(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫原性ウイルスタンパク質をコードするプラスミドとＩＬ−２８をコードするプラスミドとを含む免疫原性組成物。
【請求項２】
前記ウイルスタンパク質が、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、単純性ヘルペスウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、西ナイルウイルス、およびＢ型肝炎ウイルスからなる群より選択されるウイルスに由来する請求項１記載の組成物。
【請求項３】
免疫原性ウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列とＩＬ−２８をコードするヌクレオチド配列とを含むプラスミドを含む免疫原性組成物。
【請求項４】
前記ウイルスタンパク質が、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、単純性ヘルペスウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、西ナイルウイルス、およびＢ型肝炎ウイルスからなる群より選択されるウイルスに由来する請求項３記載の組成物。
【請求項５】
前記ウイルスタンパク質が、インフルエンザタンパク質である請求項４記載の組成物。
【請求項６】
請求項１の組成物を含む注射用医薬組成物。
【請求項７】
個体において前記ウイルスタンパク質に対する免疫応答を誘導するための、請求項１記載の組成物。
【請求項８】
個体において前記ウイルスタンパク質に対する免疫応答を誘導するための、請求項３記載の組成物。
【請求項９】
前記ウイルスタンパク質に対する免疫応答を誘導するための、請求項２記載の組成物。
【請求項１０】
前記ウイルスタンパク質に対する免疫応答を誘導するための、請求項４記載の組成物。
【請求項１１】
前記ウイルスタンパク質に対する免疫応答を誘導するための、請求項６記載の注射用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改善されたワクチン、免疫原に対して個体を予防的及び／又は治療的に免疫化するための改善された方法及び改善された免疫治療組成物及び改善された免疫療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる２００８年４月４日に出願された米国特許仮出願第６１／０４２，６７４号に対して優先権を主張する。
【０００３】
免疫療法は、ヒトの免疫応答を調節して望ましい治療効果を付与することを指す。免疫治療薬は、個体に投与した場合、望ましくない免疫応答を伴う症状を最終的に減らす又は望ましい免疫応答を高めて最終的に症状を緩和するのに十分な個体の免疫系を調整する組成物を指す。場合によっては、免疫療法は、そのような場合、個体がそれに対して免疫応答を生じる免疫原に個体を暴露するワクチンを個体に投与し、免疫治療薬が免疫応答を高め、及び／又は特定の状態、感染又は疾患を治療する又は予防するのが望ましい免疫応答の一部（たとえば、細胞性又は液性）を選択的に向上させるワクチン接種のプロトコールの一部である。
【０００４】
参照により本明細書に組み込まれる特許文献１は、ヒトＩＬ−２８ＡとヒトＩＬ−２８Ｂの核酸配列とアミノ酸配列及びウイルス感染した個体に対するＩＬ−２８Ａ又はＩＬ−２８Ｂのタンパク質の投与を開示している。
【０００５】
参照により本明細書に組み込まれる特許文献２は、ＩＬ−２３ｐ１９に結合する抗体を開示している。抗体を含む組成物と、ＩＬ−２８を含む任意のインターロイキンタンパク質との併用での抗ＩＬ−２３ｐ１９抗体を含む、他の作用剤との併用での抗体の投与を含む使用が記載されている。
【０００６】
参照により本明細書に組み込まれる特許文献３は、ＨＣＶに感染している個体を治療するための抗ウイルス剤との併用でのＨＣＶワクチンを開示している。開示されたＨＣＶワクチンとの併用でＨＣＶに感染した個体を治療するために使用される抗ウイルス化合物のリストにＩＬ−２８タンパク質は含まれる。
【０００７】
参照により本明細書に組み込まれる特許文献４は、２つ以上の治療タンパク質をコードする核酸分子によって形質移入した癌細胞と、そのような癌細胞を個体に投与することによって癌に罹った個体を治療することを開示している。サイトカインは列記される治療タンパク質に含まれ、ＩＬ−２８はサイトカインのリストに含まれる。
【０００８】
参照により本明細書に組み込まれる特許文献５は、癌細胞標的部分と抗細胞増殖部分を含む抗癌化合物と、癌を治療する及び癌細胞の化学耐性を防ぐ又は阻止するためのそのような化合物の使用を開示している。ホルモンは、列記される癌細胞標的部分に含まれ、ＩＬ−２８はホルモンのリストに含まれる。
【０００９】
参照により本明細書に組み込まれる特許文献６は、治療タンパク質をコードする核酸分子を送達するための処方を開示している。ＩＬ−２８は、治療タンパク質として記載されたタンパク質のリストに含まれる。
【００１０】
ヒトの免疫応答を調節して改善された免疫応答を誘導する作用剤の送達によってワクチンプロトコールを改善することができる。個体がそれに対して免疫応答を生じる免疫原に個体を暴露するワクチンを個体に投与するワクチンプロトコールの一部では、免疫応答を高め、及び／又は特定の状態、感染又は疾患を治療する又は予防するのが望ましい免疫応答の一部（たとえば、細胞性又は液性）を選択的に向上させる作用剤が提供される。
【００１１】
ワクチンは、たとえば、アレルゲン、病原体抗原又はヒトの疾患に関与する細胞と関連する抗原のような標的抗原に対して個体を免疫化するのに有用である。ヒトの疾患に関与する細胞と関連する抗原には、癌関連の腫瘍抗原及び自己免疫疾患に関与する細胞に関連する抗原が挙げられる。
【００１２】
そのようなワクチンの設計において、ワクチン接種された個体の細胞において標的抗原を産生させるワクチンは免疫系の細胞性免疫を誘導することにおいて有効であることが認識されている。具体的には、弱毒生ワクチン、無毒のベクターを用いる組換えワクチン及びＤＮＡワクチンはそれぞれ、ワクチン接種された個体の細胞において抗原の産生をもたらし、結果的に免疫系の細胞性免疫の誘導を生じる。他方で、死菌ワクチン又は不活化ワクチン、及びタンパク質だけを含むサブユニットワクチンは、有効な液性応答を誘導するが、良好な細胞性の免疫応答を誘導しない。
【００１３】
病原体感染に対して防御を提供するのに、及び病原体感染、癌又は自己免疫疾患の治療のために有効な免疫介在療法を提供するのに細胞性の免疫応答が必要であることが多い。従って、ワクチン接種された個体の細胞において標的抗原を産生するワクチン、たとえば、弱毒生ワクチン、無毒のベクターを用いる組換えワクチン及びＤＮＡワクチンが好まれることが多い。
【００１４】
病原体感染又はヒトの疾患に対して予防的に又は治療上、個体を免疫化するのにそのようなワクチンが有効であることが多い一方で、改善されたワクチンに対するニーズがある。向上した免疫応答を生じる組成物及び方法に対するニーズがある。
【００１５】
同様に、一部の免疫治療薬が患者において免疫応答を調節するのに有用である一方で、改善された免疫治療薬の組成物及び方法に対するニーズが依然として存在したままである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許第７，１３５，１７０号明細書
【特許文献２】米国特許第７，４９１，３９１号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００５００３７０１８号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００６０１６５６６８号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００６０２６３３６８号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００７００６６５５２号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、組成物、ＩＬ−２８又はその機能的断片をコードする単離された核酸分子との組み合わせで免疫原をコードする単離された核酸分子に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明はさらに、組成物、免疫原とＩＬ−２８又はその機能的断片との双方をコードする単離された核酸分子に関する。
【００１９】
本発明は、ＩＬ−２８又はその機能的断片をコードする単離された核酸分子との組み合わせで免疫原をコードする単離された核酸分子を含む注射用医薬組成物に関する。
【００２０】
本発明は、免疫原とＩＬ−２８又はその機能的断片との双方をコードする単離された核酸分子を含む注射用医薬組成物に関する。
【００２１】
本発明はさらに、組成物、ＩＬ−２８又はその機能的断片をコードする単離された核酸分子との組み合わせで免疫原をコードする単離された核酸分子を個体に投与することを含む、個体において免疫原に対する免疫応答を誘導する方法に関する。
【００２２】
本発明はさらに、免疫原とＩＬ−２８又はその機能的断片をコードする核酸分子を個体に投与することを含む、個体において免疫原に対する免疫応答を誘導する方法に関する。
【００２３】
本発明はさらに、調節エレメントに操作可能に連結された免疫原をコードするヌクレオチド配列、ＩＬ−２８又はその機能的断片をコードするヌクレオチド配列を含む組換えワクチンと、個体にそのような組換えワクチンを個体に投与することを含む、個体において免疫原に対する免疫応答を誘導する方法に関する。
【００２４】
本発明はさらに、ＩＬ−２８又はその機能的断片をコードするヌクレオチド配列を含む弱毒化した生きた病原体と、弱毒化した生きた病原体を個体に投与することを含む、個体において病原体に対する免疫応答を誘導する方法に関する。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される；
（項目１）
免疫原をコードする単離された核酸分子とＩＬ−２８又はその機能的断片をコードする単離された核酸分子を含む組成物。
（項目２）
前記核酸分子がプラスミドである項目１の組成物。
（項目３）
前記免疫原が、病原体抗原、癌関連抗原、又は自己免疫疾患に関与する細胞に関連する抗原である項目１の組成物。
（項目４）
前記免疫原が、病原体抗原である項目３の組成物。
（項目５）
免疫原をコードするヌクレオチド配列とＩＬ−２８又はその機能的断片をコードするヌクレオチド配列とを含む単離された核酸分子を含む組成物。
（項目６）
前記核酸分子がプラスミドである項目５の組成物。
（項目７）
前記免疫原が、病原体抗原、癌関連抗原、又は自己免疫疾患に関与する細胞に関連する抗原である項目５の組成物。
（項目８）
前記免疫原が、病原体抗原である項目７の組成物。
（項目９）
項目１の組成物を含む注射用医薬組成物。
（項目１０）
項目１の組成物を個体に投与することを含む、前記個体において免疫原に対する免疫応答を誘導する方法。
（項目１１）
項目５の組成物を個体に投与することを含む、前記個体において免疫原に対する免疫応答を誘導する方法。
（項目１２）
調節エレメントに操作可能に連結された免疫原をコードするヌクレオチド配列と、ＩＬ−２８又はその機能的断片をコードするヌクレオチド配列とを含む組換えワクチン。
（項目１３）
前記免疫原が、病原体抗原、癌関連抗原、又は自己免疫疾患に関与する細胞に関連する抗原である項目１２の組換えワクチン。
（項目１４）
前記免疫原が、病原体抗原である項目１３の組換えワクチン。
（項目１５）
前記組換えワクチンが組換えワクシニアワクチンである項目１４の組換えワクチン。
（項目１６）
項目１２の組換えワクチンを個体に投与することを含む、前記個体において免疫原に対する免疫応答を誘導する方法。
（項目１７）
ＩＬ−２８又はその機能的断片をコードするヌクレオチド配列を含む弱毒化した生きた病原体。
（項目１８）
項目１７の弱毒化した生きた病原体を個体に投与することを含む、前記個体において病原体に対する免疫応答を誘導する方法。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＩＬ−２８の同時処理の存在下又は非存在下にてＧａｇプラスミドで免疫化したマウスと比べた場合のマウス脾細胞によるインターフェロンγの応答を測定する実験のデータを示す図である。
【図２】フローサイトメトリーを用いたＩＬ−２８処理の存在下又は非存在下での脾細胞の解析のデータを示す図である。
【図３】実施例３に記載された実験のデータを示す図である。３μｇのアカゲザルＩＬ−２８Ｂ（ｍａｃＩＬ−２８Ｂ）又は対照としての空のベクターによってＲＤ細胞に形質移入した。形質移入の４８時間後のＥＬＩＳＡによってサルＩＬ−２８Ｂの存在について上清をアッセイした。
【図４】実施例３に記載された実験のデータを示す図である。ＨＩＶＰｏｌのみをコードするプラスミドで又はサルＩＬ−２８Ｂをコードするプラスミドと組み合わせてＨＩＶＰｏｌをコードするプラスミドでアカゲザルを２回免疫化した。ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔによってアッセイした場合、ｍａｃＩＬ−２８Ｂの添加によって、抗原特異的免疫応答が約３倍高まった。
【図５】免疫スケジュール及びプラスミドマップを示す図である。図５Ａは、アジュバントの有無にて複数クレードＨＩＶＧａｇ構築物で０日目と１４日目にマウスを免疫化し、次いで、各免疫後、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）適合定電流装置を用いた電気穿孔法を行ったことを示す。２１日目にマウスを屠殺し、リンパ球を単離して分析した。図５Ｂは、マウスのＩＬ−２８ＢとＩＬ−１２の構築物のプラスミドマップを示す。
【図６】試験管内でのマウスＩＬ−１２とマウスＩＬ−２８Ｂの発現と分泌を示す図である。図６Ａは、形質移入後４８時間でのＨＥＫ２９３Ｔ細胞溶解物からのマウスＩＬ−１２ｐ４０とマウスＩＬ−２８のタンパク質についてのウエスタンブロットのデータを示す。模擬形質移入細胞には空のｐＶＡＸベクターを与えた。図６Ｂは、形質移入した細胞の上清への活性のあるＩＬ−１２ｐ３５／ｐ４０へテロダイマー及びＩＬ−２８タンパク質の分泌を示すＥＬＩＳＡのデータを示す。
【図７Ａ】単離した脾細胞のＨＩＶＧａｇ特異的なＩＦＮγ及びＩＬ−４のＥＬＩＳｐｏｔを示す図である。図７Ａは、単離した脾細胞で実施した使用抗原特異的なＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔによって測定したＴｈ１応答の誘導に対するサイトカインアジュバントの効果を示す。ＥＬＩＳｐｏｔは、ＩＬ−１２をアジュバントとして又はＩＬ−２８Ｂをアジュバント（ｎ＝４）として与えたマウスから回収された脾細胞で実施し、ＩＦＮγスポット形成単位（ＳＦＵ）を数えた。図７Ｂは、同様にＩＬ−４ＥＬＩＳｐｏｔにて測定したＴｈ２応答の誘導に対するサイトカインアジュバントの効果を示す。
【図７Ｂ】単離した脾細胞のＨＩＶＧａｇ特異的なＩＦＮγ及びＩＬ−４のＥＬＩＳｐｏｔを示す図である。図７Ａは、単離した脾細胞で実施した使用抗原特異的なＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔによって測定したＴｈ１応答の誘導に対するサイトカインアジュバントの効果を示す。ＥＬＩＳｐｏｔは、ＩＬ−１２をアジュバントとして又はＩＬ−２８Ｂをアジュバント（ｎ＝４）として与えたマウスから回収された脾細胞で実施し、ＩＦＮγスポット形成単位（ＳＦＵ）を数えた。図７Ｂは、同様にＩＬ−４ＥＬＩＳｐｏｔにて測定したＴｈ２応答の誘導に対するサイトカインアジュバントの効果を示す。
