(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー工程を含むタンパク質の精製方法であって、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー工程に使用する溶出緩衝液の成分そのものがグリシンであり、前記緩衝液のグリシン濃度が１０〜１００ｍＭであり、前記緩衝液のｐＨが２．５〜４．５であるタンパク質の精製方法。
【請求項２】
前記緩衝液のｐＨが３．２〜３．４である請求項１に記載の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的なタンパク質の精製に関する。特に、本発明は、抗体のクロマトグラフィー法による精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組み換え技術の発達によって、種々のタンパク質医薬品が供給されるようになった。特に近年は数多くの抗体医薬品が開発および上市されている。また、これらタンパク質医薬品を大規模、かつ経済的に精製することは、バイオ医薬品産業にとってますます重要な問題となっている。【０００３】
このようなタンパク質医薬品は、一般にその目的タンパク質遺伝子を含むベクターを挿入された組み換え細胞を培養することによって産生される。その培養液には、目的タンパク質の他に、多種多様の培地由来成分や、細胞副生成物等の不純物が含まれているため、医薬品として要求される純度まで分離・精製すること、さらには、上述の大量生産・経済性とを両立させることは、非常に困難かつ、挑戦的である。【０００４】
目的タンパク質の精製方法は、一般に異なるモードのクロマトグラフィー法の組み合わせで行われる。これらの手法は、例えば、電荷、親水性の程度、又は大きさに基づいてタンパク質混合物を分離する分離法である。いくつかの異なるクロマトグラフィー用樹脂を、これらのそれぞれの手法に使用することができ、特異タンパク質にかかわる精製計画に正確に調整することも可能である。【０００５】
これらそれぞれの分離法の本質は、より速くカラムを通過するように物理的な分離を増大させることにより、タンパク質が異なる速度比で長いカラムを通過するようにするか、又は、異なる溶媒によって異なる溶出をすることにより、分離媒体に選択的に付着するようにするかのいずれかである。場合によって、不純物が非常に良くカラムに付着し、目的タンパク質が付着しない、つまり、目的タンパク質が「フロースルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）」である時に、目的タンパク質が不純物から分離される。【０００６】
特に、目的タンパク質が、動物細胞を宿主として得られた抗体であるときは、ＰｒｏｔｅｉｎＡまたはＰｒｏｔｅｉｎ  ＧがＩｇＧのＦｃ鎖などの特定部位に結合する性質を利用して、ＰｒｏｔｅｉｎＡまたはＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇのアフィニティークロマグラフィー処理を行った後に、陽イオンイオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーまたは混合モードクロマトグラフィー等の組み合わせで、精製し得る。【０００７】
例えば、哺乳動物細胞培養液から得られた抗体含有水性培地をＰｒｏｔｅｉｎＡまたはＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラムクロマトグラフィーに適用して抗体をカラムに吸着させ、次いで酸性溶液を用いて抗体を溶出させ、得られた溶出液をイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除カラムクロマトグラフィーに順次適用して精製することができる（特許文献１）。【０００８】
また、アミノ酸の一種であるアルギニンをＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーの緩衝液添加剤として使用し、重合体生成を抑制したという報告がある（非特許文献１及び２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】日本国特表平５−５０４５７９号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ３６（２００４）２４４−２４８
【非特許文献２】Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ５４（２００７）１１０−１１６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかし、前記クロマトグラフィー条件の設定や、各種クロマトグラフィーの組み合わせ条件の設定は、多くの時間、労力およびコストがかかり、煩雑であり、また医薬品としての要求純度まで精製できる保証もない。【００１２】
また、非特許文献１及び２に記載の技術は、添加アミノ酸がアルギニンのみ、およびその効果が重合体抑制のみという限られた用法・用途であり、高純度が達成されるタンパク質の精製方法とは言いがたい。【００１３】
したがって、本発明は、従来の精製方法より、確実に不純物が除去でき、その結果、高純度が達成されるタンパク質の精製方法を提供することを課題とする。また、工業規模の精製においては、コストや労力が大きな問題となり得るため、コストや労力の軽減が可能なタンパク質の精製方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、上記課題を解決する為に鋭意研究をした結果、驚くべきことに、１以上のクロマトグラフィー工程を含むタンパク質の精製方法において、少なくとも１のクロマトグラフィー工程に使用する緩衝液の成分または、その一部に、アミノ酸を含有させることにより、従来の方法より高純度で目的タンパク質を精製できることを見出し、本発明を完成させた。【００１５】
すなわち、本発明は以下（１）〜（１２）のとおりである。
（１）ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー工程を含むタンパク質の精製方法であって、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー工程に使用する溶出緩衝液の成分そのものがグリシンであるタンパク質の精製方法。
