(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オオムギ品種にプロアントシアニジンフリー遺伝子を導入してなるオオムギの子実を粉砕して、メタノールで抽出して得られた抽出物を酢酸エチル及び水で分離し、その酢酸エチル層から、ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏを移動相としてＨＰＬＣにより、ジヒドロトリシン７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド、ジヒドロトリシン、クリソエリオール７−Ｏ−［α−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→６）−β−Ｄ−グルコピラノシド］、クリソエリオール７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド及びトリシンから選択される少なくとも１種のフラボノイドを分離して採取することを含む、フラボノイド含有組成物の製造方法であって、
プロアントシアニジンフリー遺伝子がａｎｔ１３、ａｎｔ１７又はａｎｔ２２であり、
オオムギ品種が、１０ｍｇ／ｋｇ以上のトリシン含有率を有するオオムギである、上記方法。
【請求項２】
オオムギ品種が、１５ｍｇ／ｋｇ以上のトリシン含有率を有するオオムギである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
オオムギ品種が、ニシノホシ又はその後代の品種である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
式Ｉで示されるジヒドロトリシン７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド：
【化１】
0005850420.tif 000006
（式中、Ｒ１はＯ−β−Ｄ−グルコピラノシドである）。
【請求項５】
式Ｉで示されるジヒドロトリシン７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド：
【化２】
0005850420.tif 000007
（式中、Ｒ１はＯ−β−Ｄ−グルコピラノシドである）
及びトリシンを含有する組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラボノイド含有組成物、フラボノイドを蓄積させる方法及びフラボノイド含有組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フラボノイドは、多くの植物に含まれる淡黄色〜無色の成分の総称で、ポリフェノールの一種である。その生理活性として、抗酸化作用、抗変異原性、抗ガン性、血圧上昇抑制作用、抗菌・抗ウィルス作用、抗う歯作用、抗アレルギー作用等の様々な生理活性が報告されている。
【０００３】
フラボノイドの一種であるトリシンは、抗ガン性（非特許文献１〜３）、抗酸化作用（非特許文献４〜５）、抗ヒスタミン作用（非特許文献６）及び抗ウィルス作用（非特許文献７）を有する化合物として注目されている。
【０００４】
トリシン等のフラボノイドは、化学合成により製造されることもあるが、近年では、ササ及びタケの葉よりトリシンを製造する方法が開発され（特許文献１〜２）、トリシンを含むクマザサエキスが販売されている。
【０００５】
一方、そのような様々な生理活性を有するフラボノイドを含有する食品・食材は、近年の健康ブームを背景に注目されており、フラボノイドを高濃度で含む食品・食材が産業界より求められている。フラボノイドを含む食材のうちオオムギでは、プロアントシアニジンフリー遺伝子ａｎｔ１７及びａｎｔ２２を導入した品種・系統において、フラボノイドの一種であるホモエリオジクチオール及びクリソエリオールが蓄積されることが報告されている（非特許文献８）。しかし、トリシンがオオムギに蓄積されたとの報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−２６５２４７号公報
【特許文献２】特開２００６−２６５２４８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Chang, C.L. et al., Calamus quiquesetinervius. Phytochemistry. (2010) 71, 271-279
【非特許文献２】Hudson, E.A. et al., Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. (2000) 9, 1163-1170
【非特許文献３】Kwon, Y.S. et al., Sorghum bicolor. Arch. Pharm. Res. (2003) 26, 535-539
【非特許文献４】Cai, H. et al., Br. J. Cancer (2004) 91, 1364-1371
【非特許文献５】Oyama, T. et al., Cancer Prev. Res. (2009) 12, 1031-1038.