【図８】ワクチン接種した動物の血清におけるＨＩＶＧａｇ特異的なＩｇＧを示す図である。免疫後１週間でのＨＩＶＧａｇ特異的な抗体の存在について対照（ｐＶＡＸ）の血清又は免疫化した動物（ｎ＝４）の血清をアッセイした（図８Ａは総ＩｇＧを示し、図８ＢはＩｇＧ１を示し、図８ＣはＩｇＧ２ａを示す）。
【図９Ａ】免疫の間の制御性Ｔ細胞とＴＧＦβ分泌の差次的誘導を示す図である。全群（ｎ＝４）から単離した脾細胞で制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋／ＣＤ２５ｈｉ／ＦｏｘＰ３＋）の存在をフローサイトメトリーによってアッセイした（図９Ａ）。フローサイトメトリーの解析は、ＴＲｅｇ集団での差異を示すが、これらの細胞からのサイトカインの分泌の分析はＴＧＦβの放出での差異を示す（図９Ｂ）。ｐ値は、Ｇａｇ４Ｙのみでワクチン接種したマウスとＧａｇ４ＹプラスＩＬ−１２又はＩＬ−２８Ｂでワクチン接種したマウスの間での比較を反映する。
【図９Ｂ】免疫の間の制御性Ｔ細胞とＴＧＦβ分泌の差次的誘導を示す図である。全群（ｎ＝４）から単離した脾細胞で制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋／ＣＤ２５ｈｉ／ＦｏｘＰ３＋）の存在をフローサイトメトリーによってアッセイした（図９Ａ）。フローサイトメトリーの解析は、ＴＲｅｇ集団での差異を示すが、これらの細胞からのサイトカインの分泌の分析はＴＧＦβの放出での差異を示す（図９Ｂ）。ｐ値は、Ｇａｇ４Ｙのみでワクチン接種したマウスとＧａｇ４ＹプラスＩＬ−１２又はＩＬ−２８Ｂでワクチン接種したマウスの間での比較を反映する。
【図１０Ａ】ＣＤ８＋Ｔ細胞集団、顆粒性及び脱顆粒における変化を示す図である。ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋／ＣＤ８＋）の比率は、脾臓及び腸間膜のリンパ球にてフローサイトメトリーによって評価した（図１０Ａ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるパーフォリンの抗原特異的誘導は、非刺激細胞（ＮＰ）のＨＩＶＧａｇペプチド（ペプチド）で刺激した細胞との比較によって解析した。単一実験の結果を示し（図１０Ｂ）、全実験の平均をグラフにする（図１０Ｃ）。抗原特異的な細胞溶解性の脱顆粒は、ＣＤ１０７ａに対する抗体の存在下でのペプチドによる刺激、次いでフローサイトメトリーを用いた解析によって測定した（図１０Ｃ）。ｐ値は、Ｇａｇ４Ｙのみでワクチン接種したマウスとＧａｇ４ＹプラスＩＬ−１２又はＩＬ−２８Ｂでワクチン接種したマウスの間での比較を反映する。
【図１０Ｂ】ＣＤ８＋Ｔ細胞集団、顆粒性及び脱顆粒における変化を示す図である。ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋／ＣＤ８＋）の比率は、脾臓及び腸間膜のリンパ球にてフローサイトメトリーによって評価した（図１０Ａ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるパーフォリンの抗原特異的誘導は、非刺激細胞（ＮＰ）のＨＩＶＧａｇペプチド（ペプチド）で刺激した細胞との比較によって解析した。単一実験の結果を示し（図１０Ｂ）、全実験の平均をグラフにする（図１０Ｃ）。抗原特異的な細胞溶解性の脱顆粒は、ＣＤ１０７ａに対する抗体の存在下でのペプチドによる刺激、次いでフローサイトメトリーを用いた解析によって測定した（図１０Ｃ）。ｐ値は、Ｇａｇ４Ｙのみでワクチン接種したマウスとＧａｇ４ＹプラスＩＬ−１２又はＩＬ−２８Ｂでワクチン接種したマウスの間での比較を反映する。
【図１０Ｃ】ＣＤ８＋Ｔ細胞集団、顆粒性及び脱顆粒における変化を示す図である。ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋／ＣＤ８＋）の比率は、脾臓及び腸間膜のリンパ球にてフローサイトメトリーによって評価した（図１０Ａ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるパーフォリンの抗原特異的誘導は、非刺激細胞（ＮＰ）のＨＩＶＧａｇペプチド（ペプチド）で刺激した細胞との比較によって解析した。単一実験の結果を示し（図１０Ｂ）、全実験の平均をグラフにする（図１０Ｃ）。抗原特異的な細胞溶解性の脱顆粒は、ＣＤ１０７ａに対する抗体の存在下でのペプチドによる刺激、次いでフローサイトメトリーを用いた解析によって測定した（図１０Ｃ）。ｐ値は、Ｇａｇ４Ｙのみでワクチン接種したマウスとＧａｇ４ＹプラスＩＬ−１２又はＩＬ−２８Ｂでワクチン接種したマウスの間での比較を反映する。
【図１１Ａ】致死的インフルエンザ抗原投与における死からの保護を示す図である。図１１Ａは、単離した脾細胞で実施した使用抗原特異的なＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔによって測定したＴｈ１応答の誘導に対するＩＬ−１２及びＩＬ−２８の効果を示す。図１１Ｂは、アジュバントの有無にてインフルエンザＮＰ構築物で０日目と１４日目にマウス（ｎ＝８）を免疫化し、次いで各免疫後、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）適合定電流装置を用いた電気穿孔法を行った実験のデータを示す。４２日目に、Ｈ１Ｎ１インフルエンザ株であるＡ／ＰＲ／８／３４の１０ＬＤ５０による鼻内抗原投与をマウスに行った。インフルエンザ感染に伴う死亡率を１４日の経過にわたって追跡した（図１１Ｂ）。
【図１１Ｂ】致死的インフルエンザ抗原投与における死からの保護を示す図である。図１１Ａは、単離した脾細胞で実施した使用抗原特異的なＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔによって測定したＴｈ１応答の誘導に対するＩＬ−１２及びＩＬ−２８の効果を示す。図１１Ｂは、アジュバントの有無にてインフルエンザＮＰ構築物で０日目と１４日目にマウス（ｎ＝８）を免疫化し、次いで各免疫後、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）適合定電流装置を用いた電気穿孔法を行った実験のデータを示す。４２日目に、Ｈ１Ｎ１インフルエンザ株であるＡ／ＰＲ／８／３４の１０ＬＤ５０による鼻内抗原投与をマウスに行った。インフルエンザ感染に伴う死亡率を１４日の経過にわたって追跡した（図１１Ｂ）。
【図１１Ｃ】致死的インフルエンザ抗原投与における死からの保護を示す図である。図１１Ａは、単離した脾細胞で実施した使用抗原特異的なＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔによって測定したＴｈ１応答の誘導に対するＩＬ−１２及びＩＬ−２８の効果を示す。図１１Ｂは、アジュバントの有無にてインフルエンザＮＰ構築物で０日目と１４日目にマウス（ｎ＝８）を免疫化し、次いで各免疫後、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）適合定電流装置を用いた電気穿孔法を行った実験のデータを示す。４２日目に、Ｈ１Ｎ１インフルエンザ株であるＡ／ＰＲ／８／３４の１０ＬＤ５０による鼻内抗原投与をマウスに行った。インフルエンザ感染に伴う死亡率を１４日の経過にわたって追跡した（図１１Ｂ）。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本明細書で使用されるとき、用語「ＩＬ−２８」は、その様々な変異体を含むが、たとえば、限定はされないが、ＩＬ−２８Ａ、ＩＬ−２８Ｂ及びＩＬ−２８Ｃなどのインターフェロンラムダであるインターロイキン２８タンパク質を指す。
【００２７】
本明細書で使用されるとき、「機能的断片」は、免疫原と併せて送達された場合、断片なしで免疫原が送達される際に誘導される免疫に比べて高い免疫応答を提供するＩＬ−２８の断片を指すことを意味する。断片は一般に１０以上のアミノ酸の長さである。
【００２８】
本明細書で使用されるとき、「標的タンパク質」は、免疫応答について標的タンパク質として作用する本発明の遺伝子構築物によってコードされたペプチド及びタンパク質を指すことを意味する。用語「標的タンパク質」と「免疫原」は交換可能に使用され、それに対して免疫応答を誘発することができるタンパク質を指す。標的タンパク質は、それに対する免疫応答が所望される、病原体又は癌細胞のような望ましくない細胞型又は自己免疫疾患に関与する細胞に由来するタンパク質と少なくともエピトープを１つ共有する免疫原性のタンパク質である。標的タンパク質に向けられた免疫応答は、標的タンパク質が関係する特定の感染又は疾患に対して個体を保護し、及び／又はそれについて個体を治療するであろう。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、たとえば、ウイルスタンパク質又はその断片のような病原体抗原である。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ＨＣＶに由来するウイルスタンパク質又はその断片である。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ＨＣＶ以外のウイルスに由来するウイルスタンパク質又はその断片である。
【００２９】
本明細書で使用されるとき、用語「遺伝子構築物」は、標的タンパク質又は免疫調節タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ又はＲＮＡの分子を指す。コーディング配列は、核酸が投与される個体の細胞にて発現を導くことが可能であるプロモータ及びポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに操作可能に連結された開始シグナルと終止シグナルを含む。
【００３０】
本明細書で使用されるとき、用語「発現可能な形態」は、個体の細胞に存在する場合、コーディング配列が発現されるように、標的タンパク質又は免疫調節タンパク質をコードするコーディング配列に操作可能に連結された必要な調節エレメントを含有する遺伝子構築物を指す。
【００３１】
本明細書で使用されるとき、用語「エピトープを共有すること」は、もう１つのタンパク質のエピトープと同一である又は実質的に類似する少なくとも１つのエピトープを含むタンパク質を指す。
【００３２】
本明細書で使用されるとき、用語「実質的に類似のエピトープ」は、タンパク質のエピトープとは同一ではないが、それにもかかわらず、そのタンパク質と交差反応する細胞性の又は液性の免疫応答を引き起こす構造を有するエピトープを指すことを意味する。
【００３３】
本明細書で使用されるとき、用語「細胞内の病原体」は、その生殖サイクル又は生命サイクルの少なくとも一部が宿主細胞内に存在し、その中で病原体タンパク質を産生する又はその産生の原因となるウイルス又は病原性生物を指すことを意味する。
【００３４】
本明細書で使用されるとき、用語「過剰増殖性疾患」は、細胞の過剰増殖を特徴とする疾患又は障害を指すことを意味する。
【００３５】
本明細書で使用されるとき、用語「過剰増殖関連性タンパク質」は、過剰増殖性疾患に関連するタンパク質を指すことを意味する。
【００３６】
本発明は、ワクチンの一部として送達されると、ＩＬ−２８及びその機能的断片、及びその組み合わせをコードする核酸分子は免疫応答を調節するという発見から生じている。従って、ＩＬ−２８及びその機能的断片、及びその組み合わせをコードする核酸分子は、ワクチンの成分と組み合わせて又はワクチンの成分として免疫治療薬として送達されてもよい。
【００３７】
ＩＬ−２８タンパク質及びそのようなタンパク質をコードする分子は、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，１３５，１７０号及び同第７，１５７，５５９号に開示されている。さらに米国特許第６，９２７，０４０号及び同第７，０３８，０３２号をそれぞれ参照によって本明細書に組み入れる。インターフェロン様タンパク質Ｚｃｙｔｏ２１，  Ｋｏｔｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４（１）：６９−７７，  ２００３及びＳｈｅｐｐａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４（１）：６３−６８，  ２００３も参照によって本明細書に組み入れる。
【００３８】
ヒトＩＬ−２８Ａのタンパク質配列についてのＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＮＰ＿７４２１５０及びＡＡＲ２４５１０であり、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
ヒトＩＬ−２８Ｂのタンパク質配列についてのＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＮＰ＿７４２１５１及びＡＡＲ２４５０９であり、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる
ヒトＩＬ−２８Ｃのタンパク質配列についてのＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＡＡＱ０１５６１であり、参照により本明細書に組み込まれる。
参照により本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ受入番号Ｑ８ＩＺＪ０は、インターロイキン−２８Ａ前駆体（ＩＬ−２８Ａ）（インターフェロンラムダ−２）（ＩＦＮ−ラムダ−２）（サイトカインＺＣＹＴＯ２０）を指す。
参照により本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ受入番号Ｑ８ＩＺＩ９は、インターロイキン−２８Ｂ前駆体（ＩＬ−２８Ｂ）（インターフェロンラムダ−３）（ＩＦＮ−ラムダ−３）（インターフェロンラムダ−４）（ＩＦＮ−ラムダ−４）（サイトカインＺＣＹＴＯ２２）を指す。
参照により本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＮＭ＿１７３０６５は、ホモサピエンスのインターロイキン２８受容体アルファ（インターフェロンラムダ受容体）（ＩＬ２８ＲＡ）、転写変異体３ｍＲＮＡを指す。
参照により本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＮＭ＿１７２１３８は、ホモサピエンスのインターロイキン２８Ａ（インターフェロンラムダ２）（ＩＬ２８Ａ）、ｍＲＮＡを指す。
参照により本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＮＭ＿１７２１３９は、ホモサピエンスのインターロイキン２８Ｂ（インターフェロンラムダ３）（ＩＬ２８Ｂ）、ｍＲＮＡを指す。
参照により本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＡＹ１２９１５３は、ホモサピエンスのインターロイキン２８受容体Ａスプライス変異体３（ＩＬ２８ＲＡ）完全ｃｄｓを指し；選択的にスプライスされた。
