(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エリスロポエチンミメティックペプチド９を含有してなる、腺筋症、内膜症、子宮筋腫または前立腺肥大症の治療・改善剤。
【請求項２】
腺筋症の治療・改善剤である請求項１記載の剤。
【請求項３】
内膜症の治療・改善剤である請求項１記載の剤。
【請求項４】
子宮筋腫の治療・改善剤である請求項１記載の剤。
【請求項５】
前立腺肥大症の治療・改善剤である請求項１記載の剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、女性ホルモン依存性増殖性疾患治療・改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、腺筋症および内膜症に対する治療手段として、外科的切除、あるいはＧｎＲＨアゴニスト、アロマターゼ阻害剤、エストロゲン製剤等のホルモン製剤の投与またはそれらを併用する方法が用いられている。しかし、これらのホルモン製剤を適用する場合は一時的に症状が軽減されるが、骨粗鬆症などの副作用のために長期間使用出来ない。さらに、内膜症・腺筋症そのものの病理的成因についての詳細な研究は進んでいない。そのため、抜本的な根治的治療手段は確立していないのが現状である。
【０００３】
エリスロポエチン（Ｅｐｏ）は、血球の増殖と分化に関与し、腎臓または肝臓で産生され血液中に放出される。エリスロポエチンは赤血球前駆細胞のうち赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）と赤芽球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−Ｅ）に作用し、その分化と増殖を促進し、赤血球の産生を誘導していると考えられている（非特許文献１：Krantz S.B., Blood, Vol. 77, pp 419-434 (1991)）。エリスロポエチンが前駆細胞の細胞膜に存在するエリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）と結合すると、受容体の細胞質内領域に存在するヤヌスキナーゼ（Janus Kinase）２（ＪＡＫ２）のリン酸化が起こり、ついで細胞質内の基質のリン酸化が誘発される。その基質の１つである転写因子シグナルトランスデューサーアクティべータートランスクリプション−５（ＳＴＡＴ５）がリン酸化され（Ｐ−ＳＴＡＴ５）、これが核内に伝達され、前駆細胞の増殖を促し（非特許文献２：Ihle J.N., Nature, Vol. 377, pp 591-594 (1995)）、赤血球の分化、すなわち、グロビンｍＲＮＡの細胞内集積、ヘモグロビンの産生が起こるとされている（非特許文献３：D’Andrea A. D. et al., Cell, Vol. 57, pp 277-285 (1989)）。また、遺伝子欠損マウスの実験から、エリスロポエチンは成人型赤血球産生に不可欠な因子であることが判明した（非特許文献４：Wu et al., Cell, Vol. 83, pp 59-67 (1995)）。
【０００４】
エリスロポエチンが赤血球造血に関する部位以外の正常組織でその遺伝子を発現している部位として、着床直後のマウス胚体（非特許文献５：Yasuda et al., Develop. Growth Differ., Vol. 35, pp 711-722 (1993))、ヒト、サル、およびマウスの脳（非特許文献６：Marti H. H. et al., Eur. J. Neu. Sci., Vol. 8, pp 666-676 (1996)）、ヒト胎盤（非特許文献７：Conrad et al., FASEB. J., Vol. 10, pp 760-768 (1996)）等が知られている。
【０００５】
着床直後のマウス子宮内腔にエリスロポエチン抗体や可溶型エリスロポエチン受容体を注入してエリスロポエチン情報を遮断すると、３日後の子宮腔では、それぞれ３６．２％および８０％の胚が発生停止を示し、胎盤の発達の障害がそれぞれ８８．２％と８５％に認められた（非特許文献８：Yasuda et al., Congenit. Anom. Vol. 47, pp 22-23 (2007)）。このことはエリスロポエチン受容体を発現する胚や胎盤原基の発達はエリスロポエチン情報に依存していることを示唆する。一方、遺伝子欠損マウスの実験から、エリスロポエチン遺伝子は心筋の発生（非特許文献９：Wu et al., Development, Vol. 126, pp 3597-3605 (1999)）や脳の発生（非特許文献１０：Yu et al., Development, Vol. 129, pp 505-516 (2002)）に不可欠のものであることが明らかにされた。さらに、筋芽細胞の増殖にエリスロポエチン情報は関与しているが、筋管形成には関与しないことが明らかにされ（非特許文献１１：Ogilvie et al., J. Biol. Chem., Vol. 275, pp 39754-39761 (2000)）、これらのことは平滑筋細胞の増殖にエリスロポエチンが関与していることを示唆している。
【０００６】
また、本発明者らはエリスロポエチン遺伝子がヒト子宮頚管、子宮内膜および卵巣に発現し、さらにエリスロポエチン受容体がこれらの女性生殖器の組織構成すなわち頚管上皮表層、頚管基質内の血管内皮細胞、子宮内膜表層、および子宮腺上皮細胞、脱落膜細胞、卵巣胚上皮細胞、原始卵胞内の卵母細胞質および卵胞上皮細胞、果粒膜細胞の内卵胞膜細胞と介在する毛細血管内皮細胞に発現していることを見出した（非特許文献１２：Yasuda et al., Ital. J. Anat. Embryol., Vol. 106 (supplement 2) pp 215-222 (2001)）。すなわち、女性生殖器のこれらのエリスロポエチン受容体発現部位はエリスロポエチン情報伝達が関与しているが、その機能そのものについては明らかにされていないのが現状である。
【０００７】
エリスロポエチン遺伝子は低酸素になると低酸素誘導因子（ＨＩＦ−１α）によって、その遺伝子発現が増強される。そのことにより循環血中の赤血球数が増え、低酸素状態が改善される仕組みになっていることが明らかにされた（非特許文献１３：Semenza G. L. and Wang G. U., Mol. Cell. Biol., Vol. 12, pp 5447-5454 (1992)；非特許文献１４：Bunn H. F. and Poyton R. O., Physiol. Rev., Vol. 76 (1996)）。ところが、子宮内膜に発現しているエリスロポエチン遺伝子は、ＨＩＦ−１αによって増強されないで、エストロゲン依存性で増強され、さらにエリスロポエチン蛋白もエストロゲン依存性で分泌されることが明らかにされた（非特許文献１５：Yasuda et al., J. Biol. Chem., Vol. 273, pp 25381-25387(1998)）。
また、本発明者らは妊娠マウスの妊娠１１日から１８日の間エチニルエストラダイオール（ＥＥ２）オリーブ油溶液１日量０．０２ｍｇ／ｋｇ体重を経口投与で１日１回投与し、その妊娠マウスより得たＦ１雌マウスを１６週齢で卵巣摘出した群としない群を作成し、以後３２週齢まで飼育し、３２週齢の子宮を観察した。卵巣摘出マウスの子宮内膜の５例中１例は子宮腺過形成を４例は糸状の子宮を示した。卵巣非摘出マウスの子宮内膜は全３例中３例に腺筋症を認めた（非特許文献１６：Yasuda et al., Am. J. Obstet. Gynecol., Vol. 130, pp 506-508 (1978)）。このことは、胎生期ＥＥ２曝露は成熟後の子宮腺の過形成を誘導し、卵摘後も胎生期ＥＥ２曝露は成マウス子宮内膜におけるエストラダイオール（Ｅ２）含量が高い状態を誘発することを示唆する。また、同様の処置による成雄マウスの精巣では、テストステロン産生量が有意に低く、反対にＥ２の含量が有意に高かった。胎生期ＥＥ２曝露量に対して、用量効果的にＥ２含量が高いことを見出した。すなわち、胎生期ＥＥ２曝露はアロマターゼ量を増強し、テストステロンからＥ2に変換される量が多いことが示唆された（非特許文献１７：Yasuda et al., Am. J. Obstet. Gynecol., Vol. 159, pp 1246-1250 (1988)）。このことは、ＥＥ2胎生期投与により、性成熟後のマウス子宮内膜に誘発される腺筋症はアロマターゼ量の増強によるプロゲステロン、アンドロステンディオン、テストステロン等のＥ２への変換が正常より高い可能性を示す。したがって、Ｅ２は子宮内膜でのエリスロポエチン遺伝子を増強させ、エリスロポエチンの過剰な分泌を誘発する。そのために内膜のエリスロポエチン受容体発現部位、腺上皮、脱落膜細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞等に作用してそれらの部位の増殖を促進すると考えられる。これらの結果から腺筋症における異所性子宮腺上皮や基質細胞、平滑筋細胞の増殖は、アロマターゼ遺伝子の局所における高発現が局所のＥ２過産生を誘導し、それにより、子宮内膜のエリスロポエチン遺伝子およびエリスロポエチンの分泌を高める。このエリスロポエチンが子宮内膜のエリスロポエチン受容体を発現している子宮腺上皮、基質細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞の増殖に係わっていることが推測された。実際、内膜症患者の腹水におけるエリスロポエチン含量は正常患者の腹水と比べ、有意に高いことが報告されている（非特許文献１８：Matsuzaki et al., Hum. Reprod., Vol. 18, pp 52-156 (2003)）。近年になって、ＥＥ２の０．０１ｍｇ／ｋｇ体重胎生期曝露マウスにさらに性成熟後（８週齢）にＥＥ２  ０．０１ｍｇ／ｋｇ体重を週２回２０週齢まで投与し、２８週齢で子宮と卵巣を観察したところ、胎生期投与のみと比べて侵襲性の腺筋症の発現頻度と腺ガン様変化の出現頻度が胎生期投与の群よりも有意に高いことを報告した（非特許文献１９：Koike et al., Congenit. Anom., Vol. 53, pp 9-17 (2013)）。
【０００８】
本発明の特徴は高発現しているアロマターゼやＥ２の産生・分泌の阻害を目的とするのではなく、Ｅ２が関与するエリスロポエチンの当該局所における機能を阻止し、腺筋症等の症状を改善することにある。
本発明者らはこれまでにエリスロポエチン抗体、エリスロポエチン受容体蛋白質などのエリスロポエチン拮抗物質が着床後のマウス子宮脱落膜体、マウス胚とそれを取り囲む脱落膜の成長を阻止し、その結果、胚は死か成長停止となる現象はエリスロポエチン抗体やエリスロポエチン受容体蛋白質の投与量と用量効果関係にあることを示した。対照として与えたβ−ガラクトシダーゼ抗体や変性エリスロポエチン受容体蛋白質にはこれらの現象は、起きない（β−ガラクトシダーゼ抗体）か、あるいは統計的に有意に低頻度（変性エリスロポエチン受容体）を示すことを見出している（非特許文献２０：Yasuda et al., Congenit. Anom., Vol. 47, pp 23-23 (2007)）。しかし、これらのエリスロポエチン拮抗物質はいずれも蛋白質であり、エリスロポエチンシグナルの遮断によって増殖性の子宮腺上皮細胞、基質細胞、血管内皮細胞および平滑筋細胞の増殖抑制効果を発現するペプチドなどの低分子化合物等については全く知られていない。
【０００９】
