(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）、ヒアルロン酸及びウリジン２リン酸を含む組成物（Ｚ）とリン酸基含有化合物（Ａ）とにウリジン３リン酸合成酵素（Ｂ）を作用させてウリジン３リン酸を製造する方法において、下記ミカエリス定数Ｋｍが下記阻害濃度ＩＣ50の１００倍未満であり、（Ａ）が、ヌクレオシド３リン酸、ポリリン酸又はω−ホスホノ−Ｌ−アルギニンであり、（Ｂ）が、ヌクレオシド−２−リン酸キナーゼ（Ｂ−１）、ポリリン酸キナーゼ（Ｂ−２）又はアルギニンキナーゼ（Ｂ−３）であるウリジン３リン酸の製造方法。
ミカエリス定数Ｋｍ：ウリジン２リン酸を基質とし、（Ｂ）を酵素とし、リン酸基含有化合物（Ａ）を作用させてウリジン３リン酸を合成する反応におけるミカエリス定数。
阻害濃度ＩＣ50：（Ｄ）をウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンに作用させる際の（Ｄ）の濃度において、基質としてウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを用いて、阻害剤としてウリジン２リン酸を用いて求めた、（Ｄ）の酵素活性が半減するときのウリジン２リン酸の濃度。
【請求項２】
下記工程（１）〜（３）を含んでなり、
工程（１）、（２）、（３）及び（１）の順に含む又は工程（１）〜（３）のうち２つを同時に行う工程を含む製造方法であり、
下記ミカエリス定数Ｋｍが下記阻害濃度ＩＣ50の１００倍未満であるヒアルロン酸の製造方法。
工程（１）：ウリジン２リン酸−グルクロン酸とウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンとにヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）を作用させて（Ｄ）、ヒアルロン酸及びウリジン２リン酸を含む組成物（Ｚ’）を得る工程。
工程（２）：組成物（Ｚ’）とリン酸基含有化合物（Ａ）とにウリジン３リン酸合成酵素（Ｂ）を作用させてウリジン３リン酸を得る工程であって、（Ａ）が、ヌクレオシド３リン酸、ポリリン酸又はω−ホスホノ−Ｌ−アルギニンであり、（Ｂ）が、ヌクレオシド−２−リン酸キナーゼ（Ｂ−１）、ポリリン酸キナーゼ（Ｂ−２）又はアルギニンキナーゼ（Ｂ−３）である工程。
工程（３）：ウリジン３リン酸と１−ホスホ−グルクロン酸とにウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｃ）を作用させてウリジン２リン酸−グルクロン酸を得る工程。
ミカエリス定数Ｋｍ：ウリジン２リン酸を基質とし、（Ｂ）を酵素とし、リン酸基含有化合物（Ａ）を作用させてウリジン３リン酸を合成する反応におけるミカエリス定数。
阻害濃度ＩＣ50：（Ｄ）をウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンに作用させる際の（Ｄ）の濃度において、基質としてウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを用いて、阻害剤としてウリジン２リン酸を用いて求めた、（Ｄ）の酵素活性が半減するときのウリジン２リン酸の濃度。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はウリジン３リン酸の製造方法及びヒアルロン酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は牛の眼球、鶏冠、動物の緩衝組織、胎盤、癌細胞及び皮膚などの生体組織に多量に含まれているもので、グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとがβ１，３結合とβ１，４結合で交互に結合した直鎖状の多糖であり、分子量が１０5〜１０6Ｄａの高分子量のグルコサミノグリカンである。ヒアルロン酸は、粘度が高く、高い保湿効果を有し、物理的摩擦に対する潤滑効果及び細菌などの侵入に対する保護効果が優れているという性質を持つ。
ヒアルロン酸はこれらの性質を持つので、化粧品添加剤だけでなく、関節炎治療剤、創傷被覆剤、眼科手術用手術補助剤及び外科手術後の癒着阻止剤などの医薬品としても広範囲に使用される。
【０００３】
ヒアルロン酸の生産方法としては、（１）前記の生体組織から抽出する方法（特許文献１及び特許文献２）、（２）グルコース等の糖の存在下で、ヒアルロン酸を生成する能力を有する微生物を培養してヒアルロン酸を生産し、回収する方法（微生物培養方法）（特許文献３及び特許文献４）が多く知られている。
しかしながら、（１）の抽出方法により得られたヒアルロン酸には、コンドロイチンサルフェート及びグリコサミノグリカンサルフェート等の不純物が含まれており、これらを除去するには複雑な精製過程を要するという問題がある。
【０００４】
また、（２）の微生物培養方法によるヒアルロン酸の生産では、ヒアルロン酸が生産されるのに伴って、培養溶液の粘度が上昇するため、通気攪拌が困難になる。さらに、通気攪拌が困難になることにより、ヒアルロン酸の生産が停止する。したがって、微生物培養方法は、ヒアルロン酸の生産効率が非常に低い問題がある。また、用いた微生物の除去に複雑な精製過程を要する問題がある。さらに、微生物の有するヒアルロン酸分解酵素により、生産されたヒアルロン酸が分解されるため、ヒアルロン酸の分子量が大きくならない及び分子量の不均一性が高くなる等の問題もある。
【０００５】
そこで、生体組織からの抽出や微生物培養によらない第３のヒアルロン酸の生産方法として、（３）ヒアルロン酸合成酵素であるヒアルロン酸シンターゼを用いた方法（非特許文献１）が検討されている。ヒアルロン酸シンターゼを用いた方法では、原料として、ウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを用いる。また、ウリジン２リン酸−グルクロン酸は、ウリジン２リン酸から合成されたウリジン３リン酸を用いて１−ホスホ−グルクロン酸と反応させることにより得られる。
【０００６】
ヒアルロン酸シンターゼを用いてヒアルロン酸を合成する際、副生成物としてウリジン２リン酸が生成する。この生成したウリジン２リン酸は、ヒアルロン酸シンターゼに対して阻害剤として作用することが知られている（非特許文献２）。また、生成したウリジン２リン酸を利用して、ウリジン３リン酸合成酵素による酵素反応によりウリジン３リン酸を合成しようとする場合、ヒアルロン酸シンターゼが存在すると、ウリジン３リン酸を合成する酵素がうまく作用せず、ウリジン３リン酸を少量しか生成できない問題がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，Ｖｏｌ．２７３，Ｎｏ．１４，Ｐ８４５４−８４５８
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００４，Ｖｏｌ４３，Ｎｏ２８，Ｐ９２３４−９２４２
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第４，１４１，９７３号明細書
【特許文献２】米国特許第４，３０３，６７６号明細書
【特許文献３】特開昭５８−０５６６９２号公報
【特許文献４】国際公開第８６／８６０４３５５号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ヒアルロン酸シンターゼを用いてヒアルロン酸を製造した際に得られるヒアルロン酸シンターゼとウリジン２リン酸とを含む組成物から、ウリジン２リン酸を効率よく利用して、ウリジン３リン酸を製造する方法を提供することを目的とする。さらに、ヒアルロン酸を製造した際に得られるウリジン２リン酸を効率よく利用してヒアルロン酸を製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明のウリジン３リン酸の製造方法は、ヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）、ヒアルロン酸及びウリジン２リン酸を含む組成物（Ｚ）とリン酸基含有化合物（Ａ）とにウリジン３リン酸合成酵素（Ｂ）を作用させてウリジン３リン酸を製造する方法において、下記ミカエリス定数Ｋｍが下記阻害濃度ＩＣ50の１００倍未満であり、（Ａ）が、ヌクレオシド３リン酸、ポリリン酸又はω−ホスホノ−Ｌ−アルギニンであり、（Ｂ）が、ヌクレオシド−２−リン酸キナーゼ（Ｂ−１）、ポリリン酸キナーゼ（Ｂ−２）又はアルギニンキナーゼ（Ｂ−３）であるウリジン３リン酸の製造方法である。
ミカエリス定数Ｋｍ：ウリジン２リン酸を基質とし、（Ｂ）を酵素とし、リン酸基含有化合物（Ａ）を作用させてウリジン３リン酸を合成する反応におけるミカエリス定数。
阻害濃度ＩＣ50：（Ｄ）をウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンに作用させる際の（Ｄ）の濃度において、基質としてウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを用いて、阻害剤としてウリジン２リン酸を用いて求めた、（Ｄ）の酵素活性が半減するときのウリジン２リン酸の濃度。
【００１１】
また、本発明のヒアルロン酸の製造方法は、下記工程（１）〜（３）を含んでなり、工程（１）、（２）、（３）及び（１）の順に含む又は工程（１）〜（３）のうち２つを同時に行う工程を含む製造方法であり、下記ミカエリス定数Ｋｍが下記阻害濃度ＩＣ50の１００倍未満であるヒアルロン酸の製造方法である。
工程（１）：ウリジン２リン酸−グルクロン酸とウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンとにヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）を作用させて（Ｄ）、ヒアルロン酸及びウリジン２リン酸を含む組成物（Ｚ’）を得る工程。
工程（２）：組成物（Ｚ’）とリン酸基含有化合物（Ａ）とにウリジン３リン酸合成酵素（Ｂ）を作用させてウリジン３リン酸を得る工程であって、（Ａ）が、ヌクレオシド３リン酸、ポリリン酸又はω−ホスホノ−Ｌ−アルギニンであり、（Ｂ）が、ヌクレオシド−２−リン酸キナーゼ（Ｂ−１）、ポリリン酸キナーゼ（Ｂ−２）又はアルギニンキナーゼ（Ｂ−３）である工程。。
工程（３）：ウリジン３リン酸と１−ホスホ−グルクロン酸とにウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｃ）を作用させてウリジン２リン酸−グルクロン酸を得る工程。
ミカエリス定数Ｋｍ：ウリジン２リン酸を基質とし、（Ｂ）を酵素とし、リン酸基含有化合物（Ａ）を作用させてウリジン３リン酸を合成する反応におけるミカエリス定数。
阻害濃度ＩＣ50：（Ｄ）をウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンに作用させる際の（Ｄ）の濃度において、基質としてウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを用いて、阻害剤としてウリジン２リン酸を用いて求めた、（Ｄ）の酵素活性が半減するときのウリジン２
リン酸の濃度。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のウリジン３リン酸の製造方法は、ヒアルロン酸シンターゼを用いてヒアルロン酸を製造した際に副生成するウリジン２リン酸を効率よく用いて、ウリジン３リン酸を多く得ることができるという効果を奏する。
また、本発明のヒアルロン酸の製造方法は、ヒアルロン酸シンターゼを用いてヒアルロン酸を製造した際に副生成するウリジン２リン酸を効率よく利用して、ウリジン３リン酸を製造することができ、さらに、このウリジン３リン酸を使用してヒアルロン酸を製造することで、ヒアルロン酸の製造において、ウリジン３リン酸の合計使用量を低減できるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ウリジン２リン酸を基質とし、ヌクレオシド−２−リン酸キナーゼ（Ｂ−１）を酵素とし、アデノシン３リン酸を作用させてウリジン３リン酸を合成する反応におけるミカエリス定数Ｋｍを求めるために作成したＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットであり、縦軸を基質濃度を反応初速度で除した値（［Ｓ］／ｖ）、横軸をウリジン２リン酸の濃度［Ｓ］としてプロットしたグラフである。
【図２】ヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）の酵素活性が半減するときのウリジン２リン酸の濃度である阻害濃度ＩＣ50を求めるために作成したグラフであり、横軸（ｘ軸）にそれぞれのウリジン２リン酸濃度［Ｉ］、縦軸（ｙ軸）にウリジン２リン酸の濃度が異なるバッファー２〜７での酵素反応初速度のウリジン２リン酸の濃度が０ｍＭであるバッファー３の結果を１００とした場合の相対値をプロットしたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明において、ウリジン２リン酸−グルクロン酸とは、ウリジン２リン酸のリン酸基にグルクロン酸が結合した化合物である。ウリジン２リン酸−グルクロン酸は、例えば、ウリジン３リン酸とグルクロン酸１リン酸から合成することができる。また、ウリジン２リン酸−グルコースの酸化によって得ることができる。さらに、ウリジン２リン酸−グルコースの酸化を行うウリジン２リン酸デヒドロゲナーゼを過剰発現した微生物を用いた微生物培養方法によっても生産可能である。
【００１５】
本発明において、ウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンとは、ウリジン２リン酸のリン酸基にＮ−アセチルグルコサミンが結合した化合物である。ウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンは、例えば、ウリジン３リン酸とＮ−アセチルグルコサミン１リン酸からウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼによって合成することができる。また、Ｎ−アセチルグルコサミンからアセチルグルコサミン１リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、ホスホアセチルグルコサミンムターゼ又はアセチルグルコサミンキナーゼ等の酵素を用いても生産可能である。
【００１６】
本発明のヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）は、ウリジン２リン酸−グルクロン酸とウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンとを基質として、ヒアルロン酸を合成する活性を有する酵素であれば特に限定されない。（Ｄ）には、動物起源の動物ヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ−１）、微生物起源の微生物ヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ−２）、（Ｄ−１）〜（Ｄ−２）が化学的に修飾された変異体（Ｄ−３）及び（Ｄ−１）〜（Ｄ−２）が遺伝子的に修飾された変異体（Ｄ−４）が含まれる。
