(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２〜２７のいずれか１つから選択される阻害性のペプチド配列を含んでいる、ペプチドである、ＪＮＫ阻害剤。
【請求項２】
配列番号８のペプチド配列を含んでいる、請求項１に記載のＪＮＫ阻害剤。
【請求項３】
トランスポータ配列を含んでいる、請求項１または２に記載のＪＮＫ阻害剤。
【請求項４】
上記阻害性のペプチド配列および上記トランスポータ配列は重なり合っている、請求項３に記載のＪＮＫ阻害剤。
【請求項５】
上記トランスポータ配列は、配列番号２８〜３０のいずれか１つにしたがう、Ｄ−およびＬ−アミノ酸が交互になっている配列を含んでいる、請求項３または４に記載のＪＮＫ阻害剤。
【請求項６】
上記トランスポータ配列は配列番号３１〜１７０のいずれか１つから選択される、請求項３〜５のいずれか１項に記載のＪＮＫ阻害剤。
【請求項７】
上記トランスポータ配列は、配列番号３１〜３４、４６、４７および５２〜１５１のいいずれか１つから選択される、請求項３〜６のいずれか１項に記載のＪＮＫ阻害剤。
【請求項８】
上記トランスポータ配列は、上記阻害性のペプチド配列のＣ末端またはＮ末端に直接に置かれている、請求項３〜７のいずれか１項に記載のＪＮＫ阻害剤。
【請求項９】
配列番号１７１〜１９０のいずれか１つにしたがう配列を含んでいる、請求項３〜８のいずれか１項に記載のＪＮＫ阻害剤。
【請求項１０】
配列番号１７２にしたがう配列を含んでいる、請求項３〜９のいずれか１項に記載のＪＮＫ阻害剤。
【請求項１１】
配列番号１７２の配列のみからなる、請求項１０に記載のＪＮＫ阻害剤。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＪＮＫ阻害剤を用いて非ヒトの動物を免疫する、方法であって、
抗体産生にとって好適な非ヒトの動物を、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＪＮＫ阻害剤と、接触させることを包含している、方法。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＪＮＫ阻害剤を認識するポリクローナル抗体を製造する方法であって、
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＪＮＫ阻害剤と、予め接触させられている、抗体産生にとって好適な非ヒトの動物から、上記ＪＮＫ阻害剤を認識するポリクローナル抗体を単離することを包含している、方法。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＪＮＫ阻害剤を認識する抗体を産生する細胞を単離する方法であって、
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＪＮＫ阻害剤と、予め接触させられている、抗体産生にとって好適な非ヒトの動物から、上記ＪＮＫ阻害剤を認識する上記抗体を産生する細胞を単離することを包含している、方法。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＪＮＫ阻害剤を認識するモノクローナル抗体を製造する、方法であって、
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＪＮＫ阻害剤を認識する抗体を、上記抗体を産生している細胞の細胞培養上清から単離することを包含している、方法。
【請求項１６】
配列番号２〜２７のいずれか１つから選択されるペプチドの少なくとも１つを認識し、Ｄ−アミノ酸の代わりにＬ−アミノ酸を有している当該ペプチドと同じペプチドを認識しない、抗体。
【請求項１７】
請求項１６に記載の抗体を産生する、細胞。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、酵素阻害の分野に関し、特にｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）の（ポリ）ペプチド阻害剤に関する。さらに、本発明は、当該（ポリ）ペプチド阻害剤に対する抗体を産生させる方法、ならびに当該抗体および当該抗体を産生する細胞に関する。
【０００２】
ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）は、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼのうちストレスによって活性化される群のメンバーである。これらのキナーゼは、細胞の増殖および分化の制御、ならびにより一般的に環境刺激に対する細胞の応答と関連付けられている。ＪＮＫのシグナル伝達経路は、環境ストレスに応じ、かついくつかの分類の細胞表面受容体の会合によって活性化される。これらの細胞表面受容体としては、サイトカイン受容体、サーペンタイン受容体および受容体チロシンキナーゼが挙げられ得る。哺乳類細胞において、ＪＮＫは、生物学的なプロセス（例えば発癌性のトランスフォーメーション）と関連付けられており、環境ストレスに対する適応応答を媒介している。また、ＪＮＫは、免疫反応の調節（免疫細胞の成熟および分化）、および免疫系による破壊について同定されている細胞におけるプログラム細胞死と関連している。マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）ｐ３８ａｌｐｈａは、ＪＮＫ−ｃ−Ｊｕｎ経路と拮抗することによって細胞の増殖を負に制御すると明らかにされた。よって、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）ｐ３８ａｌｐｈａは、正常細胞および癌細胞の増殖の抑制において活性であると考えられている（例えば、Hui et al., Nature Genetics, Vol 39, No. 6, June 2007を参照）。また、ｃ−ＪｕｎのＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）は、脊髄神経結紮（ＳＮＬ）によって生じる神経障害性の痛みに関与している。ＳＮＬは、持続的かつ緩やかなＪＮＫ（特にＪＮＫ１）の活性化を誘導し、ｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼの活性化は、ＳＮＬ後の脊髄ミクログリアに認められ、２１日目までにほぼ基底レベルまで低下した（Zhuang et al., The Journal of Neuroscience, March 29, 2006, 26(13):3551-3560)）。
【０００３】
従来技術において既に公知の、ＪＮＫのシグナル経路の阻害剤としては、例えば、上流キナーゼ阻害剤（例えばＣＥＰ−１３４７）、例えばプロテインキナーゼのＡＴＰ結合部位と競合することによって、キナーゼ活性に直接的に影響するＪＮＫの小さな化学的阻害剤（ＳＰ６００１２５およびＡＳ６０１２４５）、およびＪＮＫとその基質との間における相互作用のペプチド阻害剤が特に挙げられる（例えば、参照によって本明細書に援用されるKuan et al., Current Drug Targets - CNS & Neurological Disorders, February 2005, vol. 4, no. 1, pp. 63-67および国際公開第２００７／０３１２８０号公報を参照）。国際公開第２００７／０３１２８０号公報は、ＨＩＶ−ＴＡＴタンパク質の塩基性輸送配列に由来するいわゆるＴＡＴトランスポータ配列、およびＩＢ１の阻害性アミノ酸配列を含んでいる、細胞透過性の小さな融合ペプチドを開示している。
【０００４】
国際公開第２００７／０３１２８０号公報は、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ、本明細書の配列番号１９６）、およびＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１のレトロインベルソ配列であるＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｄｑｓｒｐｖｑｐｆｌｎｌｔｔｐｒｋｐｒｐｐｒｒｒｑｒｒｋｋｒｇ、本明細書の配列番号１９７）の２つの特定の配列を、特に開示している。ＨＩＶ  ＴＡＴ由来のトランスポータ配列によって、これらの融合ペプチドは標的細胞内により効率的に輸送され、それらはタンパク質分解性の分解を受けるまで有効性を維持する。
【０００５】
ＪＮＫのＡＴＰ非依存性のペプチド阻害剤は、通常、より特異的な阻害剤であるため、それらはＪＮＫの阻害を考える場合の第１の選択肢であることが多い。しかし、国際公開第２００７／０３１２８０号公報に開示されているペプチド阻害剤でさえ、最適ではない。例えば、Ｌアミノ酸のみからなる化合物Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（本明細書の配列番号１９６）は、速やかにタンパク質分解性に分解される。また、この問題を克服するために、国際公開第２００７／０３１２８０号公報の発明者らは、Ｄアミノ酸を含んでいるＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１（本明細書の配列番号１９７）を提案した。より詳細には、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１は、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１のレトロインベルソ配列を示している。しかし、Ｄ−アミノ酸の組み込みは、立体化学の変更が機能の消失を導き得るという事実のために、困難である。逆ペプチド配列においてではなく、Ｄ−アミノ酸のみの使用が、１つ以上のＤ−アミノ酸を元の配列に組み込むことと比べて、元の配列に対する許容可能な立体配座の類似物をより良好に生じ得るので、レトロインベルソ手法は、このリスクを低下させるために使用され得る。しかし、国際公開第２００７／０３１２８０号公報の場合、レトロインベルソ手法は、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１と比較して阻害能の著し低下をもたらした（図４を参照）。さらに、レトロインベルソペプチドは、タンパク質分解性の消化に対して極めて安定であり、例えば時間依存性実験における、制御消化は非常に困難であるという結果をもたらした。
【０００６】
したがって、当該分野において、例えばＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（本明細書の配列番号１９６）より安定なＪＮＫのペプチド阻害剤に対する要求が依然としてある。一方で、例えばＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１（本明細書の配列番号１９７）より活性であり、より低い安定性のＪＮＫのペプチド阻害剤に対する要求がある。
【０００７】
したがって、本発明によってが解決されるべき課題は、好ましくは国際公開第２００／０３１２８０号公報に開示されているＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１よりタンパク質分解性の消化に低い感受性を示し、同時に、好ましくは国際公開第２００７／０３１２８０号公報に開示されているＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１よりタンパク質分解性の消化に高い感受性を示すか、および／またはＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１より活性であるＪＮＫの（ペプチド）阻害剤を提供することである。
【０００８】
本発明の目的は、添付の特許請求の範囲に記載されている主題を用いて、本発明者によって達成されている。
【０００９】
以下に添付の図面の簡単な説明が示されている。図面は、本発明をより詳細に例示することが意図されている。しかし、図面は、本発明の内容を限定するとは決して意図されていない。
【００１０】
図１：インビトロのAlphaScreenアッセイ（増幅ルミネセンス近接ホモジニアスアッセイ（Amplified Luminescence Proximity Homogeneous−Screen Assay））によって調べられた、本発明に係るいくつかのＪＮＫ阻害剤の阻害作用を示す図。図１Ａ：配列番号１９３、２、３、５、６および７によるＪＮＫ１の阻害。図１Ｂ：配列番号１９３、２、３、５、６および７によるＪＮＫ２の阻害。図１Ｃ：配列番号１９３、２、３、５、６および７によるＪＮＫ３の阻害。
【００１１】
図２：本発明に係るいくつかのＪＮＫ阻害剤（配列番号１９３、２、３、５、６および７）の阻害作用を示す表。示されているのはｎＭ範囲におけるＩＣ５０値、それぞれの平均の標準誤差および実施した実験の回数（ｎ）である。
【００１２】
図３：本発明に係るいくつかのＪＮＫ阻害剤の阻害作用を示す図であり、当該ＪＮＫ阻害剤は、ＪＮＫ阻害性の（ポリ）ペプチド配列およびトランスポータ配列を含んでいる融合タンパク質である。上記ＪＮＫ阻害剤の阻害作用は、インビトロのAlphaScreenアッセイ（増幅ルミネセンス近接ホモジニアスアッセイ）によって決定された。図３Ａ：配列番号１９４、１９５、１７２、２００、４６、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１および１９７によるＪＮＫ１の阻害。図３Ｂ：配列番号１９４、１９５、１７２、２００、４６、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１および１９７によるＪＮＫ２の阻害。図３Ｃ：配列番号１９４、１９５、１７２、２００、４６、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１および１９７によるＪＮＫ３の阻害。図３Ｄ：配列番号１９４、１９５、１７２、２００、４６、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０および１９７によるＪＮＫ１の阻害。図３Ｅ：配列番号１９４、１９５、１７２、２００、４６、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０および１９７によるＪＮＫ２の阻害。図３Ｆ：配列番号１９４、１９５、１７２、２００、４６、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０および１９７によるＪＮＫ３の阻害。
【００１３】
図４：本発明に係るいくつかのＪＮＫ阻害剤の阻害作用を示す表であり、当該ＪＮＫ阻害剤は、ＪＮＫ阻害性の（ポリ）ペプチド配列および輸送配列を含んでいる融合タンパク質である。示されているのは、ｎＭ範囲におけるＩＣ５０値、平均の標準誤差（ＳＥＭ）および実施された実験の回数（ｎ）である。
【００１４】
図５：配列番号１７２、１９６および１９７を有しているＪＨＫ阻害剤の、５０％ヒト血清における安定性。配列番号１９６を有しているＪＮＫ阻害剤は、６時間以内に完全に分解されてアミノ酸残基になった（Ａ）。配列番号１７２を有しているＪＮＫ阻害剤は、１４日後にようやく完全に分解された（Ｂ）。配列番号１９７を有しているＪＮＫ阻害剤は、３０日まで安定であった（Ｂ）。
【００１５】
図６：配列番号３０に示されるようなＤ−アミノ酸／Ｌ−アミノ酸パターンを有しているＴＡＴ由来のトランスポータコンストラクトを用いた内在化実験を示す。分析されたトランスポータ配列は、配列番号５２〜９４、４５、４７、４６、４３および９９に示す配列（図６ａ）、ならびに配列番号１００〜１４７（図６ｂ）に対応している。図から明らかなように、コンセンサス配列ｒＸＸＸｒＸＸＸｒ（配列番号３１）を有しているすべてのトランスポータは、Ｌ−ＴＡＴトランスポータ（配列番号４３）より高い内在化能を示した。Ｈｅｌａ細胞を、１０ｍＭのトランスポータのそれぞれとともに、９６ウェルプレートにおいて２４時間にわたって培養した。細胞を、それから酸性緩衝液（０．２Ｍのグリシン、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ３．０）を用いて２回にわたって洗浄し、ＰＢＳを用いて２回にわたって洗浄した。細胞を、ＲＩＰＡ溶解緩衝液の添加によって破砕した。内在化したペプチドの相対量を、それから各抽出物の蛍光強度の読み取り（Fusion Alphaプレートリーダ、PerkinElmer）、バックグラウンドの減算によって決定した。
【００１６】
図７：配列番号１７２の配列を有しているＪＮＫ阻害剤は、ＴＨＰ１−ＰＭＡ−分化されたマクロファージにおけるＬＰＳに誘導されるサイトカインおよびケモカインの放出を阻害する。図７Ａ：ＴＮＦ放出（ＴＨＰ１ｐｍａ  ６時間  ３ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ）。図７Ｂ：ＴＮＦａ放出（ＴＨＰ１ｐｍａ  ６時間  １０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ）。図７Ｃ：ＩＬ６放出（ＴＨＰ１ｐｍａ  ６時間  １０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ）。図７Ｄ：ＭＣＰ１放出（ＴＨＰ１ｐｍａ  ６時間  ３ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ）。