参照により本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＡＹ１２９１５２は、ホモサピエンスのインターロイキン２８受容体Ａスプライス変異体２（ＩＬ２８ＲＡ）完全ｃｄｓを指し；選択的にスプライスされた。
参照により本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＡＹ１２９１５１は、ホモサピエンスのインターロイキン２８受容体Ａ（ＩＬ２８ＲＡ）ｍＲＮＡ完全ｃｄｓを指し；選択的にスプライスされた。
参照により本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＡＹ１２９１４９は、ホモサピエンスのインターロイキン２８Ｂ（ＩＬ２８Ｂ）完全ｃｄｓを指す。
参照により本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＡＹ１２９１４８は、ホモサピエンスのインターロイキン２８Ａ（ＩＬ２８Ａ）完全ｃｄｓを指す。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＩＬ−２８又はその機能的断片をコードする核酸配列、及び免疫原をコードする核酸配列との組み合わせの個体への送達は、免疫原に対する免疫応答を高める。転写因子をコードする核酸分子が個体の細胞に取り込まれると、ＩＬ−２８又はその機能的断片、及び免疫原をコードするヌクレオチド配列が細胞内で発現され、それによってタンパク質が個体に送達される。本発明の態様は、単一の核酸分子でタンパク質のコーディング配列を送達する方法、異なった核酸分子でタンパク質のコーディング配列を送達する方法並びに組換えワクチンとして及び弱毒化ワクチンの一部としてタンパク質のコーディング配列を送達する方法を提供する。
【００４０】
本発明の一部の態様によれば、病原体又は異常な疾患関連の細胞に対して個体を予防的及び／又は治療的免疫化する組成物及び方法が提供される。ワクチンは、たとえば、弱毒生ワクチン、組換えワクチン又は核酸若しくはＤＮＡのワクチンのようなワクチンのいずれの種類であってもよい。ＩＬ−２８又はその機能的断片をコードする核酸分子を送達することによって、ワクチンで誘導された免疫応答が調節されうる。たとえば、プラスミド又は組換えベクター若しくは弱毒化病原体若しくは細胞のゲノムの一部として発現可能な核酸分子を送達する際、ＩＬ−２８は特に有用である。感染していない又は疾患に罹っていない個体にて防御的な免疫応答を誘導するために予防的に送達される際、ＩＬ−２８は特に有用である。ＩＬ−２８ＢはＩＬ−２８の特に有用な形態である。ヒトにおいて防御的な免疫応答を誘導するのに送達される際、ＩＬ−２８は特に有用である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２８をコードする核酸分子は無細胞組成物で送達される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２８をコードする核酸分子は、癌細胞を含まない組成物で送達される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２８又はＩＬ−２８をコードする核酸分子が他のサイトカインなしで投与される。いくつかの実施形態では、その中に組み込まれる又はそれに連結される非ＩＬ−２８配列なしでＩＬ−２８又はＩＬ−２８をコードする核酸分子が提供される。
【００４１】
免疫調節タンパク質をコードする単離されたｃＤＮＡは、免疫調節タンパク質を産生することができる構築物の構築において出発物質として有用である。常法及び容易に入手できる出発物質を用いて、免疫調節タンパク質をコードする核酸分子を調製してもよい。
【００４２】
本発明は、免疫調節タンパク質を送達するための組成物及びその使用方法に関する。本発明の態様は、調節エレメントに操作可能に連結された免疫原をコードするヌクレオチド配列との組み合わせで、調節エレメントに操作可能に連結されたＩＬ−２８又はその機能的断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。本発明の態様は、調節エレメントに操作可能に連結された免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子との組み合わせで、調節エレメントに操作可能に連結されたＩＬ−２８又はその機能的断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子含む組成物に関する。本発明はさらに、そのような核酸分子を含む注射用医薬組成物に関する。
【００４３】
ＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも言う）、組換えアデノウイルスのような組換えベクター、組換えアデノウイルス関連のウイルス及び組換えワクシニアウイルスを含む幾つかの周知の技術のいずれかを用いて核酸分子を送達してもよい。
【００４４】
ＤＮＡワクチンは、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，７３９，１１８号、同第５，８１７，６３７号、同第５，８３０，８７６号、同第５，９６２，４２８号、同第５，９８１，５０５号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号、同第５，６７６，５９４及びその中で引用された優先出願に記載されている。これらの出願に記載された送達プロトコールに加えて、ＤＮＡを送達する代替方法は、双方共参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，９４５，０５０号及び同第５，０３６，００６に記載されている。
【００４５】
投与の経路には、筋肉内、鼻内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内、動脈内、眼内、及び口腔、並びに局所、経皮での投与、吸入又は座薬による投与又は粘膜組織への投与、たとえば、膣、直腸、尿道、頬内又は舌下の組織に対する洗浄による投与が挙げられるが、これらに限定されない。投与の好ましい経路には、粘膜への投与、筋肉内、腹腔内、皮内及び皮下への注射が挙げられる。従来の注射、針の無い注射用具又は「微量発射衝撃遺伝子銃」を含むが、これらには限定されない手段によって遺伝子構築物を投与してもよい。
【００４６】
投与の別の経路には、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，２７３，５２５号、同第５，４３９，４４０号、同第５，７０２，３５９号、同第５，８１０，７６２号、同第５，９９３，４３４号、同第６，０１４，５８４号、同第６，０５５，４５３号、同第６，０６８，６５０号、同第６，１１０，１６１号、同第６，１２０，４９３号、同第６，１３５，９９０号、同第６，１８１，９６４号、同第６，２１６，０３４号、同第６，２３３，４８２号、同第６，２４１，７０１号、同第６，３４７，２４７号、同第６，４１８，３４１号、同第６，４５１，００２号、同第６，５１６，２２３号、同第６，５６７，６９４号、同第６，５６９，１４９号、同第６，６１０，０４４号、同第６，６５４，６３６号、同第６，６７８，５５６号、同第６，６９７，６６９号、同第６，７６３，２６４号、同第６，７７８，８５３号、同第６，８６５，４１６号、同第６，９３９，８６２号及び同第６，９５８，０６０に記載されたような遺伝子構築物を送達するための電気穿孔法の使用が関与する。
【００４７】
ＤＮＡワクチンの送達を円滑にするために好まれる電気穿孔装置及び電気穿孔法の例には、その内容物が全体として参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉ，らによる米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈらによって出願された米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載されたものが挙げられる。全てその全体が本明細書に組み入れられる、２００６年１０月１７日に出願された米国特許仮出願、出願番号６０／８５２，１４９及び２００７年１０月１０日に出願された同出願番号６０／９７８．９８２に対して３５ＵＳＣ１１９（ｅ）のもとで利益を主張する２００７年１０月１７日に出願された同時係属、同時所有の米国特許仮出願、出願番号１１／８７４０７２で提供されたＤＮＡワクチンの送達を円滑にするための電気穿孔装置及び電気穿孔法も好まれる。
【００４８】
以下は電気穿孔技術を用いた実施形態の例であり、上記で議論した特許参考文献でさらに詳細に議論される：電気穿孔装置は、ユーザーによって入力された前もって設定された電流に類似する定電流を生じるエネルギーのパルスを哺乳類の所望の組織に送達するように構成される。電気穿孔装置は、電気穿孔構成要素と電極アセンブリ又は取っ手アセンブリを備える。電気穿孔構成要素は、コントローラ、電流波形発生器、インピーダンステスター、波形自動記録器、入力要素、状態報告要素、連通ポート、記憶構成要素、電源及び電源スイッチを含む電気穿孔装置の１つ以上の種々の要素を含み、組み入れることができる。電気穿孔構成要素は、電気穿孔装置の１要素として機能することができ、ほかの要素は電気穿孔構成要素と連通して別々の要素（又は構成要素）である。実施形態の１つでは、電気穿孔構成要素は、電気穿孔装置の１を超える要素として機能することができ、電気穿孔構成要素と分かれた電気穿孔装置のさらにほかの要素と連通することができる。要素は１つの装置として又は互いに連通した別の要素として機能することができるので、１つの電気機械的又は機械的な装置の一部として存在する電気穿孔装置の要素によってＣＤ２８構築物を送達するための電気穿孔技術の使用は限定されない。電気穿孔構成要素は、所望の組織で定電流を生じるエネルギーのパルスを送達することが可能であり、フィードバック機構を含む。電極アセンブリは、空間的配置で複数の電極を有する電極アレイを含み、その際、電極アセンブリは、電気穿孔構成要素からエネルギーのパルスを受け取り、電極を介してそれを所望の組織に送達する。複数の電極の少なくとも１つはエネルギーのパルスの送達の間、中性であり、所望の組織でインピーダンスを測定し、インピーダンスを電気穿孔構成要素に伝える。フィードバック機構はインピーダンスを受け取り、電気穿孔構成要素から送達されたエネルギーのパルスを調整して定電流を維持することができる。
【００４９】
いくつかの実施形態では、複数の電極が分散化パターンでエネルギーのパルスを送達する。いくつかの実施形態では、複数の電極は、プログラムされた順序のもとで電極の制御を介して分散化パターンでエネルギーのパルスを送達し、プログラムされた順序はユーザーによって電気穿孔構成要素に入力される。いくつかの実施形態では、プログラムされた順序は順序で送達される複数のパルスを含み、その際、複数のパルスの各パルスは、一方がインピーダンスを測定する中性電極である少なくとも２つの活性電極によって送達され、複数のパルスの次のパルスは、一方がインピーダンスを測定する中性電極である少なくとも２つの活性電極の別の１つによって送達される。
【００５０】
いくつかの実施形態では、フィードバック機構は、ハードウエア又はソフトウエアのいずれかによって実行される。好ましくは、フィードバック機構は、アナログの閉鎖ループ回路によって実行される。好ましくは、このフィードバックは、５０μｓ、２０μｓ、１０μｓ又は１μｓ毎に生じるが、好ましくはリアルタイムフィードバック又は瞬時フィードバック（すなわち、応答時間を測定するために利用可能な技法によって測定される実質的に瞬時の）である。いくつかの実施形態では、中性電極が所望の組織でインピーダンスを測定し、フィードバック機構にインピーダンスを伝え、フィードバック機構はインピーダンスに応答し、事前に設定した電流に類似する値で定電流を維持するようにエネルギーのパルスを調整する。いくつかの実施形態では、フィードバック機構は、エネルギーのパルスを送達する間、連続的に及び瞬時的に定電流を維持する。
【００５１】
細胞に取り込まれると、遺伝子構築物は、機能する染色体外分子として細胞内に存在したままでありうる。ＤＮＡを細胞に導入してもよいが、その際、それはプラスミド（単数）又はプラスミド（複数）の形態で一時的な基準のもとで存在する。或いは、ＲＮＡを細胞に投与してもよい。セントロメア、テロメア及び複製開始点を含む線状のミニ染色体としての遺伝子構築物を提供することが熟考される。遺伝子構築物は、対象に投与される弱毒化した生きた微生物又は組換え微生物ベクターにおける遺伝物質の一部を構成してもよい。遺伝子構築物は、遺伝物質が染色体外のままである組換えウイルスワクチンのゲノムの一部であってもよい。遺伝子構築物は、核酸分子の遺伝子発現に必要な調節エレメントを含む。エレメントには、プロモータ、開始コドン、停止コドン及びポリアデニル化シグナルが挙げられる。さらに、標的タンパク質又は免疫調節タンパク質をコードする配列の遺伝子発現にはエンハンサが必要とされることが多い。これらのエレメントは所望のタンパク質をコードする配列に操作可能に連結され、それらが投与される個体にて調節エレメントが操作可能であることが必要である。
【００５２】
開始コドンと停止コドンは一般に所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部であるとみなされる。しかしながら、これらの要素は、遺伝子構築物が投与される個体にて機能的であることが必要である。開始コドンと終止コドンはコーディング配列と共にインフレームでなければならない。
【００５３】
プロモータ及びポリアデニル化シグナルは個体の細胞内で機能的でなければならない。
【００５４】
本発明を実践するのに、特にヒトのための遺伝子ワクチンの製造にて有用なプロモータの例には、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のプロモータ、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）のプロモータ、ヒト免疫不全ウイルス（ＭＶ）、たとえば、ＢＩＶロングターミナルリピート（ＬＴＲ）のプロモータ、モレニーウイルス、ＡＬＶ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、たとえば、ＣＭＶ前初期プロモータ、エプステイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）に由来するプロモータ、並びにヒトの遺伝子、たとえば、ヒトのアクチン、ヒトのミオシン、ヒトのヘモグロビン、ヒトの筋肉クレアチン及びヒトのメタロチオネインのようなヒト遺伝子に由来するプロモータが挙げられるが、こられに限定されない。
【００５５】
本発明を実践するのに、特にヒトのための遺伝子ワクチンの製造にて有用なポリアデニル化シグナルの例には、ＳＶ４０のポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化（ｂｇｈ−ポリＡ）シグナル、及びＬＴＲのポリアデニル化シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。特に、ｐＣＥＰ４プラスミド（カリフォルニア州、サンディエゴのインビトロゲン）中のＳＶ４０のポリアデニル化シグナルがＳＶ４０ポリアデニル化シグナルと呼ばれ、使用される。
