(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己組織化能を有するタンパク質を含む免疫学的測定用ウイルス様粒子であって、該自己組織化能を有するタンパク質がＨＢｓＡｇタンパク質であり、該自己組織化能を有するタンパク質の少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して酵素によって修飾されてなる、ウイルス様粒子。
【請求項２】
前記自己組織化能を有するタンパク質が配列番号１に示すアミノ酸配列を含む、請求項１のウイルス様粒子。
【請求項３】
前記自己組織化能を有するタンパク質が抗体結合ドメインを有する、請求項１または２に記載のウイルス様粒子。
【請求項４】
前記酵素が、ペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼからなる群より選択される何れかである、請求項１〜３のいずれかに記載のウイルス様粒子。
【請求項５】
前記抗体結合ドメインが、プロテインＡ中の抗体結合ドメイン、プロテインＧ中の抗体結合ドメイン、及びプロテインＬ中の抗体結合ドメインからなる群より選択される少なくとも一種である、請求項３に記載のウイルス様粒子。
【請求項６】
前記抗体結合ドメインが、配列番号３〜５の何れかに示されるアミノ酸配列からなる、請求項３に記載のウイルス様粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫学的測定法に用いられるウイルス様粒子、それに用いられるブロッキング剤、及びこれらを含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
各種の粒子をイムノアッセイのセンサーとして利用する方法が知られている（特許文献１〜８）。例えば、特許文献１又は特許文献２では蛍光性の半導体ナノ粒子またはシリカ粒子をイムノアッセイの検出素子として利用する方法が提示されており、ナノ粒子が発生する蛍光でイムノアッセイを行う手法である。【０００３】
一方、特許文献８では金属材料、磁性材料、または半導体材料を核として各種ペプチドを結合させたナノ粒子コンジュゲートが提示されている。【０００４】
Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原を有するウイルス様粒子であって、斯かる抗原のＮ末端にあるＰｒｅ−Ｓ１及びＰｒｅ−Ｓ２領域に、プロテインＡ由来の抗体のＦｃ領域に対する結合ドメイン（Ｚタグ）がタンデムで２個挿入されたもの（以後ＺＺ−ＢＮＣと呼ぶことがある。）は、酵母を用いて遺伝子組み換えで製造したＬ型のＢ型肝炎ウイルス粒子（特許文献９）のＰｒｅ−Ｓ１及びＰｒｅ−Ｓ２領域にプロテインＡ由来の抗体のＦｃ領域に対する結合ドメイン（Ｚタグ）を２個挿入したものであり、その製造法や薬物送達システムとしての有用性は特許文献１０に記載されている。【０００５】
このＢＮＣ−ＺＺの持つ高いセンサー素子としての機能に注目し、特許文献３では酵素標識抗体とＢＮＣ−ＺＺを併用した利用方法、蛍光標識したＢＮＣ−ＺＺによる抗体検出法、イムノアッセイで利用する方法が実施例として例示されている。特許文献６ではＢＮＣ−ＺＺを固相化抗体の整列に利用して感度を高める手法が例示されている。特許文献４ではビオチン化したＢＮＣ−ＺＺの免疫学的測定への利用方法が記載されており、ビオチン化ＢＮＣ−ＺＺにストレプトアビジンを介してビオチン化ＨＲＰ酵素を又はビオチン化抗体を結合させることで、ビオチン化されていないＢＮＣ−ＺＺを用いるよりも感度上昇が図れることが実施例に例示されている。【０００６】
特許文献５ではＢＮＣ−ＺＺ粒子の持つ抗体結合能を上げることで免疫学的測定の感度を上げるためＺＺタグを持つタンパク質分子とＰｒｅ−Ｓ領域を持たないタンパク質分子を有するハイブリッド型の粒子の製法と利用方法が記載されている。さらに、特許文献７では蛍光標識したＢＮＣ−ＺＺへ抗体を弱く架橋することによって多抗原を同時検出する手法が実施例に例示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００６−５１７９８５号公報
【特許文献２】特表２００２−５４４４８８号公報
【特許文献３】特開２００７−１２７６２６号公報
【特許文献４】特開２００８−１９１１４３号公報
【特許文献５】特開２０１０−０９６６７７号公報
【特許文献６】特開２００７−１２１２７６号公報
【特許文献７】特開２０１０−２１０４４４号公報
【特許文献８】特表２００７−５０６０８４号公報
【特許文献９】特開２００１−３１６２９８号公報
【特許文献１０】特開２００４−００２３１３号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｖａｃｃｉｎｅ  １９，３１５４−３１６３、２００１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
一般に、イムノアッセイにおいて感度を上昇させるためには、（１）検出素子の検出対象物質に対し高い親和性を持つ素子を利用する、（２）検出対象物質と結合した検出素子の発生するシグナル強度を上げるの、何れかの手法が用いられる。ここで、上述のようなＢＮＣ−ＺＺを検出素子として利用する場合、その検出対象への親和性は一定であるため、発生するシグナル強度を上げることが最も有効な手段となる。【００１０】
しかしながら、ＢＮＣ−ＺＺを利用したことが開示された文献では、よく知られたビオチンとストレプトアビジンの特異的結合能を利用し、ＨＲＰ結合量を上昇させてシグナルを上昇させる方法が、ビオチン化ＢＮＣ−ＺＺとして用いられている（特許文献４）に過ぎず、その検討は行われてこなかった。【００１１】
ＺＺ−ＢＮＣはプロテインＡ由来の抗体結合部位を持つため、免疫学的測定法で重要なマウスＩｇＧ１、ラットＩｇＧ、ヒツジＩｇＧ１、ヤギＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ３などの抗体との結合が弱く、使用法や使用範囲が大きく制限される。さらにＺＺーＢＮＣは各種ＩｇＧと結合するため、複数抗体が存在する環境、例えば、抗体サンドイッチＥＬＩＳＡや複数抗体が存在する血清等の評価では目的外の抗体との結合が起こるため、抗体特異的な検出が困難である。【００１２】
そして、実用化を考えた場合、ＢＮＣ−ＺＺやその標識体や修飾体はリポタンパク質であるため、ガラスやプラスチックに非特異的な結合を示す。非特異的吸着はイムノアッセイに大きな影響を与えるのみならず、希釈溶液の長時間保存でも大きな問題となる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、ウイルス様粒子に含まれる自己組織化能を有するタンパク質の特定の部位を介して生理活性分子を標識すると、斯かるウイルス様粒子を免疫学的測定に好適に用いることができることを見出した。【００１４】
更に、特定のブロッキング剤が上述のウイルス様粒子を免疫学的測定に用いる際に優れたブロッキング効果を発揮することを見出した。【００１５】
本発明は斯かる知見に基づいて完成されたものであり、以下に示す広い態様の発明を含むものである。【００１６】
項１  自己組織化能を有するタンパク質を含む免疫学的測定用ウイルス様粒子であって、該自己組織化能を有するタンパク質の少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して生理活性分子によって修飾されてなる、ウイルス様粒子。【００１７】
項２  前記自己組織化能を有するタンパク質がＨＢｓＡｇタンパク質である、上記項１に記載のウイルス様粒子。【００１８】
項３  前記自己組織化能を有するタンパク質が配列番号１に示すアミノ酸配列を含む上記項１のウイルス様粒子。【００１９】
項４  前記自己組織化能を有するタンパク質が抗体結合ドメインを有する、上記項１〜項３の何れか１項に記載のウイルス様粒子。【００２０】
項５  前記生理活性分子が、酵素、抗体結合ドメイン、ビオチン、蛍光色素、発光色素、及びアビジン化合物からなる群より選択される少なくとも１種である、上記項１〜項４の何れか１項に記載のウイルス様粒子。【００２１】
項６  前記酵素が、アルカリホスファターゼ及び／又はペルオキシダーゼである、上記項５に記載のウイルス様粒子。【００２２】
項７  前記抗体結合ドメインが、プロテインＡに含まれる抗体結合ドメイン、プロテインＧに含まれる抗体結合ドメイン、及びプロテインＬに含まれる抗体結合ドメインからなる群より選択される少なくとも１種である、上記項４又は項５に記載のウイルス様粒子。【００２３】
項８  前記抗体結合ドメインが、配列番号３〜５の何れかに示されるアミノ酸配列からなる上記項４又は項５に記載のウイルス粒子。【００２４】
項９  前記アビジン化合物が、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、ＡＶＲタンパク質、ブラダビジン（Ｂｒａｄａｖｉｄｉｎ）、リザビジン（Ｒｈｉｚａｖｉｄｉｎ）、及びタマビジン（登録商標）からなる群より選択される少なくとも１種である、上記項５に記載のウイルス様粒子。【００２５】
項１０  上記項１〜９の何れか１項に記載のウイルス様粒子であって、生理活性分子が抗体結合ドメインであり、該抗体結合ドメインに抗体が結合してなるウイルス様粒子。【００２６】
項１１  上記項１〜項１０の何れか１項に記載のウイルス様粒子を用いた免疫学的測定用ブロッキング剤であって、当該ブロッキング剤が、ヒドロキシアルキルセルロース、ポリビニルアルコール、エチレンオキサイド／プロピレンオキサイド共重合体、及び２−メタクリロイルオキシエチルホスホコリンで構成される共重合体からなる群より選択される少なくとも１種を含むブロッキング剤。【００２７】
項１２  前記ヒドロキシアルキルセルロースがヒドロキシプロピルメチルセルロースである上記項１１に記載のブロッキング剤。【００２８】
項１３  前記ポリビニルアルコールの重合度が、２００〜５０００である、上記項１１に記載のブロッキング剤。【００２９】
項１４  前記エチレンオキサイド／プロピレンオキサイド共重合体が、プルロニック（登録商標）である上記項１１に記載のブロッキング剤。【００３０】
項１５  前記エチレンオキサイド／プロピレンオキサイド共重合体が、プルロニック（登録商標）Ｆ１２７及び／又はプルロニック（登録商標）Ｐ１０５である上記項１１に記載のブロッキング剤。【００３１】
項１６  ２−メタクリロイルオキシエチルホスホコリンで構成される共重合体が、バイオリピジュア（登録商標）である、上記項１１に記載のブロッキング剤。【００３２】
項１７  ２−メタクリロイルオキシエチルホスホコリンを構成単位とする重合体がバイオリピジュア（登録商標）２０６及び／又はバイオリピジュア（登録商標）８０２である、上記項１１記載のブロッキング剤。【００３３】
項１８  上記項１〜項１０の何れか１項に記載のウイルス様粒子と上記項１１〜項１７の何れか１項に記載のブロッキング剤を含む免疫学的測定用キット。
【発明の効果】
【００３４】
本発明に係るウイルス様粒子は、優れた検出感度で免疫学的測定を行うことができる。【００３５】
本発明に係るブロッキング剤は、本発明に係るウイルス様粒子を用いて行う免疫学的測定において、得られるデータのバックグラウンドの低下及び／又は検出シグナルを増感させる作用を発揮し、Ｓ／Ｎ比を顕著に上昇させることが可能となる。【００３６】
本発明に係るキットを用いた免疫学的測定によると、得られるデータのＳ／Ｎ比を顕著に上昇させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】実施例５の結果を示す図。
【図２】実施例６の結果を示す図。
【図３】実施例１６の結果を示す図。
【図４】実施例１７の結果を示す図。
【図５】実施例１８の結果を示す図。
【図６】実施例２０の結果を示す図。
【図７】実施例２１の結果を示す図。
【図８】実施例２２の結果を示す図。
【図９】実施例２３の結果を示す図。
【図１０】実施例２４の結果を示す図（抗ＧＦＰ抗体）。
【図１１】実施例２４の結果を示す図（ＨＭＧモノクローナル抗体）。
【図１２】実施例２５の結果を示す図。
【図１３】実施例２７の結果を示す図。
【図１４】実施例２８の結果を示す図。
【図１５】実施例２９の結果を示す図。
【図１６】実施例３０の結果を示す図。
【図１７】実施例３１の結果を示す図。
【図１８】実施例３２の結果を示す図。
【図１９】実施例３３の結果を示す図。
【図２０】実施例３４の結果を示す図。
【図２１】実施例３５の結果を示す図。
【図２２】実施例３６の結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
＜ウイルス様粒子＞
本発明に係るウイルス様粒子は、免疫学的測定法に用いられ、自己組織化能を有するタンパク質を含む。自己組織化能を有するタンパク質は、そのシステイン残基のチオール基を介して、生理活性分子が修飾されてなる。
【００３９】
自己組織化能を有するタンパク質とは、生体内、特に細胞内で小胞体ルーメン、細胞膜、核膜等の脂質二重膜を巻き込んでウイルス様粒子を形成し得るタンパク質であり、且つシステイン残基を有する範囲において特に限定はされないが、例えば、エンベローブを有するウイルスの出芽機能に関連するタンパク質、エンベローブタンパク質、又はこれらの変異体等が挙げられる。
【００４０】
エンベローブを有するウイルスは、特に限定はされないが、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、アヒルＢ型肝炎ウイルス等のヘパドナウイルス科に属するウイルス；センダイウイルス（ＨＶＪ）等のパラミクソウイルス科に属するウイルス；単純ヘルペスウイルス等のヘルペスウイルス科に属するウイルス；インフルエンザウイルス等のオルトミクソウイルス科に属するウイルス；ヒト免疫不全ウイルス等のレトロウイルス科に属するウイルス等が挙げられる。
【００４１】
自己組織化能を有するタンパク質は特に限定はされないが、例えば、ＨＶＢの出芽機能に関連するタンパク質であるＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）タンパク質；ＨＶＪの出芽機能に関連するタンパク質であるＦプロテイン、ヘマグルチニンーノイラミニダーゼタンパク質、又はこれらの変異体が挙げられる。中でもＨＢｓＡｇタンパク質、Ｆプロテイン、ヘマグルチニンーノイラミニダーゼタンパク質、これらの変異体等が好ましい。
【００４２】
