(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４のアミノ酸残基３７６〜５０３（ドメインＣ）を欠くという条件で、配列番号３のアミノ酸残基３７６〜４８７（ドメインＢ）を含む、可溶性梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）抗原４７（ＴｐＮ４７抗原）であって、該ＴｐＮ４７抗原がシャペロンに融合している、前記抗原。
【請求項２】
配列番号４のアミノ酸残基３７６〜５０３（ドメインＣ）を欠くという条件で、配列番号２のアミノ酸残基３７６〜５７２（ドメインＡ＋Ｂ）を含む、可溶性梅毒トレポネーマ抗原４７（ＴｐＮ４７抗原）であって、該ＴｐＮ４７抗原がシャペロンに融合している、前記抗原。
【請求項３】
配列番号６のアミノ酸残基３７６〜４５８（ドメインＤ）をさらに含む、請求項１または２記載の可溶性梅毒トレポネーマ抗原４７（ＴｐＮ４７抗原）（ドメインＢまたはＡ＋Ｂ）。
【請求項４】
配列番号４のアミノ酸残基３７６〜５０３（ドメインＣ）を欠くという条件で、配列番号３のアミノ酸残基３７６〜４８７（ドメインＢ）を含み、配列番号６のアミノ酸残基３７６〜４５８（ドメインＤ）をさらに含む、可溶性梅毒トレポネーマ抗原４７（ＴｐＮ４７抗原）。
【請求項５】
配列番号４のアミノ酸残基３７６〜５０３（ドメインＣ）を欠くという条件で、配列番号２のアミノ酸残基３７６〜５７２（ドメインＡ＋Ｂ）を含み、配列番号６のアミノ酸残基３７６〜４５８（ドメインＤ）をさらに含む、可溶性梅毒トレポネーマ抗原４７（ＴｐＮ４７抗原）。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項記載の梅毒トレポネーマ抗原４７（ＴｐＮ４７抗原）をコードする、組換えＤＮＡ分子。
【請求項７】
機能可能であるように連結された請求項６記載の組換えＤＮＡ分子を含む、発現ベクター。
【請求項８】
請求項７記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項９】
−請求項８記載の宿主細胞を培養し
−前記ＴｐＮ４７抗原を発現させ、そして
−前記ＴｐＮ４７抗原を精製する
工程を含む、可溶性および免疫反応性梅毒トレポネーマ抗原４７（ＴｐＮ４７抗原）を産生する方法。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項記載のＴｐＮ４７抗原、およびＴｐＮ１７抗原およびＴｐＮ１５抗原からなる群より選択される少なくとも１つのさらなる梅毒トレポネーマ抗原を含む、少なくとも２つの梅毒トレポネーマ抗原の組成物。
【請求項１１】
単離試料において、梅毒トレポネーマに特異的な抗体を検出するための方法であって、請求項１〜５のいずれか一項記載のＴｐＮ４７抗原、または請求項１０記載の抗原の組み合わせまたは組成物を、前記梅毒トレポネーマ抗体の捕捉試薬として、および/または結合パートナーとして用いる、前記方法。
【請求項１２】
単離試料において、梅毒トレポネーマに特異的な抗体を検出するための方法であって、
ａ）請求項１〜５のいずれか一項記載のＴｐＮ４７抗原または請求項１０記載の少なくとも２つの梅毒トレポネーマ抗原の組成物と、体液試料を混合することによって、免疫反応混合物を形成すること
ｂ）体液試料中に存在する前記トレポネーマ抗原またはトレポネーマ抗原の組成物に対する抗体が、前記トレポネーマ抗原またはトレポネーマ抗原の組成物と免疫反応して、免疫反応産物を形成することを可能にするために十分な期間、前記免疫反応混合物を維持すること；そして
ｃ）前記免疫反応産物のいずれかの存在および／または濃度を検出すること
を含む、前記方法。
【請求項１３】
抗梅毒トレポネーマ抗体の検出のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断試験における、請求項１〜５のいずれか一項記載のＴｐＮ４７抗原、または請求項１０記載の梅毒トレポネーマ抗原の組成物の使用。
【請求項１４】
少なくとも請求項１〜５のいずれか一項記載のＴｐＮ４７抗原、または請求項１０記載の組成物を含む、抗梅毒トレポネーマ抗体の検出のための試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）抗原４７（ＴｐＮ４７）の可溶性で、安定な、そして免疫反応性の変異体であって、抗原がＴｐＮ４７のアミノ酸２２４〜３５１（すなわちドメインＣ）を欠くという条件で、ＴｐＮ４７タンパク質分子の少なくともアミノ酸残基６３〜１７４（すなわちドメインＢ）を含み、ＴｐＮ４７抗原がシャペロンに融合している、前記変異体に関する。本発明はさらに、これらの抗原がドメインＣを欠くという条件で、ドメインＢおよびＤまたはドメインＡ＋ＢおよびＤを含む可溶性梅毒トレポネーマ抗原４７（ＴｐＮ４７抗原）に関する。さらに、本発明は、これらの可溶性で、安定な、そして免疫反応性のＴｐＮ４７変異体を産生する方法、ならびに単離試料中の梅毒トレポネーマに対する抗体の検出に向けられる免疫診断アッセイにおける、これらの抗原の使用に関する。
【発明の概要】
【０００２】
梅毒トレポネーマは、スピロヘータの細菌ファミリーに属し、そして梅毒の原因病原体である。梅毒（Ｓｙｐｈｉｌｉｓ、またＬｕｅｓとも）は、主に、性的接触によって伝染する。梅毒トレポネーマはまた、妊娠中に母親から赤ん坊にうつる可能性もある。この疾患は、別個の臨床段階および長期間の潜伏性無症候性感染によって特徴付けられる。多くの人々は症状に気づかず、そしてしたがって梅毒感染に何年も気づかない。一次感染は限定され、そして通常、小さい無痛の潰瘍を引き起こす（第一段階、「梅毒Ｉ」）。ペニシリンによって治療されずに放置されると、疾患は第二段階の梅毒ＩＩに進行し（感染約８週後）、これはインフルエンザ様症状、かゆみのない皮膚発疹およびリンパ節腫脹を伴う。数年後、梅毒ＩＩＩの段階で、梅毒性結節が全身に現れる。最終段階（梅毒ＩＶ）は、中枢神経系の崩壊によって特徴付けられ、最終的に、神経学的障害および心臓障害、全身麻痺、運動失調、認知症および失明につながる。
【０００３】
２０世紀半ばにペニシリンが導入されて以来、有効な療法が利用可能になっているが、梅毒はなお、重要な世界的健康問題であり続けている。抗生物質療法を補助し、そしてしたがって梅毒の蔓延を防止するため、トレポネーマに感染した患者を同定することが必須である。その結果、梅毒トレポネーマに対する抗体の検出のため、イムノアッセイなどの信頼性がある診断ツールを提供する必要がある。さらに、血清学的適用における特異的化合物として用いるため、組換えタンパク質は、可溶性、安定性および抗原性などのいくつかの必要条件を満たす必要がある。
【０００４】
梅毒トレポネーマ（梅毒感染の原因病原体）の膜会合ポリペプチドの１つは、４３４アミノ酸残基からなる巨大タンパク質である、ＴｐＮ４７である。ＴｐＮ４７は、トレポネーマに対する体液性免疫反応において免疫優性と見なされており（Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  （２００３）４８（４），  ５４９−５５３）、そしてＴｐＮ４７に向けられる抗体は、しばしば、トレポネーマに感染した個体由来のヒト血清に見出される。したがって、組換えＴｐＮ４７の可溶性および抗原性変異体は、高い感受性および特異性を組み合わせたトレポネーマ抗体を検出するイムノアッセイを確立するための貴重な成分であろう。最高の場合、こうした抗原は、ＩｇＧおよびＩｇＭ分子両方の検出を可能にするはずである。
【０００５】
ＴｐＮ４７の組換え変異体が文献に記載されてきている。Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９６）  Ｊｕｌ  １５；１５７（２）：７２０−３１において、Ｂａｕｇｈｎらは、ＴｐＮ４７の全配列を含む、１２量体ペプチドのエピトープスキャン（重複８アミノ酸残基、オフセット４アミノ酸残基）に関して報告する。このスキャンに基づき、著者らは、長さ９〜２９アミノ酸残基の範囲の、１０もの免疫優性ＴｐＮ４７断片を記載する。ＴｐＮ４７の結晶構造およびドメイントポロジーもまた記載されてきている（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２），  ２７７（４），  ４１８５７−４１８６４，  Ｄｅｋａら）。
【０００６】
トレポネーマ抗体を検出するためのイムノアッセイが当該技術分野に知られる。例えば、Ｒｏｓｔｏｐｉｒａら（Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４８（４），  ５４９−５５３，  ２００３）は、免疫優性抗原の１つとしてＴｐＮ４７を同定する、ＴｐＮ１７およびＴｐＮ４７の組み合わせを用いて梅毒を診断するためのイムノアッセイを記載する。この刊行物において、全長ＴｐＮ４７を抗原として用いた。
【０００７】
本発明者らは、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）宿主（ＢＬ２１／ＤＥ３）において、ＴｐＮ４７の全長変異体を過剰産生し、そしてＴｐＮ４７抗原を均質に調製することに成功した。さらに、ＴｐＮ４７の全長型を用いた本発明者らの最初の実験によって、このタンパク質が３５℃より高い温度で凝集する傾向があることが明白に明らかになった。ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤまたはさらに（より熱安定性の）ＥｃＳｌｐＡ−ＥｃＳｌｐＡなどのタンデムシャペロン融合体の融合にもかかわらず、全長ＴｐＮ４７は、必然的に、３５℃を超えた温度で高分子量会合物に凝集する。梅毒トレポネーマは、むしろ温度感受性の病原体として知られ、主要膜タンパク質の１つが温度感受性を共有するという発見はそれほど驚くべきことではないようである。いずれにしても、イムノアッセイ中のタンパク質性成分の熱誘導性凝集プロセスは、通常、シグナルの喪失または特異性の喪失のいずれかを生じる。したがって、全長ＴｐＮ４７（ＳｌｙＤまたはＳｌｐＡなどの可溶性増進シャペロンとの融合においてさえ）が、中程度に上昇した温度（＞３５℃）であっても凝集する傾向があるという事実は、この分子を、ＤＡＧＳ形式の感受性イムノアッセイにおける、単純でそして簡単な適用から明らかに排除する。
【０００８】
ＴｐＮ４７に関する詳細な構造的知識（Ｄｅｋａら  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （２００２），  ２７７（４），  ４１８５７−４１８６４）があるにもかかわらず、先行技術は、ＴｐＮ４７の顕著な熱不安定を開示せず、また熱誘導性凝集、およびそれと同時の、試料中の梅毒トレポネーマに対する抗体の検出に向けられるイムノアッセイにおける感受性の喪失の問題を克服するＴｐＮ４７抗原変異体を開示しない。
【０００９】
