(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物担体および二本鎖核酸分子を含む医薬組成物であって、該薬物担体がレチノイドと脂質とを含み、該二本鎖核酸分子が、構造：
５’  （Ｎ）ｘ−Ｚ            ３’（アンチセンス鎖）
３’    Ｚ’−（Ｎ’）ｙ−ｚ”  ５’（センス鎖）
式中、ＮおよびＮ’の各々は、非修飾であっても、修飾されていてもよいヌクレオチドであるか、または非定型部分であり、
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの各々は、各々の連続するＮまたはＮ’が次のＮまたはＮ’に共有結合により連結されたオリゴヌクレオチドであり、
ＺおよびＺ’の各々は、独立して、存在するか、不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端に共有結合的に付着した１〜５個の連続したヌクレオチド、１〜５個の連続した非ヌクレオチド部分、またはその組合せを含み、
ｚ”は存在しても、または不在であってもよいが、存在する場合は、（Ｎ’）ｙの５’末端に共有結合的に付着したキャッピング部分であり、
ｘおよびｙの各々は、独立して１８〜４０の間の整数であり、
（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に相補的であり、および
（Ｎ）ｘは、配列番号１で例示されるヒトｈｓｐ４７のｍＲＮＡコード配列に対するアンチセンス配列を含む、
を含み、脂質が
【化１】
0005873168.tif 000107
および／または
【化２】
0005873168.tif 000108
を含む、前記医薬組成物。
【請求項２】
二本鎖核酸分子が、配列番号６０および１２７（ＳＥＲＰＩＮＨ１＿２）、配列番号９８および１６５（ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａ）、ならびに配列番号１０１および１６８（ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１）の配列からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
レチノイドが、レチノイド−ＰＥＧ結合体として含まれる、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
薬物担体が、ポリマーミセル、リポソーム、エマルジョン、ミクロスフェア、およびナノスフェアからなる群から選択される形態である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
アンチセンス鎖が配列番号１２７を含み、センス鎖が配列番号６０を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
アンチセンス鎖が、
（ｉ）２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチド、１、５、６または７位の少なくとも１つにおける２’-５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着した非ヌクレオチド部分、
（ｉｉ）３、５、９、１１、１３、１５、１７および１９位における２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチド、７位における２’-５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着した非ヌクレオチド部分、
（ｉｉｉ）１、３、５、９、１１、１３、１５、１７および１９位における２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ（プロピルホスホ−プロパノール）非ヌクレオチド部分、または
（ｉｖ）１、３、５、９、１１、１３、１５、１７および１９位における２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチド、７位における２’-５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ（プロピルホスホ−プロパノール）非ヌクレオチド部分、
をさらに含み、センス鎖が、
（ｉ）少なくとも１個の２’−５’−リボヌクレオチドまたは２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着した非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着したキャップ部分、
（ｉｉ）３’末端の１５、１６、１７、１８および１９位における５個の連続した２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着した非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基部分、
（ｉｉｉ）３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ（プロピルホスフェート）非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基部分、
（ｉｖ）３’末端の１５、１６、１７、１８および１９位における５個の連続した２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ（プロピルホスフェート）非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基部分、または
（ｖ）７、１３、１６、および１８位における２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチド、９位における２’-５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ（プロパノール）非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基部分
をさらに含む、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
アンチセンス鎖が、１、３、５、９、１１、１３、１５、１７および１９位における２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチド、７位における２’-５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ（プロピルホスホ−プロパノール）非ヌクレオチド部分をさらに含み、センス鎖が、３’末端の１５、１６、１７、１８および１９位における５個の連続した２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ（プロピルホスフェート）非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基部分をさらに含む、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項８】
センス鎖が配列番号９８を含み、アンチセンス鎖が配列番号１６５を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
センス鎖が、３’末端またはその近傍の位置における２’-５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着した非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着したキャップ部分をさらに含み、アンチセンス鎖が、２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチド、５、６または７位の少なくとも１つにおける２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着した非ヌクレオチド部分をさらに含む、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
センス鎖が、１５、１６、１７、１８および１９位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ（プロパノール）３’部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分をさらに含み、アンチセンス鎖が、２、４、６、８、１１、１３、１５、１７および１９位における２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ（プロピルホスホ−プロパノール）部分をさらに含む、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
センス鎖が配列番号１０１を含み、アンチセンス鎖が配列番号１６８を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
センス鎖が、
（ｉ）２’−Ｏ−メチル修飾ピリミジンリボヌクレオチド、９または１０位のうちの１つにおける任意の２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着した非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着したキャップ部分、
（ｉｉ）４、１１、１３および１７位における２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチド、９位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ（プロパノール）非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分、
（ｉｉ）４、１１、１３および１７位における２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ（プロパノール）非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分、または
（ｉｖ）２、４、１１、１３および１７位における２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ（プロパノール）非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分
をさらに含み、アンチセンス鎖が、
（ｉ）２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチド、５、６または７位の少なくとも１つにおける２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着した非ヌクレオチド部分、または
（ｉｉ）１、４、８、１１および１５位における２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチド、６位における２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ（プロピルホスホ−プロパノール）部分、
をさらに含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
センス鎖が、４、１１、１３および１７位における２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチド、９位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ（プロパノール）非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分をさらに含み、アンチセンス鎖が、１、４、８、１１および１５位における２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチド、６位における２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ（プロピルホスホ−プロパノール）部分をさらに含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
ｈｓｐ４７に関連する疾患を予防または処置するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
肝臓、肺、腎臓、膵臓、皮膚、心臓、脳、腸、結腸、声帯、咽頭、腹膜、眼、筋肉、骨髄、骨、卵巣、尿管、および子宮を含む組織の線維症、慢性肝障害、原線維形成、肝硬変、非アルコール性脂肪肝炎、腹膜硬化症、糖尿病性腎症、眼瘢痕性類天疱瘡、ならびにがんからなる群から選択される疾患を予防または処置するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
非経口投与される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年６月１５日に出願された米国仮出願第61/497,447号および、２０１１年６月８日に出願された米国仮出願第61/494,832号の利益を主張する。これらの各々は、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
本明細書で提供されるのは、ｓｉＲＮＡによるｈｓｐ４７発現の調節を増強するレチノイド−リポソームを含む医薬組成物である。
【背景技術】
【０００３】
肝臓の線維症は活性化された肝星細胞（ＨＳＣ）によって引き起こされ得て、その結果、複数種のコラーゲン分子およびフィブロネクチンが間質組織上に沈着する。これにより、肝硬変、肝不全、および／または肝細胞癌が生じ得る。さらに、肝線維症と同じメカニズムにより、膵線維症の結果として慢性膵炎が発症する（Madro, et al., 2004; Med Sci Monit. 10:RA166-70；Jaster, 2004, Mol Cancer. 6:26）。さらに星細胞は、声帯瘢痕、声帯粘膜線維症、および喉頭線維症などの声帯および喉頭の疾患に存在する。これらの臓器および体内の他の場所における線維症を予防または処置するため、薬物担体および薬物担体キットの開発に対する要求が存在する。
【０００４】
星細胞は、線維症を処置するための重要な標的候補の１つである（Fallowfield et al., 2004, Expert Opin Ther Targets. 8:423-35；Pinzani, et al., 2004, Dig Liver Dis.36:231-42）。線維症において、星細胞は近傍の細胞からのサイトカインにより活性化され、肝線維症を引き起こす多くの因子を産生する。星細胞はビタミンＡを貯蔵し、筋線維芽細胞ファミリーに属する。
【０００５】
線維症を予防または処置する治療方法は、コラーゲン代謝の制御、コラーゲン分解系の促進、および星細胞活性化の抑制を試みる。しかしこれらの全てのケースにおいて、低い作用特異性および／または低い臓器特異性、限定された効力、および副作用は問題を引き起こす。
【０００６】
コラーゲンタンパク質合成の阻害は、治療法として確立されていない。コラーゲン産生を標的化する分子の効力は、副作用を引き起こす可能性のために限定されている。コラーゲン産生の阻害は、線維症を予防または処置するための別の治療法を直ちに提供する。かかる方法には、種々のＩ〜ＩＶ型コラーゲンのうちの１または２以上の制御が必要である。これを達成する方法は、種々のタイプのコラーゲンが必要とする細胞内輸送および分子成熟に必須のコラーゲン特異的分子シャペロンである熱ショックタンパク質４７（ＨＳＰ４７）を介するものであってもよい。したがって、ＨＳＰ４７の機能を星細胞において特異的に制御できれば、肝線維症を抑制する可能性がある。
【発明の概要】
【０００７】
本明細書は、診断薬および／または治療薬を星細胞に特異的に輸送することを可能とする、薬物担体および薬物担体キットに関する。本明細書の薬物担体は、ポリマーミセル、リポソーム、エマルジョン、ミクロスフェア、およびナノスフェアの形態から選択することができ、これに結合するかまたはこの中に含めることにより、レチノイドまたはレチノイド結合体および治療薬をＨＳＣに特異的に輸送することができる。レチノイドには、ビタミンＡ、レチナール、レチノイン酸、飽和ビタミンＡ、トレチノイン、アダパレン、またはパルミチン酸レチノール、およびフェンレチニド（４−ＨＰＲ）が含まれる。さらに、薬物担体に、切断型ＴＧＦβＩＩ型受容体および可溶性ＴＧＦβＩＩ型受容体などのＴＧＦβ活性阻害剤、ＨＧＦなどの成長因子製剤、ＭＭＰ遺伝子含有アデノウイルスベクターなどのＭＭＰ生産プロモーター、ＰＰＡＲγリガンド、アンギオテンシンＩＩ  Ｉ型受容体アンタゴニスト、ＰＤＧＦチロシンキナーゼ阻害剤を含む細胞活性化阻害剤および／または増殖阻害剤、アミロリドなどのナトリウムチャネル阻害剤、およびcompound 861およびグリオトキシンなどのアポトーシス誘導剤、から選択される１分子または複数分子を含めるよう調製することにより、およびこれを、線維症または線維症症状のリスクを有する患者に、または、例えば、肝硬変、肝不全、肝がん、または慢性膵炎などの種々の線維症関連疾患を有する患者に対して、例えば経口的、非経口、静脈内または腹腔内に投与することにより、星細胞の活性化を抑制することができ、これにより前記患者における線維症および／または線維症に関連する疾患状態を、予防、抑制または改善することができる。代替的に、またはこれに加えて、ＨＳＰ４７もしくは、ＭＭＰ阻害剤であるＴＩＭＰを特異的に阻害する、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡをその中に封入している薬物担体を用いることにより、Ｉ〜ＩＶ型コラーゲンの分泌を同時に抑制することができ、その結果線維形成を効率的に阻害することができる。
【０００８】
本明細書の一態様は医薬組成物であって、センス鎖およびアンチセンス鎖が、下表４中にＳＥＲＰＩＮＨ１＿２（配列番号６０および１２７）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａ（配列番号９８および１６５）、およびＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１（配列番号１０１および１６８）として記載されたオリゴヌクレオチドから選択される、前記センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖核酸分子、ならびに脂質小胞とレチノイドまたはレチノイド結合体の混合物を含む薬物担体を含む、前記医薬組成物である。レチノイドは、以下の１または２以上であってもよい：ビタミンＡ、レチノイン酸、飽和ビタミンＡ、レチナール、トレチノイン、アダパレン、パルミチン酸レチノール、またはフェンレチニド。好ましくは、レチノイドはレチノイン酸の結合体を含み、最も好ましくはレチノイド−ＰＥＧ結合体を含む。脂質小胞は、脂質分子の二重層を含んでもよく、さらに、レチノイドを含んでもよい。レチノイドは、薬物担体中０．２〜２０ｗｔ％の濃度であることが好ましい。脂質小胞は、脂質小胞の内部を被包する内部表面、および脂質小胞の外側の水性媒体にアクセス可能な外表面を含んでもよい。レチノイドは、脂質二重層に結合していてもよい。二本鎖核酸は、脂質小胞の外表面に露出していてもよい。
【０００９】
一部の態様において、二本鎖核酸分子は、配列番号１２７を有し、かつ、２’−Ｏ−メチル糖（２’ＯＭｅ）−修飾リボヌクレオチド、１、５、６または７の少なくとも１つの位置における２’−５’−リボヌクレオチド、および、３’末端に共有結合的に付着した３’末端非ヌクレオチド部分を含むアンチセンス鎖、ならびに、配列番号６０を有し、かつ、少なくとも１個の２’−５’−リボヌクレオチドまたは２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着した非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基部分を含む、センス鎖を含む。好ましい態様において、アンチセンス鎖は配列番号１２７であり、３、５、９、１１、１３、１５、１７および１９位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着した非ヌクレオチド部分を含み、ならびにセンス鎖は配列番号６０であり、３’末端の１５、１６、１７、１８および１９位における５個の連続した２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着した非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基部分を含む。一部の態様において、二本鎖核酸分子はさらに、アンチセンス鎖の１位に、２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドまたは２’−５’−リボヌクレオチドを含む。（本明細書でのヌクレオチド位置の参照は、二本鎖核酸分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖両方について、オリゴヌクレオチドの５’＞３’方向に基づいて表される。）
【００１０】
種々の態様において、センス鎖は配列番号９８であり、３’末端の位置における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着した非ヌクレオチド部分、および、５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基部分を含み、ならびに、アンチセンス鎖は配列番号１６５であり、２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、５、６、または７位の少なくとも１つにおける２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着した非ヌクレオチド部分を含む。好ましい態様において、センス鎖は配列番号９８であり、１５、１６、１７、１８および１９位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−ＯＨ３’部分、および、５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、ならびに、アンチセンス鎖は配列番号１６５であり、４、６、８、１１、１３、１５、１７、および１９位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む。一部の態様において、二本鎖核酸分子はさらに、２位に、２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。
【００１１】
種々の態様において、センス鎖は配列番号１０１であり、２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、任意に、９または１０位の１つにおける２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着した非ヌクレオチド部分、および、５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基部分を含み、ならびに、アンチセンス鎖は配列番号１６８であり、２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、５、６、または７位の少なくとも１つにおける２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着した非ヌクレオチド部分を含む。好ましい態様において、センス鎖は配列番号１０１であり、４、１１、１３および１７位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、９位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖は配列番号１６８であり、１、４、８、１１および１５位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、６位における２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む。一部の態様において、二本鎖核酸分子はさらに、アンチセンス鎖の１３位におよびまたはセンス鎖の２位に、２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。
【００１２】
別の側面は、二本鎖核酸分子と、レチノイドと脂質との混合物を含む薬物担体とを含む、医薬組成物であり、ここで二本鎖オリゴヌクレオチド化合物は、以下の構造（Ａ１）を含む：
（Ａ１）  ５’  （Ｎ）ｘ−Ｚ              ３’（アンチセンス鎖）
３’    Ｚ’−（Ｎ’）ｙ−ｚ”  ５’（センス鎖）
式中、ＮおよびＮ’の各々は非修飾であっても、修飾されていてもよいヌクレオチドであるか、非定型部分（unconventional moiety）であり、
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの各々は、各々連続するＮまたはＮ’が次のＮまたはＮ’に共有結合的に連結されたオリゴヌクレオチドであり、
ＺおよびＺ’の各々は、独立して、存在するか、不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端に共有結合的に付着した１〜５個の連続したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分またはその組合せを含み、
ｚ”は存在しても、または不在であってもよいが、存在する場合は、（Ｎ’）ｙの５’末端に共有結合的に付着したキャッピング部分であり、
ｘおよびｙの各々は、独立して１８〜４０の間の整数であり、
（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に相補的であり、および（Ｎ）ｘは、以下に示す配列番号１により例示されるヒトｈｓｐ４７のｍＲＮＡコード配列に対するアンチセンス配列を含む。
【化１】
0005873168.tif 000002
【００１３】
標的遺伝子の発現を調節するための組成物、方法およびキットが、本明細書において提供される。様々な側面および態様において、本明細書において提供される組成物、方法およびキットは、ＳＥＲＰＩＮＨ１（配列番号１）としても知られる、熱ショックタンパク質４７（ｈｓｐ４７）の発現を調節する。本組成物、方法およびキットは、ｈｓｐ４７をコードするヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ配列など）、例えば配列番号１によって例示されるヒトｈｓｐ４７のためのｍＲＮＡコード配列を結合する核酸分子（例えば短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖（double-stranded）ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））の使用を伴い得る。特定の好ましい態様において、本明細書で開示される組成物、方法およびキットは、ｈｓｐ４７の発現を阻害する。例えば、ｈｓｐ４７の発現を低減するか、阻害するｓｉＮＡ分子（例えば、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）長ｄｓＮＡ分子またはダイサー長ｄｓＮＡ分子）が提供される。また、ｈｓｐ４７に関連する疾患、状態または障害、例えば肝線維症、肝硬変、肺線維症（間質性肺線維症（ＩＬＦ）を含む）を含む肺の線維症、任意の状態に起因する腎線維症（例えば末期腎不全（ＥＳＲＤ）を含む慢性腎臓病（ＣＫＤ））、腹膜線維症、慢性肝障害、原線維形成、他の臓器における線維性疾患、偶発的および医原性（手術）の全ての可能な種類の皮膚損傷に関連する異常な瘢痕化（ケロイド）、強皮症、心線維症、緑内障濾過手術の失敗、および腸管癒着症などを治療および／または予防するための組成物、方法およびキットも提供される。
【００１４】
一側面において医薬組成物が提供され、これは核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）を医薬製剤の成分として含み、該核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖とを含み、該核酸分子の各々の鎖は、独立して１５〜４９ヌクレオチドの長さであり、アンチセンス鎖の１５〜４９のヌクレオチド配列は、ヒトｈｓｐ４７をコードするｍＲＮＡの配列（例えば、配列番号１）に相補的であり、かつセンス鎖の１５〜４９のヌクレオチド配列はアンチセンス鎖の配列に相補的であり、ヒトｈｓｐ４７をコードするｍＲＮＡ（例えば、配列番号１）の１５〜４９のヌクレオチド配列を含む。
【００１５】
特定の態様において、ヒトｈｓｐ４７をコードするｍＲＮＡの配列に相補的であるアンチセンス鎖の配列は、配列番号１のヌクレオチド６００〜８００の間、または８０１〜８９９の間、または９００〜１０００の間、または１００１〜１３００の間、または配列番号１のヌクレオチド６５０〜７３０の間、または９００〜９７５の間の配列に相補的な配列を含む。一部の態様において、アンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド６７４〜６９３もしくはその部分、または配列番号１のヌクレオチド６９８〜７１６もしくはその部分、または配列番号１のヌクレオチド６９８〜７２２もしくはその部分、または配列番号１のヌクレオチド７０１〜７２０もしくはその部分、または配列番号１のヌクレオチド９２０〜９３９もしくはその部分、または配列番号１のヌクレオチド９６３〜９８２もしくはその部分、または配列番号１のヌクレオチド９４７〜９７２もしくはその部分、または配列番号１のヌクレオチド９４８〜９６６もしくはその部分、または配列番号１のヌクレオチド９４５〜９６９もしくはその部分、または配列番号１のヌクレオチド９４５〜９６３もしくはその部分に一致する、ヒトｈｓｐ４７をコードするｍＲＮＡの配列に相補的な配列を含む。
【００１６】
特定の態様において、本明細書に開示される医薬製剤の成分としての核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）のアンチセンス鎖は、配列番号４もしくはその部分、または配列番号６もしくはその部分、または配列番号８もしくはその部分、または配列番号１０もしくはその部分、または配列番号１２もしくはその部分、または配列番号１４もしくはその部分、または配列番号１６もしくはその部分、または配列番号１８もしくはその部分、または配列番号２０もしくはその部分、または配列番号２２もしくはその部分、または配列番号２４もしくはその部分、または配列番号２６もしくはその部分、または配列番号２８もしくはその部分、または配列番号３０もしくはその部分、または配列番号３２もしくはその部分、または配列番号３４もしくはその部分、または配列番号３６もしくはその部分、または配列番号３８もしくはその部分、または配列番号４０もしくはその部分、または配列番号４２もしくはその部分、または配列番号４４もしくはその部分、または配列番号４６もしくはその部分、または配列番号４８もしくはその部分、または配列番号５０もしくはその部分、または配列番号５２もしくはその部分、または配列番号５４もしくはその部分、または配列番号５６もしくはその部分、または配列番号５８もしくはその部分に一致する配列を含む。特定の態様において、本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）のセンス鎖は、配列番号３もしくはその部分、または配列番号５もしくはその部分、または配列番号７もしくはその部分、または配列番号９もしくはその部分、または配列番号１１もしくはその部分、または配列番号１３もしくはその部分、または配列番号１５もしくはその部分、または配列番号１７もしくはその部分、または配列番号１９もしくはその部分、または配列番号２１もしくはその部分、または配列番号２３もしくはその部分、または配列番号２５もしくはその部分、または配列番号２７もしくはその部分、または配列番号２９もしくはその部分、または配列番号３１もしくはその部分、または配列番号３３もしくはその部分、または配列番号３５もしくはその部分、または配列番号３７もしくはその部分、または配列番号３９もしくはその部分、または配列番号４１もしくはその部分、または配列番号４３もしくはその部分、または配列番号４５もしくはその部分、または配列番号４７もしくはその部分、または配列番号４９もしくはその部分、または配列番号５１もしくはその部分、または配列番号５３もしくはその部分、または配列番号５５もしくはその部分、または配列番号５７もしくはその部分に一致する配列を含む。
【００１７】
一部の好ましい態様において、本明細書に開示される医薬製剤の成分としての核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）のアンチセンス鎖は、表４に示すアンチセンス配列のいずれかに一致する配列を含む。一部の好ましい態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、表４に示す配列のペアから選択される。一部の態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１２、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１８、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿３０、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５８およびＳＥＲＰＩＮＨ１＿８８に記載の配列のペアから選択される。一部の態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４（配列番号１９５および２２０）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１２（配列番号１９６および２２１）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿３０（配列番号１９９および２２４）およびＳＥＲＰＩＮＨ１＿５８（配列番号２０８および２３３）に記載の配列のペアから選択される。
【００１８】
一部の態様において、本明細書に開示される医薬製剤の成分としての核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４に記載の配列のペア（配列番号１９５および２２０）を含む。本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）の一部の態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１２に記載の配列のペア（配列番号１９６および２２１）を含む。一部の態様において、本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿３０に記載の配列のペア（配列番号１９９および２２４）を含む。本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）の一部の態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５８に記載の配列のペア（配列番号２０８および２３３）を含む。
【００１９】
特定の態様において、本明細書に開示される医薬製剤の成分としての核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）のアンチセンス鎖は、表ＢまたはＣのいずれかに示すアンチセンス配列のいずれかに一致する配列を含む。
【００２０】
特定の好ましい態様において、本明細書に開示される医薬製剤の成分としての核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）のアンチセンス鎖は、表５に示すアンチセンス配列のいずれかに一致する配列を含む。特定の好ましい態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、表５に示す配列のペアから選択される。本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）の一部の態様は、
ＳＥＲＰＩＮＨ１＿２（配列番号６０および１２７）、
ＳＥＲＰＩＮＨ１＿６（配列番号６３および１３０）、
ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１１（配列番号６８および１３５）、
ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１３（配列番号６９および１３６）、
ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５（配列番号９７および１６４）、
ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａ（配列番号９８および１６５）、
ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１（配列番号１０１および１６８）、
ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５２（配列番号１０２および１６９）または
ＳＥＲＰＩＮＨ１＿８６（配列番号１２３および１９０）、
に記載の配列のペアから選択されるアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。
【００２１】
一部の好ましい態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、
ＳＥＲＰＩＮＨ１＿２（配列番号６０および１２７）、
ＳＥＲＰＩＮＨ１＿６（配列番号６３および１３０）、
ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａ（配列番号９８および１６５）および
ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１（配列番号１０１および１６８）、
に記載の配列のペアから選択される。
【００２２】
一部の好ましい態様において、本明細書に開示される医薬製剤の成分としての核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿２に記載の配列のペア（配列番号６０および１２７）から選択されるアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。一部の態様においてアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿６に記載の配列のペア（配列番号６３および１３０）を含む。一部の好ましい態様において、本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１１に記載の配列のペア（配列番号６８および１３５）のアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。一部の態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖はＳＥＲＰＩＮＨ１＿１３に記載の配列のペア（配列番号６９および１３６）である。一部の態様においてアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５に記載の配列のペア（配列番号９７および１６４）である。一部の態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａに記載の配列のペア（配列番号９８および１６５）である。一部の態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１に記載の配列のペア（配列番号１０１および１６８）である。
【００２３】
特定の態様において、本明細書に開示される医薬製剤の成分としての核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）のアンチセンス鎖は、表ＤまたはＥのいずれかに示すアンチセンス配列のいずれかに一致する配列を含む。
【００２４】
本明細書に開示される医薬製剤の成分としての核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）の種々の態様において、アンチセンス鎖は長さが１５〜４９ヌクレオチド（例えば長さが１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９ヌクレオチド）、または長さが１７〜３５ヌクレオチド、または長さが１７〜３０ヌクレオチド、または長さが１５〜２５ヌクレオチド、または長さが１８〜２５ヌクレオチド、または長さが１８〜２３ヌクレオチド、または長さが１９〜２１ヌクレオチド、または長さが２５〜３０ヌクレオチド、または長さが２６〜２８ヌクレオチドであってもよい。本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）の一部の態様において、アンチセンス鎖は長さが１９ヌクレオチドであってもよい。同様に、本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）のセンス鎖は、長さが１５〜４９ヌクレオチド（例えば長さが１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９ヌクレオチド）、または長さが１７〜３５ヌクレオチド、または長さが１７〜３０ヌクレオチド、または長さが１５〜２５ヌクレオチド、または長さが１８〜２５ヌクレオチド、または長さが１８〜２３ヌクレオチド、または長さが１９〜２１ヌクレオチド、または長さが２５〜３０ヌクレオチド、または長さが２６〜２８ヌクレオチドであってもよい。本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）の一部の態様において、センス鎖は長さが１９ヌクレオチドであってもよい。本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）の一部の態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、長さが１９ヌクレオチドであってもよい。本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）の二重鎖（duplex）領域は、長さが１５〜４９ヌクレオチド（例えば、長さが約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９ヌクレオチド）、長さが１５〜３５ヌクレオチド、または長さが１５〜３０ヌクレオチド、または長さが約１５〜２５ヌクレオチド、または長さが１７〜２５ヌクレオチド、または長さが１７〜２３ヌクレオチド、または長さが１７〜２１ヌクレオチド、または長さが２５〜３０ヌクレオチド、または長さが２５〜２８ヌクレオチドであってもよい。本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）の種々の態様において、二重鎖領域は長さが１９ヌクレオチドであってもよい。
【００２５】
特定の態様において、本明細書において提供される医薬製剤の成分としての核酸（例えばｓｉＮＡ核酸分子）のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、別々のポリヌクレオチド鎖である。一部の態様において、別々のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、水素結合、例えばワトソン−クリック型塩基対形成を介して、二本鎖構造を形成する。一部の態様において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、互いに共有結合的に連結された２つの別々の鎖である。他の態様において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、センス領域およびアンチセンス領域を有する単一のポリヌクレオチド鎖の一部であり、一部の好ましい態様において、ポリヌクレオチド鎖は、ヘアピン構造を有する。
【００２６】
特定の態様において、核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、オーバーハングに関して対称な二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）分子であり、両端に平滑末端を有する。他の態様において、核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、オーバーハングに関して対称なｄｓＮＡ分子であり、ｄｓＮＡ分子の両端にオーバーハングを有し、好ましくは、分子は、１、２、３、４、５、６、７または８ヌクレオチドのオーバーハングを有し、好ましくは、分子は２ヌクレオチドのオーバーハングを有する。一部の態様において、オーバーハングは５’オーバーハングであり、代替的な態様において、オーバーハングは３’オーバーハングである。特定の態様において、オーバーハングヌクレオチドは、本明細書に開示される修飾で修飾されている。一部の態様において、オーバーハングヌクレオチドは、２’−デオキシヌクレオチドである。
【００２７】
一部の好ましい態様において、医薬製剤の成分としての核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、オーバーハングに関して非対称なｄｓＮＡ分子であり、分子の一端に平滑末端を有し、分子の他端にオーバーハングを有する。特定の態様において、オーバーハングは１、２、３、４、５、６、７または８ヌクレオチドである、好ましくは、オーバーハングは２ヌクレオチドである。一部の好ましい態様において、非対称なｄｓＮＡ分子は、センス鎖に存在する二重鎖の一方の側に３’オーバーハング（例えば２ヌクレオチドの３’オーバーハング）を、分子の他方の側に平滑末端を有する。一部の好ましい態様において、非対称ｄｓＮＡ分子は、センス鎖に存在する二重鎖の一方の側に５’オーバーハング（例えば２ヌクレオチドの５’オーバーハング）を、分子の他方の側に平滑末端を有する。他の好ましい態様において、非対称ｄｓＮＡ分子は、アンチセンス鎖に存在する二重鎖の一方の側に３’オーバーハング（例えば２ヌクレオチドの３’オーバーハング）を、分子の他方の側に平滑末端を有する。一部の好ましい態様において、非対称ｄｓＮＡ分子は、アンチセンス鎖に存在する二重鎖の一方の側に５’オーバーハング（例えば２ヌクレオチドの５’オーバーハング）を、分子の他方の側に平滑末端を有する。一部の好ましい態様において、オーバーハングは２’−デオキシヌクレオチドである。
【００２８】
一部の態様において、医薬製剤の成分としての核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、一端がループ構造であり、他端が平滑末端であるヘアピン構造（１つのポリヌクレオチドにセンス鎖とアンチセンス鎖を有する）を有する。一部の態様において、核酸分子は、一端がループ構造であり、他端がオーバーハング末端である（例えば１、２、３、４、５、６、７または８ヌクレオチドのオーバーハング）ヘアピン構造を有し、特定の態様において、オーバーハングは３’オーバーハングであり、特定の態様において、オーバーハングは５’オーバーハングであり、特定の態様において、オーバーハングはセンス鎖にあり、特定の態様において、オーバーハングはアンチセンス鎖にある。
【００２９】
一部の好ましい態様において、核酸分子は、表３に示す核酸分子から選択される。
【００３０】
本明細書に開示される医薬製剤の成分としての核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、本明細書に記載の１または２以上の修飾または修飾ヌクレオチドを含んでもよい。例えば、本明細書において提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、修飾糖を有する修飾ヌクレオチド、修飾核酸塩基を有する修飾ヌクレオチド、または修飾リン酸基を有する修飾ヌクレオチドを含んでもよい。同様に、本明細書において提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、修飾ホスホジエステル骨格を含んでもよく、かつ／または、修飾末端リン酸基を含んでもよい。
【００３１】
医薬製剤の成分として提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、例えば本明細書に記載されているような、修飾糖部分を含む１個または２個以上のヌクレオチドを有してもよい。一部の好ましい態様において、修飾糖部分は、２’−ＯＭｅ、２’−メトキシエトキシ、２’−デオキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−（２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル）、４’−チオ、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−架橋、２’−ＬＮＡ（ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’酸素と４’炭素とを結合する追加の架橋で修飾されている）、および２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）からなる群から選択される。
【００３２】
医薬製剤の成分として提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、例えば本明細書に記載の１または２以上の修飾核酸塩基を有してもよく、これは好ましくは、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよびアシクロヌクレオチドからなる群から選択されるものであってもよい。
【００３３】
医薬製剤の成分として提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、ホスホジエステル骨格への１または２以上の修飾（例えば、本明細書に記載のもの）を有してもよい。一部の好ましい態様において、ホスホジエステル結合は、ホスホジエステル結合を、ホスホロチオエート、３’−（または−５’）デオキシ−３’−（または−５’）チオ−ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、３’−（または−５’）デオキシホスフィネート、ボラノホスフェート、３’−（または５’−）デオキシ−３’−（または５’−）アミノホスホルアミデート、水素ホスホネート、ボラノリン酸エステル、ホスホルアミデート、アルキルまたはアリールホスホネートおよびホスホトリエステルまたはリン結合で置換することにより修飾されている。
【００３４】
種々の態様において、医薬製剤の成分として提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、１または２以上の修飾をアンチセンス鎖ではなくセンス鎖に含んでもよい。一部の態様において、提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、１または２以上の修飾をセンス鎖ではなくアンチセンス鎖に含む。一部の態様において提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、１または２以上の修飾をセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方に含む。
【００３５】
医薬製剤の成分として提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）が修飾を有する一部の態様において、センス鎖は修飾ヌクレオチドと非修飾ヌクレオチドとが交互するパターンを含み、かつ／または、アンチセンス鎖は修飾ヌクレオチドと非修飾ヌクレオチドとが交互するパターンを含む。かかる態様の一部の好ましいバージョンにおいて、修飾は２’ＯＭｅ部分である。修飾ヌクレオチドと非修飾ヌクレオチドとが交互するパターンは、一方の鎖の５’末端または３’末端の修飾ヌクレオチドから始まってもよい。例えば、修飾ヌクレオチドと非修飾ヌクレオチドとが交互するパターンは、センス鎖の５’末端または３’末端の修飾ヌクレオチドから始まってもよく、かつ／または、修飾ヌクレオチドと非修飾ヌクレオチドとが交互するパターンは、アンチセンス鎖の５’末端または３’末端の修飾ヌクレオチドから始まってもよい。アンチセンス鎖およびセンス鎖の両方が修飾ヌクレオチドが交互するパターンを含む場合、修飾ヌクレオチドのパターンは、センス鎖の修飾ヌクレオチドがアンチセンス鎖の修飾ヌクレオチドに対向するように構成されてもよく、または、センス鎖の修飾ヌクレオチドがアンチセンス鎖の非修飾ヌクレオチドに対向するか、センス鎖の非修飾ヌクレオチドがアンチセンス鎖の修飾ヌクレオチドに対向するといったように、パターンに位相シフトがあってもよい。
【００３６】
