(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬学的に許容される担体、及び、
野生型パルボウイルスＨ−１と比較して高い抗腫瘍能力を示すパルボウイルスＨ−１に由来するパルボウイルス変異体であって、前記パルボウイルス変異体は、（ｉ）配列番号１３におけるＮＳ−２の９６位でのＬｙｓは親水性極性アミノ酸によって置換される、および／または配列番号１３におけるＮＳ−２の１０３位でのＬｅｕは中性非極性アミノ酸によって置換される、または（ｉｉ）配列番号１２におけるアミノ酸５８７〜６２４の欠失を有するＮＳ−１タンパク質および配列番号１３におけるアミノ酸９６〜１３３の欠失を有するＮＳ−２タンパク質の翻訳を結果として生じさせるパルボウイルスＨ−１ゲノムの配列番号１１におけるヌクレオチド２０２２〜２１３５のインフレーム欠失、によって特徴づけられる、パルボウイルス変異体、を含み、癌を治療する方法において使用するための医薬組成物。
【請求項２】
前記（ｉ）が、配列番号１３におけるＮＳ−２のアミノ酸置換Ｌｙｓ９６Ｇｌｕおよび／またはＬｅｕ１０３Ｐｒｏを有する請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記アミノ酸置換が、
（ａ）配列番号１３におけるＮＳ−２のＬｙｓ９６Ｇｌｕ、または、
（ｂ）配列番号１３におけるＮＳ−２のＬｅｕ１０３Ｐｒｏおよび配列番号１２におけるＮＳ−１のＴｙｒ５９５Ｈｉｓ、を有する請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記癌は、膵臓癌、子宮頸癌、肝臓癌、またはリンパ腫である請求項１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、野生型パルボウイルスと比較して高い抗腫瘍能力を示すパルボウイルス変異体であって、前記変異体が、（ａ）ＮＳ２のＬｙｓ９６位および／またはＮＳ２のＬｅｕ１０３位（後者はＮＳ１のＴｙｒ５９５位でのアミノ酸置換も誘導する）でのアミノ酸置換、欠失もしくは付加、好ましくは置換、または（ｂ）Ｈ−１ＰＶゲノムの左側の部分におけるインフレーム欠失、好ましくはそれらのＣ末端および中央部分各々における３８アミノ酸の欠失を有するＮＳ１およびＮＳ２タンパク質の翻訳を生じさせる欠失を特徴とするパルボウイルス変異体に関する。本発明はさらに、癌療法のための前記パルボウイルス変異体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍退縮ウイルス、例えば齧歯類パルボウイルスは、癌治療にとっての新規なツールを表す（非特許文献１［１］、非特許文献２［２］）。特に癌細胞を殺滅する（腫瘍退縮）の他に、これらの物質はさらに免疫系がウイルス感染腫瘍を排除するように刺激する危険信号を発生する（非特許文献３［３］）。腫瘍退縮事象の結果として、先天性および後天性免疫系は腫瘍抗原に接近し、クロスプライミングおよびワクチン接種作用を生じさせることができる（非特許文献４［４］、非特許文献５［５］）。齧歯類パルボウイルスは、「内因性」腫瘍退縮活性を有する一本鎖ＤＮＡウイルスである、つまり齧歯類パルボウイルスは、マウスおよびヒト両方の起源の癌細胞中で優先的に複製して該癌細胞を殺滅する（非特許文献６［６］、非特許文献７［７］）。それでもヒト臨床用途にとって最も前途有望な候補（Ｈ−１ＰＶを含む）の抗癌有効性は依然、改良の必要がある。現在までに、改良のために以下の戦略が適用された。
（ａ）治療遺伝子（例、ケモカインもしくはサイトカイン）の導入によるＰＶをベースとするベクターの作製（非特許文献８［８］、非特許文献９［９］、非特許文献１０［１０］）、
（ｂ）化学療法薬（例、ゲムシタビン）と組み合わせた天然齧歯類ＰＶの使用（非特許文献１１［１１］）、および、
（ｃ）大きな非構造タンパク質ＮＳ１の潜在的リン酸化部位で点突然変異するＰＶ変異体の作製（非特許文献１２［１２］）。
【０００３】
しかし、得られた結果は、特に現在使用されている天然ＰＶと比較してより高い抗腫瘍能力および製造工程中の時間の短縮に関して一層の改良を必要とする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Rommelaere J, Geletneky K, Angelova AL, Daeffler L, Dinsart C, Kiprianova I, Schlehofer JR, Raykov Z.、「Oncolytic parvoviruses as cancer therapeutics.」、Cytokine Growth Factor Rev., 2010, 21: 185-195.
【非特許文献２】Cornelis JJ, Salome N, Dinsart C, Rommelaere J.、「Vectors based on autonomous parvoviruses: novel tools to treat cancer?」、J Gene Med., 2004, 6: S193-202.
【非特許文献３】Bhat R, Dempe S, Dinsart C, and Rommelaere J.、「Enhancement of NK cell anti-tumour responses using an oncolytic parvovirus.」、International Journal of Cancer, 2010, in press [EPub ahead of print]
【非特許文献４】Raykov Z, Grekova S, Galabov AS, Balboni G, Koch U, Aprahamian M, Rommelaere J.、「Combined oncolytic and vaccination activities of parvovirus H-1 in a metastatic tumor model.」、Oncol Rep., 2007, 17: 1493-1499.
【非特許文献５】Raykov Z, Grekova S, Leuchs B, Aprahamian M, Rommelaere J.、「Arming parvoviruses with CpG motifs to improve their oncosuppressive capacity.」、Int J Cancer, 2008, 122: 2880-2884.
【非特許文献６】Rommelaere J, Giese N, Cziepluch C, Cornelis JJ.、「Parvoviruses as anticancer agents.」、In: Sinkovics JG, Horvath JC, eds . Viral therapy of human cancers. New-York: Marcel Dekker, 2005, 627p.
【非特許文献７】Rommelaere J, Cornelis JJ.、「Antineoplastic activity of parvoviruses.」、J Virol Methods, 1991, 33: 233-251.
【非特許文献８】Cornelis JJ, Lang SI, Stroh-Dege AY, Balboni G, Dinsart C, Rommelaere J.、「Cancer gene therapy through autonomous parvovirus-mediated gene transfer.」、Curr Gene Ther., 2004, 4: 249-261.
【非特許文献９】Wetzel K, Struyf S, Van Damme J, Kayser T, Vecchi A, Sozzani S, Rommelaere J, Cornelis JJ, Dinsart C.、「MCP-3 (CCL7) delivered by parvovirus MVMp reduces tumorigenicity of mouse melanoma cells through activation of T lymphocytes and NK cells.」、Int J Cancer, 2007, 120: 1364-1371.
【非特許文献１０】Enderlin M, Kleinmann EV, Struyf S, Burrachi C, Vecchi A, Kinscherf R, Kiessling F, Paschek S, Sozzani S, Rommelaere J, Cornelis JJ, Van Damme J, Dinsart C.、「TNF-alpha and IFN-gamma-inducible protein 10 (IP-lO/CXCL-10) delivered by parvoviral vectors act in synergy to induce antitumor effects in mouse glioblastoma.」Cancer Gene Ther, 2009, 16: 149-160.
【非特許文献１１】Angelova A, Aprahamian M, Grekova S, Hajri A, Leuchs B, Giese N, Herrmann A, Dinsart C, Balboni G, Rommelaere J, Raykov Z.、「Improvement of gemcitabine-based therapy of pancreatic carcinoma by means of oncolytic parvovirus H-1PV.」、Clinical Cancer Research, 2009, 15: 511-519.
【非特許文献１２】Daeffler L, Hoerlein R, Rommelaere J, Nueesch JP.、「Modulation of minute virus of mice cytotoxic activities through site-directed mutagenesis within the NS coding region.」、J Virol., 2003, 77: 12466-12478.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このため、本発明の目的は、治療に使用するための改良されたパルボウイルスを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によると、この課題は、特許請求の範囲に規定した主題によって達成される。本発明は、同時感染した細胞培養中での標準ｗｔ  Ｈ−１ＰＶに取って代わるＨ−１ＰＶ変異体の本出願人による単離に基づいている［１３］。本発明は、さらに齧歯類ＰＶの小さな非構造タンパク質およびそれらとウイルス適応のための特定細胞パートナーとの相互作用が果たす極めて重要な役割［１４，１５］ならびにこれらのウイルスタンパク質内のわずかな修飾によってマウスパルボウイルスの適応度を改良することができる可能性［１６］に基づいている。
【０００７】
本発明者らは、齧歯類ＰＶの小さな非構造タンパク質の活性を改良することは、さらにウイルス産生およびそれらの抗腫瘍能力におけるこれらのウイルスのより高い有効性の原因となるという前提から出発した。これらの前提は、これらの突然変異をＨ−１ＰＶゲノム内に導入して、（ａ）生殖細胞から回収された子孫ビリオンの量、および（ｂ）ヒト腫瘍モデルに対する該生殖細胞の腫瘍毒性／腫瘍退縮活性に関して試験することによって確証された。これらの改良されたＨ−１ＰＶを用いて得られたデータは、実際に子孫ビリオンのより高いバーストおよびウイルスストック内の感染性粒子対完全粒子の上昇した比率、細胞培養内でのより速い増殖および腫瘍異種移植片に対するより優れた抗癌活性を証明した。
【０００８】
これらを要約すると、本発明の改良されたＰＶは、（ａ）前臨床アッセイにおいて現在使用されている天然ＰＶと比較して高い抗腫瘍能力を示す、ならびに（ｂ）製造工程中の時間の短縮および（ｃ）（前）臨床アッセイ中に使用する完全ビリオンの用量の削減をもたらす。したがって、本発明のウイルスは、治療遺伝子の存在および効果的療法のための化学療法薬との併用を必要としない。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】（Ａ）ｐＰＭｕｔ１Ｈ−１ＰＶ、（Ｂ）ｐＰＭｕｔ２Ｈ−１ＰＶ、（Ｃ）ｐＰＭｕｔ３Ｈ−１ＰＶ、（Ｄ）ｐＰＭｕｔ４Ｈ−１ＰＶおよび（Ｅ）ｐＤｅｌＨ−１ＰＶ感染性分子クローンの略図  ウイルスゲノムは、グレーの囲み枠で表示した。ウイルスプロモーターＰ４およびＰ３８は、黒色矢印として示した。グレーの囲み枠の上方に記載した「ＮＳ１／ＮＳ２」および「ＶＰ１／２」は、非構造的ＮＳ１／ＮＳ２およびカプシドＶＰ１／ＶＰ２タンパク質各々をコードするゲノム領域を示している。ｐＵＣ１９発現ベクターは、黒色のレーンによって示した。点突然変異の部位（Ａ〜Ｄ）はグレーのバーとして指示し、欠失（Ｅ）はグレーの三角形として指示した。ヌクレオチド（ｎｔ）の修飾（Ａ〜Ｄ）または欠失（Ｅ）は、ゲノムの下方にイタリック体で指示した。ゲノムの下方のグレーの矢印は、結果として生じるウイルスタンパク質を適切な場合はグレーで指示した結果として生じるアミノ酸（ａａ）の修飾（Ａ〜Ｄ）または欠失（Ｅ）とともに示している。Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔは、各々、アミノ酸のロイシン、プロリン、チロシン、ヒスチジン、リシン、グルタミン酸およびメチオニンを示す。
【図２】ｗｔ  Ｈ−１ＰＶと比較して増加したＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶの感染性、ならびにＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶと比較してＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶおよびＰＭｕｔ２  Ｈ−１ＰＶ変異体の類似もしくはより一層良好な感染性  ウイルスはＮＢ−３２４Ｋ細胞の感染によって作製し、プラークアッセイ（ＰＦＵ＝プラーク形成単位の数を得る）、ハイブリダイゼーションアッセイ（ＲＵ＝複製単位の数を得る）およびドットブロット（完全ウイルス粒子の数を得る）によって分析した。  グレーの数は、ｗｔ（野生型）  Ｈ−１ＰＶを用いて得られた数値より小さいＰ／Ｉ値を示している。  矢印上のグレーおよびパターン模様の囲み枠は、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶのＰ／Ｉ比と対応するＨ−１ＰＶ欠失もしくは点突然変異体のＰ／Ｉ比との間の減少（／）または増大（×）因数を示している。
【図３】感染ＮＢ−３２４Ｋ細胞内のｗｔ  Ｈ−１ＰＶと比較したＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶの増大した増殖（Ａ）新規に作製されたｗｔ  Ｈ−１ＰＶ、Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶ、ＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶ、ＰＭｕｔ２  Ｈ−１ＰＶおよびＰＭｕｔ３  Ｈ−１ＰＶウイルスストックは、ＮＢ−３２４Ｋ細胞を用いたプラークアッセイによって分析した。各ウイルスストックを用いて得られたプラークの１例は、該プラークのサイズを例示するために示した。（Ｂ）ｗｔ  Ｈ−１ＰＶ（グレーの囲み枠）またはＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶ（黒色の囲み枠）ウイルスストックを用いた所定サイズを示しているプラークの比率は、各場合について試験したプラークの総量（ｎ＞１００プラーク）のパーセンテージとして示した。ｗｔ  Ｈ−１ＰＶまたはＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶウイルスストックを用いて得られたプラークの平均サイズはグレーもしくは黒色の囲み枠内に示し、各々グレーまたは黒色の点線によって示した。
【図４】感染ＮＢ−３２４Ｋ細胞内のウイルスタンパク質の蓄積  １．５×１０５のＮＢ−３２４Ｋ細胞は、３ＰＦＵ／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）でｗｔ  Ｈ−１ＰＶ、Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶ、ＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶまたはＰＭｕｔ２  Ｈ−１ＰＶを用いて感染させた。全細胞溶解は感染後の指定時点（時間）に実施し、１０μｇの全タンパク質抽出物を１２％  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に移し、続いてイムノブロッティングによって分析した。非構造タンパク質ＮＳ１およびＮＳ２ならびにウイルスカプシドタンパク質ＶＰは、各々ウサギポリクローナル抗体ＳＰ８、抗ＮＳ２Ｐおよび抗ＶＰｐｅｐを用いて検出した。白色および黒色の矢印は、ＰＭｕｔ変異体ＮＳ１およびＶＰタンパク質各々の、感染８時間または２４時間後でのｗｔ  Ｈ−１ＰＶ感染細胞抽出物中で観察された蓄積に比較して増加した、および／または早期の蓄積を示している。野生型ＮＳ２タンパク質と比較したＤｅｌまたはＰＭｕｔ変異体ＮＳ２タンパク質の蓄積における変動は、黒色の囲み枠によって強調されている。タンパク質マーカーのサイズは、右側に示した。擬似（ｍｏｃｋ）は非感染培地処理細胞を、ｋＤはキロダルトンを示す。
