(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
不死化細気道上皮細胞に、がん関連遺伝子を導入することにより、腫瘍細胞を作製する方法であって、
前記不死化細気道上皮細胞が、正常細気道上皮細胞に以下の（1）〜（3）の処理を施すことにより作製されたものであり、
（1）テロメア逆転写酵素遺伝子の強制発現
（2）サイクリン依存性キナーゼ4遺伝子の強制発現
（3）p53の機能喪失
前記がん関連遺伝子が、c-Myc遺伝子とv-Src遺伝子との組み合わせである、前記方法。
【請求項２】
不死化細気道上皮細胞に、がん関連遺伝子を導入することにより、腫瘍細胞を作製する方法であって、
前記不死化細気道上皮細胞が、正常細気道上皮細胞に以下の（1）〜（3）の処理を施すことにより作製されたものであり、
（1）テロメア逆転写酵素遺伝子の強制発現
（2）サイクリン依存性キナーゼ4遺伝子の強制発現
（3）p53の機能喪失
前記がん関連遺伝子が、c-Myc遺伝子とKRAS変異遺伝子とBCL2遺伝子との組み合わせである、前記方法。
【請求項３】
前記腫瘍細胞が、未分化型がん細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記腫瘍細胞が、がん幹細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記c-Myc遺伝子が前記不死化ヒト細気道上皮細胞内で誘導発現される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記腫瘍細胞が、低分化型肺がん細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
不死化細気道上皮細胞に、がん関連遺伝子を導入することにより、腫瘍細胞を作製する方法であって、
前記不死化細気道上皮細胞が、正常細気道上皮細胞に以下の（1）〜（3）の処理を施すことにより作製されたものであり、
（1）テロメア逆転写酵素遺伝子の強制発現
（2）サイクリン依存性キナーゼ4遺伝子の強制発現
（3）p53の機能喪失
前記がん関連遺伝子が、KRAS変異遺伝子と、PIK3CA変異遺伝子、Cyclin D1遺伝子及びLKB1変異遺伝子から選ばれるいずれか1つの遺伝子との組み合わせである、前記方法。
【請求項８】
前記がん関連遺伝子が、KRAS変異遺伝子とCyclin D1遺伝子との組み合わせである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
不死化細気道上皮細胞に、がん関連遺伝子を導入することにより、腫瘍細胞を作製する方法であって、
前記不死化細気道上皮細胞が、正常細気道上皮細胞に以下の（1）〜（3）の処理を施すことにより作製されたものであり、
（1）テロメア逆転写酵素遺伝子の強制発現
（2）サイクリン依存性キナーゼ4遺伝子の強制発現
（3）p53の機能喪失
前記がん関連遺伝子が、KRAS変異遺伝子とCyclin D1遺伝子とTP63遺伝子との組み合わせである、前記方法。
【請求項１０】
前記がん関連遺伝子が、KRAS変異遺伝子とPIK3CA変異遺伝子との組み合わせである、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記がん関連遺伝子が、KRAS変異遺伝子とLKB1変異遺伝子との組み合わせである、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
不死化細気道上皮細胞に、がん関連遺伝子を導入することにより、腫瘍細胞を作製する方法であって、
前記不死化細気道上皮細胞が、正常細気道上皮細胞に以下の（1）〜（3）の処理を施すことにより作製されたものであり、
（1）テロメア逆転写酵素遺伝子の強制発現
（2）サイクリン依存性キナーゼ4遺伝子の強制発現
（3）p53の機能喪失
前記がん関連遺伝子が、EGFR変異遺伝子とCyclin D1遺伝子との組み合わせである、前記方法。
【請求項１３】
前記腫瘍細胞が、分化型肺がん細胞である、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記腫瘍細胞が、分化型肺がんのがん幹細胞である請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
不死化細気道上皮細胞が哺乳類または霊長類の細胞である、請求項７〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項1〜１５のいずれか1項に記載の方法により製造された腫瘍細胞。
【請求項１７】
請求項１６に記載の腫瘍細胞が移植された非ヒト担癌モデル動物。
【請求項１８】
以下の工程を含む、腫瘍の治療剤のスクリーニング方法。
（a）請求項１６に記載の腫瘍細胞に由来するサンプルと候補物質とを接触させる工程
（b）腫瘍細胞の増殖阻害効果を検出する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細気道上皮細胞をベースに、遺伝子導入により腫瘍細胞を作製する方法、該方法により作製される腫瘍細胞及び該腫瘍細胞を用いた抗腫瘍剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
毎年１００万人以上が肺がんを原因に死亡しており、肺がんは男女を通して最も身近な種類のがんであるといえる。非小細胞肺がんは、腺がんを伴う全ての種類の肺がんの８０％を占めており、多くの場合、病状が進行した段階で診断され、初期の検出及び治療方法が進歩しているにも関わらず、良好な予後を得ることが困難である（非特許文献１及び２）。非小細胞肺がんの状態及び進行を分子的に理解することにより、治療法及び予防法を改善することが期待されるが、現段階では有効な治療法及び予防法は確立されていない。初期の検出及び治療介入に最も適した標的を見い出すに当たり、細胞の腫瘍化に伴う最小限かつ最重要な変化を同定することが不可欠となる。このような変化の同定のため、近年において、正常なヒト細胞を遺伝子操作することによるインビトロ用のがんモデルシステムの開発が進んでいる。腫瘍組織から樹立された従来型のセルラインは、未知の遺伝子異常を含んでいるために、遺伝子変化による腫瘍化の研究に適していなかったが、上記のようなインビトロ用の癌モデルシステムのいくつかについては、特定の遺伝子変化による腫瘍化への影響を直接的に解明するのに有用であることが報告されている（非特許文献３及び４）。
ヒトの肺上皮細胞の不死化および癌化については、複数の研究グループが研究を行っている（非特許文献５〜７）。これらの研究では、レトロウィルスを用いた遺伝子操作により、大部分のヒト非小細胞肺がんに認められる３種類の遺伝子変化、即ち、テロメラーゼ逆転写酵素遺伝子の導入並びに、ｐＲＢ経路及びｐ５３経路の不活化、が検討されている。テロメラーゼの高発現は殆どの肺がんに共通して観察され（非特許文献８）、ｐ５３の機能喪失は、約５０％の非小細胞肺がんで観察され、また、プロモーター領域のメチル化又はホモ接合型欠失によるｐ１６タンパク質の発現不全が約７０％の非小細胞肺がんで観察されている（非特許文献９）。
しかしながら、このような研究が進められているにも関わらず、現時点において、実際に肺がん患者から採取される肺がん組織と病理学的に高い類似性を示す肺がん細胞を人工的に作製できたという報告は殆ど存在しない。
現時点において、がん細胞の研究及び抗がん剤の開発には、がん患者から採取したがん細胞株を使用しているが、患者から採取されたがん細胞株の殆どは、不特定の遺伝子損傷を有するために、細胞株間で遺伝子異常の状態にばらつきがある。従って、このような細胞を特定の分子又はシグナル経路の研究に用いた場合、得られた実験結果を異なる細胞株に応用することができない。また、このような細胞は、不特定の遺伝子損傷を有するため、がん化に対する個々の遺伝子の貢献を評価するための実験には適さない。
【非特許文献１】Ｍｅｕｗｉｓｓｅｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，（２００５）．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１９，６４３−６６４
【非特許文献２】Ｈｅｒｂｓｔ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，（２００８）．Ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５９，１３６７−１３８０
【非特許文献３】Ａｋａｇｉ，Ｔ．（２００４）．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１０，５４２−５４８
【非特許文献４】Ｚｈａｏ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（２００４）．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１０，３４４−３５０
【非特許文献５】Ｌｕｎｄｂｅｒｇ，Ａ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，（２００２）．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２１，４５７７−４５８６
【非特許文献６】Ｒａｍｉｒｅｚ，Ｒ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，（２００４）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４，９０２７−９０３４
【非特許文献７】Ｓａｔｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（２００６）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６，２１１６−２１２８
【非特許文献８】Ｓｅｋｉｄｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，（２００３）．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５４，７３−８７
【非特許文献９】Ｈｅｒｂｓｔ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，（２００８）．Ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５９，１３６７−１３８０
【発明の開示】
【０００３】
以上の状況に鑑み、遺伝子状態が特定されたがんモデル細胞の開発が待たれている。
本発明者らは、細気道上皮細胞に遺伝子操作を施すことにより、前記細胞を完全に腫瘍化させることに成功した。このようにして得られた腫瘍化細胞は、正常細胞に遺伝子操作を行って腫瘍化させたものであるため、遺伝子状態が特定されている。本発明者らがこれらの細胞を詳細に観察したところ、導入した遺伝子要素の組合せに応じて、分化型又は未分化型のヒト肺がん細胞の組織学的特徴を示すことが判明した。さらに未分化型および分化型ヒト肺癌の癌幹細胞の性質を持つ細胞の作製にも成功した。
すなわち、本発明は以下に関する。
［１］  不死化細気道上皮細胞に、がん関連遺伝子を導入することにより、腫瘍細胞を作製する方法であって、
前記不死化細気道上皮細胞が、正常細気道上皮細胞に以下の（１）〜（３）の処理を施すことにより作製されたものであり、
（１）テロメラーゼ逆転写酵素遺伝子の強制発現
（２）サイクリン依存性キナーゼ４遺伝子の強制発現
（３）ｐ５３の機能喪失
前記がん関連遺伝子が、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子、ｖ−Ｓｒｃ遺伝子、ＫＲＡＳ変異遺伝子、ＢＣＬ２遺伝子、ＰＩＫ３ＣＡ変異遺伝子、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１遺伝子及びＬＫＢ１変異遺伝子、ＴＰ６３遺伝子及びＥＧＦＲ変異遺伝子から選択される１又は複数の遺伝子である、前記方法。
