(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）をコードする遺伝子と、ニューロゲニン１及びその活性フラグメントからなる群より選択される１つ又は複数の転写因子をコードする遺伝子とを間葉系幹細胞に導入することによって改変した間葉系幹細胞。
【請求項２】
骨髄、血液、臍帯血、脂肪組織、及び胎盤からなる群から選択される１つ又は複数の組織に由来する幹細胞である、請求項１に記載の間葉系幹細胞。
【請求項３】
前記転写因子がニューロゲニン１である、請求項１に記載の間葉系幹細胞。
【請求項４】
前記ニューロゲニン１が配列番号２のヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載の間葉系幹細胞。
【請求項５】
前記ＨＧＦ遺伝子が配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の間葉系幹細胞。
【請求項６】
前記ＨＧＦ遺伝子がアデノウイルスベクターを用いて前記間葉系幹細胞に導入される、請求項１に記載の間葉系幹細胞。
【請求項７】
改変間葉系幹細胞を作製する方法であって、
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を有する肝細胞増殖因子をコードする遺伝子と、配列番号２のヌクレオチド配列を有するニューロゲニン１をコードする遺伝子とを培養間葉系幹細胞に導入する工程と、
（ｂ）前記肝細胞増殖因子をコードする遺伝子及び前記ニューロゲニン１をコードする遺伝子の両方が導入された前記改変間葉系幹細胞を選択する工程と、
（ｃ）選択した前記改変間葉系幹細胞を培養する工程と、
を含む、方法。
【請求項８】
前記肝細胞増殖因子をコードする遺伝子と、前記ニューロゲニン１をコードする遺伝子との導入を順に又は逆の順序で又は同時に行う、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記間葉系幹細胞が骨髄、血液、臍帯血、脂肪組織、及び胎盤からなる群から選択される１つ又は複数の組織に由来する幹細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
神経疾患の予防又は治療用の組成物であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載の改変間葉系幹細胞、又は請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法によって生成される改変間葉系幹細胞を活性成分として含む、組成物。
【請求項１１】
前記神経疾患がパーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、癲癇、統合失調症、急性脳卒中、慢性脳卒中及び脊髄損傷、並びに脳卒中後の慢性機能障害を含む神経疾患からなる群から選択される１つ又は複数である、請求項１０に記載の組成物。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）をコードする遺伝子と、塩基性ヘリックスループヘリックス（ｂＨＬＨ）ファミリーの神経原性転写因子をコードする遺伝子とを成体幹細胞株に導入することによって改変した成体幹細胞株及びその使用、より具体的には、肝細胞増殖因子の遺伝子と、塩基性ヘリックスループヘリックスファミリーの神経原性転写因子の遺伝子とを導入した成体幹細胞株、該成体幹細胞株の作製方法、該成体幹細胞株を含む神経疾患の予防又は治療用の組成物、及び神経疾患を患うか又は神経疾患を患う疑いのある被験体に該組成物を投与する工程を含む神経疾患を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨髄での造血を助け、未分化幹細胞のプールを維持する一方で骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞及び筋細胞を含む様々な中胚葉系細胞に分化する能力を有するため、人工組織用の細胞源として注目を集めている間質細胞である。
【０００３】
ＭＳＣは脳内の神経膠細胞に分化する可能性を有することが報告されており、ＭＳＣを中枢神経系の神経疾患の治療の源として利用することができると提唱されている。
【０００４】
幾つかの増殖因子又はホルモンが人工神経細胞への未分化細胞の分化を誘導することが知られている。残念なことに、これらの方法には神経細胞とともに非神経細胞が発生するという問題があり、この問題は細胞を実験動物の脳内に移植した場合により顕著となる。このため、神経細胞へのＭＳＣの分化を誘導する直接的方法を開発する必要がある。
【０００５】
ニューロゲニン（ニューロＤとも称される）は塩基性ヘリックスループヘリックス（ｂＨＬＨ）ファミリーに属する転写因子であり、神経系の形成に重要な役割を果たし、Ｅ１２又はＥ４７等の他のｂＨＬＨタンパク質と複合体を形成して、Ｅボックス（ＣＡＮＮＴＧ）を含有するＤＮＡ配列又は稀にはＮボックスを含有するＤＮＡ配列に結合する。この結合は、ｂＨＬＨタンパク質が神経分化を促進する組織特異的な遺伝子発現を活性化するのに重要であることが見出されている。
【０００６】
本発明者らは、ＭＳＣを神経細胞へと効率的に分化させる安定な物質の開発を試みた。その結果、予期せぬことに、ニューロゲニン及びニューロＤ等のｂＨＬＨ転写因子を形質導入したＭＳＣがｂＨＬＨ転写因子を継続的に発現することができること、並びにｂＨＬＨ転写因子を発現するＭＳＣが、実験動物の脳内に移植した場合に高レベルの神経細胞へと分化形質転換することができることを見出した。この所見に基づいて、神経細胞へのＭＳＣの分化が誘導され、脳卒中の動物モデルにおいて非誘導ＭＳＣと比較して優れた治療効果が得られると報告された（特許文献１）。
【０００７】
神経疾患の治療におけるＭＳＣの使用は、異種細胞ではなく自己細胞を使用することが可能であるという点で有利である。しかしながら、実際的な治療手順では、この方法は、脳卒中の発症から自己細胞療法までに、自己細胞の単離及び培養並びに遺伝子トランスフェクションに２週間〜４週間を要するという欠点を有する。したがって、脳卒中の発症後の自己細胞移植の時間のかかる臨床手順の問題に対処するために、慢性損傷に対する自己細胞の治療有効性を確認し、最大化する方法を開発する多くの研究が行われている。
【０００８】
