(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
入院患者、６０歳超の患者及び喘息又はＣＯＰＤを患っている患者からなる群から選択される患者の確定的なインフルエンザ様疾患（ＩＬＩ）の間又は後に発症する下気道疾患治療に使用するためのインターフェロン−β（ＩＦＮ−β）を含む医薬組成物であって、治療が前記医薬組成物の下気道へのエアロゾル送達によるものであり、ＩＬＩは、（ａ）３７．８℃超の発熱と、頭痛、咳、咽頭痛及び筋肉痛から選択される２つの症状、並びに（ｂ）確認されたインフルエンザとして定義され、確定的なＩＬＩは、少なくとも２４時間症状が現れている疾患であり、下気道疾患はインフルエンザによりもたらされ、ＩＦＮ−βはＩＬＩ症状が現れてから少なくとも４８時間後にエアロゾルにより下気道に送達される、医薬組成物。
【請求項２】
（ａ）ヒトＩＦＮ−β１ａ（配列番号２）又は（ｂ）ヒトＩＦＮ−β１ｂ（配列番号４）の配列を含む、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
ノイラミニダーゼ阻害剤と組み合わされる、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ノイラミニダーゼ阻害剤が局所的に活性である、請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】
ノイラミニダーゼ阻害剤がザナミビルである、請求項３又は４記載の医薬組成物。
【請求項６】
（ｉ）インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）と、（ｉｉ）吸入ノイラミニダーゼ阻害剤を、同時に、別々に又は逐次的に下気道にエアロゾル投与するために含む、入院患者、６０歳超の患者及び喘息又はＣＯＰＤを患っている患者からなる群から選択される患者の確定的なインフルエンザ様疾患（ＩＬＩ）の間又は後に発症する下気道疾患の治療に使用するための医薬組成物であって、ＩＬＩは、（ａ）３７．８℃超の発熱と、頭痛、咳、咽頭痛及び筋肉痛から選択される２つの症状、並びに（ｂ）確認されたインフルエンザとして定義され、確定的なＩＬＩは、少なくとも２４時間症状が現れている疾患を意味し、下気道疾患はインフルエンザによりもたらされ、ＩＦＮ−βはＩＬＩ症状が現れてから少なくとも４８時間後にエアロゾルにより下気道に送達される、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、確定的な（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ）インフルエンザ様疾患（ＩＬＩ）の間又は後に発症（ｄｅｖｅｌｏｐ）する下気道疾患を有する個体の治療に関する。確定的なインフルエンザ様疾患とは、例えば、個体又は介護者に、少なくとも２４時間、とりわけ少なくとも４８時間、症状が現れている疾患を意味する。より詳細には、本発明は、インターフェロンβ（ＩＦＮ−β）、又はＩＦＮ−βの発現を増加させる薬剤の下気道へのエアロゾル（ａｅｒｏｓｏｌ）送達による、ＩＬＩの間又は後に発症する下気道疾患を有する個体、特に入院患者の治療に関する。インフルエンザ様疾患は、以下の症状の２つ：頭痛、咳、咽頭痛及び筋肉痛、並びに／又は確認されたインフルエンザにより特徴づけられる病気である。より詳細には、ＩＬＩは、３７．８℃超の発熱と以下の症状の２つ：（頭痛、咳、咽頭痛及び筋肉痛）、並びに／又は確認されたインフルエンザ感染として定義されてよい。
【背景技術】
【０００２】
季節性インフルエンザは、特に冬の間に一般的な感染症である。毎年、インフルエンザ株（Ａ型又はＢ型）が流行し、これは、一次医療での臨床的な相談、入院治療のエピソード（主に、高齢者及び幼児であるが、時に中年成人）及び死（主に高齢者）を引き起こす。インフルエンザウイルス感染の直接的な影響又は可能性のある合併症（最も一般的には細菌二次感染）に起因して、一次医療及び病院での治療が必要とされ得る。ＩＬＩについての一次医療での相談の増加、及び冬季の病床の圧迫は、既知のコミュニティインフルエンザ活動の時期と多くの場合関連する。
【０００３】
近年広まっているインフルエンザウイルスのサブタイプ及び株と著しく異なる新型インフルエンザウイルスサブタイプが出現した場合に、汎発性インフルエンザが起こり、これは、
・ヒトに感染でき；
・ヒトからヒトへと効率的に広まり；
・感染者の大部分において有意な臨床的疾患をもたらし得る。
【０００４】
当該ウイルスはヒトにおいて新規であるため、集団の大部分は、ほとんど或いは全く免疫を有さず、感染しやすい人の巨大プールを生じさせ；従って、病気は、広範囲且つ急速に広がる。
【０００５】
インターフェロンは、インフルエンザ治療において、予防的に、又は初期段階の治療介入のいずれかで以前に提案されていたが、その成功は限定されたものであった。
【０００６】
高病原性インフルエンザは、急速且つ高レベルの罹患率をもたらす、Ｈ５Ｎ１などの病原型インフルエンザである。
【０００７】
ＩＬＩとしては、季節性インフルエンザ、汎発性インフルエンザ及び高病原性インフルエンザが挙げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
我々は、現在、ＩＬＩの間又は後に発症する下気道疾患を有する個体、特に入院患者の新規治療方法を発見した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の概要）
従って、本発明は、
（ａ）インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）；
（ｂ）ＩＦＮ−βの発現を増加させる薬剤；又は
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）を発現できるポリヌクレオチド
から選択される、確定的なＩＬＩの間又は後に発症する下気道疾患を有する個体の治療に使用するための薬剤であって、治療が薬剤の下気道へのエアロゾル送達による、薬剤を提供する。
【００１０】
本発明はさらに、確定的なＩＬＩの間又は後に発症する下気道疾患と診断された個体の治療方法であって、個体の下気道に、
（ａ）インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）；
（ｂ）ＩＦＮ−βの発現を増加させる薬剤；
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）を発現できるポリヌクレオチド
からなる群から選択される薬剤をエアロゾル送達することを含む、方法を提供する。
【００１１】
さらに、確定的なＩＬＩの間又は後に発症する下気道疾患の治療のための医薬の製造における、
（ａ）インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）；
（ｂ）ＩＦＮ−βの発現を増加させる薬剤；又は
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）を発現できるポリヌクレオチド
から選択される薬剤の使用であって、治療が薬剤の下気道へのエアロゾル送達による、使用も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１ａ】図１ａは、インフルエンザＡウイルスの感染後９６時間に亘り、感染したヒト肺気管支上皮細胞の割合が増加すること、及び感染４８時間後からのＩＦＮ−βの治療効果を示す（ｎ＝１実験）。