［２］  前記がん関連遺伝子が、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子とｖ−Ｓｒｃ遺伝子との組み合わせである、前記［１］に記載の方法。
［３］  前記がん関連遺伝子が、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子とＫＲＡＳ変異遺伝子とＢＣＬ２遺伝子との組み合わせである、前記［１］に記載の方法。
［４］  前記腫瘍細胞が、未分化型がん細胞である、前記［２］又は［３］に記載の方法。
［５］  前記腫瘍細胞が、がん幹細胞である、前記［４］に記載の方法。
［６］  前記がん関連遺伝子が、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子とｖ−Ｓｒｃ遺伝子であり、前記ｃ−Ｍｙｃ遺伝子が前記不死化細気道上皮細胞内で誘導発現される、前記［１］に記載の方法。
［７］  前記腫瘍細胞が、低分化型肺がん細胞である、前記［６］に記載の方法。
［８］  前記がん関連遺伝子が、ＫＲＡＳ変異遺伝子と、ＰＩＫ３ＣＡ変異遺伝子、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１遺伝子又はＬＫＢ１変異遺伝子から選ばれるいずれか１つの遺伝子との組み合わせである、前記［１］に記載の方法。
［９］  前記がん関連遺伝子が、ＫＲＡＳ変異遺伝子とＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１遺伝子との組み合わせである、前記［８］に記載の方法。
［１０］  前記がん関連遺伝子が、ＫＲＡＳ変異遺伝子とＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１遺伝子とＴＰ６３遺伝子との組み合わせである、前記［８］に記載の方法。
［１１］  前記がん関連遺伝子が、ＫＲＡＳ変異遺伝子とＰＩＫ３ＣＡ変異遺伝子との組み合わせである、前記［８］に記載の方法。
［１２］  前記がん関連遺伝子が、ＫＲＡＳ変異遺伝子とＬＫＢ１変異遺伝子との組み合わせである、前記［８］に記載の方法。
［１３］  前記がん関連遺伝子が、ＥＧＦＲ変異遺伝子とＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１遺伝子との組み合わせである、前記［１］に記載の方法。
［１４］  前記腫瘍細胞が、分化型肺がん細胞である、前記［８］〜［１３］に記載の方法。
［１５］  前記腫瘍細胞が、分化型肺がんのがん幹細胞である前記［９］に記載の方法。
［１６］  前記不死化細気道上皮細胞が、哺乳類または霊長類の細胞である、前記［８］〜［１５］に記載の方法。
［１７］  前記不死化細気道上皮細胞が、ヒトの細胞である、前記［８］〜［１５］に記載の方法。
［１８］  前記［１］〜［１７］のいずれか１項に記載の方法により製造された腫瘍細胞。
［１９］  前記［１５］に記載の腫瘍細胞が移植された担癌モデル動物。
［２０］  以下の工程を含む、腫瘍の治療剤のスクリーニング方法。
（ａ）前記［１８］に記載の腫瘍細胞に由来するサンプルと候補物質とを接触させる工程
（ｂ）腫瘍細胞の増殖阻害効果を検出する工程
本発明の方法により作製される腫瘍細胞は、正常細胞に遺伝子操作を行って腫瘍化させたものであるため、遺伝子状態が特定されている。従って、本発明により、肺がんの発達における個々の遺伝子の貢献の評価に非常に有用なモデルシステムが提供される。また、本発明の方法により作製される腫瘍細胞のうち、がん関連遺伝子のみを導入することによって作製された細胞は、がん細胞の特性を忠実に表現した細胞であり、抗がん剤等の開発に非常に有効であると期待される。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】（Ａ）ｃ−Ｍｙｃ及びｖ−Ｓｒｃ遺伝子をＨＳＡＥ／４Ｔ５３細胞に導入して作製した細胞（以下、４Ｔ５３ＭＳ細胞）の造腫瘍能を示す図である。（Ｂ）４Ｔ５３ＭＳ細胞の腫瘍増殖能を示すグラフである。（Ｃ）４Ｔ５３ＭＳ細胞由来腫瘍組織のヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色した結果、および腫瘍組織の免疫染色の結果を示す図である。
【図２】（Ａ）４Ｔ５３ＭＳ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏにおける造腫瘍能を、移植する細胞数ごとに調べた結果を示す表である。（Ｂ）４Ｔ５３ＭＳ細胞１０個をＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに移植した７週間後の腫瘍形成を示す図である。
【図３】（Ａ）誘導性ｃ−Ｍｙｃ遺伝子とｖ−Ｓｒｃ遺伝子をＨＳＡＥ／４Ｔ５３細胞に導入して作製した細胞（以下、４Ｔ５３ｍＳ細胞（ｍは小文字）と表記する）において、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）処理によって、ｃ−Ｍｙｃ発現が誘導されることを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験系で示した図である。（Ｂ）低分化型肺癌モデルの作製方法の簡略図である。４Ｔ５３ｍＳ細胞をヌードマウスに移植し、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）を投与し続け、腫瘍形成が見られた後に、ドキシサイクリン投与を停止する。（Ｃ）４Ｔ５３ｍＳ細胞由来腫瘍組織の免疫染色（サイトケラチン染色）の結果を示す図である。
【図４】ＨＳＡＥ／４Ｔ５３細胞に、様々な癌関連遺伝子（Ｍ：ｃ−Ｍｙｃ、Ｒ：ＫＲＡＳＶ１２、Ｂ：ＢＣＬ２、Ｐ：ＰＩＫ３ＣＡＨ１０４７Ｒ、Ｄ：Ｃｙｃｌｉｎ−Ｄ１、Ｌ：ＬＫＢ１Ｄ１９４Ａ、Ｅ：ＥＧＦＲＴ７９０Ｍ  Ｌ８５８Ｒ）の１種又は複数種を導入して樹立した細胞株の造腫瘍能を示す表である。
【図５】ＨＳＡＥ／４Ｔ５３細胞に、図に表示される遺伝子（Ｍ：ｃ−Ｍｙｃ、Ｒ：ＫＲＡＳＶ１２、Ｂ：ＢＣＬ２）を導入し、４Ｔ５３ＲＭ細胞（ＫＲＡＳＶ１２及びｃ−Ｍｙｃを導入）と４Ｔ５３ＲＭＢ細胞（ＫＲＡＳＶ１２，ｃ−Ｍｙｃ，ＢＣＬ２を導入）を作製し、このようにして作製した細胞をヌードマウスに移植して、Ｈ＆Ｅ染色（上段）、抗サイトケラチン染色（ＡＥ１／ＡＥ３：中段及び抗ＶＩＭＥＮＴＩＮ染色（下段）を行った結果を示す図である。
【図６】４Ｔ５３ＲＰ（左欄）、４Ｔ５３ＲＤ（中央欄）及び４Ｔ５３ＲＬ細胞（右欄）由来の移植片切片のＨ＆Ｅ染色（上段）、抗サイトケラチン染色（ＡＥ１／ＡＥ３：中段）及び抗ＶＩＭＥＮＴＩＮ染色（下段）の結果を示す図である。なお、４Ｔ５３ＲＰ細胞とは、ＨＳＡＥ／４Ｔ５３細胞にＫＲＡＳＶ１２とＰＩＫ３ＣＡ変異遺伝子を導入した細胞である。４Ｔ５３ＲＤ細胞とは、ＨＳＡＥ／４Ｔ５３細胞にＫＲＡＳＶ１２とＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１遺伝子を導入した細胞である。４Ｔ５３ＲＬ細胞とは、ＨＳＡＥ／４Ｔ５３細胞にＫＲＡＳＶ１２とＬＫＢ１変異遺伝子を導入した細胞である。
【図７】４Ｔ５３細胞に導入する遺伝子の組み合わせにより、様々なタイプの肺癌モデルを作製することが可能であることを示す概念図である。
【図８】（Ａ）４Ｔ５３ＲＤ細胞のシングル細胞に由来する細胞クローンを皮下移植し、当該移植切片の抗ｐ６３染色（左パネル）、抗ＴＴＦ１染色（中央パネル）、Ａｌｃｉａｎ  Ｂｌｕｅ染色（右パネル）の結果を示す図である。（Ｂ）マウスの気道上皮の模式図である。
【図９】４Ｔ５３ＲＤ細胞のシングル細胞に由来する細胞クローンのｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍形成能を、移植する細胞数ごとに調べた結果を示す表である。
【図１０】（Ａ）４Ｔ５３ＲＤ細胞及び（Ｂ）４Ｔ５３ＲＤΔＮｐ６３細胞由来の移植片切片のＨ＆Ｅ染色の結果を示す図である。
【図１１】４Ｔ５３ＥＤ細胞由来の移植片切片の（Ａ）Ｈ＆Ｅ染色の結果、（Ｂ）Ａｌｃｉａｎ  Ｂｌｕｅ染色の結果、（Ｃ）抗サイトケラチン染色（ＡＥ１／ＡＥ３）の結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、２０１０年５月３１日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願２０１０−１２５２５６号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
１．腫瘍細胞の作製方法
本発明は、不死化細気道上皮細胞に、がん関連遺伝子を導入することにより、腫瘍細胞を作製する方法を提供する。
好ましくは、本発明の方法は、前記不死化細気道上皮細胞が、正常細気道上皮細胞に以下の（１）〜（３）の処理を施すことにより作製されたものであり、
（１）テロメラーゼ逆転写酵素遺伝子の強制発現
（２）サイクリン依存性キナーゼ４遺伝子の強制発現
（３）ｐ５３の機能喪失
前記がん関連遺伝子が、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子、ｖ−Ｓｒｃ遺伝子、ＫＲＡＳ変異遺伝子、ＢＣＬ２遺伝子、ＰＩＫ３ＣＡ変異遺伝子、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１遺伝子、ＬＫＢ１変異遺伝子、ＴＰ６３遺伝子及びＥＧＦＲ変異遺伝子から選択される１又は複数の遺伝子であることを特徴とする。
がん関連遺伝子
本発明の方法において使用する、「がん関連遺伝子」とは、正常細胞内で発現させた場合に、前記細胞を腫瘍化又はがん化させることが可能な遺伝子、あるいは正常細胞内で発現させた場合に、前記細胞を腫瘍化又はがん化させることが可能な遺伝子の発現制御に関連する遺伝子を意味する。がん関連遺伝子の具体例としては、ｍｙｅｌｏｃｙｔｏｍａｔｏｓｉｓ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ（ｃ−Ｍｙｃ）遺伝子、ｖ−Ｓｒｃ遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ／ｌｙｍｐｈｏｍａ  ２（ＢＣＬ２）遺伝子、ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ  ｉｎｏｓｉｔｏｌ  ３−ｋｉｎａｓｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔ（ＰＩＫ３ＣＡ）遺伝子、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１遺伝子、Ｌｉｖｅｒ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｂ１（ＬＫＢ１）遺伝子、ｃ−Ａｂ１遺伝子、ｃ−Ｓｉｓ遺伝子、ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）遺伝子、ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＰＤＧＦＲ）遺伝子、ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＥＧＦＲ）遺伝子，ＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子、Ｒａｆキナーゼ遺伝子、サイクリン依存性キナーゼ遺伝子、Ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐ６３（ＴＰ６３）遺伝子及びこれらの変異遺伝子等が挙げられる。
