(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト心臓組織由来細胞を生成するための方法であって、
ａ．ヒト心臓組織を解離させる工程と、
ｂ．前記ヒト心臓組織を消化して細胞を放出させる工程と、
ｃ．前記放出された細胞から心筋細胞を除去する工程と、
ｄ．残りの細胞を培養して接着性の心臓組織由来細胞を得る工程とを含んでなり、
ここで、前記除去する工程が、濾過することを含んで成り、ここで、前記培養する工程が、任意に再播種を含んで成り、そしてここで、前記心臓組織由来細胞が、テロメラーゼ及びＩＳＬ−１を発現せず且つＣＤ１０５及びＣＤ１１７を発現する、上記方法。
【請求項２】
前記心臓組織を手で解離させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記心臓組織を機械的に解離させる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記心臓組織を、コラゲナーゼ及びディスパーゼからなる群から選択される少なくとも１種類の酵素により消化する、請求項１から３のいずれか１に記載の方法。
【請求項５】
心臓全体を前記心臓組織の供給源として使用する、請求項１から４のいずれか１に記載の方法。
【請求項６】
前記ヒト心臓組織由来細胞が、更に、以下のマーカー：ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５９、ＣＤ９０及びＣＤ３４、の少なくとも１つを発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ヒト心臓組織由来細胞が、更に、以下のマーカー：ＣＤ１６、ＣＤ３１、ＣＤ４５及びＣＤ４６の少なくとも１つを発現しない、請求項１または６に記載の方法。
【請求項８】
損傷した心筋を治療するうえで充分な量のヒト心臓組織由来細胞の集団を含んでなる、患者の損傷した心筋を治療するための医薬組成物であって、ここで、前記細胞が、テロメラーゼ及びＩＳＬ−１を発現せず且つＣＤ１０５及びＣＤ１１７を発現し、ここで、前記細胞が請求項１から５のいずれか１に記載の方法によって得ることができる、上記組成物。
【請求項９】
前記ヒト心臓組織由来細胞が、前記損傷した心筋への直接的注入によって投与される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ヒト心臓組織由来細胞が、前記損傷した心筋に直接隣接した前記心臓の領域への直接的注入によって投与される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
損傷した心筋を修復するうえで充分な量のヒト心臓組織由来細胞を含んでなる、患者の損傷した心筋を修復するための医薬組成物であって、ここで、前記細胞が、テロメラーゼ及びＩＳＬ−１を発現せず且つＣＤ１０５及びＣＤ１１７を発現し、ここで、前記細胞が請求項１から５のいずれか１に記載の方法によって得ることができる、上記組成物。
【請求項１２】
前記ヒト心臓組織由来細胞が、前記損傷した心筋への直接的注入によって投与される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ヒト心臓組織由来細胞が、前記損傷した心筋に直接隣接した前記心臓の領域への直接的注入によって投与される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
テロメラーゼ及びＩＬＳ−１を発現せず、ＣＤ１０５及びＣＤ１１７を発現し、そして更に以下のマーカー：ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５９、ＣＤ９０及びＣＤ３４の少なくとも１つを発現する、ヒト心臓組織由来細胞の純化された集団であって、ここで、前記細胞が請求項１から５のいずれか１に記載の方法によって得ることができる、上記ヒト心臓組織由来細胞の純化された集団。
【請求項１５】
テロメラーゼ及びＩＬＳ−１を発現せず、ＣＤ１０５及びＣＤ１１７を発現し、以下のマーカー：ＣＤ１６、ＣＤ３１及びＣＤ４５の少なくとも１つを発現しない、ヒト心臓組織由来細胞の純化された集団であって、ここで、前記細胞が請求項１から５のいずれか１に記載の方法によって得ることができる、上記ヒト心臓組織由来細胞の純化された集団。
【請求項１６】
前記細胞がＧＡＴＡ４及びＮｋｘ２．５を発現する、請求項１４または１５に記載のヒト心臓組織由来細胞の集団の純化された集団。
【請求項１７】
テロメラーゼ、ＩＬＳ−１、ＣＤ１６、ＣＤ３１及びＣＤ４５を発現せず且つＣＤ１１７、ＧＡＴＡ４、Ｎｋｘ２．５、ＣＤ１０５及びＣＤ９０を発現する、ヒト心臓組織由来細胞の純化された集団であって、ここで、前記細胞が請求項１から５のいずれか１に記載の方法によって得ることができる、上記ヒト心臓組織由来細胞の純化された集団。
【請求項１８】
ヒト心臓組織由来細胞が、ＧＡＴＡ４及びＮｋｘ２．５を発現する、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１９】
ヒト心臓組織由来細胞が、テロメラーゼ、ＩＬＳ−１、ＣＤ１６、ＣＤ３１及びＣＤ４５を発現せず、ＣＤ１１７、ＧＡＴＡ４、Ｎｋｘ２．５、ＣＤ１０５及びＣＤ９０を発現する、請求項１〜５のいずれか１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本発明は、２００９年７月９日出願の米国特許出願第６１／２２４，４４６号に基づく優先権を主張するものである。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ヒト心臓組織由来細胞を用いて損傷した心筋を修復するための方法及び組成物に関する。詳細には、本発明は、テロメラーゼを発現しない増殖させたヒト心臓組織由来細胞を用いて損傷した心筋を修復するための方法及び組成物を提供する。
【背景技術】
【０００３】
急性心筋梗塞（ＡＭＩ）は米国における死因の第１位である。ＡＭＩは、一般に冠状動脈の狭窄により心臓の一部への血流が突然かつ持続的に失われることによって引き起こされる。充分な血液の供給がなくなるために組織は虚血状態となり、筋細胞及び血管構造の死につながる。この組織の壊死部分は梗塞部位と呼ばれ、最終的に瘢痕組織化する。残りの心筋細胞は壊死組織を再生させることはできず、心臓は時間とともに劣化する。この劣化は、損傷した心筋のリモデリングをともなう心筋の機能の喪失という形をとりうる。
【０００４】
現在の急性心筋梗塞の治療法には、閉塞した血管を開通させて、梗塞部位への血液の供給を回復させる目的で血栓溶解、あるいは血管形成術に重点を置いたものがある。これらの治療法は、梗塞部位のサイズを効果的に縮小して心臓の収縮機能を改善させうるものであるが、損傷した心筋のリモデリングをともなう心筋の機能の喪失を回復させるものではない。例えばアンジオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥＩ）及びβ遮断薬などの他の治療法もやはり、全体的機能及び生存率を改善するものである。しかしながら、これらの薬物療法の治療効果によるＡＭＩ後の患者における生存率の改善は、５％未満に過ぎない。
【０００５】
細胞移植は、急性心筋梗塞に対する別の有望な治療法となりうるものである。例えば、オーリック（Orlic）らは、損傷した心筋へのＬｉｎ-ｃ−ｋｉｔ+骨髄細胞の注入について報告している（Ｎａｔｕｒｅ  ４１０：７０１〜７０５（２００１））。オーリックらは、「我々の研究は局所投与された骨髄細胞が新たに心筋を形成し、冠動脈疾患の転帰を改善しうることを示している」と述べている。
【０００６】
別の例では、ニグレン（Nygren）らは、「我々は非分画骨髄細胞及び純化された造血幹及び前駆細胞の集団が梗塞した心筋内に効率的に生着することを示した。しかしながら、生着は一時的であり、その性質は造血性であった。これに対して、骨髄由来の心筋細胞は梗塞した心筋の外側で低頻度で観察され、細胞融合によってのみ誘導された」と述べている（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １０：４９４〜５０１（２００４））。
【０００７】
しかしながら、骨髄由来細胞がＡＭＩを治療する機構は解明されていない。例えばミュリー（Murry）らは、「我々は、心筋に限定されるレポーター導入遺伝子及び普遍的に発現するレポーター導入遺伝子の両方を用い、正常な成体マウス心臓及び傷害された成体マウス心臓への１４５例の移植後の造血幹細胞の運命を追跡した。細胞運命を追跡するためのこれらの遺伝子技術を用いた場合、心筋細胞への分化転換は検出されず、幹細胞を移植した心臓は、シャムを移植した心臓と比較して心筋細胞の明らかな増加は示さなかった。これらの結果は、造血幹細胞は心筋の表現型を容易には獲得しないことを示しており、梗塞修復の臨床研究について注意を喚起するものである」と述べている（Ｎａｔｕｒｅ  ４２８：６６４〜６６８（２００４））。
【０００８】
別の例として、ワーナー（Werner）らは、「しかしながら、最も効果的な前駆細胞のサブ集団、前駆細胞を増加させるための最良の方法、基礎となる作用機序、並びに方法の長期的安全性及び効果に関しては、解明されなければならない不明な点が依然数多く存在している。更に、ＡＭＩの患者における［骨髄細胞］療法の複数の臨床試験においてネガティブな結果が得られているが、これは、ＡＭＩ後の［骨髄細胞］投与のタイミング、使用される前駆細胞調製の方法の違い、又はその両方によるものである可能性がある」と述べている（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５：７８〜７９（２００８））。
【０００９】
別の例として、バルサム（Balsam）らは、「傷害された心臓の微小環境においてさえも、ｃ−ｋｉｔが濃縮されたＢＭ細胞、Ｌｉｎ-  ｃ−ｋｉｔ+ＢＭ細胞、及びｃ−ｋｉｔ+  Ｔｈｙ１．１lo  Ｌｉｎ−Ｓｃａ−１+の長期再生型の造血幹細胞は、従来の造血細胞の運命のみを獲得する」と述べている（Ｎａｔｕｒｅ  ４２８：６６８〜６７３（２００４））。
【００１０】
別の可能な細胞の供給源として、胚性幹細胞がある。例えば、ゴールド（Gold）ら（国際特許出願公開第２００５０９０５５８号）は、再生医療において使用するために胚性幹細胞から心筋細胞系統の細胞を生成するための方法を開示している。
【００１１】
別の例として、ゴールド（Gold）及びハッサニプア（Hassanipour）（国際特許出願公開第２００７００２１３６号）は、霊長類の多能性幹細胞を心筋細胞系統の細胞に分化させる方法を開示している。
【００１２】
別の可能な細胞の供給源として、心臓前駆細胞がある。心臓前駆細胞は、ヒト及びラットの心臓において同定されている。心臓前駆細胞は自己再生能を有し、すべての心臓細胞系統を生じる多能性を有している。
【００１３】
例えば、米国特許出願第２００４０１２６８７９Ａ１号は、損傷した心筋を治療するためのＣＤ３１+であり、ＣＤ３８+かつｃ−ｋｉｔ-である心臓幹細胞の使用について開示している。
【００１４】
別の例として、オー（Oh）らは、Ｓｃａ−１、ＣＤ３１及びＣＤ３８を発現し、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ２２０、Ｇｒ−１、Ｍａｃ−１、ＴＥＲ１１９、ｃ−ｋｉｔ、Ｆｌｋ−１、ｅ−カドヘリン、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子、ＣＤ４５及びＣＤ３４を発現しない成人心臓由来の心臓前駆細胞の存在について開示している（ＰＮＡＳ  １００：１２３１３〜１２３１８（２００３））。
【００１５】
別の例として、米国特許出願第２００８０２４１１１１Ａ１号は、（ｉ）哺乳動物からの心臓組織片を酵素的に処理することによって細胞懸濁液を調製する工程と、（ｉｉ）密度勾配法によって前記細胞懸濁液から一群の心臓組織由来細胞を分離する工程と、（ｉｉｉ）得られた一群の心臓組織由来細胞を、線維芽細胞増殖因子及び上皮成長因子を含む培地中で懸濁培養した後、浮遊する球状体を形成する細胞を選択及び分離する工程とによって調製される哺乳動物の心臓組織由来細胞を調製するための方法について開示している。
【００１６】
別の例として、米国特許出願第２００８０２１３２３１Ａ１号は、ヒト又はマウスの骨格筋組織に由来する多能性幹細胞からなる多能性幹細胞群であって、この多能性幹細胞がｃ−ｍｅｔ陰性、Ｐａｘ−７陰性、Ｍｙｆ−５陰性、ＭｙｏＤ−陰性、ミオゲニン−陰性、Ｍ−カドヘリン−陰性、ＣＤ１０５−陽性、ＣＤ９０−陽性、ｃ−ｋｉｔ−陰性かつＣＤ−４５陰性であり、多能性幹細胞がヒト由来幹細胞の場合にはＣＤ３４−陰性であり、マウス由来幹細胞の場合にはＣＤ３４−陽性であり、多能性幹細胞群が１個の細胞の増殖によって得られるような多能性幹細胞群について開示している。
【００１７】
別の例として、ラウグウィッツ（Laugwitz）らは、出生後ラット、マウス及びヒト心筋におけるｉｓｌ１−１+心臓前駆細胞について開示している（Ｎａｔｕｒｅ  ４３３：６４７〜６５３（２００５））。
【００１８】
別の例として、メッシーナ（Messina）らは、「生後心房又は心室ヒト生検試料のサブ培養及びマウス心臓からの、自己接着性の細胞塊（「カーディオスフェア」と我々は命名した）として増殖する未分化細胞の単離」について開示しており、「これらの細胞は、クローン原性であり、幹細胞及び内皮前駆細胞抗原／マーカーを発現し、成人心臓幹細胞の性質を有しているようである」としている。メッシーナらは、「新たに発生するヒト及びマウスのカーディオスフェアは、内皮（ＫＤＲ（ヒト）／ｆｌｋ−１［マウス］、ＣＤ−３１）及び幹細胞（ＣＤ−３４、ｃ−ｋｉｔ、ｓｃａ−１）のマーカーを発現していることが明らかとなった」と述べている（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９５：９１１〜９２１，（２００４））。
【００１９】
別の例として、スミス（Smith）らは、「初代培養中で増殖させた経皮的心筋内生検試料はカーディオスフェアとして知られる多細胞細胞塊を形成したが、これを播種してカーディオスフェア由来細胞（ＣＤＣ）を得た」と述べている（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１５（７）：８９６〜９０８（２００７））。
【００２０】
別の例として、米国特許出願第２００７００２０７５８号は、細胞移植及び心筋又は他の臓器の機能修復に使用するためにヒト又は動物組織生検試料から心臓幹細胞を単離、増殖及び保存するための方法を開示している。
【００２１】
別の例として、ベルトラミ（Beltrami）らは、「心臓幹細胞の性質を有するＬｉｎ−ｃ−ｋｉｔＰＯＳ細胞の存在」について開示しており、「これらの細胞は自己再生能を有し、クローン原性及び多能性であり、筋細胞、平滑筋、及び拝披細胞を生じる」としている（Ｃｅｌｌ  １１４（６）：７６３〜７７６（２００３））。
【００２２】
別の例として、国際特許出願公開第２００８０５４８１９号は、ｉｓｌ１+／Ｎｋｘ２．５+／ｆｌｋ１+のマーカーについて陽性である心血管幹細胞、並びに内皮、心臓、及び平滑筋細胞系統に沿って分化可能な心血管幹細胞を開示している。
【００２３】
別の例として、国際特許出願公開第２００８１０９８３９Ａ１号は、ＣＸＣＲ４ポリペプチド及びＦＩｋ−Ｉポリペプチドを含む幹細胞の濃縮化集団であって、前記幹細胞がＭｅｆ２Ｃ、ＧＡＴＡ−４、ミオカルディン、及びＮｋｘ２．５ポリペプチドを発現する細胞に分化可能である、幹細胞の濃縮化集団について開示している。
【００２４】
別の例として、国際特許出願公開第２００８０８１４５７Ａ２号は、心臓幹細胞を単離する方法であって、細胞の解離を誘導するうえで充分な条件下で、心臓幹細胞を含む組織を、ディスパーゼＩＩを含む組成物と接触させることによって心臓幹細胞を単離する工程を含む、方法を開示している。
【００２５】
別の例として、国際特許出願公開第２００８０５８２７３Ａ２号は、心房又は心室の心臓組織から哺乳動物の幹細胞様筋細胞由来細胞（ＭＤＣ）を得るための方法であって、心房又は心室の心臓組織から細胞を単離して細胞懸濁液を形成する工程と、この細胞を、分裂促進因子を含む培地中で培養することによってＭＤＣを含む組成物を形成する工程と、を含む方法を開示している。
【００２６】
別の例として、国際特許出願公開第２００８０５４８１９Ａ２号は、心血管幹細胞を単離するための方法であって、細胞の集団を、Ｉｓｌｅｔ１、Ｎｋｘ２．５及びｆｌｋ１と反応性を有する物質と接触させ、反応性の陽性細胞を非反応性の細胞から分離する工程を含む、方法を開示している。
【００２７】
別の例として、国際特許出願公開第２００７０２１２４２３Ａ１号は、ｃ−ｋｉｔ-／ｃ−ｍｅｔ-である筋肉由来の心筋細胞前駆細胞を単離する方法であって、筋細胞の懸濁液から直径４０μｍ未満の細胞を分離する工程と、この細胞を固体基材上で組織培地中で培養する工程と、この培地中に浮遊している細胞を単離することによって、ｃ−ｋｉｔ-／ｃ−ｍｅｔ-の筋肉由来の心筋細胞前駆細胞を単離する工程と、を含む方法を開示している。
【００２８】
別の例として、米国特許出願第２００５００５８６３３号は、単離された哺乳動物の筋肉由来のｃ−ｋｉｔ−／ｃ−ｍｅｔ−の心筋細胞前駆細胞を開示している。
【００２９】
別の例として、国際特許出願公開第２００４０１９７６７号は、ｃ−ｋｉｔｎｅｇ／ＣＤ３１＋／ＣＤ３８＋を有し、テロメラーゼ逆転写酵素を発現している単離された哺乳動物心筋細胞の幹細胞を開示している。
【００３０】
別の例として、国際特許出願公開第２００８０８３９６２Ａ１号は、細胞表面上のＳｃａ−１又はＳｃａ−１様エピトープ及びＣＤ３１によって特徴付けられる心筋細胞前駆細胞（ＣＭＰＣ）を開示している。
【００３１】
別の例として、米国特許出願第２００８０２１３２３０Ａ１号は、幹細胞又は前駆細胞が濃縮された単離された細胞集団を調製するための方法であって、（ａ）組織試料を培養する工程と、（ｂ）前記培養の間に接着性線維芽細胞の上に移動する細胞を得る工程と、（ｃ）（ｂ）において得られた１以上の細胞をクローニングして１以上のクローン原性集団を生成する工程と、（ｄ）所望の表現型を有する１以上のクローン原性集団を特定する工程と、（ｅ）幹細胞又は前駆細胞の１以上の細胞表面又は内部マーカーを用いた細胞選別によって、工程（ｄ）で特定された１以上のクローン原性集団から幹細胞又は前駆細胞を単離する工程と、（ｆ）単離された幹細胞又は前駆細胞を条件培地中でフィーダー細胞の非存在下で培養することによって、幹細胞又は前駆細胞が濃縮された単離された細胞集団を得る工程と、を含む方法を開示する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３２】
しかしながら、細胞を単離又は増殖させる効率的な方法がないことが心臓前駆細胞の使用の１つの障害となっている。したがって、心筋の損傷の治療法としての心筋前駆細胞の有効性を評価するためには、心筋前駆細胞を効率的に単離及び増殖させることが依然求められている。
【課題を解決するための手段】
【００３３】
本発明は、ヒト心臓組織に由来する細胞を単離及び増殖させるための方法を提供する。本発明の方法に基づいて単離及び増殖された細胞はテロメラーゼを発現せず、損傷した心筋を治療又は修復するうえで有用である。
【００３４】
本発明は、テロメラーゼを発現しない純化されたヒト心臓組織由来細胞の集団を提供する。
【００３５】
本発明は、テロメラーゼを発現しないヒト心臓組織由来細胞を生成するための方法であって、
ａ．心臓組織を得る工程と、
ｂ．この心臓組織を解離させる工程と、
ｃ．この心臓組織を消化して細胞を放出させる工程と、
ｄ．放出された細胞から心筋細胞を除去する工程と、
ｅ．残りの細胞を培養する工程と、を含む方法を提供する。
【００３６】
一実施形態では、本発明は患者の損傷した心筋を治療又は修復するための方法であって、
ａ．テロメラーゼを発現しないヒト心臓組織由来細胞の集団を得る工程と、
ｂ．損傷した心筋を治療又は修復するうえで充分な量のヒト心臓組織由来細胞の集団を患者に投与する工程と、を含む方法を提供する。
【００３７】
一実施形態では、患者を治療するために使用されるヒト心臓組織由来細胞は凍結保存されたものである。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明の細胞を単離する手順の概略を示す。細胞集団を得るためのプロセスの詳細については実施例１で述べる。
【図２】本発明のヒト心臓組織由来細胞の単離の概略を示す。細胞の初期の集団を得るためのプロセスの詳細については実施例１で述べる。
【図３】本発明のヒト心臓組織由来細胞を単離するための別の方法の概略を示す。
【図４】本発明のヒト心臓組織由来細胞（ｈＣＴＣ）の形態を示す。図に示されるすべての画像は、特に断らないかぎりはいずれも１００倍の倍率である。パネルａ：最初の消化で得られた細胞のプレプレーティングにより得られた細胞懸濁液を示す画像である。黒い矢印は、フェーズブライトな非接着性のＳ細胞を示す。パネルｂ：黒い矢印は、フェーズブライトなＳ細胞の細胞塊を示す。白い矢印は、初期の播種により得られた接着性細胞を示す（示される画像は２００Ｘ倍の倍率である）。パネルｃは、Ｓ細胞培養を再播種することにより誘導されるＡ２細胞を示す。パネルｄは、Ａ２細胞培養中に再播種されたフェーズブライトなＳ細胞を示す。
【図５】ｈＣＴＣの増殖能力に対する播種密度の影響を示す。Ｘ軸は、凍結バイアルからｈＣＴＣ（Ａ１）細胞とｈＣＴＣ（Ｓ）細胞との混合物を播種した後の培養日数を示す。Ｙ軸は、ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞の累積全集団倍加数を示す。
