(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットと特異性的に結合する物質の、対象の血液サンプルにおけるインテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットのレベルを検出することにより、静脈血栓塞栓（ＶＴＥ）を診断するための診断剤の製造への使用。
【請求項２】
前記血液サンプルが末梢静脈血サンプルである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記診断剤は、インテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットからの少なくとも１種とそれぞれ特異性的に結合する少なくとも１種の物質を含む、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記診断剤は、インテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット及びインテグリンβ３サブユニットとそれぞれ異性的に結合する物質を含む、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項５】
前記静脈血栓塞栓は、急性肺塞栓（ＡＰＥ）、慢性血栓塞栓性肺高血圧（ＣＴＥＰＨ）あるいは深部静脈血栓（ＤＶＴ）である、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項６】
前記静脈血栓塞栓は、急性肺塞栓あるいは急性深部静脈血栓である、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項７】
前記物質は、抗体、リガンド、及び／又はアンタゴニストである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記物質は、標識された抗体、リガンド、及び／又はアンタゴニストである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
前記抗体、リガンド、及び／又はアンタゴニストは、蛍光標識されたものである、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記抗体、リガンド、及び／又はアンタゴニストは、フィコエリスリン（ＰＥ）で標識されたものである、請求項８に記載の使用。
【請求項１１】
インテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットとそれぞれ特異性的に結合する物質を含む、対象の血液サンプルにおけるインテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットのレベルを検出することにより静脈血栓塞栓（ＶＴＥ）を診断するためのキット。
【請求項１２】
前記血液サンプルが末梢静脈血サンプルである、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
インテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットからの少なくとも１種とそれぞれ特異性的に結合する少なくとも２種の物質を含む、請求項１１又は１２に記載のキット。
【請求項１４】
インテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット及びインテグリンβ３サブユニットとそれぞれ特異性的に結合する物質を含む、請求項１１又は１２に記載のキット。
【請求項１５】
前記静脈血栓塞栓は、急性肺塞栓（ＡＰＥ）、慢性血栓塞栓性肺高血圧（ＣＴＥＰＨ）あるいは深部静脈血栓（ＤＶＴ）である、請求項１１又は１２に記載のキット。
【請求項１６】
前記静脈血栓塞栓は、急性肺塞栓あるいは急性深部静脈血栓である、請求項１１又は１２に記載のキット。
【請求項１７】
前記物質は、抗体、リガンド、及び／又はアンタゴニストである、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１８】
前記物質は、標識された抗体、リガンドあるいはアンタゴニストである、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１９】
前記抗体、リガンド、及び／又はアンタゴニストは、蛍光標識されたものである、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記抗体、リガンド、及び／又はアンタゴニストは、フィコエリスリン（ＰＥ）で標識されたものである、請求項１８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は静脈血栓塞栓（ＶＴＥ）の技術分野に属する。具体的に、本発明は、対象の血液サンプルにおけるインテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットのレベルを検出することを含む新規ＶＴＥ診断方法に関する。本発明は、インテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットと特異性的に結合できる物質の、ＶＴＥを診断するための診断剤の製造への使用にも関する。さらに、本発明は、インテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットと特異性的に結合できる物質を含む、ＶＴＥを診断するためのキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
静脈血栓塞栓は、静脈内に形成された血栓の総称で、肺動脈血栓塞栓（ＰＥ）と深部静脈血栓（ＤＶＴ）を含む。そのうち、ＰＥは、急性肺塞栓（ＡＰＥ）と、慢性血栓塞栓性肺動脈高血圧（ＣＴＥＰＨ）を含む。ＶＴＥは、多発病に属し、特にＰＥは高い発病率、高い誤診率及び高い死亡率で世界的な健康上の難問になった（Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｖｅｎｏｕｓ  ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉｓｍ．  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ  （ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ａｃｃｏｒｄｉｎｇ  ｔｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ）．  Ｉｎｔ．  Ａｎｇｉｏｌ．  ２００６；２５（２）：１０１−１６１）。
【０００３】
伝統的な静脉血栓形成理論（ｐｈｌｅｂｏｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ｔｈｅｏｒｙ）によると、緩慢の血流状態で、静脈血管内皮細胞が損傷されたり、凝固因子が亢進状態になったりして、損傷された内皮細胞及び血小板が活性化され、凝固因子の機能が活発され、静脉血栓が形成される。静脈内に形成された血栓はフィブリンおよび赤血球に富み、血小板を僅かに含んでいる（Ｆｕｒｉｅ，  Ｂｒｕｃｅ；  Ｆｕｒｉｅ，  Ｂａｒｂａｒａ，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｕｓ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，  Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００８；３５９  （９）：９３８−９４９）。
【０００４】