散乱因子としても知られるＨＧＦは、肝臓又は腎臓等の器官において強い抗線維化活性を有するヘパリン結合糖タンパク質であることが知られている（非特許文献１）。脳卒中及び脊髄損傷を含む神経疾患の治療に対する肝細胞増殖因子の研究が現在進行中である。急性疾患に対するその治療効果が報告されているが、慢性疾患に対する良好な転帰は未だ報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】韓国特許第１０−０５１９２２７号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Silver et al., Nat. Rev. Neurosci., 5:146-156, 2004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、ＨＧＦを導入したＭＳＣを活性成分として含む慢性脳卒中に対する治療組成物の開発に多大な努力を払ってきた。その結果、ｂＨＬＨ転写因子ニューロゲニン１を導入したＭＳＣがｂＨＬＨ転写因子を継続的に発現し、更にＨＧＦを導入したＭＳＣが脳卒中の動物モデルに移植した場合に治療効果を示すことが見出され、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の目的は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）をコードする遺伝子と、塩基性ヘリックスループヘリックス（ｂＨＬＨ）ファミリーの神経原性転写因子をコードする遺伝子とを成体幹細胞株に導入することによって改変した成体幹細胞株を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、成体幹細胞株の作製方法を提供することである。
【００１４】
本発明の更に別の目的は、成体幹細胞株を含む神経疾患の予防又は治療用の組成物を提供することである。
【００１５】
本発明の更に別の目的は、神経疾患を治療する方法であって、組成物を、神経疾患を患うか又は神経疾患を患う疑いのある被験体に投与する工程を含む、方法を提供することである。
【発明の効果】
【００１６】
ＨＧＦ遺伝子とｂＨＬＨファミリーの神経原性転写因子の遺伝子とを導入した本発明による成体幹細胞を使用して、脳卒中後の細胞死に起因する慢性機能障害を克服することができる。このようにして、成体幹細胞を新規の治療剤として開発するか、又はパーキンソン病、アルツハイマー病及び脊髄損傷並びに脳卒中を含む神経疾患に適用可能な細胞置換療法及び遺伝子療法の臨床試験及び研究に広く使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】脂肪細胞、軟骨細胞及び骨細胞へのＭＳＣの分化を示す写真である。図１ａはオイルレッドＯで染色したＭＳＣから分化した脂肪細胞の写真であり、図１ｂはアルシアンブルーで染色したＭＳＣから分化した軟骨細胞の写真であり、図１ｃ及び図１ｄは、それぞれアルカリホスファターゼ及びフォンコッサで染色した、ＭＳＣから分化した骨細胞の写真である。
【図２】ヒトニューロゲニン１遺伝子を含有するレトロウイルスベクター（上パネル）を導入した２９３Ｔ細胞におけるヒトニューロゲニン１の発現を示すウエスタンブロット法の結果（下パネル）を示す図である。
【図３】ヒトニューロゲニン１遺伝子を導入したＭＳＣにＧＦＰ発現アデノウイルスを感染させ、アルビノラットの線条体に移植した２週間後にＭＳＣの神経発生分化を検査する、抗ニューロンマーカーＴｕＪ１（βチューブリンＩＩＩ）抗体を用いた免疫組織化学的染色の結果を示す図である。
【図４】ヒトＨＧＦを発現するアデノウイルスベクターを導入したＭＳＣにおける細胞内（細胞溶解物）及び細胞外（馴化培地；ＣＭ）のＨＧＦの発現を示すウエスタンブロット分析の結果を示す図である。
【図５】段階希釈したヒトＨＧＦを発現するアデノウイルスベクターを導入したＭＳＣにおけるＨＧＦの発現レベルを検査する免疫細胞化学の結果を示す写真である。
【図６】脳卒中動物モデルにおけるヒトＨＧＦ遺伝子とヒトニューロゲニン１遺伝子とを導入したＭＳＣの治療有効性を評価する、接着剤除去試験（左パネル）及びロータロッド試験（右パネル）を含む動物行動試験の結果を示すグラフである。
【図７】脳卒中動物モデルにおけるヒトＨＧＦ遺伝子とヒトニューロゲニン１遺伝子とを導入したＭＳＣの治療有効性を評価する、ＭＲＩ（上パネル）及び梗塞領域の定量分析（下パネル）の結果を示す写真である。
【図８】ヒトＨＧＦ遺伝子とヒトニューロゲニン１遺伝子とを導入したＭＳＣの移植後の梗塞領域中のグリア細胞及びその発現パターンを検査する、ＧＦＡＰ抗体及びＭＡＰ２抗体を用いた免疫組織化学の結果を示す写真である。
【図９】細胞移植時間に応じた、脳卒中動物モデルにおけるヒトＨＧＦ遺伝子とヒトニューロゲニン１遺伝子とを導入したＭＳＣの治療有効性をまとめた図（上パネル）及びグラフ（下パネル）である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の一態様では、本発明は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）をコードする遺伝子と、塩基性ヘリックスループヘリックス（ｂＨＬＨ）ファミリーの神経原性転写因子をコードする遺伝子とを成体幹細胞株に導入することによって改変した成体幹細胞株を提供する。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、「成体幹細胞」という用語は、必要に応じて特殊化した組織の細胞型に分化することができる未分化細胞を意味する。成体幹細胞株は、好ましくは骨髄、脂肪組織、血液、臍帯血、肝臓、皮膚、胃腸管、胎盤、子宮又は流産した胎児に由来する幹細胞、より好ましくは骨髄由来成体幹細胞株、最も好ましくは骨髄由来ＭＳＣであるが、特にこれらに限定されるわけではない。骨髄由来成体幹細胞には、血球及びリンパ球を産生することが可能なＭＳＣ及び造血幹細胞等の様々な成体幹細胞が含まれる。中でも、ＭＳＣはｅｘ  ｖｉｖｏで容易に増殖し、様々な細胞型（脂肪細胞、軟骨細胞、筋細胞及び骨細胞）へと分化することが可能である。このため、ＭＳＣは遺伝子療法及び細胞療法における有用な標的として使用することができるが、その使用は特に限定されない。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、散乱因子としても知られる「肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）」という用語は、間葉系細胞によって産生される多機能ヘテロ二量体ポリペプチドを意味する。ＨＧＦは、Ｎ末端フィンガードメイン及び４つのクリングルドメインを含有する６９ｋＤａのα鎖と、キモトリプシン様セリンプロテアーゼのプロテアーゼドメインと類似性を有する３４ｋＤａのβ鎖とから構成される。ヒトＨＧＦは、７２８個のアミノ酸からなる生物学的に不活性な単鎖前駆体として合成される。生物学的に活性なＨＧＦは、特異的な血清セリンプロテアーゼによるＲ４９４残基での切断によって得られる。活性型ＨＧＦは、ジスルフィド結合によって連結した６９ｋＤａのα鎖と３４ｋＤａのβ鎖とから構成されるヘテロ二量体である。本発明では、ＨＧＦを成体幹細胞株に導入し、形質転換細胞株を得る。好ましいＨＧＦをコードするヌクレオチド配列は既知である（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００６０１．４  １６６〜２３５２又はＢＣ１３０２８６．１（７６〜２２６２））。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、「塩基性ヘリックスループヘリックス（ｂＨＬＨ）」という用語は転写因子の形状を表し、ループによって結ばれた２つのヘリックスという形態を指す。ｂＨＬＨ転写因子は、多細胞生物の遺伝子発現において重要な役割を果たすことが知られている。
【００２２】
