(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の低分子量疎水性タンパク質の外部ドメイン、及び担体を含む免疫原性組成物であって、前記外部ドメインは、
（ａ）配列番号１、
（ｂ）配列番号２、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｄ）４番目のシステイン残基がセリン残基に置換された配列番号１、
（ｅ）配列番号４〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は
（ｆ）配列番号１７及び１９〜３０からなる群から選択されるアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を有する、免疫原性組成物。
【請求項２】
外部ドメインがオリゴマーとして提示される、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
担体が非タンパク質性担体又はリポソームである、請求項１又は２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
外部ドメインが担体と遺伝子的に結合した、請求項１又は２に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
外部ドメインが担体と化学的に結合した、請求項１又は２に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
担体がオリゴマーである、請求項１、２、４及び５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
オリゴマーがペンタマーである、請求項６に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
担体が軟骨オリゴマー基質タンパク質（ｃｏｍｐ）、Ｌｐｐ−５６、及びウイルス様粒子からなる群から選択される、請求項１、２及び４〜７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
ワクチンとして使用するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
呼吸器合胞体ウイルス感染の防御用又は治療用ワクチンを製造するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物の使用。
【請求項１１】
ＲＳＶ感染を予防又は治療するための医薬の製造における、ＲＳＶの低分子量疎水性タンパク質（ＲＳＶ−ＳＨ−タンパク質）の外部ドメインに対するヒト型抗体を含む血液、血清及び／又は血漿の使用であって、前記外部ドメインは、
（ａ）配列番号１、
（ｂ）配列番号２、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｄ）４番目のシステイン残基がセリン残基に置換された配列番号１、又は
（ｅ）配列番号４〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を有する、使用。
【請求項１２】
ＲＳＶ感染を予防又は治療するための医薬の製造における、ＲＳＶ−ＳＨ−タンパク質の外部ドメインに対するモノクローナル抗体の使用であって、前記外部ドメインは、
（ａ）配列番号１、
（ｂ）配列番号２、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｄ）４番目のシステイン残基がセリン残基に置換された配列番号１、
（ｅ）配列番号４〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は
（ｆ）配列番号１７及び１９〜３０からなる群から選択されるアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を有する、使用。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を含む、ＲＳＶ感染の治療又は予防のためのワクチン。
【請求項１４】
ヒトに使用するための、請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１５】
獣医学的使用のための、請求項１３に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対するワクチンに関する。より具体的には、本発明は、ＲＳＶによりコードされる低分子量疎水性（ＳＨ）タンパク質の外部ドメインを含む組換えサブユニットワクチンに関する。ＳＨの外部ドメインはＳＨｅと呼ばれる。前記外部ドメインはオリゴマーとして提示されることが好ましく、ペンタマーとして提示されることがさらに一層好ましい。さらに本発明は、前記外部ドメインに対して産生された抗体または前記外部ドメインに特異的な抗体、ならびにＲＳＶ感染に対して対象を防御するためおよび／または感染した対象を治療するためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＳＶ感染は、工業国における幼児入院の主な原因である。２歳未満で一般に起こる一次ＲＳＶ感染後、ＲＳＶに対する免疫は依然として不完全であり、再感染が起こる可能性がある。さらに、ＲＳＶは年配者において重度の疾患を引き起こす可能性があり、非流行年におけるインフルエンザＡより高い死亡率と一般に関連している（Ｆａｌｓｅｙら、１９９５）。ＷＨＯの推定する、世界全体の人間母集団における年間感染率は６４００万の症例と推定され、米国のみで１６００００の死亡数であり、８５０００から１４４０００の幼児がＲＳＶ感染の結果として毎年入院している（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｖａｃｃｉｎｅ＿ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｄｉｓｅａｓｅｓ／ａｒｉ／ｅｎ／ｉｎｄｅｘ２．ｈｔｍｌ  ２００９年更新）。
【０００３】
ＲＳＶはパラミクソウイルス科（ｆａｍｉｌｙ  Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ニューモウイルス亜科（ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ）、ニューモウイルス属（ｇｅｎｕｓ  Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）に属し、ヒトでは２つの亜群、ＡとＢが存在する。ヒトＲＳＶ以外に、ウシ型変異体が存在する。ヒトＲＳＶのゲノムは約１５２００ヌクレオチド長であり、ネガティブセンスＲＮＡ分子である。ＲＳＶゲノムは、１１の周知のタンパク質、糖タンパク質（Ｇ）、融合タンパク質（Ｆ）、低分子量疎水性タンパク質（ＳＨ）、核タンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、巨大タンパク質（Ｌ）、基質タンパク質（Ｍ）、Ｍ２ＯＲＦ−１タンパク質（Ｍ２−１）、Ｍ２ＯＲＦ−２タンパク質（Ｍ２−２）、非構造タンパク質１（ＮＳ１）および非構造タンパク質２（ＮＳ２）をコードする。Ｇ、ＦおよびＳＨは膜貫通型表面タンパク質であり、Ｎ、Ｐ、Ｌ、Ｍ、Ｍ２−１はヌクレオカプシド関連タンパク質であり、ＮＳ１とＮＳ２は非構造タンパク質である。構造または非構造タンパク質としてのＭ２−２の状態は知られていない。（Ｈａｃｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｈｕｌｌ、２００２）。ＲＳＶの亜群はＧ、Ｆ、ＮおよびＰタンパク質の抗原特性の違いを示す（Ｏｇｒａ、２００４）。
【０００４】
ＲＳＶ感染に、血清およびいくつかの他の体液において検出可能な特異的ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体の形成が続く。いくつかの研究は、抗体応答は主に主要ＲＳＶ膜貫通型タンパク質ＦおよびＧに対するものであることを実証しており、ＦおよびＧ特異的抗体のみがインビトロＲＳＶ中和活性を有することが知られている。Ｆタンパク質に対する抗体応答はＡ亜群とＢ亜群の間で交差反応性であることが多く、一方Ｇタンパク質に対する抗体応答は亜群特異的である（Ｏｇｒａ、２００４）。ＦおよびＧとは対照的に、膜貫通型タンパク質ＳＨは非免疫原性として考えられており（Ｇｉｍｅｎｅｚら、１９８７；Ｔｓｕｔｓｕｍｉら、１９８９）、いくつかのワクチン候補の中で、不可逆弱毒ワクチンを得るためＳＨさえ削除されている（Ｋａｒｒｏｎら、２００５）。
【０００５】
ＲＳＶ感染を予防するためのワクチンの開発は、宿主免疫応答が、疾患の病因において有意な役割を果たすように思われるという事実により複雑になっている。ホルマリン不活化ＲＳＶを子供に予防接種した初期の試みは、予防接種した子供が、非予防接種対照と比較して、後のウイルスへの曝露時により重度の疾患を経験したことを示した（Ｋａｐｉｋｉａｎら、１９６９）。弱毒生ワクチンが試験されているが、臨床試験において過剰または不十分な弱毒化を示すことが多い（Ｍｕｒａｔａ、２００９）。
【０００６】
１つの免疫原性タンパク質または免疫原性タンパク質の組合せを使用するサブユニットワクチンは、安全であると考えられる。それらは、毒性ウイルスに復帰するまたは突然変異することができないからである。精製Ｆタンパク質に基づく候補ワクチンが開発されており、げっ歯類、コットンラット、およびヒトにおいて試験され、安全であるが、ごくわずかに免疫原性であることが示された（ＦａｌｓｅｙおよびＷａｌｓｈ、１９９６；ＦａｌｓｅｙおよびＷａｌｓｈ、１９９７；Ｇｒｏｏｔｈｕｉｓら、１９９８）。同様の形式で、Ｆ−、Ｇ−およびＭ−タンパク質の混合物を用いた臨床試験はフェーズＩＩで中断された（ＡＤＩＳｉｎｓｉｇｈｔ臨床データベース）。代替手法は、レンサ球菌Ｇタンパク質のアルブミン結合ドメインのＣ末端とヒトＲＳＶ  Ｇタンパク質の抗原ドメインの組換え遺伝子融合からなっていた（ＢＢＧ２Ｎａ；Ｐｏｗｅｒら、２００１）。ＢＢＧ２Ｎａは健常ボランティアにおいて臨床試験のフェーズＩＩＩまで調べられたが、何人かの免疫処置済みボランティアにおける予期せぬ３型過敏症副作用（紫斑病）の出現が原因で試験は止めなければならなかった（Ｍｅｙｅｒら、２００８）。
【０００７】
近年の進展は、ＲＳＶ抗原用ベクターとしてのキメラ組換えウイルスの使用である。キメラ組換えウシ／ヒトパラインフルエンザウイルス３型（ｒＢ／ＨＰＩＶ−３）が、ＢＰＩＶ−３ゲノムにおいてＦおよびＨＮ遺伝子とＨＰＩＢＶ−３由来の相同遺伝子を置換することによって操作された。生成したキメラｒＢ／ＨＰＩＶ−３株を次いで使用してＨＲＳＶ  ＦおよびＧ遺伝子を発現させた（Ｓｃｈｍｉｄｔら、２００２）。このワクチンは現在臨床研究下にある。
【０００８】
ＲＳＶによって引き起こされる重度の疾患に利用可能な、ごく限られた数の予防および治療オプションが存在する。最も広く使用されている介入は、マウスモノクローナル抗体１１２９に由来するヒト化モノクローナル抗体を用いた受動免疫防御に基づく（Ｂｅｅｌｅｒ  ａｎｄ  ｖａｎ  Ｗｙｋｅ  Ｃｏｅｌｉｎｇｈ、１９８９）。この抗体はＲＳＶ  Ｆタンパク質に特異的であり、亜群ＡおよびＢウイルスを中和する。組換えヒト化抗体１１２９はパリビズマブとして知られており（シナジスとしても知られる）、ＲＳＶ感染時に合併症を発症するリスクが高い幼児の予防療法に使用される。この抗体を１ヶ月単位で筋肉内投与して、未熟児、慢性肺疾患、または血行動態が重大な先天性心疾患が原因のリスクがある幼児においてＲＳＶ感染のリスクを低下させる（Ｂｏｃｃｈｉｎｉら、２００９）。いくつかの研究が、パリビズマブを用いたＲＳＶ予防に関する許容可能なコスト効率比を報告している（Ｐｒｅｓｃｏｔｔら、２０１０）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｖａｃｃｉｎｅ＿ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｄｉｓｅａｓｅｓ／ａｒｉ／ｅｎ／ｉｎｄｅｘ２．ｈｔｍｌ  ２００９年更新
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
市販されている承認されたワクチンはないので、安全で有効なＲＳＶワクチンの開発および利用性に関する満たされていないニーズが依然として存在する。驚くことに、本発明者らは、ＳＨｅと呼ばれる低分子量疎水性タンパク質ＳＨの細胞外部分（外部ドメイン）は、特にそれが担体においてオリゴマーとして、好ましくはペンタマーとして現れるとき、ＲＳＶ感染に対する予防接種に安全に使用することができることを発見した。さらに、ＳＨｅに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、それぞれＲＳＶ感染を予防または治療するために、予防的または治療的に使用することもできる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第一の態様は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の低分子量疎水性（ＳＨ）タンパク質の外部ドメイン、および担体を含む免疫原性組成物である。好ましい一実施形態では、ＲＳＶはヒト亜群Ａまたはヒト亜群Ｂ株のいずれかであり、別の好ましい実施形態では、ＲＳＶはウシＲＳＶである。ＳＨタンパク質は当業者に知られており、６４（ＲＳＶ亜群Ａ）、６５（ＲＳＶ亜群Ｂ）個のアミノ酸残基、またはウシＲＳＶに関して８１、７７もしくは７２個のアミノ酸残基を含有する。好ましい一実施形態では、ＳＨの外部ドメイン（ＳＨｅ）は、亜群Ａに関して２３のカルボキシ末端アミノ酸（配列番号１）、および亜群Ｂに関して２４のカルボキシ末端アミノ酸（配列番号２）からなる。外部ドメインの配列は、配列番号１（外部ドメイン亜群Ａ）および配列番号２（外部ドメイン亜群Ｂ）、またはそれらの変異体からなる群から選択されることが好ましい。本明細書で使用する変異体は、配列が欠失、挿入または置換などの１つまたは複数の突然変異を有し得ることを意味する。前記突然変異は置換であることが好ましい。さらにより好ましくは、前記変異体は、ＢＬＡＳＴｐアラインメント（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７）で測定して、８０％の同一率、好ましくは８５％の同一率、さらにより好ましくは９０％の同一率、最も好ましくは９５％の同一率を有する。前記変異体は、配列ＮＫＬ  Ｃ／Ｓ  Ｅ  Ｙ／Ｈ  Ｋ／Ｎ  ＸＦ（配列番号３）を含むことが好ましい。好ましい変異体は配列番号４−配列番号１６で列挙する。別の好ましい実施形態では、外部ドメインは、前に定義したように配列番号１７（ウシＲＳＶ  ＳＨの外部ドメイン）またはその変異体からなる。前記変異体は、配列ＮＫＬＣＸＸＸＸＸＨＴＮＳＬ（配列番号１８）を含むことが好ましい。好ましい変異体は配列番号１９−３０で列挙する。担体分子はＳＨタンパク質とは異種である分子であり、担体は抗原提示に適した当業者に知られている任意の担体であってよく、ＨＢｃｏｒｅ（Ｗｈｉｔａｃｒｅら、２００９）などのウイルス様粒子、および集合体ウイルスカプシドまたはコートタンパク質由来の他のＶＬＰを含むが、これらだけには限られない。