(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）とを含み、該ＬＣＶＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３ポリペプチドを含み、かつ該ＨＣＶＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３ポリペプチドを含み、該ＬＣＶＲおよび該ＨＣＶＲは、
ａ）ＬＣＤＲ１はＫＳＳＱＳＬＬＹＳＲＧＫＴＹＬＮ（配列番号３）であり、ＬＣＤＲ２はＡＶＳＫＬＤＳ（配列番号４）であり、ＬＣＤＲ３はＶＱＧＴＨＹＰＦＴ（配列番号５）であり、ＨＣＤＲ１はＧＹＤＦＴＲＹＹＩＮ（配列番号６）であり、ＨＣＤＲ２はＷＩＮＰＧＳＧＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号８）であり、かつＨＣＤＲ３はＥＧＩＴＶＹ（配列番号９）である、
ｂ）ＬＣＤＲ１はＫＳＳＱＳＬＬＹＳＲＧＫＴＹＬＮ（配列番号３）であり、ＬＣＤＲ２はＡＶＳＫＬＤＳ（配列番号４）であり、ＬＣＤＲ３はＶＱＧＴＨＹＰＦＴ（配列番号５）であり、ＨＣＤＲ１はＧＹＴＦＴＲＹＹＩＮ（配列番号７）であり、ＨＣＤＲ２はＷＩＮＰＧＳＧＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号８）であり、かつＨＣＤＲ３はＥＧＴＴＶＹ（配列番号１０）である、
ｃ）ＬＣＤＲ１はＫＳＳＱＳＬＬＹＳＲＧＫＴＹＬＮ（配列番号３）であり、ＬＣＤＲ２はＡＶＳＫＬＤＳ（配列番号４）であり、ＬＣＤＲ３はＶＱＧＴＨＹＰＦＴ（配列番号５）であり、ＨＣＤＲ１はＧＹＴＦＴＤＹＹＩＮ（配列番号４０）であり、ＨＣＤＲ２はＷＩＮＰＧＳＧＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号８）であり、かつＨＣＤＲ３はＥＧＥＴＶＹ（配列番号４１）である、および
ｄ）ＬＣＤＲ１はＫＳＴＲＳＬＬＹＳＲＳＫＴＹＬＮ（配列番号４５）であり、ＬＣＤＲ２はＡＶＳＫＬＤＳ（配列番号４）であり、ＬＣＤＲ３はＶＱＧＴＨＹＰＦＴ（配列番号５）であり、ＨＣＤＲ１はＧＹＴＦＴＤＹＹＩＮ（配列番号４０）であり、ＨＣＤＲ２はＷＩＮＰＧＳＧＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号８）であり、かつＨＣＤＲ３はＥＧＶＴＶＹ（配列番号４６）である、
からなる群から選択される、
抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）とを含み、該ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲは、
ａ）配列番号１１のＬＣＶＲかつ配列番号１２のＨＣＶＲ、
ｂ）配列番号１１のＬＣＶＲかつ配列番号１３のＨＣＶＲ、
ｃ）配列番号１１のＬＣＶＲかつ配列番号４２のＨＣＶＲ、および
ｄ）配列番号４７のＬＣＶＲかつ配列番号４８のＨＣＶＲ
からなる群から選択されるポリペプチドである、
請求項１に記載の抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
１つの軽鎖（ＬＣ）と１つの重鎖（ＨＣ）とを含み、該ＬＣおよびＨＣポリペプチドは、
ａ）配列番号１４のＬＣかつ配列番号１５のＨＣ、
ｂ）配列番号１４のＬＣかつ配列番号１６のＨＣ、
ｃ）配列番号１４のＬＣかつ配列番号４４のＨＣ、および
ｄ）配列番号４９のＬＣかつ配列番号５０のＨＣ
からなる群から選択される、
請求項１または２に記載の抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
２つの軽鎖と２つの重鎖とを含み、各軽鎖および各重鎖は、
ａ）配列番号１４のＬＣかつ配列番号１５のＨＣ、
ｂ）配列番号１４のＬＣかつ配列番号１６のＨＣ、
ｃ）配列番号１４のＬＣかつ配列番号４４のＨＣ、および
ｄ）配列番号４９のＬＣかつ配列番号５０のＨＣ
からなる群から選択されるポリペプチドである、
請求項３に記載の抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片と、薬学上許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項６】
療法における使用のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片と、薬学上許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項７】
臨床もしくは前臨床アルツハイマー病、前駆期アルツハイマー病、ダウン症候群、または臨床もしくは前臨床アミロイド血管症（ＣＡＡ）からなる群から選択される病態の処置における使用のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片と、薬学上許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項８】
アルツハイマー病の処置における使用のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片と、薬学上許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項９】
療法における使用のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
臨床もしくは前臨床アルツハイマー病、前駆期アルツハイマー病、ダウン症候群、または臨床もしくは前臨床ＣＡＡからなる群から選択される病態の処置における使用のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
アルツハイマー病の処置における使用のための、請求項１０に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ３ｐＧｌｕアミロイドベータペプチドを選択的に結合する抗体及びアミロイドベータ（Ａβ、Ａベータとも呼ばれる）に関係する疾患を治療することにおけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
循環形態でのＡβペプチドは前駆体タンパク質、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の切断で生じる３８〜４３（ほとんど３８、４０又は４２のアミノ酸）のアミノ酸で構成される。Ａβの可溶性形態から、高いβシート含量を有する不溶性形態への変換及び脳における老人斑及び脳血管プラークとしてのこれら不溶性形態の沈着は、アルツハイマー病（ＡＤ）、ダウン症候群及び脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）を含む多数の状態及び疾患に関連している。
【０００３】
プラークに見られる沈着は、Ａβペプチドの不均質な混合物で主として構成される。Ｎ３ｐＥ又はＡβｐ３−４２とも呼ばれるＮ３ｐＧｌｕＡβは、プラークにのみ見られるＡβペプチドの短縮形態である。Ｎ３ｐＧｌｕＡβはＡβのＮ末端で最初の２つのアミノ酸残基を欠き、第３番目のアミノ酸の位置にてグルタミン酸に由来したピログルタメートを有する。Ｎ３ｐＧｌｕＡβは脳にて沈着したＡβの軽微な成分ではあるが、研究によってＮ３ｐＧｌｕＡβペプチドは活発な凝集特性を有し、沈着カスケードの早期に蓄積することが明らかにされている。
【０００４】
Ｎ３ｐＧｌｕＡβペプチドを標的とするポリクローナル及びモノクローナルの抗体は以前記載されている（米国特許第７，１２２，３７４号及びＷＯ２０１０／００９９８７）が、生体内で標的に関与し（すなわち、プラークへの結合）、その後、プラークのレベルを下げる高親和性の抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβモノクローナル抗体へのニーズが依然として存在する。加えて、アミノ末端及びカルボキシ末端の抗Ａβ抗体が脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）に関連する微細出血の増加を招くことを考えると、習慣的な治療が沈着したプラークの有意な減少を生じるとしても、微細出血の増加を生じない抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβ抗体へのニーズが存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の範囲内の抗体は、多数の望ましい特性を持つ、治療上有用なＮ３ｐＧｌｕＡβペプチド拮抗剤である。本抗体は、高親和性でヒトＮ３ｐＧｌｕＡβペプチドを結合し、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）に関連する微細出血の増加を起こすことなく、用量依存性で生体内のプラーク減少を示す。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ヒトの操作された抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβ抗体、又は２５℃にてヒトＮ３ｐＧｌｕＡβペプチドに対して１×１０−９Ｍ未満のＫｄを有するその抗原結合断片を提供する。好まれる実施形態では、本発明は、ヒトの操作された抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβ抗体、又は２５℃にてヒトＮ３ｐＧｌｕＡβペプチドに対して９×１０−１０Ｍ未満のＫｄを有するその抗原結合断片を提供する。別の好まれる実施形態では、本発明は、ヒトの操作された抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβ抗体、又は２５℃にてヒトＮ３ｐＧｌｕＡβペプチドに対して７×１０−１０Ｍ未満のＫｄを有するその抗原結合断片を提供する。別の好まれる実施形態では、本発明は、ヒトの操作された抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβ抗体、又は２５℃にてヒトＮ３ｐＧｌｕＡβペプチドに対して９×１０−１０Ｍ〜１×１０−１０Ｍの間のＫｄを有するその抗原結合断片を提供する。別の好まれる実施形態では、本発明は、抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβ抗体、又は２５℃にてヒトＮ３ｐＧｌｕＡβペプチドに対して９×１０−１０Ｍ〜１×１０−１０Ｍの間のＫｄを有するその抗原結合断片を提供する。
【０００７】
本発明はさらに、ヒトの操作された抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβ抗体、又は２５℃にてヒトＮ３ｐＧｌｕＡβペプチドに対して１×１０−９Ｍ未満、又は９×１０−１０Ｍ未満、又は７×１０−１０Ｍ未満、又は９×１０−１０Ｍ〜１×１０−１０Ｍの間のＫｄを有し、生体内でプラークを減少させるその抗原結合断片を提供する。さらなる好まれる実施形態では、本発明は、ヒトの操作された抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβ抗体、又は２５℃にてヒトＮ３ｐＧｌｕＡβペプチドに対して１×１０−９Ｍ未満、又は９×１０−１０Ｍ未満、又は７×１０−１０Ｍ未満、又は９×１０−１０Ｍ〜１×１０−１０Ｍの間のＫｄを有し、ＣＡＡ関連の微細出血を増加させることなく生体内でプラークを減少させるその抗原結合断片を提供する。
