(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フルクタンを含んでなる、細胞の凍結保存液であって、
該保存液中にジメチルスルホキシドを、終濃度０．１〜１０％（Ｖ／Ｖ）で含んでなる、または、含まず、かつ、
フルクタンが、フルクトースのβ２→１およびβ２→６の両グルコシド結合を含む重合体を主鎖とする、フルクタンであり、
フルクタンの終濃度が２０〜６０％（ｗ／ｖ）である、
保存液。
【請求項２】
無血清である、請求項１に記載の凍結保存液。
【請求項３】
エチレングリコール、プロピレングリコール、またはこれらの混合物を有効成分としてさらに含んでなる、請求項１または２に記載の凍結保存液。
【請求項４】
フルクタンが、ネギ科植物およびユリ科植物からなる群から選択される植物の根または根茎由来である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の凍結保存液。
【請求項５】
フルクタンが、ラッキョウ、ニンニク、タマネギからなる群より選択されるネギ属植物の根または根茎由来である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の凍結保存液。
【請求項６】
フルクタンを植物の抽出物として含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の凍結保存液。
【請求項７】
フルクタンが、植物の抽出物を、限外濾過膜処理、エタノール沈殿処理、またはアセトン沈殿することにより精製されたものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の凍結保存液。
【請求項８】
フルクタンの濃度が、２５〜５０％（ｗ／ｖ）である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の凍結保存液。
【請求項９】
細胞が、動物細胞である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の凍結保存液。
【請求項１０】
細胞が、細胞集合体、組織、または組織片を形成しているものである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の凍結保存液。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の凍結保存液を用いて、細胞を凍結保存することを含んでなる、細胞の凍結保存方法。
【請求項１２】
細胞を懸濁した凍結保存液を、液体窒素によって急冷する工程を含んでなる、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を凍結保存するために用いる凍結保存液およびそれを用いた凍結保存方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞は、継代を繰り返すことにより、細胞変質、遺伝的変異および雑菌汚染を生じることがある。そこで、安定的な品質の細胞を長期間保存するために、様々な凍結保存技術が用いられている。例えば、哺乳類細胞の場合では、従来、ウシ胎児、仔牛または成牛などの牛血清をベースに５〜２０容量％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）やグリセリンを添加したものを、凍結保存液として用いて凍結保存する方法が、一般的に行われていた。
【０００３】
しかしながら、哺乳類の血清は、その供給に制限があり、かつ非常に高価である。このため、凍結保存する際に血清を用いると、作業が煩雑になって労力が増加する一方、保存コストも上昇することになる。また、血清は、ロットによって、その特質にばらつきがみられることが多く、血清中に含まれるサイトカインおよび増殖因子などの哺乳類由来の因子により、保存細胞の性質を変質させるおそれもある。さらに、特に動物由来の血清には、ヒトにヤコブ病を導くことが危惧されている牛の狂牛病やヒツジのスクレイピーなどを引き起こす異常プリオンの混入の危険性に加え、ウイルス感染の危険性があった。
【０００４】
そこで、従来、動物に由来する血清を一切使用しない凍結保存液の検討が進められてきた。
【０００５】
従来、細胞凍結保存液に使用されている成分としては、アミノ酸、タンパク質、糖類、アルコール類等が知られている。例えば、アミノ酸の一つのプロリンは、凍結保護効果を有することが報告されている(非特許文献１： Shinozaki, K. et al.: FEBS Lett., 461(3), 205, (1999)および非特許文献２： Takagi, H. et al.: Appl. Environ. Microbial., 69(11), 6527(2003)参照)。また、特開２００２−２３３３５６号公報(特許文献１)には、糖類（特にグルコース）を使用した細胞凍結保存液が、開示されている。しかしながら、これら成分の成分単独での凍結保護効果は、本発明者らの知る限り、血清成分に比べて充分なものではなかった。
【０００６】
例えば、特許第４５８８５９８号公報（特許文献２）には、血清代替物として、絹タンパク質であるセリシンあるいはその加水分解物を使用することが開示されており、アミノ酸および糖類との併用により、血清由来成分を使用する場合と同等の凍結保護効果が期待できることが示されている。しかしながら、この凍結保存液においても、高い保護効果を示すためには、凍結保護因子として、ジメチルスルホキシドを使用することが必要あった。ジメチルスルホキシドは細胞保護作用のあることが知られており、凍結保存液を構成する際には必須の成分であると考えられていた。
【０００７】