【００５６】
ＤＮＡの発現に必要とされる調節エレメントに加えて、ほかのエレメントもＤＮＡ分子に包含されてもよい。そのような追加のエレメントにはエンハンサが挙げられる。エンハンサは、ヒトのアクチン、ヒトのミオシン、ヒトのヘモグロビン、ヒトの筋肉クレアチンのエンハンサ、及びたとえば、ＣＭＶ、ＲＳＶ及びＥＢＶに由来するもののようなウイルスのエンハンサを含むが、これらに限定されない群から選択されてもよい。
【００５７】
構築物を染色体外で維持し、細胞内で複数コピーの構築物を産生するために遺伝子構築物に哺乳類の複製開始点を設けることができる。インビトロゲン（カリフォルニア州、サンディエゴ）のプラスミドｐＶＡＸ１、ｐＣＥＰ４及びｐＲＥＰ４は、エプステイン・バーウイルスの複製開始点と、統合しないで高いコピーのエピソーム複製を生じる核抗原ＥＢＮＡ−１のコーディング領域を含有する。
【００５８】
免疫応用に関する一部の好ましい実施形態では、標的タンパク質、免疫調節タンパク質、さらに、そのような標的タンパク質に対する免疫応答をさらに高めるタンパク質の遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が送達される。そのような遺伝子の例は、そのほかのサイトカイン及びケモカイン、たとえば、アルファ−インターフェロン、ガンマ−インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、及びシグナル配列を欠損し、任意でＩｇＥのシグナルペプチドを含むＩＬ−１５を含むＩＬ−１５をコードするものである。
【００５９】
方法で使用される組成物は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２００３０１７６３７８号に相当する米国特許出願、出願番号１０／１３９，４２３に示されたような、１つ以上の以下のタンパク質及び／又はそのようなタンパク質をコードする核酸分子をさらに含んでもよい：主要組織適合複合体クラスＩ抗原又は主要組織適合複合体クラスＩＩ抗原を含む主要組織適合複合体抗原；Ａｐｏ−１、Ｆａｓ、ＴＮＦＲ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２及びＤＲ６を含むが、これらに限定されない死のドメイン受容体；死のシグナル、すなわち、ＦＡＤＤ、ＦＡＰ−１、ＴＲＡＤＤ、ＲＩＰ、ＦＬＩＣＥ及びＲＡＩＤＤを含むが、これらに限定されない死のドメイン受容体と相互作用するタンパク質；又は、ＦＡＳ−Ｌ及びＴＮＦを含むが、これらに限定されない死のドメイン受容体に結合し、アポトーシスを開始するリガンドを含む死のシグナル；並びにＦＡＤＤ、ＭＯＲＴ１及びＭｙＤ８８を含むが、これらに限定されない死のドメイン受容体と相互作用するメディエータ；たとえば、昆虫及び蛇の毒、Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎｅｕｓの内毒素のような細菌の内毒素、シグナル鎖毒素を含むリシン、及びゲロニンのようなタンパク質を不活化する二本鎖リボソームに限定されない細胞を殺傷するタンパク質を含む毒素。
【００６０】
方法で使用される組成物は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２００７００４１９４１号に相当する米国特許出願、出願番号１０／５６０，６５０に示されたような、１つ以上の以下のタンパク質及び／又はそのようなタンパク質をコードする核酸分子をさらに含んでもよい：たとえば、ＩＬ−１５タンパク質配列に連結されたＩｇＥのシグナルペプチドを含む融合タンパク質のようなＩＬ−１５タンパク質配列に連結された非ＩＬ−１５シグナルペプチドを含む融合タンパク質を含むＩＬ−１５、ＣＤ４０Ｌ、ＴＲＡＩＬ；ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、Ｆ４６１８１１又はＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＣＤ３０、ＣＤ１５３（ＣＤ３０Ｌ）、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、ＮＩＫ、ＳＡＰＫ、ＳＡＰ１、ＪＮＫ２、ＪＮＫ１Ｂ２、ＪＮＫ１Ｂ１、ＪＮＫ２Ｂ２、ＪＮＫ２Ｂ１、ＪＮＫ１Ａ２、ＪＮＫ２Ａ１、ＪＮＫ３Ａ１、ＪＮＫ３Ａ２、ＮＦ−カッパＢ２、ｐ４９スプライス形態、ＮＦ−カッパＢ２、ｐ１００スプライス形態、ＮＦ−カッパＢ２、ｐ１０５スプライス形態、ＮＦ−カッパＢ５０Ｋ鎖前駆体、ＮＦκＢｐ５０、ヒトＩＬ−１アルファ、ヒトＩＬ−２、ヒトＩＬ−４、マウスＩＬ−４、ヒトＩＬ−５、ヒトＩＬ−１０、ヒトＩＬ−１５、ヒトＩＬ−１８、ヒトＴＮＦアルファ、ヒトＴＮＦベータ、ヒトインターロイキン１２、ＭａｄＣＡＭ−１、ＮＧＦＩＬ−７、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ−Ｒ、Ｆａｓ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−４、ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−３、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−１、ＰＥＣＡＭ、Ｐ１５０．９５、Ｍａｃ−１、ＬＦＡ−１、ＣＤ３４、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１アルファ、Ｅ−セレクトン、ＣＤ２、ＭＣＰ−１、Ｌ−セレクトン、Ｐ−セレクトン、ＦＬＴ、Ａｐｏ−１、Ｆａｓ、ＴＮＦＲ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４（ＴＲＡＩＬ）、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、ＩＣＥ、ＶＬＡ−１及びＣＤ８６（Ｂ７．２）。
【００６１】
方法で使用される組成物は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２００７１０１４６８６号に相当する米国特許出願、出願番号１０／５６０，６５３に示されたような、１つ以上の以下のタンパク質及び／又はそのようなタンパク質をコードする核酸分子をさらに含んでもよい：Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ，不活性ＮＩＫ、ＳＡＰＫ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１及びＴＡＰ２。
【００６２】
何らかの理由で遺伝子構築物を受け取った細胞を排除することが望ましいのであれば、細胞破壊について標的として役立つ追加のエレメントを添加してもよい。発現可能な形態でのヘルペスチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子をその遺伝子構築物に含めることができる。薬剤ガングシクロビルを個体に投与することができ、その薬剤はｔｋを産生する任意の細胞を選択的に殺傷する原因となるので、遺伝子構築物による細胞の選択的破壊の手段を提供する。
【００６３】
タンパク質の産生を最大化するために、構築物が投与される細胞での遺伝子発現に上手く適合する調節性配列を選択してもよい。さらに、細胞内で最も効率的に転写されるコドンを選択してもよい。当業者は、細胞内で機能的であるＤＮＡ構築物を製造することができる。
【００６４】
いくつかの実施形態では、ＩｇＥのシグナルペプチドに連結された、本明細書で記載される免疫調節タンパク質のためのコーディング配列を製造するために遺伝子構築物が提供されてもよい。
【００６５】
本発明の方法の１つは、筋肉内に、鼻内に、腹腔内に、皮下に、皮内に、若しくは局所に、又は吸入、膣、直腸、尿道、頬内及び舌下から成る群から選択される粘膜組織への洗浄によって核酸分子を投与する工程を含む。
【００６６】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド機能エンハンサ又は遺伝子ワクチン促進剤の投与と併せて核酸分子が細胞に送達される。ポリヌクレオチド機能エンハンサは、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，９６２，４２８号に記載されている。遺伝子ワクチン促進剤は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７３９，１１８号に記載されている。核酸分子と併せて投与される同時作用剤は、核酸分子との混合物として投与されてもよいし、又は核酸分子の投与の前後に別々に、同時に投与されてもよい。さらに、形質移入剤及び／又は複製剤及び／又は炎症剤の役目を行い、ポリヌクレオチド機能エンハンサと同時に投与されてもよいそのほかの作用剤には、増殖因子、サイトカイン及びケモカイン、たとえば、アルファ−インターフェロン、ガンマ−インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２及びＩＬ−１５、並びに線維芽細胞増殖因子、表面活性剤、たとえば、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、モノホスホリル脂質Ａ（ＷＬ）を含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、及びスクワレン及びスクワレンのような小胞が挙げられ、ヒアルロン酸を使用してもよく、遺伝子構築物と併せて投与されてもよい。いくつかの実施形態では、免疫調節タンパク質をポリヌクレオチド機能エンハンサとして使用してもよい。いくつかの実施形態では、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）と関連して核酸分子が提供されて送達／取り込みを高める。
【００６７】
本発明に係る医薬組成物は、約１ナノグラム〜約２０００マイクログラムのＤＮＡを含む。一部の好ましい実施形態では、本発明に係る医薬組成物は、約５ナノグラム〜約１０００マイクログラムのＤＮＡを含む。一部の好ましい実施形態では、医薬組成物は、約１０ナノグラム〜約８００マイクログラムのＤＮＡを含有する。一部の好ましい実施形態では、医薬組成物は、約０．１〜約５００マイクログラムのＤＮＡを含有する。一部の好ましい実施形態では、医薬組成物は、約１〜約３５０マイクログラムのＤＮＡを含有する。一部の好ましい実施形態では、医薬組成物は、約２５〜約２５０マイクログラムのＤＮＡを含有する。一部の好ましい実施形態では、医薬組成物は、約１００〜約２００マイクログラムのＤＮＡを含有する。
【００６８】
本発明に係る医薬組成物は、使用される投与の方式に従って処方される。医薬組成物が注射用医薬組成物である場合、それは無菌で、発熱物質を含まず、粒子を含まない。等張の処方が好ましく使用される。一般に、等張性のための添加剤には、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール及びラクトースが挙げられる。場合によっては、リン酸緩衝生理食塩水のような等張溶液が好まれる。安定剤にはゼラチン及びアルブミンが挙げられる。いくつかの実施形態では、処方に血管収縮剤が添加される。
【００６９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、免疫原とＩＬ−２８又はその機能的断片の組み合わせを個体に送達することによって免疫原に対する免疫応答を誘導する方法が提供される。ワクチンは、弱毒生ワクチン、組換えワクチン又は核酸若しくはＤＮＡのワクチンであってもよい。
【００７０】
本発明は、標的タンパク質、すなわち、病原体、アレルゲン又は個体自身の「異常な」細胞と特異的に関連するタンパク質に対する高い免疫応答を引き出すのに有用である。本発明は、病原体タンパク質に対する免疫応答が病原体に対する保護的免疫を提供するように病原性の作用物質及び生物に対して個体を免疫化するのに有用である。本発明は、過剰増殖細胞と特異的に関連する標的タンパク質に対する免疫応答を引き出すことによって癌のような過剰増殖性の疾患及び障害と闘うのに有用である。本発明は、自己免疫状態に関与する細胞と特異的に関連する標的タンパク質に対する免疫応答を引き出すことによって自己免疫性の疾患及び障害と闘うのに有用である。
【００７１】
本発明の一部の態様によれば、標的タンパク質及び免疫調節タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡは、それが発現される個体の組織の細胞内に導入されるので、コードされたタンパク質を産生する。標的タンパク質及び免疫調節タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡの配列は、個体の細胞での発現に必要な調節エレメントに連結される。ＤＮＡ発現のための調節エレメントにはプロモータ及びポリアデニル化シグナルが挙げられる。さらに、そのほかのエレメント、たとえば、コザック領域も遺伝子構築物に含めてもよい。
【００７２】
いくつかの実施形態では、標的タンパク質をコードする発現可能な形態の配列及び免疫調節タンパク質をコードする発現可能な形態の配列が、個体に送達される同一の核酸分子に見い出される。
【００７３】
いくつかの実施形態では、標的タンパク質をコードする発現可能な形態の配列は、免疫調節タンパク質をコードする発現可能な形態の配列とは別の核酸分子に存在する。いくつかの実施形態では、標的タンパク質をコードする発現可能な形態の配列と１つ以上の免疫調節タンパク質をコードする発現可能な形態の配列は、免疫調節タンパク質をコードする特定の発現可能な形態の配列を含有する核酸分子とは別である１つの核酸分子に存在する。本発明に従って複数の異なった核酸分子を製造し、送達することができる。
【００７４】
核酸分子は、プラスミドＤＮＡ，組換えベクターの核酸分子、又は弱毒ワクチンで提供される遺伝物質の一部として提供されてもよい。或いは、いくつかの実施形態では、標的タンパク質及び免疫調節タンパク質は、それらをコードする核酸分子に加えたタンパク質として、又はそれらをコードする核酸分子の代わりのタンパク質として送達されてもよい。
【００７５】
遺伝子構築物は、遺伝子発現に必要とされる調節エレメントと操作可能に連結された、標的タンパク質又は免疫調節タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。本発明によれば、標的タンパク質をコードする発現可能な形態のヌクレオチド配列を含む１つの構築物と、免疫調節タンパク質をコードする発現可能な形態のヌクレオチド配列を含む１つの構築物を含む遺伝子構築物の組み合わせが提供される。遺伝子構築物の組み合わせを含むＤＮＡ又はＲＮＡの分子の生細胞への送達によって結果的に、ＤＮＡ又はＲＮＡの発現並びに標的タンパク質及び１つ以上の免疫調節タンパク質の産生を生じる。標的タンパク質に対する高められた免疫応答が結果的に生じる。
【００７６】
