(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎｏｔｃｈ１に結合する抗体であって、
配列番号７１に示される重鎖可変領域に由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号９７に示される軽鎖可変領域に由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
を含む抗体。
【請求項２】
（ａ）配列番号７３に示す重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号７７に示す重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号８１に示す重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号９９に示す軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号１０１に示す軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号１０３に示す軽鎖可変領域ＣＤＲ３、
を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
配列番号６９および７１からなる群から選択される重鎖可変領域アミノ酸配列、および、配列番号８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、１０５、１０７および１０９からなる群から選択される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む、
請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
配列番号７１に記載する重鎖可変領域アミノ酸配列、および、配列番号９７に記載する軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
配列番号１１１に記載する重鎖アミノ酸配列、および、配列番号１１３に記載する軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
Ｎｏｔｃｈ１に結合する抗体であって、
配列番号１１５に示される重鎖可変領域に由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号１２９に示される軽鎖可変領域に由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
を含む抗体。
【請求項７】
（ａ）配列番号１１７に示す重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１２１に示す重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１２５に示す重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号１３１に示す軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号１３３に示す軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号１３５に示す軽鎖可変領域ＣＤＲ３、
を含む、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
配列番号１１５に記載する重鎖可変領域アミノ酸配列、および、配列番号１２７、１２９、１３７、１３９、１４１、１４５および１４７からなる群から選択される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む、
請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
配列番号１１５に記載する重鎖可変領域アミノ酸配列、および、配列番号１２９に記載する軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
配列番号１４９に記載する重鎖アミノ酸配列を含み、配列番号１５１に記載する軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
ネイティブなＮｏｔｃｈ１受容体のＮｏｔｃｈ１活性化の阻害と比較して、突然変異Ｎｏｔｃｈ１受容体のＮｏｔｃｈ１活性化のより高い阻害を示す、請求項６に記載の抗体。
【請求項１２】
抗体が、ＩｇＧ１サブクラスのものである、請求項１から１１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか一項に記載の抗体とＮｏｔｃｈ１への結合について競合する、Ｎｏｔｃｈ１に結合する抗体。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸。
【請求項１５】
配列番号７２および９８、または、配列番号１１２および１１４から選択される配列を各々が含む配列群を含む核酸の組合せ。
【請求項１６】
配列番号１１６および１３０、または、配列番号１５０および１５２から選択される配列を各々が含む配列群を含む核酸の組合せ。
【請求項１７】
請求項１４から１６のいずれか一項に記載の核酸または核酸の組合せを含むベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１９】
抗体を生産するための方法であって、請求項１８に記載の宿主細胞を培養するステップと、培養培地から抗体を回収するステップとを含む方法。
【請求項２０】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗体を組換えにより産生する宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗体および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項２２】
対象においてＮｏｔｃｈ１の異常な活性化と関連した障害を治療するための医薬組成物であって、請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２３】
前記Ｎｏｔｃｈ１の異常な活性化と関連した障害が癌である、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
癌が、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、乳がん、卵巣がんおよび大腸がんからなる群から選択される、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
障害を治療するための医薬の製造のための、請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項２６】
障害がＮｏｔｃｈ１の異常な活性化に関連している、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記Ｎｏｔｃｈ１の異常な活性化と関連した障害が癌である、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
癌が、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、乳がん、卵巣がんおよび大腸がんからなる群から選択される、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
障害を治療するための医薬の製造のための、請求項２１から２４のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３０】
障害がＮｏｔｃｈ１の異常な活性化と関連している、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記Ｎｏｔｃｈ１の異常な活性化と関連した障害が癌である、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
癌が、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、乳がん、卵巣がんおよび大腸がんからなる群から選択される、請求項３１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ノッチ１抗体に関する。さらに、本発明は、がんの治療において、そのような抗体を使用する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ノッチ（Ｎｏｔｃｈ）受容体は、多細胞生物における正常な細胞の増殖、分化および死を、リガンド誘導性のタンパク質分解により誘発されるシグナル伝達経路を通して制御する（Ｂｒａｙ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７（９）：６７８〜６８９、２００６）。部位Ｓ１においてフューリン様プロテアーゼにより切断された後の成熟ノッチヘテロ二量体は、３つのＬｉｎ１２／ノッチリピート（ＬＮＲ−Ａ、Ｂ、Ｃ）およびヘテロ二量体化（ＨＤ）ドメインからなる膜近傍の負の調節領域（ＮＲＲ）により自己阻害状態に保たれる。ＨＤドメインは、部位Ｓ１における切断により、Ｎ末端側の半分（ＨＤ１）とＣ末端側の半分（ＨＤ２）とに分割される。Ｄｅｌｔａ／Ｓｅｒｒａｔｅ／Ｌａｇ−２（ＤＳＬ）ファミリーのリガンドがＮ末端に結合すると、未解明の機構を通して、ＥＧＦ−反復領域がこの阻害を和らげ、ノッチ内において、Ｃ末端領域ＨＤ−２付近のＳ２および膜貫通ドメイン内部のＳ３における２つの連続的な追加の切断を誘発し、これらの切断はそれぞれ、ＡＤＡＭ型メタロプロテイナーゼおよびガンマ−セクレターゼにより触媒される（Ｇｏｒｄｏｎ，Ｗ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００７、ｖｏｌｕｍｅ  １４、２９５〜３００）。後者の切断により、ノッチの細胞内ドメイン（ノッチＩＣＤ）が放出され、ノッチの細胞内ドメインが、核にトランスロケーションし、標的遺伝子の転写を活性化させるのを可能にする。
【０００３】
哺乳動物細胞中には、４つの知られているノッチ受容体がある。ノッチ１〜４は、胚および成体の組織において、広い重複する発現パターンを示し、造血幹細胞の特定化、Ｔ細胞の発生、腸腺窩細胞の特定化および血管の発生の間に、重複しない役割を果たす。特定のノッチ１受容体が関与する異常の獲得は、がん、例として、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、乳がんおよび肺がんに関係があるとされている。さらに、活性化されたノッチ１は、マウスモデルにおける白血病の強力な誘導因子であり、非小細胞肺がん、乳がんおよび卵巣がんを含めた、種々の固形腫瘍中で過剰発現する。
【０００４】
Ｔ−ＡＬＬ患者の５０％超が、ノッチ１受容体の突然変異を有し、それらのうちのいくつかからは、ＮＲＲの自己阻害性ドメインの中または付近の変化により引き起こされたノッチ１のリガンド過感受性またはリガンド依存性の活性化に一部起因して、受容体の構成的な切断およびノッチ１ＩＣＤの産生が生じる。これらの突然変異は、３つの主要なクラスのカテゴリーに分けられる。クラス１の突然変異は、ＨＤ１中の単一アミノ酸置換および小さなインフレームの欠失または挿入である。クラス２の突然変異は、ＨＤ２の遠位領域中のより長い挿入であり、これらの挿入により、Ｓ２−金属プロテアーゼの切断部位が、自己阻害性ＮＲＲドメインを越えて移転する。クラス３の突然変異は、膜近傍伸長（ｊｕｘｔａｍｅｍｂｒａｎｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）（ＪＭＥ）突然変異ともまた呼ばれ、大きな挿入から生じ、これらの挿入は、ＮＲＲを細胞膜から離れたところに動かす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
いくつかの戦略が、がんにおける治療の目的でノッチシグナル伝達を阻害するために開発されつつある。１つのアプローチは、膜からの細胞内ノッチのタンパク質分解性の放出を、ガンマ−セクレターゼ（ＧＳＩ）の阻害剤を用いる治療により遮断することである。ＧＳＩは、診察室で使われるまでになったが、個々のノッチ受容体を区別することができず、ノッチ１およびノッチ２の両方の阻害によるものである腸毒性を引き起こす。当技術分野では、がんを治療し、かつ副作用、特に、腸毒性を低下させるための新規の抗ノッチ１療法が依然として求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一実施形態では、本発明は、配列番号７１を含む重鎖可変領域に由来するＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域を有するノッチ１に結合する抗体を提供する。
【０００７】
別の実施形態では、本発明は、配列番号９７を含む軽鎖可変領域に由来するＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を有する軽鎖可変領域を有するノッチ１に結合する抗体を提供する。
【０００８】
また、本発明は、１）配列番号７１を含む重鎖可変領域に由来するＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域、ならびに２）配列番号９７を含む軽鎖可変領域に由来するＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を有する軽鎖可変領域を有するノッチ１に結合する抗体も提供する。
【０００９】
また、配列番号７１と少なくとも９０％同一である重鎖可変領域アミノ酸配列を有するノッチ１に結合する抗体も提供する。さらに、配列番号７１に記載する重鎖可変領域アミノ酸配列を有するノッチ１に結合する抗体も提供する。
【００１０】
また、配列番号９７と少なくとも９０％同一である軽鎖可変領域アミノ酸配列を有するノッチ１に結合する抗体も提供する。さらに、配列番号９７に記載する軽鎖可変領域アミノ酸配列を有するノッチ１に結合する抗体も提供する。
【００１１】
また、配列番号１１１と少なくとも９０％同一である重鎖アミノ酸配列を有するノッチ１に結合する抗体も提供する。さらに、配列番号１１１に記載する重鎖アミノ酸配列を有するノッチ１に結合する抗体も提供する。
【００１２】
また、配列番号１１３と少なくとも９０％同一である軽鎖アミノ酸配列を有する抗体も提供する。さらに、配列番号１１３に記載する軽鎖アミノ酸配列を有する抗体も提供する。
【００１３】
さらなる実施形態では、本発明は、配列番号７１と少なくとも９０％同一である重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号９７と少なくとも９０％同一である軽鎖可変アミノ酸配列を有するノッチ１に結合する抗体を提供する。さらに、配列番号７１に記載する重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号９７に記載する軽鎖可変領域アミノ酸配列を有するノッチ１に結合する抗体も提供する。
【００１４】
さらなる実施形態では、本発明は、配列番号１１１と少なくとも９０％同一である重鎖アミノ酸配列および配列番号１１３と少なくとも９０％同一である軽鎖アミノ酸配列を有するノッチ１に結合する抗体を提供する。さらに、配列番号１１１に記載する重鎖アミノ酸配列および配列番号１１３に記載する軽鎖アミノ酸配列を有するノッチ１に結合する抗体も提供する。
【００１５】
さらなる実施形態では、本発明は、ヒトノッチ１に結合する抗体であって、抗体が、Ａｓｎ１４６１、Ｌｙｓ１４６２、Ｖａｌ１４６３、Ｃｙｓ１４６４、Ｌｅｕ１４６６、Ｌｅｕ１５８０、Ｔｙｒ１６２１、Ｇｌｙ１６２２、Ｍｅｔ１６７０、Ａｓｐ１６７１、Ｖａｌ１６７２、Ａｒｇ１６７３、Ｌｅｕ１７０７、Ａｌａ１７０８、Ｌｅｕ１７１０、Ｇｌｙ１７１１、Ｓｅｒ１７１２、Ｌｅｕ１７１３、Ｐｒｏ１７１６およびＬｙｓ１７１８から選択される少なくとも８個のアミノ酸残基を有するエピトープに結合する、抗体を提供する。
【００１６】
別の実施形態では、本発明は、配列番号１１５を含む重鎖可変領域に由来するＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域を有するノッチ１に結合する抗体を提供する。
【００１７】
別の実施形態では、本発明は、配列番号１２９を含む軽鎖可変領域に由来するＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を有する軽鎖可変領域を有するノッチ１に結合する抗体を提供する。
【００１８】
また、本発明は、１）配列番号１１５を含む重鎖可変領域に由来するＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域、ならびに２）配列番号１２９を含む軽鎖可変領域に由来するＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を有する軽鎖可変領域を有するノッチ１に結合する抗体も提供する。
【００１９】
また、配列番号１１５と少なくとも９０％同一である重鎖可変領域アミノ酸配列を有するノッチ１に結合する抗体も提供する。さらに、配列番号１１５に記載する重鎖可変領域アミノ酸配列を有するノッチ１に結合する抗体も提供する。
【００２０】
また、配列番号１２９と少なくとも９０％同一である軽鎖可変領域アミノ酸配列を有するノッチ１に結合する抗体も提供する。さらに、配列番号１２９に記載する軽鎖可変領域アミノ酸配列を有するノッチ１に結合する抗体も提供する。
【００２１】
また、配列番号１４９と少なくとも９０％同一である重鎖アミノ酸配列を有するノッチ１に結合する抗体も提供する。さらに、配列番号１４９に記載する重鎖アミノ酸配列を有するノッチ１に結合する抗体も提供する。
【００２２】
また、配列番号１５１と少なくとも９０％同一である軽鎖アミノ酸配列を有する抗体も提供する。さらに、配列番号１５１に記載する軽鎖アミノ酸配列を有する抗体も提供する。
【００２３】
さらなる実施形態では、本発明は、配列番号１１５と少なくとも９０％同一である重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号１２９と少なくとも９０％同一である軽鎖可変アミノ酸配列を有するノッチ１に結合する抗体を提供する。さらに、配列番号１１５に記載する重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号１２９に記載する軽鎖可変領域アミノ酸配列を有するノッチ１に結合する抗体も提供する。
【００２４】
さらなる実施形態では、本発明は、配列番号１４９と少なくとも９０％同一である重鎖アミノ酸配列および配列番号１５１と少なくとも９０％同一である軽鎖アミノ酸配列を有するノッチ１に結合する抗体を提供する。さらに、配列番号１４９に記載する重鎖アミノ酸配列および配列番号１５１に記載する軽鎖アミノ酸配列を有するノッチ１に結合する抗体も提供する。
【００２５】
さらなる実施形態では、本発明は、ヒトノッチ１に結合する抗体であって、Ａｓｐ１４５８、Ａｓｎ１４６１、Ｖａｌ１４６３、Ｃｙｓ１４６４、Ｌｅｕ１４６６、Ｌｅｕ１５８０、Ｍｅｔ１５８１、Ｐｒｏ１５８２、Ｔｙｒ１６２１、Ｇｌｙ１６２２、Ａｒｇ１６２３、Ａｓｐ１６７１、Ｖａｌ１６７２、Ａｒｇ１６７３、Ｇｌｙ１６７４、Ｌｅｕ１７１０、Ｇｌｙ１７１１、Ｓｅｒ１７１２、Ｌｅｕ１７１３、Ａｓｎ１７１４、Ｉｌｅ１７１５、Ｐｒｏ１７１６およびＬｙｓ１７１８から選択される少なくとも８個のアミノ酸残基を有するエピトープに結合する、抗体を提供する。
【００２６】
別の実施形態では、本発明は、ネイティブなノッチ１受容体のノッチ１活性化の阻害と比較して、突然変異ノッチ１受容体のノッチ１活性化のより高い阻害を示す抗体を提供する。さらに、突然変異ノッチ１受容体が、負の調節領域（ＮＲＲ）中に突然変異を有する場合を想定している。さらなる実施形態では、ＮＲＲ中の突然変異は、クラス１、クラス２およびクラス３の突然変異からなる群から選択される。さらなる実施形態では、ＮＲＲ中の突然変異は、ノッチ１の異常な活性化を示す細胞と関連している。さらに、細胞は、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）細胞である場合を想定している。また、Ｔ−ＡＬＬ細胞は、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞、ＡＬＬ−ＳＩＬ細胞、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞、ＭＯＬＴ−４細胞およびＤＮＤ−４１細胞からなる群から選択される場合を想定している。
【００２７】
また、ノッチ１に結合し、ノッチ１に対する結合について本明細書に記載する抗体のうちのいずれかと競合する抗体も提供する。
【００２８】
さらなる実施形態では、本発明は、ノッチ１に結合する抗体であって、アイソタイプＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭである抗体を提供する。さらに、ノッチ１に結合する抗体であって、アイソタイプはＩｇＧであり、サブクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４であるかまたはそれらに由来する抗体も提供する。また、ノッチ１に結合する抗体であって、サブクラスはＩｇＧ１に由来する抗体も提供する。
【００２９】
さらなる実施形態では、本発明は、本明細書に記載する抗体のうちのいずれかをコードする核酸または本明細書に記載する抗体の重鎖および／もしくは軽鎖のうちのいずれかをコードする核酸を提供する。例えば、一実施形態では、本発明は、配列番号１１２に記載する配列を有する核酸を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、配列番号１１４に記載する配列を有する核酸を提供する。別の実施形態では、本発明は、配列番号１５０に記載する配列を有する核酸を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、配列番号１５２に記載する配列を有する核酸を提供する。
【００３０】
さらなる実施形態では、本発明は、本明細書に記載する核酸のうちのいずれかを含むベクターを提供する。さらなる実施形態では、本発明は、本明細書に記載するベクターのうちのいずれかを含む宿主細胞を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、本明細書に記載する抗体のうちのいずれかを生産するための方法であって、本明細書に記載する任意の宿主細胞を培養するステップと、培養培地から抗体を回収するステップとを含む方法を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、本明細書に記載する抗体のうちのいずれかを組換えにより産生する宿主細胞を提供する。一実施形態では、本明細書に記載する宿主細胞のうちのいずれかを単離する。
【００３１】
さらなる実施形態では、本発明は、本明細書に記載する抗体のうちのいずれかおよび薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、それを必要とする対象において障害を治療する方法であって、本明細書に記載する抗体または医薬組成物のうちのいずれかを対象に投与するステップを含む方法を提供する。さらに、本発明は、それを必要とする対象においてノッチ１の異常な活性化と関連している障害を治療する方法であって、本明細書に記載する抗体または医薬組成物のうちのいずれかを対象に投与するステップを含む方法を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、それを必要とする対象において、障害、例として、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、乳がんおよび結腸がんを治療する方法であって、本明細書に記載する抗体または医薬組成物のうちのいずれかを対象に投与するステップを含む方法を提供する。さらに、本発明は、それを必要とする対象において障害を治療する方法であって、本明細書に記載する抗体または医薬組成物のうちのいずれかを、１つまたは複数の治療剤と組み合わせて対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００３２】
別の実施形態では、本発明は、療法において使用するための、本明細書に開示する抗体のうちのいずれかを提供する。さらなる実施形態では、本発明は、療法のための医薬の製造のための、本明細書に開示する抗体のうちのいずれかを使用する。さらなる実施形態では、本発明は、それを必要とする対象におけるノッチ１の異常な活性化と関連している障害の治療において使用するための、本明細書に開示する抗体のうちのいずれかを提供する。さらなる実施形態では、本発明は、それを必要とする対象における障害、例として、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、乳がんおよび結腸がんの治療において使用するための、本明細書に開示する抗体のうちのいずれかを提供する。
【００３３】
さらなる実施形態では、本発明は、ヒト、マウスおよびカニクイザル（以下、「ｃｙｎｏ」）のノッチ１に結合するが、ヒトノッチ２には結合しない抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、ヒト、マウスおよびｃｙｎｏのノッチ１に結合するが、ヒトおよびマウスのノッチ３には結合しない抗体を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ＡｖｉおよびＨｉｓからなるタグを有する、組換えのＳ１切断されたヘテロ二量体ノッチ１ＮＲＲタンパク質免疫原を示す概略図である。
【図２】抗ノッチ１抗体のラット３５１−ｍＩｇＧ１、ラット４３８−ｍＩｇＧ１、およびＡ２のエピトープマッピングのための、組換えヒトノッチ１ＮＲＲドメインと組換えヒトノッチ３ＮＲＲドメインとのスワップキメラ構築物を示す図である。
【図３】ヒトノッチ１ＮＲＲ上のラット４３８エピトープの構造的見解を示す図である。
【図４】ヒトノッチ１ＮＲＲ上のラット３５１エピトープの構造的見解を示す図である。
【図５】ヒトノッチ１ＮＲＲ上のＡ２エピトープの構造的見解を示す図である。
【図６】ラット４３８抗体およびＡ２抗体に結合しているノッチ１ＮＲＲの構造の重ね合わせである。
【図７】ラット３５１抗体およびＡ２抗体（分子表面として示す）に結合しているノッチ１ＮＲＲ（リボンとして示す）の構造の重ね合わせである。
【図８】ヒトノッチ１のレポーター細胞中の、ノッチ１依存性のシグナル伝達に対するヒト化４３８ＶＨ１．１／ＶＬ１．８抗体、ラット４３８−ｍＩｇＧ１抗体およびＡ２抗体の中和活性を示すグラフである。
【図９】マウスノッチ１のレポーター細胞中の、ノッチ１依存性のシグナル伝達に対するヒト化４３８ＶＨ１．１／ＶＬ１．８抗体、ラット４３８−ｍＩｇＧ１抗体およびＡ２抗体の中和活性を示すグラフである。
【図１０】ヒトノッチ１シグナル伝達に対するラット３５１抗体およびＡ２抗体の中和活性を示すグラフである。
【図１１】マウスノッチ１シグナル伝達に対するラット３５１抗体およびＡ２抗体の中和活性を示すグラフである。
【図１２】ヒトノッチ１のレポーター細胞中の、ノッチ１依存性のシグナル伝達に対するヒト化３５１変異体抗体、ラット３５１−ｍＩｇＧ１抗体およびＡ２抗体の中和活性を示すグラフである。
【図１３】マウスノッチ１のレポーター細胞中の、ノッチ１依存性のシグナル伝達に対するヒト化３５１変異体抗体、ラット３５１−ｍＩｇＧ１抗体およびＡ２抗体の中和活性を示すグラフである。
【図１４Ａ】ラット３５１とＬＮＲ−Ａ領域中のノッチ１ＮＲＲとの間の相互作用の界面の構造的見解を示す図である。
【図１４Ｂ】ラット３５１とＬＮＲ−Ａ領域中のノッチ１ＮＲＲとの間の相互作用の界面の構造的見解を示す図である。
【図１５】同時培養レポーター遺伝子アッセイにおける、ラット３５１、突然変異させたラット３５１およびＡ２の中和活性を示すグラフである。
【図１６】ラット４３８、ラット３５１およびＡ２、ならびに対照の培地単独および抗ＶＥＧＦ抗体を用いた処理の第１０日時のＨＵＶＥＣの出芽のＣＤ３１−Ｃｙ３の免疫染色の代表的な落射蛍光画像である。
【図１７】血管形成のマウス網膜モデルにおける、ラット４３８−ｍＩｇＧ１抗体、ラット３５１−ｍＩｇＧ１抗体およびＡ２抗体ならびに対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体を用いて処理した後の、さらに、対照の未処理の、イソレクチンＢ４−Ａｌｅｘａ４８８の染色の代表的な共焦点画像である。
【図１８】組換えヒトＤＬＬ４リガンド上に蒔き、ラット３５１、ラット４３８およびＡ２ならびに対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体の濃度を増加させて用いて処理したＣＣＤ１０７６ＳＫヒト線維芽細胞から生成したタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析を示す写真である。
【図１９】ヒト化４３８ＶＨ１．１／ＶＬ１．８、ラット４３８−ｍＩｇＧ１および対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体の濃度を増加させて用いて処理したＨＢＰ−ＡＬＬ細胞から生成したタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析を示す写真である。
【図２０】ラット３５１−ｍＩｇＧ１、ラット４３８−ｍＩｇＧ１およびＡ２ならびに対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体の濃度を増加させて用いて処理したＴ−ＡＬＬ細胞株から生成したタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析を示す写真である。
【図２１】３７６２２Ａ１  ＮＳＣＬＣ患者に由来する異種移植片中のノッチ１受容体およびジャギド１リガンドの免疫組織化学的検出を示す写真である。
【図２２】３７６２２Ａ１  ＮＳＣＬＣ患者に由来する異種移植片が、ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子中のＧ１３Ｖ突然変異を保有したことを示すクロマトグラムである。
【図２３】ラット４３８−ｍＩｇＧ１抗体、Ａ２抗体および対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体を用いて処理した、３７６２２Ａ１  ＮＳＣＬＣ患者に由来する異種移植片から生成したタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析を示す写真である。
【図２４】ラット３５１−ｍＩｇＧ１抗体および対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体を用いて処理した、８７３９３Ａ１  ＮＳＣＬＣ患者に由来する異種移植片中に生成したタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析を示す写真である。
【図２５】ラット３５１−ｍＩｇＧ１抗体および対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体を用いた処理後の８７３９３Ａ１  ＮＳＣＬＣ患者に由来する異種移植片におけるインボルクリンの発現の免疫組織化学的検出を示す写真である。
【図２６】ラット３５１−ｍＩｇＧ１抗体および対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体を用いた処理後の８７３９３Ａ１  ＮＳＣＬＣ患者に由来する異種移植片におけるインボルクリンの発現のウエスタンブロット分析を示す写真である。
【図２７】ラット４３８−ｍＩｇＧ１、Ａ２および対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体を用いる処理を行ったＣａｌｕ−６有効性研究から得られたマウス腸の回腸切片に対してアルシアンブルー染色を使用した、分泌性の杯細胞の組織化学的同定を示す画像である。
【図２８】ラット４３８−ｍＩｇＧ１、Ａ２および対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体を用いる処理を行ったＣａｌｕ−６有効性研究から得られたマウス腸腺窩に対する抗Ｋｉ６７の免疫組織化学的検査を示す画像である。
