(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
0005850843.tif 000059
（上式中、ｐは１から４である）
を有し、遊離システインアミノ酸を介してリンカー（Ｌ）及びジルコニウム錯体（Ｚ）へ結合したシステイン改変抗体（Ａｂ）を含む、ジルコニウム標識されたシステイン改変抗体であって、
システイン改変抗体が、リンカー及び
0005850843.tif 000060
から選択されるデスフェリオキサミン成分へ結合し、
波線は抗体への結合を示し；ジルコニウムはデスフェリオキサミン成分へ錯体形成し；及び
システイン改変抗体が、配列番号１１、１２、１３、１５及び３８：
0005850843.tif 000061
から選択される重鎖配列を含み、ここで配列番号１１、１２、１３、１５及び３８のシステインは遊離システインアミノ酸であり、又はシステイン改変抗体が、配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、４５、及び４６：
0005850843.tif 000062
から選択される軽鎖配列を含み、ここで配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、４５、及び４６のシステインは遊離システインアミノ酸である、ジルコニウム標識されたシステイン改変抗体。
【請求項２】
ｐが２である、請求項１に記載のジルコニウム標識されたシステイン改変抗体。
【請求項３】
システイン改変抗体が
（ｉ）システイン改変抗体をコードする核酸配列を突然変異誘発し、
（ｉｉ）システイン改変抗体を発現し、及び
（ｉｉｉ）システイン改変抗体を単離し精製する
ことを含む方法により調製される、請求項１に記載のジルコニウム標識されたシステイン改変抗体。
【請求項４】
システイン改変抗体がモノクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂ断片から選択される、請求項１に記載のジルコニウム標識されたシステイン改変抗体。
【請求項５】
システイン改変抗体がＡ１２１Ｃ チオ-トラスツズマブである、請求項１に記載のジルコニウム標識されたシステイン改変抗体。
【請求項６】
システイン改変抗体が親抗体の一以上のアミノ酸残基を一以上の遊離システインアミノ酸で置換することを含む方法で調製され、親抗体は抗原に選択的に結合し、システイン改変抗体は、親抗体と同じ抗原に選択的に結合する、請求項１に記載のジルコニウム標識されたシステイン改変抗体。
【請求項７】
システイン改変抗体又は親抗体が、レセプター（１）−（５１）：
（１）ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形成タンパク質レセプターＩＢ型）；
（２）Ｅ１６（ＬＡＴ１，ＳＬＣ７Ａ５）；
（３）ＳＴＥＡＰ１（前立腺の６回膜貫通型上皮抗原）；
（４）０７７２Ｐ（ＣＡ１２５，ＭＵＣ１６）；
（５）ＭＰＦ（ＭＰＦ，ＭＳＬＮ，ＳＭＲ，巨核球増強因子、メソテリン）；
（６）Ｎａｐｉ３ｂ（ＮＡＰＩ−３Ｂ，ＮＰＴＩＩｂ，ＳＬＣ３４Ａ２，溶質輸送体ファミリー３４（リン酸ナトリウム），メンバー２，ＩＩ型ナトリウム依存性リン酸トランスポーター３ｂ）；
（７）Ｓｅｍａ ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２，ＫＩＡＡ１４４５，Ｍｍ.４２０１５，ＳＥＭＡ５Ｂ，ＳＥＭＡＧ，セマフォリン ５ｂ Ｈｌｏｇ，セマドメイン（sema domain)，７回トロンボスポンジン反復（１型及び１型様），膜貫通ドメイン（ＴＭ）および短い細胞質ドメイン（セマフォリン）５Ｂ）；
（８）ＰＳＣＡ ｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ，Ｃ５３０００８Ｏ１６Ｒｉｋ，ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２，ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２ 遺伝子）；
（９）ＥＴＢＲ（エンドセリンＢ型レセプター）；
（１０）ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４，推定タンパク質ＦＬＪ２０３１５）；
（１１）ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ＿８６３９，ＩＰＣＡ−１，ＰＣＡＮＡＰ１，ＳＴＡＭＰ１，ＳＴＥＡＰ２，ＳＴＭＰ，前立腺癌関連遺伝子１，前立腺癌関連タンパク質１，前立腺の６回膜貫通型上皮抗原２，６回膜貫通型前立腺タンパク質）；
（１２）ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０，ＦＬＪ２００４１，ＴＲＰＭ４，ＴＲＰＭ４Ｂ，一過性レセプター電位カチオンチャネル，サブファミリーＭ，メンバー４）；
（１３）ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ，ＣＲ１，ＣＲＧＦ，ＣＲＩＰＴＯ，ＴＤＧＦ１，奇形癌腫由来増殖因子）；
（１４）ＣＤ２１（ＣＲ２（補体レセプター２）又はＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／エプスタイン・バーウイルスレセプター）又はＨｓ.７３７９２）；
（１５）ＣＤ７９ｂ（ＣＤ７９Ｂ，ＣＤ７９β，ＩＧｂ（免疫グロブリン関連ベータ（immunoglobulin-associated beta）），Ｂ２９）；
（１６）ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４，ＩＲＴＡ４，ＳＰＡＰ１Ａ（ＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼアンカータンパク質１ａ），ＳＰＡＰ１Ｂ，ＳＰＡＰ１Ｃ）；
（１７）ＨＥＲ２；
（１８）ＮＣＡ；
（１９）ＭＤＰ；
（２０）ＩＬ２０Ｒα；
（２１）ブレビカン；
（２２）ＥｐｈＢ２Ｒ；
（２３）ＡＳＬＧ６５９；
（２４）ＰＳＣＡ；
（２５）ＧＥＤＡ；
（２６）ＢＡＦＦ−Ｒ（Ｂ細胞活性化因子レセプター，ＢＬｙＳレセプター３，ＢＲ３）；
（２７）ＣＤ２２（Ｂ細胞レセプターＣＤ２２−Ｂアイソフォーム）；
（２８）ＣＤ７９ａ（ＣＤ７９Ａ，ＣＤ７９α，免疫グロブリン関連アルファ（immunoglobulin-associated alpha），免疫グロブリンベータ（ＣＤ７９Ｂ）と共有結合性に相互作用し、ＩｇＭ分子と表面上で複合体を形成し、Ｂ細胞分化に関与するシグナルを伝達するＢ細胞特異的タンパク質）；
（２９）ＣＸＣＲ５（バーキットリンパ腫レセプター１は、ＣＸＣＬ１３ケモカインによって活性化され、リンパ球遊走及び体液性防御において機能し、ＨＩＶ−２感染、おそらくエイズ、リンパ腫、骨髄腫、及び白血病の発症において役割を果たす、Ｇタンパク質共役型受容体）；
（３０）ＨＬＡ−ＤＯＢ（ペプチドを結合してそれらをＣＤ４＋Ｔリンパ球に提示するＭＨＣクラスＩＩ分子（Ｉａ抗原）のベータサブユニット）；
（３１）Ｐ２Ｘ５（プリンレセプターＰ２Ｘリガンド開口型イオンチャネル５は、細胞外ＡＴＰにより開閉されるイオンチャネルであり、シナプス伝達及び神経発生に関与する可能性があり、欠乏は、特発性排尿筋不安定性の病態生理の一因となり得る）；
（３２）ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗原ＣＤ７２，Ｌｙｂ−２）；
（３３）ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５），ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質であり、Ｂ細胞の活性化及びアポトーシスを制御し、機能喪失は全身性エリテマトーデスの患者における疾患活性の上昇に関連する）；
（３４）ＦｃＲＨ１（Ｆｃレセプター様タンパク質１，Ｃ２タイプＩｇ様ドメイン及びＩＴＡＭドメインを含む免疫グロブリンＦｃドメインについての推定上のレセプターであり、Ｂ−リンパ球分化において役割を有し得る）；
（３５）ＩＲＴＡ２（免疫グロブリンスーパーファミリーレセプタートランスロケーション関連２（Immunoglobulin superfamily receptor translocation associated 2）、Ｂ細胞発生及びリンパ腫形成において役割を有し得る推定上の免疫レセプター；一部のＢ細胞悪性腫瘍においてトランスロケーションによる遺伝子の調節解除が発生する）；
（３６）ＴＥＮＢ２（推定上の膜貫通型プロテオグリカン、増殖因子のＥＧＦ／ヘレグリンファミリー及びフォリスタチンに関連する）；
（３７）ＰＭＥＬ１７（シルバーホモログ；ＳＩＬＶ；Ｄ１２Ｓ５３Ｅ；ＰＭＥＬ１７；（ＳＩ）；（ＳＩＬ）；ＭＥ２０；ｇｐ１００）；
（３８）ＴＭＥＦＦ１（ＥＧＦ様及び２つのフォリスタチン様ドメインを有する膜貫通タンパク質１；Tomoregulin-1；Ｈ７３６５；Ｃ９ｏｒｆ２；Ｃ９ＯＲＦ２；Ｕ１９８７８；Ｘ８３９６１；
（３９）ＧＤＮＦ−Ｒａ１（ＧＤＮＦファミリーレセプターアルファ１；ＧＦＲＡ１；ＧＤＮＦＲ；ＧＤＮＦＲＡ；ＲＥＴＬ１；ＴＲＮＲ１；ＲＥＴ１Ｌ；ＧＤＮＦＲ−アルファ１；ＧＦＲ−ＡＬＰＨＡ−１；Ｕ９５８４７；ＢＣ０１４９６２）；
（４０）Ｌｙ６Ｅ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｅ；Ｌｙ６７，ＲＩＧ−Ｅ，ＳＣＡ−２，ＴＳＡ−１）；
（４１）ＴＭＥＭ４６（シサホモログ(shisa homolog)２（アフリカツメガエル）；ＳＨＩＳＡ２）；
（４２）Ｌｙ６Ｇ６Ｄ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｇ６Ｄ；Ｌｙ６−Ｄ，ＭＥＧＴ１）；
（４３）ＬＧＲ５（ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体５；ＧＰＲ４９，ＧＰＲ６７）；
（４４）ＲＥＴ（ｒｅｔプロトオンコジーン；ＭＥＮ２Ａ；ＨＳＣＲ１；ＭＥＮ２Ｂ；ＭＴＣ１；（ＰＴＣ）；ＣＤＨＦ１２；Ｈｓ.１６８１１４；ＲＥＴ５１；ＲＥＴ−ＥＬＥ１）；
（４５）ＬＹ６Ｋ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ；ＬＹ６Ｋ；ＨＳＪ００１３４８；ＦＬＪ３５２２６）；
（４６）ＧＰＲ１９（Ｇタンパク質共役型受容体１９；Ｍｍ.４７８７）；
（４７）ＧＰＲ５４（ＫＩＳＳ１レセプター；ＫＩＳＳ１Ｒ；ＧＰＲ５４；ＨＯＴ７Ｔ１７５；ＡＸＯＲ１２）；
（４８）ＡＳＰＨＤ１（アスパラギン酸β−ヒドロキシラーゼドメイン含有１；ＬＯＣ２５３９８２）；
（４９）チロシナーゼ（ＴＹＲ；ＯＣＡＩＡ；ＯＣＡ１Ａ；チロシナーゼ；ＳＨＥＰ３）；
（５０）ＴＭＥＭ１１８（リングフィンガータンパク質，膜貫通型２；ＲＮＦＴ２；ＦＬＪ１４６２７）；及び
（５１）ＧＰＲ１７２Ａ（Ｇタンパク質共役型受容体１７２Ａ；ＧＰＣＲ４１；ＦＬＪ１１８５６；Ｄ１５Ｅｒｔｄ７４７ｅ）
の一以上と結合する、請求項１に記載のジルコニウム標識されたシステイン改変抗体。
【請求項８】
式ＩＩ：
0005850843.tif 000063
（上式中、Ｌ-Ｄｆは
0005850843.tif 000064
（上記構造において、波線は抗体（Ａｂ）への結合を示す）
から選択され、及び
ｐは１から４である）
を有し、遊離システインアミノ酸を介してリンカー（Ｌ）及びデスフェリオキサミン成分（Ｄｆ）へ結合するシステイン改変抗体（Ａｂ）を含む、デスフェリオキサミン標識されたシステイン改変抗体。
【請求項９】
構造：
0005850843.tif 000065
（上記構造において、Ｒは
0005850843.tif 000066
から選択される）
から選択されるデスフェリオキサミン標識試薬。
【請求項１０】
式ＩＩ：
0005850843.tif 000067
（上式中、Ｌ-Ｄｆは
0005850843.tif 000068
（波線は抗体（Ａｂ）への結合を示す）
から選択され、及び
ｐは１から４である）
を有し、遊離システインアミノ酸を介してリンカー（Ｌ）及びデスフェリオキサミン成分（Ｄｆ）へ結合したシステイン改変抗体（Ａｂ）を含む、デスフェリオキサミン標識されたシステイン改変抗体を作製する方法であって、
構造：
0005850843.tif 000069
（上記構造において、Ｒは
0005850843.tif 000070
から選択される）
から選択される組成物を、一以上の遊離システインアミノ酸を有するシステイン改変抗体と反応させることを含み、
それによって、デスフェリオキサミン標識されたシステイン改変抗体が形成される方法。
【請求項１１】
式Ｉ：
0005850843.tif 000071
（上式中、ｐは１から４である）
を有し、遊離システインアミノ酸を介してリンカー（Ｌ）及びジルコニウム錯体（Ｚ）へ結合したシステイン改変抗体（Ａｂ）を含む、ジルコニウム標識されたシステイン改変抗体を作る方法であって、
式ＩＩ：
0005850843.tif 000072
（上式中、Ｌ-Ｄｆは、
0005850843.tif 000073
（上記構造において波線は抗体（Ａｂ）への結合を示す）
から選択され、及び
ｐは１から４であり、
それによって、デスフェリオキサミン標識されたシステイン改変抗体が形成される）
を有し、遊離システインアミノ酸を介してリンカー（Ｌ）及びデスフェリオキサミン成分（Ｄｆ）へ結合したシステイン改変抗体（Ａｂ）を含む、デスフェリオキサミン標識されたシステイン改変抗体でジルコニウム試薬を錯体化させることを含む方法。
【請求項１２】
ジルコニウム試薬が89ジルコニウムシュウ酸塩である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ジルコニウム標識されたシステイン改変抗体の存在をインビボで検出することによるイメージングのためのキットであって、ジルコニウム標識されたシステイン改変抗体を含み、
該ジルコニウム標識されたシステイン改変抗体が、式Ｉ：
0005850843.tif 000074
（ここでｐは１から４である）
を有し、リンカー（Ｌ）を介して一以上のジルコニウム錯体（Ｚ）と結合した一以上の遊離システインアミノ酸を持つシステイン改変抗体（Ａｂ）を含む、キット。
【請求項１４】
ＺがデスフェリオキサミンＢへ錯体形成したジルコニウムを含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
ジルコニウム標識されたシステイン改変抗体が抗原に結合する、請求項１３に記載のキット。
【請求項１６】
ジルコニウム標識されたシステイン改変抗体が腫瘍異種移植マウスモデルに投与されるものである、請求項１３に記載のキット。
【請求項１７】
重鎖にＡ１２１Ｃ変異又はＳ４００Ｃ変異を含む、請求項８に記載のデスフェリオキサミン標識されたシステイン改変抗体。
【請求項１８】
軽鎖にＶ２０５Ｃ変異を含む、請求項８に記載のデスフェリオキサミン標識されたシステイン改変抗体。
【請求項１９】
軽鎖の位置１３９から１４９にある何れかのアミノ酸がシステインで置換されている、請求項８に記載のデスフェリオキサミン標識されたシステイン改変抗体。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本出願は、２００５年９月２２日に出願した米国特許出願第１１／２３３２５８号であって現在２００９年４月２１日に発行された米国特許第７５２１５４１号の継続である、２００９年３月６日に出願した米国特許出願第１２／３９９２４１号の一部継続出願である、２００９年１１月５日に出願した米国特許出願第１２／６１２９１２号に対する優先権を主張し、また、米国特許法１１９（ｅ）に基づき、２００４年９月２３日に出願の米国仮出願第６０／６１２４６８号、及び２００５年６月３０日に出願の米国仮出願第６０／６９６３５３号の優先権の利益を主張し、出典明記によりその内容全体を援用するものである。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、一般に反応性システイン残基で改変された抗体、より具体的には治療適用又は診断適用を有する抗体に関する。システイン改変抗体は、化学療法薬、毒素、ビオチンなどの親和性リガンド、放射性同位元素及び蛍光物質などの検出標識と結合させることができる。また、本発明は、哺乳動物細胞又は関連する病理学的状態の、インビトロ、インサイツ、及びインビボでの診断又は治療のための抗体及び抗体-薬物結合体化合物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
分子イメージングは、新規医薬品の開発及び評価における重要なツールである。免疫陽電子放射断層撮影（ＩｍｍｕｎｏＰＥＴ）は、インビボでモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を追跡し定量化するために、ＰＥＴの高感度性をモノクローナル抗体の高い特異性と効率的に組み合わせた急速に現れた方法である。ＩｍｍｕｎｏＰＥＴは、「生体内における包括的な免疫組織化学的染色」を提供する非侵襲的な診断のための臨床的方法の選択肢となることを目指している(van Dongen GA, et al. “Immuno-PET: a navigator in monoclonal antibody development and applications” Oncologist 2007;12:1379-89)。ImmunoPETは、標的特異的分子に結合されるべき陽電子放出放射性同位体を必要とするため、分子の生物学的半減期を放射性核種の半減期と一致させることが不可欠である(Verel I, et al. “The promise of immuno-PET in radioimmunotherapy” J Nucl Med 2005;46 Suppl 1:164S-71S)。抗体（〜１５０ｋＤａ）は数日から数週間にわたる半減期を持っているが、イメージングは、通常、抗体ベースのトレーサー投与後２から６日で最大のターゲット対バックグラウンド比を提供し、８９Ｚｒ及び１２４Ｉ（それぞれ半減期が３．３日及び４．２日）などの放射性同位元素の使用を求めている。残念ながら、容易に入手できる６４Ｃｕの半減期（１２．７時間）は、この時間枠の中で良好なコントラストを持つ画像を与えるためには短すぎる。
【０００４】
ＭＡＢのテンプレート（Ｉｍｍｕｎｏ-ＰＥＴ）からの陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）イメージング剤の開発は、分子標的を局所化して定量化するためのツールとしての期待でき、病理学的状態の非侵襲的な臨床診断を強化させることができる(van Dongen et al (2007) Oncologist 12;1379-89; Williams et a (2001) Cancer Biother Radiopharm 16:25-35; Holliger et al (2005) Nat Biotechnol 23:1126-36)。ＰＥＴは疾患の検出のためにますます用いられる分子イメージング技術である。ＰＥＴイメージングシステムは、患者の組織中の陽電子放出同位体の分布に基づいて画像を作成する。同位体は、典型的には、例えば体内で容易に代謝されるか又は局在している分子（例えばグルコース）に共有結合性に結合しているか又は体内のレセプター部位に化学的に結合したＦ-１８、Ｃ-１１、Ｎ-１３又はＯ-１５等の陽電子放出同位体を含むプローブ分子の注入により患者に投与される。いくつかのケースでは、同位体は、イオン溶液として、または吸入によって患者に投与される。Ｆａｂ抗体断片（５０ｋＤａ）またはダイアボディなどの小さなｉｍｍｕｎｏ-ＰＥＴイメージング剤、５５ｋＤａのＭａｂの共有結合性に結合したＶＨ−ＶＬ領域のペア２量体は、短い循環半減期、高い組織透過性を示し、注射後２〜４時間の間にバックグラウンド比に対して最適な腫瘍に到達するため特に有用であり得、広く入手可能な１８Ｆ（１０９.８分）などの短い半減期の同位体の利用を促進している。
【０００５】
ヨウ素１２４（１２４Ｉ）を抗体３Ｆ９に結合させ、神経芽細胞腫の放射免疫療法のための線量を推定するために使用されている(Larson SM, et al “PET scanning of iodine-124-3F9 as an approach to tumor dosimetry during treatment planning for radioimmunotherapy in a child with neuroblastoma” J Nucl Med 1992;33:2020-3)。その後、より洗練されたＰＥＴ計測手段及び放射性ヨウ素化するための改良技術が現れたため、１２４Ｉは、多くのｉｍｍｕｎｏＰＥＴ研究で採用された(Verel I, et al “High-quality 124I-labelled monoclonal antibodies for use as PET scouting agents prior to 131I-radioimmunotherapy” European journal of nuclear medicine and molecular imaging 2004;31:1645-52; Lee FT et al “Immuno-PET of human colon xenograft- bearing BALB/c nude mice using 124I-CDR-grafted humanized A33 monoclonal antibody” J Nucl Med 2001;42:764-9; Sundaresan G, et al. “124I-labeled engineered anti-CEA minibodies and diabodies allow high-contrast, antigen-specific small-animal PET imaging of xenografts in athymic mice” J Nucl Med 2003;44:1962-9; Jain M and Batra SK. “Genetically engineered antibody fragments and PET imaging: a new era of radioimmunodiagnosis” J Nucl Med 2003;44:1970-2; Gonzalez Trotter DE et al. “Quantitation of small-animal (124)I activity distributions using a clinical PET/CT scanner” J Nucl Med 2004;45:1237-44; Robinson MK, et al. “Quantitative immuno-positron emission tomography imaging of HER2-positive tumor xenografts with an iodine-124 labeled anti-HER2 diabody” Cancer Res 2005;65:1471-8; Jayson GC et al. “Molecular imaging and biological evaluation of HuMV833 anti-VEGF antibody: implications for trial design of antiangiogenic antibodies” J Natl Cancer Inst 2002;94:1484-93; Divgi CR, et al. “Preoperative characterisation of clear-cell renal carcinoma using iodine-124-labelled antibody chimeric G250 (124I-cG250) and PET in patients with renal masses: a phase I trial” Lancet Oncol 2007;8:304-10)。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に１２４Ｉを結合するための可能な比較的単純な放射性ヨウ素化技術にもかかわらず、重要な制限事項が、この放射性核種の広範な前臨床的使用を遅らせている。特に、複雑な崩壊方式は小動物のｍｉｃｒｏＰＥＴの分解能に負の影響を与えるエネルギー性の陽電子（β＋最大、１．５及び２．１ＭｅＶ）を含む。さらに、内在化ヨウ素化タンパク質が酵素的に脱ヨード化を受け、遊離のヨウ化物が標的細胞から急速に除去され、実際のモノクローナル抗体の取り込みを反映していないＰＥＴ画像を与える“Perera RM et al. “Internalization, intracellular trafficking, and biodistribution of monoclonal antibody 806: a novel anti-epidermal growth factor receptor antibody” Neoplasia (New York, N.Y 2007;9:1099-110)。８９Ｚｒの使用は、８９Ｚｒ崩壊（β＋最大、８９７ｋｅＶ）に放出される陽電子が１８Ｆ及び１１Ｃに匹敵するｍｉｃｒｏＰＥＴ分解能（約１ｍｍ）を与えるためこれらの欠点を克服する。また、８９Ｚｒ-ｍＡｂは内在の代謝物がリソソームの細胞内に捕捉され、実際のモノクローナル抗体の取り込みとＰＥＴイメージングとの優れた相関を与えている(van Dongen GA, et al. “Immuno-PET: a navigator in monoclonal antibody development and applications” Oncologist 2007;12:1379-89)。
【０００６】
抗体に対して、標識、放射性同位元素、蛍光色素又は薬物成分を結合させる、すなわち共有結合を介して連結させる従来の手段は、一般的に標識成分が抗体上の数多くの部位で結合した分子の不均質な混合物を生じる。例えば、細胞傷害性薬物は、一般的に抗体のしばしば多数のリジン残基を介して抗体に結合し、不均質な抗体−薬物コンジュゲート混合物を生成する。反応条件に応じて、不均一な混合物は、通常、０からおよそ８、又はそれ以上の薬物成分が結合した抗体の分布を含む。さらに、抗体対薬物成分の特定の整数比を持つコンジュゲートの各サブグループ内においては、薬物成分が抗体上のさまざまな部位で結合している不均一な混合物である可能性がある。分析及び調製方法は、抱合反応に起因する不均一な混合物内における抗体−薬物コンジュゲート種の分子を分離し、特徴づけるには不十分である。抗体は、大きくて複雑で構造的に多様な生体分子であり、しばしば多くの反応性官能基を有する。リンカー試薬および薬物リンカー中間体との反応性は、ｐＨ、濃度、塩濃度、および共溶媒などの要因に依存する。更に、多段階の結合工程は、反応条件を制御し、及び反応物及び中間体を特徴づけるのが困難であるため再現できない場合がある。
【０００７】
システインのチオールは、プロトン化してｐＨ７付近で非求核性である多くのアミンとは異なり、中性ｐＨで反応性である。遊離のチオール（ＲＳＨ、スルフヒドリル）基は比較的反応性であるため、システイン残基を有するタンパク質は、しばしばジスルフィド結合オリゴマーとして酸化型で存在するか、又は内部に架橋されたジスルフィド基を有する。細胞外タンパク質は一般に遊離チオールを持たない(Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London , at page 55)。タンパク質中の遊離チオールの量は、標準的なエルマンアッセイによって推定することができる。免疫グロブリンＭは、ジスルフィド結合した五量体の例であるが、免疫グロブリンＧは一緒にサブユニットを接着する内部のジスルフィド結合を持つタンパク質の例である。このようなタンパク質では、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）又セレノール等の試薬によるジスルフィド結合の還元は (Singh et al (2002) Anal. Biochem. 304:147-156)、反応性の遊離のチオールを生成する必要がある。このアプローチでは、抗体の立体構造及び抗原結合特異性が失われる場合がある。
【０００８】
抗体のシステインチオール基は、抗体のアミンまたはヒドロキシル基より、求電子抱合試薬に対して、一般により反応的、すなわちより求核性である。システイン残基が遺伝子工学的手法によりタンパク質に導入され、リガンドに対して共有結合を形成するか、または新しい分子内ジスルフィド結合を形成する(Better et al (1994) J. Biol. Chem. 269(13):9644-9650; Bernhard et al (1994) Bioconjugate Chem. 5:126-132; Greenwood et al (1994) Therapeutic Immunology 1:247-255; Tu et al (1999) Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:4862-4867; Kanno et al (2000) J. of Biotechnology, 76:207-214; Chmura et al (2001) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98(15):8480-8484; 米国特許第6248564号）。しかし、タンパク質の種々のアミノ酸残基のシステインのアミノ酸への変異によりシステインチオール基を設計することは、特に不対（遊離Ｃｙｓ）残基、又は反応や酸化を比較的受けやすいであるものである場合、潜在的に問題がある。タンパク質の濃縮溶液においては、大腸菌のペリプラズム、培養上清にあろうが、又は部分的又は完全に精製したタンパク質であろうが、タンパク質の表面上の不対システイン残基は対をなして酸化し、分子間ジスルフィドを形成し、従ってタンパク質の２量体又は多量体を形成することができる。ジスルフィド二量体形成は、薬物、リガンド、又は他の標識への結合のために新しいＣｙｓを非反応性にする。さらに、タンパク質が、新たに改変されたＣｙｓおよび既存のＣｙｓ残基間に分子内ジスルフィド結合を形成する場合、両方のＣｙｓ基は、活性部位への酸化及び相互作用に使用できない。また、タンパク質は誤った折り畳み又は三次構造の喪失によって、不活性化又は非特異的な状態にされる場合がある(Zhang et al (2002) Anal. Biochem. 311:1-9)。
【０００９】
部位特異的結合は、結合部位から離れた部位の化学的修飾を可能にし、生物学的活性の完全保持を促進し、かつ追加された補欠分子族の可能な数の管理を可能とするため、ランダムなアミノ酸改変より好まれる。システイン改変抗体は、Ｆａｂ抗体フラグメント（ｔｈｉｏＦａｂ）として設計され、全長でＩｇＧモノクローナル（ｔｈｉｏＭａｂ）抗体として発現される。米国特許第７５２１５４１号；Junutula JR et al. “Rapid identification of reactive cysteine residues for site-specific labeling of antibody-Fabs”J Immunol Methods 2008;332:41-52; Junutula JR et al. “Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index”(2008) Nat Biotechnol. 26:925-32を参照し、その内容は参照により援用される。ＴｈｉｏＦａｂ及びＴｈｉｏＭａｂ抗体はチオール反応性リンカー試薬および薬物リンカー試薬を用いて新たに導入されたシステインのチオール基でリンカーを介して接合され、抗ＭＵＣ１６（米国特許出願公開第２００８／０３１１１３４号）、抗ＣＤ２２（米国特許出願公開第２００８／００５０３１０号）、抗ＲＯＢＯ４（米国特許出願公開第２００８／０２４７９５１号）、抗ＴＥＮＢ２（米国特許出願公開第２００９／０１１７１００号）、抗ＣＤ７９Ｂ（米国特許出願公開第２００９／００２８８５６号、米国特許出願公開第２００９／００６８２０２号）チオＡＤＣを含む、抗癌特性を持つシステイン改変抗体薬物複合体（チオＡＤＣ）を調製する。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の化合物は、親抗体の１つまたは複数のアミノ酸が遊離システインアミノ酸で置換されているシステイン改変抗体を含む。システイン改変抗体は、チオール反応性値を０．６から１．０の範囲に有する１つ以上の遊離システインアミノ酸を含む。遊離システインアミノ酸は、親抗体中に改変される、ジスルフィド結合の一部ではないシステイン残基である。
【００１１】
システイン改変抗体は、癌の診断及び治療において有用であり、かつ細胞表面及び膜貫通型レセプターに特異的な抗体、及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を含み得る。そのような抗体はネイキッド抗体（薬物又は標識の成分に対して非結合型）または抗体-ジルコニウムコンジュゲート（ＡＺＣ）として使用することができる。
【００１２】
システイン改変抗体を調製しスクリーニングする方法の実施態様は、親抗体が抗体断片、例えばｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８等である場合を含む。親抗体はまた、アルブミン結合ペプチド配列（ＡＢＰ）を含む融合タンパク質であってもよい。親抗体はまた、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-７及びｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８（トラスツズマブ）から選択されるヒト抗体であってもよい。
【００１３】
本発明のシステイン改変抗体は、部位特異的でかつ効率的にチオール反応性試薬と結合しうる。チオール反応性試薬は、放射性同位体試薬、多機能リンカー試薬、キャプチャラベル試薬、蛍光試薬、又は薬物−リンカー中間体であり得る。
【００１４】
システイン改変抗体は、固相支持体上に固定化され及び／又は薬物成分を結合させた検出可能な標識で標識され得る。
【００１５】
本発明の別の態様は、ジルコニウム標識された、システイン改変抗体であり、遊離システインアミノ酸を介してリンカー（Ｌ）及びジルコニウム錯体（Ｚ）へ結合するシステイン改変抗体（Ａｂ）を含み、式Ｉを有する：
0005850843.tif 000002
ここでｐは１から４である。
【００１６】
本発明の別の態様は、デスフェリオキサミン標識された、システイン改変抗体であり、遊離システインアミノ酸を介してリンカー（Ｌ）及びデスフェリオキサミン成分（Ｄｆ）へ結合するシステイン改変抗体（Ａｂ）を含み、式ＩＩを有する：
0005850843.tif 000003
ここでＬ-Ｄｆは、
0005850843.tif 000004
から選択され、ここで波線は抗体（Ａｂ）への結合を示し、及び
ｐは１から４である。
【００１７】
本発明の別の態様は、次の構造
0005850843.tif 000005
から選択されたデスフェリオキサミン標識試薬であり、
ここでＲは
0005850843.tif 000006
から選択される。
【００１８】
本発明の別の態様は、デスフェリオキサミン標識された、システイン改変抗体を作る方法であり、遊離システインアミノ酸を介してリンカー（Ｌ）及びデスフェリオキサミン成分（Ｄｆ）へ結合するシステイン改変抗体（Ａｂ）を含み、式ＩＩを有する：
0005850843.tif 000007
ここでＬ-Ｄｆは、
0005850843.tif 000008
から選択され、ここで波線は抗体（Ａｂ）への結合を示し、及び
ｐは１から４であり、
本方法は、次の構造
0005850843.tif 000009
から選択された組成物を反応させることを含み、
ここでＲは
0005850843.tif 000010
から選択され、一以上の遊離システインアミノ酸を有するシステイン改変抗体を持ち、それによって、デスフェリオキサミン標識されたシステイン改変抗体が形成される。
【００１９】
本発明の別の態様は、ジルコニウム標識された、システイン改変抗体を作る方法であり、遊離システインアミノ酸を介してリンカー（Ｌ）及びジルコニウム錯体（Ｚ）へ結合するシステイン改変抗体（Ａｂ）を含み、式Ｉを有し、
0005850843.tif 000011
ここでｐは１から４であり、
本方法は、ジルコニウム試薬とデスフェリオキサミン標識された、システイン改変抗体との錯体形成を含む方法であり、遊離システインアミノ酸を介してリンカー（Ｌ）及びデスフェリオキサミン成分（Ｄｆ）へ結合するシステイン改変抗体（Ａｂ）を含み、式ＩＩを有し、
0005850843.tif 000012
ここでＬ-Ｄｆは、
0005850843.tif 000013
から選択され、ここで波線は抗体（Ａｂ）への結合を示し、及び
ｐは１から４であり、
それによって、デスフェリオキサミン標識された、システイン改変抗体が形成される。
【００２０】
本発明の別の態様は、イメージングの方法であり、
動物へジルコニウム標識されたシステイン改変抗体を投与すること、及びイメージングによりジルコニウム標識された、システイン改変抗体の存在をインビボで検出することを含み、
ここで、ジルコニウム標識されたシステイン改変抗体は、リンカー（Ｌ）を介して一以上のジルコニウム錯体（Ｚ）と結合した一以上の遊離システインアミノ酸を持つシステイン改変抗体（Ａｂ）を含み、かつ式Ｉを有し、
0005850843.tif 000014
ここでｐは１から４である。
【００２１】
本発明の別の態様は、本明細書に開示される化合物及び組成物の診断への適用が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】図１Ａは、Ｘ線結晶座標に由来するｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ７抗体断片の三次元の表現を示す。重鎖及び軽鎖の例示的に改変されたＣｙｓ残基の構造上の位置は（配列番号付け方式に従って）番号が付けられている。
【図１Ｂ】図１Ｂは、４Ｄ５ｖ７ｆａｂＨのＫａｂａｔの番号付け方式（下段）と比較して、Ｎ末端で始まる配列番号付け方式（上段）を示す。Ｋａｂａｔの番号付けの挿入はａ、ｂ、ｃにより記載される。
【図２Ａ−２Ｂ】図２Ａ及び２Ｂはｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８及びｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８のＣｙｓ変異（ＴｈｉｏＦａｂ）ファージ変異体の吸光度の検出による結合測定を示す：ＢＳＡ（空のバー）、ＨＥＲ２（縞のバー）又はストレプトアビジン（実線のバー）との相互作用に関するＰＨＥＳＥＬＥＣＴＯＲアッセイによる、（Ａ）非ビオチン標識ファージｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８及び（Ｂ）ビオチン標識ファージｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８。
【図３Ａ−３Ｂ】図３Ａ及び３Ｂはｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８（左）及びｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８のＣｙｓ変異（ＴｈｉｏＦａｂ）変異体の４５０ｎｍでの吸光度の検出による結合測定を示す：ＢＳＡ（空のバー）、ＨＥＲ２（縞のバー）又はストレプトアビジン（実線のバー）との相互作用に関するＰＨＥＳＥＬＥＣＴＯＲアッセイによる、（Ａ）非ビオチン標識ファージｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８及び（Ｂ）ビオチン標識ファージｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８。軽鎖変異体は左側にあり、重鎖変異体は右側にある。チオール反応性＝ストレプトアビジン結合のＯＤ４５０ｎｍ÷ＨＥＲ２（抗体）結合のＯＤ４５０ｎｍ。
【図４Ａ】図４Ａは野生型ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８の部分的表面接触性( Fractional Surface Accessibility)の値を示す。軽鎖の部位は左側にあり、重鎖の部位は右側にある。
【図４Ｂ】図４ＢはＨＥＲ２（２日目）、ストレプトアビジン（ＳＡ）（２日目）、ＨＥＲ２（４日目）、及びＳＡ（４日目）との相互作用に関するビオチン標識ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８（左）及びｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８のＣｙｓ変異（ＴｈｉｏＦａｂ）変異体の４５０ｎｍでの吸光度の検出による結合測定を示す。ファージｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８のＣｙｓ変異体が単離され、４℃で保存された。ビオチン抱合は、２日目又は４日目のいずれかで行われ、続いてＰＨＥＳＥＬＥＣＴＯＲ分析が行われ、実施例２に記載のようにＨｅｒ２及びストレプトアビジンとの相互作用をモニタリングし、改変されたＴｈｉｏＦａｂ変異体の反応性チオール基の安定性を調べた。