本発明者らの特許文献１（特開平１０−１０１５７４号公報）には、エリスロポエチン拮抗物質を有効成分として含有する、増殖性臓器疾患の治療・改善剤が開示されている。また、特許文献２（特開２００２−３２６９５８号公報）には、エリスロポエチン拮抗物質を有効成分として含有する、肥厚性瘢痕、ケロイドまたは関節炎症性疾患の予防・治療剤が、特許文献３（特開２００３−２０１２５２号公報）には、エリスロポエチンミメティックペプチドを含有してなる増殖性臓器疾患、慢性関節炎症性疾患、肥厚性瘢痕またはケロイド予防・治療剤が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平１０−１０１５７４号公報
【特許文献２】特開２００２−３２６９５８号公報
【特許文献３】特開２００３−２０１２５２号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Krantz S.B., Blood, Vol. 77, pp 419-434 (1991)）
【非特許文献２】Ihle J.N., Nature, Vol. 377, pp 591-594 (1995)）
【非特許文献３】、D’Andrea A. D. et al., Cell, Vol. 57, pp 277-285 (1989)）
【非特許文献４】Wu et al., Cell, Vol. 83, pp 59-67 (1995)）
【非特許文献５】Yasuda et al., Develop. Growth Differ., Vol. 35, pp 711-722 (1993))
【非特許文献６】Marti H. H. et al., Eur. J. Neu. Sci., Vol. 8, pp 666-676 (1996)）
【非特許文献７】Conrad et al., FASEB. J., Vol. 10, pp 760-768 (1996)）
【非特許文献８】Yasuda et al., Congenit. Anom. Vol. 47, pp 22-23 (2007)）
【非特許文献９】Wu et al., Development, Vol. 126, pp 3597-3605 (1999)）
【非特許文献１０】Yu et al., Development, Vol. 129, pp 505-516 (2002)）
【非特許文献１１】Ogilvie et al., J. Biol. Chem., Vol. 275, pp 39754-39761 (2000)）
【非特許文献１２】Yasuda et al., Ital. J. Anat. Embryol., Vol. 106 (supplement 2) pp 215-222 (2001)）
【非特許文献１３】Semenza G. L. and Wang G. U., Mol. Cell. Biol., Vol. 12, pp 5447-5454 (1992)
【非特許文献１４】Bunn H. F. and Poyton R. O., Physiol. Rev., Vol. 76 (1996)）
【非特許文献１５】Yasuda et al., J. Biol. Chem., Vol. 273, pp 25381-25387(1998)）
【非特許文献１６】Yasuda et al., Am. J. Obstet. Gynecol., Vol. 130, pp 506-508 (1978)）
【非特許文献１７】Yasuda et al., Am. J. Obstet. Gynecol., Vol. 159, pp 1246-1250 (1988)）
【非特許文献１８】Matsuzaki et al., Hum. Reprod., Vol. 18, pp 52-156 (2003)）
【非特許文献１９】Koike et al., Congenit. Anom., Vol. 53, pp 9-17 (2013)
【非特許文献２０】Yasuda et al., Congenit. Anom., Vol. 47, pp 23-23 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明はペプチドなどの低分子化合物を有効成分として含有する、女性ホルモン依存性増殖性疾患、例えば、腺筋症、内膜症および前立腺肥大症の治療・改善剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、エリスロポエチン受容体拮抗作用を有する低分子ペプチドが、予想外にも優れた上記増殖組織抑制作用を有することを見出した。本発明は、これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、
（１）エリスロポエチン受容体拮抗作用を有する低分子ペプチドを含有してなる女性ホルモン依存性増殖性疾患治療・改善剤、
（２）エリスロポエチン受容体拮抗作用を有する低分子ペプチドがエリスロポエチンミメティックペプチド（ＥＭＰ）である上記（１）記載の剤、
（３）エリスロポエチン受容体拮抗作用を有する低分子ペプチドがエリスロポエチンミメティックペプチド６、７、９、１２、２２、２３、２４、２５、３３および３９から選ばれる上記（１）記載の剤、
（４）エリスロポエチン受容体拮抗作用を有する低分子ペプチドがエリスロポエチンミメティックペプチド９（ＥＭＰ９）である上記（１）記載の剤、および
（５）女性ホルモン依存性増殖性疾患が腺筋症、内膜症、子宮筋腫または前立腺肥大症である上記（１）〜（４）いずれか１項記載の剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、本発明のエリスロポエチン受容体拮抗作用を有する低分子ペプチド、特に、エリスロポエチンミメティックペプチド、とりわけエリスロポエチンミメティックペプチド９を含有してなる女性ホルモン依存性増殖性疾患治療・改善剤を、女性ホルモン依存性疾患である腺筋症、内膜症、子宮筋腫、前立腺肥大症の増殖性臓器疾患の病巣に直接あるいは静注により投与することにより、これらの疾患を改善あるいは治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】腺筋症組織標本におけるＥｐｏＲタンパク画分の電気泳動図である。
【図２ａ】ＥｐｏＲ発現細胞（腺上皮）とその周辺組織の組織像である。
【図２ｂ】ＥｐｏＲ発現細胞（平滑筋繊維）とその周辺組織の組織像である。
【図３】エストラジオールレセプター（ＥｓｔＲ）α発現細胞を示す組織像である。
【図４】ＥｓｔＲα発現細胞を示す組織像である。
【図５】アロマターゼ発現細胞を示す組織像である。
【図６】アロマターゼ発現細胞を示す組織像である。
【図７】ＥｐｏＲとＥｓｔＲαの共存を示す組織像である。
【図８】ＥｐｏＲとＥｓｔＲαの共存を示す組織像である。
【図９】Ｅｐｏとアロマターゼの共存を示す組織像である。
【図１０】Ｅｐｏとアロマターゼの共存を示す組織像である。
【図１１】腺上皮におけるＳＴＡＴ５とＰＳＴＡＴ５の共発現を示す組織像である。
【図１２】平滑筋細胞におけるＳＴＡＴ５とＰＳＴＡＴ５の共発現を示す組織像である。
【図１３】腺筋症組織における血管の密度を示すグラフである。
【図１４】腺構造の破壊を示す標本組織のＨ・Ｅ染色像である。
【図１５】腺構造の破壊を示す標本組織のＨ・Ｅ染色像である。
【図１６】平滑筋組織の欠損部位が多発している標本組織のＨ・Ｅ染色像である。
【図１７】腺上皮と基質細胞のアポトーシス死を示す標本組織のＴｄＴ反応像である。
【図１８】平滑筋細胞のアポトーシス死を示す標本組織のＴｄＴ反応像である。
【図１９】腺脱落細胞壊死を示す標本組織のＴｄＴ反応像である。
【図２０】ＥＭＰ９処置による血管内皮細胞の局在に関する組織像である。
【図２１】ＥＭＰ９処置による血管内皮細胞の喪失に関する組織像である。
【図２２】腺筋症組織のＥＭＰ９による血管の破壊を示すグラフである。
【図２３】ＥＥＭＰ９処置腺筋腫を示す。
【図２４】図２３の腫瘍の横断切片のホルマザン反応後のものを示す。
【図２５】生食水処置の腺筋種の横断切片ホルマザン反応後のものを示す。
【図２６】移植後未処置の腺筋種を示す。
【図２７】移植材料の移植前と移植後の組織像である。
【図２８】移植後の腺筋腫の組織像である。
【図２９】ＥＭＰ９処置腺筋腫での腺体の変化と平滑筋断裂を示す組織像である。
【図３０】ＥＭＰ９処置による腺体の崩壊を示す組織像である。
【図３１】アロマターゼ染色による生食水処置での腺筋腫を示す組織像である。
【図３２】ＥＭＰ９処置による腺上皮細胞のアポトーシス死を示す組織像である。
【図３３】抗ＦVIII陽性微小血管の分布の組織像を示す。
【図３４】ＥＭＰ９処置による腺筋腫の血管崩壊（ex vivo）を示すグラフである。
【図３５】腺筋症標本におけるＳＴＡＴ５−チロシンリン酸の発現を示す電気泳動図である。
【図３６ａ】腺筋症標本in vitro ＥＭＰ９処置によるＳＴＡＴ５とＰ−ＳＴＡＴ５を示す組織像である。
【図３６ｂ】腺筋症標本in vitroリン酸生食緩衝液処置によるＳＴＡＴ５とＰ−ＳＴＡＴ５を示す組織像である。
【図３７ａ】ＥＭＰ９ ex vivo処置の腺筋腫を示す組織像である。
【図３７ｂ】生食水ex vivo処置の腺筋腫を示す組織像である。
【図３８ａ】ＥＭＰ９ ex vivo処置の腺筋腫を示す組織像である。
【図３８ｂ】図３８ａの腺上皮稀薄部位の拡大像である。
【図３８ｃ】生食水処置の腺筋腫の組織像である。
【図３８ｄ】図３８ｃの矢印部位の強拡大組織像である。
【図３９】前立腺肥大症（ＢＰＨ）組織に発現するＥｐｏＲとＥｓｔＲαの局在を示す組織像である。
【図４０】ＢＰＨの腺上皮におけるＥｐｏＲとＥｓｔＲαの共存を示す標本の組織像である。
【図４１】増殖性の平滑筋細胞を示す組織像である。
【図４２】ＢＰＨ標本におけるＥｐｏＲタンパクの発現を示す電気泳動図である。
【図４３】ＥＭＰ９処置によるＢＰＨの病理組織学的所見を示す組織像である。
【図４４】ＥＭＰ９処置によるＢＰＨ組織血管網の破壊を示す組織像である。
【図４５】ＢＰＨ組織におけるＥＭＰ９処置組織での血管径の異なる血管密度の変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の女性ホルモン依存性増殖性疾患予防・治療剤（以下、「本発明の剤」と略記する）に用いられるエリスロポエチン受容体拮抗作用を有する低分子ペプチドとしては、エリスロポエチンの部分配列と類似したアミノ酸配列を有するペプチドであって、少なくとも５個以上、好ましくは５〜３０個程度特に好ましくは１５〜２５個程度のアミノ酸残基からなる低分子ペプチドなどが用いられる。なかでも、バイオケミストリー(Biochemistry 37, 3699, 1998）に記載されたエリスロポエチンミメティックペプチド（ＥＭＰ）、特に、ＥＭＰ６、ＥＭＰ７、ＥＭＰ９、ＥＭＰ１２、ＥＭＰ２２、ＥＭＰ２３、ＥＭＰ２４、ＥＭＰ２５、ＥＭＰ３３、ＥＭＰ３９が好ましく、そのなかでもＥＭＰ９が特に好ましい。
【００１８】
配列番号１にＥＭＰ９のアミノ酸は配列を示す。本発明の剤で使用するペプチドとしては、好ましくは、アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドなどが用いられる。
配列番号１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドとは、配列番号１で表されるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するペプチドなどが挙げられる。
