(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＰＡＤ４および／もしくはＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストン２Ａおよび／もしくはヒストン４における、ならびに／またはヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ３におけるシトルリン化エピトープに特異的に反応する、関節リウマチの予防または治療における使用のための抗体であって、
配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に反応し、
配列番号１８で示される可変重鎖ドメインおよび配列番号１７で示される可変軽鎖ドメイン、
配列番号２０で示される可変重鎖ドメインおよび配列番号３９で示される可変軽鎖ドメイン、
配列番号４０で示される可変重鎖ドメインおよび配列番号４１で示される可変軽鎖ドメイン、
配列番号１８で示される可変重鎖ドメインおよび配列番号１９で示される可変軽鎖ドメイン、
配列番号４２で示される可変重鎖ドメインおよび配列番号４３で示される可変軽鎖ドメイン、ならびに
配列番号４４で示される可変重鎖ドメインおよび配列番号４５で示される可変軽鎖ドメインからなる群から選択される可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインの組み合わせによってコードされるアミノ酸配列を含むことを特徴とする抗体。
【請求項２】
リコンビナント抗体、単一鎖抗体、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖｓ）、およびフラグメント抗原結合領域（Ｆａｂｓ）からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の使用のための抗体。
【請求項３】
モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１または２に記載の使用のための抗体。
【請求項４】
配列番号１８で示される可変重鎖ドメインおよび配列番号１７で示される可変軽鎖ドメイン、
配列番号２０で示される可変重鎖ドメインおよび配列番号３９で示される可変軽鎖ドメイン、
配列番号４０で示される可変重鎖ドメインおよび配列番号４１で示される可変軽鎖ドメイン、
配列番号１８で示される可変重鎖ドメインおよび配列番号１９で示される可変軽鎖ドメイン、
配列番号４２で示される可変重鎖ドメインおよび配列番号４３で示される可変軽鎖ドメイン、ならびに
配列番号４４で示される可変重鎖ドメインおよび配列番号４５で示される可変軽鎖ドメインからなる群から選択される可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインの組み合わせによってコードされるアミノ酸配列を含み、
配列番号２１で示されるペプチドに特異的に反応することを特徴とするポリペプチド。
【請求項５】
請求項４に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とする核酸。
【請求項６】
配列番号１８で示される可変重鎖ドメインの核酸配列および配列番号１７で示される可変軽鎖ドメインの核酸配列、
配列番号２０で示される可変重鎖ドメインの核酸配列および配列番号３９で示される可変軽鎖ドメインの核酸配列、
配列番号４０で示される可変重鎖ドメインの核酸配列および配列番号４１で示される可変軽鎖ドメインの核酸配列、
配列番号１８で示される可変重鎖ドメインの核酸配列および配列番号１９で示される可変軽鎖ドメインの核酸配列、
配列番号４２で示される可変重鎖ドメインの核酸配列および配列番号４３で示される可変軽鎖ドメインの核酸配列、ならびに
配列番号４４で示される可変重鎖ドメインの核酸配列および配列番号４５で示される可変軽鎖ドメインの核酸配列からなる群から選択される可変重鎖ドメインの核酸配列および可変軽鎖ドメインの核酸配列の組み合わせを含むことを特徴とする請求項５に記載の核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトおよび動物における炎症の治療または予防の分野に属し、様々な炎症状態を治療または予防するための医薬組成物および方法に関する。特に、本発明は、シトルリン関連疾患、好ましくは炎症性疾患、より好ましくは関節リウマチのような炎症性リウマチのような炎症状態を、予防または治療するための組成物および方法に関する。本発明は、炎症性リウマチ、好ましくは関節リウマチのような炎症状態の治療および予防に使用するための、シトルリン含有エピトープに対する、抗体のような特異的結合分子を提供する。
【背景技術】
【０００２】
炎症状態は、慢性であろうと急性であろうと、医療業界における重大な問題を突き付ける。簡潔に述べるならば、慢性的な炎症は、活動性炎症、組織破壊および治癒の試行が同時に進行する、持続時間の長い（数週間または数ヶ月の）炎症であると考えられる（Robbins Pathological Basis of Disease by R.S. Cortran, V.Kumar and S.L.Robbins, W.B.Saunders Co., p.75, 1989）。慢性炎症は、急性炎症の発症後に続き得るが、たとえば、持続感染（たとえば、結核、梅毒、真菌症）の結果として、内因性（たとえば、血漿脂質）もしくは外因性（たとえば、シリカ、アスベスト、タバコのタール、手術用縫合糸）の毒素への遷延性の曝露、または体自身の組織に対する自己免疫反応（たとえば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬）のような、時間経過とともに進行する潜行性のプロセスとしても生じ得る。
【０００３】
炎症性関節炎は、特に高齢者の数が増加した先進国において深刻な健康問題である。たとえば、炎症性関節炎の一種である関節リウマチ（ＲＡ）は、世界の人口の１〜２％が侵されている多系統慢性の再発性炎症性疾患である。
【０００４】
多くの器官が侵され得るが、ＲＡは、基本的に、侵された関節の破壊および強直を導くこともある慢性滑膜炎症の重度の形態である（Robbins Pathological Basis of Disease, by R.S. Cotran, V.Kumar, and S.L. Robbins, W.B.Saunders Co., 1989）。疾患は、関節隙に拡張する様々な投射を形成する滑膜の顕著な厚化、滑膜ライニング（滑膜細胞増殖）の多層化、白血球細胞（マクロファージ、リンパ球、形質細胞およびリンパ濾胞）による滑膜の炎症（「炎症性滑膜炎」と称される）、ならびに滑膜内の細胞壊死によるフィブリンの沈着によって病理学的に特徴付けられる。この過程の結果として形成された組織はパンヌスと称され、パンヌスは最終的に関節隙を埋めるまで増殖する。パンヌスは、滑膜炎の進展に不可欠である血管新生の過程を通じて、新しい血管の広範なネットワークを発達させる。パンヌス組織の細胞に由来する、消化酵素（マトリックスメタロプロテアーゼ（たとえば、コラゲナーゼ、ストロメリシン））ならびに炎症性プロセスの他の修飾因子（たとえば、過酸化水素、スーパーオキサイド、リソソーム酵素およびアラキドン酸代謝の生産物）の放出は、軟骨組織の進行性破壊を導く。パンヌスは、関節軟骨に侵潤し、びらんおよび軟骨組織の断片化を導く。結果的に、関与する関節について、線維性強直を有する軟骨下骨びらんを生じ、最終的に骨性強直を生じる。
【０００５】
ＲＡは自己免疫疾患であり、その上、多くの異なる関節刺激が免疫遺伝学的に感受性である宿主における免疫応答を活性化すると一般的に考えられている。外因性感染性病原体（Epstein-Barrウイルス、風疹ウイルス、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、マイコプラズマなど）と、コラーゲン、プロテオグリカン、改変された免疫グロブリンおよびシトルリン化タンパク質のような翻訳後修飾されたタンパク質などの内因性タンパク質との両者は、不適切な宿主免疫応答を引き起こす病原体として関与している。誘発物質に関わらず、自己免疫は疾患の進行に影響を与える。特に、従来の抗原は、抗原提示細胞（滑膜における、マクロファージまたは樹状細胞）によって摂取され、処理され、Ｔリンパ球に提示される。Ｔ細胞は、細胞性免疫応答をイニシエートし、増殖を刺激し、Ｂリンパ球の形質細胞への分化を刺激する。最終的に、宿主組織に対する過剰の不適切な免疫応答（たとえば、ＩＩ型コラーゲンに対する抗体、自己由来のＩｇＧのＦｃ部分に対する抗体（「リウマチ因子」と称する））、および異なるシトルリン化エピトープに対する抗体（抗ＣＣＰ）が生じる。このことは、さらに免疫応答を増幅し、軟骨組織の破壊を早める。一度このカスケードがイニシエートされれば、軟骨破壊の多数の修飾因子が関節リウマチの進行に関与する。
【０００６】
上述の抗ＣＣＰ抗体は、ＲＡに特異性が高いことが示された。最近の証拠は、これらの抗体についての血清反応陽性である各個人が、既にＲＡを有しているか、または将来この疾患が進展するであろうことを示す。抗ＣＣＰ抗体の存在（特に、高力価が存在している場合）は、びらん性疾患の転帰の前兆である（Nijenhuis et al., Clin. Chim. Acta, vol 350, 17-34, 2004）。さらに、抗ＣＣＰ抗体は、炎症の局所的な部位において産生されることが示された。ＲＡ患者に由来する滑膜物質において見出される総ＩｇＧに対する抗ＣＣＰ抗体の割合は、同一患者の血清における当該割合よりも顕著に高いことが明らかである（Masson-Bessiet al., Clin Exp Immunol, vol 119, 544-552, 2000）（Reparon-Schuijt et al., Arthritis Rheum, vol 44、41-47、2001）。
【０００７】
滑膜における抗ＣＣＰ産生形質細胞の存在は、炎症部位におけるＣＣＰ特異的なＢ細胞の抗原駆動型成熟の指標である。抗ＣＣＰ抗体が一度産生されれば、滑膜におけるシトルリン化タンパク質を有する免疫複合体の形成は、炎症過程の進行を引き起こし得る。これらのデータおよびその他のデータは、抗ＣＣＰ抗体がＲＡの疾患症状の少なくとも一部を実際に引き起こすという仮説を支持する。ＲＡの病因における抗ＣＣＰ抗体の役割は、ＲＡ患者におけるＢリンパ球減少実験の結果によって支持される（Cambridge et al., Arthritis Rheum, vol48, 2146-2154, 2003）。
【０００８】
進行した関節リウマチを有する人々の死亡率は、数種のがんの死亡率を超えている。したがって、治療法は、不可逆的な関節破壊の可能性を減少させるために設計された積極的な早期の薬物療法に移行した。米国リウマチ学会の最近の推奨事項（Arthritis and Rheumatism 39（5): 713-722, 1996）は、診断が確定し、症状が進行中の全ての患者について病態修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）治療の早期開始を含む。抗がん剤は大半の患者について第１選択療法となり、化学療法薬メトトレキサートが６０％〜７０％のリウマチ専門医の第１選択薬である。重度疾患では、多くの場合、無期限にこの薬剤による毎週の治療を必要とし、メトトレキサート治療にも関わらず症状が進行する患者（患者の５０％以上）には、シクロスポリンおよびアザチオプリン（単独または組み合わせ）のような第２化学療法薬が頻繁に採用される。
【０００９】
特に、滑膜が関与する疾患およびシトルリン関連炎症性疾患などの炎症性疾患の病理発生を抑制することができる炎症性疾患の治療または予防のための化合物が、依然として必要である。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、炎症性疾患の治療または予防における使用のためのｐ１５および／またはｐ１７におけるシトルリン化エピトープと特異的に反応する結合分子を提供する。
【００１１】
本明細書において、ｐ１５およびｐ１７は、ヒトＰＡＤ４および／もしくはＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストン２Ａおよび／もしくはヒストン４、ならびに／またはヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ３と同定される。
【００１２】
また、本発明は、炎症性疾患を治療または予防するための方法であって、ｐ１５および／またはｐ１７におけるシトルリン化エピトープと特異的に反応する結合分子を含む、治療上有効な量の抗炎症組成物をそれが必要とされる患者に投与する工程を含む方法を提供する。
【００１３】
本発明の組成物および方法は、シトルリン残基に反応する特異的結合分子の薬学的に受容可能な形態を含む。特に、結合分子は、本明細書においてｐ１５およびｐ１７と称されるような２つのポリペプチドにおけるシトルリン化されたエピトープに特異的に反応する。
【００１４】
また、本発明は、本明細書において同定されたようなポリペプチドおよび核酸に関する。
【００１５】
本発明のこれらの態様および他の態様は、以下の詳細な説明、図面および実施例を参照すれば明らかになるであろう。また、より詳細な具体的手順、装置または組成物を記載した様々な参考文献が本明細書に明記されており、その全体が参照によって組み込まれる。
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、炎症性疾患の治療または予防における使用のための、ｐ１５および／またはｐ１７におけるシトルリン化エピトープと特異的に反応する結合分子を提供する。
【００１７】
用語「特異的結合分子」は、特異的結合をすることができる分子、好ましくは小分子を示すために本明細書において用いられる。この点において、特異的結合は、分子が選択された標的分子に結合することができるが、同一条件下において標的分子に関連しない他のものには結合しないことを意味する。たとえば、結合分子が、血清アルブミンに結合し、その他、好ましくは血清中に見出される他の全てのタンパク質に、ほとんどまたは全く結合しない場合、血清アルブミンに特異的に結合すると表現する。好ましい特異的結合分子は、抗体である。
【００１８】
本明細書において、用語「シトルリンに特異的に反応する」または「シトルリン化エピトープに反応する」または「シトルリンエピトープに反応する」は、特異的結合分子または抗体が、シトルリン残基を含むペプチドのような構造に反応するが、前記抗体が、シトルリン残基の換わりにアルギニン残基を含む同一の構造にほとんど反応しないか、または好ましくは全く反応しないことを意味する。用語ペプチドは、好ましくは人体または動物体に登場するような同一の文脈、好ましくは天然ポリペプチドの文脈において、本明細書に記載されたような特異的結合分子との免疫反応性についての正確な文脈において、シトルリン残基を提示することができる構造として解釈されるべきである。また、シトルリン残基は、細胞の活性化または補体結合のような免疫システムの他の要素を活性化しない、または引き起こさない、天然ポリペプチドの文脈において示されることが好ましい。
【００１９】