【図２９】ラット３５１−ｍＩｇＧ１抗体および対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体を用いる処理を行った８７３９３Ａ１患者由来の異種移植片の有効性研究から得られたマウス腸腺窩に対する抗Ｋｉ６７の免疫組織化学的検査を示す画像である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、ノッチ１に結合する単離抗体、特に、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体およびラットモノクローナル抗体に関する。さらに、本開示は、ネイティブなノッチ１受容体のノッチ１活性化の阻害と比較して、突然変異ノッチ１受容体のノッチ１活性化のより高い阻害を示す単離抗体も提供する。本開示は、単離抗体、およびそのような抗体を作製する方法、および抗体を含有する医薬組成物を提供する。さらに、本開示は、そのような抗体を含有するイムノコンジュゲートおよび二重特異性分子にも関する。また、本開示は、抗体を使用して、ノッチ１活性化を阻害し、異常な細胞の増殖に関する種々の疾患、例として、がん（例えば、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、結腸がん、乳がんおよび卵巣がんを治療する方法にも関する。
【００３６】
一般的な技法
別段の記載がない限り、本発明の方法および技法は一般に、当技術分野でよく知られている従来法に従って実施し、別段の記載がない限り、本明細書全体を通して引用し、論じる種々の一般的な参考文献およびより特定の参考文献の記載に従って実施する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２ｄ  ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、および  Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２）、ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９０）を参照されたい。これらは、参照により本明細書に組み込まれている。
【００３７】
定義
「ノッチ１」または「ノッチ−１」は、ネイティブなヒトノッチ１タンパク質、ヒトノッチ１タンパク質の変異体、ヒトノッチ１タンパク質のアイソフォーム、およびヒトノッチ１タンパク質の種相同体を指す。ネイティブなヒトノッチ１タンパク質は、例えば、リーダーペプチド、大型の上皮増殖因子（ＥＧＦ）様の反復領域、３つのＬｉｎ１２リピート、Ｎ末端ヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ−１）、Ｃ末端ヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ−２）、膜貫通（ＴＭ）配列および細胞内ドメイン（ノッチ１ＩＣＤ）から構成される。完全長ヒトノッチ１のＮＣＢＩ／ＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、ＮＭ＿０１７６１７．２である。
【００３８】
「ノッチ１の負の調節領域」または「ノッチ１ＮＲＲ」は、本明細書で使用する場合、別段の記載がない限り、ノッチ１の３つのＬｉｎ１２ドメイン、および３つのＬｉｎ１２ドメインの間に位置する１つまたは複数のアミノ酸配列、さらに、ＨＤ１ドメインおよびＨＤ２ドメインからなる、ノッチ１の任意の本来または合成のポリペプチド領域を指す。一実施形態では、「ノッチ１ＮＲＲ」は、３つのＬｉｎ１２ドメイン、ならびに２つのヘテロ二量体化ドメインＨＤ−１およびＨＤ−２を含み、ノッチ１のＨＤ−１ドメインとＨＤ−２ドメインとが、共有結合しており、フューリン様プロテアーゼによりまだ切断されていない（Ｓ１切断前）。別の実施形態では、「ノッチ１ＮＲＲ」は、３つのＬｉｎ１２ドメイン、ならびに２つのヘテロ二量体化ドメインＨＤ−１およびＨＤ−２を含み、ＨＤ−１ドメインとＨＤ−２ドメインとが非共有結合している（Ｓ１切断後）。この実施形態の一態様では、ＨＤ−２ドメイン内部のＳ２部位が、ＡＤＡＭ型金属プロテアーゼにより切断されていない。この実施形態の別の特定の態様では、ＨＤ−２ドメイン内部のＳ２部位は、ＡＤＡＭ型金属プロテアーゼにより切断されつつあるかまたはすでに切断されている。（Ｇｏｒｄｏｎ，Ｗ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００７、ｖｏｌｕｍｅ  １４、２９５〜３００）。
【００３９】
「抗体」は、免疫グロブリン分子であり、標的、例として、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等に、免疫グロブリン分子の可変領域中に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を通して特異的に結合することが可能である。本明細書で使用する場合、この用語は、未変化のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のみならず、また、それらの断片（例えば、抗原結合性部分）（例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖（ＳｃＦｖ）、ならびにドメイン抗体、例として、サメおよびラクダ科の抗体）も、抗体の部分（例として、ドメイン抗体）を含む融合タンパク質も、抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変された配置も網羅する。抗体は、任意のクラス、例として、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭ（またはそれらのサブクラス）の抗体を含み、抗体は、いずれかの特定のクラスである必要はない。その重鎖の定常ドメインの抗体のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを、異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス（アイソタイプ）、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元配置はよく知られている。
【００４０】
「単離抗体」は、本明細書で使用する場合、異なる抗原特異性を示す他の抗体を実質的に含有しない抗体を指すことを意図する（例えば、ノッチ１に特異的に結合する単離抗体は、ノッチ１以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含有しない）。しかし、ノッチ１に特異的に結合する単離抗体は、他の抗原、例として、他の種に由来するノッチ−１分子に対して交差反応性を示し得る。さらに、単離抗体は、他の細胞材料および／または化学物質も実質的に含有しない場合がある。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得る抗体を指す。すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量存在する場合がある、天然に存在する可能性がある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、極めて特異的であり、単一の抗原部位に対して作られる。
【００４２】
「ヒト化」抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最低限の配列を含有するキメラの免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらの断片（例として、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２もしくは抗体の他の抗原結合性サブ配列）である非ヒト（例えば、マウス）抗体の形態を指す。好ましくは、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、所望される特異性、親和性および能力を有する、非ヒト種、例として、マウス、ラットまたはウサギのＣＤＲ（ドナー抗体）に由来する残基で置き換わっているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖのフレームワーク領域（ＦＷ）の残基が、対応する非ヒト残基で置き換わっている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にも、移入したＣＤＲ配列およびフレームワーク配列中にも見出されないが、抗体の性能をさらに精緻化および最適化するために含まれる残基を含む場合もある。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含み、この場合、ＣＤＲ領域の全部または実質的に全部が、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＷ領域の全部または実質的に全部が、ヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のＦＷ領域である。また、ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリンの定常領域または定常ドメイン（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部も含む。ヒト化抗体の他の形態は、元々の抗体に関して変化している、１つまたは複数のＣＤＲ（Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２またはＨ−ＣＤＲ３）を有し、これらのＣＤＲはまた、元々の抗体に由来する１つまたは複数のＣＤＲ「から誘導した」１つまたは複数のＣＤＲとも呼ばれる。
【００４３】
「ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことを意図する。さらに、抗体が定常領域を含有する場合には、定常領域もまた、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本開示のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってはコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるランダム変異誘発もしくは部位特異的変異誘発によってかまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける体細胞突然変異によって導入された突然変異）を含むことができる。ヒト抗体のこの定義は、少なくとも１つのヒト重鎖ポリペプチドまたは少なくとも１つのヒト軽鎖ポリペプチドを含む抗体を含む。ヒト抗体は、当技術分野で知られている種々の技法を使用して生産することができる。
【００４４】
用語「キメラ抗体」は、可変領域配列が１つの種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体、例として、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体を指すことを意図する。
【００４５】
用語「組換え抗体」は、本明細書で使用する場合、組換えの手段により調製、発現、創出または単離が行われる全ての抗体を含む。そのような組換え抗体は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域が生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかし、特定の実施形態では、そのような組換え抗体に対して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける変異誘発（または、Ｉｇ配列についてトランスジェニックな動物を使用する場合には、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける体細胞変異誘発）を行うことができ、したがって、組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、生殖系列のＶＨ配列およびＶＬ配列に由来し、それらの配列に関連するが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗体の生殖系列レパートリー内に天然には存在し得ない配列となる。
【００４６】
本明細書においては、句「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」を、用語「抗原に特異的に結合する抗体」と互換的に使用する。
【００４７】
当技術分野で知られているように、用語「Ｆｃ領域」を使用して、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域（ＣＨ２＋ＣＨ３）を定義する。「Ｆｃ領域」は、ネイティブな配列のＦｃ領域であってもまたは変異体のＦｃ領域であってもよい。
【００４８】
「ネイティブな配列のＦｃ領域」は、自然界において見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。「変異体のＦｃ領域」は、ネイティブな配列のＦｃ領域のアミノ酸配列とは少なくとも１つのアミノ酸の改変によって異なるが、にもかかわらず、ネイティブな配列のＦｃ領域の少なくとも１つの機能を保持するアミノ酸配列を含む。
【００４９】
用語「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」を使用して、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載する。例えば、ＦｃＲは、ネイティブな配列のヒトＦｃＲであり得る。さらに、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合する受容体であり得（ガンマ受容体）、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃγＲＩＶのサブクラスの受容体を含み、これらの受容体の対立遺伝子変異体および選択的にスプライシングされる形態も含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）を含み、これらは、主としてそれらの細胞質ドメインにおいて異なる、類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメイン中に、免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。当業者であれば理解するであろうが、阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメイン中に、免疫受容体チロシンに基づく阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する。ＦｃＲは、広範に検討されており、当業者にはよく知られている。本明細書においては、用語「ＦｃＲ」は、将来同定されるものを含めて、他のＦｃＲを包含する。また、この用語は、新生児型受容体ＦｃＲｎも含み、この受容体は、母体のＩｇＧの胎児への移動およびＩｇＧの半減期の延長に関与する。
【００５０】
用語「結合する」は、２つの分子、例えば、抗原と抗体との間の親和性を指す。「ノッチ１に特異的に結合する」抗体は、複数の異なる抗原を含む試料中の、抗体のノッチ１抗原に対する優先的な結合を指し、ＫＤの差は、少なくとも１００倍、または好ましくは、１，０００倍である。
【００５１】
用語「高い親和性」は、１×１０−６Ｍ以下のＫＤを有する、より好ましくは、１×１０−８Ｍ以下のＫＤを有する抗体を指す。親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴を使用して測定することができる。
【００５２】
「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合することが可能である、任意のタンパク質決定因子を含む。エピトープ決定因子は、通常、分子の化学的に活性な表面集団、例として、アミノ酸または糖側鎖からなり、通常、特異的な三次元の構造的な特徴および特異的な電荷の特徴を有する。
【００５３】
用語「ｋｏｎ」は、本明細書で使用する場合、特定の抗体抗原相互作用のオン速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）または結合速度を指すことを意図し、一方、用語「ｋｏｆｆ」は、本明細書で使用する場合、特定の抗体抗原相互作用のオフ速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）または解離速度を指すことを意図する。用語「ＫＤ」は、本明細書で使用する場合、平衡解離定数を指すことを意図し、平衡解離定数は、ｋｏｆｆ対ｋｏｎの比（すなわち、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される。抗体についてのＫＤ値は、当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定することができる。抗体のＫＤを決定するための１つの方法は、バイオセンサーシステム、例として、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムを典型的に使用する表面プラズモン共鳴を使用することによる方法である。
【００５４】
本明細書においては、用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」を互換的に使用して、任意の長さ、好ましくは、比較的短い（例えば、１０〜１００個のアミノ酸）アミノ酸の鎖を指す。鎖は、直鎖であってももしくは分枝であってもよく、アミノ酸の改変を含んでもよく、かつ／または非アミノ酸を介在させてもよい。ポリペプチドは、単鎖として存在してもまたは結合状態の複数の鎖として存在してもよいことを理解されたい。
【００５５】
当技術分野で知られているように、「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、本明細書においては互換的に使用して、任意の長さのヌクレオチドの鎖を指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、改変されたヌクレオチドもしくは塩基、および／またはそれらの類似体であってもよく、さらに、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼにより鎖中に組み込まれ得る任意の基質であってもよい。
【００５６】
抗体の「可変領域」は、単独でまたは組み合わせてのいずれかの抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を指す。当技術分野で知られているように、重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、超可変領域としてもまた知られている、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）により接続されている４つのフレームワーク領域（ＦＷ）からなる。それぞれの鎖中のＣＤＲは、ＦＷにより、密接に近接して一緒に保たれ、他の鎖に由来するＣＤＲと共に、抗体の抗原結合性部位の形成に寄与する。
【００５７】
可変ドメインの「ＣＤＲ」は、Ｋａｂａｔの定義、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの両方の集積、ＡｂＭ、接触および／もしくは立体構造の定義、または当技術分野でよく知られている、ＣＤＲの決定の任意の方法に従って同定される可変領域内部のアミノ酸残基である。抗体のＣＤＲは、Ｋａｂａｔらにより当初定義された超可変領域として同定することができる。例えば、Ｋａｂａｔら、１９９２、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ  ｅｄ．、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、ＮＩＨ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．を参照されたい。また、ＣＤＲの位置は、Ｃｈｏｔｈｉａらにより当初記載された構造的なループとして同定することもできる。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７〜８８３を参照されたい。ＣＤＲの同定に対する他のアプローチは、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａとの間の折衷案であり、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ  ＡｂＭ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｏｄｅｌｉｎｇソフトウエア（現在、Ａｃｃｅｌｒｙｓ（登録商標））を使用して誘導される「ＡｂＭの定義」、またはＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６２：７３２〜７４５に記載されている、観察された抗原の接触に基づくＣＤＲの「接触による定義」を含む。本明細書においてはＣＤＲの「立体構造の定義」と呼ぶ、別のアプローチでは、ＣＤＲの位置は、抗原結合にエンタルピーの寄与をもたらす残基として同定することができる。例えば、Ｍａｋａｂｅら、２００８、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８３：１１５６〜１１６６を参照されたい。さらなる他のＣＤＲの境界の定義は、上記のアプローチのうちの１つに厳格には従わない場合があるが、それにもかかわらず、特定の残基もしくは残基の群またはさらにはＣＤＲ全体が抗原結合に顕著には影響しないという予測または実験的知見に照らしてそれらが短縮または伸張されていることがあるものの、ＫａｂａｔのＣＤＲの少なくとも一部と重複する。本明細書で使用する場合、ＣＤＲは、アプローチの組合せを含めて、当技術分野で知られている任意のアプローチにより定義されるＣＤＲを指すことができる。本明細書において使用する方法は、これらのアプローチのうちのいずれかに従って定義されるＣＤＲを活用することができる。２つ以上のＣＤＲを含有する、任意の所与の実施形態については、ＣＤＲを、Ｋａｂａｔの定義、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、延長された定義、ＡｂＭの定義、接触の定義および／または立体構造の定義のうちのいずれかに従って定義することができる。
【００５８】
抗体の「定常領域」は、単独でまたは組み合わせてのいずれかの抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域を指す。
【００５９】
「宿主細胞」は、ポリヌクレオチド挿入部の組込みのためのベクター（複数可）についてのレシピエントになり得るかまたはそうしたレシピエントになっている個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含み、子孫は、天然の、偶発的な、または意図的な突然変異に起因して、（形態学的状態としてまたはゲノムＤＮＡの相補体として）元々の親細胞と必ずしも完全には同一でない場合がある。宿主細胞は、本開示のポリヌクレオチド（複数可）をｉｎ  ｖｉｖｏにおいてトランスフェクトした細胞を含む。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「ベクター」は、構築物を意味し、この構築物は、宿主細胞において、１つまたは複数の、目的の遺伝子または配列を送達する、好ましくは、発現することが可能である。ベクターの例として、これらに限定されないが、ウイルスベクター、裸のＤＮＡまたはＲＮＡの発現ベクター、プラスミドベクター、コスミドベクターまたはファージベクター、カチオン性縮合剤を伴うＤＮＡまたはＲＮＡの発現ベクター、リポソーム中に被包されているＤＮＡまたはＲＮＡの発現ベクター、および特定の真核細胞、例として、プロデューサー細胞が挙げられる。
【００６１】
本明細書で使用する場合、「発現制御配列」は、核酸の転写を導く核酸配列を意味する。発現制御配列は、プロモーター、例として、構成性もしくは誘導性のプロモーター、またはエンハンサーであり得る。発現制御配列は、転写されるべき核酸配列に作動可能に連結している。
【００６２】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容できる担体」または「薬学的に許容できる賦形剤」は、活性成分と組み合わせた場合、この成分が生物学的活性を保持するのを可能にし、対象の免疫系とは反応しない、任意の材料を含む。例として、これらに限定されないが、標準的な薬学的担体、例として、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルジョン、例として、油／水エマルジョン、および種々のタイプの湿潤剤のうちのいずれかが挙げられる。エアロゾルまたは非経口投与に好ましい希釈剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または通常の（０．９％）生理食塩水である。そのような担体を含む組成物を、よく知られている従来法により製剤化する。
【００６３】
「個体」または「対象」は、哺乳動物、より好ましくは、ヒトである。また、哺乳動物として、これらに限定されないが、家畜、競技用動物、ペット、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、マウスおよびラットも挙げられる。
【００６４】
「単離タンパク質」、「単離ポリペプチド」または「単離抗体」は、その起源または入手源によって、（１）タンパク質、ポリペプチドまたは抗体にそのネイティブな状態において伴う、天然に付随する構成成分が付随しない、（２）同じ種に由来する他のタンパク質を含有しない、（３）異なる種に由来する細胞が発現する、または（４）自然界においては存在しないタンパク質、ポリペプチドまたは抗体である。したがって、化学的に合成されるかまたはポリペプチドの天然の起源である細胞とは異なる細胞系中で合成されるポリペプチドは、その天然に付随する構成成分から「単離」されている。また、タンパク質を、当技術分野でよく知られているタンパク質精製の技法を使用する単離により、天然に付随する構成成分を実質的に含有しない状態になすこともできる。
【００６５】
ノッチ１受容体
ヒトノッチ１のｃＤＮＡは、リーダーペプチド、３６個のＥＧＦ様リピート、負の調節領域（ＮＲＲ）、膜貫通（ＴＭ）配列および細胞内ドメイン（ノッチ１ＩＣＤ）からなる２５５６個のアミノ酸残基のタンパク質をコードする。
【００６６】
ＮＲＲに結合する抗ノッチ１抗体
現在の開示では、ノッチ１ドメインに高い親和性で結合する抗体は、ノッチ１のシグナル伝達を低下させることができ、したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて生物学的活性を示して、がん細胞の増殖、特に、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、乳がん、結腸がんおよび卵巣がんを阻害することができることも企図する。そのような抗体は、当業者に知られている一般的な方法に従って生産することができる。一実施形態では、そのような抗体を、免疫原を用いるラットの免疫化、続いて、抗体のハイブリドーマによるクローニングを通して生産し、こうして生成した、クローニングした抗体を、多様なアッセイによりアッセイすることができる。使用して、ノッチ１と特異的に反応する抗体を同定することができる多くのアッセイの中には、例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイ、免疫沈降、ＢＩＡｃｏｒｅ、ＦＡＣＳおよびウエスタンブロット分析がある。ＥＬＩＳＡアッセイに従って選択した抗体のノッチ１結合親和性を、表面プラズモン共鳴Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）計測器上で測定することができる。
【００６７】
現在の開示の抗ノッチ１抗体は、上記の段落に記載した方法以外の、任意の他の当技術分野で知られている方法により生産することもできる。宿主動物の免疫化の経路およびスケジュールは一般に、本明細書においてさらに記載する、抗体の賦活および生産のための確立された従来の技法に沿うものである。ヒトおよびマウスの抗体の生産のための一般的な技法は、当技術分野で知られており、かつ／または本明細書に記載されている。
【００６８】
ハイブリドーマ技術により生成する抗ノッチ１抗体。
現在の開示では、ヒトを含めた、任意の哺乳動物の対象、またはそれらに由来する抗体産生細胞を操作して、ヒトを含めた、哺乳動物のハイブリドーマ細胞株の生産のための基礎として用いることができることも企図する。典型的には、宿主動物に、ある量の、本明細書に記載する免疫原を含めた、免疫原を、腹腔内に、筋肉内に、経口により、皮下に、足底内に、かつ／または皮内に接種する。
【００６９】
ハイブリドーマは、リンパ球と不死化骨髄腫細胞とから、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｂ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７の一般的な体細胞ハイブリダイゼーションの技法を使用して、またはＢｕｃｋ，Ｄ．Ｗ．ら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ、１８：３７７〜３８１（１９８２）により改変された技法に従って調製することができる。抗体の供給源として使用することができるハイブリドーマは、ノッチ１に特異的なモノクローナル抗体またはそれらの一部を産生する親ハイブリドーマの全ての派生物、子孫細胞を包含する。
【００７０】
そのような抗体を産生するハイブリドーマを、知られている手順を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは  ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて増殖することができる。モノクローナル抗体を、培地または体液から、従来の免疫グロブリン精製の手順により単離することができる。
【００７１】
宿主動物における免疫化により生成した抗ノッチ１抗体のヒト化。
現在の開示では、宿主動物における免疫化により生成する、本開示の抗ノッチ１抗体は、多くの方法で操作して、それらの生物学的活性および医薬特性を改善することができることも企図する。そのような操作の１つの方法がヒト化である。
【００７２】
抗体をヒト化する方法は、当業者によく知られている。一般に、モノクローナル抗体をヒト化するためには、４つの基本的なステップがある。これらには、（１）抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインを開始するヌクレオチドおよび予測されるアミノ酸の配列を決定するステップ、（２）ヒト化抗体を設計する、すなわち、ヒト化のプロセスの間に、どの抗体のフレームワーク領域を使用すべきかを決めるステップ、（３）実際のヒト化の方法／技法のステップ、ならびに（４）ヒト化抗体のトランスフェクションおよび発現のステップがある。
【００７３】
非ヒト免疫グロブリンに由来する抗原結合性部位を含む、いくつかの「ヒト化」抗体分子が文献に記載されており、これには、ヒト定常ドメインに融合しているげっ歯類または改変されたげっ歯類のＶ領域およびそれらに付随するＣＤＲを有するキメラ抗体；ヒト支持フレームワーク領域（ＦＲ）中にグラフトしてから、適切なヒト抗体定常ドメインと融合させたげっ歯類ＣＤＲ；ならびに組換えにより遺伝子工学的に作製したげっ歯類フレームワーク領域により支持されているげっ歯類ＣＤＲがある。そのような「ヒト化」分子を設計して、ヒトレシピエントにおいて、げっ歯類抗ヒト抗体分子の治療的適用の持続時間および有効性を制限する、それらの部分に対する望まれない免疫学的応答を最小限に留める。
【００７４】
ヒト抗ノッチ１抗体
現在の開示では、完全ヒト抗ノッチ１抗体を、特定のヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように遺伝子工学的に作製されている、市販されているマウスを使用することによって得ることができることも企図する。また、より望ましい（例えば、完全ヒト抗体）またはよりロバストな免疫応答をもたらすように設計されるトランスジェニック動物を、ヒト化抗体またはヒト抗体の生成のために使用することもできる。そのような技術の例が、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）製のＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）、ならびにＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）製のＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（登録商標）およびＴＣ  Ｍｏｕｓｅ（商標）である。
【００７５】