本明細書において医薬製剤の成分として提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、センスおよび／またはアンチセンス鎖の３’末端に１〜３個（すなわち１、２または３個）のデオキシヌクレオチドを含んでもよい。
【００３７】
本明細書において医薬製剤の成分として提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、センスおよび／またはアンチセンス鎖の５’末端にリン酸基を含んでもよい。
【００３８】
一側面において、構造（Ａ１）：
（Ａ１）  ５’        （Ｎ）ｘ−Ｚ        ３’（アンチセンス鎖）
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ−ｚ”    ５’（センス鎖）
を有する二本鎖核酸分子が医薬製剤の成分として提供され、
式中、ＮおよびＮ’の各々は非修飾であっても、修飾されていてもよいヌクレオチドであるか、非定型部分（unconventional moiety）であり、
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの各々は、各々連続するＮまたはＮ’が次のＮまたはＮ’に共有結合的に連結されたオリゴヌクレオチドであり、
ＺおよびＺ’の各々は、独立して、存在するか、不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端に共有結合的に付着した１〜５個の連続するヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分またはその組合せを含み、
ｚ”は存在しても、または不在であってもよいが、存在する場合は、（Ｎ’）ｙの５’末端に共有結合的に付着したキャッピング部分であり、
ｘおよびｙの各々は、独立して１８〜４０の間の整数であり、
（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に相補的であり、（Ｎ）ｘは、配列番号１に対するアンチセンス配列を含む。
【００３９】
一部の態様において（Ｎ）ｘは、表４に存在するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。他の態様において、（Ｎ）ｘは、表ＢまたはＣに存在するアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される。
【００４０】
一部の態様において、各々連続するＮまたはＮ’を連結する共有結合は、ホスホジエステル結合である。
【００４１】
一部の態様において、ｘ＝ｙであり、ｘとｙの各々は１９、２０、２１、２２または２３である。種々の態様において、ｘ＝ｙ＝１９である。
【００４２】
本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）の一部の態様において、二本鎖核酸分子はｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡまたはｍｉＲＮＡである。
【００４３】
一部の態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、
ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４（配列番号１９５および２２０）、
ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１２（配列番号１９６および２２１）、
ＳＥＲＰＩＮＨ１＿３０（配列番号１９９および２２４）および
ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５８（配列番号２０８および２３３）、
に記載の配列のペアから選択される。
【００４４】
一部の態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖はＳＥＲＰＩＮＨ１＿４（配列番号１９５および２２０）に記載の配列のペアである。一部の態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖はＳＥＲＰＩＮＨ１＿１２（配列番号１９６および２２１）に記載の配列のペアである。一部の態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖はＳＥＲＰＩＮＨ１＿３０（配列番号１９９および２２４）に記載の配列のペアである。一部の態様においてアンチセンス鎖およびセンス鎖はＳＥＲＰＩＮＨ１＿５８（配列番号２０８および２３３）に記載の配列のペアである。
【００４５】
一部の態様において、医薬製剤の成分としての二本鎖核酸分子は、アンチセンス鎖の１位（５’末端）に、ＤＮＡ部分または標的に対するミスマッチを含む。かかる構造は本明細書に記載されている。提供される１つの態様は、下記の構造：
（Ａ２）  ５’  Ｎ１−（Ｎ）ｘ−Ｚ          ３’（アンチセンス鎖）
３’  Ｚ−Ｎ２−（Ｎ’）ｙ−ｚ”  ５’（センス鎖）
を有する修飾核酸分子であり、
式中、Ｎ２、ＮおよびＮ’の各々は、非修飾リボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドまたは非定型部分であり、
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの各々は、各々連続するＮまたはＮ’が隣接するＮまたはＮ’に共有結合によって連結したオリゴヌクレオチドであり、
ｘとｙの各々は、独立して１７〜３９の間の整数であり、
（Ｎ’）ｙの配列は（Ｎ）ｘの配列に相補性を有し、（Ｎ）ｘは、標的ＲＮＡの連続する配列に相補性を有し、
Ｎ１は（Ｎ）ｘに共有結合的に結合しており、標的ＲＮＡに対してミスマッチであるか、または、標的ＲＮＡに対する相補的ＤＮＡ部分であり、
Ｎ１は、天然または修飾ウリジン、デオキシリボウリジン、リボチミジン、デオキシリボチミジン、アデノシンまたはデオキシアデノシンからなる群から選択される部分であり、
ｚ”は存在しても、または不在であってもよいが、存在する場合はＮ２−（Ｎ’）ｙの５’末端に共有結合的に付着したキャッピング部分であり、および
ＺおよびＺ’の各々は、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端に共有結合的に付着した、１〜５個の連続するヌクレオチド、連続する非ヌクレオチド部分またはその組合せである。
【００４６】
一部の態様において、（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に完全に相補的である。種々の態様において、Ｎ２−（Ｎ’）ｙの配列は、Ｎ１−（Ｎ）ｘの配列に相補的である。一部の態様において、（Ｎ）ｘは、標的ＲＮＡにおける約１７〜約３９の連続するヌクレオチドに完全に相補的であるアンチセンスを含む。他の態様において、（Ｎ）ｘは、標的ＲＮＡにおける約１７〜約３９の連続するヌクレオチドに実質的に相補的なアンチセンスを含む。
【００４７】
一部の態様において、Ｎ１とＮ２とは、ワトソン−クリック塩基対を形成する。一部の態様において、Ｎ１とＮ２とは、非ワトソン−クリック塩基対を形成する。一部の態様において、塩基対はリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドとの間で形成される。
【００４８】
一部の態様において、ｘ＝ｙ＝１８、ｘ＝ｙ＝１９またはｘ＝ｙ＝２０である。好ましい態様において、ｘ＝ｙ＝１８である。Ｎ１−（Ｎ）ｘにおいてｘ＝１８である場合、Ｎ１は１位を指し、２〜１９位は（Ｎ）１８に含まれる。Ｎ２−（Ｎ’）ｙにおいてｙ＝１８である場合、Ｎ２は１９位を指し、１〜１８位は（Ｎ’）１８に含まれる。
【００４９】
一部の態様において、Ｎ１は（Ｎ）ｘと共有結合的に結合しており、かつ標的ＲＮＡとミスマッチである。種々の態様において、Ｎ１は（Ｎ）ｘと共有結合的に結合しており、かつ標的ＲＮＡに相補的なＤＮＡ部分である。
【００５０】
一部の態様において、アンチセンス鎖の１位のウリジンは、アデノシン、デオキシアデノシン、デオキシウリジン（ｄＵ）、リボチミジンまたはデオキシチミジンから選択されるＮ１で置換されている。種々の態様において、Ｎ１はアデノシン、デオキシアデノシンまたはデオキシウリジンから選択される。
【００５１】
一部の態様において、アンチセンス鎖の１位のグアノシンは、アデノシン、デオキシアデノシン、ウリジン、デオキシウリジン、リボチミジンまたはデオキシチミジンから選択されるＮ１で置換されている。種々の態様において、Ｎ１はアデノシン、デオキシアデノシン、ウリジンまたはデオキシウリジンから選択される。
【００５２】
一部の態様において、アンチセンス鎖の１位のシチジンは、アデノシン、デオキシアデノシン、ウリジン、デオキシウリジン、リボチミジンまたはデオキシチミジンから選択されるＮ１で置換されている。種々の態様において、Ｎ１はアデノシン、デオキシアデノシン、ウリジンまたはデオキシウリジンから選択される。
【００５３】
一部の態様において、アンチセンス鎖の１位のアデノシンは、デオキシアデノシン、デオキシウリジン、リボチミジンまたはデオキシチミジンから選択されるＮ１で置換されている。種々の態様において、Ｎ１はデオキシアデノシンまたはデオキシウリジンから選択される。
【００５４】
一部の態様において、Ｎ１とＮ２とは、ウリジンまたはデオキシウリジンと、アデノシンまたはデオキシアデノシンとの間で塩基対を形成する。他の態様において、Ｎ１とＮ２とは、デオキシウリジンとアデノシンとの間で塩基対を形成する。
【００５５】
一部の態様において、医薬製剤の成分としての二本鎖核酸分子は、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡまたはｍｉＲＮＡである。本明細書において提供される二本鎖核酸分子はまた、「二重鎖（duplex）」とも称する。
【００５６】
一部の態様において、（Ｎ）ｘは、表５に存在するアンチセンスオリゴヌクレオチド含む。一部の態様において、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ１−（Ｎ）ｘは、表４に存在するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。一部の態様において、ｘ＝ｙ＝１９またはｘ＝ｙ＝２０である。一部の好ましい態様において、ｘ＝ｙ＝１８である。一部の態様において、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ１−（Ｎ）ｘおよびＮ２−（Ｎ’）ｙの配列は、表４に記載のオリゴヌクレオチドのペアから選択される。一部の態様において、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ１−（Ｎ）ｘおよびＮ２−（Ｎ’）ｙの配列は、表ＤおよびＥに記載のオリゴヌクレオチドのペアから選択される。一部の態様においてアンチセンス鎖およびセンス鎖は、
ＳＥＲＰＩＮＨ１＿２（配列番号６０および１２７）、
ＳＥＲＰＩＮＨ１＿６（配列番号６３および１３０）、
ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１１（配列番号６８および１３５）、
ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１３（配列番号６９および１３６）、
ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５（配列番号９７および１６４）、
ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａ（配列番号９８および１６５）、
ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１（配列番号１０１および１６８）、
ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１ａ（配列番号１０５および１７２）、
ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５２（配列番号１０２および１６９）、および
ＳＥＲＰＩＮＨ１＿８６（配列番号２３および１９０）、
に記載の配列のペアから選択される。
【００５７】
一部の好ましい態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、
ＳＥＲＰＩＮＨ１＿２（配列番号６０および１２７）、
ＳＥＲＰＩＮＨ１＿６（配列番号６３および１３０）、
ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａ（配列番号９８および１６５）、
ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１（配列番号１０１および１６８）、および
ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１ａ（配列番号１０５および１７２）、
に記載の配列のペアから選択される。
【００５８】
一部の好ましい態様においてアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿２に記載の配列のペア（配列番号６０および１２７）から選択される。一部の態様においてアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿６に記載の配列のペア（配列番号６３および１３０）である。一部の態様においてアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１１に記載の配列のペア（配列番号６８および１３５）である。一部の態様においてアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１３に記載の配列のペア（配列番号６９および１３６）である。一部の態様においてアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５に記載の配列のペア（配列番号９７および１６４）である。一部の態様においてアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａに記載の配列のペア（配列番号９８および１６５）である。一部の態様においてアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１に記載の配列のペア（配列番号１０１および１６８）である。一部の態様においてアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１ａに記載の配列のペア（配列番号１０５および１７２）である。一部の態様においてアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５２に記載の配列のペア（配列番号１０２および１６９）である。一部の態様においてアンチセンス鎖およびセンス鎖はＳＥＲＰＩＮＨ１＿８６に記載の配列のペア（配列番号２３および１９０）である。一部の好ましい態様においてアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿２（配列番号６０および１２７）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿６（配列番号６３および１３０）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａ（配列番号９８および１６５）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１（配列番号１０１および１６８）およびＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１ａ（配列番号１０５および１７２）に記載の配列のペアから選択される。
【００５９】
一部の態様において、Ｎ１とＮ２とは、ワトソン−クリック塩基対を形成する。他の態様において、Ｎ１とＮ２とは、非ワトソン−クリック塩基対を形成する。一部の態様において、Ｎ１は修飾リボアデノシンまたは修飾リボウリジンである。
【００６０】
一部の態様において、Ｎ１とＮ２とは、ワトソン−クリック塩基対を形成する。他の態様において、Ｎ１とＮ２とは、非ワトソン−クリック塩基対を形成する。特定の態様において、Ｎ１は、リボアデノシン、修飾リボアデノシン、デオキシリボアデノシン、修飾デオキシリボアデノシンからなる群から選択される。他の態様において、Ｎ１は、リボウリジン、デオキシリボウリジン、修飾リボウリジンおよび修飾デオキシリボウリジンからなる群から選択される。
【００６１】
特定の態様において、アンチセンス鎖の１位（５’末端）は、デオキシリボウリジン（ｄＵ）またはアデノシンを含む。一部の態様において、Ｎ１は、リボアデノシン、修飾リボアデノシン、デオキシリボアデノシン、修飾デオキシリボアデノシンからなる群から選択され、Ｎ２は、リボウリジン、デオキシリボウリジン、修飾リボウリジンおよび修飾デオキシリボウリジンからなる群から選択される。特定の態様において、Ｎ１は、リボアデノシンおよび修飾リボアデノシンからなる群から選択され、Ｎ２は、リボウリジンおよび修飾リボウリジンからなる群から選択される。
【００６２】
特定の態様において、Ｎ１はリボウリジン、デオキシリボウリジン、修飾リボウリジンおよび修飾デオキシリボウリジンからなる群から選択され、Ｎ２はリボアデノシン、修飾リボアデノシン、デオキシリボアデノシン、および修飾デオキシリボアデノシンからなる群から選択される。特定の態様において、Ｎ１はリボウリジンおよびデオキシリボウリジンからなる群から選択され、Ｎ２はリボアデノシンおよび修飾リボアデノシンからなる群から選択される。特定の態様において、Ｎ１はリボウリジンであり、Ｎ２はリボアデノシンである。特定の態様において、Ｎ１はデオキシリボウリジンであり、Ｎ２はリボアデノシンである。
【００６３】
構造（Ａ２）の一部の態様において、Ｎ１は２’ＯＭｅ修飾リボウラシルまたは２’ＯＭｅ修飾リボアデノシンを含む。構造（Ａ２）の特定の態様において、Ｎ２は２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む。
【００６４】
構造（Ａ２）の一部の態様において、Ｎ１は２’ＯＭｅ修飾リボウラシルまたは２’ＯＭｅ修飾リボシトシンを含む。構造（Ａ２）の特定の態様において、Ｎ２は２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。
【００６５】
一部の態様において、ＮおよびＮ’の各々は、非修飾ヌクレオチドである。一部の態様において、ＮまたはＮ’の少なくとも１つは、化学的に修飾されたヌクレオチドまたは非定型部分を含む。一部の態様において、非定型部分は、ミラー（mirror）ヌクレオチド、無塩基（abasic）リボース部分および無塩基デオキシリボース部分から選択される。一部の態様において、非定型部分は、ミラーヌクレオチド、好ましくはＬ−ＤＮＡ部分である。一部の態様において、ＮまたはＮ’の少なくとも１つは、２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。
【００６６】
一部の態様において、（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に完全に相補的である。他の態様において（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に実質的に相補的である。
【００６７】
一部の態様において、（Ｎ）ｘは、標的ｍＲＮＡの約１７〜約３９の連続するヌクレオチドに完全に相補的なアンチセンス配列を含む。他の態様において、（Ｎ）ｘは、標的ｍＲＮＡの約１７〜約３９の連続するヌクレオチドに実質的に相補的なアンチセンス配列を含む。
【００６８】
構造Ａ１および構造Ａ２の一部の態様において、化合物は平滑末端を有し、例えば、ＺおよびＺ’の両方が不在である。代替的な態様において、ＺまたはＺ’の少なくとも１つは存在する。ＺおよびＺ’は、独立して、１または２以上の共有結合的に連結した修飾および／または非修飾ヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む）、または非定型部分、例えば逆位（inverted）無塩基デオキシリボース部分または無塩基リボース部分、非ヌクレオチドＣ３、Ｃ４またはＣ５部分、アミノ−６部分、ミラーヌクレオチドなどを含む。一部の態様において、ＺおよびＺ’の各々は、独立して、Ｃ３部分またはアミノ−Ｃ６部分を含む。一部の態様において、Ｚ’は不在であり、Ｚは存在し、非ヌクレオチドＣ３部分を含む。一部の態様において、Ｚは不在であり、Ｚ’存在し、非ヌクレオチドＣ３部分を含む。
【００６９】
構造Ａ１および構造Ａ２の一部の態様において、各々のＮは非修飾リボヌクレオチドからなる。構造Ａ１および構造Ａ２の一部の態様において、各々のＮ’は非修飾ヌクレオチドからなる。好ましい態様において、ＮおよびＮ’の少なくとも１つは、修飾リボヌクレオチドまたは非定型部分である。
【００７０】
他の態様において、構造Ａ１または構造Ａ２の化合物は、糖残基が修飾された少なくとも１つのリボヌクレオチドを含む。一部の態様において、化合物は糖残基の２’位に修飾を含む。一部の態様において、２’位における修飾は、アミノ、フルオロ、アルコキシまたはアルキル部分の存在を含む。特定の態様において、２’修飾はアルコキシ部分を含む。好ましい態様において、アルコキシ部分はメトキシ部分（２’ＯＭｅ）である。一部の態様において、核酸化合物は、アンチセンス鎖およびセンス鎖の一方または両方に、２’ＯＭｅ修飾の交互するリボヌクレオチドを含む。他の態様において、化合物は２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドをアンチセンス鎖、（Ｎ）ｘまたはＮ１−（Ｎ）ｘのみに含む。特定の態様において、アンチセンス鎖の中央のリボヌクレオチド、例えば、１９ｍｅｒ鎖の１０位のリボヌクレオチドは、非修飾である。種々の態様において、核酸化合物は、少なくとも５個の交互する２’ＯＭｅ修飾および非修飾リボヌクレオチドを含む。さらなる態様において、構造Ａ１または構造Ａ２の化合物は、交互する位置に修飾リボヌクレオチドを含み、ここで、（Ｎ）ｘまたはＮ１−（Ｎ）ｘの５’および３’末端の各々のリボヌクレオチドは、その糖残基が修飾されており、（Ｎ’）ｙまたはＮ２−（Ｎ）ｙの５’および３’末端の各々のリボヌクレオチドは、その糖残基が非修飾である。
【００７１】
一部の態様において、医薬製剤の成分としての二本鎖分子は、以下の修飾の１または２以上を含む：
・アンチセンス鎖の５、６、７、８または９位の少なくとも１つのＮが、２’−５’−ヌクレオチドまたはミラーヌクレオチドから選択される、
・センス鎖の９または１０位の少なくとも１つのＮ’が、２’−５’−ヌクレオチドおよびシュードウリジンから選択される、および
・（Ｎ’）ｙの３’末端位の４、５または６個の連続する位置のＮ’が、２’−５’−ヌクレオチドを含む。
【００７２】
一部の態様において、二本鎖分子は、以下の修飾の組合せを含む：
・アンチセンス鎖は、５、６、７、８または９位の少なくとも１つに、２’−５’−ヌクレオチドまたはミラーヌクレオチドを含む、および
・センス鎖は、９または１０位に、２’−５’−ヌクレオチドおよびシュードウリジンの少なくとも１つを含む。
【００７３】
一部の態様において、二本鎖分子は、以下の修飾の組合せを含む：
＊アンチセンス鎖は、５、６、７、８または９位の少なくとも１つに、２’−５’−ヌクレオチドまたはミラーヌクレオチドを含む、および
＊センス鎖は、３’の最後から２番目または３’末端位に、４、５または６個の連続する２’−５’−ヌクレオチドを含む。
【００７４】
一部の態様において、センス鎖（（Ｎ）ｘまたはＮ１−（Ｎ）ｘ）は、１、２、３、４、５、６、７、８または９個の２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。一部の態様において、アンチセンス鎖は、２、４、６、８、１１、１３、１５、１７および１９位に、２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。他の態様において、アンチセンス鎖は、１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９位に、２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。他の態様において、アンチセンス鎖は、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９位に、２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。一部の態様において、アンチセンス鎖は１または２以上の２’ＯＭｅ修飾ピリミジンを含む。一部の態様において、アンチセンス鎖の全てのピリミジンヌクレオチドは、２’ＯＭｅ修飾を有する。一部の態様において、センス鎖は２’ＯＭｅ修飾ピリミジンを含む。
【００７５】
構造Ａ１および構造Ａ２の一部の態様において、センス鎖もアンチセンス鎖も、３’および５’末端がリン酸化されていない。他の態様において、センス鎖またはアンチセンス鎖の一方または両方は、３’末端がリン酸化されている。
【００７６】
構造Ａ１および構造Ａ２の一部の態様において、（Ｎ）ｙは、ミラーヌクレオチド、２’−５’−ヌクレオチドおよびＴＮＡから選択される少なくとも１個の非定型部分を含む。一部の態様において、非定型部分はミラーヌクレオチドである。種々の態様において、ミラーヌクレオチドは、Ｌ−リボヌクレオチド（Ｌ−ＲＮＡ）およびＬ−デオキシリボヌクレオチド（Ｌ−ＤＮＡ）から選択される。好ましい態様において、ミラーヌクレオチドはＬ−ＤＮＡである。特定の態様において、センス鎖は、非定型部分を９または１０位（５’末端から）に含む。好ましい態様において、センス鎖は、非定型部分を９位（５’末端から）に含む。一部の態様において、センス鎖は長さが１９ヌクレオチドであり、４、５または６個の連続する非定型部分を１５位（５’末端から）に含む。一部の態様において、センス鎖は４個の連続する２’−５’−リボヌクレオチドを、１５、１６、１７および１８位に含む。一部の態様において、センス鎖は５個の連続する２’−５’−リボヌクレオチドを、１５、１６、１７、１８および１９位に含む。種々の態様において、センス鎖はＺ’をさらに含む。一部の態様において、Ｚ’は、Ｃ３ＯＨ部分またはＣ３Ｐｉ部分を含む。
【００７７】
構造Ａ１の一部の態様において、（Ｎ’）ｙは、少なくとも１個のＬ−ＤＮＡ部分を含む。一部の態様において、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは、１〜１７および１９位における非修飾リボヌクレオチドと、３’の最後から２番目の位置の１個のＬ−ＤＮＡ（１８位）とからなる。他の態様において、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは、１〜１６および１９位の非修飾リボヌクレオチドと、３’の最後から２番目の位置の２個の連続するＬ−ＤＮＡ（１７および１８位）とからなる。種々の態様において、非定型部分は、隣接するヌクレオチドに２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合で連結したヌクレオチドである。種々の態様によれば、（Ｎ’）ｙは、２’−５’ヌクレオチド間結合で連結された２、３、４、５または６個の連続するリボヌクレオチドを３’末端に含む。一態様において、（Ｎ’）ｙの３’末端の４個の連続するヌクレオチドは、３個の２’−５’ホスホジエステル結合で連結しており、ここで、２’−５’ホスホジエステル結合を形成する２’−５’ヌクレオチドの１個または２個以上は、３’−Ｏ−メチル（３’ＯＭｅ）糖修飾をさらに含む。好ましくは、（Ｎ’）ｙの３’末端ヌクレオチドは、２’ＯＭｅ修飾を含む。特定の態様において、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは１５、１６、１７、１８および１９位に２個または３個以上の連続するヌクレオチドを含み、これは、隣接するヌクレオチドに２’−５’ヌクレオチド間結合で連結したヌクレオチド（２’−５’ヌクレオチド）を含む。種々の態様において、２’−５’ヌクレオチド間結合を形成するヌクレオチドは、３’デオキシリボースヌクレオチドまたは３’メトキシヌクレオチド（３’ＯＨの代わりに、３’Ｈまたは３’ＯＭｅ）を含む。一部の態様において、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは、２’−５’ヌクレオチドを、１５、１６および１７位に、隣接するヌクレオチドが１５〜１６、１６〜１７および１７〜１８位の間で２’−５’ヌクレオチド間結合により連結するように含むか、１５、１６、１７、１８および１９位に、隣接するヌクレオチドが１５〜１６、１６〜１７、１７〜１８および１８〜１９位の間で２’−５’ヌクレオチド間結合により連結し、かつ、３’ＯＨが３’末端ヌクレオチドにおいて利用可能となるように含むか、１６、１７および１８位に、隣接するヌクレオチドが１６〜１７、１７〜１８および１８〜１９位の間で２’−５’ヌクレオチド間結合により連結するように含む。一部の態様において、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは、２’−５’−ヌクレオチドを、１６および１７位または１７および１８位または１５および１７位に、隣接するヌクレオチドが１６〜１７および１７〜１８の間または１７〜１８および１８〜１９の間または１５〜１６および１７〜１８の間でそれぞれ２’−５’ヌクレオチド間結合により連結するように含む。他の態様において、（Ｎ’）ｙ中のピリミジンリボヌクレオチド（ｒＵ、ｒＣ）は、隣接するヌクレオチドに２’−５’ヌクレオチド間結合で連結するヌクレオチドに置換されている。一部の態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１２、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１８、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿３０、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５８またはＳＥＲＰＩＮＨ１＿８８に記載の配列ペアから選択され、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは、３’末端に４個の２’−５’結合、特に、１５〜１６、１６〜１７、１７〜１８および１８〜１９位のヌクレオチドの間の結合で連結した５個の連続するヌクレオチドを含む。
【００７８】
一部の態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１２、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１８、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿３０、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５８またはＳＥＲＰＩＮＨ１＿８８に記載の配列ペアから選択され、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは、３’末端に４個の２’−５’結合で連結した５個の連続するヌクレオチドを含み、任意に、独立して、逆位無塩基部分およびＣ３アルキル［Ｃ３：１，３−プロパンジオールモノ（リン酸二水素）］キャップから選択されるＺ’およびｚ’をさらに含む。Ｃ３アルキルキャップは、３’または５’末端ヌクレオチドに共有結合的に連結している。一部の態様において、３’Ｃ３末端キャップは、３’ホスフェートをさらに含む。一部の態様において、３’Ｃ３末端キャップは、３’末端ヒドロキシ基をさらに含む。
【００７９】
一部の態様において、医薬製剤の成分としてのアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１２、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１８、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿３０、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５８またはＳＥＲＰＩＮＨ１＿８８に記載の配列ペアから選択され、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは、Ｌ−ＤＮＡを１８位に含み、（Ｎ’）ｙは、任意に、独立して、逆位無塩基部分およびＣ３アルキル（Ｃ３、１，３−プロパンジオールモノ（リン酸二水素））キャップから選択されるＺ’およびｚ’をさらに含む。
【００８０】
一部の態様において、（Ｎ’）ｙは、３’末端ホスフェートを含む。一部の態様において、（Ｎ’）ｙは、３’末端ヒドロキシルを含む。
【００８１】
一部の態様において、医薬製剤の成分としてのアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１２、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１８、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿３０、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５８またはＳＥＲＰＩＮＨ１＿８８に記載の配列ペアから選択され、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ）ｘは、１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９位または２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９位に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。一部の態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１２、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１８、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿３０、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５８またはＳＥＲＰＩＮＨ１＿８８に記載の配列ペアから選択され、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ）ｘは、２’ＯＭｅ修飾ピリミジンを含む。一部の態様において、（Ｎ）ｘにおける全てのピリミジンは、２’ＯＭｅ修飾を含む。
【００８２】
一部の態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿２、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿６、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１１、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１３、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１、ＳＥＲＰＩＮ５１ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５２またはＳＥＲＰＩＮＨ１＿８６に記載の配列のペアから選択され、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ２はリボアデノシン部分である。
【００８３】
一部の態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿２、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿６、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１１、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１３、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１、ＳＥＲＰＩＮ５１ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５２またはＳＥＲＰＩＮＨ１＿８６に記載の配列のペアから選択され、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ２−（Ｎ’）ｙは、３’末端に４個の２’−５’結合、特に、１５〜１６、１６〜１７、１７〜１８および１８〜１９位のヌクレオチドの間の結合で連結した５個の連続するヌクレオチドを含む。一部の態様において、結合はホスホジエステル結合を含む。
【００８４】
一部の態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿２、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿６、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１１、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１３、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１、ＳＥＲＰＩＮ５１ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５２またはＳＥＲＰＩＮＨ１＿８６に記載の配列のペアから選択され、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ２−（Ｎ’）ｙは、３’末端に４個の２’−５’結合で連結した５個の連続するヌクレオチドを含み、任意に、独立して、逆位無塩基部分およびＣ３アルキル［Ｃ３：１，３−プロパンジオールモノ（リン酸二水素）］キャップから選択されるＺ’およびｚ’をさらに含む。
【００８５】
一部の態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿２、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿６、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１１、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１３、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１、ＳＥＲＰＩＮ５１ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５２またはＳＥＲＰＩＮＨ１＿８６に記載の配列のペアから選択され、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ２−（Ｎ’）ｙは、Ｌ−ＤＮＡを１８位に含み、（Ｎ’）ｙは、任意に、独立して、逆位無塩基部分およびＣ３アルキル［Ｃ３：１，３−プロパンジオールモノ（リン酸二水素）］キャップから選択されるＺ’およびｚ’をさらに含む。
【００８６】
一部の態様において、Ｎ２−（Ｎ’）ｙは、３’末端ホスフェートを含む。一部の態様において、Ｎ２−（Ｎ’）ｙは、３’末端ヒドロキシルを含む。
【００８７】
一部の態様において、医薬製剤の成分としてのアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿２、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿６、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１１、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１３、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１、ＳＥＲＰＩＮ１＿５１ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５２またはＳＥＲＰＩＮＨ１＿８６に記載の配列のペアから選択され、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ１−（Ｎ）ｘは、１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９位、または１、３、５、９、１１、１３、１５、１７、１９位、または３、５、９、１１、１３、１５、１７位、または２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９位に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。一部の態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿２、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿６、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１１、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１３、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５２またはＳＥＲＰＩＮＨ１＿８６に記載の配列のペアから選択され、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ１−（Ｎ）ｘは、１１、１３、１５、１７および１９位に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。一部の態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿２、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿６、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１１、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１３、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１、ＳＥＲＰＩＮ１＿５１ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５２またはＳＥＲＰＩＮＨ１＿８６に記載の配列のペアから選択され、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ１−（Ｎ）ｘは、１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９位、または、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９位に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。一部の態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿２、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿６、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１１、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１３、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５２またはＳＥＲＰＩＮＨ１＿８６に記載の配列のペアから選択され、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ１−（Ｎ）ｘは、２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９位に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。
【００８８】
一部の態様において、医薬製剤の成分としてのアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿２、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿６、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１１、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１３、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１、ＳＥＲＰＩＮ１＿５１ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５２またはＳＥＲＰＩＮＨ１＿８６に記載の配列ペアから選択され、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ１−（Ｎ）ｘは、２’ＯＭｅ修飾ピリミジンを含む。一部の態様において、（Ｎ）ｘにおける全てのピリミジンは、２’ＯＭｅ修飾を含む。一部の態様において、アンチセンス鎖はＬ−ＤＮＡまたは２’−５’ヌクレオチドを、５、６または７位にさらに含む。他の態様において、アンチセンス鎖は、５〜６または６〜７位のリボヌクレオチドの間に２’−５’ヌクレオチド間結合を生成するリボヌクレオチドをさらに含む。
【００８９】
さらなる態様において、Ｎ１−（Ｎ）ｘはＺをさらに含み、ここでＺは非ヌクレオチドオーバーハングを含む。一部の態様において、非ヌクレオチドオーバーハングは、Ｃ３−Ｃ３［１，３−プロパンジオールモノ（リン二水素酸）］２である。
【００９０】
構造Ａ２の一部の態様において、（Ｎ）ｙは、少なくとも１個のＬ−ＤＮＡ部分を含む。一部の態様において、ｘ＝ｙ＝１８であり、（Ｎ’）ｙは、１〜１６および１８位の非修飾リボヌクレオチドと、３’の最後から２番目の位置（１７位）の１個のＬ−ＤＮＡとからなる。他の態様において、ｘ＝ｙ＝１８であり、（Ｎ’）ｙは、１〜１５および１８位の非修飾リボヌクレオチドと、３’の最後から２番目の位置の２個の連続するＬ−ＤＮＡ（１６および１７位）とからなる。種々の態様において、非定型部分は、隣接するヌクレオチドに２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合で連結しているヌクレオチドである。種々の態様によると、（Ｎ’）ｙは、３’末端における２’−５’ヌクレオチド間結合で連結された２、３、４、５または６個の連続するリボヌクレオチドを含む。一態様において、（Ｎ’）ｙの３’末端の４個の連続するヌクレオチドは、３個の２’−５’ホスホジエステル結合で連結しており、ここで、２’−５’ホスホジエステル結合を形成する２’−５’ヌクレオチドの１個または２個以上は、３’−Ｏ−メチル（３’ＯＭｅ）糖修飾をさらに含む。好ましくは、（Ｎ’）ｙの３’末端ヌクレオチドは、２’ＯＭｅ修飾を含む。特定の態様において、ｘ＝ｙ＝１８であり、（Ｎ’）ｙにおいて、１４、１５、１６、１７および１８位における２個または３個以上の連続するヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドに２’−５’ヌクレオチド間結合で連結したヌクレオチドを含む。種々の態様において、２’−５’ヌクレオチド間結合を形成するヌクレオチドは、３’デオキシリボースヌクレオチドまたは３’メトキシヌクレオチドを含む。一部の態様において、ｘ＝ｙ＝１８であり、（Ｎ’）ｙは、１４〜１５、１５〜１６、１６〜１７および１７〜１８位の間、または、１５〜１６、１６〜１７および１７〜１８位の間、または１６〜１７および１７〜１８位の間、または１７〜１８位の間、または１５〜１６位および１７〜１８位の間の２’−５’ヌクレオチド間結合により隣接するヌクレオチドに連結したヌクレオチドを含む。一部の態様において、ｘ＝ｙ＝１８であり、（Ｎ’）ｙは、１５〜１６、１６〜１７および１７〜１８位の間、または、１６〜１７および１７〜１８位の間の２’−５’ヌクレオチド間結合により隣接するヌクレオチドに連結したヌクレオチドを含む。他の態様において、（Ｎ’）ｙ中のピリミジンリボヌクレオチド（ｒＵ、ｒＣ）は、隣接するヌクレオチドに２’−５’ヌクレオチド間結合で連結するヌクレオチドに置換されている。
【００９１】
一部の態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、表５に記載され、本明細書中でＳＥＲＰＩＮＨ１＿２（配列番号６０および１２７）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿６（配列番号６３および１３０）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａ（配列番号９８および１６５）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１（配列番号１０１および１６８）およびＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１ａ（配列番号１０５および１７２）として同定されるオリゴヌクレオチドペアから選択される。
【００９２】
一部の態様において、医薬製剤の成分としての二本鎖核酸分子は、配列番号１２７に記載のアンチセンス鎖と、配列番号６０に記載のセンス鎖とを含み、本明細書においてＳＥＲＰＩＮＨ１＿２として同定される。一部の態様において、二本鎖核酸分子は、構造
【化２】
0005873168.tif 000003
を有し、ここで、各々の
【化３】
0005873168.tif 000004
は、リボヌクレオチド間の塩基対合を表し、
Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕの各々は、独立して、非修飾もしくは修飾リボヌクレオチド、または非定型部分であり、
ＺおよびＺ’の各々は、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端に共有結合的に付着した、１〜５個の連続するヌクレオチド、または非ヌクレオチド部分またはその組合せであり、
ｚ”は存在しても、または不在であってもよいが、存在する場合はＮ２−（Ｎ’）ｙの５’末端に共有結合的に付着したキャッピング部分である。
【００９３】
一部の態様において提供されるのは、アンチセンス鎖（配列番号１２７）が、１個または２個以上の２’ＯＭｅ修飾ピリミジンおよび／またはプリン、５、６、７または８位における２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドオーバーハングを含む、二本鎖核酸分子である。一部の態様において、センス鎖（配列番号６０）は、３’末端または３’の最後から２番目の位置における４個または５個の連続する２’−５’−ヌクレオチド、３’末端に共有結合により付着したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合により付着したキャップ部分を含む。他の態様において、センス鎖（配列番号６０）は、１個または２個以上の２’ＯＭｅピリミジン、３’末端に共有結合により付着したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合により付着したキャップ部分を含む。
【００９４】
一部の態様において提供されるのは、アンチセンス鎖（配列番号１２７）が、１、３、５、９、１１、１５、１７および１９位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含み、センス鎖（配列番号６０）が、
・１５、１６、１７、１８および１９位における２’−５’−リボヌクレオチド、Ｃ３ＯＨ  ３’末端非ヌクレオチドオーバーハング、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分、または、
・１５、１６、１７、１８および１９位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端ホスフェート、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分、または、
・５、７、１３および１６位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、１８位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分、または、
・７、１３、１６および１８位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、９位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分、または、
