(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
規定された人為的環境において新しい幹細胞系を生成するための方法であって、
コーティングを含む基材を提供することであって、該コーティングは、完全な組換えラミニン−５１１（ＬＮ−５１１又はラミニン−１０）のみを含み、タンパク質もフィーダー細胞も含まない、こと、
ヒト幹細胞を該コーティング上にプレーティングすること、
該ヒト幹細胞を、４０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸および９６ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含み、フィーダー細胞を含まない既知組成培地に曝露すること、及び
該ヒト幹細胞の増殖物から新しい幹細胞を得ること
を含む、方法。
【請求項２】
前記新しい幹細胞が非分化である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記新しい幹細胞が均質である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒト幹細胞が前記コーティング上に単層を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒト幹細胞が非分化胚性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記新しい幹細胞を収集すること、
前記コーティングを含む第２の基材上に該新しい幹細胞を再度プレーティングすること、
該新しい幹細胞を、４０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸および９６ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含み、フィーダー細胞を含まない既知組成培地に曝露すること、及び
該新しい幹細胞の増殖物から精製幹細胞を得ること
を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記培地が増殖因子を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記培地がヒトアルブミンを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
自己複製する多能性ヒト幹細胞を維持するための方法であって、
コーティングを含む基材を提供することであって、該コーティングは、完全な組換えラミニン−５１１（ＬＮ−５１１又はラミニン−１０）のみを含み、動物タンパク質もフィーダー細胞も含まない、こと、
ヒト幹細胞を前記コーティング上にプレーティングすること、
該ヒト幹細胞を、４０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸および９６ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含み、フィーダー細胞を含まない既知組成培地に曝露すること、及び
該幹細胞を定期的に収集し、再度プレーティングすること
を含む、方法。
【請求項１０】
前記培地が増殖因子を更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記培地がヒトアルブミンを更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記コーティングが完全な組換えラミニン−５１１からなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
インビトロで成長した多能性ヒト幹細胞の自己複製を可能にするための組成物であって、
基材、
完全な組換えラミニン−５１１（ＬＮ−５１１又はラミニン−１０）のみを含み、動物タンパク質もフィーダー細胞も含まない、コーティング、及び
４０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸および９６ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含み、フィーダー細胞を含まない既知組成培地
を含む、組成物。
【請求項１４】
前記培地が増殖因子を更に含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記培地がヒトアルブミンを更に含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記コーティングが完全な組換えラミニン−５１１からなる、請求項１３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２００７年１月４日に出願した米国仮出願第６０／８８３，４０６号に対する優先権を主張する２００８年１月４日に出願した米国特許出願第１１／９６９，６２０号の一部継続出願である２０１０年３月１７日に出願した米国特許出願第１２／７２５，８７７号に対する優先権を主張する。
【０００２】
これらの出願のすべてを参照によりその全体を本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００３】
背景
本開示は、種々の例示的実施形態において、一般に、インビトロで成長した多能性又は未分化ヒト幹細胞の接着、増殖及び自己複製（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ）維持を可能にする組成物及び方法に関する。これらのヒト幹細胞としては、胚性幹細胞、骨髄幹細胞及び多能性幹細胞が挙げられる。
【０００４】
幹細胞は、未分化細胞であり、分化した細胞がその後にそれから誘導される。胚性幹細胞は、広範な自己複製能力及び多能性を有し、全３種類の胚葉の細胞に分化する潜在能力を有する。それらは治療目的に有用であり、組織置換療法、薬物スクリーニング、機能ゲノミクス及びプロテオミクスのための細胞の無限の供給源を提供することができる。（非特許文献１）。
【０００５】
ヒト胚性細胞は、インビトロで多能性状態で維持するためにフィーダー細胞を必要とし、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）上で培養するときにはＮｏｇｇｉｎのような分化阻害剤及び／又は高用量の塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を必要とする（概説については、非特許文献１を参照されたい）。しかし、フィーダー細胞の使用は幾つかの欠点を有する。例えば、フィーダー細胞は、幹細胞に感染し得るウイルスなどの病原体を含む可能性がある。（非特許文献２；非特許文献１）
ヒト胚性幹細胞の自己複製を支援するフィーダー細胞のないシステムは、接着剤基層としてｉ）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（非特許文献３）；（非特許文献４）；（非特許文献５）、又はｉｉ）マウスフィーダー細胞由来の細胞外マトリックス（非特許文献６）を必要とする。しかし、これらのコーティングは、異種起源であり、したがってＦＤＡ要件に従って診療に使用することができない（非特許文献２）。これらのコーティングは、明確なシステム及び非免疫原性の判定基準を満たすこともできない。その重要性は、（非特許文献２；非特許文献１）で考察されている。
【０００６】
上記問題のために、化学的に明確であり、異種を含まない、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞培養環境の開発は、重要な目標である。この点に関して、ｈＥＳ細胞増殖用基層の探索は、特に重要である。細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質、特に基底膜（ＢＭ）成分は、人体における分化、表現型維持並びに多数のタイプの体細胞及び幹細胞の機能のためのｉｎ  ｖｉｖｏ微小環境の重要な部分を構成し、したがって、ある細胞型の自己複製の可能性を有する。基底膜タンパク質のうち、ラミニンは、細胞分化、接着、増殖及び移動に影響を及ぼすことが示された。
【０００７】
ほ乳動物の胚発生の間、受精した卵母細胞は、まず２個の細胞に分裂し、続いて別の細胞を複製して４細胞胚を生成する。４細胞段階では、胚性細胞は、細胞膜タンパク質及び新しい結合組織（細胞外マトリックス）の分子の助けを借りて互いに結合する。出現する最初の細胞外マトリックス分子は、ラミニン、プロテオグリカンなどの基底膜タンパク質である。続いて、胚性細胞は、３種類の生殖細胞層、すなわち外胚葉、内胚葉及び中胚葉に分化し始め、形態形成が始まる。ラミニンなどの細胞外マトリックス分子は、細胞表面受容体との相互作用の原因であり、したがって接着、増殖、移動、分化などの細胞挙動を調節する（非特許文献７）。一方、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶ型コラーゲンなどの別の細胞外マトリックス成分は機械的支持機能に主に役立つ（非特許文献８）。
【０００８】
ラミニンは、アルファ、ベータ及びガンマ鎖で構成される大きい三量体細胞外マトリックスタンパク質である。ヒト組織においては少なくとも１５の異なる組合せで見いだされた、５本の異なるアルファ鎖、３本のベータ鎖及び３本のガンマ鎖が存在する（非特許文献７）；（非特許文献９）。これらの分子は、その歴史的発見に基づいてラミニン−１からラミニン−１５と称されるが、別の命名法は、その鎖組成に基づいてアイソフォーム、例えば、アルファ−１、ベータ−１及びガンマ−１鎖を含むラミニン−１１１（ラミニン−１）を記述する（ラミニン命名法：（非特許文献９））。
【０００９】
ラミニンアイソフォームは、種々の時空間的発現パターン並びに組織特異的位置及び機能を示す。すなわち、ＬＮ−２１１は、筋細胞及び運動ニューロンシナプスのＢＭ中に主に存在し、一方ＬＮ−１１１は、初期胚及びその後のある種の上皮細胞に限定される。ＬＮ−３３２は上皮下のＢＭ中に特異的に見いだされ、ＬＮ−４１１は内皮下のＢＭ中にある。ＬＮ−５１１は一様に分布し、初期胚のＢＭ及び大部分の成体組織のＢＭ中に見いだされた。多数のラミニン鎖の変異は、接合部型表皮水泡症（α３、β３、γ２鎖）及び先天性筋ジストロフィー（α２鎖）、ネフローゼ症候群（β２鎖）、毛細血管障害（α４鎖）などの重篤な疾患をもたらす。これらは、特定の組織における細胞系譜に対するその重大な機能的役割を示すものである。広範に分布するα５、β１及びγ１鎖の遺伝子の欠失は、マウスの死を招く。これは、生物体の発生に対するその本質的な役割を強調するものである。
【００１０】
ラミニンは、初期胚において同定された最初のＥＣＭタンパク質細胞であり、ラミニン鎖は、マウス胚の２細胞段階において細胞表面で検出された。胚盤胞の内部細胞塊は、ＥＳ細胞の天然の起源であり、ラミニンα５鎖を含むことが示された。
【００１１】
ＥＣＭタンパク質がインビトロでのｈＥＳ培養のコーティング基層として使用された多数の試験がある。しかし、これらの例では、ＥＣＭタンパク質の不明確な混合物若しくは不明確な培地が使用され、又はすべての必要なアッセイがなされる十分な時間実験が実施されなかった。これまで、ｈＥＳ細胞培養に使用された最も成功したフィーダー細胞のないコーティング材料はＭａｔｒｉｇｅｌ、すなわち、ネズミＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）肉腫組織から得られた複合腫よう・ＢＭ様抽出物である。Ｍａｔｒｉｇｅｌは、ネズミＬＮ−１１１、ＩＶ型コラーゲン、パールカン及びニドジェンを主に含むが、増殖因子（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）及び細胞タンパク質を含めて異なる量の別の材料も含み、したがって、その組成は不明確であり、バッチごとに異なる。この可変性のために、科学的結果を再現することができず、さらに、動物起源の基層という理由から、Ｍａｔｒｉｇｅｌは、ヒト細胞療法のためのｈＥＳ細胞の増殖及び維持に容認されない。