また、当業者に容易に明らかになるであろうが、現在の開示では、完全ヒト抗ノッチ１抗体は、ファージディスプレイ技術の一般的な方法に従って、組換えにより得ることができることも企図する。あるいは、ファージディスプレイ技術を使用して、未免疫化ドナーに由来する免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメインの遺伝子レパートリーから、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてヒトの抗体および抗体断片を生産することもできる。
【００７６】
また、遺伝子シャッフリングを使用して、げっ歯類抗体からヒト抗体を得ることもでき、ヒト抗体は、出発げっ歯類抗体に類似する親和性および特異性を有する。上記の論述は、ヒト化抗体およびヒト抗体に関するが、論じた一般的な原理は、例えば、イヌ、ネコ、霊長類、ウマおよびウシにおいて使用するための抗体を特別に作るために適用できる。本明細書に記載する、抗体をヒト化する１つまたは複数の態様を、例えば、ＣＤＲグラフト化、フレームワーク突然変異およびＣＤＲ突然変異と組み合わせることができる。
【００７７】
組換えにより作製した、遺伝子工学的に作製および改変されている抗ノッチ１抗体
一般に、所望される抗体のＤＮＡ配列を発現ベクター中に置き、続いて、宿主細胞においてトランスフェクションおよび発現を行うによって、抗体を組換えにより作製することができ、宿主細胞として、これらに限定されないが、別の場合には免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または骨髄腫細胞が挙げられる。また、他の宿主細胞、例として、トランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック乳細胞を使用してもよい。
【００７８】
また、抗体を組換えにより改変することもできる。例えば、ヒトの重鎖および軽鎖の定常領域のＤＮＡを、マウス抗体ＤＮＡの相同なマウス配列の代わりに使用することができ、または非免疫グロブリンポリペプチドをコードする配列の全部もしくは一部を、免疫グロブリンコード配列に共有結合性につなぐことができる。類似の様式で、本明細書の抗ノッチ１モノクローナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」の抗体を調製することもできる。
【００７９】
また、抗体の可変領域を、ＣＤＲグラフト化により改変することもできる。ＣＤＲ配列が、ほとんどの抗体抗原相互作用に主に関与するので、異なる特性を有する異なる抗体に由来するフレームワーク配列上にグラフトした、特定の天然に存在する抗体に由来するＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって、特定の天然に存在する抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である。
【００８０】
したがって、本開示の別の態様は、本明細書に記載するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、ならびに本明細書に記載するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体に関する。したがって、そのような抗体は、本明細書に記載するモノクローナル抗体のＶＨのＣＤＲ配列およびＶＬのＣＤＲ配列を含有するが、にもかかわらず、これらの抗体とは異なるフレームワーク配列を含有し得る。そのようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公共のＤＮＡデータベースまたは公開されている参考文献から得ることができる。
【００８１】
別のタイプの可変領域の改変は、ＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域および／またはＣＤＲ３領域内部のアミノ酸残基を突然変異させて、それにより、目的の抗体の１つまたは複数の結合特性（例えば、親和性）を改善することである。部位特異的変異誘発またはＰＣＲ媒介型変異誘発を実施して、突然変異（複数可）を導入することができ、抗体結合に対する作用または目的とする他の機能特性を、本明細書に記載するｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおけるアッセイを使用して評価することができる。典型的には、（下記に論じるような）保存的改変を導入する。突然変異は、アミノ酸の置換、付加または欠失であり得る。さらに、典型的には、ＣＤＲ領域内部の１、２、３、４または５つ以下の残基を改変する。
【００８２】
エピトープマッピング
モノクローナル抗体に結合する抗原上のエピトープを、抗原抗体相互作用のタイプに応じて、いくつかの方法によりマッピングすることができる。
【００８３】
抗体が、抗原中の連続的なアミノ酸残基からなる単一のエピトープに結合する場合、エピトープの結合は通常、抗原の立体構造変化の影響を受けず、結合性エピトープは、直鎖状エピトープと呼ばれる。直鎖状エピトープのアミノ酸配列の決定を、当技術分野でよく知られている技法を活用することによって達成することができる。抗原がそのネイティブな構造に折り畳まれることによって一緒になる、いくつかの順次に不連続なセグメントまたは隣接しない残基により構成される非直鎖状エピトープは、立体構造エピトープとして知られている。
【００８４】
立体構造エピトープのマッピングは、抗原のネイティブな立体構造における、抗体の抗原に対する相互作用に依存する。いくつかの当技術分野でよく知られている技法が、立体構造エピトープを決定するのに有用である。例えば、抗原抗体の複合体の共結晶化、Ｘ線回析および構造解析は、抗原抗体相互作用の方向を可視化する。こうした技術は、アミノ酸の変異誘発と組み合わせた場合、抗体結合性エピトープについての強力な証拠および鮮明な絵を提供することができる。エピトープ、または抗ノッチ１抗体のそれぞれが結合するエピトープのセットを、上記のマッピング方法または当技術分野で一般に知られている他の方法に従って決定することができる。
【００８５】
保存的置換
また、抗体のアミノ酸残基のうちの１つもしくは複数の保存的置換によってかまたは抗体のアミノ酸に対する、アミノ酸の１つもしくは複数の欠失もしくは付加によって、抗体を組換えにより改変することもできる。アミノ酸配列の挿入は、１つの残基から１００個以上の残基を含有するポリペプチドまでの長さの範囲に及ぶアミノ末端および／またはカルボキシル末端の融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端への挿入の例として、Ｎ末端のメチオニル残基を有する抗体またはエピトープタグに融合している抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異体には、血液循環中の抗体の半減期を増加させる、酵素またはポリペプチドの、抗体のＮ末端またはＣ末端への融合がある。
【００８６】
置換変異体では、抗体分子中の少なくとも１個のアミノ酸残基が除去され、その場所に、異なる残基が挿入される。置換変異誘発について最も大きな関心がある部位は、超可変領域を含むが、また、ＦＲの変化も企図する。
【００８７】
親和性成熟抗ノッチ１抗体
本開示は、親和性成熟の実施形態を含む。例えば、親和性成熟抗体を、当技術分野で知られている手順により生産することができる（例として、Ｍａｒｋｓら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９〜７８３；Ｂａｒｂａｓら（１９９４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ  ９１：３８０９〜３８１３；Ｓｃｈｉｅｒら（１９９５）Ｇｅｎｅ、１６９：１４７〜１５５；Ｙｅｌｔｏｎら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５５：１９９４〜２００４；Ｊａｃｋｓｏｎら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４（７）：３３１０〜９；Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２６：８８９〜８９６；および国際公開第２００４／０５８１８４号）。そのような方法を、抗体の親和性を調節するためおよびＣＤＲを特徴付けるために使用することができる。
【００８８】
抗ノッチ１抗体の翻訳後の改変
また、翻訳後の改変により、抗体を改変することもでき、それらの改変として、これらに限定されないが、当技術分野でよく知られている技法による異なる糖を用いるグリコシル化、アセチル化およびリン酸化が挙げられる。
【００８９】
翻訳後の改変の他の方法には、当技術分野で知られているカップリングの技法の使用があり、それらの技法として、これらに限定されないが、酵素的手段、酸化的置換およびキレート化が挙げられる。改変は、例えば、イムノアッセイのための標識をつなぐために使用することができる。
【００９０】
定常領域の改変を有する抗ノッチ１抗体
本開示のいくつかの実施形態では、抗体は、定常領域の改変、例として、免疫学的に不活性もしくは部分的に不活性である、例えば、補体媒介性溶解を引き起こさない、抗体依存性細胞媒介型細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を賦活しない、もしくはミクログリアを活性化させない定常領域；または以下、すなわち、補体媒介性溶解を引き起こすこと、抗体依存性細胞媒介型細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を賦活すること、もしくはミクログリアを活性化することのうちの任意の１つもしくは複数において、（未改変の抗体と比較して）活性の低下を示す定常領域を含む。定常領域の異なる改変を使用して、エフェクター機能の最適なレベルおよび／または組合せを達成することができる。例えば、Ｍｏｒｇａｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８６：３１９〜３２４（１９９５）；Ｌｕｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５７：４９６３〜９  １５７：４９６３〜４９６９（１９９６）；Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６４：４１７８〜４１８４（２０００）；Ｔａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４３：２５９５〜２６０１（１９８９）；およびＪｅｆｆｅｒｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １６３：５９〜７６（１９９８）を参照されたい。
【００９１】
いくつかの実施形態では、抗体は、以下の突然変異、すなわち、より低いヒンジ領域中のＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａを含むヒト重鎖ＩｇＧ１定常領域を含み、結果として、ＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性の実質的な低下が生じる。例えば、ＵＳ２００９０１５５２５６を参照されたい。
【００９２】
典型的には、Ｆｃ領域内部の改変を使用して、抗体の１つまたは複数の機能特性、例として、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合性および／または抗原依存性細胞傷害性を変化させることができる。さらに、本開示の抗体は、化学的に改変して（例えば、１つもしくは複数の化学的部分を抗体につなぐことができる）か、または改変し、そのグリコシル化パターンを変化させて、ここでも、抗体の１つまたは複数の機能特性を変化させることもできる。
【００９３】
本開示が企図する本明細書の抗体の別の改変はペグ化である。抗体をペグ化して、例えば、抗体の生物学的（例えば、血清）半減期を増加させることができる。抗体をペグ化するためには、典型的には、抗体またはその断片を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例として、ＰＥＧの反応性のエステルまたはアルデヒドの誘導体と、１つまたは複数のＰＥＧ基を抗体または抗体断片につなげる条件下で反応させる。典型的には、反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して、ペグ化を実施する。本明細書で使用する場合、用語「ポリエチレングリコール」は、モノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミド等の他のタンパク質を誘導体化するために使用されているＰＥＧの形態であれば、いずれも包含することを意図する。特定の場合には、ペグ化しようとする抗体は、アグリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は、当技術分野で知られており、本開示の抗体に適用することができる。
【００９４】
融合タンパク質
また、本開示は、本開示の抗体またはポリペプチドに由来する１つまたは複数の断片または領域を含む融合タンパク質も網羅する。一実施形態では、現在の開示の抗体の可変軽鎖領域の少なくとも１０個の近接するアミノ酸および／または可変重鎖領域の少なくとも１０個のアミノ酸を含む融合ポリペプチドを提供する。他の実施形態では、可変軽鎖領域の少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個もしくは少なくとも約３０個の近接するアミノ酸、および／または可変重鎖領域の少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個もしくは少なくとも約３０個の近接するアミノ酸を含む融合ポリペプチドを提供する。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、現在の開示の抗体の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、現在の開示の抗体の１つまたは複数のＣＤＲを含む。本開示の目的では、融合タンパク質は、１つまたは複数の抗体、およびそうした抗体がネイティブな分子中ではつながっていない別のアミノ酸配列、例えば、異種の配列または別の領域に由来する同属の配列を含有する。例示的な異種の配列として、これに限定されないが、「タグ」、例として、ＦＬＡＧタグまたは６Ｈｉｓタグが挙げられる。
【００９５】
融合ポリペプチドは、当技術分野で知られている方法によって、例えば、合成または組換えにより生み出すことができる。
【００９６】
二重特異性分子
本開示の抗体またはその抗原結合性部分を、誘導体化してか、別の機能性分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質（例えば、別の抗体もしくは受容体のためのリガンド）に連結させて、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を生成することができる。本開示の抗体は実際に、誘導体化してか、または２つ以上の他の機能性分子に連結させて、３つ以上の異なる結合部位および／または標的分子に結合する多重特異性分子を生成することができる。用語「二重特異性分子」は、本明細書で使用する場合、そのような多重特異性分子もまた包含することを意図する。本開示の二重特異性分子を生み出すためには、本開示の抗体を、１つまたは複数の他の結合性分子、例として、別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合性模倣物質に、（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合性に結び付けることまたは別の方法により）機能的に連結することができ、結果として、二重特異性分子が生じる。
【００９７】
単鎖抗体
本開示の抗体は、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）であり得、この場合、重鎖および軽鎖の可変領域（Ｆｖ領域）が柔軟なリンカーにより接続されて、単一のポリペプチド鎖を形成しており、このポリペプチド鎖が、抗原結合性領域を形成する。そのような単鎖抗体は、２つの可変ドメインのポリペプチド（ＶＬおよびＶＨ）をコードするＤＮＡの間にペプチドリンカーをコードするＤＮＡを融合させることによって調製することができる。結果として生じるポリペプチドは、２つの可変ドメインの間の柔軟なリンカーの長さに応じて、自らの上に再び折り畳まれて、抗原結合性の単量体を形成する場合、または多量体（例えば、二量体、三量体もしくは四量体）を形成する場合がある（Ｋｏｒｔｔら（１９９７）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：４２３；Ｋｏｒｔｔら（２００１）Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：９５〜１０８）。異なるＶＬとＶＨとを含むポリペプチドを組み合わせることによって、異なるエピトープに結合する多量体性のＳｃＦｖを形成することができる（Ｋｒｉａｎｇｋｕｍら（２００１）Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：３１〜４０）。単鎖抗体は、当技術分野で知られている種々の技法を使用して生産することができる。
【００９８】
イムノコンジュゲート
本開示の抗体は、イムノコンジュゲートまたは抗体−薬物のコンジュゲート（ＡＤＣ）であり得る。イムノコンジュゲートにより、モノクローナル抗体の結合特異性と化学療法剤の効力とが組み合わさる。
【００９９】
抗ノッチ１抗体をコードするポリヌクレオチド
また、本開示は、本開示の抗体をコードする単離ポリヌクレオチドおよびペプチド、ならびにポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞も提供する。
【０１００】
一態様では、本開示は、本開示のポリヌクレオチドのうちのいずれかを含む組成物、例として、医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、本開示の抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。他の実施形態では、組成物は、本開示の抗体またはポリペプチドのうちのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。
【０１０１】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載するポリヌクレオチドのうちのいずれかを作製する方法を提供する。
【０１０２】
また、本開示は、任意のそのような配列に相補的なポリヌクレオチドも包含する。ポリヌクレオチドは、一本鎖（コード鎖もしくはアンチセンス鎖）であってもまたは二本鎖であってもよく、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡもしくは合成ＤＮＡ）分子であってもまたはＲＮＡ分子であってもよい。ＲＮＡ分子は、イントロンを含有し、ＤＮＡ分子に一対一の様式で対応するＨｎＲＮＡ分子、およびイントロンを含有しないｍＲＮＡ分子を含む。追加のコード配列または非コード配列が、必要でない場合もあるが、本開示のポリヌクレオチド内部に存在し得、ポリヌクレオチドが、必要でない場合もあるが、他の分子および／または支持材料に連結され得る。
【０１０３】
ポリヌクレオチドは、ネイティブな配列（すなわち、抗体もしくはその一部をコードする内在性の配列）を含んでもよく、またはそのような配列の変異体を含んでもよい。ポリヌクレオチドの変異体は、コードするポリペプチドの免疫反応性を、ネイティブな免疫反応性分子と比べて減少させないように、１つまたは複数の置換、付加、欠失および／または挿入を含有する。コードするポリペプチドの免疫反応性に対する作用は一般に、本明細書の記載に従って評価することができる。変異体は、ネイティブな抗体またはその一部をコードするポリヌクレオチド配列に対して、好ましくは、少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは、少なくとも約８０％の同一性、その上より好ましくは、少なくとも約９０％の同一性、最も好ましくは、少なくとも約９５％の同一性を示す。
【０１０４】
２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列は、一致が最大となるように整列させる場合、２つの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が同じであるならば、「同一」であるといわれる。
【０１０５】
当業者であれば、遺伝暗号の縮重の結果として、本明細書に記載するポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列があることを理解するであろう。これらのポリヌクレオチドのうちのいくつかは、任意のネイティブな遺伝子のヌクレオチド配列に対して最低限の相同性を示す。にもかかわらず、コドンの使用の差に起因して変化するポリヌクレオチドは、本開示により具体的に企図される。さらに、本明細書において提供するポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子も、本開示の範囲に属する。対立遺伝子は、１つまたは複数の突然変異、例として、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換の結果として変化している内在性の遺伝子である。結果として生じたｍＲＮＡおよびタンパク質は、必要でない場合もあるが、構造または機能の変化を示し得る。対立遺伝子は、標準的な技法（例として、ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列との比較）を使用して同定することができる。
【０１０６】
本開示のポリヌクレオチドは、化学的合成、組換えの方法またはＰＣＲを使用して得ることができる。
【０１０７】
組換えの方法を使用してポリヌクレオチドを調製するためには、所望の配列を含むポリヌクレオチドを、適切なベクター内に挿入することができ、続いて、ベクターを適切な宿主細胞内に導入して、複製および増幅を行うことができる。適切なクローニングベクターは、標準的な技法に従って構築してもよく、または当技術分野で利用可能な多数のクローニングベクターから選択してもよい。選択するクローニングベクターは、使用することを意図する宿主細胞に従って変化し得るが、有用なクローニングベクターは一般に、自己複製する能力を有し、特定の制限エンドヌクレアーゼのための単一の標的を有し得、かつ／またはベクターを含有するクローンを選択する際に使用することができるマーカーのための遺伝子を担持し得る。
【０１０８】
発現ベクターは一般に、本開示に従うポリヌクレオチドを含有する複製可能なポリヌクレオチド構築物である。発現ベクターは、エピソーム、または染色体ＤＮＡに内在する部分のいずれかとして、宿主細胞中で複製可能でなければならないことが示唆される。ベクターの構成成分として一般に、これに限定されないが、以下、すなわち、シグナル配列；複製開始点；１つもしくは複数のマーカー遺伝子；適切な転写制御エレメント（例として、プロモーター、エンハンサーおよび転写終結コドン）のうちの１つまたは複数を挙げることができる。
【０１０９】
目的のポリヌクレオチドを含有するベクターを、いくつかの適切な手段のうちのいずれかにより、宿主細胞内に導入することができ、それらの手段には、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランまたは他の物質を利用するトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（例えば、ベクターが、感染性病原体、例として、ワクシニアウイルスである場合）がある。導入するベクターまたはポリヌクレオチドの選択はしばしば、宿主細胞の特徴に依存する。
【０１１０】
また、本開示は、本明細書に記載するポリヌクレオチドのうちのいずれかを含む宿主細胞も提供する。異種のＤＮＡを過剰発現することが可能である任意の宿主細胞を、目的の抗体、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を単離する目的で使用することができる。適切な非哺乳動物宿主細胞は、原核生物（例として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ））および酵母（例として、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、分裂酵母（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）；またはクリベロミセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ））を含む。好ましくは、宿主細胞は、宿主細胞中に対応する内在性の目的の抗体またはタンパク質のｃＤＮＡが存在する場合には、それよりも、約５倍高い、より好ましくは、１０倍高い、さらにより好ましくは、２０倍高いレベルでｃＤＮＡを発現する。
【０１１１】
医薬組成物
別の態様では、本開示は、組成物、例えば、本開示のモノクローナル抗体またはそれらの抗原結合性部分（複数可）の１つまたは組合せを、薬学的に許容できる担体と一緒に製剤化して含有する医薬組成物を提供する。そのような組成物は、本開示の抗体の１つもしくは組合せ（例えば、２つ以上の異なる抗体）またはイムノコンジュゲートもしくは二重特異性分子を含むことができる。例えば、本開示の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合するかまたは相補的な活性を示す抗体の組合せ（またはイムノコンジュゲートもしくは二重特異性）を含むことができる。
【０１１２】
また、本開示の医薬組成物は、組合せ療法において、すなわち、他の薬剤と組み合わせて投与することもできる。例えば、組合せ療法は、本開示の抗ノッチ１抗体を、少なくとも１つの他の抗炎症剤、抗がん剤または免疫抑制剤と組み合わせて含むことができる。組合せ療法において使用することができる治療剤の例が、下記の本開示の抗体の使用に関するセクションに、より詳細に記載されている。
【０１１３】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容できる担体」は、生理学的に適合性であるあらゆる溶媒、分散媒体、被覆、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤等を含む。典型的には、担体は、（例えば、注射または注入による）静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与または上皮投与に適している。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち、抗体、その抗原結合性部分、イムノコンジュゲートまたは二重特異性分子を、化合物を不活性化させる可能性がある酸の作用および他の天然の条件から化合物を保護するための材料中に被覆することができる。
【０１１４】
特定の実施形態では、本開示の抗体は、（双性イオンの形態を含めた）中性の形態をとってかまたは正もしくは負に荷電している種として存在し得る。場合によっては、抗体は、対イオンと複合体を形成して、薬学的に許容できる塩を形成することもできる。したがって、本開示の医薬化合物は、１つまたは複数の薬学的に許容できる塩を含むことができる。
【０１１５】
「薬学的に許容できる塩」は、親化合物（例えば、抗体）の所望の生物学的活性を保持し、望まれない毒物学的作用をもたらさない塩を指す（例えば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．ら（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１〜１９を参照されたい）。例えば、用語「薬学的に許容できる塩」は、１つまたは複数の抗体と１つまたは複数の対イオンとを含む複合体を含み、対イオンは、薬学的に許容できる無機および有機の酸および塩基から得られる。
【０１１６】
そのような塩の例は、酸付加塩および塩基付加塩を含む。酸付加塩は、無毒性の無機酸、例として、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸等、および無毒性の有機酸、例として、脂肪族のモノ−およびジカルボン酸、フェニル置換アルカノン酸、ヒドロキシアルカノン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族のスルホン酸等から得られるものを含む。塩基付加塩は、アルカリ土類金属、例として、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等、および無毒性の有機アミン、例として、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカイン等から得られるものを含む。
【０１１７】
さらに、薬学的に許容できる無機塩基は、金属イオンも含む。金属イオンとして、これに限定されないが、適切なアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩および他の生理学的に許容できる金属イオンが挙げられる。無機塩基から得られる塩は、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、コバルト、ニッケル、モリブデン、バナジウム、マンガン、クロム、セレニウム、スズ、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、第二マンガン塩、第一マンガン、カリウム、ルビジウム、ナトリウムおよび亜鉛、ならびにそれらの通常の原子価をとるものを含む。
【０１１８】
本開示の抗体の薬学的に許容できる酸付加塩は、以下の酸から調製することができ、それらの酸として、非限定的に、ギ酸、酢酸、アセトアミド安息香酸、アジピン酸、アスコルビン酸、ホウ酸、プロピオン酸、安息香酸、樟脳酸、炭酸、シクラミン酸、デヒドロコール酸、マロン酸、エデト酸、エチル硫酸、芬くぬぎ酸、メタリン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、タンニン酸、クエン酸、硝酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、葉酸、フマル酸、プロピオン酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リジン、イソクエン酸、トリフルオロ酢酸、パモ酸、プロピオン酸、アントラニル酸、メシル酸、オロト酸、シュウ酸、オキサロ酢酸、オレイン酸、ステアリン酸、サリチル酸、アミノサリチル酸、ケイ酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、ニコチン酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボニン酸、スルホン酸、メタンスルホン酸、リン酸、ホスホン酸、エタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、アンモニウム、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、ナフタレンスルホン酸、トルエンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、スルファニル酸、硫酸、硝酸、亜硝酸、硫酸モノメチルエステル、シクロヘキシルアミノスルホン酸、β−ヒドロキシ酪酸、グリシン、グルシルグリシン、グルタミン酸、カコジル酸、ジアミノヘキサン酸、カンファースルホン酸、グルコン酸、チオシアン酸、オキソグルタル酸、ピリドキサール５−リン酸、クロロフェノキシ酢酸、ウンデカン酸、Ｎ−アセチル−Ｌ−アスパラギン酸、ガラクタル酸およびガラクツロン酸が挙げられる。
【０１１９】
