(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホリパーゼＡ２による脂肪酸とリゾリン脂質のエステル化反応により得られるリン脂質に、無機塩類のグリセリン溶液（ただし、無機塩類のグリセリン溶液中の水分量は１重量％以下である）及び炭素数４以下のアルコール、さらにはグリセリンと混和せずリン脂質を溶解する有機溶剤として炭素数が５〜８の炭化水素溶剤及び／又はエーテル類を添加し、充分に撹拌した後静置し、該有機溶剤層を抽出することを特徴とする、残存するホスホリパーゼＡ２活性が５ユニット／ｇ以下であるリン脂質の製造方法。
【請求項２】
グリセリン溶液中の塩濃度が、０．２〜４０重量％である請求項１に記載の、残存するホスホリパーゼＡ２活性が５ユニット／ｇ以下であるリン脂質の製造方法。
【請求項３】
無機塩類が、硫酸亜鉛、塩化カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム及び塩化カルシウムの群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１又は２に記載の、残存するホスホリパーゼＡ２活性が５ユニット／ｇ以下であるリン脂質の製造方法。
【請求項４】
炭化水素溶剤がヘキサンである、請求項１〜３の何れかに記載の、残存するホスホリパーゼＡ２活性が５ユニット／ｇ以下であるリン脂質の製造方法。
【請求項５】
炭素数４以下のアルコールがエタノールである、請求項１〜４の何れかに記載の、残存するホスホリパーゼＡ２活性が５ユニット／ｇ以下であるリン脂質の製造方法。
【請求項６】
撹拌中の温度が４０〜６０℃である、請求項１〜５の何れかに記載の、残存するホスホリパーゼＡ２活性が５ユニット／ｇ以下であるリン脂質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食用や飼料用に適したリン脂質及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の脂質に関する研究から、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）などの高度不飽和脂肪酸が学習機能向上、動脈硬化性予防、脂質代謝改善機能など様々な機能を持つことが明らかになっている。特にＤＨＡは、ホスファチジルコリンのようなリン脂質に結合した形態で摂取することにより、トリグリセリド型と比較して抗酸化性が強く安定性が高まり、また吸収が良いためＤＨＡの持つ生理活性が発現しやすいことが明らかになっている。ＤＨＡ以外のＥＰＡや共役リノール酸、アラキドン酸などの機能性脂肪酸においてもリン脂質に結合することで生理活性が高まることが期待できる。
【０００３】
そこで、種々の機能性の脂肪酸が結合したリン脂質の製造方法が開示されてきたが、中でも原料が安価で供給が安定な、食用として用い得る原料のみを使用し、高い反応率でリン脂質の２位に脂肪酸を導入できる方法、とりわけＤＨＡのような高度不飽和脂肪酸を２位に導入したリン脂質及びその製法が特許文献１に開示されている。さらに、炭素数４以下のアルコールを添加してから、炭化水素溶剤及び／又はケトン溶剤及び／又はエステル溶剤からなる溶剤を加えて、グリセリン溶液層と溶剤層を形成させ、リン脂質と脂肪酸が移行した溶剤層を分離（分取）し、溶剤、もしくはシリカゲルで精製することにより目的のリン脂質が得られる旨が記載されている。
【０００４】
しかし、リン脂質の加水分解反応と比較して、リン脂質のエステル合成反応には多量の酵素が必要となるため、大量のホスホリパーゼＡ２（以下、ＰＬＡ２ともいう）が残存し、そのためアレルギーなどの問題が起こる可能性があり、また経時的にリン脂質の２位が加水分解する可能性がある。
【０００５】
一方、アレルギー問題などのために、ＰＬＡ２を用いた反応により得られたリゾリン脂質溶液中の残存ＰＬＡ２を失活させる技術がいくつか開示されている。例えば特許文献２の実施例では中性プロテアーゼのみで処理しており、特許文献３では清水中７０℃以上で加熱処理しており、特許文献４の実施例では中性プロテアーゼのみで処理してから蛋白除去工程を通しているが、ＰＬＡ２を用いた反応により得られたリン脂質溶液系でそれらの処理を行うと、何れの系でもＰＬＡ２の量は減るものの、加熱により高度不飽和脂肪酸が劣化するか、或いは処理の最中に残存ＰＬＡ２によりリン脂質の２位の脂肪酸が加水分解してしまう。