【図６】ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞の増殖能力に対する低酸素濃度の影響を示す。
【図７】ラット心臓組織由来ｒＣＴＣ（Ａ２）細胞（ｒＣＴＣ（Ａ２））の増殖能力を示す。Ｘ軸は、凍結バイアルからｒＣＴＣ（Ｓ）細胞を再播種した後の培養日数を示す。Ｙ軸は、ｒＣＴＣ（Ａ２）細胞の累積全集団倍加数を示す。
【図８】凍結保存及び潜在的な投与装置（３０ゲージの注射針からなる）による模擬的投与後のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞の回復率及び生存率を示す。左Ｙ軸に回復した生細胞数を示す。右Ｙ軸に細胞生存率を示す。黒塗りの菱形は細胞生存率を示し、白抜きの四角は細胞回復率を示す。詳細については実施例６に述べる。
【図９】凍結保存及び潜在的な投与装置（３０ゲージの注射針からなる）による模擬的投与後のｒＣＴＣ（Ａ２）細胞の回復率及び生存率を示す。左Ｙ軸に回復した生細胞数を示す。右Ｙ軸に細胞生存率を示す。黒塗りの四角は注射針通過前の細胞回復率を示し、黒塗りの三角形は注射針通過前の細胞生存率を示し、白抜きの四角は注射針通過後の細胞生存率を示し、白抜きの三角は注射針通過後の細胞回復率を示す。詳細については実施例６に述べる。
【図１０】フローサイトメトリーによって調べたｈＣＴＣ（Ａ３）細胞表面マーカーの発現を示す。各ヒストグラムにおいて、破線はアイソタイプ抗体のコントロールである。実線は抗原の染色である。各抗原を各パネルに示した。Ｘ軸は、対数目盛で示したフィコエリトリン（ＰＥ）強度である。Ｙ軸は細胞カウント。
【図１１】ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞（上側のパネル）と成人ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ（カタログ番号：ＣＣ−２５１１、ロンザ社（Lonza）、下側のパネル））との間の細胞表面マーカーの発現の比較を示す。各ヒストグラムにおいて、Ｘ軸は対数目盛で示したＰＥ強度である。Ｙ軸は細胞カウントである。破線は抗体のアイソタイプコントロールを示す。実線は抗原の染色である。陽性集団は、アイソタイプコントロール中の１％の陽性集団に基づいてゲート設定した。個々のマーカーを各ヒストグラムに示した。
【図１２】フローサイトメトリーによって調べたｒＣＴＣ（Ａ２）細胞表面マーカーの発現を示す。破線はアイソタイプコントロールを示す。実線は、ＣＤ３１（左パネル）及びＣＤ９０（右パネル）に対する抗原の染色。
【図１３】定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって調べた、ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞における心臓特異的遺伝子の遺伝子発現を示す。詳細については実施例８に述べる。Ｙ軸は、ＧＡＰＤＨの比率（％）を示し、上側と下側の目盛に分けられている。下側の目盛は０〜０．０１％の範囲であり、上側の目盛は０．０５％〜０．１５％の範囲である。略語は以下の意味を有する。すなわち、ＭＨＣはミオシン重鎖を意味する。心臓ＴＦは転写因子を意味する。ＮＨＤＦは新生児ヒト皮膚線維芽細胞を意味する。ｈ心臓はヒト心臓を意味する。データは、平均±Ｓ．Ｄ（ｎ＝３）として表す。
【図１４】マウス心臓組織由来（Ａ２）細胞（ｍＣＴＣ（Ａ２））と、ラット新生児心筋細胞（カタログ番号Ｒ３５７−６Ｗ、セル・アプリケーション社（Cell Application）、テキサス州オースチン）との共培養中におけるマウス特異的ミオシン重鎖の発現の上昇を示す。マウスＭＨＣ遺伝子の発現レベルを、各試料中のマウスＧＡＰＤＨの比率（％）として示した。Ｙ軸は、マウスＧＡＰＤＨの比率（％）を示す。略語は以下の意味を有する。ｍＣＴＣは実施例９で述べるような分化培地中で培養したｍＣＴＣ（Ａ２）細胞を意味する。ＣＭは心筋細胞を意味する。ｍＣＴＣ＋ＣＭは、分化培地中でラット心筋細胞ＣＭと共培養したｍＣＴＣを意味する。データは、平均±Ｓ．Ｄ（ｎ＝３）として表す。
【図１５】実施例１０で述べる方法に従って培養した、ブタ心臓組織由来（Ａ３）細胞（ｐＣＴＣ（Ａ３））で観察された増殖曲線を示す。Ｘ軸は播種後の培養時間を示す。Ｙ軸は累積全集団倍加数を示す。
【図１６】フローサイトメトリーによって検出されたｐＣＴＣ（Ａ３）細胞表面マーカーの発現を示す。破線はアイソタイプコントロールを示す。実線は、ＣＤ９０（左上のパネル）、ＣＤ１０５（右上のパネル）、ブタ内皮細胞マーカー（左下のパネル）、ＣＤ１６（下段中央のパネル）、ＣＤ４５（右下のパネル）に対する抗原の染色である。
【図１７】急性心筋梗塞後の心臓リモデリングの描画を示す。描画は、Ｐｆｅｆｆｅｒ  Ｍ．ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ（Ｃｏｌｕｃｃｉ  Ｗ，ｅｄｉｔｏｒ，１９９９）より転載したもの。
【図１８】心エコーによって測定した、急性心筋梗塞を誘発させた動物における左室内径短縮率（ＦＳ）に対する本発明の心臓組織由来細胞の投与の影響を示す。左室内径短縮率は、各心臓周期における拡張期からの収縮期の変化率（ＦＳ％）であり、心臓の全体的機能を反映している。図に示されるデータは、ＡＭＩの誘発の５日（Ｄ５）又は２８日（Ｄ２８）後に個々の動物において記録された左室内径短縮率である。各動物に、ｒＣＴＣ（Ａ２）細胞、又はｈＣＴＣ（Ａ３）細胞をＸ軸に示した用量で投与した。
【図１９】心エコーによって測定した、急性心筋梗塞を誘発させた動物における局所壁運動スコア（ＲＷＭＳ）に対する本発明の心臓組織由来細胞の影響を示す。縦方向の実線によって隔てられた各パネルは、この実験における実験群である。５Ｄ及び２８Ｄは、それぞれＡＭＩ誘発の５日及び２８日後を反映している。ＲＷＭＳは、５Ｄにベースラインとして、２８Ｄにフォローアップとして測定した。各動物に、ｒＣＴＣ（Ａ２）、又はｈＣＴＣ（Ａ３）細胞をＸ軸に示した用量で投与した。
【図２０】急性心筋梗塞を誘発させた動物における左室拡張末期径（ＬＶＥＤＤ）に対する本発明の心臓組織由来細胞の影響を示す。ＬＶＥＤＤは、拡張末期の左心室の径の測定値である。ＬＥＶＤＤは、心筋梗塞の誘発の５日後（５Ｄ）及び２８日後（２８Ｄ）に測定した。図に示されるデータは、個々の動物の相対変化率［（２８Ｄ−５Ｄ）／５Ｄ］である。各動物に、ｒＣＴＣ（Ａ２）、又はｈＣＴＣ（Ａ３）細胞をＸ軸に示した用量で投与した。
【図２１】各実験群におけるＬＶＥＤＤの相対変化率を比較した統計的分析を示す。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いてデータにＦ検定を行った。第１群：溶媒、第２群：ｒＣＴＣ（Ａ２）細胞、１×１０6個の細胞（標的用量）、第３群：ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞、１×１０4個の細胞（標的用量）、第４群：ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞、１×１０5個の細胞（標的用量）、第５群：ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞、１×１０6個の細胞（標的用量）。
【図２２】左室収縮末期径（ＬＶＥＳＤ）に対するヒト心臓組織由来細胞の投与の影響を示す。ＬＶＥＳＤは、各心臓周期における収縮末期の室径の測定値である。縦方向の実線によって隔てられた各パネルは、この実験における実験群である。ＬＶＥＳＤは、心筋梗塞の誘発の５日後（５Ｄ）及び２８日後（２８Ｄ）に測定した。図に示されるデータは、各時点における１匹の動物からの記録値である。各動物に、ｒＣＴＣ（Ａ２）又はｈＣＴＣ（Ａ３）細胞をＸ軸に示した用量で投与した。
【図２３】個々の動物における梗塞及びヒト心臓組織由来細胞の投与後５日目及び２８日目の心機能を、心エコーによって測定される４つのパラメータ（ＦＳ、ＲＷＭＳ、ＬＶＥＳＤ、ＬＶＥＤＤ）で示したものである。黒い点はそれぞれ、Ｘ軸に示された時点における個々の動物の心機能を示す。黒い実線は、各動物における５Ｄ〜２８Ｄにかけての変化の傾向を示す。各パネルは、心エコーによって測定されるパラメータの１つを示す。
【図２４】左室内径短縮率と心臓組織由来細胞の用量との間の相関を示す。Ｙ軸は、梗塞及び細胞投与後２８日目における５日目からの変化の絶対値（２８Ｄ−５Ｄ）である。Ｘ軸は、線形目盛上のｈＣＴＣ（Ａ３）の用量である。データは、平均±Ｓ．Ｄ（ｎ＝３５）として表す。
【図２５】ＬＶＥＤＤの変化率と、本発明のヒト心臓由来組織の用量との間の相関を示す。Ｙ軸は、梗塞及び細胞投与後２８日目における５日目からの変化の絶対値（２８Ｄ−５Ｄ）を示す。Ｘ軸は、線形目盛上のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞の用量を示す。データは、平均±Ｓ．Ｄ（ｎ＝３５）として表す。
【図２６】心筋梗塞を有する動物の心臓に投与されたｈＣＴＣ（Ａ３）細胞の保持率を示す。保持率は、ラット心臓において検出されるβ−ミクログロブリンの発現レベルから推定した。パネル「ａ」は、Ｘ軸上に示す各用量の投与の４週後のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞の保持率を示す。パネル「ｂ」は、ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞の保持率の時間的経過を示し、Ｘ軸はラットＭＩ心臓に細胞を投与した後の日数を示し、Ｙ軸は標的用量の比率（％）を示す。パネル「ｃ」は、細胞投与の直後に検出されたヒト細胞の量を１００％として、ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞の保持率の経時変化を、検出された細胞の平均比率（％）を用いて示す。Ｘ軸は、ラットＭＩ心臓に細胞を投与した後の日数を示す。
【図２７】ｈＣＴＣ（Ａ３）の保持率と、ラットＭＩにおけるリモデリングの防止との間の相関を示す。左パネルは相関グラフを示す。Ｘ軸は細胞数を対数目盛で示し、Ｙ軸はリモデリングの変化率を示す（Δ  ＬＶＥＤＤ、２８Ｄ−５Ｄ）。投与の４週後の各動物の細胞数、及び対応するΔ  ＬＶＥＤＤをグラフにプロットした。右パネルは線形回帰の統計的分析を示す。
【図２８】ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞（１×１０6個の細胞の標的用量）で処理したラット心筋におけるヒトＮｕＭＡ（核マトリクス抗原）の局在化を示す。左パネルは、１×１０6個のｈＣＴＣの標的用量で処理したラット心筋において４００倍の倍率で観察された陽性ヒトＮｕＭａ染色を示す。右パネルは、溶媒コントロール動物における染色を示す。
【図２９】１×１０6個のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞の標的用量を投与した別の動物におけるヒトＮｕＭＡの局在化を示す。左上のパネルは、ＮｕＭＡ陽性細胞の２個の細胞塊を示す低倍率画像（倍率１００倍）を示す。右上のパネルは、ＮｕＭＡ陽性細胞の細胞塊の高倍率画像（倍率４００倍）である。左下のパネルは、ＮｕＭＡ陽性細胞塊の高倍率画像である。右下のパネルは、筋細胞様の形態を有するＮｕＭＡ陽性細胞核を示す高倍率画像。
【図３０】ヒト及びラット心筋で観察されたＮｕＭＡに対する抗体コントロールの染色を示す。上段の２枚の画像は、ヒト心臓において高い核特異性を有する（アイソタイプコントロールでは染色されていない、右パネル）を有するＮｕＭＡ陽性染色（左パネル）を示す。下段の２枚の画像は、ヒト細胞に対するＮｕＭＡ抗体の特異性を示す、ラット心臓コントロールを示す。
【図３１】ｈＣＴＣ（Ａ３）処理群又は溶媒処理群における心筋肥大のスコア評価を示す。標的用量をＹ軸上に示す。ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞を投与した動物には、１×１０4、１×１０5、又は１×１０6個の細胞のいずれかの標的用量を投与した。明るい灰色の部分は、全心臓における肥大のない切片の割合を示す。濃い灰色の部分は、全心臓における肥大切片の割合を示す。
【図３２】梗塞のサイズの評価を示す。左パネルは相対的な梗塞のサイズ（全左心室領域における梗塞領域の比率（％））を示し、右パネルは梗塞領域の絶対値を示す。黒い点は、個々の動物のそれぞれを示す。その群の梗塞の平均サイズを黒い実線で示した。
【図３３】ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞による処理群、又は溶媒処理群における毛細血管密度の染色を示す。ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞を投与した動物には、１×１０4、１×１０5、又は１×１０6個の細胞のいずれかの標的用量を投与した。パネル「ａ」は、イソレクチン−Ｂ４染色によって検出された、心筋における梗塞の境界領域における毛細血管密度を示す。パネル「ｂ」は、ＣＤ３１染色によって検出された、境界領域における毛細血管密度を示す。
【図３４】非梗塞領域における筋細胞密度を示す。パネル「ａ」は、溶媒処理動物（左パネル）及び１×１０5個のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞で処理した動物（右パネル）からの心筋のＨ＆Ｅ染色の代表的な画像を示す。パネル「ｂ」は、１ｍｍ2当たりの心筋細胞の数として表した、心臓の非梗塞領域において観察される筋細胞密度を示す。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝６）として示した。パネルｃは、Ｋｉ−６７及びミオシン重鎖の二重染色によって観察された増殖中の筋細胞を示す。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝６）として表す。
【図３５】ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞による処理に応じてラット心筋で差次的に発現する遺伝子をすべての標的用量について示す。
【図３６】急性ＭＩを有するラットにおいて心臓組織に対するｈＣＴＣ及びｈＭＳＣ細胞の投与の影響を定量化したものを示す。パネル「ａ」は、左心室自由壁における健康な組織に対する梗塞領域の比を示す。パネル「ｂ」は、すべての群の動物からの心臓で観察された拡張のランク付けを示す。パネル「ｃ」は、生存心筋を示す。
【図３７】急性ＭＩを有するラットの心臓組織に対するｈＣＴＣ（Ａ３）細胞及びヒト間葉系幹細胞（カタログ番号ＰＴ−２５０１、ロンザ社（Lonza）、メリーランド州ウォーカーズビル）の投与の影響を示す。各動物について、乳頭筋と動脈レベルとの間の中心線から取ったものと、乳頭筋から取ったものの２枚の切片を並べて示す。左の２列は、溶媒処理群からのものであり、中央の２列は、ｈＭＳＣ処理群（１×１０6個の標的用量）、右の２列は、ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞処理群（１×１０5個の標的用量）からのもの。
【図３８】梗塞及び細胞投与後２８日目における、急性ＭＩを有するラットの心機能に対するｈＣＴＣ（Ａ３）細胞投与の影響を示す。心エコーにより３つのパラメータ（ＦＳ、ＬＶＥＳＤ、ＬＶＥＤＤ）を測定した。細胞投与及び梗塞後２８日目のベースラインからの相対変化率（梗塞及び細胞投与後７日目）を示した。異なるドナーからの３つのｈＣＴＣ（Ａ３）細胞のロット、ヒト皮膚線維芽細胞、及びｐＣＴＣ（Ａ３）細胞を示す。
【図３９】梗塞及び細胞投与後８４日目における、急性ＭＩを有するラットの心機能に対するｈＣＴＣ（Ａ３）細胞投与の影響を示す。心エコーにより３つのパラメータ（ＦＳ、ＬＶＥＳＤ、ＬＶＥＤＤ）を測定した。細胞投与及び梗塞後８４日目のベースラインからの相対変化率（梗塞及び細胞投与後７日目）を示した。ヒト皮膚線維芽細胞、及び異なるドナーから調製された３つの異なるｈＣＴＣ（Ａ３）細胞のロットについて調べた。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
開示を分かりやすくするため、ただし限定を目的とすることなく、本発明の詳細な説明を、本発明の特定の特徴、実施形態、又は用途を説明若しくは図示した以下の小項目に分けて説明する。
【００４０】
定義
本明細書で使用するところの「損傷した心筋」なる用語は、虚血状態に曝された心筋細胞のことを指す。これらの虚血状態は、心筋梗塞又は他の心血管疾患若しくは関連疾患によって引き起こされるものである。
【００４１】
本明細書で使用するところの「急性心筋梗塞」なる用語は、一般的に「心臓発作」として知られる、心臓の一部への血液供給が遮断されて一部の心臓細胞の死をもたらす状態のことを指す。これは、動脈壁内の脂質（コレステロールなど）及び白血球（特にマクロファージ）の不安定な集合体である脆いアテローム斑が破裂した後の冠状動脈の閉塞（閉鎖）によるものが最も一般的である。その結果生ずる虚血（血液供給の制限）及び酸素不足は、長期にわたって治療されずに放置されると心筋組織（心筋）の損傷及び／又は死をもたらしうる。
【００４２】
本明細書で使用するところの「ｈＣＴＣ（Ｓ）集団」又は「ｈＣＴＣ（Ｓ）」なる用語は、本発明の方法に従ってヒトの心臓組織を解離させ、酵素的に消化し、濾過した後の細胞の初期培養の後に得られる非接着性のヒト心臓組織由来細胞の集団のことを指す。
【００４３】
本明細書で使用するところの「ｈＣＴＣ（Ａ１）集団」又は「ｈＣＴＣ（Ａ１）細胞」なる用語は、本発明の方法に従ってヒトの心臓組織を解離させ、酵素的に消化し、濾過した後の細胞の初期培養の後に得られる接着性のヒト心臓組織由来細胞の集団のことを指す。
【００４４】
本明細書で使用するところの「ｈＣＴＣ（Ａ２）集団」又は「ｈＣＴＣ（Ａ２）細胞」なる用語は、ｈＣＴＣ（Ｓ）細胞のインビトロ培養から得られる接着性細胞の集団のことを指す。
【００４５】
本明細書で使用するところの「ｈＣＴＣ（Ａ３）集団」又は「ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞」なる用語は、ｈＣＴＣ（Ｓ）とｈＣＴＣ（Ａ１）細胞との混合物のインビトロ培養から得られる接着性細胞の集団のことを指す。
【００４６】
本発明の細胞を誘導する方法
本発明は、テロメラーゼを発現しないヒト心臓組織由来細胞を生成するための方法であって、
ａ．心臓組織を得る工程と、
ｂ．この心臓組織を解離させる工程と、
ｃ．この心臓組織を消化して細胞を放出させる工程と、
ｄ．放出された細胞から心筋細胞を除去する工程と、
ｅ．残りの細胞を培養する工程と、を含む方法を提供する。
【００４７】
心臓組織は、手で解離させてもよい。また、心臓組織は機械的に解離させることもできる。
【００４８】
心筋細胞は、任意の適当な方法によって放出された細胞から除去することができる。例えば、心筋細胞は濾過、遠心分離、又はＦＡＣＳによって除去することができる。
【００４９】
一実施形態では、心臓組織の消化によって放出された細胞を濾過することによって心筋細胞を除去する。濾過工程の目的は、本発明のヒト心臓組織由来細胞よりもサイズの大きな細胞を除外することである。一実施形態では、本発明のヒト心臓組織由来細胞は直径約５マイクロメートル〜約５０マイクロメートルであり、本発明のヒト心臓組織由来細胞をフィルターに通過させるために５０マイクロメートルの孔径のフィルターが選択される。
【００５０】
一実施形態では、フィルターを通過したヒト心臓組織由来細胞をインビトロで培養する。一実施形態では、濾過工程後にインビトロで培養されるヒト心臓組織由来細胞は、非接着性細胞と接着性細胞との混合物である。
【００５１】
本発明のヒト心臓組織由来細胞は、あらゆる固体基材に接着しうる。一実施形態では、固体基材はポリカーボネートである。また、固体基材はポリスチレンであってもよい。また、固体基材はガラスであってもよい。固体基材は、例えばコラーゲン又はラミニンなどの細胞外マトリクスタンパク質を含む吸着層でコーティングしてもよい。
【００５２】
初期培養工程後に得られる本発明の接着性細胞を、本明細書ではヒト心臓組織由来（Ａ１）細胞集団、又はｈＣＴＣ（Ａ１）細胞と呼ぶ。初期培養工程後に得られる本発明の非接着性細胞を、本明細書ではヒト心臓組織由来（Ｓ）細胞集団、又はｈＣＴＣ（Ｓ）細胞と呼ぶ。
【００５３】
一実施形態では、ｈＣＴＣ（Ａ１）細胞を培養中で増殖させる。本発明のｈＣＴＣ（Ａ１）細胞は、任意の適当な組織培養培地中で培養することができる。例えば一実施形態では、心臓組織由来細胞は、１，０００ｇ／ＬのＤ−グルコース、５８４ｍｇ／ＬのＬ−グルタミン、及び１１０ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム、及び１０％  ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中で培養することができる。例えば、ペニシリン５０Ｕ／ｍＬ及びストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬなどの抗生物質を培地に添加することができる。また、心臓組織の解離及び酵素的消化の後に得られる細胞の懸濁液に抗生物質を添加してもよい。本発明のｈＣＴＣ（Ａ１）細胞は、組織培養基材上に約１，０００〜約１０，０００生細胞／ｃｍ2の播種密度で播種することができる。本発明のｈＣＴＣ（Ａ１）細胞は、５〜２０％  ｖ／ｖの大気酸素下でインキュベートすることができる。
【００５４】
一実施形態では、本発明のｈＣＴＣ（Ａ１）細胞は、細胞が約８０％コンフルエンスに達した時点で継代する。また、本発明のｈＣＴＣ（Ａ１）細胞は、細胞が約９０％コンフルエンスに達した時点で継代する。また、本発明のｈＣＴＣ（Ａ１）細胞は、１〜７日毎に継代する。
