(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビフィドバクテリウム・ビフィダムYIT11926（FERM BP -11504）又はビフィドバクテリウム・ビフィダムYIT11939（FERM BP -11505）。
【請求項２】
請求項１記載のビフィドバクテリウム・ビフィダムを含有することを特徴とする飲食品。
【請求項３】
発酵乳食品である請求項２記載の飲食品。
【請求項４】
更に、甘味料を含有するものである請求項２又は３記載の飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸管に留まり、かつ腸管で増殖できる新規なビフィドバクテリウム属細菌、及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビフィドバクテリウム属細菌はヒトの腸内菌叢における主要細菌で、便秘や下痢の改善等の整腸作用、血清コレステロール上昇抑制作用、免疫賦活作用等、ヒトの健康に対して有益な作用を有することが知られており、各種発酵飲食品や生菌製剤等の形態で多数の製品が販売されている。【０００３】
ビフィドバクテリウム属細菌は主として生菌の状態で上記の効果を発揮すると考えられており、発酵飲食品や生菌製剤中のビフィドバクテリウム属細菌の生残性を高め、より多くの生菌を摂取するための工夫が種々なされてきた。しかし、ビフィドバクテリウム属細菌が単に腸管を通過するだけでは、上記の効果を十分に発揮できない可能性も指摘されており、ビフィドバクテリウム属細菌が腸管に留まり、かつ、腸管内で増殖することが重要であると考えられている。【０００４】
腸管に留まるためには、腸管への接着能を有することが必要とされる。腸管への接着能を有する細菌として乳酸菌ではラクトバチルスＧＧ（ＡＴＣＣ  ５３１０３）、ラクトバチルス・パラカゼイ  ＫＷ３１１０等（特許文献１，２）が報告されている。また、報告例は少ないものの、ビフィドバクテリウム属細菌としてはビフィドバクテリウム・ビフィダム  ＷＢ１００３（特許文献３）が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表平１１−５０７９３４号公報
【特許文献２】特開２００５−１３９１６０号公報
【特許文献３】ＷＯ９９／６４０２３号国際公開パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、前記の乳酸菌やビフィドバクテリウム属細菌は、腸管に接着はするが、腸管内で増殖しなければその効果を十分に発揮することは不可能である。【０００７】
従って本発明は、腸管に留まるだけでなく腸管内で増殖することができるビフィドバクテリウム属細菌を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで本発明者らは、上記課題を解決するため、腸管細胞への接着能に加えて、腸管粘膜の主成分であるムチン資化能を有することを指標として、数多くのビフィドバクテリウム属細菌をスクリーニングしてきた結果、腸管細胞への接着能及びムチン資化能を有し、腸管に留まるだけでなく腸管内で増殖可能な新規なビフィドバクテリウム属細菌を見出し、本発明を完成した。【０００９】
すなわち、本発明は、腸管細胞への接着能及びムチン資化能を有することを特徴とするビフィドバクテリウム属細菌を提供するものである。【００１０】
また、本発明は、前記ビフィドバクテリウム属細菌を含有することを特徴とする飲食品、特に発酵乳飲食品を提供するものである。
さらに、本発明は、腸管細胞への接着能及びムチン資化能を指標としてビフィドバクテリウム属細菌を選抜することを特徴とする腸管に留まり、腸管内で増殖可能なビフィドバクテリウム属細菌のスクリーニング方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のビフィドバクテリウム属細菌は、腸管細胞への接着能及びムチン資化能を有するため、腸管に留まり、かつ、腸管内で増殖することができ、腸管内においてビフィドバクテリウム属細菌が有する生理効果を効果的かつ持続的に発揮することができる。また、これらの生理効果を有する飲食品、特に発酵乳飲食品の製造に好適に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＨＴ−２９細胞への接着能を有するＢ．ビフィダム  ＹＩＴ  １１９２６の接着画像を示す図である（図中、黄色の蛍光を発色している箇所がＨＴ−２９細胞に接着したＹＩＴ  １１９２６を示す）。
【図２】ＨＴ−２９細胞への接着能を有するＢ．ビフィダム  ＹＩＴ  １１９３９の接着画像を示す図である（図中、黄色の蛍光を発色している箇所がＨＴ−２９細胞に接着したＹＩＴ  １１９３９を示す）。
【図３】ＨＴ−２９細胞への接着能を有さないＢ．ビフィダム  Ｙ１１０７７の接着画像を示す図である（図中、黄色の蛍光を発色している箇所がＨＴ−２９細胞に接着したＹ１１０７７を示す）。
