(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
透過性容器、及び前記容器の内部に固定化された、分離膜生物反応槽用の生物膜形成抑制微生物を含む生物膜形成抑制微生物固定化容器であって、
前記生物膜形成抑制微生物は、定足数感知機序を抑制する遺伝子組換微生物又は天然微生物であり、
前記透過性容器は、水中曝気によって流動性を有する流動状担体である、
生物膜形成抑制微生物固定化容器。
【請求項２】
前記流動状担体は、ハイドロゲルを含む、
請求項１に記載の生物膜形成抑制微生物固定化容器。
【請求項３】
前記流動状担体は、アルジネイト、ＰＶＡ、ポリエチレングリコール及びポリウレタン群から選択される少なくとも１種を含む、
請求項１又は請求項２に記載の生物膜形成抑制微生物固定化容器。
【請求項４】
前記流動状担体は、内部の化学的架橋結合を介して３次元網状構造を有する、
請求項１から請求項３までの何れか一項に記載の生物膜形成抑制微生物固定化容器。
【請求項５】
前記流動状担体は、球形からなる、
請求項１から請求項４までの何れか一項に記載の生物膜形成抑制微生物固定化容器。
【請求項６】
前記生物膜形成抑制微生物は、定足数感知抑制酵素を生産することができる、
請求項１から請求項５までの何れか一項に記載の生物膜形成抑制微生物固定化容器。
【請求項７】
前記定足数感知抑制酵素は、ラクトナーゼ又はアシラーゼであることを特徴とする、
請求項６に記載の生物膜形成抑制微生物固定化容器。
【請求項８】
被処理水を収容する反応槽、水処理用分離膜モジュール及び前記反応槽内部に配置された請求項１から請求項７までの何れか一項に記載の生物膜形成抑制微生物固定化容器を含む、
分離膜水処理装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水処理用分離膜工程運転の中に分離膜表面で成長して形成される生物膜（biofilm）による生物膜汚染（membrane biofouling）を抑制する技術に関するものであって、より具体的には、生物膜形成を抑制することができる微生物を固定化させた生物膜形成抑制微生物固定化容器及びこれを水処理反応槽内部に投入し、分離膜の透過性能を長期間で安定的に維持することができる水処理用分離膜装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近来に良質の処理水を得るために、様々な水処理工程に分離膜工程が適用されている。生物学的水処理反応槽に膜分離工程を結合した分離膜生物反応槽（Membrane Bio Reactor、MBR）工程を始めとした、物理化学的前処理工程に結合された通常の分離膜水処理工程、及び高度水処理のためのナノ濾過及び逆浸透膜工程などが最近活発に研究されており、実際の工程にも広く適用されている。
【０００３】
ところが、分離膜工程の運転が進行されるのにともない、反応槽内部に存在するバクテリア、かび、藻類（algae）などのような微生物等が分離膜表面で付着成長（attached growth）を始め、最終的には数十ミクロメーター内外の厚さを有する膜（film）、すなわち生物膜（biofilm）を形成して表面を覆うようになる。これは分離膜生物反応槽工程だけでなく、通常の分離膜水処理工程又はナノ濾過及び逆浸透膜工程の高度水処理工程でもよく発見される現象である。このような生物膜は、分離膜の濾過性能を低下させる濾過抵抗（filtration resistance）として作用する生物膜汚染（membrane biofouling）問題を誘発し、最終的には透水度の減少、分離膜の洗浄周期及び寿命の短縮、濾過に必要なエネルギー消費量の増加など、分離膜工程の濾過性能を低下させることで水処理用分離膜工程の経済性を悪化させる。
【０００４】
このような問題解決のため、これまでの20余年間で様々な研究が進められてきたが、水気が存在する表面で微生物により自然に形成される生物膜は、一度形成されると既存の物理的方法（例えば、曝気）及び化学的方法（例えば、高分子凝集剤などの薬品投入）では完全に除去されず、このような生物膜汚染の防止及び制御と関連して現在までも満足する水準の解決策が提示されていない。このような生物膜汚染問題の未解決は、水処理用分離膜工程での膜汚染に直/間接的に影響を及ぼす反応槽内の微生物の特性に対する理解、及びこれに対する技術的考慮が足りないところに起因するといえる。
【０００５】
水処理用分離膜工程の生物膜汚染の主な原因である生物膜は、一度形成された後には外部の物理/化学的衝撃にも高い耐性を有するので取り除き難い。したがって、既存の物理化学的方法による膜汚染抑制技術等は、主に生物膜形成の初期段階では効果的であるが、生物膜が充分に形成（maturation）された後には膜汚染抑制効果が落ちると言える。このような既存の技術の問題点を克服するためには反応槽内の微生物の特性、特に分離膜表面で生物膜の形成及び成長の調節及び制御の側面で近付くことができる新しい技術の開発が要求される。
【０００６】