【００５５】
一実施形態では、ｈＣＴＣ（Ｓ）細胞を培養中で増殖させる。一実施形態では、本発明のｈＣＴＣ（Ｓ）細胞は、任意の適当な組織培養培地中で培養することができる。例えば一実施形態では、心臓組織由来細胞は、１，０００ｇ／ＬのＤ−グルコース、５８４ｍｇ／ＬのＬ−グルタミン、及び１１０ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム、及び１０％  ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中で培養することができる。例えば、ペニシリン５０Ｕ／ｍＬ及びストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬなどの抗生物質を培地に添加することができる。また、心臓組織の解離及び酵素的消化の後に得られる細胞の懸濁液に抗生物質を添加してもよい。本発明のｈＣＴＣ（Ｓ）細胞は、５〜２０％  ｖ／ｖの大気酸素下でインキュベートすることができる。一実施形態では、組織培養培地を３日毎に交換する。
【００５６】
一実施形態では、ｈＣＴＣ（Ｓ）細胞は培養中で時間とともに接着性となる。ｈＣＴＣ（Ｓ）細胞が接着性となる培養中での時間は、約１日〜約７日である。ｈＣＴＣ（Ｓ）細胞が接着性となることにより生じる接着性細胞の集団を、本明細書ではヒト心臓組織由来（Ａ２）細胞集団、又はｈＣＴＣ（Ａ２）細胞と呼ぶ。
【００５７】
一実施形態では、ｈＣＴＣ（Ａ２）細胞を培養中で増殖させる。本発明のｈＣＴＣ（Ａ２）細胞は、任意の適当な組織培養培地中で培養することができる。例えば一実施形態では、心臓組織由来細胞は、１，０００ｇ／ＬのＤ−グルコース、５８４ｍｇ／ＬのＬ−グルタミン、及び１１０ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム、及び１０％  ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中で培養することができる。例えば、ペニシリン５０Ｕ／ｍＬ及びストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬなどの抗生物質を培地に添加することができる。また、心臓組織の解離及び酵素的消化の後に得られる細胞の懸濁液に抗生物質を添加してもよい。本発明のｈＣＴＣ（Ａ２）細胞は、組織培養基材上に約１，０００〜約１０，０００生細胞／ｃｍ2の播種密度で播種することができる。本発明のｈＣＴＣ（Ａ２）細胞は、５〜２０％  ｖ／ｖの大気酸素下でインキュベートすることができる。
【００５８】
一実施形態では、本発明のｈＣＴＣ（Ａ２）細胞は、細胞が約８０％コンフルエンスに達した時点で継代する。また、本発明のｈＣＴＣ（Ａ２）細胞は、細胞が約９０％コンフルエンスに達した時点で継代する。また、本発明のｈＣＴＣ（Ａ２）細胞は、１〜７日毎に継代する。
【００５９】
一実施形態では、ｈＣＴＣ（Ａ１）細胞とｈＣＴＣ（Ｓ）細胞との混合物を培養中で増殖させる。一実施形態では、ｈＣＴＣ（Ａ１）細胞とｈＣＴＣ（Ｓ）細胞との混合物は、培養中で時間とともに接着性細胞の集団を形成する。ｈＣＴＣ（Ｓ）細胞が接着性となる培養中での時間は、約２日〜約１４日である。ｈＣＴＣ（Ａ１）細胞とｈＣＴＣ（Ｓ）細胞との混合物が接着性となることにより生じる接着性細胞の集団を、本明細書ではヒト心臓組織由来（Ａ３）細胞集団、又はｈＣＴＣ（Ａ３）細胞と呼ぶ。
【００６０】
一実施形態では、ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞を培養中で増殖させる。本発明のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞は、任意の適当な組織培養培地中で培養することができる。例えば一実施形態では、心臓組織由来細胞は、１，０００ｇ／ＬのＤ−グルコース、５８４ｍｇ／ＬのＬ−グルタミン、及び１１０ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム、及び１０％  ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中で培養することができる。例えば、ペニシリン５０Ｕ／ｍＬ及びストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬなどの抗生物質を培地に添加することができる。また、心臓組織の解離及び酵素的消化の後に得られる細胞の懸濁液に抗生物質を添加してもよい。本発明のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞は、組織培養基材上に約１，０００〜約１０，０００生細胞／ｃｍ2の播種密度で播種することができる。本発明のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞は、５〜２０％  ｖ／ｖの大気酸素下でインキュベートすることができる。
【００６１】
一実施形態では、本発明のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞は、細胞が約８０％コンフルエンスに達した時点で継代する。また、本発明のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞は、細胞が約９０％コンフルエンスに達した時点で継代する。また、本発明のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞は、１〜７日毎に継代する。
【００６２】
本発明のヒト心臓組織由来細胞を得るための方法の１つの概略を図１に示す。本発明のヒト心臓組織由来細胞を得るための別の方法の概略を図２に示す。本発明のヒト心臓組織由来細胞を得るための別の方法の概略を図３に示す。
【００６３】
本発明の細胞は、全心臓を解離させ、次いで解離した組織を消化することによって得ることができる。また、本発明の細胞は心臓組織の一部分を解離させ、次いで解離した組織を消化することによって得ることもできる。こうした部分は、例えば心房、又は心室、心尖、又は心臓の両側などの心臓の任意の部分から得ることができる。
【００６４】
解離した心臓組織は、例えばコラゲナーゼ及びディスパーゼなどの酵素を使用して消化することができる。これらの酵素は別々に、又は組み合わせて使用することができる。一実施形態では、解離した心臓組織をコラゲナーゼとディスパーゼとの混合物を使用して消化する。
【００６５】
コラゲナーゼは、約０．１Ｕ／ｍＬ〜約１０Ｕ／ｍＬの濃度で使用することができる。また、コラゲナーゼは、約０．１Ｕ／ｍＬ〜約５Ｕ／ｍＬの濃度で使用してもよい。また、コラゲナーゼは、約５Ｕ／ｍＬの濃度で使用してもよい。また、コラゲナーゼは、約１Ｕ／ｍＬの濃度で使用してもよい。
【００６６】
ディスパーゼは、約０．５Ｕ／ｍＬ〜約５０Ｕ／ｍＬの濃度で使用することができる。また、コラゲナーゼは、約０．５Ｕ／ｍＬ〜約１０Ｕ／ｍＬの濃度で使用してもよい。また、コラゲナーゼは、約１０Ｕ／ｍＬの濃度で使用してもよい。また、コラゲナーゼは、約５Ｕ／ｍＬの濃度で使用してもよい。
【００６７】
解離した組織は、約５分〜約５時間にわたって酵素で処理することができる。また、解離した組織は、約３０分〜約５時間にわたって酵素で処理してもよい。また、解離した組織は、約３０分〜約４時間にわたって酵素で処理してもよい。また、解離した組織は、約３０分〜約３時間にわたって酵素で処理してもよい。また、解離した組織は、約３０分〜約２時間にわたって酵素で処理してもよい。また、解離した組織は、約３０分〜約１時間にわたって酵素で処理してもよい。一実施形態では、解離した組織は、約２．５時間にわたって酵素で処理することができる。
【００６８】
必要に応じて、本発明の心臓組織由来細胞は、心臓組織由来細胞を識別及び選択するため、例えば心臓組織由来細胞によって発現されるタンパク質マーカーを特異的に認識する物質（抗体など）に曝露することにより、ほぼ純粋な心臓組織由来細胞の集団を得ることができる。
【００６９】
本発明の細胞
本発明は、テロメラーゼを発現せず、培養中で維持及び増殖させることが可能であり、損傷した心筋の治療及び修復に有用なヒト心臓組織由来細胞を提供する。本発明の心臓組織由来細胞の性質を表１にまとめて示す。
【００７０】
一実施形態では、テロメラーゼを発現しない本発明のヒト心臓組織由来細胞は以下のマーカー、すなわちＣＤ４９ｅ、ＣＤ１０５、ＣＤ５９、ＣＤ５４、ＣＤ９０、ＣＤ３４、及びＣＤ１１７の少なくとも１つを発現する。
【００７１】
一実施形態では、テロメラーゼを発現しない本発明のヒト心臓組織由来細胞は以下のマーカー、すなわちＭＤＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１６、ＣＤ３１、ＣＤ４５、及びＩｓｌ−１の少なくとも１つを発現しない。
【００７２】
一実施形態では、テロメラーゼを発現しない本発明のヒト心臓組織由来細胞は以下のマーカー、すなわちＣＤ４９ｅ、ＣＤ１０５、ＣＤ５９、ＣＤ５４、ＣＤ９０、ＣＤ３４、及びＣＤ１１７を発現する。
【００７３】
一実施形態では、テロメラーゼを発現しない本発明のヒト心臓組織由来細胞は以下のマーカー、すなわちＭＤＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１６、ＣＤ３１、ＣＤ４５、及びＩｓｌ−１を発現しない。
【００７４】
一実施形態では、本発明のヒト心臓組織由来細胞を心筋細胞に更に分化させる。この分化は、患者への投与の前、又は後に行うことができる。分化とは、元の細胞の特徴又は機能とは異なる１以上の特徴又は機能の獲得又は保有の程度が増大することを指す（すなわち細胞の特化）。これは例えば、細胞の表現型の変化についてスクリーニングすることによって検出することができる（すなわち、細胞の形態的変化及び／又は細胞上の表面マーカーを識別する）。本発明の心臓組織由来細胞を心筋細胞に分化させることが可能な任意の方法を使用することができる。
【００７５】
例えば、本発明の心臓組織由来細胞は、米国特許出願第２００４０１２６８７９号に開示される方法に従って更に心筋細胞に分化させることができる。
【００７６】
別の例では、本発明の心臓組織由来細胞は、国際特許出願公開第２００４０１９７６７号に開示される方法に従って更に心筋細胞に分化させることができる。
【００７７】
損傷した心筋を治療又は修復するための方法
損傷した心筋は、例えば急性心筋梗塞、慢性心筋梗塞、うっ血性心不全などの様々な心臓疾患から生じる。本発明の心臓組織由来細胞は、損傷した心筋を修復するための治療として使用することができる。一実施形態では、本発明の心臓組織由来細胞は、急性心筋梗塞の結果、損傷した心筋を修復するための治療として使用することができる。
【００７８】
一実施形態では、本発明は、患者の損傷した心筋を治療するための方法であって、
ａ．テロメラーゼを発現しないヒト心臓組織由来細胞の集団を得る工程と、
ｂ．損傷した心筋を治療するうえで充分な量のヒト心臓組織由来細胞の集団を患者に投与する工程と、を含む方法を提供する。
【００７９】
一実施形態では、本発明は、患者の損傷した心筋を修復するための方法であって、
ａ．テロメラーゼを発現しないヒト心臓組織由来細胞の集団を得る工程と、
ｂ．損傷した心筋を修復するうえで充分な量のヒト心臓組織由来細胞の集団を患者に投与する工程と、を含む方法を提供する。
【００８０】
一実施形態では、ヒト心臓組織由来細胞の集団を、細胞を培養することなく調製して患者に投与する。別の実施形態では、心臓組織由来細胞の集団を患者への投与に先立ってインビトロで調製及び培養する。
【００８１】
ヒト心臓組織由来細胞の集団をインビトロで培養及び増殖させる場合には、培養及び増殖させる細胞の集団はｈＣＴＣ（Ａ１）細胞の集団であってよい。また、培養及び増殖させる細胞の集団は、ｈＣＴＣ（Ａ２）細胞の集団であってもよい。また、培養及び増殖させる細胞の集団は、ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞の集団であってもよい。
【００８２】
本発明のヒト心臓組織由来細胞は、損傷した心筋を有する患者に当該技術分野における任意の適当な方法によって投与することができる。こうした方法は当業者によって容易に選択される。
【００８３】
例えば、損傷した心筋への本発明のヒト心臓組織由来細胞の投与は、損傷した心筋の直接的注入によるものでよい。また、本発明のヒト心臓組織由来細胞は全身的に投与することもできる。本発明のヒト心臓組織由来細胞を全身的に投与する場合、損傷した心筋に細胞を送達させる効率は、例えば患者を少なくとも１種類の他の物質で処置するか、又は損傷した心筋への細胞の送達性を高めることが可能な別の方法によって高めることができる。
【００８４】
例えば本発明のヒト心臓組織由来細胞は、幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＳＣＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ストロマ細胞由来因子１、造血幹細胞因子、血管内皮増殖因子、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球マクロファージ刺激因子、及びインターロイキン３からなる群から選択される別の物質とともに投与することができる。
【００８５】
一実施形態では、本発明のヒト心臓組織由来細胞を、米国特許出願第２００２００６１５８７号に開示される方法に従う別の物質とともに投与する。
【００８６】
一実施形態では、本発明のヒト心臓組織由来細胞を、米国特許出願第２００２１６２７９６号に開示される方法に従う別の物質とともに投与する。
【００８７】
例えば損傷した心筋への細胞の送達性は、患者の体循環から患者の心循環を隔離し、細胞を含む溶液を心臓回路内に灌流することによって高めることができる。この方法の一例は、国際特許出願公開第２００７０６７５０２号に開示されている。
【００８８】
一実施形態では、本発明のヒト心臓組織由来細胞は、イワサキ（Iwasaki）、カワモト（Kawamoto）らにより開示される方法に従って患者に投与される（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１３：１３１１〜１３２５；２００６）。
【００８９】
別の実施形態では、本発明のヒト心臓組織由来細胞は、シャーマン（Sherman）、マーテンス（Martens）らにより開示される方法に従って冠状動脈内に挿入されるカテーテルを使用して患者に投与される（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３，ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ５７〜６４；２００６）。
【００９０】
別の実施形態では、本発明のヒト心臓組織由来細胞は、心筋の電気的活動をマッピングすることが可能なカテーテルを使用して患者に投与される。一実施形態では、本発明の心臓組織由来細胞は、ペリン（Perin）、ドーマン（Dohmann）ら（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０７：２２９４〜２３０２；２００３）、及びペリン（Perin）、シルバ（Silva）ら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  ４４：４８６〜４９５；２００８）により開示される方法に従って、心筋の電気的活動をマッピングすることが可能なカテーテルを使用して患者に投与される。別の実施形態では、本発明の心臓組織由来細胞は、シャーマン（Sherman）、マーテンス（Martens）らにより開示される方法に従って患者に投与される（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３，ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ５７〜６４；２００６）。
【００９１】
別の実施形態では、本発明のヒト心臓組織由来細胞は、ハシェミ（Hashemi）、ゴーズ（Ghods）らにより開示される方法に従って心筋内注入が可能なカテーテルを使用して患者に投与される（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２９：２５１〜２５９；２００８）。
【００９２】
本発明を以下の実施例によって更に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００９３】
（実施例１）
ヒト心臓組織由来細胞の単離
材料及び方法−消化酵素混合液の調製：ヒトの心臓から心臓組織由来細胞を単離するために本発明で使用した消化酵素混合液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ、インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州カールスバッド）中で２倍の混合保存溶液として調製した。その濃度は、０．２Ｕ／ｍＬ又は２Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ（セルバ・エレクトロフォレシス社（Serva Electrophoresis GmbH）、ハイデルベルグ、ドイツ）及び１０Ｕ／ｍＬのディスパーゼＩＩ（ロシュ・アプライド・サイエンス社（Roche Applied Science）、インディアナ州インディアナポリス）である。これらの酵素混合保存溶液を−４０℃で保存した。消化に先立って、酵素混合液を０．２２μｍの真空フィルターシステム（コーニング社（Corning Incorporated）、マサチューセッツ州アクトン）により濾過した。ヒトの心臓を消化するため、消化手順において２Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ保存溶液を使用した。消化酵素の最終濃度は、１Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ及び５Ｕ／ｍＬのディスパーゼである。ヒトの全心臓の消化、及びヒト心臓組織由来細胞（ｈＣＴＣ）の単離のプロセスを図１にまとめて示す。
【００９４】
材料及び方法−ヒト心臓：廃棄処分となった移植用全心臓を、ＮＤＲＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ、ニューヨーク州ニューヨーク）より入手した。廃棄処分となった移植用心臓の調達時間は４０〜９８時間であった。臓器全体を増殖培地（ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清）中に浸漬し、細胞単離の処理を行うまで４℃で保存した。
【００９５】
材料及び方法−ヒト心臓組織の処理：全心臓組織を安全キャビネットに移し、四角いバイオアッセイ皿内に置いた（コーニング社（Corning Inc.）、マサチューセッツ州アクトン）。余分な脂肪組織を滅菌メス（Ｂａｒｄ  Ｐａｒｋｅｒ、ベクトンディキンソン社（Becton Dickinson）、ニューヨーク州ハンコック）を用いて除去した。第１の全心臓は小片（２〜３ｃｍ3）に切断した。この小さな組織片の３／４を、手で細片（１〜２ｍｍ3の大きさ）に切り刻んだ。この手順を終えるのに２時間を要した。組織片の１／４は、ＰＲＯ２５０ホモジナイザーチャンバ（プロ・サイエンティフィック社（Pro Scientific）、コネティカット州オックスフォード）に移した。チャンバに蓋をして、ＰＲＯ２５０ジェネレーターの速度を３に設定して取り付けた。緩衝液を一切加えずに組織片を室温で１０秒間ホモジナイズし、組織を目視にて検査した。組織が細片化された（１ｍｍ3のサイズの細片となった）時点で、ホモジナイズを終了した。
【００９６】
材料及び方法−ヒト組織の消化：手動で処理したものとホモジナイズしたものの両方の組織片を、別々の２５０ｍＬのコニカルチューブに移した（コーニング社（Corning Inc.）、ニューヨーク州コーニング）。１００ｍＬの室温のＰＢＳを加え、チューブを５回逆さにすることによって、各チューブ内の組織を３回洗浄した。次いで、チューブを直立させて置いて組織を沈殿させた。２ｍＬの吸引ピペット（ＢＤ  ｆａｌｃｏｎ、ビー・ディー・バイオサイエンス社（BD Biosciences）、カリフォルニア州サンホセ）を使用して上清を吸引した。消化酵素混合液の保存溶液（２倍）を、酵素：組織の比が１：１となるように２５０ｍＬチューブに加えた。各酵素の最終濃度は、１Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ及び５Ｕ／ｍＬのディスパーゼＩＩとした。組織及び酵素の入ったチューブを、２２５ｒｐｍに設定した３７℃のオービタルシェーカー（バーンステッドラブ社（Barnstead Lab）、イリノイ州メルローズパーク）に移し、２．５時間インキュベートした。インキュベート後、チューブを再び安全キャビネットに移した。この細胞懸濁液を室温のＰＢＳでチューブを満たすことによって希釈した。残留する未消化の組織をすべて除去するため、細胞懸濁液を直径２０．３ｃｍ（８インチ）の２５０μｍ標準試験用シーブ（シグマ・アルドリッチ社（Sigma-Aldrich）、ミズーリ州セントルイス）に通して、５００ｍＬガラスビーカー内に濾過した。この工程の後、ガラスビーカー内の細胞懸濁液を、１００μｍのセルストレーナー（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に通して複数の５０ｍＬコニカルチューブ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）内に更に濾過した。次いで、細胞懸濁液をＳｏｒｖａｌｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  Ｔ遠心機（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社（Thermo Fisher Scientific,Inc）マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して室温で３３８Ｇで５分間遠心することによって洗い、細胞をペレット化した。上清を吸引除去し、細胞のペレットをＰＢＳに再懸濁して、手による細片化処理及びホモジナイズ処理について各１本ずつの別々の５０ｍＬチューブにプールした。この細胞懸濁液を４０ｍＬの室温のＰＢＳで更に３回洗浄した。洗浄後、ペレットを２０ｍＬのＡＣＫ溶解バッファー（ロンザ社（Lonza）、メリーランド州ウォーカーズビル）に再懸濁し、室温で１０分間インキュベートすることによって残留する赤血球をすべて溶解した。インキュベート後、細胞懸濁液を４０ｍＬの室温のＰＢＳで更に２回洗浄した。最終的な遠心の後、ペレットを２０ｍＬの室温の増殖培地（ＤＭＥＭ、１，０００ｍｇ／ＬのＤ−グルコース、Ｌ−グルタミン、及び１１０ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン５０Ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン５０ｕｇ／ｍＬ）に再懸濁し、カウントした。