【００１２】
大部分のラミニンアイソフォームは、ＥＣＭタンパク質間の広範な架橋のために、組織から未変性の形態で抽出及び精製することが困難又は不可能であり、角化細胞、内皮細胞などの細胞から微量でしか生成することができない。ごく最近、ＬＮ−３３２、ＬＮ−４１１、ＬＮ−５１１などのラミニンをヒト組換えタンパク質として生成することに成功した。
【００１３】
上記のことにもかかわらず、引き続き、ヒト胚性幹細胞を培養及び成長させるための組成物及び方法を提供する必要がある。この点に関して、ＬＩＦなどの分化阻害剤やフィーダー細胞を使用せずに、インビトロで多能性ヒト幹細胞の増殖及び生存を可能にする組成物及び方法を提供することが有利であろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｓｋｏｔｔｍａｎ，Ｈ．，Ｄｉｌｂｅｒ，Ｍ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｈｏｖａｔｔａ，Ｏ．（２００６）；Ｔｈｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ−ｇｒａｄｅ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ；ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５８０，２８７５−２８７８
【非特許文献２】Ｈｏｖａｔｔａ，Ｏ．，ａｎｄ  Ｓｋｏｔｔｍａｎ，Ｈ．（２００５）；Ｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ；Ｌａｎｃｅｔ  ３６５，１６０１−１６０３
【非特許文献３】Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｍ．，Ｆｏｎｇ，Ｃ．Ｙ．，Ｃｈａｎ，Ｗ．Ｋ．，Ｗｏｎｇ，Ｐ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｂｏｎｇｓｏ，Ａ．（２００２）；Ｈｕｍａｎ  ｆｅｅｄｅｒｓ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｎｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍａｓｓｅｓ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ；Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０，９３３−９３６
【非特許文献４】Ｘｕ，Ｃ．，Ｉｎｏｋｕｍａ，Ｍ．Ｓ．，Ｄｅｎｈａｍ，Ｊ．，Ｇｏｌｄｓ，Ｋ．，Ｋｕｎｄｕ，Ｐ．，Ｇｏｌｄ，Ｊ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｍ．Ｋ．（２００１）；Ｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ；Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９，９７１−９７４
【非特許文献５】Ｘｕ，Ｒ．Ｈ．，Ｐｅｃｋ，Ｒ．Ｍ．，Ｌｉ，Ｄ．Ｓ．，Ｆｅｎｇ，Ｘ．，Ｌｕｄｗｉｇ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．（２００５）；Ｂａｓｉｃ  ＦＧＦ  ａｎｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＢＭＰ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｓｕｓｔａｉｎ  ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ；Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２，１８５−１９０
【非特許文献６】Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ，Ｉ．，Ｃｈｕｎｇ，Ｙ．，Ｍｅｉｓｎｅｒ，Ｌ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．，Ｗｅｓｔ，Ｍ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｌａｎｚａ，Ｒ．（２００５）；Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｆｅｅｄｅｒ  ｃｅｌｌｓ；Ｌａｎｃｅｔ  ３６５，１６３６−１６４１
【非特許文献７】Ｃｏｌｏｇｎａｔｏ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｙｕｒｃｈｅｎｃｏ，Ｐ．Ｄ．（２０００）；Ｆｏｒｍ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ：  ｔｈｅ  ｌａｍｉｎｉｎ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒｓ；Ｄｅｖ  Ｄｙｎ  ２１８，２１３−２３４
【非特許文献８】Ａｕｍａｉｌｌｅｙ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｇａｙｒａｕｄ，Ｂ．（１９９８）；Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ；Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ７６，２５３−２６５
【非特許文献９】Ａｕｍａｉｌｌｅｙ，Ｍ．，Ｂｒｕｃｋｎｅｒ−Ｔｕｄｅｒｍａｎ，Ｌ．，Ｃａｒｔｅｒ，Ｗ．Ｇ．，Ｄｅｕｔｚｍａｎｎ，Ｒ．，Ｅｄｇａｒ，Ｄ．，Ｅｋｂｌｏｍ，Ｐ．，Ｅｎｇｅｌ，Ｊ．，Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．，Ｈｏｈｅｎｅｓｔｅｒ，Ｅ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（２００５）；Ａ  ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｌａｍｉｎｉｎ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ；Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ  ２４，３２６−３３２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
概要
本開示は、細胞外マトリックスなどの組成物の開発、及びヒト幹細胞をインビトロで未分化状態で培養するためにそれを使用するプロセスを対象とする。
【００１６】
ある種のラミニンは、未分化ヒト胚性幹細胞のインビトロでの成長（ｇｒｏｗｔｈ）及び増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）のための規定された適切な細胞外マトリックスを提供することが見いだされた。これは、フィーダー細胞及び／又は分化阻害剤がない。換言すれば、フィーダー細胞及び／又は分化阻害剤は、胚性幹細胞がラミニン細胞外マトリックス上で成長及び増殖するのに不要である。さらに、多能性ヒト胚性幹細胞を、組換えラミニン−１０（ラミニン−５１１）で被覆されたプレート上でｍＴｅＳＲ１の類似物などの既知組成培地（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）中で培養すると、細胞は、増殖し、分化阻害剤の非存在下でもその多能性を維持できることが見いだされた。本明細書では「既知組成」（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ）という用語は、その成分すべてが既知である培地を指し、各成分の（絶対的又は相対的）量が既知であり、培地は、植物組織も動物組織も含まない。
【００１７】
さらに、動物産物もフィーダー細胞も全く含まず、唯一の不明確な成分である純度９６％以上のヒトアルブミンのみを含む系が、自然なｈＥＳ細胞微小環境であるヒト組換えラミニン−５１１上で種々のｈＥＳ細胞系を培養することによって樹立された。ｈＥＳ細胞は、正常な核型で少なくとも４か月（２０継代）自己複製し、その後、細胞は、全３種類の胚葉の細胞系譜を含む奇形腫を発生することができた。ラミニン−５１１上で小さい塊でプレーティングすると、ｈＥＳ細胞は単層で広がり、約９７％Ｏｃｔ−４陽性細胞を含む細胞均質性を維持した。ｈＥＳ細胞の接着は、α６β１インテグリンに依存した。均質な単層ｈＥＳ細胞培養物を使用すると、幹細胞の分化経路の設計条件がより制御可能になる。この異種もフィーダー細胞も含まない系は、細胞療法目的の細胞系譜の開発に有用であり得る。
【００１８】
本開示のこれら及び他の非限定的特徴を以下により詳細に考察する。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
インビトロで成長した多能性ヒト幹細胞の自己複製を可能にするための組成物であって、
基材、
完全な組換えラミニン−５１１（ＬＮ−５１１又はラミニン−１０）を含み、動物タンパク質もフィーダー細胞も含まない、コーティング、及び
フィーダー細胞を含まない既知組成培地
を含む、組成物。
（項目２）
前記培地が増殖因子を更に含む、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記培地がヒトアルブミンを更に含む、項目１に記載の組成物。
（項目４）
前記コーティングが完全な組換えラミニン−５１１からなる、項目１に記載の組成物。
（項目５）
規定された人為的環境において新しい幹細胞系を生成するための方法であって、
コーティングを含む基材を提供することであって、該コーティングは、完全な組換えラミニン−５１１（ＬＮ−５１１又はラミニン−１０）を含み、タンパク質もフィーダー細胞も含まない、こと、
ヒト幹細胞を該コーティング上にプレーティングすること、
該ヒト幹細胞を、フィーダー細胞を含まない既知組成培地に曝露すること、及び
該ヒト幹細胞の増殖物から新しい幹細胞を得ること
を含む、方法。
（項目６）
前記新しい幹細胞が非分化である、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記新しい幹細胞が均質である、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記ヒト幹細胞が前記コーティング上に単層を形成する、項目５に記載の方法。
（項目９）
前記ヒト幹細胞が非分化胚性幹細胞である、項目５に記載の方法。
（項目１０）
前記新しい幹細胞を収集すること、
前記コーティングを含む第２の基材上に前記新しい幹細胞を再度プレーティングすること、
前記新しい幹細胞をフィーダー細胞を含まない既知組成培地に曝露すること、及び
前記新しい幹細胞の増殖物から精製幹細胞を得ること
を更に含む、項目５に記載の方法。
（項目１１）
前記培地が増殖因子を更に含む、項目５に記載の方法。
（項目１２）
前記培地がヒトアルブミンを更に含む、項目５に記載の方法。
（項目１３）
項目５に記載の方法によって製造される新しいヒト幹細胞。
（項目１４）
自己複製する多能性ヒト幹細胞を維持するための方法であって、
コーティングを含む基材を提供することであって、該コーティングは、完全な組換えラミニン−５１１（ＬＮ−５１１又はラミニン−１０）を含み、動物タンパク質もフィーダ
ー細胞も含まない、こと、
ヒト幹細胞を前記コーティング上にプレーティングすること、
該ヒト幹細胞を、フィーダー細胞を含まない既知組成培地に曝露すること、及び
該幹細胞を定期的に収集し、再度プレーティングすること
を含む、方法。
（項目１５）