前記のような水処理用分離膜工程以外にも建物、産業施設などの水槽、配管のような水系システムでも水中に存在する微生物の影響で物体表面に生物膜又は水垢が形成され、装備の性能を低下（例えば金属表面の腐食、冷却塔の効率低下、管網の微生物汚染）させるか外観を不良にする問題が発生しているので、このような生物膜又は水垢の除去が要求されているが、従来の物理/化学的な方法以外に微生物の特性研究に基づいた解決技術はまだ基礎的な水準に過ぎない実情である。
【０００７】
一方、微生物等は温度、pH、養分などさまざまな周りの環境の変化に応じて特定信号分子を合成し、これを細胞外に排出/吸収する方法で周辺の細胞密度を認知する。細胞密度が増加し、このような信号分子の濃度が一定の水準に至るようになれば特定遺伝子の発現が始まり、その結果、微生物集団の生理現象が調節（group behavior regulation）されるが、これを定足数感知現象（quorum sensing phenomena）といい、一般的に細胞の密度が高い環境下で発生する。このような定足数感知現象の代表的な例としては、共生（symbiosis）、感染（virulence）、競争（competetion）、接合（conjugation）、抗生剤生産（antibiotic production）、運動性（motility）、胞子形成（sporulation）、生物膜形成（biofilm formation）などが報告されている（Fuqua et al.、Ann.Rev.Microbiol.、2001、Vol.50、pp.725〜751）。
【０００８】
特に、浮遊相に比べて細胞密度が格段に高い生物膜条件で微生物の定足数感知機序はより容易く活発に発生することができる。1998年Davies等（Science、Vol．280、pp．295〜298）により、このような微生物定足数感知機序が病原性微生物であるPseudomonas aeruginosaの生物膜形成の進行程度、厚さ及び形状（morphology）のような物理的構造特性、抗生剤耐性等のような生物膜の様々な特性と密接な関連性を示すと報告されて以来、定足数感知機序の人為的な調節を介して生物膜形成を抑制する研究が最近医療及び農業等のような一部の分野において、医療機器の汚染防止（Baveja et al.、Biomaterials、2004、Vol.50、pp.5003〜5012）、植物病（Dong et al.、Nature、2001、Vol.411、pp.813〜817）の抑制などが目的となっているのみである。
【０００９】
微生物定足数感知機序を調節し、生物膜形成を抑制する従来の方法は、大きく次の何種類かに分類される。
【００１０】
第一に、定足数感知機序に用いられる信号分子を始めとした構造を有し、信号分子と遺伝子発現部位をおいて競争関係にあるものとして知られた拮抗剤（antagonist）を投入して生物膜形成を抑制することができるが、一番代表的な拮抗剤としては紅藻類の一種であるDelisea pulchraが分泌するフラノン（furanone）及びそのハロゲン化誘導体等が報告されている（Henzer et al.、EMBO Journal、Vol.22、3803〜3815）。
【００１１】
第二に、定足数感知機序に用いられる信号分子を分解する酵素（微生物定足数感知抑制酵素のような生物膜形成抑制酵素：例えば、ラクトナーゼ、アシラーゼ）、あるいはその酵素を生産する微生物を用いて生物膜形成を抑制することができる。例えば、Xuなど（2004）はグラム陰性菌の信号分子であるアシル−ホモセリンラクトン（acyl-homoserine lactone：AHL）を分解する酵素であるアシラーゼ溶液を注入して多様な表面での生物膜形成を抑制する方法を開発したところにある（米国特許 第6、777、223号公報）。ラクトナーゼ、アシラーゼなどの酵素によって信号分子が分解される反応は次の通りである。
【００１２】
【化１】
【００１３】
ところが、前記アシラーゼ酵素溶液を直接注入して生物膜形成を抑制する場合、酵素の流失が激しいのみならず、酵素の変性（denaturation）によって非活性化が早く進められるなど実用的な側面での適用可能性は低いと言える。
【００１４】
その他の方法として、最近では磁性を帯びた担体にアシラーゼ酵素を積層法（layer-by-layer）で固定化することで、酵素の変性による非活性化を防ぐと同時に、磁場を用いた酵素−固定化磁性担体の分離及び回収を容易にし、浸漬型分離膜生物反応槽（submerged Membrane BioReactor、sMBR）に適用することで、分離膜表面の生物膜汚染を抑制した結果が報告された（韓国登録特許 第981519号）。しかし、高濃度の微生物フロックが存在して、このようなフロックがスラッジ滞留時間（sludge retention time）を維持するために、持続的に取り出しされるMBR工程の特性上、磁性を帯びている担体だとしても、フロックに混ざっている担体を磁場のみで全量回収するには実質的な限界がある。
【００１５】
また、このような磁性担体の回収率を極大化するためには、担体がシステム内部（例えば、チュービング、バルブ、フィッティングなど）を循環せず、反応槽内でのみ存在する浸漬型反応槽ではなければならないが、ナノ濾過工程や逆浸透膜工程のように高圧を用いなければならない分離膜工程の場合、大部分が外部加圧型であるため適用が困難であるという限界がある。ひいては、前記のような酵素−固定化磁性担体の場合、通常の微生物再組合技術を用いて酵素を生産するのにおいて、微生物を培養して抽出・精製過程を経なければ、固定化可能な酵素を生産することができず、これによる費用消耗が大きく、精製を経た酵素を積層法を介して固定化することもやはり多くの費用と時間を消耗するのが問題点として指摘される。