一方、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの幹細胞においては、凍結保存する際に、凍結保護剤としてジメチルスルホキシドを用いると、無秩序な分化誘導が生じることが報告されている（特許文献３：特開２０１０−２７３５４９参照）。
【０００８】
このため、動物に由来する血清を含有せず、かつジメチルスルホキシドを使用しないか、またはできるだけ使用しない凍結保存液が望まれていた。
【０００９】
フルクタンは、主にフルクトース分子から構成される重合体であり、アーティチョーク、アスパラガス、ラッキョウ、タマネギ、小麦など植物中や微生物中に存在することが知られている多糖である。フルクタンについては、無血清の細胞増殖用培地での使用が報告されており、また、細胞保護因子であるジメチルスルホキシド存在下で、フルクタンを少量添加することによる、細胞凍結保護効果が確認されている（特許文献４：特開２００８−２２８５８７号公報参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００２−２３３３５６号公報
【特許文献２】特許第４５８８５９８号公報
【特許文献３】特開２０１０−２７３５４９号公報
【特許文献４】特開２００８−２２８５８７号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Shinozaki, K. et al.: FEBS Lett., 461(3), 205, (1999)
【非特許文献２】Takagi, H. et al.: Appl. Environ. Microbial., 69(11), 6527(2003)
【発明の概要】
【００１２】
本発明者らは、今般、動物由来の血清を使用することなく、またジメチルスルホキシドを使用することなく、フルクタンを有効成分として使用することで優れた細胞凍結保護効果を発揮させることに成功した。従来、フルクタンはジメチルスルホキシドと共に使用することで、細胞凍結保護効果が示されると考えられてきたところ、フルクタンの使用量を検討することで、ジメチルスルホキシドを全く使用せずに、有効な細胞凍結保護効果が得られたことは予想外のことであった。このことから、ジメチルスルホキシドの代替物としてフルクタンを使用することで、ジメチルスルホキシドを使用する場合と同様の優れた細胞の凍結保護効果を示しうることがわかった。さらにこの効果は、フルクタンに加えてさらに、エチレングリコール、またはプロピレングリコールを選択して使用することによって、より顕著となった。本発明は、これらの知見に基づくものである。
【００１３】
よって、本発明は、ジメチルスルホキシドを使用することなく、さらには、細胞の凍結障害を避けるのに非常に有効であるが問題の多いウシ胎児などの動物に由来する血清や血清由来成分を使用することなく、長期にわたって細胞を凍結しておくことが可能な、細胞の凍結保存液の提供をその目的とする。
【００１４】
すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）ジメチルスルホキシド代替物としてのフルクタンを有効成分とする、細胞の凍結保存液。
【００１５】
（２）凍結保護作用として有効な量のジメチルスルホキシドを含まないものである、前記（１）に記載の凍結保存液。
【００１６】
（３）無血清である、前記（１）または（２）に記載の凍結保存液。
【００１７】
（４）エチレングリコール、プロピレングリコール、またはこれらの混合物を有効成分としてさらに含んでなる、前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の凍結保存液。
【００１８】
（５）フルクタンが、
フルクトースのβ２→１グルコシド結合による直鎖状重合体を主鎖とする、イヌリン型フルクタン、
フルクトースのβ２→６グルコシド結合による直鎖状重合体を主鎖とする、レバン型フルクタン、
フルクトースのβ２→１およびβ２→６の両グルコシド結合を含む重合体を主鎖とする、フルクタン、および
これらのフルクタンの加水分解物
からなる群から選択される一種以上のものである、前記（１）〜（４）のいずれか一つに記載の凍結保存液。
【００１９】
（６）フルクタンが、ネギ科植物、キク科植物、マメ科植物、イネ科植物、ユリ科植物、ヤマノイモ科、リュウゼツラン科植物、アヤメ科植物、およびラン科植物からなる群から選択される植物の根または根茎由来である、前記（１）〜（５）のいずれか一つに記載の凍結保存液。
【００２０】
（７）フルクタンが、ラッキョウ、ニンニク、タマネギからなる群より選択されるネギ属植物の根または根茎由来である、前記（１）〜（６）のいずれか一つに記載の凍結保存液。
【００２１】
（８）フルクタンを植物の抽出物として含んでなる、前記（１）〜（７）のいずれか一つに記載の凍結保存液。
【００２２】
（９）フルクタンが、植物の抽出物を、限外濾過膜処理、エタノール沈殿処理、またはアセトン沈殿することにより精製されたものである、前記（１）〜（８）のいずれか一つに記載の凍結保存液。
【００２３】
（１０）フルクタンの濃度が、２０〜６０％（ｗ／ｖ）である、前記（１）〜（９）のいずれか一つに記載の凍結保存液。
【００２４】
（１１）細胞が、動物細胞である、前記（１）〜（１０）のいずれか一つに記載の凍結保存液。
【００２５】
（１２）細胞が、細胞集合体、組織、または組織片を形成しているものである、前記（１）〜（１１）のいずれか一つに記載の凍結保存液。
【００２６】
（１３）前記（１）〜（１２）のいずれか一つに記載の凍結保存液を用いて、細胞を凍結保存することを含んでなる、細胞の凍結保存方法。
【００２７】
（１４）細胞を懸濁した凍結保存液を、液体窒素によって急冷する工程を含んでなる、前記（１３）に記載の方法。
【００２８】
