(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
接着細胞の生産方法であって、
ａ．培養培地中にマイクロキャリアを含有する培養容器に接着細胞を導入すること；
ｂ．この同培養容器中にて数回の連続細胞継代を行うことによって該細胞を増幅すること（ここで、１回目の細胞継代の後の各細胞継代は、
ｉ．先行細胞継代の間に得られた細胞集団の全部または一部を、マイクロキャリアから細胞を脱離させるために該細胞集団を酵素処理した後に使用し、
ｉｉ．培養培地および増加量のマイクロキャリアを導入する
ことによって行われる）；
ｃ．最終細胞継代の間に生産された細胞集団を回収すること（該回収前に、マイクロキャリアから細胞を脱離させるために細胞集団を酵素処理してもよい）
による、方法。
【請求項２】
接着細胞によって生産された生物学的作用物質の生産方法であって、
ａ．培養培地中にマイクロキャリアを含有する培養容器に接着細胞を導入すること；
ｂ．この同培養容器中にて数回の連続細胞継代を行うことによって該細胞を増幅すること（ここで、１回目の細胞継代の後の各細胞継代は、
ｉ．先行細胞継代の間に得られた細胞集団の全部または一部を、マイクロキャリアから細胞を脱離させるために該細胞集団を酵素処理した後に使用し、
ｉｉ．培養培地および増加量のマイクロキャリアを導入する
ことによって行われる）；
ｃ．最終細胞継代の間に生産された細胞集団を、生物学的作用物質を生産するように処理すること（ここで、この処理は、細胞を増幅するために使用したものと同じ培養容器中にて行われる）；および
ｄ．生物学的作用物質を回収すること
による、方法。
【請求項３】
生物学的作用物質が感染病原体であり、工程ｃにおける細胞集団の処理が、感染培地中にて細胞集団を該感染病原体に感染させることによって行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
感染病原体が狂犬病ウイルスである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
感染培地が動物由来の生成物を含まない、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
同じ培養容器中で行われる細胞継代の回数が２回、３回または４回である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
１回目の細胞継代の間の培養培地中のマイクロキャリアの濃度が１ｇ／ｌ未満である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
１回目の細胞継代の間の培養培地中のマイクロキャリアの濃度が０.５ｇ／ｌ以下である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
酵素処理がタンパク質分解酵素を含有する溶液を使用する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質分解酵素がトリプシンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
各次細胞継代が培養培地の量を増加させることによって行われる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
１回目の細胞継代が培養容器の作業容積の１／５〜半分である量の培養培地中にて行われる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
培養培地が動物由来の血清を含まない、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
培養培地が動物由来の生成物を含まない、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
培養培地中のタンパク質濃度が１５ｍｇ／ｌ以下である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
培養培地がさらに細胞保護剤を含有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
細胞保護剤がポリビニルピロリドンまたはポロキサマーである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
培養容器が、３〜３０００リットルの作業容積を有するバイオリアクターである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
培養容器が、２０〜１０００リットルの作業容積を有するバイオリアクターである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
培養容器が、２０〜５００リットルの作業容積を有するバイオリアクターである、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
培養容器が使い捨てバイオリアクターである、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
接着細胞がベロ細胞である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
工程ｃにおいて回収される細胞集団が、工程ａにおいて最初に導入された細胞の数の少なくとも６０倍の細胞を含有する、請求項１および６〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
接着細胞の生産方法であって、
ａ．接着細胞のストックを解凍すること、次いで
ｂ．この解凍した接着細胞に請求項１および６〜２３のいずれか１項に記載の方法を施すこと
による、方法。
【請求項２５】
さらに、
ａ．マイクロキャリアから細胞を脱離させるために細胞集団を酵素処理した後に回収した細胞集団を第２の培養容器に移すこと（ここで、この第２の培養容器は、より大きい作業容積を有し、第１の培養容器中で行われた最終細胞継代の間じゅう存在していたマイクロキャリアの量よりも多量のマイクロキャリアを含有する培養培地を含有する）；および
ｂ．この第２の容器中にて、請求項１および６〜２４のいずれか１項に記載の方法の工程ｂおよびｃを行うこと
による、請求項１および６〜２４のいずれか１項に記載のマイクロキャリアに対する接着細胞の生産方法。
【請求項２６】
請求項２５の工程ａおよびｂを第３の培養容器中にて再度繰り返す（ここで、この第３の培養容器は、第２の培養容器の作業容積よりも大きい作業容積を有する）、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１および７〜２３のいずれか１項に記載の方法であって、単一の培養容器中にて連続細胞継代を行うことにより、生産された細胞の量が６０倍以上増加する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の課題は、培養培地中にマイクロキャリアを含有する培養容器に接着細胞を導入し、同容器中にて数回の連続細胞継代を行うことを含む接着細胞の製造方法であって、毎回、先行細胞継代の細胞集団の全てまたは一部を使用して次の細胞継代を行う方法である。本発明はまた、生物学的作用物質の製造、特にワクチンまたは薬物の製造のためのこの方法の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９８０年代に、マイクロキャリアによる細胞培養技術の発達によって、接着細胞の大規模生産が促進され、その結果、生物学的作用物質の製造が促進された。それにもかかわらず、医薬用の生物学的作用物質の製造を目的とする接着細胞の生産は、細胞の形態学的および／または生物学的変換のリスクがあるので、一定数の規制上の要求、特に、一定数の「細胞継代」を超える接着細胞の使用の禁止という規制上の要求に気を付けなければならない。ベロ株の細胞の場合には特にそうである。
【０００３】
特許文献１には、工業的スケールで用いられる、ワーキング・セル・バンク由来の種細胞から接着細胞のバッチを製造する方法が記載されている。それは、連続細胞継代の過程で作業容積を大きくしていく異なるバイオリアクター中にて毎回生じる一連の細胞継代に基づく。これにより、毎回マイクロキャリアの量を増加させることができるが、同時に、一般的に１〜５ｇ／ｌである培養培地中のマイクロキャリアの最適濃度を維持することができる。このようにして、細胞バイオマスは、所望の工業的な細胞バッチが得られるまで連続細胞継代の間に増加する。あるバイオリアクターから別のバイオリアクターへの細胞の移動は、トリプシン処理によって接着細胞をマイクロキャリアから脱離させ、次いで、血清タンパク質または血清を該培地に導入することによって酵素の作用を遮断して細胞の完全性をできる限り保存した後に行われる。次いで、得られた細胞懸濁液を（使用したマイクロキャリアの存在下または不在下で）、より多量の新しいマイクロキャリアを含有するより大きなバイオリアクターに移す。しかしながら、この工業的な接着細胞生産方法は、多量の材料の使用および扱いを必要とし、生物学的作用物質の生産コストに影響を及ぼす。
【０００４】
生物学的作用物質の生産を目的とする接着細胞の生産コストを低減するために、特許文献２は、工業的な細胞バッチを生産しようとするたびにワーキング・バンク由来の種細胞から再度出発することを要しないより速い生産方法を提案している。この方法は、各細胞継代後に、ほとんどの細胞（細胞バイオマスの８０〜９０％）を１個以上の別のバイオリアクターに移して細胞バイオマスの増幅を継続させ、細胞の工業的生産バッチを継続させることができ、一方、該細胞の残り１０〜２０％を保持してさらなる細胞バッチを生産する「フィーダー細胞の」ストックを保持することができる。それにもかかわらず、この方法は、以下の欠点を有する：
・  生産された細胞バッチは、それらがすべて同数の細胞継代を有するとは限らないので、ある種の不均一性を示す；
・  各移動操作時に培養液中に「フィーダー」細胞のストックを保持することにより、必ず、細胞継代の回数と直接関係する細胞の「老化」が生じ、その結果、既に記載された規制上の理由のために限られた期間のみ使用することができる。
【０００５】
細胞の完全性に害を及ぼすトリプシンのようなタンパク質分解酵素の使用を省略するために、非特許文献１は、いかなる酵素処理も行われなかった場合の接着細胞のマイクロキャリア間移動（ビース間移動）技法を記載している。接着細胞で被覆されたマイクロキャリアと未被覆マイクロキャリアとの密接な接触は、細胞を増幅することができる未被覆マイクロキャリア上への細胞の移動を促進する。したがって、細胞増殖を増大させるために、接着細胞で被覆されたマイクロキャリアを含有する培養培地に未被覆マイクロキャリアを添加し、マイクロキャリア間の接触を促進するために、培養培地の断続的な撹拌が行われる。それにもかかわらず、生産される細胞集団は、該細胞が細胞周期の様々な段階のものであるので、「非同期化」され、これは、生物学的作用物質の生産の主たる欠点となり得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第４，６６４，９１２号明細書
