(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＡＦ阻害剤を用いた治療に抵抗性であるかまたは抵抗性を生じる可能性が高い癌を有する被験者の同定を補助する試験方法であって、該方法は：
（ａ）被験者から得られた癌細胞中のＭＡＰ３Ｋ８（ＴＰＬ２／ＣＯＴ）からなる標的キナーゼの遺伝子コピー数、ｍＲＮＡもしくはタンパク質レベルまたはリン酸化を測定するための分析を行い、該遺伝子コピー数、該ｍＲＮＡもしくは該タンパク質レベルまたは該リン酸化を、癌を有さない被験者から得られた細胞中の標的キナーゼの遺伝子コピー数、ｍＲＮＡもしくはタンパク質レベルまたはリン酸化と比較すること；および、
（ｂ）癌を有さない被験者からの細胞と比較した、癌細胞中の標的キナーゼの遺伝子コピー数の増加、または、ｍＲＮＡ発現の変化、または、タンパク質の過剰発現もしくはリン酸化を有する被験者を上記分析の結果に基き同定し、ＲＡＦ阻害剤を用いた治療に抵抗性であるかまたは抵抗性を生じる可能性が高い癌を有する被験者であると同定すること、
を含む、上記方法。
【請求項２】
（ｃ）癌細胞から得られた核酸サンプルを、アミノ酸位置６００に突然変異を有するＢ−ＲＡＦポリペプチドをコードする核酸分子中の突然変異の存在について分析すること、および、
（ｄ）該突然変異のＢ−ＲＡＦポリペプチドをコードする核酸分子中における存在を、ＲＡＦ阻害剤を用いた治療に抵抗性であるかまたは抵抗性を生じる可能性が高い癌を有する被験者と相関付けること、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｂ−ＲＡＦをコードする核酸分子中のアミノ酸位置６００にバリンからグルタミン酸への突然変異（Ｖ６００Ｅ）の存在を、ＲＡＦ阻害剤を用いた治療に抵抗性であるかまたは抵抗性を生じる可能性が高い癌を有する被験者と相関付けることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＭＡＰ３Ｋ８（ＴＰＬ／ＣＯＴ）の遺伝子コピー数、ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルを分析することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
アミノ酸Ｓ３３８におけるＣ−ＲＡＦのリン酸化を分析することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＲＡＦ阻害剤は、Ｂ−ＲＡＦ阻害剤、または、ｐａｎ−ＲＡＦ阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＲＡＦ阻害剤は、ＲＡＦ２６５、ソラフェニブ、ＳＢ５９０８８５、ＰＬＸ４７２０、ＰＬＸ４０３２、ＧＤＣ−０８７９、および、ＺＭ３３６３７２からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記癌は、黒色腫、乳癌、結腸直腸癌、神経膠腫、肺癌、卵巣癌、肉腫、および、甲状腺癌からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記癌は、黒色腫である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
癌治療を必要とする被験者において癌を治療する方法に使用するための、物質を組み合わせてなる薬剤であって、有効量のＲＡＦ阻害剤と有効量の第二の阻害剤とを含み、ここで第二の阻害剤は、ＭＥＫ阻害剤、または、ＭＡＰ３Ｋ８（ＴＰＬ２／ＣＯＴ）阻害剤であり、
前記方法は、癌細胞中の標的キナーゼの遺伝子コピー数の増加、または、ｍＲＮＡ発現の変化、または、タンパク質の過剰発現もしくはリン酸化を有すると同定された被験者を特定することを含み、
標的キナーゼが、ＭＡＰ３Ｋ８（ＴＰＬ２／ＣＯＴ）であり、
前記特定された被験者に、有効量のＲＡＦ阻害剤と有効量の第二の阻害剤が投与されるように用いられる、上記薬剤。
【請求項１１】
前記被験者は、Ｂ−ＲＡＦに突然変異を含む癌細胞を有する、請求項１０に記載の物質を組み合わせてなる薬剤。
【請求項１２】
前記被験者は、Ｂ−ＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異を含む癌細胞を有する、請求項１０に記載の物質を組み合わせてなる薬剤。
【請求項１３】
前記ＲＡＦ阻害剤は、ＲＡＦ２６５、ソラフェニブ、ＳＢ５９０８８５、ＰＬＸ４７２０、ＰＬＸ４０３２、ＧＤＣ−０８７９、および、ＺＭ３３６３７２からなる群より選択される、請求項１０に記載の物質を組み合わせてなる薬剤。
【請求項１４】
前記ＭＥＫ阻害剤は、ＣＩ−１０４０／ＰＤ１８４３５２、ＡＺＤ６２４４、ＰＤ３１８０８８、ＰＤ９８０５９、ＰＤ３３４５８１、ＲＤＥＡ１１９、６−メトキシ−７−（３−モルホリン−４−イル−プロポキシ）−４−（４−フェノキシ−フェニルアミノ）−キノリン−３−カルボニトリル、および、４−［３−クロロ−４−（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イルスルファニル）−フェニルアミノ］−６−メトキシ−７−（３−モルホリン−４−イル−プロポキシ）−キノリン−３−カルボニトリルからなる群より選択される、請求項１０に記載の物質を組み合わせてなる薬剤。
【請求項１５】
前記被験者は、ＲＡＦ阻害剤に対する先天的な耐性を有するか、または、ＲＡＦ阻害剤に対する耐性を発生させる可能性が高い、請求項１０に記載の物質を組み合わせてなる薬剤。
【請求項１６】
前記癌は、黒色腫、乳癌、結腸直腸癌、神経膠腫、肺癌、卵巣癌、肉腫、および、甲状腺癌からなる群より選択される、請求項１０に記載の物質を組み合わせてなる薬剤。
【請求項１７】
前記癌は、黒色腫である、請求項１０に記載の物質を組み合わせてなる薬剤。
【請求項１８】
前記被験者は、ＭＥＫ阻害剤に対する先天的な耐性を有するか、または、ＭＥＫ阻害剤に対する耐性を発生させる可能性が高い、請求項１０に記載の物質を組み合わせてなる薬剤。
【請求項１９】
前記第二の阻害剤は、ＭＡＰ３Ｋ８（ＴＰＬ２／ＣＯＴ）阻害剤である、請求項１０に記載の物質を組み合わせてなる薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
［0001］本願は、合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）に基づく以下の２０１０年３月９日付けで出願された米国仮特許出願第６１／３１２，１９３号；２０１０年３月１０日付けで出願された６１／３１２，５１９号；２０１０年４月２０日付けで出願された６１／３２６，０２１号；および、２０１０年１１月１９日付けで出願された６１／４１５，５６９号（これらは全て、参照によりその全体を本発明に組み入れられる）の出願日の優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府によって支援された研究または開発
［0002］本発明は、国立健康研究所（National Institutes of Health）によって付与された連邦認可番号Ｋ０８ＣＡ１１５９２７および１ＤＰ２０Ｄ００２７５０の政府支援のもとでなされた。本発明において政府が一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
［0003］悪性黒色腫の５０〜７０％において、セリン／スレオニンキナーゼＢ−ＲＡＦ（またＢＲＡＦとしても知られている）における腫瘍形成性の突然変異が見出されている(Davies, H. et al., Nature 417, 949-954 (2002))。病状発現前の研究では、黒色腫において、Ｂ−ＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）突然変異は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達カスケードへの依存性の予測になることが実証されている(Hoeflich, K. P. et al., Cancer Res. 69, 3042-3051 (2009); McDermott, U. et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 104, 19936-19941 (2007); Solit, D. B. et al. BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition. Nature 439, 358-362 (2006); Wan, P. T. et al., Cell 116, 855-867 (2004); Wellbrock, C. et al., Cancer Res. 64, 2338-2342 (2004))-an observation that has been validated by the success of RAF or MEK inhibitors in clinical trials (Flaherty, K. T. et al., N. Engl. J. Med. 363, 809-819 (2010); Infante, J. R. et al., J. Clin. Oncol. 28 (suppl.), 2503 (2010); Schwartz, G. K. et al., J. Clin. Oncol. 27 (suppl.), 3513 (2009))。しかしながら、目的とする抗癌剤に対する臨床的な応答は、新たに獲得した耐性または後天的な耐性によってたびたび妨害される。(Engelman, J. A. et al., Science 316, 1039-1043 (2007); Gorre, M. E. et al., Science 293, 876-880 (2001); Heinrich, M. C. et al., J. Clin. Oncol. 24, 4764-4774 (2006); Daub, H., Specht, K. & Ullrich, A. Nature Rev. Drug Discov. 3, 1001-1010 (2004))。従って、有効な長期的な治療方策のための「創薬的に価値のある（druggable）」標的を解明するような方式で耐性メカニズムを同定する新しい方法、このような治療方策によって利益を得る可能性が高い患者を同定する新しい方法、および、このような有効な長期的な治療方策での患者の治療方法の必要性が未だある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Davies, H. et al., Nature 417, 949-954 (2002)
【非特許文献２】Hoeflich, K. P. et al., Cancer Res. 69, 3042-3051 (2009)
【非特許文献３】McDermott, U. et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 104, 19936-19941 (2007)
【非特許文献４】Solit, D. B. et al. BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition. Nature 439, 358-362 (2006)
【非特許文献５】Wan, P. T. et al., Cell 116, 855-867 (2004)
【非特許文献６】Wellbrock, C. et al., Cancer Res. 64, 2338-2342 (2004))-an observation that has been validated by the success of RAF or MEK inhibitors in clinical trials (Flaherty, K. T. et al., N. Engl. J. Med. 363, 809-819 (2010)
【非特許文献７】Infante, J. R. et al., J. Clin. Oncol. 28 (suppl.), 2503 (2010)
【非特許文献８】Schwartz, G. K. et al., J. Clin. Oncol. 27 (suppl.), 3513 (2009))
【非特許文献９】Engelman, J. A. et al., Science 316, 1039-1043 (2007)
【非特許文献１０】Gorre, M. E. et al., Science 293, 876-880 (2001)
【非特許文献１１】Heinrich, M. C. et al., J. Clin. Oncol. 24, 4764-4774 (2006)
【非特許文献１２】Daub, H., Specht, K. & Ullrich, A. Nature Rev. Drug Discov. 3, 1001-1010 (2004))
【発明の概要】
【０００５】
［0004］本発明は、癌治療における治療剤に対する耐性の発達、および、癌治療に対する耐性を与える標的の同定に関する。本発明はまた、有効な長期的な治療方策を容易にするための並行使用できる薬剤標的の同定、および、このような治療によって利益を得ると予想される患者の同定にも関する。
【０００６】
［0005］従って、一形態において、ＲＡＦ阻害剤と第二の阻害剤とを用いた併用療法での治療によって利益を得る可能性が高い癌を有する被験者を同定する方法が提供される。本方法は、被験者から得られた癌細胞中のＭＡＰ３Ｋ８（ＴＰＬ２／ＣＯＴ）、ＲＡＦ１（ＣＲＡＦ）、ＣＲＫＬ（ＣｒｋＬ）、ＦＧＲ（Ｆｇｒ）、ＰＲＫＣＥ（Ｐｒｋｃｅ）、ＰＲＫＣＨ（Ｐｒｋｃｈ）、ＥＲＢＢ２（ＥｒｂＢ２）、ＡＸＬ（Ａｘｌ）、またはＰＡＫ３（Ｐａｋ３）からなる群より選択される１種またはそれより多くの標的キナーゼの遺伝子コピー数、ｍＲＮＡもしくはタンパク質レベルまたはリン酸化を分析すること、を含む。本方法はさらに、遺伝子コピー数、ｍＲＮＡもしくはタンパク質レベルまたはリン酸化を、癌を有さない被験者から得られた細胞中の標的キナーゼの遺伝子コピー数、ｍＲＮＡもしくはタンパク質レベルまたはリン酸化と比較すること、および、癌を有さない被験者からの細胞と比較して、癌細胞中の標的キナーゼの遺伝子コピー数の増加、または、ｍＲＮＡ発現の変化、または、タンパク質の過剰発現もしくはリン酸化が示された場合、その癌を有する被験者は併用療法での治療によって利益を得る可能性が高いことを決定（correlating with）すること、を含む。
【０００７】
［0006］その他の形態において、癌治療を必要とする被験者において癌を治療する方法が提供される。本方法は、被験者に、有効量のＲＡＦ阻害剤と有効量の第二の阻害剤とを投与することを含み、ここで第二の阻害剤は、ＭＥＫ阻害剤またはＴＰＬ２／ＣＯＴ阻害剤である。
【０００８】
［0007］その他の形態において、第一の阻害剤に対する耐性を付与する標的キナーゼを同定する方法が提供される。本方法は、第一の阻害剤に対する感受性を有する細胞を培養すること、および、細胞培養物で複数のキナーゼＯＲＦクローンを発現させること、を含み、ここでそれぞれの細胞培養物は、異なるキナーゼＯＲＦクローンを発現する。本方法はさらに、それぞれの細胞培養物を上記阻害剤に晒すこと、および、上記阻害剤に晒した後にコントロール細胞培養物よりも高い生存率を有する細胞培養物を同定することにより、第一の阻害剤に対する耐性を付与するキナーゼＯＲＦクローンを同定すること、を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１−１】［0008］図１は、Ｂ−ＲＡＦ阻害に対する耐性のドライバーとしてＣＯＴおよびＣ−ＲＡＦキナーゼを同定したＯＲＦベースの機能的なスクリーニングを説明する。（ａ）ＣＣＳＢ／ブロード・インスティテュート・キナーゼ・ＯＲＦコレクション（CCSB/Broad Institute Kinase ORF collection）の概略を示す図である。キナーゼの分類と分類ごとのキナーゼの数を記す。（ｂ）ＣＣＳＢ／ブロード・インスティテュート・キナーゼ・ＯＲＦコレクションを発現するＡ３７５細胞を１μＭのＰＬＸ４７２０存在下における相対的な生存率について分析し、構造的に活性なＭＥＫ１（ＭＥＫ１ＤＤ）に標準化した。９種のＯＲＦ（○）が全てのＯＲＦの平均（点線、４４．２６％）からの２つの標準偏差（点線、５８．６４％）にスコア付けされた。（ｃ）指定されたＯＲＦを５種のＢ−ＲＡＦＶ６００Ｅ細胞系中で発現させ、ＤＭＳＯまたは１μＭのＰＬＸ４７２０で処理した。４日後に生存率（ＤＭＳＯと比較）を定量した。エラーバーは、反復実験間の標準偏差を示す（ｎ＝６）。
【図１−２】図１続き。（ｄ）Ａ３７５およびＳＫＭＥＬ２８における二次スクリーニングによって、マルチポイントのＰＬＸ４７２０濃度のスケールで上位９種の候補ＯＲＦの順序を決めた。
【図２−１】［0009］図２は、ＭＡＰＫ経路活性化を介したＢ−ＲＡＦ阻害に対する耐性を説明する。（ａ）指定されたＯＲＦをＡ３７５中で発現させた。１８時間後にリン酸化されたＭＥＫおよびＥＲＫのレベルを分析した。ＤＭＳＯ（−）またはＰＬＸ４７２０（濃度は示した通り）での処理。（ｂ）指定されたＯＲＦを発現するＡ３７５の増殖である。エラーバーは、反復実験間の標準偏差を示す（ｎ＝６）。（ｃ）指定されたＯＲＦを発現するＡ３７５由来の溶解産物におけるＣ−ＲＡＦ（Ｓ３３８）およびＥＲＫリン酸化を示す。