前記培地が増殖因子を更に含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記培地がヒトアルブミンを更に含む、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記コーティングが完全な組換えラミニン−５１１からなる、項目１４に記載の方法。
【００１９】
本特許又は出願ファイルは、少なくとも１つのカラー図面を含む。カラー図面（単数又は複数）を含むこの特許又は特許出願の複製は、請求次第、かつ必要な手数料の支払い次第、特許庁によって提供される。
【００２０】
以下は、図面の簡単な記述である。これらは、本明細書に開示する例示的実施形態を説明するためのものであって、それを限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、組換えラミニン−１０（ラミニン−５１１）で被覆されたプレート上の既知組成培地における１０５日間のフィーダー細胞のない培養後のヒト胚性幹細胞の顕微鏡写真（位相差）である。
【図２】図２は、既知組成培地においてラミニン−１０（ラミニン−５１１）上で１０５日間（ＬＮ−５１１、２０継代）、及び従来の培地においてヒト包皮線維芽細胞（対照）上で、培養されたヒト胚性幹細胞における多能性マーカー（Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ）、内部標準（ＧＡＰＤＨ）及び分化マーカー（アルファ−フェトプロテイン、ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｓｏｘ１及びＰａｘ６）の発現を示すＲＴ−ＰＣＲの写真である。ここで、ｈＧＡＤＰＨ、ｈＯｃｔ４、ｈＮａｎｏｇ、ｈＢｒａｃｈ、ｈＡＦＰ、ｈＳｏｘ１及びｈＰａｘ６は、それぞれＧＡＰＤＨ、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、アルファ−フェトプロテイン、Ｓｏｘ１及びＰａｘ６を表す。
【図３】図３は、ラミニン−５１１上のヒト胚性幹細胞自己複製効果を示す一連のカラー顕微鏡写真（免疫蛍光）を含む。既知組成培地におけるラミニン−５１１上の１０５日間（２０継代）の培養後、ヒト胚性幹細胞は、多能性マーカーＯｃｔ４（緑）及びＳｏｘ２（赤）（ＬＮ−５１１、２０継代）を発現し続ける。従来の培地におけるヒト包皮線維芽細胞上で培養されたヒト胚性幹細胞は、多能性マーカーＯｃｔ４及びＳｏｘ２（対照）も発現する。
【図４ａ】図４は、ヒトＥＳ細胞と種々のコーティングの接着、及びｈＥＳ細胞におけるラミニン鎖の発現を示す。図４ａは、ＬＮ−５１１及びＬＮ−１１１に付着したヒトＥＳ細胞のクリスタルバイオレット染色を示す。拡大率：×５（挿入図：×２０）
【図４ｂ】図４は、ヒトＥＳ細胞と種々のコーティングの接着、及びｈＥＳ細胞におけるラミニン鎖の発現を示す。図４ｂは、ＥＳ細胞と種々の接着基層の接触面積を示すグラフである。値は、（ポリ−Ｄ−リジン上にプレーティングされた細胞と比較した）平均相対接触面積として示される。統計的有意性（Ｐ）は、Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定によって計算された。エラーバーは標準誤差（ＳＥ）を示し、各バー内の数は独立した測定数を示す。略語：ＬＮ、ラミニン；ＭＧ、Ｍａｔｒｉｇｅｌ；ＰＬ、ポリ−Ｄ−リジン。
【図４ｃ】図４は、ヒトＥＳ細胞と種々のコーティングの接着、及びｈＥＳ細胞におけるラミニン鎖の発現を示す。図４ｃは、ＨＳ４２０細胞から単離された全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。既知のラミニン鎖すべてに対するプライマーセットを使用した。
【図５ａ】図５は、ｈＥＳ細胞表面のインテグリン受容体、及びＬＮ−５１１との接着におけるその役割を示す。図５ａは、種々の抗インテグリン抗体による、ヒトＥＳ細胞とＬＮ−５１１の接着阻害を示すグラフである。バーは（左から右に）β１、α６、α１、α２、α３、α４、α５、αＶ、αＶβ３、β２、β３、β４（すべてＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製）を示す。ＩｇＧは、阻害されない細胞接着の対照として使用された。エラーバーは標準誤差（ｎ＝４）を示す。統計的有意性（Ｐ）は、Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定によって計算された。
【図５ｂ】図５は、ｈＥＳ細胞表面のインテグリン受容体、及びＬＮ−５１１との接着におけるその役割を示す。図５ｂは、種々の抗インテグリン抗体によって被覆された表面とｈＥＳ細胞の接着を示す別のグラフである。バーは（左から右に）β１（１００％）、β２、β３、β４及びＩｇＧとの接着を示す。エラーバーは標準誤差（ｎ＝４）を示す。Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定によって計算された統計的有意性（Ｐ）を示す：＊＊、Ｐ＜０．０１。
【図５ｃ】図５は、ｈＥＳ細胞表面のインテグリン受容体、及びＬＮ−５１１との接着におけるその役割を示す。図５ｃは、ＬＮ−５１１上で培養された多能性（Ｓｏｘ２陽性）ｈＥＳ細胞におけるβ１インテグリンサブユニットとインテグリンα６の同時発現を示す１セットの免疫蛍光の図である。拡大率×４０。
【図６ａ】図６は、Ｏ３培地及び動物由来の成分を含まないＨ３培地においてＬＮ−５１１上で培養されたＨＳ２０７の代表的な免疫染色分析、ＲＴ−ＰＣＲ、ＦＡＣＳ分析、実時間定量ＲＴ−ＰＣＲ及び定量ウエスタンブロット分析を示す。図６ａは、Ｏ３培地においてＬＮ−５１１及びＭａｔｒｉｇｅｌ上で培養されたｈＥＳ細胞の成長曲線を示す。細胞は、長期実験のために以下に示すように継代された。各ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ処理及びそれに続く洗浄後、塊状の細胞の１／３のみを使用して、新しいＬＮ−５１１又はＭａｔｒｉｇｅｌ被覆皿上にプレーティングした。残りを解離させて単細胞懸濁液とし、数えた。実験をコーティングごとに２つの独立した二つ組で実施した。第５継代後、細胞の一部を固定し、免疫蛍光染色によって分析して、細胞の大多数が依然として多能性のマーカーＮａｎｏｇを発現することを確認した。
【図６ｂ】図６は、Ｏ３培地及び動物由来の成分を含まないＨ３培地においてＬＮ−５１１上で培養されたＨＳ２０７の代表的な免疫染色分析、ＲＴ−ＰＣＲ、ＦＡＣＳ分析、実時間定量ＲＴ−ＰＣＲ及び定量ウエスタンブロット分析を示す。図６ｂは、Ｏ３培地におけるＬＮ−５１１上の２０継代（６か月）後の（Ｎａｎｏｇと表示された）抗Ｎａｎｏｇ、抗Ｓｏｘ２（Ｓｏｘ２）及び抗Ｏｃｔ４（Ｏｃｔ４）抗体によるＨＳ２０７細胞の免疫染色を示す。右側のパネルは、核のＤＡＰＩ染色である。より高い拡大率で示された同じ染色。拡大率：×２０。バー：０．１５ｍｍ。
【図６ｃ】図６は、Ｏ３培地及び動物由来の成分を含まないＨ３培地においてＬＮ−５１１上で培養されたＨＳ２０７の代表的な免疫染色分析、ＲＴ−ＰＣＲ、ＦＡＣＳ分析、実時間定量ＲＴ−ＰＣＲ及び定量ウエスタンブロット分析を示す。図６ｃは、（フィーダーと表示された）フィーダー細胞上、Ｏ３培地において７継代後のＭａｔｒｉｇｅｌ上（ＭＧ、ｐ７  ｉｎ  Ｏ３）、Ｈ３培地において８継代後のＬＮ−５１１上（ＬＮ−５１１、ｐ．８  ｉｎ  Ｈ３）、及びＯ３培地において２７継代後のＬＮ−５１１上（ＬＮ−５１１、ｐ．２７  ｉｎ  Ｏ３）で成長したＨ２０７細胞から単離された全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。多能性マーカーＯｃｔ４及びＮａｎｏｇ；分化マーカーｂｒａｃｈｙｕｒｙ、α−フェトプロテイン、Ｓｏｘ１及びＰａｘ６；並びにグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のハウスキーピング遺伝子に対するプライマーセットを分析した。
【図６ｄ】図６は、Ｏ３培地及び動物由来の成分を含まないＨ３培地においてＬＮ−５１１上で培養されたＨＳ２０７の代表的な免疫染色分析、ＲＴ−ＰＣＲ、ＦＡＣＳ分析、実時間定量ＲＴ−ＰＣＲ及び定量ウエスタンブロット分析を示す。図６ｄは、実時間定量ＲＴ−ＰＣＲ分析を使用して、ＬＮ−５１１上及びＭａｔｒｉｇｅｌ上で培養されたＨＳ２０７細胞において、実験の異なる時点における多能性マーカーＯｃｔ４（灰色のバー）及びＮａｎｏｇ（黒色のバー）のｍＲＮＡ転写物の数をフィーダー細胞上で培養されたＨＳ２０７細胞のそれと比較した。バーは（左から右に）、比較する基準値としての支持層上で培養された対照ＨＳ２０７細胞（フィーダー）における、Ｏ３培地において７継代後のＭａｔｒｉｇｅｌ上で培養されたＨＳ２０７細胞（ＭＧ、ｐ．７  ｉｎ  Ｏ３）における、Ｏ３において５（ＬＮ−５１１、ｐ．５  ｉｎ  Ｏ３）、１０（ＬＮ−５１１、ｐ．１０  ｉｎ  Ｏ３）、１６（ＬＮ−５１１、ｐ．１６  ｉｎ  Ｏ３）、２０（ＬＮ−５１１、ｐ．２０  ｉｎ  Ｏ３）継代後のＬＮ−５１１上で培養されたＨＳ２０７細胞における、及びＨ３において８継代後のＬＮ−５１１上の細胞（ＬＮ−５１１、ｐ．８  ｉｎ  Ｈ３）における、Ｏｃｔ４及びＮａｎｏｇ発現のレベルを示す。エラーバーは９５％信頼区間を示す。
【図６ｅ】図６は、Ｏ３培地及び動物由来の成分を含まないＨ３培地においてＬＮ−５１１上で培養されたＨＳ２０７の代表的な免疫染色分析、ＲＴ−ＰＣＲ、ＦＡＣＳ分析、実時間定量ＲＴ−ＰＣＲ及び定量ウエスタンブロット分析を示す。図６ｅは、異なる時点及び種々の培地において、ウエスタンブロットによって測定され、濃度測定によって定量された、フィーダー細胞、Ｍａｔｒｉｇｅｌ及びＬＮ−５１１上で培養されたＨＳ２０７細胞における多能性マーカーＯｃｔ４及びＳｏｘ２の発現を示す。灰色のバーはＯｃｔ４の発現レベル、黒色のバーはＳｏｘ２の発現レベルを示す。略語は図６ｄと同様である。エラーバーは範囲を表す。
【図６ｆ】図６は、Ｏ３培地及び動物由来の成分を含まないＨ３培地においてＬＮ−５１１上で培養されたＨＳ２０７の代表的な免疫染色分析、ＲＴ−ＰＣＲ、ＦＡＣＳ分析、実時間定量ＲＴ−ＰＣＲ及び定量ウエスタンブロット分析を示す。図６ｆは、多能性の細胞表面マーカーＯｃｔ４について、Ｏ３培地においてＬＮ−５１１上で２５継代後のＨＳ２０７細胞のＦＡＣＳ分析を示す。陽性細胞の割合を括弧内に示す。
【図７ａ】図７は、ＬＮ−５１１上の長期継代後のＨＳ２０７細胞の多能性を示す。３種類の胚葉の組織成分で構成された奇形腫が、ＬＮ−５１１上で１５継代の培養後のＨＳ２０７細胞をＳＣＩＤマウスに皮下注射した後に形成された。図７ａは、軟骨、ＨＥ染色を示す。拡大率×１００。
【図７ｂ】図７は、ＬＮ−５１１上の長期継代後のＨＳ２０７細胞の多能性を示す。３種類の胚葉の組織成分で構成された奇形腫が、ＬＮ−５１１上で１５継代の培養後のＨＳ２０７細胞をＳＣＩＤマウスに皮下注射した後に形成された。図７ｂは、発達中の神経組織及び腸内胚葉を示す。杯細胞は赤色で示される。ＨＥ−ＰＡＳ染色。拡大率×４００。
【図７ｃ】図７は、ＬＮ−５１１上の長期継代後のＨＳ２０７細胞の多能性を示す。３種類の胚葉の組織成分で構成された奇形腫が、ＬＮ−５１１上で１５継代の培養後のＨＳ２０７細胞をＳＣＩＤマウスに皮下注射した後に形成された。図７ｃは、発達中の腎糸球体、ＨＥ染色を示す。拡大率×４００。
【図７ｄ】図７は、ＬＮ−５１１上の長期継代後のＨＳ２０７細胞の多能性を示す。３種類の胚葉の組織成分で構成された奇形腫が、ＬＮ−５１１上で１５継代の培養後のＨＳ２０７細胞をＳＣＩＤマウスに皮下注射した後に形成された。図７ｄは、網膜色素上皮、ＨＥ染色を示す。拡大率×４００。
【図７ｅ】図７は、ＬＮ−５１１上の長期継代後のＨＳ２０７細胞の多能性を示す。３種類の胚葉の組織成分で構成された奇形腫が、ＬＮ−５１１上で１５継代の培養後のＨＳ２０７細胞をＳＣＩＤマウスに皮下注射した後に形成された。図７ｅは、ＬＮ−５１１上で２０継代後にＨＳ２０７細胞から形成された胚様体の免疫染色によって、３種類の胚性細胞層のマーカーの発現が明らかになったことを示す：（ＳＭアクチンと表示された）平滑筋アクチン、ネスチン（ネスチン）、ＭＡＰ−２（ＭＡＰ−２）及びα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）。下側のパネルは、核のＤＡＰＩ染色である。
