(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物：
【化１】
0005906244.tif 000020
式中：
Ａｒ１およびＡｒ２は独立して１価のアリールまたはヘテロアリール部分であり、それは未置換であってよく、またはハロ、アミノ、アミジノ、グアニジノ、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アシル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アルキルアミノ、アシルアミノ、アミド、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、ヒドロキサメート、チオアシル、およびアルキルスルホニルからなる群から選択される５個までの置換基により置換されていてよく；
Ｒ１は１価アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール部分であり、それは未置換であってよく、または加えて以下の：シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アシル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アミド、スルホンアミド、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、ヒドロキサメート、チオアシル、アルキルスルホニル、およびアミノスルホニルからなる群から選択される置換基のいずれかにより置換されていてよく；
Ｒ２およびＲ３は独立して水素、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、およびアシルアミノ部分からなる群から選択され；
Ｒ４は水素、１価アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、およびヘテロシクロアルキル部分からなる群から選択され；
そして式中：
Ｒ２およびＲ３はつながって炭素環式または複素環式環を形成していてよく；
Ｒ２およびＲ３が異なる場合、その鏡像異性体は（Ｒ）−もしくは（Ｓ）−立体配置のどちらか、またはラセミ化合物であってよい；
および医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤を含む、哺乳類におけるインフルエンザウイルス感染を阻害するための医薬組成物。
【請求項２】
前記の化合物がインフルエンザウイルスの宿主細胞中への侵入を阻害するのに有効である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記の医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤が結合剤、増量剤、潤滑剤、崩壊剤、湿潤剤、懸濁化剤、乳化剤、非水性ビヒクル、および保存剤から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記のインフルエンザがトリインフルエンザである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記のトリインフルエンザがＨ５Ｎ１亜型である、請求項４に記載の組成物。  
【請求項６】
インフルエンザウイルス感染を処置または予防するための医薬品の製造における、請求項１に記載の組成物の使用。  
【請求項７】
哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
組成物が皮内、経皮、筋内、腹腔内、静脈内および経口投与から選択される経路により投与される、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
組成物が経口投与される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
経口投与が錠剤、ゼラチンカプセル、マイクロカプセルおよび溶液製剤からなる群より選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
以下のものから選択される化合物を含む、哺乳類におけるインフルエンザウイルス感染を阻害するための医薬組成物。
【化２】
0005906244.tif 000021
【請求項１２】
以下のものから選択される化合物を含む、哺乳類におけるインフルエンザウイルス感染を阻害するための医薬組成物。
【化３】
0005906244.tif 000022
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本明細書で開示される主題は、２０１０年９月１３日に出願された米国仮特許出願一連番号６１／３８２，２１５の利益を主張し、その開示を本明細書にそのまま援用する。
【０００２】
連邦政府により資金提供を受けた研究に関する記載
本明細書で記述される発明は国立衛生研究所の助成金番号１Ｒ４３Ａ１０７２８６１−０１Ａ２により支援された。従って、米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、ウイルスの表面上に存在するタンパク質を標的とすることによりウイルスの宿主細胞中への侵入の阻害剤として機能する新規非ペプチド性小分子の発見に向けられている。特に、本発明は、受容体結合およびウイルスの宿主細胞との融合によりインフルエンザウイルスの侵入を媒介するヘマグルチニン（ＨＡ）エンベロープ糖タンパク質を特異的に標的とする抗Ｈ５Ｎ１侵入阻害剤の発見に、およびエボラウイルスの表面タンパク質を標的としてエボラウイルスの宿主細胞中への侵入を予防する阻害剤に向けられている。
【背景技術】
【０００４】
ウイルスは地球上で群を抜いて最も豊富な寄生体であり、それらは動物、植物、および細菌を含む全てのタイプの細胞性生命に感染することが分かっている。しかし、様々なタイプのウイルスは限られた範囲の宿主にしか感染することができず、多くは種特異的である。例えば天然痘ウイルスのような一部のウイルスは１つの種（この場合はヒト）にしか感染することができず、狭い宿主範囲を有すると言われる。他のウイルス、例えば狂犬病ウイルスは哺乳類の異なる種に感染することができ、広い範囲を有すると言われる。植物に感染するウイルスは動物には無害であり、他の動物に感染するほとんどのウイルスはヒトには無害である。ウイルスにより引き起こされる一般的なヒトの疾患の例には、感冒、インフルエンザ、水疱および口唇ヘルペスが含まれる。多くの重篤な疾患、例えばエボラ、ＡＩＤＳ、トリインフルエンザおよびＳＡＲＳはウイルスにより引き起こされる。ウイルスの疾患を引き起こす相対的な能力は、病原性の点から記述される。世界的流行は世界中に広がった流行である。例えば、一般にスペイン風邪と呼ばれる１９１８年の流感の世界的流行は、異常に重症型の致命的なインフルエンザＡウイルスにより引き起こされたカテゴリー５のインフルエンザの世界的流行であった。その犠牲者はしばしば健康な若年成人であり、これは主に年少の、年輩の、またはそうでなければ弱った患者を冒すほとんどのインフルエンザの大流行と対照的であった。広範囲に及ぶ世界的流行（ｐａｎｄｅｍｉｃｅ）を引き起こすことができるウイルスの他の例には、トリインフルエンザウイルス、エボラウイルス、および水疱性口内炎ウイルスが含まれるが、それらに限定されない。
【０００５】
ウイルスの侵入を妨害することは、ウイルス感染を制御するための新規の魅力的な療法戦略である。このアプローチの原理証明は、ペプチド性ＨＩＶ阻害剤であるエンフビルチド（ｅｎｆｕｖｉｒｔｉｄｅ）から来ている。ウイルス感染の処置のための侵入阻害剤の療法的利益を確証する一方で、エンフビルチドはペプチド性抗ウイルス薬の潜在的な問題も目立たせてきた。エンフビルチドのような大きな７回繰り返し（ｈｅｐｔａｄ  ｒｅｐｅａｔ）に由来するペプチドは製造に費用がかかり、胃腸管からの乏しい吸収は静脈内送達を余儀なくさせる。
【０００６】
インフルエンザウイルス
トリインフルエンザＡ（Ｈ５Ｎ１）ウイルスの拡大している地理的分布はより多くのヒトを感染の危険にさらしており、ヒトの集団中にこれらのウイルスに対する既存の免疫が存在しないことは、新しいインフルエンザの世界的流行の懸念を生じさせてきた(Trampuz et al., Mayo Clin Proc., 79: 523-530 (2004))。加えて、そのウイルスは種の障壁を越えて１９９７年以来アジアおよび欧州の特定の地域において数多くのヒトの死を引き起こしてきた(Beigel et al., 2005 上記)。現在、ヒトのためのこのウイルスに対する有効なワクチンは存在しない(Cox et al., Topley & Wilson's Microbiology and Microbial Infections, Collier L, Balows A, Sussman M.(編者), ロンドン, pp. 634-698 (2005); Kemble, G., and H. Greenberg, Vaccine, 21: 1789-1795 (2003))。
【０００７】
オルトミクソウイルス科（ｆａｍｉｌｙ  Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）はインフルエンザＡ、Ｂ、およびＣウイルス、ならびにトゴトウイルスおよびイサウイルスを含む(Cox et al., 2005, 上記; Lamb, R.A., and R. M. Krug, Fields Virology, 第４版, vol. 1, pp. 1487-1531, Knipe, D.M., Howley, P.M.(編者), Lippincott Williams and Wilkins Publishers, フィラデルフィア(2001))。ヒトにおけるインフルエンザの世界的流行は、インフルエンザＡウイルスにより引き起こされる。インフルエンザＡウイルスは、１０〜１１個のタンパク質をコードする８個の一本鎖のマイナスセンス（ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｅｎｓｅ）ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）を含有する(Lamb, R.A., 2001, 上記; Wright, P.F., and R. G. Webster, Fields Virology, 第４版, vol. 1, p. 1533-1579, Knipe, D.M., Howley, P.M.(編者), Lippincott Williams and Wilkins Publishers, フィラデルフィア(2001))。
【０００８】
インフルエンザＡウイルスは２個の表面糖タンパク質：ヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含有する（図１）。ＨＡおよびＮＡタンパク質の抗原性に基づいて、インフルエンザＡウイルスの１６種類の異なるＨＡ亜型（Ｈ１〜Ｈ１６）および９種類の異なるＮＡ亜型（Ｎ１−Ｎ９）が同定されている。これらの内で、限られた数のウイルス亜型のみがヒトにおいて循環する（すなわち、Ｈ１〜Ｈ３、およびＮ１、Ｎ２）(Lamb, R.A., 2001, 上記; Wright, P.F., 2001, 上記)。
【０００９】
ＨＡは主要なウイルス抗原であり、受容体結合および膜融合活性を媒介し、一方でＮＡは細胞表面からウイルス粒子を放出させる受容体破壊酵素である(Lamb, R.A., 2001, 上記; Wright, P.F., 2001, 上記)。原型のＨＡは単一のポリペプチドとして合成され、続いて切断されてＨＡ１およびＨＡ２サブユニットになる。ＨＡの切断は感染性に必要であり、これはそれがＨＡ２の疎水性のＮ末端を生成し、それがウイルス膜と細胞膜の間の融合を媒介するためである(Steinhauer, D.A., Virology, 258: 1-20 (1999); Skehel, J. J. and D.C. Wiley, Annu. Rev. Biochem., 69: 531-569 (2000); Lamb, R.A., 2001, 上記; Wright, P.F., 2001, 上記)。
【００１０】
ＨＡに媒介される侵入プロセスにおけるいくつかの段階は、新規の抗インフルエンザ療法薬のための魅力的な標的である：
（ａ）ＨＡのそのシアル酸受容体への付着：ＨＡの受容体結合部位は、それぞれのサブユニット上でＨＡ１の末端の球形部分に位置するポケットであり、多価の付着プロセスで細胞表面のシアル酸残基に結合する。そのポケットを形成する残基（Ｙ９８、Ｗ１５３、Ｈ１８３、Ｅ１９０、Ｌ１９４）は、インフルエンザの全ての亜型の間で大部分が保存されている(Skehel, J. J., 2000, 上記)。
【００１１】
従って、受容体結合部位に結合するか、または何らかの他の機構によりその相互作用を妨げるかのどちらかによりそのウイルスの細胞への結合を遮断するであろう阻害剤を開発することができる。いくつかの高分子量ポリマー、例えばポリフェノールおよびリグニンは、そのウイルスの細胞膜への結合を阻害することが報告されている(Sakagami et al., Sieb. Et Zucc. In Vivo, 6: 491-496 (1992); Mochalova et al., Antiviral Research, 23: 179-190 (1994); Sidwell et al., Chemotherapy, 40: 42-50 (1994))。
【００１２】
（ｂ）ＨＡに媒介されるウイルス−細胞融合：インフルエンザウイルスはその宿主細胞に、受容体に媒介されるエンドサイトーシスおよびそれに続くエンドソームにおける酸に活性化される膜融合により侵入する。エンドソーム中の低ｐＨ環境は、ＨＡの非膜融合立体構造から膜融合立体構造への移行を誘発するのに必要である。この立体構造変化はその融合ペプチド断片をＨＡ２のアミノ末端からその分子の先端へと再配置する。この立体構造変化の後、その融合ペプチドはウイルス膜をエンドソーム膜と融合させる。エンドソームの酸性化を妨げるエンドソームのＨ＋-ＡＴＰアーゼの阻害は、ＭＤＣＫ細胞におけるインフルエンザウイルスの複製を強く阻害する(Hernandez et al., Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 12: 627-661 (1996))。しかし、エンドソームのＨ＋-ＡＴＰアーゼの活性はウイルス特異的な標的ではなく、Ｈ＋-ＡＴＰアーゼの活性を妨げることは望ましくない毒性の副作用をもたらす可能性がある；
（ｃ）膜融合性ヘアピン三量体（ｔｒｉｍｅｒ−ｏｆ−ｈａｉｒｐｉｎｓ）構造：クラスＩ融合タンパク質は次の３種類の別個の立体構造状態を取ることができる：（ｉ）非膜融合性の天然構造、ここでその融合ペプチドはその三量体タンパク質内に埋まっている；（ｉｉ）一過性の前ヘアピン中間体、ここでそのＮ末端の融合ペプチドは延びて宿主細胞の標的膜を貫通する；ならびに（ｉｉｉ）膜融合性ヘアピン三量体構造、ここでそのＣ末端およびＮ末端の７回繰り返しペプチド（ＨＲ−ＣおよびＨＲ−Ｎ）は６本のらせんの束（ｓｉｘ−ｈｅｌｉｘ−ｂｕｎｄｌｅ）の立体構造で会合し、それは融合に重要である(Hernandez et al., 1996, 上記; Dutch et al., Biosci. Rep., 20: 597-612 (2000); Eckert, D. and Kim P., Annu. Rev. Biochem., 70: 777-810 (2001))。その融合ヘアピン三量体構造はタンパク質間相互作用により維持されている。そのＨＲ−Ｎ三量体表面のＣ末端において、空洞に通じている深い溝が存在し、小分子阻害剤に関する可能性のある結合部位として認識されている疎水性のポケットを形成している。その保存された受容体結合ドメインおよび膜融合性ヘアピン三量体構造を標的とすることは、薬剤耐性を与える変化の可能性を小さくするであろう。
【００１３】
インフルエンザの世界的流行
インフルエンザの世界的流行は“抗原不連続変異”、すなわちヒト集団中への新規のＨＡ（または新規のＨＡおよびＮＡ）亜型の導入により引き起こされる(Cox et al., Annu. Rev. Med., 51: 407-421 (2000))。その新規のＨＡ（またはＨＡおよびＮＡ）亜型への事前の曝露の欠如は、その“抗原不連続変異”変種に対して免疫学的にナイーブである集団を作り出し、結果として極度に高い感染率および世界中への急速な蔓延をもたらす。２０世紀において、合計３回の主な世界的流行が起きた：１９１８／１９１９年の“スペイン風邪”は記録上最も破壊的な感染症である。世界中で推定２０００〜５０００万人の人々が死亡し、米国における期待寿命が１０年減少した(Johnson et al., Bull. Hist. Med., 76: 105-115 (2000))。‘スペイン風邪’の原因微生物はＨ１Ｎ１インフルエンザＡウイルスであり、それはトリの種からヒト集団中に導入された可能性がある(Gamblin et al., Science, 303: 1838-1842 (2004); Reid et al., Nature Rev. Microbiol, 2: 909-914 (2004); Stevens et al., Science, 303: 1866-1870 (2004))。１９５７年および１９６８年に、‘アジアインフルエンザ’および‘香港インフルエンザ’は米国においてそれぞれ推定７０，０００人および３３，８００人の人々を殺した(Johnson et al., 2002, 上記)。これらの２回の世界的流行のインフルエンザウイルス株も、ヒトおよびトリの株の再集合に起因した(Scholtissek et al., Virology, 87: 13-20 (1978); Kawaoka et al., J. Virol., 63: 4603-4608 (1989); Nakajima et al., Nature, 274: 334-339 (1978))。