（２）前記緩衝液のグリシン濃度が１０〜１００ｍＭである（１）に記載の精製方法。
（３）前記緩衝液のｐＨが２．５〜４．５である（１）または（２）に記載の精製方法。
（４）さらに、少なくとも陽イオン交換クロマトグラフィー工程、陰イオン交換クロマトグラフィー工程、ゲルろ過クロマトグラフィー工程、疎水性クロマトグラフィー工程、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー工程および混合モードクロマトグラフィー工程から選択されるクロマトグラフィー工程の１以上を含む（１）〜（３）のいずれか１に記載の精製方法。
（５）陽イオン交換クロマトグラフィー工程を、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー工程に引き続いて行う（１）〜（４）のいずれか１に記載の精製方法。
（６）陰イオン交換クロマトグラフィー工程を、さらに引き続いて行う（５）に記載の精製方法。
（７）陽イオン交換クロマトグラフィー工程を、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー工程及び陰イオン交換クロマトグラフィー工程に引き続いて行う（１）〜（４）のいずれか１に記載の精製方法。
（８）陽イオン交換クロマトグラフィー工程に使用する緩衝液の成分または、その一部に含まれるアミノ酸が、グルタミン酸、ヒスチジンおよびグルタミンから選ばれるアミノ酸である（５）〜（７）のいずれか１に記載の精製方法。
（９）ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー工程において、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーにロードするタンパク質含有試料に塩の添加をすることを含む（１）〜（８）のいずれか１に記載の精製方法。
（１０）陽イオン交換クロマトグラフィー工程終了後の精製物における、宿主細胞タンパク質の割合が１００ｎｇ／ｍｇ未満である（５）〜（９）のいずれか１に記載の精製方法。
（１１）陽イオン交換クロマトグラフィー工程終了後の精製物における、重合体の割合が１．５％未満である（５）〜（１０）のいずれか１に記載の精製方法。
（１２）（８）〜（１１）のいずれか１に記載の精製方法により精製されたタンパク質を有効成分とする医薬品の製剤処方に含有されるアミノ酸が、（８）〜（１１）のいずれか１に記載の陽イオン交換クロマトグラフィー工程で使用された緩衝液の成分または、その一部に含まれるアミノ酸と同じアミノ酸であるタンパク質の精製方法。 
【発明の効果】
【００１６】
本発明のタンパク質の精製方法により、抗体等の目的タンパク質を精製することにより、精製されたタンパク質に含まれる不純物（例えば、重合体量または宿主細胞タンパク質の量）の量を極めて少なく抑制することができ、高い純度で目的タンパク質を精製することができる。【００１７】
また、本発明の精製方法によれば、クロマトグラフィー工程に用いる緩衝液成分または、その一部にアミノ酸を含有させることで、高い純度でタンパク質を精製することが可能なため、従来のタンパク質の精製工程における一部の工程を削減できる可能性もあり、その場合はタンパク質精製装置の簡素化、及び収量増大による経済的なメリットも期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーカラム（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ）、陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ）及び陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ）を使用した精製における各工程終了後の精製物における重合体割合を示す。縦軸は重合体の割合を示す。
【図２】図２は、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーカラム（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ）、陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ）及び陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ）を使用した精製における各工程終了後の精製物における宿主細胞タンパク質の割合を示す。縦軸は宿主細胞タンパク質の割合を示す。
【図３】図３は、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーカラム（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ）、陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｇｉｇａｃａｐ  Ｑ）、及び陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  ＨｉＣａｐ）を使用した精製における各工程終了後の精製物における重合体の割合を示す。縦軸は重合体の割合を示す。
【図４】図４は、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーカラム（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ）、陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｇｉｇａｃａｐ  Ｑ）、及び陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  ＨｉＣａｐ）を使用した精製における各工程終了後の精製物における宿主細胞タンパク質の割合を示す。縦軸は宿主細胞タンパク質の割合を示す。
