(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）配列番号５７および配列番号７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ１、配列番号５８および配列番号１４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ２、および配列番号５９のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ３を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域；ならびに
（ｉｉ）配列番号６０のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ１、配列番号６１のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ２、および配列番号６２のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ３を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域
を含んでなる、ヒトＥｒｂＢ３に結合する単離抗体。
【請求項２】
前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号５７および配列番号７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ１、配列番号５８のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ２、ならびに配列番号５９のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ３を含んでなり、
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号６０のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ１、配列番号６１のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ２、および配列番号６２のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ３を含んでなる、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号５７および配列番号７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ１、配列番号１４８のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ２、および配列番号５９のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ３を含んでなり、
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号６０のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ１、配列番号６１のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ２、および配列番号６２のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ３を含んでなる、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記ＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列またはヒト化フレームワーク配列の間に挿入される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
（ａ）配列番号１５４のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号１６８のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域；
（ｂ）配列番号１５４のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号１６６のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域；
（ｃ）配列番号１５２のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号１６８のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域；および
（ｄ）配列番号１５２のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号１６６のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域；
からなる群から選択される、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなる、ヒトＥｒｂＢ３に結合する単離抗体。
【請求項６】
前記免疫グロブリン重鎖可変領域が配列番号１５４のアミノ酸配列を含んでなり、前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が配列番号１６８のアミノ酸配列を含んでなる、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
前記免疫グロブリン重鎖可変領域が配列番号１５４のアミノ酸配列を含んでなり、前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が配列番号１６６のアミノ酸配列を含んでなる、請求項５に記載の抗体。
【請求項８】
前記免疫グロブリン重鎖可変領域が配列番号１５２のアミノ酸配列を含んでなり、前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が配列番号１６８のアミノ酸配列を含んでなる、請求項５に記載の抗体。
【請求項９】
前記免疫グロブリン重鎖可変領域が配列番号１５２のアミノ酸配列を含んでなり、前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が配列番号１６６のアミノ酸配列を含んでなる、請求項５に記載の抗体。
【請求項１０】
（ａ）配列番号１９０のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖と、配列番号２０６のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖；
（ｂ）配列番号１９０のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖と、配列番号２０４のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖；
（ｃ）配列番号１８８のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖と、配列番号２０６のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖；および
（ｄ）配列番号１８８のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖と、配列番号２０４のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖；
からなる群から選択される、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含んでなる、ヒトＥｒｂＢ３に結合する単離抗体。
【請求項１１】
前記免疫グロブリン重鎖が配列番号１９０のアミノ酸配列を含んでなり、前記免疫グロブリン軽鎖が配列番号２０６のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
前記免疫グロブリン重鎖が配列番号１９０のアミノ酸配列を含んでなり、前記免疫グロブリン軽鎖が配列番号２０４のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１３】
前記免疫グロブリン重鎖が配列番号１８８のアミノ酸配列を含んでなり、前記免疫グロブリン軽鎖が配列番号２０６のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１４】
前記免疫グロブリン重鎖が配列番号１８８のアミノ酸配列を含んでなり、前記免疫グロブリン軽鎖が配列番号２０４のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１５】
前記抗体が、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１６】
表面プラズモン共鳴による測定で、２００ｐＭ以下のＫＤを有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の有効量の抗体を含んでなる、ヒト腫瘍細胞の増殖を阻害または低下させるための組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の有効量の抗体を含んでなる、ヒトにおいて腫瘍成長を阻害または低下させるための組成物。
【請求項１９】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の有効量の抗体を含んでなる、ヒトにおいて癌を治療するための組成物であって、前記組成物は、癌の治療を必要とするヒトに投与されることを特徴とする、組成物。
【請求項２０】
前記癌が、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、皮膚癌、腎臓癌、頭頸部癌、およびシュワン細胞腫からなる群より選択される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記癌が、乳癌、肺癌および膵臓癌からなる群より選択される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の免疫グロブリン重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列および請求項１〜１４のいずれか一項に記載の免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸。
【請求項２３】
請求項２２に記載の核酸を含んでなる発現ベクター。
【請求項２４】
請求項２３に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項２５】
（ａ）請求項２４に記載の宿主細胞が免疫グロブリン重鎖可変領域を含んでなるポリペプチドおよび免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを発現する条件下で、前記宿主細胞を培養し、それによって抗体または前記抗体の抗原結合性断片を生成するステップと；
（ｂ）前記抗体または前記抗体の抗原結合性断片を精製するステップ
を含んでなる、ヒトＥｒｂＢ３に結合する抗体または前記抗体の抗原結合性断片を生成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、２０１０年４月９日に出願された米国仮特許出願第６１／３２２，７１２号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
本発明の技術分野は、分子生物学、免疫学、および腫瘍学である。より具体的には、本分野は、ヒトＥｒｂＢ３／ＨＥＲ３に結合するヒト化抗体である。
【背景技術】
【０００３】
ＨＥＲ３／ｃ−ＥｒｂＢ３（本明細書ではＥｒｂＢ３と称される）は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーのメンバーである。ＥｒｂＢ３は、ニューレグリン／ヘレグリン（ＮＲＧ／ＨＲＧ）と結合する。ＥＧＦＲファミリーの受容体は、細胞内チロシンキナーゼドメインがある１回膜貫通型受容体である。ＥＧＦＲファミリーの他のメンバー、すなわちＥＧＦＲ／ＨＥＲ１／ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２、およびＨＥＲ４／ＥｒｂＢ４が、それぞれチロシンキナーゼ活性を有する一方、ＥｒｂＢ３はチロシンキナーゼ活性がわずかまたは皆無であり、したがって「キナーゼ切れ」を起こしている。
【０００４】
ＥＧＦＲファミリーの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、４つのドメインを含有している。ドメイン１および３（ドメインＬ１およびＬ２としてもまた知られている）は、リガンド結合に関与する。システインに富むドメイン２および４（ドメインＣ１およびＣ２としてもまた知られている）は、受容体パートナーとの二量体化に関与する。リガンド結合に際して、ＥＣＤは構造変化を起こす。受容体の係留（不活性）コンフォメーションを維持するドメイン２および４の相互作用は解除され、伸長（活性）コンフォメーションになる。伸長コンフォメーションは、他の受容体パートナーとの二量体化を好む。ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２は、この原則の唯一の例外であり、すなわちＨｅｒ２−ＥＣＤは恒常的に伸長コンフォメーションにある。ＨＥＲ２のリガンドは、これまで同定されていない。
【０００５】
ＥｒｂＢ３は固有のキナーゼ活性を欠いているので、それは別の活性チロシンキナーゼ受容体と二量化して、チロシンリン酸化によって活性化されなくてはならない。二量体化は、例えばＥｒｂＢ３およびＥＧＦＲ／ＨＥＲ１／ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２、またはＨＥＲ４／ＥｒｂＢ４などの２種の異なる受容体間で生じ得る（ヘテロ二量体化）。最近、ＥｒｂＢ３はＭＥＴとも二量化することが示された。別のチロシンキナーゼ受容体と結合すると、ＥｒｂＢ３は細胞内ドメインの中の少なくとも９個のチロシン残基のリン酸化によって、活性化され、次にＥｒｂＢ３は、アダプターにまたは下流シグナル伝達分子に迅速に結合する。ＥｒｂＢ３リン酸化チロシン残基の内６個は、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩＫ３）のｐ８５サブユニットと直接結合し、それはＰＩ３Ｋ／Ａｋｔａｘｉｓによって制御される細胞生存経路の活性化をもたらす。ＥｒｂＢ３の無制御の二量体化および／または無制御のリン酸化によるＥｒｂＢ３の構成的活性化は、特定の癌をもたらし得る。
【０００６】
ＥｒｂＢ３の過剰発現は、様々な癌腫（例えば乳癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、および頭頸部癌）における予後不良と結びついている。ＥｒｂＢ３の過剰発現はまた、肺癌、胃癌、および結腸直腸癌における局所からの遠隔転移、および前立腺癌における骨浸潤とも関連がある（非特許文献１）。ＥｒｂＢ３の過剰発現は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）および頭頸部癌におけるＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤による治療、乳癌におけるＨｅｒ２阻害剤による治療、および膵臓癌における放射線療法による治療をはじめとする、いくつかの癌療法に対する抵抗性と関係している。さらにＥｒｂＢ３のリガンドであるＮＲＧの過剰発現は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤療法に対する抵抗性ともまた関係している。Ｃｈｅｎらは、ＮＲＧ機能を阻害して、乳癌および卵巣癌細胞に対する成長阻害活性を示す、抗ＥｒｂＢ３モノクローナル抗体の使用について述べている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｉｔｈａｎａｎｄａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２００８）１５：４１３
【非特許文献２】Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９６）７１：７６２０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
治療薬として使用し得る、改善された抗ＥｒｂＢ３抗体に対する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ヒトＥｒｂＢ３と特異的に結合する抗体ファミリーの発見に基づく。抗体は、ヒトＥｒｂＢ３と特異的に結合するＣＤＲに基づく、ＥｒｂＢ３結合部位を含有する。治療薬として使用される場合、抗体は例えばヒト化されて改変され、ヒト患者に投与した際の免疫応答が低下または排除される。
【００１０】
本明細書で開示される抗体は、ヒトＥｒｂＢ３の活性化を妨げまたは阻害する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＥｒｂＢ３が、例えばＮＲＧ／ＨＲＧなどのリガンドに結合するのを妨げ、それによってＥｒｂＢ３の生物学的活性を中和する。別の実施形態では、抗ＥｒｂＢ３抗体はＥｒｂＢ３の二量体化を阻害し、それによってＥｒｂＢ３の生物学的活性を中和する。本明細書で開示される抗体を使用して、生体外または生体内で腫瘍細胞の増殖を阻害し得る。ヒト癌患者（またはマウスモデルなどの動物モデル）に投与されると、抗体はヒト患者（または動物モデル）において腫瘍成長を阻害しまたは低下させる。
【００１１】
本発明のこれらのおよびその他の態様および利点は、以下の図、詳細な説明、および特許請求の範囲によって例証される。本明細書の用法では、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、制限がないことを意味し、言及される例は非限定的である。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
（ａ）（ｉ）配列番号５７（２４Ｃ０５）および配列番号７５（２４Ｃ０５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ１、配列番号５８（２４Ｃ０５）および配列番号１４８（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  Ｎ６２Ｓ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ２、および配列番号５９（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ３を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域；
（ｉｉ）配列番号６０（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ１、配列番号６１（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ２、および配列番号６２（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ３を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域、および
（ｂ）（ｉ）配列番号５（０４Ｄ０１）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ１、配列番号６（０４Ｄ０１）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ２、および配列番号７（０４Ｄ０１）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ３を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域；および
（ｉｉ）配列番号８（０４Ｄ０１）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ１、配列番号９（０４Ｄ０１）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ２、および配列番号１０（０４Ｄ０１）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ３を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域；
（ｃ）（ｉ）配列番号１５（０９Ｄ０３）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ１、配列番号１６（０９Ｄ０３）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ２、および配列番号１７（０９Ｄ０３）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ３を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域；および
ｉｉ）配列番号１８（０９Ｄ０３）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ１、配列番号１９（０９Ｄ０３）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ２、および配列番号２０（０９Ｄ０３）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ３を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域；
（ｄ）（ｉ）配列番号２５（１１Ｇ０１）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ１、配列番号２６（１１Ｇ０１）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ２、および配列番号２７（１１Ｇ０１）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ３を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域；および
（ｉｉ）配列番号２８（１１Ｇ０１）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ１、配列番号９（１１Ｇ０１）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ２、および配列番号２９（１１Ｇ０１）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ３を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域；
（ｅ）（ｉ）配列番号３４（１２Ａ０７）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ１、配列番号３５（１２Ａ０７）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ２、および配列番号３６（１２Ａ０７）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ３を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域；および
（ｉｉ）配列番号８（１２Ａ０７）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ１、配列番号９（１２Ａ０７）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ２、および配列番号１０（１２Ａ０７）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ３を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域；
ｆ）（ｉ）配列番号４１（１８Ｈ０２）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ１、配列番号４２（１８Ｈ０２）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ２、および配列番号４３（１８Ｈ０２）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ３を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域；および
（ｉｉ）配列番号４４（１８Ｈ０２）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ１、配列番号４５（１８Ｈ０２）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ２、および配列番号４６（１８Ｈ０２）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ３を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域；および
（ｇ）（ｉ）配列番号５１（２２Ａ０２）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ１、配列番号５２（２２Ａ０２）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ２、および配列番号３６（２２Ａ０２）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ３を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域；および
（ｉｉ）配列番号８（２２Ａ０２）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ１、配列番号９（２２Ａ０２）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ２、および配列番号１０（２２Ａ０２）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ３含んでなる、免疫グロブリン軽鎖可変領域からなる群から選択される、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなる、ヒトＥｒｂＢ３に結合する単離抗体。
（項目２）
上記免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号５７（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ１、配列番号５８（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ２、および配列番号５９（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ３を含んでなり、
上記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号６０（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ１、配列番号６１（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ２、および配列番号６２（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ３を含んでなる、項目１に記載の抗体。
（項目３）
上記免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号５７（２４Ｃ０５）および配列番号７５（２４Ｃ０５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ１、配列番号１４８（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  Ｎ６２Ｓ）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ２、および配列番号５９（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ３を含んでなり、