【図５】図５はストレプトアビジン及びＨＥＲ２への結合に関するビオチン−マレイミド結合-ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８（Ａ１２１Ｃ）及び非ビオチン標識化野生型ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８の４５０ｎｍでの吸光度の検出による結合測定を示す。各Ｆａｂは２ｎｇ及び２０ｎｇで試験した。
【図６】図６はウサギアルブミン、ストレプトアビジン（ＳＡ）、及びＨＥＲ２との結合に関する、ビオチン標識ＡＢＰ-ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８野生型（野生型（ｗｔ））、及びＡＢＰ-ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８のシステイン変異体Ｖ１１０Ｃ及びＡ１２１Ｃの４５０ｎｍでの吸光度の検出によるＥＬＩＺＡ分析を示す。
【図７】図７はウサギアルブミン、ＨＥＲ２及びストレプトアビジン（ＳＡ）との結合、およびＦａｂ-ＨＲＰ又はＳＡ-ＨＲＰでの探索に関して、ビオチン標識ＡＢＰ-ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８システイン変異体（ＴｈｉｏＦａｂ変異体）：（左から右へ）単一のＣｙｓ変異体ＡＢＰ-Ｖ１１０Ｃ、ＡＢＰ-Ａ１２１Ｃ、二重のＣｙｓ変異体ＡＢＰ-Ｖ１１０Ｃ-Ａ８８Ｃ及びＡＢＰ-Ｖ１１０Ｃ-Ａ１２１Ｃの４５０ｎｍでの吸光度の検出によるＥＬＩＺＡ分析を示す。
【図８】図８はビオチン標識ＴｈｉｏＦａｂファージ及び抗ファージＨＲＰ抗体のＨＥＲ２（上）及びストレプトアビジン（下）に対する結合を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、吸光度を検出するためにＨＲＰ標識二次抗体の結合を伴ったビオチン化抗体が、固定化したＨＥＲ２へ結合する模式図を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、固定化されたＨＥＲ２への結合におけるビオチン−マレイミド抱合チオトラスツズマブ変異体及び非ビオチン標識化野生型トラスツズマブの４５０ｎｍでの吸光度の検出による結合測定を示す。左から右に：Ｖ１１０Ｃ（単一Ｃｙｓ）、Ａ１２１Ｃ（単一Ｃｙｓ）、Ｖ１１０Ｃ／Ａ１２１Ｃ（二重Ｃｙｓ）、及びトラスツズマブ。各チオＩｇＧ変異体及びトラスツズマブは１ｎｇ、１０ｎｇ、及び１００ｎｇで試験された。
【図１４Ａ】図１４Ａは、吸光度を検出するためにビオチンが抗ＩｇＧ-ＨＲＰへ結合し、固定化したＨＥＲ２へ結合するビオチン標識化抗体の模式図を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、固定化されたストレプトアビジンに対する結合における、ビオチン-マレイミド抱合チオトラスツズマブ変異体及び非ビオチン標識化野生型トラスツズマブの４５０ｎｍでの吸光度の検出による結合測定を示す。左から右へ：Ｖ１１０Ｃ（単一Ｃｙｓ）、Ａ１２１Ｃ（単一Ｃｙｓ）、Ｖ１１０Ｃ／Ａ１２１Ｃ（二重Ｃｙｓ）、及びトラスツズマブ。各チオＩｇＧ変異体及びトラスツズマブは１ｎｇ、１０ｎｇ、及び１００ｎｇで試験された。
【図１５】図１５は、抱合のために細胞培養から発現されたシステイン改変抗体（ＴｈｉｏＭａｂ）を調製するための一般的な方法を示す。
【図１６】図１６は、２Ｈ９ ＴｈｉｏＭａｂのＦｃ変異体の非還元（上）及び還元（下）変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析（左から右に、レーン１−９）を示す：固定化されたプロテインＡ上で精製後のＡ３３９Ｃ；Ｓ３３７Ｃ；Ｓ３２４Ｃ；Ａ２８７Ｃ；Ｖ２８４Ｃ；Ｖ２８２Ｃ；Ｖ２７９Ｃ；Ｖ２７３Ｃ及び２Ｈ９野生型。右側のレーンは、サイズマーカーラダーであり、インタクトなタンパク質が約１５０ｋＤａ、約５０ｋＤａの重鎖断片及び約２５ｋＤａの軽鎖断片であることを示す。
【図１７Ａ】図１７Ａは、２Ｈ９ ＴｈｉｏＭａｂ変異体の非還元（左）及び還元（＋ＤＴＴ）（右）変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析（左から右に、レーン１−４）を示す：固定化されたプロテインＡ上で精製後のＬ-Ｖ１５Ｃ；Ｓ１７９Ｃ；Ｓ３７５Ｃ；Ｓ４００Ｃ。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、固定化されたプロテインＡ上で精製後の２Ｈ９及び３Ａ５ ＴｈｉｏＭａｂ変異体の非還元（左）及び還元（＋ＤＴＴ）（右）変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、ビオチン標識化チオ-ＩｇＧ変異体のウェスタンブロット分析を示す。２Ｈ９及び３Ａ５ ＴｈｉｏＭａｂ変異体は、還元変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析され、タンパク質はニトロセルロース膜に移された。抗体及び抱合ビオチンの存在は、それぞれ、抗ＩｇＧ-ＨＲＰ（上）及びストレプトアビジン-ＨＲＰ（下）により探索された。レーン１：３Ａ５ Ｈ-Ａ１２１Ｃ、レーン２：３Ａ５ Ｌ-Ｖ１１０Ｃ、レーン３：２Ｈ９ Ｈ-Ａ１２１Ｃ、レーン４：２Ｈ９ Ｌ-Ｖ１１０Ｃ、レーン５：２Ｈ９野生型。
【図１９】図１９は、抗ＩｇＧ-ＨＲＰで探索し及び４５０ｎｍでの吸光度を測定することによる、ストレプトアビジンに対するビオチン標識化２Ｈ９変異体の結合に関するＥＬＩＳＡ分析を示す（上の棒図表）。下の模式図は、ＥＬＩＳＡ分析で用いた実験デザインを示す。
【図２０】図２０は、キレート剤８９ＺｒデスフェリオキサミンＢ（Ｄｆ，上）をアミノ反応性リンカーのＴＦＰ-Ｎ-ＳｕｃＤｆ及びＤｆ-Ｂｚ-ＮＣＳ（中央）及びチオールリンカーのＤｆ-Ｃｈｘ-Ｍａｌ、Ｄｆ-Ｂａｃ、及びＤｆ-ｌａｃ（下）を用いて、タンパク質に結合させるための二官能性試薬を示す。
【図２１】図２１はＤｆ-Ｃｈｘ-Ｍａｌ、Ｄｆ-Ｂａｃ、Ｄｆ-Ｉａｃの調製及びＦａｂの重鎖に組込まれたＣｙｓ残基を介してチオトラスツズマブへの結合を示す。反応条件；ｉ．ＤＩＥＡ，ＤＭＦ／Ｈ２Ｏ（１０：１），ＲＴ，０．５−１時間；ｉｉ．ＤＩＥＡ，ＤＭＦ，０℃，４時間；ｉｉｉ．ｐＨ７．５，ＲＴ，１時間；ｉｖ．ｐＨ９，ＲＴ，５時間；ｖ．ｐＨ９，ＲＴ，２時間。
【図２２】図２２は、ジルコニウム−８９シュウ酸塩の、デスフェリオキサミン標識化されたシステイン改変抗体、例えば４つのリンカーとしてＮ-Ｓｕｃ、Ｂｚ-ＳＣＮ、Ｃｈｘ-マレイミド（ＣＨｘ-Ｍａｌ）、又はアセチル（Ａｃ）を含むＤｆリンカートラスツズマブの変異体等とのキレート化を示す。
【図２３】図２３は、軽鎖及び重鎖から別々のシグナルを示す還元された抗体の質量分析を示す。Ａ：チオ-トラスツズマブ、Ｂ：Ｄｆ-Ａｃ-チオ-トラスツズマブ（Ｄｆ-Ｂａｃを使用）、及びＣ：Ｄｆ-Ａｃ-チオ-トラスツズマブ（Ｄｆ-Ｉａｃを使用）、及びＤ：Ｄｆ-Ｃｈｘ-Ｍａｌ-チオ-トラスツズマブ。
【図２４】図２４は３７℃におけるマウス血清中の８９Ｚｒ-Ｃｈｘ-Ｍａｌチオ-トラスツズマブ（白まる）及び８９Ｚｒ-Ｄｆ-Ａｃチオ-トラスツズマブ（黒まる）の安定性を示す（ｎ＝３）。
【図２５】図２５は、４つの異なるリンカー（Ｂｚ-ＳＣＮ、Ｎ-Ｓｕｃ、Ｃｈｘ-Ｍａｌ、及びＡｃ）を用いて調製された８９Ｚｒ-トラスツズマブの１００μＣｉを尾静脈ボーラス注入後９６時間後に得られた代表的な全身の画像（最大強度の投影）を示す。
【図２６】図２６はＰＥＴにより測定された注射後２４時間、９６時間及び１４４時間において選択された組織におけるインビボでの取込みを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
典型的な実施態様の詳細な記述
参照は本発明の所定の実施態様に対して詳細になされ、その実施例は添付の構造や数式に示される。本発明は、列挙された実施態様と一緒に説明されるが、それらはそれらの実施態様に本発明を限定することを意図していないことが理解されるであろう。逆に本発明は、全ての代替物、修正、及び等価物を包含することを目的としており、それらは特許請求の範囲によって定義されているように、本発明の範囲内に含まれ得る。
【００２４】
当業者は、本明細書に記載と類似または同等の多くの方法および材料を認識し、それらは本発明の実施において使用することができる。本発明は、記載された方法や材料に少しも限定されるものではない。
【００２５】
特に定義しない限りは、本明細書中で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を持ち、 Singleton et al (1994) Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2nd Ed., J. Wiley & Sons, New York, NY; and Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New Yorkと一致する。
【００２６】
定義
特に断りのない限り、本明細書中で使用される以下の用語および語句は以下の意味を持つように意図されている：
商標名が本明細書中で使用されている場合、申請者は独立して商品名の製品製剤、ジェネリック医薬品、及び商号製品の医薬品有効成分を含めることを意図する。
【００２７】
本明細書における「抗体」なる用語は最も広い意味で用いられ、特に、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、２量体、多量体、多特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、及び、望ましい生物学的活性を提示する限りにおいて抗体断片を包含する(Miller et al (2003) Jour. of Immunology 170:4854-4861)。抗体は、マウス、ヒト、ヒト化、キメラ、又は他の種由来のものであってよい。抗体は、特異的な抗原を認識して結合することができる免疫系によって生成されるタンパク質である。(Janeway, et al (2001) &quot;Immunobiology&quot;, 5th Ed., Garland Publishing, New York)。標的抗原は一般に、エピトープとも呼ばれ、複数の抗体上のＣＤＲによって認識される多数の結合部位を有する。。異なるエピトープに特異的に結合する各々の抗体は異なる構造を有する。よって、１つの抗原は１より多い対応する抗体を有しうる。また、抗体は、完全長免疫グロブリン分子又は完全長免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な成分、すなわち限定するものではないが、癌細胞又は自己免疫性疾患と関連した自己免疫抗体を産生する細胞を含む標的などの対象の標的の抗原ないしその一部を免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を含む。本明細書において開示される免疫グロブリンは、免疫グロブリン分子のいずれかのタイプ(例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＡ)、クラス(例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２)又はサブクラスのものであってよい。免疫グロブリンは任意の種から得られてよい。一態様では、しかしながら、免疫グロブリンは、ヒト、マウス又はウサギ起源のものである。
【００２８】
「抗体断片」には、完全長抗体の一部、一般に抗原結合又はその可変領域が含まれる。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；線状抗体；ミニボディ(Olafsen et al (2004) Protein Eng. Design & Sel. 17(4):315-323)；Ｆａｂ発現ライブラリーによって生産される断片、抗イディオタイプ(抗Ｉｄ)抗体、ＣＤＲ(相補性決定領域)、ＥＣＤ(細胞外ドメイン)、及び癌細胞抗原、ウイルス抗原又は微生物抗原、単鎖抗体分子に免疫特異的に結合する上記の何れかのエピトープ結合断片；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
【００２９】
本明細書における「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、少量で存在しうる天然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対している。さらに、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体によって汚染されずに合成される点で有利である。「モノクローナル」との修飾詞は、抗体の実質的に均一な集団から得られている抗体の性質を表すものであって、抗体を何か特定の方法で生成しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において有用なモノクローナル抗体は、最初にKohler et al (1975) Nature 256:495により記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法(例えば、米国特許第４８１６５６７号、米国特許第５８０７７１５号を参照)によって作られてもよい。また「モノクローナル抗体」は、例えばClackson et al (1991) Nature, 352:624-628；Marks et al (1991) J. Mol. Biol., 222:581-597に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。
【００３０】
本明細書中におけるモノクローナル抗体には特に、特定の種由来または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列に同一又は相同である重鎖及び／又は軽鎖の一部を含み、残りの鎖は、所望の生物学的活性を表す限り、他の種由来または他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体並びに該抗体の抗体断片の対応する配列に同一又は相同である「キメラ」抗体が含まれる（米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855)。本明細書で対象とするキメラ抗体には、非ヒト霊長類(例えば旧世界ザル、サルなど)及びヒト定常領域配列由来の可変ドメイン抗原結合配列を含む「霊長類化」抗体が含まれる。
【００３１】
本明細書における「インタクトな抗体」は、ＶＬ及びＶＨドメイン、並びに軽鎖定常ドメイン(ＣＬ)及び重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むものである。定常ドメインは、天然型配列の定常ドメイン(例えばヒト天然型配列定常ドメイン)又はそのアミノ酸配列変異体であってもよい。インタクトな抗体は、抗体のＦｃ領域(天然型配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域)に起因する生物活性を意味する一又は複数の「エフェクター機能」を有してよい。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞障害作用；Ｆｃレセプター結合；抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用(ＡＤＣＣ)；食作用；及び細胞表面レセプター(例えばＢ細胞レセプター；ＢＣＲ)の下方制御などが含まれる。
【００３２】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、インタクトな抗体は異なる「クラス」に分類できる。インタクトな抗体の五つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらの幾つかは更に「サブクラス」(アイソタイプ)、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３，ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分類される。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ及びμと称される。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び３次元構造はよく知られている。Igの形態にはヒンジを修飾した型又はヒンジ欠損型を含む(Roux et al (1998) J. Immunol. 161:4083-4090; Lund et al (2000) Eur. J. Biochem. 267:7246-7256; 米国特許出願公開第２００５／００４８５７２号；米国特許出願公開第２００４／０２２９３１０号）。
【００３３】
「ＥｒｂＢレセプター」は、ＥｒｂＢレセプターファミリーに属するレセプタープロテインキナーゼであり、そのメンバーは細胞増殖、分化及び生存の重要なメディエーターである。ＥｒｂＢレセプターファミリーは上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２又はｐ１８５ｎｅｕ）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）及びＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４又はｔｙｒｏ２）を含む４つの異なるメンバーを含む。抗ＥｒｂＢ２抗体のパネルは、ヒト乳癌細胞株ＳＫＢＲ３を使用して特徴づけられている(Hudziak et al (1989) Mol. Cell. Biol. 9(3):1165-1172）。最大阻害は細胞増殖を５６％抑制した４Ｄ５と呼ばれる抗体で得られた。パネル内の他の抗体は、このアッセイにおいて、細胞増殖をより少ない程度で減少させた。抗体４Ｄ５は更に、ＴＮＦ-α（米国特許第５６７７１７１号）の細胞傷害効果に対してＥｒｂＢ２過剰発現乳癌細胞株を感作することが見いだされた。 Hudziakらによって議論された抗ＥｒｂＢ２抗体は、更にFendly et al (1990) Cancer Research 50:1550-1558; Kotts et al. (1990) In Vitro 26(3):59A; Sarup et al. (1991) Growth Regulation 1:72-82; Shepard et al. J. (1991) Clin. Immunol. 11(3):117-127; Kumar et al. (1991) Mol. Cell. Biol. 11(2):979-986; Lewis et al. (1993) Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263; Pietras et al. (1994) Oncogene 9:1829-1838; Vitetta et al. (1994) Cancer Research 54:5301-5309; Sliwkowski et al. (1994) J. Biol. Chem. 269(20):14661-14665; Scott et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:14300-5; D'souza et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:7202-7206; Lewis et al. (1996) Cancer Research 56:1457-1465; and Schaefer et al. (1997) Oncogene 15:1385-1394において特徴付けられる。
【００３４】
ＥｒｂＢレセプターは、一般的に、細胞外ドメインを含み、それはＥｒｂＢリガンド、親油性の膜貫通ドメイン；保存された細胞内チロシンキナーゼドメイン、及びリン酸化可能な幾つかのチロシン残基を保有するカルボキシ末端シグナル伝達ドメインを結合し得る。ＥｒｂＢレセプターは「天然配列」ＥｒｂＢレセプター又はその「アミノ酸配列変異体」であってもよい。好ましくは、ＥｒｂＢレセプターは、天然配列のヒトのＥｒｂＢレセプターである。従って、「ＥｒｂＢレセプターファミリーのメンバー」はＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１）、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、又は現在知られているか又アーは将来的に同定される任意の他のＥｒｂＢレセプターである。
【００３５】
「ＥｒｂＢ１」、「上皮成長因子レセプター」、「ＥＧＦＲ」及び「ＨＥＲ１」という用語は本明細書において互換的に使用され、例えばCarpenter et al (1987) Ann. Rev. Biochem., 56:881-914に開示されているようなＥＧＦＲを指し、その自然発生突然変異体(例えば、Humphrey等, PNAS(USA) 87:4207-4211(1990)に記載されているような欠失変異体ＥＧＦＲ)を含む。ｅｒｂＢ１なる用語は、ＥＧＦＲタンパク質産物をコードする遺伝子を指す。ＨＥＲ１に対する抗体は例えばMurthy et al (1987) Arch. Biochem. Biophys., 252:549-560、及び国際公開第９５／２５１６７号に記載されている。
【００３６】
「ＥＲＲＰ」、「ＥＧＦレセプター関連タンパク質」、「ＥＧＦＲ関連蛋白質」及び「上皮成長因子レセプター関連タンパク質」は本明細書中で互換的に使用され、例えば、米国特許第６３９９７４３号、米国特許出願公開第２００３／００９６３７３号に開示されているＥＲＲＰを指す。
【００３７】
「ＥｒｂＢ２」及び「ＨＥＲ２」なる表記は、ここで互換的に使用され、例えば、 Semba et al (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 82:6497-6501及びYamamoto et al (1986) Nature, 319:230-234（Ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号Ｘ０３３６３）に記載されているヒトＨＥＲ２タンパク質を指す。「ｅｒｂＢ２」なる用語は、ヒトＥｒｂＢ２をコードする遺伝子を指し、「ｎｅｕ」はラットｐ１８５ｎｅｕをコードする遺伝子を指す。好ましいＥｒｂＢ２は天然配列ヒトＥｒｂＢ２である。
【００３８】
「ＥｒｂＢ３」及び「ＨＥＲ３」は、例えば米国特許第５１８３８８４号、同第５４８０９６８号、及びKraus et al (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 86:9193-9197に開示されている。ＥｒｂＢ３に対する抗体は当該技術分野で公知であり、例えば米国特許第５１８３８８４号、同５４８０９６８号及び国際公開第９７／３５８８５号に記載されている。
【００３９】
「ＥｒｂＢ４」及び「ＨＥＲ４」なる用語は本明細書において、例えば欧州特許第５９９２７４号；Plowman et al (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1746-1750; 及びPlowman et al (1993) Nature 366:473-475、そのアイソフォームを含むものは、例えば国際公開第９９／１９４８８号に開示される。ＨＥＲ４に対する抗体は、例えば、国際公開第０２／１８４４４号に記載される。
【００４０】
ＥｒｂＢレセプターに対する抗体は、例えばサンタクルスバイオテクノロジー社、米国カリフォルニア州を含むいくつかの供給源 から市販されている。
【００４１】
「アミノ酸配列変異体」という用語は、天然配列ポリペプチドから或る程度異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。通常、アミノ酸配列変異体は天然のＥｂｒＢリガンドの少なくとも１つのレセプター結合ドメインと又は天然のＥｂｒＢレセプターの少なくとも１つのリガンド結合ドメインと少なくとも約７０％の相同性を有しており、好ましくは該レセプター又はリガンド結合ドメインと少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約９０％の相同性を有している。アミノ酸配列変異体は、天然アミノ酸配列のアミノ酸配列内の或る位置において、置換、欠失及び／又は挿入を有している。アミノ酸は、通常の名前、１文字及び３文字のコードで指定される。
【００４２】
「配列同一性」は、配列を整列し、最大のパーセント配列同一性を達成するために、必要に応じてギャップを導入した後における、同一のアミノ酸配列変異体の残基の割合として定義される。整列するための方法及びコンピュータプログラムは、当技術分野において周知である。そのようなコンピュータプログラムの一つは、ジェネンテック社により著され１９９１年１２月１０日に米国著作権局（ワシントンＤ．Ｃ．２０５５９）にユーザーマニュアルとともに提出された、「Ａｌｉｇｎ２」である。
【００４３】
「抗体依存性細胞媒介性障害活性」及び「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃレセプター(ＦｃＲ)を発現する非特異的細胞障害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球、及びマクロファージ)が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞を溶解する細胞媒介性反応を意味する。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血性細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, (1991) “Annu. Rev. Immunol.” 9:457-92の４６４頁の表３に要約されている。対象分子のＡＤＣＣ活性を評価するためには、米国特許第５５００３６２号又は５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイが実施されうる。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー細胞(ＮＫ)細胞を含む。あるいは、又は付加的に、対象分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes et al (1998) PROC. NAT. ACAD. SCI. (USA) (USA) 95:652-656に開示されたような動物モデルにおいて、インビボで評価されうる。
【００４４】
「ヒトエフェクター細胞」は、一又は複数のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を実行する白血球である。好ましくは、その細胞が少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例には、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞及び好中球が含まれるが、ＰＢＭＣとＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、その天然源、例えば血液又は本明細書に記載のＰＢＭＣから単離され得る。
【００４５】
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載するために使用される。好適なＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(γレセプター)に結合し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含むものであり、これらのレセプターの対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング型を含む。ＦｃγＲＩＩレセプターは、ＦｃγＲＩＩＡ(「活性化レセプター」)及びＦｃγＲＩＩＢ(「阻害レセプター」)を含み、それらは、主としてその細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化レセプターＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン-ベース活性化モチーフ(ＩＴＡＭ)を有する。阻害レセプターＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシンベースの阻害モチーフ(ＩＴＩＭ)を有する(Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234(1997)参照)。ＦｃＲはRavetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capelら, Immunomethods 4:25-34 (1994)；及びde Haasら, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41(1995)において概説されている。将来同定されるものも含む他のＦｃＲが、ここにおける「ＦｃＲ」なる用語によって包含される。この用語は胎児への母性ＩｇＧの移動の原因である新生児レセプターＦｃＲｎもまた含む(Guyerら, J. Immumol. 117:587(1976)及びKimら, J. Immunol. 24:249 (1994))。
【００４６】
「補体依存性細胞障害」又は「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解する分子の能力を意味する。補体活性化経路は補体系(Ｃｌｑ)の第１成分が、同族抗原と結合した分子(例えば抗体)に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoroら, J. Immunol. Methods 202:163(1996)に記載されているようにして実施することができる。
【００４７】
「天然抗体」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を、その他端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
【００４８】
「可変」なる用語は、可変ドメインのある部位が、抗体間で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する３つの高頻度可変領域により連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲをそれぞれ含んでいる。各鎖の高頻度可変領域は、ＦＲによって近接して結合され、他の鎖の高頻度可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabatら, Sequence of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞媒介性障害活性(ＡＤＣＣ)への抗体の関与を示す。
【００４９】
本明細書で使用されるところの「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合に寄与する抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基(例えば、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７(Ｌ３)、及び重鎖可変ドメインの３１−３５(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)及び９５−１０２(Ｈ３)；Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest,５版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))及び／又は「高頻度可変ループ」からの残基(例えば、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)及び重鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｈ１)、５３−５５(Ｈ２)及び９６−１０１(Ｈ３)；Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917(1987))を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基はここで定義するように高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００５０】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ(ａｂ')２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を架橋することができる。
【００５１】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この配置において、各可変ドメインの３つの高頻度可変領域は相互に作用してＶＨ-ＶＬ二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６つの高頻度可変領域が抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つの高頻度可変領域のみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
【００５２】
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(ＣＨ１)を有する。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも一つの遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生産された。また、抗体断片の他の化学結合も知られている。
【００５３】
任意の脊椎動物種からの抗体(イムノグロブリン)の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられうる。
【００５４】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、ＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPlueckthunを参照のこと。抗ＥｒｂＢ２抗体のｓｃＦｖ断片は国際公開第９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号、及び同５５８７４５８号に記載されている。
【００５５】
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を意味し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ-ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合してなる。短すぎて同一鎖上で二つのドメインの対形成が可能でないリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディは、例えば、欧州特許出願公開第４０４,０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；及びHollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448(1993)により詳細に記載されている。
【００５６】
非ヒト(例えば齧歯類)抗体の「ヒト化」形とは、非ヒト抗体から得られた最小配列を含むキメラ抗体である。ヒト化は、非免疫原性ヒト抗体のアクセプターにネズミの抗原結合情報を転送する方法であり、多くの治療的に有用な薬剤をもたらした。ヒト化の方法は、一般に全ての６つのマウス相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体のフレームワーク上に転送することによって開始される(Jones et al, (1986) Nature 321:522-525)。これらのＣＤＲ移植抗体は、一般的に抗原結合について元の親和性を保持せず、実際には親和性はしばしば著しく損なわれている。ＣＤＲに加えて、選択非ヒト抗体のフレームワーク残基はまた、適切なＣＤＲの立体構造を維持するために組み込む必要がある(Chothia et al (1989) Nature 342:877)。グラフトされたＣＤＲの構造のコンフォメーションをサポートするために、鍵となるマウスフレームワーク残基のヒトアクセプターへの転送は、抗原結合及び親和性を復元することが示されている(Riechmann et al (1992) J. Mol. Biol. 224, 487-499; Foote and Winter, (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499; Presta et al (1993) J. Immunol. 151, 2623-2632; Werther et al (1996) J. Immunol. Methods 157:4986-4995; and Presta et al (2001) Thromb. Haemost. 85:379-389)。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の抗体特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、全て又はほとんど全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又はほとんど全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細は、Jones等, Nature 321, 522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332, 323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照のこと。
【００５７】
「遊離したシステインアミノ酸」は、親抗体内に改変されているシステインアミノ酸残基を指し、チオール官能基(−ＳＨ)を有し、分子内又は分子間ジスルフィド架橋として対形成しない。
【００５８】
「チオール反応値」なる用語は、遊離したシステインアミノ酸の反応性の定量的特徴づけである。チオール反応値は、チオール反応試薬と反応するシステイン改変抗体の遊離したシステインアミノ酸の割合であって、１の最大値に変換される。例えば、ビオチン−マレイミド試薬などのチオール反応試薬と１００％の収率で反応してビオチン標識抗体を形成するシステイン改変抗体の遊離システインアミノ酸はチオール反応値が１．０となる。チオール反応試薬と８０％の収率で反応する同じ又は異なる親抗体内で改変された他のシステインアミノ酸はチオール反応値が０．８となる。チオール反応試薬と完全に反応しない同じ又は異なる親抗体内で改変された他のシステインアミノ酸はチオール反応値が０となる。特定のシステインのチオール反応値の測定は、ＥＬＩＳＡアッセイ、質量分析、液体クロマトグラフィ、オートラジオグラフィ、又は他の定量的な分析試験によって行ってもよい。
【００５９】
「親抗体」は、一又は複数のアミノ酸残基が一又は複数のシステイン残基に置き換わっているアミノ酸配列を含む抗体である。親抗体は、天然型又は野生型の配列を含んでいてもよい。親抗体は、他の天然型、野生型又は修飾した形態の抗体と比較して既存のアミノ酸配列修飾(例えば付加、欠失及び／又は置換)を有してもよい。親抗体は、対象の標的抗原、例えば生物学上重要なポリペプチドに対するものであってもよい。また、非ポリペプチド抗原(例えば腫瘍関連糖脂質抗原；米国特許第５０９１１７８号を参照)に対する抗体も考慮される。
【００６０】
典型的な親抗体は、細胞表面および膜貫通型レセプター及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する親和性及び選択性を有する抗体を含む。
【００６１】
他の典型的な親抗体は、抗エストロゲンレセプター抗体、抗プロゲステロンレセプター抗体、抗ｐ５３抗体、抗ＨＥＲ-２／ｎｅｕ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗カテプシンＤ抗体、抗Ｂｃｌ-２抗体、抗Ｅ-カドヘリン抗体、抗ＣＡ１２５抗体、抗ＣＡ１５-３抗体、抗ＣＡ１９-９抗体、抗ｃ-ｅｒｂＢ-２抗体、抗Ｐ−糖蛋白質抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗網膜芽細胞腫蛋白質抗体、抗-ｒａｓ癌タンパク質抗体、抗ルイスＸ抗体、抗Ｋｉ-６７抗体、抗ＰＣＮＡ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ５抗体、抗ＣＤ７抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ９／ｐ２４抗体、抗ＣＤ１０抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体、抗ＣＤ１３抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１５抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ２３抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ３５抗体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ４１抗体、抗ＬＣＡ／ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体、抗ＣＤ３９抗体、抗ＣＤ１００抗体、抗ＣＤ９５／Ｆａｓ抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＣＤ１０６抗体、抗ユビキチン抗体、抗ＣＤ７１抗体、抗ｃ-ｍｙｃ抗体、抗サイトケラチン抗体、抗ビメンチン抗体、抗ＨＰＶ蛋白質抗体、抗κ軽鎖抗体、抗λ軽鎖抗体、抗メラノソーム抗体、抗前立腺特異抗原抗体、抗Ｓ-１００抗体、抗タウ抗原抗体、抗フィブリン抗体、抗ケラチン抗体及び抗Ｔｎ-抗原抗体から選択されるものを含むがこれらに限定されない。