本発明は、たとえば、ウイルス、原核生物及び病原性真核生物、たとえば、単細胞病原性生物及び多細胞寄生虫のような病原体に対して個体を免疫化するのに使用してもよい。本発明は、細胞に感染し、ウイルスや、淋病菌、リステリア菌及び赤痢菌のような原核生物のように内包されない病原体に対して個体を免疫化するのに特に有用である。さらに、本発明はまた、それらが細胞内病原体である生命サイクルの段階を含む原虫病原体に対して個体を免疫化するのにも有用である。表１は、本発明に係るワクチンを製作できるウイルスの科及び属の一部の一覧を提供する。表に列記される抗原のような病原性抗原で示されるエピトープと一致する又は実質的に類似する少なくとも１つのエピトープを含むペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物はワクチンにおいて有用である。さらに、本発明はまた、たとえば、表２に列記されるような原核生物病原体及び真核原虫病原体並びに多細胞寄生虫を含むそのほかの病原体に対して個体を免疫化するのにも有用である。
【００７７】
表
表１：ウイルス
ピコルナウイルス科
属
リノウイルス：（医学）感冒の約５０％の症例に関与
エテロウイルス：（医学）ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス及びヒトのエンテロウイルス、たとえな、Ａ型肝炎ウイルスを含む
アプソウイルス：（獣医学）これらは口蹄疫のウイルスである
標的抗原：ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、ＶＰＧ
カルシウイルス科
属
ウイルスのノーウォーク群：（医学）これらのウイルスは流行性胃腸炎の重要な原因因子である。
トガウイルス科
属
アルファウイルス：（医学及び獣医学）例には、シンドビスウイルス、ロスリバーウイルス及び東西ベネズエラのウマ脳炎ウイルスが挙げられる。
レオウイルス：（医学）ルベラウイルス
フラリビリダエ科
例には、（医学）デング熱、黄熱病、日本脳炎、セントルイス脳炎及びダニ媒介性脳炎のウイルスが挙げられる。西ナイルウイルス（ＧＥＮＢＡＮＫ：ＮＣ００１５６３、ＡＦ５３３５４０、ＡＦ４０４７５７、ＡＦ４０４７５６、ＡＦ４０４７５５、ＡＦ４０４７５４、ＡＦ４０４７５３、ＡＦ４８１８６４、Ｍ１２２９４、ＡＦ３１７２０３、ＡＦ１９６８３５、ＡＦ２６０９６９、ＡＦ２６０９６８、ＡＦ２６０９６７、ＡＦ２０６５１８及びＡＦ２０２５４１）
代表的な標的抗原：Ｅ  ＮＳ５  Ｃ
Ｃ型肝炎ウイルス（医学）このウイルスは科には入れられえていないが、トガウイルス又はフラビウイルスのいずれかであると考えられる。類似性のほとんどはトガウイルス科にある。
コロナウイルス科（医学及び獣医学）
感染性気管支炎ウイルス（家禽）
ブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ブタ）
ブタ血球凝集性脳脊髄炎（ブタ）
ネコ感染性腹膜炎（ネコ）
ネコ腸コロナウイルス（ネコ）
イヌコロナウイルス（イヌ）
ＳＡＲＳ関連コロナウイルス
ヒト呼吸器コロナウイルスは感冒の約４０％の原因であるＥＸ．２２４Ｅ，ＯＣ４３．注：コロナウイルスは非Ａ，非Ｂ、又は非Ｃ型の肝炎の原因となりうる。
標的抗原：Ｅｌ−Ｍとも呼ばれる、又はマトリクスタンパク質Ｅ２−Ｓとも呼ばれる、又はスパイクタンパク質Ｅ３−ＢＥとも呼ばれる、又は血液凝集−エルテロース糖タンパク質（すべてのコロナウイルスに存在するわけではない）、Ｎ−ヌクレオカプシド
ラブドウイルス科
属
ベシクロウイルス、リサウイルス：（医学及び獣医学）狂犬病
標的抗原：Ｇタンパク質、Ｎタンパク質
フィロビリダエ科（医学）
出血熱ウイルス、たとえば、マルブルグウイルス及びエボラウイルス
パラミクソウイルス科
属
パラミクソウイルス：（医学及び獣医学）ムンプスウイルス、ニューキャッスル病ウイルス（ニワトリにおける重要な病原体）
モルビリウイルス：（医学及び獣医学）麻疹、イヌジステンパー
ニューモウイルス：（医学及び獣医学）呼吸器シンシチウムウイルス
オルソミクソウイルス科：（医学）インフルエンザウイルス
バンヤウイルス科
属
バンヤウイルス：（医学）カリフォルニア脳炎、ラクロス
フレボウイルス：（医学）リフトバレー熱
ハンタウイルス：プレマラはヘマハギン熱ウイルスである
ナイルウイルス（獣医学）ナイロビヒツジ病
割り振られないバンガウイルス多数
アレナウイルス科（医学）ＬＣＭ、ラッサ熱ウイルス
レオウイルス科
属
レオウイルス：ヒトの病原体の可能性あり
ロタウイルス：ニワトリにおける急性胃腸炎
オルビウイルス：（医学及び獣医学）コロラドダニ熱
レボンボ（ヒト）ウマ脳炎、青い舌
レトロウイルス科
亜科
オンコリウイルス：（獣医学）（医学）ネコ白血病ウイルス、ＨＴＬＶＩ及びＨＴＬＶＩＩ
レンチウイルス：（医学及び獣医学）ＨＩＶ、ネコ免疫不全ウイルス、ウマ感染、貧血ウイルス
スプマウイルスパポバウイルス科
亜科
ポリマウイルス：（医学）ＢＫＵ及びＪＣＵウイルス
亜科
パピローマウイルス：（医学）癌及び乳頭腫の悪性進行に関連する多数のウイルス型
アデノウイルス：（医学）ＥＸＡＤ７、ＡＲＤ、Ｏ．Ｂ呼吸器疾患の原因となる−２７５のような一部のアデノウイルスは腸炎の原因となる
パルボウイルス科（獣医学）
ネコパルボウイルスはネコ腸炎の原因となる
ネコ汎白血球減少症ウイルス
イヌパルボウイルス
ヘルペスウイルス科
亜科
アルファへヘルペスウイルス亜科
属
単純性ウイルス（医学）
ＨＳＶＩ（ＧＥＮＢＡＮＫ  Ｘ１４１１２、ＮＣ００１８０６）
ＨＳＶＩＩ（ＮＣ００１７９８）
バリセラゾスター（医学、獣医学）
偽狂犬病
バリセラゾスター
亜科
ベータヘルペスウイルス亜科
属
サイトメガロウイルス（医学）
ＨＣＭＶ
ムロメガロウイルス
亜科
ガンマヘルペスウイルス亜科
属
リンホクリプトウイルス（医学）
ＥＢＶ−（バーキットリンパ腫）
ポックスウイルス科
亜科
コルドポックスウイルス亜科（医学−獣医学）
属
バリオラ（スモールポックス）
ワクシニア（カウポックス）
パラポックスウイルス−獣医学
アウイポックスウイルス−獣医学
カプリポックスウイルス
レポリポックスウイルス
スイポックスウイルス
亜科
エンテモポックスウイルス亜科
ヘパドナウイルス科
Ｂ型肝炎ウイルス
未分類のデルタ型肝炎ウイルス
【００７８】
表２
細菌性病原体
病原性のグラム陽性の球菌には、肺炎球菌、ブドウ球菌及び連鎖球菌が挙げられる
病原性のグラム陰性球菌には、髄膜炎球菌及び淋病球菌が挙げられる。
病原性の腸のグラム陰性桿菌には、腸内細菌、シュードモナス、アシネトバクター及びエイケネラ、メリオイドシス；サルモネラ；シゲロシス；ヘモフィルス；カンクロイド；ブルセロシス；ツラレミア；エルシニア（パステウレラ）；ストレプトバチルス・モルチリフォルミス及びスプリラム；リステリア・モノサイトジーン；エリシペロトリクス・ルシオパチエ；ジフテリア、コレラ、炭疽菌；ドノバノシス（鼡径部肉芽腫）及びバルトネロシスが挙げられる。
病原性嫌気性細菌には、破傷風；ボツリヌス；そのほかのクロストリジウム；結核；ハンセン氏病の細菌、及びそのほかのマイクロ細菌が挙げられる。
病原性のスピロヘータ疾患には、梅毒；トレポネーマ症；イチゴ腫、ピンタ及び風土性梅毒；及びレプトスピラ症が挙げられる。
高等な病原性細菌及び病原性真菌によって引き起こされるそのほかの感染症には、放線菌症、ノカルジア症、クリプトコッカス症、分芽菌症、ヒストプラスマ症及びコクシジオイデス症；カンジダ症；アスペルギルス症；及びムコール菌症；スポロトリクム症；パラコクシジオイデス症；ペトリエリジオシス症；トルロプシス症；足菌腫及びクロモミコーシス；及び皮膚糸状菌症が挙げられる。
リケッチャ感染にはリケッチャ病及びリケッチャ症が挙げられる。
マイコプラズマ及びクラミジア感染の例には、マイコプラズマ性肺炎、鼠径リンパ肉芽腫症、オウム病、及び周産期クラミジア感染が挙げられる。
病原性真核生物
病原性原虫と蠕虫及びそれによる感染症には、アメーバ症；マラリア；リーシュマニア症；トリパノゾーマ症；トキソプラズマ症；カリニ肺炎；ピロプラスマ症；ランブル鞭毛虫症；旋毛虫症；フィラリア症；住血吸虫症；線虫；吸虫又は吸虫類；及び多節条虫類（サナダムシ）の感染が挙げられる。
【００７９】
病原体感染に対して防御する遺伝子ワクチンを製造するために、それに対して防御的免疫応答を搭載することができる免疫原タンパク質をコードする遺伝物質を、標的についてのコーディング配列として遺伝子構築物に含めなければならない。ＤＮＡ及びＲＮＡは双方共相対的に小さく、相対的に容易に製造できるので、本発明は複数の病原性抗原によるワクチン接種を可能にするという追加の利点を提供する。遺伝子ワクチンに使用される遺伝子構築物は、多数の病原性抗原をコードする遺伝物質を含むことができる。たとえば、幾つかのウイルス遺伝子が単一の構築物に包含され、それによって複数の標的を提供してもよい。
【００８０】
表１及び表２は、そのために遺伝子ワクチンを調製し、それによって感染から個体を保護することができる病原性の因子及び生物の一部のリストを包含する。一部の好ましい実施形態では、病原体に対して個体を免疫化する方法は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純性ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）、又はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に向けられる。
【００８１】
本発明の別の態様は、過剰増殖性疾患で特徴的である過剰増殖する細胞に対する防御的免疫応答を付与する方法、及び過剰増殖性疾患に罹っている個体を治療する方法を提供する。過剰増殖性疾患の例には、癌及び乾癬のあらゆる形態が挙げられる。
【００８２】
免疫原性の「過剰増殖する細胞」に関連するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物の個体の細胞への導入が結果的に個体のワクチン接種した細胞でそのタンパク質の産生を生じることが発見されている。過剰増殖性疾患に対して免疫化するには、過剰増殖性疾患に関連するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を個体に投与する。
【００８３】
過剰増殖に関連するタンパク質を有効な免疫原性標的にするために、それは、正常な細胞に比べて過剰増殖性の細胞で排他的に又は高いレベルで産生されるタンパク質でなければならない。標的抗原には、そのようなタンパク質、そのようなタンパク質に見い出される少なくとも１つのエピトープを含むその断片及びペプチドが挙げられる。場合によっては、過剰増殖に関連するタンパク質は、タンパク質をコードする遺伝子の突然変異の産物である。変異させたタンパク質は、結果的に正常のタンパク質に見られない異なったエピトープを生じるわずかに異なるアミノ酸配列を有することを除いて正常のタンパク質とほとんど同一のタンパク質をコードする。そのような標的タンパク質には、たとえば、ｍｙｂ、ｍｙｃ、ｆｙｎのような癌遺伝子、及び転座遺伝子、ｂｃｒ／ａｂｌ、ｒａｓ、ｓｒｃ、Ｐ５３、ｎｅｕ、ｔｒｋ及びＥＧＲＦによってコードされるタンパク質であるものが挙げられる。標的抗原としての癌遺伝子産物に加えて、抗癌治療及び防御的療法のための標的タンパク質には、Ｂ細胞リンパ腫によって作られる抗体の可変領域及びＴ細胞リンパ腫のＴ細胞受容体の可変領域が挙げられ、いくつかの実施形態では、自己免疫疾患のための標的抗原も使用される。そのほかの腫瘍関連のタンパク質、たとえば、モノクローナル抗体１７−ＩＡによって認識されるタンパク質及び葉酸塩結合タンパク質又はＰＳＡを含む腫瘍細胞にて高レベルで見い出されるタンパク質を標的抗原として使用することができる。
【００８４】
本発明は、癌の１つ以上の幾つかの形態に対して個体を免疫化するのに用いてもよい一方で、本発明は、特定の癌を発症する素因を有する又は癌に罹った後、再発に感受性である個体を予防的に免疫化するのに特に有用である。疫学と同様に遺伝学及び技術の進展によって個体における癌の発症についての確率の判定やリスク評価が可能になっている。遺伝的スクリーニング及び／又は家族病歴を用いて、癌の幾つかの形態のいずれか１つを発症する、特定個体が有する確率を予測することが可能である。
【００８５】
同様に、すでに癌を発症している及び治療して癌を除去し、又は寛解に入っている個体は特に、再発及び再発生に敏感である。治療計画の一環として、再発と闘うために、彼らが有していたと診断された癌に対してそのような個体を免疫化することができる。従って、個体がある種の癌を有しており、再発のリスクにあることがいったん分かれば、癌の今後の出現と闘うようにその免疫系を準備するために個体を免疫化することができる。
【００８６】
本発明は、過剰増殖性疾患に罹っている個体を治療する方法を提供する。そのような方法では、遺伝子構築物の導入が免疫治療薬として役立ち、標的タンパク質を産生する過剰増殖性細胞と闘うように個体の免疫系を導き、推進する。
【００８７】
癌を治療する又は予防することにおいて、細胞を含まない実施形態は特に有用である。
【００８８】
本発明は、自己免疫を誘導する細胞の受容体及び「自己」に向けられた抗体を産生する細胞に関連する標的に対する幅広い保護的免疫応答を付与することによって自己免疫疾患及びその障害に罹っている個体を治療する方法を提供する。
【００８９】
Ｔ細胞が介在する自己免疫疾患には、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シューグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、血管炎、ヴェグナー肉芽腫症、クローン病及び潰瘍性大腸炎が挙げられる。疾患のそれぞれは、内因性抗原に結合するＴ細胞受容体を特徴とし、自己免疫疾患に関連する炎症性カスケードを開始する。Ｔ細胞の可変領域に対するワクチン接種はＣＴＬを始めとする免疫応答を引き出し、これらのＴ細胞を排除する。
【００９０】
ＲＡでは、疾患に関与するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の幾つかの特異的な可変領域が性状分析されている。これらのＴＣＲには、Ｖベータ−３、Ｖベータ−１４、２０Ｖベータ−１７及びＶａ−１７が挙げられる。従って、これらのタンパク質の少なくとも１つをコードするＤＮＡ構築物によるワクチン接種は、ＲＡに関与するＴ細胞を標的とする免疫応答を引き出すであろう。それぞれ参照により本明細書に組み込まれるＨｏｗｅｌｌ，  Ｍ．  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：１０９２１−１０９２５；  Ｐｉｌｉａｒｄ，  Ｘ．，  ｅｔ  ａｌ，  １９９１  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：３２５−３２９；  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｗ．  Ｖ．，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２  Ｊ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９０：３２６−３３３を参照のこと。ＭＳでは、疾患に関与するＴＣＲの幾つかの特異的な可変領域が性状分析されている。これらのＴＣＲには、ＶｆＰ及びＶａ−１０が挙げられる。従って、これらのタンパク質の少なくとも１つをコードするＤＮＡ構築物によるワクチン接種は、ＭＳに関与するＴ細胞を標的とする免疫応答を引き出すであろう。それぞれ参照により本明細書に組み込まれるＷｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｇ，  Ｋ．  Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：１０１６−１０１９；  Ｏｋｓｅｎｂｅｒｇ，  Ｊ．  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ，  １９９０  Ｎａｔｕｒｅ  ３４５：３４４−３４６を参照のこと。
