(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）及び（ｂ）を有する流体サンプルの分析を行う分析システム：
（ａ）１または２以上のマイクロ流体チャネルが配設され、前記チャネル内に裁置されたサンプルに存在する分析対象物（検体）を結合させるための結合剤；カートリッジに前記流体サンプルを導入するサンプルポート；１以上の流体を関連する読み取りデバイスからカートリッジに導入し、マイクロ流体チャネルを経由して移送する少なくとも１つのポート；及び／または前記カートリッジから放出される空気；及び前記チャネルから流体を除去するための流体アウトレットシンクを含むカートリッジ：
（ｂ）下記(i)〜(iii)：
(i)カートリッジを読み取りデバイスに導くレシービングポート、
(ii)空気洗浄を用いて前記カートリッジの流体アウトレットシンクに結合していない標識／サンプルを吐出する手段；
(iii)カートリッジ内で、検体または検体が結合剤と結合する結果として形成する反応生成物を空気の環境下で検出できる検出手段を有する読み取りデバイス。
【請求項２】
読み取りデバイスが、前記カートリッジのポートと共存し、読み取りデバイス内に正しく挿入されたカートリッジが液漏れしないシールを形成するシール手段を１つ以上含む請求項１に記載の分析システム。
【請求項３】
読み取りデバイスが、流体をカートリッジを通して送り出すポンプを１つ以上含む請求項１または２に記載の分析システム。
【請求項４】
前記ポンプが、カートリッジに移送された液体がカートリッジ内で相補的に動く方向に液体を駆送できる請求項３に記載の分析システム。
【請求項５】
前記読み取りデバイスが、カートリッジへの流体移送を制御できる流体管理システムを含む先行する請求項のいずれかに記載の分析システム。
【請求項６】
前記流体管理システムが、流体を前記カートリッジの少なくとも１つのポートに、他のポートと無関係に移送できる請求項５に記載の分析システム。
【請求項７】
単一のサンプルについて複数の分析を行うことができる請求項1〜６のいずれかに記載の分析システム。
【請求項８】
前記複数の分析が同一及び／または異なる分析である請求項７に記載の分析システム。
【請求項９】
前記読み取りデバイスが、磁石、または磁場を発生する手段を含み、前記カートリッジ内の結合剤が磁気特性を有し、磁場が適用され、または読み取り機の磁石が動いてカートリッジ内の結合剤に最接近して、前記結合剤が前記磁場または磁石によって適切な場所に保持される請求項１〜８のいずれかに記載の分析システム。
【請求項１０】
前記磁石または磁場が制御可能であり、結合剤に適用される磁力を分析中に変えることができる請求項９に記載の分析システム。
【請求項１１】
前記結合剤が、特異的に所望の検体に結合するように設計された結合部を表面に有する磁性または常磁性粒子である請求項９または１０に記載の分析システム。
【請求項１２】
前記結合部が、抗体、タンパク、ペプチドまたはオリゴヌクレオチドである請求項１１に記載の分析システム。
【請求項１３】
前記空気洗浄がカートリッジ内に存在する空気を用いて行われる請求項１〜１２のいずれかに記載の分析システム。
【請求項１４】
前記検出手段が蛍光の測定である請求項1〜１３のいずれかに記載の分析システム。
【請求項１５】
前記蛍光の測定が空気中で行われる請求項１４に記載の分析システム。
【請求項１６】
１以上のマイクロ流体チャネルが配設され、前記チャネル内にサンプル中に存在する分析対象物（検体）に結合させる結合剤を含む基材；流体サンプルをカートリッジに導入するサンプルポート；前記チャネルから流体を除去する流体アウトレットシンク；毛管作用のみによって、サンプル及び／または他の流体がストップ機能を通過するのを妨げるように設計されている、１または２以上の流体ストップ機能；及び１以上の流体を関連する読み取りデバイスから前記カートリッジに導入しマイクロ流体チャネルを経由して移送し、かつ／または前記カートリッジから空気を吐出する、少なくとも１つのポートを含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の分析システムで使用するマイクロ流体分析カートリッジ。
【請求項１７】
さらに、結合した検体を検出する検出領域を含み、前記検出領域はサンプルポートの下流のテスト・サンプル・チャネル内にある請求項１６に記載のマイクロ流体分析カートリッジ。
【請求項１８】
前記カートリッジ、前記チャネル及びそこに搭載される他の機能が３枚の別個の基板（上板、中板及び下板）のサンドイッチ構造として形成されている請求項１６または１７に記載のマイクロ流体分析カートリッジ。
【請求項１９】
前記上板及び下板が２００μｍより厚くない請求項１８に記載のマイクロ流体分析カートリッジ。
【請求項２０】
前記カートリッジが、上板面、下板面及び前記上板面及び下板面の間に設けられた少なくとも１つの壁を含む請求項１６〜１９のいずれかに記載のマイクロ流体分析カートリッジ。
【請求項２１】
前記上板面が、前記読み取りデバイスから流体を前記マイクロ流体チャネルに導入する前記少なくとも１つのポートを含む請求項２０に記載のマイクロ流体分析カートリッジ。
【請求項２２】
前記サンプルポートが、前記上板面及び下板面の間に設けられた前記壁に形成されている請求項２０または２１に記載のマイクロ流体分析カートリッジ。
【請求項２３】
前記カートリッジのポートが読み取りデバイス内のシール手段と共存し、流体を読み取りデバイスからカートリッジに導入できる請求項１６〜２２のいずれかに記載のマイクロ流体分析カートリッジ。
【請求項２４】
さらに、流体サンプルについて電気的測定を行うための、チャネルと接触している１以上の電極機能を含む請求項１６〜２３のいずれかに記載のマイクロ流体分析カートリッジ。
【請求項２５】
前記結合剤が、カートリッジ内の壁あるいは前記チャネル内に配設された磁性あるいは常磁性粒子のような磁性剤の表面に直接付けられている請求項１６〜２４のいずれかに記載のマイクロ流体分析カートリッジ。
【請求項２６】
さらに、前記マイクロ流体チャネル内に配設された、捕捉した分析対象物の検出を促進する標識のような１以上の試薬を含む請求項１６〜２５のいずれかに記載のマイクロ流体分析カートリッジ。
【請求項２７】
前記１以上の試薬は、その試薬がカートリッジに初期装填されたサンプルとは接触しないように前記マイクロ流体チャネルの中に配設されている請求項２７に記載のマイクロ流体分析カートリッジ。
【請求項２８】
検出領域を形成する前記カートリッジ材料がポリカーボネート、ポリエステル、ポリスチレン及びポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）から選択されるクレーム１６〜２７のいずれかに記載のマイクロ流体分析カートリッジ。
【請求項２９】
請求項１６〜２８のいずれかに記載のマイクロ流体カートリッジに、１以上のストップ機能により停止される前に、毛管作用により流体サンプルを導入し、前記流体サンプルがカートリッジから汲み出されて結合剤に接触し、サンプル中に存在する分析対象物（検体）の少なくとも一部が前記結合剤に結合する工程；前記カートリッジ内に存在する空気を用い、結合した検体から結合していない物質を洗浄し除去する工程、及びカートリッジに存在する結合した検体を検出する工程を有するサンプルの分析方法。
【請求項３０】
前記結合剤が磁性または常磁性であり、結合した検体が洗浄工程の間、磁石または磁場によりその場所に保持される請求項２９に記載の分析方法。
【請求項３１】
洗浄が１工程以上行われる請求項２９または３０に記載の分析方法。
【請求項３２】
標識または他の試薬を、結合した検体と接触させる請求項２９〜３１のいずれかに記載の分析方法。
【請求項３３】
検出が、結合していないサンプル成分を実質的に含まない検体について行われる請求項２９〜３２のいずれかに記載の分析方法。
【請求項３４】
流体サンプルが全血サンプルである請求項２９〜３３のいずれかに記載の分析方法。
【請求項３５】
マイクロ流体カートリッジに導入される流体サンプルが１μＬ未満である請求項２９〜３４のいずれかに記載の分析方法。
【請求項３６】
検出が蛍光測定により行われる請求項２９〜３５のいずれかに記載の分析方法。
【請求項３７】
検出が空気中で行われる請求項２９〜３６のいずれかに記載の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、使い捨てのアッセイ(分析)（assay）用カートリッジとそれに関連するリーダー（reader）（読み取り装置）、またそれらの個々の構成部品を含む、マイクロ流体に基づくアッセイ装置に関する。本発明はまた、本発明のカートリッジやデバイス、さらにはアッセイを行うためのキットを使用するアッセイ方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インビトロ診断（ＩＶＤ）市場はかなり競争が激しく、ＩＶＤ市場では、絶えず高速、低容量、正確かつ安価な体外（インビトロ）診断テスト開発のニーズがある。また、ユーザーの複雑度を軽減する毛細管指先採血検査の開発をし、市場全体（介護の現場、医師の手術、自宅等）へ普及させるという市場の強い要求もある。この毛細管指先採血ＩＶＤテスト様式は、糖尿病テスト用として３５億ドル市場（参照：Medical Device Today）に発展し、非常に成功したことが証明されている。ＩＶＤ免疫測定法を毛細管指先採血テストに進化させる要望と能力は、技術開発に妨げられてきたが、複雑さを軽減でき、また製品を既存の市場や未開拓市場へより多く販売できる可能性があるために、多くの診断用器具会社の将来的な目標となっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、体外診断テストを実施するための、安価で信頼性の高いアッセイシステムを提供することである。
【０００４】
本発明の別の目的は、簡単かつ安価に組み立てられると同時に、特定のアッセイ（単数または複数）を実施するよう構成できる、アッセイ用カートリッジ設計のプラットフォーム（platform；基板ということがある。）とリーダーを提供することである。
【０００５】
本発明の別の目的は、種々の異なる特定のアッセイを実施するよう簡単に適合させることができるアッセイ用カートリッジを提供することである。
【０００６】
本発明の別の目的は、種々の異なるアッセイを行うために好ましく使用されるか、または容易に適合できるリーダーを含むアッセイシステムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、第１の態様において、流体試料（サンプル）中の分析対象物（検体）（analyte）検出用のマイクロ流体アッセイ用カートリッジを提供する。カートリッジは以下のものを含む：
内部に配置された１以上の微小流体流路（チャネル）（channel）を含み、及び試料内の任意の検体を結合させるチャネル内に配置された結合剤を含む基板、
カートリッジ内に流体試料を導入するためのサンプルポート、
連結するリーダ装置から１以上の流体をカートリッジに導入し、マイクロ流体チャネルを通って移送できるようにするための少なくとも１つの流体注入（インプット）（input）ポート、及び
チャネルから流体を除去するための流体排出（アウトプット；outlet）シンク。
【０００８】
カートリッジは、結合した任意の検体を検出する検出領域を含んでもよい。検出領域は、サンプルポートと直接隣接しているか、またはその下流側にあるサンプルチャネル内にあってもよい。
【０００９】
本発明のカートリッジの設計は、容易に適合され、複数の異なるアッセイを行うことも可能なので、種々のアッセイのためのアッセイプラットフォームとみなすこともできる。配置されるカートリッジ及びチャネルは、当業者に公知の方法、フォトリソグラフィ、湿式化学エッチング、レーザーアブレーション法、射出成形、エンボス加工と印刷技術などの任意の方法で形成することができる。しかしながら、好ましい実施態様では、それらに配置されるカートリッジ、チャネル、及びその他の機能（feature）は、上板、中板、下板の３つの別々の基板のサンドイッチ構造に形成される。
【００１０】
カートリッジは、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリスチレン、ＰＭＭＡ等任意の適当な材料から形成することができ、その／各基板は単数のまたは複数の材料から形成することができる。３つの基板を含む実施態様では、中層の基板は、チャネル、流体リザーバー（reservoir）（貯蔵器、単数でも複数でも可。以下特に記載のない場合は同様とする。）ポート、シンク領域などのカートリッジの特定の機能に対応して基板を切り抜いたパターンを含む。適当にカットした上層及び下層の基板を、それらの間に中層の基板を挟むようにサンドイッチ状にし、適合することにより（例えば、熱シール、接着、ステープル留め等により）、チャネルや他の機能が配置されている位置へカートリッジを設置することができる。上部及び／または下部基板の開口部または機能は、リーダー装置の機能と同じ位置に配置するように設計することができる（以下に説明するように）。それは開口部または機能はリーダーにおいてカートリッジを正しい位置に配置しやすくし、さらに洗浄用緩衝液などの流体をリーダーの流体リザーバーからカートリッジへと導入しやすくしたり、試料の適用やカートリッジからの空気排出を促進する。流体／洗浄用緩衝液またはガスは、リーダーのポンプ（複数可。以下特に記載のない場合は同様とする。）等の適当な手段によりカートリッジへ導入することができ、その流体の移送手段は、カートリッジ内で流体移送を制御することができる。このように、一旦サンプルが毛細管作用などの方法によりカートリッジ内に導入されると、カートリッジの内部への、またカートリッジ全域へのさらなる流体の移送は、リーダー装置に設けられた手段により、制御／促進される。流体注入ポートを介してカートリッジに導入される流体は、当然、液体及び／または空気などの気体であってもよい。
【００１１】
上記するように、使用にあたって、試料は、毛細管現象や他の手段などにより、サンプル注入ポート（導入口）を介してカートリッジに導入される。好ましい実施態様では、試料注入ポートは、カートリッジの側面または表面の開口部である。カートリッジは、一般的に上面と底面と４つの端面を含む薄い平面状のデバイスであることが望ましい。この構成では、サンプル注入ポートをカートリッジエッジのいずれか１つの端面に形成し、ユーザーが端面に形成された開口部に試料を接触させるだけでカートリッジ内へ試料を取り込むことができるようにする。ある実施態様において、使用時にユーザーが流体サンプルをポート／開口部に接触させると、カートリッジ内の前記チャネルの寸法により、流体が毛細管現象によりカートリッジ内に引き込まれる。サンプルポート／開口部の寸法は、チャネルの寸法よりも小さくする。流体がカートリッジを通って移送されているとき、湿潤面が存在しないので、流体はサンプルポートから排出されない。しかし、シンクには湿潤可能な大きな空隙エリアがあるので、優先的な流体経路はシンクへと入る。
【００１２】
前記カートリッジの流体注入ポート（複数可）は、リーダーの機能と同じ場所に配置するよう構成されており、それにより、リーダー内のリザーバーに含まれる洗浄緩衝液や空気のような気体などの流体を、カートリッジに導入することができる。通常、注入ポートは、カートリッジの上面にある単なる開口部または孔である。カートリッジは、通常、単一の流体または複数の流体をカートリッジ内の異なる時点及び／または位置で添加することができるように、複数の注入ポートを含んでもよい。一般的に、前記各カートリッジの流体注入ポートと、リザーバーの流体に接続できるリーダー内の弁（バルブ）や配管などの機能との間に、流体密封が形成されていることは理解されるであろう。
【００１３】
前記カートリッジ内のチャネルには、１以上の流体ストップ（停止）機能を備えることが望ましい。流体ストップ機能は、毛細管現象のみで試料及び／またはその他の流体がストップ機能を通過するのを防止するよう設計されている。すなわち、試料及び／またはその他の流体は、リーダーに備えられたポンプ（複数可）の使用などの圧力により、前記ストップ機能を超えて積極的に押し流される可能性がある。ストップ機能は、疎水性材料（例えば、印刷可能な導電性または非導電性インク）、またはチャネル表面の表面特性を変化させ親水性／疎水性の違いを生み出す（例えば、レーザアブレーション、表面刻み加工（surface scoring）、表面材料除去、金属材料の蒸着などの方法により）プロセスまたは材料が好ましく、障壁となるように／障壁に接するように設計されているか、またはチャネルの壁面にコーティングされている。チャネルが３つの基板を積層したサンドイッチ構造で形成されている実施態様では、疎水性材料を、上板及び／または下板に付与することができる。例えば、３つの基板が共にサンドイッチされた場合、疎水停止材料は前記チャネルの上面及び／または底面上で役立つ機能となる。