薬学的に許容できる有機塩基は、トリメチルアミン、ジエチルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジベンジルアミン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）、プロカイン、環状アミン、四級アンモニウムカチオン、アルギニン、ベタイン、カフェイン、クレミゾール、２−エチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタンジアミン、ブチルアミン、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、エチルグルカミン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イミダゾール、イソプロピルアミン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピリジン、ピリドキシン、ネオジウム、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、メチルアミン、タウリン、コール酸、６−アミノ−２−メチル−２−ヘプタノール、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、脂肪族のモノ−およびジカルボン酸、フェニル置換アルカノン酸、ヒドロキシアルカノン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族のスルホン酸、ストロンチウム、トリシン、ヒドラジン、フェニルシクロヘキシルアミン、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−トリス（ヒドロキシメチル）メタン、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸、１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパン、４−モルホリンプロパンスルホン酸、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸、２−［（２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル）アミノ］エタンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、４−（Ｎ−モルホリノ）ブタンスルホン酸、３−（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］アミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、２−ヒドロキシ−３−［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−１−プロパンスルホン酸、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）二水和物、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノプロパンスルホン酸、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−４−アミノブタンスルホン酸、Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸、３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸、３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸、４−（シクロヘキシルアミノ）−１−ブタンスルホン酸、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール、ならびにトロメタモールを含む。
【０１２０】
また、本開示の医薬組成物は、薬学的に許容できる抗酸化剤も含むことができる。薬学的に許容できる抗酸化剤の例として、（１）水溶性の抗酸化剤、例として、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等；（２）油溶性の抗酸化剤、例として、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロール等；および（３）金属キレート化剤、例として、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等が挙げられる。
【０１２１】
本開示の医薬組成物中で利用することができる適切な水性および非水性の担体の例として、水、エタノール、ポリオール（例として、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）およびそれらの適切な混合物、植物油、例として、オリーブ油、ならびに注射用有機エステル、例として、オレイン酸エチルが挙げられる。例えば、被覆材料、例として、レシチンの使用により、分散液の場合には、必要な粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。
【０１２２】
また、これらの組成物は、アジュバント、例として、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散化剤を含有することもできる。上記の滅菌手順、ならびに種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール  ソルビン酸等を含ませることの両方によって、微生物の存在の阻止を保証することができる。また、等張化剤、例として、糖、塩化ナトリウム等を組成物中に含めるのが望ましい場合もある。さらに、吸収を遅延させる薬剤、例として、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによって、注射用医薬剤型の吸収の延長をもたらすこともできる。
【０１２３】
薬学的に許容できる担体は、無菌の水性の溶液または分散液、および無菌の注射用の液剤または分散剤を用時調製するための無菌の粉末を含む。薬学的に活性な物質のための、そのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で知られている。従来の媒体または薬剤はいずれも、活性化合物と不和合性である場合を除き、本開示の医薬組成物中でのそれらの使用を企図する。また、補助的な活性化合物も、組成物中に組み込むことができる。
【０１２４】
治療用組成物は典型的には、製造および保存の条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物を、高い薬物濃度に適した液剤、マイクロエマルジョン、リポソームまたは他の秩序ある構造として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）、ならびにそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒体であり得る。例えば、被覆、例として、レシチンの使用により、分散剤の場合には、必要な粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖、ポリアルコール、例として、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物中に含めるのが好ましいであろう。吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアレートの塩およびゼラチンを組成物中に含めることによって、注射用組成物の吸収の延長をもたらすことができる。
【０１２５】
適切な溶媒中に、必要量の活性化合物を、必要に応じて上記に列挙した成分の１つまたは組合せと共に組み込み、続いて、滅菌精密ろ過を行うことによって、無菌注射用液剤を調製することができる。一般に、基剤としての分散媒体、および上記に列挙したものに属する必要な他の成分を含有する無菌のビヒクル中に、活性化合物を組み込むことによって、分散剤を調製する。無菌注射用液剤を調製するための無菌の散剤の場合には、調製の方法として、これらに限定されないが、任意の追加の所望の成分を足した活性成分のあらかじめ無菌ろ過した溶液から得られた、それらの成分の粉末を得る真空乾燥および凍結して乾燥すること（凍結乾燥）が挙げられる。
【０１２６】
担体材料と組み合わせて、単一の剤形を生成することができる活性成分の量は、治療される対象および特定の投与様式に応じて変化する。担体材料と組み合わせて、単一の剤形を生成することができる活性成分の量は一般に、治療効果をもたらす組成量である。一般に、薬学的に許容できる担体と組み合わせた場合、百分率として、この量は、約０．０１パーセント〜約９９パーセントの活性成分、好ましくは、約０．１パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは、約１パーセント〜約３０パーセントの活性成分の範囲に及ぶ。
【０１２７】
投与計画を調節して、最適な所望の応答（例えば、治療応答）をもたらす。例えば、単回のボーラスを投与すること、いくつかの分割用量を、長期にわたり投与すること、または用量を、治療状況の要件が示すところに従って比例的に低下もしくは増加させることができる。投与の簡便性および投与量の一様性のために、非経口組成物を投与量単位剤型として製剤化するのがとりわけ好都合である。投与量単位剤型は、本明細書で使用する場合、治療しようとする対象のための投与量の単位として適した物理的に個別の単位を指す。それぞれの単位が、必要な薬学的担体と一緒に合わさって所望の治療効果をもたらすように計算された活性化合物の所定の分量を含有する。本開示の投与単位剤型についての特定化は、（ａ）活性化合物の特有の特徴および達成しようとする特定の治療効果、ならびに（ｂ）そのような活性化合物を調剤する当技術分野に内在する、個体における感受性を取り扱うことについての制限により定まり、それらに直接依存する。
【０１２８】
抗体を投与する場合、投与量は、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ宿主体重、より一般的に、０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ宿主体重の範囲に及ぶ。例えば、投与量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。例示的な治療計画では、投与を、週１回、２週に１回、３週に１回、４週に１回、月１回、３カ月に１回または３〜６カ月に１回行う。本開示の抗ノッチ１抗体のための投与計画として、例えば、静脈内投与を介する１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重が挙げられ、抗体を、以下の投与スケジュール、すなわち、（ｉ）４週に１回、６回投与し、次いで、３カ月毎；（ｉｉ）３週毎；（ｉｉｉ）３ｍｇ／ｋｇ体重を１回、続いて、１ｍｇ／ｋｇ体重を３週毎のうちの１つを使用して投与する。
【０１２９】
いくつかの方法では、異なる結合特異性を有する２つ以上のモノクローナル抗体を、同時に投与し、この場合には、投与されるそれぞれの抗体の投与量が、指定される範囲内に収まる。抗体は通常、複数の機会を設けて投与する。各投与の間の間隔は、例えば、１週、１カ月、３カ月または１年であり得る。また、間隔は、患者中の標的抗原に対する抗体の血中レベルの測定による指標に従って変則的であってもよい。投与量を調節して、いくつかの方法では、約１〜１０００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度を達成し、いくつかの方法では、約２５〜３００μｇ／ｍｌを達成する。
【０１３０】
あるいは、抗体を、持続放出性製剤として投与することもでき、この場合には、必要な投与頻度が低下する。投与量および頻度は、患者中の抗体の半減期に応じて変化する。一般に、ヒト抗体が、最も長い半減期を示し、それに、ヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体が続く。投与量および投与頻度は、治療が、予防のためまたは治療のためのいずれであるかに応じて変化し得る。予防的適用では、比較的低い投与量を、比較的長い間隔で、長い期間にわたり投与する。患者の中には、残りの生涯にわたり治療を受け続ける者もいる。治療的適用では、時には、比較的高い投与量が、比較的短い間隔で、疾患の進行が低下するかまたは止まるまで、好ましくは、患者が、疾患の症状の部分的または完全な寛解を示すまで必要になる。その後、患者には、予防的な形態を投与し得る。
【０１３１】
患者に対して毒性を示すことなく、特定の患者に望まれる治療応答を達成するのに有効な活性成分の量、組成物および投与様式を得るように、本開示の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルを変化させることができる。選択される投与量レベルは、多様な薬物動態学的要因に依存し、それらの要因には、利用する本開示の特定の組成またはそれらのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時期、利用する特定の化合物の排泄速度、治療の持続期間、利用する特定の組成と組み合わせて使用する他の薬物、化合物および／または材料、治療する患者の年齢、性別、体重、状態、全般的な健康および以前の病歴、ならびに医学技術においてよく知られている同類の要因が含まれる。
【０１３２】
本開示の抗ノッチ抗体の「治療有効投与量」の結果、好ましくは、疾患症状の重症度の減少、疾患症状を示さない期間の頻度および持続時間の増加、または疾患に罹患していることに起因する機能的障害もしくは身体障害の阻止が得られる。例えば、ノッチ１陽性腫瘍の治療のためには、「治療有効投与量」により、細胞の増殖または腫瘍の増殖が、未治療対象と比べて、好ましくは、少なくとも約２０％、より好ましくは、少なくとも約４０％、さらにより好ましくは、少なくとも約６０％、さらにより好ましくは、少なくとも約８０％だけ阻害される。化合物の、腫瘍の増殖を阻害する能力を、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において評価することができる。あるいは、組成物のこの特性は、化合物の阻害する能力を検査することによって評価することもでき、アッセイによるｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるそのような阻害は、当業者に知られている。治療用化合物の治療有効量は、腫瘍サイズを減少させるか、または別の点で対象における症状を寛解させることができる。当業者であれば、対象のサイズ、対象の症状の重症度、および選択した特定の組成または投与経路等の要因に基づいて、そのような量を決定することができるであろう。
【０１３３】
本開示の組成物を、当技術分野で知られている多様な方法のうちの１つまたは複数を使用して、１つまたは複数の投与経路を介して投与することができる。当業者であれば理解するであろうが、投与の経路および／または様式は、所望の結果に応じて変化する。本開示の抗体のための投与経路は、例えば、注射または注入による静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口投与経路を含む。句「非経口投与」は、本明細書で使用する場合、経腸投与および外用投与以外の通常、注射による投与様式を意味し、非限定的に、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節腔内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内の注射および注入を含む。あるいは、本開示の抗体またはその抗原結合部分を、外用、上皮または粘膜の投与経路等の非経口以外の（ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）経路、例えば、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下または外用の投与経路を介して投与することもできる。
【０１３４】
インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達システムを含めた、制御放出性製剤等、化合物を急速な放出から保護する担体を用いて、活性化合物を調製することができる。生分解性、生体適合性ポリマー、例として、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を使用することができる。そのような製剤を調製するための多くの方法が、特許権を有するかまたは当業者に一般に知られている。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７８を参照されたい。
【０１３５】
本開示の使用および方法
本開示の抗体、特に、ヒト抗体、抗体組成物および方法には、ノッチ１媒介性障害の診断および治療に関与する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける診断および治療の多数の有用性がある。例えば、これらの分子を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて培養物中の細胞に投与してか、またはヒト対象には、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて投与して、多様な障害を治療、予防および診断することができる。本明細書で使用する場合、用語「対象」は、ヒトおよび非ヒト動物を含むことを意図する。非ヒト動物は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例として、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類および爬虫類を含む。好ましい対象は、ノッチ１活性が媒介する障害を有するヒト患者を含む。方法は、異常なノッチ１の発現または活性化と関連している障害を有するヒト患者を治療するのに特に適している。ノッチ１に対する抗体を、別の薬剤と一緒に投与する場合、これら２つは、いずれかの順番でかまたは同時に投与することができる。
【０１３６】
本開示の抗体がノッチ１に特異的に結合することを考慮すると、本開示の抗体は、細胞表面上のノッチ１の発現を特異的に検出するために使用することができ、さらに、ノッチ１を、免疫親和性による精製を介して精製するために使用することもできる。
【０１３７】
さらに、本開示の抗体、抗体組成物および方法は、異常なノッチ１の発現、例えば、がんを有する対象を治療するためにも使用することができる。１つの特定の実施形態では、がんは、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）である。別の特定の実施形態では、がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、乳がん、結腸がんまたは卵巣がんである。
【０１３８】
本開示の抗体により治療することができる異常なノッチ１の発現の他のタイプとして、例えば、中皮腫、肝胆道（肝臓および胆道の導管）、原発性もしくは続発性のＣＮＳ腫瘍、原発性もしく続発性の脳腫瘍、肺がん（ＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣ）、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部もしく頚部のがん、皮膚もしく眼内のメラノーマ、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、消化器（胃、結腸直腸および十二指腸）、子宮がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頚部癌、膣癌、外陰部癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、精巣がん、慢性もしく急性の白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓もしくは尿管がん、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、副腎皮質がん、胆嚢がん、多発性骨髄腫、胆管癌、線維肉腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、または前述のがんのうちの１つもしく複数の組合せが挙げられる。
【０１３９】
本開示の抗体組成物（例えば、ヒトモノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性の分子、ならびにイムノコンジュゲート）をｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて投与する適切な経路は、当技術分野でよく知られており、当業者が選択することができる。例えば、抗体組成物を、（例えば、静脈内または皮下の）注射により投与することができる。使用する分子の適切な投与量は、対象の年齢および体重、ならびに抗体組成物の濃度および／または処方に依存する。
【０１４０】
本開示のヒト抗ノッチ１抗体は、１つまたは他の複数の治療剤、例えば、細胞傷害剤、放射毒性の薬剤または免疫抑制剤と同時投与することができる。抗体を、（免疫複合体として）薬剤に連結すること、または薬剤とは別個に投与することができる。後者（別個の投与）の場合、抗体は、薬剤の前、後にかもしくは薬剤と同時に投与してもよく、または他の知られている療法、例えば、抗がん療法、例えば、放射線と同時投与してもよい。抗体および薬剤を、同時の、連続的なまたは別個の投与のために調製することができる。そのような治療剤として、とりわけ、抗悪性腫瘍剤、例として、ドセタキセル、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン  硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシルおよびシクロホスファミド  ヒドロキシ尿素が挙げられ、それらの抗悪性腫瘍剤自体は、患者にとって毒性または準毒性であるレベルにおいてのみ有効である。シスプラチンを、１００ｍｇ／用量として４週に１回静脈内投与することができ、アドリアマイシンを、６０〜７５ｍｇ／ｍｌの用量として２１日に１回静脈内投与する。本開示のヒト抗ノッチ１抗体と化学療法剤との同時投与により、ヒト腫瘍細胞に対して細胞傷害作用をもたらす異なる機構を介して作動する２つの抗がん剤が提供される。
【０１４１】
キット
また、本開示の抗体組成物（例えば、ヒト抗体、二重特異性もしくは多重特異性の分子、またはイムノコンジュゲート）、および使用のための指示を含むキットも本開示の範囲に属する。キットは、１つまたは複数の追加の試薬、例として、免疫抑制試薬、細胞傷害剤もしくは放射毒性の薬剤、または１つもしくは複数の追加の本開示の抗体（例えば、第１のヒト抗体とは明確に異なるノッチ１抗原中のエピトープに結合する相補的な活性を有するヒト抗体）をさらに含有することができる。
【０１４２】
したがって、本開示の抗体組成物を用いて治療する患者には、（本開示のヒト抗体の投与の前に、それと同時にまたはその後に）、ヒト抗体の治療効果を増強するかまたは増大させる別の治療剤、例として、細胞傷害性または放射毒性の薬剤もさらに投与することができる。
【０１４３】
本開示を、以下の実施例によりさらに例証するが、これらの実施例は、本開示をさらに限定すると解釈してはならない。全ての図ならびに本出願全体を通して引用する全ての参考文献、特許および公開されている特許出願の内容が、参照により本明細書に明確に組み込まれている。
【実施例】
【０１４４】
（実施例１）
組換えのヒトおよびマウスのノッチ１タンパク質免疫原の生成
Ａ．ヒトおよびマウスのノッチ１ＮＲＲタンパク質の発現および精製
Ｎ末端にシグナルペプチドを、Ｃ末端にＡｖｉおよびＨｉｓ６からなるタグを有する、表１に示すノッチ１ＮＲＲ領域、すなわち、ヒトノッチ１についての配列番号２のアミノ酸、およびマウスノッチ１についての配列番号６のアミノ酸をコードするｃＤＮＡ構築物を、発現ベクターｐＳＭＥＤ２中にクローニングした。これらの構築物を、ＣＯＳ細胞またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中に一過性にトランスフェクトし、馴化培地中の分泌タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析した。Ｓ１切断部位におけるプロセシングの後に、ノッチ１ＮＲＲドメインのＮ末端側の約２６キロダルトン（ＬＮＲ−Ａ、Ｂ、ＣおよびＨＤ１）の半分とＣ末端側の約１２キロダルトン（ＨＤ２およびＡｖｉ＿Ｈｉｓタグ）の半分とが、非共有結合性相互作用を通して結び付いた状態を維持して、図１に示すヘテロ二量体複合体を形成する。ノッチ１ＮＲＲのＳ１プロセシングは、ＣＨＯ細胞から調製した試料中では約５０％以下であることを決定した。
【０１４５】
Ｓ１切断部位におけるプロセシングを増強するために、ノッチ１ＮＲＲ発現構築物を、ＣＨＯ−ＰＡＣＥ細胞中にトランスフェクトし（Ｈａｒｒｉｓｏｎら、Ｓｅｍｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ．１９９８  Ａｐｒ；３５（２  Ｓｕｐｐｌ  ２）：４〜１０）、ノッチ１ＮＲＲの最も高い発現および完全なプロセシングを示す安定な細胞株を選択した。これらの細胞株の培養を拡大して、馴化培地（ＣＭ）の収集を行い、そこから、ノッチ１ＮＲＲタンパク質を精製した。
【０１４６】
濃縮したＣＨＯ−ＰＡＣＥのＣＭを、ＰＢＳを用いて平衡化した２７ｍｌのＱｉａｇｅｎ  Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラム上に、１ｍｌ／分の流速、４℃で充填した。充填の後、１０カラム体積（ＣＶ）のＰＢＳ、続いて、１０ＣＶの緩衝液Ａ（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ８．０）、続いて、１０ＣＶの４％緩衝液Ｂ（５００ｍＭイミダゾール、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ８．０）を用いて、カラムを洗浄した。ヒトノッチ１Ａｖｉ＿Ｈｉｓを、１０ＣＶ上の１００％緩衝液Ｂに対する直線勾配を使用して溶出した。ヒトノッチ１Ａｖｉ＿Ｈｉｓを含有する画分をプールし、ろ過し、カルシウム、マグネシウムを含有しない（ＣＭＦ）ＰＢＳに対して透析した。ＴＢＳ＋１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ２を用いて平衡化した、縦に並べたＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００カラムおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ−７５カラム（総ＣＶ＝６００ｍｌ）上における２回の分子ふるいクロマトグラフィーを用いて、タンパク質をさらに精製した。精製したヒトおよびマウスのノッチ１ＮＲＲ＿Ａｖｉ＿Ｈｉｓタグタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、精製タンパク質の＞９０％が予測されるノッチ１ＮＲＲのＮ末端およびＣ末端のペプチドのサイズに正しく切断されたことを示している。精製したヒトおよびマウスのノッチ１ＮＲＲタンパク質の光散乱（ＳＥＣ−ＭＡＬ）解析は、ネイティブな条件下で、分子ふるいカラム上に４０キロダルトンの予想される分子量におけるピークを示し、このことは、未変化のノッチ１ＮＲＲヘテロ二量体の適切な形成を示している。
【０１４７】
Ｂ．ｃｙｎｏ−ノッチ１ＮＲＲ−Ｆｃの融合タンパク質の発現および精製
Ｎ末端にシグナルペプチド、Ｃ末端にヒトＩｇＧ１のＦｃ断片を有する、表１に示すｃｙｎｏノッチ１ＮＲＲ領域、すなわち、ｃｙｎｏノッチ１についての配列番号１０のアミノ酸をコードするｃＤＮＡ構築物を、発現ベクターｐＳＭＥＤ２中にクローニングした。この構築物を、２９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）細胞中に、可溶性ＰＡＣＥ過剰発現構築物と共に一過性にコトランスフェクトして（Ｈａｒｒｉｓｏｎら、Ｓｅｍｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ．１９９８  Ａｐｒ；３５（２  Ｓｕｐｐｌ  ２）：４〜１０）、ｃｙｎｏ−ノッチ１ＮＲＲ領域の完全なプロセシングを確保した。馴化培地を、トランスフェクトした細胞から収集し、ｃｙｎｏ−ノッチ１ＮＲＲ−Ｆｃの融合タンパク質を、プロテインＡ親和性による精製を介して精製した。次いで、精製タンパク質を、１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有するＴＢＳ中に透析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、２つのポリペプチド断片を、１２キロダルトン（ＨＤ１）および３７キロダルトン（ＨＤ２＋Ｆｃ）の予想されるサイズにおいて示し、タンパク質は、＞９５％の純度で調製された。ネイティブな条件下におけるＳＥＣによる解析は、上記に記載した２つの断片のヘテロ二量体を示す、およそ５０キロダルトンの単一ピークを示し、調製物中の凝集体は最低限の量（＜１％）であった。
【０１４８】
下記の表１は、ヒト、マウスおよびｃｙｎｏのノッチ１ＮＲＲ領域のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
【０１４９】
【表１−１】
0006016800.tif 000002
【０１５０】
【表１−２】
0006016800.tif 000003
【０１５１】
【表１−３】
0006016800.tif 000004
【０１５２】
【表１−４】
0006016800.tif 000005
【０１５３】
【表１−５】
0006016800.tif 000006
【０１５４】
【表１−６】
0006016800.tif 000007
【０１５５】
（実施例２）
ラット抗ノッチ１阻害性抗体の生成、クローニングおよびヒト化
Ａ．免疫化およびハイブリドーマ生成
実施例１に記載したヒトおよびマウスの免疫原をＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット中に同時注射して、ハイブリドーマの生成を行った。フロイントの完全アジュバント中に、ヒトおよびマウスのノッチ１ＮＲＲ＿Ａｖｉ＿Ｈｉｓ組換えタンパク質をそれぞれ２０μｇ含有する混合物の皮下注射により、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを免疫化した。免疫化を、２週間隔で１２週間繰り返した。第１の注射後の第０、３５、４９および６３日に収集した血清試料を、下記の記載に従って、循環している抗ノッチ１抗体の力価の活性について、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により試験した。
【０１５６】
最適力価に達したら、タンパク質混合物の最終用量を、最適抗体価を有するラット中に静脈（尾静脈）内注射し、４日後に、ラットを屠殺して、脾細胞の収集を行った。ラットから得られた全ての脾細胞（２×１０Ｅ０８個）を、ＰＥＧ４０００を使用して、マウス骨髄腫細胞株Ｐ３Ｘ６３．Ａｇ８．６５３（２．５×１０Ｅ０７個）と融合させた。融合させた細胞を、９６ウエルプレート中に蒔き（０．２ｍｌ／ウエル）、ＨＡＴ選択を行った（５×１０Ｅ−０４Ｍヒポキサンチン、１．６×１０Ｅ−０５Ｍチミジン、４×１０Ｅ−０４Ｍアミノプテリンおよび２０％熱不活性化ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０）。
【０１５７】
融合後の第１４日に、ハイブリドーマ上清を収集し、下記の記載に従って、ＥＬＩＳＡにより、ヒトおよび／またはマウスのノッチ１ＮＲＲ組換えタンパク質、ならびにＵ−２ＯＳ細胞表面上に発現させた完全長ノッチ１に対する結合活性を示すラットＩｇＧの存在について試験した。ノッチ１標的に対して結合活性を示した上清を、下記の記載に従って、レポーター遺伝子アッセイにおいて、ノッチ１媒介性シグナル伝達活性を遮断するそれらの能力についてさらに試験した。次いで、選択したノッチ１シグナル伝達を遮断するクローンをサブクローニングして、さらに分析した。
【０１５８】
Ｂ．ノッチ１特異的抗体のスクリーニングおよび選択
１．組換えタンパク質結合ＥＬＩＳＡ
ハイブリドーマ培養物から得られた上清を、組換えのヒトおよびマウスの免疫原に対する結合について、ＥＬＩＳＡにより最初にスクリーニングした。精製したヒトまたはマウスのノッチ１ＮＲＲ＿Ａｖｉ＿Ｈｉｓタグタンパク質を、１μｇ／ｍｌの濃度のＭｇ／Ｃａを有する１００μｌのＰＢＳ中で、ＣｏＳｔａｒ高結合性９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレート上に一晩コートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｍｇ／Ｃａを用いて洗浄し、ＰＢＳ−Ｍｇ／Ｃａ中で１％ＢＳＡを用いて１時間ブロックした。ブロック用溶液をプレートからデカンテーションし、ハイブリドーマ培養物上清をプレートに適用した。室温で１時間インキュベーションを行った後、プレートを、ＰＢＳ−Ｍｇ／Ｃａを用いて再び洗浄してから、ブロック用緩衝液中で（１：２０，０００に）希釈したＨＲＰコンジュゲート二次抗体を適用した。試験する一次抗体がラットＩｇＧである場合には、二次抗体はヤギ抗ラットＩｇＧ  Ｆｃ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）であり、一次抗体がマウスＩｇＧである場合には、二次抗体はヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ（Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）であった。
【０１５９】