【００１７】
図８：配列番号１７２の配列を有しているＪＮＫ阻害剤は、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（配列番号１９７）、ｄＴＡＴ（配列番号４５）およびＳＰ６００１２５より高い作用強度を有して、ＴＨＰ１−分化されたマクロファージにおけるＬＰＳに誘導されるＩＬ６放出を阻害する。ＬＰＳは６時間にわたって加えられていた（１０ｎｇ／ｍｌ）。
【００１８】
図９：配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤は、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（配列番号１９７）、ｄＴＡＴ（配列番号４５）およびＳＰ６００１２５より高い作用強度を有して、ＴＨＰ１−分化されたマクロファージにおけるＬＰＳに誘導されるＴＮＦα放出を阻害する。ＬＰＳは６時間にわたって加えられていた（１０ｎｇ／ｍｌ）。
【００１９】
図１０：配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤は、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（配列番号１９７）およびＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（配列番号１９６）より高い作用強度を有して、ＰＭＡ−分化されたマクロファージにおけるＬＰＳに誘導されるＩＬ−６放出を阻害する。ＬＰＳは６時間にわたって加えられていた（１０ｎｇ／ｍｌ）。
【００２０】
図１１：配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤は、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（配列番号１９７）およびＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（配列番号１９６）より高い作用強度を有して、ＰＭＡ−分化されたマクロファージにおけるＬＰＳに誘導されるＴＮＦα放出を阻害する。
【００２１】
図１２：配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤は、ラットの初代の全血細胞におけるＬＰＳに誘導されるＴＮＦα放出を、３ｎｇ／ｍｌにおいて阻害する。示されているのは、異なる濃度のＬＰＳ（ｎｇ／ｍｌ）における、対照、１μＭの配列番号１７２、３μＭの配列番号１７２、および１０μＭの配列番号１７２である。
【００２２】
図１３：配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤は、ＰＭＡ／イオノマイシンに応答した初代のヒトＴ細胞によるＩＬ２分泌を阻害する。
【００２３】
図１４：配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤は、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激に応答した初代のヒトＴ細胞によるＩＬ２分泌を阻害する。使用されたＪＮＫ阻害剤は、配列番号１７２および１９７によって示されている。
【００２４】
図１５：ラットのリンパ節から精製された初代のＴ細胞におけるＣＤ３／ＣＤ２８に誘導されるＬ−２放出の、配列番号１７２を有しているＪＮＫ阻害剤による用量依存的な阻害。対照のラットは屠殺され、リンパ節が回収された。Ｔ細胞を、さらに精製し（磁気的なネガティブセレクションを用いて）、２０００００細胞／ウェルにおいて９６ウェルプレートに播いた。細胞を、抗ラットＣＤ３抗体（２μｇ／ｍｌ）および抗ラットＣＤ２８抗体（２μｇ／ｍｌ）を用いて処理した。配列番号１７２を有しているＪＮＫ阻害剤を、ＣＤ３／ＣＤ２８処理の１時間前に培養物に加え、ＩＬ−２放出を、処理後の２４時間の上清において評価した。
【００２５】
図１６：ラットのリンパ節から精製された初代のＴ細胞におけるＣＤ３／ＣＤ２８に誘導されるＬ−２放出の用量依存的阻害。いくつかのＪＮＫ阻害剤（すなわち配列番号１７２、１９７およびＰ６００１２５）の比較。
【００２６】
図１７：ＰＭＡおよびイオノマイシンを用いて刺激したラット全血におけるＩＬ−２放出の用量依存的阻害。ＰＭＡ＋イオノマイシンを用いた刺激の１時間前に、配列番号１７２を有しているＪＮＫ阻害剤を３つの異なる濃度（すなわち、１μＭ、３μＭおよび１０μＭ）において加えた。３種の用量の活性化剤は４時間にわたって加えられていた（２５／５００ｎｇ／ｍＬ、５０／７５０ｎｇ／ｍＬおよび５０／１０００ｎｇ／ｍＬ）。ＩＬ−２放出を上清において評価した。配列番号１７２を有している１０μＭのＪＮＫ阻害は、試験された３つの活性化剤濃度において、ＰＭＡ−ｉｏｎｏに誘導されるＩＬ−２放出を効率的に低下させた。
【００２７】
図１８：ヒト全血におけるＪＮＫ阻害およびＩＬ−６放出。ＬＰＳ（０．０２ｎｇ／ｍＬ）を用いた４時間にわたる全血刺激の１時間前に、配列番号１７２を有しているＪＮＫ阻害剤を、３つの異なる濃度（すなわち、１μＭ、３μＭおよび１０μＭ）において加えた。配列番号１７２を有しているＪＮＫ阻害剤は、ＬＰＳに誘導されるＩＬ−６放出を用量依存的に低下させた。
【００２８】
図１９：ヒト全血におけるＪＮＫ阻害およびＩＬ−２放出。ＰＭＡ＋イオノマイシン（２５／７００ｎｇ／ｍＬ、５０／８００ｎｇ／ｍｌおよび５０／１０００ｎｇ／ｍＬ）を用いた４時間にわたる全血刺激の１時間前に、配列番号１７２を有しているＪＮＫ阻害剤を、異なる３つの濃度（すなわち、１μＭ、３μＭおよび１０μＭ）において加えた。配列番号１７２を有しているＪＮＫ阻害剤は、ＰＭＡ＋イオノマイシンに誘導されるＩＬ−２放出を用量依存的に低下させた。
【００２９】
図２０：ヒト全血におけるＪＮＫ阻害およびＩＦＮ−γ放出。ＰＭＡ＋イオノマイシン（２５／７００ｎｇ／ｍＬ、５０／８００ｎｇ／ｍｌおよび５０／１０００ｎｇ／ｍＬ）を用いた４時間にわたる全血刺激の１時間前に、配列番号１７２を有しているＪＮＫ阻害剤を、異なる３つの濃度（すなわち、１μＭ、３μＭおよび１０μＭ）において加えた。配列番号１７２を有しているＪＮＫ阻害剤は、ＰＭＡ＋イオノマイシンに誘導されるＩＦＮ−γ放出を用量依存的に低下させた。
【００３０】
図２１：ヒト全血におけるＪＮＫ阻害およびＩＦＮ−α放出。ＰＭＡ＋イオノマイシン（２５／７００ｎｇ／ｍＬ、５０／８００ｎｇ／ｍｌおよび５０／１０００ｎｇ／ｍＬ）を用いた４時間にわたる全血刺激の１時間前に、配列番号１７２を有しているＪＮＫ阻害剤を、異なる３つの濃度（すなわち、１μＭ、３μＭおよび１０μＭ）において加えた。配列番号１７２を有しているＪＮＫ阻害剤は、ＰＭＡ＋イオノマイシンに誘導されるＩＦＮ−α放出を用量依存的に低下させた。
【００３１】
図２２：ヒト全血におけるＪＮＫ阻害およびＩＦＮ−α放出。ＰＨＡ−Ｌ（５μｇ／ｍＬ）を用いた３日にわたる全血刺激の１時間前に、配列番号１７２を有しているＪＮＫ阻害剤を、異なる３つの濃度（すなわち、１μＭ、３μＭおよび１０μＭ）において加えた。配列番号１７２を有しているＪＮＫ阻害剤は、ＰＨＡ−Ｌに誘導されるＩＦＮ−α放出を用量依存的に低下させた。
【００３２】
図２３：ヒト全血におけるＪＮＫ阻害およびＩＬ−２放出。ＰＨＡ−Ｌ（５μｇ／ｍＬ）を用いた３日にわたる全血刺激の１時間前に、配列番号１７２を有しているＪＮＫ阻害剤を、異なる３つの濃度（すなわち、１μＭ、３μＭおよび１０μＭ）において加えた。配列番号１７２を有しているＪＮＫ阻害剤は、ＰＨＡ−Ｌに誘導されるＩＬ−２放出を用量依存的に低下させた。
【００３３】
図２４：ヒト全血におけるＪＮＫ阻害およびＴＦＮ−α放出。ＣＤ３抗体＋／−ＣＤ２８抗体（２μｇ／ｍＬ）を用いた３日にわたる全血刺激の１時間前に、配列番号１７２を有しているＪＮＫ阻害剤を、異なる３つの濃度（すなわち、１μＭ、３μＭおよび１０μＭ）において加えた。配列番号１７２を有しているＪＮＫ阻害剤は、ＣＤ３抗体／ＣＤ２８抗体に誘導されるＴＦＮ−α放出を用量依存的に低下させた。
【００３４】
〔ＪＮＫ阻害剤〕
第１の局面において、本発明は、阻害性の（ポリ）ペプチド配列を含んでいるＪＮＫ阻害剤に関する。当該阻害性の（ポリ）ペプチド配列は、以下の一般式：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｒ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｌ−Ｘ７−Ｌ−Ｘ８（配列番号１）
にしたがう。当該一般式において、
Ｘ１は、Ｒ、Ｐ、Ｑおよびｒのアミノ酸から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ２は、Ｒ、Ｐ、Ｇおよびｒのアミノ酸から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ３は、Ｋ、Ｒ、ｋおよびｒのアミノ酸から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ４は、ＰおよびＫから選択されるアミノ酸であり、
Ｘ５は、Ｔ、ａ、ｓ、ｑ、ｋのアミノ酸から選択されるアミノ酸であるか、または存在せず、
Ｘ６は、Ｔ、ＤおよびＡのアミノ酸から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７は、Ｎ、ｎ、ｒおよびＫのアミノ酸から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ８は、Ｆ、ｆおよびｗのアミノ酸から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７およびＸ８からなる群から選択されるアミノ酸の少なくとも１、２、３、４、５または６つがＤ−アミノ酸であることを前提としており、好ましくは、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７およびＸ８からなる群から選択されるアミノ酸の少なくとも１、２、３または４つがＤ−アミノ酸であることを前提としている。
【００３５】
本発明に係るＪＮＫ阻害剤の阻害性の（ポリ）ペプチド配列は、Ｌ−アミノ酸を含んでおり、ほとんどの実施形態においてＤ−アミノ酸を含んでいる。特に断りがない限り、本明細書において、Ｌ−アミノ酸残基は大文字として示されており、Ｄ−アミノ酸残基は小文字として示されている。グリシンは、大文字または小文字において示され得る（Ｄ−またはＬ−グリシンがないため）。特に断りがない限り、本明細書に開示されているアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端（左から右）に、常に示されている。所定のアミノ酸配列は、Ｃ末端および／またはＮ末端において、修飾され得るか、または未修飾であり得る（例えば、Ｃ末端におけるアセチル化、および／またはＮ末端におけるアミド化もしくはシステアミドを用いた修飾）。本明細書に開示されているアミノ酸配列のＣ末端および／またはＮ末端における、起こり得る全体的に任意のそのような修飾は、明瞭さを目的として、特に示されていない。
【００３６】
本発明のＪＮＫ阻害剤は、ｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）の（ポリ）ペプチド阻害剤である。ＪＮＫ阻害剤は、ｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）のキナーゼ活性を阻害する。すなわち、ＪＮＫ阻害剤は、ＪＮＫ基質（例えばｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２およびＥｌｋ−１の１つ以上）のリン酸化の程度を抑えるか、または低下させる。本明細書に使用されるとき、用語“阻害剤”が、ｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）分子および／またはキナーゼ活性を不可逆的に破壊する化合物を包含していないことを、当業者は理解する。さらに、本明細書に使用されるとき、用語“ＪＮＫ活性を阻害すること”は、ｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）のキナーゼ活性の阻害を指す。
【００３７】
さらに、本明細書に使用されるとき、ＪＮＫ阻害剤は、アミノ酸の重合体の機能的な単位（すなわち（ポリ）ペプチド配列）の少なくとも１つを含んでいる。さらに、アミノ酸重合体のこの機能的な単位の少なくとも１つは、ＪＮＫ活性の阻害をもたらす。阻害性の（ポリ）ペプチド配列のアミノ酸単量体は、通常、ペプチド結合を介して互いに連結されているが、当該ペプチド結合または側鎖残基の（化学）修飾は、阻害活性（ＪＮＫ活性の阻害）が完全に消失しない（すなわち生じた化学修飾物が、本明細書において機能的に規定されているようなＪＮＫ阻害剤として依然としてみなされ得る）限り許容され得る。用語“（ポリ）ペプチド”は、（ポリ）ペプチド単位の長さを限定していると解釈されるべきではない。好ましくは、本発明のＪＮＫ阻害剤の阻害性の（ポリ）ペプチド配列の長さは、５００、４９０、４８０、４７０、４６０、４５０、４４０、４３０、４２０、４１０、４００、３９０、３８０、３７０、３６０、３５０、３４０、３３０、３２０、３１０、３００、２９０、２８０、２７０、２６０、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３または１２のアミノ酸長未満である。好ましくは、上記阻害性の（ポリ）ペプチド配列は１０以上のアミノ酸残基を含んでおり、より好ましくは１１以上のアミノ酸残基を含んでいる。
【００３８】
さらに、本発明の“ＪＮＫ阻害剤”はＪＮＫ活性を阻害する。例えば、ＪＮＫ阻害剤は、ｃ−Ｊｕｎ基質（配列番号１９８）のヒトＪＮＫに媒介されるリン酸化の阻害に対して、以下のＩＣ５０値を示す。当該ＩＣ５０値は、
（ａ）ヒトＪＮＫ１の阻害に対する、３０００ｎＭ未満、より好ましくは２０００ｎＭ未満、さらに好ましくは１０００ｎＭ未満、さらに好ましくは５００ｎＭ未満、さらに好ましくは２５０ｎＭ未満、さらに好ましくは２００ｎＭ未満、さらに好ましくは１５０未満、さらに好ましくは１００ｎＭ未満、
（ｂ）ヒトＪＮＫ２の阻害に対する、３０００ｎＭ未満、より好ましくは２０００ｎＭ未満、さらに好ましくは１０００ｎＭ未満、さらに好ましくは５００ｎＭ未満、さらに好ましくは２５０ｎＭ未満、さらに好ましくは２００ｎＭ未満、さらに好ましくは１５０未満、さらに好ましくは１００ｎＭ未満、および／または
（ｃ）ヒトＪＮＫ３の阻害に対する、３０００ｎＭ未満、より好ましくは２０００ｎＭ未満、さらに好ましくは１０００ｎＭ未満、さらに好ましくは５００ｎＭ未満、さらに好ましくは２５０ｎＭ未満、さらに好ましくは２００ｎＭ未満、さらに好ましくは１５０未満、さらに好ましくは１００ｎＭ未満である。
【００３９】
いくつかの用途において、上記阻害剤は、上述の定義付けにしたがってヒトＪＮＫ２および／またはヒトＪＮＫ３を阻害するが、上述の定義付けにしたがってＪＮＫ１を阻害しないことが好ましい。
【００４０】
ＪＮＫ活性が阻害されているか否かは、当業者によって容易に評価され得る。当該分野において公知のいくつかの手法がある。一例は、このような判断方法の一例として、放射性キナーゼアッセイまたは非放射性キナーゼアッセイ（例えば、Alphaスクリーン試験；例えばGuenat et al. J Biomol Screen, 2006; 11: pages 1015-1026を参照）である。
【００４１】
したがって、本発明に係るＪＮＫ阻害剤は、例えば、配列番号２〜２７のいずれかにしたがう阻害性の（ポリ）ペプチド配列を含んでいる（表１を参照）。
【００４２】
【表１】
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【００４３】
また、本発明に係るＪＮＫ阻害剤は、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、さらに好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも６５％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を、配列番号１〜２７から選択される配列（特に配列番号８）と共有している阻害性の（ポリ）ペプチド配列を含んでいるＪＮＫ阻害剤（バリアント）であり得る。配列番号１〜２７から選択されるそれぞれの配列に対して、当該阻害性の（ポリ）ペプチド配列は、
（ａ）４位におけるＬ−アルギニン（Ｒ）残基を保持しており、
（ｂ）８位および１０位（配列番号２５〜２７に関する７位および９位）における２つのＬ−アルギニン（Ｒ）残基を保持しており、
（ｃ）配列番号１のＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７およびＸ８からなる群から選択されるアミノ酸に対応するそれぞれ位置ならびに配列番号２〜２７におけるそれぞれの位置において、１、２、３、４、５または６つのＤ−アミノ酸（より好ましくは配列番号１のＸ３、Ｘ５、Ｘ７およびＸ８からなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置ならびに配列番号２〜２７におけるそれぞれの位置において、１、２、３または４つのＤ−アミノ酸）を示しており、
