(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から得た試料中の、ＳＤＣ４、ＥＺＲ、ＬＲＩＧ３、又はＴＰＭ３とＲＯＳ１との融合タンパク質であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は該ポリペプチドの存在を検出する工程を含むことを特徴とするＲＯＳ１キナーゼ領域を含む融合遺伝子又は該融合遺伝子によってコードされる融合タンパク質の検出方法であって、前記融合タンパク質が、
ＳＤＣ４遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン２までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３２からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド、
ＳＤＣ４遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン４までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３２からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド、
ＳＤＣ４遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン４までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３４からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド、
ＥＺＲ遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン１０までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３４からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド、
ＬＲＩＧ３遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン１６までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３５からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は、
ＴＰＭ３遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン８までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３５からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド
がコードする融合タンパク質である、前記検出方法。
【請求項２】
被験者から得た試料中の、以下のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は該ポリペプチドの存在を検出する工程を含むことを特徴とする、ＲＯＳ１キナーゼ領域を含む融合遺伝子又は該融合遺伝子によってコードされる融合タンパク質の検出方法：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、又は配列番号１６で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、若しくは配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、若しくは配列番号１６で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、又は配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
被験者から得た試料中の、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を検出する工程を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合遺伝子の検出方法。
【請求項６】
ＳＤＣ４、ＥＺＲ、ＬＲＩＧ３、又はＴＰＭ３とＲＯＳ１との融合タンパク質であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＲＯＳ１遺伝子キナーゼ領域を含む融合遺伝子の検出用キットであって、
前記融合タンパク質が、
ＳＤＣ４遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン２までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３２からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド、
ＳＤＣ４遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン４までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３２からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド、
ＳＤＣ４遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン４までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３４からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド、
ＥＺＲ遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン１０までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３４からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド、
ＬＲＩＧ３遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン１６までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３５からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は、
ＴＰＭ３遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン８までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３５からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド
がコードする融合タンパク質である、前記キット。
【請求項７】
以下のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＲＯＳ１遺伝子キナーゼ領域を含む融合遺伝子の検出用キット：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、又は配列番号１６で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、若しくは配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、若しくは配列番号１６で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、又は配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項７に記載のキット。
【請求項１０】
ＳＤＣ４、ＥＺＲ、ＬＲＩＧ３、又はＴＰＭ３をコードする部分から設計されるセンスプライマー及びＲＯＳ１をコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、ＳＤＣ４、ＥＺＲ、ＬＲＩＧ３、又はＴＰＭ３遺伝子とＲＯＳ１遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーは請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなり、センスプライマーは請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子からなるプライマーセット。
【請求項１１】
ＳＤＣ４、ＥＺＲ、ＬＲＩＧ３、又はＴＰＭ３をコードする部分から設計されるセンスプライマー及びＲＯＳ１をコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、ＳＤＣ４、ＥＺＲ、ＬＲＩＧ３、又はＴＰＭ３遺伝子とＲＯＳ１遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、下記ａ）〜ｆ）からなる群より選択されるプライマーセット：
ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
ｂ）配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
ｃ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
ｄ）配列番号９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
ｅ）配列番号１３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、及び
ｆ）配列番号１５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット。
【請求項１２】
配列番号１の塩基番号１から１９９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号２００から１９９５間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
【請求項１３】
配列番号３の塩基番号１から４４５間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号３の塩基番号４４６から２２４１間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
【請求項１４】
配列番号５の塩基番号１から４４５間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号５の塩基番号４４６から１９３２間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
【請求項１５】
配列番号９の塩基番号１から１０９０間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号９の塩基番号１０９１から２５７７間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
【請求項１６】