本発明者らは最近研究したところ、ＡＰＥ血栓におけるタンパク成分が、主にフィブリノーゲンからなり、少量の血清タンパクおよび細胞骨格タンパクも含むことを発見した（Ｗａｎｇ  Ｌ，  Ｇｏｎｇ  Ｚ，  Ｊｉａｎｇ  Ｊ，  Ｘｕ  Ｗ，  Ｄｕａｎ  Ｑ，  Ｌｉｕ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｉｄｅ  Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ  Ｔｉｍｅ  Ｗｉｎｄｏｗ  ｆｏｒ  Ａｃｕｔｅ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｅｍｂｏｌｉｓｍ：  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｇｒａｐｈｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｒｏｍｂｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｒｅｓｐｉｒ．  Ｃｒｉｔ．  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．  ２０１１  １８４：  １４５−１４６）。この発見により、静脈血栓タンパクが主にフィブリンであるとの知見が変わり、ＶＴＥの診断および治療に新たな経路を提供する。例えば、ＶＴＥ血栓中のフィブリノーゲンと血栓中の白血球や血小板や赤血球との間の結合方式を検討することにより、静脈血栓の形成機構についての情報を提供することが可能になる。
【０００５】
インテグリンはレセプタータンパク質であり、細胞-細胞、細胞-その周囲組織（例えばそのほかの細胞或いは細胞外マトリックス）の接着の主役である。インテグリンは細胞内信号伝達においても重要な作用を持ち、細胞と周囲環境との情報交換に仲介し、細胞を環境の変化に応じて速く応答させる（例えば血小板による血液凝集）（  Ｈｙｎｅｓ  Ｒ，  Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ：  ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ，  ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｍａｃｈｉｎｅｓ．  Ｃｅｌｌ  （２００２），  １１０  （６）：  ６７３−８７）。
【０００６】
インテグリンはヘテロ二量体であり、二本の異なる鎖を持ち、αサブユニットとβサブユニットと呼ばれる。今まで哺乳動物のインテグリンから１８種類のαサブユニット、および９種類のβサブユニットが同定され、これらのサブユニットを別々に組み合わせると、２０種類以上のインテグリンが構成される（Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ  ＭＪ．  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ．  ２０００；２８（４）：３１１−３９）。この２０種類以上のインテグリンはインテグリン家族になり、そのうち、同一種類のβサブユニットを含むインテグリンがインテグリンβ亜族になる。例えばＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ２およびＩＴＧＢ３遺伝子にコードされるインテグリンβ１−３サブユニットは、それぞれＩＴＧＢ１（ＣＤ２９とも呼ばれる）、ＩＴＧＢ２（ＣＤ１８とも呼ばれる）およびＩＴＧＢ３（ＣＤ６１とも呼ばれる）である。ＩＴＧＢ１サブユニットを含むインテグリンβ１亜族は広く分布し、主に細胞と細胞外マトリックスとの接着、リンパ球のホーミング、及び白血球と活性化内皮細胞との粘着に仲介する。β１亜族は主に活性化したリンパ球および血小板の膜表面に存在する（Ｂｉｌｌａｒｄ  ＭＪ，  ＭｃＩｎｔｙｒｅ  ＢＷ．  ＣＤ４５ＲＡ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｐａｒｔｉａｌ  ａｇｏｎｉｓｔ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ｂｅｔａ１  ｉｎｔｅｇｒｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００８  Ｍａｙ−Ｊｕｎ；８６（４）：３８１−４）。インテグリンβ２を含む亜族は主に各種の白血球の表面に存在し、細胞同士の相互作用を仲介し、主に好中球、単核球に分布する（Ｆｕ  Ｃ，  Ｔｏｎｇ  Ｃ，  Ｗａｎｇ  Ｍ，  Ｇａｏ  Ｙ，  Ｚｈａｎｇ  Ｙ，  Ｌu  Ｓ，  Ｌｉａｎｇ  Ｓ，  Ｄｏｎｇ  Ｃ，  Ｌｏｎｇ  Ｍ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｂｅｔａ２−ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  １  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｔｏ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａ  ｇａｓ−ｄｒｉｖｅｎ  ｍｉｃｒｏｐｉｐｅｔｔｅ  ａｓｓａｙ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２０１１  Ｏｃｔ  ７；２８６（４０）：３４７７７−８７）。インテグリンβ３を含む亜族は主に血小板の表面に存在し、血小板の凝集を仲介したり、血栓の形成にも参与したりする（Ｓａｃｈｓ  ＵＪ，  Ｂａｋｃｈｏｕｌ  Ｔ，  Ｅｖａ  Ｏ，  Ｇｉｐｔｎｅｒ  Ａ，  Ｂｅｉｎ  Ｇ，  Ａｓｔｅｒ  ＲＨ，  Ｇｉｔｔｅｒ  Ｍ，  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  Ｊ，  Ｓａｎｔｏｓｏ  Ｓ．  Ａ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＥＧＦ−４  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  β３  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｉｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｅｃａ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｌｌｏａｎｔｉｇｅｎ  ａｎｄ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．  ２０１１；１０７（１））。
【発明の概要】
【０００７】
一つの方面で、本発明はインテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットと特異性的に結合する物質の、静脈血栓塞栓を診断するための診断剤の製造への使用に関する。
【０００８】
一つの実施態様において、本発明は、インテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットと特異性的に結合する物質の、対象の血液サンプルにおけるインテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットのレベルを検出することにより静脈血栓塞栓（ＶＴＥ）を診断するための診断剤の製造への使用に関する。
【０００９】
一つの実施態様において、本発明の血液サンプルは、末梢血サンプルであり、好ましくは末梢静脈血サンプルである。
