(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的受容体細胞外ドメインのアミノ末端に共有結合した重鎖免疫グロブリンまたは軽鎖免疫グロブリンのアミノ酸配列を含む二官能性デコイ受容体融合抗体であって、ＢＢＢ上に発現された受容体および標的受容体細胞外ドメインのリガンドに結合する融合抗体。
【請求項２】
該ＢＢＢ上に発現された受容体がインスリン受容体、トランスフェリン受容体、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）受容体、レプチン受容体、またはリポタンパク質受容体である、請求項１記載の二官能性デコイ受容体融合抗体。
【請求項３】
該ＢＢＢ上に発現された受容体がインスリン受容体である、請求項２記載の二官能性デコイ受容体融合抗体。
【請求項４】
該インスリン受容体がヒトインスリン受容体である、請求項３記載の二官能性デコイ受容体融合抗体。
【請求項５】
該二官能性デコイ受容体融合抗体が、該ヒトインスリン受容体との結合に関して、配列番号４および６または配列番号６および７のアミノ酸配列を含む二官能性デコイ受容体融合抗体と競合する、請求項４記載の二官能性デコイ受容体融合抗体。
【請求項６】
該標的受容体細胞外ドメインがサイトカイン受容体由来である、請求項１記載の二官能性デコイ受容体融合抗体。
【請求項７】
該標的受容体細胞外ドメインがＴＮＦ−α受容体、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）受容体、アポトーシスのＴＮＦ様弱インデューサー（ＴＷＥＡＫ）受容体、ＩＬ−６受容体、血管内皮成長因子受容体、またはエフリン（ephrin）受容体由来である、請求項１記載の二官能性デコイ受容体融合抗体。
【請求項８】
該標的受容体細胞外ドメインがＴＮＦ−α受容体細胞外ドメインを含む、請求項７記載の二官能性デコイ受容体融合抗体。
【請求項９】
該ＴＮＦ−α受容体細胞外ドメインが、配列番号４のアミノ酸４６５〜６９９のＴＮＦ−α受容体細胞外ドメインに対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項８記載の二官能性デコイ受容体融合抗体。
【請求項１０】
ＴＮＦ−α受容体細胞外ドメインが、重鎖免疫グロブリンまたは軽鎖免疫グロブリンのカルボキシル末端に融合している、請求項８記載の二官能性デコイ受容体融合抗体。
【請求項１１】
ＴＮＦ−α受容体細胞外ドメインが重鎖免疫グロブリンのカルボキシル末端に融合している、請求項８記載の二官能性デコイ受容体融合抗体。
【請求項１２】
（ｉ）重鎖免疫グロブリンおよび該重鎖免疫グロブリンとフレーム内の標的受容体細胞外ドメインをコードする第１の配列、
（ｉｉ）軽鎖免疫グロブリンおよび該軽鎖免疫グロブリンとフレーム内の標的受容体細胞外ドメインをコードする第２の配列、または
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の相補性配列
を含む核酸であって、該重鎖および軽鎖免疫グロブリンがＢＢＢ受容体に対する抗体に由来し、該免疫グロブリンが該標的受容体細胞外ドメインのアミノ末端に共有結合している、核酸。
【請求項１３】
該コードされた標的受容体細胞外ドメインがＴＮＦ−α受容体、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）受容体、アポトーシスのＴＮＦ様弱インデューサー（ＴＷＥＡＫ）受容体、ＩＬ−６受容体、血管内皮成長因子受容体、またはエフリン受容体由来である、請求項１２記載の核酸。
【請求項１４】
該コードされた標的受容体細胞外ドメインがＴＮＦ−α受容体由来である、請求項１３記載の核酸。
【請求項１５】
該ＴＮＦ−α受容体由来のコードされた標的細胞外ドメインが、重鎖免疫グロブリンまたは軽鎖免疫グロブリンのカルボキシル末端に融合している、請求項１４記載の核酸。
【請求項１６】
該ＴＮＦ−α受容体由来のコードされた標的細胞外ドメインが、重鎖免疫グロブリンのカルボキシル末端に融合している、請求項１４記載の核酸。
【請求項１７】
該ＴＮＦ−α受容体由来のコードされた標的細胞外ドメインが、配列番号４のアミノ酸４６５〜６９９のＴＮＦ−α受容体細胞外ドメインに対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１４記載の核酸。
【請求項１８】
該ＢＢＢ受容体に対する抗体が、ヒトインスリン受容体、トランスフェリン受容体、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）受容体、レプチン受容体、またはリポタンパク質受容体に対する抗体である、請求項１２記載の核酸。
【請求項１９】
（ｉ）またはその相補体を含む、請求項１２記載の核酸。
【請求項２０】
さらに、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸配列またはその相補配列を含み、ここに、該コードされた免疫グロブリン軽鎖がＢＢＢ受容体に対する抗体由来である、請求項１９記載の核酸。
【請求項２１】
（ｉｉ）またはその相補体を含む、請求項１２記載の核酸。
【請求項２２】
さらに、免疫グロブリン重鎖をコードする核酸配列またはその相補配列を含み、ここに、該コードされた免疫グロブリン重鎖がＢＢＢ受容体に対する抗体由来である、請求項２１記載の核酸。
【請求項２３】
該第１の配列が配列番号４または７に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列をコードし、または該第２の配列が配列番号６に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列をコードする、請求項１２記載の核酸。
【請求項２４】
高ストリンジェンシー条件下で、配列番号３または５のアミノ酸配列をコードする核酸にハイブリダイズする、請求項１２記載の核酸。
【請求項２５】
請求項１２記載の核酸を含む、核酸ベクター。
【請求項２６】
（ｉ）を含み、さらに、ＢＢＢ受容体に対する抗体由来の軽鎖免疫グロブリンをコードする核酸配列を含むか、または
（ｉｉ）を含み、さらに、ＢＢＢ受容体に対する抗体由来の重鎖免疫グロブリンをコードする核酸を含む、請求項２５記載の核酸ベクター。
【請求項２７】
請求項２５記載の核酸ベクターを含む細胞。
【請求項２８】
請求項２６記載の核酸ベクターを含む細胞。
【請求項２９】
哺乳動物細胞である、請求項２７記載の細胞。
【請求項３０】
ＣＮＳ疾患の治療のための医薬組成物の製造のための、標的受容体細胞外ドメインのアミノ末端に共有結合した重鎖免疫グロブリンまたは軽鎖免疫グロブリンのアミノ酸配列を含む二官能性デコイ受容体融合抗体の使用であって、該融合抗体がＢＢＢ上に発現された受容体および標的受容体細胞外ドメインのリガンドに結合するところの、使用。
【請求項３１】
該ＢＢＢ上に発現された受容体がインスリン受容体、トランスフェリン受容体、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）受容体、レプチン受容体、またはリポタンパク質受容体である、請求項３０記載の使用。
【請求項３２】
該ＢＢＢ上に発現された受容体がインスリン受容体である、請求項３１記載の使用。
【請求項３３】
該標的受容体細胞外ドメインがＴＮＦ−α受容体、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）受容体、アポトーシスのＴＮＦ様弱インデューサー（ＴＷＥＡＫ）受容体、ＩＬ−６受容体、血管内皮成長因子受容体、またはエフリン受容体由来である、請求項３０記載の使用。
【請求項３４】
該標的受容体細胞外ドメインがＴＮＦ−α受容体由来である、請求項３３記載の使用。
【請求項３５】
該ＣＮＳ疾患が急性ＣＮＳ疾患である、請求項３０記載の使用。
【請求項３６】
該急性ＣＮＳ疾患が全脳虚血、局所脳虚血、外傷性脳損傷、または脊髄損傷である、請求項３５記載の使用。
【請求項３７】
該ＣＮＳ疾患が慢性ＣＮＳ疾患である、請求項３０記載の使用。
【請求項３８】
該慢性ＣＮＳ疾患が神経変性ＣＮＳ疾患である、請求項３７記載の使用。
【請求項３９】
該神経変性ＣＮＳ疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、多発性硬化症、横断性脊髄炎、運動ニューロン疾患、ピック病、結節硬化症、カナバン病、レット症候群、脊髄小脳失調症、フリードライヒ失調症、視神経萎縮、または網膜変性である、請求項３８記載の使用。
【請求項４０】
該ＴＮＦ−α受容体由来の標的細胞外ドメインが、重鎖免疫グロブリンまたは軽鎖免疫グロブリンのカルボキシル末端に共有結合している、請求項３４記載の使用。
【請求項４１】
該ＴＮＦ−α受容体由来の標的細胞外ドメインが重鎖免疫グロブリンのカルボキシル末端に共有結合している、請求項３４記載の使用。
【請求項４２】
（ｉ）標的受容体細胞外ドメインに融合した免疫グロブリン重鎖、および免疫グロブリン軽鎖の両方、または
（ｉｉ）標的受容体細胞外ドメインに融合した免疫グロブリン軽鎖、および免疫グロブリン重鎖の両方
をコードする単一タンデム発現ベクターを真核細胞中に安定に組み込むことを含む、二官能性デコイ受容体融合抗体を製造する方法であって、該コードされた免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖がＢＢＢ上に発現された受容体に対する抗体由来であり、該免疫グロブリンが標的受容体細胞外ドメインのアミノ末端に共有結合しているところの、方法。
【請求項４３】
該単一タンデム発現ベクターが（ｉ）をコードする、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
該単一タンデム発現ベクターが（ｉｉ）をコードする、請求項４２記載の方法。
【請求項４５】
該ＢＢＢ上に発現された受容体がインスリン受容体、トランスフェリン受容体、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）受容体、レプチン受容体、またはリポタンパク質受容体である、請求項４２記載の方法。
【請求項４６】
該ＢＢＢ上に発現された標的受容体がインスリン受容体である、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
該コードされた標的受容体細胞外ドメインがＴＮＦ−α受容体、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）受容体、アポトーシスのＴＮＦ様弱インデューサー（ＴＷＥＡＫ）受容体、ＩＬ−６受容体、血管内皮成長因子受容体、またはエフリン受容体由来である、請求項４２記載の方法。
【請求項４８】
該標的受容体細胞外ドメインがＴＮＦ−α受容体由来である、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
該ＴＮＦ−α受容体由来の標的受容体細胞外ドメインが免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン軽鎖のカルボキシル末端に融合している、請求項４８載の方法。
【請求項５０】
該ＴＮＦ−α受容体由来の標的受容体細胞外ドメインが免疫グロブリン重鎖のカルボキシル末端に融合している、請求項４８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本願は、２００９年３月１８日出願の米国仮出願第６１／１６１，３２０号（出典明示により全体として本明細書の一部とする）の利益を請求する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）などの標的受容体の可溶性細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、ヒトの疾患において治療作用を有する。受容体ＥＣＤは、内因性リガンド、例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αを封鎖し、それにより、内因性リガンドの内因性標的受容体へのアクセスを遮断する外因性デコイ（decoy）受容体として作用する。デコイ受容体は、脳疾患の強力な新規治療となる可能性があった。しかしながら、デコイ受容体は、他の巨大分子薬物のように、血液脳関門（ＢＢＢ）を横断しない。かくして、今日までに、組み換えデコイ受容体の全身投与によって脳障害患者を治療することはできなかった。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
発明の概要
本明細書には、ＢＢＢを横断してＩｇＧ−受容体ＥＣＤ（デコイ受容体）融合タンパク質を対象のＣＮＳへ送達するための組成物および関連する方法が記載される。特に、該方法は、受容体ＥＣＤおよびＢＢＢの表面に発現される受容体の細胞外ドメインに結合する抗体を含む二官能性デコイ受容体融合抗体の治療上有効量を全身投与することによって、デコイ受容体のＣＮＳへの送達を可能にする。
【０００４】
したがって、一の態様において、受容体細胞外ドメインのアミノ酸配列に共有結合した重鎖免疫グロブリンまたは軽鎖免疫グロブリンのアミノ酸配列を含む二官能性デコイ受容体融合抗体であって、ＢＢＢ上に発現した受容体および受容体細胞外ドメインのリガンドに結合する融合抗体が提供される。いくつかの具体例において、ＢＢＢ上に発現される受容体は、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、またはリポタンパク質受容体である。いくつかの具体例において、ＢＢＢ上に発現される受容体は、ヒトインスリン受容体である。いくつかの具体例において、該二官能性デコイ受容体融合抗体は、ヒトインスリン受容体との結合に関して、配列番号４および６または配列番号６および７のアミノ酸配列を含む二官能性デコイ受容体融合抗体と競合する。いくつかの具体例において、受容体細胞外ドメインは、サイトカイン受容体、ＴＮＦ−α受容体、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）受容体、アポトーシスのＴＮＦ様弱インデューサー（ＴＷＥＡＫ）受容体、ＩＬ−６受容体、血管内皮成長因子受容体、またはエフリン（ephrin）受容体由来である。いくつかの具体例において、受容体細胞外ドメインは、ＴＮＦ−α受容体細胞外ドメインを含む。いくつかの場合、ＴＮＦ−α受容体細胞外ドメインは、ヒト、マウス、ラットまたはブタＴＮＦ−α受容体細胞外ドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも８５％（例えば、９０％、９５％または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の具体例において、ＴＮＦ−α受容体細胞外ドメインのアミノ酸配列は、重鎖免疫グロブリンまたは軽鎖免疫グロブリンのカルボキシル末端に融合される。ある特定の具体例において、ＴＮＦ−α受容体細胞外ドメインのアミノ酸配列は、重鎖免疫グロブリンのカルボキシル末端に融合される。
【０００５】
関連する態様において、脳への取り込みがタンパク質１００グラムあたり１％、２％、３％、５％、７％または１０％以上のＩＤである二官能性デコイ受容体融合抗体（例えば、ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質）が提供される。いくつかの具体例において、該二官能性デコイ受容体融合抗体（例えば、ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質）は、デコイ受容体およびヒトＩｇＧのＦｃフラグメントの融合タンパク質、例えば、ＴＮＦＲ：Ｆｃの脳への取り込み量よりも１−、２−、５−、１０−、１３−、１５−、１７−、２０−、２５−、３０−、３５−、４０−、４５−または５０−倍大きい脳内取り込み量を示す。いくつかの具体例において、本明細書に記載の二官能性デコイ受容体融合抗体（例えば、ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質）は、他の器官と比べて、選択的に脳に豊富にある。いくつかの具体例において、ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質に関する器官ＰＳ積（organ PS product）に対する本明細書に記載のデコイ受容体−ＢＢＢ受容体ＡＢ融合抗体（例えば、ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質）に関する器官ＰＳ積の比率を複数の器官について決定する場合、脳の比率は、脂肪、筋肉、心臓、肺、肝臓および／または脾臓の比率よりも１、２、５、１０、１３、１５、１７、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０倍大きい。
【０００６】
関連する態様において、（ｉ）重鎖免疫グロブリンおよび該重鎖免疫グロブリンとフレーム内の受容体細胞外ドメインをコードする第１の配列、（ｉｉ）軽鎖免疫グロブリンおよび該軽鎖免疫グロブリンとフレーム内の受容体細胞外ドメインをコードする第２の配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の相補性配列を含む核酸であって、ここに、該重鎖および軽鎖免疫グロブリンがＢＢＢ受容体に対する抗体由来である核酸が提供される。いくつかの具体例において、該コードされた受容体細胞外ドメインは、ＴＮＦ−α受容体、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）受容体、アポトーシスのＴＮＦ様弱インデューサー（ＴＷＥＡＫ）受容体、ＩＬ−６受容体、血管内皮成長因子受容体、またはエフリン（ephrin）受容体由来である。いくつかの具体例において、該コードされた受容体細胞外ドメインは、ＴＮＦ−α受容体（例えば、ヒトＴＮＦ−α受容体）由来である。他の具体例において、該ＴＮＦ−α受容体由来のコードされた受容体細胞外ドメインは、ヒト、マウス、ラットまたはブタＴＮＦ−α受容体細胞外ドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの具体例において、該コードされた免疫グロブリン重鎖または軽鎖は、ヒトインスリン受容体、トランスフェリン受容体またはリポタンパク質受容体に対する抗体由来である。ある特定の具体例において、上記の第１の配列は、配列番号４または７に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも８５％（例えば、９０％、９５％または１００％）同一のアミノ酸配列をコードし、または上記の第２の配列は、配列番号６に対応するアミノ酸配列と少なくとも８５％（例えば、９０％、９５％または１００％）同一のアミノ酸配列をコードする。他の具体例において、該核酸は、高ストリンジェンシー条件下で、配列番号４、６または７をコードする核酸（例えば、配列番号３または５のヌクレオチド配列を含む核酸）にハイブリダイズする。いくつかの具体例において、該ＴＮＦ−α受容体由来のコードされた細胞外ドメインは、重鎖免疫グロブリンまたは軽鎖免疫グロブリンのカルボキシル末端に共有結合される。いくつかの具体例において、該ＴＮＦ−α受容体由来のコードされた細胞外ドメインは、重鎖免疫グロブリンのカルボキシル末端に共有結合される。
【０００７】
いくつかの具体例において、核酸は、核酸ベクターとして提供される。いくつかの具体例において、核酸ベクターは、（ｉ）重鎖免疫グロブリンおよび該重鎖免疫グロブリンとフレーム内の受容体細胞外ドメインをコードする第１の配列、（ｉｉ）軽鎖免疫グロブリンおよび該軽鎖免疫グロブリンとフレーム内の受容体細胞外ドメインをコードする第２の配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の相補性配列を含み、ここに、該重鎖および軽鎖免疫グロブリンは、ＢＢＢ受容体に対する抗体由来である。いくつかの具体例において、該核酸ベクターは、（ｉ）を含み、さらに、ＢＢＢ受容体に対する抗体由来の軽鎖免疫グロブリンをコードする核酸配列を含むか、または（ｉｉ）を含み、さらに、ＢＢＢ受容体に対する抗体由来の重鎖免疫グロブリンをコードする核酸を含む。関連する態様において、上記核酸のいずれかを含む細胞（例えば、哺乳動物細胞）が提供される。
【０００８】
さらなる態様において、受容体細胞外ドメインのアミノ酸配列に共有結合した重鎖免疫グロブリンまたは軽鎖免疫グロブリンのアミノ酸配列を含む二官能性デコイ受容体融合抗体を含む医薬組成物を対象に全身投与することを含む、血液脳関門を横切ってデコイ受容体を送達する方法であって、該融合抗体がＢＢＢ上に発現された受容体および受容体細胞外ドメインのリガンドに結合するところの方法が提供される。いくつかの具体例において、該ＢＢＢ上に発現された受容体は、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）受容体、レプチン受容体、またはリポタンパク質受容体である。いくつかの具体例において、該受容体細胞外ドメインは、ＴＮＦ−α受容体、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）受容体、アポトーシスのＴＮＦ様弱インデューサー（ＴＷＥＡＫ）受容体、ＩＬ−６受容体、血管内皮成長因子受容体、またはエフリン受容体由来である。いくつかの具体例において、該ＴＮＦ−α受容体由来の細胞外ドメインは、重鎖免疫グロブリンまたは軽鎖免疫グロブリンのカルボキシル末端に共有結合している。いくつかの具体例において、該ＴＮＦ−α受容体由来の細胞外ドメインは、重鎖免疫グロブリンのカルボキシル末端に共有結合している。
【０００９】
別の態様において、受容体細胞外ドメインのアミノ酸配列に共有結合した重鎖免疫グロブリンまたは軽鎖免疫グロブリンのアミノ酸配列を含む二官能性デコイ受容体融合抗体を含む医薬組成物の治療上有効量を対象に全身投与することを含むＣＮＳ疾患の治療方法であって、該融合抗体がＢＢＢ上に発現された受容体および受容体細胞外ドメインのリガンドに結合するところの方法が提供される。いくつかの具体例において、該ＢＢＢ上に発現された受容体は、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）受容体、レプチン受容体、またはリポタンパク質受容体である。いくつかの具体例において、該受容体細胞外ドメインは、ＴＮＦ−α受容体、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）受容体、アポトーシスのＴＮＦ様弱インデューサー（ＴＷＥＡＫ）受容体、ＩＬ−６受容体、血管内皮長因子受容体、またはエフリン受容体由来である。いくつかの具体例において、治療されるべきＣＮＳ疾患は、急性ＣＮＳ疾患、例えば、全脳虚血、局所脳虚血、外傷性脳損傷、または脊髄損傷である。他の具体例において、治療されるべきＣＮＳ疾患は、慢性ＣＮＳ疾患、例えば、神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、多発性硬化症、横断性脊髄炎、運動ニューロン疾患、ピック病、結節硬化症、カナバン病、レット症候群、脊髄小脳失調症、フリードライヒ失調症、視神経萎縮、または網膜変性である。
【００１０】
また別の態様において、（ｉ）受容体細胞外ドメインに融合した免疫グロブリン重鎖、および免疫グロブリン軽鎖の両方、または
（ｉｉ）受容体細胞外ドメインに融合した免疫グロブリン軽鎖、および免疫グロブリン重鎖の両方
をコードする単一タンデム発現ベクターを真核細胞中に安定に組み込むことを含む、二官能性デコイ受容体融合抗体を製造する方法であって、該コードされた免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖がＢＢＢ上に発現された受容体に対する抗体由来であるところの方法が提供される。いくつかの具体例において、該ＢＢＢ上に発現された受容体は、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）受容体、レプチン受容体、またはリポタンパク質受容体である。いくつかの具体例において、該コードされた受容体細胞外ドメインは、ＴＮＦ−α受容体、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）受容体、アポトーシスのＴＮＦ様弱インデューサー（ＴＷＥＡＫ）受容体、ＩＬ−６受容体、血管内皮成長因子受容体、またはエフリン受容体由来である。いくつかの具体例において、該ＴＮＦ−α受容体由来の受容体細胞外ドメインは、免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン軽鎖のカルボキシル末端に共有結合される。いくつかの具体例において、該ＴＮＦ−α受容体由来のコードされた受容体細胞外ドメインは、免疫グロブリン重鎖のカルボキシル末端に共有結合される。
【００１１】
出典明示による組み込み
本明細書に挙げられた全ての出版物、特許、および特許出願は、出典明示により、あたかも個々の出版物、特許または特許出願が詳細かつ個々に出典明示により本明細書の一部とされることが示されたかの如く、同程度まで本明細書の一部とされる。
【００１２】
図面の簡単な説明
本発明の新規な特徴は、特に、添付の特許請求の範囲で示される。本発明の特徴および利益のより良い理解は、発明の本質を利用する実例となる具体例を示す下記の詳細な説明、および添付の図面を参照して得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質は、ＴＮＦＲ  ＥＣＤのアミノ末端の、キメラＨＩＲＭＡｂの重鎖のＣＨ３領域のカルボキシル末端への融合によって形成される。該融合タンパク質は、二官能性分子である。すなわち、該融合タンパク質は、ＢＢＢにて、ＨＩＲを結合して脳中への輸送を媒介し、かつ、ＴＮＦ−αを結合して該サイトカインの炎症性を抑制する。
【００１４】