それが免疫系に対して抗原を有効に提示することができるという条件で、ペンタマー軟骨オリゴマー基質タンパク質（ｃｏｍｐ；ＭｃＦａｒｌａｎｅら、２００９）、トロンボスポンジン３および４（Ｍａｌａｓｈｋｅｖｉｃｈら、１９９６）、細菌ＡＢ５型毒素のＢサブユニット（例えば、コレラ毒素のサブユニットまたはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定性毒素；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、２００６）、ペンタマートリプトファン−ジッパー（Ｌｉｕら、２００４）、ペンタマーフェニルアラニン−ジッパー（Ｌｉｕら、２００６）またはテトラマーＧＣＮ４由来ロイシンジッパー（ｔＧＣＮ４、Ｄｅ  Ｆｉｌｅｔｔｅら、２００８）およびＬｐｐ−５６（Ｓｈｕら、２０００）などの、任意の他の分子構築物を使用することもできる。担体はタンパク質性、および非タンパク質性であってよい。非タンパク質性担体の例は、非制限的な例として、リポソーム、ＣＬＩＰＳ（商標）構築物（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎら、２００７）およびトリメチルキトサン（Ｓｌｕｔｔｅｒら、２０１０）���ある。前記担体は、１つの足場上に複数のＳＨｅ分子を提示することによって、多量体化した足場上に１つのＳＨｅを提示することによって、または両方の組合せによって、ＳＨｅを好ましくはオリゴマーとして提示し、さらに一層好ましくはペンタマーとして提示する。ＳＨｅオリゴマーは線状反復構造として、またはオリゴマー複合体を形成する個々のＳＨｅ単位として、または両方の組合せとして提示され得る。前記担体は、オリゴマー担体（ダイマー、デカマーまで）であることが好ましい。さらに一層好ましくは、前記担体はペンタマー担体である。具体的な一実施形態では、細胞質ドメインを好ましくは含まないＳＨの膜貫通ドメインを、場合によってさらに担体と融合または結合させて、オリゴマードメインとして使用することができる。全ての担体分子がＳＨｅによって負荷されるはずはなく、実際非制限的な例として、ヘキサマー担体のわずか５単位がＳＨｅで負荷され、それによってヘキサマー担体複合体上にペンタマーＳＨｅ複合体が提示されることは想像可能である。外部ドメインを担体と遺伝学的に結合させ、融合タンパク質を形成することが可能であり、両ドメインは直接融合することが可能であり、またはそれらはヒンジ配列もしくはスペーサー配列によって結合させることが可能である。本明細書で使用するように、遺伝学的に融合した構築物では、ヒンジ配列は２つのドメインを１つに結合させるアミノ酸配列であり、前記配列は柔軟な形式で２つのドメインを結合させることが好ましい。前記ヒンジ配列は好ましくは１５０アミノ酸より短く、さらに一層好ましくは１００アミノ酸より短く、さらに一層好ましくは５０アミノ酸より短く、最も好ましくは２０アミノ酸より短い。本明細書で使用するスペーサーは、１５アミノ酸より短い、短いヒンジ配列を示す。好ましい実施形態では、ヒンジ配列は、ｎが１、２、３、…２０に等しい配列（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎを含む。別の好ましい実施形態では、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域などの免疫グロブリン遺伝子のヒンジを、ヒンジ配列として使用する。遺伝的結合の場合、前記結合はＳＨｅのアミノ末端、およびカルボキシ末端で起こり得る。
【００１２】
あるいは、外部ドメインは担体と化学的に結合する。化学結合は当業者に知られており、担体表面上の反応部位とペプチドの共有結合により担体と結合したペプチドを含むがこれだけには限られない。生成する構造は結合体である。担体表面上の反応部位は、化学的に活性がある、または活性化することができ、ペプチドとの共有結合に立体的にアクセス可能である部位である。好ましい反応部位はアミノ酸リシンのε窒素である。共有的に結合は、生理的条件下において加水分解に対して安定である共有結合の存在を指す。共有結合は、付加体形成、酸化、および還元を含めた生理的条件下において起こり得る他の反応に対して安定であることが好ましい。担体と抗原ペプチドの結合は、二官能性試薬を使用して得ることが多い（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、１９９６）。ＳＨｅにおける任意の適切な残基は化学的担体との結合に使用することができ、ＳＨｅはそのアミノ末端またはカルボキシ末端付近で担体と結合することが好ましい。
【００１３】
さらに別の実施形態では、疎水性相互作用、協同的Ｈ−結合相互作用、またはファンデルワールス相互作用などであるがこれらだけには限られない非共有結合的相互作用によって、外部ドメインと担体を結合させる。
【００１４】
本発明の別の態様は、本発明による免疫原性組成物のワクチンとしての使用である。本発明のさらに別の態様は、ＲＳＶ感染に対する防御用ワクチンを調製するための、本発明による免疫原性組成物の使用である。前記ＲＳＶは、ＲＳＶ亜群ＡおよびＲＳＶ亜群Ｂからなる群から選択されることが好ましい。鼻腔内、腹腔内、筋肉内および皮内投与を含むがこれらだけには限られない当業者に知られている任意の経路により、治療する対象にワクチンを投与することができる。予防接種後、ＲＳＶ感染による疾患症状の増大がないことが好ましい。ワクチンは動物またはヒト使用のためであってよい。好ましい動物用途は、ウシＲＳＶなどであるがこれだけには限られないヒトＲＳＶと関係があるウシ呼吸器ウイルスに対する予防接種による、畜牛または他のウシ科動物の防御である。ＲＳＶ感染に対する防御は、予防用途と治療用途の両方を含む。より具体的には、ワクチンの好ましい用途は予防目的である。本明細書で使用する「ワクチンの調製」は、本発明による免疫原性組成物を適切な賦形剤の添加により最適化することができること、または非制限的な例として、貯蔵寿命の増大もしくはワクチンの医薬的特性の改善のために、本発明による免疫原性組成物を製剤化することができることを意味する。
【００１５】
本発明の別の態様は、本発明による免疫原性組成物、または本発明による免疫原性組成物の組合せを含むワクチンである。実際、非制限的な例として、ＲＳＶ亜群ＡのＳＨｅおよびＲＳＶ亜群ＢのＳＨｅを含む免疫原性組成物を混合して、より広い特異性を有するワクチンを得ることができる。前記ワクチンはヒトまたは獣医学的使用のためであってよい。免疫原性組成物以外に、ワクチンはアジュバントなどの１つまたは複数の他の化合物を含むことができる。ワクチンは、ＲＳＶ感染に対してヒトを防御するためのワクチン、またはウシＲＳＶなどであるがこれだけには限られないヒトＲＳＶと関係がある動物呼吸器ウイルスに対して動物を防御するためのワクチンであることが好ましい。
【００１６】
本発明の別の態様は、ＲＳＶの外部ドメインに対する抗体を検出および／または精製するための、本発明による免疫原性組成物の使用である。このような抗体は、本発明の免疫原性組成物を対象に予防接種した後に単離することができ、あるいは、同様の抗体および／または抗体産生細胞をＲＳＶ感染したヒトまたは動物対象から得ることもでき、当技術分野で知られている適切な開発後、前に記載した予防または治療目的に使用することができる、ＳＨｅ特異的抗体、好ましくはヒト型抗体の産生に使用することができる。
【００１７】
本発明のさらに別の態様は、動物から血液、血漿および／または血清を生成するための方法であり、前記血液、血漿および／または血清はＲＳＶのＳＨｅドメインに対する１つまたは複数の抗体または抗体産生細胞を含み、前記方法は（ａ）本発明による免疫原性組成物を前記動物に送達することおよび（ｂ）前記動物から血液、血漿および／または血清を得ることを含み、前記血液、血漿および／または血清はＲＳＶのＳＨｅドメインに対する１つまたは複数の抗体または抗体産生細胞、または前記抗体を産生する細胞を含む。前記動物は非ヒト動物であることが好ましい。本明細書で使用するように、血漿は血液細胞除去後の血液の液体分画であり、血清はフィブリノゲンおよび他の血液凝固因子除去後の血漿である。前に示したように、本発明による免疫原性組成物を使用して特異的抗ＳＨｅ抗体を単離することができる。
【００１８】
本発明のさらなる態様は、ＲＳＶ感染に対する防御および／またはＲＳＶ感染の治療のための、ＲＳＶ抗体を含有する血液、血漿および／または血清ならびに本発明による方法で得られる血液、血漿および／または血清の使用である。前述のように、ＲＳＶ感染に対する防御は予防用途と治療用途の両方を含む。実際、抗体を含む血清をヒトまたは動物に投与し、それによってＲＳＶ感染に対する受動免疫をもたらすことができる。前記血清は血清を含む医薬組成物の一部であってよく、この場合血清は適切な賦形剤と製剤化および／または混合する。したがって、本発明の別の態様は、本発明による方法によって得られる血清を含む医薬組成物である。
【００１９】
本発明の別の態様は、ＲＳＶ  ＳＨ−タンパク質の外部ドメインに対するＲＳＶ阻害性モノクローナル抗体である。本明細書で使用するＲＳＶ阻害は、感染時に、適切な動物モデルで測定して、未治療動物と比較して、肺中ウイルス力価が治療動物においてより低いことを意味する。前記モノクローナル抗体は、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体であることが好ましい。
【００２０】
本発明のさらに別の態様は、本発明によるＲＳＶ  ＳＨ−タンパク質の外部ドメインに対するモノクローナル抗体を含む医薬組成物である。実際、免疫処置済み非ヒト動物の臓器、好ましくは前記動物の脾臓、または免疫処置済み動物またはヒト対象由来の血液サンプルは、単鎖抗体、多価抗体、または抗ウイルス化合物と結合した抗体などであるがこれらだけには限られないモノクローナル抗体および誘導体を産生するための出発物質として使用することができる。前記モノクローナル抗体および誘導体は受動免疫処置、またはＲＳＶ感染の治療に使用される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】Ａは亜型ＡヒトＲＳＶ（ｈＲＳＶ）ＳＨ外部ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）、亜型ＢヒトＲＳＶ  ＳＨ外部ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）、およびウシＲＳＶ（ｂＲＳＶ）ＳＨ外部ドメインのアミノ酸配列（配列番号１７）の図である。ＢはＦｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−Ｓｈｅのアミノ酸配列（配列番号３５）の図である。最初の９個のアミノ酸はＮ末端Ｆｌａｇタグを表す。イタリックフォントのアミノ酸（ＡＡ）はラットＣＯＭＰ（ＡＡ２５−７２）のコイルドコイルドメインを表す。下線を引いたＡＡはＲＳＶのＡ低分子量疎水性タンパク質の外部ドメイン（ＳＨｅ）を表す。ＣはＦｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅペンタマータンパク質の概略図である。ＤはＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅペンタマータンパク質の概略図である。
【図２−１】ＡはＦｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅの精製および相対分子量の決定の図である。ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムでのゲル濾過時のアルドラーゼ（１）、コンアルブミン（２）、アルブミン（３）、キモトリプシノーゲン（４）、リボヌクレアーゼＡ（５）およびＦｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅ（６および７）の溶離曲線の図である。
【図２−２】ＢはＦｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅの精製および相対分子量の決定の図である。ゲル濾過後のＦｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析のクーマシーブルー染色の図である（パネルＡのピーク６）。ＣはＦｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅの精製および相対分子量の決定の図である。ゲル濾過用カラムを測定するため使用したタンパク質、それらの相対分子量（Ｍｒ）、カラムから溶離した容積（Ｖｅ）および計算したＫａｖ（Ｖ０＝カラム空隙容積＝９．０５およびＶｔｏｔ＝カラム床容積＝１９．８１６で、Ｋａｖ＝（Ｖｅ−Ｖ０）／（Ｖｔｏｔ−Ｖ０））の概略図である。ピーク６中に存在したＦｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅのＭｒは、そのＶｅおよびパネルＤ中に示す較正曲線に基づいて計算した。
【図２−３】ＤはＦｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅの精製および相対分子量の決定の図である。ペンタマーＦｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅを精製するため使用したｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ゲル濾過用カラムの較正曲線の図である。
【図３−１】ＬＴＲ１９２Ｇと組み合わせたＦｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅによるＢａｌｂ／ｃマウスの予防接種は、Ｓｈｅ特異的抗体を誘導することを示す図である。示したワクチンによる第一、第二または第三の免疫処置後の、マウスの血清プール中に存在したＳＨｅペプチド特異的ＩｇＧ抗体の力価の、ＥＬＩＳＡベースの決定の図である。ＢはＬＴＲ１９２Ｇと組み合わせたＦｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅによるＢａｌｂ／ｃマウスの予防接種は、Ｓｈｅ特異的抗体を誘導することを示す図である。示したワクチンによる第一、第二または第三の免疫処置後の、マウスの血清プール中に存在したＳＨｅペプチド特異的ＩｇＧ抗体の力価の、ＥＬＩＳＡベースの決定の図である。
【図３−２】ＣはＬＴＲ１９２Ｇと組み合わせたＦｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅによるＢａｌｂ／ｃマウスの予防接種は、Ｓｈｅ特異的抗体を誘導することを示す図である。示したワクチンによる第一、第二または第三の免疫処置後の、マウスの血清プール中に存在したＳＨｅペプチド特異的ＩｇＧ抗体の力価の、ＥＬＩＳＡベースの決定の図である。ＤはＬＴＲ１９２Ｇと組み合わせたＦｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅによるＢａｌｂ／ｃマウスの予防接種は、Ｓｈｅ特異的抗体を誘導することを示す図である。ＰＢＳ、Ｍ２ｅ−ｔＧＣＮ４／ＬＴＲ１９２ＧまたはＦｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅ／ＬＴＲ１９２Ｇで予防接種したマウスの血清プール中に存在したＳＨｅペプチド特異的ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体の図である。
