不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説については、Lonberg, Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125を参照されたい。また、例えば、XENOMOUSE(商標)技術を説明する米国特許第6,075,181号および同第6,150,584号;HUMAB(登録商標)技術を説明する米国特許第5,770,429号;K-M MOUSE(登録商標)技術を説明する米国特許第7,041,870号、ならびにVELOCIMOUSE(登録商標)技術を説明する米国特許出願公開第2007/0061900号も参照されたい。このような動物によって産生されるインタクト抗体に由来するヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と結合させることによって、さらに改変することができる。
【０２１８】
また、ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づく方法によって作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体を作製するためのヒト骨髄腫細胞株およびマウス-ヒト異種骨髄腫細胞株は説明されている。例えば、Kozbor, J. Immunol., 133 (1984) 3001; Brodeur, et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63;およびBoerner, et al., J. Immunol., 147 (1991) 86を参照されたい)。また、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術によって作製したヒト抗体が、Li, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103 (2006) 3557-3562において説明されている。その他の方法には、例えば、米国特許第7,189,826号(ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトIgM抗体の作製を説明)およびNi, Xiandai Mianyixue, 26(4) (2006) 265-268(ヒト-ヒトハイブリドーマを説明)において説明されているものが含まれる。ヒトハイブリドーマ技術(トリオーマ技術)は、Vollmers, and Brandlein, Histology and Histopathology 20(3) (2005) 927-937およびVollmers, and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27(3) (2005) 185-91においても説明されている。
【０２１９】
ヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーより選択されるFvクローン可変ドメイン配列を単離することによって作製することもできる。次いで、このような可変ドメイン配列を、所望のヒト定常ドメインと結合させてよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術を後述する。
【０２２０】
ライブラリー由来の抗体
本発明の抗体は、所望の1種または複数種の活性を有する抗体を求めてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって、単離することができる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作製し、所望の結合特徴を有する抗体を求めてそのようなライブラリーをスクリーニングするための様々な方法が、当技術分野において公知であるこのような方法は、例えば、Hoogenboom, H.R., et al., in Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)において概説されており、例えば、McCafferty, J., et al., Nature 348 (1990) 552-554; Clackson, et al., Nature 352 (1991) 624-628; Marks, et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597; Marks, and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248 161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu, et al., J. Mol. Biol. 338(2) (2004) 299-310; Lee, et al., J. Mol. Biol. 340(5) (2004) 1073-1093; Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34) (2004) 12467-12472;およびLee, et al., J. Immunol. Methods 284(1-2) (2004) 119-132においてさらに説明されている。
【０２２１】
いくつかのファージディスプレイ法では、VH遺伝子のレパートリーおよびVL遺伝子のレパートリーをポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって別々にクローニングし、ファージライブラリーにおいて無作為に組み換え、次いで、Winter, et al., Ann.Rev.Immunol., 12 (1994) 433-455で説明されているようにして、抗原結合ファージについてそれらをスクリーニングすることができる。典型的には、ファージは、単鎖Fv(scFv)断片またはFab断片のいずれかとして抗体断片を提示する。免疫化された供給源に由来するライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なしに、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、Griffiths, et al., EMBO J, 12 (1993) 725-734によって説明されているように、未処置のレパートリーを(例えばヒトから)クローニングして、まったく免疫化せずに、広範な非自己抗原およびまた自己抗原に対する単一の抗体供給源を提供することもできる。最後に、Hoogenboom, and Winter, J. Mol. Biol., 227 (1992) 381-388によって説明されているように、幹細胞由来の再配列されていないV遺伝子セグメントをクローニングし、かつランダム配列を含むPCRプライマーを用いて可変性に富むCDR3領域をコードし、インビトロでの再配列を達成することによって、未処置のライブラリーを合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを説明している特許公報には、例えば、米国特許第5,750,373号、ならびに米国特許公報第2005/0079574号、同第2005/0119455号、同第2005/0266000号、同第2007/0117126号、同第2007/0160598号、同第2007/0237764号、同第2007/0292936号、および同第2009/0002360号が含まれる。
【０２２２】
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体断片は、本明細書においてヒト抗体またはヒト抗体断片とみなされる。
【０２２３】
多重特異性抗体
一定の態様において、本明細書において提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。一定の態様において、結合特異性のうちの1つは、ある特異的抗原に対するものであり、他は、他の任意の抗原に対するものである。一定の態様において、二重特異性抗体は、抗原の2つの異なるエピトープに結合し得る。また、二重特異性抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞に細胞障害性物質を局在化させるのにも使用され得る。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片として調製することができる。
【０２２４】
多重特異性抗体を作製するための技術には、異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の組み換え同時発現(Milstein, and Cuello, Nature 305 (1983) 537、WO 93/08829、およびTraunecker, et al., EMBO J. 10 (1991) 3655を参照されたい)および「ノブインホール(knob-in-hole)」操作(例えば、米国特許第5,731,168号を参照されたい)が含まれるが、それらに限定されるわけではない。また、抗体Fcヘテロ二量体分子を作製するための静電気的操縦(electrostatic steering)効果を操作すること(WO 2009/089004 A1);2つまたはそれ以上の抗体または断片を架橋すること(例えば、米国特許第4,676,980号、およびBrennan, et al., Science, 229 (1985) 81を参照されたい);二重特異性抗体を作製するためのロイシンジッパーを用いること(例えば、Kostelny, et al., J. Immunol., 148(5) (1992) 1547-1553を参照されたい);二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術を用いること(例えば、Hollinger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 (1993) 6444-6448を参照されたい);;および単鎖Fv(sFv)二量体を用いること(例えば、Gruber, et al., J. Immunol., 152 (1994) 5368を参照されたい);ならびに例えばTutt, et al., J. Immunol. 147 (1991) 60で説明されているようにして、三重特異性抗体を調製することによって、多重特異性抗体を作製することもできる。
【０２２５】
「オクトパス抗体(Octopus antibodies)」を含む、3つまたはそれ以上の機能的抗原結合部位を有する操作された抗体もまた、本明細書に含まれる(例えば、US 2006/0025576 A1を参照されたい)。
【０２２６】
また、本明細書の抗体または断片には、ある特異的抗原ならびに別の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用性Fab」または「DAF」が含まれる(例えば、US 2008/0069820を参照されたい)。
【０２２７】
抗原に対する結合親和性が変化した抗体変種
一定の態様において、抗体の抗原への結合親和性および/または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変種は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することによって、またはペプチド合成によって、調製することができる。このような改変には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、ならびに/または残基中への挿入、および/もしくは残基の置換が含まれる。最終構築物が所望の特徴、例えば、抗原結合を示すことを条件として、欠失、挿入、および置換の任意の組合せを行って、最終構築物に到達することができる。
【０２２８】
置換変種、挿入変種、および欠失変種
一定の態様において、Fc部分以外の部分に1つまたは複数のアミノ酸置換をさらに有する、Fc変種を含むポリペプチドが、提供される。対象となる置換変異誘発部位には、HVRおよびFRが含まれる。保存的置換は、表1の「保存的置換」という項目の下に示す。より実質的な変更は、表1の「例示的置換」という項目の下に提供し、アミノ酸側鎖のクラスに関してさらに後述する。アミノ酸置換を関心対象の抗体に導入し、その作製物を所望の活性、例えば、保持された/向上した抗原結合、または低下した免疫原性についてスクリーニングすることができる。