上記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号６０（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ１、配列番号６１（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ２、および配列番号６２（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ３を含んでなる、項目１に記載の抗体。
（項目４）
上記ＣＤＲ配列がヒトおよびヒト化フレームワーク配列の間に挿入される、項目１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
（項目５）
上記抗体が抗原結合性断片である、項目１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
（項目６）
項目１〜３のいずれか一項に記載の免疫グロブリン重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸。
（項目７）
項目１〜３のいずれか一項に記載の免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸。
（項目８）
項目６に記載の核酸を含んでなる発現ベクター。
（項目９）
項目７に記載の核酸を含んでなる発現ベクター。
（項目１０）
項目６に記載の核酸をさらに含んでなる、項目９に記載の発現ベクター。
（項目１１）
項目８に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
（項目１２）
項目９に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
（項目１３）
項目１０に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
（項目１４）
項目８に記載の発現ベクターをさらに含んでなる、項目１２を含んでなる宿主細胞。
（項目１５）
（ａ）上記宿主細胞が免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを発現する条件下で、項目１１または１２に記載の宿主細胞を培養するステップと；
（ｂ）上記免疫グロブリン重鎖可変領域または上記免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなる上記ポリペプチドを精製するステップ
を含んでなる、免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを生成する方法。
（項目１６）
（ａ）上記宿主細胞が免疫グロブリン重鎖可変領域および／または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを発現する条件下で、項目１３または１４に記載の宿主細胞を培養し、それによって抗体または上記抗体の抗原結合性断片を生成するステップと；
（ｂ）上記抗体または上記抗体の抗原結合性断片を精製するステップ
を含んでなる、ヒトＥｒｂＢ３に結合する抗体または上記抗体の抗原結合性断片を生成する方法。
（項目１７）
（ａ）配列番号５４（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号５６（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域；
（ｂ）配列番号１５４（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  Ｎ６２Ｓ）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と、
配列番号１６８（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−１７）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域；
（ｃ）配列番号１５４（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  Ｎ６２Ｓ）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と、
配列番号１６６（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−１６）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域；
（ｄ）配列番号２（０４Ｄ０１）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と、
配列番号４（０４Ｄ０１）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域；
（ｅ）配列番号１２（０９Ｄ０３）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と、
配列番号１４（０９Ｄ０３）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域；（ｆ）配列番号２２（１１Ｇ０１）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と、
配列番号２４（１１Ｇ０１）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域；（ｇ）配列番号３１（１２Ａ０７）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と、
配列番号３３（１２Ａ０７）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域；（ｈ）配列番号３８（１８Ｈ０２）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と、
配列番号４０（１８Ｈ０２）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域；および
（ｉ）配列番号４８（２２Ａ０２）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と、
配列番号５０（２２Ａ０２）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域
からなる群から選択される、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなる、ヒトＥｒｂＢ３に結合する単離抗体。
（項目１８）
上記免疫グロブリン重鎖可変領域が配列番号５４（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなり、上記免疫グロブリン軽鎖可変領域が配列番号５６（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなる、項目１７に記載の抗体。
（項目１９）
上記免疫グロブリン重鎖可変領域が配列番号１５４（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  Ｎ６２Ｓ）のアミノ酸配列を含んでなり、上記免疫グロブリン軽鎖可変領域が配列番号１６８（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−１７）のアミノ酸配列を含んでなる、項目１７に記載の抗体。
（項目２０）
上記免疫グロブリン重鎖可変領域が配列番号１５４（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  Ｎ６２Ｓ）のアミノ酸配列を含んでなり、上記免疫グロブリン軽鎖可変領域が配列番号１６６（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−１６）のアミノ酸配列を含んでなる、項目１７に記載の抗体。
（項目２１）
項目１７〜２０のいずれか一項に記載の免疫グロブリン重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸。
（項目２２）
項目１７〜２０のいずれか一項に記載の免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸。
（項目２３）
項目２１に記載の核酸を含有する発現ベクター。
（項目２４）
項目２２に記載の核酸を含有する発現ベクター。
（項目２５）
項目２１に記載の核酸をさらに含んでなる、項目２４に記載の発現ベクター。
（項目２６）
項目２３に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
（項目２７）
項目２４に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
（項目２８）
項目２５に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
（項目２９）
項目２３に記載の発現ベクターをさらに含んでなる、項目２７に記載の宿主細胞。
（項目３０）
（ａ）上記宿主細胞が免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを発現する条件下で、項目２６または２７に記載の宿主細胞を培養するステップと；
（ｂ）上記免疫グロブリン重鎖可変領域または上記免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなる上記ポリペプチドを精製するステップと
を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを生成する方法。
（項目３１）
（ａ）上記宿主細胞が免疫グロブリン重鎖可変領域および／または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを発現する条件下で、項目２８または２９に記載の宿主細胞を培養し、それによって上記抗体または上記抗体の抗原結合性断片を生成するステップと；
（ｂ）上記抗体または上記抗体の抗原結合性断片を精製するステップと
を含んでなる、ヒトＥｒｂＢ３に結合する抗体または上記抗体の抗原結合性断片を生成する方法。
（項目３２）
（ａ）配列番号１３３（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖と、配列番号１３５（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖；
（ｂ）配列番号１９０（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  Ｎ６２Ｓ  ＩｇＧ１）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖と、配列番号２０６（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−１７κ）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖；
（ｃ）配列番号１９０（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  Ｎ６２Ｓ  ＩｇＧ１）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖と、配列番号２０４（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−１６κ）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖；
（ｄ）配列番号１０９（０４Ｄ０１）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖と、番号１１１（０４Ｄ０１）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖；
（ｅ）配列番号１１３（０９Ｄ０３）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖と、配列番号１１５（０９Ｄ０３）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖；
（ｆ）配列番号１１７（１１Ｇ０１）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖と、配列番号１１９（１１Ｇ０１）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖；
（ｇ）配列番号１２１（１２Ａ０７）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖と、配列番号１２３（１２Ａ０７）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖；
（ｈ）配列番号１２５（１８Ｈ０２）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖と、配列番号１２７（１８Ｈ０２４）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖；および
（ｉ）配列番号１２９（２２Ａ０２）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖と、配列番号１３１（２２Ａ０２）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖
からなる群から選択される、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含んでなる、ヒトＥｒｂＢ３に結合する単離抗体。
（項目３３）
上記免疫グロブリン重鎖が配列番号１３３（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなり、上記免疫グロブリン軽鎖が配列番号１３５（０５Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなる、項目３２に記載の抗体。
（項目３４）
上記免疫グロブリン重鎖が配列番号１９０（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  Ｎ６２Ｓ
ＩｇＧ１）のアミノ酸配列を含んでなり、上記免疫グロブリン軽鎖が配列番号２０６（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−１７κ）のアミノ酸配列を含んでなる、項目３２に記載の抗体。
（項目３５）
上記免疫グロブリン重鎖が配列番号１９０（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  Ｎ６２Ｓ
ＩｇＧ１）のアミノ酸配列を含んでなり、上記免疫グロブリン軽鎖が配列番号２０４（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−１６κ）のアミノ酸配列を含んでなる、項目３２に記載の抗体。
（項目３６）
上記抗体が抗原結合性断片である、項目１７〜２０または３２〜３５のいずれか一項に記載の抗体。
（項目３７）
項目３２〜３５のいずれか一項に記載の免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸。
（項目３８）
項目３２〜３５のいずれか一項に記載の免疫グロブリン軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸。
（項目３９）
項目３７に記載の核酸を含有する発現ベクター。
（項目４０）
項目３８に記載の核酸を含有する発現ベクター。
（項目４１）
項目３７に記載の核酸をさらに含んでなる、項目４０に記載の発現ベクター。
（項目４２）
項目３９に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
（項目４３）
項目４０に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
（項目４４）
項目４１に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
（項目４５）
項目３９に記載の発現ベクターをさらに含んでなる、項目４３に記載の宿主細胞。
（項目４６）
（ａ）上記宿主細胞が免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを発現する条件下で、項目４２または４３に記載の宿主細胞を培養するステップと；
（ｂ）上記免疫グロブリン重鎖可変領域または上記免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなる上記ポリペプチドを精製するステップと
を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを生成する方法。
（項目４７）
（ａ）上記宿主細胞が免疫グロブリン重鎖可変領域および／または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを発現する条件下で、項目４４または４５に記載の宿主細胞を培養し、それによって抗体または上記抗体の抗原結合性断片を生成するステップと；
（ｂ）上記抗体または上記抗体の抗原結合性断片を精製するステップ
を含んでなる、ヒトＥｒｂＢ３に結合する抗体または上記抗体の抗原結合性断片を生成する方法。
（項目４８）
表面プラズモン共鳴による測定で、２００ｐＭ以下のＫＤを有する、項目１〜５、１７〜２０、または３２〜３６のいずれか一項に記載の抗体。
（項目４９）
腫瘍細胞を項目１〜５、１７〜２０、または３２〜３６のいずれか一項に記載の有効量の抗体に曝露して、上記腫瘍細胞の増殖を阻害または低下させるステップを含んでなる、腫瘍細胞の増殖を阻害または低下させる方法。
（項目５０）
哺乳類を項目１〜５、１７〜２０、または３２〜３６のいずれか一項に記載の有効量の抗体に曝露して、上記腫瘍の増殖を阻害または低下させるステップを含んでなる、哺乳類において腫瘍成長を阻害または低下させる方法。
（項目５１）
項目１〜５、１７〜２０、または３２〜３６のいずれか一項に記載の有効量の抗体をそれを必要とする哺乳類に投与するステップを含んでなる、哺乳類において癌を治療する方法。
（項目５２）
上記癌が、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、皮膚癌、腎臓癌、および頭頸部癌、およびシュワン細胞腫からなる群から選択される、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
上記癌が、乳癌、肺癌、および膵臓癌からなる群から選択される、項目５１に記載の方法。
（項目５４）
上記哺乳類がヒトである、項目５１に記載の方法。
【００１２】
以下の図面を参照して、本発明をより完全に理解し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】（先行技術）典型的な抗体の概略図である。
【図２】０４Ｄ０１、０９Ｄ０３、１１Ｇ０１、１２Ａ０７、１８Ｈ０２、２２Ａ０２、および２４Ｃ０５と表記される抗体の完全長免疫グロブリン重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す概略図である。各抗体のアミノ酸配列は、互いに配列比較され、相補性決定配列（ＣＤＲ）（Ｋａｂａｔ定義）であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３がボックス内で同定される。ボックスで囲まれない配列は、フレームワーク（ＦＲ）配列に相当する。
【図３】図２の免疫グロブリン重鎖可変領域配列のそれぞれのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列（Ｋａｂａｔ定義）を示す概略図である。
【図４】０４Ｄ０１、０９Ｄ０３、１１Ｇ０１、１２Ａ０７、１８Ｈ０２、２２Ａ０２、および２４Ｃ０５と表記される抗体の完全長免疫グロブリン軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す概略図である。各抗体のアミノ酸配列は、互いに配列比較され、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列（Ｋａｂａｔ定義）がボックス内で同定される。ボックスで囲まれない配列は、フレームワーク（ＦＲ）配列に相当する。
【図５】図２の免疫グロブリン軽鎖可変領域配列のそれぞれのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列（Ｋａｂａｔ定義）を示す概略図である。
【図６】（図６Ａ）ＮＲＧ１−β１とｈＥｒｂＢ３の結合を阻害する、陰性対照（マウスＩｇＧ（Δ））と抗ＥｒｂＢ３モノクローナル抗体０４Ｄ０１（■）、１２Ａ０７（○）、１８Ｈ０２（◇）、２２Ａ０２（●）、および２４Ｃ０５（□）の中和活性（図６Ａ）を測定する実験からの結果を要約するグラフである。（図６Ｂ）抗ＥｒｂＢ３ｍＡｂ０９Ｄ０３（▲）および１１Ｇ０１（＊）によるＮＲＧ１−β１とｒｈＥｒｂＢ３の結合強化を測定する実験からの結果を要約するグラフである。
【図７】ＮＲＧ１−α１のｒｈＥｒｂＢ３への結合を阻害する、陰性対照（マウスＩｇＧ）と抗ＥｒｂＢ３モノクローナル抗体０４Ｄ０１、０９Ｄ０３、１１Ｇ０１、１２Ａ０７、１８Ｈ０２、２２Ａ０２、および２４Ｃ０５の中和活性を測定する実験からの結果を要約するグラフである。
【図８】ＣＨＯ細胞表面に発現されるキメラタンパク質Ｈｅｒ２／３ｄ２の抗ＥｒｂＢ３抗体の細胞表面認識を測定する実験からの結果を要約するグラフである。
【図９】Ｈｅｒ２およびＥｒｂＢ３を発現するＢａＦ／３細胞中における、ＮＲＧ１−β１の存在下で、陰性対照ＩｇＧ（マウスＩｇＧ（Δ）、および抗ＥｒｂＢ３モノクローナル抗体０４Ｄ０１（■）、０９Ｄ０３（▼）、１１Ｇ０１（◆）、１２Ａ０７（○）、１８Ｈ０２（◇）、２２Ａ０２（●）、および２４Ｃ０５（□）の抗増殖活性を測定する実験からの結果を要約するグラフである。
【図１０】ＭＣＦ７細胞中における、ＮＲＧ１−β１の存在下で、抗ＥｒｂＢ３モノクローナル抗体０４Ｄ０１（■）、０９Ｄ０３（▼）、１１Ｇ０１（◆）、１２Ａ０７（○）、１８Ｈ０２（◇）、２２Ａ０２（●）、および２４Ｃ０５（□）の抗増殖活性を測定する実験からの結果を要約するグラフである。
【図１１】５μｇ／ｍｌの抗体によって処理されたＳＫＢＲ−３細胞中における、血清の存在下で、陰性対照（マウスＩｇＧ）と抗ＥｒｂＢ３モノクローナル抗体０４Ｄ０１、０９Ｄ０３、１１Ｇ０１、１２Ａ０７、１８Ｈ０２、２２Ａ０２、および２４Ｃ０５の抗増殖作用を測定する実験からの結果を要約するグラフである。
【図１２】ＳＫＢＲ−３細胞中における、ＮＲＧによって誘導されたＥｒｂＢ３のリン酸化に対する、陰性対照ＩｇＧと抗ＥｒｂＢ３モノクローナル抗体０４Ｄ０１、０９Ｄ０３、１１Ｇ０１、１２Ａ０７、１８Ｈ０２、２２Ａ０２、および２４Ｃ０５の阻害活性を測定する実験からの結果を要約するグラフである。抗体なし／リガンドなし、および抗体なしの対照もまた示される。
【図１３】（図１３Ａ）ＥＬＩＳＡによる測定で、ＭＣＦ７細胞（図１３Ａ）中における、ＮＲＧ１−β１に応えたＡｋｔリン酸化に対する、抗ＥｒｂＢ３モノクローナル抗体０４Ｄ０１、０９Ｄ０３、１１Ｇ０１、１２Ａ０７、１８Ｈ０２、２２Ａ０２、および２４Ｃ０５の阻害活性を測定する実験からの結果を表すグラフである。抗体なし／リガンドなし、および抗体なしの対照もまた示される。（図１３Ｂ）ＥＬＩＳＡによる測定で、ＤＵ１４５細胞（図１３Ｂ）中における、ＮＲＧ１−β１に応えたＡｋｔリン酸化に対する、抗ＥｒｂＢ３モノクローナル抗体０４Ｄ０１、０９Ｄ０３、１１Ｇ０１、１２Ａ０７、１８Ｈ０２、２２Ａ０２、および２４Ｃ０５の阻害活性を測定する実験からの結果を表すグラフである。抗体なし／リガンドなし、および抗体なしの対照もまた示される。
【図１４】ＣＢ１７ＳＣＩＤマウス中のＢｘＰＣ３膵臓腫瘍異種移植モデルに２０ｍｇ／ｋｇで投与された、抗ＥｒｂＢ３抗体０４Ｄ０１（Δ）、０９Ｄ０３（＊）、１１Ｇ０１（□）、１２Ａ０７（▲）、１８Ｈ０２（●）、２２Ａ０２（■）、２４Ｃ０５（○）、およびヒトＩｇＧｃｏｎｔｒｏｌ（−−■−−）の腫瘍阻害活性を測定する実験からの結果を要約するグラフである（ビヒクル対照、ＰＢＳ（◆））。
【図１５】２４Ｃ０５の完全長重鎖可変領域のアミノ酸配列と、Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−７、Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  、Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  Ｎ６２Ｓ、Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−２１、Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−２３、Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−３０、およびＨｕ２４Ｃ０５  ＨｖＡと表記される完全長ヒト化重鎖可変領域のアミノ酸配列とを示す概略図である。各重鎖可変領域抗体のアミノ酸配列は、互いに配列比較され、相補性決定配列（ＣＤＲ）（Ｋａｂａｔ定義）であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３がボックス内で同定される。ボックスで囲まれない配列は、フレームワーク（ＦＲ）配列に相当する。
【図１６】２４Ｃ０５の完全長軽鎖可変領域のアミノ酸配列と、Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−９、Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−１６、Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−１７、Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−３３，、Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−３９、およびＨｕ２４Ｃ０５  ＫｖＡと表記される完全長ヒト化軽鎖可変領域のアミノ酸配列とを示す概略図である。各軽鎖可変領域のアミノ酸配列は互いに配列比較され、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列（Ｋａｂａｔ定義）は、ボックス内に同定される。ボックスで囲まれない配列は、フレームワーク（ＦＲ）配列に相当する。
【図１７】抗ＥｒｂＢ３モノクローナル抗体、Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１、Ａｂ＃６、Ｕ１−５３、およびＵ１−５９の動力学値を測定する実験からの結果を表す、Ｂｉａｃｏｒｅセンサーグラムである。
【図１８】（図１８Ａ）陰性対照（ヒトＩｇＧ（□））および抗ＥｒｂＢ３モノクローナル抗体Ｓｈ２４Ｃ０５−２５  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１（▲），Ｓｈ２４Ｃ０５−２５  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ２（Δ），Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１（●）、およびＳｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ２（○）の中和活性を測定する実験からの結果を要約するグラフである。（図１８Ｂ）ヒトＩｇＧ（□）と、抗ＥｒｂＢ３モノクローナル抗体Ａｂ＃６ＩｇＧ２（▼）、Ｕ１−５３（◇）、およびＵ１−５９（■）の中和活性を測定する実験からの結果を要約するグラフである。
【図１９】（図１９Ａ）ＮＲＧ１−β１の存在下でＨｅｒ２およびＥｒｂＢ３を発現するＢａＦ／３細胞中における、陰性対照（ヒトＩｇＧ（□））と抗ＥｒｂＢ３モノクローナル抗体Ｓｈ２４Ｃ０５−２５  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１（▲）、Ｓｈ２４Ｃ０５−２５  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ２（Δ）、Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１（●）、およびＳｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ２（○）の阻害活性を測定する実験からの結果を要約するグラフである。（図１９Ｂ）ＮＲＧ１−β１の存在下でＨｅｒ２およびＥｒｂＢ３を発現するＢａＦ／３細胞中における、ヒトＩｇＧ（□）および抗ＥｒｂＢ３モノクローナル抗体Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１（●）、Ａｂ＃６ＩｇＧ２（N）、Ｕ１−５３（◇）、およびＵ１−５９（■）の阻害活性を測定する実験からの結果を要約するグラフである。