【図８】図８は、ＬＮ−５１１上で成長した種々のｈＥＳ細胞の免疫染色分析を示す。図８は、Ｏ３培地においてＬＮ−５１１上の５継代（１か月）後のＨ１及びＨ９細胞が多能性のマーカーＯｃｔ４（緑）、Ｎａｎｏｇ（緑）及びＳｏｘ２（赤）を発現したことを示す。ＤＡＰＩ染色は青色である。拡大率×２０。
【図９】図９は、ＬＮ−５１１上で２０継代後のＨＳ２０７細胞のＧバンディング染色体分析を示す。
【図１０】図１０は、多能性の細胞表面マーカー（ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ１−６０、Ｔｒａ１−８１）及び分化の細胞表面マーカーＳＳＥＡ−１について、Ｏ３培地においてＬＮ−５１１上で２０継代後のＨＳ２０７細胞のＦＡＣＳ分析を示す。ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ１−６０及びＴｒａ１−８１陽性細胞の割合を括弧内に示す。
【図１１】図１１は、多能性のマーカーＯｃｔ−４及びＳＳＥＡ−４について、Ｏ３培地においてＭａｔｒｉｇｅｌ上の１０継代後のＨＳ２０７細胞のＦＡＣＳ分析を示す。陽性細胞の割合を括弧内に示す。
【図１２】図１２は、ＬＮ−５１１、Ｍａｔｒｉｇｅｌ及びフィーダーＨＳ２０７細胞培養物における自発的分化のレベルを示すグラフである。実時間定量ＲＴ−ＰＣＲ分析を使用して、Ｏ３培地においてＭａｔｒｉｇｅｌ上で（白色のバー）、Ｏ３培地においてＬＮ−５１１上で（灰色のバー）、及び血清代替物質に基づく培地においてヒト包皮線維芽細胞層上で（黒色のバー）、培養されたＨＳ２０７細胞における分化マーカーＰａｘ６、Ｓｏｘ１７及びＳｏｘ７のｍＲＮＡ転写物数を比較した。エラーバーは９５％信頼区間を示す。
【図１３ａ】図１３は、Ｏ３培地においてＬＮ５１１上でｈＥＳＣ系ＨＳ５８８の誘導の初期段階を示す１組の図である。図１３ａは、内部細胞塊の機械的単離及びＬＮ５１１上の平板培養から４日後の６日目の胚盤胞の内部細胞塊から成長した形態学的に典型的なｈＥＳＣを示す。
【図１３ｂ】図１３は、Ｏ３培地においてＬＮ５１１上でｈＥＳＣ系ＨＳ５８８の誘導の初期段階を示す１組の図である。図１３ｂは、Ｏ３培地においてＬＮ−５１１上で継代２における抗Ｎａｎｏｇ抗体によるＨＳ５８８細胞の免疫染色を示す。
【図１３ｃ】図１３は、Ｏ３培地においてＬＮ５１１上でｈＥＳＣ系ＨＳ５８８の誘導の初期段階を示す１組の図である。図１３ｃは、抗Ｏｃｔ４抗体による同じ細胞の免疫染色を示す。
【図１４】図１４は、還元及び非還元条件下で３〜８％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用した、論文に使用されたヒト組換えＬＮ−５１１の特性分析を示す。タンパク質は、Ｓｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙタンパク質染色によって可視化された。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
詳細な説明
ヒト幹細胞をインビトロで未分化状態で培養するための組成物及びプロセスを開示する。この点に関して、ヒト胚性幹細胞は、組換えラミニン−１０（ラミニン−５１１）で被覆されたプレート上で培養すると、増殖し、その多能性を維持した。
【００２３】
サイトカインの発現、細胞周期調節及び自己複製機序は、ヒトとマウスのＥＳ細胞では異なる。例えば、ＳＴＡＴ３活性化は、マウスＥＳ細胞の自己複製に十分であるが、ｈＥＳ細胞の分化を防止することができない。したがって、マウスＥＳ細胞を用いて得られた結果をヒトＥＳ細胞に直接外挿することはできない。
【００２４】
最近、フィーダーも異種も含まないｈＥＳ細胞培養システムが報告された。それは、血しょうから精製されたヒトアルブミン、及び培養皿コーティングのためのヒトタンパク質混合物を含む。ヒトタンパク質細胞培養皿コーティングは、ＩＶコラーゲン、ビメンチン、フィブロネクチン及びヒトラミニンを含むことが報告された。ヒトラミニンは、ヒト胎盤由来の分解タンパク質の混合物であることが示された。それは、幾つかのラミニンタイプの断片を含み、しばしば他のＢＭタンパク質及びフィブロネクチンも含む。したがって、これらのｈＥＳ細胞状態は可変であり、化学的に明確であるとは考えられず、自己複製を与える基質の成分（単数又は複数）は不明である。
【００２５】
本開示においては、本出願人らは、ヒト組換えＬＮ−５１１単体が長期間の培養においてｈＥＳ細胞の自己複製を支援することができるかどうか調べた。本出願人らは、ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３）において産生されたヒト組換えＬＮ−５１１であらかじめ被覆された培養皿上でｈＥＳ細胞系ＨＳ４２０、ＨＳ２０７及びＨＳ４０１３３を培養した。２つの異なる培地Ｏ３及びＨ３を使用した。Ｏ３培地は、唯一の動物由来の成分としてウシ血清アルブミンを含む、市販の既知組成ｍＴｅＳＲ１培地の改変物であった。Ｈ３培地は、ヒト血清アルブミンを含む、異種を含まない既知組成ＴｅＳＲ１培地の改変物であった。使用したヒトアルブミンの潜在的なバッチ間のばらつきを抑制するために、本出願人らは１２〜１４ＫＤａ透析膜を使用してタンパク質溶液を透析した。動物由来の成分を含まない細胞を継代するために、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ酵素を使用した。対照細胞を、Ｏ３培地においてＭａｔｒｉｇｅｌ上で、又は血清代替物質に基づく培地においてフィーダー細胞の層上で、培養した。本出願人らは、ｈＥＳＣ細胞と種々のＥＣＭタンパク質の接着を試験した。ＬＮ−５１１は、基層に最大細胞接触面積を与えた。人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞系もＬＮ−５１１上で自己複製した。接着は、ｈＥＳ細胞表面で最も豊富であることが示されたα６β１インテグリンに依存した。ＬＮ−５１１は、ｈＥＳ細胞において発現され、フィーダー依存性細胞培養及び初期胚におけるｈＥＳ細胞環境の一部としてｈＥＳ細胞接着、移動及び増殖の天然の基層とすることができた。
【００２６】
多能性ヒト胚性幹細胞は、既知組成培地において組換えヒトラミニン−１０（ラミニン−５１１）で被覆されたプレート上で培養すると、増殖し、その多能性を少なくとも１０５日間（２０継代）維持することも見いだされた（図１〜３）。Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇなどの多能性マーカーの発現、及び増殖速度も安定なままであった。
【００２７】
本明細書では「自己複製」という用語は、多数の細胞分裂サイクルを通過し、未分化（すなわち多能性）のままである幹細胞の能力を指す。多能性自体は、任意の細胞型に分化する幹細胞の能力を指す。「増殖」（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）という用語は、幹細胞の分裂能力を指す。生存とは、分化型であろうと未分化であろうと、幹細胞の生存能力を指し、分裂又は分化するその能力を幹細胞が維持する必要はない。
【００２８】
本開示を以下の非限定的な２組の実施例で更に説明するが、これらの実施例は単なる説明のためのものであって、本開示が、本明細書に列挙された材料、条件、プロセスパラメータなどに限定されるものではないことを理解されたい。別段の記載がないかぎり、割合はすべて重量単位である。
【実施例】
【００２９】
Ｉ．第１の実験セットの方法
細胞培養
ヒト胚性幹細胞（２つの系を使用した：ＨＳ４２０及びＨＳ２０７、どちらもＰｒｏｆ．Ｈｏｖａｔｔａ、Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｈｕｄｄｉｎｇｅ、Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｓｗｅｄｅｎの好意で提供された）を、既知組成培地、すなわちｍＴｅＳＲ１の類似物において組換えラミニン−１０（ラミニン−５１１）で被覆されたプレート上で培養した。幾つかの点を除いて、培地を（Ｌｕｄｗｉｇ，Ｔ．Ｅ．，Ｂｅｒｇｅｎｄａｈｌ，Ｖ．，Ｌｅｖｅｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．Ｅ．，Ｙｕ，Ｊ．，Ｐｒｏｂａｓｃｏ  Ｍ．Ｄ．ａｎｄ  Ｔｈｏｍｓｏｍ，Ｊ．Ａ．（２００６）；Ｆｅｅｄｅｒ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ；Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８，６３７−６４６）に記載のように調製した。第一に、組換えヒトＦＧＦ  ｂａｓｉｃ（Ｒ＠ＤＳｙｓｔｅｍｓ）をｚｂＦＧＦの代わりに使用し、ウシ血清由来のアルブミン（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂ４２８７）をＢＳＡ画分Ｖの代わりに使用した。第二に、既製培地に添加されたＩｎｓｕｌｉｎ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−Ｓｅｌｅｎｉｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、論文に記載された方法の代わりに要素源として使用した。ヒト胚性幹細胞は、ＴｒｙｐＬＥ（商標）  Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＧＩＢＣＯ）に曝露することによって４〜６日間隔で塊状の継代であった。細胞を酵素に室温で２分間さらし、次いで培地で２回洗浄し、続いて静かにこすって収集した。細胞の大きい塊を軽いピペット操作によって破壊し、１：３継代した。
【００３０】
（Ｉｎｚｕｎｚａａ，Ｊ．，Ｇｅｒｔｏｗ，Ｋ．，Ｓｔｒｏｅｍｂｅｒｇ，Ｍ．，Ａ．，Ｍａｔｉｌａｉｎｅｎ，Ｅ．，Ｂｌｅｎｎｏｗ，Ｅ．，Ｓｋｏｔｔｍａｎ，Ｈ．，Ｗｏｌｂａｎｋ，Ｓ．，Ａｅｈｒｌｕｎｄ−Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｌ．ａｎｄ  Ｈｏｖａｔｔａ，Ｏ．（２００５）；Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  ｉｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｏｓｔｎａｔａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ａｓ  Ｆｅｅｄｅｒ  Ｃｅｌｌｓ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００５；２３：５４４−５４９）に記載のように、対照ヒト胚性幹細胞を従来の培地においてヒト包皮線維芽細胞上で維持した。実体顕微鏡下でメスを使用してコロニーを８個の小片に切断することによって、細胞を機械的に継代した。機械的分割を６日間隔で実施した。非分化細胞を、形態によって判断して、各々更なる継代用に選択した。
【００３１】
プレートコーティング