【００１４】
高病原性Ｈ５Ｎ１トリインフルエンザウイルスの大流行
高病原性Ｈ５Ｎ１ウイルスはまだヒトでの世界的流行を引き起こしていないが、それらの継続的なヒトへの伝染およびヒトにおける高い死亡率は、これらのウイルスに対する療法の開発を優先させてきた。高病原性Ｈ５Ｎ１トリインフルエンザウイルスのヒトへの最初の伝染は１９９７年に香港で起こり、その際に１８人の感染者の内の６人がその感染で死亡した。２００３年以来、高病原性Ｈ５Ｎ１トリインフルエンザウイルスは東南アジアで流行するようになり、この地域のいくつかの国で家禽の風土病になっている(Fauci, A. S., Cell, 124: 665-670 (2006))。４２００回より多くの大流行がアジア、アフリカ、および欧州の国々で報告されており、結果として１億以上の家禽の死または殺処分をもたらしてきた(Beigel et al., 2005, 上記)。これらの地域の農村地帯におけるヒトと家禽の間の密接な接触は、おそらくウイルスのヒトへの伝染を促進する。１３８件の死亡を伴う２３６件のヒトの感染が９の異なる国で報告されてきた(Beigel et al., 2005, 上記)。さらに、Ｈ５Ｎ１のオセルタミビル（ｏｓｅｌｔａｍｉｖｉｒ）（ＮＡ阻害剤）耐性株の出現は、新規の療法処置が緊急に必要とされていることを示している(Le et al., 2005, 上記)。
【００１５】
世界的流行の制御のための選択肢
Ｈ５Ｎ１トリインフルエンザウイルスまたはヒトにおけるあらゆる新興もしくは再興インフルエンザウイルスと戦うための理想的な方法は、種間の移動を阻止する、または少なくともその可能性を低減することであり、これは包括的、多面的なアプローチを必要とする。現在、ワクチン接種はインフルエンザ感染に対する防御のための証明された有効な戦略である。しかし、世界的流行の間のその有効性は、新興株（単数または複数）に対する‘世界的流行ワクチン’を前もって開発することができないため、限られているであろう(Hayden, F. G., 2004, 上記)。現在の不活化３価ワクチンはＨ５およびＨ７トリインフルエンザ株に対する防御を提供しない(Cox et al., 2005); Kemble, G., and H. Greenberg, 2003)。さらに、この時点で我々は現在循環しているＨ５Ｎ１が次の世界的流行株であろうかどうかを予測することができない。加えて、そのワクチン生産能力は、世界中で膨大な数の人を短期間に免疫する必要により、世界的流行の間は限度一杯に使われるであろう。従って、抗ウイルス薬は医療介入の最前線である。
【００１６】
最新の抗インフルエンザ薬であるオセルタミビルおよびザナミビル（ｚａｎａｍｉｖｉｒ）は２００４年のＨ５Ｎ１ウイルスのＮＡ活性をインビトロで効率的に遮断し、これはＨ５Ｎ１ウイルス感染に対するインフルエンザ化学療法および予防におけるそれらの有効性を示している(Ward et al., 2005, 上記; Mase et al., Virology, 332: 167-176 (2005); Gubareva et al., Lancet, 355: 827-835 (2000))。しかし、最近のこれらの化合物に対する耐性変異株の分離は、新規の抗ウイルス薬の開発に関する緊急の必要性を強調してきた(Le et al., 2005, 上記)。ＨＡの保存された受容体結合部位または融合ドメインを遮断するであろう新規の抗ウイルス薬の開発は有望なアプローチであり、他の機構的アプローチを補完するであろう。
【００１７】
エボラウイルス
エボラウイルスは急性、致死的な出血熱を引き起こし、現在それに関するワクチンまたは処置は存在しない。エボラウイルスのＧＰはＩ型膜貫通糖タンパク質である。異なるエボラウイルス株のＧＰに関する予測されるアミノ酸配列の比較は、そのタンパク質の中央における高度に可変性の領域を伴う、アミノ末端およびカルボキシ末端領域におけるアミノ酸の保存を示す(Feldmann et al., Virus Res., 24: 1-19 (1992))。エボラウイルスのＧＰは高度に糖鎖付加されており、Ｎ結合型およびＯ結合型糖質の両方を含有し、それはそのタンパク質の分子量の５０％に至るまでに寄与している。その糖鎖付加部位のほとんどは、ＧＰの中央の可変領域にある。
【００１８】
その膜に固定された糖タンパク質は、ウイルス粒子および感染細胞の表面上にあることが既知の唯一のウイルスタンパク質であり、そのウイルスの受容体結合および宿主細胞との融合の原因であると推定されている。結果として、エボラ糖タンパク質はウイルスの宿主細胞中への侵入を予防する重要な標的である可能性がある。エボラウイルスに関する予防的処置の開発は、エボラ糖タンパク質がいくつかの形態で存在するという観察によりくじかれる。エボラウイルスの膜貫通糖タンパク質は、それが２個のオープンリーディングフレームでコードされている点で普通でない。糖タンパク質の発現は、その２個の読み枠が転写的または翻訳的編集により連結された際に起こる(Sanchez et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 3602-3607 (1996); Volchkov et al., Virology, 214: 421-430, (1995))。その未編集のＧＰのｍＲＮＡは非構造的な分泌される糖タンパク質（ｓＧＰ）を生成し、それは感染の過程の初期の間に大量に合成される(Volchkov et al., 1995, 上記; Sanchez et al., 1996, 上記; Sanchez et al., J. Infect. Dis. 179 (suppl. 1, S164, (1999)。編集の後、そのウイルス粒子と会合した膜貫通糖タンパク質はタンパク質分解的に処理されて２個のジスルフィドでつながった生成物になる(Sanchez et al., J. Virol., 72: 6442-6447 (1998))。そのアミノ末端生成物はＧＰ１と呼ばれ（１４０ｋＤａ）、そのカルボキシ末端切断生成物はＧＰ２と呼ばれる（２６ｋＤａ）。ＧＰ１および膜に結合したＧＰは共有結合的に会合してウイルス粒子の表面上にあるＧＰスパイクの単量体を形成する(Volchkov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 5762 (1998); Sanchez et al., J. Virol., 72: 6442 (1998))。ＧＰ１はまた、感染細胞から可溶性形態で放出される(Volchkov. et al., Virology, 245: 110 (1998))。ｓＧＰおよびＧＰ１はそれらの最初の２９５個のＮ末端アミノ酸において同一であり、一方でｓＧＰの残りの６９個のＣ末端アミノ酸およびＧＰ１の残りの２０６個のアミノ酸は異なる読み枠によりコードされている。そのウイルスの受容体結合および宿主細胞との融合を妨げるであろう新規の抗ウイルス薬の開発は、エボラおよび侵入、すなわち宿主細胞への感染に関して類似の機構を有するあらゆるウイルスに対するワクチンのための有望なアプローチである。
【００１９】
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）は非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスであり、ラブドウイルス科（ｆａｍｉｌｙ  Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、ヴェシキュロウイルス属（ｇｅｎｕｓ  Ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）に属する。ＶＳＶはウマ、ウシ、ブタ、ヒツジおよびヤギにおいて接触感染症を引き起こし、それは舌、口腔粘膜および乳房上の水疱性病変を特徴とし、媒介節足動物により伝染する。水疱性口内炎の顕著な臨床症状は、口腔中ならびに頻度はより低いが乳頭および蹄冠帯上の小水疱および潰瘍の発生である。死亡率は典型的には非常に低いが、冒された動物は体重が減少し、跛行または乳腺炎を発現する可能性があるため、生産が損害を受ける。水疱性口内炎による最も重大な懸念は、ウシおよびブタにおいて、それは足および口の疾患ならびにブタの水疱性疾患と臨床的に識別できないことである。結果として、水疱性口内炎の大流行は国際検疫の迅速な賦課ならびに動物および畜産物の貿易の停止につながる。
【００２０】
ヒトが感染する可能性があり(Patterson, W. C., et al., J. Am. Vet. Med. Ass., 133, 57 (1958))、そのウイルスは媒介昆虫により広められる可能性がある(Ferris et al., J. Infect. Dis., 96, 184 (1955), Tesh et al., Science, 175, 1477 (1972))ため、公衆衛生の懸念もある。
【００２１】
ＶＳＶは単一のリボ核酸（ＲＮＡ）のマイナス鎖を含有し、それは５種類のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードしており、その１１ｋｂのゲノムはそのウイルスの５種類の構造タンパク質をコードする５個の遺伝子を有する：複製されたＲＮＡのカプシド形成のために化学量論量で必要なヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）；ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）の補助因子であるリンタンパク質（Ｐ）；マトリックスタンパク質（Ｍ）および付着糖タンパク質（Ｇ）（例えばGallione et al., 1981 J. Virol., 39:529-535; Rose and Gallione, 1981, J. Virol., 39:519-528；米国特許第６，０３３，８８６号；米国特許第６，１６８，９４３号参照）。
【００２２】
水疱性口内炎ウイルスのエンベロープタンパク質Ｇは宿主細胞表面に結合して感染を開始する。そのウイルスエンベロープタンパク質は、ウイルスの宿主細胞への結合および／またはその感染性ウイルスの宿主細胞中への侵入に関与する。
【００２３】
ウイルスの侵入を妨害することは、ウイルス感染を制御するための新規の魅力的な療法戦略である。このアプローチの原理証明は、ペプチド性ＨＩＶ阻害剤であるエンフビルチドから来ている。ウイルス感染の処置のための侵入阻害剤の療法的利益を確証する一方で、エンフビルチドはペプチド性抗ウイルス薬の潜在的な問題も目立たせてきた。エンフビルチドのような大きな７回繰り返しに由来するペプチドは製造に費用がかかり、胃腸管からの乏しい吸収は静脈内送達を余儀なくさせる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２４】
【特許文献１】米国特許第６，０３３，８８６号
【特許文献２】米国特許第６，１６８，９４３号
【非特許文献】
【００２５】
【非特許文献１】Trampuz et al., Mayo Clin Proc., 79: 523-530 (2004)
【非特許文献２】Beigel et al., 2005
【非特許文献３】Cox et al., Topley & Wilson's Microbiology and Microbial Infections, Collier L, Balows A, Sussman M.(編者), ロンドン, pp. 634-698 (2005)
【非特許文献４】Kemble, G., and H. Greenberg, Vaccine, 21: 1789-1795 (2003)
【非特許文献５】Lamb, R.A., and R. M. Krug, Fields Virology, 第４版, vol. 1, pp. 1487-1531, Knipe, D.M., Howley, P.M.(編者), Lippincott Williams and Wilkins Publishers, フィラデルフィア(2001)
【非特許文献６】Lamb, R.A., 2001, 上記; Wright, P.F., and R. G. Webster, Fields Virology, 第４版, vol. 1, p. 1533-1579, Knipe, D.M., Howley, P.M.(編者), Lippincott Williams and Wilkins Publishers, フィラデルフィア(2001)
【非特許文献７】Steinhauer, D.A., Virology, 258: 1-20 (1999)
【非特許文献８】Skehel, J. J. and D.C. Wiley, Annu. Rev. Biochem., 69: 531-569 (2000)
【非特許文献９】Sakagami et al., Sieb. Et Zucc. In Vivo, 6: 491-496 (1992)
【非特許文献１０】Mochalova et al., Antiviral Research, 23: 179-190 (1994)
【非特許文献１１】Sidwell et al., Chemotherapy, 40: 42-50 (1994)
【非特許文献１２】Hernandez et al., Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 12: 627-661 (1996)
【非特許文献１３】Dutch et al., Biosci. Rep., 20: 597-612 (2000)
【非特許文献１４】Eckert, D. and Kim P., Annu. Rev. Biochem., 70: 777-810 (2001)
【非特許文献１５】Cox et al., Annu. Rev. Med., 51: 407-421 (2000)
【非特許文献１６】Johnson et al., Bull. Hist. Med., 76: 105-115 (2000)
【非特許文献１７】Gamblin et al., Science, 303: 1838-1842 (2004)
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【非特許文献３３】Volchkov. et al., Virology, 245: 110 (1998)
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【非特許文献３８】Rose and Gallione, 1981, J. Virol., 39:519-528
【発明の概要】
【００２６】
本発明は、ウイルスの宿主細胞中への侵入を阻害するための非ペプチド性小分子の開発に関する。これらの薬物様分子に関して多数の投与経路が考えられ、非常に対費用効果の高い生産戦略を容易に達成することができる。このアプローチに関する概念的支持は、以前のパラミクソウイルスの侵入を妨害するいくつかの小分子の同定から来ている(Plemper et al., Antimicrob. Agents Chemother., 49: 3755-3761 (2005); Plemper et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101: 5628-5633 (2004); Cianci et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101: 15046-15051 (2004); Cianci et al., Antimicrob. Agents Chemother., 48: 413-422 (2004))。ＨＡは、ＨＩＶのＧｐ１２０およびパラミクソウイルスのＦタンパク質がそうであるように、クラスＩ融合タンパク質である(Cianci et al., 2004, 上記)。クラスＩ融合タンパク質は、ＣおよびＮ末端の７回繰り返しの会合をもたらす一連の立体構造の再編成を経る。その結果として生じる構造である安定な６本のらせんの束は、融合の間にウイルスおよび細胞のエンベロープが近くに配置される（ｊｕｘｔａｐｏｓｉｔｉｏｎ）のを促進する。この最終的な融合ヘアピン構造は、タンパク質間相互作用により維持されている。その最終的な融合ヘアピン構造の形成または硬化（ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｉｏｎ）を妨害するパラミクソウイルスの小分子侵入阻害剤が同定されている(Plemper et al., 2005, 上記; Cianci et al., 2004, 上記)。インフルエンザのＨＡを含む異なるクラスＩ融合タンパク質において類似の構造が存在するため、これらの結果は創薬のための戦略としてＨＡを標的とする仮説を支持する。
【００２７】
抗ウイルス薬は世界的流行の事象における医療介入の最前線であろう。耐性株の出現を防ぐための相乗的抗ウイルス作用のためには、異なる機構の抗ウイルス活性を有する多数の薬物の併用が必要であろう。従って、新しい世界的流行に対抗するための新規の薬物に関する緊急の必要性が存在する。加えて、抗ウイルス薬に関する世界的市場はおおよそ１００億＄／年であると概算されており（Ｄａｔａｍｏｎｉｔｏｒ）、新規の療法が利用可能になるにつれて急速に成長することが予想されている。
【００２８】