【００１４】
またストップ機能は、サンプル導入の初期時にサンプルがシンクに流入しないように、シンク機能の上流に位置することが好ましい。リーダー内においてポンプなどの手段により圧力がもたらされる場合のみシンク機能の上流のストップ機能を通過し、流体がシンクへと流入する。流体排出シンクは、使用済みの流体、または必要でない流体や望ましくないとみなされる流体を排出するカートリッジの空隙領域になるように設計されている。例えば、全血液は、アッセイ反応及び／または蛍光検出などの方法による捕捉検体の検出を妨害する可能性のある、多くのタンパク質及び他の化学物質を含む。本発明は、全血液試料内で行われる任意の検体の初期の結合を可能にするが、全てまたは実質的に全ての非結合材料は、その後シンク機能に排出することができ、規定の媒体または緩衝液中で実施されるべきさらなる反応及び／または検出を可能にする。
【００１５】
本発明のカートリッジは、マイクロ（微小）流体チャネルだけでなく、チャネルと接続されその後サンプルが一旦カートリッジに導入される１以上の電極の機能を備えることができる。電極は、必要に応じて様々な測定値が取得できるよう、リーダー内の電気接点に接続するように設計されている。例えば、カートリッジ内の１つまたは複数の電極は、カートリッジの正しい装填を検出するように設計されており、リーダーはユーザーに、カートリッジがリーダーに正しく挿入されたか、及び／またはサンプルがカートリッジに正しく導入されたかどうかについて信号を送る。電極はまた、サンプル自体の１つまたは複数の電気的測定を行うこともできる。例えば、試料が全血液試料である場合には、電極は、検出される検体の正確な濃度を決定することが重要である試料のヘマトクリット測定を行うことができる。導電性及び／またはインピーダンス（電気抵抗）測定は、検査される試料に応じて決定することができる。このように、本発明のカートリッジは、任意の検体を結合する方法により試料中に検体が存在するか否かを検出するだけでなく、試料の電気的測定も行うことができる。
【００１６】
カートリッジに導入される試料は、任意の適当な流体試料でよい。例えば、全血液、血漿、唾液、精液、汗、血清、月経、羊水粘膜液、涙、組織スワブ、尿、脳脊髄液、粘液などのように、被験体から採取された流体試料が挙げられる。本発明のアッセイシステムは大規模な成長中のＩＶＤ市場（例えば、癌、心臓病、感染症）を含むヒトの健康の分野に応用できることが理解されるであろう。このアッセイはまた、薬物や薬物作用を検査するために使用することもできる。しかしこのシステムはまた、有毒物質、細菌やウイルスなどの感染性病原体を検出することが望ましい環境にて応用することもできる。従って、河川や湖沼または固体表面からのスワブ（細菌検査用標本）からの試料が、カートリッジに供給する流体試料を得るために取得されることもある。このアッセイシステムはまた、獣医学用途に利用することもできる。基本的に、試料が流体の態様で提供される任意のアッセイは、本発明で利用することができる。
【００１７】
試料には、例えば、供給源から直接得られる全血液などの物質、並びにろ過、沈殿、希釈、蒸留、混合、濃縮、阻害剤の不活化などの技術を用いて前処理された物質が含まれる。これらの工程は、試料がカートリッジに導入される前に行ってもよいし、カートリッジ自体により行うこともできる。
【００１８】
試料は、カートリッジがリーダーに装着される前またはリーダーに装着された後に、導入することができる。カートリッジは、試料が毛細管現象により導入されるか、またはカートリッジとリーダーの注入ポートとの間を密閉し、リーダー内のポンプなどのポンプによりマイクロ流体チャネルを通って引き込まれる空気により、試料が積極的にカートリッジ内に引き込まれるように設計することができる。
【００１９】
検出される検体は、任意の所望の検体であり、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、微生物（細菌やウィルスなど）、化学薬品、毒物、医薬品、代謝物、細胞部位などが挙げられる。例えば、本システムは、適当な結合剤と結合できる任意の種類の検体を検出するように構成される。結合剤は、検出すべき検体に特異的に結合することができる適当な任意の薬剤でよい。例えば、検体がタンパク質またはペプチドである場合、結合剤は、タンパク質／ペプチドに特異的に結合することができる受容体または抗体である。一方、抗体は、抗体が特異的に結合するように設計されているタンパク質／ペプチドと結合する。核酸は、特に検体核酸とハイブリダイズすることが可能な他の核酸と結合する。微生物は、その微生物の表面上のタンパク質に特異的に結合する抗体と結合する。化学薬品、毒物、医薬品、代謝物は、適当な結合反応または親和性を介して、前記化学的検体と反応可能であるか、結合可能である化学部位と結合する。多くの種類の結合技術が、当業者によく知られている。
【００２０】
さらに、結合剤として酵素または酵素基質が挙げられる。例えば、酵素方法論でよく説明されるグルコースなどの検体が検出される、例えばグルコースとの酵素反応に引き続いて形成される反応生成物が当業者に公知の電気化学的または光学的検知法を用いて検出される。このような測定は、独立した（スタンドアロン）測定として、または試料中の検出すべき他の検体の測定と組み合わせて行うことができる。
【００２１】
結合剤は、例えば物理的吸着、共有化学結合、非共有結合性の化学結合（例えば、ビオチン−アビジン）、または上記の任意の組み合わせの方法で、壁面や表面に適した結合により、カートリッジ内の前記チャネルの壁面や表面にそれ自体を直接接着することができる。好ましい実施態様では、結合剤は磁性または常磁性粒子の形状であり、結合部位を含み、その結合部位は粒子の表面に非共有結合性の化学結合（例えば、ビオチン−アビジン）で結合している。他の実施態様として、磁性粒子などの磁気剤の表面への物理吸着、共有化学結合、非共有結合性の化学結合（例えば、ビオチン−アビジン）またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。磁気剤／粒子に結合する結合剤を含む機能化した磁気剤／粒子をカートリッジのチャネル内に単に置いて、試料をカートリッジに適用し、チャネル内に引き込まれる際に機能化した磁気剤／粒子流体試料によって再懸濁して試料内の検体（分析対象物）と接触するようにしてもよい。
投入の領域は、測定／検出領域に乾燥されて投入される試薬成分（例えば、蛍光ラテックス）に起因するバックグラウンドの高い測定値が得られないように、検出領域と投入領域を分離するために前記した技術によって疎水性のストップ機能を用いて決めることができる。
【００２２】
前述したように、カートリッジには結合剤だけでなく、さらに前記マイクロ流体チャネルに堆積させる１または複数の試薬（reagents）を含んでもよい。この試薬は捕捉検体の検出を容易にすることができる。前記の１または複数の試薬としては、例えば、捕捉検体に特異的に結合するように調整された標識（label）が挙げられる。これによりその検出が容易になる。
【００２３】
結合した検体（結合分析対象物）は、その検体が検出可能な信号を発生することができる場合は直接検出することができるし、検体の結合において反応生成物を発生させるために反応を行い、その反応生成物を検出することができる。しかし好ましい実施態様では、結合した検体を、その検体と結合できる標識と接触させ、続いて標識／結合剤／検体の複合体が検出される。さらに標識はそれ自体、結合剤／検体の複合体に特異的に結合できるさらなる結合部位に結合する。通常、標識は最初に結合剤が結合した部位とは異なる、検体の別の部位に結合することができ、またそのような複合体の生成においてのみ形成される結合剤／検体の複合体の部位に結合することができる。
【００２４】
結合した検体は、その検体の移動をもたらすリーダーの移送手段により、カートリッジの領域内の標識へと移送される。あるいは、リーダーの流体リザーバー（複数可。以下、特に記載しない場合は同様とする。）からカートリッジへと流入する一定量の流体により、検出剤や標識に結合した検体を接触させる。
【００２５】
結合剤及び任意の検出剤／標識は、カートリッジのチャンネルで堆積されるとき、乾燥状態であることが望ましい。
【００２６】
ある実施態様では、検体の検出を容易にするために設計された検出剤／標識は、最初はそのようなストップ機能の（試料がカートリッジ導入後に流れる方向の観点から）上流に位置している。この場合、前記検出剤は、最初に試料をカートリッジに投入するとき試料と接触する状態になっていない。緩衝液などの流体が、流体注入ポートを介してカートリッジに供給される場合にのみ、検出剤は結合した検体とともに構成される。流体がリーダーからカートリッジに導入される場合、検出剤は流体により移送され再懸濁した結合した検体と接触するようになり、また流体によって移送されストップ機能を通過し捕捉検体との接触が生じる。
【００２７】
他の実施態様では、試料と結合剤の初期結合段階及び任意の洗浄の後、緩衝液媒体中の磁性粒子−検体の複合体を、標識が乾燥状態で配置されているチャネル内の上流領域の場所へ移動させることができる。緩衝液媒体中の磁性粒子−検体複合体は、標識を再懸濁／再水和し、検体への結合を可能にする。この移送事象により、リーダーの性能に応じて、チャネル（密封されたシステムである）から効果的かつ正確に空気を除去することができる。この方法では、堆積した試薬の再水和及び試薬の分散均一性をより良好に制御することができる。
【００２８】
他の実施態様では、結合剤及び標識は試料チャネルに堆積される。試料はこれらの試薬を再水和し、結合反応が生じるようにする。この態様では、全ての試薬が試料に接触することができ、その後リーダーは、磁石／電磁石の適用により試料チャネル内の領域に磁性粒子−検体−標識の複合体を蓄積する。次にリーダーは、空気／流体洗浄により結合されていない標識／試料をシンクに排出する。リーダーは、使い捨ての空気／流体のリザーバー、または同様の再利用可能な空気／流体のリザーバーを使用することができる。その後磁性粒子−検体−標識の複合体は、流体中や空気環境で定量化される。
【００２９】
各カートリッジは単数または複数の検体の検出を行うよう設計することができる。また、各カートリッジは、単一のカートリッジの使用で１以上のアッセイを行うことができるように、１以上のマイクロ流体チャネルシステムを含むことができる。
【００３０】
カートリッジは容易に大量生産できることが望ましい。カートリッジは、ストリップ（strip）に設けられる。そこでは多数のカートリッジは最初に、例えば最初は穴のあいたシールなどにより一緒に接続される。この方法では、ユーザーは使用前に、簡単にカートリッジをストリップから取り出すことができる。
【００３１】
カートリッジが試料とともに搭載されると、任意の捕捉検体は、適当なリーダーによって検出される。本発明はこのようなリーダーを提供し、本発明の重要な態様は、リーダー内で流体／緩衝液のリザーバーが独立した設備であることである。この利点の１つとしては、カートリッジ自体は初めに乾燥していてもよいこと、すなわち試料の投入前にはカートリッジ内に流体がほとんどまたは全く含まれていないことである。これは、カートリッジ自体の製造を簡素化するだけでなく、貯蔵寿命を向上させ、本発明のほとんどのカートリッジを室温で保存することができるので、カートリッジ内の化学的または生物学的成分が使用前に劣化することはほとんどない。
【００３２】
さらなる態様において、サンプルの分析を行う方法が提供される。この方法は、
サンプル中に存在する任意の分析対象物が結合剤によって結合されることが可能となるように本発明のマイクロ流体カートリッジに試料を導入すること；
注入ポートによりカートリッジに導入された適当な流体やガスを使用して、結合した検体から任意の未結合物質を洗浄する工程、また；
カートリッジに存在する任意の標識化された結合した検体を検出する
ことを含む。
【００３３】
さらなる態様では、流体試料の分析を行うアッセイシステムが提供される。そのアッセイシステムは、
ａ）第一の態様（またはそれらの好ましい具体例）によるマイクロ流体カートリッジ、及び；
ｂ）リーダー装置
を含む。
リーダーのデバイスは、
ｉ）リーダー内にカートリッジを導入するためのレシービングポート；
ii）流体やガスを貯蔵するための内部リザーバー；
iii）一旦リーダー内に導入された流体やガスを、カートリッジのマイクロ流体チャンネルを通して移送できるように、流体やガスをカートリッジの注入ポートに供給する手段；
iv）任意の結合した分析対象物、または分析対象物が結合剤を結合して形成される反応生成物のカートリッジ内での検出を可能にする検出手段
を含む。
【００３４】
リーダーは、カートリッジが装着されるレシービングポート（receiving port）を含む。リーダーはカートリッジが正しく装着されるように調節することができ、種々の態様を取ることができる。例えば、カートリッジは、ＣＤなどを載せるコンピュータのように、リーダーに入る搬送機構上に最初に配置することができる。または、レシービングポートはカートリッジを受入れられる大きさにし、カートリッジが正しく装着されたとき、リーダー内にある内部ストッパー部材と接した状態となる。さらに、またはあるいは、カートリッジの表面上、またはカートリッジの表面のカット部に見られる機能が、リーダー内にある機能と同じ場所に配置するように設計され、カートリッジがリーダー内に正しく配置されたときのみ、カートリッジの読み取りが可能となる。
【００３５】
流体リザーバーは、リザーバー内の流体の交換が必要とされる前に、１以上の試料カートリッジを分析し、読み取ることができるような大きさにすることが好ましい。アッセイの多くは、リザーバー内の流体の交換が必要となる前に行われることが望ましい。あるいは、内部リザーバーが空気で満たされている場合には、リザーバーは完全に排出されている状態と同様で交換する必要がなく、大気中から空気を引き込み、初期の状態に戻すことができる。流体リザーバーの場合、流体を別のソースから手動でリザーバーに導入してもよい。リザーバーは、必要なときにリーダーに装着することができる交換可能なカートリッジの形状を採用することが好ましい。例えば、ユーザーは、種々のタイプのアッセイを実行するよう構成できるリーダーを有していてもよくまたは備えられるが、ユーザーは、検出される特定の分析対象物に適した分析カートリッジ及び流体リザーバーカートリッジを含むキットを提供される。この場合、ユーザーは使用前に、流体リザーバーカートリッジをリーダーに挿入する。リザーバーカートリッジ自体は、リーダーにより試料カートリッジとリザーバーカートリッジに適した特定のアッセイに関連付けられていることが認識される、バーコードやチップデバイスなどの固有の識別子機能を有していてもよい。または、特定の試料カートリッジ及び任意のリザーバーカートリッジに関連付けられるその特定の分析を実施するようにリーダーを構成することもできる。いくつかの分析では、別々に製造された試料カートリッジが必要になることもあるが、異なる種々のアッセイを行うために、単一の流体リザーバーカートリッジを使用することもできる。単一の流体リザーバーカートリッジは、リザーバーカートリッジの交換が必要となる前に、２５または５０を超える多くの分析を行うことができるよう十分な流体を含むことが望ましい。流体は、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸）等の緩衝液を含有する水などの洗浄剤であってもよい。他の流体も適宜使用できる。
【００３６】
結合剤が磁気ビーズなどの磁気剤の表面に結合されている実施態様では、リーダーには、磁場を印加するようまたは近接近にして付与するよう設計されているか、または磁場を印加した永久磁石や電磁石が含まれ、それにより、前記カートリッジの微小流体チャネルの特定の領域で、磁性粒子を集めたり、保持したりすることが理解される。この領域は、検出領域となることもある。特定の領域に磁性粒子を収集することにより、捕捉された任意の分析対象物の検出を容易にしたり、及び／または検出感度を向上させたりすることができる。また、磁場により粒子を保持することによって、結合した分析対象物の周囲にある不要な流体を洗い流すことができ、それにより、初期試料中に存在し得る潜在的な妨害剤／汚染物質を捕捉検体から遠ざけることができる。永久磁場または電磁場は、カートリッジから永久磁石を近くにまたは遠くに移動することにより、または印加磁場の強度を増加させたり減少させたりすることにより、軽減または増加させることができる。これにより、磁性粒子が磁場によりある程度保持されている状態または保持されていない状態で、特定の場所において“リラックス（緩和状態）”または低濃度にさせることができる。これにより粒子で実施すべき更なる反応を促進することができ、磁性粒子がしっかりと収集されている場合と比較してより効率的に行うことができる。また、粒子の“濃縮”が少ない場合または緩和状態のときに検出が行われる特定の場合に好ましく適用される。