配列番号１３の塩基番号１から２６９５間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１３の塩基番号２６９６から４０９８間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
【請求項１７】
配列番号１５の塩基番号１から７７５間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１５の塩基番号７７６から２１７８間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＯＳ１キナーゼ領域を含む新規の融合遺伝子又は該融合遺伝子によってコードされる融合タンパク質の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
チロシンキナーゼ阻害剤のイレッサやタルセバの登場により、分子診断と癌治療効果の関係について、最近になり臨床で示されつつあり、分子診断による適応患者の選別による患者を層別化した上での治療薬投与というコンセプトが広がりつつある。
ロス１（ROS 1）キナーゼはＵＲ２（University of Rochester 2）鳥肉腫ウイルスのオンコジーンであるｖ−ｒｏｓのヒトオーソログとして同定された（非特許文献１）。ＲＯＳ１遺伝子転座はグリオブラストーマでの発見が最初であり、融合パートナーはエフアイジー（ＦＩＧ：Fused in glioblastoma）であった（非特許文献２）。野生型全長のＲＯＳ１の発現は広範な組織の上皮細胞で観察されており、癌との関連性も示唆されている。ＲＯＳ１とＦＩＧの融合により、ＲＯＳ１キナーゼ活性は恒常的となり、発現した細胞を癌化することやそのトランスジェニックマウスにおいて癌が発生することが知られている（非特許文献３）。
非小細胞肺癌におけるＲＯＳ１とＣＤ７４またはＳＬＣ３４Ａ２との融合遺伝子の存在が報告された（非特許文献４；なお、非特許文献４では、「ＲＯＳ１」の代わりに「ＲＯＳ」の名称を使用している）。ＣＤ７４−ＲＯＳ１は患者検体１５０例中１例、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１は４１細胞株中１例でのみ同定されていることから、実際の患者での頻度や患者の臨床的特徴は不明である。報告されたＣＤ７４−ＲＯＳ１遺伝子の融合部位はＣＤ７４遺伝子のエクソン６とＲＯＳ１遺伝子のエクソン３４であり、他のエクソンでの融合については見出されておらず、腫瘍形成能についても示されていない。本発明で見出したＣＤ７４ｅｘ６−ＲＯＳ１ｅｘ３２の融合部位はＣＤ７４遺伝子のエクソン６とＲＯＳ１遺伝子のエクソン３２である。また、報告されたＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１遺伝子の融合部位はＳＬＣ３４Ａ２遺伝子のエクソン４とＲＯＳ１遺伝子のエクソン３２または３４であり、他のエクソンでの融合については示されていない。本発明で見出したＳＬＣ３４Ａ２ｅｘ１３−ＲＯＳ１ｅｘ３２の融合部位はＳＬＣ３４Ａ２遺伝子のエクソン１３とＲＯＳ１遺伝子のエクソン３２である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】「モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Molecular and cellular biology）」，（（米国），１９８６年，６巻，ｐ．３０００−３００４）
【非特許文献２】「ジーンズ・クロモソームス・アンド・キャンサー（Genes, chromosomes & cancer）」，（（イギリス），２００３年，３７巻，ｐ．５８−７１）
【非特許文献３】「キャンサー・リサーチ（Cancer research）」，（（米国），２００６年，６６巻，ｐ．７４７３−７４８１）
【非特許文献４】「セル（Cell）」，（（米国），２００７年，１３１巻，ｐ．１１９０−１２０３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、癌の新たな原因遺伝子であるポリヌクレオチドを解明し、これにより、当該ポリヌクレオチド又はそれがコードするポリペプチドの検出方法、及びそのためのキット及びプライマーセットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、肺癌患者から得た検体から、各種遺伝子（ＳＤＣ４、ＣＤ７４、ＥＺＲ、ＳＬＣ３４Ａ２、ＬＲＩＧ３、ＴＰＭ３）の一部と、キナーゼであるＲＯＳ１遺伝子の一部とが融合した新規の融合遺伝子を単離同定し（実施例３）、これらの融合遺伝子が肺癌患者検体に存在すること（実施例５及び実施例６）、また、これらの融合遺伝子が腫瘍形成能を有し、癌の原因遺伝子であることを見出した（実施例４）。本発明者は、これらの知見から、これらの融合遺伝子およびそれにコードされる融合タンパク質の検出方法を構築し（実施例５及び実施例６）、そのためのキット及びプライマーセットを提供し、これらの融合遺伝子を検出することにより、ＲＯＳ１阻害薬物治療の対象となる癌患者を選別することを可能とした。【０００６】
本発明は、
［１］下記工程を含むことを特徴とするＲＯＳ１キナーゼ領域を含む融合遺伝子又は該融合遺伝子によってコードされる融合タンパク質の検出方法：
被験者から得た試料中の、ＳＤＣ４、ＥＺＲ、ＬＲＩＧ３、又はＴＰＭ３とＲＯＳ１との融合タンパク質であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は該ポリペプチドの存在を検出する工程、
［２］被験者から得た試料中の、以下のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は該ポリペプチドの存在を検出する工程を含むことを特徴とする、ＲＯＳ１キナーゼ領域を含む融合遺伝子又は該融合遺伝子によってコードされる融合タンパク質の検出方法：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、又は配列番号１６で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
［３］前記ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、若しくは配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、若しくは配列番号１６で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、［２］の方法、
［４］前記ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、又は配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、［２］の方法、
［５］被験者から得た試料中の、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を検出する工程を含むことを特徴とする、［１］〜［４］のいずれかの融合遺伝子の検出方法、
［６］ＳＤＣ４、ＥＺＲ、ＬＲＩＧ３、又はＴＰＭ３とＲＯＳ１との融合タンパク質であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＲＯＳ１遺伝子キナーゼ領域を含む融合遺伝子の検出用キット、
［７］以下のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＲＯＳ１遺伝子キナーゼ領域を含む融合遺伝子の検出用キット：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、又は配列番号１６で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
［８］前記ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、若しくは配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、若しくは配列番号１６で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、［７］のキット、
［９］前記ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、又は配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、［７］のキット、
［１０］ＳＤＣ４、ＣＤ７４、ＥＺＲ、ＳＬＣ３４Ａ２、ＬＲＩＧ３、又はＴＰＭ３をコードする部分から設計されるセンスプライマー及びＲＯＳ１をコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、ＳＤＣ４、ＣＤ７４、ＥＺＲ、ＳＬＣ３４Ａ２、ＬＲＩＧ３、又はＴＰＭ３遺伝子とＲＯＳ１遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーは［１］〜［４］のいずれかのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなり、センスプライマーは［１］〜［４］のいずれかのポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子からなるプライマーセット、
［１１］ＳＤＣ４、ＣＤ７４、ＥＺＲ、ＳＬＣ３４Ａ２、ＬＲＩＧ３、又はＴＰＭ３遺伝子とＲＯＳ１遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、下記ａ）〜ｈ）からなる群より選択されるプライマーセット：
ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
ｂ）配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
ｃ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
ｄ）配列番号７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
ｅ）配列番号９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
ｆ）配列番号１１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
ｇ）配列番号１３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、及び
ｈ）配列番号１５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
［１２］配列番号１の塩基番号１から１９９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号２００から１９９５間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、
［１３］配列番号３の塩基番号１から４４５間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号３の塩基番号４４６から２２４１間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、
