(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
波長６００ｎｍでの吸光度が０．０２以上０．１未満の線維化コラーゲンを含有し、かつ、架橋されたコラーゲン線維を０．０３質量％〜０．５質量％含み、厚み２ｍｍ〜５ｍｍであるコラーゲンゲル膜と、孔径２０μｍ〜５０００μｍの孔を有する水不溶性高分子膜材料とを備えた複合材料。
【請求項２】
前記架橋されたコラーゲン線維の架橋が、水溶性架橋剤によるものである請求項１に記載の複合材料。
【請求項３】
前記架橋されたコラーゲン線維におけるコラーゲンが、アルカリ処理又は酸処理コラーゲンである請求項１又は請求項２に記載の複合材料。
【請求項４】
前記架橋されたコラーゲン線維におけるコラーゲンが、該コラーゲン中の官能基が化学修飾された化学修飾コラーゲンである請求項１〜請求項３のいずれか１項記載の複合材料。
【請求項５】
培養液を収容して細胞を培養可能な培養領域となる溶液収容部と、
波長６００ｎｍでの吸光度が０．０２以上０．１未満の線維化コラーゲンを含有し、かつ、架橋されたコラーゲン線維を０．０３質量％〜０．５質量％含み、厚み２ｍｍ〜５ｍｍであるコラーゲンゲル膜と、
を有する培養容器。
【請求項６】
培養液を収容して細胞を培養可能な培養領域となる溶液収容部と、
前記溶液収容部に挿入されて前記培養領域を上下に仕切ると共に、下部開口が、請求項１〜請求項４のいずれか１項記載の複合材料で閉じられた筒状の仕切り部材と
を有する培養容器。
【請求項７】
前記仕切り部材の外周部には、前記溶液収容部の開口縁部に支持される支持部材が設けられている請求項６記載の培養容器。
【請求項８】
前記支持部材には、前記開口縁部に位置決めされる突起が設けられている請求項７記載の培養容器。
【請求項９】
請求項１〜請求項４のいずれか１項記載の複合材料と、
前記複合材料の周囲を支持する支持部材と、
を有する細胞培養器用仕切り部材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複合材料、培養容器及び細胞培養器用仕切り部材に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体環境下では、細胞の成長に、他の細胞から分泌（産生）されたタンパク質などの物質が関与していることが知られている。細胞を培養する場合には、このような生体環境に類似させて、他の細胞、即ちフィーダー細胞と共に目的細胞を培養することが行われている。特に、近年注目を集めている誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの幹細胞では、一般に、未分化状態を維持しつつ培養するため、動物由来のフィーダー細胞との共培養が行われている。
【０００３】
しかしながら、目的細胞を利用する場合には、他の細胞と分離することが必要になるが、一旦、培養系に他の細胞を混在してしまうと、目的細胞の単離が困難なことが多い。細胞の状態に対して良好な培養を行うために、フィーダー細胞が産生する物質を単離し、精製して利用することも求められるが、このような産生物質を含有する専用の培養液の開発には時間がかかる。
【０００４】
このため、共培養下の細胞を分離するために、細胞が通過せず、タンパク質などの物質を透過する膜等の開発が行われている。例えば、特許文献１は、ポリ乳酸などのポリエステル類による所定の多孔質薄膜と、ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル類による不織布とを含む複合膜を用いて、互いに異なる細胞群を仕切って細胞共培養することが開示されている。
一方、細胞に対する親和性の高さから、コラーゲンを利用した技術も細胞培養の分野では種々提案されている。例えば、特許文献２には、コラーゲン水溶液を凍結乾燥した多孔質コラーゲンシートが開示されている。また、特許文献３及び４並びに、非特許文献１には、コラーゲンを線維化させたコラーゲンゲルが開示されている。更には、非特許文献２には、コラーゲン水溶液を乾燥させた透明フィルムが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−２０７４３０号公報
【特許文献２】国際公開第２００６／０２１９９２号パンフレット
【特許文献３】特開２００５−２６１２９２号公報
【特許文献４】特開２００７−２９７３６０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】組織培養、1998年、第１３（１）巻、第２６頁〜第３０頁
【非特許文献２】J. Biol. Macromolecules, (1999) Vol.24, pp.337-340
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
フィーダー細胞と幹細胞などの目的細胞とでは、形態が異なることも多いため、光学顕微鏡などによる観察によって充分に目的細胞の状態を把握できる。しかしながら、細胞の分離を目的として用いられる分離膜や物質の透過のみを考慮したコラーゲンシートなどでは、細胞観察の容易性の観点まで考慮されていない。このため、上述したいずれの技術も、細胞の不透過及び物質の透過に加えて、観察に適した透明性をも有するものではない。
従って、本発明の目的は、細胞を通過させずに培養液成分などの物質を通過可能であると共に、細胞の観察に適した透明性をも有するコラーゲンゲル膜及びこれを用いた培養容器を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下のとおりである。
［１］  波長６００ｎｍでの吸光度が０．０２以上０．１未満の線維化コラーゲンを含有し、かつ、架橋されたコラーゲン線維を０．０３質量％〜０．５質量％含み、厚み２ｍｍ〜５ｍｍであるコラーゲンゲル膜と、孔径２０μｍ〜５０００μｍの孔を有する水不溶性高分子膜材料とを備えた複合材料。
［２］  前記架橋されたコラーゲン線維の架橋が、水溶性架橋剤によるものである［１］に記載の複合材料。
［３］  前記架橋されたコラーゲン線維におけるコラーゲンが、アルカリ処理又は酸処理コラーゲンである［１］又は［２］に記載の複合材料。
［４］  前記架橋されたコラーゲン線維におけるコラーゲンが、該コラーゲン中の官能基が化学修飾された化学修飾コラーゲンである［１］〜［３］のいずれかに記載の複合材料。
［５］  培養液を収容して細胞を培養可能な培養領域となる溶液収容部と、
波長６００ｎｍでの吸光度が０．０２以上０．１未満の線維化コラーゲンを含有し、かつ、架橋されたコラーゲン線維を０．０３質量％〜０．５質量％含み、厚み２ｍｍ〜５ｍｍであるコラーゲンゲル膜と、を有する培養容器。
［６］  培養液を収容して細胞を培養可能な培養領域となる溶液収容部と、前記溶液収容部に挿入されて前記培養領域を上下に仕切ると共に、下部開口が、［１］〜［４］のいずれかに記載の複合材料で閉じられた筒状の仕切り部材とを有する培養容器。
［７］  前記仕切り部材の外周部には、前記溶液収容部の開口縁部に支持される支持部材が設けられている［６］に記載の培養容器。
［８］  前記支持部材には、前記開口縁部に位置決めされる突起が設けられている［７］に記載の培養容器。
［９］  前記［１］〜［４］のいずれかに記載の複合材料と、前記複合材料の周囲を支持する支持部材と、を有する細胞培養用仕切り部材。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、細胞を通過させずに培養液成分などの物質を通過可能であると共に、細胞の観察に適した透明性をも有するコラーゲンゲル膜及びこれを用いた培養容器を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の第一の実施形態にかかる培養容器の断面図である。