Ｇｕｏら（Ｘｉａｍｅｎ  Ｄａｘｕｅ  Ｘｕｅｂａｏ−Ｚｉｒａｎ  Ｋｅｘｕｅ  Ｂａｎ  （２００８），  ４７（６），  ８７４−８７８）は、大腸菌において組換え発現される特異的可溶性ＴｐＮ４７  Ｎ末端またはＣ末端一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）突然変異体を記載する。しかし、全長ＴｐＮ４７タンパク質の熱不安定性および凝集の傾向の問題には取り組んでいない。さらにＧｕｏらのデータは、ＴｐＮ４７のドメインＣおよびＤの組み合わせ（Ｃ１９０）が、全長ＴｐＮ４７タンパク質の抗原性とほぼ同等であると示唆している。
【００１０】
梅毒トレポネーマ抗原４７（ＴｐＮ４７抗原）の可溶性で、安定な、そして免疫反応性の変異体であって、抗原がＴｐＮ４７のドメインＣ（ａａ  ２２４〜３５１）を欠くという条件で、ＴｐＮ４７タンパク質分子の少なくともドメインＢ（ａａ  ６３〜１７４）を含み、ＴｐＮ４７抗原がシャペロンと融合している、前記変異体を生成することによって、安定性の問題は、本発明によって解決されている。
【００１１】
この問題のさらなる解決は、ドメインＢおよびＤを含む可溶性ＴｐＮ４７抗原（配列番号１のａａ  ６３〜１７４および３５２〜４３４）またはドメインＡ＋ＢおよびＤを含むＴｐＮ４７抗原（配列番号１のａａ  ２６〜２２３および３５２〜４３４）である。どちらの変異体も、ＴｐＮ４７のドメインＣを欠く。
【００１２】
本発明は、可溶性梅毒トレポネーマ抗原に、すなわちＴｐＮ４７抗原であって、ＴｐＮ４７抗原がドメインＣ（配列番号１のアミノ酸残基２２４〜３５１）を欠くという条件で、少なくともドメインＢ（配列番号１のアミノ酸残基６３〜１７４）または少なくともドメインＡ＋Ｂ（配列番号１のアミノ酸残基２６〜２２３）を含み、シャペロンに融合している、前記抗原に関する。本発明はまた、これらの抗原がドメインＣ（配列番号１のアミノ酸残基２２４〜３５１）を欠くという条件で、少なくともドメインＢ（配列番号１のアミノ酸残基６３〜１７４）およびドメインＤ（配列番号１のアミノ酸残基３５２〜４３４）、またはドメインＡ＋Ｂ（配列番号１のアミノ酸残基２６〜２２３）およびドメインＤ（配列番号１のアミノ酸残基３５２〜４３４）を含む、可溶性ＴｐＮ４７抗原にも関する。可溶性をさらに増加させるため、これらの抗原をシャペロンに融合させてもよいし、または別の融合パートナーに融合させてもよい。
【００１３】
本発明はさらに、前記ＴｐＮ４７抗原をコードする組換えＤＮＡ分子に関し、そして本発明はまた、機能可能であるように連結されているかまたは組み込まれている、ＴｐＮ４７抗原をコードする上述のＤＮＡを含有する発現ベクターにも関する。本発明はまた、前記発現ベクターで形質転換された宿主細胞にも、そしてまた前記ＴｐＮ４７抗原を産生する方法にも関する。
【００１４】
さらに、本発明は、梅毒の検出のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断法に、すなわち前記ＴｐＮ４７抗原変異体を用いて、ＴｐＮ４７に対する抗体を検出する方法に関し、そして本発明はまた、本発明記載のＴｐＮ４７抗原を含む試薬試験キットにも関する。本発明はまた、例えばＴｐＮ４７抗原およびＴｐＮ１７またはＴｐＮ１５抗原を含む、少なくとも２つの梅毒トレポネーマ抗原の組成物にも関する。別の態様において、前記組成物は、ＴｐＮ４７抗原ならびにＴｐＮ１７およびＴｐＮ１５抗原の両方を含む。さらに、本発明は、これらの抗原を産生する方法、ならびに単離試料中の梅毒トレポネーマに対する抗体の検出のための免疫診断アッセイにおけるこれらの抗原の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
図１〜６は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨＲ  １０／３０カラム上の別個のＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７ドメイン構築物の分析ゲル濾過プロファイルを示す。実施例５もまた参照されたい。およそ２００μｌの１．３ｍｇ／ｍｌタンパク質溶液（１５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＫＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ中に溶解された融合タンパク質）をＳＥＣカラム上に適用し、そして０．８ｍｌ／分の流速で、２８０ｎｍで溶出を監視した。ＦＰＬＣ標準（薄い灰色の点線）は、β−ガラクトシダーゼ（４６５  ０００  Ｄａ）、ヒツジＩｇＧ（１５０  ０００  Ｄａ）、ヒツジＩｇＧ  Ｆａｂ断片（５０  ０００  Ｄａ）、ウマ・ミオグロビン（１７  ０００  Ｄａ）、および二ペプチド、グリシン−チロシン（２３８  Ｄａ）を含有する。
【００１６】
すべてのタンパク質構築物を、１５．２μＭ〜２６．５μＭのモル濃度に同等の１．３ｍｇ／ｍｌの濃度で、同一緩衝剤濃度（１５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＫＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）下、一晩インキュベーション（１８時間）で、温度上昇（３５℃、４０℃）に供した。熱ストレス後、タンパク質試料を遠心分離に供し、そして次いで、上述のようなＦＰＬＣ分析によって、凝集傾向に関して評価した。
【図１】図１は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム上、分析ゲル濾過によって評価した際のＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７／ＡＢ（２６〜２２３）の熱安定性を示す。３００μｇタンパク質に相当する２３０μｌをカラムに適用した。４℃、３５℃および４０℃でのインキュベーション後のＴｐＮ４７／ＡＢの溶出プロファイルは非常によく一致する。凝集または会合プロセスの気配は全くない。２８０ｎｍでの吸収によって監視した際の溶出プロファイルは、４０℃などの上昇した温度であっても、可溶性タンパク質断片ＴｐＮ４７／ＡＢを示す。
【図２】図２は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム上、分析ゲル濾過によって評価した際のＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７／Ｂ（６３〜１７４）の熱安定性を示す。３５０μｇタンパク質に相当する２７０μｌをカラムに適用した。４℃、３５℃および４０℃でのインキュベーション後のＴｐＮ４７／Ｂの溶出プロファイルはほぼ完全に一致する。凝集または会合プロセスの気配は全くない。２８０ｎｍでの吸収によって監視した際の溶出プロファイルは、タンパク質断片ＴｐＮ４７／Ｂが可溶性であり、そして４０℃などの上昇した温度であっても安定であるという、説得力がある証拠を示す。
【図３】図３は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム上、分析ゲル濾過によって評価した際のＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７／Ｃ（２２４〜３５１）の熱安定性を例示する。２００μｇタンパク質に相当する１５４μｌをカラムに適用した。４℃および３５℃でのインキュベーション後のＴｐＮ４７／Ｃの溶出プロファイルはほぼ完全に一致する。しかし、３５℃であっても、非常に少量のＴｐＮ４７  Ｃがゲル濾過カラムのボイド容量中に溶出し（連続した濃い灰色の線）、これは凝集プロセスの開始を示す。４０℃でのインキュベーション後、溶出タンパク質のほぼ１／３が、ＳＥＣカラムのボイド容量中に溶出し、これは、巨大な凝集タンパク質粒子の形成を示す。図３から、ＴｐＮ４７ドメインＣが３５℃を超える温度で凝集する実質的な傾向を所持することが明らかとなる。
【図４】図４は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム上、分析ゲル濾過によって評価した際のＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７／ＣＤ（２２４〜４３４）の熱安定性を示す。２５０μｇタンパク質に相当する１９５μｌをカラムに適用した。４℃でのインキュベーション後のＴｐＮ４７／ＣＤの溶出プロファイルは、優れた対称的なピークを示し、可溶性でそして均質なタンパク質であることを示す。３５℃でインキュベーションした際、ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７／ＣＤは、対応するプロファイルによって判断されるように、巨大な凝集タンパク質粒子を形成し、これはタンパク質のかなりの部分がゲル濾過カラムのボイド容量で溶出することを示す（連続した濃い灰色の線）。４０℃でインキュベーションした後、ＣＤ融合タンパク質の最大の部分は、ゲル濾過カラムのボイド容量中に溶出する（連続した黒線）。図４から、ＴｐＮ４７のＣ末端部分、すなわち融合タンパク質ＣＤが、３５℃などの中程度に上昇した温度であっても凝集する非常に本質的な傾向を所持することが明らかである。
【図５】図５は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム上、分析ゲル濾過によって評価した際のＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７／Ｄ（３５２〜４３４）の熱安定性を例示する。４３０μｇタンパク質に相当する３３１μｌをカラムに適用した。４℃、３５℃および４０℃でのインキュベーション後のＴｐＮ４７／Ｄの溶出プロファイルはほぼ区別不能であり、そして完璧に一致する。凝集または会合プロセスの気配はどんなものであれまったくない。２８０ｎｍでの吸収によって監視した際の溶出プロファイルは、タンパク質断片ＴｐＮ４７／Ｄが完全に可溶性であり、そして４０℃などの上昇した温度であっても安定であるという、説得力がある証拠を示す。
【図６】図６は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム上、分析ゲル濾過によって評価した際の全長ＴｐＮ４７変異体ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７／ＡＢＣＤ（２１〜４３４）の熱安定性を示す。１１７μｇタンパク質に相当する９０μｌをカラムに適用した。４℃でのインキュベーション後のＴｐＮ４７／ＡＢＣＤの溶出プロファイルは、１３．５ｍｌの溶出体積で優れたピークを示し、可溶性でそして均質なタンパク質であることを示す。３５℃でインキュベーションした際、ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７／ＡＢＣＤは、対応するプロファイルによって判断されるように、巨大凝集タンパク質粒子を形成し、これはタンパク質の６６％より多くが、ＳＥＣカラムのボイド容量中に溶出することを示す（連続した濃い灰色の線）。４０℃でインキュベーションした後、ほぼ９６％の全長ＴｐＮ４７が、ゲル濾過カラムのボイド容量中に溶出する（連続した黒線）。図６から、全長ＴｐＮ４７が、３５℃などの中程度に上昇した温度であっても凝集する非常に本質的な傾向を所持することが明らかである。
