(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミモザ抽出物を有効成分とする魚病に対する免疫賦活剤。
【請求項２】
ミモザ抽出物が、タンニンを５０〜９０質量％（固形分）含むものである請求項１記載の魚病に対する免疫賦活剤。
【請求項３】
ミモザ抽出物が、ミモザの樹皮の熱水抽出物である請求項１又は２記載の魚病に対する免疫賦活剤。
【請求項４】
エドワジエラ症の魚病に対するものである請求項１、２又は３記載の魚病に対する免疫賦活剤。
【請求項５】
マダイの魚病に対するものである請求項１〜４のいずれか１項記載の魚病に対する免疫賦活剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載の魚病に対する免疫賦活剤を含有する魚用飼料。
【請求項７】
ミモザ抽出物を含有する、魚病に対する免疫賦活用飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミモザ抽出物を含有する魚病防除剤及び飼料に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
養殖業における細菌感染による病害防除対策として、甘草末を配合した養魚用飼料（特許文献１参照）及び甘草末を含有する養魚用飼料添加物組成、それを用いた養殖魚類の生長促進方法及び飼料（特許文献２参照）、魚病原因菌に対する抗菌剤（特許文献３参照）、魚病防除剤（特許文献４参照）が提案されている。しかしながら、さらに安全で効果が高い魚病防除剤が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平２−２８３２４７号公報
【特許文献２】特開平１１−１６９０９９号公報
【特許文献３】特開２００４−２９２３８５号公報
【特許文献４】特開２００７−７０２４０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、養殖業における細菌感染による病害防除対策ができ、安全で優れた免疫賦活効果を有する、魚病に対する免疫賦活剤及び飼料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討した結果、ミモザ抽出物、特にミモザタンニンが、優れた魚病の原因菌に対する発育阻止効果、免疫賦活効果を有することを知見し、本発明をなすに至ったものである。
【０００６】
従って、本発明は下記魚病に対する免疫賦活剤及び飼料を提供する。
［１］．ミモザ抽出物を有効成分とする魚病に対する免疫賦活剤。
［２］．ミモザ抽出物が、タンニンを５０〜９０質量％（固形分）含むものである［１］記載の魚病に対する免疫賦活剤。
［３］．ミモザ抽出物が、ミモザの樹皮の熱水抽出物である［１］又は［２］記載の魚病に対する免疫賦活剤。
［４］．エドワジエラ症の魚病に対するものである［１］、［２］又は［３］記載の魚病に対する免疫賦活剤。
［５］．マダイの魚病に対するものである［１］〜［４］のいずれかに記載の魚病に対する免疫賦活剤。
［６］．［１］〜［５］のいずれかに記載の魚病に対する免疫賦活剤を含有する魚用飼料。
［７］．ミモザ抽出物を含有する、魚病に対する免疫賦活用飼料。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、魚病に対して、安全で優れた免疫賦活効果を有する免疫賦活剤及び飼料を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】マダイのエドワジエラ症に対するミモザ抽出物の効果（マダイの累積死亡率％）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の魚病に対する免疫賦活剤の有効成分であるミモザ抽出物は、マメ科アカシア（Ａｃａｓｉａ）属に属する植物である。使用部位は、樹皮、根、根茎、葉、茎のいずれの部位でも原料として使用することができるが、樹皮を使用することが好ましい。抽出方法は特に限定されず、溶媒抽出、熱水抽出、水蒸気蒸留、超臨界抽出等の公知の抽出方法を採用することができる。例えば、溶媒抽出の場合、ミモザ樹皮を生のまま、又は乾燥した後に適当な大きさに切断・加工し、抽出溶媒に浸漬、撹拌することによって得ることができる。抽出は必要に応じて加温してもよく、時間は適宜選定され、抽出ｐＨは、極端な酸性又はアルカリ性でなければ特に制限はない。上記抽出方法に用いる溶媒としては、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類等が挙げられ、これらを１種単独で又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。抽出後ろ過を行い、適宜公知の精製を行ってもよい。さらに、抽出液は、適宜、濃縮、分離精製、噴霧乾燥等を行うことができる。