二次抗体との１時間のインキュベーションの後、プレートを上記の記載に従って再び洗浄し、ＴＭＢ基質溶液を添加した。反応を１０分間発生させてから、停止用溶液０．１８Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加した。Ｏ．Ｄ．４５０ｎＭにおける吸光度を測定し、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥｘｃｅｌおよびＧｒａｐｈｐａｄ−Ｐｒｉｚｍソフトウエアを用いて、データをプロットし、解析した。ヒトおよび／またはマウスのノッチ１ＮＲＲに対して結合活性を示す抗体を選択して、下記の記載に従って、細胞ベースＥＬＩＳＡをさらに行った。
【０１６０】
２．細胞ベースＥＬＩＳＡ
次いで、上記に記載した組換えノッチ１ＮＲＲに基づいたＥＬＩＳＡにおいて免疫原に対する陽性の結合を提示したクローンから得られた上清を、細胞ベースＥＬＩＳＡにおいて、細胞表面のノッチ１に対する結合についてスクリーニングした。細胞表面上にヒトまたはマウスの完全長ノッチ１タンパク質を安定に過剰発現するＵ−２ＯＳ細胞を、ＥＬＩＳＡアッセイの前日に、９６ウエルプレート（白色不透明、ＢＤ／ＶＷＲ）中に５０，０００細胞／ウエルで蒔いた。ＥＬＩＳＡの当日に、培地をウエルから除去し、（ブロック用緩衝液中で１：３に）段階希釈した抗体溶液またはハイブリドーマ培養物上清をプレートに適用した。プレートを、室温で２時間インキュベートしてから、ＰＢＳ−Ｍｇ／Ｃａを用いて洗浄した。次いで、ＨＲＰコンジュゲート二次抗体を適用し、上記の記載に従って細胞と共に１時間インキュベートして、組換えタンパク質のＥＬＩＳＡを行った。プレートを、ＰＢＳ−Ｍｇ／Ｃａを用いて洗浄してから、Ｐｉｃｏ−Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ発光キット（Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて発光させ、化学発光の測定を、製造元の指示に従って実施した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥｘｃｅｌおよびＧｒａｐｈｐａｄ−Ｐｒｉｚｍソフトウエアを用いて、データのプロットおよび解析を実施した。下記の実施例の記載に従って、ハイブリドーマクローンのスクリーニング、ならびに親ラット抗体およびヒト化抗体の特徴付けにおいて、このデータを使用した。
【０１６１】
３．レポーター遺伝子アッセイ
次いで、免疫原に対する陽性の結合を提示したクローンから得られた上清を、ヒトおよびマウスのノッチ１のレポーター遺伝子同時培養アッセイ（ＲＧＡ）において、中和活性についてスクリーニングした。スクリーニングの結果を使用して、初代クローンを選択した。
【０１６２】
ヒトノッチ１のレポーター細胞を、トリプシン処理し、培養プレートからマッコイ５Ａ完全培地（１０％ＦＢＳおよびペニシリン、ストレプトマイシンを有するマッコイ５Ａ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に収集し、計数した。同じ培地を用いて、細胞の適切な希釈度を得て、９６ウエル培養プレート（白色不透明、ＢＤ／ＶＷＲ）上で、８０μｌの総体積／ウエル中に、（マッコイ５Ａ完全培地中で１：３に）段階希釈した抗体溶液またはハイブリドーマ培養物上清の存在下において、３，０００細胞／ウエルを整えた。細胞と抗体の希釈物との混合物を、細胞培養用インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中、プレート上で１時間インキュベートしてから、１５，０００個／ウエルのヒトＤＬＬ４−ＨＥＫ２９３細胞を、各ウエルに添加した。ｈＨＤＬＬ４−ＨＥＫ２９３細胞の添加後、プレートを、インキュベーター中でさらに２０時間インキュベートし、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、製造元の指示に従って、ホタルルシフェラーゼ活性および内部対照ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ活性を測定した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥｘｃｅｌおよびＧｒａｐｈｐａｄ−Ｐｒｉｓｍソフトウエアを使用して、データをプロットし、解析した。マウスノッチ１のレポーター遺伝子同時培養アッセイを、ヒトノッチ１のレポーター遺伝子同時培養アッセイについての記載に従って実施したが、ただし、２０，０００細胞／ウエルのマウスノッチ１のレポーター細胞を、４０，０００細胞／ウエルのマウスＤＬＬ４−ＨＥＫ２９３細胞と同時培養した。
【０１６３】
Ｃ．クローニングおよび配列決定
細胞表面結合性または中和活性が確認された初代クローンをサブクローニングし、例として、下記にさらに記載するクローン４３８および３５１を得た。下記の記載に従って、サブクローンに由来するＲＮＡを抽出し、発現した抗体に由来する可変領域ＤＮＡ配列を、ＲＴ−ＰＣＲクローニングを介して得た。
【０１６４】
１〜５×１０６個のサブクローニングしたハイブリドーマ細胞をホモジナイズし、ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮＡｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキットを用いて、全ＲＮＡを単離した。次いで、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、第１の鎖のｃＤＮＡを生産した。続いて、抗ノッチ１ＩｇＧの可変領域についての二本鎖ｃＤＮＡを生成し、下記の記載に従って、ＰＣＲにより、ラットのＩｇＧ重鎖（ＩｇＧ１、２ａ、２ｂ）および軽鎖（カッパまたはラムダ）の定常領域に由来するプライマーを使用して増幅した。ＰＣＲサイクリングの条件：９５℃、１分間を１サイクル；９５℃、１分間、６３℃、１分間および７２℃、１分間を２５サイクル。結果として生じたＲＴ−ＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ−Ｂｌｕｎｔクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、従来法により配列決定する。
【０１６５】
親ラット４３８および親ラット３５１（以下それぞれ、「ラット４３８」および「ラット３５１」）に由来する可変（Ｖ）領域ｃＤＮＡを、哺乳動物発現ベクター中にサブクローニングし、ラット可変重鎖（ＶＨ）を、マウスＩｇＧ１（ｍＩｇＧ１）を有するフレーム中に融合させ、ラット可変軽鎖（ＶＬ）を、マウスカッパと融合させた。同様に、ラットＶ領域とヒトＩｇＧ定常領域とを有するキメラ抗体を生成するために、ラットＶＨを、ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）を有するフレーム中に、ＶＬをヒトカッパと、それぞれ融合させた。対応するキメラ抗体を、ＣＯＳ細胞中で、これらの構築物から一過性のトランスフェクションにより生成し、それらの結合性および中和活性を、アッセイにおいて確認した。
【０１６６】
下記の実施例の記載に従って、精製したラット可変−マウス定常のキメラ抗体（以下、「ラット４３８−ｍＩｇＧ１」および「ラット３５１−ｍＩｇＧ１」）を、組換え抗原と細胞表面標的との結合のアッセイ、ＲＧＡにおけるノッチ１活性阻害アッセイおよび血管形成アッセイ、ならびにマウスモデルにおける腫瘍増殖阻害を含めた、一連のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおけるアッセイにおいてさらに特徴付けた。リード抗体であるラット４３８およびラット３５１は、これらの研究に基づいて選択された。表２は、ラット４３８およびラット３５１の可変領域、ならびに追加のクローン９０、１３２、１３２（Ａ１２／Ｇ１１）および１３７の種々の領域のアミノ酸および核酸の配列を列挙する。
【０１６７】
【表２−１】
0006016800.tif 000008
【０１６８】
【表２−２】
0006016800.tif 000009
【０１６９】
【表２−３】
0006016800.tif 000010
【０１７０】
【表２−４】
0006016800.tif 000011
【０１７１】
【表２−５】
0006016800.tif 000012
【０１７２】
【表２−６】
0006016800.tif 000013
【０１７３】
Ｄ．ラット４３８およびラット３５１のヒト化
ラット４３８およびラット３５１をヒト化し、さらに開発を進めて、ヒト化モノクローナル抗体４３８および３５１（以下それぞれ、「ヒト化４３８」および「ヒト化３５１」）を得た。より低いヒンジ領域中にｈＩｇＧ１のエフェクター機能を不活性化させる３つの突然変異（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ）を有するヒトＩｇＧ１重鎖定常領域、およびヒトカッパ軽鎖定常領域を、ヒト化４３８抗体およびヒト化３５１抗体のための定常領域として使用した。ラット４３８およびラット３５１の可変領域のヒト化を、ＣＤＲグラフト戦略を使用して実施した。
【０１７４】
表３は、ヒト化４３８変異体およびヒト化３５１変異体の種々の領域のアミノ酸および核酸の配列を示す。試験後に、リードヒト化４３８変異体は、ＶＨ１．１／ＶＬ１．８であることが決定された。ヒト化４３８ＶＨ１．１／ＶＬ１．８は、配列番号７１に記載する可変重鎖および配列番号９７に記載する可変軽鎖を有する。ヒト化４３８変異体の場合、変異体ＶＨ１．０および１．１についてのＣＤＲ領域が同じであり、変異体ＶＬ１．０、１．１、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、１．１０および１．１１についてのＣＤＲ領域が同じである。試験後に、リードヒト化３５１変異体は、ＶＨ１．０／ＶＬ１．１であることが決定された。ヒト化３５１ＶＨ１．０／ＶＬ１．１は、配列番号１１５に記載する可変重鎖および配列番号１２９に記載する可変軽鎖を有する。ヒト化３５１変異体の場合、変異体ＶＬ１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６および１．７についてのＣＤＲ領域が同じである。
【０１７５】
【表３−１】
0006016800.tif 000014
【０１７６】
【表３−２】
0006016800.tif 000015
【０１７７】
【表３−３】
0006016800.tif 000016
【０１７８】
【表３−４】
0006016800.tif 000017
【０１７９】
【表３−５】
0006016800.tif 000018
【０１８０】
【表３−６】
0006016800.tif 000019
【０１８１】
【表３−７】
0006016800.tif 000020
【０１８２】
【表３−８】
0006016800.tif 000021
【０１８３】
【表３−９】
0006016800.tif 000022
【０１８４】
【表３−１０】
0006016800.tif 000023
【０１８５】
【表３−１１】
0006016800.tif 000024
【０１８６】
関連のＣＤＲドナー配列を有する、ヒトアクセプターフレームワークである重鎖についてのＤＰ５４および軽鎖についてのＤＰＫ９を含有するｃＤＮＡが、ＧｅｎｅＡｒｔ，ＡＧにより合成された。合成されたｃＤＮＡ産物を、サブクローニングし、哺乳動物発現ベクターのｐＳＭＥＤ２およびｐＳＭＮ２中でそれぞれ、重鎖についてはヒトＩｇＧ１−３ｍ定常領域と、または軽鎖についてはヒトカッパと、インフレームで融合させた。ヒトアクセプターフレームワーク、ラット４３８およびヒト化４３８変異体、ならびにラット３５１およびヒト化３５１変異体のＶＨならびにＶＬのアラインメントを、下記の表４に示す。ＫａｂａｔスキームのＣＤＲに、下線を付す。３５１ＶＨおよび３５１ＶＬについては、フレームワーク領域中の小文字のテキストにより、ラット３５１とヒト化３５１変異体との間の残基の差を示す。
【０１８７】
ヒトアクセプターフレームワークとラット４３８可変領域フレームワークとの間には顕著な、すなわち、ＶＨについては７８％およびＶＬについては６１％の相同性がある。また、ヒトアクセプターフレームワークとラット３５１可変領域との間にも顕著な、すなわち、ＶＨについては７６％およびＶＬについては６１％の相同性がある。
【０１８８】
【表４−１】
0006016800.tif 000025
【０１８９】
【表４−２】
0006016800.tif 000026
【０１９０】
ヒト化の間に、ＣＤＲグラフト化抗体から、元々の抗体の活性の喪失が生じる可能性がある。フレームワーク領域の差が、結果として生じたヒト化４３８抗体およびヒト化３５１抗体の立体構造の変化の原因となり得、元々の抗体のフレームワークに対して、ヒトアクセプターフレームワーク中の復帰突然変異を選択して、導入して、活性および結合性エピトープを回復させた。表５は、活性および結合性エピトープを最適化するために選択した、ラット４３８およびラット３５１の残基に対する、対応する位置におけるヒトアクセプターフレームワーク中の復帰突然変異を示す。
【０１９１】
【表５】
0006016800.tif 000027
【０１９２】
（実施例３）
抗ノッチ１阻害性抗体の特徴付け
Ａ．発現、およびノッチ１に対する結合
ヒト化４３８変異体およびヒト化３５１変異体の相対的な発現収率を、ＣＯＳ細胞中の一過性の発現アッセイにおいて試験した。表６に示すように、ヒト化４３８ＶＨ１．１／ＶＬ１．８を含めた、いくつかのヒト化４３８変異体、およびヒト化３５１ＶＨ１．０／ＶＬ１．１を含めた、いくつかのヒト化３５１変異体が、顕著な収率を示した。
【０１９３】
【表６】
0006016800.tif 000028
【０１９４】
馴化培地中のＩｇＧの総合的な発現レベルを、実施例２の記載に従って、定量的なＩｇＧのＥＬＩＳＡにより測定した。表７は、ヒト化４３８変異体およびラット４３８、ならびにヒト化３５１変異体およびラット３５１について、細胞表面のノッチ１に対する結合ＥＬＩＳＡから計算したＥＣ５０（ｎＭ）値を示す。
【０１９５】
データから、ヒト化４３８ＶＨ１．１／ＶＬ１．８を含めた、ヒト化４３８の複数の変異体が、Ｕ−２ＯＳ細胞の細胞表面上に発現する完全長ヒトノッチ１に対する結合において、ラット４３８に類似することが実証されている。さらに、表７は、ヒト化４３８のＶＨ１．１／ＶＬ１．８およびＶＨ１．１／ＶＬ１．３の両方が、Ｕ−２ＯＳ細胞の細胞表面上に発現するマウスノッチ１に対するラット４３８の交差反応性を完全に保持したことも示す。
【０１９６】
データから、ヒト化３５１のＶＨ１．０／ＶＬ１．１およびＶＨ１．１／ＶＬ１．４が、Ｕ−２ＯＳ細胞の細胞表面上に発現する完全長ヒトノッチ１に対する結合において、ラット３５１に類似することがさらに実証されている。さらに、表７は、ヒト化３５１のＶＨ１．０／ＶＬ１．１およびＶＨ１．１／ＶＬ１．４が、Ｕ−２ＯＳ細胞の細胞表面上に発現するマウスノッチ１に対するラット３５１の交差反応性を完全に保持したことも示す。
【０１９７】
【表７】
0006016800.tif 000029
【０１９８】
Ｂ．競合ＥＬＩＳＡ
組換えのヒトノッチ１または細胞表面に発現する完全長ヒトノッチ１に対する、ヒト化４３８変異体とビオチン化ラット４３８との間、およびヒト化３５１変異体とビオチン化ラット３５１との間の競合ＥＬＩＳＡを実施した。組換えタンパク質または細胞ベースＥＬＩＳＡについての記載に従って、類似する様式で、９６ウエル細胞培養プレートに、ノッチ１ＮＲＲ−Ａｖｉ＿Ｈｉｓタンパク質をコートする（高結合性ｃｏ−Ｓｔａｒプレート）かまたは完全長ノッチ１を発現するＵ−２ＯＳ細胞を播種する（細胞培養プレート、Ｃｏ−ｓｔａｒ）のそれぞれのいずれかを行った。（ブロック用緩衝液中で１：３に）段階希釈した抗体溶液または細胞培養の馴化培地を、０．８ｎＭのビオチン化ラット４３８抗体またはビオチン化ラット３５１抗体の存在下において、プレートに適用した。
【０１９９】
２時間のインキュベーションの後、プレートを、上記の記載に従って洗浄し、ブロック用緩衝液中で１：５０００に希釈したＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を適用した。ストレプトアビジンを伴うインキュベーションを３０分間行ってから、プレートを再び洗浄し、ＴＭＢ溶液を加えて１０分間発色させた。発色反応を、０．１８Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加することによって停止し、４５０ｎＭにおける吸光度を測定した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥｘｃｅｌおよびＧｒａｐｈｐａｄ−Ｐｒｉｚｍソフトウエアを用いて、データのプロットおよび解析を実施した。
【０２００】
表８は、組換えヒトノッチ１ＮＲＲ免疫原に対する結合についての、ヒト化４３８変異体とビオチン化ラット４３８抗体との競合ＥＬＩＳＡのＥＣ５０（ｎＭ）値を示す。データから、ヒト化４３８ＶＨ１．１／ＶＬ１．８を含めた、ヒト化４３８の複数の変異体は、競合ＥＬＩＳＡにおいて、未標識のラット４３８に類似するＥＣ５０値を示したことが示されている。このことは、ヒト化４３８変異体が、未標識のラット４３８と同じ程度に良好に、ノッチ１ＮＲＲ免疫原に対する結合について、ビオチン化ラット４３８と競合することを実証している。これらの結果から、ヒト化４３８変異体は、ラット４３８抗体と同じであるかまたはラット４３８抗体に類似する、免疫原上のエピトープに結合することが示されている。
【０２０１】
表８は、Ｕ−２ＯＳ細胞の細胞表面上に発現する完全長ヒトノッチ１に対する結合についての、ヒト化４３８変異体とビオチン化ラット４３８抗体との競合ＥＬＩＳＡのＥＣ５０（ｎＭ）値をさらに示す。データから、ヒト化４３８ＶＨ１．１／ＶＬ１．８を含めた、ヒト化４３８の複数の変異体は、競合ＥＬＩＳＡにおいて、未標識のラット４３８に類似するＥＣ５０値を示したことが示されている。このことは、ヒト化４３８変異体が、未標識のラット４３８と同じ程度に良好に、Ｕ−２ＯＳ細胞の細胞表面上に発現する完全長ヒトノッチ１に対する結合について、ビオチン化ラット４３８と競合することを実証している。これらの結果から、ヒト化４３８変異体は、ラット４３８抗体と同じであるかまたはラット４３８抗体に類似する、Ｕ−２ＯＳ細胞の細胞表面上に発現する完全長ヒトノッチ１上のエピトープに結合することが示されている。
【０２０２】
【表８】
0006016800.tif 000030
【０２０３】
表９は、Ｕ−２ＯＳ細胞の細胞表面上に発現する完全長ヒトノッチ１に対する結合についての、ヒト化３５１変異体とビオチン化ラット３５１抗体との競合ＥＬＩＳＡのＥＣ５０（ｎＭ）値を示す。データから、ヒト化３５１ＶＨ１．０／ＶＬ１．１を含めた、ヒト化３５１の複数の変異体は、競合ＥＬＩＳＡにおいて、未標識のラット３５１に類似するＥＣ５０値を示したことが示されている。このことは、ヒト化３５１変異体が、未標識のラット３５１と同じ程度に良好に、細胞表面上に発現する完全長ヒトノッチ１に対する結合について、ビオチン化ラット３５１と競合することを実証している。これらの結果から、ヒト化３５１変異体は、ラット３５１抗体と同じであるかまたはラット３５１抗体に類似する、Ｕ−２ＯＳ細胞の細胞表面上に発現する完全長ヒトノッチ１上のエピトープに結合することが示されている。
【０２０４】
【表９】
0006016800.tif 000031
【０２０５】
Ｃ．他のヒトノッチ相同体に対する結合の特異性
ノッチ受容体ファミリーの他のメンバーが、生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たす。例えば、マウスモデルにおいて、ノッチ２が欠損すると、胎性致死が生じる。対照的に、マウスモデルにおいては、ノッチ３が欠損しても、遠位動脈における軽度の表現型が生じるに過ぎず、ノッチ４が欠損しても、検出可能な表現型は生じない。ノッチ１ＮＲＲ領域の最も近い相同体は、ノッチ２およびノッチ３であり（約５０％の相同性）、ノッチ４は、関係のより薄い相同体である（３４％の相同性）。抗ノッチ１抗体の、ノッチファミリーの他のメンバー、とりわけ、ノッチ２に対する交差反応性が、患者において望まれない作用をもたらす可能性がある。したがって、ラット４３８抗体およびヒト化４３８抗体、ならびにラット３５１抗体およびヒト化３５１抗体の、他のノッチファミリーメンバーに対する潜在的な交差反応性を評価した。
【０２０６】
ヒトＩｇＧ１のＦｃ断片と融合させたヒトノッチ２およびノッチ３のＮＲＲ領域をコードする発現構築物を、ＣＨＯ−ＰＡＣＥ細胞中に安定に導入した。ＮＲＲ−Ｆｃの融合体を発現するこれらの細胞から得られた馴化培地を収集した。ヒトノッチ２ＮＲＲ−Ｆｃならびにヒトおよびマウスのノッチ３ＮＲＲ−Ｆｃを、プロテインＡ親和性により精製し、続いて、分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ）を行った。精製した調製物を、１ｍＭ  ＣａＣｌ２を有するＴＢＳ中に透析し、ＳＥＣにより解析して分析すると、＞９９％の純度を得た。
【０２０７】
表１０に示すように、ラット４３８は、ヒトノッチ２ＮＲＲ−Ｆｃの融合タンパク質に対する検出可能な結合を欠いた。さらに表１０に示すように、ヒト化４３８変異体は、Ｕ−２ＯＳ細胞表面上に発現する完全長ヒトノッチ３に対する検出可能な結合を欠き、このことは、４３８は、ノッチ３と交差反応しなかったことを示している。
【０２０８】
【表１０】
0006016800.tif 000032
【０２０９】
表１１に示すように、ヒト化３５１ＶＨ１．０／ＶＬ１．１は、ヒトノッチ２ＮＲＲ−Ｆｃの融合タンパク質ならびにヒトおよびマウスの両方のノッチ３ＮＲＲ−Ｆｃの融合タンパク質に対する検出可能な結合を欠いた。しかし、ヒト化３５１ＶＨ１．０／ＶＬ１．１は、ヒト、マウスおよびｃｙｎｏ−のノッチ１ＮＲＲと交差反応した。
【０２１０】
【表１１】
0006016800.tif 000033
【０２１１】
Ｄ．ヒトノッチ１ＮＲＲに対する結合親和性
抗ノッチ１ＮＲＲの相互作用の反応速度定数を、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）により決定した。ＣＭ５チップのフローセルに、１０ｍＭグリシン、ｐＨ５．０中で、およそ１０，０００レゾナンスユニット（ＲＵ）の抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標））を１０μｌ／分で６００秒間固定化した。１ｍＭ  ＣａＣｌ２を有するＴＢＳ中で希釈した抗ノッチ１ヒト化４３８変異体および抗ノッチ１ヒト化３５１変異体１０μｇ／ｍｌを、１０μｌ／分で捕捉した。１００μｌ／分において、ヒトノッチ１ＮＲＲ＿Ａｖｉ＿Ｈｉｓ組換えタンパク質の４つの濃度（３．７〜１００ｎＭ）およびゼロ濃度（試験用緩衝液）の結合を、１ｍＭ  ＣａＣｌ２を有するＴＢＳ中で３分間記録した。複合体の解離を、１０分間測定した。チップの表面を、３ｍＭ  ＥＧＴＡを有する３Ｍ  ＭｇＣｌ２を１０μｌ／分で６０間注入することによって再生した。参照シグナルおよび緩衝液のシグナルを減じた後に得られた曲線を、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００評価ソフトウエア（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標））を用いて、１：１のラングミュア結合モデルに適合させた。
【０２１２】
選択したヒト化４３８変異体およびヒト化３５１変異体、ならびにＡ２抗体（Ｗｕ，Ｙ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４６４：１０５２〜１０５７、２０１０）の、ヒトノッチ１ＮＲＲタンパク質に対する結合親和性を決定し、表１２に示した。Ｂｉａｃｏｒｅによる動態解析は、選択したヒト化４３８変異体について、ＶＨ１．１／ＶＬ１．８およびＶＨ１．１／ＶＬ１．３を含めて、Ａ２抗体と比較して、類似するｋａ（オン）速度およびｋｄ（オフ）速度を示した。
【０２１３】
さらに、Ｂｉａｃｏｒｅによる動態解析は、ラット３５１および選択したヒト化３５１変異体について、ＶＨ１．０／ＶＬ１．１およびＶＨ１．１／ＶＬ１．４を含めて、Ａ２抗体と比較して、より高いｋａ（オン）速度およびｋｄ（オフ）速度を示した。ラット３５１および選択したヒト化３５１変異体について得られたＫＤ値は類似するが、ｋａ（オン）速度およびｋｄ（オフ）速度に示されるこれらの差は、下記の実施例に記載する、ノッチ１依存性のシグナル伝達に対する明確に異なる中和活性において役割を果たしている可能性がある。
【０２１４】
【表１２】
0006016800.tif 000034
【０２１５】
Ｄ．熱安定性
タンパク質またはタンパク質ドメインの熱安定性は、タンパク質またはタンパク質ドメインの安定性と正に相関する。タンパク質またはタンパク質ドメインのより高い融点はしばしば、製造性の改善およびより長い有効期間をもたらす。示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を使用して、ヒト化４３８変異体およびラット４３８−ｍＩｇＧ１の熱安定性を評価した。タンパク質試料をＰＢＳ中に希釈して、２５０μｌの体積中の０．３ｍｇ／ｍｌとした。対応する調合用緩衝液のブランクを使用して、参照試料を得た。８℃に設定したＭｉｃｒｏＣａｌ  ＴｈｅｒｍｏＶａｃ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｄｅｇａｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｔ（Ｍｉｃｒｏｃａｌ，Ｉｎｃ．、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ）を使用して、両方の試料を徹底的に脱気した。  ＭｉｃｒｏＣａｌ  ＶＰ−ＤＳＣ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｃｅｌｌ  ＭｉｃｒｏＣａｌｏｒｉｍｔｅｒ（Ｍｉｃｒｏｃａｌ，Ｉｎｃ．、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ）の適切なセル中に試料を分注した。試料を、１５℃で４分間平衡化し、次いで、１００℃／時間の速度で１００℃までスキャンした。２０秒のフィルタリング期間を選択した。生データをベースライン補正し、タンパク質濃度を正規化した。Ｏｒｉｇｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ）を使用して、データを、適切な数の転移を有するＭＮ２−Ｓｔａｔｅ  Ｍｏｄｅｌに適合させた。
【０２１６】
下記の表１３に示すように、全てのヒト化４３８変異体が、それらのＦａｂ領域において、ラット４３８−ｍＩｇＧ１と比較して、より高い熱安定性を示し、このことは、より高い融点により示されている（全てが、７７℃を上回った）。
【０２１７】
【表１３】
0006016800.tif 000035
【０２１８】
（実施例４）
ノッチ１ＮＲＲ上の、抗ノッチ１阻害性抗体に結合するエピトープの同定
Ａ．ドメインスワップキメラ構築物
実施例３に記載したように、ヒト化４３８変異体およびヒト化３５１変異体は、ノッチ３タンパク質との交差反応性を欠いた。ノッチ１ＮＲＲとノッチ３ＮＲＲとのドメインスワップキメラ構築物を調製して、抗ノッチ１ラット４３８−ｍＩｇＧ１抗体、抗ノッチ１ラット３５１−ｍＩｇＧ１抗体およびＡ２抗体のエピトープマッピングを行った。Ｃ末端Ｆｃ融合（ヒトＩｇＧ１のＦｃ断片）を有する、ヒトノッチ３−ノッチ１（本明細書においては、ノッチ３−１と呼ぶ）ＮＲＲ領域のドメインスワップキメラをコードする発現構築物を個々に、ＣＨＯ−ＰＡＣＥ中にトランスフェクトし、各キメラを発現する安定なプールを確立した。それぞれの安定なプールから得られた馴化培地を、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーに、続いて、分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ）に適用して、キメラ融合タンパク質の精製を行った。次いで、精製した調製物を、１ｍＭ  ＣａＣｌ２を有するＴＢＳ中に透析し、ＳＥＣにより解析して分析した。図２は、ラット３５１−ｍＩｇＧ１、ラット４３８−ｍＩｇＧ１およびＡ２についてエピトープマッピングを行うための、組換えヒトノッチ１ＮＲＲドメインと組換えヒトノッチ３ＮＲＲドメインとのスワップキメラ構築物を示す。図２に示すように、組換えＮＲＲキメラタンパク質は、ヒトＦｃ（未表示）に融合させた、種々のノッチ３（灰色で示す）およびノッチ１（黒色で示す）のドメインからなる。
【０２１９】
ノッチ３−１ＮＲＲドメインスワップキメラに対する、ラット４３８−ｍＩｇＧ１およびラット３５１−ｍＩｇＧ１の相対的な結合能力を、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＳＰＲ技術を用いて試験し、抗体の相対的なレゾナンスユニット（ＲＵ）による結合能力を試験した。ノッチ３−１ＮＲＲキメラに対する、ラット４３８−ｍＩｇＧ１およびラット３５１−ｍＩｇＧ１のＳＰＲによる結合性を、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）により決定した。ＣＭ５チップのフローセルに、１０ｍＭグリシン、ｐＨ５．０中で、抗マウスＩｇＧ（ヤギ）および対照としてのヤギＩｇＧのそれぞれのおよそ１０，０００ＲＵを１０μｌ／分で６００秒間固定化した。０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２を有するＨＢＳ−Ｐ中で１μｇ／ｍｌに希釈したラット４３８−ｍＩｇＧ１抗体およびラット３５１−ｍＩｇＧ１抗体を、１０μｌ／分で３００秒間捕捉した。およその捕捉は、それぞれの抗体について、１５０ＲＵであった（応答１）。次に、１０μｇ／ｍｌのノッチ３−１ＮＲＲキメラを、同じ緩衝液中で、捕捉されたラット４３８−ｍＩｇＧ１抗体およびラット３５１−ｍＩｇＧ１抗体上に１０μｌ／ｍｌで３００秒間注入し、捕捉されたノッチ３−１ＮＲＲを測定した（応答２）。各サイクルの後の複合体の解離を、１０ｍＭ  Ａｃ  ｐＨ１．５を３０μｌ／分で２０秒間使用して達成した。
【０２２０】
図２に示すように、ノッチ１ＮＲＲのドメインに対する、ラット４３８−ｍＩｇＧ１およびラット３５１−ｍＩｇＧ１のエピトープ結合プロファイルは、ノッチ１ＮＲＲのドメインに対するＡ２の結合プロファイルとは明確に異なる。より具体的には、ＮＲＲに対するＡ２の結合性は、ＬＮＲ−Ｂドメインに、ラット４３８−ｍＩｇＧ１よりも依存する。さらに、ノッチ１ＮＲＲに対するラット３５１−ｍＩｇＧ１の結合性の、ＬＮＲ−ＡドメインおよびＬＮＲ−Ｂドメインに依存する程度は、Ａ２と比較して低い。ドメインの結合プロファイルの差を、下記に記載する共結晶構造から明らかになったノッチ１ＮＲＲ中の接触残基の差に関する、ならびにラット４３８−ｍＩｇＧ１およびＡ２との結合におけるノッチ１ＮＲＲの明確に異なる配向性に関するより詳細な情報と組み合わせると、ラット４３８−ｍＩｇＧ１は、ノッチ１ＮＲＲと、Ａ２とは異なる様式で相互作用することが示される。
【０２２１】
Ｂ．Ｘ線結晶解析
ラット４３８およびラット３５１を、上記の実施例２の記載に従って、発現させ、精製した。Ｆａｂ（抗原結合性断片）を、ラット４３８およびラット３５１から、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｆａｂ調製キット（固定化パパイン）、製品番号４４６８５を使用して生成した。ラット４３８およびラット３５１を、固定化パパインと共に３７℃で２４時間インキュベートした。Ｆａｂを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０を用いて平衡化したＺｅｂａカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて脱塩することによって精製した。Ｆａｂを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０を用いて平衡化したＱ  ＦＦカラムから得られたフロースルー中に収集した。
【０２２２】
得られたＦａｂ断片とヒトノッチ１ＮＲＲタンパク質とを、１：１．２のモル比で、０．９ｍＭ  ＣａＣｌ２を添加して混合し、氷上で３０分間インキュベートしてから、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．９ｍＭ  ＣａＣｌ２を用いて平衡化したＳ２００分子ふるいカラム上で精製した。Ｆａｂ：ＮＲＲの複合体を含有する顕著なピークから得られた画分を、プールし、１０キロダルトンのカットオフのＶｉｖａｓｐｉｎ  ＨＹ濃縮器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して１１ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。Ｆａｂ：ＮＲＲの複合体を、懸滴蒸気拡散法を使用して結晶化した。
【０２２３】
ラット４３８については、結晶を得るためには、キモトリプシンを使用する複合体の限定的なタンパク質分解が必要であった。最初に、複合体をキモトリプシンと混合して、２μｇ／ｍｌの最終濃度を得、次いで、１００ｍＭカコジル酸ナトリウム  ｐＨ５．５、１４〜２０％ＰＥＧ８０００、１００〜２００ｍＭ酢酸カルシウムからなる等しい体積のウエル溶液と組み合わせた。結晶が、１週間以内に出現し、３週間成長し続けた。ラット３５１については、複合体を、２０％ＰＥＧ３３５０、２００ｍＭ硫酸ナトリウムからなる等しい体積のウエル溶液と組み合わせた。結晶が、１週間後に出現し、３週間成長し続けた。