【図５】ヒトＮＢ−３２４Ｋ細胞内の感染後の早期の時点でのＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶおよびＰＭｕｔ２  Ｈ−１ＰＶ変異体の増加した増殖阻害およびウイルス産生（Ａ）ＮＢ−３２４Ｋ細胞は、３ＰＦＵ／細胞のＭＯＩでｗｔ  Ｈ−１ＰＶ、Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶ、ＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶまたはＰＭｕｔ２  Ｈ−１ＰＶを用いて感染させた。生細胞の量は、ＣＡＳＹ細胞計数システムを使用して感染後（ｐ．ｉ）の指定時点（日）に決定した。感染させたサンプル中の生細胞の比率は、擬似（Ｍｏｃｋ）処理サンプル中の生細胞の数のパーセンテージとして表示した。ライトグレーのバーは擬似（ｍｏｃｋ）（非感染の培地処理）、黒色のバーは野生型、白色のバーはＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶ、ダークグレーのバーはＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶ、グレーの破線のバーはＰＭｕｔ２  Ｈ−１ＰＶを示す。（Ｂ）１．５×１０５のＮＢ−３２４Ｋ細胞は、０．５ＰＦＵ／細胞のＭＯＩでｗｔ  Ｈ−１ＰＶ、Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶ、ＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶまたはＰＭｕｔ２  Ｈ−１ＰＶを用いて感染させた。ウイルスは、感染後の指示時点（日）に回収し、プラーク形成単位（ＰＦＵ）の総量は、プラークアッセイによって決定した。ｗｔ  Ｈ−１ＰＶ、Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶ、ＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶおよびＰＭｕｔ２  Ｈ−１ＰＶを用いて得られたデータは、グラフにおいて指示したように、黒色またはグレーのレーンによって表示した。
【図６】感染ＮＢ−３２４Ｋ細胞の核および細胞質内のＰＦＵ分布  ５×１０５のＮＢ−３２４Ｋ細胞は、１ＰＦＵ／細胞のＭＯＩでｗｔ  Ｈ−１ＰＶ（上方および下方パネル）、Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶ（上方および下方パネル）、ＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶ（下方パネル）、ＰＭｕｔ２  Ｈ−１ＰＶ（下方パネル）またはＰＭｕｔ４  Ｈ−１ＰＶ（下方パネル）を用いて感染させた。ウサギ中和ポリクローナル抗体ＰＶ１は、二次感染を阻止するために感染２時間後に感染細胞の培地中に加えた。感染細胞の核および細胞質分画の単離は、感染後の指定時点（時間）に実施した。各核（Ａ、Ｃ）および細胞質（Ｂ、Ｄ）分画内のプラーク形成単位（ＰＦＵ）の総量は、プラークアッセイによって決定した。
【図７】Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶの生活環の一部の過程はｗｔ  Ｈ−１ＰＶの生活環の一部の過程より高速である  ＮＢ−３２４Ｋ細胞は、３ＰＦＵ／細胞のＭＯＩでハイブリッドｈＨ−１ＰＶまたはハイブリッドＤｅｌ  ｈＨ−１ＰＶを用いて感染させた。細胞は感染後の指定時点（時間）に固定し、遊離もしくは集合したカプシドタンパク質は一次抗体として３ｃ３Ｆ１２を用いた免疫蛍光染色法によって検出した。白色（Ｄｅｌ  ｈＨ−１ＰＶについては白丸）で表示した数は、優勢な核染色を示す陽性細胞のパーセンテージを表している。白色矢印は、感染細胞から出てくるビリオンを示している。３ｃ３Ｆ１２はウイルスカプシドＶＰタンパク質および全カプシドの両方を認識するマウスモノクローナル抗体、ＤＡＰＩは４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、ＤＮＡに結合する蛍光染色を示す。
【図８】Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶはｗｔ  Ｈ−１ＰＶより低い細胞毒性を示す  ＮＢ−３２４Ｋ細胞は、様々なＭＯＩで野生型（ｗｔ）Ｈ−１ＰＶまたはＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶを用いて感染させた（Ｂを参照）。感染細胞は感染４時間後に回収し、低密度で新鮮細胞培養皿上に播種した。（Ａ）細胞コロニーの増殖は再播種後数日間追跡し、細胞を固定し、クリスタルバイオレットを用いて染色すると光学顕微鏡によってコロニーが容易に検出された。（Ｂ）野生型（ｗｔ）Ｈ−１ＰＶまたはＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶを用いた感染後の生存細胞のパーセンテージは、各々グレーまたは黒色のレーンで表示した。
【図９】様々な膵臓癌細胞系およびＨｅＬａ細胞内でのＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶの増加したウイルス産生  １×１０５個のＮＢ−３２４Ｋ、ＭｉａＰａＣａ−２、Ｐａｎｃ−１またはＨｅＬａ＋細胞は、０．５ＰＦＵ／細胞のＭＯＩでＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶまたは野生型（ｗｔ）Ｈ−１ＰＶを用いて感染させた。ウイルスは、感染後の指定時点（日）に回収し、プラーク形成単位（ＰＦＵ）の総量は、プラークアッセイによって決定した。Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶおよびｗｔ  Ｈ−１ＰＶによって産生した感染性粒子の量は、各々レーンおよび黒色ドットまたは黒色四角形を用いて表示した。
【図１０】Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶは腫瘍増殖の抑制においてより効率的である（Ａ）４×１０７のＰａｎｃ−１細胞は、３ＲＵ／細胞のＭＯＩで野生型（ｗｔ）Ｈ−１ＰＶまたはＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶを用いて感染させた（ＲＵ＝複製単位）。細胞は感染４時間後に採取し、５×１０６個の細胞を続いてＢａｌｂ／ｃヌードマウスに注射した。（Ｂ）腫瘍サイズは、細胞移植後の８３日間測定し、ｍｍ３で提示した。擬似（ｍｏｃｋ）処理（すなわち、非感染）、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶ感染またはＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶ感染Ｐａｎｃ−１細胞を受容した動物における腫瘍サイズは、各々ダークグレーのレーンおよび小さな四角形、黒色レーンおよび大きな四角形、またはライトグレーのレーンおよび三角形によって示した。（Ｃ）測定値は、２９０ｍｍ３超の腫瘍サイズのパーセンテージとして提示した。擬似（ｍｏｃｋ）処理（すなわち、非感染）、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶ感染またはＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶ感染Ｐａｎｃ−１細胞を受容した動物における腫瘍サイズは、各々ダークグレーのレーンおよび小さな四角形、黒色レーンおよび大きな四角形、またはライトグレーのレーンおよび三角形によって示した。
【図１１】Ｈ−１ＰＶ完全ゲノム配列（ヌクレオチドで）ならびにＨ−１ＰＶ  ＮＳおよびＶＰタンパク質配列（アミノ酸で）  Ｈ−１ＰＶゲノム配列は、Gene Databankアクセッション番号X01457.1:−gi｜60993｜emb｜X01457.1｜パルボウイルス（Parvovirus）  ｈ−１、完全ゲノム（complete genome）−Rhode S.L.III., Paradiso P.R. “Parvovirus genome : nucleotide sequence of h−1 and mapping of its genes by hybrid-arrested translation”J. Virol．  45:173-184(1983)から検索され、そして、ＮＳコーディング領域内で見いだされた配列の誤りの修正を含み、そして、−Faisst S, Faisst SR, DupressoirT, Plaza S, Pujol A, JauniauxJC, Rhode SL, Rommelaere J. “Isolation of a fully infectious variant of parvovirus H-1 supplanting the standard strain in human cells”J. Virol., 1995, 69:4538-4543.    nt a305c NS1 aa T14:silent & NS2 aaT14:silentntc634a NS1 aa P124Q  nt g1101a NS1 aa E280Kで更に公表された。これらの修正は、Ｈ−１ＰＶヌクレオチドおよびアミノ酸配列内で下線が引かれている。これらの修正はいずれも、本文献に記載されたＮＳ１およびＮＳ２タンパク質配列内のアミノ酸およびアミノ酸の位置に影響を及ぼさない。
【図１２】Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶの腫瘍内注射はｗｔ  Ｈ−１ＰＶに比較してＨｅＬａ細胞由来腫瘍の増殖抑制においてより効果的である  ２×１０６個のＨｅＬａ細胞をＢａｌｂ／ｃヌードマウスの右側腹部へ皮下注射した。移植９日後、１０８ＰＦＵのＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶまたはｗｔ  Ｈ−１ＰＶを腫瘍内へ注射した。腫瘍サイズは、注射４２日後までモニタリングした。（Ａ）各群における１，０００ｍｍ３超の腫瘍を持つマウスのパーセンテージ。（Ｂ）屠殺することを阻止した３，０００ｍｍ３未満腫瘍を持つマウスのパーセンテージ。
【図１３】野生型ＮＳ２Ｐタンパク質と比較したＤｅｌ  ＮＳ２Ｐの増加した新規合成および不安定性  ８×１０５個のＮＢ−３２４Ｋ細胞は、最初に低温（すなわち、非放射性）完全培地中で１８時間インキュベートし、その後Ｔｒａｎ３５Ｓ標識培地（すなわち、３５Ｓ標識システインおよびメチオニンアミノ酸を含有する）の存在下において３０分パルスでインキュベートした、１０ＰＦＵ／細胞のＭＯＩで野生型（ｗｔ）またはＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶを用いて感染させた。細胞は、直ちに（追跡（チェイス）時点０分）または未標識培地中で追加の２０、４０、６０または２４０分間のさらなる追跡期間後のいずれかに採取した。タンパク質をＲＩＰＡ緩衝液中で抽出し、３５Ｓ−Ｃｙｓ／Ｍｅｔ標識ＮＳ１もしくはＮＳ２タンパク質中で抽出し、ウサギポリクローナル抗体ＳＰ８および抗ＮＳ２Ｐを用いて各々免疫沈降させ、ＳＤＳ−１２％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動法によって分離し、オートラジオグラフィーによって視認した。
【図１４】Ｄｅｌ  ＮＳ２Ｐは、依然として核外輸送因子Ｃｒｍ１および１４−３−３タンパク質ファミリーのメンバーと相互作用することができる（Ａ）事前に擬似（ｍｏｃｋ）処理した（φ）、または１８時間ｗｔ  Ｈ−１ＰＶもしくはＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶ（ＭＯＩ＝１０ＰＦＵ／細胞）のいずれかを用いて感染させ、Ｔｒａｎ３５Ｓ−Ｃｙｓ／Ｍｅｔを用いて２時間代謝標識したＮＢ−３２４Ｋ細胞の溶解液をＳＤＳの存在下（＋）または非存在下（−）で調製し、ＣＲＭ１（左のパネル）もしくは１４−３−３（右のパネル）に対する抗血清を用いて免疫沈降させた。オートラジオグラムは、ＳＤＳ−１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分離後に免疫沈降した物質を示している。野生型（ｗｔ）ＮＳ２（２５ｋＤａ）、Ｄｅｌ  ＮＳ２（約１８ｋＤａ）、ＣＲＭ１（１２３ｋＤａ）および１４−３−３（３０ｋＤａ）の位置は図の左および／または右側に表示した、αは抗、ｋＤａはキロダルトンでの分子サイズを示す。（Ｂ）事前に擬似（ｍｏｃｋ）処理した（φ）、または１８時間ｗｔ  Ｈ−１ＰＶもしくはＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶ（ＭＯＩ＝１０ＰＦＵ／細胞）のいずれかを用いて感染させ、Ｔｒａｎ３５Ｓ−Ｃｙｓ／Ｍｅｔを用いて２時間代謝標識したＮＢ−３２４Ｋ細胞の溶解液をＳＤＳの存在下（＋）または非存在下（−）で調製し、ＮＳ２Ｐに向けられたウサギポリクローナル抗血清を用いて免疫沈降させた。オートラジオグラムは、ＳＤＳ−１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分離後に免疫沈降した物質を示している。野生型（ｗｔ）ＮＳ２（２５ｋＤａ）およびＤｅｌ  ＮＳ２（約１８ｋＤａ）の位置は図の右側に表示した。αは抗、ｋＤａはキロダルトンでの分子サイズを示す。
【図１５】Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶビリオンは、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶビリオンよりも熱変性に対して感受性である  精製完全ウイルス粒子を１０分間様々な指示温度（ＰＣＲ装置において生成）に曝露させ、この処理後に入手可能になったウイルスゲノムの量はＤＮａｓｅ処理およびアルカリ溶菌後の定量的リアルタイムＰＣＲによって滴定した。ポイントＡ（すなわち、５９．１１℃）およびポイントＢ（すなわち、６１．５３℃）は、５０％のＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶビリオン（実線）およびｗｔ  Ｈ−１ＰＶビリオン（破線）が各々破壊された温度を示している。この結果は、２．４２℃の温度差を生じさせる。この図に示したデータは、２つの独立実験の平均値を示している。
【図１６】Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶを用いた改良された細胞結合および取り込み（Ａ）５×１０５個のＮＢ−３２４Ｋ細胞は、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶまたはＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶを用いて細胞１個当たり１０４個のウイルスゲノムの感染多重度で４℃にて１時間感染させた。細胞培養培地を取り除き、細胞は掻爬による細胞収集の前にＰＢＳを用いて洗浄した。膜結合完全粒子の量は、細胞溶解およびＤＮＡ精製後の定量的リアルタイムＰＣＲによって決定し、全ウイルス完全粒子の％として表示した。データは、２つの独立実験からの２回の測定値の平均値±標準偏差を表している。＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｂ）８×１０４個のＮＢ−３２４Ｋ細胞は、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶまたはＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶを用いて細胞１個当たり１０４個のウイルスゲノムの感染多重度で感染させ、３７℃で０．５時間、１時間、２時間または３時間インキュベートした。細胞培養培地を除去し、膜結合ウイルス粒子はトリプシン／ＥＤＴＡ処理によって分離した。細胞内部のウイルス粒子の量は、細胞溶解およびＤＮＡ精製後の定量的リアルタイムＰＣＲによって決定した。データは、３回ずつ実施された１回の代表的実験の平均値を表している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図１７】感染ＮＢ−３２４Ｋ細胞内でのＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶゲノムの早期の複製および一本鎖ＤＮＡの高度の蓄積（Ａ）９×１０５個のＮＢ−３２４Ｋ細胞は、野生型（ｗｔ）Ｈ−１ＰＶまたはＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶを用いて細胞１個当たり６，８４４個のウイルスゲノムの感染多重度で感染させ、さらに感染後（ｐ.ｉ.）の指定時点での収集される前の二次感染を回避するために中和抗体ＰＶ１の存在下でインキュベートした。ウイルスＤＮＡ複製型は細胞溶解物から抽出し、１％アガロースゲル電気泳動法によって分離し、サザンブロット分析にかけた。ウイルス複製中間体は、ＮＳ１特異的３２Ｐ−放射標識プローブおよびオートラジオグラフィーを用いたハイブリダイゼーションを通して解明された。二量体複製型（ｄＲＦ）、単量体複製型（ｍＲＦ）および一本鎖（ｓｓ）ゲノムの位置は、図の右側に指示した。（Ｂ）Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶまたはｗｔ  Ｈ−１ＰＶ感染サンプルにおいて検出された単量体複製型（ｍＲＦ）、二量体複製型（ｄＲＦ）および一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡに対応するシグナル強度は、Ｐｈｏｓｐｈｏ  Ｉｍａｇｅｒ分析によって定量した。シグナル強度は、感染９時間、１２時間、１６時間および２４時間後のｗｔ  Ｈ−１ＰＶに比したｍＲＦ、ｄＲＦおよびｓｓ  ＤＮＡのＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶの比率として表示した。
【図１８】Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶまたはｗｔ  Ｈ−１ＰＶのいずれかを用いたＮＢ−３２４Ｋ細胞のトランスフェクション後、複製型の蓄積に差は見られない  ２×１０６個のＮＢ−３２４Ｋ細胞は、６μｇのｐｗｔＨ−１ＰＶまたはｐＤｅｌＨ−１ＰＶプラスミド構築体を用いてトランスフェクトし、二次感染を防止するためにトランスフェクション４時間後に細胞培養培地中へ中和抗体ＰＶ１を加えた（＋ＰＶ１）。細胞をトランスフェクション後（ｐ．ｔ．）の指定時点に収集し、ウイルスＤＮＡ分子を細胞溶解物から抽出し、Ｄｐｎｌ消化にかけ、３２Ｐ標識したＮＳ１−コーディング領域特異的プローブを用いたサザンブロット法によって分析し、オートラジオグラフィーによって検出した。ｍＲＦは単量体複製型、ｄＲＦは二量体複製型を示す。
