(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリの５’末端にタグ配列を付加するとともに，前記成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリの３’末端にリボソームの翻訳伸長を停止させるアレスト配列を付加し，前記成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリの末端修飾物を得る工程と，
前記末端修飾配列物を転写させ，転写物を得る転写工程と，
前記転写物をインビトロで翻訳し、ｍＲＮＡ−リボソーム−オリゴペプチドの３者複合体を形成させるインビトロ翻訳工程と，
前記タグ配列を有するオリゴペプチドを含むｍＲＮＡ−リボソーム−オリゴペプチドの３者複合体を選択することにより、アレスト配列まで翻訳されたインフレームのオリゴヌクレオチドを選択する工程
を含み，
前記成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリがランダムオリゴヌクレオチドライブラリである，
成熟化オリゴヌクレオチドライブラリの製造方法。
【請求項２】
前記ランダムオリゴヌクレオチドライブラリは，ＮＮＫ配列，ＮＮＳ配列又はＮＮＹ配列を含むオリゴヌクレオチドライブラリである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リボソームの翻訳伸長を停止させるアレスト配列は，ＳｅｃＭ配列である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記タグ配列は，ＦＬＡＧ配列である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記インビトロ翻訳工程は，
無細胞翻訳系を用いて前記転写物をインビトロで翻訳する工程である，
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記インビトロ翻訳工程は，
大腸菌無細胞翻訳系を用いて前記転写物をインビトロで翻訳する工程である，
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記インビトロ翻訳工程は，
再構成型無細胞翻訳系を用いて前記転写物をインビトロで翻訳する工程である，  請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記タグ配列に対する抗体を用いて、前記タグ配列を有するオリゴペプチドを含むｍＲＮＡ−リボソーム−ポリペプチド３者複合体を選択する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，蛋白質ライブラリ調製を目的としたオリゴヌクレオチドライブラリの高速成熟化法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質のある部位に複数のランダムなアミノ酸配列を導入する場合，ランダムに合成したオリゴヌクレオチドを蛋白質の遺伝子に導入する。しかしながら，導入配列を完全にランダムに合成した場合（ＮＮＮ配列），約１／２１の割合でストップコドンが出現する。また，導入する合成オリゴヌクレオチドが長鎖である場合，数パーセントの割合で塩基が欠失または挿入されたオリゴヌクレオチドが混入する。これらはいずれも得られる蛋白質ライブラリの多様性を著しく低下させる原因となるため，オリゴヌクレオチドライブラリ調製の際にこれらのオリゴヌクレオチドを取り除く必要がある。【０００３】
合成オリゴヌクレオチドライブラリからこれらの不要なオリゴヌクレオチドを取り除く方法として，抗生物質の薬剤選択を利用した方法が挙げられる。例えば，βラクタマーゼのような薬剤耐性遺伝子の５’末端に成熟化の対象とするランダムオリゴヌクレオチドライブラリを繋ぎ合わせ，プラスミドに導入する。このプラスミドを大腸菌に形質転換した後，対応する抗生物質を含む寒天プレートに塗布すると，ストップコドンや塩基の欠失，挿入によるフレームシフトを含まないインフレーム遺伝子を持った大腸菌だけが薬剤耐性蛋白質を発現できるため，プレート上でコロニーとして生育できる。従って，これらコロニー群から遺伝子を回収することで，不要なオリゴヌクレオチドを含まない成熟化オリゴヌクレオチドライブラリを得ることができる。【０００４】
しかしながら，この方法にはいくつかの問題点がある。第一に生育する大腸菌のコロニー数は，オリゴヌクレオチドライブラリのベクターへのライゲーション効率と大腸菌への形質転換効率に依存するため，一般的な方法によって，大量にコロニーを形成させることは難しい。第二に，大量のコロニーを得るためには，それにともなったサンプル調製が必要であり，多大な労力と時間を要する。【０００５】