【図４】Ａは図３の凡例と同様のＦｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅの予防接種が、細胞表面上のＳＨ外部ドメインを認識することができる抗体を誘導することを示す図である。Ｆｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅ予防接種マウスの異なる希釈の血清により染色したＧＦＰおよびＲＳＶ  ＳＨ発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリー解析の図である。Ｂは図３の凡例と同様のＦｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅの予防接種が、細胞表面上のＳＨ外部ドメインを認識することができる抗体を誘導することを示す図である。Ｆｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅまたはＭ２ｅ−ｔＧＣＮ４（陰性対照）予防接種マウス由来の血清により染色したＧＦＰおよびＲＳＶ  ＳＨ発現ＨＥＫ細胞のフローサイトメトリー解析の図である。Ｃは図３の凡例と同様のＦｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅの予防接種が、細胞表面上のＳＨ外部ドメインを認識することができる抗体を誘導することを示す図である。Ｆｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅまたはＭ２ｅ−ｔＧＣＮ４予防接種マウス由来の血清により染色したＧＦＰおよびルシフェラーゼ発現ＨＥＫ細胞のフローサイトメトリー解析の図である。
【図５】Ｆｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅ予防接種が、ＲＳＶ複製を阻害することを示す図である。攻撃後４日で、示したグループのマウスを屠殺しプラークアッセイにより肺中ウイルス力価を決定した。グラフは、各マウスの肺当たりのプラーク形成単位の数を示す。プラークアッセイの検出限界は肺当たり１０ＰＦＵである。Ｆｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅ予防接種マウスとＭ２ｅ−ｔＧＣＮ４予防接種マウスの間のＲＳＶ肺中力価の差は非常に有意であった（＊＊＊ｐ≦０．０００５）。
【図６】Ｆｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅ予防接種が、ＲＳＶ感染による疾患の増大を誘導しないことを示す図である。グラフは、１００を掛けて屠殺日（感染後４日）の重量とウイルス感染日の重量の間の比として計算した、各マウスの相対体重を示す。
【図７】ｍＨＢｃウイルス様粒子の免疫優性ループとＳＨｅ（ｃｃ４ｓ）ペプチドの化学結合の図である。ゲル上に示した、異なる段階の化学結合におけるｍＨＢｃのクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。ｍＨＢｃ＝精製ｍＨＢｃ、ｍＨＢｃ−ＳＭＢＳ＋ｓＭＢＳ＝化学リンカーＳｕｌｆｏ−ＭＢＳの付加後のｍＨＢｃ、ｍＨＢｃ−ＳＭＢＳ＝サイズ排除クロマトグラフィー後のｍＨＢｃ−ＳＭＢＳ、ｍＨＢＣ−ＳＨｅ（ｃｃ４ｓ）＋ＳＨｅ（ｃｃ４ｓ）＝ＳＨｅ（ｃｃ４ｓ）ペプチドとのインキュベーション後の精製ｍＨＢｃ−ＳＭＢＳ、ｍＨＢＣ−ＳＨｅ（ｃｃ４ｓ）＝サイズ排除クロマトグラフィーによる精製後にｍＨＢｃ  ＶＬＰと結合したＳＨｅ。
【図８】ｍＨＢｃ−ＳＨｅ（ｃｃ４ｓ）がそのＶＬＰ立体配座を保持することを示す図である。グラフはｍＨＢｃ−ＳＨｅ（ｃｃ４ｓ）の大きさ分布を表し、動的光散乱法により決定したＭ２ｅ−ｍＢＨｃ  ＶＬＰ１６０４を十分に記載する。大きさ分布は容積の関数で表す。
【図９】ＳＨｅ−ｔＧＣＮ４の精製の図である。一連のカラムクロマトグラフィーステップ：アニオン交換、疎水性相互作用およびゲル濾過クロマトグラフィーによる精製後の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析、次にＳＨｅ−ｔＧＣＮ４のクーマシーブルー染色。左パネルと右パネルは、それぞれ還元下（β−メルカプトエタノールの存在下）または非還元下（β−メルカプトエタノールの不在下）におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を表す。矢印はモノマーおよびダイマーＳＨｅ−ｔＧＣＮ４タンパク質を示す。
【図１０】ＡはＳＨｅ−ｔＧＣＮ４とｍＨＢｃ−ＳＨｅ（ｃｃ４ｓ）の両方の予防接種が、ＳＨｅペプチド特異的抗体を誘導することを示す図である。ＳＨｅペプチドＥＬＩＳＡにより解析した、第一回免疫処置、第一回追加抗原刺激免疫処置（追加抗原刺激）および第二回追加抗原刺激免疫処置（追加抗原刺激２）後の、示したグループのマウスの血清プール中に存在したＳＨｅ特異的ＩｇＧ抗体の力価を表す図である。ＢはＳＨｅ−ｔＧＣＮ４とｍＨＢｃ−ＳＨｅ（ｃｃ４ｓ）の両方の予防接種が、ＳＨｅペプチド特異的抗体を誘導することを示す図である。ペプチドＥＬＩＳＡにより決定した、第二回追加抗原刺激免疫処置後の、示したグループのマウスの血清プール中に存在したＳＨｅ特異的ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体の力価を表す図である。
【図１１】ＡはＳＨｅ−ｔＧＣＮ４とｍＨＢｃ−ＳＨｅ（ｃｃ４ｓ）の両方の予防接種が、肺におけるＲＳＶ複製を低下させることを示す図である。攻撃後３日で、マウスを屠殺しＱＲｔ−ＰＣＲにより肺中ウイルス力価を決定した。上のグラフは、示したグループ中の各マウスのサンプル中に存在したＧＡＤＰＨ  ｍＲＮＡレベルに標準化した、ゲノムＲＳＶ  ＲＮＡの相対的発現を表す。予防接種群間の統計学的差を示す。下パネルＢは上パネルＡと同一であるが、ＰＢＳ予防接種マウスからの結果も含む。
【図１２】ｍＨＢｃ−ＳＨｅ（ｃｃ４ｓ）もｔＧＣＮ４−ＳＨｅ予防接種も、ＲＳＶ感染による疾患の増大を誘導しないことを示す図である。この図は、１００を掛けて示した日の重量と感染日（第０日）の重量の間の比として計算した、それぞれ示したマウスのグループの平均相対体重を示す。
【図１３】３Ｄ１１および３Ｇ８が、それぞれＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ亜型の、２つのＳＨｅ特異的モノクローナル抗体であることを示す図である。グラフは、マウスＩｇＧ１またはマウスＩｇＧ２ａ特異的二次抗体のいずれかによって検出した、ＥＬＩＳＡアッセイにおける１μｇ／μｌ希釈系列のＳＨｅペプチドに対する３Ｄ１１および３Ｇ８モノクローナル抗体の結合を示す。
【図１４】Ａは３Ｄ１１および３Ｇ８モノクローナル抗体が、それらの細胞表面上でＲＳＶ  ＳＨタンパク質を発現する生きた細胞におけるＲＳＶ  ＳＨ外部ドメインと結合することを示す図である。ＧＦＰおよびＲＳＶ  ＳＨタンパク質を発現するＨｅｋ２９３Ｔ細胞と、３Ｄ１１および３Ｇ８モノクローナル抗体および各アイソタイプ適合対照抗体の結合のフローサイトメトリー解析の図である。Ｂは３Ｄ１１および３Ｇ８モノクローナル抗体が、それらの細胞表面上でＲＳＶ  ＳＨタンパク質を発現する生きた細胞におけるＲＳＶ  ＳＨ外部ドメインと結合することを示す図である。ＲＳＶ  ＳＨタンパク質または対照タンパク質（ルシフェラーゼ）のいずれかと組み合わせた、ＧＦＰを発現するＨｅｋ２９３Ｔ細胞と３Ｄ１１および３Ｇ８モノクローナル抗体の結合のフローサイトメトリー解析の図である。
【図１５】ＲＳＶ感染細胞の細胞表面と３Ｄ１１および３Ｇ８モノクローナル抗体の結合の図である。Ｖｅｒｏ細胞を０．５ＭＯＩのＲＳＶ  Ａ２で感染させた。トランスフェクション後２４時間で、細胞を固定、透過処理、およびポリクローナル抗ＲＳＶ血清と組み合わせた３Ｄ１１または３Ｇ８で染色し、感染および非感染細胞を同定した。上パネルは、感染および非感染細胞を含めた、免疫染色（ＤＡＰＩ核染色、３Ｄ１１およびポリクローナルＲＳＶ血清）の概要を表す。下パネルは、上パネルで示した感染細胞の共焦点画像を表す。
【図１６】ＳＨｅ特異的モノクローナル抗体を用いた受動免疫処置が、マウスにおけるＲＳＶ感染を低減したことを示す図である。Ｂａｌｂ／ｃマウスは、ＲＳＶ攻撃１日前と１日後に鼻腔内投与により、ＰＢＳ、ＳＨｅ特異的３Ｇ８モノクローナル抗体またはアイソタイプ対照抗体で処理した。それぞれの記号は、ＲＳＶ攻撃後第４日での、個々のマウスの肺中ウイルス力価を表す（＊＊ｐ≦０．０１）。
【図１７−１】Ａはフロイント不完全アジュバントと組み合わせたＫＬＨ−ＳＨｅによるＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内予防接種はＳＨｅ特異的抗体を誘導し、ＲＳＶ複製を低減することを示す図である。示したワクチンによる第三回免疫処置（追加抗原刺激２）後に個々のマウスの血清中に存在した、Ｓｈｅ特異的ＩｇＧ抗体のＥＬＩＳＡベースの決定の図である。Ｂはフロイント不完全アジュバントと組み合わせたＫＬＨ−ＳＨｅによるＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内予防接種はＳＨｅ特異的抗体を誘導し、ＲＳＶ複製を低減することを示す図である。ＫＬＨ−ＳＨｅで予防接種したマウスの血清プール中に存在したＳＨｅ特異的ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体のＥＬＩＳＡベースの決定の図である。
【図１７−２】Ｃはフロイント不完全アジュバントと組み合わせたＫＬＨ−ＳＨｅによるＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内予防接種はＳＨｅ特異的抗体を誘導し、ＲＳＶ複製を低減することを示す図である。ＫＬＨ−ＳＨｅ予防接種が、ＲＳＶ感染による疾患の増大を誘導しないことを示す図である。グラフは、１００を掛けて屠殺日（感染後５日）の重量とウイルス感染日の重量の間の比として計算した、各マウスの相対体重を示す。ＫＬＨ−ＳＨｅ予防接種マウスとＫＬＨ予防接種マウスの間の相対体重の差は有意である（ｐ≦０．００５、マンホイットニーのＵ検定）。Ｄはフロイント不完全アジュバントと組み合わせたＫＬＨ−ＳＨｅによるＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内予防接種はＳＨｅ特異的抗体を誘導し、ＲＳＶ複製を低減することを示す図である。ＫＬＨ−ＳＨｅ予防接種が、ＲＳＶ複製を妨害することを示す図である。１０６のＰＦＵ  ＲＳＶによる攻撃後５日で、示したグループのマウスを屠殺し、肺ホモジネートを調製して、プラークアッセイにより肺中ウイルス力価を決定した。グラフは、各マウスの肺当たりのプラーク形成単位の数を示す。プラークアッセイの検出限界は肺当たり２０ＰＦＵである。ＫＬＨ−ＳＨｅ予防接種マウスとＫＬＨ予防接種マウスの間のＲＳＶ肺中力価の差は有意である（ｐ≦０．００５、マンホイットニーのＵ検定）。
【図１７−３】Ｅはフロイント不完全アジュバントと組み合わせたＫＬＨ−ＳＨｅによるＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内予防接種はＳＨｅ特異的抗体を誘導し、ＲＳＶ複製を低減することを示す図である。ＫＬＨ−ＳＨｅ予防接種マウスに関して、ＳＨｅ特異的血清抗体の高い力価が、ＲＳＶ複製の低下と強く相関関係があることを示す図である。グラフは、それぞれのＫＬＨ−ＳＨｅ予防接種マウスに関する、感染後５日で検出可能であったＳＨｅ特異的血清ＩｇＧ抗体の力価およびＰＦＵ／肺の数を示す。グラフ中に、最適曲線（累乗数）およびそのＲ２（決定係数）を示す。
【図１８−１】ＡはＬＴＲ１９２Ｇと組み合わせたＫＬＨ−ＳＨｅによるＢａｌｂ／ｃマウスの鼻腔内予防接種はＳＨｅ特異的抗体を誘導し、ＲＳＶ複製を低減することを示す図である。示したワクチンによる第三回免疫処置（追加抗原刺激２）後に個々のマウスの血清中に存在した、ＳＨｅ特異的ＩｇＧ抗体のＥＬＩＳＡベースの決定の図である。
【図１８−２】ＢはＬＴＲ１９２Ｇと組み合わせたＫＬＨ−ＳＨｅによるＢａｌｂ／ｃマウスの鼻腔内予防接種はＳＨｅ特異的抗体を誘導し、ＲＳＶ複製を低減することを示す図である。ＫＬＨ−ＳＨｅで予防接種したマウスの血清プール中に存在したＳＨｅ特異的ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体のＥＬＩＳＡベースの決定の図である。ＣはＬＴＲ１９２Ｇと組み合わせたＫＬＨ−ＳＨｅによるＢａｌｂ／ｃマウスの鼻腔内予防接種はＳＨｅ特異的抗体を誘導し、ＲＳＶ複製を低減することを示す図である。示したワクチンで予防接種しＢＡＬ液回収５日前にＲＳＶを感染させた個々のマウスのＢＡＬ液中に存在した、ＳＨｅ特異的ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体のＥＬＩＳＡベースの決定の図である。
【図１８−３】ＤはＬＴＲ１９２Ｇと組み合わせたＫＬＨ−ＳＨｅによるＢａｌｂ／ｃマウスの鼻腔内予防接種はＳＨｅ特異的抗体を誘導し、ＲＳＶ複製を低減することを示す図である。示したワクチンで予防接種しＢＡＬ液回収５日前にＲＳＶを感染させた個々のマウスのＢＡＬ液中に存在した、ＳＨｅ特異的ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体のＥＬＩＳＡベースの決定の図である。ＥはＬＴＲ１９２Ｇと組み合わせたＫＬＨ−ＳＨｅによるＢａｌｂ／ｃマウスの鼻腔内予防接種はＳＨｅ特異的抗体を誘導し、ＲＳＶ複製を低減することを示す図である。ＫＬＨ−ＳＨｅ予防接種が、ＲＳＶ複製を妨害することを示す図である。１０６のＰＦＵ  ＲＳＶによる攻撃後５日で、示したグループのマウスを屠殺し、プラークアッセイにより肺中ウイルス力価を決定した。グラフは、各マウスの肺当たりのプラーク形成単位の数を示す。プラークアッセイの検出限界は肺当たり２０ＰＦＵである。ＫＬＨ−ＳＨｅ予防接種マウスとＫＬＨ予防接種マウスの間のＲＳＶ肺中力価の差は有意である（ｐ≦０．０５、マンホイットニーのＵ検定）。ＦはＬＴＲ１９２Ｇと組み合わせたＫＬＨ−ＳＨｅによるＢａｌｂ／ｃマウスの鼻腔内予防接種はＳＨｅ特異的抗体を誘導し、ＲＳＶ複製を低減することを示す図である。ＫＬＨ−ＳＨｅ予防接種マウスに関して、ＢＡＬ液中に存在したＳＨｅ特異的ＩｇＧ抗体の高い力価が、ＲＳＶ複製の低下と強く相関関係があることを示す図である。グラフは、それぞれのＫＬＨ−ＳＨｅ予防接種マウスに関する、感染後５日で検出可能であったＳＨｅ特異的ＢＡＬ  ＩｇＧ抗体の力価およびＰＦＵ／肺の数を示す。グラフ中に、最適曲線およびそのＲ２（決定係数）を示す。