【図１９】ｗｔ  Ｈ−１ＰＶ完全ビリオンの遊離に比較したトランスフェクトＮＢ−３２４Ｋ細胞の培地中でのＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶ完全ビリオンの増加した、および／またはより迅速な遊離  ２×１０６個のＮＢ−３２４Ｋ細胞は、６μｇのｐｗｔＨ−１ＰＶまたはｐＤｅｌＨ−１ＰＶプラスミド構築体を用いてトランスフェクトし、さらに中和抗体ＰＶ１の存在下（＋ＰＶ１）または非存在下（−ＰＶ１）でさらにインキュベートした。細胞培養上清は、トランスフェクション後（ｐ．ｔ．）の指定時点に回収した。一本鎖ＤＮＡ分子（ｓｓＤＮＡ）はトランスフェクト細胞培養の上清からＨｉｒｔ抽出によって単離し、ＮＳ１特異的３２Ｐ−放射標識プローブおよびオートラジオグラフィーを用いたハイブリダイゼーションを通してサザンブロット法によって分析した。さらに、完全ウイルス粒子およびトランスフェクション７２時間後にトランスフェクトされたＮＢ−３２４Ｋ細胞の上清中に存在する感染性ウイルス粒子の量は、ＤＮａｓｅ処理およびアルカリ溶菌後のウイルスゲノム（ｖｇ）の量を前者の場合には定量的リアルタイムＰＣＲによっておよび後者の場合にはプラーク形成単位（ＰＦＵ）の量をプラークアッセイによって測定し分析した。
【図２０】ｗｔ  Ｈ−１ＰＶおよび野生型ｈＨ−１ＰＶに比較したヒト２９３Ｔ細胞のトランスフェクションによって生成されるＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶおよびＤｅｌ  ｈＨ−１ＰＶの増加した感染性  トランスフェクトヒト２９３  Ｔ細胞内で生成した新規に作製されたＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶ、Ｄｅｌ  ｈＨ−１ＰＶ、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶおよび野生型ｈＨ−１ＰＶウイルスストックは、ストックの感染力価（ＰＦＵ／ｍＬで提示）を決定するためのプラークアッセイおよびウイルスゲノム力価（ｖｇ／ｍＬで提示）を決定するための定量的リアルタイムＰＣＲによって分析した。Ｐ／Ｉ比は粒子対感染性比を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
そこで本発明は、野生型パルボウイルスと比較して高い抗腫瘍能力を示すパルボウイルス変異体であって、前記変異体が、（ａ）ＮＳ２のＬｙｓ９６位および／またはＮＳ２のＬｅｕ１０３位（後者はＮＳ１のＴｙｒ５９５位でのアミノ酸置換も誘導する）に対応する位置でのアミノ酸置換、欠失もしくは付加、好ましくは置換、または（ｂ）ＮＳ２タンパク質配列の中央部分およびＮＳ１タンパク質配列のＣ末端部分の両方に影響を及ぼすＨ−１ＰＶゲノムの左側部分におけるインフレーム欠失を特徴とするパルボウイルス変異体を提供する。
【００１１】
上記に記載したアミノ酸の位置は参照ポイント点としてのＨ−１ＰＶと関連しているが、当業者であればＮＳ１／ＮＳ２タンパク質のホモロジーに基づいていずれかのパルボウイルス内の対応するアミノ酸位置を容易に決定することができる。
【００１２】
好ましくは、この欠失は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも２０個および一層より好ましくは少なくとも３０個のアミノ酸の長さを有する。好ましくは、前記欠失は、連続アミノ酸の欠失である、および／または（野生型に比較した）また別の変異は存在しない。特に好ましいのは、５８７〜６２４の欠失を有するＮＳ１タンパク質およびアミノ酸９６〜１３３の欠失を有するＮＳ２タンパク質（例、Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶ）を結果として生じさせるヌクレオチド２０２２〜２１３５のフレーム内欠失である。
【００１３】
用語「野生型パルボウイルスと比較して高い抗腫瘍能力を示す」は、感染１日後のＮＢ−３２４Ｋ細胞の増殖阻害が野生型と比較して少なくとも１．４倍、好ましくは少なくとも１．７倍、より好ましくは少なくとも２倍高いことを意味する。
【００１４】
本明細書で使用する用語「パルボウイルス」は、野生型もしくはそれらの改変された複製能力のある誘導体ならびにそのようなウイルスもしくは誘導体をベースとする関連ウイルスもしくはベクターを含んでいる。適切なパルボウイルス、誘導体等ならびに前記パルボウイルスを生成するために使用可能な細胞は、無用な実験努力をせずに、本明細書の開示に基づけば当業者であれば容易に決定することができる。語句「パルボウイルス」は、任意のパルボウイルス、特に齧歯類パルボウイルス、例えばマウスの微小ウイルス（ＭＶＭ）およびＨ−１ウイルス（Ｈ−１ＰＶ）を含んでいる。当業者であればＮＳ２のＬｙｓ９６位および／またはＮＳ２のＬｅｕ１０３位でのアミノ酸変化（後者の場合にはＮＳ１のＴｙｒ５９５位でのアミノ酸変化とともに）またはＮＳ２タンパク質配列の９６〜１３３位およびＮＳ１タンパク質の５８７から６２４位の両方での大きな欠失をパルボウイルスの構造タンパク質および非構造タンパク質の公知の核酸配列およびアミノ酸配列、例えばパルボウイルスＨ−１ＰＶから出発する標準方法にしたがって導入することができる（図１１および［１７］、さらに配列修正については［１３］および［１８］も参照されたい）。当業者であれば、さらに特定の変異体が列挙した所望の生物学的特性を示すか、以下の実施例で説明するアッセイを使用して、例えば哺乳動物細胞、例えばＮＢ−３２４Ｋ細胞の感染性または増殖阻害の野生型に比較した増加を比較することによって容易にアッセイすることができる。
【００１５】
好ましいのはアミノ酸置換である上述した部位の１つ以上の部位での点突然変異または上述した部位でのウイルスＮＳ１およびＮＳ２両方のタンパク質配列におけるアミノ酸の大きな欠失のいずれかを有するパルボウイルス変異体である。
【００１６】
本発明のより好ましい実施形態では、ＮＳ２の９６位のＬｙｓはまた別の親水性極性アミノ酸（例、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＧｉｎまたはＡｓｎ）で置換される、および／またはＮＳ２の１０３位のＬｅｕは天然非極性アミノ酸（例、ＰｒｏまたはＧｌｙ）によって置換され、後者は天然極性アミノ酸（例、Ｓｅｒ、ＨｉｓまたはＴｈｒ）によるＮＳ１の５９５位のＴｙｒの置換を誘導する。
【００１７】
本発明の一層より好ましい実施形態では、本パルボウイルス変異体は、（ａ）以下のアミノ酸置換ＮＳ２、Ｌｙｓ９６ＧｌｕまたはＮＳ２、Ｌｅｕ１０３Ｐｒｏ（後者は置換ＮＳ１、Ｔｙｒ５９５Ｈｉｓも誘導する）、または（ｂ）以下のアミノ酸欠失ＮＳ２、Δ９６〜１３３およびＮＳ１、Δ５８７〜６２４を含んでいる。
【００１８】
特に好ましいのは、以下の修飾、
（ａ）ＮＳ２  Ｌｙｓ９６Ｇｌｕの置換（ＰＭｕｔ２  Ｈ−１ＰＶ変異体）、
（ｂ）ＮＳ２  Ｌｅｕ１０３ＰｒｏおよびＮＳ１  Ｔｙｒ５９５Ｈｉｓの置換（ＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶ変異体）、または
（ｃ）ＮＳ２  アミノ酸９６〜１３３およびＮＳ１  アミノ酸５８７〜６２４の欠失（Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶ変異体）を有するパルボウイルス変異体である。
【００１９】
好ましくは、本発明のパルボウイルスは、パルボウイルスＨ−１（Ｈ−１ＰＶ）由来または関連齧歯類パルボウイルスに由来する。好ましい関連齧歯類パルボウイルスの例としては、ＬｕＩＩＩ、マウス微小ウイルス（ＭＭＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＰＶ）、マウスの微小ウイルス（ＭＶＭ）、ラット微小ウイルス（ＲＭＶ）、ラットパルボウイルス（ＲＰＶ）、ラットウイルス（ＲＶ）またはキルハムラム（Ｋｉｌｈａｍ）ラットウイルス（ＫＲＶ）が挙げられる。
【００２０】
本発明のまた別の主題は、核酸、特に上述のパルボウイルス変異体をコードするＤＮＡに関する。
【００２１】
本発明によるＤＮＡは、各々ベクターおよび発現ベクター内に存在する可能性がある。当業者であれば、それらの例に習熟している。Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）のための発現ベクターの場合には、例えばｐＧＥＭＥＸ、ｐＵＣ誘導体、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＥＴ３ｂ、Ｔ７をベースとする発現ベクターおよびｐＱＥ−８である。酵母内での発現のためには、例えばｐＹ１００およびＹｃｐａｄ１が挙げられ、動物細胞内の発現のためには、例えばｐＣＭＶ、ｐＣＩ、ｐＫＣＲ、ｐＥＦＢＯＳ、ｃＤＭ８、ｐＭＳＣＮＤおよびｐＣＥＶ４を指定しなければならない。バキュロウイルス発現ベクターｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａは、昆虫細胞内の発現のために特に適合する。
【００２２】
好ましい実施形態では、本発明によるＤＮＡを含有するベクターは、ウイルス、例えばアデノウイルス、ワクシニアウイルス、ＡＡＶウイルスまたはパルボウイルス、例えばＭＶＭまたはＨ−１ＰＶであるが、パルボウイルスが好ましい。このベクターは、さらにまたレトロウイルス、例えばＭｏＭＵＬＶ、ＭｏＭｕＬＶ、ＨａＭｕＳＶ、ＭｕＭＴＶ、ＲＳＶまたはＧａＬＶであってよい。
【００２３】
本発明によるＤＮＡを含有する発現ベクターを構築するためには、当分野において公知の一般的方法を使用することができる。これらの方法には、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換え技術、合成法およびｉｎ  ｖｉｖｏ組換え法が含まれる。
【００２４】
さらに、本発明は、上述したベクターを含有する宿主細胞に関する。これらの宿主細胞には、細菌、酵母、昆虫および動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞が含まれる。Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＨＢ１０１、ＤＨ１、ｘ１７７６、ＪＭ１０１、ＪＭ１０９、ＢＬ２１、ＸＬ１Ｂｌｕｅ、ＳＧ１３００９およびＳｕｒｅ（登録商標）、後者は完全パルボウイルスゲノムをベースとするベクターのために好ましく、酵母菌株サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および動物細胞Ｌ、Ａ９、３Ｔ３、ＦＭ３Ａ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ、２９３ＴおよびＮＢ−３２４Ｋ、後者２つはＨ−１ＰＶベクターのために好ましく、昆虫細胞ｓｆ９が好ましい。これらの宿主細胞を形質転換させる方法、形質転換体を表現型に関して選択する方法および上述したベクターを使用することによって本発明によるＤＮＡを発現させる方法は、当分野において公知である。
【００２５】
そこで、本発明は、本発明のパルボウイルス変異体を生成する方法であって、本発明の形質転換体を適切な条件下で培養する工程および細胞または培養物からパルボウイルス変異体を収集する工程を含む方法も提供する。
【００２６】
さらに、本発明は、上述したパルボウイルス変異体ＮＳ１もしくはＮＳ２タンパク質、すなわち野生型に比較して高い抗腫瘍能力の原因となる変異が所在する該パルボウイルス変異体タンパク質の領域、を特異的に認識する抗体に関する。抗体は、モノクローナル、ポリクローナルもしくは合成抗体またはそれらのフラグメント、例えばＦａｂ、ＦｖまたはｓｃＦＶフラグメントであってよい。好ましくは、モノクローナル抗体に関する。産生のためには、動物、特にポリクローナル抗体のためにはウサギもしくはヤギおよびモノクローナル抗体のためにはマウスを上述したパルボウイルス変異体の非構造タンパク質またはそれらのフラグメントで免疫することが好ましい。動物のまた別の追加免疫は、同一パルボウイルス変異体の非構造タンパク質またはそれらのフラグメントを用いて実施することができる。ポリクローナル抗体は、次に動物血清から入手し、さらに精製することができる。モノクローナル抗体は、標準方法にしたがって得られるが、特にKohler and Milstein［１９−Nature 256(1975), 495］およびGalfre and Milstein［２０−Meth. Enzymol. 73(1981), 3］による方法を参照されたい。この場合には、マウス骨髄腫細胞が免疫された動物に由来する脾臓細胞と融合される。本発明による抗体は、多数の方法で、例えば上述したパルボウイルス変異体から発現した変異体非構造タンパク質を免疫沈降させるため、またはそれらを単離するために使用することができる。これらの抗体は、イムノアッセイにおいて液相内に、または固体担体へ結合させることができる。これに関連して、抗体は、様々な方法で標識することができる。当業者であれば、適切なマーカーおよび標識法に習熟している。イムノアッセイの例として、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡならびに（共）免疫沈降法、免疫蛍光法およびイムノブロッティング法が挙げられる。
【００２７】
そこで、本発明は、治療（および診断）目的のために適合する生成物を提供する。特に、本発明による発現ベクター、例えばパルボウイルスは、遺伝子治療手段のために使用することができる。さらに、本発明によるパルボウイルス変異体は、例えば腫瘍疾患を治療するための毒素として適当である。
【００２８】
このため、本発明の適用のためのキットも提供される。このキットは、以下、
（ａ）本発明によるパルボウイルス変異体、
（ｂ）本発明によるＤＮＡ、例えば発現ベクター、特にパルボウイルス、
（ｃ）本発明による抗体、ならびに
（ｄ）従来型補助物質、例えば溶媒、緩衝液、担体、マーカーおよびコントロールを含んでいる。
【００２９】
成分（ａ）〜（ｄ）の内で、１つ以上の代表的な成分が各々存在してよい。
【００３０】
本発明は、さらに本発明のパルボウイルス変異体、前記パルボウイルス変異体を産生するベクターもしくは細胞（「パルボ治療薬」もしくは「パルボ治療用組成物」）、例えばヒト２９３（Ｔ）、ヒトＮＢ−３２４ＫまたはラットＲＧ２細胞を含有する医薬組成物を提供する。
【００３１】
投与するために、本パルボ治療薬は、適切な医薬担体と結合することができる。当分野において周知のタイプおよび市販の容易に入手可能な適切な医薬担体には、リン酸緩衝食塩（ＰＢＳ）液、水、エマルジョン、例えば油／水型エマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、造影剤（例、Ｖｉｓｉｐａｑｕｅ）、無菌溶液などが含まれる。そのような担体は、適切な用量で被験者に投与するための従来型調製方法によってパルボ治療薬とともに調製することができる。
【００３２】
追加の医薬上適合する担体は、ゲル、生体吸収性マトリックス材料、該治療薬を含有する移植成分または任意の他の適切な媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）、送達もしくは分注手段もしくは物質を含むことができる。
【００３３】
本発明のパルボ治療薬によって治療可能な患者には、ヒトならびに非ヒト動物が含まれる。後者の例には、制限なく、動物、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌおよびネコが含まれる。
【００３４】
パルボ治療用医薬組成物の患者、例えば脳腫瘍患者への投与は、数多くの適切な方法のいずれか、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、皮内、頭蓋内および腫瘍内投与によって実行することができる。投与経路は、当然ながら、疾患の性質および該医薬組成物中に含有された特定の治療薬に左右される。
【００３５】
そのようなパルボ治療薬が血液脳関門を通って進入する能力を備える感染性ウイルス粒子を含む場合、治療は、該ウイルス治療薬、例えばＨ−１ＰＶ変異体の静脈内注射によって実施できる、または少なくとも開始できる。
【００３６】
長期静脈内治療はウイルス治療薬に対する中和抗体が形成されるために非効率になり易いので、静脈内ウイルス投与の初期投与計画後に様々な投与様式を採用することができる、またはそのような様々な投与技術、例えば頭蓋内もしくは腫瘍内ウイルス投与を、パルボウイルス治療の全経過を通して代替的に使用することができる。
【００３７】
また別の特殊な投与技術として、パルボ治療薬（ウイルス、ベクターおよび／または細胞剤）は、患者に移植された起源から該患者に投与することができる。例えば、シリコーンもしくは他の生体適合性材料製のカテーテルを、それ以上の外科的介入を行わずに様々な時点に該パルボ治療用組成物を局所的に注射することを可能にするために腫瘍除去中もしくは別個の手技によって該患者内に設置された小さな皮下リザーバー（Ｒｉｃｋｈａｍリザーバー）に接続することができる。パルボウイルス変異体もしくはパルボウイルス由来ベクターは、定位固定外科技術または神経ナビゲーションターゲティング技術によって例えば腫瘍内に注射することもできる。
【００３８】
パルボウイルス剤もしくは組成物の投与は、移植されたカテーテルを通して低流量でウイルス粒子もしくはウイルス粒子を含有する流体の、適切なポンプシステム、例えば蠕動式注入ポンプまたは対流強化送達（ＣＥＤ）ポンプを使用した連続注入によって実施することもできる。
【００３９】
パルボ治療用組成物のさらにまた別の投与方法は、所望の場所、例えば腫瘍へ該パルボ治療薬を分注するために構築および配置された移植器具からである。例えば、パルボ治療用組成物、例えばパルボウイルスＨ−１変異体が含浸されたウエハーを使用することができるが、このとき該ウエハーを外科的腫瘍切除の終了時に切除腔の辺縁に付着させる。そのような治療的介入において複数のウエハーを使用することができる。
【００４０】
パルボ治療薬を能動的に生成する細胞、例えばパルボウイルスＨ−１ＰＶ変異体またはＨ−１ＰＶベクターは、所望の組織、例えば腫瘍内へ、または腫瘍切除後の腫瘍腔内へ注射することができる。
【００４１】
上述した投与様式の２つ以上の組み合わせは、任意の適切な方法、例えば同時に、同時期に、または連続的に使用することができる。
【００４２】
パルボ治療薬の投与レジメンは、当分野の技術の範囲内で、患者データ、観察所見および他の臨床因子、例えば患者のサイズ、体表面積、年齢、性別および投与される特定ウイルス、ベクター、細胞など、投与の時間および経路、疾患のタイプ、例えば腫瘍のタイプおよび特性、患者の一般的健康状態ならびに該患者が受ける他の薬物もしくは療法に基づいて担当医が容易に決定することができる。
