(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程（１）、（２）及び（３）：
（１）水性媒体の存在下、ラムノシド構造を有する難水溶性ポリフェノール類（Ａ）を、可溶化剤（Ｃ）との関係が、
０≦（Ｃ）／（（Ａ）＋（Ｃ））＜０．１
である条件で１１０〜１８０℃で加熱処理し、加熱処理液を得、次いで加熱処理温度から９０℃まで低下するのに要した時間から算出される冷却速度が３℃／ｓ以上１００℃／ｓ以下の条件で、加熱処理液を加熱処理温度から９０℃以下まで冷却する工程、
（２）得られた冷却後の加熱処理液に対し、加熱処理後３００分以内にラムノース脱離反応を開始し、ラムノースが脱離した難水溶性ポリフェノール類（Ａ'）を含む反応液を得る工程、及び
（３）得られた反応液に糖供与体（Ｂ）及び糖転移酵素を添加し、糖転移反応によりラムノースが脱離した難水溶性ポリフェノール類の糖付加物を得る工程、
を含む、難水溶性ポリフェノール類の糖付加物の製造方法。
【請求項２】
前記工程（１）で用いる水性媒体のｐＨが３以上７未満である、請求項１記載の難水溶性ポリフェノール類の糖付加物の製造方法。
【請求項３】
ラムノシド構造を有する難水溶性ポリフェノール類（Ａ）のｌｏｇＰ値が−１．０〜４．０である請求項１又は２記載の難水溶性ポリフェノール類の糖付加物の製造方法。
【請求項４】
前記（３）の工程において、糖転移反応の温度が１０〜８０℃である請求項１〜３のいずれか１項記載の難水溶性ポリフェノール類の糖付加物の製造方法。
【請求項５】
更に、工程（１）で得られた加熱処理液から固体を除去する工程を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の難水溶性ポリフェノール類の糖付加物の製造方法。
【請求項６】
糖転移反応の反応開始時におけるラムノースが脱離した難水溶性ポリフェノール類（Ａ'）に対する糖供与体（Ｂ）の質量比（Ｂ）／（Ａ'）が１〜３０である、請求項１〜５のいずれか１項記載の難水溶性ポリフェノール類の糖付加物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、難水溶性ポリフェノール類の糖付加物を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
昨今、生理機能を有する様々な素材が提案され、これらを含有する数多くの健康食品が上市されている。なかでも、ポリフェノールは、抗酸化力を有することが知られており、抗動脈硬化、抗アレルギー、血流増強等の効果が期待されるため、健康食品の重要な成分として認識されている。
しかしながら、ポリフェノールには難水溶性のものが多く、それらを清涼飲料等の水性食品へ使用することは難しい。
【０００３】
そこで、難水溶性のポリフェノールを水に可溶化させる技術が検討され、ポリフェノールにグルコース等の糖を付加させた糖付加物が提案されている。例えば、ヘスペリジンの２５℃における水への溶解度は僅かに０．０２ｍｇ／ｇであるが、ヘスペリジンにグルコースを結合させたα-グルコシルヘスペリジンでは、２５℃の水への溶解度が２００ｍｇ／ｇ以上と高くなる。更に、ポリフェノールの糖付加物は、ポリフェノールと同等の生理機能を発揮する等の利点がある。
【０００４】
ポリフェノールの糖付加物を製造する方法としては、例えば、懸濁状もしくはｐＨ７．０を超えるアルカリ側ｐＨで溶解させた溶液状のルチン又はヘスペリジンと澱粉部分加水分解物等を含有する溶液に糖転移酵素を作用させる方法（特許文献１、２）、フラボノイドをｐＨ８〜１０に調整した増粘多糖類溶液に溶解させ、サイクロデキストリン合成酵素を作用させるフラボノイド糖転移法（特許文献３）、フラボノイド類をｐＨ８以上のアルカリ域であるいは／およびサイクロデキストリンを加えて可溶化し、さらにアルカリ域でサイクロデキストリン合成酵素を作用させるフラボノイド配糖体の製造方法（特許文献４）等が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平３−２７２９３号公報