【００１７】
全長タンパク質が不足していたため、わずか１１７μｇのＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤをＳｕｐｅｒｄｅｘカラム上に適用し（より低い吸収シグナルを生じ）、これは他のＴｐＮ４７変異体と比較した際、わずかな部分でしかなかった。しかし、熱ストレス評価は、各ＴｐＮ４７変異体と同一の条件下で行われた。
【図７】図７は、免疫優性ＴｐＮ４７抗原変異体に関する検索におけるＢ細胞エピトープマッピングの本発明者らの戦略を示す。上部：ＴｐＮ４７  Ｎ末端に融合したＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤを含む全長ＴｐＮ４７（２１〜４３４、ドメインＡＢＣＤを含む）。中央部分：個々のＴｐＮ４７ポリペプチド断片（ＥｃＳｌｙＤへの融合は示さない）、はしご状の順序で：配列番号８〜１６にしたがった、ＴｐＮ４７ポリペプチド断片、３０〜６６、１０６〜１３２、１３７〜１７０、１９７〜２１９、２２５〜２５０、２７３〜２９６、３２１〜３６２、３６８〜３８８、３９１〜４３４；実施例４にしたがった、これらのペプチドの免疫反応性に関する実験結果を表２に示す（図８ａ〜ｃ）。下部：全長ＴｐＮ４７に対する、ＴｐＮ４７ドメインＢ、ＡＢ、Ｃ、ＤおよびＣＤの位置（ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤへの融合は示さない）；実施例４にしたがった、これらのＴｐＮ４７融合変異体の免疫反応性（すなわち抗原性）に関する実験結果を表３に示す（図９）。
【図８−１】図８ａ〜ｃは、実施例４において得られる結果を含有する表２を示す：ＥｃＳｌｙＤシャペロンに融合した小分子（直鎖）非構造化ＴｐＮ４７断片の免疫学的反応性。Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）２０１０分析装置を用いることによって、イムノアッセイを実行した。シグナル動力学を、トレポネーマ陰性試料に関して得られる平均値に対して規準化する。トレポネーマ陽性血清をＢｏｃａ  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ（米国フロリダ州ココナツクリーク）より購入し、トレポネーマ陰性対照は、内部献血者であった。右の列（実験１０、全長ＴｐＮ４７）は、それぞれ、図８ａ、ｂ、およびｃの各々に同一であることに注目されたい。
【図８−２】図８ａ〜ｃは、実施例４において得られる結果を含有する表２を示す：ＥｃＳｌｙＤシャペロンに融合した小分子（直鎖）非構造化ＴｐＮ４７断片の免疫学的反応性。Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）２０１０分析装置を用いることによって、イムノアッセイを実行した。シグナル動力学を、トレポネーマ陰性試料に関して得られる平均値に対して規準化する。トレポネーマ陽性血清をＢｏｃａ  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ（米国フロリダ州ココナツクリーク）より購入し、トレポネーマ陰性対照は、内部献血者であった。右の列（実験１０、全長ＴｐＮ４７）は、それぞれ、図８ａ、ｂ、およびｃの各々に同一であることに注目されたい。
【図８−３】図８ａ〜ｃは、実施例４において得られる結果を含有する表２を示す：ＥｃＳｌｙＤシャペロンに融合した小分子（直鎖）非構造化ＴｐＮ４７断片の免疫学的反応性。Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）２０１０分析装置を用いることによって、イムノアッセイを実行した。シグナル動力学を、トレポネーマ陰性試料に関して得られる平均値に対して規準化する。トレポネーマ陽性血清をＢｏｃａ  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ（米国フロリダ州ココナツクリーク）より購入し、トレポネーマ陰性対照は、内部献血者であった。右の列（実験１０、全長ＴｐＮ４７）は、それぞれ、図８ａ、ｂ、およびｃの各々に同一であることに注目されたい。
【図９】図９は、実施例４において得られる結果を含有する表３を示す：ＥｃＳｌｙＤ−ＥｓＳｌｙＤタンデムシャペロンに融合した巨大ＴｐＮ４７断片（ドメイン）の免疫学的反応性（すなわち抗原性）。Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）２０１０分析装置を用いることによって、イムノアッセイを実行した。シグナル動力学（ＳＤ）を、トレポネーマ陰性試料に関して得られる平均値に対して規準化する。トレポネーマ陽性血清をＢｏｃａ  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ（米国フロリダ州ココナツクリーク）より購入し、陰性対照は、内部献血者であった。
【図１０】図１０は、表４を示す：熱ストレス（４２℃で７２時間）に続くＴｐＮ４７ドメインＡＢ（２６〜２２３）およびＢ（６３〜１７４）の残渣抗原性。ドメインＡＢおよびドメインＢのどちらも記載するような可溶性増進タンデムシャペロンモジュールＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤに融合させた。Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）２０１０分析装置を用いることによって、イムノアッセイを実行した。シグナル動力学（ＳＤ）を、トレポネーマ陰性試料に関して得られる平均値に対して規準化する。トレポネーマ陽性血清をＳｅｒａＣａｒｅ（米国マサチューセッツ州）より購入し、トレポネーマ陰性対照をＴｒｉｎａ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｉｖｅｓ  ＡＧ（スイス・ナニコン）より購入した。
【図１１】図１１は、表５を示す：熱ストレス（４２℃で７２時間）に続く、ＴｐＮ４７ドメインＣ（２２４〜３５１）およびＤ（３５２〜４３４）の残渣抗原性。ドメインＣおよびＤのどちらも、記載するような可溶性増進タンデムシャペロンモジュールＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤに融合させた。Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）２０１０分析装置を用いることによって、イムノアッセイを実行した。シグナル動力学（ＳＤ）を、トレポネーマ陰性試料に関して得られる平均値に対して規準化する。トレポネーマ陽性血清をＳｅｒａＣａｒｅ（米国マサチューセッツ州）より購入し、トレポネーマ陰性対照をＴｒｉｎａ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｉｖｅｓ  ＡＧ（スイス・ナニコン）より購入した。
【図１２】図１２は、表６を示す：熱ストレス（４２℃で７２時間）に続く、ＴｐＮ４７／ＣＤ（２２４〜４３４）および全長ＴｐＮ４７（２１〜４３４）の残渣抗原性。ドメインＣＤおよび全長ＴｐＮ４７のどちらも、記載するような可溶性増進タンデムシャペロンモジュールＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤに融合させた。Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）２０１０分析装置を用いることによって、イムノアッセイを実行した。シグナル動力学（ＳＤ）を、トレポネーマ陰性試料に関して得られる平均値に対して規準化する。トレポネーマ陽性血清をＳｅｒａＣａｒｅ（米国マサチューセッツ州）より購入し、トレポネーマ陰性対照をＴｒｉｎａ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｉｖｅｓ  ＡＧ（スイス・ナニコン）より購入した。
【００１８】
配列表にさらに詳述するように、以下のタンパク質配列を本明細書内で用いる：
配列番号１は、２つの大腸菌ＳｌｙＤ分子に融合した全長ＴｐＮ４７を示す：
ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  Ｐ２９７２３のａａ  ２１〜４３４  ＴｐＮ４７を下線で示す）；３１５位において、システインはアラニンに置換されており、そして精製目的のため、ヘキサ−ヒスチジンタグがＣ末端に付加されている。
【００１９】
【化１】
0005985657.tif 000002
【００２０】
配列番号２は、２つの大腸菌ＳｌｙＤ分子に融合したＴｐＮ４７のドメインＡＢを示す：ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７／ＡＢ（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  Ｐ２９７２３のａａ  ２６〜２２３  ＴｐＮ４７を下線で示す）；精製目的のため、ヘキサ−ヒスチジンタグがＣ末端に付加されている。
【００２１】
【化２】
0005985657.tif 000003
【００２２】
配列番号３は、２つの大腸菌ＳｌｙＤ分子に融合したＴｐＮ４７のドメインＢを示す：ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７／Ｂ（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  Ｐ２９７２３のａａ  ６３〜１７４  ＴｐＮ４７を下線で示す）；精製目的のため、ヘキサ−ヒスチジンタグがＣ末端に付加されている。
【００２３】
【化３】
0005985657.tif 000004
【００２４】
配列番号４は、２つの大腸菌ＳｌｙＤ分子に融合したＴｐＮ４７のドメインＣを示す：ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７／Ｃ（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  Ｐ２９７２３のａａ  ２２４〜３５１  ＴｐＮ４７を下線で示す）；３１５位において、システインはアラニンに置換されており、そして精製目的のため、ヘキサ−ヒスチジンタグがＣ末端に付加されている。
【００２５】
【化４】
0005985657.tif 000005
【００２６】
配列番号５は、２つの大腸菌ＳｌｙＤ分子に融合したＴｐＮ４７のドメインＣＤを示す：ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７／ＣＤ（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  Ｐ２９７２３のａａ  ２２４〜４３４  ＴｐＮ４７）；３１５位において、システインはアラニンに置換されており、そして精製目的のため、ヘキサ−ヒスチジンタグがＣ末端に付加されている。
【００２７】