【特許文献２】欧州特許第１０６０２４１号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ohlson et al., in Cytotechnology (1994), vol. 14, pages 67-80
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
生産コストを低減するために、接着細胞の大規模生産方法およびそれに由来する生物学的作用物質の生産を最適化することが依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この趣旨で、本発明の対象は、以下のものである：
ａ．培養培地中にマイクロキャリアを含有する培養容器に接着細胞を導入すること、
ｂ．同培養容器中にて連続細胞継代を行うことによって該細胞を増幅すること（ここで、１回目の細胞継代の後の各細胞継代は、
ｉ．先行細胞継代の間に得られた細胞集団の全部または一部を、細胞をマイクロキャリアから脱離させるために該細胞集団を酵素処理した後に使用すること、および
ｉｉ．培養培地および漸増量のマイクロキャリアを導入すること
によって行われる）、および
ｃ．最終細胞継代の間に生産された細胞集団を回収すること（細胞をマイクロキャリアから脱離させるために該細胞集団を酵素処理した後であってもよい）
による、接着細胞の生産方法。
【００１０】
本発明の対象は、また、以下のものである：
ａ．培養培地中にマイクロキャリアを含有する培養容器に接着細胞を導入すること、
ｂ．同培養容器中にて数回の連続細胞継代を行うことによって該細胞を増殖させること（ここで、１回目の細胞継代の後の各細胞継代は、
ｉ．先行細胞継代の間に得られた細胞集団の全部または一部を、細胞をマイクロキャリアから脱離させるために該細胞集団を酵素処理した後に使用すること、および
ｉｉ．培養培地および漸増量のマイクロキャリアを導入すること
によって行われる）、
ｃ．最終細胞継代の間に生産された細胞集団を、生物学的作用物質を生産するように処理すること（ここで、この処理は、細胞を増殖させるために使用した培養培地と同じ培養培地にて行われる）、および
ｄ．生物学的作用物質を回収すること
による、接着細胞によって生産された生物学的作用物質の生産方法。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、連続細胞継代によってマイクロキャリアに接着した細胞を増幅する次の２つの方法を示す：ａ）慣用の方法に従って、連続細胞継代が、作業容積を大きくしていく異なる培養容器中で行われる方法、およびｂ）本発明の方法（一体型法）に従って、連続細胞継代が同一の培養容器中で行われる方法。細胞は、ステップ０で凍結形態である。ステップ０→１は、解凍細胞のバイオリアクターへの移動に相当する。ステップ１は、１回目の細胞継代に相当する。ステップ１→２は、１回目の細胞継代の後に得られた細胞集団の、細胞をマイクロキャリアから脱離させるためにタンパク質分解酵素で処理した後の、方法ａ）の場合にはより大きな作業容積を有する第２のバイオリアクターへの移動、方法ｂ）の場合には同じ培養容器への移動に相当する。ステップ２は、２回目の細胞継代に相当する。方法ｂ）の場合には、２回目の細胞継代は、一般的に、より多量の培養培地中にてより高濃度のマイクロキャリアの存在下にて行われる。ステップ２→３は、この２回目の細胞継代の最後に得られた細胞集団の、細胞をマイクロキャリアから脱離させるためにタンパク質分解酵素で処理した後の、方法ａ）の場合にはより大きな作業容積を有する第３のバイオリアクターへの移動、方法ｂ）の場合には同じ培養容器への移動に相当する。ステップ３は、３回目の細胞継代に相当する。方法ｂ）の場合には、この３回目の細胞継代は、２回目の細胞継代の時と比べてより多量の培養培地中にてより高濃度のマイクロキャリアの存在下にて行われる。
【図２】図２は、ａ）一体型法またはｂ）ビーズ間移動法を実行する８日間のベロ細胞培養（操作条件は実施例２を参照）の後の顕微鏡（倍率Ｘ２０）下でのマイクロビーズの外観を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
生物学的作用物質の生産方法の一の態様によると、生物学的作用物質は、感染病原体であり、細胞集団の処理は、最終細胞継代の間に生産された細胞集団を感染培地中にて該感染病原体に感染させることによって行われる。
【００１３】
一の特定の態様によると、感染病原体は、狂犬病ウイルスであり、感染培地は、動物由来の生成物を含まないウイルス感染培地である。
【００１４】
一般に、同一培養培地中にて行われる細胞継代の回数は、２回、３回または４回である。
【００１５】
１回目の細胞継代の間の培養培地中のマイクロキャリアの濃度は、一般に、１ｇ／ｌ未満、好ましくは、０.５ｇ／ｌ以下である。
【００１６】
非常に好ましくは、酵素処理は、トリプシンのようなタンパク質分解酵素を含有する溶液を用いる。
【００１７】
本発明の方法の別の態様によると、１回目の細胞継代の後の各細胞継代は、培養培地の量を増やしながら行われる。
【００１８】
好ましくは、１回目の細胞継代は、培養容器の作業容積の５分の１〜２分の１の量の培養培地中にて行われる。
【００１９】
本発明の方法の別の実施態様では、培養培地は、動物由来の血清を含まない。
【００２０】
好ましくは、培養培地は、動物由来の生成物を含まない。
【００２１】
別の態様によると、培養培地中のタンパク質濃度は、１５ｍｇ／ｌ以下である。
【００２２】
さらに別の態様によると、培養培地はまた、細胞保護剤も含有する。
【００２３】
好ましくは、細胞保護剤は、ポリビニルピロリドンまたはポロキサマーである。
【００２４】
本発明の方法のさらに別の実施態様によると、培養容器は、３〜３０００リットル、好ましくは２０〜１０００リットル、特に好ましくは２０〜５００リットルの作業容積を有するバイオリアクターである。
【００２５】
さらに別の実施態様では、培養容器は、使い捨てのバイオリアクターである。
【００２６】
本発明の方法の一の特定の態様では、接着細胞は、ベロ細胞である。
【００２７】
一般に、回収される細胞集団は、最初に培養容器に導入した細胞の量の少なくとも６０倍の細胞を含有する。
【００２８】
別の態様では、本発明は、
ａ．接着細胞のストックを解凍すること、次いで、
ｂ．解凍した接着細胞に本発明の方法の実施態様の１つを施すこと
による、接着細胞の生産方法に関する。
【００２９】
さらに別の態様では、本発明は、本発明の方法に従って第１の培養容器中で接着細胞を生産した後、
ａ．細胞をマイクロキャリアから脱離させるために細胞集団を酵素処理した後に回収した細胞集団を第２の培養容器に移すこと（ここで、この第２の培養容器は、より大きな作業容積を有し、第１の培養容器中で行われた最終細胞継代の間に存在したマイクロキャリアの量よりも多いマイクロキャリアを含有する培養培地を含有する）、および
ｂ．この第２の容器中にて、本発明の方法の実施態様の１つが行われること
による、接着細胞の生産方法に関する。
【００３０】
一の特定の態様では、本発明の方法の実施態様の１つは、第２の培養容器の作業容積よりも大きい作業容積をもつ第３の培養容器中にて繰り返される。
【００３１】
本発明は、また、生物学的作用物質の生産のための、本発明の方法に従って生産された細胞の使用に関する。
【００３２】
最後に、同一の培養容器中にて連続細胞継代を行うことによって、生産された細胞の量が６０倍以上増加する、培養培地中にマイクロキャリアを含有する培養容器中にて接着細胞を生産する方法に関する。
【００３３】
発明の詳細な説明
本発明は、細胞を増幅して、細胞の工業バッチを形成するために、同一の細胞培養容器中にて連続細胞継代が数回行われる、接着細胞の生産方法に関する。この方法によって、使用されるべき培養容器の数は減少し、生産された細胞のバッチは、それらが同数の細胞継代を有するので均一である。
【００３４】
本発明の目的として、「細胞継代」は、接着細胞の懸濁液が培養培地中でマイクロキャリアと接触させられた時に始まり、通常、接着細胞が酵素処理によってマイクロキャリアから遊離され、再度培養培地中懸濁液の形態となった時に終わる。細胞継代は、通常、以下の期を含む：
−  培養培地中にてマイクロキャリアと接触させられた細胞がマイクロキャリアに接着する、マイクロキャリア・コロニー形成期；
−  マイクロキャリア上で細胞が増幅して、コロニー形成されたマイクロキャリアの利用可能な表面の７０％超、好ましくは８０％超が細胞によって覆われるまでの期間に相当する、マイクロキャリアに接着した細胞の増幅期（該細胞がコロニー形成マイクロキャリアの利用可能な表面の７０％超が細胞によって覆われた場合、「実質的にコンフルエント」であるかまたは「コンフルエンスの段階」に達したと見なされる）；および
−  細胞の最大数（一般的には８０％より多く、好ましくは９０％より多く）が短時間で（一般的には３０分未満で、しばしば２０分未満で）それらの支持体から脱離するように酵素処理することによる実質的にコンフルエントな細胞のマイクロキャリアからの脱離期。
【００３５】
本発明の場合、生産される接着細胞の使用に応じて、培養容器中で行われる最終細胞継代は、脱離期を含むか、または含まない。
【００３６】
本発明に関連して、連続細胞継代は、先行細胞継代の間に得られた細胞集団の全部または一部を次の細胞継代を行うために使用して同一の培養容器中にて行われる。通常、先行細胞継代の間に得られた細胞集団の少なくとも８０％が、次の細胞継代を行うために使用される。好ましくは、最大量の細胞を生産するために、連続細胞継代は、毎回、先行細胞継代の間に得られた全細胞集団を使用して次の細胞継代を行うことによって行われる。各細胞継代の最後に、細胞は、酵素処理によってマイクロキャリアから遊離（脱離）するが、従来技術で推奨されている、細胞増幅を継続するための１個以上の他の細胞培養容器への細胞バイオマスの移動はない。細胞バイオマスの増幅は、同一の培養容器中にて行われる。この方法は、いくつかの培養容器を使用したり扱ったりすることを要せずに、等しい量の細胞が同じ期間で生産され、工業的な量の細胞を生産するために要する空間を縮小し、その結果、生産コストを実質的に減縮するので、非常に有利である。驚くことには、細胞バイオマスの増幅は、細胞継代ごとに酵素処理を必要とするが、本発明の方法の実行の最後に生産される細胞の量は、慣用の「マイクロキャリア間移動」法を使用して得られる細胞の量よりも有意に多い（実施例２を参照）。
【００３７】
１回目の細胞継代の後の細胞継代に相当する各新細胞継代は、同一の培養容器中にて行われる。１回目の細胞継代の後の継代を開始するために、培養培地と、利用可能な細胞支持表面を増大させるために先行細胞継代の間に導入されたマイクロキャリアの量よりも多い量のマイクロキャリアが導入される。「新細胞継代」または「１回目の細胞継代の後の継代」という用語は、培養容器中にて行われた細胞継代の後の細胞継代を意味すると解される。培養容器へのマイクロキャリアの導入または添加は、未被覆マイクロキャリアの導入に相当すると解される。好ましくは、接着細胞の接着を促進するために、未使用のマイクロキャリアが使用される。通常、培養培地の量は、１回目の細胞継代の後の継代ごとに付随して増加するにもかかわらず、マイクロキャリアの量の増加は、一般的に、培地の量の増加よりも高い比率であり、一般的に、連続細胞継代の間に培養培地中のマイクロキャリア濃度の漸増をもたらす。最終細胞継代の間、例えばｃｙｔｏｄｅｘTMの名称の下に販売されているデキストランマイクロビーズ（ＣｙｔｏｄｅｘTM  １、２または３）をマイクロキャリアとして使用した場合、培養培地中のマイクロキャリア濃度は、一般的に、１〜７ｇ／ｌであるが、１０〜１５ｇ／ｌに達することもある。細胞バイオマスが同一の培養容器中で連続細胞継代によって増加する本発明の方法は、「一体型法」と称される（図１ｂを参照）。