本発明においては、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子、ｖ−Ｓｒｃ遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、ＢＣＬ２遺伝子、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１遺伝子、ＬＫＢ１遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、ＴＰ６３遺伝子並びにこれらの変異遺伝子及びスプライシングアイソフォームを好適に用いることができる。
本発明においては、がん関連遺伝子の種別は特に問わないが、好ましくは哺乳類のがん関連遺伝子であり、より好ましくは霊長類のがん関連遺伝子であり、さらに好ましくは、ヒトのがん関連遺伝子である。
「ｃ−Ｍｙｃ遺伝子」は、種々の遺伝子の発現調節及びＤＮＡ複製に関与するＤＮＡ結合因子、即ち転写因子をコードする遺伝子であり、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子の発現異常は、種々のがんとの関連性が示唆されている（Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ−Ｓｏｌａ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，（２００７），Ｎａｔｕｒｅ，４４８，４４５−４５１）。
「ｖ−Ｓｒｃ遺伝子」は、レトロウィルスの一種であるＲｏｕｓ  ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓに由来するがん関連遺伝子であり、その配列はＭａｙｅｒ  ＢＪ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．，（１９８６），６０，（３），８５８−６７）に記載されている。
「ＲＡＳ遺伝子」は、細胞の分化及び増殖に関与するシグナルを伝達する低分子ＧＴＰアーゼをコードする遺伝子であり、これらのシグナル伝達の異常により細胞ががん化することが知られている（Ｇｏｏｄｓｅｌｌ，Ｄ．Ｓ．，（１９９９），Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ，４，（３），２６３−２６４）。また、非小細胞肺がんの２０−３０％でＲＡＳ遺伝子の変異が報告されている（Ａｖｉｅｌ−Ｒｏｎｅｎｖ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，（２００６），Ｃｌｉｎ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ，１，３０−３８）。本発明において、ＲＡＳ遺伝子は、好ましくは、ＫＲＡＳ変異遺伝子である。本発明において、ＫＲＡＳ変異遺伝子は、野生型ＫＲＡＳ遺伝子が変異したＫＲＡＳ遺伝子であり、例えば、１２番目のグリシン残基がバリン残基に置換した変異体ＫＲＡＳＶ１２（配列番号６）をコードする遺伝子が挙げられる。ＫＲＡＳＶ１２をコードする遺伝子の詳細については、Ｓａｔｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００６），，６６，（４），２１１６−２１２８）に記載されている。
「ＢＣＬ２遺伝子」は、アポトーシス抑制活性を持つがん関連遺伝子であり、メラノーマ、前立腺がん、乳がん及び肺がんとの関連性が示唆されている（Ｃｈａｏ，Ｄ．Ｔ．，Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ，Ｓ．Ｊ．，（１９９８），Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６，３９５−４１９）。
「ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子」は、クラスＩ型のＰＩ  ３−ｋｉｎａｓｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔをコードする遺伝子であり、乳がん、大腸がん及び肺がんとの関連が報告されている（（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，（２００５），５，９２１−９２９、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，（２０１０），２，２６−２５）。また、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子は、子宮頸がんの発達においてがん関連遺伝子として機能することが示唆されている（Ｍａ，Ｙ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，（２０００），Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９，（２３），２７３９−２７４４）。本発明において、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子は、好ましくはＰＩＫ３ＣＡ変異遺伝子である。ＰＩＫ３ＣＡ変異遺伝子は、野生型が変異したＰＩＫ３ＣＡ遺伝子であり、例えば、、１０４７番目のヒスチジン残基がアルギニンで置換されたＰＩＫ３ＣＡＨ１０４７Ｒ変異タンパク質（配列番号１０）をコードする遺伝子が挙げられる。
「Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１遺伝子」は、細胞周期調節因子をコードする遺伝子であり、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１遺伝子の過剰発現は、副甲状腺腺腫、乳がん、前立腺がん、大腸がん、リンパ腫、メラノーマ及び肺がんの発達に関与している（Ｍｏｒｇａｎ，Ｄ．Ｏ．，（２００８），Ｃｅｌｌ，１３５，７６４−７９４、Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ，（２００７），５５，１−１４）。
「ＬＫＢ１遺伝子」は、Ｌｉｖｅｒ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｂ１をコードする遺伝子であり、ＬＫＢ１遺伝子の変異と肺がん、子宮頸がん、乳がん、精巣がん、膵がん及び皮膚がんの発達との関連性が示唆されている（Ｋａｔａｊｉｓｔｏ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，（２００７），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１７７５，（１），６３−７５）。本発明においては、ＬＫＢ１遺伝子は、好ましくはＬＫＢ１変異遺伝子である。ＬＫＢ１変異遺伝子は、野生型が変異したＬＫＢ１遺伝子であり、例えば、ＬＫＢ１のドミナントネガティブ型変異体（ＬＫＢ１−ＤＮ）をコードする遺伝子を好適に使用することができる。ドミナントネガティブ型ＬＫＢ１変異体の例としては、１９４番目のアスパラギン酸がアラニンで置換されたＬＫＢ１Ｄ１９４Ａ（配列番号１６）が挙げられる。
「ＥＧＦＲ遺伝子」は、上皮成長因子受容体をコードする遺伝子であり、ＥＧＦＲ遺伝子の発現上昇は肺がん、乳がん、大腸がん、胃がん、脳腫瘍など多くのがんで認められる。また、肺腺がんではＥＧＦＲ遺伝子の変異が高率で見つかることも知られている。（Ｓｈａｒｍａ  ＳＶ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７），Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ，７，（３），１６９−８１）。本発明において、ＥＧＦＲ遺伝子は、好ましくは、ＥＧＦＲ変異遺伝子である。ＥＧＦＲ変異遺伝子は、野生型が変異したＥＧＦＲ遺伝子であり、例えば、７９０番目のスレオニン残基がメチオニン残基で、８５８番目のロイシン残基がアルギニン残基で置換されたＥＧＦＲＴ７９０Ｍ  Ｌ８５８Ｒ変異タンパク質（配列番号１８）をコードする遺伝子が挙げられる。
「ＴＰ６３遺伝子」は、ＴＰ５３がん抑制遺伝子の類縁遺伝子であるが、がんを抑制する場合も促進する場合もあることが知られている。頭頸部、肺、食道など様々な臓器由来の扁平上皮がんでＴＰ６３遺伝子の発現上昇が報告されている。（Ｄｅｙｏｕｎｇ  ＭＰ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７），Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２６，５１６９−５１８３）。本発明においてＴＰ６３遺伝子は、好ましくはＴＰ６３のスプライシングアイソフォームをコードする遺伝子である。ＴＰ６３のスプライシングアイソフォームをコードする遺伝子として、例えば、Ｎ末端側のトランス活性化ドメインを欠損したＴＰ６３のスプライシングアイソフォーム（配列番号２０）をコードするＴＰ６３ΔＮ遺伝子が挙げられる。
ヒトのｃ−Ｍｙｃ、ＢＣＬ２及びＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１遺伝子の各ヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩデータベースに下記のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒで登録されている。ＫＲＡＳＶ１２、ＰＩＫ３ＣＡＨ１０４７Ｒ及びＬＫＢ１Ｄ１９４Ａ遺伝子の各ヌクレオチド配列の詳細は、ＮＣＢＩデータベースに下記のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒで登録されている野生型の遺伝子配列並びにＭｃＣｏｙ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９８４），４，１５７７−１５８２）、Ｓａｍｕｅｌｓ，Ｙ  ｅｔ  ａｌ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，（２００４），３０４，５５４）、及びＳｃｏｔｔ、Ｋ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，（２００７），６７，５６２２−５６２７）を参照することができる。
【表１】
0005894914.tif 000002
0005894914.tif 000003
不死化細気道上皮細胞
本発明において、「不死化細気道上皮細胞」とは、細気道上皮細胞に由来する不死化細胞であれば特に限定されるものではないが、好ましくは、哺乳類の細気道上皮細胞に由来する細胞であり、より好ましくは、霊長類の細気道上皮細胞に由来する細胞であり、さらに好ましくは、ヒトの細気道上皮細胞に由来する不死化細胞である。これらの細気道上皮細胞に由来する不死化細胞のうち、さらに好ましくは、正常な細気道上皮細胞に由来する不死化細胞である。ここで、「正常」とは、健康な状態、即ち、検出可能な疾患又は異常を有しない状態を意味する。
不死化ヒト細気道上皮細胞
本発明において、「不死化ヒト細気道上皮細胞」とは、ヒトの細気道上皮細胞に由来する不死化細胞であれば特に限定されるものではないが、好ましくは、正常ヒト細気道上皮細胞に由来する不死化細胞である。「正常ヒト細気道上皮細胞」とは、健常人のヒトの細気道上皮細胞などを意味するものであり、例えば、検出可能な疾患又は異常を有しない状態にあるヒトの細気道上皮細胞である。
上述の不死化細気道上皮細胞または不死化ヒト細気道上皮細胞は、正常な細気道上皮細胞または正常ヒト細気道上皮細胞に以下の（１）〜（３）の処理のいずれか又はその組み合わせを施すことにより作製することができるが、処理（１）〜（３）の全てを施すことが好ましい。なお、処理（１）〜（３）の処理の順番は特に問わない。
（１）テロメラーゼ遺伝子の強制発現