【０００８】
本発明はまた、ヒトの操作された抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβ抗体、又はＬＣＶＲ及びＨＣＶＲを含むその抗原結合断片を提供するが、その際、ＬＣＤＲ１はＫＳＸ１Ｘ２ＳＬＬＹＳＲＸ３ＫＴＹＬＮ（配列番号５１）であり、ＬＣＤＲ２はＡＶＳＫＬＸ４Ｓ（配列番号５２）であり、ＬＣＤＲ３はＶＱＧＴＨＹＰＦＴ（配列番号５）であり、ＨＣＤＲ１はＧＹＸ５ＦＴＸ６ＹＹＩＮ（配列番号５３）であり、ＨＣＤＲ２はＷＩＮＰＧＳＧＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号８）であり、ＨＣＤＲ３はＥＧＸ７ＴＶＹ（配列番号５４）であり、Ｘ１はＳ又はＴであり；Ｘ２はＱ又はＲであり、Ｘ３はＧ又はＳであり、Ｘ４はＤ又はＧであり、Ｘ５はＤ又はＴであり、Ｘ６はＲ又はＤであり、Ｘ７はＩ、Ｔ、Ｅ又はＶである。
【０００９】
本発明は、ヒトの操作された抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβ抗体、又は軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）及び重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含むその抗原結合断片を提供するが、該ＬＣＶＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３のポリペプチドを含み、ＨＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３のポリペプチドを含み、それらは以下から成る群から選択される：
（ａ）ＬＣＤＲ１はＫＳＳＱＳＬＬＹＳＲＧＫＴＹＬＮ（配列番号３）であり、ＬＣＤＲ２はＡＶＳＫＬＤＳ（配列番号４）であり、ＬＣＤＲ３はＶＱＧＴＨＹＰＦＴ（配列番号５）であり、ＨＣＤＲ１はＧＹＤＦＴＲＹＹＩＮ（配列番号６）であり、ＨＣＤＲ２はＷＩＮＰＧＳＧＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号８）であり、ＨＣＤＲ３はＥＧＩＴＶＹ（配列番号９）である；
（ｂ）ＬＣＤＲ１はＫＳＳＱＳＬＬＹＳＲＧＫＴＹＬＮ（配列番号３）であり、ＬＣＤＲ２はＡＶＳＫＬＤＳ（配列番号４）であり、ＬＣＤＲ３はＶＱＧＴＨＹＰＦＴ（配列番号５）であり、ＨＣＤＲ１はＧＹＴＦＴＲＹＹＩＮ（配列番号７）であり、ＨＣＤＲ２はＷＩＮＰＧＳＧＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号８）であり、ＨＣＤＲ３はＥＧＴＴＶＹ（配列番号１０）である；
（ｃ）ＬＣＤＲ１はＫＳＳＱＳＬＬＹＳＲＧＫＴＹＬＮ（配列番号３）であり、ＬＣＤＲ２はＡＶＳＫＬＤＳ（配列番号４）であり、ＬＣＤＲ３はＶＱＧＴＨＹＰＦＴ（配列番号５）であり、ＨＣＤＲ１はＧＹＴＦＴＤＹＹＩＮ（配列番号４０）であり、ＨＣＤＲ２はＷＩＮＰＧＳＧＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号８）であり、ＨＣＤＲ３はＥＧＥＴＶＹ（配列番号４１）である；
（ｄ）ＬＣＤＲ１はＫＳＳＱＳＬＬＹＳＲＧＫＴＹＬＮ（配列番号３）であり、ＬＣＤＲ２はＡＶＳＫＬＧＳ（配列番号３５）であり、ＬＣＤＲ３はＶＱＧＴＨＹＰＦＴ（配列番号５）であり、ＨＣＤＲ１はＧＹＴＦＴＲＹＹＩＮ（配列番号７）であり、ＨＣＤＲ２はＷＩＮＰＧＳＧＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号８）であり、ＨＣＤＲ３はＥＧＴＴＶＹ（配列番号１０）である；及び
（ｅ）ＬＣＤＲ１はＫＳＴＲＳＬＬＹＳＲＳＫＴＹＬＮ（配列番号４５）であり、ＬＣＤＲ２はＡＶＳＫＬＤＳ（配列番号４）であり、ＬＣＤＲ３はＶＱＧＴＨＹＰＦＴ（配列番号５）であり、ＨＣＤＲ１はＧＹＴＦＴＤＹＹＩＮ（配列番号４０）であり、ＨＣＤＲ２はＷＩＮＰＧＳＧＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号８）であり、ＨＣＤＲ３はＥＧＶＴＶＹ（配列番号４６）である。
【００１０】
実施形態では、本発明は、ヒトの操作された抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβ抗体、又はＬＣＶＲ及びＨＣＶＲを含むその抗原結合断片を提供し、その際、ＬＣＤＲ１は配列番号３であり、ＬＣＤＲ２は配列番号４であり、ＬＣＤＲ３は配列番号５であり、ＨＣＤＲ１は配列番号６であり、ＨＣＤＲ２は配列番号８であり、ＨＣＤＲ３は配列番号９である。実施形態では、本発明は、ヒトの操作された抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβ抗体、又はＬＣＶＲ及びＨＣＶＲを含むその抗原結合断片を提供し、その際、ＬＣＤＲ１は配列番号３であり、ＬＣＤＲ２は配列番号４であり、ＬＣＤＲ３は配列番号５であり、ＨＣＤＲ１は配列番号７であり、ＨＣＤＲ２は配列番号８であり、ＨＣＤＲ３は配列番号１０である。好まれる実施形態では、本発明は、ヒトの操作された抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβ抗体、又はＬＣＶＲ及びＨＣＶＲを含むその抗原結合断片を提供し、その際、ＬＣＤＲ１は配列番号３であり、ＬＣＤＲ２は配列番号４であり、ＬＣＤＲ３は配列番号５であり、ＨＣＤＲ１は配列番号４０であり、ＨＣＤＲ２は配列番号８であり、ＨＣＤＲ３は配列番号：４１である。好まれる実施形態では、本発明は、ヒトの操作された抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβ抗体、又はＬＣＶＲ及びＨＣＶＲを含むその抗原結合断片を提供し、その際、ＬＣＤＲ１は配列番号３であり、ＬＣＤＲ２は配列番号３５であり、ＬＣＤＲ３は配列番号５であり、ＨＣＤＲ１は配列番号７であり、ＨＣＤＲ２は配列番号８であり、ＨＣＤＲ３は配列番号１０である。好まれる実施形態では、本発明は、ヒトの操作された抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβ抗体、又はＬＣＶＲ及びＨＣＶＲを含むその抗原結合断片を提供し、その際、ＬＣＤＲ１は配列番号４５であり、ＬＣＤＲ２は配列番号４であり、ＬＣＤＲ３は配列番号５であり、ＨＣＤＲ１は配列番号４０であり、ＨＣＤＲ２は配列番号８であり、ＨＣＤＲ３は配列番号４６である。
【００１１】
別の実施形態では、本発明は、ヒトの操作された抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβ抗体、又は軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）及び重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含むその抗原結合断片を提供し、その際、該ＬＣＶＲ及びＨＣＶＲは
（ａ）配列番号１１のＬＣＶＲ及び配列番号１２のＨＣＶＲ；
（ｂ）配列番号１１のＬＣＶＲ及び配列番号１３のＨＣＶＲ；
（ｃ）配列番号１１のＬＣＶＲ及び配列番号４２のＨＣＶＲ；
（ｄ）配列番号３６のＬＣＶＲ及び配列番号３７のＨＣＶＲ；並びに
（ｅ）配列番号４７のＬＣＶＲ及び配列番号４８のＨＣＶＲから成る群から選択されるポリペプチドである。
【００１２】
実施形態では、本発明は、配列番号１１のＬＣＶＲ及び配列番号１２のＨＣＶＲを含む抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を提供する。実施形態では、本発明は、配列番号１１のＬＣＶＲ及び配列番号１３のＨＣＶＲを含む抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を提供する。実施形態では、本発明は、配列番号１１のＬＣＶＲ及び配列番号４２のＨＣＶＲを含む抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を提供する。好まれる実施形態では、本発明は、配列番号３６のＬＣＶＲ及び配列番号３７のＨＣＶＲを含む抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を提供する。好まれる実施形態では、本発明は、配列番号４７のＬＣＶＲ及び配列番号４８のＨＣＶＲを含む抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００１３】
本発明は、軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）を含む抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβモノクローナル抗体を提供するが、その際、ＬＣ及びＨＣのポリペプチドは、
（ａ）配列番号１４のＬＣ及び配列番号１５のＨＣ；
（ｂ）配列番号１４のＬＣ及び配列番号１６のＨＣ；
（ｃ）配列番号１４のＬＣ及び配列番号４４のＨＣ；
（ｄ）配列番号３８のＬＣ及び配列番号３９のＨＣ；並びに
（ｅ）配列番号４９のＬＣ及び配列番号５０のＨＣ；から成る群から選択される。
【００１４】
実施形態では、本発明は、配列番号１４のＬＣ及び配列番号１５のＨＣを含む抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を提供する。実施形態では、本発明は、配列番号１４のＬＣ及び配列番号１６のＨＣを含む抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を提供する。実施形態では、本発明は、配列番号１４のＬＣ及び配列番号４４のＨＣを含む抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を提供する。好まれる実施形態では、本発明は、配列番号３８のＬＣ及び配列番号３９のＨＣを含む抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を提供する。好まれる実施形態では、本発明は、配列番号４９のＬＣ及び配列番号５０のＨＣを含む抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００１５】
好まれる実施形態では、抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβモノクローナル抗体は、２つの軽鎖及び２つの重鎖を含み、各ＬＣは配列番号１４のポリペプチドであり、各ＨＣは配列番号１５のポリペプチドである。好まれる実施形態では、抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβモノクローナル抗体は、２つの軽鎖及び２つの重鎖を含み、各ＬＣは配列番号１４のポリペプチドであり、各ＨＣは配列番号１６のポリペプチドである。好まれる実施形態では、抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβモノクローナル抗体は、２つの軽鎖及び２つの重鎖を含み、各ＬＣは配列番号１４のポリペプチドであり、各ＨＣは配列番号４４のポリペプチドである。好まれる実施形態では、抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβモノクローナル抗体は、２つの軽鎖及び２つの重鎖を含み、各ＬＣは配列番号３８のポリペプチドであり、各ＨＣは配列番号３９のポリペプチドである。好まれる実施形態では、抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβモノクローナル抗体は、２つの軽鎖及び２つの重鎖を含み、各ＬＣは配列番号４９のポリペプチドであり、各ＨＣは配列番号５０のポリペプチドである。