さらに、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１から７個程度、より好ましくは１から５個程度、さらに好ましくは１から３個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号１で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１から７個程度、より好ましくは１から５個程度、さらに好ましくは１から３個）のアミノ酸が付加または挿入されたアミノ酸配列、配列番号１で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１から７個程度、より好ましくは１から５個程度、さらに好ましくは１から３個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはそれらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するペプチドなども用いられる。
【００１９】
配列番号１の配列は、ペプチド表記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する低分子ペプチドをはじめとするエリスロポエチン受容体拮抗作用を有する低分子ペプチドは、Ｃ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロへキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチル、α−ナフチルメチルなどのＣ６−１２アリールＣ１−２アルキル基のほか、ピバロイルオキシメチルエステルなどが用いられる。
エリスロポエチン受容体拮抗作用を有する低分子ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の低分子ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば、上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、エリスロポエチン受容体拮抗作用を有する低分子ペプチドには、分子内のアミノ酸の側鎖上にある、例えば、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ２、ＳＨなどが適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
【００２０】
配列番号１
Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Ala Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys 
1               5                  10                  15
Pro Gln Gly Gly
20
【００２１】
エリスロポエチン受容体拮抗作用を有する低分子ペプチドは哺乳動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル、ヒトなど）の細胞［例えば、異所性増殖性内膜腺上皮、増殖性内膜基質細胞、増殖性平滑筋細胞、介在する血管内皮細胞など]または血球系の細胞もしくはその培養細胞株などに由来するペプチド、合成ペプチド、組換え型ペプチドの何れであってもよい。
また、ペプチド合成法に準じて製造することもできるし、当該低分子ペプチドをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。
【００２２】
哺乳動物の細胞または組織から製造する方法として、例えば、ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行い、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより単離精製することができる。
【００２３】
ペプチド合成法に準じて製造する方法として、例えば、本発明の剤に含有される低分子ペプチドは、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいはエリスロポエチンを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。
ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによってもよい。すなわち、本発明の剤に含有される低分子ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的の低分子ペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の文献に記載された方法が挙げられる。
M.Bodanszky and M.A.Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)
Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965)
泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（１９７５年）
矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座１、タンパク質の化学IV、２０５、
（１９７７年）
矢島治明監修、続医薬品の開発  第１４巻  ペプチド合成  広川書店
【００２４】
より具体的には、本発明の剤に含有される低分子ペプチドの合成には、通常市販のペプチド合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニルヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とする低分子ペプチドの配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂から低分子ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的の低分子ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、ペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、または、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行った後に樹脂を添加することができる。
【００２５】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。
反応温度は、ペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常−２０℃から５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５から４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することができる。
【００２６】
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃ１−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化、（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナンシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔｅｒｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔｅｒｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル［アルコール（例えば、ペンタクロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、ＨＯＢｔ）とのエステル］などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
【００２７】
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また、液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃から４０℃の温度で行われるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジオチールなどのようなカオチン補足剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記１，２―エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
【００２８】
目的とする低分子ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシル末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いた部分ペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去した部分ペプチドとを製造し、この両部分ペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗低分子ペプチドを得ることができる。この粗分子ペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の低分子ペプチドのアミド体を得ることができる。
低分子ペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシル末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、低分子ペプチドのアミド体と同様にして、所望の低分子ペプチドのエステル体を得ることができる。
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶などを組み合わせて目的の低分子ペプチドを単離精製することができる。上記方法で得られる低分子ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
より具体的には、本発明の剤に含有される低分子ペプチドはBiochemistry 37, 3699, 1998に記載された方法で製造される。
【００２９】
本発明の剤に含有される低分子ペプチドは、腫瘍増殖抑制作用などを有しているので、本発明の剤は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）に対して、腺筋症、内膜症、子宮筋腫および前立腺肥大症の予防・治療剤として有用である。
【００３０】
本発明の剤に含有される低分子ペプチドは、毒性が低く、医薬製剤の製造法で一般的に用いられている自体公知の手段に従って、そのままあるいは薬理学的に許容される担体と混合して、例えば錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、散剤、顆粒剤、カプセル剤、（ソフトカプセルを含む）、液剤、注射剤、坐剤、徐放剤等の医薬製剤として、経口的または非経口的（例、局所、直腸、静脈、点眼投与等）に安全に投与することができる。特に、女性ホルモン依存性疾患である腺筋症、内膜症、子宮筋腫、前立腺肥大症の増殖性臓器疾患の病巣に直接あるいは静注により投与できる剤形が好ましい。
