(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を保持、培養するための培養容器であって、
細胞容器本体と、該細胞容器本体に前記細胞及び培地を供給する流路回路を接続するため接続ポートとを備えており、
前記細胞容器本体は、対をなす少なくとも１組の第一容器と第二容器と、容器蓋部とを有し、
前記第一容器及び前記第二容器は、各々、培地及び細胞を、または培地のみを収容するための容器であり、前記第一容器と前記第二容器間の隔壁の一部は、液体及び気体が相互に移動可能に構成されており、
前記第一容器は、前記第二容器と前記容器蓋部の間に挿入され、
前記第一容器の上部と前記第二容器の上部との間には、相互に気体の流通を可能にするギャップが存在しており、
前記接続ポートとして、
前記第一容器には、前記培地の供給と、気体の供給及び排出をするための第一供給ポートと、前記培地を排出するための第一排出ポートとが前記容器蓋部を貫通して接続され、
前記第二容器には、前記培地の供給と、前記気体の供給及び排出をするための第二供給ポートと、前記培地を排出するための第二排出ポートとが接続され、
前記第一供給ポート及び前記第二供給ポートは、前記培地を前記培養容器に対して常に一方向へ流す流路として機能することを特徴とする培養容器。
【請求項２】
請求項１において、
前記第一供給ポート及び前記第二供給ポートは、前記培地を前記培養容器の外側から内側への方向のみに流す流路、及び、前記気体を双方的に流す流路として機能し、
前記第一排出ポート及び前記第二排出ポートは、前記培地を前記培養容器の内側から外側への方向のみに流す流路として機能し、前記気体は流さない
ことを特徴とする培養容器。
【請求項３】
請求項２において、
前記第一供給ポートの前記第一容器における開口位置は、前記第一排出ポートの前記第一容器における開口位置よりも高い位置にあり、
前記第二供給ポートの前記第二容器への開口位置は、前記第二排出ポートの前記第二容器への開口位置よりも高い位置にある
ことを特徴とする培養容器。
【請求項４】
請求項３において、
前記培養容器は、細胞容器本体と、該細胞容器本体に第二の流路回路及び第一の流路回路を接続するための前記第一、前記第二供給ポート、及び、前記第一、第二排出ポートを備えており、
前記細胞容器本体は、該細胞容器本体に一体に形成された複数の前記第二容器と、前記蓋部と、前記各第二容器と前記蓋部との間に挿入される複数の前記第一容器とを備えている
ことを特徴とする培養容器。
【請求項５】
請求項４において、
前記第一排出ポートの前記第一容器における開口位置は、前記第一容器の底面付近に位置し、
前記第二排出ポートの前記第二容器における開口位置は、前記第二容器の底面と前記第二排出ポートの内径最下部が、同じ高さとなる位置にある
ことを特徴とする培養容器。
【請求項６】
請求項５において、
前記培養容器を略水平に保持する状態と、傾けた状態の何れかを取るよう制御する回転制御部を含むこと
を特徴とする培養容器。
【請求項７】
培養容器内への細胞播種と培地交換を行い、前記培養容器内において細胞を培養する自動培養装置であって、
少なくとも１つの閉鎖系培養容器と、
前記閉鎖系培養容器の供給側に１つの細胞バッグ、培地バッグ、第一のフィルタ、及び排液回収バッグを接続する第一の流路回路と、
前記閉鎖系培養容器の供給側に他の細胞バッグ、培地バッグ、第二のフィルタ及び排液回収バッグを接続する第二の流路回路と、
前記第一の流路回路及び前記第二の流路回路に設けられた流体移動制御機構部及び電磁弁とを備え、
前記閉鎖系培養容器は、
細胞容器本体と、該細胞容器本体に前記第一の流路回路及び前記第二の流路回路を接続するため接続ポートとを備えており、
前記細胞容器本体は、対をなす少なくとも１組の第一容器と第二容器と、容器蓋部とを有し、
前記第一容器及び前記第二容器は、各々、培地及び細胞を、または培地のみを収容するための容器であり、前記第一容器と前記第二容器間の隔壁の一部は、液体及び気体が相互に移動可能に構成されており、
前記第一容器は、前記第二容器と前記容器蓋部の間に挿入され、
前記第一容器の上部と前記第二容器の上部との間には、相互に気体の流通を可能にするギャップが存在しており、
前記第一容器には、前記容器蓋部を貫通して、前記培地の供給と、気体の供給及び排出をするための第一供給ポートと、前記培地を排出するための第一排出ポートとに、前記第一の流路回路が接続され、
前記第二容器には、前記培地の供給と、前記気体の供給及び排出をするための第二供給ポートと、前記培地を排出するための第二排出ポートとに、前記第二の流路回路が接続され、
前記培地が、前記第一の流路回路、前記第二の流路回路、前記第一供給ポート及び前記第二供給ポートを介して、前記培養容器に対して常に一方向に供給される
ことを特徴とする自動培養装置。
【請求項８】
請求項７において、
前記第一供給ポート及び前記第二供給ポートは、前記培地を、前記第一の流路回路及び前記第二の流路回路を経由して、前記培養容器の外側から内側への方向のみに流す流路、及び、前記気体を双方的に流す流路として機能し、
前記第一排出ポート及び前記第二排出ポートは、前記第一の流路回路及び前記第二の流路回路を経由して、前記培地を前記培養容器の内側から外側への方向のみに流す流路として機能し、前記気体は流さない
ことを特徴とする自動培養装置。
【請求項９】
請求項８において、
前記第一の流路回路及び前記第二の流路回路に設けられた前記流体移動制御機構部及び前記電磁弁を備え制御する制御装置を備えており、
前記制御装置は、データベースに保持された情報に基づいて、前記培地及び前記気体が前記第一の流路回路及び前記第二の流路回路を流れる時期及び流れの方向を制御する
ことを特徴とする自動培養装置。
【請求項１０】
培養容器内への細胞播種と培地交換を行い、培養容器内において細胞を培養する自動培養装置であって、
細胞懸濁液が収容される細胞バッグと、
培地が収容される培地バックと、
培地を冷蔵保存する冷蔵庫と
培地を３７℃に温めるヒーターと、
細胞を培養する培養容器と、
細胞懸濁液及び培地及び空気を送液/送気する流体移動制御機構部と
前記培養容器、細胞バッグ、培地バッグ、流体移動制御機構部からなる流路回路が設置される細胞培養用恒温槽と、
前記培養容器の培養環境を制御する制御装置を備え、
前記培養容器は、培地及び細胞を、または培地のみを収容する第一容器と、
当該第一容器を内部に格納するとともに、培地及び細胞を、または培地のみを収容する第二容器と、
当該第二容器を少なくとも封止する蓋部材を有する培養容器において、
前記第一容器には、前記蓋部材を貫通して、前記培地の供給と、気体の供給及び排出をするための第一供給ポートと、前記培地を排出するための第一排出ポートとが接続され、
前記第二容器には、前記培地の供給と、前記気体の供給及び排出をするための第二供給ポートと、前記培地を排出するための第二排出ポートとが接続され、
前記第一容器の上部と前記第二容器の上部との間には、相互に気体の流通を可能にするギャップが存在しており、
前記制御装置は、
当該第一容器への培地の排出または供給、あるいは前記第二容器からの培地の排液または供給をする場合に、前記第一供給ポート、前記第二供給ポートと、前記第一排出ポート、前記第二排出ポートを切り替え、送液を制御する
ことを特徴とする自動培養装置。
【請求項１１】
請求項１０において、
前記細胞播種あるいは前記培地交換において、前記培地は前記第一供給ポート及び前記第二供給ポートの少なくとも一方から前記培養容器内へ供給され、
前記第一排出ポート及び前記第二排出ポートの少なくとも一方から前記培養容器外へ排出されることにより、前記培地は一方向のみに送液される
ことを特徴とする自動培養装置。
【請求項１２】
請求項１０において、
前記第一排出ポート及び前記第二排出ポートは、
前記第一容器及び前記第二容器の底面に近接し、
前記培養容器を略水平に保持する状態と、傾けた状態の何れかを取るよう制御する回転制御部を含み、
該回転制御部により、前記第一容器及び前記第二容器の培地の排出において、全量または所定量を排出する
ことを特徴とする自動培養装置。
【請求項１３】
請求項１２において、
細胞播種時は、前記細胞バッグ内の細胞懸濁液を送液/送気機構により、前記第一供給ポート及び前記第二供給ポートの何れか一方から前記培養容器の前記第一容器または前記第二容器へ供給し、
同時に、前記細胞懸濁液を供給していない前記第一供給ポート若しくは前記第二供給ポートから前記培養容器外へ気体を排出する
ことを特徴とする自動培養装置。
【請求項１４】
請求項１２において、
前記培地交換時は、前記培地バッグ内の培地を前記流体移動制御機構部により、前記培養容器の第一容器または第二容器の前記第一供給ポートまたは第二供給ポートまで送液しつつ、送液されていない他の前記第一供給ポートまたは前記第二供給ポートから空気を排出し、
続いて培地交換を行う前記一容器または前記第二容器から、前記第一排出ポートまたは前記第二排出ポートより古い培地を排出しつつ、
送液されていない前記第一供給ポートまたは前記第二供給ポートから空気を排出し、
最後に送液された前記第一供給ポートまたは前記第二供給ポートから前記培地を前記第一容器または前記第二容器へ供給しつつ、送液されていない前記第一供給ポートまたは前記第二供給ポートから空気を排出する
ことを特徴とする自動培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞又は組織を自動操作により培養する培養容器と自動培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療治療に用いる再生組織の製造は、医薬品等の製造管理及び品質管理の基準であるGMP（Good Manufacturing Practice；適正製造基準）に基づく。一般に、再生組織は清潔な製造環境を提供するCPC（Cell Processing Center；細胞処理施設）において、専門の細胞培養技術を有した製造従事者により、SOP（Standard Operational Procedure；標準手順書）に従い製造される。そのため、多大な人件費、労力、運用コストが発生する。また、全ての製造工程は人手でなされるため、再生組織の製造量には限界がある。結果として、再生組織を製造するための製造コストは高くなり、再生医療治療の普及の妨げとなっている。【０００３】
このような現状を打破するため、培養工程の一部ないし全てを自動化する自動培養装置の導入が求められている。培養工程を人手ではなく自動培養装置により実施することで、省力化とコストダウンを実現し、大量生産が可能となる。加えて、自動培養装置による操作は一定であるため、製造後に得られる再生組織の品質一定化への寄与も期待される。【０００４】