【００１０】
特に、ミモザ抽出物（固形分）にタンニン量が５０〜９０質量％（固形分）、好ましくは５５〜９０質量％、より好ましくは６０〜８０質量％含まれるものが好ましい。このようなミモザ抽出物としては、ミモザの樹皮の熱水抽出物が挙げられる。また、上記のようなタンニン量のミモザ抽出物を得る方法としては、例えば、ミモザの樹皮を粉砕し、原料の３〜２０倍量、好適には５〜１５倍量の６０〜９０℃、より好ましくは熱水抽出により得ることができる。その後、減圧濃縮等の濃縮、分離精製、噴霧乾燥等を行うことができる。
【００１１】
なお、本発明のタンニン含量の測定は、以下の測定方法による。
カテキン１００ｍｇを９９容量％エタノール１００ｍＬに溶解した溶液０．１ｍＬに、蒸留水８．０ｍＬ及びフォーリン・デニス試薬０．５ｍＬを加え、室温で３分間静置した後、１０質量％炭酸ナトリウム溶液１．０ｍＬを加え、室温で３０分間静置し、７６０ｎｍにおける吸光度Ａｏを求める。次にミモザ抽出物１００ｍｇを５０容量％エタノール１００ｍＬに溶解した溶液０．１ｍＬを、同様に処理し吸光度Ａを求める。カテキンの含量を１００質量％として、その相対値（Ａ／Ａｏ×１００）をもってミモザ抽出物のタンニン含量とする。
【００１２】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の魚病に対する免疫賦活剤は、ミモザ抽出物を有効成分とする魚病に対する免疫賦活剤である。魚病に対する免疫賦活剤の対象となる魚病としては、エドワジエラ症：エドワジエラ  タルダ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ  ｔａｒｄａ）、ビブリオ病：ビブリオ  ダムセラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｄａｍｓｅｌａ）、ビブリオ  ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉ）、ビブリオ  オーダリー（Ｖｉｂｒｉｏ  ｏｒｄａｌｌｉ）、ビブリオ  ペスシダ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐｅｎａｅｉｃｉｄａ）、ビブリオ  スプレンディダス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｌｅｎｄｉｄｕｓ）、ビブリオ  バルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）、ビブリオ  アンギラルム（Ｖｉｂｒｉｏ  ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）、細菌性腸管白濁症：ビブリオ  イチオエンテリー（Ｖｉｂｒｉｏ  ｉｃｈｔｈｙｏｅｎｔｅｒｉ）、潰瘍病：ビブリオ  パラヘモリティカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、桿菌性壊死症：ビブリオ  トゥビアッシ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｔｕｂｉａｓｈｉｉ）、カラムナリス病：フラボバクテリウム  カラムナレ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｌｕｍｎａｒｅ）、冷水病：フレキシバクター  サイクロフィラム（Ｆｌｅｘｉｂａｃｔｅｒ  ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ）、滑走細菌症：フレキシバクター  マリティマス（Ｆｌｅｘｉｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｉｔｉｍｕｓ）、テナチバキュラム・マリティマム（Ｔｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍ  ｍａｒｉｔｉｍｕｍ）、ノカルジア症：ノカルディア  アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ノカルジア・セリオラエ（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｅｒｉｏｌａｅ）、類結節症：フォトバクテリウム  ダムセラ（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｓｅｌａ）、乳酸桿菌症：カーノバクテリウム  ピシコラ（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｉｓｃｉｃｏｌａ）、ブドウ球菌症：スタフィロコッカス  