【００１７】
動物ヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ−１）としては、例えば、ラット由来及びアフリカツメガエル由来のもの等が挙げられる。
【００１８】
微生物ヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ−２）としては、例えば、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｕｓ）属由来及びパスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ属由来のもの等が挙げられる。
【００１９】
化学的に修飾したヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ−３）としては、例えば上記（Ｄ−１）〜（Ｄ−２）にカルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及びイミダゾール化合物等を作用させて化学修飾したもの等が挙げられる。
【００２０】
遺伝子的に修飾したアルロン酸シンターゼ（Ｄ−４）としては、Ｓｍｉｔｈらの方法（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，Ｖｏｌ．２５３，Ｎｏ．１８，Ｐ６５５１−６５６０）で上記ヒアルロン酸シンターゼの遺伝子を改変してアミノ酸を置換したもの等が挙げられる。
【００２１】
上記ヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）のうち、入手しやすさの観点から、微生物ヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ−２）が好ましい。また、（Ｄ）のうち、ヒアルロン酸合成活性の高さの観点から、ストレプトコッカス属由来ヒアルロン酸シンターゼが好ましい。
ヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）としては、２種以上を用いてもいい。
【００２２】
本発明のウリジン３リン酸の製造方法は、ウリジン２リン酸−グルクロン酸とウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンとにヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）を作用させて得られた、（Ｄ）、ヒアルロン酸及びウリジン２リン酸を含む組成物（Ｚ）とリン酸基含有化合物（Ａ）とにウリジン３リン酸合成酵素（Ｂ）を作用させる製造方法である。
上記組成物（Ｚ）は、（Ｄ）、ヒアルロン酸及びウリジン２リン酸を含んでいればよく、ヒアルロン酸を生産した際の反応溶液をそのままを（Ｚ）として用いてもいい。
また、本発明のウリジン３リン酸の製造方法は、上記反応を含んでいればよく、ウリジン２リン酸−グルクロン酸、ウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン及び（Ａ）を含む溶液中で、（Ｄ）及び（Ｂ）を同時に作用させてもいい。
【００２３】
本発明において、ウリジン２リン酸は、ヌクレオチドの１種であり、ウリジンヌクレオシドのピロリン酸エステル化物である。
【００２４】
本発明において、リン酸基含有化合物（Ａ）は、リン酸基を有する化合物である。（Ａ）としては、ウリジン３リン酸合成酵素（Ｂ）との親和性の観点から、ウリジン２リン酸にリン酸基を供与し得る化合物が好ましい。（Ａ）として、例えば、トリアミノホスフィンオキシド、リン酸化したアミノ酸（例えばω−ホスホノ−Ｌ−アルギニン等）、ポリリン酸、ホスホエノールピルビン酸、カルバモイルリン酸、３−ホスホグリセロールリン酸、ホスホクレアチン及びヌクレオチド（例えば、グアノシン３リン酸及びアデノシン３リン酸等のヌクレオシド３リン酸等）等が挙げられる。
【００２５】
本発明において、ウリジン３リン酸合成酵素（Ｂ）は、ウリジン２リン酸及びリン酸基含有化合物（Ａ）から、ウリジン３リン酸を合成するウリジン３リン酸合成活性を有する酵素である。ウリジン３リン酸合成活性は、具体的には、リン酸基含有化合物（Ａ）をリン酸基供与体として、ウリジン２リン酸にリン酸基を供与し、ウリジン３リン酸を合成する能力をいう。
（Ｂ）には、ヌクレオシド−２−リン酸キナーゼ（Ｂ−１）、ポリリン酸キナーゼ（Ｂ−２）、アルギニンキナーゼ（Ｂ−３）、ピルビン酸キナーゼ（Ｂ−４）、カルバミン酸キナーゼ（Ｂ−５）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｂ−６）、及びホスホクレアチンキナーゼ（Ｂ−７）が含まれる。
【００２６】
本発明において、ヌクレオシド−２−リン酸キナーゼ（Ｂ−１）は、ウリジン２リン酸とヌクレオシド３リン酸からウリジン３リン酸とヌクレオシド２リン酸を生成する活性を有する酵素である。（Ｂ−１）には、動物起源の動物ヌクレオシド−２−リン酸キナーゼ（Ｂ−１−１）、植物起源の植物ヌクレオシド−２−リン酸キナーゼ（Ｂ−１−２）、微生物起源の微生物ヌクレオシド−２−リン酸キナーゼ（Ｂ−１−３）、（Ｂ−１−１）〜（Ｂ−１−３）が化学的に修飾された変異体（Ｂ−１−４）及び（Ｂ−１−１）〜（Ｂ−１−３）が遺伝子的に修飾された変異体（Ｂ−１−５）が含まれる。
（Ｂ）として（Ｂ−１）を用いる場合、リン酸基含有化合物（Ａ）としては、反応性の観点から、ヌクレオシド３リン酸を用いることが好ましい。
【００２７】
動物ヌクレオシド−２−リン酸キナーゼ（Ｂ−１−１）としては、例えば、ヒト由来、ウシ由来及びラット由来のもの等が挙げられる。
【００２８】
植物ヌクレオシド−２−リン酸キナーゼ（Ｂ−１−２）としては、例えば、シロイヌナズナ由来及びコメ由来のもの等が挙げられる。
【００２９】
微生物ヌクレオシド−２−リン酸キナーゼ（Ｂ−１−３）としては、例えばエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属由来、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属由来、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来及びサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属由来のもの等が挙げられる。
【００３０】
化学的に修飾したヌクレオシド−２−リン酸キナーゼ（Ｂ−１−４）としては、上記（Ｂ−１−１）〜（Ｂ−１−３）に化学反応する化合物｛カルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及びイミダゾール化合物等、１種でも２種以上でもいい｝を作用させて化学修飾したもの等が挙げられる。
【００３１】
遺伝子的に修飾したヌクレオシド−２−リン酸キナーゼ（Ｂ−１−５）としては、Ｓｍｉｔｈらの方法（参考文献１；Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，Ｖｏｌ．２５３，Ｎｏ．１８，Ｐ６５５１−６５６０に記載の方法、以下同じ）で上記ヌクレオシド−２−リン酸キナーゼの遺伝子を改変してアミノ酸を改変したもの等が挙げられる。
【００３２】
上記ヌクレオシド−２−リン酸キナーゼ（Ｂ−１）のうち、入手しやすさの観点から、微生物ヌクレオシド−２−リン酸キナーゼ（Ｂ−１−３）が好ましい。また、（Ｂ−１）のうち、ウリジン３リン酸合成活性の高さの観点から、ラット由来ヌクレオシド−２−リン酸キナーゼが好ましい。
【００３３】
本発明においてポリリン酸キナーゼ（Ｂ−２）は、ウリジン２リン酸とポリリン酸とから、ウリジン３リン酸と、重合度の１つ少ないポリリン酸とを生成する活性を有する酵素である。（Ｂ−２）には、植物起源の植物ポリリン酸キナーゼ（Ｂ−２−１）、微生物起源の微生物ポリリン酸キナーゼ（Ｂ−２−２）、（Ｂ−２−１）〜（Ｂ−２−２）が化学的に修飾された変異体（Ｂ−２−３）及び（Ｂ−２−１）〜（Ｂ−２−２）が遺伝子的に修飾された変異体（Ｂ−２−４）が含まれる。
（Ｂ）として（Ｂ−２）を用いる場合、リン酸基含有化合物（Ａ）としては、反応性の観点から、ポリリン酸を用いることが好ましい。
【００３４】
植物ポリリン酸キナーゼ（Ｂ−２−１）としては、例えば、タバコ由来のもの等が挙げられる。
【００３５】
微生物ポリリン酸キナーゼ（Ｂ−２−２）としては、例えばエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属由来、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属由来、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属由来及びサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属由来のもの等が挙げられる。
【００３６】
化学的に修飾したポリリン酸キナーゼ（Ｂ−２−３）として、例えば上記（Ｂ−２−１）〜（Ｂ−２−２）に化学反応する化合物｛カルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及びイミダゾール化合物等、１種でも２種以上でもいい｝を作用させて化学修飾したもの等が挙げられる。
【００３７】
遺伝子的に修飾したポリリン酸キナーゼ（Ｂ−２−４）として、Ｓｍｉｔｈらの方法で上記ポリリン酸キナーゼの遺伝子を改変してアミノ酸を置換したもの等が挙げられる。
【００３８】
上記ポリリン酸キナーゼ（Ｂ−２）のうち、入手しやすさの観点から、微生物ポリリン酸キナーゼ（Ｂ−２−３）が好ましい。また、（Ｂ−２）のうち、ウリジン３リン酸合成活性の高さの観点から、シュードモナス属由来のリン酸キナーゼが好ましい。
【００３９】
本発明においてアルギニンキナーゼ（Ｂ−３）は、ウリジン２リン酸とω−ホスホノ−Ｌ−アルギニンからウリジン３リン酸とＬ−アルギニンを生成する活性を有する酵素である。（Ｂ−３）には、動物起源の動物アルギニンキナーゼ（Ｂ−３−１）、植物起源の植物アルギニンキナーゼ（Ｂ−３−２）、微生物起源の微生物アルギニンキナーゼ（Ｂ−３−３）、（Ｂ−３−１）〜（Ｂ−３−３）が化学的に修飾された変異体（Ｂ−３−４）及び（Ｂ−３−１）〜（Ｂ−３−３）が遺伝子的に修飾された変異体（Ｂ−３−５）が含まれる。
（Ｂ）として（Ｂ−３）を用いる場合、リン酸基含有化合物（Ａ）としては、反応性の観点から、ω−ホスホノ−Ｌ−アルギニンを用いることが好ましい。
【００４０】
動物アルギニンキナーゼ（Ｂ−３−１）としては、例えば、ショウジョウバエ由来、エビ由来及びノミ由来のもの等が挙げられる。
【００４１】
植物アルギニンキナーゼ（Ｂ−３−２）としては、例えば、ケヤリ由来のもの等が挙げられる。
【００４２】
微生物アルギニンキナーゼ（Ｂ−３−３）としては、例えばバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来のもの等が挙げられる。
【００４３】
化学的に修飾したアルギニンキナーゼ（Ｂ−３−４）として、例えば上記（Ｂ−３−１）〜（Ｂ−３−３）に化学反応する化合物｛カルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及びイミダゾール化合物等、１種でも２種以上でもいい｝を作用させて化学修飾したもの等が挙げられる。
【００４４】
遺伝子的に修飾したアルギニンキナーゼ（Ｂ−３−５）として、Ｓｍｉｔｈらの方法で上記アルギニンキナーゼの遺伝子を改変してアミノ酸を置換したもの等が挙げられる。
【００４５】
上記アルギニンキナーゼ（Ｂ−３）のうち、入手しやすさの観点から、微生物アルギニンキナーゼ（Ｂ−３−３）が好ましい。また、（Ｂ−３）のうち、ウリジン３リン酸合成活性の高さの観点から、トノサマバッタ由来アルギニンキナーゼが好ましい。
【００４６】
本発明においてピルビン酸キナーゼ（Ｂ−４）は、ウリジン２リン酸とホスホエノールピルビン酸とからウリジン３リン酸とピルビン酸とを生成する活性を有する酵素である。（Ｂ−４）には、動物起源の動物ピルビン酸キナーゼ（Ｂ−４−１）、植物起源の植物ピルビン酸キナーゼ（Ｂ−４−２）、微生物起源の微生物ピルビン酸キナーゼ（Ｂ−４−３）、（Ｂ−４−１）〜（Ｂ−４−３）が化学的に修飾された変異体（Ｂ−４−４）及び（Ｂ−４−１）〜（Ｂ−４−３）が遺伝子的に修飾された変異体（Ｂ−４−５）が含まれる。
（Ｂ）として（Ｂ−４）を用いる場合、リン酸基含有化合物（Ａ）としては、反応性の観点から、ホスホエノールピルビン酸を用いることが好ましい。
【００４７】
動物ピルビン酸キナーゼ（Ｂ−４−１）としては、例えば、ヒト由来、ウシ由来及びラット由来のもの等が挙げられる。
【００４８】
植物ピルビン酸キナーゼ（Ｂ−４−２）としては、例えば、シロイヌナズナ由来及びトウゴマ由来のもの等が挙げられる。
【００４９】
微生物ピルビン酸キナーゼ（Ｂ−４−３）としては、例えばエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属由来及びサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属由来のもの等が挙げられる。
【００５０】
化学的に修飾したピルビン酸キナーゼ（Ｂ−４−４）として、例えば上記（Ｂ−４−１）〜（Ｂ−４−３）に化学反応する化合物｛カルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及びイミダゾール化合物等、１種でも２種以上でもいい｝を作用させて化学修飾したもの等が挙げられる。
【００５１】
遺伝子的に修飾したピルビン酸キナーゼ（Ｂ−４−５）として、Ｓｍｉｔｈらの方法で上記ピルビン酸キナーゼの遺伝子を改変してアミノ酸を置換したもの等が挙げられる。
【００５２】
上記ピルビン酸キナーゼ（Ｂ−４）のうち、入手しやすさの観点から、微生物ピルビン酸キナーゼ（Ｂ−４−３）が好ましい。また、（Ｂ−４）のうち、ウリジン３リン酸合成活性の高さの観点から、ラット由来ピルビン酸キナーゼが好ましい。
【００５３】
本発明において、カルバミン酸キナーゼ（Ｂ−５）は、カルバモイルリン酸とウリジン２リン酸からウリジン３リン酸、二酸化炭素、及びアンモニアを生成する活性を有する酵素である。（Ｂ−５）には、動物起源の動物カルバミン酸キナーゼ（Ｂ−５−１）、微生物起源の微生物カルバミン酸キナーゼ（Ｂ−５−２）、（Ｂ−５−１）〜（Ｂ−５−２）が化学的に修飾された変異体（Ｂ−５−３）、及び（Ｂ−５−１）〜（Ｂ−５−２）が遺伝子的に修飾された変異体（Ｂ−５−４）が含まれる。
（Ｂ）として（Ｂ−５）を用いる場合、リン酸基含有化合物（Ａ）としては、反応性の観点から、カルバモイルリン酸を用いることが好ましい。
【００５４】
動物カルバミン酸キナーゼ（Ｂ−５−１）としては、例えばラット由来のもの等が挙げられる。
【００５５】
微生物カルバミン酸キナーゼ（Ｂ−５−２）としては、例えばピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属由来、及びラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来のもの等が挙げられる。
