(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒスチジンで安定化させたヒトインターロイキン−２を含んでなる、安定な凍結乾燥薬剤学的組成物であって、グリシンおよびスクロースを含み、該ＩＬ−２が、単一アミノ酸置換Ｎ８８Ｒを有するムテインであり、そして該ムテインが、突然変異の結果として生じるタンパク質である、上記組成物。
【請求項２】
水による再形成が以下のもの：
ＩＬ−２            ０.１−５ｍｇ／ｍｌ
ヒスチジン          ０.０８−１.６重量％
ＮａＣｌ            ０−０.９重量％
スクロース          １−１０重量％および
グリシン            ３重量％以下
を５〜６.５のｐＨにおいて含んでなる安定な凍結乾燥組成物であって、
該ＩＬ−２が、単一アミノ酸置換Ｎ８８Ｒを有するムテインである、上記組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
分野：  本発明は一般的に薬剤学的調剤(pharmaceutical formulation)の分野に関する。より具体的には、本発明はＴ細胞（ＰＨＡ−芽細胞）を選択的に活性化可能でありそして、非常に好ましくは、ナチュラルキラー（「ＮＫ」）細胞の減じられた活性化を示すＩＬ−２ムテインを含む安定化させた治療上活性なインターロイキン−２調剤に関する。好ましい性質を有する安定化させた組成物は以下に記載されているＩＬ−２の変種を含む。
【背景技術】
【０００２】
背景：  １９９９年１１月２５日に公告された関連出願ＰＣＴ／ＵＳ ９９／１０６４
３で論じられたように、インターロイキン２（ＩＬ−２）はＴ細胞、Ｂ細胞、および単球を包含する免疫系の多様な細胞を活性化する有効な免疫刺激剤である。ＩＬ−２はまた、Ｔ細胞の有効で且つ決定的な成長因子でもある。これらの活性に基づき、ＩＬ−２を癌を処置するその能力に関して試験した。ヒトＩＬ−２は転移性腎臓癌および転移性黒色腫の処置のためのＦＤＡが認可した薬品である。適格な患者におけるＩＬ−２の使用はＩＬ−２療法に伴う重い毒性のために制限され、適格な患者の最良でも２０％だけが実際に療法を受けることが推定される。ＩＬ−２療法に伴う毒性は重い発熱、悪心、嘔吐、脈管漏出およびひどい低血圧を包含する。しかしながら、これらの毒性にもかかわらず、ＩＬ−２はその認可された適応症に関して有効である。減じられた毒性を有するＩＬ−２の変種は特許文献１の主題である。
【０００３】
ＩＬ−２および他の治療用蛋白質調剤の安定化に関する重要な情報が入手可能である。最近認可されたヒトＩＬ−２調剤（プロロイキン(Proluekin)RＩＬ−２、チロン・コーポレーション(Chiron Corporation)）はマンニトール、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および燐酸塩緩衝液を含む凍結乾燥調剤である。ＩＬ−２を含む他の調合された治療用蛋白質は下記の参考文献に記載されている。
【０００４】
Fernandes et al., 1986, Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2 （特許文献２）は、安定剤（マンニトール）および溶解剤、例えばドデシル硫酸ナトリウムまたはデオキシコレート硫酸ナトリウム、を１ｍｇのＩＬ−２当たり約１００〜約２５０μｇで含有する凍結乾燥調剤を記載している。最近入手可能なプロロイキンRＩＬ−２製品用の調剤はこの参考文献に記載されていると信じられる。
【０００５】
Patel, 1994 Stabilization of protein formulations （特許文献３）は、メチオニン、ヒスチジンまたはそれらの混合物を組み入れることによる延長した貯蔵寿命を有するインターフェロン、顆粒球−大食細胞コロニー−刺激因子またはインターロイキンの水性調剤を記載している。インターロイキン−２を包含する数種のインターロイキン類に言及しているが、ＩＬ−２調剤を用いて行われた研究では特許権者は使用した安定剤試験の条件下ではヒスチジンがメチオニンより安定剤として有効性が少ないことを見いだした。
【０００６】
Shaked, et al., 1991, Pharmaceutical compositions of recombinant interleukin-2and formulation process （特許文献４）は、凍結乾燥または液体形態のいずれかであ
る調剤を記載している。調剤の賦形剤は非イオン性重合体状洗剤、例えばトライトン(Triton)Ｘ４０５、トライトンＸ３０５、ＰＥＧ（４０００）モノステアレート、ツィーン(Tween)８０およびツィーン２０を約０.００１％〜約５％の濃度で、増量／安定剤、例えばスクロース、フルクトース、デキストロース、マルトース、グルコース、デキストラン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、キシリトール、ラクトー
ス、トレハロース、ヒト血清アルブミンおよび牛血清アルブミン、並びに緩衝剤、例えばグリシン、クエン酸塩または燐酸塩を約１０ｍＭ〜５０ｍＭの濃度範囲で、約３〜約７の範囲のｐＨで含む。ポリオール糖増量剤の濃度（重量／容量）は約０.０２５％〜約１０