・１５、１６、１７、１８および１９位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−Ｐｉ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分、
を含むセンス鎖から選択される、二本鎖核酸分子である。
【００９５】
本明細書において提供されるのは、アンチセンス鎖（配列番号１２７）が、１、３、５、９、１１、１５、１７および１９位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含み、センス鎖（配列番号６０）が、１５、１６、１７、１８および１９位における２’−５’−リボヌクレオチド、Ｃ３  ３’末端オーバーハング、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【００９６】
本明細書において提供されるのは、アンチセンス鎖（配列番号１２７）が、１、３、５、９、１１、１５、１７および１９位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ  ３’末端オーバーハングを含み、センス鎖（配列番号６０）が、１５、１６、１７、１８および１９位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端ホスフェート、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【００９７】
本明細書において提供されるのは、アンチセンス鎖（配列番号１２７）が、１、３、５、９、１１、１５、１７および１９位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含み、センス鎖（配列番号６０）が、５、７、１３および１６位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、１８位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【００９８】
本明細書において提供されるのは、アンチセンス鎖（配列番号１２７）が、１、３、５、９、１１、１５、１７および１９位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含み、センス鎖（配列番号６０）が、７、１３、１６および１８位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、９位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【００９９】
本明細書において提供されるのは、アンチセンス鎖（配列番号１２７）が、１、３、５、９、１１、１５、１７および１９位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含み、センス鎖（配列番号６０）が、１５、１６、１７、１８および１９位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−Ｐｉ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１００】
一部の態様において、本明細書において提供されるのは、アンチセンス鎖（配列番号１２７）が、１、３、５、９、１１、１３、１５、１７、１９位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、およびＣ３-Ｃ３  ３’末端オーバーハングを含み、センス鎖（配列番号６０）が、７、９、１３、１６および１８位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１０１】
一部の態様において、本明細書において提供されるのは、センス鎖（配列番号６０）が、１５、１６、１７、１８および１９位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端ホスフェート、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号１２７）が、
・１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、および、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分、または
・１、３、６、８、１０、１２、１４、１７、１８位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、および、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分、
の１つから選択されるアンチセンス鎖を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１０２】
一部の態様において、本明細書において提供されるのは、配列番号１３０に記載のアンチセンス鎖と、配列番号６３に記載のセンス鎖とを含み、本明細書においてＳＥＲＰＩＮＨ１＿６として同定される、医薬製剤の成分としての二本鎖核酸分子である。一部の態様において二重鎖は、構造：
【化４】
0005873168.tif 000005
を有し、ここで、各々の
【化５】
0005873168.tif 000006
は、リボヌクレオチド間の塩基対合を表し、
Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕの各々は、独立して、非修飾もしくは修飾リボヌクレオチド、または非定型部分であり、
ＺおよびＺ’の各々は、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端に共有結合的に付着した、１〜５個の連続するヌクレオチド、または非ヌクレオチド部分またはその組合せであり、
ｚ”は存在しても、または不在であってもよいが、存在する場合はＮ２−（Ｎ’）ｙの５’末端に共有結合的に付着したキャッピング部分である。
【０１０３】
一部の態様において本明細書に提供されるのは、センス鎖（配列番号６３）が、１個または２個以上の２’ＯＭｅ修飾ピリミジン、３’末端ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドオーバーハング、および５’末端に共有結合的に付着したキャップ部分を含む、二本鎖核酸分子である。一部の態様において、アンチセンス鎖（配列番号１３０）は、１個または２個以上の２’ＯＭｅ修飾ピリミジン、３’末端に共有結合的に付着したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着したキャップ部分を含む。
【０１０４】
一部の態様において本明細書に提供されるのは、センス鎖（配列番号６３）が、２、１４および１８位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨまたはＣ３Ｐｉ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号１３０）が、
・１、３、５、９、１１、１３、１５および１７位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分、または、
・１、３、５、７、９、１２、１３および１７位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分、または、
・３、５、９、１１、１３、１５および１７位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分、または、
・３、５、９、１１、１３、１５および１７位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、１位におけるｄＵ、７位における２’−５’−リボヌクレオチドおよび３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分、
を含むアンチセンス鎖から選択される、二本鎖核酸分子である。
【０１０５】
一部の態様において本明細書に提供されるのは、センス鎖（配列番号６３）が、２、１４および１８位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号１３０）が、１、３、５、９、１１、１３、１５および１７位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１０６】
一部の態様において本明細書に提供されるのは、センス鎖（配列番号６３）が、１４および１８位および任意に２位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号１３０）が、１、３、５、７、９、１２、１３および１７位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む、二重鎖オリゴヌクレオチド分子である。
【０１０７】
一部の態様において本明細書に提供されるのは、センス鎖（配列番号６３）が、１４および１８位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号１３０）が、
・１、３、５、９、１１、１３、１５および１７位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＰｉまたはＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分、または、
・１、３、５、７、９、１２、１３および１７位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＰｉまたはＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分、
を含むアンチセンス鎖から選択される、二重鎖オリゴヌクレオチド分子である。
【０１０８】
本明細書において提供されるのは、センス鎖（配列番号６３）が、１４および１８位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号１３０）が、１、３、５、７、９、１２、１３および１７位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１０９】
本明細書において提供されるのは、センス鎖（配列番号６３）が、１４および１８位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号１３０）が、１、３、５、９、１１、１３、１５および１７位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、およびＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ  ３’末端オーバーハングを含む、二本鎖核酸分子である。
【０１１０】
一部の態様において、二重鎖は、配列番号１６５に記載のアンチセンス鎖と、配列番号９８に記載のセンス鎖とを含み、本明細書においてＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａとして同定される。一部の態様において二重鎖は、構造：
【化６】
0005873168.tif 000007
を有し、ここで、各々の
【化７】
0005873168.tif 000008
は、リボヌクレオチド間の塩基対合を表し、
Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕの各々は、独立して、非修飾もしくは修飾リボヌクレオチド、または非定型部分であり、
ＺおよびＺ’の各々は、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端に共有結合的に付着した、１〜５個の連続するヌクレオチド、または非ヌクレオチド部分またはその組合せであり、
ｚ”は存在しても、または不在であってもよいが、存在する場合はＮ２−（Ｎ’）ｙの５’末端に共有結合的に付着したキャッピング部分である。
【０１１１】
一部の態様において，センス鎖（配列番号９８）は、１５、１６、１７および１８位、または１５、１６、１７、１８および１９位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分、および、５’末端に共有結合的に付着したキャップ部分を含む。一部の態様において、アンチセンス鎖（配列番号１６５）は、２’ＯＭｅ修飾ピリミジンおよび／またはプリン、５、６、７または８位における２’−５’ヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分を含む。
【０１１２】
一部の態様において、センス鎖（配列番号９８）は、１５、１６、１７、１８および１９位における２’−５’−リボヌクレオチド、Ｃ３ＰｉまたはＣ３−ＯＨ  ３’末端非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号１６５）は、
・２、４、６、８、１１、１３、１５、１７および１９位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、およびＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＰｉまたはＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ  ３’末端オーバーハング、または、
・２、４、６、８、１１、１３、１５、１７および１９位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、およびＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＰｉまたはＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ  ３’末端のオーバーハング、
・１、３、５、９、１１、１３、１５、１７および１９位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、およびＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＰｉまたはＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ  ３’末端オーバーハング、または、
・１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、およびＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＰｉまたはＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ  ３’末端のオーバーハング、
の１つから選択されるアンチセンス鎖を含む。
【０１１３】
本明細書において提供されるのは、センス鎖（配列番号９８）が、１５、１６、１７、１８および１９位における２’−５’−リボヌクレオチド、Ｃ３−ＯＨ  ３’末端部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号１６５）が、２、４、６、８、１１、１３、１５、１７および１９位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、およびＣ３Ｐｉ−ＣＯＨ  ３’末端オーバーハングを含む、二本鎖核酸分子である。
【０１１４】
一部の態様において、医薬製剤の成分としての二本鎖核酸分子は、配列番号１６８に記載のアンチセンス鎖と、配列番号１０１に記載のセンス鎖とを含み、本明細書においてＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１として同定される。一部の態様において二重鎖は、構造：
【化８】
0005873168.tif 000009
を有し、ここで、各々の
【化９】
0005873168.tif 000010
は、リボヌクレオチド間の塩基対合を表し、
Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕの各々は、独立して、非修飾もしくは修飾リボヌクレオチド、または非定型部分であり、
ＺおよびＺ’の各々は、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端に共有結合的に付着した、１〜５個の連続するヌクレオチド、または非ヌクレオチド部分またはその組合せであり、
ｚ”は存在しても、または不在であってもよいが、存在する場合はＮ２−（Ｎ’）ｙの５’末端に共有結合的に付着したキャッピング部分である。
【０１１５】
一部の態様において、本明細書で提供されるのは、センス鎖（配列番号１０１）が、２’ＯＭｅ修飾ピリミジン、任意に、９または１０位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分、および、任意に、５’末端に共有結合的に付着したキャップ部分を含む、二本鎖核酸分子である。一部の態様において、アンチセンス鎖（配列番号１６８）は、２’ＯＭｅ修飾ピリミジンおよび／またはプリン、５、６、７または８位における２’−５’ヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分を含む。
【０１１６】
一部の態様において、本明細書で提供されるのは、センス鎖（配列番号１０１）が、４、１１、１３および１７位における２’ＯＭｅ修飾ピリミジン、任意に、９または１０位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＰｉまたはＣ３ＯＨ非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号１６８）が、
ａ）１、８および１５位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、６または７位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨオーバーハング、または、
ｂ）１、４、８、１３および１５位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、６または７位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨオーバーハング末端、または、
ｃ）１、４、８、１１および１５位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、６位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨオーバーハング、または、
ｄ）１、３、８、１２、１３および１５位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、６位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分、
を含むアンチセンス鎖から選択される、二本鎖核酸分子である。
【０１１７】
本明細書において提供されるのは、センス鎖（配列番号１０１）が、４、１１、１３および１７位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、任意に、９位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−ＯＨ非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号１６８）が、１、８および１５位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、６位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１１８】
本明細書において提供されるのは、センス鎖（配列番号１０１）が、４、１１、１３および１７位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、任意に、９位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−ＯＨ非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号１６８）が、１、４、８、１３および１５位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、６位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１１９】
本明細書において提供されるのは、センス鎖（配列番号１０１）が、４、１１、１３および１７位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、９位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号１６８）が、１、４、８、１１および１５位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、６位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１２０】
本明細書において提供されるのは、センス鎖（配列番号１０１）が、４、１１、１３および１７位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、９位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号１６８）が、１、３、８、１２、１３および１５位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、６位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１２１】
一部の態様において、医薬製剤の成分としての二本鎖核酸分子は、配列番号１７２に記載のアンチセンス鎖と、配列番号１０５に記載のセンス鎖とを含み、本明細書においてＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１ａとして同定される。一部の態様において二重鎖は、構造：
【化１０】
0005873168.tif 000011
を有し、ここで、各々の
【化１１】
0005873168.tif 000012
は、リボヌクレオチド間の塩基対合を表し、
Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕの各々は、独立して、非修飾もしくは修飾リボヌクレオチド、または非定型部分であり、
ＺおよびＺ’の各々は、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端に共有結合的に付着した、１〜５個の連続するヌクレオチド、または非ヌクレオチド部分またはその組合せであり、
ｚ”は存在しても、または不在であってもよいが、存在する場合はＮ２−（Ｎ’）ｙの５’末端に共有結合的に付着したキャッピング部分である。
【０１２２】
一部の態様において、本明細書で提供されるのは、センス鎖（配列番号１０５）が、２’ＯＭｅ修飾ピリミジン、任意に、９または１０位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分、および、任意に、５’末端に共有結合的に付着したキャップ部分を含む二本鎖核酸分子である。一部の態様においてアンチセンス鎖（配列番号１７２）は、２’ＯＭｅ修飾ピリミジンおよび／またはプリン、５、６、７または８位における２’−５’ヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分を含む。
【０１２３】
一部の態様において、本明細書で提供されるのは、センス鎖（配列番号１０５）が、４、１１、１３および１７位における２’ＯＭｅ修飾ピリミジン、任意に、９または１０位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＰｉまたはＣ３ＯＨ非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号１７２）が、
ａ）８および１５位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、６または７位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分、または、
ｂ）４、８、１３および１５位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、６または７位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分、または、
ｃ）４、８、１１および１５位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、６位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分、または、
ｄ）３、８、１２、１３および１５位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、６位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分、
を含むアンチセンス鎖から選択される、二本鎖核酸分子である。
【０１２４】
本明細書において提供されるのは、センス鎖（配列番号１０５）が、４、１１、１３および１７位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、任意に、９位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−ＯＨ非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号１７２）が、８および１５位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、６位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１２５】
本明細書において提供されるのは、センス鎖（配列番号１０５）が、４、１１、１３および１７位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、任意に、９位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−ＯＨ非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号１７２）が、４、８、１３および１５位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、６位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１２６】
本明細書において提供されるのは、センス鎖（配列番号１０５）が、４、１１、１３および１７位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、９位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−ＯＨ非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号１７２）が、４、８、１１および１５位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、６位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１２７】
本明細書において提供されるのは、センス鎖（配列番号１０５）が、４、１１、１３および１７位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、９位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号１７２）が、３、８、１２、１３および１５位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、６位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１２８】
一部の態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、表５に記載され、本明細書においてＥＲＰＩＮＨ１＿４（配列番号１９５および２２０）およびＳＥＲＰＩＮＨ１＿１２（配列番号１９６および２２１）として同定されるオリゴヌクレオチドのペアから選択される。
【０１２９】
一部の態様において、医薬製剤の成分としての二本鎖核酸分子は、配列番号２２０に記載のアンチセンス鎖と、配列番号１９５に記載のセンス鎖とを含み、本明細書においてＳＥＲＰＩＮＨ１＿４として同定される。一部の態様において二重鎖は、構造：
【化１２】
0005873168.tif 000013
を有し、ここで、各々の
【化１３】
0005873168.tif 000014
は、リボヌクレオチド間の塩基対合を表し、
Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕの各々は、独立して、非修飾もしくは修飾リボヌクレオチド、または非定型部分であり、
ＺおよびＺ’の各々は、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端に共有結合的に付着した、１〜５個の連続するヌクレオチド、または非ヌクレオチド部分またはその組合せであり、
ｚ”は存在しても、または不在であってもよいが、存在する場合はＮ２−（Ｎ’）ｙの５’末端に共有結合的に付着したキャッピング部分である。
【０１３０】
一部の態様において、提供されるのは、アンチセンス鎖（配列番号２２０）が、３、５、９、１１、１５、１７および１９位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含み、センス鎖（配列番号１９５）が
ａ）１５、１６、１７、１８および１９位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分、または
ｂ）１５、１６、１７、１８および１９位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端ホスフェート、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分、または、
ｃ）５、７、１３および１６位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、１８位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分、または、
ｄ）７、１３、１６および１８位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、９位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分、または、
ｅ）１５、１６、１７、１８および１９位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分、
を含むセンス鎖から選択される、二本鎖核酸分子である。
【０１３１】
本明細書において提供されるのは、アンチセンス鎖（配列番号２２０）が、３、５、９、１１、１５、１７、１９位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含み、センス鎖（配列番号１９５）が、１５、１６、１７、１８および１９位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１３２】
本明細書において提供されるのは、アンチセンス鎖（配列番号２２０）が、３、５、９、１１、１５、１７、１９位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含み、センス鎖（配列番号１９５）が、１５、１６、１７、１８および１９位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端ホスフェート、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１３３】
本明細書において提供されるのは、アンチセンス鎖（配列番号２２０）が、３、５、９、１１、１５、１７、１９位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含み、センス鎖（配列番号１９５）が、５、７、１３および１６位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、１８位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１３４】
本明細書において提供されるのは、アンチセンス鎖（配列番号２２０）が、３、５、９、１１、１５、１７、１９位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含み、センス鎖（配列番号１９５）が、７、１３、１６および１８位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、９位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１３５】
本明細書において提供されるのは、アンチセンス鎖（配列番号２２０）が、３、５、９、１１、１５、１７、１９位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含み、センス鎖（配列番号１９５）が、１５、１６、１７、１８および１９位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１３６】
一部の態様において、本明細書において提供されるのは、アンチセンス鎖（配列番号２２０）が、１、３、５、９、１１、１３、１５、１７、１９位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含み、センス鎖（配列番号１９５）が、７、９、１３、１６および１８位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１３７】
一部の態様において、本明細書において提供されるのは、センス鎖（配列番号１９５）が、１５、１６、１７、１８および１９位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端ホスフェート、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号２２０）が、
ａ）３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分、または
ｂ）１、３、６、８、１０、１２、１４、１７、１８位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分、
の１つから選択されるアンチセンス鎖を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１３８】
一部の態様において、本明細書において提供されるのは、配列番号１３０に記載のアンチセンス鎖と、配列番号６３に記載のセンス鎖とを含み、本明細書においてＳＥＲＰＩＮＨ１＿１２として同定される、医薬製剤の成分としての二本鎖核酸分子である。一部の態様において二重鎖は、構造：
【化１４】
0005873168.tif 000015
を有し、ここで、各々の
【化１５】
0005873168.tif 000016
は、リボヌクレオチド間の塩基対合を表し、
Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕの各々は、独立して、非修飾もしくは修飾リボヌクレオチド、または非定型部分であり、
ＺおよびＺ’の各々は、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端に共有結合的に付着した、１〜５個の連続するヌクレオチド、または非ヌクレオチド部分またはその組合せであり、
ｚ”は存在しても、または不在であってもよいが、存在する場合はＮ２−（Ｎ’）ｙの５’末端に共有結合的に付着したキャッピング部分である。
【０１３９】
一部の態様において、提供されるのは、センス鎖（配列番号１９６）が、１個または２個以上の２’ＯＭｅ修飾ピリミジン、３’末端ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドオーバーハング、および５’末端に共有結合的に付着したキャップ部分を含む、二本鎖核酸分子である。一部の態様において、アンチセンス鎖（配列番号２２１）は、１個または２個以上の２’ＯＭｅ修飾ピリミジン、３’末端に共有結合的に付着したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着したキャップ部分を含む。
【０１４０】
一部の態様において、提供されるのは、センス鎖（配列番号１９６）が、２、１４および１８位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号２２１）が、
ａ）３、５、９、１１、１３、１５および１７位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分、または、
ｂ）３、５、７、９、１２、１３および１７位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分、
を含むアンチセンス鎖から選択される、二本鎖核酸分子である。
【０１４１】
一部の態様において、提供されるのは、センス鎖（配列番号１９６）が、２、１４および１８位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号２２１）が、３、５、９、１１、１３、１５および１７位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１４２】
一部の態様において、提供されるのは、センス鎖（配列番号１９６）が、１４および１８位および任意に２位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号２２１）が、３、５、７、９、１２、１３および１７位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む、二重鎖オリゴヌクレオチド分子である。
【０１４３】
一部の態様において、提供されるのは、センス鎖（配列番号１９６）が、１４および１８位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号２２１）が、
ａ）３、５、９、１１、１３、１５および１７位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分、または、
ｂ）３、５、７、９、１２、１３および１７位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分、
を含むアンチセンス鎖から選択される、二重鎖オリゴヌクレオチド分子である。
【０１４４】
本明細書において提供されるのは、センス鎖（配列番号１９６）が、１４および１８位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号２２０）が、１、３、５、９、１１、１３、１５および１７位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含むアンチセンス鎖から選択される、二本鎖核酸分子である。
【０１４５】
本明細書において提供されるのは、センス鎖（配列番号１９６）が、１４および１８位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号２２０）が、１、３、５，７、９、１２、１３および１７位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１４６】
構造Ａ１およびＡ２のさらなる態様において、（Ｎ’）ｙは、１〜８個の修飾リボヌクレオチドを含み、ここで、修飾リボヌクレオチドはＤＮＡヌクレオチドである。特定の態様において、（Ｎ’）ｙは、１、２、３、４、５、６、７個または８個までのＤＮＡ部分を含む。
【０１４７】
一部の態様において、ＺおよびＺ’のいずれか一方が存在し、独立して２個の非ヌクレオチド部分を含む。
【０１４８】
さらなる態様において、ＺおよびＺ’が存在し、各々は独立して、２個の非ヌクレオチド部分を含む。
【０１４９】
一部の態様において、ＺおよびＺ’の各々は、無塩基部分、例えばデオキシリボ無塩基部分（本明細書において「ｄＡｂ」と称する）またはリボ無塩基部分（本明細書において「ｒＡｂ」と称する）を含む。一部の態様において、Ｚおよび／またはＺ’の各々は、２個の共有結合的に連結した無塩基部分を含み、例えば、ｄＡｂ−ｄＡｂまたはｒＡｂ−ｒＡｂまたはｄＡｂ−ｒＡｂまたはｒＡｂ−ｄＡｂであり、ここで、各々の部分は隣接する部分に共有結合により、好ましくはリン酸ベース（phospho-based）の結合を介して、付着している。一部の態様において、リン酸ベースの結合は、ホスホロチオエート、ホスホノアセテートまたはホスホジエステル結合を含む。好ましい態様において、リン酸ベースの結合は、ホスホジエステル結合を含む。
【０１５０】
一部の態様において、Ｚおよび／またはＺ’の各々は、独立して、アルキル部分、任意にプロパン（（ＣＨ２）３）部分（「Ｃ３」）、またはその誘導体であるプロパンジオール（Ｃ３−ＯＨ）およびプロパンジオールのホスホ誘導体（「Ｃ３Ｐｉ」）などを含む。一部の態様において、Ｚおよび／またはＺ’の各々は、アンチセンス鎖またはセンス鎖の３’末端にホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合を介して共有結合により結合し、互いにホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合を介して共有結合により結合した２個のアルキル部分を含み、一部の例において、これはＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＰｉまたはＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨである。センス鎖の３’末端および／またはアンチセンス鎖の３’末端は、Ｃ３部分にリン酸ベースの結合を介して共有結合的に付着しており、Ｃ３部分は、Ｃ３ＯＨ部分にリン酸ベースの結合を介して共有結合的に結合している。一部の態様において、リン酸ベースの結合は、ホスホロチオエート、ホスホノアセテートまたはホスホジエステル結合を含む。好ましい態様において、リン酸ベースの結合は、ホスホジエステル結合を含む。
【０１５１】
構造Ａ１または構造Ａ２の種々の態様において、ＺおよびＺ’は不在である。他の態様において、ＺまたはＺ’は存在する。一部の態様において、Ｚおよび／またはＺ’の各々は、独立して、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５またはＣ６アルキル部分、任意に、Ｃ３部分、または、プロパノール（Ｃ３ＯＨ／Ｃ３ＯＨ）、プロパンジオール、およびプロパンジオールのホスホジエステル誘導体（Ｃ３Ｐｉ）を含むその誘導体を含む。好ましい態様において、Ｚおよび／またはＺ’の各々は、２個の炭化水素部分を含み、一部の例においてそれはＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨまたはＣ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉである。各々のＣ３は、共有結合、好ましくはリン酸ベースの結合を介して、隣接するＣ３に共有結合している。一部の態様において、リン酸ベースの結合は、ホスホロチオエート、ホスホノアセテートまたはホスホジエステル結合である。
【０１５２】
具体的な態様において、ｘ＝ｙ＝１９であり、Ｚは、少なくとも１個のＣ３アルキルオーバーハングを含む。一部の態様において、Ｃ３−Ｃ３オーバーハングは、（Ｎ）ｘまたは（Ｎ’）ｙの３’末端に、共有結合、好ましくはホスホジエステル結合を介して、共有結合的に付着している。一部の態様において、第１のＣ３と第２のＣ３との間の結合は、ホスホジエステル結合である。一部の態様において、３’非ヌクレオチドオーバーハングは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉである。一部の態様において、３’非ヌクレオチドオーバーハングは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉである。一部の態様において、３’非ヌクレオチドオーバーハングは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨである。
【０１５３】
種々の態様において、アルキル部分は、末端ヒドロキシル基、末端アミノ基または末端リン酸基を含む、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、Ｃ５アルキルまたはＣ６アルキル部分を含むアルキル誘導体を含む。一部の態様において、アルキル部分は、Ｃ３アルキルまたはＣ３アルキル誘導体部分である。一部の態様において、Ｃ３アルキル部分は、プロパノール、プロピルホスフェート、プロピルホスホロチオエートまたはこれらの組合せを含む。Ｃ３アルキル部分は、（Ｎ’）ｙの３’末端および／または（Ｎ）ｘの３’末端に、ホスホジエステル結合を介して共有結合的に連結している。一部の態様において、アルキル部分は、プロパノール、プロピルホスフェートまたはプロピルホスホロチオエートを含む。一部の態様において、ＺおよびＺ’の各々は、独立して、プロパノール、プロピルホスフェート、プロピルホスホロチオエート、これらの組合せまたはこれらを複数含むもの（multiple）、特に共有結合的に連結した２個または３個のプロパノール、プロピルホスフェート、プロピルホスホロチオエートまたはその組合せから選択される。一部の態様において、ＺおよびＺ’の各々は、独立して、プロピルホスフェート、プロピルホスホロチオエート、プロピルホスホ−プロパノール、プロピルホスホ−プロピルホスホロチオエート、プロピルホスホ−プロピルホスフェート、（プロピルホスフェート）３、（プロピルホスフェート）２−プロパノール、（プロピルホスフェート）２−プロピルホスホロチオエートから選択される。任意のプロパンまたはプロパノール結合部分を、ＺまたはＺ’に含めることができる。
【０１５４】
例示的な３’末端の非ヌクレオチド部分の構造は、以下のとおりである：
【化１６】
0005873168.tif 000017
【０１５５】
一部の態様において、ＺおよびＺ’の各々は、独立して、プロパノール、プロピルホスフェート、プロピルホスホロチオエート、これらの組合せまたはこれらを複数含むものから選択される。
一部の態様において、ＺおよびＺ’の各々は、独立して、プロピルホスフェート、プロピルホスホロチオエート、プロピルホスホ−プロパノール、プロピルホスホ−プロピルホスホロチオエート、プロピルホスホ−プロピルホスフェート、（プロピルホスフェート）３、（プロピルホスフェート）２−プロパノール、（プロピルホスフェート）２−プロピルホスホロチオエートから選択される。任意のプロパンまたはプロパノール結合部分を、ＺまたはＺ’に含めることができる。
【０１５６】
さらなる態様において、Ｚおよび／またはＺ’の各々は、無塩基部分と非修飾デオキシリボヌクレオチドまたは非修飾リボヌクレオチドとの組合せ、または、炭化水素部分と非修飾デオキシリボヌクレオチドまたは非修飾リボヌクレオチドとの組合せ、または、無塩基部分（デオキシリボまたはリボ）と炭化水素部分との組合せを含む。かかる態様において、Ｚおよび／またはＺ’の各々はＣ３−ｒＡｂまたはＣ３−ｄＡｂを含み、ここで各々の部分は、隣接する部分に、リン酸ベースの結合、好ましくはホスホジエステル、ホスホロチオエートまたはホスホノアセテート結合を介して、共有結合的に結合している。
【０１５７】
特定の態様において、本明細書で開示される核酸分子は、下記の表４および５に示すオリゴヌクレオチド（配列番号６０〜１２６および１９４〜２１８）のいずれかから選択される、センスオリゴヌクレオチド配列を含む。
【０１５８】
一部の好ましい態様において、提供される化合物は、以下に記載の化合物＿１、化合物＿２、化合物＿３、化合物＿４、化合物＿５、化合物＿６、化合物＿７、化合物＿８および化合物＿９を含む。
【０１５９】
一部の態様（例えば化合物＿１、化合物＿５および化合物＿６）において、提供されるのは、アンチセンス鎖が配列番号１２７であり、センス鎖が配列番号６０である、１９ｍｅｒの二本鎖核酸分子である。特定の態様において、提供されるのは、アンチセンス鎖が配列番号１２７であり、２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、少なくとも１、５、６または７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および、３’末端に共有結合的に付着した非ヌクレオチド部分を含み、センス鎖が配列番号６０であり、少なくとも１個の２’−５’−リボヌクレオチドまたは２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着した非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着したキャップ部分を含む、１９ｍｅｒの二本鎖核酸分子である。一部の態様において、提供されるのは、アンチセンス鎖が配列番号１２７であり、３、５、９、１１、１３、１５、１７および１９位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ非ヌクレオチド部分を含み、センス鎖が配列番号６０であり、３’末端の１５、１６、１７、１８および１９位における５個の連続する２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基部分を含む、１９ｍｅｒの二本鎖核酸分子である。
【０１６０】
一態様において、提供されるのは、１９ｍｅｒの二本鎖核酸分子である化合物＿１であり、ここで、アンチセンス鎖は配列番号１２７であり、３、５、９、１１、１３、１５、１７および１９位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ非ヌクレオチド部分を含み、センス鎖は配列番号６０であり、３’末端の１５、１６、１７、１８および１９位における５個の連続する２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基部分を含み、アンチセンス鎖の１位に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドをさらに含む。
【０１６１】
一態様において、提供されるのは、１９ｍｅｒの二本鎖核酸分子である化合物＿６であり、ここで、アンチセンス鎖は配列番号１２７であり、３、５、９、１１、１３、１５、１７および１９位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ非ヌクレオチド部分を含み、センス鎖は配列番号６０であり、３’末端の１５、１６、１７、１８および１９位における５個の連続する２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基部分を含み、アンチセンス鎖の１位に２’−５’−リボヌクレオチドをさらに含む。
【０１６２】
一態様において、提供されるのは、１９ｍｅｒの二本鎖核酸分子である化合物＿５であり、ここで、アンチセンス鎖は配列番号１２７であり、１、３、５、９、１１、１３、１５、１７および１９位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ非ヌクレオチド部分を含み、センス鎖は配列番号６０であり、７、１３、１６および１８位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、９位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基部分を含む。
【０１６３】
一部の態様（例えば、以下に記載の化合物＿２および化合物＿７など）において、提供されるのは、センス鎖が配列番号６３であり、アンチセンス鎖が配列番号１３０である、１９ｍｅｒの二本鎖核酸分子である。一部の態様において、提供されるのは、センス鎖が配列番号６３であり、２’ＯＭｅ修飾ピリミジンリボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着した非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着したキャップ部分を含み、アンチセンス鎖が配列番号１３０であり、２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着した非ヌクレオチド部分を含む、１９ｍｅｒの二本鎖核酸分子である。一部の態様において、提供されるのは、センス鎖が配列番号６３であり、２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着した非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着したキャップ部分を含み、アンチセンス鎖が配列番号１３０であり、２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、５、６または７位の少なくとも１つにおける２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着した非ヌクレオチド部分を含む、１９ｍｅｒの二本鎖核酸分子である。