ｂＨＬＨ転写因子は、好ましくは神経原性転写因子、より好ましくはニューロゲニン１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ６３８４２、Ｕ６７７７６）、ニューロゲニン２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ７６２０７、ＡＦ３０３００１）、ニューロＤ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ２４６７９、ＡＢ０１８６９３）、ＭＡＳＨ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ９５６０３、Ｌ０８４２４）、ＭＡＴＨ３遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ８５８４５）、Ｅ４７遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ６５２１４、ＡＦ３５２５７９）等であるが、特にこれらに限定されるわけではない。さらに、神経原性転写因子と同等又は類似の活性を示す限り、ポリヌクレオチド配列の一部に変化、欠失又は置換を有する神経原性転写因子を使用することができる。
【００２３】
ｂＨＬＨ転写因子の遺伝子を導入したＭＳＣは、骨細胞、筋細胞、脂肪細胞及び軟骨細胞へと分化する可能性ではなく、神経細胞へと分化する可能性を有し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて特定の条件下で神経細胞へと分化することが可能である。本発明の一実施例によると、ＨＧＦ遺伝子とニューロゲニン１遺伝子とを導入した成体幹細胞を作製したところ、実験動物の脳組織に移植した場合に神経細胞へと効率的に分化することが見出された（図３）。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、「ＨＧＦ遺伝子とｂＨＬＨファミリーの神経原性転写因子の遺伝子とを導入した成体幹細胞株」という用語は、上記のＨＧＦ遺伝子とｂＨＬＨファミリーの神経原性転写因子の遺伝子とを導入した成体幹細胞株、好ましくは配列番号１のＨＧＦ遺伝子と配列番号２のニューロゲニン１遺伝子とを導入した成体幹細胞株を指す。しかしながら、成体幹細胞株は神経細胞へと分化する能力を保持する限り、特にこれらに限定されない。
【００２５】
本発明の目的に関して、ＨＧＦ遺伝子をベクターへとクローニングした後、成体幹細胞に導入することが好ましい。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、好適な宿主細胞において標的タンパク質を発現することが可能な発現ベクターを表す「ベクター」という用語は、遺伝子挿入断片が発現されるように操作可能に連結した重要な調節要素を含む遺伝子構築物を指す。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、「操作可能に連結した」という用語は、一般的な機能を可能にするように、所望のタンパク質をコードする核酸配列と核酸発現制御配列とを機能的に連結することを指す。操作可能な連結は、当該技術分野で既知の遺伝子組換え技法を用いて作り出すことができ、部位特異的なＤＮＡ切断及びライゲーションは、当該技術分野で一般に知られる酵素を用いて行うことができる。
【００２８】
ベクターは、好ましくはプラスミドベクター、コスミドベクター、ウイルスベクター、より好ましくはＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＭＬＶ（マウス白血病ウイルス）、ＡＳＬＶ（トリ白血病肉腫ウイルス）、ＳＮＶ（脾臓壊死ウイルス）、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）、ＭＭＴＶ（マウス乳がんウイルス）、ＭＳＶ（マウス肉腫ウイルス）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス等に由来するウイルスベクターであるが、特にこれらに限定されるわけではない。
【００２９】
本発明の一実施例によると、ニューロゲニン１遺伝子の導入については、図２のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ６３８４２の遺伝子配列中のコード領域（５５ｂｐ〜７６８ｂｐ）をｐＭＳＣＶ−ｐｕｒｏプラスミドにクローニングして、組換えベクターｐＭＳＣＶ／ｐｕｒｏ−ｈＮｇｎ１を作製し、得られた組換えベクターを、レトロウイルスを産生する細胞株に導入して、レトロウイルスベクターを作製した。次いで、得られたレトロウイルスベクターを骨髄由来ＭＳＣ株に導入して、形質転換成体幹細胞を作製した。
【００３０】
本発明の別の実施例によると、ＨＧＦ遺伝子の導入については、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００６０１．４の遺伝子配列中のコード領域（１６６ｂｐ〜２３５２ｂｐ）をｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶにクローニングした後、ｐＡｄＥａｓｙ−１との組換えによって組換えベクターｐＡｄ−ＨＧＦを作製した。この組換えベクターを制限酵素ＰａｃＩによる切断によって線状化し、線状化した組換えベクターを、アデノウイルスを産生する細胞株に導入して、Ａｄｅｎｏ−ＨＧＦベクターを作製した。次いで、得られたＡｄｅｎｏ−ＨＧＦベクターを骨髄由来ＭＳＣ株に導入して、形質転換成体幹細胞を作製した。
【００３１】
本発明の成体幹細胞への遺伝子導入は、形質転換によって行うが、特にこれに限定されるわけではない。形質転換は、当該技術分野で既知の典型的な方法によって容易に行うことができる。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、「形質転換」という用語は、外来ＤＮＡ又は外来ＤＮＡを含有するウイルスベクターを、染色体外要素として又は染色体への組込みによって宿主細胞に導入することによる人工的な遺伝子変化を指す。概して、形質転換法には、レトロウイルス及びアデノウイルスを用いた感染、ＤＮＡのＣａＣｌ２沈殿、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を還元物質として用いた改良ＣａＣｌ２法であるＨａｎａｈａｎ法、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、原形質融合、炭化ケイ素繊維を用いた撹拌、アグロバクテリウム媒介形質転換、ＰＥＧ、硫酸デキストラン、リポフェクタミン及び乾燥／抑制（desiccation/inhibition）媒介の形質転換が含まれる。本発明の一実施例によると、ニューロゲニン遺伝子を含有するレトロウイルスベクターと、ＨＧＦ遺伝子を含有するＡｄｅｎｏ−ＨＧＦベクターとを幹細胞に導入することによって形質転換を行った。
【００３３】
別の態様では、本発明は、ＨＧＦ遺伝子とニューロゲニン１遺伝子とを導入した成体幹細胞株の作製方法を提供する。
【００３４】
上記のように、ＨＧＦ遺伝子とニューロゲニン１遺伝子とが導入される成体幹細胞株のタイプは特に限定されず、特殊化した組織の細胞型へと分化する可能性を有する限り、任意の細胞株を本発明の細胞株として使用することができる。
【００３５】
