(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロード流体から精製タンパク質生成物を回収する方法であって、
ａ）タンパク質生成物を含むロード流体を、第１の樹脂を含むカラムに、前記生成物が前記樹脂に結合する条件下で曝すステップであって、該第１の樹脂がプロテインＡ樹脂であるステップと、
ｂ）第１の樹脂から前記生成物を含む流体を回収して第１の溶出液を生成するステップと、
ｃ）第１の溶出液が第２の樹脂に移動する際に、第１の溶出液を滴定液で滴定するステップであって、該第２の樹脂が陰イオン交換樹脂であり、かつ、溶出液と滴定液の容積比（ｖ）が中心点の値から最大±４０％変化する場合に、関数ｋ（％）＝ＡＢＳ［Ｋｐ（ｖ＋Δｖ）−Ｋｐ（ｖ−Δｖ）］／Ｋｐ（ｖ）で表される、第２の樹脂に対する前記生成物の分配係数（Ｋｐ）の変化（ｋ）が２０％未満であるように（ｋ＜２０％）、滴定液が第１の溶出液の１つまたは複数の条件を変更するような、滴定のステップと、
ｄ）滴定された溶出液を、第２の樹脂を含むカラムに、前記生成物が第２の樹脂に結合する条件下で曝すステップであって、第１の樹脂を含むカラムが、第２の樹脂を含むカラムとタンデムで配置されているステップと、
ｅ）第２の樹脂から前記生成物を含む流体を回収して第２の溶出液を生成し、それによって、ロード流体から精製タンパク質生成物を回収するステップと
を含む方法。
【請求項２】
第１の溶出液が、９５：５〜８０：２０の間の容積比の滴定液で滴定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１のポンプがロード流体を第１の樹脂に送り、第２のポンプが滴定液を第１の溶出液に送り、ポンプが３０％未満変化する流量の比で稼動される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
滴定液および第１の溶出液が、第２の樹脂に曝される前にミキサーを通過する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
第２の樹脂に曝される前に、滴定される溶出液のｐＨを検出するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
滴定される溶出液が、第２の樹脂に曝される前にフィルターを通過する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
固体が、沈殿によってロード流体から除去される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
固体を、ポリマー凝集剤を使用してロード流体から沈殿させる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
固体を、低溶解度を有する塩を形成する陽イオンおよび陰イオンを使用してロード流体から沈殿させる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
固体を、カルシウムおよびホスフェートを使用して沈殿させる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ロード流体が細胞培養培地を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
細胞が細胞培養培地から除去される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
細胞が、遠心分離によって細胞培養培地から除去される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質が抗体の抗原結合部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
タンパク質がモノクローナル抗体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
タンパク質が小モジュラー免疫薬である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
滴定液が、滴定される溶出液中の生成物が弱い分配モードで第２の樹脂に結合するように、第１の溶出液の１つまたは複数の条件を変更する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
滴定される溶出液および樹脂の条件が、樹脂に対する生成物の分配係数が０．１〜２０であるようなものである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
滴定される溶出液および樹脂の条件が、樹脂に対する生成物の分配係数が０．５〜５であるようなものである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
滴定液が、第２の樹脂が、樹脂１ｍＬ当たり少なくとも１ｍｇの生成物に結合するように、第１の溶出液の１つまたは複数の条件を変更する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
第２の樹脂に曝される、滴定される溶出液のｐＨが可変である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
滴定液が、陰イオン交換樹脂が弱い分配モードで滴定される溶出液中の生成物に結合するｐＨの０．５ｐＨ単位高いｐＨを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
滴定液が塩を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
滴定液が、生成物が様々な滴定液量の添加にわたって第２の樹脂への結合を維持するように、第１の樹脂の溶出液のイオン強度を増大させる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
滴定液が少なくとも５０ｍＭの塩濃度を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ロード流体、第１の溶出液、または第２の溶出液を、１つまたは複数のウイルス低減処理で処理するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
１つまたは複数のウイルス低減処理が、酸不活性化、界面活性剤不活性化、ウイルス低減フィルターの通過、またはこれらの組合せを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
１つまたは複数のウイルス低減処理が酸不活性化を含まない、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
ロード流体を第１の樹脂に曝す前に、界面活性剤を用いたロード流体の処理を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
第２の樹脂の溶出液をウイルス低減フィルターに通過させるステップを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
ポンプが、第２の樹脂の溶出液をウイルス低減フィルターに送る、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ウイルス低減フィルターに通過させた後に、酸を用いた第２の溶出液の処理を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
ロード流体を第１の樹脂に曝す前に、酸を用いたロード流体の処理を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ロード流体、第１の溶出液、または第２の溶出液を、１つまたは複数の粘度降下処理で処理するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
１つまたは複数の粘度降下処理が、加熱、塩の添加、ｐＨの変化、またはこれらの組合せを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
第１の溶出液を加熱するステップを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
生成物が、生成物が樹脂から溶出する条件付近であるｐＫａを有する緩衝液、および生成物が弱い分配モードで第２の樹脂に結合する条件付近のｐＫａを有する緩衝液を含む流体中で、第１の樹脂から回収される、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
生成物が、５．５超のｐＫａを有する緩衝液を含む流体中で、第１の樹脂から回収される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
緩衝液がトリスを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ロード流体から精製タンパク質生成物を回収する方法であって、
ａ）タンパク質生成物を含むロード流体を、第１の樹脂を含むカラムに、前記生成物が樹脂に結合する条件下で曝すステップであって、第１の樹脂がプロテインＡ樹脂であるステップと、
ｂ）第１の樹脂から前記生成物を含む流体を溶出することによって第１の溶出液を生成するステップであって、前記生成物が、前記生成物が樹脂から溶出する条件付近であるｐＫａを有する緩衝液、および前記生成物が弱い分配モードで第２の樹脂に結合する条件付近のｐＫａを有する緩衝液を含む溶出流体中で、第１の樹脂から溶出されるステップであって、第２の樹脂が陰イオン交換樹脂であるステップと、
ｃ）第１の溶出液が第２の樹脂に移動する際に、第１の溶出液を滴定液で滴定するステップと、
ｄ）滴定される溶出液を、第２の樹脂を含むカラムに、前記生成物が第２の樹脂に結合する条件下で曝すステップであって、第１の樹脂を含むカラムが、第２の樹脂を含むカラムとタンデムで配置されているステップと、
ｅ）第２の樹脂から前記生成物を含む流体を回収することによって第２の溶出液を生成し、それによって、精製タンパク質生成物をロード流体から回収するステップと
を含む方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の、ロード流体から精製タンパク質生成物を回収する方法であって、滴定される溶出液中の前記生成物が弱い分配モードで陰イオン交換樹脂に結合するように、滴定液が第１の溶出液の１つまたは複数の条件を変更するものであり、かつ、溶出液と滴定液の容積比（ｖ）が中心点の値から最大±４０％変化する場合に、関数ｋ（％）＝ＡＢＳ［Ｋｐ（ｖ＋Δｖ）−Ｋｐ（ｖ−Δｖ）］／Ｋｐ（ｖ）で表される、第２の樹脂に対する前記生成物の分配係数（Ｋｐ）の変化（ｋ）が２０％未満であるように（ｋ＜２０％）、滴定液が第１の溶出液の１つまたは複数の条件を変更するものであり、かつ、前記生成物が様々な滴定液量の添加にわたって第２の樹脂への結合を維持するように、第１の樹脂の溶出液のイオン強度を増大させるようなステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１０年７月３０日に出願された米国仮出願第６１／３６９，５５７号の利益を主張し、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれている。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、治療および診断での使用などの商業的用途のために、ある程度の純度を有していなければならない。組換えタンパク質は、一般的に、このタンパク質をコードする遺伝子を発現するように操作された培養真核細胞または原核細胞内で産生される。発現タンパク質は、不純物、例えば、無関係な宿主細胞タンパク質、他の宿主細胞成分（例えば、ＤＮＡ、細胞膜など）、および培地成分などから分離される。精製技法、例えば、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー、およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどでは、サイズ、電荷、溶解度、疎水性、および／またはリガンドに対する親和性の差異に基づいて不純物が分離される。費用効果的方法で厳格な規制基準を満たす精製プロセスを開発することは、医薬品の分野における会社にとって、非常な努力を要する仕事である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
治療用タンパク質および診断用タンパク質を商業的に使用するのに適切な程度の純度を達成するために、精製プロトコールは、２つ以上の精製ステップの使用を必要とすることが多い。より複雑な精製スキームによって、課題が提示されている。例えば、１つの精製モードによって処理された生成物プールは、第２の精製モードにおける処理に対して適合性にしなければならない。また、部分的に処理された生成物プールは、下流の精製システムが使用するのに直ちに利用可能でない場合、適切に貯蔵されなければならない。複数のシステムは、一貫した適切な作業を保証するために、複数のサンプリングステップおよびバリデーションステップを必要とする。複数の精製モードを一体化するシステムは、現在の精製スキームの複雑性を潜在的に低減し、それによって、効率を高め、製造されるタンパク質の取り扱いの費用を低減するはずである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は、とりわけ、精製ユニットがタンデムで連結され、精製ユニットのロバストな稼動を可能にするシステムを使用してタンパク質を精製する方法を提供する。稼動パラメータ（例えば、ポンプ速度、滴定液の容量添加など）の変動に対してロバスト性を維持する方法は、フィードバック制御がより少なく済み、より費用効果的であり、それによって、実際面で、精製タンパク質の商品の費用を低減する。精製ユニットを一体化すると、運転間で、部分的に処理された生成物プールを貯蔵する必要性が排除される。生成物を１回のシフトで処理することができ、精製時間を低減する。一体化は、サンプリング、バリデーション、およびドキュメンテーション要求（例えば、汚染微生物数サンプリング、バッチ記録のドキュメンテーションなど）も低減する。パラメータ、例えば、流量、背圧、およびカラム同士間の滴定液と溶出液の混合などが変動すると、生成物結合が変化し、生成物の回収率および品質を損なう場合がある。本方法の特徴は、このような変動に対する高い許容性をもたらす。