【図２−２】図２続き。（ｄ）ＢＲＡＦＶ６００Ｅまたは空のベクターを発現する不死化初代メラニン細胞由来の溶解産物におけるＣＯＴ発現を示す。ＣＯＴのｍＲＮＡは、異なる長さの２種のタンパク質産物；アミノ酸１〜４６７または３０〜４６７（矢印で示される）を生産する内部開始コドン（３０Ｍ）を有する。（ｅ）コントロールｓｈＲＮＡ（ｓｈＬｕｃ）と比較したｓｈＲＮＡ介在Ｂ−ＲＡＦ欠損（ｓｈＢＲＡＦ）後の指定されたＯＲＦを発現するＡ３７５由来の溶解産物におけるＣＯＴおよびＥＲＫリン酸化を示す。（ｆ）ｓｈＲＮＡ介在Ｃ−ＲＡＦ欠損（ｓｈＣＲＡＦ）またはコントロールｓｈＲＮＡ（ｓｈＬｕｃ）の１８時間後の、指定されたＯＲＦを発現するＡ３７５由来の溶解産物におけるＥＲＫリン酸化を示す。ＤＭＳＯ（−）または１μＭのＰＬＸ４７２０（＋）で処理した。
【図３−１】［0010］図３は、癌細胞系においてＣＯＴ発現がＢ−ＲＡＦ阻害に対する耐性を予測することを説明する。（ａ）ＭＡＰ３Ｋ８／ＣＯＴのコピー数；赤色のバー：ＣＯＴ増幅あり、青色のバー：ＣＯＴ増幅なし。（ｂ）Ｂ−ＲＡＦＶ６００Ｅ細胞株におけるＣＯＴ発現を示す。（ｃ）Ｂ−ＲＡＦＶ６００Ｅ細胞株における短時間の培養を示す。
【図３−２】図３続き。（ｄ）Ｂ−ＲＡＦＶ６００Ｅ細胞株におけるＰＬＸ４７２０のＧＩ５０を示す。色は（ａ）で示した通り。（ｅ）ＤＭＳＯまたはＰＬＸ４７２０（濃度は指定通り）で処理した後のＭＥＫおよびＥＲＫリン酸化。（ｆ）ＤＭＳＯまたは１μＭのＰＬＸ４７２０（ＰＬＸ）またはＣＩ−１０４０（ＣＩ）で処理したＭ３０７溶解産物（ＡＺＤ−Ｒ；ＡＺＤ６２４４耐性）におけるＥＲＫリン酸化。
【図３−３】図３続き。（ｇ）患者／病巣を適合させたＰＬＸ４０３２で処理した転移性黒色腫組織サンプルにおけるＣＯＴのｍＲＮＡ発現（ＱＲＴ／ＰＣＲ）を示す。患者１〜３は、同じ病巣由来の複数の生検を含む。エラーバーは、ＳＥＭを示す（ｎ＝３）Ｕ；検出不可能。（ｈ）コントロール（ｓｈＬｕｃ）と比較したｓｈＲＮＡ介在ＣＯＴ欠損（ｓｈＣＯＴ）およびＤＭＳＯ（−）または１μＭのＰＬＸ４７２０（＋）処理後のＲＰＭＩ−７９５１におけるＥＲＫおよびＭＥＫリン酸化を示す。ＥＲＫおよびＭＥＫリン酸化を定量した。（ｉ）低分子物質ＣＯＴキナーゼ阻害剤で１時間処理した後のＲＰＭＩ−７９５１におけるＥＲＫおよびＭＥＫリン酸化を示す。ＥＲＫおよびＭＥＫリン酸化を定量した。
【図３−４】図３続き。（ｊ）ＢＲＡＦＶ６００Ｅ細胞株のパネルにおけるＰＬＸ４７２０感受性の曲線を示す。ＯＵＭＳ−２３およびＭ３０７はＣＯＴ発現／増幅細胞株であることが示され、残りの全てはＣＯＴが検出不可能／不変の細胞株であった。（ｋ）ＰＬＸ４０３２に対する後天的な耐性を有する転移性の皮下の悪性黒色腫におけるＣＯＴの選択的な発現およびそれに相当するＭＡＰＫ経路活性化を示す（＊は、バックグラウンドバンド、ＭＥＴ−ＭＭ（ＰＬＸ−Ｒ）；転移性の悪性黒色腫、ＰＬＸ４０３２耐性を意味する）。
【図４−１】[0011]図４は、ＣＯＴを発現するＢ−ＲＡＦＶ６００Ｅ細胞株は、アロステリックＭＥＫ阻害剤に対する耐性を有することを説明する。（ａ）Ｂ−ＲＡＦＶ６００Ｅ細胞株パネルにおけるＣＩ−１０４０ＧＩ５０を示す。（ｂ）ＤＭＳＯまたはＣＩ−１０４０で処理した（濃度は記載した通り）指定された細胞株由来の溶解産物におけるＭＥＫおよびＥＲＫリン酸化を示す。（ｃ）ＰＬＸ４７２０、ＲＡＦ２６５、ＣＩ−１０４０およびＡＺＤ６２４４に関する指定されたＯＲＦを異所性発現するＡ３７５の（ＭＥＫ１と比較した）変化倍率ＧＩ５０を示す。
【図４−２】図４続き。（ｄ）ＤＭＳＯまたは１μＭのＰＬＸ４７２０、ＲＡＦ２６５、ＣＩ−１０４０またはＡＺＤ６２４４で処理した後の、指定されたＯＲＦを発現するＡ３７５におけるＥＲＫリン酸化を示す。（ｅ）ＣＩ−１０４０またはＡＺＤ６２４４（全て１μＭ）と組み合わせてＤＭＳＯ、ＰＬＸ４７２０（濃度は指定通り）およびＰＬＸ４７２０で処理した、指定されたＯＲＦを発現するＡ３７５の生存率を示す。エラーバーは、標準偏差を示す（ｎ＝６）を示す。（ｆ）ＣＩ−１０４０またはＡＺＤ６２４４（全て１μＭ）と組み合わせてＤＭＳＯ、ＰＬＸ４７２０（１μＭ）またはＰＬＸ４７２０で処理した後の、指定されたＯＲＦを発現するＡ３７５におけるＥＲＫリン酸化を示す。
【図４−３】図４続き。（ｇ）異常なＭＡＰ３Ｋ８／ＣＯＴのコピー数／発現を示す細胞株は、アロステリックＭＥＫ阻害剤ＣＩ−１０４０に対して感受性を有さない。（ｈ）異常なＭＡＰ３Ｋ８／ＣＯＴのコピー数／発現を示す細胞株は、ＡＺＤ６２４４に対して感受性を有さない。
【図４−４】図４続き。（ｉ）Ｂ−ＲＡＦＶ６００Ｅ−突然変異体細胞株において、Ｂ−ＲＡＦ阻害に応答してＭＡＰ３Ｋ複合体の形成を説明する概略図を示す。ＰＬＸ４７２０は、Ｃ−ＲＡＦを配置してシグナル伝達能のある複合体（右上のパネル）を形成し、これは、Ｃ−ＲＡＦ上流の腫瘍形成性の現象（右下のパネル）、それに続く駆動耐性によって活性化される。ＣＯＴ発現に関して、ＣＯＴ／ＲＡＦを含む複合体はＭＡＰＫ経路を活性化するのに十分であり、耐性を仲介する（左下のパネル）。
【図５】［0012］図５は、Ｂ−ＲＡＦ阻害に対する耐性を駆動させるキナーゼに関するＯＲＦベースの機能的なスクリーニングを説明する概略図を示す。ＣＣＳＢ／ブロード・インスティテュート・キナーゼ・ＯＲＦコレクションにおいて、Ｂ−ＲＡＦＶ６００Ｅ細胞株Ａ３７５に、レンチウイルスによって５９７キナーゼを形質導入した。コントロールで処理したＡ３７５において増殖に正または負の作用を有するＯＲＦを同定し、最終的な解析から除いた。Ｂ−ＲＡＦ阻害（ＰＬＸ４７２０処理）細胞とコントロール処理細胞との生存率の差異を見出すによって、耐性を促進するＯＲＦを同定した。生存率の差異を、構成的に活性なＭＥＫ１対立遺伝子、ＭＥＫ１ＤＤ；分析特異的なポジティブコントロールに標準化した。
【図６−１】[0013]図６は、ＣＣＳＢ／ブロード・インスティテュート・キナーゼ・ＯＲＦコレクションは高タイターのレンチウイルスによってよく発現されることを説明する。（ａ）全てのＯＲＦスクリーニングおよびそれに続く確認に用いられるｐＬＸ−ＢＬＡＳＴ−Ｖ５レンチウイルス発現ベクターの略図を示す。（ｂ）ジャーカット（Jurkat）細胞中で様々なサイズのＧＦＰタグを有するＯＲＦをレンチウイルスにより発現させ、さらにＧＦＰを発現する細胞／ＯＲＦ（例えば感染細胞）のパーセンテージを定量したところ、様々なＯＲＦサイズにわたり高ウイルスタイターが示された。
【図６−２】図６続き。（ｃ）細胞性ＤＮＡと比べて、９６種のランダムＯＲＦの発現がＶ５−エピトープタグに対する抗体を用いたＬｉＣｏｒによって検出された。ウェルの８３％で発現を検出することができた。
【図７】[0014]図７は、耐性ＯＲＦ候補の発現を説明する。２９３Ｔを（指定された）ｐＬＸ−ＢＬＡＳＴ−Ｖ５−ＯＲＦで一時的にトランスフェクションし、抗Ｖ５−ＨＲＰ抗体を用いて発現を検出した。ＡＸＬクローンを「閉環」し、Ｖ５タグの前に停止コドンを入れた。発現の検証については図１２を参照；（＊）暗所露出で、明所での曝露では可視化されなかった３種のＯＲＦの発現が示された。
【図８】[0015]図８は、二次スクリーニングによって、上位９種のＢ−ＲＡＦ阻害剤耐性ＯＲＦ候補の順序を決めたことを説明する。一次スクリーニングでスコア付けされた上位９種のＯＲＦをＡ３７５またはＳＫＭＥＬ２８中で発現させ、ＧＩ５０を８ポイントのＰＬＸ４７２０濃度範囲から得た。
【図９】[0016]図９は、Ｂ−ＲＡＦＶ６００Ｅ細胞株の増殖に与えるＯＲＦ発現の作用を説明する。（ａ）ＭＥＫ１と比較した、増殖の７日後における、指定されたＯＲＦを発現するＡ３７５における増殖を示す。（ｂ）ＭＥＫ１と比較した、増殖の７日後における、指定されたＯＲＦを発現するＳＫＭＥＬ２８における増殖を示す。
【図１０】[0017]図１０は、構成的に活性なＭＥＫ１（ＭＥＫ１ＤＤ）およびＣＯＴの異所性発現によりＡ３７５においてｐＭＥＫ／ｐＥＲＫが増加するが、それに対してＣ−ＲＡＦはｐＭＥＫ／ｐＥＲＫレベルを減少させることを説明する。ＧＦＰ、ＭＥＫ１、ＭＥＫＤＤ、ＣＯＴまたはＣ−ＲＡＦを異所性発現するＡ３７５由来の溶解産物を免疫ブロットによってｐＥＲＫおよびｐＭＥＫのレベルについて解析した。残留したＶ５−ＭＥＫ１シグナルがかなり低いレベルでしか発現されないＣＯＴおよびＣ−ＲＡＦのシグナルを損なわないように、ＧＦＰおよびＭＥＫ１（レーン１〜３）をＣＯＴ／Ｃ−ＲＡＦ（レーン４〜５）から分離した。
【図１１】[0018]図１１は、ＰＬＸ４７２０処理に関して、ＣＯＴおよびＣ−ＲＡＦのキナーゼ活性が持続的なＥＲＫリン酸化に必要であることを説明する。（ａ）１μＭのＰＬＸ４７２０で１８時間処理した異所性のＭＥＫ１、野生型ＣＯＴ、または、キナーゼ不活性ＣＯＴ（ＣＯＴＫ１６７Ｒ）を発現するＡ３７５の免疫ブロット解析を示す。（ｂ）１μＭのＰＬＸ４７２０で１８時間処理した異所性のＭＥＫ１、野生型Ｃ−ＲＡＦ、または、キナーゼ不活性なＣ−ＲＡＦ（Ｃ−ＲＡＦＫ３７５Ｍ）を発現するＡ３７５の免疫ブロット解析を示す。
【図１２】[0019]図１２は、Ｂ−ＲＡＦ阻害剤ＰＬＸ４７２０に関してＭＡＰＫシグナル伝達に与えるＯＲＦ発現の作用を説明する。ＰＬＸ４７２０（１８時間，濃度は指定通り）の存在下で指定されたＯＲＦを発現するＡ３７５におけるｐＥＲＫおよびｐＭＥＫの免疫ブロット解析によってＭＡＰＫ経路活性化を評価した。（＊）は、Ｖ５エピトープではなく発現されたＯＲＦに対して向けられた抗体の使用を示す。Ｖ５タグを用いずにＡＸＬをクローニングした。
【図１３】[0020]図１３は、Ｂ−ＲＡＦは、１８時間後にＡ３７５中で免疫沈降したＣ−ＲＡＦと関連することを説明する。（ａ）１μＭのＰＬＸ４７２０（＋）またはＤＭＳＯ（−）での処理を示す。ＷＣＥ；全細胞抽出物コントロールを示す。異所性発現されたＣ−ＲＡＦは、構造的にＢ−ＲＡＦと関連しており、Ｓ３３８でリン酸化されており、これは膜局在化および活性化と一致していた。（ｂ）ＭＥＫ１、ＭＥＫＤＤおよびＣＯＴを発現するＡ３７５は、Ｃ−ＲＡＦ活性化の証拠を示さなかった。
【図１４】[0021]図１４は、野生型Ｃ−ＲＡＦまたはＣ−ＲＡＦの高活性のトランケーション突然変異体（Ｃ−ＲＡＦ（２２Ｗ））をレトロウイルスで発現させたところ、Ｂ−阻害剤ＰＬＸ４７２０にＡ３７５耐性が生じたこと（ａ）、そして、野生型Ｃ−ＲＡＦまたはＣ−ＲＡＦの高活性のトランケーション突然変異体（Ｃ−ＲＡＦ（２２Ｗ））をレトロウイルスで発現させたところ、ＰＬＸ４７２０処理（１μＭ，１８時間）により持続的なｐＥＲＫレベルが生じたこと（ｂ）を説明する。レトロウイルスを用いて達成されたＣ−ＲＡＦ発現レベルはレンチウイルスベースの系よりも有意に低く、その結果として、ＧＩ５０もレンチウイルスのＣ−ＲＡＦを用いて達成された値よりも低かった。
【図１５】[0022]図１５は、ＣＯＴのｍＲＮＡに与えるＢ−ＲＡＦＶ６００Ｅの作用を説明しており、（ａ）は、形質転換した野生型Ｂ−ＲＡＦ（ベクター）またはＢ−ＲＡＦＶ６００Ｅを発現する初代メラニン細胞における、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現と比較したＣＯＴのｍＲＮＡ発現の定量ＲＴ／ＰＣＲを示す。ＣＯＴ発現をベクターを発現する初代メラニン細胞の発現に標準化した。（＊＊）有意、ｐ０．０５（スチューデントのｔ検定、両側）。（ｂ）は、ＰＬＸ４７２０感受性Ａ３７５において内因性ＣＯＴのｍＲＮＡは、検出不可能であり、異所性発現されたＣＯＴのｍＲＮＡレベルは１μＭのＰＬＸ４７２０処理による影響を受けなかった。ＧＦＰまたはＣＯＴを発現するＡ３７５を１μＭのＰＬＸ４７２０で１８時間処理した。逆転写したｍＲＮＡをＧＡＰＤＨで標準化したＣＯＴ発現についてＤＭＳＯ処理したＧＦＰ発現Ａ３７５と比較して解析した。（＊）有意ではない、ｐ＞０．０５（スチューデントのｔ検定、両側）。エラーバーは、ＳＥＭを示す。
【図１６】[0023]図１６は、Ｂ−およびＣ−ＲＡＦタンパク質レベルはＣＯＴ介在ＥＲＫリン酸化に必要ではないことを説明する。異所性ＭＥＫ１（コントロール）またはＣＯＴを発現するＡ３７５をＢ−ＲＡＦ、Ｃ−ＲＡＦを標的とするｓｈＲＮＡまたはコントロールｓｈＲＮＡ（ｓｈＬｕｃ）を発現するレンチウイルスで連続的に感染させ、１８時間の１μＭのＰＬＸ４７２０の存在下（＋）または非存在下（−）で指定されたタンパク質の発現に関して分析した。
【図１７】[0024]図１７は、７５２細胞株のＳＮＰ解析から、ＭＡＰ３Ｋ８／ＣＯＴのコピー数が明らかに変化していることを説明する。コピー数解析を受けた７５２細胞株のうち５３４種について、さらに突然変異のプロファイリングを行った。突然変異の特徴を示す細胞のうち３８種（７．１％）がＢ−ＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異を含んでいた。２種の細胞株（ＯＵＭＳ−２３、ＲＰＭＩ−７９５１、指定された通り）が、Ｂ−ＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異を含み、かつＭＡＰ３Ｋ８／ＣＯＴのコピー数の増加を示した。
【図１８−１】[0025]図１８は、癌細胞株ＯＵＭＳ−２３におけるＭＡＰ３Ｋ８／ＣＯＴの変化を説明する。（ａ）ｍＲＮＡマイクロアレイ解析からのＭＡＰ３Ｋ８／ＣＯＴプローブ（記載された通り）のＲＭＡシグナルを示す。ＯＵＭＳ−２３は、ＣＯＴのｍＲＮＡを発現する（７６５種の細胞株のうち）上位２％のうちの１種である。
【図１８−２】図１８続き。（ｂ）Ｂ−ＲＡＦＶ６００Ｅ−突然変異細胞株のパネルにおけるＣＯＴのｍＲＮＡ発現。（ｃ）Ａ３７５およびＳＫＭＥＬ２８細胞株において異所性発現されたＣＯＴと比較した、ＯＵＭＳ−２３における内因性ＣＯＴタンパク質発現であり、これは指定された細胞の免疫ブロット解析によって決定された。
【図１９】[0026]図１９は、ＣＯＴのｍＲＮＡおよびタンパク質は、ＢＲＡＦ阻害剤耐性細胞株および組織で発現されることを説明する。（ａ）再発したＰＬＸ４０３２処理した悪性黒色腫（ＭＭ−Ｒ）由来の細胞株、短時間の培養および組織のパネルにおける、ＧＡＰＤＨで標準化したＣＯＴのｍＲＮＡ発現のＲＴ／ＰＣＲ解析を示す。それに相当する細胞株および短時間の培養によるタンパク質発現は、それぞれ図３ｂおよび３ｃに示される。（ｂ）初代メラニン細胞（１ｏＭｅｌ（Ｂ−ＲＡＦＷＴ））、患者を適合させた正常な皮膚（Skin）および転移性悪性黒色腫（パネルａに示されるＭＭ−Ｒ；ＣＯＴのｍＲＮＡ）、Ａ３７５細胞、ならびにＢ−ＲＡＦＶ６００Ｅ（１ｏＭｅｌ（Ｂ−ＲＡＦＶ６００Ｅ））を発現する初代メラニン細胞由来の溶解産物のウェスタンブロット解析を示す。
【図２０】[0027]図２０は、ＣＯＴ欠損は、ＣＯＴを増幅した細胞株ＲＰＭＩ−７９５１の生存率に影響を与えることを説明する。（ａ）コントロールｓｈＲＮＡ（ｓｈＬｕｃ）と比較した、レンチウイルスｓｈＲＮＡ介在ＣＯＴ欠損（ｓｈＣＯＴ）後のＲＰＭＩ−７９５１の生存率の定量化を示す。エラーバーは、反復実験間の標準偏差を示す。（ｂ）ｓｈＬｕｃおよびｓｈＣＯＴを発現するＲＰＭＩ−７９５１における相対的なＣＯＴタンパク質発現を示す免疫ブロット解析を示す。
【図２１】[0028]図２１は、ＳＫＭＥＬ２８におけるＭＡＰＫ経路阻害剤パネルのＧＩ５０に与える作用を説明する。ＭＥＫ１、ＭＥＫ１ＤＤまたはＣＯＴを異所性発現するＳＫＭＥＬ２８の半数最大増殖阻害濃度（ＧＩ５０）を、ＲＡＦ阻害剤ＰＬＸ４７２０およびＲＡＦ２６５およびＭＥＫ１／２阻害剤ＣＩ−１０４０およびＡＺＤ６２４４に関して決定した。各化合物ごとにＭＥＫ１ＤＤおよびＣＯＴの（ＭＥＫ１と比較した）ＧＩ５０の変化を決定した。
【図２２】[0029]図２２は、ＣＯＴは、ＭＥＫとは独立したメカニズムとＭＥＫ依存性メカニズムを介してＥＲＫを活性化できることを説明する。（ａ）ＧＦＰまたはＣＯＴ発現、それに続くレンチウイルスｓｈＲＮＡ介在ＭＥＫ１、ＭＥＫ２またはＭＥＫ１およびＭＥＫ２（ＭＥＫ１＋２）欠損後の、Ａ３７５由来の溶解産物におけるＥＲＫリン酸化の、コントロールｓｈＲＮＡ（ｓｈＬｕｃ）と比較した免疫ブロット解析を示す。左および右のパネルは、２種の異なるＭＥＫ１およびＭＥＫ２ｓｈＲＮＡコンストラクトの対を示す。（ｂ）インビトロでのキナーゼ分析における組換えＣＯＴによる組換えの不活性なＥＲＫリン酸化（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）の免疫ブロット解析を示す。
【図２３】［００３０］図２３は、コンビナトリアルなＭＡＰＫ経路の阻害が、ＳＫＭＥＬ２８における増殖を効果的に抑制することを説明する。ＭＥＫ１、ＭＥＫ１ＤＤまたはＣＯＴを異所性発現し、ＤＭＳＯ、ＰＬＸ４７２０（濃度は指定通り）、ＰＬＸ４７２０（１μＭ）およびＣＩ−１０４０（１μＭ）またはＰＬＸ４７２０（１μＭ）およびＡＺＤ６２４４（１μＭ）で処理したＳＫＭＥＬ２８の（ＤＭＳＯと比較した）生存率を示す。エラーバーは、反復実験間の標準偏差を示す。
【図２４】[0031]図２４は、ＣＯＴの過剰発現は、Ｂ−ＲＡＦ阻害に対するＢ−ＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異耐性を有する黒色腫癌細胞を提供するのに十分であることを説明する。