【図１ｂ】図１ｂは、インフルエンザＡウイルスの感染後９６時間に亘り、感染したヒト肺気管支上皮細胞の割合が増加すること、及び感染４８時間後からのＩＦＮ−βの治療効果を示す（オリジナルデータを含む、ｎ＝３実験）。
【図２ａ】図２ａは、インフルエンザＡウイルスをヒト肺気管支上皮細胞に感染させた後９６時間に亘るウイルス排出、及び感染４８時間後からのＩＦＮ−βの治療効果を示す。ウイルス排出は、４８〜９６時間で頭打ちとなる（ｎ＝１実験）。
【図２ｂ】図２ｂは、インフルエンザＡウイルスをヒト肺気管支上皮細胞に感染させた後９６時間に亘るウイルス排出、及び感染４８時間後からのＩＦＮ−βの治療効果を示す。ウイルス排出は、４８〜９６時間で頭打ちとなる（オリジナルデータを含む、ｎ＝３実験）。
【図３】図３は、健常ヒトボランティア又はカニクイザルマカク（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）由来の血液細胞における、ＩＦＮ−β依存性抗ウイルス遺伝子ミクソウイルス耐性タンパク質１（ＭｘＡ）の発現に対するヒトＩＦＮ−βの治療効果を示す（ｎ＝３）。全血をＩＦＮ−β（０〜１０００ＩＵ／ｍＬ）で４時間処理し、ＲＮＡを抽出し、ＭｘＡ遺伝子発現に対する効果を測定した。
【図４】図４は、健常ヒトボランティア又はカニクイザルマカク由来の血液細胞における、ＩＦＮ−β依存性抗ウイルス遺伝子２’−５’オリゴアデニル酸合成酵素（２’−５’ＯＡＳ）の発現に対するヒトＩＦＮ−βの治療効果を示す（ｎ＝３）。全血をＩＦＮ−β（０〜１０００ＩＵ／ｍＬ）で４時間処理し、ＲＮＡを抽出し、２’−５’ＯＡＳ遺伝子発現に対する効果を測定した。
【図５】図５は、季節性インフルエンザに感染させたカニクイザルマカク細胞におけるヒトＩＦＮ−βの保護効果を示す（ｎ＝４）。カニクイザルマカク細胞をＩＦＮ−β（０、１００又は１０００ＩＵ／ｍＬ）で予め処理した後、ＭＯＩ＝０．０１でインフルエンザ株Ａ／ビクトリア／３／７５（Ｈ３Ｎ２）に感染させた。ウイルス感染４８時間後に上清を集め、プラークアッセイによりウイルス排出を測定した。＊はｐ＜０．０５を示す。
【００１３】
（配列表の簡単な説明）
配列番号１は、ヒトＩＦＮ−β１ａのヌクレオチド配列を示す。配列番号２は、ヒトＩＦＮ−βＩａのアミノ酸配列を示す。配列番号３は、ヒトＩＦＮ−β１ｂのヌクレオチド配列を示す。配列番号４は、ヒトＩＦＮ−β１ｂのアミノ酸配列を示す。ＩＦＮ−β１ｂは、残基１７のシステインがセリンで置き換えられている以外は、ヒトＩＦＮ−β１ａと同一である。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
以上に示すとおり、本発明は、ＩＦＮ−βの新規治療的使用に関する。特に、本発明は、例えば、インフルエンザ様疾患の間又は後に発症する下気道疾患を有すると診断された個体の治療、特に入院患者の治療のための、下気道へのエアロゾル送達によるＩＦＮ−βの治療的使用に関する。
【００１５】
上述のとおり、インターフェロンは、ＩＬＩの予防的又は初期段階の治療のために以前に提案されている。従って、インターフェロンは、ＩＬＩの症状が現れる前か、又はこのような症状の最初の発生時のいずれかにおける使用が提案されていた。一般に、これらのインターフェロンは、上気道、例えば咽頭鼻部に投与されている。通常、インターフェロンでの治療の開始は、症状の発現から２４時間以内に始まる。
【００１６】
一方、我々は、ＩＬＩから生じる合併症、特に下気道疾患を有する入院患者が、下気道へのインターフェロンβ薬剤のエアロゾル化送達により治療され得ることを発見した。通常、入院は、症状の最初の発現から４８時間後に起こる。
【００１７】
（ＩＦＮ−βの定義）
本明細書で使用されるＩＦＮ−βという用語は、天然のＩＦＮ−βの生物学的活性を保持し、肺、とりわけ気管支及び／又は肺胞上皮に存在するＩＦＮ−βの活性を好ましくは保持する、ＩＦＮ−βの任意の形態又は類似体を意味することが理解されるだろう。ＩＦＮ−βは、ヒトＩＦＮ−β１ａ（配列番号２）又はヒトＩＦＮ−β１ｂ（配列番号４）の配列と同一であってよく、又は含んでもよい。ＩＦＮ−βはまた、配列番号２又は４のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する変異ポリペプチドも意味する。或いは、ＩＦＮ−βは化学的に修飾されてよい。ＩＦＮ−βの変異体は、天然に生じる変異体、例えば、ヒト以外の種で発現される変異体であってよい。また、ＩＦＮ−βの変異体は、配列番号２又は４と異なる配列を含むが、必ずしも天然に生じるものではない。配列番号２又は４のアミノ酸配列の全長にわたって、変異体は、アミノ酸同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）に基づいて、当該配列と少なくとも８０％相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）であることが好ましいだろう。より好ましくは、ポリペプチドは、全配列にわたって、アミノ酸同一性に基づき、配列番号２又は４のアミノ酸配列と少なくとも８５％又は９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９７％、又は９９％相同である。４０以上、例えば、６０、８０、１００、１２０、１４０又は１６０以上の連続アミノ酸のストレッチにわたって、少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％又は９５％のアミノ酸同一性が存在し得る（「高い相同性（ｈａｒｄ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」）。相同性は、当分野で公知の任意の方法を用いて測定できる。例えば、ＵＷＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅは、例えばそのデフォルト設定で使用される、相同性を計算するために使用され得るＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２，ｐ３８７−３９５）。ＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴアルゴリズムは相同性を計算するために、又は配列を並べるために用いることができる（等価残基又は対応する配列を同定するなど（通常、それらのデフォルト設定による））（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ３６：２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆら（１９９０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−１０に記載される）。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｈｎ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）より公的に利用することが可能である。