【０００５】
したがって、一態様では、本開示は、流体から精製生成物（例えば、タンパク質生成物；例えば、抗体）を回収する方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、ａ）タンパク質生成物を含むロード流体（ｌｏａｄ  ｆｌｕｉｄ）を、第１の樹脂を含むカラムに、生成物が樹脂に結合する条件下で曝すステップと、ｂ）第１の樹脂から生成物を含む流体を回収して第１の溶出液を生成するステップと、ｃ）第１の溶出液が第２の樹脂に移動する際に、第１の溶出液を滴定液で滴定するステップと、ｄ）滴定された溶出液を、第２の樹脂を含むカラムに、生成物が第２の樹脂に結合する条件下で曝すステップであって、第１の樹脂を含むカラムが、第２の樹脂を含むカラムとタンデムで配置されているステップと、ｅ）第２の樹脂から生成物を含む流体を回収して第２の溶出液を生成し、それによって、ロード流体から精製タンパク質生成物を回収するステップとを含む。
【０００６】
いくつかの実施形態では、滴定液は、溶出液と滴定液の容積比が最大４０％変化する場合に、第２の樹脂に対する生成物の分配係数（Ｋｐ）の変化が１０％未満であるように、第１の溶出液の１つまたは複数の条件を変更する。
【０００７】
第１の溶出液は、様々な容積比の滴定液で滴定することができる。いくつかの実施形態では、第１の溶出液は、約９５：５〜８０：２０の間の容積比の滴定液で滴定される。いくつかの実施形態では、溶出液は、固定された容積比の滴定液で滴定される。
【０００８】
いくつかの実施形態では、精製ユニットのタンデムシステムを通じた流体の流れは、１つまたは複数のポンプによって促進される。例えば、いくつかの実施形態では、第１のポンプは、ロード流体を第１の樹脂に送り、第２のポンプは、滴定液を第１の溶出液に送る。ポンプは、３０％未満、２０％未満、または１０％未満変化する流量の比で稼動させることができる。いくつかの実施形態では、溶出液および滴定液は、後続の精製ユニットに曝される前にミキサーを通過する。タンデム稼動は、精製の所与の段階（例えば、稼動がｐＨによって影響される精製ユニットの前）でｐＨを検出するためのｐＨモニターを任意選択により含むことができる。
【０００９】
いくつかの実施形態では、精製方法は、流体に１つまたは複数のフィルター（例えば、０．２μｍのフィルター）を通過させることを含む。タンデム精製方法のいくつかの実施形態では、フィルターは、２つのカラムの間に配置される。
【００１０】
フィルターに加えて、またはフィルターに代えて、沈殿によって固体を流体から除去することができる。いくつかの実施形態では、ポリマー凝集剤を使用して固体を流体から沈殿させることができる。いくつかの実施形態では、固体を、低溶解度を有する塩を形成する陽イオンおよび陰イオンを使用して（例えば、陽イオンおよび陰イオンを有する塩の溶解度積定数が、約１０−４Ｍ２未満である；例えば、カルシウムおよびホスフェートを使用して）流体から沈殿させる。
【００１１】
いくつかの実施形態では、一連の精製ユニットに曝されるロード流体は、細胞培養培地を含む。細胞培養培地は、細胞が除去された（例えば、遠心分離によって）ものである場合がある。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、無血清（例えば、添加されるタンパク質および／または添加される動物生成物を欠いている）とすることができる。
【００１２】
本明細書で提供される方法は、様々なタイプの対象とする生成物を回収するのに使用することができる。多くの実施形態では、生成物は、タンパク質、例えば、抗体（例えば、モノクローナル抗体、抗体断片、単鎖抗体など）、Ｆｃ融合タンパク質、または小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ（商標））などである。抗体、Ｆｃ融合タンパク質、および／または小モジュラー免疫薬の精製は、プロテインＡ（ｐｒｏＡ）などの免疫グロブリンに選択的に結合する樹脂の使用を含むことができる。
【００１３】
本明細書で提供される方法の様々な実施形態では、滴定液は、滴定される溶出液中の生成物が弱い分配モードで第２の樹脂に結合するように、第１の溶出液の１つまたは複数の条件を変更する。例えば、滴定される溶出液および樹脂の条件は、樹脂に対する生成物の分配係数（Ｋｐ）が０．１〜２０（例えば、０．２〜１０、または０．５〜５）であるようなものとすることができる。いくつかの実施形態では、滴定液は、第２の樹脂が、樹脂１ｍＬ当たり少なくとも１ｍｇの生成物（例えば、１ｍＬ当たり少なくとも５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、または６０ｍｇの生成物）に結合するように、第１の溶出液の１つまたは複数の条件を変更する。
【００１４】
本明細書で提供される方法では、第２の樹脂に曝される、滴定される溶出液のｐＨは、可変となり得る。
【００１５】
本明細書で提供される方法は、イオン交換樹脂の使用を含むことができる。いくつかの実施形態では、イオン交換樹脂は、陰イオン交換樹脂である。いくつかの実施形態では、滴定液は、陰イオン交換樹脂が弱い分配モードで滴定される溶出液中の生成物に結合するｐＨの０．５ｐＨ単位高いｐＨを有する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、滴定液は塩を含む。生成物が様々な滴定液量の添加にわたって第２の樹脂（例えば、イオン交換樹脂）への結合を維持するように、第１の樹脂の溶出液のイオン強度を増大させる滴定液を使用することができる。いくつかの実施形態では、滴定液は、少なくとも５０ｍＭ（例えば、少なくとも１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ、７５０ｍＭ、１Ｍ、またはそれ以上）の塩濃度を有する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法において使用されるイオン交換樹脂は、陽イオン交換樹脂である。
【００１８】
提供される方法によって処理される流体は、１つまたは複数のウイルス低減処理、例えば、酸不活性化、界面活性剤不活性化、ウイルス低減フィルターの通過、またはこれらの組合せなどで処理することができる。いくつかの実施形態では、一方法において使用されるウイルス不活性化処理は、酸不活性化を含まない。いくつかの実施形態では、一方法は、ロード流体をタンデムシステム内の第１の樹脂に曝す前に、界面活性剤でロード流体を処理するステップを含む。ウイルス低減フィルターが使用されるいくつかの実施形態では、ポンプが流体をフィルターに送る。
【００１９】
方法は、粘度降下処理を含むことができ、これは、例えば、加熱、塩の添加、ｐＨの変化、またはこれらの組合せを使用することができる。
【００２０】
ある特定の実施形態では、第１の樹脂はプロテインＡ樹脂であり、第２の樹脂はイオン交換樹脂であり、生成物は、生成物が第１の樹脂から溶出する条件付近であるｐＫａを有する緩衝液、および生成物が弱い分配モードで第２の樹脂に結合する条件付近のｐＫａを有する緩衝液を含む流体中で、第１の樹脂から回収される。いくつかの実施形態では、生成物は、５．５超のｐＫａを有する緩衝液（例えば、トリス）を含む流体中で、第１の樹脂から回収される。
【００２１】
別の態様では、本開示は、イオン交換樹脂に曝すためのロード流体を調製する方法を提供する。一方法は、例えば、ａ）イオン交換樹脂に結合するタンパク質生成物を含むロード流体を提供するステップと、ｂ）ロード流体に滴定液を添加するステップであって、滴定液は、生成物が様々な滴定液量の添加にわたってイオン交換樹脂への結合を維持するように、ロード流体のイオン強度を増大させるステップとを含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、ロード流体は、プロテインＡ樹脂の溶出液である。
【００２３】
いくつかの実施形態では、一方法は、生成物が樹脂に結合する条件下で、滴定される溶出液をイオン交換樹脂に曝すステップを含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、イオン交換樹脂は陰イオン交換樹脂である。
【００２５】
方法は、ロード流体（例えば、第２の溶出液）を１つまたは複数の追加の樹脂に曝すステップと、樹脂（複数）から生成物を含む流体を回収するステップとをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、ロード流体は、ヒドロキシアパタイト樹脂（例えば、セラミックヒドロキシアパタイト樹脂）、疎水性相互作用樹脂、金属親和性樹脂、イオン交換樹脂、またはこれらの組合せに曝される。
【００２６】
別の態様では、本開示は、イオン交換樹脂に曝すためのロード流体を調製する方法を提供する。方法は、例えば、ａ）イオン交換樹脂に結合するタンパク質生成物を含むロード流体を提供するステップと、ｂ）ロード流体に滴定液を添加するステップであって、滴定液は、少なくとも５０ｍＭ（例えば、少なくとも１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ、７５０ｍＭ、１Ｍ、またはそれ以上）の塩濃度を有するステップとを含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、ロード流体は、プロテインＡ樹脂の溶出液である。
【００２８】
いくつかの実施形態では、一方法は、生成物が樹脂に結合する条件下で、滴定される溶出液をイオン交換樹脂に曝すステップを含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、イオン交換樹脂は陰イオン交換樹脂である。
【００３０】
方法は、１つまたは複数の追加の樹脂にロード流体（例えば、陰イオン交換樹脂の溶出液）を曝すステップと、樹脂（複数可）から生成物を含む流体を回収するステップとをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、ロード流体は、ヒドロキシアパタイト樹脂（例えば、セラミックヒドロキシアパタイト樹脂）、疎水性相互作用樹脂、金属親和性樹脂、イオン交換樹脂、またはこれらの組合せに曝される。
【００３１】
さらに別の態様では、本開示は、ロード流体から精製タンパク質生成物を回収する方法を提供する。一方法は、例えば、ａ）タンパク質生成物を含むロード流体を、第１の樹脂を含むカラムに、生成物が樹脂に結合する条件下で曝すステップであって、第１の樹脂がプロテインＡ樹脂であるステップと、ｂ）第１の樹脂から生成物を含む流体を溶出することによって第１の溶出液を生成するステップであって、生成物は、生成物が樹脂から溶出する条件付近であるｐＫａを有する緩衝液、および生成物が弱い分配モードで第２の樹脂に結合する条件付近のｐＫａを有する緩衝液を含む溶出流体中で、第１の樹脂から溶出されるステップと、ｃ）第１の溶出液が第２の樹脂に移動する際に、第１の溶出液を滴定液で滴定するステップと、ｄ）滴定される溶出液を、第２の樹脂を含むカラムに、生成物が第２の樹脂に結合する条件下で曝すステップと、ｅ）第２の樹脂から生成物を含む流体を回収することによって第２の溶出液を生成し、それによって、精製タンパク質生成物をロード流体から回収するステップとを含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、第１の樹脂を含むカラムは、第２の樹脂を含むカラムとタンデムで配置される。いくつかの実施形態では、第２の樹脂は、イオン交換樹脂（例えば、陰イオン交換樹脂、または陽イオン交換樹脂）である。
【００３３】
方法は、ロード流体（例えば、第２の溶出液）を１つまたは複数の追加の樹脂に曝すステップと、樹脂（複数可）から生成物を含む流体を回収するステップとをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、ロード流体は、ヒドロキシアパタイト樹脂（例えば、セラミックヒドロキシアパタイト樹脂）、疎水性相互作用樹脂、金属親和性樹脂、イオン交換樹脂、またはこれらの組合せに曝される。
【００３４】
別の態様では、本開示は、ロード流体から精製タンパク質生成物を回収する方法を提供する。一方法は、例えば、ａ）タンパク質生成物を含むロード流体を、第１の樹脂を含むカラムに、生成物が樹脂に結合する条件下で曝すステップであって、第１の樹脂がプロテインＡ樹脂であるステップと、ｂ）第１の樹脂から生成物を含む流体を溶出することによって第１の溶出液を生成するステップであって、生成物は、５．５超のｐＫａを有する緩衝液を含む溶出流体中で、第１の樹脂から溶出されるステップと、ｃ）第１の溶出液が第２の樹脂に移動する際に、第１の溶出液を滴定液で滴定するステップと、ｄ）滴定される溶出液を、第２の樹脂を含むカラムに、生成物が第２の樹脂に結合する条件下で曝すステップと、ｅ）第２の樹脂から生成物を含む流体を回収することによって第２の溶出液を生成し、それによって、精製タンパク質生成物をロード流体から回収するステップとを含む。
【００３５】
いくつかの実施形態では、第１の樹脂を含むカラムは、第２の樹脂を含むカラムとタンデムで配置される。いくつかの実施形態では、第２の樹脂は、イオン交換樹脂（例えば、陰イオン交換樹脂、または陽イオン交換樹脂）である。
【００３６】
方法は、ロード流体（例えば、第２の溶出液）を１つまたは複数の追加の樹脂に曝すステップと、樹脂（複数可）から生成物を含む流体を回収するステップとをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、ロード流体は、ヒドロキシアパタイト樹脂（例えば、セラミックヒドロキシアパタイト樹脂）、疎水性相互作用樹脂、金属親和性樹脂、イオン交換樹脂、またはこれらの組合せに曝される。
【００３７】