「特異的結合分子」は分子であってもよく、好ましくは標的化合物に特異的に結合することができる、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質ドメイン、タンパク質全体、またはそれらの組み合わせ、もしくはその一部であってもよい。特異的結合分子の好ましい例は、ペプチドまたは抗体である。
【００２０】
天然の抗体（免疫グロブリンとしても知られる）は、脊椎動物の血液または他の体液に見出すことができ、細菌およびウイルスのような外来の異物を見分け、中和する免疫系によって使用されるガンマグロブリンタンパク質である。
【００２１】
天然の抗体は、通常、基本的な構造ユニット（それぞれ、２つの大きな重鎖および２つの小さな軽鎖）からできており、たとえば、１ユニットを有するモノマー、２ユニットを有するダイマー、または５ユニットを有するペンタマーを形成する。抗体は、Ｂ細胞と称される種類の白血球によって生産される。重鎖のいくつかの異なる種類が存在し、異なる抗体をもたらす。抗体は、それらの有する重鎖に基づく異なるアイソタイプに分類できる。異なる役割を行う５種の異なる抗体アイソタイプが哺乳類で知られており、それらが遭遇した外来の異物の異なる種類のそれぞれについて適切な免疫応答を直接に補助する。ラクダ（たとえば、ラマ）およびサメのような数種の動物種は、異常な抗体構造を有し得る。
【００２２】
全ての抗体の一般的な構造は非常によく似ているが、タンパク質の先端にある小さな領域は、非常に変化に富んでおり、わずかに異なる先端構造を有する数百万の抗体が存在することを可能にする。この領域は可変領域として知られている。これらの変異体のそれぞれは、抗原として知られる異なる標的に結合することができる。抗体のこの豊かな多様性によって、免疫系は同様に広範な抗原の多様性を認識することが可能となる。
【００２３】
抗体によって認識される抗原の独特の部分は、エピトープと称される。これらのエピトープは、生物を構成する異なる数百万の分子中の独特な抗原のみを識別して結合することができる、特異性の高い相互作用でそれらの抗体に結合する。抗体タグによる抗原の認識は、免疫系の他の部分による攻撃のためである。また、抗体は、たとえば、感染症を引き起こす病原体の一部に結合することによって、直接に標的を中和することができる。
【００２４】
抗体の多種多様な集団は、異なる抗原結合部位（またはパラトープ）をコードする一組の遺伝子セグメントのランダムな組み合わせ、その後の更なる多様性を生み出す抗体遺伝子のこの領域におけるランダムな突然変異によって作り出される。また、抗体遺伝子は、重鎖の基礎を他のものに変え、抗原特異的可変領域を保持する抗体の異なるアイソタイプを生み出す、クラススイッチングと称される過程において再構成される。このことは、単一抗体が、免疫系のいくつかの異なる部分によって、いくつかの異なるアイソタイプで用いられることを可能にする。
【００２５】
本明細書において使用される、用語「抗体（antibodies）」または「抗体（antibody）」は、通常「抗原」と称される標的分子に特異的に結合することができる構造、好ましくはタンパク質またはポリペプチド構造を表す。
【００２６】
抗体は、単一鎖抗体、一本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖｓ）、フラグメント抗原結合領域（Ｆａｂｓ）、リコンビナント抗体、モノクローナル抗体、天然抗体またはアプタマーの抗原結合ドメインを含む融合タンパク質、単一ドメイン抗体（ｓｄａｂｓ）、ＶＨＨ抗体としても知られるナノボディ（ラクダ由来の単一ドメイン抗体）、ＶＮＡＲと呼ばれるサメＩｇＮＡＲ由来単一ドメイン抗体フラグメント、アンチカリン、アプタマー（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、およびそれらの活性成分または断片からなる群から選択されてもよい。
【００２７】
他の好ましい実施形態において、抗体は、天然の抗体、またはＤＮＡもしくはＲＮＡの形態におけるアプタマーのようなアプタマーの抗原結合ドメインを含む融合タンパク質である。
【００２８】
抗体または他の特異的結合分子の文脈において、用語「またはそれらの一部」または「それらの断片」は、抗体または特異的結合分子の特異的な結合部位を構成する、抗体または特異的結合分子の一部を表し、抗体全体または特異的結合分子全体と同一のエピトープに反応することができる、抗体または特異的結合分子の一部と解釈されてもよい。
【００２９】
ヒト抗体またはそれらのフラグメントが、本発明の好ましい実施形態である。好ましくは、ＩｇＧ１重鎖とラムダ軽鎖とを有するＩｇＧ１（たとえば、ＩｇＧ１λ）抗体が有利に用いられてもよい。しかし、カッパまたはラムダ軽鎖に組み合わせた、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤおよびＩｇＥを含む、他のヒト抗体アイソタイプも本発明に包含される。また、動物に由来する抗体の多様なアイソタイプの全ては、本発明において用いることができる。抗体は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖフラグメント、または単一ドメインＶＨＨ、ＶＨもしくはＶＬを含む、全長抗体または抗体の抗原結合フラグメントとすることができる。
【００３０】
用語「シトルリン化エピトープに反応する特異的結合分子」は、ペプチドまたはペプチド核酸またはアプタマーまたは疑似ペプチド構造のような大きな構造の文脈において、シトルリン残基に特異的に反応する特異的結合分子として解釈される。
【００３１】
シトルリンは、通常の翻訳の間にタンパク質に組み込まれないアミノ酸であるが、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）によるアルギニン残基の翻訳後修飾によって生成されてもよい。
【００３２】
シトルリン化は、アルギニン残基をシトルリン残基に翻訳後変換することであり、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）によって触媒される。ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ、ＥＣ３．５．３．１５）酵素は、タンパク質においてアルギニン残基をシトルリン残基に変換することを触媒する。シトルリンについてのtＲＮＡは存在せず、タンパク質中におけるシトルリン残基の存在は、全て翻訳後修飾の結果である。哺乳類（ヒト、マウスおよびラット）における５種のＰＡＤアイソタイプ（ＰＡＤ１〜ＰＡＤ６、「ＰＡＤ４」および「ＰＡＤ５」は同一のアイソタイプに用いられる）は、別個の遺伝子にコードされ、それぞれ同定された（Vossenaar, et al., Bioessays 25, 1106-1118, 2003）。全てのこれらの酵素は、活性についてＣａ２＋の存在に強く依存しており、遊離のＬ−アルギニンを遊離のＬ−シトルリンに変換することはできない。遊離のＬ−アルギニンは、細菌真核生物においては一酸化窒素合成酵素（ＥＣ１．１４．１３．３９）によって、または細菌においてはアルギニンデイミナーゼ（ＥＣ３．５．３．６）によって、遊離のＬ−シトルリンに変換することができる。これらの酵素は、Ｃａ２＋に依存していない。
【００３３】
相同性の高いＰＡＤ酵素の間の最も顕著な相違は、それらの組織特異的な発現である。表皮におけるＰＡＤ１（同義語として、ＰＡＤＩ、ＰＡＤタイプＩ）は、角化エンベロープの再組織化のために重要である、ケラチノサイト分化の最終段階の間におけるケラチン繊維のシトルリン化に関与している。表皮におけるシトルリン化の他の部位は毛包であり、ＰＡＤ３（同義語として、ＰＡＤＩＩＩ、ＰＡＤタイプＩＩＩ）およびその天然基質であるトリコヒアリンを（ＴＨＨ）を含む。ＴＨＨは、毛包内毛根鞘細胞および毛包髄質層、ならびにそれほどではないにせよ他の特殊な上皮の髄質層の主要な構造タンパク質である。ごく最近同定されたＰＡＤアイソタイプ、ＰＡＤ６（同義語としてｅＰＡＤ）は、初期胚発生に重要な役割を果たすマウス卵母細胞の細胞シートにおいて見出された。そのヒトオーソログの発現は、卵巣、精巣、末梢血白血球に制限されることが見出された（Chavanas et al., Gene vol 330; 19-27, 2004）。当初、このＰＡＤアイソタイプは、ｅＰＡＤと称されたが、他のＰＡＤの系統番号に基づいて、このアイソタイプはＰＡＤ６（Vossenaar et al., Bioessays vol 25 1106-1118, 2003）に改名された。最も広く発現するアイソタイプであるＰＡＤ２（同義語として、ＰＡＤＩＩ、ＰＡＤタイプＩＩ、ＰＡＤ−Ｈ１９）は、骨格筋、脳、脾臓、分泌腺およびマクロファージのような多くの異なる組織に存在する。この広範な発現パターンにも関わらず、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）およびビメンチンのみが天然基質として同定されている。多発性硬化症（ＭＳ）の患者では、ＭＢＰに対する自己免疫応答が発生する。ＭＢＰは、ミエリン鞘に豊富なタンパク質であり、そのシトルリン化は中枢神経系の発生中に生じる。ビメンチンのシトルリン化は、カルシウムイオノフォアに誘導される、ヒトおよびマウスにおけるマクロファージのアポトーシスの間に観察され、上述したように、シトルリン化されたビメンチンは、ＲＡ特異的な抗Ｓａ自己抗体の標的であることが示された。全て主に細胞質に局在する上述したＰＡＤｓとは対照的に、ＰＡＤ４アイソタイプ（同義語として、ＰＡＤＩＶ、ＰＡＤタイプＩＶ、ＨＬ−６０ＰＡＤ、ＰＡＤ  Ｖ、ＰＡＤタイプＶ、ＰＡＤＩ４）は核内に存在する。ＰＡＤ４の核局在化シグナルは、タンパク質のＮ末端領域で見出された。ＰＡＤ４は、主に末梢血の顆粒球および単球に発現する。核内におけるＰＡＤ４の基質は、ヒストンコアタンパク質（Ｈ２Ａ、Ｈ３およびＨ４）ならびにリボソームアセンブリ、核細胞質間輸送および中心体の複製に機能する核小体タンパク質であるヌクレオホスミン／Ｂ２３である。
【００３４】
本発明にかかる特異的結合分子は、それぞれ１５ｋＤａおよび１７ｋＤａであるそれらの分子量によって特徴付けられる２つのポリペプチドである、ｐ１５および／またはｐ１７におけるシトルリン化エピトープを対象とする。
【００３５】
このような特異的結合分子は、炎症性疾患の治療または予防に特に適していることが見出された。
【００３６】
本明細書において用いられる、「炎症性条件」または「炎症性疾患」は、好中球の浮腫および浸潤（たとえば、急性炎症反応）、単核球による組織の浮腫、炎症細胞、結合組織細胞およびそれらの細胞性産物による組織破壊、ならびに結合性組織の置換による修復の試行（たとえば、慢性的な炎症反応）のような血管病変によって特徴付けられる任意の数の状態または疾患を表す。
【００３７】
このような状態の代表的な例は、シトルリンに関連する炎症性疾患および自己免疫疾患を含む。シトルリン関連炎症性疾患は、シトルリンが疾患の発症に影響を与える疾患として本明細書において定義される。シトルリンが疾患の発症に影響を与えるか否かは、当分野において利用可能な常用試験を用いて当業者によって容易に決定されてもよい。たとえば、これらの疾患は、罹患した、または疾患に関連する組織におけるシトルリン化タンパク質の異常な量の存在によって特徴付けられてもよい。このことは、ウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡのような免疫学的検査によって達成することができ、罹患した組織は抗原として用いられ、その抗原のシトルリン化は本明細書に記載されたような抗シトルリン抗体を用いて検出されてもよい。
【００３８】
また、当業者は、罹患患者由来の患部組織と健康な組織とにおける、シトルリンの量および種類を比較するためのマススペック分析のようなプロテオミクスアプリケーションを用いることができる。
【００３９】
また、疾患は、ペプチドまたはタンパク質を含むシトルリンに対する免疫応答の存在によって特徴付けられてもよい。これは、Ｔ細胞またはＢ細胞によって媒介される応答のような、体液性または細胞性免疫応答であってもよい。検査のための抗シトルリン抗体は、当分野で記述され、市販されている。
【００４０】
したがって、本発明は、シトルリンに関連する炎症性疾患の、治療または予防における使用のための特異的結合分子に関する。
【００４１】
このような疾患は、たとえば、関節リウマチおよび変形性関節症、多発性硬化症、乾癬性関節炎、乾癬、アルツハイマー病、自己免疫性肝炎、若年性特発性関節炎、脊椎関節症、ダウン症候群、多系統萎縮症、パーキンソン病、ならびにレビー小体型認知症を含む炎症性関節炎である。したがって、本発明は、関節炎、関節リウマチ、変形性関節症、多発性硬化症、乾癬性関節炎、乾癬、アルツハイマー病、自己免疫性肝炎、若年性特発性関節炎、脊椎関節症、ダウン症候群症候群、多系統萎縮症、パーキンソン病およびレビー小体型認知症からなる群から選択される疾患の治療または予防における使用のための特異的結合分子に関する。
【００４２】
特に、本発明は、自己免疫疾患、より具体的には関節リウマチまたは変形性関節症の治療または予防のための特異的結合分子に関する。
【００４３】
多発性硬化症またはＭＳは、ミエリン鞘の自己免疫性破壊によって特徴付けられる中枢神経系の慢性炎症性疾患である。ミエリン鞘の細胞は、約３：１の割合の脂質タンパク質複合体からなる軸索周囲の多重二分子層構造を形成する。２つの主要なタンパク質であるＭＢＰおよびプロテオリピドタンパク質が、タンパク質画分の８５％を占める。ＭＢＰは、高カチオン性タンパク質であり、ホスファチジルセリンのような負に帯電したリン脂質と強い相互作用を形成することができる。健康な成人におけるＭＢＰ分子の約１８％では、６個（１９個中）のアルギニンがシトルリン化される（Wood et al., J Biol Chem, vol264, 5121-5127, 1989, Wood et al., Ann Neurol, vol40, 18-24, 1996）。残りのＭＢＰ分子は、シトルリンを含んでいない。ＭＳ患者において、ＭＢＰ−ｃｉｔ６の割合は全ＭＢＰの４５％に増加する。ＭＢＰ−ｃｉｔ６における正の実効電荷（net positive charge）の減少は、ＭＢＰ分子の部分的なアンフォールディングを引き起こし、リン脂質とのそれらの相互作用を弱める（Boggs et al., J Neurosci Res, vol57, 529-535, 1999, Pritzker et al., Biochemistry, vol39, 5374-5381, 2000）。ＭＢＰ−ｃｉｔ６は、非シトルリン化ＭＢＰよりも迅速に脂質複合体を形成することができるが、形成された複合体は、非シトルリン化ＭＢＰによって形成された複合体の充填された密度ほどではなく形成される（Boggs et al., J Neurosci Res, vol57, 529-535, 1999, Beniac et al., J Struct Biol, vol129, 80-95,2000）。ＭＢＰ−ｃｉｔ６は、非シトルリン化ＭＢＰよりも４倍の速さでカテプシンＤによって分解される（Cao et al., Biochemistry, vol38, 6157-6163, 1999）。急性劇症のＭＳ（マールブルグ型）のまれなケースでは、ＭＢＰの分子の８０％が重度にシトルリン化される(ＭＢＰｃｉｔ１８）（Wood et al., Ann Neurol, vol40, 18-24, 1996）。重度にアンフォールドされたＭＢＰ−ｃｉｔ１８は、通常のＭＢＰよりも４５倍の速度でカテプシンＤによって分解される（Cao et al., Biochemistry, vol38, 6157-6163, 1999）。抗がん剤タキソールの有効成分であるパクリタキセルの臨床試験が、進行中である（O'Connor et al., Ann Neurol, vol46, 470, 1999）。低用量のパクリタキセルは、in vitroにおいてＰＡＤ２によるＭＢＰのシトルリン化を抑制することができる（Pritzker et al., Biochim Biophys Acta, vol1388, 154-160, 1998）。パクリタキセルによる治療は、臨床的な症状を和らげ、損傷した鞘の再ミエリン化を誘導し（Moscarello et al., Mult Scler, vol8, 130138, 2002）、脱ミエリン化疾患における候補因子としてＰＡＤの潜在的重要性を際立たせた（Moscarello et al., J Neurochem, vol81, 335-343, 2002）。