【００６２】
「単離された抗体」とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、抗体は、(１)ローリー(Lowry)法によって定量して９５重量％以上まで、最も好ましくは９９重量％以上まで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分な程度まで、又は(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた還元又は非還元条件下でＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体には、組換え体細胞内のインサイツの抗体が含まれるが、これは抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないからである。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一つの精製工程により調製される。
【００６３】
分子標的又は目的とする抗原、例えばＥｒｂＢ２抗原を「結合する」抗体とは、抗体が抗原を発現する細胞を標的にすることにおいて有用であるよう十分な親和性でその抗原を結合することができるものである。抗体がＥｒｂＢ２のをバインドするものである場合、それは他のＥｒｂＢレセプターとは対照的に、通常は優先的にＥｒｂＢ２を結合し、他のタンパク質、例えばＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３又はＥｒｂＢ４などとは有意に交差反応しないものであり得る。そのような実施態様において、これらの非ＥｒｂＢ２タンパク質への抗体の結合（例えば、内因性レセプターへの細胞表面の結合）の程度は、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析又は放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）によって決定されると１０％未満となる。時には、例えば、Schecter et al. (1984) Nature 312:513及びDrebin et al (1984) Nature 312:545-548に記載されるように、抗ＥｒｂＢ２抗体がラットｎｅｕタンパク質と有意には交差反応しない場合がある。
【００６４】
本発明によって包含される抗体の標的分子は、ＣＤタンパク質及びそのリガンド、例えば、限定されないが、（ｉ）ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９α（ＣＤ７９ａ）、及びＣＤ７９β（ＣＤ７９ｂ）；（ｉｉ）ＥｒｂＢレセプターファミリーのメンバー、例えばＥＧＦレセプター、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４レセプター；（ｉｉｉ）ＬＦＡ-１、Ｍａｃ１、ｐ１５０,９５、ＶＬＡ-４、ＩＣＡＭ-１、ＶＣＡＭ及びαｖ／β３インテグリンリンなどの細胞接着分子で、そのαサブユニット又はβサブユニットの何れかを含む（例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８又は抗ＣＤ１１ｂ抗体）；（ｉｖ）ＶＥＧＦなどの増殖因子；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３レセプター；肥満（ＯＢ）レセプター；ｍｐｌレセプター；ＣＴＬＡ-４、プロテインＣ、ＢＲ３、ｃ-ｍｅｔ、組織因子、β７など、及び（ｖ）細胞表面及び膜貫通の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を含む。
【００６５】
特に示されなければ、「モノクローナル抗体４Ｄ５」という用語は、マウス４Ｄ５抗体（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１０４６３）の、又は該抗体由来の抗原結合残基を有する抗体を指す。例えば、モノクローナル抗体４Ｄ５はマウスモノクローナル抗体４Ｄ５又はその変異体、例えばヒト化４Ｄ５であってもよい。典型的なヒト化４Ｄ５抗体は米国特許第５８２１３３７号に記載されているように、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-７及びｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８を含む。
【００６６】
「ファージディスプレイ」は、変異体ポリペプチドを、ファージ、例えば糸状ファージ粒子の表面上のコートタンパク質への融合タンパク質としてディスプレイする技術である。ファージディスプレイの有用性は、ランダム化タンパク質変異体の大きなライブラリーを、高親和性でもって標的分子に結合する配列について迅速にかつ効率的に選別できるという点にある。ファージ上へのペプチド及びタンパク質ライブラリーのディスプレイは、特異的結合特性を持つものについて何百万ものポリペプチドをスクリーニングするために使用されている。多価ファージディスプレイ法は、典型的には糸状ファージのｐＩＩＩ又はｐＶＩＩＩへの融合体を通してランダム小ペプチド及び小タンパク質をディスプレイするために使用されている（Wells及びLowman, Curr. Opin. Struct. Biol., 3:355-362 (1992)と、そこで引用されている文献）。一価ファージディスプレイでは、タンパク質又はペプチドライブラリーはファージコートタンパク質又はその一部に融合させられ、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質の存在下で低レベルで発現される。選別が内因的なリガンド親和性に基づくように親和性の効果が多価ファージに対して低減され、ファージミドベクターが使用され、これがＤＮＡ操作を単純にするLowman and Wells, Methods: A companion to Methods in Enzymology, 3:205-0216 (1991)。ファージディスプレイ法は、抗体様分子を生成するため技術を含む(Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York, p627-628; Lee et al )。
【００６７】
「ファージミド」は、細菌の複製起点、例えばＣｏ１Ｅ１、及びバクテリオファージの遺伝子間領域のコピーを有するプラスミドベクターである。ファージミドは、糸状バクテリオファージ及びラムダ状バクテリオファージを含む任意の既知のバクテリオファージで使用されうる。プラスミドはまた一般には抗生物質耐性の選択マーカーも含む。これらのベクターにクローニングされるＤＮＡのセグメントはプラスミドとして増殖することができる。これらのベクターを内部に持つ細胞がファージ粒子の生産のために必要な全ての遺伝子を備えているとき、プラスミドの複製様式はローリングサークル複製に変化し、プラスミドＤＮＡの１つの鎖のコピーとパッケージファージ粒子を生成する。ファージミドは感染性または非感染性ファージ粒子を形成しうる。この用語は、異種ポリペプチドがファージ粒子表面に提示されるように遺伝子融合体としてこの異種ポリペプチドの遺伝子と結合したファージコートタンパク質遺伝子又はその断片を含むファージミドを含む。
【００６８】
「リンカー」、「リンカーユニット」又は「連結」は、共有結合を含む化学的成分又は共有結合にて抗体を薬剤成分に結合させる原子の鎖を意味する。様々な実施態様では、リンカーはＬと表される。リンカーには、二価のラジカル、例としてalkyldiyl、aryldiyl、heteroaryldiyl、アルキロキシ(例としてpolyethylenoxy、PEG、polymethyleneoxy)及びアルキラミノ(例えばpolyethyleneamino、JeffamineTM)の繰り返しユニットである-(CR2)nO(CR2)n-などの成分、及び、スクシナート、スクシンアミド、ジグリコレート、マロネート及びカプロアミドを含む二酸エステル及びアミドが含まれる。
【００６９】
「標識」なる用語は、抗体に共有結合的に接着することができ、(i) 検出可能なシグナルを生じ；(ii) 第二標識と相互作用して、第一又は第二標識、例えばＦＲＥＴ(蛍光共鳴エネルギー転移)によって生じる検出可能なシグナルを修飾し；(iii) 抗原又はリガンドとの相互作用を安定させるかまたは結合の親和性を増やし；(iv) 電荷、疎水性、形状又は他の物理学的パラメータによって、移動度、例えば電気泳動移動度又は細胞透過性に作用し、又は(v) キャプチャ分子を生じさせ、リガンド親和性、抗体／抗原結合又はイオン複合体調節するために機能する、任意の成分を意味する。
【００７０】
本明細書中で用いる立体化学的定義及び慣例は、一般にS. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York；及び、Eliel, E. and Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley &amp; Sons, Inc., New Yorkに従う。多くの有機化合物は光学的に活性な形態で存在し、すなわち直線偏光の平面を回転する能力を有する。光学的に活性な化合物を記載する場合、接頭語ＤとＬ又はＲとＳを用いて、キラル中心(一又は複数)の周りの分子の絶対配置を示す。接頭後ｄとｌ又は(＋)と(−)は、化合物による直線偏光の回転のサインを示すために用いるものであって、(−)又は１は化合物が左旋性であることを意味する。(＋)又はｄを接頭に付した化合物は右旋性である。所定の化学構造では、互いの鏡像であることを除いて、これらの立体異性体は同一である。また、特定の立体異性体は鏡像異性体とも称され、この異性体の混合物は鏡像異性体混合物と称されることが多い。鏡像異性体の５０：５０混合物は、化学的反応又は過程において立体選別でも立体特異性でもなくなった場合に生じうるラセミ混合物又はラセミ化合物を指す。「ラセミ混合物」及び「ラセミ化合物」なる用語は、光学的活性を欠く、２つの鏡像異性種を指す。
【００７１】
「薬学的に許容される塩」なる用語は、薬学的に許容可能なAZCの有機塩又は無機塩を言う。例示的な塩には、限定するものではないが、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ素、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、琥珀酸塩、マレイン酸塩、gentisinate、フマル酸塩、グルコン酸塩、グロクロン酸塩、糖酸塩、蟻酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、及びパモ酸塩(すなわち、１,１'-メチレンビス(２-ヒドロキシ-３-ナフトエート))が含まれる。薬学的に許容可能な塩は、他の分子、例えば酢酸イオン、琥珀酸イオン又は他の対イオンの包含を伴ってもよい。対イオンは、親化合物上の荷電を安定化する任意の有機又は無機の成分でもよい。さらに、薬学的に許容可能な塩は、その構造内に複数の荷電原子を有してもよい。複数の荷電原子が薬学的に許容可能な塩の一部である場合は複数の対イオンを有しうる。したがって、薬学的に許容可能な塩は、一又は複数の荷電原子及び／又は一又は複数の対イオンを有してもよい。
【００７２】
「薬学的に許容される溶媒和物」とは、１つまたは複数の溶媒分子及びＡＺＣとの会合を指す。薬学的に許容される溶媒和物を形成する溶媒の例としては、限定されないが、水、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、酢酸エチル、酢酸、エタノールが含まれる。
【００７３】
次の略語が本明細書中で使用され、指定された定義を持つ：ＢＭＥは、β-メルカプトエタノールであり。ＢｏｃはＮ-（ｔ-ブトキシカルボニル)（N-(t-butoxycarbonyl)）であり、ｃｉｔはシトルリン （２-アミノ-５-ウレイドペンタン酸）（citrulline (2-amino-5-ureido pentanoic acid)）であり、ｄａｐはドラプロリン（dolaproine）であり、ＤＣＣは、１,３-ジシクロヘキシルカルボジイミド（ 1,3-dicyclohexylcarbodiimide）であり、ＤＣＭは、ジクロロメタン（dichloromethane）であり、ＤＥＡは、ジエチルアミン（diethylamine）であり、DEADは、アゾジカルボン酸ジエチル（diethylazodicarboxylate）であり、ＤＥＰＣは、シアノホスホン酸ジエチル（diethylphosphorylcyanidate）であり、ＤＩＡＤは、アゾジカルボン酸ジイソプロピル（diisopropylazodicarboxylate）であり、ＤＩＥＡはＮ,Ｎ-エチルアミンジイソプロピル（N,N-diisopropylethylamine）であり、ｄｉｌはドライソロイシン（dolaisoleucine）であり、ＤＭＡはジメチルアセトアミド（dimethylacetamide）であり、ＤＭＡＰは４-ジメチルアミノピリジン（4-dimethylaminopyridine）であり、ＤＭＥは、エチレングリコールジメチルエーテル（ethyleneglycol dimethyl ether）（又は１,２-ジメトキシエタン（1,2-dimethoxyethane））であり、ＤＭＦはN,N-ジメチルホルムアミド（N,N-dimethylformamide）であり、ＤＭＳＯは、ジメチルスルホキシド（dimethylsulfoxide）であり、ｄｏｅはドラフェニン（dolaphenine）であり、ｄｏｖは、Ｎ,Ｎ-ジメチルバリン（N,N-dimethylvaline）であり、DTNBは５,５’-ジチオビス（２-ニトロ安息香酸）（5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)）であり、ＤＴＰＡは、ジエチレントリアミン５酢酸（diethylenetriaminepentaacetic acid）であり、ＤＴＴは、ジチオスレイトール（dithiothreitol）であり、ＥＤＣＩは１-（３-ジメチルアミノプロピル）-３-エチルカルボジイミド塩酸塩（1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride）であり、ＥＥＤＱは、２-エトキシ-１-エトキシカルボニル-１,２-ジヒドロキノリン（2-ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1,2-dihydroquinoline）であり、ＥＳ−ＭＳは、エレクトロスプレー質量分析であり、ＥｔＯＡｃは、酢酸エチルであり、Ｆｍｏｃは、Ｎ-（９-フルオレニルメトキシカルボニル)（N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)）であり、ｇｌｙはグリシンであり、ＨＡＴＵは、Ｏ-（７-アザベンゾトリアゾル-１-イル）-Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N’,N’-tetramethyluronium hexafluorophosphate）であり、ＨＯＢｔは、１-ヒドロキシベンゾトリアゾール（1-hydroxybenzotriazole）であり、ＨＰＬＣは、高速液体クロマトグラフィーであり、ｉｌｅは、イソロイシンであり、ｌｙｓはリジンであり、ＭｅＣＮ（ＣＨ３ＣＮ）はアセトニトリル（acetonitrile）であり、ＭｅＯＨは、メタノールであり、Ｍｔｒは、４-アニシルジフェニルメチル(又は４-メトキシトリチル)（4-anisyldiphenylmethyl (or 4-methoxytrityl)）、もしくは、（１Ｓ, ２Ｒ）-(＋)-ノルエフェドリン（(1S, 2R)-(+)-norephedrine）であり、ＰＢＡは、ｐ-アミノベンジルカルバモイル（p-aminobenzylcarbamoyl）であり、ＰＢＳは、リン酸緩衝塩類溶液（phosphate-buffered saline）（ｐＨ７）であり、ＰＥＧは、ポリエチレングリコールであり、Ｐｈは、フェニルであり、Pnpは p-ニトロフェニル （p-nitrophenyl）であり、ＭＣは、６-マレイミドカプロイル（6-maleimidocaproyl）であり、ｐｈｅは、Ｌ-フェニ��アラニンであり、ＰｙＢｒｏｐは、ブロモトリス-ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（bromo tris-pyrrolidino phosphonium hexafluorophosphate）であり、ＳＥＣは、サイズ排除クロマトグラフィーであり、Ｓｕは、スクシンイミドであり、ＴＦＡは、トリフルオロ酢酸であり、ＴＬＣは薄層クロマトグラフィーであり、ＵＶは、紫外線であり、及びｖａｌはバリンである。
【００７４】
システイン改変抗体
本発明の化合物は、野生型又は親抗体の一つまたは複数のアミノ酸がシステインアミノ酸で置換されているシステイン改変抗体を含む。抗体の何れの型でも改変、すなわち変異導入され得る。例えば、親のＦａｂ抗体断片は、システイン改変Ｆａｂを形成するために改変され得、ここでは「ＴｈｉｏＦａｂ」として参照される。同様に、親のモノクローナル抗体は「ＴｈｉｏＭａｂ」を形成するために改変され得る。単一部位の変異はＴｈｉｏＦａｂの単一の改変システイン残基を生成し、一方、ＩｇＧ抗体の二量体の性質のために単一部位の変異はＴｈｉｏＭａｂの２つの改変されたシステイン残基を生成するすることに留意すべきである。置換された（改変された）システイン（Ｃｙｓ）残基を持つ変異体は、新たに導入され、改変されたシステインのチオール基の反応性について評価される。チオールの反応性値は０から１．０の範囲の相対的な数値であり、任意のシステイン改変抗体について測定できる。本発明のシステイン改変抗体のチオールの反応性値は、０．６から１．０；０．７から１，０；又は０．８から１．０である。本発明の設計、選択、及び調製方法は求電子的機能性により反応的であるシステイン改変抗体を可能とする。これらの方法はさらに、指定され、設計された、選択的な部位でジルコニウム原子を有する抗体ジルコニウムコンジュゲート（ＡＺＣ）などの抗体複合体化合物を可能とする。抗体表面の反応性のシステイン残基は、マレイミド基又はハロアセチル基などのチオール反応性基を介してジルコニウム基を特異的に結合させることを可能とする。Ｃｙｓ残基のチオール機能のマレイミド基に対する求核反応性は、タンパク質内の他のアミノ酸の機能性、例えばリジン残基のアミノ基又はＮ末端アミノ基などに比べ約１０００倍高い。ヨードアセチル試薬及びマレイミド試薬のチオール固有の機能性によりアミン基と反応し得るが、より高いｐＨ（＞９．０）及びより長い反応時間を要する(Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London)。
【００７５】
本発明のシステイン改変抗体は、好ましくは、野生型、親抗体のカウンターパートの抗原結合能力を保持する。従って、システイン改変抗体は、好ましくは特異的には、抗原に結合することが可能である。そのような抗原としては、例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、細胞表面レセプタータンパク質及び他の細胞表面分子、膜貫通タンパク質、シグナル伝達タンパク質、細胞生存調節因子、細胞増殖調節因子、組織発達又は分化、リンホカイン、サイトカインに関連付けられている分子（例えば、既知であるか又は機能性に寄与すると疑われるもの）、細胞周期の調節に関与する分子、脈管形成に関与する分子、及び血管新生に関連付けられている分子（例えば、既知であるか又は機能性に寄与すると疑われるもの）を含む。腫瘍関連抗原は、クラスター分化因子（すなわちＣＤタンパク質）である可能性がある。システイン改変抗体が結合することができる抗原は、上記のカテゴリのいずれかのサブセットのメンバーであり得、前記カテゴリの他のサブセットは（対象の抗原に関して）異なる特性を持つ他の分子／抗原を含む。
【００７６】
親抗体は、米国特許第５８２１３３７号の表３に記載されるｈｕＭＡｂ４Ｄ５-１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-７及びｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８（トラスツズマブ、ハーセプチン（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）（登録商標））から選択されるヒト化抗体であってもよく、本明細書に記述されるヒト化５２０Ｃ９抗体（国際公開第９３／２１３１９号）及びヒト化２Ｃ４抗体を参照により本明細書に明確に援用される。
【００７７】
本発明のシステイン改変抗体は、部位特異的かつ効率的にチオール反応性試薬と結合させることができる。チオール反応性試薬は、多機能リンカー試薬、キャプチャ、すなわち親和性、標識試薬（例えば、ビオチン−リンカー試薬）、検出標識（例えば、フルオロフォア試薬）、固相固定化試薬（例えばＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ、ポリスチレン、又はガラス）、又はジルコニウムリンカー中間体であり得る。チオール反応性試薬の一例はＮ-エチルマレイミド（ＮＥＭ）である。典型的な実施態様において、ＴｈｉｏＦａｂのビオチンリンカー試薬との反応は、ビオチン標識化ＴｈｉｏＦａｂを与え、それによって改変されたシステイン残基が検出され測定され得る。ＴｈｉｏＦａｂの多機能性リンカー試薬との反応は多機能性リンカー付きのＴｈｉｏＦａｂを与え、それにより更にジルコニウム成分又は別の標識と反応され得る。ＴｈｉｏＦａｂのジルコニウムリンカー中間体との反応はＴｈｉｏＦａｂジルコニウムコンジュゲートを与える。
【００７８】
ここで記載される典型的な方法は一般に抗体の同定及び産生に適用され得、より一般的には本明細書に記載された設計及びスクリーニング工程の適用を通じて別のタンパク質に適用され得る。
【００７９】
このようなアプローチは、反応基が、例えば、マレイミド、ヨードアセトアミド、ピリジルジスルフィド、又は他のチオール反応性結合パートナーである、他のチオール反応性剤の結合に適用され得る(Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, pp. 40-55, 643-671)。パートナーは、細胞毒性剤 （例えば、ドキソルビシン又は百日咳毒素など）、フルオレセイン様又はローダミン様蛍光色素などのフルオロフォア、イメージング又は放射線治療の金属のためのキレート剤、ペプチジル又は非ペプチジル標識又は検出タグ、又はポリエチレングリコールの様々なアイソフォームなどのクリアランス修飾剤、第３の成分に結合するペプチド、又はその他の炭水化物又は親油性剤であり得る。
【００８０】
典型的な抗体断片であるｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８で同定された部位は、ここでは主に抗体の定常ドメインにあり、抗体の全ての種にわたって保存されている。これらの部位は、さらに特定の抗体の構造の構造設計及び知識を必要とせずに、かつ抗体の可変ドメインに固有の抗原結合特性の干渉することなく、他の抗体に広く適用可能であるべきである。
【００８１】
癌の治療に有用なシステイン改変抗体は、限定されないが、細胞表面レセプター及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する抗体を含む。そのような抗体は、（標識成分に結合していない）ネイキッド抗体、又は式Ｉの抗体−ジルコニウムコンジュゲート（ＡＺＣ）として使用することができる。腫瘍関連抗原は、当技術分野で知られており、当該技術分野で周知の方法及び情報を使用して、抗体を生成する際に使用するために調製することができる。癌の診断及び治療のための効果的な細胞標的を発見する試みにおいて、研究者は、膜貫通ポリペプチド、又はそうでなければ一つ以上正常な非癌細胞上に比べて癌細胞の一つ以上特定の型の表面上に特異的に発現された腫瘍関連ポリペプチドを同定しようとしてきた。多くの場合、腫瘍関連ペプチドは、非癌細胞の表面上に比べてより豊富に癌細胞の表面に発現している。そのような腫瘍関連細胞表面の抗原ペプチドの同定は、抗体ベースの治療を経由して癌細胞を破壊するために標的とする能力を生じさせてきた。
【００８２】
ＴＡＡの例は、限定されないが、下にリストされたＴＡＡ（１）−（３６）を含む。便宜上、これらの抗原に関連する情報で当該技術分野で知られているすべては以下のリストされ、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の核酸及びタンパク質の配列同定規則に従い、名前、代替名、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号及び主要参照文献を含む。ＴＡA（１）−（３６）に対応する核酸とタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋなどの公共のデータベースで利用可能である。抗体により標的とされる腫瘍関連抗原は引用文献で同定された配列に対して少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を含むか、又は引用文献に記載の配列を有するＴＡＡとして、実質的に同一な生物学的特性ないしは特徴を示す全てのアミノ酸配列変異体及びアイソフォームを含む。たとえば、変異体配列を有するＴＡＡは、一般に、記載された対応する配列を持つＴＡＡに特異的に結合する抗体に特異的に結合することができる。
本明細書に具体的に引用される文献中の配列及び開示は参照により明示的に援用される。
【００８３】
腫瘍関連抗原（１）−（３６）：
（１）ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形成タンパク質レセプタータイプＩＢ型，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２０３）
ten Dijke,P., et al Science 264 (5155):101-104 (1994), Oncogene 14 (11):1377-1382 (1997)); 国際公開第２００４０６３３６２号（請求項２）；国際公開第２００３０４２６６１号（請求項１２）；米国特許出願公開第２００３１３４７９０−Ａ１号（頁３８−３９）；国際公開第２００２１０２２３５号（請求項１３；頁２９６）；国際公開第２００３０５５４４３号（頁９１−９２）；国際公開第２００２９９１２２号（実施例２；頁５２８−５３０）；国際公開第２００３０２９４２１号（請求項６）；国際公開第２００３０２４３９２号（請求項２；図１１２）；国際公開第２００２９８３５８号（請求項１；頁１８３）；国際公開第２００２５４９４０号（頁１００−１０１）；国際公開第２００２５９３７７号（頁３４９−３５０）；国際公開第２００２３０２６８号（請求項２７；頁３７６）；国際公開第２００１４８２０４号（実施例；図４）
ＮＰ＿００１１９４骨形成タンパク質レセプター，タイプＩＢ／ｐｉｄ＝ＮＰ＿００１１９４．１−
相互参照：ＭＩＭ：６０３２４８；ＮＰ＿００１１９４．１；ＡＹ０６５９９４
【００８４】
（２）Ｅ１６（ＬＡＴ１，ＳＬＣ７Ａ５，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３４８６）
Biochem. Biophys. Res. Commun. 255 (2), 283-288 (1999), Nature 395 (6699):288-291 (1998), Gaugitsch, H.W., et al (1992) J. Biol. Chem. 267 (16):11267-11273); 国際公開第２００４０４８９３８号（実施例２）；国際公開第２００４０３２８４２号（実施例ＩＶ）；国際公開第２００３０４２６６１号（請求項１２）；国際公開第２００３０１６４７５号（請求項１）；国際公開第２００２７８５２４号（実施例２）；国際公開第２００２９９０７４号（請求項１９；頁１２７−１２９）；国際公開第２００２８６４４３号（請求項２７；頁２２２，３９３）；国際公開第２００３００３９０６号（請求項１０；頁２９３）；国際公開第２００２６４７９８号（請求項３３；頁９３−９５）；国際公開第２０００１４２２８号（請求項５；頁１３３−１３６）；米国特許出願公開第２００３２２４４５４号（図３）；国際公開第２００３０２５１３８号（請求項１２；頁１５０）；
ＮＰ＿００３４７７ 溶質担体ファミリー７（カチオン性アミノ酸輸送体，ｙ＋システム），メンバー５／ｐｉｄ＝ＮＰ＿００３４７７．３−ホモサピエンス
相互参照：ＭＩＭ：６００１８２；ＮＰ＿００３４７７．３；ＮＭ＿０１５９２３；ＮＭ＿００３４８６＿１
【００８５】
（３）ＳＴＥＡＰ１（前立腺の６回膜貫通型上皮抗原，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１２４４９）
Cancer Res. 61 (15), 5857-5860 (2001), Hubert, R.S., et al (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (25):14523-14528); 国際公開第２００４０６５５７７号（請求項６）；国際公開第２００４０２７０４９号（図１Ｌ）；欧州特許第１３９４２７４号（実施例１１）；国際公開第２００４０１６２２５号（請求項２）；国際公開第２００３０４２６６１号（請求項１２）；米国特許出願公開第２００３１５７０８９号（実施例５）；米国特許出願公開第２００３１８５８３０号（実施例５）；米国特許出願公開第２００３０６４３９７号（図２）；国際公開第２００２８９７４７号（実施例５；頁６１８−６１９）；国際公開第２００３０２２９９５号（実施例９；図１３Ａ，実施例５３；頁１７３，実施例２；図２Ａ）；
ＮＰ＿０３６５８１前立腺の６回膜貫通型上皮抗原
相互参照：ＭＩＭ：６０４４１５；ＮＰ＿０３６５８１．１；ＮＭ＿０１２４４９＿１
【００８６】
（４）０７７２Ｐ（ＣＡ１２５，ＭＵＣ１６，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ３６１４８６）
J. Biol. Chem. 276 (29):27371-27375 (2001)); 国際公開第２００４０４５５５３号（請求項１４）；国際公開第２００２９２８３６号（請求項６；図１２）；国際公開第２００２８３８６６号（請求項１５；頁１１６−１２１）；米国特許出願公開第２００３１２４１４０号（実施例１６）；相互参照：ＧＩ：３４５０１４６７；ＡＡＫ７４１２０．３；ＡＦ３６１４８６＿１
【００８７】
（５）ＭＰＦ（ＭＰＦ，ＭＳＬＮ，ＳＭＲ，巨核球増強因子、メソテリン，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５８２３）Yamaguchi, N., et al Biol. Chem. 269 (2), 805-808 (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (20):11531-11536 (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (1):136-140 (1996), J. Biol. Chem. 270 (37):21984-21990 (1995)); 国際公開第２００３１０１２８３号（請求項１４）；（国際公開第２００２１０２２３５号（請求項１３；頁２８７−２８８）；国際公開第２００２１０１０７５号（請求項４；頁３０８−３０９）；国際公開第２００２７１９２８号（頁３２０−３２１）；国際公開第９４１０３１２号（頁５２−５７）；相互参照：ＭＩＭ：６０１０５１；ＮＰ＿００５８１４．２；ＮＭ＿００５８２３＿１
【００８８】
（６）Ｎａｐｉ３ｂ（ＮＡＰＩ−３Ｂ，ＮＰＴＩＩｂ，ＳＬＣ３４Ａ２，溶質輸送体ファミリー３４（リン酸ナトリウム），メンバー２，ＩＩ型ナトリウム依存性リン酸トランスポーター３ｂ，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００６４２４）J. Biol. Chem. 277 (22):19665-19672 (2002), Genomics 62 (2):281-284 (1999), Feild, J.A., et al (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 258 (3):578-582);国際公開第２００４０２２７７８号（請求項２）；欧州特許第１３９４２７４号（実施例１１）；国際公開第２００２１０２２３５号（請求項１３；頁３２６）；欧州特許第８７５５６９号（請求項１；頁１７−１９）；国際公開第２００１５７１８８号（請求項２０；頁３２９）；国際公開第２００４０３２８４２号（実施例ＩＶ）；国際公開第２００１７５１７７号（請求項２４；頁１３９−１４０）；
相互参照：ＭＩＭ：６０４２１７；ＮＰ＿００６４１５．１；ＮＭ＿００６４２４＿１
【００８９】
（７）Ｓｅｍａ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２，ＫＩＡＡ１４４５，Ｍｍ.４２０１５，ＳＥＭＡ５Ｂ，ＳＥＭＡＧ，セマフォリン ５ｂ Ｈｌｏｇ，セマドメイン（ｓｅｍａ ｄｏｍａｉｎ），７回トロンボスポンジン反復（１型及び１型様），膜貫通ドメイン（ＴＭ）および短い細胞質ドメイン（セマフォリン）５Ｂ，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢ０４０８７８）Nagase T., et al (2000) DNA Res. 7 (2):143-150); 国際公開第２００４０００９９７号（請求項１）；国際公開第２００３００３９８４号（請求項１）；国際公開第２００２０６３３９号（請求項１；頁５０）；国際公開第２００１８８１３３号（請求項１；頁４１−４３，４８−５８）；国際公開第２００３０５４１５２号（請求項２０）；国際公開第２００３１０１４００号（請求項１１）；受託番号：Ｑ９Ｐ２８３；ＥＭＢＬ；ＡＢ０４０８７８；ＢＡＡ９５９６９．１．Ｇｅｎｅｗ；ＨＧＮＣ：１０７３７；
【００９０】
（８）ＰＳＣＡ ｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ，Ｃ５３０００８Ｏ１６Ｒｉｋ，ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２，ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２ 遺伝子，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ３５８６２８）；Ross et al (2002) Cancer Res. 62:2546-2553; 米国特許出願公開第２００３１２９１９２号（請求項２）；米国特許出願公開第２００４０４４１８０号（請求項１２）；米国特許出願公開第２００４０４４１７９号（請求項１１）；米国特許出願公開第２００３０９６９６１号（請求項１１）；米国特許出願公開第２００３２３２０５６号（実施例５）；国際公開第２００３１０５７５８号（請求項１２）；米国特許出願公開第２００３２０６９１８号（実施例５）；欧州特許第１３４７０４６号（請求項１）；国際公開第２００３０２５１４８号（請求項２０）；
相互参照：ＧＩ：３７１８２３７８；ＡＡＱ８８９９１．１；ＡＹ３５８６２８＿１
【００９１】
（９）ＥＴＢＲ（エンドセリンタイプＢレセプター，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ２７５４６３）；
Nakamuta M., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 177, 34-39, 1991; Ogawa Y., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 248-255, 1991; Arai H., et al Jpn. Circ. J. 56, 1303-1307, 1992; Arai H., et al J. Biol. Chem. 268, 3463-3470, 1993; Sakamoto A., Yanagisawa M., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 656-663, 1991; Elshourbagy N.A., et al J. Biol. Chem. 268, 3873-3879, 1993; Haendler B., et al J. Cardiovasc. Pharmacol. 20, s1-S4, 1992; Tsutsumi M., et al Gene 228, 43-49, 1999; Strausberg R.L., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16899-16903, 2002; Bourgeois C., et al J. Clin. Endocrinol. Metab. 82, 3116-3123, 1997; Okamoto Y., et al Biol. Chem. 272, 21589-21596, 1997; Verheij J.B., et al Am. J. Med. Genet. 108, 223-225, 2002; Hofstra R.M.W., et al Eur. J. Hum. Genet. 5, 180-185, 1997; Puffenberger E.G., et al Cell 79, 1257-1266, 1994; Attie T., et al, Hum. Mol. Genet. 4, 2407-2409, 1995; Auricchio A., et al Hum. Mol. Genet. 5:351-354, 1996; Amiel J., et al Hum. Mol. Genet. 5, 355-357, 1996; Hofstra R.M.W., et al Nat. Genet. 12, 445-447, 1996; Svensson P.J., et al Hum. Genet. 103, 145-148, 1998; Fuchs S., et al Mol. Med. 7, 115-124, 2001; Pingault V., et al (2002) Hum. Genet. 111, 198-206；国際公開第２００４０４５５１６号（請求項１）；国際公開第２００４０４８９３８号（実施例２）；国際公開第２００４０４００００号（請求項１５１）；国際公開第２００３０８７７６８号（請求項１）；国際公開第２００３０１６４７５号（請求項１）；国際公開第２００３０１６４７５号（請求項１）；国際公開第２００２６１０８７号（図１）；国際公開第２００３０１６４９４号（図６）；国際公開第２００３０２５１３８号（請求項１２；頁１４４）；国際公開第２００１９８３５１号（請求項１；頁１２４−１２５）；欧州特許第５２２８６８号（請求項８；図２）；国際公開第２００１７７１７２号（請求項１；頁２９７−２９９）；米国特許出願公開第２００３１０９６７６号；米国特許第６５１８４０４号（図３）；米国特許第５７７３２２３号（請求項１ａ；Ｃｏｌ ３１−３４）；国際公開第２００４００１００４号；
【００９２】
（１０）ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４，推定タンパク質 ＦＬＪ２０３１５，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７７６３）；
国際公開第２００３１０４２７５号（請求項１）；国際公開第２００４０４６３４２号（実施例２）；国際公開第２００３０４２６６１号（請求項１２）；国際公開第２００３０８３０７４号（請求項１４；頁６１）；国際公開第２００３０１８６２１号（請求項１）；国際公開第２００３０２４３９２号（請求項２；図９３）；国際公開第２００１６６６８９号（実施例６）；
相互参照：遺伝子座番号：５４８９４；ＮＰ＿０６０２３３．２；ＮＭ＿０１７７６３＿１
【００９３】
（１１）ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ＿８６３９，ＩＰＣＡ−１，ＰＣＡＮＡＰ１，ＳＴＡＭＰ１，ＳＴＥＡＰ２，ＳＴＭＰ，前立腺癌関連遺伝子１，前立腺癌関連タンパク質１，前立腺の６回膜貫通型上皮抗原２，６回膜貫通型前立腺タンパク質，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ４５５１３８）
