(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｋ−ＳＦＭ培地、並びにＮＡＣ、インスリン、またはインスリン様因子、ヒドロコルチゾン、ｂＦＧＦ及びセレニウムを含有する培地で脂肪組織由来中間葉幹細胞を培養する工程を含む、血管内投与に適した大きさを持つ脂肪組織由来中間葉幹細胞の製造方法。
【請求項２】
前記培地は、ＦＢＳ、カルシウム及びＥＧＦで構成された群から選択される成分をさらに含有することを特徴とする請求項１に記載の血管内投与に適した大きさを持つ脂肪組織由来中間葉幹細胞の製造方法。
【請求項３】
前記培養された幹細胞をトリプシンで処理する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の血管内投与に適した大きさを持つ脂肪組織由来中間葉幹細胞の製造方法。
【請求項４】
前記培養された幹細胞をアスピリン含有溶液に浮遊させる工程をさらに含むことを特徴とする請求項１または請求項３に記載の血管内投与に適した大きさを持つ脂肪組織由来中間葉幹細胞の製造方法。
【請求項５】
前記血管内投与に適した大きさを持つ幹細胞は、径が１１〜１６μｍであることを特徴とする請求項１に記載の血管内投与に適した大きさを持つ脂肪組織由来中間葉幹細胞の製造方法。
【請求項６】
Ｋ−ＳＦＭ培地、並びにＮＡＣ、インスリン、またはインスリン様因子、ヒドロコルチゾン、ｂＦＧＦ及びセレニウムを含有する、血管内投与に適した大きさを持つ脂肪組織由来中間葉幹細胞製造用培地。
【請求項７】
前記培地は、ＦＢＳ、カルシウム及びＥＧＦで構成された群から選択される成分をさらに含有することを特徴とする請求項６に記載の血管内投与に適した大きさを持つ脂肪組織由来中間葉幹細胞製造用培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は血管内投与に適した大きさを持つ幹細胞の製造方法に関し、より詳細には血管内投与に適するように径が１〜１６μｍである幹細胞を製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）とは、自己複製能力を有すると共に、二つ以上の細胞に分化する能力を有する細胞をいい、万能幹細胞（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、分化万能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、多能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）に分類できる。万能幹細胞は、一つの完全な個体に発生していくことができる万能性を有する細胞で、卵子と精子の受精以後８細胞期までの細胞がこのような性質を有し、この細胞を分離して子宮に移植すると一つの完全な個体に発生していくことができる。分化万能性幹細胞は、外胚葉、中胚葉、内胚葉層由来の多様な細胞と組織から発生できる細胞であり、受精４〜５日後現れる胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）の内側に位置した内部細胞塊（ｉｎｎｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍａｓｓ）から由来し、これを胚芽幹細胞といい、多様な他の組織細胞に分化するが新しい生命体を形成することはできない。多能性幹細胞は、この細胞が含まれている組織及び器官に特異的な細胞だけに分化できる幹細胞で、胎児期、新生児期及び成体期の各組織及び臓器の成長と発達のみならず成体組織の恒常性維持と組織損傷時再生を誘導する機能に関与しており、組織特異的多能性細胞を総称して成体幹細胞という。
【０００３】
成体幹細胞は、人体の各臓器に既に存在する細胞を採取、幹細胞を発展させたもので、特定組織だけに分化する特徴がある。しかし、最近では成体幹細胞を利用して、肝細胞等各種の多様な組織に分化させる実験が成功しており注目される。特に、病気や事故による機能障害や不調和に陥った生体組織及び臓器の再生及び機能回復のために細胞を積極的に活用して実施する治療法である再生医療において、患者本人から幹細胞、血液由来単核細胞或いは骨髄由来単核細胞を収集する工程、試験管培養で細胞増殖及び／または、分化を誘導する工程、及び選択された未分化（幹細胞及び／または、前駆細胞）及び／または、分化細胞を着床によって患者自身の体に導入する工程を含む方法が多く利用されている。このように、既存の古典的な薬品処置や手術的方法を介した病気治療が、損傷した細胞・組織・臓器を健康体に変える細胞・組織代替治療法に代替されると予測されるため、幹細胞の活用度はより一層高まることになる。
【０００４】
