(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
気道のウイルス感染を有する対象において気道のウイルス感染による炎症を治療又は予防するための組成物であって、
ａ）古典的補体経路、代替補体経路及びレクチン補体経路を阻害し、及び／又は
ｂ）エイコサノイド活性を阻害する、
治療有効量又は予防有効量の剤を含み、
該剤が、
（ｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸１９〜１６８又はアミノ酸１〜１６８からなるタンパク質、
（ｉｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｉｉｉ）上記ａ）及び／又はｂ）の活性を保持する、（ｉ）又は（ｉｉ）のタンパク質の断片
であり、ここで前記気道のウイルス感染による炎症が急性呼吸促迫症候群ではない、前記組成物。
【請求項２】
剤は補体Ｃ５と結合する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
剤は、Ｃ５転換酵素によって補体Ｃ５が補体Ｃ５ａと補体Ｃ５ｂ−９（ＭＡＣ）へ切断されることを阻害する、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
剤はＬＴＢ４と結合する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
剤は吸血性節足動物に由来する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
気道のウイルス感染を有する対象において気道のウイルス感染による炎症を治療又は予防するための組成物であって、
ａ）古典的補体経路、代替補体経路及びレクチン補体経路を阻害し、及び／又は
ｂ）エイコサノイド活性を阻害する、
治療有効量又は予防有効量の剤を含み、
該剤は、請求項１に記載のタンパク質をコードする核酸分子であり、ここで前記気道のウイルス感染による炎症が急性呼吸促迫症候群ではない、前記組成物。
【請求項７】
核酸分子は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の塩基５３〜５０７を含むか又は該塩基で構成される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
核酸分子は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の塩基１〜５０７を含むか又は該塩基で構成される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
対象は哺乳動物である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
哺乳動物がヒトである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
剤は、対象内で可能な限り多量の有効Ｃ５及び／又はＬＴＢ４と結合するのに十分な用量で投与する、請求項４〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
剤は、有効Ｃ５全量と結合するのに十分な用量で投与する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
気道のウイルス感染による炎症は、急性肺傷害を含む呼吸不全、又は多臓器不全を含む呼吸不全の続発症である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
ウイルス感染は、インフルエンザＡＨ５Ｎ１（トリインフルエンザ）やインフルエンザＡＨ１Ｎ１（ブタインフルエンザ）を含む汎発流行性インフルエンザウイルスやＳＡＲＳコロナウイルスを含む上気道又は下気道の感染である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、上気道及び下気道のウイルス感染、例えば、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ）や汎発流行性インフルエンザＡＨ５Ｎ１（トリインフルエンザ）、インフルエンザＡＨ１Ｎ１（ブタインフルエンザ）による感染による炎症を治療及び予防する方法に関する。
【０００２】
本明細書のテキスト内及び本明細書の末尾に記載の全ての文献は、本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
【背景技術】
【０００３】
ＳＡＲＳや汎発流行性インフルエンザに伴う死亡率は、急性肺傷害（ＡＬＩ）や急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）を引き起こす急速進行性呼吸不全と関連している。多臓器不全を特徴とすることもある。汎発流行性Ｈ５Ｎ１インフルエンザの場合、呼吸不全や多臓器不全による死亡率は約６０％である。致死的Ｈ１Ｎ１インフルエンザの主要な肺病理については最近説明され、壊死性肺胞炎や高密度の好中球浸潤を特徴とする［１］。
【０００４】
当初、ＳＡＲＳや汎発流行性インフルエンザに伴う呼吸不全は、気道の標的細胞（例えば、肺胞上皮細胞）の細胞溶解破壊や呼吸器系から遠く離れた組織や器官（例えば、中枢神経系）へのウイルスの逃避をもたらす急速なウイルス複製に起因すると考えられていた。しかし、最近のエビデンスから、呼吸不全の発生は実際には高ウイルス価には関係しないことが分かった。研究者らによって、呼吸不全はＴＦＮαやＩＦＮβ等の炎症促進性サイトカインの大幅な増加に関係することが見出された。これによって、専門家らは、このような合併症の病因はいわゆる「サイトカインストーム」を引き起こす自然免疫系の不適切な刺激であることを提案するに至っている［２、３］。
【０００５】
呼吸不全の現在の治療においては、酸素マスクを用いて患者の酸素レベルを上昇させることや人工呼吸器を用いた機械的な酸素供給、また、最も重篤な場合には、体外膜型酸素供給（ＥＣＭＯ）（即ち、患者の血液を体外に循環させ、そこへ人工的に酸素を添加する）を行う。
【０００６】
気道のウイルス感染による炎症に起因する呼吸不全に対して現在行われている治療を改善する剤の必要性が高まっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明は、気道のウイルス感染による炎症を治療又は予防する方法であって、古典的補体経路、代替補体経路及びレクチン補体経路を阻害する剤の治療有効量又は予防有効量をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【０００８】
また、本発明は、気道のウイルス感染による炎症を治療又は予防するための、古典的補体経路、代替補体経路及びレクチン補体経路を阻害する治療有効量又は予防有効量の剤も提供する。
【０００９】