【図２０】増殖ＳＫＢＲ−３細胞中のＥｒｂＢ３の定常状態リン酸化に対する、陰性対照（ヒトＩｇＧ）および抗ＥｒｂＢ３モノクローナル抗体Ｓｈ２４Ｃ０５−２５  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１、Ｓｈ２４Ｃ０５−２５  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ２、Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１、およびＳｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ２の阻害活性を測定する実験からの結果を要約するグラフである。
【図２１】増殖ＳＫＢＲ−３細胞中における、陰性対照（ヒトＩｇＧ）と抗ＥｒｂＢ３モノクローナル抗体Ｓｈ２４Ｃ０５−２５  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１、Ｓｈ２４Ｃ０５−２５  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ２、Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１、およびＳｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ２による、ＥｒｂＢ３受容体分解を測定する実験からの結果を要約するグラフである。
【図２２】Ｂ１７ＳＣＩＤマウス中のＢｘＰＣ３膵臓腫瘍異種移植モデルに２ｍｇ／ｋｇで投与された、ヒトＩｇＧ、マウスＩｇＧ、または抗ＥｒｂＢ３モノクローナル抗体の腫瘍阻害活性を測定する実験からの結果を要約するグラフである（マウス２４Ｃ０５（△）、Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ  ＩｇＧ１（●）、Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ  ＩｇＧ２（◆）、Ｓｈ２４Ｃ０５−２５  Ｎ６２Ｓ  ＩｇＧ１（▲）、Ｓｈ２４Ｃ０５−２５  Ｎ６２Ｓ  ＩｇＧ２（■）、ビヒクル対照（□）、マウスＩｇＧ（ｘ）、およびヒトＩｇＧ（◇））。
【図２３Ａ】ＮＣＲヌードマウス中のＣａｌｕ−３非小細胞肺癌異種移植モデルに５ｍｇ／ｋｇで投与された、マウスＩｇＧまたは抗ＥｒｂＢ３モノクローナル抗体の腫瘍阻害活性を測定する実験からの結果を要約するグラフである（ビヒクル対照（□）、マウスＩｇＧ（ｘ）、Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ  ＩｇＧ１（▲）、Ａｂ＃６ＩｇＧ２（●）、およびＵ１−５９（■））。
【図２３Ｂ】ＮＣＲヌードマウス中のＣａｌｕ−３非小細胞肺癌異種移植モデルに１０ｍｇ／ｋｇで投与されたマウスＩｇＧまたは抗ＥｒｂＢ３モノクローナル抗体の腫瘍阻害活性を測定する実験からの結果を要約するグラフである（ビヒクル対照（□）、マウスＩｇＧ（ｘ）、Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ  ＩｇＧ１（▲）、Ａｂ＃６ＩｇＧ２（●）、およびＵ１−５９（■））。
【図２３Ｃ】ＮＣＲヌードマウス中のＣａｌｕ−３非小細胞肺癌異種移植モデルに２０ｍｇ／ｋｇで投与された、マウスＩｇＧまたは抗ＥｒｂＢ３モノクローナル抗体の腫瘍阻害活性を測定する実験からの結果を要約するグラフである（ビヒクル対照（□）、マウスＩｇＧ（ｘ）、Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ  ＩｇＧ１（▲）、Ａｂ＃６ＩｇＧ２（●）、およびＵ１−５９（■））。
【図２４】ＮＯＤ  ＳＣＩＤマウス中のＭＤＡ−ＭＢ−４５３乳癌異種移植モデル中のヒトＩｇＧ、マウスまたは抗ＥｒｂＢ３モノクローナル抗体の腫瘍阻害活性を測定する実験からの結果を要約するグラフである（ビヒクル対照（□）、ヒトＩｇＧ（ｘ）、投与量５ｍｇ／ｋｇのＳｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ  ＩｇＧ１（◇）、投与量１０ｍｇ／ｋｇのＳｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ  ＩｇＧ１（△）、投与量２０ｍｇ／ｋｇのＳｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ  ＩｇＧ１（▲）、投与量１０ｍｇ／ｋｇのＡｂ＃６ＩｇＧ２（●）、および投与量１０ｍｇ／ｋｇのＵ１−５９（■））。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書で開示されるＥｒｂＢ３抗体は、ヒトＥｒｂＢ３ポリペプチドに対する生物学的活性を中和するそれらの能力について選択された、特定のモノクローナル抗体の抗原結合部位に基づく。抗体はＥｒｂＢ３結合部位を画定する、免疫グロブリン可変領域ＣＤＲ配列を含有する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＥｒｂＢ３が、例えばＮＲＧ／ＨＲＧなどのリガンドに結合するのを妨げ、それによってＥｒｂＢ３の生物学的活性を中和する。別の実施形態では、抗ＥｒｂＢ３抗体はＥｒｂＢ３の二量体化を阻害し、それによってＥｒｂＢ３の生物学的活性を中和する。なおも別の実施形態では、抗ＥｒｂＢ３抗体はＥｒｂＢ３のリン酸化および下流シグナル伝達を阻害する。
【００１５】
これらの抗体は中和活性があることから、特定の癌細胞および腫瘍の成長および／または増殖阻害のために有用である。抗体を改変して、ヒト患者に投与した際の免疫応答を最小化または排除し得る。いくつかの実施形態では、抗体は検出可能な標識、または小分子毒素のようなエフェクター分子などのその他の部分に、融合またコンジュゲートされる。
【００１６】
Ｉ．ＥｒｂＢ３に結合する抗体
いくつかの実施形態では、抗体は、（ａ）構造ＣＤＲＨ１−ＣＤＲＨ２−ＣＤＲＨ３を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域、および（ｂ）免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなり、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は組み合わさって、ヒトＥｒｂＢ３に結合する単一結合部位を画定する。ＣＤＲＨ１は、配列番号５（０４Ｄ０１）、配列番号１５（０９Ｄ０３）、配列番号２５（１１Ｇ０１）、配列番号３４（１２Ａ０７）、配列番号４１（１８Ｈ０２）、配列番号５１（２２Ａ０２）、配列番号５７（２４Ｃ０５）、および配列番号７５（２４Ｃ０５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなり；ＣＤＲＨ２は、配列番号６（０４Ｄ０１）、配列番号１６（０９Ｄ０３）、配列番号２６（１１Ｇ０１）、配列番号３５（１２Ａ０７）、配列番号４２（１８Ｈ０２）、配列番号５２（２２Ａ０２）、配列番号５８（２４Ｃ０５）、および配列番号７（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  Ｎ６２Ｓ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなり；ＣＤＲＨ３は、配列番号６（０４Ｄ０１）、配列番号１７（０９Ｄ０３）、配列番号２７（１１Ｇ０１）、配列番号３６（１２Ａ０７、２２Ａ０２）、配列番号４３（１８Ｈ０２）、および配列番号５９（２４Ｃ０５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる。明細書全体を通じて、特定の配列番号に続けて、配列がそれに由来する抗体を括弧内に示す。例えば「配列番号５（０４Ｄ０１）」は、配列番号５が抗体０４Ｄ０１に由来することを意味する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５（０４Ｄ０１）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ１、配列番号６（０４Ｄ０１）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ２、および配列番号７（０４Ｈ０１）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ３を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域を含んでなる。
【００１８】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１５（０９Ｈ０３）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ１、配列番号１６（０９Ｈ０３）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ２、および配列番号１７（０９Ｈ０３）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ３を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域を含んでなる。
【００１９】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２５（１１Ｇ０１）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ１、配列番号２６（１１Ｇ０１）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ２、および配列番号２７（１１Ｇ０１）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ３を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域を含んでなる。
【００２０】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３４（１２Ａ０７）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ１、配列番号３５（１２Ａ０７）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ２、および配列番号（１２Ａ０７，２２Ａ０２）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ３を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域を含んでなる。
【００２１】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号４１（１８Ｈ０２）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ１、配列番号４２（１８Ｈ０２）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ２、および配列番号４３（１８Ｈ０２）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ３を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域を含んでなる。
【００２２】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５１（２２Ａ０２）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ１、配列番号５２（２２Ａ０２）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ２、および配列番号３６（１２Ａ０７，２２Ａ０２）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ３を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域を含んでなる。
【００２３】
特定の実施形態では、抗体は、配列番号５７（２４Ｃ０５）または配列番号７５（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ１、配列番号５８（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ２、および配列番号５９（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ３を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域を含んでなる。
【００２４】
特定の実施形態では、抗体は、配列番号５７（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ１、配列番号５８（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ２、および配列番号５９（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ３を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域を含んでなる。
【００２５】
別の実施形態では、抗体は、配列番号７５（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ１、配列番号５８（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ２、および配列番号５９（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ３を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域を含んでなる。
【００２６】
特定の実施形態では、抗体は、配列番号５７（２４Ｃ０５）または配列番号７５（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ１、配列番号１４８（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  Ｎ６２Ｓ）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ２、および配列番号５９（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＨ３を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域を含んでなる。
【００２７】
好適には、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３配列は、ヒトまたはヒト化免疫グロブリンＦＲの間に挿入される。抗体は、無処理抗体または抗原結合性抗体断片であり得る。
【００２８】
いくつかの実施形態では、抗体は、（ａ）構造ＣＤＲＬ１−ＣＤＲＬ２−ＣＤＲＬ３を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域、および（ｂ）免疫グロブリン重鎖可変領域を含んでなり、ＩｇＧ軽鎖可変領域およびＩｇＧ重鎖可変領域は組み合わさって、ヒトＥｒｂＢ３に結合する単一結合部位を画定する。ＣＤＲＬ１は、配列番号８（０４Ｄ０１、１２Ａ０７、２２Ａ０２）、配列番号１８（０９Ｄ０３）、配列番号２８（１１Ｇ０１）、配列番号４４（１８Ｈ０２）、および配列番号６０（２４Ｃ０５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなり；ＣＤＲＬ２は、配列番号９（０４Ｄ０１、１１Ｇ０１、１２Ａ０７、２２Ａ０２）、配列番号１９（０９Ｄ０３）、配列番号４５（１８Ｈ０２）、および配列番号６１（２４Ｃ０５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなり；ＣＤＲＬ３は、配列番号１０（０４Ｄ０１、１２Ａ０７、２２Ａ０２）、配列番号２０（０９Ｄ０３）、配列番号２９（１１Ｇ０１）、配列番号４６（１８Ｈ０２）、および配列番号６２（２４Ｃ０５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる。
【００２９】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号８（０４Ｄ０１、１２Ａ０７、２２Ａ０２）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ１、配列番号９（０４Ｄ０１、１１Ｇ０１、１２Ａ０７、２２Ａ０２）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ２、および配列番号１０（０４Ｄ０１、１２Ａ０７、２２Ａ０２）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ３を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなる。
【００３０】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１８（０９Ｄ０３）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ１、配列番号１９（０９Ｄ０３）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ２、および配列番号２０（０９Ｄ０３）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ３を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなる。
【００３１】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２８（１１Ｇ０１）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ１、配列番号９（０４Ｄ０１、１１Ｇ０１、１２Ａ０７、２２Ａ０２）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ２、および配列番号２９（１１Ｇ０１）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ３を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなる。
【００３２】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号４４（１８Ｈ０２）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ１、配列番号４５（１８Ｈ０２）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ２、および配列番号４６（１８Ｈ０２）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ３を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなる。
【００３３】
一実施形態では、抗体は、配列番号６０（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ１、配列番号６１（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ２、および配列番号６２（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲＬ３を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなる。
【００３４】
好適には、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列は、ヒトまたはヒト化免疫グロブリンＦＲの間に挿入される。抗体は、無処理抗体または抗原結合性抗体断片であり得る。
【００３５】
いくつかの実施形態では、抗体は、（ａ）構造ＣＤＲＨ１−ＣＤＲＨ２−ＣＤＲＨ３を含んでなるＩｇＧ重鎖可変領域、および（ｂ）構造ＣＤＲＬ１−ＣＤＲＬ２−ＣＤＲＬ３を含んでなるＩｇＧ軽鎖可変領域を含んでなり、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は組み合わさって、ヒトＥｒｂＢ３に結合する単一結合部位を画定する。ＣＤＲＨ１は、配列番号５（０４Ｄ０１）、配列番号１５（０９Ｄ０３）、配列番号２５（１１Ｇ０１）、配列番号３４（１２Ａ０７）、配列番号４１（１８Ｈ０２）、配列番号５１（２２Ａ０２）、配列番号５７（２４Ｃ０５）、および配列番号７５（２４Ｃ０５）からなる群から選択されるアミノ酸配列であり；ＣＤＲＨ２は、配列番号６（０４Ｄ０１）、配列番号１６（０９Ｄ０３）、配列番号２６（１１Ｇ０１）、配列番号３５（１２Ａ０７）、配列番号４２（１８Ｈ０２）、配列番号５２（２２Ａ０２）、配列番号５８（２４Ｃ０５）、および配列番号１４８（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  Ｎ６２Ｓ）からなる群から選択されるアミノ酸配列であり；ＣＤＲＨ３は、配列番号７（０４Ｄ０１）、配列番号１７（０９Ｄ０３）、配列番号２７（１１Ｇ０１）、配列番号３６（１２Ａ０７、２２Ａ０２）、配列番号４３（１８Ｈ０２）、および配列番号５９（２４Ｃ０５）からなる群から選択されるアミノ酸配列である。ＣＤＲＬ１は、配列番号８（０４Ｄ０１、１２Ａ０７、２２Ａ０２）、配列番号１８（０９Ｄ０３）、配列番号２８（１１Ｇ０１）、配列番号４４（１８Ｈ０２）、および配列番号６０（２４Ｃ０５）からなる群から選択されるアミノ酸配列であり；ＣＤＲＬ２は、配列番号９（０４Ｄ０１、１１Ｇ０１、１２Ａ０７、２２Ａ０２）、配列番号１９（０９Ｄ０３）、配列番号４５（１８Ｈ０２）、および配列番号６１（２４Ｃ０５）からなる群から選択されるアミノ酸配列であり；ＣＤＲＬ３は配列番号１０（０４Ｄ０１、１２Ａ０７、２２Ａ０２）、配列番号２０（０９Ｄ０３）、配列番号２９（１１Ｇ０１）、配列番号４６（１８Ｈ０２）、および配列番号６２（２４Ｃ０５）からなる群から選択されるアミノ酸配列である。
【００３６】
別の実施形態では、抗体は、配列番号２（０４Ｄ０１）、配列番号１２（０９Ｄ０３）、配列番号２２（１１Ｇ０１）、配列番号３１（１２Ａ０７）、配列番号３８（１８Ｈ０２）、配列番号４８（２２Ａ０２）、配列番号５４（２４Ｃ０５）、および配列番号１５４（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  Ｎ６２Ｓ）からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号４（０４Ｄ０１）、配列番号１４（０９Ｄ０３）、配列番号２４（１１Ｇ０１）、配列番号３３（１２Ａ０７）、配列番号４０（１８Ｈ０２）、配列番号５０（２２Ａ０２）、配列番号５６（２４Ｃ５）、配列番号１６６（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−１６）、および配列番号１６８（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−１７）からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含んでなる。
【００３７】
別の実施形態では、抗体は、配列番号２（０４Ｄ０１）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号４（０４Ｄ０１）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含んでなる。
【００３８】
別の実施形態では、抗体は、配列番号１２（０９Ｄ０３）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号１４（０９Ｄ０３）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含んでなる。
【００３９】
別の実施形態では、抗体は、配列番号２２（１１Ｇ０１）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号２４（１１Ｇ０１）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含んでなる。
【００４０】
別の実施形態では、抗体は、配列番号３１（１２Ａ０７）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号３３（１２Ａ０７）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含んでなる。
【００４１】
別の実施形態では、抗体は、配列番号３８（１８Ｈ０２）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号４０（１８Ｈ０２）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含んでなる。
【００４２】
別の実施形態では、抗体は、配列番号４８（２２Ａ０２）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号５０（２２Ａ０２）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含んでなる。
【００４３】
別の実施形態では、抗体は、配列番号５４（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号５６（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含んでなる。
【００４４】
別の実施形態では、抗体は、配列番号１５４（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  Ｎ６２Ｓ）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号１６６（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−１６）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含んでなる。
【００４５】
別の実施形態では、抗体は、配列番号１５４（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  Ｎ６２Ｓ）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号１６８（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−１７）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含んでなる。
【００４６】
別の実施形態では、抗体は、（ｉ）配列番号１０９（０４Ｄ０１）、配列番号１１３（０９Ｄ０３）、配列番号１１７（１１Ｇ０１）、配列番号１２１（１２Ａ０７）、配列番号１２５（１８Ｈ０２）、配列番号１２９（２２Ａ０７）、配列番号１３３（２４Ｃ０５）、配列番号１９０（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  Ｎ６２Ｓ  ＩｇＧ１）、および配列番号１９２（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  Ｎ６２Ｓ  ＩｇＧ２）からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖と、（ｉｉ）配列番号１１１（０４Ｄ０１）、配列番号１１５（０９Ｄ０３）、配列番号１１９（１１Ｇ０１）、配列番号１２３（１２Ａ０７）、配列番号１２７（１８Ｈ０２）、配列番号１３１（２２Ａ０７）、配列番号１３５（２４Ｃ０５）、配列番号２０４（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−１６κ）、および配列番号２０６（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−１７κ）からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖とを含んでなる。
【００４７】