従って、世界的に公衆衛生に対する重大な脅威である世界的流行の問題に取り組みために、ウイルス感染に対する広いスペクトルの療法薬が決定的に必要とされている。ウイルス感染の阻害剤の発見および開発は、本明細書で概説するように、世界中で救命療法を提供し、潜在的に壊滅的な世界的流行の対処において計り知れないほど価値があることが分かるであろう。ウイルスの侵入を妨害することは、本明細書で記述するように、ウイルス感染を制御するための新規の魅力的な療法戦略であり、ＲＮＡエンベロープウイルスに関する宿主細胞侵入の類似の機構のため、類似の小分子阻害剤が多くのこれらのタイプのウイルスの宿主細胞中への侵入を予防するのに有効であろうと信じられている。本発明の小分子阻害剤が宿主細胞の感染の予防において有効であると考えられるウイルスの例には、インフルエンザウイルス、例えばトリＨ５Ｎ１インフルエンザウイルス、エボラウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、およびＳＡＲＳが含まれるが、それらに限定されない。
【００２９】
従って、本発明は、新規の非ペプチド性小分子阻害剤化合物の発見、およびその化合物をそれを必要とする個体、すなわち哺乳類に投与することを含むウイルス感染を処置または予防するための方法に関する。別の態様において、本発明は、新規の（ｎｏｅｌ）非ペプチド性小分子阻害剤化合物の発見、および本明細書で記述される阻害剤化合物のそれを必要とする個体、すなわち哺乳類への投与を含むウイルスの宿主細胞中への侵入を処置または予防、すなわち阻害するための方法に向けられている。
【００３０】
別の態様において、本発明は、インフルエンザウイルスの哺乳類宿主細胞中への侵入を予防する新規の非ペプチド性小分子阻害剤の発見に関する。特に好ましい態様において、その新規の非ペプチド性小分子は、ヒトにおけるトリＨ５Ｎ１インフルエンザウイルス亜型の侵入、すなわち感染を阻害する。本明細書で記述される阻害剤は、哺乳類、とくにヒトにおけるトリＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスの処置および／または予防に適している。
【００３１】
別の好ましい態様において、本発明は、エボラウイルスの哺乳類宿主細胞、好ましくはヒト宿主細胞中への侵入を予防する新規の非ペプチド性小分子阻害剤の発見に関する。本明細書で記述される阻害剤は、哺乳類、とくにヒトにおけるエボラウイルス感染の処置および／または予防に適している。
【００３２】
別の好ましい態様において、本発明は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の哺乳類宿主細胞、好ましくはヒト宿主細胞中への侵入を予防する新規の非ペプチド性小分子阻害剤の発見に関する。本明細書で記述される阻害剤は、哺乳類、とくにヒトにおける水疱性口内炎ウイルス感染の処置および／または予防に適している。
【００３３】
本発明に従うウイルスの宿主細胞中への侵入の非ペプチド性小分子阻害剤は、式Ｉを含む化合物およびそれらの医薬的に許容できる塩類であり：
【００３４】
【化１】
0005906244.tif 000002
【００３５】
式中：
Ａｒ１およびＡｒ２は独立して１価のアリールまたはヘテロアリール部分であり、それは未置換であってよく、または以下：ハロ、アミノ、アミジノ、グアニジノ、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アシル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アミド、スルホンアミド、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、ヒドロキサメート、チオアシル、アルキルスルホニル、およびアミノスルホニルから選択される５個までの置換基により置換されていてよく、そして
Ｒ１は１価アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール部分であり、それは未置換であってよく、または加えて以下の：シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アシル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アミド、スルホンアミド、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、ヒドロキサメート、チオアシル、アルキルスルホニル、およびアミノスルホニルから選択される置換基の１個以上により置換されていてよく、そして
Ｒ２およびＲ３は独立して水素またはアルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、およびアシルアミノ部分から選択され、そして
Ｒ４は水素または１価アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、およびヘテロシクロアルキル部分から選択され；
そして式中：
置換基Ｒ２およびＲ３はつながって炭素環式または複素環式環を形成していてよく、そして
置換基Ｒ２およびＲ３が異なる場合、その鏡像異性体は（Ｒ）−もしくは（Ｓ）−立体配置のどちらか、またはラセミ化合物であってよい。
【００３６】
別の態様において、本発明は、式Ｉの非ペプチド性小分子阻害剤の投与を含む、ウイルスの宿主細胞中への侵入、すなわちウイルス感染を処置または予防するための方法に関する。好ましい態様において、本発明は、式Ｉの非ペプチド性小分子阻害剤化合物の投与によりインフルエンザウイルスの哺乳類宿主細胞中への侵入を処置または予防するための方法に関する。特に好ましい態様において、本発明は、式Ｉの非ペプチド性小分子阻害剤の投与によりヒトにおけるトリインフルエンザウイルスＨ５Ｎ１亜型の侵入、すなわち感染を処置または予防するための方法に向けられている。本明細書で記述される方法は、哺乳類、特にヒトにおけるトリＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスの処置および／または予防に適している。
【００３７】
別の態様において、本発明は、式Ｉの非ペプチド性小分子阻害剤化合物の投与により哺乳類宿主細胞におけるエボラウイルスの侵入、すなわち感染を処置または予防するための方法に関する。特に好ましい態様において、本発明は、式Ｉの非ペプチド性小分子阻害剤化合物の投与によりヒトにおけるエボラウイルスの侵入、すなわち感染を予防するための方法に向けられている。本明細書で記述される方法は、哺乳類、特にヒトにおけるエボラウイルス感染の処置および／または予防に適している。
【００３８】
さらに別の態様において、本発明は、式Ｉの非ペプチド性小分子阻害剤化合物の投与により哺乳類宿主細胞における水疱性口内炎ウイルスの侵入、すなわち感染を処置または予防するための方法に関する。特に好ましい態様において、本発明は、式Ｉの非ペプチド性小分子阻害剤化合物の投与によりヒトにおける水疱性口内炎ウイルスの侵入、すなわち感染を予防するための方法に向けられている。本明細書で記述される方法は、哺乳類、特にヒトにおける水疱性口内炎ウイルス感染の処置および／または予防に適している。
【００３９】
好ましい態様において、トリＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスのヒト中への侵入を予防することが望ましい場合、本発明の阻害剤は、ウイルスの細胞中への侵入を媒介するヘマグルチニン（ＨＡ）エンベロープ糖タンパク質を標的とする、すなわちそれに特異的であろう。しかし、本明細書で記述される手順に従うことにより、あらゆるインフルエンザウイルス、ウイルス亜型、またはウイルス標的に関する非ペプチド性小分子阻害剤を同定することができる。
【００４０】
Ｈ５Ｎ１ウイルスの宿主細胞中への侵入を予防する阻害剤を同定するため、ＨＡ（Ｈ５亜型）を発現する偽型ウイルスを、生ウイルスの細胞中へのＨＡに媒介される侵入を模倣するためのモデルとして開発した。その偽型ウイルスは、ウイルス侵入機構を安全に複製する、およびその阻害剤を同定するための手段を提供し、次いでその阻害剤をその偽型ウイルスを用いる最初のスクリーニングには必要でない厳しい制御条件下で生ウイルス感染に対して試験することができる。
【００４１】
従って、本明細書で記述される手順に従うことにより、ＨＡ（Ｈ５）阻害剤に関してスクリーニングするためにＨＴＳアッセイをＨＩＶ／ＨＡ（Ｈ５）を用いて開発した。２５μＭ未満のＩＣ９０および２５μＭより大きいＣＣ５０を有する３６種類のＨＡ（Ｈ５）特異的阻害剤が同定され、３６種類の化合物全部が細胞培養で増殖させたインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１）（ＰＲ８）を阻害した。
【００４２】
加えて、エボラウイルスおよび水疱性口内炎ウイルスの宿主細胞中へのウイルス侵入を予防するいくつかの阻害剤が同定されている（図４参照）。
この発明の好ましいウイルス侵入阻害剤化合物は、図１２で示す構造を有する。
【００４３】
別の態様において、本発明の阻害剤化合物は医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤中に配合され、皮内、経皮、筋内、腹腔内および静脈内が含まれるがそれらに限定されない注射により適用される。本発明の別の態様によれば、その阻害剤化合物の投与は経口投与によってよく、そのワクチンは例えば錠剤の形で与えられてよく、またはゼラチンカプセルもしくはマイクロカプセルに入っていてよく、それは経口適用を単純化する。これらの投与の形態の製造は、当業者の一般知識の範囲内である。多数の投与経路がこれらの薬物様分子に関して予想されており、非常に対費用効果の高い製造戦略を容易に達成することができる。
【００４４】
特許請求するスルホンアミド化合物がインフルエンザ、エボラ、および水疱性口内炎ウイルス感染を阻害することを示す、本明細書で示すデータは、式Ｉのスルホンアミド化合物のクラスは、ＲＮＡエンベロープウイルスが含まれるがそれらに限定されないある範囲のウイルスの感染性、すなわち宿主細胞への侵入を阻害するのに有効であろうことを示している。ＲＮＡエンベロープウイルスは、全てが１型膜タンパク質を有し、宿主細胞への侵入に関して類似の機構、すなわち受容体に媒介されるエンドサイトーシスおよびそれに続く細胞質中への放出のための酸溶解による機構を利用する点で類似している。特定の理論には一切限定されないが、本明細書で記述されるスルホンアミド化合物はウイルスの感染性のこの機構を有効に遮断すると信じられている。
【００４５】
従って、式Ｉの化合物がトリＨ５Ｎ１インフルエンザウイルス、エボラウイルス、および水疱性口内炎ウイルスの宿主細胞中へのウイルス侵入を予防することを実証する、本明細書で示すデータは、単に本発明に従って阻害され得るウイルスのタイプを代表するものであり、従って、当業者は、本明細書で記述される阻害剤化合物は多くの他のタイプのウイルス、特に上記でＲＮＡエンベロープウイルスに関して記述した侵入機構を利用するウイルス、例えばＳＡＲＳウイルスの宿主細胞中へのウイルス侵入を予防するのに適しているであろうことを認識するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、インフルエンザＡウイルスの模式図である。
【図２】図２は、高病原性トリインフルエンザ（ＨＰＡＩ）ウイルスおよび低病原性トリインフルエンザ（ＬＰＡＩ）ウイルスにおけるＨＡ前駆体分子の翻訳後タンパク質分解的切断部位の模式図である。
【図３】図３は、４種類の細胞株：２９３Ｔ（ヒト）、ＨｅＬａ（ヒト）、ＱＴ６（ウズラ）、およびＤＦ−１（ニワトリ）細胞におけるＨＩＶ／ＨＡ偽型ウイルスの対照と比較した感染性（ルシフェラーゼ活性）を示す。そのＨＩＶ／ＨＡ偽型ウイルスに感染した４種類の細胞株は全て、感染性を示す高レベルのルシフェラーゼ活性を示した。
【図４】図４は、２９３Ｔ産生細胞（ｐｒｏｄｕｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ）におけるノイラミニダーゼ（ＮＡ）処理（０〜４０単位／ｍｌ）のＨＩＶ／ＨＡ偽型ウイルスの感染性への作用を示す。形質移入の２６時間後にＮＡ（０〜４０単位／ｍｌ）で処理した細胞は、対照と比較してより高いレベルの感染性を示した。
【図５】図５は、ＨＩＶ／ＨＡおよびＨＩＶ／ＨＡ（ＵＳＤＡ）偽型ウイルスの、トリプシンによる前処理を行った、または行っていない２９３Ｔ細胞への感染の比較を示す。トリプシンによる処理はＨＩＶ／ＨＡの侵入への作用を一切有さず、これはこの偽型ウイルスがそのプロテアーゼの切断部位を含むためである。トリプシンによる前処理は、天然のプロテアーゼの切断部位（ｃｉｔｅ）を有しないが感染性に酵素処理を必要とするＨＩＶ／ＨＡ（ＵＳＤＡ）の侵入を増進した。
【図６】図６は、エンドソームの酸性化を妨害するバフィロマイシン（ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ）Ａ（０〜１５０ｎＭ）および弱塩基であるＮＨ４Ｃｌ（０〜２５ｎＭ）の、ＨＩＶ／ＨＡ偽型ウイルスの２９３Ｔ細胞への感染性への作用を示す。２９３Ｔ細胞のバフィロマイシンによる前処理はその細胞のＨＩＶ／ＨＡ感染を予防し、これはＨＩＶ／ＨＡのその細胞中への侵入が低ｐＨ環境に依存していることを示している。
【図７】図７は、バフィロマイシン（０〜２００ｎＭ）処理のインフルエンザ株Ａ／ＷＳ／３３のＭＤＣＫ細胞への感染性への作用を示す。その結果は、インフルエンザＡウイルスＡ／ＷＳ／３３の侵入も低ｐＨ環境に依存していることを示唆している。
【図８】図８は、いくつかの標的細胞株のＨＩＶ／ＨＡ偽型ウイルスへの感染に対する感受性を示す。ヒト肺細胞株Ａ５４９およびＮＣＩ／Ｈ６６１は、ＨＩＶ／ＨＡによる感染に非常に感受性であった。これらの２種類の細胞株を、そのインフルエンザウイルスの侵入を予防する小分子阻害剤に関する化合物ライブラリーのスクリーニングのために用いた。
【図９Ａ】図９は、ＨＡ／阻害剤相互作用の方式を解明するための、感受性細胞に対するＨＡ結合アッセイの開発を示す。図９Ａは、ヒトＩｇＧのＦｃと融合させて融合タンパク質を生成したＨ５Ｎ１のＨＡ１の４つの異なる領域を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、１マイクログラムのそれぞれの融合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動し、クマシーブルーで染色したものを示す。
【図９Ｃ】図９Ｃは、フローサイトメトリーにより測定した、融合タンパク質（１μｇ〜２０μｇ）の２９３Ｔ細胞への結合を示す。コンストラクト＃２および＃３は優れた結合を示さなかったが、コンストラクト＃１および＃４は２９３Ｔ細胞への優れた結合を示した。ＨＡ１のＮ末端の残基１７〜８８を欠くコンストラクト＃４が完全長ＨＡ１タンパク質であるコンストラクト＃１よりも優れた２９３Ｔ細胞への結合を示したことは、興味深い。
【図９Ｄ】図９Ｄは、融合タンパク質の感受性２９３ＴおよびＡ５４９細胞ならびに耐性Ｊｕｒｋａｔ（ヒトＴ細胞株）細胞への結合を示す。予想されたように、コンストラクト＃４は２９３ＴおよびＡ５４９細胞への著しい結合を示したが、Ｊｕｒｋａｔ細胞への結合は示さなかった。従って、これらの結果は、高感度なＨＡ結合アッセイが開発されたことを示している。
【図１０】図１０は、ＨＩＶ／ＨＡ偽型ウイルスを生成するためのプロセスおよびそのウイルスによる細胞の感染の図式的（ｄｉａｇｒａｍａｔｉｃ）表現である。
【図１１】図１１は、ＨＩＶ／ＨＡを用いた最初のスクリーニング段階からの小さい化合物の“ヒット”をＨＡ特異的インフルエンザ阻害剤へと進めるための作業の流れの図である。
【図１２】図１２は、実施例９において記述するような本発明に従って同定された類似の小分子阻害剤化合物を研究するための予備的なＳＡＲの骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄ）として用いられた、単離された化合物２の構造を示す。
【００４７】
定義
用語“ハロ”または“ハロゲン”は、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素を示す。
“アルキル”は、飽和および／または不飽和炭素原子および水素原子の直鎖または分枝鎖の１価または２価の基、例えばメチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、プロピル（Ｐｒ）、イソプロピル（ｉＰｒ）、ブチル（Ｂｕ）、イソブチル（ｉＢｕ）、ｓｅｃ−ブチル（ｓＢｕ）、ｔｅｒｔ−ブチル（ｔＢｕ）等を指し、それは未置換であってよく、または１個以上の本明細書で見付かる適切な置換基により置換されていてよい。
【００４８】
“ハロアルキル”は、１個以上の同一または異なるハロゲン原子で置換されているアルキル部分、例えば−ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＣＦ３、−ＣＨ２ＣＣｌ３等を指す。
【００４９】
“アルケニル”は、２〜８個の炭素原子および少なくとも１個の二重結合を有する直鎖、分枝状、または環状炭化水素基、例えばエテニル、３−ブテン−１−イル、３−ヘキセン−１−イル、シクロペンタ−１−エン−３−イル等を指し、それは未置換であってよく、または１個以上の本明細書で見付かる適切な置換基により置換されていてよい。
【００５０】
“アルキニル”は、２〜８個の炭素原子および少なくとも１個の三重結合を有する直鎖または分枝状炭化水素基、例えばエチニル、３−ブチン−１−イル、２−ブチン−１−イル、３−ペンチン−１−イル等を指し、それは未置換であってよく、または１個以上の本明細書で見付かる適切な置換基により置換されていてよい。
【００５１】
“シクロアルキル”は、そのそれぞれが飽和または不飽和であってよい３〜１２個の炭素原子を有する非芳香族の１価または２価の単環式または多環式基、例えばシクロペンチル、シクロヘキシル、デカリニル（ｄｅｃａｌｉｎｙｌ）等を指し、それは未置換または本明細書で見付かる適切な置換基の１個以上により置換されており、１個以上のアリール基、ヘテロアリール基、またはヘテロシクロアルキル基がそれに融合していてよく、それはそれら自体が未置換であってよく、または１個以上の本明細書で見付かる適切な置換基により置換されていてよい。
