(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヤブコウジ科（Ｍｙｒｓｉｎａｃｅａｅ）のヤブコウジ属マンリョウ（Ａｒｄｉｓｉａ ｃｒｅｎａｔａ Ｓｉｍｓ）の葉の抽出物を含有するマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）阻害剤の製造方法であって、
上記抽出物は、上記葉から９５％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液の溶媒によって常温で２４時間かけて２回抽出して得られたマンリョウ抽出液をろ過し、６０℃真空下で前記溶媒を留去した後、水に再溶解してからエチルアセテートで抽出して得たエチルアセテート抽出物であることを特徴とするマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤の製造方法。
【請求項２】
ヤブコウジ科（Ｍｙｒｓｉｎａｃｅａｅ）のヤブコウジ属マンリョウ（Ａｒｄｉｓｉａ ｃｒｅｎａｔａ Ｓｉｍｓ）の葉の抽出物を含有するエラスターゼ阻害剤の製造方法であって、
上記抽出物は、上記葉から９５％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液の溶媒によって常温で２４時間かけて２回抽出して得られたマンリョウ抽出液をろ過し、６０℃真空下で前記溶媒を留去した後、水に再溶解してからエチルアセテート又はヘキサンで抽出して得たエチルアセテート抽出物又はヘキサン抽出物であることを特徴とするエラスターゼ阻害剤の製造方法。
【請求項３】
ヤブコウジ科（Ｍｙｒｓｉｎａｃｅａｅ）のヤブコウジ属マンリョウ（Ａｒｄｉｓｉａ ｃｒｅｎａｔａ Ｓｉｍｓ）の葉の抽出物を含有するヒアルロニダーゼ阻害剤の製造方法であって、
上記抽出物は、上記葉から９５％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液の溶媒によって常温で２４時間かけて２回抽出して得られたマンリョウ抽出液をろ過し、６０℃真空下で前記溶媒を留去した後、水に再溶解してからエチルアセテート又はヘキサンで抽出して得たエチルアセテート抽出物又はヘキサン抽出物であることを特徴とするヒアルロニダーゼ阻害剤の製造方法。
【請求項４】
ヤブコウジ科（Ｍｙｒｓｉｎａｃｅａｅ）のヤブコウジ属マンリョウ（Ａｒｄｉｓｉａ ｃｒｅｎａｔａ Ｓｉｍｓ）の葉の抽出物を含有するシワ防止用皮膚外用剤の製造方法であって、
上記抽出物は、上記葉から９５％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液の溶媒によって常温で２４時間かけて２回抽出して得られたマンリョウ抽出液をろ過し、６０℃真空下で前記溶媒を留去した後、水に再溶解してからエチルアセテートで抽出して得たエチルアセテート抽出物であり、
上記エチルアセテート抽出物の成分量は、０．０００１〜１０重量％であることを特徴とするシワ防止用皮膚外用剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の植物の抽出物を含有するマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤の製造方法、エラスターゼ阻害剤の製造方法、ヒアルロニダーゼ阻害剤の製造方法及びシワ防止用皮膚外用剤の製造方法に関する。さらに詳しくは、ヤブコウジ科（Ｍｙｒｓｉｎａｃｅａｅ）のヤブコウジ属マンリョウ（Ａｒｄｉｓｉａ ｃｒｅｎａｔａ Ｓｉｍｓ）を、水若しくは有機溶媒またはこれらの混合溶媒で抽出して得られる抽出物を含有するマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ：Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｎａｓｅｓ）阻害剤の製造方法、エラスターゼ阻害剤の製造方法、ヒアルロニダーゼ阻害剤の製造方法及びシワ防止用皮膚外用剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の老化は、シワの増加と弾力の減少、色素沈着など様々な形で現れてくる。その最も代表的な老化現象がシワである。シワが発生する皮膚の老化の原因は大きく二つに分けることができる。加齢による自然老化の内的要因と外的要因による老化である。外的要因としては、紫外線、公害、病気、飲酒、喫煙などがあり、内的要因としては、フリーラジカルと炎症の発生、ストレス、細胞活性の低下及び突然変異化、細胞の代謝の不均衡などがある（非特許文献１参照）。皮膚は大まかに表皮と真皮に分けることができる。表皮のシワの発生原因としては、表皮細胞のターンオーバーの減少により、角質層が厚くなり、角質層の水分の含有能力が減少により、角質全体が硬化してシワが生成される。表皮と真皮の境界部位は、表皮細胞の支持、接着、栄養物質の移動、表皮の分化の調節などに関与する。様々な老化の要因から、真皮支持機能が減少し、選別透過機能が弱化して有害な成分が容易に皮膚に影響を及ぼすために、シワが生成されるのである。（非特許文献２参照）これらの変化を誘導する因子として、コラーゲン、エラスチンなどの繊維状のタンパク質と、ヒアルロン酸等の多糖類からなる、細胞外マトリックス（ＥＣＭ：ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）成分の減少、変性が関与することが知られている。