％の範囲である。
【０００７】
Roskam et al., 1995, Drugs containing a glycosylataed interleukin-2 （特許文献５）は加水分解されたゼラチン（またはヒト血清アルブミン）およびアラニンを含有するｐＨ６.５を有する凍結乾燥調剤を記載している。
【０００８】
Hora et al., 1992, Pharmaceutical composition for interleukin-2 containing physiologically compatible stabilizers （特許文献６）は、液体であるかまたは凍結乾燥調剤を記載している。調剤は例えばアルギニン、カルニチン、ベタイン、ピリドキシンポリビニルピロリドン、カプリン酸の塩類、糖類、糖アルコール類、血清アルブミン、およびクエン酸塩の如き安定剤の１種または組み合わせを緩衝液のｐＨ５.０−８.５で含有することができる。安定剤の濃度は、アルギニンに関しては０.２〜３.０％（重量／容量）の間であり、カルニチンに関しては０.２〜３.０％（重量／容量）の間であり、スクロースに関しては２〜６％（重量／容量）の間であり、そしてクエン酸塩に関しては０.０１
〜０.３Ｍの間である。
【０００９】
Yasushi et al., 1987 Stable composition of interleukin-2 and albumin （特許文
献７）は、ヒト血清アルブミン（０.１−５０ｍｇ／ｍｌ）を還元性賦形剤、例えばグル
タチオン、チオクト酸、Ｎ−アセチルシステイン、またはアスコルビン酸（０.０５−２
０ｍｇ／ｍｌの濃度）と共にまたはそれらなしに３〜５.５の間のｐＨで含有する安定な
水性調剤を記載している。アルブミン調剤はモノアミノ脂肪族アミノ酸、環式アミノ酸、単糖、糖アルコールまたはモノアミノ脂肪族アミノ酸を含有できる（５〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度）。
【００１０】
Lee et al., 1989 Pharmaceutical plasma protein formulations in low ionic strength media; sodium chloride and/or potassium chloride, lysine hydrochloride, and histidine （特許文献８）は、塩化ナトリウム、塩化カリウムまたはそれらの混合物、リシン塩酸塩、および緩衝剤としてのヒスチジンを含んでなる低イオン強度媒体中の安定な因子VIIIおよび他の血漿蛋白質調剤を記載している。
【００１１】
Nayar, 1998 stabilized albumin-free recombinant Factor VIII preparation havinga low sugar content （特許文献９および特許文献１０）は、グリシン、ヒスチジン、
スクロースおよびＮａＣｌを含むアルブミンを含まない安定化させたＦVIII調剤を記載している。
【００１２】
（特に特許文献１の好ましいＩＬ−２ムテイン（Ｎ８８Ｒ）のための）安定なＩＬ−２調剤を見いだす試みにおいて、我々は非常に安定であり且つ生物学的活性および有用なヒトＩＬ−２のための製薬学的に許容可能な調剤を今回見いだした。我々の発見は、我々が信じることが以下に記載されているように安定性の原因となる基本的機構であることの提唱に基づいている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】ＷＯ ９９／６０１２８
【特許文献２】米国特許第４,６０４,３７７号
【特許文献３】米国特許第５,３５８,７０８号
【特許文献４】米国特許第５,０３７,６４４号
【特許文献５】米国特許第５,４１７,９７０号
【特許文献６】米国特許第５,０７８,９９７号
【特許文献７】米国特許第４,６４５,８３０号
【特許文献８】米国特許第４,８７７,６０８号
【特許文献９】米国特許第５,７６３,４０１号
【特許文献１０】米国特許第５,８７４,４０８号
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１はＩＬ−２水溶液に関する最適なｐＨ範囲を示すグラフである。
【図２】図２は蛋白質溶液を１℃／分で２５℃から９５℃に加熱することにより誘発されるＩＬ−２凝集に関するヒスチジン対酢酸塩およびクエン酸塩の安定化効果を比較する。
【発明の概要】
【００１５】
発明の要旨
本発明は、ヒスチジンで安定化させたＩＬ−２またはその変種（ムテイン類）の薬剤学的組成物または調剤である。好ましくは、組成物は低いイオン強度（例えば＜０.１）の
溶液を生ずる混合物を含んでなりそして他の安定剤、例えば糖類およびアミノ酸類、好ましくはスクロースおよびグリシン、を含む。調剤は０〜０.９重量％のＮａＣｌを含むこ
とができる。組成物はアルブミンを含まずそして凍結乾燥形態での調剤は水を用いて急速（＜１分間）に再形成することができる。組成物は生理学的に許容可能なｐＨ条件下で、好ましくは約５.０〜約６.５の範囲のｐＨにおいて、界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウムを使用せずに溶解する。再形成された溶液はほぼ等張性であり且つ皮下および静脈内の両方で投与することができる。非常に好ましい態様では、組成物のＩＬ−２は単一アミノ酸置換を有するムテイン、好ましくはＷＯ ９９／６０１２８に記載された変種、