（２）サイクリン依存性キナーゼ遺伝子の強制発現
（３）アポトーシス誘導タンパク質の機能喪失
操作（１）について：テロメラーゼは、真核生物の染色体末端の特異的反復配列を伸張させる酵素であり、テロメラーゼは、それぞれ異なる遺伝子座にコードされるテロメア逆転写酵素、テロメアＲＮＡコンポーネント（ＴＥＲＣ）、ジスケリン及びテロメラーゼ関連タンパク質１（ＴＥＰ１）等のサブユニットから構成される。操作（１）において強制発現させるテロメラーゼ遺伝子としては、テロメア逆転写酵素、ＴＥＲＣ、ジスケリン及びＴＥＰ１をコードする各遺伝子が挙げられるが、本発明においては、特にテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子（以下、ＴＥＲＴ遺伝子という）を好適に用いることができる。
操作（２）について：サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）は、細胞周期の回転に関与し、そのファミリーは、ＣＤＫ１〜１３から構成される。操作（２）において強制発現させるサイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋ）遺伝子は、ＣＤＫ１〜１３のいずれをコードする遺伝子であってもよいが、好ましくは、ＣＤＫ４をコードする遺伝子（Ｃｄｋ４遺伝子）を用いることができる。ＣＤＫ４は、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１の結合パートナーであり、Ｃｄｋ４遺伝子の変異が各種腫瘍内で検出されている（Ｚｕｏ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９６），Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１２，９７−９９）。
操作（３）について：アポトーシス誘導タンパク質の例としては、ｐ５３、カスパーゼ−３、−８〜１０、１２等が挙げられる。操作（３）において機能喪失させるタンパク質は、ｐ５３、カスパーゼ−３、−８〜１０、１２のいずれのタンパク質であってもよいが、本発明においては、好ましくは、ｐ５３である。ｐ５３の機能を喪失させる方法としては、ｐ５３タンパク質の中和抗体の添加、前記抗体をコードする遺伝子の細胞導入、ｐ５３をコードする遺伝子であるＴＰ５３遺伝子のノックアウト、ＲＮＡ干渉によるノックダウン、ドミナントネガティブ型ＴＰ５３遺伝子の強制発現等が挙げられる。
ＴＰ５３遺伝子のＲＮＡ干渉によるノックダウンの報告例として、Ｓａｔｏ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，（２００６），６６，２１１６−２１２８）が挙げられる。Ｓａｔｏ  Ｍ  ｅｔ  ａｌは、ＴＰ５３遺伝子のＲＮＡ干渉によるノックダウンを行ってヒト気管上皮細胞を不死化させている。
なお、上記の処理（１）〜（３）において、強制発現する遺伝子および機能消失するタンパク質の種別は特に問わないが、好ましくは哺乳類の遺伝子またはタンパク質であり、より好ましくは霊長類の遺伝子またはタンパク質であり、さらに好ましくは、ヒトの遺伝子またはタンパク質である。
本発明において、特に好適に使用できる不死化細気道上皮細胞は、正常な細気道上皮細胞（以下、ＳＡＥ細胞という）に、ＴＥＲＴ遺伝子（以下、ＴＥＲＴ遺伝子という）及びＣｄｋ４遺伝子を強制発現させ、かつｐ５３の機能を損失させることにより不死化能を獲得した細胞である。より好適な例としては、ＳＡＥ細胞に、ＴＥＲＴ遺伝子、Ｃｄｋ４遺伝子、及びドミナントネガティブ型ＴＰ５３遺伝子を導入して強制発現させることにより不死化能を獲得した細胞である。
さらに好適に使用できる不死化ヒト細気道上皮細胞は、正常なヒト細気道上皮細胞（以下、ＨＳＡＥ細胞という）に、ｈＴＥＲＴ遺伝子及びＣｄｋ４遺伝子を強制発現させ、かつｐ５３の機能を損失させることにより不死化能を獲得した細胞である。より好適な例としては、ＨＳＡＥ細胞に、ｈＴＥＲＴ遺伝子、Ｃｄｋ４遺伝子、及びドミナントネガティブ型ＴＰ５３遺伝子を導入して強制発現させることにより不死化能を獲得した細胞（以下、ＨＳＡＥ／４Ｔ５３細胞という）である。ｈＴＥＲＴ遺伝子及びＣｄｋ４遺伝子及びＴＰ５３遺伝子のヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩに以下のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒで登録されている。ドミナントネガティブ型ＴＰ５３遺伝子のヌクレオチド配列はＳｈａｕｌｉａｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，（１９９２），１２，５５８１）を参照することができる。
【表２】
0005894914.tif 000004
ＳＡＥ細胞は、哺乳類から採取したものを用いてもよく、あるいは市販の細胞（ＣＥＬＬｎＴＥＣ社：Ｂｅｒｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてもよい。
ＨＳＡＥ細胞は、ヒトから採取したものを用いてもよく、あるいは市販の細胞（Ｌｏｎｚａ社：Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いてもよい。
正常な細気道上皮細胞または正常なヒト細気道上皮細胞への遺伝子導入の方法は、以下で述べる不死化ヒト細気道上皮細胞への遺伝子導入の方法と同様である。
遺伝子導入方法
本発明において、がん関連遺伝子を不死化ヒト細気道上皮細胞に導入する場合、がん関連遺伝子を適切な発現カセットとして発現ベクターに挿入し、該ベクターで不死化ヒト細気道上皮細胞を形質転換すればよい。適切な発現カセットは、少なくとも以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）を構成要素として含む。
（ｉ）不死化ヒト細気道上皮細胞で転写可能なプロモーター；
（ｉｉ）該プロモーターに結合したがん関連遺伝子；及び
（ｉｉｉ）ＲＮＡ分子の転写終結及びポリアデニル化シグナルをコードする配列
不死化ヒト細気道上皮細胞で転写可能なプロモーターの例としては、ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＬＴＲ、ＥＦ−１ａ、ＳＶ４０プロモーター等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
前記発現ベクターは、前記発現カセットの他に、形質転換された不死化ヒト細気道上皮細胞をセレクションするための選択マーカー発現カセットを有していてもよい。選択マーカーの例としては、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子等のポジティブセレクションマーカー、ＬａｃＺ、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）及びルシフェラーゼ遺伝子などの発現レポーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ＴＫ）、ジフテリア毒素Ａフラグメント（ＤＴＡ）等のネガティブセレクションマーカー等が挙げられるが、これらに限定されない。
形質転換された不死化ヒト細気道上皮細胞は、上記マーカーにより容易に選択することができる。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子をマーカーとして導入した細胞であれば、Ｇ４１８を加えた培地中で培養することにより、一次セレクションを行うことができる。また、ターゲティングベクターがＧＦＰ等の蛍光タンパク質の遺伝子をマーカーとして含む場合には、薬剤耐性によるセレクションに加えて、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ）等を用いた蛍光タンパク質発現細胞のソーティングを行ってもよい。
不死化ヒト細気道上皮細胞へのがん関連遺伝子の導入に使用可能な発現ベクターは、例えば細胞へ遺伝子導入可能な既存の発現ベクターが挙げられ、市販されているものを用いてもよい。発現ベクターの例としてｐＥＧＦＰ−Ｃ１ＴＭ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＣＭＶ−ＨＡＴＭ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＭＳＣＶｐｕｒｏＴＭ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＥＦ−ＤＥＳＴ５１  ＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＥＰ４ＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＶｉｒａＰｏｗｅｒ  ＩＩ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｇａｔｅｗａｙ  ＳｙｓｔｅｍＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等が挙げられる。発現ベクターは、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ウィルス感染等、公知の遺伝子導入法により不死化ヒト細気道上皮細胞へ導入することができる。遺伝子導入法の詳細については、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｖｏｌ．３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１」等を参照することができる。
２．腫瘍細胞
本発明において「腫瘍細胞」とは、ｉｎ  ｖｉｖｏで自立的に過剰増殖する細胞を意味する。腫瘍細胞の例としては、（１）骨肉腫や軟部組織肉腫等の肉腫、（２）乳がん腫、肺がん腫、膀胱がん腫、甲状腺がん腫、前立腺がん腫、結腸がん腫、結腸直腸がん腫、膵臓がん腫、胃がん腫、肝臓がん腫、子宮がん腫、子宮頸がん腫、卵巣がん腫等のがん腫、（３）ホジキンや非ホジキンリンパ腫等のリンパ腫、（４）神経芽細胞腫、（５）メラノーマ、（６）ミエローマ、（７）ウィルムス腫瘍、（８）急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）等の白血病、（９）グリオーマ、（１０）網膜芽細胞腫等に含まれる細胞が挙げられる。
「腫瘍細胞」の例としては、分化の程度の観点から、分化型がん細胞及び未分化型がん細胞を挙げることもできる。本発明のある実施態様では、腫瘍細胞の好ましい形態は、未分化型がん細胞及び分化型肺がん細胞が挙げられる。分化型肺がん細胞は、さらに低分化型肺がん細胞及び分化型肺がん細胞に分類することができる。低分化型肺がん細胞の例としては、大細胞がん様細胞が挙げられる。一方、分化型肺がん細胞の例としては、扁平上皮がん細胞及び腺がん細胞が挙げられる。
細胞の腫瘍化の確認は、不死化ヒト細気道上皮細胞または不死化ヒト細気道上皮細胞にがん関連遺伝子を導入して、前記細胞を数日培養した後に、前記細胞を適切なモデル動物に皮下注射して腫瘍塊形成を観察することにより行うことができる。
モデル動物の例としては、ヒトを除く哺乳動物が好ましく、特に免疫抑制された哺乳動物が好ましい。免疫抑制された哺乳動物の例としては、ヌードラット、ヌードマウス及びスキッドマウスが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
細胞の腫瘍化を確認するための別の方法としては、がん関連遺伝子を導入した不死化ヒト細気道上皮細胞をソフトアガー上で培養し、そのコロニー形成を観察する方法（ソフトアガーコロニー形成アッセイ）が挙げられる。具体的には、不死化ヒト細気道上皮細胞を一定の細胞濃度に調製した上でソフトアガー培地に播種し、細胞増殖速度を観察する方法である。ソフトアガーコロニー形成アッセイの詳細については、Ｔａｎａｋａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９９７），９４，２３５６−２３６１）を参照できる。