【図２５】[0032]図２５は、一次スクリーニングでスコア付けされた上位９種のＯＲＦがＳＫＥＬ２８（ａ）でＡ３７５（ｂ）の発現したこと、４種のＭＡＰＫ経路阻害剤（ＰＬＸ４７２０、ＲＡＦ２６５、ＣＩ−１０４０、ＡＺＤ−６２４４）についてのＧＩ５０を示す。
【図２６】[0033]図２６は、Ｂ−ＲＡＦＶ６００Ｅ細胞株のパネルにおいて、ＣＲＫＬ発現は、選択的なＢ−ＲＡＦ阻害剤ＰＬＸ４７２０に対する感受性を変化させることを説明する。
【図２７】[0034]図２７は、ＭＡＰ３Ｋ８／ＣＯＴ増幅／Ｂ−ＲＡＦＶ６００Ｅ−突然変異癌細胞株ＯＵＭＳ−２３は、ＰＬＸ４７２０の全用量範囲にわたりＥＲＫ／ＭＥＫの構成的リン酸化を示すを説明する。
【図２８】[0035]図２８は、ＭＡＰＫ経路阻害に対する不感受性は、皮膚癌細胞株の部分集合におけるＭＡＰ３Ｋ８／ＣＯＴのコピー数の増加と相関することを説明する。２０種のＢ−ＲＡＦＶ６００Ｅ−突然変異細胞株のパネル、および、それらの（ａ）Ｂ−ＲＡＦ阻害剤ＰＬＸ４７２０ならびに（ｂ）ＭＥＫ阻害剤ＡＺＤ６２４４に対する感受性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
[0036]本発明は、癌治療における治療剤に対する耐性の発達、および、癌治療に対する耐性を与える標的の同定に関する。本発明はまた、有効な長期的な治療方策を容易にするための並行使用できる薬剤標的の同定、および、このような治療によって利益を得ると予想される患者の同定にも関する。いくつかの実施態様において、本発明は、キナーゼに関し、具体的にはＭＡＰキナーゼ経路の構成要素に関する。
【００１１】
［００３７］
本発明の実施において、特に他の指定がない限り、従来の分子生物学、免疫学、微生物学、細胞生物学および組換えＤＮＡ技術が用いられると予想され、これらの技術は当業界の技術の範囲内である。例えば、Sambrook, Fritsch and Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, (現行版); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel et al. eds., (現行版)); METHODS IN ENZYMOLOGYシリーズ(Academic Press, Inc.): PCR ２: A PRACTICAL APPROACH (現行版) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (１９８７)). DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 現行版); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins編集, 現行版); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins編集, 現行版); Fundamental Virology, ２nd Edition, vol. I & II (B. N. Fields and D. M. Knipe編集)を参照。
【００１２】
[0038]分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードは、増殖因子、サイトカインおよび癌原遺伝子などの多様な細胞外の刺激に応答してシグナル伝達を調節する重要な細胞内シグナル伝達経路である。この経路を活性化すると、転写因子の活性化および遺伝子発現の変化が起り、最終的に細胞増殖、細胞周期調節、細胞生存、血管新生および細胞移動などの細胞機能における変化が起る。典型的なＭＡＰＫシグナル伝達は細胞表面上のチロシンキナーゼ受容体によって始動するが、インテグリン、ヘテロ三量体Ｇタンパク質およびサイトカイン受容体などのその他多くの細胞表面分子が、ＭＡＰＫカスケードを活性化することができる。
【００１３】
[0039]例えばチロシンキナーゼ受容体などの細胞表面の受容体に結合するリガンドは、典型的には受容体のリン酸化を引き起こす。アダプタータンパク質Ｇｒｂ２は活性化された受容体のリン酸化された細胞内ドメインに結合し、この結合により、ＳＯＳ−ＩやＣＤＣ２５などのグアニンヌクレオチド交換因子が細胞膜に補充される。これらのグアニンヌクレオチド交換因子はＧＴＰアーゼＲａｓと相互作用し、それらを活性化させる。一般的なＲａｓアイソフォームとしては、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓなどが挙げられる。Ｒａｓ活性化後、Ｒａｓとの相互作用を介して細胞膜にセリン／スレオニンキナーゼＲａｆ（例えばＡ−Ｒａｆ、Ｂ−ＲａｆまたはＲａｆ−１）が補充される。続いてＲａｆはリン酸化される。Ｒａｆは、２１７位および２２１位における２つのセリン残基をリン酸化することにより直接的にＭＥＫｌおよびＭＥＫ２を活性化する。活性化後、ＭＥＫｌおよびＭＥＫ２は、セリン／スレオニンキナーゼＥｒｋｌおよびＥｒｋ２のチロシン（Ｔｙｒ−１８５）およびスレオニン（Ｔｈｒ−１８３）残基をリン酸化し、その結果としてＥｒｋが活性化される。活性化されたＥｒｋは、サイトゾル中の様々な標的を調節したり、細胞核に移動させたりして、そこで遺伝子発現を調節する様々な転写因子をリン酸化する。Ｅｒｋキナーゼは様々な標的を有しており、このような標的としては、ＥＩｋ−Ｉ、ｃ−Ｅｔｓｌ、ｃ−Ｅｔｓ２、ｐ９０ＲＳＫｌ、ＭＮＫｌ、ＭＮＫ２、ＭＳＫｌ、ＭＳＫ２およびＴＯＢが挙げられる。前述の経路はＭＡＰＫシグナル伝達の典型的な例であるが、ＭＡＰＫ経路とその他のシグナル伝達カスケードとの間にかなりの混線がみられる。
【００１４】
[0040]ＭＡＰＫシグナル伝達における異常は、癌生物学において重要な役割がある。多くの癌でＲａｓ発現の変化は共通しており、Ｒａｓにおける突然変異の活性化も確認されている。このような突然変異は全ての癌の３０％に見出されており、特に膵臓癌（９０％）および結腸癌（５０％）でよくみられる。加えて、Ｒａｆ突然変異の活性化は、黒色腫および卵巣癌でも確認されている。最も一般的な突然変異であるＢＲＡＦＶ６００Ｅは、下流のＭＡＰキナーゼ経路の構造的な活性化を引き起こし、これは、黒色腫細胞の増殖、軟寒天での増殖、および、腫瘍の異種移植片形成に必要である。ヒト癌におけるＭＡＰＫの過剰な活性化の明確な役割に基づいて、特定の阻害剤でＭＡＰＫ経路の構成要素を標的化することは、癌治療の有望なアプローチである。しかしながら、患者は、先天的な耐性を有する場合もあるし、または、これらの有望な治療剤に対する耐性を獲得する場合もある。以下で、標的キナーゼ、診断剤および／または予後マーカーの同定、ならびにこのような先天的または後天的な耐性を有する患者のための治療法を説明する。
【００１５】
[0041]ハイスループットの機能的なスクリーニング分析
[0042]いくつかの形態において、本発明は、ハイスループットスクリーニング分析を用いて臨床的に有効な治療剤に対する耐性を生じさせることができる標的を同定する方法に関する。いくつかの実施態様において、本方法は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）ベースの、治療剤に対する耐性を発生させるキナーゼに関する機能的なスクリーニングを含む可能性がある。本方法は、腫瘍形成性の突然変異を有することがわかっているキナーゼを含む細胞株を提供することを含み得る。キナーゼＯＲＦのライブラリーは、それぞれライブラリーからの異なるＯＲＦを発現する複数のクローンをさらに評価できるように細胞株で個々に発現されたものでもよい。それぞれのクローンを、（１）細胞株中で既知のキナーゼの阻害剤に晒し、（２）阻害剤を使用しない細胞株中でのＯＲＦ発現を基準として増殖の変化についてモニターしてもよい。ＯＲＦ発現単独よりも正または負の増殖のいずれかの増殖作用を有する全てのクローンを除去する。続いて残りの異なるキナーゼを発現するクローンをそれぞれ、コントロールと処理済クローンとの生存率について比較し、ポジティブコントロールに標準化する。阻害剤での処理後の細胞生存率の増加によって、耐性を与えるＯＲＦが同定され、すなわちそれにより、追加の阻害剤を用いた治療のための標的キナーゼが同定される。いくつかの実施態様において、標準化平均からの２つの標準偏差より上位にスコア付けされたクローンは標的キナーゼである可能性があり、追加の阻害剤を用いた治療が被験者にとって有益であることを示す。
【００１６】
[0043]一例として、これらに限定されないが、図５にＢ−ＲＡＦ阻害に対する耐性を駆動させるキナーゼに関するハイスループットの機能的なスクリーニング分析の略図を示す。クローニングされた約６００種のコレクションと配列が確認されたＯＲＦを集めたところ、全ての注釈がつけられたキナーゼ（センター・フォー・キャンサー・システム・バイオロジー(Center for Cancer Systems Biology ；CCSB)/Broad Institute Kinase ORF Collection、図１ａ、１ｂ、表３）の約７５％を占めていた。公共的に利用可能なコレクションは、すぐに様々な最終目的のための様々な発現ベクターに移すことができる。キナーゼＯＲＦコレクションを発現させるために、当業者によく知られたあらゆるタイプの発現ベクターを用いることができる。一例として、これらに限定されないが、キナーゼコレクションを発現させるために、哺乳動物細胞において高タイターのウイルスの生産および活発なＯＲＦ発現が可能な、選択可能なエピトープ−タグを有するレンチウイルス発現ベクターを作製することができる（ｐＬＸ−ＢＬＡＳＴ−Ｖ５、図６ａ）。
【００１７】
[0044]ＲＡＦ阻害を回避することができるキナーゼを同定するために、配列させたキナーゼＯＲＦコレクションを、ＲＡＦキナーゼ阻害剤ＰＬＸ４７２０に対して感受性を有するＢ−ＲＡＦＶ６００Ｅ悪性黒色腫細胞株のＡ３７５で安定して発現させてもよい（図１ａ、１ｂおよび６ｃ、表３）。１μＭのＰＬＸ４７２０で処理したＯＲＦ発現細胞のクローンを、未処理細胞と比較した生存率に関してスクリーニングし、分析特異的なポジティブコントロール、ＭＥＫ１Ｓ２１８／２２２Ｄ（ＭＥＫ１ＤＤ）に標準化する（表４）。基準の生存率または増殖と比較して変化があったＯＲＦは解析から除去される。第二の阻害剤に関して耐性を付与する標的キナーゼを同定するために、標準化平均からの２つの標準偏差を上回るとスコア付けされたクローンをさらに評価してもよい。いくつかの実施態様において、標的キナーゼをコードする遺伝子は、ＭＡＰ３Ｋ８（ＴＰＬ２／ＣＯＴ）、ＲＡＦ１（ＣＲＡＦ）、ＣＲＫＬ（ＣｒｋＬ）、ＦＧＲ（Ｆｇｒ）、ＰＲＫＣＥ（Ｐｒｋｃｅ）、ＰＲＫＣＨ（Ｐｒｋｃｈ）、ＥＲＢＢ２（ＥｒｂＢ２）、ＡＸＬ（Ａｘｌ）、またはＰＡＫ３（Ｐａｋ３）であり得る。いくつかの実施態様において、標的キナーゼをコードする遺伝子は、ＭＡＰＫ経路活性化因子であり得る。いくつかの実施態様において、標的キナーゼをコードする遺伝子は、直接ＭＥＫをリン酸化して活性化するＭＡＰ３キナーゼであり得る。いくつかの実施態様において、標的キナーゼをコードする遺伝子は、黒色腫において増幅されリン酸化されるアダプタータンパク質をコードしているものでもよい。
【００１８】
[0045]その他の実施態様において、ＯＲＦコレクションは、例えば約６００のアミノ酸位置におけるその他の突然変異（例えばＶ６００Ｋ、Ｖ６００ＤおよびＶ６００Ｒ）などの、Ｂ−ＲＡＦに異なる突然変異を有する細胞株で安定して発現させることもできる。追加のＢ−ＲＡＦ突然変異としては、Davies et al. Nature, 417, 949-954, 2002の表１で説明されている突然変異が挙げられる。これらに限定されないが、ＰＬＸ４０３２；ＧＤＣ−０８７９；ＲＡＦ２６５；ソラフェニブ；ＳＢ５９０８５５、および／または、ＺＭ３３６３７２などのその他のＲＡＦキナーゼ阻害剤に対して感受性を有する細胞株を用いてもよい。いくつかの実施態様において、ＯＲＦコレクションは、ＭＥＫ阻害剤に対する感受性を有する細胞株で安定して発現させることができる。ＭＥＫ阻害剤の例としては、これらに限定されないが、ＡＺＤ６２４４；ＣＩ−１０４０；ＰＤ１８４３５２；ＰＤ３１８０８８、ＰＤ９８０５９、ＰＤ３３４５８１、ＲＤＥＡ１１９、６−メトキシ−７−（３−モルホリン−４−イル−プロポキシ）−４−（４−フェノキシ−フェニルアミノ）−キノリン−３−カルボニトリルおよび４−［３−クロロ−４−（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イルスルファニル）−フェニルアミノ］−６−メトキシ−７−（３−モルホリン−４−イル−プロポキシ）−キノリン−３−カルボニトリルが挙げられる。以下で追加のＲＡＦおよびＭＥＫ阻害剤を説明する。一例として、これらに限定されないが、典型的なＲＡＦ阻害剤としては表１に示されるものが挙げられ、典型的なＭＥＫ阻害剤としては表２に示されるものが挙げられる。
【００１９】
【表１】
0005985401.tif 000002
【００２０】
【表２】
0005985401.tif 000003
【００２１】
【表３】
0005985401.tif 000004
【００２２】
[0048]標的化療法に対する先天的および後天的な抵抗性に関する診断／予後マーカー
[0049]いくつかの形態において、本発明は、サンプル（例えば癌患者由来の生体サンプル）中の１種またはそれより多くの診断または予後マーカーの存在を検出する方法に関する。当業者によく知られた様々なスクリーニング方法を用いて、例えばＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質検出などの、サンプル中のマーカーの存在の検出が可能である。以下で説明される技術を用いて、患者から得られたサンプル中の標的キナーゼの存在または非存在を決定することができる。いくつかの実施態様において、患者は、例えばＢ−ＲＡＦ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤などのキナーゼを標的とする治療剤に対する先天的または後天的な耐性を有する可能性がある。例えば、患者は、Ｂ−ＲＡＦ阻害剤のＰＬＸ４７２０、および／または、ＰＬＸ４０３２に対する先天的または後天的な耐性を有する可能性がある。いくつかの実施態様において、患者は、ＭＥＫ阻害剤のＡＺＤ６２４４に対する先天的または後天的な耐性を有する可能性がある。患者における１種またはそれより多くの標的キナーゼマーカーを同定することは、医師がその患者のための治療プロトコールを決定する手助けになる。例えば、１種またはそれより多くの標的キナーゼマーカーを有する患者の場合、医師は、以下でより詳細に説明されているような併用療法で患者を治療してもよい。
【００２３】
[0050]いくつかの実施態様において、このような標的キナーゼとしては、これらに限定されないが、ＭＡＰ３Ｋ８（ＴＰＬ２／ＣＯＴ）、ＲＡＦ１（ＣＲＡＦ）、ＣＲＫＬ（ＣｒｋＬ）、ＦＧＲ（Ｆｇｒ）、ＰＲＫＣＥ（Ｐｒｋｃｅ）、ＰＲＫＣＨ（Ｐｒｋｃｈ）、ＥＲＢＢ２（ＥｒｂＢ２）、ＡＸＬ（Ａｘｌ）、またはＰＡＫ３（Ｐａｋ３）が挙げられる。これらのマーカーは、標的キナーゼに関する遺伝子コピー数の増加、タンパク質発現の増加、１種またはそれより多くのＭＡＰキナーゼ経路の構成要素のリン酸化、ｍＲＮＡ発現の変化などであり得る。
【００２４】
[0051]一例として、これらに限定されないが、Ｂ−ＲＡＦに腫瘍形成性の突然変異を有する患者における活性化された標的キナーゼの同定は、患者に応じた治療プロトコールを特徴付けるために有用である可能性がある。例えばＢ−ＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異を有する患者において、ＲＡＦ阻害剤単独で治療する場合、その患者が、所定期間の後にその治療に対して耐性を獲得する危険が比較的高いことを示す可能性がある。腫瘍形成性の突然変異を有する患者において、活性化された標的キナーゼがその患者で同定された場合、それは、治療プロトコールに第二の阻害剤を含める必要があることを示す可能性がある。
【００２５】
[0052]活性化された標的キナーゼの同定としては、標的キナーゼの遺伝子コピー数の解析および標的キナーゼのコピー数の増加の同定がある。例えばＭＡＰ３Ｋ８のコピー数の増加は、特にその患者がＢ−ＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異も有する場合、その患者は先天的な耐性を有するか、または後天的な耐性を獲得したことを示す。
【００２６】
[0053]いくつかの実施態様において、活性化された標的キナーゼの同定としては、標的キナーゼおよび／またはＭＡＰキナーゼ経路の構成要素のリン酸化の解析がある。例えばＳ３３８におけるＣ−ＲＡＦのリン酸化は、特にその患者がＢ−ＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異も有する場合、その患者が先天的な耐性を有するか、または後天的な耐性を獲得したことを示す。いくつかの実施態様において、ＭＥＫ／ＥＲＫリン酸化の増加の同定は、患者が先天的な耐性を有するか、または後天的な耐性を獲得したことを示す可能性がある。Ｂ−ＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異を有する患者におけるＣＯＴタンパク質発現の増加によって、ＲＡＦ阻害およびＭＥＫ阻害に対する耐性を予想できる可能性がある。