エピデルミデス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｅｉｓ）、菌血症：ラクトコッカス  ガービア（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｒｖｉｅａｅ）、せっそう病：エロモナス  サルモニシダ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）、連鎖球菌症：エンテロコッカス種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、ストレプトコッカス  イニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｕｓ  ｉｎｉａｅ）、ストレプトコッカス  ディスガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・パラユベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｕｓ  ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ）等が挙げられる。中でも、エドワジエラ症に対して有効である。
【００１３】
上記の魚病は、マダイ、ヒラメ、タイ類、ブリ類、ボラ、カレイ、アイナメ、ウナギ、コイ、ティラピア、ギンザケ、ニジマス、トラフグ、マグロ、メバル、アジ、サバ、カワハギ、アナゴ、チョウザメ等の広範囲な種類の魚介類に発生する上記記載の病害に有効であるが、マダイの魚病に好適であり、特にマダイのエドワジエラ症に対して有効である。なお、マダイのエドワジエラ症と、ヒラメのエドワジエラ症とは別の株である。
【００１４】
本発明の魚病に対する免疫賦活剤は、ミモザから得られる抽出物を用いるため、抗生物質による薬剤耐性菌の出現や副作用の問題がなく、安心して投与することができる。さらに、薬剤の残留による人体や環境への影響の心配がないため、特に、養殖魚に対する魚病の防除剤として好適である。
【００１５】
本発明の魚病に対する免疫賦活剤は、稚魚から成魚に投与することができ、投与方法は経口投与が可能である。経口投与する場合は、魚病に対する免疫賦活剤をそのまま又は任意の魚用飼料成分と混合し、魚用飼料として投与することが可能である。また、その投与量は、通常、魚体重１ｋｇあたり１０〜１０００ｍｇが好ましく、５０〜２００ｍｇがより好ましい。投与期間は特に限定されないが、７〜２８日間で効果を得ることができる。
【００１６】
本発明のミモザ抽出物は、後述する実施例における結果からも明らかであるように、優れた免疫賦活効果を有するため、ミモザ抽出物を有効成分とする免疫賦活剤を提供することができる。
【００１７】
本発明は、上記魚病に対する免疫賦活剤を含有する魚用飼料や、ミモザ抽出物を含有する魚病に対する免疫賦活用飼料を提供する。ミモザ抽出物、対象となる魚病や、投与方法等は同じである。
【００１８】
ミモザ抽出物以外の魚用飼料成分としては、魚粉、小麦粉、でん粉、魚油等が挙げられ、１種単独で又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。飼料中のミモザ抽出物（魚病に対する免疫賦活）の含有量は０．０３〜１０質量％が好ましく、より好ましくは０．１〜２．０質量％である。
【実施例】
【００１９】
以下、実施例及び比較例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
【００２０】
[実施例１]
ミモザ（樹皮）１０００ｇを粉砕し、ミモザ（樹皮）の１０倍量で熱水抽出した。固体と液体とを分離して抽出液を得た。得られた抽出液を濃縮し、濃縮液（固形４５質量％）を得て、これを噴霧乾燥し、ミモザ抽出物１５０ｇ（タンニン含量６５質量％）を得た。
得られたミモザ抽出物について、下記評価を行った。
【００２１】
<魚病原因菌に対する発育阻止効果>
ミモザ抽出物含有寒天培地（ミモザ抽出物濃度：０．００２〜１．０００％（ｗ／ｖ）、２倍希釈系列）に種々の菌液を滴下し（５μＬ／滴）、２〜４日間、２５℃で培養した。目視でコロニーの発育が確認できなかったミモザ抽出物最小濃度を、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）とした。寒天培地には、ミモザ抽出物を溶解した培地２４ｍＬを直径９ｃｍのシャーレに注いだものを使用した。また、発育陽性培地として、ミモザ抽出物不含寒天培地も同様に作成し、細菌の発育と滴下菌量を確認した。結果を表１に示す。下記９種類(１５株)の魚病原因菌（細菌）に対し、発育阻止効果が認められた。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