別の実施形態では、抗体は、配列番号１０９（０４Ｄ０１）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖と、配列番号１１１（０４Ｄ０１）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖とを含んでなる。
【００４８】
別の実施形態では、抗体は、配列番号１１３（０９Ｄ０３）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖と、配列番号１１５（０９Ｄ０３）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖とを含んでなる。
【００４９】
別の実施形態では、抗体は、配列番号１１７（１１Ｇ０１）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖と、配列番号１１９（１１Ｇ０１）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖とを含んでなる。
【００５０】
別の実施形態では、抗体は、配列番号１２１（１２Ａ０７）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖と、配列番号１２３（１２Ａ０７）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖とを含んでなる。
【００５１】
別の実施形態では、抗体は、配列番号１２５（１８Ｈ０２）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖と、配列番号１２７（１８Ｈ０２）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖とを含んでなる。
【００５２】
別の実施形態では、抗体は、配列番号１２９（２２Ａ０２）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖と、配列番号１３１（２２Ａ０２）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖とを含んでなる。
【００５３】
別の実施形態では、抗体は、配列番号１３３（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖と、配列番号１３５（２４Ｃ０５）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可とを含んでなる。
【００５４】
別の実施形態では、抗体は、配列番号１９０（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  Ｎ６２Ｓ  ＩｇＧ１）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖と、配列番号（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−１６κ）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖とを含んでなる。
【００５５】
別の実施形態では、抗体は、配列番号１９２（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  Ｎ６２Ｓ  ＩｇＧ２）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖と、配列番号２０４（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−１６κ）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖とを含んでなる。
【００５６】
別の実施形態では、抗体は、配列番号１９０（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  Ｎ６２Ｓ  ＩｇＧ１）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖と、配列番号２０６（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−１７κ）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖とを含んでなる。
【００５７】
別の実施形態では、抗体は、配列番号１９２（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  Ｎ６２Ｓ  ＩｇＧ２）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖と、配列番号２０６（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−１７κ）のアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖とを含んでなる。
【００５８】
本明細書の用法では、特に断りのない限り、「抗体」という用語は、無処理抗体または修飾、遺伝子改変、または化学的にコンジュゲートされた抗原結合性断片をはじめとする、無処理抗体（例えば無処理モノクローナル抗体）または抗体の抗原結合性断片（例えばモノクローナル抗体の抗原結合性断片）を意味する。修飾または遺伝子改変されている抗体の例としては、キメラ抗体、ヒト化抗体、および多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）が挙げられる。抗原結合性断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）、ミニ抗体、および二特異性抗体が挙げられる。化学的にコンジュゲートした抗体の一例は、毒素部分にコンジュゲートした抗体である。
【００５９】
図１は、４本のポリペプチド鎖を含有する無処理モノクローナル抗体の概略図を示す。ポリペプチド鎖の内２本は免疫グロブリン重鎖（Ｈ鎖）と称され、ポリペプチド鎖の内２本は免疫グロブリン軽鎖（Ｌ鎖）と称される。免疫グロブリン重軽鎖は、鎖間ジスルフィド結合によって結合する。免疫グロブリン重鎖は、鎖間ジスルフィド結合によって結合する。軽鎖は、１つの可変領域（図１のＶＬ）と１つの定常領域（図１のＣＬ）からなる。重鎖は、１つの可変領域（図１のＶＨ）と少なくとも３つの定常領域（図１のＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）からなる。可変領域は、抗体特異性を左右する。
【００６０】
各可変領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）として知られている４つの比較的保存された領域で挟まれた、相補性決定領域（ＣＤＲ）として知られている３つの超可変領域を含有する。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と称される３つのＣＤは、抗体結合特異性に寄与する。
【００６１】
特定の実施形態では、ヒトＥｒｂＢ３に結合する単離抗体は、配列番号２（０４Ｄ０１）、配列番号１２（０９Ｄ０３）、配列番号２２（１１Ｇ０１）、配列番号３１（１２Ａ０７）、配列番号３８（１８Ｈ０２）、配列番号４８（２２Ａ０２）、配列番号５４（２４Ｃ０５）、および配列番号１５４（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  Ｎ６２Ｓ）の全可変領域またはフレームワーク領域配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン重鎖可変領域を含んでなる。
【００６２】
特定の実施形態では、ヒトＥｒｂＢ３に結合する単離抗体は、配列番号４（０４Ｄ０１）、配列番号１４（０９Ｄ０３）、配列番号２４（１１Ｇ０１）、配列番号３３（１２Ａ０７）、配列番号４０（１８Ｈ０２）、配列番号５０（２２Ａ０２）、配列番号５６（２４Ｃ０５）、配列番号１６６（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−１６）、および配列番号１６８（Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−１７）の全可変領域またはフレームワーク領域配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含んでなる免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなる。
【００６３】
前述の各実施形態では、ヒトＥｒｂＢ３に一緒に結合する免疫グロブリン重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域配列は、重鎖および／または軽鎖可変領域のフレームワーク領域にアミノ酸の変更（例えば少なくとも１、２、３、４、５、または１０個のアミノ酸の置換、欠損、または付加）を含有してもよいことが本明細書で熟考された。
【００６４】
いくつかの実施形態では、単離抗体は、３５０ｐＭ、３００ｐＭ、２５０ｐＭ、２００ｐＭ、１５０ｐＭ、１００ｐＭ、７５ｐＭ、５０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ以下のＫＤで、ｈＥｒｂＢ３に結合する。特に断りのない限り、ＫＤ値は、表面プラズモン共鳴法によって測定される。表面プラズモン共鳴法は、例えば実施例３および１２に記載される条件を使用して実施し得て、測定はそれぞれ２５℃および３７℃で実施された。
【００６５】
いくつかの実施形態では、抗体は、ｈＥｒｂＢ３がＮＲＧ１−β１に結合するのを阻害する。例えば抗体は、実施例４および１３に記載されるプロトコルを使用して分析した際に、約５ｎＭ、２ｎＭ以下のＩＣ５０（最大阻害の５０％での濃度）を有し得る。
【００６６】
ＩＩ．抗体の生成
抗体を生成する方法は本明細書で開示され、当該技術分野で知られている。例えば本明細書で提供される配列情報を使用して、軽鎖可変領域および重鎖可変領域をコードするＤＮＡ分子を化学的に合成し得る。合成ＤＮＡ分子は、例えば定常領域コード配列および発現調節配列をはじめとするその他の適切なヌクレオチド配列にライゲートして、所望される抗体をコードする、従来の遺伝子発現コンストラクトを生成し得る。定義された遺伝子コンストラクトの生成は、当該技術分野の通例の技術範囲内である。代案としては、本明細書で提供される配列は、その配列が、本明細書で提供される配列情報、またはハイブリドーマ細胞中のマウス抗体重軽鎖をコードする遺伝子に関する先行技術の配列情報に基づく、合成核酸プローブを使用して、従来のハイブリダイゼーション技術またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術によって、ハイブリドーマからクローンし得る。
【００６７】
本明細書で開示される抗体をコードする核酸は、発現ベクターに組み込み（ライゲートし）得て、それは従来の形質移入または形質転換技術を通じて宿主細胞に導入し得る。例示的な宿主細胞は、さもなければＩｇＧタンパク質を産生しない、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、幼若ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎培養細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨｅｐＧ２）、および骨髄腫細胞である。形質転換宿主細胞は、宿主細胞が免疫グロブリン軽鎖および／または重鎖可変領域をコードする遺伝子を発現できるようにする条件下で培養し得る。
【００６８】
特異的発現および精製条件は、用いられる発現系次第で変動する。例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で遺伝子を発現させる場合、改変遺伝子を例えばＴｒｐまたはＴａｃなどの適切な細菌プロモーター、および原核生物シグナル配列から下流に配置させることで、それを最初に発現ベクターにクローンする。発現された分泌タンパク質は、屈折体または封入小体中に蓄積し、フレンチプレスまたは超音波処理による細胞の破砕後に採取し得る。次に屈折体を可溶化し、当該技術分野で既知の方法によって、タンパク質を再び折り畳んで切断する。
【００６９】
本明細書で開示される抗体をコードするＤＮＡコンストラクトを例えばＣＨＯ細胞などの真核（ｅｕｋａｙｏｔｉｃ）宿主細胞中で発現させる場合、それを最初に、適切な真核生物プロモーター、分泌シグナル、ＩｇＧエンハンサー、および様々なイントロンを含有する発現ベクターに挿入する。この発現ベクターは、定常領域の全部または一部をコードする配列を任意に含有して、重鎖および／または軽鎖の全部またはその一部が発現できるようにする。いくつかの実施形態では、重鎖および軽鎖可変領域の双方を含有する単一発現ベクターが発現される。
【００７０】
遺伝子コンストラクトは、従来の技術を使用して、真核生物宿主細胞に導入し得る。宿主細胞は、ＶＬまたはＶＨ断片、ＶＬ−ＶＨヘテロ二量体、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ一本鎖ポリペプチド、完全長重または軽免疫グロブリン鎖、またはその部分を発現し、そのそれぞれが別の機能（例えば細胞毒性）を有する部分に付着してもよい。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、重鎖（例えば重鎖可変領域）または軽鎖（例えば軽鎖可変領域）の全部または一部を発現するポリペプチドを発現する、単一ベクターで形質移入される。別の実施形態では、宿主細胞は、（ａ）重鎖可変領域を含んでなるポリペプチドおよび軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドをコードし、または（ｂ）免疫グロブリン重鎖全体および免疫グロブリン軽鎖全体をコードする単一ベクターで形質移入される。なおも別の実施形態では、宿主細胞は１つを超える発現ベクター（例えば重鎖または重鎖可変領域の全体または一部を含んでなるポリペプチドを発現する１つの発現ベクター、および軽鎖または軽鎖可変領域の全体または一部を含んでなるポリペプチドを発現する別の発現ベクター）で同時形質移入される。
【００７１】
免疫グロブリン重鎖可変領域を含んでなるポリペプチド、または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドを生成する方法は、免疫グロブリン重鎖可変領域を含んでなるポリペプチド、または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドが発現できるようにする条件下において、発現ベクターで形質移入された宿主細胞を培養するステップを含んでなってもよい。重鎖可変領域を含んでなるポリペプチド、または軽鎖可変領域を含んでなるポリペプチドは、次に例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびヒスチジンタグのような親和性タグなどの当該技術分野で良く知られている技術を使用して、精製されてもよい。
【００７２】
ヒトＥｒｂＢ３に結合するモノクローナル抗体または抗体の抗原結合性断片を生成する方法は、（ａ）完全長または部分的免疫グロブリン重鎖をコードする発現ベクター、および完全長または部分的免疫グロブリン軽鎖をコードする別個の発現ベクター；または（ｂ）双方の鎖（例えば完全長または部分的鎖）をコードする単一発現ベクターで形質移入された宿主細胞を双方の鎖が発現できるようにする条件下で、培養するステップを含んでなってもよい。無処理抗体（または抗原結合性断片）は、例えばプロテインＡ、プロテインＧ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）やヒスチジンタグのような親和性タグなどの当該技術分野で良く知られている技術を使用して、収集し精製し得る。単一発現ベクターから、または２つの別個の発現ベクターから重鎖および軽鎖を発現することは、当該技術分野の通常の技術の範囲内である。
【００７３】
ＩＩＩ．抗体の修飾
抗体および抗体断片の抗原性を低下させまたは排除する方法は、当該技術分野で知られている。抗体をヒトに投与することが意図される場合、抗体は、好適には「ヒト化」されて、ヒトにおける抗原性が低下しまたは排除される。好適には、ヒト化抗体はそれが由来する抗原に対して、非ヒト化マウス抗体と同一のまたは実質的に同一の親和性を有する。
【００７４】
１つのヒト化アプローチでは、その中でマウス免疫グロブリン定常領域がヒト免疫グロブリン定常領域で置換されている、キメラタンパク質が作られる。例えばＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ８１：６８５１−６８５５，Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８；米国特許第，８９３，６２５号明細書（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）；米国特許第５，５００，３６２号明細書（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）；および米国特許第４，８１６，５６７号明細書（Ｃａｂｉｌｌｙ）を参照されたい。
【００７５】
ＣＤＲグラフトとして知られているアプローチでは、軽鎖および重鎖可変領域のＣＤＲが、別の種からのフレームワークにグラフトされる。例えばマウスＣＤＲをヒトＦＲにグラフトし得る。いくつかの実施形態では、抗ＥｒｂＢ３抗体の軽鎖および重鎖可変領域のＣＤＲが、ヒトＦＲまたはコンセンサスヒトＦＲ上にグラフトされる。コンセンサスヒトＦＲを作り出すために、いくつかのヒト重鎖または軽鎖アミノ酸配列からのＦＲを配列比較して、コンセンサスアミノ酸配列を同定する。ＣＤＲグラフトは米国特許第７，０２２，５００号明細書（Ｑｕｅｅｎ）；米国特許第６，９８２，３２１号明細書（Ｗｉｎｔｅｒ）；米国特許第６，１８０，３７０号明細書（Ｑｕｅｅｎ）；米国特許第６，０５４，２９７号明細書（Ｃａｒｔｅｒ）；米国特許第５，６９３，７６２号明細書（Ｑｕｅｅｎ）；米国特許第５，８５９，２０５号明細書（Ａｄａｉｒ）；米国特許第５，６９３，７６１号明細書（Ｑｕｅｅｎ）；米国特許第５，５６５，３３２号明細書（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ）；米国特許第５，５８５，０８９号明細書（Ｑｕｅｅｎ）；米国特許第５，５３０，１０１号明細書；（Ｑｕｅｅｎ）Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６；およびＷｉｎｔｅｒ（１９９８）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４３０：９２−９４に記載される。
【００７６】
「ＳＵＰＥＲＨＵＭＡＮＩＺＡＴＩＯＮ（商標）」と称されるアプローチでは、ヒトＣＤＲ配列は、ヒトＣＤＲとヒト化されるマウス抗体との構造的な類似性に基づいて、ヒト生殖細胞系遺伝子から選択される。例えば米国特許第６，８８１，５５７号明細書（Ｆｏｏｔｅ）；およびＴａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ  １６９：１１１９−１１２５を参照されたい。
【００７７】
免疫原性を低下させるその他の方法としては、「再形成」、「ハイパーキメラ化」、および「ベニアリング／表面再構成」が挙げられる。例えばＶａｓｗａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ，＆  Ｉｍｍｕｎｏｌ．８１：１０５；Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒ  ９：８９５−９０４；および米国特許第６，０７２，０３５号明細書（Ｈａｒｄｍａｎ）を参照されたい。ベニアリング／表面再構成アプローチでは、マウス抗体中の表面接近可能アミノ酸残基が、ヒト抗体中の同一位置でより頻繁に見られるアミノ酸残基によって置換される。このタイプの抗体表面再構成は、例えば米国特許第５，６３９，６４１号明細書（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ）に記載される。
【００７８】
マウス抗体をヒトにおける医療用途に適した形態に転換する別のアプローチは、ＡＣＴＩＶＭＡＢ（商標）技術（Ｖａｃｃｉｎｅｘ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）として知られており、それはワクシニアウィルスベースのベクターが哺乳類細胞内で抗体を発現することを伴う。ＩｇＧ重軽鎖に高レベルのコンビナトリアル多様性が生じるとされている。例えば米国特許第，７０６，４７７号明細書（Ｚａｕｄｅｒｅｒ）；米国特許６，８００，４４２（Ｚａｕｄｅｒｅｒ）号明細書；および米国特許６，８７２，５１８号明細書（Ｚａｕｄｅｒｅｒ）を参照されたい。
【００７９】
マウス抗体をヒトでの使用に適した形態に転換する別のアプローチは、ＫａｌｏＢｉｏｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）によって商業的に実施される技術である。この技術は、抗体を選択するための「エピトープ注目」ライブラリーを作成する、独自仕様のヒト「受容体」ライブラリーの使用を伴う。
【００８０】
マウス抗体をヒトでの医療用途に適した形態に修飾する別のアプローチは、ＸＯＭＡ（ＵＳ）ＬＬＣ．によって商業的に実施されるＨＵＭＡＮＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ（商標）技術である。例えば国際公開第９３／１１７９４号パンフレット、および米国特許第５，７６６，８８６号明細書；米国特許第５，７７０，１９６号明細書；米国特許第５，８２１，１２３号明細書；および国特許第５，８６９，６１９号明細書を参照されたい。
【００８１】
上のアプローチのいずれかをはじめとするあらゆる適切なアプローチを使用して、本明細書で開示されるヒト抗体の免疫原性を低下させ、または排除し得る。
【００８２】
多特異性抗体を作成する方法は、当該技術分野で知られている。多特異性抗体としては、二重特異性抗体が挙げられる。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、関心のある抗原の２つの異なるエピトープに結合する。二重特異性抗体は、例えばＭｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−５３９（１９８３）、国際公開第９３／０８８２９号パンフレット、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯＪ．，１０：３６５５−３６５９（１９９１）、国際公開第９４／０４６９０号パンフレット、Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）、国際公開第９６／２７０１１号パンフレット、Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）、Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：２１７−２２５（１９９２）、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，９０：６４４４−６４４８，Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２５（１１）：１２９０−１２９７、米国特許公開第２００７／００７１６７５号明細書、およびＢｏｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２３：１６４０−１６４４（２００９）に記載されるように、完全長抗体または抗体断片（例えばＦ（ａｂ’）２二重特異性抗体および二特異性抗体）として調製し得る。
【００８３】
いくつかの実施形態では、抗体は標準生体外共役化学を使用して、小分子毒素または放射性核種などのエフェクター作用因子にコンジュゲートされる。エフェクター作用因子がポリペプチドである場合、抗体をエフェクターに化学的にコンジュゲートさせ、またはエフェクターに融合タンパク質として結合させ得る。融合タンパク質の構築は、当該技術分野の通常の技術の範囲内である。
【００８４】
ＩＶ．抗体の使用
本明細書で開示される抗体を使用して、例えば乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、肺癌（例えば非小細胞肺癌）、膵臓癌、胃癌、皮膚癌、腎臓癌、頭頸部癌、およびシュワン細胞腫などの様々な形態の癌を治療し得る。癌細胞は、癌細胞の増殖を阻害または低下させるように、治療的有効量の抗体に曝露される。いくつかの実施形態では、抗体は、癌細胞の増殖を少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％阻害する。
【００８５】
いくつかの実施形態では、抗体は、例えば、ヒトＥｒｂＢ３が、ニューレグリン／ヘレグリン、特にＮＲＧβ１／ＮＲＧ１−β１／ＮＲＧβ１／ＨＲＧβ１およびＮＲＧα１／ＮＲＧ１−α１／ＮＲＧα１／ＨＲＧα１などのＥｒｂＢ３リガンドへ結合するのを阻害することで、腫瘍細胞の増殖を阻害しまたは低下させる。抗体は、ヒト患者において腫瘍成長を阻害する方法で使用し得る。方法は、治療的有効量の抗体を患者に投与するステップを含んでなる。
【００８６】
ＥｒｂＢ３の過剰発現および／または活性化に関係のある癌としては、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮頸癌、肺癌（例えば非小細胞肺癌）、いくつかの形態の脳癌（例えばシュワン細胞腫）、メラノーマ、皮膚癌、腎臓癌、および胃腸癌（例えば結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、頭頸部癌）が挙げられる。
【００８７】
本明細書の用法では、「ｔｒｅａｔ」、「ｔｒｅａｔｉｎｇ」、および「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」は、哺乳類、例えばヒトにおける疾患治療を意味する。これは（ａ）疾患を阻害する、すなわちその進行を抑止する；および（ｂ）疾患を軽減する、すなわち疾患状態の退縮を引き起こす；および（ｃ）疾患を治癒させることを含む。
【００８８】
概して活性構成要素の治療的有効量は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇであり、例えば１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内である。投与量は、疾患のタイプと程度、または治療される適応症、患者の全般的健康、抗体の生体内効力、製剤処方、および投与経路などの変数に左右される。初期用量は、所望される血液レベルまたは組織レベルを迅速に達成するために、上限レベルを越えて増大させ得る。代案としては、初期用量は最適用量よりも低くあり得て、治療過程において１日量を徐々に増大させてもよい。ヒト用量は、例えば０．５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇで行われるようにデザインされた、従来の第Ｉ相用量漸増試験中で最適化し得る投与回数は、投与経路、投与量、および治療される疾患などの要素に応じて変動し得る。例示的な投与回数は、日に１回、週に１回、および隔週で１回である。望ましい投与経路は、例えば静脈輸液などの非経口経路である。モノクローナル抗体ベースの薬剤の処方は、当該技術分野の通常の技術の範囲内である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は凍結乾燥されて、投与時に緩衝食塩水で戻される。
【００８９】
治療用途では、抗体は、好適には薬学的に許容できるキャリアと組み合わせられる。本明細書の用法では、「薬学的に許容できるキャリア」とは、過剰な毒性、刺激、アレルギー性応答、またはその他の問題または合併症がなく、利点／リスクの比率が妥当な、ヒトおよび動物の組織と接触する用途に適した、緩衝液、キャリア、および賦形剤を意味する。キャリアは、製剤のその他の成分と適合性であり、受容者にとって有害でないという意味で、「許容可能」でなくてはならない。薬学的に許容できるキャリアとしては、製薬投与に適合する、緩衝液、溶剤、分散媒、コーティング、等張吸収遅延剤などが挙げられる。薬理的活性物質のためのこのような媒体および作用物質の使用は、当該技術分野で知られている。
【００９０】