（ｄ）依然としてＪＮＫ活性を示す（すなわち、本明細書に定義付けられているようなＪＮＫ阻害剤である）ことを前提としている。
【００４４】
本明細書に開示されているバリアント（特に、配列番号１〜２７から選択される配列と、上述の定義の範囲内において配列同一性の特定の程度を共有している阻害性の（ポリ）ペプチド配列を含んでいるＪＮＫ阻害剤バリアント）は、基準配列と１００％未満の配列同一性を好ましく共有している。
【００４５】
上記定義付けに鑑み、かつ明瞭さを目的として、配列番号１〜２７を含んでいるＪＮＫ阻害剤のバリアントにおいて変更され得ない残基（上記定義付けの（ａ）および（ｂ）を参照）は、表１において下線が付されている。
【００４６】
同一ではないアミノ酸は、保存的なアミノ酸置換の結果であることが好ましい。
【００４７】
本明細書に使用されるとき、保存的なアミノ酸置換は、一群に属するメンバー間における置換が分子の生物学的な活性を保存するような、十分に類似した生理化学的な特性を有している一群の範囲にあるアミノ酸残基を包含している（例えば、Grantham, R. (1974), Science 185, 862-864を参照）。保存的なアミノ酸置換は、アミノ酸が同じ分類のアミノ酸（例えば、塩基性アミノ酸、酸性アミノ酸、極性アミノ酸、脂肪族の側鎖を有しているアミノ酸、正または負に帯電している側鎖を有しているアミノ酸、芳香族基を側鎖に有しているアミノ酸、側鎖が水素結合の一部になり得る（例えば、水酸基などを有している側鎖）アミノ酸）に由来するアミノ酸置換であることが好ましい。保存的な置換は、例えば、塩基性アミノ酸残基（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）を他の塩基性アミノ酸残基に置換する場合、脂肪族アミノ酸残基（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ）を他の脂肪族アミノ酸残基に置換する場合、芳香族アミノ酸残遺（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）を他の芳香族アミノ酸残基に置換する場合、スレオニンをセリンに置換する場合、またはロイシンをイソロイシンに置換する場合である。さらなる保存的なアミノ酸置換は、当業者にとって公知である。異性体の形態は好ましく保持されるべきである。例えば、ＫはＲまたはＨに好ましく置換され、ｋはｒおよびｈに好ましく置換される。
【００４８】
ＪＮＫ阻害剤のバリアントにとっての上述の定義付けの範囲にある考えられる他の置換は、例えば
（ａ）配列番号１のＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７および／またはＸ８の１または２つ以上、または配列番号２〜２７から選択されるそれぞれの配列内にある対応する位置が、Ａまたはａに置換されている場合；
（ｂ）配列番号１のＸ１もしくはＸ８、または配列番号２〜２７から選択されるそれぞれの配列内にある対応する位置が欠失している場合；
（ｃ）配列番号１のＸ５、または配列番号２〜２７から選択される配列内にある対応する位置が、Ｅ、Ｙ、Ｌ、Ｖ、ＦまたはＫである場合；
（ｄ）配列番号１のＸ５、または配列番号２〜２７から選択される配列内にある対応する位置が、Ｅ、Ｌ、Ｖ、ＦまたはＫである場合；または
（ｅ）配列番号１のＸ１、Ｘ２およびＸ３のうちの１、２または３つ、または配列番号２〜２７から選択される配列内にある対応する位置が、中性アミノ酸である場合である。
【００４９】
本明細書に使用されるとき、用語“配列同一性の％”は、以下のように理解される。比較されるべき２つの配列は、これらの配列の間における最大の相関を示すように整列化される。これは、整列化の程度を上昇させるために、一方または両方の配列に“ギャップ”を挿入することを包含し得る。同一性の％は、それから比較されるべき配列のそれぞれの全長にわたって（いわゆる全体的な整列化）決定され得、同じか、もしくは同様の長さ、またはより短い限定された長さの配列にとって特に好適である同一性の％が決定され得（いわゆる局所的な整列化）、不揃いの長さの配列にとってより好適である同一性の％が決定され得る。以上を鑑みて、クエリアミノ酸配列に対して例えば少なくとも９５％の“配列同一性”を有しているアミノ酸配列は、対照のアミノ酸配列がクエリアミノ酸配列のそれぞれ１００アミノ酸ごとに５アミノ酸以下の変更を含み得る場合を除いて、対象のアミノ酸配列の配列がクエリ配列と同一であることを意味すると、意図されている。言い換えると、クエリアミノ酸配列と少なくとも９５％同一な配列を有しているアミノ酸配列を得るために、対象の配列におけるアミノ酸残基の５％（１００分の５）以下は、他のアミノ酸を挿入され得るか、当該アミノ酸を用いて置換され得るか、または欠失させられ得る。配列同一性を決定するために、Ｌ−アミノ酸のＤ−アミノ酸への置換（およびその逆）は、非常に類似しているアミノ酸のＤ異性体（またはＬ異性体）に過ぎなくても、同一ではない残基を生じるとみなされる。
【００５０】
２つ以上の配列の同一性および相同性を比較する方法は、当該技術分野において公知である。２つの配列が同一である割合（％）は、例えば、数学アルゴリズムを用いることによって決定され得る。使用され得る数学アルゴリズムの好適な例は、Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90:5873-5877のアルゴリズムがあるが、これに限定されない。当該アルゴリズムは、ワールドワイドウェブサイトncbi.nlm.nih.govにおけるＮＣＢＩのホームページを介してアクセス可能なプログラムのＢＬＡＳＴファミリー（例えば、ＢＬＡＳＴプログラムまたはＮＢＬＡＳＴプログラム）（Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410またはAltschul et al. (1997), Nucleic Acids Res, 25:3389-3402を参照）、およびＦＡＳＴＡ（Pearson (1990), Methods Enzymol. 183, 63-98；Pearson and Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 85, 2444-2448）に組み込まれている。これらのプログラムにより、ある程度まで他の配列と同一である配列は、これらのプログラムによって同定され得る。さらに、Wisconsin Sequence Analysis Package Ver 9.1（Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Res., 387-395）（例えば、ＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰ）は、２つのポリペプチド配列の間における同一性の％を決定するために使用され得る。ＢＥＳＴＦＩＴは、“局所的な相同性”アルゴリズム（Smith and Waterman (1981), J. Mol. Biol. 147, 195-197）を使用しており、２つの配列間における類似性が最大の領域を１つ見出す。
【００５１】
当然、本発明に係るＪＮＫ阻害剤は、本明細書に規定されているようなＪＮＫの阻害能を消失しない限り、上述の阻害性の（ポリ）ペプチド配列だけでなく、さらなる配列、ドメイン、標識（例えば、蛍光標識または放射性標識）、エピトープなどを含み得る。また、本発明に係るＪＮＫ阻害剤はトランスポータ配列を含み得る。本明細書に使用されるとき、“トランスポータ配列”は、トランスポータ配列をともなっている分子の、生体膜を越える転位をもたらす（ポリ）ペプチド配列である。したがって、トランスポータ配列を含んでいる本発明に係るＪＮＫ阻害剤は、生体膜を越えて好ましく転位可能である。したがって、本発明に係るそのようなＪＮＫ阻害剤は、細胞、細胞の小区画、および／または細胞の核へ容易に進入し得る。
【００５２】
トランスポータ配列は、ＪＮＫ阻害剤の阻害性の（ポリ）ペプチド配列に対して、例えばＮ末端またはＣ末端に対して（例えば直接的に）連結され得る。また、トランスポータ配列および阻害性の（ポリ）ペプチド配列は、互いに間隔を空けて配置され得る。例えば、トランスポータ配列および阻害性の（ポリ）ペプチド配列は、介在配列によって隔てられ得る。また、トランスポータ配列は、ＪＮＫ阻害剤より複雑な分子である（例えば、いくつかのドメインを含んでおり、多量体の抱合物である）場合に特に、ＪＮＫ阻害剤における阻害性の（ポリ）ペプチド配列とまったく異なる場所に配置され得ることが、意図されている。また、上記ＪＮＫ阻害活性が維持される限り、トランスポータ配列および阻害性の（ポリ）ペプチド配列は、重なり合ってもよいことが意図されている。このような重なり合いの例は以下においてさらに説明されている。
【００５３】
本発明のＪＮＫ阻害剤とともに使用するためのトランスポータ配列は、ＨＩＶ  ＴＡＴ（ＨＩＶ）（例えば、未変性のタンパク質（例えば、参照によって本明細書に援用される米国特許第５，８０４，６０４号および米国特許第５，６７４，９８０号に開示されているようなＴＡＴタンパク質など））、ＨＳＶ  ＶＰ２２（Herpes simplex）（例えば、国際公開第９７／０５２６５号公報およびElliott and O'Hare, Cell 88 : 223-233 (1997)に記載されている）、非ウイルスタンパク質（Jackson et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10691-10695 (1992)）、トランスポータ配列（アンテナペディア（特にDrosophila antennapedia）に由来するトランスポータ配列（例えば、それらのアンテナペディアキャリア配列）、ＦＧＦ、ラクトフェリンなど、または塩基性ペプチドに由来するトランスポータ配列（例えば、５〜１５アミノ酸、好ましくは１０〜１２アミノ酸の長さを有しており、少なくとも８０％、より好ましくは８５％、さらに９５％の塩基性アミノ酸（例えば、アルギニン、リジンおよび／またはヒスチジン）を含んでいるペプチド））から選択され得るが、これらに限定されない。また、本発明のＪＮＫ阻害剤とともに使用するためのトランスポータ配列は、アルギニンリッチペプチド配列（例えば、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（Ｒ９；配列番号１５２）、ＲＲＲＲＲＲＲＲ（Ｒ８；配列番号１５３）、ＲＲＲＲＲＲＲ（Ｒ７；配列番号１５４）、ＲＲＲＲＲＲ（Ｒ６；配列番号１５５）、ＲＲＲＲＲ（Ｒ５；配列番号１５６）など）、ＶＰ２２、ＰＴＤ−４タンパク質もしくはペプチド、ＲＧＤ−Ｋ１６、ＰＥＰＴ１／２もしくはＰＥＰＴ１／２タンパク質もしくはペプチド、ＳｙｎＢ３もしくはＳｙｎＢ３タンパク質もしくはペプチド、Ｐ２１由来のタンパク質もしくはペプチド、またはＪＮＫ１タンパク質もしくはペプチドから選択され得る。
【００５４】
本発明のＪＮＫ阻害剤における使用のためのトランスポータ配列は、特に、ＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質に由来する塩基性トランスポータ配列であるが、これらに限定されない。好ましくは、ＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質の塩基性トランスポータ配列は、例えば、米国特許第５，８０４，６０４号および米国特許第５，６７４，９８０号（参照によって本明細書に援用される）に記載ような、ヒト免疫不全ウイルスのＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質に由来する配列を含み得る。これに関連して、全長のＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質は、ＨＩＶ  ＴＡＴ遺伝子の２つのエクソンにコードされている８６アミノ酸残基を含んでいる。ＴＡＴの１〜７２位のアミノ酸はエクソン１にコードされており、７３〜８６位のアミノ酸はエクソン２にコードされている。全長のＴＡＴタンパク質は、２つのリジンおよび６つのアルギニンを含んでいる塩基性領域（４９〜５７位のアミノ酸）、および７つのシステイン残基を含んでいるシステインリッチ領域（２２〜３７位のアミノ酸）によって特徴付けられる。上記塩基性領域（すなわち４９〜５７位のアミノ酸）は、核局在に重要であると考えられていた（Ruben, S. et al., J. Virol. 63: 1-8 (1989); Hauber, J. et al., J. Virol. 63 1181-1187 (1989)）。システインリッチ領域は、インビトロにおいて金属によって連結されている二量体の形成を媒介しており（Frankel, A. D. et al, Science 240: 70-73 (1988); Frankel, A. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 6297-6300 (1988)）、転写促進因子の活性にとって必須である（Garcia, J. A. et al., EMBO J. 7: 3143 (1988); Sadaie, M. R. et al., J. Virol. 63:1 (1989)）。他の調節タンパク質と同様に、Ｎ末端領域は、細胞内プロテアーゼからの保護に関与している（Bachmair, A. et al., Cell 56: 1019-1032 (1989)）。本発明のＪＮＫ阻害剤における使用にとって好ましいＴＡＴトランスポータ配列は、ＴＡＴの塩基性領域のアミノ酸（天然に存在するＴＡＴタンパク質の４９〜５７位のアミノ酸）の存在；ＴＡＴのシステインリッチ領域のアミノ酸配列（天然に存在するＴＡＴタンパク質の２２〜３６位のアミノ酸）の非存在、およびＴＡＴのエクソン２にコードされているカルボキシ末端ドメイン（天然に存在するＴＡＴタンパク質の７３〜８６位のアミノ酸）の非存在によって特徴付らけれていることが好ましい。本発明のＪＮＫ阻害剤における使用のためのＴＡＴトランスポータ配列は、ＴＡＴの４８〜５７残基もしくは４９〜５７残基、またはそれらのバリアントを含んでいるアミノ酸配列から、より好ましく選択され得る。
【００５５】
また、本発明の所定のＪＮＫ阻害剤のトランスポータ配列は、例えばプロテアーゼに対する安定性を向上させるために、Ｄ−アミノ酸を示すことが好ましい。交互になっているＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の特定の順序を示しているトランスポータ配列は特に好ましい。交互になっているＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸のそのような順序（モチーフ）は、配列番号２８〜３０のいずれか１つのパターン：
ｄ１ＬＬＬｘｄｍＬＬＬｙｄｎ（配列番号２８）；
ｄＬＬＬｄ（ＬＬＬｄ）ａ（配列番号２９）；および／または
ｄＬＬＬｄＬＬＬｄ（配列番号３０）にしたがうが、これらに限定されない。ここで、
ｄはＤ−アミノ酸であり；
ＬはＬ−アミノ酸であり；
ａは、０〜３、好ましくは０〜２、より好ましくは０、１、２または３、さらに好ましくは０、１または２、最も好ましくは１であり；
ｌ、ｍおよびｎは互いに独立して、１または２、好ましくは１であり；
ｘおよびｙは互いに独立して、０、１または２、好ましくは１である。
【００５６】
Ｄ−およびＬ−アミノ酸のそのような順序（モチーフ）は、トランスポータ配列が合成される、つまり、アミノ酸配列（すなわち残基の側鎖の種類）が変更されずに残り、それぞれの異性体に代わっている場合に、該当する。例えば、ＨＩＶ  ＴＡＴに由来する公知のトランスポータ配列は、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号４３）である。これに対して配列番号３０のＤ／Ｌ−の順序を適用することによって、ＫＫＲｒＱＲＲｒ（配列番号４６）が得られる。
【００５７】
特定の実施形態において、本発明のＪＮＫ阻害剤のトランスポータ配列は、ｒＸＸＸｒＸＸＸｒ（配列番号３１）したがう少なくとも１つの配列を含み得る。ここで、ｒはＤ−鏡像異性のアルギニンを表し；
Ｘは任意のＬ−アミノ酸（グリシンが挙げられる）であり；
Ｘのそれぞれは個々に独立して、配列番号３１内の任意の他のＸから選択され得る。配列番号３１内の６つのＸのＬ−アミノ酸のうち少なくとも４つは、ＫまたはＲであることが好ましい。他の実施形態において、本発明に係るＪＮＫ阻害剤はトランスポータ配列ｒＸ１Ｘ２Ｘ３ｒＸ４Ｘ５Ｘ６ｒ（配列番号３２）を含んでいる。ここで、Ｘ１はＫであり、Ｘ２はＫであり、Ｘ３はＲであり、Ｘ４、Ｘ５およびＸ６は互いに独立して選択される任意のＬ−アミノ酸（グリシンが挙げられる）である。同様に、本発明に係るＪＮＫ阻害剤のトランスポータ配列は、配列ｒＸ１Ｘ２Ｘ３ｒＸ４Ｘ５Ｘ６ｒ（配列番号３３）を含み得る。ここで、Ｘ４はＱであり、Ｘ５はＲであり、Ｘ６はＲであり、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は互いに独立して選択される任意のＬ−アミノ酸（グリシンが挙げられる）である。また、本発明のＪＮＫ阻害剤は、配列ｒＸ１Ｘ２Ｘ３ｒＸ４Ｘ５Ｘ６ｒ（配列番号３４）を含み得る。ここで、１、２、３、４、５または６つのＸのアミノ酸残基は、Ｘ１はＫであり、Ｘ２はＫであり、Ｘ３はＲであり、Ｘ４はＱであり、Ｘ５はＲであり、Ｘ６はＲであることからなる群から選択され、選択されなかった残りのＸのアミノ酸は、任意のＬ−アミノ酸（グリシンが挙げられる）であり、互いに独立して選択される。そのとき、Ｘ１はＹであることが好ましく、Ｘ４はＫまたはＲであることが好ましい。