９６ウェル組織細胞培養プレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）を、終夜４℃で以下の細胞外マトリックスタンパク質の無菌溶液で被覆した：ネズミラミニン−１１１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ヒト組換えラミニン−３３２、ヒト組換えラミニン−４１１（Ｋｏｒｔｅｓｍａａ，Ｊ．，Ｙｕｒｃｈｅｎｃｏ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｔｒｙｇｇｖａｓｏｎ，Ｋ．（２０００）；Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５，１４８５３−１４８５９，米国特許６，６３８，９０７）、ヒト組換えラミニン−５１１（Ｄｏｉ，Ｍ．，Ｔｈｙｂｏｌｌ，Ｊ．，Ｋｏｒｔｅｓｍａａ，Ｊ．，Ｊａｎｓｓｏｎ，Ｋ．，Ｉｉｖａｎａｉｎｅｎ，Ａ．，Ｐａｒｖａｒｄｅｈ，Ｍ．，Ｔｉｍｐｌ，Ｒ．，Ｈｅｄｉｎ，Ｕ．，Ｓｗｅｄｅｎｂｏｒｇ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｔｒｙｇｇｖａｓｏｎ，Ｋ．（２００２）；Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ−ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｎ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７，１２７４１−１２７４８；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ６，９３３，２７３）（すべて、濃度３０μｇ／ｍｌ（５μｇ／ｍｍ２））、増殖因子が欠乏したＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（１：３０）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ウシのゼラチン１ｍｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ）、０．１ｍｇ／ｍｌポリ−Ｄ−リジン（Ｓｉｇｍａ）。
【００３２】
細胞接着アッセイ
付着アッセイを（［Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２０００）に記載のように実施した。手短に述べると、上述したように細胞外マトリックスタンパク質で被覆し、１％熱変性ＢＳＡ溶液でブロックされたＭａｘｉＳｏｒｐ  ９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）。未分化胚性細胞を細胞密度８００細胞／ｍｍ２で細胞外マトリックス被覆プレート上で培養し、３７℃で１時間付着させた。非接着細胞を洗浄除去し、接着細胞を５％グルタルアルデヒドによって２０分間固定し、０．１％クリスタルバイオレットによって染色した。
【００３３】
ＲＴ−ＰＣＲ：
全ＲＮＡをＡｂｓｏｌｕｔｅｌｙ  ＲＮＡ  Ｍｉｃｒｏｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して製造者の指示に従ってヒト試料から単離した。オリゴ（ｄＴ）１２〜１８プライマー及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む反応混合物２０μｌ中の全ＲＮＡ０．２μｇを使用して、製造者の指示に従って、ｃＤＮＡを合成した）。可変のｃＤＮＡ収率を補償するために、各ＰＣＲ反応のｃＤＮＡの量を、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＤＰＨの発現レベルを標準として使用することによって較正した。（２０サイクルにおいて）等量のＧＡＤＰＨ  ＰＣＲ産物を生成するｃＤＮＡ量（データ示さず）を後続のＰＣＲ反応に使用した。ｃＤＮＡをヒト試料のための表１のプライマーを使用して増幅した。（図示したＧＡＤＰＨ  ＰＣＲを含めて）全ＰＣＲ反応を３０サイクル行い、２０μｌで標準条件下で１ＵのＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｉｍｅｒａｓｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して実施した。ＰＣＲ産物を臭化エチジウムを含む１．５％アガロースゲル上で分析した。
【００３４】
各ＲＮＡ試料について、逆転写酵素なしのＲＴ−ＰＣＲを実施して、ゲノムＤＮＡが単離されないことを確認した。
【００３５】
【表１】
0006016642.tif 000002
【００３６】
免疫蛍光：
免疫蛍光では、胚性細胞を４％パラホルムアルデヒドによって９６ウェルプレートウェルに固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘによって透過処理し、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ）ＰＢＳ中の１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって１時間ブロックした。一次抗体と一緒に室温で１．５時間インキュベートした。以下のヒト抗原に対する一次抗体を使用した：Ｏｃｔ４及びＳｏｘ２（どちらもＲ＠ＤＳｙｓｔｅｍｓ製）。（Ａｌｅｘａ４８８及びＡｌｅｘａ５４６で標識された）二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ）及びＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ）と一緒に４０分間インキュベートした。インキュベーション間に、試料を０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０のＰＢＳ溶液で３から５回各１０分間洗浄した。試料を蛍光封入剤（Ｄａｋｏ）に保存し、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）で観察した。
【００３７】
第１の実験セットの結果
Ａ．ラミニン−５１１上で培養されたヒト胚性幹細胞は、既知組成培地においてフィーダーなしで増殖し、多能性のままである。
【００３８】
ラミニン−５１１上では、ヒト胚性幹細胞は、既知組成培地において少なくとも１０５日間（２０継代）多能性のままであることが判明した。
【００３９】
形態：ラミニン−５１１上で培養されたヒト胚性幹細胞の形態は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（Ｂｅｎｄａｌｌ，Ｓ．，Ｃ．，Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｍ．，Ｈ．，Ｍｅｎｅｎｄｅｚ，Ｐ．，Ｇｅｏｒｇｅ，Ｄ．，Ｖｉｊａｙａｒａｇａｖａｎ，Ｋ．，Ｗｅｒｂｏｗｅｔｓｋｉ−Ｏｇｉｌｖｉｅ，Ｔ．，Ｒａｍｏｓ−Ｍｅｊｉａ，Ｖ．，Ｒｏｕｌｅａｕ，Ａ．，Ｙａｎｇ，Ｊ．，Ｂｏｓｓｅ’，Ｍ．，Ｌａｊｏｉｅ，Ｇ．ａｎｄ  Ｂｈａｔｉａ，Ｍ．（２００７）；ＩＧＦ  ａｎｄ  ＦＧＦ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｎｉｃｈｅ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｎａｔｕｒｅ，２００７  Ａμｇ  ３０；４４８（７１５７）：１０１５−２１．）又は細胞外マトリックス被覆プレート（Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ，Ｉ．，Ｃｈｕｎｇ，Ｙ．，Ｍｅｉｓｎｅｒ，Ｌ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．，Ｗｅｓｔ，Ｍ．，Ｄ．ａｎｄ  Ｌａｎｚａ，Ｒ．（２００５）；Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｆｅｅｄｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｌａｎｃｅｔ．２００５  Ｍａｙ  ７−１３；３６５（９４７１）：１６０１−１６０３）上で培養されたヒト胚性幹細胞のそれと極めて類似した。図１を参照されたい。しかし、上記２つのコーティングとは異なり、組換えヒトラミニン−５１１は、ＦＤＡ要件に従って異種を含まない規定された非免疫原性化合物として製造することができ、続いて臨床に使用することができる。
【００４０】
ＲＴ−ＰＣＲマーカー：多能性マーカーＯｃｔ４及びＮａｎｏｇは、既知組成培地におけるラミニン−５５１上で１０５日間培養されたヒト胚性幹細胞によって、従来の培地におけるヒト線維芽細胞包皮上で培養された多能性胚性幹細胞と同程度に発現された。図２を参照されたい。
【００４１】
免疫蛍光：ヒト胚性幹細胞は、従来の環境で成長した胚性幹細胞と同程度にＯｃｔ４及びＳｏｘ２のような多能性マーカーを発現した。図３を参照されたい。
【００４２】
ＩＩ．第２の実験セットの方法
ヒトＥＳ細胞培養
Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの本発明者らの研究室で最初に誘導されたＨＳ２０７、ＨＳ４２０及びＨＳ４０１のヒトＥＳ細胞は、ＬＮ−５１１被覆実験皿上で（１）既知組成Ｏ３培地（ｍＴｅＳＲ１培地の改変物）及び（２）異種を含まない既知組成Ｈ３培地（ＴｅＳＲ培地の改変物）において３７℃、５％ＣＯ２で培養された。臨床等級の純度９６％以上のヒトアルブミンをＯｃｔａｐｈａｒｍａ  ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍから購入した。最初に、系の細胞を、無菌ナイフを使用して慎重にはがし取ることによって、フィーダー細胞層から小片でＬＮ−５１１上に移した。ほんの数滴の新しい培地が添加された継代後の第１日を除いて、恒温器で１時間予熱した新しい培地を１日１回細胞に供給した。ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＧＩＢＣＯ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ）に室温で１．５分間曝露することによって６〜７日間で１回細胞を常法に従って継代した。次いで、それを皿上で培地で２回洗浄し、静かにこすり、ピペット操作によって（単細胞懸濁液ではなく）小片に破壊し、１：２又は１：３比（多数の細胞が必要な場合は最高１：６比）で培養した。同じ系の対照細胞をＯ３培地におけるＭａｔｒｉｇｅｌ上で、及びヒト包皮線維芽細胞上で、培養した。実験皿を被覆した。使用前に、皿を恒温器で１時間予熱し、次いで予熱培地で２回慎重に洗浄した。
【００４３】
Ｏ３培地（ｍＴｅＳＲ１の改変物）の調製
Ｌ−アスコルビン酸がないこと以外はＬｕｄｗｉｇ，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３：６３７−６４６（２００６）に記載のようにして、チアミン１６５ｍｇ及び還元型グルタチオン５０ｍｇを蒸留水５００ｍｌに添加することによってストックＡを調製した。蒸留水をＧＩＢＣＯ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した。次いで、溶液をろ過し（０．２２μｍフィルター）、等分し、−２０℃で凍結させた。
【００４４】
ストックＢを、セレン、インスリン及びホロ−トランスフェリンないこと以外はＬｕｄｗｉｇに記載のとおりに調製した。次いで、フェノールレッド６μｇを添加し、慎重に撹拌し、ろ過した。ストックＢは、＋４℃で最高２か月貯蔵することができた。
【００４５】
トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−β１、ピペコリン酸、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）及びＬｉＣｌのストックを調製し、Ｌｕｄｗｉｇに記載のように貯蔵した。
【００４６】