そこで、現在の幹細胞の多様な機能が研究されており、その中でも中間葉幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）を利用した細胞治療技術が脚光を浴び始め、人体から分離した中間葉幹細胞を治療に適するように改善するための技術が開発されている（国際公開２００６／０１９３５７号、韓国登録特許第０７９５７０８号、韓国登録特許第０８１８２１４号公報）。
【０００５】
しかし、血管内投与に適するように幹細胞を製造する方法に対する技術はまだ研究が不十分であるのが現状である。
【０００６】
そこで、本発明者等は、基本培地、並びにＮＡＣ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、インスリン、またはインスリン様因子、ヒドロコルチゾン、ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）及び抗酸化剤で構成された群から選択される二つ以上の成分を含有する培地で幹細胞を培養する場合、血管内投与に適した大きさの幹細胞を製造できることを確認して、本発明を完成するようになった。
【発明の要約】
【０００７】
本発明の目的は、血管内投与に適した大きさを持つ幹細胞の製造方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、血管内投与に適した大きさを持つ幹細胞製造用培地を提供することにある。
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明は、基本培地、並びにＮＡＣ、インスリン、またはインスリン様因子、ヒドロコルチゾン、ｂＦＧＦ及び抗酸化剤で構成された群から選択される二つ以上の成分を含有する培地で幹細胞を培養する工程を含む、血管内投与に適した大きさを持つ幹細胞の製造方法を提供する。
【０００９】
本発明はさらに、基本培地、並びにＮＡＣ、インスリン、またはインスリン様因子、ヒドロコルチゾン、ｂＦＧＦ及び抗酸化剤で構成された群から選択される二つ以上の成分を含有する、血管内投与に適した大きさを持つ幹細胞製造用培地を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】培養液と継代による脂肪由来中間葉幹細胞の大きさを示したグラフ。
【図２】培養液による脂肪由来中間葉幹細胞のマーカー発現を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法及び以下で詳述する実験方法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
【００１２】
本発明で用いる用語「幹細胞」は、自己複製能力を有すると共に、二つ以上の細胞に分化する能力を有する細胞をいう。また、「成体幹細胞」は、発生過程が進んで胚芽の各臓器が形成される工程或いは成体工程に現れる幹細胞を意味する。
【００１３】
本発明で用いられる用語「中間葉幹細胞」とはヒトまたは哺乳類の組織から分離した未分化幹細胞であり、多様な組織から由来してもよい。特に、臍帯由来中間葉幹細胞、臍帯血由来中間葉幹細胞、骨髄由来中間葉幹細胞、脂肪由来中間葉幹細胞、筋肉由来中間葉幹細胞、神経由来中間葉幹細胞、皮膚由来中間葉幹細胞、羊膜由来中間葉幹細胞及び胎盤由来中間葉幹細胞であってもよく、各組織から幹細胞を分離する技術は当業界にすでに公示されている。
【００１４】
本発明で用いられる用語「脂肪組織由来中間葉幹細胞」とは、脂肪組織から分離した未分化成体幹細胞であり、本明細書では略して「脂肪由来成体幹細胞」、「脂肪幹細胞」または「脂肪由来幹細胞」とも称する。これは当業界に公示された通常の方法を介して収得できるが、その分離方法は、例えば次のとおりである。即ち、脂肪吸入術から得られる生理食塩水に浮遊された脂肪含有懸濁液（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）を培養した後、フラスコなど培養容器に付着した幹細胞層をトリプシンで処理した後回収したり、スクレーパーで掻いて少量の生理食塩水に浮遊されるものを直接回収したりする方法等を介して脂肪由来中間葉幹細胞を分離することができる。
【００１５】
本発明で「血管内投与に適した大きさを持つ幹細胞」とは、血管内に投与された幹細胞が血流内流れや循環を邪魔することなく標的組織に容易に移動してその活性を示すことができるように径が静脈や毛細血管の径に比べて小さい、好ましくは径が１１〜１６μｍである幹細胞を意味する。
【００１６】