【００１０】
一つの実施態様において、本発明は、インテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットからの少なくとも２種と特異性的に結合する物質の、対象の血液サンプルにおける、対応するインテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットからの少なくとも２種のレベルを検出することにより静脈血栓塞栓を診断するための診断剤の製造への使用に関する。
【００１１】
一つの実施態様において、本発明は、インテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及びインテグリンβ３サブユニットとそれぞれ特異性的に結合する物質の、対象の血液サンプルにおける、対応するインテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及びインテグリンβ３サブユニットの上昇レベルを検出することにより静脈血栓塞栓を診断するための診断剤の製造への使用に関する。
【００１２】
一つの実施態様において、本発明に記載の静脈血栓塞栓は急性肺塞栓症（ＡＰＥ）、慢性血栓塞栓性肺高血圧症（ＣＴＥＰＨ）あるいは深部静脈血栓症（ＤＶＴ）である。
【００１３】
一つの実施態様において、本発明に記載の静脈血栓塞栓は急性肺塞栓症（ＡＰＥ）あるいは深部静脈血栓症（ＤＶＴ）である。
【００１４】
一つの実施態様において、本発明のインテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットと特異性的に結合する物質は、抗体、リガンドあるいはアンタゴニストである。一つの実施態様において、本発明の抗体、リガンド及び／又はアンタゴニストは蛍光標識されたものである。一つの実施態様において、本発明の抗体、リガンド及び／又はアンタゴニストはフィコエリスリン（ＰＥ）で標識された抗体である。
【００１５】
もう一つの方面で、本発明は、対象の血液サンプル、例えば末梢静脈血サンプルにおけるインテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットのレベルを検出することにより静脈血栓塞栓（ＶＴＥ）を診断するためのキットを提供する。
【００１６】
一つの実施態様において、本発明は、インテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットとそれぞれ特異性的に結合する物質を含む、対象の血液サンプル、例えば末梢静脈血サンプルにおけるインテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットのレベルを検出することにより静脈血栓塞栓（ＶＴＥ）を診断するためのキットを提供する。
【００１７】
一つの実施態様において、本発明のキットは、インテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットからの少なくとも２種と特異性的に結合する物質を含む。一つの実施態様において、本発明のキットは、インテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及びインテグリンβ３サブユニットとそれぞれ特異性的に結合する物質を含む。
【００１８】
一つの実施態様において、本発明のキットに含まれているインテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットと特異性的に結合する物質は、抗体、リガンド及び／又はアンタゴニストである。一つの実施態様において、本発明の抗体、リガンド及び／又はアンタゴニストは標識されたものである。一つの実施態様において、本発明の抗体、リガンド及び／又はアンタゴニストは蛍光標識されたものである。一つの実施態様において、本発明の抗体、リガンド及び／又はアンタゴニストはフィコエリスリン（ＰＥ）で標識された抗体である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ショットガン法による血栓タンパクサンプルの前分離結果を示す図である。
【図２】血栓タンパクサンプルの酵素分解したペプチド断片、破片配列情報の結果を示す図である。
【図３】急性ＰＥ患者の血栓サンプルのタンデムタンパク質量分析および情報分析、Ｇｅｎｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ分析の結果である。
【図４】急性ＰＥ患者の血栓サンプルのタンデムタンパク質量分析および情報分析、交互網路分析の結果である。この図から、β２、β３及びβ１サブユニットインテグリンが赤色血栓のコアタンパクであることが分かった。
【図５】急性下肢ＶＴＥ患者の血栓サンプルのタンデムタンパク質量分析および情報分析、Ｇｅｎｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ分析の結果である。
【図６】急性下肢ＶＴＥ患者の血栓サンプルのタンパク質量分析および情報分析、交互網路分析の結果である。この図から、β３サブユニットインテグリンおよびＩＴＧＡ２Ｂ（すなわちインテグリンα鎖ＩＩｂ）が赤色血栓のコアタンパクであることが分かった。
【図７】健康人対照群におけるインテグリンβ１、β２、β３サブユニットの分布である。図７  ａにおいて、インテグリンβ１サブユニットが正規分布を呈する、図７  ｂにおいて、インテグリンβ２サブユニットが非正規分布を呈する、図７  ｃにおいて、β３サブユニットが正規分布を呈することが示される。
【図８】健康人対照群におけるインテグリンβ１サブユニットの発現情報である。図８  ａは対照群におけるインテグリンβ１サブユニットの発現平均値およびベースライン区間を表し、そのうち、平均値が８．１８±２．６９（％）、ベースライン区間が２．８〜１３．５６（％）である。図８  ｂは対照群におけるインテグリンβ１サブユニットの発現レベルの分布を示す。
【図９】健康人対照群におけるインテグリンβ２サブユニットの発現情報である。図９  ａは対照群におけるインテグリンβ２サブユニットの発現平均値およびベースライン区間を表し、そのうち、発現中央値が８８．６  （％）、ベースライン区間が７１．１〜９５．８  （％）である。図９  ｂは対照群におけるインテグリンβ２サブユニットの発現レベルの分布を示す。
【図１０】健康人対照群におけるインテグリンβ３サブユニットの発現情報である。図１０  ａは対照群におけるインテグリンβ３サブユニットの発現平均値およびベースライン区間を表し、その平均値が９．６５±２．５３  （％）、ベースライン区間が４．５９〜１４．７１  （％）である。図１０  ｂは対照群におけるインテグリンβ３サブユニットの発現レベルの分布を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
特に断りのない限り、すべての技術や科学上の専門用語は本分野によく知られる一般的な意味を持つ。特に断りのない限り、すべての特許、特許出願、出版物、配列及びそのほかの開示された資料は援用により本文に納入される。
【００２１】
本発明において、検討したところ、あるβサブユニットを含むインテグリンがＶＴＥ血栓形成に重要な役割を果たし、静脈血栓タンパク網路のコアタンパクであることを発見した。前記インテグリンはβ１〜３亜族のインテグリンを含む。この発見に基づいて、本発明は、対象の血液サンプルにおけるインテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットのレベルを検出や、調節することを含む、静脈血栓塞栓を診断あるいは治療する新規方法を提供する。また、本発明は、インテグリンβサブユニットと特異性的に結合、検出あるいは調節する物質、及びこの物質の、ＶＴＥを診断するためのキットの製造への使用に関する。