本発明の細胞の凍結保存液は、従来のようにジメチルスルホキシドを使用する場合と比べて、ジメチルスルホキシドにより引き起こされうる細胞の機能損傷や細胞の分化レベルへの悪影響を無くすか（未分化な細胞は未分化なまま、分化した細胞はその分化レベルを保持したまま）または大幅に低減できると同時に、従来のようにジメチルスルホキシドを使用する場合と同等か、それに近い凍結保護効果を示すことができる。また、本発明の凍結保存液は、動物由来の血清または血清由来成分を含まなくてもよいため、保存している細胞の性質を変える可能性が低く、人畜共通感染症の原因となる異常プリオンや未知ウイルスの混入の危険性が殆どないものである。そのため、バイオ医薬品の生産に用いられる細胞や、再生医療・細胞治療など医療で利用される細胞・組織を保存すること、および種の保存を行うために必要とされる生殖細胞や受精卵、胚を保存することに適している。さらに、本発明の凍結保存液は、その組成が明瞭であるため、安全性が高く、品質の安定性を保ち、安定供給する上でも有利である。加えて、本発明の凍結保存液は、簡略な凍結操作、凍結保存、および解凍操作を通じて、細胞生存率や細胞機能を高く保持できる。これにより、目的とする細胞数まで増殖させるのに要する時間を短縮することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】限界濾過膜によるフルクタン抽出液の精製過程における、抽出液と、膜処理後の精製液の分析結果（フルクタン分子量ＨＰＬＣ分析結果）を示す。
【図２】エタノール沈殿処理によるフルクタン抽出液の精製過程における、抽出液と、エタノール沈殿処理後の精製液の分析結果（フルクタン分子量ＨＰＬＣ分析結果）を示す。
【図３】ＣＨＯ細胞における、各凍結保存液の解凍後の生細胞数の変化を示す。
【図４】間葉系幹細胞における、各凍結保存液の解凍後の生細胞数の変化を示す。
【発明の具体的説明】
【００３０】
細胞の凍結保存液
本発明は、前記したように、ジメチルスルホキシド代替物としてのフルクタンを有効成分とする、細胞の凍結保存液である。
【００３１】
本発明において、「凍結保存液」とは、将来解凍して使用することを目的として、所望の細胞を、凍結による影響から保護しつつ凍結保存できる溶液のことをいい、凍結させる温度は、凍結保存液が凍結し細胞が凍結保存可能であれば特に限定されず、通常−２０℃以下であり、好ましくは−８０℃以下、必要により−１９６℃以下である。
【００３２】
本発明において、「ジメチルスルホキシド代替物」とは、従来の細胞の凍結保存液では凍結保護作用として有効な量のジメチルスルホキシドを必須の成分としていたことから、そのジメチルスルホキシドの全部または一部の代わりに使用でき、ジメチルスルホキシドと同様の効果を奏しうる成分を意味する。
【００３３】
本発明において、「有効成分とする」とは、本発明による凍結保存液が、所望の細胞の凍結保護効果を発揮するのに充分な量（すなわち、有効量）のフルクタンを含有することをいう。
【００３４】
したがって、フルクタンのみを含む水溶液や緩衝液を、そのまま凍結保存液として用いてもよいが、凍結保護に有効な量で有効成分を含み、かつ凍結保護効果を損なわない限りにおいて、本発明による凍結保存液は、必要に応じて他の添加剤を含んでなることができる。このような添加剤としては、例えば、他の凍結保護成分、賦形剤、結合剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、ｐＨ調整剤、保湿剤、防腐剤が挙げられる。
【００３５】
本発明による凍結保存液は、好ましくは、フルクタンが、動物由来の血清としての効果も有する（特開２００８−２２８５８７号公報参照）点で、無血清である。本発明において、「無血清」とは、動物に由来の血清または血清由来成分を、凍結保存液が含まないことをいう。
【００３６】
フルクタン
本発明において、フルクタンとは、フルクトースを主成分とする多糖であり、主に微生物および植物内に存在している。
【００３７】
フルクタンとしては、例えば、キク科、ユリ科、アヤメ科、ラン科植物の根、根茎、殻物などに存在している、イヌリン型フルクタン（Ｄ−フラクトフラノースのβ２→１結合により構成されている）、禾本科植物の葉や茎などに存在し、または細菌の作用によりショ糖から生産される細菌分泌多糖である、レバン型フルクタン（Ｄ−フラクトフラノースのβ２→６結合により構成されている）、またはラッキョウ、ニンニク、タマネギなどのネギ属植物に存在する、β２→６結合とβ２→１結合が混合している、フルクタン（特許第３１１１３７８号公報参照）が知られている。
【００３８】
本発明のフルクタンとは、
フルクトースのβ２→１グルコシド結合による直鎖状重合体を主鎖とする、イヌリン型フルクタン、
フルクトースのβ２→６グルコシド結合による直鎖状重合体を主鎖とする、レバン型フルクタン、
フルクトースのβ２→１およびβ２→６の両グルコシド結合を含む重合体を主鎖とする、フルクタン、および
これらのフルクタンの加水分解物
からなる群から選択される一種以上のものである。
【００３９】
フルクタンの加水分解物とは、フルクタンの非加水分解物を、慣用の手段、例えば、熱、酸、アルカリ、または酵素等を利用することにより加水分解を施して得ることができるものである。
【００４０】
フルクタンおよびフルクタンの加水分解物の重合度は、細胞の凍結保護効果を有する限り特に限定されず、例えば、重合度２０〜１０００（分子量４〜１８０ｋＤａ）、好ましくは、重合度３０〜６００（分子量５〜１１０ｋＤａ）である。この重合度および分子量は、分子量の測定方法、分子量マーカーおよび分析条件の違いによって、測定結果が変動することがあるため、これに限定されるものではない。
【００４１】
フルクタンおよびフルクタンの加水分解物の分子量の測定方法としては、特に限定されず、例えば、ＨＰＬＣによるゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＦＣ）分析、またはゲル浸透クロマトグラフ（ＧＰＣ）分析が挙げられる。具体的には、下記実施例に記載する、プルランを標準物質として用いるＧＦＣ分析による測定方法が挙げられる。