【０００３】
また、近年研究が進み、これらの変化を誘導する因子として、ＭＭＰｓの関与が指摘されている。ＭＭＰｓは、ＥＣＭを主要な基質とする一群の金属プロテアーゼの総称名である。ＭＭＰｓは現在２０種類あることが知られており、その構造や作用は様々である。例えば、コラゲナーゼ、即ち、ＭＭＰ−１は皮膚の真皮マトリックスの主な構成成分であるコラーゲンＩ型、ＩＩＩ型を分解している酵素として知られている。また、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９は、基底膜成分であるタイプＩＶ型コラーゲンやラミニン、真皮マトリックス成分のエラスチン等を分解する酵素として知られている。
【０００４】
さらにこれらの各酵素の発現は、紫外線照射によって促進され、皮膚のシワの形成等の大きな要因になることも考えられる。従って、ＭＭＰｓ阻害、エラスターゼ阻害及びヒアルロニダーゼ阻害は、皮膚の老化を防止する上で重要である。
【０００５】
なお、本発明に係わるヤブコウジ科（Ｍｙｒｓｉｎａｃｅａｅ）植物の従来の技術としては、安定性の高い美白作用、抗炎症作用を合わせ持つ山豆根を含有することを特徴とする化粧料（特許文献１参照）、活性酸素消去による老化防止効果、抗炎症効果及び美白効果を合わせ持つ、ヤブコウジ科植物であるヤブコウジ（Ａｒｄｉｓｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｂｌｕｍｅ）、シシアクチ（Ａ． ｐｕｓｉｌｌａ Ｂｌｕｍｅ）、及びモクタチバナ（Ａｒｄｉｓｉａ Ｓｉｅｂｏｌｄｉ Ｍｉｑ）の抽出物より選ばれる１種又は２種以上を含有することを特徴とする皮膚外用剤（特許文献２参照）、上記記載のヤブコウジ科植物３種の抽出物より選ばれる１種又は２種以上を含有することにより細胞賦活作用及び抗酸化作用を合わせ持つ皮膚外用剤（特許文献３参照）、上記記載のヤブコウジ科植物３種の抽出物より選ばれる１種又は２種以上と、構成糖であるグルコースの２位又は６位を硫酸化したβ‐１、３‐グルカンより選ばれる１種又は２種以上を含有することにより、抗炎症作用、創傷治癒促進作用及び抗アレルギー作用を有することを特徴とする皮膚外用剤（特許文献４参照）が開示されている。しかし、これらの文献公知発明には、ヤブコウジ科（Ｍｙｒｓｉｎａｃｅａｅ）のヤブコウジ属マンリョウ（Ａｒｄｉｓｉａ ｃｒｅｎａｔａ Ｓｉｍｓ）植物抽出物のＭＭＰｓ阻害作用、エラスターゼ阻害作用、ヒアルロニダーゼ作用について記載はなく、知られていない。また、これらの作用を利用したシワ防止用皮膚外用剤への利用は想定されていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｓｋｉｎ，Ａｌｌｕｒｅｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉ ｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｅｔｅｒ Ｔ．Ｐｕｇｌｉｓｅ ＭＤ，ｐ６１−７２
【非特許文献２】Ｋｅｅｎｅ，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１０４，ｐ６１１−６１２，１９８７
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平４−３４９１２号公報
【特許文献２】特開平１０−１４３８号公報
【特許文献３】特許公報３７３４２２２号
【特許文献４】特開平１１−１７１７８４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
天然由来成分は、様々は薬理作用や美容効果を有することが知られ、これまでにも数多くの植物が皮膚外用剤に幅広く応用されている。しかし、天然由来成分の中には未だその効果が知られていないものも数多く存在し、中でも優れたＥＣＭ保護作用などを有する天然由来の成分開発が期待されていた。しかし、従来のシワ予防皮膚外用剤には、ＥＣＭに対するＭＭＰｓの活性阻害剤に着目したものは数限られ、未だ十分満足し得るものが提供されていない。またその他、エラスターゼ阻害剤、ヒアルロニダーゼ阻害剤を含んだこれらの作用を利用した天然由来成分の提供が強く望まれているが、未だ十分満足し得るものが提供されていないのが現状である。
【０００９】