幹細胞は、種々の方法、例えば、静脈内、動脈内、または腹腔内投与などの方法で体内に投与されるが、その中でも静脈内投与は、外科的手術をしなくとも手軽ながら安全に疾病を治療できて有用である。しかし、静脈内に投与された幹細胞が実際に標的部位に安定的に到達して目的する治療効果を示すためには、種々の要件が満たされなければならない。まず、血管内に投与された幹細胞が、血流内速度を減少させたり血栓を形成しないように血管内投与に適した大きさでなければならない。多様な組織から由来する中間葉幹細胞は、患者やその由来、培養状態や方法により形態や増殖程度がまちまちであり、その大きさも径が約１０〜３００μｍと多様である。しかし、ヒトの後毛細管細静脈（ｐｏｓｔ−ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｖｅｎｕｌｅｓ）は概その径が１０〜５０μｍであり、小動脈は径が８〜３０μｍで（Ｓｃｈｍｉｄｔ  ＧＴ，１９８９）、毛細血管は径が８μｍ程度で（Ｓｃｈｍｉｄｔ  ＧＴ，１９８９；Ｃｈｉｅｎ，１９７５；Ｊｏｈｎ  Ｒｏｓｓ，１９９１；Ｈｅｒｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ａｒｔｈｕｒ  ａｎｄ  Ｇｕｙｔｏｎ，１９９７；Ｒｅｎｋｉｎ，１９８９；Ｇａｅｈｔｇｅｎｓ，１９８０；Ｒｏｗ  １９７９）、通常の中間葉幹細胞の径より小さい。従って、相対的に大きさが大きい中間葉幹細胞が静脈内に投与されると、血管内活性に影響を与えることができる。具体的に、血流速度を減少させることができるだけでなく、血液循環を邪魔して血流の中断、血栓形成、血管閉塞、さらに死亡を誘発しうる問題点がある。これと関連して、径が約１６〜５３μｍである中間葉幹細胞をマウスに静脈内投与時血流速度が減少し、心筋梗塞、血栓形成の誘発が観察されたとの報告がある（Ｄ．Ｆｕｒｌａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７７（２００９）３７０−３７６）。従って、適した大きさの幹細胞を血管内に投与することが重要である。また、血管内に投与される前細胞の破砕や凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）が形成されてはならず、血管内に投与された後にも単一細胞（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ）として細胞の破壊や凝集を形成することなく標的部位に安定的に到達しなければならない。それだけでなく、標的部位に到達した幹細胞が目的する治療効果を示すように、前提として一定濃度以上の細胞投与しなければならない。前記種々の要件のうち、本発明は、血管内投与に適した大きさを持って、血管内に投与された幹細胞が血流内速度を減少させたり血栓を形成することなく、安定的に治療効果を示すようにするための幹細胞を提供するためのものである。
【００１７】
一観点において、本発明は、基本培地、並びにＮＡＣ、インスリン、またはインスリン様因子、ヒドロコルチゾン、ｂＦＧＦ及び抗酸化剤で構成された群から選択される二つ以上の成分を含有する培地で幹細胞を培養する工程を含む、血管内投与に適した大きさを持つ幹細胞の製造方法に関する。
【００１８】
本発明で用いられる基本培地（ｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ）は、当業界で幹細胞培養に適すると知られている簡単な組成を持つ通常の培地を意味する。一般に培養に利用される基本培地としては、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｋ−ＳＦＭ（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）があり、この他にも当業界で利用される培地であれば制限なしに用いられる。好ましくは、Ｍ１９９／Ｆ１２（ｍｉｘｔｕｒｅ）（ＧＩＢＣＯ）、ＭＥＭ−ａｌｐｈａ培地（ＧＩＢＣＯ）、低濃度グルコース含有ＤＭＥＭ培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ）、ＭＣＤＢ１３１倍地（Ｗｅｌｇｅｎｅ）、ＩＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ）、Ｋ−ＳＦＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＰＣＭ培地及びＭＳＣ拡張培地（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）で構成された群から選択されうる。特に、この中でも好ましくはＫ−ＳＦＭ培地が用いられる。
【００１９】