ここで、自動培養装置は人手による作業の代替として細胞を培養するが、人手による作業内容に対するGMPに準拠していることが必要である。また、自動培養装置に特化したGMPは現在のところ規定されていないが、臨床用途の自動培養装置に関する開発ガイドライン（非特許文献１）が経済産業省より提示されている。この開発ガイドラインへの準拠も必要である。以上より自動培養装置は、手作業に対するGMP及び自動培養装置の開発ガイドラインを鑑みて、科学的根拠に基づき、清浄な環境を維持した状態で高品質の再生組織を再現性良く製造可能であることが求められる。【０００５】
これらの課題を解決する手段として、例えば、特許文献１、２、３に示すような、閉鎖系の流路を用いて培養工程を自動化する装置が開発されている。培養容器の蓋を開閉する操作が不要な閉鎖系の培養容器を用いることにより、培養工程の自動化と生物学的汚染リスクの低減が達成される。閉鎖系培養容器は、培地が外部へ容易に漏出しない構造である。また、生物学的汚染の原因となる菌等が外部から混入しない隔離された環境を実現する。よって、培養容器の蓋を開閉する開放系培養容器よりも清潔性を維持しやすいという利点がある。【０００６】
加えて、再生医療治療の対象臓器が角膜上皮、食道粘膜、表皮等である場合、培養する細胞種は、角膜上皮細胞、口腔粘膜細胞、表皮細胞といった上皮系細胞となる。この場合、培養容器の構造は２層構造が望ましい。上皮系細胞は、マウス由来３Ｔ３−Ｊ２細胞等のフィーダー細胞と共に共培養し、フィーダー細胞が産出する成長因子により生育するが、上皮系細胞とフィーダー細胞を同一培養平面上で培養した場合、製造後の再生組織にフィーダー細胞が混入する。一方、２層構造の培養容器を用いて培養した場合、フィーダー細胞であるヒトとは異種のマウス由来の細胞は異なる培養表面上で培養するため、上皮系細胞へのフィーダー細胞の混入を回避することができる。これは、ヒトに対する再生医療治療において、より好ましい。自動培養装置を用いて上皮系細胞を培養する場合においても、同様に２層構造が望ましい。２層構造の閉鎖系培養容器は、特許文献１が示すように、既に開発が進められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００６−１４９２３７号公報
【特許文献２】特開２００４−２０８６６４号公報
【特許文献３】特開２００７−３１２６６８号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】経済産業省、再生医療分野（ヒト細胞培養加工装置についての設計ガイドライン［改訂］）、２００９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
自動培養装置は、前述の通り、手作業において要求されるGMP及び自動培養装置に関する開発ガイドラインを満たすことが要求される。特に、製造後の再生組織の品質を一定にするためには、全量の培地を交換する場合の培地交換工程において、古い培地を排出し新しい培地を供給する際、新しい培地に古い培地が混入しないことが必要である。また、培地交換時の排液である古い培地を用いた培地成分分析によるモニタリング機能を搭載する場合、正確に培地成分分析を行うには、排液である古い培地の中に、新しい培地が混入することは回避する必要がある。【００１０】
また、再生医療治療に必要な再生組織の量は対象臓器毎に異なる。例えば食道粘膜再生の場合、３−５層程度に重層化した直径２４ｍｍの口腔粘膜シートである再生組織を、約８枚使用することによる再生医療治療の臨床研究が既に進められている。治療を行う前日には、製造した再生組織が移植可能な品質か検査する必要があり、検査用としてさらに約２枚が必要となる。検査用に用いる再生組織は移植前日に取り出すため、取り出した後も移植用の再生組織は無菌性を維持した培養が可能である必要がある。よって再生医療用途の自動培養装置は、移植用と検査用とで少なくとも複数枚の再生組織が製造可能であり、前日に検査用の再生組織を取り出した後も無菌性を維持可能であることが望ましい。【００１１】
また、自動培養装置は前述の通り、手作業において要求されるGMP及び自動培養装置に関する開発ガイドラインを満たすことが要求される。その中の一つの要求として、自動培養装置で製造した再生組織の品質を一定にする必要がある。再生組織の品質を一定にする条件は複数存在するが、その中の一つとして、多くの場合で採用されている培地の全量を交換する培地交換工程において、古い培地を排出し新しい培地を供給する際、新しい培地に古い培地が混入しないことが必要である。古い培地は細胞が生育するために使用した培地であり、例えばグルコースが消費され、代わりに乳酸が排出されている。よって古い培地が新しい培地に混入した場合、培地交換後のグルコース量等は新しい培地における濃度と一致せず、結果として培養工程の再現性は失われる。同様に、古い培地に含まれる乳酸は培地のｐＨを変化させるため、培地交換後の古い培地に由来する乳酸の混入も、培養工程の再現性に影響を与える。以上より、培養工程の再現性を向上させるには、培地交換工程において古い培地と新しい培地が混入しないことが必要である。また、培養工程において培養状況を把握するため、排液である古い培地を用いた培地成分分析によるモニタリング機能の搭載が望ましいとされる。正確に培地成分分析を行うには、排液である古い培地の中に、新しい培地が混入することは回避する必要がある。前述の通り、古い培地と新しい培地とで成分組成が異なるため、培地成分分析に使用する古い培地に新しい培地が混入すると、培地成分分析の結果が古い培地のみの分析結果と異なるためである。以上より、培養工程において、古い培地と新しい培地の混入を回避する技術が必要である。【００１２】
さらに、製造する再生組織を、表皮細胞、角膜上皮細胞、口腔粘膜細胞等の上皮系細胞とした場合、培養容器は２層構造である必要がある。また、自動培養装置による再生組織の培養枚数は、移植用と検査用とで、複数枚である必要がある。再生医療治療を施す臓器により必要な培養枚数は異なるが、例えば食道粘膜再生の場合、約１０枚となる。また、検査用に再生組織を移植前日に取り出した後も、移植用の再生組織の入った培養容器は無菌性を維持可能である必要がある。【００１３】
加えて、自動培養装置で閉鎖系培養容器を用いて培養する場合、培養に必要な培地等の送液及び５％二酸化炭素等を含む気体の送気を、閉鎖系培養容器に取り付けた流路チューブにより行うことになる。前述の食道粘膜再生のように培養容器１０枚の場合、送液及び送気のために閉鎖系培養容器へ取り付ける流路チューブの総長は多大なものとなる。また、１個の培養容器あたりに取り付ける流路チューブの本数は、少なければ少ない程、流路回路が簡潔となるため好ましい。流路回路が複雑化した場合、自動培養装置の故障原因やコスト上昇の原因となるためである。【００１４】
特許文献１、特許文献２の発明では、培地交換時、培養容器内に古い培地が存在した状態で新しい培地を供給し、培養容器内部で新しい培地と古い培地とが混在した状態を経て、過剰な分の液体が排出される連続的な培地の交換方法をとる。すなわち、新しい培地と古い培地とが混在した状態で、新しい培地により古い培地を培養容器から押し出す方式が採用されている。排出される液体には古い培地の占める割合が多いが、同じ培養容器内に新しい培地と古い培地は混在するため、低濃度になるものの古い培地は新しい培地に混入する。古い培地の組成は、細胞の生育段階（細胞数、分化度）により異なるため、本方法による培地交換後の培養容器内の培地の各成分の濃度も細胞生育段階により異なることになる。また、この方法で得られた古い培地を用いて培地成分分析を行い、細胞の生育状態をモニタリングする場合、回収した古い培地には新しい培地が混入しているため、モニタリング結果は正確ではなくなるという問題がある。【００１５】
加えて、培養中において５％二酸化炭素を含む気体を培養空間に提供する必要があるが、特許文献１の発明では閉鎖系培養容器の一部を気体透過膜にし、閉鎖系培養容器の外部から気体を供給する。閉鎖系培養容器内へ直接気体を送気する場合に比べ、閉鎖系流路に取り付けられた流路チューブの本数は少なくなるという利点は得られるものの、直接気体を送気する場合に比べ気体透過膜からの供給効率は低いという問題がある。【００１６】
特許文献３の発明は、１個の１層構造の閉鎖系培養容器により培養する自動培養装置を提示している。１層構造であるため、この培養容器を用いて上皮系細胞を培養する場合、製造後の再生組織に共培養するフィーダー細胞が混入する。また、本方法は培地等の液体を送液及び排出する流路チューブに加え、培養容器内の圧力を調整するための空気のみを送気する流路チューブを設けている。すなわち、送気を担う流路チューブを設け、培養容器内の古い培地を除いてから新しい培地を供給するので、古い培地が新しい培地に混入する事態を排除できる。また、特許文献１の発明に比べ、閉鎖系培養容器内へ直接送気するので、気体供給効率は特許文献３の発明が優れる。しかし、仮に本方法を２層構造の閉鎖系培養容器に適用する場合、１個の閉鎖系培養容器あたりに必要な流路チューブは、上層及び下層に対し、それぞれの層に対する送液及び排出を担う流路チューブに加え、送気を担う流路チューブが必要となり、合計５本が必要となる。本方法では１個の閉鎖系培養容器を自動で培養するが、例えば食道粘膜再生に対する再生医療治療では１０個の閉鎖系培養容器を培養するため、流路チューブの合計本数は５０本と多くなる。結果として、流路回路の構成はかなり複雑なものとなる。【００１７】
さらに、培地交換時において古い培地を排出後、速やかに新しい培地を供給することが必要である。古い培地を排出した状態のまま長時間放置すると、細胞は乾燥し、死滅する。加えて、古い培地を排出してから新しい培地を供給するまでの間、培養表面上にわずかに残った培地の蒸発により、培養表面の温度が低下する可能性がある。ところで、再生医療治療用の再生組織の製造において通常使用する培養表面の素材は、ポリスチレン、ポリカーボネイト等である。近年、それらの培養表面素材に加え、温度変化のみで性能が変化する温度応答性高分子を塗布した温度応答性培養表面を用いた再生医療治療の臨床研究が進められている。温度応答性培養表面では、温度応答性高分子の相転移温度より高い３７℃では疎水性を示し、細胞は通常の培養表面と同じく接着、伸展、増殖する。しかし、温度応答性高分子の相転移温度より低い温度である、例えば２０℃まで下げると、親水性を示す。その結果、細胞は自発的に形態変化を生じ、培養表面から剥離する。通常使用する培養表面から細胞を剥離する場合は、タンパク質分解酵素を用いるため、細胞周囲の細胞外マトリクスや細胞間結合が侵襲され、回収後の細胞の活性は低下するという問題がある。【００１８】