【００５６】
化学的に修飾したカルバミン酸キナーゼ（Ｂ−５−３）としては、上記（Ｂ−５−１）〜（Ｂ−５−２）に化学反応する化合物｛カルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及びイミダゾール化合物等、１種でも２種以上でもいい｝を作用させて化学修飾したもの等が挙げられる。
【００５７】
遺伝子的に修飾したカルバミン酸キナーゼ（Ｂ−５−４）としては、Ｓｍｉｔｈらの方法で上記カルバミン酸キナーゼの遺伝子を改変してアミノ酸を改変したもの等が挙げられる。
【００５８】
上記カルバミン酸キナーゼ（Ｂ−５）のうち、入手しやすさの観点から、微生物カルバミン酸キナーゼ（Ｂ−５−２）が好ましい。また、（Ｂ−５）のうち、ウリジン３リン酸合成活性の高さの観点から、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来カルバミン酸キナーゼが好ましい。
【００５９】
本発明において、ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｂ−６）は、３−ホスホグリセロールリン酸とウリジン２リン酸からウリジン３リン酸及び３−ホスホグリセリン酸を生成する活性を有する酵素である。（Ｂ−６）には、動物起源の動物ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｂ−６−１）、微生物起源の微生物ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｂ−６−２）、（Ｂ−６−１）〜（Ｂ−６−２）が化学的に修飾された変異体（Ｂ−６−３）、及び（Ｂ−６−１）〜（Ｂ−６−２）が遺伝子的に修飾された変異体（Ｂ−６−４）が含まれる。
（Ｂ）として（Ｂ−６）を用いる場合、リン酸基含有化合物（Ａ）としては、反応性の観点から、３−ホスホグリセロールリン酸を用いることが好ましい。
【００６０】
動物ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｂ−６−１）としては、例えばラット由来のもの等が挙げられる。
【００６１】
微生物起源の微生物ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｂ−６−２）としては、例えばサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属由来のもの等が挙げられる。
【００６２】
化学的に修飾したホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｂ−６−３）としては、上記（Ｂ−６−１）〜（Ｂ−６−２）に化学反応する化合物｛カルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及びイミダゾール化合物等、１種でも２種以上でもいい｝を作用させて化学修飾したもの等が挙げられる。
【００６３】
遺伝子的に修飾したホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｂ−６−４）としては、Ｓｍｉｔｈらの方法で上記ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子を改変してアミノ酸を改変したもの等が挙げられる。
【００６４】
上記ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｂ−６）のうち、入手しやすさの観点から、微生物ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｂ−６−２）が好ましい。また、（Ｂ−６）のうち、ウリジン３リン酸合成活性の高さの観点から、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属由来ホスホグリセリン酸キナーゼが好ましい。
【００６５】
本発明において、クレアチンキナーゼ（Ｂ−７）は、ホスホクレアチンとウリジン２リン酸からウリジン３リン酸及びクレアチンを生成する活性を有する酵素である。（Ｂ−７）には、動物起源の動物クレアチンキナーゼ（Ｂ−７−１）、（Ｂ−７−１）が化学的に修飾された変異体（Ｂ−７−２）、及び（Ｂ−７−１）が遺伝子的に修飾された変異体（Ｂ−７−３）が含まれる。
（Ｂ）として（Ｂ−７）を用いる場合、リン酸基含有化合物（Ａ）としては、反応性の観点から、ホスホクレアチンを用いることが好ましい。
【００６６】
動物クレアチンキナーゼ（Ｂ−７−１）としては、例えばラット由来のもの等が挙げられる。
【００６７】
化学的に修飾したクレアチンキナーゼ（Ｂ−７−２）としては、上記（Ｂ−７−１）に化学反応する化合物｛カルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及びイミダゾール化合物等、１種でも２種以上でもいい｝を作用させて化学修飾したもの等が挙げられる。
【００６８】
遺伝子的に修飾したクレアチンキナーゼ（Ｂ−７−３）としては、Ｓｍｉｔｈらの方法で上記クレアチンキナーゼの遺伝子を改変してアミノ酸を改変したもの等が挙げられる。
【００６９】
上記クレアチンキナーゼ（Ｂ−７）のうち、入手しやすさの観点から、動物クレアチンキナーゼ（Ｂ−７−１）が好ましい。また、（Ｂ−７−１）のうち、ウリジン３リン酸合成活性の高さの観点から、ラット由来ホスホグリセリン酸キナーゼが好ましい。
【００７０】
ウリジン３リン酸合成酵素（Ｂ）のうち、ウリジン３リン酸合成活性の高さの観点から、ヌクレオシド−２−リン酸キナーゼ（Ｂ−１）、ポリリン酸キナーゼ（Ｂ−２）及びカルバミン酸キナーゼ（Ｂ−５）が好ましい。
また、ウリジン３リン酸合成酵素（Ｂ）は、１種でもよく、２種以上を用いてもいい。
【００７１】
本発明の製造方法において、下記ミカエリス定数Ｋｍは下記阻害濃度ＩＣ50の１００倍未満である。
ミカエリス定数Ｋｍ：ウリジン２リン酸を基質とし、（Ｂ）を酵素とし、リン酸基含有化合物を作用させてウリジン３リン酸を合成する反応におけるミカエリス定数。
阻害濃度ＩＣ50：（Ｄ）をウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンに作用させる際の（Ｄ）の濃度において、基質としてウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを用いて、阻害剤としてウリジン２リン酸を用いて求めた、（Ｄ）の酵素活性が半減するときのウリジン２リン酸の濃度。
本発明において、２種以上の（Ｂ）を用いる場合は、それぞれの（Ｂ）についてＫｍを求め、全ての（Ｂ）についてＫｍがＩＣ50の１００倍未満であるとする。
また、２種以上の（Ｄ）を用いる場合は、それぞれの（Ｄ）についてＩＣ50を求め、Ｋｍが、求めたＩＣ50の中で最も大きいＩＣ50の１００倍未満であるとする。
【００７２】
ミカエリス定数Ｋｍは、Ａｇａｒｗａｌらによって報告された方法（参考文献２；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９７８，Ｖｏｌ．５１，Ｐ４８３−４９１に記載の方法）で酵素反応初速度の基質濃度依存性を求めることによって求められる。ミカエリス定数Ｋｍの測定に用いる（Ｂ）の形態としては、精製酵素を用いる。
【００７３】
阻害濃度ＩＣ50は、酵素反応初速度の阻害濃度依存性を求めることによって求められる。具体的には、下記阻害濃度ＩＣ50の測定法によって求めたものである。阻害濃度ＩＣ50の測定に用いる（Ｄ）の形態としては、精製酵素を用いる。
【００７４】
阻害濃度ＩＣ50は、本発明の製造方法において、（Ｄ）を作用させる際の濃度と同様の（Ｄ）の濃度、温度及びｐＨの条件下において、下記測定方法によって求められる。
＜（Ｄ）の酵素活性が半減するときのウリジン２リン酸の濃度である阻害濃度ＩＣ50の測定方法＞
一定量のヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）、ウリジン２リン酸、ウリジン２リン酸−グルクロン酸、ウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、ｐＨ調整剤（Ｋ）及び水を含む一定の温度及びｐＨに調製した液量１ｍＬ以下の酵素反応溶液（Ｆ）を作成する。
酵素反応溶液（Ｆ）の温度は、ウリジン３リン酸及び／又はヒアルロン酸を製造する際に（Ｄ）を作用させる温度と同じの温度を選ぶ。
酵素反応溶液（Ｆ）のｐＨは、ウリジン３リン酸及び／又はヒアルロン酸を製造する際に（Ｄ）を作用させるｐＨと同じのｐＨを選ぶ。
酵素反応溶液（Ｆ）中のヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）のモル濃度は、ウリジン３リン酸及び／又はヒアルロン酸を製造する際に（Ｄ）を作用させる濃度に調整する。
酵素反応溶液（Ｆ）中のウリジン２リン酸の含有量（モル濃度）は、ウリジン２リン酸が０Ｍの酵素反応溶液と、ウリジン２リン酸の濃度が０Ｍより大きくヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）の活性が０になる（ヒアルロン酸の生成が観測できなくなる）ウリジン２リン酸の濃度以下の濃度でウリジン２リン酸の濃度が異なる４種類以上の酵素反応溶液とを、すなわち、合計５種類以上の酵素反応溶液（Ｆ）を作成すればいい。また、類似のヒアルロン酸シンターゼに対するウリジン２リン酸の阻害定数Ｋｉが分かっている場合は、ウリジン２リン酸の濃度が０Ｍのもの、類似ヒアルロン酸シンターゼの０より大きくＫｉ未満の濃度範囲で２種類以上、Ｋｉ以上及びＫｉの１０倍以下の濃度範囲で２種類以上、合計５種類以上作成すればいい。
酵素反応溶液（Ｆ）中のウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンの含有量は、経時的なピーク面積変化を観測できる点を１点選べばよい。測定に使用する（Ｄ）と類似のヒアルロン酸シンターゼのミカエリス定数Ｋｍが分かっている場合は、Ｋｍ以上及びＫｍの５倍以下の濃度範囲の間で選べばよい。
酵素反応溶液（Ｆ）に用いるｐＨ調整剤（Ｋ）は、扱いやすさ及び酵素の安定性の観点から、リン酸塩、ホウ酸塩、ＨＥＰＥＳバッファー及びＭＥＳバッファー等のＧｏｏｄバッファーが好ましい。酵素反応溶液（Ｆ）中の（Ｋ）の含有量（モル濃度）は、１００〜５００ｍＭである。
酵素反応溶液（Ｍ）について、（Ｆ）を作成直後及び一定時間（例えば５分）ごとに溶液の一部（例えば１００μＬ）を取り出し、取り出したものを１００℃で１分間熱処理し、酵素反応を停止する。液体クロマトグラフィーを用いて取り出した反応溶液中のヒアルロン酸の量を定量する。酵素反応溶液（Ｆ）を作成直後のピーク面積をＰ0、ｈ時間後のピーク面積をＰhとし、ピーク面積の変化ΔＰ（ΔＰ＝Ｐh−Ｐ0）とヒアルロン酸のピーク面積に対する検量線を用いて酵素反応初速度ｖ（Ｍ／ｓ）を算出する。
さらに、ウリジン２リン酸の濃度が異なる酵素反応溶液（Ｆ）を用いて、同様に測定し、酵素反応初速度ｖを算出する。
阻害濃度ＩＣ50は、横軸に（ｘ軸）にそれぞれのウリジン２リン酸の濃度、縦軸（ｙ軸）にウリジン２リン酸濃度が０の時の酵素反応初速度ｖを１００（％）としたときの相対活性をプロットする。プロットを直線でつなぎ、ｙ＝５０（％）となるときのウリジン２リン酸濃度を阻害濃度ＩＣ50とする。
【００７５】
本発明において、ミカエリス定数Ｋｍは、阻害濃度ＩＣ50の１００倍未満である。ウリジン２リン酸を効率よくウリジン３リン酸に変換する及びヒアルロン酸を効率よく生産する観点から、６０倍以下が好ましく、さらに好ましくは１０倍以下である。
ウリジン２リン酸の（Ｂ）に対するミカエリス定数Ｋｍが、ウリジン２リン酸のヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）に対する阻害濃度ＩＣ50の１００倍以上では、ウリジン２リン酸がウリジン３リン酸合成酵素（Ｂ）に触媒されてウリジン３リン酸を合成する活性が低く、効率よくウリジン３リン酸を合成することができない。また、ウリジン２リン酸がヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）との結合で消費され、ウリジン２リン酸を効率よく再利用できない。１００倍未満であることで、（Ｄ）との結合により消費されるウリジン２リン酸とウリジン３リン酸合成酵素（Ｂ）に触媒されるウリジン２リン酸とのバランスがよく、効率よくウリジン３リン酸を合成することができる。
例えば、無精製のウリジン２リン酸−グルクロン酸とウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンとにヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）を作用させる際に、ＫｍがＩＣ50の１００倍（Ｋｍ＝１００×ＩＣ50）であるウリジン３リン酸合成酵素（Ｂ）とヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）とが等モル量存在している場合、ウリジン３リン酸合成酵素（Ｂ）に触媒されるウリジン２リン酸のモル量は、ヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）と結合するウリジン２リン酸のモル量のおよそ１００分の１程度であると推察される。
【００７６】
本発明のウリジン３リン酸の製造方法において、ミカエリス定数Ｋｍが阻害濃度ＩＣ50の１００倍未満であることにより、ヒアルロン酸シンターゼの存在下でもウリジン２リン酸を効率よくウリジン３リン酸に変換することができ、ウリジン３リン酸の生産量が多くなる。
【００７７】
本発明のウリジン３リン酸の製造方法の一例は、下記工程（ａ）及び（ｂ）を含むウリジン３リン酸の製造方法である。下記工程（ａ）及び（ｂ）において、組成物（Ｚ）は工程（ａ）で反応を行った後の反応溶液（Ｉ）である。
工程（ａ）：所定量のウリジン２リン酸−グルクロン酸、ウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、ヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）及び溶剤を含む反応溶液（Ｉ）を、所定の温度、所定のｐＨに調整し、反応を行う。
工程（ｂ）：工程（ａ）の反応溶液（Ｉ）、所定量のリン酸基含有化合物（Ａ）及びウリジン３リン酸合成酵素（Ｂ）を混合して反応溶液（ＩＩ）とし、所定の温度、所定のｐＨに調整し、反応を行う。
【００７８】
本発明において、溶剤としては、水、有機溶剤及びこれらの混合物が含まれる。
【００７９】
本発明において、水としては、特に限定されるものではなく、例えば、水道水、イオン交換水、蒸留水及び逆浸透水等が挙げられる。また、水中に、後述するｐＨ調整剤（Ｋ）を含むバッファー水溶液等が挙げられる。
【００８０】