【００１６】
本発明は、本発明の抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物も提供する。好まれる実施形態では、医薬組成物は、本発明の抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβモノクローナル抗体又はその抗原結合断片及び薬学上許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を含む。別の好まれる実施形態では、医薬組成物は１以上の治療成分をさらに含む。
【００１７】
さらなる態様では、本発明は、それを必要とするヒト患者に本発明の抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβモノクローナル抗体又は抗原結合断片を投与することを含むＡβペプチド活性に関連する状態を治療する方法を提供する。
【００１８】
さらなる態様では、本発明は、それを必要とするヒトに本発明の抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を投与することを含む、臨床上の又は前臨床のアルツハイマー病、前駆アルツハイマー病、ダウン症候群、及び臨床上の又は前臨床のＣＡＡから成る群から選択される状態を治療する方法を提供する。好まれる実施形態では、本発明はアルツハイマー病を治療する方法を提供する。
【００１９】
さらなる態様では、本発明は、治療で使用するための抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を提供する。好まれる実施形態では、臨床上の又は前臨床のアルツハイマー病、前駆アルツハイマー病、ダウン症候群、及び臨床上の又は前臨床のＣＡＡから成る群から選択される状態の治療において使用するための抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を提供する。さらに好まれる実施形態では、本発明はアルツハイマー病の治療で使用するための抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を提供する。別の好まれる実施形態では、本発明は、臨床上の又は前臨床のアルツハイマー病、前駆アルツハイマー病、ダウン症候群、及び臨床上の又は前臨床のＣＡＡから成る群から選択される状態の予防において使用するための抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を提供する。さらに好まれる実施形態では、本発明はアルツハイマー病の予防で使用するための抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００２０】
さらなる態様では、本発明は、臨床上の又は前臨床のアルツハイマー病、前駆アルツハイマー病、ダウン症候群、及び臨床上の又は前臨床のＣＡＡから成る群から選択される状態の治療のために薬物を製造することにおける抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の使用を提供する。好まれる実施形態では、本発明はアルツハイマー病の治療のために薬物を製造することにおける抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の使用を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
完全長の抗体は、ジスルフィド結合によって相互結合した２本の重鎖（Ｈ）及び２本の軽鎖（Ｌ）を含む免疫グロブリン分子である。各鎖のアミノ末端部分には、その中に含有される相補性決定領域（ＣＤＲ）を介して主として抗原認識に関与する約１００〜１１０アミノ酸の可変領域が含まれる。各鎖のカルボキシ末端部分は主としてエフェクター機能に関与する定常領域を規定する。
【００２２】
ＣＤＲはフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存されている領域に散在する。各軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）及び重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）は、以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端に配置される３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成される。軽鎖の３つのＣＤＲは「ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３」と呼ばれ、重鎖の３つのＣＤＲは「ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３」と呼ばれる。ＣＤＲは抗原と特異的な相互作用を形成する残基のほとんどを含有する。ＬＣＶＲ及びＨＣＶＲ領域内におけるＣＤＲアミノ酸残基の番号付け及び位置決めは周知のＫａｂａｔ番号方式に準じる。
【００２３】
軽鎖はカッパ及びラムダとして分類され、当該技術で既知の特定の定常領域を特徴とする。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ又はイプシロンとして分類され、それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥとしての抗体のアイソタイプを定義する。ＩｇＧ抗体はさらに、たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のようなサブクラスに分類される。各重鎖の型は、当該技術で周知の配列を持つ特定に定常領域を特徴とする。
【００２４】
本明細書で使用されるとき、用語「モノクローナル抗体」（Ｍａｂ）は、たとえば、真核、原核又はファージのクローンを含む単一のコピー又はクローンに由来する又はそれから単離される抗体を指すのであって、それが作出される方法ではない。本発明のＭａｂは好ましくは均質な又は実質的に均質な集団で存在する。完全なＭａｂは２本の重鎖と２本の軽鎖を含有する。語句「抗原結合断片」には、たとえば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、及び単鎖Ｆｖ断片が含まれる。本発明のモノクローナル抗体及びその抗原結合断片は、たとえば、組換え技法、ファージディスプレイ法、合成法、たとえば、ＣＤＲグラフト又はそのような技法の組み合わせ、又は当該技術で既知のその他の技法によって作出することができる。たとえば、ヒト抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβ又はその断片によってマウスを免疫することができ、得られた抗体を回収し、精製することができ、それらが本明細書で開示する抗体化合物に類似する又はそれと同一である結合特性及び機能特性を持つかどうかの判定を、特に以下の実施例で記載されるような開示される方法によって評価することができる。従来の方法によって抗原結合断片も調製することができる。抗体及び抗原結合断片を産生させ、精製する方法は、当該技術で周知であり、たとえば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｃｈａｐｔｅｒｓ、５−８ａｎｄ１５，ＩＳＢＮ：０−８７９６９−３１４−２に見つけ出すことができる。
【００２５】
語句「ヒトの操作された抗体」は、本発明に係る結合特性及び機能特性を有し、非ヒト抗体に由来するＣＤＲを取り囲む実質的にヒトの又は完全にヒトのものであるフレームワーク領域を有するモノクローナル抗体を指す。そのようなヒトの操作された抗体の「抗原結合断片」には、たとえば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、及び単鎖Ｆｖ断片が挙げられる。「フレームワーク領域」又は「フレームワーク配列」はフレームワーク領域１〜４のいずれか１つを指す。本発明に包含されるヒトの操作された抗体及びその抗原結合断片は、フレームワーク領域１〜４のいずれか１以上が実質的に又は完全にヒトのものである、すなわち、個々の実質的に又は完全にヒトのフレームワーク領域１〜４の考えられる組み合わせのいずれかが存在する分子を含む。たとえば、これには、フレームワーク領域１及びフレームワーク領域２、フレームワーク領域１及びフレームワーク領域３
フレームワーク領域１、２及び３等が実質的に又は完全にヒトのものである分子が含まれる。実質的に、ヒトのフレームワークは既知のヒトの生殖系列フレームワーク配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有するものである。好ましくは、実質的にヒトのフレームワークは既知のヒトの生殖系列フレームワーク配列に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％又は約９９％の配列同一性を有する。
【００２６】
完全にヒトのフレームワークは既知のヒトの生殖系列フレームワーク配列に一致するものである。ヒトのフレームワーク生殖系列配列は、そのウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒを介してＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）から、又はＴｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ＦａｃｔｓＢｏｏｋ  ｂｙ  Ｍａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅ  Ｌｅｆｒａｎｃ  ａｎｄ  Ｇｅｒａｒｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，２００１，ＩＳＢＮ：０１２４４１３５１から入手することができる。たとえば、生殖系列の軽鎖フレームワークは、Ａｌ１、Ａ１７、Ａ１８、Ａ１９、Ａ２０、Ａ２７、Ａ３０、ＬＩ、Ｌ１Ｉ、Ｌ１２、Ｌ２、Ｌ５、Ｌ１５、Ｌ６、Ｌ８、Ｏ１２、Ｏ２及びＯ８から成る群から選択することができ、生殖系列の重鎖フレームワーク領域は、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−７２、ＶＨＩ−４６、ＶＨ３−９、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−３１、ＶＨＩ−１８、ＶＨＩ−６９、ＶＩ−１３−７、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−４８、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９及びＶＨ５−５Ｉから成る群から選択することができる。