【００４４】
乾癬では、ケラチノサイトが非常に急速に増殖し、約４日間で基底層から表面に移動する。これらの細胞は、厚く、乾燥したパッチまたはプラークに蓄積されるので、皮膚はそれらの細胞を充分に迅速に脱落させることができない。通常のケラチノサイトでは、ケラチンＫ１は、末端の分化の間にＰＡＤ１によってシトルリン化される。この過程は、表皮における通常の角化のプロセスに不可欠である、ケラチンフィラメントをコンパクト化する原因となる。乾癬性高増殖性プラークにおけるケラチノサイトは、シトルリン化ケラチンＫ１を含まない（Ishida-Yamamoto et al., J Invest Dermatol, vol114, 701-705, 2000）。細胞増殖の増加がＰＡＤによる適切なシトルリン化を予防するか、またはＰＡＤの不活性化がケラチノサイトの過剰増殖および蓄積を可能にするのかは明らかではない。メカニズムは不明であるが、乾癬表皮における異常なシトルリン化は明らかにＰＡＤ１に関する。
【００４５】
好ましい実施形態では、本発明にかかる組成物は、水溶液、ゲル、ヒドロゲル、フィルム、ペースト、クリーム、スプレー、軟膏またはラップからなる群から選択される形態である。さらなる実施形態において、上述の方法は、関節内、腹膜内、腹腔内、局所、直腸、静脈内、経口、眼または腫瘍の周辺部の切除から選択される経路によって、本明細書に記載された組成物の投与のために用いられる。
【００４６】
特定の実施形態において、薬学的に許容される担体は、共溶媒溶液、リポソーム、ミセル、液晶、ナノ結晶、ナノ粒子、エマルジョン、微粒子、微小球、ナノスフェア、ナノカプセル、ポリマーまたはポリマー担体、界面活性剤、懸濁化剤、シクロデキストリンまたはアルブミンのような吸着分子などの錯化剤、表面活性粒子およびキレート剤からなる群から選択される少なくとも１つの担体を含む。さらなる実施形態では、多糖類は、ヒアルロン酸およびその誘導体、デキストランおよびその誘導体、セルロースおよびその誘導体（たとえば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、酢酸フタル酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、コハク酸酢酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、キトサンおよびその誘導体、[ベータ]−グルカン、アラビノキシラン、カラギーナン、ペクチン、グリコーゲン、フコイダン、コンドロイチン、デルマタン、ヘパラン、ヘパリン、ペントサン、ケラタン、アルギン酸塩、シクロデキストリンならびにそれらのエステルおよび硫酸塩を含む塩および誘導体を含む。
【００４７】
さらに別の態様において、本発明にかかる方法は、本発明にかかる組成物を標的部位、特に滑膜関節に送達することを含む。
【００４８】
本発明のある特定の実施例では、特異的結合分子は、ｐ１５および／またはｐ１７に結合するモノクローナル抗体である、RhmAb2.102、RhmAb2.108、RhmAb2.109、RhmAb2.110、RhmAb2.111、RhmAb2.112およびRhmAb22.101に競合する。
【００４９】
これらの抗体は、それらの重鎖および軽鎖の一次アミノ酸配列によって本明細書に開示される。表１０を参照。
【００５０】
【表１０】
0005980683.tif 000002
本明細書に開示されたようなモノクローナル抗体と競合する結合分子または抗体は、通常の手順によって選択されてもよい。要するに、本明細書に開示されたような抗原が固体支持体上に固定化されるＥＬＩＳＡのような結合分析が、開発されてもよい。本明細書に開示されるようなモノクローナル抗体は、標識されてもよく、固定化された抗原へのそれらの結合の妨害は、通常の分析によって容易に決定されてもよい。これらの方法およびさらに洗練された他の方法が、当業者に知られており、通常の研究室で規定通りに行うことができる。
【００５１】
特に、分析は、固体支持体上に固定化された配列番号２１、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３７および配列番号３８にかかる抗原性タンパク質の全てを用いて容易に開発されてもよい。RhmAb2.102、RhmAb2.108、RhmAb2.109、RhmAb2.110、RhmAb2.111、RhmAb2.112およびRmmAb22.101からなる群から選択されたモノクローナル抗体は、標識されてもよく、試験抗体の存在下および非存在下において固定化抗原と接触させられてもよい。試験抗体が、結合を妨害する場合、すなわち標識された抗体で得られるいずれかのシグナルを低下させる場合、試験抗体は、標識された抗体の結合と競合すると結論付けてもよい。よって、そのような競合抗体は、本発明の方法における使用のために好適であろう。
【００５２】
したがって、本発明は、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３７および配列番号３８からなる群から選択されるペプチドに特異的に反応する、関節リウマチの治療または予防における使用のための抗体に関する。
【００５３】
モノクローナル抗体RhmAb2.101の可変領域の一次ｍＲＮＡ配列が公開され、表１に示すような受入番号でＥＭＢＬデータベースに供託された。モノクローナル抗体RhmAb2.102、RhmAb2.108、RhmAb2.109、RhmAb2.110、RhmAb2.111およびRhmAb2.112の可変領域の一次配列は、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号３９、配列番号２０、配列番号４１、配列番号４０、配列番号１９、配列番号４３および配列番号４２として本明細書において開示される。
【００５４】
マウスモノクローナル抗体であるRmm22.101およびRmmAb22.102は、ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstra7B, 38124 Braunschweig, GERMANY）に供託されたハイブリドーマに由来し、受け入れられたＤＳＭＺ供託番号は、それぞれACC3031およびACC3032であった。シークエンス後、それらは、配列番号４４および配列番号４５に示される同一のＤＮＡ配列を有することが明らかになった。
【００５５】
したがって、本発明は、配列番号１８、配列番号１７、配列番号２０、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号１９、配列番号４３、配列番号４２、配列番号４４および配列番号４５からなる群から選択される、可変重鎖または軽鎖を含むポリペプチドにも関する。また、本発明は、配列番号１８、配列番号１７、配列番号２０、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号１９、配列番号４３、配列番号４２、配列番号４４および配列番号４５からなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸に関する。また、本発明は、Rmm22.101およびRmmAb22.102に存在するような可変重鎖および軽鎖を含むポリペプチドに関する。
【００５６】
また、本発明は、配列番号４４および配列番号４５に示される、RmmAb22.101およびRmmAb22.102に存在するような可変重鎖および軽鎖にかかるポリペプチドをコードする核酸に関する。
【００５７】
別の好ましい実施形態では、特異的結合分子は、モノクローナル抗体RhmAb2.102、RhmAb2.108、RhmAb2.109、RhmAb2.110、RhmAb2.111およびRhmAb2.112、RmmAb22.101、ならびにRmmAb22.102からなる群から選択される抗体である。
【００５８】
別の好ましい実施形態では、特異的結合分子は、モノクローナル抗体RhmAb2.102、RhmAb2.108、RhmAb2.109、RhmAb2.110、RhmAb2.111およびRhmAb2.112、RmmAb22.101、ならびにRmmAb22.102からなる群から選択される抗体に由来する、または前記モノクローナル抗体から得られるＶＨおよび／またはＶＬドメインを含む。
【００５９】
この文脈において、用語「由来する」または「得られる」は、ＶＨおよび／またはＶＬドメインの一次構造が本明細書に開示されるタンパク質および核酸配列から決定されてもよく、たとえばマウスＶＨまたはＶＬドメインを示すヒト抗体文脈のような、異なる文脈において複製され、再配列されてもよいことを意味する。より詳細には、この点について、用語「由来する」または「得られる」は、特定の抗体におけるＶＨおよび／またはＶＬドメインの特異的結合特性に関する必須の残基が同定され、これらの必須の残基またはそれらの構造的ホモログが他のペプチドの文脈に移されることを意味する。
【００６０】
本発明にかかる特異的結合分子は、２つの方法で本質的に作り出されてもよい。第１に、それらは本明細書に示されるような、抗体およびその配列に由来してもよい。抗体の反応性は、部位特異的突然変異誘発、chainシャフリング、sexual PCR法、または当業者に知られる抗体の導出および最適化のための他の手段によって改良されてもよい。代替的に、特異的結合分子、特に抗体は、本明細書に記載されたような任意の特異的反応性エピトープ、特に、脱イミノ化ヒストン２Ａ、ペプチド１（配列番号２１）および他の特異的反応性ペプチドにパニングすることによって得られてもよい。
【００６１】
当業者は、たとえば、以下の実施例に記載されたように、ｃＤＮＡまたはゲノム配列をクローニングまたは作り出すために本明細書に記載された配列を用いてもよい。ｐｃＤＮＡ３（In Vitrogen）またはそれらの誘導体のような適切な真核生物の発現ベクターにおけるこれらの配列のクローニング、続いて適切な軽鎖と重鎖との組み合せを含むベクターを用いた哺乳類細胞（たとえば、ＣＨＯ細胞）のトランスフェクションは、記載された抗体である、RhmAb2.102、RhmAb2.108、RhmAb2.109、RhmAb2.110、RhmAb2.111およびRhmAb2.112、RmmAb22.101、ならびにRmmAb22.102の発現および分泌をもたらすであろう。また、マウスモノクローナル抗体RmmAb22.101およびRmmAb22.102は、供託されたような、それぞれのハイブリドーマ細胞株（ＤＳＭＺ番号ACC3031およびACC3032）によって、直接発現されてもよく、分泌されてもよい。
【００６２】
また、当業者は、抗体配列の特異的結合ドメインを用いて本明細書に記載されたような特異的結合分子の類似体を作製し、融合タンパク質のようなポリペプチドなどの異なる状況でそれらを発現させてもよい。このことは、当分野でよく知られている。
【００６３】
ヒトおよびマウスのリコンビナント抗シトルリンモノクローナル抗体は、実施例１、１３および１４に記載されたようにして得られた。モノクローナル抗体重鎖RhmAb2.102、RhmAb2.108、RhmAb2.109、RhmAb2.110、RhmAb2.111およびRhmAb2.112は、マウスリーダー配列（配列番号１２）およびヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域（配列番号１４）によって得られた。モノクローナル抗体軽鎖RhmAb2.102、RhmAb2.108、RhmAb2.109、RhmAb2.111およびRhmAb2.112は、マウスリーダー配列（配列番号１２）およびヒトラムダ定常領域（配列番号１６）によって得られた。モノクローナル抗体RhmAb2.110は、マウスリーダー配列（配列番号１２）およびヒトカッパ定常領域（配列番号１１）によって得られた。
【００６４】
マウス抗シトルリンペプチドモノクローナル抗体であるRmmAb13.101、RmmAb13.102およびRmmAb13.103は、商業的供給源から入手した（ModiQuest Research BV Nijmegen、The Netherlands、カタログ番号、MQ13.101、MQ13.102およびMQ13.103）。
【００６５】
抗シトルリン抗体は、実験モデルにおいて試験され、炎症は、マウスに抗コラーゲン抗体を注入することによって誘導された。このモデルは、コラーゲン抗体誘導関節炎（ＣＡＩＡ）として知られている（Nandakumar and Holmdahl, J Immunol Methods, vol304, 126-136, 2005）。抗コラーゲン抗体は、商業的供給源（ModiQuest Research BV  Nijmegen、The Netherlands、カタログ番号、MQ18.101）から入手した。
【００６６】
マウス抗シトルリンモノクローナル抗体である、RmmAb13.101、RmmAb13.102およびRmmAb13.103は、Kuhnら（J.Clin. Invest, vol116, 961-871, 2006）、およびHillら（J Exp Med, vol 205, 967-979, 2008）によっても記載されたようにコラーゲン抗体に誘導される関節炎の重症度を増すことが確認された。このことは、図１ａおよび１ｂに示す。
【００６７】
さらに、ヒト患者におけるいくつかの研究は、シトルリン化エピトープに対する抗体がＲＡの発症を増加させることを示す（Masson-Bessiet al., J.immunol, vol166, 4177-4184, 2001、Vossenaar and van Venrooij, Arthritis Res Ther, vol6, 107-111, 2004）。このことは、同じ実験の「平均関節炎スコア」および「関節炎の発症率」をそれぞれ示す、図１ａおよびｂに示される。
【００６８】