Lab. Invest. 82 (11):1573-1582 (2002))；国際公開第２００３０８７３０６号；米国特許出願公開第２００３０６４３９７号（請求項１；図１）；国際公開第２００２７２５９６号（請求項１３；頁５４−５５）；国際公開第２００１７２９６２号（請求項１；図４Ｂ）；国際公開第２００３１０４２７０号（請求項１１）；国際公開第２００３１０４２７０号（請求項１６）；米国特許出願公開第２００４００５５９８号（請求項２２）；国際公開第２００３０４２６６１号（請求項１２）；米国特許出願公開第２００３０６０６１２号（請求項１２；図１０）；国際公開第２００２２６８２２号（請求項２３；図２）；国際公開第２００２１６４２９号（請求項１２；図１０）；
相互参照：ＧＩ：２２６５５４８８；ＡＡＮ０４０８０．１；ＡＦ４５５１３８＿１
【００９４】
（１２）ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０，ＦＬＪ２００４１，ＴＲＰＭ４，ＴＲＰＭ４Ｂ，一過性レセプター電位カチオンチャネル，サブファミリーＭ，メンバー４，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７６３６）
Xu, X.Z., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (19):10692-10697 (2001), Cell 109 (3):397-407 (2002), J. Biol. Chem. 278 (33):30813-30820 (2003));米国特許出願公開第２００３１４３５５７号（請求項４）；国際公開第２０００４０６１４号（請求項１４；頁１００−１０３）；国際公開第２００２１０３８２号（請求項１；図９Ａ）；国際公開第２００３０４２６６１号（請求項１２）；国際公開第２００２３０２６８号（請求項２７；頁３９１）；米国特許出願公開第２００３２１９８０６号（請求項４）；国際公開第２００１６２７９４号（請求項１４；図１Ａ−Ｄ）；
相互参照：ＭＩＭ：６０６９３６；ＮＰ＿０６０１０６．２；ＮＭ＿０１７６３６＿１
【００９５】
（１３）ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ，ＣＲ１，ＣＲＧＦ，ＣＲＩＰＴＯ，ＴＤＧＦ１，奇形癌腫由来増殖因子，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００３２０３又はＮＭ＿００３２１２）
Ciccodicola, A., et al EMBO J. 8 (7):1987-1991 (1989), Am. J. Hum. Genet. 49 (3):555-565 (1991))；米国特許出願公開第２００３２２４４１１号（請求項１）；国際公開第２００３０８３０４１号（実施例１）；国際公開第２００３０３４９８４号（請求項１２）；国際公開第２００２８８１７０号（請求項２；頁５２−５３）；国際公開第２００３０２４３９２号（請求項２；図５８）；国際公開第２００２１６４１３号（請求項１；頁９４−９５，１０５）；国際公開第２００２２２８０８号（請求項２；図１）；米国特許第５８５４３９９号（実施例２；Ｃｏｌ １７−１８）；米国特許第５７９２６１６号（図２）；
相互参照：ＭＩＭ：１８７３９５；ＮＰ＿００３２０３．１；ＮＭ＿００３２１２＿１
【００９６】
（１４）ＣＤ２１（ＣＲ２（補体レセプター２）又はＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／エブスタインバーウイルスレセプター）又はＨｓ.７３７９２ Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ２６００４）
Fujisaku et al (1989) J. Biol. Chem. 264 (4):2118-2125); Weis J.J., et al J. Exp. Med. 167, 1047-1066, 1988; Moore M., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 9194-9198, 1987; Barel M., et al Mol. Immunol. 35, 1025-1031, 1998; Weis J.J., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5639-5643, 1986; Sinha S.K., et al (1993) J. Immunol. 150, 5311-5320; 国際公開第２００４０４５５２０号（実施例４）；米国特許出願公開第２００４００５５３８号（実施例１）；国際公開第２００３０６２４０１号（請求項９）；国際公開第２００４０４５５２０号（実施例４）；国際公開第９１０２５３６号（図９．１−９．９）；国際公開第２００４０２０５９５号（請求項１）；
受託番号：Ｐ２００２３；Ｑ１３８６６；Ｑ１４２１２；ＥＭＢＬ；Ｍ２６００４；ＡＡＡ３５７８６．１．
【００９７】
（１５）ＣＤ７９ｂ（ＣＤ７９Ｂ，ＣＤ７９β，ＩＧｂ（免疫グロブリン関連β（immunoglobulin-associated beta）），Ｂ２９，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号 ＮＭ＿０００６２６又は１１０３８６７４）
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (7):4126-4131, Blood (2002) 100 (9):3068-3076, Muller et al (1992) Eur. J. Immunol. 22 (6):1621-1625); 国際公開第２００４０１６２２５号（請求項２，図１４０）；国際公開第２００３０８７７６８号，米国特許出願公開第２００４１０１８７４号（請求項１，頁１０２）；国際公開第２００３０６２４０１号（請求項９）；国際公開第２００２７８５２４号（実施例２）；米国特許出願公開第２００２１５０５７３号（請求項５，頁１５）；米国特許第５６４４０３３号；国際公開第２００３０４８２０２号（請求項１，頁３０６及び３０９）；国際公開第９９／５５８６５８号，米国特許第６５３４４８２号（請求項１３，図１７Ａ／Ｂ）；国際公開第２０００５５３５１号（請求項１１，頁１１４５−１１４６）；
相互参照：ＭＩＭ：１４７２４５；ＮＰ＿０００６１７．１；ＮＭ＿０００６２６＿１
【００９８】
（１６）ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４，ＩＲＴＡ４，ＳＰＡＰ１Ａ（ＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼアンカータンパク質１ａ），ＳＰＡＰ１Ｂ，ＳＰＡＰ１Ｃ，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３０７６４，ＡＹ３５８１３０）
Genome Res. 13 (10):2265-2270 (2003), Immunogenetics 54 (2):87-95 (2002), Blood 99 (8):2662-2669 (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17):9772-9777 (2001), Xu, M.J., et al (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 280 (3):768-775; 国際公開第２００４０１６２２５号（請求項２）；国際公開第２００３０７７８３６；国際公開第２００１３８４９０号（請求項５；図１８Ｄ−１−１８Ｄ−２）；国際公開第２００３０９７８０３号（請求項１２）；国際公開第２００３０８９６２４号（請求項２５）；
相互参照：ＭＩＭ：６０６５０９；ＮＰ＿１１０３９１．２；ＮＭ＿０３０７６４＿１
【００９９】
（１７）ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ１１７３０）
Coussens L., et al Science (1985) 230(4730):1132-1139); Yamamoto T., et al Nature 319, 230-234, 1986; Semba K., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6497-6501, 1985; Swiercz J.M., et al J. Cell Biol. 165, 869-880, 2004; Kuhns J.J., et al J. Biol. Chem. 274, 36422-36427, 1999; Cho H.-S., et al Nature 421, 756-760, 2003; Ehsani A., et al (1993) Genomics 15, 426-429;国際公開第２００４０４８９３８号（実施例２）；国際公開第２００４０２７０４９号（図１Ｉ）；国際公開第２００４００９６２２；国際公開第２００３０８１２１０；国際公開第２００３０８９９０４号（請求項９）；国際公開第２００３０１６４７５号（請求項１）；米国特許出願公開第２００３１１８５９２号；国際公開第２００３００８５３７号（請求項１）；国際公開第２００３０５５４３９号（請求項２９；図１Ａ−Ｂ）；国際公開第２００３０２５２２８号（請求項３７；図５Ｃ）；国際公開第２００２２２６３６号（実施例１３；頁９５−１０７）；国際公開第２００２１２３４１号（請求項６８；図７）；国際公開第２００２１３８４７号（頁７１−７４）；国際公開第２００２１４５０３号（頁１１４−１１７）；国際公開第２００１５３４６３号（請求項２；頁４１−４６）；国際公開第２００１４１７８７号（頁１５）；国際公開第２０００４４８９９号（請求項５２；図７）；国際公開第２０００２０５７９号（請求項３；図２）；米国特許第５８６９４４５号（請求項３；Ｃｏｌ ３１−３８）；国際公開第９６３０５１４号（請求項２；頁５６−６１）；欧州特許第１４３９３９３号（請求項７）；国際公開第２００４０４３３６１号（請求項７）；国際公開第２００４０２２７０９号；国際公開第２００１００２４４号（実施例３；図４）；
受託番号：Ｐ０４６２６；ＥＭＢＬ；Ｍ１１７６７；ＡＡＡ３５８０８．１．ＥＭＢＬ；Ｍ１１７６１；ＡＡＡ３５８０８．１．
【０１００】
（１８）ＮＣＡ（ＣＥＡＣＡＭ６，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ１８７２８）；
Barnett T., et al Genomics 3, 59-66, 1988; Tawaragi Y., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 150, 89-96, 1988; Strausberg R.L., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:16899-16903, 2002;国際公開第２００４０６３７０９；欧州特許第１４３９３９３号（請求項７）；国際公開第２００４０４４１７８号（実施例４）；国際公開第２００４０３１２３８号；国際公開第２００３０４２６６１号（請求項１２）；国際公開第２００２７８５２４号（実施例２）；国際公開第２００２８６４４３号（請求項２７；頁４２７）；国際公開第２００２６０３１７号（請求項２）；
受託番号：Ｐ４０１９９；Ｑ１４９２０；ＥＭＢＬ；Ｍ２９５４１；ＡＡＡ５９９１５．１．ＥＭＢＬ；Ｍ１８７２８；
【０１０１】
（１９）ＭＤＰ（ＤＰＥＰ１，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＢＣ０１７０２３）
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26):16899-16903 (2002)); 国際公開第２００３０１６４７５号（請求項１）；国際公開第２００２６４７９８号（請求項３３；頁８５−８７）；特公平５−００３７９０号公報（図６−８）；国際公開第９９４６２８４号（図９）；
相互参照：ＭＩＭ：１７９７８０；ＡＡＨ１７０２３．１；ＢＣ０１７０２３＿１
【０１０２】
（２０）ＩＬ２０Ｒα（ＩＬ２０Ｒａ，ＺＣＹＴＯＲ７，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１８４９７１）；
Clark H.F., et al Genome Res. 13, 2265-2270, 2003; Mungall A.J., et al Nature 425, 805-811, 2003; Blumberg H., et al Cell 104, 9-19, 2001; Dumoutier L., et al J. Immunol. 167, 3545-3549, 2001; Parrish-Novak J., et al J. Biol. Chem. 277, 47517-47523, 2002; Pletnev S., et al (2003) Biochemistry 42:12617-12624; Sheikh F., et al (2004) J. Immunol. 172, 2006-2010; 欧州特許第１３９４２７４号（実施例１１）；米国特許出願公開第２００４００５３２０号（実施例５）；国際公開第２００３０２９２６２号（頁７４−７５）；国際公開第２００３００２７１７号（請求項２；頁６３）；国際公開第２００２２２１５３号（頁４５−４７）；米国特許出願公開第２００２０４２３６６号（頁２０−２１）；国際公開第２００１４６２６１号（頁５７−５９）；国際公開第２００１４６２３２号（頁６３−６５）；国際公開第９８３７１９３号（請求項１；頁５５−５９）；
受託番号：Ｑ９ＵＨＦ４；Ｑ６ＵＷＡ９；Ｑ９６ＳＨ８；ＥＭＢＬ；ＡＦ１８４９７１；ＡＡＦ０１３２０．１．
【０１０３】
（２１）ブレビカン（ＢＣＡＮ，ＢＥＨＡＢ，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ２２９０５３）
Gary S.C., et al Gene 256, 139-147, 2000; Clark H.F., et al Genome Res. 13, 2265-2270, 2003; Strausberg R.L., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16899-16903, 2002; 米国特許出願公開第２００３１８６３７２号（請求項１１）；米国特許出願公開第２００３１８６３７３号（請求項１１）；米国特許出願公開第２００３１１９１３１号（請求項１；図５２）；米国特許出願公開第２００３１１９１２２号（請求項１；図５２）；米国特許出願公開第２００３１１９１２６号（請求項１）；米国特許出願公開第２００３１１９１２１号（請求項１；図５２）；米国特許出願公開第２００３１１９１２９号（請求項１）；米国特許出願公開第２００３１１９１３０号（請求項１）；米国特許出願公開第２００３１１９１２８号（請求項１；図５２）；米国特許出願公開第２００３１１９１２５号（請求項１）；国際公開第２００３０１６４７５号（請求項１）；国際公開第２００２０２６３４号（請求項１）；
【０１０４】
（２２）ＥｐｈＢ２Ｒ（ＤＲＴ，ＥＲＫ，Ｈｅｋ５，ＥＰＨＴ３，Ｔｙｒｏ５，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４４４２）
Chan,J. and Watt, V.M., Oncogene 6 (6), 1057-1061 (1991) Oncogene 10 (5):897-905 (1995), Annu. Rev. Neurosci. 21:309-345 (1998), Int. Rev. Cytol. 196:177-244 (2000)); 国際公開第２００３０４２６６１号（請求項１２）；国際公開第２０００５３２１６号（請求項１；頁４１）；国際公開第２００４０６５５７６号（請求項１）；国際公開第２００４０２０５８３号（請求項９）；国際公開第２００３００４５２９号（頁１２８−１３２）；国際公開第２０００５３２１６号（請求項１；頁４２）；
相互参照：ＭＩＭ：６００９９７；ＮＰ＿００４４３３．２；ＮＭ＿００４４４２＿１
【０１０５】
（２３）ＡＳＬＧ６５９（Ｂ７ｈ，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＸ０９２３２８）
米国特許出願公開第２００４０１０１８９９号（請求項２）；国際公開第２００３１０４３９９号（請求項１１）；国際公開第２００４０００２２１号（図３）；米国特許出願公開第２００３１６５５０４号（請求項１）；米国特許出願公開第２００３１２４１４０号（実施例２）；米国特許出願公開第２００３０６５１４３号（図６０）；国際公開第２００２１０２２３５号（請求項１３；頁２９９）；米国特許出願公開第２００３０９１５８０号（実施例２）；国際公開第２００２１０１８７号（請求項６；図１０）；国際公開第２００１９４６４１号（請求項１２；図７ｂ）；国際公開第２００２０２６２４号（請求項１３；図１Ａ−１Ｂ）；米国特許出願公開第２００２０３４７４９号（請求項５４；頁４５−４６）；国際公開第２００２０６３１７号（実施例２；頁３２０−３２１，請求項３４；頁３２１−３２２）；国際公開第２００２７１９２８号（頁４６８−４６９）；国際公開第２００２０２５８７号（実施例１；図１）；国際公開第２００１４０２６９号（実施例３；頁１９０−１９２）；国際公開第２０００３６１０７号（実施例２；頁２０５−２０７）；国際公開第２００４０５３０７９号（請求項１２）；国際公開第２００３００４９８９号（請求項１）；国際公開第２００２７１９２８号（頁２３３−２３４，４５２−４５３）；国際公開第０１１６３１８号；
【０１０６】
（２４）ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原前駆体，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＪ２９７４３６）
Reiter R.E., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1735-1740, 1998; Gu Z., et al Oncogene 19, 1288-1296, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun. (2000) 275(3):783-788; 国際公開第２００４０２２７０９号；欧州特許第１３９４２７４号（実施例１１）；米国特許出願公開第２００４０１８５５３号（請求項１７）；国際公開第２００３００８５３７号（請求項１）；国際公開第２００２８１６４６号（請求項１；頁１６４）；国際公開第２００３００３９０６号（請求項１０；頁２８８）；国際公開第２００１４０３０９号（実施例１；図１７）；米国特許出願公開第２００１０５５７５１号（実施例１；図１ｂ）；国際公開第２０００３２７５２号（請求項１８；図１）；国際公開第９８５１８０５号（請求項１７；頁９７）；国際公開第９８５１８２４号（請求項１０；頁９４）；国際公開第９８４０４０３号（請求項２；図１Ｂ）；
受託番号：Ｏ４３６５３；ＥＭＢＬ；ＡＦ０４３４９８；ＡＡＣ３９６０７．１．
【０１０７】
（２５）ＧＥＤＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ２６０７６３）；
ＡＡＰ１４９５４脂肪腫ＨＭＧＩＣ融合パートナー様タンパク質(fusion-partner-like protein)／ｐｉｄ＝ＡＡＰ１４９５４．１ − ホモ・サピエンス種：ホモサピエンス（ヒト）
国際公開第２００３０５４１５２号（請求項２０）；国際公開第２００３０００８４２号（請求項１）；国際公開第２００３０２３０１３号（実施例３，請求項２０）；米国特許出願公開第２００３１９４７０４号（請求項４５）；
相互参照：ＧＩ：３０１０２４４９；ＡＡＰ１４９５４．１；ＡＹ２６０７６３＿１
【０１０８】
（２６）ＢＡＦＦ−Ｒ（Ｂ細胞活性化因子レセプター，ＢＬｙＳレセプター３，ＢＲ３，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１１６４５６）；ＢＡＦＦレセプター／ｐｉｄ＝ＮＰ＿４４３１７７．１ − ホモサピエンス Thompson, J.S., et al Science 293 (5537), 2108-2111 (2001); 国際公開第２００４０５８３０９号；国際公開第２００４０１１６１１；国際公開第２００３０４５４２２号（実施例；頁３２−３３）；国際公開第２００３０１４２９４号（請求項３５；図６Ｂ）；国際公開第２００３０３５８４６号（請求項７０；頁６１５−６１６）；国際公開第２００２９４８５２号（Ｃｏｌ １３６−１３７）；国際公開第２００２３８７６６号（請求項３；頁１３３）；国際公開第２００２２４９０９号（実施例３；図３）；
相互参照：ＭＩＭ：６０６２６９；ＮＰ＿４４３１７７．１；ＮＭ＿０５２９４５＿１；ＡＦ１３２６００
【０１０９】
（２７）ＣＤ２２（Ｂ細胞レセプターＣＤ２２−Ｂアイソフォーム，ＢＬ−ＣＡＭ，Ｌｙｂ−８，Ｌｙｂ８，ＳＩＧＬＥＣ−２，ＦＬＪ２２８１４，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＫ０２６４６７）；
Wilson et al (1991) J. Exp. Med. 173:137-146; 国際公開第２００３０７２０３６号（請求項１；図１）；
相互参照：ＭＩＭ：１０７２６６；ＮＰ＿００１７６２．１；ＮＭ＿００１７７１＿１
【０１１０】
（２８）ＣＤ７９ａ（ＣＤ７９Ａ，ＣＤ７９α，免疫グロブリン関連アルファ（immunoglobulin-associated alpha），免疫グロブリンベータ（ＣＤ７９Ｂ）と共有結合性に相互作用し、ＩｇＭ分子と表面上で複合体を形成し、Ｂ細胞分化に関与するシグナルを伝達するＢ細胞特異的タンパク質），等電点：４．８４，分子量：２５０２８ ＴＭ：２［Ｐ］遺伝子染色体：１９ｑ１３．２，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１７７４．１０）国際公開第２００３０８８８０８号，米国特許出願公開第２００３０２２８３１９号；国際公開第２００３０６２４０１号（請求項９）；米国特許出願公開第２００２１５０５７３号（請求項４，頁１３−１４）；国際公開第９９５８６５８号（請求項１３，図１６）；国際公開第９２０７５７４号（図１）；米国特許第５６４４０３３号；Ha et al (1992) J. Immunol. 148(5):1526-1531; Mueller et al (1992) Eur. J. Biochem. 22:1621-1625; Hashimoto et al (1994) Immunogenetics 40(4):287-295; Preud’homme et al (1992) Clin. Exp. Immunol. 90(1):141-146; Yu et al (1992) J. Immunol. 148(2) 633-637; Sakaguchi et al (1988) EMBO J. 7(11):3457-3464;
【０１１１】
（２９）ＣＸＣＲ５（バーキットリンパ腫レセプター１は、ＣＸＣＬ１３ケモカインによって活性化され、リンパ球遊走及び体液性防御において機能し、ＨＩＶ−２感染、おそらくエイズ、リンパ腫、骨髄腫、及び白血病の発症において役割を果たす、Ｇタンパク質共役型受容体）；３７２アミノ酸，等電点：８．５４ 分子量：４１９５９ ＴＭ：７［Ｐ］遺伝子染色体：１１ｑ２３．３，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１７０７．１）
国際公開第２００４０４００００号；国際公開第２００４０１５４２６号；米国特許出願公開第２００３１０５２９２号（実施例２）；米国特許第６５５５３３９号（実施例２）；国際公開第２００２６１０８７号（図１）；国際公開第２００１５７１８８号（請求項２０，頁２６９）；国際公開第２００１７２８３０号（頁１２−１３）；国際公開第２０００２２１２９号（実施例１，頁１５２−１５３，実施例２，頁２５４−２５６）；国際公開第９９２８４６８号（請求項１，頁３８）；米国特許第５４４００２１号（実施例２，ｃｏｌ ４９−５２）；国際公開第９４２８９３１号（頁５６−５８）；国際公開第９２１７４９７号（請求項７，図５）；Dobner et al (1992) Eur. J. Immunol. 22:2795-2799; Barella et al (1995) Biochem. J. 309:773-779;
【０１１２】
（３０）ＨＬＡ−ＤＯＢ（ペプチドを結合しそれらをＣＤ４＋Ｔリンパ球に提示するＭＨＣクラスＩＩ分子（Ｉａ抗原）のベータサブユニット）；２７３アミノ酸，等電点：６．５６   分子量：３０８２０ ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：６ｐ２１．３，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２１１１．１）
Tonnelle et al (1985) EMBO J. 4(11):2839-2847; Jonsson et al (1989) Immunogenetics 29(6):411-413; Beck et al (1992) J. Mol. Biol. 228:433-441; Strausberg et al (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:16899-16903; Servenius et al (1987) J. Biol. Chem. 262:8759-8766; Beck et al (1996) J. Mol. Biol. 255:1-13; Naruse et al (2002) Tissue Antigens 59:512-519;国際公開第９９５８６５８号（請求項１３，図１５）；米国特許第６１５３４０８号（Ｃｏｌ ３５−３８）；米国特許第５９７６５５１号（ｃｏｌ １６８−１７０）；米国特許第６０１１１４６号（ｃｏｌ １４５−１４６）；Kasahara et al (1989) Immunogenetics 30(1):66-68; Larhammar et al (1985) J. Biol. Chem. 260(26):14111-14119;
【０１１３】
（３１）Ｐ２Ｘ５（プリンレセプターＰ２Ｘリガンド開口型イオンチャネル５は、細胞外ＡＴＰにより開閉されるイオンチャネルであり、シナプス伝達及び神経発生に関与する可能性があり、欠乏は、特発性排尿筋不安定性の病態生理の一因となり得る；４２２アミノ酸），等電点：７．６３，分子量：４７２０６ ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：１７ｐ１３．３，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２５５２．２）
Le et al (1997) FEBS Lett. 418(1-2):195-199;国際公開第２００４０４７７４９号；国際公開第２００３０７２０３５号（請求項１０）；Touchman et al (2000) Genome Res. 10:165-173;国際公開第２００２２２６６０号（請求項２０）；国際公開第２００３０９３４４４号（請求項１）；国際公開第２００３０８７７６８号（請求項１）；国際公開第２００３０２９２７７号（頁８２）；
【０１１４】
（３２）ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗原ＣＤ７２，Ｌｙｂ−２） PROTEIN SEQUENCE Full maeaity...tafrfpd （１．．３５９；３５９アミノ酸），等電点：８．６６，分子量：４０２２５ ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：９ｐ１３．３，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１７７３．１）
国際公開第２００４０４２３４６号（請求項６５）；国際公開第２００３０２６４９３号（頁５１−５２，５７−５８）；国際公開第２０００７５６５５号（頁１０５−１０６）；Von Hoegen et al (1990) J. Immunol. 144(12):4870-4877; Strausberg et al (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:16899-16903;
【０１１５】
（３３）ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５），ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質であり、Ｂ細胞の活性化及びアポトーシスを制御し、機能喪失は全身性エリテマトーデスの患者における疾患活性の上昇に関連する）；６６１アミノ酸，等電点：６．２０，分子量：７４１４７ ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：５ｑ１２，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５５７３．１）
米国特許出願公開第２００２１９３５６７号；国際公開第９７０７１９８号（請求項１１，頁３９−４２）；Miura et al (1996) Genomics 38(3):299-304; Miura et al (1998) Blood 92:2815-2822; 国際公開第２００３０８３０４７号；国際公開第９７４４４５２号（請求項８，頁５７−６１）；国際公開第２０００１２１３０号（頁２４−２６）；
【０１１６】
（３４）ＦｃＲＨ１（Ｆｃレセプター様タンパク質１，Ｃ２タイプＩｇ様ドメイン及びＩＴＡＭドメインを含む免疫グロブリンＦｃドメインについての推定上のレセプターであり、Ｂ−リンパ球分化において役割を有し得る）;４２９アミノ酸，等電点：５．２８，分子量：４６９２５ ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：１ｑ２１−１ｑ２２，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿４４３１７０．１）
国際公開第２００３０７７８３６号；国際公開第２００１３８４９０号（請求項６，図１８Ｅ−１−１８−Ｅ−２）；Davis et al (2001) Proc. Natl. Acad. Sci USA 98(17):9772-9777; 国際公開第２００３０８９６２４号（請求項８）；欧州特許第１３４７０４６号（請求項１）；国際公開第２００３０８９６２４号（請求項７）；
【０１１７】
（３５）ＩＲＴＡ２免疫グロブリンスーパーファミリーレセプタートランスロケーション関連２（Immunoglobulin superfamily receptor translocation associated 2）、Ｂ細胞発生及びリンパ腫形成において役割を有し得る推定上の免疫レセプター；一部のＢ細胞悪性腫瘍においてトランスロケーションによる遺伝子の調節解除が発生する）；９７７アミノ酸，等電点：６．８８ 分子量：１０６４６８ ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：１ｑ２１，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｈｕｍａｎ：ＡＦ３４３６６２，ＡＦ３４３６６３，ＡＦ３４３６６４，ＡＦ３４３６６５，ＡＦ３６９７９４，ＡＦ３９７４５３，ＡＫ０９０４２３，ＡＫ０９０４７５，ＡＬ８３４１８７，ＡＹ３５８０８５；Ｍｏｕｓｅ：ＡＫ０８９７５６，ＡＹ１５８０９０，ＡＹ５０６５５８；ＮＰ＿１１２５７１．１
国際公開第２００３０２４３９２号（請求項２，図９７）； Nakayama et al (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 277(1):124-127; 国際公開第２００３０７７８３６号；国際公開第２００１３８４９０号（請求項３，図１８Ｂ−１−１８Ｂ−２）；
【０１１８】
（３６）ＴＥＮＢ２（ＴＭＥＦＦ２，tomoregulin，ＴＰＥＦ，ＨＰＰ１，ＴＲ，増殖因子のＥＧＦ／ヘレグリンファミリー及びフォリスタチンに関連する推定上の膜貫通型プロテオグリカン）；３７４アミノ酸，ＮＣＢＩ受託番号：ＡＡＤ５５７７６，ＡＡＦ９１３９７，ＡＡＧ４９４５１，ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０５７２７６；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ：２３６７１；ＯＭＩＭ：６０５７３４；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｑ９ＵＩＫ５；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１７９２７４；ＡＹ３５８９０７，ＣＡＦ８５７２３，ＣＱ７８２４３６
国際公開第２００４０７４３２０号（配列番号８１０）；特開２００４−１１３１５１号公報（配列番号２，４，８）；国際公開第２００３０４２６６１号（配列番号５８０）；国際公開第２００３００９８１４号（配列番号４１１）；欧州特許第１２９５９４４号（頁６９−７０）；国際公開第２００２３０２６８号（頁３２９）；国際公開第２００１９０３０４号（配列番号２７０６）；米国特許出願公開第２００４２４９１３０号；米国特許出願公開第２００４０２２７２７号；国際公開第２００４０６３３５５号；米国特許出願公開第２００４１９７３２５号；米国特許出願公開第２００３２３２３５０号；米国特許出願公開第２００４００５５６３号；米国特許出願公開第２００３１２４５７９号；Horie et al (2000) Genomics 67:146-152; Uchida et al (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:593-602; Liang et al (2000) Cancer Res. 60:4907-12; Glynne-Jones et al (2001) Int J Cancer. Oct 15;94(2):178-84;
【０１１９】
（３７）ＰＭＥＬ１７（シルバーホモログ（ｓｉｌｖｅｒ ｈｏｍｏｌｏｇ）；ＳＩＬＶ；Ｄ１２Ｓ５３Ｅ；ＰＭＥＬ１７；（ＳＩ）；（ＳＩＬ）；ＭＥ２０；ｇｐ１００）ＢＣ００１４１４；ＢＴ００７２０２；Ｍ３２２９５；Ｍ７７３４８；ＮＭ＿００６９２８；McGlinchey,R.P. et al (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (33), 13731-13736; Kummer,M.P. et al (2009) J. Biol. Chem. 284 (4), 2296-2306;
【０１２０】
（３８）ＴＭＥＦＦ１（ＥＧＦ様及び２つのフォリスタチン様ドメインを有する膜貫通型タンパク質１；Tomoregulin-1；Ｈ７３６５；Ｃ９ｏｒｆ２；Ｃ９ＯＲＦ２；Ｕ１９８７８；Ｘ８３９６１）ＮＭ＿０８０６５５；ＮＭ＿００３６９２； Harms, P.W. (2003) Genes Dev. 17 (21), 2624-2629; Gery, S. et al (2003) Oncogene 22 (18):2723-2727;
【０１２１】
（３９）ＧＤＮＦ−Ｒａ１（ＧＤＮＦファミリーレセプターアルファ１；ＧＦＲＡ１；ＧＤＮＦＲ；ＧＤＮＦＲＡ；ＲＥＴＬ１；ＴＲＮＲ１；ＲＥＴ１Ｌ；ＧＤＮＦＲ−アルファ１；ＧＦＲ−ＡＬＰＨＡ−１；Ｕ９５８４７；ＢＣ０１４９６２；ＮＭ＿１４５７９３）ＮＭ＿００５２６４； Kim,M.H. et al (2009) Mol. Cell. Biol. 29 (8), 2264-2277; Treanor, J.J. et al (1996) Nature 382 (6586):80-83;
【０１２２】
（４０）Ｌｙ６Ｅ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｅ；Ｌｙ６７，ＲＩＧ−Ｅ，ＳＣＡ−２，ＴＳＡ−１）ＮＰ＿００２３３７．１；ＮＭ＿００２３４６．２； de Nooij-van Dalen,A.G. et al (2003) Int. J. Cancer 103 (6), 768-774; Zammit,D.J. et al (2002) Mol. Cell. Biol. 22 (3):946-952;
【０１２３】
（４１）ＴＭＥＭ４６（シガホモログ(shisa homolog)２（アフリカツメガエル）；ＳＨＩＳＡ２）ＮＰ＿００１００７５３９．１；ＮＭ＿００１００７５３８．１； Furushima,K. et al (2007) Dev. Biol. 306 (2), 480-492; Clark,H.F. et al (2003) Genome Res. 13 (10):2265-2270;
【０１２４】
（４２）Ｌｙ６Ｇ６Ｄ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｇ６Ｄ；Ｌｙ６−Ｄ，ＭＥＧＴ１）ＮＰ＿０６７０７９．２；ＮＭ＿０２１２４６．２； Mallya, M. et al (2002) Genomics 80 (1):113-123; Ribas,G. et al (1999) J. Immunol. 163 (1):278-287;
【０１２５】
（４３）ＬＧＲ５（ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体５；ＧＰＲ４９，ＧＰＲ６７）ＮＰ＿００３６５８．１；ＮＭ＿００３６６７．２；Salanti,G. et al (2009) Am. J. Epidemiol. 170 (5):537-545; Yamamoto,Y. et al (2003) Hepatology 37 (3):528-533;
【０１２６】
（４４）ＲＥＴ（ｒｅｔプロトオンコジーン；ＭＥＮ２Ａ；ＨＳＣＲ１；ＭＥＮ２Ｂ；ＭＴＣ１；（ＰＴＣ）；ＣＤＨＦ１２；Ｈｓ．１６８１１４；ＲＥＴ５１；ＲＥＴ−ＥＬＥ１）ＮＰ＿０６６１２４．１；ＮＭ＿０２０９７５．４；Tsukamoto,H. et al (2009) Cancer Sci. 100 (10):1895-1901; Narita,N. et al (2009) Oncogene 28 (34):3058-3068;
【０１２７】
（４５）ＬＹ６Ｋ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ；ＬＹ６Ｋ；ＨＳＪ００１３４８；ＦＬＪ３５２２６）ＮＰ＿０５９９９７．３；ＮＭ＿０１７５２７．３； Ishikawa,N. et al (2007) Cancer Res. 67 (24):11601-11611; de Nooij-van Dalen,A.G. et al (2003) Int. J. Cancer 103 (6):768-774;
【０１２８】
（４６）ＧＰＲ１９（Ｇタンパク質共役型受容体１９；Ｍｍ．４７８７）ＮＰ＿００６１３４．１；ＮＭ＿００６１４３．２；Montpetit, A. and Sinnett,D. (1999) Hum. Genet. 105 (1-2):162-164; O'Dowd, B.F. et al (1996) FEBS Lett. 394 (3):325-329;
【０１２９】
（４７）ＧＰＲ５４（ＫＩＳＳ１レセプター；ＫＩＳＳ１Ｒ；ＧＰＲ５４；ＨＯＴ７Ｔ１７５；ＡＸＯＲ１２）ＮＰ＿１１５９４０．２；ＮＭ＿０３２５５１．４； Navenot, J.M. et al (2009) Mol. Pharmacol. 75 (6):1300-1306; Hata, K. et al (2009) Anticancer Res. 29 (2):617-623;
【０１３０】
（４８）ＡＳＰＨＤ１（アスパラギン酸β−ヒドロキシラーゼドメイン含有１；ＬＯＣ２５３９８２）ＮＰ＿８５９０６９．２；ＮＭ＿１８１７１８．３； Gerhard, D.S. et al (2004) Genome Res. 14 (10B):2121-2127;
【０１３１】
（４９）チロシナーゼ（ＴＹＲ；ＯＣＡＩＡ；ＯＣＡ１Ａ；チロシナーゼ；ＳＨＥＰ３）ＮＰ＿０００３６３．１；ＮＭ＿０００３７２．４； Bishop,D.T. et al (2009) Nat. Genet. 41 (8):920-925; Nan, H. et al (2009) Int. J. Cancer 125 (4):909-917;
【０１３２】
（５０）ＴＭＥＭ１１８（リングフィンガータンパク質，膜貫通型２；ＲＮＦＴ２；ＦＬＪ１４６２７）ＮＰ＿００１１０３３７３．１；ＮＭ＿００１１０９９０３．１； Clark, H.F. et al (2003) Genome Res. 13 (10):2265-2270; Scherer,S.E. et al (2006) Nature 440 (7082):346-351
【０１３３】
（５１）ＧＰＲ１７２Ａ（Ｇタンパク質共役型受容体１７２Ａ；ＧＰＣＲ４１；ＦＬＪ１１８５６；Ｄ１５Ｅｒｔｄ７４７ｅ）ＮＰ＿０７８８０７．１；ＮＭ＿０２４５３１．３； Ericsson, T.A. et al (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (11):6759-6764; Takeda, S. et al (2002) FEBS Lett. 520 (1-3):97-101.