【００２２】
専門用語「血栓」は血管内に形成される血の塊であり、血流を障害あるいは閉塞させる。血管が損傷される時、血液中の血小板はあるタンパク（例えばフィブリン、フィブリノーゲン、血清蛋白および細胞骨格タンパクなど）と凝集し、血の塊になることにより、損傷した部位を回復させる。ただし、もし血の塊が脱落すると、血栓になる可能性がある。
【００２３】
専門用語「静脈血栓塞栓」は静脈内に形成される血栓の総称であり、肺動脈血栓塞栓（ＰＥ）と深部静脈血栓（ＤＶＴ）を含む。そのうち、ＰＥは急性肺塞栓（ＡＰＥ）と、慢性血栓塞栓性肺高血圧（ＣＴＥＰＨ）を含む。深部静脈血栓は急性および慢性深部静脈血栓を含む。
【００２４】
専門用語「インテグリン」は細胞表面受容体蛋白である。このタンパクはヘテロ二量体であり、二本の異なる鎖を持ち、それぞれαサブユニットとβサブユニットと呼ばれる。同一種類のβサブユニットを含むインテグリンはインテグリンβ亜族になる。例えば、インテグリンβ１サブユニット（ＣＤ２９とも呼ばれる）を含むβ１亜族、インテグリンβ２サブユニット（ＣＤ１８とも呼ばれる）を含むβ２亜族およびインテグリンβ３サブユニット（ＣＤ６１とも呼ばれる）を含むβ３亜族がある。前記αサブユニットとβサブユニットは差別的スプライシング（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ）による変異株を包含し、例えばＩＴＧＢ１の４種の変異株。
【００２５】
本発明書において、「差別的スプライシング」とは、同一のｍＲＮＡ前駆体内において、異なるスプライシング方式で（すなわち異なるグスプライス部位によるエキソンの組合せ）  異なるｍＲＮＡスプライシングイソフォームを得る手順である。差別的スプライシングにより得られたタンパク産物は互いにイソフォームであり、異なる機能や構造特性を表現し、あるいは同じ細胞内に異なる発現によって異なる表現型を呈する。
【００２６】
専門用語「対象」とは哺乳動物の個体を指し、好ましくはヒトである。
【００２７】
一つの方面で、本発明は、静脈血栓塞栓を診断する新規方法を提供する。
【００２８】
一つの実施態様において、本発明の方法は、対象の血液サンプルにおけるインテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットのレベルを検出し、その結果を対照となる健康対象の血液サンプルの検出したレベルと比べ、このレベルの上昇が、ＶＴＥを診断するための兆候である。
【００２９】
血液サンプルにおけるタンパクを定量検出する方法は、本分野によく知られる技術である。当業者は具体的な要求に応じて選択することができる。例えばフローサイトメトリーや、ＥＬＩＳＡなどの抗体に基づく方法を用いる。
【００３０】
専門用語「血液サンプル」は対象の循環システムからの血液組織サンプルであり、好ましくは末梢静脈の血液サンプルである。本発明の血液サンプルの中に血細胞および細胞外液（すなわち血漿）が含まれることができる。
【００３１】
本発明における「レベルの上昇」は、下記方法のように確定される。すなわちある数量の健康人群を対照群として、健康人群における正常レベルの範囲を調べ、被験対象のレベルが正常レベル範囲を超える場合、被験対象においてレベルが上昇すると判断する。
【００３２】
健康人群における正常レベルの範囲について、統計学上の方法により確定される。例えば、Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ検定により正規性の検定を行ったところ、Ｐ＞０．０５の場合、正規分布と判断する。正規分布のデータについて、健康人群で計測した平均値と標準偏差
【数１】
0005989893.tif 000002
から正常レベルの範囲を確定する。非正規分布のデータについて、中央値を統計学上のＰ２．５〜Ｐ９７．５と組み合わせて正常レベルの範囲を表示する。
【００３３】
本発明において、「レベルの上昇」とは、例えば検出したレベルが対照となる健康対象の血液サンプルのレベルと比べ、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％及びそれ以上に上昇することを指す。
【００３４】
「健康対象」は健康検査で正常な対象群である。「対照レベル」は健康の対象群で検出し得たインテグリン関連タンパクのレベルであり、その統計学上の平均値を標準偏差と組合せたものを対照レベルとする。対照となる健康対象群は、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、５００及びそれ以上の人数である。
【００３５】
本発明の方法は以下のステップを含む。被験対象から血液サンプル、例えば末梢静脈血サンプルを採り、各種のインテグリンβサブユニットと特異性的に結合する物質、例えば抗体により、前記血液サンプルにおける各種のインテグリンβサブユニットの量をフローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡなどの常用定量方法で定量検出する。例えば２００人あるいはそれ以上の健康人の末梢血サンプルを採り、前記と同様の方法により、各種のインテグリンβサブユニットの量をそれぞれ検出し、その統計学上の平均値を標準偏差と組み合わせたものを対照レベルとする。被験対象で検出した各種のインテグリンβサブユニットの量を相応する対照レベルと比べ、そのうち、各種のインテグリンβサブユニットの上昇がＶＴＥを診断するための兆候である。
【００３６】
一つの実施態様において、本発明の方法は、対象の血液サンプルにおけるインテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットからの少なくとも２種のレベルを検出することを含む。一つの実施態様において、本発明の方法は、対象の血液サンプルにおけるインテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットからの少なくとも２種のレベルを検出することを含む。一つの実施態様において、本発明の方法は、対象の血液サンプルにおけるインテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及びインテグリンβ３サブユニットのレベルを検出することを含む。
【００３７】
本発明に記載の静脈血栓塞栓は、急性肺塞栓（ＡＰＥ）、慢性血栓塞栓性肺高血圧（ＣＴＥＰＨ）あるいは深部静脈血栓（ＤＶＴ）であってもよく、好ましくは急性肺塞栓あるいは深部静脈血栓である。
【００３８】
一つの実施態様において、本発明の方法は、フローサイトメトリーによりインテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットのレベルを検出する。
【００３９】
フローサイトメトリーは本分野の常用技術であり、その具体的な操作について、関連文献、教科書あるいはメーカーの操作ガイドを参照すること。例えば、（Ｌｏｋｅｎ  ＭＲ  （１９９０）．  Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ｓｏｒｔｉｎｇ  （２ｎｄ  ｅｄ．）．  Ｗｉｌｅｙ．  ｐｐ．  ３４１−５３）を参照することができる。
【００４０】
もう一つの方面で、本発明は、インテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットのレベルを特異性的に検出する物質を提供する。一つの実施態様において、本発明は抗体、インテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットと特異性的に結合する物質を提供し、前記物質は、例えば、リガンド及び／又はアンタゴニストである。一つの実施態様において、本発明の抗体、リガンド及び／又はアンタゴニストは標識されたものである。一つの実施態様において、本発明の抗体、リガンド及び／又はアンタゴニストは蛍光標識されたものである。一つの実施態様において、本発明の抗体、リガンド及び／又はアンタゴニストはフィコエリスリン（ＰＥ）で標識されたものである。