Ｏ３培地１００ｍｌを調製するために、Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２培地にストックＢ２０ｍｌ、ＴＧＦ−β１ストック２００μｌ、ピペコリン酸ストック１３μｌ、ＧＡＢＡストック２００μｌ、ＬｉＣｌストック２００μｌ、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（ＧＩＢＣＯ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）１ｍｌ、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン溶液（ＧＩＢＣＯ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）１ｍｌ及びインスリン−トランスフェリン−セレン補助剤（ＧＩＢＣＯ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）２ｍｌを補充した。塩バランスを補償し、培地のｐＨを調節するために、ＮａＣｌ  １４５ｍｇ及びＮａＨＣＯ３  ５６ｍｇを添加した。次いで、溶液を徹底的に混合し、室温における培地のｐＨを１０Ｎ  ＮａＯＨを用いて７．４に調節した。溶液を０．２２μｍフィルターを使用してろ過し、次いで既知組成の脂質濃縮物（ＧＩＢＣＯ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）２００μｌを添加した。
【００４７】
Ｏ３培地は、＋４℃で最高１か月貯蔵することができた。使用前に、組換えヒトＦＧＦ  ｂａｓｉｃ（Ｒ＠Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＬＴＤ、Ａｂｉｎｇｄｏｎ、Ｅｎｇｌａｎｄ）９６ｎｇ／ｍｌ及びアスコルビン酸（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）４０μｇ／ｍｌを培地に補充した。
【００４８】
Ｈ３培地（ＴｅＳＲ１の改変物）の調製
Ｏ３培地の項で上述したように、ストックＡを調製した。
【００４９】
ヒトアルブミン溶液（Ａｌｂｕｍｉｎａｔｉｖ）をＯｃｔａｐｈａｒｍａ  ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎから購入した。溶液を１２〜１４Ｋｄａ透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ）を使用して細胞培養リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回各３時間透析し、続いてＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２培地で１回透析した。光学濃度を測定して、溶液中のタンパク質の最終濃度を測定した。この場合、（濃度に応じた）適切な体積の透析ヒトアルブミン溶液を使用してストックＢを混合して、（上記）Ｏ３培地のストックＢの場合と同じ濃度のアルブミンを得た。微量元素及びフェノールレッドを添加し、水の代わりにＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２を使用した。
【００５０】
ＴＧＦ−β１のストックを、ウシアルブミンの代わりに透析ヒトアルブミンを使用したこと以外はＬｕｄｗｉｇに記載のとおりに調製した。他のストックをすべて上述したように調製した。
【００５１】
Ｈ３培地をＯ３の場合と同様に混合した。ただし、ＮａＣｌは全く添加されなかった。
【００５２】
使用前に、担体を含まない組換えヒトＦＧＦ  ｂａｓｉｃ（Ｒ＠Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＬＴＤ、Ａｂｉｎｇｄｏｎ、Ｅｎｇｌａｎｄ）９６ｎｇ／ｍｌ及びアスコルビン酸（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）４０μｇ／ｍｌを培地に補充した。
【００５３】
ラミニン及び他のコーティング材料
ＢｉｏＬａｍｉｎａ、ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍから入手可能なヒト組換えＬＮ−５１１を、完全長ラミニンγ１、β１及びα５構築物を逐次的に移入したヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）中で産生させた。タンパク質産生のために、ＨＥＫ２９３細胞を、ＧｌｕｔａＭａｘ  Ｉ及び４．５ｇ／ｌグルコース（ＧＩＢＣＯ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で最高６日間培養した。ＬＮ−５１１分子を抗ＦＬＡＧ基質（Ｓｉｇｍａ）を使用して親和性精製し、次いで３〜８％（図１４）及び４〜１５％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して還元及び非還元条件下で特性分析した。ポリフッ化ビニリデン膜上で鎖のＳｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）タンパク質染色及び免疫染色を使用して、タンパク質を可視化した。タンパク質を更に特徴づけるために、ラミニンα５、β１及びγ１鎖に対する抗体を使用したウエスタンブロット分析を実施した。調製物は、正しいサイズの全３本の鎖を含んだ。ヒト組換えラミニン−４１１は、ＬＮ−５１１と同様に産生された。他のＥＣＭタンパク質はすべて上述したように得られた。
【００５４】
細胞接触面積測定
ＭａｘｉＳｏｒｐ  ９６ウェルプレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を上述したようにＥＣＭタンパク質で被覆し、１％熱変性ＢＳＡ溶液によってブロックした。未分化ＥＳ細胞を分割して単細胞懸濁液とし、４０μｍ無菌細胞篩によってろ過し、細胞密度７００細胞／ｍｍ２でＥＣＭ被覆プレート上にプレーティングし、３７℃で１時間付着させた。非接着細胞を洗浄除去し、接着細胞を５％グルタルアルデヒドによって２０分間固定し、洗浄し、０．１％クリスタルバイオレットによって染色した。６〜１０個の無作為な場の写真を撮影し、Ｖｏｌｏｃｉｔｙイメージングソフトウェア（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ．ｃｏｍ）を使用して１３〜９３個の細胞の細胞接触面積を測定した。非拡散ヒトＥＳ細胞の細胞面積を測定するために、細胞をポリ−Ｄ−リジン上で２０分間培養し、固定し、上述したように染色した。
【００５５】
抗インテグリン抗体を使用した接着ブロッキングアッセイ
接着ブロッキングアッセイを実施した。手短に述べると、プレートをＬＮ−５１１で被覆し、１％熱変性ＢＳＡ溶液でブロックした。ＥＳ単細胞懸濁液を機能阻害抗インテグリン抗体（供給業者によって推奨された濃度）と一緒に３０分間インキュベートし、ＬＮ−５１１被覆プレートにプレーティングし、３７℃で１時間付着させた。非接着細胞を除去し、残りの細胞を固定し、接着細胞を５％グルタルアルデヒドによって２０分間固定し、洗浄し、０．１％クリスタルバイオレットによって染色した。１時間後、クリスタルバイオレットを細胞から１０％酢酸によって抽出し、５７０ｎｍにおける光学濃度を測定することによって定量した。
【００５６】
抗インテグリン抗体アッセイによって被覆された表面との細胞接着
アッセイは、抗インテグリン特異抗体で被覆された表面に付着した細胞を保持するのに十分な量で発現されるインテグリン受容体を特定するように設計された。ＭａｘｉＳｏｒｐ  ９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を精製抗インテグリン抗体を用いて濃度１０μｇ／ｍｌで＋４℃で終夜被覆し、その後１％ＢＳＡ溶液で洗浄し、ブロックした。ＥＳ細胞を抗体被覆プレートにプレーティングし、３７℃で１時間付着させた。付着しない細胞を除去し、残りの細胞を固定し、染色し、上述したように定量した。エラーバーはＳＥＭを示す。
【００５７】
ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡをＡｂｓｏｌｕｔｅｌｙ  ＲＮＡ  Ｍｉｃｒｏｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  ＣＡ、ｗｗｗ．ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ．ｃｏｍ）を使用して製造者の指示に従って単離した。オリゴ（ｄＴ）１２〜１８プライマー及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含む反応混合物２０μｌ中の全ＲＮＡ０．２μｇを使用して、製造者の指示に従って、ｃＤＮＡを合成した。可変のｃＤＮＡ収率を補償するために、各ＰＣＲ反応のｃＤＮＡの量を、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のハウスキーピング遺伝子の発現レベルを標準として使用することによって較正した。（２０サイクルにおいて）等量のＧＡＰＤＨ  ＰＣＲ産物を生成するｃＤＮＡ量（データ示さず）を後続のＰＣＲ反応に使用した。ｈＥＳ細胞の多能性又は分化の種々のマーカーの発現を分析するために、表２に記載のプライマーを使用してｃＤＮＡを増幅した。種々のラミニン鎖の発現を分析するために、プライマーを使用した。（図示したＧＡＰＤＨ  ＰＣＲを含めて）全ＰＣＲ反応を３０サイクル行い、２０μｌで標準条件下で１ＵのＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｉｍｅｒａｓｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（ＧＩＢＣＯ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して実施した。ＰＣＲ産物を臭化エチジウムを含む１．５％アガロースゲル上で分析した。各ＲＮＡ試料について、逆転写酵素なしのＲＴ−ＰＣＲを実施して、ゲノムＤＮＡが単離されないことを確認した。
【００５８】
【表２】
0006016642.tif 000003
【００５９】
免疫蛍光
免疫蛍光試験のために、ＥＳ細胞を培養し、８ウェルスライドチャンバー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）又は９６ウェルプレートウェルに４％パラホルムアルデヒドによって固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘによって透過処理し、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含むリン酸−食塩水緩衝剤（ＰＢＳ）中の１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって１時間ブロックした。一次抗体と一緒に室温で１．５時間インキュベートした。二次抗体及び４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と一緒に４０分間インキュベートした。インキュベーション間に、試料を０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０のＰＢＳ緩衝剤溶液で３から５回洗浄した。試料を蛍光封入剤（Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に保存し、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、Ｈｅｅｒｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で観察した。
【００６０】
種々のｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ定量
全ＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲの項で上述したようにｃＤＮＡを合成した。実時間定量ＲＴ−ＰＣＲ  Ｔａｑｍａｎアッセイを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して実施した。対象とするｍＲＮＡのプライマー及びプローブを含むｐｒｅ−ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して全反応を四つ組で実施した。各実験の追加の反応は、ＲＮＡ入力を正規化するためのＧＡＰＤＨのｐｒｅ−ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｍｉｘを含んだ。全データを７３００  Ｓｙｓｔｅｍ  ＳＤＳ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ１．４によって分析した。