【図２】（Ａ）ヒトＵ８７グリア細胞由来のＲＮＡの逆転写によって生産されたｃＤＮＡからＰＣＲによって生産されたヒトＴＮＦＲ  ＥＣＤ  ｃＤＮＡのアガロースゲルのエチジウムブロマイド染色（レーン１）、およびＴＮＦＲ−特異的ＯＤＮプライマー（表２）。レーン２および３：ＤＮＡサイズ標準。（Ｂ）ｐＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ、ＴＮＦＲ  ＥＣＤおよびキメラＨＩＲＭＡｂの重鎖（ＨＣ）の融合タンパク質をコードする真核細胞発現プラスミドの遺伝子操作。融合遺伝子の５’側には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プローモーターが配置され、３’側には、ウシ成長ホルモンポリＡ（ｐＡ）配列が配置される。
【００１５】
【図３】タンパク質Ａアフィニティー精製キメラＨＩＲＭＡｂおよびＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブルー染色。どちらも均質に精製され、重鎖および軽鎖から構成される。
【００１６】
【図４】抗ヒト（ｈ）ＩｇＧ一次抗体（左パネル）または抗ヒトＴＮＦＲ−ＩＩ一次抗血清（右パネル）のいずれかでのウェスタンブロット。ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質の免疫反応性をキメラＨＩＲＭＡｂと比較する。ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質およびＨＩＲＭＡｂの両方は、抗−ｈＩｇＧウェスタンにおいて同一の軽鎖を有する。ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合重鎖は、抗−ｈＩｇＧおよび抗−ヒトＴＮＦＲ抗体の両方と反応するが、ＨＩＲＭＡｂ重鎖は、抗−ｈＩｇＧ抗体とのみ反応する。ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合重鎖のサイズは、３０ｋＤａ  ＴＮＦＲ  ＥＣＤの５５ｋＤａ  ＨＩＲＭＡｂ重鎖への融合のために、ＨＩＲＭＡｂの重鎖のサイズよりも約３０ｋＤａ大きい。
【００１７】
【図５】キメラＨＩＲＭＡｂまたはＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質のいずれかのＨＩＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する結合は飽和可能である。ＨＩＲ  ＥＣＤに結合するＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲのＥＤ５０は、キメラＨＩＲＭＡｂの結合のＥＤ５０に匹敵する。
【００１８】
【図６】ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質（Ａ）またはＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質（Ｂ）のＴＮＦαに対する結合は飽和可能である。パネルＡに示されるように、ヒトＩｇＧ１のＴＮＦαに対する結合はない。線形回帰分析の傾きは、ＫＤ／Ａｍａｘ比を生じ（ここに、ＫＤは、ＴＮＦαの結合定数であり、Ａｍａｘは、最大吸光度である）、ＴＮＦαに対する結合のＫＤの相対的指標である。ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質およびＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質のどちらも、比較可能なアフィニティーで、ＴＮＦαに結合する。
【００１９】
【図７】（Ａ）ＴＮＦαのＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質に対する結合に関する放射性受容体アッセイのアウトライン。マウス抗−ヒト（ＭＡＨ）ＩｇＧ１  Ｆｃを播種し、それは、ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質のＦｃ領域に結合した。次いで、該融合タンパク質のＴＮＦＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）領域が［１２５Ｉ］−ＴＮＦαに結合し、それを非標識ＴＮＦαの添加によって置換した。（Ｂ）飽和可能な結合を非線形回帰分析によって分析して、ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質に結合しているＴＮＦαの５０％阻害を与えた濃度ＫＤを得た。
【００２０】
【図８】ＴＮＦαは、アクチノマイシンＤで処理したヒトＷＥＨＩ−１３ＶＡＲ細胞において、ＥＤ５０  約１０ｐｇ／ｍＬで細胞毒性を引き起こす。しかしながら、１．４ｎＭ  ＴＮＦＲ：Ｆｃまたは１．４ｎＭ  ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲのいずれかの存在下、高濃度のＴＮＦαによって細胞毒性は引き起こされない。
【００２１】
【図９】ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質の重鎖および軽鎖をコードする分離したタンデムな発現カセット（各遺伝子は、ＣＭＶプロモーターを有する分離したタンデムなイントロンによって駆動し、各々、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化（ｐＡ）配列を末端に有する）を含有するタンデムベクター（ＴＶ）であるｐＴＶ−ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲの遺伝子操作。ｐＴＶ−ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲは、ＨＩＲＭＡｂをコードするユニバーサルＴＶ（ｐＴＶ−ＨＩＲＭＡｂと称する）内で、ＴＮＦＲ  ＥＣＤ  ｃＤＮＡをＨＩＲＭＡｂ  ＨＣカセットの３’末端にて、独特なＨｐａＩ部位にサブクローニングすることによって生じる。ＴＮＦＲ  ＥＣＤ  ｃＤＮＡは、ｐＣＤ−ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲプラスミド（図２Ｂ）を鋳型として用いるＰＣＲによって生産された。
【００２２】
【図１０】ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質の重鎖のドメイン構造。１９アミノ酸ＩｇＧシグナルペプチドの次にＨＩＲＭＡｂ重鎖のＶＨが配置され、それは、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）および４つのＦＲ（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）からなり、次に、ヒトＩｇＧ１重鎖Ｃ領域のドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３）が配置され、次に、３−アミノ酸リンカー（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）が配置され、次に、ヒトＴＮＦＲ−ＩＩ  ＥＣＤの２３５−アミノ酸配列が配置される。３つのＮ−結合型グリコシル化部位に下線を付し、ＣＨ２領域内に１部位およびＴＮＦＲ領域内に２部位を含む。
【００２３】
【図１１】ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質の軽鎖ドメイン構造。２０アミノ酸ＩｇＧシグナルペプチドの次に、ＨＩＲＭＡｂ軽鎖のＶＬが配置され、それは、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）および４つのＦＲ（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）からなり、その次に、ヒトカッパ軽鎖Ｃ領域が配置される。
【００２４】
【図１２】（Ａ）［１２５Ｉ］−ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質および［３Ｈ］−ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質の血漿濃度を、成体アカゲザルにおける該タンパク質の単回静脈内注射後の時間に対してプロットする。データは、％注射用量（Ｉ．Ｄ．）／ｍＬとして表される。（Ｂ）１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）によって沈澱可能な血漿放射活性の％を両タンパク質の注射後の時間に対してプロットする。データは、平均±ＳＥ（ｎ＝１時点につき３回繰り返す）である。
【００２５】
【図１３】濃度曲線下の血漿面積またはＡＵＣ（Ａ）、脳１００グラムあたりの脳取り込み量または注射用量（Ｉ．Ｄ．）％（Ｂ）、およびＢＢＢの透過係数表面積（permeability surface area: ＰＳ）の積（Ｃ）をＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質、ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質、および脳血漿量マーカー、ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）についてプロットする。全ての測定値は、該タンパク質の静脈内投与後２時間で得られた。データは、平均±ＳＥ（ｎ＝１時点につき３回繰り返す）である。
【００２６】
【図１４】ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質に関する器官ＰＳ積に対する、ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質に関する器官ＰＳ積の比率を各器官についてプロットする。データは、平均±ＳＥ（ｎ＝１時点につき３回繰り返す）である。脳に関する比率は、前頭灰白質、前頭白質、小脳灰白質、および小脳白質についての値の平均であり、２２〜３７で変動した。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
Ｉ．序文
ＩＩ．いくつかの定義
ＩＩＩ．血液脳関門
ＩＶ．ＢＢＢを横断する輸送のためのデコイ受容体融合抗体
Ｖ．組成物
ＶＩ．核酸、ベクター、細胞および製造
ＶＩＩ．方法
ＶＩＩＩ．実施例
ＩＸ．配列
【００２８】
略語
ＡＡ                  アミノ酸
ＢＢＢ                血液脳関門
ＢＣＡ                ビシンコニン酸
ＢＧＨ                ウシ成長ホルモン
ＣＤＲ                相補性決定領域
ＣＨＯ                チャイニーズハムスター卵巣
ＣＭＶ                サイトメガロウイルス
ＤＣ                  希釈クローニング
ＤＨＦＲ              ジヒドロ葉酸還元酵素
ＥＣＤ                細胞外ドメイン
ＥＤ５０              ５０％飽和をもたらす有効用量
ＦＲ                  フレームワーク領域
ＦＳ                  フランキング領域
ＦＷＤ                順方向
ＨＣ                  重鎖
ＨＩＲ                ヒトインスリン受容体
ＨＩＲＭＡｂ        ＨＩＲに対するＭＡｂ
ＨＩＲＭＡｂ  ＨＣ    ＨＩＲＭＡｂの重鎖
ＨＩＲＭＡｂ  ＬＣ    ＨＩＲＭＡｂの軽鎖
ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ    ＨＩＲＭＡｂおよびＴＮＦＲ  ＥＣＤの融合タンパク質（ここに、ＴＮＦＲがＨＣカルボキシル末端に融合する）
ＨＴ                  ヒポキサンチン−チミジン
ＩｇＧ                免疫グロブリンＧ
ＩＧＦ                インスリン様成長因子
ＬＣ                  軽鎖
ＭＡｂ                モノクローナル抗体
ＭＡＨ                マウス抗−ヒトＩｇＧ
ＭＴＸ                メトトレキサート
ＭＷ                  分子量
Ｎ                    アスパラギン
ｎｔ                  ヌクレオチド
ＯＤＮ                オリゴデオキシヌクレオチド
ｏｒｆ                オープンリーディングフレーム
ｐＡ                  ポリ−アデニル化
ＰＡＧＥ              ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＰＢＳ                リン酸緩衝化セーライン
ＰＢＳＴ              ＰＢＳおよびＴｗｅｅｎ−２０
ＰＣＲ                ポリメラーゼ連鎖反応
ｐＩ                  等電点
Ｒ                    受容体
ＲＥＶ                逆方向
ＲＮａｓｅ  Ａ        リボヌクレアーゼＡ
ＲＴ                  逆転写
ＲＴ                  室温
ＳＤＭ                部位特異的変異誘発
ＳＤＳ                ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＥＣ                サイズ排除クロマトグラフィー
Ｓｅｒ                セリン
ＳＦＭ                無血清培地
ＴＨ                  トロイの木馬
ＴＮＦ                腫瘍壊死因子
ＴＮＦＲ              ＴＮＦ受容体
ＴＶ                  タンデムベクター
ＵＴＶ                ユニバーサルＴＶ
ＶＨ                  重鎖の可変領域
ＶＬ                  軽鎖の可変領域
【００２９】
Ｉ．序文
遺伝子操作されたデコイ受容体は、特に受容体ＥＣＤがヒト免疫グロブリンＧ、例えばＩｇＧ１のＦｃフラグメントのアミノ末端に融合される場合、強力な新規治療剤である。Ｆｃフラグメントは、２つの定常領域鎖からなる二量体タンパク質である。ほとんどの受容体は膜内で二量体を形成するので、受容体ＥＣＤのＦｃフラグメントへの融合により、受容体タンパク質の天然二量体コンフィギュレーションが可能となる。デコイ受容体のよく記載される一例は、ＴＮＦαデコイ受容体−Ｆｃ融合タンパク質である。ＴＮＦαデコイ受容体−Ｆｃ融合タンパク質は、プロ炎症性サイトカイン、ＴＮＦαを封鎖し、それにより、その内因性リガンドによる内因性ＴＮＦＲの活性化を阻害する能力のために、末梢性炎症疾患の強力な生物学的治療剤である。しかしながら、ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質は、ＣＮＳ疾患のために処方することはできない。
【００３０】
血液脳関門は、全身投与された可溶性デコイ受容体の中枢神経系への送達に対する厳しい障害であり、ここに、それらは、いくつかの神経病理、例えば、神経炎症において役割を果たすある種のリガンド（例えば、ＴＮＦ−α）を中和するように作用する。本明細書に記載の組成物および方法は、ＢＢＢを横断してデコイ受容体をＣＮＳへ送達することにおける重要な３つの因子、すなわち、１）ＢＢＢを横断できるようにするための受容体細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の修飾（本明細書中で、「デコイ受容体」という）、２）全身投与された修飾されたＩｇＧ−受容体融合抗体のＣＮＳ中への取り込み量および率、および３）一旦ＢＢＢを横断したデコイ受容体活性の保持に向けられる。本明細書に記載の方法および組成物の種々の態様は、介在するリンカー配列を用いて、またはリンカー配列を用いずに、ＢＢＢ上に発現された受容体（例えば、ヒトインスリン受容体）の細胞外ドメインに対する免疫グロブリン（重鎖または軽鎖）に融合したデコイ受容体を含む、全身投与することができる融合抗体を提供することによって、これらの因子に向けられる。
【００３１】
したがって、本発明は、その必要のある対象に、ＢＢＢ上に発現された受容体（例えば、ｈＩＲ）に対する抗体および受容体ＥＣＤ（例えば、ヒトＴＮＦ−α受容体ＥＣＤ）を含む二官能性デコイ受容体融合抗体の治療上有効量を全身投与することによる、必要とする対象、例えば、ＣＮＳ炎症に罹患した対象またはその危険性のある対象の中枢神経系にデコイ受容体（例えば、可溶性ＴＮＦ−α受容体ＥＣＤ）を送達するための組成物および方法を提供する。
【００３２】
ＩＩ．いくつかの定義
「抗体」なる語は、天然または部分合成もしくは全合成免疫グロブリンをいう。該用語は、また、抗原結合ドメインである結合ドメインまたは抗原結合ドメインに相同性の結合ドメインを有するいずれかのポリペプチドまたはタンパク質を包含する。ＣＤＲ移植（grafted）抗体もまた、該用語によって意図される。
【００３３】
「天然抗体」および「天然免疫グロブリン」は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、典型的に、１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結され、一方、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖によってジスルフィド結合の数は変化する。各重鎖および軽鎖は、また、規則的に間隔をあけた鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一方の端に可変ドメイン（「ＶＨ」）を有し、続いて、いくつかの定常ドメイン（「ＣＨ」）を配置する。各軽鎖は、一方の端に可変ドメイン（「ＶＬ」）、もう一方の端に定常ドメイン（「ＣＬ」）を有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと並んでおり、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと並んでいる。特定のアミノ酸残基は、軽鎖および重鎖可変ドメイン間にインターフェースを形成すると考えられる。
【００３４】
「可変ドメイン」なる語は、ファミリーメンバーのなかで（すなわち、異なるアイソ形態のなかで、または異なる種において）広範囲に配列が異なるタンパク質ドメインをいう。抗体に関して、「可変ドメイン」なる語は、特定の抗原に対する各特定の抗体の結合および特異性において使用される抗体の可変ドメインをいう。しかしながら、変化性（variability）は、抗体の可変ドメインを通して均等に分布されているわけではない。それは、軽鎖および重鎖可変ドメインともに、超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分を「フレームワーク領域」または「ＦＲ」と呼ぶ。非修飾重鎖および軽鎖の各々の可変ドメインは、４つのＦＲ（各々、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）を含み、それは、主として、場合によっては、β−シート構造の一部を形成するβ−シート構造を連結するループを形成する３つの超可変領域によって連結されたβ−シートコンフィギュレーションを採用している。各鎖の超可変領域は、ＦＲによってごく接近して結びついており、他の鎖由来の超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、（１９９１），Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．，第６４７−６６９頁参照）。定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞毒における抗体の関与などの種々のエフェクター機能を示す。
【００３５】
「超可変領域」なる語は、本明細書中で使用される場合、抗原−結合に関与する抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域は、相補的に抗原に直接結合し、各々、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として知られる３つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基を含む。軽鎖可変ドメインにおいて、ＣＤＲは、典型的に、およその残基２４−３４（ＣＤＲＬ１）、５０−５６（ＣＤＲＬ２）および８９−９７（ＣＤＲＬ３）に相当し、重鎖可変ドメインにおいて、ＣＤＲは、典型的に、およその残基３１−３５（ＣＤＲＨ１）、５０−６５（ＣＤＲＨ２）および９５−１０２（ＣＤＲＨ３）に相当し（Ｋａｂａｔら、（１９９１），  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．参照）、および／または「超可変ループ」由来の残基（すなわち、軽鎖可変ドメインにおいて、残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）および９１−９６（Ｌ３）、および重鎖可変ドメインにおいて、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）および９６−１０１（Ｈ３））に相当する（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ，（１９８７），  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９６：９０１−９１７参照）。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、「可変フレームワーク領域」または「ＶＦＲ」なる語は、抗原結合ポケットまたは溝の一部を形成し、および／または抗原に接触しうるフレームワーク残基をいう。いくつかの具体例において、フレームワーク残基は、抗原結合ポケットまたは溝の一部であるループを形成する。該ループにおけるアミノ酸残基は、抗原に接触しても、しなくてもよい。ある具体例において、ＶＦＲのループアミノ酸は、抗体の三次元構造、抗体重鎖または抗体軽鎖の検査により決定される。溶媒にアクセス可能なアミノ酸位置はおそらく、ループを形成し、および／または抗体可変ドメインに接触する抗原を提供するので、該三次元構造は、溶媒にアクセス可能なアミノ酸位置について分析することができる。溶媒にアクセス可能な位置のいくつかは、アミノ酸配列多様性を容認でき、その他は（例えば、構造的位置）あまり多様化されることがない。抗体可変ドメインの三次元構造は、結晶構造またはタンパク質モデリングから由来することができる。いくつかの具体例において、ＶＦＲは、重鎖可変ドメインのアミノ酸位置７１〜７８（該位置は、Ｋａｂａｔら、１９９１にしたがって規定される）に対応するアミノ酸位置を含む、該アミノ酸位置から実質的になる、または該アミノ酸位置からなる。いくつかの具体例において、ＶＦＲは、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３の間に配置されたフレームワーク領域３の一部を形成する。ＶＦＲは、標的抗原と接触するように、または抗原結合ポケットの一部を形成するように配置されたループを形成することができる。
【００３７】
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは種々のクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、このうちいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメイン（Ｆｃ）は、各々、α、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元コンフィギュレーションは、よく知られている。
【００３８】
いずれかの脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパまたは（「κ」）およびラムダまたは（「λ」）と呼ばれる２つの明らかに別個の型のうちの１つに割り当てることができる。
【００３９】
本明細書に記載の抗体または融合抗体への言及において、「選択的に結合する」、「選択的に結合」、「特異的に結合する」または「特異的に結合」なる語は、解離定数（Ｋｄ）が約１０−６Ｍ以下、すなわち、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１または１０−１２Ｍである、抗体または融合抗体のその標的抗原に対する結合をいう。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、「抗体」なる語は、また、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１以上のフラグメントを意味すると理解される（概して、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、（２００５），  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  ２３（９）：１１２６−１１２９参照）。かかる抗体の非限定的な例は、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる１価のフラグメント、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２個のＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄら、（１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ，  ３４１：５４４  ５４６）、および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を包含する。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、組み換え法を用いて、これらのドメインを、ＶＬおよびＶＨ領域が対になって一価の分子を形成する単一タンパク質鎖とすることが可能な合成リンカーによって連結することができる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄら、（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４２：４２３  ４２６；  ａｎｄ  Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８５：５８７９  ５８８３；およびＯｓｂｏｕｒｎら、（１９９８），  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １６：７７８参照）。かかる一本鎖抗体もまた、「抗体」なる語に包含されることが意図される。特異的ｓｃＦｖのいずれのＶＨおよびＶＬ配列も、完全ＩｇＧ分子または他のアイソタイプをコードする発現ベクターを生成するために、ヒト免疫グロブリン定常領域ｃＤＮＡまたはゲノム配列に連結することができる。ＶＨおよびＶＬは、また、タンパク質化学または組み換えＤＮＡ技術を用いて、Ｆａｂ、Ｆｖまたは免疫グロブリンの他のフラグメントの生成に使用することができる。一本鎖抗体の他の形態、例えば、ダイアボディもまた包含される。