【００３７】
使用中の際、一旦磁場が試料にもたらされると、磁石は任意の結合物質を保持するために使用される。流体注入ポートからカートリッジに導入される流体は、任意の非結合成分を洗い出すこともできるし、及び／または検出剤などの他の試薬を捕捉検体に接触させることもできる。
【００３８】
本発明のリーダーはさらに、試料カートリッジ内の任意の捕捉検体を検出する検出手段を備えている。検出手段は、特定の分析に応じて任意の適当な手段とすることができる。例えば、検出手段として、適切に励起した標識化された、または非標識の結合した検体または反応生成物からの蛍光信号を検出する蛍光光度計を使用することができる。結合した検体／反応生成物は、その検体／生成物を励起するのに適した波長の光が使用されると自然に蛍光を発することができる。または結合した検体と蛍光手段により検出された標識を別々に結合するために、さらなる標識を使用することができる。その他の標識として、放射性標識、リン光標識、金属コロイド粒子、生物発光標識、比色標識、電気化学標識などが採用され、それに従い検出手段が調節される。さらに、上記したように、結合した検体や放射生成物自体は、ラマン分光法などを用いて直接検出することができる。
【００３９】
検出可能な標識は、単独でまたは金属酸化物、多糖類またはラテックス粒子などの微小粒子やビーズと組み合わせて使用することができる。多くの種類のラテックス及び他の粒子が、当該技術分野で知られている。
【００４０】
リーダーには、流体リザーバーからカートリッジへ、またカートリッジ全体へ流体を移送するのに適した手段が備えられている。リーダーはまた、フィルターを通した空気などの空気を、前記カートリッジの微小流体チャネルへ移送するように構成されている。リーダーは、リザーバーの流体及び／または空気をカートリッジに導入することができるように、必要に応じて適当な配管、弁及び／またはシールを備えている。この手段は、ポンプとすることができ、ポンプは１方向に流体／気体を送り出すことができるものでも、また前後に流体／気体を送り出すことができるものでもよい。好ましいポンプとしては、ステッピングモータリニアアクチュエータ、圧電ポンプ、浸透ポンプ、蠕動ポンプ、またはピストンポンプが挙げられる。流体／気体の試料カートリッジへの移送は、試料カートリッジへの１以上の流体／気体の移送または１以上の注入開口部への移送を、カートリッジ内及び適当なタイミングで制御するマイクロ流体制御アセンブリによって制御することができる。
【００４１】
リーダーは、特定の温度で分析ができるような加熱装置だけでなく、１以上の異なる分析を実施するようにリーダーをプログラムすることができる適当な電気回路及びソフトウェアなどの他の機能を設けることもできる。
【００４２】
カートリッジとリーダーを含む本発明の基板（プラットフォーム）システムには、以下のような多くの特徴的な利点がある：
１．サンプル量の縮小：指先穿刺血液サンプルのような流体の毛管導入により、使用時の複雑さを軽減し、どのような環境でも検査を行うことができ（例えば、救急車、ケア（介護）の現場、医師の手術、戦場等）、またグルコース検査のように製品をどこにでも置くことができる。
２．性能、感度、精度：複数工程の分析を実行する性能により、任意の体外診断（ＩＶＤ）検査で主に要求される分析感度、精度及び再現性が向上する。ＦＤＡ（食品医薬品局）は、ＩＶＤ検査の新製品の発売ための許容全誤差を下げているので、これはますます重要になるであろう（既存及び新製品の市場への参入が難しくなる。）。
３．室温安定性：既存のＩＶＤテストの多くは、冷蔵貯蔵して移送することを要するが、この要件は、製品にかなりのコストがかかり、製品の使用と配布を制限することになる。試料カートリッジは初期状態で“乾燥している”ので、その安定性と貯蔵寿命の向上につながる。
４．材料の低コストと簡便な製造工程により、売上原価（ＣＯＧＳ）が低くなり、体外診断（ＩＶＤ）ストリップの販売により、実質的に利益が増加するようになる。従来の検査では、ストリップ材料費や全体的なアッセイ費用が高く複雑になる傾向にあったので、これは特に、免疫測定及び分子ＩＶＤの市場で望まれている。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
以下、図面を参照しながら、実施例として本発明をさらに説明する。
【００４４】
【図１】本発明による試料カートリッジの概略図を示す；
【図２】本発明のカートリッジの形成方法についての概略図である；
【図３】種々の機能を示す本発明によるカートリッジの一部の写真である；
【図４】図３に示すカートリッジの一部に血液が注入し充満する状態を示す；
【図５】図３に示すカートリッジの一部に血液が注入し充満する状態を示す；
【図６】磁性粒子が磁石により捕捉され、次に保持され、その後血液サンプルを洗い流す状態を示す、本発明のカートリッジの詳細部分の写真である；
【図７】磁性粒子が磁石により捕捉され、血液サンプルを洗い流した後保持されている状態を示す、本発明のカートリッジの詳細部分の写真である；
【図８】磁性粒子が磁石により捕捉され、血液サンプルを洗い流した後保持されている状態を示す、本発明のカートリッジの詳細部分の写真である；
【図９】磁石を部分的に除いた後、磁性粒子がより拡散している状態を示す、本発明のカートリッジの詳細部分の写真である；
【図１０】本発明による試料カートリッジのさらなる実施態様の概略図である；
【図１１】（Ａ）及び（Ｂ）は、本発明による試料カートリッジのさらなる実施態様の概略図である；
【図１２】（Ａ）及び（Ｂ）は、本発明によるリーダー装置の概略図である；
【図１３】（Ａ）及び（Ｂ）は、本発明によるリーダー装置に関連する内部機構の概略図である；
【図１４】（Ａ）及び（Ｂ）は、本発明のリーダ装置内に見られる流体管理システムの概略図である；
【図１５】（Ａ）及び（Ｂ）は、流体リザーバーシステム、及び本発明のリーダー内での使用方法についての概略図を示す；
【図１６】本発明によるＭＳＴプロメーターＶ１（MST Pro Meter V1；Multi-Sense Technologies社の製品）で測定されたアッセイカートリッジを用いた総ＰＳＡ洗浄湿式アッセイの実験結果のグラフを示す；
【図１７】MST Pro meter及び参照装置のVictor V（登録商標）のストリップ（strip）で測定された総ＰＳＡ洗浄湿式アッセイの相関関係を示す実験結果のグラフを示す；
【図１８】MST Pro meter及び参照装置のVictor Vのストリップで測定された総ＰＳＡ洗浄湿式アッセイの実験結果の相関関係を示すグラフを示す；
【００４５】
【図１９】チャネルから未結合の標識を排除する空気洗浄工程を使用する、MST Pro Meter及びStripで行われた総ＰＳＡ湿式アッセイの実験結果のグラフを示す；
【図２０】洗浄工程を使用せず、磁性粒子−ＰＳＡ−蛍光ラテックス複合体が磁石により蓄積された後、フルオロフォア（fluorophore）（蛍光色素分子）の蛍光強度を測定する、MST Pro Meter及びStripで行われた総ＰＳＡ湿式アッセイの実験結果のグラフを示す；
【図２１】MST pro meter V1及びStripで行われた総ＰＳＡ洗浄湿式アッセイを示す実験結果のグラフを示す。データにおいて、ＭＳＴプロメーターＶ１は試料（未結合の標識を含む）をストリップチャネルからシンクへと排出する流体洗浄を使用している；
【図２２】ＭＳＴプロストリップＶ１（MST Pro Strip V1；Multi-Sense Technologies社の製品）で乾燥した試薬を用い、本発明によるMST Pro Meter V1で行われた総ＰＳＡ乾式アッセイの実験結果のグラフを示す。
【図２３】MST Pro Strip V1で乾燥した試薬を用い、MST Pro Meter V1で行われた総ＰＳＡ半乾式２工程アッセイの実験結果のグラフを示す。この場合、蛍光ラテックスは乾燥状態で検査（テスト）カートリッジに投入された。
【図２４】MST Pro Strip V1で乾燥した試薬を用い、MST Pro Meter V1で行われた総ＰＳＡ半乾式２工程アッセイの実験結果のグラフを示す。この場合、磁性粒子は乾燥状態で検査カートリッジに投入された。
【図２５】MST Pro Meter V1装置を用い、MST Pro Strip V1のストリップにおける検査サンプルチャネルの全体スキャンの実験結果のグラフを示す；及び
【図２６】本発明による試料カートリッジ（実施例で使用されたMST pro strip V1）の実施態様の概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明の１実施態様による試料カートリッジ（１０）は図１に示される。血液などの流体は試料導入口（１２）へ導入される（例えば、指や静脈血から）。血液を提供しているユーザーにはチャネルは１つであると思われるかもしれないが、この特定の実施態様では、１つの試料導入口（１２）から２つのチャネル（１４，１６）へ広がり、チャネル（１４，１６）は分離して連結していない。以下の説明は全血試料であるサンプルに関するが、これに限定するものとして解釈されるべきではない。
【００４７】
全試料の投入量は、充満させるチャネル数に応じて１μｌより少ない量とする。それはユーザーが１滴の血液などのサンプルを注入すると、２つのチャネル（１４，１６）が毛管力により満たされる程度の量である。この作業は非常に速く、いくつかのイムノアッセイプラットフォームを充填する非常に長い血液分離とは対照的に、血糖ストリップの充填により適合するものである。２つのチャネル（１４，１６）に堆積させるものは、抗体（１８）で機能化された磁性粒子である。詳細に説明するように、血液は流体ストップ機能（２０，２２）まで、各チャネル（１４，１６）を満たす。一方のストップ機能（２２）はシンク空間（２８）の下流にあり、もう一方のストップ機能（２０）はサンプルチャネルの本管にある。流体ストップ機能は、チャネル表面に印刷可能な疎水性のインクを塗布することによって作成される。図２ｂに示すように、カートリッジ（１０）が３枚の基板（５０，５２，５４）から形成される場合、疎水性インクは、ストップ機能をチャネルの上面及び下面に形成するために、上板（５０）と下板（５４）の基板に塗布する。メインのサンプルチャネル内の流体ストップ機能（２０，２２）はまた、好適な疎水性導電性材料で形成した場合、充満を検出する電極としても作用する。カートリッジ（１０）をリーダーに挿入するとき、カートリッジの加熱機構が開始され、試験中、カートリッジを所定の一定温度に加熱する場合もある。これは、以下に説明するように多くの利点がある。
【００４８】
カートリッジ上の２つのサンプルチャネル（１４，１６）のそれぞれの端には、図２を参照すると電極（２３）を設けてもよい。また、排出シンク（２８）の近くに存在する電極（２３）があってもよい（また、電気化学測定ゾーンとして使用することもできる）。リーダーを介して電極間の電気的導通をチェックし、リーダーはチャネル（１４，１６）が正常に試料で満たされていることを確認することができる。これは、簡単なコンダクタンス測定により行うことができる。特定のチャネルについては、電極（２３）が正常に血液で湿潤すると（両方のチャネルが完全に試料で充満されていることを意味する）、電流は血液試料を介して一方の電極からもう一方の電極へ伝導する。血液サンプルがチャネルに存在しないか、または部分的にのみ充満している状態では、一方の電極が湿潤されない。これは電流が一方の電極からもう一方の電極へ流れることができないことを意味する。
【００４９】
本発明のカートリッジ／アッセイシステムでは、血液サンプルのヘマトクリット値の測定が可能である。カートリッジの設計により、一次分析（primary assay functionality）で用いられる試薬の影響を受けずに測定が実行できる。
図３は、カートリッジ（１）の一部をより詳細に示したものであり、特に流体ストップ機能（２０，２２）を示している。追加の機能（６０）は、試料導入口（１２）に隣接して示されている。この機能（６０）は、試料導入により試料がカートリッジの外表面を湿らせないように設計されている。
【００５０】
疎水ストップ機能（２０，２２）は、親水性の経路を取り除いて、流体がこの機能で停止する両内面に設けられている。１実施態様では、２つの親水性表面が使用できるが、別の組み合わせとして、親水性／疎水性表面も使用され、毛細管現象によってストリップを満たすことができる。極端な例では、２つの疎水性内面を利用することができ、リーダーのポンプによりもたらされる“吸引”作用により、カートリッジに試料を充填することができる。
【００５１】
血液がサンプルチャネル（１４，１６）（図４及び５を参照）を充満すると、抗体で機能化された磁性粒子（１８）（乾式試薬としてチャネル内に予め堆積されている）が血液によって再懸濁され、それによって存在している任意の検体を結合させることが可能になる。血液は図５を参照すると、ストップ機能（２０，２２）まで充満する。粒子（１８）が再懸濁されると、血液サンプルとのインキュベーションを一定時間（定温放置時間）発生させ、リーダーの適当なソフトウェアやプログラミングによって制御することができる。磁性粒子がその動き易さと機能性（サイズ依存性、すなわち拡散係数など）により補足相として選択され、拡散距離、最終的にはインキュベーション時間が短縮される。このタイプの反応は、血液試料からの結合検体において非常に効率的かつ再現性がある。磁性粒子が検体と結合している間、ヘマトクリット（ＨＣＴ）の電極（２４）によってヘマトクリット値の測定を実行することができる。ヘマトクリット値は、参照値が臨床分析機器によってなされる血漿測定になるので、分析検体の最終濃度を計算するためにリーダーにより使用される。ヘマトクリット値の測定は、血漿に対する赤血球の割合が異なることによるサンプル体積中に存在する検体に応じた濃度補正をする必要がある。従って、全血液測定は、結果が血漿サンプルに一致するようにヘマトクリット値測定により濃度補正される。
【００５２】
抗体で機能化された磁性粒子（１８）が血液中の任意の検体を結合した後、永久磁石（８０）または電磁場は、所定の位置に検体−抗体磁性粒子複合体を保持するために使用される（図６参照）。次に洗浄緩衝液またはガスが導入口（２６）から移送される。洗浄媒体は、リーダーにある緩衝液リザーバーから提供され（特定の緩衝液リザーバー、すなわち緩衝液が、特定のアッセイ、すなわち検出される検体に応じてリーダーに導入される）。一定量の緩衝液（例えば、１〜２μＬ）が、ポンプシステムにより流体ストップ機能（２２）を越えてシンク空間（２８）へと血液を押し出して、緩衝液内に磁性粒子を残しながら、リーダーのリザーバーからサンプルチャネル（１４，１６）へと排出される（図７及び図８を参照）。磁性粒子（１８）は、チャネル（１４，１６）内にまだ保持されているので、目立たない帯状のもの（discreet band）（８２）として観察することができる。
【００５３】
この工程の後、上記のようなさらなる一連の洗浄工程を実行することができ（すべて印加磁場による磁性粒子保持工程を用いて）、堆積している他の乾燥試薬（３０，３２）は緩衝液中（例えば、洗浄緩衝液と同じ緩衝液）で再懸濁され、その後緩衝液はサンプルチャネル（１４，１６）へと圧送され、非常に制御された方法で結合事象が生じる。または、前述のように、他の物質が混ざっていない（クリーンな）緩衝液基質に含まれる洗浄された磁性粒子−検体複合体はストップ機能（２０）を通過して、標識が乾燥して使い捨て検査カートリッジで堆積しているストリップ内の場所まで上流方向へ移送される。この位置で、磁性粒子−検体複合体は標識に結合することができ、その後追加の洗浄工程と標識の測定が行われる（これら両方の具体例では、磁気ビーズ−検体の結合反応のみが血液中で発生し、他のすべての反応及び／または結合工程は非常に制御された緩衝液の環境で発生する）。
【００５４】
しかし、磁場はまた、磁石をカートリッジから離すよう移動させ磁力を減少させることにより、“リラックスさせる（緩和状態とする）”（図９を参照）ことができる。この方法では、磁性粒子（１８）は少ないものの磁場により保持されており、粒子がより拡散する帯（８４）が形成される。磁石（８０）をカートリッジに向かって戻るように移動すると、再び多くの粒子（１８）が集中するであろう。
【００５５】
要約すると、このことは、任意の試薬及び／または標識は”ダーティな（汚染された）”血液基質に決して接触しないことを意味し、また全ての反応／結合（初期の検体捕捉工程以外の）が、緩衝液環境下で、また任意的に加熱環境下で、検出効率を最大化するため、及び非特異的な結合している物質や排除すべき妨害物質を最小限に抑える／防ぐために、非常に制御されていることを意味する（測定の再現性／精度を最大化する）。これにより、血漿／血液で”問題のある”ものであったために選択されなかった試薬を、本システムで使用することができる。さらに、蛍光測定などのすべての検出測定が、試料の消滅／干渉（血液または血漿中で予想されるように）が減少／排除され、精度が高く再現性のある測定を行うことができる“クリーンな”緩衝液環境で行われることを意味する。これにより、例えば蛍光色素分子など、はるかに良い検出標識の選択ができ、励起または発光の消滅が最小限に抑えられる。