【００２７】
本明細書で開示されるものに加えて、本発明に係る同様の機能特性を示すヒトの操作された抗体は幾つかの異なった方法を用いて生成することができる。本明細書で開示される特定の抗体化合物を鋳型又は親抗体化合物として使用して追加の抗体化合物を調製することができる。アプローチの１つでは、親抗体化合物のＣＤＲを、親抗体化合物のフレームワークと高い配列同一性を有するヒトのフレームワークに接合する。新しいフレームワークの配列同一性は一般に、親抗体化合物における相当するフレームワークの配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％同一である。この接合は、親抗体に比べて結合親和性に低下を生じ得る。その場合、フレームワークは、Ｑｕｅｅｎら（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ.８８：２８６９によって開示された特定の基準に基づいた特定の位置にて親フレームワークに復帰変異し得る。マウスの抗体をヒト化するのに有用な方法を記載している追加の参考文献には、米国特許第４，８１６，３９７号；同第５，２２５，５３９号及び同第５，６９３，７６１号；Ｌｅｖｉｔｔ（１９８３）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６８：５９５−６２０に記載されたようなコンピュータプログラムＡＢＭＯＤ及びＥＮＣＡＤ；並びにＷｉｎｔｅｒ及び共同研究者らの方法（Ｊｏｎｅｓら（１９８６）、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３−３２７；及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４−１５３６）が挙げられる。
【００２８】
復帰突然変異について考慮するための残基の特定は以下のように実施することができる：
アミノ酸が以下のカテゴリーに入る場合、使用されているヒト生殖系列配列のフレームワーク（「受容体フレームワーク」）のアミノ酸は、本抗体化合物のフレームワークからのフレームワーク（「ドナーフレームワーク」）のアミノ酸によって置き換えられる。
（ａ）受容体フレームワークのヒトフレームワーク領域におけるアミノ酸がその位置ではヒトのフレームワークに普通ではないが、ドナーの免疫グロブリンにおける相当するアミノ酸はその位置でヒトのフレームワークに典型的である；
（ｂ）アミノ酸の位置がＣＤＲの１つに直接隣接する；又は
（ｃ）フレームワークのアミノ酸の側鎖原子が免疫グロブリン三次元モデルにてＣＤＲのアミノ酸のいずれかの原子の約５〜６オングストローム以内（中心間）である。
【００２９】
受容体フレームワークのヒトフレームワーク領域におけるアミノ酸及びドナーフレームワークにおける相当するアミノ酸のそれぞれが、その位置でヒトフレームワークにとって一般に普通ではない場合、そのようなアミノ酸はその位置でヒトフレームワークに典型的なアミノ酸によって置き換えられ得る。この復帰突然変異の基準によって親抗体化合物の活性を回復するのが可能になる。
【００３０】
本明細書で開示される抗体化合物に類似する機能特性を示すヒトの操作された抗体を生成することへの別のアプローチには、フレームワークを変えることなく接合されたＣＤＲの範囲内でアミノ酸を無作為に変異させることと、親抗体化合物と同じくらい又はそれよりも良好な結合親和性及び他の機能特性について得られた分子をスクリーニングすることが関与する。各ＣＤＲの範囲内で各アミノ酸位置にて単一の変異を導入し、その後、結合親和性及び他の機能特性に対するそのような変異の効果を評価する。改善された特性を作り出す単一の変異を組み合わせて互いの組み合わせにおけるその効果を評価することができる。
【００３１】
さらに、前述のアプローチ双方の組み合わせも可能である。ＣＤＲを接合した後、ＣＤＲにてアミノ酸の変更を導入することに加えて、特定のフレームワーク領域を復帰変異させることができる。この方法論はＷｕら、（１９９９）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４：１５１−１６２に記載されている。
【００３２】
本発明の教示を適用して、当業者は、たとえば、部位特異的変異誘発のような一般的技法を用いて、現在開示されているＣＤＲ及びフレームワークの配列の範囲内でアミノ酸を置換し、それによって本配列に由来するさらなる可変領域のアミノ酸配列を生成する。代替の天然に存在するアミノ酸はすべて、特定の置換部位にて導入することができる。次いで本明細書で開示される方法を用いてこれら追加の可変領域のアミノ酸配列をスクリーニングして示された生体内での機能を有する配列を特定することができる。このようにして、本発明に係るヒトの操作された抗体及びその抗原結合断片を調製するのに好適なさらなる配列を特定することができる。好ましくは、フレームワーク内でのアミノ酸の置換は、本明細書で開示される４つの軽鎖及び/又は重鎖のフレームワーク領域の１以上の範囲内で１、２又は３の位置に限定される。好ましくは、ＣＤＲ内でのアミノ酸置換は、３つの軽鎖及び/又は重鎖のＣＤＲの１以上の範囲内で１、２又は３の位置に限定される。上述されたこれらのフレームワーク領域及びＣＤＲの中での種々の変更の組み合わせも可能である。
【００３３】
用語「治療すること」（又は「治療する」又は「治療」）は、存在する症状、障害、状態又は疾患の進行又は重症度を遅らせる、中断する、停止させる、制御する、止める、軽減する又は防ぐことが関与する過程を指すが、抗Ｎ３ｐＧｌｕＡβ抗体に関係する疾患関連の症状、状態又は障害すべての完全な排除は必ずしも関与しない。
【００３４】
本発明の抗体を種々の経路で投与されるヒトの薬物の中間体として使用することができる。最も好ましくは、そのような組成物は非経口投与用である。そのような医薬組成物は、当該技術で周知の方法（たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈｅｄ．（１９９５），Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏら、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．を参照のこと）によって調製することができ、本明細書で開示されるような抗体又はその抗原結合断片及び薬学上許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を含む。
【００３５】
以下のアッセイの結果は、本発明のモノクローナル抗体及びその抗原結合断片が、たとえば、アルツハイマー病、ダウン症候群及びＣＡＡのようなＡβペプチドの活性に関連する状態を治療するのに有用であることを明らかにしている。
【実施例】
【００３６】
実施例１：抗体の作出
最初の抗体の生成：
３７℃で一晩予備処理して凝集させたＮ末端を切除し、ピログルタミン酸で修飾したヒトのアミロイドβペプチド３〜４２（Ｎ３ｐＧｌｕ）でＦＶＢトランスジェニックマウスを免疫する。マウスの脾臓細胞を回収し、ＭＡＣＳによってＡβ１〜４０に反応性のＢ細胞を除く。凝集したＮ３ｐＧｌｕＡβペプチドへの結合について残りの細胞を選別する。選択したＢ細胞からＲＮＡを単離し、オリゴｄＴを用いてｃＤＮＡに変換する。抗体のシグナル配列プライマーを用いたＰＣＲによって抗体の重鎖と軽鎖の可変領域を得、Ｋｕｎｋｅｌの変異誘発によってファージベクターにクローニングし、Ｆａｂライブラリを作る。シングルポイントＥＬＩＳＡ（ＳＰＥ）によって凝集Ｎ３ｐＧｌｕペプチドへの結合についてＦａｂライブラリをスクリーニングし、Ａβ１〜４０に対して対比スクリーニングする。陽性のクローンは、ＤＮＡ配列決定、ｆａｂの発現、及びＮ３ｐＧｌｕＡβペプチドへの結合、及び可溶性Ａβ１〜４０又はＡβ１〜４２のペプチドへの結合の欠如によって特徴付けられる。
【００３７】
単一アミノ酸変異体ライブラリを構築し、凝集Ｎ３ｐＧｌｕＡβペプチドに結合するが、Ａβ１〜４２には結合しないことについてスクリーニングする。有益な変異を組み合わせライブラリに組み合わせる。親和性を最適化した組み合わせ変異体を選択し、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）による親和性測定及び免疫組織化学によるＡβプラーク結合のためのマウスＩｇＧ１に変換する。特定されたクローンから、生体内の有効性試験のためにマウスＩｇＧ1（ｍＥ８）及びＩｇＧ２ａ（ｍＥ８ｃ）のアイソタイプ双方にてｍＡｂタンパク質を作製する。ｍＥ８はマウスＮ３ｐＧｌｕＡβの配列（ｍｐＥ３〜１６）又はヒトＡβ１〜４２に結合しない。
【００３８】
最初のヒト化には、ヒトの生殖系列フレームワークＶＨ１−６９／ＪＨ６及びＶｋ−Ａ１８／ＪＫ２を使用する。ｍＥ８抗体（４つの親和性変異を伴う）のＣＤＲをヒトのフレームワークに接合して抗体ｈＥ８-Ｃ６を生じる。ｈＥ８-Ｃ６の主鎖でさらなる親和性の最適化を行い、有益な変異を組み合わせて高親和性のヒト化変異体Ｒ５、Ｒ１７、Ｒ２４及び２４２０を作製する。
【００３９】
薬剤開発性を改善するための２回目の最適化：
細胞への非特異的結合を減らすことによって抗体の血清での半減期を改善し、可溶性Ｎ３ｐＧｌｕＡβペプチドへの抗体親和性を高めるための２回目の最適化のために主鎖として２つのヒト化変異体、ｈＥ８-Ｃ６及びＲ１７を選択する。Ｎ３ｐＧｌｕＡβのＮ末端１４アミノ酸（ｐＥ３〜１３Ｂ）から成るビオチン化可溶性ペプチドを合成し、抗体ｍＥ８の結合についてＮ３ｐＧｌｕＡβペプチドと同等であることを評価する。ｐＥ３〜１６Ｂを用いた高処理能力フィルター寿命アッセイを開発し、その後のライブラリのスクリーニングすべてに適用する。凝集Ｎ３ｐＧｌｕＡβへの結合によってフィルター寿命選抜からの的中すべてが裏付けられる。
【００４０】
フィルター寿命アッセイを用いてｈＥ８-Ｃ６変異体のライブラリを再びスクリーニングして一連の有益な変異を特定する。それらのサブセットを用いて組み合わせライブラリを作製する。このアプローチから４つの組み合わせ変異体（ＣｏＩＩ-Ｅ１０、ＣｏＩＩ-Ｇ２、ＣｏＩＩ-Ｇ８及びＣｏＩＩ-Ｅ２）を選択する。
【００４１】
コンピュータのモデル化を用いて、ｈＥ８-Ｃ６、Ｒ１７、Ｒ２４及びその他の変異体のＶ領域構造モデルを創る。構造モデルの解析によって、細胞への抗体の非特異的結合の考えられる原因である、結合部位でクラスター形成する親和性最適化のために導入された陽性電荷が特定される。モデル化に基づいて、表面の静電電位の均衡を保つ変更を導入するために幾つかの位置を選択する。ライブラリのスクリーニングからの幾つかの有益な変異と構造モデル化によって定義された変更を組み合わせることによって組み合わせライブラリを合成する。この取り組みからさらなる試験のために３つの変異体（Ｒ１７ｍ−Ｂ４、Ｒ１７ｍ−Ａ１２及びＲ１７ｍ−Ｂ１２）を選択する。
【００４２】
構造モデルの解析によって、軽鎖フレームワーク残基Ｙ３６と重鎖ＣＤＲ３における残基との間の立体的対立も発見される。変異Ｙ３６ＬをｈＥ８-Ｃ６の軽鎖に導入して変異体ｈＥ８Ｌを作出する。このフレームワークの変更単独が、抗体の親和性を高めること及び非特異的な細胞への結合を減らすこと双方に対して有意な影響を有することが見出される。
【００４３】