このアルゴリズムはまず、クエリー配列中の長さＷの短いワード（データベース配列中の同じ長さのワードと整列させた場合に、ポジティブな値を示す閾値のスコアＴと一致するか又は満たす）を同定することによってハイスコアの配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔとは近接するワードスコア閾値をいう（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記）。これら最初の近接するワードヒットが検索を開始するためのシードとして機能し、それらを含むＨＳＰを見つける。累積的アライメントスコアが増加し得る限り、ワードヒットを各配列に沿って両方向に伸ばす。累積的アライメントスコアがその得られた最大値から、量Ｘだけ少ない；１つ又は複数のネガティブスコア残基のアライメントの集積により、累積的スコアが０又はそれ以下になる；或いはいずれかの配列の末端に達する、以上の場合に各方向へのワードヒットの伸長を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータであるＷ、Ｔ及びＸは、感度及びアライメントの速さを決定する。ＢＬＡＳＴプログラムはデフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９を参照のこと）アライメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、並びに両鎖の比較を用いる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性を統計学的に分析する；Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７などを参照のこと。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって与えられる類似性の１つの尺度は最小の総確率（Ｐ（Ｎ））であり、２つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列間の一致がたまたま生じる確率の指標を与える。例えば、第１の配列と第２の配列の比較における最小の総確率が、約１未満、好ましくは約０．１未満、さらに好ましくは約０．０１未満、そして最も好ましくは約０．００１未満の場合、配列は別の配列と類似とみなされる。アミノ酸置換は配列番号１又は２のアミノ酸配列に、例えば、１、２、３、４又は５から１０、２０又は３０の置換が生じ得る。保存的置換が例えば表１に示すように生じ得る。第２カラムの同じブロックと、好ましくは第３カラム中の同じ列のアミノ酸が相互に置換され得る：表１−保存的アミノ酸置換  非芳香族：非極性ＧＡＰＩＬＶ；極性−非荷電ＣＳＴＭＮＱ；極性−荷電ＤＥＨＫＲ  芳香族：ＨＦＷＹ
【００１８】
【表１】
0005926200.tif 000002
【００１９】
配列番号１又は２のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸残基を、選択的に又は付加的に削除することができる。１、２、３、４又は５から１０、２０又は３０個の残基又はそれ以上を削除することが可能である。またＩＦＮ−βは上記配列の断片を含む。このような断片はＩＦＮ−β活性を保持する。断片は少なくとも１２０又は１４０アミノ酸からの長さであり得る。このような断片を、以下に詳細に示すようなキメラ薬剤を作製するために用いることができる。ＩＦＮ−βは配列番号２又は４の断片又は一部分を含むキメラタンパク質を含む。１以上のアミノ酸を上記ポリペプチドに選択的に又は追加的に付加することができる。配列番号２若しくは４のアミノ酸配列又はそのポリペプチド変異体若しくは断片のＮ末端又はＣ末端に、伸長を生じ得る。この伸長は極めて短く、例えば１〜１０個のアミノ酸長であり得る。或いは、もっと長い伸長であり得る。担体タンパク質を上記のアミノ酸配列に融合することができる。従って、上記ポリペプチドの１つを組み込んだ融合タンパク質を、本発明に用いることができる。さらに、ＩＦＮ−βは化学的に改変されている配列番号２若しくは４又はその変異体を含む。多数の側鎖の改変は、当分野で公知であり、上記で考察したタンパク質又はペプチドの側鎖に生じ得る。このような改変としては、グリコシル化、リン酸化、アルデヒドとの反応に続くＮａＢＨ４を用いた還元による還元的アルキル化を用いたアミノ酸の改変、メチルアセトイミデート（ｍｅｔｈｙｌａｃｅｔｉｍｉｄａｔｅ）によるアミジン化（ａｍｉｄｉｎａｔｉｏｎ）又は無水酢酸によるアシル化などが挙げられる。この改変は好ましくはグリコシル化である。ＩＦＮ−βを合成的に、又は当分野で公知の方法を用いた組換え方法によって作製することができる。タンパク質及びポリペプチドのアミノ酸配列を改変して、非天然のアミノ酸を含むか、又は化合物の安定性を高めることができる。タンパク質又はペプチドを合成方法によって作製した場合、作製の間にこのようなアミノ酸を導入することができる。またタンパク質又はペプチドを、合成的に又は組換え的に作製した後に改変することができる。また、ＩＦＮ−βをＤ−アミノ酸を用いて作製することができる。このような場合、アミノ酸をＣからＮ向きの逆配列に結合する。これは、このようなタンパク質又はペプチドを作製するための、当分野において慣用的な方法である。ＩＦＮ−βを、組換え発現ベクターから、ｉｎ  ｓｉｔｕにおけるポリペプチドの発現によって細胞内で作製することができる。発現ベクターは、任意選択で、ポリペプチドの発現を制御するための誘導性プロモーターを保有してよい。ＩＦＮ−β又はその類似体を、組換え発現後の任意のタンパク質液体クロマトグラフィー系による精製の後に、大量に作製することができる。好ましいタンパク質液体クロマトグラフィー系としては、ＦＰＬＣ、ＡＫＴＡ系、Ｂｉｏ−Ｃａｄ系、Ｂｉｏ−ＲａｄＢｉｏＬｏｇｉｃ系及びＧｉｌｓｏｎ  ＨＰＬＣ系が挙げられる。ＩＦＮ−β又はその類似体の市販される形態を本発明に用いることができる。例としては、Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標）及びＡｖｏｎｅｘ（登録商標）が挙げられる。
【００２０】
（ＩＦＮ−βの発現を増加させる薬剤）
本発明はまた、肺、又は好ましくは気管支及び／若しくは肺胞の上皮におけるＩＦＮ−βの内因性の発現を増加させる薬剤を用いることを含むことができる。この薬剤は、ＩＦＮ−β遺伝子のプロモーター配列又は他の調節配列に直接的に作用することができる。このような薬剤は、ＩＦＮ−βプロモーターの構成的なサイレンシングを減少させるように作用し得る。或いは、この薬剤は細胞を刺激し、細胞表面の受容体における作用によって、内因性ＩＦＮ−βを産生させることができる。本発明に関して、目的のＩＦＮ−βの内因性の発現を増加させる薬剤としては、ポリ（イノシン酸）−ポリ（シチジル酸）（ポリ（ＩＣ））、ＡＮＡ７７３、ペリンドプリル、ＢＬ−２０８０３、チロロン、ＡＢＭＰ、ＤＲＢ、アタブリン、１０−カルボキシ−９アクリドン、ＣＰ−２８８８８、ブロピリミン及びイミキモドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