【図２】本発明の第二の実施形態にかかる培養容器の断面図である。
【図３】本発明の他の実施形態にかかる培養容器の斜視図である。
【図４】図３のＡ−Ａ’断面図である。
【図５】本発明の実施例１にかかるコラーゲンゲル膜上で培養された細胞の光学顕微鏡写真像である。
【図６Ａ】本発明の実施例２にかかるコラーゲンゲル膜上で培養された細胞のＳＥＭ写真像である。
【図６Ｂ】図６Ａ枠内を拡大したＳＥＭ写真像である。
【図７】本発明の実施例３にかかるコラーゲン濃度が異なるコラーゲンゲル膜における透過性を確認したゲル写真である。
【図８Ａ】本発明の実施例６にかかるコラーゲンゲル膜上で培養されたｉＰＳ細胞の光学顕微鏡写真像である。
【図８Ｂ】図８Ａ枠内を拡大した光学顕微鏡写真像である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のコラーゲンゲル膜は、架橋されたコラーゲン線維を０．０３質量％〜０．５質量％含み、厚み２ｍｍ〜５ｍｍであるコラーゲンゲル膜である。
本発明のコラーゲンゲル膜によれば、コラーゲンゲル膜に含まれるコラーゲンを、架橋されたコラーゲン線維とし、０．０３質量％〜０．５質量％という濃度で含む２ｍｍ〜５ｍｍの厚みのコラーゲンゲル膜とするので、培養時の細胞を通過させることなく培養液中の有用なタンパク質等の物質を通過させると共に、細胞を観察するには充分な透明性も備える。
【００１２】
本発明の複合材料は、前記コラーゲンゲル膜と、孔径２０μｍ〜５０００μｍの孔を有する水溶性高分子材料とを備えた複合材料である。
本複合材料によれば、前記コラーゲンゲル膜を、孔径２０μｍ〜５０００μｍの孔を有する前記水溶性高分子材料と共に備えているので、コラーゲンゲル膜を前記水溶性高分子材料で保持することができる。また水溶性高分子材料は孔径２０μｍ〜５０００μｍの孔を有するので、コラーゲンゲル膜を水溶性高分子材料の表面に保持することが可能であり、コラーゲンゲル膜のゲル強度を補って取り扱いしやすくすることができ、また、コラーゲンゲル膜による物質の通過容易性、細胞を観察する際の十分な透明性を損なわない。これにより、前記コラーゲンゲル膜の作用を損なわずに取り扱い性を高めることができる。
【００１３】
また、本発明の培養容器は、培養液を収容して細胞を培養可能な培養領域となる溶液収容部と、前記培養領域を上下に仕切る上記のコラーゲンゲル膜と、を有する培養容器である。
【００１４】
本発明の培養容器によれば、培養液を収容可能な溶液収容部の培養領域を、上述したコラーゲンゲル膜で上下に仕切っているので、コラーゲンゲル膜を挟んで培養領域が分かれている。コラーゲンゲル膜は、上記のとおり、細胞を通過させることなく培養液中の有用なタンパク質等の物質を通過させるので、溶液収容部に培養液を収容した場合には、コラーゲンゲル膜を挟んで培養液中の成分が通過して、溶液収容部全体に拡散可能である一方で、細胞はコラーゲンゲル膜を挟んでの移動が抑制される。また、コラーゲンゲル膜は、細胞を観察するには充分な透明性を有するので、培養領域の上下にそれぞれ配置する細胞の観察を妨げない。
この結果、共培養の場合には、それぞれの収容空間に細胞を配置させることにより、細胞の観察を行いながら共培養を行って、共培養後に容易に細胞を分離することができる。また、共培養に限らず、細胞培養後に細胞のみを分離して、細胞産生物質のみを含む培養液を容易に回収することができる。
【００１５】
また本発明の他の培養容器は、培養液を収容して細胞を培養可能な培養領域となる溶液収容部と、前記溶液収容部に挿入されて前記培養領域を上下に仕切ると共に、下部開口が、上記コラーゲンゲル膜と孔径２０μｍ〜５０００μｍの孔を有する水不溶性高分子膜材料とを備えた複合材料で閉じられた筒状の仕切り部材とを有する培養容器である。
【００１６】
本培養容器によれば、前記溶液収容部に挿入されて前記培養領域を上下に仕切ると共に、下部開口が、上記コラーゲンゲル膜と孔径２０μｍ〜５０００μｍの孔を有する水不溶性高分子膜材料とを備えた複合材料で閉じられた筒状の仕切り部材を有するので、コラーゲンゲル膜を用いることによる上述した効果に加えて、培養領域におけるコラーゲンゲル膜の位置を調整することができる。例えば、コラーゲンゲル膜を溶液収容部から浮かせることができ、上下に仕切られたそれぞれの培養領域を所望の大きさに設定することができる。また、仕切り部材は溶液収容部に挿入可能となっているので、上下に仕切られた培養領域のそれぞれの細胞を播種する際に、仕切り部材を容易に取り外すことができ、操作しやすい。
【００１７】
本発明の細胞培養用仕切り部材は、前記複合材料と、該複合材料の周囲を支持する支持部材と、を有する細胞培養用仕切り部材である。
本細胞培養用仕切り部材によれば、前記複合材料の周囲を支持する支持部材により、前記複合材料の取り扱い性を更に向上させることができる。また、本細胞培養用仕切り部材は、支持部材により前記複合材料の周囲が保持されているので、他の、細胞培養用の培養容器における溶液収容部に組み込み可能となる。これにより、他の細胞培養用の培養容器の溶液収容部に前記複合材料を挿入して、前記溶液収容部における培養領域を簡便に仕切ることができる。その結果、本発明に係るコラーゲンゲル膜及び複合材料による利点を、他の培養容器についても享受することができる。
【００１８】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
また、本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
また、本発明において、組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
以下、本発明について説明する。
【００１９】
［コラーゲンゲル膜］
本発明のコラーゲンゲル膜は、架橋されたコラーゲン線維を０．０３質量％〜０．５質量％含み、厚み２ｍｍ〜５ｍｍであるコラーゲンゲル膜である。
本発明で用いられるコラーゲンは、その由来について特に限定されるものではないが、資源量およびコラーゲン収率の観点から脊椎動物の真皮に由来するコラーゲンが好ましく用いられる。中でも、ＢＳＥ等の病原体を保有する可能性が家畜よりも潜在的に低い魚類真皮コラーゲン、例えば、鮭皮、サメ皮、マグロ皮、タラ皮、カレイ皮、スズキ皮、タイ皮等が用いられる。特に好ましくは、スズキ皮とタイ皮である。
【００２０】
脊椎動物の真皮に由来するコラーゲンはtype Iコラーゲンが主成分であり、type IIIコラーゲンが僅かに含まれる。Type Iコラーゲンのみを精製して用いても、コラーゲンゲル膜の機能は損なわれないため、このような精製物を本発明に使用してもよい。
脊椎動物の真皮からコラーゲンを製造する方法としては、酸処理もしくはアルカリ処理を用いてもよい。アルカリ処理を用いた場合、一部のアミノ酸が変質するが、コラーゲンゲル膜の機能は損なわれないため、このようなアルカリ処理物を本発明に使用することができる。
【００２１】
本発明におけるコラーゲンは、３本鎖螺旋構造のコラーゲン分子が会合して得られた線維状コラーゲンである。このようなコラーゲン線維は、例えば、Journal of Agricultural Good Chemistry, Vol.48, pp.2028-2032 (2000) に開示されている構造を有する。