その他の取り組みはヒト化のために別のヒトのフレームワークを調べることであった。ｍＥ８抗体のＣＤＲをフレームワークＶＨ５−５１／ＶＫＯ２及びＶＨ３−２３／ＶＫＡ２に接合する。ＶＨ５−５１／ＶＫＯ２（ｈＥ８−５１Ｏ２）によるヒト化Ｆａｂは、それ以上ではないが、Ｎ３ｐＧｌｕＡβへの結合においてｈＥ８-Ｃ６と同等であると判定される。追加の有益な変異のｈＥ８-５１Ｏ２への導入によって、組み合わせ変異体、ＣＩ−Ａ１、ＣＩ−Ｂ６、ＣＩ−Ｃ７及びＣＩ−Ｂ８が生成される。
【００４４】
抗原特異性及び親和性のためのＥＬＩＳＡ及びＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）、非特異的細胞結合並びにＩＨＣ染色を含む試験管内のアッセイにおけるすべてを通過した後、５つの変異体ｍＡｂ、Ｂ１２Ｌ、ＣＩ−Ｃ７、ｈＥ８Ｌ、Ｒ１７Ｌ及びＲ１７を選択する。
【００４５】
抗体を以下のように作製し、本質的に精製することができる。最適な所定のＨＣ：ＬＣベクター比を用いて抗体をスクリーニングするための発現系によって、又は配列番号５６及び配列番号４３のようなＨＣと配列番号５５のようなＬＣの双方をコードする単一ベクター系によって、たとえば、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ又はＣＨＯのような適当な宿主細胞に一過性に又は安定的に形質移入を行う。多数の一般に使用される技法のいずれかを用いて、抗体が分泌されている澄んだ培地を精製する。たとえば、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）のような相溶性の緩衝液によって平衡化されているプロテインＡ又はＧセファロースＦＦカラムに培地を従来のように適用してもよい。カラムを洗浄して非特異的な結合成分を取り除く。結合した抗体を、たとえば、ｐＨ勾配（たとえば、０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．８から０．１Ｍのクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ２．５）によって溶出する。たとえば、ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって抗体分画を検出し、次いでプールする。さらなる精製は用途に応じて任意である。一般の技法によって抗体を濃縮してもよく、及び/又は無菌のフィルターを通してもよい。サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、又はハイドロキシアパタイトのクロマトグラフィを含む一般の技法によって可溶性の凝集物及び多量体を効果的に除き得る。これらのクロマトグラフィ工程の後、抗体の純度は９９％を超える。生成物を直ちに−７０℃で凍結してもよく、又は凍結乾燥してもよい。本発明のこれらの抗体のアミノ酸配列を以下に提供する。
【表１】
0005980207.tif 000002
【００４６】
実施例２：可溶性Ｎ３ｐＧｌｕへの結合親和性
ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００機器によって測定される表面プラズモン共鳴を用いて抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体へのＮ３ｐＧｌｕＡβの結合を測定する。言及される場合を除いて、試薬及び材料はすべてＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ）からのものである。測定はすべて２５℃で行う。試料をＨＢＳ-ＥＰ緩衝液（１５０ｍＭの塩化ナトリウム、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％（ｗ／ｖ）界面活性剤Ｐ−２０及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）に溶解する。
【００４７】
位置変更（グリシン変異体）を伴った一連のＡβペプチドを合成し、抗体結合に対する所与の残基の影響を評価し、それによって抗体認識に必要とされる特徴及び配列を特定する：
ペプチド名        Ａβ３〜１６の配列        
ｐＥ３−１６    ＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫ−ビオチン  配列番号２５
Ｅ３−１６      ＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫ−ビオチン  配列番号２６
ｐＥＧ４        Ｐｙｒ−ＥＧＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫ−ビオチン  配列番号２７
ｍｐＥ３−１６  Ｐｙｒ−ＥＦＧＨＤＳＧＦＥＶＨＨＱＫ−ビオチン  （齧歯類）配列番号２８
ｐＥＧ６        Ｐｙｒ−ＥＦＲＧＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫ−ビオチン  配列番号２９
ｐＥＧ７        Ｐｙｒ−ＥＦＲＨＧＳＧＹＥＶＨＨＱＫ−ビオチン  配列番号３０
ｐＥＧ８        Ｐｙｒ−ＥＦＲＨＤＧＧＹＥＶＨＨＱＫ−ビオチン  配列番号３７
ｐＥＦ１０      Ｐｙｒ−ＥＦＲＨＤＳＧＦＥＶＨＨＱＫ−ビオチン  配列番号３９
Ａβ１〜４２への結合対Ａβ３〜１６への結合対ｐＥ３〜１６への結合（それぞれ配列番号１対配列番号２６対配列番号２５）を比較することによってグルタミン酸の切除（ｄｅｓ１,２）形態及び修飾形態（３−ｐｙｒ-Ｅ又は３-ｐｙｒ-Ｇｌｕ）の重要性を評価する。結合実験の希釈前にペプチドは５ｍｇ/ｍｌにてＰＢＳに溶解する。
【００４８】
抗体捕捉の多重解析サイクル、ペプチドの注入/会合、解離のための延長緩衝液流、及び表面再生を用いて結合を評価する。抗体の捕捉工程については、捕捉される抗体の種類に応じて、プロテインＡ又はヤギ抗マウスＦｃのいずれかでＣＭ５チップを固相化する。マウスの抗体を除いて、各サイクルは、５μＬ/分での１０μｇ/ｍＬの抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体約５〜７μＬの注入（捕捉：約３，０００ＲＵ）、５０μＬ/分での１００μＬのペプチドの注入（各サイクルについて２倍連続希釈で１０００ｎＭ〜６２．５ｎＭ）、その後の解離のための１０分間から成る。マウスの抗体については、流速は５０μＬ/分であり、５０μｇ/ｍＬのマウス抗体２０μＬを注入する。双方の場合にて、１０ｍＭの塩酸グリシンｐＨ１．５を２０μＬ用いてチップの表面を再生する。次いで、ＢＩＡ評価解析ソフトウエアにおける１：１結合モデルを用いて各サイクルについての会合と解離の速度から結合親和性（ＫＤ）を得る。抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体、Ｂ１２ＬとＲ１７Ｌ、及び親マウス抗体（ｍＥ８Ｃ）は１ｎＭ未満のＫＤにてＮ３ｐＧｌｕＡβを特異的に認識する。抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体、Ｂ１２ＬとＲ１７Ｌ、及び親マウス抗体（ｍＥ８Ｃ）が同様の親和性にてｐＥ３〜１６にも結合するということは、エピトープがペプチドのこの領域内に位置することを示している。グリシン変異体ペプチドへの抗体の結合解析は、結合に決定的な残基が、３〜７：３位のピロＥ、４位のＦ、５位のＲ、６位のＨ及び７位のＤであったことを示す。Ａβ１〜４０への検出可能な結合は本発明の抗体については検出されない。
【００４９】
実施例３：凝集したＮ３ｐＧｌｕに対する結合親和性
凝集したＮ３ｐＧｌｕＡβに対する抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体の結合を監視するために、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）実験も実施した。本実験において、Ｎ３ｐＧｌｕＡβペプチドは、アミンカップリング化学反応を通じてＣＭ−５チップ上のフローセル2（低密度、LD）、フローセル３（中程度の密度、ＭＤ）、およびフローセル４（高密度、HD）へと異なる密度で固定化されている。異なるレベルのＮ３ｐＧｌｕＡβペプチドを固定化して、抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体の結合に及ぼす表面密度の影響を検討する。固定化の際に、Ｎ３ｐＧｌｕＡβの大部分は、単量体ペプチドしか認識しない対照モノクローナル抗体の結合がないことによって示されるように、表面上に凝集する。この凝集型のペプチドは、原繊維型またはアミロイド型で凝集したaベータペプチドの特性を模倣しており、該型において、該ペプチドのＮ末端領域は露出しており、抗体の標的にされることができる。
【００５０】
２５℃での複数の分析周期を使用して、結合を評価する。各周期は５０μＬ／分の流速で実施され、以下の工程からなる。すなわち、２５０μＬのＮ３ｐＧｌｕ抗体溶液の注入（５００ｎＭで出発し、各周期について２倍連続希釈物を使用）に続いて解離と、約３０μＬの１０ｍＭグリシン塩酸塩（ｐＨ１．５）を使用した再生とについて２０分間であった。各周期についての結合速度および解離速度を、ＢＩＡ評価ソフトウエアにおける異種性リガンドモデルを使用して評価する。１：１結合モデルはこのデータに適合しないので、異種性適合は、２つの結合親和性（低親和性および高親和性）を生じる。Ｒ１７Ｌ抗体およびＢ１２Ｌ抗体ならびに親ネズミ抗体ｍＥ８ｃは、凝集したＮ３ｐＧｌｕＡβに、高親和性ＫＤ，１＜１００ｐＭおよびより低い親和性ＫＤ，２＜１０ｎＭで結合する。最大結合シグナル（Ｒｍａｘ）を低親和性結合および高親和性結合からのＲｍａｘの合計として算出した。Ｒｍａｘは、より多くの結合部位がより高密度の表面において利用可能である場合に期待されるように、表面上のペプチド密度が増加するにつれて高まることが示されている。これらの結合研究は、本発明の抗体が凝集したＮ３ｐＧｌｕＡβに結合することを示している。
【００５１】
実施例４：生体外での標的会合研究
固定したＰＤＡＰＰ脳（２４か月齢）からの脳切片上での生体外での標的会合を決定するために、外来的に添加したAβ抗体を用いて免疫組織化学的分析を実施する。該ＰＤＡＰＰトランスジェニックマウスは、アルツハイマー病と関連した病状の多くを発症することが示されている。ネズミ抗体について、本実験をネズミ組織に関して実施したので、ビオチンタグを標識として使用したのであって、したがって、ビオチン化していない非ネズミ抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体間での直接的な比較は適切ではない。ビオチン化した３Ｄ６のＮ末端（１〜５）抗体は、ＰＤＡＰＰ海馬に沈着した有意な量のＡβを頑強に標識するのに対し、ビオチン化したｍＥ８は、沈着物の部分集合しか標識しない。ヒトアルツハイマー病脳とは異なり、ＰＤＡＰＰ脳に沈着したＡβのほとんどは全長である。（ｍＥ８と比較して）Ｂ１２ＬおよびＲ１７Ｌなどのビオチン化していない抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体について、類似のプラーク標識が観察される。非特異的プラーク標識は、マウス対照ＩｇＧおよびヒト対照ＩｇＧのいずれにおいても観察されない。沈着したＡβの組成および起こりそうな構造が、アルツハイマー病脳とは劇的に異なっているので、ビオチン化していない抗Ｎ３ｐＧｌｕ（３μｇ／ｍＬ）抗体が新鮮凍結アルツハイマー病脳からの脳切片上での沈着したＡβを結合するかどうかを判定するために、該抗体を研究する。陽性対照抗体（ビオチン化した３Ｄ６）は、アルツハイマー病脳における多くのＡβプラークを強く標識するのに対し、陰性対照抗体（ネズミおよびヒトのＩｇＧ）は、いずれの適切な結合も欠失している。Ｂ１２ＬおよびＲ１７Ｌなどのビオチン化していない抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体のうちのいくつかは、沈着したＡβに同様に結合する。これらの組織学的研究は、本発明の抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体が、沈着したＡβ標的と生体外で会合することができることを示している。