変異体とは、少なくとも一つ以上のシステイン残基を有し、且つ上述のようなウイルス様粒子を形成し得る作用を発揮する範囲に限りにおいて、特に限定はされることはなく、具体的な変異導入数も同様の範囲において、特に限定はされないが、通常は変異導入前のアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する変異体となるような変異導入数とすればよい。
【００４３】
なお、ここでいう変異導入とは、置換、欠失、挿入等を包含する。具体的な変異導入については、公知の方法を用いて実施することができ、特に限定はされないが、例えば置換であれば保存的な置換技術を採用すればよい。用語「保存的な置換技術」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。
【００４４】
例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン等といった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換技術にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸等といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン等といった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン等といった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシン等といったβ−分枝側鎖を有するアミノ酸残基、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン等といった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。
【００４５】
用語「同一性」とは、２以上の対比可能なアミノ酸配列の、お互いに対する同一のアミノ酸配列の程度をいう。従って、ある２つのアミノ酸配列の同一性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。アミノ酸配列又同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるＦＡＳＴＡを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、National Center of Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）のウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照すればよい。
【００４６】
ＨＢｓＡｇとは、特に限定はされないが、例えば配列番号１に示すアミノ酸配列を含むタンパク質等が挙げられ、そのＨＢｓＡｇの変異体とは、例えば特許文献５や９に記載されるＨＢｓＡｇの変異体等が挙げられる。Ｆプロテインとは、特に限定はされないが、例えばＮＣＢＩのウェブサイトに登録されたAccession No. NP_056877 ; Version: NP_056877.1 GI : 9627226にて示されるアミノ酸配列からなるタンパク質等が挙げられる。ヘマグルチニンーノイラミニダーゼタンパク質とは、特に限定はされないが、例えばＮＣＢＩのウェブサイトに登録されたAccession No. NP_056878 ; Version: NP_056878.1 GI : 9627227にて示されるアミノ酸配列からなるタンパク質等が挙げられる。
【００４７】
自己組織化能を有するタンパク質はシステイン残基を有しており、斯かるシステイン残基のチオール基を介して生理活性分子が修飾されてなる。具体的なシステイン残基は、特に限定はされないが、自己組織化能を有するタンパク質に基づいて形成されたウイルス様粒子の表面に位置する特定のシステイン残基に生理活性分子が修飾されてなることが好ましい。
【００４８】
このようなシステイン残基として、例えば上述の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるＨＢｓＡｇタンパク質であれば、１０７番目、１２１番目、１２４番目、１３７番目、１３８番目、１３９番目、１４７番目、又は１４９番目のシステイン残基が挙げられる。なお、このＨＢｓＡｇタンパク質の膜貫通ドメインとして９〜２８番目、８０〜９８番目、及び１７０〜１９２番目のアミノ酸配列が推定されている。
【００４９】
例えば、上記ＮＣＢＩのウェブサイトに記載されたアミノ酸配列からなるＦプロテインであれば、７０番目、１９９番目、３３８番目、３４７番目、３６２番目、３７０番目、３９４番目、３９９番目、４０１番目、又は４２４番目のシステイン残基が挙げられる。なお、このＦプロテインの膜貫通ドメインとして、１〜２５番目、１１７〜１３９番目、及び５０１〜５２３番目のアミノ酸配列が推定されている。
【００５０】
例えば、上記ＮＣＢＩのウェブサイトに記載されたアミノ酸配列からなるヘマグルチニンーノイラミニダーゼタンパク質であれば、１２９番目、１３８番目、１６１番目、１９２番目、２１６番目、２５８番目、２７１番目、３５２番目、３５７番目、３６５番目、４６３番目、４６９番目、４７３番目、５３５番目、５４４番目、又は５７１番目のシステイン残基が挙げられる。なお、このヘマグルチニンーノイラミニダーゼタンパク質の膜貫通ドメインとして、３８〜６０番目のアミノ酸配列が推定されている。
【００５１】
生理活性分子とは特に限定はされないが、例えば酵素、抗体結合ドメイン、ビオチン、蛍光色素、発光色素、アビジン化合物等が挙げられる。上述のように、本発明に係る自己組織化能を有するタンパク質のシステイン残基は複数存在し、この中の少なくとも１つのシステイン残基を介して生理活性分子が結合することから、上述の酵素、抗体結合ドメイン、ビオチン、蛍光色素、発光色素、アビジン化合物等のうち、１種のみならず２種以上が組み合わさって別個のシステイン残基を介して結合していてもよい。
【００５２】
具体的な酵素とは、通常、免疫学的測定の分野で酵素であれば、特に限定はされず、例えばペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等が挙げられる。
【００５３】
具体的な抗体結合ドメインは、特に限定はされないが、抗体のＦｃドメインに結合するドメインであることが好ましい。具体的な抗体結合ドメインは、特に限定はされないが、例えばプロテインＡに含まれる抗体結合ドメイン（配列番号３）、プロテインＧに含まれる抗体結合ドメイン（配列番号４）、及びプロテインＬに含まれる抗体結合ドメイン（配列番号５）等が挙げられる。
【００５４】
生理活性分子に包含される抗体結合ドメインとは、このような抗体結合ドメインが同一又は異なって複数含まれた態様であってもよい。このような態様として、例えば、Ｎ末端から順に、プロテインＡに含まれる抗体結合ドメイン、プロテインＧに含まれる抗体結合ドメイン、及びプロテインＧに含まれる抗体結合ドメインの順に配置されたアミノ酸配列からなる抗体結合ドメイン（配列番号６）、Ｎ末端から順にプロテインＡに含まれる抗体結合ドメインをタンデムで含むＺＺタグ等が挙げられる。
【００５５】
抗体結合ドメインに結合する抗体は、特に限定はされず、その構造もイムノグロブリンに限定はされず、少なくとも抗原を認識する機能を発揮する構造を有する分子であればよく、例えば多価化抗体などといった積み木構造を有する抗体であってもよい。
【００５６】
また、抗体の由来も特に限定されず、抗体産生に適した種々の動物に由来する抗体を用いることができる。
【００５７】
例えば、抗体がイムノグロブリンである場合、そのサブタイプは特に限定はされない。また、イムノグロブリンがＩｇＧ、ＩｇＡ等である場合のサブクラスも特に限定はされない。
【００５８】
上述の生理活性分子が抗体結合ドメインである場合、斯かるドメインと上述の抗体が結合した態様も、本発明に係るウイルス様粒子に包含される。なお、抗体結合ドメインと抗体の結合は、更に公知の架橋剤を用いて強固な結合（本明細書中で、不可逆的な結合と呼ぶことがある。）とされていてもよい。公知の架橋剤として、ＢＳ３等が挙げられる。
【００５９】
ビオチン、蛍光色素、及び発光色素は通常、免疫学的測定の分野で用いられるものであれば、特に限定はされず公知のものを適宜用いればよい。
【００６０】
具体的なアビジン化合物は、特に限定はされないが、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、ＡＶＲタンパク質、ブラダビジン（Ｂｒａｄａｖｉｄｉｎ）、リザビジン（Ｒｈｉｚａｖｉｄｉｎ）、タマビジン等が挙げられる。
【００６１】
本発明に係るウイルス様粒子は、公知の方法を用いて自己組織化能を有するタンパク質を含むウイルス様粒子を入手し、これに対してシステイン残基を介して修飾するキット等を用いて上述の生理活性分子を結合させればよい。また、結合させた後に、適宜ゲル濾過等の公知の手段を採用して、精製工程に供してもよい。
【００６２】
なお、生理活性分子を結合させた後に、公知の架橋剤を公知の方法で使用して、ウイルス様粒子に含まれる自己組織化能を有するタンパク質のシステイン残基と、生理活性分子との結合を強固にする処理が行われていてもよい。公知の架橋剤として、ＢＳ３等が挙げられる。
【００６３】
本発明に係るウイルス様粒子には、上述のシステイン残基と結合する生理活性分子の他に、更に生理活性分子（以後明細書中で第２の生理活性分子と呼ぶことがある。）が結合する自己組織化能を有するタンパク質を有する態様ウイルス様粒子も包含される。
【００６４】
このような態様のウイルス様粒子として、ウイルス様粒子の脂質二重膜を構成する脂質成分と第２の生理活性分子が結合する態様、上述の自己組織化能を有するタンパク質のシステイン残基以外のアミノ酸残基又は糖鎖を介して第２の生理活性分子が結合する態様、上記自己組織化能を有するタンパク質の特定の部位に第２の生理活性分子が組み込まれた態様が挙げられる。
【００６５】
上述の第２の生理活性分子は、上述のシステイン残基を介して修飾される生理活性分子と同様とすることができる。
【００６６】
例えば、第２の生理活性分子として抗体結合ドメインが上述の自己組織化能を有するタンパク質のＮ末端領域に組み込まれた態様として、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる自己組織化能を有するタンパク質を有するウイルス様粒子が挙げられる。すなわち、このような自己組織化能を有するタンパク質は、斯かるタンパク質のＮ末端領域及び斯かるタンパク質の少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して生理活性分子として抗体結合ドメインを有していてもよい。
【００６７】
例えば、上述の自己組織化能を有するタンパク質の糖鎖に第２の生理活性分子が結合する態様であれば、シアル酸等の糖鎖の末端糖残基をアルデヒド化する処理を施して得ることができる。
【００６８】
自己組織化能を有するタンパク質と、第２の生理活性分子の結合は、上述のように公知の架橋剤を使用して、結合を強固にする処理が行われていてもよい。公知の架橋剤として、ＢＳ３等が挙げられる。
【００６９】
また、第２の生理活性分子が抗体結合ドメインである場合、斯かるドメインに抗体が結合した態様も、本発明に係るウイルス様粒子に包含される。必要に応じて当該結合を強固にするための架橋処理が施された態様も、本発明に係るウイルス様粒子に包含される。公知の架橋剤として、ＢＳ３等が挙げられる。
【００７０】
本発明に係るウイルス様粒子の好ましい態様は、自己組織化能を有するタンパク質を含み、（１）当該タンパク質のＮ末端領域に抗体結合ドメインを有し、且つ当該タンパク質の上述する特定のシステイン残基を介して酵素が結合した態様（下記実施例の〔製造例３〕における「ＳＨ−ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ」及び〔製造例４〕における「ＳＨ−ＡＬＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ」がこれに相当する）；（２）当該タンパク質のＮ末端領域に抗体結合ドメインを有し、且つ当該タンパク質の上述する特定のシステイン残基を介して抗体結合ドメインが結合した態様（下記実施例の〔製造例５〕における「ＡＧＧ−ＢＮＣ−ＺＺ」がこれに対応する。）；（３）当該タンパク質のＮ末端領域に抗体結合ドメインを有し、当該タンパク質の上述する特定のシステイン残基を介して抗体結合ドメインが結合し、且つ当該タンパク質のＮ末端又はリジン残基を介して酵素が結合する態様（下記実施例の〔製造例６〕における「ＨＲＰ標識ＡＧＧ−ＢＮＣ−ＺＺ」がこれに対応する。）；（４）当該タンパク質の上述する特定のシステイン残基を介してアビジン化合物が結合する態様（下記実施例の〔製造例８〕における「ＢＮＣ−ＳＡ」がこれに対応する。）；（５）当該タンパク質の上述する特定のシステイン残基を介してアビジン化合物が結合し、且つ当該タンパク質のリジン残基を介して酵素が結合する態様（下記実施例の〔製造例８〕における「ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＳＡ」がこれに対応する。）；（６）当該タンパク質の上述する特定のシステイン残基を介して酵素が結合する態様（下記実施例の〔製造例９〕における「ＨＲＰ標識ＢＮＣ−Ｌ」がこれに対応する。）；（７）当該タンパク質の糖鎖を介して抗体結合ドメインが結合し、且つ当該タンパク質の上述する特定のシステイン残基を介して酵素が結合する態様（下記実施例の〔製造例１０〕における「ＳＨ−ＨＲＰ標識ＢＮＣ−（糖鎖）ーＡＧＧ」がこれに対応する。）；（８）当該タンパク質の上述する特定のシステイン残基を介して酵素が結合する態様（下記実施例の〔製造例１１：ＨＲＰ標識ＨＶＪ−Ｅ〕がこれに対応する。）等が挙げられる。
【００７１】
本明細書において定義する免疫学的測定法とは、抗体による抗原ー抗体結合作用を測定原理として採用する測定方法であれば、特に限定はされないが、例えば、ウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法、免疫染色法、ＥＩＡ法、ＦＩＡ法、及びこれらを基にした各種変法等が挙げられる。
【００７２】
＜ブロッキング剤＞
本発明に係るブロッキング剤は、上述の本発明に係るウイルス様粒子を用いた免疫学的測定法に用いられる。斯かるブロッキング剤は、上述の免疫学的測定において得られるデータのバックグラウンドの低下及び／又は検出シグナルを増感させる作用を発揮し、Ｓ／Ｎ比を顕著に上昇させることが可能となる。
【００７３】