本明細書で開示される抗体を含有する医薬組成物は、投薬単位形態で提供し得て、あらゆる適切な方法で調製し得る。医薬組成物は、その意図される投与経路に適合するように処方されなくてはならない。投与経路の例は、静脈内（ＩＶ）、皮内、吸入、経皮、局所、経粘膜、および直腸内投与である。モノクローナル抗体投与の望ましい経路は、ＩＶ輸液である。有用な製剤は、製薬技術で良く知られている方法によって調製し得る。例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）を参照されたい。非経口投与に適した製剤構成要素としては、注射用水、食塩溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の合成溶剤などの無菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；酢酸、クエン酸またはリン酸などの緩衝液；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの浸透圧調節剤が挙げられる。
【００９１】
静脈内投与のための適切なキャリアとしては、生理学的食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。キャリアは、製造および保存条件下で安定しているべきであり、微生物から保護されていなくてはならない。キャリアは、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレン（ｐｏｌｙｅｔｈｅｙｌｅｎｅ）グリコール）、およびそれらの適切な混合物を含有する、溶媒または分散媒であり得る。
【００９２】
医薬製剤は、好適には無菌である。滅菌は、例えば滅菌濾過膜を通した濾過によって達成し得る。組成物が凍結乾燥されている場合、濾過滅菌は凍結乾燥と水戻しに先だって、またはそれに続いて実施し得る。
【実施例】
【００９３】
以下の実施例は単に例証的であり、本発明の範囲または内容をどのようにも制限することは意図されない。
【００９４】
実施例１−抗ｈＥｒｂＢ３モノクローナル抗体の生成
免疫化、融合、および一次スクリーニングは、反復複数部位免疫法（ＲＩＭＭＳ）プロトコルに従って、Ｍａｉｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｉｎｃ．で実施された。３匹のＡＪマウスおよび３匹のＢａｌｂ／ｃマウスを組換えヒトＥｒｂＢ３／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３４８−ＲＢ）で免疫化した。切断ｒｈＥｒｂＢ３（免疫化Ａ）、またはそのリガンドである組換えヒトＮＲＧ１−β１／ＨＲＧ１−β１−ＥＧＦドメインに架橋された切断ｒｈＥｒｂＢ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３９６−ＨＢ）（免疫化Ｂ）のどちらかを用いて、２組の免疫化を実施した。血清による免疫化を通じて、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）で高い抗ＥｒｂＢ３活性を示す２匹のＡＪマウスを、引き続く融合のために選択した。適切なマウスから脾臓およびリンパ節を採取した。次にＢ細胞を採取して、骨髄腫細胞系と融合させた。融合生成物を４０枚の９６ウェルプレート上で、クロナリティー近くまで連続希釈した。得られた融合物からの合計５２８０の上清を組換えｒｈＥｒｂＢ３／Ｆｃとの結合について、ＥＬＩＳＡを使用してスクリーニングした。同一上清はまた、ＣＨＯ細胞中で過剰発現されたヒトＥｒｂＢ３に対するそれらの結合についてもスクリーニングした（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ電気化学発光アッセイによる）。下述する生体外生化学的および細胞ベースアッセイによって、ＥｒｂＢ３に対する抗体を含有すると同定された３００の上清をさらに特性解析した。ハイブリドーマパネルを選択し、ハイブリドーマをサブクローニングして拡大した。ハイブリドーマ細胞系を抗体発現のためにＢｉｏＸＣｅｌｌ（元Ｂｉｏ−Ｅｘｐｒｅｓｓ）に移し、標準条件下でプロテインＧ樹脂上の親和性クロマトグラフィーによって精製した。
【００９５】
抗ｈＥｒｂＢ３モノクローナル抗体０４Ｄ０１を上述の免疫化Ａから作り出した。抗ｈＥｒｂＢ３モノクローナル抗体０９Ｄ０３、１１Ｇ０１、１２Ａ０７、１８Ｈ０２、２２Ａ０２、および２４Ｃ０５を上述の免疫化Ｂから作り出した。
【００９６】
実施例２−抗ｈＥｒｂＢ３モノクローナル抗体の配列分析
ＩｓｏＳｔｒｉｐ（商標）マウスモノクローナル抗体アイソタイプ判定キットを使用し、製造会社（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）の使用説明書に従って、実施例１の各モノクローナル抗体の軽鎖アイソタイプおよび重鎖アイソタイプを判定した。全ての抗体は、κ軽鎖およびＩｇＧ１またはＩｇＧ２ｂ  ＩｇＧ重鎖であると判定された。
【００９７】
５’ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）を使用して、マウスモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域を配列決定した。ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用して、供給業者（Ｑｉａｇｅｎ）の使用説明書に従って、各モノクローナルハイブリドーマ細胞系から全ＲＮＡを抽出した。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＳＭＡＲＴｅｒ（商標）ＲＡＣＥｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のどちらかを使用して、製造会社の使用説明書に従って、５’ＲＡＣＥのためのランダムプライマーを使用して、５’末端を含有する完全長第一鎖ｃＤＮＡを作り出した。
【００９８】
ＫＯＤ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）またはＡｄｖａｎｔａｇｅ  ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、製造会社の使用説明書に従って、ＰＣＲによってκおよび重（ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ｂ）ＩｇＧ鎖の可変領域を増幅した。５’ｃＤＮＡ末端の増幅では、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）キットと併せて、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）５’プライマーである５’ｃｇａｃｔｇｇａｇｃａｃｇａｇｇａｃａｃｔｇａ３’（配列番号１３６）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５’プライマーとして使用した。５’ｃＤＮＡ末端の増幅では、ＳＭＡＲＴｅｒ（商標）ＡＣＥｃＤＮＡ増幅キットと併せて、５’ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ３’（配列番号１３７）と５’ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ３’（配列番号１３８）の混合物であるＵｎｉｖｅｒｓａｌＰｒｉｍｅｒＭｉｘＡプライマー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を５’プライマーとして使用した。重鎖可変領域は、上の５’プライマーと５’ＴＡＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＡＣＡＡＣＣＡＣＡ３’（配列番号１３９）または５’ＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＣＧ３’（配列番号１４０）のどちらかの３’ＩｇＧ１定常領域特異的プライマーとを使用して増幅した。ＩｇＧ２ｂ配列は、５’ＡＧＧＡＣＡＧＧＧＧＴＴＧＡＴＴＧＴＴＧＡ３’（配列番号１４１）、５’ＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＴＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＴＧＴ３’（配列番号１４２）、または５’ＧＧＡＧＧＡＡＣＣＡＧＴＴＧＴＡＴＣＴＣＣＡＣＡＣＣＣＡ３’（配列番号１４３）のいずれかを用いて増幅した。κ鎖可変領域は、上の５’プライマーと、５’ＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＧＡＣＡＡＴ３’（配列番号１４４）または５’ＣＧＡＣＴＧＡＧＧＣＡＣＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＴ３’（配列番号１４５）のどちらかの３’κ定常領域特異的プライマーとを用いて増幅した。
【００９９】
アガロースゲル電気泳動によって個々のＰＣＲ生成物を単離し、製造会社（Ｑｉａｇｅｎ）の使用説明書に従ってＱｉａｑｕｉｃｋ（登録商標）ゲル精製キットを使用して精製した。ＺｅｒｏＢｌｕｎｔ（登録商標）ＴＯＰＯ（登録商標）ＰＣＲクローニングキットを使用して、製造会社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の使用説明書に従って、ＰＣＲ生成物を引き続いてｐＣＲ（登録商標）４Ｂｌｕｎｔプラスミドにクローンし、標準分子生物学技術を通じて、ＤＨ５−α細菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。標準ジデオキシＤＮＡ配列決定方法を使用して、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＧｅｎｏｍｉｃｓからのＭ１３順方向（５’ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ３’）（配列番号１４６）およびＭ１３逆方向（５’ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ３’）（配列番号１４７）プライマーを使用し、形質転換細菌クローンから単離されたプラスミドＤＮＡを配列決定して、可変領域配列の配列を同定した。ＶｅｃｔｏｒＮＴＩソフトウェア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＩＭＧＴ／Ｖ−Ｑｕｅｓｔソフトウェアを使用して配列を分析し、可変領域配列を同定および確認した。
【０１００】
マウスモノクローナル抗体の可変領域をコードする核酸配列、およびそれを画定するタンパク質配列を下に要約する（アミノ末端シグナルペプチド配列は示されない）。ＣＤＲ配列（Ｋａｂａｔ定義）は、アミノ酸配列中で太字／下線で示される。
【０１０１】
０４Ｄ０１抗体の重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号１）
【化１】
0005906233.tif 000002
【０１０２】
０４Ｄ０１抗体の重鎖可変領域を画定するタンパク質配列（配列番号２）
【化２】
0005906233.tif 000003
【０１０３】
０４Ｄ０１抗体のκ鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号３）
【化３】
0005906233.tif 000004
【０１０４】
０４Ｄ０１抗体のκ鎖可変領域を画定するタンパク質配列（配列番号４）
【化４】
0005906233.tif 000005
【０１０５】
０９Ｄ０３抗体の重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号１１）
【化５】
0005906233.tif 000006
【０１０６】
０９Ｄ０３抗体の重鎖可変領域を画定するタンパク質配列（配列番号１２）
【化６】
0005906233.tif 000007
【０１０７】
０９Ｄ０３抗体のκ鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号１３）
【化７】
0005906233.tif 000008
【０１０８】
０９Ｄ０３抗体のκ鎖可変領域を画定するタンパク質配列（配列番号１４）
【化８】
0005906233.tif 000009
【０１０９】
１１Ｇ０１抗体の重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号２１）
【化９】
0005906233.tif 000010
【０１１０】
１１Ｇ０１抗体の重鎖可変領域を画定するタンパク質配列（配列番号２２）
【化１０】
0005906233.tif 000011
【０１１１】
１１Ｄ０１抗体のκ鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号２３）
【化１１】
0005906233.tif 000012
【０１１２】
１１Ｇ０１抗体のκ鎖可変領域を画定するタンパク質配列（配列番号２４）
【化１２】
0005906233.tif 000013
【０１１３】
１２Ａ０７抗体（配列番号３０）の重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号３０）
【化１３】
0005906233.tif 000014
【０１１４】
１２Ａ０７抗体の重鎖可変領域を画定するタンパク質配列（配列番号３１）
【化１４】
0005906233.tif 000015
【０１１５】
１２Ａ０７抗体（配列番号３２）のκ鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号３２）
【化１５】
0005906233.tif 000016
【０１１６】
１２Ａ０７抗体のκ鎖可変領域を画定するタンパク質配列（配列番号３３）
【化１６】
0005906233.tif 000017
【０１１７】
１８Ｈ０２抗体の重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号３７）
【化１７】
0005906233.tif 000018
【０１１８】
１８Ｈ０２抗体の重鎖可変領域を画定するタンパク質配列（配列番号３８）
【化１８】
0005906233.tif 000019
【０１１９】
１８Ｈ０２抗体のκ鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号３９）
【化１９】
0005906233.tif 000020
【０１２０】
１８ＨＤ０２抗体のκ鎖可変領域を画定するタンパク質配列（配列番号４０）
【化２０】
0005906233.tif 000021
【０１２１】
２２Ａ０２抗体の重鎖可変領域をコードする核酸配列  （配列番号４７）
【化２１】
0005906233.tif 000022
【０１２２】
２２Ａ０２抗体の重鎖可変領域を画定するタンパク質配列（配列番号４８）
【化２２】
0005906233.tif 000023
【０１２３】
２２Ａ０２抗体  のκ鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号４９）
【化２３】
0005906233.tif 000024
【０１２４】
２２Ａ０２抗体のκ鎖可変領域を画定するタンパク質配列（配列番号５０）
【化２４】
0005906233.tif 000025
【０１２５】
２４Ｃ０５抗体の重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号５３）
【化２５】
0005906233.tif 000026
【０１２６】
２４Ｄ０５抗体の重鎖可変領域を画定するタンパク質配列（配列番号５４）
【化２６】
0005906233.tif 000027
【０１２７】
２４Ｃ０５抗体のκ鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号５５）
【化２７】
0005906233.tif 000028
【０１２８】
２４Ｃ０５抗体のκ鎖可変領域を画定するタンパク質配列（配列番号５６）
【化２８】
0005906233.tif 000029
【０１２９】
実施例１で作成された抗体について、免疫グロブリン重鎖可変領域を画定するアミノ酸配列を図２で配列比較する。（適切な発現／分泌のための）アミノ末端シグナルペプチド配列は、示されない。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３（Ｋａｂａｔ定義）は、ボックスによって同定される。図３は、各抗体について、別個のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列の配列比較を示す。
【０１３０】
実施例１の抗体について、免疫グロブリン軽鎖可変領域を画定するアミノ酸配列を図４で配列比較する。（適切な発現／分泌のための）アミノ末端シグナルペプチド配列は、示されない。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、ボックスによって同定される。図５は、各抗体について、別個のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列の配列比較を示す。
【０１３１】
表１は、本明細書の実施例で考察される各配列の配列番号を示す、一致度チャートである。
【０１３２】
【表１】
0005906233.tif 000030
【０１３３】
【表２】
0005906233.tif 000031
【０１３４】
【表３】
0005906233.tif 000032
【０１３５】
マウスモノクローナル抗体重鎖ＣＤＲ配列（Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、およびＩＭＧＴ定義）を表２に示す。
【０１３６】
【表４】
0005906233.tif 000033
【０１３７】
【表５】
0005906233.tif 000034
【０１３８】
【表６】
0005906233.tif 000035
【０１３９】
マウスモノクローナル抗体κ軽鎖ＣＤＲ配列（Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、およびＩＭＧＴ定義）を表３に示す。
【０１４０】
【表７】
0005906233.tif 000036
【０１４１】
【表８】
0005906233.tif 000037
【０１４２】
表２および３では、免疫グロブリン重鎖および軽鎖について最長ＣＤＲ配列を太字で示す。
【０１４３】
完全長重鎖またはκ鎖抗体配列を作り出すために、上の各可変配列をそれぞれの定常領域と組み合わせる。例えば完全長重鎖は、重可変配列とそれに続くマウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２ｂ重鎖定常配列を含んでなり、完全長κ鎖は、κ可変配列とそれに続くマウスκ軽鎖定常配列を含んでなる。
【０１４４】
マウスＩｇＧ１重鎖定常領域をコードする核酸配列（配列番号１０２）
【化２９】
0005906233.tif 000038
【０１４５】
マウスＩｇＧ１重鎖定常領域を画定するタンパク質配列（配列番号１０３）
【化３０】
0005906233.tif 000039
【０１４６】
マウスＩｇＧ２ｂ重鎖定常領域をコードする核酸配列（配列番号１０４）
【化３１】
0005906233.tif 000040
【０１４７】
マウスＩｇＧ２ｂ重鎖定常領域を画定するタンパク質配列（配列番号１０５）
【化３２】
0005906233.tif 000041
【０１４８】
マウスκ軽鎖定常領域をコードする核酸配列（配列番号１０６）
【化３３】
0005906233.tif 000042
【０１４９】
マウスκ軽鎖定常領域を画定するタンパク質配列（配列番号１０７）
【化３４】
0005906233.tif 000043
【０１５０】
以下の配列は本実施例で説明される各抗体について、実際のまたは熟考された完全長重鎖および軽鎖配列（すなわち可変および定常領域配列の双方を含有する）を表わす。抗体の適切な分泌のためのシグナル配列もまた、ＤＮＡ配列の５’末端、またはタンパク質配列のアミノ末端に含まれる。可変領域配列を他の定常領域配列にライゲートして、活性完全長ＩｇＧ重鎖および軽鎖を生成し得る。
【０１５１】
０４Ｄ０１の完全長重鎖配列（重鎖可変領域およびＩｇＧ１定常領域）をコードする核酸配列（配列番号１０８）
【化３５】
0005906233.tif 000044
【０１５２】
０４Ｄ０１の完全長重鎖配列（重鎖可変領域およびＩｇＧ１定常領域）を画定するタンパク質配列（配列番号１０９）
【化３６】
0005906233.tif 000045
【０１５３】
０４Ｄ０１の完全長軽鎖配列（κ鎖可変領域および定常領域）をコードする核酸配列（配列番号１１０）
【化３７】
0005906233.tif 000046
【０１５４】
０４Ｄ０１の完全長軽鎖配列（κ鎖可変領域および定常領域）を画定するタンパク質配列（配列番号１１１）
【化３８】
0005906233.tif 000047
【０１５５】
０９Ｄ０３の完全長重鎖配列（重鎖可変領域およびＩｇＧ２ｂ定常領域）をコードする核酸配列（配列番号１１２）
【化３９】
0005906233.tif 000048
【０１５６】
０９Ｄ０３の完全長重鎖配列（重鎖可変領域およびＩｇＧ２ｂ定常領域）を画定するタンパク質配列（配列番号１１３）
【化４０】
0005906233.tif 000049
【０１５７】
０９Ｄ０３の完全長軽鎖配列（κ鎖可変領域および定常領域）をコードする核酸配列（配列番号１１４）
【化４１】
0005906233.tif 000050
【０１５８】
０９Ｄ０３の完全長軽鎖配列（κ鎖可変領域および定常領域）を画定するタンパク質配列（配列番号１１５）
【化４２】
0005906233.tif 000051
【０１５９】
１１Ｇ０１の完全長重鎖配列（重鎖可変領域およびＩｇＧ１定常領域）をコードする核酸配列（配列番号１１６）
【化４３】
0005906233.tif 000052
【０１６０】
１１Ｇ０１の完全長重鎖配列（重鎖可変領域およびＩｇＧ１定常領域）を画定するタンパク質配列（配列番号１１７）
【化４４】
0005906233.tif 000053
【０１６１】
１１Ｇ０１の完全長軽鎖配列（κ鎖可変領域および定常領域）をコードする核酸配列（配列番号１１８）
【化４５】
0005906233.tif 000054
【０１６２】
１１Ｇ０１の完全長軽鎖配列（κ鎖可変領域および定常領域）を画定するタンパク質配列（配列番号１１９）
【化４６】
0005906233.tif 000055
【０１６３】
１２Ａ０７の完全長重鎖配列（重鎖可変領域およびＩｇＧ１定常領域）をコードする核酸配列（配列番号１２０）
【化４７】
0005906233.tif 000056
【０１６４】
１２Ａ０７の完全長重鎖配列（重鎖可変領域およびＩｇＧ１定常領域）を画定するタンパク質配列（配列番号１２１）
【化４８】
0005906233.tif 000057
【０１６５】
１２Ａ０７の完全長軽鎖配列（κ鎖可変領域および定常領域）をコードする核酸配列（配列番号１２２）
【化４９】
0005906233.tif 000058
【０１６６】
１２Ａ０７の完全長軽鎖配列（κ鎖可変領域および定常領域）を画定するタンパク質配列（配列番号１２３）
【化５０】
0005906233.tif 000059
【０１６７】
１８Ｈ０２の完全長重鎖配列（重鎖可変領域およびＩｇＧ１定常領域）をコードする核酸配列（配列番号１２４）
【化５１】
0005906233.tif 000060
【０１６８】
１８Ｈ０２の完全長重鎖配列（重鎖可変領域およびＩｇＧ１定常領域）を画定するタンパク質配列（配列番号１２５）
【化５２】
0005906233.tif 000061
【０１６９】
１８Ｈ０２の完全長軽鎖配列（κ鎖可変領域および定常領域）をコードする核酸配列（配列番号１２６）
【化５３】
0005906233.tif 000062
【０１７０】
１８Ｈ０２の完全長軽鎖配列（κ鎖可変領域および定常領域）を画定するタンパク質配列（配列番号１２７）
【化５４】
0005906233.tif 000063
【０１７１】
２２Ａ０２の完全長重鎖配列（重鎖可変領域およびＩｇＧ１定常領域）をコードする核酸配列（配列番号１２８）
【化５５】
0005906233.tif 000064
【０１７２】
２２Ａ０２の完全長重鎖配列（重鎖可変領域およびＩｇＧ１定常領域）を画定するタンパク質配列（配列番号１２９）
【化５６】
0005906233.tif 000065
【０１７３】
２２Ａ０２の完全長軽鎖配列（κ鎖可変領域および定常領域）をコードする核酸配列（配列番号１３０）
【化５７】
0005906233.tif 000066
【０１７４】
２２Ａ０２の完全長軽鎖配列（κ鎖可変領域および定常領域）を画定するタンパク質配列（配列番号１３１）
【化５８】
0005906233.tif 000067
【０１７５】
２４Ｃ０５の完全長重鎖配列（重鎖可変領域およびＩｇＧ１定常領域）をコードする核酸配列（配列番号１３２）
【化５９】
0005906233.tif 000068
【０１７６】
２４Ｃ０５の完全長重鎖配列（重鎖可変領域およびＩｇＧ１定常領域）を画定するタンパク質配列（配列番号１３３）
【化６０】
0005906233.tif 000069
【０１７７】
２４Ｃ０５の完全長軽鎖配列（κ鎖可変領域および定常領域）をコードする核酸配列（配列番号１３４）
【化６１】
0005906233.tif 000070
【０１７８】
２４Ｃ０５の完全長軽鎖配列（κ鎖可変領域および定常領域）を画定するタンパク質配列（配列番号１３５）
【化６２】
0005906233.tif 000071
【０１７９】
便宜のため、表４は、本実施例で考察される抗体の完全長配列と、配列表に示すものとの対応を示す、一致度チャートを提供する。
【０１８０】
【表９】
0005906233.tif 000072
【０１８１】
【表１０】
0005906233.tif 000073
【０１８２】
実施例３−結合親和性
Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００（Ｂｉａｃｏｒｅ）装置を使用して、表面プラズモン共鳴によって、モノクローナル抗体０４Ｄ０１、０９Ｄ０３、１１Ｇ０１、１２Ａ０７、１８Ｈ０２、２２Ａ０２、および２４Ｃ０５と、組換えヒトＥｒｂＢ３／Ｆｃ融合タンパク質（ｒｈＥｒｂＢ３−Ｆｃ）との結合親和性および結合動態を測定した。
【０１８３】
標準カップリングプロトコルを使用して、供給業者の使用説明書に従って、アミンカップリング（ＢＩＡｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１０００−５０）によって、ウサギ抗マウスＩｇＧｓ（Ｂｉａｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１００８−３８）をカルボキシメチル化デキストランＣＭ４センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１００５−３４）上に固定化した。０．０５％の界面活性剤Ｐ２０（Ｂｉａｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１０００−５４）を含有するＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１４０４０−１３３）を泳動用緩衝液として使用して、２５℃で分析を実施した。
【０１８４】
流速１０μｌ／分で、個々のフローセル内において抗体を捕捉した。各抗体毎に注入時間を変えて、３０〜６０ＲＵのＲｍａｘを得た。緩衝液または泳動用緩衝液で希釈したｒｈＥｒｂＢ３−Ｆｃを参照表面（抗体捕捉なし）および活性表面（試験抗体）上に、６０μｌ／分で３００秒間逐次注入した。解離相を３６００秒までモニターした。次にｐＨ１．７の１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（グリシンｐＨ１．５（Ｂｉａｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１００３−５４）およびｐＨ２．０（Ｂｉａｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１００３−５５）から作られた）を２回にわたり流速６０μｌ／分で６０秒間注入して、表面を再生した。試験したｒｈＥｒｂＢ３−Ｆｃの濃度範囲は、０．１２５ｎＭ〜２０ｎＭであった。
【０１８５】
ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ）の動態学機能を使用して、二重参照減法で動態学パラメータを測定した。各抗体の動態学パラメータ、ｋａ（結合速度定数）、ｋｄ（解離速度定数）、およびＫＤ（平衡解離定数）を測定した。２５℃における、ｒｈＥｒｂＢ３−Ｆｃに対するモノクローナル抗体の動力学値を表５に要約する。
【０１８６】
【表１１】
0005906233.tif 000074
【０１８７】
表５のデータは、約３５０ｐＭ以下、２５０ｐＭ以下、２００ｐＭ以下、１５０ｐＭ以下、１００ｐＭ以下、５０ｐＭ以下、または１０ｐＭ以下のＫＤで、抗体がｒｈＥｒｂＢ３に結合することを実証する。
【０１８８】
実施例４−中和活性