【００５２】
実施例５：生体内での標的会合研究
沈着した標的に生体内で会合する抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体の能力を測定する。亜慢性の４週間の研究を、ビオチン化したネズミ抗体３Ｄ６およびｍＥ８ｃを４０ｍｇ／ｋｇで毎週腹腔内（ＩＰ）投与して実施する。本実験の終結時に脳を収集し、標的会合のレベルを脳の組織学的検討によって決定する。ビオチン化した３Ｄ６を注射した動物では、海馬裂に沿ってのみプラーク標識を有しているのに対し、ビオチン化したｍＥ８ｃを注射したマウスでは、海馬および皮質領において頑強なプラーク標識を示す。非常に類似した標的会合パターンは、より急性の３日間アッセイにおいて観察される（３Ｄ６の海馬裂染色ならびにｍＥ８の海馬領および皮質領の両方の標識）。これらの結果は、可溶性および不溶性の両Ａβを結合する３Ｄ６抗体が、可溶性Ａβで飽和となり、したがって所望の沈着した標的に会合することができないことを強く示唆している。純然たる対照において、ネズミ抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体であるｍＥ８ｃは、決定的な脳領域のいずれにおいても、意図された標的と一貫して会合する。高用量および低用量のＲ１７ＬおよびＢ１２Ｌ抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体を、同様の３日間の生体内での研究において評価する。該抗体を１０ｍｇ／ｋｇ（低用量）または４０ｍｇ／ｋｇ（高用量）のいずれかでＩＰ注射する。本研究の終結時に、血漿および脳を収集し、血漿ＰＫを決定する。脳を切片にし、免疫組織化学的分析を同種の切片に関して、（結合型抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体を検出するための）抗ヒト抗体および（該切片における沈着した標的の総量を検出するための）３Ｄ６を使用して実施する。生体内での標的会合のレベルをより良好に定量化するために、抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体によって結合した％面積を、起こり得る標的の総％面積（外来性３Ｄ６の免疫組織化学的分析によって可視化される沈着型Ａβ全体）に対して標準化する。加えて、有意な曝露を本研究の終結時に検出するので、％標的会合全体を各個々のマウスについての血漿薬物動態（ＰＫ）値に対して標準化する。Ｒ１７ＬおよびＢ１２Ｌの両抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体は、ネズミ抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体（ｍＥ８）を使用して観察されるのと類似の分布を有する沈着したプラークと会合することが発見されている。これらの結果は、Ｒ１７ＬおよびＢ１２Ｌ抗Ｎ３ｐＧｌｕ抗体が末梢性投与されると、血液脳関門を通過することができ、かつ沈着したＡβの意図された標的と会合できるのに対し、可溶性および不溶性の両Ａβを結合する抗体は、可溶性Ａβで飽和となり、かつ意図された沈着型標的と会合できないことを示している。
【００５３】
実施例６：治療的プラーク減少研究
２３か月齢のＰＤＡＰＰマウスにおける治療的プラーク減少研究を以下の抗体、すなわち陰性対照抗体（ＩｇＧ２ａ）、３Ｄ６、ｍＥ８（ＩｇＧ１）、およびｍＥ８ｃ（ＩｇＧ２ａ）を使用して実施する。老齢ＰＤＡＰＰマウスに１２．５ｍｇ／ｋｇの各抗体を毎週３か月間皮下注射する。２３か月齢での初期的なプラーク負荷量を決定するために、マウスの１群を、研究開始時（時間０）に剖検する。本研究の終結時に、血漿を得、脳を生化学的結果および組織学的結果のために加工する（各１半球）。海馬および皮質領を５Ｍグアニジンにおいて均質化し、Ａβ含有量を酸尿素ゲルに続くウェスタンブロット法によって測定する。２３か月齢の時間０および陰性抗体対照（２６か月齢）の同齢集団からの海馬グアニジン溶解物の分析は、沈着したＡβ１−４２の有意ではない増加を示し、それによりＰＤＡＰＰマウスの脳がプラークの平衡状態にあることを確認している。老齢ＰＤＡＰＰマウスにおける先行研究と同様に、比較因子である抗体３Ｄ６による処置は、プラーク減少に何ら効果がない。ｍＥ８またはｍＥ８ｃのいずれかのＮ３ｐＧｌｕ抗体による処置は、ＩｇＧ２ａ陰性対照抗体と比較して、有意なプラーク減少を結果的に生じる（それぞれ、ｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１）（表２）。ｍＥ８およびｍＥ８ｃは、海馬のＡβ１−４２をそれぞれ約３８％および約５３％減少させる。最大のエフェクター機能を有するＮ３ｐＧｌｕ抗体ｍＥ８ｃは、（対照と比較して）最小のエフェクター機能の抗体ｍＥ８よりも有効である傾向にあるが、この差は統計的有意性に到達していない。また、ｍＥ８ｃ抗体は、時間０マウスと比較して、海馬のＡβ１−４２を約３０％有意に減少させ（ｔ検定、ｐ＜0.0066）、したがって、すでに沈着したプラークのクリアランスを示している。皮質グアニジン溶解物の分析は、非常に類似した結果を生じているが、例外は、最大のエフェクター機能を有するｍＥ８ｃしかＡβ１−４２沈着を有意に減少させないことである。これらの結果は、本実施例のＮ３ｐＧｌｕ抗体による慢性的な処置が、老齢ＰＤＡＰＰマウスにおけるプラーク沈着をエフェクター機能依存的様式で有意に減少させることを示している。加えて、これらの結果は、（老化とは反対に）可溶性および不溶性の両Ａβを結合するＡβ抗体の標的会合の乏しいことが、治療パラダイムにおいて使用される場合に有効性に欠ける原因となる因子であったという仮説を支持している。
【００５４】
【表２】
0005980207.tif 000003
【００５５】
実施例７：老齢ＰＤＡＰＰマウスにおける微量出血の分析
老齢ＰＤＡＰＰマウスにおける低下したプラーク減少をもたらすＮ３ｐＧｌｕ抗体の作用機序が、脳アミロイド血管症と関連した微量出血の増悪を結果として生じるであろうかどうかを研究するために、組織学的研究を実施する。先行研究は、ある抗Ａβアミノ末端抗体およびカルボキシル末端抗体による老齢ＡＰＰトランスジェニックマウスの処置が、脳アミロイド血管症と関連した微量出血の増加をもたらすことを示している（Pfeifer et al. 2002; Wilcock et al. 2004; Racke et al. 2005）。この潜在的な有害事象に潜む機序は未明だが、独立して排他的な２つの仮説、すなわち、脳血管へのＡβの再分布（Wilcock et al. 2004）、または存在する脳アミロイド血管症に対する抗体の直接的な結合（Racke et al. 2005）が提供されている。生化学的および組織学的分析は、Ａβｐ３−ｘがアルツハイマー病患者および老齢ＰＤＡＰＰマウスの両方において脳アミロイド血管症の構成因子であることを示している。Ｎ３ｐＧｌｕ抗体および対照抗体で治療的に処置された老齢ＰＤＡＰＰマウス（２３から２６か月齢）における微量出血についての詳細な組織学的分析を、１２．５ｍｇ／ｋｇの毎週の皮下注射を３か月間実施する。微量出血についての陽性対照は、この抗Ａβアミノ末端抗体が微量出血を有意に増悪させることをすでに示している、３Ｄ６で慢性的に処置した動物である（Racke et al. 2005）。本研究の終結時に、各動物からの１つの半球を４％ホルムアルデヒドにおいて浸漬固定（ｄｒｏｐ-ｆｉｘ）し、パラフィン中に包埋する。２ｍｍの組織を包囲する冠状断を５０枚のスライドへと切片作製した（スライド１枚につき４つの１０μｍ切片）。ヘモシデリン（微量出血による細胞の鉄蓄積）を可視化するために、２ｍｍの組織を等間隔で横断する１１枚のスライドをパールズブルー（Perls Blue）で染色する。スライド１枚につき２つの切片を盲検様式で手動で計数する。老齢ＰＤＡＰＰマウスの３Ｄ６（陽性対照）による慢性的な処置は、微量出血を劇的に増加させる（ｐ＜0.001）。重要なことに、ｍＥ８（ＩｇＧ１）またはｍＥ８ｃ（ＩｇＧ２ａ）のいずれによる処置も微量出血を増悪させないが、これらのＮ３ｐＧｌｕ抗体はこれらの動物における沈着したＡβを有意に減少させることが示されている。これらの結果は、本実施例のＮ３ｐＧｌｕ抗体が老齢ＰＤＡＰＰマウスにおける脳アミロイド血管症と関連した微量出血を増悪させないことを示している。
【００５６】
配列表
<配列番号1; PRT1; 人工>
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA              (Aβ 1-42)
<配列番号2; PRT1; 人工>
[pE]FRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA            (N3pE Aβ)
<配列番号3; PRT1; 人工>
KSSQSLLYSRGKTYLN                                (LCDR1-B12L/R17L/hE8L/R17)
<配列番号4; PRT1; 人工>
AVSKLDS                                          (LCDR2-B12L/R17L/hE8L/CI-C7)
<配列番号5; PRT1; 人工>
VQGTHYPFT                                  (LCDR3-B12L/R17L/hE8L/R17/CI-C7)
<配列番号6; PRT1; 人工>
GYDFTRYYIN                                                    (HCDR1-B12L)
<配列番号7; PRT1; 人工>
GYTFTRYYIN                                                  (HCDR1-R17L/R17)
<配列番号8; PRT1; 人工>
WINPGSGNTKYNEKFKG                              (HCDR2-B12L/R17L/R17/CI-C7)
<配列番号9; PRT1; 人工>
EGITVY                                                        (HCDR3 - B12L)
<配列番号10; PRT1; 人工>