さらに別の態様では、本開示は、ロード流体から精製タンパク質生成物を回収する方法を提供する。方法は、例えば、ａ）タンパク質生成物を含むロード流体をプロテインＡカラムに、生成物がプロテインＡに結合する条件下で曝すステップと、ｂ）プロテインＡカラムから生成物を含む流体を溶出することによって第１の溶出液を生成するステップであって、生成物は、生成物が樹脂から溶出する条件付近であるｐＫａを有する緩衝液、および生成物が弱い分配モードで第２の樹脂に結合する条件付近のｐＫａを有する緩衝液を含む溶出流体中で、第１の樹脂から溶出されるステップと、ｃ）第１の溶出液がプロテインＡカラムから溶出する際に、第１の溶出液を滴定液で滴定するステップであって、滴定液は、滴定される溶出液中の生成物が弱い分配モードで陰イオン交換樹脂に結合するように第１の溶出液の１つまたは複数の条件を変更し、溶出液と滴定液の容積比が最大４０％変化する場合に、第２の樹脂に対する生成物の分配係数の変化が１０％未満であるように、第１の溶出液の１つまたは複数の条件を変更し、生成物が様々な滴定液量の添加にわたって第２の樹脂への結合を維持するように、第１の樹脂の溶出液のイオン強度を増大させるステップと、ｄ）滴定される溶出液を、陰イオン交換樹脂を含むカラムに、生成物が陰イオン交換樹脂に結合する条件下で曝すステップであって、プロテインＡカラムは、陰イオン交換樹脂を含むカラムとタンデムで配置されているステップと、ｅ）陰イオン交換樹脂から生成物を含む流体を回収することによって第２の溶出液を生成し、それによって、精製タンパク質生成物をロード流体から回収するステップとを含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、第１の溶出液は、約９５：５〜８０：２０の間の容積比の滴定液を用いて滴定される。
【００３９】
いくつかの実施形態では、精製ユニットのタンデムシステムを通じた流体の流れは、１つまたは複数のポンプによって促進される。ポンプは、３０％未満、２０％未満、または１０％未満変化する流量の比で稼動させることができる。
【００４０】
いくつかの実施形態では、曝されるロード流体は、細胞培養培地、例えば、細胞が除去された（例えば、遠心分離によって）細胞培養培地を含む。
【００４１】
いくつかの実施形態では、生成物は、タンパク質、例えば、抗体（例えば、モノクローナル抗体、抗体断片、単鎖抗体など）、Ｆｃ融合タンパク質、または小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ（商標））などである。
【００４２】
いくつかの実施形態では、滴定される溶出液および樹脂の条件は、樹脂に対する生成物の分配係数（Ｋｐ）が０．１〜２０（例えば、０．２〜１０、または０．５〜５）であるようなものとすることができる。いくつかの実施形態では、滴定液は、第２の樹脂が、樹脂１ｍＬ当たり少なくとも１ｍｇの生成物（例えば、１ｍＬ当たり少なくとも５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、または６０ｍｇの生成物）に結合するように、第１の溶出液の１つまたは複数の条件を変更する。
【００４３】
いくつかの実施形態では、滴定液は、陰イオン交換樹脂が弱い分配モードで滴定される溶出液中の生成物に結合するｐＨの０．５ｐＨ単位高いｐＨを有する。
【００４４】
いくつかの実施形態では、滴定液は塩を含む。いくつかの実施形態では、滴定液は、少なくとも５０ｍＭ（例えば、少なくとも１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ、７５０ｍＭ、１Ｍ、またはそれ以上）の塩濃度を有する。方法は、ロード流体（例えば、第２の溶出液）を１つまたは複数の追加の樹脂に曝すステップと、樹脂（複数可）から生成物を含む流体を回収するステップとをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、ロード流体は、ヒドロキシアパタイト樹脂（例えば、セラミックヒドロキシアパタイト樹脂）、疎水性相互作用樹脂、金属親和性樹脂、イオン交換樹脂、またはこれらの組合せに曝される。
【００４５】
提供される方法を実行するためのシステムも提供される。
【００４６】
本開示のある特定の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に示されている。本開示の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかとなる。すべての引用された特許、および特許出願、および参考文献は、すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】プロテインＡ（ＰｒｏＡ）カラム、陰イオン交換（ＡＥＸ）カラム、およびウイルス低減フィルター（ＶＲＦ）の例示的なタンデム稼動の概略的描写の図である。
【図２】溶出ピークおよびＡＥＸストリップ領域を示す、ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステムで得られるインプロセスタンデムｐｒｏＡ−ＡＥＸ−ＶＲＦクロマトグラムの一部を示す図である。２８０ｎｍでのＵＶシグナル（ｍＡＵ）；全システム圧力（ｐｓｉ）；中和されたｐｒｏＡ流出物のｐＨ；およびＡＥＸ流出物の伝導率が示されている。プロセスの各段階におけるｐＨおよび圧力の読みは、インラインセンサーで得た。これらは、正確でない場合がある。
【図３】ピーク画分（各画分の量＝ＡＥＸ  ＣＶの１／２）のオフライン分析から得られるタンデムｐｒｏＡ−ＡＥＸ−ＶＲＦクロマトグラムを示す図である。正方形−タンパク質濃度。円−ＶＲＦデバイス全体にわたる圧力。
【図４Ａ】中和前および中和後のｐｒｏＡピーク画分（約０．２ＣＶ）中の濁度を示すグラフである。凝集させ、パッドで濾過したロード。画分Ａ５は、５５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を伴うピーク頂点に対応する。
【図４Ｂ】中和前および中和後のｐｒｏＡピーク画分（約０．２ＣＶ）中の濁度を示すグラフである。凝集させずにパッドで濾過したロード。画分Ａ５は、５５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を伴うピーク頂点に対応する。
【図５】タンパク質濃度のオフライン分析、および一定の１２容量％の滴定液を用いてインラインで中和された、分画されたｐｒｏＡのピークのｐＨを示すグラフである。
【図６Ａ】中和比（ｖ）の関数としてのｐＨ、［Ｃｌ−］、およびＫｐの例を示すグラフである。中和緩衝液に塩がまったく添加されない、タンデム中和の対照モード（現在の最新技術）。
【図６Ｂ】中和比（ｖ）の関数としてのｐＨ、［Ｃｌ−］、およびＫｐの例を示すグラフである。中和緩衝液に塩が添加される、タンデム中和の（本発明の）ロバストモード。
【図７Ａ】等Ｋｐ（ｉｓｏ−Ｋｐ）関数およびｐＨ＝ｆ（［Ｃｌ−］）関数のスケッチを示すグラフである。対照モード（現在の最新技術）。
【図７Ｂ】等Ｋｐ関数およびｐＨ＝ｆ（［Ｃｌ−］）関数のスケッチを示すグラフである。重なり領域を示す（本発明の）ロバストモード。
【図８】治療剤ＭＡｂのタンデムｐｒｏＡ−トリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）精製の対照（正方形）モードおよびロバスト（クロス）モードについてのシミュレートされたＫｐ＝ｆ（ｖ）を示すグラフである。プロットは、実験的に試験した3つの条件を示す。
【図９】タンデム稼動の対照（クロス）モードおよびロバスト（正方形）モードについての、相対的なＫｐ変化の関数、ｋを示すグラフである。強調された範囲は、ロバストな稼動ウインドウを示す。
【図１０】対照中和モードおよびロバスト中和モードにおいて、様々な中和比ｖで得られた、重なったＵＶトレースを示すグラフである。
【図１１Ａ−Ｆ】１つのＴＭＡＥ  ＣＶ画分中で収集されるｐｒｏＡ−ＴＭＡＥタンデム生成物のオフライン分析を示すグラフである。グラフは以下のように配置されている：左側（図１１Ａ、１１Ｃ、１１Ｅ）−対照モード；右側（図１１Ｂ、１１Ｄ、１１Ｆ）−ロバストモード；上側のパネル（図１１Ａ、１１Ｂ）−過少滴定シナリオ（ｖ＝６．５％）；中央パネル（図１１Ｃ、１１Ｄ）−中心点（ｖ＝１１．５％）；下側のパネル（図１１Ｅ、１１Ｆ）−過剰滴定シナリオ（ｖ＝１６．５％）。
【図１２Ａ】中和後にポンプＡおよびＢによって供給される塩基性（高ｐＫａ）緩衝液成分および酸性（低ｐＫａ）緩衝液成分の濃度を示すタンデムｐｒｏＡ−ＡＥＸクロマトグラムのスケッチである。現在の最新技術：過剰滴定のためにｐＨは上昇する。
【図１２Ｂ】中和後にポンプＡおよびＢによって供給される塩基性（高ｐＫａ）緩衝液成分および産生（低ｐＫａ）緩衝液成分の濃度を示すタンデムｐｒｏＡ−ＡＥＸクロマトグラムのスケッチである。本発明の条件：塩基性緩衝液は、完全にプロトン化された状態で溶出緩衝液中に存在し、中和後のｐＨの揺れに対する抵抗力をもたらす。
【図１３Ａ】バッチ式中和についてのｖの関数としてのｐＨ、［Ｃｌ−］、およびＫｐの例を示すグラフである。中和緩衝液に塩がまったく添加されない対照モード（現在の最新技術）。
【図１３Ｂ】バッチ式中和についてのｖの関数としてのｐＨ、［Ｃｌ−］、およびＫｐの例を示すグラフである。中和緩衝液に塩が添加される、ロバストモード（本明細書で提供される）。
【図１４Ａ】バッチ式中和の対照モードおよびロバストモードの例を示すグラフである。３つの滴定シナリオを示すＫｐ＝ｆ（ｖ）のプロット。
【図１４Ｂ】バッチ式中和の対照モードおよびロバストモードの例を示すグラフである。相対的なＫｐ変化関数、ｋ。強調された範囲は、ロバストな稼動ウインドウを示す。
【図１５Ａ】小モジュラー免疫薬の精製の比較プロセスを示すグラフである。対照（バッチ）ＡＥＸ精製の結果を示す。ｐＨ（菱形）、タンパク質濃度（正方形）、およびＨＭＷ種（三角形、円）のオフライン測定がプロットされている。
【図１５Ｂ】小モジュラー免疫薬の精製の比較プロセスを示すグラフである。プロテインＡ溶出緩衝液中にトリスを含まない、Ｋｐ＝１．５でのタンデムｐｒｏＡ−ＡＥＸクロマトグラフィーの結果を示す。ｐＨ（菱形）、タンパク質濃度（正方形）、およびＨＭＷ種（三角形、円）のオフライン測定がプロットされている。
【図１５Ｃ】小モジュラー免疫薬の精製の比較プロセスを示すグラフである。溶出緩衝液中にトリスを含む、Ｋｐ＝１．５でのタンデムｐｒｏＡ−ＡＥＸクロマトグラフィーの結果を示す。ｐＨ（菱形）、タンパク質濃度（正方形）、およびＨＭＷ種（三角形、円）のオフライン測定がプロットされている。
【図１６Ａ】小モジュラー免疫薬の精製の比較プロセスを示すグラフである。対照（バッチ）ＡＥＸ精製の結果を示す。ｐＨ（菱形）、タンパク質濃度（正方形）、およびＨＭＷ種（三角形、円）のオフライン測定がプロットされている。
【図１６Ｂ】小モジュラー免疫薬の精製の比較プロセスを示すグラフである。プロテインＡ溶出緩衝液中にトリスを含まない、Ｋｐ＝３．０でのタンデムｐｒｏＡ−ＡＥＸクロマトグラフィーの結果を示す。ｐＨ（菱形）、タンパク質濃度（正方形）、およびＨＭＷ種（三角形、円）のオフライン測定がプロットされている。
【図１６Ｃ】小モジュラー免疫薬の精製の比較プロセスを示すグラフである。溶出緩衝液中にトリスを含む、Ｋｐ＝３．０でのタンデムｐｒｏＡ−ＡＥＸクロマトグラフィーの結果を示す。ｐＨ（菱形）、タンパク質濃度（正方形）、およびＨＭＷ種（三角形、円）のオフライン測定がプロットされている。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
定義
用語「抗体」は、本明細書において、任意の免疫グロブリンまたはその断片を指し、抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを包含する。この用語は、それだけに限らないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体、非特異的抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、突然変異抗体、移植抗体、およびインビトロで生成された抗体を含む。用語「抗体」は、抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂなど、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、免疫グロブリン新抗原受容体（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｎｅｗ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）（ＩｇＮＡＲＳ）、マキシボディ（ｍａｘｉｂｏｄｙ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、細胞内発現抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、三重特異性抗体（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、四重特異性抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、抗原結合機能を保持する他の分子も含む。一般的に、このような断片は、抗原結合ドメインを含むはずである。
【００４９】
ある特定の実施形態では、抗体は、ＣＨ２／ＣＨ３領域を含み、したがって、プロテインＡクロマトグラフィーによる精製に適用できるものである。用語「ＣＨ２／ＣＨ３領域」は、プロテインＡと相互作用する免疫グロブリン分子のＦｃ領域中のアミノ酸残基を指す。いくつかの実施形態では、ＣＨ２／ＣＨ３領域は、インタクトなＣＨ２領域と、後続のインタクトなＣＨ３領域を含み、他の実施形態では、免疫グロブリンのＦｃ領域を含む。ＣＨ２／ＣＨ３領域含有タンパク質の例には、抗体、免疫接着物（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｏｎ）、およびＣＨ２／ＣＨ３領域に融合またはコンジュゲートした対象とするタンパク質を含む融合タンパク質が含まれる。
【００５０】
「結合生成物（ｂｏｕｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ）」（Ｏ）は、本明細書において、フィードストリームと平衡状態にあるとき、樹脂に結合する生成物の量を指す。