【００５６】
当然のことながら、前述の説明は、図１を参照して２つのチャネルのカートリッジに関してなされたものであるが、本発明はまた、単一のチャネル、また複数のチャネル、例えば６つ、７つ、８つのチャネルを有するカートリッジにも関する。各チャネルでは、再現性／精度向上目的のために、同じ反応を行ってもよいし、異なるアッセイを実施するように設計することができる−この場合、各カートリッジは、“マルチプレックス(multiplex)(複数の）”反応が行えるようにしてもよい。
【００５７】
図１０は、図１に示すものと同様のカートリッジ（１０）を示すが、さらにカートリッジ（１０）までの試料の正しい充填を検出することができるフィル電極（fill electrodes）（２３）を示す。さらに電極（２４）は血液サンプルからヘマトクリット値を得られるようにするために設けられる。
【００５８】
本発明によるカートリッジ（１１）の他の実施態様を図１１（Ａ）及び（Ｂ）に示す。この好ましい実施態様では、２つのチャネルが単一のサンプル注入口から供給される代わりに、６つのチャネルが単一のサンプル注入口から供給される。６チャネルストリップの設計は、図１に示す２チャネルストリップに、すべて同じシンク（９０）を共有する付加的なチャネルを追加し、拡張したものである。これは、ストリップのフットプリントをより効果的に使用可能にし、多重化能力の向上を実現する。
【００５９】
最終的には、測定は検出される標識に適した光または他の検出手段を用いてリーダーによって行われる（例えば、蛍光測定）。例えば、標識が蛍光標識である場合、検出手段は選択された蛍光色素分子の励起及び発光を行い、検出することができる。：本発明による手持ち式のリーダーの模式図を図１２〜１５に示す。この実施態様のリーダー（MST pro meter V1）は、実施例にて説明する通り、実験を行うために使用された具体的な実施態様である。さらに、すべての実験結果は、６チャネルストリップの設計（図２６に示すように）を使用して得られた。リーダー（１００）は、本発明のカートリッジ（１０）を受け入れ保持するためのプラットフォーム（１０６）、及び封止ヘッド（１０５）を備える。封止ヘッドの作動は、装置が空気などの気体や緩衝液などの液体を制御された方法でストリップ内へ圧送することができる密封系を構築するためにソレノイド（１０８）により制御することができる。さらにリーダーは、流体や気体を後にカートリッジ（１０）へ移送するために保持する流体リザーバーカートリッジ（１１１）を含む。リザーバーカートリッジは、各試験チャネルの流体／空気の作動及び制御が、事実上別々のポンプ源であるものから直接駆動されるように、ストリップに含まれる各試験チャネルごとに別々のチャンバーを含んでもよい。あるいはリザーバーカートリッジは、各試験チャネルの流体／空気の作動及び制御が共通のポンプ源から駆動されるように１つのチャンバーを含み、その後、複数の排出口に分離する構成としてもよい。液体または気体は、リザーバーカートリッジに作用するアクチュエータ（１１３）により移送される。また、適切な光学検出手段（１０７）、電気回路（１１２）、関連のコンピュータチップ（複数可）、及びリーダーを制御しアッセイを行うためのソフトウェアを備えることができる。さらに、説明されたシステムは、多くの洗浄工程と試薬移送工程を実行する柔軟性を備えているので、本システムを使用して、多くのアッセイ形式を構成することができる。
【００６０】
磁石ホルダー（１０３）及び４５度に配向することができる関連する磁石（１０４）は、検査ストリップに含まれる磁性または常磁性粒子に影響を与えるために、その磁石を検査ストリップに接触させるか、または近くに持って来るためにモーター（１１０）を使用して制御することができる。アッセイ測定（例えば、蛍光）を行うために、モーター（１０９）によって制御される検査カートリッジ内の複数の各テストチャネルの測定または検出領域（２２２）に沿って、光学読み取りヘッド（１０７）を移動することができる。このように光学読み取りヘッドは、１つの使い捨て検査カートリッジを横切って、複数の測定を実行するために利用することができる。図２５に示すプロットは、検査カートリッジ内の試験チャネルをわたる光学読み取りヘッドの読み取りの１例の結果を示す（MST pro meter V1のリーダーデザインを使用）。結果から、テストチャネルの全幅に渡って、この装置により複数の測定が可能であることが分かり、ピーク蛍光シグナルが特定されアルゴリズムの使用により計算値に変換され、ＬＣＤ（１０１）を介してユーザーに表示されることが理解される。さらに、この装置は、試験チャネル全域で得られた測定に関する形状を読み取りることができ、またこれを組み込み型のコントロールとして用いることができる。例えば、読み取り応答が、放物線応答ではなく、定常減衰または定常増加の形を示す場合には、それは誤った結果や不均一な結果であると判断することができる。
【００６１】
当然のことながら、リーダーは、例えば使い捨てのカートリッジの洗浄緩衝液などの流体／気体の移送の非常に正確な制御が必要とされる。カートリッジは複数の個別のサンプルチャネルを含み、各サンプルチャネルに必要とされる複数の洗浄工程を伴うことができる。各洗浄工程は正確な流速、正確な量で行われる。各チャネルには、リーダーのリザーバーから洗浄緩衝液／洗浄気体の正しい移送を確保するためにその上を封止された、複数の洗浄インタフェースポート（図１の（２６））を有してもよい。適当な流体管理システムは、流体ポンプ（１１３）、緩衝液リザーバーカートリッジ１１１（及び図１５）、及びリーダー／カートリッジ流体インタフェースまたはシール（１０５）の３つの主要コンポーネントから構成することができる（図１４に示す）。
【００６２】
緩衝液リザーバーカートリッジからカートリッジへ、またはカートリッジを通して流体を移送するために使用される流体ポンプとしては、ステッピングモーター線形アクチュエータ（stepper motor linear actuator）（例えば、E21H4U-5‐900 Haydon Kerk Motion Solutions）を用いることができ、ステッピングモーター線形アクチュエータに関連する機能は、停止したときの位置でロックすること（流体が緩衝液リザーバーカートリッジと線形アクチュエータに対して押し戻されないように）、及びステッピングモーターが非常に微細な分解能で駆動することを含む（例えば0.0015mm/moter step）。
【００６３】
リーダー／カートリッジ流体インタフェースは、前記カートリッジの洗浄注入ポート（２６）と同一場所に位置する、ソフトラバーコーティング（軟質ゴム被膜）されたリーダーの封止ヘッドを用いて実現することができる。または、ゴム製のガスケットは使い捨て検査カートリッジ上に配置されるか、あるいは封止ヘッドと使い捨ての検査カートリッジの両方の上にゴム製のガスケットがあってもよい。封止ヘッドは、カートリッジの流体注入ポートのそれぞれに配列する排出口を有していてもよい（例えば、流体管理システムからの排出口を含むゴム製皮膜の孔）。
【００６４】
リーダーは、好ましくは、緩衝液洗浄リザーバーを含むことができる。緩衝液洗浄リザーバーは複数のカートリッジでアッセイを行うための緩衝洗浄液を含んでもよい。または、リザーバーが空気で満たされている場合には、前記で説明したように交換する必要はないリーダー設計の常設要素（permanent feature of the reader design）となる。
【００６５】
ユーザーによる使用に適するリーダーにするために、緩衝液リザーバーカートリッジを交換しても、流体がこぼれたりリーダーやユーザーにかからないよう、緩衝液／ガス洗浄リザーバーカートリッジ及びリーダーは自己封止型の（セルフシーリング）インターフェイスを有するように設計することができ、リザーバーカートリッジがリーダーがら取り外されるとき、どの流体もリザーバーや装置の範囲内で密閉される。密閉はリザーバーが装置のインターフェイスの適切な場所に正しく挿入された場合のみ開くように設計することができ、自己封止緩衝液リザーバーカートリッジに浸透する機能が組み込まれてもよい。
【００６６】
緩衝液洗浄リザーバーカートリッジ内の緩衝液が蒸発し、空気の隙間が形成されないようにするために、緩衝液リザーバーカートリッジは、シリンジのプランジャーの端、及び自己封止のシールの端の両端を覆うフォイル（箔）シールを有してもよい。
【００６７】
これらのフォイルシールは、それぞれシリンジポンプドライバー及びメーターカートリッジインターフェイス機能により破られる。このような実施態様の例は、図１５に示すように、リーダー／サンプルカートリッジ流体インターフェースは、サンプルカートリッジと接合するリーダー内のソフトラバーでコーティングされた封止ヘッドを用いて達成される。封止ヘッドは各ストリップ注入位置に沿って配列する排出口（すなわち、流体管理システムからの排出口を含むラバー膜の孔）を有する。
【００６８】
緩衝液／ガスリザーバーカートリッジは、単一のソースから各試験チャネルに関連付けられ、その後様々なバルブとチューブを介して複数の排出ポート位置へ分離される、さまざまな洗浄工程を駆動する単数のチャンバーを有してもよい。好ましくは、緩衝液／ガスリザーバーカートリッジは、各テストチャネルに関連付けられる洗浄工程が個々のソースから駆動されるように、各試験チャネルごとに個別のチャンバーを有する。このタイプの設計についても図１５に示されており、リーダーまたは検査カートリッジ内にはどんなバルブも必要としない設計である。その他に、リザーバーカートリッジは、検査カートリッジに含まれる共通の代替の一群のテストチャネルに関連付けられる複数のチャンバーを有してもよい。
【００６９】
上述のように、緩衝液洗浄工程と試薬洗浄工程において、キャプチャ相及び結合した検体などが流されないようにするために、使い捨て検査ストリップ中の磁気ビーズがリーダーによって保持される必要がある。この機能は、永久磁石または電磁石のいずれかを利用することにより発揮される。測定の精度、感度、範囲を向上させることのできる特定の方法で、磁気ビーズを操作することが可能である。例えば、アッセイの蛍光シグナルが低い場合には、すべての磁気ビーズを強固に結合した塊状に収集し存在する蛍光体の密度を増加させ、検出器に向かう発光の強度を向上させることが効果的である。一方、シグナルが高く、光センサーやリーダーエレクトロニクスが飽和状態に近づいている場合には、磁気ビーズが特定領域に緩和したり拡散するように磁石を取り除くかまたは移動させ、センサーへ向かう放出光の強度を減少させることが効果的である。これは、アッセイの感度と範囲の両方に影響を与えるために磁石を使用する、また複数工程アッセイの結合反応速度に影響を与える新規な方法である。一般的に磁石は、磁束密度が最高となる地点である（そのため、磁束線はＮ極からＳ極への最短移動経路を有するものなので、磁気ビーズは磁石のエッジに沿って引き寄せられる傾向にある。）。
【００７０】
アッセイ開発の物理的な機能としては、周辺温度が応答の大きさに影響を与えることができることである。本発明では、この温度による効果は、主に拡散に及ぼす温度の効果によりもたらされ、温度の上昇が磁気ビーズと標的検体との結合、その後の移送された試薬との結合の効率向上につながる。本システムは、例えば、病室用や家庭用として使用することができ、システムの温度範囲は、恐らく１０℃から３５℃までの広い範囲とすることができる。この温度の影響を取り除く１つの方法は、検査ストリップの加熱において、所定の温度に、例えば４０℃に加熱しておく。これにより、温度の影響によるアッセイに関するすべてのばらつきが取り除かれるだろう。このように、リーダーには、ヒーター等の温度制御手段も備えることができる。
【００７１】
カートリッジの温度制御は、試料カートリッジの温度を維持するためのヒーターとして光学ブロック（これは、ストリップと接するものであり、また良好な熱伝導特性を有するアルミニウムなどの熱伝導性金属から作製されたものである）の上面を利用することにより実現することができる。あるいは、リーダー内において使い捨て検査カートリッジが配置されている保持プラットフォームを、ストリップに接触する加熱表面として利用することができる。加熱表面の加熱は、高電力（ワット）、低抵抗値（例えば１Ω）で、または光学ブロックの上面に設けられたＭＯＳＦＥＴ（モス電界効果トランジスタ）のヒートシンクタブを備えるＭＯＳＦＥＴを使用して実行できる。温度は、加熱ブロックの表面に温度センサを配置し、高ワット抵抗／ＭＯＳＦＥＴを流れる電流を調整するようこの温度センサの出力（アウトプット）を用いて制御することができる。このような実装の別の利点としては、ＭＰＰＣ（Multi-Pixel Photon Counter）のシリコンフォトダイオードのゲイン（ＭＰＰＣのシリコンフォトダイオードは、検査ストリップにて標的蛍光色素分子により発光する光の強度を測定するために使用される検出器である。）が周辺温度に敏感であることであり、それにより、ヒーターとして光学ブロック表面を実装する場合、ＭＰＰＣシリコンフォトダイオード近傍の周辺温度の制御も確保できる。
【００７２】
サンプルカートリッジを加熱するための別の方法としては、非常に薄い発熱体を設置することである。発熱体を非常に薄くする（１００〜２５０ミクロン）ということは、磁石をその発熱体の下に配置できるので、磁石はカートリッジのごく近くにあり、磁気ビーズを収集できることも意味するであろう。薄い発熱体は、フレキシブルＰＣＢ（ポリ塩化ビフェニル）の発熱体と同様に、２つのポリマー層の間に挟まれた銅トラック（copper tracks）を有する形状にすることができる。そして、発熱体がＭＰＰＣのシリコンフォトダイオードに戻るように向かって標的蛍光色素分子から発せられた光を反射することが要求される場合は、層の片側を反射性材料で被覆したり、または鏡面を作成するために反射性材料を付した反射層を有することもできる。あるいは、バックグラウンド蛍光がシステム内で問題になる場合には、発熱体の片側に、反射面とは対照的なマットブラック仕上げを施すこともできる。
【００７３】
本発明のリーダーの光学ブロックは、複数の蛍光色素分子の励起波長に対する光源を設けることができ、その後の蛍光色素分子からの発光を測定することができる。使い捨て検査カートリッジ内の蛍光色素分子から発せられるこの光の強度により、アッセイ測定が提供される。光学測定ブロックは、蛍光色素分子などの関連付けられる結合標識によりカートリッジ内に存在する標的検体の定量測定に関与する。光学測定ブロックは、マルチピクセルフォトンカウンター（ＭＰＰＣ）シリコンフォトダイオード（例えば、浜松ホトニクス社製、S10362-11-100C）、及び、波長範囲の広い光を発する高出力広帯域ＬＥＤ（発光ダイオード）を備えることができる（例えば、HP803WW Roithner LaserTechnik GmbH）。
【００７４】
ＭＰＰＣシリコンフォトダイオードは、標準的なフォトダイオード（ゲイン＝１）またはアバランシェフォトダイオード（ゲイン＝１００の範囲内）に比べて非常に高い内部ゲイン（１００万の範囲内）を有しているので、好ましい。ＭＰＰＣシリコンフォトダイオードのある便利な機能は、その内部ゲインがそれに印加される逆バイアス電圧に応じて変化することである（例えば、バイアス電圧７０Ｖではゲインは１００万程度であり、バイアス電圧６５Ｖでは、ゲインは１０万程度である）。この関係は、測定システムのダイナミックレンジを操作するリーダーで使用することができる。すなわち、検体の濃度が高い場合、フォトダイオードの出力が電子機器を飽和させないように、フォトダイオードのバイアス電圧を減らすことができる。別の実施態様では、ＭＰＰＣシリコンフォトダイオードではなく、標準のフォトダイオードやアバランシェフォトダイオードを実装することができることに留意すべきである。
【００７５】
高出力広帯域ＬＥＤは、異なる波長の光を発生するＬＥＤの正面に別のフィルタを設置するよう移動することができるフィルタスライドを有することにより、単一のＬＥＤを用い複数の励起波長（すなわち、標的検体の蛍光色素分子に入射する光）を発生するよう使用できるので便利である。フィルタスライドは、シリコンフォトダイオードが蛍光色素分子から放出された光のみを測定するよう励起光を遮断するために、シリコンフォトダイオードに連結するフィルタを含む。
【００７６】