本発明はまた、ＩＦＮ−βを発現できるか、又は肺気道におけるＩＦＮ−βの内因性の発現を増加させる薬剤を発現できるポリヌクレオチドを使用することを含み得る。このようなポリヌクレオチドは、好ましくは、ＩＦＮ−β、又は気管支及び／若しくは肺胞の上皮におけるＩＦＮ−βを誘導する薬剤を直接的に発現できるベクターの形態であり得る。このようにして、得られたＩＦＮ−β又は薬剤は治療効果を有し得る（「遺伝子治療」）。ポリヌクレオチドは上記で考察したＩＦＮ−βの任意の形態（その変異体、断片及びキメラタンパク質を含む）をコードし得る。ＩＦＮ−βをコードするポリヌクレオチドは、ヒト配列（配列番号１若しくは３）又は天然の配列変異体（非ヒト種によって発現される変異体など）を含むことができる。さらに、ＩＦＮ−βをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１又は３と異なる配列（これらは必ずしも天然ではない）を含む。配列番号１又は３のアミノ酸配列の全長にわたって、変異体は好ましくはヌクレオチドの同一性に基づいて、当該配列と少なくとも８０％相同である。より好ましくは、ポリヌクレオチドは、全長配列にわたって配列番号１又は３のヌクレオチドに対して、ヌクレオチドの同一性に基づいて少なくとも８５％又は９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９７％又は９９％相同である。４０以上（例えば６０、８０、１００、１２０、１４０又は１６０以上）の連続ヌクレオチドのストレッチにわたって、少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％又は９５％ヌクレオチド同一性を有し得る（「高い相同性」）。相同性を上記で考察したように測定できる。ポリヌクレオチドはＤＮＡ又はＲＮＡを含むことができるが、好ましくはＤＮＡを含む。これらはまた、合成又は改変されたヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであり得る。ポリヌクレオチドに対する多数の異なる型の改変が、当分野にて公知である。これらはメチルホスフェート及びホスホロチオエートのバックボーンを含み、この分子の３’末端及び／又は５’末端におけるアクリジン鎖又はポリリジン鎖の付加を含む。本発明の目的に関して、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドを、当分野で利用可能である任意の方法によって改変し得ることが認識される。ポリヌクレオチド（ＤＮＡポリヌクレオチドなど）を、組換え、合成又は当業者が利用することができる任意の方法によって作製することができる。さらにこれらを標準的な技術によってクローン化できる。一般的に、ポリヌクレオチドは、単離及び／又は精製した形態で得られる。一般的に、ポリヌクレオチドは、組換え方法（例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術など）を用いて作製される。これは、クローンに所望される必要とされる遺伝子領域に対するプライマー対（例えば約１５〜３０ヌクレオチド）を作製すること、そのプライマーを好適な細胞から得られたＤＮＡと接触させること、所望される領域の増幅をなす条件下において、ポリメラーゼ連鎖反応を行うこと、増幅した断片を単離すること（アガロースゲルで反応混合物を精製するなど）、そして増幅したＤＮＡを回収することを含む。プライマーを、好適な制限酵素認識部位を含み、その結果、増幅したＤＮＡが好適なクロ��ニングベクターにクローン化できるように設計し得る。一般的に、本明細書中で述べられる技術は当分野において周知であるが、特にＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９に説明がなされる。本明細書中前述のとおり、好ましくはポリヌクレオチドを発現ベクターに用いる。ここでポリヌクレオチドは、ヒト肺の気道にコード配列の発現を得ることができる制御配列に機能的（ｏｐｅｒａｂｌｙ）に連結されている。本発明に用いるための発現ベクターは、遺伝子治療に従来的に用いられている任意の型のベクターであり得る。ネイキッド（ｎａｋｅｄ）ＤＮＡ又は１以上のカチオン性両親媒性物質（１以上のカチオン性脂質など）との複合体（例えば、ＤＮＡ／リポソームの形態）として投与されるプラスミド発現ベクターであり得る。或いは、ウイルスベクターを用いることができる。ヒト肺の気道に治療用タンパク質を発現するためのベクターがこれまでに報告されている。このような目的のために、例えば、国際公開公報ＷＯ０１／９１８００（Ｉｓｉｓ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）に、ヒトユビキチンＣプロモーター又はその機能的類似体を含む発現ベクターが記載されている。ヒトユビキチンＣプロモーターは、マウスの気道において数週間にわたって高レベルのタンパク質発現を可能とすることが示されており、そのため、種々の呼吸器疾患の気道における遺伝子治療に用いることが好ましいプロモーターであるとして提案されている。気道上皮において導入遺伝子を発現するように用いる発現ベクターの例はまた、Ｃｈｏｗら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９７；９４：１４６９５−１４７００にも記載されている。このような発現ベクターを、気道を介して、例えば鼻腔又は気管に投与することができる。
【００２２】
ＩＦＮ−β、薬剤又はポリヌクレオチドを、気道送達に好適な医薬又は医薬組成物の状態で投与でき、これらは一般的に医薬上許容される賦形剤をさらに含む。このような「賦形剤」は一般的に実質的に不活性物質をいい、非毒性であり、且つ組成物の他の成分と有害な様式で相互作用しない。医薬上許容される賦形剤としては、水、食塩水、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、グリセロール及びエタノールなどの液体が挙げられるが、これらに限定されない。医薬上許容される塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などのような鉱酸塩；及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸塩が挙げられ得る。また好ましくは（しかし必要ではないが）、治療剤を含む組成物又は医薬は、特にペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド又は他の薬剤の安定剤として働く医薬上許容される担体を含む。ペプチドの安定剤としても作用する好適な担体の例としては、医薬品グレードのブドウ糖、ショ糖、乳糖、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストランなどが挙げられるが、これらに限定されない。他の好適な担体としては、デンプン、セルロース、リン酸ナトリウム又はリン酸カルシウム、クエン酸、酒石酸、グリシン、高分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。また、電荷脂質及び／又は界面活性剤を用いることも有用であり得る。好適な電荷脂質としては、ホスファチジルコリン（レシチン）などが挙げられるが、これに限定されない。界面活性剤は一般的に、非イオン性、アニオン性、カチオン性又は両性の界面活性剤である。好適な界面活性剤の例としては、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）界面活性剤、及びＴｒｉｔｏｎ（登録商標）界面活性剤（Ｕｎｉｏｎ  Ｃａｒｂｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｎａｐｌａｓｔｉｃｓ，Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ）、ＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤などのポリオキシエチレンソルビタン（Ａｔｌａｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）、Ｂｒｉｊなどのポリオキシエチレンエーテル、ラウリル硫酸及びその塩（ＳＤＳ）などの医薬上許容される脂肪酸エステル、並びに同様の物質などが挙げられる。医薬上許容される賦形剤、担体、安定剤及び他の補助物質の綿密な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）より入手可能である。