本発明者らがこの方法によって１０８の多様性をもつオリゴヌクレオチドライブラリを成熟化するのに要した期間は約１週間であった。仮に抗体の６箇所のＣＤＲ（相補性決定領域）をランダム化した抗体遺伝子ライブラリをコードするオリゴヌクレオチドライブラリを作成する場合，これら６箇所のＣＤＲのそれぞれをコードするオリゴヌクレオチドライブラリについて順次成熟化を実施することになり，抗体遺伝子ライブラリをコードするオリゴヌクレオチドライブラリ全体を成熟化するには約６週間を必要とすることになる。【０００６】
さらに，上記操作には，高価な試薬（酵素類等）を大量に必要とするため，非常にコストがかかる。【０００７】
一方，特許文献１には，リボソームディスプレイが開示されている。そして，特許文献１の段落［００５１］には，大腸菌ＳｅｃＭの翻訳反応伸長停止配列をコードする配列をスペーサ配列の下流に配置したｍＲＮＡが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００８−２７１９０３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は，一度に多種類の成熟化オリゴヌクレオチドライブラリを短時間に簡便かつ安価に製造できる成熟化オリゴヌクレオチドライブラリの製造方法を提供することを目的とする。【００１０】
また，本発明は，インビトロ選択系のリボソームディスプレイ（特開２００８−２７１９０３号公報）を用いたランダムオリゴヌクレオチドライブラリの効率的な成熟化方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は，ランダムオリゴヌクレオチドライブラリを成熟化するに際して，オリゴヌクレオチドの３’末端にアレスト配列（例えば，ＳｅｃＭ配列）を付加することでインフレーム率を向上させ，極めて効率的に成熟化を達成できるという知見に基づくものである。【００１２】
本発明の第１の側面は，成熟化オリゴヌクレオチドライブラリの製造方法に関する。この方法は，まず，成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリの５’末端にタグ配列を付加するとともに，３’末端にアレスト配列（例えば，ＳｅｃＭ配列）を付加し，成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリの末端修飾物（末端修飾配列物）を得る。成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリは，ランダムオリゴヌクレオチドライブラリである。ランダムオリゴヌクレオチドライブラリの例は，ＮＮＳ配列を含むオリゴヌクレオチドライブラリである。ＮＮＳ配列の例は，３１アミノ酸に対応するコドンを含むＮＮＳ配列である。成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリが完全なランダムオリゴヌクレオチドライブラリの場合，約１／２１の割合でストップコドンが出現する。このため，ランダムオリゴヌクレオチドライブラリは，完全なランダム配列（ＮＮＮ）を含まないものが好ましい。【００１３】
次に，末端修飾配列物を転写させ，転写物を得る。その後，転写物をインビトロで翻訳する。【００１４】
上記の方法においてタグ配列の例は，ＦＬＡＧ配列である。例えば，アンチ−ＦＬＡＧ抗体を固定化したビーズを用いることで，生成物を容易に回収できる。【００１５】
上記の方法においては，無細胞翻訳系を用いて転写物をインビトロで翻訳するものが好ましい。完全にインビトロで処理を行うため，オリゴヌクレオチドライブラリの成熟化効率を向上させることができる。無細胞翻訳系の例は，大腸菌無細胞翻訳系である。無細胞翻訳系として好ましいものは，再構成型無細胞翻訳系である，いわゆるＰＵＲＥシステムである。再構成型無細胞蛋白質合成系は，本発明者らを含むグループによって開発された蛋白質合成に関与する翻訳因子やリボソームなどの特定された因子のみからなる合成系である。【００１６】