【００５８】
本発明のＪＮＫ阻害分子における使用のためのトランスポータ配列の例は、以下の表２に示されているような配列（配列番号３１〜１７０）、またはそれらの任意の断片、バリアント、化学修飾された誘導体（生体膜を越えて転位する機能を保持していることが好ましい）から選択され得るが、これらに限定されない。
【００５９】
【表２】
0005926250.tif 000003
【００６０】
【表３】
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【００６１】
【表４】
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【００６２】
【表５】
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【００６３】
【表６】
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【００６４】
また、上述のように、トランスポータ配列は、以上の表２の配列の断片またはバリアントから選択され得る（このような断片またはバリアントは、生体膜を越える転位をもたらす機能を保持していることを前提とする）。特にこれに関連して、それらのトランスポータ配列のバリアントおよび／または断片は、表２に示されているようなトランスポータ配列の全長配列と少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を共有しているペプチド配列を含んでいることが好ましい。特にこれに関連して、表２に示されているようなトランスポータ配列の“断片”は、当該トランスポータ配列のトランケートされた配列（すなわち、元の配列のアミノ酸配列と比較して、Ｎ末端、Ｃ末端および／または配列内においてトランケートされているアミノ酸配列）と好ましく理解される。
【００６５】
さらに、以上において定義付けられているようなトランスポータ配列またはその断片の“バリアント”は、バリアントのアミノ酸配列が、本明細書に規定されているような元のトランスポータ配列またはそれらの断片と１つ以上の変異において異なる配列として好ましく理解される。当該変異は、例えば、置換されている（必要に応じて挿入されているか、および／または欠失させられている）１つ以上のアミノ酸である。以上において規定されているようなトランスポータ配列のバリアントは、元のトランスポータ配列のそれぞれと比較して、同じ生物学的な機能または特異的な活性を好ましく有している（すなわち輸送（例えば細胞内または核内への）をもたらす）。これに関連して、以上において規定されているようなトランスポータ配列のバリアントは、例えば、約１〜５０、約１〜２０、より好ましくは１〜１０、最も好ましくは１〜５、４、３、２または１つのアミノ酸の改変を含み得る。以上において規定されているようなトランスポータ配列のバリアントは、保存的なアミノ酸置換を好ましく含み得る。保存的なアミノ酸置換の概念は、当該分野において公知であり、ＪＮＫ阻害性の（ポリ）ペプチド配列に関してすでに述べられており、したがってここにも適用される。
【００６６】
本発明のＪＮＫ阻害剤に組み込まれるトランスポータ配列の長さは、異なり得る。いくつかの実施形態において、本発明に係るＪＮＫ阻害剤のトランスポータ配列の長さは、１５０未満、１４０未満、１３０未満、１２０未満、１１０未満、１００未満、９０未満、８０未満、７０未満、６０未満、５０未満、４０未満、３０未満、２０未満および／または１０未満のアミノ酸長であることが意図されている。
【００６７】
特定のトランスポータ配列が本発明に係るＪＮＫ阻害剤との関連において依然として機能的であるか否かは、当業者によって容易に決定され得る。例えば、トランスポータドメインを含んでいるＪＮＫ阻害剤は、標識（例えば、細胞において容易に検出され得る、蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ）、放射性標識、酵素、フルオロフォア、エピトープなど）と融合され得る。したがって、トランスポータドメインおよび標識を含んでいるＪＮＫ阻害剤は、細胞にトランスフェクトされるか、または培養上清に添加され、細胞膜の透過作用は、生物物理学的および生化学的な標準の方法（例えば、フローサイトメトリー、（免疫）蛍光顕微鏡検査法など）を用いることによって観察され得る。
【００６８】
トランスポータ配列を含んでいる本発明に係るＪＮＫ阻害剤の特定の例は表３に示されている。
【００６９】
【表７】
0005926250.tif 000008
【００７０】
上述のように、本発明の特定の実施形態において、トランスポータ配列および阻害性の（ポリ）ペプチド配列は重なり合っていてもよい。言い換えると、トランスポータ配列のＮ末端は、阻害性の（ポリ）ペプチド配列のＣ末端と重なり合っているか、またはトランスポータ配列のＣ末端は、阻害性の（ポリ）ペプチド配列のＮ末端と重なり合っていてもよい。後者の実施形態は特に好ましい。トランスポータ配列は、阻害性の（ポリ）ペプチド配列と、１、２または３つのアミノ酸残基だけ重なり合っている好ましい。そのような場合において、所定のトランスポータ配列は、配列番号１またはそのバリアントのそれぞれと、１位（１Ｘ１）、１位および２位（Ｘ１、Ｘ２）、または１位、２位および３位（Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３）において重なり合っていてもよい。
【００７１】
配列番号１７４、１７５、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８８、１８９および１９０の配列は、トランスポータ配列および阻害性の（ポリ）ペプチド配列の重なり合っている本発明のＪＮＫ阻害剤にとって良好な例であり、例えば
【００７２】
【化１】
0005926250.tif 000009
【００７３】
（配列番号１７４）は、配列番号４６（下線）および配列番号１１（イタリック）が重なり合っている部分である。
【００７４】
当然、本発明のＪＮＫ阻害剤は、配列番号１７１〜１９０にしたがうＪＮＫ阻害剤のいずれか１つのバリアントであるＪＮＫ阻害剤から選択され得る。このようなバリアントは、少なくとも５０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも５５％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも６０％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも６５％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも７０％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも７５％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも８０％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を、配列番号１７１〜１９０の配列（特に、配列番号１７２の配列）と共有していることが好ましい。阻害性の（ポリ）ペプチド配列（配列番号１の基準の阻害性の（ポリ）ペプチド配列および配列番号２〜２７の特定の例について参照）と、配列同一性を共有しているそのような配列は、
（ａ）阻害性の（ポリ）ペプチド配列内の４位にＬ−アルギニン（Ｒ）を保持し、
（ｂ）阻害性の（ポリ）ペプチド配列内の８位および１０位（配列番号２５〜２７関して７位および９位）に２つのＬ−ロイシンを保持し、
（ｃ）配列番号１の配列内のＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７およびＸ８ならびに配列番号２〜２７におけるそれぞれの位置からなる群から選択されるアミノ酸に対応するそれぞれの位置に少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５または６つのＤ−アミノ酸を含んでおり、より好ましくは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３または４つのＤ−アミノ酸を示しており、
（ｄ）ＪＮＫ活性を依然として阻害する（すなわち、本明細書に規定されるようなＪＮＫ阻害剤であることを前提としている。
【００７５】
上記定義付けに鑑み、かつ明瞭さのために、配列番号１７１〜１９０を含んでいるＪＮＫ阻害剤のバリアントにおいて変更され得ない残基（以上の定義付けにおける件（ａ）および（ｂ）を参照）は、表３において下線が付されている。
【００７６】
配列番号１７１〜１９０を含んでいるＪＮＫ阻害剤のバリアントにおける同一ではないアミノ酸は、保存的なアミノ酸置換の結果であることが好ましい（上記参照）。当然、上述の可能な他の置換は、配列番号１７１〜１９０を含んでいるＪＮＫ阻害剤のバリアントについても意図されている。また同様にして、本発明は、当然、配列１７１〜１９０にしたがうＪＮＫ阻害剤のいずれか１つのバリアントを意図している。当該バリアントは、阻害性の（ポリ）ペプチド配列ではないか、またはこれに限定されない元の配列に由来し、トランスポータ配列におけるバリアント残基を示さない。トランスポータ配列のバリアントおよび断片について、それぞれ上述した特定の開示を参照すればよい。
【００７７】
上述のように、本発明に係るトランスポータ配列およびＪＮＫ阻害剤のＪＮＫ阻害性の（ポリ）ペプチド配列は、必ずしも互いに直接的に連結されている必要はない。また、これらは、例えば介在（ポリ）ペプチド配列によって、間隔を空けて配置され得る。阻害性の（ポリ）ペプチド配列および他の（機能的な）配列（例えばトランスポータ配列）を分離する好ましい介在配列は、１０未満のアミノ酸長の短いペプチド配列（例えば、八量体、五量体、四量体、トリペプチド、またはわずかに、ジペプチドもしくは単一のアミノ酸残基さえ）からなる。特に好ましい介在配列は、Ｌ−アミノ酸のみの形態であるか、Ｄ−アミノ酸のみの形態であるか、ならびに混合されているＬ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸であるジプロリン、ジグリシン、ジアルギニンおよび／またはジリジンの１または２以上のコピーである。もちろん、公知の他のペプチドスペーサが同様に採用され得る。
【００７８】
本発明に係る特に好ましいＪＮＫ阻害剤は、配列番号８（または以上においてさらに規定されている範囲および制限をともなって、配列番号８と配列同一性を共有している配列）およびトランスポータ配列を含んでいる。トランスポータ配列は、好ましくは本明細書に規定されているように配列番号３１〜１７０またはそれらのバリアントいずれか１つから選択されることが好ましく、配列番号３１〜３４および４６〜１５１のいずれか１つから選択されることがより好ましい。本発明に係るＪＮＫ阻害剤の特に好ましい実施形態は、配列番号８および配列番号４６（または以上においてさらに規定されている範囲および制限をともなって、それらと配列同一性を共有している配列）を含んでいるＪＮＫ阻害剤である。好ましい例は、配列番号１７２の配列、または本明細書に規定されているようなトランスポータ配列および／または阻害性の（ポリ）ペプチド配列において変異しているそれらの各バリアントを含んでいるＪＮＫ阻害剤である。
【００７９】
さらなる局面において、本発明は、阻害性の（ポリ）ペプチドおよびトランスポータ配列を含んでいるＪＮＫ阻害剤に関する。
（ａ）当該阻害性の（ポリ）ペプチドは、ＲＰＴＴＬＮＬＦ（配列番号１９１）、ＫＲＰＴＴＬＮＬＦ（配列番号１９２）、ＲＲＰＴＴＬＮＬＦ、および／またはＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦ（配列番号１９３）からなる群から選択される。
（ｂ）当該トランスポータ配列は、表２に開示されているトランスポータ配列またはそれらのバリアント／断片からなる群から好ましく選択され、配列番号３１〜３４および４６〜１５１の配列、またはそれらのバリアントもしくは断片のそれぞれからなる群からより好ましく選択される。
【００８０】
トランスポータ配列および阻害性の（ポリ）ペプチド配列は、重なり合っていてもよい。本発明の上述の実施形態にとって好ましいトランスポータ配列は、特に配列番号４６のトランスポータ配列、好ましくは阻害性の（ポリ）ペプチド配列のＮ末端と（例えば直接的に）連結されている。
【００８１】
また、本発明のＪＮＫ阻害剤は、配列ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ（配列番号１９４）もしくは配列ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ（配列番号１８５）を含んでいるＪＮＫ阻害剤、またはこれらの配列のいずれかからなるＪＮＫ阻害剤であり得る。
【００８２】
さらなる局面において、本発明は、ｒＫＫＲｒＱＲｒ（配列番号１４８）、ｒＫＫＲｒＱＲｒＫ（配列番号１４９）、ｒＫＫＲｒＱＲｒＫ、および／またはｒＫＫＲｒＱＲｒＲ（配列番号１５０）からなる配列の群から選択されるトランスポータ配列を含んでいる（ポリ）ペプチドに関する。
【００８３】
本明細書に使用されるとき、特定の配列または特定の配列番号を含んでいることは、通常、当該配列の（少なくとも）１コピーが、例えばＪＮＫ阻害分子に存在していることを示している。例えば、阻害性の（ポリ）ペプチド配列は、ＪＮＫ活性の十分な阻害を果たすために１つで十分である。しかし、生じた分子のＪＮＫ活性の阻害能がすべて破壊されない（すなわちそれぞれの分子は本明細書に規定されているようなＪＮＫ阻害剤である）限り、それぞれの配列の２コピー以上（例えば、異なる種類もしくは同じ種類の阻害性の（ポリ）ペプチド配列の２コピー以上、および／または異なる種類もしくは同じ種類のトランスポータ配列の２コピー以上）の使用が採用され得ることを、発明者は意図している。
【００８４】
本発明のＪＮＫ阻害剤は、当該分野に周知の方法によって入手され得るか、または製造され得る。当該方法は、例えば、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）を用いた固相ペプチド合成を介する化学合成（すなわち、Ｆｍｏｃ脱保護およびＦｍｏｃアミノ酸結合のサイクルの連続的な繰返し）である。そのようなペプチド合成を提供している商業サービスは、多くの会社（例えばPolyPeptide社（ストラスブール、フランス））によって提供されている。
【００８５】
〔抗体〕
さらなる局面において、本発明は、本発明のＪＮＫ阻害剤に対して産生される抗体の製造（すなわち、本発明のＪＮＫ阻害剤を認識する抗体を製造する方法）に関する。抗体を製造する方法は、当該分野において極めて周知である。
【００８６】
またしたがって、本発明は、本発明に係るＪＮＫ阻害剤を用いて非ヒトの動物を免役する方法に関する。当該方法は、抗体産生にとって好適な非ヒトの動物（特に非ヒトの哺乳類（より好ましくは、ヤギおよびげっ歯類（例えばマウス、ラットおよびウサギ）から選択される動物））を、本発明のＪＮＫ阻害剤（より好ましくは配列番号１〜２７のいずれか１つから選択される配列を有している（ポリ）ペプチドを含んでいるＪＮＫ阻害剤）と、接触させる（免疫する）ことを包含している。
【００８７】
本明細書に使用されるとき、“免疫する”は、本発明に係るＪＮＫ阻害剤が病原体ではない（すなわち治療を必要としない）ため、非治療的な性質と理解される。
【００８８】
また、本発明は、本発明に係るＪＮＫ阻害剤を認識する（ポリクローナル）抗体を製造する方法に関する。当該方法は、本発明のＪＮＫ阻害剤（より好ましくは配列番号１〜２７のいずれか１つから選択される配列を有している（ポリ）ペプチドを含んでいるＪＮＫ阻害剤）と接触させられている（免疫されている）、抗体産生にとって好適な非ヒトの動物（特に非ヒトの哺乳類（より好ましくは、ヤギおよびげっ歯類（例えばマウス、ラットおよびウサギ）から選択される動物））から、上記ＪＮＫ阻害剤を認識する（ポリクローナル）抗体を単離することを包含している。
【００８９】
また、本発明は、本発明に係るＪＮＫ阻害剤を認識する抗体を産生する細胞を単離する方法に関する。当該方法は、本発明のＪＮＫ阻害剤（より好ましくは配列番号１〜２７のいずれか１つから選択される配列を有している（ポリ）ペプチドを含んでいるＪＮＫ阻害剤）を用いて接触させられている（免疫されている）、抗体産生にとって好適な非ヒトの動物（特に非ヒトの哺乳類（より好ましくは、ヤギおよびげっ歯類（例えばマウス、ラットおよびウサギ）から選択される動物））から、上記ＪＮＫ阻害剤を認識する上記抗体を産生する細胞を単離すること、ならびに必要に応じて当該細胞を不死化することを包含している。
【００９０】