そこで、本発明者等は、生物膜形成抑制酵素の代わりに前記のような酵素を生産する生物膜形成抑制微生物を所定の容器に固定化させて水処理反応槽内部に投入することで、前記のような酵素直接利用技術から由来される各種の問題点を解決して分子生物学的な観点での生物膜形成抑制技術を分離膜水処理工程に適用し、経済的/安定的に分離膜水処理工程を具現しようと鋭意研究を繰り返した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の目的は、水処理用分離膜工程において、生物膜の形成による膜汚染現象を抑制又は緩和させるためのものであって、従来の逆洗浄及び化学洗浄のような物理/化学的な観点での接近ではなく、生物膜形成機序の理解を土台にした分子生物学的観点での接近を基本とし、選択的に物理的な分離膜洗浄効果も得ることができる膜汚染抑制/緩和技術を提供するためのものである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
このような目的を果たすための研究の結果、本発明者は透過性（permeable）容器の内部に固定化された生物膜形成抑制微生物を含む生物膜形成抑制微生物固定化容器を分離膜水処理工程に適用することで、生物膜形成抑制微生物の活性を安定的に維持して、分子生物学的な観点で分離膜の膜汚染を効率的に抑制/緩和することができるという点を発見し、本発明を完成するに至った。
【００１８】
すなわち、本発明は透過性容器及び前記容器の内部に固定化された生物膜形成抑制微生物を含む生物膜形成抑制微生物固定化容器を提供し、さらに被処理水を収容する反応槽、水処理用分離膜モジュール及び前記反応槽内部に配置した前記生物膜形成抑制微生物固定化容器を含む分離膜水処理装置を提供する。
【００１９】
本発明で透過性容器とは、水処理反応槽内で生物膜形成抑制微生物を高密度に分離して配置することができるとともに、生物膜形成抑制微生物の生長及び活性に係わる酸素、栄養分、代謝物質などの流出入を可能にするように適切な透過性を有する容器であれば、材質、形態などに特別な制限はない。例えば、所定の孔径分布を有する多孔性の容器でもよく（本発明の第1実施形態参照）、ハイドロゲルのように曝気によって流動性を有する透過性の流動状担体でもよい（本発明の第2実施形態参照）。
【００２０】
本発明の第1実施形態は中空型の多孔性容器及び前記容器の内部に固定化された生物膜形成抑制微生物を含む生物膜形成抑制微生物固定化容器に関するものである。
【００２１】
図1aないし図1dは、本発明の第1実施形態による生物膜形成抑制微生物固定化容器の概念図及びその製作例の実際の写真であり（図1a及び図1b：両側末端の密封構造、図1c及び図1d：一側末端の密封構造）、図3は生物膜形成抑制微生物固定化容器が配置された水処理用分離膜生物反応槽装置の概略図である。
【００２２】
本発明の第1実施形態による微生物固定化容器は、中空型の多孔性容器の内部に前記容器の内部に生物膜形成抑制微生物を補集した形態に製作することができるし、生物膜形成抑制微生物が中空型の多孔性容器内部に固定化され、水処理反応槽の方に流出されないながらも、生物膜形成抑制酵素などの物質が容易に水処理反応槽の方に排出されるようにすることで、分離膜表面と分離膜細孔内部などでの生物膜汚染を安定的に低減することができるようにする。
【００２３】
本発明の第1実施形態による中空型の多孔性容器は、生物膜形成抑制微生物を流出させないながらも、生物膜形成抑制酵素、水、信号分子物質などのような微細物質の伝達は可能にする程度の多孔性を有するものであるなら、材質又は形態上に特別な制限はなく、従来に水処理用に用いる管型又は中空糸型のような中空型のメンブレンや、所定の形態に製作したフィルタ容器などを用いることができる。
【００２４】
通常の場合であれば、微生物の平均大きさが1〜10μmであるので、これより小さな平均孔径の大きさを有することが微生物遺失を最小化することができるという点で好ましい。
【００２５】
また、本発明の第1実施形態による生物膜形成抑制微生物固定化容器は、中空型の多孔性容器の内部に生物膜形成抑制微生物を注入/補集して両側末端を密封して製作することもできるが（図1a及び図1b参照）、一側末端のみを密封し、他の一側の末端にはフィルタのような微生物流出入防止用多孔性部材を付着した導管を追加して連結し、水処理反応槽外部の大気に露出され得る構造に製作することで、水処理反応槽内で中空型メンブレンを介した水、生物膜形成抑制酵素などの物質伝達をより容易にすることもできる（図1c及び図1d参照）。
【００２６】
一方、本発明の第2実施形態は、水中曝気によって流動性を有する透過性容器（担体）及び前記容器（担体）内部に固定化された生物膜形成抑制微生物を含む生物膜形成抑制微生物固定化容器に関するものである。これにより、担体内部に固定化された生物膜形成抑制微生物によって分子生物学的に生物膜形成を抑制することができるし、これとともに水中曝気条件での担体の流動性によって、分離膜表面に直接物理的な打撃を加えて分離膜表面に形成された生物膜の脱離を誘導するようになることで、物理的な生物膜の脱離を誘発することができるようになる。