本発明の剤の製造に用いられてもよい薬理学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が挙げられ、例えば固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤および崩壊剤、あるいは液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤および無痛化剤等が挙げられる。さらに必要に応じ、通常の防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、吸着剤、湿潤剤等の添加物を適宜、適量用いることもできる。
賦形剤としては、例えば乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、コーンスターチ、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸等が挙げられる。
滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカ等が挙げられる。
結合剤としては、例えば結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、デンプン、ショ糖、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等が挙げられる。
崩壊剤としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、Ｌ−ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。
溶剤としては、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油等が挙げられる。
溶解補助剤としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。
懸濁化剤としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン、等の界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられる。
等張化剤としては、例えばブドウ糖、Ｄ−ソルビトール、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等が挙げられる。
緩衝剤としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液等が挙げられる。
無痛化剤としては、例えばベンジルアルコール等が挙げられる。
防腐剤としては、例えばパラヒドロキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられる。
抗酸化剤としては、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸、α―トコフェロール等が挙げられる。
【００３１】
本発明の剤において、低分子ペプチドの含有量は、製剤の形態によって相違するが、通常、製剤全体に対して約０．１〜１００重量％、好ましくは約１０〜９９．９重量％、さらに好ましくは約２０〜９９重量％程度である。
本発明の剤において、低分子ペプチド以外の成分の含有量は、製剤の形態によって相違するが、通常、製剤全体に対して約１０〜９９．９重量％、好ましくは約２０〜９０重量％程度である。
本発明の剤の投与量は、低分子ペプチドの種類、投与ルート、症状、患者の年齢などによっても異なるが、例えば、腺筋症を治療する目的で静注など非経口的に投与する場合、１日当たり体重１ｋｇあたり低分子ペプチドとして約０．００５〜５０ｍｇ、好ましくは約０．０５〜１０ｍｇ、さらに好ましくは約０．２〜４ｍｇを１〜３回に分割投与できる。
【００３２】
本発明の剤は、低分子ペプチド以外に、適宜、他の医薬と適量配合して、または適量併用して使用することもできる。
このような併用薬としては、例えば、女性ホルモン依存性増殖の治療に供することのできる種々のホルモン製剤が挙げられる。具体的には、免疫抑制作用の低い医薬、例えば、ＧｎＲＨアゴニスト、抗エストロゲン製剤およびアロマターゼ阻害剤、分泌療法薬（ＬＨ−ＲＨアゴニストおよびアンタゴニスト、性ホルモンアンタゴニスト、性ホルモン合成阻害薬など）などが挙げられる。
また、α１−ブロッカーであるフェントールアミンやアトロピン製剤などの自律神経遮断剤が本発明の剤と併用し得る。
【００３３】
本発明の剤と併用薬との併用に際しては、本発明の剤と併用薬の投与時期は限定されず、本発明の剤と併用薬とを、投与対象に対し、同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。併用薬の投与量は、臨床上用いられている投与量に準ずればよく、投与対象、投与ルート、疾患、組み合わせ等により適宜選択することができる。
本発明の剤と併用薬の投与形態は、特に限定されず、投与時に、本発明の剤と併用薬とが組み合わされていればよい。このような投与形態としては、例えば、（１）本発明の剤と併用薬とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での同時投与、（２）本発明の剤と併用薬とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での時間差をおいての投与、（３）本発明の剤と併用薬とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での時間差をおいての投与（例えば、本発明の剤→併用薬の順序での投与、あるいは逆の順序での投与）などが挙げられる。以下、これらの投与形態をまとめて、本発明の併用剤と略記する。
【００３４】
本発明の併用剤は、毒性が低く、例えば、本発明の剤または（および）上記併用薬を自体公知の方法に従って、薬理学的に許容される担体と混合して医薬組成物とすることができる。
本発明の併用剤の製造に用いられてもよい薬理学的に許容される担体としては、前記した本発明の医薬組成物に使用されるものと同様のものを使用することができる。
本発明の剤および併用薬を同時に製剤化して単剤として使用する場合、本発明の併用剤におけるエリスロポエチン受容体拮抗物質またはそのプロドラッグの含有量は、製剤の形態によって相違するが、通常、製剤全体に対して約０．１〜１００重量％、好ましくは約１０〜９９．９重量％、さらに好ましくは約２０〜９０重量％程度である。
また、本発明の併用剤における併用薬に含有量は、製剤の形態によって相違するが、通常、製剤全体に対して約０．１〜１００重量％、好ましくは約１０〜９９．９重量％、さらに好ましくは約２０〜９０重量％程度である。
本発明の併用剤において、エリスロポエチン受容体拮抗物質またはそのプロドラッグおよび併用薬以外の成分の含有量は、製剤の形態によって相違するが、通常、製剤全体に対して約１０〜９９．９重量％、好ましくは約２０〜９０重量％程度である。
本発明の併用剤におけるエリスロポエチン受容体拮抗物質またはそのプロドラッグとの併用薬との配合比は、投与対象、投与ルート、疾患等により適宜選択することができる。
本発明の併用剤の投与量は、エリスロポエチン受容体拮抗物質またはそのプロドラッグおよび併用薬の種類、投与ルート、症状、患者の年齢などによっても異なるが、例えば、腺筋症を治療する目的で非経口的に投与する場合、１日当たり体重１ｋｇあたりエリスロポエチン受容体拮抗物質またはそのプロドラッグおよび併用薬として約０．００５〜５０ｍｇ、好ましくは約０．０５〜１０ｍｇ、さらに好ましくは約
０．２〜４ｍｇを１〜３回に分割投与できる。
【００３５】
本発明の剤に含有されるエリスロポエチン受容体拮抗物質および併用薬物をそれぞれ別々に製剤化する場合も同様の含有量でよい。
本発明の剤に含有されるエリスロポエチン受容体拮抗物質と併用薬をそれぞれ別々に製剤化して併用投与するに際しては、本発明の剤と併用薬を含有する医薬組成物とを同時期に投与してもよいが、併用薬を含有する医薬組成物を先に投与した後、本発明の剤を投与してもよいし、本発明の剤を先に投与し、その後で併用薬を含有する医薬組成物を投与してもよい。時間差をおいて投与する場合、時間差は投与する有効成分、剤形、投与方法により異なるが、例えば、併用薬を含有する医薬組成物を先に投与する場合、併用薬を含有する医薬組成物を投与した後１分から３日以内、好ましくは１０分〜１日以内、より好ましくは１５分〜１時間以内に本発明の剤を投与する方法が挙げられる。本発明の剤を先に投与する場合、本発明の剤を投与した後、１分〜１日以内、好ましくは１０分〜６時間以内、より好ましくは１５分から１時間に本発明の剤を投与する方法が挙げられる。
【００３６】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸を略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ        ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ      ：相補的デオキシリボ核酸
Ｇｌｙ        ：グリシン
Ａｌａ        ：アラニン
Ｌｅｕ        ：ロイシン
Ｖａｌ        ：バリン
Ｐｒｏ        ：プロリン
Ｓｅｒ        ：セリン
Ｃｙｓ        ：システイン
Ｔｈｒ        ：トレオニン
Ｔｙｒ        ：チロシン
Ｈｉｓ        ：ヒスチジン
Ｔｒｐ        ：トリプトファン
Ｇｌｎ        ：グルタミン
Ｌｙｓ        ：リジン
Ｐｈｅ        ：フェニルアラニン
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３７】
ＥＭＰ９の腺筋症に対する効果
１）標本の採取・処置および検索方法
ａ）採取
充分な説明により同意の得られた患者の切除組織片を用いた。切除後、直ちに組織片をストレプトマイシン・ペニシリン混入Ｄ−ＭＥＭ培養液（Sigma）に移し、実験開始まで冷暗所（８℃）に保存した。標本数は１５症例であった。病巣と非病巣が得られる場合は両者を、非病巣が取れない場合は病巣のみを標本とした。未処置とin vitro処置後の組織片およびex vivoの腺筋腫（ヌードマウスへの腺筋症組織標本移植による腫瘍、以下、腺筋腫と称する）はそれぞれ冷培養液で洗滌後、液体窒素で凍結、またはザンボニ（Zamboni）固定液で固定した。凍結材料は生化学的検索に、固定材料は病理組織学的および免疫組織化学的検索に供した。
【００３８】
ｂ）薬物
エリスロポエチンと類似の赤血球増殖作用を有するペプチドとして合成されたエリスロポエチンミメティックペプチド（Erythropoietin mimetic peptides）の内のＥＭＰ１とＥＭＰ９をペプチド研究所（箕面、大阪）に作製依頼した。ＥＭＰ１はエリスロポエチンと類似の作用を有し、ＥＭＰ９はエリスロポエチン受容体拮抗作用を有する（Johnson D.L. et al., Biochemistry, Vol. 37, pp3699-3710 (1998)）。
【００３９】
ｃ）腺筋症標本への処置（Ｅｐｏ−ＥｐｏＲ情報遮断）方法
i）in vitro実験
器官培養下で処置したＥＭＰ９の１０ｍｇ、５ｍｇまたは１ｍｇ／ｍｌを０．０２５Ｍリン酸緩衝液で溶かし、標本片に直接注入した。さらにエリスロポエチン様作用を誘導するためにＥＭＰ１の、ＥＭＰ９  １０ｍｇ／ｍｌの等価量である０．０６ｍｇ／ｍｌを使用した（Johnson D.L. et al., Biochemistry, Vol. 37, pp3699-3710 (1998)）。対照はリン酸緩衝液を用いた。４症例（３４、４７、４２、４８歳）の標本を用い、切除後１時間から２４時間の標本を５０ｍｇ〜８０ｍｇ大の大きさに切断し、シャーレ内で薬物を０．５μｌ／ｍｇ組織重量の用量で、注射針（ハミルトン３２Ｇ）と注射筒で組織片の異なった部位に注入した。１時間毎の３回注入と４回注入を行った。注入時以外は３７℃、５％ＣＯ２の条件下、シャーレ内で培養液を入れずに反応させた。最終の注入後はＤ−ＭＥＭ培養液を用いたいかだ法により、２４穴培養血（Falcon、３０４７）で培養した。４〜６組織片を１処置として使用した。