線維化コラーゲンゲルの作製には、コラーゲン溶液に中性緩衝液を加えてコラーゲンの線維化を惹起させ、コラーゲン線維ネットワークから構成されるゲルを得るゲル化方法を挙げることができる。このようなコラーゲン線維は、線維化が充分に行われており、細胞培養用として充分な強度および柔軟性を有するものである。なお、線維化と同時にゲル化した場合には、線維化コラーゲン分子の長さが、線維化を充分に行ってから架橋したコラーゲン分子よりも短くなり、また、線維化とともに架橋反応をするため、コラーゲンゲル内のコラーゲン分子の数が増加し、この結果、その分コラーゲン分子間の架橋点が増える傾向がある。このため、コラーゲンゲル膜としての強度は高くなるが、コラーゲンゲルの網目構造がより緻密になり、物質透過性に劣る。線維化が充分であることは、吸光度に基づいて判断することができる。例えば、倒立顕微鏡「オリンパスＴＭＴ−２−２１  ＲＦＭ」で測定した値とする波長６００ｎｍの光に対する光路長２ｍｍでの吸光度が０．０２以上の場合には、線維化が充分であると判断できる。
【００２２】
コラーゲン線維を架橋する際に用いられる架橋剤としては、タンパク質を架橋できれば特に制限はないが、水溶性を有する水溶性架橋剤であることが好ましい。水溶性架橋剤によって架橋されたコラーゲン線維とすることによって、未反応の架橋剤を洗浄することができるなどの利点が得られる。中でも、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなどのカルボジイミド系架橋剤、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド系架橋剤、グリセロールジグリシジルエーテルやグリセロールトリグリシジルエーテルなどのエポキシ系架橋剤、ヘキサメチレンジイソシアネートなどのイソシアネート系架橋剤、およびトランスグルタミナーゼなどの酵素系架橋剤が、経済性、安全性および操作性の観点から好ましく用いられ、特に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩が、水溶性を示し、架橋時に生成する副生物を、水による洗浄作業で容易に除去することができるため、好ましい。
【００２３】
このようにして得られるコラーゲン線維は、ナノサイズの線維が互いに絡み合って構成されており、マイクロサイズの細胞は、コラーゲン線維の間への侵入が阻止される一方で、細胞よりもサイズの小さいタンパク質などの物質はコラーゲン線維の間に侵入し、通過可能である。この結果、細胞を通過させず物質を通過するという選択性をコラーゲンゲル膜は備えることができる。
コラーゲン線維の長さは、アミノ酸が約１０００個連なったポリペプチド鎖３本が螺旋状に組み合わさった立体構造の観点から３００ｎｍ程度であることが好ましい。コラーゲン繊維の長さが２５０ｎｍ〜３５０ｎｍであれば、特有の構造を採りやすく、充分な強度を得ることができるため、好ましい。
【００２４】
コラーゲン線維を構成するコラーゲンは、細胞に対する生物学的応答性を調整する目的で、種々の生体高分子を結合したコラーゲンであってもよい。生物学的応答性を調整する方法としては、フィブロネクチンやビトロネクチン、ラミニン、ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）配列を持つペプチドなど細胞接着のリガンドを結合させる方法を挙げることができる。
また、コラーゲン線維を構成するコラーゲンは、水溶性化合物に対する物理化学的応答性を調整する目的で、側鎖に対して種々の化学修飾が施されたコラーゲンであってもよい。物理化学的応答性を調整する方法としては、サクシニル化、メチル化あるいはミリスチル化によりコラーゲンの等電点や疎水性を調整する方法を挙げることができる。
【００２５】
コラーゲンに対する生体高分子の結合や側鎖への化学修飾は、コラーゲンの線維化又はコラーゲン線維の架橋化の前に行ってもよく、線維化の前後、又は架橋化の前後のいずれの段階で行ってもよい。化学修飾により線維化能が低下する場合、架橋化により化学修飾に利用するコラーゲン側鎖の官能基が現象する場合があるため、化学修飾は線維化の後及び架橋化の前に行うことが好ましい。
【００２６】
本発明のコラーゲンゲル膜におけるコラーゲン線維の含有量としては、コラーゲンゲル膜の全質量の０．０３質量％〜０．５質量％である。０．０３質量％未満では、細胞培養における細胞足場としてのゲルが形成されない。一方、０．５質量％を超えるとコラーゲン線維密度が高くなって透明性とタンパク質透過性に劣る。
コラーゲン線維の含有量は、強度とタンパク質の透過性の観点から、０．０５質量％〜０．１質量％であることがより好ましい。
【００２７】
コラーゲンゲル膜は、コラーゲン線維を含むヒドロゲルである。ハイドロゲルに占める水（液状成分）の割合は、コラーゲンゲル膜の全質量に対して９９．５〜９９．９５質量％であるのが好ましく、０．０５〜０．１質量％であることが更に好ましい。ハイドロゲルに含まれる液状成分の割合がこの範囲であれば、細胞の観察を阻害することなく実用上十分なゲル層の強度が得られるため、好ましい。
液状成分は、コラーゲン線維を維持できる溶液に由来する成分であればよい。このような溶液としては、水、酸性溶液などを挙げることができる。
【００２８】
コラーゲンゲル膜の厚みは、２ｍｍ〜５ｍｍである。２ｍｍ未満では強度が低下してゲルの形態が維持できない。一方、５ｍｍを超えるとタンパク質の透過性が劣化する場合や、細胞観察時の焦点距離の調整が複雑になり、観察容易性に劣る。コラーゲンゲル膜の厚みは、強度と観察容易性の観点から２．５ｍｍ〜３．５ｍｍであることが好ましい。
【００２９】
コラーゲンゲル膜の透明性については、例えば、吸光度に基づいて評価することができ、架橋されたコラーゲン線維が、波長６００ｎｍの光に対する光路長２ｍｍでの吸光度が０．０２以上０．１未満である線維化コラーゲンを含むコラーゲンゲル膜である。吸光度が０．１を超えると透明性が低下する場合があり、細胞の観察時において通常用いられる光学顕微鏡による観察に向かない。０．０２未満では、コラーゲン線維が充分に線維化していない場合があり、ゲルの強度が充分でない場合がある。本発明におけるコラーゲンゲル膜の吸光度による透過性は、倒立顕微鏡「オリンパスＴＭＴ−２−２１  ＲＦＭ」で測定した値とする。なお、線維化コラーゲンと、線維化コラーゲンを架橋させたコラーゲンゲルとでは、吸光度について大きく変わらないため、線維化コラーゲンの吸光度をコラーゲンンゲル膜の吸光度としてもよい。
【００３０】
このようなコラーゲンゲル膜は、細胞に対する親和性も高く、各種の細胞を良好に成育させる。
コラーゲンゲル膜を有する培養系において培養可能な細胞としては特に制限はない。例えば、繊維芽細胞、筋芽細胞、骨芽細胞、神経細胞、血液細胞、リンパ球系細胞、肝細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等の細胞を挙げることができる。これらの細胞を組み合わせて共培養する場合には、繊維芽細胞と幹細胞（胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞など）との組み合わせ、骨芽細胞と軟骨細胞との組み合わせなどを挙げることができる。
【００３１】