【０００６】
また特許文献５では、ＰＬＡ２を用いた反応により得られたリゾリン脂質溶液を、エタノールやヘキサンを一例とする溶剤と水との混合液及び無機塩類アセトン溶液とで処理することが開示されているが、系中に水分があるためにＰＬＡ２の除去は十分では無かった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−６８７９９号公報
【特許文献２】特開昭６３−２３３７５０号公報
【特許文献３】特開２００２−１６５５８０号公報
【特許文献４】特開２００３−９３０８６号公報
【特許文献５】国際公開第０５／０９０５８７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、ＰＬＡ２を用いたリン脂質の製造において、反応溶液中の残存ＰＬＡ２を失活させ、リン脂質の加水分解を抑制された安定なリン脂質及び該リン脂質を安価に製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ホスホリパーゼＡ２による脂肪酸とリゾリン脂質の反応により得られるリン脂質反応液に、炭素数４以下のアルコール、無機塩類グリセリン溶液及び炭素数が５〜８の炭化水素溶剤を添加し、充分に撹拌した後静置し、炭化水素溶剤層を抽出するか、或いは酸性プロテアーゼで処理すれば、ホスホリパーゼＡ２活性が１０ユニット／ｇ以下になることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明の第一は、ホスホリパーゼＡ２による脂肪酸とリゾリン脂質のエステル化反応により得られるリン脂質であり、残存するホスホリパーゼＡ２活性が１０ユニット／ｇ以下であるリン脂質に関する。好ましい実施態様は、残存するホスホリパーゼＡ２活性が５ユニット／ｇ以下である上記記載のリン脂質に関する。より好ましくは、リン脂質の構成脂肪酸全体中、二重結合を４つ以上持つ脂肪酸及び共役した２つ以上の二重結合を持つ脂肪酸の合計量が、１５重量％以上である上記記載のリン脂質に関する。
【００１１】
本発明の第二は、（１）ホスホリパーゼＡ２による脂肪酸とリゾリン脂質のエステル化反応により得られるリン脂質に、無機塩類のグリセリン溶液及び炭素数４以下のアルコール、さらにはグリセリンと混和せずリン脂質を溶解する有機溶剤を添加し、充分に撹拌した後静置し、該有機溶剤層を抽出することを特徴とする、残存するホスホリパーゼＡ２活性が１０ユニット／ｇ以下であるリン脂質の製造方法に関する。好ましい実施態様は、（２）無機塩類のグリセリン混合溶液中の水分量が１０重量％以下である、上記記載の、残存するホスホリパーゼＡ２活性が１０ユニット／ｇ以下であるリン脂質の製造方法に関する。より好ましくは、（３）グリセリンと混和せずリン脂質を溶解する有機溶剤が、炭素数が５〜８の炭化水素溶剤及び／又はエーテル類である、上記記載の、残存するホスホリパーゼＡ２活性が１０ユニット／ｇ以下であるリン脂質の製造方法、（４）グリセリン溶液中の塩濃度が、０．２〜４０重量％である上記記載の、残存するホスホリパーゼＡ２活性が１０ユニット／ｇ以下であるリン脂質の製造方法、（５）無機塩類が、硫酸亜鉛、塩化カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム及び塩化カルシウムの群より選ばれる少なくとも１種である、上記記載の、残存するホスホリパーゼＡ２活性が１０ユニット／ｇ以下であるリン脂質の製造方法、（６）炭化水素溶剤がヘキサンである、上記記載の、残存するホスホリパーゼＡ２活性が１０ユニット／ｇ以下であるリン脂質の製造方法、（７）炭素数４以下のアルコールがエタノールである上記記載の、残存するホスホリパーゼＡ２活性が１０ユニット／ｇ以下であるリン脂質の製造方法、（８）撹拌中の温度が４０〜６０℃である、上記記載の、残存するホスホリパーゼＡ２活性が１０ユニット／ｇ以下であるリン脂質の製造方法に関する。