【０１３４】
親抗体はまた、アルブミン結合ペプチド（ABP）配列を有する融合タンパク質であってもよい(Dennis et al. (2002) “Albumin Binding As A General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins” J Biol Chem. 277:35035-35043; 国際公開第 01/45746号)。本発明の抗体は、(i) Dennis et al (2002) J Biol Chem. 277:35035-35043 at Tables III and IV, 頁 35038; (ii) 米国特許出願公開第 20040001827号 の[0076]配列番号: 9-22; 及び(iii) 国際公開第 01/45746号の 頁 12-13,配列番号: z1-z14に記載のABP配列を有する融合タンパク質を含み、その全てが参照により本明細書に援用される。
【０１３５】
変異誘発
出発ポリペプチドのアミノ酸配列変異体をコードするＤＮＡは、当技術分野で公知の種々の方法により調製される。これらの方法は、前に調製した、ポリペプチドをコードするＤＮＡの部位特異的（またはオリゴヌクレオチド介在性）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、及びカセット変異誘発による調製を含むがこれらに限定されない。組換え抗体の変異体は、制限断片の操作によって、または合成オリゴヌクレオチドとの重複伸長ＰＣＲによっても構築されうる。変異誘発プライマーは、システインのコドンの置換をコードする。標準的な変異誘発法が、そのような変異システイン改変抗体をコードするＤＮＡを生成するために用いることができる。一般的なガイダンスはSambrook et al Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989;及びAusubel et al Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, N.Y., 1993に見出すことができる。
【０１３６】
部位特異的変異誘発法は、置換変異体、すなわち変異タンパク質を作製するための一つの方法である。この手法は当技術分野でよく知られている（例えばCarter (1985) et al Nucleic Acids Res. 13:4431-4443; Ho et al (1989) Gene (Amst.) 77:51-59; and Kunkel et al (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488)を参照）。簡単に言うと、ＤＮＡの部位特異的変異誘発を実施する際に、出発ＤＮＡは、望ましい変異をコードするオリゴヌクレオチドをその出発ＤＮＡの一本鎖に最初にハイブリダイズすることで改変される。ハイブリダイゼーションの後、ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーとしてハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドを使用し、テンプレートとして出発ＤＮＡの一本鎖を使用して、第二鎖全体を合成するために使用される。従って、望まれる変異をコードするオリゴヌクレオチドが得られた二本鎖DNAに組み込まれる。部位特異的変異誘発法は、変異を誘発されるべきタンパク質を発現プラスミド内で発現する遺伝子内で行うことができ、得られたプラスミドは配列が決定され、望まれるシステイン置換変異生成の導入を確認する(Liu et al (1998) J. Biol. Chem. 273:20252-20260)。部位特異的プロトコールや形式は市販に入手可能なもの、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）多重部位特異的変異生成キット（ストラタジーン、ラホーヤ、カリフォルニア州）を含む。
【０１３７】
ＰＣＲ突然変異誘発はまた、出発ポリペプチドのアミノ酸配列変異体を作るのに適している。Higuchi, (1990) in PCR Protocols, pp.177-183, Academic Press; Ito et al (1991) Gene 102:67-70; Bernhard et al (1994) Bioconjugate Chem. 5:126-132; 及びVallette et al (1989) Nuc. Acids Res. 17:723-733を参照。簡単に説明すると、ＰＣＲにおける出発物質としてテンプレートＤＮＡの少量が用いられる場合、テンプレートＤＮＡの対応する領域とは配列が若干異なるプライマーが、プライマーがテンプレートとは異なる場所においてのみ、テンプレート配列とは異なる特異的ＤＮＡ断片の比較的多量を産生するために用いることができる。
【０１３８】
変異体を調製するための別の方法であるカセット式変異誘発は、Wells et al (1985) Gene 34:315-323により記載される技術にもとずく。出発材料は、変異されるべき出発ポリペプチドを含むプラスミド（又は他のベクター）である。変異されるべき出発ＤＮＡのコドンが同定される。同定された変異部位のそれぞれの側にユニークな制限エンドヌクレアーゼ部位が存在する必要がある。そのような制限酵素部位が存在しない場合、それらは出発ポリペプチドＤＮＡの適切な場所でそれらを導入するために、上記オリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発法を用いて生成される場合がある。プラスミドＤＮＡは、それを線形化するために、これらの部位で切断される。制限部位間のＤＮＡの配列をコードするが、望まれる変異を含む二本鎖オリゴヌクレオチドは、標準的な手順を用いて合成され、ここでオリゴヌクレオチドの二本鎖は別々に合成され、標準的な技術を用いて一緒にハイブリダイズされる。この二本鎖オリゴヌクレオチドは、カセットと呼ばれる。このカセットは、それが直接プラスミドにライゲーションすることができるように、線状プラスミドの両端と一致する５’及び３’の両端を持つように設計されている。このプラスミドは、今や変異ＤＮＡ配列を含む。コードされたシステインの置換を含む変異体ＤＮＡは、ＤＮＡ配列決定により確認することができる。
【０１３９】
単一の変異はまた、ＰＣＲに基づく変異誘発によって、テンプレートとして二本鎖プラスミドＤＮＡを用いたオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によって生成される (Sambrook and Russel, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; Zoller et al (1983) Methods Enzymol. 100:468-500; Zoller, M.J. and Smith, M. (1982) Nucl. Acids Res. 10:6487-6500)。
【０１４０】
本発明において、Ｍ１３ファージ上に提示されたｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８が(Gerstner et al (2002) “Sequence Plasticity In The Antigen-Binding Site Of A Therapeutic Anti-HER2 Antibody”, J Mol Biol. 321:851-62)、モデル系として実験に用いられた。システイン変異が、ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８-ファージ、ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８、及びＡＢＰ-ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８のコンストラクトにおいて導入された。ｈｕ４Ｄ５-ＴｈｉｏＦａｂ-ファージプレップは、前述のようにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿法を用いて行った(Lowman, Henry B. (1998) Methods in Molecular Biology (Totowa, New Jersey) 87 (Combinatorial Peptide Library Protocols) 249-264)。
【０１４１】
オリゴヌクレオチドは、ホスホラミダイトの合成方法によって調製される（米国特許第４４１５７３２号、米国特許第４４５８０６６号； Beaucage, S. and Iyer, R. (1992) "Advances in the synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite approach", Tetrahedron 48:2223-2311）。ホスホロアミダイト法は、オリゴヌクレオチド鎖に反応性の3 'ホスホロアミダイト成分を持つヌクレオチドモノマー単位の周期的な付加を伴い、制御された細孔ガラスで構成される固体支持体又は高度に架橋されたポリスチレン上で、最も一般的には３’末端ヌクレオシドが合成の開始時に固相支持体に結合されて、３’から５’の方向に成長させる（米国特許第５０４７５２４号；米国特許第５２６２５３０号）。本方法は、通常、自動化された市販のシンセサイザ−（アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州）を用いて実践される。オリゴヌクレオチドは、検出、捕獲、安定化、又は他の目的のため非同位体成分で化学的に標識されることができる(Andrus, A. "Chemical methods for 5' non-isotopic labelling of PCR probes and primers" (1995) in PCR 2: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford, pp. 39-54; Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, pp. 40-55, 643-671; Keller, G. and Manak, M. in DNA Probes Second Edition (1993), Stockton Press, New York, pp. 121-23)。
【０１４２】
ＰＨＥＳＥＬＥＣＴＯＲアッセイ
ＰＨＥＳＥＬＥＣＴＯＲ（反応性チオールの選択のためのファージＥＬＩＳＡ）アッセイは、ＥＬＩＳＡファージ形式で抗体の反応性システイン群の検出を可能にする(米国特許第７５２１５４１号; Junutula JR et al. “Rapid identification of reactive cysteine residues for site-specific labeling of antibody-Fabs” J Immunol Methods 2008;332:41-52)。ウエル表面で目的のタンパク質（例えば抗体）をコーティングし、ファージ粒子、次いでＨＲＰ標識された吸光度検出２次抗体と共にインキュベートする方法が実施例２に詳述される。ファージ上に提示された変異体タンパク質は、急速、堅牢でかつハイスループットな方法でスクリーニングすることができる。システイン改変抗体のライブラリーが生成され、同じアプローチを用いた結合選択に供され、抗体又は他のタンパク質のランダムなタンパク質ファージライブラリーに由来する遊離のＣｙｓを取り込んだ反応部位を適切に同定することができる。また、この手法は、チオール反応性でもある親和性試薬またはレポーター基をファージ上に提示されたシステイン変異体タンパク質を反応させることを含む。図８は、ＰＨＥＳＥＬＥＣＴＯＲアッセイについて、Ｆａｂ又はＴｈｉｏＦａｂのＨＥＲ２への結合（上）及びビオチン標識化ＴｈｉｏＦａｂのストレプトアビジンへの結合（下）を描いた模式図により示す。
【０１４３】
タンパク質発現・精製
システイン改変された抗体をコードするＤＮＡは容易に単離され、従来の手順を使用して配列決定される（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いて）。ハイブリドーマ細胞は、ＤＮＡの供給源として機能する。ひとたび単離されると、ＤＮＡは、発現ベクター中に置かれ、次いで本来ならば抗体タンパク質を生産しない、例えば大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの宿主細胞、又は他の哺乳動物の宿主細胞、例えば骨髄腫細胞（米国特許第５８０７７１５号；米国特許出願公開第２００５／００４８５７２号；米国特許出願公開第２００４／０２２９３１０号）にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を得ることができる。ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８システイン改変抗体の収率は野生型ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８と類似していた。抗体をコードするDNAの細菌における組換え発現に関する総説として、Skerra et al (1993) Curr. Opinion in Immunol. 5:256-262 and Pluckthun (1992) Immunol. Revs. 130:151-188が含まれる。
【０１４４】
設計及び選択の後、反応性の高い不対Ｃｙｓ残基を持つシステイン改変抗体、例えばＴｈｉｏＦａｂは、（ｉ）大腸菌などの細菌系、又は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）等の哺乳動物細胞培養系（国際公開第０１／００２４５号）における発現、及び（ｉｉ）一般的なタンパク質精製技術を使用しての精製により(Lowman et al (1991) J. Biol. Chem. 266(17):10982-10988)生成され得る。ＴｈｉｏＦａｂは３４Ｂ８、非サプレッサーＥ．ｃｏｌｉ株にて誘導によって発現させた(Baca et al (1997) Journal Biological Chemistry 272(16):10678-84)。実施例３ａを参照。収穫細胞ペレットをＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に再懸濁し、全細胞溶解は、マイクロフルイダイザーを通過させることで行い、ＴｈｉｏＦａｂは、プロテインＧ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ（アマシャム社製）による親和性クロマトグラフィーにより精製した。ＴｈｉｏＦａｂは、上述のようにビオチン-ＰＥＯ-マレイミドと結合され、ビオチン標識化ＴｈｉｏＦａｂは更にＳｕｐｅｒｄｅｘ-２００ＴＭ（アマシャム）ゲルろ過クロマトグラフィーにより精製され、遊離ビオチン-ＰＥＯ-マレイミド及びＴｈｉｏＦａｂのオリゴマー画分を除去した。
【０１４５】
質量分析
液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＬＣ-ＥＳＩ-ＭＳ）分析が、ビオチン結合Ｆａｂの正確な分子量測定のために使用された(Cole, R.B. Electro Spray Ionization Mass Spectrometry: Fundamentals, Instrumentation And Applications. (1997) Wiley, New York)。ビオチン化ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８（Ａ１２１Ｃ）ペプチドのアミノ酸配列は、トリプシン消化に続いてＬＣ-ＥＳＩ-タンデムＭＳ分析（表４、実施例３ｂ）によって決定された。
【０１４６】
抗体Ｆａｂ断片ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８１０は１０個のＣｙｓ残基（５個が軽鎖、５個が重鎖）を含む約４４５アミノ酸残基を含有する。ヒト４Ｄ５可変断片（Ｆｖ４Ｄ５）の高分解能構造が確立されており、Eigenbrot et al “X-Ray Structures Of The Antigen-Binding Domains From Three Variants Of Humanized Anti-P185her2 Antibody 4D5 And Comparison With Molecular Modeling” (1993) J Mol Biol. 229:969-995)を参照。すべてのＣｙｓ残基がジスルフィド結合の形で存在し、したがって、これらの残基は、（還元剤で処理していない限り）ジルコニウム−マレイミドと結合するための、任意の反応性チオール基を持たない。したがって、新たに改変されたＣｙｓ残基は不対のままで、求電子性リンカー試薬又はジルコニウムリンカ−中間体、例えばジルコニウム−マレイミドと反応する、すなわち結合することができる。図１ＡはＸ線結晶座標に由来したｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８抗体断片の３次元表示を示す。重鎖及び軽鎖の改変されたＣｙｓ残基の位置は連続する番号付けに従って番号がついている。図１Ｂによるトラスツズマブの４ｄ５ｖ７ｆａｂＨ変異体において、この連続番号システムは、Ｋａｂａｔの番号付けシステムに相関し(Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD)、Ｎ末端で開始した連続番号方式（上の行）を示し、ａ、ｂ、ｃで記された挿入によってＫａｂａｔの番号付け方式（下の行）とは異なる。Ｋａｂａｔの番号付け方式を使用して、実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲへの短縮、または挿入に対応して減少したり又は増加したアミノ酸を含み得る。システインが改変された重鎖変異体の部位は、以下のチャートにある連続番号付け方式及びＫａｂａｔの番号付け方式により同定される。
0005850843.tif 000015
【０１４７】
Ｍ１３ファージミド-Ｃｙｓ変異体のＦａｂ（図３Ａ及び図３Ｂ）はＦａｂタンパク質に比べて迅速にスクリーニングすることができる。抗原及びストレプトアビジンへのファージミド-ＴｈｉｏＦａｂの結合は、ＥＬＩＳＡプレート上にそれぞれＨＥＲ２およびストレプトアビジンをコーティングし、続いて実施例２に記載され図８に示すように、抗Ｆａｂ-ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）で探査することで試験することができる。この方法は、抗原結合の作用及び改変Ｃｙｓ残基／結合型ビオチン分子によるチオール基の反応性の同時モニタリングを可能にした。また、この方法は、Ｍ１３ファージ上に提示された任意のタンパク質に対して反応性チオール基をスクリーニングするために適用することができる。結合型または非結合型ファージミド-ＴｈｉｏＦａｂは、単純なＰＥＧ沈殿により精製される。
【０１４８】
ヒト化４Ｄ５（ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂ）の抗原結合断片は大腸菌で良好に発現され、バクテリオファージに提示される(Garrard et al (1993) Gene 128:103-109)。抗体Ｆａｂ断片ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８は、チオール反応性を探査するためのＥＬＩＳＡに基づくアッセイにおけるモデルシステムとしてＭ１３ファージ上に提示された。図８は、ビオチン標識化ＴｈｉｏＦａｂファージ、及びＨＥＲ２（上）及びストレプトアビジン（下）に対する抗ファージＨＲＰ抗体の結合を描いたＰＨＥＳＥＬＥＣＴＯＲアッセイのグラフィック表現である。5個のアミノ酸残基（Ｌ-Ａｌａ４３、Ｈ-Ａｌａ４０、Ｈ-Ｓｅｒ１１９、Ｈ-Ａｌａ１２１及びＨ-Ｓｅｒ１２２）が抗原結合表面から離れているとして最初に結晶構造情報から選択された(Eigenbrot et al. (1993) J Mol Biol. 229:969-995)。タンパク質データベースのＸ線結晶構造は１ＦＶＣとして指定された。Ｃｙｓ残基が部位特異的突然変異誘発によってこれらの位置で改変された。ＴｈｉｏＦａｂファージ調製物が単離され、ビオチン化試薬と反応させた。
【０１４９】
ビオチン結合型及び非結合型変異体は、ＨＥＲ２及びストレプトアビジン結合に関してＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）標識抗ファージ抗体を用いたＥＬＩＳＡにもとずくＰＨＥＳＥＬＥＣＴＯＲアッセイ（図８、実施例２）を用いて試験した。非ビオチン化したファージｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８（図２Ａ）及びビオチン化ファージｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８（図２Ｂ）のＢＳＡ（オープンボックス）、ＨＥＲ２（グレーボックス）またはストレプトアビジン（ソリッドボックス）との相互作用は、抗Ｍ１３西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抗体を介する標準的なＨＲＰ反応を開発し、４５０ｎｍの吸光度を測定することによりモニタリングされた。発色基質の代謝回転によって生成された吸光度を４５０ｎｍで測定した。ＴｈｉｏＦａｂのＨＥＲ２との反応性は抗原結合を測定する。ＴｈｉｏＦａｂのストレプトアビジンとの反応性は、ビオチン化の程度を測定する。ＴｈｉｏＦａｂのＢＳＡとの反応性は、非特異的な相互作用に対する負の制御である。図２Ａに示すように、すべてのＴｈｉｏＦａｂ-ファージ変異体は野生型ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８ファージと比べてＨＥＲ２に対する類似の結合を持っている。さらに、ビオチンとの結合は、ＨＥＲ２に結合するＴｈｉｏＦａｂに干渉しない（図２Ｂ）。
【０１５０】
驚くべきことにかつ予期せずに、ＴｈｉｏＦａｂファージサンプルはストレプトアビジン結合活性のさまざまな値を示した。試験された全てのファージＴｈｉｏＦａｂから、Ａ１２１Ｃシステイン改変抗体が最大のチオール反応性を示した。野生型ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８ファージは、ビオチン−マレイミドの同量でインキュベートしたにもかかわらず、これらのファージは、少ししかストレプトアビジンに結合せず、ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８及びＭ１３ファージコートタンパク質由来の既存のシステイン残基（ジスルフィド結合形成に関与する）がビオチン−マレイミドの部位特異的結合を妨げないことを示唆している。これらの結果はファージＥＬＩＳＡアッセイが、Ｆａｂ表面上の反応性チオール基をスクリーニングするために首尾良く使用できることを示している。
【０１５１】
ＰＨＥＳＥＬＥＣＴＯＲアッセイは、抗体の反応性チオール基のスクリーニングを可能とする。この方法によるＡ１２１Ｃ変異体の同定が例示である。Ｆａｂ分子全体を反応性チオール基を持つより多くのＴｈｉｏＦａｂ変異体を特定するために効果的に検索することができる。パラメータとして、部分的表面接触性が、ポリペプチドのアミノ酸残基への溶媒の接触性を同定、定量するために採用された。表面接触性は、溶媒分子、すなわち水により接触され得る表面積（Ａ２）として表される。水の占有空間は、1.4Å半径の球として近似される。ソフトウェアは、既知のＸ線結晶由来座標を持つタンパク質の個々のアミノ酸の表面接触性を計算するアルゴリズムを用いる結晶学プログラムのＣＣＰ４一式として(“The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography” (1994) Acta. Cryst. D50:760-763)、自由に利用又はライセンス可能である(CCP4の秘書, Daresbury Laboratory, Warrington, WA4 4AD, United Kingdom, Fax: (+44) 1925 603825, 又はインターネットによる: www.ccp4.ac.uk/dist/html/INDEX.html) 。表面接触性の計算を実行する２つの典型的なソフトウエアモジュールは、B.Lee and F.M.Richards (1971) J.Mol.Biol. 55:379-400のアルゴリズムにもとずく「ＡＲＥＡＩＭＯＬ」及び「ＳＵＲＦＡＣＥ」である。ＡＲＥＡＩＭＯＬは、プローブ球（溶媒分子を表す）がタンパク質のファンデルワールス表面を転がるときの、その中心の軌跡として、タンパク質の溶媒接触可能表面を定義する。ＡＲＥＡＩＭＯＬは、各原子に関する拡張球（原子とプローブの半径の和に等しい原子の中心からの距離で）上の表面点を生成し、隣接する原子に関連付けられている等価な球の中にあるものを排除することで、溶媒接触可能表面積を計算する。ＡＲＥＡＩＭＯＬは、ＰＤＢの座標ファイルの原子の溶媒接触可能な面積を見いだし、残基ごと、鎖ごと及び全体の分子に対して接触可能面積をまとめている。個々の原子の接触可能面積（または面積の違いは）擬似ＰＤＢ出力ファイルに書き込むことができる。ＡＲＥＡＩＭＯＬは、各要素に単一の半径を想定し、異なる要素の限られた数を認識するだけである。未知の原子の種類（すなわちＡＲＥＡＩＭＯＬの内部データベース内に無いもの）は１.８Åのデフォルトの半径が割り当てられる。認識される原子の一覧は以下である。
0005850843.tif 000016
【０１５２】
ＡＲＥＡＩＭＯＬ及びＳＵＲＦＡＣＥは絶対的な接触性、すなわち平方オングストローム（Å）を報告する。部分的表面接触性は、ポリペプチド内のアミノ酸に関連する基準状態を参照することにより計算される。基準状態はトリペプチドＧｌｙ-Ｘ-Ｇｌｙであり、ここで、Ｘは、目的のアミノ酸であり、基準状態は、「拡張した」コンフォメーション、すなわちβ-ストランドにおけるようなものである必要がある。拡張されたコンフォメーションは、Ｘの接触性を最大限にする。計算された接触可能な面積をＧｌｙ-Ｘ-Ｇｌｙトリペプチド基準状態における接触可能面積で割ってその商が報告され、それが部分的接触性である。パーセント接触性は、１００を乗じた部分的接触性である。
【０１５３】
表面の接触性を計算するための別の典型的なアルゴリズムは、プログラムｘｓａｅのＳＯＬＶモジュールに基づき(Broger, C., F. Hoffman-LaRoche, Basel)、ポリペプチドのＸ線座標に基づいて水の球対するアミノ酸残基の部分的接触性を計算する。
【０１５４】
ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ７内のすべてのアミノ酸の部分的表面接触性は、結晶構造情報を用いて計算した(Eigenbrot et al. (1993) J Mol Biol. 229:969-995)。ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ７の軽鎖及び重鎖のアミノ酸の部分的表面接触性の値を表１に降順で表示する。
【０１５５】
0005850843.tif 000017
0005850843.tif 000018
0005850843.tif 000019
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【０１５６】
次の２つの基準が、Ｃｙｓ残基と置換するために改変可能なｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８の残基を同定するために適用された。
【０１５７】
１．完全に埋め込まれているアミノ酸残基、すなわち１０％未満の部分的表面接触性は除去された。表１は、１０％以上接触可能である（部分的表面接触性）ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８の１３４残基（軽鎖）及び１５１残基（重鎖）があることを示している。上位１０の最も接触可能なＳｅｒ、Ａｌａ及びＶａｌ残基が他のアミノ酸に対してＣｙｓに対するその構造上の近い類似性のため選択され、新たに改変されたＣｙｓにより抗体に最小限の構造上の制約だけを導入している。 他のシステインの置換部位をスクリーニングすることもでき、結合のために役に立つ可能性がある。
【０１５８】
２．残基はＦａｂの機能的及び構造的相互作用における役割に基づいて並べ替えられる。抗原の相互作用に関与せず、既存のジスルフィド結合から離れた残基がさらに選択された。新たに改変されたＣｙｓ残基は抗原結合とは異なり、かつ抗原結合に干渉せず、またジスルフィド結合形成に関与するシステインと誤対合すべきではない。
【０１５９】
ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８の以下の残基は上記の基準を持ち、Ｃｙｓに置換されるべく選択された：Ｌ-Ｖ１５、Ｌ-Ａ４３、Ｌ-Ｖ１１０、Ｌ-Ａ１４４、Ｌ-Ｓ１６８、Ｈ-Ａ８８、Ｈ-Ａ１２１、Ｈ-Ｓ１２２、Ｈ-Ａ１７５及びＨ-Ｓ１７９（図１に示す）。
【０１６０】
チオール反応性は、任意の抗体に一般化することができ、アミノ酸の反応性システインアミノ酸との置換は、Ｌ-１０からＬ-２０；Ｌ-３８からＬ-４８；Ｌ-１０５からＬ-１１５；Ｌ-１３９からＬ-１４９；Ｌ-１６３からＬ-１７３、から選択される軽鎖の範囲内で、及び、Ｈ-３５からＨ-４５；Ｈ-８３からＨ-９３；Ｈ-１１４からＨ-１２７；及びＨ-１７０からＨ-１８４，から選択される重鎖の範囲内で、及びＨ-２６８からＨ-２９１；Ｈ-３１９からＨ-３４４；Ｈ-３７０からＨ-３８０；及びＨ-３９５からＨ-４０５から選択される範囲内のＦｃ領域で行われ得る。
【０１６１】
チオール反応性はまた、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖定常ドメインのＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３などの抗体の特定のドメインに対して一般化することができる。0.6以上のチオール反応性値をもたらすシステインの置換は、インタクトな抗体の重鎖定常ドメイン、α、δ、ε、γ、及びμ：それぞれＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭであり、ＩｇＧサブクラスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２を含む。
【０１６２】
選択された１０のＣｙｓ変異は、抗原結合部位、例えば、このケースではＨＥＲ２とのインタフェースから遠く離れていることが結晶構造データから明らかである。これらの変異体は、機能的相互作用おける間接的な影響について実験的に試験することができる。すべてのＣｙｓＦａｂ変異体のチオール反応性が、実施例１及び２に記載され、表２に示すように測定され計算された。残基Ｌ-Ｖ１５Ｃ、Ｌ-Ｖ１１０Ｃ、Ｈ-Ａ８８ＣとＨ-Ａ１２１Ｃは、反応性があり安定したチオール基を有する（図３Ａおよび図３Ｂ）。変異体びＶ１５Ｃ、Ｖ１１０Ｃ、Ａ１４４Ｃ、Ｓ１６８Ｃは、軽鎖のＣｙｓ変異体である。変異体Ａ８８Ｃ、Ａ１２１Ｃ、Ａ１７５Ｃ、Ｓ１７９Ｃは、重鎖のＣｙｓ変異体である。高い部分的表面接触性を持つ部位がＰＨＥＳＥＬＥＣＴＯＲアッセイ（表２）によって計算されるように、最高のチオール反応性を持たなかったことは驚きと予想外であった。言い換えれば、部分的表面接触性（表１、表２）は、チオール反応性と相関しなかった（表２）。実際には、２０％から８０％の中程度の表面接触性をも持つ部位（図４Ａ，表１）、又はＡｌａまたはＶａｌ残基のような部分的に露出した部位で改変されたＣｙｓ残基は、Ｓｅｒ残基で導入されたＣｙｓよりも良好なチオール反応性、すなわち＞０．６を示し（図３Ｂ、表２）、従って、結晶構造情報だけではこれらの部位を選択するのに十分ではないので、チオール反応性部位のスクリーニングにおけるＰＨＥＳＥＬＥＣＴＯＲアッセイの使用を必要としている（図３Ｂ及び４Ａ）。
【０１６３】
チオール反応性データは、４Ｄ５ ＴｈｉｏＦａｂシステイン変異体のアミノ酸残基については、図３Ａおよび図３Ｂに示される：（３Ａ）非ビオチン標識化（コントロール）及び（３Ｂ）ビオチン標識化ファージＴｈｉｏＦａｂ。抗体／Ｆａｂの表面上の反応性チオール基は、非ビオチン標識化ファージｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８（３Ａ）及びビオチン標識化ファージｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８（３Ｂ）のＢＳＡ（オープンボックス）、ＨＥＲ２（グレーボックス）またはストレプトアビジン（ソリッドボックス）との相互作用に関してＰＨＥＳＥＬＥＣＴＯＲアッセイ分析により同定された。アッセイは実施例2に記載の通りを行われた。軽鎖変異体は左側で、重鎖変異体は右側である。非ビオチン標識化４Ｄ５ ＴｈｉｏＦａｂシステイン変異体の結合は予想通り低いが、ＨＥＲ２への強い結合は保持されている。ビオチン標識化４Ｄ５ ＴｈｉｏＦａｂシステイン変異体のストレプトアビジンおよびＨＥＲ２に対する結合の比率は表２にチオール反応性値を与える。４５０ｎｍでのバックグラウンドの吸光度、又はＢＳＡに対するビオチン標識化４Ｄ５ ＴｈｉｏＦａｂシステイン変異体の非特異的タンパク質結合の少量もまた図３Ｂにおいて明らかである。Ｃｙｓ残基に置き換えられた選択されたアミノ酸残基の部分的表面接触性の値は図４Ａに示される。部分的表面接触性は、利用可能なｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ７の構造から計算して表１に示す (Eigenbrot et al. (1993) J Mol Biol. 229:969-995)。ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ７及びｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８の構造の立体配座パラメータは非常に一貫性があり、ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ７の部分的表面接触性の計算とｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８システイン変異体のチオール反応性との間の任意の相関関係の決定を可能にする。部分的に露出した残基（ＡｌａまたはＶａｌ）で導入されたファージＴｈｉｏＦａｂ Ｃｙｓ残基の測定されたチオール反応性は、Ｓｅｒ残基で導入されたものに比べて優れたチオール反応性を持っている（表２）。表２のＴｈｉｏＦａｂ Ｃｙｓ変異体から、チオ反応性の値及び部分的表面接触性の間には、ほとんど、あるいは全く相関関係が無いことが見て取れる。
【０１６４】
抗体の位置、Ｌ-１５、Ｌ-４３、Ｌ-１１０、Ｌ-１４４、Ｌ-１６８、Ｈ-４０、Ｈ-８８、Ｈ-１１９、Ｈ-１２１、Ｈ-１２２、Ｈ-１７５、及びＨ-１７９のアミノ酸は一般に遊離システインアミノ酸で変異（置換）され得る。これらの位置の両側の約５アミノ酸残基内の範囲、すなわち、Ｌ-１０からＬ-２０；Ｌ-３８からＬ-４８；Ｌ-１０５からＬ-１１５；Ｌ-１３９からＬ-１４９；Ｌ-１６３からＬ-１７３；Ｈ-３５からＨ-４５；Ｈ-８３からＨ-９３；Ｈ-１１４からＨ-１２７；及びＨ-１７０からＨ-１８４，並びにＨ-２６８からＨ-２９１；Ｈ-３１９からＨ-３４４；Ｈ-３７０からＨ-３８０；及びＨ-３９５からＨ-４０５，から選択されるＦｃ領域の範囲もまた遊離システイン酸で置き換えることができ、本発明のシステイン改変抗体を与え得る。
0005850843.tif 000021
【０１６５】
軽鎖（Ｌ-Ｖ１５Ｃ及びＬ-Ｖ１１０Ｃ）由来の２つのＣｙｓ変異体、及び重鎖（Ｈ-Ａ８８Ｃ及びＨ-Ａ１２１Ｃ）由来の２つのＣｙｓ変異体が、これらの変異体が最高のチオール反応性を示したため（表２）、更なる分析のために選ばれた。
【０１６６】
ファージの精製とは異なり、Ｆａｂの調製は生産規模に応じて、２−３日必要になる場合がある。この間、チオール基の酸化のため、反応性を失う可能性がある。ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８−ファージ上のチオール基の安定性を調べるために、ファージｔｈｉｏＦａｂｓのチオール反応性の安定性を測定した（図４Ｂ）。ＴｈｉｏＦａｂファージの精製後、１日目、２日目及び４日目に、全てのサンプルは、ビオチン-ＰＥＯ-マレイミドを結合させ、及びＨＥＲ２及びストレプトアビジンの結合をテストするためにファージＥＬＩＳＡアッセイ（ＰＨＥＳＥＬＥＣＴＯＲ）で探索された。Ｌ-Ｖ１５Ｃ、Ｌ-Ｖ１１０Ｃ、Ｈ-Ａ８８Ｃ及びＨ-Ａ１２１Ｃは、他のＴｈｉｏＦａｂ変異体（図４Ｂ）と比較して、チオール反応性のかなりの量を保持している。
【０１６７】
システイン改変抗体を調製する方法
本発明の化合物は、親抗体の１つまたは複数のアミノ酸が遊離システインアミノ酸で置換されているシステインで改変された抗体を含む。システイン改変抗体は、１．０〜０．６の範囲にチオール反応性値を有する１つ以上の遊離システインアミノ酸を含む。遊離システインアミノ酸は、親抗体に改変されて、かつジスルフィド結合の一部ではないシステイン残基である。
【０１６８】
一態様では、システイン改変抗体は、
（ａ）システインによって親抗体の１つまたは複数のアミノ酸残基を置換し、及び
（ｂ）システイン改変抗体をチオール反応性試薬と反応させることにより、システイン改変抗体のチオール反応性を決定する
ことを含む方法によって調製される。
【０１６９】
システイン改変抗体は、チオール反応性試薬に対して親抗体よりも反応性がある。
【０１７０】
遊離システインアミノ酸残基は、重鎖又は軽鎖、または定数ドメイン又は可変ドメインに配置され得る。抗体断片、例えばＦａｂは、また、抗体断片のアミノ酸を置換を１以上のシステインアミノ酸で改変されることができシステイン改変抗体断片を形成する。
【０１７１】
本発明の別の態様は、システイン改変抗体を調製（作製）する方法を提供し、
（ａ）システイン改変抗体を生成するために、親抗体に１つ以上のシステインのアミノ酸を導入し、及び
（ｂ）チオール反応性試薬とシステイン改変抗体のチオール反応性を決定する
ことを含み、
該システイン改変抗体は、チオール反応性試薬に対して親抗体よりも反応性である。
【０１７２】
システイン改変抗体を調製する方法の工程（ａ）は、
（ｉ）システイン改変抗体をコードする核酸配列を突然変異誘発し、
（ｉｉ）システイン改変抗体を発現し、及び
（ｉｉｉ）システイン改変抗体を単離し精製する
ことを含み得る。
【０１７３】
システイン改変抗体を調製する本方法の工程（ｂ）はファージ又はファージミド粒子から選択されるウイルス粒子にシステイン改変抗体を発現することを含み得る。
【０１７４】
システイン改変抗体を調製する本方法の工程（ｂ）はまた、
（ｉ）チオール反応性親和性試薬とシステイン改変抗体を反応させ、親和性標識された、システイン改変抗体を生成し、および
（ｉｉ）親和性標識されたシステイン改変抗体のキャプチャメディアに対する結合を測定する
ことを含み得る。
【０１７５】
本発明の別の態様は、チオール反応性に関して、反応性の高い不対システインアミノ酸によるシステイン改変抗体のスクリーニングの方法であり、
（ａ）システイン改変抗体を生成するために、親抗体に１つ以上のシステインアミノ酸を導入し、
（ｂ）システイン改変抗体をチオール反応性親和性試薬と反応させ、親和性標識された、システイン改変抗体を生成し、及び
（ｃ）親和性標識されたシステイン改変抗体のキャプチャメディアに対する結合を測定し、及び
（ｄ）チオール反応性試薬とのシステイン改変抗体のチオール反応性を決定する
ことを含む。
【０１７６】
システイン改変抗体をスクリーニングする本方法の工程（ａ）は、
（ｉ）システイン改変抗体をコードする核酸配列を変異誘発し、
（ｉｉ）システイン改変抗体を発現し、及び
（ｉｉｉ）システイン改変抗体を単離して精製する
を含む。
【０１７７】
システイン改変抗体をスクリーニングする本方法の工程（ｂ）は、ファージ又はファージミド粒子から選択されるウイルス粒子にシステイン改変抗体を発現することを含み得る。
【０１７８】
システイン改変抗体をスクリーニングする本方法の工程（ｂ）はまた、
（ｉ）システイン改変抗体をチオール反応性親和性試薬と反応させ、親和性標識された、システイン改変抗体を生成し、及び
（ｉｉ）親和性標識されたシステイン改変抗体のキャプチャメディアに対する結合を測定する
ことを含み得る。
【０１７９】
標識されたシステイン改変抗体
本発明のシステイン改変抗体は反応性システインチオール基を介して抗体に共有結合することができる任意の標識成分と結合させることができる(Singh et al (2002) Anal. Biochem. 304:147-15; Harlow E. and Lane, D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Lundblad R.L. (1991) Chemical Reagents for Protein Modification, 2nd ed. CRC Press, Boca Raton, FL)。付着した標識は：（ｉ）検出可能なシグナルを提供し、（ｉｉ）第一または第二標識によって提供された検出可能なシグナルを修飾し、例えば（蛍光共鳴エネルギー転移）、ＦＲＥＴを与えるために第二の標識と相互作用し、（ｉｉｉ）抗原又はリガンドとの相互作用を安定化するか又は結合の親和性を増加させ、（ｉｖ）電荷、疎水性、形状、又は他の物理的パラメータにより、移動度、例えば、例えば電気泳動移動度又は細胞透過性に影響を与え、又は（ｖ）キャプチャ成分を提供し、リガンド親和性、抗体／抗原の結合、またはイオン性錯体形成を調節することに機能し得る。
【０１８０】
標識化システイン改変抗体は、例えば、特定の細胞、組織、又は血清中の目的の抗原の発現を検出するための、診断アッセイに有用であり得る。診断へ適用のために、抗体は、典型的には検出可能な成分で標識される。多数のラベルが利用可能であり一般的に次のカテゴリに分類することができる。
（ａ）放射性同位元素（放射性核種）、例えば、３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｘｅ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔ又は２１３Ｂｉ。放射性同位元素標識抗体は、レセプター標的イメージング実験に有用である。抗体は、Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al, Ed. Wiley-Interscience, New York, NY, Pubs. (1991)に記載の技術を用いて、抗体の改変されたシステインチオールと反応する、放射性同位元素の金属と結合し、キレートするかそうでなければ複合体を作るリガンド試薬で標識化可能である。金属イオンと複合体を作るキレート配位子はＤＯＴＡ、ＤＯＰＡ、ＤＯＴＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＴＰＡ及びＴＥＴＡ（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ、ダラス、テキサス州）を含む。放射性核種は、本発明の抗体−ジルコニウムコンジュゲートとしてのシステイン改変抗体との複合体を介して標的にすることができる(Wu et al (2005) Nature Biotechnology 23(9):1137-1146)。
【０１８１】
イメージング実験のための抗体標識として適した金属キレート錯体が開示されている：米国特許第５３４２６０６号；米国特許第５４２８１５５号；米国特許第５３１６７５７号；米国特許第５４８０９９０号；米国特許第５４６２７２５号；米国特許第５４２８１３９号；米国特許第５３８５８９３号；米国特許第５７３９２９４号；米国特許第５７５０６６０号；米国特許第５８３４４５６号; Hnatowich et al (1983) J. Immunol. Methods 65:147-157; Meares et al (1984) Anal. Biochem. 142:68-78; Mirzadeh et al (1990) Bioconjugate Chem. 1:59-65; Meares et al (1990) J. Cancer1990, Suppl. 10:21-26; Izard et al (1992) Bioconjugate Chem. 3:346-350; Nikula et al (1995) Nucl. Med. Biol. 22:387-90; Camera et al (1993) Nucl. Med. Biol. 20:955-62; Kukis et al (1998) J. Nucl. Med. 39:2105-2110; Verel et al (2003) J. Nucl. Med. 44:1663-1670; Camera et al (1994) J. Nucl. Med. 21:640-646; Ruegg et al (1990) Cancer Res. 50:4221-4226; Verel et al (2003) J. Nucl. Med. 44:1663-1670; Lee et al (2001) Cancer Res. 61:4474-4482; Mitchell, et al (2003) J. Nucl. Med. 44:1105-1112; Kobayashi et al (1999) Bioconjugate Chem. 10:103-111; Miederer et al (2004) J. Nucl. Med. 45:129-137; DeNardo et al (1998) Clinical Cancer Research 4:2483-90; Blend et al (2003) Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 18:355-363; Nikula et al (1999) J. Nucl. Med. 40:166-76; Kobayashi et al (1998) J. Nucl. Med. 39:829-36; Mardirossian et al (1993) Nucl. Med. Biol. 20:65-74; Roselli et al (1999) Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 14:209-20.