［１４］配列番号５の塩基番号１から４４５間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号５の塩基番号４４６から１９３２間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、
［１５］配列番号７の塩基番号１から６２５間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号７の塩基番号６２６から２４２１間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、
［１６］配列番号９の塩基番号１から１０９０間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号９の塩基番号１０９１から２５７７間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、
［１７］配列番号１１の塩基番号１から２０２６間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１１の塩基番号２０２７から３８２２間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、
［１８］配列番号１３の塩基番号１から２６９５間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１３の塩基番号２６９６から４０９８間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、
［１９］配列番号１５の塩基番号１から７７５間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１５の塩基番号７７６から２１７８間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、
に関する。
また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とするＲＯＳ１キナーゼ領域を含む融合遺伝子陽性の癌（特には肺癌）の存在の検出方法；
被験者から得た試料中の、下記（１）乃至（３）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を検出する工程、
（１）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、若しくは配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、若しくは配列番号１６で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、又は配列番号１６で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、又は配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。
また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とするＲＯＳ１キナーゼ領域を含む融合遺伝子陽性の癌（特には肺癌）の診断方法；
被験者から得た試料中の、下記（１）乃至（３）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を検出する工程、
（１）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、若しくは配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、若しくは配列番号１６で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、又は配列番号１６で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、又は配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。
また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とする癌（特には肺癌）の存在の検出方法；
被験者から得た試料を鋳型とし、請求項６乃至請求項１３に記載された前記プライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、
ＰＣＲ産物の存在を検出する工程、
に関する。
また、本発明は、
以下工程を含むことを特徴とする、染色体の再構成（genomic rearrangement）を検出する方法；
被験者から得た試料中の、下記（１）乃至（３）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を検出する工程、
（１）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、若しくは配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、若しくは配列番号１６で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、又は配列番号１６で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、又は配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。
さらに、本発明は、
以下工程を含むことを特徴とする、染色体の再構成（genomic rearrangement）を検出する方法；
ｉ）被験者から得た試料並びにii）ＳＤＣ４、ＣＤ７４、ＥＺＲ、ＳＬＣ３４Ａ２、ＬＲＩＧ３、又はＴＰＭ３をコードする５’側ゲノム領域を含む標識プローブ及びiii）ＲＯＳ１をコードする３’ゲノム領域を含む蛍光標識プローブを用い、インサイチュハイブリダイゼーションを行う工程、
前記標識のシグナルの重なりを検出する工程
に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の検出方法は、ＳＤＣ４、ＣＤ７４、ＥＺＲ、ＳＬＣ３４Ａ２、ＬＲＩＧ３、又はＴＰＭ３の各遺伝子と、ＲＯＳ１遺伝子との融合遺伝子陽性の癌（特には肺癌）を検出する方法として利用できる。また、本発明の検出方法は、染色体の再構成を検出する方法として利用できる。また、本発明の検出方法によれば、ＲＯＳ１阻害剤の適用対象者であるか否かを鑑別することができる。本発明の検出用キット及びプライマーセットは、本発明の検出方法に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】３Ｔ３繊維芽細胞に融合遺伝子ＳＤＣ４ｅｘ２−ＲＯＳ１ｅｘ３２（配列番号１）を導入し、１４日間培養後の状態を示す、図面に代わる顕微鏡写真である。
【図２】３Ｔ３繊維芽細胞に融合遺伝子ＳＤＣ４ｅｘ４−ＲＯＳ１ｅｘ３２（配列番号３）を導入し、１４日間培養後の状態を示す、図面に代わる顕微鏡写真である。
【図３】３Ｔ３繊維芽細胞に融合遺伝子ＳＤＣ４ｅｘ４−ＲＯＳ１ｅｘ３４（配列番号５）を導入し、１４日間培養後の状態を示す、図面に代わる顕微鏡写真である。
【図４】３Ｔ３繊維芽細胞に融合遺伝子ＣＤ７４ｅｘ６−ＲＯＳ１ｅｘ３２（配列番号７）を導入し、１４日間培養後の状態を示す、図面に代わる顕微鏡写真である。
【図５】３Ｔ３繊維芽細胞に融合遺伝子ＥＺＲｅｘ１０−ＲＯＳ１ｅｘ３４（配列番号９）を導入し、１４日間培養後の状態を示す、図面に代わる顕微鏡写真である。
【図６】３Ｔ３繊維芽細胞に融合遺伝子ＳＬＣ３４Ａ２ｅｘ１３−ＲＯＳ１ｅｘ３２（配列番号１１）を導入し、１４日間培養後の状態を示す、図面に代わる顕微鏡写真である。
【図７】３Ｔ３繊維芽細胞に融合遺伝子ＬＲＩＧ３ｅｘ１６−ＲＯＳ１ｅｘ３５（配列番号１３）を導入し、１４日間培養後の状態を示す、図面に代わる顕微鏡写真である。
【図８】３Ｔ３繊維芽細胞に融合遺伝子ＴＰＭ３ｅｘ８−ＲＯＳ１ｅｘ３５（配列番号１５）を導入し、１４日間培養後の状態を示す、図面に代わる顕微鏡写真である。
【図９】３Ｔ３繊維芽細胞に空ベクター（ｐＭＸＳ）を導入し、１４日間培養後の状態を示す、図面に代わる顕微鏡写真である。
【図１０】融合遺伝子ＳＤＣ４ｅｘ２−ＲＯＳ１ｅｘ３２（配列番号１）を導入した３Ｔ３繊維芽細胞をヌードマウスの皮下に接種した後、１４乃至２１日後の状態を示す、図面に代わる写真である。
【図１１】融合遺伝子ＳＤＣ４ｅｘ４−ＲＯＳ１ｅｘ３２（配列番号３）を導入した３Ｔ３繊維芽細胞をヌードマウスの皮下に接種した後、１４乃至２１日後の状態を示す、図面に代わる写真である。
【図１２】融合遺伝子ＳＤＣ４ｅｘ４−ＲＯＳ１ｅｘ３４（配列番号５）を導入した３Ｔ３繊維芽細胞をヌードマウスの皮下に接種した後、１４乃至２１日後の状態を示す、図面に代わる写真である。
【図１３】融合遺伝子ＣＤ７４ｅｘ６−ＲＯＳ１ｅｘ３２（配列番号７）を導入した３Ｔ３繊維芽細胞をヌードマウスの皮下に接種した後、１４乃至２１日後の状態を示す、図面に代わる写真である。
【図１４】融合遺伝子ＥＺＲｅｘ１０−ＲＯＳ１ｅｘ３４（配列番号９）を導入した３Ｔ３繊維芽細胞をヌードマウスの皮下に接種した後、１４乃至２１日後の状態を示す、図面に代わる写真である。
【図１５】融合遺伝子ＳＬＣ３４Ａ２ｅｘ１３−ＲＯＳ１ｅｘ３２（配列番号１１）を導入した３Ｔ３繊維芽細胞をヌードマウスの皮下に接種した後、１４乃至２１日後の状態を示す、図面に代わる写真である。
【図１６】融合遺伝子ＬＲＩＧ３ｅｘ１６−ＲＯＳ１ｅｘ３５（配列番号１３）を導入した３Ｔ３繊維芽細胞をヌードマウスの皮下に接種した後、１４乃至２１日後の状態を示す、図面に代わる写真である。
【図１７】融合遺伝子ＴＰＭ３ｅｘ８−ＲＯＳ１ｅｘ３５（配列番号１５）を導入した３Ｔ３繊維芽細胞をヌードマウスの皮下に接種した後、１４乃至２１日後の状態を示す、図面に代わる写真である。
【図１８】空ベクター（ｐＭＸＳ）を導入した３Ｔ３繊維芽細胞をヌードマウスの皮下に接種した後、１４乃至２１日後の状態を示す、図面に代わる写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
《本発明の検出方法》
本発明の検出方法には、融合遺伝子の検出方法と、前記融合遺伝子によってコードされる融合タンパク質の検出方法とが含まれる。以下、融合遺伝子の検出方法について説明し、その後、融合タンパク質の検出方法について説明する。
【００１０】
本発明における融合遺伝子の検出方法は、被験者から得た試料中の、特定のポリヌクレオチドの存在を検出する工程を含む。
【００１１】
被験者から得た試料としては、被験者からの採取物（生体から分離した試料）、具体的には、任意の採取された体液（好ましくは血液）、肺胞・気管支洗浄液、生検された試料、喀痰試料を用いるが、好適には、被験者の肺患部の生検試料又は喀痰試料を用いる。試料からゲノムＤＮＡを抽出して用いることができ、またその転写産物（ゲノムが転写及び翻訳される結果生じる産物；例えばｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、蛋白質）を用いることができる。特にはｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを調製して用いることが好ましい。
【００１２】