【００９１】
強皮症では、疾患に関与するＴＣＲの幾つかの特異的な可変領域が性状分析されている。これらのＴＣＲには、Ｖベータ−６、Ｖベータ−８、Ｖベータ−１４及びＶａ−１６、Ｖａ−３Ｃ、Ｖａ−７、Ｖａ−１４、Ｖａ−１５、Ｖａ−１６、Ｖａ−２８及びＶａ−１２が挙げられる。従って、これらのタンパク質の少なくとも１つをコードするＤＮＡ構築物によるワクチン接種は、強皮症に関与するＴ細胞を標的とする免疫応答を引き出すであろう。
【００９２】
Ｔ細胞が介在する自己免疫疾患、特にＴＣＲの可変領域が未だに性状分析される必要があるものに罹っている患者を治療するために、滑液生検を実施することができる。存在するＴ細胞の試料を取り、常法を用いてそれらＴＣＲの可変領域を特定することができる。この情報を用いて遺伝子ワクチンを調製することができる。
【００９３】
Ｂ細胞が介在する自己免疫疾患には、ループス（ＳＬＥ）、グレーブ病、重症筋無力症、自己免疫性出血性貧血、自己免疫性血小板減少症、喘息、クリオグロブリン血症、原発性胆汁性硬化症及び悪性貧血が挙げられる。これら疾患のそれぞれは、内因性抗原に結合する抗体を特徴とし、自己免疫疾患に関連する炎症性カスケードを開始する。抗体の可変領域に対するワクチン接種は、ＣＴＬを始めとする免疫応答を引き出し、抗体を産生するそれらＢ細胞を排除するであろう。
【００９４】
Ｂ細胞が介在する自己免疫疾患に罹っている患者を治療するために、自己免疫活性に関与する抗体の可変領域を特定しなければならない。生検を実施し、炎症部位に存在する抗体の試料を採取することができる。常法を用いて、それら抗体の可変領域を特定することができる。この情報を用いて遺伝子ワクチンを調製することができる。
【００９５】
ＳＬＥの場合、抗原の１つはＤＮＡであると考えられる。従って、ＳＬＥに対して免疫される患者では、抗ＤＮＡ抗体についてその血清をスクリーニングし、血清で見つけられたそのような抗ＤＮＡ抗体の可変領域をコードするＤＮＡ構築物を含むワクチンを調製することができる。
【００９６】
ＴＣＲ及び抗体の可変領域の共通する構造的特徴は周知である。特定のＴＣＲ又は抗体をコードするＤＮＡ配列は一般に、参照により本明細書に組み込まれるＫａｂａｔら（１９８７年）の免疫学的に関心のあるタンパク質の配列（メリーランド州、ベセスダの米国保健社会福祉省）に記載されたもののような以下の周知の方法に見い出すことができる。さらに、抗体から機能的な可変領域をクローニングする一般的な方法は、参照により本明細書に組み込まれるＣｈａｕｄｈａｒｙ，  Ｖ．  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ，  １９９０  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：１０６６に見い出すことができる。
【００９７】
遺伝子ワクチンを改善する配列をコードする免疫調節タンパク質の発現可能な形態を使用することに加えて、本発明は、改善された弱毒生ワクチン及び抗原をコードする異種遺伝子を送達するための組換えベクターを使用する改善されたワクチンに関する。弱毒生ワクチンと、異種抗原を送達するための組換えベクターを使用するものの例は、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，７２２，８４８号、同第５，０１７，４８７号、同第５，０７７，０４４号、同第５，１１０，５８７号、同第５，１１２，７４９号、同第５，１７４，９９３号、同第５，２２３，４２４号、同第５，２２５，３３６号、同第５，２４０，７０３号、同第５，２４２，８２９号、同第５，２９４，４４１号、同第５，２９４，５４８号、同第５，３１０，６６８号、同第５，３８７，７４４号、同第５，３８９，３６８号、同第５，４２４，０６５号、同第５，４５１，４９９号、同第５，４５３，３６４号、同第５，４６２，７３４号、同第５，４７０，７３４号、及び同第５，４８２，７１３に記載されている。ＩＬ−２８又はその機能的断片をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を提供するが、その際、ヌクレオチド配列は、発現を達成するようにワクチンで機能することができる調節性配列に操作可能に連結される。遺伝子構築物が弱毒生ワクチン及び組換えワクチンに組み入れられ、本発明に係る改善されたワクチンを産生する。
【００９８】
本発明は、ＤＮＡワクチン、弱毒生ワクチン及び組換えワクチンを含むワクチン組成物の一部として個体の細胞に遺伝子構築物を送達する工程を含む個体を免疫化する改善された方法を提供する。遺伝子構築物は、ＩＬ−２８又はその機能的断片をコードし、発現を達成するようにワクチンで機能することができる調節性配列に操作可能に連結されるヌクレオチド配列を含む。改善されたワクチンは結果として高い細胞性の免疫応答を生じる。
【実施例】
【００９９】
実施例１
ＩＬ−２８はインターフェロンの最新のクラス、インターフェロンラムダの一員であり、ＩＬ−２８ＲアルファとＩＬ−１０Ｒベータから構成されるヘテロダイマーの受容体を有する。ＩＬ−１０Ｒベータ鎖はＩＬ−１０受容体の一部でもあるので、標的受容体へのＩＬ−１０の結合の阻止を期待してワクチン接種試験にＩＬ−２８を採用した。
【０１００】
プラスミドＨＩＶＧａｇ構築物と一緒にプラスミドＩＬ−２８を含むことは、プラスミドがＧａｇプラスミドのみである組成物で免疫化したマウスに比べると、マウスの脾細胞のインターフェロンガンマの応答を有意に増強した。空のベクター（ｐＶＡＸ）、複数クレードＨＩＶＧａｇ構築物（ＨＩＶＧａｇ−クエン酸ナトリウムとブピバカイン水溶液３０μＬ中１０μｇのプラスミドＨＩＶＧａｇ）又はＩＬ−２８プラスミドを伴ったＨＩＶＧａｇ構築物（ＨＩＶＧａｇＩＬ−２８−クエン酸ナトリウムとブピバカイン水溶液３０μＬ中プラスミドＨＩＶＧａｇＤＮＡ１０μｇ＋プラスミドＩＬ−２８ＤＮＡ５μｇ）によってマウスを免疫化した。図１のデータに示すように、ＩＬ−２８は、ＨＩＶＧａｇのみに比べて７倍を超えてＥＬＩＳｐｏｔの数を増やした。
【０１０１】
また驚くべきことに、フローサイトメトリーを用いた脾細胞の解析は、ＩＬ−２８が脾臓のＣＤ８Ｔ細胞を増やすことを示唆した。上記のようにマウスを免疫化し、フローサイトメトリーによってＣＤ８Ｔ細胞の比率を解析した。図２のデータに示すように、ＩＬ−２８の添加は、ｐＶＡＸのみで免疫化したマウスを４．７２％超えてＣＤ８Ｔ細胞の比率を高め、それは、ＣＤ８全体の約２０％の増加を説明する。ＨＩＶＧａｇ構築物のみで免疫化したマウスは、ｐＶＡＸのマウスを０．４８％超えるのみの増加を示したにすぎず、それはＣＤ８全体の約２％の増加を説明する（白棒はｐＶＡＸ対照を超えたＣＤ８の％増加を示す）。
【０１０２】
従って、ワクチン接種にアジュバントとしてインターフェロンを用いる以前の試みが期待はずれの結果を有した一方で、本明細書の結果はＩＬ−２８がワクチン接種、特にＤＮＡワクチンの接種で有効なアジュバントであることを示している。
【０１０３】
実施例２
１）ＨＩＶＧａｇ構築物（ＨＩＶＧａｇ−クエン酸ナトリウムとブピバカイン水溶液３０μＬ中１０μｇのプラスミドＨＩＶＧａｇ）、又は２）ＩＬ−２８プラスミドを伴ったＨＩＶＧａｇ構築物（ＨＩＶＧａｇＩＬ−２８−クエン酸ナトリウムとブピバカイン水溶液３０μＬ中プラスミドＨＩＶＧａｇＤＮＡ１０μｇ＋プラスミドＩＬ−２８ＤＮＡ３μｇ）、又は３）ＩＬ−２８タンパク質を伴ったＨＩＶＧａｇ構築物（ＨＩＶＧａｇ−クエン酸ナトリウムとブピバカイン水溶液３０μＬ中１０μｇのプラスミドＨＩＶＧａｇプラス４０ｎｇのＩＬ−２８タンパク質）、又は４）インターフェロンγタンパク質を伴ったＨＩＶＧａｇ構築物（ＨＩＶＧａｇ−クエン酸ナトリウムとブピバカイン水溶液３０μＬ中１０μｇのプラスミドＨＩＶＧａｇプラス４０ｎｇのインターフェロンγタンパク質）によってマウスを免疫化した。
【０１０４】
ＥＬＩＳｐｏｔを用いて、プラスミドＩＬ−２８を与えたマウスは、ＨＩＶＧａｇのみと比べて高い抗Ｇａｇ免疫応答を示した。ＩＬ−２８タンパク質もインターフェロンγタンパク質もＨＩＶＧａｇのみと比べて抗Ｇａｇ免疫応答を高めなかった。
【０１０５】
実施例３
ＩＬ−２８Ｂ（ＩＦＮλ３）はＤＮＡワクチン接種のマウスでの試験で強力なアジュバントとして使用されると示唆されたが、抗原特異的な免疫応答を増強することに関するその有効性は大きな動物、たとえば、非ヒト霊長類では研究されていない。我々は、コドンとＲＮＡを最適化させたアカゲザルＩＬ−２８Ｂを、この動物での免疫アジュバントとしてＨＩＶ抗原に対するワクチン接種試験で調べることを望んだ。この方法におけるアジュバントプラスミドの最適化は、コードされた遺伝子の発現を高め、得られたＲＮＡの構造を安定化させるだけでなく、宿主ゲノムへの統合の可能性を低減し、遺伝子内にコードされている可能性があるミクロＲＮＡを排除して結果的に高い安全性特性を生じる。サルＩＬ−２８Ｂ（ｍａｃＩＬ−２８）の発現の解析は、ｍａｃＩＬ−２８又は空のベクターによる横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞株の試験管内形質移入を介して行った。空のベクターではなく、ｍａｃＩＬ−２８を形質移入した細胞から回収した上清は、ＥＬＩＳＡでアッセイした際、形質移入後４８時間で存在する多量のサルＩＬ−２８を示し、高度のプラスミド発現を示唆した（図３）。
【０１０６】
試験管内で高度の発現を見て、我々は、アカゲザルにおけるＨＩＶＰｏｌに対する免疫処方計画にｍａｃＩＬ−２８Ｂを加えることを決定した。ＩＬ−２８Ｂの添加は、２回の免疫の後、ＥＬＩＳｐｏｔで測定した場合、ＨＩＶＰｏｌ特異的なＩＦＮγの放出にて約３倍の増加をもたらす（図４）。これらのデータは、ｍａｃＩＬ−２８ＢプラスミドはＩＬ−２８Ｂを高いレベルで発現する新規の方法であり、ＤＮＡワクチン接種の非ヒト霊長類モデルにて有効な免疫アジュバントとして使用できることを示唆している。
【０１０７】
実施例４
免疫応答の有効性を改善することは、生命にかかわる病原体に対するワクチンに関する課題の中で最重要である。ＩＬ−２８Ｂは、サイトカインの新規に記載されたインターフェロンラムダ（ＩＦＮλ）ファミリーに属するが、適応免疫応答に影響を及ぼす、又はワクチンのアジュバントとして作用するその潜在的能力については未だ評価されていない。我々は、ＤＮＡワクチン接種の間、複数クレードのコンセンサスＨＩＶＧａｇプラスミドに対する免疫応答を後押しする能力についてＩＬ−２８をコードするプラスミドをＩＬ−１２のそれと比較した。我々はここで、ＩＬ−１２と同様にＩＬ−２８Ｂも適応免疫を確実に高めることが可能であることを示す。さらに、我々は、ＩＬ−２８ＢがＤＮＡワクチン接種の間、どのように制御性Ｔ細胞集団を減らし、一方でＩＬ−１２がこの細胞サブセットを増やすのかを初めて記載する。我々はまた、ＩＬ−１２とは異なって、ＩＬ−２８Ｂはワクチン接種された動物で脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を高めることができ、アジュバントとしてＩＬ−１２を与えた動物から得た細胞と比べると、これらの細胞は顆粒性が高く、高い抗原特異的な細胞溶解性の脱顆粒を有することも示す。最後に我々は、ＩＬ−２８Ｂが致死的なインフルエンザ抗原投与後の死亡から１００％の保護を誘導できることを報告する。これらのデータは、ＩＬ−２８Ｂがワクチン又は免疫療法のプロトコールのさらなる検討にとって強い候補であることを示唆している。
【０１０８】
序論
免疫系とその構成要素の包括的な理解を有することは、感染の間の宿主−病原体の相互作用の理解にとってだけでなく、ワクチンの開発と設計の背景でも重要である。免疫関連のシグナル伝達化合物、たとえば、サイトカインに関して、ワクチン接種試験は、これらの分子がどのように抗原特異的な免疫応答に影響を及ぼすのかを検討する手段を我々に与え得る。
【０１０９】
ＤＮＡワクチン接種は、生体内で抗原特異的な免疫応答を誘導する安全で且つ有効な方法であり１〜３、免疫モジュレータの導入に役立つ。ＤＮＡワクチン接種の基本骨格にサイトカインをコードするプラスミドを容易に添加する能力によって、ワクチンのアジュバントとしての潜在的価値を決定することと同様にサイトカインがどのように適応免疫応答に影響するのかを同時に評価することが可能になる。さらに、最適化されたＤＮＡの処方による非ヒト霊長類の最近のデータは、さらに有望な免疫特性を示しつつある。これらの励みになる結果に改良を加えることが重要な目標である。
【０１１０】
インターフェロンラムダファミリーは、最近発見された３つのサイトカイン、ＩＬ−２９とＩＬ−２８ＡとＩＬ−２８Ｂ（それぞれＩＦＮλ１、２及び３）から成る４〜７。３つのサイトカインはすべて試験管内でウイルス感染に応答して発現し、主として樹状細胞及びマクロファージから分泌される４〜７。さらに、これらサイトカインによる細胞の処理が、ＩＬ−２８受容体を介したＳＴＡＴ、ＩＲＦ及びＩＳＧＦの活性化によって培養におけるウイルスの複製を阻害する抗ウイルス状態を誘導できるという事実により３つのサイトカインはすべてインターフェロンとして分類されている４〜７。受容体の発現が、Ｔリンパ球を始めとして種々の白血球で示されているが８、抗原特異的な適応免疫応答を方向付けるＩＬ−２８の相対的な能力はこの点で広範には検討されていない。
【０１１１】
この試験では、我々は、ＤＮＡワクチン接種の背景でアジュバントとして作用するＩＬ−２８Ｂの能力を分析し、免疫応答を増強するその能力を、強力な且つ最良の確立されたＤＮＡ免疫アジュバントである９〜１３ＩＬ−１２のそれと比較した。そうすることで、我々は未だ検討されていない、抗原特異的な適応免疫応答に対するＩＬ−２８Ｂの影響を特徴付けた。ＩＬ−２８Ｂ又はＩＬ−１２をコードするプラスミドを含むことは、ＩＦＮγのＥＬＩＳｐｏｔ及びフローサイトメトリーによるパーフォリンの検出によって測定した場合、抗原のみによるワクチン接種を超えて高い抗原特異的な細胞性の免疫応答をもたらす。ＩＬ−１２ではなくＩＬ−２８Ｂはさらに、抗原特異的ＩｇＧ２ａ、抗原特異的細胞溶解性脱顆粒及び脾臓に見られるＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を増やすことができた。さらに、我々は、ＩＬ−２８Ｂアジュバントがワクチン接種した動物の脾臓で見られるＣＤ４＋／ＣＤ２５ｈｉ／ＦｏｘＰ３＋（Ｔｒｅｇ）細胞の数を減らす一方で、ＩＬ−１２はこの集団の大きさを増やすことを見い出した。最後に我々はここで、マウスにおけるワクチン接種のアジュバントとして使用したとき、ＩＬ−２８Ｂは、致死的なインフルエンザ抗原投与後の死から１００％の保護を結果的に生じるように免疫応答を増強することができることを示す。この試験は、ＩＬ−２８Ｂが生体内での細胞性免疫の有効なアジュバントとして作用することを示し、ＤＮＡワクチン接種後のＴｒｅｇ集団に対するＩＬ−２８ＢとＩＬ−１２の差次的効力を初めて記載する。これは、生体内で適応免疫応答を方向付けるＩＬ−２８Ｂの能力の最初の主な分析を構成する。
【０１１２】
材料及び方法
プラスミド：マウスのｐ３５とｐ４０のタンパク質をコードするＩＬ−１２プラスミドは記載されている１１，１４。マウスのＩＬ−２８Ｂは、遺伝子の５’末端に付加された効率の高いリーダー配列を有し、合成されたが、コドンを最適化し、続いてＧｅｎｅＡｒｔ（ドイツ、レネンスベルグ）によりｐＶＡＸ１の基幹にサブクローニングした。ＨＩＶ−１Ｇａｇ（Ｇａｇ４Ｙ）を発現するプラスミドは以前記載された１５ように調製した。