【０２２９】
【表１】
0005926791.tif 000002
側鎖の共通特性に基づいてグループ分けされる:
(1)疎水性:Ile、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性で親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖の向きに影響する残基:Gly、Pro;
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
【０２３０】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。
【０２３１】
置換変種の1つのタイプは、親抗体(例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体)の1つまたは複数の超可変領域残基の置換を含む。一般に、その後の研究のために選択される得られた変種は、親抗体を基準としていくつかの生物学的特性の改変(例えば改善)(例えば、増大した親和性、低下した免疫原性)を有し、かつ/または親抗体のいくつかの生物学的特性を実質的に保持する。例示的な置換変種は、例えば、本明細書において説明するもののようなファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて簡便に作製することができる、親和性成熟抗体である。簡単に説明すると、1つまたは複数のHVR残基を変異させ、変種抗体をファージ上に提示させ、特定の生物学的活性(例えば結合親和性)についてスクリーニングする。
【０２３２】
例えば、抗体親和性を向上させるために、HVR中に変化(例えば置換)を起こしてよい。このような変化は、HVR「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセスの間に高頻度で変異を受けるコドンにコードされる残基(例えば、Chowdhury, Methods Mol.Biol. 207 (2008) 179-196を参照されたい)、および/またはSDR(a-CDR)中に起こしてよく、得られた変種VHまたはVLを結合親和性について試験する。二次ライブラリーを構築し、それから再選択することによる親和性成熟は、例えば、Hoogenboom, et al., in Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))において説明されている。親和性成熟のいくつかの態様において、様々な方法(例えば、誤りがちなPCR、チェーンシャッフリング、またはオリゴヌクレオチド指定変異誘発)のいずれかによって、成熟のために選択された可変遺伝子中に多様性が導入される。次いで、二次ライブラリーが作製される。次いで、ライブラリーをスクリーニングして、所望の親和性を有する任意の抗体変種を同定する。多様性を導入するための別の方法は、いくつかのHVR残基(例えば、同時に4〜6個の残基)がランダム化される、HVRを対象とするアプローチを伴う。抗原結合に関与しているHVR残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発またはモデリングを用いて、特異的に同定することができる。特に、CDR-H3およびCDR-L3がしばしば標的とされる。
【０２３３】
一定の態様において、置換、挿入、または欠失は、このような変化によって、抗体が抗原に結合する能力が実質的に低下しない限り、1つまたは複数のHVR内に存在してよい。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的変化(例えば、本明細書において提供される保存的置換)をHVR中に起こしてよい。このような変化は、HVR「ホットスポット」またはSDRの外側でもよい。上記で提供した変種VH配列およびVL配列の一定の態様において、各HVRは、不変であるか、または1個、2個、もしくは3個以下のアミノ酸置換を含むかのいずれかである。
【０２３４】
変異誘発の標的とされ得る抗体の残基または領域を同定するために有用な方法は、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれ、Cunningham, and Wells, Science 244 (1989) 1081-1085によって説明されている。この方法では、残基または標的残基群(例えば、arg、asp、his、lys、およびgluなどの荷電残基)を同定し、中性アミノ酸または負電荷を持つアミノ酸(例えば、アラニンまたはポリアラニン)によって置換して、抗体と抗原の相互作用が影響を受けるかどうか判定する。最初の置換に対して機能的感受性を示すアミノ酸位置に、さらに置換を導入してよい。あるいはまたはさらに、抗原-抗体複合体の結晶構造から、抗体と抗原の接触点を特定する。このような接触残基および隣接残基を、置換の候補として標的とするか、または除去してよい。変種をスクリーニングして、それらが所望の特性を有するかどうかを判定してよい。
【０２３５】
アミノ酸配列挿入には、長さが残基1個から100個またはそれ以上の残基を含むポリペプチドまで及ぶアミノ末端融合および/またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、N末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変種には、(例えばADEPTのための)酵素または抗体の血清半減期を長くするポリペプチドへの、抗体のN末端またはC末端の融合が含まれる。
【０２３６】
グリコシル化変種
一定の態様において、本明細書において提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を大きくするか、または小さくするように変化させられる。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、1つまたは複数のグリコシル化部位が作り出されるかまたは取り除かれるようにアミノ酸配列を変化させることによって、簡便に達成することができる。
【０２３７】
抗体がFc領域を含む場合、それに結合する炭水化物を変化させてよい。典型的には、哺乳動物細胞によって産生される天然抗体は、Fc領域のCH2ドメインのAsn297にN結合によって通常結合している分枝状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Wright, et al., TIBTECH 15 (1997) 26-32を参照されたい。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えば、マンノース、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、ガラクトース、およびシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「軸(stem)」中のGlcNAcに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの態様において、いくつかの特性が改善した抗体変種を作り出すために、本発明の抗体中のオリゴ糖に改変を加えてよい。
【０２３８】
シアリル化オリゴ糖を伴う（例えば、抗体のFc領域に結合したFcコアオリゴ糖の差次的なシアリル化が提供される）、Fc変種を含むポリペプチドが、さらに提供される。このようなポリペプチドでは、シアリル化が増大する場合があり、かつ/またはADCC機能が低下する場合がある。このような抗体変種の例は、例えば、Kaneko, et al., Science 313 (2006) 670-673によって説明されている。
【０２３９】
システインで操作された抗体変種
一定の態様において、システインで操作された抗体、例えば、抗体の1つまたは複数の残基がシステイン残基で置換されている「チオMAb」を作り出すことが望ましい場合がある。特定の態様において、置換される残基は、抗体の接近可能な部位に存在する。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基が、その結果、抗体の接近可能な部位に位置づけられ、本明細書においてさらに説明するように、薬物部分またはリンカー-薬物部分などの他の部分に抗体を結合させて免疫結合体を作り出すために使用され得る。一定の態様において、次の残基の任意の1つまたは複数をシステインで置換してよい:軽鎖のV205(Kabatの番号付与);重鎖のA118(EU番号付与);および重鎖Fc領域のS400(EU番号付与)。システインで操作された抗体は、例えば、米国特許第7,521,541号において説明されているようにして作製することができる。
【０２４０】
抗体誘導体
一定の態様において、本明細書において提供される抗体は、当技術分野において公知であり、容易に入手可能である付加的な非タンパク性部分を含むようにさらに改変され得る。抗体の誘導体化に適した部分には、水溶性ポリマーが含まれるがそれに限定されるわけではない。水溶性ポリマーの非限定的な例には、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸(ホモポリマーまたはランダム共重合体のいずれか)、およびデキストランまたはポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロプロピレン(propropylene)グリコールホモポリマー、プロリプロピレン(prolypropylene)オキシド/エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が含まれるが、それらに限定されるわけではない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中で安定であるため、製造の際に有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量のものでよく、分枝状または非分枝状でよい。抗体に結合されるポリマーの数は変動してよく、複数のポリマーが結合される場合、それらは同じ分子または異なる分子でよい。通常、誘導体化のために使用されるポリマーの数および/またはタイプは、限定されるわけではないが、改善しようとする抗体の特定の特性または機能、その抗体誘導体が所定の条件下で治療法において使用されるかなどを含む考慮すべき事柄に基づいて決定することができる。
【０２４１】
別の態様において、抗体と放射線への曝露によって選択的に加熱され得る非タンパク性部分との結合体が提供される。1つの態様において、非タンパク性部分は炭素ナノチューブである(Kam, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605)。放射線は、任意の波長のものでよく、普通の細胞には害を与えないが、抗体-非タンパク性部分の近位にある細胞が死滅する温度まで非タンパク性部分を熱する波長が含まれるが、それに限定されるわけではない。
【０２４２】
組換え法および組換え組成物
抗体は、例えば、米国特許第4,816,567号において説明されているようにして、組換え法および組換え組成物を用いて作製することができる。1つの態様において、本明細書において説明する抗体変種をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列および/またはVHを含むアミノ酸配列(例えば、抗体の軽鎖および/または重鎖)をコードし得る。さらなる態様において、このような核酸を含む1つまたは複数のベクター(例えば発現ベクター)が提供される。さらなる態様において、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。1つのこのような態様において、宿主細胞は、(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列および抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクターおよび抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクターを含む(例えば、それらで形質転換されている)。1つの態様において、宿主細胞は、真核生物性、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞またはリンパ系細胞(例えば、Y0細胞、NS0細胞、Sp20細胞)である。1つの態様において、抗体変種を作製する方法が提供され、この方法は、抗体の発現に適した条件下で、上記に提供されるような抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養する段階、および任意で、宿主細胞(または宿主細胞培地)から抗体を回収する段階を含む。