一方、温度応答性培養表面を使用した場合、細胞外マトリクスや細胞間結合は維持されたまま回収可能なため、回収した細胞の活性は高度に保たれ、移植後の再生組織の生着生は向上する。この温度応答性培養表面を用いた再生医療治療の臨床研究は、食道粘膜、角膜上皮、心臓といった臓器を対象に、臨床研究が既に進められている。この温度応答性培養表面を、自動培養装置の閉鎖系培養容器の培養表面に使用する場合、培地交換時に温度が低下すると、接着していた細胞が剥離してしまう。これは、再生組織の製造は失敗を意味する。よって培地交換時において、培養容器内の温度低下は避けることが必須である。そのためには、培地交換時において、古い培地を排出後に、新しい培地を速やかに供給する必要がある。また、この段階で供給する新しい培地は、冷蔵保存状態の４℃から、温度応答性培養表面の性質を維持可能な３７℃まで、事前に加温されている必要がある。【００１９】
以上を踏まえ、本発明の目的は、簡潔な流路回路により、培地が一方向に流れ古い培地が新しい培地に混入しないようにすると共に、培地交換時に古い培地を全て排出した後に新しい培地が速やかに供給される、培養容器及び自動培養装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
上記の目的を達成するため、本発明においては、次のような構成の培養容器を提供する。すなわち、細胞を保持、培養するための培養容器であって、細胞容器本体と、該細胞容器本体に前記細胞及び培地を供給する流路回路を接続するため接続ポートとを備えており、前記細胞容器本体は、対をなす少なくとも１組の第一容器と第二容器と、容器蓋部とを有し、前記第一容器及び前記第二容器は、各々、培地及び細胞を、または培地のみを収容するための容器であり、前記第一容器と前記第二容器間の隔壁の一部は、液体及び気体が相互に移動可能に構成されており、前記第一容器の上部と前記第二容器の上部との間には、相互に気体の流通を可能にするギャップが存在しており、前記接続ポートとして、前記第一容器には、前記培地の供給と、気体の供給及び排出をするための第一供給ポートと、前記培地を排出するための第一排出ポートとが接続され、前記第二容器には、前記培地の供給と、前記気体の供給及び排出をするための第二供給ポートと、前記培地を排出するための第二排出ポートとが接続され、前記第一供給ポート及び前記第二供給ポートは、前記培地を前記培養容器に対して常に一方向へ流す流路として機能することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、細胞播種工程及び培地交換工程において、培地は常に一方向に流れるので、古い培地が新しい培地に混入せず、培養の再現性が向上する。培地交換時に古い培地を全て排出した後に新しい培地が速やかに供給される。しかも、閉鎖系培養容器に取り付けた流路チューブの一部は、送液と送気の機能を兼ねるため、全体流路回路は簡潔となる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の第１の実施例に係る自動培養装置において、閉鎖系培養容器を１０枚培養する時の全体流路回路図である。
【図２】第１の実施例における、閉鎖系培養容器の断面図である。
【図３】図１の全体流路回路図から、１個の閉鎖系培養容器に対して関連する流路回路のみを抽出した図である。
【図４】第１の実施例における、閉鎖系培養容器を有する自動培養装置の制御機構を示した図である。
【図５】第１の実施例における、本実施例の自動培養装置を用いて細胞の培養を実施する一連の制御フローを示した図である。
【図６】第１の実施例における、閉鎖系培養容器の上層への播種時制御用のテーブルの一例を示す図である。
【図７】第１の実施例における、１個の閉鎖系培養容器の上層への、細胞播種時の培地及び空気の流れを示した図である。
【図８】第１の実施例における、閉鎖系培養容器の下層への播種時制御用のテーブルの一例を示す図である。
【図９】第１の実施例における、１個の閉鎖系培養容器の下層への、細胞播種時の培地及び空気の流れを示した図である。
【図１０】第１の実施例における、閉鎖系培養容器の上層への培地交換制御用のテーブルの一例を示す図である。
【図１１Ａ】第１の実施例における、上層の培地交換時の培地及び空気の流れを示した図である。
【図１１Ｂ】第１の実施例における、上層の培地交換時の培地及び空気の流れを示した図である。
【図１１Ｃ】第１の実施例における、上層の培地交換時の培地及び空気の流れを示した図である。
【図１１Ｄ】第１の実施例における、上層の培地交換時の培地及び空気の流れを示した図である。
【図１２】第１の実施例における、閉鎖系培養容器の下層への培地交換制御用のテーブルの一例を示す図である。
【図１３Ａ】第１の実施例における、下層の培地交換時の培地及び空気の流れを示した図である。
【図１３Ｂ】第１の実施例における、下層の培地交換時の培地及び空気の流れを示した図である。
【図１３Ｃ】第１の実施例における、下層の培地交換時の培地及び空気の流れを示した図である。
【図１３Ｄ】第１の実施例における、下層の培地交換時の培地及び空気の流れを示した図である。
【図１４】本発明の第２の実施例に係る、閉鎖系培養容器の断面図である。
【図１５】本発明の第３の実施例に係る、自動培養装置の全体流路回路図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明においては、内部に培養空間を有し、第一容器及び第二容器を有した２層構造の閉鎖系培養容器であって、第一容器及び第二容器それぞれへ、細胞懸濁液または培地の供給と、空気の供給及び排出を行う第一及び第二の供給ポートと、第一容器及び第二容器それぞれから培地の排出を行う第一及び第二の排出ポートを有した構成の培養容器を提供する。閉鎖系培養容器の第一及び第二のポートは、各々流路チューブに接続されて、送液と送気の機能を兼ねる流路回路を構成する。なお、２層構造の閉鎖系培養容器は、対をなす第一容器と第二容器の上下配置された積層構造のみならず、対をなす第一容器と第二容器が並列配置された２層構造であっても良い。
【００２４】
また、上記の目的を達成するため、本発明においては、上記２層構造の閉鎖系培養容器を用いた自動培養装置おいて、培地が常に一方向に流れるように構成可能な流路回路と、この流路回路を制御する制御プロトコルとを採用している。すなわち、内部に培養空間を有する閉鎖系培養容器を用いた自動培養装置おいて、培養容器内の第一容器への細胞播種時は、流体移動制御機構部により細胞懸濁液を細胞バッグから流路チューブ及び第一供給ポートを経由して第一容器へ供給しつつ、第二供給ポート及び流路チューブを介して培養容器内の空気を外部へ排出する。培養容器内の第二容器への細胞播種時は、第一供給ポート及び第二供給ポートの切り替え後、流体移動制御機構部により細胞懸濁液を細胞バッグから流路チューブ及び第二供給ポートを経由して第一容器へ供給しつつ、第一供給ポート及び流路チューブを介して培養容器内の空気を外部へ排出する。尚、第一容器及び第二容器へ細胞播種を行う順番は任意である。
【００２５】
これにより、流路回路において培地は常に一方向に流れることになる。古い培地と新しい培地は混じり合わない。結果として、回収した古い培地に対する培地成分分析の精度も向上する。また、前述したとおり第一供給ポート及び第二供給ポートは、培地の送液及び気体の送気の機能を併せ持つ。よって、気体送気用の流路チューブを独立に設けた場合に比較し、閉鎖系培養容器に取り付けることになる流路チューブの数は減ることになる。そのため流路回路はより簡潔となる。
【００２６】
また、上記の目的を達成するため、本発明においては、内部に培養空間を有する閉鎖系培養容器を用いる自動培養装置であって、細胞懸濁液が収容される細胞バッグと、培地が収容される培地バックと、培地を冷蔵保存する冷蔵庫と培地交換時に事前に培地を３７℃に温めるヒーターと、細胞を培養する培養容器と、細胞懸濁液及び培地及び空気を送液/送気する流体移動制御機構部と、二酸化炭素等を供給源となるガスタンク及びガス濃度を調節するガス濃度調節部及び外界との気圧調整を行うフィルタと、流路の開閉を行う二方弁及び三方弁から成る。培養容器、細胞バッグ、培地バッグ、流体移動制御機構部等から構成される流路回路は恒温機の中に設置され、流路回路全体の温度が制御される。培養容器の培養環境は、制御装置により制御する。また、装置内には温度センサを設置し、内部温度をモニタリングする。加えて顕微鏡も設置し、細胞の生育状態を光学的に適宜モニタリングする。
【００２７】
培養容器内の第一容器の培地交換時は、流体移動制御機構部により培地を培地バッグから第一供給ポートまで送液しつつ、第二供給ポートから培養容器内の空気を外部へ排出する。第一供給ポートまで達した培地は、保存時に４℃にて冷蔵状態であったが３７℃まで温めるヒーターを経由しており、よってこの時点で温度は３７℃である。第一供給ポートまで達している培地は、常に３７℃に維持されている恒温槽内で待機するため、培地の温度も３７℃に維持される。次に、流体移動制御機構部により第一容器の古い培地を第一排出ポートから排出しつつ、第二供給ポートから培養容器内の空気を内部へ供給する。続いて、流体移動制御機構部により第一供給ポートにて待機している培地を第一容器内へ供給しつつ、第二供給ポートから培養容器内の空気を外部へ排出する。この操作は、第一排出ポートから排出した古い培地が第一容器から全量排出された直後より、開始する。第一排出ポートから排出した古い培地が排液バッグ等まで完全に送液することを完了させる必要はない。最後に、流路チューブ内にある第一排出ポートから排出した古い培地に対し、一部を排液回収バッグより回収し、残りを排液バッグへ排出する。以上により、第一容器内において、古い培地は新しい培地と混じることなく、排出することが可能となる。培地交換後の第一容器内の培地は、培地交換時に供給した新しい培地のみとなる。
【００２８】
培養容器内の第二容器の培地交換時は、第一容器の培地交換時に比べ、第一供給ポートと第二供給ポートの役割が入れ替わる。また、排出口は、第一容器では第一排出ポートであったのに対し、第二容器では第二排出ポートとなる。最初に、流体移動制御機構部により培地を培地バッグから第二供給ポートまで送液しつつ、第一ポートから培養容器内の空気を外部へ排出する。第二供給ポートまで達した培地の温度は、第一容器の時と同様に、この時点で３７℃を維持している。次に、流体移動制御機構部により第二容器の古い培地を第二排出ポートから排出しつつ、第一供給ポートから培養容器内の空気を内部へ供給する。続いて、流体移動制御機構部により第二供給ポートにて待機している培地を第二容器内へ供給しつつ、第一供給ポートから培養容器内の空気を外部へ排出する。この操作は、第二排出ポートから排出した古い培地が第一容器から全量排出された直後より、開始する。第二排出ポートから排出した古い培地が排液バッグ等まで完全に送液することを完了させる必要はない。最後に、流路チューブ内にある第二排出ポートから排出した古い培地に対し、一部を排液回収バッグより回収し、残りを排液バッグへ排出する。以上により、第一容器内と同様に、第二容器においても古い培地は新しい培地と混じることなく、排出することが可能となる。培地交換後の第二容器内の培地は、培地交換時に供給した新しい培地のみとなる。尚、第一容器及び第二容器に愛し培地交換を行う順番は任意である。