【００３８】
通常、同一の培養容器中にて２細胞継代、３細胞継代または４細胞継代が行われる。行われる次の使用に応じて、本発明の方法の実行の最後に回収された細胞集団は、マイクロキャリアから遊離した細胞の懸濁液の形態（この場合、最終細胞継代は、包含される細胞脱離工程を用いて行われる）またはマイクロキャリアに接着した細胞の懸濁液の形態（この場合、最終細胞継代は、細胞脱離工程を省略して行われる）のいずれかである。接着細胞の生産方法が同一の培養容器中で行われる２連続細胞継代を含む場合、本発明の方法は、以下の工程を行うことに相当する：
ａ．培養培地、マイクロキャリアおよび接着細胞を培養容器に導入する工程、
ｂ．細胞をマイクロキャリアに接着させて増殖させることを可能にする培養条件下に細胞をおく工程、
ｃ．酵素処理によって細胞をマイクロキャリアから脱離させる（細胞の一部を培養容器から取り出してもよい）工程、
ｄ．導入されるマイクロキャリアの量が前に導入されたマイクロキャリアの量よりも多くなるように培養培地およびマイクロキャリアを再度導入する工程、
ｅ．再度、細胞をマイクロキャリアに接着させて増殖させることを可能にする培養条件下に細胞をおく工程、および
ｆ．得られた細胞集団を回収する工程（酵素処理によって細胞をマイクロキャリアから脱離させた後であってもよい）、
ここで、工程ａ）〜ｅ）は同一の培養容器中にて行われる。
【００３９】
工程ａ）〜ｃ）は、１回目の細胞継代に相当し、工程ｄ）〜ｆ）は、細胞の回収をもって終わる２回目の細胞継代に相当する。
【００４０】
同一の容器中で行われる３以上の連続細胞継代がある場合、これは、細胞を回収する工程ｆ）を行う前に、同一の培養容器中にて工程ｅ）の後に工程ｃ）、ｄ）およびｅ）を再度繰り返すことに相当する。通常、工程ｃ）、ｄ）およびｅ）は、工程ｅ）の後に１回繰り返される（３連続細胞継代を行うことに相当する）か、または、工程ｅ）の後に２回繰り返される（４連続細胞継代を行うことに相当する）。好ましくは、工程ｃ（細胞のマイクロキャリアからの脱離に相当する）は、細胞が実質的にコンフルエントである場合に行われる。通常、培養培地の容量は、マイクロキャリアが添加されるたびに増加する（工程ｄ）。
【００４１】
本発明の方法の実行の最後に回収される細胞の集団が細胞のストックを形成するために使用される場合、一般的に、最終細胞継代は、同一の培養容器中で一般的に行われる酵素処理によって細胞を脱離させる工程を含む。そこで、細胞集団は、本質的に、マイクロキャリアから遊離された細胞の懸濁液の形態である。
【００４２】
細胞の集団が生物学的作用物質の生産に使用される場合、最終細胞継代は、しばしば、細胞脱離工程を含まずに行われる。次いで、マイクロキャリアに接着している細胞の懸濁液の形態の生産された細胞の集団は、目的の生物学的作用物質を生産するように同一の培養容器中で直接処理される。「生物学的作用物質」という用語は、接着細胞によって生産され得る物質または生物を意味することを意図される。これらは、特に、ウイルスまたはタンパク質（抗体、抗原、酵素など）である。接着細胞によって生産される生物学的作用物質の生産方法が同一の培養容器中で行われる２連続細胞継代を含む場合、したがって、本発明の方法は、以下の工程を行うことに相当する：
ａ．培養培地、マイクロキャリアおよび接着細胞を培養容器に導入する工程、
ｂ．細胞をマイクロキャリアに接着させて増殖させることを可能にする培養条件下に細胞をおく工程、
ｃ．酵素処理によって細胞をマイクロキャリアから脱離させる（細胞の一部を培養容器から取り出してもよい）工程、
ｄ．新しく導入されるマイクロキャリアの量が前に導入されたマイクロキャリアの量よりも多くなるように培養培地およびマイクロキャリアを再度導入する工程、
ｅ．再度、細胞をマイクロキャリアに接着させて増殖させることを可能にする培養条件下に細胞をおく工程、
ｆ．得られた細胞集団を生物学的作用物質を生産するように処理する工程、および
ｇ．得られた細胞集団を回収する工程、
ここで、工程ａ）〜ｆ）は同一の培養容器中にて行われる。
【００４３】
同一の容器中で３以上の連続細胞継代が行われる場合、これは、生物学的作用物質を生産する工程ｆ）の行う前に、同一の培養容器中で工程ｅ）の後に工程ｃ）、ｄ）およびｅ）を再度繰り返すことに相当する。通常、工程ｃ）、ｄ）およびｅ）は、工程ｅ）の後に１回繰り返される（３連続細胞継代を行うことに相当する）か、または、工程ｅ）の後に２回繰り返される（４連続細胞継代を行うことに相当する）。好ましくは、工程ｃ（細胞のマイクロキャリアからの脱離に相当する）は、細胞が実質的にコンフルエントである場合に行われる。通常、培養培地の容量は、マイクロキャリアが添加されるたびに増加する（工程ｄ）。
【００４４】
例えばサイトカイン、抗体またはワクチンタンパク質のような組換えタンパク質の問題である場合、細胞懸濁液は、適切な生産培地を使用してこのタンパク質の生産を促進する培養条件下におく。例えば、ＥＰ０３５４１２９に記載のＣＨＯおよびベロ細胞による組換えタンパク質の生産のための培地が挙げられる。生物学的作用物質が感染病原体である場合、マイクロキャリアに接着している細胞の懸濁液は、一般に培養培地を感染培地と置き換えた後、培養容器に感染病原体（細菌、ウイルス、寄生虫など）を導入することによって、感染させられる。感染性生物学的作用物質は、特に、組換えウイルス（組換えポックスウイルス、組換えアデノウイルス）であり得るか、または狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルスなどのようなウイルスであり得る。生物学的作用物質は、通常、１つ以上の工程で培養上清を除去することによって回収される（実施例７を参照）。生物学的作用物質が非溶解性ウイルスの場合のように細胞内にある場合、上清および後に溶解剤で処理される細胞を回収することはしばしば有利である。
【００４５】
生物学的作用物質の生産に使用される培地、特に狂犬病のようなウイルスの生産に使用される感染培地は、有利には、動物由来の血清、動物由来のタンパク質または動物由来の生成物を含まないものであり得る。
【００４６】
本発明の対象に適しているマイクロキャリアは、通常、マイクロビーズの形態であり、それらは、好ましくは酵素の作用を促進にするために非多孔性である。それらは、一般に、９０〜２５０μｍの直径を有する。それらの密度は、簡単な沈殿によってそれらの回収を促進するために、培養培地の密度よりわずかに高いが、同時に、培地を適度に撹拌し場合に該マイクロビーズの完全な再懸濁が得られるほど高すぎてはならない。標準的な培養条件下で、マイクロキャリアの密度は、通常、１.０２０〜１.０５０ｇ／ｍｌである。マイクロビーズの表面は、細胞の接着性を促進するように選択される。マイクロキャリアのマトリックスは、好ましくは、マイクロビーズ間で衝突が生じた場合に細胞がより良く保存されるように軟質である。細胞の接着に利用可能な平均表面積は、マイクロビーズ１ｇあたり４０００〜５０００ｃｍ2である。これらの特徴は、特に、ｃｙｔｏｄｅｘTMの名称の下に販売されている架橋デキストランマトリックス（ｃｙｔｏｄｅｘ  １、ｃｙｔｏｄｅｘ  ２、ｃｙｔｏｄｅｘ  ３）を有するマイクロビーズに見られるが、マトリックスが架橋ポリスチレンに基づいている他のビーズ（Ｂｉｏｓｉｌｏｎ、Ｓｏｌｏｈｉｌｌ）またはガラスマイクロビーズ（Ｓｉｇａｍ  Ａｌｄｒｉｃｈ）にも見られる。
【００４７】
本発明に関連して、１回目の細胞継代の間のマイクロキャリア濃度は、特にマイクロキャリアとしてｃｙｔｏｄｅｘTM  １マイクロビーズのようなｃｙｔｏｄｅｘTMマイクロビーズを使用する場合には、一般的に、１ｇ／ｌ未満の濃度に低下するが、一方、従来技術では、マイクロキャリアは、１〜５ｇ／ｌの濃度で使用される。それは、通常、０.５ｇ／以下であり、より詳しくは、０.１〜０.４ｇ／ｌであり、特に、０.１〜０.３ｇ／ｌである。この濃度は、実際、細胞を培養容器に導入した後の培養培地中のマイクロキャリアの初期濃度に相当する。したがって、それは、１ｇ／ｌ未満であり、好ましくは０.５ｇ／ｌ以下である；特に、０.１〜０.４ｇ／ｌであり、より詳しくは、０.１〜０.３ｇ／ｌである。
【００４８】
培養容器に導入される細胞の初期量は、マイクロキャリアの８０％超が細胞によってコロニー形成されるように選択される。このコロニー形成度を得るためには、慣用的には、培養培地中に存在するマイクロキャリアの量の少なくとも５〜１０倍多い細胞の初期量が培養容器に導入される。例えば、ベロ細胞生産の場合、培養容器に導入される細胞の初期量は、一般に、ｃｙｔｏｄｅｘTMマイクロビーズ１ｃｍ2あたり５×１０3〜５×１０4細胞であり、これは、マイクロビーズ１個あたり約５細胞〜５０細胞を表す。実際、１回目の細胞継代の間の培養培地中のマイクロキャリア濃度は、従来技術で慣用的に使用されているものよりも低いので、その結果、初期細胞濃度もまた低くなる。
【００４９】
各細胞継代の最後に、タンパク質分解活性を有する酵素溶液（プロテアーゼ）で細胞を処理することによって、短時間（一般に３０分未満、好ましくは１５分未満）で細胞をマイクロキャリアから脱離させる。本発明に関連して、細胞は、通常、連続細胞継代を行うのに使用される培養容器中にてマイクロキャリアから脱離する。これは、全ての細胞培養期、および連続細胞継代の間に細胞に対して行われる全ての処理が同一の培養容器中で行われることを意味する。所望により、酵素処理が行われる第２の容器にそれらを移した後に細胞をマイクロキャリアから脱離させることができ、次いで、得られた細胞懸濁液を、連続細胞継代が行われる第１の培養容器に再導入することができる。この方法は、移動操作の間に細胞を喪失させるので、有利ではない。
【００５０】