補体系は、異物侵入に対する身体の自然防御機構の必須部分であり、炎症プロセスにも関与する。血清内や細胞表面における３０を超えるタンパク質が補体系の機能や調節に関与する。最近では、有益なプロセス及び病理学的プロセスの両方に関連し得る補体系の約３５種の公知成分と共に、補体系自身が、血管形成や血小板活性化、糖代謝、精子形成等の様々な機能を有する少なくとも８５種の生物学的経路と相互作用することが明らかになっている。
【００１０】
補体系は異種抗原の存在によって活性化される。次の３種の活性化経路、即ち、（１）ＩｇＭとＩｇＧの複合体によって、又は炭水化物の認識によって活性化される古典的経路、（２）非自己表面（特定の調節分子がない）及び菌体内毒素によって活性化される代替経路、及び（３）病原体表面のマンノース残基へのマンナ結合性レクチン（ＭＢＬ）の結合によって活性化されるレクチン経路が存在する。これら３種の経路は、細胞表面への類似のＣ３転換酵素及びＣ５転換酵素の形成によって炎症の急性メディエーター（Ｃ３ａ及びＣ５ａ）を放出し、膜侵襲複合体（ＭＡＣ）を形成して補体活性化をもたらす事象の並列カスケードを含む。古典的経路及び代替経路に関与する並列カスケードを図１に示す。
【００１１】
補体系は、多くの炎症カスケードを開始する自然免疫応答の初期アクチベーターとして認識される。しかし、以前は、補体系が呼吸器系のウイルス感染の呼吸器合併症の原因に関係あるとはされていなかった。驚くべきことに、本願に提示のデータによって、代替補体経路、古典的補体経路及びレクチン補体経路を阻害する剤が気道のウイルス感染による炎症を抑制することが初めて示される。
【００１２】
気道のウイルス感染による炎症の抑制は、このようなウイルス感染症に罹患している対象における炎症性サイトカイン及び／又は好中球の低下によって評価することができる。本発明の一様相においては、代替補体経路、古典的補体経路及びレクチン補体経路を阻害する剤を気道のウイルス感染に罹患している対象に投与することによって、未処理の対象と比べて、炎症性サイトカイン（例えば、ＣＸＣＬ２、ＩＬ−１β及び／又はＩＬ−６）のレベルを低下させることができる。また、代替補体経路、古典的補体経路及びレクチン補体経路を阻害する剤を気道のウイルス感染症に罹患している対象に投与することによって、未処理の対象と比べて、好中球のレベルを低下させることもできる。サイトカインレベル及び好中球レベルは、例えば、対象由来の気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液にて評価することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の一様相においては、剤は補体Ｃ５と結合することができる。剤を作用させて、補体Ｃ５がＣ５転換酵素によって補体Ｃ５ａと補体Ｃ５ｂ〜９へ切断されることを防止することができる。また、剤を作用させて、気道のウイルス感染症に罹患している対象（例えば、このような対象由来のＢＡＬ液）におけるＣ５ａレベルを、未処理の対象と比べて低下させることができる。驚くべきことに、本願に提示のデータによって、気道のウイルス感染後のＢＡＬ液においてＣ５ａが有意に増加することが初めて示される。
【００１４】
補体Ｃ５タンパク質（本明細書においては「Ｃ５」とも称する）はＣ５転換酵素（それ自身はＣ３ａ、即ち、代替経路の初期生成物から生成する）によって切断される（図１）。この切断による生成物としては、アナフィラトキシンＣ５ａや溶解性複合体Ｃ５ｂ〜９（膜侵襲複合体（ＭＡＣ）としても知られる）が挙げられる。Ｃ５ａは、多くの病理学的炎症プロセス（例えば、好中球及び好酸球の化学遊走や、好中球の活性化、毛細血管透過性の上昇、好中球アポトーシスの阻害）に関与する高反応性ペプチドである［４］。
【００１５】
ＭＡＣは他の重要な病理学的プロセス、例えば、関節リウマチ［５；６］や増殖性糸球体腎炎［７］、特発性膜性腎症［８］、タンパク尿［９］、急性軸索損傷後の脱髄［１０］と関連し、また、異種移植後の急性移植片拒絶［１１］にも関与する。
【００１６】
Ｃ５ａは補体関連障害の分野では特に注目の標的となっている［１２］。Ｃ５ａに関しては多くの病理学的関連性が認識されているが、ヒトにおけるＣ５ａ欠乏の作用は限られているように思われる。Ｃ５ａ及びＣ５ａ受容体と結合して阻害するモノクローナル抗体や小分子が種々の自己免疫疾患の治療用に開発されている。しかし、これらの分子はＭＡＣの放出を防止しない。
【００１７】
これに対し、本発明で用いる剤はＣ５ａペプチド及びＭＡＣ両方の生成を阻害する。Ｃ５は古典的補体経路及び代替補体経路の後期生成物であるため、カスケード内の初期生成物を標的にする場合に存在する随伴感染のリスクにＣ５の阻害が関連する可能性は低い［１３］。
【００１８】
剤がＣ５と結合する能力は、当該技術分野で公知の標準的なインビトロアッセイ、例えば、ゲル上の該タンパク質を標識したＣ５と共にインキュベートした後のウェスタンブロッティングによって求めることができる。本発明に係る剤がＣ５と結合する際のＩＣ50は０．２ｍｇ／ｍＬ未満であることが好ましく、好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ未満、好ましくは０．０５ｍｇ／ｍＬ未満、好ましくは０．０４ｍｇ／ｍＬ未満、好ましくは０．０３ｍｇ／ｍＬ未満、好ましくは０．０２ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１μｇ／ｍＬ未満、好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ未満、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ未満、より好ましくは１ｎｇ／ｍＬ未満である。
【００１９】
本発明の一実施形態においては、Ｃ５と結合する剤は抗Ｃ５モノクローナル抗体ではない。
【００２０】
また、本発明は、気道のウイルス感染による炎症を治療又は予防する方法であって、エイコサノイド活性を阻害する剤の治療有効量又は予防有効量をそれを必要とする対象に投与することを含む方法も提供する。
【００２１】
また、本発明は、気道のウイルス感染による炎症を治療又は予防するための、エイコサノイド活性を阻害する治療有効量又は予防有効量の剤も提供する。
【００２２】
本発明のこの様相に係る剤はロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）活性を阻害することができる。特に、本発明のこの様相に係る剤はＬＴＢ４と結合することができる。剤がＬＴＢ４と結合する能力は、当該技術分野で公知の標準的なインビトロアッセイ、例えば、ゲル上の該タンパク質を標識したＬＴＢ４と共にインキュベートした後のウェスタンブロッティングによって求めることができる。本発明に係る剤がＬＴＢ４と結合する際のＩＣ50は０．２ｍｇ／ｍＬ未満とすることができ、好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ未満、好ましくは０．０５ｍｇ／ｍＬ未満、好ましくは０．０４ｍｇ／ｍＬ未満、好ましくは０．０３ｍｇ／ｍＬ未満、好ましくは０．０２ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１μｇ／ｍＬ未満、好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ未満、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ未満、より好ましくは１ｎｇ／ｍＬ未満である。