【０１６４】
一態様において、提供されるのは、１９ｍｅｒの二本鎖核酸分子である化合物＿２であり、ここで、センス鎖は配列番号６３であり、２、１４および１８位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖は配列番号１３０であり、１、３、５、９、１２、１３および１７位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、５、６または７位の少なくとも１つにおける２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ非ヌクレオチド部分を含む。
【０１６５】
一態様において、提供されるのは、１９ｍｅｒの二本鎖核酸分子である化合物＿７であり、ここで、センス鎖は配列番号６３であり、２、１４および１８位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖は配列番号３０であり、１、３、５、９、１１、１３および１７位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ非ヌクレオチド部分を含む。
【０１６６】
一部の態様（例えば、以下に記載の化合物＿３など）において、提供されるのは、センス鎖が配列番号９８であり、アンチセンス鎖が配列番号１６５である、１９ｍｅｒの二本鎖核酸分子である。一部の態様において、提供されるのは、センス鎖が配列番号９８であり、３’末端の位置における２個以上の２’−５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着した非ヌクレオチド部分、および、５’末端に共有結合的に付着したキャップ部分を含み、アンチセンス鎖は配列番号１６５であり、２個以上の２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、５、６または７位の少なくとも１つにおける２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着した非ヌクレオチド部分を含む、１９ｍｅｒの二本鎖核酸分子である。一態様において、提供されるのは、１９ｍｅｒの二本鎖核酸分子である化合物＿３であり、ここで、センス鎖は配列番号９８であり、１５、１６、１７、１８および１９位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−ＯＨ  ３’部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖は配列番号1６５であり、２、４、６、８、１１、１３、１５、１７および１９位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３Ｏを含む。
【０１６７】
一部の態様（例えば、以下に記載の化合物＿４、化合物＿８および化合物＿９など）において、提供されるのは、センス鎖が配列番号１０１であり、アンチセンス鎖が配列番号１６８である、１９ｍｅｒの二本鎖核酸分子である。一部の態様において、提供されるのは、センス鎖が配列番号１０１であり、２’ＯＭｅ修飾ピリミジンリボヌクレオチド、任意に９または１０位のうちの１つにおける２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着した非ヌクレオチド部分および５’末端に共有結合的に付着したキャップ部分を含み、アンチセンス鎖が配列番号１６８であり、２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、５、６または７位の少なくとも１つにおける２’−５’−リボヌクレオチドおよび３’末端に共有結合的に付着した非ヌクレオチド部分を含む、１９ｍｅｒの二本鎖核酸分子である。
【０１６８】
一態様において、提供されるのは、１９ｍｅｒの二本鎖核酸分子である化合物＿４であり、ここで、センス鎖は配列番号１０１であり、４、１１、１３および１７位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、９位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖は配列番号１６８であり、１、４、８、１１および１５位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、６位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着した３’Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨオーバーハングを含む。
【０１６９】
一態様において、提供されるのは、１９ｍｅｒの二本鎖核酸分子である化合物＿８であり、ここで、センス鎖は配列番号１０１であり、４、１１、１３および１７位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖は配列番号１６８であり、１、４、８、１３および１５位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、６位における２’−５’−リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨオーバーハングを含む。
【０１７０】
一態様において、提供されるのは、１９ｍｅｒの二本鎖核酸分子である化合物＿９であり、ここで、センス鎖は配列番号１０１であり、２、４、１１、１３および１７位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖は配列番号１６８であり、１、４、８、１１および１５位における２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、６位における２’−５’−リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む。
【０１７１】
別の側面において、提供されるのは、本明細書において提供される核酸分子を、ｈｓｐ４７の発現を低減するのに十分な量で細胞に導入することにより、細胞においてｈｓｐ４７の発現を低減する方法である。一態様において、細胞は肝星細胞である。別の態様において、細胞は腎臓または肺組織における星細胞である。特定の態様において、方法はin vitroで行われ、他の態様において、方法はin vivoで行われる。
【０１７２】
さらに別の側面において、提供されるのは、ｈｓｐ４７に関連する疾患を患う個体を処置する方法である。方法は、個体に、例えば本明細書において提供される核酸分子などを、ｈｓｐ４７の発現を低減するのに十分な量で投与することを含む。特定の態様において、ｈｓｐ４７に関連する疾患は肝線維症、肝硬変、肺線維症（ＩＬＦを含む）を含む肺の線維症、腎線維症を惹起するあらゆる状態（例えば、ＥＳＲＤを含むＣＫＤ）、腹膜線維症、慢性肝障害、原線維形成、他の臓器における線維性疾患、偶発的および医原性（手術）の全ての可能な種類の皮膚損傷に関連する異常な瘢痕化（ケロイド）、強皮症、心線維症、緑内障濾過手術の失敗、および腸管癒着症からなる群から選択される疾患である。一部の態様において、化合物は臓器特異的な適応症、例えば臓器およびそれぞれの適応症をリストした下記の表１に示すものを含む適応症の処置に有用たり得る。
【表１】
0005873168.tif 000018
【０１７３】
本説明の別の態様は、星細胞関連疾患を処置するための方法であって、以下に記載の医薬組成物の有効量を、これを必要とする対象に投与することを含む前記方法である。疾患としては、肝炎、肝線維症、肝硬変、肝がん、膵炎、膵線維症、膵がん、瘢痕声帯、声帯粘膜線維症、および喉頭線維症を含む。一部の態様において、好ましい適応症は、肝移植後Ｃ型肝炎による肝硬変、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）による肝硬変、特発性肺線維症、肺線維症につながる放射線肺炎、糖尿病性腎症、持続携帯式腹膜透析（ＣＡＰＤ）に関連する腹膜硬化症、または眼瘢痕性類天疱瘡を含む。
【０１７４】
線維性肝の適応症は、アルコール性肝硬変、Ｂ型肝炎肝硬変、Ｃ型肝炎肝硬変、同所性肝移植（ＯＬＴＸ）後のＣ型肝炎（Ｈｅｐ  Ｃ）肝硬変、非アルコール性脂肪性肝炎／非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤ）、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、胆道閉鎖症、アルファ１抗トリプシン欠乏症（Ａ１ＡＤ）、銅蓄積症（ウイルソン病）、フルクトース血症、ガラクトース血症、糖原病（特にＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩ、ＩＸおよびＸ型）、鉄過剰症候群（ヘモクロマトーシス）、脂質異常（例えばゴーシェ病）、ペルオキシソーム障害（例えばツェルヴェーガー症候群）、チロシン血症、先天性肝線維症、細菌感染症（例えばブルセラ症）、寄生虫疾患（例えば包虫症）、バット・キアリ症候群（肝静脈閉塞性疾患）を含む。
【０１７５】
肺の適応症は、特発性肺線維症、珪肺症、塵肺症、新生児呼吸窮迫症候群に続発する新生児における気管支肺異形成症、ブレオマイシン／化学性肺損傷、肺移植後閉塞性細気管支炎（ＢＯＳ）、慢性閉塞性肺障害（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、および喘息を含む。
【０１７６】
心臓の適応症は、心筋症、アテローム性硬化症（バージャー病など）、心内膜心筋線維症、心房細動、心筋梗塞（ＭＩ）後瘢痕形成を含む。
【０１７７】
他の胸部の適応症は、テクスチャードタイプの乳房インプラント周囲における放射線による被膜組織反応（Radiation-induced capsule tissue reactions）および口腔粘膜下線維症を含む。
【０１７８】
腎臓の適応症は、常染色体優性多発性嚢胞腎（ＡＤＰＫＤ）、糖尿病性腎症（糖尿病性糸球体硬化症）、巣状分節状糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）（崩壊性、他の組織学的変種）、ＩｇＡ腎症（バージャー病）、ループス腎炎、ウェゲナー病、強皮症、グッドパスチャー症候群、尿細管間質性線維症：薬剤性（保護的）ペニシリン、セファロスポリン、鎮痛性腎症、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）、ヘーノホ−シェーンライン紫斑病、先天性腎症、腎髄質嚢胞症、爪膝蓋骨症候群およびアルポート症候群を含む。
【０１７９】
骨髄の適応症は、リンパ脈管筋腫症（ＬＡＭ）、慢性移植片対宿主病、真性多血症、本態性血小板血症、骨髄線維症を含む。
【０１８０】
眼の適応症は、未熟児網膜症（ＲｏＰ）、眼瘢痕性類天疱瘡、涙腺線維化、網膜復位術、角膜混濁、ヘルペス角膜炎、翼状片、緑内障、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ／ＡＲＭＤ）、真性糖尿病（ＤＭ）網膜症に関連する網膜線維症を含む。
【０１８１】
婦人科の適応症は、瘢痕形成の防止のためのホルモン療法に合併する子宮内膜症、ＳＴＤ後の線維症／卵管炎を含む。
【０１８２】
全身性の適応症は、デュピュイトラン病、手掌線維腫症、ペイロニー病、レダーホース病、ケロイド、多巣性線維硬化症、腎性全身性線維症、および骨髄線維症（貧血症）を含む。
【０１８３】
傷害関連性線維性疾患（injury associated fibrotic diseases）は、熱傷性（化学物質を含む）の皮膚および軟部組織の瘢痕形成および収縮、がん放射線治療後の放射線による皮膚および器官の瘢痕形成、ケロイド（皮膚）を含む。
【０１８４】
外科的な適応症は、腹膜透析カテーテル後の腹膜線維症、角膜移植、人工内耳、他の移植物、胸部へのシリコーン移植物、慢性副鼻腔炎、癒着、透析グラフトの偽内膜過形成を含む。
【０１８５】
他の適応症は、慢性膵炎を含む。
【０１８６】
一部の態様において、提供されるのは、肝線維症を患う対象を処置する方法であって、該対象に、本明細書に開示される核酸分子の有効量を投与することを含み、それによって肝線維症を処置する方法である。一部の態様において、対象は肝炎による肝硬変を患っている。一部の態様において、対象はＮＡＳＨによる肝硬変を患っている。
【０１８７】
一部の態様において、提供されるのは、肝線維症を処置するための薬物の製造のための、本明細書に開示される核酸分子の使用である。一部の態様において、肝線維症は、肝炎によるものである。一部の態様において、肝線維症は、ＮＡＳＨによるものである。
【０１８８】
一部の態様において、提供されるのは、瘢痕組織をリモデリングするための方法であって、本明細書に開示される核酸分子の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含み、それによって瘢痕組織リモデリングをもたらす方法である。一部の態様において、瘢痕組織は肝臓にある。一部の態様において、対象は肝炎による肝硬変を患っている。一部の態様において、対象はＮＡＳＨによる肝硬変を患っている。
【０１８９】
一部の態様において、線維症の消退を調節するための方法であって、本明細書に開示される核酸分子の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含み、それによって線維症の消退をもたらす方法が提供される。
【０１９０】
一部の態様において、提供されるのは、対象における瘢痕組織の縮小のための方法であって、瘢痕組織を縮小するために、該対象に本明細書に開示される核酸分子の有効量を投与するステップを含む方法である。一部の態様において、提供されるのは、対象における瘢痕組織を縮小するための方法であって、瘢痕組織を縮小するために、本明細書に開示される核酸分子の有効量を瘢痕組織に局所的に適用するステップを含む方法である。
【０１９１】
一部の態様において、提供されるのは、瘢痕組織の外観を改善する方法であって、瘢痕組織の外観を改善するために、本明細書に開示される核酸分子の有効量を瘢痕組織に局所的に適用するステップを含む方法である。
【０１９２】
一部の態様において、提供されるのは、肺線維症を患う対象の処置のための方法であって、対象に本明細書に開示される核酸分子の有効量を投与することを含み、それによって肺線維症を処置する方法である。一部の態様において、対象は間質性肺線維症（ＩＬＦ）を患っている。一部の態様において、対象は肺線維症につながる放射線肺炎を患っている。一部の態様において、対象は薬剤性肺線維症を患っている。
【０１９３】
一部の態様において、提供されるのは、肺線維症を処置するための薬物の製造のための、本明細書に開示される核酸分子の使用である。一部の態様において、肺線維症はＩＬＦである。一部の態様において、肺線維症は、薬剤性または放射線性肺線維症である。
【０１９４】
一側面において、提供されるのは、薬学的に許容し得る担体中の、本明細書に記載の核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）を含む医薬組成物である。特定の態様において、医薬製剤は、患者などの個体に核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）を送達するのに適した送達システム、例えば、以下にさらに詳細に記述される送達システムを含むか、これを伴う。
【０１９５】
関連する側面において、提供されるのは、患者による使用のためにパッケージされた、核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）を含む組成物またはキットである。パッケージは、ラベルを付されていても、パッケージラベルまたは添付文書を含んでいてもよく、これは、パッケージの内容を示し、核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）が患者によりどのように使用されるべきか、または、どのように使用することができるかに関するある種の情報を提供し、例えば、ラベルは投薬情報および／または使用適応を含んでもよい。特定の態様において、ラベルの内容は、政府関係機関、例えば米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって定められた形式の通知を有する。特定の態様において、ラベルは核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）が、ｈｓｐ４７に関連する疾患を患う患者を処置するために適することを示してもよく、例えば、ラベルは、核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）が線維性疾患を治療するために適することを示してもよく、または、例えば、ラベルは、核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）が線維症、肝線維症、肝硬変、肺線維症、腎線維症、腹膜線維症、慢性肝障害および原線維形成からなる群から選択される疾患を処置するために適することを示してもよい。
【０１９６】
本明細書で用いる場合、用語「熱ショックタンパク質４７」または「ｈｓｐ４７」または「ＨＳＰ４７」は互換可能に用いられ、あらゆる熱ショックタンパク質４７、あらゆるｈｓｐ４７タンパク質活性を有するペプチドまたはポリペチドを指す。熱ショックタンパク質４７はセリンプロテイナーゼ阻害剤（セルピン）であり、例えば、セルピンペプチダーゼ阻害剤、クレードＨ（clade H）、メンバー１（ＳＥＲＰＩＮＨ１）、ＳＥＲＰＩＮＨ２、コラーゲン結合タンパク質１（ＣＢＰ１）、ＣＢＰ２、ｇｐ４６、ヒ素トランス活性化タンパク質３（ＡｓＴＰ３）、ＨＳＰ４７、増殖誘導遺伝子１４（ＰＩＧ１４）、ＰＰＲＯＭ、関節リウマチ抗原Ａ−４７（ＲＡ−Ａ４７）、コリジン（colligin）−１、およびコリジン−２としても知られている。一部の好ましい態様において、「ｈｓｐ４７」はヒトｈｓｐ４７を指す。熱ショックタンパク質４７（または、より具体的にヒトｈｓｐ４７）は、配列番号２と同一か、または実質的に同一のアミノ酸配列を有してもよい。
【０１９７】
本明細書で用いる場合、用語「ｈｓｐ４７をコードするヌクレオチド配列」は、ｈｓｐ４７タンパク質またはその部分をコードするヌクレオチド配列を意味する。用語「ｈｓｐ４７をコードするヌクレオチド配列」はまた、ｈｓｐ４７コード配列、例えばｈｓｐ４７アイソフォーム、変異体ｈｓｐ４７遺伝子、ｈｓｐ４７遺伝子のスプライスバリアント、およびｈｓｐ４７遺伝子多型を含むものとする。ｈｓｐ４７をコードする核酸配列は、ｈｓｐ４７をコードするｍＲＮＡ配列を含み、それはまた、「ｈｓｐ４７  ｍＲＮＡ」と称することもある。ヒトｈｓｐ４７  ｍＲＮＡの例示的な配列は、配列番号１である。
【０１９８】
本明細書で用いる場合、用語「核酸分子」または「核酸」は、互換可能に用いられ、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを指す。「核酸分子」のバリエーションは、本明細書にさらに詳細に記載されている。核酸分子は、本明細書に記載の修飾核酸分子と非修飾核酸分子の両方を含む。核酸分子は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを、あらゆる組合せで含んでもよい。
【０１９９】
本明細書で用いる場合、用語「ヌクレオチド」は、糖（またはそのアナログ、または修飾糖）、ヌクレオチド塩基（またはそのアナログ、または修飾塩基）およびリン酸基（またはそのアナログ、または修飾リン酸基）を有する化学部分を指す。ヌクレオチドは、本明細書に記載の修飾ヌクレオチドまたは非修飾ヌクレオチドを含む。本明細書で用いる場合、ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド（例えば非修飾デオキシリボヌクレオチド）、リボヌクレオチド（例えば非修飾リボヌクレオチド）、および修飾ヌクレオチドアナログを含んでもよく、修飾ヌクレオチドアナログは、とりわけ、ＬＮＡおよびＵＮＡ、ペプチド核酸、Ｌ−ヌクレオチド（ミラーヌクレオチドとも称する）、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、アラビノシド、ＰＡＣＥ、六炭糖を有するヌクレオチド、ならびに、しばしば非ヌクレオチドとみなされるヌクレオチドアナログ（無塩基ヌクレオチドを含む）を含む。一部の態様において、ヌクレオチドは、糖、ヌクレオチド塩基および／またはリン酸基が、当該技術分野において既知の任意の修飾（例えば、本明細書に記載された修飾）で修飾されていてもよい。本明細書で用いる「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、連結されたヌクレオチドの鎖を指す。ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、同様に、当該技術分野において周知のように、および／または、本明細書に開示されているように、ヌクレオチド糖、ヌクレオチド塩基およびリン酸骨格に修飾を有してもよい。
【０２００】
本明細書で用いる場合、用語「短鎖干渉核酸」、「ｓｉＮＡ」または「短鎖干渉核酸分子」は、遺伝子発現またはウイルス複製を調節することができるあらゆる核酸分子を指す。好ましくは、ｓｉＮＡは遺伝子発現またはウイルス複製を阻害または下方制御する。ｓｉＮＡは、限定されずに、配列特異的ＲＮＡｉを誘導することができる核酸分子、例えば、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短鎖干渉オリゴヌクレオチド、短鎖干渉核酸、短鎖干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学修飾ｓｉＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）などを含む。本明細書で用いる場合、「短鎖干渉核酸」、「ｓｉＮＡ」または「短鎖干渉核酸分子」は、本明細書の別の箇所でより詳細に記載された意味を有する。
【０２０１】
本明細書で用いる場合、用語「相補的」は、核酸が、他の核酸配列と、古典的なワトソン−クリック型か、または他の非古典的なタイプによる水素結合を形成できることを意味する。本明細書に開示される核酸分子に関して、核酸分子の、その相補配列との結合自由エネルギーは、核酸が、関連する機能、例えばＲＮＡｉ作用を遂行することを許容するのに十分である。核酸分子の結合自由エネルギーの決定は、当該技術分野において周知である（例えば、Turner et al., 1987, CSH Symp. Quant. Biol. LII pp. 123-133、Frier et al., 1986, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83:9373-9377、Turner et al., 1987, J. Am. Chem. Soc. 109:3783-3785を参照）。相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン−クリック塩基対）を形成することができる核酸分子の連続する残基のパーセンテージを示す（例えば、第１のオリゴヌクレオチドの合計１０ヌクレオチドのうち５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドが、１０個のヌクレオチドを有する第２の核酸配列と塩基対を形成することは、それぞれ、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および１００％の相補性を表す）。「完全に相補的」は、核酸配列の全ての連続する残基が、第２の核酸配列における同じ数の連続する残基と水素結合することを意味する。一態様において、本明細書に開示される核酸分子は、１または２以上の標的核酸分子またはその部分に相補的なヌクレオチドを、約１５〜約３５個以上（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５個以上）含む。
【０２０２】
本明細書で用いる場合、用語「センス領域」は、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域と（部分的にまたは完全に）相補的なｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を指す。ｓｉＮＡ分子のセンス鎖は、標的核酸配列と相同性を有する核酸配列を含んでもよい。本明細書で用いる場合、「センス鎖」は、センス領域を含み、また追加のヌクレオチドを含んでもよい核酸分子を指す。センス鎖のヌクレオチド位置は、本明細書において５’＞３’で番号付けする。
【０２０３】
本明細書で用いる場合、用語「アンチセンス領域」は、標的核酸配列と（部分的にまたは完全に）相補的なｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を指す。ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖は、ｓｉＮＡ分子のセンス領域に相補的な核酸配列を任意に含むことができる。本明細書で用いる場合、「アンチセンス鎖」はアンチセンス領域を含み、また追加のヌクレオチドを含んでもよい核酸分子を指す。アンチセンス鎖のヌクレオチド位置は、本明細書において５’＞３’で番号付けする。
【０２０４】
本明細書で用いる場合、用語「ＲＮＡ」は、少なくとも１個のリボヌクレオチド残基を含む分子を指す。
【０２０５】
本明細書で用いる場合、用語「二重鎖領域」は、相補的か実質的に相補的な２個のオリゴヌクレオチドにおいて、ワトソン−クリック型塩基対、または、相補的か実質的に相補的な２個のオリゴヌクレオチド鎖の間での二重鎖を可能にする他の任意の方法によって、互いに塩基対を形成する領域を指す。例えば、２１ヌクレオチド単位を有するオリゴヌクレオチド鎖は、２１ヌクレオチド単位の別のオリゴヌクレオチドと塩基対を形成するが、二重鎖領域が１９塩基対からなるよう、各々の鎖の１９塩基のみが相補的か実質的に相補的であってもよい。残りの塩基対は、例えば、５’および３’オーバーハングとして存在してもよい。さらに、二重鎖領域内で１００％の相補性は必要とされず、実質的な相補性が二重鎖領域内で許容される。実質的な相補性は、生物学的条件下でアニーリングできる鎖間の相補性を指す。２本の鎖が生物学的条件下でアニーリングができるかどうかを実験的に決定する技法は、当該技術分野において周知である。あるいは、２本の鎖を合成し、生物学的条件下で一緒に添加して、これらが互いにアニーリングするかを決定することができる。
【０２０６】
本明細書で用いる場合、用語「非対合（non-pairing）ヌクレオチドアナログ」は、非塩基対部分を含むヌクレオチドアナログを意味し、非塩基対部分は、限定されずに、６デスアミノアデノシン（ネブラリン）、４−Ｍｅ−インドール、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、Ｄｓ、Ｐａ、Ｎ３−ＭｅリボＵ、Ｎ３−ＭｅリボＴ、Ｎ３−Ｍｅ  ｄＣ、Ｎ３−Ｍｅ−ｄＴ、Ｎ１−Ｍｅ−ｄＧ、Ｎ１−Ｍｅ−ｄＡ、Ｎ３−エチル−ｄＣ、Ｎ３−Ｍｅ  ｄＣを含む。一部の態様において、非塩基対ヌクレオチドアナログは、リボヌクレオチドである。他の態様において、それはデオキシリボヌクレオチドである。
【０２０７】
本明細書で用いる場合、用語「末端官能基」は、限定されずに、ハロゲン、アルコール、アミン、カルボン酸、エステル、アミド、アルデヒド、ケトン、エーテル基を含む。
【０２０８】
本明細書で用いる「無塩基ヌクレオチド」または「無塩基ヌクレオチドアナログ」は、本明細書および当該技術分野において、しばしば、偽ヌクレオチドまたは非定型部分とも称することがある。ヌクレオチドは核酸のモノマー単位であり、一般的に、リボースまたはデオキシリボース糖、リン酸、および塩基（ＤＮＡにおけるアデニン、グアニン、チミンまたはシトシン、ＲＮＡにおけるアデニン、グアニン、ウラシルまたはシトシン）からなるが、無塩基または偽ヌクレオチドは塩基を欠き、したがって厳密には、当該技術分野で一般的に用いられる用語としてのヌクレオチドではない。無塩基デオキシリボース部分は、例えば、無塩基デオキシリボース−３’−ホスフェート、１，２−ジデオキシ−Ｄ−リボフラノース−３−ホスフェート、１，４−アンヒドロ−２−デオキシ−Ｄ−リビトール−３−ホスフェートを含む。逆位無塩基デオキシリボース部分は、逆位デオキシリボ無塩基、３’，５’逆位デオキシ無塩基５’−ホスフェートを含む。
【０２０９】
本明細書で用いる用語「キャッピング部分」（ｚ”）は、（Ｎ’）ｙの５’末端に共有結合的に連結できる部分を含み、無塩基リボース部分、無塩基デオキシリボース部分、無塩基リボースおよび無塩基デオキシリボース部分の修飾体（２’Ｏアルキル修飾体を含む）、逆位無塩基リボースおよび無塩基デオキシリボース部分およびその修飾体、Ｃ６−イミノ−Ｐｉ、Ｌ−ＤＮＡとＬ−ＲＮＡを含むミラーヌクレオチド、５’ＯＭｅヌクレオチド、および、ヌクレオチドアナログ、例えば、４’，５’−メチレンヌクレオチド、１−（β−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、５’−アミノ−アルキルホスフェート、１，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート、３−アミノプロピルホスフェート、６−アミノヘキシルホスフェート、１２−アミノドデシルホスフェート、ヒドロキシプロピルホスフェート、１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、アルファ−ヌクレオチド、トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環式３’，４’−セコヌクレオチド、３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−逆位無塩基部分、１，４−ブチレングリコールホスフェート、５’−アミノ、および架橋または非架橋メチルホスホネートおよび５’−メルカプト部分を含む。
【０２１０】
一部のキャッピング部分は、無塩基リボースまたは無塩基デオキシリボース部分、逆位無塩基リボースまたは無塩基デオキシリボース部分、Ｃ６−アミノ−Ｐｉ、Ｌ−ＤＮＡおよびＬ−ＲＮＡを含むミラーヌクレオチドであってもよい。本明細書に開示される核酸分子は、１個または２個以上の逆位ヌクレオチド、例えば、逆位チミジンまたは逆位アデニンを用いて合成してもよい（例えば、Takei, et al., 2002. JBC 277(26):23800-06参照）。
【０２１１】
本明細書で用いる用語「非定型部分」は、無塩基部分、逆位無塩基部分、炭化水素（アルキル）部分およびその誘導体を含む非ヌクレオチド部分を指し、さらに、デオキシリボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、ミラーヌクレオチド（Ｌ−ＤＮＡまたはＬ−ＲＮＡ）、非塩基対ヌクレオチドアナログおよび２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合で隣接するヌクレオチドと連結したヌクレオチド、ＬＮＡおよびエチレン架橋核酸を含む架橋核酸、結合修飾ヌクレオチド（例えばＰＡＣＥ）および塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、本明細書で非定型部分として明示的に開示されているさらなる部分を含む。
【０２１２】
本明細書で用いる場合、用語「阻害する」、「下方制御する」または「低減する」は、遺伝子発現に関して、遺伝子の発現、または１または２以上のタンパク質またはタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子または同等のＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）のレベル、または１または２以上のタンパク質またはタンパク質サブユニットの活性が、阻害因子（核酸分子、例えばｓｉＮＡ、例えば、本明細書に記載の構造的特徴を有するものなど）の非存在下で観察されるものよりも低減していることを意味し、例えば、発現は、インヒビターの非存在下で観察されるものの９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％またはそれ未満に低減していてもよい。
【図面の簡単な説明】
【０２１３】
【図１】図１は、ＮＲＫ細胞を用いたin vitroでのｇｐ４６−ｓｉＲＮＡの効果の評価、および最適配列、タイミング、および濃度の決定についてのプロトコルを示した図である。
【０２１４】
【図２】図２は、ｇｐ４６とアクチンのウエスタンブロッティングの結果を示した写真図である（２４時間培養、最適配列の検討）。
【０２１５】
【図３】図３は、ｇｐ４６とアクチンのウエスタンブロッティングの結果を示した写真図である（２４時間培養、最適濃度の検討）。
【０２１６】
【図４】図４は、ｇｐ４６とアクチンのウエスタンブロッティングの結果を示した写真図である（濃度５０ｎＭ、最適培養時間の検討）。
【０２１７】
【図５】図５は、ＮＲＫ細胞における、ｇｐ４６−ｓｉＲＮＡによるコラーゲン発現の阻害を評価するためのプロトコルを示した図である。
【０２１８】
【図６】図６は、ｓｉＲＮＡによるコラーゲン合成の阻害を示したグラフである。
【０２１９】
【図７】図７は、ＨＳＣ特異的ｓｉＲＮＡトランスフェクションを示した写真図である。
【０２２０】
【図８】図８は、ＨＳＣ特異的ｓｉＲＮＡトランスフェクションのパーセンテージを評価するための写真図である。
【０２２１】
【図９】図９は、ｓｉＲＮＡによるｇｐ４６発現の阻害を評価するための写真図である。
【０２２２】
【図１０】図１０は、ＤＭＮを投与したラット肝臓のアザン染色を示した写真図である。
【０２２３】
【図１１】図１１は、ＬＣラットの処置プロトコルを示した図である。
【０２２４】
【図１２】図１２は、ＶＡ−Ｌｉｐ−ｇｐ４６ｓｉＲＮＡを投与したＬＣラット肝臓のアザン染色を示した写真図である。
【０２２５】
【図１３】図１３は、ＮＩＨ画像によって染色部分を抽出するための方法を示した図である（アザン染色画像から６つの部位をランダムに選択）。
【０２２６】
【図１４】図１４は、肝臓組織における線維化部分が占める面積の比率を示したグラフである（コラーゲンの面積比率、％）。
【０２２７】
【図１５】図１５は、肝臓組織におけるヒドロキシプロリンの量を示したグラフである。
【０２２８】
【図１６】図１６は、ＶＡ−Ｌｉｐ−ｇｐ４６ｓｉＲＮＡを門脈内投与した肝硬変ラットの生存曲線を示したグラフである。
【０２２９】
【図１７】図１７は、ＶＡ−Ｌｉｐ−ｇｐ４６ｓｉＲＮＡを門脈内投与した肝硬変ラットの肝臓組織のアザン染色を示した写真図である。
【０２３０】
【図１８】図１８は、ＶＡ−Ｌｉｐ−ｇｐ４６ｓｉＲＮＡを門脈内投与した肝硬変ラットの生存曲線を示したグラフである。
【０２３１】
【図１９】図１９は、ＶＡ−Ｌｉｐ−ｇｐ４６ｓｉＲＮＡを門脈内投与した肝硬変ラットの肝臓組織のアザン染色を示した写真図である。
【０２３２】
【図２０】図２０は、ＶＡ−Ｌｉｐ−ｇｐ４６ｓｉＲＮＡを静脈内投与した肝硬変ラットの生存曲線を示したグラフである。
【０２３３】
【図２１】図２１は、ＶＡ−Ｌｉｐ−ｇｐ４６ｓｉＲＮＡを静脈内投与した肝硬変ラットの生存曲線を示したグラフである。
【０２３４】
【図２２】図２２は、ＶＡ−Ｌｉｐ−ｇｐ４６ｓｉＲＮＡを静脈内投与した肝硬変ラットの肝臓組織のアザン染色を示した写真図である。
【０２３５】
【図２３】図２３は、ＶＡ−Ｌｉｐ−ｇｐ４６ｓｉＲＮＡトランスフェクション効率の、ＲＢＰによる改善を示した図である。
【０２３６】
【図２４】図２４は、ＶＡ−Ｌｉｐ−ｇｐ４６ｓｉＲＮＡトランスフェクションの、抗ＲＢＰ抗体による阻害を示した図である。
【０２３７】
【図２５】図２５は、ＧＦＰｓｉＲＮＡの種々のレポーター細胞系に対する効果を示した棒グラフである。細胞系は、ヒトＨＳＰ４７  ｃＤＮＡ−ＧＦＰまたはラットＧＰ４６  ｃＤＮＡ−ＧＦＰコンストラクトの、ＨＥＫ２９３、ヒト線維肉腫細胞系ＨＴ１０８０、ヒトＨＳＣ系ｈＴＥＲＴまたはＮＲＫ細胞系へのレンチウイルスによる導入により確立した。陰性対照ｓｉＮＡまたはＧＦＰに対するｓｉＮＡを細胞に導入し、ＧＦＰ蛍光を測定した。結果は、ＧＦＰに対するｓｉＮＡが、異なる細胞系において異なる程度に蛍光をノックダウンすることを示した。トランスフェクションの容易性および蛍光ノックダウンへの感受性により、２９３＿ＨＳＰ４７−ＧＦＰおよび２９３＿ＧＰ４６−ＧＦＰ細胞系をｓｉＨｓｐ４７スクリーニングのために選択した。
【０２３８】
【図２６】図２６Ａ、２６Ｂ、２６Ｃおよび２６Ｄは、２９３＿ＨＳＰ４７−ＧＦＰおよび２９３＿ＧＰ４６−ＧＦＰ細胞系における、種々のｓｉＨｓｐ４７の細胞障害性およびノックダウン効率を示した一連の棒グラフである。結果は、ｓｉＨｓｐ４７−Ｃ、ｓｉＨｓｐ４７−２およびｓｉＨｓｐ４７−２ｄが、実質的な細胞障害作用なしに、ヒトＨＳＰ４７およびラットＧＰ４６（ヒトｈｓｐ４７ホモログ）の両方を効果的にノックダウンすることを示した。ＧＰ４６に対するｓｉＧｐ４６Ａは、ヒトＨＳＰ４７をノックダウンしない。さらに、新しく設計されたｓｉＨｓｐ４７は、ラットＧＰ４６のノックダウンに関して、ｓｉＧｐ４６Ａを上回った。
【０２３９】
【図２７】図２７は、ヒトＨＳＣ細胞系ｈＴＥＲＴを用いてTaqMan(R)ｑＰＣＲにより測定した、ｈｓｐ４７  ｍＲＮＡに対する種々のｓｉＨｓｐ４７のノックダウン効果を示した棒グラフである。Ｙ軸は、ｈｓｐ４７の残存するｍＲＮＡレベルを表す。試験した全てのｈｓｐ４７  ｓｉＮＡの中で、ＨＳＰ４７−Ｃが最も効果的であった。
【０２４０】
【図２８】図２８は、ｈＴＥＲＴ細胞におけるコラーゲンＩ発現に対する、様々なｈｓｐ４７  ｓｉＮＡの効果を示した棒グラフである。コラーゲンＩ  ｍＲＮＡのレベルは、TaqMan(R)プローブを用いたリアルタイム定量ＰＣＲで測定した。Ｙ軸は、コラーゲンＩの残存するｍＲＮＡ発現レベルを表す。結果は、コラーゲンＩ  ｍＲＮＡレベルが、候補の一部（ｓｉＨｓｐ４７−２、ｓｉＨｓｐ４７−２ｄ、および、これらとｓｉＨｓｐ４７−１との組合せ）で処置した細胞において顕著に低下していることを示した。
【０２４１】
【図２９】図２９は、ｓｉＨＳＰ４７で処置した動物における肝臓の線維化領域の減少を示したグラフである。
【０２４２】
【図３０】図３０は、例２２で使用した処置のスケジュールおよび評価方法の模式図である。
【０２４３】
【図３１】図３１は、肺野におけるアザンによる組織染色の結果を示した図である。写真は、８０倍の倍率での、各群のアザン染色切片の代表的な肺野を示す。（ａ）前処置（ＢＬＭ  ＩＴ−２Ｗ）、（ｂ）疾患ラット（ＢＬＭ  ＩＴ−５Ｗ＋ＰＢＳ静脈内）、および（ｃ）処置（ＢＬＭ  ＩＴ＋ｓｉＲＮＡ静脈内）、（ｄ）シャム（生理食塩水−ＩＴ＋ＰＢＳ静脈内）。
【０２４４】
【図３２】図３２は線維症のスコアを示した図であり、各ラットについて、８０倍の倍率でランダムに選択された２０の肺野の評価結果を示す。棒グラフは、各群のアザン染色切片の線維症スコアをまとめたものである。統計分析には、Prism5ソフトウェアを使用した一元配置ＡＮＯＶＡボンフェローニ多重比較テストを用いた。
【発明を実施するための形態】
【０２４５】
発明の詳細な説明
ＲＮＡ干渉およびｓｉＮＡ核酸分子
ＲＮＡ干渉は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって誘導される、動物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを指す（Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33、Fire et al., 1998, Nature, 391, 806、Hamilton et al., 1999, Science, 286, 950-951、Lin et al., 1999, Nature, 402, 128-129、Sharp, 1999, Genes & Dev., 13:139-141およびStrauss, 1999, Science, 286, 886）。細胞におけるｄｓＲＮＡの存在は、未だに完全には特徴づけられていないメカニズムを通してＲＮＡｉ反応を引き起こす。
【０２４６】
ダイサーは、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られるｄｓＲＮＡの短い部分への、ｄｓＲＮＡのプロセッシングに関与している（Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33、Bass, 2000, Cell, 101, 235、Berstein et al., 2001, Nature, 409, 363）。ダイサー活性に由来するｓｉＲＮＡは、長さが約２１〜約２３ヌクレオチドであることができ、約１９塩基対の二重鎖を含む（Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33、Elbashir et al., 2001, Genes Dev., 15, 188）。ダイサーはまた、翻訳調節に関与する保存された構造の前駆体ＲＮＡからの、２１および２２ヌクレオチドの短鎖一過性ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）の切り出しにも関与している（Hutvagner et al., 2001, Science, 293, 834）。ＲＮＡｉ反応はまた、一般にＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と称されるエンドヌクレアーゼ複合体を特徴とし、これはｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を誘導する。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央で生じる（Elbashir et al., 2001, Genes Dev., 15, 188）。
【０２４７】
ＲＮＡｉは、種々の系で研究されている。Fire et al., 1998, Nature, 391, 806は、C. elegansにおいてＲＮＡｉを観察した最初のものであった。Bahramian and Zarbl, 1999, Molecular and Cellular Biology, 19, 274-283およびWianny and Goetz, 1999, Nature Cell Biol., 2, 70は、哺乳動物の系におけるｄｓＲＮＡによって誘導されるＲＮＡｉを記載している。Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494およびTuschl et al., WO 01/75164は、ヒト胎児腎臓細胞とＨｅＬａ細胞を含む培養哺乳動物細胞への合成２１ヌクレオチドＲＮＡの二重鎖の導入によって誘導されるＲＮＡｉを記載している。最近の研究（Elbashir et al., 2001, EMBO J., 20, 6877およびTuschl et al., WO 01/75164）は、ｓｉＲＮＡの長さ、構造、化学組成および効果的なＲＮＡｉ活性を誘導するために重要な配列に関する、特定の必要条件を明らかにした。
【０２４８】
核酸分子（例えば、本明細書に記載の構造特徴を有するもの）は、配列特異的にＲＮＡ干渉「ＲＮＡｉ」または遺伝子サイレンシングを誘導することによって、遺伝子発現またはウイルス複製を阻害または下方制御することができる（例えば、Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33、Bass, 2001, Nature, 411, 428-429、Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494-498、およびKreutzer et al., WO 00/44895、Zernicka-Goetz et al., WO 0136646、Fire, WO 9932619、Plaetinck et al., WO 0001846、Mello and Fire, WO 0129058、Deschamps-Depaillette, WO 9907409、およびLi et al., WO 0044914、Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819、Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837、Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218、およびHall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237、Hutvagner and Zamore, 2002, Science, 297, 2056-60、McManus et al., 2002, RNA, 8, 842-850、Reinhart et al., 2002, Gene & Dev., 16, 1616-1626、およびReinhart & Bartel, 2002, Science, 297, 1831参照）。
【０２４９】
ｓｉＮＡ核酸分子は、２個の別々のポリヌクレオチド鎖から組み立てられてもよく、ここで一方の鎖はセンス鎖であり、他方の鎖はアンチセンス鎖であり、アンチセンス鎖とセンス鎖は自己相補性である（すなわち、各々の鎖は、他の鎖におけるヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む）。例えば、アンチセンス鎖とセンス鎖は、提供される核酸分子について、本明細書に記載の任意の長さおよび構造を有する二重鎖または二本鎖構造を形成する。例えば、ここで、二本鎖領域（二重鎖領域）は約１５〜約４９（例えば約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９）塩基対であり、アンチセンス鎖は、標的核酸分子（すなわちｈｓｐ４７  ｍＲＮＡ）におけるヌクレオチド配列またはその部分に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス鎖は、標的核酸配列またはその部分と一致するヌクレオチド配列を含む（例えば、この中の核酸分子の約１７〜約４９以上のヌクレオチドは、標的核酸またはその部分に相補的である）。
【０２５０】
一部の側面および態様において、本明細書において提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、以下でさらに詳細に解説されるように、「ＲＩＳＣ長」分子であってもよく、ダイサー基質であってもよい。
【０２５１】
ｓｉＮＡ核酸分子は、別々のセンスおよびアンチセンス配列または領域を含んでもよく、ここで、センスおよびアンチセンス領域は、当該技術分野で既知のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカー分子によって共有結合的に連結されるか、あるいはイオン相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水的相互作用および／またはスタッキング相互作用によって非共有結合的に連結されている。核酸分子は、標的遺伝子ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでもよい。核酸分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列と、標的遺伝子の発現阻害を引き起こすような様式で相互作用することができる。
【０２５２】
あるいは、ｓｉＮＡ核酸分子は、単一のポリヌクレオチドから組み立てられ、ここで、核酸分子の自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域は、核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカーによって連結されている。すなわちアンチセンス鎖およびセンス鎖は、折り畳まれて二重鎖領域を形成する（例えば、当該技術分野において周知のヘアピン構造を形成する）アンチセンス領域とセンス領域とを有する単一のポリヌクレオチドの一部である。かかるｓｉＮＡ核酸分子は、二重鎖、非対称二重鎖、ヘアピンまたは非対称ヘアピン二次構造を有し、自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を有するポリヌクレオチドであってもよく、ここで、アンチセンス領域は、別個の標的核酸分子またはその部分におけるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列（例えば、ｈｓｐ４７  ｍＲＮＡの配列）に対応するヌクレオチド配列を有する。かかるｓｉＮＡ核酸分子は、２個または３個以上のループ構造と、自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を含むステムとを有する環状の一本鎖ポリヌクレオチドであってもよく、ここで、アンチセンス領域は標的核酸分子またはその部分におけるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列またはその部分に対応するヌクレオチド配列を有し、環状ポリヌクレオチドは、in vivoまたはin vitroでプロセシングされ、ＲＮＡｉを誘導することができる活性核酸分子を生成することができる。
【０２５３】
以下の命名法が、ｓｉＮＡ分子の長さとオーバーハングを記述するために当該技術分野においてしばしば用いられ、これらを本明細書および例の全体にわたって用いることができる。本明細書におけるオリゴヌクレオチドの全ての記載において、配列中のヌクレオチドの同定は、センスおよびアンチセンス鎖両方について、５’から３’の方向で行う。二重鎖に付与される名称は、オリゴマーの長さとオーバーハングの有無を示す。例えば、「２１＋２」二重鎖は、２本の核酸鎖を含み、その両方が２１ヌクレオチドの長さであり（２１ｍｅｒ  ｓｉＲＮＡ二重鎖または２１ｍｅｒ核酸とも呼ばれる）、２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有する。「２１−２」のデザインは、２ヌクレオチドの５’オーバーハングを有する２１ｍｅｒ核酸二重鎖を指す。２１−０のデザインは、オーバーハングを有しない（平滑な）２１ｍｅｒ核酸二重鎖である。「２１＋２ＵＵ」は２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有し、３’末端の２ヌクレオチドが両方ともＵ残基である、２１ｍｅｒ二重鎖である（それは、標的配列とのミスマッチをもたらし得る）。前記の命名法は、様々な長さの鎖、二重鎖およびオーバーハングのｓｉＮＡ分子に適用することができる（例えば、１９−０、２１＋２、２７＋２、など）。代替的だが、類似した命名法において、「２５／２７」は、２５塩基のセンス鎖と２７塩基のアンチセンス鎖とを有し、２ヌクレオチドの３’オーバーハングを伴う非対称の二重鎖である。「２７／２５」は、２７塩基のセンス鎖と２５塩基のアンチセンス鎖とを有する非対称の二重鎖である。
【０２５４】
化学修飾
一部の側面および態様において、本明細書において提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、１または２以上の修飾（または化学修飾）を含む。特定の態様において、かかる修飾は、分子を、「非修飾」リボヌクレオチドまたは非修飾リボ核酸と称することがある、標準的なリボヌクレオチドまたはＲＮＡ分子（すなわち、標準的なアデノシン、シトシン、ウラシルまたはグアノシン部分を含むもの）とは異なるようにするところの、核酸分子またはポリヌクレオチドへの任意の変化を含む。アデノシン、シトシン、チミンまたはグアノシン部分によって代表される、２’−デオキシ糖を有する伝統的なＤＮＡ塩基およびポリヌクレオチドは、「非修飾デオキシリボヌクレオチド」または「非修飾デオキシリボ核酸」と称することができる。したがって、本明細書で用いる用語「非修飾ヌクレオチド」または「非修飾核酸」は、それと異なる明確な指示がない限り、「非修飾リボヌクレオチド」または「非修飾リボ核酸」を指す。かかる修飾は、ヌクレオチド糖、ヌクレオチド塩基、ヌクレオチドリン酸基および／またはポリヌクレオチドのリン酸骨格におけるものであってもよい。
【０２５５】