本発明において、有機溶剤としては、アルコール（炭素数１〜１８のアルコールが挙げられ、具体的には、メタノール、エタノール、ブタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール及びグリセリン等）、ケトン（アセトン及びメチルエチルケトン等）、エーテル（テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、エチレングリコールモノアルキルエーテル、プロピレングリコールモノアルキルエーテル及び環状エーテル等）、スルホキシド（ジメチルスルホキシド等）、脂肪族または脂環式炭化水素（ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ミネラルスピリット及びシクロヘキサン等）及びふっ素含有化合物（テトラフルオロエチレン等）等が挙げられる。これらの有機溶剤のうち、タンパク質の安定性の観点からスルホキシドが好ましい。
【００８１】
本発明において、溶剤としては、酵素の安定性の観点から、スルホキシド及び水が好ましく、さらに好ましくは水であり、特に好ましくはｐＨ調整剤（Ｋ）を含むバッファー水溶液である。
【００８２】
本発明において、ｐＨ調整剤（Ｋ）としては、ホウ酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー、Ｔｒｉｓバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、硫酸、塩酸、クエン酸、乳酸、ピルビン酸、蟻酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、モノエタノールアミン及びジエタノールアミン等が挙げられる。
【００８３】
上記工程（ａ）において、反応溶液（Ｉ）中のウリジン２リン酸−グルクロン酸の含有量（モル濃度）は、ヒアルロン酸を効率よく製造する観点から、０．０００１ｍＭ〜１Ｍが好ましく、さらに好ましくは０．００１ｍＭ〜５００ｍＭである。
反応溶液（Ｉ）中のウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンの含有量（モル濃度）は、ヒアルロン酸を効率よく製造する観点から、０．０００１ｍＭ〜１Ｍが好ましく、さらに好ましくは０．００１ｍＭ〜５００ｍＭである。
反応溶液（Ｉ）中のヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）の含有量（ユニット／ｍＬ）は、反応効率の観点から、０．００００１ユニット／ｍＬ〜１０，０００ユニット／ｍＬが好ましく、さらに好ましくは０．００１ユニット／ｍＬ〜１，０００ユニット／ｍＬである。
１ユニットとは、１分間に１μｍｏｌのウリジン２リン酸−グルクロン酸及び１μｍｏｌのウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンをヒアルロン酸にする酵素量である。
反応溶液（Ｉ）の温度は、ヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）の酵素活性の安定性の観点から、０℃〜１００℃が好ましく、さらに好ましくは３０℃〜７０℃である。
反応溶液（Ｉ）のｐＨは、ヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）の酵素活性の安定性の観点から、ｐＨ２〜１２が好ましく、さらに好ましくはｐＨ４〜９である。
反応溶液（Ｉ）において、ヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）を作用させる時間は、（Ｄ）の酵素活性の安定性の観点から、１分〜１，０００時間が好ましい。
【００８４】
上記工程（ｂ）において、反応溶液（ＩＩ）中のリン酸基含有化合物（Ａ）の含有量（モル濃度）は、反応しやすさの観点から、０．０００１ｍＭ〜１Ｍが好ましく、さらに好ましくは０．００１ｍＭ〜５００ｍＭである。
反応溶液（ＩＩ）において、（Ｂ）が（Ｂ−１）である場合は、ウリジン３リン酸合成酵素（Ｂ）との結合しやすさの観点から、（Ａ）としてヌクレオシド３リン酸を用いることが好ましい。また、（Ｂ）が（Ｂ−２）である場合は、ウリジン３リン酸合成酵素（Ｂ）との結合しやすさの観点から、（Ａ）としてポリリン酸を用いることが好ましい。また、（Ｂ）が（Ｂ−３）である場合は、ウリジン３リン酸合成酵素（Ｂ）との結合しやすさの観点から、ω−ホスホノ−Ｌ−アルギニンを用いることが好ましい。また（Ｂ）が（Ｂ−４）である場合は、ウリジン３リン酸合成酵素（Ｂ）との結合しやすさの観点から、ホスホエノールピルビン酸を用いることが好ましい。（Ｂ−１）〜（Ｂ−４）以外の（Ｂ）を用いる場合は、その（Ｂ）が作用する（Ａ）を適宜選択する。
反応溶液（ＩＩ）中のウリジン３リン酸合成酵素（Ｂ）の含有量（ユニット／ｍＬ）は、ウリジン３リン酸を合成する反応を触媒しやすさの観点から、０．００００１ユニット／ｍＬ〜１０，０００ユニット／ｍＬが好ましく、さらに好ましくは０．００１ユニット／ｍＬ〜１，０００ユニット／ｍＬである。
１ユニットとは、１分間に１μｍｏｌのウリジン２リン酸及び１μｍｏｌのリン酸基含有化合物（Ａ）をウリジン３リン酸にする酵素量である。
反応溶液（ＩＩ）の温度は、（Ｂ）の酵素活性の安定性の観点から、０℃〜１００℃が好ましく、さらに好ましくは３０℃〜７０℃である。
反応溶液（ＩＩ）のｐＨは、（Ｂ）の酵素活性の安定性の観点から、ｐＨ２〜１２が好ましく、さらに好ましくはｐＨ４〜９である。
反応溶液（ＩＩ）において、ウリジン３リン酸合成酵素（Ｂ）を作用させる時間は、（Ｂ）の酵素活性の安定性の観点から、１０分〜１，０００時間が好ましい。
【００８５】
反応溶液（ＩＩ）中には、ピロリン酸分解酵素を含有してもいい。工程（ｂ）では副生成物としてピロリン酸が生成し、ピロリン酸が（Ｂ）の活性を阻害してしまう場合がある。本発明の製造方法でピロリン酸分解酵素を用いると、ピロリン酸を分解し、ピロリン酸が（Ｂ）の酵素活性を阻害することを緩和することができる。
ピロリン酸分解酵素としては、ＥＣ３．１．３及びＥＣ３．６．１に分類される酵素が挙げられ、具体的にはアルカリホスファターゼ、アピラーゼ、フィターゼ及びジホスファターゼ等が挙げられる。
ピロリン酸分解酵素としては、反応生成物（ウリジン３リン酸及びヒアルロン酸）を分解しにくいという観点から、ジホスファターゼが好ましい。
反応溶液（ＩＩ）中のピロリン酸分解酵素の含有量（ユニット／ｍＬ）は、反応生成物（ウリジン３リン酸）を分解せずにピロリン酸を分解する観点から、０．００００１〜１００ユニット／ｍＬが好ましい。
ピロリン酸分解酵素において、ユニットは、１分間に１μｍｏｌのピロリン酸を分解する酵素量である。
【００８６】
また、反応溶液（ＩＩ）及び（Ｉ）には、上記以外に、酵素の安定化及び酵素の活性化の観点から、脂質（Ｍ）、糖類（Ｎ）及びオリゴ糖（Ｏ）を用いてもよい。
脂質（Ｍ）としては、例えば、カルディオトロピン及びオレイン酸等が挙げられる。
糖類（Ｎ）としては、例えば、グリセリン等が挙げられる。
オリゴ糖（Ｏ）としては、例えば、オリゴヒアルロン酸等が挙げられる。
【００８７】
反応溶液（ＩＩ）及び（Ｉ）中の脂質（Ｍ）の含有量（重量％）は、酵素の安定化及び酵素の活性化の観点から、０〜１重量％が好ましい。
反応溶液（ＩＩ）及び（Ｉ）中の糖類（Ｎ）の含有量（重量％）は、酵素の安定化及び酵素の活性化の観点から、０〜３０重量％が好ましい。
反応溶液（ＩＩ）及び（Ｉ）中のオリゴ糖（Ｏ）の含有量（重量％）は、酵素の安定化及び酵素の活性化の観点から、０〜１重量％が好ましい。
【００８８】
本発明のウリジン３リン酸の製造方法において、上記工程（ａ）及び（ｂ）は何回含んでもいい。また、（ａ）及び（ｂ）の間に別の工程が入ってもいい。本発明の製造方法では、上記工程（ａ）及び（ｂ）を工程（ａ）及び（ｂ）の順に含んでいればいい。
【００８９】
また、本発明のウリジン３リン酸の製造方法は、上記工程（ａ）及び（ｂ）を同時に行ってもいい。
本発明のウリジン３リン酸の製造方法の別の一例は、リン酸基含有化合物（Ａ）、ウリジン３リン酸合成酵素（Ｂ）、ウリジン２リン酸−グルクロン酸、ウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、ヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）及び溶剤を仕込んで反応溶液（Ｘ）として、ウリジン３リン酸を製造する方法である。反応溶液（Ｘ）には、上記以外に、酵素の安定化及び酵素の活性化の観点から、脂質（Ｍ）、糖類（Ｎ）及びオリゴ糖（Ｏ）を用いてもよい。反応溶液（Ｘ）中の（Ｍ）、（Ｎ）及び（Ｏ）の好ましい含有量は、（ＩＩ）と同様である。
本発明の製造方法においては、反応溶液（Ｘ）中でウリジン２リン酸−グルクロン酸とウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンとにヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）が作用し、ヒアルロン酸及びウリジン２リン酸が生成するので、反応溶液（Ｘ）中には組成物（Ｚ）を含むことになる。
【００９０】
反応溶液（Ｘ）中のウリジン２リン酸−グルクロン酸の含有量（モル濃度）は、ヒアルロン酸の合成効率の観点から、０．０００１ｍＭ〜１Ｍが好ましく、さらに好ましくは０．０１ｍＭ〜１ｍＭである。
反応溶液（Ｘ）中のウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンの含有量（モル濃度）は、ヒアルロン酸の合成効率の観点から、０．０００１ｍＭ〜１Ｍが好ましく、さらに好ましくは０．０１μＭ〜１ｍＭである。
反応溶液（Ｘ）中のヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）の含有量（ユニット／ｍＬ）は、ヒアルロン酸を効率よく製造する観点から、０．００００１ユニット／ｍＬ〜１０，０００ユニット／ｍＬが好ましく、さらに好ましくは０．００１ユニット／ｍＬ〜１，０００ユニット／ｍＬである。
反応溶液（Ｘ）中のリン酸基含有化合物（Ａ）の含有量（モル濃度）は、ウリジン３リン酸合成酵素（Ｂ）との結合しやすさの観点から、０．０００１ｍＭ〜１Ｍが好ましく、さらに好ましくは０．０１ｍＭ〜１００ｍＭである。
反応溶液（Ｘ）中のウリジン３リン酸合成酵素（Ｂ）の含有量（ユニット／ｍＬ）は、ウリジン２リン酸を効率よくウリジン３リン酸に変換するの観点から、０．００００１ユニット／ｍＬ〜１０，０００ユニット／ｍＬが好ましく、さらに好ましくは０．００１ユニット／ｍＬ〜１，０００ユニット／ｍＬである。
（Ｂ）として、（Ｂ−１）〜（Ｂ−４）を用いる際に用いる好ましい（Ａ）は、反応溶液（ＩＩ）と同様である。
反応溶液（Ｘ）の温度は、酵素｛（Ｂ）及び（Ｄ）｝の安定性の観点から、０℃〜１００℃が好ましく、さらに好ましくは３０℃〜７０℃である。
反応溶液（Ｘ）のｐＨは、酵素｛（Ｂ）及び（Ｄ）｝の安定性の観点から、ｐＨ２〜１２が好ましく、さらに好ましくはｐＨ４〜９である。
【００９１】
反応溶液（Ｘ）を作成する場合、上記原料｛ウリジン２リン酸−グルクロン酸、ウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン及び（Ａ）｝並びに酵素｛（Ｂ）及び（Ｄ）｝を同時に仕込んで反応溶液（Ｘ）を作成してもよく、逐次的に投入して反応溶液（Ｘ）としてもいい。
【００９２】
反応溶液（Ｘ）中にはピロリン酸分解酵素を用いてもいい。本発明の製造方法では、副生成物としてピロリン酸が生成し、ピロリン酸が酵素｛（Ｂ）及び（Ｄ）｝の活性を阻害してしまう場合がある。本発明の製造方法でピロリン酸分解酵素を用いると、ピロリン酸を分解し、ピロリン酸が（Ｂ）及び（Ｄ）の酵素活性を阻害することを緩和することができる。。
好ましいピロリン酸分解酵素としては、上記反応溶液（ＩＩ）に用いるピロリン酸分解酵素と同様である。
反応溶液（Ｘ）中のピロリン酸分解酵素の含有量（ユニット／ｍＬ）は、反応生成物（ウリジン３リン酸及びヒアルロン酸）を分解せずにピロリン酸を分解する観点から、０．００００１〜１００ユニット／ｍＬが好ましい。
【００９３】
反応溶液（Ｘ）において、ウリジン３リン酸合成酵素（Ｂ）及びヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）を作用させる時間は、それぞれの酵素活性、反応溶液（Ｘ）の温度、原料の量比等によって異なる。反応溶液（Ｘ）の温度を、全て酵素の活性が高く、反応速度が速い温度に調整すれば、反応時間を短くすることができる。また、反応溶液（Ｘ）中のそれぞれの基質に対する酵素の量が多いほど、反応は早くなり、反応時間は短くなる。
反応溶液（Ｘ）において、反応時間は、酵素の安定性の観点から、１０分〜１，０００時間が好ましい。
【００９４】
本発明のヒアルロン酸の製造方法は、下記工程（１）〜（３）を含んでなり、工程（１）、（２）、（３）及び（１）の順に含む又は工程（１）〜（３）のうち２つを同時に行う工程を含む製造方法であり、下記ミカエリス定数Ｋｍが下記阻害濃度ＩＣ50の１００倍未満であるヒアルロン酸の製造方法である。
工程（１）：ウリジン２リン酸−グルクロン酸とウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンとにヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）を作用させて（Ｄ）、ヒアルロン酸及びウリジン２リン酸を含む組成物（Ｚ’）を得る工程。
工程（２）：工程（１）で得られた（Ｄ）、ヒアルロン酸及びウリジン２リン酸を含む組成物（Ｚ’）とリン酸基含有化合物（Ａ）とにウリジン３リン酸合成酵素（Ｂ）を作用させてウリジン３リン酸を得る工程。
工程（３）：工程（２）で得られたウリジン３リン酸と１−ホスホ−グルクロン酸とにウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｃ）を作用させてウリジン２リン酸−グルクロン酸を得る工程。
ミカエリス定数Ｋｍ：基質としてウリジン２リン酸を用いて求めたウリジン２リン酸の（Ｂ）に対するミカエリス定数。
阻害濃度ＩＣ50：作用させる際の（Ｄ）の濃度において、基質としてウリジン２リン酸−グルクロン酸及びウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを用いて、阻害剤としてウリジン２リン酸を用いて求めた、（Ｄ）の酵素活性が半減するときのウリジン２リン酸の濃度。
【００９５】
本発明のヒアルロン酸の製造方法において、工程（１）で用いるヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）として好ましい（Ｄ）は、上記ウリジン３リン酸の製造方法における好ましい（Ｄ）と同様である。
また、工程（２）で用いるウリジン３リン酸合成酵素（Ｂ）として好ましい（Ｂ）は、上記ウリジン３リン酸の製造方法における好ましい（Ｂ）と同様である。
また、本発明において、ミカエリス定数Ｋｍは、阻害濃度ＩＣ50の１００倍未満である。ウリジン２リン酸を効率よくウリジン３リン酸に変換する及びヒアルロン酸を効率よく生産する観点から、６０倍以下が好ましく、さらに好ましくは１０倍以下である。
【００９６】
本発明のヒアルロン酸の製造方法において、ミカエリス定数Ｋｍが阻害濃度ＩＣ50の１００倍未満であることにより、ヒアルロン酸シンターゼの存在下でもウリジン２リン酸がウリジン３リン酸に効率よく変換されるので、ヒアルロン酸を効率よく生産することができ、ヒアルロン酸の生産量が多くなる。また、ウリジン２リン酸がウリジン３リン酸に効率よく変換されるので、ウリジン３リン酸の添加量を低減できる。
【００９７】