【特許文献２】特開平３−７５９３号公報
【特許文献３】特開平１０−１０１７０５号公報
【特許文献４】特開平７−１０７９７２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１〜４のように、ポリフェノールをアルカリ性の水溶液に溶解した後、糖転移酵素と反応させる方法は、アルカリ域でのポリフェノールの安定性が低く分解され易い上に、アルカリの中和と脱塩の工程が必要で、製造プロセスの煩雑化が懸念される。また、特許文献１及び２のように、難水溶性のポリフェノールを懸濁した溶液に糖転移酵素を作用させる方法は、糖転移反応液中のポリフェノールの溶解量が少ないため十分な転化率が得られない場合がある。
したがって、本発明の課題は、難水溶性ポリフェノール類からその糖付加物を効率よく製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討したところ、ラムノシド構造を有する難水溶性ポリフェノール類を特定の温度範囲で加熱処理した後に、特定の時間内にラムノシダーゼ活性を有する酵素を作用させて当該ポリフェノール類のラムノースを脱離させ、次いでその反応液に糖転移酵素を作用させると、ラムノシド構造を有する難水溶性ポリフェノール類の溶解濃度を大幅に高め、かつ高濃度を維持したままラムノース脱離反応が進行し、その後糖転移反応も高濃度で進行するため、水溶性に優れたポリフェノール糖付加物が高収率で得られることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、次の工程（１）、（２）及び（３）：
（１）水性媒体の存在下、ラムノシド構造を有する難水溶性ポリフェノール類（Ａ）を１００〜１８０℃で加熱処理し、加熱処理液を得る工程、
（２）得られた加熱処理液に対し、加熱処理後３００分以内にラムノース脱離反応を開始し、ラムノースが脱離した難水溶性ポリフェノール類（Ａ’）を含む反応液を得る工程、及び
（３）得られた反応液に糖供与体（Ｂ）及び糖転移酵素を添加し、糖転移反応によりラムノースが脱離した難水溶性ポリフェノール類の糖付加物を得る工程、を含む難水溶性ポリフェノール類の糖付加物の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ラムノース脱離反応の転化率、及びポリフェノール糖付加物の収率を向上させることができ、高収率で溶解性に優れるポリフェノール類の糖付加物を製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の方法における工程（１）は、水性媒体の存在下、ラムノシド構造を有する難水溶性ポリフェノール類（Ａ）を１００〜１８０℃で加熱処理し、加熱処理液を得る工程である。
【００１１】
本明細書において「難水溶性ポリフェノール類」とは、ｌｏｇＰ値が−１．０〜４．０のポリフェノール類を云う。難水溶性ポリフェノール類は、ｌｏｇＰ値が−０．５〜３．５のものが好ましい。ｌｏｇＰ値は、１−オクタノール／水間の分配係数の常用対数をとった値で、有機化合物の疎水性を示す指標である。この値が正に大きい程疎水性が高いことを表す。ポリフェノールのｌｏｇＰ値は、日本工業規格  Ｚ７２６０−１０７記載のフラスコ振盪法により測定できる。詳細は実施例に記載した。また、２５℃における水への溶解量が５ｇ／Ｌ以下のものに適用するのが好ましく、２ｇ／Ｌ以下がより好ましく、さらに１ｇ／Ｌ以下、さらに０．５ｇ／Ｌ以下、さらに０．１ｇ／Ｌ以下が好ましい。
【００１２】
本発明に用いられるラムノシド構造を有する難水溶性ポリフェノール類（Ａ）は、ｌｏｇＰ値が−１．０〜４．０である、ラムノシド構造を有するポリフェノール類である。当該原料のラムノシド構造を有するポリフェノール類（Ａ）としては、ベンゼン環にヒドロキシ基が１個以上、更に２個以上結合し、かつラムノシド構造を有するフェノール性物質が好ましく適用できる。例えば、植物由来のフラボノイド、タンニン、フェノール酸等が挙げられる。より好ましく適用できるラムノシド構造を有する難水溶性ポリフェノール類としては、ラムノシド構造を有するフラボノール類、フラバノン類、フラボン類、イソフラボン類、フェノールカルボン酸類から選ばれるものが挙げられる。