【００１２】
本発明の第三は、ホスホリパーゼＡ２による脂肪酸とリゾリン脂質のエステル化反応により得られるリン脂質反応液を、酸性プロテアーゼで処理することを特徴とする、残存するホスホリパーゼＡ２活性が１０ユニット／ｇ以下であるリン脂質の製造方法に関する。好ましい実施態様は、酸性プロテアーゼで処理した後、さらに中性プロテアーゼで処理することを特徴とする上記記載の、残存するホスホリパーゼＡ２活性が１０ユニット／ｇ以下であるリン脂質の製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に従えば、ＰＬＡ２を用いたリン脂質の製造において、反応溶液中の残存ＰＬＡ２を失活させ、リン脂質の加水分解を抑制された安定なリン脂質及び該リン脂質を安価に製造する方法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明につき、さらに詳細に説明する。本発明のリン脂質は、ホスホリパーゼＡ２による脂肪酸とリゾリン脂質の反応により得られるリン脂質であって、該リン脂質中に残存するホスホリパーゼＡ２活性が１０ユニット／ｇ以下であることを特徴とする。該リン脂質中に残存するホスホリパーゼＡ２は少ない程良いが、５ユニット／ｇ以下が好ましく、１ユニット／ｇ以下がより好ましい。
【００１５】
そして、本発明のリン脂質の構成脂肪酸全体中、二重結合を４つ以上持つ脂肪酸及び共役した２つ以上の二重結合を持つ脂肪酸の合計量は、学習機能向上、動脈硬化性予防、脂質代謝改善機能など様々な機能をより強く発現するには多いほど好ましいが、１５重量％以上であることがより好ましい。ここで二重結合を４つ以上持つ脂肪酸としてはＤＨＡ、ＥＰＡ、アラキドン酸（ＡＲＡ）などが挙げられ、共役した２つ以上の二重結合を持つ脂肪酸としては共役リノール酸、共役リノレン酸などが挙げられる。
【００１６】
リン脂質１グラム中に残存するホスホリパーゼＡ２活性は、大豆レシチンを基質として測定することができる。測定は大豆レシチンを分散させた水溶液に対してＰＬＡ２を含む溶液を加えて、一定のｐＨ（例えば８．０）を維持するために１分当たりどれだけの水酸化ナトリウム水溶液を要するかで測定することができる。その際、あらかじめ酵素標準溶液で作成した検量線を用いてリン脂質に残存するＰＬＡ２活性を算出する。
【００１７】
本発明におけるリゾリン脂質は、リン脂質から２位の脂肪酸を除いたものを指し、リン脂質とは異なる脂質を意味する。本発明に用いるリゾリン脂質は、リン脂質を改質したものを用いることができ、入手のし易さからは大豆由来や菜種由来、卵黄由来のものが好ましく、価格面からは大豆由来のものがより好ましいが、その他の植物由来のリゾリン脂質も用いることができる。
【００１８】
リン脂質を改質してその２位の脂肪酸を除く方法としては、有害な物質を使用しない限り特に限定はないが、例えばホスホリパーゼＡ２などを用いてリン脂質の２位の脂肪酸を加水分解する方法などが挙げられる。この場合に用いることができるリン脂質は、グリセリン骨格とリン酸基及び２つの脂肪酸エステルを持つ分子で、ホスホリパーゼＡ２の基質になり得るものであり、スフィンゴシン骨格を持つものは含まれない。具体的には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリンなどが例示できる。
【００１９】
本発明の脂肪酸とリゾリン脂質のエステル化反応において、リゾリン脂質の２位に導入する脂肪酸としては特に限定はないが、昨今の消費者の健康志向から、生理活性を高められる脂肪酸が好ましく、二重結合を４つ以上持つ脂肪酸及び共役した２つ以上の二重結合を持つ脂肪酸が例示でき、具体的には共役リノール酸、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）などの高度不飽和脂肪酸が例示できる。前記ＤＨＡやＥＰＡは、主に海産動物油や藻類から得られる油脂を加水分解し遊離脂肪酸の形態にしたものを用いることができる。
【００２０】
尚、本発明で高度不飽和脂肪酸とは、炭素−炭素間の２重結合の数が３つ以上の不飽和脂肪酸、又は共役リノール酸を意味するものとする。
【００２１】