【００４２】
本発明で用いるフルクタンとしては、天然物由来のものであっても、慣用の化学的または遺伝子工学的手法により人工的に合成されたものであってもよい。フルクタンは、好ましくは、微生物由来、植物由来などの天然物であり、より好ましくは、植物の根または根茎由来である。
【００４３】
フルクタンを産生する微生物としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌などが挙げられる。
【００４４】
フルクタンを含む植物としては、ラッキョウ、ニンニク、タマネギ、ワケギ、リーキなどのネギ科植物、キクイモ、ダリア、ゴボウ、アザミ、タンポポ、アーティチョーク（チョウセンアザミ）、チコリー、ヤーコンなどのキク科植物、サヤマメ、クズイモなどのマメ科植物、コムギ、ライムギなどのイネ科植物、アスパラガスなどのユリ科植物、ヤムイモなどのヤマノイモ科、リュウゼツランなどのリュウゼツラン科植物、アヤメ科植物、ラン科植物などが挙げられる。フルクタンを含む植物は、好ましくは、ネギ属植物、アヤメ科、イネ科、キク科、ユリ科、ラン科植物であり、より好ましくは、根または根茎由来のフルクタンの構造が複雑であり、かつ様々な生理活性を示し得るという点で、ラッキョウ、ニンニク、タマネギなどのネギ属植物である。
【００４５】
本発明で用いるフルクタンは、植物の抽出物として提供されてもよい。
【００４６】
本発明で用いるフルクタンの抽出方法および調製方法は、特に限定されない。例えば、天然物の場合、熱水を用いて抽出し、その後、液体クロマトグラフィーなどの技法により調製してもよい。また、特許第３１１１３７８号公報に記載の方法や、その他当業者に公知な方法により調製してもよい。さらに、フルクタンは市販のものを用いてもよく、例えば、三里浜特産農業協同組合製のフルクタンが挙げられる。
【００４７】
本発明で用いるフルクタンの純度は、特に限定されず、必要に応じて高純度に精製することができる。精製方法としては、例えば、特許第３１１１３７８号公報に記載のような、フルクタンを含んでなる植物抽出物を、エタノールやアセトンを用いてフルクタンを沈殿させる方法や、分子量１００〜１００，０００で分離可能な限外濾過膜、好ましくは分子量５００〜２，０００で分離可能な限外濾過膜を用いて、低分子不純物を除去する方法が挙げられる。
【００４８】
本発明による細胞凍結保存液中におけるフルクタンの含有量は、好ましくは、終濃度が、０．１〜７５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは５〜６０％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは１０〜６０％（ｗ／ｖ）、特に好ましくは２０〜６０％（ｗ／ｖ）、最も好ましくは２０〜５０％（ｗ／ｖ）となるような量である。ここで、本発明の細胞凍結保存液中におけるフルクタンの含有量を測定する方法は、糖の検出に用いられる方法であれば、特に限定されず、例えば、分光光度計を用いるフェノール硫酸法（中村道徳、貝沼圭二編、生物化学実験法１９  澱粉・関連糖質実験法、学会出版センター参照）が挙げられる。
【００４９】
本発明による凍結保存液は、好ましくは、凍結保護作用として有効な量のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含まないものである。
【００５０】
ここで、有効な量のジメチルスルホキシドとは、ジメチルスルホキシドが細胞の凍結保護効果を十分に発揮できる量をいう。本発明による細胞凍結保存液中における有効な量でないジメチルスルホキシドの含有量は、終濃度が、好ましくは０．１〜１０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは０．１〜５％（ｖ／ｖ）、さらに好ましくは０．１〜４％（ｖ／ｖ）、特に好ましくは０．１〜３％（ｖ／ｖ）、より特に好ましくは０．１〜２％（ｖ／ｖ）、最も好ましくは０．１〜１％（ｖ／ｖ）となるような量である。このような量であると、ジメチルスルホキシドは、凍結保存液中に含まれていたとしても、細胞凍結保護効果を奏することはできない一方で、凍結保存液中のフルクタンがその効果を奏することになり、ジメチルスルホキシドはフルクタンの効果を増強することができる。
【００５１】
本発明の凍結保存液は、必要に応じて、滅菌することができる。滅菌方法としては、例えば、濾過滅菌、高圧蒸気滅菌、紫外線滅菌、電子線滅菌、γ線滅菌が挙げられる。滅菌方法は、好ましくは、フルクタンが熱に強く、より確実性の高い滅菌ができる点で、高圧蒸気滅菌である。
【００５２】
追加の凍結保護成分
本発明による凍結保存液は、好ましくは、エチレングリコール、プロピレングリコール、またはこれらの混合物を有効成分としてさらに含んでなる。フルクタンに加えて、エチレングリコールやプロピレングリコールを含むことは、凍結保存液が、ジメチルスルホキシドを使用することなく、充分な細胞の凍結保護効果を発揮する上で有利である。
【００５３】
本発明による細胞凍結保存液中におけるエチレングリコールの含有量は、好ましくは、終濃度が、０．１〜２０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは１〜１０％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは２．５〜１０％（ｗ／ｖ）、特に好ましくは２．５〜５％（ｗ／ｖ）となるような量である。
【００５４】
本発明による細胞凍結保存液中におけるプロピレングリコールの含有量は、好ましくは、終濃度が、０．１〜２０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは、１〜１０％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは１〜７％（ｗ／ｖ）、特に好ましくは１〜４％（ｗ／ｖ）、最も好ましくは２〜４％（ｗ／ｖ）となるような量である。