【００４０】
ii）ex vivo実験
ヌードマウス（BalbC nu/nu、CLEA）を５週齢で購入し、１週間後に移植に供した。術後標本組織片をゴム板上とシャーレ内で片刃（フェザー剃刀）とハサミで細切した（１ｍｍ〜３ｍｍ）。細切片をよく混和し、培養液で湿潤な状態にした０．１〜０．３ｍｌ量のものを肩甲骨間皮下部位に麻酔下で移植した。術後切除から移植開始に要した時間は３０分から２４時間であった。１症例標本につき３匹から１２匹のマウスを使用した。ヌードマウスはケージ毎に１匹ずつの飼育とした。移植後1週間で薬物をマウスの体表から腫瘍内に注入（ＩＴ）または腹腔内注入
（ＩＰ）した。ＥＭＰ９の１０、５または１ｍｇ／ｍｌ生理的食塩水(生食水、大塚製薬)溶液を投与した。対照としては生食水を用いた。薬物投与後１週間あるいは投与開始後１週間または２週間の時点で、深麻酔下でヌードマウスの背面肩甲骨に切開を入れ、腫瘍の外表観察後、腫瘍を摘出した。腫瘍のマクロ観察下での生死部位判定の為に、１１症例中９症例由来の腫瘍を脳スライサー（NeuroScience Idea、Osaka）で１ｍｍの厚さの横断切片を作製し、切片をホルマザン染色後、マクロ観察を行った。２症例由来の腺筋腫とホルマザン処置後の切片は凍結またはザンボニ液で固定し、生化学的検査と病理組織学的検査に使用した。移植に使用した標本は１１症例で、動物はＩＴが２９匹、ＩＰが３６匹、無処置のもの８匹で総数７３匹を使用した。
【００４１】
ｄ）病理組織学的および免疫組織学的検索方法
ザンボニ液で固定した術後の標本、およびin vitro、ex vivoの系で処置した標本を２５％蔗糖リン酸緩衝溶液で凍結保護した後、凍結し、６〜７μｍの連続凍結切片を作製した。切片は７０〜９８μｍ離れた箇所の切片５枚を１枚のスライドに貼付し、複数枚のスライドを作製した。そのうちの１枚はへマトキシリン・エオジン（Ｈ・Ｅ）染色に、他は免疫染色に使用した。一次抗体は以下のものを使用した。抗Ｎ末ＥｐｏＲ抗体（Yasuda et al., Develop. Growth Differ., Vol. 35, pp711-722 (1993)）、抗Ｅｐｏ抗体（Ｒ＆Ｄ社）、抗エストロゲンレセプター（Estrogen receptor、ＥｓｔＲ）−α抗体（Santa Cruz社）、抗アロマターゼ（Aromatase、Ａｒｏｍ）抗体（abcam社）、抗VIII因子（ＦVIII）抗体（DAKO社）、抗ＰＣＮＡ抗体（Santa Cruz社）、抗ＳＴＡＴ５抗体と抗Ｐ−ＳＴＡＴ５ａ／ｂ抗体（Santa Cruz社）、抗Ｆ４／８０抗体（Serotec社）、抗ＣＤ１６３抗体（Santa Cruz社）を用いて反応させ、それぞれの２次抗体で処理し、ＤＡＢ反応により発色あるいは蛍光二次抗体を用いて蛍光発光させ、観察に供した。
【００４２】
ｅ）生化学的検索方法
i）量的ＲＴ−ＰＣＲ法による転写の検索
イ）Ｅｐｏ ｍＲＮＡ、ロ）ＥｐｏＲ ｍＲＮＡ、ハ）アロマターゼｍＲＮＡ、ニ）平滑筋−ミオシン（myosin）ｍＲＮＡ（ＭＹＨ−１１ ｍＲＮＡ）、ホ）エストラジオールレセプター（Estradiol-receptor）α ｍＲＮＡの発現量を、それぞれの組織標本の１８ＳｒＲＮＡ ｍＲＮＡの発現量の比として算出した。各組織片から全ＲＮＡをトリゾール（Trizol、Gibco BRL）液を用いて抽出し、ＡＭＶ−逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを作成し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００（Applied Biosystems）でQuantitative PCR Supermix-UDG（Invitrogen）を用いて、ＰＣＲ反応を行った。Ｅｐｏ、ＥｐｏＲ、アロマターゼ、Ｓｍ−ミオシン（ＭＹＨ １１）、エストラジオールレセプター−α、１８ＳｒＲＮＡ等のプライマーやプローブはApplied BiosystemのAssay-on Demand Gene Expressionによる製品とTaq Man Ribosomal RNA control試薬を用いた。それぞれのｃＤＮＡの１０倍希釈プラスミッド液を用いて、それぞれの標準曲線を求めた。ＰＣＲの反応は、変性を５０℃ ２分と９５℃ １０分、アニーリングを９５℃で４０サイクル１５分、伸長を６０℃ １分で行った。それぞれのデータは少なくとも３回の独立した実験で得たものによった。
【００４３】
ii）ウエスタンブロット法によるＥｐｏＲの証明
凍結組織片をポリトロン（Polytron）で粉砕し、公知の方法で可溶化緩衝液を用いてタンパク画分を抽出した（Yasuda et al., 2003）。膜成分画分を分離した後、各標本より抽出した膜画分のタンパク量１００μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動を行い、ＰＶＤＶ膜に移した。抗ＥｐｏＲ抗体（Ｃ−２０、Santa Cruz ０．１μｍｌ）または抗Ｎ末ＥｐｏＲ抗体；（１：１００；Yasuda et al., Develop. Growth Differ., Vol.35, pp711-722 (1993)）を用いて免疫反応させ、２次抗体と化学発光（Amersham Bioscience）を用いて可視化した。
【００４４】
iii）エストロゲン含有量の測定
凍結組織片を、２５ｍＭリン酸緩衝液を用いてポリトロンで粉砕し、組織上清中のエストラジオール１７βをＥＣＬＩＡ（電気化学発光免疫測定法）による方法で測定した。それぞれの上澄のタンパク含量はウシアルブミンを標準としてタンパク定量キット（Bio Rad）を用いて測定した。
【００４５】
２）結果
ａ）腺筋症組織におけるエリスロポエチン情報伝達系とエストロゲン反応系の発現
i）腺筋症標本におけるＥｐｏＲタンパクの発現
図１にタンパク画分の電気泳動図を示す。陽性対照としてＰＣ−３細胞株膜画分を示した。図１に示すごとく、６５ｋＤａの大きさのＥｐｏＲタンパクの存在が全ての検査標本で認められた。図中、アルファベットは患者識別、数字は年齢を示す。ＰＣ−３は前立腺癌細胞株（Yasuda et al., Carcinogenesis, 24;1021-1029, 2003）である。
【００４６】
ii）ＥｐｏＲ、ＥｓｔＲαおよびアロマターゼの発現部位
Ｅｐｏは分泌型のタンパクなので、通常の免疫染色の局在は必ずしもＥｐｏタンパクのみを証明することにならないので、Ｅｐｏ応答部位としてＥｐｏＲのタンパク局在部位として証明した。それぞれの組織におけるＥｐｏＲの発現部位とＥｓｔＲαおよびアロマターゼの発現部位、ならびに共存タンパク部位（Merge）を図２〜図１２に示す。
【００４７】
図２ａは、ＥｐｏＲ発現細胞（腺上皮）とその周辺の組織を示す。腺上皮細胞（大きい矢印）、血管内皮細胞（小さい矢印）、基質細胞（矢尻）に陽性反応が認められる。目盛棒は５０μｍを示す。
図２ｂは、ＥｐｏＲ発現細胞（平滑筋繊維）とその周辺の組織を示す。平滑筋細胞（大きい矢印）、血管周辺部（小さい矢印）に陽性反応が認められる。目盛棒は５０μｍを示す。
図３は、ＥｓｔＲα発現細胞を示す。腺上皮細胞（矢尻）、血管内皮細胞（小さい矢印）、平滑筋線維（大きい矢印）に陽性反応が認められる。目盛棒は５０μｍを示す。
図４は、ＥｓｔＲα発現細胞を示す。中膜平滑筋線維（大きい矢印）、血管内皮細胞（小さい矢印）に陽性反応が認められる。目盛棒は５０μｍを示す。
図５は、アロマターゼ発現細胞を示す。腺上皮細胞（大きい矢印）、平滑筋線維（小さい矢印）、基質細胞（矢尻）、脱落細胞（二重矢印）に陽性反応が認められる。目盛棒は５０μｍを示す。
図６は、アロマターゼ発現細胞を示す。平滑筋線維（大きい矢印）、基質細胞（矢尻）に陽性反応が認められる。目盛棒は５０μｍを示す。
図７は、ＥｐｏＲとＥｓｔＲαの共存（Ｍｒ）を示す。腺上皮細胞（矢印）に顕著に発現している。目盛棒は５０μｍを示す。
図８は、ＥｐｏＲとＥｓｔＲαの共存（Ｙｋ）を示す。腺上皮細胞（矢印）、基質細胞（星印）に顕著に発現している。目盛棒は５０μｍを示す。
図９は、Ｅｐｏとアロマターゼの共存（Ｍｒ）を示す。腺上皮細胞（矢印）に顕著に発現している。目盛棒は１０μｍを示す。
図１０は、Ｅｐｏとアロマターゼの共存（Ｍｒ）を示す。平滑筋線維（矢印）、腺上皮細胞（二重矢印）に顕著に発現している。目盛棒は１０μｍを示す。
図１１は、腺上皮におけるＳＴＡＴ５とＰＳＴＡＴ５の共発現（Ｉｚ）を示す。腺上皮細胞（矢印）に顕著に発現している。目盛棒は５０μｍを示す。
図１２は、平滑筋細胞におけるＳＴＡＴ５とＰＳＴＡＴ５の共発現（Ｉｚ）を示す。平滑筋細胞（矢印）に顕著に発現している。目盛棒は５０μｍを示す。
【００４８】
iii）腺筋症切除標本における各種ｍＲＮＡの発現量
表１に腺筋症における種々のｍＲＮＡの発現量を示す。
腺筋症標本でのＥｐｏ ｍＲＮＡとＳｍ−ミオシンｍＲＮＡの発現量は正常内膜におけるよりも、有意に高値を示した（Ｐ＜０．００１）。アロマターゼｍＲＮＡの発現量は正常内膜よりも高値を示したが、有意差は認められなかった。反対にＥｐｏＲ ｍＲＮＡの発現量は腺筋症での発現量が正常内膜より有意に低値を示した（Ｐ＜０．００１）。
【表１】
0005867949.tif 000002
【００４９】
iv）腺筋症、筋腫および正常内膜標本におけるＥ２の含有量
表２に、子宮内膜病変におけるＥ２の含有量を示す。
腺筋症組織でのＥ２の組織内含有量は筋腫や正常内膜の組織と比べ高く、正常内膜との間に有意差を示した（Ｐ＜０．０５）。
【表２】
0005867949.tif 000003
【００５０】
v）腺筋症における血管の分布
腺筋症組織標本における血管分布密度を見る目的で、図１３のグラフに標本切片内の一定区域の血管数を腺上皮周辺、平滑筋部位およびそれらの合計した血管数を示した。血管密度は症例によって有意差を示す程差異があった。また、１２症例中１０症例において腺病巣部域の方が平滑筋部域よりも多数の血管を有していた（ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．００１）。
【００５１】
vi）腺筋症の性状のまとめ
腺筋症では正常子宮内膜の組織と比べて、特にＥｐｏ ｍＲＮＡの発現が有意に高く、全症例においてＥｐｏＲタンパクが発現していることが明らかとなった。また、このＥｐｏＲ発現局所、すなわち、Ｅｐｏ応答部位にはＥｓｔＲαも共存し、さらにアロマターゼタンパクも共存している。Ｅ２の含有量も高い。これらのことは血液中より運搬されて来るテストステロンやアンドロステンダイオン結合タンパクが局所のアロマターゼでエストロゲンに変換され、このエストロゲンがＥｐｏ産生をin situで増強し、ＥｐｏＲを介してＳＴＡＴ５−ＰＳＴＡＴ５の経路が腺上皮細胞、基質細胞、平滑筋細胞で情報伝達を増強し、それらの細胞の増殖が誘導されていることを示している。
【００５２】
ｂ）腺筋症のＥＭＰ９処置による増殖性組織崩壊の誘導
ｂ−１．in vitro実験
i）in vitroにおけるＥＭＰ９処置の病理組織変化
ＥＭＰ９直接注入による腺筋症組織における病理変化を図１４〜図１９に示す。
図１４は腺構造の破壊を示すＨｒ（ＥＭＰ９  １５．０）標本組織のＨ・Ｅ染色像である。腺体の破壊（大きい矢印、破壊程度＋３とした）、基質細胞の壊死（小さい矢印）、基質細胞の融解（＊印）および平滑筋細胞組織の欠損（無核・死＊＊）が認められる。目盛棒は５０μｍを示す。