また、ＤＨＡなどのように、天然由来のものを単体で入手することが困難である場合は、所望の脂肪酸を含有する脂肪酸の混合物を用いることができる。その際、脂肪酸混合物中の所望の脂肪酸の含有量は、概ね２０重量％以上であることが望ましい。ＤＨＡの場合を例示すると、ＤＨＡ含有脂肪酸中のＤＨＡの濃度は好ましくは２０重量％以上であり、４５重量％以上がより好ましい。尚、本発明による反応の後に溶剤分別などを行い、反応生成物であるリン脂質の濃度を高めても構わない。
【００２２】
本発明のリン脂質は、例えば以下のようにして製造することができる。
＜無機塩類などを用いてリン脂質中に残存するホスホリパーゼＡ２を低減するリン脂質の製造方法＞
（リゾリン脂質と脂肪酸とのエステル化反応）
ホスホリパーゼＡ２を触媒としてリゾリン脂質に脂肪酸を結合させることができる反応系であれば方法は問わないが、反応性が高く食品に利用可能なことから、グリセリンを溶剤に用いた反応系で行うが好ましい。即ち、グリセリン中にリゾリン脂質、脂肪酸、ホスホリパーゼＡ２を適量添加し、反応溶液を３０〜６０℃に維持しながら、３〜４８時間攪拌することで反応を行うことができる。反応系にはさらに、反応を活性化させるための塩化カルシウムなどのカルシウム塩、及びその他アミノ酸等の反応を活性化するための添加物を加えることが好ましい。
【００２３】
（リン脂質が生成した反応溶液からのホスホリパーゼＡ２の除去）
上記リゾリン脂質と脂肪酸とのエステル化反応で得られるリン脂質を含む反応溶液、該反応溶液から単離したリン脂質及び該反応溶液からリン脂質を抽出した溶液の何れかに、炭素数４以下のアルコール及び無機塩類のグリセリン混合溶液、さらにはグリセリンと混和せずリン脂質を溶解する有機溶剤を添加・混合する。なお、それらの添加量は、反応溶液や抽出溶液に当該溶剤を含む場合は適宜調整する。
【００２４】
そして混合後、２０〜６０℃に温調し、非極性溶剤とグリセリンが分離しないように強く攪拌する。好ましくは、４０〜６０℃に温調する。その後しばらく静置して、グリセリン溶液層と溶剤層とを形成させ、リン脂質と脂肪酸が移行した当該溶剤層を分離（分取）する。このような所定溶剤の添加および分取操作は、純度の向上と作業効率を考慮し、適宜繰り返しても良い。
【００２５】
リン脂質もしくはリン脂質と脂肪酸が移行した前記溶剤層を分離したら、溶剤を留去してリン脂質を回収できる。溶剤を留去した後、リン脂質を溶解せず脂肪酸や水を溶解する溶剤で洗浄処理を行い、沈澱したリン脂質を回収する方が好ましい。ここで、リン脂質を溶解せず脂肪酸や水を溶解する溶剤としてはアセトンなどが挙げられる。
【００２６】
ここで前記炭素数４以下のアルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール及びブタノールが挙げられ、それらの群より選ばれる少なくとも１種を用いることができる。それらの内、毒性が低く食品添加物として利用できることから、エタノールが好ましい。
【００２７】
また、無機塩類としてはグリセリンへの溶解性があるものなら特に限定は無いが、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、塩化カリウム、塩化ナトリウム及び塩化カルシウムからなる群より選ばれる少なくとも１種を使用することが好ましい。無機塩類は、グリセリン混合溶液全体中０．２重量％以上となるように混合して用いることが好ましい。０．２重量％部より少ないとＰＬＡ２の除去が十分でない場合がある。無機塩類の濃度は濃いほどＰＬＡ２の除去効率は高くなるが、一般にはグリセリン混合溶液全体中４０重量％以下とすることが好ましい。４０重量％を超えるとグリセリンの粘度が上昇し、もしくは無機塩類が析出して扱いにくくなる場合がある。
【００２８】
ここで無機塩類のグリセリン混合溶液の調製は、グリセリンへの塩類の分散性を考慮して、無機塩類を水溶液にしてからグリセリンと混合することが好ましい。さらに、無機塩類を混合したグリセリン混合溶液全体中の水分量は少ないほど好ましいが、３０重量％以下であることが好ましく、１０重量％以下であることがより好ましく、さらに好ましくは１重量％以下である。グリセリン中の水分量が３０重量％を超えると、ＰＬＡ２の除去が十分に行えない場合がある。また、無機塩類を水溶液にしてからグリセリン混合溶液を調整した場合は、混合溶液中の水を留去してから用いることが好ましい。