したがって本発明は、皮膚の老化によるシワと密接に関係する、ＭＭＰｓ、エラスターゼ及びヒアルロニダーゼの活性を確実に阻害する作用を有し、これらの作用を通じて、ＥＣＭ成分の減少、変性を抑制し、シワの防止に有用なシワ防止用皮膚外用剤に関し、そのマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤の製造方法、エラスターゼ阻害剤の製造方法、ヒアルロニダーゼ阻害剤の製造方法及びシワ防止用皮膚外用剤の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するため、広く種々物質についてそれぞれＥＣＭ分解阻害作用を検討した結果、驚くべきことに、ヤブコウジ科（Ｍｙｒｓｉｎａｃｅａｅ）のヤブコウジ属マンリョウ（Ａｒｄｉｓｉａ ｃｒｅｎａｔａ Ｓｉｍｓ）植物を、水若しくは親水性有機溶媒またはこれらの混合溶媒から得られる抽出物を含有させることにより、ＭＭＰｓ、エラスターゼ及びヒアルロニダーゼの活性を確実に阻害することができ、ＭＭＰｓ阻害作用、エラスターゼ阻害作用、及びヒアルロニダーゼ阻害作用を通じて、シワ予防作用を持つ皮膚外用剤が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、請求項１に記載の発明は、ヤブコウジ科（Ｍｙｒｓｉｎａｃｅａｅ）のヤブコウジ属マンリョウ（Ａｒｄｉｓｉａ ｃｒｅｎａｔａ Ｓｉｍｓ）の葉の抽出物を含有するマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）阻害剤の製造方法であって、上記抽出物は、上記葉から９５％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液の溶媒によって常温で２４時間かけて２回抽出して得られたマンリョウ抽出液をろ過し、６０℃真空下で前記溶媒を留去した後、水に再溶解してからエチルアセテートで抽出して得たエチルアセテート抽出物であることを特徴とするマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤の製造方法である。
請求項２に記載の発明は、ヤブコウジ科（Ｍｙｒｓｉｎａｃｅａｅ）のヤブコウジ属マンリョウ（Ａｒｄｉｓｉａ ｃｒｅｎａｔａ Ｓｉｍｓ）の葉の抽出物を含有するエラスターゼ阻害剤の製造方法であって、上記抽出物は、上記葉から９５％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液の溶媒によって常温で２４時間かけて２回抽出して得られたマンリョウ抽出液をろ過し、６０℃真空下で前記溶媒を留去した後、水に再溶解してからエチルアセテート又はヘキサンで抽出して得たエチルアセテート抽出物又はヘキサン抽出物であることを特徴とするエラスターゼ阻害剤の製造方法である。
請求項３に記載の発明は、ヤブコウジ科（Ｍｙｒｓｉｎａｃｅａｅ）のヤブコウジ属マンリョウ（Ａｒｄｉｓｉａ ｃｒｅｎａｔａ Ｓｉｍｓ）の葉の抽出物を含有するヒアルロニダーゼ阻害剤の製造方法であって、上記抽出物は、上記葉から９５％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液の溶媒によって常温で２４時間かけて２回抽出して得られたマンリョウ抽出液をろ過し、６０℃真空下で前記溶媒を留去した後、水に再溶解してからエチルアセテート又はヘキサンで抽出して得たエチルアセテート抽出物又はヘキサン抽出物であることを特徴とするヒアルロニダーゼ阻害剤の製造方法である。
請求項４に記載の発明は、ヤブコウジ科（Ｍｙｒｓｉｎａｃｅａｅ）のヤブコウジ属マンリョウ（Ａｒｄｉｓｉａ ｃｒｅｎａｔａ Ｓｉｍｓ）の葉の抽出物を含有するシワ防止用皮膚外用剤の製造方法であって、上記抽出物は、上記葉から９５％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液の溶媒によって常温で２４時間かけて２回抽出して得られたマンリョウ抽出液をろ過し、６０℃真空下で前記溶媒を留去した後、水に再溶解してからエチルアセテートで抽出して得たエチルアセテート抽出物であり、上記エチルアセテート抽出物の成分量は、０．０００１〜１０重量％であることを特徴とするシワ防止用皮膚外用剤の製造方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、優れたＭＭＰｓ阻害作用、エラスターゼ阻害作用、ヒアルロニダーゼ阻害作用を有し、これらを応用した本発明のシワ防止用皮膚外用剤は、シワ予防に極めて顕著な効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明によるマンリョウ抽出物配合クリームによるシワスコア変化度を示す図である。