好ましくは、成体幹細胞株は骨髄、脂肪組織、血液、臍帯血、肝臓、皮膚、胃腸管、胎盤、子宮又は流産した胎児に由来する成体幹細胞株であり得る。より好ましくは、成体幹細胞株は骨髄由来成体幹細胞株である。更により好ましくは、成体幹細胞株は骨髄由来ＭＳＣ株である。
【００３６】
幹細胞株への特定の遺伝子の導入は形質転換法を用いて行うことができる。上記のように、当該技術分野で既知の典型的な形質転換法を、制限なしに使用することができる。本発明の一実施例によると、ＭＳＣＶ−ｐｕｒｏ／ｈＮｇｎ１とＡｄｅｎｏ−ＨＧＦとを成体幹細胞株に導入することによって形質転換成体幹細胞株を作製した。ＭＳＣＶ−ｐｕｒｏ／ｈＮｇｎ１遺伝子によるＭＳＣのトランスフェクションの後、ピューロマイシンを使用して選択した。Ａｄｅｎｏ−ＨＧＦによるＭＳＣのトランスフェクションの後、ＨＧＦ抗体を用いてその発現を検査し、感染多重度（ＭＯＩ）を決定し、使用した。
【００３７】
本発明のＨＧＦ遺伝子とニューロゲニン１遺伝子とを導入した骨髄由来成体幹細胞株を生成する方法は、
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を有する肝細胞増殖因子をコードする遺伝子と、配列番号２のヌクレオチド配列を有するニューロゲニン１をコードする遺伝子とを培養成体幹細胞に導入する工程と、
（ｂ）肝細胞増殖因子をコードする遺伝子及びニューロゲニン１をコードする遺伝子の両方が導入された改変成体幹細胞株を選択する工程と、
（ｃ）選択した改変成体幹細胞株を培養する工程と、
を含み得る。
【００３８】
ＨＧＦ遺伝子とニューロゲニン１遺伝子とを導入した骨髄由来成体幹細胞株を生成する方法では、肝細胞増殖因子をコードする遺伝子と、ニューロゲニン１をコードする遺伝子との導入は、順に又は逆の順序で又は同時に行われ、その順序及び方法は特に限定されない。
【００３９】
本発明の一実施例によると、成体幹細胞の中でも骨髄由来ＭＳＣを単離した。単離したＭＳＣを１０％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地中で培養し、４継代まで継代培養して実験に使用した。
【００４０】
ニューロゲニン１遺伝子を用いて形質転換する工程では、ニューロゲニン１遺伝子を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いてｐＭＳＣＶ−ｐｕｒｏベクターにライゲーションし、大腸菌（E.coli）ＤＨ５αに形質転換した。最後に、ｈＮｇｎ１遺伝子をｐＭＳＣＶ−ｐｕｒｏベクターに挿入することによってｐＭＳＣＶ−ｐｕｒｏ／ｈＮｇｎ１ベクターを作製し、ニューロゲニン１遺伝子を継代培養細胞株に導入した。ニューロゲニン１を導入した細胞を、２μｇ／ｍＬのピューロマイシンを含有する培地中で２週間継代培養し、ニューロゲニン１が導入された生存細胞を選択した。最後に、ニューロゲニン１を継続的に発現する細胞株を上記の手順によって作製した。
【００４１】
ＨＧＦ遺伝子を用いて形質転換する工程では、ＨＧＦをクローニングしたｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶ−ＨＧＦ及びｐＡｄＥａｓｙ−１を、大腸菌（ＢＪ  ５１８３株）にエレクトロポレーションによって同時形質転換した後、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有する培地中でコロニーが形成されるまで培養した。各々のコロニーからプラスミドが得られ、標準的な制限酵素消化によって候補コロニーを選択した。塩基配列を分析してｐＡｄ−ＨＧＦを得た。ｐＡｄ−ＨＧＦを制限酵素ＰａｃＩで切断することによって線状化し、ＣａＣｌ２沈殿によってＨＥＫ２９３細胞に導入して、Ａｄｅｎｏ−ＨＧＦウイルスを含有する培養ブロスを得た。ＨＧＦが首尾よく導入されたＭＳＣ株を選択するために、ＨＧＦのタンパク質発現を、ＨＧＦに対する抗体を用いる免疫細胞化学的染色によって検査した。
【００４２】
更に別の態様では、本発明は、ＨＧＦ遺伝子とニューロゲニン１遺伝子とを導入した成体幹細胞株を含む、神経疾患の予防又は治療用の組成物を提供する。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、「神経疾患」という用語は神経、特に脳神経に関連する様々な疾患を指す。神経疾患はパーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、癲癇、統合失調症、急性脳卒中、慢性脳卒中又は脊髄損傷、好ましくは慢性脳卒中であり得るが、特にこれらに限定されるわけではない。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、「予防」という用語は、神経疾患又はそれに関連する疾患の発生を、ＨＧＦ遺伝子とニューロゲニン１遺伝子とを導入した成体幹細胞株を用いて抑えるか又は遅らせる全ての行為を指す。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、「治療」という用語は、神経疾患又はそれに関連する疾患の症状を、ＨＧＦ遺伝子とニューロゲニン１遺伝子とを導入した成体幹細胞株を用いて快方に向かわせるか又は好ましい状態に変える全ての行為を指す。
【００４６】
本発明のＨＧＦ遺伝子とニューロゲニン１遺伝子とを導入したＭＳＣは、治療用のＭＳＣを含む医薬組成物の形態で存在し得る。
【００４７】
また、本発明の組成物は、薬学的に許容される担体を更に含む医薬組成物であってもよい。薬学的に許容される担体を含む組成物は、経口配合物又は非経口配合物として作製することができる。配合物は希釈剤又は充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤及び界面活性剤等の通常用いられる添加剤を用いて作製することができる。経口投与用の固形製剤の例としては、錠剤、丸薬、粉剤、顆粒剤及びカプセル剤が挙げられ、固形製剤は１つ又は複数の化合物とデンプン、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース及びゼラチン等の少なくとも１つの賦形剤とを混合することによって作製することができる。さらに、賦形剤に加えて、ステアリン酸マグネシウム及びタルク等の滑沢剤を使用してもよい。経口投与用の液体製剤の例としては、懸濁液、内用液、エマルション及びシロップが挙げられ、水及び流動パラフィン等の一般的な希釈剤に加えて、湿潤剤、甘味料、香料及び防腐剤等の様々な添加剤が含有されていてもよい。非経口投与用の製剤の例としては、無菌水溶液、非水溶媒、懸濁液、エマルション、凍結乾燥剤（lyophilized agent）及び坐剤を挙げることができる。非水溶媒及び懸濁液としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油及びオレイン酸エチル等の注射用エステルを使用することができる。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール、マクロゴール、ツイーン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチン等を使用することができる。医薬組成物は錠剤、丸薬、粉剤、顆粒剤及びカプセル剤、懸濁液、内用液、エマルション及びシロップ、無菌水溶液、非水溶媒、懸濁液、エマルション、凍結乾燥剤及び坐剤からなる群から選択される任意の製剤へと配合することができる。