【００２７】
本発明の第2実施形態での担体は、親水性の高分子からなるハイドロゲルを主成分として含むものを用いることができ、より具体的には、ハイドロゲルはアルジネイト、PVA、ポリエチレングリコール及びポリウレタンからなる群から選択される少なくとも1種（これら成分の複合体も含む）を含むことができるし、このような材質の流動状担体を用いることで担体の内外を通じた物質伝達が容易くなるのみならず水中曝気条件で浸漬型分離膜表面の損傷を防止することができる。
【００２８】
また、本発明の第2実施形態でのハイドロゲルは、内部の化学的架橋結合を介して3次元網状構造を有することが、生物膜形成抑制微生物を化学的架橋結合の間に捕獲させて担体内部で持続的に成長することができるようになるという点で好ましい。
【００２９】
例えば、アルジネイトは親水性天然高分子を主成分として含む担体物質であるが、塩化カルシウム溶液内で化学的な結合である架橋を介して物質伝達に対する抵抗を最小化する網状型構造に固形物を形成することになる。これをもって、生物膜形成抑制微生物だけでなく、前記微生物によって生産された酵素も固定化することが可能であり、生体適合性（biocompatibility）が優れているので、水処理用微生物が存在する反応槽内で用いるのに適しており、価格が安く経済性が高いながらも人体に無害だという点でも好ましい。
【００３０】
ひいては、本発明の第2実施形態での担体は、実質的に球形からなるか球形に近い形態を有するものを用いることができるが、これによって水中曝気条件で浸漬型分離膜表面の損傷を防止することができる。
【００３１】
また、本発明の第2実施形態の流動状担体は、担体の大きさの調節が容易であるので、マイクロシーブ（micro-sieve）のような手段を容易く分離/回収することができ、従来の磁性担体容器において、問題になった担体の回収問題を解決することができるという長所がある。
【００３２】
本発明に適用可能な生物膜形成抑制微生物は、生物膜形成抑制酵素を生産することができる種類の微生物であるなら、遺伝子再組合微生物又は天然微生物のどのような種類でも用いることができる。代表的には、定足数感知機序に用いられる信号分子を分解する「定足数感知抑制酵素」を生産することができる微生物を用いることができ、好ましくはラクトナーゼ又はアシラーゼのような定足数感知抑制酵素を生産する微生物を用いることができる。例えば、遺伝子再組合に広く使われる大腸菌E.coli XL1-blueにBacillus thuringiensis subsp.kurstakiから抽出したaiiA遺伝子（ラクトナーゼ生産に関わる遺伝子）を再組合させた大腸菌、又は自然界に存在する天然微生物（例えば、Rhodococcus qingshengii種の菌株）を用いることができる。本発明者は、水処理工程に適用するのに相応しいRhodococcus qingshengii種の菌株を手に入れるために、実際に都市下水処理場の生物反応槽からスラッジを採取して、微生物を分離/同定した後、分離した多くの微生物から集積培養（Enrichment culture）方法を用いて、信号分子分解活性が優れたRhodoccocus属の微生物（Rhodococcus qingshengiiなど）を分離して用いたりもした。
【００３３】
本発明において、生物膜形成抑制微生物を固定化容器の内部に固定化させる方法は、流動状担体の内部に微生物を固定化させることができる方法であれば特別な制限はなく、付着（adhesion）、包括法（entrapment）、カプセル化（encapsulation）などの方法のみならず、容器内部にセルを注入させて補集させる単純な方法を用いることもできる。例えば、本発明の第1実施形態では生物膜形成抑制微生物をポンプを用いて、メンブレンのような中空型の多孔性容器内部に注入し（図2参照）、本発明の第2実施形態では生物膜形成抑制微生物を水に懸濁した高濃縮微生物懸濁液をハイドロゲルとともに混合し、塩化カルシウム溶液に一定の流量で滴下しながら「包括」して一定の大きさの担体（容器）を製造した（図11参照）。
【００３４】
また、本発明は生物膜形成抑制微生物固定化容器が内部に配置された水処理反応槽と、水処理用分離膜モジュールを含む分離膜水処理装置を提供する。本発明の分離膜水処理装置に適用することができる分離膜モジュールとしては、生物膜汚染の抑制又は緩和を介して透水度を向上させることができる一般的な水処理用分離膜モジュールであれば特別な制限はない。また、本発明の分離膜水処理装置としては、反応槽内部の数多くの種類の水処理用微生物などによって分離膜表面に生物膜が形成される分離膜生物反応槽（MBR）装置のみならず、被処理水に存在する微生物によって分離膜表面に生物膜が形成される精密濾過膜装置、限外濾過膜装置のような通常の分離膜水処理装置の他にナノ濾過装置、逆浸透濾過装置などの高度水処理装置を挙げることができる。
【発明の効果】
【００３５】