【００９７】
材料及び方法−細胞のカウント：Ｖｉ−Ｃｅｌｌ（商標）ＸＲ（ベックマン・コールター社（Beckman Coulter）、カリフォルニア州フラートン）を使用して全体の生細胞密度及び生存率の分析を行った。Ｖｉ−Ｃｅｌｌ（商標）細胞生存率分析装置は、フローセル内の細胞の最大で１００個の画像についてビデオキャプチャー技術及び画像解析を用いて、細胞生存率の評価のためのトリパンブルー色素排除試験法を自動化するものである。Ｖｉ−Ｃｅｌｌは±６％のカウント精度を有する。製造者の指示（参照マニュアルＰＮ  ３８３６７４  Ｒｅｖ．Ａ）に従って、試料を調製及び分析した。簡単に述べると、赤血球溶解後に得られる最終細胞懸濁液の５００μＬの一定分量をＶｉ−Ｃｅｌｌ（商標）の４ｍＬ試料バイアルに移し、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ（商標）ＸＲ細胞生存率分析装置により分析した。以下のデフォルトの細胞型のプロファイルを用いた。
【００９８】
【表１】
0005894071.tif 000002
【００９９】
結果−全心臓消化から得られた細胞収率：第１の全心臓からは消化後、手による細片化処理による収率は、解離及び酵素的消化後に４３００万個の生細胞を生じた。生存率は６５％であった。機械的ホモジナイズ処理は１２００万個の生細胞を生じ、生存率は６３％であった。手による処理では３倍多くの組織を処理したため、２つの処理の間に収率及び生存率の差はなかった。この結果に基づき、これに続くヒト心臓は機械的ホモジナイズ処理によって処理した。消化後の全収率は、一般的に心臓１個当たり３４００万〜６４００万個の生細胞であった。表２に示されるように、生存率は５５〜８１％であった。
【０１００】
（実施例２）
本発明のヒト心臓組織由来細胞の選択及びインビトロ培養
ヒト心臓の解離及び酵素的消化後に得られる細胞懸濁液を更なる実験分析用に増殖させた。
【０１０１】
ヒト心臓の解離及び酵素的消化により得られた細胞の初期播種：実施例１で述べた方法に従って、ヒト心臓の解離及び酵素的消化により得られた細胞懸濁液をＴ２２５組織培養フラスコ（コーニング社（Corning Inc.）、ニューヨーク州コーニング）に加えた。１０ｍＬの細胞懸濁液を５０ｍＬの増殖培地（ＤＭＥＭ、１，０００ｍｇ／ＬのＤ−グルコース、５８４ｍｇ／ＬのＬ−グルタミン、及び１１０ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン５０Ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬ（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州カールスバッド））が入った各フラスコに加えた。初期培養の最終体積を６０ｍＬとした。細胞を、２０％  Ｏ2及び５％  ＣＯ2を含む大気中で３７℃で２日間インキュベートした。この時間の後、不均質な細胞培養物が観察された。非接着性の、フェーズブライトな細胞が観察され（本明細書においてｈＣＴＣ（Ｓ）細胞と呼ぶ）、更に接着性細胞が観察された（本明細書においてｈＣＴＣ（Ａ１）細胞と呼ぶ）。図４を参照されたい。
【０１０２】
初期培養工程後に得られたｈＣＴＣ（Ｓ）細胞は、アンバーサ（Anversa）によって心臓幹細胞として述べられた細胞（Ｂｅｌｔｒａｍｉ，Ｂａｒｌｕｃｃｈｉら、２００３；Ｃｅｌｌ  １１４（６）：７６３〜７６））と同様の形態を有していた。図４ａを参照されたい。更に、図４ｂに示されるような、メッシーナ（Messina）らによって述べられるもの（Ｍｅｓｓｉｎａ，Ｄｅ  Ａｎｇｅｌｉｓら、２００４；Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９５（９）：９１１〜２１）と同様の細胞塊も観察された。
【０１０３】
ｈＣＴＣ（Ｓ）集団の増殖：１つの実験では、最初の２日間の培養期間の後、培養フラスコからｈＣＴＣ（Ｓ）細胞を取り出した。このｈＣＴＣ（Ｓ）細胞を５０ｍＬのコニカルチューブに移した。ｈＣＴＣ（Ｓ）細胞を３３８Ｇで５分間、室温で遠心した。上清を捨て、細胞のペレットを２０ｍＬの新鮮な増殖培地に再懸濁した。再懸濁後、ｈＣＴＣ（Ｓ）細胞をカウントした。初期培養工程から得られたｈＣＴＣ（Ｓ）細胞の全数は、全体で約１０００万〜１４００万個の細胞であった。ｈＣＴＣ（Ｓ）細胞の一部を、１００万〜１５０万個／ｍＬで保存培地中に凍結保存し、−１４０℃で保存した。残りを培養中で増殖させた。このｈＣＴＣ（Ｓ）細胞を、５，０００細胞／ｃｍ2の播種密度で再びフラスコに播いた。培養２日後にｈＣＴＣ（Ｓ）細胞は接着性となり、本明細書においてｈＣＴＣ（Ａ２）集団又はｈＣＴＣ（Ａ２）細胞と呼ぶ均質な接着性の細胞集団を形成した。本発明のｈＣＴＣ（Ａ２）細胞が、ｈＣＴＣ（Ｓ）の播種の約１０〜１４日後に８０％コンフルエンスに達した時点で、増殖培地を吸引除去し、６０ｍＬの室温のＰＢＳで洗浄した後、４ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡ（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州カールスバッド）を各フラスコに加えることによって細胞をトリプシン処理した。ｈＣＴＣ（Ａ２）細胞を、細胞が剥離するまで室温で約５分間インキュベートした。各フラスコに６ｍＬの増殖培地を加え、その細胞懸濁液を新しい５０ｍＬのコニカルチューブ（ＢＤ  ｆａｌｃｏｎ、ビー・ディー・バイオサイエンス社（BD Biosciences）、カリフォルニア州サンホセ）に移した。５００μＬの一定分量を取り出し、実施例１において述べたようにＶｉ−Ｃｅｌｌ（商標）細胞生存率分析装置を使用してカウントするためにＶｉ−Ｃｅｌｌ試料カップに移した。これらの細胞を５，０００細胞／ｃｍ2又は３，０００細胞／ｃｍ2で再び播いた。
【０１０４】
ｈＣＴＣ（Ｓ）細胞の増殖を凍結保存した細胞を用いて更に行った。Ｓ細胞の凍結バイアルを３７℃で解凍し、ＰＢＳで１回洗浄した。次いで細胞をカウントし、培養フラスコ中、増殖培地に５，０００細胞／ｃｍ2で播いた。細胞の増殖及びコンフルエンスを毎日観察した。
【０１０５】
目視による観察によれば、非接着性のｈＣＴＣ（Ｓ）細胞は培養中で２日後に大幅に減少し、非接着性のｈＣＴＣ（Ｓ）の数は、培養中で１０〜１４日間にわたって増加しなかった。培養中のｈＣＴＣ（Ｓ）細胞は培養２日後にフラスコに付着しはじめ、接着性細胞として増殖した。細胞は、ｈＣＴＣ（Ｓ）細胞の播種１０〜１４日後に８０％コンフルエンスに達した。培養中ではある程度のｈＣＴＣ（Ｓ）細胞が依然観察されたものの、この非接着性細胞の集団の数が培養中で増加することはなかった。これは、恐らくは培養中での非接着性のｈＣＴＣ（Ｓ）から接着性のｈＣＴＣ（Ａ２）への形態の変化によるものと思われた。２日後にｈＣＴＣ（Ｓ）細胞がフラスコに付着したことにより、非接着性細胞の数は極めて低く、カウントされなかった。
【０１０６】
これに対して、ｈＣＴＣ（Ｓ）細胞から誘導された接着性のｈＣＴＣ（Ａ２）細胞は、図５ａに示されるように最大で１０ＰＤＬの一定の増殖能力を示した。この集団の増殖速度は、ｈＣＴＣ（Ａ２）細胞を５，０００細胞／ｃｍ2又は３，０００細胞／ｃｍ2で播種した場合、９〜１０ＰＤＬのプラトーに達するまで１〜３ＰＤＬ／継代の間であった。しかしながら、ＰＤＬの計算は、培養中に播かれた最初の細胞数（すなわちｈＣＴＣ（Ｓ）細胞の数）に基づいたものであり、ＰＤＬの推定値は完全に正確ではない可能性がある。
【０１０７】
ｈＣＴＣ（Ａ１）集団の増殖：ｈＣＴＣ（Ｓ）細胞を含む培地を、最初の２日間の培養からの細胞が入ったフラスコから取り去った後、６０ｍＬの新鮮な増殖培地をフラスコ中に存在する残りの接着性細胞に加えた。このｈＣＴＣ（Ａ１）細胞を、細胞が８０％コンフルエンスに達するまで培養した。この時間の後、増殖培地を吸引除去し、６０ｍＬの室温のＰＢＳで洗浄してから、４ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡ（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州カールスバッド）を加えることによって細胞をトリプシン処理した。細胞を、細胞が剥離するまで室温で約５分間インキュベートした。各フラスコに６ｍＬの増殖培地を加え、その細胞懸濁液を新しい５０ｍＬのコニカルチューブ（ＢＤ  ｆａｌｃｏｎ、ビー・ディー・バイオサイエンス社（BD Biosciences）、カリフォルニア州サンホセ）に移した。５００μＬの一定分量を取り出し、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ（商標）細胞生存率分析装置を使用してカウントするためにＶｉ−Ｃｅｌｌ試料カップに移した。次いで細胞の一部を凍結保存用培地（９０％  ＦＢＳ及び１０％  ＤＭＳＯ）に再懸濁し、１００万〜１５０万細胞／ｍＬで保存し、−１４０℃で保存した。残りの細胞を、３，０００細胞／ｃｍ2で凍結バイアルに細胞を再び播種することによって増殖させた。使用済みの培地は再播種の３日後に交換し、細胞を７日目に継代した。これらの細胞を、トリプシン処理を用い、３日目に培地を交換し、７日毎に継代した。
【０１０８】
ｈＣＴＣ（Ａ３）集団の増殖：１バイアルのｈＣＴＣ（Ａ１）細胞と１バイアルのｈＣＴＣ（Ｓ）細胞を洗浄した後、５０ｍＬのコニカルチューブ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ、ビー・ディー・バイオサイエンス社（BD Biosciences）、カリフォルニア州サンホセ）中で合わせた。合わせた細胞懸濁液の５，０００細胞／ｃｍ2又は３，０００細胞／ｃｍ2の混合物を、別々のＴ２２５フラスコに加えた。各フラスコを各フラスコ当たり６０ｍＬにまで新鮮な増殖培地で満たし、細胞を３７℃、２０％大気Ｏ2下で２日間インキュベートした。この時間の後、細胞の大部分が、本明細書においてｈＣＴＣ（Ａ３）集団又はｈＣＴＣ（Ａ３）細胞と呼ぶ接着性の細胞集団を形成した。細胞が８０％コンフルエンスに達した時点で、適当な播種密度を特定するために細胞をトリプシン処理し、５，０００細胞／ｃｍ2又は３，０００細胞／ｃｍ2の播種密度で再播種することによって継代し、３７℃、２０％大気Ｏ2下でインキュベートした。ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞は通常、播種７日後に８０％コンフルエンスに達した。非接着性のｈＣＴＣ（Ｓ）細胞を毎日目視で観察したところ、培養２日後で大幅に減少し、このためｈＣＴＣ（Ａ３）細胞は均質な細胞集団となった。これには平均で約２日間を要した。このｈＣＴＣ（Ａ３）細胞は、１〜３ＰＤＬ／継代の速度で増殖することが可能であった。ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞は、５，０００細胞／ｃｍ2の密度で播種した場合、老化に到る前に９〜１０ＰＤＬに達することが可能であった。これに対して、ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞は、３，０００細胞／ｃｍ2の密度で播種した場合には、老化に到る前に２４ＰＤＬに達することが可能であった。これについては、図５ｂを参照されたい。
【０１０９】
本発明のヒト心臓組織由来細胞の特性評価：ｈＣＴＣ（Ａ２）細胞及びｈＣＴＣ（Ａ３）細胞は、各継代において１〜３ＰＤＬの同様の増殖速度を示した。これらの細胞はいずれも、細胞が継代に必要な８０〜９０％コンフルエンスに達するのに約７日間を要した。２つの細胞集団の間で認められた全ＰＤＬの差は、ｈＣＴＣ（Ａ２）細胞がｈＣＴＣ（Ｓ）細胞集団から誘導される際に、ｈＣＴＣ（Ａ２）細胞のＰＤＬが最初に実際よりも低く想定されていることによるものと考えられる。
【０１１０】
本発明の方法によって単離されたヒト心臓組織由来細胞のすべての集団において、細胞表面マーカー又は遺伝子の発現に差異は認められなかった。ｈＣＴＣ（Ａ１）、ｈＣＴＣ（Ｓ）、ｈＣＴＣ（Ａ２）、及びｈＣＴＣ（Ａ３）細胞はテロメラーゼを発現していなかった。本発明のヒト心臓組織由来細胞、及び当該技術分野における心臓前駆細胞において発現する遺伝子のリストについては、表１を参照されたい。本発明の方法に従って単離されたすべての細胞集団が、ＧＡＴＡ４及びＮｋｘ２．５の遺伝子発現について陽性であった。ミオシン重鎖の発現は認められなかった。幹細胞マーカーであるｃ−ｋｉｔが、本発明のすべての細胞集団において遺伝子発現によって検出された。これについては、表８を参照されたい。フローサイトメトリーによれば、本発明のヒト心臓組織由来細胞はＣＤ１０５及びＣＤ９０について陽性であった。本発明の細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ４５、及びＣＤ１６を発現していなかった。これについては、表８を参照されたい。
【０１１１】
本発明のヒト心臓組織由来細胞の各集団の特性に顕著な差は認められなかった。更なる特性評価を行うためにｈＣＴＣ（Ａ３）集団を選択した。
【０１１２】
（実施例３）
ヒト心臓組織由来細胞のインビトロ細胞培養
細胞密度及び低酸素状態は細胞の増殖に影響する（Ｔａｖａｌｕｃ  Ｒら、Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ６：２０、２５５４〜２５６２、１５  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００７）。細胞−細胞間の接触は、細胞増殖の潜在能力を低下させうるものであり、低い播種密度によって細胞の接触の機会が低下して増殖の潜在能力が高められる。低酸素状態又は低Ｏ2圧は、細胞増殖の接触阻害を低減させることが示されている（Ｎｏｎｏｍｕｒａ  Ｙ．ら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｐｒｉｌ  １，２００９  ｖｏｌ．３６  ｎｏ．４  ６９８〜７０５）。本発明では、３，０００細胞／ｃｍ2の播種密度が、５，０００細胞／ｃｍ2と比較してより高い増殖の潜在能力を示した。
【０１１３】
細胞増殖に対するＯ2濃度の影響を比較するため、ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞をＴ２２５フラスコ中での各継代後に３，０００細胞／ｃｍ2で播種した。細胞を２０％  Ｏ2又は５％  Ｏ2のいずれかの雰囲気中でインキュベートした。３日目に、使用済み培地を６０ｍＬの新鮮な増殖培地と交換した。７日目に、ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞を、実施例２に述べられる方法に従って収穫した。増殖速度を、老化に到るまでの累積の全ＰＤＬを調べることによって求めた。この実験の全期間は１００日よりも長く、その間に細胞を１６〜１７回継代した。正常な酸素条件下（２０％  Ｏ2）で培養されたｈＣＴＣ（Ａ３）細胞では、増殖曲線はＰＤＬ  ２４でプラトーに達した。しかしながら、ＰＤＬ  １２のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞を低酸素条件下（５％  Ｏ2）で培養した場合には、増殖曲線は図６に示されるようにＰＤＬ  ２８でプラトーに達した。
【０１１４】
（実施例４）
ラット心臓組織由来細胞の単離
８〜１２週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットをイソフルランによって麻酔し、腹腔を開いた。腸をずらして、大動脈を切断した。２７ゲージの注射針を胸部大静脈に挿入し、５Ｕ／ｍＬヘパリンを含む１０ｍＬのＰＢＳで心臓を灌流した。次いで、５Ｕ／ｍＬのヘパリンを含む１０ｍＬのＰＢＳを胸部大動脈に注入することによって、心臓の逆行性灌流を行った。この処置の全体を通じて確実に心臓が拍動しつづけるように注意を払った。次いで胸腔から全心臓を取り出し、氷冷ハンクスの緩衝液に入れた。５個の単離したラット心臓を、解離及び酵素的消化用に合わせた。
【０１１５】
次いで、単離したラット心臓を２０ｍＬの室温のＰＢＳで２回洗浄し、上清を捨てた。次いで心臓を室温で外科用メスにより手で細片化し、細片化した組織を３本の５０ｍＬチューブに移した。次いで細片化組織を２５ｍＬのＰＢＳで３回洗浄し、チューブを５回逆さにした。
【０１１６】
組織片を、別々の５０ｍＬコニカルチューブ（コーニング社（Corning Inc.）、ニューヨーク州コーニング）に移した。３０ｍＬの室温のＰＢＳを加え、チューブを５回逆さにすることによって、各チューブ内の組織を３回洗浄した。次いでチューブを直立させて置いて、組織を沈殿させた。２ｍＬの吸引ピペット（ＢＤ  ｆａｌｃｏｎ、ビー・ディー・バイオサイエンス社（BD Biosciences）、カリフォルニア州サンホセ）を使用して、上清を吸引した。消化酵素混合液の保存溶液（２倍）を、酵素：組織の比が１：１となるように５０ｍＬチューブに加えた。混合酵素の最終濃度を、１Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ及び５Ｕ／ｍＬのディスパーゼＩＩとした。組織及び酵素の入ったチューブを２２５ｒｐｍに設定した３７℃のオービタルシェーカー（バーンステッドラブ社（Barnstead Lab）、イリノイ州メルローズパーク）に移し、２．５時間インキュベートした。インキュベート後、チューブを再び安全キャビネットに移した。この細胞懸濁液を室温のＰＢＳでチューブを満たすことによって希釈した。残存する未消化の組織をすべて除去するため、細胞懸濁液を直径２０．３ｃｍ（８インチ）の１００μｍのセルストレーナー（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）、次いで４０μｍのセルストレーナー（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に通して６本の５０ｍＬコニカルチューブ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）内に濾過した。ラットとヒトの筋細胞の大きさの差のため、ラットＣＴＣ用のフィルターサイズは、ヒト細胞用に使用されるものよりも小さいものとした。次いで、細胞懸濁液をＳｏｒｖａｌｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  Ｔ遠心機（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社（Thermo Fisher Scientific,Inc）マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して室温で３３８Ｇで５分間遠心することによって洗い、細胞をペレット化した。上清を吸引除去し、細胞のペレットを増殖培地に再懸濁し、１本の５０ｍＬチューブ内で２０ｍＬの増殖培地中にプールし、試料を取って細胞収率を決定した。得られた典型的な収率は、心臓１個当たり細胞１０００万個であり、生存率は７０％であった。
【０１１７】
ラットの心臓組織由来細胞の調製に際しては、０．１Ｕ／ｍＬ又は１Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ保存溶液を使用して心臓組織を消化した。３時間のインキュベートの後、実施例１で述べたように２０ｍＬの増殖培地をそれぞれのチューブに加えた。しかしながら、０．１Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼで消化したラット心臓組織は、細胞を一切生じなかった。
【０１１８】