【００２９】
また、第一容器及び第二容器の培地交換において、古い培地を排出完了後、第一供給ポートまたは第二供給ポートに待機している事前に３７℃に維持された培地を、古い培地を第一排出ポートまたは第二排出ポートから排出直後、速やかに供給する。これにより、培養容器内の培養表面の乾燥と温度低下を回避することが可能となる。
【００３０】
このように、本発明に係る閉鎖系培養容器を用いた培養容器及び自動培養装置によれば、細胞播種工程及び培地交換工程において、培地は常に一方向に流れる。全量を交換する培地交換において、古い培地が新しい培地に混入しないようにするため、培養の再現性が向上する。回収した古い培地を用いた培地成分分析の分析精度が向上する。古い培地を回収後は、速やかに事前に３７℃へ温めた新しい培地を供給する。閉鎖系培養容器に取り付けた流路チューブの一部は、送液と送気の機能を兼ねるため、全体流路回路は簡潔となる。
【実施例１】
【００３１】
以下、本実施例に係る培養容器及び自動培養装置の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。なお、本明細書において、自動培養装置の流路を流れる気体、液体、気体及び液体を総称して流体と呼ぶ場合がある。【００３２】
図１は、閉鎖系培養容器を１０枚培養する時の全体の流路回路図を示したものである。図２は、閉鎖系培養容器の断面図を示したものである。【００３３】
培養対象は、角膜上皮細胞、口腔粘膜細胞、表皮細胞等の上皮系細胞である。閉鎖系培養容器１０１として、上皮系細胞の培養に用いるため、上皮系細胞を培養する層と、上皮系細胞のための成長因子を産出するフィーダー細胞を培養する層から成る、２層構造の培養容器を用いる。なお、閉鎖系培養容器１０１の詳細は図２において説明する。【００３４】
本実施例では２種類の細胞を用いるため、細胞バッグ１０２、１０３は２種類となる。また、細胞播種時において２種類の細胞が混じらないようにするため、播種するための流路回路は分ける。【００３５】
図１を用いて、閉鎖系培養容器を１０枚培養する時の全体流路を説明する。本実施例の自動培養装置は、複数の閉鎖系培養容器１０１（１０１ａ〜１０１ｊ）と、これらの各閉鎖系培養容器１０１の供給側との間に、第二の流路回路（流路チューブ）の導入部１０４を介して細胞バッグ１０３が接続され、第一の流路回路（流路チューブ）の導入部１０５を介して他の細胞バッグ１０２が接続されている。また、これらの閉鎖系培養容器１０１に、第一、第二の流路回路（流路チューブ）の導入部１０４、１０５、複数の二方弁１０６（１０６ａ〜１０６ｆ）、流体移動制御機構部１０８（ａ、ｂ）、多分岐部１０９（ａ、ｂ）を介して、培地バッグ１１１、ヒーター１１２、ガス供給部１１５（ａ、ｂ）、ガス濃度調整部１１６（ａ、ｂ）、フィルタ１１７（ａ、ｂ）が接続されている。流体移動制御機構部１０８は、流体を移動させるポンプとして機能する。また、各閉鎖系培養容器１０１の供給側には、多分岐部１０９（ａ、ｂ）と第二の流路回路の分岐路１２１、第一の流路回路の分岐路１２２、第一の電磁弁１３０（１３０ａ〜１３０ｊ）、第二の電磁弁１３２（１３２ａ〜１３２ｊ）、及び無菌脱着部１１８が設けられている。各閉鎖系培養容器１０１の排出口側は、無菌脱着部１１８を介して第二の流路回路の分岐路１２３、第一の流路回路の分岐路１２４が接続されており、これらの流路回路は、多分岐部１０９（ｃ、ｄ）で各々第二の流路回路の排出部、第一の流路回路の排出部となり、これらの流路回路はさらに、流体移動制御機構部１０８（ｃ、ｄ）、三方弁１０７（ａ、ｂ）を介して、排液バッグ１１３、排液回収バッグ１１４（ａ、ｂ）、及びフィルタ１０７に接続されている。各閉鎖系培養容器１０１は、回転機構１１０によりその位置を任意の角度にすなわち３次元的に回転可能に構成されている。【００３６】
流路回路において、各二方弁１０６、各流体移動制御機構部１０８、各第一の電磁弁１３０、各第二の電磁弁１３２、各三方弁１０７は、予め与えられた制御プロトコルにより、所定のシーケンスに基づいて制御される。これにより、培養容器１０１に対して培地が常に一方向に流れるように、かつ、古い培地を排出後に新しい培地を供給する、流路回路が制御される。【００３７】
すなわち、図１において、細胞バッグ１０３に入れた細胞は、実線で示された第二の流路回路（１０４、１２１、１２３及び排出部）を通過する。細胞バッグ１０２に入れた細胞は、破線で示された第一の流路回路（１０５、１２２、１２４及び排出部）を通過する。細胞播種時は、細胞バッグ１０２、１０３より、それぞれの細胞懸濁液を培養容器１０１まで送液する。所定のシーケンスに基づいて、送液時は、事前に所定の二方弁１０６、三方弁１０７の開閉を行う。そして流体移動制御機構部１０８を作動させ、流量、送液時間を制御しつつ送液する。送液された細胞懸濁液は、多分岐部１０９において、細胞播種を行う培養容器へ分岐する。事前に、送液対象となる培養容器に連結する流路回路に設置された二方弁１０６、三方弁１０７は開いて送液可能な状態にする。【００３８】
一方、送液対象ではない培養容器に連結する流路回路に設置された二方弁１０６、三方弁１０７は、所定のシーケンスに基づいて、閉じて送液不可能な状態にする。細胞播種は、１０個の培養容器に対し、１個ずつ順次実施する。全培養容器の上層及び下層へ細胞播種後、培養容器の下部に取り付けた回転機構１１０を作動させる。細胞播種時及び細胞培養時において培養容器１０１は水平状態を保持しているが、細胞播種直後、培地交換時は、培養容器１０１を傾ける。細胞播種時は連続的に揺動させることにより、播種後の細胞の分布を一様化する。その後、培養容器１０１を水平状態に戻し、その状態で培養を行う。【００３９】
図２を用いて、培養容器１０１の基本的な構成要素を詳細に説明する。培養容器１０１の素材はポリカーボネイト、ポリスチレン、ポリプロピレンなどの可塑性と共に剛性有するプラスチックである。本例では、容器底面の形状が正方形である場合を示している。培養容器１０１は、細胞容器本体２００とこの細胞容器本体に第二の流路回路（流路チューブ）及び第一の流路回路（流路チューブ）を接続するための４つの接続ポートによって構成されている。細胞容器本体２００は、この本体に一体に形成された複数の第二容器２０１と、蓋部２０２と、各第二容器と蓋部２０２との間に挿入される第一容器２０３とで構成されている。各容器の平面形状は例えば円形である。第二容器２０１と蓋部２０２は、各々、射出成形、切削加工等により形成される。第一容器２０３として、例えば、一般に培養において使用されるセルカルチャーインサート容器を、本体２００の内部の各第二容器２０１に挿入可能な構造となっている。セルカルチャーインサート容器は市販のものでよく、ＢＤ社製、コーニング社製、グライナー社製等があり、使用可能な製品は限定されない。培養容器における第一容器２０３は、図２の例ではセルカルチャーインサート容器であり、この第一容器２０３を上層とする。また、本例では第二容器２０１を下層とし、この第二容器２０１は細胞容器本体２００に一体に形成される。第一容器２０３であるセルカルチャーインサート容器では、細胞はセルカルチャーインサート容器の底面上にて播種、培養する。本体部の第二容器２０１及び蓋部２０２側では、細胞は第二容器２０１の底面上にて播種、培養する。【００４０】
細胞容器本体２００の蓋部２０２或いは細胞容器第二容器２０１には、Ｏリング等の弾性部材２０４が設けられる。これにより、細胞容器の外部から、気体や菌等を含む粒子は内部に混入しない。細胞容器の蓋部２０２の本体部２００への接続は、蓋部２０２及び本体部２００に設けられたネジ山同士を嵌合させることにより固定できるが、この方法に限定されるものではない。【００４１】
培養容器の第二容器２０１には、培地供給と、気体すなわち空気/水蒸気等の供給及び排出をするための、接続突起構造２０５をその一端に有する流路（第二供給ポート）２０６と、培地排出をするための、接続突起構造２０７をその一端に有する流路（第二排出ポート）２０８を有する。【００４２】
流路（第二供給ポート）２０６の第二容器２０１への開口位置は、流路（第一排出ポート）２０８の第一容器２０３への開口位置よりも高い位置にある。【００４３】
すなわち、流路（第二供給ポート）２０６の培養容器本体の第二容器２０１における開口位置は、容器内に導入する培養液の量によって変えるべきであるが、導入された培養液面よりも上部であればよい。流路（第二排出ポート）２０８の培養容器の第二容器２０１における開口位置は、細胞容器本体部の第二容器２０１から培地を排出するために使用するため、細胞容器の第二容器２０１の底面と流路２０８の内径最下部が、同じ高さとなるように設置することが望ましい。そうすることで、培養液の排出効率を向上させることが可能となる。図１に示した培養容器を回転機構１１０により適宜傾けつつ培地を排出することで、排出効率はより向上する。【００４４】
培養容器蓋部２０２には、セルカルチャーインサート容器（第一容器）２０３に対し、培地供給と、気体すなわち空気/水蒸気等の供給及び排出をするための、接続突起構造２０９をその一端に有する流路（第一供給ポート）２１０と、培地排出をするための、接続突起構造２１１をその一端に有する流路（第一排出ポート）２１２を有する。流路（第一供給ポート）２１０の第一容器２０３における開口位置は、流路（第一排出ポート）２１２の第一容器２０３における開口位置よりも高い位置にある。【００４５】
すなわち、流路（第一供給ポート）２１０の第一容器２０３における開口位置は、容器内に導入する培養液の量によって変えるべきであるが、導入された培養液面よりも上部であればよい。流路（第一排出ポート）２１２の第一容器２０３の底面における開口位置は、セルカルチャーインサート容器から培地の排出に使用するため、セルカルチャーインサート容器２０３の底面と流路（第一排出ポート）２１２が、近接していることが望ましい。但し近接しすぎると、再生組織の製造において、細胞の増殖に従い流路２１２が接触し、細胞の増殖に対し支障を及ぼす。口腔粘膜細胞の場合、再生組織まで培養すると約数百μｍの高さまで細胞は増殖する。よって、流路２１２は約５００μｍまでセルカルチャーインサート容器２０３の底面まで近接可能である。近接が可能となる距離は、培養対象となる細胞の種類に合わせ、決定すればよい。培養液の排出時は、上層の培地交換時と同様に、培養容器を図１における回転機構１１０により適宜傾けつつ培地を排出することで、排出効率を向上させることが可能である。【００４６】
なお、第一容器２０３の底面２２０には多孔性膜やポアメンブレンが設けられており、該部分を介して第一容器２０３と第二容器２０１間で液体及び気体が相互に移動可能になっている。また、第一容器２０３の上部と第二容器２０１の上部との間には、相互に気体の流通を可能にするギャップ２２２が存在する。なお、図面では便宜上第一容器２０３の側壁にギャップ２２２を表示しているが、第一容器２０３と第二容器２０１とが上部空間で相互に連通するものであれば、その位置や形状に制限はない。【００４７】