【図２】本発明によるマンリョウ抽出物配合クリームによるシワ面積率及びシワの数の変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。本発明に用いられるマンリョウ（Ａｒｄｉｓｉａ ｃｒｅｎａｔａ Ｓｉｍｓ）は、ヤブコウジ科（Ｍｙｒｓｉｎａｃｅａｅ）のヤブコウジ属（Ｍｙｒｓｉｎａｃｅａｅ）に属する植物種である。日本、朝鮮半島、韓国、台湾、中国などの暖地の山林内に生息する高さ５０〜６０ｃｍの常緑小低木である。これらの抽出物は、これらの植物の葉、樹皮、花、果実、根、いずれの部位も使用することができるが、葉を使用することが好ましい。
【００１４】
抽出溶媒としては、有機溶媒としてはエタノール、エチルアセテート、ヘキサンを使用するのが好ましい。参考となる抽出溶媒の具体例としては、水、メタノール、プロパノール、ブタノール、プロピレングリコール、グリセリン等のアルコール類、含水アルコール類、アセトン等の有機溶媒等を用いることができる。これらの溶媒は１種でも２種以上を混合しても良い。
【００１５】
マンリョウの抽出物は常法により得ることができ、例えば、マンリョウの抽出溶媒とともに浸漬または加熱還流した後、濾過して濃縮して得ることができる。
【００１６】
例えば、マンリョウの葉を乾燥させて重量（ＫＧ）の５倍から２０倍、好ましくは８〜１０倍の重量比の水、有機溶媒又はこれらの混合溶媒によって、２０〜２００℃、好ましくは５０ないし１００℃で、３０分〜２０時間、好ましくは２〜５時間抽出して得る、あるいは５〜３７℃、好ましくは常温で２時間から１５日間、好ましくは１〜３日間抽出して、収得することができる。
【００１７】
以上のようにして得られる抽出物は、ＭＭＰｓ阻害作用、エラスターゼ阻害作用、ヒアルロニダーゼ阻害作用を有する。また、皮膚に適用した場合、上記作用により、シワ防止用皮膚外用剤に配合するのに好適である。
【００１８】
本発明のマンリョウ抽出物は多様な製剤形態で投与できる。製剤中の有効成分の量は特に限定されるものではないが、０．０００１〜２０重量％、好ましくは０．０００１〜１重量％である。０．０００１重量％未満では本発明効果が十分に発揮され難く、一方、２０重量％を越えて配合してもさほど大きな効果の向上は認められず、また製剤化が難しくなるのであまり好ましくない。
【００１９】
製剤化の際は、効果を損なわない範囲内で、通常化粧料や医薬部外品や医薬品に配合可能な成分、例えば、美白剤、保湿剤、酸化防止剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、洗浄剤、増粘剤、薬剤、アルコール類、香料、樹脂、アルコール類、粉末成分、色材、色素、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。また、本発明の効果を損なわない範囲において、これ以外に、他のＭＭＰｓ阻害剤、エラスターゼ阻害剤、ヒアルロニダーゼ阻害剤の併用も可能である。
添加してもよい配合成分は、これに限定されるわけではなく、また、上記のどの成分も、本発明の目的や効果を損傷させない範囲で配合可能である。
【００２０】
本発明の皮膚外用剤とは、医薬品、医薬部外品、化粧品等の分野にて、皮膚に適用される組成物を意味する。その剤型は本発明の効果が発揮される限り限定されない。溶液、可溶化系、乳化系、粉末分散系、水−油二相系、水−油−粉末三相系、固形、軟膏、ゲル、エアゾール、ムースなど、任意の剤型が適用される。また、その使用形態も任意であり、例えば、ローション、乳液、パック、美容液、ジェル、クリームなどの基礎化粧料や、ファンデーションなどのメーキャップ化粧料、毛髪用化粧料、芳香化粧料、浴用剤などとすることができるが、これらに限定されるものではない。
【実施例】
【００２１】
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例等によってなんら限定されるものではない。
【００２２】
実施例に先立ち、本発明に用いられるマンリョウ抽出物の製造方法について説明する。
【００２３】
（調整例１）マンリョウ葉エチルアセテート抽出物
乾燥したマンリョウ（Ａｒｄｉｓｉａ ｃｒｅｎａｔａ Ｓｉｍｓ）の葉を、９５％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液で、室温で２４時間かけて２回抽出した。得られたマンリョウ抽出液をろ過、６０℃真空下で溶媒を留去した後、水に再溶解し、これらかエチルアセテートで抽出することによりエチルアセテート抽出物を得た。これを調整例１とした。
【００２４】
（調整例２）マンリョウ葉ヘキサン抽出物
乾燥したマンリョウ（Ａｒｄｉｓｉａ ｃｒｅｎａｔａ Ｓｉｍｓ）の葉を、９５％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液で、室温で２４時間かけて２回抽出した。得られたマンリョウ抽出液をろ過、６０℃真空下で溶媒を留去した後、水に再溶解し、これからヘキサンで抽出することによりヘキサン抽出物を得た。これを調整例２とした。
【実施例１】
【００２５】
ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３阻害試験