図１に示す２チャネルカートリッジを参照すると、光学測定ブロックは、２セットのＬＥＤとシリコンフォトダイオードがそれぞれストリップ内の各チャネル当たり１セットになるように配置することができる。フォトダイオードとＬＥＤの位置は固定される。フィルタスライドは、異なる測定に対してＬＥＤとＭＰＰＣシリコンフォトダイオードの間に異なるフィルタを配置できるように移動することができる。あるいは、ＬＥＤとシリコンフォトダイオードの２つの固定セットの代わりに、異なる検査チャネル間を移動することができる単一の光学ヘッドを実装してもよい。
【００７７】
前記の光学ブロックの構成とは別の実施態様は、次の通りである。
１．一実施態様では、励起源と発光検出器の両方がカートリッジの同一面に配置されている。あるいは、カートリッジが発光源と発光検出器との間に挟まれている。
【００７８】
励起源と検出器が同一面上に配置されてもよいことの理由は、流体管理システム、カートリッジコネクターインタフェース、加熱ブロック、及び磁性粒子制御を有するカートリッジを組み入れるためのスペースを確保することである。
【００７９】
２．別の実施態様では、複数の蛍光色素分子の励起と検出の選択を可能にする可動フィルタースライドを実装する。より簡素化された構成では、チャネル当り１種類の蛍光色素分子を検出することが必要とされ、フィルタのスライドは必要とされず、各チャネルにおいて単一の固定された励起フィルタ及び単一の発光フィルタに置き換えることができる。
【００８０】
３．さらなる実施態様では、蛍光色素分子の励起用光源は、広帯域エミッタから発生している。複数の波長で励起させる必要がない場合は、狭帯域のＬＥＤのような特定波長の光源を含むことができる。
【００８１】
広帯域のＬＥＤの他の選択肢としては、キセノン閃光電球があり、キセノン閃光電球の輝度は、ＬＥＤの輝度よりはるかに大きい。さらにキセノン閃光電球は、波長のより広い範囲に渡って発光する。ブロードバンドの“白色”または“温白色”ＬＥＤは、波長４００ｎｍ程度まで発することができるが、キセノン閃光電球は、波長２００ｎｍ程度まで発することができるので、ＵＶ領域での励起波長に使用できる。
【００８２】
４．その他の実施態様では、光学ブロックは、通常の場合、使い捨て検査カートリッジ内の試料に向かって９０度で励起光を反射するが、それに対し、４５度の角度で取り付けられたダイクロイック（２色性）ミラー（またはビームスプリッター）で励起光を検出する構成とすることができる。ダイクロイックミラーは、蛍光色素分子によって発生する励起光が、シリコンフォトダイオードが放射光を検出するよう位置付けられているダイクロイックミラーをある波長で通過するよう選択される（すなわち、発光源に向かって戻るように反射しない）。この構成では、エミッターによって発生し検出器に入る光の波長の通過帯域を狭くするために、光源と光検出器の正面に付加的な光学フィルタを配置することができる。
【００８３】
使い捨てアッセイ検査カートリッジの製造に関連する工程中のばらつきがあるので、最終分析結果が表示される前に、検査カートリッジにより生じるアッセイ応答が内部で正規化されるよう、通常カートリッジのバッチごとに特徴付けされる、特定のキャリブレーション値をリーダーに入力することが必要とされる。
【００８４】
本発明では、関連の特定データ、例えば、関連付けられるカートリッジのバッチについてのアッセイキャリブレーションパラメータを転送するためのツールとして、緩衝液カートリッジを利用する機会がある。ある実装では、ＥＥＰＲＯＭメモリチップ内のデータをリーダーで読み取ることができるよう、リザーバーカートリッジにＥＥＰＲＯＭメモリチップを取り付けることができる。
【００８５】
ある特定の態様においては、サンプルカートリッジとそれに関連付けられるリーダーは、検出すべき検体が抗原であり結合剤が抗体であるイムノアッセイ（免疫学的測定法）を行うように設計される。常磁性粒子は、遊離型抗原か、遊離型及び複合型抗原のどちらかに対する抗体の結合によって機能化される。
【００８６】
本発明のカートリッジ設計によれば、重要なことは、最初に生じる唯一の結合反応が抗体の血液中の任意の抗原への結合であり、これは多くの利点となる。まず、複数工程のアッセイを実行できることを意味し、選択された標識分子／粒子は決して血液に接触する（“触れる”）ことがないことを意味する。これは、捕捉相（capture phase）と標識の両方が試料に接触する状態になる既存のＰＯＣ（Proof of Concept）イムノアッセイ技術に勝る重要な利点である。典型的なＰＯＣイムノアッセイの結合スキームは、一般的に平面または磁気捕捉粒子のいずれか、及び粒子、複合体または重合体に結合することができる標識で構成されている。しかし、キャプチャ相と標識相の両方とも試料（血液、血漿など）に接触する。これは、多くの問題につながることがある。イムノアッセイでは、イムノアッセイ結合工程を妨げる多くの物質がある。最も疑わしい物質は、ヒト抗−マウス抗体（HAMA）などのヒト抗−動物抗体、動物抗−動物抗体（獣医学用途の場合）、リウマチ因子、抗ＢＳＡ抗体、フィブリノゲンなどである。特定の非特異的結合（HAMA、リウマチ因子）及び非特異的結合は、性能低下の結果、非常に不正確な測定値となり、最終的に患者サンプルの不正確な診断につながる。これは、特にＰＯＣイムノアッセイが、一般的に、複数段階アッセイ、非常に効果的な洗浄工程、クリーンな基質中での標識検出を組み込んだ臨床分析機器の性能を基準にしている場合に起こりうる。特定の非特異的及び非特異的結合の両方とも、検体の濃度に整合しないで、標識が捕捉相に結合することになり（予想される結果よりも高くまたは低くなる）、その結果不正確な結果が生じる。遊離型及び複合型の抗原に対する抗体の結合によって機能化されている蛍光ラテックス粒子が使用される。このように磁性粒子、検出される抗原、及び蛍光ラテックス粒子のサンドイッチを形成することができる。
【００８７】
しかしながら、本システムの一実施態様は、結合した検体に任意の標識が接するようになる前に血液が洗い流されるので、蛍光部分などの検出標識は決して血液に接触しない。いくつかの臨床分析システムのように、磁気ビーズ（１８）と検出標識は同時に血液中に存在していないので、非特異的な結合を促進するこれらのいずれの基質事象も発生することはない。これはイムノアッセイの合計許容誤差（Allowable Total Error）（ＡＴＥ）を考慮すると、非常に重要である。ＦＤＡ（米国食品医薬品局）などの規制当局内には、参照システム（reference systems）に対する検査の精度を高めるために、新しいアッセイ製品のＡＴＥを厳しくする動きがある。
【００８８】
臨床検体の所定の個体群については、たとえ血液／試料の大部分が正確にリカバーされても、ＡＴＥは少数の不正確な応答によりかなり影響を受ける可能性がある。それ故、任意の新しいプラットフォーム技術が、これらの影響を最小限に抑えるように設計されていることが非常に重要である。本発明は、カートリッジ及び関連するリーダーの適切な設計を行うことを目的としており、それによりサンプルに対するサンプルのバイアスが減少する（例えば、特定の非特異的結合及び非特異的結合の除去）。
【００８９】
血液などの未処理の試料で、磁性粒子捕捉工程のみを行う別の利点は、血液の測定が非常に正確になることである。ほとんどのイムノアッセイは試薬濃度（すなわち、捕捉相と標識相の濃度）に対して非常に敏感である。アッセイを行うには十分な試薬濃度が必要であるが、試薬濃度が高すぎるとアッセイへの妨害が増えることになる。全血アッセイでは、さらにこの問題が拡大する可能性があり、たとえ全く同じ量で同じ濃度の試薬を導入した場合でも、異なるヘマトクリット血中では、試薬の濃度が異なる場合がある（試薬は異なる量の血漿中で再懸濁されるので）。例えば、６０％のヘマトクリット血液中に投入される同じ試薬は、２５％ヘマトクリット血液中よりも１．８７倍体積が少なくなる。その結果、試薬は２５％ヘマトクリット血液中より６０％ヘマトクリット血液中でより濃縮される。これだけで、捕捉相及び標識相の両方が濃度が異なるようになるので、血液対血液のバイアス問題を引き起こす可能性があり、全体的な捕捉効率（可能な捕捉相−検体−標識相相互作用の総数中の行われた捕捉相−検体−標識相相互作用の数＝捕捉効率）は、ヘマトクリット効果のみにより血液間で異なる。さらにこれは異なる血液（及び血漿）の様々な粘度と相まって、任意の可動性の試薬の拡散係数に影響を及ぼし、ＡＴＥが悪化する可能性がある。
【００９０】
血液中に磁性粒子に結合している検体のみを有していることは、非常に可動性があり機能的な磁性粒子が、検体の結合に関して非常に有効であるので、この問題をかなり低減させるのに役に立つ。したがって高または低ヘマトクリット血中での磁性粒子の濃度差は、利用可能なほぼすべての検体はこの工程で結合されるので、それほど重要な問題とならない。前述のようにカートリッジは常に一定温度を有しているので温度による影響はなく、血液と血液の粘着性の影響は、カートリッジの加熱によってさらに最小限に抑えられる。
【００９１】
イムノアッセイについては、一旦血中の非結合の物質が積極的にサンプルチャネルの外部へ洗い出され、シンクへと排出されると、その後リーダーは、抗体で機能化された蛍光ラテックスビーズの乾燥堆積物（または他の二次的結合試薬のどちらか）を含むストリップ上の緩衝液注入口を介して少量の緩衝液を検査カートリッジへと移送する。抗体で標識化された蛍光ラテックスビーズは緩衝液で再懸濁され、その後磁性粒子−検体複合体を含むチャネル内へ圧送される。リーダーに収められた永久磁石や電磁石は、この時点ではまだ磁場を印加しており、磁性粒子−検体複合体をチャネル内の所定の位置に“保持”している。一旦抗体で機能化された蛍光ラテックスがリーダーにより磁性粒子−検体複合体を含むチャネルへ移送されると、磁場が解除され、第二の結合反応が生じるようになる（磁石が所定位置に配置され、磁気ビーズが所定位置に保持されている状態で、結合フェーズが可能になることもあるが。）
【００９２】
別の方法として、磁性粒子−検体複合体を、標識に接触させるために試料カートリッジの上流へ移送することもできる。あるいは、前述のように、すべての結合試薬（磁性粒子捕捉フェーズ及び標識）をサンプルチャネルに堆積させ、サンプルチャネルで結合反応を生じさせることも可能である。リーダーによる磁気的な蓄積及び空気／流体の洗浄により、空気／流体環境での磁性粒子−検体−標識複合体の定量化ができる。
【００９３】
本システムの適応性は、非常に適応性のあるかつ高感度の測定を可能にする。この時点でシステム全体は、高捕捉効率用に設定され、磁性粒子が予め効果的に検体を担持するので、標識との衝突により非常に効果的な結合事象が生じ、結果的に非常に感度の高いアッセイとなる。明確化のために結合スキームを説明するが、本発明のプラットフォーム設計の適応性にもよるが、考えられるほぼすべてのアッセイアーキテクチャ（構築）をフォーマットすることができる。
【００９４】
洗浄工程は一般的に、任意の未結合の標識を除去するために行われ、その後の光学的測定は、“クリーンな”環境で行われる。蛍光検出の場合、特定の信号がかなり消滅する可能性のある（この基質を除去しないで）いくつかの基質（例えば血液）では使用できない蛍光色素の使用が可能になる。
【００９５】
さらに必要に応じて、要求される場合には、第３の結合試薬を懸濁しチャンネルへポンプで送り込むことによって、信号を増幅させることもできる。例えば、最初に標識化した粒子の成分に対する抗体を有する追加の標識化粒子（同じまたは異なる標識）を使用することができる（例えば、優れた抗体が存するように標識化された粒子と結合した免疫原）。すべての第２の非結合標識で被覆された標識化粒子を除去するために、再度、磁気保持及び洗浄工程が行われる。リーダーはその後同じ方法で（同じ標識が使用された場合）、または別の標識が使用された場合は別の方法で標識を測定する。この付加的な測定は、測定範囲や感度を向上させるために使用することができる。
【００９６】
蛍光標識を使用する現在の多くのＰＯＣイムノアッセイは、血液または血漿基質内の標識を測定する。前述のように血液または血漿中には、捕捉したフルオロフォアの濃度を測定するために使用される励起または発光波長のいずれかを妨げる多くの成分がある（ヒト血清アルブミン、ビリルビン、ヘモグロビンなど）。その結果、他のＰＯＣイムノアッセイの血液内の及び血液間の精度は、単に蛍光標識測定のみの影響を受ける可能性がある（すべての基質結合の問題に加えて）。その結果、フルオロフォアは、これらの影響を最小限にしようとすることに使用されるので、使用に最適な蛍光標識がなくてもよいが、“不純物のあるマトリクス（基質）”で蛍光測定を行うときには必要とされる。しかし、本発明のプラットフォームでは、選択される最良のアッセイ性能をもたらす標識を選択することができるように蛍光標識の選択肢が増えることになる。これは類のない利点であり、また説明したように多重化がより容易に達成できることをも意味する。
【００９７】
本発明は、可能な捕捉相として磁性粒子を用いて単一のチャネル内で多重化（すなわち、単一のサンプルを使用して複数の検体の検出をすること）の実現を可能にする。例えば、血液及び血漿の光学的特性により複数の蛍光標識を使用できない場合、磁性粒子は空間的に検体１，２などに用いる磁性粒子に分配することができないので、測定の特異性をもたらすことができず、チャネル内での多重化は不可能である。これが、多重化できるＰＯＣプラットフォームでは捕捉相として平面的捕捉が使用されている理由である。例えば、いくつかのパネル検査では、多重化ができるように、ストリップ上に空間的に分配される各検体に対する捕捉抗体をもつ標識として（血液及び血漿の制限がある）同じ蛍光標識を使用する。磁性粒子は、印加磁場に対して可動性及び感受性があるので、血漿または血液中における蛍光標識の光学的制限により、磁性粒子の空間分布に起因する特異性（異なる検体に対する特異性）を取得することは困難である。しかし、本発明のように洗浄工程を提供することで、単一のチャネル内で磁性粒子と蛍光標識を使用して多重化することが実現される。また、６チャネルストリップの設計では、１つのフルオロフォアで多重化を達成することができるので、チャネル内の多重化（複数のフルオロフォア）を考慮に入れると、全体的な多重化能力が向上する。
【００９８】
１工程、多工程アッセイ及び複数洗浄工程を実行する能力により示される適応性により、検体の測定範囲を拡張したり、アッセイの用量反応曲線を線形化する可能性は高い。例えば、典型的なイムノアッセイ用量応答曲線はＳ字状である。これは、試薬の飽和（線形結合を維持するのに不十分な試薬）、または標識／検出方法の飽和（すなわち、検出方法が飽和になり、直線的に標識を測定することはできない状態）のいずれかによるものである。しかし、本発明のプラットフォームは、測定範囲の全域で完全な線形応答が可能となり、これはいくつかの方法によって得ることができる。例えばリーダーは、複数工程アッセイの各段階で蛍光粒子の濃度測定をすることができる。そのため、蛍光粒子の初期結合工程が生じた後に、リーダーは蛍光強度を測定することができる。これは、領域測定とすることができるので、例えば、強度がしきい値（校正（キャリブレーション）時に設定）を超える場合、検体濃度を計算するために蛍光強度を使用し（キャリブレーション１）、この時点で試験は停止する。一方、蛍光強度がしきい値を下回っている場合、検体の濃度が低く示され、前記で説明したように追加の増幅工程が発生し、その後の蛍光強度が検体濃度を計算するために用いられる（キャリブレーション２）。これはまた、一方のチャネルが非常に敏感な測定を行うよう調整し、もう一方のチャネルが、検体の測定範囲の残りの部分の全域で線形測定を行うために調整（試薬濃度及び／または結合時間）することにより、２つのチャネルの使用によって達成することができる。非直線性となる光飽和はまた、リーダーによって対処することもできる。本発明のプラットフォームは、測定可能範囲全域で線形応答を取得する様々な方法を可能とし、それにより、正確なキャリブレーションができるので、血液間または血液内の精度がより向上しＡＴＥがより良好になる。磁性粒子分布は、蛍光標識の測定と結合反応の両方に影響を与えるために使用されることが想定される。例えば、磁性粒子は、領域測定可能なチャネル全体で均一／分散分布として測定され、さらにその後、同じ磁性粒子が、測定感度を促進するよう蛍光強度を高めるために蓄積される。同様に、同じ原理を結合反応に影響を与えるために使用し、それによりアッセイを調整することができる。
【００９９】
図１に示すカートリッジの設計では、同一の２つのチャネルが表示されるが、測定ではこれは必須ではないのでカートリッジ内で１つのチャネルを使用してもよく、またこれは１μＬの補助測定を可能にする。
【０１００】