本実施例では、ｒｈＥｒｂＢ３とＮＲＧ１−β１およびＮＲＧ１−α１との結合を阻害する能力について、実施例１で作成された抗体を試験した。ｈＥｒｂＢ３とＮＲＧ１−β１との結合の阻害について、電気化学発光（ＥＣＬ）アッセイによって抗体を試験した。５０μｌのＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１４０４０−１３３）中の０．５μｇ／ｍＬのｒｈＥｒｂＢ３／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３４８−ＲＢ）によって、ＭＡ２４００９６ウェル標準結合プレート（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、カタログ番号Ｌ１５ＸＡ−６）を４℃で撹拌せずに一晩被覆した。次にプレートをＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＳｉｇｍａＰ５９２７）で３回洗浄し、２００μｌの５％ＢＳＡ（Ｓｅｒａ  Ｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＡＰ−４５１０−８０）含有ＰＢＳによって、室温で１．５時間ブロックした。プレートをＰＢＳで３回洗浄した後、室温でさらに１時間撹拌しながら、２５μｌの抗体希釈液をプレートに添加した。リガンドＮＲＧ１−β１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３７７−ＨＢ、２６ｋＤａ）を最終濃度０．２５μｇ／ｍｌでウェルに添加した。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、ＳＵＬＴＯ−ＴＡＧストレプトアビジン（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、カタログ番号Ｒ３２ＡＤ−５）と共に１時間プレインキュベートされた、２５μｌの１μｇ／ｍＬ抗ヒトＮＲＧ１−β１ビオチン化抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＢＡＦ３７７）と共に、室温で撹拌しながら１時間インキュベートした。次にプレートをＰＢＳで３回洗浄し、Ｓｅｃｔｏｒ（登録商標）Ｉｍａｇｅｒ２４００（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）装置上でプレートを分析する前に、１５０μｌの１×読み取り緩衝液（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、カタログ番号Ｒ９２ＴＣ−１）を各ウェルに添加した。
【０１８９】
ＮＲＧ１−β１とＥｒｂＢ３の相互作用は、抗体０４Ｄ０１、１２Ａ０７、１８Ｈ０２、２２Ａ０２、および２４Ｃ０５によって阻害された（図６Ａ）。ＮＲＧ１−β１とｒｈＥｒｂＢ３の相互作用は抗体０９Ｄ０３よって促進されたが、抗体１１Ｇ０１によって同様には促進されなかった（図６Ｂ）。
【０１９０】
抗体（すなわち０４Ｄ０１、１２Ａ０７、１８Ｈ０２、２２Ａ０２、および２４Ｃ０５）について、ＮＲＧ１−β１とｒｈＥｒｂＢ３との結合を中和する、マウス抗ヒトＥｒｂＢ３抗体のＩＣ５０値を計算し、表６に要約する。
【０１９１】
【表１２】
0005906233.tif 000075
【０１９２】
結果は、抗体０４Ｄ０１、１２Ａ０７、１８Ｈ０２、２２Ａ０２、および２４Ｃ０５が、ＮＲＧ１−β１とｒｈＥｒｂＢ３との結合を効率的に中和したことを示す。抗体０９Ｄ０３および１１Ｇ０１は、ｈＮＲＧ１−β１とｈＥｒｂＢ３との結合を促進した。
【０１９３】
抗体は、ｈＥｒｂＢ３と、第２のＥｒｂＢ３リガンドであるＮＲＧ１−α１との結合の阻害に関するＥＣＬアッセイによって、試験した。ＮＲＧ１−α１とｒｈＥｒｂＢ３の結合の阻害をアッセイするために、播種されるｒｈＥｒｂＢ３／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ４５１８−ＲＢ）およびリガンドＮＲＧ１−α１（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＲＰ−３１７−Ｐ１ＡＸ）の濃度をそれぞれ１μｇ／ｍｌおよび１．５μｇ／ｍｌに変更したこと以外は、ＮＲＧ１−β１について使用したのと同一方法を使用した。
【０１９４】
ＮＲＧ１−α１とｒｈＥｒｂＢ３の相互作用は、１１Ｇ０１、１２Ａ０７、１８Ｈ０２、２２Ａ０２、および２４Ｃ０５ＩｇＧ１によって阻害され、抗体０９Ｄ０３によって促進された（図７）。
【０１９５】
実施例５−ＥｒｂＢ３ドメインＩＩへの結合
本実施例では、ｈＥｒｂＢ３−ＥＣＤの二量体化ドメイン（ドメイン２）に対する結合について、実施例１で作成された抗体を試験した。Ｈｅｒ２（１１９個のアミノ酸、ＡＡ２２０〜３３８位）のドメイン２の代わりに、ｈＥｒｂＢ３（１１８個のアミノ酸、２１０〜３２７位）ドメイン２を完全長Ｈｅｒ２受容体にクローンした。ハイブリッドコンストラクトＨｅｒ２／３ｄ２をｐＬｅｎｔｉ６．３にクローンし、ＶｉｒａＰｏｗｅｒ（商標）レンチウィルスサポートキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｋ４９７０００）を使用して、２９３Ｔ細胞をレンチウィルス内へ一過性に形質移入することでパッケージ化した。ＣＨＯ細胞に、Ｈｅｒ２／３ｄ２ハイブリッドタンパク質を発現するレンチウィルスを感染させた。これらの遺伝子改変ＣＨＯ細胞上で、スルホ標識抗マウス抗体を用いたＥＣＬによって、抗ＥｒｂＢ３ハイブリドーマ上清とＨｅｒ２／３ｄ２との結合を試験した。ハイブリドーマ上清と、ＣＨＯ細胞の細胞表面で発現されるキメラタンパク質Ｈｅｒ２／３ｄ２との結合に関するデータを図８に要約する。これらの結果は、抗体０９Ｄ０３および１１Ｇ０１が、ＥｒｂＢ３ドメインＩＩであるＡＡ２１０−３２７に結合することを示す。
【０１９６】
実施例６−抗増殖性活性
本実施例は、細胞のＮＲＧ１−β１依存性増殖を阻害する能力に関する、実施例１で作成された抗体の特性解析について述べる。ヒトＨｅｒ２およびＥｒｂＢ３の双方を発現するように遺伝子改変されたＢａＦ／３細胞系において、そしてＨｅｒ２およびＥｒｂＢ３の双方を自然に発現してＮＲＧ１−β１刺激に応えて増殖するヒトＭＣＦ７乳癌細胞において、抗体を試験した。
【０１９７】
ＢａＦ／３細胞に、ヒトＨｅｒ２またはヒトＥｒｂＢ３を発現するよう遺伝子改変された２種のレンチウイルスを感染させた。ブラストサイジン（１５μｇ／ｍｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｒ２１００１）を用いて、感染した細胞を選択し、個々のコロニーを単離して、双方の受容体の発現について試験した。Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ３を発現するクローンを添加ブラストサイジン選択下の培養中で維持した。［８０％ＲＰＭＩ培地１６４０（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１１８７５−０９３）、１０％ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１０４３８−０２６）、および１０％ＷＥＨＩ細胞馴化培地｛９０％ＩＳＣＯＶＥの修正ダルベッコ培地（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１２４４００５３）、１０％ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１０４３８−０２６）＋２ｍＭＬ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号２５０３０−０８１）＋０．００２５ｍＭメルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号２１９８５−０２３）｝］。拮抗ＥｒｂＢ３抗体についてスクリーニングするために、細胞をＰＢＳで洗浄し、ブラストサイジンおよびＷＥＨＩ馴化培地の不在下で培養した。アッセイは、ＮＲＧ１−β１（１００ｎｇ／ｍｌ）および様々な濃度（最終容積１００μｌ中に０．０１８〜５０００ｎｇ／ｍｌ）の抗体の存在下、９６ウェルプレート（５，０００細胞／ウェル）内で実施した。ＮＲＧ１−β１刺激の３〜４日間後に、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイを実施した。
【０１９８】
マウス抗ヒトＥｒｂＢ３抗体による、Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ３−ＢａＦ／３のＮＲＧ１−β１依存性細胞増殖の用量依存的阻害の一例を図９に示す。モノクローナル抗体（すなわち０４Ｄ０１、０９Ｄ０３、１１Ｇ０１、１２Ａ０７、１８Ｈ０２、２２Ａ０２、および２４Ｃ０５）によるＮＲＧ１−β１依存性Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ３−ＢａＦ／３細胞系増殖阻害のデータを表７に要約する。
【０１９９】
【表１３】
0005906233.tif 000076
【０２００】
表７の結果は、抗体０４Ｄ０１、０９Ｄ０３、１１Ｇ０１、１２Ａ０７、１８Ｈ０２、２２Ａ０２、および２４Ｃ０５が、Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ３を発現するＢａＦ／３細胞のＮＲＧ１−β１誘導性増殖を強力に阻害したことを示す。
【０２０１】
ＭＣＦ７細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＴＢ−２２）は、ＡＴＣＣによる推奨に従って維持された。９６ウェルプレートに、５，０００細胞／ウェルで細胞を播種した。細胞を血清不在下で、一晩飢餓状態にした。翌日、ＮＲＧ１−β１（４０ｎｇ／ｍｌ）および様々な濃度（最終容積１００μｌ中に１２．８ｐｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌ）の抗体を細胞に添加した。ＮＲＧ１−β１刺激の３日後に、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイを実施した。
【０２０２】
マウス抗ヒトＥｒｂＢ３抗体による、ＭＣＦ７細胞のＮＲＧ１−β１依存性増殖の用量依存的阻害の一例を図１０に示す。モノクローナル抗体０４Ｄ０１、０９Ｄ０３、１１Ｇ０１、１２Ａ０７、１８Ｈ０２、２２Ａ０２、および２４Ｃ０５による、ＮＲＧ１−β１依存性ＭＣＦ７細胞増殖阻害のデータを表８に要約する。
【０２０３】
【表１４】
0005906233.tif 000077
【０２０４】
表８の結果は、抗体０４Ｄ０１、０９Ｄ０３、１１Ｇ０１、１２Ａ０７、１８Ｈ０２、２２Ａ０２、および２４Ｃ０５が、ＭＣＦ７細胞のＮＲＧ１−β１誘導性増殖を強力に阻害したことを実証する。
【０２０５】
実施例１で作成された抗体はまた、ＥｒｂＢ３発現ヒト癌細胞の増殖を阻害する能力についても試験された。乳癌細胞ＳＫＢＲ−３はＨｅｒ２を過剰発現し、Ｈｅｒ２特異的阻害抗体に対して感受性である。
【０２０６】
ＳＫＢＲ３細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＴＢ−３０）は、ＡＴＣＣによる推奨に従って維持された。５μｇ／ｍｌの抗体存在下であるが外来性ＮＲＧ１−β１不在下で、９６ウェルプレートに５，０００細胞／ウェルで細胞を播種した。３日間の培養後に、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイを実施した。
【０２０７】
マウス抗ヒトＥｒｂＢ３抗体による、ＳＫＢＲ−３細胞の細胞増殖阻害の一例を図１１に示す。図１１の結果は、抗体０４Ｄ０１、０９Ｄ０３、１１Ｇ０１、１２Ａ０７、１８Ｈ０２、２２Ａ０２、および２４Ｃ０５が、ＳＫＢＲ−３細胞の増殖を阻害したことを示す。
【０２０８】
実施例７−下流シグナル伝達の阻害
本実施例は、ＰＩ３Ｋ活性化の読み取りとして、ＥｒｂＢ３と下流キナーゼＡｋｔのＮＲＧ１−β１依存性リン酸化を阻害する能力に関する、実施例１で作成された抗体の特性解析について述べる。これらの抗体はまた、指数関数的に増殖する細胞中における、ＥｒｂＢ３およびＡｋｔの定常状態リン酸化を阻害する能力についても試験された。
【０２０９】
乳癌細胞ＳＫＢＲ−３およびＭＣＦ７、そして前立腺癌細胞ＤＵ１４５は、ＡＴＣＣの推奨に従って維持された。細胞を０％ＦＢＳ中で一晩飢餓状態にして、５μｇ／ｍｌの抗体で１時間処理し、ＮＲＧ１−β１刺激がそれに続いた。溶解産物は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号ＤＹＣ１７６９）からのホスホ−ＥｒｂＢ３キットによるＥＬＩＳＡ、またはＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇからのホスホ−ＡｋｔＥＬＩＳＡキット（カタログ番号７１４３）のどちらかを用いて分析した。
【０２１０】
ＳＫＢＲ−３細胞中における、ＥｒｂＢ３のＮＲＧ１−β１誘導性リン酸化のマウス抗ヒトＥｒｂＢ３抗体による阻害の一例を図１２に示す。図１２の結果は、抗体０４Ｄ０１、０９Ｄ０３、１１Ｇ０１、１２Ａ０７、１８Ｈ０２、２２Ａ０２、および２４Ｃ０５が、ＳＫＢＲ−３細胞中でＮＲＧ１−β１によって誘導されるＥｒｂＢ３リン酸化の少なくとも５０％を阻害したことを実証する。
【０２１１】
ＭＣＦ７およびＤＵ１４５細胞中における、ＡｋｔのＮＲＧ１−β１誘導性リン酸化のマウス抗ヒトＥｒｂＢ３抗体による阻害の一例をそれぞれ図１３Ａおよび図１３Ｂに示す。図１３Ａおよび１３Ｂの結果は、ＭＣＦ７およびＤＵ１４５細胞の双方で、抗体０４Ｄ０１、０９Ｄ０３、１１Ｇ０１、１２Ａ０７、１８Ｈ０２、２２Ａ０２、および２４Ｃ０５が、ＮＲＧ１−β１に応えたＡｋｔリン酸化を少なくとも８０％阻害することを実証する。
【０２１２】
指数関数的に増殖する細胞を５μｇ／ｍｌの抗体の存在下で１時間処理することにより、乳癌細胞系ＳＫＢＲ−３および膵臓癌細胞系ＢｘＰＣ３中において、ＥｒｂＢ３およびＡｋｔの定常状態リン酸化状態を阻害する、抗ＥｒｂＢ３抗体の能力を試験した。
【０２１３】
これらの実験のウエスタンブロット分析は、抗体０４Ｄ０１、０９Ｄ０３、１１Ｇ０１、１２Ａ０７，１８Ｈ０２、２２Ａ０２、および２４Ｃ０５が、ＳＫＢＲ−３およびＢｘＰＣ３細胞の双方で、ＡｋｔおよびＥｒｂＢ３の定常状態レベルのリン酸化を阻害することを実証した。
【０２１４】
実施例８−ＮＲＧ１−β１誘導性ＥＧＦＲリン酸化の阻害
本実施例では、実施例１で作成された抗体を卵巣癌細胞系ＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ中で、ＥＧＦＲのＮＲＧ１−β１依存性リン酸化を阻害する能力について試験した。ＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ細胞（ＤＴＰ／ＤＣＴＤＮＣＩ腫瘍リポジトリ）を０％ＦＢＳ中で一晩飢餓状態にして、抗体（５μｇ／ｍｌ）で１時間前処理し、１５分間のＮＲＧ１−β１（２０ｎｇ／ｍｌ）刺激がそれに続いた。チロシン１０６８上におけるＥＧＦＲのリン酸化をウエスタンブロットによって分析した。本実験の結果は、ＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ細胞中において、抗体０４Ｄ０１、０９Ｄ０３、１１Ｇ０１、１２Ａ０７、１８Ｈ０２、２２Ａ０２、および２４Ｃ０５が、ＮＲＧ１−β１に応えたＥＧＦＲリン酸化を阻害することを実証した。
【０２１５】
実施例９−ＥＧＦ誘導性ＥｒｂＢ３リン酸化の阻害
本実施例では、ＥＧＦＲ過剰発現，類表皮癌細胞系Ａ４３１内で、ＥｒｂＢ３のＥＧＦ依存性リン酸化を阻害する能力について、実施例１で作成された抗体を試験した。Ａ４３１細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ−１５５５）を０％ＦＢＳで一晩飢餓状態にして、抗体（５μｇ／ｍｌ）で１時間前処理し、１５分間のＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２３６−ＥＧ）（５０ｎｇ／ｍｌ）刺激がそれに続いた。ＥｒｂＢ３のリン酸化をウエスタンブロットによって分析した。本実験の結果は、Ａ４３１細胞中において、抗体０４Ｄ０１、０９Ｄ０３、１２Ａ０７、１８Ｈ０２、２２Ａ０２、および２４Ｃ０５が、ＥＧＦに応えたＥｒｂＢ３リン酸化を様々な程度に阻害することを実証した。
【０２１６】
実施例１０−ＮＲＧ１−β１誘導性Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ３ヘテロ二量体形成の阻害
本実施例は、ＳＫＢＲ−３細胞中において、ＮＲＧ１−β１に応えたＨｅｒ２／ＥｒｂＢ３二量体の形成を阻害する能力に関する、実施例１で作成された抗体の特性解析について述べる。乳癌細胞ＳＫＢＲ−３を０％ＦＢＳで一晩飢餓状態にして、５μｇ／ｍｌの抗体で１時間処理し、ＮＲＧ１−β１刺激（３０ｎｇ／ｍｌ、３０分間）がそれに続いた。溶解産物を抗Ｈｅｒ２抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＢＡＦ１１２９）で免疫沈降させ、ポリクローナル抗ＥｒｂＢ３抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ、カタログ番号ＳＣ２８５）を用いたウエスタンブロットによって分析した。
【０２１７】
本実験の結果は、抗体０４Ｄ０１、０９Ｄ０３、１１Ｇ０１、１２Ａ０７、１８Ｈ０２、２２Ａ０２、および２４Ｃ０５が、ＳＫＢＲ−３細胞中におけるＮＲＧ１−β１−誘導性Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ３二量体形成を阻害することを実証する。
【０２１８】
実施例１１−ＢｘＰＣ３腫瘍異種移植成長の阻害
実施例１で作成されたマウスモノクローナル抗体が、膵臓ＢｘＰＣ３異種移植モデル中で、腫瘍成長を阻害する能力を試験した。１０％ウシ胎仔血清を含有するＲＭＰＩ培地を使用して、ヒト膵臓ＢｘＰＣ３細胞を５％ＣＯ２含有雰囲気内において３７℃で培養した。８週齢のメスＣＢ。１７ＳＣＩＤマウス（ＴａｃｏｎｉｃＬａｂｓ）に、マウスあたり１０ｘ１０６細胞で、５０％マトリゲル（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号３５６２３７）中のＢｘＰＣ３細胞を側腹部に皮下接種した。ノギスを使用して、腫瘍測定を週に２回実施した。式：幅×幅×長さ／２を使用して、腫瘍体積を計算した。腫瘍がおよそ２００ｍｍ３に達すると、それぞれ１０匹ずつの９群にマウスを無作為化した。１つの群にはＰＢＳを投与し、別の群にはヒトＩｇＧ対照（ｈｕＩｇＧ）を投与した。他の８群には、それぞれ０４Ｄ０１、０９Ｄ０３、１８Ｈ０２、１１Ｇ０１、２４Ｃ０５、２２Ａ０２、または１２Ａ０７の抗体の１つを投与した。全ての抗体は、腹腔内注射によって２０ｍｇ／ｋｇ体重で６週間にわたり週２回投与した。腫瘍体積およびマウス体重を週に２回記録した。腫瘍成長阻害をＡＮＯＶＡを使用して分析し、ＰＢＳ対照と比較した阻害率として表す。
【０２１９】
図１４の結果は、このモデルにおいて抗体２４Ｃ０５が、腫瘍成長を７６％阻害することを示す（ｐ＜０．００１）。抗体０４Ｄ０１、１８Ｈ０２、および１１Ｇ０１はまた、このモデルにおいて、腫瘍成長をそれぞれ６４％、７１％、および７２％（ｐ＜０．００１）阻害する。抗体１２Ａ０７および２２Ａ０２が最小の活性すなわち約４０％の腫瘍成長阻害を実証したのに対し、抗体０９Ｄ０３はこのモデルで６０％の腫瘍成長阻害を与えた。
【０２２０】
実施例１２−抗ＥｒｂＢ３抗体のヒト化
Ａ．ヒト化およびキメラ抗ＥｒｂＢ３抗体の構築
本実施例は、２４Ｃ０５と命名されたマウス抗体のヒト化と、得られたヒト化抗体の特性解析について述べる。ヒト化抗ＥｒｂＢ３抗体は、ＳＵＰＥＲＨＵＭＡＮＩＺＡＴＩＯＮ（商標）法（Ａｒａｎａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｌｔｄ．ａｎｄ  Ｈｗａｎｇ，Ｗ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）ＭＥＴＨＯＤＳ  ３６：３５−４２）、または（いくつかのヒトフレームワーク残基がマウス残基に変更される）復帰突然変異によるＣＤＲグラフト法（例えば米国特許第５，５３０，１０１号明細書；米国特許第５，６９３，７６１号明細書；米国特許第５，６９３，７６２号明細書；米国特許第５，５８５，０８９号明細書；米国特許第６，１８０，３７０号明細書；米国特許第７，０２２，５００号明細書を参照されたい）を使用してデザインされた。重鎖ＣＤＲ１を除いて、ヒトフレームワーク上へのＣＤＲグラフトには、ＫａｂａｔＣＤＲ定義を使用した。重鎖ＣＤＲ１をグラフトするために、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ定義の組み合わせを使用した。デザインされたアミノ酸配列はコドン最適化ＤＮＡ配列に転換され、ＤＮＡ２．０，Ｉｎｃ．によって合成され、以下を（この順で）含む：５’ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位、コザックコンセンサス配列、アミノ末端シグナル配列、ヒト化可変領域、ヒトＩｇＧ１またはκ定常領域、停止コドン、および３’ＥｃｏＲＩ制限部位。さらにオーバーラップ伸長ＰＣＲを使用して、１本のヒト化重鎖Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  重ＩｇＧ１を変異させてヒト化を促進し、Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  Ｎ６２Ｓ重鎖ＩｇＧ１がもたらされた。Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  Ｎ６２Ｓ重鎖のヒトＩｇＧ２バージョンもまた構築された。
【０２２１】
本明細書に記載されるＳＵＰＥＲＨＵＭＡＮＩＺＡＴＩＯＮ（商標）法に従ってヒト化された抗ＥｒｂＢ３抗体鎖は、抗体鎖名の前に接頭辞「Ｓｈ」を付けて命名される。本明細書に記載される復帰突然変異を用いたＣＤＲグラフト法によってヒト化された抗ＥｒｂＢ３抗体鎖は、抗体鎖名の前に接頭辞「Ｈｕ」を付けて命名される。
【０２２２】
キメラ（マウス可変領域およびヒト定常領域）２４Ｃ０５重鎖（ヒトＩｇＧ１）および軽鎖（ヒトκ）鎖もまた構築された。マウス可変領域はオーバーラップ伸長ＰＣＲを使用してヒト定常領域と融合され、以下を（この順で）含む：５’ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位，コザックコンセンサス配列、アミノ末端シグナル配列、マウス可変領域、ヒトＩｇＧ１またはκ定常領域、停止コドン、および３’ＥｃｏＲＩ制限部位。
【０２２３】
Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（商標）ＰＣＲクローニング（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位を通じて、ヒト化およびキメラ重鎖をｐＥＥ６．４（ＬｏｎｚａＢｉｏｌｏｇｉｃｓ）にサブクローニングした。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（商標）ＰＣＲクローニングを使用して、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位を通じて、ヒト化およびキメラκ軽鎖をｐＥＥ１４．４（ＬｏｎｚａＢｉｏｌｏｇｉｃｓ）にサブクローニングした。
【０２２４】
ヒト化抗体鎖またはキメラ抗体鎖を２９３Ｔ細胞に一過性に形質移入して、抗体を作成した。引き続く生体外分析のために、抗体を精製し、または細胞培養液上清中で使用した。キメラおよびヒト化抗体とヒトＥｒｂＢ３との結合を下述するようにして測定した。得られた結果を下の表１５に要約する。
【０２２５】
さらにまた、大量の精製ヒト化抗体を生成するために、ＧＳシステム（商標）（ＬｏｎｚａＢｉｏｌｏｇｉｃｓ）を使用して、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞内でいくつかのヒト化抗体重および軽鎖の組み合わせを安定して発現させた。ｐＥＥ６．４およびｐＥＥ１４．４ベースのベクターを組み合わせて、単一発現ベクターを構築した。最初に、ｐＥＥ６．４含有完全長ヒト化重鎖ｃＤＮＡをＮｏｔＩおよびＳａｌＩで消化して、ｈＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター＋完全長ヒト化重鎖ｃＤＮＡ＋ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ断片を単離した。この断片を完全長ヒト化軽鎖ｃＤＮＡを既に含有するｐＥＥ１４．４ベクターに、ＮｏｔＩ／ＳａｌＩ部位を通じて挿入し、それによって重および軽鎖を同時に発現する発現ベクターを作り出した。合わせた重および軽鎖ベクターを直線化して、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞に形質移入した。メチオニンスルホキシイミンの存在下で、安定クローンを選択した。
【０２２６】
ヒト化免疫グロブリン重鎖と免疫グロブリン軽鎖可変領域との可能な各組み合わせを下の表９に示す．
【０２２７】
【表１５】
0005906233.tif 000078
【０２２８】
【表１６】
0005906233.tif 000079
【０２２９】
ヒト化２４Ｃ０５抗体の可変領域をコードする核酸配列、およびそれを画定するタンパク質配列を下に要約する（アミノ末端シグナルペプチド配列は示されない）。ＣＤＲ配列（Ｋａｂａｔ定義）は、アミノ酸配列中で太字で示され下線付きである。
【０２３０】
Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−７重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号１４９）
【化６３】
0005906233.tif 000080
【０２３１】
Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−７重鎖可変領域を画定するタンパク質配列（配列番号１５０）
【化６４】
0005906233.tif 000081
【０２３２】
Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号１５１）
【化６５】
0005906233.tif 000082
【０２３３】
Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  重鎖可変領域を画定するタンパク質配列（配列番号１５２）
【化６６】
0005906233.tif 000083
【０２３４】
Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  Ｎ６２Ｓ重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号１５３）
【化６７】
0005906233.tif 000084
【０２３５】
Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  Ｎ６２Ｓ重鎖可変領域を画定するタンパク質配列（配列番号１５４）
【化６８】
0005906233.tif 000085
【０２３６】
Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−２１重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号１５５）
【化６９】
0005906233.tif 000086
【０２３７】
Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−２１重鎖可変領域を画定するタンパク質配列（配列番号１５６）
【化７０】
0005906233.tif 000087
【０２３８】
Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−２３重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号１５７）
【化７１】
0005906233.tif 000088
【０２３９】
Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−２３重鎖可変領域を画定するタンパク質配列（配列番号１５８）
【化７２】
0005906233.tif 000089
【０２４０】
Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−３０重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号１５９）
【化７３】
0005906233.tif 000090
【０２４１】
Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−３０重鎖可変領域を画定するタンパク質配列（配列番号１６０）
【化７４】