【００２３】
本発明は、その一様相において、気道のウイルス感染による炎症を治療又は予防する方法であって、
ａ）古典的補体経路、代替補体経路及びレクチン補体経路を阻害し、
ｂ）エイコサノイド活性を阻害する
剤の治療有効量又は予防有効量をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【００２４】
また、本発明は、気道のウイルス感染による炎症を治療又は予防するための、
ａ）古典的補体経路、代替補体経路及びレクチン補体経路を阻害し、
ｂ）エイコサノイド活性を阻害する、
治療有効量又は予防有効量の剤も提供する。
【００２５】
本発明のこの様相の一実施形態においては、剤はＣ５及びＬＴＢ４の両方と結合する。従って、この実施形態に係る剤を作用させて、補体Ｃ５がＣ５転換酵素によって補体Ｃ５ａと補体Ｃ５ｂ〜９（ＭＡＣ）へ切断されることを防止すると共に、ＬＴＢ４活性を阻害することができる。
【００２６】
本明細書に記載の本発明の方法及び使用によって、上気道又は下気道のウイルス感染による炎症を治療又は予防することができる。特に、本明細書に記載の本発明の方法及び使用によって、ウイルス感染に起因する呼吸不全、例えば、急性肺傷害や急性呼吸促迫症候群を治療又は予防することができる。また、本発明の方法及び使用によって、ウイルス感染に起因する呼吸不全の続発症、例えば、多臓器不全を治療又は予防することもできる。
【００２７】
炎症は、上気道又は下気道の如何なるウイルス感染にも起因し得る。特に、本発明の方法及び使用によって、インフルエンザＡＨ５Ｎ１（トリインフルエンザ）やインフルエンザＡＨ１Ｎ１（ブタインフルエンザ）等の汎発流行性インフルエンザウイルスによる感染に起因する炎症を治療又は予防することができる。また、本発明の方法及び使用によって、ＳＡＲＳコロナウイルスによる感染に起因する炎症を治療又は予防することもできる。
【００２８】
本発明の剤は吸血性節足動物に由来することが好ましい。「吸血性節足動物」には適切な宿主から血液を摂取する全ての節足動物が含まれ、例えば、昆虫やマダニ、シラミ、ノミ、コダニが挙げられる。剤はマダニに由来することが好ましく、マダニ類オルニソドロス・モウバタ（Ornithodoros moubata）に由来することが好ましい。
【００２９】
本発明の一実施形態においては、剤は、図２のアミノ酸配列のアミノ酸１９〜１６８を含むタンパク質、又はこのタンパク質の機能等価物である。剤は、図２のアミノ酸配列のアミノ酸１９〜１６８で構成されるタンパク質、又はこのタンパク質の機能等価物とすることができる。
【００３０】
他の一実施形態においては、本発明のこの実施形態において用いるタンパク質は、図２のアミノ酸配列のアミノ酸１〜１６８を含むか又は該アミノ酸で構成することができ、或いは、その機能等価物とすることができる。図２に記載のタンパク質配列の最初の１８個のアミノ酸は、Ｃ５結合やＬＴＢ４結合活性に必要のないシグナル配列を形成するため、例えば、組換えタンパク質生成の効率化のために必要に応じて省くことができる。
【００３１】
図２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質（本明細書では「ＥＶ５７６タンパク質」とも称する）は、マダニ類オルニソドロス・モウバタ（Ornithodoros moubata）の唾液腺から単離された。ＥＶ５７６はリポカリンファミリーの外（outlying）メンバーであり、補体活性化を阻害することが示された最初のリポカリンファミリーメンバーである。ＥＶ５７６タンパク質は、Ｃ５と結合し、Ｃ５がＣ５転換酵素によって補体Ｃ５ａと補体Ｃ５ｂ〜９へ切断されることを防止して代替補体経路、古典的補体経路及びレクチン補体経路を阻害し、Ｃ５ａペプチド及びＭＡＣの両方の作用を阻害する。また、ＥＶ５７６タンパク質はＬＴＢ４とも結合する。本明細書に記載の「ＥＶ５７６タンパク質」とは、シグナル配列の有無に関わらず、図２に記載の配列を意味する。
【００３２】
ＥＶ５７６タンパク質及びこのタンパク質が補体活性化を阻害する能力については、［１４］に開示されているが、そこでは、ＥＶ５７６タンパク質が「ＯｍＣＩタンパク質」と称されている。また、ＥＶ５７６タンパク質が重症筋無力症［１５］、呼吸器障害［１６］及び末梢神経障害［１７］の治療に有効であることも示されている。ＥＶ５７６タンパク質がエイコサノイド（ＬＴＢ４等）と結合する能力、及びロイコトリエンやヒドロキシエイコサノイド介在による疾患の治療における該タンパク質の使用は［１８］に示唆されている。しかし、ウイルス感染の治療又は予防、特に、気道のウイルス感染による炎症の治療又は予防にＥＶ５７６タンパク質が有用となり得ることは、これらの開示のいずれにも示唆されていない。
【００３３】
気道のウイルス感染による炎症の治療及び予防にＥＶ５７６タンパク質が驚くほど有効であることが見出された。本明細書に提示のデータによって、気道のヒトＨ１Ｎ１インフルエンザ感染のマウスモデルにおいては、ＥＶ５７６で処理したマウスの場合、媒体処理マウスと比べて、タンパク質及び総細胞数のレベルが有意に低く、補体Ｃ５ａのレベルが低く、炎症性サイトカインＩＬ−６、ＩＬ−１β及びＣＸＣＬ２のレベルが低く、好中球数が非常に有意に少ないことが示される。従って、ＥＶ５７６は、気道のウイルス感染による炎症の治療及び予防に対するヒト治療の可能性を示す。呼吸器障害の治療におけるＥＶ５７６の驚くほどの有効性は、ＥＶ５７６がＣ５と結合してＣ５ａ及びＭＡＣの生成を阻害するように作用するという事実、又はＥＶ５７６のＬＴＢ４結合活性に起因し得る。
【００３４】
本発明の更なる一実施形態においては、剤は、ＥＶ５７６タンパク質をコードする核酸分子又はその機能等価物とすることができる。例えば、遺伝子治療を用いて、対象における関連細胞によるＥＶ５７６タンパク質の内在的産生をインビボ又はエクスビボで行うことができる。別のアプローチは「ネイキッドＤＮＡ」の投与（即ち、治療遺伝子を血流又は筋組織に直接注入する）である。
【００３５】
このような核酸分子は、図２のヌクレオチド配列の塩基５３〜５０７を含むか又は該塩基で構成されることが好ましい。このヌクレオチド配列は、シグナル配列を有しない図２のＥＶ５７６タンパク質をコードする。図２のヌクレオチド配列の最初の５４個の塩基は、補体阻害活性やＬＴＢ４結合活性に必要のないシグナル配列をコードする。或いは、核酸分子は、図２の核酸配列の塩基１〜５０７を含むか又は該塩基で構成することができるが、この場合、シグナル配列を有するタンパク質をコードする。
【００３６】