特定の態様において、本明細書に開示される修飾は、分子のＲＮＡｉ活性を増大させるため、および／または分子のin vivoでの安定性、特に血清中の安定性を増大させるため、および/または分子の生体利用能を増大させるために用いてもよい。修飾の非限定例は、ヌクレオチド間またはヌクレオシド間結合、核酸分子の任意の位置および鎖におけるデオキシヌクレオチドまたはジデオキシリボヌクレオチド、２’位における、好ましくはアミノ、フルオロ、メトキシ、アルコキシおよびアルキルから選択される修飾を有する核酸（例えばリボ核酸）、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’ＯＭｅリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、非環式ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド、ビオチン基、および末端グリセリルおよび／または逆位デオキシ無塩基残基の導入、立体障害分子、例えば、蛍光分子などを含む。他のヌクレオチド修飾因子は、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、および３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）および２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）の一リン酸ヌクレオチドを含んでもよい。種々の修飾に関するさらなる詳細は、以下でさらに詳細に解説する。
【０２５６】
修飾ヌクレオチドは、ノーザンコンフォメーション（例えば、ノーザン擬似回転サイクル、例えばSanger, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag ed., 1984参照）を有するものを含む。ノーザンコンフォメーションを有するヌクレオチドの非限定例は、ＬＮＡヌクレオチド（例えば２’−Ｏ、４’−Ｃ−メチレン−（Ｄ−リボフラノシル）ヌクレオチド）、２’−メトキシエトキシ（ＭＯＥ）ヌクレオチド、２’−メチルチオエチル、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−クロロヌクレオチド、２’−アジドヌクレオチド、および２’ＯＭｅヌクレオチドを含む。ＬＮＡは、例えば、Elman et al., 2005、Kurreck et al., 2002、Crinelli et al., 2002、Braasch and Corey, 2001、Bondensgaard et al., 2000、Wahlestedt et al., 2000、およびWO 0047599、WO 9914226、WO 9839352およびWO 04083430に記載されている。一態様において、ＬＮＡはセンス鎖の５’末端に組み込まれている。
【０２５７】
化学修飾はまたＵＮＡを含み、これはＣ２’−Ｃ３’結合が存在しない非ヌクレオチド、非環式アナログである（ＵＮＡは、真の意味でのヌクレオチドではないが、ここで考慮する「修飾」ヌクレオチドまたは修飾核酸の範囲に明示的に含まれる）。具体的な態様において、オーバーハングを有する核酸分子は、オーバーハングの位置（すなわち２ヌクレオチドオーバーハング）にＵＮＡを有するよう修飾されてもよい。他の態様において、ＵＮＡは３’または５’末端に含まれる。ＵＮＡは、核酸鎖に沿ってどこに位置してもよく、すなわち７位に位置してもよい。核酸分子は、１個または２個以上のＵＮＡを含んでもよい。例示的なＵＮＡは、Nucleic Acids Symposium Series No. 52 p. 133-134 (2008)に開示されている。特定の態様において、本明細書に記載の核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、１個または２個以上のＵＮＡ、または１個のＵＮＡを含む。一部の態様において、本明細書に記載の３’オーバーハングを有する核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、３’オーバーハングに１個または２個のＵＮＡを含む。一部の態様において、本明細書に記載の核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、アンチセンス鎖、例えばアンチセンス鎖の６位または７位に、ＵＮＡ（例えば１個のＵＮＡ）を含む。化学修飾はまた、非対合ヌクレオチドアナログ、例えば、本明細書に開示されるものを含む。化学修飾はさらに、本明細書に開示される非定型部分をさらに含む。
【０２５８】
化学修飾はまた、オリゴヌクレオチドの５’および／または３’部分に末端修飾を含み、これはキャッピング部分としても知られる。かかる末端修飾は、ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、脂質、ペプチドおよび糖から選択される。
【０２５９】
化学修飾はまた、６員の「６員環ヌクレオチドアナログ」を含む。６員環ヌクレオチドアナログの例は、Allart, et al., Nucleosides & Nucleotides, 1998, 17:1523-1526およびPerez-Perez, et al., 1996, Bioorg. and Medicinal Chem Letters 6:1457-1460に開示されている。ヘキシトールおよびアルトリトールヌクレオチドモノマーを含む６員環ヌクレオチドアナログは、WO 2006047842に開示されている。
【０２６０】
化学修飾はまた、正常な天然に存在するヌクレオチドと比較して逆のキラリティーを有する「ミラー」ヌクレオチドを含む。つまり、ミラーヌクレオチドは、天然に存在するＤ−ヌクレオチドのＬ−ヌクレオチドアナログであってもよい（US 6602858参照）。ミラーヌクレオチドは、少なくとも１つの糖または塩基修飾および／または骨格修飾、例えば、本明細書に記載のもの、例えば、ホスホロチオエートまたはホスホネート部分などをさらに含んでもよい。US 6602858は、少なくとも１個のＬ−ヌクレオチド置換を含む核酸触媒を開示している。ミラーヌクレオチドは、例えば、Ｌ−ＤＮＡ（Ｌ−デオキシリボアデノシン−３’−ホスフェート（ミラーｄＡ）、Ｌ−デオキシリボシチジン−３’−ホスフェート（ミラーｄＣ）、Ｌ−デオキシリボグアノシン−３’−ホスフェート（ミラーｄＧ）、Ｌ−デオキシリボチミジン−３’−ホスフェート（鏡像チミジン））およびＬ−ＲＮＡ（Ｌ−リボアデノシン−３’−ホスフェート（ミラーｒＡ）、Ｌ−リボシチジン−３’−ホスフェート（ミラーｒＣ）、Ｌ−リボグアノシン−３’−ホスフェート（ミラーｒＧ）、Ｌ−リボウラシル−３’−ホスフェート（ミラーｄＵ）を含む。
【０２６１】
一部の態様において、修飾リボヌクレオチドは、修飾デオキシリボヌクレオチド、例えば、５’末端位（１位）におけるヌクレオチドとして有用たり得る５’ＯＭｅ  ＤＮＡ（５−メチル−デオキシリボグアノシン−３’−ホスフェート）、ＰＡＣＥ（デオキシリボアデノシン  ３’ホスホノアセテート、デオキシリボシチジン  ３’ホスホノアセテート、デオキシリボグアノシン  ３’ホスホノアセテート、デオキシリボチミジン  ３’ホスホノアセテート）を含む。
【０２６２】
修飾は、本明細書に開示される核酸分子の１または２以上の鎖、例えば、センス鎖、アンチセンス鎖または両方の鎖に存在してもよい。特定の態様において、アンチセンス鎖は修飾を含んでもよく、センス鎖は非修飾ＲＮＡのみを含んでもよい。
【０２６３】
核酸塩基
本明細書に開示される核酸の核酸塩基は、非修飾リボヌクレオチド（プリンおよびピリミジン）、例えばアデニン、グアニン、シトシン、ウラシルを含んでもよい。一方または両方の鎖の核酸塩基は、天然核酸塩基および合成核酸塩基、例えばチミン、キサンチン、ヒポキサンチン、イノシン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチル誘導体および他のアルキル誘導体、任意の「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、アデニンおよびグアニンの２−プロピル誘導体および他のアルキル誘導体、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよび５−置換シトシン、７−メチルグアニン、デアザプリン、プリンおよびピリミジンの複素環置換アナログ、例えばアミノエチオキシフェノキサジン、プリンおよびピリミジンの誘導体（例えば１−アルキル誘導体、１−アルケニル誘導体、複素芳香環誘導体および１−アルキニル誘導体）およびその互変異性体、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、７−ジアザキサンチン、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、５（１−プロピニル）ウラシル、５−（１−プロピニル）シトシンおよび４，４−エタノシトシンなどにより修飾されていてもよい。好適な塩基の他の例は、非プリン塩基および非ピリミジン塩基、例えば２−アミノピリジンおよびトリアジンなどを含む。
【０２６４】
糖部分
本明細書に開示される核酸の糖部分は、何ら修飾のない２’−ヒドロキシル−ペントフラノシル糖部分を含んでもよい。あるいは、糖部分は修飾されていてもよく、例えば２’−デオキシ−ペントフラノシル糖部分、Ｄ−リボース、ヘキソース、ペントフラノシル糖部分の２’位における修飾、例えば、２’−Ｏ−アルキル（２’ＯＭｅおよび２’−Ｏ−エチルを含む）、すなわち２’−アルコキシ、２’−アミノ、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｓ−アルキル、２’−ハロゲン（２’−フルオロ、２’−クロロおよび２’−ブロモを含む）、２’−メトキシエトキシ、２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−Ｏ−２−メトキシエチル、２’−アリルオキシ（−ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−プロパルギル、２’−プロピル、エチニル、エテニル、プロペニル、ＣＦ、シアノ、イミダゾール、カルボキシレート、チオエート、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリルまたはアラルキル、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキル、Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルケニル、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノまたは置換シリル、特に、例えば、欧州特許EP 0586520またはEP 0618925に記載のものなどであってもよい。
【０２６５】
アルキル基は、飽和脂肪族基を含み、これは直鎖アルキル基（例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなど）、分枝鎖アルキル基（イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチルなど）、シクロアルキル（脂環式）基（シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル）、アルキル置換シクロアルキル基を含む。特定の態様において、直鎖または分枝鎖アルキルはその骨格に６個またはそれ未満の炭素原子を有し（例えば、直鎖についてはＣ１〜Ｃ６、分枝鎖についてはＣ３〜Ｃ６）、より好ましくは４個またはそれ未満の炭素原子を有する。同様に、好ましいシクロアルキルは、その環構造中に３〜８個の炭素原子を有してもよく、より好ましくは５個または６個の炭素を環構造中に有してもよい。用語Ｃ１〜Ｃ６は、１〜６個の炭素原子を含有するアルキル基を含む。アルキル基は、置換アルキル基、例えば、炭化水素骨格の１個または２個以上の炭素上で水素に置換する置換基を有するアルキル部分であってもよい。かかる置換基は、例えば、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、硫酸塩、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリールまたは、芳香族部分または複素環式芳香族部分を含んでもよい。
【０２６６】
アルコキシ基は、酸素原子に共有結合的に連結した、置換および非置換アルキル、アルケニルおよびアルキニル基を含む。アルコキシ基の例は、メトキシ、エトキシ、イソプロピルオキシ、プロポキシ、ブトキシおよびペントキシ基を含む。置換アルコキシ基の例は、ハロゲン化アルコキシ基を含む。アルコキシ基は、例えば、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、硫酸塩、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリールまたは芳香族部分または複素環式芳香族部分で置換されていてもよい。ハロゲン置換アルコキシ基の例は、限定されずに、フルオロメトキシに、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、クロロメトキシ、ジクロロメトキシ、トリクロロメトキシなどを含む。
【０２６７】
一部の態様において、ペントフラノシル環は、ペントフラノシル環のＣ２’−Ｃ３’結合を欠く非環式誘導体と置き換わっていてもよい。例えば、アシクロヌクレオチドは、ｄＮＭＰに通常存在する２’−デオキシリボフラノシル糖の２’−ヒドロキシエトキシメチル基と置換してもよい。
【０２６８】
ハロゲンは、フッ素、臭素、塩素、ヨウ素を含む。
【０２６９】
骨格
本明細書に開示される核酸のヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合によって互いに連結されていてもよい。ホスホジエステル結合は、任意に、他の結合で置換されていてもよい。例えば、ホスホロチオエート、チオリン酸−Ｄ−リボース体、トリエステル、チオエート、２’−５’架橋骨格（５’−２’または２’５’ヌクレオチドまたは２’５’リボヌクレオチドとも称する）、ＰＡＣＥ、３’−（または−５’）デオキシ−３’−（または−５’）チオ−ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、３’−（または−５’）デオキシホスフィネート、ボラノホスフェート、３’−（または−５’）デオキシ−３’−（または５’−）アミノホスホルアミデート、水素ホスホネート、ホスホネート、ボラノリン酸エステル、ホスホルアミデート、アルキルまたはアリールホスホネートおよびホスホトリエステル修飾、アルキルホスホトリエステル、ホスホトリエステルリン結合、５’−エトキシホスホジエステル、Ｐ−アルキルオキシホスホトリエステル、メチルホスホネートなど、および非リン含有結合、例えば、炭酸塩、カルバメート、シリル、硫黄、スルホネート、スルホンアミド、ホルムアセタール、チオホルムアセチル、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾおよびメチレンオキシメチルイミノなどである。
【０２７０】
本明細書に開示される核酸分子は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格を含んでもよい。ＰＮＡ骨格は、ペプチド結合で連結されたＮ（２−アミノエチル）グリシン単位の繰り返しを含む。種々の塩基、例えば、プリン、ピリミジン、天然および合成塩基は、メチレンカルボニル結合によって骨格に連結している。
【０２７１】
末端ホスフェート
修飾は、末端リン酸基でなされてもよい。様々な安定化化学の非限定例を、例えば、核酸配列の３’末端を安定させるのに用いてもよく、これは、（３’−３’）−逆位デオキシリボース、デオキシリボヌクレオチド、（５’−３’）−３’−デオキシリボヌクレオチド、（５’−３’）−リボヌクレオチド、（５’−３’）−３’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、３’−グリセリル、（３’−５’）−３’−デオキシリボヌクレオチド、（３’−３’）−デオキシリボヌクレオチド、（５’−２’）−デオキシリボヌクレオチド、および（５’−３’）−ジデオキシリボヌクレオチドを含む。さらに、非修飾骨格化学は、本明細書に記載の１または２以上の異なる骨格修飾と組み合わせることができる。
【０２７２】
例示的な化学的に修飾した末端リン酸基は、以下に示すものを含む：
【化１７】
0005873168.tif 000019
【０２７３】
結合体（conjugate）
本明細書で提供される修飾ヌクレオチドおよび核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は結合体、例えば化学修飾核酸分子に共有結合的に付着した結合体を含んでもよい。結合体の非限定例は、Vargeese et al., U.S. Ser. No. 10/427,160に記載の結合体およびリガンドを含む。結合体は、生分解可能なリンカーを介して核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）に共有結合的に付着していてもよい。結合体分子は、化学修飾核酸分子のセンス鎖、アンチセンス鎖のいずれか一方または両方の鎖の３’末端に付着していてもよい。結合体分子は、化学修飾核酸分子のセンス鎖、アンチセンス鎖のいずれか一方または両方の鎖の５’末端に付着していてもよい。結合体分子は、化学修飾核酸分子のセンス鎖、アンチセンス鎖のいずれか一方または両方の鎖の３’末端および５’末端の両方に付着していてもよく、またはこれらの任意の組合せであってもよい。一態様において、結合体分子は、生物系（例えば細胞）への化学修飾核酸分子の送達を容易にする分子を含んでもよい。別の態様において、化学修飾核酸分子に付着する結合体分子は、ポリエチレングリコール、ヒト血清アルブミンまたは細胞取り込みを誘導することができる細胞レセプターに対するリガンドである。化学修飾核酸分子に付着することができる、本明細書で企図される具体的な結合体分子の例は、Vargeese et al., U.S. Ser. No. 10201394に記載されている。
【０２７４】
リンカー
本明細書において提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ）は、核酸のセンス領域と核酸のアンチセンス領域とを連結する、ヌクレオチドリンカー、非ヌクレオチドリンカー、またはにヌクレオチド／非ヌクレオチド複合リンカーを含んでもよい。ヌクレオチドリンカーは、長さが≧２ヌクレオチド、例えば長さが約３、４、５、６、７、８、９、１０ヌクレオチドのリンカーであってもよい。ヌクレオチドリンカーは、核酸アプタマーであってもよい。本明細書で用いる「アプタマー」または「核酸アプタマー」は、標的分子に特異的に結合する核酸分子を指し、ここで、前記核酸分子は、標的分子がその天然の状態で認識する配列を含む配列を有する。あるいは、アプタマーは、標的分子が天然では核酸と結合しない標的分子（例えばｈｓｐ４７  ｍＲＮＡ）に結合する核酸分子であってもよい。例えば、アプタマーはタンパク質のリガンド結合領域と結合することに用いることができ、それによって天然に存在するリガンドのタンパク質との相互作用を防止する。これは非限定例であり、当業者は、他の態様が、当該技術分野において一般的に知られている技術を用いて容易に生成できることを認識している。例えば、Gold et al., 1995, Annu. Rev. Biochem., 64, 763、Brody and Gold, 2000, J. Biotechnol., 74, 5、Sun, 2000, Curr. Opin. Mol. Ther., 2, 100、Kusser, 2000, J. Biotechnol., 74, 27、Hermann and Patel, 2000, Science, 287, 820およびJayasena, 1999, Clinical Chemistry, 45, 1628参照。
【０２７５】
非ヌクレオチドリンカーは、無塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素または他の高分子化合物（例えばポリエチレングリコール（例えば、２〜１００エチレングリコール単位を有するもの））を含んでもよい。具体的な例は、Seela and Kaiser, Nucleic Acids Res. 1990, 18:6353およびNucleic Acids Res. 1987, 15:3113、Cload and Schepartz, J. Am. Chem. Soc. 1991, 113:6324、Richardson and Schepartz, J. Am. Chem. Soc. 1991, 113:5109、Ma et al., Nucleic Acids Res. 1993, 21:2585およびBiochemistry 1993, 32:1751、Durand et al., Nucleic Acids Res. 1990, 18:6353、McCurdy et al., Nucleosides & Nucleotides 1991, 10:287、Jschke et al., Tetrahedron Lett. 1993, 34:301、Ono et al., Biochemistry 1991, 30:9914、Arnold et al., WO 8902439、Usman et al., WO 9506731、Dudycz et al., WO 9511910 およびFerentz and Verdine, J. Am. Chem. Soc. 1991, 113:4000に記載されたものを含む。
【０２７６】
５’末端、３’末端およびオーバーハング
本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、両端が平滑であっても、両端にオーバーハングを有しても、または平滑末端およびオーバーハング末端の組合せを有してもよい。オーバーハングは、センス鎖またはアンチセンス鎖の５’末端または３’末端のいずれかに存在してもよい。
【０２７７】
二本鎖核酸分子（例えばｓｉＮＡ）の５’末端および／または３’末端は、平滑末端であっても、オーバーハングを有してもよい。５’末端は平滑末端であってもよく、３’末端は、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかにおいてオーバーハングを有する。他の態様において、３’末端は平滑末端であってもよく、５’末端はセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかにおいてするオーバーハングを有する。さらに他の態様においては、５’末端および３’末端の両方が平滑末端であるか、５’末端および３’末端の両方がオーバーハングを有する。
【０２７８】
核酸の一方または両方の鎖の５’末端および／または３’末端は、フリーのヒドロキシル基を含んでもよい。任意の核酸分子の鎖の５’末端および／または３’末端は、化学修飾を含むように改変されていてもよい。かかる修飾は核酸分子を安定させることができ、例えば、３’末端は核酸分子修飾の存在により安定性が増大していてもよい。末端修飾（例えば末端キャップ）の例は、限定されずに、無塩基、デオキシ無塩基、逆位（デオキシ）無塩基、グリセリル、ジヌクレオチド、非環式ヌクレオチド、アミノ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ＣＮ、ＣＦ、メトキシ、イミダゾール、カルボキシレート、チオエート、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリルまたはアラルキル、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキル、Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルケニル、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノまたは置換シリル、特に、欧州特許EP 586520およびEP 618925に記載のもの、および本明細書に開示される他の修飾を含む。
【０２７９】
核酸分子は、平滑末端、すなわちオーバーハングヌクレオチドを全く含まない末端を有するものを含む。核酸分子は、１個または２個以上の平滑末端を含むことができる。平滑末端核酸分子は、核酸分子の各々の鎖に存在するヌクレオチドの数に等しい数の塩基対を有する。核酸分子は１個の平滑末端を含むことができ、例えば、ここで、アンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖の３’末端はオーバーハングヌクレオチドを全く有しない。核酸分子は１個の平滑末端を含んでもよく、例えば、ここで、アンチセンス鎖の３’末端とセンス鎖の５’末端はオーバーハングヌクレオチドを全く有しない。核酸分子は２個の平滑末端を含んでもよく、例えば、ここで、アンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖の３’末端、ならびに、アンチセンス鎖の３’末端とセンス鎖の５’末端はオーバーハングヌクレオチドを全く有しない。平滑末端核酸分子に存在する他のヌクレオチドは、例えば、ＲＮＡ干渉を誘導するための核酸分子の活性を調節するための、ミスマッチ、バルジ、ループまたはゆらぎ（wobble）塩基対を含んでもよい。
【０２８０】
本明細書において提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）の特定の態様において、分子の少なくとも一端は、少なくとも１ヌクレオチドのオーバーハング（例えば、１〜８個のオーバーハングヌクレオチド）を有する。例えば、本明細書に開示される二本鎖核酸分子の一方または両方の鎖は、５’末端または３’末端または両方にオーバーハングを有してもよい。オーバーハングは、核酸分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖の一方または両方に存在してもよい。オーバーハングの長さは、わずか１ヌクレオチドであっても、１〜８ヌクレオチド程度またはそれを超えてもよく（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８ヌクレオチド）、一部の好ましい態様において、オーバーハングは２、３、４、５、６、７または８ヌクレオチドであり、例えば、オーバーハングは２ヌクレオチドであってもよい。オーバーハングを形成する１個または２個以上のヌクレオチドは、１個または２個以上のデオキシリボヌクレオチド、１個または２個以上のリボヌクレオチド、天然もしくは非天然核酸塩基、または糖、塩基もしくはリン酸基が修飾された任意のヌクレオチド、例えば本明細書に開示されるものなどを含んでもよい。二本鎖核酸分子は、５’オーバーハングおよび３’オーバーハングの両方を有してもよい。５’末端および３’末端のオーバーハングは、異なる長さであってもよい。オーバーハングは少なくとも１個の核酸修飾を含んでもよく、それはデオキシリボヌクレオチドであってもよい。１個または２個以上のデオキシリボヌクレオチドが５’末端にあってもよい。核酸分子のそれぞれの反対鎖（counter-strand）の３’末端は、オーバーハングを有さなくてもよく、より好ましくはデオキシリボヌクレオチドオーバーハングを有さなくてもよい。１個または２個以上のデオキシリボヌクレオチドは、３’末端にあってもよい。ｄｓＲＮＡのそれぞれの反対鎖の５’末端は、オーバーハングを有さなくてもよく、より好ましくはデオキシリボヌクレオチドオーバーハングを有さなくてもよい。好ましくは、鎖の５’末端または３’末端のいずれかにおけるオーバーハングは、１〜８個（例えば、約１、２、３、４、５、６、７または８個）の不対ヌクレオチドであってもよく、オーバーハングは２〜３個の不対ヌクレオチドであり、より好ましくは２個の不対ヌクレオチドである。核酸分子は、約１〜約２０（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１、１５、１６、１７、１８、１９または２０）、好ましくは１〜８（例えば、約１、２、３、４、５、６、７または８）ヌクレオチドのオーバーハング末端を有する二重鎖核酸分子、例えば約１９個の塩基対と３’末端モノヌクレオチド、ジヌクレオチドまたはトリヌクレオチドオーバーハングとを有する約２１ヌクレオチドの二重鎖を含んでもよい。本明細書に記載の核酸分子は、平滑末端を有する二重鎖核酸分子を含んでもよく、ここで、両端は平滑であるか、あるいは、末端の１つは平滑である。本明細書に開示される核酸分子は、１個または２個以上の平滑末端を含むことができ、すなわち、ここで、平滑末端はオーバーハングヌクレオチドを全く有しない。一態様において、平滑末端核酸分子は、核酸分子の各々の鎖に���在するヌクレオチドの数に等しい数の塩基対を有する。核酸分子は１個の平滑末端を含むことができ、例えば、ここで、アンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖の３’末端はオーバーハングヌクレオチドを全く有しない。核酸分子は１個の平滑末端を含んでもよく、例えば、ここで、アンチセンス鎖の３’末端とセンス鎖の５’末端はオーバーハングヌクレオチドを全く有しない。核酸分子は２個の平滑末端を含んでもよく、例えば、ここで、アンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖の３’末端、ならびに、アンチセンス鎖の３’末端とセンス鎖の５’末端はオーバーハングヌクレオチドを全く有しない。一部の好ましい態様において、核酸化合物は平滑末端を有する。平滑末端ｓｉＮＡ分子に存在する他のヌクレオチドは、例えば、ＲＮＡ干渉を誘導するための核酸分子の活性を調節するための、ミスマッチ、バルジ、ループまたはゆらぎ塩基対を含んでもよい。
【０２８１】
多くの態様において、本明細書に記載の核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）の、１個もしくは２個以上、または、全てのオーバーハングヌクレオチドは、本明細書に記載のとおりに修飾されており、例えば、１個もしくは２個以上、または全てのヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドであってもよい。
【０２８２】
修飾の数、位置およびパターン
本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、核酸分子に存在するヌクレオチドの総数の一定パーセンテージで、修飾ヌクレオチドを含んでもよい。このように、核酸分子は、約５％〜約１００％の修飾ヌクレオチド（例えば約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の修飾ヌクレオチド）を含んでもよい。所定の核酸分子に存在する修飾ヌクレオチドの実際のパーセンテージは、核酸に存在するヌクレオチドの総数に依存する。核酸分子が一本鎖の場合、パーセント修飾は一本鎖核酸分子に存在するヌクレオチドの総数に基づくことができる。同様に、核酸分子が二本鎖の場合、パーセント修飾はセンス鎖、アンチセンス鎖またはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方に存在するヌクレオチドの総数に基づくことができる。
【０２８３】
本明細書に開示される核酸分子は、核酸分子における総ヌクレオチドの一定パーセンテージで、非修飾ＲＮＡを含んでもよい。このように、核酸分子は約５％〜約１００％の修飾ヌクレオチド（例えば、核酸分子に存在する総ヌクレオチドの約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％）を含んでもよい。
【０２８４】
核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、約１個〜約５個、具体的には約１、２、３、４または５個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１個または２個以上（例えば、約１、２、３、４、５個または６個以上）の２’−デオキシ、２’ＯＭｅ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、および／または１個または２個以上（例えば、約１、２、３、４、５個または６個以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチド、および任意に、センス鎖の３’末端、５’末端または３’末端および５’末端の両方に末端キャップ分子を含むセンス鎖を含んでもよく、ここで、アンチセンス鎖は、約１個〜約５個、具体的には約１、２、３、４、５個または６個以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１個または２個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個または１１個以上）の２’−デオキシ、２’ＯＭｅ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、および／または１個または２個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個または１１個以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチド、および任意に、アンチセンス鎖の３’末端、５’末端または３’末端および５’末端の両方に末端キャップ分子を含む。核酸分子は、２’−デオキシ、２’ＯＭｅおよび／または２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学的に修飾され、約１個〜約５個または６個以上、例えば、約１、２、３、４、５個または６個以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、または有しない、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個または１１個以上の、センス鎖および／またはアンチセンス核酸鎖のピリミジンヌクレオチド、および／または、３’末端、５’末端、または、同じ鎖もしくは異なる鎖に存在する３’末端および５’末端の両方における末端キャップ分子を含んでもよい。
【０２８５】
核酸分子は、約１個〜約５個または６個以上（具体的には、約１、２、３、４、５個または６個以上）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を核酸分子の各々の鎖に含んでもよい。
【０２８６】
核酸分子は、２’−５’ヌクレオチド間結合を、例えば、一方または両方の核酸配列鎖の３’末端、５’末端または３’末端および５’末端の両方に含んでもよい。さらに、１個または２個以上の２’−５’ヌクレオチド間結合は、一方または両方の核酸配列鎖内の他の様々な位置に存在してもよく、ヌクレオチド間にそのうえ、分子が含むことができる、例えば、ｓｉＮＡ分子の一方または両方の鎖におけるピリミジンヌクレオチドの全てのヌクレオチド間結合を含む１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０箇所または１１箇所以上が、２’−５’ヌクレオチド間結合を含んでもよく、または、ｓｉＮＡ分子の一方または両方の鎖におけるプリンヌクレオチドの全てのヌクレオチド間結合を含む１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０箇所または１１箇所以上が、２’−５’ヌクレオチド間結合を含んでもよい。
【０２８７】
化学修飾短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子は、アンチセンス領域に存在する任意の（例えば、１個または２個以上または全ての）ピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、または、複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである）、アンチセンス領域に存在する任意の（例えば、１個または２個以上または全ての）プリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである（例えば、全てのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか、または、複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである）アンチセンス領域を含んでもよい。
【０２８８】
化学修飾短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子は、アンチセンス領域に存在する任意の（例えば、１個または２個以上または全ての）ピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、または、複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである）、アンチセンス領域に存在する任意の（例えば、１個または２個以上または全ての）プリンヌクレオチドが２’ＯＭｅプリンヌクレオチドである（例えば、全てのプリンヌクレオチドが２’ＯＭｅプリンヌクレオチドであるか、または、複数のプリンヌクレオチドが２’ＯＭｅプリンヌクレオチドである）アンチセンス領域を含んでもよい。
【０２８９】
細胞または再構成されたin vitroの系の内部でｈｓｐ４７に対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を誘導することができる化学修飾ｓｉＮＡ分子は、センス領域に存在する１個または２個以上のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、または、複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである）、センス領域に存在する１個または２個以上のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチド（例えば、全てのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか、または、複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである）センス領域、および、アンチセンス領域に存在する１個または２個以上のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、または、複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである）、アンチセンス領域に存在する１個または２個以上のプリンヌクレオチドが２’ＯＭｅプリンヌクレオチドである（例えば、全てのプリンヌクレオチドが２’ＯＭｅプリンヌクレオチドであるか、または、複数のプリンヌクレオチドが２’ＯＭｅプリンヌクレオチドである）アンチセンス領域を含んでもよい。センス領域および／またはアンチセンス領域は、末端キャップ修飾、例えば、センス配列および／またはアンチセンス配列の３’末端、５’末端または３’末端および５’末端の両方に任意に存在する任意の修飾などを有してもよい。センス領域および／またはアンチセンス領域は、任意に、約１個〜約４個の（例えば約１、２、３または４個の）２’−デオキシヌクレオチドを有する３’末端ヌクレオチドオーバーハングをさらに含んでもよい。オーバーハングヌクレオチドは、１個または２個以上（例えば、１、２、３、４個または５個以上）のホスホロチオエート、ホスホノアセテート、および／または、チオホスホノアセテートヌクレオチド間結合をさらに含んでもよい。センス領域のプリンヌクレオチドは、代替的に２’ＯＭｅプリンヌクレオチドであってもよく（例えば、全てのプリンヌクレオチドが２’ＯＭｅプリンヌクレオチドであるか、または、複数のプリンヌクレオチドが２’ＯＭｅプリンヌクレオチドである）、アンチセンス領域に存在する１個または２個以上のプリンヌクレオチドは、２’ＯＭｅプリンヌクレオチドである（例えば、全てのプリンヌクレオチドが２’ＯＭｅプリンヌクレオチドであるか、または、複数のプリンヌクレオチドが２’ＯＭｅプリンヌクレオチドである）。センス領域の１個または２個以上のプリンヌクレオチドは、代替的にプリンリボヌクレオチドであってもよく（例えば、全てのプリンヌクレオチドがプリンリボヌクレオチドであるか、または、複数のプリンヌクレオチドがプリンリボヌクレオチドである）、アンチセンス領域に存在する任意のプリンヌクレオチドは２’ＯＭｅプリンヌクレオチドである（���えば、全てのプリンヌクレオチドが２’ＯＭｅプリンヌクレオチドであるか、または、複数のプリンヌクレオチドが２’ＯＭｅプリンヌクレオチドである）。センス領域における、および／またはアンチセンス領域に存在する１個または２個以上のプリンヌクレオチドは、代替的に、２’−デオキシヌクレオチド、ＬＮＡヌクレオチド、２’−メトキシエチルヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、および２’ＯＭｅヌクレオチドからなる群から選択されてもよい（例えば、全てのプリンヌクレオチドが２’−デオキシヌクレオチド、ＬＮＡヌクレオチド、２’−メトキシエチルヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、および２’ＯＭｅヌクレオチドからなる群から選択されるか、または、複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシヌクレオチド、ＬＮＡヌクレオチド、２’−メトキシエチルヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、および２’ＯＭｅヌクレオチドからなる群から選択される）。
【０２９０】
一部の態様において、本明細書に記載の核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、アンチセンス鎖に修飾ヌクレオチド（例えば１個の修飾ヌクレオチド）を、例えばアンチセンス鎖の６位または７位に含む。
【０２９１】
修飾パターンおよび交互する修飾
本明細書において提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、修飾核酸および非修飾核酸のパターンを有してもよい。ヌクレオチドの連続するストレッチ（stretch）におけるヌクレオチドの修飾のパターンは、単一のヌクレオチド、または、標準的なホスホジエステル結合、もしくは少なくとも部分的に、ホスホロチオエート結合を介して互いに共有結合的に連結されたヌクレオチドの群に含まれる修飾であってもよい。したがって、本明細書で企図する「パターン」は、必ずしも反復単位を伴う必要はないが、反復単位を伴ってもよい。本明細書において提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）に関連して用いることができる修飾パターンの例は、Giese、US 7452987に開示されるものを含む。例えば、本明細書において提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、例えば、Giese、US 7452987の図２に図式的に示されているパターンに類似の修飾パターン、またはそれと同じ修飾パターンを有するものを含む。
【０２９２】
修飾ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドの群はセンス鎖またはアンチセンス鎖の５’末端または３’末端にあってもよく、隣接するヌクレオチドまたはヌクレオチドの群は、修飾ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドの群の両側に配列し、隣接するヌクレオチドまたはヌクレオチドの群は非修飾であるか、前のヌクレオチドまたはヌクレオチドの群と同じ修飾は有しない。隣接するヌクレオチドまたはヌクレオチドの群は、しかしながら、異なる修飾を有してもよい。それぞれ、修飾ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドの群、および、非修飾か、異なる修飾を有するヌクレオチド、または非修飾か、異なる修飾を有するヌクレオチドの群のこの配列は、１回または２回以上繰り返されてもよい。
【０２９３】
一部のパターンにおいて、鎖の５’末端ヌクレオチドは修飾ヌクレオチドであり、一方、他のパターンにおいて、鎖の５’末端ヌクレオチドは非修飾ヌクレオチドである。一部のパターンにおいて、鎖の５’末端は修飾ヌクレオチドの群で開始し、一方、他のパターンにおいて、５’末端は、非修飾ヌクレオチドの群である。このパターンは、核酸分子の第１のストレッチもしくは第２のストレッチのいずれか、またはその両方にあってもよい。
【０２９４】
核酸分子の一方の鎖の修飾ヌクレオチドは、他方の鎖の修飾または非修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドの群に対し、位置について相補的であってもよい。
【０２９５】
修飾群が重ならないように、一方の鎖の修飾または修飾のパターンの間に、他の鎖の修飾のパターンに対する位相シフトがあってもよい。１つの例において、シフトは、センス鎖の修飾ヌクレオチドの群が、アンチセンス鎖の非修飾ヌクレオチドの群に対応するもの、およびその逆のものである。
【０２９６】
修飾群が重なるように、修飾のパターンの部分的なシフトがあってもよい。任意の所定の鎖における修飾ヌクレオチドの群は、任意に同じ長さであってもよいが、異なる長さであってもよい。同様に、任意の所定の鎖の非修飾ヌクレオチドの群は、任意に、同じ長さであっても、または異なる長さであってもよい。
【０２９７】
一部のパターンにおいて、鎖の末端の２番目の（最後から２番目の）ヌクレオチドは、非修飾ヌクレオチドであるか、または非修飾ヌクレオチドの群の始まりである。好ましくは、この非修飾ヌクレオチドまたは非修飾ヌクレオチドの群は、センス鎖およびアンチセンス鎖の一方または両方の５’末端、より一層好ましくはセンス鎖の末端に位置する。非修飾ヌクレオチドまたは非修飾ヌクレオチドの群は、センス鎖の５’末端に位置してもよい。好ましい態様において、パターンは交互する単一の修飾ヌクレオチドおよび非修飾ヌクレオチドを含む。
【０２９８】
一部の二本鎖核酸分子において、２’ＯＭｅ修飾ヌクレオチドおよび非修飾ヌクレオチド、好ましくは２’ＯＭｅ修飾されていないヌクレオチドが、両方の鎖に交互する様式で組み込まれ、その結果、２’ＯＭｅ修飾ヌクレオチドと、非修飾か、または、少なくとも２’ＯＭｅ修飾を含まないヌクレオチドが交互するパターンがもたらされる。特定の態様において、同じ２’ＯＭｅ修飾および非修飾の配列は第２の鎖に存在し、他の態様において、交互する２’ＯＭｅ修飾ヌクレオチドはセンス鎖のみに存在し、アンチセンス鎖には存在せず、さらに他の態様において、交互する２’ＯＭｅ修飾ヌクレオチドは、センス鎖のみに存在し、アンチセンス鎖には存在しない。特定の態様において、２本の鎖の間に位相シフトが存在し、例えば、第１の鎖における２’ＯＭｅ修飾ヌクレオチドは第２の鎖の１個または２個以上の非修飾ヌクレオチドと塩基対を形成し、この逆もまた同様である。この特定の配置、すなわち、両方の鎖における１個または２個以上の２’ＯＭｅ修飾ヌクレオチドおよび非修飾ヌクレオチドの塩基対形成は、特定の態様において特に好ましい。特定の態様において、交互する２’ＯＭｅ修飾ヌクレオチドのパターンは、核酸分子全体、または二重鎖領域全体にわたって存在する。他の態様において、交互する２’ＯＭｅ修飾ヌクレオチドのパターンは、核酸の部分、または二重鎖領域の部分にのみに存在する。
【０２９９】
「位相シフト」パターンにおいて、アンチセンス鎖が５’末端の２’ＯＭｅ修飾ヌクレオチドから開始し、その結果、２番目のヌクレオチドが非修飾であり、３番目、５番目、７番目といったヌクレオチドが再び２’ＯＭｅ修飾であり、２番目、４番目、６番目、８番目といったヌクレオチドが非修飾ヌクレオチドとなることが好ましいことがある。
【０３００】
修飾位置およびパターン
例示的なパターンを以下でさらに詳細に提供するが、本明細書に開示される、および、当該技術分野において既知の、核酸分子の全ての可能な特徴（例えば、特徴は、限定されずに、センス鎖の長さ、アンチセンス鎖の長さ、二重鎖領域の長さ、オーバーハングの長さ、二本鎖核酸分子の一方または両方の末端が平滑であるか、または、オーバーハングを有するか、修飾核酸の数、修飾の種類、ダブルオーバーハング核酸分子が、各側のオーバーハングに同じか、または、異なる数のヌクレオチドを有するか、核酸分子において用いられている修飾は１種類か、または１種類を超えるか、および、連続する修飾／非修飾ヌクレオチドの数を含む）を有する全てのパターンの置換が企図される。以下で提供される全ての詳細な例に関して、二重鎖領域は１９ヌクレオチドであることが示されているが、二重鎖領域の各々の鎖は独立して１７〜４９ヌクレオチドの長さであることができるため、本明細書において提供される核酸分子は１〜４９ヌクレオチドの長さの範囲の二重鎖領域を有することができる。例示的なパターンを本明細書において提供する。
【０３０１】
核酸分子は、単一の修飾核酸または修飾核酸の連続したセットを含む両方の末端に、平滑末端（ｎが０である場合）を有してもよい。修飾核酸は、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかに沿った任意の位置に位置してもよい。核酸分子は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９個の連続する修飾ヌクレオチドの群を含んでもよい。修飾核酸は、核酸鎖の１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または１００％を形成してもよい。すぐ下の例の修飾核酸は、センス鎖のみ、アンチセンス鎖のみ、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方にあってもよい。
【０３０２】
一般的な核酸パターンを以下に示し、ここで、Ｘ＝二重鎖領域におけるセンス鎖ヌクレオチド、Ｘａ＝センス鎖における５’オーバーハングヌクレオチド、Ｘｂ＝センス鎖における３’オーバーハングヌクレオチド、Ｙ＝二重鎖領域におけるアンチセンス鎖ヌクレオチド、Ｙａ＝アンチセンス鎖における３’オーバーハングヌクレオチド、Ｙｂ＝アンチセンス鎖における５’オーバーハングヌクレオチド、およびＭ＝二重鎖領域における修飾ヌクレオチドである。ａおよびｂの各々は、独立して０〜８（例えば０、１、２、３、４、５、６、７または８）である。Ｘ、Ｙ、ａおよびｂの各々は、独立して修飾または非修飾である。センス鎖およびアンチセンス鎖は、各々独立して１７〜４９ヌクレオチドの長さであることができる。以下で提供される例は、１９ヌクレオチドの二重鎖領域を有する。しかし、本明細書に開示される核酸分子は、１７〜４９ヌクレオチドの二重鎖領域をどこにでも有することができ、ここで、各々の鎖は独立して１７〜４９ヌクレオチドの長さである。
【化１８】
0005873168.tif 000020
【０３０３】
さらなる例示的な核酸分子パターンを以下に示し、ここで、Ｘ＝非修飾センス鎖ヌクレオチド、ｘ＝センス鎖における非修飾オーバーハングヌクレオチド、Ｙ＝非修飾アンチセンス鎖ヌクレオチド、ｙ＝アンチセンス鎖における非修飾オーバーハングヌクレオチド、Ｍ＝修飾ヌクレオチドである。センス鎖およびアンチセンス鎖は、各々独立して１７〜４９ヌクレオチドの長さであることができる。以下で提供される例は、１９ヌクレオチドの二重鎖領域を有する。しかし、本明細書に開示される核酸分子は、１７〜４９ヌクレオチドの二重鎖領域をどこにでも有することができ、ここで、各々の鎖は独立して１７〜４９ヌクレオチドの長さである。
【化１９】
0005873168.tif 000021
【０３０４】
核酸分子は、両方の末端に平滑末端を有し、交互する修飾核酸を伴ってもよい。修飾核酸は、センス鎖またはアンチセンス鎖に沿った任意の位置に位置してもよい。
【化２０】
0005873168.tif 000022
【０３０５】
平滑な５’末端および３’末端のオーバーハング末端を有し、単一の修飾核酸を含む核酸分子である。
【０３０６】
５’末端オーバーハングおよび平滑な３’末端を有し、単一の修飾核酸を含む核酸分子である。
【０３０７】
両方の末端にオーバーハングを有し、全てのオーバーハングが修飾核酸である核酸分子である。すぐに下のパターンにおいて、Ｍはｎ個の修飾核酸であり、ここで、ｎは０〜８の整数（すなわち０、１、２、３、４、５、６、７および８）である。
【化２１】
0005873168.tif 000023
【０３０８】
両方の末端にオーバーハングを有し、一部のオーバーハングヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである核酸分子である。すぐに下のパターンにおいて、Ｍはｎ個の修飾核酸であり、ｘはセンス鎖におけるｎ個の非修飾オーバーハングヌクレオチドであり、ｙはアンチセンス鎖におけるｎ個の非修飾オーバーハングヌクレオチドであり、ここで、各々のｎは、独立して、０〜８の整数（すなわち０、１、２、３、４、５、６、７および８）であり、各々のオーバーハングは最大２０ヌクレオチド、好ましくは最大８ヌクレオチド（修飾および／または非修飾）である。
【化２２】
0005873168.tif 000024
【化２３】
0005873168.tif 000025
センス領域の３’末端における修飾ヌクレオチド。
【化２４】
0005873168.tif 000026
センス領域の５’末端におけるオーバーハング。
【化２５】
0005873168.tif 000027
【０３０９】
アンチセンス領域の３’末端におけるオーバーハング。
【化２６】
0005873168.tif 000028
センス領域内における１個または２個以上の修飾ヌクレオチド。
【化２７】
0005873168.tif 000029