【図４】ＨＴ−２９細胞への接着能を有さないＢ．ビフィダム  ＹＩＴ  １１０８２の接着画像を示す図である（図中、黄色の蛍光を発色している箇所がＨＴ−２９細胞に接着したＹＩＴ  １１０８２を示す）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のビフィドバクテリウム属細菌は、腸管細胞への接着能及びムチン資化能を有し、腸管細胞への接着能を有することで腸管に留まることができ、ムチン資化能を有することで腸管内で増殖することができる。
【００１４】
本発明において、「腸管細胞への接着能を有する」とは、対象となるビフィドバクテリウム属細菌が腸管に留まることができる程度に腸管細胞に接着できる能力を有することを意味し、接着部位や接着の様式等は問わない。具体的には、ヒト大腸がん由来細胞であるＨＴ−２９細胞に対し、十分量（ＨＴ−２９細胞１個当たり５０個以上）のビフィドバクテリウム属細菌を２時間作用させたとき、ＨＴ−２９細胞１個当たり１個以上のビフィドバクテリウム属細菌が接着することを言う。ＨＴ−２９細胞１個当たり２個以上の細菌が接着することが好ましく、３個以上の細菌が接着することがより好ましく、３〜１０個の細菌が接着することがさらに好ましい。接着する細菌数が多いほど、より効率的に腸管に留まることができるため、本発明のビフィドバクテリウム属細菌として好適に用いることができる。
【００１５】
また、「ムチン資化能を有する」とは、対象となるビフィドバクテリウム属細菌を、ムチンのみを糖源とする培地で４８時間培養したときの濁度（クレット値、Ｋｌｅｔｔ−Ｓｕｍｍｅｒｓｏｎ比色計、Ｎｏ．６６フィルター）が５０以上であることを言う。クレット値は７５以上が好ましく、１００以上がより好ましく、１００〜２００がさらに好ましい。クレット値が高いほど、腸管内での増殖能が高いため、本発明のビフィドバクテリウム属細菌として好適に用いることができる。
【００１６】
ムチン資化能の試験に用いられる培養培地としては、糖源を除いた培地にムチンを添加したものを用いればよく、糖源を除いた培地の組成は、Ｒｏｇｏｓａ培地、Ｍ−ＩＬＳ培地、ＰＹ培地、ＧＡＭ培地、ＴＯＳプロピオン酸培地等の組成とすることができる。添加するムチンはヒト腸管由来ムチンが好ましいが、ブタ胃ムチンで代用できる。ムチンの添加量は培地中に０．１〜１０質量％が好ましく、０．５〜５質量％がより好ましく、０．５〜２質量％がさらに好ましい。なお、糖源が存在しなくても増殖する菌がまれに存在するため、対照として糖源を除いた培地で対象となるビフィドバクテリウム属細菌を培養し、クレット値を確認しておくことが望ましい。糖源を除いた培地でのクレット値が１０以上の場合は、ムチンのみを糖源とする培地のクレット値から糖源を除いた培地でのクレット値を差し引き、上記の判定基準に当てはめればよい。
【００１７】
本発明の対象となるビフィドバクテリウム属細菌の種類は特に限定されないが、例えば、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アニマーリス（Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ズイス（Ｂ．ｓｕｉｓ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・カテヌラータム（Ｂ．ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラータム（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ラクチス（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・グロボサム（Ｂ．ｇｌｏｂｏｓｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アンギュラータム（Ｂ．ａｎｇｕｌａｔｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンティウム（Ｂ．ｄｅｎｔｉｕｍ）等が挙げられる。中でも、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ビフィダムは以前から乳製品に数多く使用されている安全性が高い菌種で、種々の生理効果も報告されていることから好ましく、特にビフィドバクテリウム・ビフィダムが好ましい。
【００１８】
本発明では、後述の実施例に示すように、ＨＴ−２９細胞１個当たりの接着菌数が１個以上、クレット値が５０以上であるビフィドバクテリウム属細菌を選抜した。一般的なビフィドバクテリウム属細菌では、ＨＴ−２９細胞１個当たりの接着菌数が０．１〜０．６個、クレット値が１０〜４０程度であるが、上記の判定基準で選抜された本発明のビフィドバクテリウム属細菌は、腸管細胞への接着能及びムチン資化能を有するため、腸管に留まり、腸管内で増殖することができ、ビフィドバクテリウム属細菌が有する生理効果を効果的かつ持続的に発揮することができる。なお、本発明のビフィドバクテリウム属細菌は、胆汁酸含有培地でも増殖し、優れた胆汁酸耐性を有し、経口で生きた状態で腸内に到達できる。