タンパク質分解酵素溶液は、通常、トリプシン、ｐｒｏｎａｓｅ（登録商標）またはｄｉｓｐａｓｅ（登録商標）のようなセリンプロテアーゼを含有する。マイクロキャリアがｃｙｔｏｄｅｘ  ３マイクロビーズである場合には、パパイン、フィシンまたはコラゲナーゼもまた使用され得る。トリプシン溶液は、一般的に、接着細胞をｃｙｔｏｄｅｘTMマイクロビーズから脱離させるために使用される。好ましくは、該プロテアーゼは、非動物由来のものであり、これは、動物由来の物質を使用しない方法を用いて生産されることを示している。例えば、植物材料を使用して、化学合成によって、または細菌、酵母、真菌類もしくは植物を使用した遺伝子組換えによって、生産される。例えば、ＴｒｐＬＥTM  ＳｅｌｅｃｔまたはＴｒｐＬＥTM  Ｅｘｐｒｅｓｓの商品名の下にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって販売されている、物由来の生成物を含まない酵素溶液を使用することができる。ＷＯ９４／２５５８３にタンパク質配列が記載されているこのプロテアーゼは、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ＤＳＭ２６７２株の発酵によって生産されるか、または、遺伝子組換えによって生産される。それは、トリプシンに類似の酵素活性を有する。細胞の脱離を促進するために、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡまたはシトレートのようなカルシウムイオンを結合するキレート化剤を酵素溶液に添加することができるか、または、酵素処理を行う前に接着細胞をキレート化剤で処理することができる。プロテアーゼの濃度、ならびに所望により、培地中のキレート化剤の濃度および細胞の酵素処理が行われる温度（通常、２０〜３８℃）は、短時間（３０分以下）で細胞の８０％超をそれらの支持体から脱離させるように設定される。実際の酵素処理の前に、少なくとも半分の培養培地を除去する。通常、約２／３の培養培地を除去する。次いで、培地に、一般的にペプチドまたはタンパク質由来の阻害剤を添加することによって、タンパク質分解活性を中和する。好ましくは、阻害剤の組成物は、動物由来の汚染物質を含まない。この阻害剤は、例えば、組換えアプロチニン、またはダイズ由来もしくはリラマメ由来のトリプシン阻害剤を含有する抽出物または精製フラクション（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）である。該培地は、一般に、培養培地を除去する期間を除いて、細胞のマイクロキャリアからの脱離の期の全体にわたって撹拌する。
【００５１】
得られた細胞懸濁液は、一般に、細胞生存率を決定することもできる慣用の計測システムを使用して定量化される。細胞が増殖しすぎた場合、細胞集団の一部を培養容器から除去することができるが、同一容器中で行われる１回目の細胞継代の後の細胞継代を開始するためにしばしば全細胞集団が使用される。連続継代の間に細胞バイオマスを増加させるためには、１回目の細胞継代の後の（酵素処理を使用する細胞脱離工程後に始まる）各継代の開始時に培養容器に、以前に導入したマイクロキャリアの量よりも多くのマイクロキャリアを導入することが必要である。連続細胞継代の間じゅう、同一量の培養培地が維持される場合、これは、１回目の細胞継代の後の細胞継代ごとにマイクロキャリア濃度を増加させることに相当する。他方、培養培地の量が新しい細胞継代ごとに同一の割合で増加する場合、連続細胞継代の間じゅう、同一のマイクロキャリア濃度が維持され得る。１回目の細胞継代の後の各細胞継代の開始時に、培養培地の量およびマイクロキャリア濃度は、ともに、細胞の最大増幅を得るために培養容器中にて増加する。例えば、新しい細胞継代ごとに、先行継代の間じゅう細胞が含有されていた量の１.２〜３倍の培養培地中にて細胞を培養する。同様に、新しい細胞継代ごとに、培養培地中のマイクロキャリア濃度は、先行の細胞継代の間に存在していたものより２〜１０倍高い。本発明に関連して、一般に、各細胞継代の最後に（すなわち、細胞の脱離工程の最後に）、使用したマイクロキャリアを除去するのは有用ではない。該マイクロキャリアが細胞によって再コロニー形成されたとしても、一般に、各新細胞継代の開始時に導入されるべきマイクロキャリアの量の算出において、先行の細胞継代由来の使用したマイクロキャリアの量は考慮されない。細胞のマイクロキャリアへの接着の期は、一般に、細胞の種類に応じて、１〜１０時間続く。接着期の後、マイクロキャリアを沈殿させた後、培養培地の全部または一部を除去し、マイクロキャリアに接着した細胞の増殖を促進するために新しい培地と交換するのが有利であり得る。
【００５２】
本発明の対象に適している培養培地は、動物由来の血清を添加した慣用の細胞培養培地であり得る。有利には、該培養培地は、血清および血清タンパク質のどちらも含有しない。該培養培地は、特に、動物由来のタンパク質または動物由来の生成物を含まないものであり得る。「動物由来のタンパク質または生成物」という用語は、製造方法が動物由来またはヒト由来の物質を使用する少なくとも１つの工程を含むタンパク質または生成物を意味することを意図される。特に有利には、細胞の培養に使用される培地は、タンパク質を全く含まないものであり得るか、または組換えタンパク質または植物（ダイズ、コメなど）もしくは酵母から抽出されたタンパク質の形態のタンパク質を非常に少量含有することができる。それらは、ほとんど一般的に、非常に低濃度の低分子量タンパク質（１０ｋＤ以下）（ポリペプチドともいう）を含有する。これらの培養培地中の総タンパク質濃度は、一般に、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によって測定された１５ｍｇ／ｌ以下である。これは、特に、本発明の方法に、特にベロ細胞の培養に適している、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎによって販売されているＶＰ  ＳＦＭ培地の場合である。例えば、Ｏｐｔｉ  ＰｒｏTM血清フリー（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｅｐｉｓｅｒｆ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｅｘ−ｃｅｌｌ（登録商標）ＭＤＣＫ  （Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｅｘ−ＣｅｌｌTM  Ｖｅｒｏ（ＳＡＦＣ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ＭＰ−ＢＨＫ（登録商標）血清フリー（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）、ＳＦＣ−１０  ＢＨＫ発現血清フリー（Ｐｒｏｍｏ  ｃｅｌｌ）、ＳＦＣ−２０  ＢＨＫ発現血清フリー（Ｐｒｏｍｏ  ｃｅｌｌ）、ＨｙＱ  ＰＦ  Ｖｅｒｏ  （Ｈｙｃｌｏｎｅ  ｒｅｆ．ＳＨ３０３５２．０２）、Ｈｙｃｌｏｎｅ  ＳＦＭ４  Ｍｅｇａｖｉｒ，  ＭＤＳＳ２培地（Ａｘｃｅｌｌ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｉｓｃｏｖｅ変法ＤＭＥＭ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、Ｈａｍ栄養培地（Ｈａｍ−Ｆ１０、Ｈａｍ−Ｆ１２）、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ  Ｌ−１５培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、Ｐｒｏ  Ｖｅｒｏ培地（Ｌｏｎｚａ）およびＰｏｗｅｒ  ＭＤＣＫ培地（Ｌｏｎｚａ）が挙げられ、これらは、動物由来の生成物を含んでおらず、また、わずかであるかまたは全くタンパク質を含有しない。
【００５３】
培養培地が動物血清もしくは血清タンパク質を含まないかまたは総タンパク質濃度が１５ｍｇ／ｌ未満である（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）場合、一般に、培地が撹拌される場合に発揮される剪断力から細胞を保護する細胞保護剤が添加される。最も一般的に使用される細胞保護剤は、一般に、界面活性特性を有する。それらは、特に、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）としても知られているビニルアルコールポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）としても知られているエチレングリコールポリマー、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）としても知られている１−ビニル−２−ピロリドンポリマー、または、化学式ＨＯ(Ｃ2Ｈ4Ｏ)a(Ｃ3Ｈ6Ｏ)b(Ｃ2Ｈ4Ｏ)aＨ［ここで、ａは、エチレンオキシド単位の数を表し、ｂは、プロピレンオキシド単位の数を表す］を有する、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドの「ブロックコポリマー」であるポロキサマーである。これらの細胞保護剤は、一般に、培養培地中０.００１％〜２％（ｗ／ｖ）の濃度範囲で使用される。特に好ましい細胞保護剤としては、ポロキサマー１８８およびＰＶＰが挙げられる。ポロキサマー１８８は、約８４００ダルトンの平均分子量を有しており、通常０.０５〜０.２％（ｗ／ｖ）の濃度で培養培地中にて使用される。ＰＶＰもまた、ＷＯ０１／４０４４３に記載されているように、細胞増殖を刺激するので、推奨される。ＰＶＰは、一般に、２０ｋＤａ〜３６０ｋＤａの平均分子量範囲、好ましくは２０ｋＤａ〜４０ｋＤａの平均分子量範囲で、一般に０.０１％〜２％（ｗ／ｖ）の培養培地中濃度、好ましくは０.０５％〜０.５％（ｗ／ｖ）の濃度で、使用される。ＰＶＰはまた、もはやその分子量によってのみ特徴付けられるのではなく、ＰＶＰの平均分子量および平均値の両側の分子量の変動を考慮に入れるそのＫ値によっても特徴付けられる。Ｋ値の算出については、文献Cryobiology, 8, 453-464 (1971)において定義されている方程式を参照する：Ｋ値は、下記式に従ってＰＶＰの１％溶液の相対粘度に基づいて算出される：
Ｌｏｇηｒｅｌ／Ｃ＝７５Ｋ02／(１＋１.５Ｋ0Ｃ)＋Ｋ0
Ｋ＝１０００Ｋ0
Ｃは、ＰＶＰ濃度を培地１００ｍｌあたりのｇで表す。
ηｒｅｌは、溶媒の粘度と比較した溶液の粘度である。
【００５４】
本発明の対象に適しているＰＶＰは、１８〜６０，好ましくは２６〜３５のＫ値を有する。例えば、本発明の方法に従ってベロ細胞のストックを生産するためには、細胞保護剤として約３０のＫ値を有するＰＶＰを０.１％（ｗ／ｖ）濃度で含有するかまたはポロキサマーを０.１％（ｗ／ｖ）の濃度で含有するＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって販売されているＶＰＳＦＭに基づく培養培地を、動物由来の生成物を含まず、かつ、タンパク質含量が非常に低い（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によって１５ｍｇ／ｌ未満）培養培地として使用し得る。
【００５５】
通常、培養培地の組成物は、連続細胞継代の間じゅう同じものであるが、必要に応じて、グルコースおよび／またはグルタミンのような栄養サプリメントを与えるのが有用であり得る。連続細胞継代の間、細胞増殖期の間じゅう、細胞の必要に応じて、培養培地の全部または一部を取り換えることも有用であり得る。これは、当業者の自由裁量によって、グルコース、グルタミン、ラクテート、アンモニウムイオンレベルの測定のような慣用の試験方法によって評価される。本発明に関連して、培養培地は、一般に、培養培地の全部または一部を除去する場合を除いて、培養培地中にてマイクロキャリアを懸濁液中に維持し続けるのに十分な強度で連続して撹拌される。
【００５６】
１回目の細胞継代の間の培養培地の量は、通常、培養容器の作業容積の半分〜１／５である。その特定の形状が少量のマイクロキャリアに接着している細胞の培養を可能にする大容量の培養容器（１００リットルを超えるバイオリアクター）（例えば、下部が円錐形の沈殿ゾーンを装備したバイオリアクター）の場合、培養培地の量は、より少ない（バイオリアクターの作業容積の１／６〜１／１０）かまたはさらに少なくてもよく、バイオリアクターの作業容積の１／２０を表す。上記したように、培養培地の量は、一般に、連続細胞継代の間にわたって増加していき、最終細胞継代は、しばしば、容器の作業容積の少なくとも７０％に相当する量の培養培地の存在下で行われる。