【００４１】
インテグリンβ１サブユニットとのリガンドは、例えばラミニン（ＬＭ）、コラーゲンタンパク（ＣＯＬ）、フィブロネクチン（ＦＮ）、血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）などがある。インテグリンβ２サブユニットとのリガンドは、例えばフィブリノーゲン（ＦＢ）、細胞間接着分子−１、細胞間接着分子−２、細胞間接着分子−２（ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３）、Ｘ因子、ｉｃ３ｂなどがある。インテグリンβ３サブユニットとのリガンドは、例えばＦＢ、ＦＮ、ビトロネクチン（ＶＮ）、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（ｖＷＦ）、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）などがある。
【００４２】
もう一つの方面で、本発明は、インテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットと特異性的に結合する物質の、対象の血液サンプルにおけるインテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットのレベルを検出することにより、静脈血栓塞栓を診断するための診断剤の製造への使用に関する。
【００４３】
一つの実施態様において、本発明は、インテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットからの少なくとも２種とそれぞれ特異性的に結合する物質の、静脈血栓塞栓を診断するための診断剤の製造への使用に関する。
【００４４】
一つの実施態様において、本発明は、インテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットからの少なくとも２種とそれぞれ特異性的に結合する少なくとも２種の物質、静脈血栓塞栓を診断するための組成物の製造への使用に関する。
【００４５】
一つの実施態様において、インテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットからの少なくとも２種とそれぞれ特異性的に結合する物質は、少なくとも２種の異なるものであり、そのうちの一つはインテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、又はインテグリンβ３サブユニットからの１種と特異性的に結合し、もう一つはインテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットからの別の１種と特異性的に結合する。
【００４６】
一つの実施態様において、本発明は、インテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及びインテグリンβ３サブユニットとそれぞれ特異性的に結合する物質の、静脈血栓塞栓を診断するための組成物の製造への使用に関する。
【００４７】
一つの実施態様において、インテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及びインテグリンβ３サブユニットとそれぞれ特異性的に結合する物質は、少なくとも３種の異なるものであり、そのうちの第一種はインテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、あるいはインテグリンβ３サブユニットからの第１種と特異性的に結合し、第二種はインテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、あるいはインテグリンβ３サブユニットからの第２種と特異性的に結合し、第三種はインテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、あるいはインテグリンβ３サブユニットからの第３種と特異性的に結合する。
【００４８】
一つの実施態様において、インテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットと特異性的に結合でき、血液サンプルにおけるインテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットのレベルを特異性的に検出することに使用できる物質は、抗体、リガンド及び／又はアンタゴニストであり、好ましくは標識された抗体、リガンド及び／又はアンタゴニストである。一つの実施態様において、本発明の抗体、リガンド及び／又はアンタゴニストは蛍光標識されたものであり、例えばフィコエリスリン（ＰＥ）で標識されたものである。
【００４９】
もう一つの方面で、本発明は、インテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットのレベルを特異性的に検出する物質を含む、静脈血栓塞栓診断用のキットを提供する。前記物質は、インテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットと特異性的に結合できるものである。
【００５０】
一つの実施態様において、本発明のキットは、インテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットからの少なくとも２種と特異性的に結合する物質を含む。
【００５１】
一つの実施態様において、本発明のキットは、インテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、あるいはインテグリンβ３サブユニットからの少なくとも２種とそれぞれ特異性的に結合する物質を含む。
【００５２】
一つの実施態様において、本発明のキットは、インテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及びインテグリンβ３サブユニットとそれぞれ特異性的に結合する物質を含む。
【００５３】
もう一つの発明において、本発明は、インテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットとのリガンド、抗体、アンタゴニスト及び／又は活性抑制剤にも関する。
【００５４】
本発明に用いられる専門用語「リガンド」、「抗体」、「アンタゴニスト」、「活性抑制剤」などは、本分野によく使われる専門用語であり、その意味は当業者の一般的な理解に合い、常用の教科書やガイドブックに記載された定義を参照することもできる。
【００５５】
本発明において、インテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及び／又はインテグリンβ３サブユニットからの少なくとも２種とそれぞれ特異性的に結合する物質は、少なくとも２種の異なるものであり、そのうちの一つは、インテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、あるいはインテグリンβ３サブユニットからの１種と特異性的に結合し、もう一つは、インテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、あるいはインテグリンβ３サブユニットからの別の１種と特異性的に結合する。インテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、及びインテグリンβ３サブユニットとそれぞれ特異性的に結合する物質は、少なくとも３種の異なるものであり、そのうちの第一種はインテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、あるいはインテグリンβ３サブユニットからの第１種と特異性的に結合し、第二種はインテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、あるいはインテグリンβ３サブユニットからの第２種と特異性的に結合し、第三種はインテグリンβ１サブユニット、インテグリンβ２サブユニット、あるいはインテグリンβ３サブユニットからの第３種と特異性的に結合する。