【０３１０】
例示的な核酸分子を、上記で用いた記号に沿った同等の一般構造とともに、以下に提供する：
【０３１１】
１９ヌクレオチド（すなわち１９ｍｅｒ）の二重鎖領域と、センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端における修飾２ヌクレオチド（すなわちデオキシヌクレオチド）オーバーハングとを有する、ヒトおよびラットｈｓｐ４７に対するｓｉＨＳＰ４７−Ｃ  ｓｉＲＮＡである。
【化２８】
0005873168.tif 000030
【０３１２】
２５ｍｅｒの二重鎖領域と、アンチセンス鎖の３’末端における２ヌクレオチドオーバーハングと、センス鎖の５’末端位および最後から２番目の位置における２個の修飾ヌクレオチドとを有する、ヒトおよびラットｈｓｐ４７に対するｓｉＨＳＰ４７−Ｃｄ  ｓｉＲＮＡである。
【化２９】
0005873168.tif 000031
【０３１３】
１９ｍｅｒの二重鎖領域と、センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端における修飾２ヌクレオチド（すなわちデオキシヌクレオチド）オーバーハングとを有する、ヒトおよびラットｈｓｐ４７ｃＤＮＡ  ７１９〜７３７に対するｓｉＨＳＰ４７−１  ｓｉＲＮＡである。
【化３０】
0005873168.tif 000032
【０３１４】
センス鎖の３’末端における平滑末端と、アンチセンス鎖の３’末端における２ヌクレオチドオーバーハングと、センス鎖の５’末端位および最後から２番目の位置における２個の修飾ヌクレオチドとを有する、２５ｍｅｒのヒトｈｓｐ４７ｃＤＮＡ  ７１９〜７４３に対するｓｉＨＳＰ４７−１ｄ  ｓｉＲＮＡである。
【化３１】
0005873168.tif 000033
【０３１５】
１９ｍｅｒの二重鎖領域と、センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端における修飾２ヌクレオチド（すなわちデオキシヌクレオチド）オーバーハングとを有する、ヒトｈｓｐ４７ｃＤＮＡ  ４６９〜４８７に対するｓｉＨＳＰ４７−２  ｓｉＲＮＡである。
【化３２】
0005873168.tif 000034
【０３１６】
センス鎖の３’末端における平滑末端と、アンチセンス鎖の３’末端における２ヌクレオチドオーバーハングと、センス鎖の５’末端位および最後から２番目の位置における２個の修飾ヌクレオチドとを有する、２５ｍｅｒの二重鎖領域を有するヒトｈｓｐ４７ｃＤＮＡ  ４６９〜４９３に対するｓｉＨＳＰ４７−２ｄ  ｓｉＲＮＡである。
【化３３】
0005873168.tif 000035
【０３１７】
センス鎖の３’末端における平滑末端と、アンチセンス鎖の３’末端における２ヌクレオチドオーバーハングと、センス鎖の５’末端位および最後から２番目の位置における２個の修飾ヌクレオチドとを有する、２５ｍｅｒの二重鎖領域を有するラットＧＰ４６ｃＤＮＡ  ４６６〜４９０に対するｓｉＨＳＰ４７−２ｄラットｓｉＲＮＡである。
【化３４】
0005873168.tif 000036
【０３１８】
１９ｍｅｒの二重鎖領域と、センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端における修飾２ヌクレオチド（すなわちデオキシヌクレオチド）オーバーハングとを有する、ヒトｈｓｐ４７ｃＤＮＡ  ９８０〜９９８に対するｓｉＨＳＰ４７〜３  ｓｉＲＮＡである。
【化３５】
0005873168.tif 000037
【０３１９】
センス鎖の３’末端における平滑末端と、アンチセンス鎖の３’末端における２ヌクレオチドオーバーハングと、センス鎖の５’末端位および最後から２番目の位置における２個の修飾ヌクレオチドとを有する、２５ｍｅｒの二重鎖領域を有するヒトｈｓｐ４７ｃＤＮＡ  ９８０〜１００４に対するｓｉＨＳＰ４７〜３ｄ  ｓｉＲＮＡである。
【化３６】
0005873168.tif 000038
【０３２０】
１９ｍｅｒの二重鎖領域と、センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端における修飾２ヌクレオチド（すなわちデオキシヌクレオチド）オーバーハングとを有する、ヒトｈｓｐ４７ｃＤＮＡ  ７３５〜７５３に対するｓｉＨＳＰ４７−４  ｓｉＲＮＡである。
【化３７】
0005873168.tif 000039
【０３２１】
センス鎖の３’末端における平滑末端と、アンチセンス鎖の３’末端における２ヌクレオチドオーバーハングと、センス鎖の５’末端位および最後から２番目の位置における２個の修飾ヌクレオチドとを有する、２５ｍｅｒの二重鎖領域を有するヒトｈｓｐ４７ｃＤＮＡ  ７３５〜７５９に対するｓｉＨＳＰ４７−４ｄ  ｓｉＲＮＡである。
【化３８】
0005873168.tif 000040
１９ｍｅｒの二重鎖領域と、センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端における修飾２ヌクレオチド（すなわちデオキシヌクレオチド）オーバーハングとを有する、ヒトｈｓｐ４７ｃＤＮＡ  ６２１〜６３９に対するｓｉＨＳＰ４７−５  ｓｉＲＮＡである。
【化３９】
0005873168.tif 000041
１９ｍｅｒの二重鎖領域と、センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端における修飾２ヌクレオチド（すなわちデオキシヌクレオチド）オーバーハングとを有する、ヒトｈｓｐ４７ｃＤＮＡ  ４４６〜４６４に対するｓｉＨＳＰ４７−６  ｓｉＲＮＡである。
【化４０】
0005873168.tif 000042
１９ｍｅｒの二重鎖領域と、センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端における修飾２ヌクレオチド（すなわちデオキシヌクレオチド）オーバーハングとを有する、ヒトｈｓｐ４７ｃＤＮＡ  ６９２〜７１０に対するｓｉＨＳＰ４７−７  ｓｉＲＮＡである。
【化４１】
0005873168.tif 000043
【０３２２】
核酸鎖におけるニックおよびギャップ
本明細書において提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、ニックまたはギャップを有する鎖、好ましくはセンス鎖を有してもよい。このように、核酸分子は、例えば、PCT/US07/081836に開示されている部分二重鎖ＲＮＡ（ｍｄＲＮＡ）のような、３本または４本以上の鎖を有してもよい。ニックまたはギャップを有する鎖を有する核酸分子は、約１〜４９ヌクレオチドであってもよく、または、ＲＩＳＣ長（例えば約１５〜２５ヌクレオチド）またはダイサー基質長（例えば約２５〜３０ヌクレオチド）、例えば本明細書に開示されているものなどであってもよい。
【０３２３】
３本または４本以上の鎖を有する核酸分子は、例えば、「Ａ」（アンチセンス）鎖、「Ｓ１」（第２の）鎖および「Ｓ２」（第３）鎖を含み、ここで、「Ｓ１」鎖および「Ｓ２」鎖は、「Ａ」鎖の非オーバーラップ領域に相補的であり、これと塩基対を形成する（例えば、ｍｄＲＮＡはＡ：Ｓ１Ｓ２の形態をとり得る）。Ｓ１、Ｓ２またはさらなる鎖は、一緒に、「Ａ」アンチセンス鎖に対するセンス鎖に実質的に類似するものを形成する。「Ｓ１」鎖と「Ａ」鎖のアニーリングによって形成される二重鎖領域は、「Ｓ２」鎖と「Ａ」鎖のアニーリングによって形成される二重鎖領域とは異なるものであり、オーバーラップしない。核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は「ギャップ」を有する分子であってもよく、これは０ヌクレオチドから約１０ヌクレオチド（例えば０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチド）の範囲の「ギャップ」を意味する。好ましくは、センス鎖がギャップ有する。一部の態様において、Ａ：Ｓ１二重鎖は、Ａ：Ｓ２二重鎖から、Ａ：Ｓ１二重鎖とＡ：Ｓ２二重鎖との間に位置し、「Ａ」鎖、「Ｓ１」鎖および「Ｓ２」鎖の１または２以上の３’末端の１個または２個以上の不対ヌクレオチドのいずれとも異なる、少なくとも１個の不対ヌクレオチド（約１０個までの不対ヌクレオチド）によって生じるギャップによって分離している。Ａ：Ｓ１二重鎖は、Ａ：Ｓ２二重鎖から、Ａ：Ｓ１二重鎖とＡ：Ｓ２二重鎖との間のゼロヌクレオチドのギャップ（すなわち、ポリヌクレオチド分子において２ヌクレオチド間のホスホジエステル結合だけが壊れているか、欠けているニック）によって分離していてもよく、これはニック入り（nicked）ｄｓＲＮＡ（ｎｄｓＲＮＡ）と呼ぶこともできる。例えば、Ａ：Ｓ１Ｓ２は、合計で約１４塩基対から約４０塩基対を組み合わせた少なくとも２個の二重鎖領域を有し、二重鎖領域が約０〜約１０ヌクレオチドのギャップによって分離され、任意に平滑末端を有するｄｓＲＮＡを含んでもよく、または、Ａ：Ｓ１Ｓ２は、１０ヌクレオチドまでのギャップによって分離された少なくとも２個の二重鎖領域を有するｄｓＲＮＡを含んでもよく、ここで二重鎖領域の少なくとも１つは約５塩基対〜１３塩基対を含む。
【０３２４】
ダイサー基質
特定の態様において、本明細書において提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、例えばRossi、US 20050244858に記載されているような、in vivoでプロセシングされ、活性な核酸分子を生成する前駆体「ダイサー基質」分子、例えば二本鎖核酸であってもよい。一部の条件および状況において、これらの比較的長いｄｓＲＮＡ  ｓｉＮＡ種、例えば約２５〜約３０ヌクレオチドのものが、効力および作用持続時間に関して予想外に効果的な結果をもたらすことができることが見出されている。いかなる特定の理論に束縛されることを望むものではないが、より長いｄｓＲＮＡ種は、細胞の細胞質における酵素ダイサーの基質として用いられると考えられる。二本鎖核酸をより短いセグメントに切断することに加えて、ダイサーは、切断されたｄｓＲＮＡに由来する一本鎖切断産物の、標的遺伝子に由来する細胞質内ＲＮＡの破壊に関与するＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ複合体）への組込みを容易にすることができる。
【０３２５】
ダイサー基質は、ダイサーによるそのプロセシングを強化するある種の特性を有してもよい。ダイサー基質は、それがダイサーによってプロセシングされ、活性な核酸分子を生成するのに十分な長さであり、以下の特性の１または２以上をさらに含んでもよい：（ｉ）ｄｓＲＮＡは非対称であり、例えば、第１の鎖（アンチセンス鎖）に３’オーバーハングを有する、および、（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、ダイサーの結合の方向およびｄｓＲＮＡの活性なｓｉＲＮＡへのプロセシングを誘導するための、アンチセンス鎖（センス鎖）における修飾３’末端を有する。特定の態様において、ダイサー基質における最長の鎖は、２４〜３０ヌクレオチドであってもよい。
【０３２６】
ダイサー基質は対称性であっても非対称性であってもよい。ダイサー基質は、２２〜２８ヌクレオチドを含むセンス鎖を有してもよく、アンチセンス鎖は２４〜３０ヌクレオチドを含んでもよい。したがって、一部の態様において、結果として生じるダイサー基質は、アンチセンス鎖の３’末端に、オーバーハングを有してもよい。ダイサー基質は、長さが２５ヌクレオチドのセンス鎖と、２塩基の３’オーバーハングを有し、２７ヌクレオチドの長さを有するアンチセンス鎖とを有してもよい。オーバーハングは、１〜３ヌクレオチド、例えば２ヌクレオチドであってもよい。センス鎖はまた、５’ホスフェートを有してもよい。
【０３２７】
非対称性ダイサー基質は、リボヌクレオチドのうちの２個の代わりに、センス鎖の３’末端に２個のデオキシヌクレオチドをさらに含んでもよい。一部の例示的なダイサー基質長および構造は、２１＋０、２１＋２、２１−２、２２＋０、２２＋１、２２−１、２３＋０、２３＋２、２３−２、２４＋０、２４＋２、２４−２、２５＋０、２５＋２、２５−２、２６＋０、２６＋２、２６−２、２７＋０、２７＋２および２７−２である。
【０３２８】
ダイサー基質のセンス鎖は、長さが約２２〜約３０（例えば、約２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０）、約２２〜約２８、約２４〜約３０、約２５〜約３０、約２６〜約３０、約２６〜２９、または約２７〜約２８ヌクレオチドであってもよい。一部の好ましい態様において、ダイサー基質は、長さが少なくとも約２５ヌクレオチドであり、約３０ヌクレオチドよりは長くないか、約２６〜２９ヌクレオチドか、または長さが２７ヌクレオチドの、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。センス鎖およびアンチセンス鎖は、同じ長さ（平滑末端）であっても、異なる長さ（オーバーハングを有する）であっても、または組合せであってもよい。センス鎖およびアンチセンス鎖は、同じポリヌクレオチドに存在しても、異なるポリヌクレオチドに存在してもよい。ダイサー基質は、約１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２７ヌクレオチドの二重鎖領域を有してもよい。
【０３２９】
本明細書において提供される他のｓｉＮＡ分子と同様に、ダイサー基質のアンチセンス鎖は、生物学的条件下、例えば、真核細胞の細胞質内などにおいて、アンチセンス鎖にアニーリングする任意の配列を有してもよい。
【０３３０】
ダイサー基質は、ヌクレオチド塩基、糖またはリン酸骨格に対する、当該技術分野において既知の、および／または、本明細書において他の核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）について記載された、任意の修飾を有してもよい。特定の態様において、ダイサー基質は、センス鎖の３’末端に位置する好適な修飾因子によってダイサープロセシングのために修飾されたセンス鎖を有してもよい。すなわち、このｄｓＲＮＡはダイサーの結合およびプロセシングの方向を誘導するように設計されている。好適な修飾因子は、ヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドなど、および、立体障害（sterically hindered）分子、例えば、蛍光分子などを含む。アシクロヌクレオチドは、ｄＮＭＰにおいて通常存在する２’−デオキシリボフラノシル糖における２−ヒドロキシエトキシメチル基を置換する。ダイサー基質ｓｉＮＡ分子において用いることができる他のヌクレオチド修飾因子は、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、ならびに３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）および２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）の一リン酸ヌクレオチドを含む。一態様において、デオキシヌクレオチドが修飾因子として用いられる。ヌクレオチド修飾因子を利用する場合、ダイサー基質の長さが変わらないように、それらはリボヌクレオチドを置換してもよい（例えば、１〜３個のヌクレオチド修飾因子または２個のヌクレオチド修飾因子が、センス鎖の３’末端におけるリボヌクレオチドと置き換わる）。立体障害分子を利用する場合、これらはアンチセンス鎖の３’末端のリボヌクレオチドに付着させてもよい。したがって、特定の態様において、鎖の長さは、修飾因子の組込みによって変化しない。特定の態様において、ｄｓＲＮＡの２個のＤＮＡ塩基が、アンチセンス鎖のダイサープロセシングの方向を誘導するために置換されている。さらなる態様において、２個の末端ＤＮＡ塩基が、センス鎖の３’末端とアンチセンス鎖の５’末端において、二重鎖の平滑末端を形成しているセンス鎖の３’末端の２個のリボヌクレオチドと置き換わり、２ヌクレオチドＲＮＡオーバーハングがアンチセンス鎖の３’末端に位置する。これは、平滑末端におけるＤＮＡとオーバーハング末端におけるＲＮＡ塩基を有する非対称性の構成である。
【０３３１】
特定の態様において、修飾は、修飾が核酸分子がダイサーのために基質として機能することを妨げないように、ダイサー基質に含められる。一態様において、ダイサー基質のダイサープロセシングを強化する１または２以上の修飾がなされる。より効果的なＲＮＡｉの生成をもたらす１または２以上の修飾がなされてもよい。より大きなＲＮＡｉ効果を支持する１または２以上の修飾がなされてもよい。各々のダイサー基質につき、細胞に送達されるより大きな能力をもたらす１または２以上の修飾がなされる。修飾は、３’末端領域、５’末端領域、３’末端領域および５’末端領域の両方、または配列内の種々の位置に組み込まれてもよい。修飾が核酸分子がダイサーのために基質として機能することを妨げない限り、任意の数と組合せの修飾をダイサー基質に組み込むことができる。複数の修飾が存在する場合、それらは同じであっても、異っていてもよい。塩基、糖部分、リン酸骨格に対する修飾、およびこれらの組合せが企図される。どちらの５’末端もリン酸化することができる。
【０３３２】
ダイサー基質リン酸骨格修飾の例は、メチルホスホネートを含むホスホネート、ホスホロチオエートおよびホスホトリエステル修飾、例えばアルキルホスホトリエステルなどを含む。ダイサー基質糖部分修飾の例は、２’−アルキルピリミジン、例えば２’ＯＭｅ、２’−フルオロ、アミノおよびデオキシ修飾などを含む（例えば、Amarzguioui et al., 2003参照）を含む。ダイサー基質塩基性基修飾の例は、無塩基糖、２−Ｏ−アルキル修飾ピリミジン、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシルおよび５−（３−アミノアリル）−ウラシルなどを含む。ＬＮＡもまた組み込むことができる。
【０３３３】
センス鎖は、センス鎖の３’末端に位置する好適な修飾因子によってダイサープロセシングのために修飾されいてもよい。すなわち、このダイサー基質はダイサーの結合およびプロセシングの方向を誘導するように設計されている。好適な修飾因子は、ヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドなど、および、立体障害分子、例えば、蛍光分子などを含む。アシクロヌクレオチドは、ｄＮＭＰにおいて通常存在する２’−デオキシリボフラノシル糖における２−ヒドロキシエトキシメチル基を置換する。他のヌクレオチド修飾因子は、コルジセピン、ＡＺＴ、ｄｄＩ、３ＴＣ、ｄ４Ｔ、ならびにＡＺＴ、３ＴＣおよびｄ４Ｔの一リン酸ヌクレオチドを含む。一態様において、デオキシヌクレオチドが修飾因子として用いられる。ヌクレオチド修飾因子を利用する場合、１〜３個のヌクレオチド修飾因子または２個のヌクレオチド修飾因子が、センス鎖の３’末端におけるリボヌクレオチドと置き換わる。立体障害分子を利用する場合、これらはアンチセンス鎖の３’末端のリボヌクレオチドに付着させる。したがって、鎖の長さは、修飾因子の組込みによって変化しない。別の態様において、本明細書は、ダイサー基質の２個のＤＮＡ塩基を、アンチセンス鎖のダイサープロセシングの方向を誘導するために置換することを企図する。本明細書のさらなる態様において、２個の末端ＤＮＡ塩基が、センス鎖の３’末端とアンチセンス鎖の５’末端において、二重鎖の平滑末端を形成しているセンス鎖の３’末端の２個のリボヌクレオチドと置き換わり、２ヌクレオチドＲＮＡオーバーハングがアンチセンス鎖の３’末端に位置する。これは、平滑末端におけるＤＮＡとオーバーハング末端におけるＲＮＡ塩基を有する非対称性の構成である。
【０３３４】
アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の３’末端に位置する好適な修飾因子によってダイサープロセシングのために修飾されいてもよい。すなわち、このｄｓＲＮＡはダイサーの結合およびプロセシングの方向を誘導するように設計されている。好適な修飾因子は、ヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドなど、および、立体障害分子、例えば、蛍光分子などを含む。アシクロヌクレオチドは、ｄＮＭＰにおいて通常存在する２’−デオキシリボフラノシル糖における２−ヒドロキシエトキシメチル基を置換する。他のヌクレオチド修飾因子は、コルジセピン、ＡＺＴ、ｄｄＩ、３ＴＣ、ｄ４Ｔ、ならびにＡＺＴ、３ＴＣおよびｄ４Ｔの一リン酸ヌクレオチドを含む。一態様において、デオキシヌクレオチドが修飾因子として用いられる。ヌクレオチド修飾因子を利用する場合、１〜３個のヌクレオチド修飾因子または２個のヌクレオチド修飾因子が、アンチセンス鎖の３’末端におけるリボヌクレオチドと置き換わる。立体障害分子を利用する場合、これらはアンチセンス鎖の３’末端のリボヌクレオチドに付着させる。したがって、特定の態様において、鎖の長さは、修飾因子の組込みによって変化しない。別の態様において、本明細書は、ｄｓＲＮＡの２個のＤＮＡ塩基を、アンチセンス鎖のダイサープロセシングの方向を誘導するために置換することを企図する。本明細書のさらなる態様において、２個の末端ＤＮＡ塩基が、センス鎖の５’末端とアンチセンス鎖の３’末端において、二重鎖の平滑末端を形成しているアンチセンス鎖の３’末端の２個のリボヌクレオチドの代わりに位置し、２ヌクレオチドＲＮＡオーバーハングがセンス鎖の３’末端に位置する。これは、平滑末端におけるＤＮＡとオーバーハング末端におけるＲＮＡ塩基を有する非対称性の構成である。
【０３３５】
センス鎖およびアンチセンス鎖を有するダイサー基質は、第３の構造で連結されていてもよい。第３の構造は、ダイサー基質におけるダイサーの活性を妨害せず、標的遺伝子から転写されるＲＮＡの有向性の破壊（directed destruction）を妨げない。第３の構造は、化学的連結基（chemical linking group）であってもよい。好適な化学的連結基は当該技術分野において既知であり、使用可能である。あるいは、第３の構造は、ｄｓＲＮＡの２個のオリゴヌクレオチドを、この２個のオリゴヌクレオチドのアニーリングによりヘアピン構造が生じ、ダイサー基質が生成される様式で連結するオリゴヌクレオチドであってもよい。ヘアピン構造は、好ましくはダイサー基質におけるダイサーの活性を妨害せず、または、標的遺伝子から転写されるＲＮＡの有向性の破壊を妨げない。
【０３３６】
ダイサー基質のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、完全に相補的であることを要しない。それらは、生物学的条件下でアニーリングし、標的配列と十分に相補的なｓｉＲＮＡを生じる、ダイサーのための基質を提供するために、実質的に相補的であることが必要とされるにすぎない。
【０３３７】
ダイサー基質は、ダイサーによるそのプロセシングを強化するある種の特性を有してもよい。ダイサー基質は、それがダイサーによってプロセシングされ、活性な核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ）を生成するのに十分な長さを有してもよく、以下の特性の１または２以上を含んでもよい：ダイサー基質は非対称であり、例えば、第１の鎖（アンチセンス鎖）に３’オーバーハングを有し、および／または、ダイサー基質は、ダイサーの結合の方向およびｄｓＲＮＡの活性なｓｉＲＮＡへのプロセシングを誘導するための、第２の鎖（センス鎖）における修飾３’末端を有する。ダイサー基質は、センス鎖が２２〜２８ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が２４〜３０ヌクレオチドを含むように、非対称であってもよい。したがって、結果として生じるダイサー基質は、アンチセンス鎖の３’末端にオーバーハングを有する。オーバーハングは、１〜３ヌクレオチド、例えば２ヌクレオチドである。センス鎖はまた、５’ホスフェートを有してもよい。
【０３３８】
ダイサー基質は、アンチセンス鎖の３’末端にオーバーハングを有してもよく、センス鎖は、ダイサープロセシングのために修飾されている。センス鎖の５’末端は、ホスフェートを有してもよい。センス鎖およびアンチセンス鎖は、生物学的条件、例えば細胞の細胞質で見出される条件下でアニーリングしてもよい。ダイサー基質の１方の鎖、特にアンチセンス鎖の領域は、少なくとも１９ヌクレオチドの配列長を有してもよく、ここで、これらヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端に隣接する２１ヌクレオチドの領域にあり、標的遺伝子から生成されるＲＮＡのヌクレオチド配列と十分に相補的である。ダイサー基質はまた、以下のさらなる特性の１または２以上を有してもよい：アンチセンス鎖は、対応する２１ｍｅｒに対して右へのシフトを有する（すなわち、対応する２１ｍｅｒと比較した場合、アンチセンス鎖は分子の右側にヌクレオチドを含む）、鎖は完全には相補的でなくてもよく、すなわち、鎖は単純なミスマッチ対を含んでもよい、および、ＬＮＡなどの塩基修飾は、センス鎖の５’末端に含まれていてもよい。
【０３３９】
ダイサー基質核酸分子のアンチセンス鎖は、５’末端に１〜９個のリボヌクレオチドを含み、２２〜２８ヌクレオチドの長さを与えるように修飾されてもよい。アンチセンス鎖が２１ヌクレオチドの長さを有する場合、１〜７個のリボヌクレオチド、または２〜５個のリボヌクレオチド、および／または、４個のリボヌクレオチドが、３’末端に追加されてもよい。追加されたリボヌクレオチドは、任意の配列を有してもよい。追加されたリボヌクレオチドは標的遺伝子配列に相補的であってもよいが、標的配列とアンチセンス鎖との間の完全な相補性は必要ではない。つまり、結果として得られるアンチセンス鎖は、標的配列と十分に相補的である。センス鎖は、したがって、２４〜３０ヌクレオチドを有してもよい。センス鎖は、生物学的条件下でアンチセンス鎖にアニーリングするために、アンチセンス鎖と実質的に相補的であってもよい。一態様において、アンチセンス鎖は、ダイサープロセシングを誘導するために、修飾３’末端を含むように合成されてもよい。センス鎖は、３’オーバーハングを有してもよい。アンチセンス鎖は、ダイサーの結合およびプロセシングのための修飾３’末端をむように合成されてもよく、センス鎖は３’オーバーハングを有する。
【０３４０】
熱ショックタンパク質４７
熱ショックタンパク質４７（ＨＳＰ４７）は、コラーゲン特異的分子シャペロンであり、小胞体に存在する。これは、フォールディング、組立ておよび小胞体からの輸送プロセスの間、プロコラーゲンと相互作用する（Nagata Trends Biochem Sci 1996; 21:22-6、Razzaque et al. 2005; Contrib Nephrol 2005; 148: 57-69、Koide et al. 2006 J. Biol. Chem.; 281: 3432-38、Leivo et al. Dev. Biol. 1980; 76:100-114、Masuda et al. J. Clin. Invest. 1994; 94:2481-2488、Masuda et al. Cell Stress Chaperones 1998; 3:256-264）。ＨＳＰ４７は種々の組織線維症（Koide et al. J Biol Chem 1999; 274: 34523-26）、例えば、肝硬変（Masuda et al. J Clin Invest 1994; 94:2481-8）、肺線維症（Razzaque et al. Virchows Arch 1998; 432:455-60、Kakugawa et al. Eur Respir J 2004; 24: 57-65）、および糸球体硬化症（Moriyama et al. Kidney Int 1998; 54: 110-19）において、発現が上方調節されていることが報告されている。標的ヒトｈｓｐ４７ｃＤＮＡの例示的な核酸配列は、GenBankアクセッション番号NM_001235、および対応するｍＲＮＡ配列、例えば配列番号１としてリストされたものに開示されている。当業者は、所定の配列が時間とともに変化し得、それにしたがって、本明細書における核酸分子に必要なあらゆる変化を組み込むことを理解する。
【０３４１】
広範なコラーゲン型とのＨＳＰ４７の特異的な結合は、ＨＳＰ４７を線維症の処置の潜在的な標的とする。ｈｓｐ４７発現の阻害は、細胞外コラーゲンＩ分泌を防止することができる。Sato et al.（Nat Biotechnol 2008; 26:431-442）は、ｈｓｐ４７発現の阻害のためにｓｉＲＮＡを用い、ラットにおいて肝線維症の進行を防止するによって、この可能性を探った。同様に、Chen et al.（Br J Dermatol 2007; 156: 1188-1195）およびWang et al.（Plast. Reconstr Surg 2003; 111: 1980-7）は、ＲＮＡ干渉技術によるｈｓｐ４７発現阻害を調査した。
【０３４２】
ｈｓｐ４７を阻害するための方法および組成物
提供されるのは、ｓｐ４７遺伝子発現に対するＲＮＡ干渉を誘導することができる、または誘導する、短鎖核酸分子、例えば短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子などを用いることによる、ｈｓｐ４７発現の抑制のための組成物および方法である。本明細書に開示される組成物および方法はまた、種々の線維症、例えば肝線維症、肺線維症および腎線維症の処置にも有用である。
【０３４３】
本明細書の１もしくは２以上の核酸分子および／または方法は、例えば、GenbankアクセッションNM_001235に記載のＲＮＡをコードする１もしくは２以上の遺伝子の発現を下方制御するのに用いられる。
【０３４４】
本明細書において提供される組成物、方法およびキットは、ｈｓｐ４７タンパク質および／またはｈｓｐ４７タンパク質をコードする遺伝子、ｈｓｐ４７をコードするタンパク質および／または遺伝子（例えば、GenBankアクセッション番号NM_001235によって言及される配列を含む配列をコードする遺伝子）の発現を、または、遺伝子または遺伝子ファミリー配列が、ｈｓｐ４７と関連する疾患、状態または障害、例えば肝線維症、肝硬変、肺線維症、腎線維症、腹膜線維症、慢性肝障害および原線維形成の、維持および／または発症に関連する配列相同性を共有しているｈｓｐ４７遺伝子ファミリーメンバーの発現を、独立して、または組み合わせて調節する（例えば下方制御する）、１または２以上の核酸分子（例えばｓｉＮＡ）および方法を含むことができる。種々の側面および態様の説明は、例示的な遺伝子ｈｓｐ４７に関して提供される。しかしながら、種々の側面および態様はまた、他の関連するｈｓｐ４７遺伝子、例えばホモログ遺伝子および転写変異体、および、一部のｈｓｐ４７遺伝子に関連する多型（例えば、一塩基多型（ＳＮＰｓ））をも対象とする。したがって、種々の側面および態様はまた、ｈｓｐ４７が誘導するシグナル伝達経路に関与している他の遺伝子、または、例えば、本明細書に記載の疾患、形質または状態の維持または発症に関与している遺伝子発現をも対象とする。これらのさらなる遺伝子は、本明細書中ｈｓｐ４７遺伝子に関して記載された方法を用いて、標的部位について分析することができる。したがって、他の遺伝子の調節および他の遺伝子のかかる調節の効果は、本明細書に記載のとおりに実行、決定、および測定することができる。
【０３４５】
一態様において、本明細書において提供される組成物および方法は、ｈｓｐ４７遺伝子（例えば、配列番号１によって例示されるヒトｈｓｐ４７）の発現を下方制御する二本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含み、ここで該核酸分子は約１５個〜約４９個の塩基対を含む。
【０３４６】
一態様において、開示される核酸は、ｈｓｐ４７遺伝子またはｈｓｐ４７遺伝子ファミリーの発現を阻害するために用いられてもよく、ここで、遺伝子または遺伝子ファミリー配列は配列相同性を共有する。かかる相同配列は、当該技術分野において知られていているように同定することができ、例えば配列アラインメントを用いて同定することができる。核酸分子は、例えば、完全に相補的な配列を用いて、または、さらなる標的配列を提供することができる非正準（non-canonical）塩基対、例えばミスマッチおよび／またはゆらぎ塩基対を組み込むことによって、かかる相同配列を標的とするように設計することができる。ミスマッチが確認された場合、非正準塩基対（例えばミスマッチおよび／またはゆらぎ塩基）を用いて、複数の遺伝子配列を標的とする核酸分子を生成することができる。非限定例において、非正準塩基対、例えば、ＵＵおよびＣＣ塩基対等を用いて、配列相同性を共有する異なるｈｓｐ４７標的のための配列をターゲティングできる核酸分子を生成する。したがって、本明細書に開示されるｓｉＮＡを用いることの１つの利点は、単一の核酸が、相同遺伝子間で保存されているヌクレオチド配列に相補的な核酸配列を含むように設計できることである。このアプローチにおいては、複数の核酸分子を異なる遺伝子のターゲティングに用いる代わりに、単一の核酸を複数の遺伝子の発現の阻害に用いることができる。
【０３４７】
核酸分子は、ｈｓｐ４７ファミリー遺伝子などの、１または２以上の遺伝子ファミリーに対応する保存配列のターゲティングに用いることができる。したがって、複数の標的ｈｓｐ４７をターゲティングする核酸分子は、増大した治療効果を提供することができる。そのうえ、核酸は、種々の用途において、遺伝子機能の経路を特徴づけるのに用いることができる。例えば、核酸分子は、遺伝子機能分析、ｍＲＮＡ機能分析または翻訳分析において、ある経路における１種または２種以上の標的遺伝子の活性を阻害し、特徴づけられていない１種または２種以上の遺伝子の機能を決定するために用いることができる。核酸分子は、医薬開発に向けて、種々の疾患および状態に関与する潜在的な標的遺伝子経路を決定するために用いることができる。核酸分子は、例えば、線維症、例えば、肝臓、腎臓または肺線維症および／または炎症性および増殖性の形質、疾患、障害および／または状態に関与する遺伝子発現の経路を理解するために用いることができる。
【０３４８】
一態様において、本明細書において提供される組成物および方法は、ｈｓｐ４７ＲＮＡに対してＲＮＡｉ活性を有する核酸分子を含み、ここで、核酸分子は、ｈｓｐ４７をコードする配列を有する任意のＲＮＡに相補的な配列、例えば、表３に示す配列を有する配列を含む。別の態様において、核酸分子は、ｈｓｐ４７ＲＮＡに対するＲＮＡｉ活性を有してもよく、ここで、核酸分子は、変異体ｈｓｐ４７をコードする配列、例えば表３に示されていないが、線維症の維持および／または発症に関連することが当該技術分野において知られている他の変異ｈｓｐ４７遺伝子、を有するＲＮＡに相補的な配列を含む。表３に示された、または、それとは別に本明細書に記載された化学修飾は、本明細書に開示される任意の核酸コンストラクトに適用することができる。別の態様において、本明細書に開示される核酸分子は、ｈｓｐ４７遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用することができ、それによって、ｈｓｐ４７遺伝子発現のサイレンシングを誘導するヌクレオチド配列を含み、例えば、ここで、核酸分子は、染色体構造またはｈｓｐ４７遺伝子のメチル化パターンを調節し、ｈｓｐ４７遺伝子の転写を防止する細胞プロセスによって、ｈｓｐ４７遺伝子発現の調整を誘導する。
【０３４９】
本明細書に開示される核酸分子は、ｈｓｐ４７ＲＮＡに対してＲＮＡｉ活性を有してもよく、ここで、核酸分子は、ｈｓｐ４７をコードする配列、例えばGenBankアクセッション番号NM_001235を有する配列、を有する任意のＲＮＡに相補的な配列を含む。核酸分子は、ｈｓｐ４７ＲＮＡに対するＲＮＡｉ活性を有してもよく、ここで、核酸分子は、変異体ｈｓｐ４７をコードする配列、例えば、線維症の維持および／または発症に関連することが当該技術分野において知られている他の変異ｈｓｐ４７遺伝子、を有するＲＮＡに相補的な配列を含む。
【０３５０】
本明細書に開示される核酸分子は、ｈｓｐ４７遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用することができ、それによって、ｈｓｐ４７遺伝子発現のサイレンシングを誘導するヌクレオチド配列を含み、例えば、ここで、核酸分子は、染色体構造またはｈｓｐ４７遺伝子のメチル化パターンを調節し、ｈｓｐ４７遺伝子の転写を防止する細胞プロセスによって、ｈｓｐ４７遺伝子発現の調整を誘導する。
【０３５１】
処置方法
広範なコラーゲン型とのＨＳＰ４７の特異的な結合は、ＨＳＰ４７を線維症の処置の標的とする。ｈｓｐ４７発現の阻害は、細胞外コラーゲンＩ分泌を防止することができる。Sato et al.（Nat Biotechnol 2008; 26:431-442）は、ｈｓｐ４７発現の阻害のためにｓｉＲＮＡを用い、ラットにおいて肝線維症の進行を防止するによって、この可能性を探った。同様に、Chen et al.（Br J Dermatol 2007; 156: 1188-1195）およびWang et al.（Plast. Reconstr Surg 2003; 111: 1980-7）は、ＲＮＡ干渉技術によるｈｓｐ４７発現阻害を調査した。
【０３５２】
一態様において、核酸分子は、ｈｓｐ４７および／または、ｈｓｐ４７および／または疾患もしくは状態（例えば線維症）と関連するｈｓｐ４７ハプロタイプ多型に起因するｈｓｐ４７タンパク質の発現を下方制御または阻害するのに用いることができる。ｈｓｐ４７および／またはｈｓｐ４７遺伝子、またはｈｓｐ４７および／またはｈｓｐ４７タンパク質の分析またはＲＮＡレベルを、かかる多型を有する対象、または、本明細書に記載の形質、状態または疾患を発症するリスクを有するこれらの対象を同定することに用いることができる。これらの対象は、処置、例えば本明細書に開示される核酸分子およびｈｓｐ４７および／またはｈｓｐ４７遺伝子発現に関連した疾患を処置するのに有用なあらゆる他の組成物による処置に適している。したがって、ｈｓｐ４７および／またはｈｓｐ４７タンパク質またはＲＮＡレベルの分析は、対象の処置における処置の種類および治療過程の決定に用いることができる。ｈｓｐ４７および／またはｈｓｐ４７タンパク質またはＲＮＡレベルのモニタリングは、処置結果の予測に、および、形質、状態または疾患に関連する特定のｈｓｐ４７および／またはｈｓｐ４７タンパク質のレベルおよび／または活性を調節する化合物および組成物の有効性の決定に、用いることができる。
【０３５３】
提供されるのは、ｈｓｐ４７遺伝子発現に対するＲＮＡ干渉を誘導することができる、または誘導する、本明細書が提供する短鎖核酸分子、例えばｓｉＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子などを用いることによるｈｓｐ４７発現の抑制のための、組成物および方法である。本明細書に開示される組成物および方法はまた、種々の線維症、例えば肝線維症、肺線維症および腎線維症の処置にも有用である。
【０３５４】
本明細書に開示される核酸分子は、単独で、または他の薬剤と組み合わせて、もしくは他の薬剤とともに、ｈｓｐ４７に関連する疾患、形質、状態および／または障害、例えば、肝線維症、肝硬変、肺線維症、腎線維症、腹膜線維症、慢性肝障害および原線維形成の予防または処置に用いることができる。
【０３５５】
本明細書に開示される核酸分子は、ｈｓｐ４７の発現を配列特異的な様式で阻害することができる。核酸分子は、ｈｓｐ４７  ｍＲＮＡに少なくとも部分的に相補的（アンチセンス）な連続ヌクレオチドを含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含んでもよい。
【０３５６】
一部の態様において、ｈｓｐ４７に特異的なｄｓＲＮＡは、例えば新たに合成されたタンパク質のフォールディングを補助する他の分子シャペロン、例えば、カルネキシン、カルレティキュリン、および／またはＢｉＰ（Bergeron et al. Trends Biochem. Sci. 1994; 19:124-128、Herbert et al. 1995; Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 60:405-415）に特異的な他のｄｓＲＮＡとともに用いることができる。
【０３５７】
線維症は、本明細書に開示される核酸分子を用いたＲＮＡ干渉により処置することができる。例示的な線維症は、肝線維症、腹膜線維症、肺線維症、腎線維症を含む。本明細書に開示される核酸分子は、配列特異的な様式でｈｓｐ４７の発現を阻害することができる。
【０３５８】
線維症の処置は、当該技術分野で既知の好適な技法を用いて、例えば、抗コラーゲンＩ抗体を用いて、細胞外のコラーゲンのレベルを決定することによりモニタリングできる。処置はまた、罹患組織の細胞におけるｈｓｐ４７  ｍＲＮＡのレベルまたはＨＳＰ４７タンパク質のレベルを決定することによってもモニタリングできる。処置はまた、罹患臓器または組織の非侵襲性スキャン、例えば、コンピュータ連動断層撮影スキャン、核磁気共鳴弾性率計測スキャンなどによってもモニタリングできる。
【０３５９】
対象または生体におけるｈｓｐ４７に関連する疾患または状態を処置または予防するための方法は、対象または生体と、本明細書において提供される核酸分子とを、対象または生体におけるｈｓｐ４７遺伝子の発現の調節に好適な条件下で接触させることを含んでもよい。
【０３６０】
対象または生体における線維症を処置または予防するための方法は、対象または生体と、核酸分子とを、対象または生体におけるｈｓｐ４７遺伝子の発現の調節に好適な条件下で接触させることを含んでもよい。
【０３６１】
対象または生体における、肝線維症、腎線維症および肺線維症からなる群から選択される１種または２種以上の線維症を処置または予防するための方法は、対象または生体と、核酸分子とを、対象または生体におけるｈｓｐ４７遺伝子の発現の調節に好適な条件下で接触させることを含んでもよい。
【０３６２】
線維性疾患
線維性疾患は、一般的に、細胞外マトリックス中の線維状物質の過剰な堆積を特徴とし、それは組織構造の異常な変化の一因となり、正常な臓器の機能を妨げる。
【０３６３】
外傷によって損傷を受けた組織は全て、創傷治癒プログラムの開始により反応する。過剰な瘢痕化を特徴とする障害の一種である線維症は、創傷治癒反応の正常な自己制御プロセスが妨げられた場合に生じ、コラーゲンの過剰な産生および堆積をもたらす。その結果、臓器の正常な組織は瘢痕組織と置き換わり、これがやがては臓器の機能不全をもたらす。
【０３６４】
線維症は、多様な原因により、種々の臓器で発症し得る。肝硬変、肺線維症、サルコイドーシス、ケロイドおよび腎線維症は全て、進行性の線維症に関連した慢性の状態であり、それによって正常な組織機能の持続的な喪失をもたらす。
【０３６５】
急性線維化（通常、突発性で重篤な発症を伴い、持続期間は短い）は、種々の形態の、偶発的な損傷（特に脊柱および中枢神経系の損傷）を含む外傷、感染症、手術、虚血性疾患（例えば心臓発作後の心臓の瘢痕化）、熱傷、環境汚染物、アルコールおよび他の種類の毒素、急性呼吸不全症候群、放射線および化学療法処置への共通の反応として生じる。
【０３６６】
線維症、線維化に関係する病態、または、細胞タンパク質の異常な架橋に関係する病態は全て本明細書に開示されるｓｉＲＮＡによって処置することができる。線維性疾患または線維化が明白な疾患（線維化に関係する病態）は、組織線維症の急性および慢性形態の両方を含み、これは以下の全ての病因的類似疾患（etiological variant）を含む：間質性肺疾患および線維性肺疾患を含む肺線維症、肝線維症、心筋線維症を含む心線維症、慢性腎不全を含む腎線維症、強皮症を含む皮膚線維症、ケロイドおよび肥厚性瘢痕、骨髄線維症（骨髄の線維症）、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、および白内障または緑内障を処置する手術により生じた瘢痕化を含むあらゆる種類の眼の瘢痕化、多様な病因の炎症性腸疾患、黄斑変性症、グレーブス眼症、薬剤誘導性麦角中毒、ケロイド瘢痕、強皮症、乾癬、リ・フラウメニ症候群における膠芽腫、散発性膠芽腫、骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性症候群、婦人科がん、カポジ肉腫、ハンセン病および膠原性大腸炎。
【０３６７】
種々の態様において、本明細書に開示される化合物（核酸分子）は線維性疾患、例えば本明細書に開示されるもの、ならびに、線維性疾患以外の多くの他の疾患および状態、例えば本明細書に開示されるものの処置に用いることができる。処置される他の状態は、他の臓器における線維性疾患、あらゆる原因の腎線維症（ＥＳＲＤを含むＣＫＤ）、肺線維症（ＩＬＦを含む）、骨髄線維症、偶発的および医原性（手術）の全ての可能な種類の皮膚損傷に関連する異常な瘢痕化（ケロイド）、強皮症、心線維症、緑内障濾過手術の失敗、および腸管癒着症を含む。
【０３６８】
眼科手術および線維性合併症
眼の手術に起因する瘢痕組織の収縮は頻繁に生じ得る。新たな排出路を形成するための緑内障手術は組織の瘢痕化と収縮のために失敗することが多く、形成した排出システムが閉塞することがあり、さらなる外科的介入が必要となる。現行の抗収縮レジメン（マイトマイシンＣまたは５ＦＵ）は、関連する合併症（例えば失明）によって制限されている（例えば、Cordeiro MF, et al., Human anti-transforming growth factor-beta2 antibody: a new glaucoma anti-scarring agent Invest Ophthalmol Vis Sci. 1999 Sep;40(10):2225-34参照）。角膜外傷または角膜手術（例えば組織の収縮が不正確な結果をもたらすことがある近視または屈折異常のためのレーザーまたは外科的処置）の後に形成される瘢痕組織の収縮もあり得る。瘢痕組織は、例えば硝子体液または網膜の上／内部に形成されることがあり、一部の糖尿病患者においては最終的に失明を生じ得、網膜剥離手術後に形成されることがあり、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）と呼ばれている。ＰＶＲは網膜剥離後の最もよく見られる合併症であり、網膜孔または網膜裂孔と関係している。ＰＶＲは、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を含む、硝子体腔内および網膜前面および後面上の細胞膜の増殖を指す。本質的に瘢痕組織であるこれらの膜は網膜を牽引し、当初は成功した網膜剥離治療の後でさえ、網膜剥離の再発をもたらすことがある。
【０３６９】
瘢痕組織は、眼窩内または眼球および眼瞼筋上に、斜視、眼窩または眼瞼の手術後に、または甲状腺眼症に生じることがある。そこでは、結膜の瘢痕形成が、緑内障手術後、または、瘢痕性疾患、炎症性疾患、例えば類天疱瘡、または感染症、例えばトラコーマにおいて生じ得るのと同様にして起こる。コラーゲン含有組織の収縮に関連するさらなる眼の問題は、白内障摘出後の水晶体カプセルの不透明化および収縮である。ＭＭＰの重要な役割が、創傷治癒、ドライアイ、無菌性角膜潰瘍、再発性上皮びらん、角膜血管新生、翼状片、結膜弛緩症、緑内障、ＰＶＲおよび眼線維症を含む眼科疾患で認められている。
【０３７０】
肝線維症
肝線維症（ＬＦ）は、複数の病因の肝障害の一般的に不可逆的な結果である。欧米諸国において、主な病因学的カテゴリーは、アルコール性肝疾患（３０〜５０％）、ウイルス性肝炎（３０％）、胆管疾患（５〜１０％）、原発性ヘモクロマトーシス（５％）、ならびに薬剤性肝硬変および病因不明の特発性肝硬変（１０〜１５％）である。ウイルソン病、α１アンチトリプシン欠損症および他の奇病も、肝線維症を症状の１つとして有する。肝線維症の末期である肝硬変は、肝移植を要することが多く、欧米諸国における死因の上位１０位以内に入っている。
【０３７１】
腎線維症および関連する状態
慢性腎不全（ＣＲＦ）
慢性腎不全は、老廃物を排出し、尿を濃縮し、電解質を維持する腎臓の能力の漸次的かつ進行性の喪失である。ＣＲＦは、ゆっくりと進行する。それは最も多くの場合、腎機能の漸次的な喪失をもたらす任意の疾患から生じ、線維症はＣＲＦを生じさせる主な病態である。
【０３７２】
糖尿病性腎障害
糖尿病性腎障害（その特徴は糸球体硬化症および尿細管間質性線維症である）は、現代社会における末期腎疾患の唯一のもっとも頻度の高い原因であり、糖尿病患者は透析を受ける最大の人口を構成する。かかる治療は高価であり、決して最適なものではない。移植はより良い結果を提供するが、提供者の深刻な不足に悩まされている。
【０３７３】
慢性腎臓病
慢性腎臓病（ＣＫＤ）は世界的な公衆衛生上の問題であり、心臓血管疾患および慢性腎不全（ＣＲＦ）の増大した危険性と関連する、よく見られる状態であると認識されている。
【０３７４】
米国腎臓財団（ＮＫＦ）の腎臓病成果品質イニシアティブ（Ｋ／ＤＯＱＩ）は、慢性腎臓病を、３ヵ月または４ヶ月以上の腎臓損傷または減少した腎臓糸球体濾過率（ＧＦＲ）として定義する。ＣＫＤの他のマーカーも知られており、診断のために用いられている。一般に、不可逆的な硬化による腎臓マス（renal mass）の破壊およびネフロンの消失は、ＧＦＲの漸進的低下につながる。最近、Ｋ／ＤＯＱＩは、ＣＫＤのステージ分類を発表し、それは以下のとおりであった：
ステージ１：正常または亢進したＧＦＲ（＞９０ｍＬ／分／１．７３ｍ２）を伴う腎臓損傷
ステージ２：ＧＦＲの軽度低下（６０〜８９ｍＬ／分／１．７３ｍ２）
ステージ３：ＧＦＲの中程度低下（３０〜５９ｍＬ／分／１．７３ｍ２）
ステージ４：ＧＦＲの重度低下（１５〜２９ｍＬ／分／１．７３ｍ２）
ステージ５：腎不全（ＧＦＲ＜１５ｍＬ／分／１．７３ｍ２または透析）
【０３７５】
ステージ１および２のＣＫＤでは、ＧＦＲだけでは診断を確定できない。血液または尿組成の異常またはイメージング試験の異常を含む腎臓損傷の他のマーカーに依拠してもよい。
【０３７６】
ＣＫＤの病態生理学
約１００万個のネフロンが各々の腎臓に存在し、各々が総ＧＦＲに寄与する。腎損傷の病因論にかかわりなく、ネフロンの漸進性破壊を受けると、腎臓は、残存する健康なネフロンの過剰ろ過および代償性肥大によって、ＧＦＲを維持することができる。このネフロンの適応性により、血漿溶質の継続的な正常なクリアランスが可能となり、総ＧＦＲが５０％に低下した後に、腎臓の余力が使い果たされて初めて、尿素およびクレアチニンなどの物質の血漿レベルが顕著な上昇を示し始める。血漿クレアチニン値は、ＧＦＲの５０％の低下でほぼ２倍になる。したがって、患者における、０．６ｍｇ／ｄＬのベースライン値から１．２ｍｇ／ｄＬへの血漿クレアチニンの倍加は、機能するネフロン数の５０％の消失を実質的に表す。
【０３７７】
残存するネフロン過剰ろ過と肥大は、指摘した理由のために有益であるが、進行性の腎臓機能障害の主な原因であると考えられている。これは、上昇した糸球体毛細血管圧が原因で生じると思われており、これは毛細血管に損傷を与え、まず最初に巣状分節性糸球体硬化症を、そしてやがては球状糸球体硬化症をもたらす。この仮説は、ＣＫＤを有するヒトで観察されるのと同一の病変を発症する５／６腎摘出ラットの研究に基づいている。
【０３７８】
慢性腎臓病の最も一般的な２つの原因は、糖尿病と高血圧である。他の要因は、造影剤を含む腎毒素による急性傷害、または灌流の低下、タンパク尿症、間質の損傷による腎アンモニア生成の増加、高脂血症、リン酸カルシウムの沈着を伴う高リン酸血症、亜酸化窒素レベルの低下および喫煙を含む。
【０３７９】
アメリカ合衆国においてＣＫＤの発生率および有病率は上昇しており、成果は乏しく、保健システムに対する高いコストを伴う。腎臓病は、米国における死因の第９位である。この高い死亡率により、米国公衆衛生局長官はアメリカ市民のHealthy People 2010に、ＣＫＤに焦点を当てた１章を含めることを命じた。この章の目的は、目標を明確化し、米国における慢性腎臓病の発生率、羅病率、死亡率および医療費を低減するための戦略を提供することである。
【０３８０】
末期腎疾患（ＥＳＲＤ）の発生率もまた、１９８９年以降世界的に着実に増加している。アメリカ合衆国はＥＳＲＤの発生率が最も高く、これに日本が続く。日本は人口１００万人あたりの有病率が最も高く、これに米国が続く。
【０３８１】
血液透析に関連する死亡率は目を引くものであり、血液透析を開始する患者の寿命が著しく短くなることを示す。どの年齢においても、透析を受けているＥＳＲＤ患者は、非透析患者および腎疾患を有しない人と比較して顕著に高い死亡率を有する。６０歳において、健康な人は、２０年を超えて生存することを期待できるが、血液透析を始めている６０才の患者の寿命は４年前後である。
【０３８２】
肺線維症
間質性肺線維症（ＩＰＦ）は、鉱物粒子、有機ダストおよびオキシダントガスを含む種々の吸入物質による、または未知の理由（特発性肺線維症）に起因する肺の瘢痕形成である。この疾患は世界中で何百万もの人を苦しめており、効果的治療手段がない。有用な処置を欠く主な理由は、治療のための適切な標的を設計するために十分に明らかにされた疾患の分子レベルのメカニズムがほとんどないことである（Lasky et al., Brody AR. (2000), “Interstitial fibrosis and growth factors”, Environ Health Perspect.;108 Suppl 4:751-62）。
【０３８３】
心線維症
心不全のみの有病率が高まる一方、他の状態は顕著に減少しているという点で、心不全は、心血管障害の中でユニークな存在である。その一部の原因は、米国および欧州の人口の高齢化に帰することができる。心筋の損傷を有する患者を救助する能力もまた主な要因であるが、それは、これらの患者が心臓の有害なリモデリングによる左室機能不全の進行を起こすことがあるためである。
【０３８４】
正常な心筋は種々の細胞、すなわち心筋細胞と非心筋細胞から構成され、後者は内皮細胞、血管平滑筋細胞および線維芽細胞を含む。