リボソームディスプレイは，インビトロ翻訳系において，ｍＲＮＡ−リボソーム−オリゴペプチドの３者複合体（リボソームディスプレイ複合体）を形成させ，特定の機能を有するポリペプチドをコードする蛋白質を選択する方法である。上記の通り，本発明の末端修飾物は，成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリの３’末端にアレスト配列を有している。インビトロ翻訳系に導入したランダムオリゴヌクレオチドライブラリを構成するオリゴヌクレオチドにストップコドンが存在する場合や，塩基の欠失又は挿入によるフレームシフトがある場合，翻訳の際に正常にアレスト配列まで翻訳されない。このため,ストップコドンが導入されたオリゴヌクレオチドや，フレームシフトを含むオリゴヌクレオチドを翻訳しても，ｍＲＮＡ−リボソーム−オリゴペプチドの３者複合体が形成されない。よって，例えば，導入したタグ配列に対する抗体でこれら複合体を選択することによって，アレスト配列まで翻訳されたインフレームのオリゴヌクレオチドのみを選択することができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の成熟化オリゴヌクレオチドライブラリの製造方法は，完全にインビトロで処理を行うため，大きな多様性を有する（例えば，１０１１〜１０１２種類以上）オリゴヌクレオチドライブラリを選択の対象とすることができる。【００１８】
本発明の成熟化オリゴヌクレオチドライブラリの製造方法は，操作が簡便であり，かつ効率的であるため，例えば，個々に独立して作成した８種類の成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリを１日で同時に成熟化できる。これは，１種類の成熟化に１週間程度要した従来法に比べて顕著な差である。【００１９】
さらに，本発明の成熟化オリゴヌクレオチドライブラリの製造方法は，高価な酵素類を大量に必要としないためコストを軽減することも同時に達成できる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は，成熟化前後のランダムオリゴヌクレオチドライブラリ（ＮＮＳ配列）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の第１の側面は，成熟化オリゴヌクレオチドライブラリの製造方法に関する。この方法は，まず，成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリの５’末端にタグ配列を付加するとともに，３’末端にアレスト配列（例えば，ＳｅｃＭ配列）を付加し，成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリの末端修飾配列物を得る。
【００２２】
本明細書において，「成熟化」とは，オリゴヌクレオチドライブラリから，ストップコドンや，塩基の欠失又は挿入によるフレームシフトを含むオリゴヌクレオチドを取り除くことを言う。「成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリ」は，成熟化され得るオリゴヌクレオチドの混合物を意味する。「ランダムオリゴヌクレオチドライブラリ」は，後述の定義のように，様々な配列を有するオリゴヌクレオチドの混合物を意味する。「成熟化オリゴヌクレオチドライブラリ」は，成熟化されたオリゴヌクレオチドの混合物を意味する。
【００２３】
成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリの例は，ランダムオリゴヌクレオチドライブラリである。ランダムオリゴヌクレオチドライブラリの例は，ＮＮＳ配列を含むオリゴヌクレオチドライブラリである。ＮＮＳ配列の例は，３１アミノ酸コドンを含むＮＮＳ配列である。成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリが完全なランダムオリゴヌクレオチドライブラリの場合，約１／２１の割合でストップコドンが出現する。このため，ランダムオリゴヌクレオチドライブラリは，完全なランダム配列（ＮＮＮ）を含まないものが好ましい。そのようなランダム配列（不完全なランダム配列）の例は，ＮＮＫ配列，ＮＮＳ配列及びＮＮＹ配列である。ここで，Ｎはアデニン（Ａ），グアニン（Ｇ），シトシン（Ｃ），チミン（Ｔ）のいずれかであることを意味する。Ｋはグアニン（Ｇ）もしくはチミン（Ｔ）のいずれかを意味する。Ｓはシトシン（Ｃ）もしくはグアニン（Ｇ）のいずれかを意味する。Ｙはシトシン（Ｃ）またはチミン（Ｔ）のいずれかを意味する。本明細書において，「ＮＮＫ配列」とは，「ＮＮＫ」を連続して複数個含むオリゴヌクレオチド配列（すなわち「ＮＮＫ」×ｍ（ｍは２以上の整数））をいう。本明細書において，「ＮＮＳ配列」とは，「ＮＮＳ」を連続して複数個含むオリゴヌクレオチド配列（すなわち「ＮＮＳ」×ｍ（ｍは２以上の整数））をいう。本明細書において，「ＮＮＹ配列」とは，「ＮＮＹ」を連続して複数個含むオリゴヌクレオチド配列（すなわち「ＮＮＹ」×ｍ（ｍは２以上の整数））をいう。一態様において，ランダムオリゴヌクレオチドライブラリは，ＮＮＫ配列，ＮＮＳ配列又はＮＮＹ配列を繰り返し含むオリゴヌクレオチドライブラリである。