このように、細胞を保持、培養するための培養容器１０１は、培地及び細胞、または培地のみを収容する第二容器２０１と、この第二容器内部２０１において、培地及び細胞、または培地のみを収容する第一容器２０３と、当該第二容器を少なくとも封止する蓋部材２０２を有する培養容器であり、この培養容器の外面に流路回路と接続可能な第一の供給ポート２１０、第二の供給ポート２０６、第一の排出ポート２１２、第二の排出ポート２０８を備え、この第一容器２０３への培地の排出または供給、あるいは第二容器２０１からの培地の排出または供給をする場合に、送液を制御する手段により、第一、第二の供給ポートへの連通状態、第一、第二の排出ポートへの連通状態が切り替えられる。後で述べるように、第一供給ポート２１０及び第二供給ポート２０６は、培地を培養容器１０１に対して常に一方向へ流し、気体は双方向に流す機能を有している。【００４８】
培養容器の蓋部２０２に設置した流路２１０及び流路２１２は、細胞観察に支障がないように配置する。細胞観察に支障がないとは、例えば細胞培養容器内を顕微鏡観察する際に、顕微鏡光軸を阻害しない形状を備え、また顕微鏡光軸を阻害しない位置に配置することを意味する。第一、第二の供給ポート（２１０、２０６）、第一、第二の排出ポート（２１２、２０８）は、流路の突起構造サイズに適合した内径を有する、シリコン等の弾性体からなる流路チューブ２１３が接続可能である。これにより、自動培養装置が有する流路回路に対し接続することができる。培養時において、培養容器内には培地２１４が入っている。上層には上皮系細胞２１５を播種し、下層にはフィーダー細胞２１６が播種されている。但し、用途においては別の細胞を播種したり、細胞を播種しないまま培養したりすることもある。細胞を播種しないまま培養する例として、上層に上皮系細胞を播種し、下層には細胞を播種せず培地のみとし培養することで、フィーダー細胞なしに培養可能であることが報告されている。【００４９】
図１に戻り、閉鎖系培養容器を培養する時の全体の流れを説明する。  
培養期間中、培地交換時を所定の日時に実施する。上皮系細胞の場合、１−３日程度に１回の頻度で一般に実施する。培地交換は、１０個の培養容器に対し、１個ずつ順次実施する。最初に、冷蔵庫内に４℃にて保管されている培地バッグ１１１を流体移動制御機構部１０８により培養容器の直前まで送液する。この時、培地バッグ１１１から送液された直後は４℃である培地を、ヒーター１１２により３７℃まで温める。培養容器の周囲は、３７℃に維持された恒温機の中であるため、ヒーター１１２により温めた培地は３７℃を保持する。続いて、培養容器内の培地を培養容器から排出する。流体移動制御機構部１０８により、排液バッグ１１３へ排出する。その時、培地成分分析に必要な排液の一部は、排液回収バッグ１１４において回収する。本実施例では、培養容器１０１の上層及び下層を分けた状態で回収することが可能となっている。また培養容器から古い培地を排出する際には、回転機構１１０により培養容器を傾け、培養容器１０１内の排出口側から古い培地が排出されやすくなるようにする。続いて、事前に培地バッグ１１１より培養容器の直前まで送液し、３７℃に保持された状態の新しい培地を、培養容器へ供給する。【００５０】
細胞播種、培地交換時以外の培養中は、流路回路が設置されている恒温機内の温度を３７℃に維持する。これにより、培養容器内の温度も３７℃に維持する。また、必要に応じＣＯ２等をガス供給部１１５から供給する。濃度はガス濃度調整部１１６にて行う。例えば、培養容器内部へ、ＣＯ２が５％含まれた気体を適宜送気する。培養対象の細胞種、使用している培地の種類に応じて気体組成と送気スケジュールは決定する。加えて、流路回路外部から気体を取り込んだり、流路回路内部の気圧を調整したりする場合は、フィルタ１１７を介して行う。フィルタは、例えば０．２２μｍ以上の粒子を通さない品質のものを使用する。【００５１】
流路回路において培養容器の前後には、無菌脱着部１１８を取り付ける。培養中は、流路チューブと同様に送液が可能である。前日検査等で培養容器を１個のみ取り外し、残りの培養容器は無菌性を維持したまま培養を継続する際、無菌脱着部より培養容器を取り外す。無菌脱着部により取り外した後の流路回路は、培養容器が取り外した場所に残された無菌脱着部により、流路チューブは閉じた状態を維持する。これにより、前日検査のため培養容器を取り外しても、残された培養容器に対して培養を継続可能となる。【００５２】
図３は、図１の全体流路回路図から、１個の閉鎖系培養容器１０１に対して、関連する第一の流路回路（１０５、１２２、１２４）及び第二の流路回路（１０４、１２１、１２３）のみを抽出して示したものである。【００５３】
図１では、多分岐部１０９により、第一の流路回路及び第二の流路回路が、各々、１０個の培養容器へ流路は分岐している。図３では、多分岐部１０９ａ，１０９ｂから１個の培養容器１０１へ流路がつながった場合を示している。【００５４】
図３を用い細胞懸濁液/培地と空気の流れる向きを説明すると、第一の供給ポート２１０、第二供給ポート２０６において、細胞懸濁液/培地は、培養容器の外側から内側への方向のみに流れる。空気は双方的に流れる。一方、第一排出ポート２１２、第二排出ポート２０８においては、細胞懸濁液/培地は、培養容器の内側から外側への方向のみに流れる。流路を構成する部品は、図１同様に示している。即ち、細胞バッグ１０２及び培地バッグ１１１が、第二の流路回路（１０４）、電磁弁１０６ｃ、１０６ｅ、流体移動制御機構部１０８ｂ、第二の流路回路（１２１）、第二の電磁弁１３０ｙを介して閉鎖系培養容器１０１の流路（第二供給ポート）２０６に接続されている。また、細胞バッグ１０３及び培地バッグ１１１が、第一の流路回路（１０５）、電磁弁１０６ｂ、１０６ｄ、流体移動制御機構部１０８ａ、第一の流路回路（１２２）、第一の電磁弁１３２ｘを介して閉鎖系培養容器１０１の流路（第一の供給ポート）２１０に接続されている。一方、閉鎖系培養容器１０１の流路（第二排出ポート）２０８は、第二の流路回路（１２３）、流体移動制御機構部１０８ｄ、三方弁１０７ｂを介して排液バッグ１１３、排液回収バッグ１１４ｂに接続されている。また、閉鎖系培養容器１０１の流路（第一排出ポート）２１２は、第一の流路回路（１２４）、流体移動制御機構部１０８ｃ、三方弁１０７ａを介して排液バッグ１１３、排液回収バッグ１１４ａに接続されている。【００５５】
図４は、閉鎖系培養容器を有する自動培養装置の制御機構を示したブロック図である。制御装置４０２により制御される各構成要素が、恒温機４０３の内部に配置された培養容器４０１に接続される全体の構成を示す図である。なお、恒温槽４０３中に配置されるものは、各実施例で説明する閉鎖系培養容器１０１等の培養容器、或いは自動培養装置内に設置された当該培養容器であることは言うまでもない。【００５６】
図４において、制御装置４０２には、恒温機４０３の温度を制御するための温度調節部４０４と、培養容器内のガス濃度を制御するための、ガス供給部４０５を有するガス濃度調節部４０６と、培養容器内の培養液を自動で交換するための、各流路回路構成要素に接続された流路チューブを有する流体移動制御４０７と、それぞれの構成要素の動作を制御することを目的とした細胞観察用の顕微鏡４０８が接続されている。【００５７】
制御装置４０２と表示画面４１０は、ＣＰＵ（Central Processing Unit；中央処理部）から成る処理部、記憶部や、ディスプレイ装置、キーボードから成る入出力部等を備えた通常のコンピュータの、処理部及び記憶部とディスプレイ装置の表示部にそれぞれ対応している。制御装置４０２は、データベース４１２に保持された情報に基づいて、記憶部で記憶された各種プログラム（制御プロトコルを実行するプログラムを含む）を、処理部としてのＣＰＵ上で動作させる。処理部は、培養容器の上層への細胞播種制御ユニット、培養容器の下層への細胞播種制御ユニット、培養容器の上層への培地交換制御ユニット、培養容器の下層への培地交換制御ユニットとしての機能を備えている。これにより、処理部は、入出力部や、温度調整部４０４、ガス供給部４０５、流体移動制御機構部４０７、顕微鏡４０８、細胞・培地・排液・排液回収バッグ４０９、ガス濃度調整部４１１、及びデータベース４１２からの情報により、恒温機４０３中の培養環境を制御し、培養容器４０１中での所定の培養工程を実施する。【００５８】
データベース４１２には、第一の流路回路及び第二の流路回路に設けられた二方弁１０６、三方弁１０７、流体移動制御機構部１０８、第一の電磁弁１３０、第二の電磁弁１３２等について、各々のオン、オフのタイミングやオン状態の時間に関する情報を与えるテーブルが格納されている。このテーブルの情報に基づき、細胞・培地・排液・排液回収の各バッグと、第二の流路回路及び第一の流路回路と、培養容器の第一、第二の供給ポートとの連通状態、第一、第二の排出ポートとの連通状態が、培養手順に従い、順次切り替えられる。これにより、第一の流路回路及び第二の流路回路と第一の供給ポート２１０、第二供給ポート２０６間における、細胞懸濁液/培地と空気の流れる向きやそのタイミングが制御される。すなわち、細胞懸濁液/培地は、培養容器の第一、第二の供給ポートに対して、外側から内側への方向のみに流れ、空気は双方的に流れる。一方、第一排出ポート２１２、第二排出ポート２０８に関しては、細胞懸濁液/培地、及び空気が、培養容器の内側から外側への方向のみに流れる。【００５９】
ガス濃度調節部４１１は、培養容器４０１に直接接続されている必要はない。温度調節部４０４、ガス濃度調節部４１１が恒温機４０３に接続された構成でも構わない。この構成の場合、細胞培養容器４０１へは容器外から気体を供給する必要があるため、細胞培養容器４０１の蓋部の一部に、ポリカーボネイトやポリスチレン、ポリメチルペンテン等のガス透過性を有した透明な薄膜を溶着し、細胞培養容器４０１内部のガス交換を可能とすることで、細胞培養を可能とすることができる。【００６０】
図５は、本実施例の自動培養装置を用いて細胞の培養を実施する一連の制御フローを示したものである。【００６１】
本実施例の自動培養装置を用い、細胞を培養する時の一連の培養手順の概要について説明する。図５は、自動培養装置の動作を説明するためのフローチャートである。【００６２】
まず、自動培養装置を起動させ（ステップＳ１）、スケジュール決定する（ステップＳ２）。さらに、適切な二方弁及び三方弁の開閉を行った後、流体移動制御機構部を作動させ、培養容器へ播種を行い（ステップＳ３）、培養容器で細胞の培養（ステップＳ４）、及び、顕微鏡による観察を行う（ステップＳ５）。細胞が正常な状態か判定し（ステップＳ６）、正常であれば培養容器の培地交換を行う（ステップＳ７）。その後、検査用組織の回収（ステップＳ８、Ｓ９）、及び、移植直前の培養及び培地交換を行う（ステップＳ１０）を行う。さらに、移植用組織の回収（ステップＳ１１）を行い、一連の処理を終了する（ステップＳ１２）。【００６３】