【図１９−１】ＡはＫＬＨ−ＳＨｅ免疫血清を用いた受動免疫処置が、マウスにおけるＲＳＶ感染を低減することを示す図である。示したワクチンによる第三回免疫処置（追加抗原刺激２）後に個々のマウスの血清中に存在した、ＳＨｅ特異的ＩｇＧ抗体のＥＬＩＳＡベースの決定の図である。ＢはＫＬＨ−ＳＨｅ免疫血清を用いた受動免疫処置が、マウスにおけるＲＳＶ感染を低減することを示す図である。ＫＬＨ−ＳＨｅもしくはＫＬＨ予防接種マウス由来の血清またはＰＢＳを、ＲＳＶ攻撃１日前と１日後にマウスに鼻腔内投与した。１０６のＰＦＵ  ＲＳＶによる攻撃後５日で、示したグループのマウスを屠殺し、肺ホモジネートを調製して、プラークアッセイにより肺中ウイルス力価を決定した。グラフは、各マウスの肺当たりのプラーク形成単位の数を示す。プラークアッセイの検出限界は肺当たり２０ＰＦＵである。ＫＬＨ−ＳＨｅ予防接種マウスとＫＬＨ予防接種マウスの間のＲＳＶ肺中力価の差は有意である（ｐ≦０．０５、マンホイットニーのＵ検定）。
【図１９−２】ＣはＫＬＨ−ＳＨｅ免疫血清を用いた受動免疫処置が、マウスにおけるＲＳＶ感染を低減することを示す図である。ＫＬＨ−ＳＨｅ血清を用いた受動免疫処置は、ＲＳＶ感染による疾患の増大を誘導しない。グラフは、１００を掛けて指定日の重量と第一回受動免疫処置日の重量の間の比として計算した、各マウスの平均＋／−ＳＥＭ相対体重を示す。ＫＬＨ−ＳＨｅ血清で処理したマウスとＫＬＨ血清で処理したマウスの間の、相対体重の差は有意である（ｐ≦０．００５、マンホイットニーのＵ検定）。
【図２０】ｍＨＢｃウイルス様粒子の免疫優性ループとＳＨｅＢペプチドの化学結合の図である。ｍＨＢｃ  ＶＬＰ、ＳＭＢＳヘテロ二官能性クロスリンカーと結合したｍＨＢｃ  ＶＬＰ（ｍＨＢｃ−ＳＭＢＳ）および化学結合ＳＨｅＢペプチドで精製されたｍＨＢｃ−ＳＭＢＳ  ＶＬＰ（ｍＨＢｃ−ＳＨｅＢ）のクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。
【図２１】ＡはＲＳＶ  Ｂ感染細胞の表面とｍＨＢｃ−ＳＨｅＢ予防接種マウスの血清の結合の図である。Ｖｅｒｏ細胞にはＲＳＶ  Ｂ臨床分離株を感染させたか、または擬似感染させた。感染後７２時間で、細胞を固定し透過処理または非透過処理した。感染および擬似感染細胞は、示したように、ｍＨＢｃ−ＳＨｅＢ予防接種マウスの血清またはＫＬＨ予防接種マウスの血清で染色した。細胞とｍＨＢｃ−ＢまたはＫＬＨ血清抗体の結合は、Ａｌｅｘａ４８８結合抗マウスＩｇＧ抗体を使用することにより分析した。顕微鏡分析用に、核染色液ＤＡＰＩでも細胞を染色した。ＢはＲＳＶ  Ｂ感染細胞の表面とｍＨＢｃ−ＳＨｅＢ予防接種マウスの血清の結合の図である。Ｖｅｒｏ細胞にはＲＳＶ  Ｂ臨床分離株を感染させたか、または擬似感染させた。感染後７２時間で、細胞を固定し透過処理または非透過処理した。感染および擬似感染細胞は、示したように、ｍＨＢｃ−ＳＨｅＢ予防接種マウスの血清またはＫＬＨ予防接種マウスの血清で染色した。細胞とｍＨＢｃ−ＢまたはＫＬＨ血清抗体の結合は、Ａｌｅｘａ４８８結合抗マウスＩｇＧ抗体を使用することにより分析した。フローサイトメトリー解析用に、非透過処理細胞もヤギ抗ＲＳＶ血清で染色して、ＲＳＶ  Ｂ感染細胞を同定した。細胞とヤギ抗ＲＳＶ血清抗体の結合は、Ａｌｅｘａ６３３結合抗ヤギＩｇＧ抗体を使用することにより決定した。グラフは示した細胞のＡｌｅｘａ４８８強度／Ａｌｅｘａ６３３強度等高線プロットを表す。
【図２２−１】ＡはｍＨＢｃ−ＳＨｅＢの予防接種がＳＨｅＢ特異的抗体を誘導し、ＲＳＶ  Ｂ誘導型肺炎症を減らすことを示す図である。第一回（ｉｍ．）、第二回（追加抗原刺激１）および第三回ｍＨＢｃ−ＳＨｅＢ免疫処置（追加抗原刺激２）後にマウスの血清プール中に存在した、ＳＨｅＢおよびＳＨｅＡ特異的ＩｇＧ抗体のＥＬＩＳＡベースの決定の図である。ＢはｍＨＢｃ−ＳＨｅＢの予防接種がＳＨｅＢ特異的抗体を誘導し、ＲＳＶ  Ｂ誘導型肺炎症を減らすことを示す図である。ＫＬＨ−ＳＨｅを予防接種したマウスの血清プール中に存在した、ＳＨｅ特異的ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体のＥＬＩＳＡベースの決定の図である。
【図２２−２】ＣはｍＨＢｃ−ＳＨｅＢの予防接種がＳＨｅＢ特異的抗体を誘導し、ＲＳＶ  Ｂ誘導型肺炎症を減らすことを示す図である。示したワクチンで予防接種した個々のマウスの血清中に存在した、ＳＨｅＢ（Ｃ）およびＳＨｅＡ特異的（Ｄ）ＩｇＧ抗体のＥＬＩＳＡベースの決定の図である。ＤはｍＨＢｃ−ＳＨｅＢの予防接種がＳＨｅＢ特異的抗体を誘導し、ＲＳＶ  Ｂ誘導型肺炎症を減らすことを示す図である。示したワクチンで予防接種した個々のマウスの血清中に存在した、ＳＨｅＢ（Ｃ）およびＳＨｅＡ特異的（Ｄ）ＩｇＧ抗体のＥＬＩＳＡベースの決定の図である。
【図２２−３】ＥはｍＨＢｃ−ＳＨｅＢの予防接種がＳＨｅＢ特異的抗体を誘導し、ＲＳＶ  Ｂ誘導型肺炎症を減らすことを示す図である。示したワクチンで予防接種したＲＳＶ感染マウスのＢＡＬ液中に存在した細胞の合計数の図である。ｍＨＢｃで予防接種したマウスのＢＡＬ液と比較して、ｍＨＢｃ−ＳＨｅで予防接種したマウスのＢＡＬ液中には有意に少ない細胞が存在する（ｐ≦０．０５、マンホイットニーのＵ検定）。ＦはｍＨＢｃ−ＳＨｅＢの予防接種がＳＨｅＢ特異的抗体を誘導し、ＲＳＶ  Ｂ誘導型肺炎症を減らすことを示す図である。ＢＡＬ液中に存在したＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、単球、好中球および好酸球の数を示す図である。ｍＨＢｃで予防接種したマウスのＢＡＬ液と比較して、ｍＨＢｃ−ＳＨｅで予防接種したマウスのＢＡＬ液中には有意に少ないＣＤ８＋Ｔ細胞が存在する（ｐ≦０．０５、マンホイットニーのＵ検定）。
【図２３】ＡはＬＰＰ（５）−ＳＨｅタンパク質の発現および精製の図である。ＬＰＰ（５）−ＳＨｅタンパク質の発現の図である。ｐＬＨ３６−ＨｉｓＤＥＶＤ−ＬＰＰ（５）−ＳＨｅ形質転換Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は１ｍＭの１−チオ−β−ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で刺激した、または無刺激のいずれかであった。４時間後、粗製抽出物は超音波処理、次に遠心分離（１３０００×ｇ、３０分、４℃）によって調製した。ＳＨｅ特異的３Ｇ８モノクローナル抗体を使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングにより上清を分析した。ＢはＬＰＰ（５）−ＳＨｅタンパク質の発現および精製の図である。精製ＬＰＰ（５）−ＳＨｅタンパク質の分析の図である。精製後、ＳＨｅ特異的３Ｇ８モノクローナル抗体を使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クーマシーブルー染色（左）およびウエスタンブロット（右）解析によりＬＰＰ（５）−ＳＨｅタンパク質を分析した。
【図２４】コットンラットの予防接種スケジュールの図である。グループの数字は以下のことを指す：  グループ１：６匹のコットンラット（ＣＲ）、第６３日過ぎまでＲＳＶによる予防接種および攻撃なし（感染対照）  グループ２：６匹のＣＲ、第０日に２．０４×１０５ＰＦＵ／ＣＲでＲＳＶ−Ｔｒａｃｙを鼻腔内接種  グループ３：６匹のＣＲ、ＫＬＨ−ＳＨｅ＋ＩＦＡをそれぞれ腹腔内（ＩＰ）予防接種  グループ４：６匹のＣＲ、ＫＬＨ＋ＩＦＡをそれぞれ腹腔内（ＩＰ）予防接種（賦形剤対照）  グループ５：６匹のＣＲ、Ｖｅｒｏ細胞で増殖した１：１０ホルマリン不活化（ＦＩ）ＲＳＶ−Ｂｅｒｎｅｔｔをそれぞれ筋肉内（ＩＭ）予防接種（攻撃による免疫悪化の陽性対照）
【実施例】
【００２２】
実施例の材料および方法
クローニングおよびプラスミド構築。
ｐＬＴ３２Ｆｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅ発現プラスミドの構築。Ｆｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅのコード配列（図１．Ｂ）を含有するプラスミドはＧｅｎｓｃｒｉｐｔ（配列番号３１）でオーダーした。Ｆｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅコード配列は、ＮｄｅＩ／ＮｏｔＩで開いたｐＬＴ３２Ｈ細菌発現ベクターにおいてＮｄｅＩ／ＮｏｔＩ断片として連結させた（Ｍｅｒｔｅｎｓら、１９９５）。
【００２３】
ｐＣＡＧＧＳ−Ｅｔａｇ−ＳＨ発現ベクターの構築。ＲＳＶ  Ａ２感染Ｈｅｐ−２細胞の全ＲＮＡは、製造者の説明書に従い高純度ＲＮＡ組織キット（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して調製した。ｃＤＮＡ合成後、ＲＳＶ  Ａ２  ＳＨコード配列を、以下のフォワードプライマーとリバースプライマー（５’ＡＴＡＡＧＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＴＧＧＡＡＡＡＴＡＣＡＴＣＣＡＴＡＡＣＡＡＴＡＧ３’；５’ＧＡＡＧＡＴＣＴＣＴＡＴＧＴＧＴＴＧＡＣＴＣＧＡＧＣＴＣＴＴＧＧＴＡＡＣＴＣＡＡＡ３’）を使用して増幅した。ＰＣＲ産物はＮｏｔＩおよびＢｇＩＩＩで消化し、ＮｏｔＩ／ＢｇＩＩＩで開いたｐＣＡＧＧＳ−ＰＴＢ−Ｅｔａｇ発現ベクターにおいて連結させた（Ｃｏｒｎｅｌｉｓら、２００５）。生成したベクターｐＬＴ３２−Ｆｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅは、２０１０年１１月８日に寄託番号ＬＭＢＰ６８１７の下、ＢＣＣＭ（ＢＣＣＭ／ＬＭＢＰ：Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｐａｒｋ  ９２７、９０５２  Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ、ベルギー）においてブダペスト条約下で寄託された。
【００２４】
ｐＣＡＧＧＳ−Ｌｕｃ発現ベクターの構築は以前に記載された（Ｓｃｈｅｐｅｎｓら、２００５；ｐＣＡＧＧＳ−ＨＩＦ−ＲＬｕｃと呼ばれる）。
【００２５】
ｐＬＴ３２ｍＨＢｃ発現ベクターの構築。「ａｂ１」プラスミドの一部としてＪｅｇｅｒｌｈｅｎｅｒらにより以前に記載されたｍＨＢｃのコード配列はＧｅｎｅａｒｔ（配列番号３２）でオーダーした（Ｄｅ  Ｆｉｌｅｔｔｅら、２００５；Ｊｅｇｅｒｌｅｈｎｅｒら、２００２）。このコード配列は、ＮｄｅＩ／ＮｏｔＩで開いたｐＬＴ３２Ｈ細菌発現ベクターにおいてＮｄｅＩ／ＮｏｔＩ断片としてクローニングした。
【００２６】
ｐＬＴ３２ＳＨｅ−ｔＧＣＮ４−Ｆｌａｇ発現ベクターの構築。ｐＬＴ３２ＳＨｅ−ｔＧＣＮ４を構築するため、ＳＨｅコード配列を融合ｐｃｒによりｔＧＣＮ４−Ｆｌａｇコード配列と融合させた。融合ｐｃｒ用のＳＨｅ断片は、プライマー：５’ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＡＣＡＡＧＴＴＡＴＧＴＧＡＧＴＡＣＡＡＣＧ３’および５’ＧＡＴＴＴＧＴＴＴＴＡＡＡＣＣＴＣＣＴＧＴＡＴＴＴＡＣＴＣＧＴＧＣＣＣＧＡＧＧＣＡＡ３’、およびＧｅｎｅａｒｔ（配列番号３３）でオーダーしＲＳＶ  Ａ２  ＳＨ外部ドメインのコード配列（ＮＫＬＣＥＹＮＶＦＨＮＫＴＦＥＬＰＲＡＲＶＮＴ）（配列番号４０）を含有する鋳型プラスミドを使用して増幅した。融合ＰＣＲ用のＧＣＮ４断片は、プライマー５’ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＡＣＡＴＴＧＡＧＡＴＴＣＣＣＧＡＧＡＴＴＧＡＧＡ３’および５’ＴＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＡＧＧ３’、およびｔＧＣＮ４コード配列を含有し、３連続Ｆｌａｇ−ｔａｇ配列（配列番号３４；Ｄｅ  Ｆｉｌｅｔｔｅら、２００８）のコード配列とＣ末端融合した鋳型プラスミドを使用して増幅した。この２つのＰＣＲ断片は、プライマー：５’ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＡＣＡＡＧＴＴＡＴＧＴＧＡＧＴＡＣＡＡＣＧ３’および５’ＴＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＡＧＧ３’を使用して融合させた。この融合ＰＣＲ産物は、ＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで開いたｐＬＴ３２Ｈ細菌発現ベクターにおいてＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片としてクローニングした。生成したｐＬＴ３２ＳＨｅ−ｔＧＣＮ４−Ｆｌａｇは、２０１０年１１月８日に寄託番号ＬＭＢＰ６８１８の下、ＢＣＣＭ（ＢＣＣＭ／ＬＭＢＰ：Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｐａｒｋ  ９２７、９０５２  Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ、ベルギー）においてブダペスト条約下で寄託された。
【００２７】
ＰＬＴ３２Ｍ２ｅ−ｔＧＣＮ４発現ベクターの構築は以前に記載された（Ｄｅ  Ｆｉｌｅｔｔｅら、２００８）。
【００２８】
ｐＬＨ３６−ＨｉｓＤＥＶＤ−ＬＰＰ（５）−ＳＨｅ発現プラスミドの構築。ＧｌｙＧｌｙリンカーのコード配列により隔てられたＳＨ外部ドメインのコード配列と融合したＬＰＰ（５）トリプトファン−ジッパーのコード配列を含有するプラスミドは、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔでオーダーした。このコード配列は、以下のフォワードプライマーとリバースプライマー（５’ＧＣＧＡＡＡＴＧＧＧＡＴＣＡＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣ−３’；５’ＡＡＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣＣＴＡＧＧＴＣＧＣＣＣＡＧＴＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧ−３’）を使用して増幅し、リン酸化しＢａｍＨＩで消化した。ｐＬＨ３６−ＨｉｓＤＥＶＤ−ＬＰＰ−ＳＨｅは、記載したＰＣＲ断片、ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ消化型ｐＬＴ３２プラスミド断片およびＥｃｏＲＶ／ＰｓｔＩ消化型ｐＬＨ３６断片を使用しツリーポイントライゲーションによって構築した。構築したｐＬＨ３６−ＨｉｓＤＥＶＤ−ＬＰＰ（５）−ＳＨｅプラスミドの配列は配列番号４９で示す。
【００２９】
ＳＨｅ−ｔＧＣＮ４、Ｍ２ｅ−ｔＧＣＮ４、Ｆｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅ、ｍＨＢｃおよびＬＰＰ（５）−ＳＨｅの発現および精製。