【００５５】
他の凍結保護成分
本発明よる凍結保存液は、他の細胞保護成分をさらに含んでなることができる。ここで、他の細胞保護成分としては、例えば、グリセロール、キシリトール、エリスリトール、グリセリン、ジグリセリン、ジプロピレングリコール、ソルビット、ソルビット酸、トリエチレングリコール、乳糖、ショ糖、バチルグリコール、１，３−ブチレングリコール、ブドウ糖、プロピレングリコール、ヘキシレングリコール、ポリエチレングリコール２００〜２００００、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレングリコール４００〜１２００、マルチトール、Ｄ−マンニット、トレハロース、グルコシルトレハロース、ヒアルロン酸、アミノブリン酸、アミノ酸などからなる群より選択されるものである。これらは２種以上を併用してもよい。
【００５６】
本発明による凍結保存液中における他の細胞保護成分の含有量は、使用する成分の種類により適宜変更することが可能であるが、好ましくは、終濃度が１〜４０重量％、より好ましくは、２〜２０重量％となるような量である。
【００５７】
溶媒成分
本発明による凍結保存液における主溶媒は、水またはアルコール系溶媒であり、好ましくは水である。溶媒は、生理食塩水などの等張液や、緩衝液であることができる。緩衝液は、緩衝剤成分を含み、ここで、緩衝剤の成分は、細胞凍結保存液のｐＨが室温（例えば２５℃）において細胞と等張でかつｐＨ５．０〜９．０、好ましくはｐＨ６．５〜７．５となる溶液状態のものであれば、特に限定されない。緩衝剤の成分の具体例としては、ハンクス液、リン酸系（例えばリン酸緩衝液：ＰＢＳ）、ＢＥＳ、ＴＥＳ、アセトアミドグリシン、グリシンアミド、グリシルグリシン、ＴＲＩＣＩＮＥ、トリスエタノールアミン、ベロナール、およびＨＥＰＥＳが挙げられる。緩衝剤の成分は、好ましくは、ＰＢＳ、ＴＲＩＣＩＮＥ、およびＨＥＰＥＳからなる群より選択され、より好ましくは、ＰＢＳである。
【００５８】
細胞の凍結保存
本発明による凍結保存液は、細胞の凍結保存処理において使用される。すなわち、細胞の凍結保存処理を行う際に、将来解凍して使用することを目的とする細胞を、溶液状態とした本発明による溶液中に入れて懸濁し、これを凍結保存する条件下に保持して凍結させる。細胞が必要になったとき、凍結した細胞および凍結保存液を解凍処理した後、そこから細胞を回収することができる。
【００５９】
本発明において、「細胞の凍結保存」とは、継代培養することなしに細胞を長期間維持する目的で、細胞を凍結させて保存することをいう。したがって、本発明によれば、本発明による凍結保存液中に目的細胞を入れ、これを凍結保存することを含んでなる、細胞の凍結方法が提供される。
【００６０】
ここで、凍結保存液中に目的細胞を入れる際、その濃度は、１万〜１０００万ｃｅｌｌｓ／ｍｌであることが望ましい。
【００６１】
ここで、凍結方法および保存方法その後の解凍方法は、細胞を害する条件でない限りは、特に限定されない。
【００６２】
細胞の凍結方法は、例えば、目的細胞を、本発明による凍結保存液中に入れて懸濁し、凍結チューブに入れて、−４０℃以下の超低温フリーザーに入れること、液体窒素によって急速冷却すること、または凍結チューブをプログラムフリーザーに入れて細胞を緩慢凍結することが挙げられる。好ましくは、目的の細胞を懸濁した凍結保存液を、液体窒素によって急速冷却することを含んでなる凍結保存方法である。
【００６３】
凍結した細胞の保存方法は、例えば、凍結させた温度にそのまま保持すること、またはプログラムフリーザーで凍結させた場合では、その後液体窒素中に保持することが挙げられる。
【００６４】
細胞を解凍する方法としては、例えば、凍結保存されたチューブを３７℃以下の水浴中に入れることにより融解させ解凍することが挙げられる。
【００６５】
本発明において、「細胞」とは、凍結保存に付されることがある細胞であれば、特に限定されず、微生物、細菌、動物細胞、植物細胞のいずれも用いることができる。細胞は、好ましくは動物細胞であり、例えば、ヒトを含む哺乳動物（マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒトなど）、鳥類（ニワトリ、ダチョウなど）、爬虫類（ワニなど）、両生類（カエルなど）、魚類（ゼブラフィッシュ、メダカなど）などの脊椎動物、昆虫（蚕、蛾、ショウジョウバエなど）などの非脊椎動物の細胞が挙げられる。本発明で対象とされる細胞は、より好ましくは哺乳類細胞である。
【００６６】
本発明における細胞は、培養細胞として株化された細胞、生物組織から得られる株化されていない正常細胞、遺伝子工学的手法により得られた形質転換細胞など、いずれの形式のものであってもよい。例えば、ＢＨＫ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＭＧ６３細胞、ＣＨＯ細胞、ハイブリドーマなどの癌細胞を含む培養細胞株であってもよく、繊維芽細胞、間葉系幹細胞、生殖細胞や受精卵、胚などの個体や組織より単離された細胞であってもよく、さらには膵ランゲルハンス島のような細胞集合体、組織または組織片であってもよい。
【実施例】
【００６７】
以下、実施例を示してこの出願の発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００６８】
例１：フルクタンの調製方法（小規模）