心臓組織の解離及び酵素的消化により得られた細胞懸濁液を、各フラスコ内に１０ｍＬを移すことによってＴ２２５組織培養フラスコ（コーニング社（Corning Inc.））内に播種した。各フラスコに３５ｍＬの増殖培地（ＤＭＥＭ、１，０００ｍｇ／ＬのＤグルコース、５８４ｍｇ／ＬのＬ−グルタミン、及び１１０ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン５０Ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬ（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州カールスバッド））を加え、各フラスコ内の最終容量を４５ｍＬとした。初期細胞培養は、３７℃で２０％  Ｏ2及び５％  ＣＯ2の雰囲気中で２日間行った。２日間の初期培養の後、非接着性のｒＣＴＣ（Ｓ）細胞を取り出して５０ｍＬコニカルチューブに移し、室温で５分間、３３８Ｇで遠心した。上清を捨て、細胞のペレットを２０ｍＬの増殖培地に再懸濁した。細胞をカウントし、５，０００細胞／ｃｍ2の播種密度でＴ２２５フラスク内に再び播いた。このｒＣＴＣ（Ｓ）細胞を増殖培地中で培養した。更に２日間の培養の後、ｒＣＴＣ（Ｓ）細胞は接着性となったことが確認された。接着性となったｒＣＴＣ（Ｓ）細胞から形成された接着性の細胞集団を、ｒＣＴＣ（Ａ２）細胞集団又はｒＣＴＣ（Ａ２）細胞と呼ぶこととした。
【０１１９】
実施例２に述べた方法に従ってｒＣＴＣ（Ａ２）細胞を収穫し、７日目にトリプシン処理によって継代した。ｒＣＴＣ（Ａ２）細胞を、各フラスコに４５ｍＬの増殖培地が入れられたＴ２２５フラスコ内に、５，０００細胞／ｃｍ2の密度で播いた。細胞が約８０％に達した時点で細胞を継代した。観察されたｒＣＴＣ（Ａ２）細胞の増殖曲線を図７に示す。
【０１２０】
（実施例５）
ＧＦＰ発現マウス心臓組織由来細胞の単離
５匹の８〜１２週齢のＦＶＢ．Ｃｇ−Ｔｇ（ＡＣＴＢ−ＥＧＦＰ）Ｂ５Ｎａｇｙ／Ｊマウス（ＧＦＰマウス、ジャクソン・ラブ社（Jackson Lab）、メイン州バーハーバー）をイソフルランによって麻酔し、腹腔を開いた。腸をずらして、大動脈を切断した。２７ゲージの注射針を胸部大静脈に挿入し、５Ｕ／ｍＬヘパリンを含む１０ｍＬのＰＢＳで心臓を灌流した。次いで、５Ｕ／ｍＬのヘパリンを含む１０ｍＬのＰＢＳを胸部大動脈に注入することによって、心臓の逆行性灌流を行った。この処置の全体を通じて確実に心臓が拍動しつづけるように注意を払った。次いで胸腔から全心臓を取り出し、氷冷ハンクスの緩衝液に入れた。
【０１２１】
５個の単離したＧＦＰマウス心臓を、解離及び酵素的消化用に合わせた。次いで、単離したラット心臓を２０ｍＬの室温のＰＢＳで２回洗浄し、上清を捨てた。次いで、心臓を室温で外科用メスにより手で細片化し、細片化した組織を３本の５０ｍＬチューブに移した。次いで細片化組織を２５ｍＬのＰＢＳで３回洗浄し、チューブを５回逆さにした。組織片を、別々の５０ｍＬコニカルチューブ（コーニング社（Corning Inc.）、ニューヨーク州コーニング）に移した。３０ｍＬの室温のＰＢＳを加え、チューブを５回逆さにすることによって、各チューブ内の組織を３回洗浄した。次いでチューブを直立させて置いて、組織を沈殿させた。２ｍＬの吸引ピペット（ＢＤ  ｆａｌｃｏｎ、ビー・ディー・バイオサイエンス社（BD Biosciences）、カリフォルニア州サンホセ）を使用して、上清を吸引した。消化酵素混合液の保存溶液（２倍）を、酵素：組織の比が１：１となるように５０ｍＬチューブに加えた。混合酵素の最終濃度は、１Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ及び５Ｕ／ｍＬのディスパーゼＩＩとした。組織及び酵素の入ったチューブを２２５ｒｐｍに設定した３７℃のオービタルシェーカー（バーンステッドラブ社（Barnstead Lab）、イリノイ州メルローズパーク）に移し、２．５時間インキュベートした。インキュベート後、チューブを再び安全キャビネットに移した。この細胞懸濁液を、室温のＰＢＳでチューブを満たすことによって希釈した。残存する未消化の組織をすべて除去するため、細胞懸濁液を直径２０．３ｃｍ（８インチ）の１００μｍのセルストレーナー（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）、次いで４０μｍのセルストレーナー（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に通して６本の５０ｍＬコニカルチューブ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）内に濾過した。ラットとヒトの筋細胞の大きさの差のため、ラットＣＴＣ用のフィルターサイズは、ヒト細胞用に使用されるものよりも小さいものとした。次いで、細胞懸濁液をＳｏｒｖａｌｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  Ｔ遠心機（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社（Thermo Fisher Scientific,Inc）マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して室温で３３８Ｇで５分間遠心することによって洗い、細胞をペレット化した。上清を吸引除去し、細胞のペレットを増殖培地に再懸濁し、１本の５０ｍＬチューブ内で２０ｍＬの増殖培地中にプールし、試料を取って細胞収率を決定した。得られた典型的な収率は、心臓１個当たり細胞１０００万個であり、生存率は７０％であった。
【０１２２】
３時間のインキュベートの後、実施例４で述べたように２０ｍＬの増殖培地をそれぞれのチューブに加えた。残存する未消化の組織をすべて除去するため、細胞懸濁液を直径２０．３ｃｍ（８インチ）の１００μｍのセルストレーナー（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）、次いで４０μｍのセルストレーナー（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に通して、６本の５０ｍＬコニカルチューブ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）内に濾過した。細胞懸濁液をＳｏｒｖａｌｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  Ｔ遠心機（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社（Thermo Fisher Scientific,Inc）マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して室温で３３８Ｇで５分間遠心することによって洗い、細胞をペレット化した。上清を吸引除去し、細胞のペレットを増殖培地に再懸濁し、１本の５０ｍＬチューブ内で２０ｍＬの増殖培地中にプールし、試料を取って細胞収率を決定した。２回の単離に基づけば、得られた典型的な収率は、心臓１個当たり細胞１０００万個であり、生存率は７０％であった。このｍＣＴＣ（Ａ２）細胞を後の実験で使用した。実験に先立って、細胞を２代にわたって継代して増殖させた。
【０１２３】
（実施例６）
細胞の凍結保存、生存率及び回復率
本発明のラット及びヒト心臓組織由来細胞を凍結保存用に調製した。簡単に述べると、ｈＣＴＣ（Ａ３）又はｒＣＴＣ（Ａ２）集団からの細胞を、初期の継代で凍結保存したｈＣＴＣ（Ａ３）細胞又はｒＣＴＣ（Ａ２）細胞を増殖させることによって得た。細胞を３，０００細胞／ｃｍ2で播種し、３７℃、２０％大気Ｏ2下でインキュベートし、培養３日目に培地を交換して培養７日後に継代した。細胞を１２〜１４ＰＤＬで回収した。
【０１２４】
細胞をトリプシン処理し、凍結保存用に２％  ＤＭＳＯを含むＣＲＹＯＳＴＯＲ  Ｄ−ＬＩＴＥ（商標）（バイオライフ・ソリューションズ社（Biolife Solutions,Inc.）ワシントン州ボッセル）中に再懸濁し、ＤｅｌｔａＴソフトウェアを用いたＩｎｔｅｇｒａ  ７５０  Ｐｌｕｓプログラム式フリーザー（プラナー社（Planer）、英国、ミドルセックス）を使用して、Ｎａｌｇｅｎｅ  ２ｍＬポリプロピレン製滅菌雌ねじスクリューキャップ式凍結バイアル（Cryovials）（ナルジーン・ヌンク社（Nalgne Nunc）、ニューヨーク州ロチェスター）中で凍結保存した。細胞及び溶液は、１５℃に維持したプログラム式フリーザーに装填する前には室温であった。試料用の温度プローブを凍結緩衝液のバイアルに入れた。凍結保存には以下のプログラムを使用した。
【０１２５】
【表２】
0005894071.tif 000003
【０１２６】
温度が−１４０℃となった時点で、試料を液体窒素タンクに移して保存した。
【０１２７】
凍結保存後の本発明のヒト心臓組織由来細胞の生存率及び回復率：液体窒素タンク（−１４０℃）内での１ヶ月の保存後、ＣＲＹＯＳＴＯＲ  Ｄ−ＬＩＴＥ（商標）中に１００万細胞／バイアルのｈＣＴＣ（Ａ３）細胞が入ったバイアルの１つを室温で解凍した。次いで、バイアルを安全キャビネットに移した。５０μＬ（５０万個の細胞を含む）の試料を、５０μＬのトリパンブルー溶液の入った１．８ｍＬのマイクロチューブに移した。１０μＬを血球計算板に移してカウントすることにより、この細胞調製物から２重のカウントを取った。これらのカウントにより、ｔ0注射針通過前の回復率及び生存率を決定した。室温でのインキュベーションを行わない注射針通過後の細胞生存率及び回復率（ｔ0注射針通過後）を調べるため、１００μＬの細胞懸濁液を１ｍＬのツベルクリン注射器（ＢＤ、カタログ番号３０９６０２）に３０ゲージの注射針（ＢＤ、カタログ番号３０５１０６）から吸入した。次いで、試料を再び注射針を通じて１．８ｍＬマイクロチューブに入れた。このチューブに、１００μＬのトリパンブルーを加え、上記に述べたように２重のカウントを行った。この手順を、室温で１０分、２０分、３０分のインキュベーションの後、更に注射針を通過させないものについて３０分後に行った。
【０１２８】
１ヶ月の保存後、ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞の解凍後の生存率は９４％であった。表３及び図８に示されるように細胞の回復率は５４万であり、凍結保存前の最初の細胞数と同等であった。
【０１２９】
３０ゲージの投与用注射針を通過させた後で試験したヒト心臓組織由来細胞の生存率は、ラットの梗塞の処置中における細胞投与に要する時間である、室温での３０分間のインキュベーション後に９０％を上回った。表３及び図８に示されるように、回復率は注射針通過前の細胞数と同等であった。
【０１３０】
ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞をＰＤＬ  １２まで増殖させ、その後のインビボ実験のために保存した。保存した細胞の試料を核型異常について調べた。結果を表４にまとめて示す。
【０１３１】
ラットＣＴＣの生体適合性：２００万細胞／バイアルのＣＲＹＯＳＴＯＲ  Ｄ−ＬＩＴＥ（商標）中のｒＣＴＣ（Ａ２）細胞のバイアルの１つを上記に述べたようにして解凍した。次いでバイアルを安全キャビネットに移した。５０μＬの試料を、５０μＬのトリパンブルー溶液の入った１．８ｍＬのマイクロチューブに移した。１０μＬを血球計算板に移してカウントすることにより、この細胞調製物から３重のカウントを取った。注射針通過後の細胞収率及び生存率のベースラインを求めるため、０、１０、２０、３０分のインキュベーション時間で注射針通過前及び注射針通過後の両方で細胞のカウントを行った。各時点において、１００μＬの細胞懸濁液を１ｍＬのツベルクリン注射器（ＢＤ、カタログ番号３０９６０２）に３０ゲージの注射針（ＢＤ、カタログ番号３０５１０６）から吸入した。次いで試料を再び注射針を通じて１．８ｍＬマイクロチューブに入れた。このチューブに、１００μＬのトリパンブルーを加え、上記に述べたように３重のカウントを行った。この手順を１０分、２０分、及び３０分のインキュベーション時間後に室温で行うことによって、ラット急性心筋梗塞モデルにおける潜在的な細胞投与の処置をシミュレートした。
【０１３２】
液体窒素中で１ヶ月の保存の後、解凍したｒＣＴＣ（Ａ２）細胞の生存率は９４％であった。細胞の回復率は１４０万個／ｍＬであり、最初の細胞濃度（２００万個／ｍＬ）の約７０％であった。注射針を通過させた後のｒＣＴＣ（Ａ２）細胞の生存率は、ラットの梗塞の処置中における注入に要する時間枠である、３０分間の室温でのインキュベーション後に９０％を上回った。表５及び図９に示されるように、回復率は注射針通過前の細胞数と同等であった。
【０１３３】
（実施例７）
本発明の心臓組織由来細胞の特性評価
本発明の方法によってラット及びヒトの心臓組織から得られた心臓組織由来細胞の集団で、細胞表面のタンパク質の発現を調べた。試験した細胞表面マーカーを表６に示す。ヒト皮膚線維芽細胞の集団をコントロールとして含めた。
【０１３４】
ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞の集団の９０％よりも多くが、ＣＤ５９、ＣＤ１０５、ＣＤ５４及びＣＤ９０を発現した（別々に分析した）。ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞の集団の約３０％が、内皮前駆細胞の幹細胞マーカーであるＣＤ３４を発現した。更に、約３０％のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞がｃ−Ｋｉｔについて陽性を示した。これに対し、ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞の集団の５％未満がＣＤ３１、ＣＤ４５又はＣＤ１６のいずれかを発現した。これについては、図１０、１１及び表７を参照されたい。ｈＣＴＣ（Ａ１）、ｈＣＴＣ（Ａ１）及びｈＣＴＣ（Ｓ）細胞の集団も、同様の細胞表面マーカーの発現を示した。これについては、表８を参照されたい。更に、ｒＣＴＣ（Ａ３）細胞についても同様の結果が観察された。これについては、図１２を参照されたい。ＣＤ５４（細胞内接着分子１（ＩＣＡＭ））は、白血球上のインテグリンと結合して、血管バリアを通じて組織内へと白血球の血管外移動を媒介する（Ｙａｎｇ  Ｌら、Ｂｌｏｏｄ  １０６（２）：５８４〜９２、Ｊｕｌｙ，２００５）。したがって、この分子の細胞表面での発現は、冠状動脈に投与される際の血管系から心筋へのｈＣＴＣ（Ａ３）の移行を促進しうるものである。
【０１３５】
（実施例８）
心臓組織由来細胞の遺伝子発現分析
以下の心臓組織由来細胞集団、すなわちｈＣＴＣ（Ａ１）、ｈＣＴＣ（Ａ２）、ｈＣＴＣ（Ａ３）、ｒＣＴＣ（Ａ２）、及びｍＣＴＣ（Ａ２）からＲＮＡ試料を採取した（それぞれの細胞集団の１００万個の細胞からＲＮＡを採取した。）。
【０１３６】
採取した試料中の遺伝子のパネルの発現を、リアルタイムＰＣＲによって調べた。リアルタイムＰＣＲ反応は表９に規定される反応ミックスに従って開始し、試験した遺伝子のプライマーを表１０に示す。心臓特異的遺伝子と、幹細胞遺伝子の２つのカテゴリーの遺伝子を調べた。心臓特異的遺伝子は、ミオシン重鎖（ＭｙＨＣ）などの分化マーカーと、ＧＡＴＡ−４及びＮｋｘ２．５などの未分化心臓マーカーとに更に分けられる。幹細胞遺伝子は更に、幹細胞マーカーであるｃ−ｋｉｔ、胚性心臓マーカーであるｉｓｌｅｔ−１、及び細胞分裂マーカーであるテロメラーゼに分類される。各試料の発現レベルを標準化するための基準遺伝子として、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を用いた。
【０１３７】
試験した遺伝子の発現は、ｈＣＴＣ（Ａ１）、ｈＣＴＣ（Ａ２）、及びｈＣＴＣ（Ａ３）集団において同様であることが判明した。これについては、表１０を参照されたい。幹細胞マーカーであるｃ−ｋｉｔが発現された（Ｃｔ：２７〜２９）のに対して、テロメラーゼ及びｉｓｌｅｔ−１の発現は、ｈＣＴＣ（Ａ１）、ｈＣＴＣ（Ａ２）、及びｈＣＴＣ（Ａ３）集団では検出不能であった。Ｃｔ値４０では各遺伝子のメッセージは検出されなかった。心臓マーカーであるＧＡＴＡ４及びＮｋｘ２．５は、それぞれ２５及び３２〜３４のＣＴ値でｈＣＴＣ（Ａ１）、ｈＣＴＣ（Ａ２）、及びｈＣＴＣ（Ａ３）集団において発現されたのに対して、ミオシン重鎖又は心臓アクチンのいずれも、ｈＣＴＣ（Ａ１）、ｈＣＴＣ（Ａ２）、及びｈＣＴＣ（Ａ３）集団のいずれにおいても発現が認められなかった。これについては、表１０を参照されたい。
【０１３８】
これらのデータは、本発明の心臓組織由来細胞が「前駆細胞様」である、すなわち、分化細胞マーカーの発現に対する前駆細胞マーカーの発現の比が、心筋細胞（１％）及びヒト線維芽細胞（１２％）と比較して、ｈＣＴＣ（Ａ１）、ｈＣＴＣ（Ａ２）、及びｈＣＴＣ（Ａ３）集団において５０，０００よりも大きいことを示唆するものである。これについては、表１０、表１１及び図１３を参照されたい。
【０１３９】
ｒＣＴＣ（Ａ２）細胞も、ＧＡＴＡ−４（Ｃｔ：２８）及びＮｋｘ２．５（Ｃｔ：２７）などの心臓系統の遺伝子を発現していた。しかしながら、ヒト心臓組織由来細胞と異なり、Ｎｋｘ２．５は、ラット心臓組織由来細胞では、ヒト心臓組織由来細胞において観察されるよりも高いレベルで発現していた。ｒＣＴＣ（Ａ２）細胞においては、マーカーであるｃ−ｋｉｔ、Ｉｓｌｅｔ−１及びテロメラーゼも発現していた。これについては、表１２を参照されたい。ラット心臓より得られた心臓組織由来細胞と同様、マウス心臓組織由来細胞もＮｋｘ２．５、ｃ−ｋｉｔ、Ｉｓｌｅｔ−１及びテロメラーゼを発現していた。これについては、表１３を参照されたい。
【０１４０】
（実施例９）
心臓組織由来細胞は心筋細胞に分化可能である。
実施例５で述べた方法に従って得られたｍＣＴＣ（Ａ２）細胞（２０万個）を、増殖培地中で最初に２日間培養し、トリプシン処理により回収してカウントした後、ラット心筋細胞（１００万個、カタログ番号Ｒ３５７、セル・アプリケーション社（Cell Application, Inc.）、テキサス州オースチン）と１：５の比で混合した。ラット心筋細胞は５日間培養してからトリプシン処理及びカウントし、ｍＣＴＣ（Ａ２）細胞と混合した。この細胞混合物を、ラミニン処理した６穴プレート（カタログ番号３５４５９５、ビー・ディー・バイオサイエンス社（BD Biosciences）、ニュージャージー州）上に５日間播種した。ｍＣＴＣ（Ａ２）細胞の分化能を、ＤＭＥＭ−Ｆ１２（１：１）＋１０％ウマ血清を含む組織培養培地（シグマ社（Sigma）、以下、分化培地と呼ぶ）中で細胞混合物を培養することによって試験した。細胞は、分化培地中で５日間、２０％  Ｏ2の雰囲気中、３７℃で培養した。この時間の後、細胞を収穫し、ＲＮＡを抽出した。ｍＣＴＣ（Ａ２）細胞とラット心筋細胞との共培養から得た全ＲＮＡ、及びｍＣＴＣ（Ａ２）細胞の並行培養から得た全ＲＮＡを、マウスミオシン重鎖の遺伝子発現について試験した。以下のマウスミオシン重鎖のプライマーを使用した。
【０１４１】
【表３】
0005894071.tif 000004
【０１４２】
ｍＣＴＣ（Ａ２）細胞とラット心筋細胞との共培養により、ｍＣＴＣ（Ａ２）細胞単独の並行培養と比較して、マウスミオシン重鎖の発現は９倍に増加した。これについては、図１４を参照されたい。これらのデータは、本発明の心臓組織由来細胞が心筋細胞に分化することが可能であり、本発明の細胞を心筋細胞と共培養することによって分化が促進されうることを示唆するものである。
【０１４３】
（実施例１０）
ブタ心臓組織由来細胞の単離、増殖、及び特性評価
８〜１２週齢のゲッチンゲンミニブタから１個の心臓を、毎回の単離を行う際に（マーシャル・バイオリソース社（Marshall Bioresources）、ニューヨーク州ノースローズ）より得た。心臓は、採取に先立って灌流して血液を抜き、輸送時には臓器全体を氷上でＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中に浸漬した。調達から組織消化までの時間は４８〜９６時間であった。以下に述べる手順に従って４回の別々の単離を行った。
【０１４４】
心臓を小片（約２〜３ｃｍ3の大きさ）に切断した。これらの組織片を、実施例１で述べたような機械的ホモジナイズ処理によってホモジナイズすることによって、１ｍｍ3未満の大きさの心臓組織片を得た後、これを１本の２５０ｍＬコニカルチューブ（コーニング社（Corning Inc.）、ニューヨーク州コーニング）に移して３回洗浄した。消化酵素混合液の保存溶液（２倍）を、酵素：組織の比が１：１となるように２５０ｍＬチューブに加えた。各酵素の最終濃度は、１Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ及び５Ｕ／ｍＬのディスパーゼＩＩとした。組織及び酵素の入ったチューブを２２５ｒｐｍに設定した３７℃のオービタルシェーカー（バーンステッドラブ社（Barnstead Lab）、イリノイ州メルローズパーク）に移し、２．５時間インキュベートした。インキュベーション後、残留する未消化の組織をすべて取り除くため、細胞懸濁液を直径２０．３ｃｍ（８インチ）の２５０μｍ標準試験用シーブ（シグマ・アルドリッチ社（Sigma-Aldrich）、ミズーリ州セントルイス）に通して濾過することによって未消化の結合組織及び脂肪組織を除去した後、更に１００μｍのセルストレーナー（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に通して濾過することにより心筋細胞を除去した。フィルターを通過した細胞を含む培地を、複数の５０ｍＬコニカルチューブ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に移した。次いで、細胞懸濁液を洗浄した。洗浄後、ペレットを２０ｍＬのＡＣＫ溶解バッファー（ロンザ社（Lonza）、メリーランド州ウォーカーズビル）に再懸濁し、室温で１０分間インキュベートすることによって残留する赤血球をすべて溶解した。インキュベート後、細胞懸濁液を４０ｍＬの室温のＰＢＳで更に２回洗浄した。最終的な遠心後、ペレットを２０ｍＬの室温の増殖培地に再懸濁してカウントした。解離及び酵素的消化の後、細胞の収率は２０ｍＬの体積中、２７００万個の細胞が典型的であった。生存率は８０％が典型的であった。