具体的には、ルチン、ケルシトリン、ミリシトリン、ヘスペリジン、ネオヘスペリジン、ナリンギン、又はこれらの誘導体が挙げられる。上記誘導体としては、アセチル化物、マロニル化物、メチル化物が例示される。なかでも、原料の溶解性の低さから、ラムノシド構造を有するフラボノール類及びフラバノン類が好ましく適用でき、ラムノシド構造を有するフラバノン類がより好ましく、ルチン、ヘスペリジンが更に好ましい。当該ラムノシド構造を有する難水溶性ポリフェノール類は、１種であっても、２種以上の混合物であってもよい。
【００１３】
本明細書において水性媒体とは、水、及び有機溶媒の水溶液を云う。水としては、水道水、蒸留水、イオン交換水、精製水が例示される。有機溶媒としては、水と均一に混合するものであれば特に限定されない。有機溶媒としては炭素数４以下のアルコールが好ましく、メタノール及びエタノールがより好ましく、食品に適用可能であるという観点よりエタノールが更に好ましい。水性媒体として有機溶媒の水溶液を用いる場合は、前記水溶液中の有機溶媒の濃度は、０．１〜８０質量％が好ましく、１〜７０質量％がより好ましく、５〜６０質量％が更に好ましい。
【００１４】
水性媒体のｐＨは、原料のラムノシド構造を有する難水溶性ポリフェノール類（Ａ）の安定性の観点より、３以上７未満が好ましく、３．５〜６．９がより好ましく、４〜６．８が更に好ましい。
【００１５】
原料のラムノシド構造を有する難水溶性ポリフェノール類（Ａ）は水への溶解度が低いため、水性媒体へ分散させ、スラリーの状態で存在させるのが好ましい。水性媒体中の原料のラムノシド構造を有する難水溶性ポリフェノール類（Ａ）の含有量は、当該難水溶性ポリフェノール類の種類によって異なるが、スラリーの流動性の点から、０．１〜１００ｇ／Ｌが好ましく、０．５〜５０ｇ／Ｌがより好ましく、０．７〜２０ｇ／Ｌが更に好ましく、０．７〜１０ｇ／Ｌが更に好ましい。
【００１６】
水性媒体の存在下、原料のラムノシド構造を有する難水溶性ポリフェノール類（Ａ）を加熱処理する方法は、特に制限されず、公知の方法を適用できる。
加熱処理の温度は、１００〜１８０℃であるが、１１０〜１７０℃がより好ましく、１２０〜１６０℃が更に好ましく、１２０〜１５０℃が更に好ましい。１００℃以上において大幅な溶解性の向上が達成され、また、１８０℃以下において原料のラムノシド構造を有する難水溶性ポリフェノール類（Ａ）の安定性が確保される。加熱の手段は、例えば、水蒸気、電気が挙げられる。
【００１７】
加熱処理時の圧力は、ゲージ圧で０〜１０ＭＰａが好ましく、０．１〜８ＭＰａがより好ましく、０．１〜６ＭＰａが更に好ましく、０．２〜６ＭＰａが更に好ましく、０．２〜４ＭＰａが更に好ましく、０．２５〜２ＭＰａが更に好ましく、０．３〜１．５ＭＰａが更に好ましく、０．３〜０．６ＭＰａが更に好ましい。また、水の飽和蒸気圧以上に設定するのが好ましい。飽和蒸気圧以上の加圧は、背圧弁により調整しても良く、また、ガスを用いてもよい。用いられるガスとしては、例えば、不活性ガスが好ましく、窒素ガス、ヘリウムガスがより好ましい。
【００１８】
加熱処理は、例えば、回分法、半回分法、流通式処理方法等いずれの方法によっても実施できる。なかでも、流通式処理方法は、処理時間の制御が容易である点で好ましい。
【００１９】
加熱処理の時間は、原料のラムノシド構造を有する難水溶性ポリフェノール類（Ａ）の溶解性向上と熱安定性の点から、上記の加熱処理の温度範囲にある時間が０．１〜３０分が好ましく、更に０．２〜１５分、更に０．５〜８分が好ましい。
流通式処理方式で行う場合、加熱処理の時間は、処理器の高温高圧部の体積を水性媒体の供給速度で割ることにより算出される平均滞留時間を用いる。
【００２０】
加熱処理後、得られた加熱処理液を９０℃以下、好ましくは５０℃以下、更に好ましくは３０℃以下に冷却する工程を行うのが、ポリフェノールの熱劣化防止の点から好ましい。冷却時に、加熱処理液を混合攪拌してもよい。