【００４１】
「Ｆ（ａｂ’）２」および「Ｆａｂ’」部分は、免疫グロブリン（モノクローナル抗体）をペプシンおよびパパインなどのプロテアーゼで処理することによって製造でき、２つのＨ鎖の各々において、ヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合付近で免疫グロブリンを消化することによって生成される抗体を包含する。例えば、パパインは、２つのＨ鎖の各々において、ヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の上流でＩｇＧを切断して、ＶＬ（Ｌ鎖可変領域）およびＣＬ（Ｌ鎖定常領域）からなるＬ鎖、およびＶＨ（Ｈ鎖可変領域）およびＣＨγ１（Ｈ鎖の定常領域におけるγ１領域）からなるＨ鎖フラグメントがジスルフィド結合を介してそれらのＣ末端領域で連結した２つの相同性抗体フラグメントを生成する。これらの２つの相同性抗体フラグメントの各々は、Ｆａｂ’と呼ばれる。また、ペプシンは、２つのＨ鎖の各々において、ヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の下流でＩｇＧを切断して、２つの上記Ｆａｂ’がヒンジ領域で連結したフラグメントよりも僅かに大きい抗体フラグメントを生成する。該抗体フラグメントをＦ（ａｂ’）２と呼ぶ。
【００４２】
Ｆａｂフラグメントは、また、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域由来の１以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端にて２、３個の残基の付加によってＦａｂフラグメントと相違する。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’のための本明細書中での名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、元々、Ｆａｂ’フラグメントの対として生産されたフラグメントであり、該フラグメント間にヒンジシステインを有する。抗体フラグメントの他の化学的カップリングもまた、知られている。
【００４３】
「Ｆｖ」なる語は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含有する最小抗体フラグメントである。該領域は、密接な非共有結合において、１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。該コンフィギュレーションにおいて、各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面における抗原−結合部位を明確に規定する。集合的に、６つの超可変領域が抗原−結合特異性を抗体に付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）であっても、抗原を認識し、結合する能力を有するが、完全な結合部位よりもアフィニティーは低い。
【００４４】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨ、ＶＬ、またはＶＨおよびＶＬの両方のドメインを含み、ここに、両ドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。いくつかの具体例において、Ｆｖポリペプチドは、さらに、ＶＨおよびＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを含み、それにより、該ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成できるようにする。ｓＦｖの概要に関し、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｖｏｌ．  １１３，  Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．  ２６９  ３１５  （１９９４）を参照のこと。
【００４５】
「キメラ」抗体は、異なる哺乳動物起源の組合せから得られる抗体を包含する。該哺乳動物は、例えば、ウサギ、マウス、ラット、ヤギ、またはヒトであってもよい。異なる哺乳動物の組合せは、ヒトおよびマウス起源のフラグメントの組合せを包含する。
【００４６】
いくつかの具体例において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）、典型的にはマウスモノクローナル抗体のヒト化によって誘導される、キメラヒト−マウス抗体である。かかる抗体は、例えば、抗原投与に応答して特異的なヒト抗体を産生するように「操作」されたトランスジェニックマウスから得られる。該技術において、ヒト重鎖および軽鎖上の座にある要素が、内在性重鎖および軽鎖上の座の標的とされた破壊を含有する胚性幹細胞系列から由来するマウス系統中に導入される。該トランスジェニックマウスは、ヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、該マウスは、ヒト抗体を分泌するハイブリドーマを生産するために使用することができる。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、「治療」または「治療する」なる語は、治療的利益および／または予防的利益を達成することを包含する。治療的利益によって、治療されている原因となる障害または疾患の根絶または改善が意味される。治療の予防的利益には、疾患の危険性を減少すること、疾患の進行を遅らせること、または疾患の発症の可能性を減少することが包含される。本明細書中で使用される場合、「治療する」または「治療」には、予防が包含される。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、「有効量」は、全身投与される場合、ＣＮＳにおいて有益な結果または所望の結果をもたらすのに十分な量であることができる。有効量は、また、予防的効果を生じる量、例えば、急性の病理学的状態または望ましくない状態の出現を遅延させる、減少させる、または排除する量である。有効量は、１以上の投与において投与することができる。治療に関して、本発明の組成物の「有効量」は、障害、例えば、神経学的障害の進行を緩和、改善、安定化、逆転または遅延させるのに十分な量である。「有効量」は、単独または疾患もしくは障害を治療するために使用される１以上の薬剤と共に使用される本発明の組成物のいずれかであってもよい。本発明の意味内で治療剤の「有効量」は、患者の担当医師または獣医師によって決定されるであろう。かかる量は、当業者によって容易に確かめられ、本発明にしたがって投与される場合、治療効果をもたらすであろう。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、「分子のトロイの木馬」なる語は、ＢＢＢを横断して輸送される分子であって、それ自体でＢＢＢを横断しない別の分子に共有または非共有結合した場合、ＣＮＳ中へのＢＢＢ横断輸送（trans-BBB transport）のための渡し船として作用することができる分子をいう。分子のトロイの木馬の例は、限定するものではないが、ＢＢＢ上に発現された受容体、例えば、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、ＩＧＦ受容体、リポタンパク質受容体、またはレプチン受容体のＥＣＤに結合するポリペプチド（例えば、抗体）を包含する。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、「対象」または「個体」は、動物、例えば、哺乳動物である。いくつかの具体例において、「対象」または「個体」は、ヒトである。いくつかの非限定的な具体例において、対象は、慢性または急性ＣＮＳ疾患に罹患している。
【００５１】
いくつかの具体例において、デコイ受容体ＥＣＤ−ＢＢＢ受容体Ａｂ融合抗体を含む薬理学的組成物は、「末梢に投与される」または「末梢投与される」。本明細書中で使用される場合、これらの用語は、ＣＮＳに対する直接的投与ではない、すなわち、薬剤を血液脳関門の脳ではない側と接触させる、個体に対する薬剤、例えば、治療剤の投与のいずれかの形態をいう。本明細書中で使用される場合、「末梢投与」は、静脈内、動脈内、皮下、筋内、腹腔内、経皮、吸入によるもの、経頬、鼻腔内、経腸、経口、非経口、舌下、または経鼻を包含する。
【００５２】
本明細書において、「医薬上許容される担体」または「医薬上許容される賦形剤」は、それ自体が組成物を受け取る個体に有害な抗体産生を誘導しないいずれかの担体をいう。かかる担体は、当業者に周知である。医薬上許容される担体／賦形剤のディスカッション全体は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｇｅｎｎａｒｏ，  ＡＲ，  ｅｄ．，  ２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２０００：  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ  ＰＡ，  ＵＳＡに見ることができる。例示的な医薬上許容される担体は、塩、例えば、無機酸塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など、および有機酸の塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等を包含することができる。例えば、本発明の組成物は、液体形態で提供されてもよく、０．０１−１％のポリソルベート−８０などの界面活性剤、または炭水化物添加剤、例えば、マンニトール、ソルビトールまたはトレハロースを用いて、または用いずに、種々のｐＨ（ｐＨ５〜８）のセーラインを基礎とする水性溶液中で処方されてもよい。一般的に使用されるバッファーは、ヒスチジン、酢酸塩、リン酸塩、またはクエン酸塩を包含する。
【００５３】
「組み換え宿主細胞」または「宿主細胞」は、挿入方法、例えば、直接的取り込み、形質導入、ｆ−交配、または組み換え宿主細胞を作出するための当該分野で既知の他の方法に関係なく、外因性ポリヌクレオチドを含む細胞をいう。該外因性ポリヌクレオチドは、非組み込みベクター、例えば、プラスミドとして維持されてもよく、または別法では、宿主ゲノム中に組み込まれてもよい。
【００５４】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」なる語は、本明細書中で交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーを示す。すなわち、ポリペプチドに向けられた記載は、等しく、ペプチドの記載およびタンパク質の記載に適用され、その逆も同様である。該用語は、天然のアミノ酸ポリマーならびに１以上のアミノ酸残基が非天然アミノ酸、例えば、アミノ酸類似体であるアミノ酸ポリマーに適用される。本明細書中で使用される場合、該用語は、全長タンパク質（すなわち、抗原）を包含するいずれの長さのアミノ酸鎖も包含し、ここに、該アミノ酸残基は共有ペプチド結合によって連結される。
【００５５】
「アミノ酸」なる語は、天然および非天然アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物をいう。天然にコードされるアミノ酸は、２０個の一般的なアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン）およびピロリジンおよびセレノシステインである。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素に結合したα炭素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムをいう。かかる類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。
【００５６】
アミノ酸は、本明細書において、一般的に知られた３文字記号によって、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される１文字記号によって言及されうる。同様に、ヌクレオチドは、一般的に許容される１文字コードによって言及されうる。
【００５７】
「核酸」なる語は、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、またはリボヌクレオチドおよび一本鎖または二本鎖形態のいずれかのそのポリマーをいう。特に限定しない限り、該用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、天然ヌクレオチドと同様に代謝される天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。別段に特に限定しない限り、該用語は、また、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、アンチセンス技術において使用されるＤＮＡの類似体（ホスホロチオエート、ホスホロアミデートなど）を包含するオリゴヌクレオチド類似体をいう。別記しない限り、特定の核酸配列は、また、その保存的に修飾された変種（限定するものではないが、縮重コドン置換を包含する）および相補性配列ならびに明示された配列を暗示的に包含する。詳細には、縮重コドン置換は、１以上の選択された（または全ての）コドンの３番目の位置を混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって達成されうる（Ｂａｔｚｅｒら（１９９１），  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，  １９：５０８１；  Ｏｈｔｓｕｋａら（１９８５），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６０：２６０５−２６０８；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉら（１９９４），  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８）。
【００５８】
「単離」および「精製」なる語は、その天然環境から実質的または本質的に除去された、またはその天然環境において濃縮された物質をいう。例えば、単離された核酸は、通常それと隣接する核酸から分離させたもの、または試料中の他の核酸または成分（タンパク質、脂質など）から分離させたものであってもよい。別の例では、ポリペプチドがその天然環境から実質的に除去された、またはその天然環境において濃縮された場合、それは精製されている。核酸およびタンパク質の精製および単離方法は、当該分野で周知である。
【００５９】
「ＢＢＢ受容体Ａｂ」なる語は、血液脳関門上に発現された受容体の細胞外ドメインに対する抗体をいう。ＢＢＢ受容体の非限定的な例は、インスリン受容体（例えば、ヒトインスリン受容体）、トランスフェリン受容体、リポタンパク質受容体、およびレプチン受容体を包含する。
【００６０】
ＩＩＩ．血液脳関門
ＢＢＢは、脳および脊髄の毛細管を形成する内皮細胞を一緒に固める密着な結合によって形成される（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，  ２００８，  Ｂｉｏｃｏｎｊ  Ｃｈｅｍ，  １９：  １３２７−１３３８）。ヒトの脳において、４００マイルの脳毛細管が存在する。ＢＢＢをイン・ビボで形成する脳毛細管内皮原形質膜を横断する電気抵抗は、いずれの生物膜と同様に高い。血液と器官との間の遊離溶質交換のための通常の細胞間隙および細胞間経路は、ＣＮＳには存在しない。結果的に、血液中の薬物は、２つのメカニズム、すなわち、（ｉ）小型分子の高い脂溶性のための自由拡散、および（ｉｉ）内因性ＢＢＢトランスポーターを介する輸送のうちの１つだけを介して脳にアクセスすることができる。デコイ受容体組成物のためのＢＢＢ薬物送達問題の解決に対する１のアプローチは、ＢＢＢ内のある特定の内因性輸送システムにアクセスできるように、デコイ受容体を再操作することである。本明細書に記載の方法は、本明細書に記載のデコイ受容体融合抗体組成物の全身投与後、機能的デコイ受容体が末梢血からＣＮＳ中へＢＢＢを横断できるようにする。本明細書中に記載の方法は、ＢＢＢ上の表面に発現された発現受容体（例えば、ヒトインスリン受容体）を利用して、所望の二官能性受容体ＥＣＤ−ＢＢＢ受容体融合抗体を末梢血からＣＮＳ中へ輸送する。
【００６１】
ＩＶ．ＢＢＢを横断する輸送のためのデコイ受容体融合抗体
一の態様において、本発明は、重鎖免疫グロブリンまたは軽鎖免疫グロブリンのアミノ酸配列に共有結合した受容体ＥＣＤ（例えば、ヒトＴＮＦ−α受容体ＥＣＤ）のアミノ酸配列を含有する二官能性デコイ受容体融合抗体を利用する組成物および方法を提供する。かかる二官能性デコイ受容体融合抗体は、ＢＢＢ上に発現された受容体および該受容体ＥＣＤのリガンドに結合することができる。該組成物および方法は、ＢＢＢを横断して末梢血からＣＮＳ中へデコイ受容体を輸送するのに有用である。
【００６２】
ＢＢＢは、いくつかの巨大分子の血液から脳への輸送を可能にする特定の受容体を有することが示された（これらのトランスポーターは、本発明の組成物のトランスポーターとして適当である）。本発明に有用な内因性ＢＢＢ受容体介在性輸送システムは、限定するものではないが、インスリン、トランスフェリン、インスリン様生長因子１および２（ＩＧＦ１およびＩＧＦ２）、レプチン、およびリポタンパク質を輸送するものを包含する。いくつかの具体例において、本発明は、内因性インスリンＢＢＢ受容体介在性輸送システム、例えば、ヒト内因性インスリンＢＢＢ受容体介在性輸送システムを介してＢＢＢを横断することができる抗体を利用する。いくつかの具体例において、該二官能性デコイ受容体融合抗体は、ＨＩＲ抗体を含む。本明細書に記載のデコイ受容体−ＨＩＲＡｂ融合抗体は、ヒトインスリン受容体のＥＣＤに結合する。いくつかの具体例において、該デコイ受容体ＥＣＤは、重鎖免疫グロブリン（例えば、ＨＩＲＡｂ重鎖免疫グロブリン）のカルボキシル末端に融合する。他の具体例において、該デコイ受容体ＥＣＤは、軽鎖免疫グロブリン（例えば、ＨＩＲＡｂ軽鎖免疫グロブリン）のＣ末端に融合する。いくつかの場合、上記の受容体ＥＣＤは、ヒト、マウス、ラットまたはブタサイトカイン受容体、ＴＮＦ−α受容体、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）受容体、アポトーシスのＴＮＦ様弱インデューサー（ＴＷＥＡＫ）受容体、ＩＬ−６受容体、血管内皮成長因子受容体、またはエピフリン受容体由来のＥＣＤに対して、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または少なくとも８０％〜１００％のうちの別のパーセント）同一のアミノ酸配列を含有する。いくつかの具体例において、上記の受容体ＥＣＤは、サイトカイン受容体由来である。いくつかの具体例において、受容体ＥＣＤは、ＴＮＦ−α受容体ドメイン（例えば、ヒトＴＮＦ−α受容体ＥＣＤ）を含有する。上記の受容体のアミノ酸配列についてＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を下記の表１に提供する。
【００６３】
【表１】
0005873003.tif 000002
【００６４】
インスリン受容体およびその細胞外インスリン結合ドメイン（ＥＣＤ）は、構造的および機能的に当該分野において広範囲に特徴付けられている。例えば、Ｙｉｐら（２００３），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７８（３０）：２７３２９−２７３３２；およびＷｈｉｔｔａｋｅｒら（２００５），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２８０（２２）：２０９３２−２０９３６参照のこと。ヒトインスリン受容体のアミノ酸およびヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ ０００２０８の下に見出すことができる。
【００６５】
ＢＢＢ上に発現されたインスリン受容体は、それにより、ＢＢＢを横断するデコイ受容体、例えば、ＴＮＦ−α受容体ＥＣＤの輸送のためのベクターとして作用することができる。ある特定のインスリン受容体ＥＣＤ特異的抗体は、内因性リガンドを模倣していてもよく、それにより、特異的受容体システム上の輸送を介して、原形質膜障壁を横断しうる。ある特定の具体例において、受容体デコイ−ＨＩＲＡｂ融合抗体は、ヒトＢＢＢ  ＨＩＲ上の外表面エピトープを結合し、該結合により、ヒトＢＢＢインスリン受容体が介在する輸送反応を介して、該融合抗体のＢＢＢの横断を可能にする。
【００６６】
ヒトにおける使用のために、キメラＨＩＲＡｂは、ヒトへの投与時に有意に免疫原性ではない十分なヒト配列、例えば、約８０％ヒトおよび約２０％マウス、または約８５％ヒトおよび約１５％マウス、または約９０％ヒトおよび約１０％マウス、または約９５％ヒトおよび約５％マウス、または約９５％より多くのヒトおよび約５％未満のマウス配列を含有することが好ましい。本発明における使用のために、十分なヒト配列を有するヒトＢＢＢインスリン受容体に対するキメラ抗体が、例えば、Ｂｏａｄｏら（２００７），  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，  ９６（２）：３８１−３９１に記載される。また、ＨＩＲＭＡｂのより高度にヒト化した形態を操作することもでき、該ヒト化ＨＩＲ  Ａｂは、ネズミＨＩＲ  Ａｂに匹敵する活性を有し、本発明の具体例において使用することができる。例えば、米国特許出願公開第２００４０１０１９０４号（２００２年１１月２７日出願）および第２００５０１４２１４１号（２００５年２月１７日出願）を参照のこと。
【００６７】
例示的具体例において、二官能性デコイ受容体融合抗体は、ヒトインスリン受容体に対する結合について、配列番号４および６、または配列番号６および７のアミノ酸配列を含有する二官能性デコイ受容体融合抗体と競合する。いくつかの場合、該競合する二官能性デコイ受容体は、配列番号４および６、または配列番号６および７のアミノ酸配列を含有する機能的デコイ受容体融合抗体に対して、少なくとも約２０％、例えば、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または少なくとも約２０％〜１００％のうちの別のパーセント同一のヒトインスリン受容体に関するアフィニティーを有する。他の具体例において、該二官能性デコイ受容体融合抗体は、配列番号４および６、または配列番号６および７に対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または少なくとも約８０％〜約１００％のうちの他のパーセント同一のアミノ酸配列を含有する。
【００６８】
本発明で使用されるＢＢＢ受容体抗体は、グリコシル化されていてもよく、またはグリコシル化されていなくてもよい。該抗体がグリコシル化されている場合、該抗体の機能に有意に影響を及ぼさないいずれかのグリコシル化パターンが用いられうる。グリコシル化は、抗体が産生される細胞の典型的なパターンで生じることができ、細胞型によって変化しうる。例えば、マウスミエローマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体のグリコシル化パターンは、トランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって産生されたモノクローナル抗体のグリコシル化パターンとは相違することができる。いくつかの具体例において、該抗体は、トランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって産生されるパターンでグリコシル化される。
【００６９】