本発明の生物膜形成抑制微生物固定化容器によれば、分離膜の表面に形成される生物膜の形成を分子生物学的な方法で抑制し、選択的に物理的な膜汚染除去効果も得ることで、分離膜の水処理工程での透水率の低下を防ぐと同時に、既存の分離膜に比べて膜洗浄周期が長くなり、洗浄薬品の消耗量を減らすことができるのみならず、長時間の濾過工程を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１ａ】本発明の第1実施形態による生物膜形成抑制微生物固定化容器（図1a及び図1b：両側末端密封構造、図1c及び図1d：一側末端密封構造）の概念図及び実際の写真である。
【図１ｂ】本発明の第1実施形態による生物膜形成抑制微生物固定化容器（図1a及び図1b：両側末端密封構造、図1c及び図1d：一側末端密封構造）の概念図及び実際の写真である。
【図１ｃ】本発明の第1実施形態による生物膜形成抑制微生物固定化容器（図1a及び図1b：両側末端密封構造、図1c及び図1d：一側末端密封構造）の概念図及び実際の写真である。
【図１ｄ】本発明の第1実施形態による生物膜形成抑制微生物固定化容器（図1a及び図1b：両側末端密封構造、図1c及び図1d：一側末端密封構造）の概念図及び実際の写真である。
【００３７】
【図２】本発明の第1実施形態による生物膜形成抑制微生物固定化容器の製作過程を示し
た概念図である。
【００３８】
【図３】水処理用分離膜生物反応槽装置に、本発明の第1実施形態による生物膜形成抑制
微生物固定化容器を設けて運転する分離膜生物反応槽工程の概略図である。
【００３９】
【図４】本発明の第1実施形態による実施例2A及び比較例2Aの場合に、膜間差圧の増加（
膜汚染の増加）程度を示す図である。
【００４０】
【図５】本発明の第1実施形態による生物膜形成抑制微生物固定化容器の信号分子分解の
活性を示す図である。
【００４１】
【図６】本発明の第1実施形態による生物膜形成抑制微生物固定化容器の信号分子分解の
活性が長時間維持されるかどうかを確認した図である。
【００４２】
【図７】本発明の第1実施形態による実施例4A及び比較例4Aの場合に、膜間差圧の増加（
膜汚染の増加）程度を示す図である。
【００４３】
【図８】本発明の第1実施形態による実施例5A及び比較例5Aの場合に、膜間差圧の増加（
膜汚染の増加）程度を示す図である。
【００４４】
【図９ａ】本発明の第2実施形態による生物膜形成抑制微生物固定化容器（流動状担体）
の概念図及び実際製造された容器（流動状担体）の写真である。
【図９ｂ】本発明の第2実施形態による生物膜形成抑制微生物固定化容器（流動状担体）
の概念図及び実際製造された容器（流動状担体）の写真である。
【００４５】
【図１０ａ】本発明の第2実施形態による生物膜形成抑制微生物固定化容器を投入した生
物反応槽（図9a：曝気がない場合。図9b：曝気中の場合）の実際の写真である。
【図１０ｂ】本発明の第2実施形態による生物膜形成抑制微生物固定化容器を投入した生
物反応槽（図9a：曝気がない場合。図9b：曝気中の場合）の実際の写真である。
【００４６】
【図１１】本発明の第2実施形態による生物膜形成抑制微生物固定化容器の製造方法の一
例を示す図である。
【００４７】
【図１２】本発明の第2実施形態による生物膜形成抑制微生物固定化容器の信号分子分解
の活性を示す図である。
【００４８】
【図１３】本発明の第2実施形態による生物膜形成抑制微生物固定化容器を生物反応槽内
部に投入して運転する分離膜生物反応槽装置の概略図である。
【００４９】
【図１４】本発明の第2実施形態による実施例及び比較例の分離膜生物反応槽装置で運転
時間による膜間差圧の増加（膜汚染の増加）程度を示す図である。
【００５０】
【図１５】本発明の第2実施形態による分離膜生物反応槽装置において、運転時間による
生物膜形成抑制微生物固定化流動状担体の信号分子分解の活性（相対的活性度）を示す図である。
【００５１】
【図１６】本発明の第2実施形態による分離膜生物反応槽装置で運転時間によって生物膜
形成抑制微生物の固定化流動状担体内で成長する程度を流動状担体の湿重量で示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
以下、実施例を介して本発明を詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５３】
[第1実施形態]
【００５４】
製作例1A-生物膜形成抑制微生物が固定化された容器（両側末端密封）の製作
【００５５】
生物膜形成抑制微生物としては、ラクトナーゼを生産することができるように遺伝子再組合された大腸菌を用いた。具体的には、遺伝子再組合に用いられた微生物は、よく使われる大腸菌（E.coli XL1-blue）を用いて、この微生物にBacillus thuringiensis subsp.kurstakiからのaiiA遺伝子を再組合して挿入した。aiiA遺伝子は、定足数感知機序に用いられる信号分子を分解する酵素であるラクトナーゼを生産する遺伝子である。
【００５６】
生物膜形成抑制微生物を固定化するための中空型の多孔性容器としては、Econity社で生産した中空糸膜を利用した。この中空糸膜は0.4μmの孔径を有するので、微生物は透過することができず、水、流入水成分及び信号伝逹物質などは容易に孔径を通過して容器内部と反応槽（被処理水）の間を移動することができる。総55本の中空糸膜を用いて、長さ10cmで、総膜表面積112.31cm2の微生物固定化容器を図1a及び図1bのように両側末端が密封された形態に製作した。