腫瘍細胞の種類
本発明の方法では、導入するがん関連遺伝子の組み合わせにより、未分化型がん細胞、低分化型肺がん細胞又は分化型肺がん細胞のいずれかを選択的に作製することができる。
未分化型がん細胞
本発明の方法において、以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示す遺伝子の組み合わせを不死化ヒト細気道上皮細胞に導入することにより、未分化型のがん細胞を作製することができる。
（Ａ）ｃ−Ｍｙｃ遺伝子とｖ−Ｓｒｃ遺伝子
（Ｂ）ｃ−Ｍｙｃ遺伝子、ＫＲＡＳ変異遺伝子およびＢＣＬ２遺伝子
本方法においては、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子の代わりにＮ−Ｍｙｃ遺伝子又はＬ−Ｍｙｃ遺伝子を用いてもよく、ＫＲＡＳ遺伝子の代わりにＨＲＡＳ遺伝子又はＮＲＡＳ遺伝子を用いてもよく、あるいはＢＣＬ２遺伝子の代わりにＢＣＬ−Ｘを用いてもよい。
上記の遺伝子の組み合わせにより作製された未分化型がん細胞（以下、「本発明の未分化型がん細胞」）は、免疫組織化学的分析において、大部分の細胞が、上皮細胞マーカーであるサイトケラチン（抗体のクローン名はＡＥ１／ＡＥ３）について陰性または弱陽性であり、かつ間葉系マーカー（ＶＩＭＥＮＴＩＮ）について陽性である（図１Ｃ、図５）。但し、ＡＥ１／ＡＥ３で陽性かつＶＩＭＥＮＴＩＮで陰性の細胞が一部に含まれていてもよい（図１Ｃ）。
また、本発明の未分化型がん細胞は、高い造腫瘍能を有することを特徴とする（図２、図４）。
上記（Ａ）の遺伝子の組み合わせにより作製された未分化型がん細胞は、図１Ｂに示すように、ＮＣｌ−Ｈ４６０ヒト非小細胞肺癌細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１７７）と比べて約２倍高い造腫瘍能を有し、免疫不全マウスの皮下に僅か１０個の細胞を接種させた場合であっても腫瘍組織を形成することが可能である（図２Ａ）。この結果より、本発明の（Ａ）の遺伝子の組み合わせにより作製された未分化型がん細胞は、非常に強いｔｕｍｏｒ−ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ能を有するという、がん幹細胞の特徴のひとつを有するものといえる。
上記（Ｂ）の遺伝子の組み合わせにより作製された未分化型がん細胞は、、８０％の高効率でヌードマウスに腫瘍を形成することが可能であり、高い腫瘍形成能を有している（図４）。
低分化型肺がん細胞
本発明の方法において、以下の（Ｃ）に示す遺伝子の組み合わせを不死化ヒト細気道上皮細胞に導入し、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子を誘導発現させることにより、低分化型の肺がん細胞を作製することができる。
（Ｃ）誘導性ｃ−Ｍｙｃ遺伝子とｖ−Ｓｒｃ遺伝子
ここで、「誘導性ｃ−Ｍｙｃ遺伝子」とは、外的刺激により誘導発現が可能なｃ−Ｍｙｃ遺伝子又はその発現系を意味する。「誘導性ｃ−Ｍｙｃ遺伝子」は、前記「ｃ−Ｍｙｃ遺伝子」に含まれるものとする。また、「誘導発現」とは、発現誘導系により遺伝子発現を制御することを意味する。誘導発現は、（Ｃ）に示す遺伝子を不死化ヒト細気道上皮細胞に導入した後から開始すればよいが、好ましくは、不死化ヒト細気道上皮細胞に導入した後から腫瘍形成が確認されるまでの期間で行われる。
発現誘導系は、目的遺伝子（ｃ−Ｍｙｃ遺伝子）の発現を人為的に制御できるものであれば特に限定されないが、具体例としては、デキサメタゾン及びｍｏｕｓｅ  ｍａｍｍａｒｙ  ｔｕｍｏｒ  ｖｉｒｕｓ（ＭＭＴＶ）プロモーターを用いた発現誘導系、テトラサイクリン又はドキシサイクリン等及びテトラサイクリン応答性プロモーターを用いた発現誘導系（Ｔｅｔ−ｏｎシステム）、ニッケル、コバルト、マンガン、鉄等の金属イオンとメタロチオネインプロモーターを用いた発現誘導系、並びにヒートショックプロテインプロモーターを用いた発現誘導系が挙げられる。
ｃ−Ｍｙｃ遺伝子を強制発現させ、腫瘍形成が確認された時点で、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子の発現を抑制する系（例えば、Ｔｅｔ−ｏｆｆシステム）又はｃ−Ｍｙｃタンパク質を分解する系（Ａｕｘｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｇｒｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ：Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１２，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ（２００９））を用いて、ｃ−Ｍｙｃの機能を破壊してもよい。好適には、Ｔｅｔ−ｏｎシステムを用いることができ、感度の観点からドキシサイクリンを添加することが好ましい。
なお、本方法においては、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子の代わりにＮ−Ｍｙｃ遺伝子又はＬ−Ｍｙｃ遺伝子を用いてもよい。
上記の遺伝子の組み合わせにより作製された低分化型の肺がん細胞（以下、「本発明の低分化型の肺がん細胞」）は、上皮細胞マーカーであるサイトケラチン（抗体のクローン名はＡＥ１／ＡＥ３）が陽性であり、大細胞癌様の形態学的特徴を示す（図３Ｃ）。
分化型肺がん細胞
本発明の方法において、以下の（Ｄ）〜（Ｈ）のいずれかに示す遺伝子の組み合わせを不死化ヒト細気道上皮細胞に導入することにより、分化型肺がん細胞を作製することができる。
（Ｄ）ＫＲＡＳ変異遺伝子とＰＩＫ３ＣＡ変異遺伝子
（Ｅ）ＫＲＡＳ変異遺伝子とＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１遺伝子
（Ｆ）ＫＲＡＳ変異遺伝子とＬＫＢ１変異遺伝子
（Ｇ）ＫＲＡＳ変異遺伝子、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１遺伝子およびＴＰ６３遺伝子
（Ｈ）Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１遺伝子とＥＧＦＲ変異遺伝子
本方法においては、ＫＲＡＳ遺伝子の代わりにＨＲＡＳ遺伝子又はＮＲＡＳ遺伝子を用いてもよく、あるいはＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１遺伝子の代わりにＣｙｃｌｉｎ  Ｄ２遺伝子又はＣｙｃｌｉｎ  Ｄ３遺伝子を用いてもよい。
上記の遺伝子の組み合わせにより作製された分化型肺がん細胞（以下、「本発明の分化型肺がん細胞」）は、いずれも非常に高い造腫瘍能を有することを特徴とする（図４）。
本発明の分化型肺がん細胞のうち、（Ｄ）又は（Ｈ）の組み合わせで作製された細胞は、扁平上皮様細胞及び腺がん様細胞が混在した形態を示し、一方、（Ｅ）又は（Ｆ）の組み合わせで作製された分化型肺がん細胞は、それぞれ腺がん様細胞の形態を示す。（Ｇ）の組み合わせで作製された細胞は、扁平上皮様細胞の形態を示す。
また、免疫組織化学的分析において、（Ｄ）、（Ｅ）又は（Ｆ）のいずれの組み合わせで作製された分化型肺がん細胞も、ＡＥ１／ＡＥ３及びｐ６３について陽性である（図６）。また、（Ｈ）の組み合わせで作製された分化型肺がん細胞は、ＡＥ１／ＡＥ３について陽性であり（図１１Ｃ）、かつＡｌｃｉａｎ  Ｂｌｕｅ染色で陽性である（図１１Ｂ）。
本発明の腫瘍細胞は、いずれも腫瘍発生率及び増殖能が高く、モデル動物に移植して腫瘍形成させた場合、がん関連遺伝子を導入する前の細気道上皮細胞が属する動物種で形成される腫瘍組織と病理学的に酷似した腫瘍を形成する。たとえばヒトの細気道上皮細胞を用いた場合にはがん患者から採取されたがん組織、特に、肺がん組織と病理学的に酷似した腫瘍を形成する。従って、本発明の腫瘍細胞は、肺がん細胞のリプログラミング、分化、生物学的機構の研究、肺がん治療のターゲット分子の同定、並びに抗癌剤のスクリーニングといった多種多様な肺がん研究に非常に有用である。
３．担癌モデル動物
本発明において「担癌モデル動物」とは、前記腫瘍細胞をヒトを除くモデル動物に移植して腫瘍塊が形成された動物を意味する。
モデル動物の例としては、ヒトを除く哺乳動物が好ましく、マウス、ラット、ブタ、イヌ、サル、ハムスター、ウサギなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。このようなモデル動物のうち、特に免疫抑制された哺乳動物が好ましい。免疫抑制された哺乳動物は、通常の哺乳動物にシクロスポリン等の免疫抑制剤を投与することにより作製することもできるが、好ましくは、遺伝的バックグラウンドにより先天的に免疫が抑制された哺乳動物が好ましい。先天的に免疫が抑制された哺乳動物の例としては、ヌードラット、ヌードマウス及びスキッドマウスが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
モデル動物への前記腫瘍細胞の移植方法は特に限定されない。移植されるモデル動物に応じて従来から利用されている方法を適宜選択すればよい。マウス以外に移植した事例として例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｓｗｉｎｅ  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２６，１０３８−１０４５（１１  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００６）等を参照できる。また、移植の際に使用する腫瘍細胞はモデル動物に移植した際に腫瘍塊を形成させる限り、モデル動物と同じ種であってもよいし、異なる種であってもよい。
移植した腫瘍細胞の再摘出の容易性の観点からは、皮下注射又は腹腔内注射による移植が好ましく、一方で、解剖学的な観点からは、同所移植が好ましい。
４．抗腫瘍剤のスクリーニング方法
本発明は、以下の工程を含む、腫瘍の治療剤のスクリーニング方法を提供する。
（ａ）本発明の腫瘍細胞に由来するサンプルと候補物質とを接触させる工程
（ｂ）腫瘍細胞の増殖阻害効果を検出する工程
「腫瘍細胞に由来するサンプル」とは、腫瘍細胞または腫瘍組織あるいはこれらをスクリーニング方法の工程で使用しやすいように適宜調整したサンプルを意味する。
「腫瘍細胞に由来するサンプルと候補物質とを接触させる」とは、該候補物質が、腫瘍細胞表面の分子と相互作用を生じさせる程度に接近するか、該分子と結合するか、又は該腫瘍細胞内に取り込まれる条件を調整することを意味する。腫瘍細胞が、培養細胞である場合、該細胞が接している培養培地に該候補物質を一定濃度以上で添加することにより、該細胞と候補物質とを接触させることができる。一方、腫瘍細胞が動物体内に移植されている場合、該動物に候補物質を一定量で投与することにより、該腫瘍細胞と候補物質とを接触させることができる。この場合、投与経路は、候補物質の投与に一般的に採用されている経路であれば、特に限定はされないが、具体例としては、経口、舌下、経鼻、経肺、経消化管、経皮、点眼、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、局所注射、外科的移植が挙げられ、好ましくは経口投与、腹腔内注射及び静脈内注射である。