【０２２４】
結晶を、２５％グリセロールを添加したウエル溶液に通すことによって低温から保護した。Ｘ線データを、ＳＥＲ−ＣＡＴのＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅにおける、ラット４３８についてはビームライン２２ＢＭ、およびラット３５１についてはビームライン２２ＩＤにおいて収集し、ＨＫＬ−２０００（ＨＫＬ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）ソフトウエアパッケージを使用して、２．６オングストロームの分解能まで処理した。構造を、Ｐｈａｓｅｒソフトウエアを使用して、分子置換により解いた。検索モデルを、ノッチ１ＮＲＲについてはｐｄｂ  ｉｄ  ３Ｌ９５、ラット４３８の場合、重鎖については２ＨＲＰ、および軽鎖については１ｘｇｐ、ならびにラット３５１の場合、重鎖については１ＢＭ３、および軽鎖については３Ｌ９５から得た。得られたモデルを、ｃｏｏｔおよびＢＵＳＴＥＲ（Ｇｌｏｂａｌ  Ｐｈａｓｉｎｇ，Ｌｔｄ．）を、ｓｏｆｔ  ＮＣＳ  ｒｅｓｔｒａｉｎｔを含めて使用して再構築および精緻化した。構造の妥当性を、ｍｏｌｐｒｏｂｉｔｙを使用して確認した。ｐｙｍｏｌおよびＰＩＳＡを使用して、相互作用に関与する残基を決定した。
【０２２５】
ヒトノッチ１ＮＲＲ上のラット４３８エピトープの構造的見解を図３に示し、ヒトノッチ１ＮＲＲ上のラット３５１エピトープの構造的見解を図４に示す。類似のＸ線結晶解析を、Ａ２抗体について公開されているデータを使用して完了し、図５は、ヒトノッチ１ＮＲＲ上のＡ２エピトープの構造的見解を示す。図３〜５については、抗体から３．８オングストローム以内のアミノ酸残基を、黒色で示す。下記の表１４は、ラット４３８、ラット３５１およびＡ２についてのノッチ１ＮＲＲと抗体との相互作用に関与する残基を示す。
【０２２６】
データは、ラット４３８およびＡ２が、ノッチ１ＮＲＲ内の重複するが明確に異なる表面に結合することを示している。両方のエピトープが、ＨＤドメインの中心を含む。ラット４３８およびＡ２が、ＬＮＲ−Ａと相互作用するが、ラット４３８は、より大きな表面と相互作用する。ラット４３８のみが、Ｓ１ループ領域と相互作用し、Ａ２のみが、ＬＮＲ−Ｂと相互作用する。より具体的には、データは、ラット４３８が、ヒトノッチ１ＮＲＲの残基のＡｓｎ１４６１、Ｌｙｓ１４６２、Ｖａｌ１４６３、Ｃｙｓ１４６４、Ｌｅｕ１４６６、Ｌｅｕ１５８０、Ｔｙｒ１６２１、Ｇｌｙ１６２２、Ｍｅｔ１６７０、Ａｓｐ１６７１、Ｖａｌ１６７２、Ａｒｇ１６７３、Ｌｅｕ１７０７、Ａｌａ１７０８、Ｌｅｕ１７１０、Ｇｌｙ１７１１、Ｓｅｒ１７１２、Ｌｅｕ１７１３、Ｐｒｏ１７１６およびＬｙｓ１７１８に結合することを示している。
【０２２７】
また、データは、ラット３５１およびＡ２が、ノッチ１ＮＲＲ内の重複するが明確に異なる表面に結合することも示している。特に、ラット３５１のみが、Ｓ１ループ領域と相互作用し、Ａ２のみが、ＬＮＲ−Ｂと相互作用する。ラット３５１およびＡ２の両方が、ＬＮＲ−Ａと相互作用するが、ラット３５１は、ＬＮＲ−Ａのアミノ酸の明確に異なるサブセットと相互作用する。より具体的には、データは、ラット３５１が、ヒトノッチ１ＮＲＲの残基のＡｓｐ１４５８、Ａｓｎ１４６１、Ｖａｌ１４６３、Ｃｙｓ１４６４、Ｌｅｕ１４６６、Ｌｅｕ１５８０、Ｍｅｔ１５８１、Ｐｒｏ１５８２、Ｔｙｒ１６２１、Ｇｌｙ１６２２、Ａｒｇ１６２３、Ａｓｐ１６７１、Ｖａｌ１６７２、Ａｒｇ１６７３、Ｇｌｙ１６７４、Ｌｅｕ１７１０、Ｇｌｙ１７１１、Ｓｅｒ１７１２、Ｌｅｕ１７１３、Ａｓｎ１７１４、Ｉｌｅ１７１５、Ｐｒｏ１７１６、Ｌｙｓ１７１８に結合することを示している。
【０２２８】
ノッチ１ＮＲＲに結合するラット４３８およびラット３５１の残基のＸ線結晶構造を、プログラムＰＩＳＡを使用してさらに解析した。データは、ラット４３８が、残基のＬｙｓ１７１８およびＡｒｇ１６７３と強い静電的相互作用（塩架橋）を形成したことを示している。ラット４３８抗体と水素結合を形成するノッチ１ＮＲＲの残基は、Ａｓｎ１４６１、Ａｓｐ１６７１、Ａｒｇ１６７３、Ｌｅｕ１７１３、Ｌｙｓ１７１８、Ｃｙｓ１４６４、Ａｌａ１７０８およびＳｅｒ１７１２であった。ラット４３８抗体との複合体の形成時に４０オングストローム２超の埋没表面積に寄与するノッチ１ＮＲＲの残基は、重鎖との相互作用からは、Ａｒｇ１６７３、Ｖａｌ１４６３、Ｌｙｓ１４６２、Ｇｌｙ１６２２、Ａｓｐ１６７１であり、軽鎖との相互作用からは、Ｌｅｕ１４６６、Ｌｙｓ１７１８、Ｇｌｙ１７１１、Ｃｙｓ１４６４、Ｐｒｏ１７１６およびＶａｌ１４６３であった。同定された残基のうち、ラット４３８は、ヒトノッチ１ＮＲＲに、少なくとも残基Ａｓｎ１４６１、Ｖａｌ１４６３、Ｌｙｓ１４６２、Ａｓｐ１６７１、Ａｒｇ１６７３、Ｌｅｕ１７１３およびＬｙｓ１７１８において結合する。
【０２２９】
データは、ラット３５１が、残基のＡｓｐ１４５８およびＡｒｇ１６７３と強い静電的相互作用（塩架橋）を形成することを示している。ラット３５１抗体と水素結合を形成するノッチ１ＮＲＲの残基は、Ａｓｐ１４５８、Ｖａｌ１４６３、Ｃｙｓ１４６４、Ｓｅｒ１４６５、Ｔｙｒ１６２１、Ａｓｐ１６７１、Ｖａｌ１６７２、Ａｒｇ１６７３、Ｇｌｙ１７１１、Ｓｅｒ１７１２、Ｌｅｕ１７１３およびＡｓｎ１７１４であった。ラット３５１との複合体の形成時に４０オングストローム２超の埋没表面積に寄与するノッチ１ＮＲＲの残基は、軽鎖との相互作用からは、Ｖａｌ１４６３、Ｃｙｓ１４６４、Ｌｅｕ１４６６、Ｇｌｙ１７１１、Ａｓｎ１７１４、Ｐｒｏ１７１６およびＬｙｓ１７１８であり、重鎖との相互作用からは、Ａｓｎ１４６１、Ｌｅｕ１５８０、Ａｓｐ１６７１およびＡｒｇ１６７３であった。同定された残基のうち、ラット３５１は、ヒトノッチ１ＮＲＲに、少なくとも残基Ａｓｐ１４５８、Ｖａｌ１４６３、Ｔｙｒ１６２１、Ａｓｐ１６７１、Ｖａｌ１６７２、Ａｒｇ１６７３、Ｓｅｒ１７１２およびＬｅｕ１７１３において結合する。さらに、Ａ２は、残基Ａｓｐ１４５８、Ｖａｌ１４６３、Ｔｙｒ１６２１、Ａｓｐ１６７１、Ｖａｌ１６７２、Ａｒｇ１６７３、Ｓｅｒ１７１２およびＬｅｕ１７１３とは相互作用しない。
【０２３０】
【表１４−１】
0006016800.tif 000036
【０２３１】
【表１４−２】
0006016800.tif 000037
【０２３２】
図６は、ラット４３８抗体およびＡ２抗体に結合しているヒトノッチ１ＮＲＲの構造の重ね合わせを示す。ヒトノッチ１ＮＲＲが、下部にある。ラット４３８およびＡ２の重鎖を黒色で示し、灰色で示す軽鎖は、２つの重鎖の間にある。図６に示すように、ＮＲＲに対するラット４３８抗体の配向性とＡ２抗体の配向性とは、ほとんど１８０度回転しており、したがって、ラット４３８の軽鎖Ｎ末端は、ＬＮＲ−Ａに向かい、一方、Ａ２の軽鎖は、（ノッチ１ＮＲＲの背部領域中の）ＬＮＲ−Ｃに向かう。このことから、ＮＲＲから眺めると、それらの重鎖は、２つの軽鎖の向かい合う側面上に置かれる。したがって、Ａ２の重鎖は、Ｓ１ループからの軽鎖の反対側にある。
【０２３３】
図７は、ラット３５１抗体およびＡ２抗体（分子表面として示す）に結合しているヒトノッチ１ＮＲＲ（リボンとして示す）の構造の重ね合わせを示す。ラット３５１およびＡ２の重鎖を黒色で示す。ラット３５１の軽鎖を、暗い灰色で示し、Ａ２の軽鎖を、明るい灰色で示す。図７は、ラット３５１抗体とＡ２抗体とは、反対の方向に結合することを示しており、このことから、それらが特有のエピトープと結合することが確認される。
【０２３４】
（実施例５）
細胞ベースアッセイにおける、抗ノッチ１阻害性抗体の機能の特徴付け。
Ａ．ノッチ１のレポーター遺伝子アッセイにおけるＥＤＴＡ処理
リガンドの不在下では、ヘテロ二量体性のＳ１切断されたノッチ１受容体は、細胞膜に不活性な状態で留まる。ノッチ１ＮＲＲドメインは、切断部位２（Ｓ２）を埋め、したがって、金属プロテアーゼへの接近を阻止することによって、自己阻害性の立体構造をとる。ノッチ１ＮＲＲドメインには、二価のカチオン、例として、カルシウムにより安定化する非共有結合性相互作用が関わる。しかし、ノッチ１ＮＲＲドメインの阻害性相互作用を、キレート化剤ＥＤＴＡにより混乱させることができる。ＥＤＴＡによるカルシウムのキレート化の結果、細胞膜からの細胞外ドメインの急速な排出が生じ、このキレート化は、ノッチ１シグナル伝達を活性化させるのに十分である（Ｒａｎｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０（５）：１８２５〜３５、２０００）。
【０２３５】
抗ノッチ１阻害性抗体が、不活性な立体構造をとるノッチ１ＮＲＲを、二価のカチオンをキレート化した際に、安定化させるかどうかを決定するために、ノッチ１−レポーター細胞（下記のセクションＢを参照されたい）を、ラット４３８−ｍＩｇＧ１抗体、ラット３５１−ｍＩｇＧ１抗体またはＡ２抗体、および対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体と共にあらかじめインキュベートし、次いで、５ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて処理した。ヒトノッチ１のレポーター細胞を、壁が白色の９６ウエルプレート中に４０，０００細胞／ウエルで蒔き、マッコイ５Ａ培地、１０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／グルタミン中で一晩培養した。培地を、吸引により除去し、ラット４３８−ｍＩｇＧ１抗体、ラット３５１−ｍＩｇＧ１抗体またはＡ２抗体、および対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体を、０、０．０１、０．１、１、１０および３０μｇ／ｍｌで含有する培地と室温で１時間かけて交換した。１時間の抗体の前処理の後に、ＥＤＴＡを、細胞に５ｍＭの最終濃度で添加し、５％ＣＯ２中、３７℃で６時間インキュベートした。Ｄｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、８×ＣＳＬホタル−ルシフェラーゼ（ノッチ１誘導性）レポーターおよびウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）−ルシフェラーゼ（構成性）レポーターの活性を測定した。ホタル−ルシフェラーゼからの発光の読取りを、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）−ルシフェラーゼの読取りで割って、ノッチ１シグナル伝達のレベルを計算した。それぞれの処理から得られた３回の反復の平均および標準偏差を計算し、プロットした。
【０２３６】
表１５は、キレート化剤ＥＤＴＡが存在し、リガンドが存在しない場合に、ラット４３８−ｍＩｇＧ１抗体、ラット３５１−ｍＩｇＧ１抗体およびＡ２抗体、ならびに対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体の濃度を増加させて用いて実施したノッチ１のレポーター遺伝子アッセイを示す。データは、ノッチ１−レポーター細胞株に、ＥＤＴＡ単独を添加する場合には、ホタル−ルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性化が刺激される（０μｇ／ｍｌ条件を参照されたい）ことを示している。予想通り、対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体は、ノッチ１シグナル伝達を阻害しなかった。対照的に、ＥＤＴＡの存在下において、ラット４３８−ｍＩｇＧ１抗体、ラット３５１−ｍＩｇＧ１抗体およびＡ２抗体それぞれを、濃度を増加させて用いて細胞を前処理する場合には、ホタル−ルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性化が用量依存的に阻害された。１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌおよび３０μｇ／ｍｌの濃度において、ラット３５１−ｍＩｇＧ１、ラット４３８−ｍＩｇＧ１およびＡ２により処理したホタル−ルシフェラーゼ対ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）−ルシフェラーゼの比は、対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）よりも顕著に低く、このことは、ノッチ１シグナル伝達の阻害を示している。
【０２３７】
【表１５】
0006016800.tif 000038
【０２３８】
Ｂ．ノッチ１のレポーター遺伝子同時培養アッセイのための細胞株の構築
抗ノッチ１ヒト化４３８抗体および抗ノッチ１ヒト化３５１抗体の阻害活性を、実施例２に記載したノッチ１のレポーター遺伝子同時培養アッセイにおいて試験した。ヒト化４３８抗体およびヒト化３５１抗体を、ノッチ１のレポーター細胞と共にあらかじめインキュベートし、次いで、ノッチ１シグナル伝達を活性化させるためのＤＬＬ４−ＨＥＫ２９３細胞または対照としての親のＨＥＫ２９３細胞と同時培養した。
【０２３９】
ノッチ１のレポーター細胞株を生成するために、連続３回の安定なトランスフェクションを、Ｕ−２ＯＳヒト骨肉腫細胞株（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）中で実施した。第１のトランスフェクションでは、ｐＣＭＶ６−Ｅｎｔｒｙ−Ｍｙｃ−Ｆｌａｇ骨格（Ｏｒｉｇｅｎｅ）に基づく完全長のヒトノッチ１またはマウスノッチ１の発現のためのベクターを使用し、両方において、ノッチ１挿入部の正しいＤＮＡ配列を確認した。ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１トランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いたトランスフェクションに続き、Ｕ−２ＯＳ細胞をＧ４１８中で選択し、クローン株を単離した。第２に、安定にノッチ１を発現するＵ−２ＯＳのクローンに、ＣＳＬエンハンサー配列（ＣＧＴＧＧＧＡＡＡＡＴ）の８つの縦に並べたコピーを含有するｐＧＬ４．２７［ｌｕｃ２Ｐ／ｍｉｎＰ／Ｈｙｇｒｏ］ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を再トランスフェクトし、ハイグロマイシンＢおよびＧ４１８中で選択を行い、クローン株を単離した。８×ＣＳＬホタル−ルシフェラーゼレポーター構築物は、活性化されたノッチ１シグナル伝達に対して応答性である（例えば、Ｊｅｆｆｒｉｅｓら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２２（１１）：３９２７〜３９４１、２００２を参照されたい）。第３に、ノッチ１−ｐＧＬ４．２７Ｕ−２ＯＳ細胞に、Ｌｉｎｅａｒ  Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  Ｍａｒｋｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を加えたｐＧＬ４．７４［ｈＲｌｕｃ／ＴＫ］ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を再トランスフェクトし、ピューロマイシン、ハイグロマイシンＢおよびＧ４１８中で選択を行い、クローン株を単離した。ｐＧＬ４．７４ベクターにより、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）−ルシフェラーゼ遺伝子がコードされ、この遺伝子は、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターから構成的に発現し、内部対照として働いた。三重に、安定にトランスフェクトしたＵ−２ＯＳ株（本明細書においては、「ノッチ１のレポーター細胞」と呼ぶ）を、１０％ＦＢＳ、１×ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、０．２５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８硫酸塩、０．３ｍｇ／ｍｌハイグロマイシンＢおよび０．００１ｍｇ／ｍｌピューロマイシンを含有するマッコイ５Ａ培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中に維持した。
【０２４０】
リガンド発現細胞を生成するために、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ）に、ヒトＤＬＬ４またはマウスＤＬＬ４の発現のためのベクターをトランスフェクトした。両方のベクターが、ｐＣＭＶ６−ＡＣ−ＨＡ−Ｈｉｓ骨格（Ｏｒｉｇｅｎｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）に基づき、ＤＬＬ４挿入部の正しいＤＮＡ配列を確認した。トランスフェクションに続き、ＨＥＫ２９３細胞を、０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８中で選択し、クローン株を単離し、拡大増殖し、ＤＬＬ４の発現について分析した。高いＤＬＬ４の発現を示すクローンおよびＵ−２ＯＳ細胞中でノッチ１のレポーター活性の高い誘導を示すクローンを使用して、抗ノッチ１抗体の阻害作用を評価した。
【０２４１】
ホタル−ルシフェラーゼからの発光の読取りを、内部対照のウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）−ルシフェラーゼの読取りで割って、シグナルを正規化した（本明細書においては、「Ｆ／Ｒ比」と呼ぶ）。ノッチ１シグナル伝達の誘導の倍率を計算するために、ＤＬＬ４−ＨＥＫ２９３の同時培養レポーターアッセイから得られたＦ／Ｒ比を、親のＨＥＫ２９３の同時培養から得られたＦ／Ｒ比で割り、これを、相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）または相対ルシフェラーゼ活性と呼んだ。
【０２４２】
ヒトノッチ１およびマウスノッチ１のレポーター同時培養アッセイにおける、ヒト化４３８ＶＨ１．１／ＶＬ１．８およびＡ２の滴定は、用量依存的な、強力なノッチ１シグナル伝達の阻害を示した。図８および９はそれぞれ、ヒトノッチ１およびマウスノッチ１のレポーター細胞中の、ノッチ１依存性のシグナル伝達に対するヒト化４３８ＶＨ１．１／ＶＬ１．８抗体およびラット４３８抗体の中和活性を示す。ヒト化４３８ＶＨ１．１／ＶＬ１．８は、ヒトおよびマウスの両方のノッチ１依存性シグナル伝達レポーターアッセイにおいて、ラット４３８の中和活性と同等の中和活性を示した。したがって、ヒト化４３８ＶＨ１．１／ＶＬ１．８は、ラット４３８の中和活性を完全に保持した。
【０２４３】
下記の表１６に示すように、ラット４３８−ｍＩｇＧ１およびヒト化４３８変異体のＩＣ５０（ｎＭ）値を、ノッチ１のレポーター遺伝子同時培養アッセイから得られたノッチ１依存性のシグナル伝達の阻害から計算した。ヒト化４３８ＶＨ１．１／ＶＬ１．８が、ヒトおよびマウスの両方のノッチ１シグナル伝達に対する阻害の最も顕著なレベルを示し、このことは、全てのヒト化４３８変異体のうちの最も低いＩＣ５０値により示されている。
【０２４４】
【表１６】
0006016800.tif 000039
【０２４５】
同時培養レポーターアッセイ上のラット３５１抗ノッチ１抗体およびＡ２抗ノッチ１抗体の阻害作用を、抗体の濃度を約０．０１ｎＭ〜２００ｎＭの範囲にわたり増加させて添加することによって調べた。抗ノッチ１抗体処理同時培養のパーセント（％）阻害を計算するために、抗体の濃度を増加させた処理から得られたＲＬＵを、式（１−（処理／未処理）×１００）を使用して、未処理の対照で割った。
【０２４６】
ヒトノッチ１およびマウスノッチ１のレポーター同時培養アッセイにおけるラット３５１抗体およびＡ２抗体の滴定は、ノッチ１シグナル伝達に対するラット３５１の特有の中和活性を実証した。図１０、１１および表１７に示すように、ラット３５１およびＡ２の両方が、ノッチ１シグナル伝達を用量依存的に阻害し、ノッチ１のレポーター同時培養アッセイから計算された類似のＩＣ５０値を示した。図１０および表１７は、Ａ２が、ヒトノッチ１のレポーター同時培養アッセイにおいて、抗体濃度がＩＣ５０値の２０倍超である場合に、約１００％のノッチ１シグナル伝達の最大阻害（プラトー阻害）を達成したことを示す。対照的に、ラット３５１は、約８５％に過ぎない最大阻害しか達成せず、これは、Ａ２について観察された最大阻害よりも低かった。ラット３５１は、抗体濃度がＩＣ５０値の２５０倍であった場合でさえ、１００％の最大阻害を達成することができなかった。図１１および表１７は、マウスノッチ１のレポーター同時培養アッセイについても、類似の結果が観察されたことを示す。Ａ２は、マウスノッチ１のレポーター同時培養アッセイにおいて、約８６％のノッチ１シグナル伝達の最大阻害を達成した。対照的に、ラット３５１は、約５５％に過ぎない最大阻害しか達成せず、これは、８６％のＡ２について観察された最大阻害よりも低い。
【０２４７】
【表１７】
0006016800.tif 000040
【０２４８】
図１２および１３は、ヒトおよびマウスの両方のノッチ１依存性シグナル伝達レポーターアッセイそれぞれにおける、ヒト化３５１変異体およびラット３５１−ｍＩｇＧ１の中和活性を示す。表１８は、ノッチ１のレポーター遺伝子同時培養アッセイから得られたノッチ１依存性のシグナル伝達の阻害から計算した、ヒト化３５１変異体、ラット３５１−ｍＩｇＧ１およびＡ２のＩＣ５０（ｎＭ）値を示す。データは、ヒト化３５１ＶＨ１．０／ＶＬ１．１が、ラット３５１−ｍＩｇＧ１およびラット３５１に類似する中和活性プロファイルを示したことを示す。ヒト化３５１ＶＨ１．０／ＶＬ１．１は、約８７．４％のノッチ１シグナル伝達の最大阻害を達成し、これは、Ａ２について観察された最大阻害よりも低い。
【０２４９】
【表１８】
0006016800.tif 000041
【０２５０】
（実施例６）
クローン３５１の中和活性についての構造上および機能上の根拠
ノッチ１ＮＲＲのＬＮＲ−Ａ、ＢおよびＣのドメインのそれぞれ中のＣａ２＋の結合が、ノッチ１ＮＲＲの構造の完全性を維持するのに必要である。Ｃａ２＋を、例えば、ノッチ１を発現している細胞の培地へのＥＤＴＡの添加により除去すると、ノッチ１ＮＲＲの構造の不安定化が生じる。この結果、ノッチ１ＮＲＲ中のＳ２のメタロプロテイナーゼ切断部位の暴露およびノッチ１シグナル伝達の活性化が生じる（Ｒａｎｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０（５）：１８２５〜３５、２０００）。
【０２５１】
ラット３５１のＦａｂとヒトノッチ１ＮＲＲとの共結晶構造は、単一の結晶中に４つの独立した複合体を有する。しかし、４つの複合体のうちの１つのみが、ＬＮＲ−Ａに対する、予想されるＣａ２＋の結合を含有した。図１４Ａは、複合体１のＬＮＲ−Ａ領域におけるラット３５１とヒトノッチ１ＮＲＲとの相互作用を示す。この構造では、ノッチ１ＮＲＲ中の負に荷電した残基Ａｓｐ１４５８が、構造中に存在するカルシウムとのイオン性相互作用を示した。図１４Ｂは、複合体２のＬＮＲ−Ａ領域におけるラット３５１とヒトノッチ１ＮＲＲとの相互作用を示す。複合体２は、複合体２〜４の代表的な画像である。複合体２〜４では、カルシウムとのイオン性相互作用を示す代わりに、ヒトノッチ１ＮＲＲのＡｓｐ１４５８は、ラット３５１のＶＨのＣＤＲ２中の正に荷電した残基Ａｒｇ５８と塩架橋を形成した。このことは、ラット３５１の正に荷電したＡｒｇ５８が、正に荷電したＣａ２＋と、ヒトノッチ１ＮＲＲの負に荷電したＡｓｐ１４５８に対する結合について競合していることを示している。
【０２５２】
ラット３５１の機能特性における正に荷電した残基Ａｒｇ５８の意義を実証するために、突然変異させたラット３５１−ｍＩｇＧ１抗体を生成し、この場合、ＶＨ中のＡｒｇ５８を、中性残基のＴｙｒに（およびＶａｌ６０−ＡｌａまたはＡｒｇと組み合わせたＡｒｇ５８−Ｔｙｒに）突然変異させた。突然変異させたラット３５１−ｍＩｇＧ１抗体を、ノッチ１シグナル伝達阻害レポーターアッセイにおいて試験し、結果を、図１５および表１９に示す。示すように、ラット３５１は、約８７％に過ぎない最大阻害しか達成せず、一方、突然変異させたラット３５１−ｍＩｇＧ１およびＡ２はそれぞれ、約９５％および約９８％のより高い最大阻害を達成した。
【０２５３】
【表１９】
0006016800.tif 000042
【０２５４】
（実施例７）
抗ノッチ１阻害性抗体の、内皮細胞の出芽、血管形成および血管化に対する作用
Ａ．抗ノッチ１阻害性抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける評価
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）フィブリンゲルビーズアッセイ（ＦＧＢＡ）（本明細書においては、ＨＵＶＥＣ−ＦＧＢＡともまた呼ぶ）を使用する、内皮細胞の出芽のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるモデルにおいて、抗ノッチ１阻害性抗体の血管形成に対する作用を調べた。ＨＵＶＥＣ−ＦＧＢＡの改変バージョンを、Ｎａｋａｔｓｕら（Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．６６（２）：１０２〜１１２、２００３）による記載に本質的に従って実施したが、ただし、初代ヒト肺腫瘍関連線維芽細胞（ＬＴＡＦ）を、Ｄｅｔｒｏｉｔ５５１皮膚線維芽細胞の代わりに用いた。ＨＵＶＥＣの出芽を、線維芽細胞の添加後の第１０〜１５日に調べた。
【０２５５】
ヒト肺腫瘍組織（試料８７８５２Ａ１；Ａｓｔｅｒａｎｄ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）を、機械的かつ酵素的に脱凝集させた。細胞を、４０μｍの細胞用ストレーナーを通してふるいにかけて、単一細胞の懸濁液を得た。生存細胞を、赤血球溶解用緩衝液（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて処理し、死んだ細胞からの磁気分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を行った後に単離した。初代肺腫瘍関連線維芽細胞を確立し、２０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地中に維持した。
【０２５６】
ＬＴＡＦ含有ＨＵＶＥＣ−ＦＧＢＡを、ラット４３８抗体、ラット３５１抗体またはＡ２抗体を用いて処理した。また、培地単独（未処理）および抗ＶＥＧＦ阻害剤のアバスチン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｓｏ．Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）対照処理も含めた。図１６は、ラット４３８、ラット３５１およびＡ２により処理したＨＵＶＥＣの出芽の第１０日時のＣＤ３１−Ｃｙ３の免疫染色の代表的な落射蛍光画像を示す。培地単独（未処理）対照と比較して、ラット４３８およびラット３５１による処理における、ＨＵＶＥＣの出芽および血管の長さの増加が実証された。対照的に、抗ＶＥＧＦ阻害剤のアバスチンを用いる処理は、ＨＵＶＥＣの出芽を完全に阻止した。したがって、ラット４３８およびラット３５１を用いるノッチ１シグナル伝達の阻害は、血管形成を、抗ＶＥＧＦ阻害剤、例として、アバスチンとは明確に異なる様式で調節解除した。
【０２５７】
さらに、表２０は、ラット４３８およびラット３５１は、ＨＵＶＥＣ−ＦＧＢＡにおいて、処理の第６日および第１２日に、対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体と比較して、１個のビーズ当たりの出芽分枝点の平均数も増加させたことを示す。しかし、ラット３５１の、１個のビーズ当たりの分枝点の平均数に対する作用は、ラット４３８およびＡ２と比較して、第６日にはより低かった。第１２日までに、ラット４３８およびラット３５１の両方、ならびにＡ２が、１個のビーズ当たりの分枝点の類似の数を誘導している。血管形成の間、活性なノッチ１シグナル伝達は、内皮の先端の細胞の数を負に制御し、したがって、分枝および出芽のレベルを調節する（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４４５（７１２９）：７７６〜７８０、２００７）。
【０２５８】
【表２０】
0006016800.tif 000043
【０２５９】
Ｂ．抗ノッチ１阻害性抗体のｉｎ  ｖｉｖｏにおける評価
抗ノッチ１阻害性抗体の作用を、血管形成および血管化のｉｎ  ｖｉｖｏにおけるマウスアッセイにおいてさらに調べた。新生児の網膜は、血管形成の十分に特徴付けられたモデルであり、このプロセスにおけるノッチ経路の役割を研究するために使用されている。出生時から始まるマウス網膜における広範な血管形成がある。ヒト網膜においてと同様、血管構造は、視神経を起源とし、広がって、血管のネットワークを形成し、次いで、このネットワークは、下方に出芽して、二次的なネットワークを確立する。ノッチシグナル伝達の遺伝子操作および薬理学的操作により、適切なノッチシグナル伝達が、新生児の網膜における血管形成に必要であることが実証されている（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４４５（７１２９）：７７６〜７８０、２００７）。
【０２６０】
妊娠中のＣＤ−１マウスを個々に飼育し、同腹仔の出生について定期的にモニターした。ラット４３８−ｍＩｇＧ１については、出生後の第１および３日に、１０ｍｇ／ｋｇの対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体、１０ｍｇ／ｋｇのラット４３８−ｍＩｇＧ１または１０ｍｇ／ｋｇのＡ２のいずれかを仔に投与した。ラット３５１−ｍＩｇＧ１については、出生後の第１および３日に、３０ｍｇ／ｋｇの対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体、３０ｍｇ／ｋｇのラット３５１−ｍＩｇＧ１または３０ｍｇ／ｋｇのＡ２のいずれかを仔に投与した。
【０２６１】
出生後の第５日に、仔を安楽死させ、眼を収集し、２％ホルムアルデヒド中で一晩固定した。翌日、眼をＰＢＳに移動させ、網膜を単離した。網膜を染色するために、イソレクチンＢ４（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８に、標識化キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いてコンジュゲートし、１０％ヤギ血清、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１％アジ化ナトリウムならびにそれぞれ０．１ｍＭのＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２およびＭｎＣｌ２を有するＰＢＳ中、１５ｍｇ／ｍｌで使用した。網膜を、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１％アジ化ナトリウムならびにそれぞれ０．１ｍＭのＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２およびＭｎＣｌ２を有するＰＢＳ中で５回洗浄し、最後に、０．１％アジ化ナトリウムならびにそれぞれ０．１ｍＭのＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２およびＭｎＣｌ２を有するＰＢＳ中で洗浄した。網膜を切断し、Ｆｌｕｏｒｍｏｕｎｔ−Ｇ（ＥＭＳ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）を用いてマウントし、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ，ＬＬＣ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）上で画像を撮影した。図１７は、血管形成のマウス網膜モデルにおける、ラット４３８−ｍＩＧ１、ラット３５１−ｍＩｇＧ１およびＡ２を用いた処理後のイソレクチンＢ４−Ａｌｅｘａ４８８の染色の代表的な共焦点画像を示す。また、抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体および未処理の対照も含めた。
【０２６２】
図１７に示すように、ラット４３８−ｍＩｇＧ１処理群中のマウス仔から得られた網膜は、抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体処理および未処理の対照群中のマウス仔から得られた網膜と比較して、異なる血管構造を有した。このことは、ラット４３８−ｍＩｇＧ１抗体が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける血管形成を混乱させたことを示す。特に、ラット４３８−ｍＩｇＧ１処理群から得られた網膜は、より広範な血管構造を示し、この構造は、これまでに報告された、ノッチシグナル伝達の遺伝子操作および薬理学的操作の後の血管構造に類似した（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４４５（７１２９）：７７６〜７８０、２００７）。このことは、ラット４３８−ｍＩｇＧ１を用いるノッチ１シグナル伝達の阻害が、マウス新生児の網膜における血管形成に直接影響を及ぼしたことを示す。