ＥＶ５７６タンパク質は、ラット、マウス及びヒト血清においてＣ５と結合してそのＣ５転換酵素による切断を防止し、ＩＣ50は約０．０２ｍｇ／ｍＬであることが示された。ＥＶ５７６タンパク質の機能等価物はＣ５と結合する能力を保持してＩＣ50が０．２ｍｇ／ｍＬ未満であることが好ましく、好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ未満、好ましくは０．０５ｍｇ／ｍＬ未満、好ましくは０．０２ｍｇ／ｍＬ未満、好ましくは１μｇ／ｍＬ未満、好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ未満、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ未満、より好ましくは１ｎｇ／ｍＬ未満である。
【００３７】
また、ＥＶ５７６タンパク質はＬＴＢ４と結合することも示された。また、ＥＶ５７６タンパク質の機能等価物はＬＴＢ４と結合する能力を保持し、ＥＶ５７６タンパク質と同様の親和性を有することもできる。
【００３８】
一様相においては、本明細書に記載の「機能等価物」は、ａ）Ｃ５と結合し、Ｃ５転換酵素によって補体Ｃ５が補体Ｃ５ａと補体Ｃ５ｂ〜９へ切断されることを防止する能力を保持し、及び／又はｂ）ＬＴＢ４と結合する能力を保持するＥＶ５７６タンパク質の相同体及び断片を説明するのに用いる。
【００３９】
また、「機能等価物」とは、ＥＶ５７６タンパク質と構造的に類似した分子、又は、同様又は同一の三次構造を、特にＣ５及び／又はＬＴＢ４と結合するＥＶ５７６タンパク質の活性部位の環境で含む分子（例えば、合成分子）をも意味する。ＬＴＢ４結合に必要となる可能性の高いＥＶ５７６内のアミノ酸は［１８］に記載されている。
【００４０】
「相同体」には、図２において明確に特定されるＥＶ５７６配列のパラログ及びオーソログも含まれ、例えば、他のマダニ種、即ち、リピセファラス・アッペンディクラトゥス（Rhipicephalus appendiculatus）やＲ．サングイネウス（R. sanguineus）、Ｒ．ブルサ（R. bursa）、Ａ．アメリカナム（A. americanum）、Ａ．カジェネンセ（A. cajennense）、Ａ．ヘブレウム（A. hebraeum）、ブーフィラス・ミクロプラス（Boophilus microplus）、Ｂ．アニュラトゥス（B. annulatus）、Ｂ．デコロラトゥス（B. decoloratus）、ダーマセンター・レティキュラトゥス（Dermacentor reticulatus）、Ｄ．アンダーソニ（D. andersoni）、Ｄ．マーギナトゥス（D. marginatus）、Ｄ．バリアビリス（D. variabilis）、ヘマフィサリス・イネルミス（Haemaphysalis inermis）、Ｈａ．レアチイ（Ha. leachii）、Ｈａ．プンクタタ（Ha. punctata）、ヒアロンマ・アナトリクム・アナトリクム（Hyalomma anatolicum anatolicum）、Ｈｙ．ドロメダリイ（Hy. dromedarii）、Ｈｙ．マージナトゥム・マージナトゥム（Hy. marginatum marginatum）、イクソデス・リシナス（Ixodes ricinus）、Ｉ．ペルスルカトゥス（I. persulcatus)、Ｉ．スカプラリス（I. scapularis）、Ｉ．ヘキサゴナス（I. hexagonus）、アルガス・ペルシカス（Argas persicus）、Ａ．リフレクサス（A. reflexus）、オルニトドロス・エラティカス（Ornithodoros erraticus）、Ｏ．モウバタ・モウバタ（O. moubata moubata）、Ｏ．ｍ．ポルシナス（O. m. porcinus）、Ｏ．サヴィギニュイ（O. savignyi）に由来するＥＶ５７６タンパク質配列も含まれる。「相同体」には更に、例えばキュレックス（Culex）、アノフェレス（Anopheles）、アエデス（Aedes）属、特にキュレックス・キンクファッシアタス（Culex quinquefasciatus）、アエデス・アエジプチ（Aedes aegypti）、アノフェレス・ガンビエ（Anopheles gambiae）等の蚊種；クテノセファリデス・フェリス（Ctenocephalides felis）（ネコノミ）等のノミ種；ウシアブ；サシチョウバエ；ブヨ；ツェツェバエ；シラミ；コダニ；ヒル；及び扁形動物に由来する等価なＥＶ５７６タンパク質配列も含まれる。天然ＥＶ５７６タンパク質はＯ．モウバタ（O. moubata）に約１８ｋＤａの他の３種の形態で存在していると考えられ、「相同体」にはこれらのＥＶ５７６の他の形態も含まれる。
【００４１】
図２に示すＥＶ５７６配列の相同体を特定するための方法は、当業者には明らかであろう。例えば、公的及び私的両方の配列データベースの相同性検索によって相同体を特定することができる。便宜上、公的に入手し得るデータベースを用いることができるが、私的なデータベース又は市販のデータベースも、特に公的データベースに示されていないデータを含む場合に同様に役立つ。一次データベースは、一次ヌクレオチド配列データ寄託又は一次アミノ酸配列データ寄託のサイトであり、公的に利用可能でもあり、市販されてもいる。公的に利用可能な一次データベースの例としては、GenBankデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）、EMBLデータベース（http://www.ebi.ac.uk/）、DDBJデータベース（http://www.ddbj.nig.ac.jp/）、SWISS-PROTタンパク質データベース（http://expasy.hcuge.ch/）、PIR（http://pir.georgetown.edu/）、TrEMBL（http://www.ebi.ac.uk/）、TIGRデータベース（http://www.tigr.org/tdb/index.html参照）、NRL-3Dデータベース（http://www.nbrfa.georgetown.edu）、タンパク質データベース（http://www.rcsb.org/pdb）、NRDBデータベース（ftp://ncbi.nlm.nih.gov/pub/nrdb/README）、OWLデータベース（http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/OWL/）、二次データベースPROSITE（http://expasy.hcuge.ch/sprot/prosite.html）、PRINTS（http://iupab.leeds.ac.uk/bmb5dp/prints.html）、Profiles（http://ulrec3.unil.ch/software/PFSCAN_form.html）、Pfam（http://www.sanger.ac.uk/software/pfam）、Identify（http://dna.stanford.edu/identify/）、Blocks（http://www.blocks.fhcrc.org）の各データベースが挙げられる。市販データベース又は私的データベースの例としては、PathoGenome（ゲノム・セラピューティックス（Genome Therapeutics）社）やPathoSeq（以前のインサイト・ファーマシューティカルズ（Incyte Pharmaceuticals）社）が挙げられる。