しかし、驚くべきことに、ヒトモノクローナル抗体RhmAb2.102は、ＣＡＩＡモデル実験における関節炎の臨床症状を顕著に軽減させた。
【００６９】
RhmAb2.102で得られた結果は、図１ｃおよび１ｄに示される。RhmAb2.108、RhmAb2.109、RhmAb2.110、RhmAb2.111およびRhmAb2.112で得られた結果は、図９に示されるように、RhmAb2.102に比較してさらに優れていた。
【００７０】
ヒトモノクローナル抗体であるRhmAb2.101は、適用された用量において、関節炎の臨床症状に全く効果を有しなかった。市販の抗体であるRhmAb2.201は、本実験において不適切な抗体のコントロールとして用いられる（ModiQuest Research B.V., カタログ番号、MQR2.201）。この抗体は、シトルリン化エピトープを認識しない。
【００７１】
また、同一の動物実験が、ヒト抗体RhmAb2.108、RhmAb2.109、RhmAb2.110、RhmAb2.111およびRhmAb2.112と同様のエピトープ集団を認識するマウスモノクローナル抗体である、RmmAb22.101およびRmmAb22.102を用いて行われた。
【００７２】
ヒト抗体RhmAb2.108、RhmAb2.109、RhmAb2.110、RhmAb2.111およびRhmAb2.112と同様の結果が、ＣＡＩＡ動物実験において得られた。マウスモノクローナル抗体RmmAb22.101およびRmmAb22.102は、関節炎の臨床症状を消失させた（図１０）。
【００７３】
図１ｅおよび１ｆは、RhmAb2.102のための臨床用量を評価した独立のＣＡＩＡ実験を示す。最大の抑制をもたらした最低用量は、０．５ｍｇＡｂ／マウスであり、これは腹腔内注入における２８ｍｇ／ｋｇに相当する。
【００７４】
これらの実験から、RhmAb2.102、RhmAb2.108、RhmAb2.109、RhmAb2.110、RhmAb2.111およびRhmAb2.112、RmmAb22.101、ならびにRmmAb22.102からなる群から選択されるモノクローナル抗体によって認識される特異的エピトープは、炎症性疾患の治療または予防に重要な役割を果たすと結論付けられる。したがって、これらのエピトープの特異的遮蔽は、特に関節リウマチのような炎症性疾患の効果的な治療となる可能性がある。
【００７５】
これらのモノクローナル抗体によって認識される抗原（antigen）または抗原（antigens）をさらに解析するために、それらは、実施例３に記載されたように、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ酵素）を用いて脱イミノ化された細胞抽出物に対するそれらの反応性について試験された。ｈＰＡＤ２またはｈＰＡＤ４をトランスフェクトされ、翻訳後に脱イミノ化されたＣＯＳ−１ライセートを含むウエスタンブロットは、モノクローナル抗体であるRhmAb2.101およびRhmAb2.102とともにインキュベートされた。RhmAb2.102とともにインキュベートされた細長い一片（strip）のみが、約１５および１７キロダルトンの分子量を有するタンパク質の二量体に反応を示した。
【００７６】
ＷＯ２００４／０７８０９８は、Ｔ細胞の活性化を阻害するための、シトルリン化ペプチド／ＭＨＣクラスＩＩ複合体に対する特異的な抗体を開示している。これらの抗体は、分離されたペプチドまたはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合しないが、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体にのみに結合する。本明細書において開示された抗体は、本明細書に記載されたような個々のペプチドおよびタンパク質を認識するので、ＷＯ２００４／０７８０９８に記載された抗体とは異なる。さらに、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子との間の複合体はイムノブロットの手順において用いられるＳＤＳゲルの還元条件において全く残存することができないので、抗体は、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子との間で複合体を形成することができないウエスタンブロットにおいてポリペプチドを認識する。したがって、本明細書に開示されたような結合分子によって認識されるエピトープは、ＷＯ２００４／０７８０９８に開示された抗体とは異なる。さらに、本明細書に記載されたような抗体は、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体に特異的に反応しない。
【００７７】
上述された実験および考察は、炎症性疾患の臨床症状を防ぐための能力と、ｐ１５およびｐ１７におけるシトルリン化エピトープの反応性との間に明確な相関関係があるという結論に我々を導いた。
【００７８】
実施例５に詳述したように、ヒトモノクローナル抗体RhmAb2.101およびRhmAb2.102を免疫沈降実験において用いた場合も同様のデータが得られた。
【００７９】
ヒトＰＡＤ２およびＰＡＤ４の両者による脱イミノ化ＣＯＳ−１ライセートにおける、RhmAb2.102を用いた免疫沈降は、顕著なｐ１５およびｐ１７タンパク質のバンドを示した。
【００８０】
したがって、ｐ１５およびｐ１７タンパク質の認識強度は、これらの抗体の治療特性に深く関連していると思われる（図１ａ〜ｄ）。
【００８１】
抗体が、ｐ１５またはｐ１７に反応するか否かは、実施例４および５で詳述されたように、免疫沈降またはウエスタンブロット分析を行うことによって容易に確立されてもよい。また、RhmAb2.102、RhmAb2.108、RhmAb2.109、RhmAb2.110、RhmAb2.111およびRhmAb2.112、RmmAb22.101、ならびにRmmAb22.102を用いる競合実験は、脱イミノ化ＣＯＳ−１ライセートを含むウエスタンブロット、またはウエスタンブロットもしくはＥＬＩＳＡにおける精製された脱イミノ化ｐ１５および／もしくはｐ１７タンパク質を用いて行われてもよい。
【００８２】
タンパク質ｐ１５およびｐ１７は、実施例６に詳述されたように、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化時間飛行質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）によってさらに特徴付けられる。アフリカミドリザルのゲノムは完全に配列決定されていないので、我々は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いて見出されたペプチドと相同である他の全ての哺乳類ゲノムデータベースをスクリーニングした。高い相同性を有するタンパク質は、ヒストンであることが判明した。このことは、表３（実施例６）に示される。
【００８３】
したがって、本発明は、炎症性疾患の治療または予防における使用のための、ヒストンにおけるシトルリン化エピトープに特異的に反応する結合分子にも関する。
【００８４】
ＰＡＤの酵素作用によるヒストンのシトルリン化は十分に実証されているので、シトルリン化ヒストンはin vitroにおいて非常に容易に作製されてもよい。このため、これらのシトルリン化ヒストンは、シトルリン化ｐ１５およびｐ１７、すなわちヒストンにおけるエピトープに反応する、ペプチドおよび抗体のような他の特異的結合分子をスクリーニングおよび選択するための酵素結合アッセイにおける基質として用いられてもよい。好ましくは、特異的結合分子は、ｐ１５および／またはｐ１７への結合について、抗体RhmAb2.102、RhmAb2.108、RhmAb2.109、RhmAb2.110、RhmAb2.111およびRhmAb2.112、RmmAb22.101、ならびにRmmAb22.102に競合するものから選択される。
【００８５】
この文書およびその特許請求の範囲において、動詞「含む」およびその語形変化は、以下に続く語が含まれる項目を意味するための非限定的な意味で用いられるが、具体的に記載されていない項目が除外されるものではない。また、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による要素表現は、文脈上明確に１つおよび１つの要素のみが存在することが要求される場合を除き、１つ以上の要素が存在している可能性を除外するものではない。このため、不定冠詞は、「ａ」または「ａｎ」は通常「少なくとも１つの」を意味する。
【００８６】
脱イミノ化ヒストンまたはヒストンのいずれがRhmAb2.102、RhmAb2.108、RhmAb2.109、RhmAb2.110、RhmAb2.111およびRhmAb2.112、RmmAb22.101、ならびにRmmAb22.102の治療効果に関与するかをさらに解析するために、市販のヒストン（Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４）をヒトペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ、ＥＣ３．５．３．１５）酵素（ｈｕＰＡＤ２またはｈｕＰＡＤ４）で脱イミノ化した。脱イミノ化ヒストンと、脱イミノ化されていないヒストンとを、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに塗布し、RhmAb2.101およびRhmAb2.102の連続希釈液とともにインキュベートした。結果を、表６および図２に示す。
【００８７】
図２に示される結果から、脱イミノ化ヒストン２Ａ、ヒストン３およびヒストン４は、抗体医薬であるRhmAb2.102によって認識されるが、RhmAb2.101によって認識されず、または顕著に低い親和性であった（図２ａ、２ｂ）。
【００８８】
さらに、これらの結果は、RhmAb2.102と、RhmAb2.101との間の親和性におけるこの相違が、ヒトＰＡＤ２および／またはＰＡＤ４脱イミノ化Ｈ２Ａと、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒストン３と、ヒトＰＡＤ４および／またはＰＡＤ２脱イミノ化ヒストン４とについて最も大きいことを示す。
【００８９】
これらのデータは、RhmAb2.102が関節炎の臨床症状を完全に消滅させるが、RhmAb2.101が関節炎の臨床症状に全く効果がない、ＣＡＩＡモデル実験における関節炎の臨床症状におけるこれらの抗体の効果とよく相関する（図１ｃおよび図１ｄ）。
【００９０】
したがって、我々は、Ｈ２Ａ／ｐ４およびＨ２Ａ／ｐ２またはその構造的模擬体における脱イミノ化エピトープは、ＲＡの炎症カスケードに重要な役割を果たしていることを示した。Ｈ３／ｐ２、Ｈ４／ｐ２およびＨ４／ｐ４における脱イミノ化エピトープについても同様である。なぜなら、RhmAb2.102は、RhmAb2.101に比較してこれらのヒストンに対する高い親和性を示すためである（図２ａ、２ｂ）。
【００９１】
模擬体は、たとえば、等価な活性の許容程度を有する分子であり、この場合、RhmAb2.101に比較してRhmAb2.102によって高い親和性で認識されるものを含む。
【００９２】
したがって、本発明は、ヒトＰＡＤ４もしくはヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストン２Ａもしくはヒストン４、またはヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ３におけるシトルリン化エピトープに反応する、上述したような特異的結合分子に関する。
【００９３】
RhmAb2.102によって認識される、Ｈ２Ａにおける正確なシトルリン化エピトープをさらに特定するために、ヒストン２Ａの潜在的な脱イミノ化部位を含む、表４に示されるようなビオチン標識化ペプチドを合成した。これらのペプチドを、９６ウェルニュートラアビジンＥＬＩＳＡプレートに塗布し、RhmAb2.101およびRhmAb2.102の連続希釈液とともにインキュベートした。結果を図３に示す。
【００９４】
【表６Ａ】
0005980683.tif 000003
【００９５】
【表６Ｂ】
0005980683.tif 000004
【００９６】
【表７】
0005980683.tif 000005
【００９７】
【表８】
0005980683.tif 000006
ペプチド1（AAASGXGKQGGK：配列番号２１）は、抗体医薬であるRhmAb2.102によって認識されるが、RhmAb2.101によっては認識されないことが観察された（表４および図３ａ、３ｂ）。ペプチド４および６における脱イミノ化エピトープについても同じことが当てはまる（表４）。なぜなら、RhmAb2.102は、RhmAb2.101よりも、これらのペプチドに対する高い親和性を示すためである（図３ａ、３ｂ）。我々は、それとともに、ペプチド１、４および６における、脱イミノ化エピトープまたはそれらの構造的等価物もしくは模擬体がＲＡの炎症カスケードに重要な役割を果たしていることを示した。この抗体の認識パターンは、Ｈ２Ａ／ｐ４およびＨ２Ａ／ｐ２の認識パターンに非常に似ている。したがって、我々は、本発明にかかる特異的結合分子は、ペプチド１、４および６（それぞれ、配列番号２１、配列番号２４および配列番号２６）に対するそれらの反応性によって定義されてもよいと結論付けた。これらの各シトルリン含有ペプチドもしくはそれらの誘導体、そのような個々のペプチドもしくはそのようなペプチドの組み合わせ、または１以上のそのようなペプチド配列を含む構造体は、本発明にかかる抗体のような特異的結合分子を作り出すために個々に用いられてもよい。そのうえ、そのような抗体は、適した反応性について本明細書に開示されたような、任意の他の抗原に対して選択されてもよい。
【００９８】
【表４】
0005980683.tif 000007
ビオチン標識され、シトルリンを含む、フィブリノゲンおよびビメンチンペプチド（表５）についても、抗体医薬との反応性について調べた。ペプチドを９６ウェルニュートラアビジン−ＥＬＩＳＡプレート上に塗布した。続いて、RhmAb2.101、RhmAb2.102の連続希釈液を塗布されたプレートに添加した。結果を表８および図４に示す。
【００９９】
【表５】
0005980683.tif 000008
マウスフィブリノゲンβペプチド（配列番号３７）が、RhmAb2.101およびRhmAb2.102によって認識されることが観察された（図４ａ）。RhmAb2.102は、RhmAb2.101と比較して高い親和性を示した（図４ａ、４ｂ）。さらに、RhmAb2.102のみが、マウスビメンチンペプチドを認識した（実施例９）。上述したペプチド以外でも、ｍｓＦｉｂβ（配列番号３７）およびｍｓＶｉｍ（配列番号３８）ペプチドにおける脱イミノ化エピトープがＲＡの炎症カスケードに重要な役割を果たしている可能性が非常に高い。しかし、それとともに、我々の抗体医薬の抗炎症作用における重要な役割を果たす上で、フィブリノゲンおよびビメンチンにおける他のエピトープも除外されない。
【０１００】
したがって、本発明は、ペプチドｍｓＦｉｂβまたはｍｓＶｉｍ（配列番号３７または配列番号３８）におけるエピトープに特異的に反応する、上述したような特異的結合分子、およびそれらの使用にも関する。