【００４８】
更に別の態様では、本発明は、神経疾患を治療する方法であって、組成物を、神経疾患を患うか又は神経疾患を患う疑いのある被験体に投与する工程を含む、方法を提供する。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、「被験体」という用語は、神経系を有し、様々な因子に起因する上記の神経疾患に罹患しやすい生物、好ましくは哺乳動物を指す。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、「哺乳動物」という用語は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、とりわけヒトを指し、子どもを乳腺から分泌される母乳で育てる高等脊椎動物の「哺乳綱」の任意の生物を指す。
【００５１】
本発明の組成物は、所望の組織に到達することが可能である限り、任意の一般的な経路で被験体に投与することができる。腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、鼻腔内投与、肺内投与及び直腸内投与を含む様々な投与方法が企図されるが、本発明は例示されるこれらの投与方法に限定されない。加えて、本発明の組成物を、抗酸化効果をもたらすために単独で又はホルモン療法、薬物療法及び生物学的応答調節剤と組み合わせて使用してもよい。
【００５２】
さらに、本発明の組成物は薬学的に有効な量で投与することができる。本明細書中で使用される場合、「薬学的に有効な量」という用語は、薬物治療に適用可能な妥当なリスク／ベネフィット比に相応する疾患の治療に十分な量を指す。本発明の組成物の有効な投与量は、被験体及び疾患の重症度、年齢、性別、薬物活性、薬物感受性、投与時間、投与経路、排泄率、治療期間、併用薬及び医学分野で既知の他の因子に応じて決定することができる。本発明の組成物は、単独の治療剤として又は他の治療剤と組み合わせて投与することができ、従来の治療剤と順に又は同時に投与することができる。この投与は単回投与又は複数回投与で行うことができる。全ての因子を考慮すると、副作用を引き起こさずに最大の効果をもたらすことが可能な最小用量で投与を行うことが重要であり、かかる用量は当業者によって容易に決定される。
【００５３】
加えて、本発明の組成物を、炎症性疾患を予防又は治療するために単独で又は外科手術、ホルモン療法、薬物療法及び生物学的応答調節剤と組み合わせて使用してもよい。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例を参照して本発明をより詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例は例示を目的とするものにすぎず、本発明がこれらの実施例に限定されることを意図するものではない。
【００５５】
実施例１：ＭＳＣの単離及び培養
実施例１−１：ＭＳＣの単離
４ｍＬのＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥ  １０７７（Sigma）及び骨髄バンク（韓国骨髄バンク、ＫＭＤＰ）から入手した４ｍＬの骨髄を、滅菌した１５ｍＬ容の試験管に入れ、遠心分離機を用いて室温及び４００×ｇで３０分間遠心分離を行った。遠心分離後、パスツールピペットを用いて相間に位置する０．５ｍＬのバフィーコートを慎重に採取し、１０ｍＬの滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の入った試験管に移した。移したバフィーコートを２５０×ｇで１０分間遠心分離して上清を除去し、１０ｍＬのリン酸緩衝液を添加して懸濁液を得て、２５０×ｇで１０分間遠心分離した。
【００５６】
上記の手順を２回繰り返し、得られた沈殿物に１０％ＦＢＳ（Gibco）を含有するＤＭＥＭ培地（Gibco）を添加した。得られた溶液の一部（１×１０７個の細胞に相当する）を１００ｍｍ皿に入れ、５％のＣＯ２及び９５％の空気を供給しながら３７℃で４時間インキュベートした。次いで、上清を除去して、培養皿の底に付着していない細胞を取り除き、新たな培地を添加して培養を続けた。
【００５７】
実施例１−２：ＭＳＣの培養
実施例１−１で単離したＭＳＣを、２日おきにＭＳＣ培地（１０％ＦＢＳ＋１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（Sigma）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco）＋８９％ＤＭＥＭ）を交換しながら、３７℃に維持したＣＯ２インキュベーター内でインキュベートした。細胞がおよそ８０％のコンフルエンスに達した時点で、０．２５％トリプシン／０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ（GIBCO）を用いて細胞を採取し、培地で２０倍に希釈した後、新たな皿で継代培養した。このようにして得られた細胞の残りを、１０％ＤＭＳＯを含有する培地中で冷凍保存し、脂肪細胞、軟骨細胞及び骨細胞に分化する可能性を以下のように検査した。
【００５８】
実施例１−３：脂肪細胞分化
ＭＳＣをＭＳＣ培地中で規定の期間にわたって培養した後、脂肪細胞分化誘導培地（１μＭデキサメタゾン（Sigma）、０．５μＭメチルイソブチルキサンチン（Sigma）、１０μｇ／ｍＬのインスリン（GIBCO）、１００ｎＭインドメタシン（Sigma）及び１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地）中で４８時間培養した。得られた混合物を続いて脂肪細胞分化維持培地（１０μｇ／ｍＬのインスリン及び１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地）中で１週間インキュベートし、オイルレッドＯで染色した（図１ａ）。図１ａは、オイルレッドＯで染色したＭＳＣから分化した脂肪細胞の写真である。図１ａに示されるように、赤色に染色された脂肪滴が細胞内に観察され、ＭＳＣが脂肪細胞に首尾よく分化したことが示唆される。
【００５９】
実施例１−４：軟骨細胞分化
ＭＳＣをＭＳＣ培地中で規定の期間にわたって培養し、トリプシンを用いて２×１０５個の細胞を採取して試験管に移し、遠心分離した後、０．５ｍＬの無血清軟骨細胞分化誘導培地（５０ｍＬの高グルコースＤＭＥＭ（GIBCO）、０．５ｍＬの１００×ＩＴＳ（０．５ｍｇ／ｍＬのウシインスリン、０．５ｍｇ／ｍＬのヒトトランスフェリン、０．５ｍｇ／ｍＬのセレン酸ナトリウム（Sigma））、５０μＬのリノレン酸アルブミン（Sigma）、０．２ｍＭ  １００ｎＭデキサメタゾン及び１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１（Sigma））中で、培地を３日おきに交換しながら３週間再インキュベートした。次いで、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、ミクロトームを用いて切片を作製した後、アルシアンブルーで染色した（図１ｂ）。図１ｂは、アルシアンブルーで染色したＭＳＣから分化した軟骨細胞の写真である。図１ｂに示されるように、細胞外軟骨基質が青色に染色されて、軟骨小腔中に軟骨細胞の存在が観察され、ＭＳＣが軟骨細胞に分化したことが示唆される。