【図５】図５は、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーカラム（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ）、陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｇｉｇａｃａｐ  Ｑ）、及び陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  ＨｉＣａｐ）を使用した精製における各工程終了後の精製物における重合体の割合を示す。縦軸は重合体の割合を示す。（陰イオン交換クロマトグラフィー工程までは、方法１、２で共通のため重合体の割合は同一である。）
【図６】図６は、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーカラム（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ）、陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｇｉｇａｃａｐ  Ｑ）、及び陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ）を使用した精製における各工程終了後の精製物における重合体の割合を示す。縦軸は重合体の割合を示す。
【図７】図７は、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーカラム（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ）、陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｇｉｇａｃａｐ  Ｑ）、及び陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ）を使用した精製における各工程終了後の精製物における重合体の割合を示す。宿主細胞タンパク質の割合を示す。縦軸は宿主細胞タンパク質の割合を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、１以上のクロマトグラフィー工程を含むタンパク質の精製方法であって、少なくとも１のクロマトグラフィー工程に使用する緩衝液（バッファー）の成分または、その一部に、アミノ酸を含むタンパク質の精製方法に関する。本発明のタンパク質の精製方法は、特にモノクローナル抗体の精製方法として用いることが好ましい。
【００２０】
本発明の精製方法によれば、少なくとも１のクロマトグラフィー工程に使用する緩衝液成分または、その一部にアミノ酸を含むことで精製されるタンパク質、特に抗体に含まれる不純物（例えば、重合体量、宿主細胞タンパク質の量）を少なくすることができ、高い純度で目的タンパク質を精製することができる。
【００２１】
本明細書中で使用される用語は、以下の定義を含むものとする。なお、本明細書において、「緩衝液」は、「バッファー」と同義である。
【００２２】
本発明の精製方法により精製される物質は、タンパク質であり、タンパク質の中でも、抗体が好ましく、モノクローナル抗体（マウス、キメラ、ヒト化、ヒト抗体、またはそれらのＦｃ領域等を改変した抗体であってもよい）がより好ましい。
【００２３】
これらのタンパク質を含む試料（以下、タンパク質含有試料ともいう。）としては、例えば、培養上清が挙げられる。培養上清は、例えば、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０ミエローマ細胞、ハイブリドーマ細胞または酵母細胞を培養し、ろ過等を行うことで得られる。目的タンパク質がモノクローナル抗体である場合、培養上清におけるモノクローナル抗体の含有量は、０．１〜３０ｇ／Ｌが好ましく、０．５〜２０ｇ／Ｌがより好ましく、１〜１０ｇ／Ｌがさらに好ましい。
【００２４】
また、血清やトランスジェニック動物由来のミルク、トランスジェニック植物抽出液由来のポリクローナル抗体、モノクローナル抗体も精製されるタンパク質として挙げられる。
【００２５】
本発明の精製方法においてクロマトグラフィー工程に使用する緩衝液成分または、その一部に含まれるアミノ酸としては、例えば、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、プロリン（Ｐｒｏ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）若しくはヒスチジン（Ｈｉｓ）、またはこれらのジペプチド、オリゴペプチド若しくはポリアミノ酸が挙げられる。
【００２６】
前記アミノ酸の中でも、特にグルタミン、ヒスチジン、グルタミン酸、グリシン、アルギニンおよびメチオニンが好ましい。これらのアミノ酸をクロマトグラフィー工程に使用する緩衝液成分またはその一部に含むことにより、より精製されるタンパク質の純度を向上することができる。
【００２７】
緩衝液としては、例えば、平衡化緩衝液、洗浄緩衝液及び溶出緩衝液が挙げられる。
【００２８】
本発明の精製方法は、１以上のクロマトグラフィー工程を含む。本発明の方法に含まれるクロマトグラフィー工程としては、例えば、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー工程、陰イオン交換クロマトグラフィー工程、陽イオン交換クロマトグラフィー工程、ゲルろ過（サイズ排除）クロマトグラフィー工程、疎水性クロマトグラフィー工程、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー工程および混合モードクロマトグラフィー工程等が挙げられる。
【００２９】
これらのクロマトグラフィー工程を当業者の技術常識によって、適宜組み合わせることにより、より高純度、高収率のタンパク質精製がなされる。例えば、モノクローナル抗体の精製方法としては、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー工程に引き続いて陽イオンクロマトグラフィー工程を行うことが好ましい。また、さらに引き続いて陰イオン工程を行うことが好ましい。
【００３０】
また、例えば、モノクローナル抗体の精製としては、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー工程、陰イオン交換クロマトグラフィー工程、の後に続いて陽イオン交換クロマトグラフィー工程を行うことが好ましい。このようにクロマトグラフィー工程を組み合わせることにより、高純度および高収率でモノクローナル抗体を精製することができる。