細胞に用いられる培養液としては、培養対象となる細胞の種類に応じて適宜選択することができる。使用可能な培養液としては、公知のもののいずれであってもよく、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ１０４、１９９、ＭＣＤＢ１５３、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、Ｂａｓａｌ培地などを挙げることができる。また、これらの培養液には、一般に添加可能な各種の成分、例えば、グルコース、ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）またはヒト血清、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシンなど）を添加してもよい。なお、血清を添加する場合の濃度は、そのときの培養状態によって適宜変更することができるが、通常１０％（v/v）とすることができる。
【００３２】
細胞の培養は、培養液中、コラーゲンゲル膜の存在下において行えばよい。細胞は、それぞれの性質に応じて、コラーゲンゲル膜に付着して又は付着せずに培養する。
なお、細胞の培養には、通常の培養条件、例えば３７℃の温度で５％ＣＯ２濃度のインキュベーター内での培養が適用される。
【００３３】
コラーゲンゲル膜は、細胞を通過させない一方で、培養液中の各種成分を透過することができる。このため、コラーゲンゲル膜を挟んで一方の領域に一の細胞を配置させ、他方の領域に他の細胞を配置させることによって、一の培養系において、複数の細胞の培養を行うことができる。このとき、コラーゲンゲル膜は適度な透明性も有しているので、コラーゲンゲル膜を挟んで複数の細胞が存在していても、それぞれの状態を観察することができる。
細胞の観察には、細胞の形態等の観察において通常用いられる方法を挙げることができ、例えば、目視、光学顕微鏡、位相差顕微鏡、蛍光顕微鏡等による観察を挙げることができる。
【００３４】
［複合材料］
本発明の複合材料は、上述した本発明のコラーゲンゲル膜と、孔径２０μｍ〜５０００μｍの孔を有する水不溶性高分子膜材料とを備えている。
本発明の複合材料は、上述したとおり、培養中の細胞を通過させずに物質を通過可能であると共に透明性に優れたコラーゲンゲル膜に加えて、孔径２０μｍ〜５０００μｍの孔を有する水不溶性高分子膜材料を備えているので、コラーゲンゲル膜のゲル強度を補い、取扱い性に優れた複合材料とすることができる。
【００３５】
本複合材料におけるコラーゲンゲル膜については、上述したコラーゲンゲル膜をそのまま適用することができる。
【００３６】
水不溶性高分子材料としては、孔径２０μｍ〜５０００μｍの孔を構成可能であればよく、透明性の高いものであることが、細胞の観察容易性の観点から好ましい。
このような水不溶性高分子材料としては、ナイロン、ＰＥＴ等を挙げることができる。なかでも、観察容易性の観点から、透明であることが好ましい。
【００３７】
また水不溶性高分子材料の孔径は、２０μｍ〜５０００μｍである。２０μｍ未満ではタンパク質の透過性が劣る場合があり、一方、コラーゲンゲル膜を水不溶性高分子材料上に維持しやすく、また、タンパク質透過性、及びｉＰＳ細胞のコロニーサイズが１００μｍ〜５００μｍ程度であるために観察容易性の観点から５０００μｍ以下である。また、コラーゲンゲル膜を水不溶性高分子材料の一面上により確実に保持可能にするという点で、３０００μｍ以下、好ましくは２０００μｍ未満の孔径を有する水不溶性高分子材料とすることが好ましく、一方、水不溶性高分子材料の両面にコラーゲンゲル膜を容易に形成可能とする点で、５００μｍ超、好ましくは１０００μｍ以上の孔径を有する水不溶性高分子材料とすることが好ましい。
【００３８】
なお、水不溶性高分子材料の孔径とは、孔の形状によって異なるが、孔の形状が円形の孔の場合にはその直径を意味し、楕円の場合には円の中心を通過する最大径を意味する。孔の形状が矩形又は多角形の場合には、矩形又は多角形の中心を通過する最大径の長さを意味する。
【００３９】
水不溶性高分子材料の形状としては、上述した孔径の孔が複数設けられていれば特に制限はなく、コラーゲンゲル膜と同一又は異なる形状に調整されたシート状、メッシュ状等を挙げることができる。タンパク質透過性及び観察容易性の観点からメッシュ状であることが好ましい。孔の形状についても特に制限はなく、矩形、円形、楕円などを挙げることができる。
【００４０】
水不溶性高分子膜材料とコラーゲンゲル膜との一体化は、従来公知の方法で一体化されていればよく、特に制限されない。例えば、水不溶性高分子材料とコラーゲンゲル膜とを押圧する方法や、水不溶性高分子材料上でコラーゲンゲル膜の線維化及び架橋を行う方法により一体化することができる。
【００４１】
コラーゲンゲル膜２０を確実に保持する観点から、コラーゲンゲル膜２０は水不溶性高分子材料の面上に配置されていることが好ましい。コラーゲンゲル膜を水溶性高分子材料面上に配置するには、対象となる面上にコラーゲンゲル膜を載置又は形成させればよい。
前記コラーゲンゲル膜は、水不溶性高分子材料の一面のみに配置されていてもよく、両面に配置されていてもよい。水不溶性高分子材料の一面のみに配置されている場合には、細胞を培養する面にコラーゲンゲル膜を配置していることが好ましい。水不溶性高分子材料の両面にコラーゲンゲル膜を有する複合材料は、例えば、水不溶性高分子材料の孔径を調整することにより作製することができる。
【００４２】
［培養容器］
次に、図面を参照して、本発明にかかる培養容器について説明する。
図１には、本発明の一実施形態にかかる培養容器１０が記載されている。
培養容器１０には、本発明における溶液収容部に相当し、所定の深さＷを有する平底の円筒状のウェル１２が複数（図示せず）設けられている。各ウェル１２には、細胞培養時には、細胞培養のための培養液が注入される。
各ウェル１２の内部は、深さＷの細胞培養のための培養領域１４となっており、付着性又は浮遊性の細胞を培養可能となっている。
【００４３】
培養容器１０の材質としては、通常用いられている透明なものであれば特に制限なく挙げることができ、例えば、ガラス、プラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリカーボネートなど）、シリコーンなどを挙げることができる。また、ウェル１２の底面には、細胞付着性を向上させる処理が付されているものであってもよい。
【００４４】
培養容器１０の表面には、水不溶性高分子材料２２が配置されており、水不溶性高分子材料２２の一部は、ウェル１２の内部に侵入し、ウェル１２の培養領域１４の中央やや下方となる位置に配置されている。ウェル１２の内部となる水不溶性高分子材料２２上には、上述したコラーゲンゲル膜２０が載置されて、複合材料２４を構成している。コラーゲンゲル膜２０と水不溶性高分子材料２２とは、予め一体化したものであってもよい。
【００４５】
各ウェル１２の培養領域１４は、コラーゲンゲル膜２０によって上下に仕切られており、コラーゲンゲル膜２０の下が第一の培養領域１６となり、コラーゲンゲル膜２０の上が第二の培養領域１８となっている。
【００４６】
本実施形態の培養容器１０の作用について、フィーダー細胞と、幹細胞などの付着性の目的細胞との共培養を例に説明する。
培養容器１０は、複合材料２４を取り外して培養液を各ウェル１２に注入し、第一の培養領域１６を得る。第一の培養領域１６には、フィーダー細胞を播種する。次いで、複合材料２４を、コラーゲンゲル膜２０がウェル１２の内部となるように載置し、培養液をコラーゲンゲル膜２０よりも上方に液面がくるよう注入して、第二の培養領域１８を確保した後に、目的細胞を第二の培養領域１８に播種する。目的細胞は、第二の培養領域１８において、コラーゲンゲル膜２０上に付着する。