【００２７】
[0054]活性化された標的キナーゼの同定としては、標的キナーゼのｍＲＮＡ発現の解析がある。例えば、第一のキナーゼ阻害剤での最初の治療後のＣＯＴのｍＲＮＡ発現が増加していれば、その患者は、耐性を有するか、または耐性を獲得していることを示す。いくつかの実施態様において、第一のキナーゼ阻害剤は、ＲＡＦ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤であり得る。
【００２８】
[0055]治療方法
[0056]様々な実施態様において、本発明は、癌を有する患者を治療する方法を提供する。本方法は、概して、第一の阻害剤と第二の阻害剤との投与を含む。一方の阻害剤は、ＲＡＦ阻害剤であってもよい。ＲＡＦ阻害剤は、ｐａｎ−ＲＡＦ阻害剤であってもよいし、または、選択的なＲＡＦ阻害剤であってもよい。ｐａｎ−ＲＡＦ阻害剤としては、これらに限定されないが、ＲＡＦ２６５、ソラフェニブ、またはＳＢ５９０８８５が挙げられる。いくつかの実施態様において、ＲＡＦ阻害剤は、Ｂ−ＲＡＦ阻害剤である。いくつかの実施態様において、選択的なＲＡＦ阻害剤は、ＰＬＸ４７２０、ＰＬＸ４０３２、またはＧＤＣ−０８７９−Ａである。一方の阻害剤は、ＭＥＫ阻害剤（表２の典型的なＭＥＫ阻害剤の説明を参照）であってもよい。一方の阻害剤は、ＣＯＴ阻害剤であってもよい。ＣＯＴ阻害剤の例としては、これらに限定されないが、以下で説明されているようなｓｈＲＮＡ阻害剤、または、低分子物質のＣＯＴ阻害剤、４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−６−（ピリジン−３−イル−メチルアミノ）−３−シアノ−［１，７］−ナフチリジン（ＥＭＤ；ＴＰＬ２阻害剤Ｉ；カタログ番号６１６３７３、PubChem番号：９５４９３００）が挙げられる。本発明の阻害剤は、１種またはそれより多くの標的キナーゼ、例えばＭＡＰ３Ｋ８（ＴＰＬ２／ＣＯＴ）、ＲＡＦ１（ＣＲＡＦ）、ＣＲＫＬ（ＣｒｋＬ）、ＦＧＲ（Ｆｇｒ）、ＰＲＫＣＥ（Ｐｒｋｃｅ）、ＰＲＫＣＨ（Ｐｒｋｃｈ）、ＥＲＢＢ２（ＥｒｂＢ２）、ＡＸＬ（Ａｘｌ）、またはＰＡＫ３（Ｐａｋ３）、または、その他のＭＡＰキナーゼ経路の標的を阻害する。
【００２９】
[0057]いくつかの実施態様において、有効量のＲＡＦ阻害剤と有効量のＭＡＰ３Ｋ８（ＴＰＬ２／ＣＯＴ）阻害剤とを含む、癌の併用療法が提供される。また本発明において、有効量のＲＡＦ阻害剤と有効量のＭＥＫ阻害剤とを含む、癌の併用療法も提供される。それ以外の併用療法は、有効量のＲＡＦ阻害剤と、１またはそれより多くの以下：ＭＡＰ３Ｋ８（ＴＰＬ２／ＣＯＴ）、ＲＡＦ１（ＣＲＡＦ）、ＣＲＫＬ（ＣｒｋＬ）、ＦＧＲ（Ｆｇｒ）、ＰＲＫＣＥ（Ｐｒｋｃｅ）、ＰＲＫＣＨ（Ｐｒｋｃｈ）、ＥＲＢＢ２（ＥｒｂＢ２）、ＡＸＬ（Ａｘｌ）、またはＰＡＫ３（Ｐａｋ３）によってコードされた遺伝子、ｍＲＮＡまたはタンパク質を標的とする有効量の第二の阻害剤とを含む。本併用療法は、Ｂ−ＲＡＦ突然変異細胞を含む癌を有する患者、具体的にはＢ−ＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異細胞を含む癌を有する患者を治療するのに適している。本発明はさらに、有効量のＲＡＦ阻害剤と有効量のＭＥＫ阻害剤とを含む癌の併用療法を提供し、ここで癌を有する被験者は、ＭＡＰ３Ｋ８（ＴＰＬ２／ＣＯＴ）発現または遺伝子コピー数が変化した細胞を含む。いくつかの実施態様において、ＭＥＫ阻害剤は、ＣＩ−１０４０／ＰＤ１８４３５２またはＡＺＤ６２４４である。
【００３０】
[0058]本明細書で示されるＭＥＫ阻害剤の例としては、これらに限定されないが、ＣＩ−１０４０、ＡＺＤ６２４４、ＰＤ３１８０８８、ＰＤ９８０５９、ＰＤ３３４５８１、ＲＤＥＡ１１９、６−メトキシ−７−（３−モルホリン−４−イル−プロポキシ）−４−（４−フェノキシ−フェニルアミノ）−キノリン−３−カルボニトリルまたは４−［３−クロロ−４−（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イルスルファニル）−フェニルアミノ］−６−メトキシ−７−（３−モルホリン−４−イル−プロポキシ）−キノリン−３−カルボニトリル、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）化合物ＲＧ７４２０、またはそれらの組み合わせが挙げられる。また当業界でよく知られている追加のＭＥＫ阻害剤を使用してもよい。
【００３１】
[0059]前述の形態の代表的な実施態様において、本明細書で示されるＲＡＦ阻害剤は、ＰＬＸ４７２０、ＰＬＸ４０３２、ＢＡＹ４３−９００６（ソラフェニブ）、ＺＭ３３６３７２、ＲＡＦ２６５、ＡＡＬ−８８１、ＬＢＴ−６１３、またはＣＪＳ３５２（ＮＶＰ−ＡＡＬ８８１−ＮＸ（以降、ＡＡＬ８８１と称する）であり、ＮＶＰ−ＬＢＴ６１３−ＡＧ−８（ＬＢＴ６１３）は、イソキノリン化合物（ノバルティス(Novartis), マサチューセッツ州ケンブリッジ）である。併用療法に有用な追加の典型的なＲＡＦ阻害剤としては、ｐａｎ−ＲＡＦ阻害剤、Ｂ−ＲＡＦ阻害剤、Ａ−ＲＡＦ阻害剤、および、ＲＡＦ−１阻害剤が挙げられる。代表的な実施態様において、併用療法に有用なＲＡＦ阻害剤としては、ＰＬＸ４７２０、ＰＬＸ４０３２、ＢＡＹ４３−９００６（ソラフェニブ）、ＺＭ３３６３７２、ＲＡＦ２６５、ＡＡＬ−８８１、ＬＢＴ−６１３、および、ＣＪＳ３５２が挙げられる。典型的なＲＡＦ阻害剤としてはさらに、ＰＣＴ公報番号ＷＯ／２００８／０２８１４１（その全内容は、参照により本明細書に組み入れられる）に記載の化合物も挙げられる。典型的なＲＡＦ阻害剤としてはさらに、ＰＣＴ公報番号ＷＯ／２００６／０２４８３６に記載されているキナゾリノン誘導体、および、ＰＣＴ公報番号ＷＯ／２００８／０２０２０３に記載されているピリジニルキナゾリンアミン誘導体（これらの内容は参照により本明細書に組み入れられる）も挙げられる。
【００３２】
[0060]このような組み合わせの投与は、これらの組み合わせを一つの製剤または１回投与量で投与すること、これらの組み合わせの個々の薬剤を別々ではなく同時に投与すること、または、これらの組み合わせの個々の薬剤をあらゆる適切な経路で連続的にを投与すること、を含む。このような組み合わせの個々の薬剤の用量は、その組み合わせの一方の薬剤の投与を、その組み合わせの他方の薬剤と比較して回数を多くしなければならない場合がある。それゆえに、適切な投与を可能にするために、薬剤の組み合わせを含む１種またはそれより多くの投薬形態を含むパッケージ化された医薬品、および、薬剤の組み合わせの一方を含むが、組み合わせの他方の薬剤は含まない１種またはそれより多くの投薬形態を含むパッケージ化された医薬品を提供してもよい。
【００３３】
[0061]薬剤は、１種またはそれより多くの非対称元素、例えばステレオジエン中心またはステレオジエン軸（stereogenic axes）、例えば不斉炭素原子を含んでいてもよく、それによりその化合物は様々な立体異性体で存在することができる。このような化合物としては、例えばラセミ化合物または光学的に活性な形態が挙げられる。２種またはそれより多くの非対称元素を有する化合物の場合、そのような化合物はさらに、ジアステレオ異性体の混合物である可能性もある。不斉中心を有する化合物の場合、当然のことながら、あらゆる光学異性体およびそれらの混合物が包含される。加えて、炭素−炭素二重結合を有する化合物は、Ｚ型およびＥ型で存在する可能性があり、そのような化合物の全ての異性体が本発明に含まれる。このような状況において、単一種のエナンチオマー（光学的に活性な形態）は、不斉合成、光学的に純粋な前駆体からの合成、または、ラセミ化合物の分解から得ることができる。またラセミ化合物の分解は、例えば分解試薬の存在下における結晶化、または、例えばキラルＨＰＬＣカラムを用いたクロマトグラフィーなどの従来の方法によっても達成することができる。
【００３４】
[0062]他の規定または文章による明確な指定が特にない限り、本発明の併用療法において有用な化合物について述べられる場合、化合物の遊離塩基に加えて、その化合物全ての医薬的に許容される塩も包含される。好ましい塩は、塩酸塩である。
【００３５】
[0063]用語「医薬的に許容される塩」は、親化合物の非毒性の酸または塩基付加塩を作製することにより親化合物を改変した、開示された化合物の誘導体を含み、さらに、このような化合物およびこのような塩の水和物などの医薬的に許容される溶媒和物も意味する。医薬的に許容される塩の例としては、これらに限定されないが、例えばアミンなどの塩基性残基の無機または有機酸付加塩；例えばカルボン酸などの酸性残基のアルカリまたは有機付加塩；など、および、前述の塩の１種またはそれより多くを含む組み合わせ、が挙げられる。医薬的に許容される塩としては、例えば非毒性の無機酸または有機酸から形成された親化合物の非毒性塩および第四アンモニウム塩が挙げられる。例えば、非毒性の酸性塩としては、例えば塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸および硝酸などの無機酸から誘導された塩が挙げられ；その他の許容できる無機塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩およびセシウム塩などの金属塩；および、例えばカルシウム塩およびマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；および、前述の塩の１種またはそれより多くを含む組み合わせ、が挙げられる。
【００３６】
[0064]医薬的に許容される有機塩としては、例えば酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、メシル酸、エシル酸、ベシル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタン二スルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸、ＨＯＯＣ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨ（式中ｎは、０〜４である）などの有機酸から製造された塩；有機アミン塩、例えば、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、エタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩；ならびに、アミノ酸性塩、例えばアルギン酸塩、アスパラギン酸塩、および、グルタミン酸塩、および、前述の塩の１種またはそれより多くを含む組み合わせ、が挙げられる。
【００３７】
[0065]物質の組み合わせ（例えばＭＥＫとＲＡＦ阻害剤、または、ＲＡＦとＣＯＴ阻害剤、または、ＲＡＦと、ＭＡＰ３Ｋ８（ＴＰＬ２／ＣＯＴ）、ＲＡＦ１（ＣＲＡＦ）、ＣＲＫＬ（ＣｒｋＬ）、ＦＧＲ（Ｆｇｒ）、ＰＲＫＣＥ（Ｐｒｋｃｅ）、ＰＲＫＣＨ（Ｐｒｋｃｈ）、ＥＲＢＢ２（ＥｒｂＢ２）、ＡＸＬ（Ａｘｌ）、または、ＰＡＫ３（Ｐａｋ３）を標的とする阻害剤）の「有効量」は、このような組み合わせで治療した障害の基準の臨床的に識別可能な徴候および症状からの識別可能な改善を提供するのに十分な量である。
【００３８】
[0066]上記医薬品は、経口投与してもよいし、またはその他の形態で例えば直腸に投与してもよいし、または非経口の注射剤で投与してもよい。「経口用投薬形態」は、経口投与用に処方された、または、経口投与を目的とする１回投与量を含むものを意味する。経口用投薬形態は、例えば単回投与での投与用にパッケージ化されたマイクロカプセルまたはマイクロタブレットのような、複数のサブユニットを含むものでもよいし、または、そうでないものもあり得る。
【００３９】
[0067]上記医薬品は、様々な形態で放出させることができる。「放出しやすい形態」は、瞬間放出、即時放出、制御放出および持続放出性の形態などを意味する。
[0068]「瞬間放出」は、例えば、より迅速に溶解するように活性物質の正常な結晶形を改変することによって、活性物質が急速に溶解するように設計された投薬形態などを意味する。
【００４０】
[0069]「即時放出型」は、例えば、投与後２時間以内に、好ましくは投与後１時間以内に、活性物質の約５０％より多くまたはそれに等しい量、または、より好ましくは活性物質の約７５％の量が放出される、従来の形態または非放出調節形態などを意味する。
【００４１】
[0070]「持続放出性」または「徐放性」は、定常状態で投与した後、少なくとも約８時間、好ましくは少なくとも約１２時間、より好ましくは約２４時間、血中（例えば血漿）濃度が治療効果のある範囲内に、ただし毒性レベルより低く維持されるような速度で活性物質が放出されることを含む。用語「定常状態」は、所定の活性物質または活性物質の組み合わせの血漿濃度に到達させ、それを、その後の活性物質の投与によって、所定の活性物質の有効な治療的に有効な最低限のレベルよりも高く、かつ、所定の活性物質が毒性を示す最低限の血漿濃度よりも低いレベルに維持することを意味する。
【００４２】
[0071]用語「〜を治療する」、「治療した」、「〜を治療すること」または「治療」は、本明細書において、被験者において病気の症状の少なくとも１つを軽減する、減少させる、または緩和することを意味するものとして用いられる。例えば、治療は、疾患の１種または数種の症状の減少のこともあるし、または、疾患（例えば癌など）の完全な根絶のこともある。本発明の趣旨の範囲内で、用語「〜を治療する」はまた、発病を止めること、発病を遅延させること（すなわち、病気の臨床症状が現れる前の期間を遅延させること）、および／または、病気を進行または悪化させる危険を減少させることも意味する。用語「予防する」は、本明細書において、被験者において病気の進行または持続または悪化を、必要に応じて予防する、遅延させる、または、治療する、または、これらの全てを意味するものとして用いられる。本発明の趣旨の範囲内で、病気は、癌に関連するものである。
【００４３】
[0072]用語「被験者」または「患者」は、例えば、癌または直接的または間接的に癌に関連するあらゆる疾患に罹っている、またはそれらに苦しむ動物を意味することとする。被験者の例としては、哺乳動物、例えば、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット、および、ヒト以外のトランスジェニック動物が挙げられる。ある種の実施態様において、被験者はヒトであり、例えば、癌に罹っている、癌に罹る危険性がある、または、癌に罹っている可能性のあるヒトである。
【００４４】
[0073]用語「約」または「およそ」は通常、示された値または範囲の２０％以内、より好ましくは１０％以内、および、最も好ましくは５％以内を意味する。あるいは、特に生物系において、用語「約」は、ほぼ対数（すなわち、一桁の規模）の範囲内を意味し、好ましくは、示された値の２倍以内を意味する。
【００４５】
[0074]本発明を説明する文脈における（特に以下の請求項に関する）用語「a」および「an」および「the」、ならびに類似の指示語の使用は、本明細書において特に他の指定がない限り、または文脈から明らかに矛盾していない限り、単数形と複数形の両方を包含するものと解釈される。用語「〜を含む」、「〜を有する」、「〜が挙げられる」、および「〜を含む」は、特に他の規定がない限りオープンエンドの（すなわち「これらに限定されないが、〜が挙げられる」を意味する）用語と解釈される。本明細書における値の範囲の詳述は、本明細書において特に他の指定がない限り、その範囲内に含まれる別々の値それぞれを個々に述べるための簡略的な表現方法として利用されているだけであって、別々の値はそれぞれ、本明細書において個々に列挙されたのものとして明細書に包含される。
【００４６】
[0075]上記で述べたように、一形態において、本発明は、被験者において、癌の症状の少なくとも１つを治療する、それらの発症を予防する、止める、遅延させる、および／または、それらの症状を進行または悪化させる危険を減少するのに有用な複合薬を提供し、本発明は、被験者に、有効量のＲＡＦ阻害剤と有効量のＭＡＰ３Ｋ８（ＴＰＬ２／ＣＯＴ）阻害剤、または、有効量のＲＡＦ阻害剤と有効量のＭＥＫ阻害剤、または、有効量のＲＡＦ阻害剤と、ＭＡＰ３Ｋ８（ＴＰＬ２／ＣＯＴ）、ＲＡＦ１（ＣＲＡＦ）、ＣＲＫＬ（ＣｒｋＬ）、ＦＧＲ（Ｆｇｒ）、ＰＲＫＣＥ（Ｐｒｋｃｅ）、ＰＲＫＣＨ（Ｐｒｋｃｈ）、ＥＲＢＢ２（ＥｒｂＢ２）、ＡＸＬ（Ａｘｌ）、または、ＰＡＫ３（Ｐａｋ３）を標的とする有効量の第二の阻害剤を含む併用療法剤を投与することを含む。好ましくは、これらの阻害剤は、組み合わされた場合に有益な作用を提供するような治療上有効な投与量で投与される。これらの投与は、同時でもよいし、または連続でもよい。
【００４７】