【００３１】
陽イオン交換クロマトグラフィーの替わりに、疎水性クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィーを用いてもよい。また、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、の後に続いて陰イオン交換クロマトグラフィーを行ってもよい。
【００３２】
更には、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーを使用せずに、モノクローナル抗体を精製してもよい。例えば、陽イオン交換クロマトグラフィーまたは、陰イオン交換クロマトグラフィーまたは、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーまたは、混合モードクロマトグラフィーの最低２つ以上の組み合わせで行うことも可能である。
【００３３】
本発明の精製方法においては、すべてのクロマトグラフィー工程において、緩衝液成分またはその一部にアミノ酸を含む必要は必ずしもなく、少なくとも１のクロマトグラフィー工程において緩衝液成分またはその一部にアミノ酸を含む。
【００３４】
また、各クロマトグラフィー工程において、平衡化緩衝液、洗浄緩衝液及び溶出緩衝液のすべての成分または一部にアミノ酸を含んでもよいし、その一部の緩衝液のみにアミノ酸を含んでもよい。
【００３５】
本発明において、「緩衝液成分またはその一部にアミノ酸を含む」とは、緩衝液成分そのものをアミノ酸とするか、または緩衝液成分の一部にアミノ酸を含有することをいう。本発明の精製方法において、少なくとも１のクロマトグラフィー工程に用いる緩衝液に含まれるアミノ酸の含有量は、目的タンパク質、含有させるアミノ酸およびクロマトグラフィー工程の種類等により適宜調整することができる。
【００３６】
具体的には、例えば、平衡化緩衝液または溶出緩衝液におけるアミノ酸の含有量は、１０〜１０００ｍＭとすることが好ましく、１０〜１００ｍＭとすることがより好ましい。また、洗浄緩衝液におけるアミノ酸の含有量は、０．５〜３Ｍとすることが好ましく、０．５〜１Ｍとすることがより好ましい。
【００３７】
また、クロマトグラフィーにロードするタンパク質含有試料に、好ましくは０．１〜２Ｍのアミノ酸を含有させてもよい。このことにより、洗浄工程なしでも不純物レベルを低減させることが可能である。
【００３８】
用いる緩衝液の成分またはその一部にアミノ酸を含むことが好ましいクロマトグラフィー工程としては、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー工程及び陽イオン交換クロマトグラフィー工程が挙げられる。
【００３９】
具体的には、例えば、以下の（１）または（２）の場合、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー工程で使用する緩衝液の成分またはその一部に、グリシンまたはスレオニンを含むことが好ましい。また、陽イオン工程で使用する緩衝液の成分またはその一部に、グルタミン酸、ヒスチジンおよびグルタミンから選ばれるアミノ酸を含むことが好ましい。
（１）ＰｒｏｔｅｉｎＡクロマトグラフィー工程に引き続いて陽イオン交換クロマトグラフィー工程を行い、さらに引き続いて好ましくは陰イオン交換クロマトグラフィー工程を行う場合
（２）陽イオン交換クロマトグラフィー工程を、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー工程および陰イオン交換クロマトグラフィー工程に引き続いて行う場合、
【００４０】
複数のクロマトグラフィー工程を組み合わせる場合、最終のクロマトグラフィー工程の緩衝液の成分またはその一部にアミノ酸を含むことが好ましい。本発明の精製方法における最終のクロマトグラフィー工程の緩衝液の成分またはその一部にアミノ酸と、該精製方法により精製されるタンパク質を含む製剤処方に使用する緩衝液に含まれるアミノ酸とを同じアミノ酸とすることにより、緩衝液を交換しなくてもよいという利点があるためである。
【００４１】
例えば、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、の後に続いて陽イオン交換クロマトグラフィーを組み合わせて用いる場合、最終工程である陽イオン交換クロマトグラフィー工程の緩衝液の成分またはその一部にアミノ酸を含むことが好ましい。
【００４２】
以下、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー工程、陰イオン交換クロマトグラフィー工程または陽イオン交換クロマトグラフィー工程について、説明する。
【００４３】
（ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー工程）
ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー用樹脂としては、例えば、ＧＥ社製ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、ＰｒｏｔｅｉｎＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｘｔｒａ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製Ｐｒｏｓｅｐ  ｖＡ  Ｈｉｃａｐａｃｉｔｙ、Ｐｒｏｓｅｐ  ｖＡ  ＵｌｔｒａおよびＰｒｏｓｅｐ  Ｕｌｔｒａｐｌｕｓ等が挙げられるがこれらに限定されない。カラム長としては、２．５〜４０ｃｍのものが挙げられる。
【００４４】
ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーカラムにタンパク質含有試料をロードする場合、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーカラムは、あらかじめ平衡化緩衝液により平衡化しておくことが好ましい。
【００４５】