【００５２】
“ヘテロシクロアルキル”は、そのそれぞれが飽和または不飽和であってよい２〜１２個の炭素原子および窒素、酸素または硫黄から選択される１〜５個の複素原子を有する非芳香族の１価または２価の単環式または多環式基、例えばピロロジニル（ｐｙｒｒｏｌｏｄｉｎｙｌ）、テトラヒドロピラニル、モルホリニル、ピペラジニル、オキシラニル等を指し、それは未置換または本明細書で見付かる適切な置換基の１個以上により置換されており、１個以上のアリール基、ヘテロアリール基、またはヘテロシクロアルキル基がそれに融合していてよく、それはそれら自体が未置換であってよく、または１個以上の本明細書で見付かる適切な置換基により置換されていてよい。
【００５３】
“アリール”は、６〜１８個の炭素環員を含む芳香族の１価または２価の単環式または多環式基、例えばフェニル、ビフェニル、ナフチル、フェナントリル等を指し、それは本明細書で見付かる適切な置換基の１個以上により置換されていてよく、１個以上のヘテロアリール基またはヘテロシクロアルキル基がそれに融合していてよく、それはそれら自体が未置換であってよく、または１個以上の本明細書で見付かる適切な置換基により置換されていてよい。
【００５４】
“ヘテロアリール”は、２〜１８個の炭素環員および窒素、酸素または硫黄から選択される少なくとも１個の複素原子を含む芳香族の１価または２価の単環式または多環式基、例えばピリジル、ピラジニル、ピリジジニル（ｐｙｒｉｄｉｚｉｎｙｌ）、ピリミジニル、フラニル、チエニル、トリアゾリル、キノリニル、イミダゾリニル、ベンズイミダゾリニル、インドリル等を指し、それは本明細書で見付かる適切な置換基の１個以上により置換されていてよく、１個以上のアリール、ヘテロアリール基、またはヘテロシクロアルキル基がそれに融合していてよく、それはそれら自体が未置換であってよく、または１個以上の本明細書で見付かる適切な置換基により置換されていてよい。
【００５５】
“ヒドロキシ”は基−ＯＨを示す。
“アルコキシ”は基−ＯＲを示し、ここでＲはアルキルまたはシクロアルキル基である。
【００５６】
“アリールオキシ”は基−ＯＡｒを示し、ここでＡｒはアリール基である。
“ヘテロアリールオキシ”は基−Ｏ（ＨＡｒ）を示し、ここでＨＡｒはヘテロアリール基である。
【００５７】
“アシル”は−Ｃ（Ｏ）Ｒ基（ここでＲはアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルである）、例えばアセチル、ベンゾイル等を示す。
【００５８】
“カルボキシ”は基−Ｃ（Ｏ）ＯＨを指す。
“アルコキシカルボニル”は−Ｃ（Ｏ）ＯＲ基を指し、ここでＲはアルキル、アルケニル、アルキニル、またはシクロアルキルである。
【００５９】
“アリールオキシカルボニル”は−Ｃ（Ｏ）ＯＲ基を指し、ここでＲはアリールまたはヘテロアリールである。
“アミノ”は基−ＮＨ２を指す。
【００６０】
“アルキルアミノ”は基−ＮＲＲ’を指し、ここでＲおよびＲ’は独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルである。
【００６１】
“アシルアミノ”は基−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（ここでＲはアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルである）、例えばアセチル、ベンゾイル等、例えばアセチルアミノ、ベンゾイルアミノ等を指す。
【００６２】
“アミド”は基−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ’を指し、ここでＲおよびＲ’は独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルである。
【００６３】
“スルホニルアミノ”は基−ＮＨＳＯ２Ｒを指し、ここでＲはアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルである。
【００６４】
“アミジノ”は基−Ｃ（ＮＲ）ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ、Ｒ’およびＲ’’は独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、ここでＲ、Ｒ’およびＲ’’はヘテロシクロアルキル環を形成していてよい）、例えばカルボキサミド、イミダゾリニル、テトラヒドロピリミジニルを指す。
【００６５】
“グアニジノ”は基−ＮＨＣ（ＮＲ）ＮＲ’Ｒ’’を指し、ここでＲ、Ｒ’およびＲ’’は独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、ここでＲ、Ｒ’およびＲ’’はヘテロシクロアルキル環を形成していてよい。
【００６６】
“メルカプト”は基−ＳＨを指す。
“アルキルチオ”は基−ＳＲを指し、ここでＲはアルキルまたはシクロアルキル基である。
【００６７】
“アリールチオ”は基−ＳＡｒを示し、ここでＡｒはアリール基である。
“ヒドロキサメート”は基−Ｃ（Ｏ）ＮＨＯＲを指し、ここでＲはアルキルまたはシクロアルキル基である。
【００６８】
“チオアシル”は−Ｃ（Ｓ）Ｒ基を指し、ここでＲはアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルである。
“アルキルスルホニル”は基−ＳＯ２Ｒを指し、ここでＲはアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルである。
【００６９】
“アミノスルホニル”は基−ＳＯ２ＮＲＲ’を指し、ここでＲおよびＲ’は独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルである。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
本発明は、新規のウイルス感染の非ペプチド性小分子阻害剤の発見に関する。より詳細には、本発明は、ウイルスの宿主細胞中への侵入、すなわち感染を予防するための新規の非ペプチド性小分子阻害剤の発見および方法に関する。
【００７１】
１態様において、本発明は、インフルエンザウイルスの哺乳類宿主細胞中への侵入を予防する新規の非ペプチド性小分子阻害剤の発見に関する。特に好ましい態様において、その非ペプチド性小分子は、ヒトにおけるトリＨ５Ｎ１インフルエンザウイルス亜型の侵入、すなわち感染を阻害する。本明細書で記述される阻害剤は、本明細書で記述される小分子阻害剤の投与による、哺乳類、特にヒトにおけるトリＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスの処置および／または予防のための方法に適している。
【００７２】
別の態様において、本発明は、エボラウイルスの哺乳類宿主細胞、好ましくはヒト宿主細胞中への侵入を予防する新規の非ペプチド性小分子阻害剤の発見に関する。本明細書で記述される阻害剤は、本明細書で開示される阻害剤の投与による、哺乳類、特にヒトにおけるエボラウイルスの処置および／または予防のための方法において適切である。
【００７３】
別の態様において、本発明は、水疱性口内炎ウイルスの哺乳類宿主細胞、好ましくはヒト宿主細胞中への侵入を予防する新規の非ペプチド性小分子阻害剤の発見に関する。本明細書で記述される阻害剤は、本明細書で開示される阻害剤の投与による、哺乳類、特にヒトにおける水疱性口内炎ウイルスの処置および／または予防のための方法において適切である。
【００７４】
可能性のあるトリインフルエンザＨ５Ｎ１の世界的流行は、世界的な公衆衛生の懸念である。Ｈ５Ｎ１ウイルスに関して利用可能な認可されたヒトのワクチンはまだなく、今までに不活化Ｈ５Ｎ１ワクチンを用いて実施された研究は、これらの試験ワクチンは低い免疫原性を有することを示唆している。従って、ヒトの患者における薬剤耐性Ｈ５Ｎ１株の出現は、新規の抗Ｈ５Ｎ１（および他のインフルエンザ）療法の開発に関するモーニングコール（ｗａｋｅ−ｕｐ  ｃａｌｌ）である(Le et al., 2005, 上記)。新規の抗インフルエンザ療法を開発するための本明細書で記述される戦略は表面タンパク質ヘマグルチニン（ＨＡ）を標的とすることであり、それはインフルエンザウイルスの受容体結合およびそのウイルスの宿主細胞との融合による侵入を媒介している(Lamb, R.A., 2001, 上記; Wright, P.F., 2001, 上記)。
【００７５】
本発明は、ウイルスの宿主細胞中への侵入を阻害するように機能する非ペプチド性小分子の単離および同定を記述する。このアプローチに関する概念的支持は、以前のＲＳＶおよびＭＶの侵入を妨害するいくつかの小分子の同定から来ている(Plemper et al., 2005, 上記; Plemper et al., 2004, 上記; Cianci et al., 2004, 上記; Cianci et al., Antimicrob. Agents Chemother., 48: 413-422 (2004))。ＨＡはクラスＩ融合タンパク質であり、それはＨＩＶのＧｐ１２０およびパラミクソウイルス（ＲＳＶおよびＭＶ）のＦタンパク質が含まれるクラスである(Lamb, R.A., 2001, 上記; Wright, P.F., 2001, 上記; Cianci et al., 2004, 上記)。
【００７６】
クラスＩ融合タンパク質は一連の立体構造の再編成を経て、結果として安定な６本のらせんの束の融合構造がもたらされ、それはタンパク質間相互作用により維持される(Cianci et al., 2004, 上記)。その最終的な融合ヘアピン構造の形成または硬化を妨害する、ＲＳＶおよびＭＶの小分子侵入阻害剤が同定されている(Plemper et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101: 5628-33 (2004); Cianci et al., 2004, 上記)。インフルエンザのＨＡを含む他のクラスＩ融合タンパク質において類似の構造が存在するため、これらの阻害剤の発見は創薬のための戦略としてＨＡを標的とする仮説を支持する。
【００７７】
本発明は、ウイルスの宿主細胞中への侵入を阻害する特定の有機化合物を提供する。本明細書で概説する手順に従うことにより、ウイルスの侵入、すなわち宿主細胞の感染を予防する、スルホンアミド骨格を有する一連の化合物が発見された。
【００７８】
本発明の化合物は式Ｉの構造およびその医薬的に許容できる塩類を含む：
【００７９】
【化２】
0005906244.tif 000003
【００８０】
式中：
Ａｒ１およびＡｒ２は独立して１価のアリールまたはヘテロアリール部分であり、それは未置換であってよく、または以下：ハロ、アミノ、アミジノ、グアニジノ、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アシル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アミド、スルホンアミド、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、ヒドロキサメート、チオアシル、アルキルスルホニル、およびアミノスルホニルから選択される５個までの置換基により置換されていてよく、そして
Ｒ１は１価アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール部分であり、それは未置換であってよく、または加えて以下の：シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アシル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アミド、スルホンアミド、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、ヒドロキサメート、チオアシル、アルキルスルホニル、およびアミノスルホニルから選択される置換基の１個以上により置換されていてよく、そして
Ｒ２およびＲ３は独立して水素またはアルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、およびアシルアミノ部分から選択され、そして
Ｒ４は水素または１価アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、およびヘテロシクロアルキル部分から選択され；
そして式中：
置換基Ｒ２およびＲ３はつながって炭素環式または複素環式環を形成していてよく、そして
置換基Ｒ２およびＲ３が異なる場合、その鏡像異性体は（Ｒ）−もしくは（Ｓ）−立体配置のどちらか、またはラセミ化合物であってよい。
【００８１】
経口で有効な療法剤（錠剤または液体）を開発するのが好ましく、これはそれが世界的流行の場合に大きな曝露された集団に薬物を投与するための最も好都合かつ迅速な方法であるためである。しかし、本明細書で記述される阻害剤は、自然な大流行の場合には感染した患者がＩＶ投与を必要とする可能性があることが予想されるため、ＩＶ投与にも適しているであろう。従って、本明細書で記述される阻害剤は、あらゆる新しく出現した世界的流行株（単数または複数）に関して有効、安全、かつ容易な療法的選択肢を提供するであろう。
【００８２】
経口投与に関して、その医薬組成物は、例えば一般に用いられる手段により医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤、例えば結合剤（例えばアルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；増量剤（例えばラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸カルシウム）；潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）、崩壊剤（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｎｔｓ）（例えばジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｓｔａｒｃｈ  ｇｌｙｃｏｌａｔｅ））；または湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）を用いて調製される錠剤またはカプセルの形をとってよい。その錠剤は、当技術で周知の方法によりコートすることができる。経口投与のための液体製剤は、例えば溶液、シロップまたは懸濁液の形をとってよく、またはそれらは使用の前に水もしくは他の適切なビヒクルを用いて構成するための乾燥製品として与えられてよい。そのような液体製剤は、一般に用いられる手段により、医薬的に許容できる添加剤、例えば懸濁化剤（例えばソルビトールシロップ、メチルセルロースまたは硬化食用脂肪）；乳化剤（例えばレシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えばアーモンド油、油性エステル類またはエチルアルコール）および保存剤（例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピルまたはソルビン酸）を用いて調製することができる。
【００８３】
本明細書で１個以上の名前を挙げられた要素または工程を“含んでいる”と記述された組成物または方法は開放型（ｏｐｅｎ−ｅｎｄｅｄ）であり、それはその名前を挙げられた要素または工程は本質的であるが他の要素または工程をその組成物または方法の範囲内に加えてよいことを意味する。冗長さを避けるため、１個以上の名前を挙げられた要素または工程を“含んでいる”（または“含む”）と記述されたあらゆる組成物または方法は、その同じ名前を挙げられた要素または工程“から本質的になっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）”（または“から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）”）対応するより限定された組成物または方法も記述し、それはその組成物または方法にはその名前を挙げられた本質的な要素または工程が含まれ、その組成物または方法の基本的および新規の特徴（単数または複数）に実質的に影響を及ぼさない追加の要素または工程も含まれていてよいことを意味することも理解されている。本明細書で１個以上の名前を挙げられた要素または工程を“含んでいる”、または１個以上の名前を挙げられた要素または工程“から本質的になっている”と記述されたあらゆる組成物または方法は、あらゆる他の名前を挙げられていない要素または工程を除外するように、名前を挙げられた要素または工程“からなっている”（または“からなる”）対応する、より限定された、および閉鎖型の（ｃｌｏｓｅｄ−ｅｎｄｅｄ）組成物または方法も記述することも理解されている。本明細書で開示されるあらゆる組成物または方法において、あらゆる名前を挙げられた本質的な要素または工程の既知の、または開示された均等物は、その要素または工程の代わりに用いられてよい。“からなる群から選択される”要素または工程は、その列挙された要素または工程のあらゆる２個以上の組み合わせを含む、後に続くリスト中の要素または工程の１個以上を指す。
【００８４】
他の用語の意味は、有機化学、薬理学、および微生物学の分野が含まれる技術分野の当業者により理解されている通りに、文脈により理解されるであろう。