【０１１３】
動物：動物はすべてペンシルベニア大学の温度制御した光周期のある施設に収容し、その世話は、米国国立衛生研究所とペンシルベニア大学の指針のもとにあった。動物実験はすべて、動物の世話に関する国家と施設の指針に従って実施し、ペンシルベニア大学の施設内倫理委員会によって認可された。
【０１１４】
マウスの免疫：８週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウス（ジャクソンラボラトリー）の大腿四頭筋に２週間離して２回注射し、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）適合定電流装置（テキサス州、ザウッドランドのＶＧＸファーマシューティカルズ）を用いて以前記載された１６ように電気穿孔を行った。マウスにおける実験については、１０μｇのｐＶＡＸ１又は１０μｇのＨＩＶ−１Ｇａｇ（Ｇａｇ４Ｙ）又はインフルエンザＮＰ（ＮＰ）のいずれかのみで、又は実験によって種々の量のマウスＩＬ−１２又はマウスＩＬ−２８Ｂのプラスミドと共に動物（群当たりｎ＝４又は８）を免疫化した。種々の遺伝子プラスミドの同時投与には、等張クエン酸緩衝液における０．２５％の塩酸ブピバカイン（シグマ）に最終体積３０μＬで注入する前に指定されたＤＮＡを混合することが含まれる。
【０１１５】
ＥＬＩＳｐｏｔ：ＩＦＮγとＩＬ−４のＥＬＩＳｐｏｔを実施して免疫化したマウスからの抗原特異的なサイトカインの分泌を測定した。ＥＬＩＳｐｏｔは、９６穴プレート（ミリポア）を用い、製造元のプロトコール（Ｒ＆Ｄシステムズ）によって実行した。免疫化したマウスからの２×１０５個の脾細胞をプレートの各ウェルに加え、Ｒ１０（陰性対照）、コンカナバリンＡ（陽性対照）、又は特異的ペプチド（ＨＩＶ−１がｇ）抗原（１０μｇ／ｍＬ）の存在下で３７℃、５％ＣＯ２にて刺激した。タンパク質全体に及び、１１のアミノ酸が重なり合うＨＩＶ−１のコンセンサスＧａｇクレードＣ１５量体ペプチドはＡＩＤＳ試薬と参照リポジトリ（メリーランド州、フレデリック）から獲得した。
【０１１６】
細胞培養及びフローサイトメトリー用の染色：免疫化したマウスから回収した脾細胞を洗浄し、次いで最終濃度１０７細胞／ｍＬでＲ１０培地に再浮遊させた。１００μＬの体積で細胞を９６穴プレートに播き、追加の１００μＬの培地のみ、ＨＩＶ−１のＧａｇコンセンサスクレードＣを含有する培地又はＰＭＡとイオノマイシン（陽性対照）を含有する培地を加え、プレートを３７℃に置いた。脱顆粒を測定するのに使用される培養では、このとき増強染色剤として抗ＣＤ１０７ａＰＥを加えた。細胞内のパーフォリンのレベルを測定するのに使用する培養にはこの抗体を与えなかった。これらの培養について、培地、ペプチド又はＰＭＡ／イオノマイシンの添加後１０分にＭｇ２＋とＥＧＴＡをそれぞれ最終濃度６ｍＭと８ｍＭで培養に加え、カルシウム依存性の細胞溶解性の脱顆粒を阻害した１７。培養はすべて３７℃にて６時間インキュベートした。このインキュベーション時間の最後に、プレートを遠心し、ＰＢＳで２回洗浄した。次いで生存率についてのバイオレット染料（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤバイオレット生存率染料、インビトロゲン）で細胞を３７℃にて１０分間染色した。上記のようにＰＢＳで洗浄した後、４℃にて抗ＣＤ４ＰｅｒＣＰＣｙ５．５（ＢＤバイオサイエンス）と抗ＣＤ８ＡＰＣＣｙ７（ＢＤバイオサイエンス）によって細胞を外的に染色し、次いで固定と透過化を行った。抗ＣＤ３ＰＥ−Ｃｙ５（ＢＤバイオサイエンス）と抗パーフォリンＡＰＣ（ｅバイオサイエンス）を加え、細胞を再び４℃にてインキュベートした。最後に細胞をＰＢＳで洗浄し、最終濃度１％のＰＦＡで固定した。ＣＤ４＋／ＣＤ２５ｈｉ／ＦｏｘＰ３＋細胞を含むフローサイトメトリーについては、マウス制御性Ｔ細胞染色キット（ｅバイオサイエンス）を採用した。外部染色は上記のように抗ＣＤ４ＦＩＴＣと抗ＣＤ２５ＡＰＣによって行った。固定、透過化及び内部染色は、抗ＦｏｘＰ３ＰＥを用いて上記のように行った。
【０１１７】
インフルエンザ抗原の投与：免疫後２８日に、３０μＬのＰＢＳ中の１０ＬＤ５０のＡ／プエルトリコ／８／３４を麻酔したマウスに鼻内接種した。抗原投与のマウス群はすべて群当たり８匹のマウスで構成された。抗原投与後、臨床的兆候と死亡率を毎日１４日間記録した。
【０１１８】
統計学：データは、少なくとも３つの独立した実験から回収したデータから算出した平均値±平均値の標準誤差（ＳＥ）として表す。適宜、対応のあるスチューデントのｔ検定を用いて免疫群間の統計的差異を評価し、各実験群について具体的なｐ値を得た。ｐ値＜０．０５となる試料間の比較を統計学的に差異があるので有意であるとみなした。
【０１１９】
結果
マウスのＩＬ−１２及びＩＬ−２８Ｂをコードするプラスミドはタンパク質を発現し、分泌する
種々のウイルス病原体に対するワクチン接種についての新規の且つ改善されたアジュバントの発見に対する絶え間ないニーズがある。過去において、ＩＬ−１２はワクチン接種の試験に採用されると強力なアジュバントであることが示されてきた９〜１３。ＩＬ−２８Ｂはこの目的で使用されたことはない。抗原特異的な免疫応答を増強するこれらサイトカインの相対的な能力を比較するために、我々はＤＮＡワクチン接種試験で使用するためにマウスＩＬ−１２１１とマウスＩＬ−２８Ｂをコードするプラスミドを構築した（図５Ａ及び５Ｂ）。これら構築物がＩＬ−１２及びＩＬ−２８Ｂを発現するかどうかを確認するために、我々は、３μｇのプラスミドによるＨＥＫ２９３Ｔ細胞への形質移入を介してそれらを試験管内で調べた。その後、細胞を溶解し、溶解物をウエスタンブロットに使用してタンパク質の発現について調べた。マウスＩＬ−１２ｐ４０とマウスＩＬ−２８Ｂのタンパク質についてのブロットは、双方の構築物が試験管内で上手く発現されることを示している（図６Ａ）。細胞外環境へのサイトカインの分泌を調べるために、形質移入後４８時間で細胞上清を得た。形質移入した細胞の培養上清から活性のあるＩＬ−１２ｐ３５／ｐ４０へテロダイマー及びＩＬ−２８Ｂタンパク質を検出するＥＬＩＳＡを行った。図６Ｂに示すように、ＩＬ−１２及びＩＬ−２８Ｂは双方とも、形質移入した培養上清にておおまかに１０，０００ｐｇ／ｍＬの濃度で存在することが認められた。形質移入した細胞からの双方のサイトカインの発現と放出を確認して、我々は、これらのサイトカインの抗原特異的な免疫応答のアジュバントになる能力を調べるワクチン接種に取り掛かった。
【０１２０】
ＩＬ−２８Ｂはワクチン接種後のＨＩＶＧａｇ特異的ＩＦＮγ放出のアジュバントになる
ＩＬ−２８Ｂが免疫アジュバントとして機能する能力を有するのか有さないのかを判定するために、我々は我々の標的抗原としての複数クレードのコンセンサスＨＩＶ−１Ｇａｇタンパク質（Ｇａｇ４Ｙ）をコードするプラスミドとの組み合わせでＤＮＡワクチン接種試験にそれを用いた。ＩＬ−２８Ｂのアジュバント効力の有効性を比較する目安を有するために、我々は、非常に強力な免疫アジュバント効力を有することが以前から示されているという事実のためにワクチン接種でアジュバントとして頻繁に採用されるサイトカインであるＩＬ−１２９〜１３とそれを比較した。その目的で、１０μｇの空のｐＶＡＸベクター（対照）又は１０μｇのＨＩＶＧａｇ４Ｙ構築物のみによって右後の大腿四頭筋にて筋肉内で８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの群（群当たりｎ＝４）を免疫化し、次いで電気穿孔を行った。追加の群に様々な用量のＩＬ−２８Ｂ又はＩＬ−１２と組み合わせた１０μｇのＨＩＶＧａｇ４Ｙを与え、その後電気穿孔を行った。ＩＦＮγのＥＬＩＳｐｏｔアッセイの結果は、Ｇａｇ４Ｙのみによる免疫がマウスにおいて細胞性の免疫応答を誘導することができた（１００万個の脾細胞当たり約４００ＳＦＵ）が、ＩＬ−２８Ｂの包含は、調べたすべての用量でＧａｇ特異的なＩＦＮγの放出をさらに数倍高めることができたことを示している（図７Ａ）。ＩＬ−２８Ｂの最適なアジュバント効力（Ｇａｇ４Ｙのみを３〜４倍上回る）は７〜９μｇの範囲に見られ（図７Ａ）、さらなる実験におけるこの用量の使用に我々を導いた。ＩＬ−１２も、ＩＬ−２８Ｂの用量と同じ範囲でちょうど３倍このアッセイでＧａｇ特異的なＩＦＮγの放出を高めた（図７Ａ）。各アッセイの解析は、応答にはＣＤ８＋Ｔ細胞が優勢に介在し（応答全体の＞８５％）、ワクチン接種の間アジュバントの存在又は非存在によってこの特性は影響されないことを示した（データは示さず）。これらの結果は、ＩＬ−２８Ｂは、実際、ワクチン接種の間、抗原特異的な免疫応答を増強するのに使用することができることを示唆し、確立された強力な免疫アジュバントであるＩＬ−１２で見られたものに匹敵するか、それを超えるＩＦＮγの放出における増加を伴った。
【０１２１】
ＩＬ−２８ＢがＴｈ１に関連するＩＦＮγの放出の増加を介して細胞性免疫応答を高めるのに使用できたことを確認して、我々は次にこのアジュバントが原型的なＴｈ２サイトカインの放出に影響を及ぼすことができるかどうかを判定することを試みた。従って、我々は、ＩＬ−２８ＢがどのようにこのＴｈ２関連のサイトカインの放出に影響するのかを観察するために上記と同様にＩＬ−４のＥＬＩＳｐｏｔを採用した。興味深いことに、ワクチン接種にＩＬ−１２を含めることは結果的に調べたすべての用量で約２００〜約６００ＳＦＵに及ぶＧａｇ特異的なＩＬ−４の放出の増加を生じた（図７Ｂ）。ＩＬ−４のＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおけるＩＬ−１２の最適な用量は結果的にＩＬ−４のＥＬＩＳｐｏｔアッセイにて約４００〜約４５０ＳＦＵを生じたが、ＩＬ−２８を含めることはこの種の効力を示さなかった。代わりに、ワクチン接種にＩＬ−２８Ｂを含めることは結果的にＨＩＶＧａｇ４Ｙ構築物のみ（図７Ｂ）に全く類似したＩＬ−４の放出を生じ、ＩＬ−２８Ｂは、それらの用量で高いＩＦＮγ放出と同時にはＩＬ−４の放出を高めないことを示唆している。従って、ＩＬ−２８Ｂは、ＩＦＮγの放出（Ｔｈ１関連の）を誘導するがＩＬ−４の放出（Ｔｈ２関連の）を誘導しないという点で、ＩＬ−１２と比べた場合、ワクチン接種の間、さらに「純粋な」Ｔｈ１関連のサイトカイン特性を誘導するとして考えられ得る。
【０１２２】
ＩＬ−１２ではなくＩＬ−２８ＢがＨＩＶＧａｇ特異的ＩｇＧ２ａを高める
ウイルス病原体に対する有効なワクチン接種は細胞性と液性の双方の免疫応答を必要とするので、我々は、ワクチン接種の間、アジュバントとして採用した場合、循環しているＨＩＶＧａｇ特異的抗体のレベルを増強するＩＬ−２８Ｂ及びＩＬ−１２の相対的な能力を調べることを決定した。これを達成するために、我々は、抗原特異的ＥＬＩＳＡにて免疫化したマウスから採取した血清を調べた。ＨＩＶＧａｇ４Ｙ構築物と併せてＩＬ−１２又はＩＬ−２８Ｂを含めることは、結果として図８に示すような顕著に異なる抗体反応を生じた。Ｇａｇ特異的な総ＩｇＧに関しては、ＩＬ−２８Ｂ構築物と一緒にＧａｇ４Ｙ構築物による免疫は、調べた最低希釈（１：２５）でのＧａｇ４Ｙのみによる免疫に比べて抗原特異的な抗体のレベルでは小さな増加をもたらしている（図８Ａ）。しかしながら、Ｇａｇ４Ｙの免疫とともにＩＬ−１２を含めることは、抗原特異的なＩｇＧを積極的に抑制し、対照（ｐＶＡＸ）マウスのそれに非常に類似する値を読み取った。ＩＬ−１２のこの効力は、以前、ＤＮＡワクチン接種で報告されていた現象であり１４、この試験でも同様に支持されている。我々は次にＩｇＧ１とＩｇＧ２ａを含むＩｇＧの異なった亜型を調べ、免疫分極の追加の効果を判定した。ＩｇＧ１アイソタイプはマウスにおいてＴｈ２の偏りに関係し、ＩｇＧ２ａはＴｈ１の偏りに関係する１８。アジュバントを含めることにかかわりなく、ＤＮＡワクチン接種は我々のアッセイではいずれの群でもＧａｇ特異的なＩｇＧ１抗体のレベルを上げるとは思えなかった（図８Ｂ）。しかしながら、ワクチン接種にＩＬ−２８Ｂを含めることは、ＨＩＶＧａｇ４Ｙのみでワクチン接種したマウスの血清に比べて、ＩｇＧ２ａの２倍を超える増加をもたらす（図８Ｃ）。さらに、対照（ｐＶＡＸ）群と比べてＩＬ−１２の群ではＩｇＧ２ａの増加が見られなかったという事実によって証拠付けられるように、ＩＬ−１２はこのアッセイで抗体反応を抑制し続けた。従って、ＩＬ−２８ＢはＴｈ１に強く偏って抗原特異的な液性の免疫応答を高めることができると思われ、それは、細胞性の免疫応答における効力に一致する（図７Ａ及び７Ｂ）。
【０１２３】
ＩＬ−２８Ｂは脾臓のＣＤ４＋／ＣＤ２５ｈｉ／ＦｏｘＰ３＋細胞を減らすが、ＩＬ−１２はそれらを増やす
ＩＬ−２８Ｂは新規に記載されたＩＦＮλファミリーのメンバーなので、ＩＦＮλ３として知られる１８〜２１。ＩＦＮλのそのほかのメンバーにはＩＬ−２８Ａ（ＩＦＮλ２）及びＩＬ−２９（ＩＦＮλ１）が挙げられる１８〜２１。以前の研究によって、ＩＬ−２９は、ＩＬ−２への応答でＣＤ２５ｈｉ／ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）の増殖を特異的に誘導するように樹状細胞に働きかける可能性があるという点で免疫の抑制及び寛容で役割を担うことが示唆された５。Ｔｒｅｇ細胞の誘導又は増殖は、特定の設定の範囲内ではワクチン接種戦略にとって不利な点であるとみなされうるが、ＣＤ４＋Ｔ細胞のこの亜集団に影響を及ぼすＩＬ−２８Ｂの能力は以前検討されていなかった。ＩＬ−２８ＢはＩＬ−２９と同じＩＦＮファミリーに入るので、我々はそれがＴｒｅｇ細胞集団に類似の効力を発揮しうる可能性に対処した。さらに、我々は、以前調べられていなかった、この種のワクチン接種に設定におけるＴｒｅｇ細胞に影響を及ぼすＩＬ−２の能力も見てみた。
【０１２４】
フローサイトメトリーによってＣＤ４、ＣＤ２５及びＦｏｘＰ３の発現を見ることによって（図９Ａ）、我々は免疫化したマウスにおけるＴｒｅｇ集団に対する、サイトカインの存在及び非存在下でのワクチン接種の影響を検討することができた。この解析の結果は、ＨＩＶＧａｇ４Ｙ構築物のみによる免疫は、ワクチン接種したマウスの脾臓Ｔｒｅｇの比率で小さいが統計的に有意な低下を生じたことを示している（図１０Ｂ）。この結果は、免疫後のＴｒｅｇ集団における類似の変化を記載している以前の報告に一致する２０。ワクチン接種にサイトカインアジュバントを含めることは、様々なやり方でＴｒｅｇ集団を劇的に変化させた。興味深いことに、免疫アジュバントとしてのＩＬ−１２の採用は、ＨＩＶＧａｇ４Ｙ構築物のみによってワクチン接種したマウスに比べて免疫化したマウスにおける脾臓Ｔｒｅｇの数を有意に増やした（図９Ｂ）。この現象がワクチン接種の設定で報告されたのはこれが初めてであり、免疫についてのアジュバントとしてのＩＬ−１２の以前知られていない表現型を構成する可能性がある。また相当に興味があるのは、免疫アジュバントとしてＩＬ−２８Ｂをワクチン接種に含めることは、ＨＩＶＧａｇ４Ｙ構築物のみによるワクチン接種に比べて脾臓Ｔｒｅｇの数を統計的に有意に減らす原因になるという事実であった（図９Ｂ）。ＩＬ−２８Ｂのこの能力が記載されたのはこれが初めてであり、ワクチン接種のアジュバントとして使用される場合、それはサイトカインの有意な利益としてみなされうる。さらにそれは、同じＩＦＮファミリーにいるが、ＩＬ−２８ＢとＩＬ−２９の間には重要な差異がありうるという可能性を示唆している。