【００５７】
培養容器は、細胞培養培地中にてマイクロキャリアを懸濁液中に維持するために（機械的なもの、空気流によるものなど）撹拌システムを装備しており、培養の要求に従って培地を取り換える手段、ならびに温度、ｐＨ、酸素圧、窒素もしくは空気による任意のガス処理、および代謝物もしくは栄養（ラクテート、グルコース、グルタミン、アンモニウムイオンなど）を試験し調節するための手段を有する。これらの装置は、使用される容器のサイズおよび形状に従ってこれらをどのように使用するかを知っている当業者に十分に知られている。例えば、本発明の培養容器は、スピナーの形態またはバイオリアクターの形態のものであり得る。該容器の作業容積が２リットル以上である場合、通常、再利用可能なガスタンクまたは金属タンクの形態であり得るバイオリアクターを使用するか、または該バイオリアクターが使い捨てバイオリアクターである場合には、特にＮｕｃｌｅｏ  ＰＧ−ＡＴＭＩTMの名称の下にＰ．Ｇｕｅｒｉｎによって販売されている使い捨てバッグの形態の容器を使用する。また、例えば、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃｓによって販売されているＢｉｏｗａｖｅシステム（Ｗａｖｅ  ＢｉｏｒｅａｃｔｏｒTM）、ＳＴＲ使い捨てＢｉｏｒｅａｃｔｏｒTMシステム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、ＳＵＢTMシステム（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、またはセル・レディ・システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用することもできる。主な目的が工業スケールの細胞バッチを生成することである本発明の方法に関連して、作業容積が３リットル〜１０００リットルのバイオリアクターが使用されるが、より一般的には、作業容積が２０リットル〜５００リットルのバイオリアクターが使用される。
【００５８】
本発明の目的のために、「接着細胞」は、使用される培養条件下で正常に増殖および発達するために固体支持体を必要とする、株として確立された細胞、または動物またはヒトの健康な組織または腫瘍組織の抽出により直接得られる細胞である。それらは、通常、接触阻害現象のためにそれらの支持体上で単一細胞層を形成する。したがって、実際、使用される培養条件下で、増殖するために固体支持体を必要とせず、培養培地中にて懸濁液中で成長することができる細胞は、排除される。接着細胞株は、健康な細胞または腫瘍細胞の一次培養から得ることができるが、ＰＥＲ.Ｃ６株の場合のように、不死化剤を使用する細胞の形質転換によって得ることもできる。
【００５９】
本発明の対象に適している接着細胞株の例としては、３Ｔ３、ＮＴＣＴまたはＷＥＨＩ株のようなネズミの細胞株、ＢＨＫ株（特に、ＢＨＫ２１株）またはＣＨＯ株のようなハムスターの細胞株、ＭＤＣＫ株のようなイヌの細胞株、ＰＫ１５株のようなブタの細胞株、ＭＤＢＫ株のようなウシの細胞株、ベロ、ＬＬＣ−ＭＫ２、ＦＲＨＬ２またはＭＡ１０４株のようなサルの細胞株、およびＭＲＣ５、２９３、ＰＥＲ.Ｃ６、Ｈｅｌａ、ＥＣＶまたはＡ４３１株のようなヒトの細胞株が挙げられる。これらの接着細胞株は、また、それらが組換えタンパク質の生産を意図される場合に、組換えベクター（プラスミド、ウイルスなど）を形質移入された株の形態であり得る。
【００６０】
本発明の方法によって、接着細胞の集団は、同一の培養容器中にて連続細胞継代を行うことによって、少なくとも４０倍、好ましくは少なくとも６０倍、特に好ましくは少なくとも１００倍増加する。これは、本発明の方法がこの単一の容器中にて行われる連続細胞継代の間に細胞支持体の表面積を５〜４０倍、好ましくは１０〜３０倍増加させることができるから、行われ得るのである。従来の方法では、この細胞増幅の大きさは、少なくとも２つの容器を使用して見られるが、より一般的には、異なるサイズの３つの培養容器を使用して見られる（実施例５を参照）。本発明の方法は、従来の方法で得られるものと同一の工業的量が同じ期間で生成されるが、同時に、培養容器の使用および維持に関連する費用ならびにこれらの細胞バッチを生成するのに必要な空間を低減するので、非常に有利である。
【００６１】
本発明に従って接着細胞を生産する方法は、培養培地中０.５ｇ／ｌ以下の濃度でのｃｙｔｏｄｅｘTMマイクロビーズの存在下における培養および／または血清を含有しないかまたは非常に僅かなタンパク質（１５ｍｇ／ｌ以下）を含有する培地における培養のような、より困難な培養条件に細胞を適応させるために１回以上の「適応」細胞継代が行われる慣用的に推奨されている適応期間に頼らずに、解凍したばかりの細胞を培養容器に直接導入することによって有利に行われ得る。典型的な例としては、当業者に周知の手順に従って接着細胞のストックを解凍し、次いで、この解凍した細胞の懸濁液を、培養培地中にマイクロキャリアを含有する培養容器に直接導入して、本発明の方法を行う。前記のように、特に、マイクロキャリアとしてｃｙｔｏｄｅｘTMマイクロビーズを使用する場合、１回目の細胞継代の間の培養培地中のマイクロキャリアの濃度は、一般的に０.５ｇ／ｌ以下の濃度に減縮される；それは、一般的には０.１〜０.４ｇ／ｌであり、より具体的には０.１〜０.３ｇ／ｌである。培養培地は、また、タンパク質を全く含まないか、または非常に低い総タンパク質含量（１５ｍｇ／ｌ以下）を有することができる。凍結細胞のストックは、バイアルからのもの（この場合、細胞の量は、一般に、比較的低く、１０7〜５×１０8細胞である）であり得るか、または有利には、最大で１００倍の細胞を含有するバッグからのものであり得る。大規模な細胞生産法は、解凍したバッグの内容物を大容量の培養容器に直接播くことができるので、特に速くできるようになる。
【００６２】
本発明の方法を使用して生産された接着細胞のストックが十分ではない場合、細胞集団に以下の処理を施すことによって、同一の細胞培養容器から得られた細胞バイオマスをさらに増加させることができる：
・慣用的に連続細胞継代を行うために使用され得る１つ以上の培養容器に移すこと、すなわち、各細胞継代後に、得られた細胞バイオマスを別のより大きな培養容器に移すこと、または、より有利には、
・より大きな作業容積を有する（第１の容器よりも、一般的には少なくとも１０倍大きい、最も一般的には１０〜５０倍大きい）第２の培養容器に移し、この第２の容器に移された細胞を本発明の方法に適用すること。このように該方法を行うことによって、細胞の工業的バッチを生産するために使用されるべき培養容器の数および必要な空間は、より有意に減少する。
【００６３】
接着細胞の工業規模生産に関連して本発明の方法の実施の経済的利点を評価するために、Reviews of Infectious Diseases, vol 6, supplement 2, S341-S344 (1984)に記載されるような、ポリオウイルスの生産を目的とするベロ細胞の工業生産に関する慣用のスキームを参照することができる。該慣用スキームは、５細胞継代を含んでおり、１回目は１リットルのバイオリアクター中にて行われ、２回目は５リットルのバイオリアクター中にて行われ、３回目は２０リットルのバイオリアクター中にて行われ、４回目は１５０リットルのバイオリアクター中にて行われ、５回目は１０００リットルのバイオリアクター中にて行われる。本発明の方法によって、最初の３細胞継代を単一の２０リットルのバイオリアクター中にて行い、次いで、最後の２継代を、細胞を１５０リットルのバイオリアクターに移した後に１０００リットルのバイオリアクターに移すことによって慣用的に行うことができる。最初の３細胞継代を単一の２０リットルのバイオリアクター中にて行い、次いで、得られた細胞を、最後の２細胞継代を行う単一の５００リットルまたは１０００リットルのバイオリアクターに直接移す本発明の方法を２回繰り返すことができる。どちらの場合も、慣用スキームを適用した場合に得られる細胞の量と同じ桁の量の細胞が同じ期間で生産されるが、１つ目のケースでは、２つのバイオリアクター（１リットルおよび５リットル）が省かれ、２つ目のケースでは、３つのバイオリアクター（１リットル、５リットルおよび１５０リットル）が省かれる（実施例５を参照）。
【００６４】
経済的な観点から特に有利な接着細胞の生産方法は、非常に異なるサイズの２つの培養容器中にて本発明の方法を繰り返すことからなる。したがって、この趣旨で、本発明の対象は、以下のものである：
【００６５】
接着細胞の生産方法であって、
ａ．接着細胞を、培養培地中にマイクロキャリアを含有する第１の培養容器に導入する工程；
ｂ．この第１の培養容器中にて数回の連続細胞継代を行うことによって細胞を増幅する工程（ここで、１回目の細胞継代の後の各細胞継代は、毎回、先行細胞継代の間に得られた細胞集団の全部または一部であって酵素処理によって細胞がマイクロキャリアから脱離したものを使用して行われ、また、毎回、培養培地および増加量のマイクロキャリアを添加して行われる）；
ｃ．この第１の培養容器中で行われた最終細胞継代の間に得られた細胞集団を、酵素処理によって細胞をマイクロキャリアから脱離させた後に回収する工程；
ｄ．回収した細胞集団を、より大きな作業容積を有し、かつ、第１の培養容器中で行われた最終細胞継代の間に存在していたマイクロキャリアの量よりも多量のマイクロキャリアを含有する培養培地を含有している第２の培養容器に移す工程；
ｅ．この第２の培養容器中にて数回の連続細胞継代を行うことによって、細胞を増幅する工程（ここで、１回目の細胞継代の後の各細胞継代は、毎回、先行細胞継代の間に得られた細胞集団の全部または一部であって酵素処理によって細胞がマイクロキャリアから脱離したものを使用して行われ、また、毎回、培養培地および増加量のマイクロキャリアを添加して行われる）；
ｆ．この第２の培養容器中にて行われる最終細胞継代の間に得られた細胞集団を、所望により酵素処理によって細胞をマイクロキャリアから脱離させた後、回収する工程；
ｇ．さらに大きな作業容積を有する第３の培養容器中にて、工程ｄからｆを再度繰り返す工程
による方法。
【００６６】
一般に、第２の培養容器の作業容積は、第１の培養容器のものより２０〜５０倍大きい。
【００６７】
有利には、該方法の工程ａにおいて導入される接着細胞は、凍結細胞のストックからのものであり、第１の培養容器への導入の直前に解凍されたものである。
【００６８】
本発明の方法の反復は、生物学的作用物質の生産のために行われ得る。この趣旨で、本発明の対象は、以下のものである：
【００６９】
マイクロキャリアに接着している細胞によって生産される生物学的作用物質の生産方法であって、
ａ．接着細胞を、培養培地中にマイクロキャリアを含有する第１の培養容器に導入する工程；
ｂ．この第１の培養容器中にて数回の連続細胞継代を行うことによって細胞を増幅する工程（ここで、１回目の細胞継代の後の各細胞継代は、毎回、先行細胞継代の間に生産された細胞集団の全部または一部であって酵素処理によって細胞がマイクロキャリアから脱離したものを使用して行われ、また、毎回、培養培地および増加量のマイクロキャリアを添加して行われる）；