本発明は、ウイルスの宿主細胞中への侵入を予防する非ペプチド性小分子阻害剤の発見に関する。式Ｉのクラスのスルホンアミド化合物は、ＲＮＡエンベロープウイルスが含まれるがそれに限定されないある範囲のウイルスの感染性、すなわち宿主細胞への侵入を阻害するのに有効であろう。ＲＮＡエンベロープウイルスは、全てが１型膜タンパク質を有し、宿主細胞への侵入に関して類似の機構、すなわち受容体に媒介されるエンドサイトーシスおよびそれに続く細胞質中への放出のための酸溶解による機構を利用する点で類似している。インフルエンザウイルス、エボラウイルス、および水疱性口内炎ウイルスは、この侵入機構を利用するＲＮＡエンベロープウイルスの代表的な例である。特定の理論には一切限定されないが、本明細書で記述されるスルホンアミド化合物はウイルスの感染性のこの機構を有効に遮断すると信じられている。従って、本明細書で記述される式Ｉのスルホンアミド化合物は、宿主細胞のこのクラスのウイルス、すなわち例えばＳＡＲＳウイルスが含まれるＲＮＡエンベロープウイルスによる感染性の阻害において有効であろうことは、当業者には理解されるであろう。
【００８５】
別の態様において、本発明は、インフルエンザウイルスの感染を処置または予防するための非ペプチド性小分子阻害剤の発見および方法に関する。本明細書で記述される阻害剤は、インフルエンザウイルスの処置および／または予防に適している。より詳細には、本明細書で記述される阻害剤はヒトにおけるインフルエンザウイルスの処置および／または予防に適している。具体的には、本発明は、そのウイルスの宿主細胞中への侵入を予防する非ペプチド性小分子（阻害剤）の同定および特性付けに関する。さらにもっと詳細には、本発明は、トリインフルエンザＨ５Ｎ１亜型の宿主細胞中への侵入を予防するための非ペプチド性小分子阻害剤の同定に関する。好ましい態様において、本発明の阻害剤は、ウイルスの細胞中への侵入を媒介するヘマグルチニン（ＨＡ）エンベロープ糖タンパク質を標的とする、すなわちそれに特異的であろう。しかし、本明細書で記述される手順に従うことにより、あらゆるインフルエンザウイルスまたはインフルエンザウイルス亜型だけでなく、例えばエボラウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス（それらに限定されない）のような他のウイルスに関しても非ペプチド性小分子阻害剤を同定することができることは理解されるであろう。
【００８６】
別の態様において、本発明は、エボラウイルスの感染を処置または予防するための非ペプチド性小分子阻害剤の発見および方法に関する。本明細書で記述される阻害剤は、哺乳類におけるエボラウイルス感染の処置および／または予防に適している。より詳細には、本明細書で記述される阻害剤はヒトにおけるエボラウイルス感染の処置および／または予防に適している。具体的には、本発明は、エボラウイルスの宿主細胞中への侵入を予防する非ペプチド性小分子（阻害剤）の同定および特性付けに関する。しかし、本明細書で記述される手順に従って、あらゆるウイルスまたはウイルス亜型による宿主感染を予防するための非ペプチド性小分子阻害剤を同定することができることは、当業者には理解されるであろう。
【００８７】
別の態様において、本発明は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の感染を処置または予防するための非ペプチド性小分子阻害剤の発見および方法に関する。本明細書で記述される阻害剤は、哺乳類におけるＶＳＶ感染の処置および／または予防に適している。より詳細には、本明細書で記述される阻害剤はヒトにおけるＶＳＶ感染の処置および／または予防に適している。具体的には、本発明は、ＶＳＶの宿主細胞中への侵入を予防する非ペプチド性小分子（阻害剤）の同定および特性付けに関する。しかし、本明細書で記述される手順に従うことにより、あらゆるウイルスまたはウイルス亜型による宿主感染を予防するための非ペプチド性小分子阻害剤を同定することができることは、当業者には理解されるであろう。
【００８８】
以下は、トリインフルエンザウイルスＨ５Ｎ１の宿主細胞中への侵入を予防するための阻害剤化合物を同定するための偽型ウイルスの構築を記述する。しかし、下記で記述する手順は、エボラウイルスおよび水疱性口内炎ウイルスが含まれるがそれらに限定されない多くのウイルスのいずれの宿主細胞中への侵入を予防する阻害剤化合物を同定するのにも適していることは、当業者には理解されるであろう。
【００８９】
トリインフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に対する阻害剤の同定。
Ｈ５Ｎ１ウイルスの宿主細胞中への侵入を予防する阻害剤を同定するために、ＨＡ（Ｈ５亜型）を発現する偽型ウイルスを、生ウイルスの細胞中へのＨＡに媒介される侵入を模倣するためのモデルとして開発した。その偽型ウイルスは、ウイルス侵入機構を安全に複製する、およびその阻害剤を同定するための手段を提供し、次いでその阻害剤をその偽型ウイルスを用いる最初のスクリーニングには必要でない厳しい制御条件下で生ウイルス感染に対して試験することができる。
【００９０】
その偽型ウイルスを構築するため、渡り鳥における高病原性Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子をコードするｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３哺乳類発現ベクター中に、ＣＭＶプロモーターの制御下にクローニングした。ＨＡを発現するＨＩＶ由来のインフルエンザ偽型（ＨＩＶ／ＨＡ）を生成するため、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有するＨＩＶ−１プロウイルスゲノム（ｐＮＬ４．３．Ｌｕｃ．Ｒ−Ｅ−）をＨ５のＨＡ（ｐｃＤＮＡ３−ＨＡ）と共に２９３Ｔ細胞中に同時形質移入した。そのＨＩＶ／ＨＡはレポーター遺伝子であるルシフェラーゼ遺伝子を含有する。標的細胞中への侵入の際、ウイルスＲＮＡが逆転写され、能動的に核の中に運び入れられ、安定にゲノム中に組み込まれる。形質導入された細胞におけるルシフェラーゼの活性は、ウイルスの感染性の尺度を提供する(Basu et al., J. Virol., 81: 3933-3941 (2007); Manicassamy et al., J. Virol., 79: 4793-4805 (2005))。ルシフェラーゼアッセイは非常に高感度であり、９６ウェルプレート形式の高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）に適している。加えて、複製しないＨＩＶに由来するインフルエンザ偽型の使用は、病原性トリインフルエンザ株を取り扱うために必要な厳重なバイオハザード条件を必要とせずにＨＴＳを実行可能にする。これは、ウイルスの付着および侵入を測定するためのＨＴＳアッセイを開発するためのＨＩＶ／ＨＡの重要な利点である。
【００９１】
本出願は、以下のことを含む本発明に従う小分子阻害剤の発見に関するいくつかの重要なパラメーターの最適化にも取り組む：（ａ）ＨＩＶ／ＨＡの生成、（ｂ）用いるべき標的細胞、（ｃ）ＨＩＶ／ＨＡの力価測定、ならびに（ｄ）感染性およびシグナル対バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）比を最大化する（＞１００／１）ための制御。
【００９２】
ＨＩＶ／ＨＡの構築の後、その偽型ウイルスを集め、標準的なプロトコルに従って感染性に関して評価した。その偽型ウイルスの特定の利点は、それが“生”ウイルスの宿主細胞中への侵入を安全に、かつ信頼できるものとして模倣する一方で直接その生ウイルスを扱う危険性を排除する手段を提供することである。最終的にこの初期のスクリーニングプロセスで同定された可能性のある阻害剤はその生ウイルスの宿主細胞中への侵入を予防する能力に関して試験されるであろうが、これらの後期の試験はその偽型ウイルスを扱うためには必要でない厳しい制御条件下で実施されるであろう。従って、その偽型ウイルスアッセイからの阻害剤の“一次ヒット”は、次いで感染性低病原性トリＨ５Ｎ２分離株に対して、および組み換えＨ５Ｎ１株に対して、強化（ｅｎｈａｎｃｅｄ）ＢＳＬ３実験室において評価されるであろう。この二次スクリーニングは、感染性ウイルスに対して有効であるそれらの化合物のみを迅速に同定するであろう。
【００９３】
初期のスクリーニングを生感染性ウイルスに対するものとして偽型ウイルスを用いて実施することの別の利点は、生ウイルスを扱うことはウイルスの侵入だけでなくウイルスの複製および放出（ｅｇｒｅｓｓ）も阻害するであろう化合物の同定をもたらすと考えられることである。その初期のスクリーニングは侵入阻害に関して１００，０００種類より多くの化合物の化合物ライブラリーを用いて実施され、従って（複製および組み立ての阻害剤の存在による）一次ヒットの数の少しの増大さえも、結果として数千種類の化合物の追加の二次試験の必要性をもたらし得る。それに対し、本明細書で記述されるような偽型ウイルスを用いた初期スクリーニングは、それは推定されるＨ５インフルエンザウイルスの侵入阻害剤のみを同定すると考えられるため、一次ヒットの数を低減する。従って、偽型ウイルスを用いた初期スクリーニングの方法は、取り扱う化合物の数および必要なスクリーニングの両方を低減した。
【００９４】
別の観点において、本発明は、可能性のあるインフルエンザウイルスの小分子阻害剤を本明細書で記述される偽型ウイルスを用いて迅速にスクリーニングするための高スループット（ＨＴＳ）アッセイに向けられている。しかし、本明細書で記述される高スループットアッセイは、ウイルスの宿主細胞中への侵入を予防する阻害剤化合物、例えばエボラウイルスまたは水疱性口内炎ウイルスの宿主細胞中への侵入を予防する阻害剤化合物（それらに限定されない）を同定するのに適合している可能性があることは、当業者には理解されるであろう。従って、本明細書で記述されるアッセイは、哺乳類、特にヒトにおける多種多様なウイルスに関連する疾患を処置または予防する可能性を有するウイルス阻害化合物を同定するための価値のある手段を提供する。
【００９５】
受容体結合および宿主細胞との融合によるインフルエンザウイルスの侵入を媒介するエンベロープ糖タンパク質であるヘマグルチニン（ＨＡ）を標的とすることは、本発明の目的である。この出願の焦点は、抗Ｈ５Ｎ１侵入阻害剤を発見すること、ならびにＨ５Ｎ１および他の世界的流行の可能性のあるインフルエンザウイルスに関する入り口となる療法（ｅｎｔｒｙ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）を開発することである。ＨＡは亜型間で著しい（３０％より大きい）変動を示すが、受容体結合および融合に関する重要なドメインは保存されている(Fauci, A. S., 2006, 上記; Lamb, R.A., 2001, 上記; Wright, P.F., 2001, 上記)。
【００９６】
従って、これらの保存された領域を標的とすることは、耐性の発生の可能性を小さくするであろう。
別の態様において、本発明は、詳細に明らかにされた作用機序を有しない可能性のある広いスペクトルの抗インフルエンザ阻害剤の同定に向けられている。このタイプの阻害剤は、可能性のあるインフルエンザウイルス阻害剤としてさらに試験する一方でその作用機序をさらに解明するのに適しているであろう。
【００９７】
下記で概説する手順に従って、おおよそ４０，０００種類の別個の化合物をスクリーニングし、１４１個の一次ヒットを同定した。ＨＴＳに関するＺ’因子（Ｚ’  ｆａｃｔｏｒ）は０．５±０．２であった。一次ヒットを、無関係な糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）を発現する偽型ウイルスおよび感染性Ｈ１Ｎ１ウイルスを用いて、それらの特異性に関してカウンタースクリーニングした。それらをそれらの効力および細胞毒性に関して、再合成した化合物を用いて評価した。その一次ヒットの内の３６種類のみがＨＡに媒介される侵入プロセスを特異的に阻害した。そのＨＴＳからの最終的なヒット率は０．０９％であった。３６種類のヒット化合物は全て２５μＭ以下のＩＣ９０値を示した。構造的に、そのＨＡ阻害剤は、それぞれ２員以上の群および単集合として表すことができる。
【００９８】
従って、本明細書で記述される手順に従うことにより、ＨＡ（Ｈ５）阻害剤に関してスクリーニングするためにＨＩＶ／ＨＡ（Ｈ５）を用いるＨＴＳアッセイが開発された。２５μＭ未満のＩＣ９０および２５μＭより大きいＣＣ５０を有する３６種類のＨＡ（Ｈ５）特異的阻害剤が同定され、３６種類の化合物は全て細胞培養で増殖させたインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１）（ＰＲ８）を阻害した。
【００９９】
この発明の好ましいウイルス侵入阻害剤は、図１２において示す構造を有する。
【実施例】
【０１００】
実施例１．Ｈ５Ｎ１トリインフルエンザの侵入に関するＨＩＶ／ＨＡ偽型系の確立。
この研究において用いられたインフルエンザウイルスのＨＡ。高病原性Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスのＨＡ（Ｈ５）遺伝子をコードするｃＤＮＡは、Ｄｒ．Ｇｅｏｒｇｅ  Ｇａｏ（中国科学院微生物研究所、中国）により親切に提供して頂いた。このＨＡ遺伝子は元々中国青海省において死んだ渡り鳥（ガン）中に存在するインフルエンザＡ  Ｈ５Ｎ１から単離された。
【０１０１】
本明細書で記述されるＨＩＶ／ＨＡ偽型ウイルスは、レポーター遺伝子であるルシフェラーゼ遺伝子を含有する。標的細胞中に侵入すると、そのウイルスＲＮＡが逆転写され、能動的に核の中に運び入れられ、安定にゲノム中に組み込まれる。形質導入された細胞におけるルシフェラーゼの活性は、ウイルスの感染性の尺度を提供する(Basu et al., J. Virol., 81: 3933-3941 (2007); Manicassamy et al., 2005, 上記)。ルシフェラーゼアッセイは非常に高感度であり、９６ウェルプレート形式に適している。加えて、複製しないＨＩＶに由来するインフルエンザ偽型の使用は、病原性トリインフルエンザ株を取り扱うために必要な厳重なバイオハザード条件を必要とせずにＨＴＳを実行可能にする。両方とも、ウイルスの付着および侵入を測定するためのＨＴＳアッセイを開発するためのＨＩＶ／ＨＡの重要な利点である。本明細書で記述される小分子を単離するために、以下のものを含むいくつかの重要なパラメーターを最適化した：（ａ）ＨＩＶ／ＨＡの生成、（ｂ）用いるべき標的細胞、（ｃ）ＨＩＶ／ＨＡの力価測定、ならびに（ｄ）感染性およびシグナル対バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）比を最大化する（＞１００／１）ための制御。
【０１０２】
ｐＮＬ  ｌｕｃ３  Ｒ−Ｅ−およびｐＮＬ  ｌｕｃ３  Ｒ＋Ｅ−は、ＨＩＶ−１プロウイルスクローンｐＮＬ４−３に基づくプラスミドである。これらのプラスミドは、両方のプラスミドが哺乳類および植物細胞中での発現に最適化された第３世代のホタルルシフェラーゼ遺伝子であるＰｒｏｍｅｇａのｌｕｃ＋遺伝子を含有している点で、前の版と異なる。それらはｐＮＬ  ｌｕｃプラスミドの前の版と、それらのそれぞれの名前におけるｌｕｃの後の３の存在により区別することができる。
【０１０３】
本明細書で記述される偽型ウイルスを構築するため、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有するエンベロープ欠損プロウイルスゲノムｐＮＬ４．３．ＬｕｃＲ−Ｅ−を、ＨＩＶ−１発現ベクターとして用いた(He et al., J. Virol., 69: 6705-6711 (1995))。そのｐＮＬ４．３．Ｌｕｃ．Ｒ−Ｅ−ベクターにおいて、そのホタルルシフェラーゼ遺伝子をｐＮＬ４−３  ｎｅｆ遺伝子中に挿入する。２個のフレームシフト（５’ＥｎｖおよびＶｐｒ  ａａ  ２６）がこのクローンをＥｎｖ−およびＶｐｒ−にして、それを単一ラウンドの複製の能力しかないようにする。そのベクターは、ソーク研究所のＤｒ．Ｎｅｄ  Ｌａｎｄｅａｕから許可を与えられた。本明細書で記述される偽型ウイルスを構築するため、ＨＡ遺伝子をコードするｃＤＮＡを哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に、ＣＭＶプロモーターの制御下にクローニングした。ＨＡを発現するＨＩＶ由来のインフルエンザ偽型［ＨＩＶ／ＨＡ］を生成するため、以前に記述されたように、ｐＮＬ４．３．Ｌｕｃ．Ｒ−Ｅ−をＨ５のＨＡ（ｐｃＤＮＡ３−ＨＡ）と共に２９３Ｔ細胞中に同時形質移入した(Basu et al., J. Virol., 81: 3933-3941 (2007); Manicassamy et al., 2005, 上記; Cormier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101: 14067-14072(2004))。その偽型ウイルスを含有する上清を形質移入の４８時間後に集め、合わせて、０．４５μｍ孔径のフィルターを通して濾過し、標準的なプロトコルに従って感染性に関して評価した(Basu et al., J. Virol., 81: 3933-3941 (2007); Hsu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 7271-7276 (2003); “Production and Use of HIV-1 Luciferase Reporter Viruses”, Enna Williams M. (編者) Current Protocols in Pharmacology, 12.5.1-12.5.12, John Wiley & Sons (2004); Connor et al., Virology, 206: 935-944 (1995))。
【０１０４】