これにより、第一の培養領域１６でフィーダー細胞を培養し、第二の培養領域１８で目的細胞を培養することができる。
【００４７】
培養期間中では、第一の培養領域１６と第二の培養領域１８とのそれぞれに細胞が配置されている。ウェル１２の内部では、培養液の成分及びフィーダー細胞から産生されたタンパク質等は、コラーゲンゲル膜２０及び水不溶性高分子材料２２を透過可能であるので、第一の培養領域１６のみならず、複合材料２４を通過して第二の培養領域１８まで拡散可能となる。このため、第二の培養領域１８で位置している目的細胞にも供給される。
【００４８】
また、第一の培養領域１６及び第二の培養領域１８のそれぞれに位置している細胞を観察する場合には、コラーゲンゲル膜２０には透明性も備わっているため、複合材料２４が介在していても、通常、光学顕微鏡を用いて焦点距離を合わせるだけで、簡便に観察することができる。
【００４９】
所定の培養期間後には、複合材料２４のみを培養容器１０から取り出せば、共培養下にあったフィーダー細胞と目的細胞とが簡便に分離される。その後、複合材料２４上に存在していた目的細胞のみを単離すればよい。
【００５０】
このようにして、本実施形態の培養容器１０を用いることによって、培養下にある複数に細胞を、細胞を通過させずに培養液成分などの物質を通過させて培養することができるともに、培養しながら細胞の観察も容易に行うことができる。
【００５１】
第一の実施形態では、複合材料２４を取り外すことによって、第二の培養領域１８で培養していた目的細胞を、簡便にフィーダー細胞から分離したが、これに限定されない。例えば、フィーダー細胞を第二の培養領域１８で培養を行うことによって、第一の培養領域１６及び第二の培養領域１８に細胞産生物質が放出される。その後に、複合材料２４をウェル１２から取り出すことによって、培養系からフィーダー細胞を除去することができるので、フィーダー細胞から産生された物質を含有し、フィーダー細胞を含有しない培養上清を、簡便に回収することができる。
【００５２】
第一の実施形態にかかる培養容器１０では、コラーゲンゲル膜２０と水不溶性高分子材料２２とで構成された複合材料２４によって第一の培養領域１６と第二の培養領域１８を得たが、これに限定されない。
図２には、本発明の第二の実施形態にかかる培養容器３０が記載されている。なお、培養容器３０において、図１に示される第一の実施形態にかかる培養容器１０と共通の部材には、同一の符合を付して説明を省略する。
【００５３】
培養容器３０は、本発明における溶液収容部に相当し、培養領域１４を形成する円形皿状の培養皿３２と、培養皿３２に挿入されて、培養領域１４を上下に仕切る円筒状の仕切り部材３４とで構成されている。
培養皿３２は、第一の実施形態における培養容器１０と同様に透明な素材であればいずれの材料で構成されていてもよい。このような材料としては、上述したものをそのまま挙げることができる。
【００５４】
仕切り部材３４は、培養皿３２よりも径の短い円筒で構成されており、上下方向に開口し、上部開口部３６と下部開口部３８とを備えている。下部開口部３８は、上述した複合材料２４で閉じられている。
また仕切り部材３４の外周部には、同心円状の支持部材４０が備えられ、仕切り部材３４と一体化されている。これにより、仕切り部材３４は、支持部材４０によって培養皿３２の縁部に支持されて、仕切り部材３４の下部開口部３８に配置された複合材料２４は、培養皿３２の底面から浮いた状態を維持している。
【００５５】
支持部材４０の裏面には、培養皿３２の縁部に支持部材４０を位置決めさせる突起部４２が、支持部材４０及び仕切り部材３４と同心円状で且つ、培養皿３２の縁部より内側となる位置に設けられている。これにより、仕切り部材３４は、培養皿３２の上部に載置されたときに、所定の位置に配置されて培養皿３２からの脱落が防止される。
【００５６】
次に、培養容器３０の作用について、フィーダー細胞と目的細胞との共培養を例に説明する。
仕切り部材３４を、支持部材４０を操作して培養皿３２から外し、培養皿３２に、培養液を注入してフィーダー細胞を播種する。次いで、支持部材４０を培養皿３２の縁部に突起部４２を合わせて位置決めしつつ載置すると、仕切り部材３４の下部開口部３８が培養液の液面よりも下方に配置される。このとき、培養皿３２の培養領域１４が仕切られて、仕切り部材３４の内部であってコラーゲンゲル膜２０よりも上方に、第二の培養領域１８が得られる。この第二の培養領域１８に目的細胞を播種して、共培養を開始する。
【００５７】
培養期間中では、第一の培養領域１６で培養されているフィーダー細胞から産生された物質は、仕切り部材３４の下部開口部３８に備えられた複合材料２４を通過して、第二の培養領域１８で培養されている目的細胞へ供給される。
また、仕切り部材３４には透明性も備わっているため、第一の培養領域１６及び第二の培養領域１８のそれぞれで培養している各細胞を、通常、光学顕微鏡を用いて焦点距離を合わせるだけで、簡便に観察することができる。
【００５８】
所定の培養期間後では、支持部材４０を仕切り部材３４と共に引き上げることによって、第二の培養領域１８に配置された細胞を第一の培養領域１６で培養しているフィーダー細部から容易に分離する。
【００５９】
このようにして、本実施形態の培養皿３２を用いることによって、培養下にある複数に細胞を、細胞を通過させずに培養液成分などの物質を通過させて培養することができるともに、培養しながら細胞の観察もすることができる。
【００６０】
なお、本実施形態の培養容器３０には、支持部材４０の、培養皿３２の縁部内側となる位置に突起部４２を設けたが、これに限定されず、培養皿３２の縁部外側であってもよい。また、突起部４２は、支持部材４０及び仕切り部材３４と同心円状となるように設けたが、これに限定されず、支持部材４０の表面の一部のみに一箇所又は複数箇所設けたものであってもよく、また突起部４２はなくてもよい。
【００６１】
本実施形態の培養容器３０では、支持部材４０を、円筒状の仕切り部材３４と同心円状となる円盤状としたが、これに限定されず、仕切り部材３４を支持することができれば、矩形や、支持棒状などの形状であってもよい。
また、仕切り部材３４の内部に複合材料２４を挿入した形態としたが、これに限定されない。例えば、コラーゲンゲル膜２０の側面が第一の培養領域１６に直接接触する形態であってもよい。この場合には、コラーゲンゲル膜２０の側面から、タンパク質などの物質が通過することができる。
【００６２】
本実施形態の培養容器３０の支持部材４０は、仕切り部材３４と一体化したものとしたが、仕切り部材３４における下部開口部３８の位置を調整可能な調整機構を備えたものであってもよい。このような調整機構としては、所望の位置に下部開口部３８を位置決め可能な複数の突起又は、ねじ機構を備えたものとしてもよい。
【００６３】
本実施形態の培養容器１０、３０では、コラーゲンゲル膜２０と水不溶性高分子材料２２とを備えた複合材料２４を用いて、第一の培養領域１６及び第二の培養領域１８のそれぞれに細胞を播種して培養を行ったが、これに限定されない。
例えば、コラーゲンゲル膜２０のみを用いて、コラーゲンゲル膜２０の一方の面に細胞を播種して培養した後に、コラーゲンゲル膜２０を反転させ、他方の面に対して別の細胞を播種することにより、コラーゲンゲル膜２０上に複数の細胞を配置させて用いてもよい。
また、このようにして得られた両面に細胞が配置されたコラーゲンゲル膜２０を、水不溶性高分子材料２２上に、細胞が離れないように載置して、培養液中で複合材料２４を構成してもよい。
【００６４】