【００６１】
ウエスタンブロット及び濃度測定分析
ＬＮ−５１１上で培養後、ｈＥＳ細胞を収集し、数え、遠心分離によってペレット化し、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝剤と２０００細胞／μｌの等濃度に混合し、５回１５秒間超音波処理した。勾配４〜１２％ゲルをＳＤＳ電気泳動に使用し、タンパク質をＰＶＤＦ膜に移した。膜を５％乳のＰＢＳ溶液−０．１％Ｔｗｅｅｎ緩衝剤で２時間ブロックした。０．１％Ｔｗｅｅｎ緩衝剤を含む５％乳のＰＢＳ溶液中のＯｃｔ４及びＳｏｘ２に対する一次抗体（どちらもＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製）を膜と一緒に＋４℃で終夜インキュベートした。４回洗浄後、ＨＲＰ複合化二次抗体の０．１％Ｔｗｅｅｎ緩衝剤を含む５％乳ＰＢＳ溶液（希釈１：１０００）を膜と一緒に室温で４０分間インキュベートし、ＰＢＳで５回洗浄した。Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製化学発光ＨＲＰ−基材を可視化に使用した。フィルムを２，４００ｄｐｉで走査し、ＣｈｅｍｉＩｍａｇｅｒ５５００プログラム（１Ｄ−Ｍｕｌｔｉ  Ｌｉｎｅ濃度測定モード）によって分析した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ上及びフィーダー細胞上で培養されたヒトＥＳ細胞を正の対照として使用した。
【００６２】
ＦＡＣＳ分析
細胞をトリプシン／ＥＤＴＡを用いて培養皿から除去し、解離させて単細胞懸濁液とし、氷冷ＦＡＣＳ緩衝剤（Ｈａｎｋｓ緩衝剤中２％ウシ胎仔血清、０．１％アジ化ナトリウム）に再懸濁させた。ＳＳＥＡ−４、ＳＳＥＡ−１（どちらもＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ  ＵＳＡ製）、Ｔｒａ１−６０又はＴｒａ１−８１（どちらもＭｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ製）に対する一次抗体と一緒に氷上で１時間インキュベートした。次いで、細胞を氷冷ＦＡＣＳ緩衝剤で３回洗浄した。その後、細胞をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ抗マウス二次抗体（ＧＩＢＣＯ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の１：４００希釈を含むＦＡＣＳ緩衝剤中で３０分間暗所でプローブし、４回洗浄した。対照細胞をマウス免疫グロブリン、続いて上述したように二次抗体と一緒にインキュベートした。細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）によって分析した。データをＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって分析した。Ｏｃｔ４発現の分析も実施した。
【００６３】
核型分析
細胞系の核型分析を標準Ｑバンディング技術を使用して継代２０でＬＮ−５１１上で実施した。細胞の試料をコルセミドＫａｒｙｏＭＡＸ（０．１μｇ／ｍｌ；Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて最高４時間処理し、続いてＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて解離させた。細胞を遠心分離によってペレット化し、予熱した０．０３７５Ｍ  ＫＣｌ低張液に再懸濁させ、１０分間インキュベートした。遠心分離後、細胞を固定液（３：１メタノール：酢酸）に再懸濁させた。中期拡散培養物（ｓｐｒｅａｄ）をガラス顕微鏡スライド上で調製し、トリプシンに短時間曝露してＧ−バンド染色し、４：１Ｇｕｒｒ’ｓ／Ｌｅｉｓｈｍａｎｎ’ｓ染料（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）で染色した。最小１０個の中期拡散培養物を分析し、追加の２０個を数えた。
【００６４】
奇形腫形成
若い（７週齢）重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの精巣嚢下の約１０６個の細胞を移植して奇形腫形成実験を実施した。各細胞系当たり３匹の動物を使用した。奇形腫成長を触診によって毎週測定し、マウスを移植から８週間後に屠殺した。奇形腫を固定し、切片をヘマトキシリンとエオシン（ＨＥ）又はヘマトキシリン、エオシン及びＰＡＳ（ＨＥ−ＰＡＳ）で染色した。全３つの胚性生殖系列層の組織成分の存在が、染色切片から分析して示された。動物実験はすべて、Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの感染のない動物施設で倫理委員会の承認に従って実施された。
【００６５】
胚様体形成
ＥＳ細胞を継代のために上述したようにＬＮ−５１１被覆細胞培養皿から解離させ、小片に分解し、懸濁９６ウェルプレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）中で培養した。これに使用した培地は、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、２０％ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、０．１ｍＭβ−メルカプトエタノール（ＧＩＢＣＯ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）及び１％非必須アミノ酸（ＧＩＢＣＯ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を補充したＫｎｏｃｋｏｕｔ  ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）であった。懸濁状態で１週間後、胚様体をゼラチン被覆組織細胞培養９６ウェルプレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）に移し、１週間培養し、次いで固定し、全３種類の胚性生殖系列層のマーカーに対する抗体（平滑筋アクチン、ネスチン、ＭＡＰ−２及びα−フェトプロテイン、全３種類の抗体はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製であった）で染色し、免疫蛍光の項で上述したように分析した。
【００６６】
統計
統計的有意性を不等分散のＳｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定によって判定した。
【００６７】
第２の実験セットの結果
Ａ．ＬＮ−５１１との強力な接着は、ヒトＥＳ細胞と基層の大きい接触面積をもたらす。
【００６８】
細胞の増殖は、その接着基層との細胞接触面積に大きく依存することが知られている。この考えは、種々のラミニン及び他のＥＣＭタンパク質とのマウスＥＳ細胞の接着、並びに種々のラミニン及び他のＥＣＭタンパク質上でのその増殖に関する本発明者らの以前の知見と一致する。種々のＥＣＭタンパク質とのヒトＥＳ細胞の接着性を比較するために、本出願人らは、ＬＮ−５１１、ＬＮ−３３２、ＬＮ−４１１、ＬＮ−１１１、Ｍａｔｒｉｇｅｌ又はポリ−Ｄ−リジン基層上でヒトＥＳ細胞接着アッセイを実施した（図４ａ及び４ｂ）。ＬＮ−５１１上で成長した接着ヒトＥＳ細胞の平均接触面積は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ上で培養された細胞より約１．６倍高く、ＬＮ−３３２上で培養された細胞より約１．２倍高かった（図４ｂ）。試験した他のコーティング上の胚性幹細胞の拡散は、ＬＮ−５１１上のそれよりもかなり小さかった。
【００６９】
Ｂ．ＨＳ２０７、ＨＳ４２０及びＨＳ４０１細胞はＬＮ−５１１を発現する。
【００７０】
幾つかのヒトＥＳ細胞系の細胞は、ラミニンα５、β１及びγ１鎖を発現することが報告された。それがその系の独特の性質であるかどうかを解明するために、本出願人らは、ＨＳ２０７、ＨＳ４２０及びＨＳ４０１の細胞から生ずるｃＤＮＡのＲＴ−ＰＣＲを、種々のラミニン鎖に特異的なプライマーを使用して実施した。α１、α２及びβ２と一緒にα５、β１及びγ１ラミニン鎖の全３種類の転写物は容易に検出でき、ＬＮ−５１１が全３種類の系のｈＥＳＣ細胞において発現されることを示した（図４ｃ）。興味深いことに、以前の報告と一致して、α３及びβ３ラミニン鎖の転写は記録されず、ＬＮ−３３２が胚性細胞において産生されなかったことを示唆している。
【００７１】
Ｃ．ＬＮ−５１１との接触は、ヒトＥＳ細胞において高度に発現されるインテグリンα６β１に依存する。
【００７２】
ＬＮ−５１１とのｈＥＳ結合に強力に関与するインテグリン受容体を特定するために、本出願人らは接着ブロッキングアッセイを実施した。胚性細胞の単細胞懸濁液をＬＮ−５１１被覆皿上で種々のインテグリン受容体に対する機能阻害抗体を含む培地中でインキュベートした。試験したすべてのインテグリンサブユニットのうち、α６及びβ１は、これらの条件下でＬＮ−５１１との相互作用に関与する最も重要なものであった（図５ａ）。単細胞懸濁液はヒトＥＳ細胞に有利な状態ではないので、実験を３回繰り返して、同じ結果を得た（データ示さず）。
【００７３】
最近、α６β１は、ｈＥＳ細胞表面で最も豊富なインテグリンアイソフォームであることが示された。ｈＥＳ細胞表面のインテグリンサブユニット量の問題に更に対処するために、本出願人らは、抗インテグリン抗体をプラスチック表面に固定し、付着したｈＥＳ細胞に結合し、それを保持することができる抗体を特定した。本出願人らは、β１インテグリンサブユニットに対する抗体が最強の接着を与えるものの、β２、β３及びβ４に対する抗体が、表面にはるかに弱く付着した細胞を保持することを見いだした（β１に対する抗体との接着に比べてそれぞれ１９％、４％及び４％）（図５ｂ）。
【００７４】
免疫蛍光染色によって、未分化（Ｓｏｘ２陽性）ｈＥＳ細胞におけるα６及びβ１インテグリンサブユニットの発現、及び細胞表面のそれらの共存が確認された（図５ｃ）。
【００７５】
Ｄ．ヒトＥＳ細胞は、異種を含まない既知組成培地におけるヒト組換えＬＮ−５１１上で少なくとも４か月自己複製する。
【００７６】
ＬＮ−５１１の自己複製支援能力を試験するために、本出願人らは、３種類のｈＥＳ細胞系をＯ３及びＨ３培地で培養した。ＨＳ２０７、ＨＳ４２０及びＨＳ４０１細胞系は、両方の培地で活発に増殖した。通常、細胞は、小塊で６〜７日ごとに１：２又は１：３の比で継代されたが、多数の細胞が必要な場合は、１：６の比で継代することができた。細胞は、両方の培地で類似した増殖速度及び表現型を示した。図６ａに示すように、ＬＮ−５１１上のヒトＥＳ細胞は、少なくともＭａｔｒｉｇｅｌ上で成長した細胞と同じ安定した速度で増殖した。記述時点で、ＨＳ４２０、ＨＳ２０７及びＨＳ４０１系は、Ｏ３培地においてそれぞれ２８、２７及び２５継代であった（培養５〜６か月）。核型は、２０継代後の全３種類の系で正常であった（図９）。ＨＳ４２０及びＨＳ２０７系は、それまで、Ｈ３においてそれぞれ２９及び２７継代増殖した（５か月）。免疫蛍光及びＲＴ−ＰＣＲ分析によれば、ｈＥＳ細胞は、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２などの多能性マーカーの高い発現レベルを維持した（図６ｂ及び６ｃ）。
【００７７】