【００４２】
通常、２個のポリペプチド間（好ましくは、活性部位等の特定の領域に亘る）の同一性が３０％を超える場合、機能面において等価であり、従って２個のタンパク質は相同性を示すと考えられる。相同体であるタンパク質は、図２に示すＥＶ５７６タンパク質配列に対する配列同一性が６０％を超えることが好ましい。より好ましい相同体は、図２に示すＥＶ５７６タンパク質配列に対して７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％を超える同一性を有する。本明細書に記載の同一率（percentage identity）は、ＢＬＡＳＴ（バージョン２．１．３）により、NCBI（the National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）が規定するデフォルトパラメータ［Blosum 62 matrix; gap open penalty=11、gap extension penalty=l］を用いて求めたものである。
【００４３】
図２に示すＥＶ５７６タンパク質配列の相同体には、Ｃ５と結合する能力を保持するのであれば、野生型配列に対するアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、７、１０又はそれ以上のアミノ酸）の置換、挿入又は欠失を含む変異体も含まれる。従って、変異体には、該タンパク質の機能や活性に悪影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換を含むタンパク質が含まれる。更にこのタームには、天然の生物学的バリアント（例えば、ＥＶ５７６タンパク質が得られる種内の対立遺伝子バリアントや配列バリエーション（geographical variations））も含まれる。該タンパク質配列の特定の残基を系統的又は指向的に変異させることによって、Ｃ５及び／又はＬＴＢ４への結合能力が改善された変異体を設計することもできる。
【００４４】
また、ＥＶ５７６タンパク質の断片及びＥＶ５７６タンパク質の相同体も、Ｃ５及び／又はＬＴＢ４への結合能力を保持しているのであれば「機能等価物」に包含される。断片としては、補体Ｃ５への結合能力を保持しているのであれば、例えば、ＥＶ５７６タンパク質配列に由来し、１５０未満のアミノ酸、１２５未満のアミノ酸、１００未満のアミノ酸、７５未満のアミノ酸、５０未満のアミノ酸又は２５未満のアミノ酸から成るポリペプチドを挙げることができる。
【００４５】
このような断片としては、本明細書にて図２で明確に特定されるＯ．モウバタ（O. moubata）ＥＶ５７６タンパク質の断片だけでなく、上述したこのタンパク質の相同体の断片も挙げられる。このような相同体の断片は通常、図２のＥＶ５７６タンパク質配列の断片に対して６０％を超える同一性を有するが、より好ましい相同体の断片は、図２のＥＶ５７６タンパク質配列の断片に対して７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％を超える同一性を示す。当然のことながら、改善された断片は、野生型配列の系統的な変異又は断片化と、それに続く活性アッセイによって合理的に設計することができる。断片はＥＶ５７６と同等又はそれ以上の親和性をＣ５及び／又はＬＴＢ４に対して示すことができる。
【００４６】
本発明において用いる機能等価物は、例えば、ＥＶ５７６タンパク質をコードするポリヌクレオチドをインフレームで異種タンパク質配列のコード配列にクローン化して得られる融合タンパク質とすることができる。本明細書に記載の「異種」とは、ＥＶ５７６タンパク質以外の如何なるポリペプチド又はその機能等価物をも示す。Ｎ末端又はＣ末端において可溶性融合タンパク質に含まれ得る異種配列の例としては、膜結合型タンパク質の細胞外ドメインや、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ領域）、多量体化ドメイン、細胞外タンパク質のドメイン、シグナル配列、搬出配列、アフィニティークロマトグラフィーによって精製可能な配列が挙げられる。このような異種配列の多くは発現プラスミドで市販されているが、それは、これらの配列が通常は、該配列に融合するタンパク質の特定の生物活性を大幅に損なわずに更なる特性をもたらすために融合タンパク質内に含まれているからである［１９］。このような更なる特性の例としては、体液内でのより長い半減期、細胞外局在化、タグ（例えば、ヒスチジンやＨＡタグ）によって可能となるより簡便な精製手続きが挙げられる。
【００４７】
ＥＶ５７６タンパク質及びその機能等価物は、宿主細胞での発現によって組換え型に調製することができる。このような発現方法は当業者にはよく知られており、詳細は［２０］及び［２１］に記載されている。ＥＶ５７６タンパク質及びその機能等価物の組換え型は非グリコシル化であることが好ましい。
【００４８】
また、本発明のタンパク質及び断片は、従来のタンパク質化学技法を用いて調製することもできる。例えば、化学合成によってタンパク質断片を調製することができる。融合タンパク質を作出するための方法は、当該技術分野では標準的であり、当業者には公知であろう。例えば、最も一般的な分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術及び免疫学的技法は［２０］又は［２２］に見出すことができる。
【００４９】
本発明の方法又は使用において剤を投与する対象は哺乳動物であることが好ましく、ヒトであることが好ましい。また、剤を投与する対象は、上気道又は下気道のウイルス感染症（例えば、インフルエンザＡＨ５Ｎ１（トリインフルエンザ）やインフルエンザＡＨ１Ｎ１（ブタインフルエンザ）等の汎発流行性インフルエンザウイルス、又はＳＡＲＳコロナウイルス）に罹患している場合もある。
【００５０】
剤は治療有効量又は予防有効量を投与する。「治療有効量」とは、ウイルス感染に伴う炎症を治療又は改善するのに必要な剤の量を意味する。本明細書に記載の「予防有効量」とは、ウイルス感染に伴う炎症を予防するのに必要な剤の量を意味する。
【００５１】
剤の用量は、対象内で可能な限り多量の有効Ｃ５（より好ましくは有効Ｃ５全量）と結合するのに十分であることが好ましい。或いは、剤の用量は、対象内で可能な限り多量の有効ＬＴＢ４（より好ましくは有効ＬＴＢ４全量）と結合するのに十分とすることができる。幾つかの様相においては、剤の用量は、可能な限り多量の有効Ｃ５及びＬＴＢ４（例えば、有効Ｃ５及びＬＴＢ４の全量）と結合するのに十分である。供給する剤の用量は、対象内で有効Ｃ５及び／又はＬＴＢ４の全量と結合するのに必要なモル用量の少なくとも２倍である。供給する剤の用量は、対象内で有効Ｃ５及び／又はＬＴＢ４の全量と結合するのに必要なモル用量の２．５倍、３倍又は４倍とすることができる。用量は０．０００１ｍｇ／ｋｇ（患者の質量に対する薬剤の質量）〜２０ｍｇ／ｋｇであることが好ましく、好ましくは０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．２ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇである。