調整例１で得られた抽出物について、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３阻害試験を行った。具体的には、以下のように試験を行った。
【００２６】
上記マンリョウの抽出物について、ＭＭＰ−１、３遺伝子の発現程度を測定するために、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を実施し、下記のようにＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３のｍＲＮＡ発現量を測定した。
【００２７】
上記の実施例で得られたマンリョウの抽出物について、正常ヒト繊維芽細胞（ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ：ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−２０７６）を６０ｍｍ培養皿に１×１０６個の１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。翌日、培地を除去したのち細胞をＨＢＳＳで洗い、生理食塩水に置換した。６Ｊ／ｃｍ２のＵＶＡを照射した後、無血清培地で２４時間培養した。その後、細胞からグアニジウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出方法で全ＲＮＡを抽出した。上記の方法で得られたＲＮＡにＤＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ‐ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を３７℃で３０分間処理し、フェノール／クロロホルム抽出法とエタノール沈殿法により、純粋なＲＮＡを得て、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＭＭＰ−１の反応条件は、９５℃１分、４８℃１分、７２℃１分を１セットとして、２９サイクル行い、ＭＭＰ−３の反応条件は、９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃４５秒を１セットとして、３０サイクル行い、β−アクチンの反応条件は、９５℃１分、６２℃１分、７２℃１分を１セットとして、２２サイクル行った。ＰＣＲ産物は、１．５％（ｗ／ｖ）アガロース（Ｓｉｇｍａ社）ゲルに電気泳動し、ゲルイメージアナライザー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）で定量した。対照群にβ−アクチンを使用し、ＲＴ−ＰＣＲに使用されたプライマーは、下記表１の序列番号に示した塩基配列のものを使用した。
【００２８】
マンリョウ抽出物を含まない反応系（コントロール ＵＶＡ照射しＭＭＰ発現させたもの）、マンリョウ抽出物を含む反応系（ＵＶＡ照射しＭＭＰ発現させ、試料添加したもの）のＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３発現率（％）を算出した。結果を表２、表３に示す。
【００２９】
また参考例として、ＭＭＰＳ発現阻害作用が良く知られている成分であるエピガロカテキンガラート（ＥＧＣＧ：ｅｐｉｇａｌｌｏ ｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ）についても、上記と同様の試験を行った。結果を併せて表２、３に示す。
【００３０】
【表１】
0005926507.tif 000002
【００３１】
【表２】
0005926507.tif 000003
【００３２】
【表３】
0005926507.tif 000004
【００３３】
表２、３の結果から、マンリョウ抽出物が、優れたＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３阻害作用を有することが確認された。また、マンリョウ抽出物濃度が５０μｇ／ｍｌの時、ポジティブコントロールのＥＧＣＧ２．２９μｇ／ｍｌと同程度であり、その効果は極めて高かった。
【実施例２】
【００３４】
ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９阻害試験
調整例１で得られた抽出物について、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９阻害試験を行った。具体的には、以下のように試験を行った。
【００３５】