【化５】
0005985657.tif 000006
【００２８】
配列番号６は、２つの大腸菌ＳｌｙＤ分子に融合したＴｐＮ４７のドメインＤを示す：ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７／ＣＤ（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  Ｐ２９７２３のａａ  ３５２〜４３４  ＴｐＮ４７）
【００２９】
【化６】
0005985657.tif 000007
【００３０】
配列番号７は、実施例１に示すリンカー配列（ＧＧＧＳ）５ＧＧＧを示す。グリシンリッチ柔軟性リンカー配列を２つの大腸菌ＳｌｙＤ分子の間に挿入し、そしてまたＳｌｙＤおよびＴｐＮ４７抗原の間にも挿入する。
【００３１】
【化７】
0005985657.tif 000008
【００３２】
配列番号８は、ＴｐＮ４７ペプチドＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７／ｐ０２−１、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  Ｐ２９７２３記載の梅毒トレポネーマ４７抗原配列のアミノ酸３０〜６６を示す：
【００３３】
【化８】
0005985657.tif 000009
【００３４】
配列番号９は、ＴｐＮ４７ペプチドＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７／ｐ０３−１、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  Ｐ２９７２３記載の梅毒トレポネーマ４７抗原配列のアミノ酸１０６〜１３２を示す：
【００３５】
【化９】
0005985657.tif 000010
【００３６】
配列番号１０は、ＴｐＮ４７ペプチドＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７／ｐ０４−１、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  Ｐ２９７２３記載の梅毒トレポネーマ４７抗原配列のアミノ酸１３７〜１７０を示す：
【００３７】
【化１０】
0005985657.tif 000011
【００３８】
配列番号１１は、ＴｐＮ４７ペプチドＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７／ｐ０５−１、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  Ｐ２９７２３記載の梅毒トレポネーマ４７抗原配列のアミノ酸１９７〜２１９を示す：
【００３９】
【化１１】
0005985657.tif 000012
【００４０】
配列番号１２は、ＴｐＮ４７ペプチドＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７／ｐ０６−１、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  Ｐ２９７２３記載の梅毒トレポネーマ４７抗原配列のアミノ酸２２５〜２５０を示す：
【００４１】
【化１２】
0005985657.tif 000013
【００４２】
配列番号１３は、ＴｐＮ４７ペプチドＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７／ｐ０７−１、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  Ｐ２９７２３記載の梅毒トレポネーマ４７抗原配列のアミノ酸２７３〜２９６を示す：
【００４３】
【化１３】
0005985657.tif 000014
【００４４】
配列番号１４は、ＴｐＮ４７ペプチドＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７／ｐ０８−１、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  Ｐ２９７２３記載の梅毒トレポネーマ４７抗原配列のアミノ酸３２１〜３６２を示す：
【００４５】
【化１４】
0005985657.tif 000015
【００４６】
配列番号１５は、ＴｐＮ４７ペプチドＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７／ｐ０９−１、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  Ｐ２９７２３記載の梅毒トレポネーマ４７抗原配列のアミノ酸３６８〜３８８を示す：
【００４７】
【化１５】
0005985657.tif 000016
【００４８】
配列番号１６は、ＴｐＮ４７ペプチドＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７／ｐ１０−１、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  Ｐ２９７２３記載の梅毒トレポネーマ４７抗原配列のアミノ酸３９１〜４３４を示す：
【００４９】
【化１６】
0005985657.tif 000017
【００５０】
発明の詳細な説明
本発明は、可溶性梅毒トレポネーマ抗原に、より正確にはトレポネーマ抗原ＴｐＮ４７の可溶性変異体に関する。本発明記載のＴｐＮ４７抗原は、ドメインＣ（配列番号１のアミノ酸残基２２４〜３５１）を欠き、そして安定であるとともに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断イムノアッセイにおいて免疫反応性である。
【００５１】
本発明者らは、形質転換原核宿主細胞から、全長ＴｐＮ４７を均質に精製することに成功した。ＴｐＮ４７の全長型を用いた本発明者らの最初の実験によって、このタンパク質が、中程度に上昇した温度に曝露された際、凝集する傾向があることが明白に明らかになった。全長ＴｐＮ４７は、全長抗原にＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤまたはさらに（より熱安定性の）ＥｃＳｌｐＡ−ＥｃＳｌｐＡなどの非常に可溶性であるタンデムシャペロン融合体を融合させても、３５℃を超える温度で、不可避的に高分子量会合物に凝集する。全長ＴｐＮ４７によって提示される安定性の問題を解決するため、本発明者らは、大腸菌において、シャペロン融合タンパク質として小分子ＴｐＮ４７断片をクローニングし、そして過剰発現させ、断片を均質に精製し（クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって判断されるように）、そしてそれぞれの抗原性に関して評価した。簡潔には、このアプローチは完全に失敗であった。驚いたことに、１０の断片のうち１つしか有意な（かなり劣ってはいたが）抗原性を示さなかった（表２／図８ａ、ＴｐＮ４７  ３０〜６６を参照されたい）。残りの有望な小分子ＴｐＮ４７断片はまったく活性ではなかった。この発見は、驚くべきことに、Ｂａｕｇｈｎら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  （１９９６）  １５７（２），  ７２０−７３１に提供される文献データと一致しない。その結果、本発明者らは、全長ＴｐＮ４７の熱誘導性凝集を回避する別の方法を検索しなければならなかった。
【００５２】
ＴｐＮ４７の小分子でそしておそらく構造化されていないペプチド断片に重点を置く代わりに、本発明者らは、ＴｐＮ４７のコンホメーション的にフォールディングされた部分を設計することを試みた。Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （２００２），  ２７７（４），  ４１８５７−４１８６４において、Ｄｅｋａらは、ＴｐＮ４７の結晶構造を提示し、そしてこのタンパク質のドメイントポロジーを明らかにする。この研究にしたがって、ＴｐＮ４７は、４つのドメインからなり、すなわちＴｐＮ４７は、４つの自律性フォールディング単位を含む。しかし、Ｄｅｋａらは、同定されたドメインの免疫学的特徴に関しては述べていない。
【００５３】
驚くべきことに、本発明者らは、ＴｐＮ４７ドメインおよびドメインの組み合わせＡＢ、Ｂ、Ｃ、ＣＤおよびＤを大腸菌宿主において成功裡に発現させることが可能であった。本発明の１つの態様において、ＴｐＮ４７抗原を、ＳｌｙＤ、ＦｋｐＡ、ＳｌｐＡおよびＳｋｐなどのシャペロンモジュールと融合させて産生した。これらの構築物すべてを均質に精製して、そして自動化Ｅｌｅｃｓｙｓ分析装置において、ヒト抗梅毒血清を用いて抗原性に関して評価した。結果は非常に明快であった：抗原性はかなり高く、そしてＣ＜Ｄ＜ＣＤ＜Ｂ＜＜ＡＢの順に増加した。興味深いことに、ドメインＣは、温度ストレスアッセイにおいて、不安定であると同定可能であった（ドメインＣおよびドメインの組み合わせＣＤは、＞３５℃の温度でのインキュベーションに際して強力に凝集し、一方、ＡＢ、ＢおよびＤは完全に可溶性のままであった）。簡潔には、ＡＢ、ＢおよびＤは、全長ＴｐＮ４７に比較した際、わずかに抗原性が減少しているが、可溶性が顕著に改善されたＴｐＮ４７断片と同定された。したがって、本発明者らが設計した実験のデータは、Ｃドメインを欠くＴｐＮ４７変異体が、可溶性および安定性に関して有意に改善されている、説得力がある証拠を提供する。
【００５４】
本発明の１つの態様において、したがって、抗原は、梅毒トレポネーマ抗原４７（ＴｐＮ４７）のドメインＢを含み、そしてＴｐＮ４７のドメインＣを欠き、すなわち本発明は、可溶性梅毒トレポネーマ抗原４７（ＴｐＮ４７抗原）であって、前記抗原が配列番号１のアミノ酸残基２２４〜３５１（ドメインＣ）を欠くという条件で、そしてＴｐＮ４７抗原がシャペロンに融合している、配列番号１のアミノ酸残基６３〜１７４（ドメインＢ）を含む、前記抗原に関する。
【００５５】
本発明のさらなる態様は、ドメインＡおよびＢを含み、そしてドメインＣを欠く、ＴｐＮ４７抗原である。これは、本発明が、可溶性ＴｐＮ４７抗原であって、前記抗原が配列番号１のアミノ酸残基２２４〜３５１（ドメインＣ）を欠くという条件で、配列番号１のアミノ酸残基２６〜２２３（ドメインＡ＋Ｂ）を含む、前記抗原を含むことを意味する。さらなる態様において、ＴｐＮ４７抗原は、ドメインＢまたはドメインＡ＋Ｂを含み、ここでドメインＤはＴｐＮ４７抗原のさらなる部分である。しかし、これらの態様においてもまた、ドメインＣは失われている。ドメインＤは、配列番号１のアミノ酸残基３５２〜４３４を含む。やはりこれらの態様において、ＴｐＮ４７抗原はシャペロンに融合している。
【００５６】
さらなる態様は、配列番号１のアミノ酸残基６３〜１７４（ドメインＢ）を含む可溶性梅毒トレポネーマ抗原４７（ＴｐＮ４７抗原）であって、前記抗原が配列番号１のアミノ酸残基２２４〜３５１（ドメインＣ）を欠くという条件で、配列番号１のアミノ酸残基３５２〜４３４（ドメインＤ）をさらに含む、前記抗原に関する。
【００５７】