本発明のヒアルロン酸の製造方法において、工程（３）で用いる１−ホスホ−グルクロン酸は、グルクロン酸の１位のヒドロキシル基がリン酸でリン酸エステル化されたものである。
【００９８】
工程（３）で用いるウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｃ）は、ウリジン３リン酸と１−ホスホ−グルクロン酸からウリジン２リン酸−グルクロン酸を生成する活性を有する酵素であれば特に限定されない。例えば、動物起源の動物ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｃ−１）、植物起源の植物ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｃ−２）、微生物起源の微生物ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｃ−３）及び（Ｃ−１）〜（Ｃ−３）が化学的に修飾された変異体（Ｃ−４）及び（Ｃ−１）〜（Ｃ−３）が遺伝子的に修飾された変異体（Ｃ−５）が含まれる。
【００９９】
動物ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｃ−１）としては、例えば、ブタ由来のもの等が挙げられる。
【０１００】
植物ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｃ−２）としては、例えば、シロイヌナズナ由来、エンドウマメ由来、オオムギ由来のもの等が挙げられる。
【０１０１】
微生物ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｃ−３）としては、例えば、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属由来のもの等が挙げられる。
【０１０２】
化学的に修飾したウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｃ−４）として、例えば、上記ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼに化学反応する化合物｛カルボジイミド化合物、無水コハク酸、ヨード酢酸及びイミダゾール化合物等、１種でも２種以上でもいい｝を作用させて化学修飾したもの等が挙げられる。
【０１０３】
遺伝子的に修飾したウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｃ−５）として、Ｓｍｉｔｈらの方法で上記ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼの遺伝子を改変してアミノ酸を置換したもの等が挙げられる。
【０１０４】
上記ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｃ）のうち、ウリジン２リン酸−グルクロン酸を合成する活性の高さの観点から、（Ｃ−２）が好ましく、さらに好ましくはシロイヌナズナ由来のヌクレオシド−２−リン酸キナーゼである。
また、ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｃ）は、２種以上を用いてもいい。
【０１０５】
本発明のウリジン３リン酸及び／又はヒアルロン酸の製造方法に使用する（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）の酵素は、前記の活性を有するものであれば、どのような形態であっても良い。具体的には、酵素を含む細胞（細胞には菌体を含む）を、破砕（ホモジナイザー、フレンチプレス、ワーリングブレンダー及び乳鉢等）、凍結融解、自己消化、乾燥、酵素処理、超音波処理若しくは化学処理（酸、アルカリ及び海面活性剤等）等の一般的処理法に従って処理して得られる処理物、精製酵素（処理物を、塩析、等電点沈殿、有機溶媒沈殿、透析又は各種クロマトグラフィー等により精製した酵素）、膜結合型タンパク（細胞の細胞壁若しくは細胞膜の変性物）及び固定化触媒（酵素を一般的な包括法、架橋法、担体結合法等で固定化したもの。固定化する際の固定化担体の例としては、ガラスビーズ、シリカゲル、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、カラギーナン、アルギン酸等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。）等が挙げられる。
【０１０６】
本発明のヒアルロン酸の製造方法において、上記工程（１）〜（３）を含んでなり、工程（１）、（２）、（３）及び（１）の順に含む場合、上記工程（１）は、ウリジン２リン酸−グルクロン酸とウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンとにヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）を作用させて、ヒアルロン酸及びウリジン２リン酸を含む組成物（Ｚ’）を得ることができれば制限なく実施できる。工程（１）の具体的な一例としては、ウリジン２リン酸−グルクロン酸、ウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、ヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）及び溶剤を混合して反応溶液（Ｉ’）とし、所定の温度、所定のｐＨに調整し、反応を行うものである。反応溶液（Ｉ’）における、好ましい原料及び酵素の含有量、好ましい温度、好ましいｐＨ及び好ましい反応時間は、上記ウリジン３リン酸の製造方法における工程（ａ）での反応溶液（Ｉ）と同様である。また反応溶液（Ｉ’）には、（Ｉ）と同様に、脂質（Ｍ）、糖類（Ｎ）及びオリゴ糖（Ｏ）を含有してもいい。
【０１０７】
上記工程（２）は、組成物（Ｚ’）とリン酸基含有化合物（Ａ）とにウリジン３リン酸合成酵素（Ｂ）を作用させてウリジン３リン酸を得ることができれば制限なく実施できる。工程（２）の具体的な一例としては、工程（１）での反応後の反応溶液（Ｉ’）、リン酸基含有化合物（Ａ）及びウリジン３リン酸合成酵素（Ｂ）を混合して反応溶液（ＩＩ’）とし、所定の温度、所定のｐＨに調整し、反応を行うものである。反応溶液（ＩＩ’）における、好ましい原料及び酵素の含有量、好ましい温度、好ましいｐＨ及び好ましい反応時間は、上記ウリジン３リン酸の製造方法における工程（ｂ）での反応溶液（ＩＩ）と同様である。また反応溶液（ＩＩ’）には、（ＩＩ）と同様に、ピロリン酸分解酵素、脂質（Ｍ）、糖類（Ｎ）及びオリゴ糖（Ｏ）を含有してもいい。
【０１０８】
上記工程（３）は、ウリジン３リン酸と１−ホスホ−グルクロン酸とにウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｃ）を作用させてウリジン２リン酸−グルクロン酸を得ることができれば制限なく実施できる。工程（３）の具体的な一例としては、工程（２）での反応後の反応溶液（ＩＩ’）、１−ホスホ−グルクロン酸及びウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｃ）を混合して反応溶液（ＩＩＩ’）とし、所定の温度、所定のｐＨに調整し、反応を行うものである。（ＩＩＩ’）には、ピロリン酸分解酵素、脂質（Ｍ）、糖類（Ｎ）及びオリゴ糖（Ｏ）を含有してもいい。（Ｍ）、（Ｎ）及び（Ｏ）の好ましい含有量は（ＩＩ）と同様である。
【０１０９】
反応溶液（ＩＩＩ’）中の１−ホスホ−グルクロン酸の含有量（モル濃度）は、ウリジン２リン酸−グルクロン酸を効率よく製造する観点から、０．０００１ｍＭ〜１Ｍが好ましく、さらに好ましくは０．００１ｍＭ〜５００ｍＭである。
反応溶液（ＩＩＩ’）中のウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｃ）の含有量（ユニット／ｍＬ）は、ウリジン２リン酸−グルクロン酸を効率よく製造する観点から、０．００００１ユニット／ｍＬ〜１０，０００ユニット／ｍＬが好ましく、さらに好ましくは０．００１ユニット／ｍＬ〜１，０００ユニット／ｍＬである。
反応溶液（ＩＩＩ’）の温度は、（Ｃ）の酵素活性の安定性の観点から、０℃〜１００℃が好ましく、さらに好ましくは３０℃〜７０℃である。
反応溶液（ＩＩＩ’）のｐＨは、（Ｃ）の酵素活性の安定性の観点から、ｐＨ２〜１２が好ましく、さらに好ましくはｐＨ４〜９である。
反応溶液（ＩＩＩ’）において、ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｃ）を作用させる時間は、（Ｃ）の酵素活性の安定性の観点から、１０分〜１，０００時間が好ましい。
【０１１０】
反応溶液（ＩＩＩ’）中には、ピロリン酸分解酵素を含有してもいい。工程（３）では副生成物としてピロリン酸が生成し、ピロリン酸が（Ｃ）の活性を阻害してしまう場合がある。本発明の製造方法でピロリン酸分解酵素を用いると、ピロリン酸が分解され、ピロリン酸が（Ｃ）の酵素活性の阻害することを緩和することができる。
好ましいピロリン酸分解酵素としては、上記反応溶液（ＩＩ）に用いるピロリン酸分解酵素と同様である。
反応溶液（ＩＩＩ’）中のピロリン酸分解酵素の含有量（ユニット／ｍＬ）は、反応生成物（ウリジン２リン酸−グルクロン酸）を分解せずにピロリン酸を分解する観点から、０．００００１〜１００ユニット／ｍＬが好ましい。
【０１１１】
反応後の反応溶液（ＩＩＩ’）に、必要により、ウリジン２リン酸−グルクロン酸、ウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン及びヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）等を追加して、反応溶液（Ｉ’）とし、工程（１）の反応を行う。
工程（１）、（２）、（３）及び（１）の順に含む含む製造方法である場合、上記工程（１）〜（３）は、（１）、（２）、（３）及び（１）の順に含んでいれば、それぞれ何回含んでもよく｛例えば（１）、（２）、（２）、（３）、（１）｝、間に別の工程を含んでいてもいい｛例えば（１）、（２）、（１）、（３）、（１）｝。
【０１１２】
また、本発明のヒアルロン酸の製造方法は、上記工程（１）〜（３）を含んでなり、工程（１）〜（３）のうち２つを同時に行う工程を含む製造方法である。具体的な一例としては、
（ｉ）工程（１）及び（２）を同時に行い、次に工程（３）、（１）を行う方法
（ｉｉ）工程（１）を行い、次に工程（２）及び（３）を同時に行い、さらに工程（１）を行う方法
（ｉｉｉ）工程（１）の後、工程（２）を行い、次に工程（３）及び（１）を同時に行う方法
（ｉｖ）工程（１）及び（２）を同時に行い、次に工程（３）及び（１）を同時に行う方法
上記のうち、ウリジン２リン酸の（Ｄ）への活性阻害を少なくする観点から（ｉ）及び（ｉｖ）が好ましい。また、ウリジン２リン酸が効率よくウリジン３リン酸に変換される観点から、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）が好ましい。
【０１１３】
上記（ｉ）の方法としては、上記反応溶液（ＩＩＩ’）において、「工程（２）での反応後の反応溶液（ＩＩ’）」に変えて「ウリジン３リン酸の製造方法における反応後の反応溶液（Ｘ）」を用いてもいい。この場合は、反応溶液（Ｘ）、１−ホスホ−グルクロン酸及びウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｃ）を混合して反応溶液（ＩＩＩ’）とし、所定の温度、所定のｐＨに調整し、反応を行う。
【実施例】
【０１１４】
以下の実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例４、８及び１３は参考例である。
【０１１５】
＜製造例１＞
ラットすい臓由来の配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＭＳテクノシステムズ社に人工合成を依頼したもの）を制限酵素ＭｓｃＩとＢａｍＨＩで処理後、ｐＥＴ−２２ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＭｓｃＩ制限酵素サイトとＢａｍＨＩ制限酵素サイトに結合した。そのＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株にこのプラスミドを形質転換して、ヌクレオシド−２−リン酸キナーゼ（Ｂ−１）発現株を作成した。
【０１１６】
＜製造例２＞
「ラットすい臓由来の配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子」に変えて、「シュードモナス由来の配列番号２のアミノ酸配列をコードする遺伝子」を用いる以外は同様にして、ポリリン酸キナーゼ（Ｂ−２）発現株を作成した。
【０１１７】
＜製造例３＞
「ラットすい臓由来の配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子」に変えて、「トノサマバッタ由来の配列番号３のアミノ酸配列をコードする遺伝子」を用いる以外は同様にして、アルギニンキナーゼ（Ｂ−３）発現株を作成した。
【０１１８】
＜製造例４＞
「ラットすい臓由来の配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子」に変えて、「ラット由来の配列番号４のアミノ酸配列をコードする遺伝子」を用いる以外は同様にして、ピルビン酸キナーゼ（Ｂ−４−１）発現株を作成した。
【０１１９】
＜製造例５＞
「ラットすい臓由来の配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子」に変えて、「トキソプラズマ属由来の配列番号７のアミノ酸配列をコードする遺伝子」を用いる以外は同様にして、ピルビン酸キナーゼ（Ｂ−４−２）発現株を作成した。
【０１２０】
＜製造例６＞
「ラットすい臓由来の配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子」に変えて、「シロイヌナズナ由来の配列番号５のアミノ酸配列をコードする遺伝子」を用いる以外は同様にしてウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｃ）発現株を作成した。
【０１２１】
＜製造例７＞
「ラットすい臓由来の配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子」に変えて、「ストレプトコッカス属由来の配列番号６のアミノ酸配列をコードする遺伝子」を用いる以外は同様にして、ヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）発現株を作成した。
【０１２２】
＜製造例８〜１４＞