また、本発明は、本発明に係るＪＮＫ阻害剤を認識する（モノクローナル）抗体を製造する方法に関する。当該方法は、本発明のＪＮＫ阻害剤を認識する抗体（より好ましくは配列番号１〜２７のいずれか１つから選択される配列を有している（ポリ）ペプチドからなるＪＮＫ阻害剤を認識する抗体）を、上記抗体を産生している細胞の細胞培養上清から単離することを包含しており、上記細胞は必要に応じて不死化されている。
【００９１】
当業者は、非ヒトの動物を免疫する方法、および本明細書に開示されているような（ポリクローナル）抗体の製造する方法が、連続的に実施され得ることを理解する。同様に、非ヒトの動物を免疫する方法、抗体を産生する細胞を単離する方法、（モノクローナル）抗体の製造する方法は、組み合わせられ得る。
【００９２】
さらなる局面において、本発明は、ポリクローナル抗体またはモノクローナルの抗体の製造する本発明に係る方法を用いて製造可能な（および／または製造される）抗体に関する。当該抗体は、配列番号１〜２７のいずれか１つから選択される配列を含んでいるか、または当該配列からなる少なくとも１つの（ポリ）ペプチド配列を認識し、好ましくは、当該抗体は、配列番号１〜２７のそれぞれの配列範囲におけるＤ−アミノ酸の代わりにＬ−アミノ酸を有している実質的に同じ（ポリ）ペプチド配列を認識しない（または少なくともより低い（例えば、少なくとも１桁小さい）程度に認識する）。好ましくは、そのような抗体は、本発明のＪＮＫ阻害剤を認識し、配列ＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦ（配列番号１９３）を含んでいる（ポリ）ペプチドを認識しない（または少なくともより低い（例えば、少なくとも１桁小さい）程度に認識する）ことが好ましい。特に好ましい抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）は、配列番号８の配列を含んでいるＪＮＫ阻害剤（例えば、配列番号１７２の配列を含んでいるＪＮＫ阻害剤）を認識し、Ｄ−アミノ酸の代わりにＬ−アミノ酸を有している全く同じ配列を含んでいる（ポリ）ペプチドを認識しない（または少なくともより低い（例えば、少なくとも１桁小さい）程度に認識する）。
【００９３】
特に好ましい抗体は、配列番号１７２の配列を含んでいる（ポリ）ペプチドを認識し、配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＲＰＫＲＰＡＴＬＮＬＦ（配列番号１９９）を含んでいる（ポリ）ペプチドを認識しない（または少なくともより低い（例えば、少なくとも１桁小さい）程度に認識する）ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。
【００９４】
また、本発明は、本発明に係るＪＮＫ阻害剤を認識する抗体を産生する細胞を単離する上述した特定の方法にしたがって単離された細胞に関する。当該細胞は、配列番号１〜２７のいずれか１つから選択される少なくとも１つの（ポリ）ペプチドを好ましく認識し、配列番号１に対応する配列におけるＤ−アミノ酸の代わりにＬ−アミノ酸を有している実質的に同じ（ポリ）ペプチドを認識しない抗体を産生する。例えば、当該細胞は例えば、配列
【００９５】
【化２】
0005926250.tif 000010
【００９６】
（配列番号８）を含んでいる（ポリ）ペプチドを認識し、配列ＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦ（配列番号１９３）を含んでいる（ポリ）ペプチドを認識しない（または少なくともより低い（例えば、少なくとも１桁小さい）程度に認識する）抗体を産生する。
【００９７】
また、本発明は、特定のトランスポータ配列に対する抗体を生成し、これによって例えば表３に開示されているようなＪＮＫ阻害剤の同定を可能にすることを意図されている。またしたがって、本発明のＪＮＫ阻害剤（特に、配列番号１〜２７のいずれか１つから選択される配列を含んでいるか、または当該配列からなる少なくとも１つの（ポリ）ペプチド）を認識する抗体について以上に述べられているすべての局面（ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体；当該抗体を製造する方法、当該抗体を生成する細胞など）は、配列番号３１〜３４および４６〜１５１のいずれか１つから選択される配列を含んでいるか、または当該配列からなる（ポリ）ペプチドとの関係において、適合され得る。当然、認識されない（または少なくともより低い（例えば、少なくとも１桁小さい）程度に認識する）必要がある基準配列は、この場合にも同様に、トランスポータ配列の範囲におけるＤ−アミノ酸の代わりにＬ−アミノ酸を有している全く同じ配列である。
【００９８】
（モノクローナルまたはポリクローナル）抗体を結合親和力について試験する方法は、当該分野において周知である。なかでも適切な１つは、標的ペプチドおよび陰性対照（例えば、Ｌ−アミノ酸のみを有している同じペプチド）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによって抗体の結合親和力を決定することである。ＥＬＩＳＡの限界は、ブランクの同型物に対して以下にしたがって算出され得るが、これに限定されない：
ＥＬＩＳＡ法の限界＝平均値（陰性対照）＋（３×陰性対照の標準偏差）。
【００９９】
サンプルの値がＥＬＩＳＡ法の限界以下の場合、試験された抗体は、標的ペプチドに対する親和性を有していないとみなされ得る。サンプルの値がＥＬＩＳＡの限界を上回っている場合、試験された抗体は標的ペプチドに対する親和性を示すとみなされ得る。さらに、サンプルの値が大きいほど、標的に対する試験された抗体の親和性は強い。
【０１００】
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の製造を提供する商業サービスは、例えばEurogentec（スラン、ベルギー）である。
【０１０１】
本明細書に引用されているすべての参考文献は、参照によって本明細書に援用される。
【０１０２】
〔実施例〕
本発明の種々の実施形態および局面を例示する特定の実施例を以下に記載する。しかし、本発明の範囲は、本明細書に記載する特定の実施形態に限定されない。当業者であれば、上述の説明、添付の図面、および以下の実施例を参照することによって、本明細書に記載の実施形態およびその種々の変更も明らかになるであろう。なお、このような全ての変更も添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれる。
【０１０３】
（実施例１：配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤の合成）
本発明を説明するための実施例として、配列番号１７２の配列を有しているＪＮＫ阻害剤の合成を以下に詳述する。当業者は、本発明の他のＪＮＫ阻害剤の合成についても、以下に詳述する合成法を使用し且つ容易に適用可能なことを理解する。
【０１０４】
Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）を利用してペプチド固相合成を行って、配列番号１７２の配列を有しているＪＮＫ阻害剤を作製した。ペプチドと樹脂との間のリンカーとして、Ｒｉｎｋアミドリンカー（ｐ−［Ｆｍｏｃ−２,３−ジメトキシベンジル］−フェノキシ酢酸）を使用した。ペプチドの合成は、Ｆｍｏｃ脱保護とＦｍｏｃアミノ酸結合のサイクルを連続して複数回行うことによって達成された。上記ペプチドの合成終了時に、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を直接使用して、完成したペプチドを開裂させ、粗製Ｃ末端アミドを作成した。その後、上記粗製Ｃ末端アミドの精製を逆相分取ＨＰＬＣ法によって行った。精製後のペプチド画分は、その酢酸塩を得る目的で、イオン交換クロマトグラフィー法で処理した均一バッチ内にプールされた。その後、上記ペプチド画分を凍結乾燥した。
【０１０５】
１．１  ペプチドの固相合成
特記する場合を除き、エアフィルタリング環境下、室温（２２℃±７℃）において上記ＪＮＫ阻害剤の作製を行った。合成のスケールを説明すると、上記樹脂上の開始アミノ酸は０．７ｍｍｏｌであり、精製後に得られるペプチドの予想生成量は約１ｇであった。機械的攪拌および／または窒素バブリングを行いながら、フリットディスクを設けた３０ｍＬ〜５０ｍＬの容量のリアクタ内でペプチドの合成を手動で行った。
【０１０６】
１．２  樹脂の調製
まず、窒素の存在下で、ｐ−メチルベンズヒドリルアミド樹脂（ＭＢＨＡ−樹脂）を、ジクロロメタン／ジメチルホルムアミド／ジイソプロピルエチルアミンを用いて洗浄した。洗浄後、ＰｙＢＯＢ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム−ヘキサフルオロフォスフェイト）／ジイソプロピルエチルアミン／１−ヒドロキシベンゾトリアゾール中で、上記ｐ−メチルベンズヒドリルアミド樹脂をＲｉｎｋアミドリンカー（ｐ−［Ｆｍｏｘ−２,４−ジメトキシベンジル］−フェノキシ酢酸）に結合させて、Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド−ＭＢＨＡ樹脂を作製した。
【０１０７】
１．３  アミノ酸のカップリング
以下のサイクルを行って、上記樹脂にアミノ酸をカップリングさせた。
上記Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド−ＭＢＨＡ樹脂を３５％（ｖ／ｖ）のピペリジン／ジメチルホルムアミド中で洗浄した後、ジメチルホルムアミド中で洗浄して、脱保護を行った。上記脱保護の反応を約１６分間行った。上記樹脂に対して、ジメチルホルムアミド／ジクロロメタン（５０／５０）中のＦｍｏｃ−保護アミノ酸（例えば、２等量のアミノ酸およびＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール））を添加した後、カップリング剤として２等量のジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を添加した。添加した上述のアミノ酸に応じて、カップリング反応は１時間〜一晩の間行った。０．５ｍＬ／１００ｍｇのペプチド−樹脂に基づいてボリュームを計算し、各サイクル後に調整した。上記カップリング後、上記樹脂をＤＭＦで３回洗浄した。上記カップリングの完遂度を、１級アミンにニンヒドリン試験（またはＫａｉｓｅｒ試験１）を行い、２級アミンにｃｈｌｏｒａｎｙｌ試験２を行うことで検査した。ある場合では、信頼性の調整のために、上記ｃｈｌｏｒａｎｙｌ試験とニンヒドリン試験とを組み合わせ得る。上記カップリングの検査によってカップリング反応が未完了であることが示された場合、ジメチルホルムアミド／ジクロロメタンおよびジイソプロピルエチルアミン中において、より低過剰（０．５等量〜１等量）のアミノ酸、ＰＹＢＯＰ、ＨＯＢＴの存在下でカップリング処理を繰り返す。上記樹脂の機能性を測定した結果、当該樹脂の初期のロード量に応じて、概して０．６ｍｅｑ／ｇ〜０．２ｍｅｇ／ｇであった。最後のアミノ酸をカップリングした後、上記ペプチド−樹脂を従来通り脱保護し、真空状態のオーブンで３０℃において乾燥させる前にＤＣＭを用いて５回洗浄した。上記ペプチド−樹脂を乾燥させた後、固相合成による生成率を、上記樹脂の初期のロード量から算出した理論上の重量増加と比較した上記ペプチド樹脂の重量増加の比率として、算出した。このように算出した上記生成率は、１００％に近い値であった。
【０１０８】
１．４  切り出しおよび脱保護
ＴＦＡ／Ｋ試薬とも呼ばれるトリフルオロ酢酸／１，２−エタンジチオール／チオアニソール／水／フェノール（８８／２．２／４．４／４．４／７  ｖ／ｖ）の混合物中において、上記樹脂からの上記ペプチドの切り出しを室温において４時間行った。この際の反応ボリュームは、１ｍＬ／１００ｍｇのペプチド樹脂であった。上記樹脂を上記試薬に添加している間において、混合温度が３０℃未満となるように管理した。
【０１０９】
１．５  樹脂からのペプチド抽出
フリットディスクを用いた濾過により、上記樹脂から上記ペプチドを抽出した。ロータベーパー（ｒｏｔａｖａｐｏｒ）で体積を１／３にまで濃縮した後、上記ペプチドを冷却したｔ−ブチルメチルエーテルを使用して沈殿させ、濾過した。その後、このようにして得られた粗製ペプチドを真空中、３０℃において乾燥させた。
【０１１０】
１．６  分取ＨＰＬＣを用いた精製
その後、逆相ＨＰＬＣを使用して、上記粗製ペプチドの純度が９５％以上となるように精製を行った。上記精製後、ロータベーパーで上記粗製ペプチドの精製分画を濃縮し、凍結乾燥させた。
【０１１１】
１．７  イオン交換クロマトグラフィー
配列番号１７２の配列を有している精製ペプチドの濃縮および凍結乾燥したプールを、水に溶解させ、Ｄｏｗｅｘアセテート５０−１００メッシュ樹脂（Dowex acetate, 50−100 mesh resin）上でイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。
【０１１２】
【表８】
0005926250.tif 000011
【０１１３】
同様の方法により、本発明の他のＪＮＫ阻害剤の調製を行ってもよい。
【０１１４】
（実施例２：本発明に係る選択されたＪＮＫ阻害剤の阻害効果）
以下に標準的な操作手順を詳述し、本発明のＪＮＫ阻害剤の阻害効果の測定方法を記載する。この方法より、ＪＮＫによるｃ−Ｊｕｎ特異的な基質のリン酸化を低下させる候補化合物の能力を、インビトロにおいて、非放射性標準化アッセイにより測定することが可能になった。さらに、ＪＮＫ用に選択した化合物の阻害効果（ＩＣ５０）およびＫｉの決定方法を説明する。この方法は、候補化合物がＪＮＫ活性を阻害するか否かの検証に好適である。当業者は、下記の方法を特定の目的および必要に応じて適合させる方法を理解する。
【０１１５】
２．１  材料
＜AlphaScreen試薬およびプレート＞
−  終濃度が５ｎＭのＨｉｓ−ＪＮＫ１（参照番号１４−３２７、Upstate社、１００μｌ中に１０μｇ：濃度：２．２μＭ）
−  終濃度が５ｎＭのＨｉｓ−ＪＮＫ２（参照番号１４−３２９、Upstate社、１００μｌ中に１０μｇ：濃度：２μＭ）
−  終濃度が５ｎＭのＨｉｓ−ＪＮＫ３（参照番号１４−５０１、Upstate社、１００μｌ中に１０μｇ：濃度：１．８８μＭ）
−  終濃度が１０ｎＭのAnti-Phospho-cJun（参照番号０６−８２８、Ｕｐｓｔａｔｅ社、ロットＤＡＭ１５０３３５６、濃度：４４．５μＭ）
−  終濃度が３０ｎＭのBiotin-cJun（２９−６７）：配列：ビオチン−ＳＮＰＫＩＬＫＱＳＭＴＬＮＬＡＤＰＶＧＳＬＫＰＨＬＲＡＫＮＳＤＬＬＴＳＰＤＶＧ（配列番号１９８）、水に溶解させたロット１００５０９（ｍｗ４３８２．１１、Ｐ ９９．２８％）、濃度：１０ｍＭ
−  終濃度が５μＭのＡＴＰ（参照番号ＡＳ００１Ａ、Invitrogen社、ロット５０８６０Ｂ、濃度１００ｍＭ）
−  終濃度が２０μｇ／ｍｌのSADビーズ（参照番号６７６０６１７Ｍ、PerkinElmer社、ロット５４０−４６０−Ａ、濃度５ｍｇ／ｍｌ）
−  終濃度が２０μｇ／ｍｌのAprotAビーズ（参照番号６７６０６１７Ｍ、PerkinElmer社、ロット５４０−４６０−Ａ、濃度５ｍｇ／ｍｌ）
−  Optiplate３８４ウェルホワイトプレート（参照番号６００７２９９、PerkinElmer社、ロット６５４２８０／２００８）
−  ペプチドの希釈用の９６ウェルプレート（参照番号８２．１５８１、Ｓａｒｓｔｅｄｔ社）
−  TopSeals−Ａ（参照番号６００５１８５、PerkinElmer社、ロット６５６７３）
−  生物発光エネルギー伝達の読取り
−  生物発光エネルギー伝達の読取りは、Fusion Alpha Plate読取器（PerkinElmer社）を使用して行った。
【０１１６】
＜ピペット＞
−  電子ピペットであるＥＤＰ３ピペット２０−３００（参照番号１７００７２４３；Ｒａｉｎｉｎ社）を使用して、上記プレートに酵素−抗体ミックス、基質−ＡＴＰミックス、および上記ビーズを充填した。
【０１１７】
−  PIPETMAN（登録商標）Ultra multichannel 8X20（参照番号２１０４０；Ｇｉｌｓｏｎ社）を使用して、上記プレートに阻害化合物を充填した。
【０１１８】
＜バッファおよび溶液＞
−  キナーゼバッファ：２０ｍＭのトリスベースｐＨ７．４、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、１００μＭのＮａ３ＶＯ４、０．０１％Ｔｗｅｅｎ、（１％ＤＭＳＯ）
−  停止バッファ：２０ｍＭのトリスベースｐＨ７．４、２００ｍＭのＮａＣｌ、８０ｍＭのＥＤＴＡ−Ｋ（ｐＨｄｅ８、ＮａＯＨに代えてＫＯＨ）、０．３％ＢＳＡ
−  ＪＮＫ希釈キナーゼバッファ：５０ｍＭのトリスベースｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＧＴＡ、０．０３％のＢｒｉｊ−３５、２７０ｍＭのスクロース、０．１％β−メルカプトエタノール。
【０１１９】
２．２  方法
上記ペプチドの阻害効果を評価するために、標準ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ（例えばGuenat et al. J Biomol Screen, 2006; 11: pages 1015-1026を参照）を行った。異なる成分を調製し、その後説明する要領でミックスした。上記プレートを封止し、以下のようにインキュベーションを行った。