「ＮＮＫ配列，ＮＮＳ配列又はＮＮＹ配列を繰り返し含むオリゴヌクレオチド」とは，１つのオリゴヌクレオチドの中に，ＮＮＫ配列，ＮＮＳ配列及びＮＮＹ配列からなる群から選択されるランダム配列を複数個含むオリゴヌクレオチドをいう。この場合，ＮＮＫ配列，ＮＮＳ配列又はＮＮＹ配列を複数個含んでいてもよいし，ＮＮＫ配列とＮＮＳ配列の双方を含む様に，相互に異なるランダム配列を複数個含んでいてもよい。本明細書におけるランダムオリゴヌクレオチドライブラリを構成するオリゴヌクレオチドとしては，３×ｎ塩基のものがあげられる。ここで，ｎの例は，５以上２０以下であり，７以上１１以下でもよい。具体的なｎの例は９である。ランダムヌクレオチドライブラリを合成する方法は公知である。よって，公知の方法に従ってランダムヌクレオチドライブラリを生成すればよい。
【００２４】
上記の方法において，成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリの５’末端に付加するタグ配列の例は，ＦＬＡＧ配列である。タグ配列は，ＦＬＡＧ配列に限定されない。タグ配列の他の例は，ミック配列である。ＦＬＡＧタグ及びミックタグに特異的に結合する抗体は，既に販売されている。このため，それらのタグを融合したタンパク質は，抗体又は抗体を固定した物質を用いて，容易に標識及び精製できる。例えば，本発明の成熟化オリゴヌクレオチドライブラリを含むリボソームディスプレイ複合体がＦＬＡＧタグを有する場合，アンチ−ＦＬＡＧ抗体を固定化したビーズを用いることで，リボソームディスプレイ複合体を容易に回収及び精製できることとなる。
【００２５】
アレスト配列は，リボソームの翻訳を途中で停止させる配列である。大腸菌由来のアレスト配列の例は，ＳｅｃＭ配列(Ｎａｋａｔｏｇａｗａ ａｎｄ Ｉｔｏ （２００２） Ｃｅｌｌ, ｖｏｌ.１０８, ｐ.６２９−６３６)，及びＴｎａＣ配列(Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ, （２００２） Ｓｃｉｅｎｃｅ, ｖｏｌ.２９７,ｐ.１８６４-１８６７)である。また，人工的に合成された大腸菌に対するアレスト配列の例は，ターナーらの報告にある配列（Ｔａｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ, （２００９） Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ,ｖｏｌ.２８４,ｐ.３４８０９-３４８１８）がある。さらに，真核生物由来のアレスト配列の例は，ｕＯＲＦ配列である（Ｈｏｏｄ ｅｔ ａｌ, （２００９） Ａｎｎｕ.Ｒｅｖ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ, ｖｏｌ.６３,ｐ.３８５-４０９）。
【００２６】
次に，末端修飾配列物を転写させ，転写物を得る。転写工程は，バイオテクノロジーの分野において公知である。よって，公知の方法に基づいて転写工程を行うことができる。
【００２７】
その後，転写物をインビトロで翻訳する。この翻訳工程の例は，無細胞翻訳系を用いて転写物をインビトロで翻訳するものである。この場合，完全にインビトロで処理を行うことにより，オリゴヌクレオチドの成熟化効率を向上させることができる。アレスト配列として大腸菌由来のものを用いた場合，好ましい無細胞翻訳系の例は，大腸菌無細胞翻訳系である。さらに無細胞翻訳系として好ましいものは，再構成型無細胞翻訳系である，いわゆるＰＵＲＥシステムである（例えば，「Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｙ, Ｉｎｏｕｅ Ａ, Ｔｏｍａｒｉ Ｙ, Ｓｕｚｕｋｉ Ｔ, Ｙｏｋｏｇａｗａ Ｔ, Ｎｉｓｈｉｋａｗａ Ｋ, Ｕｅｄａ Ｔ （２００１）  Ｃｅｌｌ-ｆｒｅｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ. Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９, ７５１-７５５」を参照）。
【００２８】