である。
【００１６】
非常に好ましい組成物は１−５ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度を有しそして以下のもの：
ＩＬ−２            ０.１−０.５重量％
ヒスチジン          ０.０８−１.６重量％
ＮａＣｌ            ０−０.９重量％
スクロース          １−１０重量％および
グリシン            ０−３重量％
を水性形態で（重量／重量基準で）５〜６.５のｐＨにおいて含んでなる。
【００１７】
我々の調剤の詳細およびそれをどのようにして発見したかを以下に記載する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
具体的態様
ここで使用される用語ＩＬ−２は、活性な野生型ＩＬ−２およびその生物学的に活性な変種またはムテイン類、例えばＷＯ ９９／６０１２８に記載されているもの、の両方を
包含する。以下の実施例では、我々はアミノ酸蛋白質８８の位置でアルギニン（Ｒ）に突然変異したアスパラギン（Ｎ）を有するヒトＩＬ−２の組み換えムテインであるＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）として知られるＩＬ−２を使用した。このムテインはチャイニーズ・ハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞から発現されそしてグリコシル化されたおよびグリコシル化されていない両方の形態の混合物を含んでなっていた。それは以上で関連出願として引用されたＷＯ ９９／６０１２８に記載されている。
【００１９】
本発明が達成した目的は、許容可能な安定性を有するアルブミンを含まない好ましいＩＬ−２ムテイン用の凍結乾燥薬用量形態を同定する必要性であった。ＩＬ−２に関する生
物学的検定法は安定性の非感受性(insensitive)測定値であったため、我々は安定性指示
検定法として逆相ＨＰＬＣによる可溶性ＩＬ−２の定量化を使用した。ここで使用される用語「安定な」または「安定化させた」は、４０℃における４カ月間にわたる貯蔵後に逆相ＨＰＬＣによる可溶性ＩＬ−２量が元の可溶性量の９０％より少ない量に減少しないことを意味する（以下の表３および４参照）。使用された追加の安定性指示検定法は凝集指数、ＵＶ／ＶＩＳ分光光度法による凝集体の測定およびサイズ排除ＨＰＬＣによる可溶性凝集体の測定を包含した。安定な生成物の他に、凍結乾燥物質の急速な（１分間以内の）再形成(reconstitute)が非常に好ましい。最後に、製造用凍結乾燥機中で容易に凍結乾燥させうる許容可能な安定性を有する凍結乾燥薬用量形態の調剤が所望されていた。
【００２０】
予備調合試験中に行われた水性安定性試験は、ＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）が液体状態で容易に凝集しそして凝集がｐＨ−依存性であったことを示した。２種の予備調剤安定性試験、すなわちＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）のｐＨグラフおよび種々の緩衝賦形剤の存在下における安定性試験、を行った。これらの試験の目的は、ＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）に関する適当なｐＨ範囲および水性安定性（減じられた凝集能力）のための適当な緩衝賦形剤を同定することであった。ｐＨグラフを作成する際には、ＩＬ−２溶液を種々のｐＨ条件を用いて製造しそして加速温度条件（４０℃）において貯蔵した。試料を種々の時間間隔で分析しそして凝集速度を計算した。図１に示されているように、低い凝集速度に関する最適なｐＨ範囲はｐＨ５.０〜６.５の間であると同定された。ヒスチジン、酢酸塩、およびクエン酸塩がこのｐＨ範囲におけるＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）用の薬剤学的緩衝剤として同定されそして１ｍｇ／ｍｌのＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）および１５０ｍＭ（０.９重量％）のＮａＣｌを含有
するＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）溶液中２０ｍＭの濃度で評価された。これらの試料を２５℃から９５℃に毎分１℃で加熱しそして沈澱をＵＶ分光光度法により３５０ｎｍで監視した。図２に示されているように、我々にとっては驚異的であるが、沈澱の開始温度における増加により示されるようにヒスチジンはｐＨ５.５においてＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）を他の緩
衝賦形剤よりＩＬ−２を有意に安定化させた。クエン酸塩、酢酸塩、およびヒスチジンの存在下における開始温度はそれぞれ６２℃、６４℃、および７０℃であった。例えばこれらのような試験は、ヒスチジンを緩衝剤としてだけでなく水性条件下でＩＬ−２用の安定剤としても使用できることを示した。