さらなる態様は、配列番号１のアミノ酸残基２６〜２２３（ドメインＡ＋Ｂ）を含む可溶性梅毒トレポネーマ抗原４７（ＴｐＮ４７抗原）であって、前記抗原が配列番号１のアミノ酸残基２２４〜３５１（ドメインＣ）を欠くという条件で、配列番号１のアミノ酸残基３５２〜４３４（ドメインＤ）をさらに含む、前記抗原に関する。
【００５８】
本発明にしたがって、用語トレポネーマは、梅毒を引き起こす病原体である生物、梅毒トレポネーマに関する完全な用語の短い型であり、そしてどちらの用語も交換可能に使用可能である。
【００５９】
「ＴｐＮ４７抗原」は、免疫学的アッセイで使用するための抗原として適切なＴｐＮ４７アミノ酸配列を含有するタンパク質である。これは、本発明記載の抗原が、生理学的緩衝条件下で、例えばリン酸緩衝系中、周囲温度で、界面活性剤の添加を伴わず、可溶性であることを意味する。抗原はまた、ヒト血清などの単離試料中に存在する、ＴｐＮ４７に特異的な抗体、例えば抗ＴｐＮ４７抗体に結合するか、またはこうした抗体に認識され、そして結合されることも可能である。
【００６０】
本発明にしたがって、また、ＴｐＮ４７抗原の変異体も含まれる。用語「変異体」は、この背景において、タンパク質に実質的に類似のタンパク質またはタンパク質断片（すなわちポリペプチドまたはペプチド）に関する。特に、変異体は、最も広く行き渡っているタンパク質アイソフォームのアミノ酸配列に比較して、アミノ酸交換、欠失または挿入を示す、アイソフォームであることも可能である。１つの態様において、こうした実質的に類似のタンパク質は、タンパク質の最も広く行き渡っているアイソフォームに対して、少なくとも８０％、別の態様において、少なくとも８５％または少なくとも９０％、さらに別の態様において少なくとも９５％の配列類似性を有する。用語「変異体」はまた、グリコシル化またはリン酸化タンパク質などの翻訳後修飾されたタンパク質にも関する。本発明にしたがって、変異体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断イムノアッセイにおいて免疫反応性が維持される限り、すなわち変異体が試料中に存在する抗ＴｐＮ４７抗体に結合し、そしてこれを検出可能である限り、ＴｐＮ４７抗原変異体と分類される。「変異体」はまた、例えば、タンパク質または抗原への標識またはキャリアー部分の共有または非共有結合によって修飾されているタンパク質または抗原である。ありうる標識は、放射性、蛍光、化学発光、電気化学発光、酵素またはその他、例えばジゴキシゲニンまたはビオチンのようなものである。これらの標識は、当業者に知られる。
【００６１】
本発明記載の抗原を別のタンパク質に融合させてもよい。用語「融合タンパク質」は、本発明において、本発明記載のＴｐＮ４７抗原に対応する少なくとも１つのタンパク質部分および融合パートナーの役割を果たす別のタンパク質由来の少なくとも１つのタンパク質部分を含むタンパク質を指す。
【００６２】
本発明の別の態様にしたがって、ＴｐＮ４７抗原をシャペロンに融合させてもよい。古典的フォールディングヘルパーとして知られるシャペロンは、他のタンパク質のフォールディングおよび構造完全性の維持を補助するタンパク質である。フォールディングヘルパーの例は、ＷＯ  ０３／０００８７７に詳細に記載される。本発明にしたがって、ペプチジルプロリルイソメラーゼクラスのシャペロン、例えばＦＫＢＰファミリーのシャペロンを、ＴｐＮ４７抗原への融合に用いてもよい。ＴｐＮ４７抗原の融合パートナーとして適したＦＫＢＰシャペロンの例は、ＦｋｐＡ、ＳｌｙＤおよびＳｌｐＡである。ＴｐＮ４７の融合パートナーとして適したさらなるシャペロンは、Ｓｋｐであり、これはＦＫＢＰファミリーに属さない、大腸菌由来の周辺質三量体シャペロンである。常にシャペロンの完全配列を使用する必要はない。必要な能力および機能をなお所持するシャペロンの機能性断片（いわゆる結合コンピテントモジュール）もまた用いてもよい（ＷＯ  ９８／１３４９６を参照されたい）。
【００６３】
本発明のさらなる態様にしたがって、ＦＫＢＰシャペロンの少なくとも１つまたは少なくとも２つのモジュール、例えば大腸菌ＳｌｙＤ、ＳｌｐＡまたはＦｋｐＡを、ＴｐＮ４７抗原の発現のための融合部分として用いる。シャペロンＳｋｐもまた、融合パートナーとして用いてもよい。２つのＦＫＢＰシャペロンドメインの融合は、生じる融合ポリペプチドの可溶性改善を生じる。融合部分は、ＴｐＮ４７抗原のＮ末端に位置してもまたはＣ末端に位置しても、あるいは両端（サンドイッチ状）に位置してもよい。
【００６４】
組換えＤＮＡ技術によって、本発明記載のＴｐＮ４７抗原を生成し、そして調製してもよい。したがって、本発明の別の側面は、上にさらに定義するようなＴｐＮ４７抗原およびその変異体をコードする組換えＤＮＡ分子である。
【００６５】
用語「組換えＤＮＡ分子」は、遺伝子操作技術によって、または化学合成によって、ポリヌクレオチドの単離セグメントの人工的操作によって達成される配列の、そうでなければ分離された２つのセグメントを組み合わせることによって作製される分子を指す。これを行う際、望ましい機能のポリヌクレオチドセグメントをともに連結して、機能の望ましい組み合わせを生じてもよい。原核あるいは低次または高次の真核宿主細胞において、タンパク質を発現させるための組換えＤＮＡ技術が、当該技術分野に周知である。これらは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）に記載されてきている。
【００６６】
本発明のさらなる主題は、梅毒トレポネーマ抗原４７（ＴｐＮ４７）をコードする組換えＤＮＡ分子であって、前記組換えＤＮＡ分子が配列番号１のアミノ酸残基２２４〜３５１（ドメインＣ）のコード領域を欠くという条件で、配列番号１のアミノ酸残基６３〜１７４（ドメインＢ）記載のアミノ酸配列を含む、ＴｐＮ４７抗原をコードするヌクレオチド配列を含む、前記ＤＮＡ分子に関連する。
【００６７】
本発明の別の態様において、組換えＤＮＡ分子は、前記組換えＤＮＡ分子が配列番号１のアミノ酸残基２２４〜３５１（ドメインＣ）のコード領域を欠くという条件で、配列番号１のアミノ酸残基２６〜２２３（ドメインＡ＋Ｂ）記載のアミノ酸配列を含むＴｐＮ４７抗原をコードする。
【００６８】
本発明のさらなる態様において、組換えＤＮＡ分子は、配列番号１のアミノ酸残基６３〜１７４（ドメインＢ）またはアミノ酸残基２６〜２２３（ドメインＡ＋Ｂ）記載のアミノ酸配列を含むＴｐＮ４７抗原をコードする。さらに、組換えＤＮＡ分子は、ドメインＤ、すなわち配列番号１のアミノ酸残基３５２〜４３４を含むアミノ酸配列をコードする。前述のように、やはりこれらの態様において、前記組換えＤＮＡ分子が配列番号１のアミノ酸残基２２４〜３５１（ドメインＣ）のコード領域を欠くという但し書きが当てはまる。
【００６９】
本発明記載の組換えＤＮＡ分子はまた、ＴｐＮ４７抗原および融合部分の間に、そしてまたいくつかの融合部分の間に、１０〜１００アミノ酸残基のリンカーペプチドをコードする配列も含有してもよい。こうしたリンカー配列は、例えば、タンパク質分解性切断部位を宿してもよい。
【００７０】
本発明のさらなる側面は、機能可能であるように連結された本発明記載の組換えＤＮＡ分子、すなわちＴｐＮ４７抗原をコードする組換えＤＮＡ分子、またはＴｐＮ４７抗原およびペプチジルプロピルイソメラーゼシャペロン、例えばＦＫＢＰシャペロンを含む融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子であって、ＦＫＢＰシャペロンがＦｋｐＡ、ＳｌｙＤおよびＳｌｐＡより選択される前記組換えＤＮＡ分子を含む発現ベクターである。代替態様において、組換えＤＮＡ分子は、ＴｐＮ４７抗原およびＳｋｐを含む融合タンパク質をコードする。本発明記載の組換えＤＮＡを含む発現ベクターを用いて、細胞不含翻訳系においてＴｐＮ４７抗原を発現させてもよいし、または当該技術分野に周知の方法にしたがって、ＴｐＮ４７抗原の発現のために宿主細胞を形質転換してもよい。したがって、本発明の別の側面は、本発明記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞に関する。本発明の１つの態様において、組換えＴｐＮ４７抗原は大腸菌細胞において産生される。
【００７１】
やはり意図されるのは、ＴｐＮ４７抗原、およびシャペロン、例えばＳｋｐまたはペプチジルプロピルイソメラーゼクラスのシャペロン、例えばＦＫＢＰシャペロンを含有する融合タンパク質としてもまた産生されてもよい、可溶性で、安定な、そして免疫反応性であるＴｐＮ４７抗原を産生するための方法である。本発明のさらなる態様において、前記ＦＫＢＰシャペロンは、ＳｌｙＤ、ＦｋｐＡおよびＳｌｐＡからなる群より選択される。
【００７２】
この方法は
ａ）ＴｐＮ４７抗原をコードする遺伝子を含有する上述の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養し
ｂ）前記ＴｐＮ４７抗原をコードする遺伝子を発現させ
ｃ）前記ＴｐＮ４７抗原を精製する
工程を含む。場合によって、さらなる工程ｄ）として、当該技術分野に知られる再フォールディング技術によって、ＴｐＮ４７抗原を可溶性および免疫反応性コンホメーションにするように、機能性可溶化を実行する必要がある。
【００７３】
本発明のさらなる側面は、単離ヒト試料中の抗トレポネーマ抗体の検出のための方法であって、本発明記載のＴｐＮ４７抗原を抗体の結合パートナーとして用いる、前記方法に関する。本発明はしたがって、単離試料において、トレポネーマに特異的な抗体の検出のための方法であって、
ａ）本発明記載のＴｐＮ４７抗原と体液試料を混合することによって、免疫反応混合物を形成し
ｂ）体液試料中に存在する前記ＴｐＮ４７抗原に対する抗体が前記ＴｐＮ４７抗原と免疫反応して、免疫反応産物を形成するのを可能にするために十分な期間、前記免疫反応混合物を維持し；そして
ｃ）任意の前記免疫反応産物の存在および／または濃度を検出する
工程を含む、前記方法に関する。
【００７４】
さらなる側面において、前記方法は、ＩｇＧおよびＩｇＭサブクラスのトレポネーマ抗体を検出するのに適している。
抗体の検出のためのイムノアッセイは、当該技術分野に周知であり、そしてこうしたアッセイならびに実際の適用および方法を実行するための方法も同様である。本発明記載のＴｐＮ４７抗原を用いて、用いる標識に独立に、そして検出様式（例えば放射性同位体アッセイ、酵素イムノアッセイ、電気化学発光アッセイ等）またはアッセイ原理（例えば試験ストリップアッセイ、サンドイッチアッセイ、間接的試験概念または均質アッセイ等）に独立に、抗トレポネーマ抗体の検出のためのアッセイを改善することも可能である。専門家に知られるすべての生物学的液体が、抗トレポネーマ抗体の検出のための試料として使用可能である。用いられる試料は通常、全血、血清、血漿、尿または唾液のような体液である。
【００７５】