ｐＬＴ３２ＳＨｅ−ｔＧＣＮ４形質転換Ｅ．コリの３０ｍｌ前培養物をＬｕｒｉａブロス内で２８℃において増殖させ、これを使用して１リットルの新たな培地を接種した。０．６−０．８のＡ６００において、細胞を１ｍｍのイソプロピル１−チオ−β−ｄ−ガラクトピラノシドで処理し、さらに４時間インキュベートし、次いで遠心分離（６０００×ｇ、２０分、４℃）によって回収した。細菌のペレットは２０ｍｌのトリス−ＨＣｌバッファー（５０ｍＭのトリス−Ｈｃｌ、５０ｍＭのＮａＣｌおよび１ｍＭのＥＤＴＡ）、ｐＨ８中に再縣濁し、超音波処理した。細菌の残骸は遠心分離（２０，０００×ｇ、１時間、４℃）によってペレット状にした。上清を、５０ｍＭのＮａＣｌを含有するトリス−ＨＣｌバッファー（バッファーＡ）で予め平衡化したＤＥＡＥセファロースカラムにかけた。洗浄後、０−４０％バッファーＢ（５０ｍＭのトリス−Ｈｃｌ、１ＭのＮａＣｌ）から４０−１００％バッファーＢまでの２ステップ勾配により結合タンパク質を溶離した。ＳＨｅ−ｔＧＣＮ４を含有する分画をプールし、２５％硫酸アンモニウム飽和状態に調節し、２５％硫酸アンモニウム、５０ｍｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８で予め平衡化したフェニル−セファロースカラムにかけた。結合タンパク質は２ステップ勾配で溶離した。２ステップの溶離は、０−４０％および４０−１００％の５０ｍＭトリス−ＨＣｌバッファー、ｐＨ８（バッファーＡ）で実施した。ＳＨｅ−ｔＧＣＮ４を含有する分画はＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムに充填した。ゲル濾過はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で実施し、ＳＨｅ−ｔＧＣＮ４を含有する分画はプールし−７０℃で保存した。
【００３０】
ｆｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅの発現および精製は、ＤＥＡＥセファロースカラムの代わりにアニオン交換クロマトグラフィー用のＱセファロースカラムを使用したこと以外、ＳＨｅ−ｔＧＣＮ４と同一であった。
【００３１】
Ｍ２ｅ−ｔＧＣＮ４の発現および精製は以前に記載された（Ｄｅ  Ｆｉｌｅｔｔｅら、２００８）。ｍＨＢｃの発現および精製は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムの代わりにゲル濾過クロマトグラフィー用Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ４００カラムを使用したこと以外、ＳＨｅ−ｔＧＣＮ４と同一であった。
【００３２】
ＬＰＰ（５）−ＳＨｅの発現および精製。ｐＬＨ３６−ＨｉｓＤＥＶＤ−ＬＰＰ（５）−ＳＨｅ形質転換Ｅ．コリの３０ｍｌ前培養物を、アンピシリンを含むＬｕｒｉａブロス内で２８℃において増殖させ、これを使用して３リットルの新たな培地を接種した。０．６−０．８のＡ６００において、細胞を１ｍＭのイソプロピル１−チオ−β−ｄ−ガラクトピラノシドで処理し、さらに４時間インキュベートし、次いで遠心分離（６０００×ｇ、２０分、４℃）によって回収した。細菌のペレットは、２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのイミダゾールを含有する３００ｍｌバッファー、ｐＨ７．５中に再縣濁し、超音波処理した。細菌の残骸は遠心分離（２０，０００×ｇ、１時間、４℃）によってペレット状にした。５ｍＭイミダゾールを含有するバッファーで予め平衡化したニッケル−セファロースカラムに、上清を充填した。洗浄後、段階的（５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭおよび４００ｍＭ）イミダゾール勾配により結合タンパク質を溶離した。ＬＰＰ（５）−ＳＨｅを含有する分画をプールし、脱塩し、Ｑ−セファロースカラムでさらに精製した。サンプルを、５０ｍＭのＮａＣｌを含有するトリス−ＨＣｌバッファー（バッファーＡ）で予め平衡化したＤＥＡＥセファロースカラムにかけた。洗浄後、０−４０％バッファーＢ（５０ｍＭのトリス−Ｈｃｌ、１ＭのＮａＣｌ）から４０−１００％バッファーまでの２ステップ勾配により結合タンパク質を溶離した。ＬＰＰ（５）−ＳＨｅを含有する分画はＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムに充填した。ゲル濾過は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、およびＬＰＰ（５）−ＳＨｅを含有する分画で実施した。
【００３３】
アジュバント
熱不安定性Ｅ．コリエンテロトキシンの解毒変異体、ＬＴＲ１９２Ｇを鼻腔内（ｉ．ｎ．）投与に使用した。この調製物は寛大なことにＤｒ．Ｊ．Ｃｌｅｍｅｎｔｓ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｔｕｌａｎｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｎｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓ、ＬＡ、ＵＳＡ）によって提供された（Ｎｏｒｔｏｎら、２０１０）。
【００３４】
Ｓｈｅ−ＨＢｃ粒子の化学結合および特徴付け。
その中で天然由来のシステインがセリンに置換されＮ末端にシステインが付加された、ＳＨｅ（ｃｃ４ｓ）、化学合成したＨＰＬＣ精製ＳＨｅペプチドを、Ｐｅｐｓｃａｎ（Ｐｅｐｓｃａｎ、Ｌｅｌｙｓｔａｄ）でオーダーした。ＳＨｅ（ｃｃ４ｓ）ペプチドは、そのＮ末端システイン残基を介して、製造者の説明書に従いヘテロ二官能性スルホ−ＭＢＳ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用した化学結合により、ＨＢｃ  ＶＬＰ表面上のｍＨＢｃの免疫優性ループ中のリシンと融合させた。わずか４００μｇのｍＨＢｃを溶かした２００μｌのＰＢＳをスルホ−ＭＢＳと１時間、（１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で）インキュベートした。サイズ排除クロマトグラフィーによる非結合スルホ−ＭＢＳ分子の除去後、スルホ−ＭＢＳ結合ｍＨＢｃ  ＶＬＰは２ｍｌのＨ２Ｏに希釈した。後に、（１００ｍｌのＰＢＳに溶かした）１００μｌのＳＨｅ（ｃｃ４ｓ）ペプチドを加え、室温で１時間インキュベートして、ｍＨＢｃ  ＶＬＰとペプチドの架橋を可能にした。最後に、遊離ＳＨｅ（ｃｃ４ｓ）ペプチドをサイズ排除クロマトグラフィーにより除去した。純度および架橋効率は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次にクーマシー染色によって試験した。
【００３５】
細胞
Ｈｅｐ−２細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２３）、Ｖｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−８１）、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｄｒ  Ｍ．Ｈａｌｌからの進物）およびＡ５４９細胞ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−１８５）を、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア）、および１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを補充したＤＭＥＭ培地中で増殖させた。
【００３６】
マウスおよびウイルス。
特定病原体を含まない、メスのＢＡＬＢ／ｃマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｗｉｇａ、Ｓｕｌｚｆｅｌｄ、ドイツ）から得た。動物は１２時間光／暗サイクルで温度調節した環境中に収容し、食物および水は制限せず与えた。動物実験室内で１週間適応させた後、マウスは８週齢で免疫処置した。
【００３７】
動物実験施設は、Ｆｌｅｍｉｓｈ  Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｌｉｃｅｎｓｅ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＬＡ１４０００９１下に管理される。全ての実験は、法律（１９９３年１１月１４日のＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｒｏｙａｌ  Ｄｅｃｒｅｅ）によって指定され動物実験倫理審査委員会によって認可された条件下で行った。
【００３８】
ＲＳＶ  Ａ２、ＲＳＶのＡ亜型（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）を、１％ＦＣＳを含有する増殖培地の存在下における０．１ＭＯＩでの単層Ｖｅｒｏ細胞の感染により増殖させた。感染後５から７日で、細胞および増殖培地を回収、プールし遠心分離（４５０×ｇ）によって浄化した。ウイルスを濃縮するため、浄化した上清を、１０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）の存在下において４℃で４時間インキュベートした。遠心分離（３０００×ｇで３０分間）後、２０％スクロースを含有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中にペレットを再縣濁し、アリコートにし−８０℃で保存した。
【００３９】
鼻腔内免疫処置および感染。
鼻腔内免疫処置または感染用に、マウスにイソフルランによって軽く麻酔をかけた。ワクチン＋アジュバントまたはウイルスの投与に使用した最終容積は５０μｌであった（鼻孔当たり２５μｌ）。ワクチン＋アジュバントはＰＢＳで製剤化し、一方ウイルス接種原はＨＢＳＳで製剤化した。
【００４０】
プラークアッセイによる肺中ウイルス力価の決定。
攻撃後３日または４日でマウスを屠殺した。マウス肺は無菌状態で除去し、１０％スクロースを含有する１ｍｌのＨＢＳＳにおいて３０秒間Ｈｅｉｄｏｌｐｈ  ＲＺＲ２０２０ホモジェナイザーを用いて均質にした。肺ホモジネートは４℃での遠心分離により後に浄化し、Ｈｅｐ−２細胞におけるウイルス滴定に使用した。単層のＨｅｐ−２細胞には、９６ウエルプレート中、ペニシリンとストレプトマイシンを補充した無血清ＯＰＴＩＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、５０μｌの連続１：３希釈肺ホモジネートを感染させた。４時間後、２％ＦＣＳを含有するＤＥＭＥＭ培地で２回細胞を洗浄し、５０μｌのオーバーレイ培地（１％ＦＣＳ、０．５％アガロースを含有する完全ＤＥＭＥＭ培地）において３７℃で５日間インキュベートした。アガロースオーバーレイの上部に５０ｕｌの４％パラホルムアルデヒド溶液を加えることにより、細胞を固定した。４℃での一晩の固定後、オーバーレイ培地およびパラホルムアルデヒド溶液を除去し、細胞はＰＢＳで２回洗浄し、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ（ＰＢＳ／ＢＳＡ）でブロッキングした。その後、ポリクローナルヤギ抗ＲＳＶ血清（ＡＢ１１２８、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を加えた（１／４０００）。ＰＢＳ／ＢＳＡで３回洗浄した後、細胞はｈｒｐ結合抗ヤギＩｇＧ抗体（ＳＣ２０２０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）と共に３０分間インキュベートした。非結合抗体は、０．０１％トリトン−Ｘ１００を含有するＰＢＳ／ＢＳＡでの４回の洗浄、およびＰＢＳでの１回の洗浄によって除去した。最後に、ＴｒｕｅＢｌｕｅペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）の使用によって、プラークを目に見える状態にした。異なる希釈のプラークを計数し、それぞれの希釈に関して、肺（１ｍｌ）当たりのＰＦＵ数は、希釈中に存在したプラークの数×希釈×２０（＝合計１０００μｌの上清容積／希釈系列の第一ウエルの感染に使用した５０μｌの上清容積）として計算した。次いでＰＦＵ／肺の数を、異なる希釈に関して計算したＰＦＵ／肺の平均数として計算した。ホモジナイズした肺の各上清は二連で試験したので、最終的なＰＦＵ／肺の数はこれら二連の平均として計算した。
【００４１】
ｑＲＴ−ＰＣＲによる肺中ウイルス力価の決定。
ｑＲＴ−ＰＣＲによって肺ＲＳＶ負荷を決定するため、前に記載したのと同様に肺ホモジネートを調製し浄化した。これらの肺ホモジネート由来の全ＲＮＡは、製造者の説明書に従い高純度ＲＮＡ組織キット（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の使用によって調製した。ヘキサマープライマーおよびＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の使用によってｃＤＮＡを調製した。ゲノムＲＳＶ  Ｍ  ｃＤＮＡの相対レベルは、ＲＳＶ  Ａ２  Ｍ−遺伝子のゲノムＲＮＡに特異的なプライマー（５’ＴＣＡＣＧＡＡＧＧＣＴＣＣＡＣＡＴＡＣＡ３’および５’ＧＣＡＧＧＧＴＣＡＴＣＧＴＣＴＴＴＴＴＣ３’）、ならびに５’末端をフルオレセイン（ＦＡＭ）および３’末端付近を黒色消光色素で標識したヌクレオチドプローブ（＃１５０  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ、Ｒｏｃｈｅ）の使用によって、ｑＲＴ−ＰＣＲにより決定した。ＧＡＤＰＨ  ｍＲＮＡの相対量は、マウスＧＡＤＰＨに特異的なプライマー（５’ＴＧＡＡＧＣＡＧＧＣＡＴＣＴＧＡＧＧＧ３’および５’ＣＧＡＡＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＴＧＧＧＡＧ３’、ならびにＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  Ｍａｓｅｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）の使用により、ｑＲＴ−ＰＣＲにより決定した。肺ホモジネート当たりのゲノムＲＳＶ  ＲＮＡの相対量は、ＲＳＶ  Ｍ−遺伝子ＲＮＡの相対量とマウスＧＡＤＰＨｍ  ＲＮＡの相対量の間の比として計算した。
【００４２】
ペプチドＥＬＩＳＡ
各免疫処置後２週間で、血液サンプルを外側尾静脈から回収した。アベルチンで麻酔した動物の心臓穿刺により最終出血を実施した。血液を３７℃で３０分間凝固させ、その後の２回の遠心分離から上清を得ることにより血清を入手した。
【００４３】