前記中間葉幹細胞培養物の獲得に用いられる基本培地は、当業界に公示された、中間葉幹細胞の未分化された表現型の増殖を促すが分化は抑制する添加剤で補充され得る。また、培地は等張液中の中性緩衝剤（例えば、リン酸塩及び／または、高濃度重炭酸塩）及び蛋白質栄養分（例えば、血清、例えば、ＦＢＳ、ＦＣＳ（ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）、ｈｏｒｓｅ  ｓｅｒｕｍ、血清代替物、アルブミン、または、必須アミノ酸及び非必須アミノ酸、例えば、グルタミン、Ｌ−グルタミン）を含有してもよい。さらに、脂質（脂肪酸、コレステロール、血清のＨＤＬまたはＬＤＬ抽出物）及びこの種の多くの保存液培地で発見されるその他の成分（例えば、インスリンまたはトランスフェリン、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、ピルビン酸塩、任意のイオン化形態または塩である糖原、例えば、グルコース、セレニウム、グルココルチコイド、例えば、ヒドロコルチゾン及び／または、還元剤、例えばβ−メルカプトエタノル）を含有してもよい。
【００２０】
また、培地は細胞が互いに癒着したり、容器壁に癒着したり、大きすぎる束を形成することを防止する目的で、好ましくは抗凝集剤（ａｎｔｉ−ｃｌｕｍｐｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、例えばＣａｔ＃００１００５７ＡＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）等を含む。
【００２１】
その中でも、下記の１以上の追加の添加剤を用いることが好ましい：
・幹細胞因子（ＳＣＦ、Ｓｔｅｅｌ因子）、ｃ−キットをニ量化する他のリガンドまたは抗体、及び同じ信号伝達経路の他の活性剤
・他のチロシンキナーゼ関連レセプター、例えば血小板−誘導された成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、ＰＤＧＦ）、マクロファージコロニー−刺激因子、Ｆｌｔ−３リガンド及び血管内皮成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）のレセプターのためのリガンド
・環状ＡＭＰ濃度を高める因子、例えばフォルスコリン
・ｇｐ１３０を誘導する因子、例えばＬＩＦまたはＯｎｃｏｓｔａｔｉｎ−Ｍ
・造血母成長因子、例えばトロンボポイエチン（ＴＰＯ）
・変形性成長因子、例えばＴＧＦβ１
・ニュロトロフィン、例えばＣＮＴＦ
・抗生剤、例えばゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）、ペニシリン、ストレプトマイシン
【００２２】
本発明で用いられる培地は、前記基本培地以外に、ＮＡＣ、インスリンまたはインスリン様因子、ヒドロコルチゾン、ｂＦＧＦ及び抗酸化剤で構成された群から選択される二つ以上の成分をさらに含有してもよい。
【００２３】
具体的に、インスリンを代替する成分として、インスリン様因子を含有してもよいが、これはブドウ糖の代謝と蛋白質の代謝を向上させて、細胞成長を促す役割を果たす。特に、組換えＩＧＦ−１（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−１）を用いることが好ましい。インスリン様因子の好ましい含有量は、１０〜５０ｎｇ／ｍＬであり、この成分が１０ｎｇ／ｍＬ未満の場合にはアポトーシス（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を招いて、５０ｎｇ／ｍＬを超える場合には細胞毒性及び費用増加の問題点がある。
【００２４】
線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含有できるが、これはｉｎ  ｖｉｖｏ状態で多様な形態の細胞増殖を引き起こせるが、好ましくは組換え蛋白質を用いる。線維芽細胞増殖因子の好ましい含有量は１〜１００ｎｇ／ｍＬである。
【００２５】
抗酸化剤としては、セレニウム（ｓｅｌｅｎｉｕｍ）、アスコルビン酸、ビタミンＥ、カテキン、リコペン、βカロチン、コエンザイムＱ−１０、ＥＰＡ（ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、ＤＨＡ（ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）等が用いられ、好ましくはセレニウムが用いられる。本発明の一実施例では、抗酸化剤としてセレニウムを用いており、用いられるセレニウムの量は０．５〜１０ｎｇ／ｍＬであることが好ましい。この時、これの含有量が０．５ｎｇ／ｍＬ未満なら酸素毒性に敏感で、１０ｎｇ／ｍＬを超えると深刻な細胞毒性を招くためである。
【００２６】
本発明で用いられる培地は、ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎ  ｓｅｒｕｍ）、カルシウム及びＥＧＦで構成された群から選択される成分をさらに含有してもよい。上皮細胞成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＥＧＦ）は、ｉｎ  ｖｉｖｏ状態で多様な形態の細胞増殖を引き起こせて、好ましくは組換え蛋白質を用いる。上皮細胞成長因子の好ましい含有量は、１０〜５０ｎｇ／ｍＬであり、この含有量が１０ｎｇ／ｍＬ未満なら特別な効果がなく、５０ｎｇ／ｍＬを超えると細胞に毒性を持たせる。