【００５２】
必要な投与頻度は用いる剤の半減期によって変わる。剤がＥＶ５７６タンパク質又はその機能等価物である場合、投与は持続点滴で行ってもよく、ボーラス投与でもよく、１日１回、１日２回、又は２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、７日毎、１０日毎、１５日毎、２０日（又はそれ以上）毎に投与してもよい。
【００５３】
また、正確な用量や投与頻度は投与時の患者の状態によっても変わり得る。用量を決める際に考慮に入れ得る因子としては、患者の疾患状態の重症度や患者の全体的な健康、年齢、体重、性別、食事、投与時間や投与頻度、薬剤併用、反応感受性、患者の治療に対する耐性や応答が挙げられる。正確な量は日常的な実験によって決めることができるが、最終的には臨床医の判断に任せることができる。
【００５４】
剤は通常、薬学的に許容し得る担体の一部として投与する。本明細書に記載の「薬学的に許容し得る担体」としては、担体自身が、毒性作用を誘発せず、また、医薬組成物を投与する個体に対して有害な抗体の産生を引き起こすことがないのであれば、遺伝子やポリペプチド、抗体、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、不活性ウイルス粒子が挙げられ、実際には他の如何なる剤も挙げられる。薬学的に許容し得る担体は更に、水や生理食塩水、グリセロール、エタノール等の液体、湿潤剤や乳化剤等の補助物質、ｐＨ緩衝物質等を含むことができる。従って、用いる薬学的担体は投与経路によって変わる。医薬組成物は担体によって、患者の摂取を助ける錠剤、丸剤、糖衣錠剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤に調製することができる。医薬的に許容し得る担体に関する詳細な考察は［２３］で得られる。
【００５５】
剤は公知の如何なる投与経路によっても送達することができる。剤は経鼻的に送達することができ、また、吸入によって、例えば、定量噴霧式吸入器やネブライザー、乾燥粉末吸入器、経鼻吸入器を用いて送達することができる。剤は非経口経路（例えば、皮下、腹腔内、静脈内又は筋肉内における注射、又は組織の間質腔への送達）によって送達することができる。また、組成物は病変部に投与することもできる。その他の投与形態としては、経口及び肺内投与や坐剤、経皮性又は経皮的塗布、針、ハイポスプレーを挙げることができる。
【００５６】
剤は単独で投与してもよく、呼吸器障害患者の治療に現在使用されている他の薬剤の投与も伴う治療レジメンの一部として投与してもよい。例えば、剤の投与は、更なる抗ウイルス薬剤の点滴及び／又は酸素処理と組み合わせて行うことができる。
剤の投与は他の薬物と同時に、逐次的に又は別々に行うことができる。例えば、剤の投与は他の薬物の投与前又は投与後に行うことができる。
【００５７】
このように、本発明は、対象（該対象は抗ウイルス薬剤による治療を予め受けている）における気道のウイルス感染による炎症を治療又は予防するための、Ｃ５及び／又はＬＴＢ４と結合する剤（好ましくは、ＥＶ５７６タンパク質又はその機能等価物）を提供する。本発明のこの様相に用いることのできる抗ウイルス薬剤の例としては、ザナミビル（リレンザ）やオセルタミビル（タミフル）が挙げられる。
【００５８】
以下、実施例によって本発明の種々の様相及び実施形態をより詳細に説明する。本発明の範囲から逸脱することなく細部を変更することができることは理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】補体活性化の古典的経路及び代替経路の概略図。酵素成分はダークグレーで示し、アナフィラトキシンは星形で囲んで示す。
【図２】ＥＶ５７６の一次配列。シグナル配列を下線で示す。システイン残基を太字で示す。ヌクレオチド番号及びアミノ酸番号を右側に示す。
【図３】ブタインフルエンザ感染マウスモデル（１０4プラーク形成単位（ＰＦＵ））へＥＶ５７６を投与した後の好中球数低下について同一モデルへＥＶ１３１又は媒体を投与した場合との比較。
【図４】ブタインフルエンザ感染マウスモデル（１０4プラーク形成単位（ＰＦＵ））へＥＶ５７６を投与した後の総細胞数低下について同一モデルへＥＶ１３１又は媒体を投与した場合との比較。
【図５】ブタインフルエンザ感染マウスモデル（１０4プラーク形成単位（ＰＦＵ））へＥＶ５７６を投与した後の総タンパク質低下について同一モデルへＥＶ１３１又は媒体を投与した場合との比較。
【図６】ブタインフルエンザ感染マウスモデル（１０6プラーク形成単位（ＰＦＵ））へＥＶ５７６を投与した後の好中球数低下について同一モデルへ媒体を投与した場合との比較。
【図７】ブタインフルエンザ感染マウスモデル（１０6プラーク形成単位（ＰＦＵ））へＥＶ５７６を投与した後の総細胞数低下について同一モデルへ媒体を投与した場合との比較。
【図８】ブタインフルエンザ感染マウスモデル（１０6プラーク形成単位（ＰＦＵ））へＥＶ５７６を投与した後の総タンパク質低下について同一モデルへ媒体を投与した場合との比較。
【図９】ブタインフルエンザ感染マウスモデル（１０4プラーク形成単位（ＰＦＵ））へＥＶ５７６（ＯｍＣＩ）を投与した後のＩＬ−６レベル低下について同一モデルへＥＶ１３１又は媒体を投与した場合との比較。
【図１０】ブタインフルエンザ感染マウスモデル（１０4プラーク形成単位（ＰＦＵ））へＥＶ５７６（ＯｍＣＩ）を投与した後のＣＸＣ２レベル低下について同一モデルへＥＶ１３１又は媒体を投与した場合との比較。
【図１１】ブタインフルエンザ感染マウスモデル（１０4プラーク形成単位（ＰＦＵ））へＥＶ５７６（ＯｍＣＩ）を投与した後のＩＬ−１β低下について同一モデルへＥＶ１３１又は媒体を投与した場合との比較。
【図１２】ブタインフルエンザ感染マウスモデル（１０6プラーク形成単位（ＰＦＵ））へＥＶ５７６（ＯｍＣＩ）を投与した後のＩＬ−６レベル低下について同一モデルへ媒体を投与した場合との比較。
【図１３】ブタインフルエンザ感染マウスモデル（１０6プラーク形成単位（ＰＦＵ））へＥＶ５７６（ＯｍＣＩ）を投与した後のＣＸＣ２レベル低下について同一モデルへ媒体を投与した場合との比較。
【図１４】ブタインフルエンザ感染マウスモデル（１０6プラーク形成単位（ＰＦＵ））へＥＶ５７６（ＯｍＣＩ）を投与した後のＩＬ−１β低下について同一モデルへ媒体を投与した場合との比較。
【図１５】ブタインフルエンザ感染マウスモデル（１０4プラーク形成単位（ＰＦＵ））へＥＶ５７６を投与した後の肺組織１００ｍｇ当たりの好中球数の相対的低下について同一モデルへＥＶ１３１又は媒体を投与した場合との比較。