【０２４３】
抗体変種を組換え作製する場合、例えば前述のような抗体をコードする核酸は、単離され、宿主細胞におけるその後のクローニングおよび/または発現のために、1つまたは複数のベクター中に挿入される。このような核酸は、従来の手順を用いて(例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって)、容易に単離および配列決定され得る。
【０２４４】
抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に適した宿主細胞には、本明細書において説明する原核細胞または真核細胞が含まれる。例えば、抗体は、グリコシル化およびFcエフェクター機能が必要とされない場合には特に、細菌において産生させることができる。細菌における抗体断片および抗体ポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第5,648,237号、同第5,789,199号、および同第5,840,523号を参照されたい。(大腸菌における抗体断片の発現を説明するCharlton, Methods in Molecular Biology 248 (2003) 245-254 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ)も参照されたい)。発現後、抗体は、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離することができ、さらに精製することができる。
【０２４５】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物も、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング宿主または発現宿主であり、これらには、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、その結果、部分的または全面的にヒトグリコシル化パターンを有する抗体を産生する真菌株および酵母株が含まれる。Gerngross, Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414およびLi, et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215を参照されたい。
【０２４６】
また、グリコシル化抗体の発現のために適した宿主細胞は、多細胞生物(無脊椎動物および脊椎動物)にも由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞および昆虫細胞が含まれる。昆虫細胞と組み合わせて、特にスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞のトランスフェクションのために使用され得る多数のバキュロウイルス株が同定されている。
【０２４７】
植物細胞培養物もまた、宿主として使用することができる。例えば、米国特許第5,959,177号、同第6,040,498号、同第6,420,548号、同第7,125,978号、および同第6,417,429号(トランスジェニック植物において抗体を産生させるためのPLANTIBODIES(商標)技術を説明している)を参照されたい。
【０２４８】
脊椎動物細胞もまた、宿主として使用され得る。例えば、懸濁液中で増殖するように順応させた哺乳動物細胞株が、有用である場合がある。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株(COS-7);ヒト胚性腎臓株(293細胞または腎臓細胞(BHK);マウスセルトリ細胞(例えば、Mather, Biol. Reprod. 23 (1980) 243-251で説明されているようなTM4細胞);サル腎臓細胞(CV1);アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76);ヒト子宮頸部癌細胞(HELA);イヌ腎臓細胞(MDCK);バッファローラット肝臓細胞(BRL 3A);ヒト肺細胞(W138);ヒト肝臓細胞(Hep G2);マウス乳房腫瘍(MMT 060562);TRI細胞(例えば、Mather, et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68で説明されている);MRC5細胞;およびFS4細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、DHFR- CHO細胞(Urlaub, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216)を含むチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ならびにY0、NS0、およびSp2/0などの骨髄腫細胞株が含まれる。抗体産生に適したいくつかの哺乳動物宿主細胞株の概要については、例えば、Yazaki, and Wu, Methods in Molecular Biology 248 (2003) 255-268 (B.K.C.Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ)を参照されたい。
【０２４９】
アッセイ法
本明細書において提供される抗体は、当技術分野において公知の様々なアッセイ法によって、同定し、物理的/化学的特性および/または生物学的活性についてスクリーニングし、またはそれらに関して特徴付けることができる。
【０２５０】
結合アッセイ法および他のアッセイ法
1つの局面において、例えば、ELISA、ウェスタンブロットなどの公知の方法によって、本発明の抗体の抗原結合活性を試験する。
【０２５１】
例示的な競合アッセイ法において、固定された抗原は、その抗原(例えば)に結合する第1の標識抗体および抗原結合に関して第1の抗体と競合する能力を試験される第2の非標識抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第2の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在してよい。対照として、固定された抗原は、第1の標識抗原を含むが第2の非標識抗体を含まない溶液中でインキュベートされる。抗原への第1の抗体の結合を許容する条件下でのインキュベーションの後、余分な未結合抗体を除去し、固定された抗原に結合した標識の量を測定する。固定された抗原に結合した標識の量が、対照試料と比べて試験試料において実質的に減少している場合、このことから、第2の抗体が抗原結合に関して第1の抗体と競合していることが示される(Harlow, and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照されたい)。
【０２５２】
免疫結合体
本発明はまた、1種または複数種の細胞障害性物質、例えば、化学療法剤または化学療法薬、増殖抑制剤、毒素(例えば、タンパク毒素、細菌、真菌、植物、もしくは動物に由来する酵素的に活性な毒素、またはそれらの断片)、または放射性同位元素に結合された本明細書の抗体を含む免疫結合体も提供する。
【０２５３】
1つの態様において、免疫結合体は、抗体が1種または複数種の薬物に結合されている抗体-薬物結合体(ADC)である。これらの薬物には、マイタンシノイド(米国特許第5,208,020号、同第5,416,064号、および欧州特許EP 0425235 B1を参照されたい);アウリスタチン、例えば、モノメチルアウリスタチン薬物部分DEおよびDF(MMAEおよびMMAF)(米国特許第5,635,483号および同第5,780,588号、ならびに同第7,498,298号を参照されたい);ドラスタチン;カリケアミシンまたはその誘導体(米国特許第5,712,374号、同第5,714,586号、同第5,739,116号、同第5,767,285号、同第5,770,701号、同第5,770,710号、同第5,773,001号、および同第5,877,296号;Hinman, et al., Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342;ならびにLode, et al., Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928を参照されたい);アントラサイクリン、例えば、ダウノマイシンまたはドキソルビシン(Kratz, et al., Current Med. Chem. 13 (2006) 477-523; Jeffrey, et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16 (2006) 358-362; Torgov, et al., Bioconj. Chem. 16 (2005) 717-721; Nagy, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834; Dubowchik, et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532; King, et al., J. Med. Chem. 45 (2002) 4336-4343;および米国特許第6,630,579号を参照されたい);メトトレキサート; ビンデシン;タキサン、例えば、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、およびオルタタキセル;トリコテセン;ならびにCC1065が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０２５４】
別の態様において、免疫結合体は、限定されるわけではないが、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素A鎖(緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)由来)、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、αサルシン、シナアブラギリ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチンタンパク質、アメリカヤマゴボウ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPII、およびPAP-S)、ツルレイシ(momordica charantia)阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンを含む、酵素的に活性な毒素またはその断片に結合された、本明細書において説明する抗体を含む。
【０２５５】
別の態様において、免疫結合体は、放射性原子に結合されて放射性結合体を形成した、本明細書において説明する抗体を含む。様々な放射性同位元素が、放射性結合体の作製のために利用可能である。例には、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212、およびLuの放射性同位元素が含まれる。放射性結合体が検出に使用される場合、放射性結合体は、シンチグラフィー調査のための放射性原子、例えば、tc99mもしくはI123、または核磁気共鳴(NMR)画像法(磁気共鳴画像法、mriとしても公知)のためのスピン標識、例えば、やはりヨウ素-123、ヨウ素-131、インジウム-111、フッ素-19、炭素-13、窒素-15、酸素-17、ガドリニウム、マンガン、もしくは鉄を含んでよい。
【０２５６】