【００２１】
凍結乾燥薬用量形態の開発のために、当業者により使用されている他の賦形剤を試験した。これらは増量剤並びに凍結防止剤、例えばグリシン、スクロース、およびマンニトール、を含む。凝集は水性安定性試験中に分子に関する不安定性機構の１つであるため、２種の界面活性剤もＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）用の安定剤として評価した。これらの試験の結果は以下の実施例でまとめられている。それらは、我々にとって驚異的であるが、ヒスチジンが他の賦形剤、例えばクエン酸塩、と比べてＩＬ−２に対する選択的な安定化効果を有することを示した。
【実施例１】
【００２２】
種々のｐＨにおける液体ＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）の安定性を４０℃において試験した。結果は、ＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）の沈澱速度がｐＨ５.０〜６.５の間で最低であったことを示した（図１）。従って、ｐＨ５.５が液体状態における最適な調剤ｐＨとしてそして凍結
乾燥調剤の製造用に選択された。
【実施例２】
【００２３】
我々はＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）の安定性に対する種々の緩衝剤の可能な影響を試験した。我々が試験した緩衝剤はクエン酸塩、酢酸塩、およびヒスチジンを含んでなっていた。これらの緩衝剤は１ｍｇ／ｍｌのＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）および１５０ｍＭ（０.９重量％）
のＮａＣｌを含有するＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）溶液中２０ｍＭで使用された。これらの安定性試料を、ＵＶ／ＶＩＳ分光光度法により監視しながら、２５℃から９５℃に毎分１℃で
加熱した。ヒスチジンは酢酸塩およびクエン酸塩と比べて、沈澱温度を高めることによりそして沈澱速度を減ずることによりＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）を有意に安定化させた（図２）。表１は、これらの３種の緩衝剤の存在下におけるＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）の開始沈澱温度を示す。開始沈澱温度は３５０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ350）がある水準（ＯＤ350の場合には０.２および１.０）に達する温度として任意に設定された。ヒスチジンの存在下におけるＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）の沈澱温度は他の２種の緩衝剤の存在下におけるものより数度ほど高かった。この実施例は、ヒスチジンが液体状態のＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）用の緩衝剤として使用されることに加えて特異的な安定剤でありえることを示した。
【００２４】
【表１】
0005989728.tif 000002
【実施例３】
【００２５】
ヒスチジンの安定化効果をさらに評価する試みでは、凍結乾燥されたＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）を種々の水性調剤から製造した（表２参照）。調剤のほとんどは２重量％のグリシンを増量剤としてそして１重量％のスクロースを安定剤として含有した。５重量％のマンニトールを調剤中でＩＬ−２の商業製品であるプロロイキンRに対する比較剤として使用し
た。両方とも０.１重量％の２種の界面活性剤であるツィーン８０およびプルロニック(Pluronic)Ｆ６８を蛋白質表面吸着及び凝集の防止に関して評価した。全ての調剤はヒスチ
ジンまたはクエン酸塩を緩衝剤として５.５に調節されたｐＨで含有していた。ｐＨ５.５におけるヒスチジンの安定化効果をクエン酸塩のものと区別するためにクエン酸塩が含まれた。これらの凍結乾燥調剤を４０℃において貯蔵しそしてＵＶ／ＶＩＳ分光光度法、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、およびＲＰ−ＨＰＬＣを包含する多くの分析方法により分析した。
【００２６】