【００５１】
「溶出液」は、本明細書において、樹脂に曝された流体を指す。溶出液は、樹脂に曝されたロード流体（例えば、「フロースルー」流体）を含む流体、樹脂に曝された洗浄流体（例えば、洗浄緩衝液）、樹脂に曝されたアイソクラチック洗浄流体、樹脂に曝された溶出流体、およびこれらの組合せとすることができる。「溶出液」は、フロースルー、弱い分配性の結合溶出クロマトグラフィーモードで稼動された樹脂から回収される流体を含む。
【００５２】
「不純物」は、本明細書において、精製されている対象とするタンパク質の試料中にやはり存在する、精製されている対象とするタンパク質以外の任意の分子を指す。不純物として、生体高分子、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、タンパク質変異体、例えば、凝集タンパク質、高分子量種、低分子量種、および断片など、ならびに脱アミド化種など；精製されているタンパク質を分泌する宿主細胞からの他のタンパク質（宿主細胞タンパク質）；プロテインＡなどの、前の精製ステップの間に試料中に浸出する場合のある、クロマトグラフィーに使用される吸着剤の一部である分子；エンドトキシン；細胞残屑；ならびにウイルスが挙げられる。
【００５３】
「アイソクラチッククロマトグラフィー」は、本明細書において、対象とする期間の間に強度を変化させない溶媒を用いたクロマトグラフィーカラムの稼動を指す。
【００５４】
「本質的にアイソクラチックな洗浄液」は、本明細書において、組成および／またはｐＨがロード流体からわずかしか変化しない溶液を指す。
【００５５】
「ロード」は、本明細書において、対象とする生成物を含有する任意の材料を指す。「ロード流体」は、ロードを含有する任意の液体を指す。いくつかの実施形態では、「ロード流体」は、精製樹脂に曝される。いくつかの実施形態では、ロード流体は、細胞培養培地である。細胞培養培地は、澄ませることができる（例えば、細胞または細胞残屑を除去するために）。
【００５６】
「分配係数」（Ｋｐ）は、本明細書において、ｐＨおよび溶液組成の指定された条件下での、樹脂に吸収される生成物の濃度（Ｏ）と、溶液中の生成物の濃度（Ｃ）との平衡状態の比を指す。分配係数Ｋｐは、生成物吸着等温線にも関係する。分配係数Ｋｐは、非常に低い溶液濃度で、生成物吸着等温線の傾きに対応する。これは、以下のような最大能力に関係する：Ｋｐ＝Ｑ／Ｃ＝Ｑｍａｘ／ｋｄ、式中、Ｑｍａｘは、生成物についての樹脂の最大能力であり、ｋｄは、「樹脂−−生成物」相互作用についての解離定数である。いくつかの実施形態では、分配係数は、バッチ結合技法で測定される。アイソクラチッククロマトグラフィーなどの他の技法も使用することができる。
【００５７】
「タンパク質」または「ポリペプチド」は、本明細書において、ペプチド結合を介して一緒に連結されたアミノ酸の連続鎖を含む任意の分子を指す。この用語は、任意の長さのアミノ酸鎖を指すのに使用されるが、当業者は、この用語は、非常に長い鎖に限定されず、ペプチド結合を介して一緒に連結された２つのアミノ酸を含む最小鎖を指すことができることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、タンパク質は、５、１０、２０、５０、１００、または２００超のアミノ酸を含む鎖を有する。タンパク質は、１つまたは複数の別個のアミノ酸鎖を含むことができる。タンパク質には、天然に産生されるタンパク質、または原核細胞もしくは真核細胞（例えば、初代細胞、もしくは細胞系）内で産生される組換えタンパク質が含まれる。
【００５８】
「精製ユニット」は、本明細書において、例えば、タンデム精製システムにおいて、精製の１つのモードを実施するのに使用することができる物理的なユニットを指す。いくつかの実施形態では、精製ユニットは、樹脂を含む容器（例えば、カラム）である。いくつかの実施形態では、精製ユニットはフィルターである。本明細書での精製技法は、例えば、カラム形式、膜形式、および／または拡張吸着流動床（ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｂｅｄ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）形式で実践することができる。
【００５９】
「樹脂」は、本明細書において、不純物から生成物を分離するのに使用することができる任意の物質を指す。いくつかの実施形態では、樹脂は、免疫グロブリンに結合する樹脂（例えば、プロテインＡ樹脂）である。いくつかの実施形態では、樹脂は、イオン交換樹脂（例えば、陰イオン交換樹脂、または陽イオン交換樹脂）である。
【００６０】
「小モジュラー免疫薬」または「ＳＭＩＰ（商標）」は、抗原などの同族構造についての結合ドメイン、免疫グロブリンヒンジ領域（これは、野生型配列と比べてアミノ酸置換を含んでいても、含んでいなくてもよい）、ならびに免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメインを有する結合ドメイン−免疫グロブリン融合タンパク質を指す。小モジュラー免疫薬は、例えば、米国特許公開第２００３／１３３９３９号、同第２００３／０１１８５９２号、同第２００５／０１３６０４９号、ならびにＷＯ０２／０５６９１０、ＷＯ２００５／０３７９８９、およびＷＯ２００５／０１７１４８に記載されている。
【００６１】
「弱い分配モード」は、本明細書において、配合物中に含有される少なくとも１つの生成物、および少なくとも１つの混入物または不純物がともに、クロマトグラフィー樹脂に結合する生成物配合物分離技法を指す。弱い分配モードでの生成物の結合は、クロマトグラフィーの樹脂または培地１ｍＬ当たり、少なくとも１ｍｇの生成物である。一般に、弱い分配モードについての生成物分配係数は、少なくとも０．１である。「弱い分配モード」は、アイソクラチック操作である。弱い分配モードを使用する分離は、米国公開第２００７／００６０７４１号に記載されており、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれている。
【００６２】
タンデム方法およびシステム
本開示は、２つ以上の精製ユニットが、タンデムで、すなわち、ロード流体を複数の精製ユニットに連続して曝すことができるように稼動される方法およびシステムを提供する。いくつかの実施形態では、精製システムは、第１の樹脂および第２の樹脂を含み、第２の樹脂は、弱い分配モードで稼動することができるもの（例えば、イオン交換樹脂）である。例示的なタンデムシステムを図１に示す。この例示的なシステムでは、プロテインＡカラム、ＡＥＸカラム、およびＶＲＦフィルターが連結されている。
【００６３】
タンデムシステムにおけるバルブは、精製ユニットの任意の組合せをインラインで稼動させるように配置することができる。例えば、第１の樹脂の下流に配置されるバルブは、ロード流体が第１の樹脂に施されている間閉じたままであり、第１の樹脂が洗浄された後、開いたままであることができる。精製ユニットを通過する流体は、要望通りに、後続の精製ユニットに向け（例えば、洗浄、平衡化、ロードし、もしくは後続の精製ユニットから溶出するために）、または廃棄することができる。精製ユニットは、専門家によって必要に応じて、かつ／または要望通りに、別個に洗浄および／または再生することができる（例えば、個々のユニットを通じてのみ向けられる流体、または上流ユニットからの流体を用いて）。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるシステムは、疑似移動床システムである。
【００６４】
連続して複数の精製ユニットを稼動させると、システム内で望ましくないレベルの圧力または圧力の変化が生じる場合がある。圧力の増大は、様々な手法によって軽減することができる。ポンプは、１つまたは複数の精製ユニットの前、間、および／または後に、流れを促進するために配置することができる。粘度を低減し、かつ／または沈殿し、流れを妨げ、システム内の圧力を増大させる場合のある不純物を除去するために、流体を処理することができる。いくつかの実施形態では、システム内の流体は、粘度を低減するために加熱される。いくつかの実施形態では、第１の精製ユニットの溶出液が、粘度を低減するために加熱される。
【００６５】
タンデムシステムが稼動する間に沈殿する場合のある不純物を除去するために、ロード流体または下流流体を処理することによって、流体から物質を分離することができる。いくつかの実施形態では、ポリマー凝集剤が使用される。ポリマー凝集剤の例には、プロタミンスルフェート、キトサン、ＤＥＡＥデキストラン、アクリルアミド系ポリマー、ポリエチレンイミン、およびポリエチレンアミンが含まれる。いくつかの実施形態では、不溶性塩を形成する陽イオンと陰イオンの組合せ、例えば、１×１０−４未満の溶解度積定数を有する塩（例えば、ＣａＰＯ４）を形成する陽イオンおよび陰イオンが、流体から不純物を除去するのに使用される。不純物を除去する方法は、例えば、米国公開第２００７／００６６８０６号に記載されており、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれている。固体の除去は、濾過によっても実現することができる。沈殿する不純物を除去するための方法のいずれか１つ、または組合せを使用することができる。いくつかの実施形態では、ロード流体（例えば、培地）は、沈殿する場合のある不純物を除去するために、第１の樹脂に曝される前に処理される。
【００６６】
タンパク質精製方法の実施の多くでは、ウイルス不活性化または除去ステップが使用される。ウイルスを不活性化するための一方法は、流体のｐＨを下げることである。いくつかの実施形態、例えば、低ｐＨが隣接する精製ステップと適合しない実施形態では、ウイルスは、ウイルス低減フィルターに流体を通過させることによって、かつ／または界面活性剤不活性化によって除去される。様々な界面活性剤のいずれも、例えば、ＴｗｅｅｎまたはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を、ウイルス不活性化に使用することができる。いくつかの実施形態では、ロード流体（例えば、培地）は、ウイルスを除去または不活性化するために、第１の樹脂に曝される前に処理される。
【００６７】
弱い分配
本明細書で提供される方法の様々な実施形態では、１つまたは複数の精製ステップは、弱い分配モードでクロマトグラフィーを使用する。弱い分配モードでは、生成物含有流体は、樹脂を通過させられ、生成物および不純物がともに樹脂に結合する。しかし、不純物は、生成物よりしっかりと結合する。ローディングが続くにつれて、結合していない生成物が樹脂を通過し、カラム流出物中に回収される。いくつかの実施形態では、樹脂が洗浄されて（例えば、アイソクラチック洗浄液で）、追加の弱く結合された生成物が回収される。
【００６８】
弱い分配モードは、樹脂が、樹脂１ｍＬ当たり少なくとも１ｍｇの生成物（例えば、１ｍＬ当たり少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、または６０ｍｇ）に結合する条件によって定義される。弱い分配モードは、少なくとも０．１の分配係数（Ｋｐ）によっても定義される。いくつかの実施形態では、弱い分配モードでの稼動は、約０．２〜２０（例えば、０．２〜１０、または０．５〜５）の範囲内のＫｐによって定義される条件下で稼動させることを含む。弱い分配と対照的に、結合−溶出モードは、一般的に２０超のＫｐによって定義され、生成物を溶出させるのに、ロード後の緩衝液組成の変化を使用する。フロースルーモードは、一般的にＫｐ＜０．１によって定義され、生成物を回収するのにアイソクラチック洗浄液を使用する。
【００６９】
Ｋｐは、平衡状態における吸着されたタンパク質濃度と遊離タンパク質濃度の比として、バッチ結合実験から計算される。Ｋｐは、平衡化緩衝液、ローディング緩衝液、および洗浄緩衝液中のｐＨおよびイオンの濃度の関数である。いくつかの実施形態では、弱い分配モードについて、ＡＥＸステップは、Ｋｐ＝１とＫｐ＝３の間で稼動される（米国公開第２００７／００６０７４１号、およびＫｅｌｌｅｙ  ＢＤ、Ｔｏｂｌｅｒ  ＳＡ、Ｂｒｏｗｎ  Ｐ、Ｃｏｆｆｍａｎ  ＪＬ、Ｇｏｄａｖａｒｔｉ  Ｒ、Ｉｓｋｒａ  Ｔ、Ｓｗｉｔｚｅｒ  Ｍ、Ｖｕｎｎｕｍ  Ｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．２００８年１０月１５日；１０１（３）：５５３〜６６を参照）。
【００７０】
弱い分配のための適切な稼動条件は、生成物を精製するために選択される樹脂の選択に依存する。条件として、ｐＨレベル、およびイオン強度、塩濃度、および／または賦形剤レベルを挙げることができる。
【００７１】
いくつかの実施形態では、弱い分配のための条件は、スクリーニングによって同定される。スクリーニングとして、バッチ結合試験またはカラム結合試験を挙げることができる。カラム結合試験として、勾配溶出試験またはアイソクラチック溶出試験を挙げることができる。例えば、当業者は、精製されている特定のタンパク質、および同定されている稼動条件について、どの緩衝液または塩が適切であるかを判定することができる。次いで、例えば、精製される生成物および不純物を含むロード流体が施されたカラムに、ある勾配の選択された緩衝液または塩を通すことによって、選択された緩衝液または塩の最適濃度を判定することができる。カラムの溶出物の画分を収集し、分析することによって、生成物の結合が樹脂１ｍＬ当たり少なくとも１ｍｇの生成物である、または代わりに、生成物についての分配係数が少なくとも０．１である緩衝液または塩の濃度を判定することができる。いくつかの実施形態では、分配係数は、バッチ結合実験において、３〜６の相比（液体の量と樹脂の量）で、１〜１０ｍｇ／ｍＬのロードチャレンジの間で測定される。
【００７２】
稼動条件が決定されると、弱い分配条件で樹脂に施される流体（例えば、プロテインＡなどの前の樹脂の溶出液）の条件を、本明細書に記載されるように、それに応じて調整することができる。流体が樹脂を通過した後、樹脂は、ある量の本質的にアイソクラチックな洗浄液で任意選択により洗浄される。精製生成物は、いずれの本質的にアイソクラチックな洗浄液からも得ることができ、ロードサイクルの間のカラム流出物からの精製生成物とともにプールすることができる。任意選択の洗浄ステップの後に、例えば、固相表面上の不純物の蓄積を最小限にし、かつ／または樹脂を安定化させて生成物に微生物が混入するのを回避するために、樹脂を任意選択によりストリップ、または再生することができる。