ｃ．この第１の培養容器中で行われた最終細胞継代の間に得られた細胞集団を、酵素処理によって細胞をマイクロキャリアから脱離させた後に回収する工程；
ｄ．回収した細胞集団を、より大きな作業容積を有し、かつ、第１の培養容器中で行われた最終細胞継代の間に存在していたマイクロキャリアの量よりも多量のマイクロキャリアを含有する培養培地を含有している第２の培養容器に移す工程；
ｅ．この第２の培養容器中にて数回の連続細胞継代を行うことによって、細胞を増幅する工程（ここで、各新細胞継代は、毎回、先行細胞継代の間に生産された細胞集団の全部または一部であって酵素処理によって細胞がマイクロキャリアから脱離したものを使用して行われ、また、毎回、培養培地および増加量のマイクロキャリアを添加して行われる）；
ｆ．この第２の培養容器中にて行われる最終細胞継代の間に得られた細胞集団を、生物学的作用物質を生産するように処理する工程（ここで、この工程ｆは、工程ｄおよびｅを行うために使用して培養容器と同じ培養容器中にて行われる）；および
ｇ．生物学的作用物質を回収する工程
による方法。
【００７０】
所望により、工程ｄおよびｅは、生物学的作用物質を生産するように細胞集団を処理する前に第３の培養容器中で繰り返すことができる。
【００７１】
前記のように、生産される生物学的作用物質は、例えば、組換えタンパク質または狂犬病ウイルスのようなウイルスであり得る。
【００７２】
本発明の対象は、また、本発明の方法のうちの１つによって生産された細胞の、生物学的作用物質の生産のための使用である。
【００７３】
最後に、本発明は、マイクロキャリアを含有する培養培地中にて接着細胞を生産する方法であって、細胞集団を４０倍以上、好ましくは６０倍以上、特に好ましくは１２０倍以上増加させるために連続細胞継代が同一の培養容器中で行われることによる方法に関する。使用される培養容器は、好ましくは、少なくとも２０リットルの作業容積を有するバイオリアクターである。
【００７４】
本発明に関連して挙げられたような培養培地は、血清を添加した慣用の培地であり得るが、好ましくは、該培地は、動物由来の血清を含まない。特に好ましくは、動物由来の生成物を含まず、かつ、タンパク質濃度が１５ｍｇ／ｌ以下である、培地を使用する。
【００７５】
本発明は、本発明を説明するためのものであって、本発明を限定するものではない、以下の実施例によってより明確に理解されるであろう。
【実施例】
【００７６】
実施例１：同一の２リットルのバイオリアクター中にて３連続細胞継代を行うことによるベロ細胞の増幅
この実施例では、初期マイクロキャリア濃度、培養培地中の血清の存在または不在、および細胞保護剤の性質のようなさまざまなパラメーターの細胞増殖に対する役割を研究した。
【００７７】
１．１）使用する材料
バイオリアクター：
Ｃｅｌｌｒｅａｄｙ（Ｍｏｂｉｕｓ）の名称の下にＭｉｌｌｉｐｏｒｅによって販売されている２.４リットルの容量を有する使い捨てバイオリアクター中にて、この実験を行った。それらは、ｐＨプローブ、ｐＯ2プローブおよび温度プローブならびにマリーンプロペラ撹拌パドルを装備している。
【００７８】
マイクロキャリア：
ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって供給されたＣｙｔｏｄｅｘ  １マイクロビーズを使用した。各細胞継代を行うのに必要な量を取り出した後、リン酸緩衝液（１×Ｃ  ＰＢＳ、、約ｐＨ７.４）中にて２４時間水和化した。次いで、それらを同緩衝液で３回リンスし、次いで、オートクレーブによって滅菌した。バイオリアクターへの導入直前に、マイクロビーズを沈殿させた後、該滅菌緩衝液を等量の培養培地と取り換えた。マイクロビーズ１ｇは、約４４００ｃｍ2の接着表面を有する。
【００７９】
試験される培養培地：
ＶＰＳＦＭ／Ｋ３０：  血清を含まず、動物由来の生成物を含まず、ＩＳＰによって供給された０.１％ｗ／ｖのポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）Ｋ３０を添加した、ＶＰＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。
ＶＰＳＦＭ／Ｆ６８：  血清を含まず、動物由来の生成物を含まず、ＢＡＳＦによって供給された０.１％ｗ／ｖのポロキサマー１８８を添加した、ＶＰＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。
ＶＰＳＦＭ／Ｋ３０／ＳＶＦ：  ４％脱補体ウシ胎仔血清を添加したＶＰＳＦＭ／Ｋ３０。
【００８０】
細胞：
細胞を冷凍するための管（Ｎｕｎｃ  ｔｕｂｅ  ｒｅｆ：４３０６６３、５ｍｌ）中にて１０％ジメチルスルホキシドを含有する血清不含培地中５０×１０6細胞／ｍｌの冷凍形態で貯蔵した細胞のバンクに由来するベロ細胞。
【００８１】
１．２）「一体型法」における初期マイクロキャリア濃度および細胞保護剤に関するパラメーターを評価するために使用した操作プロトコール
これら２つのパラメーターを研究するために同じ操作プロトコール用いた。
ベロ細胞増殖に対する１回目の細胞継代の間の非常に低いマイクロキャリア濃度の効果を評価するために、０.１ｇ／ｌおよび０.３ｇ／ｌの濃度を試験した。
７.２〜７.５のｐＨ、３７℃の温度および約２５％のｐＯ2のようなバイオリアクターのレギュレーションパラメーターを調節した後、マイクロキャリア０.６ｇを含有するＶＰＳＦＭ／Ｋ３０培地２リットル中６６×１０6細胞をバイオリアクター１（ｂｉｏ１）に導入した（接着表面１ｃｍ2あたり２５０００細胞と等価であり、初期マイクロビーズ濃度０.３ｇ／ｌを表す）。
マイクロキャリア０.２ｇを含有するＶＰＳＦＭ／Ｋ３０培地２リットル中２２×１０6細胞をバイオリアクター２（ｂｉｏ２）に導入した（接着表面１ｃｍ2あたり２５０００細胞と等価であり、初期マイクロビーズ濃度０.１ｇ／ｌを表す）。
【００８２】
培養培地を取り換えるためまたは培養培地の量を減少させるために使用されるマイクロビーズ沈殿期の間を除いて細胞培養の期間じゅう、培養培地を撹拌し続けた。
３日目に、以下のプロトコールに従って、細胞をトリプシンで処理した：
マイクロビーズを沈殿させた後、ＶＰＳＦＭ／Ｋ３０培養培地約３００ｍｌをバイオリアクター中に放置し、次いで、カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝液中に組換えトリプシン（ｒｅｆ：Ｒｏｃｈｅ  ０４６１８７３４）６００ｍｇを含有する０.０２５Ｍクエン酸ナトリウム約３００ｍｌを添加した。該培地を適度な撹拌下に保持した。試験サンプルによって細胞が実際に脱離したことを確認した後（一般に、この脱離は、１５〜３０分間で生じた）、１ｍｇ／ｍｌのトリプシン阻害剤（ｒｅｆ：Ｓｉｇｍａ  Ｔ６５２２）を含有するＶＰＳＦＭ／Ｋ３０の溶液約３００ｍｌを添加することによってトリプシンの作用を停止した。細胞をカウントした後、細胞懸濁液の一部を取り出して、２回目の細胞継代を行うために総量２リットルの培養培地中のマイクロキャリア２.４ｇ（ｂｉｏ１）またはマイクロキャリア０.６ｇ（ｂｉｏ２）を導入した後に接着表面１ｃｍ2あたり約２５×１０3細胞となるように細胞の残量を調節した。次いで、レギュレーションパラメーターを１回目の細胞継代の間と同様に再度調節した。４〜６時間後、この培地を新しい培養培地と取り換え、次いで、所望により２４〜４８時間の培養の後に２回目の取り換えを行った。７日目に、３日目に使用したプロトコールと同じプロトコールに従って細胞を再度トリプシン処理した。細胞をカウントした後、細胞懸濁液の一部を取り出して、３回目の細胞継代を行うために総量２リットルの培養培地中のマイクロキャリア６ｇ（ｂｉｏ１）またはマイクロキャリア２.４ｇ（ｂｉｏ２）を導入した後に接着表面１ｃｍ2あたり約２５×１０3細胞となるように細胞の残量を調節した。次いで、バイオリアクターのレギュレーションパラメーターを再度調節した。４〜６時間後、該培地を新しい培養培地と取り換え、次いで、所望により２４〜４８時間の培養の後に２回目の取り換えを行った。１０日目に、培養容器中の初期マイクロキャリア濃度に従って細胞増幅の程度を評価するために細胞を回収した。
【００８３】
細胞保護剤の役割を評価するために、ポロキサマー１８８およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）Ｋ３０を、同じ操作プロトコールを使用して初期マイクロキャリア濃度０.３ｇ／ｌで試験した。
【００８４】
１．３）「一体型」法における血清の役割を評価するために使用される操作プロトコール
以下の特徴をもって、セクション１．２に記載したものと同じ操作プロトコールを使用した：
−  ＶＰＳＦＭ／Ｋ３０／ＳＶＦ培地を使用した。
−  初期マイクロキャリア濃度は０.３ｇ／ｌであった。
−  ５日目および８日目にトリプシン処理を行った。各トリプシン処理前に、血清を除去するために、リンス、沈殿、およびリンス緩衝液の除去を含む一連の工程によって、マイクロビーズの懸濁液をリンス緩衝液（リン酸緩衝液（１×Ｃ  ＰＢＳ））６００ｍｌで３回「リンス」した。
【００８５】
１．４）結果
細胞増殖について研究した様々なパラメーターの役割を評価するために、Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ（登録商標））カウンティングシステムを使用して一定間隔で細胞濃度を測定し、累積細胞世代数を算出した。毎回、マイクロビーズ懸濁液の２つのサンプルを採取した。示された値は、各分析時に採取した２つのサンプルの平均値を表す。
【００８６】
研究したパラメーターの各々に従って、培養の間に観察された細胞の量および累積細胞世代数を以下の３つの表に示す。
【００８７】
１．４．１）「初期マイクロキャリア濃度」パラメーター
【表１】
0005894929.tif 000002
*：トリプシン処理前。
**：トリプシン処理、および接着表面１ｃｍ2あたり２５×１０3細胞への細胞濃度調節後。
***：累積世代数の算出のため、連続細胞継代の間に行われた可能な細胞濃度調節を考慮し、下記一般式を使用した：
【数１】
0005894929.tif 000003
最終［細胞］：検討中の日の細胞濃度に相当する。
初期［細胞］：０日目の初期細胞濃度に相当する。
【００８８】
３連続細胞継代の後に生産された細胞の量は、初期マイクロキャリア濃度が０.１ｇ／ｌであるバイオリアクターにおけるほうが少ないが、細胞集団の倍増期間は、このバイオリアクターにおけるほうが僅かに早い。なぜなら、試験期間の全体にわたって観察された累積細胞世代数がより高いからである。
【００８９】
驚くことに、１回目の細胞継代の間の非常に低いマイクロキャリア濃度（約０.１ｇ／ｌ）は、細胞増殖に悪影響を及ぼさない。反対に、該細胞は、それらがより高いマイクロキャリア濃度（０.３ｇ／ｌ）を含有するバイオリアクター中にある場合よりもさらに活発に分裂する傾向がある。
【００９０】
１．４．２）「細胞保護剤」パラメーター
【表２】
0005894929.tif 000004
*：トリプシン処理前。
**：トリプシン処理、および接着表面１ｃｍ2あたり２５×１０3細胞への細胞濃度調節後。
【００９１】