このような効果は得られるデータでのみ評価されるものではなく、例えば免疫学的測定法において汎用される実験器具への上述のウイルス様粒子の吸着抑制を確認することによっても評価される。
【００７４】
ウイルス様粒子及び免疫学的測定法は、上記＜ウイルス様粒子＞にて詳述した通りとすることができる。
【００７５】
本発明に係るブロッキング剤は、ヒドロキシアルキルセルロース、ポリビニルアルコール、エチレンオキサイド／プロピレンオキサイド共重合体、２−メタクリロイルオキシエチルホスホコリンで構成される共重合体、又はこれらのうちの２種以上を含むものである。
【００７６】
ヒドロキシアルキルセルロースとは、特に限定はされることはないが、炭素数が１〜４程度のアルキル基を有することが好ましい。例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、ヒドロキシエチルエチルセルロース等が挙げられ、これら中でもヒドロキシプロピルメチルセルロースが好ましい。
【００７７】
本発明に係るブロッキング剤に含まれるヒドロキシアルキルセルロースは、上述の化合物を２種以上組み合わせたものであってもよく、具体的な入手方法としては、市場からの購入、公知の方法を用いた製造等が挙げられる。
【００７８】
ポリビニルアルコールとは、ビニルアルコールをモノマー単位とするポリマーであればよい。ポリビニルアルコールの重合度は特に限定はされないが、通常２００〜５０００程度が好ましく、より好ましくは５００〜２０００程度である。
【００７９】
また、通常用いられるポリビニルアルコールはポリ酢酸ビニルを鹸化して得られるものであることが多いため、上述のように酢酸ビニルをモノマー単位として有していてもよい。このような観点に基づき、上述のポリビニルアルコールの鹸化度（モル％）は、通常８０〜９８程度とすればよく、好ましくは８５〜９８程度である。
【００８０】
本発明に係るブロッキング剤に含まれるポリビニルアルコールは、上述の化合物を２種以上組み合わせたものであってもよく、具体的な入手方法としては、市場からの購入、公知の方法を用いた製造等が挙げられる。
【００８１】
エチレンオキサイド／プロピレンオキサイド共重合体とは、エチレンオキサイドとプロピレンオキサイドをモノマー単位とする共重合体であればよく、特に限定はされないが、例えばプルロニック（登録商標）又はその同等品であることが好ましい。
【００８２】
より好ましいエチレンオキサイド／プロピレンオキサイド共重合体としては、プルロニックＬ３１、プルロニックＬ３５、プルロニックＬ６４、プルロニックＰ９４、プルロニックＦ６８、プルロニックＦ８７、プルロニックＦ−１２７、プルロニックＰ−１０５等（以上、ＢＡＳＦ社商標）が挙げられ、これらの同等品としてポロキサマー（ＩＣＩ社商標）が挙げられる。これら中でも、プルロニックＦ−１２７又はプルロニックＰ−１０５、その同等品等が最も好ましい。
【００８３】
本発明に係るブロッキング剤に含まれるエチレンオキサイド／プロピレンオキサイド共重合体は、上述の化合物を２種以上組み合わせたものであってもよく、具体的な入手方法としては、市場（ＢＳＡＦ社やＩＣＩ社など）からの購入、公知の方法を用いた製造等が挙げられる。
【００８４】
２−メタクリロイルオキシエチルホスホコリンで構成される共重合体とは、２−メタクリロイルオキシエチルホスホコリン及びその他のモノマー成分を構成単位とする共重合体であればよく、特に限定はされない。
【００８５】
より具体的には、上述の２−メタクリロイルオキシエチルホスホコリンで構成される共重合体としては、リピジュア（登録商標）、バイオリピジュア（登録商標）、これらの同等品等が挙げられる。
【００８６】
好ましい２−メタクリロイルオキシエチルホスホコリンで構成される共重合体としては、例えば、リピジュアＢＬ−４０５、リピジュアＢＬ−２０３、リピジュアＢＬ−１００２、リピジュアＢＬ−１０３、リピジュアＢＬ−２０６、リピジュアＢＬ−８０２、これらの同等品等が挙げられ、特に限定はされないが、中でも、リピジュアＢＬ−２０６、リピジュアＢＬ−８０２、これらの同等品等が最も好ましい（なお、本文中では、例えばリピジュアＢＬ−８０２はリピジュア８０２と簡略記載した）。
【００８７】
本発明に係るブロッキング剤に含まれる２−メタクリロイルオキシエチルホスホコリンで構成される共重合体は、上述の化合物を２種以上組み合わせたものであってもよく、具体的な入手方法としては、市場（日油株式会社）からの購入、公知の方法を用いた製造等が挙げられる。
【００８８】
本発明に係るブロッキング剤に含まれるヒドロキシアルキルセルロース、ポリビニルアルコール、エチレンオキサイド／プロピレンオキサイド共重合体、又は２−メタクリロイルオキシエチルホスホコリンで構成される共重合体の含有量は、特に限定はされないが、ブロッキング剤１００重量部に対するヒドロキシアルキルセルロース、ポリビニルアルコール、エチレンオキサイド／プロピレンオキサイド共重合体及び２−メタクリロイルオキシエチルホスホコリンで構成される共重合体の総重量が、０．００１重量部〜１００重量部程度とすればよい。すなわち、ヒドロキシアルキルセルロース、ポリビニルアルコール、エチレンオキサイド／プロピレンオキサイド共重合体、又は２−メタクリロイルオキシエチルホスホコリンで構成される共重合体そのものを本発明に係るブロッキング剤としてもよい。
【００８９】
本発明に係るブロッキング剤には、上述の効果を妨げない範囲に限り、免疫学的測定法にて用いられる、上記ヒドロキシアルキルセルロース、ポリビニルアルコール、エチレンオキサイド／プロピレンオキサイド共重合体、２−メタクリロイルオキシエチルホスホコリンで構成される共重合体以外の成分が含まれていてもよい。具体的な他の成分とは、特に限定はされないが、例えば、防腐剤、ｐＨ調整剤、塩、界面活性剤、安定化剤等が挙げられる。また、本発明に係るブロッキング剤は、予め免疫学的測定法にて汎用される、水、緩衝液等に含まれた態様にて提供されてもよく、固体状のものとして提供され、これを上述の水、緩衝液等に溶解させて用時調製して用いることのできる態様で提供されてもよい。
【００９０】
本発明に係るブロッキング剤の使用量は特に限定はされないが、例えば免疫学的測定において用いる緩衝液等の溶液１００容量部に対して、通常は０．０００１〜５容量部程度とすればよい。
【００９１】
＜免疫学的測定用キット＞
本発明に係る免疫学的測定用キットとは、上述の本発明に係るウイルス様粒子と上述の本発明に係るブロッキング剤とを含む。
【００９２】
ウイルス様粒子及びブロッキング剤は、上記＜ブロッキング剤＞にて詳述した通りである。免疫学的測定とは、上記＜ウイルス様粒子＞にて詳述した免疫学的測定法と同様とすることができる。
【００９３】
本発明に係る免疫学的測定用キットには、更に、反応容器、発色・発光基質、反応溶液、標準物質、ディスポーザブル器具、マニュアル等を含んでいてもよい。
【００９４】
なお、本発明に係る免疫学的測定用キットにおいて、上述の本発明に係るウイルス様粒子と、上述の本発明に係るブロッキング剤とは、それぞれ別の容器（パック、ボトル等）に充填されていてもよく、同一の容器に充填されていてもよい。また、ウイルス様粒子及びブロッキング剤は、水、緩衝液等に含まれる態様で提供されていてもよく、特にブロッキング剤は粉末状で提供され、免疫学的測定を行う際に水、緩衝液等で適宜用時調製（希釈）して用いられる態様で提供されてもよい。
【実施例】
【００９５】
以下に、本発明をより詳細に説明するための実施例を示す。ただし、本願発明が下記に示す実施例に限定されないのは言うまでもない。【００９６】
〔製造例１：ＢＮＣ−Ｌの調製〕
ＢＮＣ−Ｌとは配列番号１に示すアミノ酸配列からなる自己組織化能を有するＨＢｓＡｇタンパク質を含むウイルス様粒子であり、特許第４０８５２３１号又は特許第４９３６２７２号に記載されている方法で調製した。【００９７】
具体的には、特許第４０８５２３１号で調製したＢＮＣ−Ｌを発現する酵母を培養し、ガラスビーズを利用して培養菌体を破砕して得られた菌体破砕液を７０℃にて２０分間の熱処理に供した。熱処理後に遠心工程に供し、得られた上清を回収した後に、硫酸セルロファインカラム及びゲル濾過カラムを用いて精製し、タンパク質濃度が０．２ｍｇ／ｍＬ以上となるように濃縮して、ＢＮＣ−Ｌを得た。【００９８】
なお、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる自己組織化能を有するタンパク質を含むＢＮＣ−Ｌは粒子を形成し、粒子当たり当該タンパク質が１１０分子程度含まれることが報告されている（Yamada et al., Vaccine 19, 3154-3163, 2001）。【００９９】
〔製造例２：ＢＮＣ−ＺＺの調製〕
ＢＮＣ−ＺＺとは、ＢＮＣ−Ｌ〔製造例１〕に含まれるＨＢｓＡｇタンパク質のＮ末端に、プロテインＡの２つの抗体結合ドメイン（Ｚドメイン）をタンデムで有する、配列番号２にて示される自己組織化能を有するタンパク質を含むウイルス様粒子であって、特許第４２１２９２１号及び特許第４９３６２７２号に記載されている方法で調製した。【０１００】
具体的には、特許第４２１２９２１号で調製したＢＮＣ−ＺＺを発現する酵母を培養し、ガラスビーズを利用して培養菌体を破砕して得られた菌体破砕液を７０℃にて２０分間の熱処理に供した。熱処理後に遠心工程に供し、得られた上清を回収した後に、Porcine IgGカラム及びゲル濾過カラムを用いて精製し、タンパク質濃度が０．２ｍｇ／ｍＬ以上となるように濃縮して、ＢＮＣ−ＺＺを得た。【０１０１】
なお、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる自己組織化能を有するタンパク質は上記のＢＮＣ−Ｌの類推からＢＮＣ−ＺＺ粒子当たり１１０分子程度含まれると推定される。また、ＢＮＣ−ＺＺは、抗体と混合すると粒子の抗体結合ドメインと抗体のＦｃドメインとの結合による抗体の抗原結合能を保持した複合体を形成する。ＢＮＣ−ＺＺの酵素標識体も同様の複合体を形成する。以下、当該複合体を混合複合体と呼ぶことがある。【０１０２】
〔製造例３：ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺの調製〕
ＢＮＣ-ＺＺ〔製造例２〕に対して、ＳＨ基を介してＨＲＰ標識するためのキット及びＮＨ２基を介してＨＲＰ標識するためのキット（それぞれ、Peroxidase Labeling Kit-SH及びPeroxidase Labeling Kit-NH2；共に同仁化学）を利用し、これらのマニュアルに従ってＨＲＰ標識後、ゲル濾過カラムにより精製し、２種類のＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺを得た。【０１０３】
なお、ＳＨ基を介したＨＲＰ標識ではＢＮＣ−ＺＺ粒子当たり、１１０分子程度のＨＲＰ分子が含まれることを確認した。すなわち、上述の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質中の少なくとも１つのシステイン残基のＳＨ基に１分子程度のＨＲＰ分子が架橋されていることが示唆される。【０１０４】
また、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺの作製時に用いたＢＮＣ−ＺＺはその粒子形状に影響を与えない緩和な条件にてＨＲＰ標識処理を施した。実際、粒子径を動的光散乱法にて測定した結果、標識前54nmに対し、標識後は58nmであり、大きな差は認められなかった。したがって、ＨＲＰ標識されるＮＨ２基及びＳＨ基は、共に粒子表面に露出したアミノ酸残基に由来するＮＨ２基及びＳＨ基であることが明らかである。【０１０５】
ＢＮＣ−ＺＺに含まれるタンパク質のアミノ酸配列を示す配列番号２を基にすれば、例えばＮＨ２基であれば、Ｎ末端のＮＨ２基、若しくは１番目、４３番目、６７番目、７０番目、９８番目、１１２番目、１１３番目、１２１番目、１２５番目、１２８番目、１５６番目、１７０番目、１７１番目、１７９番目、３０８番目、又は３２７番目の何れかのリジン残基側鎖のＮＨ２基を介してＨＲＰ標識されていることが示唆される。【０１０６】
一方で、ＳＨ基であれば、例えば、２９３番目、３０７番目、３１０番目、３２３番目、３２４番目、３２５番目、３３３番目、又は３３５番目の何れかのシステイン残基のＳＨ基を介してＨＲＰ標識されていることが示唆される。【０１０７】
実施例１
上記製造例３に示す２種類の方法にて調製したＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺのＨＲＰ活性を測定する実験を行った。ＨＲＰの基質としてSAT-blue溶液（同仁化学）を用い、４９２ｎｍの吸光度（Abs 492nm）を測定し、また２８０ｎｍの吸光度を測定して算出したタンパク質量を用いて比活性を求めた。【０１０８】
その結果、ＮＨ２基を介してＨＲＰ標識したＢＮＣ−ＺＺ（以後これをＮＨ２−ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺと呼ぶことがある。）の比活性は０．３５１ｕｎｉｔ／μｇ（Ｕ／μｇ）であり、一方でＳＨ基を介してＨＲＰ標識したＢＮＣ−ＺＺ（以後これをＳＨ−ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺと呼ぶことがある。）の比活性は０．８４４Ｕ／μｇであった。すなわち、ＮＨ２−ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺはＳＨ−ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺの約４１％の活性しか示さなかった。なお、ｕｎｉｔは基質であるSAT-blueを上記の条件で用いて測定した時のAbs 492nm値の特異的な上昇値を示す。【０１０９】
この結果は、ＨＲＰというタンパク質分子が標識できるレベルでアクセス可能なＮＨ２基はＳＨ基と比べると少ないことを示唆している。また、より多くのＨＲＰ分子がＳＨ基を介しては標識可能なことから、この標識法の方が、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺをより高感度の抗体検出プローブとして利用できる可能性を持つことが明らかとなった。【０１１０】
〔製造例４：ＡＬＰ標識ＢＮＣ−ＺＺの調製〕
ＢＮＣ-ＺＺ〔製造例２〕に対してＳＨ基を介してＡＬＰ標識するためのキット及びＮＨ２基を介してＡＬＰ標識するためのキット（それぞれ、Alkaline Phosphatase Labeling Kit-SH及びAlkaline Phosphatase Labeling Kit-NH2；共に同仁化学）を利用し、これらのマニュアルに従ってＡＬＰ標識後、ゲル濾過カラムにより精製し、２種類のＡＬＰ標識ＢＮＣ−ＺＺを得た。【０１１１】