現行の技術により、ＢＢＢ受容体Ａｂｓまたはデコイ受容体ＥＣＤの大量の配列変種を容易に生成し（例えば、イン・ビトロで）、ヒトインスリン受容体のＥＣＤなどの標的抗原への結合について、またはデコイ受容体ＥＣＤのリガンドへの結合についてスクリーンすることが可能になることは、当業者に明らかであろう。例えば、抗体配列変種のウルトラハイスループットスクリーニングの一例として、Ｆｕｋｕｄａら（２００６），  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，  ３４（１９）（オンラインで公開）を参照のこと。また、Ｃｈｅｎら、（１９９９），  Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ，  １２（４）：  ３４９−３５６を参照のこと。配列変種を単離するために、全配列または特定のドメインに対応する特定のサブ配列の無作為変異誘発を行ってもよい。別法では、ＢＢＢ受容体またはデコイ受容体リガンド結合に不可欠であることが知られている残基の変異を回避しつつ、部位特異的変異誘発を繰り返し実施することができる。例えば、Ｍｕｋａｉら（２００９），  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，  ３８５（４）：１２２１−１２２９に記載されているように、例えば、ＴＮＦ−α受容体の構造機能が当該分野で知られている。さらに、デコイ受容体ＥＣＤ配列の複数の変種、例えば、ヒトＴＮＦ−α受容体の変種の生成において、変異認容予測（mutation tolerance prediction）プログラムを用いて、厳密な無作為変異誘発によって生じるであろう非機能的配列変種の数を大幅に減らすことができる。タンパク質配列におけるアミノ酸置換のタンパク質機能に対する影響を予測するための種々のプラグラム（例えば、ＳＩＦＴ、ＰｏｌｙＰｈｅｎ、ＰＡＮＴＨＥＲ  ＰＳＥＣ、ＰＭＵＴ、およびＴｏｐｏＳＮＰ）が例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆら（２００６），  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ７：６１−８０に記載されている。したがって、上記のように、当該分野でルーチンな方法によって、デコイ受容体（例えば、ヒトＴＮＦ−α受容体ＥＣＤ配列）配列変種の非常に多様な「ライブラリー」を作製し、スクリーニングすることによって、非常に大量の操作可能なデコイ受容体ＥＣＤ配列変種を得ることができることは、当業者に明らかであろう。
【００７０】
パーセント配列同一性は、常法によって決定される。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９８６），  Ｂｕｌｌ．  Ｍａｔｈ．  Ｂｉｏ．，  ４８：６０３、およびＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ，（１９９２），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８９：１０９１５を参照のこと。簡単に言えば、ギャップオープニングペナルティ１０、ギャップエクステンションペナルティ１、およびＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（上掲）の「ＢＬＯＳＵＭ６２」スコアリングマトリックスを用いて、２つのアミノ酸配列をアラインメントスコアが最適になるようにアラインする。次いで、パーセント同一性は、｛（完全に一致した全数）／［（より長い配列の長さ）＋（２つの配列をアラインするためにより長い配列中に導入したギャップの数）］｝（１００）として計算される。
【００７１】
２つのアミノ酸配列をアラインするために利用可能な多くの確立されたアルゴリズムが存在することは、当業者に明らかである。ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの「ＦＡＳＴＡ」類似性サーチアルゴリズムは、本明細書中に開示されるアミノ酸配列および別のペプチドのアミノ酸配列によって共有される同一性のレベルを調べるための適当なタンパク質アラインメント法である。ＦＡＳＴＡアルゴリズムは、Ｐｅａｒｓｏｎら（１９８８），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８５：２４４４、およびＰｅａｒｓｏｎ（１９９０），  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １８３：６３によって記載される。簡単に言えば、ＦＡＳＴＡは、まず、保存的アミノ酸置換、挿入または欠失を考慮せずに、クエリー配列（例えば、配列番号４または配列番号６）および最大密度の同一性（ｋｔｕｐ変数が１の場合）または同一性対（ｋｔｕｐ＝２の場合）のいずれかを有する試験配列によって共有される領域を同定することによって、配列類似性を特徴付ける。次いで、最大密度の同一性を有する１０個の領域を、アミノ酸置換マトリックスを用いて、全ての対になったアミノ酸の類似性を比較することによって再スコア化し、該領域の末端は、最大スコアに寄与する残基のみを含むように「トリミング」する。「カットオフ」値（配列の長さおよびｋｔｕｐ値に基づく所定の式によって計算される）よりも大きいスコアを有するいくつかの領域が存在する場合、トリミングされた最初の領域を、ギャップを有する近似のアラインメントを形成するように該領域を結合できるか否か決定するために試験する。最終的に、２つのアミノ酸配列の最大スコア領域を、アミノ酸挿入および欠失を可能にするＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ−Ｓｅｌｌｅｒｓアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０），  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４４；  Ｓｅｌｌｅｒｓ  （１９７４），  ＳＩＡＭ  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．，  ２６：７８７）の修飾を用いてアラインする。ＦＡＳＴＡ分析の実例的パラメーターは、ｋｔｕｐ＝１、ギャップオープニングペナルティ＝１０、ギャップエクステンションペナルティ＝１、および置換マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２である。これらのパラメーターは、Ｐｅａｒｓｏｎ，  （１９９０），  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １８３：６３のＡｐｐｅｎｄｉｘ  ２において説明されるように、スコアリングマトリックスファイル（「ＳＭＡＴＲＩＸ」）を修飾することによって、ＦＡＳＴＡプログラム中に導入することができる。
【００７２】
本発明は、また、本明細書中に開示されるアミノ酸配列と比較して、保存的アミノ酸変化を有するタンパク質を包含する。一般的なアミノ酸のなかでも、例えば、「保存的アミノ酸置換」は、下記の各群内でのアミノ酸間の置換によって説明される。（１）グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、（２）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、（３）セリンおよびスレオニン、（４）アスパラギン酸およびグルタミン酸、（５）グルタミンおよびアスパラギン、および（６）リジン、アルギニンおよびヒスチジン。ＢＬＯＳＵＭ６２表は、タンパク質配列セグメントの約２，０００の局所的な複数のアラインメントに由来するアミノ酸置換マトリックスであり、５００以上のグループの関連タンパク質の非常に保存された領域を示す（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら（１９９２），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ，  ８９：１０９１５）。したがって、ＢＬＯＳＵＭ６２置換頻度を用いて、本発明のアミノ酸配列中に導入されうる保存的アミノ酸置換を規定することができる。化学的特性のみに基づいて（上記のように）アミノ酸置換を設計することが可能であるが、「保存的アミノ酸置換」なる語は、好ましくは、−１よりも大きいＢＬＯＳＵＭ６２値によって表される置換をいう。例えば、アミノ酸置換は、置換が０、１、２または３のＢＬＯＳＵＭ６２値によって特徴付けられるが場合、保存的である。該システムによると、好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも１（例えば、１、２または３）のＢＬＯＳＵＭ６２値によって特徴付けられるが、より好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも２（例えば、２または３）のＢＬＯＳＵＭ６２値によって特徴付けられる。
【００７３】
また、アミノ酸配列は、該配列が本発明の組成物および方法において機能的であるのに十分な生物学的タンパク質活性を保持する限り、付加的な残基、例えば、付加的なＮ−またはＣ−末端アミノ酸を含んでいてもよく、依然として実質的に、本明細書中に開示される配列の１つにおいて示されるとおりであることは、理解されよう。
【００７４】
Ｖ．組成物
顕著なことには、本明細書に記載の二官能性デコイ受容体融合抗体は、高い割合で、それらの分離した構成タンパク質の活性、すなわち、ＢＢＢ受容体ＡｂのＢＢＢ受容体、例えば、ヒトインスリン受容体ＥＣＤに対する結合、およびデコイ受容体ＥＣＤ（例えば、ＴＮＦ−α受容体）の同族（cognate）リガンドに対する結合を保持する。
【００７５】
本明細書には、デコイ受容体ＥＣＤに融合したＢＢＢを横断することができるＢＢＢ受容体Ａｂを含有する二官能性デコイ受容体−ＢＢＢ受容体融合抗体であって、ここに、該血液脳関門を横断できるＢＢＢ受容体Ａｂおよび該受容体ＥＣＤは各々、別々に存在した場合のそれらの活性と比較して、それらの活性の少なくとも約５、１０、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４０、４５または５０％を保持する該融合抗体が記載される。ＢＢＢ受容体Ａｂの例は、インスリン受容体（例えば、ヒトインスリン受容体）、トランスフェリン受容体、およびリポタンパク質受容体に対するＡｂｓ（例えば、モノクローナルＡｂｓ）を包含する。適当な受容体ＥＣＤの例は、限定するものではないが、ヒト、マウス、ラット、またはブタサイトカイン受容体、ＴＮＦ−α受容体、ＴＮＦ−関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）受容体、アポトーシスのＴＮＦ様弱インデューサー（ＴＷＥＡＫ）受容体、ＩＬ−６受容体、血管内皮成長因子受容体、またはエフリン受容体に対して、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％または少なくとも８０％〜１００％のうちの別のパーセント）同一のアミノ酸配列を含有するものを包含する。
【００７６】
いくつかの具体例において、ＢＢＢ受容体Ａｂは、ヒトインスリン受容体（ＨＩＲ）のＥＣＤに対する抗体である。本明細書に記載の二官能性デコイ受容体−ＢＢＢ受容体Ａｂ融合抗体において、ＢＢＢ受容体抗体および受容体ＥＣＤ間の共有結合は、該結合が該デコイ受容体ＥＣＤ−ＢＢＢ受容体Ａｂ融合抗体の該ＢＢＢ受容体のＥＣＤに対する結合および血液脳関門の横断を可能にし、かつ、該デコイ受容体ＥＣＤの活性の治療上有用な部分の保持、例えば、該活性の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または約１０％〜１００％のうちの別のパーセントの保持を可能にする限り、ＢＢＢ受容体抗体重鎖免疫グロブリンまたは軽鎖免疫グロブリンのカルボキシまたはアミノ末端にあってもよい。ある特定の具体例において、共有結合は、該抗体のＨＣおよび該デコイ受容体ＥＣＤ間にある。他の具体例において、共有結合は、該抗体のＬＣおよび該デコイ受容体ＥＣＤ間にある。いずれの適当な結合を用いてもよく、例えば、デコイ受容体ＥＣＤのアミノ末端に対して軽鎖のカルボキシル末端、デコイ受容体ＥＣＤのアミノ末端に対して重鎖のカルボキシル末端、またはデコイ受容体ＥＣＤのカルボキシル末端に対して軽鎖のアミノ末端を用いてもよい。好ましい具体例において、該結合は、ＨＣのカルボキシル末端からデコイ受容体ＥＣＤのアミノ末端へのものである。いくつかの具体例において、該融合抗体組成物は、そのＮ末端を介してヒトインスリン受容体抗体の重鎖のＣ末端に共有結合したヒトＴＮＦ−α受容体ＥＣＤを含む。
【００７７】
末端アミノ酸間の結合が融合アミノ酸配列の一部を形成する介在性ペプチドリンカー配列によって達成できることは、明らかであろう。該ペプチド配列リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０以上のアミノ酸長であってもよい。いくつかの具体例において、２−アミノ酸リンカーを用いる。いくつかの具体例において、該リンカーは、配列ｓｅｒ−ｓｅｒを有する。該ペプチドリンカー配列は、プロテアーゼ切断部位を含みうるが、これは、デコイ受容体ＥＣＤの活性の必要条件ではない。実際、本発明のこれらの具体例の利点は、該二官能性デコイ受容体−ＢＢＢ受容体抗体融合抗体が切断を伴わずに、一旦ＢＢＢを横断すれば、輸送および活性の両方に関して部分的または完全に活性であることである。図１０は、デコイ受容体ＥＣＤ−ＢＢＢ受容体抗体融合抗体のアミノ酸配列の例示的具体例を示し、それは、ＨＣがそのカルボキシル末端によって、３アミノ酸「ｓｅｒ−ｓｅｒ−ｓｅｒ」リンカーを介して、該ＴＮＦ−α受容体ＥＣＤのアミノ末端に融合しているヒトＴＮＦ−α受容体ＥＣＤ−ＨＩＲ抗体融合抗体（配列番号４）である。
【００７８】
いくつかの具体例において、デコイ受容体−ＢＢＢ受容体Ａｂ融合抗体は、ＨＣおよびＬＣの両方を含む。いくつかの具体例において、該デコイ受容体−ＢＢＢ受容体Ａｂ融合個体は一価抗体である。他の具体例において、該デコイ受容体−ＢＢＢ受容体Ａｂ融合抗体は、実施例セクションにいおいて本明細書中で記載されるような二価抗体である。
【００７９】
該デコイ−ＢＢＢ受容体Ａｂ融合抗体の一部として用いられるＢＢＢ受容体Ａｂは、グリコシル化または非グリコシル化することができる。いくつかの具体例において、該抗体は、例えば、ＣＨＯ細胞におけるその合成によって生じるグリコシル化パターンにおいて、グリコシル化される。
【００８０】
本明細書中で使用される場合、「活性」は、生理学的活性（例えば、ＢＢＢ横断能および／または治療活性）、ＢＢＢ受容体Ａｂのその標的ＢＢＢ受容体に関する結合アフィニティー、またはデコイ受容体の同族リガンド（例えば、ＴＮＦ−αデコイ受容体の場合、ＴＮＦ）に関するアフィニティーを包含する。
デコイ受容体−ＢＢＢ受容体Ａｂ融合抗体のＢＢＢを横断する輸送は、標準的な方法によってＢＢＢ受容体Ａｂを単独でＢＢＢを横断して輸送する場合と比較してもよい。例えば、動物モデル、例えば、非ヒト霊長類のような哺乳動物によるデコイ受容体−ＢＢＢ受容体Ａｂ融合抗体の薬物動力学および脳への取り込みを用いてもよい。同様に、デコイ受容体リガンド結合を決定するための標準的なモデル（例えば、ＥＬＩＳＡ）を用いて、デコイ受容体ＥＣＤ単独の機能およびデコイ受容体−ＢＢＢ受容体Ａｂ融合抗体の一部としての機能を比較してもよい。例えば、ＴＮＦαのＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦ−デコイ受容体融合タンパク質に対する結合  対  ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）−ＩＩ：ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質（ＴＮＦＲ：Ｆｃと称する）に対する結合を明らかにする実施例４を参照のこと。ＢＢＢ受容体に関する結合アフィニティーをまた、デコイ受容体−ＢＢＢ受容体Ａｂ融合抗体  対  ＢＢＢ受容体Ａｂ単独に関して比較することができる。例えば、実施例４を参照のこと。
【００８１】
いくつかの場合、デコイ受容体−ＢＢＢ受容体ＡＢ融合抗体（例えば、ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質）の脳への取り込みは、タンパク質１００グラムあたり１％、２％、３％、５％、７％または１０％ＩＤ以上である。デコイ受容体−ＢＢＢ受容体Ａｂ融合抗体のＢＢＢを横断する輸送は、また、デコイ受容体およびヒトＩｇＧのＦｃフラグメントの融合タンパク質、例えば、ＴＮＦＲ：ＦｃのＢＢＢを横断する輸送と比較してもよい。デコイ受容体−ＢＢＢ受容体ＡＢ融合抗体（例えば、ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質）の脳への取り込みは、デコイ受容体およびヒトＩｇＧのＦｃフラグメントの融合タンパク質、例えば、ＴＮＦＲ：Ｆｃの脳への取り込みより１、２、５、１０、１３、１５、１７、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０倍以上大きくてもよい。脳および他の器官について、器官クリアランス定数（本明細書中では、透過係数表面積（ＰＳ）積という）は、本明細書に記載の融合タンパク質について計算されうる。本明細書に記載のデコイ受容体−ＢＢＢ受容体ＡＢ融合抗体（例えば、ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質）は、他の器官と比較した場合、脳において選択的に豊富に存在しうる。例えば、ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質に関する器官ＰＳ積に対する、本明細書に記載のデコイ受容体−ＢＢＢ受容体ＡＢ融合抗体（例えば、ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質）に関する器官ＰＳ積の比率を複数の器官について測定した場合（例えば、図１４参照）、脳での比率は、他の器官、例えば、脂肪、筋肉、心臓、肺、肝臓または脾臓の比率より１、２、５、１０、１３、１５、１７、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０倍以上大きくてもよい。
【００８２】
また、本明細書中には、本明細書に記載の１以上のデコイ受容体−ＢＢＢ受容体Ａｂ融合抗体、および医薬上許容される賦形剤を含有する医薬組成物が包含される。医薬上許容される担体／賦形剤の全体的な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｇｅｎｎａｒｏ，  ＡＲ，  ｅｄ．，  ２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２０００：  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ  ＰＡ，  ＵＳＡに見出すことができる。本発明の医薬組成物は、静脈内、皮下、筋内、腹腔内注射、経口、経腸、経頬、経皮、鼻腔内、またはいずれか他の末梢投与に適当な経路を包含するいずれかの末梢経路を介する投与に適当な組成物を包含する。
【００８３】
本発明の組成物は、例えば、静脈内、皮下、筋内、または腹腔内投与のための医薬組成物として、特に注射に適する。本発明の水性組成物は、本発明の組成物の有効量を含み、医薬上許容される担体または水性媒体中に溶解または分散させてもよい。「医薬上」または「薬理学上許容される」なる語は、適宜、動物、例えば、ヒトに投与時に、有害な反応、アレルギー性反応または他の都合の悪い反応を生じない分子および組成物をいう。本明細書中で使用される場合、「医薬上許容される担体」は、いずれかおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを包含する。医薬上活性な物質のためのかかる媒体および剤の使用は、当該分野で周知である。いずれかの通常の媒体または剤が活性成分と混合できない場合を除き、治療組成物におけるその使用が意図される。補足的活性成分もまた、該組成物中に配合することができる。
【００８４】
注射組成物のための例示的医薬上許容される担体は、カルシウム塩、例えば、塩化カルシウム、臭化カルシウム、硫化カルシウムなど、および有機酸の塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などを包含することができる。例えば、本発明の組成物は、液体形態で提供されてもよく、０．０１−１％のポリソルベート−８０などの界面活性剤、または炭水化物添加剤、例えば、マンニトール、ソルビトールまたはトレハロースを用いて、または用いずに、種々のｐＨ（ｐＨ５〜８）のセーラインを基礎とする水性溶液中で処方されてもよい。一般的に使用されるバッファーは、ヒスチジン、酢酸塩、リン酸塩、またはクエン酸塩を包含する。通常の保管および使用条件下、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するための保存剤を含有することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされることができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖類または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射組成物の吸収延長は、該組成物における吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム、およびゼラチンの使用によってもたらされることができる。
【００８５】
ヒト投与の場合、調製物は、ＦＤＡおよび他の規制当局標準によって要求される滅菌性、発熱性、一般的な安全性および純度標準を満たす。活性化合物は、一般に、非経口投与のために処方され、例えば、静脈内、筋内、皮下、病巣内または腹腔内経路を介する注射のために処方される。活性成分を含有する水性組成物の調製は、本明細書の開示を考慮して、当業者に既知であろう。典型的には、かかる組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかの注射剤として調製でき、注射前に、液体の添加による溶液または懸濁液の調製において使用するのに適当な固体形態も調製することができ、該調製物は乳化されることもできる。
【００８６】
滅菌注射溶液は、必要量の活性化合物を上記した種々の他の成分と共に、適当な溶媒中に配合し、次いで、フィルター滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、種々の滅菌活性成分を、基礎分散媒体および上記した必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に配合することによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法は、予めフィルター滅菌した溶液から活性成分およびいずれかの付加的な所望の成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥技術を包含する。
【００８７】
処方において、溶液は、投与処方に適合する方法で、かつ、本明細書に記載の基準に基づいて治療上有効量で、全身投与される。該処方は、種々の投与形態で、例えば、上記の注射溶液の形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども使用できる。
【００８８】
投与されるべき医薬組成物の適当な量、治療の回数、および単位投与量は、本明細書に記載のデコイ受容体−ＢＢＢ受容体Ａｂ融合抗体のＣＮＳ取り込み特徴によって、および治療されるべき対象および対象の病態によって変化する。いずれの事象においても、投与責任者が個々の対象の適当な投与量を決定する。
【００８９】
静脈内または筋内注射などの非経口投与のために処方された化合物の他に、限定するものではないが、皮内投与（米国特許第５，９９７，５０１号、第５，８４８，９９１号、および第５，５２７，２８８号参照）、肺投与（米国特許第６，３６１，７６０号、第６，０６０，０６９号、および第６，０４１，７７５号参照）、頬投与（米国特許第６，３７５，９７５号および第６，２８４，２６２号参照）、経皮投与（米国特許第６，３４８，２１０号および第６，３２２，８０８号参照）および経粘膜投与（米国特許第５，６５６，２８４参照）を包含する本発明の他の投与方法を用いてもよい。かかる投与方法は、当該分野で周知である。また、例えば、点鼻溶液またはスプレー、エーロゾルまたは吸入薬と共に、本発明の鼻腔内投与を使用してもよい。点鼻溶液は、通常、滴またはスプレーで鼻道に投与されるように設計された水性溶液である。点鼻溶液は、多くの点で、鼻汁に類似するように調製される。かくして、水性点鼻溶液は、通常、等張性であり、ｐＨ５．５〜６．５を維持するようにわずかに緩衝化される。さらに、必要に応じて、眼科用調製物において使用されるものと同様な抗微生物保存剤および適当な安定化剤を処方中に含ませてもよい。種々の市販の点鼻調製物が知られており、例えば、抗生物質および抗ヒスタミン剤を包含し、喘息予防に使用される。
【００９０】
他の投与様式に適当なさらなる処方は、座剤およびペッサリーを包含する。直腸ペッサリーまたは座剤もまた、使用してもよい。座剤は、通常、薬物を加えられた、直腸または尿道に挿入するための種々の重量および形状の固体投与形態である。挿入後、腔液中で座剤が軟化、溶融または溶解する。座剤の場合、伝統的な結合剤および担体は、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを包含し、かかる座剤は、活性成分を適当な範囲、例えば、０．５％〜１０％、好ましくは１％−２％で含有する混合物から形成されうる。
【００９１】
経口処方は、例えば、製薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような通常使用される賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性処方、または粉末の形態を取る。ある規定された具体例において、経口医薬組成物は、不活性希釈剤、または同化可能な食用担体を含み、または硬もしくは軟外皮ゼラチンカプセル中に被包されてもよく、または打錠されてもよく、または食事の食物と直接混合してもよい。経口治療投与の場合、活性化合物は賦形剤と混合してもよく、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁、シロップ、ウウェハーなどの形態で使用されうる。かかる組成物および調製物は、少なくとも０．１％の活性化合物を含有することができる。組成物および調製物のパーセンテージは、もちろん、変動してもよく、通常、単位重量の約２〜７５％または約２５−６０％でありうる。かかる治療上有用な組成物中における活性化合物の量は、適当な投与量が得られるような量である。
【００９２】