結果は、ポロキサマー１８８またはＰＶＰ（Ｋ３０）の血清不含培養培地への添加が、一体型法に従って行われた細胞増幅に対して全体的に等価な効果を及ぼすことを示している。
【００９２】
１．４．３）「血清」パラメーター
【表３】
0005894929.tif 000005
*：トリプシン処理前。
**：トリプシン処理後。
【００９３】
これらの結果は、「一体型」法が、血清含有培養培地中にて培養されたマイクロキャリアに接着している細胞に適用できることを示している。
【００９４】
実施例２：  本発明の方法（「一体型法」）またはマイクロキャリアの単純添加による方法（「ビーズ間移動」技法）のいずれかを使用することによって得られるベロ細胞生産の比較
「一体型法」に従って行われたかまたは「ビーズ間移動」技法を使用して行われた２連続細胞継代の後の細胞生産を比較した。
【００９５】
この研究は、Ｑｕａｔｔｒｏの名称の下にＳａｒｔｏｒｉｕｓによって販売されている、容量４リットルのガラス製バイオリアクター中にて行われた。
【００９６】
２．１）「一体型法」の実施に使用した操作プロトコール
「一体型法」について、セクション１．２に記載したものと同じ原理が以下の特徴とともに適用された：
−  使用した培養培地は、ＶＰＳＦＭ／Ｋ３０培地であった。
−  培養培地の量は、２連続細胞継代の間、一定に保たれており、４リットルであった。
−  １回目の細胞継代を、０.３ｇ／ｌのマイクロビーズ濃度を使用し、接着表面１ｃｍ2あたり５００００細胞となる量の細胞を導入することによって行った。
−  ３日目に、培養培地を取り換えた。
−  ４日目に、セクション１．２に記載の方法と同様に細胞をトリプシンで処理した。該細胞のトリプシン処理およびカウンティングの後、細胞集団の２／３の量を取り出し、２回目の細胞継代を行うために総量４リットルの培養培地中のマイクロビーズ４.８ｇ（すなわち、１.２ｇ／ｌの濃度）を導入した後、残りの細胞を接着表面１ｃｍ2あたり２５０００細胞に調節した。
−  培養培地を２回取り換えた：１回目は、マイクロビーズ導入の４〜６時間後であり、２回目は、６日目であった。
−  ８日目に、細胞を回収し、細胞増幅の程度を評価するためにカウントした。マイクロビーズの細胞による被覆の程度を評価するためにマイクロビーズ懸濁液のアリコートを分析した。
【００９７】
２．２）「ビーズ間移動」法を実施するために使用した操作プロトコール
４日目に細胞をトリプシンで処理しなかったことを除いて、セクション２．１に記載の操作プロトコールを適用した。４日目に、同じ割合の細胞およびマイクロビーズを取り出すようにマイクロビーズ懸濁液の量の２／３を取り出して、「一体型」法において使用した培養条件下においた。次いで、総量４リットルの細胞培養培地中にｃｙｔｏｄｅｘ  １４.８ｇ（すなわち、１.２ｇ／ｌの濃度）を含有するマイクロビーズ懸濁液を導入した。次いで、操作プロトコールは、セクション２．１に記載と同じであった。
【００９８】
２．３）結果
試験した２つの方法の細胞増殖を比較するために、セクション１．４に記載の手順に従って、一定間隔で細胞濃度を測定した。
【００９９】
培養の間に観察された細胞の量および累積細胞世代数を下記表に示す。
【表４】
0005894929.tif 000006
*：トリプシン処理前。
**：細胞濃度調節および所望によりトリプシン処理（「一体型」法の場合）後。
【０１００】
１回目の細胞継代（０日目〜３日目）の間の細胞増殖は、２つのバイオリアクター中において類似している。他方、２回目の細胞継代（３日目から８日目）の間の細胞増幅は、「ビーズ間移動」技法を行ったバイオリアクター中のほうが非常に弱い。８日目に、回収した細胞の量は、「一体型」法を行ったバイオリアクターにおいて回収したもののほぼ半分である。累積細胞世代数の変化に関する結果も同様である。８日目に、一体型法によって増幅された細胞に関する累積細胞世代数は６を超えている。「ビーズ間移動」技法によって増幅された細胞に関してそれは５である。したがって、「一体型」法によって増幅された細胞は、より活発に増加する。これらの結果は、「一体型」法が、細胞に対して連続細胞継代を行うために、細胞の完全性に有害であることが知られているトリプシンの使用を必要とする限り意外なことである。
【０１０１】
これらの結果は、同じ操作条件下で行われた２つの独立した実験において確認された。８日目の累積細胞世代数の変動の分析は、有意に異なることを示している（ｐ＝０.０１３７）。
【０１０２】
８日目のマイクロビーズの顕微鏡による分析は、一体型法を行った場合、マイクロビーズの大半が細胞によって被覆されていることを示している（図２ａを参照）。他方、「ビーズ間移動」技法を行った場合、マイクロビーズの一部だけが細胞によって被覆されている。この結果は、４日目にｃｙｔｏｄｅｘ  １マイクロビーズを添加した後の、培地の連続撹拌または培地の断続的撹拌（例えば、５分間の撹拌後に２０分間休息期を含むサイクルを２時間繰り返す）によっては実質的に変わらない（図２ｂを参照）。
【０１０３】
実施例３：２０リットルの同一バイオリアクター中で２連続細胞継代を行うことによるベロ細胞の増幅
３．１）使用した材料
バイオリアクター：
Ｎｕｃｌｅｏ−２０の名称の下にＡＴＭＩよって販売されている使い捨てバッグの形態の２０リットルのバイオリアクターを使用した。ｐＨプローブ、ｐＯ2プローブおよび温度プローブを、較正し、オートクレーブによって滅菌した後、標準的なＡＴＭＩプロトコールに従ってプローブホルダーバッグによってバッグに取り付けた：他方、一端をバッグに取り付け、他端をプローブホルダーに取り付けるＫｌｅｅｎｐａｋ（登録商標）コネクションを接続し、次いで、このようにして得られた連結を介してプローブをバイオリアクターに導入した。
マイクロキャリア：  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって供給されたｃｙｔｏｄｅｘ  １マイクロビーズ（セクション１．１を参照）。
培養培地：ＶＰＳＦＭ／Ｋ３０培地（セクション１．１を参照）。
【０１０４】
３．２）操作プロトコール
ＶＰＳＦＭ／Ｋ３０培養培地６リットルをＮｕｃｌｅｏ−２０に導入し、次いで、ｃｙｔｏｄｅｘ  １（４ｇ）を含有するマイクロビーズ懸濁液１リットル（細胞の添加後の初期マイクロビーズ濃度０.５ｇ／ｌを表す）を添加した。
３７℃の温度、７.２〜７.４のｐＨおよび約２５％のｐＯ2のようなＮｕｃｌｅｏ−２０の内部のレギュレーションパラメーターを調節し、培地を適度に撹拌して培養培地にビーズを再懸濁させた後、解凍した後にＶＰＳＦＭ／Ｋ３０培養培地１リットルに入れた５００×１０6細胞をＮｕｃｌｅｏに導入した。培養培地を取り換えるためまたは培養培地の量を減らすために行われるマイクロビーズ沈殿期の間を除いて操作プロトコールの期間の全体にわたって、培養培地を撹拌し続けた。
【０１０５】
２日目に（培養下で２日後）、培地を新しいＶＰＳＦＭ／Ｋ３０培地と取り換えた。
【０１０６】
５日目に、以下のプロトコールに従って細胞をトリプシン処理した。
撹拌、ｐＨ調整およびｐＯ2調整を停止した。温度調整だけを維持した。マイクロビーズの沈殿後、ＶＰＳＦＭ／Ｋ３０培養培地約３リットルをバイオリアクター中に残し、次いで、組換えトリプシン（ｒｅｆ：Ｒｏｃｈｅ  ０４６１８７３４）６００ｍｇを含有する０.０２５Ｍクエン酸ナトリウム溶液約３リットルを添加した。次いで、培地を再度適度に撹拌した。試験サンプルによって細胞が実際に脱離したことを確認した後（一般に、この分離は、１５〜３０分間に生じる）、１ｍｇ／ｍｌのトリプシン阻害剤（ｒｅｆ：Ｓｉｇｍａ  Ｔ６５２２）を含有するＶＰＳＦＭ／Ｋ３０の溶液約３リットルを添加することによって、トリプシンの作用を停止した。次いで、ｃｙｔｏｄｅｘ  １（２８ｇ）を含有するマイクロビーズ懸濁液を添加し、これは、培養培地の量をＶＰＳＦＭ／Ｋ３０培養培地で２０リットルに調節した後の培地中約１.４ｇ／ｌのマイクロビーズ濃度であった。次いで、Ｎｕｃｌｅｏ−２０の内部のレギュレーションパラメーターを、１回目の細胞継代の間と同様に再度調節した。マイクロビーズの導入の４〜６時間後、培地を新しい培養培地と取り換えた。７日目に、この培養培地の新しい培養培地との２回目の取り換えを行った。９日目に、細胞は、実質的にコンフルーエントであった。次いで、それらを、５日目に使用したプロトコールと同じプロトコールによってトリプシン処理した。２細胞継代が同一バイオリアクター中にて行われた後に得られた細胞増幅のレベルを、得られた細胞懸濁液から決定した。
【０１０７】
３．３）結果
得られた細胞増幅のレベルを測定するために、セクション１．４に記載の手順と同様の手順で一定間隔で細胞濃度を測定した。
【０１０８】
培養の間に観察された細胞の量および濃度を下記表Ｉに示す。
【表５】
0005894929.tif 000007
*：トリプシン処理前。
**：トリプシン処理および細胞の接着の後。
***：播かれた生存細胞の初期量を表す。
【０１０９】
２０リットルの同バイオリアクター中にて行った２連続細胞継代の後、９日間の培養後、細胞集団は、６８倍増加したが、一方、細胞支持体の表面は、７倍増加した。
【０１１０】
実施例４：２０リットルの同一バイオリアクター中にて３連続細胞継代を行うことによるベロ細胞の増幅
４．１）使用した材料
使用した材料は、実施例３に記載に材料と同じである。
【０１１１】
４．２）操作プロトコール
以下の変更をともなってセクション３．２に記載のプロトコールと同じプロトコールに従って細胞継代を行った。
−  １回目の継代を、ｃｙｔｏｄｅｘ  １マイクロビーズ２ｇを含有するＶＰＳＦＭ／Ｋ３０培養培地８リットルに２５０×１０6細胞を導入することによって行った（０.２５ｇ／ｌのマイクロビーズ濃度となる）；
−  ５日目に、１回目のトリプシン処理の後、２回目の細胞継代を行うために、ｃｙｔｏｄｅｘ  １（１４ｇ）を含有するマイクロビーズ懸濁液を添加して、培養培地の量をＶＰＳＦＭ／Ｋ３０培養培地で１３リットルに調節した後のマイクロビーズ濃度を約１.０７ｇ／ｌとした；
−  ９日目に、２回目のトリプシン処理の後、３回目の細胞継代を行うために、ｃｙｔｏｄｅｘ  １（６０ｇ）を含有するマイクロビーズ懸濁液を添加して、培養培地の量をＶＰＳＦＭ／Ｋ３０培養培地で２０リットルに調節した後のマイクロビーズ濃度を約３ｇ／ｌとした。
【０１１２】
１２日目に、細胞は実質的にコンフルーエントであった。次いで、それらを、５日目に使用したプロトコールと同じプロトコールに従ってトリプシン処理した。
【０１１３】
３細胞継代を同一のバイオリアクター中にて行った後に得られた細胞増幅のレベルを、得られた最終細胞懸濁液を使用して測定した。
【０１１４】
４．３）結果
培養の間に観察された細胞の量および濃度を下記表に示す。
【表６】
0005894929.tif 000008
*：トリプシン処理前。
**：トリプシン処理および細胞の接着の後。
【０１１５】
２０リットルの同一バイオリアクター中にて行われたベロ細胞の３連続細胞継代の後、１２日間の培養の後に細胞集団は１２６倍増加したが、一方、細胞支持体の表面は３０倍増加した。
【０１１６】
実施例５：本発明の方法（同一バイオリアクター中にて連続細胞継代を行う）または慣用の細胞増殖法（毎回、より大きいサイズの異なるバイオリアクター中にて連続細胞継代を行う）のいずれかを使用するベロ細胞の生産の比較
５．１）操作プロトコール