また、製造例３にて作製したＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺと同様に、ＡＬＰ標識ＢＮＣ−ＺＺの作製時用いたＢＮＣ−ＺＺは、その粒子形状が破壊されないような条件にてＡＬＰ標識処理を施した。【０１１２】
従って、それぞれのＡＬＰ標識ＢＮＣ−ＺＺにおいても、上述のＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺと同様のアミノ酸残基におけるＮＨ２基又はＳＨ基にＡＬＰ標識されていることが示唆される。【０１１３】
実施例２
上記製造例４に示す２種類の方法にて調製したＡＬＰ標識ＢＮＣ−ＺＺのＡＬＰ活性を測定する実験を行った。ＡＬＰの基質としてｐＮＰＰ（Sigma Fast p-nitro phenyl phosphate tablets）を用い、４０５ｎｍの吸光度（Abs 405nm）を測定し、また、２８０ｎｍの吸光度を測定して算出したタンパク質量を用いて比活性を求めた。【０１１４】
その結果、ＮＨ２基を介してＡＬＰ標識したＢＮＣ−ＺＺ（以後これをＮＨ２−ＡＬＰ標識ＢＮＣ−ＺＺと呼ぶことがある。）のＡＬＰ酵素の比活性は３．５６Ｕ／μｇであり、一方で、ＳＨ基を介してＡＬＰ標識したＢＮＣ−ＺＺ（以後これをＳＨ−ＡＬＰ標識ＢＮＣ−ＺＺと呼ぶことがある。）は５．６１Ｕ／μｇであった。すなわち、ＮＨ２−ＡＬＰ標識ＢＮＣ−ＺＺはＳＨ−ＡＬＰ標識ＢＮＣ−ＺＺの約６０％の活性しか示さなかった。なお、ｕｎｉｔは基質であるｐＮＰＰを上記の条件で反応させた時のAbs 405nm値の特異的な上昇値を示す。【０１１５】
この結果、より多くのＡＬＰ分子がＳＨ基を介して標識可能なことがわかり、本標識法の方が、ＡＬＰ標識ＢＮＣ−ＺＺをより高感度の抗体検出プローブとして利用できる可能性を持つことが明らかとなった。【０１１６】
〔製造例５：ＡＧＧ−ＢＮＣ−ＺＺの調製〕
上記Ｚドメインを有するプロテインＡ由来の結合ドメイン１個とプロテインＧ由来の結合ドメイン２個を含む配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質を大腸菌で調製した（以下、これをＡＧＧと呼ぶことがある）。ＡＧＧタンパク質溶液にＥＭＣＳ（同仁化学）を添加して、ＡＧＧのアミノ基にマレイミド基を導入した。【０１１７】
ＢＮＣ−ＺＺ〔製造例２〕を、ＴＣＥＰ（Thermo Scientific）を用いて還元処理し、還元処理されたＢＮＣ−ＺＺとマレイミド基が導入されたＡＧＧとをインキュベートすることで架橋反応を行い、ＡＧＧ−ＢＮＣ−ＺＺを得た。すなわち、ＡＧＧ−ＢＮＣ−ＺＺとは上記配列番号２にて示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を含むウイルス様粒子であって、当該タンパク質中のシステイン残基を介してＡＧＧが結合した粒子である。【０１１８】
〔製造例６：ＨＲＰ標識ＡＧＧ−ＢＮＣ−ＺＺの調製〕
Peroxidase labeling Kit-NH2を用い、そのマニュアルに従ってＡＧＧ−ＢＮＣ−ＺＺ〔製造例５〕にＨＲＰを標識し、ＨＲＰ標識ＡＧＧ−ＢＮＣ−ＺＺを得た。【０１１９】
実施例３
ＨＲＰ標識ＡＧＧ−ＢＮＣ−ＺＺ〔製造例６〕のＨＲＰ酵素活性を、ＳＨ―ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ〔製造例３〕の酵素活性と比較検討するための実験を行った。両者の一定量を取り、そこへＨＲＰの基質であるＴＭＢ溶液（One-Step TMB Ultra、Thermo Scientific）を添加し、Abs 450nmを測定した。【０１２０】
その結果、ＨＲＰ標識ＡＧＧ−ＢＮＣ−ＺＺのＨＲＰ比活性はＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺの約１／３であることが分かった。ＢＮＣ−ＺＺをＮＨ２基又はＳＨ経由でＨＲＰ標識し、ＨＲＰ活性を検討した実施例２の結果から判断し、ＡＧＧ−ＢＮＣ−ＺＺもＢＮＣ−ＺＺとほぼ同様の効率でＮＨ２基を介したＨＲＰ標識が可能であることが明らかとなった。【０１２１】
〔製造例７：ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ／ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体複合体の調製〕
製造例２に記載したようにＢＮＣ−ＺＺと抗体を混合すると混合複合体が形成される。この混合複合体は抗体のＦｃ領域とＢＮＣ−ＺＺの抗体結合部位との結合が可逆的なため複数の抗体存在下では、結合した抗体の入れ替わりがおこる。そこでこの結合を不可逆的な結合にすれば、結合した抗体の持つ結合能をＢＮＣ−ＺＺに付与できると考えられる。そこで抗体結合ドメインと抗体との結合を架橋したものを以下の様に製造した。即ち、ＳＨ―ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ〔製造例３〕とウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体(Bethyl)を混合して両者の複合体を形成させ、更に架橋剤であるＢＳ３（同仁化学）をそれぞれ終濃度で0、50、200、400、又は1000μＭとなる様に加えた。次いで、Protein A Sepharose樹脂（GE Healthcare）用いて余剰のウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体を除去し、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ／ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体複合体を得た。【０１２２】
実施例４
ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ／ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体複合体〔製造例７〕のＨＲＰ活性を測定する実験を行った。ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ／抗体複合体を用い、実施例３に記載する方法でＨＲＰ活性測定を行った。結果を表１に示す。何れの架橋剤濃度を用いた場合でもAbs 450nmはほぼ同じ値を示し、ＨＲＰの活性が殆ど変化しないことを示している。【０１２３】
【表１】
0005867890.tif 000002
【０１２４】
実施例５
ＳＨ―ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ／抗体複合体に結合した抗体の結合様式を評価するために競合実験を行った。正常マウス血清からプロテインA/Gセファロース（GE Healthcare）で精製して得た、抗原特性を持たないＩｇＧ（以下、コントロールマウス由来ＩｇＧと呼ぶことがある。）をＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに各種濃度で添加して固相化した。その後、k-Block-e（ビークル社製）を用いてブロッキングした。【０１２５】
ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ／ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体複合体〔製造例７〕と、コントロールウサギ由来ＩｇＧ（上記と同様に調製、自社製）を混合してインキュベーションした後、その混合物を固相化済みの各ウェルに添加し反応させ、洗浄後、実施例３と同様の方法でＡｂｓ４５０ｎｍを測定した。その結果を図１に示す。【０１２６】
ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺと抗マウスＩｇＧウサギ由来抗体複合体であって、用いた架橋剤濃度が０Ｍのもの、すなわち架橋処理を行わない場合、コントロールウサギ由来ＩｇＧの共存下では、非共存下に比べ、固相化されたマウス由来ＩｇＧに対する反応は全ての濃度範囲で７０％まで低下した。ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ／ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体複合体に５０μＭのＢＳ３を用いて架橋処理を施した場合、コントロールウサギ由来ＩｇＧ存在下では、固相化されたマウス由来ＩｇＧに対して若干の反応の低下がみられ、可逆的な結合が残っていることを示す。そして２００μＭの濃度のＢＳ３を用いて架橋処理を施した複合体では、コントロールウサギ由来ＩｇＧを添加してもマウス由来ＩｇＧに対する反応には全く変化がなかった。即ち、２００μＭのＢＳ３で架橋させたＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ／ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体複合体では、それに結合する抗体の入れ替わりが起こらず、不可逆的な結合による複合体が出来ていることを示す。【０１２７】
以上のことから、２００μＭ以上の濃度のＢＳ３で架橋させたＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ／ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体複合体では不可逆的な結合による複合体ができることが明らかとなった。【０１２８】
実施例６
ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ／ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体複合体〔製造例７〕の残存抗体結合活性及び可逆的抗体結合活性を評価する実験を行った。上記製造例７に示す各種濃度の架橋剤を用いて処理したＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ／ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体複合体の製造法において、ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体に換えて、コントロールウサギ由来ＩｇＧとの複合体を作製した。なお、使用したＢＳ３の濃度は、０μＭ、５０μＭ、及び２００μＭである。これら複合体をＥＬＩＳＡ用プレートの各ウェルに加えて固相化し、更にk-Block-e（ビークル社製）を用いてブロッキングした。次いで、各ウェルに1/10000、1/5000、及び1/1000に希釈したＡＬＰ標識ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体（Invitrogen）を添加し反応させ、洗浄後、実施例２と同様の方法でAbs405nmを測定した。結果を図２に示す。【０１２９】
ＢＮＣ−ＺＺやＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺではＡＬＰ標識したウサギ抗体は添加量に依存してＡＬＰ酵素活性が増大し、1/1000希釈を添加時では非添加時に比べ４倍以上になった。このことはＡＬＰ標識ウサギ抗体がＢＮＣ−ＺＺやＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺの抗体結合部位に結合していることを示している。一方、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺとコントロールウサギ由来ＩｇＧを予め混合しただけで形成させた混合複合体（図中のＺＺ−ＨＲＰ  ０）や、ＢＳ３の５０μＭを加えて架橋させた複合体（図中のＺＺ−ＨＲＰ  ５０）では1/1000希釈添加時で、非添加時に比べ前者で１７０％、後者で１３７％のＡＬＰ活性が見られた。これらの複合体ではＡＬＰ標識ウサギ抗体が結合可能であることを示しており、その一方で、ＢＳ３の２００μＭで架橋させた複合体の場合（図中のＺＺ−ＨＲＰ  ２００）、ＡＬＰ標識ウサギ抗体の結合は見られなかった。【０１３０】
以上のことから、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺと抗体の複合体の場合、ＢＳ３の２００μＭ以上の濃度で架橋させればＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺに残存する抗体結合活性は無く、可逆的な結合もないことを示している。【０１３１】
〔製造例８：ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＳＡ／抗マウスＩｇＧ抗体複合体の調製〕
ＥＭＣＳを用いて、ストレプトアビジン（ＳＡ；Thermo Scientific社製）のアミノ基にマレイミド基（ＭＡＬ基）を導入した。次いで、ＢＮＣ−Ｌ〔製造例１〕と上記ＭＡＬ基が導入されたＳＡとインキュベートすることで、架橋反応を行い、ＳＡ標識ＢＮＣ−Ｌ（以下、ＢＮＣ−ＳＡと呼ぶことがある。）を得た。すなわち、ＢＮＣ−ＳＡとは配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質を含むウイルス様粒子であって、当該タンパク質のシステイン残基を介してＳＡが結合している粒子である。更に、得られたＢＮＣ−ＳＡにPeroxidase Labeling Kit- NH2を用いてＨＲＰを架橋させ、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＳＡを得た。また、Biotin Labeling Kit-NH2（同仁化学）を利用してウサギ由来のビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体を得た。そして上記ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＳＡとウサギ由来ビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体をタンパク質量として等量混合してＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＳＡ／ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体複合体を調製した。【０１３２】