【００１９】
このようにして選抜した新規の菌株を、ビフィドバクテリウム・ビフィダム  ＹＩＴ  １１９２６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０４）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム  ＹＩＴ  １１９３９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０５）として、平成２３年９月６日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託した。これらの菌株は、以下のような菌学的性質を有する。
【００２０】
（１）ビフィドバクテリウム・ビフィダム  ＹＩＴ  １１９２６
本菌は健康成人より分離され、科学的性質は、グラム陽性多形性桿菌、偏性嫌気性菌、至適生育温度３７℃である。ＹＩＴ  １１９２６より得られた１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列をデータベースで検索して菌種を同定した。ビフィドバクテリウム・ビフィダム  ＹＩＴ  １１９２６の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列は、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＤＳＭ２０４５６（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ３８０１８）と９９．５％の相同性を示し、ビフィドバクテリウム・ビフィダムと同定された。
【００２１】
（２）ビフィドバクテリウム・ビフィダム  ＹＩＴ  １１９３９
本菌は健康成人より分離され、科学的性質は、グラム陽性多形性桿菌、偏性嫌気性菌、至適生育温度３７℃である。ＹＩＴ  １１９３９より得られた１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列をデータベースで検索して菌種を同定した。ビフィドバクテリウム・ビフィダム  ＹＩＴ  １１９３９の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列は、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＤＳＭ２０４５６（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ３８０１８）と９９．６％の相同性を示し、ビフィドバクテリウム・ビフィダムと同定された。
【００２２】
本発明のビフィドバクテリウム属細菌の利用形態は特に制限されず、凍結乾燥したものであってもよく、あるいはこれら細菌を含む培養物として利用することもできるが、いずれの形態であっても、細菌が生菌の状態であることが好ましい。
【００２３】
本発明のビフィドバクテリウム属細菌は、固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬品製剤の形態で利用することもできる。このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥製剤等が挙げられる。これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤、賦形剤等の慣用の添加剤を適宜添加することもできる。
【００２４】
本発明のビフィドバクテリウム属細菌は、上記のような製剤とするだけでなく、飲食品に配合して使用することもできる。飲食品に配合する場合は、そのまま、または種々の栄養成分と共に含有せしめればよい。具体的に本発明のビフィドバクテリウム属細菌を飲食品に配合する場合は、飲食品として使用可能な添加剤を適宜使用し、慣用の手段を用いて食用に適した形態、すなわち、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペースト等に成形してもよく、また種々の食品、例えば、ハム、ソーセージ等の食肉加工食品、かまぼこ、ちくわ等の水産加工食品、パン、菓子、バター、粉乳に添加して使用したり、水、果汁、牛乳、清涼飲料、茶飲料等の飲料に添加して使用してもよい。なお、飲食品には、動物の飼料も含まれる。
【００２５】
本発明のビフィドバクテリウム属細菌は、ビフィドバクテリウム属細菌が有する整腸作用等の生理効果を効果的かつ持続的に発揮させることができる。特に、腸管に留まり、腸管内で増殖することができることから、ビフィドバクテリウム属細菌を継続的に摂取しなくても、例えば、隔月、隔週、隔日のように摂取間隔を開けた場合や摂取期間が短くても生理効果が期待できるため、経済的なメリットも大きい。