血清抗体力価を、グループからプールした血清を使用してＥＬＩＳＡにより決定した。Ｍ２ｅまたはＳＨｅ特異的抗体力価を決定するため、マイクロタイタープレート（タイプＩＩ  Ｆ９６  ＭａｘｉＳｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）を、それぞれ５０ｍＭ重炭酸ナトリウムバッファー、ｐＨ９．７中５０μｌの２μｇ／ｍｌのＭ２ｅ−ペプチド溶液または２μｇ／ｍｌのＳＨｅ−ペプチド溶液でコーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。洗浄後、ＰＢＳ中１％２００μｌのＢＳＡで１時間、プレートをブロッキングした。１時間のインキュベーション後、プレートを再度洗浄した。１／１００希釈で始めた異なる血清サンプルの１／３希釈系列を、ペプチドコーティングプレートに充填した。結合抗体は、マウスアイソタイプＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａに対するペルオキシダーゼ標識抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ、ＵＳＡ）で検出し、ＰＢＳ＋１％  ＢＳＡ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０中に１／６０００に希釈した。洗浄後、マイクロタイタープレートをＴＭＢ基質（テトラメチルベンジジン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と５分間インキュベートした。反応は等容積の１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４を加えることにより停止させ、４５０ｎｍで吸光度を測定した。終点力価は、バックグラウンド（免疫前血清）の２倍のＯ．Ｄ．値をもたらす最高希釈として定義する。
【００４４】
フローサイトメトリー解析。
Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞を示した発現ベクターでトランスフェクトした。２４時間後、酵素を含まない解離バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｓｌｂａｄ、カリフォルニア）を使用して細胞を剥離し、ＰＢＳで１回洗浄し、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ（ＰＢＳ／ＢＳＡ）中で１時間インキュベートした。その後、示した濃度で示した血清または抗体と共に、細胞をインキュベートした。１時間後、細胞はＰＢＳ／ＢＳＡで３回洗浄し、抗マウスＩｇＧ  ａｌｅｘａ６３３二次抗体と共に３０分間インキュベートした。ＰＢＳ／ＢＳＡで４回およびＰＢＳで１回細胞を洗浄した後、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーターを使用して細胞を分析した。一種のＧＦＰ発現細胞を、側方散乱シグナルのピーク表面、前方散乱シグナルのピーク表面およびピーク高、および緑色蛍光シグナルのピーク表面に基づいて選択した。最後に、これらのＧＦＰ陽性単細胞の中で、ａｌｅｘａ６３３蛍光シグナルを測定した。
【００４５】
免疫染色。
Ｖｅｒｏ細胞を擬似感染、または無血清培地の存在下において０．５ＭＯＩのＲＳＶ  Ａ２で感染させた。４時間後、遊離ウイルスは洗浄除去し、１％ＦＣＳを含有する増殖培地中で細胞をインキュベートした。１６時間後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、２％パラホルムアルデヒドで２０分間固定した。その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５分間０．２％トリトン−Ｘ１００洗剤で透過処理した。ＰＢＳで１回洗浄した後、細胞はＰＢＳ／ＢＳＡでブロッキングした。１時間後、Ｓｈｅ特異的３Ｇ８モノクローナル抗体またはアイソタイプ対照抗体を５μｇ／ｍｌの最終濃度で加えた。ＰＢＳ／ＢＳＡで２回細胞を洗浄した後、ポリクローナル抗ＲＳＶヤギ血清を加えた。１時間後、細胞をＰＢＳ／ＢＳＡで３回洗浄した。細胞と示した抗体の結合は、それぞれａｌｅｘａ４８８とａｌｅｘａ５６８蛍光色素で標識した抗マウスと抗ヤギＩｇＧ抗体の使用により分析した。染色細胞の共焦点画像はＺｅｉｓｓ共焦点顕微鏡で記録した。
【００４６】
ＳＨｅモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作成。
ＳＨｅ特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を産生する安定的ハイブリドーマ細胞を、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  １９７５）によって作成した。簡単に言うと、ＳＨｅ特異的ハイブリドーマを、オールハイドロゲルを補充した１０μｇのＳＨｅ−ｔＧＣＮ４ワクチン（Ｂｒｅｎｎｔａｇ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ）を用いて３週間間隔で３回腹腔内免疫処置した個々のマウスから誘導した。融合３日前に、マウスを同じ製剤でもう１回追加抗原刺激し、脾臓細胞を単離し、次いでＰＥＧ１５００（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、ドイツ）の存在下でＳＰ２／０−Ａｇ１４ミエローマ細胞と融合させた。融合した細胞は、１０％ウシ胎児血清、１０％ＢＭコンディムドＨ１（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、ドイツ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、および２４μＭのβ−メルカプトエタノールおよび１×ＨＡＴサプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で増殖させた。ＳＨｅ特異的抗体を分泌するハイブリッドはＳＨｅペプチドＥｌｉｓａスクリーニングによって同定し、モノクローナル抗体産生ハイブリッドは、限界希釈手順による２ラウンドのサブクローニング後に得た。モノクローナル抗体は、プロテインＡ−セファロースカラム（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で精製した。
【００４７】
生成したハイブリドーマは、それぞれ２０１０年１１月８日に３Ｇ８に関して寄託番号ＬＭＢＰ７７９５ＣＢ、および２０１０年１１月１０日に３Ｄ１１に関して寄託番号ＬＭＢＰ７７９６ＣＢの下、ＢＣＣＭ（ＢＣＣＭ／ＬＭＢＰ：Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｐａｒｋ  ９２７、９０５２  Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ、ベルギー）においてブダペスト条約下で寄託された。
【００４８】
［実施例１］  Ｆｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−Ｓｈｅの設計、発現および精製
ＳＨタンパク質は、ＲＳＶビリオンの表面、およびＲＳＶ感染細胞の原形質膜で、ペンタマーとして発現される。ＳＨのペンタマー構造は、５パラレルα−ヘリックスのコイルドコイルとしてオリゴマー化するＳＨ膜貫通型ドメインによって構造化される。その本来の立体配座を模倣するペンタマーとしてＲＳＶ  ＡのＣ末端ＳＨ外部ドメイン（ＳＨｅ）を提示するために、これも５パラレルα−ヘリックスで構成されるラット軟骨オリゴマー基質タンパク質の短いペンタマーコイルドコイルドメイン（ＣＯＭＰｃｃ）と、ＳＨｅを遺伝学的に融合させた（Ｍａｌａｓｈｋｅｖｉｃｈら、１９９６；図１）。Ｆｌａｇ−タグをＣＯＭＰのＮ末端と融合させ、Ｆｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅにした。Ｆｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅはｐＬＴ−３２（Ｍｅｒｔｅｎｓら、１９９５）発現ベクターにおいてクローニングし、Ｅ．コリ中で発現させ精製した。ゲル濾過分析によりＦｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅが５５−６０ｋＤａ複合体として溶離したことを明らかにし、１１ｋＤａのＦｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅタンパク質は実際ペンタマーとしてオリゴマー化することを示した（図２）。
【００４９】
［実施例２］  Ｆｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅの予防接種は、ＳＨｅ特異的抗体およびＲＳＶ感染に対する防御を誘導する
Ｆｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅを用いた予防接種が、ＲＳＶ感染に対する防御を誘発し得るかどうか試験するために、本発明者らはＢＡＬＢ／ｃマウスＲＳＶ感染モデルを使用した。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、１μｇのＥ．コリ熱不安定性エンテロトキシンＬＴＲ１９２Ｇアジュバントと組み合わせた２５μｇのＦｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅで３回鼻腔内免疫処置した。テトラマーＧＮＣ４足場と融合したＰＢＳおよびインフルエンザＡ  Ｍ２外部ドメインは（Ｍ２ｅ−ｔＧＮＣ４）（Ｄｅ  Ｆｉｌｅｔｔｅら、２００８）は陰性対照として使用した。免疫処置は２週間毎に実施した。１つのＲＳＶ感染（５×１０５ＰＦＵ）は陽性対照として使用した。各免疫処置後の第一週と第二週の間に、血液を回収してＳＨｅ特異的ＩｇＧ抗体の誘導を調べた。ＳＨｅ特異的抗体の存在は、最初にＳＨｅペプチドＥＬＩＳＡによって試験した。Ｍ２ｅペプチドＥＬＩＳＡは陰性対照として使用した。図３は、ＳＨｅペプチド特異的ＩｇＧ抗体を誘導し、それぞれＦｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅによる第二および第三免疫処置後に追加抗原刺激することを実証する。３連続のＦｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅ／ＬＴＲ１９２Ｇ免疫処置は高レベルのＩｇＧ２ａ  ＳＨｅ特異的抗体、ただしごく低レベルのＩｇＧ１ＳＨｅ特異的抗体をもたらし、Ｔｈ１指向型／誘導型免疫応答を示した。ＰＢＳまたはＭ２ｅ−ｔＧＣＮ４／ＬＴＲ１９２Ｇ予防接種マウスにおいて、ＳＨｅ特異的ＩｇＧ抗体を検出することはできなかった（図３Ａ、ＢおよびＣ）。予想通り、Ｆｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅ／ＬＴＲ１９２ＧまたはＰＢＳ予防接種マウスデータの血清において、Ｍ２ｅ特異的抗体を検出することはできなかった。以前の結果（Ｄｅ  Ｆｉｌｅｔｔｅら、２００８）に従い、Ｍ２ｅ−ｔＧＣＮ４で免疫処置したマウスは高力価のＭ２ｅ特異的ＩｇＧ２ａ抗体を蓄積した。
【００５０】
次に本発明者らは、フローサイトメトリーにより、Ｆｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅ免疫血清中に存在したＳＨｅ特異的抗体が、それらの表面でＲＳＶ−ＳＨタンパク質を発現する細胞と結合可能であるかどうか調べた。ＳＨ発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ−Ｅｔａｇ−ＳＨ）または陰性対照としてルシフェラーゼ発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ−Ｌｕｃ）のいずれかと組み合わせたＧＦＰ発現ベクターで、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後２４時間で、細胞を剥離し、異なる希釈のＦｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅまたはＭ２ｅ−ｔＧＣＮ４免疫血清で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。図４は、Ｍ２ｅ−ｔＧＣＮ４免疫血清とは対照的に、Ｆｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅ予防接種マウス由来の血清は、生きた細胞の表面で発現されるＳＨタンパク質と特異的に結合することを示す。
【００５１】
Ｆｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅ／ＬＴＲ１９２Ｇ予防接種が、ＲＳＶ感染に対する防御を誘導することができるかどうか試験するために、最後の免疫処置後９週間で、１×１０６のＰＦＵ  ＲＳＶ  Ａ２でマウスを攻撃した。感染後４日でマウスを屠殺し、プラークアッセイにより肺中ウイルス力価を決定した。図５は、ＰＢＳおよびＭ２ｅ−ｔＧＣＮ４予防接種マウスと比較して、Ｆｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅを用いた予防接種がＲＳＶ複製を低下させたことを示す。攻撃前に生きたＲＳＶを感染させたマウスにおいて、ウイルスは検出されなかった。
【００５２】
ホルマリン不活化ウイルスまたはＲＳＶ  Ｇタンパク質を用いた予防接種は感染時に疾患の増大を誘導し、不均衡なＴｈ２免疫応答の誘導により相当な罹患率をもたらし得ることはよく知られている（Ｐｒｉｎｃｅら、１９８６）。Ｆｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅ予防接種も疾患の増大を誘導し得るかどうか試験するために、本発明者らは、ＲＳＶ攻撃前後に体重をモニタリングした（図６）。ＲＳＶ攻撃後いかなるマウスのグループにおいても、体重の減少は観察されなかった。これは、Ｆｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅ予防接種がＲＳＶ感染時に疾患の増大をもたらさないことを強く示唆する。
【００５３】
［実施例３］  ｍＨＢｃ−ＳＨｅの設計、構築および精製
Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質（ＨＢｃ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、密なアレイとして抗原を提示することができる。このようにしてＨＢｃ−ＶＬＰは、提示抗原に対する強力な液性免疫応答を誘導することができる（Ｂｏｉｓｇｅｒａｕｌｔら、２００２）。したがって、ペンタマーとしてのＳＨｅの提示に対する代替として、ｍＨＢｃ−ＶＬＰの免疫優性領域ループにＳＨ外部ドメインを提示した。ＨＢｃ−ＳＨｅ−ＶＬＰは、リシンがＨＢｃ免疫優性領域の上部に導入されたＨＢｃの変異体であるｍＨＢｃとＳＨｅペプチドの化学結合によって得られた（Ｄｅ  Ｆｉｌｅｔｔｅら、２００５）。化学結合を可能にするため、システイン残基をＳＨｅのＮ末端に加えた。加えて、ＳＨｅペプチドの位置４に存在するシステイン残基をセリン残基に置換した。このペプチドをＳＨｅ−ＣＣ４Ｓと呼んだ。サイズ排除クロマトグラフィーによるｍＨＢｃ−ＳＨｅ−ＶＬＰの精製後、架橋の程度をＳＤＳ  ＰＡＧＥによって調べた。図７は、約５０％のＨＢｃタンパク質がＳＨｅ−ＣＣ４Ｓペプチドと化学結合したことを示す。ゆっくり移動したバンドは、２または３個のＳＨｅ（ｃｃ４ｓ）ペプチドが結合したｍＨＢｃモノマーを表し得る。ＳＨｅＣＣ４Ｓ結合ｍＨＢｃタンパク質が依然予想される大きさ（３０−３４ｎｍ）のＶＬＰに構築するかどうか試験するために、動的光散乱法による分析を、生成されたｍＨＢｃ−ＳＨｅ粒子および完全に機能的な参照物である１６０４Ｍ２ｅ−ＨＢｃ  ＶＬＰに実施した。図８は、ｍＨＢｃ−ＳＨｅ−ＣＣ４Ｓの大きさ分布は１６０４Ｍ２ｅ−ＨＢｃ対照のそれと重複し、３０ｎｍにおいて最大値であり、それはＨＢｃ  ＶＬＰの報告された大きさ（Ｃｌａｒｋｅら、１９８７）に相当することを示す。