実施例７
ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＳＡ／抗マウスＩｇＧ抗体複合体のＨＲＰ活性を測定する実験を行った。上記実施例１と同様の方法にてＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＳＡ／ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体複合体〔製造例８〕のＨＲＰ活性を測定した。【０１３３】
その結果、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＳＡ／ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体複合体のＨＲＰ活性は、対照のＳＨ−ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺの約１／８であることが分かった。実施例１の結果から、ＮＨ２−ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺのＨＲＰ活性は、ＳＨの約１／２．４であることから、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＳＡ／ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体のＨＲＰ活性は、ＮＨ２−ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺと比べると約１／３であると判断することができる。【０１３４】
実施例８
ＢＮＣ−ＺＺの容器への吸着とブロッキング剤の効果を検討するための実験を行った。ＢＮＣ−ＺＺ〔製造例２〕をＰＢＳに３００ｎｇ／ｍＬになる様に溶解した溶液をポリエチレン製マイクロチューブ中に分注し、そこに表２に示す各種ブロッキング剤を添加した。各チューブを密栓後、室温で４日間、容器を回転させながら放置した後、溶液中に残存するＢＮＣ−ＺＺ量を測定した。測定にはＢＮＣ−ＺＺの粒子表面のＰｒｅ−Ｓ１領域を測定するＥＬＩＳＡキット（HB Pre-S1 Antigen Quantitative ELISA Kit, Rapid、ビークル社製）を利用し、付属のマニュアルに従って測定した。結果を表２に示す。【０１３５】
ＰＢＳのみの場合、溶液中には１．３％のＢＮＣ−ＺＺが残存し、殆どが容器に吸着されることが分かった。これに各種ブロッキング剤を添加すると何れも抑制効果を示したが、効果の高かったのはスキムミルク、ブロックエース（大日本製薬）、Pluronic F-127、Lipidure802であった。【０１３６】
【表２】
0005867890.tif 000003
【０１３７】
実施例９
ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺの容器への吸着とブロッキング剤の効果を検討する実験を行った。表３に示す各種ブロッキング剤を含む終濃度３００ｎｇ／ｍＬのＳＨ−ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ〔製造例３〕のＰＢＳ溶液を調製し、それぞれ表面処理なしのポリエチレン製チューブ、ＭＰＣ（2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine）処理したチューブ、及びガラスチューブに入れた。すべてのチューブを密栓し、回転させながら４℃で２日間放置し、溶液中に含まれるＨＲＰ活性を次の方法で測定した。即ち、２μｇ／ｍＬのブタＩｇＧをＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレートの各ウェルへ添加して固相化した。次いで１％ブロックエースを添加しブロッキングした。ここへ上述の各種チューブ中で放置したＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ溶液を各ウェルに添加し、固相化したブタＩｇＧへ結合させた。次いで、各ウェルにＴＭＢ溶液（1-Step TMB slow:Thermo Scientific）添加した後、Ａｂｓ４５０ｎｍ値をプレートリーダーにて測定した。各サンプルのＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺの残存率は、コントロールとして５００μｇ／ｍＬでＭＰＣ処理チューブに同様に保存していたものを３００ｎｇ／ｍＬに希釈して得られたもののAbs４５０ｎｍ値を基に算出した。表３にその結果を示す。【０１３８】
【表３】
0005867890.tif 000004
【０１３９】
ブロッキング剤を含まない溶液（表中のＰＢＳ）を無処理のプラスチックチューブへ入れたものでは２日で７８％、ガラスチューブへは４８％の吸着が起こった。ＭＰＣ処理チューブでは吸着は抑え得られたが１０％の吸着が残った。ここへ各種ブロッキング成分を添加すると何れも抑制効果が見られたが、良好な結果を示したものはＢＳＡ、ＨＰＭＣ、Pluronic F-127、Pluronic P-105であった。【０１４０】
実施例１０
ＰＶＤＦ膜に対するＢＮＣ−ＺＺの吸着とブロッキング剤の効果を検討するための実験を行った。ＰＶＤＦ膜を小片に切り分け、表４に示す各種濃度のブロッキング剤を含有するＰＢＳ中に室温で１時間浸すことでブロッキング処理を行い、ＰＢＳ−Ｔにて３回洗浄することで膜に結合していないブロッキング剤を除去した。次いで、表４に示す各種濃度のブロッキング剤を含有するＰＢＳ−Ｔに、ＢＮＣ−ＺＺ〔製造例２〕を３００ｎｇ／ｍＬの濃度で溶解した反応溶液を上記ブロッキング済のＰＶＤＦ膜と室温で１時間反応させ、その後、ＰＢＳ−Ｔに溶解したＨＲＰ標識ウサギ抗体と室温で２０分間反応させた。【０１４１】
反応終了後、ＰＢＳ−Ｔにて５回洗浄し、ＨＲＰの発光用基質であるECL Prime（GE Healthcare）と反応させ、発光検出装置（ChemiDoc XRS, Bio-Rad）を利用して発光を２０分間露光することで測定した。【０１４２】
なお、コントロールとしてブロッキング成分を含まないＰＢＳ−Ｔで同じ処理を行ったものを利用した。結果を表４に示す。【０１４３】
【表４】
0005867890.tif 000005
【０１４４】
ブロッキング剤を含有しないＰＢＳのみで処理したＰＶＤＦ膜は、全体が黒くなりＰＶＤＦ膜にＢＮＣ−ＺＺが大量に吸着したことが明らかであった。【０１４５】
一方、各種ブロッキング剤を用いてＰＶＤＦ膜にブロッキング処理を施し、更に反応させるＢＮＣ−ＺＺ溶液中に同じブロッキング剤を含有させた場合には、何れのブロッキング剤でもＰＶＤＦ膜へのＢＮＣ−ＺＺの吸着は殆ど認められなかった。【０１４６】
以上のことから、本実験で利用した全てのブロッキング剤は、ＰＶＤＦ膜のブロッキング処理と反応液中に添加して行うブロッキング処理の両方に用いた場合、ブロッキング効果を発揮することが明らかとなった。【０１４７】
実施例１１
ＰＶＤＦ膜へのＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺの吸着とブロッキング剤の効果を検討するための実験を行った。ＴＢＳに、５％のスキムミルク、１０％のスキムミルク＋３％の魚ゼラチン（フナコシ）、４％のブロックエース、５％の牛血清アルブミンとなる様に溶解した溶液（メンブレンブロッキング液）を調製した。小片に切り分けたＰＶＤＦ膜を、上記メンブレンブロッキング液を用いてブロッキング処理に供した。メンブレンブロッキング処理のコントロールは未処理のＰＶＤＦ膜とした。【０１４８】
次いで、ＳＨ−ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ〔製造例３〕を含むＴＢＳ−Ｔを調製し、さらに１％のスキムミルク、１％のブロックエース、１％のＢＳＡ、又は２％のゼラチンを添加して、反応ブロッキング液を調製し、上記ＰＶＤＦ膜に反応ブロッキング液を添加した。コントロールとしてＳＨ−ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺを含むＴＢＳ−Ｔを用いた。添加後、適宜洗浄したＰＶＤＦ膜を、実施例１０と同様の方法にて検出した。結果を表５に示す。【０１４９】
【表５】
0005867890.tif 000006
【０１５０】
ＰＶＤＦ膜をブロッキング処理せず、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺを含むＴＢＳ−Ｔを添加した場合には、像全体が黒くなり、そのシグナル強度のスコアは＋＋＋＋＋であった。これは、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺが大量にＰＶＤＦ膜に吸着したことを示す。一方で、各種メンブレンブロッキング液で処理したＰＶＤＦ膜にＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺを含むＴＢＳ−Ｔを添加した場合、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺのＰＶＤＦ膜への吸着は抑制されたが、依然として明らかな吸着反応が見られた。また、ＰＶＤＦ膜をメンブレンブロッキング液で処理し、更に各ブロッキング液を添加した場合には、ＢＳＡを含む反応ブロッキング液を除き、コントロールと比べ、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺのＰＶＤＦ膜への吸着が強く抑制された。ＢＳＡを含む反応ブロッキング液では、他の反応ブロッキング液とは異なり、ＰＶＤＦ膜のブロッキング処理の種類にかかわらず、ＰＶＤＦ膜から得られるシグナル強度の程度が高かった。【０１５１】
以上の結果は、ＰＶＤＦ膜へのブロッキング処理が、ＰＶＤＦ膜へのＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺの吸着抑制に重要であり、さらに反応ブロッキング液の種類がそれ以上に重要であることを示す。ＰＶＤＦ膜へのブロッキング液は何れも同程度の効果であったが、反応ブロッキング液としては、ブロックエース、スキムミルク、魚ゼラチンはほぼ同程度の効果であるが、ＢＳＡは弱いことがわかった。【０１５２】
実施例１２
ＰＶＤＦ膜へのＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ吸着と化学性ブロッキング剤の効果検討するための実験を行った。ＴＢＳにそれぞれ１％の濃度となるように表６に示す各種ブロッキング剤を溶解させた。対照としてＴＢＳに５％スキムミルクが溶解したＴＢＳを調製した。これらを用いてＰＶＤＦ膜をブロッキングし、次いで、ＳＨ−ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ〔製造例３〕と反応させた後、実施例１１と同様の方法にて評価した。結果を表６に示す。【０１５３】
５％スキムミルクでブロッキング処理したＰＶＤＦ膜では、膜全体に薄い黒化が見られＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺの膜への吸着が完全には抑制されていなかった。検討した化合物の内、Pluronic F-127、Pluronic P-105、ＨＰＭＣ、PVA2000、PVA500、Lipidure206、及びLipidure802では膜の黒化は殆ど起こらず、強い抑制効果が認められた。【０１５４】
【表６】
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【０１５５】
実施例１３
ウエスタンブロットにおけるＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺの効果をするための実験を行った。実施例１１及び１２の結果から、ＳＨ−ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺをＰＶＤＦ膜で利用する際には、ブロッキング剤としてPluronic F-127、Pluronic P-105、ＨＰＭＣ、PVA2000、PVA500、Lipidure206及びLipidure802を利用するとＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺの膜への吸着を抑制し、さらに実施例１０の結果からＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺの反応液中にブロッキング剤を含有させるとさらに効果が高いことが想定された。【０１５６】
そこでこれらのブロッキング剤を反応液中に含有させた時の効果を、抗vimentin抗体及びＳＨ−ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ〔製造例３〕を用いたＨｕＨ７細胞抽出液のウエスタンブロットにより検討した。検出方法は、実施例１０と同様に行った。なお、メンブレンのブロッキングは５％スキムミルクで行い、下記表７に示す各種ブロッキング剤を１％の終濃度となるようにしたものを反応時のブロッキングに用いた。【０１５７】
【表７】
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【０１５８】
１％のスキムミルクを追加した対照実験ではバックグラウンドとして膜全体に薄い黒化が起こった。一方で、反応液にPluronic F-127、Pluronic P-105、ＨＰＭＣ、PVA2000、PVA500、Lipidure 206及びLipidure 802を添加した場合には、ブロッキング剤の種類により多少効果の差はあるが、何れもバックグラウンドは対照より低く吸着抑制に有効であることがわかった。一方、抗体特異的なバンドのシグナル強度は何れのブロッキング剤でも殆ど変化はなかった。【０１５９】
以上の結果から、ブロッキング剤をＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺの反応液中に加えることで、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺの非特異的吸着を抑制可能であり、その時、抗体特異的なシグナルは保持されることが分かった。【０１６０】
実施例１４