【非特許文献６】Kuwabara, H. et al., J. Nat. Prod. (2003) 66, 1273-1275
【非特許文献７】Sakai, A. et al., Antivir. Chem. Chemoth. (2008) 19, 125-132
【非特許文献８】Jende-Strid, B., Hereditas (1993) 119, 187-204
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、トリシン等のフラボノイドを高濃度で含む組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、オオムギを用いて、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、プロアントシアニジンフリー遺伝子ａｎｔ１３、ａｎｔ１７及びａｎｔ２２を導入したオオムギ品種において、トリシンを含む特定のフラボノイドが蓄積されることを見い出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
即ち、本発明は、以下の発明を包含する。
［１］オオムギ品種にプロアントシアニジンフリー遺伝子を導入してなるオオムギの子実又は茎葉を抽出もしくは粉砕して得られ、又は得られた抽出物もしくは粉砕物をさらに処理して得られ、かつ、ジヒドロトリシン７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド、ジヒドロトリシン、クリソエリオール７−Ｏ−［α−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→６）−β−Ｄ−グルコピラノシド］、クリソエリオール７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド及びトリシンから選択される少なくとも１種のフラボノイドを含有する組成物。
［２］プロアントシアニジンフリー遺伝子がａｎｔ１３、ａｎｔ１７又はａｎｔ２２である、［１］に記載の組成物。
［３］オオムギ品種が、１０ｍｇ／ｋｇ以上のトリシン含有率を有するオオムギである、［１］又は［２］に記載の組成物。
［４］オオムギ品種が、ニシノホシ又はその後代の品種である、［１］〜［３］のいずれかに記載の組成物。
［５］飲食品用である、［１］〜［４］のいずれかに記載の組成物。
［６］［５］に記載の組成物を用いた飲食品。
［７］オオムギ品種にプロアントシアニジンフリー遺伝子を導入することにより、ジヒドロトリシン７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド、ジヒドロトリシン、クリソエリオール７−Ｏ−［α−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→６）−β−Ｄ−グルコピラノシド］、クリソエリオール７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド及びトリシンから選択される少なくとも１種のフラボノイドを蓄積させる方法。
［８］プロアントシアニジンフリー遺伝子がａｎｔ１３、ａｎｔ１７又はａｎｔ２２である、［７］に記載の方法。
［９］オオムギ品種が、１０ｍｇ／ｋｇ以上のトリシン含有率を有するオオムギである、［７］又は［８］に記載の方法。
［１０］オオムギ品種が、ニシノホシ又はその後代の品種である、［７］〜［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］オオムギ品種にプロアントシアニジンフリー遺伝子を導入してなるオオムギから、ジヒドロトリシン７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド、ジヒドロトリシン、クリソエリオール７−Ｏ−［α−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→６）−β−Ｄ−グルコピラノシド］、クリソエリオール７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド及びトリシンから選択される少なくとも１種のフラボノイドを採取することを含む、フラボノイド含有組成物の製造方法。
［１２］プロアントシアニジンフリー遺伝子がａｎｔ１３、ａｎｔ１７又はａｎｔ２２である、［１１］に記載の方法。
［１３］オオムギ品種が、１０ｍｇ／ｋｇ以上のトリシン含有率を有するオオムギである、［１１］又は［１２］に記載の方法。
［１４］オオムギ品種が、ニシノホシ又はその後代の品種である、［１１］〜［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］式Ｉで示されるジヒドロトリシン７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド：
【化１】
0005850420.tif 000002