【０１２５】
ＩＬ−２８Ｂを与えたマウスの脾細胞はＴＧＦβをあまり分泌しない
我々は、ＩＬ−１２又はＩＬ−２８Ｂをワクチン接種に含めることが、完全に機能的なＴ制御性細胞の増殖を誘導する代わりに、正常なＣＤ４＋細胞をＴｒｅｇに見えるように表現型を変えつつあることが可能であると推論した。従って、これらの細胞が表現型上Ｔｒｅｇに似ていることに加えてＴｒｅｇとして機能しているかどうかを判定するために、我々は、Ｔｒｅｇを基にした非接触性の免疫抑制の主なメディエータの１つとして認識される２１ＴＧＦβを産生する能力をワクチン接種したマウスの脾細胞で測定した。これを達成するために、我々は、活性化細胞からのＴＧＦβの放出を測定するために、ＰＭＡ及びイオノマイシンとの組み合わせと共に各群のマウスの脾細胞を４８時間培養した。この時間の最後に、細胞培養から上清を取り、ＥＬＩＳＡを用いてＴＧＦβを検出した。図９Ｂに示すように、Ｇａｇ４Ｙのみを与えたマウスに比べてＩＬ−１２をアジュバントとして与えたマウスから単離した脾細胞の活性化は結果としてＴＧＦβ産生の統計的に有意な増加を生じた（図９Ｂ）。この結果は、ＩＬ−１２を与えたマウスとＨＩＶＧａｇ４Ｙのみを与えたマウスの間でのフローサイトメトリーで認められたＴｒｅｇの数の差異はＴｒｅｇの集団を正しく特定していることを示唆している。さらに、アジュバントとしてＩＬ−２８Ｂを与えたマウスから単離した脾細胞は、ＰＭＡとイオノマイシンで活性化した場合、有意に少ないＴＧＦβしか産生しなかった（図９Ｂ）。このことは再び、ＨＩＶＧａｇ４Ｙのみを与えたマウスと比べてＩＬ−２８Ｂを与えたマウスにおけるＴｒｅｇ集団での差異を示唆するフローサイトメトリーのデータを支持している。
【０１２６】
ＩＬ−２はＴｒｅｇの誘導及び増殖に重要なサイトカインであるので２１、我々は、ワクチン接種した群間でのＴｒｅｇ集団の差異は、ＩＬ−２の差次的産生により得ると推論した。この可能性を調べるために、我々は再び各群から単離した活性化脾細胞からのサイトカインの放出を測定した。これらの細胞から産出されたＩＬ−２の解析は、いずれの群間にも有意差がないことを示し、ＤＮＡワクチン接種後に見られるＴｒｅｇ集団における差異に関与する代替メカニズムがあることを示唆している。
【０１２７】
ＩＬ−１２ではなくＩＬ−２８Ｂが脾臓のＣＤ８＋Ｔ細胞を増やす
ＩＬ−２８Ｂが脾臓のＴｒｅｇの量に影響を及ぼしうることを判定して、我々は、このアジュバントがワクチン接種後そのほかの細胞種に対して類似の効力を有するかどうかを検討することを決定した。その目的で、対照マウス及びワクチン接種したマウスからの脾細胞をフローサイトメトリーによってＣＤ８Ｔ細胞（ＣＤ３＋／ＣＤ８＋）の存在について解析した。図１０Ａに示すように、対照（ｐＶＡＸ）の脾臓におけるＣＤ８Ｔ細胞の比率は、Ｇａｇ４Ｙ構築物のみ、又はＩＬ−１２アジュバントを伴ったＧａｇ４Ｙ構築物を与えたマウスと有意に異なることはなかった。しかしながら、ＩＬ−２８Ｂをアジュバントとして与えたマウスは、ほかの群すべてと比べて、脾臓における有意に高い比率のＣＤ８Ｔ細胞を示したが、それはＩＬ−２８Ｂが免疫後、脾臓のＣＤ８Ｔ細胞集団を増殖させる能力を有することを示唆している。ＩＬ−２８Ｂのこの効力が脾臓に限定されているのか、ほかのリンパ系臓器や末梢血で見られうるのかどうかを判定するために、我々は次にマウスの各群からの循環ＰＢＭＣと同様に腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）から単離したリンパ球を解析した。ＨＩＶＧａｇ４Ｙ構築物のみで免疫化したマウスは対照のマウスと比べると、ＭＬＮで見い出されたＣＤ８＋Ｔ細胞の数において小さいが統計的に有意な増加を示した。アジュバントとしてＩＬ−１２を与えたマウスは、Ｇａｇ４Ｙのみを与えたマウスに比べてＭＬＮでＣＤ８＋Ｔ細胞の数の増加を示し、この増加は統計的に有意に達することができた（図１０Ａ）。ＨＩＶＧａｇ４Ｙと併せてＩＬ−２８Ｂを与えたマウスは免疫の間、ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率でやや高い増加を有したが、それは、印象的な統計的有意（ｐ＜０．００５）に達した。末梢血から単離されたリンパ球は、ＩＬ−２８Ｂアジュバントを与えた群ではＣＤ８＋Ｔ細胞集団のみの増加を示したが、それは、脾臓において見られたパターンを彷彿させものである（図１０Ａ）。これらの結果は、ＩＬ−１２ではなくＩＬ−２８Ｂが免疫化したマウスの脾臓及び末梢血でＣＤ８＋Ｔ細胞集団の大きさを高めるが、双方のアジュバントがＭＬＮにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞を増やすことができることを示している。
【０１２８】
ＩＬ−２８ＢはＨＩＶＧａｇ特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞のパーフォリン誘導と脱顆粒を高める
ＩＬ−２８Ｂがワクチン接種後、脾臓のＣＤ８＋Ｔ細胞の比率において有意な影響を有すると判定して、我々は、この細胞のサブセットをさらに解析することを決定した。ＩＬ−１２はＣＤ８＋Ｔ細胞の顆粒性に影響を及ぼすことが以前から示されていた１９。我々の以前の実験は、ＩＬ−２８ＢがＩＬ−１２に等しいがそれを超える細胞性免疫（ＩＦＮγの放出を介した）に対する強い影響を有している（図７Ａ）ことを示唆していたので、我々は、ＩＬ−２８ＢがＩＬ−１２と同様に細胞の顆粒性に影響を及ぼすことができるかどうかを尋ねた。従って、我々は、各群のマウスの脾臓から単離したＣＤ８＋Ｔ細胞におけるパーフォリンの抗原特異的誘導を測定する実験を設計した。抗原特異的なパーフォリンの上方制御の量を決定するために、我々は、培地対照と共に、又は一連の重なり合うＨＩＶＧａｇクレードＣペプチドと共に単離脾細胞を６時間インキュベートし、その後、細胞性マーカー及びパーフォリンについて細胞外及び細胞内の染色を行い、次いでフローサイトメトリーによる解析を行った（図１０Ｂ）。細胞溶解性の脱顆粒を防ぐために、方法１７に記載したように、ＥＧＴＡとＭｇ２＋を培養に加えた。この刺激の結果は図１０Ｃに提示する。培地のみとインキュベートした群すべてからの脾細胞におけるＣＤ８＋Ｔ細胞はおおまかに等量のパーフォリンの量を示し、そのことは、アジュバントの有無によるワクチン接種は、この系における基本となるＣＤ８＋Ｔ細胞の顆粒性に有意な効力を有さないことを示唆している。重なり合うＨＩＶＧａｇペプチドによる脾細胞の刺激は異なる結果を示した。ＨＩＶＧａｇ４Ｙ構築物のみで免疫化したマウスからの脾細胞におけるＣＤ８＋Ｔ細胞は、対照マウスに比べてパーフォリンｈｉのゲートに入る控えめな増加を示した。しかしながら、ＩＬ−１２又はＩＬ−２３Ｂを与えたマウスから得たＣＤ８＋Ｔ細胞は双方とも、Ｇａｒ４Ｙ構築物のみを与えたマウスから得たものよりも明らかに高いパーフォリンｈｉ細胞の比率での増加を示した（図１０Ｃ）。これらの結果は、ＩＬ−１２がリンパ球のパーフォリン含量を高める可能性があるという以前の報告２２に一致し、この効力がＩＬ−２８Ｂで報告されたのは初めてである。
【０１２９】
ＩＬ−２８ＢがＣＤ８＋Ｔ細胞のパーフォリン含量に影響を及ぼすという知識と共に、我々はこのサイトカインアジュバントが同様に抗原特異的な脱顆粒に影響を及ぼし得るかどうかを調べた。これを調べるのに、我々は、ＥＧＴＡ又はＭｇ２＋を培養に加えないという事実を除いてパーフォリン誘導を測定したのと同様に細胞をインキュベートし、脱顆粒のマーカーであるＣＤ１０７ａに対する抗体２３を代わりにペプチド刺激の時点で増強染色剤として加えた。細胞を再び細胞性マーカーの染色に供し、その後フローサイトメトリーによって解析した。我々は、Ｇａｇ４Ｙ構築物のみを与えたマウスからのＣＤ８＋Ｔ細胞が低レベルのＧａｇ特異的な脱顆粒を示すことを認めた（図１０Ｃ）。ＨＩＶＧａｇ４Ｙ構築物との組み合わせでＩＬ−１２を与えたマウスからのＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｇａｇ構築物のみを与えたマウスと比べて抗原特異的な脱顆粒で小幅な増加を示したが、この差異は統計的な有意には達しなかった。しかしながら、ワクチン接種におけるアジュバントとしてのＩＬ−２８Ｂを与えたマウスからのＣＤ８＋Ｔ細胞は、アジュバントを与えなかったマウスから採取したＴ細胞に比べてＨＩＶＧａｇ特異的な脱顆粒において有意な増加を示した（図１０Ｃ）。結果は、ＩＬ−２８ＢがＤＮＡワクチン接種でアジュバントとして用いられるとＣＤ８＋Ｔ細胞の脱顆粒にてより大きい且つ統計的に有意な増加を招くことを示している。
【０１３０】
ＩＬ−２８Ｂは生体内での致死的インフルエンザ抗原投与から保護する
細胞性の免疫応答に関する我々のアッセイは、ＩＬ−２８ＢがＴｈ１に偏った細胞性免疫に対して強いアジュバントとして作用する潜在力を有することを示唆したので、我々は、生体内での致死的なウイルス抗原の投与に対して保護するこのサイトカインの能力を調べることを決定した。これを達成するために、我々は上記と同様の方法で４セットの追加マウス（各群当たりｎ＝８匹）を免疫化し、その後電気穿孔を行った。対照マウスには１０μｇの空のｐＶＡＸベクターを与えたが、ほかの群のマウスは、インフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）をコードする１０μｇのプラスミドのみ、又はそれに加えてＩＬ−１２若しくはＩＬ−２８Ｂを与えた。インフルエンザの核タンパク質は内部構造のタンパク質であり、ビリオンの外側に暴露されていない。従って、ＮＰタンパク質に対して標的とされるインフルエンザ感染に対する免疫は、液性免疫であると同時に細胞性免疫である１６。ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔを介したワクチン接種したマウスの細胞性免疫の解析は、ＨＩＶＧａｇ４Ｙ構築物に対する応答を増強したのとほぼ同じようにＩＬ−１２及びＩＬ−２８ＢのアジュバントはインフルエンザＮＰ抗原に対して高い応答を誘導した（図１１Ａ）。免疫後４週間の休息期間の後（図１１Ｂ）、Ｈ１Ｎ１インフルエンザ株：Ａ／プエルトリコ８／３４（Ａ／ＰＲ／８／３４）の１０ＬＤ５０を鼻内にてすべてのマウスに抗原投与した。ウイルス感染に関連した死亡率について次の１４日間の経過にわたってマウスをモニターした。この実験の結果は、対照マウスの抗原投与は感染後８日目で結果的に１００％の死亡率を生じたことを示している（図１１Ｃ）。１０μｇのＮＰ構築物を与えたマウスが以後の１４日間で５０％の死亡率を示したということは、ＮＰ構築物のみでは保護を誘導するのに完全に十分ではないことを示唆している。ＩＬ−１２は、抗原投与試験でアジュバントとして使用した場合、ウイルス感染に関連した死亡に対して十分な保護を誘導することができることが過去において示されている１３，１４。ＮＰに対するアジュバントとしてＩＬ−１２を与えたマウスが感染による死亡から１００％の保護を示したという事実によって示されたように、現在の試験でもこれはそのとおりである。さらに、ＩＬ−２８Ｂは強力な細胞性の免疫応答を誘導することができたことを示唆する我々の以前のアッセイに一致して、ＮＰに対するアジュバントとしてＩＬ−２８Ｂを与えたマウスもウイルス抗原投与後１００％の生存を示した。この実験の結果は、ＩＬ−２８ＢがＤＮＡワクチン接種の間にアジュバントとして使用されると生体内でのウイルス感染に伴った死亡から１００％の保護を誘導し得ることを示している。
【０１３１】
考察
ここに提示した試験は、プラスミドにコードされたＩＬ−２８ＢがＤＮＡワクチン接種でアジュバントとして使用された場合、抗原特異的な免疫応答に対して強力な効力を有し得ることを示している。ＩＬ−２８Ｂは、Ｔｈ１に偏って複数クレードＨＩＶＧａｇ抗原に対する抗原特異的な免疫応答を増強することができたが、それは、ワクチン接種したマウスの血清で検出される高いレベルのＧａｇ特異的ＩｇＧ２ａと同様に抗原特異的なＥＬＩＳｐｏｔにおける大きく高められたＩＦＮγの放出によって証拠付けられた。さらに、これは、ＤＮＡワクチン接種後の脾臓Ｔｒｅｇ集団を減らすＩＬ−２８Ｂの能力を記載する最初の記録である。ＩＬ−２８Ｂはまたここで、脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖させることができることが示され、これらの細胞が同族の抗原に応答して高いパーフォリン誘導と脱顆粒を示すことが示された。ＩＬ−２８Ｂが致死的なウイルス抗原投与においてマウスの保護を増強することができたという事実は、ワクチン接種におけるアジュバントとしてのこのサイトカインの継続した試験を強く主張する。
【０１３２】
ＩＬ−１２はワクチン接種試験におけるアジュバントとして使用されることが多い高度に強力なサイトカインである９〜１３ことが知られているという事実のために、ＩＬ−２８Ｂの影響をＩＬ−１２に対して測定した。この組み合わせの解析はＩＬ−２８Ｂが、それ以上ではなくても場合によっては少なくともＩＬ−１２と同じくらい強力であることを示している。さらに、ＩＬ−２８Ｂは、抗原特異的な抗体力価の上昇と、高い程度の抗原特異的な細胞溶解性の脱顆粒か可能である脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞集団の増加を含む、ＩＬ−１２にはない、ワクチン接種についての追加の利益を与えている。Ｔｒｅｇ集団に対するＩＬ−２８ＢとＩＬ−１２の効力は劇的に異なった。これは、ＤＮＡワクチン接種においてＩＬ−１２に応答したＴｒｅｇの誘導を分析し、このアジュバントがこの細胞集団を増やし得ることを報告する最初の試験である。この知見の影響は今のところ明らかではないが、この結果は、ＩＬ−２８Ｂは細胞性免疫が最重要である特定の状況では優れうることを支持し得る。最近の報告は生体内でのＴｒｅｇの生成に対するＩＬ−１２受容体の重要性を強調しているが２４、ＩＬ−１２を与えたマウスがさらに大きなＴｒｅｇ集団を有する具体的なメカニズムは不明のままであり、このサイトカインとＴｒｅｇ集団の誘導及び増殖との間の連鎖の可能性を示唆している。Ｔｒｅｇメンバーを減らすＩＬ−２８Ｂの能力は、それがＴ細胞の一部のサブセット（ＣＤ８）を増やすことができる一方でほか（Ｔｒｅｇ）を減らすので、標的メカニズムである可能性が高いと思われる。具体的なメカニズムに対する追加の試験が必要とされるが、これもまたＩＬ−２８受容体が介在することが可能である。
【０１３３】
ここに提示した結果は、生体内でのＩＬ−２８Ｂの機能の重要な分析を含み、構成し、ＩＬ−２８Ｂが免疫応答にどのように影響を及ぼすかということの我々の理解の始まりに寄与する。データは、ＩＬ−２８ＢがＩＦＮ様の機能に加えて適応免疫応答のレギュレータであり得ることを示唆し、この効力はＣＤ８＋Ｔ細胞の数と機能に大きく集中していると思われる。ＩＬ−２８Ｂが抗原特異的免疫応答を方向付けることができることに加えて抗ウイルス状態を誘導するという事実は、それが天然の免疫と適応性の免疫との間のギャップを繋ぐ独特の能力を有することを示唆している。さらに、ＩＬ−２８Ｂは、特定のアジュバント設定にてＩＬ−１２を超えた免疫療法のアプローチで独特の役割を有し得る。特に、寛容が特に問題である腫瘍免疫におけるアジュバントとして、ＩＬ−２８Ｂが非常に有用であり得る。これを適切に検証するためにさらなる試験が必要である。
【０１３４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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