【００７３】
高いロード濃度およびロード量が、弱い分配モードで可能である。一実施形態では、ロード流体中の生成物の濃度は、ロード流体１ｍＬ当たり少なくとも１ｍｇの生成物であり、別の実施形態では、ロード流体中の生成物の濃度は、ロード流体１ｍＬ当たり少なくとも５ｍｇの生成物、別の実施形態では、ロード流体１ｍＬ当たり少なくとも５０ｍｇの生成物、別の実施形態では、ロード流体１ｍＬ当たり少なくとも１００ｍｇの生成物である。精製生成物は、樹脂を通過した最大５０ＣＶのロード流体から回収することができる。
【００７４】
従来のバッチクロマトグラフィーモードにおける正確な配合を得るために、第１の樹脂（例えば、ｐｒｏＡ樹脂）の溶出液の滴定は、ｐＨフィードバックによって、またはプログラムされた比の緩衝液を送るポンプによって制御されるポンプの使用を必要とする場合がある。本明細書で提供される方法は、精製手順にロバスト性を加え、より複雑な制御機構の必要性を排除することができる。
【００７５】
本明細書で提供されるタンデム精製方法のある特定の実施形態では、生成物は、緩衝液を含む流体中で第１の樹脂から回収される。いくつかの実施形態では、第１の樹脂の溶出液のより早い画分が滴定液と混合される際に、ｐＨの揺れが起こる。条件は、滴定される溶出液はｐＨの揺れを示すが、溶出液のより遅い画分中の緩衝液が、第２の樹脂の性能に対するｐＨの揺れという負の作用を緩和するものとすることができることが発見された。
【００７６】
例えば、溶出の過程にわたってｐＨが一貫して低下する限り、ｐｒｏＡ溶出の最後のｐＨがタンデムプール（ｔａｎｄｅｍ  ｐｏｏｌ）の生成物の品質および回収率を決定することが見出された。反対に、ｐｒｏＡ溶出の最初における最適より高いｐＨは、生成物の品質および回収率に最小の作用をもたらす。したがって、本開示のいくつかの実施形態では、可変のｐＨにもかかわらず、タンデムｐｒｏＡ−ＡＥＸプロセスを稼動することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、このような方法におけるポンプ速度を変更する必要がない。
【００７７】
上記に言及したように、分配係数、Ｋｐは、ｐＨおよび溶液組成（例えば、イオン強度および緩衝液組成）に関係する。イオン交換樹脂に曝すための流体を調製するのに使用される滴定液に塩を添加すると、様々な滴定比にわたって一定の程度の結合強度が維持されることによって、精製のロバスト性が増大することが発見された。この原理は、タンデム法および非タンデム法に適用可能である。
【００７８】
さらなる実施形態では、Ｋｐの変化（ｋ）がある特定の量未満になるタンデム精製（例えば、ｐｒｏＡ−ＡＥＸ）を、溶出液と滴定液の様々な中和比（ｖ）で設計することができる。Ｋｐおよびｖに依存しないロバストな稼動ウインドウを、以下のように関数ｋとして記述することができる：
ｋ＝ＡＢＳ［Ｋｐ（ｖ＋Δｖ）−Ｋｐ（ｖ−Δｖ）］／Ｋｐ（ｖ）、％、これは、所与の稼動範囲（ｖ±Δｖ）内で、Ｋｐの絶対的な％変化の程度を示す。
【００７９】
例えば、いくつかの実施形態では、ｖが目標の５０％〜１５０％変化するとき、Ｋｐ（ｋ）の相対変化が１００％未満になるタンデムｐｒｏＡ−ＡＥＸは、様々な中和比（ｖ）およびパラメータの組合せで行われる。いくつかの実施形態では、タンデムｐｒｏＡ−ＡＥＸは、目標のｖの７５％〜１２５％の範囲内で、ｋ＜５０％の条件で行われる。いくつかの実施形態では、条件は、目標のｖの９０％〜１１０％の範囲内で、ｋ＜２０％をもたらす。
【００８０】
本明細書で提供される精製方法を改善するための別の態様は、タンパク質がｐｒｏＡから溶出される条件に関係する。高いｐＫａ（例えば、５．５以上）を有する緩衝液を酸性のｐｒｏＡ溶出緩衝液に添加すると、例えば、陰イオン交換樹脂への施用に備えて、引き続いて滴定液で中和する間のｐＨの変動に対する抵抗力がもたらされることが発見された。５．５以上のｐＫａを有する緩衝液を表Ａに列挙する。これらのいずれも、プロテインＡ溶出緩衝液中に使用することができる。
【００８１】
【表１−１】
0005980782.tif 000002
【００８２】
【表１−２】
0005980782.tif 000003
【００８３】
樹脂
結合−溶出樹脂（ｂｉｎｄ−ｅｌｕｔｅ  ｒｅｓｉｎ）、陰イオン交換樹脂、サイズ排除樹脂、疎水性相互作用樹脂、固定化金属親和性樹脂、およびヒドロキシアパタイト樹脂を含めた樹脂の様々な組合せを、本明細書で提供される方法（例えば、タンデム精製方法）において使用することができる。
【００８４】
使用することができる陰イオン交換樹脂には、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、トリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）基、４級アミノエチル（ＱＡＥ）基、および４級アミン（Ｏ）基などの置換基を有する樹脂が含まれる。
【００８５】
使用することができる陽イオン交換樹脂には、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、ホスフェート（Ｐ）、およびスルホネート（Ｓ）などの置換基を有する樹脂が含まれる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、セルロースイオン交換樹脂（例えば、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｌｔｄ．  Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ、Ｋｅｎｔ、Ｕ．Ｋから入手可能なＤＥ２３、ＤＥ３２、ＤＥ５２、ＣＭ−２３、ＣＭ−３２、またはＣＭ−５２）が使用される。精製に使用されるセファデックスベースのイオン交換体ならびに架橋イオン交換体として、例えば、ＤＥＡＥ−セファデックス、ＱＡＥ−セファデックス、ＣＭ−セファデックス、およびＳＰ−セファデックス、ならびにＤＥＡＥ−セファロース、Ｑ−セファロース、ＣＭ−セファロース、およびＳ−セファロース、ならびにセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。ＤＥＡＥおよびＣＭ誘導体化エチレングリコール−メタクリレートコポリマー、例えば、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）ＤＥＡＥ−６５０ＳまたはＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）ＤＥＡＥ−６５０Ｍ、およびＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）ＣＭ−６５０ＳまたはＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）ＣＭ−６５０Ｍなどは、Ｔｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａから入手可能である。
【００８７】
市販のプロテインＡクロマトグラフィーカラムとして、例えば、ＰＲＯＳＥＰ−Ａ（商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｕ．Ｋ．）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＡＳＴ  ＦＬＯＷ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）６５０ＭプロテインＡ（ＴｏｓｏＨａｓｓ  Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ．）、およびＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。
【００８８】
いくつかの実施形態では、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂が精製に使用される。ＨＩＣは、疎水性に基づいて分子を分離する。一般に、高塩濃度緩衝液中の試料分子がＨＩＣ樹脂上にロードされる。緩衝液中の塩は、水分子と相互作用することによって、溶液中の分子の溶液を低減し、それによって、試料分子中の疎水性領域を露出し、したがって試料分子は、ＨＩＣ媒体によって吸収される。分子がより疎水性であるほど、結合を促進するのに必要とされる塩がより少ない。したがって、生成物分子とＨＩＣ媒体の間の相互作用は、媒体のｐＨ、イオン強度、および塩濃度などの条件に依存する。使用することができる市販のＨＩＣ樹脂には、疎水性リガンド（例えば、アルキル基またはアリール基）が結合されるベースマトリックス（例えば、架橋アガロースまたは合成コポリマー材料）を含む樹脂が含まれる。例として、ＰｈｅｎｙｌＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、６ＦＡＳＴ  ＦＬＯ（商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＡＢ、スウェーデン）；Ｐｈｅｎｙｌ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＡＢ、スウェーデン）；Ｏｃｔｙｌ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＡＢ、スウェーデン）；Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤプロピルまたはＦＲＡＣＴＯＧＥＬ（商標）ＥＭＤフェニル（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）；ＭＡＣＲＯ−ＰＲＥＰ（商標）メチルまたはＭＡＣＲＯ−ＰＲＥＰ（商標）ｔ−ブチル支持体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＣＡ）；ＷＰ  ＨＩ−Ｐｒｏｐｙｌ（Ｃ３）（商標）（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｎ．Ｊ．）；およびＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）エーテル、フェニル、またはブチル（ＴｏｓｏＨａａｓ、Ｐａ．）が挙げられる。ＨＩＣは、弱い分配モードで実施することができる。
【００８９】
いくつかの実施形態では、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーが精製に使用される。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、マトリックスおよびリガンドの両方として、式［Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２］の不溶性ヒドロキシル化リン酸カルシウムを利用する。官能基は、正に帯電したカルシウムイオン（Ｃ−部位）と負に帯電したホスフェート基のクラスター（Ｐ−部位）の対からなる。生成物とヒドロキシアパタイト媒体の間の結合相互作用は、媒体のｐＨ、イオン強度、および賦形剤濃度、例えば、ホスフェート濃度、カルシウム濃度、アルギニン濃度、グリシン濃度、およびＨＥＰＥＳ濃度などに依存する。様々なヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー樹脂が市販されている。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、弱い分配モードで実施することができる。
【００９０】
いくつかの実施形態では、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂が精製に使用される。ＩＭＡＣは、樹脂上に固定化されたキレート化遷移金属イオンと、対象とするタグ付けされた生成物上のヒスチジン残基のイミダゾール側鎖との間の相互作用に基づく。分子の分離は、ＩＭＡＣ樹脂上の金属群に対する、対象とするタグ付けされた生成物とカウンターリガンドとの間の競合の結果として起こる。生成物と金属が装填されたＩＭＡＣ媒体との間の結合相互作用は、媒体のイミダゾール濃度などのカウンターリガンドレベル、およびイオン強度などの条件に依存する。様々なＩＭＡＣ樹脂が市販されている。ＩＭＡＣは、弱い分配モードで実施することができる。
【００９１】
上記樹脂のいずれかを使用する精製は、当業者に公知の条件下で、本明細書で提供される本発明の方法と組み合わせて行うことができる。
【００９２】
例えば、ｐｒｏＡ樹脂を様々な条件下で稼動させることができる。いくつかの実施形態では、ｐｒｏＡカラムは、ロード流体と接触させる前に、１つまたは複数の溶液でフラッシュおよび平衡化される。このような溶液は、例えば、緩衝液（例えば、トリス、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ヒスチジン、もしくはホスフェート、例えば、１〜５００ｍＭ、２５〜１００ｍＭの間、もしくは５０ｍＭ）、および／または塩（例えば、ＮａＣｌ、ＮａＰＯ４、酢酸ナトリウム、もしくはＣａＣｌ２、例えば、０〜２Ｍ、もしくは５〜２５０ｍＭの間）を含むことができる。平衡溶液のｐＨは、一般に、３．５〜１０（例えば、ｐＨ６．０〜８．０の間）である。
【００９３】
ｐｒｏＡ樹脂をロード流体と接触させた後、結合された樹脂を洗浄することができる。洗浄液は、緩衝液（例えば、トリス、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ホスフェート、もしくはヒスチジン、例えば、１〜５００ｍＭの間）、および／または塩（例えば、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２、ＮａＰＯ４、もしくは酢酸ナトリウム、例えば、０〜２Ｍの間）、および／または添加剤（例えば、グアニジン、尿素、スクロース、アルギニン、もしくはアルギニン誘導体）、および／または溶媒（例えば、エタノール、アセトニトリル、もしくはポリエチレングリコール）を含むことができる。洗浄液は一般に、３．５〜１０の間のｐＨ（例えば、４．５〜８．０のｐＨ）を有する。いくつかの実施形態では、樹脂は、樹脂を平衡化するのに使用されるのと同じ溶液で洗浄される。