本発明の実施形態にかかる培養容器１０、３０には、無菌培養を考慮して、それぞれ蓋を備えたものであってもよい。
【００６５】
また、培養容器１０、３０における複合材料２４は、コラーゲンゲル膜２０を水不溶性高分子材料２２の一面にのみに有していたが、これに限定されない。例えば、コラーゲンゲル膜２０が水不溶性高分子２２の上面（おもて面）のみならず裏面に配置されていてもよい。
【００６６】
コラーゲンゲル膜２０を水不溶性高分子２２のおもて面と裏面の双方に配置させる方法としては特に制限はなく、水不溶性高分子２２の両面にそれぞれコラーゲンゲル膜２０を貼り合わせてもよい。
好ましくは、コラーゲンゲル膜２０を構成するコラーゲンが通過可能な大きさの孔径を有する水不溶性高分子材料２２上で、コラーゲンの線維化及び架橋を行うことにより、コラーゲンゲル膜２０の両面に水不溶性高分子材料２２を有する複合材料を得る。これにより、コラーゲンゲル膜２０の両面に水不溶性高分子材料２２を有する複合材料を簡便に得ることができる。
【００６７】
コラーゲンが通過可能な大きさの孔径としては、５００μｍ〜５０００μｍであることが好ましく、１０００μｍ〜５０００μｍであることがより好ましい。
水不溶性高分子材料２２の両面に配置されるコラーゲンゲル膜２０の厚みは、同一であってもよく異なっていてもよい。水不溶性高分子材料２２のおもて面、即ち、第二の培養領域１８に面した側のコラーゲンゲルと、裏面、即ち第一の培養領域１６に面した側のコラーゲンゲルの厚みの比率は、例えば、裏面の厚みに対しておもて面の厚みを０．５倍〜３倍とすることができ、０．８倍〜２倍が好ましい。おもて面を厚くした場合には、位相差顕微鏡で観察するときにおもて面に培養した細胞に焦点が合わせやすく観察しやすい点で好ましい。おもて面を厚くする場合には、例えば、裏面の厚みに対して１倍を超え、３倍以下とすることができ、１．２倍〜２倍が好ましい。
【００６８】
［仕切り部材］
また、本発明にかかるコラーゲンゲル膜２０及び水不溶性高分子材料２２で構成される複合材料２４は、市販のウェルプレートの各ウェルに挿入して、ウェルの培養領域を仕切ることができる仕切り部材の形態であってもよい。これにより、本発明の複合材料を市販の細胞培養用の培養プレートに簡便に適用することができる。
【００６９】
図３及び図４には、本発明に係る仕切り部材の一例としての、市販のウェルプレートの所定の深さＷを有する各ウェルに挿入可能であると共に、水不溶性高分子材料２２の両面にコラーゲンゲル膜２０を有する仕切り部材５０を示す。なお、図３及び図４の仕切り部材５０において、図１に示される第一の実施形態にかかる培養容器１０と共通の部材には、同一の符合を付して説明を省略する。
【００７０】
図３及び図４に示される仕切り部材５０は、市販の６ウェルプレート６０の各ウェル６２に挿入可能な大きさの円筒の支持部５２と、水不溶性高分子材料２２及びコラーゲンゲル膜２０で構成された複合材料５６とを有している。支持部５２は、支持部５２の底面近傍に、複合材料５６の周囲を支持して配置させている。
【００７１】
仕切り部材５０における複合材料５６は、水不溶性高分子材料２２の両面にコラーゲンゲル膜２０を備えている。この場合の水不溶性高分子材料２２の孔径は、５００μｍ〜５ｍｍ、例えば、２ｍｍとすることができるが、前述のとおり、これに限定されない。また、コラーゲンゲル膜２０の厚みは、例えば、全体として３ｍｍであり、水不溶性高分子材料２２の上面（おもて面）側に２ｍｍ、裏面側に１ｍｍとすることができるが、前述のとおり、これに限定されず、上述した本発明におけるコラーゲンゲル膜について既述した範囲内であればよい。
【００７２】
仕切り部材５０の下端部には、水不溶性高分子材料２２が連結されている。水不溶性高分子材料２２と仕切り部材５０との連結方法については特に制限はなく、はめ込み、接着等を挙げることができる。
【００７３】
仕切り部材５０の上端部は外周方向に延長して保持部５４を構成している。保持部５４は、仕切り部材５０を各ウェル６２に挿入したときにウェル６２の端部に接触して、仕切り部材５０をウェル６２の内部に位置決めする。これにより、ウェル６２の内部の培養領域が２つに仕切られ、第一の培養領域１６と第二の培養領域１８が形成される（図４参照）。
【００７４】
仕切り部材５０の作用について説明する。
仕切り部材５０を、市販のウェルプレート６０のウェル６２に、下端部をウェル６２の底面に対向させて挿入すると、ウェル６２内の培養領域１４は、仕切り部材５０の下端部に配置された複合材料５６により、第一の培養領域１６と第二の培養領域１８とに仕切られる。
複合材料５６には、水不溶性高分子材料２２の両側にコラーゲンゲル膜２０が配置されているので、コラーゲン膜の両面で培養することができる。
【００７５】
このように、仕切り部材５０は、仕切り部材５０を市販のウェルプレート６０のウェル６２に挿入することにより、本発明の他の実施形態に係る培養容器１０、培養皿３０と同様に、第一の培養領域１６と第二の培養領域１８とに培養領域１４全体を簡便に仕切ることができる。これにより、それぞれの異なる種類の細胞の培養が可能となるなど、培養容器１０、培養皿３０と同様の効果を奏することができる。
【００７６】
仕切り部材５０は、市販の６ウェルプレートの各ウェルに挿入可能な大きさ及び形状としたが、これに限定されない。仕切り部材５２の大きさには特に制限はなく、市販の６ウェルプレート以外の他のプレート、例えば、２４ウェルプレート等のウェルサイズに適合した形状及びサイズであってもよい。また、仕切り部材５０は、１つのウェルに挿入可能な形状としたが、これに限定されない。例えば、２つ以上のウェルに適合する仕切り部材５０を連結させたものであってもよい。これにより、ウェルプレート上の複数のウェルに対して同時に挿入可能となる。
【００７７】
なお、本実施形態における仕切り部材５０では、水不溶性高分子材料２２の両面にコラーゲンゲル膜２０を備えた複合材料５６を備えたものとしたが、これに限定されず、水不溶性高分子材料２２のおもて面のみにコラーゲンゲル膜２０を備えた複合材料２４を有するものとしてもよい。また、水不溶性高分子材料２２の両面にコラーゲンゲル膜２０を備えた複合材料５６は、前記培養容器１０、３０における複合材料２４の代えて用いてもよい。
また、本実施形態における仕切り部材５０では、支持部５２の形状を円筒状としたが、これに限定されない。市販のウェルの形状に応じて矩形等であってもよい。また、支持部５２の形状に応じて保持部５４を支持部５２の周囲に設けたが、これに限定されない。保持部５４は、仕切り部材５０をウェル６２内の所定の位置に位置決め可能であれば、支持部５２の上端部の一部のみに設けてもよい。
【実施例】
【００７８】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「部」は質量基準である。
【００７９】
［実施例１］
＜コラーゲンゲル膜を組み込んだ培養容器の作製＞
豚皮由来アテロコラーゲン水溶液（濃度０．５３％、ｐＨ３希塩酸溶媒、新田ゼラチン製）を、ｐＨ３希塩酸で１０倍に希釈した。このコラーゲン溶液５ｍＬに、ｐＨ７．０、３０ｍＭのリン酸緩衝液（２００ｍＭ塩化ナトリウム含有）を４５ｍＬ添加した。そのコラーゲン水溶液を、ポリスチレントレーに置いたカップ状培養容器（セルインサート、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）に流し込んだ。カップ状培養容器は、事前に枠を残して底面のフィルムを剥がし、ナイロンメッシュ（孔径１２５μｍ）を接着剤で貼り付けた。流し込むコラーゲン水溶液の容量は、ナイロンメッシュ上に形成されるゲルの厚みが１ｍｍになるように設定した。その後、３７℃で２４時間、湿度を与えながら加温してコラーゲンを線維化させた。１００ｍＭの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド水溶液を、カップに１０ｍｌ加え、２４時間静置してコラーゲン線維ゲルを架橋して、架橋されたコラーゲンゲル膜を得た（コラーゲン濃度：０．０５質量％）。