候補物質の例としては、既に抗腫瘍効果が確認されている薬剤及び抗腫瘍作用を潜在的に有する化合物、ポリペプチド、核酸、抗体及び低分子化合物等が挙げられる。このような候補物質の具体例としては、代謝拮抗剤（例えば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ））、葉酸代謝拮抗薬（例えば、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ阻害薬であるスルファジアジン及びスルファメトキサゾール、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害薬（ＤＨＦＲ阻害薬）であるメソトレキセート、トリメトプリム、ピリメタミン）、ピリミジン代謝阻害薬（例えば、チミジル酸シンターゼ阻害薬である５−ＦＵ、フルシトシン（５−ＦＣ））、プリン代謝阻害薬（例えば、ＩＭＰＤＨ阻害薬である６−メルカプトプリン及びそのプロドラッグであるアザチオプリン）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）阻害薬）（例えば、ペントスタチン）、リボヌクレオチドレダクターゼ阻害薬（リボヌクレオチドレダクターゼ阻害薬であるヒドロキシウレア）、ヌクレオチドアナログ（プリンアナログであるチオグアニン、リン酸フルダラビン及びクラドリビン、ピリミジンアナログであるシタラビン及びゲムシタビン）、Ｌ−アスパラギナーゼ、アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタードであるシクロホスファミド、メルファラン及びチオテパ、白金製剤であるシスプラチン、カルボプラチン及びオキサリプラチン、ニトロソウレアであるダカルバシン、プロカルバシン及びラニムスチン）抗腫瘍性構成物質（ザルコマイシン、マイトマイシンＣ、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン）、トポイソメラーゼ阻害剤（イリノテカン、ノギテカン、ドキソルビシン、エトポシド、レボフロキサシン、シプロフロキサシン）、微小管重合阻害剤（ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン）、コルヒチン、微小管脱重合阻害薬（パクリタキセル、ドセタキセル）、分子標的剤（トラスツズマブ、リツキシマブ、イマチニブ、ゲフィチニブ、ボルテゾミブ、エルロチニブ）、デキサメサゾン等のステロイド薬、フィナステリド、アロマターゼ阻害剤及びタモキシフェン並びにこれらの組合せが挙げられるが、以上に限定されるものではない。
腫瘍細胞の増殖阻害効果については、同一の細胞数を同一の細胞密度で培養ディッシュに播種した同一条件の培養系、あるいは同一の細胞数を同一の細胞密度で移植した同一系統の移植モデル動物を２系用意し、一方の系（サンプル）の細胞に前記候補物質を接触させ、他方の系（コントロール）の細胞には前記候補物質を接触させずに、両系の腫瘍細胞の増殖を観察し、一定期間経過後に前記２系のそれぞれに含まれる腫瘍細胞数を測定し、比較することで増殖阻害効果を確認することができる。
本発明の腫瘍細胞を培養細胞の形態でスクリーニングに用いる場合、上記サンプル細胞に候補物質を接触させた後に、サンプル細胞の細胞数とコントロール細胞の細胞数とをセルカウンター等で測定し、それぞれの細胞数を比較して腫瘍増殖効果を確認することができる。
本発明の腫瘍細胞をモデル動物に移植した形態でスクリーニングに用いる場合、サンプル系のモデル動物に候補物質を投与した後に、サンプル系及びコントロール系の動物から腫瘍組織を取り出し、該サンプル系及びコントロール系の腫瘍組織に含まれる細胞数を測定及び比較することができる。あるいは、前記腫瘍組織を取り出して、該腫瘍組織の体積をサンプル系とコントロール系の間で比較して、腫瘍増殖効果を確認することもできる。腫瘍の体積は、以下の式により求めることができる。
腫瘍体積＝ａｂ２／２  （ａ：横幅、ｂ：長さ）
あるいは、サンプル系及びコントロール系の動物に候補物質を投与した後に、腫瘍細胞の移植箇所に対し、計測可能な腫瘍塊が形成された割合をサンプル系とコントロール系の間で比較して、腫瘍増殖効果を確認することもできる。
モデル動物は、項目「２．腫瘍細胞」で述べたモデル動物と同様である。モデル動物への移植方法は特に限定されないが、移植した腫瘍細胞の再摘出の容易性から、皮下注射又は腹腔内注射が好ましい。
サンプル系の腫瘍細胞の増加率が、コントロール系の腫瘍細胞の増加率よりも小さい場合には、用いた候補物質は、抗腫瘍効果を有するものと判断することができる。あるいは、本発明の腫瘍細胞に関し、既に一定の条件下での増加率について複数のデータが存在する場合には、そのデータを統計処理して得られる平均値、標準偏差等から導き出される基準値と比較して判断してもよい。
腫瘍の増加率の平均値、標準偏差等は、種々の統計方法によって得ることができるが、具体的には、培養細胞であれば、播種した時点の初期細胞数及び細胞密度をパラメーターとし、あるいは移植細胞であれば使用したモデル動物の移植時の体重及び移植した腫瘍細胞の細胞数をパラメーターとして、ＩＢＭ  ＳＳＰＳ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  １８（ＳＳＰＳ）等の統計解析ソフトでｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ解析することにより求めることができる。本発明の方法の実施により得られた腫瘍細胞の増加率を新たなデータとして統計解析用の母集団に加えて母数を大きくすることにより、さらに解析の精度を向上させることができる。
本発明の腫瘍細胞は、患者から採取された肺がん細胞と病理学的に酷似した特徴を示すことから、本発明のスクリーニング方法で腫瘍細胞の増加抑制効果が確認された抗腫瘍剤は、実際にがん患者、特に肺がん患者の治療に用いた場合にも抗腫瘍効果を奏すると期待される。
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例に記載された態様に限定されるものではない。
【実施例】
【０００６】
以下に、本実施例で行った実験の手順を記載する。
レトロウィルスベクター及びレトロウィルス媒介性遺伝子導入
表１に示した遺伝子のうち、ｖ−Ｓｒｃ（配列番号１）、ＫＲＡＳＶ１２（配列番号５）に関しては、ｐＣＸ４ｐｕｒベクター（ＧｅｎＢａｎｋ＃：ＡＢ０８６３８６）に組み込んだ。ｃ−Ｍｙｃ（配列番号３）、ＰＩＫ３ＣＡＨ１０４７Ｒ（配列番号１１）、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１（配列番号１３）及びＬＫＢ１Ｄ１９４Ａ（配列番号１５）は、ｐＣＸ４ｂｌｅｏベクター（ＧｅｎＢａｎｋ＃：ＡＢ０８６３８８）に組み込んだ。ＢＣＬ２（配列番号７）は、ｐＣＸ４ｒｅｄＥｘベクター（ＧｅｎＢａｎｋ＃：ＡＢ２９６０８４）に組み込んだ。ＥＧＦＲＴ７９０Ｍ  Ｌ８５８Ｒ遺伝子（配列番号１７）は、ｐＣＸ４ｐｕｒベクター（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０８６３８６）に組み込んだ。ＴＰ６３ΔＮ遺伝子（配列番号１９）は、ｐＣＸ４ｈｙｇベクター（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０８６３８７）に組み込んだ。表２に示した遺伝子のうち、ｈＴＥＲＴ（配列番号２１）はｐＣＸ４ｎｅｏベクター（ＧｅｎＢａｎｋ＃：ＡＢ０８６３８５）に組み込んだ。ＣＤＫ４（配列番号２３）はｐＣＸ４ｂｓｒベクター（ＧｅｎＢａｎｋ＃：ＡＢ０８６３８４）に組み込んだ。ドミナントネガティブＴＰ５３（配列番号２５）はｐＣＸ４．１ｈｉｓＤベクター（ＧｅｎＢａｎｋ＃：ＡＢ０８６３８９）に組み込んだ。また、誘導性ｃ−Ｍｙｃ遺伝子用に、テトラサイクリンによって発現を制御可能なｐＴ−ＲＥｘ誘導発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にｃ−Ｍｙｃ遺伝子を組み込んだ誘導発現ベクターも調製した。上記のレトロウイルス発現用のベクター並びにｐＧＰおよびｐＥ−ｅｃｏプラスミド（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社、Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＵＳＡ）に導入することで、ウイルスを作製した。その後に、Ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｅｃｏ  ＶＲ）を発現させたＨＳＡＥ細胞にレトロウイルスを感染させた。上記ウィルスベクターに感染した細胞は、ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ  Ｓ、Ｇ４１８、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、ｚｅｏｃｉｎｅ、Ｌ−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｏｌの存在下で２週間培養することによりセレクションを行った。いずれの薬剤でセレクションを行う場合でも、培養細胞は、感染細胞のポリクローナルな増殖集団から選択した。
細胞培養
１９歳の白人女性に由来する正常ヒト細気道上皮細胞をＬｏｎｚａ社（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）から購入した。これらの細胞を、コラーゲンコーティングしたディッシュ上で、Ｌｏｎｚａ社から提供された種々の増殖因子を添加した血清不含ＳＡＧＭ  ｍｅｄｉｕｍ（ＳＡＧＭ  Ｂｕｌｌｅｔ  Ｋｉｔ；Ｌｏｎｚａ）中にて培養した。細胞は、湿潤インキュベーター内で低酸素環境下（３％  Ｏ２及び５％  ＣＯ２）で３７℃にて維持した。
異種移植片増殖実験
マウスを用いて異種移植片増殖実験を行った。具体的には、各がん関連遺伝子が導入された１ｘ１０６個のＨＳＡＥ／４Ｔ５３細胞またはＨＳＡＥ細胞を含む細胞懸濁液（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ−ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）を、５０％  ＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）に懸濁し、週齢６又は７のメスの胸腺欠損ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ；Ｊａｐａｎ  ＳＬＣ，Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）または、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス（チャールズリバー社）のわき腹に皮下注射した。ノギスを用いて腫瘍の寸法を測定し、以下の式に基づいて腫瘍の体積を計算し、造腫瘍能として見積もった。
腫瘍体積＝ａｂ２／２  （ａ：横幅、ｂ：長さ）
また、各がん関連遺伝子が導入されたＨＳＡＥ／４Ｔ５３細胞またはＨＳＡＥ細胞の移植箇所に対し、計測可能な腫瘍塊が形成された割合を腫瘍発生率として算出し、造腫瘍能として見積もった。
組織学的分析及び免疫組織化学染色