【００５６】
もう一つの方面で、本発明は、本発明の方法により診断を行う装置にも関する。例えば、臨床の迅速診断をすることができる装置。
【実施例】
【００５７】
本発明を下記の実施例によりさらに説明する。これらの実施例はただ示例的に挙げられるものであり、本発明の範囲を限定するためのものではない。本発明は具体的に下記の実施例を挙げる。
【００５８】
例１：カテーテルで急性ＶＴＥ血栓を採集
大腿静脈穿刺法により、７Ｆ右冠状動脈カテーテル（Ｍｅｔｒｏｎｉｃ，ＵＳＡ）で３９歳の男性の急性ＰＥ（ＡＰＥ）患者の肺動脈内および５０歳の男性の急性ＤＶＴ（ＡＤＶＴ）患者の下肢大腿静脈内（ＡＤＶＴ）から５−１５ｍｍ長さ、１０ｇの赤色血栓を３〜５本採集した。得られた新鮮な血栓を下記の実施例におけるタンデムタンパク質量分析に供する。
【００５９】
例２：タンデムタンパク質量分析およびデータ情報の分析方法：
１．方法学：
タンデムタンパク質量（ＭＳ／ＭＳ）分析およびデータ情報の分析方法のフローチャート：
急性ＰＥ、ＤＶＴ血栓−ＭＳ／ＭＳ（型番ＬＴＱ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＵＳＡ）−データベース−タンパク検索−対応の遺伝子−ＧＯ（Ｇｅｎｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）分析−差別的遺伝子−差別的タンパク−ＫＥＧＧ  Ｐａｔｈｗａｙ解析−遺伝子交互網路分析−交互網路コア蛋白の同定。
【００６０】
１．１血栓タンパクのショットガン実験について、得られたペプチド断片データをバイオインフォマティクス分析し、ペプチド断片に対応するタンパクを正確に同定し、このタンパクに機能分類及び生物学的経路を分析した。
【００６１】
１．２  ＧＯ解析：
ＧＯデータベースは遺伝子の、参加する生物学的過程、その細胞にある部位およびその果たす分子機能の三つの機能情報を含む。差別的発現タンパクは入力としてＧＯ解析に用いられた。差別的遺伝子はそれぞれＧＯデータベースの各節点にマップされた。各節点の遺伝子数を数えた。
【００６２】
１．３    ＫＥＧＧ  Ｐａｔｈｗａｙ解析方法：
差別的発現タンパクに対してＫＥＧＧ  Ｐａｔｈｗａｙ解析を行った。
【００６３】
１．４  Ｇｅｎｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ解析方法：
下記の三種類の異なる相互作用関係を統合した。（１）  ＫＥＧＧデータベースにおける遺伝子の間のタンパク相互作用、遺伝子調節、タンパク質修飾などの関係；（２）既存のハイスループット実験；（３）従来の文献に報告された遺伝子同士の相互作用。
【００６４】
Ｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）のＫＥＧＧＳＯＡＰソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ／ｐａｃｋａｇｅｓ／２．４／ｂｉｏｃ／ｈｔｍｌ／ＫＥＧＧＳＯＡＰ．ｈｔｍｌ）により、ＫＥＧＧデータベースのシグナル経路のデータを分析し、ゲノム内範囲内の遺伝子同士の相互作用を同定し、下記の三種類の関係が存在した。
ＥＣｒｅｌ      酵素‐酵素の関係、継続的反応段階を触媒する二種類の酵素
ＰＰｒｅｌ      タンパク‐タンパクの相互作用、例えば結合および修飾
ＧＥｒｅｌ      遺伝子発現の相互作用、転写因子と標的遺伝子産物との関係を表す
【００６５】
タンパク‐タンパク同士の相互作用のデータはＭＩＰＳデータから得られる（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｐｓ．ｈｅｌｍｈｏｌｔｚ−ｍｕｅｎｃｈｅｎ．ｄｅ／ｐｒｏｊ／ｐｐｉ／）。Ｃｏ−ｃｉｔａｔｉｏｎアルゴリズムを採用し、具体的方法は下記のようである。ＰｕｂＭｅｄデータベースの要約をダウンロードし、各要約をセンテンスに分けて、そしてセンテンスに共存している遺伝子の名称を分析し、即ちＣｏ−ｃｉｔａｔｉｏｎの遺伝子とした。各Ｃｏ−ｃｉｔａｔｉｏｎの遺伝子対の現れる頻度を合計した。遺伝子対の現れる頻度が高ければ高いほど、この遺伝子対の間に相互作用が存在する可能性が高い。ＰｕｂＭｅｄデータベースの資料数をＮとし、遺伝子対の二つの遺伝子がＰｕｂＭｅｄデータベースにおける独立に現れる頻度をそれぞれｍ、ｎとし、遺伝子対を実際に同時に現れる回数をｋとし、超幾何分布（ｈｙｐｅｒｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）に基づいて、完全ランダムの条件でｋ回以上のＣｏ−ｃｉｔａｔｉｏｎの確率を計算した。
【数２】
0005989893.tif 000003
ここで、
【数３】
0005989893.tif 000004
最後のデータ結果に基づいて、遺伝子の間の相互関係交互網路を統合した。この関係交互網路はｍｅｄｕｓａソフトにより図で示した。
【００６６】
２．質量分析とデータ処理
例１で得たＡＰＥ、ＡＤＶＴ血栓サンプルに対し、それぞれ質量分析を行い、質量分析計の型番がＬＴＱ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＵＳＡ）である。
【００６７】
２．１  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ
ＥｔｔａｎＴＭ  ＭＤＬＣシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりトリプシンペプチド混合物に対し脱塩および単離をした。このシステムにおいて、サンプルがＲＰトラップカラム（ＲＰ  ｔｒａｐ  ｃｏｌｕｍｎ，  Ｚｏｒｂａｘ  ３００  ＳＢ  Ｃ１８，  Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で脱塩され、続いてＲＰカラム（１５０  μｍ  ｉ．ｄ．，  １００  ｍｍ長さ、ＣｏｌｕｍｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，  Ｆｒｅｍｏｎｔ，  ＣＡ）で単離された。移動相Ａ（ＨＰＬＣ用水に０．１％ギ酸）及び移動相Ｂ（アセトニトリルに０．１％ギ酸）が選択された。トリプシンペプチド混合物２０μｇをカラムに添加し、４−５０％線形勾配のＢにより流速２μＬ／ｍｉｎで１２０分間の単離をした。電気噴霧界面を備えるＦｉｎｎｉｇａｎＴＭ  ＬＴＱＴＭリニアイオントラップＭＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）を前記ＬＣ装置に連続し、溶出されたペプチドを検出した。同時にデータ依存性のＭＳ／ＭＳスペクトラムも得られた。各スキャニングサイクルが下記のようである。一つの完全なＰｒｏｆｉｌｅモードＭＳスキャニング、それから五個のＣｅｎｔｒｏｉｄモードＭＳ／ＭＳスキャニングであり、ここでＤｙｎａｍｉｃ  ＥｘｃｌｕｓｉｏｎＴＭの設置は繰り返し回数＝２、繰り返し時間＝３０ｓ、除外時間＝９０ｓである。サンプルずつに三重に分析された。
【００６８】
２．２データ分析