正常ヒト線維芽細胞（ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ：ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−２０７６）を６０ｍｍ培養皿に１×１０６個になるよう播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。翌日、培地を除去したのち、細胞をＨＢＳＳで２回洗い、無血清培地に交換し１０ｎｇ／ｍｌＴＮＦ−αと試料を加え２４時間曝露させた。培地を回収し、タンパク質量をＢＣＡ法にて決定した。その試料を非還元条件下で１０％ゼラチンを含むポリアクリルアミドゲルにアプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動後のゲルを、２．５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００（ｐＨ ７．５）で洗い、更に３７℃で１６時間、再生バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ２００ｍＭ、ＮａＣｌ ５ｍＭ、ＣａＣｌ２ ０．０００６％、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００）で反応させ、０．１％クーマシーブリリアントブルーで染色後、１０％酢酸／５０％メタノールで脱色し、脱色後に現れるバンドの強度をイメージアナライザー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）で定量化した。
【００３６】
マンリョウ抽出物を含まない反応系（コントロール ＴＮＦ−α１０μｇ／ｍｌのみ添加したもの）、マンリョウ抽出物を含む反応系（ＴＮＦ−α１０μｇ／ｍｌと試料添加したもの）のＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９発現率（％）を算出した。結果を表４、５に示す。
【００３７】
参考例として、ＭＭＰｓ活性阻害作用で良く知られている成分であるＥＧＣＧについても、上記と同様の試験を行った。結果を併せて表４、５に示す。
【００３８】
【表４】
0005926507.tif 000005
【００３９】
【表５】
0005926507.tif 000006
【００４０】
表４、５の結果から、マンリョウ抽出物が、優れたＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９活性阻害作用を有することが確認された。
また、その作用の強さは、ＭＭＰ−２において、マンリョウ抽出物濃度が５０μｇ／ｍｌの時、ポジティブコントロールのＥＧＣＧ２．２９μｇ／ｍｌと同程度、かつＭＭＰ−９において、マンリョウ抽出物濃度が５０μｇ／ｍｌの時、ポジティブコントロールのＥＧＣＧ２．２９μｇ／ｍｌと同程度であり、その効果は極めて高かった。
【実施例３】
【００４１】
エラスターゼ阻害作用の試験
調整例１〜２で得られた抽出物について、エラスターゼ阻害作用を試験した。具体的には、以下のように試験を行った。
【００４２】
基質（Ｎ−ＳＵＣＣＩＮＹＬ−ＡＬＡ−ＡＬＡ−ＡＬＡ−ｐ−ＮＩＴＲＯＡＮＩＬＩＤＥ、Ｓｉｇｍａ社）濃度が１．０１５ｍＭになるように０．１２３２Ｍ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌバッファーで調製し、この溶液１３００μｌと終濃度１００，５０，１０μｇ／ｍｌになるように調製した試料とを混合した。
それらを２５℃で１０分間ボルテックスしながらプレインキュベートした。ブタ由来膵臓エラスターゼ５μｌ（０．０２５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ Ｓｉｇｍａ社）をこの溶液１００μｌに加えた。ボルテックスした後、２５℃の水浴に１０分間静置し、４１０ｎｍの吸光度を測定した。
【００４３】
試料濃度を３００、１５０、５０μｇ／ｍｌに減少させて上記の阻害率の測定を行い、エラスターゼの活性を５０％阻害する試料溶液濃度を内挿法により求めた。結果を表６に示す。
【００４４】
【表６】
0005926507.tif 000007
【００４５】
表６の結果から、マンリョウ抽出物が、エラスターゼ阻害作用を有することが確認された。
【実施例４】
【００４６】
ヒアルロニダーゼ阻害試験
調整例１〜２で得られた抽出物について、ヒアルロニダーゼ阻害作用を試験した。具体的には、以下のように試験を行った。
【００４７】
ヒアルロン酸ナトリウムの主構成成分であるＮ−アセチルグルコサミンの量を分光光度計で測定することにより、ヒアルロニダーゼ活性を決定した。０．１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ３．５）に溶解したウシ由来ヒアルロニダーゼ５０ｍｌ（７９００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を決められた濃度の試料１００ｍｌと混合し、３７℃の湯浴で２０分間インキュベートした。試料の代わりに４０％ＢＧを１００ｍｌ加えて同処理したものをコントロールと設定した。１２．５ｍＭ ＣａＣｌ２水溶液１００ｍｌを反応溶液に加え、３７℃の湯浴で２０分間インキュベートした。２５０ｍｌのヒアルロン酸ナトリウム水溶液（１．２ｍｇ／ｍｌ）を加え、３７℃の湯浴で４０分間インキュベートした。０．４Ｎ ＮａＯＨ １００ｍｌと０．４Ｎ ホウ酸カリウムをさらに加え、３分間熱湯につけインキュベートした。室温まで冷やした後、３ｍｌ ＤＭＡＢ溶液を加え３７℃の湯浴に２０分間インキュベートした。分光光度計にて５８５ｎｍにおける吸光度を測定し、反応混合液の濃度を決定した。