【０１０１】
また、我々は、シトルリン化エピトープが炎症組織で新たに現れることを示した。関節リウマチの実験用マウスモデルにおいて、我々は、ヒトモノクローナル抗体１０２（RhmAb2.102）を用いて、罹患マウスの炎症を起こした前足からシトルリン化ペプチドを免疫沈降可能であることを示すことができた。
【０１０２】
したがって、通常のＣＡＩＡ実験を、０日目に８つの抗コラーゲン抗体（２．８ｍｇ／マウス）の混合物を腹腔内注入したマウス（グループあたり３匹）において行った。３日後、マウスに２５μｇのＬＰＳを含む別の腹腔内注入を行った。採点は上述したように行った。この実験の間、毎日１グループのマウスを犠牲し、足をウエスタンブロット解析および免疫組織化学的手法によってシトルリンの存在について分析した。
【０１０３】
各グループのマウスについて前足を集めて抽出した。免疫沈降（ＩＰ）を、ＩＰ毎に２０マイクログラムのRhmAb2.102を用いてこれらの抽出を行った。沈殿物について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、ウエスタンブロット法によってニトロセルロース膜に転写した。前記ブロットを、第１に全タンパク質を検出するためにポンソーＳで染色した。ポンソーＳ染色は、各ＩＰについて同量の抗体が用いられたことを確かめるために行われる。明白な抗体の重鎖および軽鎖が同量で観察できた。
【０１０４】
続いて、ブロット上に存在するシトルリン残基を、Senshuらに従って化学的に修飾した（Senshu et al, Anal Biochem 203, 94〜100, 1992）。化学的修飾は、その後、シトルリン残基の化学修飾を認識する抗体を用いて可視化されることができる（Senshu et al, Anal Biochem 203, 94〜100, 1992）。脱イミノ化フィブリノゲンは、この実験においてポジティブコントロールとして用いられた。これらの実験のネガティブコントロールとして、抽出物を含まない免疫沈降を用いた。
【０１０５】
４日目からは、５０、１５および１７キロダルトンの分子量を有するタンパク質に対応する位置のブロット上に顕著なバンドが現れた。これらのバンドは、５日目により顕著になり、６日目に最も濃くなった。
【０１０６】
通常の関節炎スコアを有するマウスにおける、実験での関節炎の発症率は１００％であり、６日目に５＋に達した（図５Ａおよび５Ｂ）。沈殿するタンパク質の量は、時間経過にともなって増加し、４日目〜６日目に可視化される。RhmAb2.102のシトルリン特異性および抗化学修飾化シトルリン抗体を用いて得られたブロットにおけるシグナルの存在に基づいて、我々は、ＣＡＩＡにさらされたマウスが、それらの炎症化関節において検出可能なシトルリン量を有すると結論付けることができる。
【０１０７】
上述されたＣＡＩＡ実験において、マウスの足における炎症が、未だ存在しないか、非常に軽度のときに、抗シトルリン抗体を抗コラーゲン抗体注入後３日目に注入した。このことは、臨床症状の発生を予防したので、炎症の治療、特に予防処置において有用である。
【０１０８】
したがって、我々は、RhmAb2.102も一度生じた臨床症状を治すことができるのかについて実験を必要とした。このことは、全てのマウスの四足全ての平均関節炎スコアが約４の任意スコアに達した抗コラーゲン注射後７日目に動物を処置することによって行った。図６Ａおよび６Ｂに示されるように、RhmAb2.102は、観察される腫脹を消滅させるのではなく、存在する炎症／腫脹を安定させた。動物を、偽薬およびRhmAb2.102で処置したマウスの間において炎症スコアが同程度であった後である３５日目までの間追跡調査した（図６Ｂおよび実施例１０）。図６Ａは、各群の四足の全ての平均炎症スコアを示し、一方図６Ｂは、３５日目において組織学的分析に用いられた動物の右後足の平均炎症スコアを示す。
【０１０９】
７日目におけるRhmAb2.102処置が、永久的な関節の損傷からマウスを保護することができるか否かについて調べるために、全ての動物における右後足の組織学的検査を行った（図７）。図７Ａは、実験３５日目における実験群の間の右後足の肉眼で確認できる炎症が類似していたことを示す。しかし、最も驚くべきことに、関節びらんについての既知パラメータの全てが低下した。RhmAb2.102を用いて７日目に処置された実験群において、炎症細胞の流入（Ｄ）、軟骨びらん（Ｂ）、軟骨ＰＧの喪失（Ｅ）、軟骨細胞死（Ｆ）および骨のびらん（Ｃ）のスコアの著しい低下が観察された場合、RhmAb2.102は、炎症の間の関節損傷を予防することに関して強力な治療可能性を秘めていることが示される（実施例１０）。したがって、本発明は、そのような処置を必要とする患者に対して、本明細書に記載されたような結合分子を投与することによって、関節の損傷を予防または治療するための方法に関する。
【０１１０】
さらに、５日目、６日目および７日目において、RhmAb2.102処置の各治療効果を調べるためにＣＡＩＡ実験を行った（図８）。この実験において、RhmAb2.102は、炎症部位に迅速に抗体を送達するために静脈内に注入された。この実験には、３日目に予防処置を施した群およびコントロール群が含められた。実験手順は、実施例１０のように行った。唯一の違いとして、３日目、５日目および６日目にマウスあたり１ｍｇのRhmAb2.102を注入した。予期されたように、３日目におけるRhmAb2.102は、炎症反応を抑制した。５日目、６日目および７日目におけるRhmAb2.102の静脈内注入によるマウスの処置は、図６にも見られるように炎症を安定させた（図８）。炎症の徴候は減少しなかったが、関節びらんの全てのパラメータが低下したことは注目に値する。このことは、関節びらんと、炎症とが、別々に処置されてもよい２つの別の実体であることを示す。
【０１１１】
RhmAb2.102に優先的に結合する他の脱イミノ化タンパク質を質量分析によって同定した。さらに、RhmAb2.102に優先的に結合するが、RhmAb2.101に結合しないか、またはあまり結合しない脱イミノ化タンパク質も、追加の質量分析によって同定した。ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ２９３細胞）ライセートを、RhmAb2.101またはRhmAb2.102で免疫沈降し（実施例１１）、high throughput nano-LC system coupled to an advanced, high-performance LTQ Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass spectrometer （nLC LTQ FTMS ULTRA）を行った（実施例１２）。Exponentially Modified Protein Abundace Index (emPAI)と組み合わせた、その超高質量分解能、質量精度および感度の算出は、RhmAb2.102に（優先的に）結合する脱イミノ化タンパク質を同定することを可能にする。このことは、表７（実施例１１および１２）に示される。
【０１１２】
このため、本発明は、表７に示されるような任意のタンパク質またはポリペプチドに特異的に反応する、炎症性疾患の予防または治療における使用のための結合分子にも関する。
【０１１３】
要約すると、我々は、ｐ１５、ｐ１７からなる群から選択される分子におけるエピトープ、具体的には、ヒトＰＡＤ４および／またはＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストン２Ａにおけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン４、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ４、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ３、または表９のタンパク質からなる群から選択されるタンパク質におけるシトルリン化エピトープ、より具体的には、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３７および配列番号３８にかかるペプチドに特異的に反応する、本明細書に明記されたような炎症性疾患の治療または予防における使用のための結合分子を本明細書に示した。所定の結合分子が、上述された分子に特異的に反応しているか否かは、ｐ１５もしくはｐ１７におけるエピトープ、または上述された任意のシトルリン化エピトープへの結合について、RhmAb2.102、RhmAb2.108、RhmAb2.109、RhmAb2.110、RhmAb2.111およびRhmAb2.112、RmmAb22.101、ならびにRmmAb22.102からなる群から選択される抗体と競合する結合分子の能力を分析することによって容易に決定されてもよい。
【０１１４】
本発明にかかる結合組成物の効果を示したことで、炎症性疾患は免疫応答を誘発することによっても治療または予防されてもよく、本発明にかかる特異的結合分子は患者自身の体において（in vivo）作り出されてもよいことが当業者に明らかである。このような免疫応答は、炎症性疾患の発症を防ぐため（予防、予防ワクチン）、または炎症性疾患の転帰を改善もしくは軽減、すなわち治療するために発生させられてもよい。
【０１１５】
したがって、本発明は、in vivoにおける免疫応答を誘発することによって炎症性疾患を予防または治療するための方法にも関し、ｐ１５、ｐ１７におけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ４および／またはＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストン２Ａにおけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ４および／またはＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストン４、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ３におけるシトルリン化エピトープ、ならびに配列番号２１、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３７および配列番号３８にかかるペプチドからなる群から選択されるエピトープに反応する特異的結合分子が作り出される。
【０１１６】
本発明にかかるワクチンまたは治療は、本発明にかかる結合分子に特異的に反応するシトルリン化エピトープを効果的に含んでもよい。より詳細には、シトルリン化エピトープは、ヒトＰＡＤ４および／もしくはＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストン２Ａ、ヒトＰＡＤ４および／もしくはＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストン４、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ３、または配列番号２１、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３７および配列番号３８からなる群から選択されるペプチドにおける、シトルリン化エピトープであってもよい。
【０１１７】
したがって、多数のシトルリン関連炎症性疾患が、治療または予防されてもよい。このため、本発明は、上述されたような方法にも関し、前記炎症性疾患は、自己免疫疾患、関節炎、関節リウマチ、変形性関節症、多発性硬化症、乾癬性関節炎、乾癬、アルツハイマー病、自己免疫性肝炎、若年性特発性関節炎、脊椎関節症、ダウン症候群、多系統萎縮症、パーキンソン病およびレビー小体型認知症からなる群から選択される。関節リウマチなどの自己免疫疾患の予防または治療が特に好ましい。
【０１１８】
本発明の実施形態は、in vivoにおける免疫応答に関するので、好ましい特異的結合分子は抗体である。
【０１１９】
当業者は、本発明において抗体を使用することがＴ細胞活性化または補体活性化のような免疫システムを活性化させない、または完全には活性化させないという利点があるという事実に気付くであろう。したがって、本発明がヒトに実行される場合、ヒトＩｇＧ４またはＩｇＧ２のＦｃ部分を用いることが好ましい。
【０１２０】
また、本明細書において言及されるようなペプチドおよびタンパク質は、炎症性疾患、より好ましくは関節リウマチを診断するために、特異的な抗体の検出について抗原として用いられてもよい。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】関節炎症状の重症度についてモノクローナル抗体の効果を検査するために、コラーゲン抗体誘導関節炎（ＣＡＩＡ）モデルを使用した。平均関節炎スコア（図１ａ、１ｃ、および１ｅ）および関節炎の発生率（図１ｂ、１ｄ、および１ｆ）を示した。５〜６匹のマウス群について抗コラーゲン抗体を腹腔内注入することによって０日目に処置した。図１ａおよび図１ｂに示される実験において使用されるマウスは、１．６ｍｇの抗コラーゲン抗体混合物の投与を受け、一方、図１ｃ−ｆに示される実験において使用されるマウスは、２．４ｍｇの投与を受けた。抗シトルリン抗体またはコントロール抗体（RhmAb2.201）とともにＬＰＳ（２５μｇ／マウス）を腹腔内投与によって３日目に投与した。グラフに記載されている場合を除いて、全ての抗体を１ｍｇ／マウスで投与した。１３日目まで毎日動物を採点した。
【図２】ｈｕＰＡＤ２またはｈｕＰＡＤ４を用いて脱イミノ化したヒトリコンビナントヒストン（Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４）についてａ）RhmAb2.101およびｂ）RhmAb2.102の親和性について検査するために、酵素標識免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用した。脱イミノ化されたヒストンと同様に脱イミノ化されていないヒストンを９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（０．３μｇ／ウェル）上に固定化した。ＣＦＣ−１およびＣＦＣ−０を同じ濃度でコートし、特異的な抗シトルリン抗体の反応性について、それぞれ陽性コントロールおよび陰性コントロールとし、コーティングコントロールとした。コートされていないウェルを抗体の特異的結合について試験するために使用した。コートされたウェルを、１０ｕｇ／ウェルから０．０００１２８μｇ／ウェルに至るまでの範囲の連続抗体希釈液を用いて室温で１時間（Ｚ軸）インキュベートした。結合した抗シトルリン抗体の検出は、ウサギ抗ヒトＨＲＰ（１：２０００）を用いて室温で１時間インキュベートし、続いて、ＴＭＢ基質とともにインキュベートすることによって行った。得られたＯＤ（ｙ軸）は、抗体結合の尺度である。Ｈ１＝リコンビナントヒストン１、Ｈ１／ｐ２＝ｈｕＰＡＤ２リコンビナントヒストン１、Ｈ１／ｐ４＝ｈｕＰＡＤ４リコンビナントヒストン１など（ｘ軸）。