【００４３】
したがって、本発明は、癌を治療するための医薬組成物を調製するための本発明によるパルボウイルス変異体、前記パルボウイルス変異体を産生する細胞、本発明のＤＮＡ、発現ベクターまたは抗体の使用にさらに関する。好ましい癌は、本発明の薬剤を用いた治療に特に影響を受け易いと期待される膵臓癌、子宮頸癌、肝細胞癌およびリンパ腫である。
【実施例】
【００４４】
以下の実施例では、本発明をより詳細に説明する。
【実施例１】
【００４５】
材料および方法
（Ａ）細胞および試薬
サルウイルス４０−形質転換ヒト新生児腎臓ＮＢ−３２４Ｋ細胞［２１］は、５％ウシ胎仔血清、グルタミンおよび抗生物質（１００μｇ／ｍＬのペニシリンおよび１００Ｕ／ｍＬのストレプトマイシン、Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、独国カールスルーエ）を補給したイーグル最小必須培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）中で増殖させた。
【００４６】
ヒトＰＤＡＣ細胞系Ｐａｎｃ−１およびＭｉａＰａＣａ−２（原発腫瘍から樹立）は、Ａ．Ｖｅｃｃｈｉ氏（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃｏ  Ｈｕｍａｎｉｔａｓ社、イタリア国ロッツァーノ）の厚意により提供された。ヒトＨｅＬａ＋細胞系は、Ｅ．Ｓｃｈｗａｒｚ氏（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、独国ハイデルベルク）の厚意により提供された。Ｐａｎｃ−１、ＭｉａＰａＣａ−２およびＨｅＬａ＋細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、オーストリア国パッシング）および２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を補給したダルベッコの変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、独国タウフキルヒェン）中で増殖させた。
【００４７】
ＳＶ４０  Ｔ抗原−、Ａｄ５−形質転換ヒト胚腎臓２９３Ｔ細胞系［２８］は、１０％のＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補給したダルベッコの変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Sigma社）中で培養した。
【００４８】
（Ｂ）ウイルスの注射および産生
ウイルス感染は、３７℃で１時間、補給物を含まない細胞培養培地中でプレートを定期的に揺動させながら希釈した精製ウイルスの６ｃｍの細胞培養皿（Ｓａｒｓｔｅｄｔ社、独国ニュルンブレヒト）１枚当たり４００μＬの接種菌を用いて実施した。
【００４９】
Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶおよびＰＭｕｔ  Ｈ−１ＰＶ変異体は、最初に適切なプラスミド構築体を使用して、以前に説明された２９３Ｔ細胞のトランスフェクション［１８］によって生成した。Ｈ−１ＰＶ変異体ならびにｗｔ  Ｈ−１ＰＶは、続いて低い感染多重度（ＭＯＩ）、すなわち１０−３ＰＦＵ／細胞でＮＢ−３２４Ｋ細胞の感染によって生成した。感染３日後または細胞変性作用の出現後に細胞を採取し、３回の冷凍−解凍サイクルによってＶＴＥ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．７）、０．５ｍＭのＥＤＴＡ）中に溶解させた。細胞破壊片を遠心分離によって除去し、ウイルスストックはイオジキサノールステップ勾配遠心分離によって精製した［２２］。
【００５０】
子孫ウイルス産生を測定するために、１×１０５個の細胞を０．５ＰＦＵ／細胞のＭＯＩでＨ−１ＰＶ変異体もしくはｗｔ  Ｈ−１ＰＶを用いて感染させた。感染後の様々な時点に培地を採取し、感染した培養を収集し、ＶＴＥ緩衝液中で３回の冷凍−解凍サイクルにかけた。ウイルス力価は、プラークアッセイによって細胞抽出物および培養培地の両方について決定した。
【００５１】
（Ｃ）感染性ウイルスの滴定
ウイルスストックは、ＮＢ−３２４Ｋ指標細胞上でプラークアッセイ［２３］または感染細胞ハイブリダイゼーションアッセイ［２４］によって滴定した。ウイルス力価は、他のどこかで記載された［１８，２３，２５］ウイルス懸濁液１ミリリットル（ｍＬ）当たりのプラーク形成単位（ＰＦＵ）または複製単位（ＲＵ）として表示した。
【００５２】
（Ｄ）完全ウイルス粒子の滴定
ウイルスストック内に存在する完全ウイルス粒子の量は、以前に記載された定量的ドットブロットハイブリダイゼーションアッセイ［２６］によって決定し、ウイルス懸濁液１ミリリットル当たりの完全ウイルス粒子数として表示した。
【００５３】
（Ｅ）増殖阻害の測定
感染ＮＢ−３２４Ｋ細胞の増殖動態は、Ｃａｓｙ細胞計数システム（Casy社、独国ロイトリンゲン）を使用して電子パルス面積分析法によって監視した。
【００５４】
（Ｆ）イムノブロッティング法
１．５×１０５個のＮＢ−３２４Ｋ細胞は、３ＰＦＵ／細胞のＭＯＩでＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶ、ＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶ、ＰＭｕｔ２  Ｈ−１ＰＶまたはｗｔ  Ｈ−１ＰＶを用いて感染させた。細胞は、感染６、８、２４および４８時間後に収集し、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ社、独国）を補給したＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１％のＮＰ−４０、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ）中に溶解させた。タンパク質の定量（Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、独国ミュンヘン）後、１０μｇの全タンパク質をＳＤＳ  １２％−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離し、Ｐｒｏｔｒａｎニトロセルロース膜（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、独国イーバーリンゲン）へ電気移送した。この膜は、最初にＮＳ１（ＳＰ８、［２７］）、ＮＳ２（α−ＮＳ２ｐ、［１８］）もしくはウイルスカプシドタンパク質（α−ＶＰｐｅｐ、［２５］）に向けられたウサギポリクローナル抗血清のいずれかと、次に適切な二次ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ社、独国マンハイム）とインキュベートした。免疫反応性タンパク質は、さらに強化化学発光法（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ社、独国フライブルク）によって解明した。
【００５５】
（Ｇ）感染培養細胞からの核および細胞質タンパク質分画
５×１０５個のＮＢ−３２４Ｋ細胞は、１ＰＦＵ／細胞のＭＯＩでＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶ、ＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶ、ＰＭｕｔ２  Ｈ−１ＰＶ、ＰＭｕｔ４  Ｈ−１ＰＶもしくはｗｔ  Ｈ−１ＰＶを用いて感染させた。感染１６、２０、２４および４２時間後に細胞を採取し、核および細胞質タンパク質分画をＮＥ−ＰＥＲ核および細胞質抽出試薬キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国ロックフォード）を製造業者の取扱説明書にしたがって使用し実施した。各分画中に存在する感染性粒子の数をプラークアッセイによって決定し、全ＰＦＵとして表示した。
【００５６】
（Ｈ）細胞クローン形成能の測定
ＮＢ−３２４Ｋ細胞は、様々なＭＯＩでｗｔ  Ｈ−１ＰＶまたはＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶを用いて感染させた。４時間後、感染細胞をトリプシン処理によって採取し、６ｃｍ細胞培養皿上に単一細胞として、すなわち培養皿１枚当たり細胞１００〜２００個で再播種した。２．５％の抗Ｈ−１カプシド血清ＰＶ１を含有する完全培地中での培養１３〜１７日後に、細胞を固定し、クリスタルバイオレット溶液（１００ｍＬの７０％  ＥｔＯＨ中に希釈させた１ｇのクリスタルバイオレット）を用いて染色した。細胞コロニー数を計数し、各ＭＯＩについて擬似（ｍｏｃｋ）処理細胞と比較した生存細胞のパーセンテージとして表示した。
【００５７】
（Ｉ）免疫蛍光法
１．５×１０４個のＮＢ−３２４Ｋ細胞は、カバースリップ（診断用顕微鏡スライド、Ｅｒｉｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国ポーツマス）上で増殖させ、Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶまたはｗｔ  Ｈ−１ＰＶを用いて３ＰＦＵ／細胞のＭＯＩで感染させた。感染の１５および２１時間後に、細胞を３．７％ホルムアルデヒド中で１０分間固定し、低温メタノールを用いて５分間、低温アセトンを用いて２分間処理し、１０分間０．２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（［４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノール］エトキシレート）を用いて透過化した。ＰＢＳを用いて洗浄した後、細胞は約３０分間１０％ウシ胎仔血清を含有するブロッキング溶液を用いて処理した。細胞は、連続的に一次抗体としてのマウスモノクローナル抗体３Ｃ３Ｆ１２（１：１００の希釈率）（Ｃ．Ｄｉｎｓａｒｔ、未公表）および二次抗体としてのロバ抗マウスａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８結合抗体（１：６００の希釈率、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、米国オレゴン州ユージーン）とともに各々室温で１時間インキュベートし、続いてリン酸緩衝食塩液により３回洗浄した。全ての溶液および希釈液は、リン酸緩衝食塩液中で調製した。ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）を用いたＤＮＡの高速染色後、カバースリップをエタノールを用いて乾燥させ、ポリビニルアルコール（Ｅｌｖａｎｏｌ、Ｓｅｒｖａ社、独国ハイデルベルク）の存在下でスライドガラス上に載せた。サンプルをＬｅｉｃａ  ＤＭＲＢＥ顕微鏡を用いて６３倍の倍率で油浸対物レンズを用いて試験し、画像をＨａｍａｍａｔｓｕ  Ｏｒｃａデジタルカメラを用いて記録し、Ｏｐｅｎｌａｂ２（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ社、英国）およびＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ２ソフトウエアを使用して処理した。所定の表現型のパーセンテージを決定するために、１表現型当たり２００個の細胞を試験した。
【００５８】
（Ｊ）腫瘍抑制のｉｎ  ｖｉｖｏ測定
４×１０７個のＰａｎＣ−１細胞は、３ＲＵ／細胞のＭＯＩでＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶまたはｗｔ  Ｈ−１ＰＶのいずれかを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで感染させた。感染４時間後に、マウス１匹当たり５×１０６個の細胞をＢａｌｂ／ｃヌードマウスの右側腹部へ皮下（ｓ．ｃ．）注射した。７匹のヌードマウスに擬似（ｍｏｃｋ）処理（つまり、緩衝液処理）細胞を注射し、７匹のヌードマウスにｗｔ  Ｈ−１ＰＶ感染細胞を注射し、他方６匹のヌードマウスにはＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶ感染細胞を注射した。
【００５９】
マウス（６〜７週齢の雌、１ケージ当たり５匹）は２１〜２４℃、４０〜６０％の湿度に設定した騒音絶縁室内で維持した。腫瘍サイズは、カリパスを用いて約３カ月間の期間にわたり週２〜３回測定した。腫瘍容積は、式Ｖ＝１／２×長さ×（幅）２にしたがって計算し、総容積（ｍｍ３）の平均値または２９０ｍｍ３超の腫瘍を有する１群のマウスのパーセンテージのいずれかで表示した。
【００６０】
２×１０６個のＨｅＬａ細胞をＢａｌｂ／ｃヌードマウスの右側腹部へ皮下注射した。移植９日後に、５匹のヌードマウスに各々１００μＬのＰＢＳを注射し、５匹のヌードマウスに各１０８ＰＦＵのＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶ（１００μＬのＰＢＳ中）を注射し、５匹のヌードマウスに各々１０８ＰＦＵのｗｔ  Ｈ−１ＰＶ（１００μＬのＰＢＳ中）を注射した。
【００６１】
マウス（６〜７週齢の雌、１ケージ当たり５匹）は２１〜２４℃、４０〜６０％の湿度に設定した騒音絶縁室内で維持した。腫瘍サイズは、カリパスを用いて約６週間の期間にわたり週２〜３回測定した。腫瘍容積は、式Ｖ＝１／２×長さ×幅２にしたがって計算し、総容積（ｍｍ３）の平均値または１，０００ｍｍ３超の腫瘍を有する１群のマウスのパーセンテージのいずれかで表示した。
【００６２】
（Ｋ）パルス・チェイス代謝放射標識および細胞抽出物
９×１０５個のＮＢ−３２４Ｋ細胞は、３ＰＦＵ／細胞のＭＯＩでＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶもしくはｗｔ  Ｈ−１ＰＶまたは擬似（ｍｏｃｋ）処理（すなわち、緩衝液処理）のいずれかを用いて感染させた。感染１８時間後、培養を３０分間に、５％透析ウシ胎仔血清、１％のＬ−グルタミンおよび１％ゲンタマイシンを補給したＭｅｔおよびＣｙｓ非含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中の２００μＣｉのＴｒａｎ３５Ｓ標識（１，１７５Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）を用いて代謝標識した。その後、標識培地を吸引し、細胞は血清非含有ＭＥＭを用いて１回洗浄した。細胞は続いて溶解させた、または３７℃の未標識完全培地（チェイス）中で再インキュベートし、その後、標識合成タンパク質の分解を調査するためにインキュベーション後の様々な時点に溶解させた。溶解は、プロテイナーゼ阻害剤の混合物（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ、ロッシュ社、独国マンハイム）を補給したＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ［ｐＨ７．５］、１ｍＭのＥＤＴＡ［ｐＨ８．０］、１％（ｖ／ｖ）のＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））を使用して実施した。タンパク質は、４℃にて１０分間全速力でエッペンドルフ遠心管中での遠心分離によって細胞破壊片を除去した後に採取した。
【００６３】
（Ｌ）細胞およびウイルスタンパク質の（共）免疫沈降法
５×１０６ｃｐｍの標識タンパク質抽出物は、４℃で１時間連続回転下（Ｒｅａｘ  ２、Ｈｅｉｄｏｌｐｈ社）のＨ−１ＰＶ  ＮＳ１、Ｈ−１ＰＶ  ＮＳ２、ヒトＣＲＭ１もしくは１４−３−３タンパク質のいずれかに向けられた８〜１０μＬのウサギポリクローナル抗血清の存在下でインキュベートし、さらに１００μＬのプロテインＡセファロース（６ＭＢ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を各サンプルに加えた後に４℃で１時間インキュベートした。サンプルは、５分間５，５００ｒｐｍおよび４℃で遠心した（Ｓｉｇｍａ  ２Ｋ１５）。タンパク質−抗体−ビーズ複合体は、次に各１ｍＬのＲＩＰＡ（＋／−ＳＤＳ）緩衝液を用いて３回洗浄した。サンプルペレットを適切な量の２×ＳＤＳローディング色素（８０〜１００μＬ）中に再懸濁させ、タンパク質を１２％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって分離した。Ａｍｐｌｉｆｙ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いた３０分間のインキュベーション後、ゲルを乾燥させ、さらにオートラジオグラフィーフィルム（ＢｉｏＭａｘｍ、ＭＳ  Ｆｉｌｍ、Ｋｏｄａｋ社）に露光させた。
【００６４】
（Ｍ）ウイルスの熱変性および定量的リアルタイムＰＣＲによるパッケージ化ウイルスＤＮＡの検出
精製Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶもしくは精製ｗｔ  Ｈ−１ＰＶいずれかの１０９個の完全ウイルス粒子を含有するＤＮＡｓｅ−緩衝液希釈液（４００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、１００ｍＭのＭｇＳＯ４、１０ｍＭのＣａＣｌ２、Ｐｒｏｍｅｇａ社、独国マンハイム）を１０分間既定温度（ＰＣＲ装置を用いて発生させた５０〜７０℃の範囲内の温度）へ加熱した。サンプルは、続いて３７℃で１時間ＤＮＡｓｅＩ［０．１Ｕ／μＬ、Ｐｒｏｍｅｇａ社、独国マンハイム］を用いて処理した。無傷カプシドの数を決定できるように、ウイルス粒子はアルカリ溶菌によって崩壊させ、パッケージ化ウイルスＤＮＡを他の場所で記載されたように［２９］Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ（登録商標）ｅｐ  ｒｅａｌｐｌｅｘ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社、独国ハンブルク）を使用して定量的リアルタイムＰＣＲによって検出した。個々の反応混合物（２０μＬ）は、１×ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  ＭｉｘＴＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、０．２８μＭの標識ＮＳ１−ＴａｇＭａｎＴＭプローブ、０．２８μＭの各フォワードプライマーおよびリバースプライマーならびに２．８５μＬのテンプレートを含有していた。ウイルス力価は、ウイルス懸濁液１ｍＬ当たりのウイルスゲノム（ｖｇ／ｍＬ）として表示し、以下の式にしたがって計算した。