【０１４５】
解離及び酵素的消化により得られた細胞懸濁液を、Ｔ２２５組織培養フラスコ（コーニング社（Corning Inc.）、ニューヨーク州コーニング）に加えた。１０ｍＬの細胞懸濁液を、５０ｍＬの増殖培地（ＤＭＥＭ、１，０００ｍｇ／ＬのＤグルコース、５８４ｍｇ／ＬのＬ−グルタミン、及び１１０ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン５０Ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬ（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州カールスバッド））が入った各フラスコに加えた。初期培養の最終体積を６０ｍＬとした。細胞を、２０％  Ｏ2及び５％  ＣＯ2を含む大気中、３７℃で２日間インキュベートした。この時間の後、不均質な細胞培養物が観察された。非接着性の、フェーズブライトな細胞が観察され（本明細書においてｐＣＴＣ（Ｓ）細胞と呼ぶ）、更に接着性細胞が観察された（本明細書においてｐＣＴＣ（Ａ１）細胞と呼ぶ）。
【０１４６】
本発明の方法に従ったブタ心臓の解離及び酵素的消化、並びにこれに続く細胞の増殖によって以下の細胞集団が得られた。すなわち、ｐＣＴＣ（Ｓ）、ｐＣＴＣ（Ａ１）、ｐＣＴＣ（Ａ２）、及びｐＣＴＣ（Ａ３）細胞である。本発明のブタ心臓組織由来細胞の形態は、本発明のヒト心臓組織由来細胞と類似していた。更なる特性評価及びその後のインビボ実験用にｐＣＴＣ（Ａ３）集団を選択した。
【０１４７】
ｐＣＴＣ（Ｓ）細胞及びｐＣＴＣ（Ａ１）細胞を、混合物としてＴ２２５フラスコ中で培養して最初に増殖させた。各フラスコを各フラスコ当たり６０ｍＬにまで新鮮な増殖培地で満たし、細胞を３７℃、２０％  Ｏ2下で２日間インキュベートした。この時間の後、細胞の大部分が、本明細書においてｐＣＴＣ（Ａ３）集団又はｐＣＴＣ（Ａ３）細胞と呼ぶ接着性の細胞集団を形成した。２日間の培養後、目視による観察によれば、非接着性細胞の数が減少したことにより、ｐＣＴＣ（Ａ３）細胞が均一な細胞の集団となった。これには平均で２日間を要した。ｐＣＴＣ（Ａ３）細胞を、細胞が９０〜１００％コンフルエンスに達した時点で継代し、３０００細胞／ｃｍ2で再播種した。培養中のｐＣＴＣ（Ａ３）細胞の増殖は、ヒト心臓組織由来細胞の増殖を上回った。ｐＣＴＣ（Ａ３）細胞は、３〜４日で９０％コンフルエンスを超えるように増殖した。本発明のｐＣＴＣ（Ａ３）細胞について観察された増殖曲線については、図１５を参照されたい。
【０１４８】
リアルタイムＰＣＲによって調べたように、ｐＣＴＣ（Ａ３）細胞はテロメラーゼもミオシン重鎖も発現していなかった。しかしながら、ｐＣＴＣ（Ａ３）細胞はＧＡＴＡ−４を発現していた。本発明のブタ心臓組織由来細胞におけるＮｋｘ２．５の発現は調べなかった。細胞表面マーカーの一重染色により、ｐＣＴＣ（Ａ３）細胞の集団の９０％よりも多くが、ＣＤ１０５及びＣＤ９０の発現について陽性であることが示された。５％未満のｐＣＴＣ（Ａ３）細胞が、ＣＤ４５、ＣＤ１６、又はブタ内皮細胞マーカー（カタログ番号ＭＣＡ１７５２、セロテック社（Serotec））のいずれかを発現した。このマーカーは、ウィルソン（Wilson）らによって示された、広範囲の組織の血管内皮上において同定された組織適合性複合体クラスＩＩの分子である（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１９９６  Ｍａｙ；８８（１）：９８〜１０３）。これについては、図１６及び表１４を参照されたい。ｐＣＴＣ（Ａ１）又はｐＣＴＣ（Ａ２）細胞などの他の細胞集団については調べなかった。
【０１４９】
（実施例１１）
本発明の心臓組織由来細胞による急性心筋梗塞の治療
ラット急性心筋梗塞モデル：ＡＣＥＩ及びβ遮断薬などの薬剤のヒトＡＭＩの治療薬としての有効性を試験する目的で、ラット心筋梗塞モデルが効果的に使用されてきた。動物は、実験のすべての段階において、現地の研究機関用のガイドラインに従って処置した。
【０１５０】
ラット心筋梗塞モデルは、心筋梗塞後のヒトの病態生理及び梗塞後の心機能の更なる低下を再現するうえでよく確立されている（Ｐｆｅｆｆｅｒ  Ｍ．Ａ．ら、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  １９７９；４４：５０３〜１２；Ｌｉｔｗｉｎ  Ｓ．Ｅ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １９９４；８９：３４５〜５４；Ｈｏｄｓｍａｎ  Ｇ．Ｐ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １９８８；７８：３７６〜８１）。
【０１５１】
雌性ヌードラット（体重２５０〜３００ｇ、静岡県実験動物農業協同組合、日本、静岡県）をケタミン及びキシラジン（それぞれ６０及び１０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与）で麻酔し、気管内チューブから陽圧呼吸を行った。第４左肋間領域で胸腔を開き、心臓を体外に露出させ、心膜を切開した。この後、心臓をピンセットで押さえ、左前下行枝の起始部から約２ｍｍの位置で６−０プロリン縫合糸を左前下行枝の下に回した。結紮糸を引っ張って動脈を永久的に閉塞することによって、心臓にＡＭＩを誘発した。梗塞した心筋の変色が目視にて観察された。以下の細胞投与において述べるように、心臓組織由来細胞の懸濁液又は溶媒を、梗塞が誘発された約２０分後に変色した領域の境界領域に注入した。注入後、胸腔を閉じ、ラットをケージに戻した。手術後の各特定の時間において、麻酔下で心臓を摘出することによりラットを屠殺した。
【０１５２】
−８０℃で保存したｈＣＴＣ（Ａ３）細胞及びｒＣＴＣ（Ａ２）細胞の凍結保存した集団を氷上で解凍し、試験動物への投与に先立ってそれらの生存率を調べた。この研究で使用したすべての細胞集団において、細胞の生存率は９５％よりも高かった。
【０１５３】
左前下行枝の結紮の２０分後に試験動物に細胞を投与した。凍結保存されたｈＣＴＣ（Ａ３）細胞の集団を、変色した領域の境界領域に注入した。１２０μＬのＣｒｙｏｓｔｏｒ  Ｄ−ｌｉｔｅ中の以下の標的用量、すなわち１×１０4細胞（低用量）、１×１０5細胞（中用量）、又は１×１０6細胞（高用量）の１つを試験動物に投与した（１つの標的用量につき１５匹）。これと並行して、凍結保存したｒＣＴＣ（Ａ２）細胞の集団を、変色した領域の境界領域に注入した。１２０μＬのＣｒｙｏｓｔｏｒ  Ｄ−ｌｉｔｅ中の以下の標的用量、すなわち１×１０6細胞の１つを試験動物に投与した（１つの標的用量につき１５匹）。
【０１５４】
すべての試験動物において、凍結保存細胞は、１２０μＬの全容量の凍結保存培地中であった。１つの標的用量の細胞を、心臓の変色した領域の周囲の別々の５箇所に注入した。凍結保存した培地（１２０μＬ）を注入したコントロール群も実験に含めた。
【０１５５】
経胸壁心エコー法（ＳＯＮＯＳ  ５５００、フィリップス・メディカル・システムズ社（Philips Medical Systems））を行って、ＡＭＩの誘発の５日後及び２８日後の左心室（ＬＶ）の機能を評価した。心エコー法を行う間、ラットはケタミン及びキシラジンで麻酔した。左室拡張末期径及び左室収縮末期径（それぞれＬＶＥＤＤ及びＬＶＥＳＤ）、並びに左室内径短縮率（ＦＳ）を中位乳頭筋レベルで測定した。ＦＳは、収縮期径（収縮の末期）との拡張期径（充填の末期）との間の差（％）を測定することにより心臓のポンプ作用を反映したものである。以下の公表されている基準に従って局所壁運動スコア（ＲＷＭＳ）を評価した。すなわち、スコア１：正常な壁の運動及び肥厚、スコア２：壁の運動及び肥厚の低下、スコア３：壁の運動及び肥厚の消失、スコア４：外側への運動又は膨らみ（例えば、Ｓｃｈｉｌｌｅｒ，Ｓｈａｈら、（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｙ  ｖｏｌ  ２：３５８〜３６７；１９８９）を参照）。
【０１５６】
簡単に述べると、１７個の連続した断面画像を心エコーにより得て、各断面に表１５の定義に基づいた壁運動スコアを与えた。１７個のセグメントのすべてのスコアの合計を、壁の収縮性の指標として用いた。ＲＷＭＳは収縮の直接的な測定値である。ＲＭＷＳの低下は収縮力の改善を示し、心筋の機能の改善を反映している。表１５は各スコアの基準を示している。
【０１５７】
この実験で観察された死亡率は１６％であった。表１６に示されるように各群間で死亡率に有意な差は認められなかった。
【０１５８】
結果
図１７は、プフェファー（Pffeffer）らによるＡｔｌａｓ  ｏｆ  Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌｕｒｅ（１９９９）より転載したものであり、梗塞後の心臓において観察される病理的変化を示している。ヒト患者におけるＡＭＩ及び慢性心不全を再現するためにラット急性心筋梗塞モデルが確立されている。ヒトにおけるような梗塞の後、心室には、梗塞領域において心筋が線維性組織によって置き換わることで始まる一連の病態生理学的変化が生じる。心室の収縮及び圧力によって梗塞が拡大し、次第に心室腔が拡張し、最終的には、楕円形から球形への心室腔の形状変化及び心筋肥大としての細胞の変化によって示されるような左心室のリモデリングにつながる。
【０１５９】
凍結保存されたｈＣＴＣ（Ａ３）細胞の集団によって、それぞれ左室内径短縮率（ＦＳ）及び局所壁運動スコア（ＲＷＭＳ）によって測定される全体的な心機能及び心筋収縮性が改善した。全体的な心機能及び心筋収縮性の改善は、ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞のすべての標的用量で認められた。これについては、図１８及び１９を参照されたい。
【０１６０】
投与５日後、ｒＣＴＣ（Ａ２）細胞又は１×１０6個のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞の標的用量を投与した動物は、溶媒で処理した動物と比較して３．３％（ｈＣＴＣ（Ａ３））及び３．８％（ｒＣＴＣ（Ａ２））低いＦＳを示した。細胞投与４週間後に、左室内径短縮率の絶対値（２８日目に観察されたＦＳ値から５日目に観察されたＦＳ値を引くことによって計算した）の改善が認められた。これについては、図１８、並びに表１７及び１８を参照されたい。１×１０4個のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞で処理した動物のＦＳの絶対値は、９．６８７±１．３２９％（ｎ＝１２，Ｐ＜０．００１）であった。１×１０5個のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞で処理した動物のＦＳの絶対値は、１０．９±１．６％（ｎ＝１１，Ｐ＜０．００１）であった。１×１０6個のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞で処理した動物のＦＳの絶対値は、１２．９±１．８％（ｎ＝１０，Ｐ＜０．００１）であった。本発明において用いた実験モデルにおいてｒＣＴＣ細胞が有効性を示さなかったことは、幾つかの可能な理由によって説明されうる。ヌードラットは免疫力が低下しているが、外来細胞に対する拒絶反応は完全に失われていなかった。今回の研究では、ｒＣＴＣはヒト細胞よりもヌードラットによる免疫拒絶反応をより受けやすいと考えられる。心筋中のｒＣＴＣの保持率は免疫反応によって低下しており、したがって心筋に対するその作用に影響しうる。
【０１６１】
ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞で処理した動物では、細胞投与の４週後にＲＷＭＳの低下も観察された。１×１０4個のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞で処理した動物におけるＲＷＭＳスコアは、梗塞及び細胞投与の５日後には２４．４２±１．４であったが、梗塞及び細胞投与の４週後には２１．０８±１．７（ｎ＝１２，Ｐ＜０．００１）にまで低下した。１×１０5個のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞で処理した動物におけるＲＷＭＳスコアは、梗塞及び細胞投与の５日後には２５．５８±１．４であり、２１．０８±１．９（ｎ＝１１，Ｐ＜０．００１）にまで低下した。１×１０6個のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞で処理した動物におけるＲＷＭＳスコアは、梗塞及び細胞投与の５日後には２５．９１±１．６であり、梗塞及び細胞投与の４週後には２０±１．７（ｎ＝１０，Ｐ＜０．００１）にまで低下した。ｒＣＴＣ（Ａ２）による処理では左室内径短縮率は低下しないようであったが、ＲＷＭＳのわずかな低下が認められた。１×１０6個のｒＣＴＣ（Ａ２）細胞で処理した動物におけるＲＷＭＳスコアは、梗塞及び細胞投与の５日後には２５．２９±１．９であり、細胞投与の４週後には２３．８６±２．３（ｎ＝１２，Ｐ＝０．０９）にまで低下した。これについては、図１９、並びに表１７及び１９を参照されたい。ｒＣＴＣ（Ａ２）で処理した動物において観察されたデータは、ｒＣＴＣ（Ａ２）細胞が全体の機能は改善しなかったものの、ＲＷＭＳによって示されるように心筋収縮性を改善したことを示唆している。
【０１６２】
これに対し、ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞で処理した動物において観察されたデータは、ヒト心臓組織由来細胞が全体の心機能及び心筋収縮性を改善したことを示唆している。
【０１６３】
ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞を投与した動物では、心臓リモデリングも防止された。心臓リモデリングとは、例えば心筋梗塞などの虚血性傷害後に観察される心臓の大きさ、形状及び機能における変化のことを指す。観察される変化としては、心筋細胞の死、及び梗塞領域における房室壁が過度に薄くなることなどが挙げられる。薄い房室壁は、心臓にかかる圧力及び容積負荷に耐えることができない。その結果、梗塞領域より房室の拡張が生じて、補償的な非梗塞性の心筋に拡がることになる。時間の経過とともに心臓の拡張が進行するに従って、心エコー検査における径の増大によって示されるように心室のサイズが拡大し、その形状が楕円形からより球状となる。心室の質量及び容積の増大は、心機能に更なる悪影響を及ぼす。拡張期の末期における容積の増大によって、心臓が各収縮の間に弛緩する能力が最終的に損なわれ、機能の更なる低下につながる。心室の拡大の重症度によって、患者の予後が決まる。房室の拡大と、心不全の患者の短い平均余命との間には相関が認められている。
【０１６４】
急性心筋梗塞の誘発後の動物の左心室における心臓リモデリングの程度を、心エコー検査によって拡張期及び収縮期の末期の左心室の径（左室拡張末期径（ＬＶＥＤＤ）及び左室収縮末期径（ＬＶＥＳＤ））を測定することによって調べた。ＬＶＥＤＤ及びＬＶＥＳＤの増大は、心臓リモデリングの重症度の増大を意味する。逆に、ＬＶＥＤＤ及びＬＶＥＳＤの観測値の低下は、心臓リモデリングの逆行又は心機能の改善を意味する。
【０１６５】
溶媒で処理した動物では、ＬＶＥＤＤは、細胞投与５日後の０．７４±０．０２０ｍｍから細胞投与４週後の０．８３±０．０１９ｍｍに増大した。これは、左心室の１２％の相対的増大率［１００％（Ｄ２８−Ｄ５）／Ｄ５］に相当する。ｒＣＴＣ（Ａ２）細胞で処理した動物では、ＬＶＥＤＤは、細胞投与５日後の０．６９±０．０２２ｍｍから細胞投与４週後の０．８０±０．０１８ｍｍに増大した。１×１０4個のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞で処理した動物では、ＬＶＥＤＤは、細胞投与５日後の０．７０±０．０１２ｍｍから細胞投与４週後の０．７７±０．０２２ｍｍに増大した。
【０１６６】
１×１０5個のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞で処理した動物では、ＬＶＥＤＤに大きな変化は見られず、ＬＶＥＤＤは細胞投与５日後に０．７３±０．０１２ｍｍ、細胞投与４週後に０．７４±０．０２３ｍｍであり、１．４％の相対的変化率であった（ｐ＜０．０１、溶媒群との比較）。同様に、１×１０6個のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞で処理した動物では、ＬＶＥＤＤに大きな変化はやはり見られず、ＬＶＥＤＤは細胞投与５日後に０．７６±０．０１１ｍｍ、細胞投与４週後に０．７１±０．０２８ｍｍであり、細胞投与５日後から６．６％減少する相対的変化率であった（ｐ＜０．００１、溶媒群との比較）。これらのデータは、１×１０5個のｈＣＴＣ（Ａ３）の用量及び１×１０6個のｈＣＴＣ（Ａ３）の用量が、心臓リモデリングを防止したことを示唆するものである。これについては、図２３、表１７及び表２０を参照されたい。ＬＶＥＤＤの相対変化率（１００％（２８Ｄ−５Ｄ）／５Ｄ）を、表２１及び図２０〜２１に示す。
【０１６７】
１×１０4個のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞で処理した動物では、ＬＶＥＤＤは５日目で０．７１±０．０４５ｍｍ、２８日目で０．７８±０．０７９ｍｍであった。１×１０6個のｒＣＴＣ（Ａ２）細胞で処理した動物では、ＬＶＥＤＤは５日目で０．７０±０．０８３ｍｍ、２８日目で０．８０±０．０７１ｍｍであった。溶媒で処理した動物からはＬＶＥＤＤに有意な差は認められず、溶媒群と比較してリモデリングが改善していないことを示唆している。これについては、表１７及び図２３を参照されたい。
【０１６８】
ヒト心臓組織由来細胞で処理した動物においても、左室収縮末期径（ＬＶＥＳＤ）の低下が認められた。ＬＶＥＳＤは、収縮の末期における心室のサイズを測定したものである。このパラメータはリモデリングを表すばかりでなく、心筋の収縮性も示している。ＬＶＥＳＤの低下は、収縮の強さの増大に相当する。
【０１６９】
溶媒で処理した動物では、ＬＶＥＳＤは５日目〜２８日目にかけて増大した。ＬＶＥＳＤは、１×１０4個のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞で処理した動物では同じレベルに維持された（５日目で０．５６±０．０５ｃｍ、２８日目で０．５４±０．０８ｃｍ）。ＬＶＥＳＤは、１×１０5個及び１×１０6個のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞で処理した動物では低下した（それぞれ、５日目で０．５８±０．０４ｃｍ、２８日目で０．５１±０．０８ｃｍ、及び、５日目で０．６２±０．０５ｃｍ、２８日目で０．４８±０．０９ｃｍ）。これについては、図２２及び表２２を参照されたい。各時点においてそれぞれの動物から心エコーによって測定された４つのパラメータすべてによる機能データを図２３に示した。５日目〜２８日目の間の傾向の変化は、各群内で一貫している。
【０１７０】
左室内径短縮率（ＦＳ）により測定される全体的な機能によって決定されるｈＣＴＣ（Ａ３）細胞投与の標的用量及び心機能の分析は、細胞の用量と機能改善との間の相関（ｐ＝０．００１，ｎ＝３５）を示した。これについては、図２４を参照されたい。
【０１７１】
同様に、５日目〜２８日目にかけてのＬＶＥＤＤの絶対値の変化（２８Ｄ−５Ｄ）によって決定される、ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞投与の標的用量及び心臓リモデリングの分析が観察された（ｐ＝０．０００２，ｎ＝３５）。これについては、図２５を参照されたい。一定の相関が確立され、これは直線的ではなく、指数関数的な相関と考えられる。
【０１７２】
（実施例１２）
急性心筋梗塞のラットモデルにおけるヒト心臓組織由来細胞の保持率
損傷した心筋の治療法としてのヒト心臓組織由来細胞の機構及び生物学的効果を更に理解するため、上記の実施例においてヒト心臓細胞で処理した動物の心臓から組織試料を採取して、投与４週後の動物におけるヒト心臓組織由来細胞の保持率を調べた。
【０１７３】
上記の実施例においてヒト心臓組織由来細胞で処理した動物から、細胞投与の４週後に心臓を摘出して採取した。細胞保持率を、組織学的検査（各細胞用量につきｎ＝６）、及び定量的リアルタイムＰＣＲ（各細胞用量につきｎ＝４）によって求めた。
【０１７４】
ベースラインの細胞保持率の値を確立するため、左前下行枝の結紮の２０分後に試験動物にｈＣＴＣ（Ａ３）細胞を投与した。凍結保存したｈＣＴＣ（Ａ３）細胞の集団を、各動物につき、変色した領域の境界領域の５箇所の別々の注入部位に注入した。各動物に、１×１０4個、１×１０5個、又は１×１０6個の細胞のいずれかの標的用量を投与した。動物を０、１、３及び７日目に屠殺し、定量的リアルタイムＰＣＲによる細胞保持率分析を行うために心臓を摘出した（各処理群につきｎ＝３）。
【０１７５】
定量的リアルタイムＰＣＲ用に試料を採取する場合には、心臓組織を処理して全ＲＮＡを得た。ヒト細胞の保持率を、心臓試料中に検出されたヒトＲＮＡの量に基づいて推定した。
【０１７６】