EGTTVY                                                      (HCDR3-R17L/R17)
<配列番号11; PRT1; 人工>                                  (LCVR-B12L/R17L/hE8L)
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLYSRGKTYLNWLLQKPGQSPQLLIYAVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHYPFTFGQGTKLEIK
<配列番号12; PRT1; 人工>                                        (HCVR - B12L)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYDFTRYYINWVRQAPGQGLEWMGWINPGSGNTKYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGITVYWGQGTTVTVSS
<配列番号13; PRT1; 人工>                                          (HCVR-R17L)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTRYYINWVRQAPGQGLEWMGWINPGSGNTKYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTTVYWGQGTTVTVSS
<配列番号14; PRT1; 人工>                                       (LC - B12L/R17L)
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLYSRGKTYLNWLLQKPGQSPQLLIYAVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHYPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
<配列番号15; PRT1; 人工>                                            (HC - B12L)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYDFTRYYINWVRQAPGQGLEWMGWINPGSGNTKYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGITVYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
<配列番号16; PRT1; 人工>                                            (HC - R17L)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTRYYINWVRQAPGQGLEWMGWINPGSGNTKYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTTVYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
<配列番号17; DNA; 人工>                                (LCVR DNA- B12L/R17L)
GATATTGTGATGACTCAGACTCCACTCTCCCTGTCCGTCACCCCTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTATATAGTCGCGGAAAAACCTATTTGAATTGGCTCCTGCAGAAGCCAGGCCAATCTCCACAGCTCCTAATTTATGCGGTGTCTAAACTGGACTCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCAGTGGGTCAGGCACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCCGAAGATGTTGGGGTTTATTACTGCGTGCAAGGTACACATTACCCATTCACGTTTGGCCAAGGGACCAAGCTGGAGATCAAA
<配列番号18; DNA; 人工>                                      (HCVR DNA- B12L)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGTTACGACTTCACTAGATACTATATAAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATTAATCCTGGAAGCGGTAATACTAAGTACAATGAGAAATTCAAGGGCAGAGTCACCATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAAGGCATCACGGTCTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
<配列番号19; DNA; 人工>                                      (HCVR DNA- R17L)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGTTACACCTTCACTAGATATTATATAAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATTAATCCTGGAAGCGGTAATACTAAGTACAATGAGAAATTCAAGGGCAGAGTCACCATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAAGGCACAACGGTCTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
<配列番号20; PRT1; 人工>                                          (LCVR - mE8)
NIVLTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLYSRGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYAVSKLDSGVPDRFIGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCVQGTHYPFTFGSGTKLEIK
<配列番号21; PRT1; 人工>                                          (HCVR - mE8)
EVQLLESGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYINWVKQRPGQGLEWIGWINPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCTREGETVYWGQGTTLTVSS
<配列番号22; PRT1; 人工>                                   (LC - mE8およびmE8c)
NIVLTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLYSRGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYAVSKLDSGVPDRFIGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCVQGTHYPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
<配列番号23; PRT1; 人工>                                            (HC - mE8)
EVQLLESGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYINWVKQRPGQGLEWIGWINPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCTREGETVYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
<配列番号24; PRT1; 人工>                                            (HC - mE8c)
EVQLLESGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYINWVKQRPGQGLEWIGWINPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCTREGETVYWGQGTTLTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
<配列番号25; PRT1; 人工>                                              (pE3-16)
Pyr-EFRHDSGYEVHHQK-ビオチン
<配列番号26; PRT1; 人工>                                                (E3-16)
EFRHDSGYEVHHQK-ビオチン
<配列番号27; PRT1; 人工>                                                (pEG4)
Pyr-EGRHDSGYEVHHQK-ビオチン
<配列番号28; PRT1; 人工>                                              (mpE3-16)
Pyr-EFGHDSGFEVHHQK-ビオチン
<配列番号29; PRT1; 人工>                                                (pEG6)
Pyr-EFRGDSGYEVHHQK-ビオチン
<配列番号30; PRT1; 人工>                                                (pEG7)
Pyr-EFRHGSGYEVHHQK-ビオチン
<配列番号31; PRT1; 人工>                                        (LCVR - hE8-C6)
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLYSRGKTYLNWYLQKPGQSPQLLIYAVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHYPFTFGQGTKLEIK
<配列番号32; PRT1; 人工>                                        (HCVR - hE8-C6)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYYINWVRQAPGQGLEWMGWINPGSGNTKYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGETVYWGQGTTVTVSS
<配列番号33; PRT1; 人工>                                          (LC - hE8-C6)
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLYSRGKTYLNWYLQKPGQSPQLLIYAVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHYPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPRQAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
<配列番号34; PRT1; 人工>                                          (HC - hE8-C6)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYYINWVRQAPGQGLEWMGWINPGSGNTKYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGETVYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
<配列番号35; PRT1; 人工>                                          (LCDR2 - R17)
AVSKLGS
<配列番号36; PRT1; 人工>                                          (LCVR - R17)
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLYSRGKTYLNWYLQKPGQSPQLLIYAVSKLGSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHYPFTFGQGTKLEIK
<配列番号37; PRT1; 人工>                                                (pEG8)
Pyr-EFRHDGGYEVHHQK-ビオチン
<配列番号38; PRT1; 人工>                                              (LC - R17)
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLYSRGKTYLNWYLQKPGQSPQLLIYAVSKLGSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHYPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
<配列番号39; PRT1; 人工>                                                (pEF10)
Pyr-EFRHDSGFEVHHQK-ビオチン
<配列番号40; PRT1; 人工>                                    (HCDR1 - hE8L/CI-C7)
GYTFTDYYIN
<配列番号41; PRT1; 人工>                                        (HCDR3 - hE8L)
EGETVY
<配列番号42; PRT1; 人工>                                          (HCVR - hE8L)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYYINWVRQAPGQGLEWMGWINPGSGNTKYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGETVYWGQGTTVTVSS
<配列番号43; DNA; 人工>                                        (HC DNA-R17L)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGTTACACCTTCACTAGATATTATATAAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATTAATCCTGGAAGCGGTAATACTAAGTACAATGAGAAATTCAAGGGCAGAGTCACCATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAAGGCACAACGGTCTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
<配列番号44; PRT1; 人工>                                            (HC - hE8L)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYYINWVRQAPGQGLEWMGWINPGSGNTKYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGETVYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ<配列番号45; PRT1; 人工>                                    (LCDR1 - CI-C7)
KSTRSLLYSRSKTYLN
<配列番号46; PRT1; 人工>                                        (HCDR3 - CI-C7)
EGVTVY
<配列番号47; PRT1; 人工>                                        (LCVR - CI-C7)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSTRSLLYSRSKTYLNWYQQKPGKAPKLLIYAVSKLDSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCVQGTHYPFTFGGGTKVEIK
<配列番号48; PRT1; 人工>                                        (HCVR - CI-C7)
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYTFTDYYINWVRQMPGKGLEWMGWINPGSGNTKYNEKFKGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCAREGVTVYWGQGTLVTVSS
<配列番号49; PRT1; 人工>                                          (LC - CI-C7)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSTRSLLYSRSKTYLNWYQQKPGKAPKLLIYAVSKLDSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCVQGTHYPFTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
<配列番号50; PRT1; 人工>                                          (HC - CI-C7)
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYTFTDYYINWVRQMPGKGLEWMGWINPGSGNTKYNEKFKGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCAREGVTVYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
<配列番号51; PRT1; 人工配列>                            (LCDR1共通)
KSx1x2SLLYSRx3KTYLN（配列中x1はSまたはTであり、x2はQまたはRであり、x3はGまたはSである。）
<配列番号52; PRT1; 人工配列>                (LCDR2共通)
AVSKLx4S（配列中x4はDまたはGである。）
<配列番号53; PRT1; 人工配列>                              (HCDR1共通)
GYx5FTx6YYIN（配列中x5はDまたはTであり、x6はRまたはDである。）
<配列番号54; PRT1; 人工配列>                              (HCDR3共通)
EGx7TVY（配列中x7はI、T、E、またはVである。）
<配列番号55; PRT1; 人工配列>            (LC DNA- B12L/R17L)
GATATTGTGATGACTCAGACTCCACTCTCCCTGTCCGTCACCCCTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTATATAGTCGCGGAAAAACCTATTTGAATTGGCTCCTGCAGAAGCCAGGCCAATCTCCACAGCTCCTAATTTATGCGGTGTCTAAACTGGACTCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCAGTGGGTCAGGCACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCCGAAGATGTTGGGGTTTATTACTGCGTGCAAGGTACACATTACCCATTCACGTTTGGCCAAGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGC
<配列番号56; PRT1; 人工配列>                            (HC DNA- B12L)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGTTACGACTTCACTAGATACTATATAAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATTAATCCTGGAAGCGGTAATACTAAGTACAATGAGAAATTCAAGGGCAGAGTCACCATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAAGGCATCACGGTCTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
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