【００５４】
［実施例４］  ＳＨｅ−ｔＧＣＮ４−Ｆｌａｇの設計、構築および精製
ｍＨＢｃ  ＶＬＰの表面上でのＳＨｅペプチドの提示に次いで、融合ペプチド（Ｒｅｆｍａｒｉｎａ  ＧＣＮ４）に対する強力な液性応答を誘導することが知られているｔＧＣＮ４とも、ＳＨｅを融合させた。ＳＨｅとＦｌａｇ−タグは、それぞれｔＧＣＮ４コード配列の５’末端と３’末端で遺伝学的に結合させ、ＰＬＴ３２発現ベクターにクローニングした。Ｅ．コリにおける発現後、アニオン交換、疎水性相互作用およびゲル濾過クロマトグラフィーにより組換えＳＨｅ−ｔＧＣＮ４−Ｆｌａｇを精製した（図９）。
【００５５】
［実施例５］  ｍＨＢｃ−ＳＨｅ（ＣＣ４Ｓ）およびＳＨｅ−ｔＧＣＮ４の予防接種は、ＳＨｅ特異的抗体およびＲＳＶ感染に対する防御を誘導する
ｍＨＢｃ−ＳＨｅ（ＣＣ４Ｓ）およびＳＨｅ−ｔＧＣＮ４を用いた予防接種が、ＲＳＶ感染に対する防御を誘発し得るかどうか試験するために、１ｕｇのＬＴＲ１９２Ｇアジュバントと組み合わせた１０μｇのｍＨＢｃ−ＳＨｅ（ＣＣ４Ｓ）およびＳＨｅ−ｔＧＣＮ４で、Ｂａｌｂ／ｃマウスを３回鼻腔内予防接種した。ＰＢＳおよび空ｍＨＢｃを、後者は１ｕｇのＬＴＲ１９２Ｇと組み合わせて、陰性対照として使用した。免疫処置は３週間毎に実施した。１つのＲＳＶ感染（５．１０５ＰＦＵ）は陽性対照として使用した。各免疫処置後の第二週と第三週の間に、血液を回収してＳＨｅ特異的ＩｇＧ抗体の誘導を調べた。Ｓｈｅ特異的抗体の存在は、ＳＨｅペプチドＥＬＩＳＡによって試験した。図１０Ａは、ＳＨｅペプチド特異的ＩｇＧ抗体を誘導し、それぞれｍＨＢｃ−ＳＨｅ（ＣＣ４Ｓ）およびＳＨｅ−ｔＧＣＮ４による第二および第三免疫処置後に追加抗原刺激することを実証する。３連続のＦｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅ／ＬＴＲ１９２Ｇ免疫処置は高レベルのＩｇＧ２ａ  ＳＨｅ特異的抗体、および幾分低いレベルのＩｇＧ１ＳＨｅ特異的抗体をもたらし、Ｔｈ１指向型／誘導型免疫応答を示した（図１０Ｂ）。
【００５６】
ｍＨＢｃ−ＳＨｅ（ＣＣ４Ｓ）またはＳＨｅ−ｔＧＣＮ４を用いた予防接種が、ＲＳＶ感染を妨げることができるかどうか試験するために、最後の追加抗原刺激による免疫処置後３週間で、５．１０６ＰＦＵのＲＳＶ−Ａ２でマウスを攻撃した。攻撃後３日でマウスを屠殺し、ＱＰＣＲにより肺中ＲＳＶ−Ａ２レベルを決定した。図１１は、ｍＨＢｃ−ＳＨｅ（ＣＣ４Ｓ）またはＳＨｅ−ｔＧＣＮ４で予防接種した全てのマウス、またはＲＳＶを事前に感染させたマウスは、ｍＨＢｃで予防接種したマウスより低い肺中レベルのゲノムＲＳＶ  ＲＮＡを有することを示す。これらのデータによって、粘膜ＳＨｅベースの予防接種はＲＳＶ複製に対してマウスを部分的に保護することができるという、本発明者らの以前の観察結果を確認する。特に、ＬＴＲ１９２Ｇアジュバントと組み合わせた空ｍＨＢｃで予防接種した全てのマウスは、ＬＴＲ１９２ＧアジュバントなしのＰＢＳで免疫処置したマウスより低レベルのＲＳＶを示した。マウスの先天性免疫系に対するＬＴＲ１９２Ｇの影響によって、これを説明することができる。Ｅ．コリ熱不安定性エンテロトキシンは、先天性インプリンティングにより、ＲＳＶを含めた肺中ウイルス感染に対して一般的な防御をもたらすことが示されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｈｕｓｓｅｌ  ２００４参照）。肺中ウイルス複製に対するＬＴＲ１９２Ｇによる先天性インプリンティングの影響は一過性であると思われる。ＲＳＶ複製に対するＴＬＲ１９２Ｒの影響は、最終ＬＴＲ１９２Ｇ投与後９週でウイルス感染が起こると、大幅に低減するからである。再度いずれのマウスも有意な体重減少を示さず、ＳＨｅの予防接種は、ＶＬＰまたはｔＧＣＮ４により提示されるとき、攻撃による疾患の増大を誘導しないことが示された（図１２）。
【００５７】
［実施例６］  ＳＨｅ特異的モノクローナル抗体の産生および試験。
感染細胞と相互作用することができるＳＨｅ特異的抗体が、ＲＳＶ感染に対する防御をもたらし得るかどうか調べるために、本発明者らは、ＳＨｅ−ＴＧＣＮ４免疫処置マウスに基づきＲＳＶ  ＳＨｅ特異的モノクローナル抗体を開発した。ＥＬＩＳＡ中でＳＨｅペプチドと効率よく結合する抗体を産生した１つのＩｇＧ１（３Ｄ１１）と１つのＩｇＧ２ａ（３Ｇ８）亜型ハイブリドーマを選択し、サブクローニングし抗体産生に使用した。３Ｄ１１および３Ｇ８はプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、ＥＬＩＳＡによりＳＨｅとの結合効率に関して試験した。図１３は、３Ｄ１１および３Ｇ８はコーティングＳＨｅペプチドと結合することができ、それぞれＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ亜型であることを示す。
【００５８】
抗体は（ＡＤＣＣ）またはＣＤＣによる感染細胞の認識および殺傷を介してウイルス感染を防御することができるので、本発明者らは、ＳＨｅ特異的モノクローナル抗体３Ｄ１１および３Ｇ８が、細胞の表面上のＳＨを認識することができるかどうか調べた。したがって、Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞を、いずれもＧＦＰ発現ベクターと組み合わせて、ＲＳＶ  ＳＨ発現ベクターまたは対照ホタルルシフェラーゼベクター（Ｓｃｈｅｐｅｎｓら、２００５）でトランスフェクトした。トランスフェクション後２４時間で、異なる濃度のＳＨｅ特異的モノクローナル抗体（３Ｄ１１および３Ｇ８）またはアイソタイプ適合インフルエンザＭ２ｅ特異的抗体（１４Ｃ２ＩｇＧ１およびＩＧ２ａ  Ｍ２ｅ特異的モノクローナル抗体）で、生きた細胞を染色した。Ｆｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅ免疫処置マウス由来のポリクローナル血清は陽性対照として使用した。図１４は、Ｆｌａｇ−ＣＯＭＰｃｃ−ＳＨｅポリクローナル血清だけでなく、３Ｄ１１モノクローナル抗体と３Ｇ８モノクローナル抗体の両方も、対照細胞ではなくＳＨ発現細胞と容易に結合することができることを実証する。対照的に、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａインフルエンザＭ２ｅ特異的抗体はいずれも、ＳＨ発現細胞と結合することができなかった。これらのデータは、３Ｄ１１と３Ｇ８の両方が細胞表面で発現されるＳＨの外部ドメインを認識することができることを、明らかに実証する。
【００５９】
感染中、ＲＳＶ  ＳＨタンパク質は、ＥＲ、ゴルジおよび細胞膜で主に発現される。したがって、ＲＳＶ  ＳＨ特異的抗体が、これらの細胞表面で発現されるＳＨを介して感染細胞を認識することができるかどうかより直接的に調べるため、本発明者らは、ＲＳＶ感染および擬似感染細胞の免疫染色を実施した。ヒトＡ５９４肺上皮細胞を、０．０５ＭＯＩのＲＳＶまたは擬似感染のいずれかで感染させた。感染後２４時間で、細胞を固定し、ポリクローナル抗ＲＳＶ免疫血清と組み合わせたＳＨｅ特異的モノクローナル抗体３Ｄ１１または３Ｇ８で染色した。
【００６０】
図１５は、ＳＨｅ特異的モノクローナル抗体３Ｄ１１および３Ｇ８は、感染細胞の細胞膜および核付近（おそらくＥＲおよびゴルジに相当）でＳＨを容易に認識することができることを示す。これは、ＳＨｅモノクローナル抗体が、ＲＳＶ感染細胞を認識することによりＲＳＶ感染に対して防御することを示す。このように、本明細書に記載するＳＨｅモノクローナル抗体３Ｄ１１および３Ｇ８は予防または療法治療剤として使用することができる。
【００６１】
［実施例７］  ＳＨｅ特異的モノクローナル抗体３Ｇ８を使用する受動免疫処置はＲＳＶ複製を低減する。
ＳＨｅ特異的抗体がインビボでＲＳＶ複製を低減することができるかどうか試験するために、ＳＨｅ特異的モノクローナル抗体でマウスを受動免疫処置した。ＳＨｅ特異的３Ｇ８モノクローナル抗体、アイソタイプ対照抗体またはＰＢＳを、ＲＳＶ攻撃の１日前と１日後にマウスに鼻腔内投与した。ＲＳＶ攻撃後３日で、血液を回収し、治療マウスの血清中のモノクローナル抗体の存在に関して試験した。ＲＳＶ攻撃後４日で、マウスを屠殺し肺中ウイルス力価を決定した。ペプチドＥＬＩＳＡは、各抗体で治療したマウス血清中の低濃度のＳＨｅ特異的およびアイソタイプ対照抗体の存在を実証した（データ示さず）。図１６は、ＳＨｅ特異的モノクローナル抗体を与えたマウスは、ＰＢＳまたはアイソタイプ対照モノクローナル抗体で治療したマウスと比較して、低い肺中ＲＳＶ力価を有することを示す。これらのデータは、ＳＨｅ特異的抗体の鼻腔内投与は、マウスにおけるＲＳＶ感染を低減することができることを示唆する。
【００６２】
［実施例８］  ＳＨｅ−ＫＬＨの構築
ＳＨｅベースのワクチンも、代替アジュバントおよび異なる担体と共に、代替経路によりこのワクチンを投与するとき、ＲＳＶ感染に対して防御することができるかどうか試験するために、担体としてのキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と共に腹腔内でワクチンを試験した。マレイミド活性化ＫＬＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）を、ＲＳＶ  Ａ  ＳＨ外部ドメインに対応するペプチド（ＣＧＧＧＳＮＫＬＳＥＹＮＶＦＨＮＫＴＦＥＬＰＲＡＲＶＮＴ（配列番号５０）；ＲＳＶ  Ａ  ＳＨ外部ドメイン（Ｓｈｅ）に対応する配列に下線を引く）と化学結合させた。直接的化学結合を助長するため、ＣｙｓＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒリンカーをＲＳＶ  Ａ  ＳＨｅペプチドのＮ末端に加えた。さらに、本来のＲＳＶ  Ａ  ＳＨｅ中に存在したシステイン残基をセリン残基に置換した。化学結合は製造者（Ｐｉｅｒｃｅ）の説明書に従い実施した。架橋ＫＬＨ−ＳＨｅタンパク質はサイズ排除クロマトグラフィーによって単離した。
【００６３】
［実施例９］  ＫＬＨ−ＳＨｅを用いた腹腔内予防接種はマウスにおけるＲＳＶ複製を低減する。
ＳＨｅベースのワクチンを用いた腹腔内（Ｉ．Ｐ．）予防接種が、ＲＳＶ感染に対する防御を誘発し得るかどうか試験するために、５０μｌのフロイント不完全アジュバント（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）とそれぞれ組み合わせた２０μｇのＫＬＨ−ＳＨｅまたはＫＬＨで、Ｂａｌｂ／ｃマウス（グループ当たり６匹のマウス）を３回腹腔内予防接種した。アジュバントなしのＰＢＳ予防接種を追加の陰性対照として使用した。予防接種後の第二週と第三週の間に、血液を回収してＳＨｅ特異的ＩｇＧ抗体の誘導を決定した。ＳＨｅ特異的抗体の存在を決定しＳＨｅペプチドＥＬＩＳＡにより定量化した。図１７（Ａ−Ｂ）は、ＫＬＨ−ＳＨｅを用いた３連続予防接種は、ＩｇＧ１亜型とＩｇＧ２ａ亜型の両方の、高レベルのＳＨｅ特異的ＩｇＧ抗体を誘導することを実証する。ＰＢＳまたはＫＬＨ予防接種マウス由来の血清において、ＳＨｅ特異的ＩｇＧ抗体を検出することはできなかった。さらにフローサイトメトリー分析は、ＫＬＨ−ＳＨｅを腹腔内予防接種したマウス由来の血清は、それらの表面でＲＳＶ  ＳＨタンパク質を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞と特異的に結合することができ、一方で免疫前血清はできなかったことを明らかにした。
【００６４】
腹腔内ＫＬＨ−ＳＨｅ予防接種がＲＳＶ感染を低減し得るかどうか試験するために、最後の予防接種後４週で１．１０６ＰＦＵのＲＳＶ−Ａ２を予防接種マウスに感染させた。攻撃後５日で、マウスを屠殺しプラークアッセイにより肺中ＲＳＶ−Ａ２力価を決定した。図１７Ｄは、ＫＬＨ予防接種マウスの肺中よりＳＨｅ−ＫＬＨ予防接種マウスの肺中で、有意に少ないウイルスを検出することができたことを示す（Ｐ＞０．００５、マンホイットニーのＵ検定）。ＫＬＨ−ＳＨｅ予防接種マウス間で、血清ＳＨｅ特異的ＩｇＧ抗体の高い力価が感染後５日で低レベルの肺中ＲＳＶと強く相関関係があったという観察結果（Ｒ２＝０．９５）は、ＫＬＨ−ＳＨｅ予防接種によるＲＳＶ複製の低減がＳＨｅ特異的抗体によって仲介されることを示唆する（図１７Ｅ）。全てのマウスの体重は、感染日および屠殺日にモニタリングした。図１７Ｃは、ＫＬＨ−ＳＨｅで予防接種したマウスは、ＫＬＨで予防接種したマウスより有意に体重が増大したことを示す（Ｐ＞０．００５、マンホイットニーのＵ検定）。これらのデータは、ＳＨｅベースのワクチンを用いた腹腔内予防接種は、罹患状態を誘導せずにＲＳＶ複製を低減することができることを実証する。さらにこれらのデータは、ｍＨＢｃに次いで、ｔＧＣＮ４およびＣＯＭＰｃｃさらにＫＬＨをＳＨｅペプチドベースワクチン用のタンパク質担体として使用することができることを示す。さらにこれらのデータは、Ｔｉｔｅｒｍａｘに次いで、フロイント不完全アジュバントも、ＳＨｅ特異的免疫を誘導するのに適したアジュバントとして使用することができることを示す。
【００６５】
［実施例１０］  ＫＬＨ−ＳＨｅを用いた鼻腔内予防接種はマウスにおけるＲＳＶ複製を低減する。
ＫＬＨ−ＳＨｅを用いた鼻腔内予防接種が、ＲＳＶ感染に対する防御を誘発し得るかどうか試験するために、１μｇのＬＴＲ１９２Ｇアジュバントとそれぞれ組み合わせた２０μｇのＫＬＨ−ＳＨｅまたはＫＬＨで、Ｂａｌｂ／ｃマウス（グループ当たり６匹のマウス）を３回鼻腔内予防接種した。アジュバントなしのＰＢＳ予防接種を追加の陰性対照として使用した。予防接種後の第二週と第三週の間に、血液を回収してＳＨｅ特異的ＩｇＧ抗体の誘導を調べた。ＳＨｅ特異的抗体の存在はＳＨｅペプチドＥＬＩＳＡにより試験した。図１８（Ａ−Ｂ）は、ＫＬＨ−ＳＨｅを用いた３連続予防接種は、ＩｇＧ１亜型とＩｇＧ２ａ亜型の両方のＳＨｅ特異的ＩｇＧ抗体を誘導することを実証する。ＰＢＳまたはＫＬＨ予防接種マウス由来の血清において、ＳＨｅ特異的ＩｇＧ抗体を検出することはできなかった。さらにフローサイトメトリー分析は、免疫前血清ではなく、ＫＬＨ−ＳＨｅ血清を鼻腔内予防接種したマウス由来の血清が、それらの表面でＲＳＶ  ＳＨタンパク質を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞と特異的に結合することができることを明らかにした。
【００６６】