融合遺伝子の検出方法における「特定ポリヌクレオチドの存在を検出する工程」において、その検出対象となるポリヌクレオチド（以下、検出対象ポリヌクレオチドと称する）は、ＲＯＳ１キナーゼ領域を含む融合遺伝子である。「ＲＯＳ１キナーゼ領域を含む融合遺伝子」は、（Ａ）ＳＤＣ４、ＥＺＲ、ＬＲＩＧ３、又はＴＰＭ３の一部とＲＯＳ１の一部との融合タンパク質であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（好ましくは、ＳＤＣ４遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン２までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３２からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド、ＳＤＣ４遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン４までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３２からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド、ＳＤＣ４遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン４までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３４からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド、ＥＺＲ遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン１０までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３４からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド、ＬＲＩＧ３遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン１６までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３５からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び、ＴＰＭ３遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン８までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３５からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド）、並びに、（Ｂ）ＣＤ７４遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン６までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３２からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド、及びＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン１３までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３２からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド、
のことをいう。
【００１３】
「ＲＯＳ１キナーゼ領域を含む融合遺伝子」としては、下記（ｉ）乃至（iii）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが特に好ましい。
（ｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、又は配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、又は配列番号１６で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド（以下、機能的等価改変体と称する）、
（ii）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、又は配列番号１６で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）、並びに、
（iii）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、又は配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００１４】
配列番号２で表されるアミノ酸配列は、配列番号１で表される塩基配列によりコードされる配列である。また、配列番号１で表される塩基配列は、ＳＤＣ４遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン２までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３２からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなる。配列番号１で表される塩基配列の内、塩基番号１〜１９９の配列はＳＤＣ４遺伝子に由来し、塩基番号２００〜１９９５の配列はＲＯＳ１遺伝子に由来する。以下、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドをＳＤＣ４ｅｘ２−ＲＯＳ１ｅｘ３２と称する。
【００１５】
配列番号４で表されるアミノ酸配列は、配列番号３で表される塩基配列によりコードされる配列である。また、配列番号３で表される塩基配列は、ＳＤＣ４遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン４までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３２からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなる。配列番号３で表される塩基配列の内、塩基番号１〜４４５の配列はＳＤＣ４遺伝子に由来し、塩基番号４４６〜２２４１の配列はＲＯＳ１遺伝子に由来する。以下、配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドをＳＤＣ４ｅｘ４−ＲＯＳ１ｅｘ３２と称する。
【００１６】
配列番号６で表されるアミノ酸配列は、配列番号５で表される塩基配列によりコードされる配列である。また、配列番号５で表される塩基配列は、ＳＤＣ４遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン４までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３４からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなる。配列番号５で表される塩基配列の内、塩基番号１〜４４５の配列はＳＤＣ４遺伝子に由来し、塩基番号４４６〜１９３２の配列はＲＯＳ１遺伝子に由来する。以下、配列番号５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドをＳＤＣ４ｅｘ４−ＲＯＳ１ｅｘ３４と称する。
【００１７】
配列番号８で表されるアミノ酸配列は、配列番号７で表される塩基配列によりコードされる配列である。また、配列番号７で表される塩基配列は、ＣＤ７４遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン６までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３２からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなる。配列番号７で表される塩基配列の内、塩基番号１〜６２５の配列はＣＤ７４遺伝子に由来し、塩基番号６２６〜２４２１の配列はＲＯＳ１遺伝子に由来する。以下、配列番号７で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドをＣＤ７４ｅｘ６−ＲＯＳ１ｅｘ３２と称する。
【００１８】
配列番号１０で表されるアミノ酸配列は、配列番号９で表される塩基配列によりコードされる配列である。また、配列番号９で表される塩基配列は、ＥＺＲ遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン１０までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３４からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなる。配列番号９で表される塩基配列の内、塩基番号１〜１０９０の配列はＥＺＲ遺伝子に由来し、塩基番号１０９１〜２５７７の配列はＲＯＳ１遺伝子に由来する。以下、配列番号９で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドをＥＺＲｅｘ１０−ＲＯＳ１ｅｘ３４と称する。
【００１９】
配列番号１２で表されるアミノ酸配列は、配列番号１１で表される塩基配列によりコードされる配列である。また、配列番号１１で表される塩基配列は、ＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン１３までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３２からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなる。配列番号１１で表される塩基配列の内、塩基番号１〜２０２６の配列はＳＬＣ３４Ａ２遺伝子に由来し、塩基番号２０２７〜３８２２の配列はＲＯＳ１遺伝子に由来する。以下、配列番号１１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドをＳＬＣ３４Ａ２ｅｘ１３−ＲＯＳ１ｅｘ３２と称する。
【００２０】
配列番号１４で表されるアミノ酸配列は、配列番号１３で表される塩基配列によりコードされる配列である。また、配列番号１３で表される塩基配列は、ＬＲＩＧ３遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン１６までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３５からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなる。配列番号１３で表される塩基配列の内、塩基番号１〜２６９５の配列はＬＲＩＧ３遺伝子に由来し、塩基番号２６９６〜４０９８の配列はＲＯＳ１遺伝子に由来する。以下、配列番号１３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドをＬＲＩＧ３ｅｘ１６−ＲＯＳ１ｅｘ３５と称する。
【００２１】