図１５は腺構造の破壊を示すＨｒ（ＥＭＰ９  ７．５）標本組織のＨ・Ｅ染色像である。腺上皮細胞の腺腔内への脱落（＊）、上皮の扁平化および嚢胞化（＊）、上皮の喪失した嚢胞（＊＊）が認められ、基質細胞の壊死（小さい矢印）と希釈化が認められる。目盛棒は５０μｍを示す。
図１６は平滑筋組織の欠損部位が多発しているＭｈ（ＥＭＰ９  ２０．０）標本組織のＨ・Ｅ染色像である。欠損部を矢印で示してある。目盛棒は５０μｍを示す。
図１７は腺上皮と基質細胞のアポトーシス死を示すＨｒ（ＥＭＰ９  １５．０）標本組織のＴｄＴ反応像である。矢印は陽性反応を示す核、矢尻は染色質濃縮、二重矢印は壊死像を示す。目盛棒は１０μｍを示す。
図１８は平滑筋細胞のアポトーシス死を示すＭｈ（ＥＭＰ９  ２０．０）標本組織のＴｄＴ反応像である。矢印は陽性反応を示す核である。目盛棒は１０μｍを示す。
図１９は腺脱落細胞壊死を示すＨｒ（緩衝液）標本組織のＴｄＴ反応像である。矢印はアポトーシス死、二重矢印は壊死を示し、目盛棒は１０μｍを示す。
【００５３】
すなわち、ＥＭＰ９直接注入による腺筋症組織では、腺体構造の破壊（図１４、図１５）、平滑筋細胞の無核像や、断裂、欠損部位の多発（図１６）、基質細胞の変性・アポトーシス死・壊死（図１７）と血管内皮細胞の破綻と血管中膜平滑筋細胞変性が認められた。これらの細胞変性・死はアポトーシス死を示した（図１７、１８）。対照群の脱落した腺上皮細胞はアポトーシス死でなく壊死で、基質細胞にアポトーシス死を認めた（図１９）。また、処置群と比べ、細胞死は少ない。これらの病理所見のうち、腺上皮増殖部における腺体および平滑筋部における平滑筋の破壊の程度と頻度を表３にまとめた。
【００５４】
【表３】
0005867949.tif 000004
【００５５】
腺体破壊の程度の高いものの頻度は緩衝液や針注入、無処置のものにも認められたが、その誘因がアポトーシス死か壊死かの差はこの分析では明らかに出来ない。そこで、崩壊像が０のものの頻度をＥＭＰ９処置群と対照群との間で比べた。
表３に示すごとく、ＥＭＰ９処置群では対照群と比べて有意に腺体正常像の頻度は少なかった（Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．００１）。一方、ＥＭＰ１処置群は有意に正常像の頻度が高かった（Ｐ＜０．００１）。平滑筋細胞への障害は一定区画での有核平滑筋細胞の占める面積が２０％以上のものはＥＭＰ９処置群で緩衝液処置と比べ有意に少ない（Ｐ＜０．００１、Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．０５）のが２症例（ＩｇとＹｈ）で認められ、反対にＥＭＰ１処置群では有意に多い（Ｐ＜０．００１、Ｐ＜０．０１）のを認めた。無核の平滑筋領域に白血球侵入を認めるものの頻度はＥＭＰ９処置群において緩衝液処置群と比べて有意に高い（Ｐ＜０．００１、Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．０５）のが３症例で認められた（Ｉｇ、Ｙｈ、Ｍｈ）。無核の平滑筋細胞のみは１症例において、ＥＭＰ９処置群が緩衝液処置群よりも頻度が高かった（Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．０５）。ＥＭＰ９は腺体を崩壊し、平滑筋細胞をも死に至らしめ、腺筋症の増殖を阻害し、全体を破壊することが示唆された。
【００５６】
ii）ＥＭＰ９処置による血管の破壊
図２０〜図２１にＥＭＰ９処置による血管破壊を示す組織像である。
図２０はＥＭＰ９処置による血管内皮細胞の局在に関する組織像で、ａは基質細胞部の局在、ｂは平滑筋細胞部の局在を示す。目盛棒は１０μｍを示す。
図２１はＥＭＰ９処置による血管内皮細胞の喪失に関する組織像で、矢印は血管内皮細胞の欠損した血管を示す。目盛棒は１０μｍを示す。
図２２は、腺筋症組織のＥＭＰ９による血管の破壊を示すグラフである。
【００５７】
すなわち、一定区画面積内の血管数は腺周辺部と平滑筋部では前者が後者より多く（図２０）、ＥＭＰ９処置群では内皮細胞の破壊が認められ（図２１）、また対照群と比べ、血管数が有意に減少していた（図２２）。全血管数はＥＭＰ９処置群において対照群と比べて有意に減少していた（Ｐ＜０．００１）。同濃度のＥＭＰ９処置では投与回数の多い方が有意な減少を示した（Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．００１）。またＥＭＰ９の等量濃度のＥＭＰ１処置ではＥＭＰ９と比べて有意に血管数が多かった（Ｐ＜０．００１）。腺病巣域にある血管数は、全症例において、ＥＭＰ９処置群での血管数は対照群と比べて有意に低値を示した（Ｐ＜０．００１）。平滑筋増殖域では３症例中１症例において、ＥＭＰ９総量１０および２０μｇ／ｍｇ組織重量処置群では対照群に比べ有意に減少していた（Ｐ＜０．００１）。これらの結果からＥＭＰ９は腺筋症の血管崩壊を誘導し、しかも腺増殖病巣では平滑筋増殖域よりも崩壊効果が高いことが認められた。
【００５８】
iii）in vitroにおけるＥＭＰ９処置による腺筋症組織の生化学的分析
表４に、ＥＭＰ９またはＥＭＰ１処置腺筋症組織標本における各種ｍＲＮＡの発現量の変化（in vitro）を示す。表４の価は、個々の処置標本におけるＥｐｏ ｍＲＮＡ、ＥｐｏＲ ｍＲＮＡ、アロマターゼｍＲＮＡおよびＳｍ−ミオシンｍＲＮＡの発現量をそれぞれの１８Ｓ−ｒＲＮＡ ｍＲＮＡの発現量の比として示したものである。
【表４】
0005867949.tif 000005
【００５９】
Ｅｐｏ ｍＲＮＡの発現量はＨｒとＹｈ、Ｍｈにおいて無処置、ＰＢＳ処置と比べ、有意差は示さなかったが、減少している。また、ＥＭＰ１処置はＥＭＰ９と比べ有意に上昇を示した（Ｐ＜０．０５）。ＥｐｏＲ ｍＲＮＡの発現量は、ＥＭＰ９処置群では緩衝液処置群と比べ有意差を示さなかったが、３症例で低下、１症例で同等の値を示した。アロマターゼｍＲＮＡ発現量についてはＥＭＰ９処置群の１症例については針挿入や緩衝液処置群と比べて有意に低下を示した（Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１）。２症例で低下を示した。Ｓｍ−ミオシンｍＲＮＡの発現量はＥＭＰ９処置群では２症例において緩衝液処置群と比べ有意に低下を示した（Ｉｇ、Ｍｈ）（Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．００１）、他の２症例ではＥＭＰ９低濃度処置群との間に有意に低下（Ｈｒ）（Ｐ＜０．０１）か、有意差はないが低下（Ｙｈ）を示した。４種のｍＲＮＡの発現量については、ＥＭＰ９処置により対照群と比べて、アロマターゼやＳｍ−ミオシンのｍＲＮＡは有意差をもって低下するのが認められた。Ｅｐｏ ｍＲＮＡについては、全症例で対照と比べ低下していた。Ｅｐｏ ｍＲＮＡは増殖性腺病巣部に強く発現する。従って個々の標本には症例毎のまた同一症例においても腺病巣の混入の程度すなわち組織構成に差異がある可能性をもつので、有意差を示さなかったものと考えられる。
【００６０】
表５にＥＭＰ９処置による腺筋症組織片内のＥ２の含有量を示す。表５に示すごとく、ＥＭＰ９に対して用量効果的にＥ２含有量の低下を示した。有意差は示さなかったが、対照群と比べても低値を示した。また、ＥＭＰ１の処置では対照と比べて高値を示した。
【表５】
0005867949.tif 000006
【００６１】
iv）in vitro処置のまとめ
表３〜表５および図１４〜図２２に示した所見から、腺筋症組織はＥＭＰ９の局所注入によって、増殖性腺上皮，平滑筋組織の崩壊と血管系の破壊により病巣が破壊することが推測される。さらに生化学的分析の所見はこれらの病理組織の結果を裏付けている。
【００６２】
ｂ−２．ex vivo実験
ｉ）ex vivoにおける腺筋腫のＥＭＰ９による組織崩壊の誘導
ヌードマウスにおける腺筋腫
図２３〜図２６にヌードマウスの腺筋種標本を示す。
図２３はＭｒ４．０処置の腺筋腫で、矢印は、腋窩動脈からの枝の腫瘍栄養動脈である。
図２４は図２３の腫瘍の横断切片のホルマザン反応後のものを示し、赤色部が陽性で生存を示す。
図２５はＭｒ生食水処置の腺筋腫の横断切片ホルマザン反応後のものを示す。
図２６はＭｒ移植後未処置の腺筋腫を示す。細片移植から１５日後のものである。
【００６３】
すなわち、移植ヌードマウスを深麻酔下で屠殺し、切開後、腫瘍の観察を行ったところ、図２３に示すような腫瘍を全ての宿主で認めた。摘出腫瘍の１ｍｍ切片のホルマザン染色マクロ標本を画像に取り込み、画像上で図２４、図２５、図２６に示すように、赤色の生存部と白色の非生存部の占める面積を画像上での方眼記入により計算し、それぞれの部域全体に対する率として表した。その結果を、下記の表６に示す。
染色後の標本はザンボニ液で固定するか、あるいは液体窒素で凍結してそれぞれ病理組織学的および生化学的解析に供した。
【００６４】
ii）ＥＭＰ９の腫瘍内注入または腹腔内注入による腺筋腫の生存抑制
表６にＥＭＰ９処置によるヌードマウス移植腺筋腫の生存抑制（マクロ観察）の観察結果を示す。表６から明らかなごとく、ＩＰの高濃度（４．０ｍｇ／匹）投与群４例のうち３例において、生食水投与群または無投与群と比べて、腺筋腫生存部が有意に低値を示した（Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１）。反対に、Ｅ２投与群では腺筋腫の生存部はＥＭＰ９および生食投与群の生存部と比べて、有意に高値を示した（Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．００１）。Ｅ２の局所増強により、局所のＥｐｏ誘導による生存部の増加を示唆する。一方、ＩＴでは４例全てにＥＭＰ９の用量効果的に生存部は低値を示したが、有意差は認められなかった。生食投与群の２例の腺筋腫の生存部は、ＥＭＰ９投与群より高値か、同値を示した。無投与群の２例は２例共にＥＭＰ９投与群と比べ高値を示した。
留意すべきことは、細切片の混合物を移植したため、腺筋腫形成に当たっては同一患者の標本であっても増殖性腺病巣の混合の差によって腫瘍の形態に差異が生ずることである。そのことは欠損部の大きさに反映されていると考えられる。ＥＭＰ９処置群の腫瘍は対照群と比べて、欠損部が必ずしも大きくない。欠損部の大きさはＥＭＰ９処置との関連性が明確でない（Ｉｚ、Ｓｓ、Ｍｇ、Ｍｒ）。ただし、Ｅ２投与群では欠損部は無処置群と比べて小さい。すなわち、Ｅ２による生存力増強が、細片組織間の結合を強固にしたと考えられる。
結論として、マクロ的検索方法でＥＭＰ９高濃度腹腔内処置は腺筋腫の生存を抑制することが明らかとなった。
【００６５】
【表６】
0005867949.tif 000007
【００６６】
iii）ＥＭＰ９処置による腺筋症の病理組織変化
移植材料は標本の細切組織であるため均一でないが、腺筋症の特性である腺組織と平滑筋組織とで構成する腫瘍を得た。
移植材料の標本とその腺筋腫の組織像を図２７に、また、移植後の組織像を図２８〜図３２に示す。
図２７は移植前の組織像を示し、ａは移植前の組織、ｂ、ｃは腺筋腫の組織像で、ａにおける矢印は基質細胞に囲まれた腺体、二重矢印は平滑筋を示す（Ｉｚ）。ｂでは生食水処置の腺体（矢印）と平滑筋部（二重矢印）が認められ、ｃでは崩壊している腺体（矢印）、無核および欠損部（＊）が認められる。目盛棒は２０μｍを示す。
図２８は移植後の腺筋腫の腺上皮（Ｔｂ）を示す組織像で、ａは腺上皮（矢印）の増殖像、ｂ〜ｄは、各々、ＥｐｏＲ陽性、アロマターゼ陽性、Ｓｍ−ミオシン陽性の平滑筋線維の局在と腺体（＊）を示す像である。目盛棒は２０μｍを示す。