腹腔内ＫＬＨ−ＳＨｅ予防接種がＲＳＶ感染を低減し得るかどうか試験するために、最後の予防接種後９週で１．１０６ＰＦＵのＲＳＶ−Ａ２を予防接種マウスに感染させた。攻撃後５日で、マウスを屠殺しＢＡＬ（気管支肺胞洗浄）液（３ｍｌ）を回収した。プラークアッセイにより回収したＢＡＬ液中のＲＳＶ−Ａ２力価を決定した。図１８Ｅは、ＫＬＨ予防接種マウスの肺中よりＫＬＨ−ＳＨｅ予防接種マウスの肺中で、有意に少ないウイルスを検出することができたことを示す（Ｐ＞０．０５、マンホイットニーのＵ検定）。回収したＢＡＬ液中のＳＨｅ特異的ＩｇＡおよびＩｇＧ抗体の存在は、ＳＨｅペプチドＥＬＩＳＡによって分析した。この分析は、ＰＢＳおよびＫＬＨ予防接種マウスと対照的に、ＫＬＨ−ＳＨｅを予防接種したマウスのＢＡＬ液は、ＩｇＧとＩｇＡ  ＳＨｅ特異的抗体の両方を含有していたことを明らかにした（図１８Ｃ−Ｄ）。ＫＬＨ−ＳＨｅ予防接種マウスのＢＡＬ液中に存在したＩｇＧ  ＳＨｅ特異的抗体のレベルは、各マウスの血清中のＩｇＧ  ＳＨｅ特異的抗体のレベルと相関関係があった。ＫＬＨ−ＳＨｅ予防接種マウス間で、ＢＡＬ液中に存在したＳＨｅ特異的ＩｇＧ抗体の高い力価が感染後５日で低レベルの肺中ＲＳＶ力価と強く相関関係があったという観察結果（Ｒ２＝０．９７）は、ＫＬＨ−ＳＨｅ予防接種によるＲＳＶ複製の低減がＳＨｅ特異的抗体によって仲介されることを示唆する（図１８Ｆ）。これらのデータは、ＳＨｅベースのワクチンを用いた鼻腔内予防接種は、罹患状態を誘導せずにＲＳＶ複製を低減することができることを実証する。さらに、これらのデータによって、ｍＨＢｃに次いで、ｔＧＣＮ４およびＣＯＭＰｃｃさらにＫＬＨをＳＨｅペプチドベースワクチン用のタンパク質担体として使用することができることを確認する。
【００６７】
［実施例１１］  ＫＬＨ−ＳＨｅ免疫血清の受動輸送はマウスにおけるＲＳＶ感染を防御する。
ＳＨｅベースワクチンで予防接種したマウスにおけるＲＳＶ複製の低減が、ＲＳＶ  ＳＨｅ特異的抗体により仲介され得るかどうかさらに調べるために、受動輸送の実験を実施した。いずれも７５μｌのフロイント不完全アジュバントと組み合わせたＫＬＨ−ＳＨｅまたはＫＬＨのいずれか２０μｇで、Ｂａｌｂ／ｃマウスを腹腔内予防接種した。追加の陰性対照として、アジュバントなしのＰＢＳでマウスを予防接種した。ＳＨｅペプチドＥＬＩＳＡは、ＫＬＨ−ＳＨｅで予防接種した全てのマウスの血清が、高レベルのＳＨｅ特異的ＩｇＧ抗体を含有することを示した。最後の出血後、各グループのマウスの血清をプールし、５６℃で３０分間熱失活させた。ＫＬＨ−ＳＨｅ血清はＲＳＶ感染を防御することができるかどうか試験するために、４０μｌのＫＬＨまたはＫＬＨ−ＳＨｅ血清を、ＲＳＶ攻撃（２．１０５ＰＦＵ）（第０日）１日前（第−１日）と１日後（第１日）にマウスに鼻腔内投与した。ＰＢＳで治療したマウスは追加の対照として含めた。全てのマウスの体重を毎日モニタリングした（図１９Ｃ）。感染後５日で、マウスを屠殺し肺ホモジネートを調製した。プラークアッセイによる分析は、ＫＬＨ−ＳＨｅ血清で治療したマウスの肺ホモジネートは、ＫＬＨ血清で治療したマウス由来の肺ホモジネートより、約４０倍少ない複製ウイルス（ウイルス力価の平均の比）を含有していたことを実証した（図１９Ｂ）。ＫＬＨ血清で治療したマウスの肺中ＲＳＶ力価が、ＰＢＳで治療したマウスの肺中ＲＳＶ力価と違わなかったという観察結果は、対照血清の投与はマウスにおける肺中ＲＳＶ複製に影響を与えないことを示す。
【００６８】
［実施例１２］  ｍＨＢｃ−ＳＨｅＢの構築
それらの亜型内で高度に保存されているにもかかわらず、ＲＳＶ  ＢウイルスのＳＨｅアミノ酸配列は、ＲＳＶ  Ａ亜型ウイルスのそれと異なる。したがって、ＲＳＶ  Ｂウイルスに対して防御するため、ＳＨｅベースワクチンはＲＳＶ  ＢのＳＨｅアミノ酸配列を含むことが最も必要とされ得る。
【００６９】
ＲＳＶ  Ｂ  ＳＨｅワクチンを、ｍＨＢｃウイルス様粒子とコンセンサスＲＳＶ  Ｂ  ＳＨｅペプチド（ＳＨｅＢ：ＣＧＧＧＳＮＫＬＳＥＨＫＴＦＳＮＫＴＬＥＱＧＱＭＹＱＩＮＴ（配列番号５１）の化学結合によって構築した。化学結合を助長するため、ＣｙｓＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒリンカーをＲＳＶ  Ｂ  ＳＨｅペプチドのＮ末端に加えた。さらに、本来のＲＳＶ  Ｂ  ＳＨｅ中に存在したシステイン残基をセリン残基に置換した。ｍＨＢｃとＲＳＶ  Ｂ  ＳＨｅペプチドの化学結合から生じた免疫原はｍＨＢｃ−ＳＨｅＢと名付けた。サイズ排除クロマトグラフィーによるｍＨＢｃ−ＳＨｅＢ  ＶＬＰの精製後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動およびクーマシー染色により架橋の程度を分析した。図２０は、半分より多くのＨＢｃモノマーが少なくとも１つのＳＨｅペプチドと架橋することを示す。
【００７０】
［実施例１３］  ｍＨＢｃ−ＳＨｅＢを用いたマウスの免疫処置は、ＲＳＶ  Ｂ感染細胞の表面と結合するＳＨｅＢ特異的抗体を誘導する。
ｍＨＢｃ−ＳＨｅＢ  ＶＬＰが免疫原性であるかどうか試験するために、５０μｌのＴｉｔｅｒｍａｘ（Ｓｉｇｍａ）と組み合わせた２０μｇのｍＨＢｃ−ＳＨｅＢで、１匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを３回皮下免疫処置した。３回の免疫処置は２週間間隔で実施した。各免疫処置１日前および最終免疫処置後２週間で、出血を実施した。ｍＨＢｃ−ＳＨｅＢ免疫血清が、感染細胞の表面上で発現されるＲＳＶ  Ｂ  ＳＨタンパク質を認識し得るかどうか試験するために、Ｖｅｒｏ細胞には、（親切なことにＤｒ．Ｍａｒｃ  ｖａｎ  Ｒａｎｓｔ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｅｕｖｅｎ、Ｌｅｕｖｅｎ、ベルギーにより提供された）ＲＳＶ  Ｂウイルスの臨床分離株を擬似感染させたか、または感染させた。感染後７２時間で、細胞を固定し、０．２％トリトンＸ−１００を使用して透過処理、または非透過処理した。フロイント不完全アジュバントと組み合わせたｍＨＢｃ−ＳＨｅＢ免疫血清（１／１００希釈）またはＫＬＨ（ＫＬＨ血清）で予防接種したＢＡＬＢ／ｃマウス由来の対照免疫血清（１／１００希釈）のいずれかで、細胞を次いで染色した。サンプルは免疫蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーによって分析した。図２１ＡおよびＢは、ｍＨＢｃ−ＳＨｅＢ免疫血清は、非感染細胞ではなく、透過処理と非透過処理ＲＳＶ  Ｂ感染細胞の両方と結合することができることを示す。対照的に、対照免疫血清はＲＳＶ  Ｂ感染細胞と結合しなかった。これは、ｍＨＢｃ−ＳＨｅＢによるマウスの予防接種は、おそらく大部分はＲＳＶ  Ｂ感染細胞の表面上で発現されるＲＳＶ  Ｂ  ＳＨタンパク質との結合によって、ＲＳＶ  Ｂ感染細胞を認識することができる血清抗体を誘導することを実証する。
【００７１】
［実施例１４］  ｍＨＢｃ−ＳＨｅＢを用いた免疫処置はマウスにおけるＲＳＶ複製を低減する。
ｍＨＢｃ−ＳＨｅＢを用いた予防接種は、ＲＳＶ  Ｂ感染からマウスを防御することができるかどうか試験するために、６匹のマウスの２グループを、５０μｌのフロイント不完全アジュバントを補充したｍＨＢｃまたはｍＨＢｃ−ＳＨｅＢ  ＶＬＰで免疫処置した。追加の対照として、６匹のマウスをＰＢＳで予防接種した。３週間間隔で３回、腹腔内予防接種した。各免疫処置後２週間で出血を実施した。ＳＨｅ特異的抗体の誘導は、コーティングペプチドとしてＳＨｅＡまたはＳＨｅＢを使用したペプチドＥＬＩＳＡにより決定した。この分析は、全てのマウスにおいて、３連続のｍＨＢｃ−ＳＨｅＢ免疫処置が、ＩｇＧ１亜型とＩｇＧ２ａ亜型の両方の高力価のＲＳＶ  Ｂ  Ｓｈｅ特異的ＩｇＧ抗体を誘導することを実証した（図２２Ａ−Ｃ）。ｍＨＢｃ−ＳＨｅＢ免疫血清も、はるかに低い程度ではあるがＳＨｅＡペプチドと結合した（図２２Ａ、ＢおよびＤ）。
【００７２】
本発明者らおよび他の研究室における以前の実験は、ＲＳＶ  Ｂ感染マウスから、全くまたはほとんど複製ウイルスを奪還することができないことを示している。それにもかかわらず本発明者らは、ＲＳＶ  Ｂ臨床分離株の感染がＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて肺炎症および体重減少を誘導することを、観察することができた（データ示さず）。したがって本発明者らは、ｍＨＢｃ−ＳＨｅＢを用いた予防接種が、ＲＳＶ  Ｂ誘導型肺炎症からマウスを防御することができたかどうか試験した。２．１０６ＰＦＵのＲＳＶ  Ｂ臨床分離株によるマウスの鼻腔内攻撃後６日で、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を実施した。擬似感染マウスは、ＢＡＬ細胞浸潤の分析用の陰性対照として使用した。Ｂｏｇａｅｒｔら、２０１１中に記載されたように、フローサイトメトリーにより免疫細胞浸潤に関してＢＡＬ液を分析した。図２２Ｅ−Ｆは、ＲＳＶ  Ｂ感染が免疫細胞、特にＣＤ８＋Ｔリンパ球の肺浸潤をもたらすことを示し、これはマウスにおけるＲＳＶ誘導型罹患の原因であることが知られている。しかしながら、ＰＢＳまたはｍＨＢｃ予防接種マウスと比較して、ｍＨＢｃ−ＳＨｅＢ予防接種マウスは有意に少ない肺細胞浸潤を示した。これらのデータは、ｍＨＢｃ−ＳＨｅＢ予防接種がＲＳＶ関連の免疫学的病状を低減することを実証する。
【００７３】
［実施例１５］  ＬＰＰ（５）−ＳＨｅタンパク質の設計、発現および精製。
ペンタマーとしてＳＨｅを提示するための代替のタンパク質足場として、本発明者らは、Ｅ．コリＬＰＰ−５６リポタンパク質（Ｌｉｕら、２００４）由来のＬｉｕらによって記載されたペンタマートリプトファン−ジッパー（ＬＰＰ（５））を使用した。Ｍｅｒｔｅｎｓら、１９９５によって記載されたように、ＬＰＰ（５）トリプトファン−ジッパーのコード配列はＳＨｅコード配列と遺伝学的に融合させ、ヘキサヒスチジンペプチドおよびカスパーゼ切断部位を含有するＥ．コリ発現ベクター（ｐＬＨ３６）にクローニングした。この発現プラスミドはｐＬＨ３６−ＨｉｓＤＥＶＤ−ＬＰＰ−ＳＨｅ（配列番号４９）と名付けた。このプラスミドからの発現によってキメラＬＰＰ（５）−ＳＨｅタンパク質（配列番号５２）が生じる（ＭＨＨＨＨＨＨＰＧＧＳＤＥＶＤＡＫＷＤＱＷＳＳＤＷＱＴＷＮＡＫＷＤＱＷＳＮＤＷＮＡＷＲＳＤＷＱＡＷＫＤＤＷＡＲＷＮＱＲＷＤＮＷＡＴＧＧＮＫＬＣＥＹＮＶＦＨＮＫＴＦＥＬＰＲＡＲＶＮＴ、ヒスタグ配列には下線を引き、リンカーはイタリック体であり、ＤＥＶＤカスパーゼ切断部位はイタリック体および下線であり、ペンタマーＬＰＰトリプトファン−ジッパーは太字であり、ＲＳＶ  Ａ  ＳＨ外部ドメインは太字およびイタリック体である）。Ｅ．コリにおける発現の誘導後、二次的ニッケルアフィニティー、アニオン交換およびゲル濾過クロマトグラフィーによりＬＰＰ（５）−ＳＨｅタンパク質を精製した。図２３は、粗製細胞抽出物中で（２３Ａ）および精製タンパク質として（２４Ｂ）、両方で、Ｓｈｅ特異的３Ｇ８モノクローナル抗体によりＬＰＰ（５）−ＳＨｅタンパク質を認識することができることを実証する。
【００７４】
［実施例１６］  コットンラットの免疫処置
独立した動物モデルにおけるワクチンの有効性を証明するため、コットンラットを使用する。コットンラット（サイグモンドンヒスピダス（Ｓｉｇｍｏｎｄｏｎ  ｈｉｓｐｉｄｕｓ））はＲＳＶ感染の影響を受けやすい（Ｐｒｉｎｃｅら、１９７８）。それぞれ６匹のコットンラットの５グループを使用する。１００μｇのＫＬＨ（賦形剤対照）または１００μｇのＫＬＨ−ＳＨｅ（すなわち、ＲＳＶ−Ａ由来のＳＨｅペプチドと担体としてのＫＬＨの化学結合体）で、２グループの動物を腹腔内（ｉ．ｐ．）免疫処置した。ＫＬＨおよびＫＬＨ−ＳＨｅワクチン抗原はフロイント不完全アジュバントで製剤化し、これらを使用して第０日、２１日、および４２日にコットンラットを免疫処置する。第三グループの動物には、アラムアジュバントの存在下においてホルマリン不活化ＲＳＶ（ＦＩ−ＲＳＶ）で筋肉内免疫処置する。後者のグループは、ＲＳＶによる二次攻撃により明らかとなるワクチン増大型疾患の誘導に関する陽性対照として働く。第四グループの動物には、第０日にコットンラット当たり２．０４×１０５プラーク形成単位のＲＳＶ−Ｔｒａｃｙを感染させ、二次攻撃に対する防御に関する陽性対照として働く。第五グループのコットンラットは攻撃の日まで未治療状態に保ち、ＲＳＶ攻撃に関する対照として働く。予防接種のスケジュールは図２４中に示す。
【００７５】
各免疫処置前および攻撃の日に血清を回収する。第６３日に、２．０４×１０５プラーク形成単位のＲＳＶ−Ｔｒａｃｙでコットンラットを鼻腔内攻撃する。攻撃ウイルスは１００マイクロリットルの容積で鼻腔内投与し、一方動物にはイソフルランで軽く麻酔をかける。第６８日に、血清を回収し、全ての動物を屠殺して、ウイルス滴定および病理組織学的解析用に肺を回収する。それぞれの肺を２つに分けて、病理組織学的解析およびウイルス滴定を実施する。左肺の血行を止め病理組織学的解析に使用する。１５％グリセリンを含む３ｍｌのイスコフ培地を使用して、右肺の葉を洗浄する。洗浄液は滴定まで氷上に保存する。さらに、同じ培地中に２ｍｌ（各鼻孔用に１ｍｌ）で鼻腔洗浄液を調製する。
【００７６】
肺および鼻腔洗浄液中のウイルス負荷は、ＨＥｐ２細胞におけるプラークアッセイによって決定する。連続希釈した洗浄液サンプルで９０分間、細胞を感染させる。接種原の除去後、抗生物質を含むＭＥＭにおいて２％メチルセルロースを細胞に塗布する。ＣＯ２インキュベーターにおける３７℃でのインキュベーションの６日後、プラークは０．１％クリスタルバイオレット／１０％ホルマリン溶液で対比染色し、２４時間室温で放置する。
【００７７】
病理組織学的解析用に、１０％中性緩衝ホルマリンで左肺を灌流させる。固定した肺組織はミクロトームで後に処理し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色する切片を得て、病理組織学的病変の程度を記録する。
【００７８】
ペプチドＥＬＩＳＡおよびマイクロ中和アッセイにより、抗ＳＨｅおよび抗ＲＳＶ中和抗体の存在に関して血清サンプルをアッセイする。ペプチドＥＬＩＳＡ用に、５０μｌの０、１Ｍ炭酸バッファー、ｐＨ９．６中の２μｇのＳＨｅ−ペプチドで、３７℃において一晩プレートをコーティングする。コーティング後、ＰＢＳ中３％（ｗ／ｖ）乳粉末でプレートをブロッキングし、次にコットンラット血清の３倍連続希釈液をかける。保持されたＳＨｅ特異的コットンラットＩｇＧは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体およびテトラメチルベンジジン基質を使用して検出する。サンプル中の終点抗ＳＨｅペプチドＩｇＧ力価は、その吸光度が免疫前血清のそれより少なくとも２倍高い最高希釈として定義する。
【００７９】
ＨＥｐ２細胞を含む９６ウエルマイクロタイタープレートにおいて、ＲＳＶ−Ａおよび−Ｂに関する中和抗体力価を決定する。血清サンプルの連続希釈液は一定量の接種原ウイルスと混合する。５０％を超える低減が細胞変性効果である血清希釈として定義する、中和抗体力価を観察する。この細胞変性効果は細胞の破壊を指し、細胞を１０％中性緩衝ホルマリンで固定しクリスタルバイオレットで染色した後に目視により決定する。これらの結果は、フロイントアジュバント中ＫＬＨ−ＳＨｅを予防接種した動物が中和抗体を発色し、明らかに防御されることを示し、一方で賦形剤対照は全く防御を示さない。
【００８０】
【表１】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２２−３】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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