抗体および細胞障害性物質の結合体は、様々な二官能性タンパク質結合剤、例えば、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオナート(SPDP)、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(SMCC)、イミノチオラン(IT)、イミドエステルの二官能性誘導体(例えばアジプイミド酸ジメチルHCl)、活性エステル(例えばスベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド(例えばグルタルアルデヒド)、ビス-アジド化合物(例えばビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えばビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン)、ジイソシアナート(例えばトルエン2,6-ジイソシアナート)、および置換基が2つの(bis-)活性なフッ素化合物(例えば1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン)を用いて作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta, et al., Science 238 (1987) 1098で説明されているようにして調製することができる。炭素14で標識された1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレントリアミン五酢酸(MX-DTPA)は、抗体に放射性ヌクレオチドを結合させるための例示的なキレート剤である。WO 94/11026を参照されたい。リンカーは、細胞における細胞障害性薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であってよい。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性のリンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィドを含むリンカー(Chari, et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131;米国特許第5,208,020号)が使用され得る。
【０２５７】
本明細書における免疫結合体またはADCは、(例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aから市販されている)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、およびスルホ-SMPB、およびSVSB(succinimidyl-(4-vinylsulfone)benzoate)を非限定的に含む架橋剤試薬を用いて調製されたこのような結合体を明確に企図するが、それらに限定されるわけではない。
【０２５８】
診断法および検出のための方法および組成物
一定の態様において、本明細書において提供される抗体変種のいずれかは、生物試料においてその抗体に結合する抗原の存在を検出するのに有用である。本明細書において使用される「検出する」という用語は、定量的検出または定性的検出を包含する。一定の態様において、生物試料は、細胞または組織を含む。
【０２５９】
1つの態様において、診断または検出の方法において使用するための抗体変種が提供される。さらなる局面において、該抗体変種が結合する抗原の存在を生物試料において検出する方法が提供される。一定の態様において、この方法は、抗体が抗原に結合するのを許容する条件下で、生物試料を本明細書において説明する抗体と接触させる段階、および抗体と抗原の間で複合体が形成されるかどうかを検出する段階を含む。このような方法は、インビトロの方法またはインビボの方法でよい。1つの態様において、抗体変種は、抗体を用いた治療法に好適な対象を選択するのに、例えば、該抗体が結合する抗原が患者選択のためのバイオマーカーである場合に、使用される。
【０２６０】
本発明の抗体を用いて診断され得る例示的な障害には、癌、心血管疾患、神経障害、および糖尿病が含まれる。
【０２６１】
一定の態様において、標識抗体変種が提供される。標識には、直接的に検出される標識または部分(例えば、蛍光性標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、および放射性標識)、ならびに例えば酵素反応または分子相互作用を通じて間接的に検出される酵素またはリガンドなどの部分が含まれるが、それらに限定されるわけではない。例示的な標識には、ラジオアイソトープ32P、14C、125I、3H、および131I、蛍光体、例えば、希土類キレートまたはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ(luceriferase)、例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ(米国特許第4,737,456号)、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシターゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、(過酸化水素を使用して色素前駆体を酸化する酵素、例えば、HRP、ラクトペルオキシダーゼ、またはミクロペルオキシダーゼと併用される)糖類酸化酵素、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、複素環系酸化酵素（例えば、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ビオチン/アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、ならびに安定なフリーラジカルなどが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０２６２】
薬学的製剤
本明細書において説明する抗体変種の薬学的製剤は、所望の程度の純度を有するそのような抗体を1種または複数種の任意の薬学的に許容される担体(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A.Ed.(1980))と混合することによって、凍結乾燥製剤または水性液剤の形態で調製される。通常、薬学的に許容される担体は、使用される投与量および濃度において受容者に非毒性であり、限定されるわけではないが、次のものが含まれる:リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝剤;アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤;保存剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール;メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン;カテコール;レソルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;およびm-クレゾールなど);低分子量(約10残基未満の)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸;単糖類、二糖類、および他の炭水化物(グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む);EDTAのようなキレート剤;スクロース、ショ糖、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖;ナトリウムのような塩を形成する対イオン;金属複合体(例えばZn-タンパク質複合体);ならびに/またはポリエチレングリコール(PEG)のような非イオン系界面活性剤。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体には、さらに、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)のような間質(insterstitial)薬物分散剤、例えば、rHuPH20(HYLENEX(登録商標), Baxter International, Inc.)のようなヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質が含まれる。rHuPH20を含む、いくつかの例示的なsHASEGPおよび使用方法は、米国特許公報第2005/0260186号および同第2006/0104968号において説明されている。1つの局面において、sHASEGPは、コンドロイチナーゼのような1種または複数種の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
【０２６３】
例示的な凍結乾燥抗体製剤が、米国特許第6,267,958号において説明されている。水性抗体製剤には、米国特許第6,171,586号およびWO2006/044908において説明されているものが含まれ、後者の製剤は、ヒスチジン-酢酸緩衝液を含む。
【０２６４】
また、本明細書における製剤は、治療される個々の適応症に対する必要に応じて複数の有効成分、好ましくは、補完的な活性を有し、互いに悪影響を及ぼさないものも含んでよい。このような有効成分は、意図される目的のために有効な量で組み合わせられて存在するのが適切である。
【０２６５】
有効成分は、例えば、コアセルベーション技術または界面重合により調製されたマイクロカプセル中に、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルもしくはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ(メチルメタシラート(methylmethacylate))マイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル)中に、またはマクロエマルジョン中に閉じ込めることができる。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)で開示されている。
【０２６６】
徐放性製剤を調製することができる。徐放性製剤の適切な例には、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、これらのマトリックスは造形品、例えばフィルム、またはマイクロカプセルの形態である。
【０２６７】
通常、インビボ投与のために使用される製剤は、滅菌済みである。無菌状態は、例えば、滅菌ろ過膜に通してろ過することによって、容易に実現することができる。
【０２６８】
治療方法および治療的組成物
本明細書において提供されるポリペプチドのいずれかを治療方法で使用することができる。
【０２６９】
本発明の特定の局面において、本発明によるポリペプチドは、疾患を治療するために使用される。より具体的な局面において、疾患は、変種のエフェクター機能が、野生型Fcポリペプチドを含むポリペプチドと比べて大きく、少なくとも50％低減していることが望まれるような疾患である。
【０２７０】
特定の局面において、本発明によるポリペプチドは、そのポリペプチドのエフェクター機能が、野生型Fcポリペプチドと比べて大きく低減していることが望まれる疾患を治療するための医薬を製造する際に使用される。別の具体的な局面において、本発明によるポリペプチドは、そのポリペプチドのエフェクター機能が、野生型Fcポリペプチドと比べて少なくとも20％低減していることが望まれる疾患を治療するための医薬を製造する際に使用される。
【０２７１】
さらなる局面は、変種のエフェクター機能が、野生型Fcポリペプチドと比べて大きく低減していることが望まれる疾患を有する個体を治療する方法であり、該方法は、有効量の本発明によるポリペプチドを個体に投与する段階を含む。
【０２７２】
エフェクター機能の大きな低減とは、野生型ポリペプチドによって誘導されるエフェクター機能の少なくとも50％の、エフェクター機能の低減である。
【０２７３】