0005906233.tif 000091
【０２４２】
Ｈｕ２４Ｃ０５  ＨｖＡ重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号１６１）
【化７５】
0005906233.tif 000092
【０２４３】
Ｈｕ２４Ｃ０５  ＨｖＡ重鎖可変領域を画定するタンパク質配列（配列番号１６２）
【化７６】
0005906233.tif 000093
【０２４４】
Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−９κ鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号１６３）
【化７７】
0005906233.tif 000094
【０２４５】
Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−９κ鎖可変領域を画定するタンパク質配列（配列番号１６４）
【化７８】
0005906233.tif 000095
【０２４６】
Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−１６κ鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号１６５）
【化７９】
0005906233.tif 000096
【０２４７】
Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−１６κ鎖可変領域を画定するタンパク質配列（配列番号１６６）
【化８０】
0005906233.tif 000097
【０２４８】
Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−１７κ鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号１６７）
【化８１】
0005906233.tif 000098
【０２４９】
Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−１７κ鎖可変領域を画定するタンパク質配列（配列番号１６８）
【化８２】
0005906233.tif 000099
【０２５０】
Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−３３κ鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号１６９）
【化８３】
0005906233.tif 000100
【０２５１】
Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−３３κ鎖可変領域を画定するタンパク質配列（配列番号１７０）
【化８４】
0005906233.tif 000101
【０２５２】
Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−３９κ鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号１７１）
【化８５】
0005906233.tif 000102
【０２５３】
Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−３９κ鎖可変領域を画定するタンパク質配列（配列番号１７２）
【化８６】
0005906233.tif 000103
【０２５４】
Ｈｕ２４Ｃ０５  ＫｖＡκ鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号１７３）
【化８７】
0005906233.tif 000104
【０２５５】
Ｈｕ２４Ｃ０５  ＫｖＡκ鎖可変領域を画定するタンパク質配列（配列番号１７４）
【化８８】
0005906233.tif 000105
【０２５６】
実施例１２で作成された抗体について、免疫グロブリン重鎖可変領域を画定するアミノ酸配列を図１５で配列比較する。（適切な発現／分泌のための）アミノ末端シグナルペプチド配列は、示されない。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３（Ｋａｂａｔ定義）は、ボックスによって同定される。
【０２５７】
実施例１２の抗体について、免疫グロブリン軽鎖可変領域を画定するアミノ酸配列を図１６で配列比較する。（適切な発現／分泌のための）アミノ末端シグナルペプチド配列は、示されない。
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、ボックスによって同定される。
【０２５８】
表１０は、本明細書の実施例で考察される各配列の配列番号を示す、一致度チャートである。
【０２５９】
【表１７】
0005906233.tif 000106
【０２６０】
【表１８】
0005906233.tif 000107
【０２６１】
【表１９】
0005906233.tif 000108
【０２６２】
ヒト化マウスモノクローナル抗体重鎖ＣＤＲ配列（Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、およびＩＭＧＴ定義）を表１１に示す。
【０２６３】
【表２０】
0005906233.tif 000109
【０２６４】
【表２１】
0005906233.tif 000110
【０２６５】
ヒト化マウスモノクローナル抗体κ軽鎖ＣＤＲ配列（Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、およびＩＭＧＴ定義）を表１２に示す。
【０２６６】
【表２２】
0005906233.tif 000111
【０２６７】
【表２３】
0005906233.tif 000112
【０２６８】
表１１および１２では、免疫グロブリン重鎖および軽鎖について最長ＣＤＲ配列を太字で示す。
【０２６９】
完全長ヒト化重鎖またはκ鎖抗体配列を作り出すために、上の各可変配列をそれぞれのヒト定常領域と組み合わせる。例えば完全長重鎖は、重鎖可変配列と、それに続くヒトＩｇＧ１重鎖定常配列またはヒトＩｇＧ２重鎖定常配列を含んでなる。完全長κ鎖は、κ可変配列と、それに続くヒトκ軽鎖定常配列を含んでなる。
【０２７０】
ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域をコードする核酸配列（配列番号１７５）
【化８９】
0005906233.tif 000113
【０２７１】
ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を画定するタンパク質配列（配列番号１７６）
【化９０】
0005906233.tif 000114
【０２７２】
ヒトＩｇＧ２重鎖定常領域をコードする核酸配列（配列番号１７７）
【化９１】
0005906233.tif 000115
【０２７３】
ヒトＩｇＧ２重鎖定常領域を画定するタンパク質配列（配列番号１７８）
【化９２】
0005906233.tif 000116
【０２７４】
ヒトκ軽鎖定数領域をコードする核酸配列（配列番号１７９）
【化９３】
0005906233.tif 000117
【０２７５】
ヒトκ軽鎖定常領域を画定するタンパク質配列（配列番号１８０）
【化９４】
0005906233.tif 000118
【０２７６】
以下の配列は本実施例で説明される各抗体について、実際のまたは熟考された完全長重鎖および軽鎖配列（すなわち可変および定常領域配列の双方を含有する）を表わす。抗体の適切な分泌のためのシグナル配列もまた、ＤＮＡ配列の５’末端、またはタンパク質配列のアミノ末端に含まれる。可変領域配列をその他の定常領域配列にライゲートして、活性完全長ＩｇＧ重鎖および軽鎖を生成し得ることも本明細書で熟考された。
【０２７７】
完全長キメラ２４Ｃ０５重鎖（マウス重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域）をコードする核酸配列（配列番号１８１）
【化９５】
0005906233.tif 000119
【０２７８】
完全長キメラ２４Ｃ０５重鎖（マウス重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域）を画定するタンパク質配列（配列番号１８２）
【化９６】
0005906233.tif 000120
【０２７９】
完全長キメラ２４Ｃ０５軽鎖（マウスκ鎖可変領域およびヒトκ定常領域）をコードする核酸配列（配列番号１８３）
【化９７】
0005906233.tif 000121
【０２８０】
完全長キメラ２４Ｃ０５軽鎖（マウスκ鎖可変領域およびヒトκ定常領域）を画定するタンパク質配列（配列番号１８４）
【化９８】
0005906233.tif 000122
【０２８１】
完全長ヒト化ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−７重鎖（ヒト化重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域）をコードする核酸配列（配列番号１８５）
【化９９】
0005906233.tif 000123
【０２８２】
完全長ヒト化Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−７重鎖（ヒト化重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ定常領域）を画定するタンパク質配列（配列番号１８６）
【化１００】
0005906233.tif 000124
【０２８３】
完全長ヒト化Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  重鎖（ヒト化重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域）をコードする核酸配列（配列番号１８７）
【化１０１】
0005906233.tif 000125
【０２８４】
完全長ヒト化Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  重鎖（ヒト化重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域）を画定するタンパク質配列（配列番号１８８）
【化１０２】
0005906233.tif 000126
【０２８５】
完全長ヒト化Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  Ｎ６２Ｓ  ＩｇＧ１重鎖（ヒト化重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域）をコードする核酸配列（配列番号１８９）
【化１０３】
0005906233.tif 000127
【０２８６】
完全長ヒト化Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  Ｎ６２Ｓ  ＩｇＧ１重鎖（ヒト化重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域）を画定するタンパク質配列（配列番号１９０）
【化１０４】
0005906233.tif 000128
【０２８７】
完全長ヒト化Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  Ｎ６２Ｓ  ＩｇＧ２重鎖（ヒト化重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ２定常領域をコードする核酸配列（配列番号１９１）
【化１０５】
0005906233.tif 000129
【０２８８】
完全長ヒト化Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  Ｎ６２Ｓ  ＩｇＧ２重鎖（ヒト化重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ２定常領域）を画定するタンパク質配列（配列番号１９２）
【化１０６】
0005906233.tif 000130
【０２８９】
完全長ヒト化Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−２１重鎖（ヒト化重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域）をコードする核酸配列（配列番号１９３）
【化１０７】
0005906233.tif 000131
【０２９０】
完全長ヒト化Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−２１重鎖（ヒト化重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域）を画定するタンパク質配列（配列番号１９４）
【化１０８】
0005906233.tif 000132
【０２９１】
完全長ヒト化Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−２３重鎖（ヒト化重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域）をコードする核酸配列（配列番号１９５）
【化１０９】
0005906233.tif 000133
【０２９２】
完全長ヒト化Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−２３重鎖（ヒト化重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域）を画定するタンパク質配列（配列番号１９６）
【化１１０】
0005906233.tif 000134
【０２９３】
完全長ヒト化Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−３０重鎖（ヒト化重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域）をコードする核酸配列（配列番号１９７）
【化１１１】
0005906233.tif 000135
【０２９４】
完全長ヒト化Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−３０重鎖（ヒト化重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域）を画定するタンパク質配列（配列番号１９８）
【化１１２】
0005906233.tif 000136
【０２９５】
完全長ヒト化Ｈｕ２４Ｃ０５  ＨｖＡ重鎖（ヒト化重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域）をコードする核酸配列（配列番号１９９）
【化１１３】
0005906233.tif 000137
【０２９６】
完全長ヒト化Ｈｕ２４Ｃ０５  ＨｖＡ重鎖（ヒト化重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域）を画定するタンパク質配列（配列番号２００）
【化１１４】
0005906233.tif 000138
【０２９７】
完全長ヒト化Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−９軽鎖（ヒト化κ鎖可変領域およびヒト定常領域）をコードする核酸配列（配列番号２０１）
【化１１５】
0005906233.tif 000139
【０２９８】
完全長ヒト化Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−９軽鎖（ヒト化κ鎖可変領域およびヒト定常領域）を画定するタンパク質配列（配列番号２０２）
【化１１６】
0005906233.tif 000140
【０２９９】
完全長ヒト化Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−１６軽鎖（ヒト化κ鎖可変領域およびヒト定常領域）をコードする核酸配列（配列番号２０３）
【化１１７】
0005906233.tif 000141
【０３００】
完全長ヒト化Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−１６軽鎖（ヒト化κ鎖可変領域およびヒト定常領域）を画定するタンパク質配列（配列番号２０４）
【化１１８】
0005906233.tif 000142
【０３０１】
完全長ヒト化Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−１７軽鎖（ヒト化κ鎖可変領域およびヒト定常領域）をコードする核酸配列（配列番号２０５）
【化１１９】
0005906233.tif 000143
【０３０２】
完全長ヒト化Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−１７軽鎖（ヒト化κ鎖可変領域およびヒト定常領域）を画定するタンパク質配列（配列番号２０６）
【化１２０】
0005906233.tif 000144
【０３０３】
完全長ヒト化ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−３３軽鎖（ヒト化κ鎖可変領域およびヒト定常領域）をコードする核酸配列（配列番号２０７）
【化１２１】
0005906233.tif 000145
【０３０４】
完全長ヒト化Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−３３軽鎖（ヒト化κ鎖可変領域およびヒト定常領域）を画定するタンパク質配列（配列番号２０８）
【化１２２】
0005906233.tif 000146
【０３０５】
完全長ヒト化Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−３９軽鎖（ヒト化κ鎖可変領域およびヒト定常領域）をコードする核酸配列（配列番号２０９）
【化１２３】
0005906233.tif 000147
【０３０６】
完全長ヒト化Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−３９軽鎖（ヒト化κ鎖可変領域およびヒト定常領域）を画定するタンパク質配列（配列番号２１０）
【化１２４】
0005906233.tif 000148
【０３０７】
完全長ヒト化Ｈｕ２４Ｃ０５  ＫｖＡ軽鎖（ヒト化κ鎖可変領域およびヒト定常領域）をコードする核酸配列（配列番号２１１）
【化１２５】
0005906233.tif 000149
【０３０８】
完全長ヒト化Ｈｕ２４Ｃ０５  ＫｖＡ軽鎖（ヒト化κ鎖可変領域およびヒト定常領域）を画定するタンパク質配列（配列番号２１２）
【化１２６】
0005906233.tif 000150
【０３０９】
便宜上、表１３は、本実施例で考察される各配列の配列番号を示す、一致度チャートを提供する。
【０３１０】
【表２４】
0005906233.tif 000151
【０３１１】
【表２５】
0005906233.tif 000152
【０３１２】
【表２６】
0005906233.tif 000153
【０３１３】
下の表１４は、キメラ免疫グロブリン重および軽鎖を含有する抗体と、完全長ヒト化免疫グロブリン重および軽鎖の可能な各組み合わせを示す。
【０３１４】
【表２７】
0005906233.tif 000154
【０３１５】
【表２８】
0005906233.tif 000155
【０３１６】
【表２９】
0005906233.tif 000156
【０３１７】
【表３０】
0005906233.tif 000157
【０３１８】
完全長キメラ重鎖および軽鎖を含有する抗体コンストラクトを下に示す：
キメラ２４Ｃ０５＝完全長キメラ２４Ｃ０５重鎖（マウス可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域）（配列番号１８２）プラス完全長キメラ２４Ｃ０５軽鎖（マウス可変領域およびヒトκ定常領域）（配列番号１８４）
【０３１９】
ヒト化可変領域を含有する完全長免疫グロブリン重鎖および軽鎖を含有する可能な抗体コンストラクトの内４つを下に示す：
Ｓｈ２４Ｃ０５−２５  Ｎ６２Ｓ  ＩｇＧ１＝ヒト化Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  Ｎ６２Ｓ重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域（配列番号１９０）プラスＳｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−１６軽鎖可変領域およびヒトκ定常領域（配列番号２０４）
Ｓｈ２４Ｃ０５−２５  Ｎ６２Ｓ  ＩｇＧ２＝ヒト化Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  Ｎ６２Ｓ重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ２定常領域（配列番号１９２）
プラスＳｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−１６軽鎖可変領域およびヒトκ定常領域（配列番号２０４）
Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ  ＩｇＧ１＝ヒト化Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  Ｎ６２Ｓ重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域（配列番号１９０）プラスＳｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−１７軽鎖可変領域およびヒトκ定常領域（配列番号２０６）
Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ  ＩｇＧ２＝ヒト化Ｓｈ２４Ｃ０５  Ｈｖ３−１１  Ｎ６２Ｓ重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ２定常領域（配列番号１９２）プラスＳｈ２４Ｃ０５  Ｋｖ１−１７軽鎖可変領域およびヒトκ定常領域（配列番号２０６）
【０３２０】
Ｂ．ヒト化およびキメラ抗ＥｒｂＢ３モノクローナル抗体の結合親和性
Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００（Ｂｉａｃｏｒｅ）装置を使用して、表面プラズモン共鳴によって、実施例１２で作成されたモノクローナル抗体の組換えヒトＥｒｂＢ３単量体タンパク質（切断ｒｈＥｒｂＢ３）に対する、結合親和性および相互作用動態を測定した。単量体ＥｒｂＢ３は、ｒｈＥｒｂＢ３−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３４８−ＲＢ）のプロテアーゼ切断によって得られた。
【０３２１】
標準カップリングプロトコルを使用して、供給業者の使用説明書に従って、アミンカップリング（Ｂｉａｃｏｒｅ，カタログ番号ＢＲ−１０００−５０）によって、ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−００５−０９８）をカルボキシメチル化デキストランＣＭ４センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１００５−３４）上に固定化した。０．０５％の界面活性剤Ｐ２０（Ｂｉａｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１０００−５４）を含有するＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１４０４０−１３３）を泳動用緩衝液として使用して、３７℃で分析を実施した。
【０３２２】
流速６０μｌ／分で、個々のフローセル内において抗体を捕捉した。各抗体毎に注入時間を変えて、Ｒ３０〜６０ＲＵのＲｍａｘを得た。緩衝液、または泳動用緩衝液で希釈した切断ｒｈＥｒｂＢ３を参照表面（抗体捕捉なし）および活性表面（試験抗体）上に６０μｌ／分で３００秒間逐次注入した。解離相を１２００秒までモニターした。次にｐＨ２．２５のグリシン（グリシンｐＨ２．０（Ｂｉａｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１００３−５６）およびｐＨ２．５（Ｂｉａｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１００３−５５）から作られた）を２回にわたり６０μｌ／分で６０秒間注入して、表面を再生した。最初のスクリーニングのために、典型的に５．０および１．２５ｎＭである１または２つの濃度のみで、切断ｒｈＥｒｂＢ３を試験した（結果を表１５に要約する）。
【０３２３】
ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ）の動態学機能を使用して、二重参照減法で動態学パラメータを測定した。各抗体の動態学パラメータ、ｋａ（結合速度定数）、ｋｄ（解離速度定数）、およびＫＤ（平衡解離定数）を測定した。分泌抗体を含有する細胞培養液上清を使用して、最初のモノクローナル抗体をスクリーニングし、３７℃における切断ｒｈＥｒｂＢ３に対するモノクローナル抗体の動力学値を表１５に要約する。
【０３２４】
【表３１】
0005906233.tif 000158
【０３２５】
【表３２】
0005906233.tif 000159
【０３２６】
表１５の結果は、ヒト化２４Ｃ０５抗体のキメラおよびそれぞれが、迅速な結合速度（ｋａ）、非常に緩慢な解離速度（ｋｄ）、および非常に高い親和性（ＫＤ）を有することを実証する）．特に抗体は、約８７ｐＭから約１ｎＭの範囲にわたる親和性を有する。
【０３２７】
特定の精製モノクローナル抗体の結合親和性および動態もまた測定した。特定の抗体をさらに特性解析するために、０．３１２５ｎＭ〜５．０ｎＭ（２倍連続希釈）濃度の切断ｒｈＥｒｂＢ３を使用して、上述の表面プラズモン共鳴実験を実施した。
【０３２８】
特定の精製モノクローナル抗体（すなわちＳｈ２４Ｃ０５−１、Ｓｈ２４Ｃ０５−２５、Ｓｈ２４Ｃ０５−２５  Ｎ６２Ｓ  ＩｇＧ１、Ｓｈ２４Ｃ０５−２５  Ｎ６２Ｓ  ＩｇＧ２、Ｓｈ２４Ｃ０５−３１、Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ  ＩｇＧ１、およびＳｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ  ＩｇＧ２）の切断ｒｈＥｒｂＢ３に対する３７℃における動力学値を表１６に要約する。
【０３２９】
【表３３】
0005906233.tif 000160
【０３３０】
表１６の結果は、３７Ｃで試験すると、精製抗体が、約６３ｐＭ〜約１６０ｐＭの範囲にわたる親和性を有することを実証する。
【０３３１】
Ｃ．その他の抗ＥｒｂＢ３抗体の比較
公表された情報を使用して、ヒトＥｒｂＢ３の機能を阻害する３種のヒト抗体を構築し発現させた。Ａｂ＃６と称される１つの抗体は、Ｓｃｈｏｅｂｅｒｌらに付与された米国特許第２００９／０２９１０８５号明細書（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）の開示に基づいて、ヒトＩｇＧ２／λ抗体として構築された．）．Ｕ１−５３およびＵ１−５９と称される２種の追加的抗体は、Ｒｏｔｈｅらに付与された米国特許第２００８／０１２４３４５号明細書（Ｕ３  Ｐｈａｒｍａ  ＡＧ  ａｎｄ  Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．）の開示に基づいて、ヒトＩｇＧ１／κ抗体として構築された。
【０３３２】
上述のように切断ｒｈＥｒｂＢ３（モノマー）を使用して、Ａｂ＃６、Ｕ１−５３、およびＵ１−５９抗体の動態学パラメータをＢｉａｃｏｒｅによって３７℃で測定した（セクションＢ．「ヒト化およびキメラ抗ＥｒｂＢ３モノクローナル抗体の結合親和性」を参照されたい）。各抗体について、Ｂｉａｃｏｒｅセンサーグラム（図１７）および動力学値（表１７）の双方を示す。
【０３３３】
【表３４】
0005906233.tif 000161
【０３３４】
表１７の結果は、Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ  ＩｇＧ１（７６ｐＭ）の全体的平衡解離定数（ＫＤ）が、Ａｂ＃６およびＵ１−５９抗体のＫＤ（それぞれ２３０ｐＭ（ｐ＜０．０１）および５３０ｐＭ（ｐ＜０．０００５）よりも低い（すなわち親和性がより高い）ことを実証する。Ｕ１−５３の平衡解離定数（ＫＤ）は、曲線適合が不良であったため測定できなかった（Ｕ１−５３の迅速なＫｏｆｆ速度を示す図１７参照）。表１６および１７を比較することで、Ａｂ＃６、Ｕ１−５３、およびＵ１−５９抗体のＫＤをその他のヒト化２４Ｃ０５変種ともまた比較し得る。
【０３３５】
したがって本明細書で開示されるように、Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ  ＩｇＧ１の親和性は、Ａｂ＃６およびＵ１−５９の親和性よりも顕著に高い。
【０３３６】