前記平衡化緩衝液としては、例えば、トリス、リン酸、酢酸、クエン酸、コハク酸、酒石酸、ビストリス、ビストリスプロパンおよびＨＥＰＳ；２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ，ＭＥＳ；２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ等が挙げられるが、これに限定されるものではない。平衡化緩衝液のｐＨは、通常５．０〜９．０であることが好ましい。
【００４６】
目的タンパク質を溶出する前に洗浄工程を含むこともできる。ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーの場合には、目的タンパク質を溶出する前に、５カラム容量の１０ｍＭトリス―１ＭＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）、または１０ｍＭトリスに０．５〜３Ｍのアミノ酸若しくは、これらのジペプチド、オリゴペプチド若しくはポリアミノ酸を添加した緩衝液を用いた洗浄工程を入れ、カラムに吸着した非特異的吸着物質を除去することができる。
【００４７】
または、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーにロードするタンパク質含有試料に直接、好ましくは０．１〜２Ｍのアミノ酸、またはこれらのジペプチド、オリゴペプチド若しくはポリアミノ酸を添加して、クロマグラフィーを実施することが好ましい。
【００４８】
このことにより、前記洗浄工程なしでも不純物レベルを低減させることができる。アミノ酸の替わりに、同濃度のＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２またはＣａＣｌ２等の塩をＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーにロードするタンパク質含有試料に添加した場合にも、同様の効果が得られるため、好ましい。
【００４９】
ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー工程に用いる溶出緩衝液としては、例えば、１０〜１００ｍＭのグリシン、スレオニン若しくは他のアミノ酸またはこれらのジペプチド、オリゴペプチド若しくはポリアミノ酸を含む緩衝液が挙げられるがこれらに限定されない。緩衝液のｐＨは、通常２．５〜４．５であることが好ましい。
【００５０】
ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーカラムにタンパク質含有試料をロードするおよび、緩衝液を通液する線速度は、通常５０〜１０００ｃｍ／ｈの範囲であることが好ましい。
【００５１】
（陰イオン交換クロマトグラフィー工程）
陰イオン交換クロマトグラフィー用樹脂としては、例えば、ＧＥ社製Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、ＡＮＸ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、Ｃａｐｔｏ  Ｑ、Ｃａｐｔｏ  ＤＥＡＥ、東ソー社製ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＧｉｇａＣａｐ  Ｑ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＳｕｐｅｒＱ−６５０、Ｍｅｒｃｋ社製Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＤＥＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＴＭＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＴＭＡＥ  ＨｉｃａｐおよびエシュムノＱ等が挙げられるがこれらに限定されない。これらの樹脂で適切な長さのカラムを作製し利用する。カラム長は、通常２．５〜４０ｃｍであることが好ましい。更には、陰イオン交換膜の使用も可能である。
【００５２】
陰イオン交換クロマトグラフィーの平衡化緩衝液としては、１０〜１００ｍＭ  ヒスチジン緩衝液、若しくは他のアミノ酸またはこれらのジペプチド、オリゴペプチド若しくはポリアミノ酸を含む緩衝液、トリス緩衝液、または１０〜１００ｍＭ  トリスを含んだ５〜１００ｍＭ  スレオニン若しくは他のアミノ酸またはこれらのジペプチド、オリゴペプチド若しくはポリアミノ酸緩衝液等が挙げられるが、これらに限定されない。緩衝液のｐＨは、通常５．０〜９．０であることが好ましい。
【００５３】
陰イオン交換クロマトグラフィーカラムにタンパク質含有試料をロードするおよび、緩衝液を通液する線速度は、通常５０〜１０００ｃｍ／ｈであることが好ましい。
【００５４】
（陽イオン交換クロマトグラフィー工程）
陽イオン交換クロマトグラフィーカラムとしては、例えば、ＧＥ社製ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、ＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ、Ｃａｐｔｏ  Ｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製Ｐｏｒｏｓ  ５０  ＨＳ、Ｐｏｒｏｓ  ５０  ＸＳ，  Ｍｅｒｃｋ社製エシュムノＳ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＣＯＯ−、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＯ３−、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  Ｈｉｃａｐ、東ソー社製ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＧｉｇａＣａｐ  Ｓ−６５０およびＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＧｉｇａＣａｐ  ＣＭ−６５０等が挙げられるがこれらに限定されない。カラム長は、通常２．５〜４０ｃｍであることが好ましい。
【００５５】