【図３】ヒトヒストンＨ２Ａに由来するペプチドを含むシトルリンに対する、ａ）RhmAb2.101およびｂ）RhmAb2.102の親和性試験に酵素標識免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いた。ヒストン２Ａに由来するペプチドを含む、ビオチンおよびシトルリンは、ニュートラアビジンでコートされた９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（０．３μg／ウェル）上に固定化した。ＣＦＣ−１およびＣＦＣ−０を、同じ濃度でコートし、特異的な抗シトルリン抗体の反応性について、それぞれ陽性コントロールおよび陰性コントロールとし、コーティングコントロールとした。コートされていないウェルを、各抗体の結合について試験するために使用した。コートされたウェルを、１０ｕｇ／ウェルから０．０００１２８μｇ／ウェルに至るまでの範囲の連続抗体希釈液を用いて室温で１時間（Ｚ軸）インキュベートした。結合した抗シトルリン抗体の検出は、ウサギ抗ヒトＨＲＰ（１：２０００）を用いて室温で１時間インキュベートし、続いて、ＴＭＢ基質とともにインキュベートすることによって行った。得られたＯＤ（ｙ軸）は、抗体結合の尺度である。
【図４】フィブリノゲンおよびビメンチンに由来するペプチドを含むシトルリンに対する、ａ）RhmAb2.101およびｂ）RhmAb2.102の親和性試験に酵素標識免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いた。フィブリノゲンおよびビメンチンに由来するペプチドを含む、ビオチンおよびシトルリンは、ニュートラアビジンでコートされた９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（０．３μg／ウェル）上に固定化した。ＣＦＣ−１およびＣＦＣ−０を同じ濃度でコートし、特異的な抗シトルリン抗体の反応性について、それぞれ陽性コントロールおよび陰性コントロールとし、コーティングコントロールとした。コートされていないウェルを、各抗体の結合について試験するために使用した。結合した抗シトルリン抗体の検出は、ウサギ抗ヒトＨＲＰ（１：２０００）を用いて室温で１時間インキュベートし、続いて、ＴＭＢ基質とともインキュベートすることによって行った。得られたＯＤ（ｙ軸）は、抗体結合の尺度である。
【図５】コラーゲン抗体誘導関節炎（ＣＡＩＡ）モデルを、足におけるシトルリンの出現を調べるために使用した。３匹のマウスの群について、０日目に腹腔内投与によって２．８ｍｇの抗コラーゲン抗体を用いて処置し、続いて３日目にＬＰＳ（２５μｇ／マウス）を追加で腹腔内に注入した。平均関節炎スコアおよび関節炎の発症率は、図５Ａおよび５Ｂにそれぞれ示した。
【図６】抗コラーゲン抗体注入後７日目にRhmAb2.102を投与した場合のRhmAb2.102の治療効果を試験するために、コラーゲン抗体誘導関節炎（ＣＡＩＡ）モデルを使用した。全ての足の平均関節炎スコア（図６Ａ）および右後足の平均関節炎スコア（図６Ｂ）を示す。５匹のマウスの群について、０日目に２．８ｍｇの抗コラーゲン抗体を用いて腹腔内注入よって処置した。ＬＰＳ（２５μｇ／マウス）を、３日目に腹腔内注入によって投与し、RhmAb2.102（１ｍｇ／マウス）または偽薬を７日目に同一の経路によって注入した。動物について３５日目まで毎日採点した。RhmAb2.102は存在する炎症を少なくとも安定化することが観察された。
【図７】ヘマトキシリン／エオシン染色およびサフラニンＯ染色された、RhmAb2.102または偽薬を用いて７日目に処置した全てのＣＡＩＡ動物の右後足の組織スライドで組織学的分析を行った（図７）。軟骨びらん（Ｂ）、骨びらん（Ｃ）、炎症細胞の流入（Ｄ）、軟骨ＰＧの喪失（Ｅ）、および軟骨細胞死（Ｆ）のパラメータは、染色された組織スライドにおいて採点された（０〜３の任意の尺度）。図７Ａは、実験最終日（３５日目）における実験群の間における右後足の肉眼で確認できる炎症を示す。各点は単一の動物を表す。水平な線は実験群内での平均スコアを示す。RhmAb2.102の注入は、永続的な関節の損傷からマウスを保護すると結論付けることができる。
【図８】抗コラーゲン抗体の注入後、３日後、５日後、６日後および７日後にRhmAb2.102を与えた場合のRhmAb2.102の治療効果を試験するために、コラーゲン抗体誘導関節炎（ＣＡＩＡ）モデルを用いた。５匹のマウスの群は、０日目に２．８ｍｇの抗コラーゲン抗体を腹腔内に注入することによって処置した。ＬＰＳ（２５μg／マウス）を腹腔内注入によって３日目に投与した。RhmAb2.102（１ｍｇ／マウス）を、３日目、５日目、６日目または７日目に静脈内投与した。動物について１９日目まで毎日採点した。グラフは、各実験群の平均関節炎スコアを示す。RhmAb2.102は、治療開始時のレベルに比較して炎症レベルを少なくとも安定化すると再度結論付けることができる。菱形：コントロール、丸：７日目、白丸：６日目、四角：５日目、および三角：３日目
【図９】抗コラーゲン抗体を注入した後、３日目に与えた場合におけるRhmAb2.102、RhmAb2.108、RhmAb2.109、RhmAb2.110、RhmAb2.111およびRhmAb2.112の抗炎症作用を試験するために、コラーゲン抗体誘導関節炎（ＣＡＩＡ）モデルを使用した。全ての足の平均関節炎スコアを示した。３匹のマウスの群を、０日目に２．８ｍｇの抗コラーゲン抗体を腹腔内注入することによって処置した。ＬＰＳ（２５μg／マウス）を、腹腔内注入によって３日目に投与し、RhmAb2.102、RhmAb2.108、RhmAb2.109、RhmAb2.110、RhmAb2.111およびRhmAb2.112（１ｍｇ／マウス）または偽薬を同日に静脈内注入によって注入した。動物を、１４日目まで毎日採点した。
【０１２２】
全ての新規の抗体RhmAb2.108、RhmAb2.109、RhmAb2.110、RhmAb2.111およびRhmAb2.112は、RhmAb2.102よりも高い抗炎症作用を示した。
【図１０】RhmAb2.102、RmmAb22.101およびRmmAb22.102抗体の抗炎症作用を試験するために、コラーゲン抗体誘導関節炎（ＣＡＩＡ）モデルを使用した。３匹のマウスの群を、０日目に２．８ｍｇの抗コラーゲン抗体を腹腔内に注入することによって処置した。ＬＰＳ（２５μg／マウス）と、RhmAb2.102、RmmAb22.101およびRmmAb22.102（６ｍｇ／マウス）、および偽薬とを腹腔内注入によって３日目に投与した。全ての動物について１０日目まで毎日炎症について採点した。
【０１２３】
全ての試験された抗体RhmAb2.102、RmmAb22.101およびRmmAb22.102は、マウスの足における炎症からマウスを保護した。RhmAb2.102およびRmmAb22.101についてのみデータを示す。
【図１１】ｈｕＰＡＤ２またはｈｕＰＡＤ４で脱イミノ化されたヒトリコンビナントヒストン（Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４）について、Ａ）RhmAb2.102、Ｂ）RhmAb2.108、Ｃ）RhmAb2.109、Ｄ）RhmAb2.110、Ｅ）RhmAb2.111、Ｆ）RhmAb2.112、Ｇ）RmmAb22.101、およびＨ）RmmAb22.102の親和性を試験するために、酵素標識免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いた。脱イミノ化されたヒストンおよびイミノ化されていないヒストンと、ＢＳＡとを９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上に固定化した（０．３μｇ／ウェル）。ＣＦＣ−１、ＣＦＣ−０、配列番号２１を、同一の濃度でコートし、特異的抗シトルリン反応性について、それぞれ陽性コントロールおよび陰性コントロールとして、ならびにコーティングコントロールとした。コートされていないウェルを、抗体の特異的結合を試験するために用いた。コートされたウェルを、２．５μｇ／ウェルから０．００４μｇ／ウェルに至る範囲で抗体希釈系列とともに室温で１時間インキュベートした（Ｚ軸）。抗シトルリン抗体結合の検出は、ウサギ抗ヒトＨＲＰ（１：２０００）とともにウェルを室温で１時間インキュベートし、続いてＴＭＢ基質とともにインキュベートすることによって行なった。得られたＯＤ（ｙ軸）は、抗体結合の測定値である。Ｈ１＝リコンビナントヒストン１、Ｈ１／ｐ２＝ｈｕＰＡＤ２リコンビナントヒストン１、Ｈ１／ｐ４＝ｈｕＰＡＤ４リコンビナントヒストン１など（ｘ軸）。
【実施例】
【０１２４】
実施例１：ヒト型およびマウス型リコンビナントモノクローナル抗体。
ＲＡ患者のシトルリン化抗原に対するモノクローナル抗体は、記載されたようにファージディスプレイ法によって最初に選択した（Raats et al., J Reumatology, vol30, 1696-711,2003）。簡潔には、３人のＲＡ患者の自己抗体レパートリを、Ｂ細胞レパートリから分離し、抗体フラグメントライブラリを作り出すために用いた。これらのライブラリについて、ＷＯ９８／２２５０３に記載されたように、シトルリン化環状ペプチドＣＦＣ１−ｃｙｃに対する４段階の親和性選択を行った。抗体のクローンは、ＣＦＣ１−ｃｙｃへの強い反応性と、シトルリン化されていないＣＦＣ０−ｃｙｃへの反応性の欠如とに基づいて選択した（ＷＯ９８/２２５０３）。
【０１２５】
Raatsらによって記載された配列をコードする抗体（J Reumatology, vol30、1696-711, 2003）を、Stemmerら（Gene, vol164, 49-53, 1995）に従って合成し、続いてヒト型およびマウス型抗体アイソタイプをコードする哺乳類発現ベクターにクローニングした。ヒト抗体は、アイソタイプＩｇＧ１ラムダであり、RhmAb2.101およびRhmAb2.102と命名した。
【０１２６】
RhmAb2.101をStemmerらのプロトコル（Gene, vol164, 49-53, 1995）に従って、クローンＲａ３の配列に基づいて（Raats et al., J Reumatology, vol30, 1696-711, 2003）合成した。RhmAb2.101は、生殖系列ファミリーλ１ｂに由来するＶＬを組み合わせた、生殖系列ファミリー３〜２１に由来するＶＨから構成される。
【０１２７】
RhmAb2.102は、Stemmerら（Gene, vol164, 49-53, 1995）に従って合成した。RhmAb2.102は、配列番号９によってコードされる免疫グロブリン軽鎖に結合した、配列番号８によってコードされた免疫グロブリン重鎖を含む。配列番号８によってコードされる免疫グロブリン重鎖は、配列番号１２にかかるマウスリーダーグロブリン、続いて配列番号１３にかかる可変抗体重鎖、続いて配列番号１４にかかる免疫グロブリン定常ドメインヒトＩｇＧ１を含む。配列番号９によってコードされる免疫グロブリン軽鎖は、配列番号１２にかかるマウスリーダーグロブリン、続いて配列番号１５にかかる可変抗体軽鎖、続いて配列番号１６にかかる免疫グロブリンヒトラムダ定常ドメインを含む。
【０１２８】
モノクローナル抗体RhmAb2.101の可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）の一次ｍＲＮＡ配列を公開し、表１に示されるような受入番号でＥＭＢＬデータベースに供託した。全長ヒト型抗体配列を、抗体RhmAb2.102について記載されたように、同一のリーダーおよび定常ヒトドメインを用いて作り出した。
【０１２９】
【表１】
0005980683.tif 000009
【０１３０】
シトルリン化フィブリノゲンに対するコントロール抗体である、RmmAb13.101、RmmAb13.102およびRmmAb13.103、ならびにヒトＵ１−７０ｋタンパク質のアポトーシス性の４０ｋＤ切断産物に対するRhmAb2.201は、Modiquest Research BV, Schoutstraat 58, 6525 XV Nijmegen, The Netherlands から市販されている(カタログ番号MQ13.101、MQ13.102、MQ13.103およびMQR2.201）。
【０１３１】
実施例２：炎症の実験モデル
ModiQuest Research B.V. から市販されているコラーゲン抗体誘導関節炎（ＣＡＩＡ）マウスモデル(カタログ番号: MQ18.101）を、マウスに関節炎を誘導するために製造規格に従って、用いた（http://www.modiquestresearch.nl/shop/files/18.101-50MG_2007.08.22.pdf）。その目的のために、０日目に８つの抗コラーゲン抗体の混合物を８週齢のＤＢＪ／Ｊ１マウス（５〜６マウス／群）に腹腔内投与した。（図１ａおよび１ｂにおいて用いたマウスは、１．６ｍｇの抗コラーゲン抗体混合物の投与を受け、一方、図１ｃ〜ｆにおいて用いたマウスは２．４ｍｇの投与を受けた）。３日目において、マウスは、１ｍｇの抗シトルリン抗体を混合した２５μｇＬＰＳを含む、他の腹腔内注入を受けた（特に記載のない限り）。ＬＰＳは、炎症を引き起こす。動物実験の１３日目まで、マウスはそれらの足における炎症の兆候について毎日採点された。採点は、表２に従って行った。各動物の最大関節炎スコアは８である。
【０１３２】
マウスモノクローナル抗シトルリン抗体である、RmmAb13.101、RmmAb13.102およびRmmAb13.103について、コラーゲン抗体が誘発する関節炎の重症度を強化することができることを確認した。これらの抗体の混合物は、さらに顕著に応答した。このことは、本質的に抗シトルリン抗体が関節炎を強化／誘導することができる早期の結果を確立する（Kuhn et al,. J. Clin. Invest, vol116, 961-871, 2006; Hill et al., J Exp Med, vol205, 967-979, 2008）。これらの結果は、同一の実験でそれぞれ「平均関節炎スコア」および「関節炎の発症率」を示す、図１ａおよびｂに示される。
【０１３３】
ヒト型モノクローナル抗体RhmAb2.102は、実験的なＣＡＩＡモデルにおける関節炎の臨床症状を軽減または欠失させたが、RhmAb2.101は用量試験において全く効果が無かった（図１ｃおよび１ｄ）。
【０１３４】
【表２】
0005980683.tif 000010
【０１３５】
抗コラーゲン抗体注入後３日目における、抗シトルリン抗体を投与するための決定は、約４日目に実験的に誘導される関節炎を有するマウスの足にシトルリン化エピトープが現れることを示す、上述された実験データに基づく。
【０１３６】
実施例３：脱イミノ化細胞抽出物の調製、ＳＤＳページ電気泳動およびウエスタンブロッティング。
【０１３７】
ＣＯＳ−１細胞（８・１０５）を、Ｖ−ｋｉｔとともにAMAXA nucleofection装置（プログラムＤ−００５）を用いて、２μｇのｈｕＰＡＤ２またはｈｕＰＡＤ４発現ベクターで一過性にトランスフェクトし、Ｔ７５における２０ｍｌ培地中に細胞を播種した。
【０１３８】