ｈＥＳ細胞を継代するときには、それらは、単細胞懸濁液としてではなく、小塊でプレーティングされた。興味深いことに、翌日既に細胞は表面に単層として拡散した（ごく薄い円板状）。これは、ＬＮ−５１１被覆表面との親和性が細胞間接着に匹敵する、又はそれよりもさらに高いことを示唆している。通常、９６ウェル培養プレート上にプレーティングされると、細胞は、まず、薄いコンフルエントな層を形成し、その後、細胞の上方に成長することによって細胞層を形成し始めた。ＬＮ−５１１上の単層とフィーダー又はＭａｔｒｉｇｅｌ上で成長する細胞には差があり、細胞はより不均質であり、より高濃度のコロニー状で出現した。
【００７８】
定性的にでも、安定な増殖速度を有するＯｃｔ４及びＳｏｘ２陽性細胞は、多能性を失い得る。特定の多能性マーカーの発現を定量するために、本出願人らは、ＬＮ−５１１上で培養されたｈＥＳ細胞の試料を異なる時点で収集し、実時間定量ＲＴ−ＰＣＲ及び定量ウエスタンブロット分析を使用して、主な多能性マーカーの発現レベルをＭａｔｒｉｇｅｌ上又はフィーダー細胞層上で培養された細胞と比較した（図６ｄ及び６ｅ）。実時間定量ＲＴ−ＰＣＲによれば、両方の培地で培養されたｈＥＳ細胞のＯｃｔ４及びＮａｎｏｇ発現レベルは、時間とともに低下せず、Ｍａｔｒｉｇｅｌ上で培養された細胞よりも安定して高く、フィーダー細胞上で培養された細胞の発現レベルに匹敵した。ウエスタンブロットの定量は、Ｏｃｔ４及びＳｏｘ２で類似した結果を示した。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によるＬＮ−５１１上で培養された細胞の分析によれば、大多数の細胞は、多能性のマーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ１−６０及びＴＲＡ１−８１を発現し、同時に、ＳＳＥＡ−１を微量しか発現しない（図６ｆ、図１０）。Ｍａｔｒｉｇｅｌ上で培養されたヒトＥＳ細胞の同様の分析によって、わずかに少ないＯｃｔ−４及びＳＳＥＡ−４陽性細胞が明らかになった（図１１）。
【００７９】
ＬＮ−５１１、Ｍａｔｒｉｇｅｌ及びフィーダー上のｈＥＳ培養物における自発的分化レベルを評価するために、本出願人らは、分化マーカーＰａｘ６、Ｓｏｘ１７及びＳｏｘ７の発現レベルを比較した。実時間定量ＲＴ−ＰＣＲによって、２０継代（４か月）後のＬＮ−５１１培養物と４継代（１か月）後のＭａｔｒｉｇｅｌ培養物における全３種類のマーカーの発現レベルが類似していることが明らかになった（図１２）。
【００８０】
ＬＮ−５１１が新しいｈＥＳ細胞系の誘導に有用であり得るかどうかを試験するために、本出願人らは、３個の６日目の胚盤胞の内部細胞塊を単離し、それをＬＮ−５１１上にプレーティングした。細胞は、コーティングに容易に付着し、ｈＥＳ細胞に典型的な増殖物（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）を生じた（図１３ａ）。培養１０日後、増殖物を小片に機械的に解離させ、その一部を免疫染色すると、多能性のマーカーＮａｎｏｇ及びＯｃｔ４の発現を示した（図１３ｂ及び１３ｃ）。実験は、倫理委員会の承認に従って実施された。
【００８１】
Ｅ．ヒトＥＳ細胞は、ＬＮ−５１１上での培養４か月後にヒト胚の全３種類の生殖系列に分化することができる。
【００８２】
Ｏ３培地においてＬＮ−５１１上で１５、２０及び２０継代培養されたＨＳ２０７、ＨＳ４２０及びＨＳ４０１細胞、並びにＨ３培地において２３継代培養されたＨＳ２０７細胞は、重症複合免疫不全マウス（ＳＣＩＤ）の精巣に移植後、奇形腫を形成した。染色切片の分析によって、細胞がヒト胚の全３種類の生殖系列の細胞に分化する能力が確認された（図７ａ〜７ｄ）。発生の可能性を更に調べるために、Ｏ３培地においてＬＮ−５１１上で２０継代後の全３種類のｈＥＳ系の細胞を、胚様体の形成及びそれに続く全３種類の胚性胚葉のマーカーの免疫染色によってインビトロで調べた。染色によって、中胚葉（平滑筋アクチン）、外胚葉（ネスチン及びＭＡＰ−２）及び内胚葉（α−フェトプロテイン）マーカーの発現が明らかになった（図７ｅ）。これは、細胞の多能性の更なる証拠である。
【００８３】
Ｆ．ＬＮ−５１１上の種々のヒトＥＳ細胞系自己複製
ＬＮ−５１１が種々のｈＥＳ系の自己複製を支援することができるかどうか判定するために、本出願人らは、Ｏ３又はｍＴｅＳＲ１培地におけるタンパク質上で培養された、十分に特徴づけられ、広く用いられるＨ１及びＨ９  ｈＥＳ系を培養した。Ｈ１及びＨ９細胞の表現型及び増殖速度は、同じ条件下でＨＳ２０７、ＨＳ４２０及びＨＳ４０１細胞と類似した。免疫蛍光分析によれば、ＬＮ−５１１上の培養５継代（１か月）後、Ｈ１及びＨ９細胞は、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２などの多能性マーカーの発現を維持した（図８）。
【００８４】
ＩＩＩ．考察
本試験によれば、ＬＮ−５１１は、異種を含まない環境における培養においてヒトＥＳ細胞の生存及び自己複製を支援する人工的微小環境を少なくとも２０継代又は４か月提供した。重要なことには、細胞は、その長期のＬＮ−５１１上の培養後に、ヒト胚の全３種類の生殖系列の細胞系譜を含む奇形腫を形成した。異種もフィーダーも含まない既知組成ｈＥＳ細胞培養システムが大いに必要とされるので、本明細書に記載のシステムは、その問題の解決策を提供することができる。
【００８５】
ＬＮ−５１１は、このタンパク質がヒトＥＳ細胞の天然の起源である胚盤胞の内部細胞塊において検出されたので、ヒト胚における幹細胞の自然微小環境の一部である可能性がある。さらに、ＬＮ−５１１は、インビトロでフィーダー細胞上で培養されたヒト胚性幹細胞のコロニー中で発現される。さらに、ヒトＥＳ細胞はＬＮ−５１１自体を発現し（図４ｃ）、このタンパク質はＥＳ細胞の構築を促進する。これは、フィーダー細胞層上のその自己複製に極めて重要である。ＬＮ−５１１は、ｈＥＳ細胞の自然環境の一部であるので、ヒトＥＳ細胞をインビトロで自己複製するための生物学的に関連したコーティング基質を提供することができる。最近、ｈＥＳ細胞がＬＮ−１１１、ＬＮ−３３２、ＬＮ−５１１などの幾つかの組換えヒトラミニン上で９６時間多能性のままでいることが報告された。しかし、マウスＥＳ細胞を使用した以前の研究によれば、ＥＳ細胞自己複製に対する基質分子の能力を実証するために、細胞をより長く培養することが重要である。該研究では、マウスＥＳ細胞は、ＬＮ−５１１とＬＮ−３３２の両方で少なくとも１６９日間生存し、増殖したが、ＬＮ−５１１上で培養されたマウスＥＳ細胞のみが生殖細胞系に適格なキメラマウスを生成することができた。
【００８６】
ｈＥＳ細胞が、新しいＬＮ−５１１被覆プレートに塊状で継代された後、単層を形成する傾向にあったことは興味深い。これは、ＬＮ−５１１が、通常、移動可能なヒトＥＳ細胞を与え、したがって可溶性栄養素及び増殖因子の移動が困難な高密度多層クラスターの形成を回避できることを示唆している。ＬＮ−５１１上で培養されたｈＥＳ細胞に対する可溶性因子の利用能は、フィーダー又はＭａｔｒｉｇｅｌ上で培養したときに過成長したＥＳ細胞コロニーの中央部で通常見られる自発的分化及び死亡を回避するのに役立ち得る。ｈＥＳ細胞の単層は、可溶性因子の同等の利用能によってより均質な分化細胞集団を生成することができるので、分化手順の開発にも有益であり得る。
【００８７】
ヒトＥＳ細胞の集団はすべて、恐らくは自発的分化に帰因するある割合の分化細胞を含む。人工的微小環境は、それにコロニーを形成し、自己複製するために、非分化ヒトＥＳ細胞に競合の優位性を与えるべきである。本出願人らは、実験中にポジティブ選択を行わなかったが、それでも、本出願人らは、ＦＡＣＳを使用して、未分化ヒトＥＳ細胞の割合が実験全体を通して安定で高いことを示した（図６ｆ）。
【００８８】
本出願人らは、ＬＮ−５１１へのヒトＥＳ細胞の付着機序が、α６β１インテグリン受容体との結合にも大きく依存することを示した（図５ａ）。さらに、本出願人らは、β１インテグリンに対する抗体がβ２、β３又はβ４インテグリンよりも強力なヒトＥＳ細胞の付着を支援することを認めた。これは、細胞接着におけるβ１含有インテグリンの枢要な役割を強調するものである（図５ｂ）。最近、α６β１は、ｈＥＳ細胞表面２４で最も豊富なインテグリンアイソフォームであることが判明した。これらの観察に基づいて、本出願人らは、α６β１インテグリンを多量に発現するヒトＥＳ細胞が、素早く付着し、ＬＮ−５１１被覆表面に効率的に移動することができ、その結果ＬＮ−５１１被覆表面はそれらの自己複製を促進することを示唆する。したがって、ＬＮ−５１１の役割は、ヒトＥＳ細胞に表面との限局的な接着接触点を与え、その上の移動を可能にすることかもしれない。ＬＮ−５１１の発現が初期胚に限定されず、多数の成体組織の基底膜において見られるという事実は、この考えを支持するものである。
【００８９】
時間的に、ＬＮ−５１１被覆実験プレート上のヒトＥＳ細胞自己複製で得られた本結果は、マウスＥＨＳ肉腫由来のＭａｔｒｉｇｅｌ又はヒトフィーダー細胞上で得られたものと少なくとも同程度に良好である。しかし、ヒトＬＮ−５１１コーティングの完全に既知組成の、異種を含まない組成物は、標準化された不変の科学的な将来の臨床応用の観点から、かなりの利点を有し得る。さらに、既知組成基層は、同じ目的でフィーダー細胞を使用するのと比較して主要な利点である。というのは、フィーダー細胞は、サイトカインなどの生理活性分子のその産生が変動し得るものであり、増殖因子及び他のタンパク質はほとんど未知であり、それらは、微生物及びウイルス混入のリスク、並びに結果におけるバッチ間のばらつきも引き起こし得る。したがって、この研究において記述されるＬＮ−５１１に基づく異種もフィーダーも含まないヒトＥＳ細胞培養システムは、この問題の重要な解決策となり得る。大部分の国では、規制当局が、ヒト療法への使用が意図されたあらゆる試薬に厳格な規則を適用する。ヒト組換えＬＮ−５１１は、ヒト細胞において産生される既知組成のタンパク質であるので、細胞療法用ヒト細胞の開発に適切なタンパク質を生産することができる製造手順を確立することが可能である。製造は、医薬品の製造管理及び品質管理に関する基準（ＧＭＰ）の実験室に容易に取り入れることができる。
【００９０】
ＴｅＳＲ１培地は、Ｍａｔｒｉｇｅｌと併用するために処方された。それは、多数の増殖因子を極めて高濃度で含む。ＬＮ−５１１は、ｈＥＳ細胞のより良好な拡散及び主要な多能性マーカーの高い平均発現を与えたので、増殖因子、特にｂＦＧＦの用量を削減するために、培地組成を最適化する可能性を広げる。Ｍａｔｒｉｇｅｌとは異なり、ＬＮ−５１１は、バッチごとのコーティングで安定である規定された均質なタンパク質分子である。ｈＥＳ細胞をインビトロで培養する、より規定された環境の使用は、分化の分子機構を明らかにし、理解するのに役立ち、インビトロでのヒトＥＳ細胞の分化経路を設計するためのより制御可能な条件を提供することができる。
【００９１】
特定の実施形態を記述したが、現在予期しない又はし得ない代替形態、改変形態、変更形態、改善形態及び実質的均等形態が本出願人ら又は他の当業者に生じ得る。したがって、提出された、さらに、補正され得る、添付の特許請求の範囲は、かかる代替形態、改変形態、変更形態、改善形態及び実質的均等形態すべてを包含するものとする。
【図１】
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【図４ａ】
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【図５ｃ】
0006016642.tif 000006
【図６ｂ】
0006016642.tif 000007
【図７ａ】
0006016642.tif 000008
【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図６ｅ】
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【図６ｆ】
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【図７ｅ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【配列表】
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