【００２９】
グリセリンと混和せずリン脂質を溶解する有機溶剤としては、炭化水素溶剤やエーテル類が好ましく、具体的にはヘプタン、ヘキサン、ペンタン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等が挙げられ、食品用途への利用の観点からヘキサンがより好ましい。
【００３０】
＜酸性プロテアーゼを用いてリン脂質中に残存するホスホリパーゼＡ２の活性を低減するリン脂質の製造方法＞
（リゾリン脂質と脂肪酸とのエステル化反応）
前記無機塩類などを用いてリン脂質中に残存するホスホリパーゼＡ２を低減するリン脂質の製造方法と同様である。
【００３１】
（リン脂質が生成した反応溶液中のホスホリパーゼＡ２活性の低減）
上記で得られるリン脂質を、好ましくはｐＨ４．０〜１．０、より好ましくは３．０〜１．５に調整した酸性水溶液に溶解し、酸性プロテアーゼを添加する。酸性プロテアーゼとしては、動物由来のペプシン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来のプロテアーゼ等が挙げられる。酸性プロテアーゼの添加量は、酸性水溶液１００重量部に対して０．１〜１０重量部が好ましい。
【００３２】
酸性プロテアーゼを添加した後は、酵素の至適温度で構わないがリン脂質の劣化を防ぐため６０℃を上回らない温度に保持して撹拌して酵素反応することが好ましい。反応時間は、酵素の量や反応温度にもよるが、１時間〜４８時間が好ましい。１時間より短いと、得られるリン脂質中のホスホリパーゼＡ２活性低減効果が小さい場合があり、４８時間より長いと、リン脂質が劣化する、もしくはリン脂質が凝集したり、プロテアーゼが失活するなどして得られるリン脂質中のホスホリパーゼＡ２活性低減効果が頭を打ってしまう場合がある。
【００３３】
ホスホリパーゼＡ２活性をさらに低減するためには、酸性プロテアーゼ反応終了後、続けてｐＨを４．０〜８．０に中和し、中性プロテアーゼを添加することが好ましく、より好ましくはｐＨを５．０〜７．０に中和し、中性プロテアーゼを添加する。中性プロテアーゼとしてはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  Ｏｒｙｚａｅ由来、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来等が挙げられる。
【００３４】
中性プロテアーゼを添加した後は、酵素の至適温度で構わないがリン脂質の劣化を防ぐため６０℃を上回らない温度に保持して撹拌して酵素反応することが好ましい。反応時間は、酵素の量や反応温度にもよるが、１時間〜４８時間が好ましい。１時間より短いと、得られるリン脂質中のホスホリパーゼＡ２活性低減効果が小さい場合があり、４８時間より長いと、リン脂質が劣化する、もしくはリン脂質が凝集したり、プロテアーゼが失活するなどして得られるリン脂質中のホスホリパーゼＡ２活性低減効果が頭を打ってしまう場合がある。
【００３５】
酸性プロテアーゼ或いは酸性プロテアーゼ及び中性プロテアーゼによる酵素反応終了後は、ヘキサン等のリン脂質を溶解し、水と混和しない溶剤を酸性水溶液１００重量部に対して１０〜２００重量部添加・撹拌し、上層（ヘキサン層）を分取し、上層の溶剤を除去してリン脂質を抽出することができる。酸性水溶液の粘度が高くなるなどして、ヘキサンだけではリン脂質を抽出しにくい場合は、さらにエタノールなどの、水と混和するアルコール溶剤を加えることで抽出効率が向上する場合がある。エタノールを加える場合は、酸性水溶液１００重量部に対して１０〜１００重量部加えるのが好ましい。この処理により得られるリン脂質中のホスホリパーゼＡ２活性は、大幅に低減されている。
【００３６】
前記において、上層の溶剤を除去した後、アセトンで洗浄する方が好ましい。アセトン洗浄により、残留している水分や加水分解で遊離した脂肪酸などを除去することができる。
【００３７】