錠剤、トローチ、丸薬、カプセルなどは、また、結合剤、例えば、トラガカントゴム、アラビアゴム、トウモロコシデンプン、またはゼラチン、賦形剤、例えば、リン酸二カルシウム、崩壊剤、例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸など、滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、および甘味剤、例えば、シュークロース、ラクトースまたはサッカリン、またはフレーバー剤、例えば、ペパーミント、冬緑油、またはチェリーフレーバーを含有していてもよい。投与単位形態がカプセルである場合、上記のタイプの材料のほかに、液体担体を含有していてもよい。種々の他の材料がコーティングとして、または投与単位の物理的形態を修飾するために存在していてもよい。例えば、錠剤、丸薬またはカプセルは、シェラック、糖またはその両方で被覆されていてもよい。エリキシルのシロップは、活性化合物、甘味剤としてシュークロース、保存剤としてメチレンおよびプロピルパラベン、色素およびフレーバー、例えば、チェリーまたはオレンジフレーバーを含有していてもよい。いくつかの具体例において、経口医薬組成物は、活性成分を胃環境から保護するために、腸溶性被覆されていてもよく、腸溶性被覆方法および処方は当該分野で周知である。
【００９３】
ＶＩ．核酸、ベクター、細胞および製造
本発明は、また、核酸、ベクター、細胞、および製造方法を提供する。いくつかの具体例において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸、例えば、（ｉ）重鎖免疫グロブリンおよび該重鎖免疫グロブリンとフレーム内の受容体細胞外ドメインをコードする第１の配列、（ｉｉ）軽鎖免疫グロブリンおよび該軽鎖免疫グロブリンとフレーム内の受容体細胞外ドメインをコードする第２の配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の相補性配列を含む核酸を提供する。該上記の核酸によってコードされる重鎖および軽鎖免疫グロブリンは、ＢＢＢ受容体、例えば、ヒトインスリン受容体、トランスフェリン受容体、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）受容体、レプチン受容体、またはリポタンパク質受容体に対する抗体由来である。いくつかの場合、該コードされる受容体ＥＣＤは、ＴＮＦ−α受容体、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）受容体、アポトーシスのＴＮＦ様弱インデューサー（ＴＷＥＡＫ）受容体、ＩＬ−６受容体、血管内皮成長因子受容体、またはエフリン受容体由来である。いくつかの場合、該コードされる受容体のアミノ酸配列は、外来受容体の一つ由来のＥＣＤのアミノ酸配列に対し、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または少なくとも約８０％〜約１００％のうちの他のパーセント同一である。いくつかの場合、該核酸は、ヒト、マウス、ラット、またはブタＴＮＦ−α受容体の細胞外ドメインに対し、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または少なくとも約８０％〜約１００％のうちの他のパーセント同一のアミノ酸配列を含むＥＣＤをコードする。いくつかの具体例において、第１の配列は、配列番号４または７に相当するアミノ酸配列に対し、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または少なくとも約８０％〜約１００％のうちの他のパーセント同一のアミノ酸配列をコードする。他の具体例において、第２の配列は、配列番号６に相当するアミノ酸配列に対し、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または少なくとも約８０％〜約１００％のうちの他のパーセント同一のアミノ酸配列をコードする。
【００９４】
本明細書中に提供される核酸は、いくつかの場合、さらに、ＭＡｂの重鎖および受容体ＥＣＤ間のペプチドリンカーをコードする核酸配列を含有することができる。いくつかの具体例において、該リンカーは、Ｓ−Ｓ−Ｍである。他の具体例において、該リンカーは、Ｓ−Ｓである。別の具体例において、該リンカーは、Ｓ−Ｓ−Ｓである。該核酸は、さらに、シグナルペプチドをコードする核酸配列を含有していてもよく、ここに、該シグナルペプチドは、該重鎖に連結される。当該分野で既知の、または続いて開発されたいずれかの適当なシグナル配列が使用されうる。いくつかの具体例において、重鎖免疫グロブリンに結合したシグナルペプチドは、配列番号４のアミノ酸１−１９と約６０、７０、８０、９０、９５、９９、または１００％同一の配列を含む。いくつかの具体例において、該核酸は、他のシグナルペプチドをコードする核酸配列を含有し、ここに、該他のシグナルペプチドは該軽鎖に連結される。該軽鎖に連結したシグナルペプチドは、配列番号６のアミノ酸１−２０と約６０、７０、８０、９０、９５、９９、または１００％同一の配列を含むことができる。
【００９５】
本発明は、また、核酸ベクターを提供する。該ベクターは、本明細書に記載の核酸配列のいずれかを含有することができる。いくつかの具体例において、該ベクターは、（ｉ）ＢＢＢ受容体に対する抗体由来の重鎖免疫グロブリンおよび該重鎖免疫グロブリンとフレーム内の受容体細胞外ドメインをコードする第１の配列（またはその相補体）、または（ｉｉ）ＢＢＢ受容体に対する抗体由来の軽鎖免疫グロブリンおよび該軽鎖免疫グロブリンとフレーム内の受容体細胞外ドメインをコードする第２の配列（またはその相補体）を含む。いくつかの具体例において、本発明は、核酸配列を提供し、いくつかの具体例において、本発明は、特定のヌクレオチド配列と少なくとも約６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％同一の核酸配列を提供する。例えば、いくつかの具体例において、本発明は、配列番号３または５に対し、少なくとも約６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％同一の配列を含有する核酸を提供する。
【００９６】
いくつかの具体例において、本発明は、（ｉ）ＢＢＢ受容体に対する抗体由来の重鎖免疫グロブリンおよび該重鎖免疫グロブリンとフレーム内の受容体細胞外ドメインをコードする第１の配列（またはその相補体）、および（ｉｉ）ＢＢＢ受容体に対する抗体由来の軽鎖免疫グロブリンおよび該軽鎖免疫グロブリンとフレーム内の受容体細胞外ドメインをコードする第２の配列（またはその相補体）の両方を含有する単一タンデム発現ベクター（全てが一片の核酸、例えば、一片のＤＮＡ中に組み込まれている）（本明細書中では、「タンデムベクター」という）を提供する。該単一タンデムベクターは、また、一以上の選択および／または増幅遺伝子、例えば、ＤＨＦＲ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイブロマイシンホスホトランスフェラーゼ、またはピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼを含むことができる。いくつかの具体例において、該コードされる選択マーカーは、ＤＨＦＲである。いくつかの具体例において、該タンデムベクターは、ＤＨＦＲおよび第２の選択／増幅マーカー（例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）をコードする。本発明の例示的なタンデムベクターの作製方法は、実施例に提供される。しかしながら、該ベクターを構築するために、当該分野で既知のいずれの適当な技術を用いてもよい。
【００９７】
単一タンデムベクターの使用は、いくつかの利益を有する。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）遺伝子での真核細胞系統のトランスフェクションは、一般的に、該細胞系統と、ＩｇＧを含む重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）をコードする別のプラスミドとの共トランスフェクションを含む。ＩｇＧ融合タンパク質の場合、該組み換え治療タンパク質をコードする遺伝子は、ＨＣまたはＬＣ遺伝子のいずれかに融合していてもよい。しかしながら、該共トランスフェクションアプローチは、ＨＣおよびＬＣ−融合遺伝子、またはＨＣ−融合およびＬＣ遺伝子を等しく高い割合で組み込んだ細胞系統の選択を困難にする。本発明のある特定の具体例において利用される融合タンパク質の製造に対するアプローチは、ＤＮＡの一本鎖上に、ＨＣ−融合タンパク質遺伝子、ＬＣ遺伝子、選択遺伝子、例えば、ｎｅｏ、および増幅遺伝子、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を包含する必要とする遺伝子の全てを含有する単一プラスミドＤＮＡで永続的にトランスフェクトされた細胞系統の生産である。図９における融合タンパク質タンデムベクターのダイアグラムに示されるように、ＨＣ−デコイ受容体融合遺伝子、ＬＣ遺伝子、ｎｅｏ遺伝子、およびＤＨＦＲ遺伝子は全て、別々であるがタンデムなプロモーター、および別々であるがタンデムな転写終止配列の調節下にある。したがって、治療タンパク質とＨＣまたはＬＣ  ＩｇＧ遺伝子のいずれかとの融合遺伝子を包含する全ての遺伝子は、宿主細胞ゲノム中に等しく組み込まれる。
【００９８】
本発明は、さらに、本発明の１以上のベクターを組み込んだ細胞を提供する。該細胞は、原核細胞または真核細胞であってもよい。いくつかの具体例において、該細胞は真核細胞である。いくつかの具体例において、該細胞は、マウスミエローマハイブリドーマ細胞である。いくつかの具体例において、該細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。ベクターを細胞中に組み込むための例示的方法は、実施例に提供する。しかしながら、ベクターを細胞中に組み込むために、当該分野で既知のいずれの適当な技術を用いてもよい。いくつかの具体例において、本発明は、免疫グロブリン融合タンパク質を発現することができる細胞を提供し、ここに、該細胞は、免疫グロブリン軽鎖遺伝子および治療剤に融合した免疫グロブリン重鎖の遺伝子の両方が一片の核酸、例えば、ＤＮＡ中に組み込まれている単一タンデム発現ベクターが永続的に組み込まれた細胞である。いくつかの具体例において、本発明は、免疫グロブリン融合タンパク質を発現することができる細胞を提供し、ここに、該細胞は、免疫グロブリン重鎖遺伝子およびデコイ受容体ＥＣＤに融合した免疫グロブリン軽鎖の遺伝子の両方が一片の核酸、例えば、ＤＮＡ中に組み込まれている単一タンデム発現ベクターが安定に組み込まれた細胞である。該タンデムベクターの細胞中への導入は、例えば、染色体核酸中への導入、またはエピソーム遺伝子エレメントの導入によるものであってもよい。
【００９９】
２つの核酸の配列比較のために、典型的には１つの配列が、試験配列を比較するための参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験および参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。デフォルトプログラムパラメーターを用いることができ、または別のパラメーターを指定することができる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
【０１００】
本明細書中で使用される場合、「比較ウィンドウ」は、２０〜６００、通常、約５０〜約２００、より普通には、約１００〜約１５０からなる群から選択される隣接位置の数のいずれか１つのセグメントに対するリファレンスを含み、ここに、配列は、２つの配列を最適にアラインした後に、同じナンバーの隣接位置の参照配列と比較されうる。比較のための配列をアラインメントする方法は、当該分野で周知である。比較のための配列の最適アラインメントは、限定するものではないが、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９７０），  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．，  ２：４８２ｃの局所ホモロジーアルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，（１９７０），  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ４８：４４３のホモロジーアラインメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，（１９８８），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８５：２４４４の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピューターによる手段によって（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）、または手動アラインメントおよび目視によって（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９５  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ），  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ参照）実施することができる。
【０１０１】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適当なアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、各々、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７），  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２５：３３８９−３４０２、およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０），  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２１５：４０３−４１０に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから公的に入手可能である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、１１のワードレングス（Ｗ）、１０のエクスペクテーション（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を用いる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、典型的に、「低複雑性」フィルターを切って（turned off）実施される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２配列間の類似性の統計学的分析を行う（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，  （１９９３），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０：５８７３−５７８７参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１測定値は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、それは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の合致が偶然に起こる確率を示す。例えば、参照核酸に対する試験核酸の比較において、最小合計確率が約０．２未満、より好ましくは、約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は参照配列に類似するとみなされる。
【０１０２】
当該分野で周知のように、遺伝子コードの縮重のために、適当なコドンのいずれかの組合せを用いて所望の融合タンパク質をコードしうる。さらに、組み換え技術に有用な他のエレメント、例えば、プロモーター、終止シグナルなどもまた、核酸配列中に含まれうる。かかるエレメントは、当該分野で周知である。さらに、本明細書中に記載され、請求される全ての核酸配列は、該配列の相補体を包含する。
【０１０３】
いくつかの具体例において、本発明の核酸は、低、中程度または高ストリンジェンシー条件下で、配列番号４、６または７のアミノ酸配列をコードする核酸に特異的にハイブリダイズする。例えば、かかる核酸は、低、中程度または高ストリンジェンシー条件下で、配列番号３、５、その両方のヌクレオチド配列、またはその相補配列を含む核酸配列にハイブリダイズしうる。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、例えば、２ＸＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中４２℃にて、約４０％〜約７０％ＧＣ含量の１００ヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイゼーションを包含する。中程度ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、例えば、０．５Ｘ  ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中５０℃でのハイブリダイゼーションを包含する。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、例えば、０．２Ｘ  ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中６５℃にて、上記のプローブを用いるハイブリダイゼーションを包含する。これらの条件下では、ハイブリダイゼーション温度が高いので、より高いホモロジーを有する核酸を得ることができる。
【０１０４】
さらに、本発明は、二官能性デコイ受容体融合抗体を製造する方法を提供する。いくつかの具体例において、本発明は、二官能性デコイ受容体融合抗体を製造する方法であって、真核細胞中に、（ｉ）受容体細胞外ドメインに融合した免疫グロブリン重鎖、および免疫グロブリン軽鎖の両方、または（ｉｉ）受容体細胞外ドメインに融合した免疫グロブリン軽鎖、および免疫グロブリン重鎖の両方（ここに、コードされる免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖は、ＢＢＢ上に発現された受容体に対する抗体由来である）をコードする単一タンデム発現ベクターを安定に組み込むことを含む方法を提供する。ＢＢＢ受容体に対する適当な抗体、および受容体ＥＣＤは、上記の抗体および受容体ＥＣＤのいずれかを包含する。
【０１０５】
本発明は、免疫グロブリン融合タンパク質を発現すること、および／または免疫グロブリン融合タンパク質を精製することを包含する。発現および精製を包含する例示的な製造方法は、実施例に提供される。
【０１０６】
しかしながら、該タンパク質を製造、所望により発現、および精製するために、当該分野で既知のいずれの適当な技術を用いてもよい。これらは、タンパク質合成の非組み換え技術、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄによって最初に開発され、Ｓｔｅｗａｒｔら（１９８４），Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓに記載されるような手動または自動の固相合成を包含する。化学合成は、アミノ酸をＣ末端で開始する所定の配列中に加える。基本的な固相方法は、Ｃ末端を保護したα−アミノ酸を適当な不溶性樹脂支持体に結合させることを必要とする。合成のためのアミノ酸は、その前の残基（または樹脂支持体）との適当なペプチド結合形成を保証するために、α−アミノ基上の保護を必要とする。カルボキシル末端での縮合反応の完了後、α−アミノ保護基を除去して、次の残基の付加を可能にする。いくつかのクラスのα−保護基が記載されており（Ｓｔｅｗａｒｔら（１９８４），Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ参照）、酸に不安定なウレタンを基礎とするターシャリー−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）が歴史的に好ましい。他の保護基、および関連する化学手法を用いてもよく、塩基に不安定な９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）を包含する。また、合成が完了するまで、反応性アミノ酸側鎖官能基は、ブロックする必要がある。官能性ブロッキング基の複雑なアレイは、それらの使用に対する手法および制限とともに、Ｂｏｄａｎｓｋｙ（１９７６），Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＳｙｎｔｈｅｓｉｓおよびＳｔｅｗａｒｔら（１９８４），Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓに概説されている。
【０１０７】
固相合成は、記載されるＣ末端α−保護アミノ酸残基のカップリングによって開始する。カップリングは、活性化剤、例えば、１−ヒドロキシベンゾ−トリアゾール（ＨＯＢＴ）を伴う、または伴わないジシクロヘキシカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＩＰＣ）、またはエチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）を必要とする。Ｃ末端残基をカップリング後、α−アミノ保護基は、酸に不安定なターシャリー−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基の場合、ジクロロメタン中のトリフルオロ酢酸（２５％以上）によって除去される。ジクロロメタン中のトリエチルアミン（１０％）での中和工程は、遊離アミン（対 塩）を回収する。Ｃ末端残基を樹脂に付加した後、脱保護、中和およびカップリングサイクルを中間の洗浄工程と共に繰り返して、保護されたペプチド鎖を伸長する。各保護されたアミノ酸は、適当な溶媒中の等モル量のカップリング試薬を用いて、過剰に（３〜５倍）導入される。最終的に、完全にブロックしたペプチドを樹脂支持体上に構築した後、試薬をアプライして該樹脂から該ペプチドを切断し、側鎖ブロッキング基を除去する。無水フッ化水素（ＨＦ）は、酸に不安定なターシャリー−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）化学基を切断する。特に側鎖官能基上の副反応を回避するために、いくつかの求核性スカベンジャー、例えば、ジメチルスルフィドおよびアニソールが含まれる。
【０１０８】
ＶＩＩ．方法
本明細書に記載のデコイ受容体−ＢＢＢ受容体Ａｂ融合抗体のいずれかを全身投与することによって、デコイ受容体をＢＢＢを横断して送達するための方法が本明細書中に記載される。いくつかの具体例において、受容体細胞外ドメインのアミノ酸配列に共有結合した重鎖免疫グロブリンまたは軽鎖免疫グロブリンのアミノ酸配列を含む二官能性デコイ受容体融合抗体であって、ＢＢＢ上に発現された受容体および該受容体細胞外ドメインのリガンドに結合する該融合抗体を含む医薬組成物を対象に全身投与することによって、ＣＮＳ疾患を治療するために、本明細書に記載の組成物を投与する。いくつかの場合、治療されるべきＣＮＳ疾患は、急性ＣＮＳ疾患、例えば、局所脳虚血、全脳虚血、外傷性脳損傷、または脊髄損傷である。いくつかの場合、治療されるべきＣＮＳ疾患は、慢性ＣＮＳ疾患である。いくつかの具体例において、慢性ＣＮＳ疾患は、神経変性ＣＮＳ疾患、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、多発性硬化症、横断性脊髄炎、運動ニューロン疾患、ピック病、結節硬化症、カナバン病、レット症候群、脊髄小脳失調症、フリードライヒ失調症、視神経萎縮、または網膜変性である。
【０１０９】
いくつかの具体例において、卒中、頭部損傷、脊髄損傷、または神経変性疾患に罹患している対象を治療するために、ＴＮＦ−α受容体ＥＣＤ−ＢＢＢ受容体融合抗体が全身投与される。他の具体例において、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）−ＥＣＤ−ＢＢＢ受容体Ａｂ融合抗体を対象に全身投与して、脳腫瘍における血管新生を阻害する。いくつかの場合、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）由来の認知症を治療するために、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド受容体（ＴＲＡＩＬ−Ｒ）ＥＣＤ−ＢＢＢ受容体Ａｂ融合抗体を投与する。いくつかの具体例において、多発性硬化症（ＭＳ）を治療するために、インターロイキン（ＩＬ）−６デコイ受容体ＥＣＤ−ＢＢＢ受容体Ａｂ融合抗体を全身投与する。さらなる具体例において、卒中を治療するために、アポトーシスのＴＮＦ様弱インデューサー（ＴＷＥＡＫ）受容体デコイＥＣＤ−ＢＢＢ受容体Ａｂ融合抗体を全身投与する。また別の具体例において、卒中または脳損傷後の神経修復を促進するために、エフリン受容体、ＥｐｈＡ  ＥＣＤ−ＢＢＢ受容体Ａｂ融合抗体を全身投与する。
【０１１０】
デコイ受容体−ＢＢＢ受容体Ａｂ融合抗体の送達に適当な全身投与量は、投与されるべき特定のデコイ受容体−ＢＢＢ受容体Ａｂ融合抗体、そのＣＮＳ取り込み特徴およびデコイ受容体リガンドに対するそのアフィニティーに基づいて、変化するであろう。
【０１１１】
いくつかの具体例において、投与されるべきデコイ受容体−ＢＢＢ受容体Ａｂ融合抗体は、インスリン受容体（例えば、ヒトインスリン受容体）、トランスフェリン受容体、
インスリン様成長お因子（ＩＧＦ）受容体、レプチン受容体、またはリポタンパク質受容体に対する抗体を含有し、該デコイ受容体は、ＴＮＦ−α受容体、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）受容体、アポトーシスのＴＮＦ様弱インデューサー（ＴＷＥＡＫ）受容体、ＩＬ−６受容体、血管内皮成長因子受容体、またはエフリン受容体由来のＥＣＤを含有する。いくつかの具体例において、投与されるべき該デコイ受容体−ＢＢＢ受容体Ａｂ融合抗体は、ＴＮＦ−α受容体−ヒトインスリン受容体Ａｂ融合抗体である。