ＰＵＲＥシステムは，翻訳に必要な因子を個々で調製し，それらを再構成した無細胞翻訳系である。ＰＵＲＥシステムは，リボソームディスプレイを実施する上で効率低下の原因となるヌクレアーゼやプロテアーゼの混入がほとんど認められない。このため，細胞抽出型の無細胞翻訳系を使用した場合よりもＰＵＲＥシステムを使用した場合の方が，高い選択効率を持つ事が報告されている（Ｖｉｌｌｅｍａｇｎｅ ｅｔ ａｌ, （２００６） Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.Ｍｅｔｈｏｄｓ, ｖｏｌ.３１３, ｐ.１４０-１４８）。一方，多くの生物は，翻訳中に生ずるリボソームの翻訳停止を回避する手段を備えている。例えば，大腸菌の場合，１０Ｓ−ＲＮＡ（ｔｍＲＮＡ）とＳｍｐＢ蛋白質が関与するｔｒａｎｓ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎと呼ばれる反応が起こり，リボソームのストールが解除される（Ｍｏｏｒｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ （２００７） Ａｎｎｕ. Ｒｅｖ. Ｂｉｏｃｈｅｍ., ｖｏｌ. ７６, ｐ.１０１-１２４）。そして，細胞内成分を含む一般的な細胞抽出液型の無細胞翻訳系は，これらの回避成分も系内に含まれている。このため細胞抽出液型の無細胞翻訳系を用いた場合，リボソームディスプレイ複合体の形成効率が低下すると考えられる。実際，大腸菌抽出液系の無細胞翻訳系に１０Ｓ−ＲＮＡのアンチセンス配列を加えることで，リボソームディスプレイ複合体の形成効率が上昇することが報告されている(Ｈａｎｅｓ ｅｔ ａｌ, （１９９７） Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ,ｖｏｌ.９４,ｐ.４９３７-４９４２)。すなわち，本発明においては，上記に説明した回避成分が含まれていないＰＵＲＥシステムが，最適な無細胞翻訳系である。
【００２９】
無細胞翻訳系は，エネルギー再生系と少なくとも一種のアミノ酸とを有する。エネルギー再生系は，タンパク質の合成に必要なＡＴＰやＧＴＰ等のエネルギー源の再生に関わる要素を意味する。エネルギー再生系物質の例は，ＡＴＰ再生に関わる酵素（クレアチンキナーゼやピルビン酸キナーゼ等），その基質（クレアチンリン酸やホスホエノールピルビン酸等）である。無細胞翻訳系は，アミノ酸を少なくとも一種，好ましくは天然に存在する２０種のアミノ酸を含む。無細胞翻訳系は，さらに非天然のアミノ酸を含んでいても良い。無細胞翻訳系は，例えば，緩衝液（例えば，ＨＥＰＥＳカリウムやトリス酢酸等），各種の塩類，界面活性剤，ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７，Ｔ３，及びＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ等），シャペロンタンパク質（ＤｎａＪ，ＤｎａＫ，ＧｒｏＥ，ＧｒｏＥＬ，ＧｒｏＥＳ，及びＨＳＰ７０等），ＲＮＡ（ｍＲＮＡ，ｔＲＮＡ等），プロテアーゼ阻害剤，又は（リボ）ヌクレアーゼ阻害剤を含んでもよい。
【００３０】
上記に説明した通り，本発明の好ましい利用は，リボソームディスプレイを用いてランダムオリゴヌクレオチドライブラリを成熟化する方法である。リボソームディスプレイは，インビトロ翻訳系において，ｍＲＮＡ−リボソーム−オリゴペプチドの３者複合体を形成させ，特定の機能を有するポリペプチドをコードする蛋白質を選択する方法である。上記の通り，本発明の末端修飾配列物は，成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリの３’末端にアレスト配列を有している。すると，インビトロ翻訳系に導入したランダムオリゴヌクレオチドライブラリを構成するオリゴヌクレオチドにストップコドンが存在する場合や，塩基の欠失又は挿入によるフレームシフトがある場合，翻訳の際に正常にアレスト配列まで翻訳されない。このため,ストップコドンが導入されたオリゴヌクレオチドや，フレームシフトを含むオリゴヌクレオチドを翻訳しても，ｍＲＮＡ−リボソーム−オリゴペプチドの３者複合体が形成されない。
【００３１】
例えば，導入したタグ配列に対する抗体でこれら複合体を選択することにより，アレスト配列まで翻訳されたインフレームのオリゴヌクレオチドのみを選択することができる。
【００３２】
以下，実施例を示して本発明をより具体的に説明するが，本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３３】
鋳型の構築