異種移植片をホルマリン固定及びパラフィン包埋した後に切片化し、通常のプロトコルに従ってヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を行った。先の文献（Ｓａｓａｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，（２００８）．Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．３２，１２２０−１２２７）の記載に従い、以下の抗体を用いて免疫組織化学染色を行った：ｍｕｌｔｉ−ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎｓ（ＡＥ１／ＡＥ３；Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ｐ６３（４Ａ４；Ｄａｋｏ）、ＴＴＦ−１（８Ｇ７Ｇ３／１；Ｄａｋｏ）、ｐ５３（ＤＯ７；Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ）、ＶＩＭＥＮＴＩＮ（Ｖ９；Ｎｉｃｈｉｒｅｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）。具体的には、以下の手順で免疫組織化学染色を行った。厚さ４μｍの組織切片をキシレンで脱パラフィン化した後にエタノールで脱水した。圧力鍋にて、１０ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）中で２分間加熱することにより、抗原を賦活させた。０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸干渉生理食塩水（ＰＢＳＴ）で組織切片を再水和させ、０．３％過酸化水素とインキュベートさせることで、内在性のペロキシダーゼを不活化させた。組織切片を、適切な希釈濃度の１次抗体で４℃にて一晩インキュベートし、ＰＢＳＴで洗浄した後、室温にてＥｎｖｉｓｉｏｎ  Ｄｕａｌ  Ｌｉｎｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で３０分間インキュベートした。次に、ジアミノベンジジン（Ｄａｋｏ）で切片を処理して抗原抗体反応部位を可視化させ、ヘマトキシリン処理を９０秒間行って核染色を行った。組織切片のスライドをＥｎｔｅｌｌａｎ  Ｎｅｕ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｅｒｃｋ，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，ＮＪ）でマウントした後にカバーガラスで封入し、観察に供した。
Ａｌｃｉａｎ  Ｂｌｕｅ染色は、異種移植片をホルマリン固定及びパラフィン包埋した後に切片化し、当該切片に対して、先の文献（Ｓｔｅｅｄｍａｎ，Ｈ．Ｆ．，Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ  ９１，ｐ４７７−４７９（１９５０））の記載に従い、行った。
イムノブロット法
タンパク質の測定、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びイムノブロッティングは、先の文献（Ａｋａｇｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，（２００２）．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２２，７０１５−７０２３）の記載に従って行った。免疫反応陽性タンパク質のシグナルは、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＷｅｓｔＦｅｍｔｏ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いてケミルミネセンスにより可視化した。抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）より入手した。
限界希釈法によるクローニング
シングル細胞由来の細胞クローンの調製は、先の文献（Ｑｕｉｎｔａｎａ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００８  Ｄｅｃ  ４；４５６（７２２２）：５９３−８）の記載に従って行った。
実験結果
［１］  ｖ−Ｓｒｃ遺伝子及びｃ−Ｍｙｃ遺伝子の導入によるがん細胞の作製
ＨＳＡＥ／４Ｔ５３細胞にｃ−Ｍｙｃ遺伝子とｖ−Ｓｒｃ遺伝子を導入して作製した４Ｔ５３ＭＳ細胞を１ｘ１０６個ずつ胸腺欠損ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ；Ｊａｐａｎ  ＳＬＣ，Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）に皮下移植し、形成された腫瘍組織について異種移植片増殖実験、組織学的分析及び免疫組織化学染色を行った。４Ｔ５３ＭＳ細胞が移植されたマウスでは、腫瘍塊の形成が認められた（図１Ａ）。４Ｔ５３ＭＳ細胞は、非常に高い造腫瘍能を有していた。造腫瘍能が高いことで知られているＮＣｌ−Ｈ４６０肺がん細胞と比較しても、約２倍高い造腫瘍能を有していた（図１Ｂ）。また、この腫瘍塊を取り出して、組織切片を調製し、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を行ったところ、分化度の非常に低く、分化形態を示さない癌組織像が示された。また、免疫染色の結果も、肺の上皮マーカーであるｐ６３染色陰性であり、上皮細胞マーカーであるサイトケラチン（抗体のクローン名はＡＥ１／ＡＥ３）染色でも陰性であった。一方で、間葉系細胞のマーカーであるＶＩＭＥＮＴＩＮは強陽性であった。以上より、４Ｔ５３ＭＳ細胞由来の腫瘍は未分化癌の性質を呈すると結論づけた（図１Ｃ）。なお、ｖ−Ｓｒｃまたはｃ−Ｍｙｃの一方のみをＨＳＡＥ／４Ｔ５３細胞に遺伝子導入して得られた細胞（それぞれ４Ｔ５３Ｓおよび４Ｔ５３Ｍ細胞という）では、造腫瘍能が認められなかった。
上記、４Ｔ５３ＭＳ細胞は、造腫瘍能が非常に強く、それぞれ１ｘ１０６，１ｘ１０４，１ｘ１０３または１ｘ１０２個の皮下移植によっても、１００％の確率でＮＯＤ−ＳＣＩＤにおいて腫瘍形成が認められた（図２Ａ）。更に、僅か１０個の細胞移植によっても、５０％の確率で腫瘍形成が可能であることが分かった（図２Ａ、図２Ｂ）。よって、４Ｔ５３ＭＳ細胞は、非常に高い造腫瘍能及び複数の系統の腫瘍細胞に分化するという特徴を有することから、癌幹細胞が有する特徴を持っていることが示された。
誘導性ｃ−Ｍｙｃ遺伝子とｖ−Ｓｒｃ遺伝子をＨＳＡＥ／４Ｔ５３細胞に導入して作製した４Ｔ５３ｍＳ細胞をドキシサイクリン（ＤＯＸ）処理することによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験系でｃ−Ｍｙｃ発現を誘導した（図３Ａ）。ＤＯＸ存在下で培養した４Ｔ５３ｍＳ細胞をヌードマウスの皮下に移植し、ＤＯＸを投与し続け、腫瘍形成が見られた時点で、ＤＯＸ投与を停止した（図３Ｂ）。（Ｃ）得られた腫瘍組織をサイトケラチンで染色すると、強陽性の腫瘍細胞と、陰性の間質細胞とに明瞭に区別された。しかしながら、腺癌・扁平上皮癌などにみられる特徴的な像は示さず、低分化型の大細胞癌様の腫瘍であることが判明した（図３Ｃ）。
［２］  ヒト由来遺伝子の導入によるがん細胞の作製
ｃ−Ｍｙｃ及びＫＲＡＳＶ１２の両方を遺伝子導入して得られた４Ｔ５３ＲＭ細胞を胸腺欠損ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ；Ｊａｐａｎ  ＳＬＣ，Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）に皮下移植し、形成された腫瘍組織について異種移植片増殖実験、組織学的分析及び免疫組織化学染色を行った。４Ｔ５３ＲＭ細胞は、造腫瘍能を有していた。ただし、腫瘍発生率は３８％であった（図４）。この４Ｔ５３ＲＭ細胞に、ＢＣＬ２を導入した４Ｔ５３ＲＭＢ細胞を胸腺欠損ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ；Ｊａｐａｎ  ＳＬＣ，Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）に皮下移植し、形成された腫瘍組織について異種移植片増殖実験、組織学的分析及び免疫組織化学染色を行った。４Ｔ５３ＲＭＢ細胞は、８０％の高効率でヌードマウスに腫瘍を形成するようになった。
組織学的検査では、４Ｔ５３ＲＭ細胞由来及び４Ｔ５３ＲＭＢ細胞由来の腫瘍の両者において、扁平上皮がん又は腺がん等の特徴を示さない組織像が観察された。これらの腫瘍は、免疫染色の結果、サイトケラチンについては弱い陽性反応しか示さなかったが（ＡＥ１／ＡＥ３：図５）、ＶＩＭＥＮＴＩＮについては強い陽性反応を示したことから、未分化癌と診断された。
ＨＳＡＥ／４Ｔ５３細胞にＫＲＡＳＶ１２遺伝子を導入して４Ｔ５３Ｒ細胞を作製し、４Ｔ５３Ｒ細胞に、ＰＩＫ３ＣＡＨ１０４７Ｒ、Ｃｙｃｌｉｎ−Ｄ１、ＬＫＢ１Ｄ１９４Ａのいずれかの遺伝子導入し、それぞれ４Ｔ５３ＲＰ、４Ｔ５３ＲＤ、４Ｔ５３ＲＬ細胞を樹立した。胸腺欠損ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ；Ｊａｐａｎ  ＳＬＣ，Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）に４Ｔ５３Ｒ、４Ｔ５３ＲＰ、４Ｔ５３ＲＤ、４Ｔ５３ＲＬ細胞を皮下移植し、形成された腫瘍組織について異種移植片増殖実験、組織学的分析及び免疫組織化学染色を行ったところ、４Ｔ５３Ｒ細胞では造腫瘍能は見られなかったが、４Ｔ５３ＲＰ、４Ｔ５３ＲＤ、４Ｔ５３ＲＬ細胞では高い腫瘍発生率が観察された（ぞれぞれ１００％、１００％、８３％：図４）。
４Ｔ５３ＲＰ、４Ｔ５３ＲＤ又は４Ｔ５３ＲＬ細胞由来の腫瘍（異種移植片）の組織学的解析を行ったところ、実際のヒト肺がん組織に類似した組織像を示すことが判明した。４Ｔ５３ＲＰ由来腫瘍では、腺がん様領域と扁平上皮癌様領域の両方を含む組織像が観察された（図６：Ｈ＆Ｅ）。一方、４Ｔ５３ＲＤ及び４Ｔ５３ＲＬ由来の腫瘍（異種移植片）は、環形成が認められ、腫瘍間質を豊富に含むことから、ヒト肺腺癌に類似した形態を有することが判明した（図６：Ｈ＆Ｅ）。いずれの腫瘍組織とも、上皮細胞マーカーであるサイトケラチン強陽性の細胞から構成されていた（図６：ＡＥ１／ＡＥ３）。また、肺上皮細胞のマーカーであるｐ６３染色も陽性であった（図６：ｐ６３）。これらのマーカー発現は、４Ｔ５３ＲＰ、４Ｔ５３ＲＤ、４Ｔ５３ＲＬ細胞由来の腫瘍がヒト肺腺癌に類似した分化型腫瘍であることを示している。なお、４Ｔ５３ＲＰ細胞由来腫瘍については、扁平上皮癌様の領域をも含むことから、ヒト肺腺癌および扁平上皮癌の混在型（ａｄｅｎｏｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）であるものと診断された。
［３］  肺腺癌の癌幹細胞の性質を持った細胞の作製
ＫＲＡＳＶ１２及びＣｙｃｌｉｎＤ１の両方の遺伝子をＨＳＡＥ／４Ｔ５３細胞に導入して作製した４Ｔ５３ＲＤ細胞由来の癌組織は、肺腺がんに類似したヘテロな細胞集団から成る腺構造を形成するが、このことは４Ｔ５３ＲＤ細胞が複数の種類の細胞に分化する能力がある幹細胞の性質を持っている可能性を示唆している。
この可能性を証明する目的で、４Ｔ５３ＲＤ細胞を限界希釈法によってクローニングし、シングル細胞由来の細胞クローンを複数得た。この細胞クローンをＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに皮下移植し、形成された腫瘍組織について異種移植片増殖実験、組織学的分析及び免疫組織化学染色を行ったところ、シングル細胞由来の４Ｔ５３ＲＤ細胞クローンも、腫瘍塊を形成し、親株の４Ｔ５３ＲＤ細胞と同様にヒト肺腺癌に類似した形態の腫瘍を形成した（図８Ａ）。
マウスの気道上皮は、図８Ｂに示すようにｐ６３を発現する基底細胞、ＴＴＦ１を発現するクララ細胞、粘液を産生するゴブレット細胞、繊毛細胞など複数の細胞集団から構成されている。
シングル細胞由来の４Ｔ５３ＲＤ細胞クローンが移植されて形成された腫瘍組織は免疫組織化学染色の結果、マウス由来の基質と接している辺縁部にはｐ６３陽性の基底細胞が存在するが、その内側で腺構造を形成している部分はｐ６３が陰性で、クララ細胞で発現するＴＴＦ１陽性細胞や、ａｌｃｉａｎ  ｂｌｕｅで染色される粘液を産生する細胞が存在していた（図８Ａ）。最近、Ｒｏｃｋ  ＪＲ．ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００９  Ａｕｇ  ４；１０６（３１）：１２７７１−５）によりｐ６３陽性の基底細胞が気管支において幹細胞として機能することが示されたことを考慮すると、この結果は、シングル細胞由来の４Ｔ５３ＲＤ細胞クローンによってできた腫瘍では、ｐ６３陽性の細胞が内側に向かって増殖しながらクララ細胞や粘液を分泌する腺細胞に分化してヘテロな細胞集団から成る癌組織を形成したと考えられる。