【図１６】ブタインフルエンザ感染マウスモデル（１０6プラーク形成単位（ＰＦＵ））へＥＶ５７６を投与した後の肺組織１００ｍｇ当たりの好中球数の相対的低下について同一モデルへＥＶ１３１又は媒体を投与した場合との比較。
【図１７】ブタインフルエンザ感染マウスモデル（１０4プラーク形成単位（ＰＦＵ））へＥＶ５７６を投与した後の総合病理組織学的スコアについて同一モデルへＥＶ１３１又は媒体を投与した場合との比較。
【図１８】ブタインフルエンザ感染マウスモデル（１０6プラーク形成単位（ＰＦＵ））へＥＶ５７６を投与した後の総合病理組織学的スコアについて同一モデルへ媒体を投与した場合との比較。
【図１９】ブタインフルエンザ感染マウスモデル（接種レベル：１０4プラーク形成単位（ＰＦＵ））の気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中Ｃ５ａレベルについて偽接種の場合との比較。
【図２０】ブタインフルエンザ感染マウスモデル（接種レベル：１０6プラーク形成単位（ＰＦＵ））の気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中Ｃ５ａレベルについて偽接種の場合との比較。
【図２１】ブタインフルエンザ感染マウスモデル（１０4プラーク形成単位（ＰＦＵ））へＥＶ５７６を投与した後のＣ５ａレベル低下について同一モデルへＥＶ１３１又は媒体を投与した場合との比較。
【図２２】ブタインフルエンザ感染マウスモデル（１０6プラーク形成単位（ＰＦＵ））へＥＶ５７６を投与した後のＣ５ａレベル低下について同一モデルへ媒体を投与した場合との比較。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００６０】
図２に示すアミノ酸配列を有するＥＶ５７６タンパク質を、気道のヒトＨ１Ｎ１インフルエンザ感染のマウスモデルで試験した。
【００６１】
方法
パスツール研究所から入手したヒトＨ１Ｎ１ウイルスの亜致死量（１０4ＰＦＵ）又は致死量（１０6ＰＦＵ）をＢａｌｂＣマウスに経鼻感染させるか、又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）により偽感染させた。
【００６２】
低接種マウスでは４日以内に下気道感染の徴候（体重減少及び呼吸器鬱血）が見られ、高接種群ではより早く、３日目までには全てのマウスがウイルスに屈した。
【００６３】
図２に示すアミノ酸配列を有するＥＶ５７６タンパク質を、感染３０分前及び１日目には２５０μｇ、２日目、３日目及び４日目には２００μｇ、５日目には１７０μｇを腹腔内注射によって投与した。ｒＥＶ１３１（ＥＶ５７６に対する同等サイズのリポカリンであるが、補体系を阻害しないことが知られている）とＰＢＳを対照として用いた。
【００６４】
高接種マウスの場合、３日目までに全て死亡したため、投与は最初の２回のみであった。高接種マウスに関しては、３日目に気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行った。低接種マウスに関しては、６日目（最後の投与から２４時間後）に気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行い、その直後に殺した。総細胞数、好中球数、総タンパク質及びサイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＣＸＣＬ２）について洗浄液のアッセイを行った。
【００６５】
結果を図３〜１６に示す。
【００６６】
偽処理マウスと比べて媒体処理マウスでは全てのパラメータが非常に有意に上昇したことが分かった。
【００６７】
結果
１０4プラーク形成単位（ＰＦＵ）の場合、ＥＶ５７６で処理したマウスでは、媒体処理マウスと比べて、タンパク質のレベル（図５）及び総細胞数（図４）が有意に低下し、好中球数（図３及び１５）が非常に有意に低下した。１０6ＰＦＵの場合も、ＥＶ５７６で処理したマウスでは好中球数が媒体処理と比べて有意に低下した。
【００６８】
１０4ＰＦＵの場合、媒体処理マウス及びｒＥＶ１３１マウスでは、偽処理マウスと比べて、総細胞数、好中球数及びタンパク質が非常に有意に（ｐ＜０．００１）増加した。ＥＶ５７６で処理したマウスでは、媒体処理マウスに比べて、総細胞数の増加は有意に低く（ｐ＜０．０５）、好中球数の増加も有意に低かった（ｐ＜０．０１）（図３及び４）。１０6ＰＦＵの場合、総細胞数（ｐ＜０．０５）及び好中球数（ｐ＜０．００１）のみが偽処理マウスに比べて増加し、ＥＶ５７６で処理したマウスでは、媒体処理マウスに比べて、好中球数の増加は有意に低かった（ｐ＜０．０５）（図６〜８及び１６）が、瀕死のマウスに対してＢＡＬを６日目ではなく３日目に行ったため、Ｈ１Ｎ１インフルエンザの呼吸器合併症の作用が十分に現れる時間がなく、従って、補体阻害の潜在的な保護作用については明らかにならなかったと考えられる。
【００６９】
低接種群の場合、媒体処理群及びｒＥＶ１３１処理群では、偽処理マウスと比べて、ＢＡＬ液中の炎症性サイトカインＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＣＸＣＬ２のレベルが有意に（ｐ＜０．０５）又は非常に有意に（ｐ＜０．０１）上昇したことが分かった（図９〜１１）が、一方、ＥＶ５７６で処理したマウスでは、上昇はしたものの有意差はなかった。細胞に関する結果と同様に、高接種群においては差があまり顕著ではなかった（図１２〜１４）。
【００７０】
低接種マウス及び高接種マウスについての肺炎症の全病理組織学的スコアの合計をそれぞれ図１７及び１８に示す。病理組織学的スコアの合計は、気道炎症、血管炎症、実質性炎症、好中球炎症及び上皮傷害のスコアを用いて算出した。低接種群においては、ＥＶ５７６によって上皮損傷及び炎症が抑制された。ヒスタミン捕捉タンパク質であるＥＶ１３１の有効性は低かった。
【００７１】
これらのデータから、ＥＶ５７６がＨ１Ｎ１感染による炎症を有意に阻害することが分かる。ＥＶ５７６はＣ５の結合を介して補体系を阻害し、エイコサノイド活性を阻害することが知られている。これらのデータから、ＥＶ５７６及び同様のＣ５結合特性を有する他の剤がウイルス感染による肺の炎症を抑制するのに有効となり得ることが示唆される。
【実施例２】
【００７２】
図２に示すアミノ酸配列を有するＥＶ５７６タンパク質を、気道のヒトＨ１Ｎ１インフルエンザ感染のマウスモデルで試験し、その補体Ｃ５ａレベルへの作用について調べた。
【００７３】
方法
実施例１で上述したようにＢａｌｂＣマウスの感染及び処理を行った。
【００７４】
ＢＡＬＦ中のＣ５ａレベルの測定は、偽接種マウスでは  日目、ヒトＨ１Ｎ１ウイルスの亜致死量（１０4ＰＦＵ）に曝露したマウスでは１日目、４日目、７日目及び１０日目、ヒトＨ１Ｎ１ウイルスの致死量（１０6ＰＦＵ）に曝露したマウスでは１日目、３日目及び５日目に行った。
【００７５】
６日目に、媒体、ＥＶ１３１又はＥＶ５７６でも処理した低接種マウスにおいてＢＡＬＦ中のＣ５ａレベルを測定した。３日目に、媒体又はＥＶ５７６でも処理した高接種マウスにおいてＢＡＬＦ中のＣ５ａレベルを測定した。