【００４８】
阻害率の計算式は、
阻害率（％）＝［（ＯＤｃ‐ＯＤｓ）／ＯＤｃ×１００］
ここでＯＤｃはコントロールの５８５ｎｍにおけるＯＤ、ＯＤｓはサンプルの５８５ｎｍにおけるＯＤである。
【００４９】
【表７】
0005926507.tif 000008
【００５０】
表７の結果から、マンリョウ抽出物が、優れたヒアルロニダーゼ阻害作用を有することが確認された。
【００５１】
以上の結果から、本発明に用いられるマンリョウ抽出物のＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−９活性阻害効果、エラスターゼ及びヒアルロニダーゼ活性効果は極めて優れたものであった。したがってマンリョウ抽出物を用いて、シワを効果的に予防することができる。
【００５２】
続いて、さらに本発明の処方例を実施例５〜９として挙げる。
【実施例５】
【００５３】
皮膚用ゲル剤
（１）１，３−ブチレングリコール                            １．０（重量％）
（２）シクロヘキサン−１，４−ジカルボン酸
ビスエトキシジグリコール                              ３．８
（３）カルボキシビニルポリマー（２重量％水溶液            ２８．０
（４）水酸化カリウム（１０％量水溶液）                      ３．０
（５）メチルパラベン                                        ０．１
（６）精製水                                              ６３．９
（７）ジプロピレングリコール                                ０．２
（８）マンリョウ葉エチルアセテート抽出物（調整剤１）        ０．２
製法：（１）〜（６）まで混合を均一に溶解したあと、（７）に（８）をよく溶解したものを入れ、製品とする。
【実施例６】
【００５４】
皮膚用クリーム
（１）流動パラフィン                                        ６．０（重量％）
（２）ミリスチン酸イソプロピル                              ３．０
（３）シクロヘキサン                                        ２．５
（４）ジメチコン                                            ２．０
（５）ベヘニルアルコール                                    ３．４
（６）ワセリン                                              ２．０
（７）ステアリン酸ソルビタン                                １．５
（８）セテス‐２０                                          ３．４
（９）トコフェロール                                        ０．０２
（１０）クエン酸                                            ０．０５
（１１）１，３−ブチレングリコール                          １．０
（１２）メチルパラベン                                      ０．１５
（１３）プロピルパラベン                                    ０．０７
（１４）精製水                                            ７２．９１
（１５）マンリョウ葉エチルアセテート抽出物（調整例１）      ０．１
（１６）ジプロピレングリコール                              １．９
製法：（１）〜（９）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（１０）〜（１６）の水相成分を８０℃にて加熱溶解する。これに上記油相成分に攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。乳化終了後、冷却を開始し、（１６）に（１５）を加えた溶液を加え、混合する。
【実施例７】