【００２６】
さらに飲食品としては、本発明のビフィドバクテリウム属細菌を生菌の状態で含有する発酵乳飲食品、発酵豆乳、発酵果汁、発酵野菜汁等の発酵飲食品が好適に用いられ、特に発酵乳飲食品の利用が好ましい。発酵乳飲食品の製造は常法に従えばよく、例えば発酵乳を製造する場合には、殺菌した乳培地に本発明のビフィドバクテリウム属細菌を単独又は他の微生物と同時に接種培養し、これを均質化処理して発酵乳ベースを得る。次に別途調製したシロップ溶液を添加混合し、ホモゲナイザー等で均質化し、更にフレーバーを添加して最終製品に仕上げればよい。このようにして得られる発酵乳飲食品は、シロップ（甘味料）を含有しないプレーンタイプ、ソフトタイプ、フルーツフレーバータイプ、固形状、液状等のいずれの形態の製品とすることもできる。
【００２７】
かかる発酵乳飲食品にはシロップ等の甘味料、乳化剤、増粘（安定）剤、各種ビタミン等の任意成分を配合することができる。シロップとしては、グルコース、ショ糖、フルクトース、果糖ブドウ糖液糖、ブドウ糖果糖液糖、パラチノース、トレハロース、ラクトース、キシロース、麦芽糖、蜂蜜、糖蜜等の糖類、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、パラチニット、還元水飴、還元麦芽糖水飴等の糖アルコール、アスパルテーム、ソーマチン、スクラロース、アセスルファムＫ、ステビア等の高甘味度甘味料が挙げられる。また、発酵乳飲食品には、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、レシチン等の乳化剤、寒天、ゼラチン、カラギーナン、グァーガム、キサンタンガム、ペクチン、ローカストビーンガム、ジェランガム、カルボキシメチルセルロース、大豆多糖類、アルギン酸プロピレングリコール等の増粘（安定）剤を配合してもよい。この他にも、ビタミンＡ、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、ビタミンＥ類等のビタミン類、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、鉄、マンガン等のミネラル分、クエン酸、乳酸、酢酸、リンゴ酸、酒石酸、グルコン酸等の酸味料、クリーム、バター、サワークリーム等の乳脂肪、ヨーグルト系、ベリー系、オレンジ系、花梨系、シソ系、シトラス系、アップル系、ミント系、グレープ系、アプリコット系、ペア、カスタードクリーム、ピーチ、メロン、バナナ、トロピカル、ハーブ系、紅茶、コーヒー系等のフレーバー類、ハーブエキス、黒糖エキス等を配合することも可能である。
【００２８】
発酵乳飲食品の製造には、本発明のビフィドバクテリウム属細菌以外の微生物を併用することも可能である。このような微生物としては例えば、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アニマーリス（Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ズイス（Ｂ．ｓｕｉｓ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・カテヌラータム（Ｂ．ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラータム（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ラクチス（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・グロボサム（Ｂ．ｇｌｏｂｏｓｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アンギュラータム（Ｂ．ａｎｇｕｌａｔｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンティウム（Ｂ．ｄｅｎｔｉｕｍ）等の本発明のビフィドバクテリウム属細菌以外のビフィドバクテリウム属細菌、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ブヒネリ（Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・ガリナラム（Ｌ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、ラクトバチルス・アミロボラス（Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・ラムノーザス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ケフィア（Ｌ．