【００２３】
ＩＦＮ−βを気道送達するための好適な組成物は、例えば、米国特許第６，０３０，６０９号に記載されるように、凍結乾燥したＩＦＮ−βを、ＩＦＮ−β活性剤の効果を高めるために必要に応じて１種以上の担体、安定剤、界面活性剤又は他の薬剤を添加した医薬上許容されるビヒクル（滅菌蒸留水又は滅菌生理食塩水）に溶解することによって処方することができる。
【００２４】
適切な組成物は、ｐＨ＝５〜８、より好ましくはｐＨ＝５．５〜７．５を有する。好ましくは、組成物は、例えばクエン酸塩バッファーを用いて、緩衝化されている。
【００２５】
米国特許第６，０３０，６０９号に開示される製剤に基づく、レンチュラー（Ｒｅｎｔｓｃｈｌｅｒ）組成物は、ｐＨ＝６．５及び２９０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。好ましくは、組成物は、使い捨てのガラスシリンジ中、滅菌、無色透明、即時使用可能なネブライザー（ｎｅｂｕｌｉｓｅｒ）水溶液として提供される。
【００２６】
活性成分に加えて、組成物は、好ましくは、ｐＨを５と８との間、より好ましくは５．５と７．５との間、特に６．５に維持するためのバッファー系（ｂｕｆｆｅｒｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）を含む。組成物はまた、好ましくは、抗酸化剤、例えばＤＬ−メチオニンを含む。
【００２７】
好ましい組成物は以下を含む：
【００２８】
【表２】
0005926200.tif 000003
【００２９】
本明細書に記載の治療的に有効な量のＩＦＮ−β、薬剤又はポリヌクレオチドを含む組成物は、下気道又は気道に活性成分微粒子を送達できる吸入装置を用いて、肺気道に都合よく送達され得る。典型的な活性成分粒子は、１〜１０ミクロンの質量中央径を有するだろう。適切な吸入装置としては、乾燥粉末吸入（ＤＰＩ）装置、加圧噴霧式定量吸入器（ｐｒｅｓｓｕｒｉｓｅｄ  ｍｅｔｅｒｅｄ  ｄｏｓｅ  ｉｎｈａｌｅｒｓ（ｐＭＤＩ））及びエアロゾルネブライザーが挙げられる。
【００３０】
典型的には、吸入装置は、マルバーンマスターライザーＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｍａｓｔｅｒｉｚｅｒ  Ｓ）を用いて測定されるように、１〜１０ミクロン、好ましくは３〜８ミクロンの粒径を有し、５ミクロン未満の径を有する質量パーセントが、２５〜８０％、好ましくは３０〜６５％である、エアロゾルを製造する。適切なネブライザーは、フィリップス・レスピロニクス（Ｐｈｉｌｉｐｓ  Ｒｅｓｐｉｒｏｎｉｃｓ）により製造されるＣＥマークのネブライザーであるＩ−ｎｅｂ装置である。
【００３１】
適切な有効量は、適切な臨床試験によって決定でき、例えば、投与されるか又は誘導されるＩＦＮ−βの活性によって変わる。ＩＦＮ−β、薬剤又はポリヌクレオチドを、例えば、マイクログラムの量で投与できる。
【００３２】
これらを治療すべき対象に、投薬形態に適合する方法で、望ましい効果をもたらすのに有効な量で投与する。投与量当たり送達されるべき量は、治療されるべき対象に応じて、０．１μｇ〜５００μｇ、例えば１〜５０μｇであってよい。
【００３３】
治療は、通常、５〜７日間続き、症状が改善しない場合には１４日間継続してよい。治療は、１日おきから１日当たり複数回まで施してよい。好ましくは、治療は１日１回施される。
【００３４】
ＩＦＮ−β、薬剤又はポリヌクレオチドは、そのままで投与してよく、又は別の治療化合物と組み合わせて同時に、逐次的（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ）に若しくは別々に投与してよい。特に、ＩＦＮ−β、薬剤又はポリヌクレオチドは、呼吸器疾患を治療するために用いられる治療化合物、又は抗ウイルス剤と共に個体に投与されてよい。ＩＦＮ−β、薬剤又はポリヌクレオチド及び追加の治療化合物は、同一又は異なる組成物中に処方されてよい。
【００３５】
一実施態様において、ＩＦＮ−β、薬剤又はポリヌクレオチドは、吸入コルチコステロイドと組み合わせて、喘息を有する個体に投与される。
【００３６】
さらなる実施態様において、ＩＦＮ−β、薬剤又はポリヌクレオチドは、吸入ノイラミニダーゼ阻害剤と同時に、逐次的に又は別々に投与されてよい。従って、本発明のさらなる側面において、インフルエンザ様疾患の間又は後に発症する下気道疾患（又は症状）を有すると診断された個体を治療するための製品であって、（ｉ）（ａ）ＩＦＮ−β、（ｂ）ＩＦＮ−βの発現を増加させる薬剤及び（ｃ）（ａ）又は（ｂ）を発現できるポリヌクレオチド、から選択される第１の薬剤、並びに（ｉｉ）吸入ノイラミニダーゼ阻害剤を、同時に、別々に又は逐次的に下気道に投与するために含む、製品が提供される。好ましくは、このような製品は、ＩＦＮ−β及び吸入ノイラミニダーゼ阻害剤、例えばザナミビルの同時、別々の又は逐次的な投与を提供する。例えば、先に定義される第１の薬剤、及び吸入ノイラミニダーゼ阻害剤は、例えば、乾燥粉末吸入器、加圧噴霧式定量吸入器、又はエアロゾルネブライザーを用いて、気道へのエアロゾル送達に適切な単一の医薬組成物の形態で提供されてよい。
【００３７】
或いは、ＩＦＮ−β、薬剤又はポリヌクレオチドは、オセルタミビルなどの経口ノイラミニダーゼ阻害剤と同時に、逐次的に又は別々に投与されてよい。
【００３８】
或いは、ＩＦＮ−β、薬剤又はポリヌクレオチドは、ペラミビルなどの全身投与されるノイラミニダーゼ阻害剤と同時に、逐次的に又は別々に投与されてよい。
【００３９】
さらなる実施態様において、ＩＦＮ−β、薬剤又はポリヌクレオチドは、吸入インフルエンザウイルス結合（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）阻害剤と同時に、逐次的に又は別々に投与されてよい。従って、本発明のさらなる側面において、インフルエンザ様疾患の間又は後に発症する下気道疾患（又は症状）を有すると診断された個体を治療するための製品であって、（ｉ）（ａ）ＩＦＮ−β、（ｂ）ＩＦＮ−βの発現を増加させる薬剤及び（ｃ）（ａ）又は（ｂ）を発現できるポリヌクレオチド、から選択される第１の薬剤、並びに（ｉｉ）吸入インフルエンザウイルス結合阻害剤を、同時に、別々に又は逐次的に下気道に投与するために含む、製品が提供される。好ましくは、このような製品は、ＩＦＮ−β及びインフルエンザウイルス結合阻害剤、例えば、シアリダーゼ融合タンパク質、ＤＡＳ１８１（Ｆｌｕｄａｓｅ（登録商標））などの同時、別々の又は逐次的な投与を提供する。先に定義される第１の薬剤、及び吸入インフルエンザウイルス結合阻害剤は、例えば、気道へのエアロゾル送達に適切な単一の医薬組成物の形態で提供されてよい。