ウイルス力価［ｖｇ／ｍＬ］＝ＩＱ［１／ｍＬ］．３５０００
因数３５０００＝［４６．７μＬ／（６．７μＬ×２０μＬ）］×（１００μＬ／１０μＬ）×１０００μＬ
ＩＱはサンプルの定量蛍光強度を意味し、因数３５０００は１ウエル当たり（４６．７μＬ／（６．７μＬ×２０μＬ）、アルカリ溶菌（１０００μＬ／１０μＬ）のために使用されるウイルス懸濁液１０μＬ当たりおよび１ｍＬのウイルスストック液当たりのウイルス力価を表示するための１ｍＬ（１０００μＬ）当たりの量を計算するために必要とされる。
【００６５】
（Ｎ）ヒトＮＢ−３２４Ｋ細胞へのウイルスの結合
５×１０５個のヒトＮＢ−３２４Ｋ細胞は、１０４ｖｇ／細胞のＭＯＩでｗｔ  Ｈ−１ＰＶまたはＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶを用いて感染させ、さらに１時間４℃でインキュベートした。細胞は、氷温１×ＰＢＳを用いて洗浄し、５００μＬの１×ＰＢＳ中で剥離させ、４℃で５分間３，５００ｒｐｍで遠心することによりペレット化した（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５４１７Ｒ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）。上清は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ試験管中に保管した。細胞は次に２００μＬの氷温１×ＰＢＳ中に再懸濁させ、ＤＮＡは細胞溶解後にＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を製造業者の取扱説明書にしたがって使用し精製した。細胞溶解液は、ウイルス粒子を変性させるために８５℃で３０分間インキュベートし（ＨＢＴ１３０、Ｈａｅｐ  Ｌａｂｏｒ  Ｃｏｎｓｕｌｔ社）、遊離したウイルスＤＮＡはＨｉｒｔ抽出によって回収した。上清分画内または細胞に結合した状態いずれかで存在するウイルスゲノムの定量は、他の場所で記載された定量的リアルタイムＰＣＲ［２８］によって決定した。
【００６６】
（Ｏ）ウイルスの取り込み
８×１０４個のＮＢ−３２４Ｋ細胞は、１０４ｖｇ／細胞のＭＯＩでｗｔ  Ｈ−１ＰＶまたはＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶのいずれかを用いて感染させ、さらに３７℃でインキュベートした。感染後の時点（０．５〜３時間）に、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、膜結合ウイルス粒子をトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）処理によって剥離させた。次に細胞を５分間３，５００ｒｐｍおよび室温での遠心分離によってペレット化した（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５４１７Ｒ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）。細胞はＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を製造業者の取扱説明書にしたがって使用して溶解させ、内在化ウイルスＤＮＡはＨｉｒｔ抽出によって抽出した。内在化ウイルスゲノムの定量は、他の場所で記載された定量的リアルタイムＰＣＲ［２８］によって決定した。
【００６７】
（Ｐ）哺乳動物細胞からの低分子量ウイルスＤＮＡの抽出（Ｈｉｒｔ抽出）
感染もしくはトランスフェクト細胞または細胞上清からの低分子量ウイルスＤＮＡの抽出は、他の場所で記載されたＨｉｒｔ抽出［３０］によって、またはＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ社）のいずれかによって実施した。
【００６８】
（Ｑ）サザンブロッティング
ウイルスＤＮＡ複製型は、１％−アガロースゲル電気泳動法によって分離した。各３０分間の２回の変性処理およびゲル各々についての１５分間の２回の中和処理後、ＤＮＡ分子を室温で１５〜２０時間ニトロセルロースフィルター（Ｐｒｏｔｒａｎ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）上へ１０×ＳＳＣ緩衝液の存在下での毛細管作用によって移した。膜をブロットから取り外し、ＤＮＡ分子は膜のＵＶ処理によって固定化した。膜はその後、３２Ｐ放射標識ＮＳ特異的プローブとともにハイブリダイズし、さらにオートラジオグラフィーフィルム上、−８０℃で露光させた（ＢｉｏＭａｘ、ＭＳ  Ｆｉｌｍ、Ｋｏｄａｋ社）。
【００６９】
（Ｒ）トランスフェクション
−  ＣａＰＯ４を使用するトランスフェクション
６μｇのｐｗｔＨ−１ＰＶおよびｐＤｅｌＨ−１ＰＶプラスミドＤＮＡは、ＨＥＰＥＳ緩衝食塩液と塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）溶液の混合液中で他の箇所で記載されたように［２８］沈降させ、さらに完全培地中の１０ｃｍ培養皿中の２×１０６の２９３Ｔ細胞に加え、その後３７℃および５％のＣＯ２でインキュベートした。
【００７０】
−リポフェクタミン  ２０００を使用するトランスフェクション
トランスフェクションの３０〜６０分前に、完全細胞培養培地を補給物が補給されていない新鮮培地と交換した。その間に、６μｇのｐｗｔＨ−１ＰＶおよびｐＤｅｌＨ−１ＰＶプラスミドＤＮＡをＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中に希釈させ、リポフェクタミン  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）およびＯＰＴＩ−ＭＥＭの混合液を製造業者の取扱説明書にしたがって調製した。２種の溶液を混合し、室温で２５分間インキュベートした後、混合液をサブコンフルエントなＮＢ−３２４Ｋ細胞の細胞培養培地へ滴下した。トランスフェクション４時間後、トランスフェクション培地を新鮮完全細胞培養培地と交換した。
【実施例２】
【００７１】
パルボウイルス変異体の構築
（Ａ）Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶ変異体
Ｈ−１ＰＶゲノム内のＮＳ−コーディング配列（すなわち、Δ２０２２〜２１３５ヌクレオチド）における欠失は、ｐＳＲ１９プラスミド［１３］および表１に列挙したプライマーを用いてＰＣＲによって構築した。欠失した領域を含有するＡｐｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを変異したＤＮＡから切断し、引き続いてｐＤｅｌＨ−１ＰＶプラスミド構築体を生成するために所望のベクター内の同等の野生型ＡｐｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントと置換した。この構築体は、全置換ＡｐｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（ＧＡＴＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、独国コンスタンス）を配列決定することによって確認した。
【００７２】
【表１】
0005873863.tif 000002
【００７３】
（Ｂ）ＰＭｕｔ  Ｈ−１ＰＶ変異体
単一および二重点突然変異の感染性Ｈ−１ＰＶクローンｐＳＲ１９内への導入は、特定部位突然変異誘発によって、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）特定部位突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、オランダ国アムステルダム）を製造業者の取扱説明書にしたがって、および表２に記載したプライマーを使用して実施した。全ての構築体は、シーケンシングによって検証した（ＧＡＴＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、独国コンスタンス）。
【００７４】
【表２】
0005873863.tif 000003
【実施例３】
【００７５】
野生型Ｈ−１ＰＶに比較してＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶの増加した感染性、およびＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶに比較してＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶおよびＰＭｕｔ２  Ｈ−１ＰＶ変異体の類似、もしくは一層良好な感染性
ウイルスストックの感染性は、完全ウイルス粒子（Ｐ）対感染性粒子（Ｉ）の比率、つまりＰ／Ｉ比によって規定される。このため、Ｐ／Ｉ比が低いほどウイルスストックの感染性は高くなる。
【００７６】
図２は、ＮＢ−３２４Ｋ細胞内で新規に生成されたウイルスストック由来のｗｔ  Ｈ−１ＰＶに比較した様々な欠失および点突然変異Ｈ−１ＰＶ変異体のＰ／Ｉ比（粒子対感染性比）を示している。各ウイルスストックについて、完全粒子の量はこのストックのゲノム力価にしたがって決定したが、感染性粒子の量は完全粒子が（ｉ）プラークを形成する（プラーク形成単位もしくはＰＦＵで与えられる）、および（ｉｉ）参照ＮＢ−３２４Ｋ細胞系内のそれらのゲノムを複製する（複製単位もしくはＲＵで与えられる）能力にしたがって決定した。２つのＰ／Ｉ比は、さらに完全粒子（すなわち、ウイルスゲノムを含有するカプシド）の量を、
−最初にＰＦＵの量（完全ビリオンが細胞溶解を通して培養内に拡散する能力を特徴付ける）（図２の比１）と、
−次にＲＵの量（それらのゲノムを増幅させることのできる完全ビリオンを特徴付ける）（図２の比２）と比較することによって決定した。
【００７７】
図２に示したように、ＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶおよびＰＭｕｔ２  Ｈ−１ＰＶ点突然変異体ならびにＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶ欠失変異体は、完全粒子がそれらのゲノムを増幅させる（図２、比２）または細胞培養内で増殖する（図２、比１）いずれかの能力に関してｗｔ  Ｈ−１ＰＶよりも低いＰ／Ｉ比を示した。実際に、Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶおよびＰＭｕｔ２  Ｈ−１ＰＶの両方のＰ／Ｉ比ならびにＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶのＰ／Ｉ比は、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶのＰ／Ｉ比と比較して、各々少なくとも５分の１および８分の１である。これは、これらの変異体の感染性がより高いことを示しており、ＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶは最高水準を示している。
【００７８】
これとは対照的に、ＰＭｕｔ３  Ｈ−１ＰＶおよびＰＭｕｔ４  Ｈ−１ＰＶ点突然変異体は、完全ビリオンがゲノムを増幅させる、および増殖する両方の能力に関して３つの他の変異体（Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶ、ＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶおよびＰＭｕｔ２  Ｈ−１ＰＶ）と比較して高い、このため不良なＰ／Ｉ比を示した。これらの２つの変異体はさらに、少なくとも細胞培養内でそれらが増殖する能力によると、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶよりも不良な（すなわち、２倍以上高い）Ｐ／Ｉ比を示した。これらのデータは、ＰＭｕｔ３  Ｈ−１ＰＶおよびＰＭｕｔ４  Ｈ−１ＰＶ両方の点突然変異体の減少した感染性を示している。ＰＭｕｔ１およびＰＭｕｔ２  Ｈ−１ＰＶ内に導入された点突然変異は単独で該変異体の感染性を増加させたが、他方両方の点突然変異の組み合わせはＰＭｕｔ４  Ｈ−１ＰＶにおけるのと同様に反対の影響を有すると思われ、感染性完全粒子より多い悲感染性粒子をもたらしたことは注目に値する。
【００７９】
要するに、点突然変異体ＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶ（ＮＳ２  Ｌｅｕ１０３ＰｒｏおよびＮＳ１  Ｔｙｒ５９５Ｈｉｓ）の感染性は欠失変異体Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶ（Δヌクレオチド  ２０２２〜２１３５）または点突然変異体ＰＭｕｔ２  Ｈ−１ＰＶ（ＮＳ２  Ｌｙｓ９６Ｇｌｕ）のいずれか１つより一層良好であり、これら２つの後者の感染性は既にｗｔ  Ｈ−１ＰＶの感染性に比較して有意に（すなわち、少なくとも５倍）増加した。
【実施例４】
【００８０】
感染ＮＢ−３２４Ｋ細胞内のｗｔ  Ｈ−１ＰＶと比較したＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶの増加した、および／またはより高速の増殖
欠失変異体Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶおよび点突然変異体ＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶ、ＰＭｕｔ２  Ｈ−１ＰＶおよびＰＭｕｔ３  Ｈ−１ＰＶならびにｗｔ  Ｈ−１ＰＶのウイルス産生をプラークアッセイによって分析した。力価の決定を可能にする他、この方法は、ウイルスが隣接細胞を感染させ、それにより単層細胞培養内で拡散する能力を意味するプラーク形成能力を示している。プラークアッセイは常に、ウイルスストックが何であれ、おそらく感染している場合は細胞が細胞周期の様々な段階にあるという事実に起因して、小さなプラークおよび大きなプラークの混合物を生じさせるが、パルボウイルス複製周期は細胞周期のＳ期でしか開始できないことは注目に値する。しかし、プラークが大きく、ウイルスによって産生する大きなプラークの量が多いほど、このウイルスが細胞培養内で増殖する能力は良好である。
【００８１】
図３のＡは、参照ＮＢ−３２４Ｋ細胞系内で様々なＨ−１ＰＶ変異体およびｗｔ  Ｈ−１ＰＶによって形成されたプラークのサイズを例示している。ＰＭｕｔ３  Ｈ−１ＰＶは、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶより小さなプラークを明確に産生したが、これは少なくともヒトＮＢ−３２４Ｋ細胞内でこの変異体の増殖効率が低いことを示唆している。これらのデータはさらに、ＮＢ−３２４Ｋ細胞内の上述したこの変異体の低い感染性とも一致している（実施例３および図２を参照されたい）。
【００８２】
これとは対照的に、３つの他の変異体ＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶ、ＰＭｕｔ２  Ｈ−１ＰＶおよびＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶによって生成されたプラークは、一般にＰＭｕｔ３  Ｈ−１ＰＶを用いて得られたプラークより大きかったが、これはこれらの変異体を用いた場合のより良好な増殖効率を示唆している。しかし、ＰＭｕｔ２  Ｈ−１ＰＶおよびＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶは、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶを用いて得られたプラークより各々小さい、および大きいプラークを産生すると思われた。これらの２つの点突然変異体によって形成されたプラークの様々なサイズおよびｗｔ  Ｈ−１ＰＶまたはＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶを用いて得られたものと比較したそれらの比率を決定するためにはまた別の実験が実施される。
【００８３】
図３のＡに示したように、欠失変異体Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶは、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶより大きなプラークを産生した。実際に図３のＢに示したように、大きな、つまり２５ｍｍ２超のプラークのより高い比率は、Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶ変異体を用いた感染後に形成されたが、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶは、小さな、つまり２０ｍｍ２までのプラークの高い比率を生成した。さらに、Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶは、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶ（各々、１３ｍｍ２および６７ｍｍ２）に比較して高い平均および最高サイズ（各々、１９ｍｍ２および１１８ｍｍ２）のプラークを生じさせた。これを言い換えると、Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶ変異体を用いて得られたプラークサイズの平均値は、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶを用いて得られたプラークサイズの平均値に比較して１．５倍高く、これはＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶ変異体のより良好な増殖効率および／または高速の感染周期を示唆している。これらのデータはさらに、ＮＢ−３２４Ｋ細胞内の上述したこのＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶ変異体の高い感染性とも一致している（実施例３および図２を参照されたい）。