【００９４】
ポリペプチドは、ｐＨ、塩のタイプ、塩濃度、溶媒のタイプ、溶媒濃度、置換剤のタイプ、置換剤濃度、またはこれらの組合せの段階変化または勾配変化を使用して、ｐｒｏＡ樹脂から溶出することができる。一般に、ｐｒｏＡ樹脂から生成物を溶出するために、樹脂は、溶出緩衝液と接触させられる。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、塩（例えば、ＮａＣｌまたはＣａＣｌ２、例えば、１〜１００ｍＭ）を含有する。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、グリシン、酢酸、またはクエン酸（例えば、２０ｍＭ〜２５０ｍＭ）を含有することができる。溶出緩衝液は、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ、例えば、１０〜１００ｍＭ）も含有することができる。溶出緩衝液は、酢酸（例えば、２０ｍＭ〜約５０ｍＭ）、添加剤（例えば、グアニジン、尿素、もしくはスクロース）、および／または溶媒（例えば、エタノール、アセトニトリル、ポリエチレングリコール、例えば、１〜１０％の溶媒、例えば、５％の溶媒）も含有することができる。溶出緩衝液のｐＨは、約２．０〜約４．０の範囲となり得る。いくつかの実施形態では、勾配溶出（例えば、ｐＨ５．０〜ｐＨ３．０の勾配溶出）を生じさせるのにｐＨを変更することができる（例えば、徐々に）。一実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは、約３．０である。樹脂から回収した後、本明細書に記載されるように滴定液を添加することによって、例えば、ｐＨを６．０〜８．０に調整することによって溶出液を中和することができる（低ｐＨが溶出に使用される場合）。
【００９５】
精製のための生成物
本明細書で提供される方法およびシステムは、天然に存在するタンパク質、融合タンパク質、Ｆｃ含有タンパク質、免疫複合体、サイトカイン、成長因子、Ｇタンパク質共役受容体、インターロイキン、ホルモン、および酵素を含めた、対象とする様々な生成物の精製（例えば、商業スケールの精製）に使用することができる。いくつかの実施形態では、精製を受けるタンパク質は、１つまたは複数の定常抗体免疫グロブリンドメイン（複数可）を含むことができる。いくつかの実施形態では、タンパク質は、単一または複数の可変抗体免疫グロブリンドメイン（複数可）も含むことができる。Ｆｃ含有タンパク質は、抗体を含むことができる。タンパク質は、培養された組換え原核生物宿主細胞系または組換え真核生物宿主細胞系を含めた様々な源に由来することができる。
【００９６】
本明細書で提供される方法によって精製するためのタンパク質（例えば、抗体）は、それだけに限らないが、免疫動物の血清、腹水、ハイブリドーマ上清または骨髄腫上清、タンパク質分子を発現する組換え細胞系を培養することから得られる馴化培地、およびタンパク質産生細胞の細胞抽出物から得られる馴化培地を含めた、いくつかの源からのものとすることができる。いくつかの実施形態では、様々なタンパク質産生組換え細胞系の馴化細胞培地からのタンパク質が精製される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、市販の配合物からのものである。いくつかの実施形態では、抗体が精製される。
【００９７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって精製するためのタンパク質は、組換え細胞内の発現によって産生される。多種多様な細胞を、組換えタンパク質を生成するのに使用することができる。対象とするタンパク質（例えば、モノクローナル抗体）を発現するように組換えＤＮＡで形質転換することができる任意の細胞を、本開示の方法において使用することができる。細胞は、様々な種、例えば、植物、酵母、線虫、蠕虫、昆虫、両生類を含めた真核生物種、または哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類、ヒツジ、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、もしくはげっ歯類源由来とすることができる。特定の実施形態では、細胞は、ヒトまたはげっ歯類由来である。特定の実施形態では、細胞は、ハムスター由来（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞）である。使用することができる哺乳動物細胞の例として、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫系（ＮＳＯ／Ｉ、ＥＣＡＣＣ番号：８５１１０５０３）；ＳＰ２／０；Ｂａｌｂ／ｃ  ３Ｔ３；ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６  （ＣｒｕＣｅｌｌ、Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ））；ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚腎臓系（２９３細胞、または懸濁培養で増殖させるためにサブクローニングされた２９３細胞、（Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．、３６：５９（１９７７））；仔ハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６（１９８０）；ＧＳ−ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−Ｓ）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、２３：２４３〜２５１（１９８０））；ラットハイブリドーマＹＢ２／０（Ｓｈｉｎｋａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６〜３４７３、２００３）；サル腎細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１  ５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、３８３：４４〜６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；ならびにヒト肝細胞癌系（Ｈｅｐ  Ｇ２）が挙げられる。いくつかの適当な細胞系は、アメリカタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａなどの受託機関から得ることができる。使用することができる植物細胞の例には、コウキクサ（Ｌｅｍｍｎａ  ｍｉｎｏｒ）（ウキクサ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌａｎｉａ）、およびヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）（コケ）の細胞が含まれる。使用することができる昆虫細胞の例には、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ９およびＳｆ２１）、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）（ＴｎｉおよびＢＴＩ−Ｔｎ  ５Ｂ１−４）、ならびにヨトウガ（Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）（Ｍｂ）の細胞が含まれる。有用な真菌細胞には、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞、およびサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞が含まれる。
【実施例】
【００９８】
（実施例１）
プロテインＡステップ、陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーステップ、およびウイルス低減フィルター（ＶＲＦ）のタンデム稼動
プロテインＡカラム、ＡＥＸカラム（弱い分配モードで実行）、およびウイルス低減フィルター（ＶＲＦ）のタンデム稼動（図１）を、ＭＡｂおよび小モジュラー免疫薬を精製するために実験室スケールで実施した。ポンプＡおよびＢは、一定の比の流量で稼動する。ミキサーは、ポンプＡによって送られるＰｒｏＡ流出物の、ポンプＢによって送られる５〜２０％ｖ／ｖの滴定液との完全な混合を保証する。バルブ１〜３は、プロセスの間、単位操作の任意の組合せをインラインとすることを可能にする。例えば、ｐｒｏＡロードステップおよび洗浄ステップの間、ｐｒｏＡカラムのみがインラインであり、ポンプＢはアイドル状態である。１ｐｒｏＡカラム体積（ＣＶ）の最終的な高ｐＨ／低濃度塩ｐｒｏＡ洗浄の後、バルブ２および３が開き、ポンプＢは、中和緩衝液（滴定液）をｐｒｏＡ流出物に添加し始め、これは、ＡＥＸおよびＶＲＦを平衡化するのに使用される。ｐｒｏＡ流出物は、中和されている最中であり、ＴＭＡＥ洗浄液として使用されるので、低ｐＨ溶出および溶出後のｐｒｏＡ洗浄の一部の間、３つすべての単位操作はインラインのままである。あるいは、ｐｒｏＡカラムの溶出後洗浄液を廃棄に向けることができ、ＴＭＡＥを専用の緩衝液で洗浄することができる。ｐｒｏＡカラムおよびＡＥＸカラムは、別個に再生される。しかし、エタノール含有保存緩衝液を、タンデムで両カラムに適用することができる。
【００９９】
溶出の間のＵＶ、ｐＨ、および圧力のトレースを表している、タンデムｐｒｏＡ−ＡＥＸ−ＶＲＦクロマトグラムの例を図２に示す。圧力の急激な変化は、システムコンポーネントのオンオフのスイッチングによるものであった。図３に示すように、溶出の間の圧力の段階的な上昇は、ＶＲＦ膜を通過するピーク頂点と相関した。溶出後、ＶＲＦにわたる圧力は、ほとんど溶出前のレベルに戻り、圧力上昇は、生成物ピークの粘度によるものであり、膜の詰まりによるものでなかったことを示した。
【０１００】
３つの単位操作を含むタンデムプロセスを、いくつかのモノクローナル抗体（ＭＡｂ）および小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ（商標））について実行して成功し、インライン中和の実現可能性を実証した。意外にも、システムは、ｐｒｏＡのピーク沈殿によって、容認しがたい高い背圧を経験しなかった。再使用で圧力の上昇はまったく観察されず、ファウリングが存在しないことを示した。
【０１０１】
（実施例２）
凝集させたｐｒｏＡロードを用いたタンデムｐｒｏＡ−ＡＥＸプロセス
生成物、ＨＭＷ、および他の不純物の沈殿は、ｐｒｏＡのピーク溶出および中和の間に起こることが多い。このプロセスは制御することが困難である。固体は、その存在がＡＥＸ樹脂のファウリングを引き起こすので、プロセスのストリームから除去されるべきである。いくつかの実施形態では、除去は、０．２μｍのフィルターを通じた濾過によって達成される。
【０１０２】
固体粒子の核形成および成長は、進行して完了するのに場合により時間のかかる、動態学的に制御されるプロセスである。ｐｒｏＡピークのプール中和（ｐｏｏｌ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）とＡＥＸローディングの間に大きなタイムラグが存在するので、核形成の継続時間は、通常のバッチクロマトグラフィーに影響しない。しかし、タンデム稼動において（例えば、図１に示すような）、沈殿が０．２μｍのフィルターの下流で発生する場合があり、これは、ＡＥＸカラムおよび／またはＶＲＦに有害となる。さらに、これがミキサーを通じて移動する際のｐｒｏＡのピーク頂点の中和により、沈殿物質の濃縮されたバンドが生じることが予期され、これは、フィルターまたは他の下流のコンポーネントを塞ぐ場合がある。したがって、中和されたｐｒｏＡピークの沈殿を最小限にする、ある特定のステップを、ｐｒｏＡカラムの上流に導入することができる。
【０１０３】
馴化培地の凝集は、別個に、またはセントレート（ｃｅｎｔｒａｔｅ）のパッド濾過と組み合わせて、中和後のｐｒｏＡピーク頂点における濁度を著しく低減することが発見された。濁度自体は、詰まりの正確な予測因子ではないが、これは、固体の濃度の好都合な代用測定として役割を果たす。過剰な背圧を伴うことなく、凝集された物質を処理することが可能であったので、濁度を低減することによって、凝集およびパッド濾過は、インライン中和を可能にした可能性がある。以下に説明する実験では、先にパッド濾過された調整培地を、３０ｍＭのＣａＣｌ２、２０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、４０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５と１時間混合することによって凝集させ、その後、遠心分離することによって形成された固体を除去した。対照と比較した場合、凝集された物質は、はるかにきれいなｐｒｏＡピーク画分を生じた（図４Ａおよび図４Ｂ）。本実施例において説明するすべてのタンデム実験では、このようにして凝集されたＣＭを使用した。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）または他の凝集剤を使用することなどの凝集の他の方法も使用することができる。凝集およびパッド濾過はともに、高濃度で、かつｐＨ変化の間に凝集する傾向がある脂質などの疎水性調整培地成分の除去の直交法であると推測することができる。
【０１０４】
（実施例３）
エンベロープウイルスを不活性化するために、ｐｒｏＡロードが溶媒−界面活性剤混合物と処理されるタンデム稼動