【００６０】
実施例１−５：骨細胞分化
ＭＳＣをＭＳＣ培地中で規定の期間にわたって培養した後、骨細胞分化誘導培地（１０ｍＭ  β−グリセロールリン酸（Sigma）、０．２ｍＭアスコルビン酸−２−リン酸（Sigma）、１０ｎＭデキサメタゾン及び１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ）中で、培地を３日おきに交換しながら２週間培養した。次いで、細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、フォンコッサ及びアルカリホスファターゼ（ＡＰ）で染色した（図１ｃ及び図１ｄ）。図１ｃ及び図１ｄは、それぞれアルカリホスファターゼ及びフォンコッサで染色した、ＭＳＣから分化した骨細胞の写真である。図１ｃ及び図１ｄに示されるように、ヒドロキシアパタイトの形態でのカルシウム鉱物の細胞外蓄積及び細胞内アルカリホスファターゼ活性の増大から、ＭＳＣが骨細胞に分化したことが示唆される。
【００６１】
実施例２：ヒト神経原性転写因子ニューロゲニン１のレトロウイルスの構築及び発現
実施例２−１：ヒトニューロゲニン１を発現するレトロウイルスベクターの構築
Ｕ６３８４２遺伝子配列中のコード領域（５５ｂｐ〜７６８ｂｐ）に相当する配列番号２の配列を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Roche）を用いてｐＭＳＣＶ−ｐｕｒｏベクター（Clontech）にライゲーションした後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換して、最終的にヒトニューロゲニン１（ｈＮｇｎ１）遺伝子がｐＭＳＣＶ−ｐｕｒｏベクターに挿入されたｐＭＳＣＶ−ｐｕｒｏ／ｈＮｇｎ１ベクターを構築した。構築したｐＭＳＣＶ−ｐｕｒｏ／ｈＮｇｎ１ベクターをリン酸カルシウム沈殿によって２９３Ｔ細胞に導入し、発現をウエスタンブロット法によって検査した（図２）。図２は、ｈＮｇｎ１遺伝子を含有するレトロウイルスベクター（上パネル）を導入した２９３Ｔ細胞におけるｈＮｇｎ１の発現を示すウエスタンブロット法の結果（下パネル）である。
【００６２】
実施例２−２：ニューロゲニン１を含有するレトロウイルスの作製
ｐＭＳＣＶ−ｐｕｒｏ／ｈＮｇｎ１ベクターを、リン酸カルシウム沈殿法に従ってレトロウイルスパッケージング細胞ＰＡ３１７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０７８）又はＰＧ１３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０６８６）に導入した。４８時間後、培養液を採取し、０．４５μｍ膜で濾過して、レトロウイルス溶液を得た。レトロウイルス溶液を使用するまで−７０℃で維持した。
【００６３】
実施例３：ニューロゲニン１遺伝子を導入したＭＳＣの構築及びｉｎ  ｖｉｖｏ神経細胞分化
実施例３−１：ＭＳＣへのニューロゲニン１の導入
ＭＳＣを１００ｍｍ培養皿内で７０％コンフルエンスまで培養した。最終濃度が８μｇ／ｍＬとなるまでポリブレン（Sigma）と混合した、実施例２−２で得られたニューロゲニン１レトロウイルス溶液を４ｍＬ添加し、８時間インキュベートした。次いで、レトロウイルス溶液を除去し、ＭＳＣを１０ｍＬのＭＳＣ培地中で２４時間培養した後、レトロウイルスの再感染を行った。上記の手順を１回〜４回繰り返した。次いで、トリプシンを用いてＭＳＣを採取し、培地で２０倍に希釈した。得られた細胞を、２μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Sigma）を添加した培地中で２週間継代培養して、レトロウイルスが感染した生存細胞を選択した。最終的に、ピューロマイシン耐性を有するＭＳＣをニューロゲニン１発現細胞として使用した。
【００６４】
実施例３−２：移植用の細胞の標識
ニューロゲニン１遺伝子が移植率及び神経分化を増大させるか否かを検査するために、ｈＮｇｎ１遺伝子を導入したＭＳＣにＧＦＰ発現アデノウイルスを感染させた。
【００６５】
アデノウイルストランスフェクションは、先に記載の１×１０８ＰＦＵ／ｍＬの力価を有するアデノウイルス溶液を１００ＭＯＩで３時間添加することによって行った。アデノウイルストランスフェクションの後、ニューロゲニン１を導入したＭＳＣを０．２５％トリプシン／０．１％ＥＤＴＡを用いて採取し、１μＬ当たり３×１０３細胞となるまでＰＢＳで希釈した。
【００６６】
実施例３−３：移植
移植は、成体スプラーグドーリーアルビノ雌性ラット（２５０ｇ）（Dae Han Bio Link Co., Ltd）を用いて以下のように行った。
【００６７】
初めに、アルビノラットを７５ｍｇ／ｋｇのケタミン及び５ｍｇ／ｋｇのランパンの腹腔内注射で麻酔し、切開部の毛を除去した後、耳及び口を定位フレームに固定した。頭頂部を７０％エタノールで消毒し、およそ１ｃｍ切開した。続いて、３×１０３個のｈＮｇｎ１発現ＭＳＣ（ＭＳＣ／ｈＮｇｎ１）を含有する１μＬのＰＢＳを１０μＬ容のHamilton製シリンジに入れ、Hamilton製シリンジラックに入れた。ブレグマのＡＰ、＋１．０；ＭＬ、３．０；ＬＶ、＋４．０の位置で露出硬膜に穿孔した後、Hamilton製シリンジを用いて１μＬの細胞を０．２μＬ／分の速度で注入した。注入の２０分後、シリンジをゆっくりと抜き取った。滅菌した糸及び針を用いて切開部を縫合し、消毒剤を用いて消毒した。５ｍｇ／ｋｇの免疫抑制剤シクロスポリンＡ（Sigma）を、腹腔内注射によって脳の摘出まで連日投与した。
【００６８】
実施例３−４：組織片の作製
移植の２週間後、アルビノラットを７５ｍｇ／ｋｇのケタミン及び５ｍｇ／ｋｇのランパンの腹腔内注射で麻酔した。開胸し、左心室から生理食塩水を用いて灌流ウォッシュアウト（wash-out）を行った。０．１Ｍリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）中のパラホルムアルデヒドを用いて灌流固定を行った。脳を摘出し、４℃で１６時間、同じ固定溶液中で後固定した。後固定した脳を３０％スクロースに２４時間浸漬し、スライディングミクロトームを用いて３５μｍ厚で切片を作製した。このようにして得られた切片をシランコーティングスライド（武藤化学株式会社、日本）に載せ、使用するまでＰＢＳ中４℃で保存した。スライドに載せた組織切片を、１×ＰＢＳ／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に３０分間浸した。
【００６９】
実施例３−５：免疫組織化学