【００８４】
要するに、欠失変異体Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶ（Δヌクレオチド  ２０２２〜２１３５）の増殖は、ＮＢ−３２４Ｋ細胞内のｗｔ  Ｈ−１ＰＶと比較して増加する、および／または高速である。点突然変異体ＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶ（ＮＳ２  Ｌｅｕ１０３ＰｒｏおよびＮＳ１  Ｔｙｒ５９５Ｈｉｓ）がｗｔ  Ｈ−１ＰＶと同様に、またはより良好に増殖するかどうかについては、今後決定される。
【実施例５】
【００８５】
感染ＮＢ−３２４Ｋ細胞内のウイルスタンパク質の蓄積
ウイルスタンパク質の蓄積は、Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶ、ＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶ、ＰＭｕｔ２  Ｈ−１ＰＶまたはｗｔ  Ｈ−１ＰＶを用いて感染させたＮＢ−３２４Ｋ細胞内での免疫ブロッティングアッセイによって決定した。図４は、感染６時間、８時間、２４時間および４８時間後の非構造的ＮＳ１およびＮＳ２タンパク質ならびにカプシドＶＰタンパク質の蓄積を示している。試験したウイルス全部が非構造タンパク質およびカプシドタンパク質を発現することができた。しかし、これらのタンパク質の蓄積パターンは、ウイルス毎に相違していた。
【００８６】
全感染ＮＢ−３２４Ｋ細胞では、カプシドタンパク質ＶＰ１およびＶＰ２は、感染２４時間および４８時間後に検出可能であったが、より早期の６時間および８時間後には検出できなかった。感染２４時間後、欠失および点突然変異体で感染させた細胞は、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶ感染細胞と比較して高い量のＶＰタンパク質を示した（図４、黒色矢印）。感染２４時間〜４８時間後には、Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶは、ＶＰタンパク質蓄積における強度の増加をもたらしたが、ＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶおよびＰＭｕｔ２  Ｈ−１ＰＶ変異体またはｗｔ  Ｈ−１ＰＶを用いた場合はＶＰタンパク質の増加は全く、またはわずかしか観察されなかった。
【００８７】
ｗｔ  Ｈ−１ＰＶおよびＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶ感染とは対照的に、非構造タンパク質ＮＳ１は、ＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶまたはＰＭｕｔ２  Ｈ１−ＰＶのいずれかによる感染８時間後に既に検出可能であった（図４、赤色の矢印）。さらに、これら２つの点突然変異体はさらに感染２４時間および／または４８時間後に観察されたようにｗｔ  Ｈ−１ＰＶまたはＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶを用いて得られたものに比較してＮＳ１の高い蓄積レベルをもたらしたが、後者は少なくとも感染後の分析した期間内にＮＳ１の最低蓄積レベルを生じさせると思われた。
【００８８】
全ての場合に感染早期、つまり感染６時間後または８時間後にはＮＳ２タンパク質を検出することができなかったが、ＮＳ２の蓄積パターンは感染後期には全４種のウイルス間で際だって相違していた（図４、黒色の囲み枠）。感染８時間〜２４時間後、ＮＳ２は、Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶを除く全ウイルスを用いて検出可能なレベルに蓄積した。感染の２４時間および４８時間後の時点に、ＮＳ２蓄積のレベルはｗｔ  Ｈ−１ＰＶを用いて感染させた細胞内で類似であったが、各々ＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶまたはＰＭｕｔ２  Ｈ−１ＰＶを用いた感染後有意に増加または減少した。Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶを用いて感染させた細胞内では、ＮＳ２は、分析した最後の時点、つまり感染４８時間後にはほとんど検出不能であった。
【００８９】
要するに、点突然変異体ＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶ（ＮＳ２  Ｌｅｕ１０３ＰｒｏおよびＮＳ１  Ｔｙｒ５９５Ｈｉｓ）およびＰＭｕｔ２  Ｈ−１ＰＶ（ＮＳ２  Ｌｙｓ９６Ｇｌｕ）は、どちらも高度に細胞毒性であると思われ（実施例６および図５を参照されたい）、非構造タンパク質ＮＳ１のより早期および高度の蓄積を生じさせたが、欠失変異体Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶ（Δヌクレオチド  ２０２２〜２１３５）は、より高速で増殖すると思われ（実施例４および図３を参照されたい）、また、少なくとも参照ヒトＮＢ−３２４Ｋ細胞系内および分析した期間内にカプシドタンパク質ＶＰ１およびＶＰ２のより高速の蓄積ならびに非構造タンパク質ＮＳ２の最低蓄積を生じさせた。
【実施例６】
【００９０】
ＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶおよびＰＭｕｔ２  Ｈ−１ＰＶ変異体を用いた増加した細胞培養増殖阻害および増加した感染性子孫ビリオンの産生
点突然変異体ＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶおよびＰＭｕｔ２  Ｈ−１ＰＶの細胞毒性および生殖特性を感染ヒトＮＢ−３２４Ｋ内の欠失変異体Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶおよびｗｔ  Ｈ−１ＰＶの細胞毒性および生殖特性と比較した。このため細胞培養増殖および感染性子孫ビリオンの産生をどちらも４日間追跡した。他方、生細胞および死細胞の量を、Ｃａｓｙ細胞計数システムを用いて測定し、図５Ａは、擬似（ｍｏｃｋ）処理細胞内で得られた生細胞の平均値に基づいた生細胞の平均パーセンテージを示している。他方、プラークを形成可能な新規に作製されたビリオンの量はプラークアッセイによって決定し、図５Ｂは、感染１、２、３および４日後に得られた全プラーク形成単位の量を示している。
【００９１】
図５Ａに示したように、全ウイルスは細胞培養増殖を阻害することができ、欠失変異体Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶおよびｗｔ  Ｈ−１ＰＶは、少なくとも感染後第１日に類似レベルの細胞増殖阻害を示した。しかしはるかに高い細胞毒性作用、つまり約１．５および２倍の細胞集団増殖のより強力な阻害は、少なくとも感染後第１日のＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶまたはｗｔ  Ｈ−１ＰＶ感染細胞と比較した場合に点突然変異体ＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶおよびＰＭｕｔ２  Ｈ−１各々を用いたＮＢ−３２４Ｋ細胞の感染後に明白に観察された。
【００９２】
図５Ｂに示したように、全ウイルスは、ヒトＮＢ−３２４Ｋ細胞内で感染性子孫ビリオンを産生することができた。しかし、点突然変異体ＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶおよびＰＭｕｔ２  Ｈ−１ＰＶの両方ならびに欠失変異体Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶはｗｔ  Ｈ−１ＰＶに比較して高い感染性子孫ビリオンの産生を生じさせ、これは少なくとも感染１日後に全プラーク形成単位の量における各々約１２倍、７．５倍および５倍の増加を示した。
【００９３】
要するに、点突然変異体ＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶ（ＮＳ２  Ｌｅｕ１０３ＰｒｏおよびＮＳ１  Ｔｙｒ５９５Ｈｉｓ）およびＰＭｕｔ２  Ｈ−１ＰＶ（ＮＳ２  Ｌｙｓ９６Ｇｌｕ）は、欠失変異体Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶ（Δヌクレオチド  ２０２２〜２１３５）およびｗｔ  Ｈ−１ＰＶに比較して一層強度にＮＢ−３２４Ｋ細胞集団の増殖を阻害する。全３種の変異体、つまりＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶ、ＰＭｕｔ２  Ｈ−１ＰＶおよびＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶはさらに、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶが少なくともヒトＮＢ−３２４Ｋ細胞において生じさせたより高度の感染性子孫ビリオンの産生を生じさせた。
【実施例７】
【００９４】
感染ヒトＮＢ−３２４Ｋ細胞の核および細胞質内のＰＦＵ分布
図６は、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶまたは変異体Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶ、ＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶもしくはＰＭｕｔ２  Ｈ−１ＰＶのいずれかを用いて感染させたＮＢ−３２４Ｋ細胞内の二次感染の非存在下での感染性子孫ビリオンの産生および細胞内分布を示している。細胞の核および細胞質分画内に存在する感染性子孫ビリオンをプラークアッセイによって感染１６時間、２０時間、２４時間および４２時間後に定量し、プラーク形成単位（すなわち、プラーク形成粒子もしくはビリオン）として表示した。
【００９５】
図６のａ）に示したように、ＮＢ−３２４Ｋ細胞の核分画から回収したプラーク形成性、つまり感染性子孫ビリオンの量は、試験した全時点でＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶまたはｗｔ  Ｈ−１ＰＶのいずれかによる感染後に同等であり、経過時間に伴って同様に増加した。
【００９６】
これとは対照的に、そして図６のｂ）に示したように、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶ感染ＮＢ−３２４Ｋ細胞と比較してＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶ内の感染２４時間および４８時間後の細胞質分画から有意に高い量のプラーク形成ビリオンが回収された。これらのデータは、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶ感染細胞と比較してＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶによる感染後のＮＢ−３２４Ｋ細胞の核から細胞質への新規に作製された感染性ビリオンのより早期および／または増加した輸送とともに一次感染の結果としての子孫ビリオンの増加した産生を明らかに示した。
【００９７】
ＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶ、ＰＭｕｔ２  Ｈ−１ＰＶまたはＰＭｕｔ４  Ｈ−１ＰＶを用いて感染させたＮＢ−３２４Ｋ細胞の核分画内でのプラーク形成子孫ビリオンの蓄積パターンは、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶまたはＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶのいずれかによる感染後に得られた蓄積パターンとは相違していた。
【００９８】
図６のｃ）に示したように、二重点突然変異体ＰＭｕｔ４  Ｈ−１ＰＶは、試験した全ての他のウイルスと比較して、ＮＢ−３２４Ｋ細胞の核分画内ではるかに高い量のプラーク形成粒子、すなわち感染２０時間後の７倍および感染２４時間後の５倍の増加を生じさせた。感染２４時間後、ＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶはさらに、ＰＭｕｔ２  Ｈ−１ＰＶ、Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶおよびｗｔ  Ｈ−１ＰＶと比較してＮＢ−３２４Ｋ細胞の核分画内で有意に高い量のプラーク形成粒子を生じさせた。なおＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶ、ＰＭｕｔ２  Ｈ−１ＰＶもしくはＰＭｕｔ３  Ｈ−１ＰＶを用いた感染後に核内で見いだされた核形成粒子の量が、感染２４時間〜４２時間後の時点に欠失変異体Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶもしくはｗｔ  Ｈ−１ＰＶとは対照的に低下したことは興味深い。
【００９９】
細胞質分画内では、および図６のｄ）に示したように、二重点突然変異体ＰＭｕｔ４  Ｈ−１ＰＶは、感染の少なくとも４２時間後にＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶを用いて得られた量にほぼ近似した野生型に比較して感染２０時間、２４時間および４２時間後のプラーク形成粒子の量の明白な増加を示した。単一点突然変異体ＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶはｗｔ  Ｈ−１ＰＶと比較して、さらに少なくとも感染の２４時間および４８時間後と比較して高い量のプラーク形成子孫ビリオンを生じさせたが、Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶを用いて得られた量ほど高くはなかった。他の変異体とは対照的に、ＰＭｕｔ２  Ｈ−１ＰＶを用いて感染させたＮＢ−３２４Ｋ細胞の細胞系質内で見いだされたプラーク形成粒子の量は、試験した全時点において実質的に一定のままであり、したがってｗｔ  Ｈ−１ＰＶを用いて感染させたサンプル内で見いだされた量より低いままであった。後者のデータは、子孫ビリオンの増加した細胞質蓄積を可能にする感染周期の一部の過程は他の変異体とは対照的にＰＭｕｔ２  Ｈ−１ＰＶを用いると損傷される可能性があることを示唆している。
【０１００】
これらをまとめると、欠失変異体Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶ（Δヌクレオチド  ２０２２〜２１３５）および二重点突然変異体ＰＭｕｔ４  Ｈ−１ＰＶ（ＮＳ２  Ｌｙｓ９６Ｇｌｕ、Ｌｅｕ１０３ＰｒｏおよびＮＳ１  Ｔｙｒ５９５Ｈｉｓ）は野生型と比較して子孫ビリオンの明白に増加した産生を示したが、ＰＭｕｔ４  Ｈ−１ＰＶは核内の早期の蓄積もまた示し、Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶは野生型と比較して新規に作製された感染性ビリオンの早期の核輸送を示している。単一点突然変異体ＰＭｕｔ１  Ｈ−１ＰＶ（ＮＳ２  Ｌｅｕ１０３ＰｒｏおよびＮＳ１  Ｔｙｒ５９５Ｈｉｓ）は、だが少なくとも試験した時点にはより少ない量のプラーク形成粒子を備える二重点突然変異体ＰＭｕｔ４  Ｈ−１ＰＶと同様に挙動すると思われるが、他方単一点突然変異体ＰＭｕｔ２  Ｈ−１ＰＶ（ＮＳ２  Ｌｙｓ９６Ｇｌｕ）は、感染細胞の細胞系質内で感染性子孫ビリオンを蓄積するその能力が損傷していると思われる。
【実施例８】
【０１０１】
Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶの生活環の一部の過程は野生型Ｈ−１ＰＶの生活環の一部の過程より高速である
図７は、感染１５時間および２１時間後の免疫蛍光アッセイによって検出されたように感染ＮＢ−３２４Ｋ内の単細胞レベルでのウイルス粒子の蓄積および細胞内局在を示している。この実験では、ヒトＮＢ−３２４Ｋ細胞をハイブリッド（ｈ）欠失変異体Ｄｅｌ  ｈＨ−１ＰＶまたはＨ−１ＰＶゲノムの左側の部分が等価の領域によって、つまり密接に関連するパルボウイルスＭＶＭｐ（ｐｄＢ−ＭＶｐ構築体から回収された、［２５］）由来のゲノムのヌクレオチド１〜ヌクレオチド９９０と置換されたハイブリッド野生型ｈＨ−１ＰＶのいずれかを用いて感染させた。これは、ウイルスプロモーターＰ３４ならびにそれらのアミノ末端でのＮＳ１の最初の２４４アミノ酸およびＮＳ２の８５アミノ酸はＭＶＭｐ起源であり、他方ＮＳ１およびＮＳ２タンパク質の両方のカルボキシ末端ならびにウイルスプロモーターＰ３８および完全ＶＰタンパク質はＨ−１ＰＶ起源であることを意味している。
【０１０２】
Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶにより感染させた細胞集団間では、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶにより感染させた集団と比較して、核内で新規に集合した粒子を示すより多数の細胞が１５時間および２１時間後の時点に観察された。さらに、核から細胞質へ既に遊離された子孫ビリオンを示している多数の細胞はまた感染２１時間後にｗｔ  Ｈ−１ＰＶにより感染させた集団と比較してＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶにより感染させた細胞集団間でも観察された（図７、白い矢印）。これらのデータはハイブリッドＤｅｌ  ｈＨ−１ＰＶおよびハイブリッド野生型ｈＨ−１ＰＶを用いて得られたが、これらのデータは、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶを用いて感染させたものに比較してＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶにより感染させたＮＢ−３２４Ｋ細胞の細胞質分画内での感染性子孫ビリオンの、上述したより高速の蓄積と一致している（実施例７および図６を参照されたい）。