【００５７】
24時間培養した前記大腸菌200mlを遠心分離した後、上澄液を捨てて培養液成分を取り除き、Tris-HCl 50mM緩衝溶液（pH7.0）を用いて再懸濁させた後、図2のようにポンプを用いて容器の内部に注入した。
【００５８】
製作例2A-生物膜形成抑制微生物が固定化された容器（一側末端密封）の製作
【００５９】
中空糸膜を利用した微生物固定化容器を両側末端の全てを密封せず、反応槽に浸漬された一方の末端のみを密封して、他の一方の末端はフィルタ（PTFE材質、0.45μm孔径）部材を挿入した後に、チューブを連結して外部大気と連通させる構造を有することを除いては、製作例1Aでと同様にして微生物固定化容器を製作して生物膜形成抑制微生物（大腸菌）を注入した（図1c、図1d及び図2参照）。
【００６０】
実施例1A-生物膜形成抑制微生物が固定化された容器の信号分子分解の活性測定
【００６１】
生物膜形成抑制微生物固定化容器の信号分子（AHL）分解活性は、代表的な信号分子中の一つであるN-octanoyl-L-homoserine lactone（OHL）を用いた。試験管にTris-HCl 50mM緩衝溶液（pH7）を入れて、OHLを0.2μM濃度になるように注入した後、生物膜形成抑制微生物が固定化された容器を入れて30℃の振盪培養器に入れて200rpmで90分間反応させた。これを介して90分間約60パーセントの信号分子物質が分解されたことを確認することができた（図5参照）。
【００６２】
比較例1A
【００６３】
実施例1Aで容器内部に微生物を充填しないことを除いては、実施例1Aと同様にして実験をした場合、信号分子がほとんど分解されないことを確認することができる（図5参照）。
【００６４】
実施例2A-分離膜生物反応槽工程への適用（遺伝子再組合微生物/両側末端密封型固定化容器）
【００６５】
前記製作例1Aで製作した生物膜形成抑制微生物固定化容器を、実験室規模の分離膜生物反応槽工程に適用した（図3参照）。具体的には、円筒状の反応槽内に活性スラッジを1.2L満たして入れ、下端部に散気石を設けて1L/minの曝気状態を維持するようにした。生物膜形成抑制微生物固定化容器は、反応槽内に対称に総2個設置した。連続工程のために、主炭素源としてグルコースを用いた合成廃水が流入ポンプを介して流入されるようにした。合成廃水の化学的酸素要求量（COD）は約550ppmであり、水理学的滞留時間は12時間として運転した。反応槽内に設けられた濾過用分離膜は浸漬型中空糸膜であって、限外濾過膜（Zeeweed 500、GE-Zenon社製、孔径0.04μm）を使い、分離膜を透過する処理水のフラックスを18L/m2・hrで運転した。また、水位調節器と3方弁（3-way-valve）を介して、処理水の一部は反応槽に戻るようにして反応槽の水位を維持させた。運転中MLSS（Mixed Liquor Suspended Solids）は4500〜5000mg/Lに維持した。運転が進行されるのに伴い、分離膜表面で生物膜が形成され、これは膜汚染の増加による分離膜の透水度低下に続くが、このような生物膜汚染の程度を膜間差圧（transmembrane pressure、TMP）の数値で表し、膜間差圧が増加するほど生物膜汚染の程度が深化されたことを示す。200時間の運転結果、膜間差圧は13kPaに過ぎなかった（図4参照）。
【００６６】
比較例2A
【００６７】
実施例2Aで容器内部に微生物を充填しないことを除いては、実施例2Aと同様に運転した。200時間の運転結果、膜間差圧は50kPaに到達した（図4参照）。
【００６８】
実施例3A-生物膜形成抑制微生物を固定化した容器の活性維持確認
【００６９】
前記生物膜形成抑制微生物固定化容器の信号分子の分解活性が長期間維持されるのかを確認してみた。具体的には、連続工程反応槽内で、25日運転後と80日運転後に生物膜形成抑制微生物が固定化された容器を取り出して蒸溜水で何回も容器の外部を洗い出した後、実施例1Aのような実験を行った（図6参照）。その結果80日が経っても、信号分子分解活性が大きく落ちないことを確認することができた。
【００７０】
実施例4A-分離膜生物反応槽工程への適用（天然微生物/両側末端密封型固定化容器）
【００７１】
実施例2Aに用いられた微生物は、大腸菌にラクトナーゼ生産遺伝子を挿入して遺伝子組み換え処理をしたものであって、これは実際廃水環境で長時間生存し難い種である。したがって、実際の水処理工程に適用するのに相応しい微生物を捜すために韓国の忠清北道に位置する沃川下水処理場からスラッジを採取して微生物を分離し出した。分離した多くの微生物の中で信号分子分解微生物を捜すために、集積培養（enrichment culture）法を用いて、これを介し信号分子分解活性が優れたRhodoccocus属の微生物を分離し出すことができた。この微生物を用いて、前記製作例1Aと同様の方法で生物膜形成抑制微生物固定化容器を製作し、前記実施例2Aと同様の条件で分離膜生物反応槽工程に適用した。
【００７２】