表３は、凝集に関するＵＶ／ＶＩＳ分光光度法により評価した多くの調剤中のＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）の安定性、サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）による可溶性凝集体の量、および逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）による蛋白質の回収率を示す。試料を凍結乾燥後に分析しそして４０℃の加速貯蔵温度において４カ月間にわたり貯蔵した。凍結乾燥工程はＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）の正味凝集指数を凍結乾燥前状態から変化させず、ＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）が蛋白質凝集／沈澱に関して凍結乾燥工程に耐えたことを示唆している。４０℃における４カ月間にわたる貯蔵後に、クエン酸塩（Ｂ）、プルロニックＦ−６８（Ｄ）またはマンニトール（Ｅ）を含有する調剤に関して正味凝集指数における有意な増加が観察された。これらの結果は、クエン酸塩もしくはマンニトール、ツィーン−８０またはプルロニックＦ−６８の含有が貯蔵中に固体状態のＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）凝集を防止しなかったことを示した。調剤ＡおよびＦは凝集指数における有意な変化を示さず、１または５ｍｇ／ｍｌのＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）と一緒のヒスチジン、グリシン、およびスクロース
の含有が安定な生成物を生じたことを示唆している。
【００２７】
しかしながら、有意な量の可溶性凝集体がツィーン−８０を含有する調剤中では凍結乾燥前でも見いだされ（表３）、ツィーン−８０は可溶性ＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）凝集体の生成を促進するが、不溶性凝集体の生成は抑制されうることを示している。プルロニックＦ−６８（調剤Ｄ）も可溶性凝集体の有意な生成をもたらしたが、界面活性剤はＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）と相容性でないかもしれない。２％のグリシン、１％のスクロース、および２０ｍＭ（０.３１重量％）のヒスチジン（Ａ、Ｆ）を含有した調剤だけは４０℃における
４カ月間にわたる凍結乾燥調剤の貯蔵後に可溶性凝集体の検出可能な生成を示さず、ここでもＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）がヒスチジンにより安定化されたことを示唆している。
【００２８】
凍結乾燥および貯蔵後の可溶性ＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）の合計回収率はＲＰ−ＨＰＣにより測定された（表３）。凍結乾燥後のＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）の回収率はマンニトールを含有する調剤以外の全ての調剤に関して約９６％より高かった。４０℃における４カ月間にわたるこれらの調剤の貯蔵後に、２％のグリシン、１％のスクロース並びに１および５ｍｇ／ｍｌのＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）を含有する２０ｍＭ（０.３１重量％）のヒスチジンを
含有する調剤ＡおよびＦ中では約９２％のＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）が回収された。これらのデータ（調剤ＡおよびＦに関する９０％より高いＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）の回収率）も、界面活性剤が蛋白質を不安定化させるがヒスチジンがＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）を安定化させることを示唆している。
【００２９】
【表２】
0005989728.tif 000003
【００３０】
【表３】
0005989728.tif 000004
【実施例４】
【００３１】
野生型ＩＬ−２も調剤Ａと同じ組成の水性調剤から凍結乾燥した。野生型ＩＬ−２に関する４０℃における安定性データはＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）のものに匹敵した（表４）。
【００３２】
【表４】
0005989728.tif 000005
【００３３】
論評
ヒトＩＬ−２は６の螺旋構造（Ａ−Ｆ）を形成する１３３個のアミノ酸類を有する。これらの螺旋の４個は四螺旋束モチーフ(tetra-helix bundle motif)と称するものを形成する。ｃｙｓ58およびｃｙｓ105の間の分子内ジスルフィド結合は螺旋間の伸びたループ上
に位置する。遊離ｃｙｓ125はアミノ酸類１１７−１３３を組み入れる螺旋Ｆ上に位置す
る。
【００３４】
ヒスチジンがＩＬ−２の特異的な安定剤であるとい驚異的な発見は、ヒスチジンがＩＬ
−２と水性および凍結乾燥状態の両方で分子を安定化させるような特異的な方法で相互作用しうることを示唆している。ＩＬ−２の不安定性の主要機構の１つは、チオール−ジスルフィド交換反応によるオリゴマー類の生成から生ずる凝集である。従って、そのヒスチジンが実際にＩＬ−２中のチオール−ジスルフィド交換反応を抑制または減少させうると仮説をたてることができる。野生型ＩＬ−２、ＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）並びにことによると他のＩＬ−２変種分子は１個のジスルフィド結合および遊離スステイン（Ｃｙｓ125）を