ＢｉｏｗｏｒｋｓＢｒｏｗｓｅｒ  ｒｅｖ．  ３．１（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ．）を使い非冗長性Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｄｅｘ  （ＩＰＩ）の人類タンパクデータベース（バージョン３．２６，  ６７６８７条目）に対し、ＭＳ／ＭＳスペクトラムを自動に検索した。ＢｕｉｌｄＳｕｍｍａｒｙによりＳＥＱＵＥＳＴ出力ファイルからタンパク同定の結果を抽出した（Ｄａｉ  Ｊ，  Ｓｈｉｅｈ  ＣＨ，  Ｓｈｅｎｇ  ＱＨ，  Ｚｈｏｕ  Ｈ，  Ｚｅｎｇ  Ｒ：  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｅｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｏｌｕｍｎ  ｕｓｉｎｇ  ｐＨ  ｓｔｅｐｓ．  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ）。
【００６９】
ペプチドはトリプシンペプチドの形に制限され、多くとも二つの割れ目が欠損すると容許された。システインのカルバモイルメチル化は固定修飾とされ、メチオニン残基の酸化は可変修飾にされる。容許された質量許容差はそれぞれ前駆イオンが２．０  Ｄａ、断片イオンが０．８  Ｄａであった。Ｄｅｌｔａ  ＣＮ  （≧０．１）及び相互相関点数（Ｘｃｏｒｒ、一個の電荷≧１．９、二個の電荷≧２．２、三個の電荷≧３．７５）に準じてタンパクを同定した。
【００７０】
３．結果および分析：
結果を上海敏芯科技有限会社（中国上海）に依頼し、下記のバイオインフォマティクス分析を行った。（例１由来のＡＰＥ患者サンプルの調製、ショットガン法によるタンパクサンプル前分離の結果を図１に示し、酵素分解したペプチド断片、破片配列情報の結果を図２に示す。）データベースに依拠−タンパク検索−対応遺伝子の同定−Ｇｅｎｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（ＧＯ）解析−差別的遺伝子の同定−差別的タンパクの同定−ＫＥＧＧ  Ｐａｔｈｗａｙのシグナル経路解析−タンパク相互作用の交互網路の獲得−交互網路コア蛋白の同定。
【００７１】
結果：
（１）ＧＯ解析方法：差別的発現タンパクがＧＯ解析の入力とされた。差別的遺伝子がそれぞれｇｅｎｅ  ｏｎｔｏｌｏｇｙデータベースの各節点にマップされ、各節点の遺伝子数を数えた。統計結果が下記に示す。
【００７２】
【表１】
0005989893.tif 000005
【００７３】
【表２】
0005989893.tif 000006
【００７４】
（２）  ＫＥＧＧシグナル経路解析：遺伝子をＧｅｎＭＡＰＰ  ｖ２．１によりＫＥＧＧ  Ｐａｔｈｗａｙデータベースにマップし、各経路における遺伝子の累積程度（ｐ−値）を合計した。ＡＰＥ血栓サンプルに対し合計で３５個の相関シグナル経路が見つかれた。ＡＶＤＴ血栓サンプルに対し、合計で９４個の相関シグナル経路が見つかれた。
【００７５】
（３）タンパク相互作用交互網路解析：同時に３種類の異なる相互作用関係を統合し、タンパク相互作用の交互網路を得た。すなわち、前記相互作用は以下の通りです：（ａ）  ＫＥＧＧシグナル経路解析データにおけるタンパク相互作用、遺伝子調節、タンパク質修飾などの関係、（ｂ）既存のハイスループット実験、例えば酵母ツーハイブリッドなどに証明されたタンパク−タンパク相互作用、（ｃ）報告された遺伝子同士およびタンパク同士の相互作用。
【００７６】
ＡＰＥ血栓サンプルのバイオインフォマティクス分析結果を図３と図４に示す。この結果から、β２、β３およびβ１サブユニットインテグリンは赤色血栓のコア蛋白であることが分かった。
【００７７】
ＡＶＤＴ血栓サンプルのバイオインフォマティクス分析結果を図５と図６に示す。この結果から、β３サブユニットインテグリンおよびＩＴＧＡ２Ｂ（すなわちインテグリンα鎖ＩＩｂ）は赤色血栓のコア蛋白であることが分かった。
【００７８】
例３：急性ＶＴＥ患者由来の血栓のタンデムタンパク質量分析
１．臨床対象の情報：
（１）  ＶＴＥ患者２４例は患者群で、図像学（ＣＴＡ、ＭＲＡ、肺換気／潅流スキャン、血管造影あるいは下肢血管超音波検査）によりＶＴＥと診断された。
【００７９】
そのうち、男性１２例、女性１２例、年齢２５−８２歳、平均年齢６２±１６歳であった。８例は急性ＶＴＥ（１カ月内で発病）で、９例は亜急性（１−３カ月内で発病）で、７例は慢性ＶＴＥ（３カ月前で発病）であり、そのうちの４例はＣＴＥＰＨ臨床症状がひどくなり再入院した患者であったある。急性期ＶＴＥで入院した患者８例毎に低分子ヘパリン５０００単位／Ｂｉｄを７−１０日間皮下注射し、低分子ヘパリンを停止する３−４日間前にワルファリン２．５ｍＧ／Ｑｄを経口投与した。亜急性期ＶＴＥの入院患者９例毎に低分子ヘパリン５０００単位／Ｂｉｄを７日間皮下注射し、及び／またはワルファリン２．５ｍＧ／Ｑｄを経口投与した。再入院のＣＴＥＰＨ患者４例は亜急性期の抗凝固療法を受け、そのほかの慢性期ＶＴＥ患者３例は追跡治療で外来通院し、ワルファリン２．５ｍＧ／Ｑｄの経口投与により治療されていた。本研究の検査期間内に、２４例のＶＴＥ患者は何れも悪性腫瘍、自己免疫疾患および動脈血栓症にかかっていなかった。
【００８０】
健康検査で健康の人２７０例を対照群とした。そのうち、１４０人の男性  （年齢２０−７５歳）  において、２０−３９歳群４９人、４０−５９歳群４８人、６０歳以上群４３人であった。１３０人の女性（年齢２１−７２歳）において、２０−３９歳群４６人、４０−５９歳群４４人、６０歳以上群４０人であった。
【００８１】
ＰＥ、ＤＶＴの診断にはいずれも図像学（ＣＴ、ＭＲＡ、ＥＣＴあるいは血管造影）の証拠及び臨床症状が必要である。診断標準について、（Ｔｏｒｂｉｃｋｉ  Ａ，  Ｐｅｒｒｉｅｒ  Ａ，  Ｋｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｅｍｂｏｌｉｓｍ：  ｔｈｅ  Ｔａｓｋ  Ｆｏｒｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｃｕｔｅ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｅｍｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  （ＥＳＣ）［Ｊ］．  Ｅｕｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ，  ２００８，  ２９（１８）：２２７６−２３１５；およびＱａｓｅｅｍ  Ａ，  Ｓｎｏｗ  Ｖ，  Ｂａｒｒｙ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｖｅｎｏｕｓ  ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃａｒｅ：  ａ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ［Ｊ］．  Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ，  ２００７，１４６（６）：４５４−４５８）に参照することができる。
【００８２】
２．インテグリンβ分子の検出