ＥＬＩＳＡにおけるプローブの特異的結合に対する各種ブロッキング剤の効果を検討する実験を行った。コントロールマウス由来ＩｇＧ（ポリクローナル）をＥＬＩＳＡ用プレートに固相化した。対照としてコントロールマウス由来ＩｇＧを固相化しないＥＬＩＳＡプレートを用意し、共にk-Block-eによってブロッキング処理を行ったプレートを準備した。【０１６１】
これらのプレートに各種プローブ（ＢＮＣ−ＺＺ〔製造例２〕、ＳＨ−ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ〔製造例３〕、ＨＲＰ標識ＡＧＧ−ＢＮＣ−ＺＺ〔製造例６〕、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ／ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体複合体〔製造例７〕、及びＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＳＡ／ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体複合体〔製造例８〕）を一定濃度で添加し、固相化したコントロールマウス由来ＩｇＧとの結合反応を観察した。【０１６２】
なお、各種プローブと共に、表８に示す各種ブロッキング剤をそれぞれ終濃度で０．１％となるようにして用いた。ブロッキング剤の対照として、終濃度が０．２％となるようにカゼインを含有させたPBS-Tを用いた。【０１６３】
なお、ＢＮＣ−ＺＺに対してはＨＲＰ標識したウサギ由来のコントロールＩｇＧ抗体を同時に添加し反応後洗浄し、実施例９と同様の方法にてＡｂｓ４５０ｎｍを測定した。測定値はプローブ毎に、固相化抗体ありでブロッキング成分を含有しない反応液での反応を１００％とし、それぞれの固相化抗体なしの値をブランク値として引いたものを特異的反応として示した。結果を表８に示す。【０１６４】
【表８】
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【０１６５】
ブロッキング成分を全く添加しないで抗体とプローブとの反応を行った場合、非特異的結合は非常に高く特異的な反応はほとんど見られなかった。対照として用いたカゼインの場合、ＳＨ−ＨＲＰ−ＢＮＣ−ＺＺではかなりの特異的反応が見られたが、その他のプローブに対する反応は低かった。ブロッキング剤の中ではＨＰＭＣとＰＶＡでは特異的反応は低かったが、他のものではプローブによって大きさは異なったものの、良好な特異的反応を示すものが見られた。【０１６６】
実施例１５
次いで、実施例１４にて用いたブロッキング剤の濃度を変えて、各種プローブのＥＬＩＳＡプレートへの吸着と各種ブロッキング剤の特異的反応に対する効果を検討する実験を行った。大腸菌を用いて調製したＧＦＰタンパク質をＥＬＩＳＡ用プレートに固相化し、k-Block-eを用いてブロッキングした。【０１６７】
このプレートに、各種ブロッキング剤を添加した各種プローブ（ＳＨ−ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ〔製造例３〕とウサギ由来抗ＧＦＰ抗体の混合複合体；ＨＲＰ標識ＡＧＧ−ＢＮＣ−ＺＺ〔製造例６〕とウサギ由来抗ＧＦＰ抗体の混合複合体；ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ／ウサギ由来抗ＧＦＰ抗体複合体）を添加し抗原との結合反応を観察した。そして表９に示す各種ブロッキング剤を終濃度がそれぞれ０．０１％、０．０５％、０．１％となるように３つの条件で検討した。【０１６８】
なお、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ／ウサギ由来抗ＧＦＰ抗体複合体は、製造例７におけるＢＳ３の濃度を１０００μＭとし、ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体に換えて、ウサギ由来抗ＧＦＰ抗体を用いて調製した。対照は抗ＧＦＰウサギ抗体の代わりに上述のコントロールウサギ由来ＩｇＧを利用し、実施例９に示す方法と同様の方法でＡｂｓ４５０ｎｍを測定した。【０１６９】
得られた結果は抗ＧＦＰ抗体が非存在下で得られた値をノイズ値とし、抗ＧＦＰ抗体が存在下で得られた値を特異的シグナル値として、各シグナル値を各ノイズ値で割った数値をＳ／Ｎ比として表９に表した。【０１７０】
【表９】
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【０１７１】
種々のブロッキング剤はプローブ毎に異なったＳ／Ｎ比を示し、ブロッキング剤の濃度が高いと高いＳ／Ｎ比を示すもの、それとは逆にブロッキング剤の濃度が低いと高いＳ／Ｎ比を示すものもあった。これらのブロッキング剤は何れも適切な使用濃度で利用すれば、ＢＮＣ−ＺＺ等のプローブをＥＬＩＳＡで利用する際に有効であることが示唆された。【０１７２】
実施例１６
ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺの抗体結合活性を評価する実験を行った。製造例３にて調製したＮＨ２−ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺとＳＨ−ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺの抗体結合活性をＥＬＩＳＡにて比較した。コントロールウサギ由来ＩｇＧをＥＬＩＳＡプレートに固相化し、各ウェルを１％のブロックエースを用いてブロッキングした。ＢＮＣ−ＺＺタンパク質量として０、９．３７５、１８．７５、３７．５、７５、１５０、３００、６００ｎｇ／ｍＬの各種濃度のＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ溶液を調製し、更に終濃度が０．０５％となるようにPluronic F-127を含むように添加したＰＢＳ−Ｔをウェルに添加し反応させ、洗浄後、
実施例９に示す方法にてＡｂｓ４５０ｎｍを測定した。その結果を図３に示す。【０１７３】
全ての濃度で、ＳＨ−ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺで得られた測定値の方がＮＨ２−ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺのそれより高かった。特に、３００ｎｇ／ｍＬや６００ｎｇ／ｍＬの濃度ではＳＨ−ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺで得られた測定値の方がＮＨ２−ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺのそれより約２．１倍から２．７倍高かった。この倍率は、上記実施例１に示す両者のＨＲＰ比活性の違い（前者が０．８４４で後者が０．３５１Ｕ／μｇであるので、約２．４倍高い）とほぼ同じレベルであり、何れのＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺもこれらの濃度では固相化抗体にほぼ最大量結合していることが示唆された。一方、これより低い濃度では、ＳＨ−ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺとＮＨ２−ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺで得られた測定値の倍率は高くなり、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ濃度が３７．５ｎｇ以下では平均で約７．２４倍まで高くなった。このことは、低濃度域ではＳＨ−ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺの方がより多く固相化抗体に結合したことを示しており、ＨＲＰの比活性が約２．４倍違うことを勘案すると、ＳＨ−ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺはＮＨ２−ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺより、抗体に対する結合親和性が３倍程度も強いことが示唆される。ＮＨ２基を介する標識は粒子を構成するＢＮＣ−ＺＺタンパク質の主にリジン残基をターゲットにして行われるが、リジン残基は抗体結合部位に多く存在することから、ＮＨ２基を介した標識は抗体結合部位に影響を与え抗体の結合を阻害するものと考えられる。一方で、ＳＨ基はＢＮＣ−ＺＺタンパク質の膜貫通領域中の外部露出部位に存在することからＳＨ基をターゲットにした場合、抗体結合能に影響を与えないと考えることができる。【０１７４】
従って、ＢＮＣ−ＺＺをＨＲＰ標識する場合、ＳＨ基を介して標識した方がＢＮＣ−ＺＺの抗体結合能をより活かすことができること、更にＨＲＰ活性も高く、抗体に対する結合活性とＨＲＰ標識を併せて約７．２倍高い標識物を形成できることから、ＳＨ基を介した標識のほうが遥かに優れていると結論される。以下、特に断らない限り、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺとはＳＨ基を介したものである。【０１７５】
実施例１７
ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺのＥＬＩＳＡにおける応用について検討する実験を行った。Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原のペプチドであるPre-S2（ビークル社製、製品番号BCL-AGS2-21）で固相化したＥＬＩＳＡプレートを、k-Block-eでブロッキングし、各種濃度の抗Pre-S2マウス抗体（特殊免疫研究所、2APS42）を添加した。次いで、終濃度が０．０５％となるようにPluronic F-127が添加されたＰＢＳ−Ｔに溶解したＨＲＰ標識抗マウス抗体、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ〔製造例３〕、又はこれらを同濃度で併用したものを添加し反応させ、洗浄後、実施例９と同様の方法にてＡｂｓ４５０ｎｍを測定した。結果を図４に示す。【０１７６】
図中、白三角印の「ＨＲＰ−ＺＺ」に示すように、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺを利用すると、図中、黒丸印の「２ｎｄ  ＩｇＧ」に示すように抗マウス抗体で検出した時と比べて１０倍程度感度が上昇しており、図中、黒四角印の「ＨＲＰ−ＺＺ＋ＩｇＧ」に示すようにこれらの両者を併用すると３０倍程度も感度が上昇することが明らかとなった。【０１７７】
実施例１８
実施例１７と同様に、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺの抗体検出型ＥＬＩＳＡについて検討した。本実験で用いたリーシュマニア原虫の組換タンパク質とコントロールヒト抗血清は何れも愛知医科大学、感染・免疫学講座教室から提供を受けたものである。Ｐｒｅ−Ｓ２に代えてリーシュマニアの病原体である原虫の組換タンパク質を固相化したＥＬＩＳＡプレートを、ｋ−Ｂｌｏｃｋ−ｅでブロッキングし、コントロールヒト抗血清の各種濃度を添加した。次いで、終濃度が０．０５％となるようにPluronic F-127が添加されたＰＢＳ−Ｔに溶解したＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ抗体、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ〔製造例３〕、又はこれらを同濃度で併用したものを添加し反応させ、洗浄後、基質としてＡＢＴＳ（１−ＳＴＥＰ  ＡＢＴＳ，Thermo Scientific）にてＡｂｓ４０５ｎｍを測定した。結果を図５に示す。なお、測定値は抗体価をUnit/mLとして表した。【０１７８】
図中、白四角印の「ＨＲＰ−ＺＺ」に示すように、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺを利用すると、図中、黒三角印の「２ｎｄ  ＩｇＧ」に示すように抗ヒトＩｇＧ抗体で検出した時と比べて１０倍弱感度が上昇しており、図中、黒丸印の「ＨＲＰ−ＺＺ＋ＩｇＧ」に示すようにこれらの両者を併用すると３０倍程度も感度が上昇することが明らかとなった。【０１７９】
以上の実施例１７及び１８に示す結果から、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺは抗体検出型ＥＬＩＳＡで高感度検出に有用であり、特に検出抗体と共存させると更に高感度での検出が可能なことが判った。【０１８０】
実施例１９
ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺのＥＬＩＳＡにおける実践的測定を検討した。ＧＦＰタンパク質で固相化されたＥＬＩＳＡプレートを、k-Block-eでブロッキングした。濃度が既知の抗ＧＦＰマウスＩｇＧ抗体をスタンダードとし、サンプルとしてマウス抗ＧＦＰ抗血清を１００倍以上に希釈したものを、それぞれ上記ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加した。次いで、終濃度が０．０５％となるようにPluronic F-127が添加されたＰＢＳに溶解したＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ〔製造例３〕、ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体とＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺの混合複合体、又はウサギ由来ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体をそれぞれ添加し反応させ、洗浄後、実施例９に示す方法と同様にＡｂｓ４５０ｎｍを測定した。測定した値は、スタンダード抗体で得られたそれぞれの検量線に基づいて、抗血清中の抗ＧＦＰマウスＩｇＧの濃度をｍｅａｎ±ｓｔｄ（ｎｇ／ｍＬ、ｎ＝３）として計算した。【０１８１】
その結果、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺと抗マウスＩｇＧの混合複合体で測定した値は、それぞれ１５６１３±９３６、１５４０３±１１９２であり、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体で定量した１５４００±１０９とよく一致し、十分な定量性を持つことが明らかとなった。【０１８２】