ヒト心臓組織由来細胞からのＲＮＡが、ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞で処理した動物において細胞投与の４週後に検出された。細胞保持率は用量依存的と考えられ、１×１０6個のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞を投与した動物は、１×１０5個のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞を投与した動物よりも高い細胞保持率を示した。１×１０4個のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞を投与した動物では、細胞保持率は試料中に検出されたヒトＲＮＡの量に基づいてバックグラウンドのレベルと推定された。
【０１７７】
ヒトＲＮＡは、細胞投与の０、１日、３日、及び７日後に屠殺した動物から得た心臓に検出された。細胞保持率は、投与直後に急速に低下し、細胞投与の２４時間後にも更に低下した。図２６のパネルｃ及びｄに示されるように、心臓試料中に検出されたヒトＲＮＡの量によって推定されるように、細胞投与直後に標的用量のわずか約８％が残留した。ベースラインとして０時点を用いると、細胞投与の２４時間後に調べた細胞保持率のレベルは、０時点の約１０％にまで更に低下していた。細胞保持率のレベルは、細胞投与の７日後に同じレベルに維持された。
【０１７８】
ヒト心臓組織由来細胞の保持率と心臓リモデリングの防止との間には一定の相関が認められた。ヒト心臓組織由来細胞を投与した動物では、ＬＶＥＤＤの変化（Ｄ２８−Ｄ５）は、ヒト心臓組織由来細胞の保持率と相関していた。図２７に見られるように、この相関の傾向は、ｐ値＝０．０２３、及びｒ2値＝４１％で有意である。高血圧に対して一般的に処方される薬剤であるエナラプリルの臨床薬理試験（Ｌｉｌｉａｎ  Ｍｕｒｒａｙら、Ｂｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９８；４５（６）：５５９〜５６６）では、エナラプリルと血圧の低下とには有意な相関が実験において認められている（ｐ＜０．０１）。しかしながら、「モデルの予測力は高くなった（ｒ2＝２３．６％，ｐ＜０．０１）が、応答の変動の大部分については説明されないままだった」としている。
【０１７９】
免疫組織化学的検査用に試料を採取した場合では、心臓をＯＣＴ媒質中に包埋し、液体窒素中で急速冷凍した（１群につきｎ＝６）。心臓の心底、中央、及び心尖のレベルで切片を切断した。包埋した凍結組織を、更なる組織学的評価を行うためにカルテック・テクノロジー社（QualTek Technology）（カリフォルニア州サンタバーバラ）に送った。組織を室温で解凍し、ホルマリンで再固定してパラフィンに包埋し、５μｍの切片に切断した。ラット心筋内のヒト心臓組織由来細胞を識別するために、切片をヒト核マトリクス抗原（ｈｕ  ＮｕＭＡ）に対する抗体で染色した。
【０１８０】
免疫組織化学的検査の結果はｑＰＣＲの結果と一致していた。１×１０6個のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞の標的用量を投与した動物から得られた心筋において、陽性のヒトＮｕＭＡ染色が特定された。これについては、図２８のパネルａ、及び図２９を参照されたい。ここでは、暗褐色に染色され、ヒト組織のコントロールにおいて見られるものと染色特性が似たＮｕＭａ陽性細胞が２個の楕円内に示され、バックグラウンド染色は見られない。推定される細胞数は、約１００個のヒト細胞／切片であった。高倍率では、図２９のパネルｄに示されるように心筋様ヒト細胞が更に特定された。溶媒で処理した動物では、ヒトＮｕＭＡの染色は認められなかった。これについては、図２８のパネルａ及びｂ、図２９、並びに図３０を参照されたい。
【０１８１】
（実施例１３）
ヒト心臓組織由来細胞は、急性心筋梗塞の動物モデルにおいて肥大を低減した。
損傷した心筋の治療法としてのヒト心臓組織由来細胞の機構及び生物学的効果を更に理解するため、実施例１１においてヒト心臓細胞で処理した動物の心臓から組織試料を採取して、心臓の梗塞サイズの一般病理学的所見に対するヒト心臓組織由来細胞の投与の影響を調べた。
【０１８２】
組織病理学的所見を、カルテック社（QualTek）（カリフォルニア州サンタバーバラ）の病理学者に評価してもらった。病理学者は実験の処理について盲検化した。心臓組織をパラフィンブロックに包埋した。臓器全体を通じて５μｍ毎に切片を得て、一般病理学的所見について評価した。肥大の評価はスコアシステムによって行った。肥大心筋（スコア１）では、拡大した細胞質及び奇形核を有する心筋細胞が一般的に見られる。そうでない場合には、心筋のスコアを０とする。肥大が見られる切片と肥大が見られない切片の数をカウントし、全心臓における肥大の割合を表す全切片の割合として図３１に示した。
【０１８３】
溶媒で処理した動物の心臓において心筋肥大が認められ、心筋の約７０％が肥大を示した（スコア１）。これについては、図３１を参照されたい。ヒト心臓組織由来細胞による処理により、溶媒で処理した動物と比較して、心臓に認められる肥大は大幅に低減された。１×１０4個、１×１０5個、又は１×１０6個の標的用量のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞を投与した心臓では、肥大心筋は３０％〜５０％に低下した。これについては、図３１を参照されたい。
【０１８４】
心筋梗塞の重症度を調べるため、各心臓から得られた乳頭筋レベルでの切片に対してマッソントリクローム染色を行った。梗塞領域及び非梗塞領域の直接的測定によって梗塞サイズを調べた。相対的な梗塞サイズを、１００％［梗塞領域／（梗塞領域＋非梗塞領域）］によって推定した。すべての形態計測実験は、イワサキ（Iwasaki）らによりＣｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００６；１１３：１３１１〜１３２５に述べられる方法に従って行った。
【０１８５】
溶媒群（２４．１±２．９％）と比較して、相対的梗塞サイズが低減する傾向が、１×１０5個、又は１×１０6個のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞を投与した動物において見られた（それぞれ、１６．５±７．３％，ｐ＝０．０２、又は１４．８±８．６％，ｐ＝０．０１）。これについては、図３２のパネルａを参照されたい。同様に、溶媒処理群（７４８±１９１）と比較して、１×１０5個、又は１×１０6個のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞を投与した動物では、梗塞サイズの低減する傾向が実際の梗塞領域によっても観察された（それぞれ、５５７±２２１，ｐ＝０．０９、又は５３７±２６１，ｐ＝０．０８）。これについては、図３２のパネルｂを参照されたい。
【０１８６】
溶媒で処理した動物の心臓において心筋肥大が認められ、心筋の約７０％が肥大を示した（スコア１）。これについては、図３１を参照されたい。ヒト心臓組織由来細胞による処理により、溶媒で処理した動物と比較して、心臓に認められる肥大は大幅に低減された。１×１０4個、１×１０5個、又は１×１０6個の標的用量のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞を投与した心臓では、肥大心筋は３０％〜５０％に低下した。これについては、図３１を参照されたい。ｈＣＴＣによって実現される肥大の低減は、栄養作用又はパラ分泌作用、すなわち表２４に示されるようなｈＣＴＣによって分泌されるサイトカインに直接起因するか、かつ／又は、下記実施例１４で述べるような新たな心筋細胞の生成が増加することの二次的な効果によるものと考えられる。
【０１８７】
（実施例１４）
ヒト心臓組織由来細胞は、急性心筋梗塞の動物モデルにおいて毛細血管密度を増大させた
損傷した心筋の治療法としてのヒト心臓組織由来細胞の機構及び生物学的効果を更に理解するため、実施例１１においてヒト心臓細胞で処理した動物の心臓から組織試料を採取して、梗塞領域の境界領域における毛細血管密度に対するヒト心臓組織由来細胞の投与の影響を調べた。
【０１８８】
梗塞領域の境界領域において採取した、各心臓の左心室の５つの組織切片を無作為に選択し、毛細血管の密度を組織学的検査によって形態計測的に評価した。その際、毛細血管はイソレクチンＢ４に対する抗体（ベクター・ラボラトリーズ社（Vector Laboratories）、カリフォルニア州バーリンゲーム）又はＣＤ３１に対する抗体を使用して可視化した。イソレクチンＢ４は内皮細胞表面の糖残基に対する特異性を有し、バスデバン（Vasudevan）らによりＮａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １１：４２９〜４３９（２００８）に、またシュミット（Schmidt）らによりＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３４，２９１３〜２９２３（２００７）に述べられるように様々な状況において内皮細胞を認識することが報告されている。ＣＤ３１は、血小板内皮細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ）としても知られ、内皮細胞、ひいては心臓を含む様々な組織における脈管構造を特定するために広く用いられている（Ｔａｂｉｂｉａｚａｒ  ａｎｄ  Ｒｏｃｋｓｏｎ  Ｅｕｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ  ２００１  ｖｏｌ  ２２；９０３〜９１８）。
【０１８９】
イソレクチンＢ４又はＣＤ３１による毛細血管の可視化によって、ヒト心臓組織由来細胞の投与が梗塞領域の境界領域における毛細血管の密度を高めることが示された。ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞の投与はすべての用量で、細胞投与の４週後に溶媒処理群と比較して毛細血管の密度を増大させた。これについては、図３３のパネルａ及びｂを参照されたい（イソレクチンＢ４染色ではｐ＝０．００６８、ＣＤ３１染色ではｐ＝０．０００５）。
【０１９０】
毛細血管密度の増大は、本発明のヒト心臓組織由来細胞からの因子の分泌に一部よるものである可能性が考えられる。これらの栄養因子は、心臓細胞に例えばパラ分泌的に作用していることが考えられる。これらの栄養因子は、血管形成、血管の機能及び血流力学、心筋のリモデリング及び機能、筋細胞増殖（筋形成など）、筋細胞肥大、線維症、又は心臓細胞の生存率の上昇に直接又は間接的に影響していることが考えられる。これらの栄養因子が、レシピエントの免疫反応を調節する可能性もある。ヒト心臓組織由来細胞が栄養因子を分泌するか否かを調べるため、インビトロで７日間培養したｈＣＴＣ（Ａ３）細胞の集団から培地を回収した。培地の試料を−８０℃で保存した後、分泌されたサイトカインの存在についてアッセイを行った。
【０１９１】
ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞によって分泌されたサイトカインとしては、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、及びアンジオポエチン２（ＡＮＧ２）があった。これについては、表２４を参照されたい。これらのサイトカインは、血管形成において重要な役割を担っている。より重要な点として、ＶＥＧＦとＡＮＧ２との組み合わせは毛細血管の出芽プロセスを開始及び促進するうえで相乗効果を示しうることがあり、これについてはメイソンピエール（Maisonpierre）らによりＳｃｉｅｎｃｅ  ２７７：５５〜６０（１９９７）に報告され、ラムサワー（Ramsauer）らによりＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １１０：１６１５〜１６１７（２００２）に概説されている。
【０１９２】
（実施例１５）
ヒト心臓組織由来細胞は、本発明のヒト心臓組織由来細胞を投与した動物において非梗塞領域の筋細胞密度を増大させた
損傷した心筋の治療法としてのヒト心臓組織由来細胞の機構及び生物学的効果を更に理解するため、実施例１１においてヒト心臓細胞で処理した動物の心臓から組織試料を採取して、梗塞領域の境界領域におけるラット筋細胞の増殖及び心臓の非梗塞領域の筋細胞の密度に対するヒト心臓組織由来細胞の投与の影響を調べた。
【０１９３】
ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した組織試料を４μｍの切片とした。大体１７番目の切片における１枚のスライドを各動物から選択した。これらの切片をＫｉ−６７（ＭＩＢ−５）に対する抗体と、室温で６０分間インキュベートし、ＰＢＳ中で洗浄し、マイクロポリマーで標識した親和性マウスＩｇＧ２二次抗体とインキュベートした。スライドをＰＢＳ中で洗浄してから、濃紺／灰色の反応生成物を生成するＶｅｃｔｏｒ  ＳＧ基質によって現像した。ＰＢＳ中でスライドを濯ぎ、ＤＡＰＩ（ケー・ピー・エル社（KPL）、メリーランド州ゲーザースバーグ）を用いて対比染色した。それぞれの染色プロトコールに陽性及び陰性コントロールを含めた。
【０１９４】
平行なホルマリンで固定した切片を、心臓ミオシンに対する抗体と室温で４５分間インキュベートし、ＰＢＳ中で洗浄し、ビオチン化マウスＩｇＧ二次抗体とインキュベートした。二次インキュベーションの終了後、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ−ＡＰ試薬（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＡＢＣ−ＡＰキット、ベクター・ラボラトリーズ社（Vector Laboratories, Inc）、カリフォルニア州バーリンゲーム）を３０分間用いた。スライドをＰＢＳ中で洗浄してから、濃いピンク〜赤色の反応生成物を生成するＬｉｑｕｉｄ  Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ  Ｒｅｄクロモゲン（ダコ社（Dako）、カリフォルニア州カーピンテリア）を用いて現像した。ＰＢＳ中でスライドを濯ぎ、ＤＡＰＩ（ケー・ピー・エル社（KPL）、メリーランド州ゲーザースバーグ）を用いて対比染色した。それぞれの染色プロトコールに陽性及び陰性コントロールを含めた。
【０１９５】
増殖中の筋細胞を、Ｋｉ−６７及びミオシン重鎖（ＭＨＣ）の二重染色により測定した。ＭＨＣ染色により認識された全筋細胞をカウントした。１つの高倍率視野内の全筋細胞の数は、溶媒処理群と細胞処理群とですべての用量で同様であった。全筋細胞中の増殖中の筋細胞の比は、溶媒で処理した動物（２．３±０．０１％）、又は１×１０6個（１．２±０．０１％）の細胞を投与した動物と比較して、１×１０4個（３．８±０．０２％）又は１×１０5個（３．７±０．０２％）のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞を投与した動物において、より高かった。これについては、表２５及び図３４を参照されたい。
【０１９６】
１×１０6個の細胞を投与した動物において全筋細胞中の増殖中の筋細胞の比が低かったことに対する可能性のある理由の１つとして、筋細胞がｈＣＴＣ（Ａ３）処理に応じてＧ０期に入ることがあるかもしれない。Ｋｉ−６７は、細胞周期のすべての期間において存在する細胞増殖マーカーである。しかしながら、周期にある細胞がＧ０期に入るとＫｉ−６７は存在しなくなる。これについては、例えばＴｈｏｍａｓ  Ｓｃｈｏｌｚｅｎ  ２０００；Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ；１８２（３），３１１〜３２２を参照されたい。
【０１９７】
Ｈ＆Ｅ染色：スライドをキシレンを２回交換してスライド１枚につき１０分間、脱パラフィン化した後、無水アルコールを２回交換してそれぞれにつき５分間、更に９５％アルコールで２分間、７０％アルコールで２分間、再水和した。スライドを蒸留水中で軽く洗ってからヘマトキシリン溶液中で８分間染色し、流水中で５分間洗浄し、１％酸アルコール中で３０秒間分別し、流水中で１分間洗浄し、０．２％アンモニア水中で３０秒〜１分間染色した。次にスライドを流水中で５分間洗い、９５％アルコールで濯いで（１０回浸漬）から、エオシン−フロキシンＢ溶液中で３０秒〜１分間対比染色し、９５％アルコール及び無水アルコールを２回交換してそれぞれにつき５分間脱水し、キシレンを２回交換してそれぞれにつき５分間洗浄し、キシレンベースの封入剤に封入した。
【０１９８】
Ｈ＆Ｅ染色したスライドについて、各動物で１レベルをサンプリングした。各レベルにおいて、梗塞から離れた左心室壁内の毛細血管の大部分が断面で示された、横断方向に切断された筋原繊維を含む５つの４００倍の視野（１視野当たり６７，５００μｍ2）を選択した。筋細胞密度を、各レベルについて５つの視野の平均として報告し、ｍｍ2で表した。平均、標準偏差、及び平均の標準誤差を各処理群に対して計算した。
【０１９９】
個々の筋細胞を、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色された組織において４００倍の倍率で概ね見ることができた。図３５は、１×１０5個のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞を投与した心臓の試料から得られた代表的な画像を、溶媒で処理した動物から得られた試料とともに示したものである。表２６において、溶媒群の平均（１８１３±８４／ｍｍ2）は、処理群のいずれの平均（１×１０4個のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞：２２１０±２２７、１×１０5個のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞：２２２０±１８６、１×１０6個のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞：２１１３±１８６）よりも低かった。高い筋細胞密度は、増殖中の筋細胞が多いこと（筋形成）、及び／又は実施例１３で述べたように筋細胞肥大が低減されていることに起因するものと考えられる。
【０２００】
（実施例１６）
ヒト心臓組織由来細胞による処理は、ラット心筋に差次的遺伝子発現を誘導した
ヒト心臓組織由来細胞投与によって誘導される分子的変化について理解するため、遺伝子プロファイル実験を行って、溶媒処理群及びヒト心臓組織由来細胞処理群における遺伝子発現レベルを比較した。ラット心臓を、実施例１１で述べた実験で使用した１×１０4個、１×１０5個、１×１０6個のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞又は溶媒を投与した動物から細胞投与の４週後に採取した。試料から全ＤＮＡを採取した。
【０２０１】
アフィメトリックス社（Affymetrix）より販売されるＨＧ−Ｕ１３３＿Ｐｌｕｓ＿２遺伝子チップを使用して、試料中の遺伝子の発現の分析を行った。Ｓｐｏｔｆｉｒｅ  ＤｅｃｉｓｉｏｎＳｉｔｅを使用し、「平均による正規化」の機能によって、マイクロアレイのデータセットをマイクロアレイチップ全体にわたって正規化した。個々のチップを、比較用に複数の群に編成した（１×１０4個、１×１０5個、及び１×１０6個のｈＣＴＣ（Ａ３）の標的用量、並びに溶媒）。Ｓｐｏｔｆｉｒｅ  ＤｅｃｉｓｉｏｎＳｉｔｅを使用し、各群間のｐ値及び倍率変化（fold change）を確立した。データのＰｒｅｓｅｎｔ  Ｃａｌｌのカラム中少なくとも３つのカラムにおいてＰを有さなかった遺伝子、少なくとも２つのカラムにおいて０．０５以下の群比較ｐ値を有さなかった遺伝子、及び少なくとも２つのカラムにおいて２．０以上、又は０．５以下の倍率変化を有さなかったすべての遺伝子をフィルタリングにより除いた。フィルタリングしたセットは４５個の対象遺伝子を含んでいた。次にこれら４５個の遺伝子をＳｐｏｔｆｉｒｅ  ＤｅｃｉｓｉｏｎＳｉｔｅからのＰｒｉｎｃｉｐｌｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＰＣＡ）プログラムに入力することにより、この遺伝子のサブセットを用いた群分けを視覚的に示した。これについては、差次的に発現される遺伝子を特定、列記した表２７を参照されたい。
【０２０２】
特定された遺伝子のうち、形質転換増殖因子β受容体（ＴＧＦβＲ）が、ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞を投与した動物においてすべての用量で下方制御されていた。これについては、図３５を参照されたい。ＴＧＦβＲ経路は、心筋における梗塞後の亢進した肥大（例えば、Ｗａｔｋｉｎｓ，Ｊｏｎｋｅｒら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．２００６  Ｆｅｂ１；６９（２）：４３２〜９を参照）及びリモデリング（Ｅｌｌｍｅｒｓ，Ｓｃｏｔｔら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．２００８  Ｎｏｖ；１４９（１１）：５８２８〜３４．）の関係がこれまでに示唆されている。ＴＧＦβ及びＴＧＦβＲの遮断により、肥大後のリモデリング及び線維症が低減されることが報告されている（例えば、Ｅｌｌｍｅｒｓ，Ｓｃｏｔｔら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．２００８  Ｎｏｖ；１４９（１１）：５８２８〜３４を参照）。更に、梗塞後のＴＧＦβ及びＴＧＦβＲ経路の活性化により、心筋及び心室の肥大及びリモデリングが増大することが報告されている（例えば、Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ−Ｉｄａ、Ｔａｋｉｍｏｔｏら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００６  Ｆｅｂ；２９０（２）：Ｈ７０９−１５を参照）。