製造例１〜７で得られた酵素発現株をそれぞれＬＢ培養液（アンピシリン  １００ｍｇ／Ｌ含有）１ｍＬに植菌して３０℃で１２時間培養を行い、終夜培養液を作成し、０．５ｍｌをＬＢ培養液（アンピシリン  １００ｍｇ／Ｌ含有）５ｍｌに植菌して３０℃３時間振とう培養を行い７種類の前培養液を作成した。７種類の前培養液をそれぞれ５０ｍＬの培養液｛水５０ｍＬ中のそれぞれの成分の含有量は、酵母エキス（日本製薬社製）１．２ｇ、ポリペプトン（日本製薬社製）０．６ｇ、リン酸２カリウム０．４７ｇ、リン酸１カリウム０．１１ｇ、硫酸アンモニウム０．３５ｇ、リン酸２ナトリウム１２水和物０．６６ｇ、クエン酸ナトリウム２水和物０．０２ｇ、グリセロール０．２ｇ、ラクトアルブミン水解物１．５ｇ、消泡剤（信越シリコーン製、「ＫＭ−７０」）０．３ｇ、１ｍＭ硫酸マグネシウム、微量金属溶液（塩化カルシウム１８．９μｇ、塩化鉄（ＩＩＩ）５００μｇ、硫酸亜鉛７水和物９．０μｇ、硫酸銅５．１μｇ、塩化マンガン４水和物６．７μｇ、塩化コバルト４．９μｇ、エチレンジアミン４酢酸４ナトリウム２００μｇ）、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン｝に植菌し微生物培養装置（エイブル社製、製品名「ＢｉｏＪｒ．８」）を用いてｐＨ６．８、３０℃を維持したまま培養を行った。培養開始後１Ｍ  ＩＰＴＧ溶液を０．１５ｍＬを加えた。培養開始１４時間後から、グリセリン／タンパク質溶液（５０％  グリセリン、５０ｇ／Ｌ  ラクトアルブミン水解物、３３ｇ／Ｌ  消泡剤（信越シリコーン製、「ＫＭ−７０」）、１００ｍｇ／Ｌ  アンピシリン）の滴下を開始した。培養開始後、４８時間目に培養液（Ｋ−１）〜（Ｋ−７）を回収した。
得られた培養液（Ｋ−１）〜（Ｋ−７）をＨｉｓ−ｔａｇ精製用担体（ＧＥヘルスケア社製  Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）で分離し、配列番号１〜７の酵素（Ｂ−１）〜（Ｂ−４−１）、（Ｂ−４−２）、（Ｃ）及び（Ｄ）の水溶液を得た。
【０１２３】
＜製造例８〜１４で得られた酵素水溶液中の酵素濃度の測定＞
製造例８〜１４で得られた（Ｂ−１）〜（Ｂ−４−１）、（Ｂ−４−２）、（Ｃ）及び（Ｄ）の水溶液を１μＬと、クマシーブリリアントブルーとＳＤＳを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル処理液１μＬ（アトー社製「イージーステイン・アクア」を混合し、ポリアクリルアミドゲル（アトー社製、ｅ・パジェル  ５〜２０％）を用いて２０ｍＡで６０分間電気泳動した。同様に処理した１μｇ、３μｇおよび５μＬのウシ血清アルブミン（和光純薬工業社製）とのバンドの濃さの比較から、（Ｂ−１）〜（Ｂ−４−１）、（Ｂ−４−２）、（Ｃ）及び（Ｄ）の水溶液中の酵素の濃度を決定しところ、全て１μｇ／μＬであった。
【０１２４】
＜製造例８〜１２で得られた酵素の比活性の測定＞
製造例８〜１２で得られた酵素（Ｂ−１）〜（Ｂ−４−１）及び（Ｂ−４−２）の比活性の測定は、後述する「ミカエリス定数Ｋｍの測定」において算出される酵素反応初速度Ｖｍａｘ（ｍＭ／ｓ）を用いて以下の数式（２）に当てはめることにより算出した。
比活性（ユニット／ｍｇ）＝Ｖｍａｘ×６０×１００（２）
その結果、それぞれの比活性は下記の通りであった。
（Ｂ−１）：１３０（ユニット／ｍｇ）
（Ｂ−２）：１３０（ユニット／ｍｇ）
（Ｂ−３）：４６（ユニット／ｍｇ）
（Ｂ−４−１）：１０４（ユニット／ｍｇ）
（Ｂ−４−２）：３０（ユニット／ｍｇ）
【０１２５】
＜製造例１３で得られた（Ｃ）の比活性の測定＞
製造例１３で得られた（Ｃ）１０μＬを、１．５ｍＬのチューブ中で８９０μＬのバッファー１［５ｍＭ塩化マグネシウム、３ｍＭウリジン３リン酸、３ｍＭ１−ホスホ−グルクロン酸を含む５０ｍＭリン酸Ｎａバッファー（ｐＨ７．５、２５℃）水溶液］に溶解し、その直後及び５分おきに１００μＬ取り出し、１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止した。遠心分離器（ＫＵＢＯＴＡ社製「５９２２」、４℃、１２，０００×ｇ、１０分）を用いて遠心し、不純物を沈殿させ、上清８０μＬを液体クロマトグラフィー（日本ウォーターズ社製  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨ３００  Ｃ１８カラム、ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣシステム及びＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＴＵＶ検出器）に供し、ウリジン２リン酸−グルクロン酸のピーク面積を記録した。
ウリジン２リン酸−グルクロン酸をバッファー１に溶解し、０．００５ｍＭ、０．１ｍＭ、１ｍＭ及び５ｍＭの濃度にしたものを作成し、８０μＬを上記と同条件の液体クロマトグラフィー（日本ウォーターズ社製  Ａｃｑｕｉｔｙ
ＢＥＨ３００  Ｃ１８カラム、ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣシステム及びＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＴＵＶ検出器）に供し、ウリジン２リン酸−グルクロン酸のピーク面積をそれぞれ記録した。横軸（ｘ軸）にそれぞれのウウリジン２リン酸−グルクロン酸（ｍＭ）、縦軸（ｙ軸）にそれぞれのピーク面積Ｐをプロットし、直線の傾きｓを算出した。
作成直後のウリジン２リン酸−グルクロン酸のピーク面積をＰ０、ｍ分後のピーク面積をＰｈとし、それぞれピーク面積の変化ΔＰ（ΔＰ＝Ｐｈ−Ｐ０）と上記直線の傾きｓを用いて下記数式（３）から比活性（ユニット／ｍｇ）を算出した。
比活性（ユニット／ｍｇ）＝ΔＰ／ｓ×６０×１００／（ｓ×ｍ×６０）（３）
その結果、（Ｃ）の比活性は６２（ユニット／ｍｇ）であった。
【０１２６】
＜製造例１４で得られた（Ｄ）の比活性の測定＞
製造例１４で得られた酵素の比活性の測定は、以下に記述する阻害濃度ＩＣ50の測定において、バッファー３を用いて測定した酵素反応初速度ｖを用いて以下の数式（４）に当てはめることにより算出した。
比活性（ユニット／ｍｇ）＝（バッファー３を用いて測定した酵素反応初速度ｖ）×６０×１００（４）
その結果、（Ｄ）の比活性は６２（ユニット／ｍｇ）であった。
【０１２７】
＜ヌクレオシド−２−リン酸キナーゼ（Ｂ−１）を用いてウリジン３リン酸を合成する反応におけるミカエリス定数Ｋｍの測定＞
製造例８で得られた（Ｂ−１）１０μＬを、１．５ｍＬのチューブ中で８９０μＬのバッファー１［５ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭアデノシン３リン酸（シグマ社製）を含む５０ｍＭ  リン酸Ｎａバッファー（ｐＨ７．５、２５℃）水溶液］に溶解し、恒温水槽を用いてチューブを４０℃で３分静置した。ここに、４０℃に温調した基質溶液（１）（ウリジン２リン酸ナトリウムをバッファー１に溶解して１０ｍＭの濃度にしたもの）を１００μＬ添加し、酵素反応溶液（Ｅ−１−１）とした。（Ｅ−１−１）を作成直後及び５分おきに１００μＬ取り出し、１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止した。遠心分離器（ＫＵＢＯＴＡ社製「５９２２」、４℃、１２，０００×ｇ、１０分）を用いて遠心し、不純物を沈殿させ、上清８０μＬを液体クロマトグラフィー（日本ウォーターズ社製  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨ３００  Ｃ１８カラム、ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣシステム及びＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＴＵＶ検出器）に供し、ウリジン３リン酸のピーク面積を記録した。
基質溶液（１）において、ウリジン２リン酸ナトリウムのバッファー１中のモル濃度を５ｍＭ（基質溶液（２））、２ｍＭ（基質溶液（３））、１ｍＭ（基質溶液（４））および０．３ｍＭ（基質溶液（５））とした溶液を作成した。基質溶液（１）に変えて基質溶液（２）〜（５）を用いる以外は同様にして酵素反応溶液（Ｅ−１−２）〜（Ｅ−１−５）を作成した。（Ｅ−１−２）〜（Ｅ−１−５）を作成直後及び５分おきに１００μＬ取り出し、１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止した。遠心分離器（ＫＵＢＯＴＡ社製「５９２２」、４℃、１２，０００×ｇ、１０分）を用いて遠心し、不純物を沈殿させ、上清８０μＬを液体クロマトグラフィー（日本ウォーターズ社製  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨ３００  Ｃ１８カラム、ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣシステム及びＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＴＵＶ検出器）に供し、ウリジン３リン酸のピーク面積を記録した。
ウリジン３リン酸ナトリウムをバッファー１に溶解し、０．００５ｍＭ、０．１ｍＭ、１ｍＭ及び５ｍＭの濃度にしたものを作成し、ウリジン３リン酸標準溶液（Ｍ−１）〜（Ｍ−４）とした。（Ｍ−１）〜（Ｍ−４）の８０μＬを上記と同条件の液体クロマトグラフィー（日本ウォーターズ社製  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨ３００  Ｃ１８カラム、ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣシステム及びＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＴＵＶ検出器）に供し、ウリジン３リン酸のピーク面積をそれぞれ記録した。横軸（ｘ軸）にそれぞれのウリジン３リン酸濃度（ｍＭ）、縦軸（ｙ軸）にそれぞれのピーク面積Ｐをプロットし、直線の傾きｓを算出した。
（Ｅ−１−１）〜（Ｅ−１−５）を作成直後のウリジン３リン酸のピーク面積をＰ０、ｍ分後のピーク面積をＰｈとし、それぞれピーク面積の変化ΔＰ（ΔＰ＝Ｐｈ−Ｐ０）と上記直線の傾きｓを用いて下記数式（５）からそれぞれの酵素反応初速度ｖ（ｍＭ／ｓ）を算出した。
ｖ＝ΔＰ／（ｓ×ｍ×６０）（５）
算出した酵素反応初速度ｖを用いて、横軸（ｘ軸）にそれぞれの基質濃度［Ｓ］、縦軸（ｙ軸）にそれぞれの基質濃度での酵素反応初速度の逆数［Ｓ］／ｖをプロットし、Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを作成した（図１）。プロットの近似直線とｘ軸との交点（−Ｋｍ）から、ミカエリス定数Ｋｍは０．２５ｍＭであった。Ｖｍａｘは０．０２２ｍＭ／ｓであった。
【０１２８】
＜ポリリン酸キナーゼ（Ｂ−２）を用いてウリジン３リン酸を合成する反応におけるミカエリス定数Ｋｍ測定＞
「ウリジン２リン酸のヌクレオシド−２−リン酸キナーゼ（Ｂ−１）に対するミカエリス定数Ｋｍの測定」において、「製造例８で得られたヌクレオシド−２−リン酸キナーゼ（Ｂ−１）」に変えて「製造例９で得られたポリリン酸キナーゼ（Ｂ−２）」を用いて、「アデノシン３リン酸」に変えて、「ポリリン酸（ナカライテスク社製、「テトラポリりん酸ナトリウム」）」を用いる以外は同様にして、酵素反応溶液（Ｅ−２−１）〜（Ｅ−２−５）を作成し、酵素反応させ、酵素反応溶液（Ｅ−２−１）〜（Ｅ−２−５）を作成直後及び５分ごとに、ウリジン３リン酸をＨＰＬＣにより定量し、酵素反応初速度ｖ（ｍＭ／ｓ）を算出した。上記Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットによりミカエリス定数Ｋｍを求めたところ、０．４２ｍＭであった。Ｖｍａｘは０．０２２ｍＭ／ｓであった。
【０１２９】
＜アルギニンキナーゼ（Ｂ−３）を用いてウリジン３リン酸を合成する反応におけるミカエリス定数Ｋｍの測定＞
「ウリジン２リン酸のヌクレオシド−２−リン酸キナーゼ（Ｂ−１）に対するミカエリス定数Ｋｍの測定法」において、「製造例８で得られたヌクレオシド−２−リン酸キナーゼ（Ｂ−１）」に変えて「製造例１０で得られたアルギニンキナーゼ（Ｂ−３）」を用いて、「アデノシン３リン酸」に変えて、「ω−ホスホノ−Ｌ−アルギニン（シグマ社製）」を用いること以外は同様にして、酵素反応溶液（Ｅ−３−１）〜（Ｅ−３−５）を作成し、酵素反応させ、（Ｅ−３−１）〜（Ｅ−３−５）を作成直後及び５分ごとに、ウリジン３リン酸をＨＰＬＣにより定量し、酵素反応初速度ｖ（ｍＭ／ｓ）を算出した。上記Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットによりミカエリス定数Ｋｍを求めたところ、０．７１ｍＭであった。Ｖｍａｘは０．００７７ｍＭ／ｓであった。
【０１３０】
＜ピルビン酸キナーゼ（Ｂ−４−１）を用いてウリジン３リン酸を合成する反応におけるミカエリス定数Ｋｍ測定＞
「ウリジン２リン酸のヌクレオシド−２−リン酸キナーゼ（Ｂ−１）に対するミカエリス定数Ｋｍの測定法」において、「製造例８で得られたヌクレオシド−２−リン酸キナーゼ（Ｂ−１）」に変えて「製造例１１で得られたピルビン酸キナーゼ（Ｂ−４−１）」を用いて、「アデノシン３リン酸」に変えて「ホスホエノールピルビン酸（シグマ社製）」を用いる以外は同様にして、酵素反応溶液（Ｅ−４−１）〜（Ｅ−４−５）を作成し、酵素反応させ、（Ｅ−４−１）〜（Ｅ−４−５）を作成直後及び５分ごとに、ウリジン３リ
ン酸をＨＰＬＣにより定量し、酵素反応初速度ｖ（ｍＭ／ｓ）を算出した。上記Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットによりミカエリス定数Ｋｍを求めたところ、６ｍＭであった。Ｖｍａｘは０．０１７ｍＭ／ｓであった。
【０１３１】
＜ピルビン酸キナーゼ（Ｂ−４−２）を用いてウリジン３リン酸を合成する反応におけるミカエリス定数Ｋｍ測定＞
「ウリジン２リン酸のヌクレオシド−２−リン酸キナーゼ（Ｂ−１）に対するミカエリス定数Ｋｍの測定法」において、「製造例８で得られたヌクレオシド−２−リン酸キナーゼ（Ｂ−１）」に変えて「製造例１２で得られたピルビン酸キナーゼ（Ｂ−４−２）」を用いて、「アデノシン３リン酸」に変えて「ホスホエノールピルビン酸（シグマ社製）」を用いる以外は同様にして、酵素反応溶液（Ｅ−５−１）〜（Ｅ−５−５）を作成し、酵素反応させ、（Ｅ−５−１）〜（Ｅ−５−５）を作成直後及び５分ごとに、ウリジン３リン酸をＨＰＬＣにより定量し、酵素反応初速度ｖ（ｍＭ／ｓ）を算出した。上記Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットによりミカエリス定数Ｋｍを求めたところ、１２ｍＭであった。Ｖｍａｘは０．００５ｍＭ／ｓであった。
【０１３２】
＜（Ｄ）の酵素活性が半減するときのウリジン２リン酸の濃度である阻害濃度ＩＣ50の測定＞