実施例２０
ＡＬＰ標識ＢＮＣ−ＺＺの抗体結合活性を評価するための実験を行った。コントロールウサギ由来ＩｇＧを用いて固相化したＥＬＩＳＡプレートを１％のブロックエースでブロッキングし、各ウェルに上記製造例４にて作製したＮＨ２−ＡＬＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ又はＳＨ−ＡＬＰ標識ＢＮＣ−ＺＺをＢＮＣ−ＺＺタンパク質量に換算してそれぞれ0、9.375、18.75、37.5、75、150、300、600ｎｇ／ｍＬを５０μＬずつ各ウェルに添加し反応後、洗浄し、実施例２と同様の方法にてＡｂｓ４０５ｎｍを測定した。なお、ＡＬＰ標識ＢＮＣ−ＺＺと共に、終濃度が０．０５％となるPluronic F-127を用いた。結果を図６に示す。【０１８３】
全てのＢＮＣ−ＺＺの濃度でＳＨ−ＡＬＰ標識ＢＮＣ−ＺＺで得られた測定値の方がＮＨ２−ＡＬＰ標識ＢＮＣ−ＺＺのそれより高かった。６００ｎｇ／ｍＬの濃度ではＳＨ−ＡＬＰ標識ＢＮＣ−ＺＺで得られた測定値の方がＮＨ２−ＡＬＰ標識ＢＮＣ−ＺＺのそれより約１．７倍程度高かった。この倍率は、両者のＡＬＰ比活性の違い（前者が５．６１で後者が３．５６ｕｎｉｔ／μｇであるので、１．６倍高い）とほぼ同じレベルであり、何れのＡＬＰ標識ＢＮＣ−ＺＺも固相化抗体にほぼ最大量結合していることが示唆された。一方、これより低い濃度では、ＳＨ−ＡＬＰ標識ＢＮＣ−ＺＺとＮＨ２−ＡＬＰ標識ＢＮＣ−ＺＺで得られた測定値の倍率は高くなり、ＢＮＣ−ＺＺ濃度が３７．５ｎｇ以下では平均で３．６倍程度にまで高くなった。【０１８４】
このことは、低濃度域ではＳＨ−ＡＬＰ標識ＢＮＣ−ＺＺの方がより多く固相化抗体に結合したことを示唆している。ＡＬＰの比活性が１．６倍程度違うことを勘案するとＳＨ−ＡＬＰ標識ＢＮＣ−ＺＺはＮＨ２−ＡＬＰ標識ＢＮＣ−ＺＺより、抗体に対する結合親和性が２．３倍強いと推定される。ＮＨ２基経由の標識ではＳＨ基を介した場合より抗体結合能が低下した原因は、上記実施例１６に記載したＨＲＰ標識の場合と同じ原因であると考えられる。【０１８５】
実施例２１
ＡＬＰ標識ＢＮＣ−ＺＺのＥＬＩＳＡへの応用を検討するための実験を行った。コントロールマウス由来ＩｇＧ（ポリクローナル）で固相化されたＥＬＩＳＡプレートを、０．５％のカゼインを用いてブロッキングした。各ウェルに各種濃度のＳＨ−ＡＬＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ〔製造例４〕又はＡＬＰ標識ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体を添加し反応させ、洗浄後、実施例２と同様の方法にてＡｂｓ４０５ｎｍを測定した。【０１８６】
なお、ＡＬＰ標識ＢＮＣ−ＺＺと共に、終濃度が０．０５％となるようにPluronic F-127を用いた。その結果を図７に示す。【０１８７】
ＡＬＰ標識ＢＮＣ−ＺＺを利用するとＡＬＰ標識した抗体よりも遙かに高い反応が見られ、ＡＬＰ標識ＢＮＣ−ＺＺが高感度の抗体検出に有用であることが示唆された。【０１８８】
実施例２２
ＨＲＰ標識ＡＧＧ−ＢＮＣ−ＺＺの抗体結合活性を評価するための実験を行った。コントロールブタ由来ＩｇＧ（実施例５の方法で調製した自社製）を用いてＥＬＩＳＡプレートを固相化し、次いで０．５％カゼインを用いてブロッキングした。各ウェルに図８のグラフ横軸に示した各種濃度のＨＲＰ標識ＡＧＧ−ＢＮＣ−ＺＺ〔製造例６〕又はＮＨ２ーＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ〔製造例３〕をプローブとして添加し反応させ、洗浄後、実施例９と同様の方法でＡｂｓ４５０ｎｍを測定した。なお、プローブには終濃度が０．０５％となるようにPluronic F-127を加えた。結果を図８に示す。【０１８９】
実施例３で示した様に、ＨＲＰ標識ＡＧＧ−ＢＮＣ−ＺＺのＨＲＰ活性はＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺの１／３であることが分かっているので、両プローブの抗体結合活性が同じと考えた場合、固相化したブタ由来ＩｇＧに対しＨＲＰ標識ＡＧＧ−ＢＮＣ−ＺＺはＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺの１／３の反応を示すはずである。【０１９０】
しかし、実際にはＨＲＰ標識ＡＧＧ−ＢＮＣ−ＺＺはＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺと比べると、１／１．１〜１／２．４程度の反応であった。このことはＨＲＰ標識ＡＧＧ−ＢＮＣ−ＺＺはＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺより高い抗体結合活性を持つことを示している。以上の結果から、ＨＲＰ標識ＡＧＧ−ＢＮＣ−ＺＺ及びＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺはいずれも抗体より優れた抗体結合活性を持つことを示している。【０１９１】
実施例２３
ＨＲＰ標識ＡＧＧ−ＢＮＣ−ＺＺのプロテインＧ由来抗体結合能を評価するための実験を行った。実施例２２に示すコントロールブタ由来ＩｇＧに代えてＢＮＣ−ＺＺでは結合しにくいと考えられている、マウス由来ＩｇＧ１を用いて固相化し、その他は、同様の実験を行った。結果を図９に示す。【０１９２】
ＨＲＰ標識ＡＧＧ−ＢＮＣ−ＺＺはマウスＩｇＧ１に対して高い結合反応を示した。一方、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺでは殆ど検出できなかった。このことはＨＲＰ標識ＡＧＧ−ＢＮＣ−ＺＺのプロテインＧ由来の抗体結合部位がうまく機能しており、プロテインＡ由来の抗体結合部位では結合しにくい抗体に対してもＨＲＰ標識ＡＧＧ−ＢＮＣ−ＺＺは高い結合力を有することを示している。【０１９３】
実施例２４
ＨＲＰ標識ＡＧＧ−ＢＮＣ−ＺＺのＥＬＩＳＡへの応用実験を行った。大腸菌を利用して製造したＧＦＰタンパク質をＥＬＩＳＡプレートへ固相化し、次いで、k-Block-eを用いてブロッキングした。各ウェルへウサギ由来抗ＧＦＰ抗体を図１０のグラフ横軸に示した各種濃度で添加し、更に１００ｎｇ／ｍＬのＨＲＰ標識ＡＧＧ−ＢＮＣ−ＺＺ〔製造例６〕又はＳＨーＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ〔製造例３〕をプローブとして加え反応させ、洗浄後、実施例９と同様の方法にてＡｂｓ４５０ｎｍを測定した。なお、プローブには終濃度が０．０５％となるようにPluronic F-127を加えた。結果を図１０に示す。【０１９４】
ＨＲＰ標識ＡＧＧ−ＢＮＣ−ＺＺは対照として用いたＳＨ−ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺと同じく、添加した抗体濃度に依存した反応を示したが、前者の反応は後者に比べると約１／２であった。ＨＲＰ標識ＡＧＧ−ＢＮＣ−ＺＺのＨＲＰ活性がＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺの１／３であることを考慮すると、ＨＲＰ標識ＡＧＧ−ＢＮＣ−ＺＺはＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ以上の反応を示すことが分かった。【０１９５】
次いでウサギ由来抗ＧＦＰ抗体に代えて、マウス由来抗ＨＭＧ１モノクローナル抗体（コスモバイオ；ＩｇＧ１）を用いて固相化処理を行い、それ以外は同様の方法で実験を行った。結果を図１１に示す。【０１９６】
ＨＲＰ標識ＡＧＧ−ＢＮＣ−ＺＺを検出プローブとして利用した場合、添加した抗体濃度に依存した反応を示したが、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺの場合には反応は殆ど見られなかった。【０１９７】
以上の結果は実践的な測定系においてもＨＲＰ標識ＡＧＧ−ＢＮＣ−ＺＺは抗体検出型ＥＬＩＳＡにて利用可能であることを示している。また、ＨＲＰ標識ＡＧＧ−ＢＮＣ−ＺＺはＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺでは検出できないマウスＩｇＧ１も検出できることを示しており、非常に有用性が高いことを示している。【０１９８】
実施例２５
ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ／ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体複合体の抗体結合活性を検討するための実験を行った。コントロールマウス由来ＩｇＧを用いて、ＥＬＩＳＡ用プレートを固相化し、次いで、k-Block-eで１時間反応させてブロッキングした。各ウェルに架橋剤ＢＳ３を用いて製造したＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ／ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体の複合体〔製造例７〕のうち、架橋剤ＢＳ３濃度が２００μＭ及び１０００μＭで作製したものを、それぞれ０、０．５５、１．６５、４．９４、１４．８、４４．４、１３３、４００ｎｇ／ｍＬの濃度のものをプローブとして添加し反応させ、洗浄後、実施例９と同様の方法でＡｂｓ４５０ｎｍを測定した。なお、プローブには終濃度が０．０５％となるようにPluronic F-127を加えた。結果を図１２に示す。【０１９９】
用いた両複合体の濃度に依存した反応が見られた。複合体調製時の架橋剤が２００μＭと１０００μＭを比較すると、後者は結合活性が若干低下したが、両者とも実用レベルの抗体結合活性を示した。【０２００】
実施例２６
卵白アルブミン（ＯＶＡ）を免疫して得られた抗ＯＶＡマウス抗血清中に存在する抗ＯＶＡマウスＩｇＥ、抗ＯＶＡマウスＩｇＧの両者を実践的に測定できるかどうかを確認した。ＯＶＡをＥＬＩＳＡプレートに固相化し、次いでh-Block-eを用いてブロッキングした。このプレートに各抗ＯＶＡマウス抗血清を１００倍以上に希釈したものを加えた。ＩｇＥ測定用プローブとして、ＳＨーＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ〔製造例３〕と抗マウスＩｇＥ（Nordic immunology Lab）を〔製造例７〕の方法に従いＢＳ３濃度を１０００μＭとして調製した複合体と、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＥを用いた。ＩｇＧ測定用プローブとしてはＳＨーＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ〔製造例３〕とウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体の混合複合体を用いた。それぞれの測定に用意したプレートのウェルにこれらのプローブを添加し反応させ、洗浄後、実施例９と同様の方法でＡｂｓ４５０ｎｍを測定した。測定値はスタンダード抗体を用いて作製した検量線を用い、スタンダード抗体の抗体価を基準にして各抗体の抗体価を、ｍｅａｎ±ｓｔｄ（ｕｎｉｔ／ｍＬ、ｎ＝３）で算出した。【０２０１】
マウス血清中の抗ＯＶＡＩｇＥの抗体価はＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ／抗マウスＩｇＥ複合体を用いた場合が３８０７±１４３９ｎｕｎｉｔ／ｍＬであり、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＥを用いた場合が３５５８±９３５ｎｕｎｉｔ／ｍＬであり、両者は同様の値を示した。【０２０２】
また、抗ＯＶＡマウスＩｇＧの抗体価は４１７５±８７１７μｕｎｉｔ／ｍＬであった。以上、これらの複合体を利用した測定系ではＩｇＥやＩｇＧの抗体価測定が十分に可能であり、実践的な有用性を持つことが分かった。【０２０３】
実施例２７
〔製造例８〕で調製したＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＳＡ／ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体の複合体を利用し、マウスＩｇＧに対する結合反応を確認する実験を行った。コントロールマウス由来ＩｇＧをＥＬＩＳＡプレートに固相化し、次いで１％のブロックエースを用いてブロッキングした。各ウェルにプローブとしてＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＳＡ／ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体複合体〔製造例８〕、及び対照としてＮＨ２ーＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ〔製造例３〕と抗マウスＩｇＧウサギ抗体（Bethyl）の混合複合体並びにウサギ由来ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体の各プローブを、それぞれ0、0.55、1.65、4.94、14.8、44.4、133、400ng/mLの濃度で添加し反応させ、洗浄後、実施例９と同様の方法でＡｂｓ４５０ｎｍを測定した。なお、プローブには終濃度が０．０５％となるようにPluronic F-127を加えた。その結果を図１３に示す。【０２０４】
いずれのプローブも加える濃度に依存して反応は大きくなった。ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＳＡ／抗体複合体は、同じＮＨ２基を介してＨＲＰを標識したＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺと抗体の混合複合体と比較して約１／２の結合活性を示した。ＨＲＰの酵素活性は前者が約１／３であることを考えると、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＳＡ／抗体複合体はＮＨ２ーＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺと抗体の混合複合体より抗体への結合能は高いことを示す。一方ＨＲＰ標識抗体と比較した場合、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＳＡ／抗体複合体は、約２倍の反応を示した。以上、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＳＡ／抗体複合体はＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体より抗体への結合能が高く、有用性があることが分かった。【０２０５】