【０１８２】
（ｂ）希土類のキレート（ユーロピウムキレート）等の蛍光標識、ＦＩＴＣ、５-カルボキシフルオレセイン、６-カルボキシフルオレセインを含むフルオレセインの型；ＴＡＭＲＡを含むローダミンの型；ダンシル；リサミン；シアニン；フィコエリトリン；テキサスレッド及びそのアナログ。蛍光標識は、例えば上掲のCurrent Protocols in Immunologyに開示される技術を使用して抗体に結合させることができる。蛍光色素及び蛍光標識試薬はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社（ユージーン、オレゴン州）及びピアースバイオテクノロジー社（ロックフォード、イリノイ州）から市販されているものが含まれている。
【０１８３】
（ｃ）様々な酵素 -基質の標識が使用可能か又は開示されている（米国特許第４２７５１４９号）。酵素は、一般的に様々な技術を用いて測定することができる発色基質の化学変化を触媒する。例えば、酵素は基質の色の変化を触媒し得、それは分光光度計で測定することができる。あるいは、酵素は、基質の蛍光または化学発光を変更することがある。蛍光の変化を定量化するための技術は上述されている。化学発光基質は、化学反応によって電子的に励起され、次いで（例えば、化学発光を使用して）測定可能な光を放出する場合があり、又は蛍光アクセプターにエネルギーを提供する。酵素標識の例としては、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４７３７４５６号）、ルシフェリン、２,３-ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、グルコース-６-リン酸脱水素酵素）、複素環オキシダーゼ（例えば、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼなど）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ等が挙げられる。抗体に酵素を結合させるための技術が、O'Sullivan et al (1981) “Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay”, in Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, New York, 73:147-166に説明されている。
【０１８４】
酵素−基質の組み合わせの例としては、例えば次のとおりである。
（ｉ）基質として過酸化水素を持つ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ここで過酸化水素は色素前駆体（例えば、オルソフェニレンジアミン（ＯＰＤ）又はは３,３',５,５'-テトラメチルベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ））を酸化する；
（ｉｉ）発色基質などのパラニトロフェニルリン酸（II）アルカリホスファターゼ（AP）、及び
（ｉｉｉ）発色基質（例えば、ｐ-ニトロフェニル-βＤ-ガラクトシダーゼ（p-nitrophenyl-β-D-galactosidase））、又は蛍光基質４-メチルウンベリフェリル-βＤ-ガラクトシダーゼ（4-methylumbelliferyl-β-D-galactosidase）を持つβＤ-ガラクトシダーゼ（βＤ-Ｇａｌ）。
【０１８５】
他の多くの酵素-基質の組み合わせが当業者に利用可能である。一般的なレビューについては、米国特許第４２７５１４９号、及び米国特許第４３１８９８０号を参照。
【０１８６】
標識は、システイン改変抗体と間接的に結合させることができる。例えば、抗体は、ビオチンを結合させることができ、上記のラベルの３つの広範なカテゴリのいずれかがアビジン又はストレプトアビジン（またはその逆）を結合させることができる。ビオチンは、ストレプトアビジンに選択的に結合し、従って、標識はこの間接的な方法で抗体と結合させることができる。あるいは、ポリペプチド変異体により標識の間接的な結合を達成するために、ポリペプチド変異体は、小さなハプテン（例えば、ジゴキシン）と結合し、及び、上記の標識の異なるタイプのうちの１つが、抗ハプテンペプチド変異体（例えば、抗ジゴキシン抗体）と結合する。従って、ポリペプチド変異体を示す標識の間接的な接合を達成することができる(Hermanson, G. (1996) in Bioconjugate Techniques Academic Press, San Diego)。
【０１８７】
本発明のポリペプチド変異体は、ＥＬＩＳＡのような公知のアッセイ法、競合結合アッセイ、直接及び間接サンドイッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイに用いることができる(Zola, (1987) Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158, CRC Press, Inc.)。
【０１８８】
検出標識は、結合又は認識事象の局在化、可視化、及び定量化のために有用であり得る。本発明の標識抗体は、細胞表面レセプターを検出することができる。検出可能な標識抗体の別の使用は、蛍光標識抗体とビーズを結合し、リガンドの結合時に蛍光シグナルを検出することを含むビーズベースの免疫捕獲法である。同様の結合検出方法は、抗体−抗原の相互作用を測定し、検出する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）効果を利用する。
【０１８９】
蛍光色素及び化学発光色素などの検出標識(Briggs et al (1997) "Synthesis of Functionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids," J. Chem. Soc., Perkin-Trans. 1:1051-1058) は、検出可能なシグナルを与え、好ましくは以下の特性を持つ抗体の標識に一般的に適用される。（ｉ）抗体の少量を無細胞及び細胞ベースのアッセイの両方で感度良く検出することができるように、標識された抗体は、低いバックグラウンドで非常に高いシグナルを生成する必要がある。及び（ｉｉ）標識された抗体は、蛍光シグナルが観察、モニタリングされ、及び著しい光退色なしで記録され得るように、光安定である必要がある。膜又は細胞表面、特に生きた細胞への標識抗体の細胞表面結合を含む適用においては、標識は（ｉｉｉ）好ましくは効果的な複合体の濃度や検出感度を達成するために良好な水溶性を有し、かつ（ｉｖ）正常な代謝過程を中断せず又は未成熟細胞の死を生じないように、生きた細胞に対して非毒性である。
【０１９０】
細胞の蛍光強度の直接的な定量及び蛍光標識されたイベントの列挙、例えば、ペプチド-色素複合体の細胞表面結合は、生きた細胞又はビーズによる、ミックス・アンド・リード、非放射性アッセイを自動化したシステム（FMATR8100 HTSシステム、アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州）において行うことができる(Miraglia, "Homogeneous cell- and bead-based assays for high throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) J. of Biomolecular Screening 4:193-204)。
【０１９１】
標識抗体の使用はまた、細胞表面レセプター結合アッセイ、免疫捕獲アッセイ、蛍光結合免疫吸着アッセイ（ＦＬＩＳＡ）、カスパーゼ切断(Zheng, "Caspase-3 controls both cytoplasmic and nuclear events associated with Fas-mediated apoptosis in vivo", (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:618-23; 米国特許第６３７２９０７号)、アポトーシス(Vermes, "A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V" (1995) J. Immunol. Methods 184:39-51)、及び細胞毒性アッセイを含む。蛍光微量アッセイ技術は、細胞表面に標的化される分子による上方またはダ下方制御を同定するために使用することができる(Swartzman, "A homogeneous and multiplexed immunoassay for high-throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) Anal. Biochem. 271:143-51)。
【０１９２】
本発明の標識システイン改変抗体は、（ｉ）ＭＲＩ（磁気共鳴画像法）、（ｉｉ）ＭｉｃｒｏＣＴ（コンピュータ断層撮影）、（ｉｉｉ）ＳＰＥＣＴ（単光子放出コンピュータ断層撮影）、（ｉｖ）ＰＥＴ（陽電子放射断層撮影）Chen et al (2004) Bioconjugate Chem. 15:41-49、（ｖ）生物発光、（ｖｉ）蛍光、及び（ｖｉｉ）超音波などの生物医学的および分子イメージングの様々な方法および技術によるイメージングバイオマーカー及びプローブとして有用である。免疫シンチグラフィーは、放射性物質で標識した抗体が、動物又はヒト患者に投与され、抗体の局在する体の部位で画像が取られるという撮像手順である（米国特許第６５２８６２４号）。イメージングバイオマーカーは、客観的に測定され、正常な生物学的プロセス、病原性プロセス、又は治療的介入への薬理学的反応の指標として評価することができる。バイオマーカーは、いくつかの種類があり：０型は、疾患の自然史のマーカーであり既知の臨床指標、例えば関節リウマチにおける滑膜炎のＭＲＩ評価との縦方向に相関し；Ｉ型マーカーはたとえ作用機構が臨床転帰と関連付けられることができなくても、作用機構に応じて介入の影響を捕獲し；ＩＩ型マーカーは、サロゲートエンドポイントとして機能し、バイオマーカーの変化又はそのシグナルが、標的とされた応答、例えばＣＴにより測定された関節リウマチの骨の侵食を「検証」するための臨床的利点を予測する。イメージングバイオマーカーは、このように（ｉ）標的タンパク質の発現、（ｉｉ）治療薬の標的タンパク質への結合、すなわち選択性、及び（ｉｉｉ）クリアランス及び半減期薬物動態データに関する薬力学的（ＰＤ）治療情報を提供することができる。実験室ベースのバイオマーカーに対するインビボのイメージングバイオマーカーの利点は、非侵襲的な治療、定量化可能な全身の評価、反復すなわち複数の時点での投与及び評価、及び前臨床的（小動物）結果から臨床的（ヒト）結果への移転可能な作用を含む。幾つかの適用では、バイオイメージングは、臨床試験における動物実験の数にとって変わるか又はそれを最小限に抑えることとなる。
【０１９３】
放射性核種イメージング標識としては放射性核種、例えば、３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｘｅ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔ，又は２１３Ｂｉを含む。放射性核種の金属イオンは、ＤＯＴＡのようなキレート化リンカーと錯体を形成することができる。ＤＯＴＡ-マレイミド（４-マレイミドブチルアミドベンジル）のようなリンカー試薬は、Axworthy et al (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(4):1802-1807)の手順に従って、アミノベンジルＤＯＴＡのクロロギ酸イソプロピルで活性化された４-マレイミド酪酸（Ｆｌｕｋａ）との反応により調製できる。ＤＯＴＡ-マレイミド試薬は、システイン改変抗体の遊離システインのアミノ酸と反応して抗体に金属錯化配位子を提供する(Lewis et al (1998) Bioconj. Chem. 9:72-86)。ＤＯＴＡ-ＮＨＳなどのキレート化リンカー試薬（（１,４,７,１０-テトラアザシクロドデカン-１,４,７,１０-四酢酸モノ(Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル)は市販に入手可能である（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ、ダラス、テキサス州）。放射性核種標識した抗体によるレセプター標的イメージングは腫瘍組織中の抗体の進行性蓄積の検出及び定量により経路の活性化のマーカーを与え得る(Albert et al (1998) Bioorg. Med. Chem. Lett. 8:1207-1210)。結合した放射性金属は、細胞内の以下のリソソーム分解で残存し得る。
【０１９４】
ペプチド標識法はよく知られている。Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, (1997) Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Glazer et al (1975) Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T. S. Work and E. Work, Eds.) American Elsevier Publishing Co., New York; Lundblad, R. L. and Noyes, C. M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification, Vols. I and II, CRC Press, New York; Pfleiderer, G. (1985) “Chemical Modification of Proteins”, Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche, Ed., Walter DeGryter, Berlin and New York; and Wong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, Fla.); De Leon-Rodriguez et al (2004) Chem.Eur. J. 10:1149-1155; Lewis et al (2001) Bioconjugate Chem. 12:320-324; Li et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:110-115; Mier et al (2005) Bioconjugate Chem. 16:240-237を参照のこと。
【０１９５】
蛍光レポーター及びクエンチャーの２つの成分で十分近接して標識されたペプチドおよびタンパク質は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を受ける。レポーター基は、通常、特定の波長の光によって励起される蛍光色素であり、最大輝度で発光するための適切なストークスシフトを有するアクセプター、またはクエンチャー基にエネルギーを転送する。蛍光色素は、フルオレセインおよびローダミンなど拡張された芳香族、及びそれらの誘導体を持つ分子を含む。蛍光レポーターは部分的または著しくインタクトなペプチド中のクエンチャー成分によってクエンチされることがある。ペプチダーゼ又はプロテアーゼによるペプチドの切断時には、検出可能な蛍光の増加を測定することができる(Knight, C. (1995) “Fluorimetric Assays of Proteolytic Enzymes”, Methods in Enzymology, Academic Press, 248:18-34)。
【０１９６】
本発明の標識抗体はまた、アフィニティー精製薬剤として使用され得る。このプロセスでは、標識抗体は、当技術分野で周知の方法を用いて、セファデックス樹脂や濾紙等の固相に固定される。固定化抗体は、精製されるべき抗原を含む試料と接触させられ、その後支持体は、固定化されたポリペプチド変異体に結合した精製されるべき抗原を除いて、試料中の実質的にすべての材料を除去する適当な溶剤で洗浄される。最後に、支持体は、例えば、グリシン緩衝液、ｐＨ５.０など、別の適当な溶剤で洗浄され、ポリペプチド変異体から抗原を解放する。
【０１９７】
標識化試薬は典型的には反応的な官能性を有し、（ｉ）システイン改変抗体のシステインチオールと直接反応し、標識化抗体を形成し、（ｉｉ）リンカー試薬によりリンカー-標識中間体を形成し、又は（ｉｉｉ）リンカー抗体により標識化抗体を形成し得る。標識試薬の反応性官能基は、次のとおりである：マレイミド（maleimide）、ハロアセチル（haloacetyl）、ヨードスクシンイミジルエステル（iodoacetamide succinimidyl ester）（例えばNHS、N-ヒドロキシスクシンイミド（hydroxysuccinimide））、イソチオシアネート（isothiocyanate）、スルホニルクロリド（sulfonyl chloride）、2,6 - ジクロロトリアジニル（dichlorotriazinyl）、ペンタフルオロフェニルエステル（pentafluorophenyl ester）、ホスホルアミダイトphosphoramidite、しかし他の官能基を使用することもできる。
【０１９８】
典型的な反応性官能基は、検出可能な標識のカルボキシル基の置換基のＮ-ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）、例えば、ビオチン又は蛍光染料である。標識のＮＨＳエステルは、予め形成され、単離され、精製され、及び／又は特性を明らかにされ、またはその場で形成され、抗体の求核基と反応させられる可能性がある。典型的に、標識のカルボキシル基の形態は、カルボジイミド試薬、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（dicyclohexylcarbodiimide）、ジイソプロピルカルボジイミド（diisopropylcarbodiimide）、又はウロニウム試薬、例えばＴＳＴＵ（Ｏ-(Ｎ-サクシニミジル)-Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート（(O-(N-Succinimidyl)-N,N,N’,N’-tetramethyluronium tetrafluoroborate）、ＨＢＴＵ（Ｏ-ベンゾトリアゾール-１-イル)-Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート）（(O-benzotriazol-1-yl)-N,N,N’,N’-tetramethyluronium hexafluorophosphate）又はＨＡＴＵ（Ｏ-(７-アザベンゾトリアゾール-１-イル)-Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート）（(O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N’,N’-tetramethyluronium hexafluorophosphate)）、活性化因子、例えば、１-ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、及びＮ-ヒドロキシサクシニミド（N-hydroxysuccinimide）との所定の組み合わせによる反応によって活性化され、標識のＮＨＳエステルを与える。いくつかの事例では、標識及び抗体は、インサイツで標識が活性化され抗体と反応して結合し得て、一段階で標識抗体複合体を形成し得る。他の活性化試薬及びカップリング試薬としては、ＴＢＴＵ（２-(１Ｈ-ベンゾトリアゾール-１-イル）-１-１,３,３-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート）（(2-(1H-benzotriazo-1-yl)-1-1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)）、ＴＦＦＨ（Ｎ,Ｎ',Ｎ",Ｎ'"-テトラメチルウロニウム ２-フルオロ-ヘキサフルオロフォスフェート）（(N,N’,N”,N’”-tetramethyluronium 2-fluoro-hexafluorophosphate)）、ＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール-１-イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロフォスフェート（benzotriazole-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate）、ＥＥＤＱ（２-エトキシ-１-エトキシカルボニル-１,２-ジヒドロキノリン）(2-ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1,2-dihydro-quinoline)、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）(dicyclohexylcarbodiimide)；ＤＩＰＣＤＩ（ジイソプロピルカルボジイミド）(diisopropylcarbodiimide)、ＭＳＮＴ（１-メシチレン-２-スルフォニル)-３-ニトロ-１Ｈ-１,２,４-トリアゾール(1-(mesitylene-2-sulfonyl)-3-nitro-1H-1,2,4-triazole）、及びアリールスルホニルハロゲン化物、例えば、トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド（triisopropylbenzenesulfonyl chloride）を含む。
【０１９９】
ＴＨＩＯＦＡＢＳに対するビオチン - マレイミドの結合
ファージコートタンパク質へのＦａｂの融合は、潜在的にシステインチオールの接触性又は反応性を変える可能性があるため、上述したＴｈｉｏＦａｂの特性は、ファージの存在下で定められた。したがって、ＴｈｉｏＦａｂのコンストラクトは、アルカリホスファターゼプロモーター下で発現ベクターにクローニングされ(Chang et al (1987) Gene 55:189-196)、ＴｈｉｏＦａｂの発現はリン酸塩を含まない培地で生育する大腸菌細胞により誘導された。ＴｈｉｏＦａｂは、プロテインＧＳＥＰＨＡＲＯＳＥTMカラムで精製され、還元及び非還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上で分析された。これらの分析は、ＴｈｉｏＦａｂは、それらの反応性チオール基を保持するか、又は分子内または分子間のジスルフィド結合を形成することにより不活性にされたかどうかの評価を可能にする。ＴｈｉｏＦａｂのＬ-Ｖ１５Ｃ、Ｌ-Ｖ１１０Ｃ、Ｈ-Ａ８８Ｃ、及びＨ-Ａ１２１Ｃは発現され、プロテイン-Ｇ ＧＳＥＰＨＡＲＯＳＥTMカラムクロマトグラフィーにより精製された（詳細については方法についての項を参照）。精製したタンパク質は、（ＤＴＴによる）還元条件、及び（ＤＴＴ無しの）非還元条件においてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析された。他の還元剤、例えばＢＭＥ（β-メルカプトエタノール）は、鎖間のジスルフィド基を切断するゲルで使用できる。ＴｈｉｏＦａｂの主要な（〜９０％）分画は、単量体にあり、一方野生型ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８は、本質的に単量体（４７ｋＤａ）にあることがＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル分析から明らかである。
【０２００】
ＴｈｉｏＦａｂ（Ａ１２１Ｃ）及び野生型ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８はビオチン-マレイミドの１００倍過剰で室温で３時間インキュベートされ、ビオチン化ＦａｂがＳｕｐｅｒｄｅｘ-２００TMゲルろ過カラムにロードされた。この精製工程は、オリゴマーのＦａｂから、及びまた過剰な遊離ビオチン-マレイミド（又はフリージルコニウム試薬）から単量体のＦａｂを分離するのに有用であった。
【０２０１】
図５はファージコンテキストの非在下でのＴｈｉｏＦａｂ変異体の特性の検証を示す。ファージ融合の無いタンパク質、ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８及びｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８-Ａ１２１Ｃ（ＴｈｉｏＦａｂ-Ａ１２１Ｃ）が発現され、プロテイン-Ｇアガロースビーズを用いて精製された後、ビオチン-マレイミドの１００倍モル過剰と共にインキュベートした。ビオチン化システイン改変ＴｈｉｏＦａｂ及び非ビオチン化野生型Ｆａｂのストレプトアビジン及びＨＥＲ２との結合を比較した。ビオチン結合（ストレプトアビジンとの相互作用）の程度及びＨＥＲ２への結合能は、ＥＬＩＳＡ分析によりモニタリングされた。各Ｆａｂは２ｎｇ及び２０ｎｇで試験された。
【０２０２】
ビオチン化Ａ１２１Ｃ ＴｈｉｏＦａｂは、野生型ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８のそれに匹敵するＨＥＲ２結合を保持した（図５）。野生型Ｆａｂ及びＡ１２１Ｃ-ＴｈｉｏＦａｂは、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより精製された。二つの試料は、二次抗体としてヤギ抗Ｆａｂ-ＨＲＰを用いるＥＬＩＳＡ法で、ＨＥＲ２及びストレプトアビジンの結合が試験された。野生型（オープンボックス）及びＴｈｉｏＦａｂ（点線のボックス）の両方は、ＨＥＲ２に同様に結合するが、ＴｈｉｏＦａｂのみ、ストレプトアビジンが結合を保持していた。ストレプトアビジンとの相互作用のバックグラウンドレベルのみ、非ビオチン化野生型ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８で観察された（図５）。ビオチン化ＴｈｉｏＦａｂ（Ａ１２１Ｃ）の質量スペクトル（ＬＣ-ＥＳＩ-ＭＳ）分析では、野生型ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８（４７７３７ダルトン）に比べて４８２９４.５ダルトンの主要ピークをもたらした。２つの分子間の５３７.５ダルトンの差はＴｈｉｏＦａｂへ結合した単一のビオチン-マレイミドに正確に対応している。質量分析タンパク質シーケンシング（ＬＣ-ＥＳＩ-タンデム質量分析解析）は、結合したビオチン分子は新たに改変されたＣｙｓ残基においてであったことを更に確認した（表４、実施例３）。
【０２０３】
アルブミン結合ペプチド(ＡＢＰ)-ＴＨＩＯＦＡＢに対するビオチン-マレイミドの部位特異的結合
血漿タンパク質の結合は、短寿命の分子の薬物動態学的特性を向上させる有効な手段とすることができる。アルブミンは、血漿中で最も豊富な蛋白質である。血清アルブミン結合ペプチド（ＡＢＰ）は、組織取り込み、浸透、及び拡散の変化を含む、融合した活性ドメインタンパク質の薬物動態を変えることができる。これらの薬物動態パラメータは、適切な血清アルブミン結合ペプチド配列の特定の選択によって調節することができる（米国特許出願公開第２００４０００１８２７号）。アルブミン結合ペプチドの系列がファージディスプレイスクリーニングによって同定された(Dennis et al. (2002) “Albumin Binding As A General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins” J Biol Chem. 277:35035-35043; 国際公開第０１／４５７４６号)。本発明の化合物は、(i) Dennis et al (2002) J Biol Chem. 277:35035-35043の表III及びIV, 頁 35038; (ii)米国特許出願公開第20040001827号の[0076]、配列番号9-22；及び(iii) 国際公開第 01/45746 号の頁 12-13、配列番号z1-z14に教示されたABP配列を含み、その全てが参照により本明細書に援用される。
【０２０４】
アルブミン結合(ＡＢＰ)-Ｆａｂは、１：１の化学量論比（１ ＡＢＰ／１ ＦＡＢ）でのＦａｂ重鎖のＣ末端に対するアルブミン結合ペプチドの融合により改変された。これらのＡＢＰ-Ｆａｂとアルブミンとの会合は、ウサギ及びマウスにおいて２５倍以上にそれらの半減期を増加させることが示された。上記の反応性Ｃｙｓ残基は、したがって、これらのＡＢＰ-Ｆａｂに導入され、ジルコニウム試薬との部位特異的結合に使用することができ、インビボでの動物実験が続く。
【０２０５】
典型的なアルブミン結合ペプチド配列は、限定されないが、配列番号１−５に記載されているアミノ酸配列を含む。
0005850843.tif 000022
【０２０６】
アルブミン結合ペプチド（ＡＢＰ）の配列はＫｄ（ウサギ）＝０.３μＭで複数の種（マウス、ラット、ウサギ、ウシ、アカゲザル、ヒヒ、ヒト）由来のアルブミンに結合する。アルブミン結合ペプチドは、アルブミン結合することが知られているリガンドとは競合せず、かつ２．３時間のウサギの半減期（Ｔ1/2）を持つ。ＡＢＰ-ＴｈｉｏＦａｂタンパク質はＢＳＡ-ＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ上で精製され、その後前の節で説明した通りに、ビオチン-マレイミドが結合され、スーパーデックス−Ｓ２００カラムクロマトグラフィー上で精製された。精製されたビオチン化タンパク質は均質であって、任意のオリゴマーの形態を欠いていた（実施例４）。
【０２０７】
図６は、アルブミン結合ペプチド（ＡＢＰ）ＴｈｉｏＦａｂ変異体の特性を示す。ＥＬＩＳＡ分析は、ウサギアルブミン、ストレプトアビジン及びＨＥＲ２と、ＡＢＰ-ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８-ＷＴ、ＡＢＰ-ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８-Ｖ１１０Ｃ及びＡＢＰ-ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８-Ａ１２１Ｃとの結合能を試験するために実施した。ビオチン化ＡＢＰ-ＴｈｉｏＦａｂは、ＥＬＩＳＡ（図６）及びＢＩＡｃｏｒｅの結合動力学解析（表３）で確認されたように、野生型ＡＢＰ-ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８のそれに似た親和性でアルブミン及びＨＥＲ２に対して結合することができる。ＥＬＩＳＡプレートは、前述のように、アルブミン、ＨＥＲ２及びＳＡで被覆された。アルブミン、ＨＥＲ２及びＳＡへのビオチン化ＡＢＰ-ＴｈｉｏＦａｂの結合は抗Ｆａｂ ＨＲＰで探索された。ビオチン化ＡＢＰ-ＴｈｉｏＦａｂは、非ビオチン化のコントロールであるＡＢＰ-ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８-ＷＴと比較して、ストレプトアビジンに結合することができ、同じシステイン変異体が両方の変異体に使用されたため、ＡＢＰ-ＴｈｉｏＦａｂは部位特異的な方法でＴｈｉｏＦａｂのようなビオチンマレイミドと結合したことを示している（図６）。
【０２０８】
0005850843.tif 000023
【０２０９】
あるいは、アルブミン結合ペプチドは、リンカー成分を介して共有結合によって抗体に結合することができる。
【０２１０】
ＦＡＢあたり２つの遊離のチオール基を持つＡＢＰチオＦＡＢの改変（engineering）
上記の結果は、４つの全ての（Ｌ-Ｖ１５Ｃ、Ｌ-Ｖ１１０Ｃ、Ｈ-Ａ８８Ｃ及びＨ-Ａ１２１Ｃ）ＴｈｉｏＦａｂ（システイン改変Ｆａｂ抗体）変異体は、標識化試薬、リンカー試薬、又はジルコニウム−リンカー中間体による部位特異的結合に使用することができる反応性チオール基を持っていることを示している。Ｌ-Ｖ１５Ｃを発現させて、比較的低い収率で精製することができる。しかし、Ｌ-Ｖ１１０Ｃ、Ｈ-Ａ８８Ｃ及びＨ-Ａ１２１Ｃ変異体の発現及び精製収量はｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８のそれに類似していた。したがって、これらの変異体は、さらなる分析のために使用され、Ｆａｂごとに複数のチオール基を得るために再結合することができる。この目的に向けて、軽鎖の１つのチオール基及び重鎖の一つのチオール基が、Ｆａｂ分子あたり２個のチオール基を獲得するために構築された（Ｌ-Ｖ１１０Ｃ／Ｈ-Ａ８８Ｃ及びＬ-Ｖ１１０Ｃ／Ｈ-Ａ１２１Ｃ。これら２つの二重Ｃｙｓ変異体は大腸菌発現系で発現され、精製された。精製されたビオチン化ＡＢＰ-ＴｈｉｏＦａｂの均質性は、単一のＣｙｓ変異体のそれに類似であることが判明した。
【０２１１】
Ｆａｂあたり二つの反応性のＣｙｓ残基へ改変することの影響が調べられた（図７）。第二のビオチンの存在が、ストレプトアビジン-ＨＲＰを使用して、ビオチン化ＡＢＰ-ＴｈｉｏＦａｂのＳＡに対する結合を探索することによって試験した（図７）。ＳＡ／Ｆａｂの分析のために、ＥＬＩＳＡプレートは、ＳＡで被覆され、抗Ｆａｂ ＨＲＰで探索された。ＳＡ／ＳＡの分析のために、ＥＬＩＳＡプレートはＳＡで被覆され、ＳＡ-ＨＲＰで探索された。図７。ＨＥＲ２、ストレプトアビジン（ＳＡ）、ＨＥＲ２／Ｆａｂ、ＳＡ／Ｆａｂ及びＳＡ／ＳＡによるビオチン化ＡＢＰ-ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８システイン変異体の相互作用に関するＥＬＩＳＡ分析は、それらの相互作用は、抗Ｆａｂ-ＨＲＰ、ＳＡ-ＨＲＰのそれぞれによってモニタリングされたことを示している。ＳＡ／Ｆａｂは、Ｆａｂごとに単一のビオチンの存在をモニタリングし、Ｆａｂごとに複数のビオチンが、ＳＡ／ＳＡ分析によってモニタリングされている。二重システイン変異体とのＨＥＲ２の結合は、単一Ｃｙｓ変異体のそれに似ている（図７）。しかし、二重Ｃｙｓ変異体におけるビオチン化の程度は、単一のＣｙｓ変異体に比べてＦａｂ分子当たり１つ以上の遊離のチオール基に起因し高かった（図７）。
【０２１２】
トラスツズマブのチオＩｇＧ抗体変異体の改変（engineering）
システインが、完全長のモノクローナル抗体であるトラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標）、ジェネンテック社）に、特定の残基にて導入された。トラスツズマブの単一システイン変異体Ｈ-Ａ８８Ｃ、Ｈ-Ａ１２１Ｃ及びＬ-Ｖ１１０Ｃ、及びトラスツズマブのＶ１１０Ｃ-Ａ１２１Ｃ及びＶ１１０Ｃ-Ａ１２１Ｃ二重システイン変異体は１ｍＭシステインを含有する培地中で一過性発酵によりＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞で発現させた。Ａ８８Ｃ変異重鎖配列（４５０アミノ酸）配列番号６である。Ａ１２１Ｃ変異重鎖配列（４５０アミノ酸）は配列番号７である。Ｖ１１０Ｃ変異軽鎖配列（２１４アミノ酸）は配列番号８である。
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0005850843.tif 000025
0005850843.tif 000026
【０２１３】
一実施態様によれば、システイン改変チオ-トラスツズマブ抗体は、遊離システインアミノ酸を持つ以下の可変領域重鎖配列の一つ以上を含んでいる（配列番号９−１６）。
0005850843.tif 000027
【０２１４】
一実施態様によれば、システイン改変チオ-トラスツズマブ抗体は、遊離システインアミノ酸を持つ以下の可変領域軽鎖配列の一つ以上を含んでいる（配列番号１７−２７）。
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【０２１５】
得られた完全長のチオトラスツズマブＩｇＧ変異体は、チオール反応性及びＨＥＲ２結合活性について測定された。図１３Ａは、固定されたＨＥＲ２及び吸光度検出用ＨＲＰ標識二次抗体に結合するビオチン化抗体の模式図を示す。図１３Ｂは、４５０ｎｍでの吸光度検出による固定化ＨＥＲ２への結合の測定値を示し、（左から右へ）非ビオチン化野生型トラスツズマブ（Ｗｔ）、ビオチン−マレイミド結合チオ−トラスツズマブ変異体Ｖ１１０Ｃ（単一Ｃｙｓ）、Ａ１２１Ｃ（単一Ｃｙｓ）、及びＶ１１０Ｃ-Ａ１２１Ｃ（２重Ｃｙｓ）。各チオＩｇＧ変異体及びトラスツズマブは１ｎｇ、１０ｎｇ、及び１００ｎｇで試験された。測定は、ビオチン化抗ＨＥＲ２ ＴｈｉｏＭａｂはＨＥＲ２結合活性を保持していることを示している。
【０２１６】
図１４Ａは、吸光度検出のために抗ＩｇＧ-ＨＲＰへのビオチンの結合した固定化ＨＥＲ２に結合するビオチン化抗体の模式図を示している。図１４Ｂは、ビオチン-マレイミド結合チオトラスツズマブ変異体及びストレプトアビジンに結合している非ビオチン化野生型トラスツズマブの４５０ｎｍでの吸光度の検出による結合測定値を示している。左から右へ：Ｖ１１０Ｃ（単一Ｃｙｓ）、Ａ１２１Ｃ（単一Ｃｙｓ）、Ｖ１１０Ｃ／Ａ１２１Ｃ（二重Ｃｙｓ）、及びトラスツズマブ。各チオＩｇＧトラスツズマブ変異体及び親のトラスツズマブは、１ｎｇ、１０ｎｇ、及び１００ｎｇで試験された。測定結果は、ＨＥＲ２ ＴｈｉｏＭａｂが高いチオール反応性を有することを示している。
【０２１７】
システインは、完全長の２Ｈ９抗ＥｐｈＢ２Ｒ抗体に所定の残基で導入された。２Ｈ９の単一システイン変異体Ｈ-Ａ１２１Ｃを１ｍＭシステインを含有する培地中で一過性発酵によりＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞で発現させた。Ａ１２１Ｃ ２Ｈ９変異体重鎖配列（４５０アミノ酸）は配列番号２８である。
【０２１８】
0005850843.tif 000029
【０２１９】
システイン改変チオ-２Ｈ９抗体は、遊離システインアミノ酸を持つ次のＦｃ定常領域の重鎖配列を含む（配列番号２９−３８）。
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【０２２０】
図１６は、固定化プロテインＡ上で精製後の２Ｈ９ ＴｈｉｏＭａｂのＦｃ変異体の非還元（上）及び還元（下）変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）解析を示す（左から右、レーン１−９）Ａ３３９Ｃ；Ｓ３３７Ｃ；Ｓ３２４Ｃ；Ａ２８７Ｃ；Ｖ２８４Ｃ；Ｖ２８２Ｃ；Ｖ２７９Ｃ；Ｖ２７３Ｃ、及び２Ｈ９野生型。右側のレーンは、サイズマーカーラダーであり、インタクトなタンパク質が約１５０ｋＤａであり、重鎖断片が約５０ｋＤａ、及び軽鎖断片が約２５ｋＤａであることを示している。図１７Ａは、固定化プロテインＡ上で精製後の２Ｈ９ ＴｈｉｏＭａｂ変異体の非還元（左）及び還元（右）変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動解析を示す（左から右、レーン１−４）：Ｌ−Ｖ１５Ｃ；Ｓ１７９Ｃ；Ｓ３７５Ｃ；Ｓ４００Ｃ。図１７Ｂは固定化プロテインＡ上で精製後の更なる２Ｈ９及び３Ａ５ ＴｈｉｏＭａｂ変異体の非還元（左）及び還元（右）変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動解析を示す。（Ｆａｂ並びにＦｃ領域における）２Ｈ９ ＴｈｉｏＭａｂ変異体が記載された通りに発現され精製された。図１６、図１７Ａ及び図１７Ｂに見られるように、全てのタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で均質であり、その後実施例１１の還元及び酸化の手順を経て、結合のための反応性ＴｈｉｏＭａｂを調製した（実施例１２）。
【０２２１】
システインは、完全長の３Ａ５抗ＭＵＣ１６抗体に所定の残基で導入された。３Ａ５の単一システイン変異体Ｈ−Ａ１２１Ｃを１ｍＭシステインを含有する培地中で一過性発酵によりＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞で発現させた。Ａ１２１Ｃ３Ａ５変異重鎖配列（４４６アミノ酸）は配列番号３９を含む。
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【０２２２】
システイン改変チオ-３Ａ５抗ＭＵＣ１６抗体は、遊離システインアミノ酸を持つ次の可変領域重鎖配列を含む（配列番号４０−４４）。
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【０２２３】
システイン改変チオ-３Ａ５抗ＭＵＣ１６抗体は、遊離システインアミノ酸を持つ次の可変領域軽鎖配列を含む（配列番号４５−４９）。
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【０２２４】
ＴＨＩＯＭＡＢのチオール反応性
完全長ＩｇＧシステイン改変抗体（ＴｈｉｏＭａｂ）のチオール反応性は、ビオチン標識及びストレプトアビジンの結合によって測定した。ウェスタンブロットアッセイは、ビオチン−マレイミドと特異的に結合されるＴｈｉｏＭａｂをスクリーニングするためにセットされた。このアッセイにおいて、抗体は還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析され、ビオチンの存在は、ストレプトアビジン-ＨＲＰと共にインキュベートすることによって特異的に探索される。図１８から分かるように、ストレプトアビジン-ＨＲＰの相互作用は、どちらの改変されたシステイン変異体が使用されているに応じて、重鎖又は軽鎖で観察されており、ＴｈｉｏＭａｂ変異体は、改変されたＣｙｓ残基で特異的にビオチンを結合させたことを示している。図１８は、固定化した抗ＩｇＧ-ＨＲＰ（上のゲル）及びストレプトアビジン-ＨＲＰ（下のゲル）上で捕獲した後の、還元され、ビオチン標識化されたチオ-ＩｇＧ変異体の変性ゲル分析を示している。レーン１：３Ａ５ Ｈ-Ａ１２１Ｃ。レーン２：３Ａ５ Ｌ-Ｖ１１０Ｃ。レーン３：２Ｈ９ Ｈ-Ａ１２１Ｃ。レーン４：２Ｈ９ Ｌ-Ｖ１１０Ｃ。レーン５：抗ＥｐｈＢ２Ｒ２Ｈ９親、野生型。各変異体（レーン１−４）はＨＲＰ検出を持つ抗ＩｇＧによって捕獲され（上）、感受性及び親和性が保持されていることを示している。ＨＲＰ検出を持つ固定化ストレプトアビジンによる捕獲で、重鎖及び軽鎖上でビオチンの位置を確認した。レーン１及び３のシステイン改変抗体のシステイン変異の場所は重鎖である。レーン２及び４のシステイン改変抗体のシステイン変異の場所は軽鎖である。システイン変異部位は、ビオチン-マレイミド試薬との結合を受ける。
【０２２５】
図１８のＴｈｉｏＭａｂシステイン改変抗体、及びＬＣ／ＭＳによる２Ｈ９ Ｖ１５Ｃ変異体の分析により、チオール反応性の定量的指標を得た（表５）。
0005850843.tif 000034
【０２２６】
システイン・エンジニアリングは、ＩｇＧ抗体の定常ドメイン、すなわち、Ｆｃ領域で行われた。様々なアミノ酸部位がシステイン部位に変換されて、変異体、すなわちシステイン改変抗体が発現され、それらのチオール反応性が評価された。ビオチン標識化２Ｈ９ ＴｈｉｏＭａｂのＦｃ変異体は、ＥＬＩＳＡアッセイで固定化ストレプトアビジン上での捕獲によるＨＲＰの定量により、チオール反応性が評価された（図１９）。ＥＬＩＳＡアッセイは、反応性チオール基を持つＣｙｓ残基を迅速にスクリーニングするために確立された。図１９の模式図に示すように、ストレプトアビジン−ビオチン相互作用は、抗ＩｇＧ-ＨＲＰによる探索と続く４５０ｎｍでの吸光度の測定によってモニタリングされる。これらの結果は、２Ｈ９-チオＦｃ変異体のＶ２８２Ｃ、Ａ２８７Ｃ、Ａ３３９Ｃ、Ｓ３７５Ｃ及びＳ４００Ｃは中程度から最高度のチオ−ル反応性有することを確認する。２Ｈ９ ＴｈｉｏＭａｂのＦｃ変異体のビオチン結合の程度は、表６に報告されているように、ＬＳ／ＭＳ分析により定量された。ＬＳ／ＭＳ分析は、Ａ２８２Ｃ、Ｓ３７５Ｃ及びＳ４００Ｃ変異体は１００％ビオチンと結合し、かつＶ２８４Ｃ及びＡ３３９Ｃは５０％結合していることが確認され、反応性システインチオール基の存在を示している。他のチオＦｃ変異体、及び親の野生型２Ｈ９は、ほとんどビオチン化されないかまたは全くビオチン化されないかのいずれかであった。
0005850843.tif 000035
【０２２７】
チオ-４Ｄ５ ＦＡＢ軽鎖変異体のチオール反応性
抗ＥｒｂＢ２抗体４Ｄ５の様々なシステイン改変軽鎖変異体Ｆａｂのスクリーニングは、図８のＰＨＥＳＥＬＥＣＴＯＲアッセイで測定されるように、チオール反応性が０．６及びそれ以上の値である数多くの変異体を与えた（表７）。表７のチオール反応性値は、ＨＣ-Ａ１２１Ｃ変異体の完全なビオチン化を想定して１００％に設定される重鎖４Ｄ５ＴｈｉｏＦａｂ変異体（ＨＣ-Ａ１２１Ｃ）に対して正規化され、パーセント値に従って表される。
【０２２８】
0005850843.tif 000036
【０２２９】
ジルコニウム標識化試薬
デスフェリオキサミンＢ（Ｄｆ）に基づく典型的な二官能性試薬はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を含む抗体に対する８９Ｚｒの錯体形成に用いられる。デスフェリオキサミンＢ（Ｎ'-{５-[アセチル(ヒドロキシ)アミノ]ペンチル}-Ｎ-[５-({４-[(５-アミノペンチル)(ヒドロキシ)アミノ]-４-オキソブタノイル}アミノ)ペンチル]-Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド（N'-{5-[acetyl(hydroxy)amino]pentyl}-N-[5-({4-[(5-aminopentyl)(hydroxy)amino]-4-oxobutanoyl}amino)pentyl]-N-hydroxysuccinamide）(ＣＡＳ登録番号７０-５１-９）；及びデフェロキサミンとしても知られるデフェロキサミンＢ、ＤＦＯ-Ｂ、ＤＦＯＡ、ＤＦＢ又はデスフェラール）は、放線菌類ストレプトマイセスピロースス（Streptomyces pilosus）によって生成された細菌のシデロフォアである（図２０上）。デスフェリオキサミンＢは、体から過剰な鉄を除去するために使用されるキレート剤としての医療用途がある (Miller, Marvin J. "Syntheses and therapeutic potential of hydroxamic acid based siderophores and analogs" (1989) Chemical Reviews 89 (7):1563-1579)。ＤＦＯ-Ｂのメシル酸塩は市販されている。最初の実験は、Ｎ-(Ｓ-アセチル)チオアセチル-Ｄｆ (ＳＡＴＡ-Ｄｆ）、及びリジン側鎖のεアミノ基に結合したマレイミド基、４-[Ｎ-マレイミドメチル]シクロヘキサン-１-カルボン酸塩（4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylate）で装飾されたｍＡｂ (ｍＡｂ-ＳＭＣＣ)で行われた(Meijs WE et al. “Zirconium-labeled monoclonal antibodies and their distribution in tumor-bearing nude mice” (1997) J. Nucl. Med. 38:112-8; Meijs WE et al. “A facile method for the labeling of proteins with zirconium isotopes” (1996) Nucl Med Biol. 23:439-48)。しかしながら、得られたチオエーテル結合体（ＭＡＢ-ＳＭＣＣ-ＳＡＴＡ-ＤＦ）は、３７℃でヒト血清中では不安定であった(Verel I et al “89Zr immuno-PET: comprehensive procedures for the production of 89Zr-labeled monoclonal antibodies” (2003) J Nucl Med 44:1271-81)。別の例示的なアミノ反応性二官能性キレート剤が、無水コハク酸（Ｓｕｃ）で修飾されたＤｆに基づいて、Ｄｆのアミノ基をカルボン酸に変換するために使用され、続いて２,３,５,６-テトラフルオロエステル（ＴＦＰ）として活性化された。ＴＦＰ-Ｎ-Ｓｕｃ-ＤＦ（図２０中央）をｍＡｂのリジンε-アミノ基に結合させ、精製されたｍＡｂ-Ｎ-Ｓｕｃ-ＤＦは８９Ｚｒでキレートされた。得られた８９Ｚｒ-ｍＡｂ-Ｎ-Ｓｕｃ-Ｄｆは生理的条件下で安定であり、マウスにおいてその生体内分布が比較された(Verel I et al “89Zr immuno-PET: comprehensive procedures for the production of 89Zr-labeled monoclonal antibodies”(2003) J Nucl Med. 44:1271-81)。しかし、ＴＦＰ-Ｎ-Ｓｕｃ-ＤＦの調製は、Ｆｅ（ＩＩＩ）錯体としてヒドロキシアミド基の保護を必要とする。鉄は８９Ｚｒとキレート化する前に、ＥＤＴＡ処理により除去されるが、多段階法は、面倒であり、デスフェリオキサミンから鉄の除去が不完全である危険性を有し、及び／又は複合体バッファからのＥＤＴＡの不完全な除去は、８９Ｚｒキレートの収率にマイナスの影響を与える可能性がある。したがって、ヘテロ二官能性アミノ反応性試薬、ｐ-イソチオシアナトベンジルデスフェリオキサミン(Ｄｆ-Ｂｚ-ＮＣＳ)（p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxaimine）が、チオ尿素結合を介してＤｆをタンパク質に導入するために近年開発された；図２０中央(Perk LR et al. “Facile radiolabeling of monoclonal antibodies and other proteins with zirconium-89 or gallium-68 for PET Imaging using p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine”(2008) Nature Protocols, published online:DOI:10.1038/nprot.2008.22; Perk LR et al. “p-Isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine: a new bifunctional chelate for facile radiolabeling of monoclonal antibodies with zirconium-89 for immuno-PET imaging” (2009) European Journal Of Nuclear Medicine And Molecular Imaging)。Ｄｆ-Ｂｚ-ＮＣＳを用いて調製された抗体複合体はＴＦＰ-Ｎ-Ｓｕｃ-Ｄｆを用いて調製された参照となる抗体複合体に匹敵する安定性及びイメージング特性を示した。リジンε-アミノ基を介して抗体と８９Ｚｒを結合させる信頼性の高い方法が開発されたため、報告される８９Ｚｒ標識抗体の前臨床的および臨床的ｉｍｍｕｎｏＰＥＴ研究の数は急速に増加している (Verel I, et al. “Long-lived positron emitters zirconium-89 and iodine-124 for scouting of therapeutic radioimmunoconjugates with PET” (2003) Cancer Biother Radiopharm. 18:655-61; Nagengast WB et al. “In vivo VEGF imaging with radiolabeled bevacizumab in a human ovarian tumor xenograft” (2007) J Nucl Med. 48:1313-9; Perk LR, et al. “(89)Zr as a PET surrogate radioisotope for scouting biodistribution of the therapeutic radiometals (90)Y and (177)Lu in tumor-bearing nude mice after coupling to the internalizing antibody cetuximab” (2005) J Nucl Med. 46:1898-906; Perk LR et al. “Quantitative PET imaging of Met-expressing human cancer xenografts with (89)Zr-labelled monoclonal antibody DN30” (2008) European Journal Of Nuclear Medicine And Molecular Imaging 35:1857-67; Perk LR et al. “Preparation and evaluation of (89)Zr-Zevalin for monitoring of (90)Y-Zevalin biodistribution with positron emission tomography” (2006) European Journal Of Nuclear Medicine And Molecular Imaging 33:1337-45; Borjesson PK et al. “Performance of immuno-positron emission tomography with zirconium-89-labeled chimeric monoclonal antibody U36 in the detection of lymph node metastases in head and neck cancer patients” (2006) Clin Cancer Res. 12:2133-40; Aerts HJ et al. “Disparity between in vivo EGFR expression and 89Zr-labeled cetuximab uptake assessed with PET” (2009) J Nucl Med. 50:123-31; Dijkers EC et al. “Development and Characterization of Clinical-Grade 89Zr-Trastuzumab for HER2/neu ImmunoPET Imaging” (2009) J Nucl Med 50(6):974-981).