【００２７】
本発明に係る培地で培養された幹細胞は、好ましくは１１〜１６μｍの径を持つため、血管内投与に適している。
【００２８】
他の観点において、本発明は、基本培地、並びにＮＡＣ、インスリン、またはインスリン様因子、ヒドロコルチゾン、ｂＦＧＦ及び抗酸化剤で構成された群から選択される二つ以上の成分を含有する、血管内投与に適した大きさを持つ幹細胞製造用培地に関する。
【００２９】
本発明の一実施例では、本発明に係る培地で脂肪由来中間葉幹細胞を培養した。脂肪由来中間葉幹細胞は、下記のような方法で取得できる。まず、脂肪吸入術（Ｌｉｐｏｓｕｃｔｉｏｎ）等によって腹部から得られたヒト脂肪組織を分離してＰＢＳで洗浄した後、組織を細かく切ってから、コラーゲン分解酵素を添加したＤＭＥＭ培地を用いて分解した後、ＰＢＳで洗浄して１０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。上澄み液は除去して、底に残ったペレットはＰＢＳで洗浄した後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。１００メッシュを用いて浮遊物を除去した後、ＰＢＳで再び洗浄した。ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  ＮＡＣ、０．２ｍＭアスコルビン酸）培地で培養して、一夜過ぎた後、培養容器底に付着しなかった細胞はＰＢＳで洗浄して、ＮＡＣ、アスコルビン酸、カルシウム、ｒＥＧＦ、インスリン及びヒドロコルチゾンを含有したＫ−ＳＦＭ培地を２日毎に交換しながら培養して、中間葉幹細胞を分離して継代培養して、中間葉幹細胞を得ることができる。しかしこの他にも当業界に公示された方法で中間葉幹細胞を得ることができる。本発明の製造方法は、本発明に係る培地で培養された幹細胞をトリプシンで処理する工程をさらに含んでもよい。培養された幹細胞をトリプシンで処理すれば、単細胞形態の幹細胞を得ることができるが、この時、トリプシンは細胞間の凝集を抑制して細胞が単細胞の形態を持つように処理されるもので、細胞間の凝集形成を抑制できる物質ならいずれのものを用いてもよい。
【００３０】
本発明の製造方法は、本発明に係る培地で培養された幹細胞をアスピリン含有溶液に浮遊させる工程をさらに含んでもよい。培養された幹細胞をアスピリン含有溶液で浮遊させると、移送や保管中幹細胞が破砕されたり凝集するのを防止できるので、有用である。従って、血管内投与時用いられる幹細胞は、アスピリン含有生理食塩水に浮遊させた後利用することができる。アスピリン含有溶液は、アスピリン化合物を含有する溶液を意味し、溶媒は、好ましくは生理食塩水を用いてもよいが、その他にもハートマンＤ液、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）等当業界で一般に用いる基剤を制限なしに用いることができる。前記アスピリンは、通常市販されているアスピリン製剤だけでなく、アスピリン類似化合物を用いてもよい。前記添加されるアスピリンの含有量は０．０００１〜０．０１ｍｇ／ｍＬであることが好ましい。添加されるアスピリンの量がそれより多ければ、細胞の生存率が減少することがあり、それより少なければ細胞凝集抑制の効果が足りないことがある。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例を通して、本発明をより一層詳細に説明する。この実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこの実施例によって制限されると解釈されないことは当業界の通常の知識を有する者には自明である。
【００３２】
≪実施例１．ヒト脂肪組織由来中間葉幹細胞分離≫
脂肪吸入術により腹部脂肪から分離した脂肪組織をＰＢＳで洗浄した後、脂肪組織を細かく切ってから、コラゲナーゼタイプ１（１ｍｇ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭ  ｍｅｄｉａを利用して、３７℃で２時間組織を分解させた。コラゲナーゼ処理された組織をＰＢＳで洗浄した後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、上澄み液を除去して、ペレットをＰＢＳで洗浄した後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離下した。１００ｍｅｓｈにフィルタリングして浮遊物を除去した後、ＰＢＳで洗浄して、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  ＮＡＣ、０．２ｍＭアスコルビン酸が添加されたＤＭＥＭ培地で培養した。