[0076]用語「癌」は、本明細書において、あらゆる固形腫瘍および血液学的な悪性疾患などを含む様々な腫瘍を意味するものとして用いられる。このような腫瘍の例としては、これらに限定されないが、白血病、リンパ腫、骨髄腫、癌腫、転移性癌、肉腫、腺腫、神経系癌、および、尿生殖器癌が挙げられる。代表的な実施態様において、前述の方法は、成人および小児の急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連の癌、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨肉腫、線維性組織球腫、脳腫瘍、脳幹グリオーマ、小脳星状細胞腫、悪性神経膠腫、脳室上皮腫、髄芽細胞腫、テント上原始神経外胚葉腫瘍、視床下部膠腫、乳癌、男性乳癌、気管支腺腫、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、原発不明癌、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、悪性神経膠腫、子宮頚癌、小児癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮内膜癌、脳室上皮腫、食道癌、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝臓外胆管癌、眼内黒色腫、網膜芽腫、胆嚢癌、胃癌、消化管間質腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性腫瘍、神経膠腫、ヘアリーセル白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部および視覚路の神経膠腫、眼内黒色腫、島細胞腫、カポジ肉腫、腎臓癌、腎細胞癌、喉頭癌、口唇および口腔癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、中枢神経系原発リンパ腫、ワルデンストレームのマクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫、髄芽細胞腫、黒色腫、メルケル細胞癌、悪性中皮腫、頸部扁平上皮癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、慢性骨髄増殖性疾患、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔咽頭癌、卵巣癌、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体芽細胞腫およびテント上原始神経外胚葉腫瘍、下垂体癌、形質細胞腫、胸膜肺芽腫、前立腺癌、直腸癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、軟部組織肉腫、子宮肉腫、セザール症候群、非黒色腫皮膚癌、小腸癌、扁平上皮癌、頸部扁平上皮癌、テント上原始神経外胚葉腫瘍、睾丸癌、咽喉癌、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺癌、移行細胞癌、絨毛性腫瘍、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、および、ウィルムス腫瘍の治療において有用である。
【００４８】
[0077]具体的には、癌は、Ｂ−ＲＡＦ遺伝子における突然変異に関連する癌である。このような癌としては、黒色腫、乳癌、結腸直腸癌、神経膠腫、肺癌、卵巣癌、肉腫、および、甲状腺癌が挙げられる。
【００４９】
[0078]具体的な実施態様において、本明細書で示される治療的組み合わせは、被験者における中度から重度の癌の治療に効果的である。
[0079]投与量
[0080]癌治療のための薬剤の組み合わせの最適な用量は、既知の方法を用いて被験者ごとに経験的に決定することができ、このような用量は、例えば薬剤の活性；被験者の年齢、体重、全体的な健康状態、性別および食物；投与時間および経路；および被験者が受けているその他の薬物療法などの様々な要素によって様々であると予想される。当業界でよく知られた慣例的な試験および手順を用いて最適な投与量を確立してもよい。
【００５０】
[0081]単一の投薬形態を生産するためのキャリアー材料と組み合わせることができる薬剤の組み合わせの量は、治療を受ける個体と具体的な投与様式に応じて様々であると予想される。いくつかの実施態様において、本明細書で説明されているような薬剤の組み合わせを含む１回投与量は、組み合わせに含まれる各薬剤が一般的に単独で投与される場合に投与される量を含むと予想される。
【００５１】
[0082]当業界において通常の技術を有する医師または獣医師であれば、必要な医薬組成物の有効量を容易に決定して処方することができる。例えば、医師または獣医師は、医薬組成物中に用いられる本発明の化合物の用量を望ましい治療効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルで開始し、望ましい作用が達成されるまで次第に用量を増加させてもよい。
【００５２】
[0083]本発明の化合物の適切な１日用量は、一般的に、治療効果を生じさせるのに有効な最も低い用量に相当する化合物の量と予想される。このような有効量は、一般的に上述の要素によって様々であり、当業界において能力を有する者によって容易に決定されると予想される。
【００５３】
[0084]一般的に、本発明の化合物の患者の治療上有効な用量、は、指定された鎮静作用を目的として用いられる場合、約０．０００１〜約１０００ｍｇ／キログラム（体重）／日、より好ましくは約０．０１〜約５０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲と予想される。
【００５４】
[0085]必要に応じて、活性化合物の有効な１日用量の投与は、２回分、３回分、４回分、５回分、６回分またはそれより多くの用量に分けて別々に投与してもよく、これは、一日あたり適切なインターバルで、任意に１回投与量でなされてもよい。
【００５５】
[0086]医薬製剤および投与経路
[0087]本発明において、癌（例えば黒色腫）を治療するための物質の組み合わせを含む医薬製剤が提供される。本医薬製剤はさらに、キャリアーもしくは賦形剤、安定剤、矯味矯臭剤および／または着色剤を含んでいてもよい。
【００５６】
[0088]本発明において、薬剤の組み合わせを含む医薬製剤が提供され、このような組み合わせは、例えば、以下の２タイプの薬剤：（１）ＲＡＦ阻害剤、および／または、ＲＡＦ阻害剤の薬理学的に活性な代謝産物、塩、溶媒和物およびラセミ化合物と、（２）ＭＡＰ３Ｋ８（ＴＰＬ２／ＣＯＴ）阻害剤、および／または、ＣＯＴ阻害剤の薬理学的に活性な代謝産物、塩、溶媒和物およびラセミ化合物との組み合わせであってもよい。その他の実施態様において、薬剤の組み合わせは、ＢＲＡＦ突然変異細胞を含む、または、ＭＡＰ３Ｋ８（ＴＰＬ２／ＣＯＴ）を過剰発現する細胞を含む被験者に提供することができ、ここで上記組み合わせは、（１）ＲＡＦ阻害剤、および／または、ＲＡＦ阻害剤の薬理学的に活性な代謝産物、塩、溶媒和物およびラセミ化合物と、（２）ＭＥＫ阻害剤、および／または、ＭＥＫ阻害剤の薬理学的に活性な代謝産物、塩、溶媒和物およびラセミ化合物とを含む。
【００５７】
[0089]薬剤の組み合わせは、当業者によく知られた様々な投与経路を用いて投与してもよい。薬剤の組み合わせは、ヒトおよびその他の動物に、要求に応じて従来の非毒性の医薬的に許容されるキャリアー、アジュバントおよび基材を含む投与単位の製剤で、経口的に、非経口的に、舌下に、エアロゾルまたは吸入スプレーによって、直腸に、嚢内に、膣内に、腹腔内に、頬内に、または、局所的に投与してもよい。また局所投与は、例えば経皮パッチまたはイオン泳動装置などの経皮投与の使用を含む場合もある。本明細書で用いられる非経口という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射または点滴技術を含む。
【００５８】
[0090]製剤化の方法は当業界公知であり、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, マック・パブリッシング社(Mack Publishing Company), ペンシルバニア州イーストン, 第１９版(１９９５)で開示されている。本発明で使用するのに適した医薬組成物は、滅菌された非発熱性の溶液または懸濁液、コーティングカプセル、坐剤、凍結乾燥粉末、経皮パッチの形態であってもよいし、または当業界でよく知られているその他の形態であてもよい。
【００５９】
[0091]注射製剤、例えば滅菌された注射可能な水性または油性懸濁液は、よく知られた技術に従って適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用いて配合することもできる。また滅菌注射製剤は、非毒性の非経口的に許容できる希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液、懸濁液またはエマルジョンであってもよく、例えば１，３プロパンジオールまたは１，３ブタンジオールの溶液である。使用が可能な許容できる基材および溶媒のなかでも特に、水、リンゲル液、米国薬局方グレードの等張塩化ナトリウム溶液が挙げられる。加えて、滅菌された不揮発性油も溶媒または懸濁媒として一般的に用いられる。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドなどのあらゆる低刺激性の不揮発性油を用いることができる。加えて、例えばオレイン酸のような脂肪酸も注射製剤の製造において使用される。注射製剤は、例えば細菌を捕獲するフィルターによるろ過によって滅菌してもよいし、または、使用前に滅菌水またはその他の滅菌された注射用媒体に溶解または分散させることができる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を取り入れることによって滅菌してもよい。
【００６０】
[0092]薬物の作用を延長させるために、しばしば皮下または筋肉内注射からの薬物の吸収を遅らせることが望ましい。これは、水溶性が低い結晶質または無定形材料の液状の懸濁液の使用によって達成される場合もある。続いて薬物の吸収速度はその溶解速度に依存しており、この溶解速度は、結晶サイズと結晶性形状に依存する場合がある。あるいは、非経口投与された薬物製剤の遅延吸収は、薬物を油性基剤に溶解または懸濁することによって達成される場合がある。注射用のデポー剤は、ポリラクチドポリグリコリドのような生分解性ポリマー中に薬物をマイクロカプセル化できるマトリックスを形成することによって製造することもできる。薬物とポリマーとの比率と用いられる具体的なポリマーの性質に応じて、薬物の放出速度を制御することができる。その他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）、および、ポリ（無水物）が挙げられる。また注射用のデポー剤は、体の組織に適合するリポソームまたはマイクロエマルジョン中に薬物を取り込むことによっても製造が可能である。
【００６１】
[0093]直腸または膣内投与のための組成物は、好ましくは坐剤であり、これは、本発明の化合物を、周囲温度で固体だが体温で液状になるため、直腸または膣内で溶融し活性化合物を放出する適切な刺激の少ない賦形剤またはキャリアー、例えばカカオバター、ポリエチレングリコール、または、坐剤用ワックスと混合することによって製造することができる。
【００６２】
[0094]経口投与のための固形の投薬形態としては、カプセル、錠剤、丸剤、粉末、および、顆粒が挙げられる。このような固形の投薬形態において、活性化合物は、少なくとも１種の不活性な医薬的に許容される賦形剤またはキャリアー、例えばクエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム、および／または、ａ）充填剤または増量剤、例えばスターチ、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および、ケイ酸、ｂ）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、および、アカシア、ｃ）潤滑剤、例えばグリセロール、ｄ）崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、ポテトスターチまたはタピオカスターチ、アルギン酸、ある種のケイ酸塩、および、炭酸ナトリウム、ｅ）溶解遅延剤、例えばパラフィン、ｆ）吸収促進剤、例えば第四級アンモニウム化合物、ｇ）湿潤剤、例えばアセチルアルコール、および、モノステアリン酸グリセロール、ｈ）吸収剤、例えばカオリン、および、ベントナイト粘土、および、ｉ）潤滑剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、および、それらの混合物と混合される。カプセル、錠剤および丸剤の場合、その投薬形態は緩衝剤を含んでいてもよい。
【００６３】
[0095]また似たようなタイプの固体組成物が、ラクトースまたは乳糖、加えて高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤を用いたソフトおよびハード充填ゼラチンカプセル中の充填物としても使用できる。
【００６４】
[0096]錠剤、糖衣錠、カプセル、丸剤および顆粒の固形の投薬形態は、コーティングおよびシェル、例えば腸溶コーティングや、医薬製剤の製造分野においてよく知られているその他のコーティングを用いて製造することができる。このような投薬形態は、任意に不透明化剤を含んでいてもよく、さらに、任意に遅延するような様式で、活性成分のみを放出させる、または、腸管の特定の部分に選択的に放出させる組成物に含まれていてもよい。用いられる可能性がある埋め込み式の組成物の例としては、高分子物質およびワックスが挙げられる。
【００６５】
[0097]活性化合物は、１種またはそれより多くの上述したような賦形剤でマイクロカプセル化された形態であってもよい。錠剤、糖衣錠、カプセル、丸剤および顆粒の固形の投薬形態は、コーティングおよびシェル、例えば腸溶コーティング、放出制御コーティングや、医薬製剤の製造分野においてよく知られているその他のコーティングを用いて製造することができる。このような固形の投薬形態において、活性化合物は、少なくとも１種の不活性希釈剤、例えばスクロース、ラクトース、または、スターチと混合してもよい。またこのような投薬形態は、通常の実施と同様に、不活性希釈剤以外の追加の物質を含んでいてもよく、このような物質としては、例えば錠剤形成のための潤滑剤、および、その他の錠剤形成を補助する物質、例えばステアリン酸マグネシウム、および、微結晶性セルロースが挙げられる。カプセル、錠剤および丸剤の場合、その投薬形態は緩衝剤を含んでいてもよい。これらは任意に不透明化剤を含んでいてもよく、さらに、任意に遅延するような様式で、活性成分のみを放出させる、または、腸管の特定の部分に選択的に放出させる組成物に含まれていてもよい。用いられる可能性がある埋め込み式の組成物の例としては、高分子物質およびワックスが挙げられる。
【００６６】
[0098]経口投与のための液状の投薬形態としては、医薬的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、および、エリキシルが挙げられる。活性化合物に加えて、液状の投薬形態は、当業界において一般的に使用されている不活性希釈剤を含んでいてもよく、このような不活性希釈剤としては、例えば、水またはその他の溶媒、可溶化剤、および、乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、ＥｔＯＡｃ、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（具体的には、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、および、ゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、および、ソルビタン脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物が挙げられる。経口用組成物はさらに、不活性希釈剤の他にも、アジュバント、例えば湿潤剤、乳化および懸濁化剤、甘味剤、矯味矯臭剤、および、着香料を含んでいてもよい。
【００６７】
[0099]本発明の化合物の局所または経皮投与のための投薬形態としては、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、吸入剤、または、パッチが挙げられる。活性成分は、滅菌条件下で医薬的に許容されるキャリアー、必要に応じてあらゆる保存剤または緩衝液と混合される。また眼用製剤、点耳剤なども本発明の範囲内であると考えられる。
【００６８】
[00100]軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは、本発明の活性化合物に加えて、例えば動物および植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、スターチ、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、および、酸化亜鉛、または、それらの混合物などの賦形剤を含んでいてもよい。