例えば、このような疾患は、例えばADCC、ADCP、またはCDCによって標的細胞が破壊されるべきではない疾患すべてである。さらに、標的細胞に薬物(例えば、毒素および同位元素)を送達するように設計された抗体にもこれは当てはまる。このような抗体の場合、Fc/FcγRによってエフェクター機能がもたらされると、健常な免疫細胞が致死的な送達物に近づき、標的細胞と共に正常なリンパ組織が減少してしまうためである(Hutchins, et al, PNAS USA 92 (1995) 11980-11984; White, et al, Annu Rev Med 52 (2001) 125-145)。これらの場合、補体またはエフェクター細胞を十分に動員しない抗体の使用は、極めて有益であるはずである(例えば、Wu, et al., Cell Immunol 200 (2000) 16-26; Shields, et al., J. Biol Chem 276(9) (2001) 6591-6604; US 6,194,551; US 5,885,573、およびPCT公報WO 04/029207を参照されたい)。
【０２７４】
他の場合、例えば、広範に発現される受容体とその同族リガンドとの相互作用を妨害することが目的である場合、抗体エフェクター機能のすべてを低下させるか、またはなくして、望まれない毒性を軽減させることが有利であると思われる。また、治療的抗体が、いくつかのヒト組織にまたがる相手を選ばない結合を示した場合、エフェクター機能のターゲティングを異なる一組の組織に限定して毒性を限定することが賢明であると思われる。
【０２７５】
また、アゴニスト抗体の場合も、これらの抗体が低いエフェクター機能を示せば、非常に助けになると思われる。
【０２７６】
ポリペプチド変種で治療できる病態は多く、癌(例えば、抗体変種がHER2受容体、アンギオポエチン受容体、または血管内皮増殖因子(VEGF)に結合する場合);喘息のようなアレルギー性病態(抗IgE抗体を使用);ならびにLFA-1の媒介による障害(例えば、ポリペプチド変種が抗LFA-1抗体または抗ICAM-1抗体である場合)、神経障害、および代謝障害が含まれる。
【０２７７】
抗体がHER2受容体に結合する場合、障害は好ましくは、HER2を発現する癌、例えば、HER2受容体の過剰発現を特徴とする良性腫瘍または悪性腫瘍である。このような癌には、乳癌、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、消化器癌、膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、膀胱癌、ヘパトーマ、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、および様々なタイプの頭頸部癌が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０２７８】
ポリペプチド変種または抗体変種は、非経口投与、皮下投与、腹腔内投与、肺内投与、および鼻腔内投与、ならびに局所的免疫抑制治療のために望ましいならば、病巣内投与を含む、任意の適切な手段によって投与される。非経口注入には、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、または皮下投与が含まれる。さらに、抗体変種は、特に、用量が減少するポリペプチド変種を用いたパルス注入によって投与されるのが適切である。好ましくは、投薬は、投与が短時間であるかまたは長期的であるかにある程度応じて、注射、最も好ましくは静脈内注射または皮下注射によって行われる。
【０２７９】
疾患を予防または治療する際、ポリペプチド変種または抗体変種の適切な投与量は、治療しようとする疾患のタイプ、疾患の重症度および経過、そのポリペプチド変種が予防目的で投与されるのかまたは治療目的で投与されるのか、以前の療法、患者の臨床歴、およびポリペプチド変種に対する応答、ならびに主治医の判断に依存する。ポリペプチド変種は、1回で、または一連の治療の間ずっと、患者に適宜投与される。
【０２８０】
疾患のタイプおよび重症度によって、約1μg/kg〜15mg/kg(例えば0.1〜20mg/kg)のポリペプチド変種または抗体変種が、患者に投与するための最初の候補投与量であり、例えば、1回または複数回の個別投与によるか持続輸注によるかを問わない。典型的な1日投与量は、前述の因子に応じて、約1μg/kg〜100mg/kgまたはそれ以上に及び得る。数日間またはそれより長い期間に渡る反復投与の場合、病態に応じて、疾患症状の所望の抑制が起こるまで治療が継続される。しかしながら、他の投与計画が有用である場合がある。この療法の進行は、従来の技術およびアッセイ法を用いて容易にモニターされる。
【０２８１】
一定の態様において、本発明は、有効量の抗体変種を個体に投与する段階を含む、癌を有する個体を治療する方法において使用するための、抗体変種またはポリペプチドを提供する。1つのこのような態様において、この方法は、例えば後述するような少なくとも1種の追加の治療物質の有効量を個体に投与する段階をさらに含む。さらなる態様において、本発明は、血管新生を阻害するか、細胞増殖を阻害するか、またはB細胞を枯渇させるのに有効な抗体変種を個体に投与する段階を含む、個体において血管新生を阻害するか、細胞増殖を阻害するか、またはB細胞を枯渇させる際に使用するための抗体変種を提供する。上記の態様のいずれかに記載の「個体」とは、好ましくはヒトである。
【０２８２】
さらなる局面において、本発明は、医薬を製造または調製する際の抗体変種またはポリペプチドの使用を提供する。1つの態様において、医薬は、癌または炎症性疾患の治療のためのものである。さらなる態様において、医薬は、癌、糖尿病、神経障害、または炎症を有する個体に有効量の医薬を投与する段階を含む、癌、糖尿病、神経障害、または炎症を治療する方法において使用するためのものである。1つのこのような態様において、この方法は、例えば後述するような少なくとも1種の追加の治療物質の有効量を個体に投与する段階をさらに含む。さらなる態様において、医薬は、血管新生を阻害するか、細胞増殖を阻害するか、またはB細胞を枯渇させるためのものである。
【０２８３】
さらなる態様において、医薬は、血管新生を阻害するか、細胞増殖を阻害するか、またはB細胞を枯渇させるのに有効な量の医薬を個体に投与する段階を含む、個体において血管新生を阻害するか、細胞増殖を阻害するか、またはB細胞を枯渇させる方法において、使用するためのものである。上記の態様のいずれかに記載の「個体」は、ヒトでよい。
【０２８４】
さらなる局面において、本発明は、例えば、上記の治療方法のいずれかで使用するための、本明細書において提供される抗体変種のいずれかを含む薬学的製剤を提供する。1つの態様において、薬学的製剤は、本明細書において提供される抗体変種のいずれかおよび薬学的に許容される担体を含む。別の態様において、薬学的製剤は、本明細書において提供される抗体変種のいずれかおよび例えば後述するような少なくとも1種の追加の治療物質を含む。
【０２８５】
本発明の抗体は、治療法において単独でまたは他の作用物質と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の抗体は、少なくとも1種の追加の治療物質と同時投与されてよい。
【０２８６】
前述のこのような併用療法は、併用投与(2種またはそれ以上の治療物質が同じ製剤または別々の製剤に含まれる)、ならびに個別投与(この場合、本発明の抗体の投与は、追加の治療物質および/またはアジュバントの投与の前、同時、および/または後に起こり得る)を包含する。また、本発明の抗体は、放射線療法と組み合わせて使用することもできる。
【０２８７】
本発明の抗体(および任意の追加の治療物質)は、非経口投与、肺内投与、および鼻腔内投与、ならびに局所的治療のために望ましいならば、病巣内投与を含む、任意の適切な手段によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、または皮下投与が含まれる。投薬は、投与が短時間であるかまたは長期的であるかにある程度応じて、任意の適切な経路によって、例えば、静脈内注射または皮下注射などの注射によって行うことができる。限定されるわけではないが、単回投与または様々な時点に渡る複数回投与、ボーラス投与、およびパルス注入を含む様々な投薬スケジュールが、本明細書において企図される。
【０２８８】
本発明の抗体は、優良医療規範と一致する様式で製剤化され、投薬され、投与される。この状況で考慮すべき因子には、治療される個々の障害、治療される個々の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、作用物質の送達部位、投与方法、投与スケジューリング、および医療担当者に公知である他の因子が含まれる。抗体は、そうする必要はないが、任意で、問題の障害を予防または治療するのに現在使用されている1種または複数種の作用物質と共に製剤化される。このような他の作用物質の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害または治療のタイプ、および上記の他の因子に依存する。通常、これらは、本明細書において説明するのと同じ投与量および投与経路で、もしくは本明細書において説明する投与量の約1〜99％で、または適切であると実験的に/臨床的に判定される任意の投与量および任意の経路で、使用される。
【０２８９】
疾患を予防または治療する際、本発明の抗体の適切な投与量(単独で、または1種もしくは複数種の他の追加の治療物質と組み合わせて使用される場合)は、治療しようとする疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度および経過、その抗体が予防目的で投与されるのかまたは治療目的で投与されるのか、以前の療法、患者の臨床歴、および抗体に対する応答、ならびに主治医の判断に依存する。抗体は、1回で、または一連の治療の間、患者に適宜投与される。疾患のタイプおよび重症度によって、約1μg/kg〜15mg/kg(例えば0.1mg/kg〜10mg/kg)の抗体が、患者に投与するための最初の候補投与量であることができ、例えば、1回または複数回の個別投与によるか持続輸注によるかを問わない。1つの典型的な1日投与量は、前述の因子に応じて、約1μg/kg〜100mg/kgまたはそれ以上に及び得る。数日間またはそれより長い期間に渡る反復投与の場合、病態に応じて、疾患症状の所望の抑制が起こるまで、通常、治療は継続される。抗体の1つの例示的な投与量は、約0.05mg/kg〜約10mg/kgの範囲である。したがって、約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、もしくは10mg/kg(またはその任意の組合せ)という1種または複数種の用量が、患者に投与され得る。このような用量は、断続的に、例えば、毎週または3週間ごとに(例えば、患者に抗体が約2〜約20回、または例えば約6回与えられるように)投与されてよい。最初に多めの負荷用量、続いて、1回または複数回の少なめの用量を投与してよい。しかしながら、他の投与計画が有用である場合がある。この療法の進行は、従来の技術およびアッセイ法を用いて容易にモニターされる。
【０２９０】
本発明による抗体の代わりにまたは本発明による抗体に加えて、本発明の免疫結合体を用いて、上記の製剤または治療方法のいずれかを実施できることが理解される。
【０２９１】
製品
本発明の別の局面において、前述の障害の治療、予防、および/または診断に有用な材料を含む製品が提供される。製品は、容器、および容器の上または容器に伴うラベルまたは添付文書を含む。適切な容器には、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、IV溶液バッグなどが含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなど様々な材料から形成されてよい。容器は、単独であるか、または病態を治療、予防、および/もしくは診断するのに有効な別の組成物と組み合わせられた組成物を含み、無菌取出口を有してよい(例えば、容器は、皮下注射針によって突き刺すことができる栓を有する静注液バッグまたはバイアルでよい)。組成物中の少なくとも1種の活性物質は、本発明の抗体である。ラベルまたは添付文書は、その組成物が、選ばれた病態を治療するのに使用されることを示す。さらに、製品は、(a)本発明の抗体を含む組成物がその中に含まれる第1の容器;および(b)別の細胞障害性物質またはそうでなければ治療物質を含む組成物がその中に含まれる第2の容器を含んでよい。本発明のこの態様の製品は、それらの組成物を用いて特定の病態を治療できることを示す添付文書をさらに含んでよい。あるいはまたはさらに、製品は、注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝化生理食塩水、リンガー溶液、およびデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第2の(または第3の)容器をさらに含んでよい。これは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジを含む、商業的観点および使用者の観点から望ましい他の材料もさらに含んでよい。