【０３８５】
心室壁の構造的リモデリングは、心疾患の臨床転帰の重要な決定要因である。かかるリモデリングは、細胞外マトリックスタンパク質の産生および破壊、細胞増殖および遊走、ならびにアポトーシス性および壊死性細胞死を含む。心線維芽細胞はこれらのプロセスに決定的に関与しており、オートクリンおよびパラクリン因子として作用する増殖因子およびサイトカイン、ならびに細胞外マトリックスタンパク質およびプロテイナーゼを産生する。最近の研究は、心線維芽細胞と心筋細胞との相互作用が、心臓リモデリング（その正味の結果は心機能の低下および心不全の発症である）の進行に不可欠であることを示した（Manabe, et al., 2002, Circ Res. 13:1103-13）。
【０３８６】
熱傷および瘢痕
特に線維性疾患で起こり得る特有の問題は、組織の収縮、例えば瘢痕の収縮である。細胞外マトリックス成分を含む組織の収縮、特にコラーゲン含有組織の収縮は、多くの異なる病的状態、および外科的または美容的手法に関連して生じることがある。例えば、瘢痕の収縮は、医学的処置が必要となり得る身体的な問題を引き起こすことがあり、または、純粋に美容的性質の問題を引き起こすことがある。コラーゲンは、瘢痕および他の収縮した組織の主成分であり、したがって、考慮すべき最も重要な構造的成分である。とはいえ、瘢痕および他の収縮した組織はまた、他の構造的成分、特に他の細胞外マトリックス成分、例えばエラスチンを含み、これもまた組織の収縮に関与し得る。
【０３８７】
他の細胞外マトリックス成分を含むことがあるコラーゲン含有組織の収縮は、しばしば熱傷の治癒において生じる。熱傷は、化学熱傷、熱による熱傷または放射線熱傷であってもよく、眼、皮膚表面、または皮膚およびその下にある組織の熱傷であってもよい。放射線処置に起因するもののように、熱傷が内部の組織にあることもある。熱傷した組織の収縮はしばしば問題であり、身体的および／または美容的問題、例えば運動の喪失および／または外観の損傷につながることがある。
【０３８８】
植皮片は種々の理由のために適用され、適用後にしばしば収縮をおこし得る。熱傷を受けた組織の治癒と同様に、収縮は身体的問題および美容的問題の両方につながり得る。多くの植皮片が、例えば重度の熱傷のケースで必要となるため、これは特に深刻な問題である。
【０３８９】
収縮はまた、人工皮膚の生産においても問題である。真の人工皮膚を作製するためには、上皮細胞（ケラチノサイト）でできた表皮と、線維芽細胞が存在するコラーゲンでできた真皮とが必要である。両方の種類の細胞を有することが重要である。それは、これらが、増殖因子を使用して互いにシグナルを送り、刺激するからである。人工皮膚のコラーゲン成分は、そこに線維芽細胞が存在する場合、その原面積の１０分の１未満にしばしば収縮する。
【０３９０】
瘢痕収縮、瘢痕の線維組織の縮小による収縮は一般的である。場合によっては、瘢痕は悪性瘢痕、収縮によって重大な変形が生じる瘢痕になることがある。患者の胃は、胃潰瘍が治癒するときに形成される瘢痕組織の収縮によって、砂時計形収縮により事実上２個の別々の室に分かれることがある。通路および管の閉塞、瘢痕性狭窄症は、瘢痕組織の収縮のために生じることがある。血管の収縮は、原発性閉塞（primary obstruction）または外科的な外傷、例えば、手術または血管形成術の後のものであってもよい。他の管腔臓器、例えば尿管の狭窄症もまた生じ得る。偶発的な傷からまたは手術から生じるかどうかに関係なく、あらゆる形の瘢痕形成が起こる所に問題が生じ得る。コラーゲン含有組織の収縮を含む皮膚および腱の状態は、手術または事故から生じる外傷後の状態、例えば、手または足の腱の損傷、移植後の状態および病的状態、例えば強皮症、デュピュイトラン拘縮および表皮水疱症を含む。眼内の組織の瘢痕形成および収縮は、種々の状態、例えば網膜剥離の後遺症または糖尿病性眼疾患（上記のとおり）において生じ得る。眼球と、外眼筋および眼瞼を含むその付属構造のための頭蓋に見出されるくぼみ（socket）の収縮は、そこに外傷または炎症性損傷がある場合に生じ得る。組織はくぼみ内で収縮し、複視および醜い外観を含む種々の問題を引き起こす。
【０３９１】
様々な種類の線維症に関するさらなる情報については、Molina V, et al., 2002, Harefuah, 141: 973-8, 1009、Yu, et al., 2002, , Curr Opin Pharmacol. 2(2):177-81、Keane, et al., 2003, Am J Kidney Dis. 41: S22-5、Bohle, et al., 1989, Pathol Res Pract. 185:421-40、Kikkawa, et al., 1997, Kidney Int Suppl. 62:S39-40、Bataller et al., 2001, Semin Liver Dis. 21:437-51、Gross, et al., 2001 N Engl J Med. 345:517-25、Frohlich, 2001, Am J Hypertens;14:194S-199S、Friedman, 2003, J Hepatol. 38:S38-53、Albanis, et al., 2003, Curr Gastroenterol Rep. 5:48-56、Weber, 2000, Curr Opin Cardiol. 15:264-72 を参照のこと。
【０３９２】
核酸分子および医薬製剤の送達
核酸の送達のために有用なレチノイドまたはレチノイド結合体は、それを溶解または保持することができる媒体中に、溶解または混合された状態にある。
【０３９３】
任意のレチノイドまたはレチノイド結合体は、それが星細胞により積極的に蓄積される限り、本明細書において使用することができ、レチノイドの例としては、限定されるものではないが、トレチノイン、アダパレン、パルミチン酸レチノール、特にビタミンＡ、飽和ビタミンＡ、レチノイン酸、レチナールが挙げられる。レチノイド結合体の例としては、ＰＥＧ−レチノイド結合体を含む。本明細書は、レチノイドおよび／またはレチノイド結合体を積極的に組み込む星細胞の特性を利用するものであり、レチノイドおよび／またはレチノイド結合体を薬物担体として用いるか、またはこれを別の薬物担体成分に結合させるか含めることによって、所望の物質または物体を星細胞に特異的に輸送する。レチノイドは、４つのイソプレノイド単位がヘッド−トゥー−テイル式に連結した骨格を有する化合物のクラスの成員である。G. P. Moss, “Biochemical Nomenclature and Related Documents,” 2nd Ed. Portland Press, pp. 247-251 (1992)を参照のこと。ビタミンＡは、レチノールの生物学的活性を定性的に示すレチノイドについての一般的な記述子である。本明細書におけるレチノイドは、がん細胞およびＣＡＦへの特定の物質の送達を促進する（すなわち、物質はこれらの細胞を標的とする）。かかるレチノイドは特に限定されず、例としては、レチノール、ビタミンＡ、飽和ビタミンＡ、レチナール、レチノイン酸、レチノールと脂肪酸のエステル、脂肪族アルコールとレチノイン酸のエステル、エトレチナート、トレチノイン、イソトレチノイン、アダパレン、アシトレチン、タザロテン、およびパルミチン酸レチノール、およびフェンレチニドなどのビタミンＡアナログ、およびベキサロテンが挙げられる。レチノイド結合体は、例えば下の構造に示されるｄｉＶＡ−ＰＥＧ−ｄｉＶＡなどのＰＥＧ結合体を含む。
【化４２】
0005873168.tif 000044
【０３９４】
したがって本明細書の薬物担体は、レチノイドおよび／またはレチノイド結合体以外の薬物担体成分を含んでいてもよい。かかる成分としては、特に限定されるものではなく、医学および薬学の分野で知られている任意の成分を用いることができるが、レチノイドおよび／またはレチノイド結合体を包含する能力があることが好ましい。このような成分としては脂質を含み、例えば、グリセロリン脂質などのリン脂質、スフィンゴミエリンなどのスフィンゴ脂質、コレステロールなどのステロール、大豆油またはケシ油などの植物油、鉱油、および卵黄レシチンなどのレシチンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。中でも、リポソームを形成することができるものが好ましく、例えば、レシチンなどの天然のリン脂質、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、およびジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）などの半合成リン脂質、およびコレステロールなどが挙げられる。
【０３９５】
さらに、本明細書の薬物担体は、星細胞への取り込みを改善する物質、例えば、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）を含んでいてもよい。
【０３９６】
レチノイドおよび／またはレチノイド結合体の、本明細書の薬物担体との結合または包含はまた、レチノイドおよび／またはレチノイド結合体を、薬物担体の他の成分と、化学的および／または物理的方法によって結合または包含することによっても実現できる。代替的に、レチノイドおよび／またはレチノイド結合体の、本明細書の薬物担体との結合または包含はまた、形成親和性を有するレチノイドおよび／またはレチノイド結合体と薬物担体の基本成分を、薬物担体の調製の間に薬物担体成分中に混合することにより行ってもよい。本明細書の薬物担体中に結合または包含されるレチノイドおよび／またはレチノイド結合体の量は、薬物担体成分に対する重量比として、０．０１％〜１００％、好ましくは０．２％〜２０％、より好ましくは１％〜５％であってよい。
【０３９７】
核酸送達システムは、例えば、水性および非水性ゲル、クリーム、多重エマルジョン、マイクロエマルジョン、リポソーム、軟膏、水性および非水性溶液、ローション、エアゾール、炭化水素基剤および粉末を含んでよく、また可溶化剤、浸透促進剤（例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪アルコールおよびアミノ酸）、および親水性ポリマー（例えば、ポリカルボフィルおよびポリビニルピロリドン）などの賦形剤を含有することができる。一態様において、薬学的に許容し得る担体は、リポソームまたは経皮吸収促進剤である。本明細書で用いることができるリポソームの例としては、以下が挙げられる：
・CellFectin、すなわち、カチオン性脂質Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−テトラメチル−Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−テトラパルミチル−スペルミンとジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）との、１：１．５（Ｍ／Ｍ）のリポソーム製剤（GIBCO BRL）、
・Cytofectin GSV、すなわち、カチオン性脂質とＤＯＰＥとの２：１（Ｍ／Ｍ）のリポソーム製剤（Glen Research）、
・ＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムメチルスルフェート）（Boehringer Manheim）、
・Lipofectamine、すなわち、ポリカチオン性脂質ＤＯＳＰＡ、中性脂質ＤＯＰＥおよびジアルキル化アミノ酸（ＤｉＬＡ２）の３：１（Ｍ／Ｍ）のリポソーム製剤（GIBCO BRL）、
・Lipotrust、すなわち、Ｏ，Ｏ’−ジテトラデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド（ＤＣ−６−１４、コレステロールおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンの４：３：３（Ｍ／Ｍ）のリポソーム製剤（Hokkaido System Science）。ＤＣ−６−１４は以下の構造からなる：
【化４３】
0005873168.tif 000045
【０３９８】
その他の脂質も有用となり得る：以下を含む永久カチオン性脂質およびイオン化可能なカチオン性脂質：
【化４４】
0005873168.tif 000046
および、以下を含むＰＥＧ−脂質：
・１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−ＰＥＧ（ＰＥＧ−ＤＭＰＥ）、
・１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−ＰＥＧ（ＰＥＧ−ＤＰＰＥ）、
・１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−ＰＥＧ（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、または
・１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−ＰＥＧ（ＰＥＧ−ＤＯＰＥ）および／または
・ＰＥＧ−セラミド。
【０３９９】
送達システムは、パッチ、錠剤、坐剤、ペッサリー、ゲルおよびクリームを含んでよく、また、可溶化剤および促進剤（例えば、プロピレングリコール、胆汁酸塩およびアミノ酸）などの賦形剤、および他のビヒクル（例えば、ポリエチレングリコール、脂肪酸エステルおよび誘導体、およびヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびヒアルロン酸などの親水性ポリマー）を含むことができる。
【０４００】
本明細書の薬物担体の形態は、所望の物質や物体を、標的とする星細胞に運搬できればいずれの形態でもよく、たとえば、限定するものではないが、高分子ミセル、リポソーム、エマルジョン、微小球、ナノ小球などのうちいずれの形態をとることもできる。また、本明細書の薬物担体は、これに含まれるレチノイドおよび／またはレチノイド結合体が、遅くとも星細胞に到達するまでに、製剤の外部に少なくとも部分的に露出していれば、運搬物を内部に含んでも、運搬物の外部に付着して存在しても、また、運搬物と混合されていてもよい。
【０４０１】
本明細書の薬物担体は、星細胞を特異的な標的とするものであり、所望の物質や物体、たとえば星細胞の活性または増殖を制御する薬物等を星細胞に効率的に運搬することによって、最大の効果および最小の副作用において、所望の効果、たとえば線維化の抑制または予防を可能にする。本薬物担体が送達する物質や物体は特に制限されないが、投与部位から星細胞が存在する肝臓や膵臓などへ、生物の体内を物理的に移動できるような大きさであることが好ましい。したがって、本明細書の薬物担体は、原子、分子、化合物、タンパク質、核酸等の物質はもとより、ベクター、ウイルス粒子、細胞、１以上の要素で構成された薬物放出システム、マイクロマシン等の物体をも運搬することができる。前記物質または物体は、好ましくは星細胞に何らかの影響を与える性質を有し、たとえば、星細胞を標識するものや、星細胞の活性または増殖を制御するものを含む。
【０４０２】
したがって、本明細書の一態様においては、薬物担体が送達するものは「星細胞の活性または増殖を制御する薬物」であり、これは、線維化促進に関係する星細胞の物理化学的な作用を直接または間接に抑制する何れの薬物であってもよく、限定するものではないが、たとえばtruncated TGFβ type II receptor、およびsoluble TGFβ type II receptorなどのＴＧＦβ活性阻害剤、ＨＧＦなどの増殖因子製剤およびそれらの発現ベクター、ＭＭＰ遺伝子含有アデノウイルスベクターなどのＭＭＰ産生促進剤、アンチセンスＴＩＭＰ核酸などのＴＩＭＰ産生阻害剤、ＰＰＡＲγリガンド、アンジオテンシン活性阻害剤、ＰＤＧＦ活性阻害剤、ナトリウムチャンネル阻害剤を含む細胞活性化抑制剤および／または細胞増殖抑制剤、ならびにcompound 861、gliotoxinなどのアポトーシス誘導剤、アディポネクチン、（＋）−トランス−４−（１−アミノエチル）−１−（４−ピリジルカルバモイル）シクロヘキサンなどのＲｈｏキナーゼ阻害活性を有する化合物を包含する。また、本明細書における「星細胞の活性または増殖を制御する薬物」は、線維化抑制に直接または間接に関係する星細胞の物理化学的な作用を直接または間接に促進する何れの薬物であってもよく、限定するものではないが、たとえばコラーゲン分解系を促進する薬物、たとえばＭＭＰ発現ベクターなどのＭＭＰ産生促進剤、およびＨＧＦ、ＨＧＦアナログ、またはこれらの発現ベクターなどのＨＧＦ様の活性を有する薬物を包含する。
【０４０３】
本明細書における「星細胞の活性または増殖を制御する薬物」の別の例としては、細胞外マトリクス、たとえばコラーゲンの代謝を制御する薬物、たとえば星細胞によって産生される細胞外マトリクス構成分子を標的とする、または該細胞外マトリクス構成分子の産生もしくは分泌に機能する分子のうちの１つまたはそれ以上を標的とする、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、またはこれらの複合物を含む）などの標的分子の発現を抑制する効果を有する物質、もしくはドミナントネガティブ効果を有する物質、またはこれらを発現するベクターなどが挙げられる。
【０４０４】
本明細書はまた、前記薬物担体と、前記星細胞の活性または増殖を制御する薬物とを含む、星細胞に関連する疾患を処置するための医薬、ならびに、前記薬物担体の、星細胞に関連する疾患を処置するための医薬の製造への使用に関する。ここで、星細胞に関連する疾患とは、星細胞が、疾患の過程、すなわち疾患の発症、増悪、改善、寛解、治癒などに直接的または間接的に関与している疾患を指し、たとえば、肝炎、特に慢性肝炎、肝線維症、肝硬変および肝がん等の肝疾患、膵炎、特に慢性膵炎、膵線維症および膵がん等の膵疾患が含まれる。
【０４０５】
本明細書の医薬においては、薬物担体に含まれるレチノイドおよび／またはレチノイド結合体の少なくとも一部が、遅くとも星細胞に到達するまでに製剤の外部に露出していれば、薬物担体が薬物を内部に含んでも、薬物含有体の外部に付着して存在しても、また、薬物と混合されていてもよい。したがって、投与経路や薬物放出様式などに応じて、上記医薬を、適切な材料、たとえば、腸溶性のコーティングや、時限崩壊性の材料で被覆してもよく、また、適切な薬物放出システムに組み込んでもよい。
【０４０６】
したがって本明細書は、薬物担体構成物質、およびレチノイドおよび／もしくはレチノイド結合体、および／または薬物のうちの１つまたはそれ以上を含む１つまたはそれ以上の容器を含む薬物担体または医薬の調製キットを含み、そのようなキットの形で提供される薬物担体または医薬の必要構成要素をも含む。本明細書のキットは、上記のほか、本明細書の薬物担体および医薬の調製方法や投与方法などが記載された説明書等を含んでいてもよい。また、本明細書のキットは、本明細書の薬物担体または医薬を完成するための構成要素の全てを含んでいてもよいが、必ずしも全ての構成要素を含んでいなくてもよい。したがって、本明細書のキットは、医療現場や、実験施設などで通常入手可能な試薬や溶媒、たとえば、無菌水や、生理食塩水、ブドウ糖溶液などを含んでいなくてもよい。
【０４０７】
本明細書はさらに、前記医薬の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、星細胞に関連する疾患を処置するための方法に関する。ここで、有効量とは、対象疾患の発症を低減し、症状を軽減し、または進行を防止する量であり、好ましくは、対象疾患の発症を予防し、または対象疾患を治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌまたはブタなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。
【０４０８】
本明細書の方法において、用語「対象」は、任意の生物個体を意味し、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの個体である。本明細書において、対象は健常であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、疾患の処置が企図される場合には、典型的には同疾患に罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。
【０４０９】
また、用語「処置」は、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全てのタイプの予防的および／または治療的介入を包含するものとする。たとえば、疾患が肝線維症の場合、「処置」の用語は、線維化の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、線維症発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
【０４１０】
本明細書はまた、上記薬物担体を利用した、星細胞への薬物送達方法に関する。この方法は、限定されずに、たとえば、上記薬物担体に送達物を担持させる工程と、送達物を担持した薬物担体を星細胞を含む生物や媒体、たとえば培養培地などに投与または添加する工程とを含む。これらの工程は、公知の任意の方法や、本明細書中に記載された方法などにしたがって適宜達成することができる。上記送達方法はまた、別の送達方法、たとえば、星細胞が存在する臓器を標的とする他の送達方法などと組み合わせることもできる。
【０４１１】
核酸分子は、線維性の（例えば、肝臓、腎臓、腹膜、および肺の）疾患、形質、状態および／または障害、ならびに／または、細胞もしくは組織におけるｈｓｐ４７のレベルに関連するかまたは応答する任意の他の形質、疾患、障害または状態を予防または処置するために、単独で、または他の治療と組み合わせて適用することができる。核酸分子は、リポソームを含む、対象に投与するための送達ビヒクル、担体および希釈剤およびそれらの塩を含むことができ、および／または核酸分子は、薬学的に許容し得る製剤中に存在することができる。
【０４１２】
本明細書の核酸分子は、表３に示す配列を含むことができる。かかる核酸分子の例は、表３に提供される配列から本質的になる。
【０４１３】
核酸分子は肺送達、例えば、関連する肺組織への核酸分子の迅速な局所取り込みをもたらす吸入装置または噴霧器によって投与されるエアゾールまたは噴霧乾燥製剤の吸入などによって投与することができる。微粉化された核酸組成物の呼吸可能な乾燥粒子を含む固体粒子組成物は、乾燥または凍結乾燥した核酸組成物を粉砕し、次いで、微粉化された組成物を４００メッシュのスクリーンに通し、大きな集塊を分割または分離することにより調製することができる。本明細書の核酸組成物を含む固体粒子組成物は、任意に、エアゾールの形成を容易にするのに役立つ分散剤、ならびに、他の治療化合物を含んでもよい。好適な分散剤はラクトースであり、それは任意の好適な比率、例えば１対１の重量比で、核酸化合物と混合することができる。
【０４１４】
液体粒子のエアゾールは、本明細書に開示される核酸分子を含んでもよく、任意の好適な手段、例えば噴霧器（例えば米国特許第4,501,729号参照）などにより製造することができる。噴霧器は、圧縮ガス、典型的には空気または酸素の、狭いベンチュリ開口を介した加速か、または超音波撹拌により、活性成分の溶液または懸濁液を治療的なエアゾールに変換する市販の装置である。噴霧器に用いられる好適な製剤は、活性成分を、製剤の４０％ｗ/ｗまでの量、好ましくは２０％ｗ/ｗ未満の量で液体担体に含む。担体は、典型的には、水または希釈アルコール水溶液であり、好ましくは、例えば塩化ナトリウムまたは他の好適な塩の添加によって体液と等張にされる。任意の添加剤は、製剤が無菌で調製されない場合は防腐剤、例えば、ヒドロキシ安息香酸メチル、抗酸化剤、香味料、揮発油、緩衝剤および乳化剤および他の製剤界面活性剤を含む。活性組成物と界面活性剤とを含む固体粒子のエアゾールは、任意の固体粒子エアゾール発生器で同様に製造することができる。対象に固体粒子治療剤を投与するためのエアゾール発生器は、上記で説明したとおり、吸入可能な粒子を産生し、ヒトへの投与に好適な速度で、治療組成物の予め定められた計量された用量を含むエアゾールの量を生成する。固体粒子エアゾール発生器の１つの例示的な種類は、吸入器（insufflator）である。吸入法による投与のための好適な製剤は、吸入器で送達することができる、微細に粉砕された粉末を含む。吸入器内で、粉末、例えば本明細書に記載の処置を実行するのに有効なその計量された用量は、カプセルまたはカートリッジ（典型的にはゼラチンまたはプラスチック製）に含まれ、それはin situで穿刺されるか開放され、粉末は、吸入により装置を介して吸い込まれる空気によって、または手動ポンプによって送達される。吸入器で使用される粉末は、単に活性成分のみか、または、活性成分、好適な粉末希釈剤、例えばラクトースおよび任意に界面活性剤を含む粉末混合物からなる。活性成分は、典型的には、製剤の０．１〜１００ｗ／ｗを含む。エアゾール発生器の第２の例示的な種類は、定量式インヘラー（inhaler）を含む。定量式インヘラーは、加圧式エアゾールディスペンサーであり、典型的には、液化噴射剤中の活性成分の懸濁液または溶液製剤を含む。使用の間、これらのデバイスは、計量された容量を送達し、活性成分を含む微粒子スプレーを生成するよう構成されたバルブを介して製剤を放出する。好適な噴射剤は、一部のクロロフルオロカーボン化合物、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンおよびこれらの混合物を含む。製剤は、１種または２種以上の共溶媒、例えば、エチルアルコール、乳化剤および他の製剤界面活性剤、例えば、オレイン酸またはトリオレイン酸ソルビタン、抗酸化剤および好適な香料をさらに含むことができる。肺送達のための他の方法は、例えば、US 20040037780、US 6,592,904、US 6,582,728およびUS 6,565,885号に記載されている。WO2008/132723は、概してオリゴヌクレオチドの、そして特にｓｉＲＮＡの呼吸器系へのエアゾール送達に関する。
【０４１５】
核酸分子は、中枢神経系（ＣＮＳ）または末梢神経系（ＰＮＳ）に投与することができる。実験は、in vivoでのニューロンによる核酸の効果的な取り込みを証明した。例えば、Sommer et al., 1998, Antisense Nuc. Acid Drug Dev., 8:75、Epa et al., 2000, Antisense Nuc. Acid Drug Dev., 10:469、Broaddus et al., 1998, J. Neurosurg., 88:734、Karle et al., 1997, Eur. J. Pharmocol., 340:153、Bannai et al., 1998, Brain Research, 784:304、Rajakumar et al., 1997, Synapse, 26:199、Wu-pong et al., 1999, BioPharm, 12:32、Bannai et al., 1998, Brain Res. Protoc., 3:83、およびSimantov et al., 1996, Neuroscience, 74:39を参照のこと。核酸分子は、したがって、ＣＮＳおよび／またはＰＮＳにおける細胞への送達およびこれらの細胞による取り込みに適している。
【０４１６】
ＣＮＳへの核酸分子の送達は、種々の異なる戦略によって提供される。用いることができるＣＮＳ送達の伝統的なアプローチは、限定されずに、クモ膜下および脳室内投与、カテーテルおよびポンプの移植、損傷部位または病変部位への直接注射または灌流、脳動脈系への注射、または血液脳関門の化学的または浸透圧的開放を含む。他のアプローチは、種々の輸送および担体システムの使用、例えば、結合体および生分解性ポリマーの使用を介するものを含んでもよい。さらに、ＣＮＳで核酸分子を発現させるために、遺伝子治療アプローチ、例えば、Kaplitt et al.、米国特許第6,180,613号およびDavidson、WO 04/013280に記載のものを用いることができる。
【０４１７】
核酸分子は、ポリエチレンイミン（例えば、直鎖または分枝ＰＥＩ）、および／または、例えば、グラフトＰＥＩ、例えば、ガラクトースＰＥＩ、コレステロールＰＥＩ、抗体誘導体化ＰＥＩ、およびこれらのポリエチレングリコールＰＥＩ（ＰＥＧ−ＰＥＩ）誘導体を含む、ポリエチレンイミン誘導体（例えば、Ogris et al., 2001, AAPA PharmSci, 3, 1-11、Furgeson et al., 2003, Bioconjugate Chem., 14, 840-847、Kunath et al., 2002, Pharm Res 19:810-17、Choi et al., 2001, Bull. Korean Chem. Soc., 22:46-52、Bettinger et al., 1999, Bioconjugate Chem., 10:558-561、Peterson et al., 2002, Bioconjugate Chem. 13:845-54、Erbacher et al., 1999, J Gene Med 1:1-18、Godbey et al., 1999., PNAS, 96:5177-81、Godbey et al., 1999, J Controlled Release, 60:149-60、Diebold et al., 1999, J Biol Chem, 274:19087-94、Thomas et al., 2002, PNAS, 99, 14640-45、およびSagara, 米国特許第6,586,524号参照）と製剤化または複合体化されてもよい。
【０４１８】
核酸分子は、バイオコンジュゲート、例えばVargeese et al.、米国出願第10/427,160号、米国特許第6,528,631号、米国特許第6,335,434号、米国特許第6,235,886号、米国特許第6,153,737号、米国特許第5,214,136号、米国特許第5,138,045号などに記載の核酸結合体を含んでもよい。
【０４１９】
本明細書に開示される組成物、方法およびキットは、本明細書の少なくとも１個の核酸分子を、該核酸分子の発現を可能にする様式でコードする核酸配列を含む発現ベクターを含んでもよい。核酸分子またはｄｓＲＮＡの鎖を発現することができる１個または２個以上のベクターを細胞の環境に導入する方法は、細胞の種類およびその環境の構成に依存する。核酸分子またはベクターコンストラクトは、細胞の内部に（すなわち、細胞内に）、直接導入しても、または生体の空洞内、間質腔内、循環中に、細胞外導入しても、経口的に導入しても、または、生体または細胞をｄｓＲＮＡを含む溶液に浸すことによって導入してもよい。細胞は、好ましくは哺乳動物細胞であり、より好ましくはヒト細胞である。発現ベクターの核酸分子は、センス領域とアンチセンス領域とを含むことができる。アンチセンス領域は、ｈｓｐ４７をコードするＲＮＡまたはＤＮＡの配列に相補的な配列を含んでもよく、センス領域はアンチセンス領域に相補的な配列を含んでもよい。核酸分子は、相補的なセンスおよびアンチセンス領域を有する２本の異なった鎖を含んでもよい。核酸分子は、相補的なセンスおよびアンチセンス領域を有する単一の鎖を含んでもよい。
【０４２０】
標的ＲＮＡ分子と相互作用し、標的ＲＮＡ分子（例えば、本明細書に記載のGenbankアクセッション番号によって示される標的ＲＮＡ分子）をコードする遺伝子を下方制御する核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現させてもよい。組換えベクターは、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターであってもよい。核酸分子を発現するウイルスベクターは、限定されずに、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスまたはアルファウイルスをベースに構築することができる。核酸分子を発現させることができる組換えベクターは本明細書に記載のとおりに送達され、標的細胞内に存続することができる。あるいは、ウイルスベクターは、核酸分子の一過性発現をもたらすことに用いることができる。かかるベクターは、必要に応じて繰り返し投与することができる。核酸分子は、ひとたび発現されると、結合し、遺伝子機能または発現をＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して下方制御する。核酸分子を発現するベクターの送達は、全身性であってもよく、これは例えば静脈内もしくは筋肉内投与によるもの、対象から外植した標的細胞への投与と、その後の対象への再導入によるもの、または、所望の標的細胞への導入を可能にする他のあらゆる手段によるものであってもよい。
【０４２１】
発現ベクターは、少なくとも１個の本明細書に開示される核酸分子をコードする核酸配列を、該核酸分子の発現を可能にする様式で含んでもよい。例えば、ベクターは、二重鎖を含む核酸分子の両方の鎖をコードする１または２以上の配列を含んでもよい。ベクターはまた、自己相補的で、したがって核酸分子を形成する単一の核酸分子をコードする１または２以上の配列を含んでもよい。かかる発現ベクターの非限定例は、Paul et al., 2002, Nature Biotech 19, 505、Miyagishi and Taira, 2002, Nature Biotech 19, 497、Lee et al., 2002, Nature Biotech 19, 500、およびNovina et al., 2002, Nature Med:10.1038/nm725に記載されている。発現ベクターはまた、哺乳動物（例えば、ヒト）の細胞に含まれていてもよい。
【０４２２】
発現ベクターは、同じであっても異なっていてもよい、２個または３個以上核酸分子をコードする核酸配列を含んでもよい。発現ベクターは、Genbankアクセッション番号NM_001235で示される核酸分子に相補的な核酸分子についての配列、例えば表２に示すものを含んでもよい。
【０４２３】
発現ベクターは、核酸二重鎖の一方または両方の鎖、または自己ハイブリダイゼーションして核酸二重鎖となる単一の自己相補的鎖をコードしてもよい。核酸分子をコードする核酸配列は、核酸分子の発現を可能にする様式で作動的に連結することができる（例えばPaul et al., 2002, Nature Biotech 19, 505、Miyagishi and Taira, 2002, Nature Biotech 19, 497、Lee et al., 2002, Nature Biotech 19, 500、およびNovina et al., 2002, Nature Med, 10.1038/nm725参照）。
【０４２４】
発現ベクターは、以下の１個または２個以上：ａ）転写開始領域（例えば真核生物ｐｏｌ  Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ開始領域）、ｂ）転写終止領域（例えば真核生物ｐｏｌ  Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ終止領域、ｃ）イントロン、およびｄ）核酸分子の少なくとも１個をコードする核酸配列、を含んでもよく、ここで、該配列は、核酸分子の発現および／または送達を可能にする様式で、開始領域および終止領域に作動的に連結している。ベクターは、核酸分子をコードする配列の５’側または３’側に作動的に連結した、タンパク質のためのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、および／またはイントロン（介在配列）を任意に含んでもよい。
【０４２５】
核酸分子配列の転写は、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ  Ｉ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩ）またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩＩ）のためのプロモーターから開始されてもよい。ｐｏｌ  ＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターからの転写物は、全ての細胞において高レベルで発現される。所定の細胞種における所定のｐｏｌ  ＩＩプロモーターのレベルは、近くに存在する遺伝子調節配列（エンハンサー、サイレンサーなど）の性質に依存する。原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素が適切な細胞で発現されているという条件で、原核生物ＲＮＡポリメラーゼプロモーターも用いられる（Elroyet al., 1990, PNAS, 87:6743-47、Gao et al., 1993, Nucleic Acids Res 21:2867-72、Lieber et al., 1993, Methods Enzymol., 217:47-66、Zhou et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10:4529-37）。複数の研究者は、かかるプロモーターから発現される核酸分子が、哺乳動物細胞において機能し得ることを証明した（例えば、Kashani-Sabet et al., 1992, Antisense Res. Dev., 2:3-15、Ojwang et al., 1992, PNAS 89:10802-06、Chen et al., 1992, Nucleic Acids Res., 20:4581-89、Yu et al., 1993, PNAS, 90:6340-44、L'Huillier et al., 1992, EMBO J., 11:4411-18、Lisziewicz et al., 1993, PNAS 90: 8000-04、Thompson et al., 1995, Nucleic Acids Res., 23:2259、Sullenger et al., 1993, Science, 262:1566）。より詳細には、転写単位、例えば、Ｕ６低分子核（ｓｎＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびアデノウイルスＶＡ  ＲＮＡをコードする遺伝子に由来するものなどが、高濃度の所望のＲＮＡ分子、例えばｓｉＮＡなどを細胞内で生成するのに有用である（上記Thompson et al.、上記Couture and Stinchcomb, 1996、Noonberg et al., 1994, Nucleic Acid Res., 22, 2830、Noonberg et al., U.S. Pat. No. 5,624,803、Good et al., 1997, Gene Ther., 4, 45、Beigelman et al.、ＰＣＴ国際公開WO 96/18736）。上記の核酸転写単位は、限定されずに、プラスミドＤＮＡベクター、ウイルスＤＮＡベクター（例えばアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベクター）またはウイルスＲＮＡベクター（例えばレトロウイルスまたはアルファウイルスベクター）などを含む、哺乳動物細胞への導入のための様々なベクターに組み込むことができる（上記Couture and Stinchcomb, 1996参照）。
【０４２６】
核酸分子は、細胞内で、真核生物プロモーター（例えば、Izant and Weintraub, 1985, Science, 229, 345、McGarry and Lindquist, 1986, PNAS 83, 399、Scanlon et al., 1991, PNAS 88:10591-95、Kashani-Sabet et al., 1992, Antisense Res. Dev., 2:3-15、Dropulic et al., 1992, J. Virol., 66:1432-41、Weerasinghe et al., 1991, J. Virol., 65:5531-34、Ojwang et al., 1992, PNAS, 89:10802-06; Chen et al., 1992, Nucleic Acids Res., 20:4581-89、Sarver et al., 1990 Science, 247:1222-25、Thompson et al., 1995, Nucleic Acids Res., 23:2259、Good et al., 1997, Gene Therapy, 4:45）から発現させることができる。当業者は、あらゆる核酸を、適切なＤＮＡ／ＲＮＡベクターから真核細胞において発現させ得ることを理解する。かかる核酸の活性は、酵素核酸による一次転写産物からのその放出によって増大させることができる（Draper et al., PCT WO 93/23569、およびSullivan et al., PCT WO 94/02595、Ohkawa et al., 1992, Nucleic Acids Symp. Ser., 27, 15-6、Taira et al., 1991, Nucleic Acids Res., 19, 5125-30、Ventura et al., 1993, Nucleic Acids Res., 21, 3249-55、Chowrira et al., 1994, J. Biol. Chem., 269, 25856）。
【０４２７】
ウイルス粒子にパッケージされたウイルスコンストラクトは、細胞への発現コンストラクトの効果的な導入と発現コンストラクトがコードするｄｓＲＮＡコンストラクトの転写の両方を達成する。
【０４２８】
経口的な導入のための方法は、ＲＮＡと生物の食物との直接の混合、ならびに、食物として用いられる種をＲＮＡを発現するように操作し、次いで、影響を受ける生物に与える、遺伝子工学的アプローチを含む。細胞に核酸分子溶液を導入するために物理的な方法を使用してもよい。核酸を導入する物理的な方法は、核酸分子を含む溶液の注射、核酸分子で被覆した粒子による爆撃、細胞または生物のＲＮＡの溶液への浸漬、または核酸分子の存在下における細胞膜のエレクトロポレーションを含む。
【０４２９】
核酸を細胞に導入するための当該技術分野で既知の他の方法、例えば、脂質媒介性担体輸送、化学物質媒介性輸送、例えばリン酸カルシウムなどを用いてもよい。したがって、核酸分子は、以下の活性の１または２以上を有する成分と共に導入されてもよい：細胞によるＲＮＡの取り込みを強化する、二重鎖のアニーリングを促進する、アニールした鎖を安定させる、または別の方法で標的遺伝子の阻害を増大させる。
【０４３０】
投与量
投与すべき有用な投与量および具体的な投与方法は、当業者に直ちに明らかであるように、細胞種、または、in vivoでの使用については、年齢、体重、および処置する動物およびその領域、使用する具体的な核酸と送達方法、考慮される治療的もしくは診断的用途、および製剤の剤形（例えば、懸濁剤、エマルション、ミセルもしくはリポソーム）などの要因に応じて異なる。典型的には、投薬量はより低いレベルで投与され、所望の効果が達成されるまで増量する。
【０４３１】
核酸を送達するのに脂質を用いる場合、投与する脂質化合物の量は異なってもよく、一般に、投与する核酸の量に依存する。例えば、脂質化合物の核酸に対する重量比は、好ましくは約１：１〜約３０：１であり、約５：１〜約１５：１の重量比がより好ましい。
【０４３２】
核酸分子の好適な投与単位は、１日あたりレシピエントの体重１キログラムにつき０．００１〜０．２５ミリグラムの範囲、１日あたり体重１キログラムにつき０．０１〜２０マイクログラムの範囲、１日あたり体重１キログラムにつき０．０１〜１０マイクログラムの範囲、１日あたり体重１キログラムにつき０．１０〜５マイクログラムの範囲、または１日あたり体重１キログラムにつき０．１〜２．５マイクログラムの範囲にあってもよい。
【０４３３】
好適な量の核酸分子を導入することができ、これらの量は、標準的な方法を用いて実験的に決定することができる。細胞の環境における個々の核酸分子種の有効濃度は、約１フェムトモル、約５０フェムトモル、１００フェムトモル、１ピコモル、１．５ピコモル、２．５ピコモル、５ピコモル、１０ピコモル、２５ピコモル、５０ピコモル、１００ピコモル、５００ピコモル、１ナノモル、２．５ナノモル、５ナノモル、１０ナノモル、２５ナノモル、５０ナノモル、１００ナノモル、５００ナノモル、１マイクロモル、２．５マイクロモル、５マイクロモル、１０マイクロモル、１００マイクロモルであっても、またはそれを上回ってもよい。
【０４３４】
１日あたり体重１キログラムにつき約０．１ｍｇ〜約１４０ｍｇ程度の投与量レベルは、上記状態の処置に有用である（１日あたり１対象につき約０．５ｍｇ〜約７ｇ）。単一の投薬形態を生成するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、処置される宿主と、具体的な投与方法によって異なる。投薬単位形態は、一般的に、約１ｍｇ〜約５００ｍｇの活性成分を含む。
【０４３５】
任意の特定の対象のための具体的な用量レベルは、使用する具体的な化合物の活性、年齢、体重、一般健康状態、性別、食事、投与、投与時間、投与経路、および排出速度、併用薬剤および治療を受けている特定の疾患の重篤度を含む種々の要因に依存することが理解される。
【０４３６】
本明細書に開示される核酸分子を含む医薬組成物は、１日１回、ｑｉｄ、ｔｉｄ、ｂｉｄ、ＱＤ、または、医学的に適切な任意の間隔で、任意の期間投与することができる。しかし、治療剤はまた、１日を通して適切な間隔で投与される、２、３、４、５、６または７以上の下位用量を含む投薬単位で投薬することもできる。その場合、各々の下位用量に含まれる核酸分子は、１日の合計投薬単位を達成するために、対応してより少なくてもよい。投薬単位はまた、例えば、数日間にわたってｄｓＲＮＡの持続的な一定の放出をもたらす従来の徐放製剤を用いて、数日にわたる単一の用量のために組み合わせる（compound）ことができる。徐放製剤は当該技術分野において周知である。投薬単位は、対応する複数の一日量を含んでもよい。組成物は、核酸の複数の単位の合計が一緒になって十分な用量を含むように、組み合わせることができる。
【０４３７】
医薬組成物、キットおよび容器
また提供されるのは、本明細書において提供されるｈｓｐ４７の発現を低減するための核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）を含む、該核酸分子を患者に投与または分配するための組成物、キット、容器および製剤である。キットは、少なくとも１個の容器と少なくとも１枚のラベルとを含んでもよい。好適な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管を含む。容器は、種々の材料、例えばガラス、金属またはプラスチックから形成されていてもよい。容器は、１または２以上のアミノ酸配列、１または２以上の小分子、１または２以上の核酸配列、１または２以上の細胞集団および／または１または２以上の抗体を保持していてもよい。一態様において、容器は、細胞のｍＲＮＡ発現プロファイルを検査するためのポリヌクレオチドを、この目的のために用いる試薬と共に保持する。別の態様において、容器は、細胞および組織におけるｈｓｐ４７タンパク質の発現の評価に用いるための、または関連する実験室用途、予後判定用途、診断用途、予防用途および治療用途のための抗体、その結合断片または特異的結合タンパク質を含む。これらの用途のための指示および／または使用法が、かかる容器上またはかかる容器と共に含まれていてもよい。これらの目的のために用いる試薬および他の組成物またはツールが、同様に含まれていてもよい。キットは、関連する指示および／または使用法をさらに含んでもよく、かかる目的のために用いる試薬および他の組成物またはツールが含まれていてもよい。
【０４３８】
容器は、代替的に、状態を処置、診断、予後判定または予防するのに有効な組成物を保持することができ、無菌のアクセスポートを有してもよい（例えば、容器はストッパーを皮下注射針によって穿刺可能な密栓を有する静脈注射用の溶液バッグまたはバイアルであってもよい）。組成物中の活性剤は、ｈｓｐ４７に特異的に結合することができる、および／またはｈｓｐ４７の機能を調節することができる核酸分子であってもよい。
【０４３９】
キットは、薬学的に許容し得るバッファー、例えばリン酸緩衝食塩水、リンゲル液および／またはブドウ糖溶液などを含む第２の容器をさらに含んでもよい。キットは、商業的見地および使用者の見地から望ましい他の材料をさらに含んでもよく、これには他のバッファー、希釈液、フィルター、撹拌器、針、注射器および／または、使用のための指示および／または説明を含む添付文書を含む。
【０４４０】
核酸分子が使用前に包装されている単位投与量アンプルまたは多用量容器は、その薬学的に有効な用量、または複数の有効用量のために適した量のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む溶液が入った密閉容器を含んでもよい。ポリヌクレオチドは無菌製剤として包装され、密閉容器は使用まで製剤の無菌性を維持するように設計されている。
【０４４１】
細胞性免疫応答要素をコードする配列またはその断片を含むポリヌクレオチドを含む容器は、ラベルが付されたパッケージを含んでもよく、ラベルは、政府関係機関、例えば米国食品医薬品局によって定められた形式の通知を有してもよく、その通知は、そこに含まれるポリヌクレオチド材料のヒトへの投与のため製造、使用または販売に関する、前記機関による連邦法上の承認を反映する。
【０４４２】
連邦法は、ヒトの治療における医薬組成物の使用について、連邦政府の機関の承認を得ることを義務づけている。米国において、執行は食品医薬品局の管轄であり、同局は、かかる承認を保証するために、21 U.S.C.§301〜392に詳述される適切な規制を設けている。動物の組織から製造される産物を含む生物学的材料のための規制は、42 U.S.C.§301に設けられている。類似した承認が外国のほとんどで必要とされる。規制は国ごとに異なるが、個々の手続は当業者に周知であり、本明細書において提供される組成物および方法は、好ましくはしかるべくそれに従う。
【０４４３】
投与される投与量は、処置する対象の状態と大きさ、および、処置の頻度と投与経路に大きく依存する。用量および頻度を含む継続的治療のためのレジメンは、初期の反応および臨床判断によってガイドされてもよい。組織間隙への注射の非経口経路が好ましいが、他の非経口経路、例えばエアゾール製剤の吸入などが、特定の投与、例えば鼻の粘膜、喉、気管支組織または肺への投与において必要とされることがある。
【０４４４】
したがって、本明細書において提供されるのは、薬学的に許容し得る注射用担体中の溶液の状態の、細胞性免疫反応要素またはその断片をコードする配列を含み、組織中の間質に導入され、組織の細胞に細胞性免疫反応要素またはその断片を発現させるのに適したポリヌクレオチド、溶液を入れた容器、および、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府関係機関によって定められた形式の、容器に付随する表示、を含んでもよい医薬製品であり、その表示は、ポリヌクレオチド溶液のヒトへの投与のための製造、使用または販売に関する、前記機関による承認を反するものである。
【０４４５】
適応症
本明細書に開示される核酸分子は、ｈｓｐ４７に関連する疾患、状態または障害、例えば肝線維症、肝硬変、肺線維症、腎線維症、腹膜線維症、慢性肝障害および原線維形成など、ならびに、細胞または組織におけるｈｓｐ４７のレベルに関係するか、または反応するあらゆる他の疾患または状態を、単独でまたは他の治療法と組み合わせて処置するのに用いることができる。したがって、本明細書に開示される組成物、キットおよび方法は、ラベルまたは添付文書を含む、本明細書に開示される核酸分子の包装を含んでもよい。ラベルは、核酸分子の使用法、例えば、肝線維症、腹膜線維症、腎線維症および肺線維症、ならびに、細胞または組織におけるｈｓｐ４７のレベルに関係するか、または反応するあらゆる他の疾患または状態の、単独での、または他の治療法と組み合わせての処置または予防のための使用法を含んでもよい。ラベルは、ｈｓｐ４７の発現の低減における使用法を含んでもよい。「添付文書」は、治療用製品の商用パッケージに通例含まれる指示を指すのに用い、それは、適応症、用法、用量、投与、禁忌、包装された製品と併用すべき他の治療用製品および／またはかかる治療用製品の使用に関する警告などに関する情報を含む。
【０４４６】
当業者は、当該技術分野において既知の他の抗線維症処置、薬剤および治療法を、本明細書に記載の核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）と容易に組み合わせることができることを認識し、それゆえに、これらは本明細書において考慮されている。
【０４４７】
本明細書において提供される方法および組成物は、以下の非限定例を参照して、以下でより詳細に解説される。
【０４４８】
例１  ｇｐ４６に対するｓｉＲＮＡの作製
collagen（Ｉ〜ＩＶ型）の共通分子シャペロンであるＨＳＰ４７の塩基配列を標的とするｓｉＲＮＡ認識至適配列のうち、配列ＡおよびＢは、株式会社iGENEのｓｉＲＮＡオリゴ用プログラムデザインに従い作成した。また配列Ｃは、インターネット上でAmbion社製のsiRNA Target Finderを用いて、ｒａｔ  ｇｐ４６（ヒトＨＳＰ４７ホモログ、GenBank Accession No. M69246）に対するtargetとなる１９塩基配列を選び検索し作成した。設計においては、開始コドンから７５〜１００塩基下流から開始すること、最初のＡＡダイマーを位置付けること、およびＧＣ含有率が３０％〜７０％であること、に留意した。本例においては、以下の配列を有するｓｉＲＮＡを作製した。