陽イオン交換クロマトグラフィーの平衡化緩衝液としては、例えば、１０〜１００ｍＭのＭＥＳ、酢酸、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リン酸緩衝液、または１０〜１００ｍＭのグルタミン酸若しくは他のアミノ酸またはこれらのジペプチド、オリゴペプチド若しくはポリアミノ酸緩衝液が挙げられるがこれらに限定されない。緩衝液のｐＨは、通常４．０〜８．０であることが好ましい。
【００５６】
陽イオン交換クロマトグラフィーの溶出緩衝液としては、例えば、１０〜１００ｍＭ  ＭＥＳ、酢酸、クエン酸、コハク酸、またはリン酸緩衝液にアルギニン若しくは他のアミノ酸またはこれらのジペプチド、オリゴペプチド若しくはポリアミノ酸を添加した緩衝液、または１０〜１００ｍＭのグルタミン酸若しくは他のアミノ酸またはこれらのジペプチド、オリゴペプチド若しくはポリアミノ酸にＮａＣｌ等の塩を添加した緩衝液、および１０〜１０００ｍＭのグルタミン酸若しくは他のアミノ酸またはこれらのジペプチド、オリゴペプチド若しくはポリアミノ酸緩衝液が挙げられるがこれらに限定されない。緩衝液のｐＨは、通常４．０〜８．０であることが好ましい。
【００５７】
陽イオン交換クロマトグラフィーカラムにタンパク質含有試料をロードするおよび、緩衝液を通液する線速度は、通常５０〜１０００ｃｍ／ｈであることが好ましい。
【００５８】
陽イオン交換クロマトグラフィーの溶出工程は、溶出緩衝液を用いてその濃度を徐々に増加させる勾配溶出、または溶出緩衝液を用いた段階溶出のいずれであってもよい。
【００５９】
また、工業スケールで本発明の精製方法により精製されるタンパク質を有効成分として含有する医薬品の製造を検討した場合、最終のクロマトグラフィー工程として陽イオン交換クロマトグラフィー工程を行う場合、陽イオン交換クロマトグラフィー工程において、該医薬品の製剤処方と同じ緩衝液を用いることで、陽イオン交換クロマトグラフィー工程後、最終的に医薬品の製剤処方を完成するまでに必要となる緩衝液交換の必要性がなくなる可能性もある。
【００６０】
したがって、本発明の精製方法において、最終のクロマトグラフィー工程、好ましくは陽イオン交換クロマトグラフィー工程に使用する緩衝液の成分または、その一部に含まれるアミノ酸は、医薬品の製剤処方に含まれるアミノ酸と同じアミノ酸であることが好ましい。
【００６１】
すなわち、本発明は、本発明の精製方法により精製されたアミノ酸を有効成分とし、かつ本発明の精製方法における最終のクロマトグラフィー工程、好ましくは陽イオン交換クロマトグラフィー工程に使用する緩衝液の成分または、その一部に含まれるアミノ酸と同じアミノ酸を含有する医薬品の製剤処方をも提供する。
【００６２】
さらには、本発明の精製方法に含まれるすべてのクロマトグラフィー工程に用いるアミノ酸を、医薬品の製剤処方に含まれるアミノ酸と同一のアミノ酸とすることで、原材料数の削減や精製装置の簡素化に伴う経済的なメリットもさらに期待することが可能である。
【００６３】
したがって、本発明の精製方法に含まれるクロマトグラフィー工程に用いる緩衝液の成分または、その一部に含まれるアミノ酸とおよび医薬品の製剤処方に含まれるアミノ酸とは同じであることが好ましい。
【００６４】
より好ましくは、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、アルギニン、またはメチオニンが、本発明の精製方法に含まれるクロマトグラフィー工程に用いる緩衝液かつ本発明の精製方法により精製されるタンパク質を有効成分とする医薬品の製剤処方に含まれることが好ましい。
【００６５】
本発明における精製方法により、モノクローナル抗体を精製することにより、高い純度のモノクローナル抗体を得ることができる。「高い純度」とは、重合体については、本発明の精製方法による精製物における重合体の割合が好ましくは４％未満、より好ましくは３．５％未満、さらに好ましくは１％未満であることを意味する。
【００６６】
また、宿主細胞タンパク質については、本発明の精製方法による精製物における宿主細胞由来のタンパク質（宿主タンパク質）の含有量が、好ましくは１０００ｎｇ／ｍｇ未満（タンパク質１ｍｇあたりに含まれる宿主細胞タンパク質が１０００ｎｇ未満）、より好ましくは１００ｎｇ／ｍｇ未満、さらに好ましくは１０ｎｇ／ｍｇ未満であることを意味する。
【００６７】
これらの精製物における重合体または宿主タンパク質の濃度は、当業者において周知の方法（例えば、宿主細胞タンパク質の場合にはＥＬＩＳＡ法や、重合体の場合にはゲルろ過ＨＰＬＣ分析の方法）を用いて測定することが可能である。
【実施例】
【００６８】
実施例１  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ及びＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦを使用した精製
精密ろ過により清澄化したヒトモノクローナル抗体を含むＣＨＯ細胞培養上清８６ｍｌを１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーカラム（ＧＥ社製ＭａｂＳｅｌｅｃｔ）  １０ｍｍ  ＩＤｘ２０ｃｍに添加した（線速度５００ｃｍ／ｈ）。培養上清添加後、５カラム容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した（線速度５００ｃｍ／ｈ）。【００６９】
次に表１に示す５カラム容量の溶出緩衝液（ｐＨ３．２）によりヒトモノクローナル抗体を溶出した（線速度５００ｃｍ／ｈ）。溶出液を１．５Ｍ  トリスでｐＨ７．０に中和した。【００７０】
中和液を表１に示す陰イオン交換緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥ社製Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ  ３ｍｍ  ＩＤｘ２０ｃｍ）に添加した（線速度３００ｃｍ／ｈ）。加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液した。カラム非吸着画分をヒトモノクローナル抗体溶出液としてプールした。【００７１】
添Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬプール液を１Ｍクエン酸にてｐＨ５．０に調整後、表１の陽イオン交換平衡化緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥ社製ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ  １０ｍｍ  ＩＤｘ２０ｃｍ）に添加した（線速度２００ｃｍ／ｈ）。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した（線速度２００ｃｍ／ｈ）。【００７２】
次に表１に示す陽イオン交換溶出緩衝液（ｐＨ４．５）を用いた２０カラム容量の０．３５Ｍ塩濃度を徐々に増加させる塩濃度勾配溶出にて、ヒトモノクローナル抗体を溶出した（線速度２００ｃｍ／ｈ）。【００７３】
【表１】
0005873016.tif 000002
【００７４】
本実施例の方法によるヒトモノクローナル抗体の精製結果を図１および２に示す。図１および２に示すように、クロマトグラフィー工程に使用する緩衝液にアミノ酸を含有させた方法１及び方法２の方が、純度（重合体の量、及び宿主細胞タンパクの量）の点から、緩衝液にアミノ酸を含有させない方法３より優れていることが確認できた。【００７５】
実施例２  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＧｉｇａＣａｐ  Ｑ、及びＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  ＨｉＣａｐを使用した精製
精密ろ過により清澄化したヒトモノクローナル抗体を含むＣＨＯ細胞培養上清８６ｍｌを１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーカラム（ＧＥ社製ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ）１０ｍｍ  ＩＤｘ２０ｃｍに添加した（線速度５００ｃｍ／ｈ）。培養上清添加後、５カラム容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した（線速度５００ｃｍ／ｈ）。【００７６】
次に表１に示す５カラム容量の溶出緩衝液（ｐＨ３．２）によりヒトモノクローナル抗体を溶出した（線速度５００ｃｍ／ｈ）。溶出液を１．５Ｍ  トリスでｐＨ７．０に中和した。【００７７】
中和液を表１に示す陰イオン交換緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（東ソー社製ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＧｉｇａＣａｐ  Ｑ  ３ｍｍ  ＩＤｘ２０ｃｍ）に添加した（線速度５００ｃｍ／ｈ）。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液した。カラム非吸着画分をヒトモノクローナル抗体溶出液としてプールした。【００７８】
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＧｉｇａＣａｐ  Ｑプール液を１Ｍクエン酸にてｐＨ  ５．０に調整後、表１の陽イオン交換平衡化緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｍｅｒｃｋ社製Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  Ｈｉｃａｐ  １０ｍｍ  ＩＤｘ２０ｃｍ）に添加した（線速度２００ｃｍ／ｈ）。【００７９】
添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した（線速度２００ｃｍ／ｈ）。次に表１に示す陽イオン交換溶出緩衝液（ｐＨ４．５）を用いた２０カラム容量の０．３５Ｍ塩濃度を徐々に増加させる塩濃度勾配溶出にて、ヒトモノクローナル抗体を溶出した（線速度２００ｃｍ／ｈ）。【００８０】
本方法によるヒトモノクローナル抗体の精製結果を図３、４に示す。図３および４に示すように、クロマトグラフィー工程に使用する緩衝液にアミノ酸を含有させた方法１及び方法２のほうが、純度（重合体の量、及び宿主細胞タンパクの量）の点から、緩衝液にアミノ酸を含有させない方法３より優れていることが確認できた。【００８１】
実施例３  陽イオン交換クロマトグラフィー工程にアミノ酸を使用した精製
精密ろ過により清澄化したヒトモノクローナル抗体を含むＣＨＯ細胞培養上清２４５ｍｌを表２に示す１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーカラム（ＧＥ社製ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ）１０ｍｍ  ＩＤｘ２０ｃｍに添加した（線速度５００ｃｍ／ｈ）。培養上清添加後、５カラム容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した（線速度５００ｃｍ／ｈ）。【００８２】
次に表２に示す５カラム容量の溶出緩衝液（１００ｍＭ  グリシン、ｐＨ３．４）によりヒトモノクローナル抗体を溶出した（線速度５００ｃｍ／ｈ）。溶出液を１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ  ７に中和した。【００８３】
中和液を表２に示す陰イオン交換緩衝液（１０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．０）で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｔｏｓｏｈ社製Ｇｉｇａｃａｐ  Ｑ  ３ｍｍ  ＩＤｘ２０ｃｍ）に添加した（線速度５００ｃｍ／ｈ）。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液した。カラム非吸着画分をヒトモノクローナル抗体溶出液としてプールした。【００８４】
Ｇｉｇａｃａｐ  Ｑプール液を１Ｍ塩酸にてｐＨ５．０に調整後、２等分してそれぞれ（１６ｍＬずつ添加）、方法１（アミノ酸使用）、方法２の条件で、陽イオン交換クロマトグラフィーを実施した。【００８５】