実施例２８
実施例１３の方法と同様に、ＨｕＨ７細胞の抽出液をウエスタンブロットに供した。メンブレンのブロッキングは５％のスキムミルクを用い、使用した一次抗体はマウス由来抗vimentin抗体（Progen、1/1000希釈）である。プローブとして１％スキムミルクを含有するウサギ由来ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Rockland、1/10000；図中の２ｎｄ  Ａｂ）、又は０．１％のPluronic F-127及び１％スキムミルクを含有するＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ〔製造例３〕を用いた。結果を図１４に示す。【０２０６】
プローブとしてウサギ由来ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を用いて検出した場合、抽出液を１／１０に希釈するとバンドのシグナルが確認できなかったが、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺを用いた場合には、１／１０に希釈の抽出液でも同等のシグナルが得られた。したがって、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺが高感度検出に有効であることが分かる。【０２０７】
実施例２９
実施例２８と同様の方法でウエスタンブロットを行った。１次抗体として用いた上記抗vimentinマウス抗体を1/3000希釈とし、２次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Rockland、#611-1302、1/10000希釈）で検出し（図中のDetect-1）、その後、更に、０．１％Lipidure802を含む溶液に溶解してＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺを追加プローブとして検出した（図中のDetect-2）。結果を図１５に示す。【０２０８】
２次抗体として用いたＨＲＰ標識抗マウス抗体では検出感度が悪い場合（Detection-1）、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺを追加プローブとして用いて再検出（Detection-2）するだけでバンドシグナルを強めることができたことが分かる。なお、データは示していないが２次抗体を追加してもシグナルは殆ど上昇しなかった。従って、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺは追加するだけでシグナルを増感できるため非常に有用性が高い。【０２０９】
実施例３０
実施例２８と同様の方法で、ウエスタンブロットを行った。１次抗体として抗vimentinマウス抗体（Progen、1/2000希釈）、抗ＧＡＰＤＨウサギ抗体（EPITOMICS、1/10000希釈）、又はこれらの両者を用い、２次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Rockland）、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Santa Cruz）、又はＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ（ＨＲＰ−ＺＺ）を用いて検出した結果である。なお、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺは終濃度が０．１％となる量のPluronic F-127と共に用いた。結果を図１６に示す。【０２１０】
ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺを利用した場合、それぞれの２次抗体で検出した位置に、一度でvimentinとＧＡＰＤＨを検出することが出来ることが分かる。また、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺの場合は、抗体の由来する動物種が異なっても同等に同時に検出できることも示された。【０２１１】
実施例３１
サンプルとしてＨｕＨ７細胞抽出液に２倍の希釈系列で濃度調製したＧＦＰ−Ｈｉｓｔａｇタンパク質を添加し、これを実施例２８と同様の方法でウェスタンブロッティングに供した。１次抗体として抗ＧＡＰＤＨウサギ抗体（EPITOMICS、1/10000）及び抗ＧＦＰウサギ抗体（Rockland、1/2000）と反応させ、その後、０．１％のLipidure 206を含有するＰＢＳ−Ｔで希釈したＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ（ＨＲＰ−ＺＺ）を用いて同時に検出した。結果を図１７に示す。【０２１２】
ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺを利用した場合、ＧＦＰタンパク質は添加した濃度に従ってシグナルは増強し、定量性があることが分かった。【０２１３】
実施例３２
実施例２８と同様の方法で、ウエスタンブロットを行った。抗vimentinマウス抗体（Progen、1/2000）とＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺを予め等量混合し、その混合複合体をＰＶＤＦ膜へ加えることでワンステップ法により検出した。なお、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺと抗体の混合複合体の反応液は０．１％Pluronic F-127を含有するＴＢＳ−Ｔを用いた。対照として抗Vimentinマウス抗体との反応の後に、ＨＲＰ標識抗マウス抗体（Rockland、1/5000）で反応を行った２ステップ操作によっても検出した。結果を図１８に示す。ワンステップ法は、ＰＶＤＦ膜へのタンパク質のトランスファーの後、検出までの操作時間として、ブロッキングに５分（図中のＱ１）又は１５分（図中のＱ２）、次いで行う洗浄に５分、次いで行う反応（一次抗体＋ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ）に３０分、次いで行う洗浄に２５分（５分×５：Ｑ１）又は１５分（３分×５：Ｑ２）で、総時間が６５分程度であるのに対し、ＨＲＰ標識抗マウス抗体を用いた２ステップ法（図中のＭ）ではブロッキングに６０分、次いで行う洗浄に１０分（５分×２）、次いで行う１次抗体反応に６０分、次いで行う洗浄に１５分（５分×３）、次いで行う２次抗体反応に６０分、次いで行う洗浄に２５分（５分×５）で、総時間が２３０分程度であった。【０２１４】
通常法の２ステップ法では、タンパク質転写膜を利用してシグナルを検出するまで合計２３０分の工程が必要であったが、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺを利用したワンステップ法（図中のＱ１，Ｑ２）の場合、洗浄時間やその他の時間を短縮することで６５分に短縮して同等の結果を得ることができた。したがって、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺは迅速検出ウエスタンブロットを可能とする有用性を持つことがわかった。【０２１５】
実施例３３
実施例２８と同様の方法で、ウエスタンブロットを行った。１次抗体として抗ｐ５３ウサギ抗体（Santa Cruz、1/200）を、２次抗体としてＡＬＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Sigma、1/50000）、又はＳＨ−ＡＬＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ〔製造例４〕を用い、ＡＬＰ用基質としてCDP-Star(NEB)を採用した。結果を図１９に示す。【０２１６】
ＡＬＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体で検出した場合とＡＬＰ標識ＢＮＣ−ＺＺで検出した場合ではほぼ同等のシグナルが得られ、ＡＬＰ標識ＢＮＣ−ＺＺはウエスタンブロットでも有用性の高いプローブであり、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺを用いた本願の実施例で示した種々の使用法が可能であることが示唆された。【０２１７】
実施例３４
実施例２８と同じ方法で、ただしＡ４３１細胞抽出液に代えてウエスタンブロットを行った。１次抗体として抗体種がマウスＩｇＧ１である抗ＥＧＦＲ抗体（Cell Singnaling、1/1000希釈）、又は抗ｐ５３ウサギ抗体（Santa Cruz、1/200希釈）と反応させた後、０．１％のPluronic F-12７含有するＴＢＳ−Ｔで希釈したＨＲＰ標識ＡＧＧ−ＢＮＣ−ＺＺ〔製造例６〕又はＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ〔製造例３〕で反応させた。結果を図２０に示す。【０２１８】
マウスＩｇＧ１である抗ＥＧＦＲ抗体を用いた場合には、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ（図中のＺ）では全く検出できなかったが、ＨＲＰ標識ＡＧＧ−ＢＮＣ−ＺＺ（図中のＡ）を利用した場合には検出が可能であった。一方、ウサギＩｇＧである抗ｐ５３抗体を利用した場合には、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺを用いてもＨＲＰ標識ＡＧＧ−ＢＮＣ−ＺＺを用いてもよく検出できた。【０２１９】
以上の結果は、ＨＲＰ標識ＡＧＧ−ＢＮＣ−ＺＺはプロテインＧ由来の抗体結合部位を持つためマウスＩｇＧ１にも容易に結合し、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺはプロテインＡ由来の抗体結合部位のみを持つためマウスＩｇＧ１には殆ど結合しないこととよく一致し、ＨＲＰ標識ＡＧＧ−ＢＮＣ−ＺＺの有用性が証明された。【０２２０】
〔製造例９：ＨＲＰ標識ＢＮＣ−Ｌの調製〕
Peroxidase Labeling Kit-SHを用いて、ＢＮＣ−Ｌ〔製造例１〕のＳＨ基を介してＨＲＰ標識を施し、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−Ｌを得た。【０２２１】
実施例３５
Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原のペプチドであるPre-S2を固相化したＥＬＩＳＡプレートをブロッキングし、各ウェルに各種濃度の抗Pre-S2抗体を添加した。次いで、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−Ｌ〔製造例９〕を添加し反応させ、洗浄後、実施例９に示す方法にてＡｂｓ４５０ｎｍを測定した（抗原サンドイッチＥＬＩＳＡ）。その結果を図２１に示す。【０２２２】
その結果、ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＬはＥＬＩＳＡ測定のプローブとして十分に用い得ることが明らかとなった。【０２２３】
〔製造例１０：ＳＨ−ＨＲＰ標識ＢＮＣ−（糖鎖）ーＡＧＧ〕
ＢＮＣ−Ｌ〔製造例１〕をＮａＩＯ４で酸化処理し、ＢＮＣ−Ｌに付加された糖鎖中の糖残基にアルデヒド基を形成させた。次いでＡＧＧタンパク質と反応させて、アルデヒド基とＡＧＧペプチドのリジン残基を結合させた。反応物にＮａＢＨ４溶液を添加し、ゲル濾過処理に供してＢＮＣ−ＡＧＧを得た。更に、Peroxidase Labeling Kit-SHを用いて、得られたＢＮＣ−ＡＧＧのＳＨ基を介してＨＲＰ標識を施した。すなわち、得られたＢＮＣは、その糖鎖を介してＡＧＧが結合しており、更に、そのＳＨ基を介してＨＲＰが結合している（以後、ＳＨ−ＨＲＰ標識ＢＮＣ−（糖鎖）ーＡＧＧと呼ぶことがある。）。【０２２４】
実施例３６
各種濃度のウサギＩｇＧで固相化されたＥＬＩＳＡプレートをブロッキングし、各ウェルにＳＨ−ＨＲＰ標識ＢＮＣ−（糖鎖）ーＡＧＧ〔製造例１０〕を添加し反応させ、洗浄後、実施例９に示す方法にてＡｂｓ４５０ｎｍを測定した。結果を図２２に示す。【０２２５】
ＳＨ−ＨＲＰ標識ＢＮＣ−（糖鎖）ーＡＧＧによるＡｂｓ４５０ｎｍ値は、対照として用いたＳＨ−ＨＲＰ標識ＢＮＣ−ＺＺ〔製造例４〕と比べて低かったものの、十分な検出能を有することが分かった。【０２２６】
〔製造例１１：ＨＲＰ標識ＨＶＪ−Ｅの調製〕
Peroxidase Labeling Kit-SHを用いて、センダイウイルスのエンベローブタンパク質を含むウイルス様粒子であるＨＶＪ−Ｅ（Genome One, 石原産業）の粒子表面に存在するタンパク質のシステイン残基におけるＳＨ基を介してＨＲＰを標識し、ＨＲＰ標識ＨＶＪ−Ｅを得た。【０２２７】
実施例３７
実施例１と同様の方法にて、ＨＲＰ標識ＨＶＪ−ＥのＨＲＰ活性〔製造例１１〕を測定したところ、０．０５Ｕ/μｇであった。【０２２８】
膜貫通型のタンパク質を持つウイルス様粒子では、タンパク質の膜貫通領域内又は近傍にＳＨ基を有する場合が多い。本実施例ではＨＶＪ−ＥにおいてでもＳＨ基を介した標識が可能であることを示しており、ウイルス様粒子に存在するＳＨ基は標識のターゲットとして有用であることを示している。
【要約】
本発明は、検出感度に優れ、且つ検出バックグラウンドを顕著に抑制する免疫学的測定法を提供することを目的とする。その解決手段は、ウイルス様粒子であって、該ウイルス様粒子が自己組織化能を有するタンパク質を含み、該自己組織化能を有するタンパク質の少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して生理活性分子によって修飾されてなるウイルス様粒子を提供することである。【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図６】
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【配列表】
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