２チャンネルのストリップ設計と比較して、６チャンネル以内のチャネルのストリップ設計（図１１を参照）が加えられる。２チャンネルストリップでは、２つのチャネルは連結されていない別々の要素である。６チャンネルストリップの設計では、システムが密閉系であるため、チャンネルを（２チャンネルストリップの設計ができるように）連結することができる。図１１は、単数または複数のサンプルチャンネルに配置できる電気化学測定（２１９）用の電極を示している。電極は、電気化学的な検出及び／または試料流体の検出だけでなく、流体ストップ機能（２２０、２２１）としても動作するように使用することができることが示されている。図１１はまた、ストリップが、ストリップの端部（２１７）またはストリップの上部（２１８）のどちらかにある試験試料を充填するための、可能性のある２つのストリップ設計の機能を示している。検査カートリッジ内の各検査チャネルは、単一または複数の洗浄ポート（２０６、２０８、２００、２０２）を有していてもよい。
【０１０１】
ストリップの洗浄ポート（２００、２０２）は閉じている（リーダによって密閉されている）。一定時間（例えば５分間）後、リーダーは、検査ストリップと接触するように、または検査ストリップに近接して、磁石を配置することができ、磁気ビーズがしっかりとまとまるよう蓄積され、第一の洗浄工程の間、所定の位置に保持される。その後、液体や気体を用いて洗浄工程を実行するために、例えば各チャンネルの開閉を制御するバルブを用いて（例えば、最初のポート（２０６）を分離する）一回に単一のチャネルについてシリンジポンプカートリッジを作動することができる。または一回にすべてのチャネルで作動させることもでき、それにより各ポート（２０６及び２０２）は、バルブシステムが存在しない状態で、または関連のすべてのバルブが開いているバルブシステムを介して、シリンジポンプカートリッジまで開放される。好ましい態様は、リーダーにも使い捨て試験カートリッジ内にも全くバルブが存在しない場合である。血液が最初のポート（２０６）から注入されている緩衝液または気体（例えば、空気）により洗い流されるとき、血液は流体ストップ機能（２２１）を超えて押し出され、シンク（２１０）内へ入る。
【０１０２】
前述した磁性粒子の蓄積、永久磁石または電磁石等による緩和過程にはまったく変わりはない。シリンジポンプカートリッジが１工程アッセイ用に検査カートリッジの検査チャンネルをガスで洗浄した場合には、この時点で各チャネルの最終的な蛍光測定は、検出／測定領域（２２２）で行うことができる。この場合、測定は蓄積された空気中の磁気ビーズ（magnetic bead band）−蛍光色素分子複合体の測定となることを留意すべきである。複数工程アッセイの場合、リーダーは下記のような追加の作業が必須となる。
【０１０３】
血液は、ポート（２００、２０２）が密閉されているか、シリンジポンプカートリッジによる同時にこれらのポートに作用する前向きの圧力下にあるかのどちらかにより、他のチャネル（２１２、２１３、２１４、２１５、２１６）には押し込まれない（この場合、リーダーにも使い捨て検査カートリッジにもバルブは必要ない）。従って、移動する血液が向かう唯一の場所は、シンク（２１０）となる。各チャンネルには少なくとも１つの流体入力ポートがあり、最初のポートが開放され（例えば２０６）、流体をカートリッジ内へ供給するポートとして使用されているので、チャネルの上方に設置される追加のポート（例えば２０８）は、任意の流体がチャネルの上方に供給されないように閉鎖される。従って、血液はチャネルから洗い流されシンクへ入る。
【０１０４】
標識の第２の移送を行うこともできるし、または磁性粒子検体複合体を、標識が堆積される領域（２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６）のあるチャネルの上方へ移送することもできる。ストリップ設計上の印刷機能は、所定の領域にこれらの試薬を含めるために使用できることに留意すべきある。この概念はまた、検査試料チャンネル（２２３）に堆積される試薬にも適用することができる。この標識の第２の移送過程は、再びチャネル過程によりチャネルで個別に行うことができ、またはすべてのチャネルに対して一度に実行される。複数のポートがチャネルとして使用される場合、この過程は、開いた状態または閉じた状態のポート（２００、２０２、２０６、２０８）に依存し（一度にチャネル当たり１つのポートのみが開いている）、単一のポートが各チャネルに連結される場合には、これは必要ない。標識を移送する場合、洗浄工程に使用される最初のストリップ洗浄ポート（２０６）は閉じられ、チャネルの上方に位置する２番目のポートが開かれ、また再水和のために流体を分配するために使用され、標識を磁性粒子−検体複合体まで移送するか、または空気を除去する（結果的に移動の事象になる）。ストリップが密閉系であるため、移動の事象が可能であり、ストリップ内に流体を圧送する代わりに、空気が“ポンプ”によりストリップから吸引され、緩衝液内の磁性粒子−検体複合体が、堆積した標識までチャネルに沿って吸引される。この過程はその後、残りのチャンネル（２１２、２１３、２１４、２１５、２１６）でも繰り返されるであろう。
【０１０５】
１つのポートのみが各試験チャネル（図２６の２２４）に連結される場合には、検査サンプルとポートとの間の領域内（２２５）に存在する空気の体積により、検査チャネル領域（サンプル注入ポート（２２６）から充填）からサンプルを移動させることができる。このように流体を含むシリンジポンプカートリッジの場合には、第１の洗浄が既に検査カートリッジの検査チャネルに存在する空気を使用して実行されるので、２工程アッセイを実行するために１つのポートのみを必要とする。カートリッジから圧送された後に続く流体が第２の試薬（位置２２７で特定される領域内に堆積された）を再水和することを可能にし、検査チャネルの試料チャネル領域に存在する磁性粒子複合体にそれら（第２の試薬）を提供することを可能にする。各チャネルに連結されている１つのポートのみ（２２４）を用いて空気洗浄で１工程アッセイを行うことは可能であり、これは実施例に関連するカートリッジの設計（MST Pro Strip V1、図２６）である。
【０１０６】
前述したように、本発明のプラットフォームは、各チャネル内で複数の検体を測定することができる。測定される検体に対して異なる結合剤を有する磁性粒子を堆積させることにより、１つのチャネルで多重化を簡単に行うことができる。これは、抗体で機能化された磁性粒子を個々に生成して、それらを組み合わせて、サンプルチャネルに堆積させることによって達成することができる。それに対し、混合の抗体集団（測定しようとしているすべての検体に対して）が磁性粒子集団に結合し、結果的にそれらに結びつく多数の異なる抗体を有する磁性粒子を単独に生成してもよい。両方の実施態様では、蛍光ラテックス粒子／蛍光分子の生成は、古典的な免疫測定法（イムノアッセイ）“サンドイッチ”複合体の作製を可能にして測定すべき検体に対する必要とされる抗体に特異性を与えることができるだろう（血液及び血漿中の蛍光測定で採用されるイムノアッセイは、前述のように異なる検体に特異的な磁性粒子を空間的に分散することができないので、これらの測定を行うことができない。）。さらに必要ならば増幅工程を実行することができ、さらにこれが可能となるよう試薬を調整することもできる。異なる励起波長及び発光波長で利用できる数多くのフルオロフォアがあり、１つのチャネル内で最大５つの異なる検体が測定できることが想定される。イムノアッセイの測定に加え、ストリップ測定に電気化学的測定を組み込むこともできる。例えば、本発明のプラットフォームを使用して、グルコース濃度の電気化学的測定及び糖化ヘモグロビン測定を実行することができる。例えば、電気化学的グルコース測定の場合には、ヘマトクリット電極の位置を反映して、他のチャネルに追加の電極セットを組み込むことができる。必要となる全ての試薬が電極上に堆積される。血液がチャンネルを満たし、前述のすべてのイムノアッセイ事象が起きると、血中グルコースの電気化学測定が生じ、リーダーはグルコース濃度を読み取り、血液がシンクへ洗い出される。従って、本発明のプラットフォームは、１つのカートリッジに非常に多様な測定を組み込むことができる。
【０１０７】
現在のＰＯＣイムノアッセイプラットフォームの多くは、ストリップを冷蔵保存しなければならない。本発明は、室温安定性を可能にする機能を採用することにより、このような問題を回避することができる。例えば、他のＰＯＣイムノアッセイシステムは酵素基質（湿式試薬）を含む緩衝液パウチを有し、これらの基質は室温安定性が劣るので、製品は冷蔵で安定性が保たれる。これに対し、本発明の唯一の“湿式”試薬は、緩衝液リザーバーカートリッジである。これは試料カートリッジ内に含まれておらず、緩衝液は一般的に室温で劣化しないので、本発明ではこの問題は回避される。同様に、試薬は、サンプルチャネルに移送される場合または血液により再懸濁される場合、すべてカートリッジに堆積し緩衝液により再懸濁するので、いずれも湿式試薬ではない。このように堆積乾燥試薬は、いかなる湿式試薬の不安定性も避けることができる。同じく酵素標識（すなわち酵素−抗体標識）は採用せず（安定性が悪いので）、他の試薬（標識など）の安定性に影響を及ぼすことなく、安定化製剤は単一の試薬（例えば磁性粒子）に最適化される。
【実施例】
【０１０８】
試薬類：
マレイミド−ＰＥＧ２−ビオチン：
サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 21901（ＥＺ-リンクマレイミド−ＰＥＧ２−ビオチン）
蛍光アミンラテックス粒子：
Invitrogen社、カタログ番号 F8765（アミンで表面機能化した1μmの黄緑色フルオロフォア）
蛍光ニュートラアビジンラテックス粒子：
Invitrogen社、カタログ番号 F8776（ニュートラアビジンで表面機能化した１μｍの黄緑色フルオロフォア）
常磁性粒子：
Ademtech社、カタログ番号 03223（200nm Strep+ 常磁性粒子）
抗体  １Ｈ１２：
Hytest社、カタログ番号 4P33 MAb 1H12（抗ＰＳＡ、ヒト）
抗体  ５Ａ６：
Hytest社、カタログ番号 4P33のMAb 5A6（抗ＰＳＡ、ヒト）
ＰＢＳ：
サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 28372（BupH リン酸緩衝生理食塩水パック）
ＢＳＡ：
Sigma社、カタログ番号 A4503-50G（ウシ血清由来アルブミン）
水：
Sigma社、カタログ番号 W4502（分子生物学のための水）
２ＭＥＡ：
サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 20408（２−メルカプトエタノールアミン塩酸塩）
ＳＰＤＰ：
ピアース社、カタログ番号 21857（Ｎ−スクシンイミジル  ３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート）
ＰＳＡ：
Hytest社、カタログ番号 8P78（前立腺特異抗原）
ビオチン定量キット：
サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 28005（商品名：ピアースビオチン定量キット）
サイズ排除カラム：
サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 89882（Zeba（登録商標）脱塩スピンカラム）
サイズ排除カラム：
ＧＥヘルスケア社、カタログ番号 17-0851-01（PD10カラム）
ＥＤＴＡ：
Sigma社、カタログ番号 EDS-100G（エチレンジアミン四酢酸、無水）
トゥイーン：
シグマ社、P7949-100ML（Tween-20）
ＤＭＳＯ：
サーモサイエンティフィック社、カタログ番号 20684（ジメチルスルホキシド）
【０１０９】
試薬の調製:
ストレプトアビジン−ビオチン及びニュートラアビジン−ビオチンの各相互作用を利用した常磁性粒子及びラテックス粒子の調製
【０１１０】
抗体
ビオチン化のための抗体のジスルフィド結合の還元；
濃度２ｍｇ／ｍｌから７ｍｇ／ｍｌの希釈していない抗体（１Ｈ１２及び５Ａ６）ストックを使用する。適量の抗体ストックを取り除き、１ｍｇの抗体を得る。１ｍｇの抗体に、適量の１４．２８ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２を添加し、ＥＤＴＡの濃度を１ｍＭにする。
６ｍｇの２ＭＥＡを、１００μｌの１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２に溶解させる。この２ＭＥＡ溶液１μｌを、抗体溶液１０μｌごとに添加する。この溶液を混合し、３７℃の水浴中で９０分間インキュベートする。
次いで、この溶液をＰＤ１０カラム（１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２で予め平衡化したもの）に通し、５００μｌのフラクション（画分）を収集する。各画分からのサンプルを取り出し、各画分で検出されるタンパク質を定量するために用いる２８０ｎｍの吸光度を用いて、ＵＶ（紫外）分光光度計で測定する。相当量のタンパク質濃度を含む画分を選び、組み合わせて、ＵＶ分光光度計で再測定する。この測定は、２８０ｎｍで１ｍｇ／ｍｌ＝１．４吸光度単位である抗体の吸光係数を用いて抗体濃度を決定するために使用される。
【０１１１】
マレイミド−ＰＥＧ２−ビオチンの抗体への結合
マレイミド−ＰＥＧ２−ビオチンをの１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２に溶解し、２０ｍＭの溶液を得る。この溶液の適量を還元された抗体に添加し、還元抗体の４０倍モル過剰のマレイミド−ＰＥＧ２−ビオチンを得る。次いで、これを混合し、室温で３時間インキュベートする。
その後、それを、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２で予め平衡化された別のＰＤ１０カラムに通す。５００μｌのフラクション（画分）を収集し、ＵＶ分光光度計を用いて２８０ｎｍで測定する。相当量レベルのタンパク質を含む画分を選択し、混合する。この溶液の試料を吸光度により２８０ｎｍで再度測定し、抗体の濃度は２８０ｎｍで１ｍｇ／ｍｌ＝１．４吸光度単位である抗体の吸光係数を用いて決定される。その後、抗体あたりの結合ビオチンの数は、製造元の指示に従って、ピアースビオチン定量キットを用いて決定される。
【０１１２】
ラテックス
ラテックスに結合するビオチン化抗体５Ａ６
１μmのニュートラアビジンを被覆したラテックスを、０．１％Tween-20、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２で洗浄し（３．５分、４℃、16100×ｇでの遠心分離を使用）、０．５％固形分の濃度で同様の溶液中で再懸濁する。ビオチン化抗体５Ａ６は、０．１％Tween-20、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２で２００μｇ／ｍｌの濃度に希釈される。 その後、同量の２００μｇ／ｍｌのｂ５Ａ６を０．５％ラテックスに添加する。この溶液を十分に混合し、ロータリーミキサー（３０ｒｐｍ）で振盪しながら、暗所、室温で２時間インキュベートする。
次いで、その粒子を同量のｐＨ７．２のＰＢＳで４回洗浄し（３．５分、４℃、16100×ｇでの遠心分離を使用）、任意の未結合ビオチン化抗体を除去し、ｐＨ７．２のＰＢＳで再懸濁し、０．２５％固形分濃度のラテックスを得る。
本明細書において、これを機能化ラテックス１と表す。
【０１１３】
常磁性粒子
粒子への抗体の結合
２００ｎｍのストレプトアビジンを被覆した常磁性粒子を、０．１％Tween、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２で洗浄し（磁気分離器を使用して）洗浄し、固形分０．５％の濃度になるように同様の液中で再懸濁する。ビオチン化抗体１Ｈ１２を０．１％Tween、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２で希釈し、５０μｇ／ｍｌとする。同量の０．５％常磁性粒子と５０μｇ／ｍｌビオチン化抗体を組み合わせ、混合し、３０ｒｐｍでロータリーシェーカーを用いて振盪しながら、室温で７０分インキュベートする。
常磁性粒子を同量の０．１％Tween、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２で４回洗浄し（磁気分離器を使用して）、同液中で再懸濁させ、常磁性粒子の濃度が固形分０．５％になるようにした。
本明細書において、これを機能化常磁性粒子と表す。
【０１１４】
アミン−ＳＰＤＰ相互作用を利用したラテックス粒子の調製
抗体
ＳＰＤＰに結合するための抗体のジスルフィド結合の還元
濃度２ｍｇ／ｍｌから７ｍｇ／ｍｌの希釈していない抗体（５Ａ６）ストックを使用する。
適量の抗体ストックを取り除き、１００μｇの抗体を得る。１００μｇの抗体に、適量の１４．２８ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２を添加し、ＥＤＴＡの濃度を１ｍＭにする。