実施例１３−ヒト化抗ＥｒｂＢ３抗体の中和活性
本実施例では、ＥＣＬアッセイによって、ｒｈＥｒｂＢ３とＮＲＧ１−β１の結合を阻害する能力について、実施例１２で作成されたヒト化抗体を試験した。５０μｌのＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１４０４０−１３３）中の０．５μｇ／ｍＬｒｈＥｒｂＢ３／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３４８−ＲＢ）によって、マルチアレイ９６ウェル標準結合プレート（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、カタログ番号Ｌ１５ＸＡ−３）を室温で撹拌せずに１時間被覆した。次にプレートをＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＳｉｇｍａＰ５９２７）で３回洗浄し、２００μｌの１００％熱不活性化ウマ血清（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号２６０５０−０８８）により、室温で１．５時間ブロックした。プレートをＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、室温でさらに１時間撹拌しながら、２５μｌの抗体希釈液をプレートに添加した。リガンドＮＲＧ１−β３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３７７−ＨＢ、２６ｋＤａ）を最終濃度０．２５μｇ／ｍｌでウェルに添加した。プレートをＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、ＳＵＬＴＯ−ＴＡＧストレプトアビジン（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、カタログ番号Ｒ３２ＡＤ−５）と共に１時間プレインキュベートされた、２５μｌの１μｇ／ｍＬ抗ヒトＮＲＧ１−β１ビオチン化抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＢＡＦ３７７）と共に、室温で撹拌しながら１時間インキュベートした。次にプレートをＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、Ｓｅｃｔｏｒ（登録商標）Ｉｍａｇｅｒ２４００（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）装置上でプレートを分析する前に、１５０μｌの１×読み取り緩衝液（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、カタログ番号Ｒ９２ＴＣ−１）を各ウェルに添加した。
【０３３７】
ＮＲＧ１−β１とｒｈＥｒｂＢ３の相互作用は、抗体Ｓｈ２４Ｃ０５−２５  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１、Ｓｈ２４Ｃ０５−２５  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ２、Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１、およびＳｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ２によって阻害された（図１８Ａ）。Ｓｃｈｏｅｂｅｒｌ  ｅｔ  ａｌ．（前出）に記載されるＡｂ＃６ＩｇＧ２抗体、およびＲｏｔｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（前出）に記載されるＵ１−５３およびＵ１−５９抗体もまた、ＥｒｂＢ３とＮＲＧ１−β１の結合を阻害する能力について試験した。図１８Ｂに示すように、Ａｂ＃６ＩｇＧ２、Ｕ１−５３、およびＵ１−５９の各抗体は、ＥｒｂＢ３とＮＲＧ１−β１の結合を阻害した。
【０３３８】
ヒト化２４Ｃ０５抗体（すなわちＳｈ２４Ｃ０５−２５  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１、Ｓｈ２４Ｃ０５−２５  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ２、Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１、およびＳｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ２）による、ＮＲＧ１−β１とｈＥｒｂＢ３の結合中和について、ＩＣ５０値を計算し表１８に要約する。抗ＥｒｂＢ３ヒト抗体Ａｂ＃６ＩｇＧ２、Ｕ１−５３、およびＵ１−５９のＮＲＧ１−β１中和活性に関するＩＣ５０値もまた、表１８に示される。
【０３３９】
【表３５】
0005906233.tif 000162
【０３４０】
表１８の結果は、抗体Ｓｈ２４Ｃ０５−２５  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１，Ｓｈ２４Ｃ０５−２５  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ２，Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１、およびＳｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ２が、ＮＲＧ１−β１とｒｈＥｒｂＢ３の結合を効率的に中和したことを実証する。抗ＥｒｂＢ３ヒト抗体Ａｂ＃６ＩｇＧ２、Ｕ１−５３、およびＵ１−５９もまた中和活性を示すが、ヒト化Ｓｈ２４Ｃ０５抗体（すなわちＳｈ２４Ｃ０５−２５  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１、Ｓｈ２４Ｃ０５−２５  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ２、Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１、およびＳｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ２）は、Ｕ１−５９またはＡｂ＃６ＩｇＧ２よりも優れた中和能力を有した。
【０３４１】
実施例１４−抗増殖性活性
本実施例では、ヒトＨｅｒ２およびＥｒｂＢ３の双方を発現するように遺伝子改変されたＢａＦ／３細胞系において、細胞のＮＲＧ１−β１依存性増殖を阻害する能力について、実施例１２で作成されたヒト化抗体を試験した。
【０３４２】
ＷＥＨＩ馴化培地不在下であるがＮＲＧ１−β１（１００ｎｇ／ｍｌ）存在下で、実施例６に記載されるＨｅｒ２およびＥｒｂＢ３受容体を発現するＢａＦ／３細胞を抗ＥｒｂＢ３抗体で処理した。アッセイは、ＮＲＧ１−β１（１００ｎｇ／ｍｌ）および様々な濃度（最終容積１００μｌ中に０．０１８〜５０００ｎｇ／ｍｌ）の抗体の存在下、９６ウェルプレート（５，０００細胞／ウェル）内で実施した。ＮＲＧ１−β１刺激の３〜４日間後に、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイを実施した。
【０３４３】
結果は、Ｓｈ２４Ｃ０５−２５  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１、Ｓｈ２４Ｃ０５−２５  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ２、Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１、およびＳｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ２が、ＮＲＧ誘導性Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ３−ＢａＦ／３細胞増殖を用量依存様式で阻害することを実証する（図１９Ａ）。
【０３４４】
ヒト化２４Ｃ０５抗体（すなわちＳｈ２４Ｃ０５−２５  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１、Ｓｈ２４Ｃ０５−２５  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ２、Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１、Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ２）による、ＮＲＧ１−β１依存性Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ３−ＢａＦ／３細胞系増殖阻害について、ＩＣ５０値を計算し表１９に要約する。
【０３４５】
【表３６】
0005906233.tif 000163
【０３４６】
表１９の結果は、抗体Ｓｈ２４Ｃ０５−２５  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１，Ｓｈ２４Ｃ０５−２５  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ２，Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１、およびＳｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ２が、Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ３を発現するＢａＦ／３細胞のＮＲＧ１−β１−誘導性増殖を強力に阻害したことを実証する。
【０３４７】
抗ＥｒｂＢ３Ａｂ＃６ＩｇＧ２、Ｕ１−５３、およびＵ１−５９抗体の阻害活性は、ＮＲＧ１−β１依存性Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ３−ＢａＦ／３細胞増殖アッセイ中でもまた試験した。図１９Ｂに示すように、結果は、Ａｂ＃６ＩｇＧ２、Ｕ１−５３、およびＵ１−５９抗体が、ＮＲＧ誘導性Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ３−ＢａＦ／３細胞増殖を用量依存様式で阻害することを実証した。抗体Ａｂ＃６ＩｇＧ２、Ｕ１−５３、およびＵ１−５９によるＮＲＧ１−β１依存性Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ３−ＢａＦ／３細胞増殖の阻害データを表１９に要約する。表１９の結果は、抗体Ａｂ＃６ＩｇＧ２、Ｕ１−５３、およびＵ１−５９が、Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ３−ＢａＦ／３細胞のＮＲＧ１−β１−誘導性増殖を阻害することを実証する。ＮＲＧ１−β１依存性Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ３−ＢａＦ／３細胞増殖アッセイにおける、試験された抗ＥｒｂＢ３抗体の阻害活性の比較は、ヒト化Ｓｈ２４Ｃ０５抗体の阻害活性が、Ａｂ＃６ＩｇＧ２、Ｕ１−５３、およびＵ１−５９抗体の阻害活性よりも優れていることを示す（例えばＵ１−５３では０．８１２８ｎＭであったのに対して、Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１のＩＣ５０は０．１２４５ｎＭであった）。
【０３４８】
実施例１５−ＳＫＢＲ−３細胞中における下流シグナル伝達の阻害
本実施例は、指数関数的に増殖するＳＫＢＲ−３細胞中で全ＥｒｂＢ３を分解し、ＥｒｂＢ３のリン酸化を阻害する能力に関する、実施例１２で作成されたヒト化抗体の特性解析について述べる。
【０３４９】
乳癌ＳＫＢＲ−３細胞は、ＡＴＣＣの推奨に従って維持された。全血清条件で維持された細胞を４０μｇ／ｍｌの抗ＥｒｂＢ３抗体（すなわちＳｈ２４Ｃ０５−２５  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１，Ｓｈ２４Ｃ０５−２５  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ２，Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１、およびＳｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ２）で、１、２、４または６時間処理した。溶解産物は、Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓからのＴｏｔａｌ−ＥｒｂＢ３およびホスホ−ＥｒｂＢ３キットのどちらかによるＥＬＩＳＡ（それぞれカタログ番号ＤＹＣ２３４およびカタログ番号ＤＹＣ１７６９）を用いて分析した。
【０３５０】
結果はまた、抗ＥｒｂＢ３抗体Ｓｈ２４Ｃ０５−２５  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１、Ｓｈ２４Ｃ０５−２５  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ２、Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１、およびＳｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ２が、指数関数的に増殖するＳＫＢＲ−３細胞中のＥｒｂＢ３リン酸化の少なくとも５０％を阻害したことも実証する（図２０）。
【０３５１】
結果はまた、抗ＥｒｂＢ３抗体Ｓｈ２４Ｃ０５−２５  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１、Ｓｈ２４Ｃ０５−２５  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ２、Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１、およびＳｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ２が、指数関数的に増殖するＳＫＢＲ−３細胞中に存在する全ＥｒｂＢ３受容体の少なくとも５０％を分解したことも実証する（図２１）。
【０３５２】
実施例１６−ＢｘＰＣ３腫瘍異種移植成長の阻害
実施例１２で作成されたヒト化モノクローナル抗体が、膵臓ＢｘＰＣ３異種移植モデル中で、腫瘍成長を阻害する能力を試験した。１０％ウシ胎仔血清を含有するＲＭＰＩ培地を使用して、ヒト膵臓ＢｘＰＣ３細胞を５％ＣＯ２含有雰囲気内において３７℃で培養した。８週齢のメスＣＢ．１７  ＳＣＩＤマウス（ＴａｃｏｎｉｃＬａｂｓ）に、マウスあたり１０ｘ１０６細胞で、５０％マトリゲル（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号３５６２３７）中のＢｘＰＣ３細胞を側腹部に皮下接種した。ノギスを使用して、腫瘍測定を週に２回実施した。式：幅×幅×長さ／２を使用して、腫瘍体積を計算した。腫瘍がおよそ２００ｍｍ３に達すると、それぞれ１０匹ずつの８群にマウスを無作為化した。１つの群にはＰＢＳを投与し、別の群にはｈｕＩｇＧ対照を投与し、および別の群にはｍｕＩｇＧ対照を投与した。残る５群にはそれぞれ抗体（すなわちマウス２４Ｃ０５、Ｓｈ２４Ｃ０５−２５  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１、Ｓｈ２４Ｃ０５−２５  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ２、Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１またはＳｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ２）の１つを投与した。全ての抗体は、腹腔内注射によって２ｍｇ／ｋｇ体重で７週間にわたり週２回投与した。腫瘍体積およびマウス体重を週に２回記録した。腫瘍成長阻害をＡＮＯＶＡを使用して分析し、ＰＢＳ対照と比較した阻害率として表す。
【０３５３】
試験されたヒト化抗体は、生体内で活性であった。全ての４種のヒト化抗ＥｒｂＢ３抗体は、ＢｘＰＣ３モデル中において２ｍｇ／ｋｇで投与すると、実験の２８日目に、７５〜８０％の腫瘍成長阻害（ｐ＜０．００１）（すなわちＳｈ２４Ｃ０５−２５  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１は７５％；Ｓｈ２４Ｃ０５−２５  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ２は７６％；Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１は７９％；およびＳｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ２は８０％）の範囲にわたる同様の有効性を有した（図２２）。マウス抗体は、この実験で６５％の腫瘍成長阻害（ｐ＜０．０５）を実証する。これらの結果は、本モデル中における、４種のヒト化抗体の同様の効力および活性を示唆する。
【０３５４】
ヒト化モノクローナル抗体Ｕ１−５３、Ｕ１−５９、およびＡｂ＃６ＩｇＧ２が、ＢｘＰＣ３異種移植モデル中で腫瘍成長を阻害する能力もまた試験した。上述のプロトコルを使用して、ＣＢ．１７  ＳＣＩＤマウスにＢｘＰＣ３腫瘍を生じさせた。腫瘍がおよそ２００ｍｍ３に達すると、それぞれ１０匹ずつの１１群にマウスを無作為化した。１つの群にはＰＢＳを投与し、別の群にはｈｕＩｇＧ対照を投与した。他の９群には、それぞれヒト化抗体（すなわちＳｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１、Ｕ１−５３、Ｕ１−５９、またはＡｂ＃６ＩｇＧ２）の１つを投与した。抗体は、腹腔内注射によって０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または５ｍｇ／ｋｇ体重のいずれかで、７週間にわたり週２回投与した。腫瘍体積およびマウス体重を週に２回記録した。腫瘍成長阻害をＡＮＯＶＡを使用して分析し、ＰＢＳ対照と比較した阻害率として表す。
【０３５５】
ヒト化抗体（すなわちＳｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１、Ｕ１−５９、またはＡｂ＃６ＩｇＧ２）の内１つによる処理に続いて、２９日目に測定された腫瘍成長阻害データを表２０に示す。
【０３５６】
【表３７】
0005906233.tif 000164
【０３５７】
【表３８】
0005906233.tif 000165
【０３５８】
結果は、Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１が、ＢｘＰＣ３膵臓異種移植モデル中において、５ｍｇ／ｋｇの用量で、２９日目に最大腫瘍成長阻害（７６．５％、ｐ＜０．００１）を示すことを実証する。Ｕ１−５９およびＡｂ＃６ＩｇＧ２抗体は、ＢｘＰＣ３モデル中において、５ｍｇ／ｋｇの用量で、それぞれおよそ６０％および４１％（Ｐ＜０．００１）の腫瘍成長阻害を実証した。
【０３５９】
結果はまた、Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１が、ＢｘＰＣ３膵臓異種移植モデル中において、０．５ｍｇ／ｋｇ（６３．３％，ｐ＜０．００１）の用量、および１ｍｇ／ｋｇ（７５．０％，ｐ＜０．００１）の用量で、２９日目に最大腫瘍成長阻害を示すことも実証する。Ｕ１−５９およびＡＢ＃６ＩｇＧ２抗体は、ＢｘＰＣ３モデル中において、０．５ｍｇ／ｋｇの用量で、それぞれおよそ３３％（ｐ＜０．０１）および３１％（ｐ＜０．０５）の腫瘍成長阻害を実証した。Ｕ１−５９およびＡＢ＃６ＩｇＧ２抗体は、ＢｘＰＣ３モデル中において、１．０ｍｇ／ｋｇの用量で、それぞれおよそ５３％（ｐ＜０．００１）および２％（有意でない）の腫瘍成長阻害を実証した。
【０３６０】
実施例１７−Ｃａｌｕ−３腫瘍異種移植成長の阻害
実施例１２で作成されたヒト化モノクローナル抗体が、Ｃａｌｕ−３非小細胞肺癌異種移植モデル中で腫瘍成長を阻害する能力を試験した。実施例１２に記載されるヒト化モノクローナル抗体Ｕ１−５９およびＡｂ＃６ＩｇＧ２が、腫瘍成長を阻害する能力もまた同一モデル中で試験した。
【０３６１】
１０％ウシ胎仔血清を含有するＥＭＥＭ培地を使用して、ヒト非小細胞肺癌Ｃａｌｕ−３細胞を５％ＣＯ２含有雰囲気内３７℃で培養した。８週齢のメスＮＣＲヌードマウス（ＴａｃｏｎｉｃＬａｂｓ）に、マウスあたり１０ｘ１０６細胞で、５０％マトリゲル（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号３５６２３７）中のＣａｌｕ−３細胞を側腹部の皮下に接種した。ノギスを使用して、腫瘍測定を週に２回実施した。式：幅×幅×長さ／２を使用して、腫瘍体積を計算した。
【０３６２】
腫瘍がおよそ２００ｍｍ３に達すると、それぞれ１０匹ずつの１１群にマウスを無作為化した。１つの群にはＰＢＳを投与し、別の群にはｍｕＩｇＧ対照を投与した。他の９群には、それぞれヒト化抗体（すなわちＳｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１、Ｕ１−５９、またはＡｂ＃６ＩｇＧ２）の１つを腹腔内注射によって５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇ体重のいずれかの用量で、４週間にわたり週２回投与した。腫瘍体積およびマウス体重を週に２回記録した。腫瘍成長阻害をＡＮＯＶＡを使用して分析し、ＰＢＳ対照と比較した阻害率として表す。
【０３６３】
ヒト化抗体（すなわちＳｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１、Ｕ１−５９、またはＡｂ＃６ＩｇＧ２）の内の１つによる処理に続いて、２６日目に測定された腫瘍成長阻害データを表２１に示す。
【０３６４】
【表３９】
0005906233.tif 000166
【０３６５】
Ｃａｌｕ−３非小細胞肺癌異種移植モデルを使用した結果は、Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１が、全ての用量（すなわち５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、および２０ｍｇ／ｋｇ体重）試験において、２６日目に最大腫瘍成長阻害を示すことを実証する。
【０３６６】
例えば１０ｍｇ／ｋｇの用量では、Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１は、Ａｂ＃６ＩｇＧ２（３６％、ＮＳ）またはＵ１−５９（５７％、Ｐ＜０．００１）との比較で、２６日目に最大腫瘍成長阻害（６２％，Ｐ＜０．００１）を示した。２０ｍｇ／ｋｇの用量でも、Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１はまた、Ａｂ＃６ＩｇＧ２（４８％，Ｐ＜０．００１）またはＵ１−５９（５８％，Ｐ＜０．００１）との比較で、２６日目に最大腫瘍成長阻害（６９％，Ｐ＜０．００１）を示した。
【０３６７】
実施例１８−ＭＤＡ−ＭＢ−４５３腫瘍異種移植成長の阻害
実施例１２で作成されたヒト化モノクローナル抗体が、（ＨＥＲ２陽性ｂｒｅａｓｔモデルである）ＭＤＡ−ＭＢ−４５３ｂｒｅａｓｔ異種移植モデル中で、腫瘍成長を阻害する能力を試験した。実施例１２に記載されるヒト化モノクローナル抗体Ｕ１−５９およびＡｂ＃６ＩｇＧ２が、腫瘍成長を阻害する能力もまた同一モデル中で試験した。
【０３６８】
１０％ウシ胎仔血清を含有するＬｅｉｂｏｖｉｔｚＡＴＣＣ培地（カタログ番号３０−２００８）を使用して、ヒトＢｒｅａｓｔＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞を０％ＣＯ２含有雰囲気内３７℃で培養した。８週齢のメスＮＯＤＳＣＩＤマウス（ＴａｃｏｎｉｃＬａｂｓ）に、マウスあたり２０ｘ１０６細胞で、５０％マトリゲル（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号３５６２３７）中のＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞を側腹部の皮下に接種した。ノギスを使用して、腫瘍測定を週に２回実施した。式：幅ｘ幅ｘ長さ／２を使用して、腫瘍体積を計算した。
【０３６９】
腫瘍がおよそ２００ｍｍ３に達すると、それぞれ１０匹ずつの７群にマウスを無作為化した。１つの群にはＰＢＳを投与し、別の群にはｈｕＩｇＧ対照を投与した。他の９群には、それぞれヒト化抗体（すなわちＳｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１、Ｕ１−５９、またはＡｂ＃６ＩｇＧ２）の１つを投与した。Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１は、腹腔内注射によって５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、または２０ｍｇ／ｋｇ体重のいずれかで、１０週間を超えて週２回投与し；Ｕ１−５９、またはＡｂ＃６は、同一頻度で１０ｍｇ／ｋｇで投与した。腫瘍体積およびマウス体重を週に２回記録した。腫瘍成長阻害をＡＮＯＶＡを使用して分析し、ＰＢＳ対照と比較した阻害率として表す。
【０３７０】
ヒト化抗体（すなわちＳｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１、Ｕ１−５９、またはＡｂ＃６ＩｇＧ２）の内の１つによる処理に続いて、７１日目に測定された腫瘍成長阻害データを表２２に示す。
【０３７１】
【表４０】
0005906233.tif 000167
【０３７２】
ＭＤＡ−ＭＢ−４５３異種移植モデルを使用した結果は、Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１が、全ての用量（すなわち５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、および２０ｍｇ／ｋｇ体重）試験において、７１日目に最大腫瘍成長阻害を示すことを実証する。
【０３７３】
結果はまた、１０ｍｇ／ｋｇの用量では、Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１が、Ａｂ＃６ＩｇＧ２（６２％，Ｐ＜０．００１）との比較で、７１日目により大きな腫瘍成長阻害（８４％、Ｐ＜０．００１）を示すことも実証する。Ｓｈ２４Ｃ０５−３１  Ｎ６２Ｓ−ＩｇＧ１は、同一用量でＵ１−５９と同等の腫瘍成長阻害を示した。
【０３７４】
参照による援用
本明細書で言及される各特許文献および科学論文の開示全体は、あらゆる目的のために参照によって援用する。
【０３７５】
均等物
本発明は、その趣旨または本質的特性を逸脱することなく、その他の特定形態で具現化されてもよい。したがって前述の実施形態は、本明細書に記載される本発明を限定せず、全ての点で例証的と見なされる。したがって本発明の範囲は、前述の説明ではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の均等物の意義と範囲内に入る全ての変更は、その中に包含されることが意図される。
【図１】
0005906233.tif 000168
【図２】
0005906233.tif 000169
【図３】
0005906233.tif 000170
【図４】
0005906233.tif 000171
【図５】
0005906233.tif 000172
【図６】
0005906233.tif 000173
【図７】
0005906233.tif 000174
【図８】
0005906233.tif 000175
【図９】
0005906233.tif 000176
【図１０】
0005906233.tif 000177
【図１１】
0005906233.tif 000178
【図１２】
0005906233.tif 000179
【図１３】
0005906233.tif 000180
【図１４】
0005906233.tif 000181
【図１５】
0005906233.tif 000182
【図１６】
0005906233.tif 000183
【図１７】
0005906233.tif 000184
【図１８】
0005906233.tif 000185
【図１９】
0005906233.tif 000186
【図２０】
0005906233.tif 000187
【図２１】
0005906233.tif 000188
【図２２】
0005906233.tif 000189
【図２３Ａ】
0005906233.tif 000190
【図２３Ｂ】
0005906233.tif 000191
【図２３Ｃ】
0005906233.tif 000192
【図２４】
0005906233.tif 000193
【配列表】
0005906233000001.app