成熟化の対象とする９アミノ酸をコードするコドンを含むランダムオリゴヌクレオチドライブラリの５’側にＦＬＡＧ配列，３’側にミック配列を付加した状態でＤＮＡ合成した(配列番号１：ATGGACTATAAAGATGACGATGACAAAnnsnnsnnsnnsnnsnnsnnsnnsnnsGAGCAGAAGCTGATCTCTGAGGAGGATCTG)。３‘末端にＦＬＡＧ配列を付加したＴ７プロモーターおよびＳＤ配列を含む５’ ＵＴＲ配列もＤＮＡ合成した（配列番号２：gaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccaatggactataaagatgacgatgacaaa）。Ｍ１３ファージのｇｅｎｅＩＩＩの部分配列（アミノ酸残基２２０−３２６位）はＭ１３ＫＯ７由来ファージゲノムを鋳型としてプライマーＭｙｃ−ｇ３ｐ(配列番号３：GAGCAGAAGCTGATCTCTGAGGAGGATCTGGAATATCAAGGCCAATCGTCTGAC)及び，プライマーｇ３ｐ−ＳｅｃＭｓｔｏｐ(配列番号４：CTCGAGTTATTCATTAGGTGAGGCGTTGAGGGCCAGCACGGATGCCTTGCGCCTGGCTTATCCAGACGGGCGTGCTGAATTTTGCGCCGGAAACGTCACCAATGAAAC)を用いてＫＯＤ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡製）によってＰＣＲ増幅（変性：９４℃,１５秒；アニーリング：５７℃,３０秒；伸長：６８℃,６０秒；２５サイクル)後，精製カラム（キアゲン社製）によって精製した。５’ ＵＴＲ, ランダムオリゴヌクレオチドライブラリ，ｇ３ｐの３種類のＤＮＡをそれぞれ１ ｐｍｏｌ，５’ プライマー（配列番号５：gaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctag) １０ ｐｍｏｌ，ＳｅｃＭストップ配列(配列番号６：ggattagttattcattaggtgaggcgttgagg) １０ ｐｍｏｌ，ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ を含むＰＣＲ反応液を調製し，１０サイクルのＰＣＲ反応（変性：９４℃,１５秒；アニーリング：５７℃,３０秒；伸長：６８℃,６０秒)を実行した。１％アガロースを用いた電気泳動によって，３遺伝子がつながったバンドを確認後，そのバンドを切り出した後カラム精製し（キアゲン製），最終的なランダム配列を含む成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリとした。【００３４】
インビトロ転写
精製した成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリＤＮＡ １μｇを２０μｌのインビトロ転写キット（ＲｉｂｏｍａｘＴＭ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ−Ｔ７, プロメガ社)によってｍＲＮＡとし，カラム精製した（ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ カラム，キアゲン社）。【００３５】
無細胞翻訳系を用いたインビトロ翻訳（リボソーム−Ｐｅｐｔｉｄｅ−ｍＲＮＡ複合体の構築）：蛋白質合成反応試薬である無細胞翻訳系（ＰＵＲＥシステム）は既報（Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ. （２００５） Ｍｅｔｈｏｄｓ, ｖｏｌ.３６, ｐ.２９９−３０４）に従い調製した。調製した反応液（１００μｌ）に１００ ｐｍｏｌの成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリｍＲＮＡを加え，３７℃で３０分間インキュベートした。氷冷したＷａｓｈ緩衝液（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＯＡｃ, ｐＨ７．５，１５０ ｍＭ ＮａＣｌ，５０ ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ)２，０．５ パーセント Ｔｗｅｅｎ ２０，１０μｇ/ｍｌ出芽酵母（Saccharomyces cereviseae） ｔｏｔａｌ ＲＮＡ (シグマ社製)）５００μＬ，加えてＢｌｏｃｋｉｎｇ緩衝液（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＯＡｃ, ｐＨ７．５，１５０ ｍＭ ＮａＣｌ，５０ ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）２，０．５ パーセント Ｔｗｅｅｎ ２０，１０μｇ/ｍｌ出芽酵母（Saccharomyces cereviseae ）ｔｏｔａｌ ＲＮＡ （シグマ社製），５ パーセント ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ （Ｐｉｅｒｃｅ））５００μＬを加えた。【００３６】
インビトロ選択