冷凍ラッキョウ５００．１ｇ（三里浜特産農協より入手）に対し１．５倍量の水を加え、フードカッター（愛工舎製作所製）でホモジナイズした後、綿布を用いて絞り、絞り汁を回収した。絞り粕に対し１．５倍量の水を加え、ホモジナイズした後、再度絞り汁を回収し、先の絞り汁と合わせた。得られた絞り汁を、ｐＨ１０になるまで５％水酸化カルシウム溶液を添加した後、炭酸ガスを通しｐＨ６．９まで中和した。中和した絞り汁を、沸騰水中で、液温が８０℃に達してから２０分間加熱（蒸煮）した。得られた絞り汁を、冷却後、濾紙（アドバンテック製  Ｎｏ．２）を用いて濾過した。濾液に対し、１／７量の活性炭（粒状活性炭、松葉薬品製）を添加し、一晩放置後、珪藻土（ナカライテスク製）で濾過し活性炭の除去を行った。
【００６９】
粉末化
得られた濾液１１００ｍｌに対しエタノール５０００ｍｌを加えてフルクタンを沈殿させた。得られた沈殿物を、デカンテーションにより回収し、水に再溶解した溶液を、一晩、４℃で、透析（透析膜１−７／８、分画分子量１２，０００〜１４，０００、三光純薬株式会社より入手）した後、凍結乾燥して、フルクタン粉末５９．０３ｇを得た。
【００７０】
例２：フルクタンの調製方法（大規模）
原料としての乾燥ラッキョウ２００．７ｋｇ（威斯食品工業より入手）を、２ｍｍ以下程度に粉砕し、２．７６ｋｇの水酸化カルシウムを懸濁させた抽出用の水に混合し、１時間、常温抽出を行い、１時間、９５℃で加熱抽出し、一晩、６０℃で加熱抽出した後、活性炭１００ｋｇ（粉末状活性炭、日本エンバイロケミカルズ製）を添加して脱臭処理を行った。その後、珪藻土（中央シリカ株式会社より入手）で濾過し、残渣と活性炭を除去した。
【００７１】
（１）限外濾過膜精製
得られた抽出液を、限外濾過膜モジュールＮＴＲ−７４３０ＨＧ−Ｓ４Ｆ（日東電工社製）に通液させて、フルクタンの精製を行った。
【００７２】
得られた精製液は、一端加熱殺菌した後、活性炭１０ｋｇを添加して再度脱色処理を行った。その後、精製液を、減圧濃縮し、８５℃で１時間加熱することにより殺菌し、噴霧乾燥により粉末化を行ったところ、精製フルクタン粉末９１．６ｋｇを得た。
得られた精製フルクタン粉末は、フルクタン含量測定、分子量分布の分析を行った。
【００７３】
フルクタン含量（純度）測定
フルクタン含量は、フルクタンを加水分解し、得られた果糖の量から算出した。
加水分解の手順としては、希釈した抽出液に１０％（ｗ／ｖ）クエン酸溶液を添加してｐＨ３．０以下に調整し、１００℃で１５０分間加熱を行った後、１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液で中和し、定容した。その後、Ｆ−キット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて、加水分解物の果糖含量と、加水分解前の抽出液の果糖含量およびスクロース含量とを測定し、下記式により、フルクタン含量を算出した。
フルクタン含量＝０．９×（加水分解後果糖含量−加水分解前果糖含量−（加水分解前スクロース含量×１８０．１６／３４２．３））
【００７４】
Ｆ−キットにより果糖含量およびスクロース含量を計測する際の吸光度の測定（３４０ｎｍ）には、島津製作所製の分光光度計（ＵＶｍｉｎｉ−１２４０）を使用した。粉末化した試料については、予め適量の脱イオン水に溶解させた後、抽出液と同様に分析を行った。
【００７５】
分子量分布の分析
フルクタンの分子量分布の分析は、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）を用いて行った（ＧＦＣ分析）。分析条件は下記の通りである。
分析用の試料は、抽出液または粉末を０．２ｍｏｌ／Ｌの硝酸ナトリウム溶液で希釈したものを、０．４５μｍのメンブレンフィルター（ミニザルトＲＣ、ザルトリウス・ステディム製）で濾過したものを用いた。
【００７６】
〔フルクタン分子量ＨＰＬＣ分析条件〕
装置          ：ＣＣＰ＆８０２０シリーズ（東ソー製）
カラム        ：ＴＳＫ  ｇｕａｒｄｃｏｌｕｍｎ  ＰＷＸＬ，ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ４０００  ＰＷＸＬ，Ｇ３０００  ＰＷＸＬ，Ｇ２５００  ＰＷＸＬ（東ソー製）
検出器        ：示差屈折計ＲＩ−８０２０（東ソー製）
溶離液        ：０．２Ｍ硝酸ナトリウム溶液
流速          ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
アプライ量    ：１００μｌ
カラム温度    ：４０℃
分子量マーカー：プルラン（Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＴＡＮＤＡＲＤ  Ｐ−８２、昭和電工社製）
【００７７】
測定の結果、得られた精製フルクタン粉末のフルクタン含量は、９２．６％であった。これは、後述する限外濾過膜処理による精製を行わない製法により調製されたフルクタン粉末の含量８１．５％を大きく上回っていた。また、フルクタン分子量は、６，０００〜１１０，０００Ｄａ付近に広い分布を示していた（図１参照）。
【００７８】
（２）エタノール沈殿による精製
限外濾過膜処理を行わない製法でフルクタンを調製し、エタノール沈殿による精製を検討した。
【００７９】
ｉ）限界濾過膜処理を行わない製法によるフルクタンの調製
原料としての乾燥ラッキョウ５００ｋｇ（威斯食品工業より入手）を、粒径２ｍｍ以下程度に粉砕し、６．９ｋｇの水酸化カルシウムを懸濁させた抽出用の水（原料に対して１０倍量）に混合し、１時間、常温抽出を行い、１時間、９５℃で加熱抽出し、３時間、６０℃で加熱抽出した後、抽出液に活性炭２５０ｋｇ（粉末状活性炭、日本エンバイロケミカルズ製）を添加し、１時間撹拌し、活性炭処理を行った。その後、４０〜４５℃の温度を維持しながら珪藻土（中央シリカ株式会社より入手）で濾過した。次に抽出液を減圧濃縮処理し、濃縮抽出液を８５℃で１時間加熱殺菌し、加熱後の濃縮抽出液を噴霧乾燥して、フルクタンを含有する粉末を２５４ｋｇ得た（フルクタン含量８１．５％）。
【００８０】
ｉｉ）エタノール沈殿