前記に言及した方法で製造した生物膜形成抑制微生物固定化容器を、実験室規模の分離膜生物反応槽工程に適用した。40時間の運転結果、膜間差圧は24kPaに到達した（図7参照）。
【００７３】
比較例4A
【００７４】
実施例4Aで容器内部に微生物を充填しないことを除いては実施例4Aと同様にして運転した。40時間の運転結果、膜間差圧は50kPaに到達した（図7参照）。
【００７５】
実施例5A-分離膜生物反応槽工程への適用（天然微生物/一側末端密封型固定化容器）
【００７６】
実施例4Aで用いた活性スラッジを円筒状の反応槽内に2.5L満たして入れ、製作例2Aで製作した生物膜形成抑制微生物固定化容器を反応槽内に対称に総4個設けて、グルコース含有合成廃水の水理学的滞留時間を8時間に設定し、分離膜を透過する処理水のフラックスを30L/m2・hrに変更して運転中MLSSは7500〜8500mg/Lに維持したことを除いては、実施例4Aと同様に分離膜生物反応槽工程を運転した。
【００７７】
50時間の運転結果、膜間差圧は22kPaに到達した（図8参照）。
【００７８】
比較例5A
【００７９】
実施例5Aで、容器内部に微生物を充填しないことを除いては、実施例5Aと同様にして運転した。40時間の運転結果、膜間差圧は64kPaに到達した（図8参照）。
【００８０】
[第2実施形態]
【００８１】
製作例1B-生物膜形成抑制微生物が固定化された流動状担体の製作及び信号分子分解の活性測定
【００８２】
生物膜形成抑制微生物としては、実際水処理工程に適用するのに相応しい微生物であって、定足数感知抑制酵素の一種であるラクトナーゼを生産するものと知られたRhodoccocus qingshengiiを、第1実施形態と同様の方法によって都市下水処理場のスラッジから分離して用いた。
【００８３】
この微生物を用いて、生物膜形成抑制微生物を固定化するための流動状担体はシグマ社（Sigma co.）で生産した天然高分子物質であるナトリウムアルジネード（sodium alginate）を利用したが、アルジネイトは微生物包括法に使われる代表的な物質である。分離膜生物反応槽内で長時間物理的な強度を維持するために、様々な濃度のアルジネイトに対して事前テストを行い、本発明の製造例では最終噴射時の濃度を基準にして、アルジネイト溶液の濃度を4wt%に調整した。
【００８４】
Rhodoccocus qingshengiiは、24時間振盪培養（shaked culture）して増殖をさせ、200mlの振盪培養液を遠心分離した後、上澄液の培養液成分を取り除いて、残ったRhodoccocus qingshengiiの凝集体をTris-HCl 50mM緩衝溶液（pH7.0）を用いて洗浄し、超純水に再懸濁させた。その後、図11に示したところのように、前記生物膜形成抑制微生物の再懸濁液と前記アルジネイト液を混合して、塩化カルシウム（CaCl2）溶液に噴射し、これによって化学的な架橋結合を介して内部に物質伝達がはかどる網状型の流動状担体を作った。流動状担体を作る際、最終噴射時のアルジネイトの濃度は4wt%にして、2wt%の塩化カルシウム（CaCl2）液で1時間架橋をさせた後、物理的な強度を増加させるために常温で20時間乾燥した。
【００８５】
生物膜形成抑制微生物固定化流動状担体の信号分子（AHL）分解活性は、第1実施形態と同様にN-octanoyl-L-homoserine lactone（OHL）を用いて測定した。試験管にTris-HCl 50mM緩衝溶液（pH7.0）30mLを入れて、OHLを0.2μM濃度になるように注入した後、生物膜形成抑制微生物（Rhodoccocus qingshengii）が固定化された流動状担体を入れて、30度の温度の振盪培養器に入れて200rpmで60分間反応させた。これを介して、生物膜形成抑制微生物から生産された生物膜形成抑制酵素（ラクトナーゼ）により、60分間約92パーセントの信号分子物質が分解されたことを確認することができた（図12）。
【００８６】
実施例1B-分離膜生物反応槽装置への適用
【００８７】
前記に言及した方法で製造した生物膜形成抑制微生物固定化流動状担体を、実験室規模の分離膜生物反応槽装置に適用した（図13参照）。具体的には、円筒状の反応槽内に活性スラッジを1.6L満たして入れ、下端部に散気石を設けて1L/minの曝気状態を維持するようにし、生物膜形成抑制微生物固定化流動状担体は、反応槽内に総60個投入した。連続工程のために、主炭素源としてグルコース（glucose）を用いた合成廃水が、流入ポンプを介して流入されるようにした。合成廃水の化学的酸素要求量（COD）は約560ppmであり、水理学的滞留時間は5.3時間（hr）で運転した。反応器内に設けられた濾過用分離膜は、浸漬型中空糸膜として限外濾過膜（Zeeweed 500、GE-Zenon社製、孔径0.04μm）を用いて、分離膜を透過する処理水のフラックスを28.7L/m2・hrで運転した。また、水位調節機と3方弁（3-way-valve）を介して処理水の一部は反応器に戻るようにし、反応器の水位を維持させた。運転が進行されるのに伴い、分離膜表面で生物膜が形成され、これは膜汚染の増加による分離膜透水度の低下に続くが、このような生物膜汚染の程度を膜間差圧（transmembrane pressure、TMP）の数値で表し、膜間差圧が増加するほど生物膜汚染の程度が深化したことを示す。実験結果、77時間の運転後には膜間差圧が5kPaに過ぎず、400時間の運転後に膜間差圧が70kPaに到達した（図14参照）。