次に、培養容器で細胞の培養（ステップＳ４）、培地交換（ステップＳ７）、及び、移植直前の培養及び培地交換（ステップＳ１０）に関し、自動培養装置の制御プロトコルを説明する。【００６４】
まず、制御装置４０２の処理部の培養容器の上層への細胞播種制御ユニットを用いて行われる、閉鎖系培養容器の上層への播種について説明する。  
図６は、データベース４１２に保持された、閉鎖系培養容器の上層への播種時制御用のテーブル６００の一例を示す図である。図中、黒丸印が電磁弁の開（オン）及びポンプの動作状態、×印が電磁弁の閉（オフ）及びポンプの停止状態を示している（以下、同じ）。テーブル６００で与えられる所定のシーケンスに従い、制御装置４０２により、１０個の閉鎖系培養容器１０１（１０１ａ〜１０１ｊ）の各々の上層への播種のために、二方弁１０６、三方弁１０７、流体移動制御機構部（チューブポンプ）１０８、第一の電磁弁１３０、第二の電磁弁１３２等が制御される。例えば、培養容器１０１ａの上層に対する播種のために、流体の流速を４ｍｌ／秒とし、３０秒かけて各弁やポンプを順次制御し培養容器１０１ａの上層に２ｍｌの細胞懸濁液を供給する。それに続いて、培養容器１０１ｂの上層に対する播種のために、同様に３０秒かけて各弁やポンプを順次制御する一連の処理がなされ、培養容器１０１ｂの上層に２ｍｌの細胞懸濁液を供給する。以下、同様にして、処理され、最後に、培養容器１０１ｊの上層への播種のための処理がなされる。なお、ここで示した流速等の数値はあくまでも一例であることは言うまでもない。【００６５】
図７は、１個の閉鎖系培養容器に対し、テーブル６００に従い形成される流路回路と、それによる細胞播種時の培地及び空気の流れを示したものである。ここでは、わかり易くするために、図３で示した１個の閉鎖系培養容器１０１ａに対する流路回路図を用い、細胞播種時の送液制御プロトコルを示している。本図では細胞播種を上層、下層の順に実施しているが、その順番は任意である。【００６６】
細胞バッグ１０２が、第一の流路回路（１０５）、電磁弁１０６ｂ、流体移動制御機構部１０８ａ、第一の流路回路（１２２）、第二の電磁弁１３２ａを介して閉鎖系培養容器１０１の流路（第一供給ポート）２１０に接続され、上層の第一容器２０３に対して細胞播種が実施される。この時、下層の第二容器２０１は、その流路（第二供給ポート）２０６が第二の流路回路（１２１）、第一の電磁弁１３０ｂ、流体移動制御機構部１０８ｂ、第二の流路回路（１０４）、電磁弁１０６ａを介してフィルタ１１７ａに接続される。第一容器２０３の上部と第二容器２０１の上部との間には、相互に気体の流通を可能にするギャップ２２２が存在するので、第一容器２０３内の気体は第二の流路回路及びフィルタ１１７ａを介して排気される。【００６７】
すなわち、図７に示すように、細胞バッグ１０２から流路２１０を経由してセルカルチャーインサート容器内へ送液する。この時同時に、流路（第二供給ポート）２０６より培養容器内の空気を培養容器外へ排出する。空気は、最終的にフィルタ１１７ａより流路外へ排出する。この時、事前に培地及び空気が流れる流路上の二方弁はあらかじめ開いた状態にする。それ以外のものは閉じた状態にする。その状態で、流体移動制御機構部１０８ｂ、１０８ａを作動させることで送液及び送気を実施する。所定量を送液し終えたら終了する。このようにして、細胞バッグ１０２から第一容器２０３に対する細胞播種は、スムーズに実行される。【００６８】
他の閉鎖系培養容器１０１ｂ〜１０１ｊに対しても、同様にして、電磁弁１０６、流体移動制御機構部１０８、第一の電磁弁１３０、第二の電磁弁１３２を順次、開閉制御し、各々の閉鎖系培養容器の上層に対して、第一の流路回路、第二の流路回路を形成し、細胞播種を実施する。【００６９】
次に、処理部の培養容器の下層への細胞播種制御ユニットを用いて行われる、閉鎖系培養容器の下層への播種について説明する。  
図８は、閉鎖系培養容器１０１の下層への播種時制御用のテーブル８００の一例を示す図である。テーブル８００で与えられる所定のシーケンスに従い、制御装置４０２により、１０個の閉鎖系培養容器１０１（１０１ａ〜１０１ｊ）の各々の下層への播種のために、二方弁１０６、三方弁１０７、流体移動制御機構部１０８、第一の電磁弁１３０、第二の電磁弁１３２が制御される。例えば、培養容器１０１ａの下層に対する播種のために、流体の流速を４ｍｌ／秒とし、各弁やポンプを順次制御し４５秒かけて培養容器１０１ａの下層に３ｍｌの細胞懸濁液を供給する。次の培養容器１０１ｂにも、同様に各弁やポンプを順次制御し、４５秒かけて一連の処理を行い３ｍｌの細胞懸濁液を供給する。以下、同様にして、処理され、最後に、培養容器１０１ｊの下層への播種のための処理がなされる。【００７０】
図９は、１個の閉鎖系培養容器に対し、テーブル８００に従い形成される流路回路と、それによる細胞播種時の培地及び空気の流れを示したものである。ここでは、わかり易くするために、図３で示した１個の閉鎖系培養容器１０１ａに対する流路回路図を用い、細胞播種時の送液制御プロトコルを示している。【００７１】
第二の胞バッグ１０３が、第二の流路回路（１０４）、電磁弁１０６ｃ、流体移動制御機構部１０８ｂ、第二の流路回路（１２１）、第一の電磁弁１３０ｂを介して閉鎖系培養容器１０１の流路（第二供給ポート）２０６に接続され、下層の第二容器２０１に対して細胞播種が実施される。この時、上層の第一容器２０３は、その流路（第一供給ポート）２１０が第一の流路回路（１２２）、第二の電磁弁１３２ａ、流体移動制御機構部１０８ａ、第一の流路回路（１０５）、電磁弁１０６ｆを介してフィルタ１１７ｂに接続される。第一容器２０３の上部と第二容器２０１の上部との間には、相互に気体の流通を可能にするギャップ２２２が存在するので、第二容器２０３内の気体は第一の流路回路及びフィルタ１１７ｂを介して排気される。【００７２】
すなわち、図９に示すように、細胞バッグ１０３から流路（第二供給ポート）２０６を経由して培養容器本体部の第二容器２０１内へ送液する。この時同時に、流路（第一供給ポート）２１０より培養容器内の空気を培養容器外へ排出する。空気は、最終的にフィルタ１１７ｂより流路外へ排出する。この時、事前に培地及び空気が流れる流路上の二方弁はあらかじめ開いた状態にする。それ以外のものは閉じた状態にする。その状態で、流体移動制御機構部１０８ｂ、１０８ａを作動させることで送液及び送気を実施する。所定量を送液し終えたら終了する。このようにして、第二の細胞バッグ１０３から第二容器２０１に対する細胞播種は、スムーズに実行される。【００７３】
他の閉鎖系培養容器１０１ｂ〜１０１ｊに対しても、同様にして、電磁弁１０６、流体移動制御機構部１０８、第一の電磁弁１３０、第二の電磁弁１３２を順次、開閉制御し、各々の閉鎖系培養容器の下層に対して、第一の流路回路、第二の流路回路を形成し、細胞播種を実施する。【００７４】
次に、第１の実施例における、制御部の培養容器の上層への培地交換制御ユニットを用いて行われる、閉鎖系培養容器１０１の上層への培地交換について説明する。  
図１０は、閉鎖系培養容器の上層への培地交換制御用のテーブル１０００の一例を示す図である。【００７５】
このテーブル１０００で与えられる所定のシーケンスに従い、制御装置４０２により、１０個の閉鎖系培養容器１０１（１０１ａ〜１０１ｊ）の各々の上層の培地交換のために、二方弁１０６、三方弁１０７、流体移動制御機構部１０８、第一の電磁弁１３０、第二の電磁弁１３２が制御される。【００７６】
図１１Ａ〜図１１Ｄは、１個の閉鎖系培養容器１０１に対し、テーブル１０００に従い形成される流路回路と、それによる上層の培地交換時の培地及び空気の流れを示したものである。【００７７】
培地交換の対象は、上層であるセルカルチャーインサート容器と、下層である培養容器本体部の第二容器である。基本的には培地交換において、両方の培地を交換する。しかし装置使用者の設定により、片方のみの培地を交換することも可能である。また、両方の培地を交換する場合において、上層と下層を交換する順番は任意である。【００７８】
まず、上層を交換する制御プロトコルについて説明する。培地バッグ１１１が、第一の流路回路（１０５）、電磁弁１０６ｄ、流体移動制御機構部１０８ａ、第一の流路回路（１２２）、第二の電磁弁１３２ａを介して閉鎖系培養容器１０１の流路（第一供給ポート）２１０に接続され、さらに上層の第二容器２０３に接続される。他方、下層の第一容器２０１は、その流路（第二供給ポート）２０６が第二の流路回路（１２１）、第一の電磁弁１３０ｂ、流体移動制御機構部１０８ｂ、第二の流路回路（１０４）、電磁弁１０６ａを介してフィルタ１１７ａに接続される。第一容器２０３の上部と第二容器２０１の上部との間には、相互に気体の流通を可能にするギャップ２２２が存在するので、第二容器２０３内の気体は第一の流路回路及びフィルタ１１７ｂを介して排気される。【００７９】
すなわち、図１１Ａに示すように、培地バッグ１１１からセルカルチャーインサート容器内の流路（第一供給ポート）２１０の接続突起構造２０９まで送液する。この時、同時に、流路２０６より培養容器内の空気を培養容器外へ排出する。空気は、最終的にフィルタ１１７ａより流路外へ排出する。この時、事前に培地及び空気が流れる流路上の二方弁はあらかじめ開いた状態にする。それ以外のものは閉じた状態にする。その状態で、流体移動制御機構部１０８ｂ、１０８ａを作動させることで送液及び送気を実施する。また、培地バッグ１１１は冷蔵庫内に設置するため、培地バッグから送液した直後の培地は４℃であるが、ヒーター１１２により３７℃まで加温し、培養容器等が設置された恒温機内にて３７℃にて維持する。【００８０】
培地バッグ１１１から第一の流路回路１２２を経て容器１０１の流路（第一供給ポート）２１０の接続突起構造２０９まで培地を送液した状態で、送液を一旦停止する。すなわち、テーブル１０００に従い、第一の流路回路の供給側の各電磁弁を閉じ、ポンプを停止させることで、第一の流路回路内の培地の先端は、接続突起構造２０９付近に維持される。なお、この停止位置は、用途によって、適宜変更すれば良い。【００８１】
この状態で、次に、図１１Ｂに示すように、セルカルチャーインサート容器内の培養に用いた古い培地を、流路（第一排出ポート）２１２から排出する。この場合、下層の第一容器２０１は、その流路２０６が第一の流路回路（１２１）、第一の電磁弁１３０ｂ、流体移動制御機構部１０８ｂ、第一の流路回路（１０４）、電磁弁１０６ａを介してフィルタ１１７ａに接続されている。他方、閉鎖系培養容器１０１の流路（第一排出ポート）２１２は、第二の流路回路（１２４）、流体移動制御機構部１０８ｃ、三方弁１０７ａを介して排液バッグ１１３、排液回収バッグ１１４ａに接続される。【００８２】