本発明のさらなる態様は、いわゆる二重抗原サンドイッチ概念（ＤＡＧＳ）にしたがって行われる、単離試料中の抗トレポネーマ抗体を検出するためのイムノアッセイである。ときに、このアッセイ概念はまた、二重抗原架橋概念とも呼ばれ、これは、２つの抗原が抗体分析物によって架橋されるためである。こうしたアッセイにおいて、抗体が、所定の抗原の少なくとも２つの異なる分子と、その２つの（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）または１０の（ＩｇＭ）パラトープを結合させる能力が必要であり、そして利用される。
【００７６】
より詳細には、抗トレポネーマ抗体を含有する試料を、２つの異なるＴｐＮ４７抗原、すなわち、前記抗原の各々が前記抗トレポネーマ抗体と特異的に結合する、第一の（「固相」）ＴｐＮ４７抗原および第二のＴｐＮ４７（「検出」）抗原とインキュベーションすることによって、二重抗原架橋形式にしたがった抗トレポネーマ抗体の決定のためのイムノアッセイを実行する。第一の抗原を直接または間接的に固相に結合させてもよく、そして該抗原は通常、生物アフィニティ（ｂｉｏａｆｆｉｎｅ）結合対、例えばビオチンおよびアビジンの一部であるエフェクター基を所持する。例えば、第一の抗原をビオチンにコンジュゲート化させる場合、固相をアビジンまたはストレプトアビジンでコーティングする。第二の抗原は標識を所持する。こうして、第一の抗原、試料抗体および第二の抗原を含む免疫反応混合物が形成される。前記抗原への試料の添加前に、または免疫反応混合物を形成した後に、第一の抗原が結合可能な固相を添加する。体液中の前記ＴｐＮ４７抗原に対して、抗トレポネーマ抗体が免疫反応して、免疫反応産物を形成するのに十分な期間、この免疫反応混合物を維持する。次の工程は、液相が固相から分離する分離工程である。最後に、前記免疫反応産物いずれかの存在を、固相または液相または両方で検出する。
【００７７】
前記ＤＡＧＳイムノアッセイにおいて、「固相抗原」および「検出抗原」の基本構造は、本質的に同じである。二重抗原架橋アッセイにおいて、免疫学的に交差反応性である、類似のしかし異なるＴｐＮ４７抗原を用いることも可能である。こうしたアッセイを実行するための本質的な必要条件は、単数または複数の適切なエピトープが両方の抗原上に存在することである。本発明にしたがって、各ＴｐＮ４７抗原に関する異なる融合部分（例えば、固相側上でＴｐＮ４７に融合したＳｌｙＤ、および検出側上でＴｐＮ４７に融合したＦｋｐＡ）を用いることが可能であり、これは、こうした変異体が、非特異的結合の問題を有意に緩和し、そしてしたがって偽陽性結果のリスクを軽減するためである。
【００７８】
本発明のさらなる態様は、したがって、本発明記載の第一のＴｐＮ４７抗原または融合タンパク質、および本発明記載の第二のＴｐＮ４７抗原または融合タンパク質を用いる、二重抗原架橋にしたがったイムノアッセイである。
【００７９】
本発明はさらに、抗トレポネーマ抗体の検出のための診断試験において、ＴｐＮ４７の少なくとも１つの抗原の使用に関する。
本発明のさらなる主題は、イムノアッセイのための通常の試験添加剤に加えて、測定しようとするトレポネーマ抗体に特異的に結合するのに適したＴｐＮ４７抗原の少なくとも１つの抗原を含有し、そしておそらく、標識ならびに必要であれば他の通常の添加剤を所持する、トレポネーマに対する抗体の検出のための試薬キットである。特に、試薬キットは、抗原各々が配列番号１のアミノ酸残基２２４〜３５１（ドメインＣ）に対応する配列を欠くという条件で、配列番号１のアミノ酸残基６３〜１７４（ドメインＢ）を含むＴｐＮ４７抗原、または配列番号１のアミノ酸残基２６〜２２３（ドメインＡ＋Ｂ）を含むＴｐＮ４７抗原を含有する。前記試薬キットの一部である抗原はシャペロンに融合している。
【００８０】
さらなる態様において、前記試薬キットは、先に定義するようなドメインＢまたはＡ＋Ｂを含み、そしてさらにドメインＤ、すなわち配列番号１のアミノ酸残基３５２〜４３４を含む、ＴｐＮ４７抗原を含む。また、この態様において、ＴｐＮ４７抗原はドメインＣを欠き、すなわちアミノ酸残基２２４〜３５１は、このＴｐＮ４７抗原には存在しない。
【００８１】
さらに、上に定義するような試薬キットは、平均的な当業者に用いられるような、通常の添加剤、緩衝剤、塩、界面活性剤等を含む、対照および標準溶液、ならびに１またはそれより多い溶液中の試薬を含有する。
【００８２】
別の側面は、本発明記載のＴｐＮ４７抗原のワクチンとしての使用である。活性成分として免疫原性ポリペプチドを含有するワクチンの調製が当該技術分野に知られる。こうしたワクチンは、一般的に、溶液または懸濁物のいずれかとして、注射剤として調製される。活性成分、すなわちＴｐＮ４７抗原またはその融合タンパク質を、薬学的に許容可能であり、そして活性成分と適合する賦形剤、例えば水、水性生理学的緩衝液、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールと混合する。ワクチンは、好適には、注射によって非経口的に投与される。
【００８３】
別の態様は、本発明記載のＴｐＮ４７抗原、ならびにＴｐＮ１７抗原およびＴｐＮ１５抗原からなる群より選択される少なくとも１つのさらなる梅毒トレポネーマ抗原を含む、少なくとも２つの梅毒トレポネーマ抗原の組成物であり、したがって、前記組成物は、ＴｐＮ４７抗原、ＴｐＮ１７抗原またはＴｐＮ１５抗原またはＴｐＮ１５およびＴｐＮ１７抗原の両方を含む。さらにさらなる態様は、本発明記載のＴｐＮ４７抗原、ならびにＴｐＮ１７およびＴｐＮ１５抗原の両方を含む、少なくとも３つの梅毒トレポネーマ抗原の組成物である。
【００８４】
本発明はまた、抗梅毒トレポネーマ抗体の検出のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断試験における、本発明記載のＴｐＮ４７抗原の使用に関する。
実施例セクションは、本発明をさらに例示する。特に、実施例は、本発明者らが、全長ＴｐＮ４７タンパク質分子より、より可溶性でそして有意により熱不安定性でないＴｐＮ４７の変異体を開発しそして生成したことを例示する。可溶性および安定性の両方が改善されている。本発明者らのＴｐＮ４７変異体は、例えば大腸菌において豊富に過剰発現可能であり、固定金属キレートクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）を通じて、容易に精製および再フォールディングされ、満足できる安定性特性を示し、そしてヒト血清中の抗トレポネーマ抗体を信頼性をもって検出するために使用可能である（さらなる態様において、梅毒トレポネーマ由来の２つの他の免疫優性膜タンパク質ＴｐＮ１７および／またはＴｐＮ１５と組み合わせて）。天然オリゴマー由来のＦｋｐＡ−ＴｐＮ４７／ＡＢおよびＳｋｐ−ＴｐＮ４７／ＡＢ融合タンパク質が、ＩｇＭ分子さえも検出するのに十分なエピトープ密度で、天然オリゴマーを形成することは注目に値する。本発明者らは、総免疫グロブリンの検出（すなわちＩｇＧおよびＩｇＭ両方の検出）のためのイムノアッセイを開発することを目的とするため、オリゴマー種ＦｋｐＡ−ＴｐＮ４７／ＡＢおよびＳｋｐ−ＴｐＮ４７／ＡＢを、ＤＡＧＳ形式の両方の側での特定因子（ｓｐｅｃｉｆｉｅｒ）として（例えばＦｋｐＡ−ＴｐＮ４７／ＡＢ−ビオチンおよびＳｋｐ−ＴｐＮ４７／ＡＢ−ルテニウム、またはその逆）、好適に使用することも可能である。
【実施例】
【００８５】
実施例１
ＴｐＮ４７およびＴｐＮ４７シャペロン融合ポリペプチドのクローニングおよび精製
発現カセットのクローニング
Ｎｏｖａｇｅｎ（米国ウィスコンシン州マディソン）のｐＥＴ２４ａ発現プラスミドに基づいて、ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７融合タンパク質をコードする発現カセットを、本質的に記載されるように得た（Ｓｃｈｏｌｚ，  Ｃ．ら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．（２００５）３４５，  １２２９−１２４１）。ＴｐＮ４７抗原の配列を、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースから回収した（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ２９７２３）。Ｎ末端にインフレームで融合させたグリシンリッチリンカー領域を含む、成熟ＴｐＮ４７  ａａ２１〜４３４（アミノ酸残基１〜２０に渡るシグナルペプチドを省いた）をコードする合成遺伝子をＭｅｄｉｇｅｎｏｍｉｘ（ドイツ・マルティンスリート）より購入した。酸化または分子間ジスルフィド架橋などの望ましくない副作用を防止するため、ＴｐＮ４７の３１５位のユニークなシステイン残基をアラニンに変更した。ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位は、それぞれ、ＴｐＮ４７コード領域の５’端および３’端にあった。グリシンリッチリンカー領域を通じて連結され、そしてＣ末端にさらなるリンカー領域部分を含む、２つのＥｃＳｌｙＤ単位をコードするさらなる合成遺伝子（配列番号１記載の残基１〜１６５、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ寄託番号Ｐ０Ａ９Ｋ９）を、同様に、Ｍｅｄｉｇｅｎｏｍｉｘから購入した。ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位は、それぞれ、このカセットの５’端および３’端にあった。単純な連結によって、シャペロン部分ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤおよびＴｐＮ４７抗原部分のインフレーム融合を可能にするように、遺伝子および制限部位を設計した。偶発性の組換えプロセスを回避し、そして大腸菌宿主における発現カセットの遺伝的安定性を増加させるため、ＥｃＳｌｙＤ単位をコードするヌクレオチド配列は縮重しており、伸長されたリンカー領域をコードするヌクレオチド配列も同様であり、すなわち、異なるコドンの組み合わせを用いて、同一アミノ酸配列をコードした。
【００８６】
ｐＥＴ２４ａベクターをＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、そしてトレポネーマＴｐＮ４７断片２１〜４３４（Ｃｙｓ  ３１５  Ａｌａ）にインフレームで融合させたタンデム−ＳｌｙＤを含むカセットを挿入した。ＳｌｙＤまたはＳｋｐまたはＦｋｐＡを含む発現カセット、ならびに全長ＴｐＮ４７と異なるターゲットポリペプチド、特にドメインおよびドメインの組み合わせ、Ｂ（ＴｐＮ４７  ６３〜１７４）、ＡＢ（ＴｐＮ４７  ２６〜２２３）、Ｃ（ＴｐＮ４７  ２２４〜３５１）、ＣＤ（ＴｐＮ４７  ２２４〜４３４）およびＤ（ＴｐＮ４７  ３５２〜４３４）を含む発現カセットを、それに合うように構築した。すべての組換え融合ポリペプチド変異体は、Ｎｉ−ＮＴＡ補助精製および再フォールディングを容易にするため、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグを含有した。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（Ｓｔｒａｇａｇｅｎｅ、米国カリフォルニア州ラホヤ）および標準的ＰＣＲ技術を用いて、点突然変異、欠失、挿入および伸長変異体またはそれぞれの発現カセットにおける制限部位を生成した。