初めに、非特異的相互作用を阻害するために、組織切片を１０％正常ウマ血清（ＮＨＳ）と室温で１時間反応させた後、各々２００倍に希釈した一次抗体であるＭＡＰ２（微小管関連タンパク質２）抗体及びＧＦＰ抗体と４℃で１６時間反応させた。１×ＰＢＳ／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１５分間の洗浄を３回行った後、切片をＧＦＰ一次抗体を検出するＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ（Vector、２００倍）、又はＭＡＰ２一次抗体を検出するテキサスレッド結合抗マウスＩｇＧ（Vector、２００倍）と反応させた（図３）。図３は、ｈＮｇｎ１遺伝子を導入したＭＳＣにＧＦＰ発現アデノウイルスを感染させ、アルビノラットの線条体に移植した２週間後にＭＳＣの神経発生分化を検査する、抗ニューロンマーカーＴｕＪ１（βチューブリンＩＩＩ）抗体を用いた免疫組織化学の結果である。図３に示されるように、ＧＦＰ発現細胞とＭＡＰ２発現細胞とが重複し、ニューロゲニン１遺伝子を導入したＭＳＣが神経細胞に分化したことが示唆される。
【００７０】
実施例４：ＨＧＦ遺伝子を導入したアデノウイルスベクターの構築及び発現
実施例４−１：ＨＧＦを発現するアデノウイルスベクターの構築
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００６０１．４の遺伝子配列中のコード領域（１６６ｂｐ〜２３５２ｂｐ）に相当する配列番号１の塩基配列をｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶベクターに導入して、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶ−ＨＧＦを作製した。このベクター及びｐＡｄＥａｓｙ−１をエレクトロポレーションによって大腸菌（ＢＪ  ５１８３株）に同時形質転換し、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有する培地中でコロニーが形成されるまで培養した。各々のコロニーからプラスミドが得られ、標準的な制限酵素消化によって候補コロニーを選択した。塩基配列を分析して、ＨＧＦを有するｐＡｄ−ＨＧＦベクターを得た。ｐＡｄ−ＨＧＦを制限酵素ＰａｃＩで切断することによって線状化し、ＣａＣｌ２沈殿によってＨＥＫ２９３細胞に導入して、Ａｄｅｎｏ−ＨＧＦウイルスを含有する培養ブロスを得た。
【００７１】
実施例４−２：アデノウイルスにおけるＨＧＦ発現のウエスタンブロット分析
ＨＧＦ遺伝子を導入したアデノウイルスにおいてＨＧＦが正常に発現されるか否かを検査するために、ＭＳＣにアデノウイルスを様々な濃度で２時間感染させ、産生されるＨＧＦをウエスタンブロット法によって細胞内タンパク質（細胞溶解物）レベル及び細胞外タンパク質（馴化培地；ＣＭ）レベルで分析した（図４）。図４は、ヒトＨＧＦを発現するアデノウイルスベクターを導入したＭＳＣにおける細胞内（細胞溶解物）及び細胞外（馴化培地；ＣＭ）のＨＧＦの発現を示すウエスタンブロット分析の結果である。図４に示されるように、細胞内ＨＧＦは、ＭＳＣに感染させたＨＧＦ発現アデノウイルスの濃度に比例して産生された。
【００７２】
実施例４−３：アデノウイルス媒介ＨＧＦ発現の免疫細胞化学
ＨＧＦの細胞内発現を検査するために免疫細胞化学を行った。ＭＳＣにＨＧＦを発現するアデノウイルスを様々な濃度で感染させ、４％ホルマリンで１０分間固定し、１０％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）と室温で１時間反応させて、非特異的相互作用を阻害した。２００倍に希釈したＨＧＦ抗体を一次抗体として使用し、４℃で１６時間反応させた後、１×ＰＢＳ／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１５分間の洗浄を３回行った。ＨＧＦ一次抗体を検出するために、細胞を２５０倍に希釈したＡｌｅｘａ  ４８８結合マウスＩｇＧ二次抗体（Invitrogen）で染色し、核をヘキストで同時染色した（図５）。図５は、段階希釈したヒトＨＧＦを発現するアデノウイルスベクターを導入したＭＳＣにおけるＨＧＦの発現レベルを検査する免疫細胞化学の結果を示す写真である。図５に示されるように、細胞内ＨＧＦは、ＭＳＣに感染させたＨＧＦ発現アデノウイルスの濃度に比例して産生された。
【００７３】
実施例５：ヒトニューロゲニン１遺伝子を導入したＭＳＣへのＨＧＦ遺伝子の導入、及び脳卒中動物モデルへのその移植
実施例５−１：ｈＮｇｎ１遺伝子を導入したＭＳＣへのＨＧＦ遺伝子の導入
ｈＮｇｎ１遺伝子を導入したＭＳＣを、細胞がおよそ７０％のコンフルエンスに達するまで１００ｍｍ培養プレート内で培養した。実施例４で得られたＨＧＦ発現アデノウイルス溶液を５０ＭＯＩで２時間添加することにより、トランスフェクションを行った。ＭＳＣをＰＢＳで３回洗浄した後、トリプシンを用いてＭＳＣを培養プレートから分離した。
【００７４】
実施例５−２：脳卒中動物モデルの作製
体重２００ｇ〜２５０ｇの成体雄性ＳＤラットを、７０％のＮ２Ｏ及び３０％のＯ２を含有する５％イソフルランガスで麻酔した。頸部腹側正中切開によって右総頸動脈（ＣＣＡ）、右外頸動脈（ＥＣＡ）及び右内頸動脈（ＩＣＡ）を露出させ、およそ２０ｍｍ〜２２ｍｍの４−０ナイロン縫合糸をＣＣＡからＩＣＡへと挿入し、右中大脳動脈（ＭＣＡ）を閉塞した。１２０分後、ナイロン縫合糸を除去した。手術の間中、ラットの体温を３７．８℃に維持し、全ての手術器具を使用前に滅菌した。
【００７５】
実施例５−３：脳卒中動物モデルへのＨＧＦ遺伝子とｈＮｇｎ１遺伝子とを導入したＭＳＣの移植
脳卒中誘導の４週間後に、アルビノラットを定位固定装置内に入れ、５．０×１０５個のＨＧＦ遺伝子とｈＮｇｎ１遺伝子とを導入したＭＳＣを、２５ゲージのHamilton製シリンジを用いて０．５μＬ／分の速度でブレグマのＡＰ＝＋０．５ｍｍ、ＭＬ＝３．５ｍｍ、ＤＶ＝５．０ｍｍ及びＡＰ＝−１．０ｍｍ、ＭＬ＝３．０、ＤＶ＝２．５ｍｍの位置に移植した。
【００７６】
移植の５分後に、Hamilton製シリンジを抜き取った。ＨＧＦ遺伝子とｈＮｇｎ１遺伝子とを発現するＭＳＣに加えて、正常ＭＳＣ、ＨＧＦ遺伝子を導入した正常ＭＳＣ、ｈＮｇｎ１を導入したＭＳＣ及びＰＢＳを細胞移植に使用した。
【００７７】
実施例６：ヒトニューロゲニン１遺伝子を導入したＭＳＣへのＨＧＦ遺伝子の導入、及び脳卒中動物モデルにおけるその有効性の評価
実施例６−１：脳卒中動物モデルにおけるＭＳＣの有効性の評価基準の確立
脳損傷を受けた動物に移植したＭＳＣの有効性を評価するために、ＭＲＩ及び行動試験を行った。中大脳動脈閉塞によってアルビノラットに脳卒中を誘導した。４週間後に、３．０Ｔ  ＭＲＩ及び行動試験を行い、一様な脳損傷を受けた動物を選択し、ＨＧＦ遺伝子とｈＮｇｎ１遺伝子とを導入したＭＳＣを移植した。
【００７８】
アルビノラットを７５ｍｇ／ｋｇのケタミン及び５ｍｇ／ｋｇのランパンの腹腔内注射で麻酔し、３５ミリテスラ／ｍが可能な勾配システムを備える３．０Ｔ  ＭＲＩスキャナーを用いてラットの脳のＭＲＩスキャンを行った。以下のパラメータを用いた高速スピンエコーイメージング手順を用いてＴ２強調解剖学的画像を取得した：繰返し時間、４０００ｍｓ；実効エコー時間、９６ｍｓ；視野、５５×５５ｍｍ２；画像行列、２５６×２５６；切片厚、１．５ｍｍ；フリップ角、９０度；励起回数、２；画素サイズ、０．２１×０．２１ｍｍ２。
【００７９】