【０２９２】
上記の製品のいずれかは、抗体変種の代わりにまたは抗体変種に加えて、本発明の免疫結合体を含んでよいことが理解される。
【０２９３】
ポリペプチドの非治療的使用
本発明の抗体変種は、アフィニティー精製剤として使用され得る。このプロセスにおいて、抗体変種は、当技術分野において周知の方法を用いて、Sephadex樹脂またはろ紙などの固相上に固定される。固定されたポリペプチド変種を、精製されるべき抗原を含む試料と接触させ、その後、固定された抗体変種に結合している精製されるべき抗原を除いて試料中の実質的にすべての材料を除去する適切な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、ポリペプチド変種から抗原を遊離させるグリシン緩衝液pH5.0のような別の適切な溶媒で、支持体を洗浄する。
【０２９４】
また、抗体変種は、例えば、特定の細胞、組織、または血清における関心対象の抗原の発現を検出するための診断的アッセイ法においても有用であり得る。
【０２９５】
診断に応用する場合、典型的には、抗体変種を検出可能な部分で標識する。多数の標識が利用可能であり、通常、これらを以下の部類に分類することができる。
(a)35S、14C、125I、3H、および131Iなどのラジオアイソトープ;ポリペプチド変種は、例えば、Coligen, et al., Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Ed.Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs. (1991)において説明されている技術を用いてラジオアイソトープで標識することができ、放射能は、シンチレーション計数を用いて測定することができる。
(b)希土類キレート(ユーロピウムキレート)またはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリトリンおよびテキサスレッド(Texas red)などの蛍光性標識が利用可能である。蛍光性標識は、例えば、上記のCurrent Protocols in Immunologyで開示されている技術を用いて、ポリペプチド変種に結合させることができる。蛍光は、蛍光計を用いて定量することができる。
(c)様々な酵素-基質標識が利用可能であり、米国特許第4,275,149号が、これらのうちのいくつかの概要を提供している。一般に、酵素は、様々な技術によって測定することができる発色基質の化学的変化を触媒する。例えば、酵素は、基質の色の変化を触媒する場合があり、この変化を分光光度的に測定することができる。あるいは、酵素は、基質の蛍光または化学発光を変化させる場合もある。蛍光の変化を定量するための技術は前述した。化学発光性基質は、化学反応によって電子的に励起され、次いで、(例えばケミルミノメーター(chemiluminometer)を用いて)測定できる光を発し得るか、または蛍光アクセプターにエネルギーを供与する。酵素標識の例には、ルシフェラーゼ(例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ;米国特許第4,737,456号)、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRPO)のようなペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類酸化酵素(例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ)、複素環系酸化酵素(ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼなど)、ラクトペルオキシダーゼ、ならびにミクロペルオキシダーゼなどが含まれる。酵素を抗体に結合させるための技術は、O'Sullivan, et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed J.Langone & H.Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981)で説明されている。
【０２９６】
酵素-基質組合せの例には、例えば、以下のものが含まれる。
(i)西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRPO)と基質としての水素ペルオキシダーゼ。水素ペルオキシダーゼは色素前駆体(例えば、オルトフェニレンジアミン(OPD)または3,3',5,5'-テトラメチルベンジジンヒドロクロリド(TMB))を酸化する);
(ii)アルカリホスファターゼ(AP)と発色基質としてのパラ-ニトロフェニルホスファート;および
(iii)β-D-ガラクトシダーゼ(β-D-Gal)と発色基質(例えばp-ニトロフェニル-β-D-ガラクトシダーゼ)または蛍光原基質4-メチルウンベリフェリル-β-D-ガラクトシダーゼ。
【０２９７】
他の多数の酵素-基質組合せが、当業者には利用可能である。これらの一般的な概説については、米国特許第4,275,149号および同第4,318,980号を参照されたい。
【０２９８】
標識は、ポリペプチド変種と間接的に結合されることがある。当業者は、これを実現するための様々な技術を承知していると考えられる。例えば、ポリペプチド変種をビオチンと結合させることができ、前述した3つの広範な部類の標識のいずれかをアビジンと結合させることができ、逆もまた同様である。
【０２９９】
ビオチンはアビジンに選択的に結合し、したがって、この間接的な様式で、標識をポリペプチド変種と結合させることができる。あるいは、標識とポリペプチド変種の間接的結合を実現するために、ポリペプチド変種を小さなハプテン(例えばジゴキシン)と結合させ、前述した様々なタイプの標識のうちの1つを抗ハプテンポリペプチド変種(例えば抗ジゴキシン抗体)と結合させる。このようにして、標識とポリペプチド変種の間接的結合を実現することができる。
【０３００】
本発明の別の態様において、抗体変種は標識される必要がなく、その存在は、ポリペプチド変種に結合する標識抗体を用いて検出することができる。
【０３０１】
本発明の抗体変種は、競合的結合アッセイ法、直接的サンドイッチアッセイ法および間接的サンドイッチアッセイ法、ならびに免疫沈降アッセイ法など任意の公知のアッセイ法において使用され得る。Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, (1987) pp. 147-158, CRC Press, Inc.。
【０３０２】
また、抗体変種は、インビボ診断アッセイ法にも使用され得る。通常、ポリペプチド変種は、免疫シンチオグラフィー(immunoscintiography)によって抗原またはそれを発現する細胞を位置決定できるように、放射性核種(111In、99Tc、14C、131I、125I、3H、32P、または35Sなど)で標識される。前述の本発明は、理解を明確にするために、例示および例としていくらか詳しく説明してきたが、これらの説明および例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０３０３】
配列表の説明
SEQ ID NO: 1  ヒトκ軽鎖
SEQ ID NO: 2  ヒトλ軽鎖
SEQ ID NO: 3  ヒトIgG1(コーカサス人アロタイプ)
SEQ ID NO: 4  ヒトIgG1(アフリカ系アメリカ人アロタイプ)
SEQ ID NO: 5  ヒトIgG1 LALA変異体(コーカサス人アロタイプ)
SEQ ID NO: 6  ヒトIgG4
SEQ ID NO: 7  本発明による変種を作製するためのベースとなり得るκ軽鎖、λ軽鎖、IgG1、およびIgG4の例示的なヒト配列を表す、ヒトIgG4 SPLE変異体。
ヒトIgG1アロタイプの配列である配列番号3〜5において、KabatのEU指標に従うP329領域は212位に位置しているのに対し、配列番号6および7の該P329領域は209位に見出すことができる。
SEQ ID NO:8  mAb 40A746.2.3のκ軽鎖
SEQ ID NO:9  mAb 40A746.2.3の野生型IgG1の重鎖
SEQ ID NO:10  mAb 40A746.2.3のIgG1 P329Gの重鎖
SEQ ID NO:11  mAb 40A746.2.3のIgG1 LALA/P329Gの重鎖
SEQ ID NO:12  mAb 40A746.2.3のIgG4 SPLEの重鎖
SEQ ID NO:13  mAb 40A746.2.3のIgG4 SPLE/P329Gの重鎖
SEQ ID NO:14  mAb 40A746.2.3のIgG1 LALAの重鎖
【実施例】
【０３０４】
以下の7つの実施例は、本発明の方法および組成物の例である。上記に提供した一般的説明を前提として、他の様々な態様が実施され得ることが理解されよう。
【０３０５】
前述の本発明は、理解を明確にするために、例示および例としていくらか詳しく説明してきたが、これらの説明および例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用されるあらゆる特許および科学文献の開示内容は、その全体が参照により明確に組み入れられる。
【０３０６】
実施例1
抗体
後述する実験のために、CD9に対する抗体(SEQ ID 8〜14を参照されたい)、P-セレクチンに対する抗体 (WO 2005/100402で説明されている配列)、およびCD20に対する抗体(異名:GA101、EP1692182で説明されている配列)を使用した。
【０３０７】
本明細書において説明するすべての変種、例えば、セレクチン、CD9、CD20(GA101)、およびCD20 (GA101)の糖鎖を操作した結合抗体の変種P329G、P329A、P329R、SPLE、LALA、P329G/LALA、P329G/SPLE(EU命名法に従って番号付与)は、PCRに基づく変異誘発を用いて作製した。HEK-EBNA系またはHEK293(CD9 Fc変種)系においてIgG分子を発現させ、プロテインAクロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した。
【０３０８】
実施例2
免疫グロブリンに対する様々なFcγ受容体の結合親和性の測定
25℃でBiacore T100機器(GE Healthcare)を用いて、表面プラズモン共鳴(SPR)により、免疫グロブリンに対する様々なFcγRの結合親和性を測定した。
【０３０９】
BIAcore(登録商標)システムは、分子相互作用の研究のために十分に確立されている。これにより、リガンド/分析物の結合を連続的にリアルタイムでモニターすること、したがって、結合速度定数(ka)、解離速度定数(kd)、および平衡定数(KD)の決定が可能になる。屈折率の変化から、固定されたリガンドと溶液中に注入された分析物の相互作用によって引き起こされる表面の質量変化が示唆される。分子が、表面の固定されたリガンドに結合する場合、質量は増加し、解離する場合は質量が減少する。
【０３１０】
結合分子が表面を覆うように注入されるか、または表面に固定される場合、1:1相互作用であれば結果の差は認められないはずである。したがって、リガンドまたは対応する分析物の溶解性および有効性に応じて、(それぞれリガンドまたは分析物としてのFcγ受容体と共に)様々な設定値を使用した。
【０３１１】