（式中、Ｒ１はＯ−β−Ｄ−グルコピラノシドである）。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、従来のオオムギ品種では得られない量の特定のフラボノイドが蓄積されているオオムギが得られ、そのオオムギから採取される特定のフラボノイドを含有する組成物の製造方法、及びそれらのフラボノイドを含有する組成物が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において、「オオムギ品種」としては、特に限定されないが、好ましくは日本のオオムギ品種である。「日本のオオムギ品種」とは、日本国で育種され普及するオオムギの品種を意味する。日本のオオムギ品種の種類としては、六条オオムギ品種、裸麦品種、二条オオムギ品種が挙げられる。
【００１３】
六条オオムギ品種としては、例えば、カシマムギ、ミノリムギ、マサカドムギ、はるしらね又はその後代の品種が挙げられる。
【００１４】
裸麦品種としては、例えば、イチバンボシ、マンネンボシ、トヨノカゼ、ダイシモチ、ユメサキボシ、キラリモチ、ビューファイバー又はその後代の品種が挙げられる。
【００１５】
二条オオムギ品種としては、例えば、アサカゴールド、さきたま二条、ニシノゴールド、ミカモゴールデン、あまぎ二条、スカイゴールデン、ニシノチカラ、ミサトゴールデン、おうみゆたか、タカホゴールデン、ニシノホシ、ミハルゴールド、きぬか二条、ダイセンゴールド、ニューゴールデン、みょうぎ二条、きぬゆたか、とね二条、はるな二条、なす二条、ほうしゅん、白妙二条、とちのいぶき又はその後代の品種が挙げられる。
【００１６】
ニシノホシは、多収で病害抵抗性をもつ、西海皮３８号（のちのニシノチカ）と、精麦品質が優れる栃系１４５とを人工交配し、派生系統育種法により育種した二条オオムギ品種である。ニシノホシの種子は、福岡、佐賀、長崎、大分等の奨励品種採用県から入手することができる。
【００１７】
本発明において、「プロアントシアニジンフリー遺伝子」とは、プロアントシアニジン合成を抑制する突然変異遺伝子を意味し、例えば、ａｎｔ１３、１７、１８、２１、２２、２５〜３０である。
【００１８】
本発明において、「遺伝子を導入」とは、公知の交配・交雑技術等により対象遺伝子をオオムギ品種に導入することを意味する。交配・交雑技術としては、特に限定されないが、例えば、系統育種法、集団育種法、もどし交配育種法が挙げられる。
【００１９】
本発明において、「子実」とは、胚と胚乳及び種皮からなる種子を意味する。
本発明において、「茎葉」とは、植物の地上部にある茎及び葉の任意の部分を意味する。
【００２０】
本発明において、「抽出」とは、化学的分離操作法の一つで、液体又は固体の原料を溶剤と接触させ、原料中に含まれている溶剤に可溶な成分を、溶剤に不溶又は難溶性の成分から選択的に分離する操作を意味する。本発明における抽出操作は、上記一般的な抽出操作に含まれ、原料が植物の固体であり、溶剤として脂溶性溶媒を用いるものである。
【００２１】
本発明において、「粉砕」とは、一般に、固形物を砕くことを意味し、特に限定されないが、例えば、磨り潰すことや、対象物の原形を留めつつ、亀裂等により組織を破壊すること等が挙げられる。粉砕は、乳鉢、包丁、カッターナイフ、ハサミ等を用いて手作業で行ってもよいが、大量の植物体を短時間で処理しようとする場合には装置を使用する。そのような装置としては、例えば、ミル、ハンマー式粉砕機、ミキサー、ブレンダーが挙げられ、また野菜用の細断機を用いてもよい。
【００２２】
本発明では、上記の抽出や粉砕により得られた抽出物や粉砕物を、必要に応じてさらに、圧搾、濃縮、固液分離、加熱滅菌、ろ過滅菌等の公知の技術を単独又は２つ以上組み合わせて処理することもできる。
【００２３】
本発明において、圧搾とは、植物体に物理的な圧力をかけて液を搾り出し、成分を搾汁に移行させる方法である。圧力は一方向のみにかけてもよいし、二以上の方向からかけてもよく、せん断力を伴わせることもできる。圧搾の操作は市販の圧搾機を用いれば容易であるが、手搾り、足踏み搾り等の機械を用いない方法で行ってもよい。このとき、植物体に水や湯を加えて圧搾してもよい。
【００２４】
濃縮とは、他の成分を減少させることなく水分量、溶媒量を減らす操作であり、例えば、減圧濃縮、加熱濃縮、ろ過膜を用いた濃縮が挙げられる。
【００２５】
固液分離とは、溶媒及びそこに溶解している成分と、不溶性の固形分を分離する方法であり、分離方法としては、例えば、フィルターろ過、圧搾ろ過、遠心分離、デカンテーション等のあらゆる方法を使用できる。清澄な植物抽出液を得る場合には、珪藻土等のろ過助剤を使用したフィルターろ過を行うことが好ましい。
【００２６】
加熱滅菌とは、熱を加えて殺菌することであり、その温度範囲は、滅菌が十分に行われ、かつ、有効成分が分解しない範囲で行う。
【００２７】
ろ過滅菌とは、微生物が通過できないサイズの膜を、加圧又は減圧して通過させることで除菌する操作である。膜の孔径は、処理方法に応じて適宜設定する。
【００２８】