対照偽型ウイルスを生成するために、ＶＳＶ−Ｇ（ＨＩＶ／ＶＳＶ−Ｇ）をコードするプラスミドおよび空ベクターもｐＮＬ４．３．Ｌｕｃ．Ｒ−Ｅ−と共に同時形質移入した。それらのそれぞれの感染性の直接的な比較のため、偽型ウイルスのｐ２４含有量を商業的に入手できるキット（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，カリフォルニア州）を用いて測定した。２９３Ｔ（ヒト）、ＨｅＬａ（ヒト）、ＱＴ６（ウズラ）、およびＤＦ−１（ニワトリ）細胞を、ｐ２４で正規化したＨＩＶ／ＨＡまたは対照のウイルス粒子を用いて感染させ、その細胞のルシフェラーゼ活性を負荷の４８時間後に決定した（図３）。予想されたように、そのＶＳＶ−Ｇ偽型ＨＩＶウイルス粒子を用いて感染させた４種類の細胞株は全て高レベルのルシフェラーゼ活性を示し（６．６〜７．２ＲＬＵのｌｏｇ）、一方で空ベクターを感染させた細胞はより低いレベルのルシフェラーゼ活性を示した（２．８〜３．１ＲＬＵのｌｏｇ）。そのＨＩＶ／ＨＡウイルス粒子により感染された細胞は、バックグラウンドよりもおおよそ１００倍高いルシフェラーゼ活性を発現し、これはヒト由来およびトリ由来の両方のこれらの細胞の全てがそのＨＩＶ／ＨＡウイルスにより感染され得ることを示唆している。
【０１０５】
これらの結果は、Ｈ５Ｎ１の感染に関する侵入機構を研究するための機能アッセイを実証している。この機能アッセイは侵入機構の研究のために、および侵入阻害剤のスクリーニングのために生Ｈ５Ｎ１ウイルスを用いることの安全性の懸念を大きく軽減するであろうことを強調するのは重要である。この機能アッセイを用いて、インフルエンザウイルスの宿主細胞中への侵入を予防する可能性のある小分子阻害剤を同定した。
【０１０６】
下記で記述するように、このアッセイを用いることによりヒト肺細胞株Ａ５４９およびＮＣＩ  Ｈ６６１はＨＩＶ／ＨＡの形質導入に非常に感受性であることが実証されており、これらの細胞はＨＩＶ／ＨＡのこれらの宿主細胞中への侵入を予防する小分子阻害剤を同定するためのＨＴＳアッセイにおける標的細胞として用いられるであろう。加えて、感染した細胞が優れたルシフェラーゼのシグナル対ノイズバックグラウンド比（＞１００／１）を与えるであろうように、十分な数の標的細胞／ウェルを有することが重要である。
【０１０７】
実施例２．産生細胞のノイラミニダーゼ（ＮＡ）処理はその偽ウイルス粒子の感染性を増進する。
そのＨＩＶ／ＨＡ偽型系を最適化するため、２９３Ｔ産生細胞のノイラミニダーゼ（ＮＡ）処理を用いてそのＨＩＶに基づく偽型ウイルスの感染を増進した。２９３Ｔ細胞にｐＮＬ４．３．Ｌｕｃ＋  Ｒ−Ｅ−およびＨＡプラスミドを同時形質移入した。形質移入後（２６時間）、その形質移入された２９３Ｔ細胞を、０、５、１０、２０、４０単位／ｍｌの濃度のＮＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理した。そのウイルス上清を５倍希釈し、それを用いてその標的細胞に負荷をかけた（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）。感染した細胞のルシフェラーゼ活性を注入の４８時間後に決定し、その結果を図４において示す。
【０１０８】
結果は、５単位／ｍｌのＮＡにおいて、ＮＡ処理した細胞から集めたＨＩＶ／ＨＡは処理しなかった細胞よりも少なくとも１０倍高いルシフェラーゼ活性を示したことを示している。産生細胞のより高い濃度のＮＡ（１０〜４０単位／ｍｌ）による処理は、標的細胞におけるルシフェラーゼシグナルを、大きくではないがさらに増大させた（５．６２〜５．７３ｌｏｇ）。ＨＩＶ／ＶＳＶＧおよび空ベクターを形質移入した偽型ウイルスを対照として用いた。これらの結果は、ＮＡ処理が産生細胞からのウイルスの放出を促進することと一致している。
【０１０９】
加えて、その高いシグナル／バックグラウンド比は、さらなるＨＴＳの最適化後に提案された実験のために広く用いられるであろう効率的なＨＩＶ／ＨＡ偽型ウイルスの確立の成功を示している。
【０１１０】
従って、ＨＩＶ／ＨＡ偽型を、２９３Ｔ細胞（１００ｍｍディッシュ中３×１０６細胞、約７０％コンフルエント）のｐｃＤＮＡ３−ＨＡ（１２μｇ）およびｐＮＬ４．３．Ｌｕｃ．Ｒ−Ｅ−（１２μｇ）による、標準的なプロトコルに従ってｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いる同時形質移入により生成した（図１０参照）。対照のため、ＨＩＶ由来ＶＳＶ−Ｇ偽型（ＨＩＶ／ＶＳＶ−Ｇ）を、２９３Ｔ細胞におけるＶＳＶ−Ｇを有するプラスミド（ｐｃＤＮＡ３−ＶＳＶ−Ｇ）およびｐＮＬ４．３．Ｌｕｃ．Ｒ−Ｅ−の同時形質移入により生成し、その化合物のＨＡ標的特異性を確立した。そのＨＩＶ／ＨＡまたはＨＩＶ／ＶＳＶ−Ｇ偽型は複製欠損であり、その偽型はその感染プロセスの１ラウンドのみに関して評価されるであろう。ウイルスの感染性は、その形質導入された細胞のルシフェラーゼ活性から測定される。バックグラウンドの活性は、空のｐｃＤＮＡ３ベクターおよびｐＮＬ４．３．Ｌｕｃ．Ｒ−Ｅ−を形質移入された細胞の上清を用いて感染させた細胞のルシフェラーゼ活性から決定される。
【０１１１】
実施例３．ＨＩＶ／ＨＡ偽型ウイルスはトリプシン処理を必要としない。
前に述べたように、ＨＡの切断は感染性に必要であり、これはそれがウイルスエンベロープおよび細胞膜の間の融合を媒介するＨＡ２の疎水性Ｎ末端を生成するためである(Skehel et al., 2000, 上記; Steinhauer, D.A., 1999, 上記; White et al., EMBO J., 1: 217-222 (1982); Luscher-Mattli M.,. Arch. Virol., 145: 2233-2248 (2000))。トリプシン処理のＨ５Ｎ１に由来するＨＩＶ／ＨＡの感染性への作用を調べた。比較のため、低病原性トリＨ５Ｎ２分離株（ＣＫ／ミチョアカン／２８１５９−５３０／９５）のＨＡを発現する別のＨＩＶ／ＨＡ偽型ウイルスを生成した。この株のＨＡはあらゆる遍在性プロテアーゼにより切断され得る切断部位を有しておらず、ＴＰＣＫ処理されたトリプシンによる処理をその切断のために必要とする。それはＤｒ．Ｄａｖｉｄ  Ｌ．Ｓｕａｒｅｚ，ＵＳＤＡにより親切に提供して頂いた。
【０１１２】
この低病原性トリ分離株のＨＩＶ／ＨＡは、それを実験のＨＩＶ／ＨＡと区別するためにＨＩＶ／ＨＡ（ＵＳＤＡ）と呼ばれる。ＨＩＶ／ＨＡまたはＨＩＶ／ＨＡ（ＵＳＤＡ）偽型ウイルスをトリプシン（５０μｇ／ｍｌ）で３７℃で３０分間処理するかトリプシン処理しないかのどちらかの後、標的２９３Ｔ細胞に負荷をかけた。トリプシン処理はＨＩＶ／ＨＡに媒介されるウイルス侵入を増進（または阻害）しなかった（図５）。それに対し、トリプシン処理されたＨＩＶ／ＨＡ（ＵＳＤＡ）の感染はトリプシン処理なしでの感染と比較して大きく増進された。
【０１１３】
実施例４．低病原性実験室インフルエンザＡウイルス［Ａ／ＷＳ／３３］は感染性にトリプシン処理を必要とする。
インフルエンザＡウイルス実験室株Ａ／ＷＳ／３３（Ｈ１Ｎ１）［ＡＴＣＣ  ＃  ＶＲ−１５２０］を、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関から得た。ウイルスのストックを増殖させ、ＭＤＣＫ細胞において力価測定し、８０％コンフルエントのＭＤＣＫ細胞にそのウイルスを感染させ、３７℃で３時間吸着させておき、ウェルが覆われた状態を保つために１５分ごとに振盪した。保温の後、その細胞を洗浄し、０．１２５％  ＢＳＡ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を補った、１μｇ／ｍｌ  ＴＰＣＫ処理トリプシンを含む、または含まないＥＭＥＭと共に保温した。トリプシン処理のインフルエンザＡウイルス［Ａ／ＷＳ／３３］の感染性への作用を決定するため、ＭＤＣＫ細胞にトリプシン処理した、または未処理のインフルエンザＡウイルス株Ａ／ＷＳ／３３を１のＭＯＩで感染させた。表１において示すように、未処理のインフルエンザＡウイルスにおいて、ＴＰＣＫ−トリプシンで処理されたウイルスと比較した場合に、感染性の著しい阻害があった。その結果は、ＨＩＶ／ＨＡ（ＵＳＤＡ）偽型ウイルスの結果と一致している。これはさらに、ＨＩＶ／ＨＡ（ＵＳＤＡ）偽型ウイルスにおいて、および低病原性実験室株において発現したＨＡの両方が類似して挙動することを示唆しており、本明細書で記述される偽型ウイルスモデルを有効にする。
【０１１４】
【表１】
0005906244.tif 000004
【０１１５】
実施例５．ＨＩＶ／ＨＡ偽型ウイルスは侵入の間リソソーム向性（ｌｙｓｏｓｏｍｏｔｒｏｐｉｃ）化合物に感受性である。
ＨＡに媒介されるウイルス侵入のｐＨ依存性を試験するため、予め決定された力価のＨＩＶ／ＨＡを用いてバフィロマイシンＡおよび塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）の存在下で２９３Ｔ細胞を感染させた。バフィロマイシンＡはエンドソームのＨ＋-ＡＴＰアーゼの非常に選択的な阻害剤であり、エンドソームの酸性化を妨げ、エンドソームのｐＨを上昇させる(Marsh et al., Adv. Virus Res., 36: 107-151 (1989); Bowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 7972-7976 (1988); Yoshimori et al., J. Biol. Chem., 266: 17707-17712 (1991); Droese et al., Biochemistry, 32: 3902-3906 (1993))。同様に、ＮＨ４Ｃｌは弱塩基であり、エンドソームのｐＨを上昇させる(Marsh, M. 1989, 上記)。図６のパネルＡにおいて示したように、２９３Ｔ細胞のバフィロマイシンＡによる処理は５０〜１５０ｎＭでＨＩＶ／ＨＡ偽型ウイルスの感染性を効率的に阻害した。同様に、最初の３時間のウイルス吸着の間の細胞のＮＨ４Ｃｌ［５〜２５ｍＭ］への曝露は、未処理の対照と比較してウイルス感染を有意に低減した（図６、パネルＢ）。従って、その結果は、ＨＩＶ／ＨＡの侵入はＨＡにおける低ｐＨに誘導される変化に依存することを示唆している。
【０１１６】
実施例６．バフィロマイシンＡはインフルエンザＡウイルス［Ａ／ＷＳ／３３］の感染を阻害する。
バフィロマイシンＡのインフルエンザＡウイルスの感染性への作用を調べた。ＭＤＣＫ細胞（６ウェルプレート中で約８０％コンフルエント）を、系列希釈した用量のバフィロマイシンＡ（２５〜２００ｎＭ）で１５分間処理した。インフルエンザＡウイルス（約１００ｐｆｕ／ウェル）を細胞に添加し、３７℃で３時間吸着させた。バフィロマイシンＡもその３時間の吸着期間の間に存在していた。保温後、未吸着のウイルスを洗浄により除去し、細胞を４％ウシ血清アルブミンおよび１μｇ／ｍｌのＴＰＣＫ処理されたトリプシンを補ったＥＭＥＭを含有する０．８％アガロースで覆い、３７℃で３日間培養した。３回の独立した実験を行ってウイルスの力価を決定した。
【０１１７】
図７において示すように、バフィロマイシンＡは試験した濃度（２５〜２００ｎＭ）でインフルエンザウイルス感染の感染性を効率的に阻害した。従って、その結果は、インフルエンザＡウイルスＡ／ＷＳ／３３の侵入もＨＡにおける低ｐＨに誘導される変化に依存することを示唆しており、本明細書で記述されるＨＩＶ／ＨＡ偽型ウイルスモデルを有効にする。
【０１１８】
実施例７．ヒト肺細胞はＨＩＶ／ＨＡ偽型ウイルスに対して最大の感染性を示す。
宿主指向性（ｈｏｓｔ  ｔｒｏｐｉｓｍ）を特性付けおよび比較するため、ＨＩＶ／ＨＡの感染性を一群の（ａ  ｐａｎｅｌ  ｏｆ）標的細胞株に対して、前に記述した方法に従うプラークアッセイにより評価した。ヒト肺細胞株（Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ６６１およびＨＡＰＥＣ）、およびラット肺細胞株（Ｌ２）を感染のための標的細胞として用いた。インフルエンザウイルス感染に耐性であるＬｅｃ１（チャイニーズハムスター卵巣）細胞株も用いた。前に記述したプロトコルに従って、細胞にＨＩＶ／ＨＡおよびＨＩＶ／ＨＡ（ＵＳＤＡ）偽型ウイルスを感染させた。ＨＩＶ／ＶＳＶＧおよび空ベクターを形質移入した偽型ウイルスを、それぞれ陽性および陰性対照として用いた。ヒト肺細胞株Ａ５４９およびＮＣＩ−Ｈ６６１は、ＨＩＶ／ＨＡ偽型ウイルスによる感染に、ヒト肺細胞株ＨＡＰＥＣと比較して非常に感受性であった（図８）。トリプシンで処理されたＨＩＶ／ＨＡ（ＵＳＤＡ）偽型ウイルスも、これらの細胞に対して非常に感染性であった。しかし、未処理のＨＩＶ／ＨＡ（ＵＳＤＡ）偽型ウイルスは感染性ではなかった（データは示していない）。ラット肺細胞（Ｌ２）はＨＩＶ／ＨＡおよびＨＩＶ／ＨＡ（ＵＳＤＡ）両方による感染にそれほど感受性ではなく、一方でＬｅｃ１細胞は両方の偽型に対して高度に耐性であった（図８）。これらの結果は、ＨＩＶ／ＨＡおよびＨＩＶ／ＨＡ（ＵＳＤＡ）はヒト肺細胞への好ましい侵入指向性を示すことを示している。そのヒト肺細胞株Ａ５４９およびＮＣＩ−Ｈ６６１は、さらなる最適化の後に、インフルエンザ侵入阻害剤に関して化合物ライブラリーをスクリーニングするために用いられるであろう。
【０１１９】
これらの結果は、ＨＩＶ／ＨＡ偽型ウイルス中のＨＡは感染性インフルエンザウイルス中に存在するＨＡの機能的特性を保持していることを示唆している。
実施例８．感受性細胞に対するＨＡ結合アッセイの開発。
【０１２０】
ＨＡ／阻害剤相互作用の方式を解明するため、ＨＡ結合アッセイを開発した。Ｈ５Ｎ１  ＨＡ１の４つの異なる領域（図９Ａにおいて＃１〜４と表示する）をヒトＩｇＧのＦｃと融合させて融合タンパク質を生成した。そのコンストラクトの全部をＤＮＡ配列決定により確認した。これらの融合タンパク質を、Kuhn et al., J. Biol. Chem., 281: 15951-15958 (2006)のプロトコルを修正したものに従って発現させ、精製した。簡潔には、それぞれのプラスミドを２９３Ｔ細胞中に形質移入した。細胞を、４ｍＭのＬ−グルタミンを補ったＶＰ−ＳＦＭ培地で、形質移入後１６時間の間、再び満たした（ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｄ）。上清を４８および７２時間の時点で２回集め、０．４５μＭフィルターを通して濾過した。それぞれの上清を、カラム中に組み立てられたプロテインＡアガロース（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）（Ｐｉｅｒｃｅ）に適用した。そのプロテインＡアガロースをＰＢＳで２回洗浄し、タンパク質を１ｍｌの０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．８）で遠心分離により３回溶離した。そのタンパク質を、溶離後すぐに６０μｌのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添加することにより中和した。次いでそのタンパク質を、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ）によりＰＢＳ中で透析し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ遠心濾過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により濃縮した。１ミリグラムのそれぞれの精製されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動し、続いてクーマシーブリリアントブルー染色を行った（図９Ｂ）。そのコンストラクトに応じて、その上清を１００ｍｍプレートからプールすることにより０．１〜１ｍｇの融合タンパク質を精製することができ、それは下記で記述する結合アッセイに適していた。
【０１２１】
これらのタンパク質の細胞への結合を、Kuhn et al., 2006 (上記)により記述されたようにフローサイトメトリーを用いて測定した。簡潔には、２９３Ｔ細胞をＰＢＳ／５ｍＭ  ＥＤＴＡにより脱離し、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で再懸濁し、３０分間氷上においた。異なる量のＨＡ−ｈＩｇＧタンパク質（１〜２０μｇ）を０．５×１０６個の細胞と共に氷上で１時間保温し、続いてＰＢＳ／１％ＢＳＡで２回洗浄した。ＦＩＴＣとコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧ抗体を１：１００の希釈度で細胞と共に氷上で４５分間保温した。細胞をＰＢＳ／１％ＢＳＡで３回、およびＰＢＳで２回洗浄し、それに対してフローサイトメトリーを行った。陰性対照（ＨＡ−ｈＩｇＧタンパク質を添加しなかった）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＨＡ＃１〜ＨＡ＃４のＭＦＩから引いた（図９Ｃ）。コンストラクト＃２および＃３はこれらの条件下では２９３Ｔ細胞に多くの結合を示さなかったことは明らかである。それに対し、コンストラクト＃１および＃４はその標的細胞に用量依存的な結合を示した。コンストラクト＃４はＨＡ１のＮ末端が欠失している（残基１７〜８８）が、それはその標的細胞に完全長ＨＡ１融合タンパク質（＃１）よりも優れた結合を与えたことは興味深い。
【０１２２】