【００４０】
さらなる実施態様において、ＩＦＮ−β、薬剤又はポリヌクレオチドは、抗細菌性抗生物質と同時に、逐次的に又は別々に投与されてよい。好ましくは、抗細菌性抗生物質は、吸入により投与される。
【００４１】
さらなる実施態様において、ＩＦＮ−β、薬剤又はポリヌクレオチドは、抗真菌性抗生物質と同時に、逐次的に又は別々に投与されてよい。好ましくは、抗真菌性抗生物質は、吸入により投与される。
【００４２】
５歳未満の幼児、特に２歳未満の幼児、６５歳以上の成人、妊婦及び併存疾患を有する患者（例えば、慢性肺疾患、神経障害及び神経発達障害、心疾患、血液疾患、内分泌疾患、腎疾患、肝疾患、代謝疾患、疾患又は薬物に起因する悪性及び弱まった免疫系）は、入院をもたらす合併症を引き起こすリスクが最も高く、最も悪い転帰不良を有し、本発明の特に標的となるグループ（ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｒｏｕｐ）である。高齢者、例えば６０歳超の高齢者は、特に標的となるグループであり、喘息及び／又はＣＯＰＤの罹患者も同様である。
【００４３】
リスクのあるさらなるグループは、以前にＩＬＩにさらされたことのない患者である。
【実施例】
【００４４】
（実施例１）
確定的な下気道感染のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおける、インフルエンザＡ感染を抑制する外因性ＩＦＮ−βの能力を以下の実施例で例証する。
【００４５】
（概要）
インフルエンザ様疾患（ＩＬＩ）の間又は後に発症する下気道疾患（又は症状）は、多くの場合、上気道から下気道へのウイルス感染の広がりにより引き起こされる。さらに、症状の持続、及び特に入院患者における入院期間の延長は、下気道における持続的なウイルス排出を伴う。ヒトにおけるインフルエンザ複製の重要部位であるヒト肺気管支上皮細胞を用いて、我々は、確定的な下気道インフルエンザＡ感染のモデルを開発した。このモデルにおいて、ＩＦＮ−βの効果を調べた。
【００４６】
（方法）
細胞培養及び感染プロトコル
グルタマックス（ｇｌｕｔａｍａｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ペニシリン（５０Ｕ／ｍＬ）及びストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む最小必須培地（ＭＥＭ）でヒト肺気管支上皮（ＨＢＥ）細胞を培養した。２４ウェルプレート中、ＨＢＥ細胞を１．５×１０５／ウェルで蒔き、４１〜４９回継代（ｐａｓｓａｇｅ）した。およそ６０〜７０％コンフルエントで、細胞を血清低減培地（グルタマックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び０．７５〜１％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＭＥＭ）で２４時間培養した。活性化インフルエンザ株（インフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）（Ｒｅｔｒｏｓｃｒｅｅｎ））を０．０００１  ＭＯＩ、３７℃で細胞に感染させた。１時間後に、非結合ウイルスを洗浄により除去した。血清低減培地を添加し、細胞をさらに４日間３７℃でインキュベートした。ウイルス感染４８時間後に、１０００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＦＮ−β１ａ（Ｒｅｎｔｓｃｈｌｅｒ）で細胞を処理した。ＩＦＮ−β処理を開始したら、２４時間毎に投与を繰り返した。
【００４７】
インフルエンザ陽性細胞パーセンテージを決定するためのフローサイトメトリー
感染２４時間後、４８時間後、７２時間後及び９６時間後に細胞培地を集め、−８０℃で保存した。感染２４時間後、４８時間後、７２時間後及び９６時間後において、細胞をトリプシン処理し、計測し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。フローサイトメトリーによる分析のために、最大２×１０５細胞を得た。細胞を４００ｇで遠心分離し、上清を捨てた。生／死細胞染色剤（ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ  ｃｅｌｌ  ｓｔａｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（５００μＬ）で再構成し、ＰＢＳで１：１００に希釈した。希釈した生／死細胞染色剤（１００μＬ）を細胞とともに、室温で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、４００ｇで遠心分離し、上清を捨てた。チューブ当たり２５０μＬのＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加し、細胞を４℃で２０分間置いた。５００ｇでの遠心分離により、２ｍＬのＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）溶液で細胞を２回洗浄した。２回目の洗浄後、１００μＬのＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液に細胞を再懸濁し、室温で１５分間置いた。抗インフルエンザＡマトリックスタンパク質抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ）をＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液で２．５μｇ／ｍＬに希釈し、１００μＬを細胞に室温で３０分間添加した。５００ｇでの遠心分離により、２ｍＬのＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液で細胞を２回洗浄した。抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ）を、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液で５μｇ／ｍＬに希釈し、１００μＬを細胞に遮光下、室温で３０分間添加した。５００ｇでの遠心分離により、２ｍＬのＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液で細胞を２回洗浄した。細胞をＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液に再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウェアを用いて、フローサイトメトリーにより分析した。その後、ＷｉｎＭＤＩソフトウェアを用いてデータを分析した。
【００４８】
ウイルス排出を決定するためのプラークアッセイ
グルタマックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）を含むＭＥＭ中でメイディン・ダービー・イヌ腎臓（Ｍａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙ  ｃａｎｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙ：ＭＤＣＫ）細胞を培養した。１２ウェルプレート中、ＭＤＣＫ細胞を１×１０５／ウェルで蒔き、２５〜３０回継代した。１００％コンフルエントに達した時点で、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。感染実験の間に集めた細胞培地を、無血清培地（ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で１：１０〜１：１０６の１０倍希釈の希釈範囲となるように希釈した。希釈した細胞培地（２００μＬ）を２連のウェルに添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートした。ウイルスを吸引し、細胞をＰＢＳで洗浄した。重層培地（１００ｍＬの１０倍濃縮ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２０ｍＬの７．５％重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、１０ｍＬの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（Ｆｌｕｋａ）、２８ｍＬの７．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）フラクションＶ（Ｓｉｇｍａ）、５ｍＬの１％ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｓｉｇｍａ）、２０ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０ｍＬの２００ｍＭグルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５０７ｍＬのｄ．Ｈ２Ｏ）を調製し、Ｌ−（トシルアミド−２−フェニル）エチルクロロメチルケトンで処理した１ｍｇ／ｍＬトリプシン（ＴＲＴＰＣＫ  トリプシン）（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．）１２．５μＬ、及び７．５ｍＬのＡｖｉｃｅｌ懸濁液（１８６ｍＬのｄ．Ｈ２０中、４．８ｇのＡｖｉｃｅｌ（ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ））に１７．５ｍＬを添加した。反転させることにより重層培地を混合し、１ウェル当たり１ｍＬ添加した。移動又は振盪させることなく、プレートを２日間インキュベートした。重層培地を吸引し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。クリスタルバイオレット溶液（０．５ｍＬ）（０．６５ｇのクリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ）、２５ｍＬのホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）、２５ｍＬの１００％エタノール（Ｓｉｇｍａ）、４５０ｍＬの１×ＰＢＳ（５  ＤｕｌＡ  ＰＢＳタブレット（Ｓｉｇｍａ）＋５００ｍＬのｄ．Ｈ２０）を室温で３０分間添加した。クリスタルバイオレットを除去し、プレートを水で洗浄した。プレートを乾燥させ、プラークを計測した。
【００４９】
３つの独立した実験を実施した。最初の実験データ及び要約データを示す。
【００５０】
データ分析
Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてデータを分析した。
【００５１】
（結果）
このモデルにおいて、フローサイトメトリーによる分析により、５〜４０％の細胞が４８〜９６時間の間に感染し（図１ａ及び１ｂを参照されたい）、これは、感染ピーク時に臨床条件で報告された生産的に感染された細胞レベルと同様であることが示唆される（Ｂａｃｃａｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８０：７５９０−７５９９）。それに応じて、この期間はまた、我々のモデルにおいて、最も高いレベルのウイルス排出とも関連する（図２ａ及び２ｂ）。
【００５２】
感染４８時間後にＩＦＮ−βで細胞を処理すると（確定的な感染の治療モデル）、感染細胞の割合及びウイルス排出において大幅な減少がもたらされた（図１ａ、１ｂ、２ａ及び２ｂ）。１０倍超のウイルス負荷の減少は、臨床的に意義があると考えられる（Ｂａｒｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４４：７８−８７）。
【００５３】
（結論）
これらの結果は、ＩＦＮ−β治療が、肺における確定的なインフルエンザ感染の経過を変化させ、それ故、確定的なインフルエンザ様疾患（ＩＬＩ）の間又は後に発症する気道疾患を減少させる可能性があることを示す。高齢患者、並びに喘息及び／又はＣＯＰＤ罹患者は、必要な時にＩＦＮ−βを産生することが困難である可能性が高いので、本明細書に記載の使用及び方法は、このような脆弱なグループに特に適用される。
【００５４】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ研究：
イントロダクション
インフルエンザ様疾患の主要な合併症は、ウイルスが下気道へと広がった後に発症するウイルス性肺炎である。
【００５５】
ヒトＩＦＮ−βは、その生物学的活性において、高度に種特異的である。カニクイマカクザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ  ｍｏｎｋｅｙ）は、ヒトＩＦＮ−βの効果を研究するのに適切な種である。ヒトＩＦＮ−βは、インターフェロン感受性抗ウイルス遺伝子ミクソウイルス耐性タンパク質１（ＭｘＡ）（図３）及び２’−５’オリゴアデニル酸合成酵素（２’−５’ＯＡＳ）（図４）をカニクイザルマカク血液細胞及びヒト血液細胞において同程度に上方制御することが示された。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究において、ヒトＩＦＮ−βは、インフルエンザ感染からカニクイザルマカク細胞を保護する（図５）。
【００５６】
高病原性インフルエンザＡ（Ｈ５Ｎ１）（Ｒｉｍｍｅｌｚｗａａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７５：６６８７−９１）及び汎発性２００９インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）（Ｈｅｒｆｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｖｅｔ．Ｐａｔｈｏｌ．４７：１０４０−７）ウイルスについて、カニクイマカクザルを用いて下気道疾患の前臨床モデルが開発されている。これらのモデルは、感染前に投与された場合の、インフルエンザに対するノイラミニダー阻害剤の臨床的有効性を予測していた。
【００５７】
この研究では、インフルエンザにより誘起される下気道疾患の類似したカニクイマカクザルモデルにおける、肺に送達されるＩＦＮ−βの効果を調べる。チャレンジウイルス株は、Ａ／インドネシア／５／０５（Ｈ５Ｎ１）及びＡ／ネーデルラント／６０２／２００９（汎発性Ｈ１Ｎ１）であり、これらはいずれも、下気道で複製し、顕著な肺の病変（ｌｕｎｇ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）をもたらすことが示されている（Ｈｅｒｆｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｖｅｔ．Ｐａｔｈｏｌ．４７：１０４０−７；Ｒｉｍｍｅｌｚｗａａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７５：６６８７−９１）。