本明細書で提供されるタンデム精製方法のいくつかの実施形態では、ウイルス不活性化のために保持される低ｐＨは使用されず、その理由は、いくつかの実施形態では、ｐｒｏＡ流出物は、これがミキサーを通じて移動する際に連続的に中和されるためである。したがって、エンベロープウイルスを不活性化するための代替ステップが必要となり得る。本開示は、溶媒−界面活性剤ウイルス不活性化ステップを、遠心分離による細胞除去の後であるが、ｐｒｏＡカラムを通過する前に組み込むことができることを示す。このステップのこのような配置は、ｐｒｏＡが、フロースルーおよび洗浄において界面活性剤を除去することができる結合溶出ステップであるので有益である。弱い分配性のＡＥＸステップは、選択吸着を通じて界面活性剤を除去することが予期されない。大きいミセル（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００について７０ｋＤａ超）は、膜によって保持されるので、ＵＦ／ＤＦステップによる界面活性剤の除去も非効率的である。同時に、界面活性剤は、細胞溶解、ならびに粘性ＤＮＡおよび他の不純物の放出を引き起こすので、細胞除去の前に添加されるべきでない。
【０１０５】
本実施例において説明されるすべての実験において、０．５％ｗ／ｖまたは０．２５％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を凝集された調整培地に添加した。界面活性剤の存在は、クロマトグラフィーステップの性能にインパクトを与えなかった。タンデムピーク画分中のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の濃度は、ＲＰ  ＨＰＬＣによって測定した。界面活性剤は、ロード中の０．５％ｗ／ｖからピーク頂点中の０．０１３５％ｗ／ｖまで、１．５ｌｏｇの低減で、タンデム稼動にわたって大部分除去された。
【０１０６】
（実施例４）
ｐｒｏＡピークからの生成物ストリームの滴定を伴う、ｐｒｏＡおよびＡＥＸクロマトグラフィーのタンデム稼動
本実施例は、ｐｒｏＡピークからの生成物ストリームの、これが固定された容積比の高ｐＨ溶液とともにカラムから溶出する際の滴定を説明する。これは、得られるプロセスストリームを、ＡＥＸでの弱い分配性のクロマトグラフィーを促進する特定の範囲のｐＨレベルおよび塩濃度レベルに移す。
【０１０７】
弱い分配性のＡＥＸクロマトグラフィーは、より弱い結合性の生成物を犠牲にして、高分子量（ＨＭＷ）種および宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）などのより強い結合性の不純物の保持力を達成するために、正確に配合された移動相を必要とする。結合強度は、熱力学的な分配係数、Ｋｐによって決定され、これは、平衡状態における吸着されたタンパク質濃度と遊離タンパク質濃度の比として、バッチ結合実験から計算される。Ｋｐは、ＡＥＸ平衡緩衝液、ローディング緩衝液、および洗浄緩衝液中のｐＨおよび陰イオン（一般的に［Ｃｌ−］）の濃度の関数である。Ｋｐ＝ｆ（ｐＨ、［Ｃｌ−］）の関数は、バッチ結合実験から経験的に導出される。
【０１０８】
従来のバッチクロマトグラフィーモードでは、ｐｒｏＡピークは、緩衝剤としてのグリシン、および下流のＡＥＸへの結合強度を制御する塩化物イオンの主要源である塩（ＮａＣｌ）を含有する低ｐＨ緩衝液で溶出される。プールされたピークは、所望のｐＨに到達するまで、濃縮された中和剤（高ｐＨトリス緩衝液）で滴定される。したがって、ＡＥＸロードのＫｐは、ｐｒｏＡ溶出緩衝液の正確な配合および滴定によって制御される。図１に示したようなタンデム配置では、ポンプＡおよびＢは、予めプログラムされた多様な比の緩衝液を送るように同調させることができる。あるいは、ポンプＢは、ミキサーの後のｐＨメーターからのフィードバックによって制御することができる。これらの実施形態では、ＡＥＸロード全体わたって一定のｐＨを生じさせることができるが、製造施設内で実施およびバリデートするのに高価となり得る。
【０１０９】
本開示によって提供されるタンデムプロセスの一例では、ポンプは、一定またはほぼ一定の比の流量で稼動する。高ｐＨの最終的なｐｒｏＡ洗浄緩衝液は、ｐｒｏＡカラムから出てくる際に低ｐＨ溶出緩衝液で置換されているので、溶出ストリームのｐＨは可変である。さらに、ｐｒｏＡリガンドおよび吸着された生成物はともに、溶出緩衝液中で酸を吸収する滴定可能残基を有する。これにより、ｐｒｏＡ溶出のｐＨが、生成物ピークより遅れる。したがって、ｐｒｏＡ溶出ストリームの組成は、ｐｒｏＡＷａｓｈ２緩衝液から、ピークの前縁部において緩衝能をまったく有さない溶出緩衝液まで、ピークの末端において改変されていない溶出緩衝液まで変化する。結果として、ｐｒｏＡ流出物が一定の比の高ｐＨ中和緩衝液で混合されるとき、ｐＨトレースは、ｐＨの揺れを示す。図５は、このｐＨの揺れを示す、分画されたｐｒｏＡピークの濃度およびｐＨのオフライン分析である。ポンプが一定の流量を搬送する場合、得られるｐＨは、ｐｒｏＡ溶出の過程にわたって変化する。
【０１１０】
図５に示したように、オフライン緩衝液滴定実験により、滴定される溶出緩衝液の最終的なｐＨは、約ｐＨ７．９で安定化することが正確に予測された。溶出緩衝液の早い画分は、酸をほぼ欠いており、結果として、中和緩衝液で過剰滴定された状態になった。ｐＨ８．３への結果として生じるｐＨ偏位がピーク頂点の間に起こった。このｐＨ偏位は、弱い分配モードで稼動する下流のＡＥＸカラムへの、影響されたｐｒｏＡピーク画分のより堅い結合を引き起こし、生成物回収に悪影響を与える。意外にも、溶出緩衝液のより遅い画分は、十分な緩衝能を含んでおり、したがって、予期されたｐＨレベルに中和され、より早くに結合された追加の生成物の脱離を引き起こし、許容される収率をもたらした。ＡＥＸカラムは、ｐＨが著しく変化したにもかかわらず、ＨＣＰの除去において順調に稼動し、許容されるレベルまでのプロテインＡを浸出した。したがって、タンデムｐｒｏＡ／ＴＭＡＥは、ＴＭＡＥを稼動させる間にｐＨが広く揺れたにもかかわらず、弱い分配性クロマトグラフィーの使用を可能にした。
【０１１１】
溶出の過程にわたってｐＨが一貫して減少する限り、ｐｒｏＡ溶出の最後のｐＨのみがタンデムプールの生成物の品質および回収率を決定することが見出された。反対に、ｐｒｏＡ溶出の最初における最適より高いｐＨは、生成物の品質および回収率に最小の作用をもたらす。したがって、本開示のいくつかの実施形態では、可変のｐＨにもかかわらず、タンデムｐｒｏＡ−ＡＥＸプロセスを稼動することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、このような方法におけるポンプ速度は一定である。
【０１１２】
（実施例５）
ＰｒｏＡおよびＡＥＸクロマトグラフィーのタンデム稼動のための、塩基性であり、塩を含有する滴定液の使用
ともに塩基性であり（ＡＥＸステップの稼動より約０．５ｐＨ単位上のｐＨレベル、および１００ｍＭ〜２Ｍの間の緩衝液濃度レベル）、塩を含有する、プロテインＡおよびＡＥＸのタンデム稼動のための滴定液の使用を試験した。条件は、滴定液を添加すると、広範囲の滴定液量添加の関数として、一定の（またはほぼ一定の）結合（Ｋｐ、分配係数のような測定基準によって測定した場合）を維持するような様式で、プロセス中間体のｐＨおよびプロセス中間体のイオン強度がともに上昇するように設計した。
【０１１３】
中和比（ｖ）とさらに呼ばれる、ポンプＡおよびＢ（例えば、図１に示した）からの流量の目標容積比を設定するために、ｐＨおよび塩化物濃度、［Ｃｌ−］、ならびにしたがってＫｐに対するｖの効果が、最初に求められなければならない。ｐＨは、ｖの関数、すなわち、ｐＨ＝ｆ（ｖ）であり、これは、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ−Ｈａｓｓｅｌｂａｃｈ方程式から計算し、溶出緩衝液を滴定することによって検証することができる。ｖの関数としての塩化物イオンの濃度、すなわち［Ｃｌ−］＝ｆ（ｖ）も、任意の比の緩衝液で計算することができる。得られるｖのｐＨおよび［Ｃｌ−］についての関数は、経験的に導出される関数、Ｋｐ＝ｆ（ｐＨ、［Ｃｌ−］）中に置換し、図６Ａに示すようにプロットすることができる。稼動の目標ｖは、所望のＫｐに基づいて選ばれる。Ｋｐ＝ｆ（ｖ）のこの形状は、現在の最新技術を反映する。したがって、関数のこの形状を生じさせるパラメータの組合せは、稼動の対照モードと呼ばれる。
【０１１４】
図６Ａに示した例では、低ｐＨ  ｐｒｏＡ溶出緩衝液は、ＮａＣｌを含有し、一方、中和緩衝液は、塩をまったく含有しない。したがって、ｖの増大とともに［Ｃｌ−］が降下する間、ｐＨは上昇し、Ｋｐが着実に増大する。稼動のこのモードは、所望のＡＥＸ性能を保証するために、正確で一定の中和比を維持するのに極めて重要となるので、課題を提示する。ポンプ性能が変わりやすい場合があるので、この精度は、製造スケールで達成することが困難となり得る。中和緩衝液中に塩を組み込むことによって、図６Ｂに示すように、Ｋｐ関数の形状を著しく変化させることができることが見出された。Ｋｐ関数のこの挙動は、添加される滴定液の量とともに、ｐＨおよび［Ｃｌ−］が同時に上昇することによるものである。より高いｐＨは、ＡＥＸへの結合をより強くし、一方、より高い［Ｃｌ−］は、反対の効果を有する。これらの２つの効果の和により、広範囲の滴定液添加において一定の結合強度の領域が生じる。Ｋｐ＝ｆ（ｖ）関数のこの形状を生じさせるパラメータの本発明の組合せは、本開示によって提供され、稼動のロバストモードと呼ばれる。図６Ａおよび図６Ｂに示した例は、滴定液に塩を添加すると、ｐｒｏＡカラム後のインラインでの緩衝液混合の精度に関して、タンデムプロセスがよりロバストになることを実証する。
【０１１５】
ロバストなタンデム稼動を視覚化する別の方法を、図７に表す。ハイスループットバッチ結合実験から得られる経験的なモデルＫｐ＝ｆ（ｐＨ，［Ｃｌ−］）は、一定の結合強度を生じさせるｐＨと［Ｃｌ−］の関係を示す等Ｋｐ線を描くことを可能にする。上記に論じた滴定モデル（図６Ａおよび図６Ｂ）から、中和されるｐｒｏＡ流出物のｐＨを、［Ｃｌ−］の関数としてプロットすることができる。現在の最新技術によれば、図７Ａに示したように、［Ｃｌ−］が上昇していると、ｐＨは降下していることになる。しかし、酸性ｐｒｏＡ溶出緩衝液がＮａＣｌも含有する塩基性中和緩衝液で滴定される場合、混合物中の塩化物イオン濃度は、ｖとともに直線的に上昇する。したがって、図７Ｂ中で総［Ｃｌ−］の関数としてプロットされる、滴定される溶出緩衝液のｐＨは、図６Ｂ中のｐＨ関数と同じ形状を有することになる。ｐＨ＝ｆ（［Ｃｌ−］）関数の一部は、等Ｋｐ曲線と重なることになる。重なりのこの領域において、％滴定液量の小さい変動は、等Ｋｐ線に沿ったシフトを引き起こし、それによって、ＡＥＸ樹脂への結合強度に影響しない。
【０１１６】
中和緩衝液中に塩を含まない稼動モード（図６Ａおよび図７Ａ、対照モード）と、塩を含む稼動モード（図６Ｂおよび図７Ｂ、ロバストモード）との間の明らかな差異を、治療剤ＭＡｂを用いて実証した。バッチクロマトグラフィーによるこの分子の精製は、ｐｒｏＡのプール中に高レベルのＨＭＷをもたらす。このＨＭＷは、弱い分配性ＴＭＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィーステップによって有効に除去される。したがって、ＨＭＷの除去を、タンデム稼動における純度のマーカーとして使用した。
【０１１７】
シミュレーションおよび実験で使用した緩衝液の組合せを表１に要約する。緩衝液組成は、ｖ＝１１．５％での稼動の両モードについて、同じＫｐ＝１．２５を生じるように選んだ。対照溶出緩衝液組成は、表３に示した、臨床的製造キャンペーンにおいて使用したものと非常に類似する。
【０１１８】
【表２】
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【０１１９】
図６に示した稼動の２つのモードのシミュレーションを、中心点（ｖ＝１１．５％）、過少滴定点（ｖ＝６．５％）、および過剰滴定点（ｖ＝１６．５％）で、合計６回の実行でタンデムを実施することによって実験的に検証した。
【０１２０】
対照モードおよびロバストモードについてシミュレートしたＫｐ関数の重ね合わせを図８に示す。定義により、両モードは、中心点において、生成物純度および回収率に関して同様に機能することが予期される。しかし、これらのＫｐ関数は、ｖの自由裁量で選んだ偏差の２つの両極端で劇的に相違する。例えば、ｖ＝６．５％（ポンプＢの流量の４６．５％の減少と等価）で、得られるＫｐは、対照モードにおける９１％の減少と比較して、ロバストモードでは、２８％しか減少しない。同様に、ｖ＝１６．５％（ポンプＢの流量の５２％の増加と等価）で、Ｋｐは、ロバストモードでは１５％しか降下しないが、対照モードでは１９７％上昇する。したがって、このモデルは、ロバストモードにおける、中和比の±５％の絶対変化の後の、生成物の品質および回収率の相対的に小さい変化を予測する。しかし、対照モードでは、５％の過少滴定は、ＨＭＷおよびＨＣＰのブレークスルーをおそらく引き起こす一方で、５％の過剰滴定は、生成物の回収率の損失をもたらす可能性がある。
【０１２１】
（実施例６）
様々な中和比（ｖ）、およびｖが目標の５０％〜１５０％変化するときに、１００％未満のＫｐ（ｋ）の相対変化をもたらすパラメータでのｐｒｏＡ−ＡＥＸタンデムステップの稼動
この実施例では、タンデムｐｒｏＡ−ＡＥＸステップを、様々な中和比（ｖ）、およびｖが目標の５０％〜１５０％変化するときに、１００％未満のＫｐ（ｋ）の相対変化をもたらすパラメータの組合せで行った。より正確には、条件は、目標ｖの９０％〜１１０％の範囲内で、ｋ＜２０％をもたらした。
【０１２２】
稼動パラメータは、溶出緩衝液および中和緩衝液のｐＨ、塩濃度、およびｐＫａである。本明細書に記載される方法の様々な実施形態は、ロバストプロセスは、ロバスト性ウインドウ内の目標ｖで稼動するべきであることを示す。いくつかの実施形態では、プロセスは、ロバスト性ウインドウの中心で稼動する。
【０１２３】
Ｋｐおよびｖの値に依存しないロバストな稼動ウインドウを定義するために、関数、ｋ＝ＡＢＳ［Ｋｐ（ｖ＋Δｖ）−Ｋｐ（ｖ−Δｖ）］／Ｋｐ（ｖ）、％、を使用することができ、これは、所与の稼動範囲（ｖ±Δｖ）内のＫｐの絶対的な％変化の程度を示す。
【０１２４】
例えば、実施例５で論じた条件について、Δｖが１０％に設定される場合、ｋ関数は、
ｋ２０＝ＡＢＳ［Ｋｐ（０．９ｖ）−Ｋｐ（１．１ｖ）］／Ｋｐ（ｖ）、％、