これらの融合タンパク質の細胞結合特性をさらに特性付けするため、２種類の感受性細胞株および１種類の耐性細胞株をそのアッセイにおいて用いた。２９３Ｔおよびヒト肺細胞株であるＡ５４９は両方とも非常に感受性であることが示されており、一方でヒトＴ細胞株であるＪｕｒｋａｔはＨＩＶ／ＨＡ感染に耐性である。２μｇのそれぞれの融合タンパク質を用いた。これらの条件下で、コンストラクト＃４のみがその感受性細胞に著しい結合を示し、一方で残りの３種類の融合タンパク質はあまり多くの結合を示さなかった。重要なことだが、その融合タンパク質はいずれもＪｕｒｋａｔ細胞にあまり多くの結合を示さず（図９Ｄ）、これは上記で示した形質導入のデータと一致する。これらの実験は、その融合タンパク質の１種類（コンストラクト＃４）は２μｇにおいてさえも特異的に感受性細胞に結合することができることを実証している。これは高感度なＨＡ結合アッセイの開発を実証し、それは次の実験において用いられるであろう。
【０１２３】
上記の実験に基づいて、構造的に多様な化合物ライブラリーをスクリーニングしてインフルエンザウイルスの宿主細胞中への侵入を予防するための小分子阻害剤を同定し、二次アッセイを用いることによりその化合物のヒットに優先順位をつけることが可能であった。上記で記述したように、ウイルス侵入の間にインフルエンザのＨＡを標的とする阻害剤を同定するためにＨＴＳアッセイが開発された。このアッセイを用いることにより、中程度のスループットから高スループットまでのアッセイ条件（１０００より多くの化合物／日）、ならびに容易な読み取り（ルシフェラーゼ／ＧＦＰレポーター）、および高いシグナル／バックグラウンド比（１０／１より大きい）でスクリーニングすることが可能であった。
【０１２４】
１．“低病原性”Ｈ５インフルエンザウイルスを用いたＨＡ阻害剤の評価。生感染性インフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスを用いる実験に必要とされる厳しい生物汚染（ｂｉｏｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ）基準は、“生”Ｈ５Ｎ１ウイルスに対して評価することができる“ヒット”の数を制限するであろう。従って、“ヒット”はＨ５亜型のＨＡを発現する低病原性トリインフルエンザＡウイルス株ＣＫ／ミチョアカン／２８１５９−５３０／９５（ＵＳＤＡ株）(Liu et al., Science, 309: 1206 (2005))に対する盲検様式で（上記のものから）スクリーニングされ、それらの効力は細胞培養において生感染性ウイルスに対して評価されるであろう。この株はＤｒ．Ｄａｖｉｄ  Ｌ．Ｓｕａｒｅｚ（ＵＳＤＡ）から得て、野生型Ｈ５Ｎ１ウイルスのような厳しい生物汚染を必要としない。ＵＳＤＡ株および野生型Ｈ５Ｎ１のＨ５のＨＡの間の唯一の違いは、あらゆる遍在性プロテアーゼにより切断され得る正規の（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）フューリン切断部位（ＲＲＲＫＫＲ）が存在しないことである(Liu et al., Science, 309: 1206 (2005))。多くの報告がＨ５のＨＡタンパク質のこのポリ塩基性切断ペプチドはＨ５ウイルスの高病原性に必要であることを示してきた(Steinhauer, D.A., 1999, 上記; Garten, W., 1999, 上記); Horimoto, T., 1997, 上記; Stieneke-Grober et al., EMBO J., 11: 2407-2414 (1992); Horimoto et al., 1994, 上記)。（既に切断されたＨＡを有する偽型ウイルスに頼るスクリーニング戦略のため）我々の“ヒット”がＨＡの切断に影響を及ぼすであろうとは予想されないため、高病原性Ｈ５Ｎ１ウイルスを阻害する“ヒット”はＵＳＤＡ株も阻害するであろうと予測される。この低病原性ＵＳＤＡ株に対する最高の阻害活性を有する“ヒット”は、野生型Ｈ５Ｎ１を用いてさらに評価されるであろう。野生型Ｈ５Ｎ１ウイルスは低病原性インフルエンザウイルスよりも攻撃的であるため、最終的な評価が必要である。
【０１２５】
インフルエンザＡウイルス株ＣＫ／ミチョアカン／２８１５９−５３０／９５は、１０日齢の有精鶏卵の尿膜腔中で増殖させられるであろう。簡潔には、ウイルスを尿膜腔に注入し、３７℃で２８〜４２時間保温するであろう。その上清を小さな分割量（ａｌｉｑｕｏｔｓ）に分け、瞬間冷凍し、将来の使用のために−８０℃で保存するであろう。それぞれの分割量は使用前に１回解凍されるであろう。ウイルス力価を決定するため、系列希釈したウイルス懸濁液を６ウェルプレート中のコンフルエントなＭＤＣＫ単層細胞培養物中に接種し、３７℃で２時間培養するであろう。その細胞を洗浄し、０．６％アガロースおよび２μｇ／ｍｌアセチル化トリプシンを含有するＤＭＥＭで覆い、３７℃で２日間培養するであろう。プラークをギムザ染色により可視化するであろう(Anders et al., J. Gen. Virol., 75: 615-622 (1994))。
【０１２６】
インフルエンザウイルスの感染性の阻害。ウイルスを系列希釈した“ヒット”と共に前保温し（１時間）、９６ウェルマイクロタイタープレート中のＭＤＣＫ細胞（２×１０５細胞／ｍｌ）に０．１のＭＯＩで、０．１ｍｌの総量で添加するであろう。未処理のウイルスが陽性対照として用いられるであろう。３７℃において２時間の保温の後、吸着していないウイルスを洗浄により除去し、２μｇ／ｍｌのトリプシンを含有する新しい培地をその細胞に添加し、３７℃で２日間培養するであろう。バックグラウンドは、それぞれのプレートにおいて、細胞を未感染の卵からの尿膜腔液を用いて感染させることにより決定されるであろう。比較対象（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒｓ）として、既知のインフルエンザ阻害剤バフィロマイシンＡ１、アマンタジンおよびスタキフリン（ｓｔａｃｈｙｆｌｉｎ）が用いられるであろう(Yoshimoto et al., Arch. Virol., 144: 865-878 (1999))。培養後、その培養上清を集め、その培養上清の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を測定するであろう。ＬＤＨは解糖の間にラクテートをピルベートに変化させる酸化酵素である。ＬＤＨは細胞膜および細胞質に広く存在し、細胞損傷の直後に細胞から培養上清中に放出される(Decker, T. and M. L. Lohmann-Matthes, J. Immunol. Meth. 115: 61-69 (1988))。従って、細胞外のＬＤＨの定量化はウイルスの感染性の尺度を提供するであろう。上清のＬＤＨ活性は、ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，米国）により、製造業者の説明書に従って測定されるであろう。インフルエンザウイルス感染のパーセント阻害は、（％阻害）＝１００−［｛（ＯＤＴ）Ｖ−（ＯＤＣ）Ｍ｝／｛（ＯＤＣ）Ｖ−（ＯＤＣ）Ｍ｝］×１００として計算されるであろう。（ＯＤＴ）Ｖは阻害剤の存在下でウイルスに感染させた培養物の上清の吸光度（ＬＤＨ活性）であり、（ＯＤＣ）Ｖは阻害剤の非存在下でウイルスを感染させた培養物の上清の吸光度（陽性対照）であり、（ＯＤＣ）Ｍは未感染の卵からの尿膜腔液を用いて感染させた細胞の上清の吸光度（陰性対照／バックグラウンド）である。１０μＭ未満のＩＣ５０を示す阻害剤をストックプレートから選び取り、プラークアッセイによりさらに確証するであろう。パーセント阻害は１００×［化合物の存在下でのプラーク数／（あらゆる阻害剤を含まない）陽性対照のプラーク数］として計算されるであろう。陽性の結果（１０μＭ未満のＩＣ５０）を示す化合物［“二次ヒット”］は、下記で記述するような組み換えＨ５Ｎ１株に対してさらに試験されるであろう。
【０１２７】
組織培養における“生”Ｈ５Ｎ１ウイルスの阻害。その“二次ヒット”の抗Ｈ５Ｎ１インフルエンザ活性は、強化ＢＳＬ３汚染施設において組み換え世界的流行Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスに対して実証されるであろう。高病原性Ｈ５Ｎ１ベトナム株（Ａ／ベトナム／１２０３／２００４）からのＨＡを有する組み換えウイルスは、Fodor et al., J. Virol., 73: 9679-9682 (1999)の逆遺伝学系を用いて、Basler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 2746-2751 (2001)の方法に従って生成されるであろう。その現在循環している病原性Ｈ５Ｎ１ベトナム株（Ａ／ベトナム／１２０３／２００４）は、それが新しい世界的流行株を示唆する特徴を有するために選択された。“ヒット”のそのＨ５Ｎ１株に対する阻害活性は、ＭＤＣＫ細胞を用いるプラークアッセイにより確証されるであろう。パーセント阻害は、＝１００×［化合物の存在下でのプラーク数／（あらゆる阻害剤を含まない）陽性対照のプラーク数］として計算されるであろう。
【０１２８】
図１１は、ＨＩＶ／ＨＡを用いた最初のスクリーニング段階からの小さい化合物の“ヒット”をヒトおよび他の哺乳類におけるワクチンとしての使用に適したＨＡ特異的インフルエンザ阻害剤へと進めるための設計の作業の流れの図を示す。
【０１２９】
実施例９．インフルエンザウイルスの小分子阻害剤を同定するための化合物ライブラリーの初期スクリーニング
上記で概説したように、１２μｇの適切なウイルスエンベロープ糖タンパク質を含有するコンストラクトを１２μｇのｐＮＬ４−３−Ｌｕｃ−Ｒ− −Ｅ− ＨＩＶベクターと共に、１０ｃｍプレート中の２９３Ｔ細胞（９０％コンフルエント）中に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、供給業者のプロトコルに従って同時形質移入することにより、偽型ウイルスを生成した。細胞培養で増殖させたインフルエンザＨ１Ｎ１（ＰＲ８）ウイルスを、標準的なプロトコル（疾病管理予防センター，２００４，上記）に従って、ＭＤＣＫ細胞において１μｇ／ｍｌのトシルスルホニルフェニルアラニル−クロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）処理されたトリプシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下で３７℃で３日間にわたって増殖させ、力価測定した。
【０１３０】
スクリーニングした化合物ライブラリーは、１５２，５００種類を超える化合物の、広い、よくバランスのとれたコレクションである。それらはＣｈｅｍｂｒｉｄｇｅ（カリフォルニア州サンディエゴ）およびＴｉｍｔｅｃ（デラウェア州ニューアーク）から購入され、９６ウェルマスタープレートにおいてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で２．５ｍＭで希釈され、−２０℃で保管された。化合物は、２００〜５００Ｄａの分子量範囲で選択された。それらは好都合なｃＬｏｇＰ値（ｎ−オクタノール／水分配係数の対数として計算される）を有し、２００を超える化学型を含む。
【０１３１】
組み合わせ化合物ライブラリーの偽型ウイルスを用いた高スループットスクリーニングを９６ウェルプレートで実施した。低継代Ａ５４９細胞の単層に、２５μＭ（終濃度）の試験化合物の存在下で、８μｇ／ｍｌのポリブレンを含有する１００μｌの偽型ウイルスを感染させた。５時間後、その接種物を除去し、新しい培地を添加し、そのプレートを３７℃および５％ＣＯ２において７２時間培養した。感染を、Ｂｒｉｔｅｌｉｔｅ  Ｐｌｕｓ（商標）アッセイシステム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いてＷａｌｌａｃ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ２１０２マルチラベルリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，マサチューセッツ州）において定量化した。パーセント阻害を以下のように計算した：１００×［化合物の存在下での相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）−陰性対照のＲＬＵ／（阻害剤を一切含まない）陽性対照のＲＬＵ−陰性対照のＲＬＵ］。
【０１３２】
ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ  ＳｕｒｅＦｉｒｅ  ＧＡＰＤＨアッセイキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、製造業者のプロトコルに従って細胞溶解物中の内在性の細胞性ＧＡＰＤＨを測定することにより、細胞の生存度を試験した。
【０１３３】
結果
おおよそ４０，０００種類の別個の化合物をスクリーニングし、１４１個の一次ヒットを同定した。ＨＴＳに関するＺ’因子は０．５±０．２であった。一次ヒットを、無関係な糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）を発現する偽型ウイルスおよび感染性Ｈ１Ｎ１ウイルスを用いて、それらの特異性に関してカウンタースクリーニングした。再合成した化合物を用いて、それらをそれらの効力および細胞毒性に関して評価した。その一次ヒットの内の３６種類のみがＨＡに媒介される侵入プロセスを特異的に阻害した。そのＨＴＳからの最終的なヒット率は０．０９％であった。３６種類のヒット化合物は全て２５μＭ以下のＩＣ９０値を示した。構造的に、そのＨＡ阻害剤は、それぞれ２員以上の群および単集合として表すことができる。
【０１３４】
本明細書で同定されたＨＡ阻害剤には、多数の化学的に関連する構造の群ならびに単集合が含まれていた。５種類の観察された“ヒット”（表２参照）の内で、特にスルホンアミド骨格を有する１種類の化合物（化合物２）は３．９μＭのＩＣ９０を示し、この結果に基づいて、一群のスルホンアミドアナログを用いてさらなる構造活性相関（ＳＡＲ）研究を実施した（表３参照）。
【０１３５】
【表２】
0005906244.tif 000005
【０１３６】
【表３】
0005906244.tif 000006
【０１３７】
表３に示した骨格に関して調べられた追加の置換基には、Ｒ１におけるエトキシ置換基（２−エトキシ、４−エトキシ）、Ｒ２におけるハロ置換基（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ）、およびＲ３−置換されたフェニル基およびアミン窒素の間の直接結合の代わりとなる柔軟なリンカー、例えば−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（すなわち、次の式の部分：
【０１３８】
【化３】
0005906244.tif 000007
【０１３９】
が次の部分：
【０１４０】
【化４】
0005906244.tif 000008
【０１４１】
の代わりとなる）が含まれていた。
上記で同定された化合物は、インフルエンザ感染の予防および処置のための抗ウイルス剤としての開発のための候補である。その化合物は、インフルエンザウイルスの宿主細胞中への侵入の研究のための分子プローブとしても有用である可能性がある。
【０１４２】
【表４−１】
0005906244.tif 000009
【０１４３】
【表４−２】
0005906244.tif 000010
【０１４４】
【表４−３】
0005906244.tif 000011
【０１４５】
実施例１０．合成スキーム
スキーム１  アミノアセトアミドスルホンアミドウイルス阻害剤化合物の合成
【０１４６】
【化５】
0005906244.tif 000012
【０１４７】
アミノアセトアミドスルホンアミド類は、２種類の置換されたアラニン（それは同じまたは異なっていることができる）、スルホニルクロリド、およびブロモアセチルブロミドから始まる収束する３工程のプロセスで合成される。一方のアラニンは水性塩基の存在下でブロモアセチルクロリドによりアセチル化されてブロモアセトアニリド（ｂｒｏｍｏａｃｅｔａｎｌｉｌｄｅ）を形成し、一方で他方のアラニンはスルホニルクロリドによりスルホニル化されてスルホンアミドを形成する。そのスルホンアミドは穏やかな塩基により脱プロトン化され、結果として生じた陰イオンを用いてブロモアセトアニリドのブロモ置換基を置換して標的化合物を形成する。
【０１４８】
標的化合物中の変動は、一般に出発するアニリン類のレベルで成し遂げられる。置換基ＲおよびＲ’は出発するアニリン類中にあり、合成を通して持ち越される。置換基Ｒ’’は出発するスルホニルクロリド中にあり、それもその合成を通して持ち越される。
【０１４９】
スキーム２  アミノアセトアミドスルホンアミド類の合成に関する代表的な手順
【０１５０】
【化６】
0005906244.tif 000013
【０１５１】
2-アミノビフェニル(10 g, 59 mmol)のジエチルエーテル(60 mL)中における-10 ℃の溶液に、1.0 M水性NaOH (32 mL, 32 mmol)を添加した。ブロモアセチルブロミド(11.93 g, 59 mmol)のジエチルエーテル(30 mL)中における溶液を１５分間かけて添加した。冷却浴を取り外し、その反応混合物をさらに１５分間撹拌した。その混合物を分離し、水層をジエチルエーテル(100 mL)で洗浄した。有機性抽出物を合わせて水(2 × 50 mL)およびブライン(50 mL)で洗浄し、次いでMgSO4で乾燥させ、濾過し、最初の量の４分の１まで蒸発させた。結果として得られた固体を濾過により集め、高真空下で乾燥させると、6.5 g (37％)の望まれる生成物が白色の結晶質固体として得られた：1H-NMR (CDCl3) δ 8.32 (d, 2H), 7.53-7.36 (m, 6H), 7.27-7.22 (m, 2H)。
【０１５２】
【化７】
0005906244.tif 000014
【０１５３】
Ｉ．N-(4-クロロフェニル)-4-メトキシベンゼンスルホンアミド