【０１１２】
本明細書中で使用される場合、「全身投与」または「末梢投与」なる語は、ＣＮＳ中への直接的投与ではない、すなわち、ＢＢＢの物理的貫通または破壊を含まないいずれかの投与方法を包含する。「全身投与」には、限定するものではないが、静脈内、動脈内、筋内、皮下、腹腔内、鼻腔内、経頬、経皮、直腸、経肺胞（吸入）、または経口投与が包含される。本明細書中に記載されるように、いずれの適当なデコイ受容体−ＢＢＢ受容体Ａｂ融合抗体を使用してもよい。
【０１１３】
本発明の組成物は、組合せ療法の一部として投与されうる。組合せ療法は、上記のＣＮＳ疾患のいずれかに罹患している患者において典型的に見出される症状の治療または軽減のための別の療法と組み合わせた本発明の組成物の投与を含む。本発明の組成物を別のＣＮＳ障害方法または組成物と組み合わせて用いる場合、本発明の組成物および付加的な方法または組成物のいずれの組合せを用いてもよい。かくして、例えば、本発明の組成物の使用が別のＣＮＳ障害治療剤と組み合わせられている場合、該２つを同時に、連続的に、持続時間が重なるように、類似した頻度で、同じ頻度で、または異なる頻度などで投与してもよい。いくつかの場合、本発明の組成物を１以上の他のＣＮＳ障害治療剤と組み合わせて含有する組成物が用いられるであろう。
【０１１４】
いくつかの具体例において、該組成物、例えば、二官能性ＴＮＦ−α受容体ＥＣＤ−ＢＢＢ受容体Ａｂ融合抗体を患者に、同じ処方内で、別の薬物療法と共に、または別々の組成物として共投与する。例えば、該二官能性ＴＮＦ−α受容体−ヒトインスリン受容体Ａｂ融合抗体は、別の二官能性デコイ受容体−ＢＢＢ受容体Ａｂ融合抗体と共に処方することができる。さらに、ＴＮＦ−α受容体ＥＣＤ−ＢＢＢ受容体Ａｂ融合抗体は、他の大きいまたは小さい分子と組み合わせて処方してもよい。ＣＮＳまたはＣＮＳ関連疾患を治療するために、デコイ受容体−ＢＢＢ受容体Ａｂ融合抗体と組み合わせて使用するための例示的薬剤は、下記に提供される。
【０１１５】
ＣＮＳ炎症疾患を治療するために共投与するための例示的薬剤
対象が自己免疫、炎症疾患、または神経系に影響を及ぼすアレルギー疾患（例えば、Ａｌｌａｎら（２００３），  Ｐｈｉｌｏｓ  Ｔｒａｎｓ  Ｒ  Ｓｏｃ  Ｌｏｎｄ  Ｂ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ，  ３５８（１４３８）：１６６９−１６７７参照）に罹患しているか、または罹患する危険性がある場合、本明細書に記載のデコイ受容体−ＢＢＢ受容体Ａｂ融合抗体（例えば、ＴＮＦ−α受容体ＥＣＤ−ＢＢＢ受容体Ａｂ融合抗体）をいずれかの組合せにおいて１以上の下記の治療剤、すなわち、免疫抑制剤（例えば、タクロリマス（tacrolimus）、シクロスポリン（cyclosporin）、ラパマイシン（rapamicin）、メトトレキサート（methotrexate）、シクロホスファミド（cyclophosphamide）、アザチオプリン（azathioprine）、メルカプトウリン（mercaptopurine）、マイコフェノラート（mycophenolate）、またはＦＴＹ７２０）、グルココルチコイド（例えば、プレドニソン、コルチゾンアセテート、プレドニソロン、メチルプレドニソロン、デクサメタゾン、ベータメタゾン、トリアムシノロン（triamcinolone）、ベクロメタゾン、フルドロコルチゾンアセテート、デオキシコルチコステロンアセテート、アルドステロン）、非スイテロイド性抗炎症薬（例えば、サリチル酸塩、アリールアルカン酸、２−アリールプロピオン酸、Ｎ−アリールアントラニル酸、オキシカム、コキシブ（coxibs）、またはスルホンアニリド）、Ｃｏｘ−２−特異的阻害剤（例えば、バルデコキシブ（valdecoxib）、セレコキシブ（celecoxib）、またはロフェコキシブ（rofecoxib））、レフルノミド（leflunomide）、金チオグルコース、金チオマレート、オーロフィン（aurofin）、スルファザラジン（sulfasalazine）、ヒドロキシクロロキニン、ミノサイクリン、ＴＮＦ−α結合タンパク質（例えば、インフリキシマブ（infliximab）、エタネルセプト（etanercept）、またはアダリムマブ（adalimumab））、アバタセプト（abatacept）、アナキンラ（anakinra）、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターロイキン−２、アレルギーワクチン、抗ヒスタミン、抗ロイコトリエン、ベータ−アゴニスト、テオフィリン、または抗コリン作用剤と一緒に使用することができる。
【０１１６】
多発性硬化症を治療するために共投与することができる例示的薬剤
対象が多発性硬化症に罹患しているか、または罹患する危険性がある場合、本明細書に記載のデコイ受容体−ＢＢＢ受容体Ａｂ融合抗体（例えば、インターロイキン（ＩＬ）−６デコイ受容体ＥＣＤ−ＢＢＢ受容体Ａｂ融合抗体）をいずれかの組合せにおいて１以上の下記の例示的多発性硬化症治療剤、すなわち、インターフェロンβ−１ａ、インターフェロンβ−１ｂ、グラチラマーアセテート（ＣｏｐａｘｏｎｅＲ（登録商標））、ミトキサントロン（ＮｏｖａｎｔｒｏｎｅＲ）、低用量ナルトレキソン、ナタリズマブ（Natalizumab）（ＴｙｓａｂｒｉＲ）、ＳａｔｉｖｅｘＲ、エイムスプロ（Aimspro）（ヤギ血清）、トリメスタ（Trimesta）（経口エストリオール）、ラキニモド（Laquinimod）、ＦＴＹ７２０（フィンゴリモド（Fingolimod））、ＭＢＰ８２９８、ＮｅｕｒｏＶａｘＲ、ＴｏｖａｘｉｎＲ、レビムン（Revimmune）、ＣＨＲ−１１０３、ＢＨＴ−３００９、ＢＧ−１２、クラドリビン（Cladribine）、ダクリズマブ（daclizumab）（Ｚｅｎａｐａｘ）リツキシマブ（Rituximab）（Ｒｉｔｕｘａｎ）、シクロホスファミド、キャンパス（Campath）、ファムプリジン（Fampridine）−ＳＲ、ＭＮ−１６６、テムシロリマス（Temsirolimus）、またはＲＰＩ−７８Ｍと一緒に使用することができる。
【０１１７】
例えば、アルツハイマー病またはＡＩＤＳ関連認知症の治療のために共投与することができる例示的薬剤
対象が認知症に罹患しているか、または罹患する危険性がある場合、本明細書に記載のデコイ受容体−ＢＢＢ受容体Ａｂ融合抗体（例えば、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド受容体（ＴＲＡＩＬ−Ｒ）ＥＣＤ−ＢＢＢ受容体Ａｂ融合抗体）をいずれかの組合せにおいて認知症を治療するための１以上の薬剤または方法と一緒に使用することができる。認知症を治療するための治療剤／治療の例は、限定するものではないが、ＦｌｕｒｉｚａｎＴＭ（登録商標）（ＭＰＣ−７８６９，ｒ フルルビプロフェン（r flurbiprofen））、メマンチン（memantine）、ガラタミン（galantamine）、リバスチグミン（rivastigmine）、ドネジピル（donezipil）、タクリン（tacrine）、Ａβ１−４２免疫療法、レスベラトロール（resveratrol）、（−）−エピガロカテキン−３−ガラート、スタチン、ビタミンＣ、またはビタミンＥを包含する。
【０１１８】
血栓塞栓性障害を治療するための例示的薬剤
対象が血栓塞栓性障害（例えば、卒中）に罹患しているか、または罹患する危険性がある場合、１以上の他の抗血栓塞栓剤とのいずれかの組合せにおいて、本明細書に記載のデコイ受容体−ＢＢＢ受容体Ａｂ融合抗体（例えば、アポトーシスのＴＮＦ様弱インデューサー（ＴＷＥＡＫ）受容体デコイＥＣＤ−ＢＢＢ受容体Ａｂ融合抗体）を用いて該対象を治療することができる。抗血栓塞栓剤の例は、限定するものではないが、血栓溶解剤（例えば、アルテプラーゼ、アニストレプラーゼ、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、または組織プラスミノーゲンアクチベーター）、ヘパリン、チンザパリン（tinzaparin）、ワーファリン（warfarin）、ダビガトラン（dabigatran）（例えば、ダビガトランエテキレート（dabigatran etexilate））、因子Ｘａ阻害剤（例えば、フォンダパリヌクス（fondaparinux）、ドラパリヌクス（draparinux）、リバロキサバン（rivaroxaban）、ＤＸ−９０６５ａ、オタミキサバン（otamixaban）、ＬＹ５１７７１７、またはＹＭ１５０）、チクロピジン（ticlopidine）、クロピドグレル（clopidogrel）、ＣＳ−７４７（プラスグレル（prasugrel），ＬＹ６４０３１５)、キシメラガトラン（ximelagatran）、またはＢＩＢＲ  １０４８を包含する。
【実施例】
【０１１９】
下記の具体例は、単なる例示として解釈されるべきものであり、如何なる方法においても、該開示の残りの部分を限定するものとして解釈されるべきではない。当業者は、さらに工夫することなく、本発明の記載に基づいて、本発明をその完全な範囲まで利用することができると確信する。本明細書中に引用された全ての出版物は、出典明示により全体として本明細書の一部とされる。ＵＲＬまたは他のかかる識別子またはアドレスに言及する場合、かかる識別子は変化することができ、インターネット上の特定の情報は移り変わることができるが、インターネットを検索することによって、等しい情報を見出すことができると理解される。その言及は、かかる情報の入手可能性および公的な流布を証明するものである。
【０１２０】
実施例１  ヒトＴＮＦＲ  ＥＣＤ  ｃＤＮＡのクローニングおよび発現
ＮＰ ００１０５７のアミノ酸２３−２５７に対応するヒトＴＮＦＲ−ＩＩ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を、表２に記載のオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮｓ）を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってクローン化し、ヒトＵ８７グリア細胞から単離したポリＡ＋ＲＮＡの逆転写からｃＤＮＡを得た。該ＴＮＦＲ  ｃＤＮＡを、２５ｎｇ  ポリＡ＋ＲＮＡ−由来のｃＤＮＡ、０．２μＭ  順方向および逆方向ＯＤＮプライマー（表Ｉの各々、配列番号１および配列番号２）、０．２ｍＭ  デオキシヌクレオシドトリホスフェート、および５０μｌ  Ｐｆｕバッファー中の２．５Ｕ  ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲによってクローン化した。Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ温度サイクラー中、９５℃で２分間の開始変性工程、次いで、９５℃で３０秒間の変性を３０サイクル、５５℃で３０秒間のアニーリング工程、および７２℃で１分間の増幅工程を用いて増幅を行い、次いで、７２℃で１０分間、最終インキュベーションを行った。ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲル電気泳動中で分析し、ヒトＴＮＦＲ  ｃＤＮＡに対応する〜０．６ｋｂの予想される主要単一バンドを生じた（図２Ａ）。ＴＮＦＲ  ＥＣＤのアミノ酸配列は、クローン化したＴＦＲ  ＥＣＤ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列から推定し、Ｌｅｕ２３−Ａｓｐ２５７を含んでいた（ＮＰ ００１０５７）。
【０１２１】
【表２】
0005873003.tif 000003
【０１２２】
実施例２  ＴＮＦＲがＨＩＲＭＡｂ重鎖のカルボキシル末端に融合した重鎖−ＴＮＦＲ融合タンパク質をコードする発現プラスミドの遺伝子操作
重鎖（ＨＣ）およびＴＮＦＲ  ＥＣＤの融合タンパク質を発現する発現プラスミドをｐＣＤ−ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲと称する。ヒトＴＮＦＲ−ＩＩ  ＥＣＤ（ＮＰ ００１０５７）のアミノ酸Ｌｅｕ２３−Ａｓｐ２５７に対応する成熟ヒトＴＮＦＲ  ｃＤＮＡを該ｐＣＤ−ＨＩＲＭＡｂ−ＨＣ発現プラスミド（図２Ｂ）のＨｐａＩ部位に挿入することによって該プラスミドを操作して、ｐＣＤ−ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲを製造した（図２Ｂ）。該ｐＣＤ−ＨＩＲＭＡｂ−ＨＣプラスミドは、キメラＨＩＲＭＡｂのＨＣをコードし、該プラスミドおよび軽鎖（ＬＣ）発現プラスミドｐＨＩＲＭＡｂ−ＬＣを用いるＣＯＳ細胞のデュアルトランスフェクションにより、キメラＨＩＲＭＡｂの一過性発現を可能にする。ＴＮＦＲ順方向（ＦＷＤ）ＰＣＲプライマー（表Ｉ）は、「ＣＡ」ヌクレオチドを導入して、オープンリーディングフレームを維持し、かつ、ＨＩＲＭＡｂ  ＨＣのＣＨ３領域のカルボキシル末端とそのシグナルペプチドを差し引いたＴＮＦＲ  ＥＣＤのアミノ末端との間に、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒリンカーを導入する。該ＴＮＦＲモノマーの各ＨＣのカルボキシル末端への融合は、図１に示される。該設計は、該ＴＮＦＲを、ＴＮＦＲ  ＥＣＤの好ましいコンフォメーションである二量体コンフィギュレーションに立体的に限定し、受容体ダイマーとして結晶化する（Ｃｈａｎら（２０００），  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  １３：４１９−４２２）。該ＴＮＦＲ逆方向（ＲＥＶ）ＰＣＲプライマー（表Ｉ）は、ＴＮＦＲ  ＥＣＤタンパク質の末端のアスパラギン酸の直後に、終止コドン「ＴＧＡ」を導入する。該操作されたｐＣＤ−ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ発現ベクターは、ＤＮＡ配列決定によって確認された。
【０１２３】
該ＨＩＲＭＡｂ  ＨＣおよびＬＣ  ｃＤＮＡ発現カセットは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによって駆動し、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化（ｐＡ）配列を含有する（図２Ｂ）。該ユニバーサルｐＣＤ−ＨＩＲＭＡｂ−ＨＣベクターの操作は、以前に記載されたように（Ｂｏａｄｏら（２００７ｂ）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．，  ９７：１３７６−１３８６）、部位特異的変異誘発（ＳＤＭ）によって、ＨＩＲＭＡｂ  ＨＣ  ＣＨ３オープンリーディングフレーム（ｏｒｆ）の末端に単一のＨｐａＩ部位を挿入することによって実施された。
【０１２４】
表２のＯＤＮｓを用いるＰＣＲによって、２３５アミノ酸ＴＮＦＲ−ＩＩ  ＥＣＤに対応するｃＤＮＡを増幅し、図２Ｂに概説されるように、該ｃＤＮＡをｐＣＤ−ＨＩＲＭＡｂ−ＨＣプラスミドのＨｐａＩ部位にサブクローン化した。ＤＮＡ配列決定は、該ｐＣＤ−ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲプラスミドの発現カセットが、７１４ヌクレオチド（ｎｔ）のＣＭＶプロモーター、９ｎｔの全Ｋｏｚａｋ部位（ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ）、２，１００ｎｔのＨＩＲＭＡｂ  ＨＣ−ＴＮＦＲ融合タンパク質オープンリーディングフレーム、および３７０ｎｔのＢＧＨ配列（配列番号３）を包含する３，１９３個のヌクレオチド（ｎｔ）を含むことを示した。該２，１００ｎｔオープンリーディングフレームは、配列番号３のｎｔ７２４〜２，８２３に相当する。該プラスミドは、１９アミノ酸ＩｇＧシグナルペプチド（ＡＡ１〜１９、配列番号４）、４４２アミノ酸ＨＩＲＭＡｂ  ＨＣ（ＡＡ２０〜４６１、配列番号４）、３アミノ酸リンカー（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）、およびそのシグナルペプチドを差し引いた２３５アミノ酸ヒトＴＮＦＲ−ＩＩ  ＥＣＤ（ＡＡ４６５〜６９９、配列番号４）からなる、６９９アミノ酸（ＡＡ）タンパク質をコードした。グリコシル化を差し引いた該重鎖融合タンパク質の予測分子量は、７３，９００Ｄａであり、予測等電点（ｐＩ）は８．４５である。該融合タンパク質のＴＮＦＲ  ＥＣＤ部分の推定アミノ酸配列は、２２個のシステイン残基および２個のＮ−連結コンセンサスグリコシル化部位を該ＴＮＦＲ  ＥＣＤ内のＡｓｎ−１４９およびＡｓｎ−１７１に含んだ（配列番号４）。
【０１２５】
該ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質は、２個の融合重鎖（ＡＡ２０−６９９、配列番号４）および２個の軽鎖（ＬＣ）からなる。該ＬＣは、ｐＣＤ−ＨＩＲＭＡｂ−ＬＣ発現プラスミドによって発現され、該ＬＣ発現カセットのｎｔ配列は、配列番号５に示す。該ｐＣＤ−ＨＩＲＭＡｂ−ＬＣプラスミドの発現カセットのＤＮＡ配列決定は、７３１ｎｔのＣＭＶプロモーター、９ｎｔの全Ｋｏｚａｋ部位（ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ）、７０５ｎｔのＨＩＲＭＡｂ  ＬＣ融合タンパク質オープンリーディングフレーム、および３７０ｎｔのＢＧＨ配列を包含する１，８０９ｎｔを含んでいた（配列番号５）。該７０５ｎｔオープンリーディングフレームは、配列番号５のｎｔ７４１〜１，４４５に相当する。該プラスミドは、２０アミノ酸ＩｇＧシグナルペプチド（ＡＡ１〜２０、配列番号６）、および２１４アミノ酸ＨＩＲＭＡｂ  ＬＣ（ＡＡ２１〜２３４、配列番号６）からなる２３４ＡＡタンパク質をコードする。
【０１２６】
実施例３  トランスフェクトしたＣＯＳ細胞によるＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質の分泌
ＣＯＳ細胞は、μｇ  ＤＮＡ：ｕＬ  リポフェクタミンの比率１：２．５でリポフェクタミン２０００を用いて、ｐＣＤ−ＨＩＲＭＡｂ−ＬＣおよびｐＣＤ−ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ（ここに、ｐＣＤ−ＨＩＲＭＡｂ−ＬＣは、ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質中に組み込まれた同じ軽鎖であるキメラＨＩＲＭＡｂの軽鎖をコードする発現プラスミドである）でデュアルトランスフェクトした。トランスフェクション後、該細胞を無血清培地中で培養した。ＣＯＳ細胞を最初、ヒトＩｇＧ特異的ＥＬＩＳＡで発現をスクリーニングするために、６ウェルクラスター皿に播種した。次いで、１０ｘＴ５００フラスコ中、トランスフェクトしたＣＯＳ細胞の培養のために、該トランスフェクションをスケールアップした。馴化した無血清培地を３日目および７日目に収集した。該融合タンパク質をタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
【０１２７】
ヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡは、Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２高結合プレート中で、ＣＯＳ細胞馴化培地を用いて行った。ヤギ抗−ヒトＩｇＧ一次抗体を０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３（１００μｌ、２μｇ／ｍｌ）中で播種し、４℃で一晩インキュベートした。プレートを０．０１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４／０．１５  Ｍ  ＮａＣｌ／ｐＨ＝７．４／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）で洗浄し、ＰＢＳＴ中における１％ゼラチンで２２℃にて３０分間ブロックした。プレートを１００μｌ／ウェルのヒトＩｇＧ１標準または融合タンパク質のいずれかと共に、室温（ＲＴ）でて６０分間インキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄後、アルカリホスファターゼにコンジュゲートしたヤギ抗−ヒトカッパＬＣ抗体を３７℃で６０分間培養した。暗所中、ｐＨ＝１０．４でｐ−ニトロフェニルホスフェートを用いて、発色を行った。ＮａＯＨを用いて該反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度をＥＬＩＳＡプレートリーダーで測定した。
【０１２８】
ＣＯＳ細胞によって産生されるタンパク質Ａ精製融合タンパク質の均質性を還元性１２％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、次いで、クーマシーブルー染色を用いて評価した。ウェスタンブロッティングの場合、ヒトＩｇＧ免疫反応性をヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対する一次ヤギ抗体を用いて試験し、ヒトＴＮＦＲ免疫反応性をヒトＴＮＦＲ−ＩＩ  ＥＣＤに対するマウスモノクローナル抗体を用いて評価した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブルー染色後、軽鎖（ＬＣ）のサイズは、ＨＩＲＭＡｂおよびＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質の両方について同じである（図３）。該融合タンパク質の重鎖（ＨＣ）のサイズは、ＨＩＲＭＡｂのＨＣよりも約３０ｋＤａ大きい（図３）。ウェスタンブロッティングにおいて、ＨＩＲＭＡｂまたはＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質のいずれかのＬＣは、図４（左パネル）に示されるように、該ウェスタン上で、ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に向けられた一次抗体と等しく反応する。該融合タンパク質のＨＣのサイズは、抗−ヒトＩｇＧ一次抗体（図４、左パネル）または抗−ヒトＴＮＦＲ一次抗体（図４、右パネル）のいずれかを用いる両方のウェスタンブロットにおいて、ＨＩＲＭＡｂのＨＣのサイズよりも約３０ｋＤａ大きい。これらの結果は、該ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質が宿主細胞によって首尾よく翻訳され、分泌されることを示す。
【０１２９】
実施例４  ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質はＨＩＲおよびＴＮＦαの両方について高アフィニティー結合を保持する
本発明の作業において、デコイ受容体のアミノ末端は、ＩｇＧ鎖のカルボキシル末端に融合される。予想外にも、該コンフィギュレーションは、二官能性デコイ受容体−ＢＢＢ受容体Ａｂ融合抗体を生じた。
【０１３０】
ＨＩＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する該融合タンパク質のアフィニティーは、レクチンアフィニティー精製ＨＩＲ  ＥＣＤを用いるＥＬＩＳＡで決定した。該ＨＩＲ  ＥＣＤで永続的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を無血清培地（ＳＦＭ）中で成育させ、該ＨＩＲ  ＥＣＤをコムギ胚芽凝集素アフィニティーカラムで精製した。該ＨＩＲ  ＥＣＤ（０．２μｇ／ウェル）をＩｍｍｕｌｏｎ  ２高結合９６ウェルプレート上に播種し、キメラＨＩＲＭＡｂ、ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質、またはヒトＩｇＧ１の該ＨＩＲ  ＥＣＤに対する結合を、ビオチン化ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（０．３μｇ／ウェル）、およびアビジン／ビオチン化ペルオキシダーゼ検出システムを用いて検出した。ＨＩＲ  ＥＣＤに対する５０％の結合をもたらした濃度、ＥＤ５０を非線形回帰分析によって決定した。各々、０．４４±０．１９ｎＭおよび０．６２±０．０６ｎＭのＥＤ５０を伴うキメラＨＩＲＭＡｂおよびＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質のＨＩＲ  ＥＣＤに対する比較可能な結合が存在する（図５）。これは、ＴＮＦＲのＨＩＲＭＡｂへの融合にもかかわらず、ＨＩＲＭＡｂによるＨＩＲへの高いアフィニティー結合の保持が存在することを示す。
【０１３１】
ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質のＴＮＦαに対する結合は、ＥＬＩＳＡを用いて決定された。捕獲試薬は、市販のヒトＴＮＦαであった。該アッセイにおける陽性対照は、市販の組み換えヒトＴＮＦＲ−ＩＩ：ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質（ＴＮＦＲ：Ｆｃと称する）であり、陰性対照は、ヒトＩｇＧ１／κであった。ＴＮＦαは、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３／ｐＨ＝９．０中に溶解し、１００μｌ／ウェル（０．２μｇ／ウェル）中４℃で一晩培養した。０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ／ｐＨ＝７．４（ＴＢＳ）での洗浄後、該ウェルをＴＢＳ中における１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で３０分間ブロックした。１００μｌ／ウェルの容量のＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ、ＴＮＦＲ：Ｆｃ、またはヒトＩｇＧ１ｋを室温で６０分間培養した。ＴＢＳおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）で洗浄後、ヤギ抗−ヒトＩｇＧ−アルカリホスファターゼコンジュゲートを６０分間インキュベートした（０．２μｇ／ウェル）。ＴＢＳＴで洗浄した後、パラ−ニトロフェニルホスフェートでの発色および１．２Ｍ  ＮａＯＨでの反応停止後、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて４０５ｎｍでの色検出を行った。該ヒトＩｇＧ１／カッパ（ｈＩｇＧ１／ｋ）は、図６Ａに示されるように、ＴＮＦαに結合しなかった。該ＴＮＦＲ：Ｆｃ、または該ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲは、０−６００ｎｇ／ｍＬの試験濃度範囲で飽和しない直線関係で、培養したＴＮＦαに結合した。したがって、該データを線形回帰分析にフィットさせて、結合曲線の傾きを計算した。該傾きの逆数は、ＫＤ／Ａｍａｘ比に等しく、ここに、ＫＤは、培養したＴＮＦαに結合しているＴＮＦＲの結合定数であり、Ａｍａｘは、最大吸光度である。該分析において、結合曲線の傾きは、該ＴＮＦＲ融合タンパク質のＴＮＦαに対するアフィニティーに正比例する。組み換えＴＮＦＲ：Ｆｃまたは該ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質のヒトＴＮＦαに対するアフィニティーをＥＬＩＳＡで測定した。該ＴＮＦＲ：Ｆｃは、０．８８±０．０２ｎＭのＫＤ／Ａｍａｘ比でＴＮＦαに結合した（図６Ａ）。該ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質は、１．４０±０．０８ｎＭの比較可能なＫＤ／Ａｍａｘ比でＴＮＦαに結合した（図６Ｂ）。これは、ＨＩＲＭＡｂのカルボキシル末端へのＴＮＦＲの融合にもかかわらず、ＴＮＦＲ  ＥＣＤによるＴＮＦαへの高アフィニティー結合の保持が存在することを示す。
【０１３２】
ヒトＴＮＦαの該ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質への飽和可能な結合は、放射性受容体アッセイ（ＲＲＡ）を用いて決定された。マウス抗−ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ抗体を９６ウェルプレート（０．４μｇ／ウェル）に播種し、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３／ｐＨ＝８．３中で一晩インキュベーションし、次いで、洗浄し、０．０１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ／ｐＨ＝７．４（ＰＢＳ）中における１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックした。次いで、下記の溶液、すなわち（ａ）ＰＢＳ中１％ＢＳＡ、（ｂ）１００ｎｇ／ウェルのヒトＩｇＧ１／カッパ、または（ｃ）１００ｎｇ／ウェルの該ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質の１つを１００μｌ／ウェルにて加え、次いで、室温で１時間インキュベーションした。次いで、該ウェルをＰＢＳで洗浄し、次いで、０．０１ｕＣｉ／ウェル（０．２ｎｇ／ウェル）濃度の［１２５Ｉ］−ＴＮＦαおよび種々の濃度の標識していないヒトＴＮＦαの共混合物２００μｌ／ウェルを加え、次いで、室温で３時間インキュベーションした。吸引によりウェルを空にし、冷ＰＢＳで洗浄し、２５０μｌ／ウェルの１Ｎ  ＮａＯＨを加え、次いで、６０℃で３０分間加熱した。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ液体シンチレーションカウンターで放射能をカウントし、ウェルあたりの部分（fractional）結合をコンピューターで算出した。該ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質に結合しているＴＮＦの半飽和定数、ＫＤは、統計学的ソフトウェアパッケージを用いる非線形回帰分析によって決定した。該ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質に対するＴＮＦαの飽和可能な結合は、放射性受容体アッセイを用いて検出可能であり、図７Ａに概説される。該結合データ（方法）の非線形回帰分析は、結合のＫＤが０．３４±０．１７ｎＭであることを示した（図７Ｂ）。これらの結果は、該ＴＮＦＲ  ＥＣＤが、該ＨＩＲＭＡｂ重鎖のカルボキシル末端へのそのアミノ末端での融合にかかわらず、まだ、非常に高いアフィニティーでその同族リガンドを結合することを示す。
【０１３３】
実施例５  ヒト細胞におけるＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質の生物学的活性
ヒトＷＥＨＩ−１３ＶＡＲ細胞（ＣＲＬ−２１４８）をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得、ＴＮＦα細胞毒性のバイオアッセイとして用いた（Ｅｓｐｅｖｉｋ  ａｎｄ  Ｎｉｓｓｅｎ−Ｍｅｙｅｒ，  （１９８６），  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ９５：９９−１０５）。該細胞を２４ウェルクラスター皿に、１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中３００，０００細胞／ウェルで播種した。一晩培養後、該培地の半分を吸引除去し、２００μｌの新鮮なＲＰＭＩ−１６４０培地、５０μｌ／ウェルの１０μｇ／ｍＬのアクチノマイシンＤ（最終濃度＝１．０μｇ／ｍＬ）、および最終濃度が１〜１００ｐｇ／ｍＬのヒト組み換えＴＮＦαで置き換えた。いくつかのウェルにおいて、ＴＮＦαをウェルに加える前の３０分間、ＴＮＦαを組み換えＴＮＦＲ：Ｆｃ、またはＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質に複合体化させた。該ＴＮＦＲ：ＦｃまたはＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質の最終濃度は、１．４ｎＭであった。加湿インキュべーター中、３７℃で一晩（２０時間）インキュベーション後、該培地にチアゾイルブルーテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬまで補足した。３７℃で３時間インキュベーション後、可溶化溶液（４８％イソプロパノール、２％  １Ｎ  ＨＣｌ）の添加によって、該反応を停止した。５７０ｎｍおよび６５０ｎｍでの吸光度を測定し、Ａ５７０−Ａ６５０差をコンピューターで計算した。ＭＴＴは、健康細胞中のミトコンドリアによって、ホルマザン結晶に酸化され、該反応は、細胞の生存に反比例する。アクチノマイシンＤの不在下で、該ＴＮＦαは、１−１００ｐｇ／ｍＬ濃度にて、細胞に対して毒性ではなかった。しかしながら、アクチノマイシンＤの存在下で、ＴＮＦαのこれらの濃度は、ＥＤ５０値  ５−１０ｐｇ／ｍＬヒトＴＮＦαを伴う用量依存性細胞毒を生じた（図８）。しかしながら、該ＴＮＦαの細胞毒効果は、１．４ｎＭ濃度のＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質またはＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質と共に該サイトカインを共インキュベーションすることによって遮断された（図８）。これは、該ＴＮＦＲデコイ受容体がＨＩＲＭＡｂのカルボキシル末端への融合にかかわらず、生物学的に活性であることを示す。
【０１３４】
実施例６  ＴＮＦＲのアミノ酸配列の部位特異的変異誘発
ヒトＵ８７グリア細胞からクローン化された該デコイ受容体の２３５ＡＡ  ＴＮＦＲ配列（ＡＡ４６５〜６９９，配列番号４）内に、１７４および２１０位置に多形が存在する。該ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ重鎖（配列番号４）の６３８位置のアルギニン（Ａｒｇ）は、２３５ＡＡ  ＴＮＦＲ  ＥＣＤのＡｒｇ−１７４に対応する。メチオニン（Ｍｅｔ）が該ヒトＴＮＦＲ配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＡ３６７５５）の１７４位置に見出されるので、該Ａｒｇ−１７４は天然のＲ１７４Ｍ多形である。Ｒ６３８Ｍ部位特異的変異誘発（ＳＤＭ）を周知の方法によって実施でき、配列番号７に示されるように、Ａｒｇ−６３８をＭｅｔ−６３８に変換する。該ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ重鎖（配列番号４）の６７４位置のリジン（Ｌｙｓ）は、２３５ＡＡ  ＴＮＦＲ  ＥＣＤのＬｙｓ−２１０に対応する。該ヒトＴＮＦＲ配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＡ３６７５５）のグルタミン酸（Ｇｌｕ）が２１０位置に見出されるので、該Ｌｙｓ−２１０は天然のＫ２１０Ｅ多形である。Ｋ６７４Ｅ部位特異的変異誘発（ＳＤＭ）を周知の方法によって実施でき、配列番号７に示されるように、Ｌｙｓ−６７４をＧｌｕ−６７４に変換する。ｐＣＤ−ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ発現ベクターのＴＮＦＲ−Ｒ６３８Ｍ多形（配列番号７）での操作は、周知の部位特異的変異誘発法を用いて、ヒトＴＮＦＲ−Ｒ６３８Ｍ  ＦＷＤ（表３、配列番号８）およびヒトＴＮＦＲ−Ｒ６３８Ｍ  ＲＥＶ（表３、配列番号９）ＯＤＮプライマーを用いるＳＤＭによって実施される。同様に、ｐＣＤ−ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ発現ベクターのＴＮＦＲ−Ｋ６７４Ｅ多形での操作は、ヒトＴＮＦＲ−Ｋ６７４Ｅ  ＦＷＤ（表３、配列番号１０）およびヒトＴＮＦＲ−Ｋ６７４Ｅ  ＲＥＶ（表３、配列番号１１）ＯＤＮプライマーを用いるＳＤＭによって実施される。
【０１３５】
実施例７  ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質をコードするタンデムベクターの遺伝子操作
ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質は、図１に示されるように、２つの重鎖（ＨＣ）および２つの軽鎖（ＬＣ）からなる。したがって、宿主細胞は、ＨＣ遺伝子およびＬＣ遺伝子の両方で永続的にトランスフェクトされなければならない。さらに、宿主細胞は、トランス遺伝子挿入部位の周囲の増幅を有する細胞系統の単離を可能にする遺伝子で永続的にトランスフェクトされなければならない。これは、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）をコードしている遺伝子で宿主細胞をトランスフェクション後の、メトトレキサート（ＭＴＸ）での細胞系統の選択を用いて達成される。したがって、最終的には製造のためのマスター・セル・バンク（Master Cell Bank）をもたらす単一細胞における３つの遺伝子全ての高産生を得る必要がある。３つの遺伝子全ての高い発現を保証するために、タンデムベクター（ＴＶ）と呼ばれる一片のＤＮＡを図９に概説されるように操作した。ｐＴＶ−ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲと称するＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質のためのＴＶの遺伝子操作は、ｐＴＶ−ＨＩＲＭＡｂのＨｐａＩ部位へのＴＮＦＲ  ＥＣＤ  ｃＤＮＡの挿入によって完了した。該ＴＮＦＲ  ＥＣＤ  ｃＤＮＡは、カスタムＯＤＮｓおよびｐＣＤ−ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ（図２Ｂ）を鋳型として用いるＰＣＲによって生成された。ｐＴＶ−ＨＩＲＭＡｂは、ＨＩＲＭＡｂ  ＨＣオープンリーディングフレームの３’末端に独特のＨｐａＩ制限酵部位を有するキメラＨＩＲＭＡｂをコードするタンデムベクターである。ｐＴＶ−ＨＩＲＭＡｂは、ＨＩＲＭＡｂ  ＬＣおよびＨＣ遺伝子のタンデム発現カセットを含有し、各カセットは、イントロンを有するＣＭＶプロモーターによって駆動し、各カセットは、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化（ｐＡ）配列によって終了する。ｐＴＶ−ＨＩＲＭＡｂは、また、ネズミジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）のための第３の発現カセットを含有し、それは、ＳＶ４０プロモーターによって駆動し、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ｐＡ配列によって終了する。ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ  ＨＣ発現カセットは、イントロンを有するＣＭＶプロモーター、９ｎｔの全Ｋｏｚａｋ部位（ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ）、２，１００ｎｔのＨＩＲＭＡｂ  ＨＣ−ＴＮＦＲ融合タンパク質オープンリーディングフレーム、およびＢＧＨ  ｐＡ配列からなる。図９に示されるタンデムベクターによってコードされる６９９  ＡＡ  ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ  ＨＣタンパク質は、配列番号４におけるものと同一であり、１９アミノ酸ＩｇＧシグナルペプチド（ＡＡ１〜１９、配列番号４）、４４２アミノ酸ＨＩＲＭＡｂ  ＨＣ（ＡＡ２０〜４６１、配列番号４）、３アミノ酸リンカー（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）、およびそのシグナルペプチドを差し引いた２３５アミノ酸ヒトＴＮＦＲ−ＩＩ  ＥＣＤ（ＡＡ４６５〜６９９、配列番号４）からなる。該重鎖融合タンパク質の予測分子量は、グリコシル化を差し引いて、７３，９００Ｄａであり、予測等電点（ｐＩ）は８．４５である。該融合タンパク質のＴＮＦＲ  ＥＣＤ部分の推定アミノ酸配列は、２２個のシステイン残基を含み、２個のＮ−結合コンセンサスグリコシル化部位をＴＮＦＲ  ＥＣＤ内のＡｓｎ−１４９およびＡｓｎ−１７１に含んだ（配列番号４）。図９に記載のタンデムベクターによって産生されるＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質は、２つの融合重鎖（ＡＡ２０−６９９、配列番号４）および２つの軽鎖（ＬＣ）からなる。ＬＣ発現カセットは、イントロンを有するＣＭＶプロモーター、９ｎｔの全Ｋｏｚａｋ部位（ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ）、７０５ｎｔのＨＩＲＭＡｂ  ＬＣ融合タンパク質オープンリーディングフレーム、およびＢＧＨ  ｐＡ配列を含む。図９に示されるタンデムベクターによってコードされる２１４ＡＡ  ＨＩＲＭＡｂ−ＬＣタンパク質は、配列番号６におけるものと同一であり、２０アミノ酸ＩｇＧシグナルペプチド（ＡＡ１〜２０、配列番号６）、および２１４アミノ酸ＨＩＲＭＡｂ  ＬＣ（ＡＡ２１〜２３４、配列番号６）からなる。
【０１３６】
実施例８  ＣＨＯ細胞の安定なトランスフェクションおよび希釈クローニング
無血清培地（ＳＦＭ）適応性ＤＧ４４チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、エレクトロポレーターを用いて、ＰｖｕＩで線形化後の５μｇのｐＴＶ−ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲでエレクトロポレーションした。５  ｘ  １０６細胞を２００μＬのリン酸緩衝化セーライン（ＰＢＳ）および０．２ｃｍキュベット中、方形波および１６０ボルトを用いて、該ＤＮＡでエレクトロポレーションした。細胞をＣＨＯ無血清培地（ＳＦＭ）中に懸濁し、４ｘ９６ウェルプレート中で培養した。安定なトランスフェクタントの選択は、エレクトロポレーションの２日後、０．５４ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を用いて開始した。トランスフェクトタントのコロニーが明らかになったとき、すなわち、２１目に、ヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡのために、上清のアリコートを採取した。陽性コロニーを単離し、さらなる特徴付のために個々に培養した。ＤＧ４４細胞は、内因性ＤＨＦＲを欠き、内因性葉酸合成に関して、栄養分、ヒポキサンチンおよびチミジン（ＨＴ）に依存する。該ＴＶを有するトランスフェクト細胞は、外因性ＤＨＦＲを発現する。トランスフェクト細胞系統は、さらに、ＨＴ−欠損培地中に置くことによって選択された。トランス遺伝子挿入部位周囲の増幅を有する系統は、細胞を、２０ｎＭ  ＭＴＸで開始する増加濃度のＭＴＸに付すことによって選択された。８０−１６０ｎＭ  ＭＴＸにて細胞系統の安定化後、１ウェルあたり１細胞の限界希釈クローニング（ＤＣ）によって、高生産性クローンを単離し、ＤＣの各ラウンドにて全部で４０００個のウェルに播種し、高容量マイクロプレートディスペンサーおよびマイクロプレートウォッシャーを用いるヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡを用いて、培地ＩｇＧを測定した。クローン化した細胞を、軌道振盪機上の１２５ｍＬのプラスチック角瓶中、１−２百万細胞／ｍＬの生存細胞密度にて増殖させ、ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡによる測定の場合、無血清培地中約１０ｍｇ／ＬのヒトＩｇＧレベルを生産した。
【０１３７】
実施例９  イン・ビボにおけるデコイ受容体の脳に対する選択的標的化
ＨＩＲＭＡｂは、旧世界霊長類のインスリン受容体と交差反応するが、低級種のインスリン受容体を認識しないので、ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質の脳浸透を成体アカゲザル（Rhesus monkey）において測定した。さらに、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域に融合した市販のＴＮＦＲデコイ受容体（ＴＮＦＲ：Ｆｃと称する）をＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。該ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質は、デコイ受容体融合タンパク質に関する当該分野の状況を示す。該ＴＮＦＲ：Ｆｃは、いずれのＢＢＢ受容体に対しても特異性を示さず、ＢＢＢに浸透しないと予測される。しかしながら、該ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質のＢＢＢ輸送は、測定されたことがない。さらに、ＩｇＧ分子がＢＢＢを横断するという文献における証拠があり［Ｚｌｏｋｏｖｉｃら、Ａ  ｓａｔｕｒａｂｌｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ  ａｃｒｏｓｓ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ（モルモットの血液脳関門を横断する免疫グロブリンＧの輸送のための飽和可能なメカニズム）、Ｅｘｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ，  １０７，  ２６３−２７０，  １９９０］、ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１の定常領域の大部分を含有するので、該タンパク質もまた、ＢＢＢを横断することを推測できた。脳への取り込み研究について、ＣＨＯ−由来ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質は、該ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質の非酸化的放射性ヨウ素化と平行して、トリチウム化された。該［３Ｈ］−ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲおよび［１２５Ｉ］−ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質を共に、アカゲザルに注射した。結果は、ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質はＢＢＢを横断せず、ＢＢＢ分子のトロイの木馬に融合後、ＴＮＦＲの脳浸透における顕著な増加があることを実証する。また、霊長類の非脳器官における該融合タンパク質の取り込みを測定し、それは、該デコイ受容体のＨＩＲＭＡｂへの融合が該医薬のＣＮＳに対する選択的標的化をもたらすことを示す。
【０１３８】
Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質であることが示されたＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質（＃７２６−Ｒ２）を放射性標識するために、［１２５Ｉ］−Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬を用いた。該ＴＮＦＲ：Ｆｃは、１．０ｘ２８ｃｍカラムのＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５での精製および０．０１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ／ｐＨ＝７．４／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）での溶出後、新鮮なＢｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬で１１．５ｕＣｉ／ｕｇの比活性および＞９９％のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈澱性まで放射性標識した。標識化ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質のＴＣＡ沈澱は、ヨウ素化の２４時間後で＞９９％のままであり、放射性標識後２４時間以内に、該ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質を該霊長類に投与した。［３Ｈ］−Ｎ−スクシンイミジルプロピオネート（ＮＳＰ）を用いて、ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質を放射性標識し、それは、１．０ｘ２８ｃｍカラムのＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５での精製および０．０２Ｍ  Ｔｒｉｓ／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ／ｐＨ＝６．５（ＴＢＳ）での溶出後、３．０ｕＣｉ／ｕｇの比活性および９５％のＴＣＡ沈澱性をもたらした。該溶液は、ＴＢＳおよびＵｌｔｒａ−１５マイクロコンセントレーター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ）とバッファー交換し、ＴＣＡ沈澱性が９９％に増加した。該３Ｈ−標識ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質は、霊長類研究の前に標識され、−７０℃で保存された。
【０１３９】
４．１ｋｇのアカゲザル雌成体の左大腿静脈に、１８０６ｕＣｉの［３Ｈ］−ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質、４２８ｕＣｉの［１２５Ｉ］−ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質を３．１ｍＬのＴＢＳ中、ボーラス注射によって３０秒かけて静脈内（ＩＶ）注射した。ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質の投与量は、０．１５ｍｇ／ｋｇであった。該動物を最初、筋内ケタミンで麻酔し、吸入による１％イソフランによって、麻酔を維持した。全ての手順は、米国国立衛生研究所（U.S. National Institutes of Health）によって採用され、公表された研究動物のケアおよび使用のためのガイド（The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）にしたがって行われた。静脈内薬物投与後、３Ｈおよび１２５Ｉ放射能測定のために、大腿静脈血漿を１、２．５、５、１５、３０、６０および１２０分に得た。該動物を安楽死させ、主要器官（心臓、肝臓、脾臓、肺、骨格筋、および大網脂肪）の試料を採取し、重量を量り、放射能測定のために処理した。頭蓋を開け、脳を取り出した。放射能測定のために、前頭皮質灰白質、前頭皮質白質、小脳灰白質、および小脳白質の試料を採取した。
【０１４０】
前頭皮質の試料（〜２グラム）を毛細管除去（capillary depletion）分析のために採取した。脳を組織グラインダー中、８ｍＬの冷ＰＢＳ中でホモジナイズした。該ホモジネートに９．４ｍＬの冷４０％デキストラン（７０ｋＤａ，  Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を補足し、放射能測定のために、該ホモジネートのアリコートを得た。該ホモジネートを固定角ローター中、３２００ｇにて、４℃で１０分間遠心分離した。脳微小血管系が高分子量デキストランの該密度にて、ペレットとして定量的に沈澱し、血管後（post-vascular）上清は、毛細管が除去された（depleted）脳実質の測定値である。血管ペレットおよび上清を３Ｈおよび１２５Ｉ放射能について、ホモジネートと平行して、カウントした。分布容量（ＶＤ）は、１２０分末梢血漿（terminal plasma）における全１２５Ｉまたは３Ｈ放射能によって割られた分数における全１２５Ｉまたは３Ｈ放射能の比率から、３つのフラクションの各々について決定した。