予め５％ ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋで４℃において一晩ブロッキングしておいたＦＬＡＧ Ｍ２ 担体（５０μＬスラリー，シグマ社製）を５００ μｌ Ｗａｓｈ緩衝液でＭｉｃｒｏＳｐｉｎ（登録商標）カラム(ＧＥヘルスケア社製)を用いて２回洗浄後，回収したＦＬＡＧ Ｍ２ 担体に翻訳反応液を加え４℃で１時間ローテーションによって攪拌した。ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ（登録商標）カラム(ＧＥヘルスケア社製)によって上清を廃棄し，回収したＦＬＡＧ Ｍ２ 担体に１ ｍＬ のＷａｓｈ緩衝液を加え，４℃で５分ローテーションによって攪拌した。この操作を２０回繰り返した後，１００μｌエルーション（Ｅｌｕｔｉｏｎ）緩衝液（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＯＡｃ, ｐＨ７．５，１５０ ｍＭ ＮａＣｌ，５０ μｇ ＦＬＡＧペプチド（シグマ社製）)を回収したＦＬＡＧ Ｍ２担体に加え，４℃で１５分静置した。このようにして，複合体をＦＬＡＧ Ｍ２担体から遊離させた。ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ（登録商標）カラム(ＧＥヘルスケア社製)によって上清を回収し，ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ(キアゲン社製)によってｍＲＮＡを回収，精製した。【００３７】
ＲＴ−ＰＣＲ
回収したｍＲＮＡはトランスクリプションハイフィデリティｃＤＮＡ合成キット（ロッシュ社）によってｃＤＮＡとした後，ＫＯＤプラスＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ反応（変性：９４℃,１５秒；アニーリング：５７℃,３０秒；伸長：６８℃,６０秒；２０サイクル)を行った。なお，使用したプライマーを以下に示す。【００３８】
逆転写リバースプライマー：Ｍｙｃ−Ｒ (配列番号７：CAGATCCTCCTCAGAGATCAGC)【００３９】
ＰＣＲプライマー：ＦＬＡＧ−Ｆ (配列番号８：atggactataaagatgacgatgacaaa)
Ｍｙｃ−Ｒ (配列番号７：CAGATCCTCCTCAGAGATCAGC)【００４０】
塩基配列解析用サブクローニング
選択前および選択後のＤＮＡ（１００ ｎｇ）をｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）によって３’末端にＡを付加した。その後，ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（インビトロジェン社製）によってサブクローニングを行った。サブクローニングは，このキットの説明書に基づいて行った。形質転換後の大腸菌シングルコロニーをそれぞれ２０コロニー３ｍｌＬＢ培地で培養し，増幅した大腸菌からプラスミドを回収し，塩基配列解析に使用した。【００４１】
結果及び考察
図１に，成熟化前後のランダムオリゴヌクレオチドライブラリ（ＮＮＳ配列）を示す。
図１に示されるように，成熟化前の塩基配列解析の結果，ストップコドン（ＴＡＧ）を含むオリゴヌクレオチドの出現頻度は４０パーセント(８/２０)，塩基の欠失では５パーセント（１/２０），塩基の挿入では０％（０/２０）であり，最終的に完全なインフレームオリゴヌクレオチドの出現頻度は５５％（１１/２０）であった。また，成熟化後においては，ストップコドン，塩基の欠失，挿入を含むものの出現頻度は０パーセント（０/２０）であり，すべてのオリゴヌクレオチドがインフレームであることが確認された。この結果は，本法によるインフレームオリゴヌクレオチドの選択がほぼ完全に達成されていることを示しており，本法の有効性が証明された。
【配列表フリーテキスト】
【００４２】
配列番号１：オリゴヌクレオチド
ｎは任意の塩基を表す。
ｓはグアニン又はシトシンを表す。
配列番号２：T7プロモーター，SD配列および開始コドンを含むオリゴヌクレオチド
配列番号３〜８：プライマー
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明の成熟化オリゴヌクレオチドライブラリの製造方法は，例えば，生化学産業や蛋白質医薬産業において利用されうる。【００４４】
本出願は日本で出願された特願２０１０−１４２４７０（出願日：２０１０年６月２３日）を基礎としており，その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【配列表】
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