これにより、第一の流路回路（１０４）流入した空気が第二供給ポート２０６から培養容器１０１内へ供給される。空気は、最終的にフィルタ１１７ａから流路２０６内へ供給する。この時、事前に培地及び空気が流れる流路上の二方弁及び三方弁は、テーブル１０００に従い、あらかじめ開いた状態にする。すなわち、閉鎖系培養容器１０１の流路（第一排出ポート）２１２が、第一の流路回路（１２４）、流体移動制御機構部１０８ｃ、三方弁１０７ａを介して排液バッグ１１３、排液回収バッグ１１４ａに接続されている。それ以外のものは閉じた状態にする。その状態で、流体移動制御機構部１０８ｂ、１０８ｄを作動させることで培養容器１０１から排液バッグ１１３、排液回収バッグ１１ａＡへの排液、及びフィルタ１１７ａから培養容器１０１への送気を実施する。排液は、上層の第一容器２０３にある古い培地が全量、上層から排出された時点で終了する。古い配置は最終的に排液バッグ１１３または排液回収バッグ１１４ａへ排出されるが、培養容器１０１内の全量に対し排液を完了する必要はない。【００８３】
培養容器１０１からの古い培地の排出に続いて、図１１Ｃに示すように、培地バッグ１１１からセルカルチャーインサート容器内の接続突起構造２０９まで送液し、３７℃にて待機させていた新しい培地を、上層の第一容器２０３へ供給する。すなわち、図１１Ａで述べたように、培地バッグ１１１から容器１０１の流路（第一供給ポート）２１０の接続突起構造２０９まで供給されこの状態で待機していた培地を、上層の第一容器２０３に送液する。この第一容器２０３への培地の送液と同時に、流路２０６より培養容器内の空気を培養容器外へ排出する。空気は、最終的にフィルタ１１７aより流路外へ排出する。この時、事前に培地及び空気が流れる流路上の二方弁は、テーブル１０００に従い、あらかじめ開いた状態にする。それ以外のものは閉じた状態にする。その状態で、流体移動制御機構部１０８ｂ、１０８ａを作動させることで送液及び送気を実施する。【００８４】
最後に、図１１Ｄに示すように、流路（第一排出ポート）２１２と排液バッグ１１３または排液回収バッグ１１４ｂの間に残存している古い培地を、排液バッグ１１３または排液回収バッグ１１４ｂへ排出する。この時同時に、流路（第一供給ポート）２１０より空気を培養容器１０１内へ供給する。空気は、最終的にフィルタ１１７aから流路内へ供給する。この時、事前に培地及び空気が流れる流路上の二方弁及び三方弁はテーブル１０００に従い、あらかじめ開いた状態にする。それ以外のものは閉じた状態にする。その状態で、流体移動制御機構部１０８ｂ、１０８ｄを作動させることで排液及び送気を実施する。排液は、上層にある古い培地が全量、排液バッグ１１３または排液回収バッグ１１４ｂへ排出された時点で終了する。【００８５】
次に、制御部の培養容器の下層への培地交換制御ユニットを用いて行われる、閉鎖系培養容器の下層への培地交換について説明する。  
図１２は、第１の実施例における、閉鎖系培養容器の下層への培地交換制御用のテーブル１２００の一例を示す図である。【００８６】
このテーブル１２００で与えられる所定のシーケンスに従い、制御装置４０２により、１０個の閉鎖系培養容器１０１（１０１ａ〜１０１ｊ）の各々の下層の培地交換のために、二方弁１０６、三方弁１０７、流体移動制御機構部１０８、第一の電磁弁１３０、第二の電磁弁１３２が、制御される。【００８７】
図１３Ａ〜図１３Ｄは、１個の閉鎖系培養容器１０１に対し、テーブル１２００に従い形成される流路回路と、それによる下層の培地交換時の培地及び空気の流れを示したものである。【００８８】
まず、図１３Ａに示すように、培地バッグ１１１から第二の流路回路１０４、１２１を介して培養容器１０１の本体部の第二容器２０１内の流路（第二供給ポート）２０６の接続突起構造２０５まで送液する。そして、この状態で、送液を一旦停止する。すなわち、テーブル１２００に従い、第二の流路回路の供給側の各電磁弁を閉じ、ポンプを停止させることで、第二の流路回路内の培地の先端は、接続突起構造２０５付近に維持される。なお、この停止位置は、用途によって、適宜変更すれば良い。この時同時に、培養容器１０１内の空気を流路（第一供給ポート）２１０から第一の流路回路１２２を介して培養容器外へ排出する。空気は、最終的にフィルタ１１７bより流路外へ排出する。この時、テーブル１２００に基づき、事前に培地及び空気が流れる流路上の二方弁は、あらかじめ開いた状態にする。それ以外のものは閉じた状態にする。その状態で、流体移動制御機構部１０８ｂ、１０８ａを作動させることで送液及び送気を実施する。また、培地バッグは冷蔵庫内に設置するため、培地バッグから送液した直後の培地は４℃であるが、ヒーター１１２により３７℃まで加温し、培養容器等が設置された恒温機内にて３７℃にて維持する。【００８９】
次に、図１３Ｂに示すように、培養容器１０１の本体部の第二容器２０１内の培養に用いた古い培地を、流路（第二排出ポート）２０８から第二の流路回路１２３を介して排液バッグ１１３または排液回収バッグ１１４ａへ排出する。この時同時に、第一の流路回路１２２を介して流路（第一供給ポート）２１０から空気を培養容器１０１内へ供給する。空気は、最終的にフィルタ１１７bから流路内へ供給する。この時、テーブル１２００に基づき、事前に培地及び空気が流れる流路上の二方弁及び三方弁はあらかじめ開いた状態にする。それ以外のものは閉じた状態にする。その状態で、流体移動制御機構部１０８ａ、１０８ｄを作動させることで排液及び送気を実施する。排液は、下層にある古い培地が全量、下層から排出された時点で終了する。古い配置は最終的に排液バッグ１１３または排液回収バッグ１１４ａへ排出されるが、全量に対し完了する必要はない。【００９０】
続いて、図１３Ｃに示すように、予め、培地バッグ１１１から３７℃にて培養容器本体部の第二容器２０１内の流路（第二供給ポート）２０６の接続突起構造２０５まで送液し該部分に待機させていた新しい培地を、下層２０１へ供給する。この時同時に、流路（第一供給ポート）２１０より培養容器内の空気を第一の流路回路１２３を介して培養容器外へ排出する。空気は、最終的にフィルタ１１７bより流路外へ排出する。この時、事前に培地及び空気が流れる流路上の二方弁はあらかじめ開いた状態にする。それ以外のものは閉じた状態にする。その状態で、流体移動制御機構部１０８ｂ、１０８ａを作動させることで送液及び送気を実施する。【００９１】
最後に、図１３Ｄに示すように、流路（第二排出ポート）２０８と排液バッグ１１３または排液回収バッグ１１４ａの間に残存している古い培地を、排液バッグ１１３または排液回収バッグ１１４ａへ排出する。この時同時に、流路２０６より空気を培養容器内へ供給する。空気は、最終的にフィルタ１１７bから流路内へ供給する。この時、テーブル１２００に基づき、事前に培地及び空気が流れる流路上の二方弁及び三方弁はあらかじめ開いた状態にする。それ以外のものは閉じた状態にする。その状態で、流体移動制御機構部１０８ａ、１０８ｄを作動させることで排液及び送気を実施する。排液は、下層にある古い培地が全量、排液バッグ１１３または排液回収バッグ１１４ａへ排出された時点で終了する。【００９２】
本実施例によれば、細胞播種工程及び培地交換工程において、培地は常に一方向に流れるので古い培地が新しい培地に混入せず、培養の再現性が向上する。培地交換時に古い培地を全て排出した後に新しい培地が速やかに供給される。しかも、閉鎖系培養容器に取り付けた流路チューブの一部は、送液と送気の機能を兼ねるため、全体流路回路は簡潔となる。【００９３】
以上述べた本実施例の自動培養装置おける一連の処理の詳細を、図５の制御フローを参照しながら、まとめて説明する。尚、使用する培養容器の数を増やす場合は、流路の多分岐部において、並列に培養容器を並べればよい。またその場合の培養手順は、以下に示すＳ１〜Ｓ１２の操作を各培養容器に対して順々に実施すればよい。【００９４】
＜ステップＳ１：スタート＞
まず、図５に示すように、自動培養装置を起動させる。操作者が制御装置にある操作部のスタートスイッチを押すことにより起動する。尚、この時点で流路回路等は事前に自動培養装置へ設置されている。制御部のディスプレイの操作画面において、自動培養装置の内部環境として適切な値であることを確認する。例えば、恒温機の温度が３７℃であることを確認する。これらの数値は限定的なものでなく、例えば温度は、０℃から４５℃の範囲より選択可能である。また装置の内部は、事前の適切な操作により、滅菌ガスによる滅菌或いはエタノールによる消毒が施され、清浄な状態となっている。また、培養に用いる流路部に対しても事前に滅菌を施してある。【００９５】
＜ステップＳ２：スケジュール決定＞
培養する細胞の種類と量に合わせ、自動培養装置により実施する自動培養スケジュールを決定する。細胞播種、培地交換、顕微鏡観察、排液回収、検査用組織回収、移植用組織回収等の操作を行う日時、頻度、液量等の条件を、制御部の操作部より入力する。【００９６】
＜ステップＳ３：細胞播種＞
適切な二方弁及び三方弁の開閉を行った後、
流体移動制御機構部を作動させ、細胞バッグより細胞懸濁液を吸引する。細胞懸濁液は、食道粘膜再生の例では口腔粘膜細胞を培養するため、ＫＣＭ培地（keratinocyte culture medium）に懸濁した口腔粘膜細胞と、同じくＫＣＭ培地に懸濁した３Ｔ３−Ｊ２細胞である。流体移動制御機構部を駆動させることにより、エアフィルタを介して流路外へ流路内の空気を排出しつつ、細胞懸濁液を吸引する。そして培養容器へ播種する。細胞播種は、各培養容器のそれぞれの上層及び下層へ、順次実施する。播種後、回転機構により培養容器を複数回揺動させることにより、培養表面上の細胞分布が均一となるようにする。【００９７】
＜ステップＳ４：細胞の培養＞
培養容器を水平に静置した状態で所定時間、培養する。例として口腔粘膜細胞の場合、静置期間は播種後５日間程度とする。培養中は、恒温機により培養容器の周囲環境を３７℃に維持する。また、必要に応じ培養容器の内部へ所定成分の気体を送気する。口腔粘膜細胞の培養の場合、ＣＯ２濃度は５％、湿度は１００％に維持する。自動培養装置内部の空気はファンにより常に攪拌し、温度分布が常に一様となるようにする。【００９８】
＜ステップＳ５：顕微鏡による観察＞
自動培養装置内に設置した顕微鏡を用い、細胞画像を取得する。自動培養装置内に設置した光源を適宜発光させ、顕微鏡により細胞に焦点を合わせ、撮像する。必要に応じ、培養表面に定点を任意に定め、撮影する。取得した細胞画像はデータベースに保存し、自動培養装置の外部に設置したディスプレイ上で必要に応じ閲覧できるようにする。顕微鏡観察により得た細胞の生育状態に関する情報から判断し、培地交換の頻度、時期の調整を行う。例えば細胞の接着が不十分な場合、Ｓ６の培地交換は実施せず、Ｓ４の細胞の培養を継続する。【００９９】
＜ステップＳ６：培地交換＞