本発明において、「フラボノイド」とは、２個のベンゼン環が３個の炭素原子を介してつながれるフェニルクロマン骨格(Ｃ６−Ｃ３−Ｃ６)を基本構造に有する芳香族化合物群の総称である。フラボノイドとしては、特に限定されないが、例えば、フラボノール、フラボン、イソフラボン、フラバノン、フラバノノール、フラバン−３，４−ジオール、フラバン−３−オール（フラバノール）、アントシアニジン、オーロン、カルコン、ジヒドロカルコンが挙げられる。これらの基本骨格に加え、異なる位置で水酸化、縮合、プレニル化されている多様な構造が存在する。また、そのような基本骨格を有する化合物に糖が結合した配糖体が存在する。本発明では、ジヒドロトリシン７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド、ジヒドロトリシン、クリソエリオール７−Ｏ−［α−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→６）−β−Ｄ−グルコピラノシド］、クリソエリオール７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド及びトリシンが好ましい。
【００２９】
本発明において、「飲食品」とは、一般に、飲料品又は食料品を意味し、特に限定されないが、例えば、飯類（例えば、おにぎり、弁当のご飯）、菓子類（例えば、アイス、ポテトチップス及び他のスナック類）、ベーカリー類（例えば、パン、パイ、ケーキ、クッキー、ビスケット、クラッカー）、麺類（例えば、うどん、そば、ラーメン）、冷凍・冷蔵流通の加工食品、離乳食、ベビーフード、ペットフード、動物用飼料、飲料（例えば、果汁飲料、清涼飲料、アルコール飲料、茶、スポーツ飲料）、薬用酒等の醗酵食品、みりん、食酢、醤油、味噌、スポーツ食品、健康食品、機能性食品、栄養補助食品（丸剤、錠剤、ゼリー剤又はカプセル剤等の形態を有するサプリメント、グラノーラ様シリアル、グラノーラ様スネークバー、シリアルバー）が挙げられる。飯類、スナック菓子類、ベーカリー類、麺類及び栄養補助食品は、本発明の対象として好ましい食品の例である。
【００３０】
本発明の好ましい実施形態として、日本のオオムギ品種、特にニシノホシに、ａｎｔ１３、ａｎｔ１７又はａｎｔ２２遺伝子を導入したオオムギ品種が挙げられる。
【００３１】
本発明の好ましい他の実施形態では、オオムギ品種が、トリシンを１０ｍｇ／ｋｇ以上、好ましくは１５ｍｇ／ｋｇ以上、特に２０ｍｇ／ｋｇ以上含有する。
【００３２】
以下、実施例をあげて本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００３３】
［実施例１］ａｎｔ１３、ａｎｔ１７又はａｎｔ２２遺伝子を導入した日本のオオムギ品種（特にニシノホシ）の育種方法
プロアントシアニジンフリー遺伝子のａｎｔ１３、ａｎｔ１７又はａｎｔ２２遺伝子を有する大麦品種・系統を１回親とし、日本のオオムギ品種（特にニシノホシ）を反復親として交配し、その雑種第２世代（Ｆ２）の種子を採種する。このＦ２個体種子について塩酸バニリン法等でプロアントシアニジンの有無を判定し、プロアントシアニジンフリー個体を選抜する。さらに、プロアントシアニジンフリー個体に日本のオオムギ品種（特にニシノホシ）を複数回連続戻し交雑を行い育成することによって、ａｎｔ１３、ａｎｔ１７又はａｎｔ２２遺伝子を導入した日本のオオムギ品種を得た。
【００３４】
［実施例２］フラボノイドの抽出及び単離
実施例１から得られた、ａｎｔ１７を導入したニシノホシの子実（５００ｇ）を粉砕して、メタノール（５Ｌ）で６日間抽出した。その抽出物（２５ｇ）を酢酸エチル及び水で２層分離した。その酢酸エチル層（２５ｇ）を、Ｃ１８ＨＰＬＣ［TSKgel ODS-80Ts、Tosoh Co.Ltd.、４．６×２５０ｍｍ；溶出液：ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（１３：７）；流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ；ＵＶ検出：２９０ｎｍ及び３５０ｎｍ］により分離したところ、７種のフラボノイド、（２ＲＳ）−ジヒドロトリシン７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（１）（３．２ｍｇ、収率：０．０００６％、ｔＲ：４．５分）、（２ＲＳ）−ジヒドロトリシン（２）（７．３ｍｇ、収率：０．００１５％、ｔＲ：７．５分）、（２ＲＳ）−ホモエリオジクチオール（３）（２．０ｍｇ、収率：０．０００４％、ｔＲ：８．１分）、クリソエリオール７−Ｏ−［α−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→６）−β−Ｄ−グルコピラノシド］（４）（４．７ｍｇ、収率：０．０００９％、ｔＲ：４．８分）、クリソエリオール７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（５）（６．６ｍｇ、収率：０．００１３％、ｔＲ：５．３分）、トリシン（６）（５．２ｍｇ、収率：０．００１０％、ｔＲ：１２．５分）及びクリソエリオール（７）（３．２ｍｇ、収率：０．０００６％、ｔＲ：１２．８分）が得られた。これらのフラボノイドの構造は、ＨＲＥＳＩＭＳ、ＮＭＲ及びＣＤスペクトルを用いて決定した。各フラボノイドの構造式を以下に示す。