図２９はＥＭＰ９処置腺筋腫での腺体の変化と平滑筋断裂（Ｈｒｔ）を示す組織像である。ａはＥｐｏＲ陽性の上皮細胞を有する退行変性を示す嚢胞（矢印）と隣接する嚢胞（＊）、ｂはＥｐｏＲ陽性を示す脱落上皮細胞で嚢胞化を示す。ｃは対照群に認められる嚢胞化（矢印）と嚢胞（＊）を示す。ｄはａ、ｂと同一標本の平滑筋部位で、欠損部（＊）と血球の侵入を示す。
目盛棒は２０μmを示す。
図３０はＥＭＰ９処置による腺体の崩壊（Ｍｕｒ）を示す組織像である。ａ、ｂはＥＭＰ処置腺筋腫での退行変性化している腺体を示す像である。ｃ、ｄはそれぞれの腺体のアロマターゼ染色像で、アロマターゼの消失部が上皮崩壊部に認められる（小さい矢印）。目盛棒は２０μmを示す。
図３１はアロマターゼ染色による生食水処置での腺筋腫（Ｍｒ）を示す組織像である。ａは腺体の嚢胞化（矢印）を示す像、ｂはａの強拡大像で、アロマターゼの局在（小さい矢印）を示す。目盛棒は２０μmを示す。
図３２はＥＭＰ９処置による腺上皮細胞のアポトーシス死（Ｍｒ）を示す組織像である。ａはアポトーシスを示す腺上皮細胞（矢印、ＴｄＴ反応）、ｂは生食水処置のアポトーシス死を示さない腺上皮（矢印、ＴｄＴ反応）を示す像である。目盛棒は２０μmを示す。
【００６７】
すなわち、移植前の組織では腺体は単層立法上皮で周辺を基質細胞が取り囲み、平滑筋組織も存在する（図２７ａ）。腺筋腫では生食水処置では腺上皮の増殖と基質細胞に囲まれ平滑筋組織の混在した形態を示した（図２７ｂ）。ＥＭＰ９処置では腺上皮の脱落および細胞死を認め、周辺組織の欠損を認めた（図２７ｃ）。移植後、無処置の腺筋腫（図２８ａ）の免疫染色では、腺組織と周辺の基質細胞にＥｐｏＲ陽性反応（図２８ｂ）を認め、腺上皮はアロマターゼ陽性反応（図２８ｃ）を示し、Ｓｍ−ミオシン陽性の平滑筋線維の局在（図２８ｄ）を認めた。
ＥＭＰ９処置により腺上皮の脱落を有する腺体（図２９ａ、ｂ）をその脱落度において、退行変性（図２９ａ）、嚢胞化（図２９ｂ）および嚢胞（図２９ａ）へと進行するのを認めた。この変化はin vitroの処置で認めた像と類似する（図１５）。さらに平滑筋部位の無核化、組織欠損、単核細胞侵入（図２９ｄ）が認められた。生食水処置においても、嚢胞化（図２９ｃ）や嚢胞（図２９ｃ）が認められた。
ＥＭＰ９処置での退行変性を示す上皮細胞ではアロマターゼ陽性反応細胞が消失していた（図３０ａ、ｂ、ｃ、ｄ）。生食水処置で認めた嚢胞の（図３１ａ）薄い扁平化した腺上皮細胞はアロマターゼ陽性（図３１ｂ）を示した。この様な場合は正常腺とした。また、脱落する腺上皮細胞はＥＭＰ９処置でアポトーシス死が顕著であったが生食水処置では異なった（図３２ａ、ｂ）。これらの組織所見を個々の腺筋腫において検査したものを表７にまとめた。
【００６８】
【表７】
0005867949.tif 000008
【００６９】
表７に示すごとく、ＥＭＰ９処置では正常腺体の存在は生食水処置や無処置の腺筋腫と比べて全腺筋腫例で少なく、４例においては生食水処置と比べて有意に（Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１、Ｈｔ、Ｔｂ、Ｋｇ、Ｍｒ）少なかった。反対にこれらの腫瘍では腺体の嚢胞化（Ｐ＜０．００１、Ｐ＜０．０１、Ｓｓ、Ｋｇ、Ｍｒ）や嚢胞形成（Ｐ＜０．００１、Ｐ＜０．０１、Ｈｔ、Ｓｓ、Ｋｗ）が有意に高くなっている。退行性腺体はＥＭＰ９処置で有意に多く認められた（Ｐ＜０．０１、Ｍｇ）。一方、無核化した平滑筋領域の宿主の単核細胞（マクロファージや好中球）の侵入による除去は１例（Ｋｗ）を除いてＥＭＰ９処置群で生食処置群と比べて有意に多く認められた（Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．００１、Ｈｔ、Ｉｚ、Ｓｓ、Ｍｇ、Ｋｇ、Ｍｒ）。これらの現象から、ＥＭＰ９処置はＥｐｏやアロマターゼ活性のある腺体を退行変性化し、さらにこれらのタンパク活性の喪失した嚢胞への変化を誘導することが示された。この腺体の嚢胞化や平滑筋の欠損はin vitroにおけるＥＭＰ９処置で認めた変化と類似している。ex vivoでは、さらに宿主の貧食細胞による無核化平滑筋除去の促進が加わり、腺筋腫の消失が予測される。
【００７０】
iv）ＥＭＰ９処置による腺筋腫の血管破壊
腺筋腫での微小血管数を算出した。
図３３に抗ＦVIII陽性微小血管の分布（Ｈｔ）の組織像を示す。ａはＥＭＰ９処置による腺筋腫の血管内皮の消失した血管（矢印）、ｂは生食水処置による腺筋腫の血管（矢印）の像を示す。目盛棒は２０μmである。
図３４は、ＥＭＰ９処置による腺筋腫の血管崩壊（ex vivo）を示すグラフである。
図３３ａ、ｂで示した様にＥＭＰ９処置の腺筋腫における血管内皮細胞は崩壊して抗ＦVIII抗体で陽性反応を示さない（図３３ａ）が、対照の生食水処置では陽性反応を示す血管が多く認められた（図３３ｂ）。それぞれの腺筋腫における血管数は図３４のとおりである。
観察した全例において無処置および生食水処置の腺筋腫の血管分布数と比べて、ＥＭＰ９処置群の血管数は有意に減少していた（Ｐ＜０．００１、Ｐ＜０．０１）。また２例において血管崩壊に対するＥＭＰ９の用量効果関係の存在することを認めた。
ｖ）ＥＭＰ９処置による腺筋腫における生化学的分析
４種のｍＲＮＡの発現量の変化を調べ、その結果を表８にまとめた。
【００７１】
【表８】
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【００７２】
表８に示すごとく、Ｅｐｏ ｍＲＮＡについては１例（Ｍｇ）の発現量が生食水処置群と比べて有意に低下（Ｐ＜０．００１）を示し、他の３例（Ｈｔ、Ｋｗ、Ｋｇ）は反対に有意に高値を示す（Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．００１）かあるいは殆ど変化を示さなかった。ＥｐｏＲ ｍＲＮＡについては２例（Ｍｇ、Ｙｋ）において、生食水処置と比べて有意に減少（Ｐ＜０．０５）を示したが、反対に１例（Ｄｃ）では生食水処置の方が有意に低値を示した（Ｐ＜０．００１）。アロマターゼｍＲＮＡについては、２例（Ｍｒ、Ｄｃ）において生食水処置の方が有意に低値（Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１）を示した。Ｓｍ−ミオシンｍＲＮＡについては、１例（Ｍｇ）において生食水処置と比べ有意に低値（Ｐ＜０．００１）を示した他は２例（Ｋｇ、Ｄｃ）において反対に生食水処置の方が有意に高値（Ｐ＜０．００１）を示した。これらからアロマターゼを除いてＥＭＰ９処置群の内の１４．３〜２８．６％がそれぞれのｍＲＮＡ発現量の有意な低下を示した。また、腺筋症標本内のＥｐｏＲ ｍＲＮＡは正常子宮内膜のＥｐｏＲ ｍＲＮＡより有意に低値を示した（表１）ことを考慮すると、ＥＭＰ９処置により正常に近い状態に誘導されたことが示唆される。
【００７３】
vi）ex vivo処置のまとめ
腺筋症標本の組織材料の細切片を移植して作成した腺筋腫は、腺筋症と同様に腺を形成し、平滑筋組織を交えた腫瘍となった。ＥＭＰ９処置により、腺上皮細胞のアポトーシス死による腺の退行変性、嚢胞化が誘導され、腺体はＥｐｏＲやアロマターゼ活性のない嚢胞となる。さらに平滑筋細胞の無核化が起こり、これらの組織は宿主のマクロファージや好中球による排除が誘導され、崩壊した腺腫の吸収・消失へと誘導されることが示唆される病理所見を得た。腺体の嚢胞化および嚢胞への変化はin vitroにおけるＥＭＰ９の腺筋症標本への直接の処置においても認められた。したがった、ヒト生体における腺筋症に対してＥＭＰ９処置はその崩壊と治癒を誘導する効果があると判断される。
【００７４】
ｂ−３．ＥＭＰ９処置によって誘導されたＥｐｏ−ＥｐｏＲ情報伝達遮断によるin vitroおよびex vivoにおける病巣の崩壊
ｉ）腺筋症標本におけるＳＴＡＴ５−チロシンリン酸の発現
腺筋症５標本においてＳＴＡＴ５のチロシンリン酸化を証明するためにＳＴＡＴ５の免疫沈降とＰ−Ｔｙｒのウエスタンブロット法を行った。
図３５は腺筋症標本におけるＳＴＡＴ５−チロシンリン酸の発現を示す電気泳動図である。
図３５に示す様に１症例（Ｋｇ）を除いてＳＴＡＴ５タンパクのバンドを発現し、かつそのうちの１例（Ｄｇ）にチロシンリン酸（Ｐ−Ｔｙｒ）の発現を認めた。この結果は使用した症例の標本に腺体を含む割合が少ないか、あるいは保存中に弱められ非常に情報量が少ないために、陽性反応を得るのが難しいことを示唆するが、ＥｐｏＲタンパクの発現（図１）とその発現部位にＳＴＡＴ５とＰ−ＳＴＡＴ５が共発現していた（図１１、１２）事象から、腺筋症はＥｐｏ−ＥｐｏＲ情報伝達の制御を受けていることが明らかとなる。
【００７５】
ii）腺筋腫におけるＳＴＡＴ５−ＰＳＴＡＴ５の発現
腺筋腫は各腫瘍の大きさが生化学的にＳＴＡＴ５免疫沈降を行うに充分なタンパク抽出が出来なかったので、免疫組織化学的に検索した。
図３６〜図３８にその結果の組織像を示す。
図３６ａは、腺筋症標本in vitro ＥＭＰ９処置（Ｉｇ、総量１．５ｍｇ）によるＳＴＡＴ５とＰ−ＳＴＡＴ５を示す組織像である。この処置例では、共発現を呈さない腺上皮の破壊（矢印）と基質細胞の破壊（＊）が認められる。目盛棒は５０μｍを示す。
図３６ｂは、腺筋症標本in vitroリン酸生食緩衝液処置（Ｉｇ、ＰＢＳ）によるＳＴＡＴ５とＰ−ＳＴＡＴ５を示す組織像である。この処置例では、共発現を示す腺上皮（矢印）や基質細胞（二重矢印）が認められる。目盛棒は５０μｍを示す。
図３７ａは、ＥＭＰ９ ex vivo処置（ＩＴ）の腺筋腫を示す組織像で、破壊部ではＰ−ＳＴＡＴ５は発現しないか低発現である。ＥＭＰ９投与（ＳＳ、総量０．４５ｍｇ）例で、矢印は腺上皮破壊部を示し、Ｐ−ＳＴＡＴ５の発現は殆ど認められない。目盛棒は５０μｍを示す。
図３７ｂは、生食水ex vivo処置（ＩＴ）の腺筋腫を示す組織像で、腺上皮および基質細胞での共発現を示す。生食投与（ＳＳ．対照）例で、矢印は共発現を示す腺上皮の核を示す。目盛棒は５０μｍを示す。
図３８ａは、ＥＭＰ９ ex vivo処置（ＩＰ）の腺筋腫を示す組織像で、稀薄化した破壊進行中の腺上皮はＰ−ＳＴＡＴ５が発現しないか低発現を示す。ＥＭＰ９投与（Ｍｇ、０．４ｍｇ）例で、腺上皮の離脱（星印）と稀薄化（矢印）が認められる。目盛棒は５０μｍを示す。
図３８ｂは、図３８ａの腺上皮稀薄部位の拡大像である。図３８ａの強拡大部のＰ−ＳＴＡＴ５の低発現を示す。目盛棒は５０μｍを示す。
図３８ｃは、生食水処置（ＩＰ）の腺筋腫の組織像である。ＳＴＡＴ５とＰ−ＳＴＡＴ５共発現を示す腺筋腫内の腺体と平滑筋線維が認められる。生食水投与（Ｍｇ、０ 対照）例で、矢印は腺体を示す。目盛棒は５０μｍを示す。
図３８ｄは、図３８ｃの矢印部位の強拡大組織像である。矢印は個々の腺細胞を示す。細胞質と核に共発現している。  目盛棒は１０μｍを示す。
図３６ａ、ｂ、図３７ａ，ｂ、図３８ａ〜ｄに示す様にＥｐｏＲ発現を認めた腺上皮・基質細胞の崩壊・変性を示す部位においては、ＥＭＰ９処置例ではＳＴＡＴ５とＰ−ＳＴＡＴ５の共発現は認められなかった。
【００７６】
以上、腺筋症標本のin vitroおよびex vivo系でのＥＭＰ９処置実験の意義をまとめると、腺筋症組織およびその移植腫においてもＥｐｏＲが機能的であることが、ＳＴＡＴ５−Ｐ−ＳＴＡＴ５の共発現が増殖性細胞の組織で認められたことで明らかとなった。
かくして、ＥＭＰ９処置は病巣におけるＥｐｏＲの機能停止へと導く、すなわち、ＳＴＡＴ５のリン酸化を阻止することによって、増殖組織を崩壊へと誘導する。
【実施例２】
【００７７】
ＥＭＰ９の前立腺肥大症に対する効果
１）標本の採取・処置および検索方法
ａ）採取