配列番号１６で表されるアミノ酸配列は、配列番号１５で表される塩基配列によりコードされる配列である。また、配列番号１５で表される塩基配列は、ＴＰＭ３遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン８までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３５からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなる。配列番号１５で表される塩基配列の内、塩基番号１〜７７５の配列はＴＰＭ３遺伝子に由来し、塩基番号７７６〜２１７８の配列はＲＯＳ１遺伝子に由来する。以下、配列番号１５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドをＴＰＭ３ｅｘ８−ＲＯＳ１ｅｘ３５と称する。
【００２２】
「機能的等価改変体」としては、「配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、又は配列番号１６で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個、好ましくは１〜数個、更に好ましくは１〜７個、最も好ましくは１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、腫瘍形成能を有するポリペプチド」が好ましく、「配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、又は配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、腫瘍形成能を有するポリペプチド」が特に好ましい。
【００２３】
「相同ポリペプチド」は、「配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、又は配列番号１６で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、腫瘍形成能を有するポリペプチド」であるが、該同一性が、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上であるアミノ酸配列を含むポリペプチドが好ましい。
【００２４】
なお、本明細書における前記「同一性」とは、ＮＥＥＤＬＥ ｐｒｏｇｒａｍ（J Mol Biol 1970; 48: 443-453）検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値Ｉｄｅｎｔｉｔｙを意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ ＝ １０
Ｅｘｔｅｎｄ ｐｅｎａｌｔｙ ＝ ０．５
Ｍａｔｒｉｘ ＝ ＥＢＬＯＳＵＭ６２
【００２５】
あるポリペプチドが「腫瘍形成能を有する」ことは、実施例４の方法で確認する。具体的には、当該ポリペプチドを発現するプラスミドを導入した宿主（３Ｔ３繊維芽細胞）をヌードマウスの皮下に接種し、腫瘍形成の有無で判断する方法で確認する。
【００２６】
本発明の検出方法における検出対象ポリヌクレオチドとしては、「配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、又は配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、腫瘍形成能を有するポリペプチド」をコードするポリヌクレオチドが好ましく、「配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、又は配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」をコードするポリヌクレオチドが最も好ましい。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチドの検出方法における「ポリヌクレオチドの存在を検出する工程」は、被験者から得た試料のゲノム中の検出対象ポリヌクレオチド（融合点を含むゲノム配列）の存在を検出すること、あるいは、被験者から得た試料から抽出したゲノムＤＮＡの転写産物（例えばｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ）を調製し、検出対象ポリヌクレオチドに対応するｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの存在を検出することにより実施する。
【００２８】
ゲノムＤＮＡの抽出は公知の方法で行うことができ、市販のＤＮＡ抽出キットを用いて簡便に行うことができる。
【００２９】
検出工程は公知の遺伝子解析法（例えば遺伝子検出法として常用されるＰＣＲ，ＬＣＲ（Ligase chain reaction）、ＳＤＡ（Strand displacement amplification）、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence-based amplification）、ＩＣＡＮ（Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids）、ＬＡＭＰ（Loop-mediated isothermal amplification）法、ＴＭＡ法（Gen-Probe’s TMA system）、インサイチュハイブリダイゼーション法、更にマイクロアレイなど周知の方法）に従って実施することができる。例えば、検出対象ポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸をプローブとしたハイブリダイゼーション技術、又は、検出対象ポリヌクレオチドにハイブリダイズするＤＮＡをプライマーとした遺伝子増幅技術等を利用する。
【００３０】
具体的には、被験者から得た試料由来の核酸、例えばｍＲＮＡ等を用いて測定する。ｍＲＮＡ量の測定は、検出対象ポリヌクレオチド配列を特異的に増幅できるように設計したプライマーを用いて遺伝子増幅反応方法にて測定する。本発明の検出方法に用いられるプライマー、又は、検出用キットに含まれるプライマーは、検出対象ポリヌクレオチド配列を特異的に増幅できるものであれば、特には限定されず、検出対象ポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計する。ＰＣＲ増幅モニター法におけるプライマー設計は、プライマー設計ソフトウェア（例えば、Primer Express; PE Biosystems）などを利用してできる。また、ＰＣＲ産物のサイズが大きくなると増幅効率が悪くなるため、センスプライマーとアンチセンスプライマーは、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを対象に増幅したときの増幅産物の大きさが１ｋｂ以下になるように設定するのが適切である。
【００３１】
より具体的には、センスプライマー（５’−プライマー）をＳＤＣ４、ＣＤ７４、ＥＺＲ、ＳＬＣ３４Ａ２、ＬＲＩＧ３、又はＴＰＭ３をコードする部分（例えば、ＳＤＣ４−ＲＯＳ１、ＣＤ７４−ＲＯＳ１、ＥＺＲ−ＲＯＳ１、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１、ＬＲＩＧ３−ＲＯＳ１、ＴＰＭ３−ＲＯＳ１（特には、ＳＤＣ４ｅｘ２−ＲＯＳ１ｅｘ３２、ＳＤＣ４ｅｘ４−ＲＯＳ１ｅｘ３２、ＳＤＣ４ｅｘ４−ＲＯＳ１ｅｘ３４、ＣＤ７４ｅｘ６−ＲＯＳ１ｅｘ３２、ＥＺＲｅｘ１０−ＲＯＳ１ｅｘ３４、ＳＬＣ３４Ａ２ｅｘ１３−ＲＯＳ１ｅｘ３２、ＬＲＩＧ３ｅｘ１６−ＲＯＳ１ｅｘ３５、ＴＰＭ３ｅｘ８−ＲＯＳ１ｅｘ３５）の各融合ポリヌクレオチド（特にはｃＤＮＡ）のＳＤＣ４、ＣＤ７４、ＥＺＲ、ＳＬＣ３４Ａ２、ＬＲＩＧ３、又はＴＰＭ３の各遺伝子領域内の任意の部分）から、アンチセンスプライマー（３’−プライマー）をＲＯＳ１をコードする部分（例えば、前記の各融合ポリヌクレオチド（特にはｃＤＮＡ）中のＲＯＳ１遺伝子領域内の任意の部分）から設計する。好ましくは、本発明の検出用キットに含まれるプライマーを用い、更に好ましくは、検出用キットに最も好適に含まれるプライマーを用いる。ＰＣＲ増幅モニター法では、各遺伝子に対応した上記センスプライマーを混ぜることにより、１反応液により全ての融合ポリヌクレオチドを検出するマルチプレックスＰＣＲ（Multiplex PCR）を設計することもできる。各増幅技術に適した方法によって目的とした遺伝子（全体又はその特異的部分）が増幅されたか否かを確認することができる。例えば、ＰＣＲ法では、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分析し、エチジウムブロマイド染色等によって目的とするサイズの増幅断片が得られたか否かを確認できる。目的とするサイズの増幅断片が得られた場合は、被験者から得た試料において、検出対象ポリヌクレオチドが存在していたことになる。このように、検出対象ポリヌクレオチドの存在を検出することができる。
本発明の融合遺伝子の検出方法としては、被験者から得た試料中の、特定のポリヌクレオチドの存在を遺伝子増幅反応により検出する工程に加え、さらに目的とするサイズの増幅断片が得られたか否かを検出する工程を含むことが好ましい。
【００３２】
ハイブリダイゼーション技術を利用した検出は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ法、ＲＮＡプロテクション法などを使用して行う。ハイブリダイゼーションに用いるプローブとしては、検出対象ポリヌクレオチド又はそれらの相補鎖にストリンジェントな条件下で（好ましくはよりストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズする連続した少なくとも３２塩基の核酸分子であって、融合点を中心にその上流及び下流のそれぞれ１６塩基からなる配列（具体的には、配列番号１で表される塩基配列の第１８４番〜第２１５番（第１９９番／第２００番）、配列番号３で表される塩基配列の第４３０番〜第４６１番（第４４５番／第４４６番）、配列番号５で表される塩基配列の第４３０番〜第４６１番（第４４５番／第４４６番）、配列番号７で表される塩基配列の第６１０番〜第６４１番（第６２５番／第６２６番）、配列番号９で表される塩基配列の第１０７５番〜第１１０６番（第１０９０番／第１０９１番）、配列番号１１で表される塩基配列の第２０１１番〜第２０４２番（第２０２６番／第２０２７番）、配列番号１３で表される塩基配列の第２６８０番〜第２７１１番（第２６９５番／第２６９６番）、配列番号１５で表される塩基配列の第７６０番〜第７９１番（第７７５番／第７７６番。なお、括弧内の塩基番号は融合点を示す。）、又はそれらの相補鎖を含むプローブを用いることができる。
インサイチュハイブリダイゼーション技術を利用した検出は、公知のFISH法（fusion assay）に従って実施することができる。または、クロモジェニックインサイチュハイブリダイゼーション（CISH）法とシルバーインサイチュハイブリダイゼーション（SISH）法を組み合わせたヒュージョンアッセイで実施することができる。好適には、実施例６に記載のFISH法（fusion assay）で検出することができる。
【００３３】
なお、本明細書における融合点とは、ＳＤＣ４、ＣＤ７４、ＥＺＲ、ＳＬＣ３４Ａ２、ＬＲＩＧ３、又はＴＰＭ３の各遺伝子由来の部分とＲＯＳ１遺伝子由来の部分とが融合した点を意味する。
【００３４】
また、本明細書における「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」の条件である。「よりストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」の条件である。
【００３５】