７２時間後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン処理し、スピンダウンし、１５μｌの氷冷溶解バッファ（ｐＨ７．４の２０ｍＭトリス、１０ｍＭβ-メルカプトエタノール、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、プロテアーゼ阻害剤）に再懸濁した。
【０１３９】
細胞サンプルを氷上で１５秒間に４回音波処理した。ライセートを５分間３．０００ｒｐｍで遠心し、上清を清浄なチューブに移した。細胞ライセートを、それぞれ１０ｍＭおよび５ｍＭの最終濃度で、ＣａＣｌ２およびＤＴＥを追加して３７℃で３０分〜２時間脱イミノ化した。脱イミノ化された細胞ライセートは、−２０℃で保存した。
【０１４０】
１０倍のサンプルバッファ（ｐＨ６．８の０．２５Ｍトリス、８％ＳＤＳ、３５％グリセロール、２．５％β-メルカプトエタノール、ブロモフェノールブルー）を脱イミノ化された細胞ライセートに添加し、５分間ボイルした。約５・１０５細胞に対応するライセートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％ゲル）の各レーンにロードして分離し、続いてHybond C extraニトロセルロース膜（Amersham Biosciences）にエレクトロブロッティングした。ブロッティングおよびローディングは、ポンソーＳ染色によって確認した。
【０１４１】
実施例４：治療用抗シトルリン抗体は、ｐ１５およびｐ１７を認識する。
実施例３において作製されたようなブロットを、細長い形に切断し、全ての非特異的部位をブロックするために、室温で２時間、５％（w/v）低脂肪粉ミルクのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（洗浄液）でブロックした。それから、ブロットを、洗浄バッファで５回５分間洗浄し、細長い一片をさらに２０μｇの抗シトルリン抗体を含む４ｍｌの洗浄バッファを用いて室温で１時間インキュベートした。その後、細長い一片を、洗浄バッファで１０分間５回洗浄し、洗浄バッファ中のペルオキシダーゼ共役化ウサギ抗ヒトＩｇＧ（DAKO）（１：２０００）とともにインキュベートした（室温で１時間）。その後、細長い一片を、洗浄バッファで１０分間３回洗浄し、続いて全ての未結合抗体を洗浄するためにＰＢＳで２回洗浄した。
【０１４２】
免疫反応性バンドは、化学発光基質（PIERCE）を用いて可視化し、Kodak BioMax XARオートラジオグラフィーフィルム（Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA）に感光させた。
【０１４３】
RhmAb2.102とともにインキュベートされた細長い一片は、約１５および１７キロダルトンの分子量を有する２量体タンパク質への反応性を示した。
【０１４４】
実施例５：抗原の免疫沈降
免疫沈降のために、３０μＬのプロテインＡ−セファロースファストフロー（Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden）を、３３０μＬの細胞ライセートに添加し、４℃で２時間回転させながらインキュベートした。続いて、セファロースビーズに免疫結合したタンパク質を、ＩＰＰ１５０（ｐＨ８の１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ＮＰ４０、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で４回洗浄した。２倍のサンプルバッファ（１００ｍｍＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８の２００ｍｍジチオスレイトール、４％ＳＤＳ、０．２％ブロモフェノールブルー、２０％グリセロール）をビーズに添加し、タンパク質について１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ゲルを、室温で一晩、染色溶液（１０％ｗ／ｖ硫酸アンモニウム、２％ｗ／ｖリン酸（８５％）、０．１％ｗ／ｖＣＢＢ  Ｇ−２５０、２０％ｖ／ｖメタノール）中で穏やかに揺らしながら染色した。全ての染色トレイをメタノールの蒸発を防ぐためにパラフィルムで密封した。翌日、ゲルをミリＱ水（milli-Q water）中で所望の染色が見えるまでインキュベートすることによって、染色されていないバックグラウンドを脱染色した。ゲルの画像を撮影後、脱染色液（ミリＱ水）を２〜３回置換した。
【０１４５】
ヒトＰＡＤ２およびＰＡＤ４脱イミノ化ＣＯＳ-１ライセートの両者における、RhmAb2.102を用いた免疫沈降は、RhmAb2.101沈降において検出できないか、またはほとんど検出できない、ｐ１５およびｐ１７タンパク質のバンドを表す。したがって、ｐ１５およびｐ１７タンパク質の認識率は、これらの抗体の治療特性とよく相関する（図１ａ〜ｄ）。
【０１４６】
実施例６：ｐ１５およびＰ１７の質量分析。
実施例３のＳＤＳ−ｐａｇｅゲルのｐ１５およびｐ１７のバンドをゲルから切り出し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析した。簡潔には、切り出したゲルの一部を、５０μｌの２５ｍＭ重炭酸アンモニウムで２回洗浄し、各洗浄工程について３０分間インキュベートした。上述したように、３０％ｖ／ｖアセトニトリルを添加して１５分間の洗浄を繰り返した。全ての液体を取り除き、２５μｌの２５ｍＭ重炭酸アンモニウム＋２５μｌのアセトニトリルを添加し、１５分間インキュベートした。再度、全ての液体を除去し、ゲルを５０μｌのアセトニトリルとともに３０分間インキュベートした。全ての液体を取り除き、一部を３７℃で２時間インキュベートした。脱水後、ゲル片を再度膨潤させるために、５μｌのトリプシン溶液（２５ｍＭ重炭酸アンモニウム／５ｍＭｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド中における、〜１５ｎｇのトリプシン／μｌ）を添加し、氷上で１時間インキュベートした。余分なトリプシン溶液を除去し、ゲル片を５μｌの２５ｍＭ重炭酸アンモニウム／５ｍＭｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドとともに３７℃で１４時間インキュベートした。ペプチドを、４μｌの５０％アセトニトリル／０．５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／ｎオクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドとともに室温で１時間インキュベートすることによって抽出した。サンプルを、超音波水槽中において２分間超音波処理し、液体を新しいチューブに移し、抽出工程を繰り返した。サンプルを真空遠心機で乾燥させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを行った。
【０１４７】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析で同定された全ての断片は、ヒストンタンパク質（表３）に起因した。
【０１４８】
【表３】
0005980683.tif 000011
【０１４９】
実施例７：治療用抗シトルリン抗体は、Ｈ２Ａ／ｐ４を認識する。
ヒト型リコンビナントヒストンＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４（１００μｇ）を、５３．４ｍＵのｈｕＰＡＤ２またはｈｕＰＡＤ４とともに、またはこれらを含まずに３７℃で３時間インキュベートした。脱イミノ化されたヒストンと、脱イミノ化されていないヒストンとを４℃で一晩インキュベートすることによって、９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート上にコート（０．３μｇ／ウェル）した。ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）で５回洗浄し、室温（ＲＴ）でＰＢＳ−Ｔ＋１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とともに１時間インキュベートすることによってブロックした。ＰＢＳ−Ｔでさらに５回洗浄後、ＰＢＳ−Ｔ＋１％ＢＳＡ中のRhmAb2.101またはRhmAb2.102の１０μｇ／ウェルの濃度から開始する連続希釈液とともに室温で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、ウサギ抗ヒト抗体ＨＲＰ（１：２０００）とともに室温で１時間インキュベートし、続いてＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、ＰＢＳで３回の洗浄工程を行った。２ＭＨ２ＳＯ４との反応を停止する前に、RhmAb2.101とともにインキュベートしたウェルを、ＴＭＢ基質とともに１５分間インキュベートし、RhmAb2.102とともにインキュベートしたウェルを、ＴＭＢ基質とともに１０分間インキュベートした。吸光度を４５０ｎｍで測定し、使用された抗体の親和性の尺度とした。
【０１５０】
実施例８：治療用抗シトルリン抗体は、ペプチド１を認識する。
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを４℃で一晩インキュベートすることによってニュートラアビジンでコートした（０．１μｇ／ウェル）。ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）とともに５回洗浄し、ＰＢＳ−Ｔ＋１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とともに室温で１時間インキュベートすることによってブロックした。ＰＢＳ−Ｔでさらに５回洗浄した後、ウェルを、ヒストン由来シトルリンおよびビオチン含有ペプチド（０．３μｇ／ウェル）とともに室温で１時間インキュベートした。さらにＰＢＳ−Ｔで５回洗浄した後、ウェルを、ＰＢＳ−Ｔ＋１％ＢＳＡ中の１０μｇ／ウェルの濃度から開始するRhmAb2.101、RhmAb2.102またはRhmAb2.104の連続希釈液とともに１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、ＰＢＳで３回洗浄工程を行い、続いて、ウサギ抗ヒトＨＲＰ（１：２０００）とともに室温で１時間インキュベートした。ウェルを、２ＭＨ２ＳＯ４を用いて反応を停止する前にＴＭＢ基質とともに５分間インキュベートした。吸光度を４５０ｎｍで測定し、使用される抗体の親和性の尺度とした。
【０１５１】
実施例９：治療用抗シトルリン抗体は、フィブリノゲンおよびビメンチン由来シトルリンペプチドを認識する。
【０１５２】
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、４℃で一晩インキュベートすることによってニュートラアビジンでコートした（０．１μｇ／ウェル）。ウェルをＰＢＳ-Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ−Ｔ）で５回洗浄し、ＰＢＳ−Ｔ＋１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて室温で１時間インキュベートすることによってブロックした。ＰＢＳ−Ｔでさらに５回洗浄した後、ウェルをフィブリノゲンおよびビメンチン由来シトルリンおよびビオチン含有ペプチド（０．３μｇ／ウェル）とともに室温で１時間インキュベートした。さらにＰＢＳ−Ｔで５回洗浄した後、ウェルを、ＰＢＳ−Ｔ＋１％ＢＳＡ中の１０μｇ／ウェルの濃度から開始するRhmAb2.101またはRhmAb2.102の連続希釈液とともに１時間インキュベートした。ウサギ抗ヒトＨＲＰ（１：２０００）とともに室温で１時間インキュベートし、続いてウェルをＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、ＰＢＳで３回洗浄工程を行った、。ウェルを、２ＭＨ２ＳＯ４を用いて反応を停止する前にＴＭＢ基質とともに５分間インキュベートした。吸光度を４５０ｎｍで測定し、使用される抗体の親和性の尺度とした。
【０１５３】
実施例１０：RhmAb2.102の治療可能性
ModiQuest Research B.V.から市販されているコラーゲン抗体誘導関節炎（ＣＡＩＡ）マウスモデル(カタログ番号: MQ18.101）を、マウスにおいて関節炎を誘導するため製造規格に従って用いた（http://www.modiquestresearch.nl/shop/files/18.101-50MG%20_2007.08.22.pdf）。その目的のために、０日目に８つの抗コラーゲン抗体の混合物を８週齢のＤＢＪ／Ｊ１雄マウス（マウス５匹／群）の腹腔内に投与した（２．８ｍｇ／マウス）。３日目、マウスは２５μｇのＬＰＳを含む、他の腹腔内投与を受けた。ＬＰＳは、炎症を引き起こす。平均関節炎スコアが約４になった７日目において（図６Ａ）、１群について１ｍｇのRhmAb2.102を含む静脈内注入を行った。一方、他の群は、偽薬を含む静脈内注入を受けた。
【０１５４】
動物の足における炎症症状について毎日採点した。採点は、表２に従って行った。動物あたりの最大関節炎スコアは８である。RhmAb2.102は炎症を安定させた（図６Ａ）。
【０１５５】
全ての右後足を組織学的分析のために用いた。組織を４％ホルムアルデヒドで４日間固定し、５％ギ酸で脱灰し、続いて脱水し、パラフィン包埋した。７μｍの標準正面セクションを、SuperFrostスライド（Menzel-Glaser, Braunschweig, Germany）にマウントした。ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を関節の炎症を調べるために行った（細胞の流入、図７Ｄ）。関節における炎症の重症度を、０〜３のスケール（０＝細胞なし、１＝軽度の細胞充実性、２＝中程度の細胞充実性、３＝最大細胞充実性）で採点した。図７Ａは、３５日目における肉眼で確認できる炎症を示す。軟骨基質からのプロテオグリカン（ＰＧ）の喪失を検討するために（図７Ｅ）、サフラニンＯ（ＳＯ）染色し、続いてファストグリーンで対比染色しした。完全に軟骨が染色された（通常）から軟骨が染色されない（完全なＰＧｓ喪失）までの範囲である０〜３の任意のスケールを用いてＰＧの喪失を測定した。軟骨細胞死（図７Ｆ）を、軟骨細胞核の損失無しから完全に軟骨表面が空洞であるまでの０〜３の範囲のスケールで採点した。軟骨および骨びらん（図７ＢおよびＣ）を、損傷無しから軟骨または骨の構造の完全な損失までの、スケール０〜３の範囲で類別した。関節における病理組織学的変化を７０μｍ離れた関節の５つの準連続切片において採点した。採点は、実験条件について既知の知識なしにブラインドで行った。
【０１５６】
群間における右後足の肉眼で観察できる炎症は３５日目において同じであったが（図６Ａおよび７Ａ）、炎症性細胞流入（図７Ｄ）、軟骨の浸食（図７Ｂ）、軟骨ＰＧの喪失（図７Ｅ）、軟骨細胞死（図７Ｆ）および骨の浸食（図７Ｃ）の関節炎についての任意のパラメータを調べた場合、コントロール群と比較してRhmAb2.102の投与を受けた実験群において著しい減少が観察された。この結果は、RhmAb2.102の治療可能性を強く支持する。