となり、これは、図９にプロットされている。このグラフに示したロバストな稼動ウインドウは、ｋ２０が＜２０％である場合のｖの範囲に及ぶ。ｖ＝１１．５％での稼動のロバストモードの中心点は、ｋ＝０に対応し、これを稼動するのに最も好ましいスポットにしている。対照的に、対照モードの中心点は、ｋ＝６１％を生じる。これは、過少滴定（１０％）条件から過剰滴定（１０％）条件までシフトすることによって、ＴＭＡＥロードのＫｐは、対照モードでは６１％シフトすることになる一方で、ロバストモードでは一定のままであることを意味する。ロバストな稼動ウインドウの外側でタンデムプロセスを稼動させると、中和比の許容される偏差が著しく制限されることになり、プロセスをより失敗する傾向にすることが予測される。
【０１２５】
タンデム稼動の任意の所与のレシピについて、Ｋｐ関数が未知であっても、実施例５に論じたロバストモードの実行範囲は、実験的に求めることができる。例えば、Ｋｐおよびｋはともに、ｖが目標の９０％、１００％、および１１０％に設定される、一連の３つのバッチ結合実験で測定することができる。
【０１２６】
実験セットアップは、図１による、抗ＩＬ−１３抗体を精製するための２つのカラムのタンデムシステムを基にした。これは、１．１ｃｍ×２３ｃｍのｐｒｏＡ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔカラム、その後の１０ｃｍ２、０．２μｍのＳｔｅｒｉｖｅｘフィルターユニット、その後の１．６ｃｍ×１４ｃｍのＡＥＸ  ＴＭＡＥカラムからなった。中和後の沈殿を最小限にするために、調整培地をリン酸カルシウムで凝集させ、パッドで濾過した。インラインでのｐｒｏＡピーク中和は、全流量の６．５％〜１６．５％の範囲内で、ある特定の比のポンプＢからの流量を送るようにＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステムをプログラミングすることによって達成した。この実験では、ＶＲＦユニットを迂回した。ＴＭＡＥ後に画分を採取して、オフラインでｐＨおよび濃度を測定した。画分中のＨＭＷをＳＥ  ＨＰＬＣによって評価した。ＨＣＰのＥＬＩＳＡおよび浸出したｐｒｏＡのＥＬＩＳＡを、画分のプールに対して実施した。
【０１２７】
溶出ピーク領域を示す、プロセスのクロマトグラムの一部を図１０に示す。タンパク質ブレークスルーの程度は、対照中和モードおよびロバスト中和モードを代表する各群内で予期された通りであった。２つの群の間のピーク保持時間の著しいシフトは、ｐｒｏＡ溶出緩衝液の異なるｐＨに起因した。対照モードは、ロバストモードより低いｐＨの溶出緩衝液を使用し（表１を参照）、ｐｒｏＡカラムからのより早い溶出、およびＴＭＡＥカラムを通じた生成物のより早いブレークスルーをもたらす。ＴＭＡＥ後の画分におけるオフライン測定を、図１１Ａ〜１１Ｆに示す。予測されたように、稼動のロバストモードは、ｖによってあまり影響されない。図１１Ｂ、図１１Ｄ、および図１１Ｆは、非常に類似したｐＨ、濃度、およびＨＭＷのプロファイルを有するように思われる。反対に、対照モードは、ｖが６．５％〜１１．５％〜１６．５％に変化する際に、ＨＭＷブレークスループロファイルおよび生成物溶出プロファイルの明確なトレンドを示した（図１１Ａ、図１１Ｃ、図１１Ｅ）。過少滴定（ｖ＝６．５％、図１１Ａ）は、ＴＭＡＥ樹脂に生成物および不純物が有効に結合するには低すぎるｐＨレベルをもたらした。結果として、生成物ピークは非常に鋭く、ＨＭＷは、溶出の早期にブレークスルーした。過剰滴定（ｖ＝１６．５％、図１１Ｅ）は、反対の結果、すなわち、ＨＭＷのブレークスルーはまったくないが、非常に広い溶出および低い生成物回収率をもたらした。
【０１２８】
中心点で対照を実行した際の、より早いＨＭＷのブレークスルーは（ｖ＝１１．５％、図１１Ｃ）、ｐＨ＝２．８でｐｒｏＡカラムから溶出する非常に濃縮されたバンドのタンパク質に、ＴＭＡＥ樹脂が対処することができないことによって生じた孔の閉塞などの非平衡状態作用に起因する可能性がある。
【０１２９】
図１１中の実行からの純度の結果を表２に要約する。予測されたように、過少滴定された対照を実行すると、最高レベルの不純物をもたらした。しかし、アッセイの感受性の限界のために、他のプールを区別することが不可能であった。
【０１３０】
【表３】
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【０１３１】
実験結果により、ロバスト性モデルからの予測が確認された。タンデムの性能は、塩が中和緩衝液に添加された場合、実際によりロバストであることが示された。
【０１３２】
（実施例７）
プロテインＡからの溶出
溶出条件付近のｐＫａを有する緩衝液（通常、酸性条件で、またはこの条件付近で稼動される）、およびまた、後続のＡＥＸステップの稼動付近のｐＫａを有する緩衝液（通常、中性または塩基性条件で、またはこの条件付近で稼動される）を含有する溶液でプロテインＡから溶出させると、プロテインＡから溶出する際のプロセスストリームの中和の間のｐＨ偏位が防止されることが発見された。
【０１３３】
一定の中和比を伴ったタンデム稼動では、ｐｒｏＡ溶出の前縁部は、目標より高いｐＨを場合により有する。ｐＨの上昇は、滴定可能なｐｒｏＡリガンドおよび結合生成物を含有するロードされたｐｒｏＡカラムを溶出緩衝液が通過する際に、溶出緩衝液による緩衝能が喪失することによって引き起こされる。高ｐＨ中和緩衝液が、酸が枯渇した溶出緩衝液に添加されると、ｐＨは、ほとんど中和緩衝液のレベルまで上昇し、ｐｒｏＡカラム上のすべての残基が滴定され、酸含有溶出緩衝液がミキサー中に現れるまで高い状態に留まる。
【０１３４】
通常、ｐＨ偏位は、タンパク質のフロントがＡＥＸを通過する直前に起こり、タンデムプールの品質または回収率に影響しないが、場合により、ｐＨの上昇がピーク収集の間に観察される。ｐＨの上昇は、目標ｐＨの中和される溶出緩衝液がカラムを通過する前に、ＡＥＸが高度に結合性の条件でロードされていることを意味する。いくつかの場合では、このｐＨ偏位は、樹脂ビーズの表面への生成物またはＨＭＷ不純物の非可逆性結合を引き起こし、孔閉塞およびＡＥＸの結合能力の早すぎる喪失をもたらす場合がある。
【０１３５】
ｐＨの揺れを緩和するために、ロバストモードにおいて２０ｍＭのトリス−ＨＣｌを溶出緩衝液に添加し、表１に列挙した目標のｐＨ＝３．７にｐＨを調整した。酸性化されたトリスは、これがｐｒｏＡカラムを通過する際にプロトン化された状態に留まり、中和の間の過剰の塩基性トリスに対する抵抗力をもたらした。
【０１３６】
図１１に示した、タンデム画分におけるオフラインｐＨ測定の比較は、ｐＨの揺れの程度に対するトリス−ＨＣｌの効果を実証する。ロバストな中和の実行は、対照の実行より軽度のｐＨトレンドを示す。例えば、中心点での実行（ｖ＝１１．５％、図１１Ｃ、Ｄ）において、ｐＨは、ロバストモードでは、ピーク溶出の間に０．１単位しか減少せず、一方、対照モードでは０．３単位減少した。すべてのロバストな実行では、ｐＨの揺れは、タンパク質濃度がピークとなるとき、大部分は終わっているが、対照の実行では、ｐＨは、目標より依然としてはるかに高い。
【０１３７】
（実施例８）
バッチｐｒｏＡクロマトグラフィーとその後のバッチＡＥＸクロマトグラフィーの稼動（タンデムでない）
実施例５、６、および７に記載した条件で、バッチｐｒｏＡクロマトグラフィーとその後のバッチＡＥＸクロマトグラフィーを実施した。
【０１３８】
従来のバッチクロマトグラフィーでは、中和されるｐｒｏＡプールのｐＨおよび伝導率は、ＡＥＸステップの性能、およびしたがって生成物の品質に影響する極めて重要なパラメータである。低ｐＨウイルス不活性化ステップの後、ｐｒｏＡピークのプールは、弱い分配性ＡＥＸステップに適したものにするために、ある特定のｐＨに中和される。バッチ中和は、通常、ＡＥＸの実行の作業ｐＨ付近のｐＫａを有する濃縮された緩衝剤を含有する１〜２容量％の滴定液を徐々に添加することによって実施される。滴定は、ｐＨが所望の値に到達するまで進行する。伝導率は、モニターおよび記録されるが、ｐＨと独立に調整することができない。ｐＨおよび伝導率はともに、同時に目標値に到達することが理想的である。しかし、不完全な混合、およびｐＨ測定での温度の効果のために、滴定の最後でのｐＨの読みが不正確となり、多すぎる、または十分でない滴定液がプールに添加される場合がある。
【０１３９】
偶発的な過剰滴定の状況では、緩衝剤は、伝導率に対して穏やかな効果しか有さないので、中和されるプールの実際のｐＨは、伝導率より高い程度で目標を上回ることになる。ｐＨの上昇は、Ｋｐの全体的な増大、およびＡＥＸステップの間の生成物回収率の対応する減少を引き起こすことになる。同様の理由で、過少滴定は、目標より低いｐＨをもたらし、これは、伝導率の適切な減少によって補償されない。この場合、生成物の品質は、不純物のより弱い結合によってインパクトを与えられる。
【０１４０】
さらに、２つの極めて重要なパラメータ（ｐＨおよび伝導率）を独立して制御する能力を伴わないで、これらを同時に満たすためのＧＭＰ要求事項は、バッチの不合格のリスクを増大させる場合がある。したがって、一方のパラメータの偏差を、他方のパラメータに、適切な方向に自動的に影響を及ぼすことによって補償するためのビルトイン機構を伴う中和機構を有することが望ましいはずである。例えば、［Ｃｌ−］（および伝導率）が付随して増大して過剰滴定が起こる場合、Ｋｐの全体的な変化はまったく生じない。緩衝液が正確に配合されているという条件で、ｐＨは、伝導率と関連付けられるはずなので、このような機構は、２つの極めて重要なパラメータを有する必要性を排除する。代わりに、バッチ記録は、プールに添加される滴定液の容積画分ｖのみを指定することができる。
【０１４１】
滴定液中に濃縮された塩を組み込むと、上述した効果が達成されることが発見された。連続的な中和を記述するのに実施例５および６で論じた同じ数学モデルおよび物理モデルを、バッチクロマトグラフィープロセスのためにここで適用する。中和緩衝液中に塩をまったく含まず、積極的なｐｒｏＡ溶出条件を伴う対照モードを、中和緩衝液が濃縮されたＮａＣｌを含有し、ｐｒｏＡ溶出が相対的に穏やかなｐＨで起こるロバストモードと比較した。例示的な緩衝液組成を表３に要約する。タンデムモデルと同様に、条件は、同じ中和比ｖ＝１．１５％で、稼動の両モードについて同じＫｐ＝１．２５を生じるように設計した。
【０１４２】
対照モードの緩衝液は、やはり表３に列挙した製造キャンペーンで使用したものと非常に同様である。バッチ記録により、ｐＨ７．８へのｐｒｏＡプールの滴定が指定され、これは、ｖ＝１．４０％でＫｐ＝０．８１に対応した。
【０１４３】
図１３に示したバッチプロセスについてのｖの関数としてのｐＨ、［Ｃｌ−］、およびＫｐの例は、図６のタンデムプロセスについてのものと非常に類似しているように思われる。中和緩衝液は、タンデム稼動において使用される濃度の正確に１０倍であり、一方、ｖは、タンデムにおけるものの正確に０．１倍であることにも注目することができる。この予期しない結果は、本明細書で提供される本発明の方法のスケーラビリティを実証し、ロバストな中和条件を求めるためのモデルは、広範囲のｖにおいて適用可能であることを示す。
【０１４４】
図１４は、過剰滴定および過少滴定の異なる効果が、稼動のロバストモードおよび対照モードにおいてＫｐ＝ｆ（ｖ）に乗ることを示す。例えば、滴定が目標のｖ＝１．１５％の代わりにｖ＝０．５５％で停止される場合、ロバストモードにおけるＫｐは１．０９となり、一方、対照モードでは、これは０．０８に低減され、ＴＭＡＥステップの失敗をもたらす可能性がある。
【０１４５】
【表４】
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【０１４６】
図１４Ｂは、稼動の主張したロバストウインドウを定義し、ここで相対的なＫｐ変化の関数、ｋ＝ＡＢＳ［Ｋｐ（１．１ｖ）−Ｋｐ（０．９ｖ）］／Ｋｐ（ｖ）、％は、２０％未満である。ロバストモードおよび対照モードにおけるｋの挙動の比較は、ロバストモードにおいて、滴定液添加の０．７５％〜１．５５％の間のいずれか（しかし、好ましくは１．１５％）の滴定目標に設定することは安全であるが、対照モードは、ｖの±１０％の範囲内でｋの著しい変化を生じることを実証する。
【０１４７】
（実施例９）
様々な結合条件でのタンデム精製
条件の様々な組合せで、対照バッチＡＥＸ、またはタンデムｐｒｏＡ−ＡＥＸによって小モジュラー免疫薬を精製した。図１５Ａ〜１５Ｃは、弱い結合条件（Ｋｐ＝１．５）をもたらすようにプログラムされたｐｒｏＡ中和を使用したこれらの精製スキームの比較を示す。１つのタンデムプロセスでは、溶出緩衝液中にトリスを含まない積極的な溶出（ｐＨ３．５）を使用した。第２のタンデムプロセスでは、穏やかな溶出（ｐＨ３．７５）を使用し、溶出緩衝液中にトリス−ＨＣｌを使用した。ｐｒｏＡ溶出緩衝液にトリスを添加すると、滴定後に見られるｐＨ上昇が解消された。より高いｐＨの緩衝液でｐｒｏＡを溶出すると、ＨＭＷ１種に結合することについて、ＡＥＸの言われている動態学的限界が緩和された。生成物の品質は優れていた。
【０１４８】
第２のセットの実験では、条件の様々な組合せで、対照バッチＡＥＸ、またはタンデムｐｒｏＡ−ＡＥＸによって小モジュラー免疫薬をやはり精製した。図１６Ａ〜１６Ｃは、第１のセット実験より強い結合条件（Ｋｐ＝３．０）をもたらすようにプログラムされたｐｒｏＡ中和を使用したこれらの精製スキームの比較を示す。１つのタンデムプロセスでは、溶出緩衝液中にトリスを含まない積極的な溶出を使用した。第２のタンデムプロセスでは、穏やかな溶出を使用し、溶出緩衝液中にトリス−ＨＣｌを使用した。より強い結合条件では、積極的な溶出プロセスにおいてＨＭＷ１のレベルが低減した（図１６Ｂ）。回収率は、すべての場合において９０％超であった。
【０１４９】
均等物
当業者は、本明細に記載されている本開示の具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識し、または日常の実験程度の実験を使用して確認することができるであろう。本開示の範囲は、上記説明に限定されることは意図されていない。代替の方法および材料、ならびに追加の用途は、当業者に明らかとなり、以下の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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