５μｌ  ＪＮＫ＋抗体
５μｌ  ＴＰキナーゼ＋／−阻害剤  ３０分間のプレインキュベーション
５μｌ  ビオチン−ｃＪｕｎ＋ＡＴＰ  ２４℃で６０分間のインキュベーション
１０μｌ  ＳＡＤビーズ＋Ａ ｐｒｏｔＡ  ２４℃の暗室で６０分間のインキュベーション。
【０１２０】
汚染を避けるために、ピペットを使用して上記ウェルの異なる隅部に上記ミックスを添加した。上記プレートに各ミックスを充填した後、上記プレートを軽く叩いて（片側を固定して、反対側でテーブルを軽く叩いて）、当該ミックスをウェルの壁に沈降させた。
【０１２１】
Ｆｕｓｉｏｎ Ａｌｐｈａ Ｐｌａｔｅ読取器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を使用して、生物発光エネルギーの伝達を読み取った。
【０１２２】
全化合物に関して、ＪＮＫの各アイソフォームにつき、試験を少なくとも３つの独立した実験において３回繰り返して行う。試験対象とする化合物のとりうる濃度は、０ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．１ｎＭ、０．３ｎＭ、１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭ、および１００μＭであった。コントロールとして、ＪＮＫまたは基質（ｃ−Ｊｕｎ）が不在のサンプルを使用した。
【０１２３】
＜ミックスの調製＞
ＪＮＫ１、ＪＮＫ２、およびＪＮＫ３  ５ｎＭ
ビオチン−ｃＪｕｎ  ３０ｎＭ
ＡＴＰ５μＭ；抗ホスホ−ｃＪｕｎ（Ｓ６３）  １０ｎＭ
Bille SAD/AprotA  ２０μｇ／ｍｌ。
抗体[終濃度]＝１０ｎＭ  （抗ホスホｃＪｕｎ（Ｓ６３））
検出の部：[ミックス]Ｘ５（２５μｌの最終体積中で５μｌ）
[ストック]＝４４．５μＭ（参照番号０６−８２８、Upstate社、ロットＤＡＭ１５０３３５６）
１０μＭ→５０ｎＭ  キナーゼバッファ中。
ＪＮＫ１、ＪＮＫ２、およびＪＮＫ３[終濃度]＝５ｎＭ
反応の部：[ミックス]Ｘ３（１５μｌの最終体積中で５μｌ）
[ストック]＝
ＪＮＫ１  ２．２μＭ（参照番号１４−３２７、Upstate社、ロットＤ７ＫＮ０２２ＣＵ）
ＪＮＫ２  ２．０μＭ（参照番号１４−３２９、Upstate社、ロット３３２２１ＣＵ）
ＪＮＫ３  １．８８μＭ（参照番号１４−５０１、Upstate社、ロットＤ７ＣＮ０４１ＣＵ）
５ｎＭ→１５ｎＭ  抗体バッファ中。
阻害剤：
反応の部：[ミックス]Ｘ３（１５μｌの最終体積中で５μｌ）
[ストック]＝１０ｍＭ
１００μＭ  →  ３００μＭ  キナーゼバッファ中
３０μＭ  →  ９０μＭ  キナーゼバッファ中
１０μＭ  →  ３０μＭ  キナーゼバッファ中
．．．
０．０３ｎＭ  →  ０．０９ｎＭ  キナーゼバッファ中
０ｎＭ  →  キナーゼバッファ。
９６ウェルプレートにおいて１０回の連続希釈を２シリーズ行い、このうち最初の連続希釈のシリーズでは３００μＭから開始して０ｎＭまでであり、２回目のシリーズでは９０μＭから開始して０．０３ｎＭまでであった。３８４プレートへの上記ペプチドの添加は、８チャンネルのマルチピペット（参照番号Ｆ１４４０１、Ｇｉｌｓｏｎ社、８Ｘ２０）を使用して行った。
ＡＴＰ[終濃度]＝５μＭ
反応の部：[ミックス]Ｘ３（１５μｌの最終体積中で５μｌ）
[ストック]＝１００ｍＭ（参照番号ＡＳ００１Ａ、Invitrogen社、ロット５０８６０Ｂ）
５μＭ  →  １５μＭ  キナーゼバッファ中。
ビオチンｃ−Ｊｕｎ[終濃度]＝３０μＭ
反応の部：[ミックス]Ｘ３（１５μｌの最終体積中で５μｌ）
[ストック]＝１０ｍＭ
３０ｎＭ  →  ３０ｎＭ  ＡＴＰバッファ中。
ＳＡＤビーズ／Ａ ＰｒｏｔＡ[終濃度]＝２０μｇ／ｍｌ（感光性）
検出の部：[ミックス]Ｘ２．５（２５μｌの最終体積中で１０μｌ）
[ストック]＝５ｍｇ／ｍｌ→２０μｇ／ｍｌ    ５０μｇ／ｍｌ  ＳＴＯＰバッファ中
ミックスは、暗室（緑色光）中または暗闇中に。
【０１２４】
ＩＣ５０曲線の分析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ４ソフトウェアにより、下記の等式を使用して分析を行った。
ドーズ−応答のシグモイド（制約(constraint)無し）
Y=Bottom + (Top-Bottom)/(1+10^((LogEC50-X)))。
Ｇｒｕｇｇ’ｓテストを使用して、異常値データを避けた。
【０１２５】
ＩＣ５０の比較
GraphPad  Prism4ソフトウェアを使用して、下記テストにより上記分析を行った。One way ANOVAテストを行った後に、Tukey's Multiple Comparisonテストを行った。Ｐ＜０．０５の場合、有意であると判断した。
【０１２６】
ＪＮＫに対するＡＴＰのＫｍおよびビオチン−ｃＪｕｎ特異的ペプチドのＫｍをｒｅｐｏｒｔ  ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ標準アッセイで判定した。
【０１２７】
ＫｉとＩＣ５０の数学的関係（Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋（[基質]／基質のＫｍ）））を使用して当該Ｋｉの値を算出してもよい。
【０１２８】
（実施例３：内在化の実験および分析）
３．１  取込み実験の材料および方法
（ａ）細胞株
本実験に使用する細胞株として、ＨＬ−６０（参照番号ＣＣＬ−２４０、ＡＴＣＣ、ロット１１６５２３）を使用した。
【０１２９】
（ｂ）培養培地およびプレート
２００８年４月４日に５６℃で３０分間デコンプリメントした１０％ＦＢＳ（参照番号ａ６４９０６−００９８、PAA社、ロットＡ１５−１５１）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（参照番号Ｓ８６３６、Sigma社、ロット番号５６Ｋ２３８６）、およびペニシリン（１００ユニット／ｍｌ）／ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）（参照番号Ｐ４３３３、Sigma社、ロット番号１０６Ｋ２３２１）を、２００８年５月５日に補充した、ＲＰＭＩ（参照番号２１８７５−０９１、Invitrogen社、ロット８２９６）またはＤＭＥＭ（参照番号４１９６５、Invitrogen社、ロット１３４８１）。
ＰＢＳ  １０Ｘ（参照番号７００１１、Invitrogen社、ロット８２７７）：滅菌Ｈ２Ｏを使用して１Ｘまで希釈。
トリプシン−０．０５％ＥＤＴＡ（参照番号Ｌ−１１６６０、PAA社、ロットＬ６６００７−１１９４）。
６ウェル培養プレート（参照番号１４０６７５、Nunc社、ロット番号１０２６１３）。
２４ウェル培養プレート（商品番号１４２４７５、Nunc社、ロット番号０９５８４９）。
９６ウェル培養プレート（商品番号１６７００８、Nunc社、ロット番号０８３３１０）。
タンパク質ドーズ用の９６ウェルプレート（識別番号８２．１５８１、Sarstedt社）。
蛍光測定用の９６ウェルプレート（識別番号６００５２７９、Perkin Elmer社）。
【０１３０】
（ｃ）溶液
ポリ−Ｄ−リジンコーティング溶液（Sigma社Ｐ９０１１、ロット番号０９５Ｋ５１０４）：ＰＢＳ  １ｘ中の、２５μｇ／ｍｌの最終希釈物。
酸性洗浄バッファ：０．２Ｍのグリシン、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ３．０。
Ｒｉｐａリーシスバッファ：１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ７．２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００、１ｍＭのＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、２００μＭのＮａ３ＶＯ２、０．１％ＳＤＳ、１Ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル（参照番号１１８７３５８０００１、Ｒｏｃｈｅ社、ロット番号１３７３２７００）。
【０１３１】
（ｄ）顕微鏡法および蛍光プレート読取器
倒立顕微鏡（Axiovert 40 CFL；Zeiss社；２０Ｘ）を使用して、細胞の数を数えるととともに、当該細胞の観察を行った。Fusion Alpha Plate読取器（Perkin Elmer社）を使用して、蛍光の読み取りを行った。
【０１３２】
（ｅ）方法
懸濁細胞において、ＦＩＴＣで標識化したペプチドの細胞内移行を研究した。ポリ−ＤＬ−リジンでコーティングしたディッシュに、１×１０６細胞／ｍｌの密度で細胞を播種した。その後、既知濃度のペプチドを添加する前に、上記プレートを３７℃、５％ＣＯ２、および１００％の相対湿度下で２４時間インキュベートした。上記ペプチドの添加後、上記細胞を３７℃、５％ＣＯ２、および１００％の相対湿度下で３０分間、１時間、６時間、または２４時間インキュベートした。その後、細胞表面に吸着したペプチドを除去するために、上記細胞を酸性バッファ（０．２Ｍのグリシン、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ３．０）で２回洗浄した（Kameyama et al., (2007), Biopolymers, 88, 98-107を参照）。塩基性アミノ酸がリッチなペプチドは細胞表面に強く吸着され、ペプチドの内在化がしばしば過大評価されるという結果を導く場合が多くなるため、上記酸性バッファを使用した。このように酸性バッファを使用した細胞の洗浄を採用して、細胞表面に吸着したペプチドを除去した。Ｆａｂ／細胞浸透性ペプチドコンジュゲートの細胞内への取り込みを判定する際に上記酸性バッファによる洗浄を行い、その後、ＰＢＳにより２回洗浄した。ＲＩＰＡリーシスバッファを添加することにより、上記細胞を破壊した。その後、バックグランドの除去およびタンパク質含有量のノーマライズを行った後に、内在化したペプチドの相対量を蛍光に基づいて決定した。すなわち、本方法の工程は以下のものである：１．細胞培養、２．酸性洗浄および細胞抽出物、３．蛍光プレート読取器を使用したペプチドの内在化の分析。
【０１３３】
（ｆ）細胞培養およびペプチド処理
上記６ウェル培養プレートは３ｍｌのＰｏｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｓｉｇｍａ社、Ｐ９０１１；ＰＢＳ中２５μｇ／ｍｌ）でコーティングされており、上記２４ウェルプレートは６００μｌのＰｏｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｓｉｇｍａ社、Ｐ９０１１；ＰＢＳ中２５μｇ／ｍｌ）でコーティングされており、上記９６ウェルプレートは１２５μｌのＰｏｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｓｉｇｍａ社、Ｐ９０１１；ＰＢＳ中２５μｇ／ｍｌ）でコーティングされており、各プレートは、３７℃、５％ＣＯ２、および１００％の相対湿度下で４時間インキュベートされる。
【０１３４】
４時間後、上記ディッシュをそれぞれＰＢＳで２回洗浄した。すなわち、上記６ウェルプレートは３．５ｍｌのＰＢＳで、上記２４ウェルプレートは７００μｌのＰＢＳで、上記９６ウェルプレートは１５０μｌのＰＢＳで２回洗浄した。
【０１３５】
上記細胞を１００００００細胞／ｍｌの密度で、懸濁細胞として、上記ディッシュ上の２．４ｍｌの培地（ＲＰＭＩ）中に播種した。播種後、上記ペプチドを添加する前に、上記プレートを３７℃、５％ＣＯ２、および１００％の相対湿度下で２４時間インキュベートした。処理当日において、接着細胞の密度は９０％〜９５％となり、当該接着細胞をＤＭＥＭ中に播種した。
【０１３６】
【表９】
0005926250.tif 000012
【０１３７】
上記細胞を所望の濃度のＦＩＴＣ標識化ペプチド（ストック溶液は、Ｈ２Ｏ中、濃度が１０ｍＭ）で処理した。
【０１３８】
上記ペプチドの添加後、上記細胞を３７℃、５％ＣＯ２、および１００％の相対湿度下で０時間〜２４時間（例えば、３０分間、１時間、６時間、または２４時間）インキュベートした。
【０１３９】
酸性洗浄および細胞抽出物：
上記抽出物を氷上で冷却する。
懸濁細胞（または上記皿に十分に接着していない細胞）：
上記細胞を「Ｆａｌｃｏｎ１５ｍｌ」に移す。細胞を最大限に回収するため、上記ディッシュを１ｍｌのＰＢＳで洗浄する。
最大で２４００ｒｐｍの回転数で２分間回転させて上記細胞を回収。
上記細胞を１ｍｌの冷ＰＢＳ中に懸濁する。
コーティングを施した“エッペンドルフチューブ”（１ｍｌのポリＤーＬｙｓで４時間コーティングを行い、１ｍｌのＰＢＳで２回洗浄を行ったエッペンドルフチューブ）に上記細胞を移す。
１ｍｌの冷却した酸性洗浄バッファで３回洗浄し、最大２４００ｒｐｍの回転数で２分間遠心分離させる。
“エッペンドルフ”中での細胞の拡散に注意する。
１ｍｌの冷却したＰＢＳで２回洗浄して、中和させる。
５０μｌのリーシスＲＩＰＡバッファを添加する。
撹拌しながら、氷上で３０分間〜１時間インキュベートする。
接着細胞：
３ｍｌ、１ｍｌ、または２００μｌ（それぞれ、６ウェルプレート、２４ウェルプレート、または９６ウェルプレートの場合）の冷却した酸性洗浄バッファで３回洗浄する。ディッシュから剥がれる細胞の発生に注意する。
１ｍｌ（６ウェルプレート、２４ウェルプレート、または９６ウェルプレートの場合）のＰＢＳで２回洗浄して、中和させる。
５０μｌのリーシスＲＩＰＡバッファを添加する。
撹拌しながら、氷上で３０分間〜１時間インキュベートする。
冷却したヘラで上記細胞をそぎ取る。２４ウェルプレートおよび９６ウェルプレートの場合、４０００ｒｐｍの回転数および４℃の温度で１５分間、直接、遠心分離にかけて、細胞残屑を除去した。その後、得られた上清（２４ウェルプレートの場合は１００ｍｌ、９６ウェルプレートの場合は５０ｍｌ）を、暗くした９６ウェルプレートに直接的に移した。上記プレートの読取を蛍光プレート読取器（Fusion Alpha、Perkin Elmer社）を使用して行った。
上記のライセートを、コーティングを行った“エッペンドルフ”（１ｍｌのポリＤ−Ｌｙｓを使用して４時間コーティングを行い、１ｍｌのＰＢＳで２時間洗浄したエッペンドルフ）内に移す。
その後、上記の溶解細胞を４℃の条件下で、１０００ｇで３０分間遠心分離して、細胞残屑を除去した。
上澄を回収し、コーティングを行った“エッペンドルフ”（１ｍｌのポリＤ−Ｌｙｓを使用して４時間コーティングを行い、１ｍｌのＰＢＳで２時間洗浄したエッペンドルフ）内で−８０℃においてこれを保存する。
【０１４０】
蛍光プレート読取器を使用したペプチドの内在化の分析：
製造者による使用説明に従って、標準ＢＡＣアッセイ（キット番号２３２２５、Pierce社）を使用して各タンパク質抽出物の内容を決定した。
１０μｌの各サンプルを蛍光プレート読取器（Fusion Alpha、Perkin Elmer社）で読み取り、バックグラウンドを除去し、タンパク質濃度によるノーマライズを行った後に、当該各サンプルの相対蛍光を決定した。
【０１４１】
３．２  摂取実験
ＦＩＴＣにより標識化されたＴＡＴ由来のトランスポータ構築物の、ＨＬ−６０細胞株の細胞内への時間依存的な内在化（摂取）は、配列番号５２〜９６、４３、および４５〜４７の配列を有しているトランスポータペプチドの配列を使用して、上記のように行われた。上記トランスポータペプチドの配列を表４に示す。
【０１４２】
【表１０】
0005926250.tif 000013
【０１４３】
【表１１】
0005926250.tif 000014
【０１４４】
【表１２】
0005926250.tif 000015
【０１４５】
上記の表中、それぞれのアミノ酸残基の前の小文字の“ｄ”でＤアミノ酸を示す（例えば、ｄＲ＝Ｄ−Ａｒｇ）。
【０１４６】
幾つかの配列の場合では、残念ながら技術的理由により、最初のアプローチで合成が失敗した。図６中、これらの配列を１、２、３、４、５、６、７、８、４３、５２、５３、５４、５５、５６、５７、８５、８６、８７、８８、８９、および９０でそれぞれ略記して示す。しかし、残りの配列は上記内在化実験で使用した。
【０１４７】
上記摂取実験の結果を図６に示す。
図６に示すように、２４時間のインキュベーション後、共通配列ｒＸＸＸｒＸＸＸｒ（配列番号３１）を有している全てのトランスポータが、上記Ｌ−ＴＡＴトランスポータ（配列番号４３）よりも高い内在化能を示した。１０ｍＭのｒ３−Ｌ−ＴＡＴ由来トランスポータの存在下で、Ｈｅｌａ細部を９６ウェルプレート内で２４時間培養した。その後、上記Ｈｅｌａ細胞を酸性バッファ（０．２Ｍのグリシン、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ３．０）で２回洗浄し、ＰＢＳで２回洗浄した。そして、ＲＩＰＡリーシスバッファを添加して細胞を破壊した。その後、各抽出物の蛍光強度を（Fusion Alphaプレート読取器（PerkinElmer社）を使用して）読み取り、バックグラウンドの除去を行って、内在化したペプチドの相対量を決定した。
【０１４８】
図６に示すように、最も高いトランスポータ活性および改善されたトランスポータ活性の動態にとって１つの位置が重要であるように見える：第２の位置におけるＹ（配列番号１４２に対応するペプチド番号９１）。
【０１４９】