【００８０】
＜コラーゲンゲル膜の可視光透過実験＞
上記で得られたコラーゲンゲル膜と同一濃度のコラーゲンゲルを、上記と同様にして、光路長２ｍｍの石英セル内に作製した。倒立顕微鏡オリンパスＴＭＴ−２−２１  ＲＦＭを使用し、分光光度計（Jasco社製、V-650）を用いて、波長６００ｎｍの可視光に対する吸光度を測定したところ、吸光度は０．０２であった。
【００８１】
＜コラーゲンゲル膜上での細胞培養＞
市販の骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１を、１０％血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）を添加したＭＥＭα改変型培地（以下α−ＭＥＭと略す）で培養した。２日おきに培地交換し、セミコンフルエントになったところで細胞を０．０２％トリプシン−０．２５％ＥＤＴＡ溶液で剥がして５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２になるように継代培養した。
【００８２】
ゲル膜は６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ製）に配置して、蒸留水に浸漬しながら、１０ｋＧｙのガンマ線で滅菌した。ゲル膜の外側に５ｍｌのリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．３）を加えて、外側と内側の液面が平衡化したのち、そのＰＢＳを取り除いて、この作業を３回繰り返して洗浄した。培養直前に外側にα−ＭＥＭを５ｍｌ添加して、培地を取り除き、再度α−ＭＥＭを５ｍｌ添加して３７℃で１時間インキュベートした後、５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２になるように細胞を播種した。α−ＭＥＭを培地として、３〜４日で培地を交換して、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で培養した。
【００８３】
＜ゲル膜上での細胞の接着と増殖＞
培養を開始して３日目と７日目に、コラーゲンゲル膜上の細胞を位相差顕微鏡で観察した。細胞の観察は、ＯＬＹＭＰＵＳ社製の光学顕微鏡ＴＭＴ−２−２１ＲＥＮを用いた。３日目に細胞の接着と形状が明確に確認でき、７日間で増殖が確認できた（図５）。
【００８４】
［実施例２］
＜コラーゲンゲルと細胞のＳＥＭ観察＞
実施例１で得られ、７日間培養したコラーゲンゲル膜を、１ｍｌのＰＢＳで２回洗浄した。洗浄後、１ｍｌの２．５％グルタルアルデヒド−ＰＢＳ溶液に１時間浸漬し、細胞を固定した。固定後、１ｍｌの蒸留水で２回洗浄した。エタノール濃度が５０v／v％、６０v／v％、７０v／v％、８０v／v％及び９０v／v％の水溶液に、各１０分ずつ順番に浸漬した。その後１００v／v％エタノールに各１５分ずつ３回浸漬し、水を完全に除去した。更にｔ−ブチルアルコールに３回各１０分浸漬した後、凍結乾燥を行った。
その試料にイオンコーター（Ｅ−１０２０、ＨＩＴＡＣＨＩ製）を用いて金を蒸着し、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）用試料とした。ＳＥＭ観察は、ＨＩＴＡＣＨＩ製の走査型電子顕微鏡Ｓ−３２００Ｎを用いた。ゲル膜は１００ｎｍ程度のコラーゲン線維が絡み合い、架橋され、その膜状に細胞が接着しており、細胞がそのゲル膜を通過することはできないことが確認できた（図６Ａ及び図６Ｂ）。
【００８５】
［実施例３］
＜タンパク質の透過実験＞
テラピア皮より抽出したコラーゲン水溶液（濃度１．０％、ｐＨ３希塩酸溶媒）を、０．０５％、０．１％及び０．４％の最終コラーゲン濃度となるように、ｐＨ３希塩酸でそれぞれ希釈した。このコラーゲン溶液２０ｍＬに、ｐＨ７、３０ｍＭのリン酸緩衝液（３００ｍＭ塩化ナトリウム含有）を２０ｍＬ添加した。そのコラーゲン水溶液を、ポリスチレントレーに置いたカップ状培養容器（セルインサート、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）に流し込んだ。カップ状培養容器は、事前に底面のフィルムを剥がし、ナイロンメッシュ（孔径１２５μｍ）を接着剤で貼り付けた。流し込むコラーゲン水溶液の容量は、ナイロンメッシュ上に形成されるゲルの厚みが３ｍｍになるように設定した。その後、３７℃で２４時間、湿度を与えながら加温してコラーゲンを線維化させた。その後、１００ｍＭの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド水溶液を、カップに１０ｍｌ加え、２４時間静置してコラーゲン線維ゲルを架橋して、架橋されたコラーゲンゲル膜を得た。
【００８６】
得られたゲル膜をそれぞれ６ウェルプレートに配置した。ゲル膜の外側に２ｍｌの０．２％血清アルブミン水溶液を加えた。ゲル膜を通過してゲル膜の内側に水溶液が透過し、内側に透過した水溶液が１ｍｌに達したら採取して、１５μｌに濃縮した。濃縮液を電気泳動し、透過前の０．２％血清アルブミン水溶液とバンドを比較した。結果を図７に示す。なお、図７において、レーン１は０．２％アルブミン水溶液、レーン２は０．０５％コラーゲン濃度のゲル、レーン３は０．１％コラーゲン濃度のゲル、レーン４は０．４％コラーゲン濃度のゲル、レーンＭはマーカーをそれぞれ表す。
【００８７】
図７に示されるように、コラーゲン濃度０．０５％〜０．４％のゲル膜であっても、ゲル膜を透過した溶液のタンパク質量は減少しているが、高分子量の血清成分を透過していることが確認できた。なお、高分子量の血清成分が確認できるため、低分子量の血清成分も透過していると確認できる。従って、本実施例のコラーゲンゲル膜は、低分子の血清分のみならず高分子の血清成分も充分な透過性を有していることがわかった。
【００８８】
［実施例４］
＜ゲル膜の強度実験と液体の透過実験＞
実施例２と同様にして、コラーゲン濃度０．０２５％、０．０５％、０．１％及び０．５％であって、厚みが１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍ及び４ｍｍの各コラーゲンゲル膜を作製し、得られたゲル膜をそれぞれ６ウェルプレートに配置した。
ゲル膜の外側に５ｍｌの水を加えて４５分間後に、ゲル膜の内側に通過した水の液面の高さを観察した。強度及び透過度の評価は、以下のように行った。結果を表１に示す。
＜強度＞
○：取扱い時に破損しない。
△：取扱い時に若干の破損部が認められるが崩れることはない。
×：取扱い時に破損して崩れる。
＜透過度＞
○：外側と内側の液面が同じであった。
△：外側の液面より内側の液面の方が低かったが、外側から内側へ水の透過が認められた。
−：ゲルが破損して、透過度の測定ができなかった。
【００８９】
【表１】
0005840054.tif 000002
【００９０】