動物行動試験については、接着剤除去試験及びロータロッド試験を行った。接着剤除去試験については、１０ｍｍ×１０ｍｍの接着テープを各前肢の足背（dorsal paw）に貼り付け、各テープが足背から剥がされる時間を測定した。ロータロッド試験については、５分間かけて４ｒｐｍから４０ｒｐｍへと加速される回転シリンダー上を走る能力について実験動物を試験した。脳卒中誘導の２週間前に、１０秒以内に接着テープを剥がし、３００秒超にわたってロータロッドシリンダー上に留まることが可能な動物のみを選択し、実験に供した。
【００８０】
実施例６−２：脳卒中動物モデルにおけるＨＧＦ遺伝子とｈＮｇｎ１遺伝子とを導入したＭＳＣの治療有効性の評価
脳卒中誘導の４週間後に、行動試験及びＭＲＩを行い、一様な脳損傷を受けた動物を選択した。脳卒中動物モデルに対照群ＰＢＳ、正常ＭＳＣ、ＨＧＦ遺伝子を導入した正常ＭＳＣ及びｈＮｇｎ１を導入したＭＳＣ、並びにＨＧＦ遺伝子とｈＮｇｎ１遺伝子とを導入したＭＳＣを含む合計で５つの細胞群を移植した。脳卒中動物モデルにおけるＭＳＣの有効性を、行動試験及びＭＲＩに基づいて評価した（図６）。図６は、脳卒中動物モデルにおけるヒトＨＧＦ遺伝子とｈＮｇｎ１遺伝子とを導入したＭＳＣの治療有効性を評価する、接着剤除去試験（左パネル）及びロータロッド試験（右パネル）の動物行動試験の結果を示すグラフである。図６に示されるように、脳卒中誘導の４週間後にＰＢＳ、ＨＧＦ遺伝子を導入した正常ＭＳＣ及びｈＮｇｎ１遺伝子を導入したＭＳＣを移植した場合、治療有効性は観察されなかった。これに反し、ＨＧＦ遺伝子とｈＮｇｎ１遺伝子とを導入したＭＳＣを移植した場合、治療有効性が明らかに観察された。
【００８１】
上記の結果から、脳卒中動物モデルにおけるＨＧＦ遺伝子とｈＮｇｎ１遺伝子とを導入したＭＳＣの移植が、脳卒中モデルにおいて脳損傷に起因する運動障害及び感覚障害に対して優れた治療有効性を示すことが示唆される。
【００８２】
加えて、脳卒中動物モデルにおけるＨＧＦ遺伝子とｈＮｇｎ１遺伝子とを導入したＭＳＣの治療有効性をＭＲＩによって検査した（図７）。図７は、脳卒中動物モデルにおけるヒトＨＧＦ遺伝子とｈＮｇｎ１遺伝子とを導入したＭＳＣの治療有効性を評価する、ＭＲＩ（上パネル）及び脳卒中病変の定量分析（下パネル）の結果を示す写真である。図７に示されるように、ＰＢＳ及びニューロゲニン１遺伝子を導入したＭＳＣを脳卒中誘導の２８日後に移植した場合、梗塞サイズは減少しなかった。これに反し、ＨＧＦ遺伝子とｈＮｇｎ１遺伝子とを導入したＭＳＣを移植した場合、梗塞サイズの減少が観察された。
【００８３】
上記の結果から、ＨＧＦ遺伝子を導入したｈＮｇｎ１遺伝子発現ＭＳＣが、ＨＧＦ遺伝子を導入しなかったｈＮｇｎ１発現ＭＳＣと比較して、脳梗塞に対して優れた治療有効性を示すことが示唆される。
【００８４】
実施例７：脳卒中動物モデルにおけるＨＧＦ遺伝子とヒトニューロゲニン１遺伝子とを導入したＭＳＣの治療有効性の機序
梗塞領域に対するＨＧＦ遺伝子とｈＮｇｎ１遺伝子とを導入したＭＳＣの治療有効性の機序を検査するために、組織片を作製し、免疫組織化学によって分析した。
【００８５】
実施例７−１：組織片の作製
移植の８週間後に、アルビノラットを実施例３−４と同様に麻酔し、脳を摘出した。脳を４℃で１６時間、固定溶液中で後固定した。後固定した脳の切片を２ｍｍ厚で作製し、自動組織処理装置内で脱水し、キシレン及びパラフィンを浸透させた。パラフィンを浸透させた組織をパラフィン包埋し、回転式ミクロトーム（Leica）を用いて５μｍ厚の切片を作製し、シランコーティングスライドに載せた。組織抗原性を回復する免疫組織化学の第一段階として、組織を１０ｍＭクエン酸ナトリウムに浸し、９９℃で１０分間マイクロ波加熱し、室温で２０分間冷却した。
【００８６】
実施例７−２：免疫組織化学的染色
実施例７−１で作製した組織片を、１×ＰＢＳ／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に３０分間浸した。免疫組織化学の第一段階として、組織片を正常ヤギ血清と室温で１時間反応させ、非特異的相互作用を阻害した。一次抗体として、２００倍に希釈したＭＡＰ２抗体及びＧＦＰ抗体を使用し、４℃で１６時間反応させた。１×ＰＢＳ／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１５分間の洗浄を３回行った後、切片をＭＡＰ２一次抗体を検出するＡｌｅｘａ  ４８８結合抗マウスＩｇＧ二次抗体（Invitrogen、２５０倍）と反応させ、ＧＦＰ一次抗体を検出するＡｌｅｘａ  ５６８結合抗マウスＩｇＧ二次抗体（Invitrogen、２５０倍）と反応させた。
【００８７】
まず、脳の線維化を媒介するグリア細胞のマーカーであるＧＦＡＰの発現パターンを検査した（図８）。図８は、ヒトＨＧＦ遺伝子とｈＮｇｎ１遺伝子とを導入したＭＳＣの移植後の梗塞領域中のグリア細胞及びその発現パターンを検査する、ＧＦＡＰ抗体及びＭＡＰ２抗体を用いた免疫組織化学の結果を示す写真である。図８に示されるように、ＰＢＳ、ＨＧＦ遺伝子を導入した正常ＭＳＣ及びｈＮｇｎ１遺伝子を導入したＭＳＣを、脳卒中誘導（ＭＣＡｏ）の４週間後に梗塞領域に移植した場合、脳卒中誘導（ＭＣＡｏ）の１２週間後にグリア集団の変化は見られなかった。これに反し、ＨＧＦ遺伝子とｈＮｇｎ１遺伝子とを導入したＭＳＣを移植した場合、グリア細胞の分散が観察された。
【００８８】
次に、神経細胞マーカーであるＭＡＰ２の発現パターンを検査した。その結果、ｈＮｇｎ１遺伝子を導入したＭＳＣの移植及びＨＧＦ遺伝子とｈＮｇｎ１遺伝子とを導入したＭＳＣの移植が、ＰＢＳ及びＨＧＦ遺伝子を導入した正常ＭＳＣの移植と比較して、より高い神経細胞の発現を示した。
【００８９】
上記の結果から、ｈＮｇｎ１遺伝子を導入したＭＳＣが神経細胞に分化し、ＨＧＦ遺伝子とｈＮｇｎ１遺伝子とを導入したＭＳＣが脳の線維化に関与するグリア細胞集団を抑制することが示唆され、ＨＧＦ遺伝子とｈＮｇｎ１遺伝子とを導入したＭＳＣが慢性脳損傷に対して治療効果を示すことが示唆される。
【００９０】
実施例８：慢性脳損傷に対するＨＧＦ遺伝子とニューロゲニン１遺伝子とを導入したＭＳＣの治療効果
総合すると、ＨＧＦ遺伝子とニューロゲニン１遺伝子とを導入したＭＳＣは慢性脳損傷に対する治療効果を示した（図９）。図９は、細胞移植時間に応じた、脳卒中動物モデルにおけるヒトＨＧＦ遺伝子とｈＮｇｎ１遺伝子とを導入したＭＳＣの治療有効性をまとめた図（上パネル）及びグラフ（下パネル）である。図９に示されるように、細胞移植時間に応じた、脳卒中動物モデルにおけるニューロゲニン１遺伝子を導入したＭＳＣの治療有効性を検査したところ、脳損傷の３日後（急性）及び２週間後（亜急性）に移植した場合、ＰＢＳ群と比較して運動機能の改善が観察され、脳損傷の４週間後に移植した場合に有効性は観察されなかった。しかしながら、ニューロゲニン１遺伝子とＨＧＦ遺伝子とを導入したＭＳＣは、脳卒中の４週間後（慢性）に移植した場合であっても高い治療有効性を示した。
【００９１】
したがって、上記の結果から、ＨＧＦ遺伝子とｈＮｇｎ１遺伝子とを導入したＭＳＣが慢性脳損傷に対して治療効果を示すことが示唆される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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