FcγRIの場合、ポリヒスチジン配列を認識する10000レゾナンスユニット(RU)の捕捉系(ペンタHisモノクローナル抗体、Qiagen Hilden、カタログ番号34660)を、GE Healthcareによって供給されるアミンカップリングキットおよびCM5チップをpH4.5で使用することによって固定した。濃度5μg/ml、60秒パルス(pulse)、流量5μl/分で、FcγRIを捕捉した。0〜100nMの範囲の様々な濃度の抗体は、流速30μl/分、298Kで120秒間、フローセルを通過させて、結合相を記録した。解離相は、最長240秒間モニターし、試料溶液を泳動用緩衝液に切り替えることによって誘発した。流速30ml/分のグリシンpH2溶液で2分間洗浄することによって、表面を再生した。いずれの実験のためにも、GE Healthcareによって供給されるHBS-P+緩衝液を選択した(10mM HEPES、pH7.4、150mM NaCl、0.05％(v/v)サーファクタントP20)。捕捉されたFcγRIのない表面から得られる応答を引くことによって、バルク屈折率の差を補正した。また、ブランクの注射も引く(=2つの基準(double referencing))。
【０３１２】
ka/kdと定義される平衡解離定数(KD)は、いくつかの異なる濃度を用いて得られるセンサーグラム曲線を、BIAevaluationソフトウェアパッケージを用いて解析することによって決定した。データのフィッティングは、適切な結合モデルに従った。
【０３１３】
FcγRIIAおよびFcγRIIIAV158の場合、10000レゾナンスユニット(RU)の試験しようとするモノクローナル抗体を、GEによって供給されるアミンカップリングキットを用いることによってCM5チップに固定した(pH4.5、濃度10μg/ml)。
【０３１４】
0〜12800nMの範囲の様々な濃度のFcγRIIAおよびFcγRIIIAは、流速5μl/分、298Kで120秒間、フローセルを通過させて、結合相を記録した。解離相は、最長240秒間モニターし、試料溶液を泳動用緩衝液に切り替えることによって誘発した。流速30ml/分の3mM NaOH/1M NaCl溶液で0.5分間洗浄することによって、表面を再生した。いずれの実験のためにも、GE Healthcareによって供給されるHBS-P+緩衝液を選択した(10mM HEPES、pH7.4、150mM NaCl、0.05％(v/v)サーファクタントP20)。
【０３１５】
捕捉された抗体のない表面から得られる応答を引くことによって、バルク屈折率の差を補正した。また、ブランクの注射も引く(=2つの基準)。
【０３１６】
平衡解離定数(KD)は、いくつかの異なる濃度を用いて得られるセンサーグラム曲線を、BIAevaluationソフトウェアパッケージを用いて解析することによって決定した。データのフィッティングは、定常状態フィッティングを用いて、適切な結合モデルに従った。
【０３１７】
FcγRIIBの場合、ポリヒスチジン配列を認識する10000レゾナンスユニット(RU)の捕捉系(ペンタHisモノクローナル抗体、Qiagen Hilden、カタログ番号34660)を、GE Healthcareによって供給されるアミンカップリングキットおよびCM5チップをpH4.5で使用することによって固定した。濃度5μg/ml、120秒パルス(pulse)、流量5μl/分で、FcγRIIBを捕捉した。様々な抗体は、濃度1340nM、流速5μl/分、298Kで60秒間、フローセルを通過させて、結合相を記録した。解離相は、最長120秒間モニターし、試料溶液を泳動用緩衝液に切り替えることによって誘発した。流速30ml/分のグリシンpH2.5溶液で0.5分間洗浄することによって、表面を再生した。いずれの実験のためにも、GE Healthcareによって供給されるHBS-P+緩衝液を選択した(10mM HEPES、pH7.4、150mM NaCl、0.05％(v/v)サーファクタントP20)。
【０３１８】
捕捉されたFcγRIIBのない表面から得られる応答を引くことによって、バルク屈折率の差を補正した。また、ブランクの注射も引く(=2つの基準)。
【０３１９】
野生型IgG1に対するFcγRIIBの固有の親和性が非常に低いため、親和性は計算せず、定性的結合を評価した。
【０３２０】
以下の表において、Fc部分中に変異を導入することが、FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、およびFcγRIIIAV1-58への結合に与える影響(A)ならびにADCC(標的細胞なし(BLT)および標的細胞あり(ADCC)で測定)およびC1q結合に与える影響(B)をまとめて示す。
【０３２１】
【表２Ａ】
0005926791.tif 000003
【表２Ｂ】
0005926791.tif 000004
-- 野生型とは異なり強く低減している/不活性である、- 野生型とは異なり低減している、+ 野生型の相互作用に匹敵している、n.d. 検出されず/結果なし。
【０３２２】
より詳細には、以下の結果が得られた。
【０３２３】
FcγRI受容体に対する親和性
P-セレクチン、CD20抗体、およびCD9抗体のFcポリペプチド中にP329G変異、P329A変異、SPLE変異、およびLALA変異を導入し、Biacoreシステムを用いて、FcγRIに対する結合親和性を測定した。P329G変異を有する抗体は引き続きFcγR1に結合する(図1aおよび図1b)のに対し、三重変異P329G/LALAおよびP329G/SPLEそれぞれの導入の結果、結合がほぼ検出できない抗体が生じた(図1b)。LALA変異またはSPLE変異は、P329Gのみの場合よりも受容体への結合を減少させたが、P329Gと組み合わせた場合よりも減少の程度は低かった(図1aおよび図1b)。したがって、P329GとLALA変異またはSPLE変異いずれかとの組合せの方が、P329G変異または二重変異LALAもしくはSPLEのみよりはるかに効果的である。CD20 IgG1野生型抗体のkd値は4.6nMであり、同じ抗体のP329G変異体のkd値は5.7nMであったが、三重変異体P329G/LALAの場合、FcγRI受容体に対する抗体の結合がほとんど検出不可能であるため、kd値を測定することができなかった。抗体それ自体は、すなわちCD9もしくはCD20またはP-セレクチンを試験したかを問わず、結合親和性には少ししか影響しない。
【０３２４】
FcγRIIA受容体に対する親和性
CD9抗体のFcポリペプチド中にP329G変異、SPLE変異、およびLALA変異をそれぞれ導入し、Biacoreシステムを用いて、FcγRIIA-R131受容体に対する結合親和性を測定した。捕捉されたmAbが100RUに相当するように、結合レベルを標準化する。したがって、1:1化学量論の場合、約20RU以下が予想される。図1cは、Fc変種にLALA変異、SPLE/P329G変異、P329G変異、およびLALA/P329G変異を導入することによって、FcγRIIA受容体に対する結合が大きく低減することを示す。FcγR1受容体への結合とは対照的に、P329G変異のみの導入により、該受容体への結合を極めて強く、三重変異P329G/LALAとほとんど同じ程度まで、妨害することができる(図1c)。
【０３２５】
FcγRIIB受容体に対する親和性
CD9抗体およびP-セレクチン抗体のFcポリペプチド中にSPLE変異、LALA変異、SPLE/P329G変異、およびLALA/P329G変異をそれぞれ導入し、Biacoreシステムを用いて、FcγRIIB受容体に対する結合親和性を測定した。図1dは、LALA変異体および三重変異体P329G/LALA、P329G/SPLEにおいて、FcγRIIB受容体に対する結合が大きく低減していることを示す。
【０３２６】
FcγRIIIA受容体に対する親和性
CD9のFcポリペプチド中にP329G変異、LALA変異、SPLE変異、P329G/LALA変異、およびSPLE/P329G変異を導入し、Biacoreシステムを用いて、FcγRIIIA-V158受容体に対する結合親和性を測定した。P329G変異および三重変異P329G/LALAは、FcγRIIIA受容体に対する結合を最も大幅に、ほとんど検出不可能なレベルまで低減させた。P329G/SPLEもまた、結合親和性の大きな低減をもたらし、変異SPLEおよびLALAはそれぞれ、FcγRIIIA受容体に対する結合親和性を少ししか減少させなかった(図1e)。
【０３２７】
実施例3
C1Q ELISA
Fc変種を含む様々なポリペプチドのC1qに対する結合特性を、ELISAサンドイッチ型イムノアッセイ法によって解析した。各変種を、10μg/ml〜0μg/mlの間の8種類の濃度で疎水性Maxisorp 96ウェルプレートに結合させる。この結合は、抗体の複合体をシミュレートし、これはC1q分子の高親和性結合のための前提条件である。洗浄後、試料をインキュベートしてC1q結合を起こさせる。さらに洗浄した後、ポリクローナルウサギ抗hC1q抗体を用いて、結合されたC1q分子を検出する。次の洗浄段階の後に、酵素標識した抗ウサギFcγ特異的抗体を添加する。色の付いた生成物に酵素によって変換される基質を添加することによって、免疫学的反応を可視化する。測光法で測定して得られる吸光度は、調査する抗体に結合したC1qの量に比例している。変種-C1q相互作用のEC50値を算出した。発色反応に起因する吸光単位を抗体濃度に対してプロットする。最大反応の半分を示す抗体濃度が、EC50値を決定する。この測定値は、同じプレート上で測定される参照標準品に対する相対的差異として、試料および参照の変動係数と共に報告される。
【０３２８】
P-セレクチンまたはCD20抗体に導入されたP329G変異は、SPLE変異と同様に、C1qへの結合を大きく減少させた(図2)。表3では、C1q受容体への変種の結合に関して算出したEC50値を要約している。C1qは、補体活性化タンパク質に属し、膜侵襲複合体の形成をもたらす補体の古典的経路の活性化において主な役割を果たす。また、C1qは、食作用の亢進、アポトーシス細胞の排除、またはウイルスの中和などの他の免疫学的プロセスにも関与している。したがって、C1qに対する結合を減少させる本明細書において示す変異体、例えばP329GおよびSPLE、ならびに高い可能性で、前述の単一変異を含む三重変異もまた、C1qの前述の機能を大きく低減させることが予想できる。
【０３２９】
【表３】
0005926791.tif 000005
【０３３０】
実施例4
標的細胞を伴わないADCC、BLTアッセイ法
試験する抗体(CD20(GA101)およびCD9)を、適切な96平底ウェルプレートにおいて4℃で一晩、PBSでコーティングした。プレートをPBSで洗浄した後、残っている結合部位を室温で1時間、PBS/1％BSA溶液でブロックした。その間に、エフェクター細胞(低親和性または高親和性のヒトFcγRIIIを発現するようにランスフェクトされたNK-92 細胞株)を採取し、ブロッキング緩衝液を廃棄した後、100μl/ウェルのAIM V培地を入れたウェルに200000生細胞/ウェルを播種した。100μl/ウェルのサポニン緩衝液(PBS中0.5％サポニン+1％BSA)を用いて、エフェクター細胞によるエステラーゼ放出の最大量を測定した。インキュベーター中で、37℃、5％CO2で3時間、細胞をインキュベートした。3時間後、20μl/ウェルの上清を180μl/ウェルのBLT基質(0.1M Tris-HCL中0.2mM BLT+0.11mM DTNB、pH8.0)と混合し、マイクロプレートリーダーにおいて405nmでプレートを読み取る前に37℃で30分間インキュベートした。最大放出(サポニンで処理した細胞)を100％に、刺激されていない細胞(抗体でコーティングされていない)を0％放出に設定して、エステラーゼ放出率(%)を決定した。
【０３３１】
野生型CD20抗体(GA101 wt(1))は、細胞溶解活性の強い誘導を示す。LALA変種は、エステラーゼ放出の著しい減少を示すのに対し、P329G変種およびP329G/LALA変種はADCC活性をまったく示さない(図3a)。図3bは、P329の位置のGの交換だけでなく、R329へのP329の交換もまた、細胞質ゾル活性の著しい低下を招くことを示す(CD20抗体)。したがって、アルギニンは、グリシンと同様に、抗体中のプロリンサンドイッチの機能を消失させると思われる。P329G変異体に関して本明細書において観察される大きく低減したADCCは、FcγRIIA受容体およびFcγRIIIA受容体への結合が大きく減少していることに起因した可能性が高い(図1cおよび図1eを参照されたい)。
【０３３２】
実施例5
標的細胞を伴うADCC