【０２３０】
ジルコニウム錯体の実施態様はまた、ジルコニウム結合（キレート）配位子、例えば、ＤＴＰＡ(ＣＡＳカタログ番号６７-４３-６）、ＤＯＰＡ（１,４,７,１０-テトラアザシクロドデカン-１,４,７,１０-四酢酸) (Liu, Shuang (2008) Advanced Drug Delivery Reviews 60(12): 1347-1370), cyclopentadienyl, and allyl groups (Erker, G. (1991) Pure and Applied Chemistry 63(6):797-806; Erker, G. (1990) Jour. of Organometallic Chem. 400(1-2):185-203)を含み、その各々は本明細書に参照により援用される。
【０２３１】
ジルコニウム錯体（Ｚ）及び他の放射性核種は、リジン側鎖のε-アミノ基、又はシステインのチオール基を介して、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）を含む抗体（Ａｂ）に対して結合させることができる。およそ４０のリジン側鎖(Wang L et al “Structural characterization of the maytansinoid-monoclonal antibody immunoconjugate, huN901-DM1, by mass spectrometry” (2005) Protein Sci. 14:2436-46)又は８つのシステイン(Hamblett KJ et al. “Effects of drug loading on the antitumor activity of a monoclonal antibody drug conjugate” (2004) Clin Cancer Res. 10:7063-70)がモノクローナル抗体において結合に利用できるため、両方の方法がｍＡｂ複合体比率及び結合部位に関して不均一性を与えている。結合部位内のリジン残基の修飾は複合体の生物学的活性を減容させる可能性があるが (Cai W et al. “PET imaging of colorectal cancer in xenograft-bearing mice by use of an 18F-labeled T84.66 anti-carcinoembryonic antigen diabody” (2007) J Nucl Med. 48:304-10; Shively JE. “18F labeling for immuno-PET: where speed and contrast meet” (2007) J Nucl Med. 48:170-2; Tait JF et al “Improved detection of cell death in vivo with annexin V radiolabeled by site-specific methods” (2006) J Nucl Med. 47:1546-53; Schellenberger EA et al “Optical imaging of apoptosis as a biomarker of tumor response to chemotherapy” (2003) Neoplasia (New York, N.Y) 5:187-92)、ヒンジ領域におけるシステインの修飾は血漿半減期の低下を与える(Hamblett KJ et al. “Effects of drug loading on the antitumor activity of a monoclonal antibody drug conjugate” (2004) Clin Cancer Res. 10:7063-70)。これらの限界は、システインへの変異のために抗体の好ましいアミノ酸の迅速な同定のために、生化学アッセイ、ＰＨＥＳＥＬＥＣＴＯＲ(米国特許第７５２１５４１号; Junutula JR et al. “Rapid identification of reactive cysteine residues for site-specific labeling of antibody-Fabs” J Immunol Methods 2008;332:41-52)による部位特異的結合の目的のために選択的に配置されたシステインを含有すように改変されたｍＡｂを用いることで避けることができる。得られた抗体（ＴＨＩＯＭＡＢ）は続いて、結合親和性又は抗体足場の安定性における有害な影響を損なうことなく化学選択的及び部位特異的に細胞傷害性薬剤に結合される (Junutula JR et al. “Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index” (2008) Nat Biotechnol. 26:925-32)。
【０２３２】
イメージングの観点から、高い標的親和性及び最小限の非特異的取り込みが、最適な画質のために必要とされる。従って、部位特異的放射性標識化システイン改変抗体（ＴＨＩＯＭＡＢ）は、標的組織外の代謝物の非特異的な取り込みを最小限に抑えることができ得る結合親和性及び足場の安定性が不変なトレーサーを提供することができる。本発明による一態様は、新規なＤｆベースのチオール反応性二官能性試薬、マレイミドシクロヘキシルデスフェリオキサミン（Ｄｆ-Ｃｈｘ-Ｍａｌ）、ブロモアセチルデスフェリオキサミン（Ｄｆ-Ｂａｃ）及びヨードアセチルデスフェリオキサミン（Ｄｆ-Ｉａｃ）（図２０）を用いる、ＴＨＩＯＭＡＢの部位特異的放射性標識のための方法である。典型的な実施態様は、これらの試薬が部位特異的にトラスツズマブＴＨＩＯＭＡＢ（チオトラスツズマブ）へ結合され、８９Ｚｒとキレート化され、インビトロ及びインビボで評価される場合を含む。
【０２３３】
ジルコニウムの一つの準安定異性体は、ベータ（電子放出）、陽電子（ベータプラス）、及びガンマ線の崩壊様式により７８.４時間の半減期を持つ８９Ｚｒである。
【０２３４】
放射性同位体又は他の標識は、既知の方法で複合体に組み込むことができる(Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57; "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" Chatal, CRC Press 1989。炭素１４標識化１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン５酢酸(isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylene triaminepentaacetic acid)は抗体への放射性核種の結合のための典型的なキレート剤である（国際公開第９４／１１０２６号）。 
【０２３５】
リンカー
「リンカー」（Ｌ）は二官能性又は多官能性成分であり、一又は複数のジルコニウム錯体成分（Ｚ）及び抗体ユニット（Ａｂ）を結合させることができ、式Ｉの抗体-ジルコニウムコンジュゲート（ＡＺＣ）を形成する。抗体-ジルコニウムコンジュゲート（ＡＺＣ）はジルコニウムおよび抗体に結合するための反応性官能基を有するリンカーを用いて都合良く調製することができる。システイン改変抗体（Ａｂ）のシステインチオールは、リンカー試薬、ジルコニウム標識成分、又はジルコニウムリンカー中間体の官能基と結合を形成することができる。
【０２３６】
一態様にて、リンカーは、抗体上に存在する求核システインに対して反応性である電子性基を有する反応性部位を有する。抗体のシステインチオールはリンカー上の求電子性基と反応性であり、リンカーに共有結合を形成している。有用な求電子性基は、マレイミド及びハロアセトアミド基を含むが、これらに限定されない。
【０２３７】
システイン改変抗体は、Klussman, et al (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773の７６６頁の結合方法、及び、実施例１７−１９のプロトコールによれば、マレイミド又はα-ハロカルボニルなどの求電子性官能基と、リンカー試薬又はジルコニウム-リンカー中間体と反応する可能性がある。
【０２３８】
その他の実施態様において、Ｚ成分は同一である。
【０２３９】
更に別の実施態様において、Ｚ成分は異なる。
【０２４０】
式Ｉの抗体-ジルコニウムコンジュゲート（ＡＺＣ）化合物は
0005850843.tif 000037
を含み、ここでＸは、
0005850843.tif 000038
Ｙは，
0005850843.tif 000039
であって、Ｒは独立して、Ｈ又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、ｎは１から１２である。
【０２４１】
その他の実施態様において、リンカーは、抗体上に存在する電子性基に対して反応性である求核基を有する反応性官能基を持つ。抗体上の有用な求電子基としては、アルデヒド及びケトンのカルボニル基を含むが、これらに限定されない。リンカーの求核基のヘテロ原子は、抗体上の求電子性基と反応し、抗体ユニットに共有結合を形成することができる。リンカーの有用な求核基としては、ヒドラジド、オキシム基、アミノ基、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸塩、及びアリルヒドラジドを含むが、これらに限定されない。抗体上の電子性基はリンカーに付着するため都合の良い部位を与える。
【０２４２】
その他の実施態様において、リンカーは、溶解性又は反応性を調節した基で置換されることがある。たとえば、スルホン酸(-ＳＯ３-）またはアンモニウム等の荷電置換基は、試薬の水への溶解度を増加させ、抗体またはジルコニウム成分とリンカー試薬のカップリング反応を容易にすることができ、又はＡＺＣを調製するために用いる合成経路に依存して、Ａｂ-Ｌ（抗体−リンカー中間体）のＺとの、又は又はＺ-Ｌ(ジルコニウム-リンカー中間体)のＡｂとのカップリング反応を容易にすることができる。
【０２４３】
本発明の化合物は、限定されないが、ピアースバイオテクノロジー社、カスタマーサービス部門（私書箱１１７、ロックフォード、イリノイ州、６１１０５ 米国）から市販されているリンカー試薬：ＢＭＰＥＯ、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ-ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホＥＭＣＳ、スルホＧＭＢＳ、スルホＫＭＵＳ、スルホＭＢＳ、スルホＳＩＡＢ、スルホＳＭＣＣ及びスルホＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ(サクシニミジル-(４-ビニルスルホン)安息香酸）、及びビスマレイミド試薬：ＤＴＭＥ、ＢＭＢ、ＢＭＤＢ、ＢＭＨ、ＢＭＯＥ、ＢＭ(ＰＥＯ)2、及びＢＭ(ＰＥＯ)43で調製されたＡＺＣを明白に意図するものである。ビスマレイミド試薬が連続的又は同時的方法で、チオール含有ジルコニウム成分、標識、又はリンカー中間体へのシステイン改変抗体のチオール基の付着を可能とする。マレイミド以外の官能基は、システイン改変抗体のチオール基、ジルコニウム成分、標識又はリンカー中間体と反応性であり、ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、ビニルピリジン、ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、イソシアネート、及びイソチオシアネートを含む。
0005850843.tif 000040
【０２４４】
有用なリンカー試薬はまた、他の商業的供給源、例えばモレキュラーバイオサイエンス社（コロラド州ボールダー）を介して入手することができ、又は、Toki et al (2002) J. Org. Chem. 67:1866-1872; Walker, M.A. (1995) J. Org. Chem. 60:5352-5355; Frisch et al (1996) Bioconjugate Chem. 7:180-186、米国特許第６２１４３４５号、国際公開第０２／０８８１７２号、米国特許出願公開第２００３１３０１８９号、米国特許出願公開第２００３０９６７４３号、国際公開第０３／０２６５７７号、国際公開第０３／０４３５８３号、及び国際公開第０４／０３２８２８号に記載の手順に従って合成することができる。
【０２４５】
典型的なリンカー試薬は、
0005850843.tif 000041
ここでｎは１−１０の範囲の整数であり、Ｔは−Ｈ又は -SO3Naである；
0005850843.tif 000042
ここでｎは０−３の範囲の整数である；
0005850843.tif 000043
を含む。
【０２４６】
その他の実施態様において、リンカーＬは、複数のジルコニウム成分が、分岐する多官能性リンカー成分を介して抗体へ共有結合するための樹枝状型リンカーであり得る(Sun et al (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768)。樹枝状リンカーは、抗体に対するジルコニウムのモル比、すなわちＡＺＣの負荷を増やすことができる。したがって、システイン改変抗体が1つの反応性システインチオール基のみを持つ場合、多数のジルコニウム成分を樹状リンカーを介して結合させることができる。
【０２４７】
樹状リンカー試薬の次の例示的な実施態様は、９つまでの求核性ジルコニウム成分の試薬がクロロエチルナイトロジェンマスタード官能基との反応により結合されることを可能とする：
0005850843.tif 000044
0005850843.tif 000045
【０２４８】
分岐状、樹枝状リンカーの他の実施態様は自壊的（self-immolative）２,６-ビス(ヒドロキシメチル)-ｐ-クレゾール及び２,４,６-トリス(ヒドロキシメチル)-フェノール デンドリマー単位によるものを含む(国際公開第２００４／０１９９３号; Szalai et al (2003) J. Amer. Chem. Soc. 125:15688-15689; Shamis et al (2004) J. Amer. Chem. Soc. 126:1726-1731; Amir et al (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4494-4499)。
【０２４９】
デスフェリオキサミン-標識化、システイン改変抗体
本発明の一態様は、遊離システインアミノ酸を介してリンカー（Ｌ）及びデスフェリオキサミン成分（Ｄｆ）に結合したシステイン改変抗体（Ａｂ）を含む、デスフェリオキサミン標識されたシステイン改変抗体であり、式IIを有する。
0005850843.tif 000046
ここでＬ-Ｄｆは
0005850843.tif 000047
から選択され、ここで波線は抗体（Ａｂ）への結合を示し、及び
ｐは１から４である。
【０２５０】
抗体-ジルコニウムコンジュゲートの調製
式Ｉの抗体 - ジルコニウムコンジュゲート（ＡＺＣ）は、当業者に公知の有機化学反応、条件及び試薬を用いて、いくつかの経路によって調製することができ、（１）システイン改変抗体のシステイン基をリンカー試薬と反応させ、共有結合を介した抗体−リンカー中間体ＡＢ-Ｌを形成し、続いて活性化ジルコニウム標識成分Ｚと反応させ、（２）ジルコニウム基の求核基をリンカー試薬との反応させ、共有結合を介したジルコニウム標識リンカー中間体Ｚ-Ｌを形成し、続いてシステイン改変抗体のシステイン基と反応させる、ことを含む。結合方法（１）と（２）は、式Ｉの抗体−ジルコニウムコンジュゲートを調製するために、さまざまなシステイン改変抗体、ジルコニウム標識成分、及びリンカーを使用することができる。
【０２５１】
抗体のシステインチオール基は、求核性であり、リンカー試薬及びジルコニウム-リンカー中間体上の求電子基と共有結合を形成するために反応することができる、（ｉ）活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルマート（haloformates）、および酸ハロゲン化物;（ｉｉ）アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド基、ケトン基、カルボキシル基及びマレイミド基；及び（ｉｖ）硫化物交換によるピリジルジスルフィドを含むジスルフィドを含む。ジルコニウム標識成分上の求核基としては、限定されないが、リンカー成分およびリンカー試薬上の求電子基と共有結合を形成するために反応することができる、アミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸塩、アリールヒドラジド基を含む。
【０２５２】
所定の条件下では、システイン改変抗体は、ＤＴＴ（クリーランドの試薬、ジチオスレイトール）、又はＴＣＥＰ(トリス（２-カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩; Getz et al (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA)等の還元剤で処理することにより、リンカー試薬との結合のために反応性になりうる。ＣＨＯ細胞で発現される完全長システイン改変モノクローナル抗体（ＴｈｉｏＭａｂ）が、新たに導入されたシステイン残基及び培地中に存在するシステインの存在の間に形成する可能性のあるジスルフィド結合を還元するために、３７℃で３時間ＴＣＥＰの約５０倍過剰で還元された。還元されたＴｈｉｏＭａｂは１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５で希釈され、ＨｉＴｒａｐ Ｓカラム上にロードされ、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含むＰＢＳで溶出した。ジスルフィド結合は、一晩室温で希釈した（２００ｎＭ）水性硫酸銅（ＣｕＳＯ４）とともに親モノクローナル抗体中に存在するシステイン残基との間で再形成された。当技術分野で公知の他の酸化体、すなわち、酸化剤、及び酸化条件を使用することができる。周囲の空気酸化もまた有効である。この穏やかな、部分的な再酸化工程は、高忠実度で効率的に鎖内ジスルフィドを形成する。ジルコニウム-リンカー中間体の約10倍過剰を加え、混合し、結合を生じさせ、ＴｈｉｏＭａｂ-ジルコニウムコンジュゲートを形成するために室温で１時間ほど放置された。結合混合物をゲル濾過し、ロードされ、過剰なジルコニウム−リンカー中間体および他の不純物を除去するためにハイトラップＳカラムを通して溶出される。
【０２５３】
図１５は、結合のための細胞培養から発現されたシステイン改変抗体を調製するための一般的な方法を示す。システイン付加体は、恐らくは様々な鎖間ジスルフィド結合とともに還元的に切断され、抗体の還元型を与える。対のシステイン残基間の鎖間ジスルフィド結合は、周囲の酸素への暴露など部分的酸化条件の下で再形成される。新たに導入され、改変された不対システイン残基は、本発明の抗体コンジュゲートを形成するため、リンカー試薬又はジルコニウム-リンカー中間体と反応させるためにいつでも利用できる状態である。哺乳動物細胞株で発現されたＴｈｉｏＭａｂは、改変されたＣｙｓへ-Ｓ-Ｓ-結合形成により、外部に結合したＣｙｓ付加体をもたらす。したがって、精製されたＴｈｉｏＭａｂは、反応性ＴｈｉｏＭａｂを生成するために実施例１１に記載の酸化還元の手続きで処理する必要がある。これらのＴｈｉｏＭａｂは、マレイミドを含む放射性標識、細胞毒性薬、フルオロフォア、及びその他の標識と結合するために用いられる。
【０２５４】
８９Ｚｒ-ＤＦ-トラスツズマブコンジュゲートの調製及び分析
保護された活性エステルＴＦＰ-Ｎ-ＳｕｃＤｆ-Ｆｅは、前述の手順に従って調製し(Verel I et al “89Zr Immuno-PET: Comprehensive Procedures For The Production Of 89Zr-Labeled Monoclonal Antibodies” (2003) J Nucl Med 44:1271-81)、ＴＦＰ-Ｎ-ＳｕｃＤｆ-Ｆｅの５倍モル過剰を使用してトラスツズマブに結合させ、デスフェリオキサミンを平均１．６分子持つＮ-ＳｕｃＤｆ-トラスツズマブを得た（表８）。Ｄｆ-Ｂｚ-ＳＣＮ-トラスツズマブは、ｐＨ８．５でＤｆ-Ｂｚ-ＳＣＮの８倍モル過剰をカップリングすることによって得られた(Perk LR, et al. “Facile radiolabeling of monoclonal antibodies and other proteins with zirconium-89 or gallium-68 for PET Imaging using p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine”(2008)Nature Protocols;published online:DOI:10.1038/nprot.2008.22)。反応はデスフェリオキサミンの平均２．４分子で装飾されたＤｆ-Ｂｚ-ＳＣＮ-トラスツズマブを与えた（表１）。
【０２５５】
マレイミドに基づいた新規なチオール反応性二官能性リンカーであるＤｆ-Ｃｈｘ-Ｍａｌは、デスフェリオキサミンメシル酸塩とＳＭＣＣの等モル量から調製した（図２１、実施例１３）。反応は室温で３０分以内に完了し、生成物は水の添加により沈殿させることにより４５％の収率及び９５％以上の純度で単離した。新たに調製されたチオ-トラスツズマブとのＤＦ-ＣＨＸ-Ｍａｌの８．５倍モル過剰の反応は（図２１、実施例１７）、１時間でデスフェリオキサミンの正確に２分子持つＤｆ-Ｃｈｘ-Ｍａｌ-チオ-トラスツズマブコンジュゲートを与えた（表１、図２１）。ブロモアセチルデスフェリオキサミン（ＢＤｆ-Ｂａｃ）は、０℃でのデスフェリオキサミンメシル酸塩及びブロモアセチルブロミド等モル量の反応によって調製した（実施例１４）。生成物はＨＰＬＣ精製後に１４％の収率で得られた。新たに調製されたチオ-トラスツズマブの１２倍モル過剰のＤｆ-Ｂａｃによるアルキル化は（図２１、実施例１６）、抗体あたり１．８分子のＤｆを持つコンジュゲート（ＤＦ-Ａｃ-チオ-トラスツズマブ）を５時間以内に与えた（表８、図２１、実施例１８）。臭化物の低い反応性は、より反応性のヨード誘導体（ＤＦ-Ｉａｃ）を探索することを私たちに促した。Ｄｆ-ＩａｃはＮ-ヒドロキシスクシンイミジルヨード酢酸のわずかに過剰とデスフェリオキサミンメシル酸との反応により５３％の収率で調製された（図２１、実施例１５）。生成物は反応混合物から沈殿させることにより９５％以上の純度で得られた。続くＤＦ-Ｉａｃの１１倍過剰の反応は、２時間以内にＤｆの１．８分子で装飾されたＤｆ-Ａｃ-チオ-トラスツズマブを与えた（表１、図２１、実施例１９）。我々の経験に基づいて、Ｄｆ-Ｃｈｘ-Ｍａｌは調べた３つの化合物の好ましい試薬である。特に、Ｄｆ-Ｃｈｘ-Ｍａｌの反応は、Ｄｆ-Ｂａｃ及びＤｆ-Ｉａｃによるチオール基のアルキル化のために必要なより高いｐＨ及びより長い反応時間とは対照的に１時間以内に穏やかなｐＨで完了した。さらに、ハロアセトアミドの低い反応性は、チオトラスツズマブの利用可能なシステインの両方の不完全な負荷を引き起こしている可能性がある。
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【０２５６】
８９Ｚｒは、前述の実験手順を使用してＤｆ-トラスツズマブのすべての４つの亜種と８９-ジルコニウムシュウ酸塩としてキレート化された(Verel I et al “89Zr immuno-PET: comprehensive procedures for the production of 89Zr-labeled monoclonal antibodies” (2003) J Nucl Med. 44:1271-81)。放射性標識タンパク質は、脱塩カラムで精製し、最終溶液は、膜濾過により必要量にまで濃縮された。８９Ｚｒコンジュゲートの収量、純度、および最終的な比活性は、表９に要約される。一般的には、キレート化収率は、おそらくは抗体分子あたりのＤｆの少量、及び／又は活性化及び結合の間キレート剤を保護するために使用される鉄（ＩＩＩ）の不完全な除去に起因して、低収率で得られたＤｆ-Ｎ-Ｓｕｃリンカーの例外を除いて、８０％を超えた。脱塩カラムを用いたＤｆ-トラスツズマブ変異体の精製後、それぞれのサンプルで検出された高分子量の凝集体は少量（１−６％）で、生成物の純度は９０％以上であった。Ｄｆ-Ｃｈｘ-Ｍａｌ-チオ-トラスツズマブは、低分子量不純物の約８％及び高分子量凝集体の２％で汚染されていたＤｆ-Ａｃコンジュゲートとは対照的に、純度９９％で８９Ｚｒ錯体を与えた（表９）。汚染物質除去はＮＡＰ-１０カラムを用いた除去に抵抗したが、アミコンフィルター上で繰り返しバッファー交換を使うことで可能であった。
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【０２５７】
８９Ｚｒ-Ｄｆ-トラスツズマブコンジュゲートの生物学的活性
新たに作製された部位特異的Ｄｆ-リンカー-チオ-トラスツズマブコンジュゲートの生物学的活性は、スキャッチャード分析によるＢＴ４７４乳癌細胞株に対する結合アッセイを用いて測定された。得られたＫＤ値は、非修飾トラスツズマブ（０．９１±０．２０ｎＭ）に対して比較した。Ｃｈｘ-Ｍａｌリンカーを含むチオ-トラスツズマブコンジュゲートのＫＤは０．９３±０．１５ｎＭであり、Ａｃリンカーを含むコンジュゲートに対する値はＤｆ-Ｂａｃを用いて調製されたコンジュゲートにおいて１．２２±０．２２ｎＭであり、Ｄｆ-Ｉａｃを用いて調製された複合体において０．８７±０．１５ｎＭであった。生物学的活性の解析の結果は、チオトラスツズマブの修飾が、ＨＥＲ２に対する抗体の結合親和性に影響を及ぼさなかったことを示している。
【０２５８】
インビトロでの血清の安定性
以前に報告された、アミドまたはチオ尿素結合を含むＮ-Ｓｕｃ及びＢｚ-ＳＣＮリンカーとのＤｆ-抗体コンジュゲートは、血清中３７℃で６日間にわたり、インビトロで安定していた(Verel I et al “89Zr immuno-PET: comprehensive procedures for the production of 89Zr-labeled monoclonal antibodies” J Nucl Med 2003;44:1271-81; Perk LR et al, (2009) European Journal Of Nuclear Medicine And Molecular Imaging 35(10):1857-1867)。Ｃｈｘ-Ｍａｌ及びＡｃリンカーとの８９Ｚｒ-チオ-トラスツズマブコンジュゲートの安定性は３７℃でマウス血清中で決定された。抗体結合した８９Ｚｒの有意な損失は、５日間の期間内に観察されなかった。両方のチオコンジュゲートは、抗体結合８９Ｚｒの平均損失が、８９Ｚｒ-Ｄｆ-Ｃｈｘ-Ｍａｌ-チオ-トラスツズマブにおいて１日たり１．８％であり、８９Ｚｒ-Ｄｆ-Ａｃｌ-チオ-トラスツズマブにおいて１日たり１．４％であり安定していた（図２４）。高分子量種、おそらくは凝集体のゆっくりとした形成は、Ｄｆ-Ｃｈｘ-Ｍａｌ及びＤｆ-Ａｃリンカーの両方で観察された。
【０２５９】
インビボマイクロペット（ＭＩＣＲＯＰＥＴ）イメージング
皮下のＢＴ４７４Ｍ１異種移植片（サイズ〜２００立方ミリメートル）を有する二十の動物（各群５匹）に89Ｚｒ-トラスツズマブを静脈内注射した。動物ごとに注入された抗体の量は１．４±０．２９ｍｇ／ｋｇであった。代表的な動物の（注射後（p.i.）96時間における）最大強度の投影画像が図３に示される。選択された組織での８９Ｚｒ-トラスツズマブの取り込みは図４に要約されている。１時間での画像（表示せず）は、親油性不純物の急速な肝胆道排泄が腸内で吸収の上昇をもたらしたＤｆ-Ｂａｃの例外を除き、高い血液プールの取り込みにより支配されていた。不純物は完全に最初の２４時間以内にクリアされ、小腸および大腸の取り込みの上昇はトレーサー注入後２４時間又は以降の時点で検出されなかった。Ｄｆ-Ａｃコンジュゲートの組織の取り込みは、結果としてわずかに（〜８％）低下したが、腫瘍対血液比率（表１０）は注射された放射活性の損失により影響を受けなかった。９６時間での画像は４つの異なる８９Ｚｒ-トラスツズマブ変異体の間で観察されたわずかな違いを示し、高い腫瘍取り込みにより支配されていた（図２５）。腫瘍の取り込みは、各トレーサーについて同一であり、注射後２４時間で最大値に到達し、血中クリアランスのため１４４時間で最大の腫瘍対血液比率に到達した（表１０）。チオールに基づくコンジュゲートの８９Ｚｒ-Ｄｆ-Ｃｈｘ-Ｍａｌ-チオ-トラスツズマブは、注射後９６時間及び１４４時間でアミンに基づくコンジュゲート（Ｄｆ-Ｂｚ-ＳＣＮ及びＤｆ-Ｎ-Ｓｕｃ）と比較して、骨の取込みの上昇を示した（Ｐ＜０．０５）。Ｄｆ-Ａｃ-チオ-トラスツズマブの骨の取込みはＤｆ-Ｂｚ-ＳＣＮリンカー及びＤｆ-Ｎ-Ｓｕｃリンカーと比較して有意には上昇しなかったが（Ｐ＝０．２０）、最初の２４時間の間、放射活性の８％の損失を補正した場合には有意となり得る。抗体に基づくトレーサーで予想されるように、各トレーサーの腎取り込みは低かったが（図２６）、８９Ｚｒ-Ｄｆ-Ｃｈｘ-Ｍａｌ-チオ-トラスツズマブは、他のリンカーと２４時間、９６時間及び１４４時間の時点で比較してわずかに高かった（Ｐ＜０．０５）。
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【０２６０】
ＢＴ４７４（ＨＥＲ２の３＋発現レベル）異種移植は、ＤｉｊｋｅｒｓらによりＳＫＯＶ３（ＨＥＲ２の３＋発現レベル）において以前測定された３３．４±７．７％ＩＤ／ｇ(Dijkers EC, et al. “Development and Characterization of Clinical-Grade 89Zr-Trastuzumab for HER2/neu ImmunoPET Imaging" (2009) J Nucl Med 50(6):974-981)よりも低いトレーサーの絶対的取込み（１５％ＩＤ／ｇ）を示した。しかし、腫瘍対血液の比率が５．７−７．１（表１０）とはＳＫＯＶ３で得られた値（腫瘍対血液の比率が７．６）に匹敵する。腫瘍の取り込みの違いは、腫瘍モデル及びトラスツズマブの総投与量に起因する可能性がある。高い比活性を有する材料が使用され、従って、ＤｉｊｋｅｒｓらのＳＫＯＶ３による研究（１００μｇ、４ｍｇ／ｋｇ）と比較して、著しく少ない抗体が注射された（３５μｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ）。比活性の違いもまた、ＳＫＯＶ３モデル（５−１０％ＩＤ／ｇ）に比較して、本明細書の実験において２−３％ＩＤ／ｇという、遊離の８９Ｚｒの低い骨の取込みに寄与した可能性がある。残念ながら、骨の取り込みの上昇に関してはいかなる指南もDijkersらによって与えられてない。ジルコニウムは、血漿タンパク質を結合することが知られている(Mealey J, Jr. “Turn-over of carrier-free zirconium-89 in man” (1957) Nature 179:673-4 and is later deposited in mineral bone (Fletcher CR. “The radiological hazards of zirconium-95 and niobium-95” (1969) Health Phys. 16:209-20; Shiraishi Y and Ichikawa R. “Absorption and retention of 144 Ce and 95 Zr- 95 Nb in newborn, juvenile and adult rats” (1972) Health Phys. 22:373-8)。注射された物質は、遊離の８９Ｚｒが含まれていなかったので、骨の取り込みは８９Ｚｒ抗体の分解から、又は、Ｄｆに結合した89Zr と比較して血漿タンパク質とトランスキレート化しうる非特異的に抗体と結合した８９Ｚｒから由来する可能性がある。
【０２６１】
システイン改変抗体のシステインのチオール基を介する、デスフェリオキサミン（Ｄｆ）のモノクローナル抗体への化学選択的結合のために、三つのチオール特異的試薬が本明細書に例示されている。チオール特異的Ｄｆ試薬は、デスフェリオキサミンＢのアミノ基のアシル化により、１４％（Ｄｆ-Ｂａｃ）、５３％（Ｄｆ-Ｉａｃ）及び４５％（Ｄｆ-Ｃｈｘ-Ｍａｌ）の収率で得られ、チオトラスツズマブへ結合させ、改変されたシステインの両方で１−５時間以内に部位特異的修飾をもたらす。ＨＥＲ２に対する部位特異的チオトラスツズマブコンジュゲートの結合活性は、非修飾トラスツズマブの活性と同一であった。Ｄｆ修飾チオトラスツズマブ（Ｄｆ-Ａｃ-チオトラスツズマブ及びＤｆ-Ｃｈｘ-Ｍａｌ-チオトラスツズマブ）は、前述のＤｆ-Ｂｚ-ＳＣＮリンカー及びＤｆ-Ｎ-Ｓｕｃリンカーを用いて調製されたリジンコンジュゲートに匹敵し、１時間以内に８０％を超える収率で ８９Ｚｒとキレート化された（図２２）。８９Ｚｒ-Ｄｆ-Ａｃ-チオトラスツズマブ及び８９Ｚｒ-Ｄｆ-Ｃｈｘ-Ｍａｌチオトラスツズマブの両方ともマウス血清中に匹敵する安定性を示した。両化合物はまた、ＢＴ４７４Ｍ１乳癌モデルにおいて、腫瘍対血液の比率が６．１から７．１の範囲で腫瘍の取込みが１０−１５％ＩＤ／ｇに到達し、リジンコンジュゲートに匹敵するＰＥＴイメージング機能を示した。全体的に新規試薬は容易に利用可能であり、タンパク質のチオール基との良好な反応性を示し、８９Ｚｒとの非常に良好なキレート化特性を示した。８９Ｚｒ標識化抗体は血清中で安定しており、優れたＰＥＴイメージング特性を示した。ＤＦ-Ｃｈｘ-Ｍａｌはシステインの側鎖を介してＤｆが抗体に結合するための有用な試薬であり、Ｄｆ-Ｂａｃ及びＤｆ-Ｉａｃに対して幾つかの利点を示した。まず、Ｄｆ-Ｂａｃ及びＤｆ-ＩａｃにおけるｐＨ９及び２又は５時間と比べて、中程度のｐＨ７．５が１時間以内でのＤｆ-Ｃｈｘ-Ｍａｌの完全な結合のために必要とされた。更に、部位特異的に８９Ｚｒ標識された改変ＴＨＩＯＭＡＢコンジュゲートが、生物医学研究におけるＰＥＴイメージングアプリケーションのための貴重なツールとして、１８Ｆ標識されたＴＨＩＯＭＡＢコンジュゲートと同様に用いることが可能である(Gill HS, et al. “A modular platform for the rapid site-specific radiolabeling of proteins with 18F exemplified by quantitative positron emission tomography of human epidermal growth factor receptor 2” (2009) Jour. of Med. Chem. 52:5816-25)。
【０２６２】
抗体-ジルコニウムコンジュゲートの投与
本発明の抗体-ジルコニウムコンジュゲート（ＡＺＣ）は治療されるべき疾患に適した任意の経路で投与され得る。ＡＺＣは、通常、非経口的に、すなわち注入、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、くも膜下腔内、及び硬膜外に投与され得る。
【０２６３】
薬学的製剤
本発明の治療上の抗体-ジルコニウムコンジュゲート(ＡＺＣ)の薬学的製剤は、典型的に、薬学的に許容可能な非経口用ビヒクルと共に単位用量注入用形態で、非経口的投与、すなわちボーラス、静脈内、腫瘍内注入のために調製される。所望の純度を持つ抗体-ジルコニウムコンジュゲート(ＡＺＣ)は、場合によって、薬学的に許容される希釈剤、担体、賦形剤又は安定化剤と、凍結乾燥又は水溶液の形態に混合される(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))。
【０２６４】
許容される希釈剤、担体、賦形剤及び安定化剤は、用いられる用量と濃度で生物源レシピエントに非毒性であり、ホスフェート、シトレート及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(約１０残基未満)のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む、単糖、二糖および他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖;ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質コンジュゲート)；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。例えば、凍結乾燥した抗ＥｒｂＢ２抗体製剤は国際公開９７／０４８０１号に記載されており、出典明記によって本明細書中に特別に援用される。
【０２６５】
また活性成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリーシステム(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ-粒子及びナノカプセル)に、あるいはマクロエマルションに捕捉させてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている
【０２６６】
徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の好ましい例は、ＡＺＣを含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチルメタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号)、Ｌ-グルタミン酸及びγエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフィア)、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシブチル酸が含まれる。
【０２６７】
インビボ投与に使用する製剤は、無菌でなければならず、それは滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
【０２６８】