上記実験結果から得られた結論は以下の通りである：
・２４時間のインキュベーション後、共通配列ｒＸＸＸｒＸＸＸｒ（配列番号３１）を有している全トランスポータ（可能性のある配列の選択については、表２を参照）が、上記Ｌ−ＴＡＴトランスポータ（配列番号４３）よりも高い内在化能を示した（図６）。上記実験結果により、上記共通配列ｒＸＸＸｒＸＸＸｒ（配列番号３１）の有効性が十分に立証された。
・一つの位置が、最も高いトランスポータ活性およびに重要であること（図６）：第２の位置におけるＹ（配列番号１４２に対応する配列９１）。
【０１５０】
したがって、表４に示すような上記第２の位置にＹが配置されているＴＡＴ由来配列が好ましく、当該ＴＡＴ由来配列が９アミノ酸からなり、かつ上記共通配列ｒＸＸＸｒＸＸＸｒ（配列番号３１）を示す場合に特に好ましい。
【０１５１】
（実施例４：サイトカイン放出およびケモカイン遊離の測定）
以下に手順を詳述し、リガンド誘導分泌後に、ヒト細胞（血液、ＷＢＣ、ＰＢＭＣ、精製した一次リンパ球、細胞株、．．．）から放出された数種類のヒトサイトカインの放出量をどのように測定したかを記載する。
【０１５２】
使用した技術は、２層の抗体（すなわち、捕捉抗体および検出抗体）間の抗原量の測定を可能にするサンドイッチＥＬＩＳＡ法であった。少なくとも２つの抗体がサンドイッチ状に機能するために、測定対象となる上記抗原は、抗体に結合可能な少なくとも２つの抗原部位を含んでいることが求められる。サンドイッチＥＬＩＳＡ系では、上記捕捉および検出抗体として、単クローン性またはポリクローン性の抗体を使用することができる。単クローン性の抗体は単一エピトープを認識し、抗原の僅かな差異を微細に検出および定量化することを可能にする。ポリクローン性抗体は、上記抗原を可能な限り多くプルダウンするための捕捉抗体として使用されることが多い。サンドイッチＥＬＩＳＡ法の利点は、分析前に上記サンプルを精製する必要が無いことであり、かつ、アッセイの精度が非常に高いことである（直接法または間接法と比較して、アッセイ精度は最大で２倍から５倍高い）。
【０１５３】
上記方法を使用して、本発明のＪＮＫ阻害剤の効果をインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）／細胞培養中で判定してもよい。非毒性のドーズ下では、化合物の効果は、非処理サンプルと比較した場合のサイトカインレベルの低下（（４５０ｎｍの吸収度における）光学濃度のバラつき）で示され、ＥＬＩＳＡ法によりモニタリングされる。これらの結果は、ｎｇ／ｍｌの単位で示される。
【０１５４】
４．１  材料
・  ９６ウェルプレート：
上記上澄の回収用（参照番号８２．１５８１、Sarstedt社）。
ＥＬＩＳＡ法用（Ｆ９６ｍａｘｉｓｏｒｐ、参照番号４４２４０４、Ｎｕｎｃ社）。
・  ＴｏｐＳｅａｌ−Ａ：９６ウェルマイクロプレート用密閉材（参照番号６００５８５、PerkinElmer社）。
・  ＥＬＩＳＡ試薬
コーティングバッファＥＬＩＳＡ：０．１ＭのＮａＣａｒｂｏｎａｔｅ  ｐＨ９．５（１リットルのＨ２Ｏ中、７．１３ｇのＮａＨＣＯ３（参照番号７１６２７、Fluka社）および１．５９ｇのＮａ２ＣＯ３（参照番号７１３４５、Fluka社）、ＮａＯＨを含み９．５までのｐＨ  濃縮）。
洗浄バッファＥＬＩＳＡ：ＰＢＳ  １Ｘ＋０．０１％のＴｗｅｅｎ２０。１リットルのＰＢＳ  １Ｘ（ＰＢＳ  １０Ｘ：参照番号７００１１、ＧＩＢＣＯ社）を調製し、磁気撹撹拌器で撹拌させながら１００μｌのＴｗｅｅｎ２０（参照番号Ｐ１３７９、Sigma社）をゆっくりと添加する）。
アッセイ希釈剤：ＰＢＳ  １Ｘ＋１０％ＦＢＳ（参照番号：Ａ１５−１５１、ＰＡＡ、５６℃で３０分間デコンプリメンテーション）。
ＤＡＫＯ  ＴＭＢ（参照番号Ｓ１５９９、ＤＡＫＯ社）：市販の基質溶液。
停止液：１ＭのＨ３ＰＯ４（２００ｍｌの場合、１７７ｍｌのＨ２Ｏ＋２３ｍｌのＨ３ＰＯ４  ８５％（参照番号３４５２４５、Ａｌｄｒｉｃｈ社））。
・ＥＬＩＳＡキット（２０プレート用の試薬）
ＩＦＮ−γ：ヒトＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡセット、BD OptEIA（商標）（参照番号５５５１４２、ＤＢ社）。
ＩＬ−１β：ヒトＩＬ−１β  ＥＬＩＳＡセットＩＩ、BD OptEIA（商標）（参照番号５５７９５３、ＢＤ社）。
ＩＬ−１０：ヒトＩＬ−１０  ＥＬＩＳＡセットＩＩ、BD OptEIA（商標）（参照番号５５５１５７、ＤＢ社）。
ＩＬ−１２：ヒトＩＬ−１２（ｐ７０）  ＥＬＩＳＡセット、BD OptEIA（商標）（参照番号５５５１８３、ＤＢ社）。
ＩＬ−１５：ヒトＩＬ−１５  ＥＬＩＳＡセット、BD OptEIA（商標）（参照番号５５９２６８、ＤＢ社）。
ＩＬ−２：ヒトＩＬ−２  ＥＬＩＳＡセット、BD OptEIA（商標）（参照番号５５５１９０、ＤＢ社）。
ＩＬ−４：ヒトＩＬ−４  ＥＬＩＳＡセット、BD OptEIA（商標）（参照番号５５５１９４、ＤＢ社）。
ＩＬ−５：ヒトＩＬ−５  ＥＬＩＳＡセット、BD OptEIA（商標）（参照番号５５５２０２、ＤＢ社）。
ＩＬ−６：ヒトＩＬ−６  ＥＬＩＳＡセットＩ、BD OptEIA（商標）（参照番号５５５２２０、ＤＢ社）。
ＩＬ−８：ヒトＩＬ−８  ＥＬＩＳＡセット、BD OptEIA（商標）（参照番号５５５２４４、ＤＢ社）。
ＭＣＰ−１：ヒトＭＣＰ−１  ＥＬＩＳＡセット、BD OptEIA（商標）（参照番号５５５１７９、ＤＢ社）。
ＴＮＦ−α：キット ヒトＴＮＦ  ＥＬＩＳＡセット、BD OptEIA（商標）（参照番号５５５２１２、ＤＢ社）。
・吸光度読取：
上記吸光度をFusion Alpha Plate読取器（Perkin Elmer社）で読み取った。
・反復ピペット、デジタルピペット、または多重チャンネルピペット。
【０１５５】
４．２  方法
サンプルの調製
サンプルとして、培養したヒト細胞（通常は、全血、ＷＢＣ、ＰＭＢＣ、ＷＢＣの精製サブタイプ、癌性細胞株）から得られた培養培地上澄を使用する。遠心分離（４００ｇ、５分間、４℃）により上記サンプルから粒子状物質を取り除き、この直後に、上記サンプルのアッセイを行うか、または上記サンプルを−２０℃以下で保存する。凍結融解を繰り返し行うことは避ける。使用の１時間前に、凍結させた上記サンプルを解凍し、遠心分離器にかける。工程１１において、上記サンプルをアッセイ希釈剤中で上記プレートにおいて直接的に希釈する（アッセイ希釈剤を添加した後に上記サンプルを添加し、ピペットによる吸い上げ下げを行う）。
【０１５６】
スタンダードの調製
凍結乾燥したスタンダードを室温まで温めた後、材料損失を避けるようにバイアルを慎重に開ける。そして、上記凍結乾燥させたスタンダードを、企図する量の脱イオン水でもどし、スタンダードのストックを作製する。希釈を行う前に上記スタンダードを少なくとも１５分間平衡化させる。穏やかにボルテックスして、混合する。上述のように上記凍結乾燥させたスタンダードを脱イオン水でもどした直後に、スタンダードのストックを各バイアル当たり５０μｌとなるようにポリプロピレン製バイアルに等分し、−２０℃で最大６か月間凍結させる。必要に応じて、これら等分／凍結を行う前に、２℃〜８℃で最大で８時間保存する。なお、上記脱イオン水でもどしたスタンダードを室温で静置することは避ける。
使用直前に、Ｄｉｌｕｅｎｔ試薬中で希釈倍率が２倍毎の段階的希釈法を使用して１０ポイントの標準曲線を調製した。４０００ｐｇ／ｍｌの高スタンダードが推奨される。
【０１５７】
ディテクタミックス（Detector Mix）の調製
ビオチン／ＳＡｖ試薬の１工程インキュベーション。必要な量の検出用抗体をアッセイ希釈剤（Assay Diluent）に添加する。使用前１５分以内に、必要な量の酵素試薬を添加して、ボルテックスまたは混合を十分に行う。推奨される希釈物を得るため、ロット固有の取扱説明書／分析証明書を参照。使用後、残留して動作しているディテクタを廃棄する。
【０１５８】
捕捉抗体によるコーティング
１．コーティング用バッファ中に希釈した捕捉抗体を各ウェル当たり１００μＬ使用して、ＰＶＣマイクロタイタープレートのウェルをコーティングする。推奨される抗体のコーティング用希釈物を得るため、ロット固有の説明書／分析証明書を参照。
２．上記ＰＶＣマイクロタイタープレートを接着性プラスチックで覆い、４℃の温度下で一晩かけてインキュベートする。
３．上記コーティング溶液を取り除き、上記プレートのウェルに１５０μｌの洗浄バッファを注入して洗浄する。
４．上記プレートを浴槽上で軽く叩いて、コーティング溶液または洗浄液を取り除く。
５．上述のプロセスを２回繰り返し行うことで、あわせて３回の洗浄を行う。
６．最後の洗浄後、上記プレートを紙タオルで軽く叩いて、残留する洗浄バッファを取り除く。
【０１５９】
ブロッキング
７．コーティングを行った上記ウェル内において、各ウェル当たり１００μｌのＤｉｌｕｅｎｔ試薬を添加して、残留しているタンパク質結合部位をブロッキングする。
８．上記プレートを接着性プラスチックで覆い、室温で１時間インキュベートする。
９．上記インキュベーションの最中に、スタンダードの調製を開始する。
【０１６０】
サンプル添加
１０．洗浄バッファ１５０μｌを使用して、工程３のように洗浄を１回行う。これにより、上記プレートは、サンプル添加への準備ができた状態である。
１１．各ウェルに対して、アッセイ希釈剤中に適切に希釈したサンプルを５０μｌづつ添加する。正確な定量結果を得るために、未知試料のシグナルを標準曲線のものと常に比較する。スタンダード（３重）とブランクとは各サイトカインを存在させて試験を行い、正確性を確保する。
１２．上記プレートを接着性プラスチックで覆い、室温で２時間インキュベートする。
【０１６１】
検出抗体と２次抗体を使用したインキュベーション
１３．上記工程３と同様に、上記プレートを１５０μｌの洗浄バッファで４回洗浄する。
１４．推奨される希釈（ロット固有の説明書／分析証明を参照）において、５０μｌのディテクタミックス（アッセイ希釈剤中の検出抗体＋二次ストレプタビジン−ＨＲＰ抗体）を各ウェルに添加する。
１５．上記プレートを接着性プラスチックで覆い、遮光した状態で、室温において１時間インキュベートする。
１６．上記工程３にように、上記プレートを１５０μｌの洗浄バッファで６回洗浄する。
１７．各ウェルに５０μｌのＤＡＫＯ ＴＭＢ溶液を添加し、上記プレートを密閉せずに室温で１５〜２０分間暗闇でインキュベートする。
１８．停止液５０μｌを各ウェルに添加する。上記プレートを優しくタップし、完全な混合を確保する。
１９．プレートミキサーにより、上記プレートを５００ｒｐｍの回転数で５分間混合する。
２０．波長４５０ｎｍで光学濃度を読み取る（プログラム：Ｆｕｓｉｏｎ Ａｌｐｈａ Ｐｌａｔｅ読取器上でサイトカイン_ＥＬＩＳＡ）。
【０１６２】
データ分析
各スタンダード対照（スタンダードコントロール）と各サンプルについて、３回繰り返した読取の平均をとる。ゼロ標準の光学濃度（Ｏ．Ｄ）の平均を差し引く。Ｏ．Ｄ対数に対応するサイトカイン対数をプロットした標準曲線を引き、回帰分析により最もよく適合する線を決定する。サンプルを希釈した場合、上記標準曲線から読み取れる濃度値は、希釈係数を乗じた値になることが求められる。標準曲線は、分析対象の各サンプルのセットに対して作成する必要がある。Ｇｒｕｇｇ試験を使用して、異常値データを避ける。その後、標準偏差の２倍の間隔内にないデータを廃棄する。ポジティブ対照（ポジティブコントロール）が予め確認されたようなデータを示す場合、独立した（independent）実験を考慮に入れる。これら独立した実験をプールする（Ｎ＞３）。
データは、サイトカイン放出量（単位：ｐｇ／ｍｌ）、または阻害剤の処理を行わない誘導条件と比較した百分率（％）で示す。
【０１６３】
（実施例５：ＴＨＰ１の分化−サイトカイン放出のための刺激）
本実施例の手順を以下に詳述し、ＬＰＳの投与を６時間受けたヒトＰＭＡ分化ＴＨＰ１細胞から如何にしてサイトカイン生成を誘導したかを説明する。本実施例は、サイトカインの刺激誘導放出を減衰させることに関する、本発明にかかるＪＮＫ阻害剤（特に、配列番号１７２の配列を有しているＪＮＫ阻害剤）の能力を試験するために行った。サイトカイン放出の読取のために、異なるリガンドを使用してＴＨＰ１細胞をｅｘ−ｖｉｖｏにおいて刺激した。非毒性のドーズ下では、ＪＮＫ阻害剤の有効性は、非処理のサンプルと比較したサイトカインレベルの低下で示され、ＥＬＩＳＡ法によりモニタリングされる。化合物の毒性は、トレタゾリウム塩（ｔｒｅｔａｚｏｌｉｕｍ ｓａｌｔ（ＭＴＳ））からホルマリンへの還元（紫色を生じさせる。）に基づき評価した。
【０１６４】
手順：
ａ．材料
・細胞株：ＴＨＰ−１（参照番号ＴＩＢ−２０２、ATCC、ロット５７７３１４７５）。
・培養培地、試薬、およびプレート
−  以下の成分を補充したＲＭＰＩ（参照番号２１８７５−０９１、Invitrogen社）：
１０％ＦＢＳ（参照番号Ａ１５−１５１、ＰＡＡ社）：５６℃で３０分間のデコンプリメンテーション。
１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（参照番号Ｈ０８８７、Sigma社）。
５０Ｍの−メルカプトエタノール（参照番号６３６９０、Fluka社：１４．３Ｍのストック）：−２０℃でストックしたＰＢＳに対して、５０ｍＭのアリコート５６０ｌを添加。
１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（参照番号Ｓ８６３６、Sigma社）。
ペニシリン（１００ユニット／ｍｌ）／ストレプトマイシン（１００ｇ／ｍｌ）（参照番号Ｐ４３３３、Sigma社）。
その後、上記ＲＰＭＩ培地を０．２２Ｍのフィルタ（参照番号ＳＣＧＰＵ０５ＲＥ、Millipore社）で濾過する。
−  ＰＢＳ  １０Ｘ（参照番号７００１１、Invitrogen社）：滅菌Ｈ２Ｏを使用して１Ｘまで希釈する。
−  ＤＭＳＯ：参照番号４１４４４、Ｆｌｕｋａ社。
−  ＰＭＡ（ホルボール  １２−ミリステート−１３アセテート、参照番号Ｐ１５８５、Sigma社、濃度１ｍＭ＝６１６．８ｕｇ／ｍｌ、−２０℃のＤＭＳＯ中）。ＲＰＭＩ中１００ｎＭの終濃度で（１０ｍｌの培地中において１μｌ）直接使用する。
−  ＬＰＳultrapure（リポ多糖体、参照番号ｔｌｒｌ−ｅｋｌｐｓ、Invivogen社、濃度５ｍｇ／ｍｌ）：ＬＰＳのストック溶液：４℃において、ＰＢＳ中３ｇ／ｍｌ。ＲＰＭＩ培地中４０ｎｇ／ｍｌの４Ｘ濃度溶液を調製するために直接使用する（最低限、１８００ｌ／プレート；５プレート：ＬＰＳ３ｇ／ｍｌを１２５ｌ＋９２５０ｌ  ＲＰＭＩ）。
−  ９６ウェルプレート
接着細胞培養用（参照番号１６７００８、Nunc社）
上澄回収用（参照番号８２．１５８１、Sarstedt社）
ＥＬＩＳＡ用（Ｆ９６ ｍａｘｉｓｏｒｐ、参照番号４４２４０４、Nunc社）
コーティング溶液：ポリＤ−リジン（参照番号Ｐ９０１１、Sigma社）：ＰＢＳ１Ｘ中、２５ｇ／ｍｌの最終希釈物。
・ＥＬＩＳＡ試薬およびキット
−  コーティングバッファＥＬＩＳＡ：０．１ＭのＮａＣａｒｂｏｎａｔｅ  ｐＨ９．５（１リットルのＨ２Ｏ中、７．１３ｇのＮａＨＣＯ３（参照番号７１６２７、Fluka社）および１．５９ｇのＮａ２ＣＯ３（参照番号７１３４５、Fluka社）、ＮａＯＨを含む９．５までのｐＨ  濃縮）
−  洗浄バッファＥＬＩＳＡ：ＰＢＳ  １Ｘ＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（参照番号Ｐ１３７９、Sigma社、ロット０９４Ｋ００５２）（＝１リットルのＰＢＳ１Ｘを調製し、磁性撹拌器を使用して撹拌を行いながら１００μｌのＴｗｅｅｎ２０をゆっくりと添加する）。
−  アッセイ希釈剤：ＰＢＳ１Ｘ＋１０％ＦＢＳ（参照番号Ａ１５−１５１、PAA社、５６℃で３０分間デコンプリメンテーション）。
−  ＤＡＫＯ  ＴＭＢ（参照番号Ｓ１５９９、DAKO社）：市販の基質溶液。
−  停止液：１ＭのＨ３ＰＯ４（２００ｍｌの場合、１７７ｍｌのＨ２Ｏ＋２３ｍｌのＨ３ＰＯ４  ８５％（参照番号３４５２４５、Aldrich社））。
−  ＴＮＦ−  ：キット ヒトＴＮＦ  ＥＬＩＳＡセット、ＢＤ ＯｐｔＥＩＡ（参照番号５５５２１２、DB社）。
・細胞毒性測定：ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６試薬（参照番号Ｇ３５８１、Promega社）。
・コントロール（対照）化合物：ＳＰ６００１２５（参照番号ＡＬＸ−２７０−３３９−Ｍ０２５、Ａｌｅｘｉｓ社、濃度：２０ｍＭ  ＤＭＳＯ）。
・吸光度の読取：Ｆｕｓｉｏｎ Ａｌｐｈａ Ｐｌａｔｅ読取器（Perkin Elmer社）で吸光度を読み取った。
・連続分注ピペット、デジタルピペット、またはマルチチャンネルピペット
ＴｏｐＳｅａｌ−Ａ：９６ウェルマイクロプレートシール（参照番号６００５８５、PerkinElmer社）。
【０１６５】
ｂ  方法
ウェルのコーティング
上記プレートを２００ｌのポリＤ−リジン（１ｘ）でコーティングした。そして、３７℃の温度条件下で、５％ＣＯ２、１００％の相対湿度下で、インキュベーションを２時間行った。
【０１６６】
細胞播種
２時間後、上記ウェルを２００ｌのＰＢＳ  １Ｘで２回洗浄した（直ちに使用するか、または使用するまで２００ｌのＰＢＳ  １ｘの存在下で３０℃の温度で静置した（但し、静置期間は３日を超えないものとした））。
【０１６７】