ｋｅｆｉｒ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ゼアエ（Ｌ．ｚｅａｅ）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌ．ｓａｌｉｖａｌｉｕｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・デルブルッキィ  サブスピーシーズ．ブルガリカス（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・デルブルッキィ  サブスピーシーズ．デルブルッキィ（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）等のラクトバチルス属細菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）等のストレプトコッカス属細菌、ラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ．ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ．クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）等のラクトコッカス属細菌、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、エ��テロコッカス・フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）等のエンテロコッカス属細菌、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属細菌、サッカロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｓｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、トルラスポラ・デルブルッキィ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、キャンジダ・ケフィア（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ）等のサッカロマイセス属、トルラスポラ属、キャンジダ属等に属する酵母が挙げられる。本発明のビフィドバクテリウム属細菌と共にラクトバチルス属細菌、ストレプトコッカス属細菌、ラクトコッカス属細菌から選ばれる１種以上を併用して発酵乳飲食品を製造すると高い嗜好性が得られ、飲食が容易となるため好ましい。
【００２９】
本発明のビフィドバクテリウム属細菌を使用する場合の投与量に厳格な制限はないが、その好適な投与量は生菌数として１日当たり１０５ｃｆｕ〜１０１３ｃｆｕであり、特に１０８ｃｆｕ〜１０１２ｃｆｕが好ましい。また、継続的な投与ではなく、例えば、隔月、隔週、隔日のように投与間隔を開けた場合や短い摂取期間でもその生理効果が期待できる。
【００３０】
腸管細胞への接着能及びムチン資化能を指標とすることで、腸管に留まり、腸管内で増殖可能なビフィドバクテリウム属細菌をスクリーニングすることができる。すなわち、多くの候補菌株の中から、前述の腸管細胞への接着能に関する判定基準、ムチン資化能に関する判定基準を用いてビフィドバクテリウム属細菌を選抜することで、腸管細胞への接着能及びムチン資化能を有し、腸管に留まり、腸管内で増殖可能なビフィドバクテリウム属細菌を得ることができる。
【００３１】
また、腸管細胞への接着能のみを有し、腸管に留まるビフィドバクテリウム属細菌や、ムチン資化能のみを有し、腸管内で増殖可能なビフィドバクテリウム属細菌も前述の判定基準を用いて得ることができる。すなわち、腸管細胞への接着能が基準値以上、ムチン資化能が基準値未満の菌株を選抜すれば、腸管細胞への接着能のみを有し、腸管に留まるビフィドバクテリウム属細菌を得ることができ、ムチン資化能が基準値以上、腸管細胞への接着能が基準値未満の菌株を選抜すれば、ムチン資化能のみを有し、腸管内で増殖可能なビフィドバクテリウム属細菌を得ることができる。
【００３２】
さらに、ビフィドバクテリウム属細菌以外の細菌についても、前述の判定基準を用いることで、当該細菌が腸管細胞への接着能やムチン資化能を有するか否か判定することができる。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例を挙げて本発明の内容をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら制約されるものではない。【００３４】
［実施例１］腸管細胞への接着能及びムチン資化能を有するビフィドバクテリウム属細菌の選抜
（１）ムチン資化能
Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂ．ｂｒｅｖｅ、Ｂ．ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ、Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ、Ｂ．ａｎｇｕｌａｔｕｍ、Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂ．ｇｌｏｂｏｓｕｍ、Ｂ．ｌａｃｔｉｓ、Ｂ．ｄｅｎｔｉｕｍ、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓの１３菌種の試験菌株を使用した。
ビフィズス菌は０．７％グルコース添加ＧＡＭ嫌気液体培地に凍結保存した試験菌液を１％接種し、２４時間前培養した。乳酸菌（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）はＭＲＳ液体培地に凍結保存した試験菌液を１％接種し、２４時間前培養した。Ｍ−ＩＬＳの乳糖をムチン（和光、ブタ胃製）に置換した培地（ムチン添加量は１％）に前培養菌を１％接種し（初発菌数は１０７／ｍｌ・培地となる）、４８時間後にクレット値を測定した。また糖質を加えないＭ−ＩＬＳ培地でも４８時間培養を行い、クレット値を測定した。【００３５】
（２）腸管細胞への接着能
（１）と同様の１３菌種の試験菌株を使用した。
ヒト大腸がん由来の細胞ＨＴ−２９は１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ−１６４０培地で培養し、使用した。
ビフィズス菌は０．７％グルコース添加ＧＡＭ嫌気液体培地で、乳酸菌（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）はＭＲＳ液体培地で２４時間培養し、ＰＢＳで２回洗浄したのち、１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ−１６４０培地にＤＡＰＩ染色法による菌数が５×１０８／ｍｌ・培地となるように懸濁した。
ＨＴ−２９をチャンバー付スライドグラスにコンフルエントになるまで培養後、１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ−１６４０に懸濁した菌懸濁液を４００μｌ加えた（ＨＴ−２９細胞１個当たりの試験菌株菌数は３００個となる）。３７℃、５％ＣＯ２下で２時間インキュベートした後、１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ−１６４０培地で２回、ＰＢＳで１回洗浄し、非接着の細菌を取り除き、２％ＰＦＡを加えて４℃で一晩固定した。９６％エタノール処理後、ビフィズス菌に対しては蛍光色素Ｃｙ５で標識したビフィドバクテリウム特異的プローブＢｉｆ１５３（腸内細菌学雑誌  １８：１４１−１４６、２００４）、乳酸菌に対しては蛍光色素Ｃｙ５で標識した乳酸菌特異的プローブＬａｂ１５８（Ｍｉｃｒｏｂ．Ｅｃｏｌ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｄｉｓ．１１：３−１２、１９９９）を用いてハイブリダイゼーションし、ＤＡＰＩ染色剤の添加された封入剤で封入し蛍光顕微鏡システムにて蛍光画像を取得し、画像処理ソフトを用いてＨＴ−２９細胞１個当たりの各試験菌株の接着菌数を定量化した。【００３６】
（３）結果
表１及び表２に各試験菌株のムチン資化能と接着能を示した。図１、２にＨＴ−２９細胞への接着能を有する菌株の画像、図３、４に接着能のない菌株の画像を示した。【００３７】
【表１】
0005980785.tif 000002
【００３８】
【表２】
0005980785.tif 000003
【００３９】
ビフィズス菌１２菌種のムチン資化能、腸管細胞への接着能を調べたところ、選抜基準（ＨＴ−２９細胞１個当たりの接着菌数が１個以上かつクレット値が５０以上）を満たす新規の２菌株（ＹＩＴ  １１９２６、ＹＩＴ  １１９３９）が見出された。
上記の２菌株以外にムチン資化能を有するビフィズス菌の菌株が３株（Ｙ１１０７７、ＹＩＴ１１０８２、Ａ−４３）あったが、これらの３菌株はいずれも腸管細胞への接着能が低かった。また、腸管細胞への接着能は、ＹＩＴ  １１９２６、ＹＩＴ  １１９３９以外にＹＩＴ１０１５５、３１−２、ＹＩＴ  ４０４４、ＹＩＴ  ４０１８が有していたが、これらの４菌株はいずれもムチン資化能が低かった。ムチン資化能、腸管細胞への接着能は、同一の種においても菌株毎のバラツキが非常に大きく、同一の種が有する特有の傾向は見られなかった。
Ｌ．ラムノーサス  ＧＧは腸管への接着能を有する乳酸菌として知られているが（特許文献１）、今回の試験系でもＹＩＴ  １１９３９と同等の腸管細胞への接着能を示した。