【０１０３】
要するに、欠失変異体Ｄｅｌ  ｈＨ−１ＰＶ（Δヌクレオチド  ２０２２〜２１３５）を産生する細胞内で野生型ｈＨ−１ＰＶを産生する細胞に比較して子孫ウイルス粒子のより早期の核退出が発生するが、これはＤｅｌ  ｈＨ−１ＰＶ感染周期の一部の過程が少なくとも参照ヒトＮＢ−３２４Ｋ細胞系においてはｗｔ  Ｈ−１ＰＶ感染周期の一部の過程よりも高速で進行することを示唆している。
【実施例９】
【０１０４】
欠失変異体Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶは、野生型Ｈ−１ＰＶより低い細胞毒性を示す
欠失変異体Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶの細胞毒性は、クローン形成性アッセイとその後のクリスタルバイオレット染色を使用してＮＢ−３２４Ｋ細胞上のｗｔ  Ｈ−１ＰＶの細胞毒性と比較した。
【０１０５】
図８のＡに示したように、コロニーを形成可能な、つまり欠失変異体Ｈ−１ＰＶによる感染後に増殖可能な細胞の量は、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶによる感染後に検出された細胞コロニーの量よりある程度多い。
【０１０６】
図８のＢに示したように、この作用は特に、細胞を低度または中等度の感染多重度（すなわち、０．５ＰＦＵ／細胞または２．５ＰＦＵ／細胞）で感染させた場合に観察される。これらのデータは全部で、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶの毒性と比較して欠失変異体Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶの減少した毒性を示している。これらは予備試験データである。しかし、欠失変異体Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶの減少した毒性は、少なくともヒトＮＢ−３２４Ｋ細胞内での子孫ビリオンのより良好な産生と相関付けることができる。実際に、これらのデータは、本発明者らの研究所で以前に得られた子孫ビリオンの優れた生産者である細胞系は感染過程中にはあまり迅速には死滅しないという観察所見と一致する。
【０１０７】
要するに、欠失変異体Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶ（Δヌクレオチド  ２０２２〜２１３５）は、ウイルス産生の増加に好都合であると思われるｗｔ  Ｈ−１ＰＶと比較して低い毒性を示す。
【実施例１０】
【０１０８】
様々な膵臓癌細胞系およびＨｅＬａ細胞内でのＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶの増加したウイルス産生
上述したように、標準ｗｔ  Ｈ−１ＰＶに比した欠失変異体Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶの有意な利点は、参照ヒトＮＢ−３２４Ｋ細胞系における感染性および産生率に関して観察された。Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶ変異体のこの作用は、様々なヒト腫瘍細胞系で確証された。
【０１０９】
図９は、感染後の様々な時点でのプラークアッセイによって決定されたように、ヒトＮＢ−３２４Ｋ、ヒト膵臓癌Ｐａｎｃ−１およびＭｉａＰａＣａ−２ならびにヒト子宮頸癌ＨｅＬａ＋細胞系においてｗｔ  Ｈ−１ＰＶを用いて得られた感染性粒子の量と比較した欠失変異体Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶによって産生した感染性粒子の量を示している。
【０１１０】
図９に示したように、試験した全ヒト細胞系におけるｗｔ  Ｈ−１ＰＶと比較してＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶによる感染後に感染性子孫ビリオンの増加した産生が観察された。
【０１１１】
要するに、欠失変異体Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶ（Δヌクレオチド  ２０２２〜２１３５）は、ヒト参照細胞系ＮＢ−３２４Ｋだけではなくヒト腫瘍由来の異なる膵臓癌または子宮頸癌細胞においても産生率に関してｗｔ  Ｈ−１ＰＶに比して有意な利点を示す。
【実施例１１】
【０１１２】
欠失変異体Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶは腫瘍増殖抑制において野生型Ｈ−１ＰＶよりも優れた効率を示す
上述したｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験に加えて、欠失変異体Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶが腫瘍増殖に及ぼす作用をｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいても調査した。
【０１１３】
図１０のＡは、実施されたｉｎ  ｖｉｖｏアッセイの略図を示している。ヒト膵臓癌Ｐａｎｃ−１細胞を緩衝液で処理した（擬似（ｍｏｃｋ）処理細胞）、またはＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶもしくはｗｔ  Ｈ−１ＰＶを用いて１ＲＵ／細胞の感染多重度で感染させた（ＲＵ、すなわち、複製単位は、そのウイルスゲノムを宿主細胞内へ送達して増幅させることのできる完全ウイルス粒子に対応する）。擬似（ｍｏｃｋ）処理Ｐａｎｃ−１細胞もしくはパルボウイルス感染Ｐａｎｃ−１細胞を、さらに以下のようにＢａｌｂ／ｃヌードマウスに皮下注射した。７匹のヌードマウスは擬似（ｍｏｃｋ）処理Ｐａｎｃ−１細胞を受容し、７匹のヌードマウスはｗｔ  Ｈ−１ＰＶより感染させたＰａｎｃ−１細胞を受容し、６匹のヌードマウスはＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶ変異体により感染させたＰａｎｃ−１細胞を受容した。
【０１１４】
腫瘍増殖を感染後８３日の期間追跡し（図１０）、２９０ｍｍ３超のサイズの腫瘍のパーセンテージについても決定した（図１０のＣ）。
【０１１５】
データは、擬似（ｍｏｃｋ）処理腫瘍と比較してパルボウイルス感染Ｐａｎｃ−１腫瘍の出現および増殖における強度の遅延を示した。さらに、明白に減少した腫瘍増殖は、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶにより感染させたＰａｎｃ−１腫瘍細胞が注射されたヌードマウスに比較してＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶ感染Ｐａｎｃ−１腫瘍細胞を受容したヌードマウスにおいても観察された。実際、２９０ｍｍ３超のサイズを有するヒトＰａｎｃ−１腫瘍は、Ｐａｎｃ−１細胞がｗｔ  Ｈ−１ＰＶを受容した場合に比較してＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶを受容した場合は約１０日後に検出され、移植８３日後、２９０ｍｍ３超のサイズを有するヒトＰａｎｃ−１腫瘍は５５％超のｗｔ  Ｈ−１ＰＶと比較してＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶにより感染させた場合は２０％未満であった（図１０のＣ）。
【０１１６】
要するに、欠失変異体Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶ（Δヌクレオチド  ２０２２〜２１３５）は、動物におけるヒト腫瘍増殖抑制においてｗｔ  Ｈ−１ＰＶより強度の効率を示す。
【実施例１２】
【０１１７】
Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶの腫瘍内注射は野生型Ｈ−１ＰＶに比較してＨｅＬａ細胞由来腫瘍の増殖抑制においてより効率的である
ｉｎ−ｖｉｖｏアッセイでは、２×１０６個のＨｅＬａ細胞をＢａｌｂ／ｃヌードマウスの右側腹部へ皮下注射した。マウスがＨｅＬａ細胞由来腫瘍を発現した９日後に、マウス１匹当たり１０８ＰＦＵ（１００μＬの容積のＰＢＳ中）のＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶまたはｗｔ  Ｈ−１ＰＶを腫瘍増殖部位の近く、すなわち腫瘍内へ注射した。腫瘍増殖は、移植４２時間後まで監視した。図１２は、欠失変異体Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶが腫瘍内に注射された場合にＨｅＬａ細胞由来子宮頸癌腫瘍の増殖に及ぼす作用を示している。
【０１１８】
加速された腫瘍増殖は、おそらくはウイルスの腫瘍内注射による腫瘍細胞質量の崩壊に起因するこれらの条件下で観察された。接種材料の液圧が腫瘍細胞の拡散に寄与し、それにより強度に加速された腫瘍増殖に関与した可能性が最も高かった。しかし、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶと比較してＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶを用いるとこれらの条件下で一層改良された腫瘍抑制を観察することができた。図１２のＡに示したように、１，０００ｍｍ３超の腫瘍を発現するマウスの数は、Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶの注射後にはｍｏｃｋ処理（緩衝液）マウスまたはｗｔ  Ｈ−１ＰＶ注射マウスと比較して遅延した。実際、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶが腫瘍内注射された場合は６０％のマウス（つまり５匹中３匹のマウス）が注射６日後に既に１，０００ｍｍ３超の腫瘍を発現したが、Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶが腫瘍内注射された場合は注射２５日後にしか発現しなかった（つまり、ほぼ２０日遅い）。
【０１１９】
図１２のＢは、各群における１，０００ｍｍ３未満の腫瘍を有する（これにより動物の犠死を防止する）マウスのパーセンテージで提示したマウスの生存率を示している。Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶにより処理されたマウスの８０％（つまり５匹中４匹）は注射３５日後まで生存したが、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶで処理されたマウスは既に注射１７日後から４０％（つまり５匹中２匹）しか生存していなかった。
【０１２０】
要するに、欠失変異体Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶ（Δヌクレオチド  ２０２２〜２１３５）は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＨｅＬａ細胞由来ヒト腫瘍の増殖抑制においてｗｔ  Ｈ−１ＰＶより強力な能力を示している。
【実施例１３】
【０１２１】
野生型ＮＳ２Ｐタンパク質と比較したＤｅｌ  ＮＳ２Ｐタンパク質の増加した新規合成および不安定性
ウイルス非構造タンパク質の新規合成および安定性をＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶまたはｗｔ  Ｈ−１ＰＶにより感染させたＮＢ−３２４Ｋ細胞からパルス・チェイス標識および免疫沈降アッセイによって決定した。図１３は、３０分の標識期間後の新規合成された非構造ＮＳ１およびＮＳ２Ｐタンパク質の量ならびにそれらの合成の２４０分後までの時間内のこれらのウイルスタンパク質の残留量を示している。
【０１２２】
新規合成された野生型ＮＳ１に比較して、より高い量の新規合成されたＤｅｌ  ＮＳ１が検出された（図１３、上方パネル、チェイス０分間）。しかし、切断形のＮＳ１（Ｄｅｌ  ＮＳ１）は、少なくとも６０分のチェイス期間までは野生型形と同様に安定性であるように見えた。野生型ＮＳ１の場合、追加のより緩徐に移動するバンドがチェイス期間の開始時（０分〜２０分の時点）にわずかに検出できたが、少なくとも４０分〜２４０分のチェイス期間には明白に見られるようになり、その量は時間の経過に伴って増加し、ＮＳ１のより高速で移動する形態は漸進的に減少した。これは、進行性および／または一時的に発生すると思われる野生型ＮＳ１の一部の翻訳後修飾の出現を表示している。野生型ＮＳ１ほど明白には見られないが、Ｄｅｌ  ＮＳ１もまた少なくとも１２０分のチェイス期間まではダブレットとして移動すると思われたが、２４０分のチェイス期間後にはＤｅｌ  ＮＳ１のより緩徐に移動する形態しか検出されず、これは野生型ＮＳ１と比較してＤｅｌ  ＮＳ１タンパク質の翻訳後修飾が相違する、および／またはより高速に発生することを示唆している。
【０１２３】
図１３に示したように（下方のパネル）、Ｄｅｌ  ＮＳ２Ｐタンパク質の合成および分解はどちらも、野生型ＮＳ２Ｐの合成および分解と比較して衝撃的に促進された。実際、新規合成されたＤｅｌ  ＮＳ２Ｐタンパク質の量は標識期間後（チェイス０分の時点）に野生型タンパク質の１つよりはるかに高かったが、大多数のＤｅｌ  ＮＳ２Ｐは６０分のチェイス期間後既に消失し、２４０分のチェイス期間後には新規合成されたＤｅｌ  ＮＳ２Ｐはもはや検出されなかったが、新規合成された野生型ＮＳ２Ｐは依然検出可能であった。
【０１２４】
要するに、Ｄｅｌ  ＮＳ２Ｐの合成および代謝回転は、野生型ＮＳ２Ｐと比較して明白に強化される。ＮＳ１の翻訳後修飾は、さらにタンパク質の野生型形と比較して切断形（Ｄｅｌ）において変化させられる可能性がある。まとめると、これらのデータは、１１４−ヌクレオチド長の、Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶゲノム内のインフレーム欠失および／または結果として生じる非構造Ｄｅｌ  ＮＳ１およびＤｅｌ  ＮＳ２タンパク質における３７アミノ酸の切断がこれらのウイルスタンパク質の一部の調節機構に影響を及ぼすことを強力に示唆している。これらの変化がＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶ子孫ビリオンの観察された、より高度の感染性および／またはより早期の核退出において重要な問題となるかは、今後調査する。
【実施例１４】
【０１２５】
Ｄｅｌ  ＮＳ２Ｐは核外輸送因子Ｃｒｍｌおよび１４−３−３タンパク質ファミリーメンバーと依然として相互作用することができる
ウイルスタンパク質が特定の細胞タンパク質と相互作用する能力は、Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶまたはｗｔ  Ｈ−１ＰＶにより感染させたＮＢ−３２４Ｋ細胞の代謝的に３５Ｓ標識したタンパク質抽出物をもちいた共免疫沈降アッセイによって決定した。
【０１２６】
図１４のＡに示したように、等価量の細胞タンパク質Ｃｒｍ１（左のパネル）および１４−３−３（右のパネル）は、適切な抗体を用いた免疫沈降後に全試験サンプル中で検出された。さらに、等価量の野生型ＮＳ２およびＤｅｌ  ＮＳ２タンパク質が、ＳＤＳの非存在下で調製されたサンプル中ではＣｒｍ１または１４−３−３のいずれかと共沈降することが見いだされた（各々、図１４のＡ、レーン３および５ならびにレーン７および９）。Ｃｒｍ１および１４−３−３両方とのウイルスＤｅｌ  ＮＳ２および野生型ＮＳ２タンパク質の共沈降は、Ｄｅｌ  ＮＳ２または野生型ＮＳ２がｍｏｃｋ処理細胞由来のサンプル中（図１４のＡ、レーン１および１０）またはタンパク質−タンパク質相互作用を中断させるＳＤＳの存在下で調製されたサンプル中（図１４のＡ、レーン２および４ならびにレーン６および８）で検出されなかったため特異的であった。
【０１２７】
図１４のＢは、類似量のＤｅｌ  ＮＳ２および野生型ＮＳ２タンパク質をＮＳ２Ｐ特異的抗血清を使用した場合に感染したサンプルから免疫沈降させたことを示す。これらのデータは、サンプル中に存在するＤｅｌ  ＮＳ２または野生型ＮＳ２タンパク質の全量の一分画だけがＣｒｍ１または１４−３−３のいずれかと相互反応できたことも指示している。
【０１２８】
要するに、ウイルスＤｅｌ  ＮＳ２タンパク質はＣｒｍ１および１４−３−３細胞生成物両方と野生型ＮＳ２と同様に効率的に相互作用するが、これはＨ−１ＰＶ  ＮＳ２タンパク質配列中の３７アミノ酸の欠失がウイルスタンパク質とその細胞パートナーとの結合特性を無効にしないこと、そしてＨ−１ＰＶ  ＮＳ２の一部の立体配座構造が切断（Ｄｅｌ）形において依然として維持されたことを示唆している。
【実施例１５】
【０１２９】
Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶビリオンは、熱変性に対して野生型Ｈ−１ＰＶビリオンよりも感受性である
感染細胞内のウイルスゲノムの脱カプシド過程は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは熱変性アッセイによって模倣することができる。Ｈ−１ＰＶ粒子の熱変性への感受性は、完全ビリオンを様々な温度へ曝露させ、ＤＮａｓｅ処理してその後にアルカリ溶菌を行った後に残留する無傷ビリオンの定量的リアルタイムＰＣＲによって該サンプル中に依然として存在するウイルスゲノムの量を決定することによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで分析した。図１５に示したように、Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶおよびｗｔ  Ｈ−１ＰＶビリオンの安定性は、精製完全粒子を各１０分間５０℃〜７０℃の（ＰＣＲ装置内で生成される）温度に曝露させることによって調査した。
【０１３０】