さらには、ＲＴ−ＰＣＲ等の遺伝子増幅技術を利用することができる。ＲＴ−ＰＣＲ法においては、遺伝子の増幅過程においてＰＣＲ増幅モニター（リアルタイムＰＣＲ）法（Genome Res., 6(10), 986, 1996）を用いることにより、検出対象ポリヌクレオチドの存在について、より定量的な解析を行うことが可能である。ＰＣＲ増幅モニター法としては、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７９００（ＰＥバイオシステムズ社）を用いることが出来る。リアルタイムＰＣＲは公知の方法であり、そのための装置およびキットは市販されており、これらを利用して簡便に行える。
【００３６】
本発明における融合タンパク質の検出方法は、被験者から得た試料における、特定のポリペプチド、すなわち、検出対象ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド（以下、検出対象ポリペプチドと称する）の存在を検出する工程を含む。
【００３７】
このような検出する工程は、被験者から得た試料（例えば、被験者から得た癌組織や細胞）由来の可溶化液を調製し、その中に含まれる検出対象ポリペプチド（例えば、ＳＤＣ４−ＲＯＳ１、ＣＤ７４−ＲＯＳ１、ＥＺＲ−ＲＯＳ１、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１、ＬＲＩＧ３−ＲＯＳ１、ＴＰＭ３−ＲＯＳ１の各融合ポリペプチド、特には、ＳＤＣ４ｅｘ２−ＲＯＳ１ｅｘ３２、ＳＤＣ４ｅｘ４−ＲＯＳ１ｅｘ３２、ＳＤＣ４ｅｘ４−ＲＯＳ１ｅｘ３４、ＣＤ７４ｅｘ６−ＲＯＳ１ｅｘ３２、ＥＺＲｅｘ１０−ＲＯＳ１ｅｘ３４、ＳＬＣ３４Ａ２ｅｘ１３−ＲＯＳ１ｅｘ３２、ＬＲＩＧ３ｅｘ１６−ＲＯＳ１ｅｘ３５、ＴＰＭ３ｅｘ８−ＲＯＳ１ｅｘ３５の各融合ポリペプチド）を、ＳＤＣ４、ＣＤ７４、ＥＺＲ、ＳＬＣ３４Ａ２、ＬＲＩＧ３、又はＴＰＭ３に対する抗体と、抗ＲＯＳ１抗体とを組み合わせることによる免疫学的測定法又は酵素活性測定法等により実施できる。好適には、検出対象ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いた、酵素免疫測定法、２抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、ウェスタンブロッティング法等の手法を用いることができる。
【００３８】
より具体的には、検出対象ポリペプチドが存在している可能性のある細胞の細胞抽出液に対し、ＳＤＣ４、ＣＤ７４、ＥＺＲ、ＳＬＣ３４Ａ２、ＬＲＩＧ３、又はＴＰＭ３に対する抗体で免疫沈降を行い、その沈降物に対して抗ＲＯＳ１抗体で検出することで、検出対象ポリペプチドの存在を検出することができる。前記免疫沈降において、抗ＲＯＳ１抗体で免疫沈降し、ＳＤＣ４、ＣＤ７４、ＥＺＲ、ＳＬＣ３４Ａ２、ＬＲＩＧ３、又はＴＰＭ３に対する抗体で検出するのでも良い。上記の通り、免疫沈降と検出をした後、更には、検出抗体により、検出したポリペプチドが目的の検出対象ポリペプチドの大きさであることを確認することが好ましい。この検出に用いる抗体は、ＳＤＣ４に関してはエクソン１からエクソン４（好ましくはエクソン１からエクソン２）、ＣＤ７４に関してはエクソン１からエクソン６、ＥＺＲに関してはエクソン１からエクソン１０、ＳＬＣ３４Ａ２に関してはエクソン１からエクソン１３、ＬＲＩＧ３に関してはエクソン１からエクソン１６、又はＴＰＭ３に関してはエクソン１からエクソン８、ＲＯＳ１に関してはエクソン３２からエクソン４３（好ましくはエクソン３４からエクソン４３、より好ましくはエクソン３５からエクソン４３）までの範囲のポリペプチドに特異的に結合できる抗体であればどれでもよく、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。
【００３９】
本発明の検出方法における検出対象ポリヌクレオチド又は検出対象ポリペプチドが、被験者から得た試料から検出された場合は、当該被験者は、当該ポリヌクレオチド陽性の癌を有する対象（患者）であり、ＲＯＳ１阻害剤による治療の適用対象となる。
【００４０】
《本発明の検出用キット、本発明のプライマーセット》
本発明の検出用キットには、少なくとも、本発明の検出方法における検出対象ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンス及びアンチセンスプライマーが含まれる。センス及びアンチセンスプライマーセットは、検出対象ポリヌクレオチド増幅用のプライマーとして機能するポリヌクレオチドのセットである。
「ＳＤＣ４遺伝子とＲＯＳ１遺伝子との融合遺伝子」とは、ＳＤＣ４遺伝子の一部とＲＯＳ１遺伝子の一部とが融合した遺伝子（ＳＤＣ４−ＲＯＳ１と称する）（好ましくは、ＳＤＣ４遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン２までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３２からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド、ＳＤＣ４遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン４までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３２からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び、ＳＤＣ４遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン４までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３４からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド）、「ＥＺＲ遺伝子とＲＯＳ１遺伝子との融合遺伝子」とは、ＥＺＲ遺伝子の一部とＲＯＳ１遺伝子の一部とが融合した遺伝子（ＥＺＲ−ＲＯＳ１と称する）（好ましくは、ＥＺＲ遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン１０までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３４からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド）、「ＬＲＩＧ３遺伝子とＲＯＳ１遺伝子との融合遺伝子」とは、ＬＲＩＧ３遺伝子の一部とＲＯＳ１遺伝子の一部とが融合した遺伝子（ＬＲＩＧ３−ＲＯＳ１と称する）（好ましくは、ＬＲＩＧ３遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン１６までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３５からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド）、「ＴＰＭ３遺伝子とＲＯＳ１遺伝子との融合遺伝子」とは、ＴＰＭ３遺伝子の一部とＲＯＳ１遺伝子の一部とが融合した遺伝子（ＴＰＭ３−ＲＯＳ１と称する）（好ましくは、ＴＰＭ３遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン８までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３５からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド）のことをいう。ＣＤ７４遺伝子の一部とＲＯＳ１遺伝子の一部とが融合した遺伝子（ＣＤ７４−ＲＯＳ１と称する）とは、ＣＤ７４遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン６までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３２からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチドのことをいう。ＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の一部とＲＯＳ１遺伝子の一部とが融合した遺伝子（ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１と称する）とは、ＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン１３までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３２からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチドのことをいう。ＳＤＣ４−ＲＯＳ１、ＣＤ７４−ＲＯＳ１、ＥＺＲ−ＲＯＳ１、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１、ＬＲＩＧ３−ＲＯＳ１、又はＴＰＭ３−ＲＯＳ１によってコードされる融合タンパク質を、それぞれ、ＳＤＣ４とＲＯＳ１との融合タンパク質、ＣＤ７４とＲＯＳ１との融合タンパク質、ＥＺＲとＲＯＳ１との融合タンパク質、ＳＬＣ３４Ａ２とＲＯＳ１との融合タンパク質、ＬＲＩＧ３とＲＯＳ１との融合タンパク質、ＴＰＭ３とＲＯＳ１との融合タンパク質という。
【００４１】
本発明のプライマーセットには、
（１）ＳＤＣ４、ＣＤ７４、ＥＺＲ、ＳＬＣ３４Ａ２、ＬＲＩＧ３、又はＴＰＭ３をコードする部分から設計されるセンスプライマー及びＲＯＳ１をコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、ＳＤＣ４、ＣＤ７４、ＥＺＲ、ＳＬＣ３４Ａ２、ＬＲＩＧ３、又はＴＰＭ３遺伝子とＲＯＳ１遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーは「検出対象ポリヌクレオチド」にストリンジェントな条件下（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基の核酸分子）からなり、センスプライマーは「検出対象ポリヌクレオチド」の相補鎖にストリンジェントな条件（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基の核酸分子）からなるプライマーセット
が含まれる。
【００４２】
また、前記プライマーセット（１）のより具体的な態様として、本発明のプライマーセットには、以下の（２）〜（９）のプライマーセットが含まれる。
【００４３】
（２）配列番号１（ＳＤＣ４ｅｘ２−ＲＯＳ１ｅｘ３２）の塩基番号１から１９９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー（好ましくは配列番号３４）及び配列番号１の塩基番号２００から１９９５間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー（好ましくは配列番号３１）のプライマーセット。
（３）配列番号３（ＳＤＣ４ｅｘ４−ＲＯＳ１ｅｘ３２）の塩基番号１から４４５間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー（好ましくは配列番号３４）及び配列番号３の塩基番号４４６から２２４１間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー（好ましくは配列番号３１）のプライマーセット。