１．５ｍＬのチューブ中で９４０μＬのバッファー２［５ｍＭ塩化マグネシウム、０．０．０５ｍＭウリジン２リン酸ナトリウムを含む５０ｍＭ  リン酸Ｎａバッファー（ｐＨ７．５、２５℃）水溶液］に製造例１４で得られたヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）を０．１ユニット／ｍＬとなるように溶解し、恒温水槽を用いてチューブを４０℃で２０分静置した。ここに、４０℃に温調した基質溶液（１）（ウリジン２リン酸−グルクロン酸ナトリウム塩、ウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンをバッファー１に溶解してそれぞれ２０ｍＭの濃度にしたもの）を５０μＬ添加し、酵素反応溶液（Ｆ−１）とした。（Ｆ−１）を作成直後及び５分おきに１００μＬ取り出し、１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止した。遠心分離器（ＫＵＢＯＴＡ社製「５９２２」、４℃、１２，０００×ｇ、１０分）を用いて遠心し、不純物を沈殿させ、上清８０μＬを液体クロマトグラフィー（日本ウォーターズ社製  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨ３００  Ｃ１８カラム、ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣシステム及びＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＴＵＶ検出器）に供し、ヒアルロン酸のピーク面積を記録した。
バッファー２において、ウリジン２リン酸ナトリウムのバッファー２中のモル濃度を０ｍＭ（バッファー３）、０．１５ｍＭ（バッファー４）、３ｍＭ（バッファー５）、１ｍＭ（バッファー６）及び３ｍＭ（バッファー７）とした溶液を作成した。バッファー２に変えてバッファー３〜６を用いる以外は同様にして酵素反応溶液（Ｆ−２）〜（Ｆ−６）を作成した。（Ｆ−２）〜（Ｆ−６）を作成直後及び５分おきに１００μＬ取り出し、１００℃で２分間加熱して酵素反応を停止した。
遠心分離器（ＫＵＢＯＴＡ社製「５９２２」、４℃、１２，０００×ｇ、１Ｒ分）を用いて遠心し、不純物を沈殿させ、上清８０μＬを液体クロマトグラフィー（日本ウォーターズ社製  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨ３００  Ｃ１８カラム、ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣシステム及びＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＴＵＶ検出器）に供し、ヒアルロン酸のピーク面積を記録した。
ヒアルロン酸ナトリウム（フナコシ社製  ヒアロース、〜１７５ｋＤａ）をバッファー１に溶解し、０．００１μｇ／ｍＬ、０．０１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ及び５μｇ／ｍＬの濃度にしたものを作成し、ヒアルロン酸標準溶液（Ｇ−１）〜（Ｇ−４）とした。（Ｇ−１）〜（Ｇ−４）の８０μＬを上記と同条件の液体クロマトグラフィー（日本ウォーターズ社製  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨ３００  Ｃ１８カラム、ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣシステム及びＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＴＵＶ検出器）に供し、ヒアルロン酸のピーク面積をそれぞれ記録した。横軸（ｘ軸）にそれぞれのヒアルロン酸濃度（μｇ）、縦軸（ｙ軸）にそれぞれのピーク面積Ｐをプロットし、直線の傾きｓを算出した。
（Ｆ−１）〜（Ｆ−６）を作成直後のウリジン３リン酸のピーク面積をＰ０、ｍ分後のピーク面積をＰｈとし、それぞれピーク面積の変化ΔＰ（ΔＰ＝Ｐｈ−Ｐ０）と上記直線の傾きｓを用いて下記数式（１）からそれぞれの酵素反応初速度ｖ（μｇ／ｓ）を算出した。
ｖ＝ΔＰ／（ｓ×ｍ×６０）（１）
バッファー３を用いて測定した酵素反応初速度ｖを１００％とし、バッファー２及び３〜７を用いて測定した酵素反応初速度の相対値（％）を算出した。算出した相対値を用いて、横軸（ｘ軸）にそれぞれのウリジン２リン酸濃度［Ｓ］、縦軸（ｙ軸）にバッファー２〜７での酵素反応初速度の相対値をプロットした。（図２）。プロットの近似曲線と直線ｙ＝５０（％）との交点から、阻害濃度ＩＣ50は０．１１ｍＭであった。
【０１３３】
上記ミカエリス定数Ｋｍ及び阻害濃度ＩＣ50の測定結果から、それぞれのＫｍとＩＣ50は以下の関係であることがわかった。
ウリジン２リン酸の（Ｂ−１）に対するミカエリス定数Ｋｍは（Ｄ）の阻害濃度ＩＣ50の２．２７倍
ウリジン２リン酸の（Ｂ−２）に対するミカエリス定数Ｋｍは（Ｄ）の阻害濃度ＩＣ50の３．８２倍
ウリジン２リン酸の（Ｂ−３）に対するミカエリス定数Ｋｍは（Ｄ）の阻害濃度ＩＣ50の６．４５倍
ウリジン２リン酸の（Ｂ−４−１）に対するミカエリス定数Ｋｍは（Ｄ）の阻害濃度ＩＣ50の５４．５倍
ウリジン２リン酸の（Ｂ−４−２）に対するミカエリス定数Ｋｍは（Ｄ）の阻害濃度ＩＣ50の１０９倍
【０１３４】
＜実施例１＞
５０ｍＭ  リン酸Ｎａバッファー（ｐＨ７．５、２５℃）水溶液中に、１ｍＭのウリジン２リン酸−グルクロン酸、１ｍＭのウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、製造例１４で得られた（Ｄ）を０．１ユニット／ｍＬ、ピロリン酸分解酵素を０．２ユニット／ｍＬ、５ｍＭの塩化マグネシウムを含む反応溶液（Ｉ−１）を１ｍＬ調整した。すべて混合してから２時間、４０℃の恒温水槽で温調し、酵素反応させた。
その後、反応溶液（Ｉ−１）に製造例９で得られた（Ｂ−２）を０．１ユニット／ｍＬ及びポリリン酸を１ｍＭとなるように添加して反応溶液（ＩＩ−１）とし、２時間、４０℃の恒温水槽で温調し、酵素反応させた。その後、反応溶液（ＩＩ−１）を液体クロマトグラフィー（日本ウォーターズ社製  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨ３００  Ｃ１８カラム、ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣシステム及びＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＴＵＶ検出器、以下同じ）に供し、ウリジン３リン酸を定量したところ、０．３μｇであった。
【０１３５】
＜実施例２＞
実施例１において、「製造例９で得られた（Ｂ−２）を０．１ユニット／ｍＬ」に変えて「製造例８で得られた（Ｂ−１）を０．１ユニット／ｍＬ」とし、「ポリリン酸を１ｍＭ」に変えて「アデノシン３リン酸を５ｍＭ」とする以外は実施例１と同様にして反応溶液（ＩＩ−２）を作成し、酵素反応させた。反応後の反応溶液（ＩＩ−２）中のウリジン３リン酸を定量したところ、０．３μｇであった。
【０１３６】
＜実施例３＞
実施例１において、「製造例９で得られた（Ｂ−２）を０．１ユニット／ｍＬ」に変えて「製造例１０で得られた（Ｂ−３）を０．１ユニット／ｍＬ」とし、「ポリリン酸を１ｍＭ」に変えて「ω−ホスホノ−Ｌ−アルギニンを５ｍＭ」とする以外は実施例１と同様にして反応溶液（ＩＩ−３）を作成し、酵素反応させた。反応後の反応溶液（ＩＩ−３）中のウリジン３リン酸を定量したところ、０．０５μｇであった。
【０１３７】
＜実施例４＞
実施例１において、「製造例９で得られた（Ｂ−２）を０．１ユニット／ｍＬ」に変えて「製造例１１で得られた（Ｂ−４−１）を０．１ユニット／ｍＬ」とし、「ポリリン酸を１ｍＭ」に変えて「ホスホエノールピルビン酸を５ｍＭ」とする以外は実施例１と同様にして反応溶液（ＩＩ−４）を作成し、酵素反応させた。反応後の反応溶液（ＩＩ−４）中のウリジン３リン酸を定量したところ、０．０３μｇであった。
【０１３８】
＜比較例１＞
実施例１において、「製造例９で得られた（Ｂ−２）を０．１ユニット／ｍＬ」に変えて「製造例１２で得られた（Ｂ−４−２）を０．１ユニット／ｍＬ」とし、「ポリリン酸を１ｍＭ」に変えて「ホスホエノールピルビン酸を５ｍＭ」とする以外は実施例１と同様にして反応溶液（ＨＩＩ−１）を作成し、酵素反応させた。反応後の反応溶液（ＨＩＩ−１）中のウリジン３リン酸を定量したところ、０．０１μｇであった。
【０１３９】
＜実施例５＞
５０ｍＭのリン酸Ｎａバッファー（ｐＨ７．５、２５℃）水溶液中に、製造例８で得られた（Ｂ−１）を０．０１ユニット／ｍＬ、製造例１４で得られた（Ｄ）を０．１ユニット／ｍＬ、ピロリン酸分解酵素（ロシュアプライドサイエンス社製）を０．２ユニット／ｍＬ、１ｍＭのウリジン２リン酸−グルクロン酸、１ｍＭのウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、５ｍＭの塩化マグネシウム及び５ｍＭのアデノシン３リン酸を含む反応溶液（Ｘ−１）を１ｍＬ調整した。すべて混合してから１時間、４０℃の恒温水槽で温調し、酵素反応させた。
その後、反応溶液（Ｘ−１）を液体クロマトグラフィーに供し、ウリジン３リン酸を定量したところ、０．１μｇであった。
【０１４０】
＜実施例６＞
実施例５において、「製造例８で得られた（Ｂ−１）を０．０１ユニット／ｍＬ」に変えて「製造例９で得られた（Ｂ−２）を０．０１ユニット／ｍＬ」とし、「５ｍＭのアデノシン３リン酸」に変えて「５ｍＭのポリリン酸（ナカライテスク社「テトラポリりん酸ナトリウム」、重合度４）」とする以外は実施例５と同様にして反応溶液（Ｘ−２）を作成し、酵素反応させた。反応後の反応溶液（Ｘ−２）中のウリジン３リン酸を定量したところ、０．０５μｇであった。
【０１４１】
＜実施例７＞
実施例５において、「製造例８で得られた（Ｂ−１）を０．０１ユニット／ｍＬ」に変えて「製造例１０で得られた（Ｂ−３）を０．１ユニット／ｍＬ」とし、「５ｍＭのアデノシン３リン酸」に変えて「５ｍＭのω−ホスホノ−Ｌ−アルギニン」とする以外は実施例５と同様にして反応溶液（Ｘ−３）を作成し、酵素反応させた。反応後の反応溶液（Ｘ−３）中のウリジン３リン酸を定量したところ、０．０２μｇであった。
【０１４２】
＜実施例８＞
実施例５において、「製造例８で得られた（Ｂ−１）を０．０１ユニット／ｍＬ」に変えて「製造例１１で得られた（Ｂ−４−１）を０．１ユニット／ｍＬ」とし、「５ｍＭのアデノシン３リン酸」に変えて「５ｍＭのホスホエノールピルビン酸」とする以外は実施例５と同様にして反応溶液（Ｘ−４）を作成し、酵素反応させた。反応後の反応溶液（Ｘ−４）中のウリジン３リン酸を定量したところ、０．０１５μｇであった。
【０１４３】
＜比較例２＞
実施例５において、「製造例８で得られた（Ｂ−１）を０．０１ユニット／ｍＬ」に変えて「製造例１２で得られた（Ｂ−４−２）を０．１ユニット／ｍＬ」とし、「５ｍＭのアデノシン３リン酸」に変えて「５ｍＭのホスホエノールピルビン酸」とする以外は実施例５と同様にして反応溶液（ＨＸ−１）を作成し、酵素反応させた。反応後の反応溶液（ＨＸ−１）中のウリジン３リン酸を定量したところ、０．００９μｇであった。
【０１４４】
実施例１〜４と比較例１との比較及び実施例５〜８と比較例２との比較から、ミカエリス定数Ｋｍが下記阻害濃度ＩＣ50の１００倍未満である酵素を用いた本発明の製造方法の実施例１〜４及び実施例５〜８の方が、ミカエリス定数Ｋｍが下記阻害濃度ＩＣ50の１００倍以上である酵素を用いた比較例１及び２よりも、ウリジン３リン酸の生産量が非常に多かった。特に、ミカエリス定数Ｋｍが下記阻害濃度ＩＣ50の１０倍以下である実施例１〜３及び実施例５〜７で得られたウリジン３リン酸は、比較例に比べて生産量が極めて多かった。
したがって、本発明のウリジン３リン酸の製造方法では、ヒアルロン酸シンターゼを用いてヒアルロン酸を製造した際に副生成するウリジン２リン酸を効率よく用いてウリジン３リン酸を多く製造することができることが分かる。
【０１４５】
＜実施例９＞
５０ｍＭ  リン酸Ｎａバッファー（ｐＨ７．５、２５℃）水溶液中に、１ｍＭのウリジン２リン酸−グルクロン酸、１ｍＭのウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、製造例１４で得られた（Ｄ）を０．１ユニット／ｍＬを含む反応溶液（Ｉ’−１）を１ｍＬ調整した。すべて混合してから２時間、４０℃の恒温水槽で温調し、酵素反応させた。
その後、反応溶液（Ｉ’−１）に、ピロリン酸分解酵素を０．２ユニット／ｍＬとなるように加え、ヌクレオシド−２−リン酸キナーゼ（Ｂ−１）を０．１ユニット、１０ｍＭのアデノシン−３−リン酸を０．１ｍＬ添加し、反応溶液（ＩＩ’−１）とした。反応溶液（ＩＩ’−１）を４０℃の恒温水槽で温調し、２時間酵素反応させた。
その後、反応溶液（ＩＩ’−１）に、製造例１３で得られたウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｃ）を０．２ユニット（１．３μＬ）及び５ｍＭの１−ホスホ−グルクロン酸を２００μＬ加え、反応溶液（ＩＩＩ’−１）とした。反応溶液（ＩＩＩ’−１）を４０℃の恒温水槽で温調し、２時間酵素反応させた。
その後、反応溶液（ＩＩＩ’−１）に、１０ｍＭのウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを１００μＬ、製造例１４で得られた（Ｄ）を反応溶液（ＩＩＩ’−１）に対して０．１ユニット／ｍＬ追加し、反応溶液（Ｉ’−２）とし、４０℃の恒温水槽で温調し、２時間酵素反応させた。
その後、反応溶液（Ｉ’−２）を液体クロマトグラフィーに供し、ヒアルロン酸を精製した。得られたヒアルロン酸の量を定量したところ、１２０μｇであった。
【０１４６】
＜実施例１０＞
５０ｍＭ  リン酸Ｎａバッファー（ｐＨ７．５、２５℃）水溶液中に、１ｍＭのウリジン２リン酸−グルクロン酸、１ｍＭのウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、製造例１４で得られた（Ｄ）を０．１ユニット／ｍＬ、ピロリン酸分解酵素を０．２ユニット／ｍＬ、製造例９で得られたヌクレオシド−２−リン酸キナーゼ（Ｂ−１）を０．１ユニット／ｍＬ、１ｍＭのアデノシン−３−リン酸及び５ｍＭの塩化マグネシウムを含む反応溶液（Ｘ−５）を１ｍＬ調整した。すべて混合してから２時間、４０℃の恒温水槽で温調し、酵素反応させた。
その後、反応溶液（Ｘ−５）に製造例１３で得られたウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｃ）を０．２ユニット（１．３μＬ）及び５ｍＭの１−ホスホ−グルクロン酸を２００μＬ加え、反応溶液（ＩＩＩ’−２）とした。反応溶液（ＩＩＩ’−２）をの恒温水槽で温調し、２時間酵素反応させた。
その後、反応溶液（ＩＩＩ’−２）に製造例１４で得られたヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）を０．２ユニット、５ｍＭのウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン２００μＬ及び製造例９で得られたヌクレオシド−２−リン酸キナーゼ（Ｂ−１）を０．１ユニット、１０ｍＭのアデノシン−３−リン酸を０．１ｍＬ添加し、反応溶液（Ｘ’−１）とした。反応溶液（Ｘ’−１）を４０℃の恒温水槽で温調し、２時間酵素反応させた。
その後、反応溶液（Ｘ’−１）を液体クロマトグラフィーに供し、ヒアルロン酸を精製した。得られたヒアルロン酸の量を定量したところ、１０４μｇであった。
【０１４７】
＜実施例１１＞
５０ｍＭ  リン酸Ｎａバッファー（ｐＨ７．５、２５℃）水溶液中に、１ｍＭのウリジン２リン酸−グルクロン酸、１ｍＭのウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、製造例１４で得られた（Ｄ）を０．１ユニット／ｍＬを含む反応溶液（Ｉ’−３）を１ｍＬ調整した。すべて混合してから２時間、４０℃の恒温水槽で温調し、酵素反応させた。