実施例４に記載のプロトコールに従って、かつ、冷凍細胞のバンクから直接得た初期量２５０×１０6細胞を使用して、２０リットルの単一のバイオリアクター中にて３連続細胞継代を行うか、または、３連続細胞継代を異なるステンレス鋼製バイオリアクター（１回目は２リットルのバイオリアクター、２回目は７リットルのバイオリアクター、３回目は２８リットルのバイオリアクター）中にて行う。使用した慣用の方法の実験条件は以下のとおりである：
【０１１７】
ベロ細胞を、解凍後、最初に、接着表面１ｃｍ2あたり４０×１０3細胞をＶＰＳＦＭ／Ｋ３０培養培地２リットルに導入することによってＣｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ（ＣＦ１０）中にて初期継代を行うことによって、培養条件に適応させた。約５日間の培養の後、得られた細胞集団を、トリプシン処理後に回収した。回収した細胞集団を使用して、ＶＰＳＦＭ／Ｋ３０培養培地２リットル中のｃｙｔｏｄｅｘ  １マイクロビーズ２ｇの懸濁液（濃度１ｇ／ｌ）を含有する２リットルの作業容積を有するバイオリアクターに播く。試験し、レギュレーションパラメーターを３７℃の温度、７.２〜７.４のｐＨ、および約２５％のｐＯ2に調節し、培地を適度に撹拌した後、２リットルのバイオリアクターに平均２２０×１０6細胞を播いた。３日目に、培養培地を新しい培養培地と取り換えた。４日目に、実質的にコンフルーエントな細胞をトリプシン処理し、次いで、使用したマイクロビーズを、ｃｙｔｏｄｅｘ  １マイクロビーズ１４ｇを予め添加しておいたＶＰＳＦＭ／Ｋ３０培養培地７リットルを含有する７リットルのバイオリアクターに移した（マイクロビーズ濃度は約２ｇ／ｌとなった）。６日目に、培養培地を新しい培養培地と取り換えた。８日目に、実質的にコンフルーエントな細胞をトリプシン処理し、次いで、同様に、ｃｙｔｏｄｅｘ  １マイクロビーズ７０ｇを予め添加しておいたＶＰＳＦＭ／Ｋ３０培養培地２８リットルを含有する２８リットルのバイオリアクターに移した（マイクロビーズ濃度は約２.５ｇ／ｌとなった）。１０日目に、培養培地を新しい培養培地と取り換えた。１１日目に、実質的にコンフルーエントな細胞をトリプシン処理し、次いで、回収してカウントした。
【０１１８】
５．２）結果
試験した２つの方法の間の細胞増殖をモニターするために、セクション１．４に記載の手順と同じ手順で細胞濃度を一定間隔で測定した。
【０１１９】
培養の間に観察された細胞の量および増幅のレベルを下記表に示す。
【表７】
0005894929.tif 000009
*：表示した値は、行われた８つの異なる実験で得られた平均値である。
**：表示した値は、行われた３つの異なる実験で得られた平均値である。
【０１２０】
「一体型」法を使用すると、平均２億５３００万個の解凍した細胞を直接２０リットルのバイオリアクターに導入した後１２日間の培養後、平均２９０億個を超える細胞が得られる。すなわち、平均細胞増幅レベルは１１５である。慣用方法を使用すると、最初に２リットルのバイオリアクターに平均２億２０００万個を導入した後１１日間の培養後、平均３２０億の細胞が得られる。すなわち、平均細胞増幅レベルは１４５である。利用可能な細胞支持表面は、２つの方法において３０倍増加したが、慣用方法の場合、２つのバイオリアクターの使用を要した。慣用方法で得られた細胞の量は、わずかに高い。これは、「一体型」法および慣用方法を行うために使用した細胞が同じ生理学的条件下におかれていなかったことに起因する。「一体型」法の場合に２０リットルのバイオリアクターに播くのに使用した細胞は解凍直後のものであったが、一方、２リットルのバイオリアクターに播くのに使用した細胞は、Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙにおいて予め培養されていたので非常に活発であった。１日目の結果は、このことを非常に明確に示している；一体型法において、１日目の細胞の数が約４０％減少しているのは、慣用の「解凍後ラグ」現象の結果である。同じ期間の間に、慣用方法においてＣｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙにおいて予め培養されていた細胞は増加した（細胞集団は倍増した）。「一体型」法において初期培養条件が明らかに望ましくないにもかかわらず、培養の最後には、２つの方法で回収した細胞の量の差は最終的にあまり見られない。試験した２つの方法において初期培養条件が同じであった場合、同じ量の細胞および同じレベルの増幅が得られたと考えられる。したがって、「一体型」法は、同じ期間の間に同じ量の細胞が生産されるので、慣用方法と比べて経済的に非常に有利である。
【０１２１】
実施例６：２００リットルの同一バイオリアクター中にて３連続細胞継代を行うことによるベロ細胞の増幅
６．１）使用した材料
バイオリアクターが、今回、Ｎｕｃｌｅｏ−２０の名称の下にＡＴＭＩによって販売されている２００リットルの使い捨てバッグであること以外、使用した材料は、実施例３に記載の材料と同じである。
【０１２２】
６．２）操作プロトコール
使用したプロトコールは、以下の変更を伴って、実施例３に記載のものと同様であった。
ベロ細胞を、解凍した後、接着表面１ｃｍ2あたり４０×１０3細胞の割合で２つのＣｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙ（ＣＦ１０）において予め培養下においた（１つのＣＦ１０につき培養培地２リットル）。５日間の培養の後、トリプシン処理工程の後に細胞集団を回収し、次いで、これを使用してＮｕｃｌｅｏ−２００に播いた。
【０１２３】
Ｎｕｃｌｅｏ−２００における１回目の細胞継代を、ｃｙｔｏｄｅｘ  １マイクロビーズ２５ｇを含有するＶＰＳＦＭ／Ｋ３０培養培地５０リットル（マイクロビーズ濃度は０.５ｇ／ｌである）に２.２×１０9細胞を導入することによって行った。３日目に、培養培地を新しい培養培地と取り換えた。４日目に、実施例３のプロトコールに従って、Ｎｕｃｌｅｏ中に培地約２０リットルを残し、次いで、カルシウムおよびマグネシウムを含有しないリン酸緩衝液中に組換えトリプシン３０００ｍｇを含有する０.０２５Ｍクエン酸ナトリウム溶液約２０リットルを添加して、細胞をトリプシン処理した。細胞の脱離の後、１ｍｇ／ｍｌのトリプシン阻害剤を含有するＶＰＳＦＭ／Ｋ３０の溶液２０リットルを添加することによって、トリプシンの作用を停止した。
【０１２４】
得られた全細胞集団に、ｃｙｔｏｄｅｘ  １（１３０ｇ）を含有するマイクロビーズ懸濁液を添加することによって、同Ｎｕｃｌｅｏ−２００中にて２回目の細胞継代を行った（培地の総量をＶＰＳＦＭ／Ｋ３０培養培地で１３０リットルに調節した後のマイクロビーズ濃度は約１ｇ／ｌである）。培養培地を２回取り換えた：１回目は、細胞のマイクロビーズへの接着直後であり、２回目は、６日後であった。７日目に、再度、細胞を、４日目に使用したプロトコールに従ってトリプシン処理した。
【０１２５】
同Ｎｕｃｌｅｏ−２００中における３回目の細胞継代を、ＶＰＳＦＭ／Ｋ３０培養培地で１８０リットルに調節した総量の培地中にてｃｙｔｏｄｅｘ  １マイクロビーズ４５０ｇを導入した後、接着表面１ｃｍ2あたり２００００細胞の濃度となるように細胞集団を調節することによって行った。同様に、培養培地を２回取り換えた：細胞のマイクロビーズへの接着直後および１０日目。次いで、同一バイオリアクター中で行った３連続細胞継代の後に得られた細胞集団を定量化した。細胞増幅のレベルは、このようにして測定することができる。
【０１２６】
６．３）結果
培養の間に観察された細胞の量および濃度を下記表に示す。
【表８】
0005894929.tif 000010
*：トリプシン処理前。
**：トリプシン処理および細胞の接着後。
***：トリプシン処理、および、細胞集団の、接着表面１ｃｍ2あたり２００００細胞の濃度への調節後。
【０１２７】
２００リットルの同一バイオリアクター中で行われたベロ細胞の３連続細胞継代の後、１１日間の培養の後、細胞集団は１４０倍増加したが、一方、細胞支持体表面は１８倍増加した。
【０１２８】
「一体型法」によるベロ細胞の増幅の試験を、特にＮｕｃｌｅｏ−５００の名称の下にＡＴＭＩによって販売されている５００リットルの単一の使い捨てバイオリアクター中にて２連続細胞継代を行うことによって行った。得られた細胞増幅のレベルは、２００リットルのバイオリアクターで得られたもの同様であった。このことは、本発明の方法が非常に大きいスケールに適していることを明確に示している。
【０１２９】
実施例７：２００リットルの同一バイオリアクター中にて３連続細胞継代を行うことによって得られた細胞のバッチからの狂犬病ウイルスの生産
実施例６に記載したプロトコールと同じプロトコールを使用して、細胞のバッチを生産した。
【０１３０】
１１日目に、培養培地をＶＰＳＦＭベースのウイルス感染培地と取り換え、次いで、細胞に、Ｗｉｓｔａｒ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから得た狂犬病ウイルスのＰｉｔｍａｎ  Ｍｏｏｒｅ株を感染させた（感染効率０.０１）。温度、ｐＨ、ｐＯ2、および細胞培養に使用した培地の適度の撹拌に関する同一のレギュレーションパラメーターを保持し、ウイルス生産のために調節した。３日目に、ウイルス感染後にウイルス感染培地を取り換え、次いで、ウイルス感染後７日目、１０日目および１４日目の感染力価を測定するために培養上清を回収した。各ウイルス回収後、新しいウイルス感染培地を再度添加した。ＢＨＫ２１細胞に対する慣用の免疫蛍光試験によって培養上清中の感染力価を測定した。試験した培養上清の各々について段階希釈を調製し、次いで、各希釈を、９６ウェルマイクロプレートの１０個のウェルに分配した。２連の試験を並行して行った。次いで、各ウェルにＢＨＫ２１細胞の懸濁液を添加した。細胞を、５％ＣＯ2下、３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間後、ウェルは、細胞の層で覆われ、次いで、アセトンで固定した。アセトンを除去し、マイクロプレートを乾燥させた後、狂犬病ウイルスに対するモノクローナル抗体（ＦＤＩ  Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ−Ｒｅｆ  ８０００９２）の７０分の１希釈液５０μｌを添加した。１時間のインキュベーションおよび数回のリンスの後、マイクロプレートを蛍光顕微鏡下で分析した。ウェルは、特定の蛍光が少なくとも１個の細胞中で観察されると、陽性であるとみなされる。正の対照として、狂犬病ウイルスの不在下で培養したＢＨＫ２１細胞を使用した。Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法に従って試験した培養上清中に含有される狂犬病ウイルスの感染力価を決定し、ｌｏｇ10細胞培養感染量５０％（ＣＣＩＤ５０）単位で表した。観察された培養上清中にて得られた感染力価は約７.０ｌｏｇ10  ＣＣＩＤ５０であった。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ）】
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【図２ｂ）】
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