【０２０３】
差次的遺伝子発現分析によって特定された別の遺伝子は、神経型一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ１）であった。梗塞後、心臓におけるＮＯＳ１の発現が増加した。ＮＯＳ１の過剰発現によって、心筋の収縮性が低下することが報告されている（例えば、Ｂｕｒｋａｒｄ，Ｒｏｋｉｔａら、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．２００７  Ｆｅｂ  １６；１００（３）：ｅ３２〜４４を参照）。機能不全に陥ったヒトの心臓では、ＮＯＳ１の発現がｍＲＮＡ及びタンパク質レベルで大幅に上昇していることが報告されており、心機能障害の病因におけるＮＯＳ１の役割を示唆している（例えば、Ｄａｍｙ，Ｒａｔａｊｃｚａｋら、Ｌａｎｃｅｔ．２００４  Ａｐｒ  ２４；３６３（９４１８）：１３６５〜７）を参照）。ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞で処理した心筋では、すべての用量においてＮＯＳ１の発現が溶媒で処理した心筋と比較して１０倍よりも大きく低下した。
【０２０４】
（実施例１７）
ヒト心臓組織由来細胞による処理は、急性心筋梗塞のラットモデルにおいて梗塞のサイズを低減させ、肥大を防止した
損傷した心筋の治療におけるヒト心臓組織由来細胞の有効性を、急性心筋梗塞の齧歯類モデルにおいて骨髄由来間葉系幹細胞と比較した。この実験では８〜１０週齢の９６匹の雌性ヌードラット（チャールズ・リバー・ラボラトリー社（Charles River Laboratories））を使用した。実施例１１で述べたようにして外科的処置を行った。１×１０5個のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞（ロット１）を、１００μＬの体積のＣｒｙｏＳｔｏｒ  Ｄ−ｌｉｔｅ中で投与した。これと並行して、１×１０6個のヒト間葉系幹細胞（カタログ番号ＰＴ−２５０１、ロンザ社（Lonza））を１００μＬの体積のＣｒｙｏＳｔｏｒ  Ｄ−ｌｉｔｅ中で投与した。実施例１１で述べたのと同様の手順に、外科医の好みに基づいて以下の改変を行って用いた。すなわち、梗塞領域の変色が明らかに認められた場合に、ＬＡＤ結紮のおよそ１０分後に２９ゲージの注射針を取り付けた０．３ｍＬのインスリン注射器を使用して、梗塞の境界領域の２箇所の部位に各５０μＬずつの細胞を注入した。細胞投与の２８日後に動物を屠殺し、後の分析用に心臓を摘出した。
【０２０５】
動脈を切り取り、心室を生理食塩水で洗い流した。心臓を１０％の中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）中に２４時間浸漬した後、４枚の２ｍｍのスライスに切断した。各スライスを顕微鏡検査用に処理し、パラフィンに包埋して５μｍの切片とし、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）、及び／又はマッソントリクロームにより染色した。各動物について、乳頭筋と基底レベルとの間の中心線から取ったものと、乳頭筋から取ったものの２枚の切片を並べて示した。
【０２０６】
すべての群及び時点において得た組織切片を盲検化し、最も重度から最も軽度まで疾患の重症度（代償不全／拡張及び肥大）に基づいて順位付けした。各順位に、最も大きな数字が最も高い疾患の重症度と対応するように数字を割り当てた。次いで盲検を解き、各群からのすべての順位の値を集計した。
【０２０７】
すべての画像は、梗塞を含む左心室自由壁の全体にわたって得た。低倍率（２倍）の画像を、各動物から得られたトリクローム染色した２枚の切片から得て、梗塞サイズについて分析した。Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  ｖ  ５．１ソフトウェア（メディア・サイバネティクス社（Media Cybernetics,Inc.）、メリーランド州ベセスダ）を使用し、得られた画像について梗塞サイズの自動形態計測分析を行った。左心室自由壁の外周をトレースして、対象領域（ＡＯＩ）とした。梗塞を表す青い染色によって占められた比率（％）、及び機能性の心筋を表す赤い染色によって占められた比率（％）が、各画像から得られる２つの測定値であった。
【０２０８】
Ｈ＆Ｅ及び／又はマッソントリクロームで染色した心臓の組織切片を梗塞の２８日後に調べた。１×１０5個のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞で処理した動物、及び１×１０6個のヒト間葉系幹細胞で処理した動物は、溶媒で処理した動物と比較して梗塞領域が低減されていた。左及び右心室の両方において拡張の低減も観察された。これについては、図３６のパネルａ及びｂを参照されたい。更に、１×１０5個のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞を投与した動物、及び１×１０6個のヒト間葉系幹細胞で処理した動物では、左心室自由壁の機能性心筋が保存されていた。これについては、図３６のパネルｃを参照されたい。
【０２０９】
興味深い点として、ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞及びヒト間葉系幹細胞（ｈＭＣＳ）は心室中隔（ＩＶＳ）に対して差次的な作用を示し、ｈＭＣＳがＩＶＳの肥大拡張作用を示したのに対して、ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞を投与した動物ではこうした変化は観察されなかった。これについては、図３７を参照されたい。心筋細胞の肥大性変化の痕跡は両群の中隔に存在したが、ｈＭＳＣを投与した動物においてより顕著であった。肥大性筋細胞及びＩＶＳは最終的な心臓のリモデリングに寄与することから、本発明のヒト心臓組織由来細胞がヒト間葉系幹細胞と比較して心機能により有益な作用を及ぼしうることを示唆するものである。
【０２１０】
（実施例１８）
急性心筋梗塞の動物モデルにおける本発明のヒト心臓組織由来細胞の複数のロット及び長期的有効性
ヒト心臓組織由来細胞の複数のロットを３人のドナーから調製した。ドナーに関する情報を表２８に示す。簡単に述べると、ロット１は、移植グレードの心臓由来のものであり、ロット２は、健康な心臓由来のものであるが、ドナーが移植の年齢基準を満たさなかったものであり、ロット３は、心臓の機能不全状態である拡張型心筋症と診断されたドナーに由来するものである。
【０２１１】
雌性ヌードラット（体重２５０〜３００ｇ）をケタミン及びキシラジン（それぞれ６０及び１０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与）で麻酔した。第４左肋間領域で胸腔を開き、心臓を体外に露出させ、心膜を切開した。この後、心臓をピンセットで押さえ、左前下行枝の起始部から約２ｍｍの位置で６−０プロリン縫合糸を左前下行枝の下に回した。結紮糸を引っ張って動脈を閉塞することによって心臓にＡＭＩを誘発した。梗塞した心筋の変色が目視にて観察された。
【０２１２】
ＭＩ誘発の２０分後に、ラットにロット１、２又は３のいずれかのｈＣＴＣ（Ａ３）細胞から１×１０6個のｈＣＴＣ（Ａ３）細胞を心筋内移植した。これと並行して、動物に１×１０6個のｐＣＴＣ（Ａ３）細胞、又はヒト新生児皮膚線維芽細胞（カタログ番号ＣＣ−２５０９、ロンザ社（Lonza））、又は溶媒を投与した。細胞集団はいずれも投与に先立って凍結保存し、ＣｒｙｏＳｔｏｒ  Ｄｌｉｔｅ中で最終容量１２０μＬとして心臓に注入した。細胞は２箇所の部位に投与し、５０μＬの細胞懸濁液又はＣｒｙｏＳｔｏｒ  Ｄｌｉｔｅを各部位に注入した。注入の完了後、胸腔を閉じた。各群で１０匹の動物を使用した。この実験で観察された死亡率は３２％であった。表２９に示されるように、各群間で死亡率に有意な差は認められなかった。心機能の絶対値を表３０に示す。
【０２１３】
経胸壁心エコー法（ＳＯＮＯＳ  ５５００、フィリップス・メディカル・システムズ社（Philips Medical Systems））を行って、細胞投与の１、４、及び１２週後のＬＶの機能を評価した。以下のパラメータを測定した。すなわち、左室（ＬＶ）拡張末期径（ＬＶＥＤＤ）、左室収縮末期径（ＬＶＥＳＤ）、左室内径短縮率（ＦＳ）、局所壁運動スコア（ＲＷＭＳ）である。
【０２１４】
ロット１からのｈＣＴＣ（Ａ３）細胞の投与により、細胞投与の２８日及び８４日後に試験したすべてのパラメータにおいて心機能が改善した。これについては、図３８及び３９を参照されたい。ロット２からのｈＣＴＣ（Ａ３）細胞の投与は、局所壁運動スコア（ＲＷＭＳ）及びＦＳによって測定されたように、梗塞の８４日後に心筋収縮性及び全体的心機能を改善することができた。
【０２１５】
細胞投与の７日後のＦＳは、溶媒処理群と細胞処理群とで同様の値であった。しかしながら、細胞投与の８４日後では、ＦＳによって測定される心機能は、ロット２からのｈＣＴＣ（Ａ３）細胞及びロット１からのｈＣＴＣ（Ａ３）細胞による処理群で、それぞれ９．５±６．０％（ｎ＝８，ｐ＜０．０１）、及び８．９±４．１％（ｎ＝８，ｐ＜０．００１）だけ改善した。これについては、図３９及び表３０を参照されたい。溶媒処理群（−１．０±３．３％）、ロット３からのｈＣＴＣ（−０．４±３．０％）、及びヒト線維芽細胞（４．１±２．１％）では、ＦＳにわずかな変化が認められたかあるいは変化が認められなかった。これについては、図３９及び表３０を参照されたい。全体的機能と一致して、ＲＷＭＳも、溶媒で処理した動物と比較してロット１からのｈＣＴＣ（Ａ３）を投与した動物で７日目の２４．８３±１．６４から２２．１３±１．５（Ｎ＝８，ｐ＜０．０５）に、あるいはロット２の細胞を投与した動物で２５．４４±１．０から２３．１３±２．２（Ｎ＝８，ｐ＜０．０５）に低下した。これについては、表３０を参照されたい。
【０２１６】
今回の実験では、ＬＶＥＳＤによって示されるように、ロット１又はロット２からのｈＣＴＣ（Ａ３）細胞により、梗塞の２８日及び８４日後にリモデリングが防止された。細胞投与の２８日後に、ロット１からのｈＣＴＣ（Ａ３）細胞を投与した動物においてＬＶＥＳＤが低下した（−８．９±４．１％）。ロット２からのｈＣＴＣ（Ａ３）細胞を投与した動物では、ＬＶＥＳＤはベースラインに維持された（−０．５±４．３％）。これに対して、溶媒で処理した動物では、細胞投与の２８日後にＬＶＥＳＤは１６．４±５．２％だけ増大した。ロット３からのｈＣＴＣ（Ａ３）細胞又はヒト線維芽細胞を投与した動物では、ＬＶＥＳＤはそれぞれ９．１±２．３％及び５．４±３．６％だけ増大した。これについては、図３８及び表３０を参照されたい。
【０２１７】
細胞投与の８４日後では、溶媒群においてＬＶＥＳＤは１６．３±２．８％だけ増大した。同様に、ロット３からのｈＣＴＣ（Ａ３）細胞を投与した動物又はヒト線維芽細胞で処理された動物においても、８４日目に左心室の拡張が認められた。ＬＶＥＳＤは、それぞれ１２．５±３．７％及び７．６±３．７％だけ増大した。これに対して、ロット１からのｈＣＴＣ（Ａ３）細胞を投与した動物（−３．９±５．２％）においても、ロット２からのｈＣＴＣ（Ａ３）細胞を投与した動物（−１．８±４．２％）においても心臓リモデリングは生じなかった。これについては、図３９及び表３０を参照されたい。
【０２１８】
拡張末期のＬＶＥＤＤによって測定される左心室の拡張性の増大は、ロット１からのｈＣＴＣ（Ａ３）細胞を投与した動物（７日目：０．８０±０．１０ｃｍ、８４日目：０．８４±０．０７ｃｍ、５％の増加）、及びロット２からのｈＣＴＣ（Ａ３）細胞を投与した動物（７日目：０．７４±０．０７ｃｍ、８４日目：０．８２±０．０６ｃｍ、６．７％の増加）において防止された。これに対して、ＬＶＥＤＤは、溶媒で処理した動物（７日目：０．７５±０．０３ｃｍ、８４日目：０．８６±０．０６ｃｍ、１４．６％の増加）及びヒト線維芽細胞を投与した動物（７日目：０．７３±０．０３４ｃｍ、８４日目：０．８３±０．０６ｃｍ、１３．７％の増加）において増大した。ロット３からのｈＣＴＣ（Ａ３）細胞を投与した動物においてもＬＶＥＤＤの増大が認められた（７日目：０．７３±０．０４ｃｍ、８４日目：０．８２±０．０６ｃｍ、１２．３％の増加）。これについては、図３９及び表３０を参照されたい。
【０２１９】
（実施例１９）
心臓組織由来細胞のサイズ
方法及び材料：本発明の方法に従ってヒト、マウス、ブタ、及びラット心臓から得られた心臓組織由来細胞の細胞サイズを、細胞のカウントを行う際に分析した。全生細胞のカウントを、細胞集団の消化後でかつ再播種の前に、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ（商標）ＸＲ（ベックマン・コールター社（Beckman Coulter）、カリフォルニア州フラートン）を使用して行った。Ｖｉ−Ｃｅｌｌ（商標）細胞生存率分析装置は、フローセル内の細胞の最大で１００個の画像についてビデオキャプチャー技術及び画像解析を用いて、細胞生存率の評価のためのトリパンブルー色素排除試験法を自動化するものである。
【０２２０】
製造者の指示（参照マニュアルＰＮ  ３８３６７４  Ｒｅｖ．Ａ）に従って試料を調製及び分析した。簡単に述べると、赤血球溶解後に得られる最終細胞懸濁液の５００μＬの一定分量をＶｉ−Ｃｅｌｌ（商標）の４ｍＬ試料バイアルに移し、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ（商標）ＸＲ細胞生存率分析装置により分析した。細胞のサイズは、カウントされた細胞の平均の直径によって求めた。
【０２２１】
ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞の直径の平均は１６．７±２．１３μｍであった。ｒＣＴＣ（Ａ２）細胞の直径は１８．４±１．０２μｍであり、ｐＣＴＣ（Ａ３）細胞の直径は１７．２±０．４２μｍであった。これらのデータに基づけば、２０μｍ以上のフィルターサイズであれば、本発明の心臓組織由来細胞を回収するためにフィルターを通過させ、他の細胞のタイプを除外することが可能であると考えられる。
【０２２２】
（実施例２０）
本発明の心臓組織由来細胞の凍結保存
病院において更なる処理を行わずに直接投与することが可能な製品を作出することが有利である。このような製品を作出するため、臨床使用が承認されている凍結保存溶液を使用してヒト心臓組織由来細胞の凍結保存の試験を行った。更に、心筋における凍結保存溶液の毒性についても試験を行った。
【０２２３】
凍結保存用に、ｈＣＴＣ（Ａ３）細胞をトリプシン処理によってフラスコから回収した。細胞バンクを、２％体積／体積ＤＭＳＯを含んだＣｒｙｏＳｔｏｒ  Ｄｌｉｔｅ（商標）（バイオライフ・ソリューションズ社（Biolife Solutions,Inc.）ワシントン州ボッセル）中で凍結保存した。ＣｒｙｏＳｔｏｒ  Ｄｌｉｔｅは、Ｊ．Ｇ．Ｂａｕｓｔ及びＪ．Ｍ．Ｂａｕｓｔによって編集されたＡｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎに述べられる原理に従って、超低温環境（−８０℃〜−１９６℃）下で細胞を調製及び保存するために設計された動物由来成分を含まない凍結保存液である。低温保存に必要な例えば電解質、浸透圧及び緩衝条件を与える他の溶液を使用することも可能である。
【０２２４】
細胞懸濁液を、ＤｅｌｔａＴソフトウェアを用いたＩｎｔｅｇｒａ  ７５０  Ｐｌｕｓプログラム式フリーザー（プラナー社（Planer）、英国、ミドルセックス）を使用してＮａｌｇｅｎｅ  ２ｍＬポリプロピレン製滅菌雌ねじスクリューキャップ式凍結バイアル（Cryovial）（ナルジーン・ヌンク社（Nalgne Nunc）、ニューヨーク州ロチェスター）中で凍結保存した。細胞及び溶液は、１５℃に維持したプログラム式フリーザーに装填する前には室温であった。試料用の温度プローブを凍結緩衝液のバイアルに入れた。以下のプログラムを使用して細胞を凍結保存した。
【０２２５】
【表４】
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【０２２６】
温度が−１４０℃となった時点で、試料を液体窒素タンクに移して保存した。
【０２２７】
本明細書の全体を通じて引用した刊行物は、その全容を本明細書に援用するものである。以上、本発明の様々な態様を実施例及び好ましい実施形態を参照して説明したが、本発明の範囲は、上記の説明文によってではなく、特許法の原則の下で適宜解釈される以下の「特許請求の範囲」によって定義されるものである点は認識されるであろう。
【０２２８】
【表５】
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【０２２９】
【表６】
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*：心臓の半分を処理した。
【０２３０】
【表７】
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【０２３１】
【表８】
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【０２３２】
【表９】
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*  ｎ＝３、データは平均を表す。時間は、心筋梗塞モデルにおける細胞注入処理時の調製時間を反映する、室温でのインキュベーション時間を示す。
【０２３３】
【表１０】
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【０２３４】
【表１１】
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【０２３５】
【表１２】
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【０２３６】
【表１３】
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【０２３７】
【表１４】
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【０２３８】
【表１５】
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線維芽細胞：ＮＨＤＦ
【０２３９】
【表１６】
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*：ｒ心臓：ラット心臓
【０２４０】
【表１７】
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【０２４１】
【表１８】
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【０２４２】
【表１９】
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【０２４３】
【表２０】
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【０２４４】
【表２１】
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【０２４５】
【表２２】
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【０２４６】
【表２３】
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【０２４７】
【表２４】
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【０２４８】
【表２５】
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【０２４９】
【表２６】
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【０２５０】
【表２７】
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【０２５１】
【表２８】
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【０２５２】
【表２９】
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【０２５３】
【表３０】
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【０２５４】
【表３１−１】
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【０２５５】
【表３１−２】
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【０２５６】
【表３２】
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【０２５７】
【表３３】
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【０２５８】
【表３４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【配列表】
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