６ｍｇの２ＭＥＡを、６２５μｌの１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２に溶解させる。この２ＭＥＡ溶液１μｌを、抗体溶液１０μｌごとに添加する。この溶液を混合し、３７℃の水浴中で９０分間インキュベートする。
次いで、この溶液をZebaスピン脱塩カラム（１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２で予め平衡化したもの）に通し、流出した溶液を回収する。流出したサンプルを取り出し、２８０ｎｍの吸光度を用いて、ＵＶ分光光度計で測定する。この測定は、２８０ｎｍで１ｍｇ／ｍｌ＝１．４吸光度単位である抗体の吸光係数を用いて抗体濃度を決定するために使用される。
【０１１５】
ラテックス
アミンで機能化した蛍光ラテックスを１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２で洗浄し（３．５分、４℃、16100×ｇでの遠心分離を使用）、固形分０．５％の濃度で同様の液中で再懸濁する。
ＳＰＤＰを適量のＤＭＳＯに溶解し、ＳＰＤＰ濃度を２０ｍＭとする。 その後ＤＭＳＯ中のＳＰＤＰを０．５％のラテックスに加え、ＳＰＤＰ濃度を１ｍＭとする。これを混合し、穏やかに振盪（ロータリーミキサーで３０ｒｐｍ）しながら、暗所で７０分間インキュベートする。その後、ラテックスを反応体積の２倍の１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２で３回洗浄する（３．５分、４℃、16100×ｇでの遠心分離を使用）。次いでラテックスを同様の溶液中で再懸濁させ、固形分０．５％の濃度のラテックスを得る。これは、還元抗体の結合（アタッチメント）に備える、ＳＰＤＰに結合しているラテックスを提供するものである。
【０１１６】
結合ＳＰＤＰとの還元抗体ラテックスの結合
還元抗体５Ａ６を、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２で１ｍｇ／ｍｌに希釈する。
１ｍｇ／ｍｌの抗体は、その後、１：１の比率でＳＰＤＰに結合した０．５％のラテックスと混合する。これにより、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＰＢＳ、ｐＨ７．２で、５００μｇ／ｍｌ抗体と０．２５％ラテックスとの結合混合物が得られる。
この結合反応物を暗所にて室温で１９．５時間インキュベートし、次いで反応体積の１倍のｐＨ７．２のＰＢＳで４回洗浄する（３．５分、４℃、16100×ｇでの遠心分離を使用）。その後、ラテックスを適量のｐＨ７．２のＰＢＳで再懸濁し、固形分０．２５％とした。
本明細書において、これを機能化ラテックス２と表す。
【０１１７】
アッセイ（分析）手順
アッセイ１：手動洗浄での１工程湿式分析
７μｌの０．５％の機能化常磁性粒子（ｂ１Ｈ１２と結合した）をエッペンドルフ（登録商標）に入れ、磁気分離器に設置する。上清を除去し、粒子を４９μｌの０．０５％Tween-20（ＰＢＳ中、ｐＨ７．２）中の３０ｍｇ／ｍｌＢＳＡで再懸濁する。これに、7μｌの０．２５％機能化ラテックス１（ビオチン化５Ａ６結合した）を添加し、溶液を混合する。
この混合物の８μｌを取り出し、２μｌのｐＨ７．２のＰＢＳ中、６０ｍｇ／ｍｌＢＳＡ中のＰＳＡタンパク質に添加する（注意； ＰＳＡは必要な最終濃度の５倍である）。これを混合し、室温で５分間インキュベートする。
その後、エッペンドルフを磁気分離器に加え、上清を慎重に除去する。次いで２０μｌの０．０５％Tween-20、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２を、磁気分離器に置いている状態でペレットに加える。上清を除去し、新たな２０μｌのの０．０５％Tween-20、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２を一旦磁気分離器から取り出し、粒子複合体を再懸濁するために使用する。
これをいくつか濃度の異なるＰＳＡで繰り返し、元の反応から２倍希釈された洗浄後の湿式分析複合体を生成する。
【０１１８】
希釈され、洗浄されたこれらの複合体は、次のように３つの異なる方法で測定される。；
洗浄後の湿式分析測定１：
２μｌの洗浄湿式分析複合体を蛍光測定用の３８４ウェルの黒色Optiplate（パーキンエルマー社、製品名；マイクロプレート）中の３８μlＰＢＳに加える。次いで、そのプレートをパーキンエルマー社のVictor3 V（登録商標）を用いて測定する。ウェル内の蛍光信号は、３８４ウェルフォーマットでの使用に適合した内蔵プログラム‘フルオレセイン（485nm/535nm、0.1秒）’を用いて測定される。このプログラムは、測定時間０．１秒で４８５ｎｍでの励起及び５３５ｎｍでの発光を利用している。
【０１１９】
洗浄後の湿式分析測定２：
８μｌの洗浄湿式分析複合体を‘MST pro strip V1’カートリッジ（図２６に示す）を満たすために使用した。洗浄湿式分析試薬はサンプル注入ポート（２２６）を介してカートリッジに入れる。これにより試料（この場合は洗浄湿式分析試薬）が流体ストップ機能（２２９、２２８、２３９、２３７）（これはコネクタ（２３０）によるリーダへの電気的接続を介して充満を検出する電極としても機能する）まで満たされる。このカートリッジは‘MST pro meter V1’リーダー（図１２に示す）へと挿入され、位置（２２２,２４２）で光学ヘッドの直線移動を利用して各チャネルをスキャンするリーダー中のoptics（光学）により信号が測定される。この方法では、洗浄湿式分析複合体はチャネル全体に均一に分散し、検出領域となる（すなわち、それらは磁場を使用することにより帯状に集められてはいない）。（なお、これらの実験において、このチャネル（２４３）はここでは使用されていない全血測定用ヘマトクリット電極（２３７）を備えたヘマトクリット補正チャネルとして設定されているので、測定がチャネル（２４３）で行われていないことに留意すべきである。またこの場合、ヘマトクリット電極は、チャネル全体への充満を防止し、サンプルを無駄しないように、疎水性材料から作られていることにも留意すべきである。ヘマトクリット電極を機能させるためには、疎水性の少ないまたは親水性の材料が使用されるだろう。）
【０１２０】
洗浄後の湿式分析測定３：
上記の洗浄湿式分析測定２にて記載したように、洗浄湿式分析複合体で充填したカートリッジ（MST pro strip V1）は、その後、Victor3 Vを用い再測定される。これはカートリッジを３８４ウェル黒色Optiplate（マイクロプレート）に装着し、測定する特定のウェル上に（位置２２２、２４１）カートリッジチャンネルを整列させることによって行われた。次いで、チャンネルの蛍光信号を、３８４ウェルフォーマットでの使用に適合した内蔵プログラム「フルオレセイン（485nm/535nm、0.1秒）」を用いて、適正な対応するウェル信号を測定することにより測定した。このプログラムは、測定時間０．１秒で４８５ｎｍでの励起及び５３５ｎｍでの発光を利用している。これを測定するチャネルごとに繰り返した。
【０１２１】
分析（アッセイ）１の結果：
洗浄湿式分析複合体の異なる測定方法での比較についての結果を図１６、図１７及び図１８に示す。
図１６は、MST Pro Meter V1にてMST pro strip V1で測定した総ＰＳＡの洗浄湿式分析を示す（洗浄湿式分析測定２）。総ＰＳＡの湿式分析は、上記の実験方法に従って行った。総ＰＳＡの洗浄湿式分析は、図１２に示すMST Pro Meter V1で測定した。結果は初期線形位相でその後非線形位相である体系的な分析応答を明確に示している。前立腺癌のスクリーニングに用いる総ＰＳＡ分析のための臨床的なカットオフ値は４ｎｇ／ｍｌである。この分析は、定量的な方法でのカットオフ閾値以下で、上記の正確な測定を行うために、十分に明らかに感度が高い。このデータセットでは、光測定段階において、常磁性粒子−ＰＳＡ−ラテックス結合複合体がストリップチャンネル全体に均一に分布している。上記MST Pro Meterはストリップでの総ＰＳＡ洗浄湿式分析の測定をするためのみに利用された。
【０１２２】
図１７は、ストリップ内でMST Pro meterとVictor3 Vで測定した洗浄湿式分析した総ＰＳＡの相関関係を示している。MST pro Meter（図１６参照、洗浄湿式分析測定２）で測定した同じストリップ（洗浄した洗浄湿式分析した総ＰＳＡを含む）が、その後Victor3 V（洗浄湿式分析測定３）で測定された。その結果は図１７にまとめられている。
２つの測定方法（MST pro Meter V1とVictor3 V）の間には明確な相関関係が確認され、特にVictor3 Vは従来のプレートリーダーであることを考慮すると、積層ストリップ内の蛍光シグナルを測定することを意図していないと考えられる。これはおそらく、ビクターV測定に関連する大きな欠陥を説明するものである。MST Pro Meter V1で行われた光学的測定を示すデータは、感度の高い正確な測定であり、特に非常に高価な「最も標準的な（ゴールドスタンダード）」の蛍光プレートリーダー技術（Victor3 V）に比べて顕著であることが示されている。
【０１２３】
図１８は、ストリップ内でMST pro meterとVictor Vで測定した洗浄湿式分析した総ＰＳＡの間の相関関係を示している。洗浄湿式分析した総ＰＳＡはまた、Victor3 V（洗浄湿式分析測定３）を用い、従来のマイクロタイタープレート分析で測定した。次いで、これらの結果を、MST pro Meter V1（洗浄湿式分析測定２）を用いストリップで測定された洗浄湿式分析した総ＰＳＡと比較した。２つの測定方法の相関関係を図１８に示す。２つの測定方法の間には良好な相関関係が確認され、MST pro MeterとStrip（プラットフォーム）を用い、非常に少量のサンプルで高感度で正確な測定を行う性能を証明している。サンプルチャネルは１μＬであるが、光学ブロックによりMST pro strip V1にで測定された量は、わずか約０．２μＬである。
【０１２４】
アッセイ２：‘MST pro meter V1’リーダーで行う洗浄及び測定を含む１工程湿式分析
アッセイ試薬をエッペンドルフチューブに、以下に示す量と濃度で混ぜ入れる：
０．５％機能化常磁性粒子（ｂ１Ｈ１２を結合した）：１μｌ
３０ｍｇ/ｍｌ  ＢＳＡ及び０．０５％tweenのすべてＰＢＳ、ｐＨ７．２に含む：６μｌ
０．２５％機能化ラテックス１（結合したビオチン化５Ａ６付）：１μｌ
ＰＳＡ（６０ｍｇ/ｍｌ  ＢＳＡ、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２で希釈）：２μｌ
全ての試薬を混合し、次いで流体ストップ機能（２２９、２２８、２３７）までチャネルを満たすサンプル注入ポート（２２６）を介して‘MST pro strip V1’カートリッジ（使用したカートリッジの説明については図２６を参照）に充填させる。カートリッジは、コネクタ（２３０）を介して‘MST pro meter V1’リーダー（使用したリーダーの説明については図１２を参照）へ挿入する。ここでは５分間インキュベーションが生じる。リーダーは、その後、常磁性粒子及びそれらに結合した全てのものを収集するよう作用し、検出エリア（２２２、２４１）へと移す永久磁石を、カートリッジに配置する。次いで、光学リーダーヘッドは、各チャネルの検出エリア（２２２、２４１）を横切って走査することにより、蛍光信号の測定を行う。この測定は、ＰＳＡにより特異的に常磁性粒子に結合した蛍光ラテックスを含み、また検出エリア内で検出される任意の非結合蛍光ラテックスをも含む（これらの結果の説明については図２０を参照）。
リーダーのシールヘッドは、流体とチャネル１、２、３、４、５、６（それぞれ２２４、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５）の注入ポートとを密閉する。常磁性複合体は磁性によって所定の位置に保持されながら、リーダーは、ａ）洗浄緩衝液（０．１％Tween-20、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２）、またはｂ）シリンジポンプカートリッジからの空気（図１５に示す６チャンバー（６室式）シリンジカートリッジの底面図）のどちらかを注入ポート（２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２２４）を介して放出することにより洗浄工程を行う。この洗浄工程では、試料流体をチャネルから移動し、それにより非結合ラテックスは検出エリアから排除されシンク（２３６）へと運ばれる。その後、光学リーダーヘッドは、各チャネル（２２２、２４１）の検出エリアを横切って走査することにより、洗浄物質基質（流体または空気）内の結合複合体から残りの蛍光信号の測定を行う（空気洗浄を用いた結果については図１９を参照、緩衝液洗浄を用いた洗浄結果については図２１を参照）。
【０１２５】
分析２の結果：
図２０は、MST Pro Meter及びStripで行った総ＰＳＡ湿式分析を示す。ここでは洗浄工程を使用せず、常磁性粒子−ＰＳＡ−蛍光ラテックス複合体が磁石によって蓄積された後の蛍光色素分子の蛍光強度を測定する。非常に効果的な統合されたオンボードコントロールが図２０に要約されている。測定器によって空気または液体の洗浄が実行される前に、常磁性粒子−ＰＳＡ−蛍光ラテックス粒子複合体は、磁石によって蓄積される。この時点で測定器はチャネルの光学的な読み取りを実行し、図２０に示すように蛍光ラテックス標識の濃度を定量することができる。興味深いことに、蛍光応答ＡＤＣカウントはＰＳＡ濃度すなわち、洗浄工程を行わない用量反応に関連しており、独立した均一な分析として使用することができる。測定器は、その後洗浄工程を行い、常磁性粒子−ＰＳＡ−蛍光ラテックス複合体の濃度を測定する。分析の蛍光信号は、結合されていない蛍光標識がチャネルから排除されるので、常に洗浄工程（空気または液体）の後で弱くなる。
【０１２６】
図１９は、MST Pro Meter及びStripで行った総ＰＳＡ湿式分析を示す。計測器は空気洗浄工程を用いてチャネルから未結合の標識を排除する。総ＰＳＡ洗浄湿式分析は、MST Pro Meter V1及びStripで行われた。MST Pro Meter V1は、空気洗浄を用いて、試料（未結合の標識を含む）をストリップチャンネルからシンクへと排除する。結果は図１９にまとめられており、分析の用量反応曲線は総ＰＳＡに対して、明らかに迅速、高感度、高精度かつ定量的分析応答を示している。５分間の試験時間で、このアッセイの感度／精度と定量的性質の向上が実証されるので、現在の急速なＰＯＣのＰＳＡ検査に対して有意な改善となるだろう。興味深いことに、データは「空気洗浄」がチャネルから未結合の蛍光標識を取り除くために非常に有効な方法であることを示している。そして検体（ＰＳＡ）を介して常磁性粒子に結合した蛍光標識の正確な高感度測定を、非液体環境で実行することができる。これはMST Pro Platform（プラットフォーム）でフォーマットされる簡便でありながら高機能の分析を可能にしている。
【０１２７】
図２１は、MST Pro Meter及びStripで行った総ＰＳＡ湿式分析の実施例データの用量反応曲線を示す。計測器は流体洗浄工程を用いてチャネルから未結合の標識を排除する。流体洗浄は、高感度、正確で迅速なＰＳＡ検査を非常に効果的に実証している。空気洗浄法と比較すると、常磁性粒子−ＰＳＡ−蛍光ラテックス標識複合体は、光学的に流体環境で測定される。流体緩衝液洗浄は、蛍光信号を強めることができる成分（例えば、キレート剤、蛍光染料離型剤等）をさらに含めることができる。
【０１２８】
アッセイ３：‘MST pro meter V1’リーダーで行う洗浄及び測定を含む１工程乾式分析
次のような試薬が、‘MST pro strip V1’カートリッジ内に投入され乾燥される。：
８μｌ  ０．５％機能化常磁性粒子（ビオチン化１Ｈ１２を結合した）
８μｌ  ２５ｍｇ／ｍｌトレハロース、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２
８μｌ  ３００ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２
８μｌ  ０．１％Tween-20、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２
８μｌ  ０．２５％機能化ラテックス２（ＳＰＤＰを介して５Ａ６と結合）