<マダイの免疫に対する効果>
エドワジエラ症の原因細菌であるＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ  ｔａｒｄａは宿主食細胞内で抵抗性を示すため、本症の予防には、食細胞のポテンシャルキリング活性（ＰＫ）の向上が有効と考えられている。ミモザ抽出物がＰＫに及ぼす影響を確認した。
１００Ｌ水槽４槽に平均体重６６．７ｇのマダイを５尾ずつ収容した。水温２５℃に馴致した後、各水槽のマダイに、実施例１で得られたミモザ抽出物を表２の割合で添加したモイストペレット（ＭＰ）を給餌率４質量％／日で４週間毎日投与した。最終投与日の翌日、下記方法により血液のポテンシャルキリング活性を測定した。結果を表２に併記する。
【００２４】
［ポテンシャルキリング活性］
マイクロチューブにＮＢＴ溶液（コントロール）及びＺｙｍｏｓａｎ加ＮＢＴ溶液を１５μＬずつ分注し、魚より採血した血液１００μＬを毛細管（長さ７５ｍｍ、φ２ｍｍ、ミナトメディカル製）に充填し１０００Ｇ、４℃で５分間遠心分離を行った。遠心分離機より毛細管を取り出し、白血球層と赤血球層の境界面及び白血球層の上方２ｃｍで毛細管を切断し、白血球を含む部分を、５０μＬＲＰＭＩ１６４０溶液を用いて新しいマイクロチューブに移動させた。得られた白血球溶液をピペッティングにて白血球細胞を分散し、ＮＢＴ溶液及びＺｙｍｏｓａｎ加ＮＢＴ溶液を１５μＬずつ加え、２５℃でインキュベート行った。その後、１５質量％ＮａＣｌ溶液を３０μＬ加えた。次に、ＤＭＦ４００μＬを各マイクロチューブに加えてピペットを用いて混和し、１５００Ｇ，４℃、１５分間遠心分離を行った。上清２５０μＬを石英マイクロプレートに移し、５４０ｎｍの吸光値（ＯＤ）を測定し、下記式を用いて評価を行った。
ポテンシャルキリング活性（ＰＫ）
＝Ｚｙｍｏｓａｎ加ＮＢＴ溶液のＯＤ−ＮＢＴ溶液のＯＤ
【００２５】
【表２】
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【００２６】
マダイのＰＫは、ミモザ抽出物投与の方がミモザ抽出物無投与より有意に高かった。ミモザ抽出物の投与により、マダイの免疫が向上することがわかった。
【００２７】
<マダイのエドワジエラ症に対する効果−１>
マダイのエドワジエラ症の感染予防に、ミモザ抽出物の投与が有効かどうか確認した。
１００Ｌ水槽６槽に平均体重５５．０ｇのマダイを１０尾ずつ収容した。水温２５℃に馴致した後、各水槽のマダイに、実施例１のミモザ抽出物を表３の割合で添加したモイストペレット（ＭＰ）を、給餌率４質量％／日で４週間毎日投与した。４週間投与した翌日、ミモザ抽出物を投与して１．５時間後にＥ．ｔａｒｄａ（ＭＥＥ０３０９株）の菌液（１０7ＣＦＵ／ｍＬ）でマダイを１．５時間浸漬攻撃した。その後水槽に再収用し、攻撃後２４時間目の血液と腎臓における菌量を測定した。
【００２８】
【表３】
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【００２９】
ミモザ抽出物０．３３質量％添加を４週間投与（水槽５）と、ミモザ抽出物０．６７質量％添加を２週間投与（水槽３）とにおける体内菌量は、ミモザ抽出物無投与（水槽１）のそれよりも有意に低かった。ミモザ抽出物の投与により、体内菌量が低下することが確認された。
【００３０】
<マダイのエドワジエラ症に対する効果−２>
マダイのエドワジエラ症の発生予防に、ミモザ抽出物の投与が有効かどうかを確認した。５００Ｌ水槽２槽に平均体重７９．１ｇのマダイを１８尾ずつ収容した。水温２５℃に馴致した後、各水槽のマダイに、実施例１のミモザ抽出物を表４の割合で添加したモイストペレット（ＭＰ）を給餌率４質量％／日で毎日投与した。４週間投与した翌日、ミモザ抽出物を投与して１．５時間後にＥ．ｔａｒｄａ（ＭＥＥ０３０９株）の菌液（１０7ＣＦＵ／ｍＬ）でマダイを１．５時間浸漬攻撃した。その後水槽に再収用し、攻撃後２８日間、マダイの累積死亡率を観察した。攻撃後も観察終了まで表４のミモザ抽出物を投与した。
【００３１】
【表４】
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【００３２】
また、ミモザ抽出物投与と、ミモザ抽出物無投与の累積死亡率（％）を図１に示す。ミモザ抽出物投与の方が、ミモザ抽出物無投与に比べ累積死亡率が低かった。以上のことから、本症の発生予防にミモザ抽出物の投与が有効であることが確認された。
【００３３】
［配合例１］
下記表５に示す組成の魚用飼料を作製した。
【００３４】
【表５】
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【図１】
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