【００６９】
[00101]本発明の組成物はまた、液体エアロゾルまたは吸入用の乾燥粉末として送達するために製剤化することもできる。液体エアロゾル製剤は、大部分が終末細気管支および呼吸細気管支に送達できるような粒度に霧状にされる。
【００７０】
[00102]本発明のエアロゾル化された製剤は、例えばジェット、振動式多孔質プレート、または、超音波ネブライザーのようなエアロゾル形成装置を用いて送達することができ、好ましくは、主として１〜５  ｍの平均質量中央径を有するエアロゾル粒子が形成されるように選択される。さらにこのような製剤は、平衡化された浸透圧モル濃度のイオン強度と塩化物濃度を有することが好ましく、さらに感染部位に有効量の本発明の化合物を送達することができるエアロゾル化可能な体積が最も小さいことが好ましい。加えて、エアロゾル化された製剤は、気道の機能を損なわず、さらに望ましくない副作用を引き起こさないことが好ましい。
【００７１】
[00103]本発明のエアロゾル製剤の投与に適したエアロゾル化装置としては、例えば、本発明の製剤を大部分が１５  ｍからのサイズ範囲のエアロゾルの粒度に霧状にすることができる、ジェット、振動式多孔質プレート、超音波ネブライザー、および、エネルギー供給式の乾燥粉末吸入器が挙げられる。本願において、大部分とは、生成した全エアロゾル粒子の少なくとも７０％、好ましくは９０％より多くが１５  ｍの範囲内であることを意味する。ジェット式ネブライザーは、空気圧によって作動し、溶液をエアロゾルの液滴に細分化することができる。振動式多孔質プレート型ネブライザーは、多孔質プレートを迅速に振動させることによって生成した超音波による吸い出しを利用して、溶媒液滴を多孔質プレートを通過して押し出すように作動する。超音波ネブライザーは、液体を小さいエアロゾル液滴にせん断する圧電結晶によって作動する。様々な適切な装置が利用可能であり、このような装置としては、例えば、エアロネブ（AERONEB）およびエアロドース（AERODOSE）振動式多孔質プレート型ネブライザー（エアロジェン社（AeroGen, Inc.）, カリフォルニア州サニーベール）、サイドストリーム（SIDESTREAM）ネブライザー（メディック・エイド社(Medic Aid Ltd.), イングランドウェストサセックス州）、パリＬＣ（PARI LC）およびパリＬＣスター（PARI LC STAR）ジェット式ネブライザー（PARIレスピレイタリー・イクイップメント社(PARI Respiratory Equipment, Inc.), バージニア州リッチモンド）、および、エアロソニック（AEROSONIC）（デビルビス・メディツィニッシェ・プロデュクテ（ドイツ）社(DeVilbiss Medizinische Produkte (Deutschland) GmbH), ドイツ国ハイデン）、および、ウルトラエア（ULTRAAIRE）（オムロン・ヘルスケア社(Omron Healthcare, Inc.), イリノイ州ヴァーノンヒルズ）超音波ネブライザーが挙げられる。
【００７２】
[00104]また本発明の化合物は、局所用の粉末およびスプレーとして使用するために製剤化することもでき、このような製剤は、本発明の化合物に加えて、賦形剤、例えばラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、および、ポリアミド粉末、または、これらの物質の混合物を含んでいてもよい。スプレーはさらに、一般的な噴射剤、例えばクロロフルオロヒドロカーボンを含んでいてもよい。
【００７３】
[00105]経皮パッチは、体への化合物の制御された送達を提供するというさらなる利点を有する。このような投薬形態は、適切な媒体に化合物を溶解または分配させることによって作製することができる。また吸収促進剤も、化合物の皮膚を通過する流動を高めるために使用することができる。その速度は、速度を制御する膜を提供すること、または、化合物を高分子マトリックスまたはゲル中に分散させることによって制御することができる。さらに本発明の化合物は、リポソームの形態で投与することもできる。当業界でよく知られているように、リポソームは、一般的にはリン脂質またはその他の脂質物質から誘導される。リポソームは、水性媒体中に分散された単層または多層状の水和した液晶によって形成される。リポソームを形成することができるあらゆる非毒性で、生理学的に許容でき、かつ代謝可能な脂質を使用することができる。本発明のリポソームの形態の組成物は、本発明の化合物に加えて、安定剤、保存剤、賦形剤などを含んでいてもよい。好ましい脂質はリン脂質、および、ホスファチジルコリン（レシチン）であり、これらは天然のものでもよいし、および、合成されたものでもよい。リポソームの形成方法は当業界でよく知られている。例えば、Prescott (編集), “Methods in Cell Biology,” 第XIV巻, アカデミック・プレス（Academic Press）, ニューヨーク, １９７６, p. ３３ et seqを参照。
【実施例】
【００７４】
[00106]実施例
[00107]実施例１：ＯＲＦベースの機能的なスクリーニングによるＢ−ＲＡＦ阻害に対する耐性のドライバー(driver)としての特異的なキナーゼの同定
[00108]ＲＡＦ阻害を回避することができるキナーゼを同定するために、注釈がつけられたキナーゼ（センター・フォー・キャンサー・システム・バイオロジー（ＣＣＳＢ）／ブロード・インスティテュート・キナーゼＯＲＦコレクション）の約７５％を代表する５９７種の配列が確認されたキナーゼＯＲＦクローンを構築し、ＲＡＦキナーゼ阻害剤ＰＬＸ４７２０に対して感受性を有するＢ−ＲＡＦＶ６００Ｅ悪性黒色腫細胞株のＡ３７５で安定して発現させた(Tsai, J. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 105, 3041-3046 (2008))（図１ａ、１ｂ、表３、Ｐ．６ｃ）。１μＭのＰＬＸ４７２０で処理したＯＲＦ発現細胞を未処理細胞と比較した生存率に関してスクリーニングし、分析特異的なポジティブコントロール、ＭＥＫ１Ｓ２１８／２２２Ｄ（ＭＥＫ１ＤＤ）に標準化した(Emery, C. M. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 106, 20411-20416 (2009))。(表４および図５にまとめた）。９種のＯＲＦが、平均からの２つの標準偏差を超えるレベルで耐性を付与し（図１ｂおよび表４）、これらを経過観察解析のために選択した（図７）。９種の候補ＯＲＦのうち３種は、受容体チロシンキナーゼであり、このクラスのキナーゼは耐性経路に関与している可能性があることを特徴とする。耐性の効果を確認し、Ｂ−ＲＡＦＶ６００Ｅ細胞株Ａ３７５およびＳＫＭＥＬ２８におけるマルチポイントのＰＬＸ４７２０薬物濃度スケールにわたり優先順位をつけた。両方の細胞株からＳｅｒ／ＴｈｒＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＡＰ３Ｋｓ）ＭＡＰ３Ｋ８（ＣＯＴ／Ｔｐｌ２）およびＲＡＦ１（Ｃ−ＲＡＦ）が上位の候補として出現した；これらのＯＲＦは、生存率に影響を及ぼすことなくＰＬＸ４７２０のＧＩ５０を１０〜６００倍にシフトさせた（表５、ならびに図８および９）。ＣＲＫＬは、ＰＬＸ４７２０のＧＩ５０をそれほどではないにせよシフトさせたＯＲＦであるが（ＳＫＭＥＬ２８細胞において９．７倍；図８）、これは、ＢＣＲ−ＡＢＬのようなチロシンキナーゼによってリン酸化されたアダプタータンパク質をコードしているが(Birge, R.B. et al., Cell Commun Signal 7, 13 (2009))、固有のキナーゼ活性がない。ＣＯＴおよびＣ−ＲＡＦは、複数のＢ−ＲＡＦＶ６００Ｅ細胞株においてＰＬＸ４７２０に対する感受性を減少させており（図１ｃ）、これらのキナーゼのＲＡＦ阻害に対する耐性に介在する能力を立証した。Ａ３７５およびＳＫＭＥＬ２８における二次スクリーニングによって、マルチポイントのＰＬＸ４７２０濃度スケールにわたり上位９種の候補ＯＲＦの順序を決めた（図１ｄ）。
【００７５】
[00109]興味深いことに、上位２種の確認済みのキナーゼはいずれも、様々な状況でＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達を活性化することがわかっているＳｅｒ／ＴｈｒＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＡＰ３Ｋ）である。Ｂ−ＲＡＦと同様に、Ｃ−ＲＡＦは、正規のＭＡＰＫカスケードにおけるＭＡＰ３Ｋであり(McKay, M.M. and Morrison, D.K. Oncogene 26, 3113−3121 (2007))、これは、以前からｐａｎ−ＲＡＦ阻害剤を用いたインビトロでの段階的な選択に伴う耐性に関与してきた(Montagut, C. et al. Cancer Res 68, 4853-4861 (2008))。ＣＯＴ（ヒトＭＡＰ３Ｋ８遺伝子のタンパク質産物）は、ＭＡＰ３Ｋとして最もよく特徴付けられており(Salmeron, A. et al. EMBO J 15, 817−826 (1996))、これは、炎症を起こした細胞におけるＮＦＫＢシグナル伝達下流に存在する(Banerjee, A. et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103, 3274−3279 (2006))；しかしながら、ヒト癌におけるその機能的な重要性はこれまで解明されていなかった。
【００７６】
[00110]実施例２：ＭＡＰＫ経路の活性化によるＢ−ＲＡＦ阻害に対する耐性
[00111]これらの遺伝子の過剰発現がＭＡＰＫ経路を活性化するのに十分かどうかも試験した。ベースライン時に、ＣＯＴ発現は、ＭＥＫ１ＤＤと同様の方法でＥＲＫリン酸化を増加させ、これはＭＡＰキナーゼ経路の活性化と一致する（図２ａおよび１０）。野生型ＣＯＴまたはＣ−ＲＡＦの過剰発現によって、ＰＬＸ４７２０の存在下で構造的なＥＲＫおよびＭＥＫのリン酸化が生じたが、それに対してキナーゼを無効にした誘導体は効果がなかった（図２ａおよび１１）。従って、ＣＯＴおよびＣ−ＲＡＦは、主としてＭＡＰＫシグナル伝達の再活性化によってＲＡＦ阻害に対する耐性を駆動させる。特筆すべきことに、最初のスクリーニングからの９種の候補ＯＲＦのなかでも、部分集合（３）は、ＲＡＦ阻害の後、持続的なＥＲＫ／ＭＥＫリン酸化を示さなかったが、これはＭＡＰＫ経路とは無関係の薬物感受性の変化であることを示唆している（図１２）。
【００７７】
[00112]実施例３：Ｃ−ＲＡＦの活性化およびＢ−ＲＡＦとのヘテロ二量体化
[00113]Ｃ−ＲＡＦの活性化およびＢ−ＲＡＦとのヘテロ二量体化は、Ｂ−ＲＡＦ阻害に対する細胞性反応の重要な構成要素を構成する。Ａ３７５細胞において、内因性Ｃ−ＲＡＦ：Ｂ−ＲＡＦヘテロ二量体は、測定可能であり、かつＰＬＸ４７２０での処理による誘導によって生じる（図１３）。しかしながら、Ｓ３３８における内因性Ｃ−ＲＡＦリン酸化（Ｃ−ＲＡＦ活性化に必要な事象）は低いままであった（図１３）。それに対して、異所性発現されたＣ−ＲＡＦはＳ３３８でリン酸化され（図１３）、そのＰＬＸ４７２０耐性表現型は、持続的なＭＥＫ／ＥＲＫ活性化に付随していた（図２ａおよび１３）。さらに、高活性Ｃ−ＲＡＦトランケーション突然変異体（Ｃ−ＲＡＦ（Ｗ２２）の異所性発現は、ＰＬＸ４７２０耐性およびＥＲＫ活性化の媒介において野生型Ｃ−ＲＡＦよりも高い有効性を示し（図１４）、さらに、Ｃ−ＲＡＦの高い活性がこの薬剤に対する耐性を誘導することも示した。このモデルと一致して、ＮＲＡＳおよびＫＲＡＳの腫瘍形成性の対立遺伝子は、Ａ３７５細胞においてＰＬＸ４７２０耐性を付与し（図２ｂ）、薬物処理によって持続的なＣ−ＲＡＦ（Ｓ３３８）およびＥＲＫリン酸化を起こした（図２ｃ）。従って、Ｃ−ＲＡＦ活性化をもたらす遺伝子変化（例えば腫瘍形成性のＲＡＳ突然変異）は、Ｂ−ＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異とは互いに両立しない傾向があるが、このような共に発生する現象は、後天性のＢ−ＲＡＦ阻害に対する耐性に関して好ましい。
【００７８】
[00114]実施例４：黒色腫におけるＣＯＴ発現の調査
[00115]これまでにＣ−ＲＡＦは黒色腫とＭＡＰＫの経路の依存性と関連しているとされていたが、(Montagut, C. et al. 2008; Karreth, F.A., DeNicola, G.M. et al., 2009; Dumaz, N. et al. Cancer Res 66, 9483−9491 (2006); Hatzivassiliou, G. et al. Nature (2010); Heidorn, S.J. et al., Cell 140, 209-221 (2010); Poulikakos, P.I. et al., Nature (2010))、ＣＯＴはいまだ黒色腫関連キナーゼであるとは説明されていない。
【００７９】
[00116]黒色腫におけるＣＯＴの役割を調査し、そのヒトメラニン細胞における発現を試験した。不死化一次メラニン細胞（Ｂ−ＲＡＦ野生型）はＣＯＴを発現したが（図２ｄ）、異所性Ｂ−ＲＡＦＶ６００Ｅ発現はＣＯＴのｍＲＮＡレベルを減少させ（図１５）、ＣＯＴタンパク質を検出不可能にした（図２ｄ）。逆に言えば、Ａ３７５細胞で異所性発現されたＣＯＴだけが弱くしか検出できなかったことに対して（図２ａ、２ｅ）、内因性Ｂ−ＲＡＦＶ６００ＥのｓｈＲＮＡ介在欠損は、Ｂ−ＲＡＦノックダウンの程度と相関するＣＯＴタンパク質レベルの増加を引き起こした（図２ｅ）。さらに、ＣＯＴを発現するＡ３７５細胞をＰＬＸ４７２０で処理したところ、ＣＯＴタンパク質の用量依存性の増加が起こり（図２ａ）異所性ＣＯＴのｍＲＮＡレベルに影響は及ばなかった（図１５）。腫瘍形成性のＢ−ＲＡＦは、主にタンパク質安定性を変化させることによってＣＯＴ発現を相殺し（図２ａ、ｄ、ｅおよび１５）、Ｂ−ＲＡＦ阻害は、処理中にＣＯＴを発現する細胞の成長を促進する。特筆すべきことに、Ｃ−ＲＡＦもＢ−ＲＡＦも、単独でも組み合わせでも、ＰＬＸ４７２０の存在下でさえもＣＯＴ発現に付随するＥＲＫリン酸化に必要ではない（図２ｅ、２ｆおよび図１６）。示した通り、ＣＯＴ発現は、ＲＡＦとは無関係の方式でＭＡＰキナーゼ経路の活性化を誘導するのに十分である。
【００８０】
[00117]実施例５：ＣＯＴ発現は、癌細胞株においてＢ−ＲＡＦ阻害に対する耐性を予想する
[00118] Ｂ−ＲＡＦＶ６００Ｅバックグラウンドにおいて高いＣＯＴを発現する細胞株がＰＬＸ４７２０処理に対する新規の耐性を示すかどうかを試験した。このような例を同定するために、細胞株のパネルを、Ｂ−ＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異に付随するＭＡＰ３Ｋ８／ＣＯＴコピー数増加の証拠に関してスクリーニングした。コピー数の解析と突然変異プロファイリングを受けた５３４種の細胞株のうち、３８種の細胞株（７．１％）にＢ−ＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異が含まれていた。このサブグループ内で、２種の細胞株、ＯＵＭＳ−２３（結腸癌）およびＲＰＭＩ−７９５１（黒色腫）はさらにＭＡＰ３Ｋ８／ＣＯＴ遺伝子座を範囲に含む染色体のコピー数増加の証拠（図３ａおよび１７）と強いＣＯＴタンパク質発現（図３ｂおよび１８）も示した。さらに短時間で培養された黒色腫のパネルもＣＯＴタンパク質発現に関してスクリーニングした。これらの細胞株のうち１種（Ｍ３０７、最初の病気が安定化した後にアロステリックＭＥＫ阻害に対する耐性を発生させたＢ−ＲＡＦＶ６００Ｅ腫瘍から誘導された短時間の培養物）がＣＯＴを発現した（図３ｃ）。３種全ての細胞株がＰＬＸ４７２０処理に対して反応がなく、８〜１０μＭの範囲のＧＩ５０値を示し（図３ｄ）、さらにＢ−ＲＡＦ阻害に際して持続的なＥＲＫリン酸化を示す（図３ｅ、３ｆ）。ＯＵＭＳ−２３およびＲＰＭＩ−７９５１は、ＭＡＰＫ経路阻害剤に感受性のある細胞株である；従って、これらの結果は、ＣＯＴは、ＲＡＦ阻害に対する新規の耐性を付与すること（Ｂ−ＲＡＦＶ６００Ｅ黒色腫の約１０％で観察された現象）を実証するものである。
【００８１】
[00119]実施例６：ＲＡＦ阻害剤で治療した患者におけるＣＯＴ発現