充分な説明により同意の得られた前立腺肥大症（benign prostate hypertrophy、ＢＰＨ）の患者の増殖部位除去術（transurethral resection of the prostate、ＴＵＲ−Ｐ）で摘出された組織片の内で病理検査用に供した残余のものを使用した。切除標本は術後直ちに凍結するかあるいはストレプトマイシン・ペニシリン混入Ｄ−ＭＥＭ培養液（Ｓｉｇｍａ）に移し、実験開始まで冷暗所（８℃）に保存した。標本数は１５症例であった。凍結保存のものは生化学的検索に、培養液保存のものはin vitro処置後、組織学的解析に使用した。
【００７８】
ｂ）薬物
ペプチド研究所製のＥＭＰ９を使用した。
ｃ）処置
in vitro器官培養法を用いた。標本塊に注射針（ハミルトン３２Ｇ）で、直接ＥＭＰ９のリン酸生食緩衝液または対照としてリン酸生食緩衝液を注入した。器官培養の方法は実施例１と同様である。
ｄ）検索方法
薬物処置後１２〜１７時間の標本塊をザンボニ液にて固定し、組織標本を作製した。通常のへマトキシリン・エオジン染色標本ではＥＭＰ９の平滑筋および腺房に対する影響を検索した。一方、分布血管への影響は抗ＦVIII抗体による免疫染色標本で検索した。
【００７９】
２）ＢＰＨにおけるＥｐｏ−ＥｐｏＲ情報発現
ａ）病理組織学的特徴
図３９は、ＢＰＨ組織に発現するＥｐｏＲとＥｓｔＲαの局在を示す組織像である。ａは腺と平滑筋を抗ＥｐｏＲ抗体で染色した像で、矢印は腺上皮細胞、＊印は平滑筋細胞を示す。ｂはＥｐｏＲを発現している平滑筋細胞群（矢印）の像、ｃは、平滑筋細胞のＳｍ−ミオシン（染色性に濃淡有り、矢印）の像で、ｄは、平滑筋細胞でのＥｓｔＲα（矢印）を示す像である。目盛棒は２０μｍを示す。
図４０はＢＰＨの腺上皮におけるＥｐｏＲとＥｓｔＲαの共存を示す標本（ＩＵ、７０）の組織像で、腺上皮のＥｐｏＲとＥｓｔＲαとは共存している。矢印は腺上皮細胞、二重矢印は血管内皮細胞を示し、目盛棒は５０μｍを示す。
図４１は増殖性の平滑筋細胞を示す組織像で、矢印はＰＣＮＡ陽性反応を示す核である。目盛棒は２０μｍを示す。
【００８０】
ＢＰＨは図３９ａに示すように、ＥｐｏＲ陽性反応を示す上皮を持つ腺房と、周辺部では主にＥｐｏＲ陽性反応（図３９ｂ）を示す平滑筋線維から成立している。さらに平滑筋線維は平滑筋ミオシン抗体陽性反応（図３９ｃ）とエストラダイオール受容体α（ＥｓｔＲα）抗体に陽性反応を示した（図３９ｄ）。図４０に示すごとく、ＥｐｏＲとＥｓｔＲαとは共発現し、これらの腺上皮や平滑筋細胞はエリスロポエチンやエストラダイオールによって増殖することが考えられ、実際に増殖性抗体（ＰＣＮＡ）に陽性反応を示した。図４１に平滑筋線維の核にＰＣＮＡ陽性反応を示した。
【００８１】
ｂ）ＢＰＨ標本組織におけるＥｐｏＲの発現
４症例の組織抽出液の膜分画でＥｐｏＲタンパクの検索を、抽出液中のタンパク分画でβ−アクチン（actin）の検索をウエスタンブロット法によって行った。結果を図４２に示す。
図４２は、ＢＰＨ標本におけるＥｐｏＲタンパクの発現を示す電気泳動図である。
各レーンは２０μｇのタンパク量を用いた。４症例共に発現の濃淡があるが、ＥｐｏＲタンパクのバンドを認めた。
ｃ）ＢＰＨ標本組織での各種ｍＲＮＡの発現
表９に各種ｍＲＮＡの発現量を示した。
【表９】
0005867949.tif 000010
腺筋症標本組織での発現量（実施例１の表１）と比べると、アロマターゼとＳｍ−
ミオシンｍＲＮＡの発現量が高い。
【００８２】
ｄ）ＥＭＰ９処置によるＢＰＨの病理組織学的所見
図４３は、ＥＭＰ９処置によるＢＰＨの病理組織学的所見を示す組織像である。ａ〜ｃは平滑筋部、ｅ〜ｈは腺房部を示す。ａはＥＭＰ９処置（ＳＳ、５．０μｇ／組織ｍｇ）例の平滑筋組織のＨ・Ｅ像である。ｂはａの近隣切片の抗ＥｐｏＲ抗体反応像、ｃはａの近隣切片でのＴｄＴ処置結果、ｄは同一ＥｐｏＲ抗体を用いた陽性対照である。マウス赤芽球細胞表面（小さい矢印）と卵黄嚢上皮細胞（大きい矢印）にＥｐｏＲの発現が認められ、矢印は平滑筋線維の断裂（ａ、ｂ）、平滑筋細胞のＴｄＴ陽性の核（ｃ）を示し、＊印は無構造部位を示す。ｅはＥＭＰ９処置（ＩＵ、５．０μｇ／組織ｍｇ）例の崩壊した腺房のＨ・Ｅ像である。ｆはｅの近隣切片のＴｄＴ処置像、ｇはＥＭＰ９処置（ＩＵ、２．５μｇ／組織ｍｇ）崩壊した腺房のＴｄＴ処置像、ｈはＰＢＳ処置（ＩＵ、対照）の小さな腺房の集合像である。矢印はｅとｆは同一死細胞を指す。ｆ、ｇ、ｈはＴｄＴ陽性の核（ｇ〜ｈ）。ａ〜ｃ、ｅ〜ｈは同倍率で目盛棒は２０μｍを示す。
【００８３】
ＥＭＰ９の２用量（１０ｍｇ／ｍｌおよび５ｍｇ／ｍｌ、組織ｍｇ当たり５．０および２．５μｇ）で処置すると、ＥｐｏＲを発現している平滑筋線維は無核となり断片化され、ついには無構造の物質に置き換えられてしまった（図４３ａ、ｂ、ｃ）。平滑筋線維および核の断片化はアポトーシス死を示した（図４３ｃ）。また、腺房ではＥＭＰ９によって腺構造の崩壊と内容物の分散を示し（図５ｅ、ｇ、ｆ）、脱落した上皮細胞はアポトーシス死を示した（４３５ｇ、ｆ）。ＰＢＳで処置したものは腺構造の破壊は認められず、少数のアポトーシス死を示す腺上皮が認められた（図４３ｈ）。
表１０にＥＭＰ９処置におけるＢＰＨ組織崩壊像を示す。これは全例のＨ・Ｅ染色標本において解析した結果をまとめたものである。
【表１０】
0005867949.tif 000011
【００８４】
腺分散（図４３ｅ）は、それぞれの対照と比べてＥＭＰ９高濃度処置７例中６例において、低濃度処置では７例中５例において有意に高頻度に現れた（Ｐ＜０．００１、Ｐ＜０．０５）。腺分散を示さなかったもののうち腺上皮脱落を示したものは、それぞれの対照と比べてＥＭＰ９高濃度で２例（ＫＮ、ＩＡ）、低濃度で２例（ＫＮ、Ｎｋｔ）において有意に多かった（Ｐ＜０．００１）。
平滑筋線維で有核細胞をもつ区画は、ＥＭＰ９処置の高および低濃度で４例において対照と比べて有意に少なかった（Ｐ＜０．００１、Ｐ＜０．０５）。反対に無核を示す細胞を有する区画はＥＭＰ９処置高濃度で４例、低濃度で３例において対照と比べて有意に多かった（Ｐ＜０．００１、Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．０５）。平滑筋線維が無核で断片化を示したものは、ＥＭＰ９処置の高濃度で４例、低濃度で５例、それぞれの対照と比べて有意に多かった（Ｐ＜０．００１、Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．０５）。また、この５例のうち１例においてＥＭＰ９の断片化に対して用量効果関係を示した。無構造領域の出現頻度は高濃度処置３例において対照と比べて有意に高かった（Ｐ＜０．００１、Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．０５）。
【００８５】
ｅ）ＥＭＰ９処置によるＢＰＨ組織血管網の破壊
図４４はＥＭＰ９処置によるＢＰＨ組織血管網の破壊を示す組織像である。ａはＢＰＨ無処置（ＩＵ）の血管分布（抗ＦVIII抗体）を示す像、ｂはＥＭＰ９処置（ＩＵ、５．０μｇ／組織ｍｇ）例を示す像、ｃはＰＢＳ処置（ＩＵ、対照）例を示す像で、矢印は陽性反応を示す崩壊（ｂ）または正常（ｃ）の血管内皮細胞を示す。＊印は腺房の腔を示す。ａ〜ｃは同倍率で目盛棒は２０μｍを示す。
ＢＰＨに分布する血管は図４４ａに示す様に腺房を取り囲んで直径の異なる血管が分布している。ＥＭＰ９ １０ｍｇ／ｍｌ処置群では崩壊した腺房の周囲に血管内皮細胞の破損した血管が多く認められた（図４４ｂ）が、対照では内皮の破損は少なかった（図４４ｃ）。
【００８６】
抗ＦVIII抗体で染色した組織標本で直径を３群（ａ＞１０μｍ、ｂ＝１０−３μｍ、ｃ＜３μｍ）に分け、それらの分布数を、一定面積（５．７×１０−３ｍｍ２）を一区画として数え、１標本につき５０区画数えた。それらの血管密度を図４５に示す。
図４５は、ＢＰＨ組織におけるＥＭＰ９処置組織での血管径の異なる血管密度の変化を示すグラフである。
また、図４５からＥＭＰ９処置とＰＢＳ処置と比較して、それぞれの直径または合計数の間に有意に血管減少を示した例の有意差出現を一覧にして表１１に示す。
【表１１】
0005867949.tif 000012
【００８７】
表１１に示すごとく、ＥＭＰ９処置により、ａ、ｂ、ｃ共にＥＭＰ９処置により有意に減少したのは８例中３例であった（Ｐ＜０．００１、Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．０５）。８例中６例はａとｂまたはｂとｃで対照群との間に有意差を示した。合計血管数においては、ＥＭＰ９処置群は１例を除いて高および低濃度共に、あるいは高濃度のみに対照群と比べ有意な減少を示した。合計数で有意差を示さなかった１例は、高濃度処置群のａとｂの大きさの血管数の有意な減少を示した。したがって、ＥＭＰ９処置はＢＰＨの血管網を障害することが明らかとなった。
【００８８】
以上、ＢＰＨ組織標本におけるＥＭＰ９処置の効果をまとめると、ＢＰＨではＥｐｏ ｍＲＮＡ、ＥｐｏＲ ｍＲＮＡ、アロマターゼｍＲＮＡ、ＥｓｔＲα ｍＲＮＡおよびＳｍ−ミオシンｍＲＮＡの発現が認められ、ＥｐｏＲタンパクの発現とＥｐｏＲとＥｓｔＲαが腺上皮や平滑筋に共存していることが明らかになった。とくにアロマターゼｍＲＮＡが高いことから、ＢＰＨでは血液経由で運ばれて来るテストステロンやデハイドロエピアンドロステロンなどがin situでエストロゲンに変換される可能性があることを示唆している。したがって、ＢＰＨの発生機序は腺筋症や子宮内膜で認められた（Yasuda et al., JBC, Vol. 273, pp 25381-25387 (1998)）ようにこのエストロゲンによりエリスロポエチン分泌が誘導され、ＥｐｏＲの発現している腺上皮細胞、平滑筋線維および血管内皮細胞の増殖が促進されることによると考えられる。
かくして、ＥＭＰ９の組織直接注入はＥｐｏＲを介する情報を遮断することによって、腺房上皮細胞、平滑筋細胞にアポトージス死を誘導し、微小血管網の破壊も相俟ってＢＰＨを崩壊へと導く可能性を有することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
以上のとおり、本発明によれば、腺筋症、内膜症、子宮筋腫、前立腺肥大症のような女性ホルモン依存性増殖性疾患の治療・改善に有用な医薬が提供できる。
【要約】エリスロポエチン受容体拮抗作用を有する低分子ペプチド、特にエリスロポエチンミメティックペプチド（ＥＭＰ）．とりわけＥＭＰ９を含有してなる女性ホルモン依存性増殖性疾患治療・改善剤を提供する。女性ホルモン依存性疾患である腺筋症、内膜症、子宮筋腫、前立腺肥大症の増殖性臓器疾患の病巣にＥＭＰ９を直接あるいは静注により投与し、これらの疾患を改善あるいは治療できる。
【選択図】なし【図１】
0005867949.tif 000013
【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
0005867949.tif 000048
【図３６ａ】
0005867949.tif 000049
【図３６ｂ】
0005867949.tif 000050
【図３７ａ】
0005867949.tif 000051
【図３７ｂ】
0005867949.tif 000052
【図３８ａ】
0005867949.tif 000053
【図３８ｂ】
0005867949.tif 000054
【図３８ｃ】
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【図３８ｄ】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
0005867949.tif 000060
【図４３】
0005867949.tif 000061
【図４４】
0005867949.tif 000062
【図４５】
0005867949.tif 000063
【配列表】
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