フルクタンの２０％溶液（前記ｉ）で得られた粉末を水に溶解したもの）を下記表１の量でエタノールに添加し、フルクタンを沈殿させた。珪藻土濾過により沈殿を回収し、水に再溶解させた後、再度濾過して得られた精製液を、凍結乾燥により粉末化した。各精製粉末のフルクタン含量とフルクタン分子量を前述の方法にて分析した結果を下記の表１および図２に示す。
【００８１】
【表１】
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【００８２】
例３：フルクタンの凍結保護効果
動物細胞の凍結保存に対して、フルクタンの細胞保護効果を検証した。
【００８３】
凍結保存液の調製
リン酸緩衝液（ＰＢＳ）（リン酸濃度９．５ｍＭ、ｐＨ７．６）に、終濃度が１０％（ｖ／ｖ）になるようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（和光純薬工業株式会社より入手）を添加し、さらにこれに対し終濃度が１０％（ｗ／ｖ）になるように例２（１）で調製したフルクタン粉末を添加したものを凍結保存液として用いた。対照凍結保存液として、１０％のＤＭＳＯを含むリン酸緩衝液を用いた。
【００８４】
凍結保存試験
試験には、０．１％ＢＳＡを添加したＡＳＦ１０４培地（味の素社製）で培養したマウスハイブリドーマ細胞２Ｅ３−Ｏ株を用いた。
各凍結保存液に、上記細胞を細胞濃度が約１．０×１０６cells／ｍｌとなるように懸濁し、これをそれぞれ凍結チューブ（住友ベークライト社製）に１ｍｌずつ入れた。次いで、凍結チューブを、−８０℃フリーザーを用いて、７日間、保存した後、３７℃水浴にチューブを漬けて解凍した。
解凍した細胞を、０．１％ＢＳＡを添加したＡＳＦ１０４培地（味の素社製）にて２０時間培養した後、トリパンブルー色素排除法により、生細胞密度と死細胞の密度とを測定し、下記式により、各凍結保存液についての生存率を算出した。
生存率＝生細胞密度／（生細胞密度＋死細胞の密度）×１００％
その結果を表２に示す。
【００８５】
【表２】
0005867912.tif 000003
【００８６】
例４：構造および抽出方法の異なるフルクタンを用いた凍結保護効果の検証
【００８７】
４−１  構造の異なるフルクタンを用いた凍結保護効果の検証
リン酸緩衝液に、終濃度が１０％（ｖ／ｖ）になるようにＤＭＳＯを添加し、さらにこれに対し終濃度が０．１％（ｗ／ｖ）になるように、レバン（和光純薬工業株式会社より入手）、イヌリン（シグマ社より入手）、上記例１にて調製したフルクタンをそれぞれ添加したものを凍結保存液として用いた。対照凍結保存液として、終濃度１０％（ｖ／ｖ）となるようにＤＭＳＯを添加したリン酸緩衝液を用いた。
凍結保存液および解凍後の培養時間を３日間に変更した以外は、例３と同様に試験し、各凍結保存液の生存率を算出した。
その結果を下記の表３に示す。
【００８８】
【表３】
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【００８９】
４−２  抽出方法の異なるフルクタンを用いた凍結保護効果の検証
リン酸緩衝液に、例２（１）で調製したフルクタン粉末（純度９２．６％）、または抽出時にｐＨ５．１〜５．４の条件下で一晩加熱させて低分子化させたフルクタン（低分子化フルクタン）を、溶媒量に対して３０％（ｗ／ｖ）となるように添加したもの（例えば、フルクタン粉末の場合は、ＰＢＳ１００ｍｌにフルクタン粉末３０ｇを添加したもの（フルクタン粉末添加濃度３０％））を凍結保存液として用いた。対照凍結保存液として、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＢＩＯＷＥＳＴ社）に、終濃度１０％（ｖ／ｖ）となるようにＤＭＳＯを添加したものを用いた。
凍結保存液および解凍後の培養時間を６５時間に変更した以外は、例３と同様に試験し、各凍結保存液の生存率を算出した。
その結果を下記の表４に示す。
【００９０】
【表４】
0005867912.tif 000005
【００９１】
フルクタンの終濃度の測定
（１）純度を用いた測定
フルクタン粉末添加濃度３０％におけるフルクタンの終濃度は、２５ｍｌのＰＢＳ溶液にフルクタン粉末７．５ｇを溶解したところ、総量２９．８ｍｌであり、フルクタン粉末の純度が９２．６％であったことから、概算上２３．３％（ｗ／ｖ）であった。
【００９２】
（２）フェノール硫酸法
前記フルクタン粉末添加濃度３０％の終濃度を、フェノール硫酸法でも測定した。
凍結保存液１００μｌと、５％（Ｗ／Ｖ）フェノール１００μｌとを試験管で混合し、撹拌した。混合液に硫酸５００μｌを加え、良く撹拌させた後、４０℃の恒温槽１５分間反応させ、反応液を４９０ｎｍで吸光度を測定した。その結果、フルクタン粉末添加濃度３０％の終濃度は、２４．０％（ｗ／ｖ）となった。
【００９３】
例５：フルクタン濃度の検証
リン酸緩衝液に、例２（１）にて調製したフルクタンを、それぞれ溶媒量に対して１５、３０、４５、６０、７５％（ｗ／ｖ）となるように添加したもの（例えば、フルクタン１５％の場合は、ＰＢＳ１００ｍｌにフルクタン１５ｇを添加したもの（フルクタン添加濃度１５％））を凍結保存液として用いた。対照凍結保存液として、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）に、終濃度１０％（ｖ／ｖ）となるようにＤＭＳＯを添加したものを用いた。
凍結保存液および解凍後の培養時間を６８時間に変更した以外は、例３と同様に試験し、各凍結保存液の生存率を算出した。
その結果を下記の表５に示す。
【００９４】
【表５】
0005867912.tif 000006
【００９５】
さらに、リン酸緩衝液に、例２（１）にて調製したフルクタンを、それぞれの溶媒量に対して２５、３０、３５、４０、４５、５０％（ｗ／ｖ）となるように添加したものを凍結保存液として用いた。対照凍結保存液として、フルクタン無添加のリン酸緩衝液およびウシ胎児血清に、終濃度１０％となるようにＤＭＳＯを添加したものを用いた。