培地交換は、一般に数日に一度の頻度で実施する。細胞の生育状況に応じ、頻度は調整を行う。適切な電磁弁の開閉を行った後、流体移動制御機構部を作動させ、流体移動制御機構部を駆動させることにより培地バッグより培地を吸引する。同時に、フィルタを介して流路外へ流路内の空気を排出する。培地バッグから送液された直後の培地は４℃であるが、ヒーター及び恒温機内の気相により、培地の温度は３７℃を維持した状態で次の工程に進む。【０１００】
続いて、培養容器から古い培地を排出する。この時、回転機構により培養容器を傾け、古い培地の全量が排出されるようにする。排出後、速やかに、３７℃に維持されている新しい培地を培養容器内へ供給する。これにより、培養表面上の細胞の乾燥と、培養表面の温度低下を回避する。【０１０１】
培養容器から排出した古い培地は、一部を排液回収バッグへ、残りを排液バッグへ送液する。回収した古い培地は、別途用意する培地成分分析装置により培地成分分析を用い、細胞の生育状況を評価する。例えば、細胞が生育時に用いるグルコースと排出する乳酸の量を測定し、細胞の生育状態を把握する。また、マイコプラズマ試験等を実施し、培地が汚染されていないか判定する。汚染があった場合には培養を直ちに終了し、自動培養装置の設置場所が汚染されないよう、細胞を適切な操作により無菌的に破棄する。【０１０２】
＜ステップＳ７：検査用組織の回収＞
移植予定日の前日に、培養中の培養容器のうち１枚を検査用に回収する。あらかじめ流路内に組み込まれた無菌脱着部を用い、培養容器を無菌的に取り外す。そして回収した培養容器において、中の細胞の状態が移植に適した質を有するか検査を行う。例えば口腔粘膜細胞による再生組織の場合、組織学的評価により３層程度の重層化した構造を有するか、免疫組織化学染色評価により口腔粘膜幹細胞が再生組織の基底層に存在するか、口腔粘膜細胞特異的タンパク質を発現しているか等の評価を行う。【０１０３】
＜ステップＳ８：移植直前の培養及び培地交換＞
ステップＳ４と同じ操作による培養を行う。そしてステップＳ９を実施する直前に、ステップＳ６と同じ操作による培地交換を行う。【０１０４】
＜ステップＳ９：移植用組織の回収＞
ステップＳ７による評価の結果、移植に適した再生組織が培養できていると判断がついた場合、移植用として組織を回収して再生医療治療に用いる。Ｓ７と同様に、無菌脱着部を用い培養容器を取り外す。その後、再生医療治療を行う手術室へ、無菌性と生物学的な質を維持した状態で搬送し、治療に用いる。【０１０５】
＜ステップＳ１０：終了＞
培養に用いた流路部を取り外す。続いて、装置の内部へ適切な操作により、滅菌ガスによる滅菌或いはエタノールによる消毒を施し、清浄な状態にする。自動培養装置の各種ソフトを終了させ、自動培養装置の作動を終了させる。【０１０６】
以上、本発明の実施の形態の一例を図面に従い説明したが、本発明はこれら実施例に限定されるものでないこと明らかである。例えば実施例において、流体を移動させる流体移動制御機構部としてペリスタルティック・ポンプを想定しているが、シリンジ・ポンプ等の他の駆動機構を用いても良いことは言うまでもない。【０１０７】
以上のように構成された自動培養装置の好適な実施形態によれば、細胞播種工程及び培地交換工程において、培地は常に一方向に流れる。全量を交換する培地交換において、古い培地が新しい培地に混入しないようにするため、培養の再現性が向上する。回収した古い培地を用いた培地成分分析の分析精度が向上する。古い培地を回収後は、速やかに事前に３７℃へ温めた新しい培地を供給する。閉鎖系培養容器に取り付けた流路チューブの一部は、送液と送気の機能を兼ねるため、全体流路回路は簡潔となる。
【実施例２】
【０１０８】
次に、本発明の第２の実施例を説明する。図１４は、本発明の第２の実施例に係る、閉鎖系培養容器の断面図である。【０１０９】
本例では、閉鎖系培養容器１０１が、細胞容器本体２００に一体的に形成された複数の第一容器２０３及び複数の第二容器２０１と、蓋部２０２Ａ、２０２Ｂとで構成されている。第一容器２０３と第二容器２０１は対をなし、各容器の平面形状は例えば半円形や方形である。一対の第一容器２０３と第二容器２０１とは、水平方向に並んで配置され、第一容器２０３と第二容器２０１間には隔壁２２０が設けられている。第一容器２０３と第二容器２０１、及び蓋部２０２は、各々、射出成形、切削加工等により形成される。この隔壁２２０には多孔性膜やポアメンブレンが設けられており、該部分を介して第一容器２０３と第二容器２０１間で液体及び気体が相互に移動可能になっている。また、第一容器２０３の上部と第二容器２０１の上部との間には、相互に気体の流通を可能にするギャップ２２２が存在する。上皮系細胞２１５、フィーダー細胞２１６は各容器の底面上にて播種、培養する。【０１１０】
このように、細胞を保持、培養するための培養容器１０１は、培地及び細胞、または培地のみを収容する第二容器２０１と、培地及び細胞、または培地のみを収容する第一容器２０３と、当該第二容器を少なくとも封止する蓋部材２０２を有し、対をなす第一容器２０３と第二容器２０１とが、水平方向に並んで配置された培養容器である。そして、この培養容器の外面に流路回路と接続可能な第一の供給ポート２１０、第二の供給ポート２０６、第一の排出ポート２１２、第二の排出ポート２０８を備え、この第一容器２０３への培地の排出または供給、あるいは第二容器２０１からの培地の排出または供給をする場合に、送液を制御する手段により、第一、第二の供給ポートへの連通状態、第一、第二の排出ポートへの連通状態が切り替えられる。すなわち、第一容器２０３に対して第一の供給ポート２１０と第一の排出ポート２１２が設けられ、第二容器２０１に対して第二の供給ポート２０６と第二の排出ポート２０８が設けられている。細胞容器本体２００の蓋部２０２或いは細胞容器第二容器２０１、２０３には、Ｏリング等の弾性部材２０４が設けられる。【０１１１】
流路（第一供給ポート）２１０の第一容器２０３における位置は、容器内に導入する培養液の量によって変えるべきであるが、導入された培養液面よりも上部であればよい。流路（第一排出ポート）２１２の第一容器２０３の底面における位置は、容器から培地の排出に使用するため、第一容器２０３の底面と流路（第一排出ポート）２１２が、近接していることが望ましい。流路（第一排出ポート）２１２の容器２０２の底面における位置は、セ容器から培地の排出に使用するため、容器２０２の底面と流路（第一排出ポート）２１２が、近接していることが望ましい。流路（第二供給ポート）２０６の培養容器本体の第二容器２０１における位置は、容器内に導入する培養液の量によって変えるべきであるが、導入された培養液面よりも上部であればよい。流路（第二排出ポート）２０８の培養容器の第二容器２０１における位置は、細胞容器本体部の第二容器２０１から培地を排出するために使用するため、細胞容器の第二容器２０１の底面と流路２０８の内径最下部が、同じ高さとなるように設置することが望ましい。【０１１２】
この実施例でも、実施例１と同様に、第一の供給ポート２１０、第二供給ポート２０６において、細胞懸濁液/培地は、培養容器の外側から内側への方向のみに流れる。空気は双方的に流れる。一方、第一排出ポート２１２、第二排出ポート２０８においては、細胞懸濁液/培地、及び空気は、培養容器の内側から外側への方向のみに流れる
本実施例の閉鎖系培養容器１０１を実施例１の培養容器に置き換え、実施例１の自動培養装置に組み込んで使用することで、実施例１と同様な効果が得られる。すなわち、細胞播種工程及び培地交換工程において、培地は常に一方向に流れるので、古い培地が新しい培地に混入せず、培養の再現性が向上する。しかも、閉鎖系培養容器に取り付けた流路チューブの一部は、送液と送気の機能を兼ねるため、全体流路回路は簡潔となる。
【実施例３】
【０１１３】
次に、本発明の第３の実施例を説明する。図１５は、本発明の第３の実施例に係る、自動培養装置の全体流路回路図である。本実施例は、閉鎖系培養容器１０１として実施例１に示したものと同じ構成の閉鎖系培養容器を１個のみを用いて、自動培養装置を構成したものである。培養容器１０１の外面に流路回路と接続可能な第一の供給ポート２１０、第二の供給ポート２０６、第一の排出ポート２１２、第二の排出ポート２０８を備え、この第一容器２０３への培地の排出または供給、あるいは第二容器２０１からの培地の排出または供給をする場合に、送液を制御する手段により、第一、第二の供給ポートへの連通状態、第一、第二の排出ポートへの連通状態が切り替えられる。この実施例でも、実施例１と同様に、第一の供給ポート２１０、第二供給ポート２０６において、細胞懸濁液/培地は、培養容器１０１の外側から内側への方向のみに流れる。空気は双方的に流れる。一方、第一排出ポート２１２、第二排出ポート２０８においては、細胞懸濁液/培地及び空気は、培養容器の内側から外側への方向のみに流れる。【０１１４】
本実施例の閉鎖系培養容器１０１を実施例１の培養容器に置き換え、実施例１の自動培養装置に組み込んで使用することで、実施例１と同様な効果が得られる。特に、１個の培養容器１０１のみを使用したい用途に適している。【０１１５】
以上、各実施例で述べたとおり、本発明は、培養容器を用いて細胞又は組織を自動操作により培養する自動培養装置、特に再生医療に使用可能な再生組織を製造することのできる自動培養装置として有用である。
【符号の説明】
【０１１６】
１０１…培養容器
１０２…細胞バッグ
１０３…細胞バッグ
１０４…第二の流路回路（導入部）
１０５…第一の流路回路（導入部）
１０６…二方弁
１０７…三方弁
１０８…流体移動制御機構部
１０９…多分岐部
１１０…回転機構
１１１…培地バッグ
１１２…ヒーター
１１３…排液バッグ
１１４…排液回収バッグ
１１５…ガス供給部
１１６…ガス濃度調整部
１１７…フィルタ      
１１８…無菌脱着部
１２１…第二の流路回路（分岐路）
１２２…第一の流路回路（分岐路）
１２３…第二の流路回路（分岐路）
１２４…第一の流路回路（分岐路）
１３０…第一の電磁弁
１３２…第二の電磁弁
２００…細胞容器本体
２０１…第二容器
２０２…細胞容器蓋部
２０３…第一容器（セルカルチャーインサート容器）
２０４…弾性部材
２０５、２０７、２０９、２１１、２１３…接続突起構造
２０６…流路（第二供給ポート）
２０８…流路（第二排出ポート）
２１０…流路（第一供給ポート）
２１２…流路（第一排出ポート）
２１４…培地
２１５…上皮系細胞
２１６…フィーダー細胞
４０１…培養容器
４０２…制御装置
４０３…恒温機
４０４…温度調節部
４０５…ガス供給部
４０６…ガス濃度調節部
４０７…流体移動制御
４０８…顕微鏡
４０９…細胞・培地・排液・排液回収バッグ
４１０…表示画面
４１１…ガス濃度調整部
４１２…データベース
６００…テーブル。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４】
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【図１５】
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