【００２１】
加熱処理温度から９０℃まで低下するのに要した時間から算出される加熱処理液の冷却速度は０．２℃／ｓ以上、更に０．５℃／ｓ以上、１℃／ｓ以上、更に３℃／ｓ以上、更に５℃／ｓ以上が好ましい。冷却速度が大きいほど原料のラムノシド構造を有する難水溶性ポリフェノール類（Ａ）の溶解量を向上させることができる。このため、冷却速度の上限は特に定めないが、例えば１００℃／ｓ以下、更に５０℃／ｓ以下が好ましい。
【００２２】
更に、加熱処理液から、溶解せずに残留する固体を除去する工程を行うのが、得られる難水溶性ポリフェノール類の糖付加物の溶解性を高める点から好ましい。固体を除去する方法としては、特に制限されず、例えば遠心分離やデカンテーション、ろ過により行うことができる。固体の除去は、下記の工程（２）の前に行うことが好ましい。
【００２３】
本発明の方法において、加熱処理は、可溶化剤（Ｃ）の存在下に行ってもよい。加熱処理は、原料のラムノシド構造を有する難水溶性ポリフェノール類（Ａ）と可溶化剤（Ｃ）の合計に対する可溶化剤（Ｃ）の質量比［（Ｃ）／（（Ａ）＋（Ｃ））］が０．１未満である条件で行うのが、原料のラムノシド構造を有する難水溶性ポリフェノール類（Ａ）からラムノースが脱離した難水溶性ポリフェノール類（Ａ’）への転化率向上の点、反応生成物の精製負荷軽減の点から好ましい。
すなわち、原料のラムノシド構造を有する難水溶性ポリフェノール類（Ａ）と可溶化剤（Ｃ）の関係は、
０≦（Ｃ）／（（Ａ）＋（Ｃ））＜０．１
と表すことができる。
反応生成物の精製負荷軽減の点という観点からは、上記質量比は０．０９以下が好ましく、０．０７以下がより好ましく、０．０５以下が更に好ましく、０．０４以下が更に好ましく、０、すなわち可溶化剤（Ｃ）が存在しない条件が殊更好ましい。
【００２４】
可溶化剤（Ｃ）としては、原料であるラムノシド構造を有する難水溶性ポリフェノール類（Ａ）より水溶性が高いものが好ましく、ラムノシド構造を有する難水溶性ポリフェノール類（Ａ）の糖付加物が好ましく、ヘスペレチン糖付加物、例えばグルコシルヘスペリジンやグルコシルヘスペレチンがより好適に用いられる。
【００２５】
本発明における工程（２）は、工程（１）で得られた加熱処理液に対し、加熱処理後３００分以内にラムノース脱離反応を開始し、ラムノースが脱離した難水溶性ポリフェノール類（Ａ’）を含む反応液を得る工程である。
【００２６】
ラムノース脱離反応は、ラムノシド構造を有する難水溶性ポリフェノール類（Ａ）からラムノースを脱離させ、ラムノースが脱離した難水溶性ポリフェノール類（Ａ’）を得る反応である。
ラムノース脱離反応は、加熱処理液にラムノシダーゼ活性を有する酵素を添加し、ラムノシダーゼ活性を発現する反応温度に設定することにより開始する。
【００２７】
本明細書において、加熱処理後「３００分以内」とは、加熱処理が終了した時点、すなわち加熱処理液が１００℃未満に下がった時点から、ラムノース脱離反応の開始までの時間である。
加熱処理後からラムノース脱離反応の開始までの時間は、ラムノース脱離反応率向上の点から、０．１〜３００分が好ましく、更に０．１〜１８０分が好ましく、更に１〜１２０分が好ましく、１〜６０分が好ましい。
【００２８】
工程（２）に用いられるラムノシダーゼ活性を有する酵素としては、ラムノシド構造からラムノースを脱離させる活性を有する酵素であればよく、例えばナリンギンからラムノースを脱離させる酵素であるナリンギナーゼ製剤、ヘスペリジンからラムノースを脱離させる酵素であるヘスペリジナーゼ製剤、セルラーゼ製剤等が挙げられる。
ラムノシダーゼ活性を有する酵素は、その起源に限定はなく、動物由来、植物由来、微生物由来等のすべての由来のものを使用することができる。さらに、遺伝子組み換え技術、部分加水分解等による人工酵素であってもよい。
また、当該酵素の形態は特に限定されず、酵素蛋白質の乾燥物、酵素蛋白質を含む粒子、及び酵素蛋白質を含む液体等を用いることができる。