有するため、Ｃｙｓ125上の遊離−ＳＨ基はチオール／ジスルフィド交換経路を介してジ
スルフィド結合と容易に反応することができ、それにより凝集／沈澱事象を生ずる。
【００３５】
チオール／ジスルフィド交換の機構は最近では Bulaj et al. により記載されている（Ionization-reactivity relationships for cysteine thiolsin polypeptides. Biochemistry 1998 Jun 23;37(25):8965-72）。モデルペプチド類および蛋白質の研究では、反応
速度は静電力並びに蛋白質の二次構造に感受性であることが示された。チオール中の硫黄原子周辺の電子分布はチオールのｐＫaを変更しうる近くの電荷および結合内誘導効果(through-bond inductive effect)の存在により影響を受けうる。例えば、チオール／ジスルフィド交換中のチオールの増加した反応性は近くの正電荷の存在または近くのアルファ−螺旋構造からのペプチド双極の貢献のいずれかによるそのｐＫaの低下に起因しうる。対
照的に、チオール基近くの負電荷はチオールのｐＫaを上昇させ且つより低いチオール／
ジスルフィド反応速度を生じうる。この提唱された機構は他の研究によっても支持され、そこでは付近の正に荷電された基による高反応性チオレートイオンの安定化が蛋白質チロシンホスファターゼ（Zhang and Dixon, 1993 Active site labeling of the Yersiniaprotein tyrosine phosphatase: the determination of the pKa of the active site cysteineand the function of the conserved histidine 402, Biochemistry 1993 Sep 14;32(36):9340-5）および蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ（Kortemmeet al., Electrostaticinteractions in the active site of the N-terminal thioredoxin-like domain of protein disulfide isomerase. Biochemistry 1996 Nov 19;35(46):14503-11）に関して示
された。
【００３６】
チオール／ジスルフィド交換反応のこれらの性質に基づき、ヒスチジンがＩＬ−２（Ｎ８８Ｒ）の安定化における速度論的または熱力学的役割のいずれかを演ずるような安定化機構を想像することができる。ジスルフィド架橋Ｃｙｓ58−Ｃｙｓ105近くには５個のグ
ルタミン酸基（５７、６０、６１、６２、および１０６）がある。これらの負に荷電された基に対するヒスチジンの特異的な結合がチオール／ジスルフィド交換反応に関する速度論的妨害を生ずることができ、またはジスルフィド架橋近くのヒスチジンの結合がＩＬ−２分子を熱力学的に安定化させて凝集反応傾向が少ない立体配座にすることができた。さらに、Ｈｉｓ−Ｇｕイオン性相互作用は３個の関係する硫黄原子間の中間的な遷移状態の生成であるチオール／ジスルフィド交換における速度決定段階をさらに減ずるであろう立体障害を生成しうる。ジスルフィド結合は蛋白質表面上の伸びたループ上に置かれているため、グルタミン酸基に対するヒスチジンの接近可能性は非常にあつらえむきである。
【００３７】
上記の実施例を前提にして、ここに開示された発明の変更が当業者により行われるであろうことが予期される。従って、上記の実施例は単なる説明としてみなすべきでありそしてここに開示された発明は請求項によってのみ限定されるべきであることが意図される。
【００３８】
以下に本発明の主な特徴と態様を列挙する。
【００３９】
１．  ヒスチジンで安定化させたヒトインターロイキン−２またはその変種を含んでなる安定な薬剤学的組成物。
【００４０】
２．  水中で急速に再形成されうる凍結乾燥形態の１．の調剤。
【００４１】
３．  約５.０〜約６.５の範囲のｐＨを有する水性形態の１．の調剤。
【００４２】
４．  グリシンを含む１．の調剤。
【００４３】
５．  スクロースを含む１．の調剤。
【００４４】
６．  グリシンおよびスクロースを含む１．の調剤。
【００４５】
７．  ＩＬ−２がムテインである１．の調剤。
【００４６】
８．  ＩＬ−２が単一アミノ酸置換を有するムテイン、すなわちＮ８８Ｒである７．の調剤。
【００４７】
９．  水による再形成が以下のもの：
ＩＬ−２            ０.１−５ｍｇ／ｍｌ
ヒスチジン          ０.０８−１.６重量％
ＮａＣｌ            ０−０.９重量％
スクロース          １−１０重量％および
グリシン            ０−３重量％
を５〜６.５のｐＨにおいて含んでなる安定な凍結乾燥組成物。
【００４８】
１０．  ＩＬ−２が単一アミノ酸置換を有するムテイン、すなわちＮ８８Ｒである９．の調剤。
【図１】
0005989728.tif 000006
【図２】
0005989728.tif 000007