【００３３】
一夜過ぎた後、付着しなかった細胞はＰＢＳで洗浄して、５％ＦＢＳ、２ｍＭ  ＮＡＣ、０．２ｍＭアスコルビン酸、０．０９ｍＭカルシウム、５ｎｇ／ｍＬ  ｒＥＧＦ、５ｎｇ／ｍＬインスリン、１０ｎｇ  ｂＦＧＦ及び７４ｎｇ／ｍＬヒドロコルチゾン及び１ｎｇ／ｍＬのセレニウムを含有したＫ−ＳＦＭを２日毎に交換しながら継代培養し、３継代培養して脂肪由来中間葉幹細胞を分離した。
実施例１で３継代まで培養して得られた脂肪由来中間葉幹細胞を下記の各培地に播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）して５日間培養した。５日目の培養日に細胞の大きさと細胞特性を測定した。
【００３４】
培地組成
１）ＫＳＦＭ＋添加物：Ｋ−ＳＦＭ＋ＦＢＳ＋ＮＡＣ＋アスコルビン酸＋カルシウム＋ｒＥＧＦ＋インスリン＋ｂＦＧＦ＋ヒドロコルチゾン＋セレニウム
２）ＤＭＥＭ＋ＦＧＦ：ＤＭＥＭ（ｌｏｗ−ｇｌｕｃｏｓｅ）＋１０％ＦＢＳ＋５ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ
３）α−ＭＥＭ＋ＦＧＦ：α−ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋５ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ
【００３５】
【表１】
0005926447.tif 000002
【００３６】
細胞の大きさは「ＫＳＦＭ＋添加物」培養群の細胞が最も小さく、α−ＭＥＭをｂａｓａｌにして培養した群の細胞の大きさがＤＥＭＥ群より細胞の大きさの変化が大きかった。「ＫＳＦＭ＋添加物」群の細胞は、継代を経ても１１〜１６μｍを維持することに対して、他の培地群は継代が進むほど２０μｍ以上の大きい細胞の大きさを示した（図１）。
前記条件の培養培地から得られた継代４脂肪由来中間葉幹細胞をＦＡＣＳ測定して細胞特性を確認した。
【００３７】
【表２】
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【００３８】
前記培地から得た脂肪中間葉幹細胞の特性を確認した結果、幹細胞のポジティブ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）マーカー発現には培地に対する影響がないがネガティブ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）マーカーは「ＫＳＦＭ＋添加物」培地群で培養した細胞よりＤＭＥＭ＋ＦＧＦ（％）処理された培養培地群の細胞で発現率がより高かった（図２）。
実施例１で分離した幹細胞をＳＥＭ（Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で観察して測定した結果、多くの幹細胞が、約１１〜１６μｍの径を持って、細胞間凝集が形成されないことを確認することができた。
【００３９】
≪実施例２．Ｓｍａｌｌ  ｓｉｚｅ幹細胞製造用培地成分の探索≫
実施例１で用いられたＫ−ＳＦＭ培地に添加される活性成分であるＦＢＳ、ＮＡＣ、アスコルビン酸、カルシウム、ｒＥＧＦ、５ｎｇ／ｍＬインスリン、ｂＦＧＦ、ヒドロコルチゾン及びセレニウムの中一つずつ除去した培地を製造して、前記活性成分が各々除去された培地及び「ＫＳＦＭ＋添加物」群で脂肪由来幹細胞を培養した。前記各々の培地で３パッセージ（ｐａｓｓａｇｅ）まで継代した後、トリプシンを処理してから共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で細胞の径を測定した。その結果、セレニウムが含まれた培地に培養された脂肪由来幹細胞の大きさは、１１．６〜１６．５μｍであったが、セレニウムが除去された培地で培養した幹細胞の大きさは、１８．１〜２３．９μｍであることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明によると、径が１１〜１６μｍである幹細胞が製造できて、標的組織への移動が容易でかつ安定性が優れた幹細胞を製造することがあるので、幹細胞の血管内投与による細胞治療効能を画期的に増進させることができる。
【００４１】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記術は単に望ましい実施様態であるだけであり、これによって本発明の範囲が制限されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は添付された請求範囲及びその等価物によって定義される。
【図１】
0005926447.tif 000004
【図２】
0005926447.tif 000005