【００２９】
ラムノシダーゼ活性を有する酵素の使用量は、用いる酵素の種類、反応条件、原料ラムノシド構造を有する難水溶性ポリフェノール類（Ａ）の種類などによって異なるが、例えばヘスペリジナーゼの場合、原料ラムノシド構造を有する難水溶性ポリフェノール類（Ａ）１ｇに対し０．０１〜１０Ｕが好ましい。ここで、ヘスペリジンから４０℃、ｐＨ３．８で１分間に１μｍｏｌの糖を生成する酵素量を１ユニット（１Ｕ）とする。
【００３０】
工程（２）のラムノース脱離反応の条件は、使用する酵素の特性に合わせて反応温度や反応液のｐＨを選択することが可能であるが、例えばヘスペリジナーゼやナリンギナーゼを用いる場合、ｐＨ３〜７とすることが好ましく、ｐＨ４〜６．５とすることがさらに好ましい。
【００３１】
また、反応温度は、ラムノシダーゼ活性を有する酵素の安定性の点、ラムノース脱離反応の反応速度向上の点から、１０〜８０℃、更に２０〜６０℃、更に３５〜５５℃とすることが好ましい。
【００３２】
反応は、例えば反応液を加熱により酵素を失活させる方法、又は反応液から酵素を分離除去する方法等により終了する。
反応時間は、ラムノシダーゼ活性を有する酵素の種類等によって異なるが、ラムノシド構造を有する難水溶性ポリフェノール類（Ａ）のラムノース脱離率向上の点、後述のラムノースが脱離した難水溶性ポリフェノール類（Ａ’）の糖付加物の生産性向上の点から、例えば、０．５〜１２０時間が好ましく、更に１〜１００時間、更に２〜２０時間が好ましい。
【００３３】
工程（２）の終了後は、反応液から、遊離したラムノースを樹脂吸着法やアルコール沈澱法により除去してもよい。樹脂としては、合成吸着樹脂ダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学（株）製）などが用いられる。その処理方法は反応液に反応前の原料難水溶性ポリフェノール１ｇに対し１０〜１０００ｍｌの樹脂を添加し、１０〜５５℃でカラム通液処理後樹脂を水で洗浄して３０〜８０％エタノール水で溶出すればよい。
【００３４】
工程（２）によれば、５０〜１００％、更に６０〜９５％、更に７０〜９０％のラムノース脱離反応率で、ラムノシド構造を有する難水溶性ポリフェノール類（Ａ）からラムノースが脱離した難水溶性ポリフェノール類（Ａ’）を製造することができる。
【００３５】
本発明の方法における工程（３）は、工程（２）で得られた反応液に糖供与体（Ｂ）及び糖転移酵素を添加し、糖転移反応によりラムノースが脱離した難水溶性ポリフェノール類の糖付加物を得る工程である。
この糖付加反応は、ラムノースが脱離した難水溶性ポリフェノール類（Ａ’）の水溶性が高まっているため、工程（２）のように、反応開始の時間に制限はない。
【００３６】
本発明の工程（３）で用いられる糖供与体（Ｂ）としては、ラムノースが脱離した難水溶性ポリフェノール類（Ａ’）に後述する糖を供与できるものであれば特に制限はない。
糖供与体（Ｂ）の具体例としては、澱粉、デキストリン、シクロデキストリン、マルトオリゴ糖等の澱粉部分加水分解物、キシロオリゴ糖、フラクタン、アラビノガラクタン、プルラン、ラフィノース、又はこれらの含有物等が挙げられる。
【００３７】
糖供与体（Ｂ）の使用量は、ラムノースが脱離した難水溶性ポリフェノール類（Ａ’）の転化率向上の点から、糖転移反応の反応開始時におけるラムノースが脱離した難水溶性ポリフェノール類（Ａ’）に対する質量比（Ｂ）／（Ａ’）として１〜３０が好ましく、更に１．２〜１５が好ましく、更に２〜１２が好ましい。
【００３８】
本発明の工程（３）で用いられる糖転移酵素としては、ラムノースが脱離した難水溶性ポリフェノール類（Ａ’）に対して糖の転移活性を有する酵素であれば特に制限はないが、用いる糖供与体（Ｂ）の種類に応じて適宜選択し得る。
糖転移酵素の具体例としては、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ、デキストリンデキストラナーゼ、アミロスクラーゼ、デキストランスクラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−アミラーゼ、キシラナーゼ、プルラナーゼ、アラビノフラノシダーゼ等が挙げられる。