表１に示されるように、コラーゲン濃度が０．０５％以上且つ厚みが２ｍｍ以上であれば、強度及び液体の透過性も充分であった。更に、コラーゲン濃度が０．１％以上であれば、２ｍｍの厚みでも充分な強度のゲル膜を得ることができることがわかる。また、コラーゲン濃度が０．５％の場合には、４ｍｍの厚みで水の透過が認められ、４ｍｍ未満の厚みであれば、水分が内部に充分に透過できることがわかった。なお、コラーゲン濃度０．５％且つコラーゲンゲルの厚みが４ｍｍでは、外側と内側の液面が平衡化せずに、ゲル膜の一部の乾燥が認められるものの、水は内側へ透過しており、使用上、問題ないと判断できる。
一方、コラーゲン濃度がいずれの濃度であっても、コラーゲンゲルの厚みが１ｍｍでは、ゲル膜が均一で作製できないうえに、外側の水で破損した。さらに、コラーゲンゲルの厚みで３ｍｍであっても、コラーゲン濃度が０．０２５％ではゲルが破損して使用できないものであった。
【００９１】
［実施例５］
＜線維化ゲル膜と未線維化ゲル膜の強度実験＞
実施例２と同様にして、厚みが３ｍｍのコラーゲン濃度０．０５質量％、０．１質量％及び０．５質量％のコラーゲンゲル膜を作製し、得られたゲル膜をそれぞれ６ウェルプレートに配置した。ゲル膜の外側に５ｍｌの水を加えて、４５分間でゲル膜を通過して内側に水の液面の高さを観察した。一方、線維化しない（未線維化）ゲル膜（コラーゲン濃度０．０５質量％）を作製し、同様に観察した。強度の評価は、次の通りである。○：破損しない、×：破損した。不可：ゲルが作製できず測定不可。結果を表２に示す。
【００９２】
【表２】
0005840054.tif 000003
【００９３】
表２に示されるように、線維化されたコラーゲンを用いたコラーゲンゲル膜では、０．０５％〜０．５％の濃度のいずれにおいても、適度な強度のコラーゲンゲル膜であった。
これに対して、線維化されていないコラーゲンを用いたコラーゲンゲル膜では、０．０５質量％ではゲル膜が作製できず、０．５質量％では架橋反応が早くて厚みが均一なゲル膜を作製できなかった。一方、コラーゲン濃度０．１質量％は、強度が不充分となり破損したことを確認した。
【００９４】
［実施例６］
＜コラーゲンゲル膜を組み込んだ培養容器の作製＞
豚皮由来アテロコラーゲン水溶液（濃度０．５３％、ｐＨ３希塩酸溶媒、新田ゼラチン製）を、ｐＨ３希塩酸で１０倍に希釈した。このコラーゲン溶液５ｍＬに、ｐＨ７．０、３０ｍＭのリン酸緩衝液（２００ｍＭ塩化ナトリウム含有）を４５ｍＬ添加した。そのコラーゲン水溶液を、ポリスチレントレーに置いたカップ状培養容器（セルインサート、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）に流し込んだ。カップ状培養容器は、事前に枠を残して底面のフィルムを剥がし、ナイロンメッシュ（孔径２ｍｍ）を接着剤で貼り付けた。
流し込むコラーゲン水溶液の容量は、ナイロンメッシュ上に形成されるゲルの厚みが３ｍｍになるように設定した。その後、３７℃で２４時間、湿度を与えながら加温してコラーゲンを線維化させた。１００ｍＭの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド水溶液を、カップに１０ｍｌ加え、２４時間静置してコラーゲン線維ゲルを架橋して、架橋されたコラーゲンゲル膜を得た（コラーゲン濃度：０．０５質量％）。コラーゲン水溶液をカップ状培養容器に流し込むことによりコラーゲンがナイロンメッシュの孔から裏側に流れ出て、この状態で、線維化及び架橋化を行った。これにより、得られたカップ状培養容器では、ナイロンメッシュのおもて面側に２ｍｍ、ナイロンメッシュの裏面側に１ｍｍの厚みでそれぞれコラーゲンゲル膜が形成された。
【００９５】
＜フィーダー細胞(MEF:マウス胎仔線維芽細胞)の作製＞
マウスフィーダー細胞（ＭＥＦ、マウス胎仔線維芽細胞）を、保存容器から取り出し、３７℃の湯浴で融解した。フィーダー細胞用の培地（１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％グルタミン補填ＤＭＥＭ）を９ｍｌ入れた１５ｍｌの遠沈管に、前記フィーダー細胞を移し、ピペッティングで混和した。１００×ｇで１分間遠心して、上清を取り除き、沈渣に１ｍｌのフィーダー細胞用培地を添加した。
３７℃、５％ＣＯ２下で培養し、翌日、細胞の生着を確認し、市販の６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ社）の各ウェルに播種して、ｉＰＳ細胞の培養に用いた。
【００９６】
＜ｉＰＳ細胞の準備＞
マウスｉＰＳ細胞（ＡＰＳ−００００２）は、理化学研究所  バイオリソースセンターより購入した。
上記と同一のマウスフィーダー細胞（ＭＥＦ、マウス胎仔線維芽細胞）上にｉＰＳ細胞を播種して、ｉＰＳ培養用培地（１５％ＦＢＳ、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、及び１０００Ｕ ＬＩＦ（Leukemia Inhibitory Factor）を補填したＤＭＥＭ）にて、３日間培養した。その後、ｉＰＳ細胞の培地を取り除き、ＰＢＳを添加して洗浄した。
トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を所定量添加して、フィーダー細胞を剥離して取り除き、フィーダー細胞除去後の培養物をその状態で更に２分間静置した。その後、ｉＰＳ細胞が完全にフィーダー細胞から剥離したことを顕微鏡で観察した。次いで、ｉＰＳ細胞のみを単離して、ｉＰＳ培養用培地を添加した。ｉＰＳ細胞を遠沈管に移し、ピペッティングを２０回行い、単一細胞状態にし、１００×ｇで１分間遠心して、上清を取り除いた。
遠心分離後の沈渣に１ｍｌのフィーダー細胞用培地を添加して、ｉＰＳ細胞を回収した。
【００９７】
＜培養容器による培養＞
上記で得られたカップ状培養容器を、フィーダー細胞を播種したウェル内に挿入した。次いで、カップ状培養容器のコラーゲンゲル膜上に、上記のようにして準備したｉＰＳ細胞を播種した。３７℃、５％ＣＯ２下で培養し、翌日、細胞の生着を確認し、毎日培地を交換した。観察は目視にて行った。
【００９８】
５日間分離培養した結果を図８Ａ及び図８Ｂに示す。図８Ａ及び図８Ｂに示されるように、カップ状培養容器にて培養したｉＰＳ細胞は、特有の球状の凝集体となっており、未分化能が維持されていることが確認できた。このような状態は従来法の共培養と同様の傾向である。
このように、本発明にかかるコラーゲンゲル膜を使用し、且つ、フィーダー細胞と分離した培養方法でも、従来法と同様に未分化能を維持した状態でｉＰＳ細胞を培養できることは明らかであった。
【００９９】
従って、本発明によれば、細胞を通過させずに培養液成分などの物質を通過可能であると共に、細胞の観察に適した透明性をも有するコラーゲンゲル膜と、これを用いたこれを用いた培養容器を提供することができる。
【符号の説明】
【０１００】
１０    培養容器
１２    ウェル（溶液収容部）
１４    培養領域
１６    第一の培養領域
１８    第二の培養領域
２０    コラーゲンゲル膜
２２    水不溶性高分子材料
２４    複合材料
３０    培養容器
３２    培養皿
３４    仕切り部材
３８    下部開口部
４０    支持部材
４２    突起部（突起）
５０    仕切り部材
５２    支持部
５４    保持部
５６    複合材料
６０    市販のウェルプレート
６２    ウェル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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