本発明のリン脂質の製造方法は、食用や飼料用のリン脂質の製造に好適に用いることができ、その為には製造過程で食用に適さない原料やトルエン、ホルムアミドなどの溶剤などを使用さえしなければよい。また、このようにして得られたリン脂質、特に、その２位に高度不飽和脂肪酸が導入されたものは、高機能の食用或いは飼料用リン脂質として好適に用いることができる。
【実施例】
【００３８】
以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。なお、実施例において「部」や「％」は重量基準である。なお、実施例１及び２は比較例に相当するものである。
【００３９】
＜ＰＬＡ２の残存活性の測定方法＞
脱脂大豆レシチン６ｇに蒸留水４００ｍｌを加えて室温で３０分間攪拌した。その脱脂大豆レシチン溶液に、デオキシコール酸ナトリウム０．７ｇ及び塩化カルシウム２水和物０．５ｇを水１１ｍｌに溶かした溶液を加え、氷冷しながら８０００ｒｐｍで１５分間ホモジナイズした。得られた溶液を活性測定溶液とした。活性測定溶液２０ｍｌを５０ｍｌのサンプル瓶に計り取り、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨを８．０に調整した。実施例・比較例で得られたリン脂質サンプル２０ｍｇを１ｍｌの蒸留水に分散させ、その溶液をｐＨ８．０に調整した活性測定溶液に加えて、再度ｐＨを８．０に調整し、ｐＨを８．０に維持するために必要な２０ｍＭ水酸化ナトリウム溶液の１分当たりの滴定量を測定した。あらかじめ酵素標準溶液で作成した検量線を用いて、リン脂質に残存するＰＬＡ２活性を計算した。
【００４０】
＜リン脂質の脂肪酸組成の分析＞
実施例・比較例で得られたリン脂質１０ｍｇをイソオクタン２ｍｌに溶かし、０．２Ｍナトリウムメチラートのメタノール溶液１ｍｌを加えて６０℃で攪拌しながら１０分間加熱した。酢酸で中和し、水を加えて上層のイソオクタン層を回収してガスクロマトグラフで分析した。ガスクロマトグラフはアジレント社製「５８９０ｓｅｒｉｅｓＩＩ」を使用した。カラムは、アジレント社製「ＤＢ−２３」（長さ３０ｍ、内径０．２５ｍｍ、膜厚０．２５μｍ）を用いて、注入口温度：２６０℃、検出温度：２６０℃、オーブン温度：２００℃一定で行った。
【００４１】
（製造例１）  リン脂質の合成
１Ｌのガラス製反応容器にグリセリン（坂本薬品社製）２００ｇにリゾホスファチジルコリン（辻製油社製「ＳＬＰ−ホワイトリゾ」）１５ｇ、ホスホリパーゼＡ２（サンヨーファイン社製「リゾナーゼ」、活性：５万Ｕ／ｇ）６ｇ、ＤＨＡ含有トリグリセリド（クローダジャパン「インクロメガＤＨＡ−Ｊ４６」、ＤＨＡ含有量：４９．７重量％）を定法によりアルカリ加水分解した脂肪酸６ｇ、グリシン６ｇ、アラニン６ｇ、２Ｍ塩化カルシウム水溶液２ｍｌを加えて攪拌しながら３００Ｐａの減圧下、５０℃で２４時間反応させた。反応終了後、エタノール１００ｍｌ、ヘキサン１００ｍｌを加えて二層にした。ここから上層を回収し、溶剤を留去した回収物を１５ｇ得た。該回収物にアセトン５０ｍｌを加えてよくかき混ぜ、０℃で１時間冷却して得られた沈澱を回収し、リン脂質を１０ｇ得た。このリン脂質中に残存するＰＬＡ２の活性は、７５Ｕ／ｇであった。また、リン脂質中の脂肪酸組成のうち、ＤＨＡの含量は１６．５重量％だった。
【００４２】
（実施例１）  無機塩類などによる処理によるＰＬＡ２低減
リン脂質０．２ｇにグリセリン１ｇを加え、２Ｍ塩化カルシウム水溶液を０．４ｍｌ加えて、グリセリン溶液を調整した。ヘキサン１ｍｌとエタノール１ｍｌを加えて室温で１時間攪拌した。攪拌終了後、静置してから上層を回収し、溶剤を留去後、アセトン１ｍｌを加えて０℃で１時間静置し、リン脂質の沈澱を回収した。回収したリン脂質中のＰＬＡ２残存活性、およびリン脂質の脂肪酸組成中のＤＨＡ含量を表１に示した。
【００４３】
【表１】
0005894377.tif 000002
【００４４】
【表２】
0005894377.tif 000003
【００４５】
（実施例２）  無機塩類などによる処理によるＰＬＡ２低減
５０℃で１時間攪拌した以外は、実施例１と同様にしてリン脂質を処理した。回収したリン脂質中のＰＬＡ２残存活性、およびリン脂質の脂肪酸組成中のＤＨＡ含量を表１に示した。