【００３９】
糖転移酵素は、その起源に限定はなく、動物由来、植物由来、微生物由来等のすべての由来のものを使用することができる。さらに、遺伝子組み換え技術、部分加水分解等による人工酵素であってもよい。
また、糖転移酵素の形態は特に限定されず、酵素蛋白質の乾燥物、酵素蛋白質を含む粒子、及び酵素蛋白質を含む液体等を用いることができる。
【００４０】
糖転移酵素の使用量は、糖転移反応の条件、糖の種類等によって異なるが、例えば、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼの場合、１０〜１０，０００Ｕ／ｍＬが好ましい。ここで活性は以下に示す方法により測定される。
５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ７．５）、０．０５％（ｗ／ｖ）アミロース、および酵素を含む液１００μＬを３０℃、３０分間反応させた後、ヨウ素溶液（１ｍｇ／ｍＬ ＫＩ，０．１ｍｇ／ｍＬ Ｉ2 ，３．８ｍＭ ＨＣｌを含む）２ｍＬを添加して反応を停止し、波長６６０ｎｍにおける吸光度を測定して定量する。１分間に吸光度を１％低下させる酵素量を１ユニット（Ｕ）とする。
【００４１】
工程（３）において糖転移反応の条件は、使用する酵素の特性に合わせて反応温度や反応液のｐＨを選択することが可能であるが、例えば、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼを用いる場合、ｐＨ３〜７とすることが好ましく、更に４〜６．５とすることが好ましい。
【００４２】
また、反応温度は、糖転移酵素の安定性の点、糖転移反応の反応速度向上の点から、１０〜８０℃、更に２０〜６０℃、更に３５〜５５℃とすることが好ましい。
【００４３】
反応時間は、糖転移酵素の種類等によって異なるが、ラムノースが脱離した難水溶性ポリフェノール類（Ａ’）転化率向上の点、目的ラムノースが脱離した難水溶性ポリフェノール類の糖付加物の生産性向上の点から、例えば、０．５〜１２０時間が好ましく、更に１〜１００時間、更に２〜２０時間が好ましい。
【００４４】
本発明の方法によれば、４０〜１００％、更に４５〜９５％の収率で、ラムノシド構造を有する難水溶性ポリフェノール類（Ａ）からラムノースが脱離した難水溶性ポリフェノール類の糖付加物を製造することができる。なお、転化率は、後記実施例に記載した式（１）により算出できる。
【００４５】
本発明の方法により得られるラムノースが脱離した難水溶性ポリフェノール類の糖付加物は、ラムノースが脱離した難水溶性ポリフェノール類（Ａ’）に少なくとも１個の糖が結合した化合物である。ラムノースが脱離した難水溶性ポリフェノール類（Ａ’）に結合する糖の種類は、特に制限されないが、グルコース、ガラクトース、フルクトース、ラムノース、キシロース、アラビノース、エリトロース等の４〜６炭糖から選ばれる少なくとも１種以上が好ましい。また、糖の結合数は、好ましくは１個〜１０個、より好ましくは１個〜６個であるラムノースが脱離した難水溶性ポリフェノール類への糖の結合部位は、フェノール性水酸基又は配糖体の糖残基である。難水溶性ポリフェノール類とこれら糖との結合様式はα−結合又はβ−結合のいずれであってもよい。
【００４６】
本発明の方法により得られるラムノースが脱離した難水溶性ポリフェノール類の糖付加物の溶解量は、好ましくは１ｇ／Ｌ以上であり、より好ましくは２ｇ／Ｌ以上であり、更に好ましくは５ｇ／Ｌ以上であり、更に好ましくは１０ｇ／Ｌ以上である。本明細書における溶解量は、水に対する２５℃での溶解量である。
【００４７】