【００３５】
【化２】
0005850420.tif 000003
【００３６】
そのうち、（２ＲＳ）−ジヒドロトリシン７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（１）の物理化学的性質は以下の通りである。また、この化合物のＮＭＲスペクトルを表１に示す。
【００３７】
（１）外観
無色個体
（２）ＵＶ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ
２７８ｎｍ（ε＝５１０００）
（３）ＨＲＥＳＩＭＳ ｍ／ｚ
５１７．１２９７［(M+Na)+; calcd for C23H26O12Na, 517.1316］。
【００３８】
【表１】
0005850420.tif 000004
【００３９】
［実施例３］フラボノイドの定量
ａｎｔ１３、ａｎｔ１７又はａｎｔ２２を導入したニシノホシ（ニシノホシを遺伝的背景とする、プロアントシアニジンフリー遺伝子ａｎｔ１３、ａｎｔ１７又はａｎｔ２２の準同質遺伝子系統で、それぞれ、ｉｓｏ ａｎｔ１３、ｉｓｏ ａｎｔ１７又はｉｓｏ ａｎｔ２２と表記する）、ニシノホシ、あまぎ二条及びHarringtonの子実（３ｇ）を粉砕して、メタノール（３０ｍＬ）で１日間抽出した。その抽出物をＣ１８ＨＰＬＣ［TSKgel ODS-80Ts、Tosoh Co.Ltd.、４．６×２５０ｍｍ；溶出液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１：３）；流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ；ＵＶ検出：２９０ｎｍ（フラボノイド１）、３５０ｎｍ（フラボノイド４、５）］に供し、（２ＲＳ）−ジヒドロトリシン７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（１）（ｔＲ：８．４分）、クリソエリオール７−Ｏ−［α−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→６）−β−Ｄ−グルコピラノシド］（４）（ｔＲ：７．７分）及びクリソエリオール７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（５）（ｔＲ：９．６分）の含有率（収穫後のオオムギの子実において乾物１ｋｇ当たりに含まれるフラボノイド含有量（ｍｇ））を決定する。また、その抽出物をＣ１８ＨＰＬＣ［TSKgel ODS-80Ts、Tosoh Co.Ltd.、４．６×２５０ｍｍ；溶出液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（１５：４：３１）；流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ；ＵＶ検出：２９０ｎｍ（フラボノイド２、３）、３５０ｎｍ（フラボノイド６、７）］に供し、（２ＲＳ）−ジヒドロトリシン（ｔＲ：１８．５分）（２）、（２ＲＳ）−ホモエリオジクチオール（３）（ｔＲ：２１．０分）、トリシン（６）（ｔＲ：２２．３分）及びクリソエリオール（７）（ｔＲ：２３．５分）の含有率を決定した。各品種について、各フラボノイドの含有率を表２に示す。
【００４０】
【表２】
0005850420.tif 000005
【００４１】
７種のフラボノイドのうち、ジヒドロトリシン７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（１）はこれまでに報告のない新規化合物である。また、ジヒドロトリシン（２）及びクリソエリオール７−Ｏ−［α−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→６）−β−Ｄ−グルコピラノシド］（４）は、オオムギの成分としてこれまでに報告されていない。さらに、クリソエリオール７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（５）及びトリシン（６）は、オオムギの成分としての報告はあるが、プロアントシアニジンフリー遺伝子ａｎｔ１３、ａｎｔ１７又はａｎｔ２２を導入することにより子実に大量に蓄積することは、今回初めて明らかになった。
【００４２】
トリシン（６）は、ニシノホシ、あまぎ二条及びHarringtonに元々含まれているが、表２より、その含有率が２倍以上に増加していることがわかる。さらに、トリシン以外の表中のフラボノイドは、ニシノホシ、あまぎ二条及びHarringtonに元々含まれていないところ、プロアントシアニジンフリー遺伝子を導入することにより、それらの含有率が増加することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明は、農業や食品等の分野で利用される。