【００４６】
（実施例３）
グリセリン５ｇに２Ｍ塩化カルシウム水溶液２ｍｌを加えた。このグリセリン溶液を８０℃、５００Ｐａで１時間乾燥させた。リン脂質サンプル０．２ｇをヘキサン１ｍｌとエタノール１ｍｌの混合溶媒に溶かし、上記で作製した塩化カルシウム−グリセリン溶液１ｇを加えて室温で１時間層分離しないように強く攪拌した。攪拌終了後、静置して上層を回収し溶剤を留去して、アセトン１ｍｌを加えて０℃で１時間静置し、リン脂質の沈澱を回収した。回収したリン脂質中のＰＬＡ２残存活性、およびリン脂質の脂肪酸組成中のＤＨＡ含量を表１に示した。
【００４７】
（実施例４）
５０℃で１時間攪拌した以外は、実施例３と同様にリン脂質サンプルを処理し、リン脂質を回収した。回収したリン脂質中のＰＬＡ２残存活性、およびリン脂質の脂肪酸組成中のＤＨＡ含量を表１に示した。
【００４８】
（実施例５）
実施例４と同様に１時間攪拌した後、上層を回収して溶剤を留去し、さらにヘキサンを加えて沈澱したグリセリンを除去した。溶剤を留去して、アセトン１ｍｌを加えて０℃で１時間静置し、リン脂質の沈澱を回収した。回収したリン脂質中のＰＬＡ２残存活性、およびリン脂質の脂肪酸組成中のＤＨＡ含量を表１に示した。
【００４９】
（実施例６）
２Ｍ塩化カルシウム水溶液の代わりに２Ｍ塩化カリウム水溶液を用いた以外は、実施例５と同様にリン脂質を処理した。回収したリン脂質中のＰＬＡ２残存活性、およびリン脂質の脂肪酸組成中のＤＨＡ含量を表１に示した。
【００５０】
（実施例７）
２Ｍ塩化カルシウム水溶液の代わりに２Ｍ塩化ナトリウム水溶液を用いた以外は、実施例５と同様に処理した。回収したリン脂質中のＰＬＡ２残存活性、およびリン脂質の脂肪酸組成中のＤＨＡ含量を表１に示した。
【００５１】
（実施例８）
２Ｍ塩化カルシウム水溶液の代わりに２Ｍ硫酸マグネシウム水溶液を用い、エタノールの代わりにイソプロパーノールを用い、５０℃で１時間攪拌した以外は、実施例３と同様にしてリン脂質サンプルを処理し、リン脂質を回収した。回収したリン脂質中のＰＬＡ２残存活性、およびリン脂質の脂肪酸組成中のＤＨＡ含量を表１に示した。
【００５２】
（実施例９）
２Ｍ塩化カルシウム水溶液の代わりに２Ｍ塩化マグネシウム水溶液を用い、ヘキサンの代わりにジエチルエーテルを用いた以外は、実施例３と同様にしてリン脂質サンプルを処理し、リン脂質を回収した。回収したリン脂質中のＰＬＡ２残存活性、およびリン脂質の脂肪酸組成中のＤＨＡ含量を表１に示した。
【００５３】
（比較例１）
リン脂質サンプル０．２ｇにグリセリン１ｇを加え、ヘキサン１ｍｌとエタノール１ｍｌを加えて５０℃で１時間攪拌した。攪拌終了後、静置して上層を回収し溶剤を留去して、アセトン１ｍｌを加えて５０℃で１時間静置し、リン脂質の沈澱を回収した。回収したリン脂質中のＰＬＡ２残存活性、およびリン脂質の脂肪酸組成中のＤＨＡ含量を表１に示した。
【００５４】
（比較例２）
国際公開第０５／０９０５８７号に準拠して、リン脂質サンプル０．２ｇをヘキサン１ｍｌとエタノール１ｍｌに溶かし、２．６Ｍ塩化ナトリウム水溶液（水１ｍｌ、塩化ナトリウム１５０ｍｇ）を１ｍｌ加えて５０℃で１時間攪拌した。攪拌終了後、静置して上層を回収し溶剤を留去して、アセトン１ｍｌを加えて０℃で１時間静置し、リン脂質の沈澱を回収した。回収したリン脂質中のＰＬＡ２残存活性、およびリン脂質の脂肪酸組成中のＤＨＡ含量を表１に示した。
【００５５】
（比較例３）
国際公開第０５／０９０５８７号に準拠して、リン脂質サンプル０．２ｇをヘキサン１ｍｌとアセトン１ｍｌに溶かし、２．６Ｍ塩化ナトリウム水溶液（水１ｍｌ、塩化ナトリウム１５０ｍｇ）を１ｍｌ加えて５０℃で１時間攪拌した。攪拌終了後、静置して上層を回収し溶剤を留去して、アセトン１ｍｌを加えて０℃で１時間静置し、リン脂質の沈澱を回収した。回収したリン脂質中のＰＬＡ２残存活性、およびリン脂質の脂肪酸組成中のＤＨＡ含量を表１に示した。
【００５６】
（比較例４）