[00120]転移性のＢ−ＲＡＦＶ６００Ｅ黒色腫を有する３人の患者から生検材料を得ることによって臨床的なＲＡＦ阻害剤ＰＬＸ４０３２に対する耐性に関するＣＯＴ発現を試験した。いずれのケースも、処理前および処理中（「前処理」および「処理中」；図３ｇ、表６）に採取した病巣を適合させた凍結生検材料からなり；加えて、１つのサンプルは、同じ再発した腫瘍部位（「再発後」；図３ｇ）からの２種の独立した生検試料を含む。上記で示した実験モデルと一致して、定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ／ＰＣＲ）解析から、３つのケースのうち２つにおいて、ＰＬＸ４０３２処理と同時にＣＯＴのｍＲＮＡ発現が増加したことが解明された。再発性の標本において、その前処理および処理中の同等な比較対象と比べてＣＯＴのｍＲＮＡレベルはさらに増加した（図３ｇ、患者番号１）。追加の再発性悪性黒色腫の生検（適合なし）は、ＲＡＦ阻害剤耐性のＣＯＴ増幅細胞株で観察されたレベルと同等の高いＣＯＴのｍＲＮＡ発現を示した（図１９）。この標本も、加えて適合させた正常な皮膚、または、Ｂ−ＲＡＦＶ６００Ｅ細胞株に比べて、強いＭＡＰＫ経路活性化、高いＢ−ＲＡＦ、Ｃ−ＲＡＦおよびＣＯＴ発現を示した（図１９）。この腫瘍の配列解析研究から、ＢＲＡＦ、ＮＲＡＳ、または、ＫＲＡＳに追加の突然変異は存在しないことが解明された（データ示さず）。これらの解析によって、ＰＬＸ４０３２耐性悪性黒色腫においてＣＯＴ依存性メカニズムが作用しているという臨床的な証拠が示された。
【００８２】
[00121]実施例７：ＭＥＫ／ＥＲＫリン酸化のＣＯＴ調節
[00122]自然に高いＣＯＴ発現を示すＢ−ＲＡＦＶ６００Ｅ細胞においてＣＯＴが活発にＭＥＫ／ＥＲＫリン酸化を調節するかどうかを、ＲＰＭＩ−７９５１細胞にＣＯＴを標的とするｓｈＲＮＡコンストラクトを導入することによって試験した。ＣＯＴ欠損によってＲＰＭＩ−７９５１の生存率が低下し（図２０）、ＥＲＫリン酸化が減少した（図３ｈ）；従って、ＣＯＴキナーゼ活性を標的化することによって、ＣＯＴ過剰発現または増幅を示す癌細胞においてＭＥＫ／ＥＲＫリン酸化が抑制される。加えて、Ｂ−ＲＡＦ阻害剤（ＰＬＸ４７２０）の存在下でＣＯＴキナーゼ活性を標的化することによって、ＭＥＫ／ＩＲＫリン酸化が抑制される（図３ｈ）。低分子物質ＣＯＴキナーゼ阻害剤（ワイス，アボット（Wyeth, Abbot）化合物番号９５４９３００）でのＲＰＭＩ−７９５１細胞の処理によって(George, D. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18, 4952-4955 (2008); Hirata, K. et al., Biol. Pharm. Bull. 33, 133-137 (2010); Lee, K. M. et al., Cancer Res. 69, 8043-8049 (2009))、用量依存性のＭＥＫおよびＥＲＫリン酸化の抑制が起こり、これは、これらの細胞においてＣＯＴがＭＥＫ／ＥＲＫ活性化に寄与することを示す追加の証拠となる（図３ｉ）。
【００８３】
[00123]実施例８：ＣＯＴを発現するＢ−ＲＡＦＶ６００Ｅ細胞株は、アロステリックＭＥＫ阻害剤に対する耐性を示す
[00124]ＣＯＴを発現する癌細胞が標的のＣＯＴまたはＲＡＦ下流においてＭＡＰＫ経路阻害に対する感受性を有したままかどうかを解析した。ＯＵＭＳ−２３およびＲＰＭＩ−７９５１細胞株をＭＥＫ１／２阻害剤ＣＩ−１０４０に対する感受性について調べた。いずれの細胞株もＭＥＫ阻害に対する反応を示さず（図４ａ）、１μＭのＣＩ−１０４０の存在かでも持続的なＥＲＫリン酸化を示した（図４ｂ）。またＡ３７５およびＳＫＭＥＬ２８細胞における異所性ＣＯＴ発現もＭＥＫ阻害剤ＣＩ−１０４０およびＡＺＤ６２４４に対する感受性が減少しており、これは、この表現型を誘導するのにＣＯＴ発現単独で十分であることを示唆している（図４ｃ、４ｄおよび２１）。薬理学的なＭＥＫ阻害剤で観察された結果と同様に、Ａ３７５細胞において、ＭＥＫ１／２ノックダウンによりＣＯＴ介在ＥＲＫリン酸化がほんのわずかに抑制された（図２２）。これらのデータから、ＣＯＴは、ＭＥＫとは独立したメカニズムとＭＥＫ依存性のメカニズムとを介してＥＲＫを活性化することが実証された。さらに、組換えＣＯＴおよびＥＲＫ１を用いたインビトロでのキナーゼ分析を行ったところ、組換えＣＯＴはインビトロでＥＲＫ１のｐＴｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４リン酸化を誘導することが実証された（図２２）。従って、ＣＯＴ発現は、ＭＥＫとは独立した方式でＥＲＫ活性化の効能を高める。
【００８４】
[00125]実施例９：細胞増殖を抑制するためのコンビナトリアルＭＡＰＫ経路阻害
[00126]図２３で示されるように、ＲＡＦおよびＭＥＫ阻害剤の併用は、単一の薬剤に対する耐性を無効にする可能性がある。組み合わされたＲＡＦ／ＭＥＫ阻害がＣＯＴによって生じる耐性を回避するかどうかを試験した。異所性ＣＯＴ発現の設定で、併用されたＡＺＤ６２４４またはＣＩ−１０４０とＰＬＸ４７０（それぞれ１μＭ）に曝露したところ、単一の薬剤ＰＬＸ４７２０を用いた場合よりも効果的に細胞増殖およびｐＥＲＫ発現が減少し、これは１０μＭの濃度でさえも同様であった（図４ｅ、４ｆおよび２３）。これらのデータから、Ｂ−ＲＡＦＶ６００Ｅ腫瘍細胞におけるこの経路の重要性が認められ、さらに、二重のＢ−ＲＡＦ／ＭＥＫ阻害はＲＡＦ阻害剤に対する耐性を回避するのに役立つことが実証された。
【００８５】
[00127]方法
[00128]センター・フォー・キャンサー・システム・バイオロジー（ＣＣＳＢ）／ブロード・インスティテュート・キナーゼ・オープンリーディングフレーム・コレクション
[00129]ｐＤＯＮＲ−２２３エントリーベクター（インビトロジェン（Invitrogen））中の５９７種のキナーゼＯＲＦのライブラリーを構築した。個々のクローンの末端を両方向のベクター特異的なプライマーを用いて配列解析した。報告されている配列から実質的に異なっている配列を有するクローンを除外した。エントリークローンおよび配列はアドジェン（Addgene）（http://www.addgene.org/human_kinases）から入手した。複数の源からキナーゼＯＲＦをから構築した；ＯＲＦｅｏｍｅ５．１コレクション（http://horfdb.dfci.harvard.edu）から、３３７種のキナーゼを単一のクローンとして単離し、正常なヒト組織のＲＮＡ（アンビオン（Ambion））から逆転写とそれに続くＰＣＲ増幅によりゲートウェイ（Gateway）配列（インビトロジェン）を付加することによって、１８３種のキナーゼをクローニングし、ハーバード・インスティテュート・オブ・プロテオミクス（HarvardInstituteof Proteomics ; HIP）によって提供されるテンプレートから６４種のキナーゼをクローニングし、さらに、１３種のキナーゼを、共同研究している研究所から得られたテンプレートからのゲートウェイシステムにクローニングした。ｐＬＫＯ．１主鎖からゲートウェイ適合性レンチウイルスベクターｐＬＸ−Ｂｌａｓｔ−Ｖ５を作製した。製造元（インビトロジェン）のプロトコールに従って、ＬＲクロナーゼを用いた酵素的組換え反応を行い、５９７種のキナーゼをｐＬＸ−Ｂｌａｓｔ−Ｖ５に導入した。
【００８６】
[00130]ハイスループットのＯＲＦスクリーニング
[00131]３８４ウェルのマイクロタイタープレート（ウェルあたり５００細胞）でＡ３７５黒色腫細胞を平板培養した。次の日、細胞を８μｇ／ｍｌポリブレンの存在下でレンチウイルスによってパッケージ化されたキナーゼＯＲＦライブラリーにスピン感染させた。感染の４８時間後、培地を、標準増殖培地（２連）、１μＭのＰＬＸ４７２０を含む培地（２連、２タイムポイント）、または、１０μｇ／ｍｌブラスチシジンを含む媒体（２連）で交換した。４日後および６日後、セルタイター−Ｇｌｏ（プロメガ（Promega））を用いて製造元の説明書に従って細胞増殖を分析した。全ての実験を２回行った。
【００８７】
[00132]候補の耐性ＯＲＦの同定
［00133］測定したままの発光値をマイクロソフトエクセルにインポートした。ブラスチシジン選択細胞において２連で得られた結果を平均した測定したままの発光値の選択されていない細胞に対するパーセンテージを得ることによって感染効率を決定した。０．７０より低い感染効率を有するＯＲＦを次の解析から除外し、同時に２連の結果間に１５，０００よりも大きい測定したままの発光単位の標準偏差を有する全てのＯＲＦも除外した。発現が増殖に影響を与えるＯＲＦを同定するために、我々は個々のＯＲＦの２連の結果を平均した測定したままの発光値を、全てのコントロール処理細胞の平均および標準偏差とｚ−スコアまたは標準スコア（以下に示す）によって比較した：
【００８８】
【数１】
0005985401.tif 000005
【００８９】
式中、ｘ＝所定のＯＲＦの平均の測定したままの発光値、μ＝全てのＯＲＦの平均の測定したままの発光値、および、σ＝全てのウェルの測定したままの発光値の標準偏差である。ｚ−スコア＞＋２または＜−２のあらゆるＯＲＦはそれぞれ増殖に影響を及ぼすものと注釈をつけ、最終的な解析から除外した。増殖の差を、ＰＬＸ４７２０（１μＭ）処理細胞における２連の結果を平均した測定したままの発光値を未処理細胞と比較したパーセンテージによって決定した。その後、増殖の差を、ＰＬＸ４７２０耐性、ＭＥＫ１Ｓ２１８／２２２Ｄ（ＭＥＫ１ＤＤ）についてポジティブコントロールに標準化した（ＭＥＫ１ＤＤの増殖の差は１．０であった）。それぞれ個々のＯＲＦのＭＥＫ１ＤＤで標準化した増殖の差を、２連の実験で、各実験ごとに２つのタイムポイントを設けて（４日目および６日目）平均化した。続いて、平均のＭＥＫ１ＤＤで標準化した増殖の差について上述したようにしてｚ−スコアを作製した。＞２より大きいｚ−スコアを有するＯＲＦをヒットとみなし、続く二次スクリーニングで追加実験した。
【００９０】
[00134]ＯＲＦおよびｓｈＲＮＡ発現
[00135]ｐＬＸ−Ｂｌａｓｔ−Ｖ５（レンチウイルス由来）、または、ｐＷＺＬ−Ｂｌａｓｔ、ｐＢＡＢＥ−Ｐｕｒｏ、または、ｐＢＡＢＥ−ゼオシン（レトロウイルス由来）発現プラスミドからＯＲＦを発現させた。レンチウイルス導入のために、２９３Ｔ細胞を１μｇのｐＬＸ−Ｂｌａｓｔ−Ｖ５−ＯＲＦ、または、ｐＬＫＯ．１−ｓｈＲＮＡ、９００ｎｇΔ８．９（ｇａｇ、ｐｏｌ）、および、１００ｎｇのＶＳＶ−Ｇで６μｌのフージーン（Ｆｕｇｅｎｅ）６トランスフェクション試薬（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を用いてトランスフェクションした。トランスフェクションから７２時間後にウイルス上清を回収した。６ウェルプレート中で、５μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で、哺乳動物細胞に１：１０〜１：２０希釈でウイルスを感染させ、３７℃、２２５０ＲＰＭで１時間遠心分離した。感染の２４時間後、ブラスチシジン（ｐＬＸ−Ｂｌａｓｔ−Ｖ５、１０μｇ／ｍｌ）、または、ピューロマイシン（ｐＬＫＯ．１、０．７５μｇ／ｍｌ）を添加し、細胞を４８時間選択した。レトロウイルス生産のために、２９３Ｔを上述のようにして１μｇのレトロウイルス由来プラスミド−ＯＲＦ、１μｇのｐＣＬ−ＡＭＰＨＯ、および、１００ｎｇのＶＳＶ−Ｇでトランスフェクションした。５μｇ／ｍｌポリブレン中で、細胞をレトロウイルスを含む上清で１：２希釈で一晩感染させ、続いて培地を増殖培地に交換した。感染をもう一度繰り返し（合計２回）、続いて上述のように選択した。
【００９１】
[00136]二次スクリーニング
[00137]Ａ３７５（１．５×１０３）およびＳＫＭＥＬ２８細胞（３×１０３）を９６ウェルプレートに植え付け１８時間そのままにした。８μｇ／ｍｌポリブレンの存在下でＯＲＦを発現するレンチウイルスを１：１０希釈で添加し、２２５０ＲＰＭ、３７℃で１時間遠心分離した。遠心分離後、ウイルスを含む培地を通常の増殖培地に交換し、そのまま１８時間インキュベートした。感染の２４時間後、ＤＭＳＯ（１：１０００）、または、１０×ＰＬＸ４７２０（ＤＭＳＯ溶液）を最終濃度１００、１０、１、０．１、０．０１、０．００１、０．０００１、または、０．００００１μＭになるように添加した。ＰＬＸ４７２０添加の４日後、ＷＳＴ−１（ロシュ）を製造元の推奨に従って用いて細胞生存率を分析した。
【００９２】
[00138]細胞株および試薬
[00139]Ａ３７５、ＳＫＭＥＬ２８、ＳＫＭＥＬ３０、ＣＯＬＯ−６７９、ＷＭ４５１ｌｕ、ＳＫＭＥＬ５、Ｍａｌｍｅ３Ｍ、ＳＫＭＥＬ３０、ＷＭ３６２７、ＷＭ１９７６、ＷＭ３１６３、ＷＭ３１３０、ＷＭ３６２９、ＷＭ３４５３、ＷＭ３６８２およびＷＭ３７０２を全てＲＰＭＩ（セルグロ（Cellgro））、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン中で増殖させた。Ｍ３０７を１ｍＭのピルビン酸ナトリウムが補充されたＲＰＭＩ（セルグロ）、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン中で増殖させた。２９３ＴおよびＯＵＭＳ−２３を、ＤＭＥＭ（セルグロ）、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン中で増殖させた。ＲＰＭＩ−７９５１細胞（ＡＴＣＣ）を、ＭＥＭ（セルグロ）、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン中で増殖させた。野生型初代メラニン細胞を、ＨＡＭ−Ｆ１０（セルグロ）、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン中で増殖させた。Ｂ−ＲＡＦＶ６００Ｅを発現する初代メラニン細胞を、ＴＩＶＡ培地［ＨＡＭ−Ｆ−１０（セルグロ）、７％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミン（セルグロ）、１００ｕＭＩＢＭＸ、５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡ、１ｍＭのｄｂｃＡＭＰ（シグマ（Sigma））および１μＭバナジン酸ナトリウム］中で増殖させた。ＣＩ−１０４０（PubChem番号：６９１８４５４）を、シャンハイ・レッチェン・インターナショナル・トレーディング社（Shanghai Lechen International Trading Co.）から購入し、ＡＺＤ６２４４（PubChem番号：１０１２７６２２）を、セレック・ケミカルズ（Selleck Chemicals）から購入し、ＰＬＸ４７２０（PubChem番号：２４１８０７１９）を、シマンシス（Symansis）から購入した。ＲＡＦ２６５（PubChem番号：１１６５６５１８）は、ノバルティス・ファーマ社（Novartis Pharma AG）より寛大にも提供頂いた。特に他の指定がない限り、全ての薬物処理は１６時間で行った。活性化された対立遺伝子ＮＲＡＳおよびＫＲＡＳは前述した通りである。(Boehm, J. S. et al. Cell 129, 1065-1079 (2007); Lundberg, A. S. et al. Oncogene 21, 4577-4586 (2002))。
【００９３】
[00140]薬理学的な増殖阻害分析
[00141]全ての黒色腫細胞株について培養細胞を９６ウェルプレートに植え付け（ウェルあたり３，０００細胞）；Ａ３７５について１，５００細胞を植え付けた。植え付けて２４時間後、関連化合物の連続希釈駅をＤＭＳＯで製造し、細胞に添加し、最終的な薬物濃度を１００μＭ〜１×１０５μＭの範囲にした（ＤＭＳＯの最終的な体積は１％以下であった）。薬物添加後９６時間、細胞をインキュベートした。ＷＳＴ１生存率分析（ロシュ）を用いて細胞生存率を測定した。バックグラウンドを差し引いた後、生存率をコントロール（未処理細胞）のパーセンテージとして計算した。各細胞株および複合薬ごとに最低でも６連の反復実験を行った。増殖−阻害分析からのデータをＳ字型の用量−応答を示す非線形回帰曲線のフィッティングを用いてモデル化した。これらの曲線を表示し、ウィンドウズ（登録商標）用のグラフパッド・プリズム（GraphPad Prism）５（グラフパッド（GraphPad））を用いてＧＩ５０を作製した。１０μＭで、または、それより上で５０％阻害ポイントを横切るＳ字型の応答曲線は、＞１０μＭと注釈がつけられたＧＩ５０値を有する。単回投与の研究のために、指定された薬物の単回投与（特に他の規定がない限り１μＭ）を用いて同じプロトコールを行った。
【００９４】
[00142]免疫ブロットおよび免疫沈降