【００８７】
以下の図は、Ｎ末端にインフレームで融合した２つのＳｌｙＤシャペロン単位を所持するトレポネーマＴｐＮ４７全長抗原２１〜４３４のスキームを示す。ＳｌｙＤ融合パートナーの大腸菌起源を示すため、示す融合ポリペプチドは、ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７（２１〜４３４）と名付けられてきている。
【００８８】
【化１７】
0005985657.tif 000018
【００８９】
生じたプラスミドの挿入物を配列決定し、そしてこれが所望の融合タンパク質をコードすることが見出された。各個々のＴｐＮ４７抗原の完全アミノ酸配列を配列番号１〜６に示す。リンカーＬのアミノ酸配列を配列番号７に示す。
【００９０】
ＴｐＮ４７を含む融合タンパク質の精製
実質的に同一のプロトコルを用いることによって、すべてのＴｐＮ４７融合タンパク質変異体を精製した。特定のｐＥＴ２４ａ発現プラスミドを宿する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を加えたＬＢ培地中、３７℃で、１．５のＯＤ６００まで増殖させ、そして１ｍＭイソプロピル−β−チオガラクトシドを添加することによって、細胞質ゾル過剰発現を誘導した。誘導３時間後、遠心分離（５０００ｇで２０分間）によって細胞を採取し、凍結し、そして−２０℃で保存した。細胞溶解のため、凍結ペレットを冷却５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８．０、７．０Ｍ  ＧｄｍＣｌ、５ｍＭイミダゾール中に再懸濁し、そして懸濁物を氷上で２時間、完全に細胞溶解するまで攪拌した。遠心分離および濾過（０．４５μｍ／０．２μｍ）後、未精製溶解物を、５．０ｍＭ  ＴＣＥＰを含む溶解緩衝液で平衡化させたＮｉ−ＮＴＡカラム上に適用した。続く洗浄工程をそれぞれのターゲットタンパク質に合わせて調整し、そして、これは５〜１５ｍＭイミダゾールの範囲であった（５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８．０、７．０Ｍ  ＧｄｍＣｌ、５．０ｍＭ  ＴＣＥＰ中）。少なくとも１０〜１５体積の洗浄緩衝液を適用した。次いで、ＧｄｍＣｌ溶液を５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、５．０ｍＭ  ＴＣＥＰに交換し、マトリックス結合タンパク質のコンホメーション再フォールディングを誘導した。同時精製プロテアーゼの再活性化を回避するため、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）ＥＤＴＡ不含、Ｒｏｃｈｅ）を再フォールディング緩衝液中に含めた。総量１５〜２０カラム体積を一晩反応中に適用した。次いで、３〜５カラム体積の５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭイミダゾールで洗浄することによって、ＴＣＥＰおよびＣｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）ＥＤＴＡ不含阻害剤カクテルを取り除いた。続いて、非特異的に結合するタンパク質混入物質を除去するため、やはり５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＫＣｌ中のイミダゾール濃度を２５ｍＭに上昇させた。次いで、同じ緩衝液中の５００ｍＭイミダゾールによって、天然タンパク質を溶出させた。Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＳＤＳ−Ｐａｇｅによって純度に関してタンパク質含有分画を評価し、そしてプールした。最後に、タンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ＨｉＬｏａｄ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に供し、そしてタンパク質含有分画をプールし、そしてＡｍｉｃｏｎセル（ＹＭ１０）において１０〜２０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
【００９１】
カップリング精製および再フォールディングプロトコルの後、それぞれのターゲットタンパク質に応じて、およそ５〜２０ｍｇのタンパク質収量が、１ｇの大腸菌湿細胞から得られた。
【００９２】
実施例２
分光学的測定
Ｕｖｉｋｏｎ  ＸＬ二重光線分光光度計を用いて、タンパク質濃度測定を行った。Ｐａｃｅ（１９９５），  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  ４，  ２４１１−２４２３によって記載される方法を用いることによって、モル消光係数（ε  Ｍ２８０）を決定した。別個のＴｐｎ４７融合ポリペプチドに関して用いたモル消光係数（ε  Ｍ２８０）を表１に明記する。
【００９３】
表１：  本実験で用いたＴｐＮ４７融合変異体のタンパク質パラメータ
【００９４】
【表１】
0005985657.tif 000019
【００９５】
ＴｐＮ４７ドメイン変異体のアミノ酸配列を配列番号１〜６に示す。ＴｐＮ４７ペプチド変異体ｐ０２−１〜Ｐ１０−１のＳｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  Ｐ２９７２３由来のＴｐＮ４７特異的配列を配列番号８〜１６に要約する。
【００９６】
実施例３
融合タンパク質へのビオチンおよびルテニウム部分のカップリング
融合ポリペプチドのリジンε−アミノ基を、１０〜３０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド活性化ビオチンおよびルテニウム標識分子を用いて、それぞれ修飾した。標識／タンパク質比は、それぞれの融合タンパク質に応じて、２：１〜５：１（ｍｏｌ：ｍｏｌ）で多様であった。反応緩衝液は、１５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡであった。反応を室温で１５分間実行し、そして１０ｍＭの最終濃度まで、緩衝Ｌ−リジンを添加することによって停止した。標識の加水分解不活性化を回避するため、乾燥ＤＭＳＯ（Ｓｅｃｃｏｓｏｌｖ品質、Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）中、それぞれのストック溶液を調製した。反応緩衝液中２０％までのＤＭＳＯ濃度は、研究したすべての融合タンパク質によってよく許容された。カップリング反応後、ゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨｉＬｏａｄ）上に、未精製タンパク質コンジュゲートを通過させることによって、未反応未結合標識を除去した。
【００９７】
実施例４
ポリペプチド融合タンパク質の免疫学的反応性
異なる融合タンパク質の免疫学的反応性（すなわち抗原性）を自動化Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）２０１０分析装置（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｗｓ  ＧｍｂＨ）において評価した。Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）は、Ｒｏｃｈｅグループの登録商標である。二重抗原サンドイッチ形式で測定を行った。
【００９８】
Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）２０１０のシグナル検出は、電気化学発光に基づく。ビオチン−コンジュゲート（すなわち捕捉抗原）は、ストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズ表面上に固定され、一方、検出抗原は、シグナル伝達部分として、複合体化ルテニウムカチオン（レドックス状態２＋および３＋の間で切り替わる）を所持する。特異的免疫グロブリン分析物の存在下で、発色性ルテニウム複合体は固相に架橋され、そして白金電極での励起後、６２０ｎｍで光を放出する。シグナル出力は、恣意的光単位である。
【００９９】
二重抗原サンドイッチ（ＤＡＧＳ）イムノアッセイ形式で、組換えトレポネーマＴｐＮ４７変異体を対で評価した。例えば、ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７／ＡＢ（２６〜２２３）−ビオチン・コンジュゲートを、各７０ｎｇ／ｍｌの濃度で、ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７／ＡＢ（２６〜２２３）−ルテニウム複合体コンジュゲートとともに評価した。さらに、ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７／Ｂ（６３〜１７４）−ビオチン・コンジュゲートを、各７０ｎｇ／ｍｌの濃度で、ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７／Ｂ（６３〜１７４）−ルテニウム複合体コンジュゲートとともに適用した。
【０１００】
ＴｐＮ４７の融合ポリペプチド変異体のビオチンおよびルテニウム・コンジュゲートを各７０ｎｇ／ｍｌの濃度で適用した。すべての測定において、化学的に重合した、未標識の過剰量（〜１０μｇ／ｍｌ）のＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤを、抗干渉物質として反応緩衝液中に組み入れ、シャペロン融合単位を通じた免疫学的交差反応を回避した。抗トレポネーマ陰性ヒト血清を対照として用いた。
【０１０１】
表２（図８ａ〜ｃ）において、ＴｐＮ４７ペプチド融合変異体（表１に列挙）の免疫学的活性を示す。全長ＴｐＮ４７分子に比較した際、小分子ＴｐＮ４７断片の抗原性は非常に劣っていることが一目で明らかである。ＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７／ｐ０２−１（ＴｐＮ４７  ３０〜６６）のみが、非常に低い度合いではあるが、有意な抗原性を示す。本発明者らの結果から、本発明者らは、ＴｐＮ４７のごくＮ末端にある部分に、いくつかの弱い直鎖エピトープが存在する可能性がある一方、ＴｐＮ４７分子の残りは本発明者らのＤＡＧＳ設定で検出可能ないかなる直鎖エピトープも持たないと結論づけられた。この発見は、トレポネーマ抗原ＴｐＮ４７内の免疫優性小分子エピトープに関する文献データ報告と著しく食い違う（Ｂａｕｇｈｎら，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （１９９６）  Ｊｕｌ  １５；１５７（２）：７２０−３１）。これらの文献データと対照的に、小分子ＴｐＮ４７断片での本発明者らの実験的知見は、直鎖エピトープが、トレポネーマ感染後の体液性免疫反応において、むしろ従属的な役割を果たすことが示唆される。