本発明の製造方法で得られるラムノースが脱離したポリフェノール類の糖付加物は、様々な飲食品や医薬品等に使用することができる。例えば、飲食品としては、飲料、パン類、麺類、クッキー等の菓子類、スナック類、ゼリー類、乳製品、冷凍食品、粉末コーヒー等のインスタント食品、でんぷん加工製品、加工肉製品、その他加工食品、調味料、栄養補助食品等の液状、固形状又は半固形状の飲食品が挙げられる。とりわけ、容器詰飲料に利用するのが有用である。容器詰飲料としては、緑茶等の茶系飲料や、スポーツ飲料、アイソトニック飲料、ニアウォーター等の非茶系飲料が挙げられる。
【実施例】
【００４８】
［難水溶性ポリフェノール類の測定］
難水溶性ポリフェノール類の測定は、日立製作所製高速液体クロマトグラフを用い、インタクト社製カラムＣａｄｅｎｚａ  ＣＤ−Ｃ１８  （４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、  ３μｍ）を装着し、カラム温度４０℃でグラジエント法により行った。移動相Ａ液は０．０５ｍｏｌ／Ｌ酢酸水溶液、Ｂ液はアセトニトリルとし、１．０ｍＬ／分で送液した。グラジエント条件は以下のとおりである。
時間（分）    Ａ液（％）      Ｂ液（％）
０            ８５          １５
２０            ８０          ２０
３５            １０          ９０
５０            １０          ９０
５０．１        ８５          １５
６０            ８５          １５
試料注入量は１０μＬ、検出はルチン類は波長３６０nm、ヘスペリジン類は波長２８３nmの吸光度により定量した。
【００４９】
［難水溶性ポリフェノール類のｌｏｇＰ値の測定］
日本工業規格  Ｚ７２６０−１０７記載のフラスコ振盪法に従って測定した。まず１−オクタノールと蒸留水を２５℃で２４時間振とうして平衡化させた。次いで蓋付きガラス瓶にポリフェノール１０ｍｇを量りとり、平衡化させた１−オクタノールと蒸留水をそれぞれ４ｍＬずつ加え、２５℃で４日間振とうした。遠心分離により１−オクタノール相と水相を分け、上記［難水溶性ポリフェノールの測定］と同様にしてＨＰＬＣにより各相のポリフェノール類の濃度を測定した。２相間の分配係数の常用対数を取った値をｌｏｇＰ値とした。
【００５０】
［水性媒体及び糖転移反応液のｐＨの測定］
蒸留水とラムノース脱離反応終了後の反応液のｐＨを２５℃にて測定した。
【００５１】
［ラムノース脱離反応の転化率の算出］
工程（２）における転化率は次式（１）により算出した。
転化率[％]＝（工程(２)終了時のラムノースが脱離した難水溶性ポリフェノール類（Ａ’）濃度）／（工程(２)開始時のラムノシド構造を有する難水溶性ポリフェノール類（Ａ）濃度）×１００          （１）
【００５２】
［ポリフェノール糖付加物の収率の算出］
工程（２）、（３）を通した、ラムノースが脱離した難水溶性ポリフェノールの糖付加物の収率は次式（２）により算出した。
収率[％]＝（工程(３)終了時のラムノースが脱離した難水溶性ポリフェノール類の糖付加物濃度）／（工程（２）開始時のラムノシド構造を有する難水溶性ポリフェノール類（Ａ）濃度）×１００          （２）
【００５３】
実施例１
ヘスペリジン製剤（ヘスペリジン「ハマリ」（商品名）、浜理薬品工業(株)製、ヘスペリジン（ＨＥＳ）含有量９０％）を蒸留水（ｐＨ６．５）に１０ｇ／Ｌの濃度で分散し、スラリー供給タンク内で均一攪拌した。内容積１００ｍＬのステンレス製流通式処理器（日東高圧（株）製）に、スラリー供給タンク内の液を１００ｍＬ／分で供給し、１５０℃で加熱処理を行った（平均滞留時間１分）。処理器内の圧力は出口バルブにより０．６ＭＰａに調整した。処理器出口から加熱処理液を抜き出し、熱交換器により２５℃まで冷却し、孔径７μｍの金属焼結フィルターを通した後、出口バルブで圧力を大気圧に戻して加熱処理液を得た。１５０℃から９０℃までの冷却時間から求めた冷却速度は８℃／ｓであった。
【００５４】