上記の試薬を混合し、この１工程の投入混合物１μｌを、‘MST pro strip V1’カートリッジのチャネル毎に添加した（図２６に示す）。試薬は各チャネルの所定の位置（２２３、２４２）で注入され、検出エリア（２２２、２４１）に入らないようにする（これは、積層カートリッジの片面上の試薬注入領域を決定するために疎水性のペンの線を用いて達成され、試薬の拡散を防止するのに十分であるが、サンプルが完全に組み立てられたカートリッジに毛細管力により充填されるのを防ぐほどは強くはない。）。
注入するために、カートリッジはカートリッジの底面と中間層のみを互いに組合せて、途中まで組み立てられている。試薬は途中まで組み立てられた試験試料チャネルの試薬注入ゾーン内にピペットで注入される（図２６を参照すると、カートリッジ上に示される試薬注入ゾーンは位置２２３、２４２である。）。これらを３３℃のオーブンで１０分間乾燥させる。その後、カートリッジの最上層を途中まで組み立てられたカートリッジに接着させ、乾燥試薬とともに完全に組み立てられた３層のカートリッジを作成する（異なるカートリッジ設計において、３層をどのように組合せて組み立てカートリッジを形成するのかの例については図２を参照。）。図２６（２４０）は、積層材料の２層間に接着するとき、チャネルとシンクの構造を形成するように切り取られている両面接着材料の形状を示す。その後カートリッジは使用するまで乾燥剤を含む密封フォイルパウチに保存される。
ＰＳＡタンパク質を、６０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２で、必要とする濃度に希釈する。乾燥試薬を含むカートリッジを、‘MST pro meter V1’リーダーに挿入し、次いで８μｌＰＳＡを、検査試料チャンネルを充填するためにカートリッジに添加する。試料は試料注入ポート（２２６）を介してカートリッジへ入れられ、疎水性流体ストップ機能（２２９、２２８、２３９、２３７）まで、毛細管力によりチャネルを満たす。リーダーが、常磁性粒子や検出エリア（２２２、２４１）内にそれらに結合するものを収集するように作用する永久磁石をカートリッジに配置する前に、５分間のインキュベーション（バインディングインキュベーション）を行う。リーダーのシールヘッドは、流体とチャネル１、２、３、４、５、６（それぞれ２２４、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５）の注入ポートとを密閉する。常磁性複合体が磁石によって所定の位置に保持されている一方で、リーダーは、シリンジポンプカートリッジ（図１５に示す６チャンバー（６室式）シリンジカートリッジの底面図）からの空気を放出することにより洗浄工程を行う。この洗浄工程では、試料流体をチャネルから移送させ、それにより非結合ラテックスは検出エリアから排除されシンク（２３６）へと運ばれる。その後、光学リーダーヘッドは、各チャネル（２２４、２４１）の検出エリアを横切って走査することにより、空気中に残る残りの蛍光信号（特定の常磁性粒子−ＰＳＡ−蛍光粒子のサンドイッチ結合複合体からの）の測定を行う（これらの結果の説明については図２２を参照）。
【０１２９】
分析３の結果：
図２２は、MST Pro Meter及びStripで行った総ＰＳＡ乾式分析の結果を示す。測定器はチャネルから未結合の標識を排除するために、空気洗浄工程を使用している。全ての試薬は、ストリップに投入された。総ＰＳＡ分析のダイナミックレンジは、異なる蛍光ラテックス標識製剤の使用により、また光検出器への入力電圧を低減することによりかなり増加した。要約した結果は、図２２に示されており、ここでの分析は、全ての試薬をストリップ内に投入した完全な乾式分析である。分析範囲は大幅に拡張され、線形応答は１０倍に増加し（１０から１００ｎｇ／ｍｌ）、いくつかの分析では、検出限界は低いが、ダイナミックレンジは高いという分析が求められているので、これは非常に価値がある値である。このような分析では、直線性は広いダイナミックレンジに渡って維持されず、高い濃度での分析性能が劣ってしまう。MST Pro platformは、この制限をいくつかの方法で、克服することができる。例えば、光検出器の飽和に起因する非直線性は、入力電圧を低くし光検出器の感度を下げることによって克服することができる。従って、結合が線形である場合は、光検出器の感度が下がると、分析のダイナミックレンジがさらに増加するだろう（測定器には光検出器の高低設定のためのＰＳＡの検量線が含まれるだろう。）。一方、非直線性が試薬の制限に起因する場合は、分析範囲に渡って分析性能を最大化するために、MST pro stripの２つのチャネルを使用することができる。制限されたダイナミックレンジを有する非常に高精度の測定を行うために開発された試薬が一方のチャネルに投入され、それほど精度は高くないが分析のダイナミックレンジを飛躍的に高めることができるような試薬がもう一方のチャネルに投入される。各試薬／チャネルのセットが各々の校正曲線を有するので、分析の全範囲に渡り分析性能が向上する。
【０１３０】
アッセイ４：‘MST pro meter V1’リーダーで行う洗浄及び測定を含む２工程半乾式分析（乾燥ラテックス粒子）
次のような試薬が、‘MST pro strip V1’カートリッジ内に投入され乾燥される。：
１０μｌ  ０．２５％機能化ラテックス１（ビオチン化５Ａ６結合）
１０μｌ  ２５ｍｇ／ｍｌトレハロース、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２
２０μｌ  ３００ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２
１０μｌ  ０．１％Tween-20、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２
上記の試薬を合わせ、この投入混合物１μｌを、‘MST pro strip V1’カートリッジのチャネル毎に添加した（図２６に示す）。試薬は各チャネルの所定位置（２２３、２４２）で注入され、検出エリア（２２２、２４１）に入らないようにする（これは、積層カートリッジの片面上の試薬注入領域を決定するために疎水性のペンの線を用いて達成され、試薬の拡散を防止するのに十分であるが、サンプルが完全に組み立てられたカートリッジに毛細管力により充填されるのを防ぐほどは強くはない。）。
注入するために、カートリッジはカートリッジの底面と中間層のみを互いに組合せて、途中まで組み立てられている。試薬は途中まで組み立てられた試験試料チャネルの試薬注入ゾーン内にピペットで注入される（図２６を参照すると、カートリッジ上に示される試薬注入ゾーンは位置２２３、２４２である。）。これらを３３℃のオーブンで１０分間乾燥させる。その後、カートリッジの最上層を途中まで組み立てられたカートリッジに接着させ、乾燥試薬とともに完全に組み立てられた３層のカートリッジを作成する（異なるカートリッジ設計において、３層をどのように組合せて組み立てカートリッジを形成するのかの例については図２を参照。）。図２６（２４０）は、積層材料の２層の間に接着するとき、チャネルとシンクの構造を形成するように切り取られている両面接着材料の形状を示す。その後カートリッジは使用するまで乾燥剤を含む密封フォイルパウチに保存される。
【０１３１】
この２工程分析では、以下のように、‘MST pro strip V1’カートリッジ内の乾燥機能化ラテックス１を用いる第２の（機能化ラテックス１と機能化常磁性粒子−ＰＳＡの）結合工程が行われる前に、第１の（ＰＳＡと機能化常磁性粒子の）結合工程が湿式形式で行われる。：
工程１
以下の試薬を混合する：
２μｌ  ０．５％機能化常磁性粒子（ビオチン化１Ｈ１２を結合した）
６μｌ  ３０ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２
２μｌ  ＰＳＡ（６０ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２で希釈したもの）
第１工程の結合反応は、図２６に示す検査試料チャネルを充満するために乾燥官能化ラテックスを含むカートリッジに８μｌを加える前に、室温で５分間インキュベートする。試料は、試料注入ポート（２２６）に投入され、疎水性流体ストップ機能（２２８、２３９、２２９）（疎水性のインクで作られている）までチャネルを満たす。リーダーが、常磁性粒子や検出エリア（２２２、２４１）内にそれらに付着するものを収集するように作用する永久磁石をカートリッジに配置する前に、結合のためのインキュベーション（バインディングインキュベーション）が５分間行われる。その後リーダーのシールヘッドは、流体とチャネル１、２、３、４、５、６（それぞれ２２４、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５）の注入ポートとをしっかりと密閉する。常磁性複合体が磁石により所定の位置に保持されている一方で、リーダーは、シリンジポンプカートリッジからの空気を放出することにより洗浄工程を行い、試料流体をチャネルから移動させ、それにより非結合ラテックスが検出エリア（２２２、２４１）から排除されシンク（236）へと運ばれる。その後、光学リーダーヘッドは、各チャネルの検出エリアを横切って走査することにより、空気中に残る残りの蛍光信号（常磁性粒子−ＰＳＡ−蛍光粒子の特定のサンドイッチ状の結合複合体からの）の測定を行う（これらの結果の説明については図２３を参照）。
【０１３２】
分析４の結果：
図２３は、MST Pro Meter及びStripで行った総ＰＳＡの２工程分析を示す。測定器は未結合の標識をチャネルから排除するために、空気洗浄工程を使用している。蛍光ラテックス標識は、ストリップに投入された。結果は図２３にまとめられている。蛍光ラテックス標識がストリップに投入され、ＰＳＡと常磁性粒子を含む試料がそこに加えられた。測定器は空気洗浄を行い、捕捉した蛍光ラテックス標識の濃度を光学的に測定した。体系的な用量反応曲線が観察され、２または３工程の分析がMST Pro Platformでフォーマットすることができること、また蛍光ラテックス標識を１つのストリップに投入し、２工程分析を実行するために使用できることを証明している。
【０１３３】
アッセイ５：‘MST pro meter V1’リーダーで行う洗浄及び測定を含む２工程半乾式分析（乾燥ラテックス粒子）
次のような試薬が、‘MST pro strip V1’カートリッジ内に投入され乾燥される。：
１０μｌ  ０．５％官能化常磁性粒子（ビオチン化１Ｈ１２結合）
１０μｌ  ＰＢＳ、ｐＨ７．２
１０μｌ  ２５ｍｇ／ｍｌトレハロース、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２
１０μｌ  ３００ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２
１０μｌ  ０．１％Tween-20、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２
上記の試薬を合わせ、この投入混合物１μｌを、‘MST pro strip V1’カートリッジのチャネル毎に添加した（図２６に示す）。試薬は各チャネルの所定の位置（２２３、２４２）で注入される（しかし、標識（蛍光ラテックス）が投入されていないとして、これらの試薬を検出領域から除外しなくてもよい。）。注入のために、カートリッジは途中まで、カートリッジの底面と中間層のみを互いに組合せて組み立てられている。試薬は途中まで組み立てられた検査試料チャネルの試薬注入ゾーン内にピペットで注入される（図２６を参照すると、カートリッジ上に示される試薬注入ゾーンは位置２２３、２４２である。）。これらを３３℃のオーブンで１０分間乾燥させる。その後、カートリッジの最上層を途中まで組み立てられたカートリッジに接合し、乾燥試薬とともに完全に組み立てられた３層のカートリッジを作成する（異なるカートリッジ設計において、３層をどのように組合せて組み立てカートリッジを形成するのかの例については図２を参照。）。図２６（２４０）は、積層材料の２層の間に接着するとき、チャネルとシンクの構造を形成するように切り取られている両面接着材料の形状を示す。その後カートリッジは使用するまで乾燥剤を含む密封フォイルパウチに保存される。
【０１３４】
この２工程分析では、以下のように、‘MST pro strip V1’カートリッジ内の乾燥機能化常磁性粒子を用いる第２の（機能化常磁性粒子と機能化ラテックス１−ＰＳＡの）結合工程が開始される前に、第１の（ＰＳＡと官能化ラテックス１の）結合工程が湿式形式で行われる。：
工程１
以下の試薬を混合する：
２μｌ  ０．２５％官能化ラテックス１（ビオチン化５Ａ６を結合したもの）
６μｌ  ３０ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２
２μｌ  ＰＳＡ（６０ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２で希釈したもの）
第１工程の結合反応は、検査試料のチャネルを充満するために乾燥官能化常磁性粒子を含むカートリッジ（図２６に示す）に８μｌを加える前に、室温で５分間インキュベートする。８μｌの試料は、試料注入ポート（２２６）に投入され、疎水性流体ストップ機能（２２９、２２８、２３９）までチャネルを満たす。リーダーが、常磁性粒子や検出エリア（２２２、２４１）内にそれらに付着するものを収集するように作用する永久磁石をカートリッジに配置する前に、結合のためのインキュベーション（バインディングインキュベーション）が５分間行われる。その後リーダーのシールヘッドは、流体とチャネル１、２、３、４、５、６（それぞれ２２４、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５）の注入ポートとをしっかりと密閉する。常磁性複合体が磁性により所定の位置に保持されている一方で、リーダーは、シリンジポンプカートリッジからの空気を放出することにより洗浄工程を行い、試料流体をチャネルから移動させ、それにより非結合ラテックスが検出エリア（２２２、２４１）から排除されシンク（２３６）へと運ばれる。その後、光学リーダーヘッドは、各チャネル（２２２、２４１）の検出エリアを横切って走査することにより、空気中に残る残りの蛍光信号（常磁性粒子−ＰＳＡ−蛍光粒子の特定のサンドイッチ状の結合複合体からの）の測定を行う（これらの結果の説明については図２４を参照）。
【０１３５】
分析５の結果：
図２４は、MST Pro Meter及びStripで行った総ＰＳＡの２工程分析を示す。測定器は未結合の標識をチャネルから排除するために、空気洗浄工程を使用している。常磁性粒子の捕獲相がストリップに投入された。測定器は空気洗浄工程を用い、チャネルから未結合の標識を排除した。常磁性粒子をストリップに入れ、ＰＳＡ試料／ラテックス標識がストリップに加えられた。測定器は空気洗浄を行い、捕捉した蛍光ラテックス標識の濃度を光学的に測定した。体系的な用量反応曲線が２工程分析で観察され、２または３工程の分析がMST Pro Platformでフォーマットすることができること、また常磁性粒子が１つのストリップに投入され、２工程分析を実行するために使用されることを証明している。これらの結果は、分析４での結果（図２３）とともに、同じカートリッジ内でラテックスと常磁性粒子がどのように乾燥し、完全な乾式２工程分析を行うことができるのかを示している。
【図１】
0006016168.tif 000002
【図１０】
0006016168.tif 000003
【図１４】
0006016168.tif 000004
【図１６】
0006016168.tif 000005
【図１７】
0006016168.tif 000006
【図１８】
0006016168.tif 000007
【図１９】
0006016168.tif 000008
【図２０】
0006016168.tif 000009
【図２１】
0006016168.tif 000010
【図２２】
0006016168.tif 000011
【図２３】
0006016168.tif 000012
【図２４】
0006016168.tif 000013
【図２５】
0006016168.tif 000014
【図２６】
0006016168.tif 000015
【図２】
0006016168.tif 000016
【図３】
0006016168.tif 000017
【図４】
0006016168.tif 000018
【図５】
0006016168.tif 000019
【図６】
0006016168.tif 000020
【図７】
0006016168.tif 000021
【図８】
0006016168.tif 000022
【図９】
0006016168.tif 000023
【図１１】
0006016168.tif 000024
【図１２】
0006016168.tif 000025
【図１３】
0006016168.tif 000026
【図１５】
0006016168.tif 000027