上記細胞の数を数えた。そこから所望の数の細胞を取り出し、１００００００細胞／ｍｌの希釈を得るのに必要な量の培地中に再懸濁した。１００ｎＭのＰＭＡを添加して、ＴＨＰ１が懸濁性の単球から接着性のマクロファージへ分化するのを誘起した。上記細胞を１００ｌの培地中において１００００００細胞／ｍｌの密度で上記ウェルに播種した。播種後、３０℃の温度条件下で、５％ＣＯ２、１００％の相対湿度でインキュベーションを３日間行うことで、実験的薬剤の添加前に上記細胞を分化させた。
【０１６８】
細胞処理
３日後、顕微鏡を使用して上述の接着細胞を観察した。ＰＭＡ含む上記培地を吸引して、ＰＭＡを含まない１００ｌの新しいＲＰＭＩ培地を代わりに供給した（ＰＢＳ  １ｘによる洗浄工程は行わなかった）。
【０１６９】
実験的薬剤は、Ｈ２Ｏ中またはＤＭＳＯ中、その濃度が１０ｍＭとなるように調製した。このように調製した上記実験的薬剤を８０℃で保存した。日々の使用に供する前に、１アリコート分のＪＮＫ阻害剤を解凍し、まず４Ｘ濃縮溶液（１２０Ｍ）を得るようにＲＰＭＩ培地中に希釈し、その後ＲＰＭＩ中で所望の濃度となるように希釈した。ＳＰ６００１２５は、まず４Ｘ濃縮溶液（４０Ｍ）を得るようにＲＰＭＩ培地中に希釈した後、０．８％ＤＭＳＯを含むＲＰＭＩ中で所望の濃度となるように希釈した。
【０１７０】
５０ｌの培地か、あるいは最終的に所望とする薬剤の濃度（ＪＮＫ化合物は最終的に０、１００ｎＭ、１Ｍ、３Ｍ、１０Ｍ、または３０Ｍの濃度、またはポジティブコントロールのＳＰ６００１２５は最終的に０ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１Ｍ、３Ｍ、または１０Ｍの濃度）の４Ｘの溶液５０ｌかを使用して、上記プレートを処理した。上記実験的薬剤の添加に続いて、３７℃の温度下で、５％ＣＯ２、１００％の相対湿度で、プレートのインキュベーションをさらにもう１時間行った。
【０１７１】
１時間後、５０ｌの４Ｘ濃縮のＬＰＳ  ultrapureの希釈物（終濃度：３ｎｇ／ｍｌ）を添加して、ＴＮＦの分泌を誘導した。
【０１７２】
アッセイ
６時間後、１００ｌの上澄を新しい９６ウェルプレートへ移した。そして、上記９６ウェルプレートを封止し、ＥＬＳＡ法（実施例４を参照）によるサイトカイン分泌の分析を行うまで−２０℃で保存した。
【０１７３】
化合物の細胞毒性効果をＭＴＳ吸収度により評価し（例えば、実施例４を参照）、倒立顕微鏡（Axiovert 40 CFL； Zeiss； １０Ｘ）を使用して細胞を観察した。
【０１７４】
データ分析
上記データの分析をＥＬＩＳＡ法で説明したように行う（実施例４を参照）。簡単に説明すると、ＥＬＩＳＡ法の場合：各スタンダードコントロールおよび各サンプルについて、３重の読取をしてその平均をとる。そして、ゼロスタンダードの光学濃度（Ｏ．Ｄ）の平均を差し引く。Ｏ．Ｄの対数に対応するサイトカイン濃度の対数をプロットする標準曲線を引き、回帰分析により最もよく適合する線を決定する。サンプルを希釈していた場合、上記標準曲線から読み取れる濃度値は希釈係数を乗じた値であることが求められる。標準曲線は、アッセイ対象のサンプルの各セットについて作成すべきである。Ｇｒｕｇｇ試験を利用して、異常値データを避けた。標準偏差の２倍の間隔範囲の外にあるデータは廃棄した。ポジティブコントロールが以前に観察されたようなデータを示した場合は、独立した実験を考慮に入れる。上記独立した実験はプールされている（Ｎ＞３）。
【０１７５】
細胞毒性効果の評価の場合：サイトカイン放出実験の分析において考慮した独立した実験それぞれの各プレート上において、上記培地のみの吸光度の平均値はバックグランドとして無視できないものであり、各吸光度値からこのバックグランドが差し引かれた。各化合物の非処理細胞の３重測定の平均は、１００％の実行性の上では無視できないものであった。各化合物のこの３重測定の平均は、その１００％によってノーマライズされた。Ｇｒｕｇｇ試験を使用して異常値データを避けた。その後、標準偏差の２倍の間隔の範囲外のデータを廃棄した。上記独立した実験をプールした（Ｎ＞３）。
【０１７６】
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４ソフトウェアを用いて、次の試験を行って、全ての条件に係る統計比較を行った：ここで試験は、one way ANOVA試験を行った後に、Tukey'ｓ Multiple Comparison試験を行った。Ｐ＜０．０５の場合、有意であると判断した。
【０１７７】
（実施例６：配列番号１７２の配列を有しているＪＮＫ阻害剤、およびラットまたはヒトのプライマリ全血細胞におけるＴＮＦα放出）
クエン酸ナトリウムを含む、予め標識化された真空管に接続した静脈穿刺を利用して、麻酔をかけたラットまたは健康な志願人の全血を採取した。上記管を７、８回反転させて採取した全血とクエン酸ナトリウムを穏やかに混合させた後、得られたミックスを、刺激を与えるまで室温に保持した。配列番号１７２に示す配列を有しているＪＮＫ阻害剤を、ＰＢＳ中６倍の濃縮度で調製し、３０μｌ／ウェルの分量で上記ミックスを９６ウェルプレートに添加した。全血をＰＢＳ中に１：２の比率で希釈し、ＰＢＳのみ又は上記配列番号１７２の配列を有している上記ＪＮＫ阻害剤が予め添加されている各ウェルに１２０μｌの希釈血液を添加した。Stuart OrbitalインキュベータＳＩ５００の回転数を８５ｒｐｍに設定し、全血を３７℃で６０分間インキュベートした。活性化因子（ＬＰＳ）は、６倍の濃縮度で調製したものを３０μｌ／ウェルの分量で使用した。培養を６０分間行った後、上記全血にＬＰＳを添加し、ピペットによる吸い上げ下げを行って混合した。その後、得られたミックスを撹拌（８５ｒｐｍ）させながら３７℃で４時間保存した。４時間のインキュベーションを行った後、上記プレートを予め冷却した遠心分離機にかけ、約７７０ｇおよび４℃で１５分間遠心分離を行った。最後に上澄を回収し、サイトカインの測定を行うまで−２０℃で保存した。その後、標準的なＥｌｉｓａキット（例えば、R&D Systems社製のDuoSet ElisasまたはBD Biosciences社製のBD Opteia Set Elisa）を使用して、サイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、およびＴＮＦα）を測定した。測定結果を、上記サイトカインの、上澄中のｐｇ／ｍｌとして示す。
【０１７８】
活性化因子／刺激物としてＬＰＳに代えてＰＭＡ＋イオノマイシンを使用して同様の実験を行った。
【０１７９】
（実施例７：ここに開示する特定のＪＮＫ阻害剤の半減期）
配列番号１９６、１９７、および１７２の配列を有しているＪＮＫ阻害剤（終濃度：０．１ｍＭ）を、ヒト血清中（ＰＢＳ  １ｘ中で１０％および５０％）で消化した。Ｔｕｇｙｉ ｅｔ ａｌ.（Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 413-418）に開示されているように実験を行った。消化されずに残った完全なペプチドをＵＰＬＣ−ＭＳで定量化した。２つの別箇のアッセイを行う以外は同一の方法で、上記配列番号１９６、１９７、および１７２の配列の安定性を算定した。上記配列番号１９６の配列を有しているＪＮＫ阻害剤は６時間以内に完全に分解されてアミノ酸残基になった一方、上記配列番号１７２の配列を有しているＪＮＫ阻害剤は１４日後に漸く完全に分解された。上記配列番号１９７の配列を有しているＪＮＫ阻害剤は３０日後も安定したままであった。
【０１８０】
（実施例８：配列番号１７２の配列を有しているＪＮＫ阻害剤による、ラットのプライマリＴ細胞内のＣＤ３／ＣＤ２８誘導ＩＬ−２放出のドーズ依存的抑制）
コントロールの動物を犠牲にし、そのリンパ節（ＬＮ）を採り、完全ＲＰＭＩ培地中で保存した。保存後、５ｍｌのピストンを使用して、７０μｍフィルタ上で、上記ＬＮを上記完全ＲＰＭＩ培地と混ぜて破砕した。数滴の培地を添加してストレーナーを濡れた状態に保った。４５０ｇおよび４℃の条件下で細胞を７分間遠心分離した。沈殿物を５ｍｌの新しい培地中に再懸濁した。再懸濁後、細胞を再度、セルストレーナーに通した。細胞を１４００ｒｍｐの回転数および４℃の条件下で１０分間にわたり再度遠心分離しつつ、１アリコート分の細胞の数を数えた。細胞をＭＡＣＳバッファ（１０７細胞当たり８０μｌのＭＡＣＳバッファ）中に再懸濁した。１０００万個の細胞当たり１０μｌの抗ラットＭＨＣマイクロビーズを添加し、細胞を４℃〜８℃で１５分間インキュベートした。そして、上記細胞を１５ｍｌのＭＡＣＳバッファで洗浄し、７００ｇおよび４℃の条件下で７分間遠心分離した。１０８個の細胞当たり５００μｌのＭＡＣＳバッファ中に沈殿物を再懸濁した。動物ごとに、上記ＭＡＣＳセパレータの磁界内にＬＳカラム（ＬＳ ｃｏｌｕｍｎ）を１つ設置した。上記ＬＳカラムを先ず３ｍｌのＭＡＣＳバッファでリンスした。上記ＬＳカラムの下方において１つの管を氷中に設置して、細胞＝Ｔ細胞を回収した（ネガティブセレクションを行い、溶出物を回収した）。細胞懸濁物を添加し、溶出物を氷上で回収した。カラムを３ｍｌのＭＡＣＳバッファで３回洗浄した。溶出したＴ細胞を、７００ｇおよび４℃下で７分間遠心分離した。再懸濁させた細胞の数を数え、２０００００細胞／ウェルの密度で１００μｌの完全培地中に播種した。２μｇ／ｍＬのＣＤ３抗体を使用する実験の前日に、プレートに予めコーティングを施し、実験日に当該プレートをＰＢＳで３回洗浄した。リガンドによる活性化の１時間前に、２倍に濃縮した１００μｌの（ポリ）ペプチドＪＮＫ阻害剤（配列番号１７２）で細胞を処理した。（ポリ）ペプチドＪＮＫ阻害剤（配列番号１７２）を用いた前処理の１時間後に、細胞を２μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８抗体で２４時間刺激した。この２４時間の刺激付与の後、上澄を回収し、分析を行うまで−２０℃で保存した。その後、標準のＥｌｉｓａキットを使用してサイトカインを測定した。測定結果を、上澄における、上記サイトカインのｐｇ／ｍｌとして示した。
【０１８１】
更なる実験では上述のものと基本的に同一のプロトコールを採用したが、配列番号１７２を有している上記（ポリ）ペプチドＪＮＫ阻害剤だけでなく配列番号１９７の配列を有しているＪＮＫ阻害剤および薬物分子「ＳＰ６００１２５」も試験して、ＣＤ３／ＣＤ２８誘導のＩＬ−２放出に対する阻害について、これら阻害剤間で比較した。
【０１８２】
（実施例９：ヒト全血における、ＪＮＫ阻害剤およびＴＮＦα／ＩＬ−２の放出）
クエン酸ナトリウムを含み、予め標識化された真空管に接続された静脈穿刺を使用して、健康状態の志願者からヒト全血を採取した。上記管を７、８回反転させて混合した後、刺激を与えるまで室温に保持する。１，２ｍｌ−９６ウェルプレートに、３５０μｌのＲＰＭＩ＋Ｐ／Ｓを添加した。ＲＰＭＩ＋Ｐ／Ｓ（各ウェル当たり５０μｌ）中において、配列番号１７２の１０倍濃縮物を調製した。この５０μｌを１，２ｍｌ−９６ウェルプレートに添加した。その後、培地のみ又はＪＮＫ阻害剤を予め添加した各ウェルに、５０μｌの全血を添加した。全血を３７℃および５％ＣＯ２の条件下で６０分間インキュベートした。ＲＰＭＩ＋Ｐ／Ｓ中に希釈した、ウェルあたり５０μｌのリガンドを、最終希釈の１０倍濃度となるように調製した。上記６０分間のインキュベーション後、リガンドを添加した。そして、ピペットで上記全血の吸い上げ下げして、上記ウェル内の混ぜ合わせを行った。上記全血は、３７℃で３日間インキュベーションを行った（各ウェル内の吸い上げ下げを１日１回行い、当該ウェル内の混ぜ合わせをした）。上記インキュベーションの終了時に、プレートの混ぜ合わせを行い、その後、予め冷却した遠心分離機を使用して、２５００ｒｐｍおよび４℃の条件下で遠心分離を１５分間行った。その後、標準のＥｌｉｓａキットを使用してサイトカインを測定した。測定結果を、上記上澄における、上記サイトカインのｐｇ／ｍｌで示す。
【０１８３】
同様の実験を僅かに変化させて行った。ＣＤ３／ＣＤ８刺激の場合では、ＰＢＳ中２μｇ／ｍＬのＣＤ３抗体で、４℃で一晩、コーティングした。実験日、ＰＢＳでウェルを３回洗浄し、洗浄後の当該ウェルを使用時期が来るまで３７℃の条件下でＰＢＳ中に静置した。配列番号１７２の添加から１時間後に、２μｇ／ｍＬの終濃度でＣＤ２８を添加した。刺激を印加してから３日後に、上澄を回収した。
【図面の簡単な説明】
【０１８４】
【図１】インビトロのAlphaScreenアッセイ（増幅ルミネセンス近接ホモジニアスアッセイ）によって調べられた、本発明に係るいくつかのＪＮＫ阻害剤の阻害作用を示す図である。
【図２】本発明に係るいくつかのＪＮＫ阻害剤（配列番号１９３、２、３、５、６および７）の阻害作用を示す図である。
【図３】本発明に係るいくつかのＪＮＫ阻害剤の阻害作用を示す図である。
【図４】本発明に係るいくつかのＪＮＫ阻害剤の阻害作用を示す図である。
【図５】配列番号１７２、１９６および１９７を有しているＪＨＫ阻害剤の、５０％ヒト血清における安定性を示す図である。
【図６】配列番号３０に示されるようなＤ−アミノ酸／Ｌ−アミノ酸パターンを有しているＴＡＴ由来のトランスポータコンストラクトを用いた内在化実験を示す図である。
【図７】配列番号１７２の配列を有しているＪＮＫ阻害剤が、ＴＨＰ１−ＰＭＡ−分化されたマクロファージにおけるＬＰＳに誘導されるサイトカインおよびケモカインの放出を阻害することを示す図である。
【図８】配列番号１７２の配列を有しているＪＮＫ阻害剤が、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（配列番号１９７）、ｄＴＡＴ（配列番号４５）およびＳＰ６００１２５より高い作用強度を有して、ＴＨＰ１−分化されたマクロファージにおけるＬＰＳに誘導されるＩＬ６放出を阻害することを示す図である。
【図９】配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤が、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（配列番号１９７）、ｄＴＡＴ（配列番号４５）およびＳＰ６００１２５より高い作用強度を有して、ＴＨＰ１−分化されたマクロファージにおけるＬＰＳに誘導されるＴＮＦα放出を阻害することを示す図である。
【図１０】配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤が、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（配列番号１９７）およびＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（配列番号１９６）より高い作用強度を有して、ＰＭＡ−分化されたマクロファージにおけるＬＰＳに誘導されるＩＬ−６放出を阻害することを示す図である。
【図１１】配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤が、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（配列番号１９７）およびＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（配列番号１９６）より高い作用強度を有して、ＰＭＡ−分化されたマクロファージにおけるＬＰＳに誘導されるＴＮＦα放出を阻害することを示す図である。
【図１２】配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤が、ラットの初代の全血細胞におけるＬＰＳに誘導されるＴＮＦα放出を、３ｎｇ／ｍｌにおいて阻害することを示す図である。
【図１３】配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤が、ＰＭＡ／イオノマイシンに応答した初代のヒトＴ細胞によるＩＬ２分泌を阻害することを示す図である。
【図１４】配列番号１７２のＪＮＫ阻害剤が、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激に応答した初代のヒトＴ細胞によるＩＬ２分泌を阻害することを示す図である。
【図１５】ラットのリンパ節から精製された初代のＴ細胞におけるＣＤ３／ＣＤ２８に誘導されるＬ−２放出の、配列番号１７２を有しているＪＮＫ阻害剤による用量依存的な阻害を示す図である。
【図１６】ラットのリンパ節から精製された初代のＴ細胞におけるＣＤ３／ＣＤ２８に誘導されるＬ−２放出の用量依存的阻害を示す図である。
【図１７】ＭＡおよびイオノマイシンを用いて刺激したラット全血におけるＩＬ−２放出の用量依存的阻害を示す図である。
【図１８】ヒト全血におけるＪＮＫ阻害およびＩＬ−６放出を示す図である。
【図１９】ヒト全血におけるＪＮＫ阻害およびＩＬ−２放出を示す図である。
【図２０】ヒト全血におけるＪＮＫ阻害およびＩＦＮ−γ放出を示す図である。
【図２１】ヒト全血におけるＪＮＫ阻害およびＩＦＮ−α放出を示す図である。
【図２２】ヒト全血におけるＪＮＫ阻害およびＩＦＮ−α放出を示す図である。
【図２３】ヒト全血におけるＪＮＫ阻害およびＩＬ−２放出を示す図である。
【図２４】ヒト全血におけるＪＮＫ阻害およびＴＦＮ−α放出を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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