グリセリン５ｇに２Ｍ塩化カルシウム水溶液２ｍｌを加えた。このグリセリン溶液を８０℃、５００Ｐａで１時間乾燥させた。リン脂質サンプル０．２ｇをヘキサン１ｍｌに溶かし、上記で作製した塩化カリウム−グリセリン溶液１ｇを加えて５０℃で１時間層分離しないように強く攪拌した。攪拌終了後、静置して上層を回収し溶剤を留去した。溶剤を留去し、アセトン１ｍｌを加えて０℃で１時間静置し、リン脂質の沈澱を回収した。回収したリン脂質中のＰＬＡ２残存活性、およびリン脂質の脂肪酸組成中のＤＨＡ含量を表１に示した。
【００５７】
（比較例５）
グリセリン５ｇに２Ｍ塩化カルシウム水溶液２ｍｌを加えた。このグリセリン溶液を８０℃、５００Ｐａで１時間乾燥させた。リン脂質サンプル０．２ｇをジエチルエーテル１ｍｌに溶かし、上記で作製した塩化カリウム−グリセリン溶液１ｇを加えて室温で１時間層分離しないように強く攪拌した。攪拌終了後、静置して上層を回収し溶剤を留去した。溶剤を留去し、アセトン１ｍｌを加えて０℃で１時間静置し、リン脂質の沈澱を回収した。回収したリン脂質中のＰＬＡ２残存活性、およびリン脂質の脂肪酸組成中のＤＨＡ含量を表１に示した。
【００５８】
（比較例６）
グリセリン５ｇに２Ｍ硫酸マグネシウム水溶液２ｍｌを加えた。このグリセリン溶液を８０℃、５００Ｐａで１時間乾燥させた。リン脂質サンプル０．２ｇをヘキサン１ｍｌとアセトン１ｍｌの混合溶媒に溶かし、上記で作製した硫酸マグネシウム−グリセリン溶液１ｇを加えて５０℃で１時間層分離しないように強く攪拌した。攪拌終了後、静置して上層を回収し溶剤を留去した。溶剤を留去し、アセトン１ｍｌを加えて０℃で１時間静置し、リン脂質の沈澱を回収した。回収したリン脂質中のＰＬＡ２残存活性、およびリン脂質の脂肪酸組成中のＤＨＡ含量を表１に示した。
【００５９】
（比較例７）
公開広報２００２−１６５５８０号公報に準拠して、リン脂質サンプル０．２ｇに水２ｍｌを加えて８０℃で９０分攪拌しながら加熱した。攪拌終了後、ヘキサンを２ｍｌ加えて１分間撹拌してから静置して上層を回収した。溶剤を留去し、アセトン１ｍｌを加えて０℃で１時間静置し、リン脂質の沈澱を回収した。回収したリン脂質中のＰＬＡ２残存活性、およびリン脂質の脂肪酸組成中のＤＨＡ含量を表１に示した。
【００６０】
（実施例１０）  酵素処理によるＰＬＡ２低減
製造例１で得たリン脂質１ｇを０．２Ｍクエン酸水溶液１０ｍｌに分散させ、ｐＨ２．４とした。この水溶液に酸性プロテアーゼ（エイチビイアイ社製「オリエンターゼ２０Ａ」）１２０ｍｇを加えて４５℃で５時間攪拌した。攪拌終了後反応液にエタノール５ｍｌとヘキサン５ｍｌを加えて攪拌してから静置して上層（ヘキサン層）を回収した。上層の溶剤を留去し、残渣にアセトン５ｍｌを加えて０℃で１時間静置し、リン脂質の沈澱を回収した。回収したリン脂質中のＰＬＡ２残存活性は４Ｕ／ｇ、リン脂質の脂肪酸組成中のＤＨＡ含量は１６．９重量％であった。
【００６１】
（実施例１１）  酵素処理によるＰＬＡ２低減
リン脂質サンプル１ｇを０．２Ｍクエン酸水溶液１０ｍｌに分散させ、ｐＨ２．４とした。この水溶液に酸性プロテアーゼ（エイチビイアイ社製「オリエンターゼ２０Ａ」）１２０ｍｇを加えて４５℃で５時間攪拌した。攪拌終了後反応液に１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を添加してｐＨ７．０に調整し、中性プロテアーゼ（アマノエンザイム社製「ペプチダーゼＲ」）１２０ｍｇを加えて４５℃で３時間攪拌した。攪拌終了後反応液にエタノール５ｍｌとヘキサン５ｍｌを加えて攪拌してから静置して上層を回収した。上層の溶剤を留去し、残渣にアセトン５ｍｌを加えて０℃で１時間静置し、リン脂質の沈澱を回収した。回収したリン脂質中のＰＬＡ２残存活性は１Ｕ／ｇ以下、リン脂質の脂肪酸組成中のＤＨＡ含量は１７．１重量％であった。
【００６２】
（比較例８）  酵素処理によるＰＬＡ２低減
リン脂質サンプル１ｇを水１０ｍｌに分散させ、プロテアーゼ（アマノエンザイム社製「ペプチダーゼＲ」）１２０ｍｇを加えて４５℃で５時間攪拌した。攪拌終了後、反応液にエタノール５ｍｌとヘキサン５ｍｌを加えて１分間攪拌してから静置して上層を回収した。上層の溶剤を留去し、残渣にアセトン５ｍｌを加えて０℃で１時間静置し、リン脂質の沈澱を回収した。回収したリン脂質中のＰＬＡ２残存活性は１５Ｕ／ｇ、リン脂質の脂肪酸組成中のＤＨＡ含量は１０．５重量％であった。