凍結保存液および解凍後の培養時間を６５時間に変更した以外は、例３と同様に試験し、各凍結保存液の生存率を算出した。
その結果を下記の表６に示す。
【００９６】
【表６】
0005867912.tif 000007
【００９７】
例６：凍結保存液の検討
リン酸緩衝液に、濃度０、１．０、３．０、５．０、１０％（ｖ／ｖ）となるようにＤＭＳＯを添加し、さらにこの混合溶媒に対して４０％（ｗ／ｖ）となるように例２（１）にて調製したフルクタンを添加したもの（例えば、ＤＭＳＯ５．０％の場合は、ＰＢＳ９５ｍｌにＤＭＳＯ５ｍｌを添加し、さらにフルクタン４０ｇを添加し、濾過滅菌したもの（ＤＭＳＯ５．０％、フルクタン添加濃度４０％））を凍結保存液として用いた。対照凍結液として、ウシ胎児血清に、終濃度１０％（ｖ／ｖ）となるようにＤＭＳＯを添加したものを用いた。
凍結保存液および解凍後の培養時間を４２時間に変更した以外は、例３と同様に試験し、各凍結保存液の生存率を算出した。
その結果を下記表７に示す。
【００９８】
【表７】
0005867912.tif 000008
【００９９】
例７：エチレングリコールとフルクタンとを含んでなる凍結保存液の検討
リン酸緩衝液に、濃度０、２．５、５．０、７．５、１０％（ｖ／ｖ）となるようにエチレングリコール（ＥＧ）（０５８−００９８６、和光純薬工業株式会社より入手）を添加し、さらにこの混合溶媒に対して３０％（ｗ／ｖ）となるように例２（１）にて調製したフルクタンを添加したもの（例えば、ＥＧ５．０％の場合は、ＰＢＳ９．５ｍｌにＥＧ０．５ｍｌを添加し、さらにフルクタン３ｇを添加し、濾過滅菌したもの（ＥＧ５．０％、フルクタン添加濃度３０％））を凍結保存液として用いた。対照凍結液として、ウシ胎児血清に、終濃度１０％（ｖ／ｖ）となるようにＤＭＳＯを添加したものを用いた。
凍結保存液および解凍後の培養時間を３７時間に変更した以外は、例３と同様に試験し、各凍結保存液の生存率を算出した。
その結果を下記表８に示す。
【０１００】
【表８】
0005867912.tif 000009
【０１０１】
また、添加するエチレングリコールの濃度は、２．５％未満では、凍結保護効果が十分でなく、１５％以上となると、生細胞密度の減少が生じた。
【０１０２】
例８：プロピレングリコールとフルクタンとを含んでなる凍結保存液の検討
リン酸緩衝液に、濃度０、１．０、２．０、４．０、８．０％（ｖ／ｖ）となるようにプロピレングリコール（ＰＧ）（１６４−０４９９６、和光純薬工業株式会社より入手）を添加し、さらにこの混合溶媒に対して３０％（ｗ／ｖ）となるように例２（１）にて調製したフルクタンを添加したもの（例えば、ＰＧ５．０％の場合は、ＰＢＳ９．５ｍｌにＰＧ０．５ｍｌを添加し、さらにフルクタン３ｇを添加し、濾過滅菌したもの（ＰＧ５．０％、フルクタン添加濃度３０％））を凍結保存液として用いた。対照凍結液としては、ウシ胎児血清に、終濃度１０％（ｖ／ｖ）となるようにＤＭＳＯを添加したものを用いた。
凍結保存液および解凍後の培養時間を３７時間に変更した以外は、例３と同様に試験し、各凍結保存液の生存率を算出した。
その結果を下記表９に示す。
【０１０３】
【表９】
0005867912.tif 000010
【０１０４】
また、添加するプロピレングリコールの濃度は、８．０％以上となると生細胞密度の減少が生じた。
【０１０５】
例９：ＣＨＯ細胞への凍結保護効果
下記の表１０記載の組成で凍結保存液を調製した。なお、フルクタンは、例２（１）にて調製したフルクタンを用いた。
試験には、無血清培地ＩＳ  ＣＤ−ＣＨＯ（ＩＳジャパン社製）にグルタミン２ｍＭを添加した培地で培養したＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）ＤＰ−１２細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより入手）を用いた。
各凍結保存液に、上記細胞を細胞濃度が約１．０×１０６cells／ｍｌとなるように懸濁し、これをそれぞれ凍結チューブ（住友ベークライト社製）に１ｍｌずつ入れた。次いで、凍結チューブを、−８０℃フリーザーを用いて、数日間（６日間）保存した後、３７℃水浴にチューブを漬けて解凍した。
解凍した細胞を、無血清培地ＩＳ−ＣＨＯ−ＣＤ（ＩＳジャパン社製）にて４日間培養した。各凍結保存液について、解凍直後、２日後、４日後の生細胞数と死細胞数をトリパンブルー色素排除法により測定した。
その結果を図３に示す。
【０１０６】
【表１０】
0005867912.tif 000011
【０１０７】
例１０：間葉系幹細胞への凍結保護効果
下記の表１１記載の組成で凍結液を調製した。なお、フルクタンは、例２（１）にて調製したフルクタンを用いた。
試験には、１５％ＦＢＳ（ＢＩＯＷＥＳＴ社より入手）を添加したα−ＭＥＭ培地（ギブコ社より入手）で培養した、ウイスターラット（三協ラボサービスより入手）から単離した骨髄由来の間葉系幹細胞を用いた。
各凍結保存液に、上記細胞を細胞濃度が約１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように懸濁し、これをそれぞれ凍結チューブ（住友ベークライト社製）に１ｍｌずつ入れた。次いで、凍結チューブを、−８０℃フリーザーを用いて、５日間保存した後、３７℃水浴にチューブを漬けて解凍した。
解凍した細胞を、ＦＢＳを１５％含むα−ＭＥＭにて３日間培養した。各凍結保存液について、解凍直後、１日後、２日後、３日後の生細胞数と死細胞数をトリパンブルー色素排除法により測定した。
その結果を図４に示す。
【０１０８】
【表１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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