（４）配列番号５（ＳＤＣ４ｅｘ４−ＲＯＳ１ｅｘ３４）の塩基番号１から４４５間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー（好ましくは配列番号３４）及び配列番号５の塩基番号４４６から１９３２間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー（好ましくは配列番号３１）のプライマーセット。
（５）配列番号７（ＣＤ７４ｅｘ６−ＲＯＳ１ｅｘ３２）の塩基番号１から６２５間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー（好ましくは配列番号３５）及び配列番号７の塩基番号６２６から２４２１間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー（好ましくは配列番号３１）のプライマーセット。
（６）配列番号９（ＥＺＲｅｘ１０−ＲＯＳ１ｅｘ３４）の塩基番号１から１０９０間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー（好ましくは配列番号３６）及び配列番号９の塩基番号１０９１から２５７７間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー（好ましくは配列番号３３）のプライマーセット。
（７）配列番号１１（ＳＬＣ３４Ａ２ｅｘ１３−ＲＯＳ１ｅｘ３２）の塩基番号１から２０２６間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー（好ましくは配列番号３７）及び配列番号１１の塩基番号２０２７から３８２２間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー（好ましくは配列番号３１）のプライマーセット。
（８）配列番号１３（ＬＲＩＧ３ｅｘ１６−ＲＯＳ１ｅｘ３５）の塩基番号１から２６９５間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー（好ましくは配列番号３８）及び配列番号１３の塩基番号２６９６から４０９８間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー（好ましくは配列番号３２）のプライマーセット。
（９）配列番号１５（ＴＰＭ３ｅｘ８−ＲＯＳ１ｅｘ３５）の塩基番号１から７７５間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー（好ましくは配列番号３９）及び配列番号１５の塩基番号７７６から２１７８間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー（好ましくは配列番号３１）のプライマーセット。
【００４４】
これらのプライマーセット（１）〜（９）においては、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーの選択位置の間隔が１ｋｂ以下であるか、あるいは、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーにより増幅される増幅産物の大きさが１ｋｂ以下であることが好ましい。
また、本発明のプライマーは、通常、１５〜４０塩基、好ましくは１６〜２４塩基、更に好ましくは１８〜２４塩基、特に好ましくは２０〜２４塩基の鎖長を有する。
【００４５】
本発明のプライマーセットは、本発明の検出方法において、検出対象ポリヌクレオチドを増幅及び検出するために用いることができる。また、本発明のプライマーセットに含まれる各プライマーは、特に限定されるものではないが、例えば、化学合成法によって製造することができる。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。【００４７】
［実施例１］臨床検体でのＲＯＳ１遺伝子異常のＦＩＳＨ法による検出
目的遺伝子の５’領域および３’領域を異なる色素で染め、遺伝子の転座を観察する方法が知られている。ＦＩＳＨ法の一種であるこの方法はスプリットアッセイ（split assay）と呼ばれている。スプリットアッセイでは、染色体転座を調べたい目的遺伝子の５’領域および３’領域のそれぞれを異なる蛍光色素で標識したプローブで染める。例えば、テキサスレッド（TexasRed）（赤）標識およびＦＩＴＣ（緑）標識した２種類のプローブにて蛍光標識することにより、正常な場合は２つの黄色のシグナル（緑色と赤色のシグナルが近傍に存在している状態）として検出され、転座または逆位が起きている場合は、離れた緑色と赤色のシグナルとして検出される。【００４８】
臨床検体でのＲＯＳ１遺伝子異常をＦＩＳＨ法スプリットアッセイで検出した。手術により摘出され、２０％ホルマリンで固定化されパラフィンに包埋された肺癌組織を４μｍの厚さで切り、グラススライド上に乗せ病理切片を作製した。ＦＩＳＨ法は文献（Takeuchi K, Choi YL, Soda M, Inamura K, Togashi Y, Hatano S, Enomoto M, Takada S, Yamashita Y, Satoh Y, Okumura S, Nakagawa K, Ishikawa Y, Mano H. Multiplex reverse transcription-PCR screening for EML4-ALK fusion transcripts. Clin Cancer Res. 2008;14:6618-6624.）の方法に従い行った。作製した未染色の切片は、組織学ＦＩＳＨアクセサリーキット（Dako社）で処理し、続いて緑と赤の蛍光標識したＲＯＳ１遺伝子５’および３’領域をカバーするＢＡＣ（bacterial atificial chromosome）（クローン番号  RP1-179P9およびRP11-323I17）クローンでハイブリダイゼーションした。さらに続いて４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（4,6-diamino-2-phenylindole）で染色を行った。蛍光観察は蛍光顕微鏡ＢＸ５１（Olympus社）を使用した。緑と赤のシグナルが離れて観察されるゲノム構造異常が示唆される切片を見出した。１５５３例の病理切片での検討から１２例のＲＯＳ１遺伝子領域のゲノム構造異常を示唆する切片を見出した。【００４９】
［実施例２］臨床検体でのＲＯＳ１融合ポリヌクレオチド遺伝子の同定
ＦＩＳＨ法解析によりＲＯＳ１ゲノム構造異常が示唆された組織１２例由来のＲＮＡをテンプレートに５’−ＲＡＣＥキット（SMAT(TM) RACE cDNA Amplification Kit; Clonetech社）のプロトコールに従い、ＲＯＳ１遺伝子キナーゼ領域の５’側に存在する遺伝子を調べた。具体的には、ファーストストランドｃＤＮＡ（1st strand cDNA）合成は、臨床検体由来のＲＮＡ０．５μｇとＲＯＳ１遺伝子キナーゼコード領域に設計したリバースプライマー（配列番号１７）を用いて行った。５’−ＲＡＣＥ（rapid amplification of cDNA ends）ＰＣＲは、キットに含まれるＵＰＭプライマーおよびリバースプライマー（配列番号１７）を用いてＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold(R)；ライフテクノロジーズジャパン株式会社）によるＰＣＲ反応（94℃30秒、72℃3分を5サイクル、94℃30秒、70℃30秒、72℃3分を5サイクル、94℃30秒、68℃30秒、72℃3分を25サイクル）を行った。【００５０】
本ＲＡＣＥ産物を電気泳動し、１−２ｋｂｐ付近のＤＮＡ断片を精製し、常法に従いＴＡクローニング後にシーケンス解析した。その結果、ＳＤＣ４遺伝子（検体番号#7130、#8701、#26356）、ＣＤ７４遺伝子（#6534、#148、#10855）、ＥＺＲ遺伝子（#11994、#9604）、ＳＬＣ３４Ａ２遺伝子（#10286）、及びＴＰＭ３遺伝子（#17970、#8405）の一部がそれぞれＲＯＳ１遺伝子キナーゼ領域の５’側に融合していることが明らかとなった。
１２例中１例（#20130由来ＲＮＡ）ではＲＡＣＥ反応で増幅が得られなかったが、配列番号３１のプライマーのみで増幅が観察され、配列確認の結果、ＲＯＳ１遺伝子の５’側にＬＲＩＧ３遺伝子の一部が融合していることが認められた。＃２０１３０検体ではＬＲＩＧ３−ＲＯＳ１融合遺伝子の存在があると仮定し、実施例３および４において他の融合遺伝子の確認に平行して存在を見極めた。【００５１】
［実施例３］臨床検体でのＲＯＳ１融合ポリヌクレオチド遺伝子の単離
ＦＩＳＨ法解析によりＲＯＳ１ゲノム構造異常が示唆され、融合する遺伝子が同定された肺癌臨床検体由来のｃＤＮＡ（#7130、#26356、#6534、#11994、#10286、#20130）を鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（PrimeStar HS DNAポリメラーゼ）を用いてＰＣＲ（98℃10秒、68℃4〜4.5分を25〜37サイクル）を行い、増幅産物をｐＴ７Ｂｌｕｅ−２にクローニングした。プライマーセットとしては、
１）＃７１３０及び＃２６３５６に対して、配列番号２０及び配列番号１８の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド；
２）＃６５３４に対して、配列番号２１及び配列番号１９の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド；
３）＃１１９９４に対して、配列番号２２及び配列番号１８の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド；
４）＃１０２８６に対して、配列番号２３及び配列番号１８の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド；及び
５）＃２０１３０に対して、配列番号２４及び配列番号１８の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
をそれぞれ用いた。【００５２】
得られた増幅産物のそれぞれの配列を確認した結果、ＳＤＣ４、ＣＤ７４、ＥＺＲ、ＳＬＣ３４Ａ２およびＬＲＩＧ３遺伝子の開始コドンＡＴＧを含む一部と、ＲＯＳ１遺伝子のエクソン４３の停止コドンを含む一部からなる新規なポリヌクレオチドが同定された。具体的には、
＃７１３０から、ＳＤＣ４遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン２までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３２からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＳＤＣ４ｅｘ２−ＲＯＳ１ｅｘ３２）（配列番号１）；
＃２６３５６から、ＳＤＣ４遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン４までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３２からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＳＤＣ４ｅｘ４−ＲＯＳ１ｅｘ３２）（配列番号３）及びＳＤＣ４遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン４までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３４からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＳＤＣ４ｅｘ４−ＲＯＳ１ｅｘ３４）（配列番号５）；