【００５５】
皮膚用クリーム
（１）セチルジメチコンポリオール                            ３．０（重量％）
（２）ラウリルＰＥＧ−９ポリジメチルシロキシエチル
ジメチコン                                            １．０
（３）流動パラフィン                                        ７．４４
（４）水添ヒマシ油                                          １．０
（５）マイクロクロスタインワックス                          ０．５６
（６）ジエチルヘキサン酸ネオペンチレングリコール          １１．８
（７）マンリョウ葉エチルアセテート抽出物（調整例１）        ０．１
（８）ジプロピレングリコール                                ０．１
（９）塩化ナトリウム                                        １．０
（１０）精製水                                            ６８．９
（１１）１，３−ブチレングリコール                          ５．０
（１２）メチルパラベン                                      ０．１
製造：（１）〜（６）の油相成分を混合し、８０℃にて加熱溶解する。一方（７）〜（１２）の水相成分を混合し、８０℃にて加熱溶解する。上記油相成分に水相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。乳化終了後、冷却する。
【実施例８】
【００５６】
化粧水
（１）マンリョウ葉エチルアセテート抽出物（調整例１）        ０．１（重量％）
（２）ジプロピレングリコール                                ０．１
（３）１，３−ブチレングリコール                            １．０
（４）メチルパラベン                                        ０．２
（５）キサンタンガム                                        ０．２
（６）精製水                                              ９８．４
製造：（２）に（１）を溶解する。溶解後、（３）〜（６）を順次添加した後、十分に攪拌し、均一に混合する。
【００５７】
実施例６について使用試験を行い、シワの予防効果を評価した。その際、実施例６において、配合したマンリョウ葉エチルアセテート抽出物を精製水に代替し、比較例１として同時に使用試験を行った。
具体的には以下のように試験を行った。
【００５８】
シワの予防効果を評価するため、何もしなければ悪化するであろう、水分量の少ない冬に実施した。実施例６は、マンリョウ葉エチルアセテート抽出物以外の成分の効果が出ないように、保湿剤はほとんど入れないようにした。２０〜５０代の男女パネラー８名を一群とし、各群に実施例２及び比較例１をそれぞれブラインドにて１日２回ずつ１２週使用させ、４週、８週、１２週後の目尻のシワの状況を観察し、使用前の値と比較した。シワの症状は表８に示す判定基準に従って点数化した。各グレードの標準に当てはまらない場合は、その中間値のスコアとした。
【００５９】
４週、８週、１２週のシワスコアの変化度の平均値を表９にまとめた。また、１２週の８名のシワ改善度を図１にまとめた。なお、シワスコアの変化度については、「−」はよりしわ形成が認められ、「＋」はしわ改善が認められることを意味する。
【００６０】
シリコーンレプリカ（Ｓｉｌｆｌｏ，ＦＬＥＸＩＣＯ ＤＥ ＶＥＬＯＰＭＥＮＴＳ社製）で目尻のレプリカを採取、シワの体積、シワの数を測定し、図２にまとめて示した。
【００６１】
【表８】
0005926507.tif 000009
【００６２】
【表９】
0005926507.tif 000010
【００６３】
表９及び図１〜２の結果から、マンリョウ抽出物を配合した皮膚化粧料は、シワの予防作用に極めて顕著な効果を有することが確認できた。また、皮膚トラブルもなく、安全であった。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明によるマンリョウ抽出物には、優れたＭＭＰｓ阻害作用、エラスターゼ阻害作用、ヒアルロニダーゼ阻害作用を有し、これらを応用した本発明のシワ防止用皮膚外用剤は、シワ予防に極めて顕著な効果を有する。
【図１】
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【図２】
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