一方、ＧＧ株のムチン資化能について、糖質なしの培地でのクレット値が７６を示したことから、ＧＧ株は糖源が存在しなくても増殖できる菌と判断され、ムチン添加培地でのクレット値（９７）から上記の値（７６）を差し引いた値（２１）で判定すると、ムチン資化能を有しないと判断された。
上記以外に、多数のビフィズス菌を用いて、ムチン資化能（合計３４０株）、腸管細胞への接着能（合計６０株）を調べたが、上記の選抜基準を満たす菌株は、ＹＩＴ  １１９２６、ＹＩＴ  １１９３９以外には得られなかった。【００４０】
また、一部のビフィズス菌については胆汁酸耐性も調べた。具体的に、ＧＡＭ液体培地で嫌気的に定常期まで培養した菌液３０μｌを、０．２％の胆汁酸を添加した３ｍｌのＧＡＭ液体培地に接種して３７℃で嫌気的に培養し、２４時間後に菌体濁度（クレット値）をＫｌｅｔｔ−Ｓｕｍｍｅｒｓｏｎ比色計（Ｎｏ．６６フィルター）で測定した。胆汁酸含有培地での増殖性を示すクレット値が高いことは、消化管内での生存率、増殖率が高いことを示し、胆汁酸含有培地での増殖性がクレット値で１００以上であるビフィズス菌は、多数の菌が生きた状態で腸内に到達することができる。【００４１】
ＹＩＴ  １１９２６のクレット値は１２５、ＹＩＴ  １１９３９は１３５であり、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍのタイプストレインであるＹＩＴ  ４０３９は、胆汁酸添加ＧＡＭ培地で殆ど生育が認められなかった。一般的なビフィズス菌の胆汁酸含有培地での増殖性は、クレット値で０〜数十程度であることから、ＹＩＴ  １１９２６、ＹＩＴ  １１９３９は高い胆汁酸耐性を有していることが明らかになった。【００４２】
［実施例２］発酵乳飲食品の製造
１５％脱脂乳に３％グルコースを添加して殺菌し、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＹＩＴ  １１９３９を１％接種し、３７℃で２４時間培養してヨーグルトベース２１０ｇを得た。一方、砂糖９７ｇ、乳化鉄０．２ｇを水に溶解し、全量を７９０ｇとして殺菌し、シロップを得た。上記のようにして得られたヨーグルトベースとシロップを混合し、香料を１ｇ添加した後、１５Ｍｐａで均質化して容器に充填して発酵乳飲料を得た。得られた発酵乳飲料は外観・風味ともに良好で、保存安定性も良好であった。【００４３】
［実施例３］発酵乳飲食品の製造
全粉乳１２４ｇを水５０６ｇに溶解し、１３５℃で３秒間殺菌した後、ビフィドバクテリウム・ブレーベを０．５％、ビフィドバクテリウム・ビフィダム  ＹＩＴ  １１９２６を１％、ラクトバチルス・アシドフィルスを０．００１％接種し、３７℃でｐＨ５．３まで培養し、１５ＭＰａで均質化して、菌液６３０ｇを得た。一方、パラチノース９８ｇ、ニンジンジュース８ｇ、ＤＨＡ含有油２．５ｇ、乳化カルシルム７ｇ、ラクトフェリン０．１ｇ、ビタミンＤ０．０２ｇ、香料１ｇを水に溶解し、水を加えて全量を３７０ｇとした後、１２０℃で３秒間殺菌してシロップ液を得た。菌液、シロップ液を混合し、テトラブリック容器に充填して、ｐＨ；５．６、酸度；３．４、無脂乳固形分；８．７％、乳脂肪分；３．２％の発酵乳を得た。得られた発酵乳飲料は外観・風味ともに良好で、保存安定性も良好であった。【００４４】
［実施例４］錠剤の製造
下記の処方で各種成分を混合して造粒・乾燥・整粒した後に、打錠して錠剤を製造した。
（処方）                            （ｍｇ）
本発明の細菌菌体の乾燥物１）           ２０
微結晶セルロース                    １００
乳糖                                  ８０
ステアリン酸マグネシウム                ０．５
メチルセルロース                      １２
１）ビフィドバクテリウム・ビフィダム  ＹＩＴ  １１９２６の生菌体を凍結乾燥して製造した。【００４５】
［実施例５］清涼飲料の製造
下記処方により、常法に従って各成分を配合し、均質化して清涼飲料を得た。得られた清涼飲料は褐色瓶に充填後、アルミキャップにて封印し、加熱処理を施した。得られた清涼飲料は外観・風味ともに良好で、保存安定性も良好であった。
（処方）                            （ｇ）
本発明の細菌菌体の乾燥物１）           ５
香料                                  ０．８
水                                １００
還元澱粉糖化物                      ２４
果糖                                １８
１）ビフィドバクテリウム・ビフィダム  ＹＩＴ  １１９３９の生菌体を凍結乾燥して製造した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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