【０２６３】
さらに、図１７には、ラット３５１−ｍＩｇＧ１処理群中のマウス仔から得られた網膜が、抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体処理および未処理の対照群中のマウス仔から得られた網膜と比較して、類似の血管構造を有したことも示されている。対照的に、Ａ２群から得られた網膜は、より広範な血管構造を示し、この構造は、これまでに報告された、ノッチシグナル伝達の遺伝子操作および薬理学的操作の後の血管構造に類似した（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４４５（７１２９）：７７６〜７８０、２００７）。このことは、Ａ２とは対照的に、ラット３５１−ｍＩｇＧ１抗体が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるマウスの血管形成を顕著には混乱させなかったこと、またはラット３５１−ｍＩｇＧ１のマウス血管構造に対する潜在的な作用が、選ばれた時点では観察されなかったか、もしくは試験した投与計画を用いては観察されなかったことを示している。
【０２６４】
（実施例８）
抗ノッチ１阻害性抗体の、ネイティブなノッチ１受容体および突然変異ノッチ１受容体を有する細胞株に対する作用
Ａ．ネイティブなノッチ１受容体を有するヒト線維芽細胞の細胞株ＣＣＤ１０７６ＳＫにおける、抗ノッチ１阻害性抗体のノッチ１活性化に対する作用
ノッチ１シグナル伝達は、細胞外ノッチ１ＮＲＲドメイン内の立体構造変化を誘発し、それにより、金属プロテアーゼおよびガンマ−セクレターゼによる切断部位を暴露させるリガンドの結合により活性化される。タンパク質分解の結果、細胞膜から、転写活性化因子であるノッチ１細胞内ドメイン（ノッチ１ＩＣＤ）が放出される。ラット４３８抗体、ラット３５１抗体またはＡ２抗体および対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体の濃度を増加させて用いて処理した組換えヒトＤＬＬ４リガンド上に２４時間蒔いたヒト線維芽細胞の細胞株ＣＣＤ１０７６ＳＫから生成したタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析により、ノッチ１活性化およびノッチ１ＩＣＤの放出を調べた。バリン残基から始まるノッチ１ＩＣＤ分子の放出を、Ｄ３Ｂ８抗体（抗ノッチ１ＩＣＤ）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）を用いて検出した。
【０２６５】
ノッチ１シグナル伝達を活性化させるために、ＣＣＤ１０７６ＳＫ皮膚線維芽細胞を、ＤＬＬ４リガンドの存在下で培養した。６ウエルプレートを、ＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２を含有する１×ＤＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌの組換えヒトＤＬＬ４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を用いてコートした。１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中の２×１０Ｅ６個のＣＣＤ１０７６ＳＫ皮膚線維芽細胞を、０、０．００１、０．０１、０．１、１ならびに１０μｇ／ｍｌのラット４３８抗体、ラット３５１抗体およびＡ２抗体ならびに対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体の存在下で、組換えヒトＤＬＬ４でコートしたウエルに添加した。細胞を、抗体と共に、５％ＣＯ２中、３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）および０．４ｍＭ  ＰＭＳＦを含有する１％ＮＰ４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中に溶解させた。抽出物を、７．５％ポリアクリルアミドゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース紙に、ｉＢｌｏｔゲル移動システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して移動させた。放出された、バリン残基から始まるノッチ１ＩＣＤ分子を、標準的なウエスタンブロットの手順を使用して、抗ノッチ１ＩＣＤおよび充填対照としての抗ベータ−アクチンを用いて検出した。濃度測定解析を、フィルム上で実施し、これらのフィルムを、ＢｉｏＲａｄ  ＧＳ−８００  Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ  Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒを用いてスキャンし、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ、４．６．９版ソフトウエア（ＢｉｏＲａｄ）を用いて解析した。ノッチ１ＩＣＤのレベルを、各試料中のベータ−アクチンの対照に対して正規化し、次いで、未処理の対照と比較した。
【０２６６】
図１８に示すように、ラット４３８の滴定は、ノッチ１活性化を用量依存的に強力に阻害し、このことは、検出されたノッチ１ＩＣＤの放出のレベルによって示されている。さらに、図１８および表２１に示すように、１０μｇ／ｍＬまでのラット３５１の滴定は、Ａ２と比較して、ネイティブなノッチ１受容体のノッチ１活性化のより低い阻害も示し、このことは、検出されたノッチ１ＩＣＤの放出のレベルによって示されている。全ての濃度、特に、０．１μｇ／ｍＬ以上では、ラット３５１は、Ａ２と比較して、ノッチ１ＩＣＤの放出のより高いレベルを示した。
【０２６７】
【表２１】
0006016800.tif 000044
【０２６８】
Ｂ．突然変異ノッチ１受容体を有するＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）細胞株における、抗ノッチ１阻害性抗体のノッチ１活性化に対する作用
構成的なノッチ１活性化およびノッチ１細胞内ドメイン（ノッチ１ＩＣＤ）の放出が、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）患者のサブセット、およびノッチ１受容体のＮＲＲドメイン内に突然変異を有するＴ−ＡＬＬ細胞株において報告されている（Ｗｅｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０６：２６９〜２７１、２００４）。これらの突然変異は、３つの主要なクラスのカテゴリーに分けられる。クラス１の突然変異は、ＨＤ１中の単一アミノ酸置換および小型のインフレームの欠失または挿入である。クラス２の突然変異は、ＨＤ２の遠位領域中のより長い挿入であり、これらの挿入により、Ｓ２−金属プロテアーゼの切断部位が、自己阻害性ＮＲＲドメインを超えて移転する。クラス３の突然変異は、膜近傍伸長突然変異（ＪＭＥ）ともまた呼ばれ、ＮＲＲを細胞膜から離れたところに動かす。
【０２６９】
試験したノッチ１受容体のクラス１の突然変異を有するＴ−ＡＬＬ細胞株は、アミノ酸１５７５におけるロイシンからプロリンへの突然変異（Ｌ１５７５Ｐ）を有するＨＰＢ−ＡＬＬ細胞、アミノ酸１５９４におけるロイシンからプロリンへの突然変異（Ｌ１５９４Ｐ）を有するＡＬＬ−ＳＩＬ細胞、アミノ酸１６０１におけるロイシンからプロリンへの突然変異（Ｌ１６０１Ｐ）を有するＭＯＬＴ−４細胞、ならびにアミノ酸位置１５９４におけるロイシンからプロリンへおよびアミノ酸位置１６１０におけるアスパラギン酸からバリンへの複合のクラス１の突然変異（Ｌ１５９４Ｐ／Ｄ１６１０Ｖ）を有するＤＮＤ−４１細胞を含む。ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞株は、クラス２の突然変異を有し、１５９５位における１２個のアミノ酸の挿入を保有する。ジャーカット細胞株は、１７４０位に１７個のアミノ酸を挿入する、クラス３のＪＥＭ突然変異を有する。
【０２７０】
ラット４３８−ｍＩｇＧ１抗体、ヒト化４３８ＶＨ１．１／ＶＬ１．８抗体、ラット３５１−ｍＩｇＧ１抗体またはＡ２抗体、および対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体の濃度を増加させて用いて処理したＴ−ＡＬＬ細胞株から生成したタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析により、ノッチ１活性化およびノッチ１ＩＣＤの放出を調べた。放出された、バリン残基から始まるノッチ１ＩＣＤ分子を、Ｄ３Ｂ８抗体（抗ノッチ１ＩＣＤ）を用いて特異的に検出する。
【０２７１】
Ｔ−ＡＬＬ細胞株であるＨＰＢ−ＡＬＬ細胞、ＡＬＬ−ＳＩＬ細胞、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞、ＭＯＬＴ−４細胞、ＤＮＤ−４１細胞およびジャーカット細胞を、上記のＣＣＤ１０７６ＳＫ線維芽細胞の代わりに使用した。Ｔ−ＡＬＬ細胞は、構成的に放出されるノッチ１ＩＣＤを保有するので、外来のＤＬＬ４リガンドを必要としなかった。２×１０Ｅ６個のＴ−ＡＬＬ細胞の浮遊培養物を、１０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／グルタミンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で、０、０．００１、０．０１、０．１、１および１０μｇ／ｍｌのラット４３８−ｍＩｇＧ１抗体、ヒト化４３８ＶＨ１．１／ＶＬ１．８抗体、ラット３５１−ｍＩｇＧ１抗体またはＡ２抗体および対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体と混合した。細胞を、抗体と共に、５％ＣＯ２中、３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を、遠心分離により収集し、培地を、吸引により除去した。Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含有する、１％ＮＰ４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中に、細胞ペレットを溶解した。抽出物を、７．５％ポリアクリルアミドゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース紙に、ｉＢｌｏｔゲル移動システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して移動させた。放出された、バリン残基から始まるノッチ１ＩＣＤ分子を、標準的なウエスタンブロットの手順を使用して、抗ノッチ１ＩＣＤおよび充填対照としての抗ベータ−アクチンを用いて検出した。濃度測定解析を、フィルム上で実施し、これらのフィルムを、ＢｉｏＲａｄ  ＧＳ−８００  Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ  Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒを用いてスキャンし、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ、４．６．９版ソフトウエア（ＢｉｏＲａｄ）を用いて解析した。ノッチ１ＩＣＤのレベルを、各試料中のベータ−アクチンに対して正規化し、次いで、未処理の対照と比較した。
【０２７２】
図１９に示すように、ラット４３８−ｍＩｇＧ１およびヒト化４３８ＶＨ１．１／ＶＬ１．８の濃度を増加させて用いてＨＢＰ−ＡＬＬ細胞を処理すると、構成的なノッチ１活性化が顕著に阻害され、このことは、検出されたノッチ１ＩＣＤの放出のレベルによって示されている。したがって、１５７５位におけるロイシンからプロリンへの突然変異は、ラット４３８−ｍＩｇＧ１抗体およびヒト化４３８ＶＨ１．１／ＶＬ１．８抗体の、ノッチ１活性化を阻害する能力に影響を及ぼさなかった。このことは、ラット４３８抗体が、野生型ＮＲＲ−抗体の共結晶構造において、１５７５位のアミノ酸と相互作用しなかったことを示す表１４と一致している。
【０２７３】
図２０および表２２に示すように、ラット４３８−ｍＩｇＧ１、ラット３５１−ｍＩｇＧ１およびＡ２の濃度を増加させて用いて、Ｔ−ＡＬＬ細胞株のＨＰＢ−ＡＬＬ細胞、ＡＬＬ−ＳＩＬ細胞、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞、ＭＯＬＴ−４細胞およびＤＮＤ−４１細胞を処理すると、ノッチ１活性化が用量依存的に阻害され、このことは、ウエスタンブロットおよび濃度測定解析による、ノッチ１ＩＣＤの放出の検出の減少によって示されている。対照的に、ラット３５１−ｍＩｇＧ１およびＡ２の濃度を増加させて用いてジャーカット細胞を処理しても、ノッチ１活性化は阻害され得ず、このことは、ウエスタンブロット分析によるノッチ１ＩＣＤの放出の検出によって示されている。予想通り、対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体は、Ｔ−ＡＬＬ細胞株のうちのいずれにおいても、ノッチ１ＩＣＤの放出のレベルに対する作用を示さなかった。
【０２７４】
ラット４３８−ｍＩｇＧ１抗体、ラット３５１−ｍＩｇＧ１抗体およびＡ２抗体は同様に、クラス１（Ｌ１５７５Ｐを有するＨＰＢ−ＡＬＬ細胞、Ｌ１５９４Ｐを有するＡＬＬ−ＳＩＬ細胞、Ｌ１６０１Ｐを有するＭＯＬＴ−４細胞および複合のクラス１の突然変異Ｌ１５９４Ｐ／Ｄ１６１０Ｖを有するＤＮＤ−４１細胞）ならびにクラス２（１５９５位における１２個のアミノ酸の挿入を有するＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞株）のＮＲＲの突然変異を有する特定のＴ−ＡＬＬ細胞株において、ノッチ１活性化およびノッチ１ＩＣＤの放出を阻害し、ラット３５１−ｍＩｇＧ１およびＡ２は、クラス３のＪＥＭ突然変異を有するジャーカット細胞においては、ノッチ１受容体の切断およびノッチ１ＩＣＤの放出を阻害し得なかった。さらに、ラット３５１−ｍＩｇＧは、図２０および表２２に示すように、図１８および表２１に示す、ラット３５１による、ネイティブなノッチ１受容体のノッチ１活性化の阻害と比較して、突然変異ノッチ１受容体のノッチ１活性化のより高い阻害も示した。
【０２７５】
【表２２】
0006016800.tif 000045
【０２７６】
Ｃ．抗ノッチ１阻害性抗体の、突然変異ノッチ１受容体を有するＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）細胞株の生存率に対する作用
抗ノッチ１抗体のＨＢＰ−ＡＬＬ細胞に対する作用を、ＭＴＳ細胞生存率指標（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用し、処理後のパーセント生存細胞を決定してさらに評価した。ＭＴＳ試薬は、４９０ナノメートルの光学密度（Ｏ．Ｄ．４９０ｎｍ）で測定することができる産物に、死んだ細胞ではなく、代謝活性を示す、生きている細胞より変換された。１０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／グルタミンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中のＨＢＰ−ＡＬＬ細胞（１×１０Ｅ４細胞／ウエル）を、０、０．４７、１．８８、７．５ならびに３０μｇ／ｍｌのヒト化４３８ＶＨ１．１／ＶＬ１．８抗体、ラット４３８−ｍＩｇＧ１抗体、ラット３５１−ｍＩｇＧ１抗体およびＡ２抗体ならびに対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体と共に７日間インキュベートし、次いで、ＭＴＳ試薬を用いて、製造元の指示に従ってアッセイした。
【０２７７】
表２３は、ラット４３８−ｍＩｇＧ１抗体、ラット３５１−ｍＩｇＧ１抗体およびＡ２抗体、ならびに対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体の濃度を増加させて用いる、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞の抗ノッチ１阻害性抗体による処理のＭＴＳ生存率アッセイを示す。結果として、ラット４３８−ｍＩｇＧ１、ラット３５１−ｍＩｇＧ１およびＡ２の濃度を３０μｇ／ｍｌまで増加させて用いて処理したＨＢＰ−ＡＬＬ細胞は、対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）による処理よりも低い、変換されたＭＴＳ試薬のＯ．Ｄ．４９０ｎｍにおけるレベルを示した。このことは、ラット４３８−ｍＩｇＧ１、ラット３５１−ｍＩｇＧ１およびＡ２により処理した細胞の場合、より少ない細胞が存在したことを示し、これは、細胞死の増加および／または増殖の減少の結果である。
【０２７８】
【表２３】
0006016800.tif 000046
【０２７９】
表２４に示すように、類似の結果が、ヒト化４３８ＶＨ１．１／ＶＬ１．８についても観察され、この表は、ヒト化４３８ＶＨ１．１／ＶＬ１．８、ラット４３８−ｍＩｇＧ１および対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）の濃度を増加させて用いる、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞の抗ノッチ１阻害性抗体による処理のＭＴＳアッセイを示す。したがって、ノッチ１活性化の阻害に加えて、また、ヒト化４３８ＶＨ１．１／ＶＬ１．８抗体は、Ｔ−ＡＬＬ患者における共通の特色であるノッチ１のＮＲＲドメイン中の突然変異を有するがん細胞の増殖も阻害した。
【０２８０】
【表２４】
0006016800.tif 000047
【０２８１】
突然変異させたラット３５１抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける活性を実証するために、ラット３５１−ｍＩｇＧ１抗体、ラット３５１（Ｒ５８Ｙ）−ｍＩｇＧ１抗体、ラット３５１（Ｒ５８Ｙ／Ｖ６０Ａ）−ｍＩｇＧ１抗体、４３８ヒト化ＶＨ１．１／ＶＬ１．８抗体、Ａ２抗体または対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体のいずれかの濃度を増加させて用いて、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞を処理した。表２５は、抗ノッチ１阻害性抗体による処理のＭＴＳアッセイ、およびそれらの結果として得られたＩＣ５０値を示す。ラット３５１（Ｒ５８Ｙ）−ｍＩｇＧ１抗体およびラット３５１（Ｒ５８Ｙ／Ｖ６０Ａ）−ｍＩｇＧ１抗体の両方が、ＨＰＢ−ＡＬＬの増殖を阻害するが、それらのＩＣ５０値により決定する場合、野生型ラット３５１−ｍＩｇＧ１抗体よりも、ヒト化４３８ＶＨ１．１／ＶＬ１．８により類似する様式で阻害した。したがって、ラット３５１−ｍＩｇＧ１中のＡｒｇ５８残基は、突然変異ＮＲＲを有するノッチ１受容体に対する、その強力な阻害活性に寄与した。
【０２８２】
【表２５】
0006016800.tif 000048
【０２８３】
（実施例９）
抗ノッチ１阻害性抗体の、ヒト腫瘍異種移植片のｉｎ  ｖｉｖｏにおける増殖に対する作用
Ａ．ノッチ１とジャギド１との同時免疫組織化学的検査
抗ノッチ１阻害性抗体の作用を、それらの潜在的な有効性を最大化するために、異種移植した腫瘍および宿主の間質細胞の両方の中でノッチ１を発現する前臨床モデルにおいて試験した。ノッチ１およびそのリガンドのうちの１つであるジャギド１を発現する前臨床モデルを同定するために、抗ノッチ１抗体および抗ジャギド１抗体を使用する免疫組織化学的検査を、３７６２２Ａ１非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）に対して実施し、この移植片を以下、「３７６２２Ａ１  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸ」と呼ぶ。３７６２２Ａ１  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸから得られた組織断片に、標準的な組織学的手順を使用して、ホルマリン固定およびパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）を行った。５ミクロンのＦＦＰＥ切片を、切断し、脱ろうし、蒸留水に対して水和させた。抗原を、圧力釜中で、ｐＨ６．０のクエン酸緩衝液中に回収した。内在性のペルオキシダーゼを、０．３％Ｈ２Ｏ２を用いて１５分かけてブロックした。切片を、ＤＡＫＯタンパク質ブロックと共に２０分間インキュベートした。内在性のビオチンを、アビジン／ビオチンのブロックキット（Ｖｅｃｔｏｒ）によりブロックした。１：５０の希釈度のウサギ抗ノッチ１（ａｂ５２６２７；Ａｂｃａｍ）を、切片に室温で１時間適用した。抗ウサギＩｇＧ−ビオチン（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏ）を、切片に室温で３０分間適用した。ストレプトアビジン−ＨＲＰを、切片に室温で３０分間添加した。ＤＡＢを使用して、５分間発色させた。切片を、ｐＨ６．０のクエン酸緩衝液中、９８℃で１０分間加熱して、最初の反応に由来する、結合している抗ノッチ１一次抗体および抗ウサギＩｇＧ二次抗体を破壊した。切片を、ＤＡＫＯタンパク質ブロック中で２０分間ブロックし、１：１００の希釈度のウサギ抗ジャギド１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）と共に室温で２時間インキュベートした。抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰのポリマー（ＤＡＫＯ）を、室温で３０分間適用した。ＩｍｍＰＡＣＴ  ＶＩＰ基質を使用して、７分間発色させた。切片を、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリン中で短時間対比染色し、脱水し、清澄化し、カバーガラスで覆った。
【０２８４】
図２１に示すように、３７６２２Ａ１  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸは、（実線で境界を定めた）腫瘍細胞のクラスター内で、ヒトノッチ１受容体（破線の左）およびヒトジャギド１リガンド（破線の右）の異種性の発現を示した。また、核性のノッチ１ＩＣＤ（矢印）も、ヒトノッチ１腫瘍細胞とヒトジャギド１腫瘍細胞との界面において検出し、これは、活性なノッチ１シグナル伝達を示している。また、マウス間質内では、マウスノッチ１も、ＰＤＸ関連の血管構造において検出され、このことは、ノッチ１シグナル伝達がマウス新生児の網膜における血管形成を制御するというこれまでの知見と一致している。３７６２２Ａ１  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸにおけるノッチ１およびジャギド１の発現パターンから、このモデルが、抗ノッチ１抗体のｉｎ  ｖｉｖｏにおける作用を調べるための適切なモデルであることが示された。
【０２８５】
ＮＳＣＬＣにおいては、Ｋ−ｒａｓが、腫瘍の増殖を促す、頻繁に突然変異するがん遺伝子である。したがって、３７６２２Ａ１  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸから得られたＫ−ｒａｓ遺伝子を配列決定して、この遺伝子が野生型Ｋ−ｒａｓまたは突然変異したＫ−ｒａｓのいずれを含有するかを決定した。ゲノムＤＮＡを、３７６２２Ａ１  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸの断片から、ＰｒｅｐＧＥＭキットを使用して、製造元（ＺｙＧＥＭ、Ｓｏｌａｎａ  Ｂｅａｃｈ、ＣＡ）の指示に従って単離した。Ｋ−ｒａｓのＤＮＡ配列を、ＫＯＤポリメラーゼ（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）を用いて、順方向プライマーおよび逆方向プライマーを使用して増幅した。ＰＣＲサイクリングの条件：７５℃、１５分間を１サイクル、９５℃、５分間を１サイクル、９６℃、１分間を１サイクル、ならびに９６℃、１５秒間、６０℃、１５秒間および７２℃、４０秒間を３５サイクル、ならびに７２℃、１分２０秒間を１サイクル。４９６塩基対の増幅したＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて精製し、ＤＮＡを、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１  Ｃｙｃｌｅ配列決定キット（ＡＢＩ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて、製造元の指示に従って配列決定した。
【０２８６】
図２２に示すように、ＤＮＡ配列解析により、３７６２２Ａ１  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸは、ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子中のアミノ酸１３におけるグリシンからバリン（ＤＮＡ配列ＧＴＴがコードする）への突然変異（Ｇ１３Ｖ）を保有することが示された。
【０２８７】
Ｂ．ＮＳＣＬＣ異種移植片のｉｎ  ｖｉｖｏにおける増殖阻害研究
適切な同意手順に従って得られた、用時切除したＮＳＣＬＣ腫瘍（Ａｓｔｅｒａｎｄ）の断片から確立された、ヒト腫瘍異種移植片のｉｎ  ｖｉｖｏにおける増殖に対する、抗ノッチ１阻害性抗体の作用を、免疫不全マウスにおいて調べた。８７３９３Ａ１  ＮＳＣＬＣ患者由来の異種移植片および３７６２２Ａ  ＮＳＣＬＣ患者由来の異種移植片（以下それぞれ、「８７３９３Ａ１  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸ」および「３７６２２Ａ１  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸ」と呼ぶ）をそれぞれ、動物間移植断片として、ＮＯＤ−ＳＣＩＤかつヌード（Ｎｕ／Ｎｕ）の雌マウス中のｉｎ  ｖｉｖｏにおいて継代した。
【０２８８】
腫瘍が、２００〜４００ｍｍ３の体積に達したら、それらを段階分けして、種々の処理群間の腫瘍サイズの一様性を確保してから、抗ノッチ１抗体および対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体の投与を行った。３７６２２Ａ１  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸモデルには、１０ｍｇ／ｋｇのラット４３８−ｍＩｇＧ１およびＡ２ならびに対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体を週１回３週間ｉ．ｐ．投与した。８７３９３Ａ１  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸモデルには、２０ｍｇ／ｋｇのラット３５１−ｍＩｇＧ１および対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体を週２回４週間ｉ．ｐ．投与した。腫瘍を、少なくとも週１回測定し、それらの体積を、式：腫瘍体積（ｍｍ３）＝０．５×（腫瘍の幅２）（腫瘍の長さ）を用いて計算した。８〜１１匹の動物から、それぞれの処理群についての平均腫瘍体積（±ＳＥＭ）を計算し、対照処理と比較した。
【０２８９】
表２６は、対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体と比較した、Ｋ−ｒａｓ中のＧ１３Ｖ突然変異を有する、３７６２２Ａ１  ＮＳＣＬＣ患者に由来する異種移植片におけるラット４３８−ｍＩｇＧ１抗体およびＡ２抗体の有効性を示す。３７６２２Ａ１  ＰＤＸのラット４３８−ｍＩｇＧ１による増殖阻害から、活性化されたノッチ１および／またはＫ−ｒａｓがん遺伝子中の突然変異を有するＮＳＣＬＣは、ノッチ１経路の阻害剤に対して感受性を示し得るであろうことが示されている。
【０２９０】
【表２６】
0006016800.tif 000049
【０２９１】
表２７は、対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体と比較した、８７３９３Ａ１  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸにおけるラット３５１−ｍＩｇＧ１の有効性を示す。ラット３５１−ｍＩｇＧ１を用いた処理の結果、第２８日に、対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）により処理した腫瘍と比較して、２９％の腫瘍増殖阻害が生じた。
【０２９２】
【表２７】
0006016800.tif 000050
【０２９３】
ノッチ１活性化が阻害されたことを確認するために、研究の終わりに、Ｄ３Ｂ８抗体（抗ノッチ１ＩＣＤ）を使用するウエスタンブロット分析を、異種移植片から生成したタンパク質抽出物に対して実施した。研究の終わりに、ラット４３８−ｍＩｇＧ１、Ａ２および対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）により処理した３７６２２Ａ１  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸモデルからの異種移植片、ならびにラット３５１−ｍＩｇＧ１および対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）により処理した８７３９３Ａ１  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸモデルからの異種移植片を収集した。Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含有する、１％ＮＰ４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中に、腫瘍組織を溶解した。抽出物を、７．５％ポリアクリルアミドゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース紙に、ｉＢｌｏｔゲル移動システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して移動させた。放出された、バリン残基から始まるノッチ１ＩＣＤ分子を、Ｄ３Ｂ８抗体（抗ノッチ１ＩＣＤ）を用いて検出し、ノッチ１のＣ末端ドメインの総合的なレベルを、標準的なウエスタンブロットの手順を使用して、Ｄ１Ｅ１１（抗ノッチ１）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて検出した。β−アクチンを、充填対照として示す。
【０２９４】
図２３は、ラット４３８−ｍＩｇＧ１およびＡ２を用いて処理した３７６２２Ａ１  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸから生成したタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析を示す。ノッチ１ＩＣＤの放出の検出を、対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）により処理した腫瘍において観察したが、ラット４３８−ｍＩｇＧ１により処理した腫瘍においては観察せず、後者は、ノッチ１活性化の阻害を示している。図２４は、ラット３５１−ｍＩｇＧ１抗体および対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体を用いて処理した８７３９３Ａ１  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸから生成したタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析を示す。ノッチ１ＩＣＤの放出の検出を、対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）により処理した腫瘍において観察したが、ラット３５１−ｍＩｇＧ１により処理した腫瘍においては観察せず、後者は、ノッチ１活性化の阻害を示している。
【０２９５】