【００７６】
結果を図１９〜２２に示す。
【００７７】
結果
高接種レベル及び低接種レベルの両方において、感染後最大１０日間、ＢＡＬ液中のＣ５ａが有意に増加する（図１９及び２０）。ＥＶ５７６で処理したマウスでは、Ｃ５ａレベルの上昇が有意に抑制された。媒体及びＥＶ１３１ではＣ５ａレベルの上昇は抑制されなかった（図２１及び２２）。
【００７８】
Ｈ１Ｎ１インフルエンザ感染に起因する炎症における補体に対する直接的な役割が示されたのはこれが初めてである。この補体の増加は補体阻害剤ＥＶ５７６によってブロックすることができる。ＥＶ５７６が補体及び関連炎症をブロックする能力は、ＥＶ５７６がＨ１Ｎ１インフルエンザ感染の治療に有効であることを示唆する。
【実施例３】
【００７９】
Ｈ１Ｎ１感染に続くサイトカインストーム及び関連炎症は、Ｈ５Ｎ１感染後にも存在する。従って、Ｈ１Ｎ１感染後の補体増加及び関連炎症をＥＶ５７６がブロックする能力は、Ｈ５Ｎ１感染後に再現されることが期待される。上述及び参考文献２４に記載の実験プロトコルを用い、図２に示すアミノ酸配列を有するＥＶ５７６タンパク質を、気道のヒトＨ５Ｎ１インフルエンザ感染のマウスモデルで試験することができる。Ｈ５Ｎ１又はＨ１Ｎ１インフルエンザ感染後のオセルタミビル（タミフル）とＥＶ５７６の併用の効果も確認することができる。
【００８０】
方法
実験プロトコルは参考文献２４に記載のものと同様である。
【００８１】
体重が２０〜２３ｇに標準化された病原体フリーの雌性マウス（８週齢）（例えば、ＦＶＢ／Ｊ株）に、パスツール研究所から入手したヒトＨ５Ｎ１ウイルス又はＨ１Ｎ１ウイルスを経鼻感染させるか、又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）により偽感染させる。
【００８２】
図２に示すアミノ酸配列を有するＥＶ５７６タンパク質を腹腔内注射によって投与する。マウスにはオセルタミビルを投与することもできる。ＰＢＳを対照として用いる。各感染モデルについて次の４群、即ち、（１）ウイルス＋ＰＢＳ、（２）ウイルス＋ＥＶ５７６、（３）ウイルス＋ＥＶ５７６＋オセルタミビル、及び（４）ウイルス＋オセルタミビルを設けることができる。感染及び処理のスケジュールを下表に示す。
【００８３】
【表１】
0005840623.tif 000002
【００８４】
次の感染徴候や処理効果の値を測定することができる。
・体重（毎日）
・群特異的生存率％
・各々の肺、背腹の写真（各時点）
・肺重量（各時点）
・肺ウイルス価（各時点）
・肺ミエロペルオキシダーゼ活性（各時点）
・オプション１：病理組織学的試験（各時点）
・オプション２：肺好中球ケモカイン（ＫＣ及びＭＩＰ−２）
・オプション３：肺単球／ＮＫ／Ｔ細胞ケモカイン（ＭＣＰ１、ＭＩＰ１α）
・オプション４：肺サイトカイン（ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ＩＬ−１β）
・オプション５：ＩＦによる肺全体のウイルス分布
・オプション６：フローサイトメトリーによるＢＡＬＦ中の細胞数カウント
【００８５】
読み出し回収の時点はＨ５Ｎ１感染後２日目、３日目及び４日目、又はＨ１Ｎ１感染後２日目、４日目、６日目、７日目、８日目とする。感染前の値を求めることもできる。
【００８６】
参考文献
[1] Mastellos, D., et al., Clin Immunol, 2005. 1 15(3): p. 225-35
[2] Peiris JSM, Cheung CY, Leung CYH, Nicholls JM. Innate immune responses to influenza A H5N1 :friend or foe? Trends in Immunology 2009; 30,12: 574-584.
[3] Lee SMY, Gardy JL, Cheung CY et al. Systems-level comparison of host-responses elicited by avian H5N1 and seasonal H1N1 influenza viruses in primary human macrophages. PLoS One, December 2009; 4, 12: 1-1 1.
[4] Guo, R.F. and P.A. Ward, Annu Rev Immunol, 2005, 23: p. 821-52
[5] Neumann, E., et al., Arthritis Rheum, 2002. 46(4): p. 934-45
[6] Williams, A.S., et al., Arthritis Rheum, 2004, 50(9): p. 3035-44
[7] Quigg, R.J., Curr Dir Autoimmun, 2004. 7: p. 165-80
[8] Papagianni, A.A., et al., Nephrol Dial Transplant, 2002, 17(1): p. 57-63
[9] He, C, et al., J Immunol, 2005. 174(9): p. 5750-7
[10] Mead, R.J., et al., J Immunol, 2002. 168(1): p. 458-65
[11] Nakashima, S., et al., J Immunol, 2002. 169(8): p. 4620-7
[12] Mizuno, M. and D.S. Cole, Expert Opin Investig Drugs, 2005. 14(7): p. 807-21
[13] Allegrerti, M., et al.,. Curr Med Chem, 2005. 12(2): p. 217-36
[14] WO2004/106369
[15] WO/2007/028968
[16] WO/2008/029169
[17] WO/2008/029167
[18] WO2009/098454
[19] Terpe K, Appl Microbiol Biotechnol, 60: 523-33, 2003
[20] Sambrook et al (2000)
[21] Fernandez & Hoeffler (1998)
[22] Ausubel et al. (1991)
[23] Remington's Pharmaceutical Sciences; Mack Pub. Co., N.J. 1991
[24] Garigliany et al., (2010) Emerg Infect Dis 16:595-603
【図１】
0005840623.tif 000003
【図２】
0005840623.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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