加熱処理終了時点から５分後に、得られた加熱処理液１０ｍＬをガラス瓶に入れ、ヘスペリジナーゼ（Sigma-Aldrich製、３units／ｇ）０．００５ｇを添加した。ラムノース脱離反応開始時の反応液中のヘスペリジン濃度は２．５ｇ／Ｌであり、２５℃における水への溶解度（０．０２ｇ／Ｌ）よりも顕著に高い過飽和溶解状態であった。反応液を５０℃においてロータリーシェーカーで７０ｒ／ｍｉｎで７時間振盪した。ガラス瓶を沸騰水中に１分間浸漬させることにより酵素を失活させて反応を停止させた。脱離反応終了後のモノグルコシルアグリコン濃度は２．４ｇ／Ｌであり、収量は０．０２４ｇであった。
【００５５】
脱離反応停止から１０分後に、γ−シクロデキストリン０．２ｇとコンチザイム０．５ｍＬを添加した。モノグルコシルアグリコンに対するγ−シクロデキストリンの質量比は８．３であった。５０℃においてロータリーシェーカーで７０ｒ／ｍｉｎで５時間振盪することにより糖転移反応を行った。ガラス瓶を沸騰水中に１分間浸漬させることにより酵素を失活させて反応を停止させた。
【００５６】
比較例１
ヘスペリジン製剤を０．０２７９ｇと蒸留水１０ｍＬをガラス瓶に入れた。ヘスペリジンは２．５ｇ／Ｌであるが懸濁状態であった。ヘスペリジナーゼ０．００５ｇを添加して実施例１と同様にラムノース脱離反応および糖転移反応を行った。
【００５７】
実施例２
ヘスペリジン製剤１０ｇ／Ｌに代えてルチン製剤（(株)常磐植物化学研究所製、ルチン含有量１００質量％）を５ｇ／Ｌとした以外は実施例１と同様に加熱処理液を得た。
加熱処理終了時点から５分後に、得られた加熱処理液１０ｍＬをガラス瓶に入れ、ナリンギナーゼ（天野エンザイム（株）製、商品名ナリンギナーゼアマノ）０．０１ｇを添加した。ラムノース脱離反応開始時の反応液中のルチン濃度は５．０ｇ／Ｌであり、２５℃における水への溶解度（０．０３ｇ／Ｌ）よりも顕著に高い過飽和溶解状態であった。反応液を５０℃においてロータリーシェーカーで７０ｒ／ｍｉｎで７時間振盪した。ガラス瓶を沸騰水中に１分間浸漬させることにより酵素を失活させて反応を停止させた。
反応停止から１０分後に、γ-シクロデキストリン０．２ｇとコンチザイム０．５ｍＬを添加し、５０℃においてロータリーシェーカーで７０ｒ／ｍｉｎで５時間振盪することにより糖転移反応を行った。ガラス瓶を沸騰水中に１分間浸漬させることにより酵素を失活させて反応を停止させた。
【００５８】
比較例２
ルチン製剤を０．０５ｇと蒸留水１０ｍＬをガラス瓶に入れた。ルチンは５．０ｇ／Ｌであるが懸濁状態であった。ナリンギナーゼ０．０１ｇを添加して実施例２と同様にラムノース脱離反応および糖転移反応を行った。
【００５９】
実施例３
加熱処理温度を１２０℃、圧力を０．３ＭＰａとした以外は実施例２と同様に加熱処理液を得た。実施例２と同様にラムノース脱離反応を行った。反応液中のルチン濃度は５．０ｇ／Ｌであるが僅かに懸濁した状態であった。
【００６０】
実施例４
実施例２で得られた加熱処理液１０ｍＬをガラス瓶に入れて静置した。加熱処理終了時点から１８０分後に実施例２と同様にラムノース脱離反応を行った。反応液中のルチン濃度は５．０ｇ／Ｌであるが懸濁した状態であった。
【００６１】
比較例３
実施例２で得られた加熱処理液１０ｍＬをガラス瓶に入れて静置した。加熱処理終了時点から３６０分後に実施例２と同様にラムノース脱離反応を行った。反応液中のルチン濃度は５．０ｇ／Ｌであるが懸濁した状態であった。
【００６２】
結果を表１に示す。
【００６３】
【表１】
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【００６４】
表１から明らかなように、本発明方法によれば、ラムノシド構造を有する難水溶性ポリフェノール類の溶解量を顕著に増大させることができ、ラムノース脱離反応が効率良く進行し、その結果として高い転化率で難水溶性ポリフェノール類の糖付加物を得ることができた。
他方、比較例１及び２では、ラムノース脱離反応開始時のヘスペリジンやルチンの溶解量が低く懸濁状態であるため、ラムノース脱離反応及び転移反応の転化率は低かった。比較例３では、加熱処理終了直後はルチンやヘスペリジンが溶解していたが、加熱処理から３６０分経過した後は懸濁状態であり、その後の反応率は低かった。