表２の陽イオン交換平衡化緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｍｅｒｋ社製Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  Ｈｉｃａｐ  １０ｍｍ  ＩＤｘ２０ｃｍ）に上記ロード液を添加した（線速度２００ｃｍ／ｈ）。【００８６】
添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した（線速度２００ｃｍ／ｈ）。次に表２に示す陽イオン交換溶出緩衝液（ｐＨ５．０）を用いた２０カラム容量の溶出緩衝液を徐々に増加させる勾配溶出にて、ヒトモノクローナル抗体を溶出した（線速度２００ｃｍ／ｈ）。【００８７】
【表２】
0005873016.tif 000003
【００８８】
本方法によるヒトモノクローナル抗体の精製結果を図５に示す。図５に示すように、クロマトグラフィー工程に用いる緩衝液にアミノ酸を含有させた方法１のほうが、純度（重合体の量）の点から、緩衝液にアミノ酸を含有させない方法２より優れていることが確認できた。【００８９】
実施例４  医薬品製剤処方の緩衝液成分であるアミノ酸（ヒスチジン）を使用した緩衝液のみでの精製
精密ろ過により清澄化したヒトモノクローナル抗体を含むＣＨＯ細胞培養上清９９ｍｌを表３に示す１０ｍＭ  ヒスチジン緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーカラム（ＧＥ社製ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ）１０ｍｍＩＤｘ２０ｃｍに添加した（線速度４０３〜５００ｃｍ／ｈ）。培養上清添加後、５カラム容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した（線速度５００ｃｍ／ｈ）。【００９０】
次に表３に示す５カラム容量の溶出緩衝液（５０ｍＭ  ヒスチジン、ｐＨ３．４）によりヒトモノクローナル抗体を溶出した（線速度５００ｃｍ／ｈ）。溶出液を１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ７に中和した。【００９１】
中和液を表３に示す陰イオン交換緩衝液（１０ｍＭ  ヒスチジン、ｐＨ７．０）で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（東ソー社製ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＧｉｇａＣａｐ  Ｑ  １０ｍｍ  ＩＤｘ２０ｃｍ）に添加した（線速度５００ｃｍ／ｈ）。添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液した。カラム非吸着画分をヒトモノクローナル抗体溶出液としてプールした。【００９２】
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＧｉｇａＣａｐ  Ｑプール液を１Ｍ塩酸にてｐＨ４．５に調整後、表３の陽イオン交換平衡化緩衝液（５０ｍＭ  ヒスチジン、ｐＨ４．５）で平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥ社製ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ  １０ｍｍ  ＩＤｘ２０ｃｍ）に添加した（線速度２００ｃｍ／ｈ）。【００９３】
添加終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した（線速度２００ｃｍ／ｈ）。次に表２に示す陽イオン交換溶出緩衝液（２５０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．０）を用いた２０カラム容量の溶出緩衝液を徐々に増加させる勾配溶出にて、ヒトモノクローナル抗体を溶出した（線速度２００ｃｍ／ｈ）。【００９４】
【表３】
0005873016.tif 000004
【００９５】
本方法によるヒトモノクローナル抗体の精製結果を図６および７に示す。図６および７に示すように、陽イオン交換クロマトグラフィー工程後の精製物における重合体の割合は１％未満であり、宿主細胞タンパク質が５０ｐｐｍ未満となった。この純度は医薬品として十分の品質レベルである。【００９６】
また、実施例１及び２で検討した表１の方法３のようにクロマトグラフィー工程に用いる緩衝液にアミノ酸を含有させない方法に比べ（図１〜４参照）、クロマトグラフィー工程に用いる緩衝液にアミノ酸を含有させる本発明の精製方法により精製されたタンパク質は、純度（重合体の量、及び宿主細胞タンパク質の量）の点においても優れていることが確認された。【００９７】
例えば、アミノ酸を緩衝液に含有させた場合の陽イオン交換クロマトグラフィーカラム後の精製物における宿主細胞タンパク質の量（図７参照）は、緩衝液にアミノ酸を含有させない場合（図２及び図４の方法３参照）と比べて、それらの２０％以下となった。【００９８】
さらに、本実施例のように、１種類のアミノ酸を含有する緩衝液でのみ抗体精製可能であること、また、そのアミノ酸が製剤の処方緩衝液成分であることは、精製で使用する原材料数や、緩衝液交換工程を削減できる可能性があり、その場合は、原材料費削減、及び精製装置の簡素化による経済的なメリットも期待される。【００９９】
本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお本出願は、２０１０年６月２１日付で出願された米国仮出願（６１／３５６８９９）および２０１１年２月９日付で出願された米国仮出願（６１／４４１０５１）に基づいており、その全体が引用により援用される。
【図１】
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【図２】
0005873016.tif 000006
【図３】
0005873016.tif 000007
【図４】
0005873016.tif 000008
【図５】
0005873016.tif 000009
【図６】
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【図７】
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