[00143]細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、２×プロテアーゼ阻害剤（ロシュ）および１×ホスファターゼ阻害剤カクテルＩおよびＩＩ（カルバイオケム（CalBiochem））を含む１％ＮＰ−４０緩衝液［１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、２ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８）、２５ｍＭのＮａＦおよび１％ＮＰ−４０］中で溶解させた。溶解産物を定量し（ブラッドフォード分析）、標準化し、体積を減らし、変性させ（９５℃）および１０％トリス／グリシンゲル（インビトロジェン）上でのＳＤＳゲル電気泳動で分解した。タンパク質をＰＶＤＦメンブレンに移し、ｐＥＲＫ１／２（Ｔ２０２／Ｙ２０４）、ｐＭＥＫ１／２（Ｓ２１７／２２１）、ＭＥＫ１／２、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、Ｃ−ＲＡＦ（ウサギ宿主）、ｐＣ−ＲＡＦ（ｐＳ３３８）（セル・シグナリング・テクノロジー（Cell Signaling Technology）；１：１，０００）、Ｖ５−ＨＲＰ（インビトロジェン；（１：５，０００）、ＣＯＴ（１：５００）、Ｂ−ＲＡＦ（１：２，０００）、アクチン（１：１，０００）、アクチン−ＨＲＰ（１：１，０００；サンタクルーズ（SantaCruz）））、Ｃ−ＲＡＦ（マウス宿主；１：１，０００；ＢＤトランスダクション・ラボ（BD Transduction Labs））、ビンキュリン（シグマ（Sigma）；１：２０，０００）、ＡＸＬ（１：５００；Ｒ＆Ｄシステムズ（R&D Systems））を認識する一次抗体でプロービングした。適切な二次抗体（抗ウサギ、抗マウスＩｇＧ、ＨＲＰ結合型；１：１，０００希釈、セル・シグナリング・テクノロジー、または、抗ヤギＩｇＧ、ＨＲＰ結合型；１：１，０００希釈；サンタクルーズ）とインキュベートした後、化学発光（ピアース（Pierce））を用いてタンパク質を検出した。上述のようにして、Ｃ−ＲＡＦ（１：５０；セル・シグナリング・テクノロジー）を認識する抗体を用いて、全タンパク質１μｇ／μｌの濃度で１％ＮＰ−４０溶解緩衝液中で４℃で一晩免疫沈降を行った。抗体：抗原複合体を４℃で２時間かけてプロテインＡアガロース（２５μＬ、５０％スラリー；ピアース）に結合させた。ビーズを遠心分離し、溶解緩衝液で３回洗浄し、溶出させ２倍濃縮したサンプル緩衝液中で変性させた（９５℃）（インビトロジェン）。上述のようにして免疫ブロットを行った。発光によるタンパク質の定量化をＮＩＨイメージＪ（NIH Image J）を用いて行った。
【００９５】
[00144]腫瘍および適合する正常な皮膚からの溶解産物を、上述のように、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含むＲＩＰＡ［５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ、１．０％ＮａＤＯＣ、１．０％トリトン（Triton）Ｘ−１００、２５ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＮＡ３ＶＯ４］中で組織を機械的にホモジナイズすることによって作製した。それに続く標準化および免疫ブロットを上述したように行った。
【００９６】
[00145]生検で得られた黒色腫の腫瘍材料
[00146]生検で得られた腫瘍材料は、インフォームド・コンセントのもとに得られ、プロトコール０２〜０１７（対のサンプル、マサチューセッツ総合病院（Massachusetts General Hospital））、および、０７〜０８７（対のないサンプル、ダナ・ファーバー癌研究所（Dana−Farber Cancer Institute））で特徴付けられた廃棄され身元をわからなくした組織からなる。対の試料について、ＰＬＸ４０３２処理開始の１０〜１４日後に「処理中」サンプルを回収した（表６）。
【００９７】
[00147]ＣＯＴキナーゼ活性の阻害
[00148]付着性のＲＰＭＩ−７９５１細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄し、血清非含有の増殖培地中で一晩インキュベートした。その後、４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−６−（ピリジン−３−イル−メチルアミノ）−３−シアノ−［１，７］−ナフチリジン（ＥＭＤ；ＴＰＬ２阻害剤Ｉ；カタログ番号：６１６３７３、PubChem番号：９５４９３００）を指定された濃度でＤＭＳＯに懸濁し、これを細胞に添加して１時間そのままにし、その後上述のようにしてタンパク質抽出物を作製した。
【００９８】
[00149]定量ＲＴ−ＰＣＲ
[00150]細胞株と新たに凍結した腫瘍からＲＮイージー（RNeasy）キット（キアゲン（Qiagen））を用いてｍＲＮＡを抽出した。それに続き、トータルｍＲＮＡを用いて、細胞株および対になっていない腫瘍サンプルにはスーパースクリプトIIIファーストストランド合成スーパーミックス（SuperScript III First−Strand Synthesis SuperMix, インビトロジェン）を用いて、さらに、対になった凍結腫瘍サンプルにはスーパースクリプトＶＩＬＯ ｃＤＮＡ合成キット（インビトロジェン）を用いて逆転写を行った。定量ＰＣＲのために、ＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス（SYBR Green PCR Master Mix）および遺伝子特異的なプライマーを用いて、３連で、ＡＢＩ７３００リアルタイムＰＣＲシステムを用いて、５μｌのＲＴ反応を行った。検出に用いられたプライマーは以下に示す通りである：
【００９９】
【表４】
0005985401.tif 000006
【０１００】
[00151]インビトロでのキナーゼ分析
[00152]インビトロでのキナーゼ分析をこれまでに述べられたようにしてそれぞれ１μｇのＣＯＴ（アミノ酸３０〜３９７, Ｒ＆Ｄシステムズ）、および、不活性ＥＲＫ１（ミリポア（Millipore））を用いて行った。
【０１０１】
[00153]細胞生存率の分析
[00154]付着性のＲＰＭＩ−７９５１細胞をＣＯＴまたはルシフェラーゼに対してｓｈＲＮＡを発現するウイルスで上述のようにして感染させた。選択後、細胞を４連で２４ウェルプレート上で平板培養した（１．５×１０５細胞／ウェル）。生存可能な細胞を、ＶＩ−セル細胞生存率分析装置（VI−CELL Cell Viability Analyzer）を製造元の説明書に従って用いてトリパンブルー色素排除試験法で計数した。４連の細胞数を平均し、コントロールｓｈＲＮＡの細胞数に標準化した。
【０１０２】
[00155]ガン細胞株百科事典（The Cancer Cell Line Encyclopedia ； CCLE）
[00156]ガン細胞株百科事典（ＣＣＬＥ）プロジェクトは、ブロード・インスティテュート、ノバルティスバイオメディカル研究所（Novartis Institutes for Biomedical Research ; NIBR）、および、ノバルティス研究財団ゲノミクス研究所（Genomics Institute of the Novartis Research Foundation ; GNF）の共同制作であり、これは、個々の薬理学的な脆弱性をゲノムパターンにリンクさせ、細胞株の総合的なゲノミクスを癌患者の層別化に翻訳する総合的なコンピューター解析を開発するために、ヒト癌モデルの大型パネルの詳細な遺伝学的および薬理学的な特徴付けを行うためのものである。この研究で用いられる染色体コピー数および遺伝子発現データは、オンラインでhttp://www.broadinstitute.org/cgi-bin/cancer/datasets.cgi.で利用可能である。
【０１０３】
[00157]癌細胞株の発現プロファイリング
[00158]ジーンチップ（GeneChip）ヒトゲノムＵ１３３と、２．０アフィメトリックス（Affymetrix）発現アレイ（アフィメトリックス）とを用いてオリゴヌクレオチドマイクロアレイ解析を行った。サンプルを、発現マイクロアレイで使用するためにアフィメトリックスのプロトコールに従って標識して断片化したｃＲＮＡに変換した。
【０１０４】
[00159]用いられたｓｈＲＮＡコンストラクト（ｐＬＫＯ．１）
[00160]用いられるｓｈＲＮＡコンストラクトを製造するためのＤＮＡ配列を以下に示す：
【０１０５】
【表５】
0005985401.tif 000007
【０１０６】
[00161]本明細書で示される定義および開示が、参照により本明細書に組み入れられる全てのものより優位である。本明細書において本発明をそれらの好ましい実施態様と共に説明したが、当業者であれば当然のことながら、添付の請求項で定義される本発明の本質および範囲から逸脱しない限り、具体的に説明されていない付加、改変、置換および欠失も可能である。従って、前述の詳細な説明は、限定ではなく説明とみなされ、当然のことながら本発明の本質および範囲を定義するのは、以下の請求項（全ての等価体を含む）であるとする。
１．  ＲＡＦ阻害剤と第二の阻害剤とを用いた併用療法での治療によって利益を得る可能性が高い癌を有する被験者を同定する方法であって、該方法は：
（ａ）被験者から得られた癌細胞中のＭＡＰ３Ｋ８（ＴＰＬ２／ＣＯＴ）、ＲＡＦ１（ＣＲＡＦ）、ＣＲＫＬ（ＣｒｋＬ）、ＦＧＲ（Ｆｇｒ）、ＰＲＫＣＥ（Ｐｒｋｃｅ）、ＰＲＫＣＨ（Ｐｒｋｃｈ）、ＥＲＢＢ２（ＥｒｂＢ２）、ＡＸＬ（Ａｘｌ）、または、ＰＡＫ３（Ｐａｋ３）からなる群より選択される１種またはそれより多くの標的キナーゼの遺伝子コピー数、ｍＲＮＡもしくはタンパク質レベルまたはリン酸化を分析し、遺伝子コピー数、ｍＲＮＡもしくはタンパク質レベルまたはリン酸化を、癌を有さない被験者から得られた細胞中の標的キナーゼの遺伝子コピー数、ｍＲＮＡもしくはタンパク質レベルまたはリン酸化と比較すること；および、
（ｂ）癌を有さない被験者からの細胞と比較した、癌細胞中の標的キナーゼの遺伝子コピー数の増加、または、ｍＲＮＡ発現の変化、または、タンパク質の過剰発現もしくはリン酸化を、その癌を有する併用療法での治療によって利益を得る可能性が高い被験者と相関付けること、
を含む、上記方法。
２．  （ｃ）癌細胞から得られた核酸サンプルを、約アミノ酸位置６００に突然変異を有するＢ−ＲＡＦポリペプチドをコードする核酸分子中の突然変異の存在について分析すること、および、（ｄ）該突然変異のＢ−ＲＡＦポリペプチドをコードする核酸分子中における存在を、併用療法での治療によって利益を得る可能性が高い被験者と相関付けること、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
３．  Ｂ−ＲＡＦをコードする核酸分子中の約アミノ酸位置６００にバリンからグルタミン酸への突然変異（Ｖ６００Ｅ）の存在を、併用療法での治療によって利益を得る可能性が高い被験者と相関付けることを含む、請求項１に記載の方法。
４．  ＭＡＰ３Ｋ８（ＴＰＬ／ＣＯＴ）の遺伝子コピー数、ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルを分析することを含む、請求項１に記載の方法。
５．  アミノ酸Ｓ３３８におけるＣ−ＲＡＦのリン酸化を分析することを含む、請求項１に記載の方法。
６．  前記第二の阻害剤は、ＭＥＫ阻害剤、ＣＲＡＦ阻害剤、ＣｒｋＬ阻害剤、または、ＴＰＬ２／ＣＯＴ阻害剤である、請求項１に記載の方法。
７．  前記ＲＡＦ阻害剤は、Ｂ−ＲＡＦ阻害剤、または、ｐａｎ−ＲＡＦ阻害剤である、請求項１に記載の方法。
８．  前記ＲＡＦ阻害剤は、ＲＡＦ２６５、ソラフェニブ、ＳＢ５９０８８５、ＰＬＸ４７２０、ＰＬＸ４０３２、ＧＤＣ−０８７９、および、ＺＭ３３６３７２からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
９．  前記被験者は、ＲＡＦ阻害剤に対する先天的な耐性を有するか、または、ＲＡＦ阻害剤に対する耐性を発生させる可能性が高い、請求項１に記載の方法。
１０．  前記癌は、黒色腫、乳癌、結腸直腸癌、神経膠腫、肺癌、卵巣癌、肉腫、および、甲状腺癌からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
１１．  前記癌は、黒色腫である、請求項１０に記載の方法。
１２．  癌治療を必要とする被験者において癌を治療する方法であって、該方法は、被験者に、有効量のＲＡＦ阻害剤と有効量の第二の阻害剤とを投与することを含み、ここで第二の阻害剤は、ＭＥＫ阻害剤、または、ＭＡＰ３Ｋ８（ＴＰＬ２／ＣＯＴ）阻害剤である、上記方法。
１３．  前記被験者は、Ｂ−ＲＡＦに突然変異を含む癌細胞を有する、請求項１２に記載の方法。
１４．  前記被験者は、Ｂ−ＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異を含む癌細胞を有する、請求項１２に記載の方法。
１５．  被験者から得られた癌細胞中のＭＡＰ３Ｋ８（ＴＰＬ２／ＣＯＴ）、ＲＡＦ１（ＣＲＡＦ）、ＣＲＫＬ（ＣｒｋＬ）、ＦＧＲ（Ｆｇｒ）、ＰＲＫＣＥ（Ｐｒｋｃｅ）、ＰＲＫＣＨ（Ｐｒｋｃｈ）、ＥＲＢＢ２（ＥｒｂＢ２）、ＡＸＬ（Ａｘｌ）、または、ＰＡＫ３（Ｐａｋ３）からなる群より選択される１種またはそれより多くの標的キナーゼの遺伝子コピー数、ｍＲＮＡもしくはタンパク質レベルまたはリン酸化を分析し、その遺伝子コピー数、ｍＲＮＡもしくはタンパク質レベルまたはリン酸化を、癌を有さない被験者から得られた細胞中の標的キナーゼの遺伝子コピー数、ｍＲＮＡもしくはタンパク質レベルまたはリン酸化と比較すること；および、
癌細胞中の標的キナーゼの遺伝子コピー数の増加、または、ｍＲＮＡ発現の変化、または、タンパク質の過剰発現もしくはリン酸化を示す被験者の中で、有効量のＲＡＦ阻害剤と有効量の第二の阻害剤とを被験者に投与すること、をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
１６．  前記ＲＡＦ阻害剤は、ＲＡＦ２６５、ソラフェニブ、ＳＢ５９０８８５、ＰＬＸ４７２０、ＰＬＸ４０３２、ＧＤＣ−０８７９、および、ＺＭ３３６３７２からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
１７．  前記ＭＥＫ阻害剤は、ＣＩ−１０４０／ＰＤ１８４３５２、ＡＺＤ６２４４、ＰＤ３１８０８８、ＰＤ９８０５９、ＰＤ３３４５８１、ＲＤＥＡ１１９、６−メトキシ−７−（３−モルホリン−４−イル−プロポキシ）−４−（４−フェノキシ−フェニルアミノ）−キノリン−３−カルボニトリル、および、４−［３−クロロ−４−（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イルスルファニル）−フェニルアミノ］−６−メトキシ−７−（３−モルホリン−４−イル−プロポキシ）−キノリン−３−カルボニトリルからなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
１８．  前記被験者は、ＲＡＦ阻害剤に対する先天的な耐性を有するか、または、ＲＡＦ阻害剤に対する耐性を発生させる可能性が高い、請求項１２に記載の方法。
１９．  前記癌は、黒色腫、乳癌、結腸直腸癌、神経膠腫、肺癌、卵巣癌、肉腫、および、甲状腺癌からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
２０．  前記癌は、黒色腫である、請求項１２に記載の方法。
２１．  前記被験者は、ＭＥＫ阻害剤に対する先天的な耐性を有するか、または、ＭＥＫ阻害剤に対する耐性を発生させる可能性が高い、請求項１２に記載の方法。
２２．  前記第二の阻害剤は、ＭＡＰ３Ｋ８（ＴＰＬ２／ＣＯＴ）阻害剤である、請求項１２に記載の方法。
２３．  第一の阻害剤に対する耐性を付与する標的キナーゼを同定する方法であって：
第一の阻害剤に対する感受性を有する細胞を培養すること；
細胞培養物で複数のキナーゼＯＲＦクローンを発現させること、ここで、それぞれの細胞培養物が異なるキナーゼＯＲＦクローンを発現する；
それぞれの細胞培養物を上記阻害剤に晒すこと；
上記阻害剤に晒した後にコントロール細胞培養物よりも高い生存率を有する細胞培養物を同定することにより、第一の阻害剤に対する耐性を付与する１種またはそれより多くのキナーゼＯＲＦクローンを同定すること、
を含む、上記方法。
２４．  前記培養細胞は、ＲＡＦ阻害剤に対する感受性を有する、請求項２３に記載の方法。
２５．  前記培養細胞は、ＭＥＫ阻害剤に対する感受性を有する、請求項２３に記載の方法。
２６．  前記培養細胞は、Ｂ−ＲＡＦ突然変異を含む、請求項２３に記載の方法。
２７．  前記培養細胞は、Ｂ−ＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異を含む、請求項２６に記載の方法。
２８．  前記培養細胞は、黒色腫細胞株を含む、請求項２３に記載の方法。
２９．  レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター中の複数のキナーゼＯＲＦクローンを提供することを含む、請求項２３に記載の方法。
【０１０７】
【表６】
0005985401.tif 000008
【０１０８】
【表７】
0005985401.tif 000009
【０１０９】
【表８】
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【０１１０】
【表９】
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【０１１１】
【表１０】
0005985401.tif 000012
【０１１２】
【表１１】
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【表４３】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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