製剤は、上記の投与経路に適したものを含む。製剤は、単位用量形態で都合良く提示することができ、製薬の分野で公知の任意の方法によって調製することができる。技術及び製剤は、一般的にレミントンの製薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）（マック出版社、イーストン、ペンシルベニア州）に記載されている。そうした方法は、１つ又は複数の副成分を構成する担体と有効成分の会合もたらす工程を含む。一般に、製剤は、均一かつ密接に液体担体又は微粉砕固体担体もしくはその両方の有効成分との会合をもたらし、必要あらば製品を成形することによって調製される。
【０２６９】
本発明の水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混合した活性物質を含む。そのような賦形剤には、懸濁剤、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、クロスカルメローゼ、ポビドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム及びアカシアガム、及び分散又は湿潤剤、例えば天然に生じるホスファチド（例えばレシチン）、脂肪酸とのアルキレンオキシドの縮合産物（例えばポリオキシエチレンステアラート）、長鎖脂肪族アルコールとのエチレンオキシドの縮合産物（例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール）、脂肪酸とヘキシトール無水物から誘導された成分エステルとのエチレンオキシドの縮合産物（例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）が含まれる。水性懸濁液はまた一又は複数の保存料、例えばエチル又はｎ-プロピルｐ-ヒドロキシ-ベンゾアート、一又は複数の着色剤、一又は複数の香味剤及び一又は複数の甘味料、例えばスクロース又はサッカリンを含みうる。
【０２７０】
ＡＺＣ化合物の薬学的組成物は滅菌された注射用製剤の形態、例えば滅菌注射用水性又は油性懸濁液であってもよい。この懸濁液は上に述べた好適な分散又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて公知技術に従って処方することができる。滅菌された注射用製剤はまた１,３-ブタン-ジオール溶液又は凍結乾燥粉末として調製したもののように、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤又は溶媒中の滅菌注射用溶液又は懸濁液であってもよい。用いることができる許容可能なビヒクル及び溶媒は水、リンガー液及び等張塩化ナトリウム溶液である。更に、滅菌固定化油を溶媒又は懸濁媒質として便宜的に用いることができる。この目的に対して、合成のモノ-又はジグリセリドを含む任意のブランドの固定化油を用いることができる。更に、オレイン酸のような脂肪酸も同様に注射剤の調製に使用することができる。
【０２７１】
単位投薬形態をつくるために担体物質と混合されうる活性成分の量は治療される宿主と特定の投与形式に応じて変わる。例えば、静脈点滴のための水溶液は、約３０ｍＬ／ｈｒの割合で適した体積の点滴が生じうるようにするために溶液１ミリリットル当たり約３から５００μｇの活性成分を含みうる。
【０２７２】
非経口投与に適した製剤には、抗酸化剤、バッファー、静菌剤及び意図したレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を含みうる水性及び非水性滅菌注射用溶液；及び懸濁剤及び増粘剤を含みうる水性及び非水性滅菌懸濁液が含まれる。
【０２７３】
タンパク質治療薬の経口投与は腸内での加水分解又は変性のため不利であるが、経口投与に適したＡＺＣ製剤は、カプセル剤、カシェ剤または錠剤等、各々ＡＺＣの所定量を含む個別の単位として調製することができる。
【０２７４】
製剤は、単位投薬又は複数投薬容器、例えば密封されたアンプル及びバイアルに包装することができ、使用直前に注射用の滅菌液体担体、例えば水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）条件で保存することができる。即時混合注射溶液及び懸濁液は既に記載された種類の滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製される。好適な単位投薬製剤は、活性成分の、上に記載されたような毎日の投薬又は毎日の部分用量単位、又はその適切な画分を含むものである。
【０２７５】
本発明は更に獣医学的担体と共に上述の少なくとも一の活性成分を含む獣医学的組成物を提供する。獣医学的担体は組成物を投与する目的に有用な物質であり、不活性な又は獣医学分野で許容され活性成分と相容性がある固形、液体又は気体物質でありうる。これらの獣医学的な組成物は非経口的、経口的又は任意の他の所望の経路によって投与することができる。
【０２７６】
標識抗体のイメージング法
本発明の別の実施態様において、システイン改変抗体は、放射性核種、蛍光色素、生物発光トリガー基質成分、化学発光トリガー基質成分、酵素により、及び、診断、薬物動態、及び治療用途を持つイメージング実験のための他の検出標識によりシステインチオールを介して標識され得る。一般に、標識されたシステイン改変抗体、すなわち「バイオマーカー」又は 「プローブ」は、例えば、ヒト、齧歯類、又は他の小動物などの生体、灌流臓器、又は組織試料に注射、灌流、または経口摂取により投与される。
【実施例】
【０２７７】
特に明記しない限り、溶媒は及び化学物質の評品は、アルドリッチ（ミルウォーキー、ウィスコンシン州）から購入した。以下の逆相ＨＰＬＣシステムが製品を分析し、精製するために使用された。システムＡ：ＵＶ吸光度、放射能検出器（ＰＭＴ）を備えたＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＢｉｏＳｅｐ-ＳＥＣ-Ｓ３０００（３００×４．６０ｍｍ，５μｍ）５０ｍＭのＰＢＳ ０．５ｍｌ／分：システムＢ：ＵＶ検出器を備えたＡｌｔｉｍａ Ｃ-１８（１００×２２．０ｍｍ，５μｍ）０．０５％ＴＦＡ＋１０−５０％アセトニトリル，０−３０分，２４ｍＬ／分。低分子量生産物の質量分析は、オニキスモノリシックＣ１８カラムを備えたＰＥ Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ １５０ＥＸ ＬＣＭＳシステムで実施された。タンパク質のＬＣＭＳ分析は広範な質量範囲でＴＳＱ量子三連四重極質量分析計で行われた（サーモエレクトロン、サーモフィッシャーサイエンティフィック社、アメリカ）。ＬＣＭＳ分析用のタンパク質試料は、重鎖と軽差を分離するために３７℃で１時間、２０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）による処置で還元された。試料は７５℃に加熱されたＰＲＬＰ-Ｓ １０００マイクロボアカラム（５０ｍｍ×２．１ｍｍ，ポリマーラボラトリーズ、バリアン社、米国）上でクロマトグラフされた。３０−４０％Ｂ（溶媒Ａ，水中の０．０５％ＴＦＡ；溶媒Ｂ，アセトニトリル中の０．０４％ＴＦＡ）からの直線勾配が用いられ、溶出液は、エレクトロスプレーソースを使用して直接イオン化した。データはＸｃａｌｉｂｕｒデータシステムによって収集され、デコンボリューションは、プロマス（ＰｒｏＭａｓｓ）ソフトウェアを使用して行った（Ｎｏｖａｔｉａ、モンマスジャンクション、ニュージャージー州）。ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩ ４００スペクトロメーターで２９８Ｋにおいて記録され、化学シフトはＴＭＳに対して報告された。タンパク質濃度は、エッペンドルフＢｉｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ウェストベリー、ニューヨーク州）を用いて２８０ｎｍで測定した。８９Ｚｒは、１Ｍシュウ酸溶液中で比放射能４７０−１１９５Ｃｉ／ｍｍｏｌを持つ８９Ｚｒ(ＩＶ)シュウ酸塩として(Holland JP, et al (2009) “Standardized methods for the production of high specific-activity zirconium-89” Nucl Med Biol. 36:729-39)、スローンケタリング記念癌センター（ニューヨーク、ニューヨーク州）から得た。ヘテロ二官能性リンカーのサクシニミジル４-[Ｎ-マレイミドメチル]シクロヘキサン-１-カルボン酸塩（ＳＭＣＣ）はピアス（ロックフォード、イリノイ州）から購入し、Ｎ-ヒドロキシサクシニミジルヨード酢酸はＩｎｄｏｆｉｎｅケミカル・カンパニー（ヒルズボロ、ニュージャージー州）から得た。ＮＡＰ-１０カラムは（ＧＥヘルスケア、米国）から、アミコンウルトラ-４遠心フィルター（１０，０００ ＭＷＣＯ）はミリポア（ビルリカ、マサチューセッツ州）から得た。Ｄｆ-Ｂｚ-ＳＣＮはＭａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ（ダラス、テキサス州）から購入した。
【０２７８】
実施例１  ビオチン標識化ＴｈｉｏＦａｂファージの調製
ＴｈｉｏＦａｂファージ（５ｘ１０１２ファージ粒子）は、ビオチン-PEO-マレイミド（(+)-ビオチニル-３-マレイミドプロピオンアミジル-３,６-ジオキサオクタンジアミン（dioxaoctainediamine）、Oda et al (2001) Nature Biotechnology 19:379-382,ピアスバイオテクノロジー社)の１５０倍過剰で３時間室温で反応させた。過剰なビオチン-ＰＥＯ-マレイミドは、ＰＥＧ沈殿を繰り返して（３−４回）ビオチン結合ファージから除去された。システインのチオール基と反応性である求電子基を持つ他の市販のビオチン化試薬を使用することができ、ビオチン-ＢＭＣＣ、ＰＥＯ-ヨードアセチルビオチン、ヨードアセチル-ＬＣ-ビオチン、及びビオチン-ＨＰＤＰ（ピアスバイオテクノロジー社）及びＮα-(３-マレイミジルプロピオニル）ビオチン（ＭＰＢ、モレキュラープローブ、ユージーン、オレゴン州)を含む。ビオチン化、二官能性及び多官能性リンカー試薬の他の商業的供給源は、モレキュラープローブ（Molecular Probes）（ユージーン、オレゴン州）、及びシグマ（Sigma）（セントルイス、ミズーリ州）を含む。
0005850843.tif 000051
【０２７９】
実施例２  ＰＨＥＳＥＬＥＣＴＯＲアッセイ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ＥｒｂＢ２の細胞外ドメイン（ＨＥＲ２）及びストレプトアビジン（２μｇ／ｍｌの１００μｌ）が別々にＭａｘｉｓｏｒｐ９６穴プレート上にコーティングされた。０．５％のＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ中）でブロックした後、ビオチン標識化及び非ビオチン標識化ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８-ＴｈｉｏＦａｂ-ファージ（２ｘ１０１０ファージ粒子）が室温で１時間インキュベートされ、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識二次抗体（抗Ｍ１３ファージコートタンパク質、ｐＶＩＩＩタンパク質抗体）とインキュベートされた。図８はＦａｂ又はＴｈｉｏＦａｂのＨＥＲ２への結合（上）及びビオチン標識化したＴｈｉｏＦａｂのストレプトアビジンへの結合（下）を示す。標準ＨＲＰ反応を実施し、吸光度を４５０ｎｍで測定した。チオール反応性は、ストレプトアビジンに対するＯＤ４５０／ＨＥＲ２に対するＯＤ４５０の比を計算することによって測定した。チオール反応性の値が１とは、システインのチオールの完全なビオチン標識化を示している。Ｆａｂタンパク質結合の測定の場合にはｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８（２−２０ｎｇ）が用いられ、その後ＨＲＰ標識したヤギポリクローナル抗Ｆａｂ抗体とインキュベーションを行った。
【０２８０】
実施例３ａ  ＴｈｉｏＦａｂの発現及び精製
ＴｈｉｏＦａｂは非抑制因子大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）株である３４Ｂ８の中で誘導によって発現された(Baca et al (1997) Journal Biological Chemistry 272(16):10678-84)。収穫細胞ペレットをＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に再懸濁し、全細胞溶解は、マイクロフルイダイザーを通過することにより行い、ＴｈｉｏＦａｂはプロテインＧ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ（アマシャム）による親和性クロマトグラフィーで精製された。ＴｈｉｏＦａｂのＬ-Ｖ１５Ｃ、Ｌ-Ｖ１１０Ｃ、Ｈ-Ａ８８Ｃ、及びＨ-Ａ１２１Ｃが発現され、プロテインＧ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭカラムクロマトグラフィーで精製された。オリゴマーのFabはフラクションの２６から３０に存在し、単量体型の大半はフラクションの３１−３４にあった。単量体型を含むフラクションはプールされ、野生型ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８とともにＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で（ＤＴＴ又はＢＭＥでの）還元状態で、及び（ＤＴＴ又はＢＭＥ無しでの）非還元状態で分析された。Ａ１２１Ｃ-ＴｈｉｏＦａｂのゲル濾過分画は非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析された。
【０２８１】
上記のようにＴｈｉｏＦａｂはビオチン-ＰＥＯ-マレイミドと結合し、ビオチン標識化したＴｈｉｏＦａｂは更にＳｕｐｅｒｄｅｘ-２００ＴＭ（アマシャム）ゲル濾過クロマトグラフィーで精製され、遊離のビオチン-ＰＥＯ-マレイミド及びＴｈｉｏＦａｂのオリゴマー画分を除去した。野生型ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８及びｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８ Ａ１２１Ｃ-ＴｈｉｏＦａｂ(量で０．５ｍｇ)は室温で３時間、ビオチン-ＰＥＯ-マレイミドの１００倍過剰でそれぞれ別々にインキュベートし、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ-２００ゲル濾過カラムへロードし、遊離のビオチン並びに単量体型からオリゴマーＦａｂを分離した。
【０２８２】
実施例３ｂ  ＴｈｉｏＦａｂの分析
ビオチン標識化ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８（Ａ１２１Ｃ）ＴｈｉｏＦａｂ及び野生型ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８は、液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＬＳ-ＥＳＩ-ＭＳ）で分析された。ビオチン標識化ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８（Ａ１２１Ｃ）の４８２９４．５一次質量及び野生型ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８の４７７３７．０一次質量の差異は５５７．５質量単位であった。この断片は単一のビオチン-ＰＥＯ-マレイミド成分(Ｃ２３Ｈ３６Ｎ５Ｏ７Ｓ２)の存在を示す。表４は、配列を確認する断片化の値の割り当てを示す。
【０２８３】
0005850843.tif 000052
【０２８４】
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ-２００ゲル濾過の前後で、ＤＴＴ又はＢＭＥによる還元とともに及び還元無しで、ビオチン標識化ＡＢＰ-ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８-Ａ１２１Ｃ、ビオチン標識化ＡＢＰ-ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８-Ｖ１１０Ｃ、ビオチン標識化２重システインＡＢＰ-ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８-(Ｖ１１０Ｃ-Ａ８８Ｃ)、及びビオチン標識化２重システインＡＢＰ-ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８-(Ｖ１１０Ｃ-Ａ１２１Ｃ)のＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル分析を行った。
【０２８５】
ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８-(Ｖ１１０Ｃ)-ＢＭＰＥＯ-ＤＭ１の質量分析（ＭＳ／ＭＳ）（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ-２００ゲル濾過精製後）：Ｆａｂ＋１ ５１６０７．５, Ｆａｂ ５０５１５．５．このデータは、９１．２％の結合を示している。ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８-(Ｖ１１０Ｃ）-ＢＭＰＥＯ-ＤＭ１（還元）のＭＳ／ＭＳ分析：ＬＣ ２３４４７．２, ＬＣ＋１ ２４５３７．３，ＨＣ（Ｆａｂ）２７０７２．５．このデータは全てのＤＭ１の結合はＦａｂの軽鎖上にあることを示している。
【０２８６】
実施例１１  結合のためのＴｈｉｏＭａｂの還元／酸化
ＣＨＯ細胞で発現された完全長システイン改変抗体（ＴｈｉｏＭａｂｓ）は、３７℃で３時間、ＴＣＥＰ（トリス（２-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩; Getz et al (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80; ソルテック・ベンチャーズ、ビバリー、マサチューセッツ州) の約５０倍過剰で還元された。還元したＴｈｉｏＭａｂ（図１５）は希釈され、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５中で希釈されＨｉＴｒａｐ Ｓカラム上でロードし、０．３Ｍの塩化ナトリウムを含むＰＢＳで溶出した。溶出された還元型ＴｈｉｏＭａｂは室温で一晩２００ｎＭの水性硫酸銅（ＣｕＳＯ４）で処理した。周囲の空気酸化も有効であった。
【０２８７】
実施例１３  Ｎ-[４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシル]デスフェリオキサミン(Ｄｆ-Ｃｈｘ-Ｍａｌ)
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Ｎ-[４-(Ｎ-マレイミドメチル）シクロヘキサン-１-カルボン酸塩（ＳＭＣＣ、４０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、デスフェリオキサミンメシル酸塩（７８ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）及びＮ,Ｎ-ジイソプロピルエチルアミン（２２μＬ、０．１３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２．０ｍＬ）及び０．２ｍＬの水の混合物に溶解した（図２１）。得られた混濁溶液を３０分間室温で撹拌した。水（８ｍＬ）を添加し、沈殿した生成物が濾過によって単離され、水で洗浄し、減圧下で乾燥させ、白色固体として４２ｍｇ（４５％）のＮ-[４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシル]デスフェリオキサミン(Ｄｆ-Ｃｈｘ-Ｍａｌ)を生じた（図２０下）。1H NMR (400 MHz, d6-DMSO) δ 0.87-0.90 (m, 2H), 1.20-1.26 (m, 8H), 1.35-1.41 (m, 6H), 1.45-1.55 (m, 8H), 1.60-1.70 (m, 4H), 1.97 (s, 3H, アセチル), 2.26-2.29 (m, 4H), 2.56-2.60 (m, 4H), 2.95-3.05 (m, 6H), 3.24 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 3.44-3.48 (m, 6H), 7.00 (s, 2H, マレイミド), 7.62 (t, J = 5.4 Hz, 1H, アミド), 7.75 (m, 2H, アミド), 9.59 (s, 2H, ヒドロキシル), 9.64 (s, 1H, ヒドロキシル). MS ESI (m/z): [M+H]+ C37H62N7O11 の計算値は780.44; 測定値は780.6.
【０２８８】
実施例１４  Ｎ-ブロモアセチルデスフェリオキサミン（Ｄｆ-Ｂａｃ）
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ＤＭＦ（１ｍＬ）中のブロモアセチルブロミドの溶液（２７μＬ，０．３０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍＬ）中のデスフェリオキサミンメシル酸塩（２００ｍｇ，０．３０ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ-ジイソプロピルエチルアミン（１０６μＬ，０．６０ｍｍｏｌ）の冷却（０℃）混合物中へ５分間滴下し、その後反応混合物は０℃で４時間攪拌した（図２１）。水（１０ｍＬ）を添加し、ＨＰＬＣ（システムＢ，保持時間７．５分）を用いて生成物を単離し、白色固体として２９ｍｇ（１４％）のＮ-ブロモアセチルデスフェリオキサミン（Ｄｆ-Ｂａｃ）を得た（図２０下）。1H NMR (400 MHz, d6-DMSO) δ 1.18-1.26 (m, 6H), 1.35-1.42 (m, 6H), 1.45-1.55 (m, 6H), 1.97 (s, 3H, アセチル), 2.24-2.30 (m, 4H), 2.54-2.59 (m, 4H), 2.96-3.07 (m, 6H), 3.44-3.47 (m, 6H), 3.82 (s, 2H, ブロモアセチル), 7.74 (m, 2H, アミド), 8.21 (t, 1H, アミド), 9.59 (s, 2H, ヒドロキシル), 9.63 (s, 1H, ヒドロキシル). MS ESI (m/z): [M+H]+ C27H50BrN6O9 の計算値は681.27, 683.27; 測定値は681.1, 683.0.
【０２８９】
実施例１５  Ｎ-ヨードアセチルデスフェリオキサミン（Ｄｆ-Ｉａｃ）
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デスフェリオキサミンメシル酸（２００ｍｇ，０．３０ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ-ジイソプロピルエチルアミン（５３μＬ，０．３０ｍｍｏｌ）がＤＭＦ（４ｍＬ）及び水（０．４ｍＬ）に混合された。Ｎ-ヒドロキシスクシンイミジルヨード酢酸（９３ｍｇ，０．３３ｍｍｏｌ）が添加され、得られた混合物は室温で１時間攪拌された（図２１）。水（８ｍＬ）を添加し、沈殿した生成物が単離され、水で洗浄し、減圧下で乾燥させ、白色固体として１１５ｍｇ（５３％）のＮ-ヨードアセチルデスフェリオキサミン（Ｄｆ-Ｉａｃ）を生じた（図２０下）。 1H NMR (400 MHz, d6-DMSO) δ1.20-1.25 (m, 6H), 1.35-1.42 (m, 6H), 1.47-1.54 (m, 6H), 1.97 (s, 3H, acetyl), 2.25-2.29 (m, 4H), 2.56-2.59 (m, 4H), 2.98-3.03 (m, 6H), 3.45 (m, 6H), 3.61 (s, 2H, iodoacetyl), 7.75 (m, 2H, amide), 8.17 (t, 1H, amide), 9.57 (s, 2H, hydroxyl), 9.61 (s, 1H, hydroxyl). MS ESI (m/z): [M+H]+ C27H50IN6O9 の計算値は729.26; 測定値は729.1.
【０２９０】
実施例１６  チオ-トラスツズマブ
重鎖におけるＡｌａ１１４（Ｋａｂａｔの番号付け）でＣｙｓ置換されたＴＨＩＯＭＡＢの構築、発現、及び精製は以前に記載した(Junutula JR, et al “Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index” (2008) Nat Biotechnol 26:925-32)。単離されたチオ-トラスツズマブは、Ｃｙｓ１１４へ結合したジスルフィド付加体を除去するために、還元及び再酸化手順による結合のために調製された。最初に、タンパク質は８８ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．５中で、４０倍モル過剰のＤＴＴ及び２ｍＭのＥＤＴＡで処理することにより２４時間還元された。再酸化の前にＤＴＴを除去するため、チオ-トラスツズマブ溶液は１０ｍＭのコハク酸ナトリウム緩衝液の添加によりｐＨを５に調整した。次いで溶液は、滅菌され、１０ｍＭコハク酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５で平衡化されたイオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ ＦＦ、ＧＥヘルスケア）にロードされた。カラムを１０ｍＭコハク酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＬ）で溶出し、次いでチオ-トラスツズマブを３ｍＬの５０ｍＭトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５で洗浄した。チオ-トラスツズマブの再酸化は、７５ｍＭトリス，１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５緩衝液中、２５°Ｃで３．５時間、デヒドロアスコルビン酸（Ｎ,Ｎ-ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）中で１００ｍＭ）の２５倍モル過剰で処理することによって達成された。再酸化した後、チオ-トラスツズマブは、更に精製することなく、デスフェリオキサミンに結合させた。 MS ESI (m/z): 測定値は軽鎖 23440.0, 重鎖50627.3.
【０２９１】
実施例１７  Ｄｆ-Ｃｈｘ-Ｍａｌ-チオ-トラスツズマブ
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二官能性キレート剤の２ｍＭのストック溶液は、Ｄｆ-Ｃｈｘ-Ｍａｌ（１．５ｍｇ，２μｍｏｌ）をＤＭＦ及びＤＭＡの１：１混合物（１ｍＬ）に４４℃で３０分間、溶解して調製し、ストック溶液は次いで分注され−８０℃で保存した（図２１）。ストック溶液の分注（２２０μＬ，０．４４０μｍｏｌ）は次いで、５０ｍＭトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液ｐＨ７．５（１．５ｍＬ）中のチオ-トラスツズマブ（７．５ｍｇ，５２ｎｍｏｌ）の溶液に添加され、室温で１時間インキュベートした。次いでその溶液はＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ-４フィルターで０．２５Ｍ酢酸ナトリウムにバッファー交換され、６ｍｇ／ｍＬの濃度で１ｍＬのＤｆ-Ｃｈｘ-Ｍａｌ-チオ-トラスツズマブコンジュゲート溶液を得た。MS ESI (m/z): 23440.2, 重鎖51407.3 (図23, D).
【０２９２】
実施例１８  Ｄｆ-Ｂａｃを用いるＤｆ-Ａｃ-チオ-トラスツズマブ
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二官能性キレート剤の１２ｍＭストック溶液は、Ｄｆ-Ｂａｃ（８ｍｇ，１２μｍｏｌ）を１ｍＬのＤＭＡに溶解して調製した（図２１）。ストック溶液はついで分注され−８０℃で保存した。再酸化されたチオ-トラスツズマブはＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ-４フィルターで０．０５Ｍのホウ酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９にバッファー交換された。Ｄｆ-Ｂａｃストック溶液の分注（３５μＬ，０．４１０μｍｏｌ）は、０．０５Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９（１ｍＬ）中のチオ-トラスツズマブ（４．９ｍｇ，３４ｎｍｏｌ）の溶液に添加され、室温で５時間インキュベートした。反応混合物を、ＮＡＰ−１０カラムにロードし、Ｄｆ-Ａｃ-チオ-トラスツズマブを０．２５Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液１．５ｍＬで溶出し、３．２ｍｇ／ｍＬの濃度で生成物を得た。
MS ESI (m/z): 測定値は軽鎖23440.1, 重鎖51228.1 (図23, B).
【０２９３】
実施例１９  Ｄｆ-Ｉａｃを用いるＤｆ-Ａｃ-チオ-トラスツズマブ
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二官能性キレート剤の１１ｍＭストック溶液はＤｆ−Ｉａｃ（８ｍｇ，１１μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解して調製し、次いで分注し、−８０℃で保存した（図２１）。チオ−トラスツズマブ溶液（３．２ｍＬ）は、０．１Ｍ炭酸ナトリウムを０．５ｍＬ添加してｐＨ９に調整された。ストック溶液の分注（１１０μＬ，１．２０μｍｏｌ）は次いで、５０ｍＭトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１２５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液中のチオ−トラスツズマブ（１６ｍｇ，１１０ｎｍｏｌ）の溶液に添加され、室温で２時間インキュベートした。次いで溶液はＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４フィルターで０．２５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液にバッファー交換され、８ｍｇ／ｍＬの濃度で１ｍＬのＤｆ−Ａｃ−チオ−トラスツズマブコンジュゲートを得た。MS ESI (m/z): 測定値は軽鎖23440.1, 重鎖51228.3 (図23, C).
【０２９４】
実施例２０  ８９Ｚｒキレートを調製するための一般的な手順
１Ｍシュウ酸中の８９Ｚｒ（ＩＶ）シュウ酸塩（２−４ｍＣｉ，１００μＬ）の溶液はＮａ２ＣＯ３（４５μＬ）の２Ｍ溶液と混合し、室温で３時間インキュベートし、その後０．５ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（０．１５ｍＬ）が添加された（図２２）。Ｄｆ-チオ-トラスツズマブコンジュゲート（１ｍｇ，７ｎｍｏｌ）は０．２５Ｍ酢酸ナトリウム／０．５％ゲンチシン酸で最終体積０．３５６ｍＬに希釈され、８９Ｚｒ溶液へ添加した。最後に、ＨＥＰＥＳ緩衝液の第二の部分（０．３５０ｍＬ）を追加し、全容量１ｍＬを得た。混合物を1時間室温でインキュベートした。遊離の８９Ｚｒを除去するため、放射標識タンパク質はＮＡＰ-１０脱塩カラムを用いて精製した。ＮＡＰ-１０カラムは２０ｍＬの０．２５Ｍ酢酸ナトリウム／０．５％ゲンチシン酸で平衡化した。反応混合物はＮＡＰ-１０カラムにロードされ、８９Ｚｒ-Ｄｆ-チオ-トラスツズマブは１．５ｍＬの０．２５Ｍ酢酸ナトリウム／０．５％ゲンチシン酸緩衝液（１．５ｍＬ）で溶出した。必要あらば、８９Ｚｒ-Ｄｆ-チオ-トラスツズマブはＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ-４フィルターで望む体積に濃縮した。生成物はＳＥＣ ＨＰＬＣ（システムＡ）で分析した。
【０２９５】
実施例２１  インビトロでの血清安定性
０．２５Ｍ酢酸ナトリウム／０．５％ゲンチシン酸緩衝液（０．１ｍＬ）中の０．５−１．５ｍＣｉ（１ｍｇ）の８９Ｚｒ-Ｄｆ-チオ-トラスツズマブコンジュゲートの溶液が新鮮なマウスの血清（０．９ｍＬ）へ添加され、３７℃で０−９６時間インキュベートした。血清溶液の試料（２０μＬ）はＳＥＣ ＨＰＬＣ（システムＡ）で分析し、図２４に示した結果を与えた。
【０２９６】
実施例２２  動物モデル
週齢６〜８週間のベージュヌードＸＩＤマウスはＨａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（リバーモア、カリフォルニア州）から得た。細胞接種前に三日間、マウスは、血清エストロゲン値を維持するために、６０日間徐放性１７β-エストラジオールのペレットを０．３６ｍｇ注入された（皮下注射（ｓ．ｃ．），左脇腹）。マウスは乳房脂肪パッドに、５０％フェノールレッドフリーマトリゲル中の５×１０６ＢＴ４７４Ｍ１細胞を接種された。ＢＴ４７４Ｍ１は、カリフォルニア太平洋医療センター（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）から得られたヒト乳癌細胞株ＢＴ４７４のサブクローンである。動物の管理及び処置は、実験動物管理評価認定協会（ＡＡＡＬＡＣ）の認定を受けたジェネンテックの機関内動物管理使用委員会で承認されたプロトコールに従った。
【０２９７】
実施例２３  ＭｉｃｒｏＰＥＴイメージング
マウスは、セボフルラン３％で麻酔し、尾静脈を経由して等張液中（１００−１３０μＬ）約０．１ｍＣｉの８９Ｚｒ-放射標識トラスツズマブを静脈内注射され、回復のためのケージに戻された。ＰＥＴイメージング（図２５）はトレーサー注射後１時間、２４時間、９６時間及び１４４時間でＩｎｖｅｏｎ ＰＥＴ／ＣＴスキャナーで以下のように行った。セボフルランで麻酔した動物はスキャナのベッドの上で頭を最初にしてうつむけに配置され、静的な１５分又３０分のスキャンが取得された。体温は直腸プローブにより測定し、暖かい空気で保持した。全身の反復画像再構成は、最大事後アルゴリズム（ＭＡＰ、ハイパーベータ（β）０．０５）を用いて得られ、ＣＴから得られた組織密度を用いて信号の減衰を補正した。投影はＡＳＩＰｒｏソフトウェア（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）で作成され、関心領域解析を用いた目的の各器官の量的活性値を取得するために使用された。
【０２９８】
統計分析：図２６のプロットは、Ｒソフトウェアのバージョン２.４.１（統計コンピューティングのためのＲ財団、ウィーン、オーストリア）で構築した。統計学的有意差は両側スチューデントｔ検定またはＡＮＯＶＡを用いて決定し、０．０５未満のＰ値が有意と見なされた；データは特に明記しない限り平均±標準偏差として表示される。
【０２９９】
本発明は、本発明のいくつかの態様の実例として意図されている実施例に開示されている特定の実施態様による範囲内に限定されるものではなく、機能的に等価である任意の実施態様は本発明の範囲内である。確かに、本明細書に示され記載されたものに加えて、本発明の様々な修飾は当業者に明らかとなり、及び添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図されている。
【０３００】
本明細書全体を通して引用した全ての特許、特許出願、及び参考文献が明示的に援用される。
【図１Ｂ】
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【図２Ａ−Ｂ】
0005850843.tif 000076
【図３Ａ−Ｂ】
0005850843.tif 000077
【図４Ａ−Ｂ】
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【図５】
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【図６】
0005850843.tif 000080
【図７】
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【図８】
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【図１３Ａ−Ｂ】
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【図１４Ａ−Ｂ】
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【図１５】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
0005850843.tif 000090
【図２４】
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【図１Ａ】
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【図１６】
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【図１７Ａ−Ｂ】
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【図１８】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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