（１）対象（ＶＴＥ患者あるいは対照）から２ｍｌの末梢静脈血を採血し、試験管に抗凝固する２ｍｇの  ＥＤＴＡおよび２０μｌの蛍光抗体を添加した。そのうちの抗体について、それぞれインテグリンβ１サブユニット（ＣＤ２９）に対する抗体は、ＰＥで標識され、マウス抗ヒトＩｇＧ２ａ，κタイプで、クローンナンバーＨＵＴＳ−２１で、濃度５０ｍｇ／Ｌであり、インテグリンβ２サブユニット（ＣＤ６１）に対する抗体は、ＰＥで標識され、マウス抗ヒトＩｇＧ１，κタイプで、クローンナンバー６．７で、濃度５０ｍｇ／Ｌであった。インテグリンβ３サブユニット（ＣＤ６１）に対する抗体は、ＰＥで標識され、マウス抗ヒトＩｇＧ１，κタイプで、クローンナンバーＶＩ−ＰＬ２で、濃度５０ｍｇ／Ｌであった。ＣＤ２９−ＰＥ（β１）、ＣＤ１８−ＰＥ（β２）、ＣＤ６１−ＰＥ（β３）蛍光抗体はアメリカＢＤ社（Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，アメリカ）から購入された。
（２）サンプルを添加し十分に混合した後、３０分間避光反応させた。
（３）試験管に溶血素を５００μｌ添加した。赤血球を溶解するための溶血素のタイプはＯｐｔｉＬｙｓｅ  Ｃであり、アメリカＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ社から購入された。
（４）  ３７℃の水浴に３０分間置いた。
（５）洗濯した後バッファ液（０．０１ＭのＰＢＳ，ＰＨ７．２）を１００μｌ添加し、フローサイトメトリー検出を行った。ここでアメリカＢＥＣＫＭＡＮ−ＣＯＵＬＴＥＲ社のＥＰＩＣＳ  ＸＬ−４型フローサイトメトリーが使用された。
【００８３】
３．細胞免疫およびインテグリンフロー検出の操作手順：
（１）実験のとき、試験管に抗凝固するＥＤＴＡを２ｍｇ添加し、同時に同型の対照管を設定し、蛍光標識によってそれぞれ２０μｌのマウスＩｇＧ１−ＰＣ５、ＩｇＧ１−ＦＩＴＣ、ＩｇＧ１−ＰＥ（ＣＤ２９分子検出の場合２０μｌのマウスＩｇＧ２−ＰＥ、５０ｍｇ／Ｌ）を加え、更に相応の蛍光抗体２０μｌ（５０ｍｇ／Ｌ）を添加した。十分に混合した後、室温において３０分間避光反応させた。タイプＯｐｔｉＬｙｓｅ  Ｃの溶血素（アメリカＢＥＣＫＭＡＮ−ＣＯＵＬＴＥＲ社製）を５００μｌ加え、３７℃水浴において３０分間反応させた。取り出した後洗浄し、管毎にアメリカＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ社からのシース液（活性成分として硫酸ナトリウム９．８４ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム４．０７  ｇ／Ｌ、プロカイン塩酸塩０．１１  ｇ／Ｌである）を５００μｌを添加し、フローサイトメトリー（アメリカＢＥＣＫＭＡＮ−ＣＯＵＬＴＥＲ社製、タイプＥＰＩＣＳ  ＸＬ−４）検出を行った。
【００８４】
ＢＥＣＫＭＡＮ−ＣＯＵＬＴＥＲ標準蛍光細粒によりフローサイトメトリーのＰＭＴ電圧、蛍光補償、感度を調節し、検出方針を設けた。管毎に１００００個の細胞を収集した。同型の対照管の散布図中に対応する細胞群に応じて口を置き、標識する蛍光に対応した象元によって、陽性細胞の百分率（％）を確定し、フローサイトメトリー付属のＳＹＳＴＥＭ−ＩＩソフトで結果を分析した。
【００８５】
統計学分析：対象群に対しＳＰＳＳ１８統計学ソフトで統計分析を行った。Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ検定により正規性を検定し、Ｐ＞０．０５の場合、正規分布を呈すると判断される。正規分布のデータを
【数４】
0005989893.tif 000007
で表し、年齢別に群間の比較について分散分析を行い、Ｐ＜０．０５である場合、統計学上の差異があると判断する。非正規性分布のデータに対し中央値及び統計学上のＰ２．５−Ｐ９７．５で表し、性別の群間の比較についてＷｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を行い、Ｐ＜０．０５である場合、統計学上の有意差があると判断する。年齢別の群間の比較についてＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  Ｈ検定を行い、Ｐ＜０．０５である場合、統計学上の差異があると判断する。
【００８６】
正規分布のデータに対し、健康人群で得た平均値および標準偏差
【数５】
0005989893.tif 000008
で表し、正常レベルの範囲を確定した。非正規分布のデータに対し、中央値及び統計学上のＰ２．５−Ｐ９７．５で正常レベルの範囲を表す。
【００８７】
ＶＴＥ群のβ１、β２およびβ３は対照群と比較し、正常の参照値の区間を超える場合、発現の増加があると判断する。
【００８８】
総細胞数に対する相応のインテグリンサブユニットを含有する細胞（陽性細胞）の百分率で結果（すなわち、１００００個の細胞に対する陽性細胞の百分率）を表し、図７〜１０および下記の表３に示す。２７０例の対照群において、インテグリンβ１、β３サブユニットは正規分布を呈し、インテグリンβ２サブユニットは非正規分布を呈した。性別の結果の間に有意差がなく、年齢の増加に従ってβ１およびβ３は降りる傾向があった。インテグリンβ１サブユニットの基線区間は２．８−１３．５６％で、インテグリンβ２サブユニットの基線区間は７１．１−９５．８％で、インテグリンβ２サブユニットの基線区間は４．５９−１４．７１％であった。
【００８９】
【表３】
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【００９０】
本研究における２４例の急性期、亜急性期及び慢性期ＶＴＥ患者において、抗凝固療法や抗凝固治療の時間が異なっても、この２４例のＶＴＥ患者のインテグリンβサブユニット単一あるいは共同の発現が何れも健康人群の区間の上限値より高い。ここで、１５／２４例（６２．５％）ＶＴＥ患者のインテグリンβサブユニット単一の発現が上昇し、１１／２４例（４５．８％）のインテグリンβ１サブユニットが上昇し、その中で急性期４／１１例、亜急性期４／１１例、慢性期３／１１例であり、１３／２４例（５４．２％）のインテグリンβ２サブユニットが上昇し、その中で急性期４／１３例、亜急性期４／１３例、慢性期５／１３例であり、１０／２４例（４１．７％）のインテグリンβ３サブユニットが上昇し、その中で急性期３／１０例、亜急性期６／１０例、慢性期１／１０例であった。９／２４例のインテグリンβサブユニット二項以上の発現が共同に上昇し（３７．５％）、ここでβ１，β２及びβ３の共同に上昇したのは３／２４例（１２．５％）であり、β１及びβ２の共同に上昇したのは６／２４例（２５％）であり、β１及びβ３の共同に上昇したのは１／２４例（４．２％）であり、β２及びβ３の共同に上昇したのは１／２４例（４．２％）であった。以上の細胞学検査結果によると、ＶＴＥ患者のインテグリンβ亜族の高発現はＶＴＥの診断に用いられることができる。
【００９１】
上記の例の結果によると、健康人群の血細胞インテグリンβ１、β２及びβ３サブユニットの発現は検出されることが可能であり、β１およびβ２サブユニットの発現は正規分布を呈し、β３サブユニットの発現は非正規分布を呈する。性別の間に統計学上の有意差はない。年齢の増加に従って、β１及びβ３サブユニットの発現は下がる傾向がある。本発明の８例急性期、９例亜急性期および７例慢性期のＶＴＥ患者におけるインテグリンβ１、β２及びβ３サブユニットの発現は別々にあるいは共同に上昇し、何れも対照群の参考区間の上限値を超え、血栓タンデムタンパク質量分析の分析結果に合う。本研究におけるＶＴＥ群のインテグリンβ１、β２及びβ３サブユニットの発現は別々にあるいは共同に顕著に上昇することは、インテグリンの活性化及び信号伝達作用は増加されることが分かった。インテグリンβ１、β２、β３サブユニットのＶＴＥ患者の持続的抗凝固療法の過程での高発現は、患者が安定性、感受性および特異性があり、塞栓しやすい状態にあることを明らかに表する。
【図７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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