また、４Ｔ５３ＲＤ細胞クローンは、強い造腫瘍能を有しており、１ｘ１０４、１ｘ１０３、１ｘ１０２、１ｘ１０１個の細胞の皮下移植によって、それぞれ、１００、８０、６０、１３％の確立でＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおいて腫瘍形成が認められた（図９）。
これらの結果より、４Ｔ５３ＲＤ細胞は、▲１▼１つ細胞からｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍を形成する過程において複数種類の細胞へと分化していく能力を有するとともに、▲２▼少ない細胞数でも腫瘍を形成することができる。という癌幹細胞がもつ２つの性質をそなえていることが示された。
［４］  肺扁平上皮癌の性質を持った細胞の作製
ＫＲＡＳＶ１２、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１及びＴＰ６３ΔＮ牧の遺伝子をＨＳＡＥ／４Ｔ５３細胞に導入して作製した４Ｔ５３ＲＤΔＮｐ６３細胞を胸腺欠損ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ；Ｊａｐａｎ  ＳＬＣ，Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）に皮下移植し、形成された腫瘍組織について組織学的分析及び免疫組織化学染色を行った。
ＫＲＡＳＶ１２及びＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１の両遺伝子をＨＳＡＥ／４Ｔ５３細胞に導入して作製した４Ｔ５３ＲＤ細胞は、ヒト肺腺癌に類似した形態の腫瘍を形成する（図１０Ａ）のに対し、ＫＲＡＳＶ１２及びＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１に加えてさらにＴＰ６３ΔＮ遺伝子を導入して作製した細胞は、組織学的解析により、扁平上皮癌様の腫瘍組織（Ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）を形成することが示された（図１０Ｂ）。
［５］  ＥＧＦＲ変異遺伝子とＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１による分化型肺がん細胞の作製
ＥＧＦＲＴ７９０Ｍ  Ｌ８５８Ｒ及びＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１の両遺伝子をＨＳＡＥ／４Ｔ５３細胞に導入して作製した４Ｔ５３ＥＤ細胞を胸腺欠損ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ；Ｊａｐａｎ  ＳＬＣ，Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）に皮下移植し、形成された腫瘍組織について異種移植片増殖実験、組織学的分析及び免疫組織化学染色を行った。
４Ｔ５３  ＥＤ細胞は、１００％の腫瘍発生率を示し（図４）、高い造腫瘍能を有することが判明した。また、４Ｔ５３  ＥＤ細胞由来の腫瘍組織は、扁平上皮様細胞が主要で、一部、腺がん様細胞が混在した形態の特殊なタイプの分化型の腫瘍組織を形成した。（図１１Ａ〜図１１Ｃ）。
以上の結果が示すように、不死化ヒト細気道上皮細胞（ＨＳＡＥ／４Ｔ５３細胞）に、がん関連遺伝子を導入することにより、腫瘍細胞の分化の程度を調節することが可能である。すなわち、図７に示すとおり、「ｃ−Ｍｙｃ遺伝子とｖ−Ｓｒｃ遺伝子（４Ｔ５３ＭＳ細胞）」または「ｃ−Ｍｙｃ遺伝子、ＫＲＡＳ変異遺伝子およびＢＣＬ２遺伝子（４Ｔ５３ＲＭＢ細胞）」の組み合わせで遺伝子を導入することにより未分化癌モデルを作製することが可能である。また、「誘導性ｃ−Ｍｙｃ遺伝子とｖ−Ｓｒｃ遺伝子（４Ｔ５３ｍＳ細胞）」の組み合わせで遺伝子を導入し、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子を誘導発現させることにより、ヒト肺大細胞癌に類似する低分化型の肺癌モデルを樹立することがが可能である。さらに、「ＫＲＡＳ変異遺伝子とＰＩＫ３ＣＡ変異遺伝子（４Ｔ５３ＲＰ細胞）」、「ＫＲＡＳ変異遺伝子とＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１遺伝子（４Ｔ５３ＲＤ細胞）」、「ＫＲＡＳ変異遺伝子とＬＫＢ１変異遺伝子（４Ｔ５３ＲＬ細胞）」、「ＫＲＡＳ変異遺伝子、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１遺伝子およびＴＰ６３遺伝子（４Ｔ５３ＲＤΔＮｐ６３細胞）」又は「ＥＧＦＲ変異遺伝子とＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１遺伝子（４Ｔ５３ＥＤ細胞）」のいずれかの組み合わせで遺伝子を導入することにより、腺癌若しくは扁平上皮癌（又はその混合型）に類似したヒト肺癌モデルを作製可能である。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明により、ヒトの肺がん細胞と同様の病理学的特徴を示す腫瘍細胞が提供される。このような腫瘍細胞は、肺がんの生物学的機構の研究、肺がん治療のターゲット分子の同定、並びに抗癌剤のスクリーニング及び試験に有用である。特にヒト由来がん関連遺伝子のみを導入することによって作製された腫瘍細胞は、細胞の特性を忠実に表現した細胞であり、抗がん剤等の開発に非常に有効であると期待される。
［配列表］
0005894914.tif 000005
0005894914.tif 000006
0005894914.tif 000007
0005894914.tif 000008
0005894914.tif 000009
0005894914.tif 000010
0005894914.tif 000011
0005894914.tif 000012
0005894914.tif 000013
0005894914.tif 000014
0005894914.tif 000015
0005894914.tif 000016
0005894914.tif 000017
0005894914.tif 000018
0005894914.tif 000019
0005894914.tif 000020
0005894914.tif 000021
0005894914.tif 000022
0005894914.tif 000023
0005894914.tif 000024
0005894914.tif 000025
0005894914.tif 000026
0005894914.tif 000027
0005894914.tif 000028
0005894914.tif 000029
0005894914.tif 000030
0005894914.tif 000031
0005894914.tif 000032
0005894914.tif 000033
0005894914.tif 000034
0005894914.tif 000035
0005894914.tif 000036
0005894914.tif 000037
0005894914.tif 000038
0005894914.tif 000039
0005894914.tif 000040
0005894914.tif 000041
0005894914.tif 000042
0005894914.tif 000043
0005894914.tif 000044
0005894914.tif 000045
0005894914.tif 000046
0005894914.tif 000047
0005894914.tif 000048
0005894914.tif 000049
0005894914.tif 000050
0005894914.tif 000051
0005894914.tif 000052
0005894914.tif 000053
0005894914.tif 000054
0005894914.tif 000055
0005894914.tif 000056
0005894914.tif 000057
0005894914.tif 000058
0005894914.tif 000059
0005894914.tif 000060
0005894914.tif 000061
0005894914.tif 000062
0005894914.tif 000063
0005894914.tif 000064
0005894914.tif 000065
0005894914.tif 000066
0005894914.tif 000067
0005894914.tif 000068
0005894914.tif 000069
0005894914.tif 000070
0005894914.tif 000071
0005894914.tif 000072
0005894914.tif 000073
0005894914.tif 000074
0005894914.tif 000075
0005894914.tif 000076
0005894914.tif 000077
0005894914.tif 000078
0005894914.tif 000079
0005894914.tif 000080
0005894914.tif 000081
0005894914.tif 000082
0005894914.tif 000083
0005894914.tif 000084
0005894914.tif 000085
0005894914.tif 000086
0005894914.tif 000087
0005894914.tif 000088
0005894914.tif 000089
0005894914.tif 000090
0005894914.tif 000091
0005894914.tif 000092
0005894914.tif 000093
0005894914.tif 000094
0005894914.tif 000095
0005894914.tif 000096
0005894914.tif 000097
0005894914.tif 000098
0005894914.tif 000099
0005894914.tif 000100
0005894914.tif 000101
0005894914.tif 000102
0005894914.tif 000103
0005894914.tif 000104
0005894914.tif 000105
0005894914.tif 000106
0005894914.tif 000107
0005894914.tif 000108
0005894914.tif 000109
0005894914.tif 000110
0005894914.tif 000111
0005894914.tif 000112
0005894914.tif 000113
【図４】
0005894914.tif 000114
【図７】
0005894914.tif 000115
【図９】
0005894914.tif 000116
【図１】
0005894914.tif 000117
【図２】
0005894914.tif 000118
【図３】
0005894914.tif 000119
【図５】
0005894914.tif 000120
【図６】
0005894914.tif 000121
【図８】
0005894914.tif 000122
【図１０】
0005894914.tif 000123
【図１１】
0005894914.tif 000124