元々の８７３９３Ａ１  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸ標本に属するドナーの臨床情報によれば、患者の腫瘍は、肺の侵襲性の分化が乏しい扁平上皮癌であることが示された。インボルクリンは、肺腫瘍における扁平上皮細胞の分化についてのマーカーである（Ｓａｉｄ，Ｊ．Ｗ．ら、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、１９８３、ｖｏｌｕｍｅ  ４９、５６３〜５６８）。ノッチ１活性化の阻害が、８７３９３Ａ１  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸ腫瘍細胞の分化に対して作用を示すかどうかを決定するために、インボルクリンの発現を、免疫組織化学的検査およびウエスタンブロット分析により解析した。図２５および２６はそれぞれ、ラット３５１−ｍＩｇＧ１および対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）により処理した腫瘍の、インボルクリンの免疫組織化学的検査およびウエスタンブロット分析を示す。８７３９３Ａ１  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸにおけるノッチ１活性化の阻害の結果、免疫組織化学的検査およびウエスタンブロット分析が示すように、インボルクリンの発現レベルの増加が生じた。したがって、腫瘍サイズの低下に加えて、また、抗ノッチ１による処理により、腫瘍細胞の分化も増加した。
【０２９６】
ノッチ１活性化の阻害が単独で体重に影響を及ぼすかどうかを決定するために、マウスを、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性の研究間に体重測定した。表２８は、８７３９３Ａ１  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸにおいて、研究の間のラット３５１−ｍＩｇＧにより処理した群および対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体により処理した群のマウス体重（−腫瘍重量）の平均が顕著には異ならなかったことを示す。
【０２９７】
【表２８】
0006016800.tif 000051
【０２９８】
Ｃ．ＨＰＢ−ＡＬＬ異種移植片についての、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける増殖阻害研究
上記に記載した３７６２２Ａ１  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸおよび８７３９３Ａ１  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸを用いて実施した実験に類似するｉｎ  ｖｉｖｏにおける実験を、突然変異ノッチ１ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞株を用いて実施した。異種移植片を生成するために、ヌード雌マウス（Ｎｕ／Ｎｕ）に、５０％マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中の８×１０Ｅ６個のＨＰＢ−ＡＬＬ細胞を皮下に埋め込んだ。腫瘍が、２００〜４００ｍｍ３の体積に達したら、腫瘍を段階分けして、種々の処理群間の腫瘍質量の一様性を確保してから、抗ノッチ１抗体および対照のＤ１６Ａ抗体の投与を行った。ＨＰＢ−ＡＬＬモデルに、２０ｍｇ／ｋｇのラット４３８−ｍＩｇＧ１、ラット３５１−ｍＩｇＧ１、Ａ２またはＤ１６Ａ抗体を、週２回２週間ｓ．ｃ．投与した。腫瘍を、少なくとも週１回測定し、それらの体積を、式：腫瘍体積（ｍｍ３）＝０．５×（腫瘍の幅２）（腫瘍の長さ）を用いて計算した。８〜１１匹の動物から、それぞれの処理群についての平均腫瘍質量（±ＳＥＭ）を計算し、対照処理と比較した。
【０２９９】
表２９は、ノッチ１ＮＲＲ中のＬ１５７５Ｐ突然変異を有するＨＰＢ−ＡＬＬ異種移植片における、ラット４３８−ｍＩｇＧ１抗体、ラット３５１−ｍＩｇＧ１抗体およびＡ２抗体の有効性を示す。データは、ラット４３８−ｍＩｇＧ１を用いた処理およびラット３５１−ｍＩｇＧ１処理の両方が、対照のＤ１６Ａ抗体と比較して、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏにおける増殖を阻害し、したがって、腫瘍の増殖を緩慢化したことを実証している。
【０３００】
【表２９】
0006016800.tif 000052
【０３０１】
Ｄ．Ｃａｌｕ−６  ＮＳＣＬＣ異種移植片についての、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける増殖阻害研究
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける研究について上記したＨＰＢ−ＡＬＬ細胞を用いて実施した実験に類似する実験を、Ｃａｌｕ−６  ＮＳＣＬＣ細胞株を用いて実施した。Ｃａｌｕ−６異種移植片を、最初に、ヌード雌マウス（Ｎｕ／Ｎｕ）において、２×１０Ｅ６個のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて５０％マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で培養した細胞から確立し、次いで、腫瘍の動物間移植断片として、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて連続継代した。腫瘍が、２００〜４００ｍｍ３の体積に達したら、腫瘍を段階分けして、種々の処理群間の腫瘍サイズの一様性を確保してから、抗ノッチ１抗体および対照抗体の投与を行った。Ｃａｌｕ−６モデルに、３、１０および３０ｍｇ／ｋｇのラット４３８−ｍＩｇＧ１もしくはＡ２、または１０ｍｇ／ｋｇの対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）を、週２回２週間ｉ．ｐ．投与し、腫瘍を、少なくとも週１回測定し、それらの体積を、式：体積（ｍｍ３）＝０．５×（腫瘍の幅２）（腫瘍の長さ）を用いて計算した。８〜１１匹の動物から、それぞれの処理群についての平均腫瘍体積（±ＳＥＭ）を計算し、対照処理と比較した。
【０３０２】
Ｃａｌｕ−６モデルが、ノッチ経路阻害剤、例として、抗ＤＬＬ４抗体（Ｒｉｄｇｅｗａｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ４４４：１０８３〜１０８７、２００６）およびＡ２抗体に応答することが以前に実証されていることから選ばれた。表３０は、Ｃａｌｕ−６肺がんモデルにおける、ラット４３８−ｍＩｇＧ１およびＡ２の有効性を示す。３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇのラット４３８−ｍＩｇＧ１を用いた処理の結果、腫瘍の増殖の用量依存的な減少が生じた。しかし、Ｃａｌｕ−６異種移植片の効率的な（＞５０％の）増殖の低下は、３０ｍｇ／ｋｇの用量においてのみ生じ、この用量は、３７６２２Ａ１  ＰＤＸの増殖を類似のレベルまで阻害するのに必要な用量よりも３倍高かった。
【０３０３】
【表３０】
0006016800.tif 000053
【０３０４】
ノッチ１シグナル伝達の阻害が単独で体重に影響を及ぼすかどうかを決定するために、マウスを、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性の研究間に体重測定した。表３１は、研究の間の、ラット４３８−ｍＩｇＧ１により処理した群およびＡ２により処理した群ならびに対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）により処理した群のマウス体重（−腫瘍重量）の平均が、顕著には異ならなかったことを示す。
【０３０５】
【表３１】
0006016800.tif 000054
【０３０６】
Ｅ．乳がん異種移植片についての、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける増殖阻害研究
ヒト化４３８ＶＨ１．１／ＶＬ１．８の作用を、トリプルネガティブ乳がん異種移植モデルであるＳｕｍ１４９およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１において、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける増殖に対して調べた。胸腺欠損雌マウス（Ｎｕ／Ｎｕ、６〜８週齢）を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手し、国際実験動物管理公認協会の指針に従って、病原体を含有しない特定条件下で飼育した。動物に、無菌のげっ歯類用固形飼料および水を自由に与えた。
【０３０７】
胸腺欠損マウス中に埋め込むための細胞を収集し、４５０×ｇで５〜１０分間遠心分離することによってペレット化した。細胞ペレットを１回洗浄し、無菌の無血清培地中に再懸濁させた。腫瘍細胞に、５０％マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を補充して、異種移植片として選択した腫瘍細胞が腫瘍として取り込まれ、増殖するのを促進した。細胞（１００μＬ中の２〜３×１０６個）を、マウスの後側腹部領域中の皮下に埋め込み、指定のサイズまで増殖させてから、それぞれの実験のために、化合物の投与を行った。
【０３０８】
腫瘍に対する有効性について、１５０〜３００ｍｍ３のサイズの腫瘍を担持する動物を、対照抗体（２６Ｈ６）またはヒト化４３８ＶＨ１．１／ＶＬ１．８のいずれかを投与する群に無作為に分け、週１回のｓ．ｃ．注射により投与を行った。ドセタキセルを、週１回のｉ．ｐ．注射により投与した。腫瘍を、２〜３日毎に測定した。腫瘍体積（ｍｍ３）を、副尺ノギスを用いて測定し、式：長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）×幅（ｍｍ）×０．５２を使用して計算し、表３２および３３に示した。
【０３０９】
【表３２】
0006016800.tif 000055
【０３１０】
【表３３】
0006016800.tif 000056
【０３１１】
パーセント（％）阻害値を、研究の最終日に、ビヒクル処理マウスと比較して、薬物処理マウスについて測定し、１００−｛１−［（処理最終日−処理第１日）／（対照最終日−対照第１日）］｝として計算した。全ての腫瘍増殖阻害実験について、８〜１０匹のマウス／用量群を使用した。スチューデントのｔ検定を使用して、Ｐ値を決定した。表３４は、トリプルネガティブ乳がん異種移植モデルにおけるヒト化４３８ＶＨ１．１／ＶＬ１．８の有効性を示す。
【０３１２】
【表３４】
0006016800.tif 000057
【０３１３】
（実施例１０）
抗ノッチ１阻害性抗体の、腸細胞の分化および増殖に対する作用
ノッチシグナル伝達が薬理学的および遺伝子的に阻害されると、腸腺窩内の増殖性の前駆細胞が分泌性の杯細胞に変換される（ｖａｎ  Ｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ４３５：９５９〜９６３、２００５）。抗ノッチ１阻害性抗体の、マウス腸中の細胞の増殖および分化に対する作用を、実施例９のＣａｌｕ−６および８７３９３Ａ１  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸにおける有効性研究から収集した組織に関して調べた。ムチン（すなわち、分泌性の杯細胞）についてのアルシアンブルー染色および増殖についての抗Ｋｉ６７を使用する免疫組織化学的検査を、腸試料に対して実施した。
【０３１４】
マウス小腸を、Ｃａｌｕ−６および８７３９３Ａ１  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸにおける有効性研究から収集し、長軸方向に切り取り、ホルマリン固定し、７０％ＥＴＯＨ中に保った。次いで、組織をパラフィン中に包埋した。アルシアンブルー染色を、粘液物質について、製造元の指示に従って実施した。抗Ｋｉ６７抗体（ＳＰ６、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を使用する免疫組織化学的検査を、ＤＡＫＯ  Ａｕｔｏ  Ｓｔａｉｎｅｒ（ＤＡＫＯ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）上で、製造元の指示に従って実施して、細胞増殖を示した。
【０３１５】
１．画像の獲得
染色した組織切片を、Ｎａｎｏｚｏｏｍｅｒ  Ｓｌｉｄｅ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ、Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、ＮＪ）上で、２０×ｏｂｊの設定を使用してスキャンした。画像をスキャンし、ｎｄｐファイルフォーマットとして保存した。仮想画像を、Ａｐｅｒｉｏ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｃｏｐｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｅｒｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖｉｓｔａ、ＣＡ）中で開いた。腸管腔の向かい合う側面から得られた２つの画像を、１０×の仮想倍率で捕捉し、Ｔｉｆｆ画像として保存した。
【０３１６】
図２７は、Ｃａｌｕ−６有効性研究から得られたマウス腸の回腸切片に対するアルシアンブルー染色を使用した、分泌性の杯細胞の組織化学的同定を示し、この有効性研究では、１０ｍｇ／ｋｇのラット４３８−ｍＩｇＧ１、Ａ２または対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体のいずれかを用いて処理が行われていた。腸の絨毛および腺窩の代表的な画像を示す。杯細胞を、矢印で画定し、簡単にするために、各画像中の１個の細胞のみを、例として強調している。抗ノッチ１抗体は、研究の間に、体重減少を引き起こさなかったが、ラット４３８−ｍＩｇＧ１またはＡ２のいずれかを用いた処理により、分泌性の杯細胞の分化が誘導され、このことは、絨毛および腺窩中のアルシアンブルー染色の増加により証明されている。したがって、ノッチ１シグナル伝達の阻害は、単独で杯細胞の分化を増加させたが、体重に顕著な影響を及ぼすレベルではなかった。
【０３１７】
２．画像解析
仮想画像を、Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ−Ｐｌｕｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）中で開いた。手動で描いたＡｒｅａ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（ＡＯＩ）を作り出し、ここには、腸組織（腺窩および絨毛）を含めたが、平滑筋、人工物、ひだおよびデブリは除外した。アルシアンブルー染色領域および組織領域を同定するための閾値を求めた。閾値を、ＡＯＩに適用し、レンジ別統計を、Ｅｘｃｅｌ表計算ソフトにエクスポートした。Ｅｘｃｅｌにおいて、平均アルシアンブルー染色比を、各動物について、２つの収集した染色比から計算して、動物毎に単一の計算したアルシアンブルー染色比を得た。平均アルシアンブルー染色比および標準偏差を、各群について求めた。統計操作を、ＪＭＰ統計ソフトウエア（ＪＭＰ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を使用して実施した。
【０３１８】
表３５は、Ｃａｌｕ−６有効性研究においてラット４３８−ｍＩｇＧ１およびＡ２ならびに対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体により処理したマウス腸のアルシアンブルー染色比の画像定量化を示す。１０ｍｇ／ｋｇの抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）対照と比較して、１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇで投与したラット４３８−ｍＩｇＧ１において、アルシアンブルー染色比が顕著に増加した。アルシアンブルー染色の定量的画像解析により、図２７に示す領域と比較して、回腸のより大きな領域にわたる杯細胞の分化の増加が確認されている。
【０３１９】
【表３５】
0006016800.tif 000058
【０３２０】
各処理群から得られた平均（ａｖｅｒａｇｅ  ｏｒ  ｍｅａｎ）アルシアンブルー染色比間の一対比較の統計学的解析を、表３６に示す。それぞれの対についての比を、スチューデントのｔ検定を使用して決定した。正の値は、顕著に異なる、対の平均を示す。Ａ２とは異なり、３ｍｇ／ｋｇで投与したラット４３８−ｍＩｇＧ１は、対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体と比較して、アルシアンブルー染色比の顕著な増加は誘導しなかった。さらに、１０ｍｇ／ｋｇで投与したＡ２は、１０ｍｇ／ｋｇで投与したラット４３８−ｍＩｇＧ１と比較して、アルシアンブルー染色比の顕著な増加を誘導し、このことは、ラット４３８−ｍＩｇＧ１が腸細胞において引き起こした細胞の分化はＡ２よりも低いことを示唆している。
【０３２１】
【表３６】
0006016800.tif 000059
【０３２２】
図２８は、１０ｍｇ／ｋｇのラット４３８−ｍＩｇＧ１、Ａ２または対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体のいずれかを用いる処理を行ったＣａｌｕ−６有効性研究から得られたマウス腸腺窩に対する、抗Ｋｉ６７の免疫組織化学的検査を示す。Ｋｉ６７で染色した腸腺窩の代表的な画像を示す。Ｋｉ６７染色が、腺窩の基部で、ラット４３８−ｍＩｇＧ１により処理した動物において低下したが、対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）により処理した動物においては低下しなかった。Ｋｉ６７で染色した増殖性の腺窩細胞の喪失は、アルシアンブルー染色により観察された、有糸分裂後の杯細胞への変換と一致した。
【０３２３】
表３７は、８７３９３Ａ１  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸ有効性研究において、ラット３５１−ｍＩｇＧ１により処理したマウス腸および対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体により処理したマウス腸のアルシアンブルー染色比の画像定量化を示す。抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）対照と比較して、ラット３５１−ｍＩｇＧ１処理マウスにおいては、アルシアンブルー染色比の有意な差はなかった（ｐ＝０．２２）。アルシアンブルー染色の定量的画像解析により、ラット３５１−ｍＩｇＧ１は、他のノッチ経路阻害剤のようには、杯細胞の過形成を誘導しないことが示された。したがって、ラット３５１−ｍＩｇＧ１を用いるノッチ１シグナル伝達の阻害は、杯細胞の分化を増加させなかった。
【０３２４】
【表３７】
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【０３２５】
図２９および表３８は、ラット３５１−ｍＩｇＧ１抗体または対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体のいずれかを用いて処理を行った８７３９３Ａ１  ＮＳＣＬＣ  ＰＤＸ有効性研究から得られたマウス腸腺窩に対する、抗Ｋｉ６７の免疫組織化学的検査およびＫｉ６７染色比の定量化を示す。図２９は、Ｋｉ６７で染色した腸腺窩の代表的な画像を示し、これらの画像から、Ｋｉ６７染色が、腺窩の基部で、ラット３５１−ｍＩｇＧ１により処理した動物において低下したが、対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）により処理した動物においては低下しなかったことが示されている。
【０３２６】
表３８は、この観察結果と一致する、ラット３５１−ｍＩｇＧ１により処理したマウス腸および対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体により処理したマウス腸のＫｉ６７染色比の画像定量化を示す。データは、ラット３５１−ｍＩｇＧ１による処理において、対照の抗鶏盲腸コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）抗体による処理と比較して、Ｋｉ６７染色比の小さいが、静的に有意な（ｐ＝０．０２３）減少があることを示している。Ｋｉ６７染色比の定量分析は、腺窩の基部における細胞の増殖の減少を示し、このことは、図２９の上部パネルに示す領域と比較して、回腸のより大きな領域にわたるＫｉ６７染色の相対レベルの低下により示されている。したがって、ラット３５１−ｍＩｇＧ１を用いるノッチ１シグナル伝達の阻害により、増殖が減少した。
【０３２７】
【表３８】
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【０３２８】
（実施例１１）
抗ノッチ１阻害性抗体の薬物動態および薬力学
１．ヨウ素化の手順
ヨウ素化を、ＩＯＤＯ−ＢＥＡＤＳ法を使用して、製造元（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）の指示に従って実施した。手短に述べると、約２００μｇの試験物品を、２ｍＣｉの１２５−ヨウ素（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）当たり使用し、２つのＩＯＤＯ−ＢＥＡＤＳおよび約２００μＬのＰＢＳと共に、室温で１５〜２５分間インキュベートした。反応混合物を、ＩＯＤＯ−ＢＥＡＤＳから、ろ過（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ製）により分離した。
【０３２９】
２．投与用溶液の調製および特徴付け
ラット４３８−ｍＩｇＧ１については、１０ｍＬ／ｋｇの投与体積のマウスにおける投与を可能にするために、未標識試験物品のラット４３８−ｍＩｇＧ１、微量の１２５Ｉ標識試験物品および調合用緩衝液（ＰＢＳ）を混合することによって、投与用溶液を調製して、２ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得た。ラット３５１−ｍＩｇＧ１については、群Ｉ（５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．）、群ＩＩ（５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）および群ＩＩＩ（３０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）のためにそれぞれ、２．５、１０および１２．５ｍＬ／ｋｇの投与体積のマウスにおける投与を可能にするために、未標識試験物品のラット３５１−ｍＩｇＧ１、微量の１２５Ｉ標識試験物品および調合用緩衝液（ＰＢＳ）を混合することによって、３つの投与用溶液を調製して、２、０．５および２．４ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得た。
【０３３０】
遊離のヨウ素が占める投与用溶液中の放射活性の割合（「％遊離ヨウ素」）を、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）による沈殿を使用して決定した。投与用溶液の一定分量（５μＬ）を、マウス血清（４５μＬ）と混合し、総放射活性について（三つ組で）計数した（Ｍｏｄｅｌ  １４８０  ＷＩＺＡＲＤ（登録商標）、Ｗａｌｌａｃ  Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、またはＭｏｄｅｌ２４７０、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ）。ＴＣＡ（５０μＬの２０％原液）を、試料に添加した。試料を、およそ３０００ｇで１０分間遠心分離した。得られた上清の５０μＬの一定分量を、１分当たりの可溶性カウント（ｃｐｍ）について計数した。投与用溶液中の遊離ヨウ素の割合を、式：［２×平均可溶性溶出ｃｐｍ／平均総溶出ｃｐｍ×１００％］を使用して計算した。投与用溶液の比活性（μＣｉ／ｍｇ）を、式：［平均総ｃｐｍ−２×平均可溶性ｃｐｍ］／［投与用溶液濃度（ｍｇ／ｍＬ）×投与用溶液体積（ｍＬ）×２，２００，０００ｃｐｍ／μＣｉ］により計算した。また、投与用溶液の純度も、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して定性的に分析し、非還元性条件下では主に単一バンドとして、および還元性条件下では二重バンドとして確認した。
【０３３１】
３．血清および組織中の放射性当量濃度の決定
血清試料（５０μＬ、二つ組）中の総放射活性を、ガンマカウントにより決定した。それぞれの血清の一定分量中に、同等体積の２０％ＴＣＡを添加し、試料を、約１２０００ｒｐｍで１０分間スピンした。５０μＬの上清の一定分量中のＴＣＡ可溶性放射活性を、ガンマ−カウントにより決定した。所与の試料中のＴＣＡ沈殿性放射活性（ｃｐｍ）（総ｃｐｍ−２×ＴＣＡ可溶性ｃｐｍ）、投与用溶液の比活性（ＴＣＡ沈殿性ｃｐｍ／ｍｇタンパク質）、ならびに試料（ｔＳ）および投与用溶液（ｔＤ）の測定の日を使用して、所与の試料中の試験物品濃度を、式：［平均ＴＣＡ沈殿性ｃｐｍ／ＥＸＰ（−０．６９３／６０．２×（ｔＳ−ｔｄ））］／［比活性（ｃｐｍ／ｍｇで示す）×試料体積（ｍＬで示す）］を使用して計算した。
【０３３２】
１２５Ｉ標識試験物品の放射性当量組織濃度（μｇｅｑ．／ｇ）の定量化は、１２５Ｉの半減期について補正を行った後の組織中の総放射活性および投与用溶液の比活性に基づき、式：［試料ｃｐｍ／ＥＸＰ（−０．６９３／６０．２×（ｔＳ−ｔＤ））］／［比活性（ｃｐｍ／ｍｇで示す）×試料重量（ｍｇで示す）］を使用した。組織試料についてのＴＣＡによる沈殿は実施しなかった。所与の時点における組織試料についての組織濃度対血清濃度の比（Ｔ／Ｓ）を、組織中の放射性当量濃度（μｇｅｑ．／ｇ）対血清中の放射性当量濃度（μｇｅｑ．／ｍＬ）の比を使用して計算した。
【０３３３】
４．薬物動態学的計算
薬物動態学的計算は、マウス中の平均の血清濃度または組織濃度に基づいた。薬物動態学ソフトウエアパッケージＷｉｎＮｏｎｌｉｎ、５．１版（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ）の非コンパートメント解析モジュール（ＩＶ投与およびＩＰ投与後の血清データの解析のためにそれぞれ、Ｍｏｄｅｌ  ２０１およびＭｏｄｅｌ  ２００）を使用した。血清濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ）を、線形台形法を使用して計算した。見かけの終末相の勾配を、対数−線形回帰により、少なくとも３つのデータ点を使用して推定し、終末速度定数（λ）を、勾配から求めた。ＡＵＣ０−∞を、ＡＵＣ０−ｔ（この場合、ｔは、最後に濃度が測定可能であった時間である）とＣｔ／λとの和として推定した。見かけの終末半減期（ｔ１／２）を、０．６９３／λとして計算した。
【０３３４】
表３９は、１２５ヨウ素標識ラット４３８−ｍＩｇＧ１抗体の単回の５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．注射の後に指定した時点で測定した、ラット４３８−ｍＩｇＧ１抗体に対する、非腫瘍担持ヌードマウスの血清および組織の暴露を示す。最も高い放射性当量（ＲＥ）濃度および暴露（ＡＵＣ０−ＩＮＦ）が、調べた全ての時点で、血清中に、続いて、肝臓、皮膚、腎臓、大腸、小腸、肺および眼中に見出された。表３９に示すように、組織中の放射活性は、時間と共に減退した。マウスの消化管において、ノッチ１が発現し、ノッチ１シグナル伝達が不可欠な役割を果たすことが知られているにもかかわらず、ラット４３８−ｍＩｇＧ１が、試験した他の組織と比較して、大腸および小腸中に優先的には蓄積しなかった。
【０３３５】
【表３９】
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【０３３６】
組織濃度対血清濃度の比を計算し、ヌードマウスへのラット４３８−ｍＩｇＧ１の単回の５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．投与の後の平均の組織濃度／血清濃度の比を、表４０に示す。組織濃度対血清濃度の比は、調べた時点を通して、比較的一定した状態を維持し、このことは、血清と組織との間の平衡を示している。ラット４３８−ｍＩｇＧ１の血清濃度は、組織濃度よりも高く、したがって、Ｔ／Ｓの比は低く（一般に、＜１）、ｍＩｇＧ１について観察される典型的な範囲に属した。
【０３３７】
【表４０】
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【０３３８】
１２５Ｉ標識ラット４３８−ｍＩｇＧ１の投与後、Ｃｍａｘを計算して、１６．４μｇｅｑ．／ｍＬを得、Ｔｍａｘには、３時間で達した。表４１に示すように、排出ｔ１／２は５８時間であり、暴露（ＡＵＣ０−∞）は、７８８μｇｅｑ．×時間／ｍＬであった。単回の５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．投与の後のラット４３８−ｍＩｇＧ１の半減期は、比較的短い（約２．４日）。
【０３３９】
【表４１】
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【０３４０】
ラット３５１−ｍＩｇＧ１の血清暴露を、非腫瘍担持ヌードマウス中で、１２５Ｉ標識ラット３５１−ｍＩｇＧ１抗体の単回の５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ注射、５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．注射または３０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．注射の後に測定した。観察された血清濃度の値を使用して、複数の薬物動態パラメータを計算し、これらを、表４２および表４３に示す。
【０３４１】
表４２は、雌ヌードマウスへの５ｍｇ／ｋｇの１２５Ｉ標識ラット３５１−ｍＩｇＧ１のｉ．ｖ．投与の後の薬物動態パラメータを示す。ラット３５１−ｍＩｇＧ１の排出ｔ１／２および全身クリアランスはそれぞれ、約３日（７０．２時間）および１．７４ｍＬ／時間／ｋｇであった。定常状態における分布体積（Ｖｄｓｓ）は、１７７ｍＬ／ｋｇであった。暴露（ＡＵＣ０−ＩＮＦ）は、２８７１μｇｅｑ．時間／ｍＬであった。
【０３４２】
【表４２】
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【０３４３】
表４３は、雌ヌードマウスへの５および３０ｍｇ／ｋｇの１２５Ｉ標識ラット３５１−ｍＩｇＧ１のｉ．ｐ．投与の後の薬物動態パラメータを示す。Ｃｍａｘはそれぞれ、３０および１５１μｇｅｑ．／ｍＬであり、両方の投与群が、Ｔｍａｘに６時間で達した。５および３０ｍｇ／ｋｇのｉ．ｐ．投与に続きそれぞれ、排出ｔ１／２は、９３および１６３時間（約４〜７日）であり、暴露（ＡＵＣ０−ＩＮＦ）は、２７５４および２４０８０μｇｅｑ．×時間／ｍＬであった。ｉ．ｐ．投与とｉ．ｖ．投与との間の投与正規化ＡＵＣ比（Ｆ）は、約１．４であり、このことは、マウスにおける３０ｍｇ／ｋｇのｉ．ｐ．投与の後の吸収が完全であったことを示唆している。
【０３４４】
【表４３】
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【０３４５】
ラット３５１−ｍＩｇＧ１に対する非腫瘍担持ヌードマウスの血清および組織の暴露を、１２５Ｉ標識ラット３５１−ｍＩｇＧ１の単回の５および３０ｍｇ／ｋｇのｉ．ｐ．注射の後に測定した。５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．投与については、表４４に示すように、最も高い放射性当量（ＲＥ）濃度および暴露（ＡＵＣ０−ＩＮＦ）が、調べた全ての時点で、血清中に、続いて、肝臓、脾臓、皮膚、腎臓、小腸、大腸、肺および眼中に見出された。３０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．投与については、表４５に示すように、最も高い放射性当量（ＲＥ）濃度および暴露（ＡＵＣ０−ＩＮＦ）が、調べた全ての時点で、血清中に、続いて、肝臓、皮膚、脾臓、小腸、肺、腎臓、眼および大腸中に見出された。データは、ラット３５１−ｍＩｇＧ１が、５ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇの両方のｉ．ｐ．投与について、試験した他の組織と比較して、大腸および小腸中に優先的には蓄積しなかったことを示している。
【０３４６】
【表４４】
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【０３４７】
【表４５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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