ヒト末梢血単核球(PBMC)は、エフェクター細胞として使用し、Histopaque-1077(Sigma Diagnostics Inc., St.Louis, MO63178 USA)を用い、製造業者の取扱い説明書に基本的に従って、調製した。手短に言えば、ヘパリン処理したシリンジを用いて、ボランティアから静脈血を採取した。血液をPBS(Ca++もMg++も含有していない)で1:0.75〜1.3に希釈し、Histopaque-1077上に積み重ねた。室温(RT)、400xgで30分間、中断せずに勾配を遠心分離した。PBMCを含む中間相(interphase)を集め、PBS(2つの勾配に由来する細胞当たり50ml)で洗浄し、室温、300xgで10分間の遠心分離によって回収した。沈殿物をPBSで再懸濁した後、PBMCを計数し、室温、200xgで10分間の遠心分離によって2回目の洗浄を行った。次いで、その後の処置のために、適切な培地中に細胞を再懸濁した。ADCCアッセイ法のために使用したエフェクターと標的の比は、PBMC細胞およびNK細胞の場合、それぞれ25:1および10:1であった。丸底96ウェルプレートのウェル当たり50mlを添加するために、適切な濃度にてAIM-V培地中でエフェクター細胞を調製した。標的細胞は、10％FCSを含むDMEM中で増殖させたヒトBリンパ腫細胞(例えばRaji細胞)であった。標的細胞をPBS中で洗浄し、計数し、マイクロウェル当たり100ml中に細胞30'000個を添加するために、30万個/mlの濃度でAIM-V中に再懸濁した。抗体をAIM-V中で希釈し、予め播種した標的細胞に50mlを添加し、室温で10分間、標的に結合させた。次いで、エフェクター細胞を添加し、5％ CO2を含む加湿された環境において37℃で4時間、プレートをインキュベートした。標的細胞の殺傷は、細胞障害性検出キット(Roche Diagnostics, Rotkreuz, Switzerland)を用いて、損傷した細胞からの乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)放出を測定することによって評価した。4時間インキュベーションした後、プレートを800xgで遠心分離した。各ウェルから得た100mlの上清を、新しい透明の平底96ウェルプレートに移した。キットの着色基質緩衝液をウェル1つにつき100ml添加した。SOFTmax PROソフトウェア(Molecular Devices, Sunnyvale, CA94089, USA)を用いて、少なくとも10分間、490nmにて、ELISAリーダーで呈色反応のVmax値を測定した。自発的LDH放出は、標的細胞およびエフェクター細胞のみを含み抗体を含まないウェルにおいて測定した。標的細胞のみおよび1% Triton X-100を含むウェルにおいて、最大放出を測定した。特異的抗体に媒介された殺傷の比率(％)を次のようにして算出した:((x-SR)/(MR-SR)×100(式中、xは特定の抗体濃度におけるVmaxの平均値であり、SRは、自発的放出のVmaxの平均値であり、MRは、最大放出のVmaxの平均値である)。
【０３３３】
従来のADCCアッセイ法によって測定されるように、免疫エフェクター細胞を動員する潜在能力は、Fc変種のタイプに応じて変わる。本実験では、ヒトFcgRIIIAをトランスフェクトしたヒトNK92細胞株をエフェクターとして使用し、CD20陽性Raji細胞を標的細胞として使用した。図4aで確認できるように、グリシンがプロリンを置換する(P329G)GA101(CD20)Fc変種において、およびまた、二重変異体P329G/LALAにおいて同様の程度まで、ADCCは大きく低減している。一方、ADCCの低下は、LALA変異では程度が低かった。様々な変種をよりうまく区別するために、糖鎖を操作した型の変種も作製して、ADCC潜在能力を高めた。予想通り、親分子(GA101(CD20))が強いADCCを示すことを観察することができる。LALA型は、ADCC潜在能力がひどく弱められている。P329G変異体は、GA101(CD20)抗体のP329A変種をはるかに上回る程度、ADCCを極めて大きく低下させた(図4b)。
【０３３４】
実施例6
補体活性
標的細胞を計数し、PBSで洗浄し、100万細胞/mlの濃度でAIM-V(Invitrogen)中に再懸濁した。平底96ウェルプレートに50ml/ウェルの細胞を播種した。AIM-V中で抗体希釈物を調製し、50mlを細胞に添加した。室温で10分間、抗体を細胞に結合させた。ヒト血清補体(Quidel)を新たに解凍し、AIM-Vで3倍に希釈し、50mlをウェルに添加した。製造業者によって説明されているようにして、ウサギ補体(Cedarlane Laboratories)を調製し、AIM-Vで3倍に希釈し、50mlをウェルに添加した。対照として、アッセイ法に添加する前に、補体源を56℃で30分間加熱した。アッセイ用プレートを37℃で2時間インキュベートした。LDH放出を測定することによって、細胞の殺傷を測定した。簡単に説明すると、プレートを300×gで3分間遠心分離した。50ml/ウェルの上清を新しい96ウェルプレートに移し、細胞障害性キット(Roche)のアッセイ用試薬50mlを添加した。ELISAリーダーを用いた動力学的測定により、上清中のLDH濃度と対応するVmaxを測定した。1％ Triton X-100の存在下で細胞をインキュベートすることによって、最大放出を測定した。
【０３３５】
SUDH-L4標的細胞に対するCDCの媒介について、様々なFc変種を解析した。糖鎖を操作していないGA101分子は、CDCの明らかな誘導を示す。LALA変種は、最も高い濃度でのみ活性を示すのに対し、P329G変種およびP329G/LALA変種は、CDC活性をまったく示さない(図5a)。さらに、糖鎖を操作したGA101分子のLALA変種ならびにP329G変種およびP329A変種も、CDC活性をまったく示さない(図5b)。
【０３３６】
実施例7
ヒトIgG1の炭水化物プロファイル
Fcγ受容体への結合を抑制することを狙いとする変異をFc内に含むヒトIgG1抗体の炭水化物プロファイルを、陽イオンモードのMALDI/TOF-MSによって解析した(中性オリゴ糖)。
【０３３７】
製造業者の取扱い説明書に従ってシアリダーゼ(QA-Bio)でヒト(h)IgG1変種を処理して、末端シアル酸を除去した。続いて、以前に説明されているようにして(Ferrara, C. et al., Biotech. Bioeng. 93 (2006) 851-861)、PNGaseF(QA-Bio)消化により、hIgG1の中性オリゴ糖を遊離させた。以前に説明されているようにして(Ferrara, C. et al., Biotech. Bioeng. 93 (2006) 851-861)、陽イオンモードの質量分析法(Autoflex, Bruker Daltonics GmbH)によって、炭水化物プロファイルを解析した。
【０３３８】
ヒトIgG1の中性Fc結合グリカンの炭水化物プロファイルは、3つの主なm/zピークを特徴とする。これらのピークは、末端ガラクトース残基なし(G0)、1個(G1)、または2個(G2)を有するフコシル化複合オリゴ糖に割り当てることができる。
【０３３９】
Fc受容体への結合を抑制することを狙いとする変異をFc内に含むhIgG1の炭水化物プロファイルを解析し、野生型抗体に関して得られたプロファイルと比較した。変異(P329G、LALA、P329A、P329G/LALA)のうちの1つをFc内に含むIgG変種は、野生型抗体と似た炭水化物プロファイルを示し、Fc結合グリカンがフコシル化複合オリゴ糖である(データ不掲載)。241位、243位、263位、265位、または301位のアミノ酸をアラニンで置換することによって観察されるように、Fc内の変異は、末端ガラクトシル化および末端シアリル化のレベルに影響を及ぼし得る(Lund, J. et al., J. Immunol. 157 (1996) 4963-4969)。
【０３４０】
図6aは、本発明書において説明する様々なhIgG1 Fc変種のガラクトシル化の相対比率を示している。異なる宿主で抗体を発現させた場合、わずかな差が観察され得るが、末端ガラクトシル化の有意な差を観察することはできなかった。
【０３４１】
図6bは、4種の異なる抗体における野生型およびIgG1-P329G/LALAのガラクトシル化含有量のばらつきを示す。4種の異なるVドメインを、Hek293 EBNA細胞において発現させた場合のガラクトシル化量に関して比較した。
【０３４２】
実施例8
全血における抗体誘導性血小板凝集アッセイ法
Dynabyte製のMultiplate機器を用いた全血血小板凝集解析。最初に、正常なヒトドナーに由来する血液20mlを採取し、ヒルイジン(hiruidin)入りチューブ(Dynabyte Medical, MP0601番)に移した。ミニセルインピーダンス器具(minicell impedance device)(Dynabead MP0021番)をMultiplate機器に差し込み、アッセイ法に使用した。次いで、0.9％ NaCl 175μlをミニセルに添加した。抗体をミニセルに添加して、最終的な試験濃度を得た。次いで、ヒト血液175μlを添加し、37℃で3分間、インキュベートした。37℃でさらに6分間のインピーダンス解析を自動的に開始させた。血小板凝集の指標として曲線下面積を定量することによって、データを解析した。
【０３４３】
CD9抗体は、血小板活性化および血小板凝集を誘導することが示されている(Worthington, et al., Br.J. Hematol. 74(2) (1990) 216-222)。血小板に結合する抗体によって誘導される血小板凝集は、FcγRIIAへの結合を伴うことが以前に示されている(de Reys, et al., Blood 81 (1993) 1792-1800)。上記に示したように、CD9抗体に導入されたLALA変異、P329G変異、P329G/LALA変異、およびP329G/SPLE変異は、FcγRIIA受容体へのCD9抗体の結合を大きく低減させた(図1c)。
【０３４４】
CD9抗体によって誘導される活性化(Ca流出に基づいて測定される、データ不掲載)ならびに血小板凝集は、三重変異P329GおよびLALAを抗体に導入することによってなくなり、その結果、FcγRIIA結合が、野生型抗体と比べて大きく低減する(図7aおよび図7bを参照されたい)。マウスIgG1は、低い抗体濃度(0.1〜1μ/ml)で、血小板凝集を誘導した。より高い濃度では、血小板の過剰刺激により、凝集応答のサイレンシングが起こる(3〜30μg/ml)。chim-hu-IgG4-SPLEを用いて、ドナーの多様性を観察した。図6aでは、より高い抗体濃度でのchim-hu-IgG4-SPLE応答者のデータを示し、図6bでは、chim-hu-IgG4-SPLE非応答者のデータを示している。血液試料のどれも、抗体変種chim-hu-IgG1-LALA、chim-hu-IgG-WT-P329G、chim-hu-IgG1-LALA-P329G、chim-hu-IgG4-SPLE-P329G、chim-hu-IgG4-SPLE-N297Qによる凝集応答をまったく示さなかった。対照:未処理の血液試料における自発的凝集(バックグラウンド);ADPに誘導された血小板凝集(ADP)およびトロンビン類似体に誘導された血小板凝集(TRAP6)。アイソタイプ対照:マウスIgG1(マウスアイソタイプ)およびヒトIgG4-SPLE(hu-IgG4-SPLEアイソタイプ)。
【０３４５】
これらのデータの1つの可能な解釈は、三重変異を有するCD9抗体のFcγRIIA受容体への結合が減少しているために、これらの種類の変異体抗体を用いて観察される血小板凝集が減少している、というものである。したがって、原理的には、抗体治療の有毒な副作用としての栓球凝集を予防することが、FcγRIIA受容体への結合を低減させることができる前述の変異を抗体のFc部分中に導入することによって、可能になり得る。
【図１ａ】
0005926791.tif 000006
【図１ｂ】
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【図１ｃ】
0005926791.tif 000008
【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図２】
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【図３ａ】
0005926791.tif 000012
【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【配列表】
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