【００５８】
本研究は２つの段階を含む。第一段階では、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）により得られた肺細胞において、ＩＦＮ−β依存性抗ウイルスマーカーの上方制御が示されることにより、吸入ＩＦＮ−βの良好な送達が実証される。臨床研究における類似のデータにより、抗ウイルス療法としての吸入ＩＦＮ−βのさらなる開発が支持される。第二段階では、インフルエンザにより誘起される肺の病変及び肺ウイルス負荷に対する、肺送達ＩＦＮ−βでの予防的及び治療的処置の効果を調べる。
【００５９】
第一段階：ＩＦＮ−βの肺への良好な送達の確認
簡単に述べると、溶液中のＩＦＮ−βを、カニクイマカクザルの肺に２回ネブライザーにより投与する。各投与の前後にＢＡＬを集める。ＢＡＬ細胞中のＩＦＮ−β依存性抗ウイルスマーカー（ＭｘＡ、２’−５’ＯＡＳ、及びインターフェロンガンマ誘導タンパク質１０ｋＤａ（ＩＰ−１０）の遺伝子発現を、定量的ＰＣＲ法を用いて決定する。上方制御レベルを、臨床研究で得られたデータと比較して、次の段階の投与量を選択する。研究スケジュール及びより詳細な方法を以下に記載する。
【００６０】
【表３】
0005926200.tif 000004
【００６１】
吸入ＩＦＮ−βの投与７日前、およそ３歳の５匹のオスカニクイマカクザルを、ケタミン−ドミトール（ｄｏｒｍｉｔｏｒ）で麻酔し、血液及び気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を集め、体重を測定する。ＢＡＬは、１０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水での肺のフラッシング（ｆｌｕｓｈｉｎｇ）を伴い、想定される回収量はおよそ５ｍＬである。ＢＡＬサンプルは、そのたびごとに、上清と細胞フラクションとに分離する。細胞フラクションはＲＬＴバッファー（Ｑｉａｇｅｎ）に溶解し、定量的ＰＣＲ法を用いて、ＩＦＮ−β依存性抗ウイルスバイオマーカーＭｘＡ、２’−５’ＯＡＳ、及びＩＰ−１０について分析する。
【００６２】
０日目において、麻酔下で血液を集め、体重を測定し、３ｍＬの吸入ＩＦＮ−β（Ｒｅｎｔｓｃｈｌｅｒ）を各マカクに送達する。ＩＦＮ−βネブライザー溶液は、小児用フェイスマスク（Ｐｈｉｌｉｐｓ  Ｒｅｓｐｉｒｏｎｉｃｓ、ｐａｒｔ  ｎｕｍｂｅｒ  ＨＳ８１１１０ＥＵ−００１）を付けたＩ−ｎｅｂ装置（Ｐｈｉｌｉｐｓ  Ｒｅｓｐｉｒｏｎｉｃｓ）を用いて吸入により送達する。Ｉ−ｎｅｂ装置は、スイッチを入れた際に、連続したエアロゾル流を生じるようにプログラムする。
【００６３】
１日目において、麻酔下で血液及びＢＡＬを集め、体重を測定する。
【００６４】
８日目において、麻酔下で血液を集め、体重を測定し、１．５ｍＬ又は４．５ｍＬの吸入ＩＦＮ−βを各マカクに送達する。選択されるＩＦＮ−βの投与量は、投与１から得られた結果に依存するだろう。
【００６５】
９日目において、麻酔下で血液及びＢＡＬを集め、体重を測定する。
【００６６】
第二段階：インフルエンザにより誘起される肺の病変及び肺ウイルス負荷に対する、肺送達ＩＦＮ−βでの予防的及び治療的処置の効果
研究の第二段階は、３つの処置グループを含む：グループ１はプラセボを投与される；グループ２は、チャレンジウイルスでの感染２４時間前に吸入ＩＦＮ−β処置を受けさせ、その後毎日ＩＦＮ−βで処置する；グループ３は、チャレンジウイルスの感染４時間後に吸入ＩＦＮ−β処置を受けさせ、その後毎日ＩＦＮ−βで処置する。このモデルでは、比較的高いウイルス量を下気道に直接投与して、確定的な下気道疾患のモデルを作製しているので、治療的処置は感染４時間後に投与する。サンプルサイズの計算は、処置動物とコントロール（未処置）動物との間に１．５  ｌｏｇのウイルス力価の差の治療効果を見るためには、グループ当たり９匹の動物が必要であることを示した。これは、ノイラミニダーゼ阻害剤を用いた臨床研究の結果に基づき、臨床的に有意であると考えられる（Ｂａｒｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４４：７８−８７）。研究スケジュールを以下に示す：
【００６７】
【表４】
0005926200.tif 000005
【００６８】
本研究に含まれる動物数のために、ブロック計画（ｂｌｏｃｋ  ｄｅｓｉｇｎ）を使用する。本研究は３つのブロックで実施し、各ブロックは９匹の動物からなり、各処置グループ由来の３種の動物で実施する。
【００６９】
ウイルスチャレンジ１４日前に、循環インフルエンザに対して血清反応陰性であると確認された９匹のカニクイザルマカクの腹腔中に、予めプログラムした温度センサーを備え付け、ケタミン及びドルミトール（ｄｏｒｍｉｔｏｒ）麻酔下で血液を集める。
【００７０】
−１日目において、手術から完全に回復した後、全ての動物に麻酔をかけ、体重を測定し、サンプル（血清のための全血、及び鼻腔／咽頭スワブ）を集める。グループ１及び２に属する動物には、麻酔下、ネブライザーによりプラセボ又はＩＦＮ−β（第一段階で決定した投与量）を投与する。
【００７１】
０日目において、グループ１及び２の動物は、上述のとおり、ネブライザーによりプラセボ又はＩＦＮ−βで処置する。次いで、全ての動物に対し、インフルエンザウイルス（１０５  ＴＣＩＤ５０  Ｈ５Ｎ１又は１０７  ＴＣＩＤ５０  Ｈ１Ｎ１）を気管内にチャレンジする。気管内にチャレンジしてから４時間後に、グループ３の動物に、上述のとおり、ネブライザーによりＩＦＮ−βを投与する。
【００７２】
１日目、２日目、３日目及び４日目において、全ての動物に麻酔をかけ、体重を測定し、サンプルを集め（血清のための全血、及び鼻腔／咽頭スワブ）、上述のとおり、ネブライザーによりプラセボ又はＩＦＮ−βで処置する。
【００７３】
チャレンジから５日後に、全ての動物に麻酔をかけ、体重を測定し、放血により安楽死させる。完全な肉眼的病理学（ｆｕｌｌ  ｇｒｏｓｓ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）を実施し、全ての主要な臓器を検査し、肺病変を記載する。全ての動物から、以下を含むサンプルを集める：血清のための全血、鼻腔／咽頭スワブ、及び右肺の組織。実験を通じて集めたスワブ、及び右肺部分を定量ＰＣＲ、及びウイルス負荷を決定するためのウイルス力価測定に供する。左肺は、その後の組織病理学的評価のために、１０％ホルマリンで膨張させる。
【００７４】
主なエンドポイントは、肺のウイルス負荷及び肺の病変スコアである。毎日採取した咽頭スワブは、ウイルス感染の時間経過の指標となり得る。特にＩＦＮ−βでの治療的処置後の、肺のウイルス負荷又は肺の病変の減少というポジティブなデータは、インフルエンザによりもたらされる下気道疾患を治療するための、吸入ＩＦＮ−βの開発を支持する。
【図１ａ】
0005926200.tif 000006
【図１ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【配列表】
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