＃６５３４から、ＣＤ７４遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン６までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３２からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＣＤ７４ｅｘ６−ＲＯＳ１ｅｘ３２）（配列番号７）；
＃１１９９４から、ＥＺＲ遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン１０までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３４からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＥＺＲｅｘ１０−ＲＯＳ１ｅｘ３４）（配列番号９）；
＃１０２８６から、ＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン１３までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３２からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＳＬＣ３４Ａ２ｅｘ１３−ＲＯＳ１ｅｘ３２）（配列番号１１）；
＃２０１３０から、ＬＲＩＧ３遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン１６までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３５からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＬＲＩＧ３ｅｘ１６−ＲＯＳ１ｅｘ３５）（配列番号１３）
がそれぞれ取得できた。【００５３】
ＴＰＭ３遺伝子とＲＯＳ１遺伝子との融合遺伝子は一回のＰＣＲ反応で全長を増幅することができなかったので、まず、肺癌臨床検体由来のｃＤＮＡ＃１７９７０を鋳型として、３種類のＲＴ−ＰＣＲ産物（Block1、Block2、Block3）を作製し、順番にＥｃｏＲＩ−ＳｃａＩ、ＳｃａＩ−ＢｓｔＸＩおよびＢｓｔＸＩ−ＮｏｔＩで消化し、３フラグメントのライゲーションにより発現ベクターのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩサイトにクローニングした。Ｂｌｏｃｋ１は、配列番号２５及び配列番号２６の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲ（98℃10秒、68℃1分を30サイクル）により、Ｂｌｏｃｋ２は、配列番号２７及び配列番号２８の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲ（98℃10秒、68℃1分を30サイクル）により得た。Ｂｌｏｃｋ３は、配列番号２９及び配列番号３０の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲ（94℃15秒、60℃15秒、68℃30秒を38サイクル）により得た増幅産物の両端にEcoRI-NotI-BamHI adaptor（Takara Bio社）を結合させプラスミドベクターのEcoRIサイトに一旦挿入し、そのプラスミドからBstXI-NotI消化で取得した。結果、ＴＰＭ３遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン８までとＲＯＳ１遺伝子のエクソン３５からエクソン４３の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＴＰＭ３ｅｘ８−ＲＯＳ１ｅｘ３５）（配列番号１５）を取得した。以上、本実施例で得たポリヌクレオチドは、いずれも新規なポリヌクレオチドであった。【００５４】
［実施例４］ＲＯＳ１融合ポリペプチドの腫瘍形成能の検討
実施例３で作製した各プラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで消化することによりインサートを取り出し、発現ベクターｐＭＸＳ（JBC 275,24945-24952,2000）のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩサイトにサブクローニングした。実施例３に記したようにＴＰＭ３−ＲＯＳ１はＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩサイトに挿入した。これら各融合ポリペプチドを発現するプラスミド又はｃＤＮＡを挿入しない空ベクター（ｐＭＸＳ）をリン酸カルシウム法で３Ｔ３繊維芽細胞に導入し１４日間培養したところ、図１〜図８（ＲＯＳ１融合ポリペプチド発現）および図９（空ベクター）に示すように、各融合ポリペプチドを発現するベクターを導入した場合に限り形質転換フォーカスが観察された。【００５５】
各融合ポリペプチドを発現するベクター又は空ベクターを導入した３Ｔ３細胞をヌードマウスの皮下に５×１０６個ずつ接種し、１４日から２１日間観察したところ、１４日以降には各融合ポリペプチドを発現するベクターを導入した３Ｔ３細胞を接種したマウスにおいて腫瘍形成が確認された（図１０〜図１７）。空ベクターを導入した３Ｔ３細胞を接種したマウスにおいては、腫瘍形成は確認されなかった（図１８）。これらの結果より（ＳＤＣ４、ＣＤ７４、ＥＺＲ、ＳＬＣ３４Ａ２、ＬＲＩＧ３、ＴＰＭ３）−ＲＯＳ１融合ポリペプチドが腫瘍形成能を持っていたことから（ＳＤＣ４、ＣＤ７４、ＥＺＲ、ＳＬＣ３４Ａ２、ＬＲＩＧ３、ＴＰＭ３）−ＲＯＳ１融合ポリヌクレオチドは癌の原因遺伝子であることが示された。【００５６】
［実施例５］融合遺伝子の検出
融合部を含む領域を直接増幅するＲＴ−ＰＣＲで各融合遺伝子の検出を行い、各融合遺伝子ｃＤＮＡが癌組織に存在していることを示した。以下に示す各検体由来ＲＮＡテンプレートに対して、フォワードプライマー（今回同定したＲＯＳ１遺伝子に融合していた遺伝子上に設計）とＲＯＳ１遺伝子上に設計したリバースプライマーを使用し、ＰＣＲは９４℃、１０分の前処理後に、以下に示す条件で増幅反応を行い、最後に７２℃、１０分間の延長反応を行った。
＃７１３０、＃８７０１、＃２６３５６（ＳＤＣ４−ＲＯＳ１）については、配列番号３４のフォワードプライマーと配列番号３１のリバースプライマーを使用し、94℃1分、70℃1分、72℃30秒を30サイクルの増幅反応；
＃６５３４、＃１４８、＃１０８５５（ＣＤ７４−ＲＯＳ１）については、配列番号３５のフォワードプライマーと配列番号３１のリバースプライマーを使用し、94℃1分、70℃1分、72℃30秒を30サイクルの増幅反応；
＃１１９９４、＃９６０４（ＥＺＲ−ＲＯＳ１）については、配列番号３６のフォワードプライマーと配列番号３３のリバースプライマーを使用し、94℃1分、70℃1分、72℃30秒を30サイクルの増幅反応；
＃１０２８６（ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１）については、配列番号３７のフォワードプライマーと配列番号３１のリバースプライマーを使用し、94℃1分、68℃1分、72℃60秒を35サイクルの増幅反応；
＃２０１３０（ＬＲＩＧ３−ＲＯＳ１）については、配列番号３８のフォワードプライマーと配列番号３２のリバースプライマーを使用し、94℃1分、68℃1分、72℃10秒を35サイクルの増幅反応；
＃１７９７０、＃８４０５（ＴＰＭ３−ＲＯＳ１）については、配列番号３９のフォワードプライマーと配列番号３１のリバースプライマーを使用し、94℃1分、70℃1分、72℃30秒を30サイクルの増幅反応
をそれぞれ行った。増幅産物を電気泳動したところ、プライマー設定位置から予想されるサイズのバンドが各遺伝子ともに観察され、臨床検体を用いて融合遺伝子の検出がそれぞれの遺伝子上にプライマーを設計することによって可能であることが示された。【００５７】
［実施例６］臨床検体でのＲＯＳ１融合遺伝子のＦＩＳＨ法による検出
各融合遺伝子がゲノム上で融合していることを確認するため、
ＲＯＳ１遺伝子についてはＢＡＣクローン（RP1-179P9）；
ＳＤＣ４遺伝子についてはＢＡＣクローン（RP3-453C12）；
ＣＤ７４遺伝子についてはＢＡＣクローン（RP11-1120I24）；
ＥＺＲ遺伝子についてはＢＡＣクローン（RP11-507C10）；
ＳＬＣ３４Ａ２遺伝子についてはＢＡＣクローン（RP11-752I1）；
ＬＲＩＧ３遺伝子についてはＢＡＣクローン（RP11-557F20）；
ＴＰＭ３遺伝子についてはＢＡＣクローン（RP11-205-M9）
を用いて、実施例１に従いＦＩＳＨ法にてＦｕｓｉｏｎ  ａｓｓａｙを行った。なお、ＲＯＳ１遺伝子についてはＦＩＴＣ（緑）で、それ以外の遺伝子についてはテキサスレッド（赤）で、それぞれ、プローブを標識した。【００５８】
Ｆｕｓｉｏｎ  ａｓｓａｙでは染色体転座によって近接する二つの目的遺伝子領域を異なる蛍光色素で標識したプローブで染める。例えば、ＴｅｘａｓＲｅｄ（赤）標識およびＦＩＴＣ（緑）標識した２種類のプローブにて蛍光標識することにより、正常な場合は赤と緑はそれぞれのシグナル（緑色と赤色のシグナルが離れて存在している状態）として検出され、転座または逆位が起きることにより２つの遺伝子領域が近接している場合は、緑色と赤色のシグナルが重なり黄色として検出される。実施例５において融合遺伝子が陽性であった病理切片上でそれぞれのＦｕｓｉｏｎ  ａｓｓａｙの結果、ＲＯＳ１遺伝子３’領域との近接したシグナル（黄色）が観察され、融合遺伝子が染色体転座により生成されたことが確かめられた。
この方法が当該融合遺伝子の存在を検出する方法として使えることがわかった。【００５９】
以上より本発明において、一部の肺癌患者においてはＲＯＳ１遺伝子の融合遺伝子が存在し、その遺伝子が癌の原因となっていることが明らかとなった。即ち、ＲＯＳ１阻害薬物治療の対象となる癌患者をＲＯＳ１融合遺伝子であるＳＤＣ４ｅｘ２−ＲＯＳ１ｅｘ３２、ＳＤＣ４ｅｘ４−ＲＯＳ１ｅｘ３２、ＳＤＣ４ｅｘ４−ＲＯＳ１ｅｘ３４、ＣＤ７４ｅｘ６−ＲＯＳ１ｅｘ３２、ＥＺＲｅｘ１０−ＲＯＳ１ｅｘ３４、ＳＬＣ３４Ａ２ｅｘ１３−ＲＯＳ１ｅｘ３２、ＬＲＩＧ３ｅｘ１６−ＲＯＳ１ｅｘ３５、及びＴＰＭ３ｅｘ８−ＲＯＳ１ｅｘ３５を検出することで選別できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明の検出方法は、本明細書の融合遺伝子陽性の癌患者の判定に有用である。本発明の検出用キット及びプライマーセットは、前記検出方法に用いることができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表フリーテキスト】
【００６１】
配列表の配列番号２５の配列で表される塩基配列は、合成プライマー配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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