【０１０２】
直接の結果として、本発明者らは、直鎖エピトープを同定するさらなる試みを放棄し、そしてその代わりにコンホメーションエピトープの同定に重点を置いた。この目的を達成するため、本発明者らは、Ｒａｎｊｉｔら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．（２００２）２７７（４４），  ｐｐ  ４１８５７−４１８６４に開示するＴｐＮ４７ドメインをターゲティングした。非構造化小分子ペプチドとは異なり、タンパク質の単離されたドメイン（すなわち自律性フォールディング単位）は、定義されたコンホメーションを採用すると推定され、そしてしたがって、コンホメーションエピトープを提示すると予期される。しかし、単離されたＴｐＮ４７ドメインが、全長タンパク質の構造的背景から取り除かれた際に、天然様コンホメーションを採用可能であるかどうかはまったく明らかでなかった。実際には、単離ＴｐＮ４７ドメインは、小分子非構造化ＴｐＮ４７断片に比較した際、非常に高い免疫学的活性を示すことが明らかになった（結果に関しては、表３、図９を参照されたい）。これらのデータから、本発明者らは、単離ドメインが、実際に、秩序だった天然様コンホメーションを採用することが可能であると推測する。本発明者らの免疫学的評価から判断した際、ドメイン断片の抗原性は、Ｃ＜Ｄ＜ＣＤ＜Ｂ＜ＡＢ＜ＡＢＣＤの順に増加する；特に、ＴｐＮ４７ドメインの組み合わせＡＢは、抗トレポネーマ陽性ヒト血清と、全長タンパク質のシグナルレベルの約５０％を生じる。
【０１０３】
実施例５
ＦＰＬＣ分析によって評価した際のＴｐＮ４７ドメイン融合体の熱安定性
ＴｐＮ４７ドメイン（すなわち、定義されたコンホメーションを持つ、秩序だった自律性フォールディング単位）が有意な抗原性を示すという、説得力がある証拠が集められてきていることから、本発明者らは、別個のドメインが、熱ストレスに曝露された際、異なる安定性を所持するかどうか疑問に思った。この疑問に取り組むため、本発明者らはすべてのＴｐＮ４７ドメイン融合タンパク質を、同一条件下でインキュベーションし、そしてこれらを上昇した温度に供した（１５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＫＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ中、３０℃、３５℃および４０℃、各１．３ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で一晩インキュベーション）。次いで、本発明者らは、各ＴｐＮ４７融合タンパク質に関して、分析サイズ排除クロマトグラフィ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００）によってすべての試料を評価し、そしてシグナル回復（吸収曲線下のピーク面積）および凝集傾向（すなわちゲル濾過カラムのボイド容量における巨大粒子の溶出）の両方をチェックした。結果を図１〜６に示す。温度誘導性凝集物を形成する傾向は、全長ＴｐＮ４７＞ＣＤ＞Ｃ＞Ｄ、Ｂ、ＡＢの順に有意に減少することがわかった。簡潔には、ＴｐＮ４７ドメインＤ、ＢおよびＡＢは、全長ＴｐＮ４７よりも凝集する傾向がはるかにより低い。熱ストレスに際して、これらは、常に、溶出プロファイル中、優れたシグナル回復を示し、そして会合物または凝集物を形成する傾向は無視できる程度にしか示さない。逆に、ドメインＣを含むすべてのＴｐＮ４７変異体（すなわち全長ＴｐＮ４７、Ｃ、ＣＤ）は、３５℃などの中程度に上昇した温度であっても、凝集する強い傾向を示す。
【０１０４】
実施例６
Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）測定によって評価した際のイムノアッセイにおけるＴｐＮ４７ドメイン融合体の熱安定性
Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）測定による、別個のＴｐＮ４７融合タンパク質の熱耐性を確かめるため、ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７変異体を、以下のような上昇した温度条件に供した：ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７ビオチンおよびルテニウム・コンジュゲートを、４２℃で３日間、別個にインキュベーションした。このストレスアッセイ中のコンジュゲートの濃度は、各７０ｎｇ／ｍｌ（〜１ｎＭ）であり、アッセイ緩衝液は、１００ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．５、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡであった。続いて、上述の実験条件下、Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）２０１０自動化分析装置において、熱ストレスを掛けた試料を、残渣免疫学的反応性（すなわち残渣抗原性）に関して評価した。ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７の曝露されていない試料（２〜８℃で保存）を参照として用いた。
【０１０５】
実験結果を表４〜６（図１０〜１２）に示す。
表４（図１０）は、記載するような自動化Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）分析装置において、ヒト抗トレポネーマ陽性および抗トレポネーマ陰性血清と、ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７／ＡＢ（２６〜２２３）およびＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７／Ｂ（６３〜１７４）の免疫学的反応性を示す。４２℃の厳しい３日間インキュベーションの前および後の、抗原変異体両方の成績を示す。表５（図１１）は、ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７  Ｃ（２２４〜３５１）およびＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７  Ｄ（３５２〜４３４）の抗原性を示し、そして表６（図１２）は、ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ４７  ＣＤ（２２４〜４３４）および全長ＴｐＮ４７（２１〜４３４）の抗原性を示す。
【０１０６】
実験結果は、シグナル回復に関して、全長ＴｐＮ４７タンパク質に勝る熱ストレスＴｐＮ４７ドメインの優位性を明らかに立証する。
熱曝露に際して、全長ＴｐＮ４７（２１〜４３４）のシグナル回復は、最初の値のほぼ５０％に低下し、一方、ＴｐＮ４７／Ｂ、ＴｐＮ４７／ＡＢおよびＴｐＮ４７／Ｄのシグナル回復は、それぞれ、最初の値の〜９３％、〜８８％および１００％に達する。したがって、シグナル回復は、全長分子の代わりにＴｐＮ４７のドメインを用いた際に、顕著に増進する。
【０１０７】
ＴｐＮ４７（２２４〜３５１）のＣドメインが、いかなる免疫学的活性も示さないことは注目に値する（結果に関しては表５、図１１を参照されたい）。この発見は、明らかに、他のＴｐＮ４７ドメインおよびドメインの組み合わせ、Ｂ、ＡＢ、ＣＤおよびＤに関して見出される抗原性と対照的である。外見上、Ｃドメインは、少なくとも単離されると、ＴｐＮ４７タンパク質分子の驚くべき抗原性にほとんどまたはまったく寄与しない。
【０１０８】
ＴｐＮ４７のＣＤ融合変異体（２２４〜４３４）は、熱ストレス後のシグナル回復が、ほぼ７０％に達し、そして明らかに、他のＴｐＮ４７ドメインおよびドメインの組み合わせより劣っている点で顕著である（結果に関しては、表６、図１２を参照されたい）。Ｄドメイン単独のシグナル回復は非常に高く、そして熱ストレス後、ほぼ不変である（表５、図１１を参照されたい）。
【０１０９】
要約すると、ＴｐＮ４７ドメインＢ、ＡＢおよびＤは、全長ＴｐＮ４７に比較した際、熱曝露に際して、明らかに増進されたシグナル回復を示す。
本発明によれば、ドメインＣ（２２４〜３５１）は、免疫診断目的のために重要でなく、これはＴｐＮ４７抗原性に目立って貢献しないためである。さらに、ドメインＣは、ドメインＤと融合された際、構築物ＣＤ（２２４〜４３４）の安定性を弱め、該構築物は、全長ＴｐＮ４７を除いて、試験したすべてのドメインおよびドメインの組み合わせのうち、最低のシグナル回復を示す（〜７０％、結果に関しては、表６、図１２を参照されたい）。
【０１１０】
Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）などの自動化イムノアッセイによって評価した際の、別個のＴｐＮ４７ドメインの相対シグナル収量（熱ストレスに際して）は、ＦＰＬＣ分析における本発明者らの知見とよく一致する。これは、どちらの実験も非常に異なる濃度で行われているため、いっそう驚くべきことである。ＦＰＬＣ分析中のタンパク質濃度は、中程度のマイクロモル範囲（１５．２μＭ〜２６．７μＭ）であり、一方、免疫学的分析におけるタンパク質濃度は、非常に低いナノモル範囲（０．８２ｎＭ〜１．４４ｎＭ）であった。ＴｐＮ４７ドメインＣなどの凝集誘導ドメインの除去は、高タンパク質濃度の条件下で、最適な結果を生じる（すなわち凝集効果を軽減する）はずである。
【０１１１】
本発明者らの免疫学的データは、ドメインＣの除去が、非常に低いタンパク質濃度の条件下であってさえ、明らかに残りのＴｐＮ４７分子の安定性および可溶性の両方を改善することを明確に示す。この発見によって、より頑強なイムノアッセイキットの開発が可能になり、そして抗トレポネーマ抗体のＴｐＮ４７に基づく血清学的検出において大きな成果を構成する。
【０１１２】
本発明者らの実験は、３５℃を超える中程度に上昇した温度に曝露された際、全長ＴｐＮ４７が極度に凝集する傾向を有する、説得力がある証拠を提供する。これらの観察から、本発明者らは、アッセイ混合物からこの凝集傾向分子の熱に誘導される喪失を回避するよう用心しない限り、全長組換えＴｐＮ４７の使用が、トレポネーマイムノアッセイいずれの特異性および感度にも非常に重要であると推測する。ＴｐＮ４７の熱誘導性凝集を回避する（または少なくとも軽減する）単純でそして好適な方法を本出願に開示する：該方法は、抗原性に直接寄与しないようであり、そしてその上、ＴｐＮ４７分子内の一般的に不安定化させる因子を構成するようである、ＴｐＮ４７ドメインＣを単純に除去することにある。（ＡＢ、ＢおよびＤにおけるように）ＴｐＮ４７ドメインＣが除外されるとただちに、ＴｐＮ４７タンパク質分子の熱不安定性は有意に軽減される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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