4-メトキシベンゼンスルホニルクロリド(5.0 g, 24 mmol)および4-クロロアニリン(3.1 g, 24 mmol)のジクロロメタン(24 mL)中における0 ℃の溶液に、トリエチルアミン(3.4 mL, 24 mmol)を１０分間かけて添加した。氷浴を取り外し、その混合物を１６時間撹拌した。その混合物をジクロロメタン(100 mL)で希釈し、その合わせた溶液を水(50 mL)およびブライン(50 mL)で洗浄した。その有機溶液をMgSO4で乾燥させ、濾過し、蒸発させ、その粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー(15〜60％ EtOAc/ヘキサン)により精製した。生成物を含有する画分をプールし、蒸発させ、高真空下で乾燥させると、4.9 g (69％)の生成物が黄褐色の油として得られた：1H-NMR (CDCl3) δ 10.17 (s, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.61 (d, 2H), 7.04 (d, 2H), 6.96 (d, 2H), 2.19 (s, 3H)。
【０１５４】
ＩＩ．N-(ビフェニル-2-イル)-2-(N-(4-クロロフェニル)-4-メトキシフェニルスルホンアミド)アセトアミド
N-(ビフェニル-2-イル)-2-ブロモアセトアミド(150 mg, 0.52 mmol)およびN-(4-クロロフェニル)-4-メトキシベンゼンスルホンアミド(154 mg, 0.52 mmol)のDMF (1.5 mL)中における混合物に、K2CO3 (180 mg, 1.3 mmol)を添加した。結果として得られた懸濁液を、６０℃に４５分間加熱した。その反応混合物を水(30 mL)中に注ぎ、酢酸エチル(2 × 50 mL)で抽出した。その有機層を合わせてブライン(1 × 50 mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、シリカゲルクロマトグラフィー(15〜40％ EtOAc/ヘキサン)により精製した。生成物を含有する画分をプールし、蒸発させると、175 mg (66％)の生成物が白色の微結晶質の固体として得られた：融点100〜104 ℃, Rf 0.17 (25% EtOAc/ヘキサン); 1H-NMR (CDCl3) δ 8.78 (s, 1H), 8.49 (d, 1H), 7.72-7.67 (dd, 2H), 7.63-7.60 (m, 1H), 7.50 (d, 2H), 7.42 (d, 2H), 7.36-7.29 (t, 2H), 7.21-7.18 (m, 2H), 7.09-7.04 (t, 1H), 6.94-6.91 (dd, 2H), 6.43 (s, 1H), 6.28 (d, 1H), 4.10 (s, 2H), 3.87 (s, 3H)。
【０１５５】
【化８】
0005906244.tif 000015
【０１５６】
ＩＩＩ．N-(4-トルオイル)-4-メトキシベンゼンスルホンアミド
4-メトキシベンゼンスルホニルクロリド(5.0 g, 24 mmol)および4-メチルアニリン(2.6 g, 24 mmol)のジクロロメタン(24 mL)中における0 ℃の溶液に、トリエチルアミン(3.4 mL, 24 mmol)を１０分間かけて添加した。氷浴を取り外し、その混合物を１６時間撹拌した。その混合物をジクロロメタン(100 mL)で希釈し、その合わせた溶液を水(50 mL)およびブライン(50 mL)で洗浄した。その有機溶液をMgSO4で乾燥させ、濾過し、蒸発させ、その粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー(15〜60％ EtOAc/ヘキサン)により精製した。生成物を含有する画分をプールし、蒸発させ、高真空下で乾燥させると、6.4 g (93％)の生成物が黄褐色の油として得られた：1H-NMR (DMSO-d6) δ 9.94 (s, 1H), 7.66-7.63 (m, 2H), 7.04-6.93 (m, 6H), 3.77 (s, 3H), 2.16 (s, 3H)。
【０１５７】
ＩＶ．N-(ビフェニル-2-イル)-2-(N-(4-トルオイル)-4-メトキシフェニルスルホンアミド)アセトアミド
N-(ビフェニル-2-イル)-2-ブロモアセトアミド(150 mg, 0.52 mmol)およびN-(4-トルオイル)-4-メトキシベンゼンスルホンアミド(144 mg, 0.52 mmol)のDMF (1.5 mL)中における混合物に、K2CO3 (180 mg, 1.3 mmol)を添加した。結果として得られた懸濁液を、６０℃に４５分間加熱した。その反応混合物を水(30 mL)中に注ぎ、酢酸エチル(2 × 50 mL)で抽出した。その有機層を合わせてブライン(1 × 50 mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、シリカゲルクロマトグラフィー(15〜40％ EtOAc/ヘキサン)により精製した。生成物を含有する画分をプールし、蒸発させると、122 mg (48％)の生成物が白色の微結晶質の固体として得られた：融点160〜161 ℃, Rf 0.19 (25％ EtOAc/ヘキサン); 1H-NMR (DMSO-d6) δ 9.19 (s, 1H), 7.67 (d, 1H), 7.50 (d, 2H), 7.42 (t, 3H), 7.33-7.24 (m, 5H), 7.07 (d, 4H), 6.75 (d, 2H), 4.24 (s, 2H), 3.83 (s, 3H), 2.27 (s, 3H)。
【０１５８】
【化９】
0005906244.tif 000016
【０１５９】
Ｖ．N-(2-メトキシフェニル)-4-メトキシベンゼンスルホンアミド
4-メトキシベンゼンスルホニルクロリド(5.0 g, 24 mmol)および2-メトキシアニリン(3.0 g, 24 mmol)のジクロロメタン(24 mL)中における0 ℃の溶液に、トリエチルアミン(3.4 mL, 24 mmol)を１０分間かけて添加した。氷浴を取り外し、その混合物を１６時間撹拌した。その混合物をジクロロメタン(100 mL)で希釈し、その合わせた溶液を水(50 mL)およびブライン(50 mL)で洗浄した。その有機溶液をMgSO4で乾燥させ、濾過し、蒸発させ、その粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー(15〜60％ EtOAc/ヘキサン)により精製した。生成物を含有する画分をプールし、蒸発させ、高真空下で乾燥させると、5.3 g (44％)の生成物が黄褐色の油として得られた：1H-NMR (CDCl3) δ 7.70-7.67 (d, 2H), 7.53-7.50 (d, 1H), 7.05-6.99 (m, 2H), 6.91-6.83 (m, 3H), 6.73 (d, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.65 (s, 3H)。
【０１６０】
ＶＩ．N-(ビフェニル-2-イル)-2-(N-(2-メトキシフェニル)-4-メトキシフェニルスルホンアミド)アセトアミド
N-(ビフェニル-2-イル)-2-ブロモアセトアミド(150 mg, 0.52 mmol)およびN-(2-メトキシフェニル)-4-メトキシベンゼンスルホンアミド(153 mg, 0.52 mmol)のDMF (1.5 mL)中における混合物に、K2CO3 (180 mg, 1.3 mmol)を添加した。結果として得られた懸濁液を、６０℃に４５分間加熱した。その反応混合物を水(30 mL)中に注ぎ、酢酸エチル(2 × 50 mL)で抽出した。その有機層を合わせてブライン(1 × 50 mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、シリカゲルクロマトグラフィー(15〜40％ EtOAc/ヘキサン)により精製した。生成物を含有する画分をプールし、蒸発させると、84 mg (33％)の生成物が白色の微結晶質の固体として得られた：融点130〜131 ℃, Rf 0.10 (25％ EtOAc/ヘキサン); 1H-NMR (DMSO-d6) δ 9.16 (s, 1H), 7.68 (d, 1H), 7.51 (d, 2H), 7.40-7.28(m, 9H), 7.07 (d, 2H), 6.95 (d, 1H), 6.86 (d, 2H), 4.19 (s, 2H), 3.84 (s, 3H), 3.31 (s, 3H)。
【０１６１】
【化１０】
0005906244.tif 000017
【０１６２】
ＶＩＩ．N-(4-メトキシフェニル)-4-メトキシベンゼンスルホンアミド
4-メトキシベンゼンスルホニルクロリド(5.0 g, 24 mmol)および4-メトキシアニリン(3.0 g, 24 mmol)のジクロロメタン(24 mL)中における0 ℃の溶液に、トリエチルアミン(3.4 mL, 24 mmol)を１０分間かけて添加した。氷浴を取り外し、その混合物を１６時間撹拌した。その混合物をジクロロメタン(100 mL)で希釈し、その合わせた溶液を水(50 mL)およびブライン(50 mL)で洗浄した。その有機溶液をMgSO4で乾燥させ、濾過し、蒸発させ、その粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー(15〜60％ EtOAc/ヘキサン)により精製した。生成物を含有する画分をプールし、蒸発させ、高真空下で乾燥させると、9.5 g (79％)の生成物が黄褐色の油として得られた：1H-NMR (DMSO-d6) δ 9.29 (s, 1H), 7.63 (d, 2H), 7.23-7.19 (m, 1H), 7.11-7.01 (m, 3H), 6.91-6.83 (m, 2H), 3.79 (s, 3H), 3.52 (s, 3H)。
【０１６３】
ＶＩＩＩ．N-(ビフェニル-2-イル)-2-(N-(4-メトキシフェニル)-4-メトキシフェニルスルホンアミド)アセトアミド
N-(ビフェニル-2-イル)-2-ブロモアセトアミド(150 mg, 0.52 mmol)およびN-(4-メトキシフェニル)-4-メトキシベンゼンスルホンアミド(153 mg, 0.52 mmol)のDMF (1.5 mL)中における混合物に、K2CO3 (180 mg, 1.3 mmol)を添加した。結果として得られた懸濁液を、６０℃に４５分間加熱した。その反応混合物を水(30 mL)中に注ぎ、酢酸エチル(2 × 50 mL)で抽出した。その有機層を合わせてブライン(1 × 50 mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、シリカゲルクロマトグラフィー(15〜40％ EtOAc/ヘキサン)により精製した。生成物を含有する画分をプールし、蒸発させると、112 mg (42％)の生成物が白色の微結晶質の固体として得られた：融点131〜133 ℃, Rf 0.12 (25％ EtOAc/ヘキサン); 1H-NMR (CDCl3) 8.98 (s, 1H), 8.35 (d, 1H), 7.62-7.47 (m, 7H), 7.29-7.19(m, 4H), 6.88 (dd, 2H), 6.71-6.67 (m, 2H), 6.21-6.18 (dd, 1H), 4.20 (s, 2H), 3.85 (s, 3H), 3.22 (s, 3H)。
【０１６４】
【化１１】
0005906244.tif 000018
【０１６５】
ＩＸ．N-(4-トルオイル)ベンゼンスルホンアミド
ベンゼンスルホニルクロリド(4.2 g, 24 mmol)および4-メチルアニリン(2.6 g, 24 mmol)のジクロロメタン(24 mL)中における0 ℃の溶液に、トリエチルアミン(3.4 mL, 24 mmol)を１０分間かけて添加した。氷浴を取り外し、その混合物を１６時間撹拌した。その混合物をジクロロメタン(100 mL)で希釈し、その合わせた溶液を水(50 mL)およびブライン(50 mL)で洗浄した。その有機溶液をMgSO4で乾燥させ、濾過し、蒸発させ、その粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー(15〜60％ EtOAc/ヘキサン)により精製した。生成物を含有する画分をプールし、蒸発させ、高真空下で乾燥させると、10.6 g (97％)の生成物が黄褐色の油として得られた：1H-NMR (DMSO-d6) δ 10.09 (s, 1H), 7.73-7.70 (m, 2H), 7.59-7.49 (m, 3H), 6.98 (dd, 4H), 2.17 (s, 3H)。
【０１６６】
Ｘ．N-(ビフェニル-2-イル)-2-(N-(トルオイル)フェニルスルホンアミド)アセトアミド
N-(ビフェニル-2-イル)-2-ブロモアセトアミド(150 mg, 0.52 mmol)およびN-(4-トルオイル)ベンゼンスルホンアミド(129 mg, 0.52 mmol)のDMF (1.5 mL)中における混合物に、K2CO3 (180 mg, 1.3 mmol)を添加した。結果として得られた懸濁液を、６０℃に４５分間加熱した。その反応混合物を水(30 mL)中に注ぎ、酢酸エチル(2 × 50 mL)で抽出した。その有機層を合わせてブライン(1 × 50 mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、シリカゲルクロマトグラフィー(15〜40％ EtOAc/ヘキサン)により精製した。生成物を含有する画分をプールし、蒸発させると、71 mg (31％)の生成物が灰白色の粉末として得られた：融点98〜100 ℃, Rf 0.27 (25％ EtOAc/ヘキサン); 1H-NMR (CDCl3) 8.84 (s, 1H), 8.48 (d, 1H), 7.72-7.67 (m, 2H), 7.62-7.59 (m, 2H), 7.54-7.46 (m, 6H), 7.46-7.28 (m, 2H), 7.2-7.17 (m, 1H), 6.90 (d, 2H), 6.18 (m, 2H), 4.16 (s, 2H), 2.26 (s, 3H)。
【０１６７】
【化１２】
0005906244.tif 000019
【０１６８】
ＸＩ．N-(4-トルオイル)-4-クロロベンゼンスルホンアミド
4-クロロベンゼンスルホニルクロリド(5.1 g, 24 mmol)および4-メチルアニリン(2.6 g, 24 mmol)のジクロロメタン(24 mL)中における0 ℃の溶液に、トリエチルアミン(3.4 mL, 24 mmol)を１０分間かけて添加した。氷浴を取り外し、その混合物を１６時間撹拌した。その混合物をジクロロメタン(100 mL)で希釈し、その合わせた溶液を水(50 mL)およびブライン(50 mL)で洗浄した。その有機溶液をMgSO4で乾燥させ、濾過し、蒸発させ、その粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー(15〜60％ EtOAc/ヘキサン)により精製した。生成物を含有する画分をプールし、蒸発させ、高真空下で乾燥させると、6.8 g (69％)の生成物が黄褐色の油として得られた：1H-NMR (CDCl3) δ 10.17 (s, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.61 (d, 2H), 7.04 (d, 2H), 6.96 (d, 2H), 2.19 (s, 3H)。
【０１６９】
ＸＩＩ．N-(ビフェニル-2-イル)-2-(N-(4-トルオイル)-4-クロロフェニルスルホンアミド)アセトアミド
N-(ビフェニル-2-イル)-2-ブロモアセトアミド(150 mg, 0.52 mmol)およびN-(4-トルオイル)-4-クロロベンゼンスルホンアミド(153 mg, 0.52 mmol)のDMF (1.5 mL)中における混合物に、K2CO3 (180 mg, 1.3 mmol)を添加した。結果として得られた懸濁液を、６０℃に４５分間加熱した。その反応混合物を水(30 mL)中に注ぎ、酢酸エチル(2 × 50 mL)で抽出した。その有機層を合わせてブライン(1 × 50 mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、シリカゲルクロマトグラフィー(15〜40％ EtOAc/ヘキサン)により精製した。生成物を含有する画分をプールし、蒸発させると、94 mg (37％)の生成物が白色の微結晶質の固体として得られた：融点159〜177 ℃, Rf 0.42 (25％ EtOAc/ヘキサン); 1H-NMR (CDCl3) δ 8.77 (s, 1H), 8.48 (d, 1H), 7.71-7.59 (m, 2H), 7.52-7.40 (m, 6H), 7.38-7.32 (m, 1H), 7.29-7.26 (m, 2H), 7.19-7.15 (t, 2H), 6.95-6.23 (m, 2H), 4.13 (s, 2H), 2.27 (s, 3H)。
【０１７０】
本明細書で引用された全ての刊行物、特許出願、特許、および他の文書をそのまま援用する。矛盾が生じる場合、定義を含め、本明細書が統制するであろう。加えて、その材料、方法、および例は説明的なものでしかなく、限定的であることを意図していない。
【０１７１】
開示された化合物に対する明らかな変形および本発明の代わりの態様は、上記の開示を考慮すれば当業者には明らかであろう。全てのそのような明らかな変形および代替案は、本明細書で記述されたような本発明の範囲内であると考えられる。
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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