【００８８】
比較例1B
【００８９】
実施例1Bで、生物膜形成抑制微生物固定化流動状担体の代わりに、微生物を全く固定化させないハイドロゲル流動状担体（製作例1Bで生物膜形成抑制微生物を固定化させず製造した担体）60個を反応槽に投入したことを除いては、実施例1Bと同様にして運転した。その結果、77時間の運転後に膜間差圧は70kPaに到達した（図14参照）。
【００９０】
比較例2B
【００９１】
実施例1Bで、分離膜生物反応槽内に生物膜形成抑制微生物固定化流動状担体を投入しないことを除いては、実施例1Bと同様にして運転した。その結果、43時間の運転後に膜間差圧は70kPaに到達した（図14参照）。
【００９２】
すなわち、前記実施例1B及び比較例1B-2Bから、本発明の生物膜形成抑制微生物固定化流動状担体が投入された分離膜生物反応槽装置の場合（実施例1B）では、微生物が固定化されない流動状担体を投入した場合（比較例1B）と流動状担体を投入しない場合（比較例2B）に比べて分離膜表面の生物膜による膜汚染現象が著しく緩和されることを確認することができるが、これは流動状担体内部に安定的に固定化された生物膜形成抑制微生物の生物膜形成抑制機序の制御による分子生物学的効果以外に、水中曝気によって流動性を有する担体による分離膜表面の物理的洗浄によって、膜汚染除去効果が相乗的に示されたものと推定される。
【００９３】
実施例2B-生物膜形成抑制微生物固定化流動状担体の活性維持確認
【００９４】
本発明の生物膜形成抑制微生物固定化流動状担体の内部にある生物膜形成抑制微生物の信号分子分解活性が長期間維持されるのかを確認する実験を行った。具体的には、前記実施例1Bで生物膜形成抑制微生物固定化流動状担体を反応槽に投入した時点を基準に、0、1、3、5、7、10、13、15、17、20、23、25、27、30日目になる日に、それぞれ生物膜形成抑制微生物固定化流動状担体を取り出し、蒸溜水で何回も流動状担体の外部を洗い出した後、前記の製作例1Bと同じ実験を行った。その結果を、0日の生物膜形成抑制微生物固定化流動状担体が有する活性を基準（100%）にして相対的活性度を測定した。その結果、20日以上運転した後にも生物膜形成抑制微生物固定化流動状担体は信号分子分解活性が減少せず、むしろ初期（0日）の活性度に比べ、やや増加していることが確認できた（図15）。
【００９５】
実施例3B-流動状担体内の生物膜形成抑制微生物の成長確認
【００９６】
本発明の生物膜形成抑制微生物固定化流動状担体を、長時間分離膜生物反応槽内で投入して運転する場合、生物膜形成抑制微生物の成長程度に対する確認実験を行った。
【００９７】
具体的には、前記実施例1Bで生物膜形成抑制微生物固定化流動状担体を反応槽に投入した時点から25日間運転しながら、24時間ごとに生物膜形成抑制微生物が固定化になった流動状担体を10個ずつ取り出し、蒸溜水で何回も流動状担体の外部を洗い出した後、湿重量（wet weight）（5回反復実験の平均値）を測定した。その結果25日が経つと、初期（0日）包括した生物膜形成抑制微生物より湿重量が徐々に増加する傾向を示している（図16）。
【００９８】
比較例3B
【００９９】
実施例3Bで、生物膜形成抑制微生物を固定化しないアルジネイト流動状担体を用いたことを除いては、実施例3Bと同様にして実験を行い、湿重量の変化がほとんどないことを確認することができた（図16）。
【０１００】
すなわち、前記実施例2B-3B及び比較例3Bから、本発明の生物膜形成抑制微生物固定化流動状担体内部に包括されている生物膜形成抑制微生物が内部で成長した結果、湿重量が増加して、これは生物膜形成抑制微生物が流動状担体内部で正常に成長することを意味する。これによって信号分子分解活性も減少せず、やや増加することが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明の生物膜形成抑制微生物固定化容器を実際に分離膜水処理濾過工程に適用すれば、分離膜の表面に形成される生物膜の形成を分子生物学的な方法で抑制し、選択的に物理的な膜汚染除去効果も得ることで、透水率の低下を防ぐと同時に、既存の分離膜に比べて膜洗浄周期が長くなり、洗浄薬品の消耗量を減らすことができるのみならず、長時間の濾過工程を行うことができる。
【０１０２】
さらに、既存の生物膜抑制酵素を固定化した磁性担体工程と比較するとき、ただ微生物を培養液に培養し、ポンプを利用して固定化容器に注入さえすればよいので、酵素の抽出過程、固定化過程などを全て省略することができ、さらに磁性を利用した別途の回収装置が不要なので、経済性の面で優れた利点を有している。
【図１ａ】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図３】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１】
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