【０１５７】
実施例１１：ｈｕＰＡＤ４脱イミノ化ＨＥＫ２９３細胞抽出物の調製およびRhmAb2.101またはRhmAb2.102を用いた免疫沈降。
【０１５８】
ＨＥＫ２９３細胞を回収し、ＰＢＳで１回洗浄し、スピンダウンし、５．１０５細胞を１５μｌの氷冷溶解バッファ（ｐＨ７．４の２０ｍＭトリス、１０ｍＭβ-メルカプトエタノール、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、プロテアーゼ阻害剤）中に再懸濁した。
【０１５９】
細胞サンプルを氷上で１５秒間に４回音波処理した。ライセートを３．０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を清浄なチューブに移した。細胞ライセートを２ｍｇのタンパク質あたり１ＵのヒトＰＡＤ４（ModiQuestResearch B.V.;カタログ番号: MQ16.203）、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、および５ｍＭ  ＤＴＴを添加することにより３７℃で２時間脱イミノ化した。
【０１６０】
脱イミノ化ＨＥＫ２９３ライセートにＳＤＳ−Ｐａｇｅ（１２．５％ゲル）電気泳動、続いてウエスタンブロッティングを行うことによって、ライセートの脱イミノ化を検証した。ウエスタンブロッティングは、抗体RhmAb2.101またはRhmAb2.102を用いて免疫染色し、陽性であった。無関係な抗体を用いて処理したブロットは、全く染色が認められなかった。
【０１６１】
その後、抗体RhmAb2.101またはRhmAb2.102を用いて脱イミノ化ＨＥＫ２９３細胞ライセートについて免疫沈降（ＩＰ）を行った。簡潔には、３０μｌのプロテインＡセファロースファストフローを、１ｍｌのＩＰＰ５００（ｐＨ８．０の１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ＮＰ４０および０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄し、２０μｇのRhmAb2.101または２０μｇのRhmAb2.102に結合させ、結合させないものをネガティブコントロールとした。プロテインＡセファロースビーズ／抗体混合物を一定の回転のもと室温で１時間インキュベートした。１ｍｌのＩＰＰ５００を用いてビーズを３回洗浄し、１ｍｌのＩＰＰ１５０（ｐＨ８．０の１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ＮＰ４０、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で１回洗浄し、続いて３００μｌの脱イミノ化ＨＥＫ２９３細胞ライセートとともに一定の回転のもと、室温で２時間インキュベートした。ＨＥＫ２９３細胞のＩＰ手順が成功したか否か決定するために、少量のビーズをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に使用し、その後ビーズを１ｍｌのＩＰＰ１５０で３回洗浄した。RhmAb2.101、RhmAb2.102およびコントロールビーズにおける免疫沈降タンパク質を、５０μｌの抽出バッファ（ｐＨ３．０の１００ｍＭナトリウムクエン酸）を用いて抽出し、ｐＨ９．０４の１Ｍトリス／ＨＣｌを１０μｌ用いて中和し、nLC LTQ FTMS ULTRA質量分析法（実施例１２）まで−２０℃で保存した。
【０１６２】
実施例１２：RhmAb2.101およびRhmAb2.102によって免疫沈降させたｈｕＰＡＤ４脱イミノ化ＨＥＫ２９３細胞タンパク質の質量分析。
【０１６３】
免疫沈降されたタンパク質からＰＥＧを取り除くために、それらを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードし、短時間泳動した。実施例６において記載されたように、タンパク質についてゲルの切り出し、およびゲル内トリプシン消化を行った。サンプルについてnLC LTQ FTMS ULTRA質量分析を実行する前にそれらを５０倍に希釈した。
【０１６４】
ペプチドおよびタンパク質の同定は、ホモサピエンス分類のNCBInr_20081022データベースを用いて検索プログラムMascotによってデータから抽出した。以下の修飾を検索において許可した。システイン（Ｃ）のカルバミドメチル化（固定）、メチオニン（Ｍ）の酸化（可変）、ならにびアスパラギン（Ｎ）、アルギニン（Ｒ）およびグルタミン（Ｑ）の脱アミノ化（可変）。脱イミノ化は、検索ツールとして使用することができなかった。脱アミノ化および脱イミノ化は、修飾されていないアルギニンと比較した場合に、両者は１ダルトンの質量差をもたらすのでこの問題は除去することができる。
【０１６５】
タンパク質の特性の検証を社内で開発したスクリプトによって行った。簡潔には、ソフトウェアは、独特に同定されたペプチド配列、ペプチドの同一の組を共有するクラスタタンパク質、および以下の条件を有するタンパク質の検証に基づいてタンパク質の特性を分類する。
【０１６６】
１本のペプチドを有するタンパク質は、＞４９のペプチドスコアを有していなければならない。
【０１６７】
１本以上のペプチドを有するタンパク質は、＞２９のペプチドスコアを有していなければならない。
【０１６８】
検証基準の使用について、ペプチドは３つの全てのサンプルで同定された（サンプル１：RhmAb2.101を用いて沈殿させたＨＥＫ２９３細胞、サンプル２：Rhm2.102を用いて沈殿させたＨＥＫ２９３細胞、サンプル３：空ビーズを用いて沈殿させたＨＥＫ２９３細胞）。
【０１６９】
emPAI（Exponentially Modified Protein Abundance Index）を全ての検証タンパク質について算出した。emPAIは、データベースの検索結果に一致するペプチドによるタンパク質範囲に基づいて、混合物中の、おおよその、標識のない、タンパク質の相対的定量を提供する。この手法は、（選択的に）RhmAb2.102に結合する脱イミノ化タンパク質を同定することを可能にする。このことを表９に示す。
【０１７０】
【表９−１】
0005980683.tif 000012
【０１７１】
【表９−２】
0005980683.tif 000013
【０１７２】
実施例１３：抗炎症抗体のファミリー産出／選択
ヒト由来のｓｃＦｖライブラリを、Raatsら（２００３）に記載された方法と同様に、ヒトヒストン２Ａ、ヒストン４、ペプチド１（AAASGXGKQGGK：配列番号２１）、およびＣＦＣ−１ペプチドのＰＡＤ２−またはＰＡＤ４−脱イミノ化形態に対してパニングした（Raats, J.M.H., Wijnen, E.W, Pruijin, G.J.M., Van den Hoogen, F.H.M., and W.J. van Verooij. 2003. J.Rheum. 30, 1696-1711）。
【０１７３】
ＣＦＣ−１ならびに／またはペプチド１（AAASGXGKQGGK：配列番号２１）ならびに／またはＰＡＤ脱イミノ化ヒストン２ａおよび／もしくはヒストン４とのシトルリン依存の反応性を示す、選択された抗体は、シトルリン化タンパク質および／もしくはそれらに由来するペプチドのアレイに対する反応性（実施例１２、表９）と、ＰＡＤ２およびＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストンアイソフォームに対する反応性と、脱イミノ化ヒトヒストン由来ペプチドに対する反応性とについてスクリーニングした。付随して、ＲＡ患者に由来するＰＡＤ２およびＰＡＤ４脱イミノ化ヒト細胞抽出物および関節液に免疫沈降を行った。
【０１７４】
続いて、ｐ１５および／もしくはｐ１７の免疫沈降されたバンドである抗体、ならびに／またはシトルリン化エピトープ（ＰＡＤ２およびＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストンアイソフォーム、および／もしくはＣＦＣ−１、および／またはペプチド１（AAASGXGKQGGK、配列番号２１）、および／もしくは表９に挙げられたタンパク質に由来するシトルリン化エピトープ）に対するＥＬＩＳＡ反応性プロファイルを有する抗体を、ヒトＩｇＧ１フォーマットにクローン化した。本明細書に記載されたように、ＣＡＩＡマウスモデルにおける、それらの予防的および治療的抗炎症可能性について全長のヒトＩｇＧ抗体を試験した。
【０１７５】
このスクリーニングの手順では、高頻度でＣＡＩＡマウスモデルにおける、予防的および／または治療的抗炎症可能性を有する抗体を得た。
【０１７６】
上述の方法に従って選択される新規抗体の例は、RhmAb2.108、RhmAb2.109、RhmAb2.110、RhmAb2.111およびRhmAb2.112であり、本明細書において、配列番号１７、配列番号１８、配列番号３９、配列番号２０、配列番号４１、配列番号４０、配列番号１９、配列番号４３、配列番号４２に開示される。配列番号１０によってコードされるRhmAb2.110免疫グロブリン軽鎖は、配列番号１２にかかるマウスリーダーグロブリン、続いて配列番号４１にかかる可変抗体軽鎖、続いて配列番号１１にかかる免疫グロブリンヒトカッパ定常ドメインを含む。
【０１７７】
その後、RhmAb2.102と比較して、RhmAb2.108、RhmAb2.109、RhmAb2.110、RhmAb2.111およびRhmAb2.112の抗炎症性作用を試験するために、コラーゲン抗体誘導関節炎（ＣＡＩＡ）マウスモデルを用いた。この目的のために、全ての抗体は、ＨＥＫ２９３細胞において一過性に産生させた。ＤＢＡ／Ｊマウスの３匹の群を、０日目に２．８ｍｇの抗コラーゲン抗体（MQ18.101）の腹腔内投与によって処置した。ＬＰＳ（２５μｇ／マウス）と、RhmAb2.108、RhmAb2.109、RhmAb2.110、RhmAb2.111、RhmAb2.112およびRhmAb2.102（１ｍｇ／マウス）、ならびに偽薬とを、３日目に腹腔内注入によって投与した。全ての動物について、１０日目まで毎日炎症について採点した。
【０１７８】
本実験における全ての新規に作り出された抗体は、RhmAb2.102、RhmAb2.1109、RhmAb2.110と比較して、より優れた抗炎症反応を示し、完全に炎症を消失させたが、MhmAb2.112は、ほぼ消失させ、RhmAb2.111と、rhmAb2.108とは、実験動物における炎症の兆候を強く減少させた。図９。
【０１７９】
実施例１４：マウスモノクローナル抗体。
本発明にかかるペプチドを含む合成されたシトルリンに対する抗体は、ＤＢＡ／Ｊ１マウスに産生させた。免疫工程開始後１２５日目に、血清試料を採取し、シトルリン特異的抗原反応を分析した。全てのマウスは、試験した時点において、特異的抗原特異的な血清価を示した。
【０１８０】
ハイブリドーマ細胞株を作製するために、最後の追加免疫後、脾臓を解剖し、脾臓から脾細胞を採取し、ModiQuest B.V.手順に従って、マウスミエローマ細胞株（ＮＳ−1）と融合させた。ハイブリドーマ上清における抗体特異性は、シトルリン含有抗原と、非シトルリン化等価物とにおいて評価した。
【０１８１】
このことによって、それぞれRmmAb22.101およびRmmAb22.102、配列番号４４および配列番号４５を産生する、ハイブリドーマクローン（ＤＳＭＺ受理番号ACC3031およびACC3032）がもたらされた。
【０１８２】
続いて、RhmAb2.102と比較して、RmmAb22.101およびRmmAb22.102の抗炎症作用を試験するために、コラーゲン抗体誘導関節炎（ＣＡＩＡ）モデルを用いた。ＤＢＡ／Ｊ１マウスの３匹の群を、２．８ｍｇの抗コラーゲン抗体（MQ18.101）の腹腔内注入によって０日目に処置した。ＬＰＳ（２５μｇ／マウス）と、RmmAb22.101、RmmAb22.102およびRhmAb2.102（６ｍｇ／マウス）、ならびに偽薬とを、３日目に腹腔内注入によって投与した。全ての動物について、１０日目まで毎日炎症について採点した。
【０１８３】
RhmAb2.102、RmmAb22.101およびRmmAb22.102抗体は、マウスの足における炎症からマウスを完全に保護した。図１０。
【０１８４】
実施例１５：新規の治療用抗シトルリン抗体は、RhmAb2.102と比較して、シトルリン化エピトープへの同様の認識パターンを示す。
【０１８５】
実施例７および８に記載された実験と同様に、新たに作り出された抗体RhmAb2.108、RhmAb2.109、RhmAb2.110、RhmAb2.111、RhmAb2.112、RmmAb22.101およびRmmAb22.102について、RhmAb2.102と比較した、様々な脱イミノ化標的における、それらの反応性をＥＬＩＳＡで分析した。
【０１８６】
ヒト型リコンビナントヒストンＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４（１００μｇ）を、実施例７に記載されたように脱イミノ化した。
【０１８７】
脱イミノ化されたヒストンと、脱イミノ化されていないヒストンとを、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにコートし（０．３μｇ／ウェル）、４℃で一晩インキュベートした。
【０１８８】
また、次に脱イミノ化ヒストン抗体を、一組のビオチン化ペプチドにおいて試験した。シトルリン化形態と、非シトルリン化形態との両者について試験した。ペプチドのコーティングは、実施例８に記載されたように行った。
【０１８９】
全てのコートしたウェルを、ＰＢＳ-Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）で５回洗浄し、ＰＢＳ−Ｔ＋１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とともに室温（ＲＴ）で１時間インキュベートすることによってブロックした。さらにＰＢＳ−Ｔで５回洗浄した後、ウェルを、２．５μｇ／ウェルの濃度から開始する、ＰＢＳ−Ｔ＋１％ＢＳＡ中の抗体の連続希釈液ととも室温で１時間インキュベートした。ウェルを、ＰＢＳ-Ｔで５回洗浄し、ウサギ抗ヒトＨＲＰ（１：２０００）とともに室温で１時間インキュベートし、続いてＰＢＳ-Ｔで５回洗浄し、ＰＢＳで３回洗浄工程を行った。２ＭＨ２ＳＯ４で反応を停止する前に、ＴＭＢ基質で１０分間染色した。４５０ｎｍで吸光度を測定し、用いられる抗体の親和性の尺度とした。このことは、全ての治療用抗体が、治療用抗体RhmAb2.102と比較して、類似性の高い染色パターンを有することを明らかに示した。マウスモノクローナル抗体のみが、Ｃｆｃ−１ペプチドに反応性を示さない。全ての治療用抗体は、配列番号２１にかかるペプチドと、ヒストン２Ａ／ｐ２、ヒストン２Ａ／ｐ４およびヒストン４／ｐ２との非常に高い反応性を有し、ヒストン３／ｐ２との極めて小さい反応性を示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ】
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【配列表】
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