その後、反応溶液（Ｉ’−３）に、ピロリン酸分解酵素を０．２ユニット／ｍＬとなるように加え、ポリリン酸キナーゼ（Ｂ−２）を０．１ユニット、１０ｍＭのポリリン酸を０．１ｍＬ添加し、反応溶液（ＩＩ’−３）とした。反応溶液（ＩＩ’−３）を４０℃の恒温水槽で温調し、２時間酵素反応させた。
その後、反応溶液（ＩＩ’−３）に、製造例１３で得られたウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｃ）を０．２ユニット（１．３μＬ）及び５ｍＭの１−ホスホ−グルクロン酸を２００μＬ加え、反応溶液（ＩＩＩ’−３）とした。反応溶液（ＩＩＩ’−３）を４０℃の恒温水槽で温調し、２時間酵素反応させた。
その後、反応溶液（ＩＩＩ’−３）に、１０ｍＭのウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを１００μＬ、製造例１４で得られた（Ｄ）を反応溶液（ＩＩＩ’−３）に対して０．１ユニット／ｍＬ追加し、反応溶液（Ｉ’−４）とし、４０℃の恒温水槽で温調し、２時間酵素反応させた。
その後、反応溶液（Ｉ’−４）を液体クロマトグラフィーに供し、ヒアルロン酸を精製した。得られたヒアルロン酸の量を定量したところ、８９μｇであった。
【０１４８】
＜実施例１２＞
５０ｍＭ  リン酸Ｎａバッファー（ｐＨ７．５、２５℃）水溶液中に、１ｍＭのウリジン２リン酸−グルクロン酸、１ｍＭのウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、製造例１４で得られた（Ｄ）を０．１ユニット／ｍＬを含む反応溶液（Ｉ’−５）を１ｍＬ調整した。すべて混合してから２時間、４０℃の恒温水槽で温調し、酵素反応させた。
その後、反応溶液（Ｉ’−５）に、ピロリン酸分解酵素を０．２ユニット／ｍＬとなるように加え、アルギニンキナーゼ（Ｂ−３）を０．１ユニット、１０ｍＭのω−ホスホノ−Ｌ−アルギニンを０．１ｍＬ添加し、反応溶液（ＩＩ’−４）とした。反応溶液（ＩＩ’−４）を４０℃の恒温水槽で温調し、２時間酵素反応させた。
その後、反応溶液（ＩＩ’−４）に、製造例１３で得られたウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｃ）を０．２ユニット（１．３μＬ）及び５ｍＭの１−ホスホ−グルクロン酸を２００μＬ加え、反応溶液（ＩＩＩ’−４）とした。反応溶液（ＩＩＩ’−４）を４０℃の恒温水槽で温調し、２時間酵素反応させた。
その後、反応溶液（ＩＩＩ’−４）に、１０ｍＭのウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを１００μＬ、製造例１４で得られた（Ｄ）を反応溶液（ＩＩＩ’−４）に対して０．１ユニット／ｍＬ追加し、反応溶液（Ｉ’−６）とし、４０℃の恒温水槽で温調し、２時間酵素反応させた。
その後、反応溶液（Ｉ’−６）を液体クロマトグラフィーに供し、ヒアルロン酸を精製した。得られたヒアルロン酸の量を定量したところ、７０μｇであった。
【０１４９】
＜実施例１３＞
５０ｍＭ  リン酸Ｎａバッファー（ｐＨ７．５、２５℃）水溶液中に、１ｍＭのウリジン２リン酸−グルクロン酸、１ｍＭのウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、製造例１４で得られた（Ｄ）を０．１ユニット／ｍＬを含む反応溶液（Ｉ’−７）を１ｍＬ調整した。すべて混合してから２時間、４０℃の恒温水槽で温調し、酵素反応させた。
その後、反応溶液（Ｉ’−７）に、ピロリン酸分解酵素を０．２ユニット／ｍＬとなるように加え、ピルビン酸キナーゼ（Ｂ−４−１）を０．１ユニット、１０ｍＭのホスホエノールピルビン酸を０．１ｍＬ添加し、反応溶液（ＩＩ’−５）とした。反応溶液（ＩＩ’−５）を４０℃の恒温水槽で温調し、２時間酵素反応させた。
その後、反応溶液（ＩＩ’−５）に、製造例１３で得られたウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｃ）を０．２ユニット（１．３μＬ）及び５ｍＭの１−ホスホ−グルクロン酸を２００μＬ加え、反応溶液（ＩＩＩ’−５）とした。反応溶液（ＩＩＩ’−５）を４０℃の恒温水槽で温調し、２時間酵素反応させた。
その後、反応溶液（ＩＩＩ’−５）に、１０ｍＭのウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを１００μＬ、製造例１４で得られた（Ｄ）を反応溶液（ＩＩＩ’−５）に対して０．１ユニット／ｍＬ追加し、反応溶液（Ｉ’−８）とし、４０℃の恒温水槽で温調し、２時間酵素反応させた。
その後、反応溶液（Ｉ’−８）を液体クロマトグラフィーに供し、ヒアルロン酸を精製した。得られたヒアルロン酸の量を定量したところ、３５μｇであった。
【０１５０】
＜実施例１４＞
５０ｍＭ  リン酸Ｎａバッファー（ｐＨ７．５、２５℃）水溶液中に、１ｍＭのウリジン２リン酸−グルクロン酸、１ｍＭのウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、製造例１４で得られた（Ｄ）を０．１ユニット／ｍＬを含む反応溶液（Ｉ’−９）を１ｍＬ調整した。すべて混合してから２時間、４０℃の恒温水槽で温調し、酵素反応させた。
その後、反応溶液（Ｉ’−９）に、ピロリン酸分解酵素を０．２ユニット／ｍＬとなるように加え、ヌクレオシド−２−リン酸キナーゼ（Ｂ−１）を０．１ユニット、１０ｍＭのアデノシン−３−リン酸を０．１ｍＬ、製造例１３で得られたウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｃ）を０．２ユニット（１．３μＬ）及び５ｍＭの１−ホスホ−グルクロン酸を２００μＬ加え、反応溶液（ＩＩＩ’−６）とした。すべて混合してから２時間、４０℃の恒温水槽で温調し、酵素反応させた。
その後、反応溶液（ＩＩＩ’−６）に、１０ｍＭのウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを１００μＬ、製造例１４で得られた（Ｄ）を反応溶液（ＩＩＩ’−６）に対して０．１ユニット／ｍＬ追加し、反応溶液（Ｉ’−１０）とし、４０℃の恒温水槽で温調し、２時間酵素反応させた。
その後、反応溶液（Ｉ’−１０）を液体クロマトグラフィーに供し、ヒアルロン酸を精製した。得られたヒアルロン酸の量を定量したところ、９０μｇであった。
【０１５１】
＜実施例１５＞
５０ｍＭ  リン酸Ｎａバッファー（ｐＨ７．５、２５℃）水溶液中に、１ｍＭのウリジン２リン酸−グルクロン酸、１ｍＭのウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、製造例１４で得られた（Ｄ）を０．１ユニット／ｍＬ、ピロリン酸分解酵素を０．２ユニット／ｍＬ、ヌクレオシド−２−リン酸キナーゼ（Ｂ−１）を０．１ユニット、１０ｍＭのアデノシン−３−リン酸を０．１ｍＬ含む反応溶液（Ｘ−６）を１ｍＬ調整した。すべて混合してから２時間、４０℃の恒温水槽で温調し、酵素反応させた。
その後、反応溶液（Ｘ−６）に、製造例１３で得られたウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｃ）を０．２ユニット（１．３μＬ）、５ｍＭの１−ホスホ−グルクロン酸を２００μＬ、１０ｍＭのウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを１００μＬ、製造例１４で得られた（Ｄ）を反応溶液（Ｘ−６）に対して０．１ユニット／ｍＬ、加え、反応溶液（ＩＩＩ’−７）とした。すべて混合してから２時間、４０℃の恒温水槽で温調し、酵素反応させた。
その後、反応溶液（ＩＩＩ’−７）を液体クロマトグラフィーに供し、ヒアルロン酸を精製した。得られたヒアルロン酸の量を定量したところ、９３μｇであった。
【０１５２】
＜比較例３＞
５０ｍＭ  リン酸Ｎａバッファー（ｐＨ７．５、２５℃）水溶液中に、１ｍＭのウリジン２リン酸−グルクロン酸、１ｍＭのウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、製造例１４で得られた（Ｄ）を０．１ユニット／ｍＬ、ピロリン酸分解酵素を０．２ユニット／ｍＬ、５ｍＭの塩化マグネシウムを含む反応溶液（ＨＩ’−１）を１ｍＬ調整した。すべて混合してから２時間、４０℃の恒温水槽で温調し、酵素反応させた。反応後、液体クロマトグラフィーにより、反応溶液（ＨＩ’−１）中のヒアルロン酸の量を定量したところ、５．７μｇであった。
【０１５３】
＜比較例４＞
５０ｍＭ  リン酸Ｎａバッファー（ｐＨ７．５、２５℃）水溶液中に、１ｍＭのウリジン２リン酸−グルクロン酸、１ｍＭのウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、製造例１４で得られた（Ｄ）を０．１ユニット／ｍＬを含む反応溶液（ＨＩ’−２）を１ｍＬ調整した。すべて混合してから２時間、４０℃の恒温水槽で温調し、酵素反応させた。
その後、反応溶液（ＨＩ’−２）にピロリン酸分解酵素を０．２ユニット／ｍＬ、製造例１２で得られた（Ｂ−４−２）を０．１ユニット／ｍＬ、５ｍＭのω−ホスホノ−Ｌ−アルギニン、及び５ｍＭの塩化マグネシウムを加えて反応溶液（ＨＩＩ’−１）とした。すべて混合してから２時間、４０℃の恒温水槽で温調し、酵素反応させた。
その後、反応溶液（ＨＩＩ’−１）に製造例１３で得られたウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｃ）を０．２ユニット（１．３μＬ）及び５ｍＭ１−ホスホ−グルクロン酸を２００μＬ加え、反応溶液（ＨＩＩＩ’−１）とした。反応溶液（ＨＩＩＩ’−１）をの恒温水槽で温調し、２時間酵素反応させた。
その後、反応溶液（ＨＩＩＩ’−１）に製造例１４で得られたヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）を０．２ユニット、５ｍＭのウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン２００μＬ、製造例１２で得られた（Ｂ−４−２）を０．１ユニット及び５ｍＭのω−ホスホノ−Ｌ−アルギニンを添加して反応溶液（ＨＩ’−２）とした。反応溶液（ＨＩ’−２）を４０℃の恒温水槽で温調し、２時間酵素反応させた。
その後、反応溶液（ＨＩ’−２）を液体クロマトグラフィーに供し、ヒアルロン酸を精製した。得られたヒアルロン酸の量を定量したところ、１０μｇであった。
【０１５４】
＜比較例５＞
５０ｍＭ  リン酸Ｎａバッファー（ｐＨ７．５、２５℃）水溶液中に、１ｍＭのウリジン２リン酸−グルクロン酸、１ｍＭのウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、製造例１４で得られた（Ｄ）を０．１ユニット／ｍＬ、ピロリン酸分解酵素を０．２ユニット／ｍＬ、５ｍＭの塩化マグネシウムを含む反応溶液（ＨＩ’−３）を１ｍＬ調整した。すべて混合してから２時間、４０℃の恒温水槽で温調し、酵素反応させた。その後、反応溶液（ＨＩ’−３）に、ウリジン３リン酸−モノサッカリド−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（Ｃ）を０．２ユニット（１．３μＬ）及び５ｍＭ１−ホスホ−グルクロン酸を２００μＬ、ウリジン３リン酸を１ｍＭとなるように加え、反応溶液（ＨＩＩＩ’−２）とした。反応溶液（ＨＩＩＩ’−２）を恒温水槽で温調し、２時間酵素反応させた。
その後、反応溶液（ＨＩＩＩ’−２）に製造例１４で得られたヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）を０．２ユニット、５ｍＭのウリジン２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン２００μＬを加えて（ＨＩ’−４）とし、反応溶液（ＨＩ’−４）を４０℃の恒温水槽で温調し、２時間酵素反応させた。その後、（ＨＩ’−４）を液体クロマトグラフィーにより、反応溶液（ＨＩ’−４）中のヒアルロン酸の量を定量したところ、７μｇであった。
【０１５５】
酵素としてヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）のみを用いた比較例３では、得られたヒアルロン酸量が５．７μｇと少なかった。また、ウリジン３リン酸合成酵素（Ｂ）とヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）を用いた場合においても、（Ｂ）のミカエリス定数Ｋｍが（Ｄ）の阻害濃度ＩＣ50の１００倍以上である酵素を用いる以外は実施例１３と同様に実施した比較例４は、得られたヒアルロン酸量が１０μｇと少なかった。
一方、ウリジン３リン酸合成酵素（Ｂ）のミカエリス定数Ｋｍがヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）の阻害濃度ＩＣ50の１００倍未満である本発明の製造方法である実施例９〜１５で得られたヒアルロン酸は３５μｇ〜１２０μｇであり、得られたヒアルロン酸量が比較例３及び４と比較して極めて多かった。
したがって、本発明のヒアルロン酸の製造方法では、ヒアルロン酸を大量に得られることが分かる。
また、比較例５ではウリジン３リン酸を添加することで、比較例３よりもヒアルロン酸の生産量は増加しているものの、実施例９〜１５よりも少なかった。一方、実施例９〜１５では、ウリジン３リン酸を添加することなくヒアルロン酸を大量に製造できた。これは、実施例１〜８で実証されている通り、副生成したウリジン２リン酸をウリジン３リン酸に効率よく変換できているため、ウリジン３リン酸を添加しなくても、ウリジン２リン酸−グルクロン酸を生成することができるためである。さらに、ウリジン２リン酸がウリジン３リン酸に変換されるため、ヒアルロン酸シンターゼ（Ｄ）の活性阻害を少なくすることができ、ヒアルロン酸を大量に得ることができている。
したがって、本発明のヒアルロン酸の製造方法では、ヒアルロン酸の製造において、ウリジン３リン酸の使用量を低減できることがわかる。
以上のことから、本発明のヒアルロン酸の製造方法は、ヒアルロン酸を製造した際に副生成するウリジン２リン酸を利用して効率よくウリジン３リン酸を生成し、ウリジン３リン酸の使用量を減らしてもヒアルロン酸を製造することができ、ヒアルロン酸の生産量が多いことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１５６】
本発明のウリジン３リン酸の製造方法によれば、ウリジン３リン酸を高効率で生産でき、生産したウリジン３リン酸はヒアルロン酸の製造に用いることができる。また、本発明のヒアルロン酸の製造方法によれば、副生成するウリジン２リン酸を再利用して使用するウリジン３リン酸の量を減らすことができ、ヒアルロン酸を高効率で生産でき、ヒアルロン酸の生産量が多い。また、本発明の製造方法により得られたヒアルロン酸は、化粧品、医薬部外品、医薬品、医療機器だけでなく、食品等にも用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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