図１５は、熱変性後に回収されたＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶゲノム（総量の％で表示）は、野生型ゲノムの１つと比較した場合に、試験した全温度で低かった。完全粒子の５０％の変性をもたらした温度は、Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶおよびｗｔ  Ｈ−１ＰＶ間の２．４２℃の差を生じさせ、前者の場合は５９．１１℃であり、後者の場合は６１．５３℃であった。
【０１３１】
要するに、Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶ粒子は、熱変性に対してｗｔ  Ｈ−１ＰＶ粒子よりも感受性であった。これは、Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶウイルスゲノムが、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶゲノムより効率的に脱カプシド化することができ、これはさらに前者の増加した感染性に好都合でもあろうことを示唆している。
【実施例１６】
【０１３２】
Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶを用いた改良された細胞結合および取り込み
完全粒子の細胞表面への結合は、ウイルス内在化を防止するために４℃で１時間のインキュベーション後に感染ＮＢ−３２４Ｋ細胞から回収されたウイルスゲノムの量を定量的リアルタイムＰＣＲによって測定し決定した。
【０１３３】
完全粒子の取り込みは、ウイルス侵入を可能にするために事前に３７℃でインキュベートし、血漿膜結合ウイルス粒子を取り除くためにトリプシン／ＥＤＴＡにより処理した感染細胞から感染後の様々な時点（０．５時間〜３時間）の内在化ウイルスゲノムの量を定量的リアルタイムＰＣＲによって測定し調査した。図１６のＡは細胞膜結合完全粒子のパーセンテージを示しているが、図１６のＢはＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶまたはｗｔ  Ｈ−１ＰＶいずれかによるＮＢ−３２４Ｋ細胞の感染後の両方の内在化ウイルスゲノムの量を示している。
【０１３４】
図１６のＡに示したように、細胞膜に結合した完全粒子のパーセンテージは野生型Ｈ−１Ｖと比較してＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶによる感染後には９．７倍高かったが、これはＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶがｗｔ  Ｈ−１ＰＶビリオンに比較して感染細胞の血漿膜で結合することにより感受性であることを指示している。
【０１３５】
図１６のＢに示したように、試験した全細胞溶解物中で、つまり試験した全インキュベーション時間で、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶと比較して有意に高い量のウイルスゲノムがＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶによる感染後に回収された。既に感染３０分後に、ほぼ９倍の増加が観察された。これらのデータは、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶと比較してＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶビリオンの上述した、より良好な結合効率と相関している。
【０１３６】
要するに、Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶの血漿膜での結合、および可能性のある結果として感染細胞の内側でのその取り込みは、野生型ウイルスに比較して有意に改善される。熱変性に対する上述したより高い感受性とともに増強された結合／取り込み（実施例１５、図１５）およびこの欠失変異体Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶ（Δヌクレオチド  ２０２２〜２１３５）の感染性子孫ビリオンのより早期／高速の核退出（実施例７、図６および実施例８、図７）をＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶウイルス粒子の一部の微細な修飾に帰せることができるかは、今後調査する。
【実施例１７】
【０１３７】
Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶゲノムの早期の複製および感染ＮＢ−３２４Ｋ細胞内の一本鎖ＤＮＡの高度の蓄積
ウイルス複製型の蓄積は、Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶまたはｗｔ  Ｈ−１ＰＶにより感染させたＮＢ−３２４Ｋ細胞由来の細胞抽出物を使用してサザンブロッティングアッセイによって分析した。図１７のＡは、細胞の感染がアッセイ中の二次感染を防止するために中和抗体の存在下で実施されたため、感染３時間、９時間、１２時間、１６時間および２４時間後の一次感染の結果としてのウイルス単量体複製型（ｍＲＦ）、二量体複製型（ｄＲＦ）の蓄積を示している。これらのウイルスＤＮＡ形各々のシグナル強度はＰｈｏｓｐｈｏ  Ｉｍａｇｅｒ分析によって定量し、図１７のＢは、感染後の指示時点でのこれらの形態各々のシグナル強度のＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶ対野生型の比率を示している。
【０１３８】
どちらのウイルスも全ウイルス複製型を蓄積することができた。しかし、これらの複製型の蓄積パターンは、Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶと比較してｗｔ  Ｈ−１ＰＶによる感染後に幾らか遅延した。
【０１３９】
全感染ＮＢ−３２４Ｋ細胞内では、より早期の３時間後の時点にウイルス複製型は検出できなかった。感染９時間後、ｍＲＦおよびｄＲＦはどちらも明白に視認することができ、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶに比較してＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶによる感染後にはより高い強度を伴った（図１７のＡ）。実際、Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶ  ｍＲＦおよびｄＲＦの蓄積におけるｗｔ  Ｈ−１ＰＶに比較した各々７倍および１１倍の増加は、感染９時間後に測定された（図１７のＢ）。感染１２時間後、Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶ  ｍＲＦおよびｄＲＦはｗｔ  Ｈ−１ＰＶ  ｍＲＦおよびｄＲＦと比較してどちらも依然として高量で、しかしより低い程度（５倍未満）で存在したが、ｄＲＦ分子のＮＳ１−依存性開裂の生成物であるｓｓＤＮＡの蓄積は、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶ  ｓｓＤＮＡの蓄積と比較して１９倍の増加に達するＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶ感染サンプル中で有意に検出可能になった。これらのデータは、感染９時間後のＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶ感染細胞中でのｗｔ  Ｈ−１ＰＶ感染細胞に比較して少なくとも感染１２時間後まで持続する強度の大きい複製活性を示している。
【０１４０】
感染後の後期の時点には、全３種の複製型は、両方の感染サンプル（図１７のＡ）中で明白に見ることができ、野生型に比較してＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶ複製型の４倍未満（感染１６時間後）および２倍未満（感染２０時間後）の上昇した蓄積を伴った。これらのデータは、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶ感染サンプル中の複製活性が感染１２時間〜１６時間後により強度になったが、それでも感染後の早期の時点に観察された強度に比較して、Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶサンプル中ほど高くなかった。
【０１４１】
要するに、欠失変異体Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶゲノム（Δヌクレオチド  ２０２２〜２１３５）の複製は、ＮＢ−３２４Ｋ細胞内のｗｔ  Ｈ−１ＰＶゲノム複製と比較してより早期に発生する。これらのデータは、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶと比較したＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶビリオンの上述した、より良好な結合、およびＮＢ−３２４Ｋ細胞内に進入するより良好な効率（実施例１６および図１６）ならびにＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶビリオンの熱変性に対する高い感受性（実施例１５、図１５）と一致している。
【実施例１８】
【０１４２】
Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶまたは野生型Ｈ−１ＰＶのいずれかを用いたＮＢ−３２４Ｋ細胞のトランスフェクション後の複製型の蓄積に差は見られない
Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶおよびｗｔ  Ｈ−１ＰＶ複製型の蓄積は、中和抗体の存在下でプラスミド構築体ｐＤｅｌＨ−１ＰＶもしくはｐｗｔＨ−１ＰＶを用いたヒトＮＢ−３２４Ｋ細胞のトランスフェクション後に評価し、その後にサザンブロッティングアッセイによるトランスフェクトサンプルの分析を実施した。この実験は、パルボウイルス生活環のいずれかの早期の過程の非存在下でのＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶおよびｗｔ  Ｈ−１ＰＶゲノムの複製活性を比較するために設計されたが、これは上述したように、特定細胞結合（取り込み）においてｗｔ  Ｈ−１ＰＶと比較してＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶを用いると強化されることが明らかになった（実施例１６および図１６）。図１８は、トランスフェクション１２時間、１６時間および２４時間後のウイルス単量体複製型（ｍＲＦ）および二量体複製型（ｄＲＦ）の蓄積を示している。
【０１４３】
図１８に示したように、ウイルスｍＲＦおよびｄＲＦ分子の外観および蓄積における有意差は、ｐｗｔＨ−１ＰＶと比較したプラスミド構築体ｐＤｅｌＨ−１ＰＶを用いたトランスフェクション後の早期の時点に観察された。ウイルスｍＲＦおよびｄＲＦ複製型はいずれもトランスフェクション１２時間後に検出できなかった。Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶおよびｗｔ  Ｈ−１ＰＶゲノム両方からのｍＲＦおよびｄＲＦはトランスフェクション１６時間後に可視できるようになり、それら両方の量はトランスフェクション２４時間後に有意に増加した。
【０１４４】
要するに、Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶゲノム自体の複製は早期には発生しない、および／またはｗｔ  Ｈ−１ＰＶゲノム複製に比較してトランスフェクトＮＢ−３２４Ｋ細胞内では強化されない。
【実施例１９】
【０１４５】
野生型Ｈ−１ＰＶ完全ビリオンの遊離に比較したトランスフェクトＮＢ−３２４Ｋ細胞の培地中でのＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶ完全ビリオンの増加した、および／またはより迅速な遊離
子孫ビリオンの遊離は、中和抗体の存在下（＋ＰＶ１）または非存在下（−ＰＶ１）においてｐＤｅｌＨ−１ＰＶまたはｐｗｔＨ−１ＰＶのいずれかを用いたＮＢ−３２４Ｋ細胞のトランスフェクション１０時間、１７時間および７２時間後に収集した細胞培養上清から観察した。ウイルスｓｓＤＮＡ分子は、Ｈｉｒｔ抽出によって上清サンプルから回収し、サザンブロッティング分析によって検出した。トランスフェクション７２時間後の上清サンプル中に存在した完全および感染粒子は、定量的リアルタイムＰＣＲによってウイルスゲノム（ｖｇ）の量およびプラークアッセイによってプラーク形成単位（ＰＦＵ）の量を各々測定し定量した。
【０１４６】
図１９は、トランスフェクション１０時間および１７時間後に上清サンプル中でｓｓｓＤＮＡは検出可能ではなかったことを示している。トランスフェクション７２時間後、ｓｓＤＮＡの検出可能な量は全試験上清サンプルから二次感染の発生を許容する中和抗体の非存在下で実施されたものに比較して二次感染を防止する中和抗体の存在下で実施されたトランスフェクションサンプルからはるかに低い程度で回収された。それでも両方の場合に、トランスフェクト２９３Ｔ細胞の上清から得られたＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶ子孫ｓｓＤＮＡのシグナル強度は、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶ子孫ｓｓＤＮＡのシグナル強度に比較して高かった。これらのデータは、Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶ子孫ビリオンの遊離がｗｔ  Ｈ−１ＰＶと比較して改良されることを示しており、これはウイルス生活環の早期の過程（細胞表面へのウイルス結合および内在化、ウイルスゲノムの脱カプシド化および転換）の非存在下でさえ生じる。
【０１４７】
さらに図１９に示したように、トランスフェクション７２時間後の上清中に存在するＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶ子孫ビリオンは、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶに比較した場合により低いＰ／Ｉ比を示した。実際、中和抗体の存在下で生成されたＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶ子孫ビリオンのＰ／Ｉ比は、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶと比較して２１分の１まで減少した。
【０１４８】
要するに、Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶ子孫ビリオンは、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶ子孫ビリオンと比較してトランスフェクト細胞の細胞培養培地中でより早期に、および／またはより優れた効率で遊離される。さらに、それらがトランスフェクションによって生成された場合でさえ、欠失変異体Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶ（Δヌクレオチド  ２０２２〜２１３５）の子孫ビリオンは、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶと比較して増強された感染性を示した。
【実施例２０】
【０１４９】
野生型Ｈ−１ＰＶおよび野生型ｈＨ−１ＰＶに比較したヒト２９３Ｔ細胞のトランスフェクションによって生成されるＤｅｌ  Ｈ−１ＰＶおよびＤｅｌ  ｈＨ−１ＰＶの増加した感染性
Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶ、Ｄｅｌ  ｈＨ−１ＰＶ、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶ、野生型ｈＨ−１ＰＶの粒子対感染性（Ｐ／Ｉ）比は、適切なプラスミド構築体によるヒト２９３Ｔ細胞のトランスフェクション後に生成し、トランスフェクション３日後に細胞ペレットから回収されたウイルスストックから決定した。各ウイルスストックについて、完全粒子の量は、ウイルス粒子含有ゲノムの数（１ｍＬ当たりのウイルスゲノム（ｖｇ）で与えられる）を決定するために、ストックのＤＮＡｓｅ処理およびアルカリ溶菌後に実施した定量的リアルタイムＰＣＲによって測定した。各ウイルスストックについて、感染粒子の量は、参照ＮＢ−３２４Ｋ細胞系内で完全粒子がプラークを形成する能力（１ｍＬ当たりのプラーク形成単位（ＰＦＵ）で与えられる）を決定するために、プラークアッセイによって測定した。
【０１５０】
図２０に示したように、Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶおよびＤｅｌ  ｈＨ−１ＰＶは、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶおよび野生型ｈＨ−１ＰＶよりも４．５分の１および５．８分の１のＰ／Ｉ比を示した。これは、より感染性の粒子が、ウイルスがそれらのゲノムのＮＳ−コーディング配列中での１１４ヌクレオチド長の欠失を含有する場合にヒト２９３Ｔ細胞のトランスフェクション後に生成されたウイルスストックによって生成されたことを示している。
【０１５１】
要するに、欠失変異体Ｄｅｌ  Ｈ−１ＰＶおよびＤｅｌ  ｈＨ−１ＰＶ（Δヌクレオチド  ２０２２〜２１３５）はどちらも、ｗｔ  Ｈ−１ＰＶおよびｈＨ−１ＰＶと比較してトランスフェクションによって生成された場合さえより優れた感染性を示す。
【０１５２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１１−６】
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【図１１−７】
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【図１１−８】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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