【０１４１】
血漿および組織試料は、ガンマカウンターを用いて１２５Ｉ放射能について分析し、液体シンチレーションカウンターを用いて３Ｈ放射能について分析した。１２５Ｉ同位体元素は、液体シンチレーションカウンター（ＬＳＣ）の３Ｈチャンネル（０−１２ｋｅＶ）において検出される放射を放つ。したがって、クエンチ剤としてクロロホルムを用いてクエンチ曲線を作製して、３Ｈウィンドウにおける１２５Ｉの計数効率をコンピューターで計算した。３Ｈ計数について全ての試料をＳｏｌｕｅｎｅ−３５０（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）中に可溶化し、Ｏｐｔｉ−Ｆｌｕｏｒ  Ｏ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）中におけるＬＳＣにおいてカウントした。
【０１４２】
血漿中の３Ｈまたは１２５Ｉ放射能（ＤＰＭ／ｍＬ）を％注入用量（ＩＤ）／ｍＬに変換し、％ＩＤ／ｍＬを双指数（bi-exponential）方程式  ％ＩＤ／ｍＬ＝Ａ１ｅ−ｋ１ｔ＋Ａ２ｅ−ｋ２ｔにフィットさせた。インターセプト（Ａ１、Ａ２）および傾斜（ｋ１、ｋ２）を用いて、中央滞留時間（ＭＲＴ）、分布の中心体積（Ｖｃ）、分布の定常体積（Ｖｓｓ）、血漿濃度曲線下の面積（ＡＵＣ）、および全身性クリアランス（ＣＬ）をコンピューター計算した。非線形回帰分析を用いて、ＰＫパラメーターをコンピューター計算し、データに１／（％ＩＤ／ｍＬ）２のウェイトをかけた。
【０１４３】
透過性−表面積（ＰＳ）積（permeability-surface area product）とも呼ばれる器官クリアランス（ｕＬ／ｍｉｎ／ｇ）を末端器官取り込み（％ＩＤ／ｇ）および１２０分血漿ＡＵＣ（％ＩＤｍｉｎ／ｍＬ）から次のようにコンピューター計算する。
器官ＰＳ積＝［（％ＩＤ／ｇ）／ＡＵＣ］＊１０００
ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質は、［３Ｈ］で放射能標識され、ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質は、［１２５Ｉ］で放射能標識され、これらのタンパク質を成体アカゲザルの静脈内に共注射した。血漿放射能のクリアランスを図１２Ａに示し、ＴＣＡにより沈澱性であった血漿放射能を図１２Ｂに示す。ＰＫパラメーターの概算のために、血漿クリアランスプロフィール（図１２Ａ）を双指数関数（Ｍｅｔｈｏｄｓ）にフィットさせ、それを各融合タンパク質につき、表４に示す。脳および末梢器官による該融合タンパク質の取り込みは、％  Ｉ．Ｄ．／１００グラム組織として測定され、これらの値を表５に示す。該融合タンパク質の分布の脳体積（ＶＤ）は、毛細管除去（capillary depletion）法で測定され、ホモジネートについてのＶＤ値、血管ペレット、および血管後上清を表６に示す。
【０１４４】
ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲおよびＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質のＢＢＢ  ＰＳ積は、２時間血漿ＡＵＣ（図１３Ａ）および脳への取り込みまたは％ＩＤ／１００ｇ（図１３Ｂ）からコンピューター計算され、該ＰＳ積を図１３Ｃに示す。比較のために、図１３のデータは、血管性間隙マーカー、ヒトＩｇＧ１のＡＵＣ、％ＩＤ／１００ｇ、およびＢＢＢ  ＰＳ積も示す。該ＰＳ積は、同様に、末梢器官におけるＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲおよびＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質についてコンピューター計算され、これらのデータを表７に示す。各器官におけるＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質についてのＰＳ積に対する、ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質についてのＰＳ積の比率を図１４にプロットする。
【０１４５】
【表３】
0005873003.tif 000004
図１２の血漿クリアランスデータから概算される。
【０１４６】
【表４】
0005873003.tif 000005
データは、％  Ｉ．Ｄ．／１００グラム；平均±ＳＥ（ｎ＝３）
【０１４７】
【表５】
0005873003.tif 000006
平均±ＳＥ（ｎ＝３）．  ＶＤ＝分布の体積（ｕＬ／ｇ）；  ＴＣＡ＝トリクロロ酢酸
【０１４８】
【表６】
0005873003.tif 000007
データは、平均±ＳＥ（ｎ＝３）
【０１４９】
ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質と比較したＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質の霊長類ＢＢＢをイン・ビボで横断する選択的輸送を表５に示し、それにより、％ＩＤ／１００グラムとして表される該タンパク質の脳への取り込みを与える。アカゲザルの脳の重量が１００グラムなので、該取り込みデータは、組織１００グラムとして表される。しかしながら、表５の脳取り込みパラメーターは、ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲおよびＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質の相対的な脳浸透の直接的な測定値ではなく、以下を考慮すべきである。まず、脳取り込みまたは％ＩＤ／ｇは、該タンパク質の血漿ＡＵＣの関数である。％ＩＤ／ｇを表４の血漿ＡＵＣ値で標準化した結果、器官ＰＳ積の算定数値が得られ、ＰＳ積は、脳について図１３に、末梢器官について表７に示される。第２に、脳取り込みまたは％ＩＤ／ｇは、器官血液容量について補正されなければならない。所定のタンパク質に関する器官取り込み値は、該器官の血液腔における該タンパク質の隔離を単純に反映することができ、それは、組織間で幅広く変化することができる。器官の血液量因子は、ＨＩＲＭＡｂのアイソタイプ対照であるヒトＩｇＧ１のような血液量マーカーについてのＰＳ積の算定数値によって標準化される。ヒトＩｇＧ１についてのＢＢＢ  ＰＳ積を図１３に示す。ヒトＩｇＧ１およびＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質についてのＢＢＢ  ＰＳ積が等価であることは、ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質がＢＢＢを横断しないことを示す定量的証拠である。脳血液量マーカー、例えば、ＩｇＧ１またはＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質についてのＰＳ積の算定数値は、どちらのタンパク質も実際のＰＳ積が、脳血液量について補正するとゼロになるので、近似値である。第３に、ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質についての高いＢＢＢ  ＰＳ積（図１３）は、脳微小血管系による該融合タンパク質の隔離を反映することができ、ＢＢＢを横断する実際のトランスサイトーシスおよび脳実質中への浸透を反映しなかった。このため、毛細管除去分析を行った。血管後上清中のＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質の高いＶＤ、および血管ペレット中の低いＶＤ（表６）は、脳によって取り込まれたＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質の＞９０％が血管後実質（post-vascular parenchyma）中に浸透したことを明らかにする。ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質のホモジネートＶＤ  １３±３ｕＬ／ｇ（表６）は、脳血液量に等しく、それは、ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質が血液中、脳の方向へＢＢＢを横断しないことを示すさらなる証拠である。
【０１５０】
ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲおよびＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質のＰＳ積は、また、末梢器官についてコンピューター計算された（表７）。脳および末梢器官に関し、ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質についてのＰＳ積に対する、ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質についてのＰＳ積の比を図１４でプロットする。これらのデータは、ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質についてのＰＳ積に対する、ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質についてのＰＳ積の比が、心臓、肺、骨格筋および脂肪などの末梢器官についてほぼ均一であり、肝臓または脾臓などの器官について２〜５倍にやや増加し、脳について、選択的かつ顕著に増加することを示す（図１４）。脳におけるＰＳ積比３０は、ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質に関する実際のＢＢＢ  ＰＳ積がゼロなので、過小評価である。
【０１５１】
霊長類の薬物動態（ＰＫ）および脳取り込みデータは、ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質を用いる治療的介入の最初の投薬についての検討を可能にする。０．２ｍｇ／ｋｇの注射用量での脳取り込み  ３．０％ＩＤ／１００グラム（表５）は、ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質の脳濃度  １．１ｐｍｏｌ／グラム融合タンパク質をもたらし、この値は、個々の融合タンパク質あたり２つのＴＮＦＲ部分が存在するので（図１）、２．２ｐｍｏｌ／グラムに等しい。正常な脳における免疫活性ＴＮＦαの濃度は、検出不可能であるが、外傷性脳損傷において、０．４ｐｍｏｌ／グラムに増加する［Ｅ．  Ｓｈｏｈａｍｉ，  Ｍ．  Ｎｏｖｉｋｏｖ，  Ｒ．  Ｂａｓｓ，  Ａ．  ＹａｍｉｎおよびＲ．  Ｇａｌｌｉｌｙ：閉鎖性頭部外傷は、脳組織によるＴＮＦアルファおよびＩＬ−６の早期産生を引き起こす（Closed head injury triggers early production of TNF alpha and IL-6 by brain tissue）、Ｊ．  Ｃｅｒｅｂ．  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．  １４：  ６１５−９  （１９９４）］。ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質のＴＮＦαに関するアフィニティーは高いので（図４Ｂ）、低用量のＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質  ０．２ｍｇ／ｋｇは、外傷性脳損傷において、脳における大脳ＴＮＦαのほとんどを隔離するであろう。より高用量の該融合タンパク質は、病態において、脳におけるＴＮＦαの本質的に１００％を隔離するであろう。
【０１５２】
まとめると、該実験は、モデルデコイ受容体医薬  ＴＮＦＲをＢＢＢ分子のトロイの木馬  ＨＩＲＭＡｂとの融合タンパク質として再操作することにより、イン・ビボでＢＢＢに迅速に浸透する新規な化学物質が生じることを明らかにする。対照的に、当該分野の現状を代表するＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質は、ＢＢＢを横断しない。比較的低い全身用量の投与後に生じるＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質の大脳濃度は、病態において、脳における標的サイトカインのほぼ全てを隔離するのに十分である。
【０１５３】
実施例１０  ヒト定常領域の変化
該キメラＨＩＲＭＡｂ  ＨＣの相補性決定領域（ＣＤＲｓ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）を包含する該融合タンパク質のＨＣのドメイン構造を図１０に示す。定常領域もまた、図１０に示し、ヒトＩｇＧ１に由来する。ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含むＣ領域のアミノ酸配列を図１０に示す。キメラＨＩＲＭＡｂ  ＬＣのＣＤＲｓおよびＦＲｓを包含するＬＣのドメイン構造は、図１１に示す。定常領域は、ヒトカッパＬＣに由来し、ヒトカッパ定常領域を含むアミノ酸配列を図１１に示す。
【０１５４】
ＨＩＲＭＡｂ  ＨＣ−ＴＮＦＲ融合タンパク質の定常（Ｃ）−領域は、配列番号４のアミノ酸１３３〜４６１からなり、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ由来である。さらに、重鎖Ｃ−領域は、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を包含する他のヒトＩｇＧアイソタイプのＣ−領域に由来することができた。異なるＣ−領域アイソタイプは、各々、ヒンジ領域周辺の柔軟性、プロテアーゼ感受性、相補体の活性化またはＦｃ受容体への結合に関係する周知の利益または不利益を提供する。ＨＩＲＭＡｂ  ＬＣのＣ領域は、配列番号６のアミノ酸１２９〜２３４からなり、ヒトカッパアイソタイプ由来である。さらに、軽鎖Ｃ−領域は、ヒトラムダ鎖アイソタイプ由来であることができた。
【０１５５】
実施例１１  ＨＩＲＭＡｂ−ＴＮＦＲ融合タンパク質を用いる脳疾患の治療
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αは、脳の急性および慢性障害において病原的役割を果たすプロ炎症性サイトカインである。ＴＮＦ−αおよびＴＮＦＲのどちらも、脳虚血においてアップレギュレートされる（Ｌａｍｂｅｒｔｓｅｎら（２００７）  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  １４４：９３４−９４９）。ＴＮＦＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の経頭蓋投与は、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）モデルにおいて、梗塞のサイズを減少させる（Ｎａｗａｓｈｉｒｏら（１９９７），  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，  ７７８：２６５−２７１）。ＴＮＦＲ  ＥＣＤは、血液脳関門（ＢＢＢ）を横断しない大型分子なので、該可溶性デコイ受容体は、脳に直接注射しなければならない。脊髄損傷（ＳＣＩ）において、ヒトＩｇＧ１  ＦｃフラグメントおよびヒトＴＮＦＲタイプＩＩのＥＣＤの融合タンパク質のクモ膜下投与は、ＳＣＩに関連ずるニューロパシー疼痛を減少させる（Ｍａｒｃｈａｎｄら（２００８），  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｐａｉｎ，  １−１２）。同様に、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）モデルにおけるＴＮＦＲ−ＩＩ：Ｆｃ融合タンパク質の経頭蓋投与は、治療的である（Ｋｎｏｂｌａｃｈら（１９９９），  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．，  ９５：１１５−１２５）。しかしながら、ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質はＢＢＢを横断しないので、ＴＢＩにおけるＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質の静脈内投与は、治療的ではない（Ｋｎｏｂｌａｃｈら（１９９９），  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．，  ９５：１１５−１２５）。虚血または脳もしくは脊髄損傷などの急性脳障害のほかに、ＢＢＢ輸送可能ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質の使用はまた、慢性神経変性においても治療的でありうる（Ｔｗｅｅｄｉｅら（２００７），  Ｃｕｒｒ．  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  Ｒｅｓ．，  ４：３７５−３７８）。
【０１５６】
実施例１２  ＭＡｂ−ＶＥＧＦＲデコイ受容体融合タンパク質を用いる脳癌の治療
デコイ血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体（ＶＥＧＦ）：Ｆｃ融合タンパク質は、操作し、発現させることができる（Ｈｏｌａｓｈら（２００２），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９９：１１３９３−１１３９８）。ＶＥＧＦ：Ｆｃ融合タンパク質は、新規な血管成長のための成長因子である内因性ＶＥＧＦを隔離すると予想される。かかる医薬は、脳癌を包含する癌における抗血管形成因子としての特定の使用を有しうる。しかしながら、ＶＥＧＦ：Ｆｃ融合タンパク質は、ＢＢＢを横断することが予測されない大型分子薬物である（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，  （２００８），  Ｂｉｏｃｏｎｊ．  Ｃｈｅｍ．，  （１９：１３２７−１３３８）。ＩｇＧ融合タンパク質、例えば、ＴＮＦＲに関して図１に示されるような融合タンパク質として、ＶＥＧＦＲデコイ受容体を再操作することが必要である。ＶＥＧＦのかかる形態は、内因性インスリン受容体上の輸送を介してヒトＢＢＢに浸透するであろう。いったんＢＢＢを横断すれば、次いで、ＭＡｂ−ＶＥＧＲ融合タンパク質は、ＢＢＢの後ろに、脳内にＶＥＧＦを隔離し、脳癌における新規な血管成長を減少させるであろう。
【０１５７】
実施例１３  ＭＡｂ−Ｆｎ１４デコイ受容体融合タンパク質を用いる脳虚血の治療
アポトーシスの腫瘍壊死因子様弱インデューサー（ＴＷＥＡＫ）は、ＴＮＦ遺伝子ファミリーのメンバーである。ＴＷＥＡＫ受容体は、Ｆｎ１４と呼ばれる膜タンパク質である。可溶性Ｆｎ１４デコイ受容体は、Ｆｎ１４のＥＣＤがヒトＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントのアミノ末端に融合したＦｃ融合タンパク質として操作されている。ＴＷＥＡＫ：Ｆｃ融合タンパク質は、中大脳動脈閉塞モデルにおいて卒中のサイズを減少させ、ＴＷＥＡＫ：Ｆｃ融合タンパク質は、該大型分子医薬はＢＢＢを包含しないので、経頭蓋注射によって脳に投与されなければならない（Ｙｅｐｅｓら（２００５），  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．，  １６６：５１１−５２０；  Ｚｈａｎｇら（２００７），  Ｊ．  Ｃｅｒｅｂ．  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．，  ２７：５３４−５４４）。しかしながら、ヒトにおける急性卒中治療を施すために、頭部に穴を開けることは実際的ではない。したがって、Ｆｎ１４  ＥＣＤがＢＢＢ浸透性ＩｇＧのカルボキシル末端に融合した図１に示されるようなＩｇＧ−Ｆｎ１４融合タンパク質として、Ｆｎ１４デコイ受容体を再操作することが必要である。かかるタンパク質は、静脈内注射によって非侵襲性で与えることができ、次いで、ＢＢＢを横断して虚血脳中への受容体を介して輸送される。
【０１５８】
実施例１４  ＭＡｂ−ＬｔαＲデコイ受容体融合タンパク質を用いる多発性硬化症の治療
リンホトキシンα（ＬＴα）は、また、ＴＮＦαとしても知られ、リンホトキシンβ（Ｌｔβ）と共に膜において、ヘテロ−三量体複合体を形成することができる。Ｌｔβ複合体は、Ｌｔβ受容体（ＬｔβＲ）を活性化させて、細胞内シグナル変換現象および炎症カスケードを開始する。ＬｔβＲ  ＥＣＤは、デコイ受容体として作用し、内因性Ｌｔβを隔離する場合があり、それは、脳疾患において治療的であることができる。ＬｔβＲ：Ｆｃ融合タンパク質は、実験的脱髄において治療的であり（Ｐｌａｎｔら、２００７）、ヒト脱髄、例えば、多発性硬化症において治療的でありうる。しかしながら、ＬｔβＲ：Ｆｃ融合タンパク質は、ヒトＢＢＢを横断することが予測されない。ＬｔβＲデコイ受容体は、図１に示されるようなＭＡｂ−ＬｔβＲ融合タンパク質として再操作されることができる。かかる融合タンパク質は、ＢＢＢを横断し、ＢＢＢの後ろに、脳内で内因性Ｌｔβを隔離するであろう。
【０１５９】
実施例１５  ＭＡｂ−ＴＲＡＩＬ−Ｒデコイ受容体融合タンパク質を用いるニューロＡＩＤＳ（neuro-AIDS）の治療
ＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）は、炎症性サイトカインであり、ＴＲＡＩＬ受容体（ＴＲＡＩＬ−Ｒ）への結合を介して作用する。ＴＲＡＩＬは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）−１による脳におけるニューロンの感染後、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の認知症において病原的役割を果たす（Ｒｙａｎら（２００４），  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４８：１２７−１３９）。ＡＩＤＳまたはニューロＡＩＤＳの神経学的発現の治療に対する新規なアプローチは、可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒデコイ受容体での、脳におけるＴＲＡＩＬの隔離でありうる。しかしながら、ＴＲＡＩＬ−ＲのＥＣＤまたはそのＦｃ融合タンパク質は、ＢＢＢを横断する輸送を欠くため、脳に浸透しないであろう。該問題は、ＴＲＡＩＬ−Ｒデコイ受容体を図１に示されるようなＭＡｂ−ＴＲＡＩＬ−Ｒ融合タンパク質として再操作することによって、解決することができた。ＭＡｂ−ＴＲＡＩＬ−Ｒ融合タンパク質は、ＢＢＢを横断する受容体介在性輸送を経験し、脳に侵入し、そこで、該融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬを脳内に隔離するであろう。
【０１６０】
実施例１６  ＭＡｂ−ＩＬ６−Ｒデコイ受容体融合タンパク質を用いる多発性硬化症の治療
インターロイキン（ＩＬ）−６のような炎症性サイトカインは、脱髄疾患、例えば、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）、または多発性硬化症において役割を果たしうる。ＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）は、可溶性ＩＬ−６Ｒデコイ受容体タンパク質の投与後、脳内で内因性ＩＬ−６の作用を抑制することができた。ＩＬ−６ＲのＥＣＤがヒトＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントのアミノ末端に融合したＩＬ−６Ｒ：Ｆｃ融合タンパク質の投与は、ＥＡＥにおいて治療的である（Ｌｉｎｋｅｒら（２００８），  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２０５：６４−７２）。しかしながら、多発性硬化症におけるＩＬ−６Ｒ：Ｆｃ融合タンパク質の脳中への浸透は、イン・ビボでのＢＢＢを介する輸送を欠くので、制限されうる。対照的に、図１に示されるようなＭＡｂ−ＩＬ−６Ｒ融合タンパク質は、受容体−媒介性輸送を介してＢＢＢに浸透し、それにより、ＢＢＢの後ろに、脳においてＩＬ−６を隔離することができた。
【０１６１】
本発明の好ましい具体例を本明細書中に示し、記載するが、かかる具体例が例示目的のためだけに提供されることは、当業者に明らかであろう。現在、当業者は、本発明から逸脱することなく、多くの変更、変化および置換を思い付くであろう。本明細書に記載の本発明の具体例の種々の代替物が本発明の実施に用いられうることは、理解されるべきである。添付の特許請求の範囲は、本発明の範囲を明確にすることを目的とし、それにより、特許請求の範囲内の方法および構造およびその等価物が包含される。
【０１６２】
配列表
表３
0005873003.tif 000008
0005873003.tif 000009
0005873003.tif 000010
0005873003.tif 000011
0005873003.tif 000012
0005873003.tif 000013
0005873003.tif 000014
【図１】
0005873003.tif 000015
【図２】
0005873003.tif 000016
【図３】
0005873003.tif 000017
【図４】
0005873003.tif 000018
【図５】
0005873003.tif 000019
【図６】
0005873003.tif 000020
【図７】
0005873003.tif 000021
【図８】
0005873003.tif 000022
【図９】
0005873003.tif 000023
【図１０】
0005873003.tif 000024
【図１１】
0005873003.tif 000025
【図１２】
0005873003.tif 000026
【図１３】
0005873003.tif 000027
【図１４】
0005873003.tif 000028
【配列表】
0005873003000001.app