【化４５】
0005873168.tif 000047
【０４４９】
例２  作製したｓｉＲＮＡ  によるｇｐ４６発現の抑制 
ratのｇｐ４６を持っており、なおかつcollagenを産生する線維芽細胞であるNormal rat kidney細胞（ＮＲＫ細胞）に、０．１ｎＭ〜５０ｎＭの各ｓｉＲＮＡをそれぞれtransfectionし、１２〜４８時間培養した（図１）。ｇｐ４６の発現量は、Western blot法で確認した（図２〜４、上のバンドがｇｐ４６、下がコントロールのａｃｔｉｎ）。いずれのｓｉＲＮＡも、vehicleに比べて顕著にｇｐ４６タンパク質の発現を抑制した（図２）。以下の実験では、このうち最も効果が強かった配列Ａを有するｓｉＲＮＡを用いた。ｓｉＲＮＡによる抑制は濃度依存的であり（図３）、ｇｐ４６の蛋白発現は５０ｎＭのｓｉＲＮＡにて４８時間後には約９０％抑制された（図４）。
【０４５０】
例３  作製したｓｉＲＮＡ  によるcollagen合成の抑制
前述のとおりの条件（ｓｉＲＮＡの濃度は５０ｎＭ、時間は４８時間で処理）で、コラーゲンの合成量を検討するためラット線維芽細胞（ＮＲＫ細胞）の培養上清に3H-prolineを加え、transfection後の分泌蛋白中の３Ｈ量を検討した（図５）。コラーゲン合成量は、Peterkofsky et al., 1971 Biochemistry 10:988-94を元に、ｇｐ４６ｓｉＲＮＡ導入線維芽細胞を3H-proline存在下に培養し、上清中に分泌された蛋白量とcollagenaseで分解された蛋白量の比から算定した。
【０４５１】
コラーゲン合成率＝コラゲナーゼ感受性画分×１００（５．４×コラゲナーゼ非感受性画分＋コラゲナーゼ感受性画分）
【０４５２】
ラット線維芽細胞におけるコラーゲン合成率はcontrol群と比較して約４０％低下した（図６）。
【０４５３】
例４  核酸のＨＳＣへの特異的な導入
１０％のビタミンＡ（ＶＡ）とリポソームを混合して形成したＶＡを被包化したリポソームと、ＧＦＰ発現プラスミドとを混合してエマルジョン（ＶＡ−Ｌｉｐ−ＧＦＰ）を作製した。カチオン性脂質としてＯ，Ｏ’−ジテトラデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアミノアセチル）ジエタノールアミンクロリド（ＤＣ−６−１４）、コレステロール、およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを含有するカチオン性リポソームを、４：３：３のモル比で、クロロホルム−メタノール混合物（４：１、ｖ：ｖ）中に溶解し、溶媒を真空下で蒸発させて除去した。脂質を、９％ショ糖水溶液と混合し、６０℃で水和し、均質になるまでホモジナイズした。分散物は、０．２２μｍの孔径のポリビニリデンフルオリドメンブレンフィルターを通して２回押し出した。分散物をガラスバイアルに分注し、凍結し、次いで凍結乾燥した。乾燥リポソームは、使用前にボルテックス下１ｍＭのＤＣ−６−１４の濃度で、蒸留水により再構成した。具体的には、まずビタミンＡ  ２５ｍｇをＤＭＳＯ８７μｌで溶解し、１００ｍＭの原液を作製した。ＶＡ結合リポソームを調製するため、ＤＭＳＯに溶解した２００ｎｍｏｌのＶＡと、１００ｎｍｏｌのＤＣ−６−１４とを、室温でボルテックスすることにより混合した。ＶＡ−ｓｉＲＮＡ−リポソームをラットに門脈内投与し、肝組織を回収固定した。エマルジョンは、２００ｇのラットの血漿量を約１０ｍｌと想定し、門脈血中のＶＡおよびＧＦＰ濃度が１０μＭとなるように作製した。このＶＡ原液１μｌにＶＡ−リポソーム１０μｌ、ＰＢＳ１７９μｌを加えて、さらにＧＦＰ発現プラスミド１０μｇを添加し合計で２００μｌとし、３分間ボルテックスしＶＡ−Ｌｉｐ−ＧＦＰとした。ＳＤラットを開腹し、ＶＡ−Ｌｉｐ−ＧＦＰを末梢門脈内にゆっくり注入した。注入の４８時間後に肝組織を採取した。中間径フィラメントのデスミンは、他の肝細胞と比較してＨＳＣに特異的に発現しているので、固定肝組織をAlexa Fluor568標識抗デスミン抗体で染色し、ＧＦＰとの蛍光二重像を観察したところ、ＨＳＣ内でＧＦＰが発現していることが確認された（図７）。無処置対照やＧＦＰ発現プラスミドベクター単独投与群ではラットＨＳＣでの発現は認めなかったが、ＶＡ−Ｌｉｐ−ＧＦＰを投与した群では、星細胞特異的にＧＦＰの発現を認めた。
【０４５４】
例５  核酸導入率の定量
ＧＦＰ発現プラスミドの代わりにＦＩＴＣ標識ｇｐ４６ｓｉＲＮＡを用いた以外は、例４と同様にして、ＶＡを被包化したリポソームとＦＩＴＣ標識ｇｐ４６ｓｉＲＮＡとを含むエマルジョン（ＶＡ−Ｌｉｐ−ｇｐ４６ｓｉＲＮＡ（ＦＩＴＣ））を作製した。ｓｉＲＮＡｇｐ４６（蒸留水中５８０ｐｍｏｌ／μｌ）の溶液を、室温で撹拌しながら、例４のＶＡ結合リポソーム溶液に添加した。ｓｉＲＮＡのＤＣ−６−１４に対する比率は１：１１．５（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であり、ｓｉＲＮＡのリポソームに対する比率（ｗｔ／ｗｔ）は１：１であった。遊離ＶＡまたはｓｉＲＮＡは、VIVASPIN濃縮器30K MWCOを用いたマイクロパーティションにより、３回の通過で除去した。メンブレン上に捕捉された物質をＰＢＳで再構成し、ＳＤラットに門脈内投与した（ｓｉＲＮＡの量として１０μｇ／２００μＬ）。投与の４８時間後に肝組織を採取し、他の肝細胞と比較してＨＳＣに特異的に発現しているαＳＭＡ（平滑筋アクチン）をAlexa Fluor568標識抗αＳＭＡ抗体で、細胞核をＤＡＰＩでそれぞれ染色し、共焦点レーザー走査顕微鏡（ＬＳＭ）で蛍光象を観察した。図８左側に示すとおり、ＶＡ−Ｌｉｐ−ｇｐ４６ｓｉＲＮＡ（ＦＩＴＣ）投与群では、ＦＩＴＣによる緑色蛍光とAlexa Fluor568による赤色蛍光の両方を発する細胞が多く見られ、ＮＩＨ  ｉｍａｇｅによって定量したところ（×1000の蛍光顕微鏡写真を任意の１０視野選び上記細胞数を検定した）、導入効率は７７．６％（１０視野平均）であった。これに対して、ＶＡを含まないＬｉｐ−ｇｐ４６ｓｉＲＮＡ（ＦＩＴＣ）投与群においては、導入効率は１４．０％と低く、しかも、星細胞以外の細胞への導入が３．０％見られた（図８右側参照）。以上の結果から、ＶＡを包含させることにより、星細胞への導入効率が劇的に高まることが分かる。
【０４５５】
例６  ＶＡ−Ｌｉｐ−ｇｐ４６ｓｉＲＮＡによるｇｐ４６の発現抑制
例５で採取した組織の別の切片において、ｇｐ４６をAlexa Fluor568標識抗ＨＳＰ４７抗体で、細胞核をＤＡＰＩでそれぞれ染色し、共焦点レーザー走査顕微鏡で蛍光象を観察した。図９に示すとおり、ＶＡ−Ｌｉｐ−ｇｐ４６ｓｉＲＮＡ投与群において、赤色蛍光として認められるｇｐ４６の発現（同図右側）が、ｇｐ４６に特異的でないｒａｎｄｏｍ  ｓｉＲＮＡを含むＶＡ−Ｌｉｐ−ｒａｎｄｏｍ  ｓｉＲＮＡを投与した対照群（同図左側）に比べて顕著に低減していることが認められた。対照群の６視野平均に対する発現抑制率は、例７と同様にＮＩＨ  ｉｍａｇｅにより×1000の蛍光顕微鏡写真を任意の１０視野選びｇｐ４６陰性細胞数を検定したところ、７５％と極めて高いものであった。
【０４５６】
例７  ＬＣラットの処置（門脈内投与１）
Jezequelらの報告（Jezequel et al., 1987, J Hepatol. 5:174-81）に従い、ジメチルニトロソアミン（ＤＭＮ）を使用して、ＬＣモデルラットを作製した（図１０）。具体的には、５週齢のＳＤラット（雄）に１％ＤＭＮを１ｍｌ／ｋｇ（腹腔内投与）の分量において週３回連日投与した。既報の如く２週目より線維の増加を認め４週目には著明な線維化、肝小葉構築の破壊、再生結節形成を伴う所見を認めた（図１１）。そこで、例４および５と同様な方法によってｇｐ４６ｓｉＲＮＡをリポソーム化し、これに１０％ＶＡを混合したエマルジョン（ＶＡ−Ｌｉｐ−ｇｐ４６ｓｉＲＮＡ）を投与した。十分に線維化の認められる３週目よりＶＡ−Ｌｉｐ−ｇｐ４６ｓｉＲＮＡの投与を開始し、４週目と５週目で評価を行った。例２によりインビトロにて４８時間まで効果が認められることを確認しているので、投与は週に２回とした（図１１）。投与量はｓｉＲＮＡをdirect injectionした既報（McCaffery et al., 2002, Nature 418: 38-39）に基づきｓｉＲＮＡを総量で４０μｇとした。ｓｉＲＮＡ投与後の肝臓のａｚａｎ染色では、４週目では生食投与群、ｓｉＲＮＡ（ｒａｎｄｏｍ）投与群、およびｓｉＲＮＡ（ｇｐ４６）投与群の間で明らかな差を認めなかったが、５週目ではｇｐ４６ｓｉＲＮＡ投与群にて線維量の低下が見られた（図１２）。線維の量を定量化するためにＮＩＨ  ｉｍａｇｅを使用して被染色部分を抽出し、その面積を計測した（図１３）ところ、ｇｐ４６ｓｉＲＮＡ投与群において有意にcollagen面積の低下が認められた（図１４）。また、別の尺度で線維化の程度を評価するために、線維化の指標となるヒドロキシプロリンの定量を定法により行った。具体的には、凍結乾燥した肝組織２０ｍｇをＨＣｌで２４時間加水分解した後、反応液を遠心分離し、上清をEhrlich’s solution等の試薬にて処理し、遠心分離した。上清を回収し、560 nmにおける吸光度を測定することで、肝組織中のヒドロキシプロリン量を測定した（Hepatology 1998, 28:1247-52）。図１５に示すとおり、ｇｐ４６ｓｉＲＮＡ投与群では、ヒドロキシプロリンの量が極めて少なくなっていた。
【０４５７】
例８  ＬＣラットの処置（門脈内投与２）
さらに、本明細書の医薬の投与による生存率の変化を検討するため、Qi Zらの方法（PNAS 1999; 96:2345-49）に基づき、通常より２０％増量したＤＭＮを使用して、ＬＣモデルラットを作製した。本モデルでは、１週目と２週目に計４回の門脈内投与を行った。投与内容は、ＰＢＳ  ２００μｌ、Ｌｉｐ−ｇｐ４６ｓｉＲＮＡ、ＶＡ−Ｌｉｐ−ｒａｎｄｏｍ  ｓｉＲＮＡおよびＶＡ−Ｌｉｐ−ｇｐ４６ｓｉＲＮＡ（後三者はそれぞれ５ｎＭ×２００μｌ）とした（各群ともｎ＝７）。３週後では、control（ＰＢＳ投与群、ＶＡ−Ｌｉｐ−ｒａｎｄｏｍ  ｓｉＲＮＡ投与群およびＬｉｐ−ｇｐ４６ｓｉＲＮＡ投与群）が全例死亡したのに対し、ＶＡ−Ｌｉｐ−ｇｐ４６ｓｉＲＮＡ投与群では７匹中６匹が生存していた（図１６）。また、２１日目の肝臓のａｚａｎ染色では、ｇｐ４６ｓｉＲＮＡ投与群にて線維量の明らかな低下が見られた（図１７）。
【０４５８】
例９  ＬＣラットの処置（門脈内投与３）
別な実験では、前記Qi Zらの方法およびUeki et al., 1999, Nat Med. 5:226-30の方法に基づいて作製したＬＣモデルラット（１％ＤＭＮ１ｍｇ／ｋｇを週３回腹腔内投与）に、３週目から下表２に示す内容の門脈内投与を行った（各群ともｎ＝６）。なお、各投与物にはＰＢＳを加えて総体積が２００μｌとなるようにして投与し、投与回数は週１回とした。
【表２】
0005873168.tif 000048
【０４５９】
この結果、本明細書の医薬を投与された群（処置群９−４）以外は、ＤＭＮの投与開始から４５日後までに６匹すべてが死亡したが、本明細書の医薬を投与された群は、３６日目に死亡した１例を除き、全個体がＤＭＮの投与開始から７０日を超えて生存を続けた（図１８）。なお、死亡個体について肝の線維量を例７と同様にコラーゲン面積に基づいて定量したところ、ＶＡ−Ｌｉｐ−ｇｐ４６ｓｉＲＮＡの投与により肝線維量の増加が顕著に抑制されていた（図１９）。
【０４６０】
例１０  ＬＣラットの処置（静脈内投与）
例９と同様に作製したＬＣモデルラット（１％ＤＭＮ１μｇ／ＢＷ（ｇ）を週３回腹腔内投与）に、３週目から下表に示す内容の静脈内投与を行った（各群ともｎ＝６）。なお、各投与物にはＰＢＳを加えて総体積が２００μｌとなるようにして投与した。また、投与期間は、１０−４群は７週目まで、１０−１０群は６週目までそれぞれ投与した以外は、死亡するまで投与した。
【０４６１】
この結果、本明細書の医薬を投与された群（処置群１０−４および１０−１０）以外は、ＤＭＮの投与開始から４５日後までに６匹すべてが死亡したが、本明細書の医薬を投与された群は、処置群４において４５日目に２匹が死亡したのを除き、全個体がＤＭＮの投与開始から７０日を超えて生存を続けた（図２０および２１）。なお、死亡個体について肝の線維量を例７と同様に定量したところ、ＶＡ−Ｌｉｐ−ｇｐ４６ｓｉＲＮＡの投与により肝線維量の増加が顕著に抑制されていた（図２２）。
【０４６２】
以上の結果は、本明細書の医薬が星細胞が関与する線維化の予防および治療に極めて有効であることを示すものである。上記の結果は、本明細書の医薬が、星状細胞が関与する線維症の予防および処置に極めて有効であることを示す。
【０４６３】
例１１  ＲＢＰ（レチノール結合タンパク質）による効果の改善
ヒトＨＳＣ由来の細胞系であるＬＩ９０を用いて、ＲＢＰがＶＡ−Ｌｉｐ−ｇｐ４６ｓｉＲＮＡ導入効率にもたらす影響について検討した。まず、例５で作製したＶＡ−Ｌｉｐ−ｇｐ４６ｓｉＲＮＡ（ＦＩＴＣ）１００ｎＭを、種々の濃度（すなわち、０、０．１、０．５、１、２、４または１０％）のＦＢＳ（ウシ胎仔血清）と共に、培養中のＬＩ９０に加え、４８時間インキュベートした後、蛍光像をＬＳＭで観察し、個々の細胞に取り込まれたｓｉＲＮＡの量をＦＡＣＳにて定量した。なお、ＦＢＳには、ＲＢＰが約０．７ｍｇ／ｄｌ含まれている。図２３に示すとおり、ＦＢＳ（ＲＢＰ）は濃度依存的にｓｉＲＮＡの導入量を増加させた。次に、１００ｎＭのＶＡ−Ｌｉｐ−ｇｐ４６ｓｉＲＮＡ（ＦＩＴＣ）と、４％のＦＢＳと共に、１０μｇ（21,476 nmol）の抗ＲＢＰ抗体を、培養中のＬＩ９０に加え、同様にｓｉＲＮＡの導入効率を評価した。図２４に示すとおり、ＲＢＰにより増大した導入量が、抗ＲＢＰ抗体の添加により顕著に減少していることが分かる。以上の結果は、ＲＢＰが本明細書の医薬の導入をさらに向上させるのに有効であることを示すものである。
【０４６４】
例１２  ｈｓｐ４７核酸分子配列の選択
Ｈｓｐ４７に対する核酸分子（例えば、２５ヌクレオチド以下のｓｉＮＡ）は、siRNA at Whitehead Institute for Biomedical Research、siRNA Design (Integrated DNA Technologies)、BLOCK-iT RNAi Designer (Invitrogen)、siDESIGN Center (Dharmacon)、およびBIOPREDsi (Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research)を含む複数のコンピュータプログラムを用いて設計した。これらのプログラムから最高のスコアを得たｓｉＲＮＡの配列を比較し、アルゴリズムならびにヒトとラットとの配列相同性に基づいて選択した（表３参照）。候補配列は、in vitroノックダウンアッセイにより有効性を確認した。
【０４６５】
複数のパラメータを、核酸分子（例えば２１ｍｅｒ  ｓｉＲＮＡ）配列を選択するために考慮した。例示的なパラメータは以下を含む：
・熱力学的安定性（ＲＩＳＣは、より安定性の低い５’末端を有する鎖に有利である）
・３０〜５２％のＧＣ含量
・位置的なヌクレオチド選好性：
（Ｃ／Ｇ）１ＮＮＮＮＮＮＮＮ（Ａ／Ｕ）１０ＮＮＮＮＮＮＮＮ（Ａ／Ｕ）１９、ここで
Ｎは任意のヌクレオチドである
・推定免疫刺激性モチーフの欠如
・２ヌクレオチドの３’オーバーハング
・転写物中のｓｉＲＮＡの位置（好ましくはｃＤＮＡ領域内）
・配列特異性（ＢＬＡＳＴを用いてチェック）
・ＳＮＰデータベースをチェックすることによる単一のヌクレオチドの変化
【０４６６】
２５個以下のヌクレオチドを有するｓｉＲＮＡ配列は、前述の方法に基づいて設計した。対応するダイサー基質ｓｉＲＮＡ（例えば２６ヌクレオチド以上）は、より短い配列に基づいて設計され、センス鎖の３’末端に４塩基、および、アンチセンス鎖の５’末端に６塩基を加えることにより、２５ヌクレオチド以下のｓｉＮＡの標的部位を拡張する。作製したダイサー基質は、一般的に、非対称の平滑末端および３’オーバーハング分子を伴う、２５塩基のセンス鎖および２７塩基のアンチセンス鎖を有する。塩基修飾のない（基本配列）および修飾のある（試験配列）、センス鎖およびアンチセンス鎖の配列を表３に提示する。
【表３−１】
0005873168.tif 000049
【表３−２】
0005873168.tif 000050
【０４６７】
ヒトおよびラットｈｓｐ４７遺伝子の両方に対する種々のｓｉＮＡ分子の有効性をスクリーニングするために、２９３、ＨＴ１０８０、ヒトＨＳＣ系ｈＴＥＲＴ、またはＮＲＫ細胞系へのヒトＨＳＰ４７  ｃＤＮＡ−緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはラットＧＰ４６  ｃＤＮＡ−ＧＦＰコンストラクトのレンチウイルスによる誘導により、種々のレポーター細胞系を樹立した。これらの細胞系は、ＧＦＰに対するｓｉＲＮＡによってさらに評価した。残存する蛍光シグナルを測定し、スクランブルｓｉＲＮＡ（Ambion）に対して正規化し、次いで細胞生存率に対して正規化した。結果は、ＧＦＰに対するｓｉＲＮＡが、異なる細胞系において異なる程度で蛍光をノックダウンすることを示した（図１）。２９３＿ＨＳＰ４７−ＧＦＰおよび２９３＿ＧＰ４６−ＧＦＰ細胞系を、そのトランスフェクションの容易性と、蛍光ノックダウンに対する感度から、ｓｉＨｓｐ４７のスクリーニングのために選択した。
【０４６８】
細胞を、９６穴組織培養プレートにて、Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen）を用い、リバーストランスフェクション法により、１ウェルあたりＧＦＰに対するｓｉＮＡ１．５ｐｍｏｌでトランスフェクションした。細胞は、１ウェルあたり６，０００個を播種し、ｓｉＮＡ複合体と混合した。蛍光の読み取りは、７２時間のインキュベーションの後、Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader（BioTek）で行った。
【０４６９】
ｓｉＮＡ有りまたは無しで処理した細胞の生存率を、７２時間のインキュベーションの後、CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Kit（Promega）用い、マニュアルに従って測定した。測定値は、スクランブルｓｉＮＡ分子で処理したサンプルに対して正規化した。
【０４７０】
例１４  レポーター細胞系におけるｈｓｐ４７発現に対するｓｉＨｓｐ４７の阻害効率の評価
ｈｓｐ４７に対するｓｉＮＡは、レポーターＧＦＰからの蛍光シグナルの変化を評価することによって、２９３＿ＨＳＰ４７−ＧＦＰおよび２９３＿ＧＰ４６−ＧＦＰ細胞系におけるその阻害効率について評価した。実験は、例２に記載したとおりに行った。蛍光シグナルは、対照として用いた、スクランブルｓｉＲＮＡ（Ambion）で処置した細胞からの蛍光シグナルに対して正規化した。結果は、試験したｈｓｐ４７  ｓｉＮＡ分子が、両方の細胞系においてｈｓｐ４７  ｍＲＮＡを阻害するのに効果的だったことを示す。しかしながら、ＧＰ４６  ｍＲＮＡに対するｓｉＮＡ（2008年のSatoらの論文で公表されたもの）は、２９３＿ＧＰ４６−ＧＦＰ細胞系においてのみ有効だった。結果を図２６Ａおよび２６Ｂに示す。
【０４７１】
ｈｓｐ４７およびｇｐ４６に対するｓｉＲＮＡで処置した２９３＿ＨＳＰ４７−ＧＦＰおよび２９３＿ＧＰ４６−ＧＦＰ細胞系は、例２に記載の方法を用いて生存率について評価した。細胞生存率は、スクランブルｓｉＲＮＡ（Ambion）で処置した細胞に対して正規化した。結果は、細胞生存率がｓｉＮＡ分子での処置により実質的に影響を受けなかったことを示す。しかしながら、種々のｈｓｐ４７  ｓｉＮＡ分子で処置した２９３＿ＨＳＰ４７−ＧＦＰ細胞系の細胞生存率は用いたｓｉＮＡ分子に応じて異なったが、２９３＿ＧＰ４６−ＧＦＰ細胞系の生存率は似通っていた。２９３＿ＨＳＰ４７−ＧＦＰ細胞の生存率は、ｓｉＨｓｐ４７−６およびＨｓｐ４７−７で処置した細胞において、残りのものより低かった。結果を図２６Ｃおよび２６Ｄに示す。
【０４７２】
例１５  TaqMan(R) qPCRによるｈｓｐ４７  ｍＲＮＡに対するｓｉＨｓｐ４７の阻害効果の評価
例１４では、レポーター細胞系におけるｓｉＨｓｐ４７のノックダウン効率を、蛍光シグナルの変化によって評価した。結果をｍＲＮＡレベルで確認するために、内因性のｈｓｐ４７を標的とするｓｉＲＮＡを、例１３に記載のとおり、Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen）を用い、リバーストランスフェクション法により、ヒトＨＳＣ細胞系ｈＴＥＲＴ細胞にトランスフェクションした。
【０４７３】
ｈｓｐ４７  ｍＲＮＡレベルは、試験した種々のｓｉＨｓｐ４７  ｓｉＮＡ分子のノックダウン効率について評価した。簡潔に述べると、トランスフェクションの７２時間後に、ｈＴＥＲＴ細胞からｍＲＮＡを、RNeasy mini kit（Qiagen）を用いて単離した。ｈｓｐ４７  ｍＲＮＡのレベルは、TaqMan(R)プローブを用いた定量ＰＣＲと組み合わせた逆転写により決定した。簡潔に述べると、ｃＤＮＡ合成を、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（ABI）を用い、メーカーの指示に従って行い、TaqMan Gene Expression Assay（ABI、hsp47）に供した。ｈｓｐ４７  ｍＲＮＡのレベルは、メーカーの指示（ABI）に従って、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのレベルに対して正規化した。結果は、ｓｉＨｓｐ４７−Ｃが全てのｈｓｐ４７  ｓｉＲＮＡの中で最も効果的であり、ｓｉＨｓｐ４７−２およびｓｉＨｓｐ４７−２ｄが次に最も効果的だったことを示す。ｓｉＨｓｐ４７−１とｓｉＨｓｐ４７−２との組合せ、またはｓｉＨｓｐ４７−１とｓｉＨｓｐ４７−２ｄとの組合せは、ｓｉＨｓｐ４７−１のみよりも効果的であった。結果を図２７に示す。
【０４７４】
例１６  ｓｉＨｓｐ４７のノックダウン効果のタンパク質レベルでの確認
ｈｓｐ４７  ｍＲＮＡ発現に対する種々のＨｓｐ４７  ｓｉＮＡ分子（ｓｉＨｓｐ４７）の阻害効果を、種々のｓｉＨｓｐ４７をトランスフェクションしたｈＴＥＲＴ細胞におけるＨＳＰ４７を測ることにより、タンパク質レベルで確認した。種々のｓｉＨｓｐ４７のｈＴＥＲＴ細胞へのトランスフェクションは、例１３に記載のとおりに行った。トランスフェクションしたｈＴＥＲＴ細胞は溶解し、細胞溶解物を遠心分離により清澄化した。清澄化した細胞溶解物中のタンパク質を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分割した。細胞溶解物中のＨＳＰ４７タンパク質のレベルを、抗ＨＳＰ４７抗体（Assay Designs）を一次抗体として、ＨＲＰと結合したヤギ抗マウスＩｇＧ（Millipore）を二次抗体として用い、その後Supersignal West Pico Chemiluminescence kit（Pierce）で検出して決定した。抗アクチン抗体（Abcam）を、タンパク質負荷対照として用いた。結果は、ｓｉＨｓｐ４７−Ｃ、ｓｉＨｓｐ４７−２ｄのみ、または、ｓｉＨｓｐ４７−１とｓｉＨｓｐ４７−２ｄとの組合せで処置した細胞における、Ｈｓｐ４７タンパク質のレベルの顕著な減少を示した。
【０４７５】
例１７  ｈｓｐ４７  ｓｉＲＮＡによるコラーゲンＩ発現の下方制御
コラーゲンＩ発現レベルに対するｓｉＨｓｐ４７の効果を決定するために、ｈｓｐ４７に対する種々のｓｉＲＮＡで処置したｈＴＥＲＴ細胞におけるコラーゲンＩ  ｍＲＮＡレベルを測定した。簡潔に述べると、ｈＴＥＲＴ細胞に種々のｓｉＨｓｐ４７を例１３に記載のとおりにトランスフェクションした。細胞を７２時間後に溶解し、ｍＲＮＡをRNeasy mini kitを用い、マニュアル（Qiagen）に従って単離した。コラーゲンＩ  ｍＲＮＡのレベルは、TaqMan(R)プローブを用いた定量ＰＣＲと組み合わせた逆転写により決定した。簡潔に述べると、ｃＤＮＡ合成を、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（ABI）を用い、メーカーの指示に従って行い、TaqMan Gene Expression Assay（ABI、COL1A1アッセイ）に供した。コラーゲンＩ  ｍＲＮＡのレベルは、メーカーの指示（ABI）に従って、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのレベルに対して正規化した。シグナルは、スクランブルｓｉＮＡをトランスフェクションした細胞から得られるシグナルに対して正規化した。結果は、図２８に示すとおり、コラーゲンＩ  ｍＲＮＡレベルが、候補の一部、ｓｉＨｓｐ４７−２、ｓｉＨｓｐ４７−２ｄ、およびこれらとｓｉＨｓｐ４７−１との組み合せで処置した細胞において顕著に低下したことを示した。
【０４７６】
例１８  ｈｓｐ４７  ｓｉＲＮＡで処置したｈＴＥＲＴ細胞の免疫蛍光染色
ｓｉＨｓｐ４７有りまたは無しでトランスフェクションしたｈＴＥＲＴ細胞における２種の線維症マーカー、コラーゲンＩおよびα平滑筋アクチン（ＳＭＡ）の発現を視覚化するために、細胞をウサギ抗コラーゲンＩ抗体（Abcam）およびマウス抗アルファＳＭＡ抗体（Sigma）で染色した。Alexa Fluor 594ヤギ抗マウスＩｇＧおよびAlexa Fluor 488ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Invitrogen（Molecular Probes））を、コラーゲンＩ（緑）およびアルファＳＭＡ（赤）を視覚化する二次抗体として用いた。Ｈｏｅｓｃｈｔを、核（青）を視覚化するために用いた。結果は、標的遺伝子の一部のｓｉＲＮＡによるノックダウンと、コラーゲン／ＳＭＡ発現との間の相関関係を示す。
【０４７７】
例１９  肝線維症の動物モデルにおけるｓｉＨＳＰ４７のin vivo試験
ＨＳＰ４７（ｓｉＨＳＰ４７Ｃ）のためのｓｉＲＮＡ二重鎖配列は以下に列挙するとおりである。
センス（５’→３’）        ｇｇａｃａｇｇｃｃｕｃｕａｃａａｃｕａＴＴ
アンチセンス（５’→３’）  ｕａｇｕｕｇｕａｇａｇｇｃｃｕｇｕｃｃＴＴ
【０４７８】
１０ｍｇ／ｍｌのｓｉＲＮＡ原液を、ヌクレアーゼフリー水（Ambion）に溶解することにより調製した。肝硬変ラットの処置のために、コラーゲンを生産する活性化肝星細胞を標的化する目的で、ｓｉＲＮＡを、Satoら（Sato Y. et al. Nature Biotech. 26, 431）によって記載されたビタミンＡ結合リポソームで製剤化した。ビタミンＡ（ＶＡ）−リポソーム−ｓｉＲＮＡ製剤は、５％のグルコース溶液中の、０．３３μｍｏｌ／ｍｌのＶＡ、０．３３μｍｏｌ／ｍｌのリポソーム（Coatsome EL-01-D, NOF Corporation）および０．５μｇ／μｌのｓｉＲＮＡからなる。
【０４７９】
４週齢の雄性ＳＤ系ラットに、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の０．５％ジメチルニトロソアミン（ＤＭＮ）（Wako Chemicals, Japan）により肝硬変を誘発した。２ｍｌ／ｋｇ体重の用量を、毎週３日連続して、第０、２、４、７、９、１１、１４、１６、１８、２１、２３、２５、２８、３０、３２、３４、３６、３８および４０日に腹腔内投与した。
【０４８０】
ｓｉＲＮＡ処置：ｓｉＲＮＡ処置は、第３２日から５回の静脈内注射で行った。詳細には、ラットは第３２、３４、３６、３８および４０日にｓｉＲＮＡで処置した。その後、ラットを第４２または４３日に致死させた。３つの異なるｓｉＲＮＡの用量（ｋｇ体重あたり１．５ｍｇのｓｉＲＮＡ、ｋｇ体重あたり２．２５ｍｇのｓｉＲＮＡ、ｋｇ体重あたり３．０ｍｇのｓｉＲＮＡ）を試験した。
【０４８１】
試験群の詳細および各群の動物数は以下のとおりである：
１）肝硬変をＤＭＮ注射によって誘発し、次いでｓｉＲＮＡの代わりに５％グルコースを注射（ｎ＝１０）
２）ＶＡ−Ｌｉｐ−ｓｉＨＳＰ４７Ｃ  １．５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝１０）
３）ＶＡ−Ｌｉｐ−ｓｉＨＳＰ４７Ｃ  ２．２５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝１０）
４）ＶＡ−Ｌｉｐ−ｓｉＨＳＰ４７Ｃ  ３．０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝１０）
５）シャム（ＤＭＮの代わりにＰＢＳを注射。ｓｉＲＮＡの代わりに５％グルコースを注射）（ｎ＝６）
６）無処置対照（インタクト）（ｎ＝６）
ＶＡ−Ｌｉｐは、ビタミンＡ−リポソーム複合体を指す。
【０４８２】
治療効果の評価：第４３日に、「疾患ラット」群の１０頭のうち２頭と、「ＶＡ−Ｌｉｐ−ｓｉＨＳＰ４７Ｃ  ｓｉＲＮＡ  １．５ｍｇ／ｋｇ」の１０頭のうち１頭が、肝硬変の進行により死亡した。残りの動物は生き残った。ラットを致死させた後、肝臓組織を１０％ホルマリンで固定した。次いで、各々の肝臓の左葉を組織学検査のためにパラフィンに包埋した。組織スライドを、シリウスレッドおよびヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）で染色した。シリウスレッド染色は、コラーゲン沈着を視覚化し、肝硬変のレベルを決定するために用いた。ＨＥ染色は、対比染色としての核および細胞質のためのものであった。各々のスライドは顕微鏡（ＢＺ−８０００（キーエンス社日本））で観察し、スライドあたりのシリウスレッド染色領域のパーセンテージを、顕微鏡に付属する画像分析ソフトウェアで決定した。各々の肝臓につき少なくとも４枚のスライドを画像分析のために調製し、各々のスライド（肝臓の切片）の全領域をカメラで撮像し、分析した。統計分析は、スチューデントのｔ検定によって行った。
【０４８３】
結果：図２９は線維化領域を示す。「疾患ラット」の線維化領域は、「シャム」または「無処置対照」群よりも広かった。したがって、ＤＭＮ処置は肝臓にコラーゲン沈着を誘発した。それは肝線維症の典型的所見であった。しかし、線維化領域は、ＨＳＰ４７遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡの処置によって、「疾患ラット」群と比較して顕著に縮小した（図２９）。この結果は、本明細書に開示されるｓｉＲＮＡが、実際の疾患において治療効果を有することを示す。
【０４８４】
さらなるｓｉＲＮＡ化合物を肝線維症動物モデルで試験し、肝臓における線維性領域を縮小することが示された。
【０４８５】
例２０  ＨＳＰ４７／ＳＥＲＰＩＮＨ１に対する活性な二本鎖ＲＮＡ化合物のための配列の生成と、表４、５、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥに示すｓｉＲＮＡの生成
相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより、二重鎖を生成する。層流フード内で、ＷＦＩ（注射用水）で希釈することにより、５００μＭの一本鎖オリゴヌクレオチドの原液を調製する。実際のｓｓＲＮＡ濃度は、各々の５００μＭのｓｓＲＮＡをＷＦＩで１：２００に希釈し、Nano Dropを用いてＯＤを測定することにより決定する。手順を３回繰り返し、平均濃度を計算する。次いで、原液を２５０μＭの最終濃度に希釈した。相補的な一本鎖を、８５℃に加熱することによりアニーリングし、少なくとも４５分にわたって室温に放冷した。二重鎖は、５μｌを、２０％のポリアクリルアミドゲルおよび染色で試験することにより、完全なアニーリングについて試験した。サンプルを−８０℃で保存した。
【０４８６】
表４、５、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは、ＨＳＰ４７／ＳＥＲＰＩＮＨ１に関するｓｉＲＮＡを提示する。各々の遺伝子について、１９ｍｅｒ  ｓｉＲＮＡ配列の別々のリストがあり、それはヒト遺伝子発現をターゲティングするための最良の配列として、独自のアルゴリズムにおけるそれらのスコアに基づいて優先順位が決められている。
【０４８７】
以下の略語が、本明細書に記載の表４、５、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥに用いられている：「他の種またはSp.」は、他の動物との種間同一性を指し、Ｄは犬、Ｒｔはラット、Ｒｂはウサギ、Ｒｈはアカゲザル、Ｐはブタ、Ｍはマウス、ＯＲＦはオープンリーディングフレームを指す。１９ｍｅｒ（表５、Ｂ、Ｃ）および１８＋１ｍｅｒ（表４、Ｄ、Ｅ）は、それぞれ１９および１８＋１（アンチセンスの１位にＵ、センス鎖の１９位にＡ）リボ核酸の長さのオリゴマーを指す。
【０４８８】
二本鎖ＲＮＡ分子を生成するのに有用なｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、以下の表４、５、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥに開示されている。
【０４８９】
【表４−１】
0005873168.tif 000051
【０４９０】
【表４−２】
0005873168.tif 000052
【０４９１】
【表４−３】
0005873168.tif 000053
【０４９２】
【表５−１】
0005873168.tif 000054
【０４９３】
【表５−２】
0005873168.tif 000055
【０４９４】
【表６−１】
0005873168.tif 000056
【０４９５】
【表６−２】
0005873168.tif 000057
【０４９６】
【表６−３】
0005873168.tif 000058
【０４９７】
【表６−４】
0005873168.tif 000059
【０４９８】
【表６−５】
0005873168.tif 000060
【０４９９】
【表６−６】
0005873168.tif 000061
【０５００】
【表６−７】
0005873168.tif 000062
【０５０１】
【表６−８】
0005873168.tif 000063
【０５０２】
【表６−９】
0005873168.tif 000064
【０５０３】
【表７−１】
0005873168.tif 000065
【０５０４】
【表７−２】
0005873168.tif 000066
【０５０５】
【表７−３】
0005873168.tif 000067
【０５０６】
【表７−４】
0005873168.tif 000068
【０５０７】
【表７−５】
0005873168.tif 000069
【０５０８】
【表７−６】
0005873168.tif 000070
【０５０９】
【表７−７】
0005873168.tif 000071
【０５１０】
【表７−８】
0005873168.tif 000072
【０５１１】
【表７−９】
0005873168.tif 000073
【０５１２】
【表７−１０】
0005873168.tif 000074
【０５１３】
【表７−１１】
0005873168.tif 000075
【０５１４】
【表８−１】
0005873168.tif 000076
【０５１５】
【表８−２】
0005873168.tif 000077
【０５１６】
【表８−３】
0005873168.tif 000078
【０５１７】
【表８−４】
0005873168.tif 000079
【０５１８】
【表８−５】
0005873168.tif 000080
【０５１９】
【表８−６】
0005873168.tif 000081
【０５２０】
【表８−７】
0005873168.tif 000082
【０５２１】
【表８−８】
0005873168.tif 000083
【０５２２】
【表８−９】
0005873168.tif 000084
【０５２３】
【表８−１０】
0005873168.tif 000085
【０５２４】
【表８−１１】
0005873168.tif 000086
【０５２５】
【表８−１２】
0005873168.tif 000087
【０５２６】
【表８−１３】
0005873168.tif 000088
【０５２７】
【表８−１４】
0005873168.tif 000089
【０５２８】
【表８−１５】
0005873168.tif 000090
【０５２９】
【表８−１６】
0005873168.tif 000091
【０５３０】
【表８−１７】
0005873168.tif 000092
【０５３１】
【表８−１８】
0005873168.tif 000093
【０５３２】
【表８−１９】
0005873168.tif 000094
【０５３３】
【表８−２０】
0005873168.tif 000095
【０５３４】
【表８−２１】
0005873168.tif 000096
【０５３５】
【表９−１】
0005873168.tif 000097
【０５３６】
【表９−２】
0005873168.tif 000098
【０５３７】
【表９−３】
0005873168.tif 000099
【０５３８】
【表９−４】
0005873168.tif 000100
【０５３９】
【表９−５】
0005873168.tif 000101
【０５４０】
【表９−６】
0005873168.tif 000102
【０５４１】
最も活性な配列をさらなるアッセイから選択した。表４からは、ｓｉＲＮＡ化合物ＳＥＲＰＩＮＨ１＿２、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿６、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１３、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５２およびｓＥＲＰＩＮＨ１＿８６が、好ましい化合物として選択された（表６−ＡおよびＢ）。
【表１０】
0005873168.tif 000103
【表１１】
0005873168.tif 000104
【０５４２】
表５からは、ｓｉＲＮＡ化合物ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１２、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１８、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿３０、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５８およびＳＥＲＰＩＮＨ１＿８８が、好ましい化合物として選択された（表７）。
【表１２】
0005873168.tif 000105
【０５４３】
例２１  線維化状態の動物モデル系
本明細書の活性なｓｉＲＮＡの試験は、予測動物モデルで行うことができる。腎線維症のラット糖尿病およびエイジングモデルは、Zucker糖尿病肥満（ＺＤＦ）ラット、老齢ｆａ／ｆａ（肥満Zucker）ラット、老齢Sprague-Dawley（ＳＤ）ラットおよびGoto Kakizaki（ＧＫ）ラットを含む。ＧＫラットは、Wisterラットに由来し、ＮＩＤＤＭ（ＩＩ型糖尿病）の自然発生について選択された近交系である。腎線維症の誘導モデルは、健康な非糖尿病動物に生じる急性間質性線維症のモデルである、恒常的片側性尿管閉塞（ＵＵＯ）モデルを含み、腎線維症は、閉塞後で数日のうちに発症する。腎線維症の別の誘導モデルは、５／６腎摘出術である。
【０５４４】
ラットにおける肝線維症の２つのモデルは、以下の参考文献に記載の、偽手術を対照とする胆管結紮（ＢＤＬ）と、オリーブ油給餌動物を対照とするＣＣｌ４中毒である：Lotersztajn S, et al Hepatic Fibrosis: Molecular Mechanisms and Drug Targets. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2004 Oct 07、Uchio K, et al., Down-regulation of connective tissue growth factor and type I collagen mRNA expression by connective tissue growth factor antisense oligonucleotide during experimental liver fibrosis. Wound Repair Regen. 2004 Jan-Feb;12(1):60-6、Xu XQ, et al., Molecular classification of liver cirrhosis in a rat model by proteomics and bioinformatics Proteomics. 2004 Oct;4(10):3235-45。
【０５４５】
眼の瘢痕形成に関するモデルは、当該技術分野において周知であり、例えば、Sherwood MB et al., J Glaucoma. 2004 Oct;13(5):407-12. A new model of glaucoma filtering surgery in the rat、Miller MH et al., Ophthalmic Surg. 1989 May;20(5):350-7. Wound healing in an animal model of glaucoma fistulizing surgery in the Rb、vanBockxmeer FM et al., Retina. 1985 Fall-Winter; 5(4): 239-52. Models for assessing scar tissue inhibitors、Wiedemann P et al., J Pharmacol Methods. 1984 Aug; 12(1): 69-78. Proliferative vitreoretinopathy: the Rb cell injection model for screening of antiproliferative drugsなどがある。
【０５４６】
白内障のモデルは、以下の出版物に記載されている：Zhou et al., 2002.Invest Ophthalmol Vis Sci.43:2293-300; Wang et al. 2004 Curr Eye Res. 29:51-58。
【０５４７】
表５および表４の化合物はこれらの線維化状態のモデルで試験され、そこにおいて、これらが肝線維症および他の線維化状態の処置に効果的であることが明らかになる。
【０５４８】
緑内障のモデル系
本明細書の活性なｓｉＲＮＡの緑内障の処置または予防に関する試験は、例えば、Maeda et al., 2004 Investigative Ophthalmology and visual Science (IOVS), 45:851に記載の、視神経挫滅ラット動物モデルで行う。具体的には、視神経切断のために、麻酔下ラットの眼窩の視神経（ＯＮ）を眼窩上アプローチで露出し、髄膜を切断し、篩板から２ｍｍのＯＮ内の全ての軸索を、１０秒間鉗子で挫滅することにより切断する。
【０５４９】
本明細書に開示される核酸分子は、この動物モデルで試験され、結果は、これらのｓｉＲＮＡ化合物が緑内障の処置および／または予防に有用であることを示す。
【０５５０】
ラット視神経挫滅（ＯＮＣ）モデル：硝子体内ｓｉＲＮＡ送達および点眼送達
視神経切断のために、麻酔下ラットの眼窩の視神経（ＯＮ）を眼窩上アプローチで露出し、髄膜を切断し、篩板から２ｍｍのＯＮ内の全ての軸索を、１０秒間鉗子で挫滅することにより切断する。
【０５５１】
ｓｉＲＮＡ化合物を、点眼液として５μｌの容量（１０μｇ／μｌ）で、単独でまたは組合せて送達する。視神経挫滅（ＯＮＣ）の直後に、２０μｇ／１０μｌの試験ｓｉＲＮＡまたは１０μｌのＰＢＳを、成体Wisterラットの片方または両方の眼に投与し、注入の５時間後および１日後、および、より遅い２日後、４日後、７日後、１４日後および２１日後に切除し、急速凍結した全網膜から取り出したｓｉＲＮＡのレベルを決定する。類似した実験を、点眼を介して投与したｓｉＲＮＡの活性および有効性を試験するために行う。
【０５５２】
ラットにおける肺移植後の虚血再灌流損傷のモデル系
肺虚血／再灌流損傷を、Mizobuchi et al., 2004 J Heart Lung Transplantation, 23およびKazuhiro et al., 2001 Am. J. Respir. Cell Mol Biol, 25:26-34に記載のラット動物モデルにおいて実施する。
【０５５３】
具体的には、イソフルランで麻酔を誘導した後、気管を１４ゲージテフロン（登録商標）カテーテルでカニューレし、ラットを、毎分７０回の速度および２ｃｍ  Ｈ２Ｏの呼気終末陽圧にて、１００％の酸素を用いた齧歯動物用ベンチレータで機械的に換気する。左肺動脈、静脈および主気管支をCastanedaクランプで閉塞する。術中、肺を食塩水で湿性にし、蒸発損失を最小にするために、切開をカバーする。虚血の期間は、６０分の長さである。虚血期間の終わりにクランプを取り外し、肺虚血誘発後、さらに４時間、２４時間および５日、肺を換気および再灌流させる。実験終了後、肺を慎重に採取し、ＲＮＡ抽出のために凍結するか、または、その後の組織学的分析のためにグルタールアルデヒドカクテルで固定する。
【０５５４】
特発性肺線維症（ＩＰＦ）のモデルとしてのブレオマイシン動物モデル
健康マウスおよびブレオマイシン処置マウスへのｓｉＲＮＡ−ビタミンＡコートソーム（Coatsome）複合体の静脈内注射および気管内投与により、ビタミンＡコートソーム製剤化ｓｉＲＮＡの、肺および肝臓への送達の実現可能性を試験する。
【０５５５】
目的：正常および線維性マウス肺へのビタミンＡコートソーム製剤化ｓｉＲＮＡの送達の実現可能性を、２種の投与経路について試験する。本研究において試験する主要な仮説は、ビタミンＡコートソーム製剤化修飾ｓｉＲＮＡの全身投与が、線維性および正常マウス肺における効率的な取込みおよび細胞特異的な分布をもたらすか否かである。ビタミンＡコートソーム製剤化修飾ｓｉＲＮＡの気管内経路を並行して試験する。肺および肝臓におけるｓｉＲＮＡの検出および細胞特異的な分布は、in situハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）によって行う。
【０５５６】
肺線維症のブレオマイシンモデルは過去３０年にわたって十分に開発され、特徴づけられている（Moeller, et al. 2008 Int J Biochem Cell Biol, 40:362-82,; Chua et al., 2005 Am J Respir Cell Mol Biol 33:9-13）。組織学的特徴、例えば肺胞内肉芽、コラーゲンの壁への取り込み、および肺胞腔の閉塞は、ＩＰＦ患者と同様にＢＬＭ処置を受けた動物に存在する。初期の研究は、Ｃ５７／Ｂｌマウスが一貫してＢＬＭ誘導性肺線維症を生じやすい一方、Ｂａｌｂ／Ｃマウスが遺伝的に抵抗性であることを示した。投与経路に応じて、異なる線維化パターンが発症する。ＢＬＭの気管内注入は気管支中心性の増強された線維症をもたらす一方、静脈内または腹膜内投与はヒト疾患に類似した胸膜下瘢痕形成を誘発する（同Chua et al）。通常型間質性肺炎（ＵＩＰ）のマウスモデルを用いる。このモデルは、不均一な分布の線維性増殖（fibroproliferation）を示し、それは主に胸膜下に分布し、特発性肺線維症（ＩＰＦ）患者の肺で観察されるのと同様の病変を形成する（Onuma, et al., 2001 J Exp Med 194:147-56、およびYamaguchi et al., 1988 Nature 336:244-46）。ＵＩＰは、マウス肺における胸膜下の線維性増殖の持続的な組成のために、ブレオマイシンを１日おきに７日間腹腔内投与することにより誘発される（Swiderski et al. 1998 Am J Pathol 152: 821-28、およびShimizukawa et al., 2003 Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 284: L526-32）。
【０５５７】
ｓｉＲＮＡを含有するビタミンＡ負荷リポソームは、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）と相互作用し、ＲＢＰレセプターを介してＨＳＣへの効果的な送達をもたらす。これらのリポソームは、ブレオマイシン処置マウスの肺における、ＲＢＰレセプターを発現する活性化筋線維芽細胞に、効率的に取り込まれる。
実験デザイン
マウス：Ｃ５７  Ｂｌ、雄性
開始Ｎ（ＢＬＭ  Ｉ．Ｐ.）：４０（最初のパイロット群用に６頭、実験用に３４頭、予想される２５％の死亡率を考慮）
開始Ｎ（合計）：６０頭
試験ｓｉＲＮＡ：本明細書に開示されるＳＥＲＰＩＮＨＩ化合物。
【表１３】
0005873168.tif 000106
【０５５８】
ブレオマイシン誘導性肺線維症。１２週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肺線維症を、０．１ｍｌの生理食塩水に溶解した０．７５ｍｇ／ｋｇ体重の塩酸ブレオマイシンを、１日おきに７日間、０、２、４および６日に腹腔内注入することにより誘導する。
【０５５９】
線維症確立のパイロット評価。マウス（Ｎ＝３０）を、最初に処置した群（Ｎ＝５）と、残りの動物との間に１週間の時間差を生じさせるために、複数の群でＢＬＭ処置に供する。第１４日に、最初の群からの２頭のマウスを致死させ、迅速（fast）ＨＥ染色および線維化の迅速な組織病理学的評価のために、肺を採取する。肺線維症が確認されたら、残りのラットを複数の群に分け、最初のＢＬＭ処置後第１４日にｓｉＲＮＡで処置する。第１４日までに肺で十分な線維化が進行しない場合は、最初に処置した群からの残りのマウスを第２１日に致死させ、次いで線維化の迅速な組織病理学的評価を行う。残りの動物は、ＢＬＭ処置後第２１日から試験ｓｉＲＮＡ複合体で処置する。
【０５６０】
ｓｉＲＮＡ投与。最初のＢＬＭ投与後第１４日または第２１日に（線維症確立のパイロット評価に基づき、実験中に決定）、動物を体重に従って群に分ける。第１群および第２群からの動物に、４．５ｍｇ／ｋｇ体重のｓｉＲＮＡ濃度で、ｓｉＲＮＡ／ｖｉｔＡ／コートソーム複合体を静脈内投与（尾静脈注射）する。同齢の無処置の動物（第５群および第６群）を同様に処置する。ＢＬＭ処置動物（第９群）を、ｖｉｔＡコートソームビヒクル対照として用いる。２４時間後に、上記のとおりの注射を全ての動物に繰り返す。
【０５６１】
第３群および第４群からのＢＬＭ動物と、第７群および第８群からの無処置マウスとをイソフルランで麻酔し、ｖｉｔＡ負荷リポソームで製剤化した２．２５ｍｇ／ｋｇ体重のｓｉＲＮＡの気管内注入に供する。ＢＬＭ群１０からのマウスには、ｖｉｔＡ／コートソームビヒクルのみを投与する。気管内注入を２４時間後に繰り返す。
【０５６２】
実験の終了。第１、３、５、７、９群からの動物を、２回目のｓｉＲＮＡ複合体の注射または注入の２時間後に致死させる。第２、４、６、８、１０群からの動物は、２回目のｓｉＲＮＡ複合体の注射または注入の２４時間後に致死させる。
【０５６３】
動物を致死させた後、マウスを１０％中性緩衝ホルマリンで経心臓的に灌流する。肺を０．８〜１．０ｍｌの１０％ＮＢＦで膨張させ、気管を結紮する。肺を切除し、１０％ＮＢＦで２４時間固定する。肝臓を各々の動物から採取し、２４時間１０％ＮＢＦで固定する。
【０５６４】
切片作製および評価。肺および肝臓から連続切片を調製する。第１の連続切片は、肺および肝臓の形態学的評価のためにヘマトキシリン−エオジンで染色し、第２の切片は、コラーゲンを同定するためにシリウスレッド（トリクローム）で染色し、第３の連続切片は、ｓｉＲＮＡの検出のためにin situハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）に供する。
【０５６５】
例２２：ｓｉＲＮＡ含有ＶＡ結合リポソームのin vivo抗肺線維症活性
（１）肺線維症の誘導および薬物の投与
雄性Ｓ−Ｄラット（８匹／群、８週齢、日本チャールスリバー株式会社）に、０．１ｍＬの生理食塩水に溶解した０．４５ｍｇのブレオマイシン（ＢＬＭ）を、麻酔下で気管内カニューレ挿入（MicroSprayer, Penn-Century, Inc.）により肺に１回投与して、ブレオマイシン肺線維症モデルを作製した。この方法では、一般的に約２週間後に、顕著な線維症が肺に発生する。リポソーム製剤（ｓｉＲＮＡの量として１．５ｍｇ／ｋｇ、体積１ｍｌ／ｋｇ、すなわち、２００ｇのラットに対して２００μｌ）またはＰＢＳ（体積１ｍｌ／ｋｇ）を、ブレオマイシン投与の２週間後から開始して全部で１０回（１日おきに）、尾静脈を介してラットに投与した。ラットは最後の処置後２日目に致死させ、肺組織の組織学的検討を行った（図３０参照）。一元配置分散分析とボンフェローニ多重比較検定を用いて、統計的有意差を評価した。
リポソームの組成は、ＨＥＤＣ／Ｓ−１０４／ＤＯＰＥ／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＰＥ／ｄｉＶＡ−ＰＥＧ−ｄｉＶＡ（２０：２０：３０：２５：５：２モル％）であった。ｓｉＲＮＡの詳細は以下である：
Ｓ鎖：５’−ｉｄＡＢ−ｒＧ−ｒＡ−ｒＧ−ｒＡ−ｒＣ−ｒＡ−ｒＣ−ｒＡ−ｒＵ−ｒＧ−ｒＧ−ｒＧ−ｒＵ−ｒＧ−２５ｒＣ−２５ｒＵ−２５ｒＡ−２５ｒＵ−２５ｒＡ−Ｃ３−Ｐ−３’
ＧＳ鎖：５’−ｍＵ−ｒＡ−ｍＵ−ｒＡ−ｍＧ−ｒＣ−２５ｒＡ−ｒＣ−ｍＣ−ｒＣ−ｍＡ−ｒＵ−ｍＧ−ｒＵ−ｍＧ−ｒＵ−ｍＣ−ｒＵ−ｍＣ−Ｃ３−Ｃ３−３’
ここで、ｒＸはリボヌクレオチドを表し、ｍＸは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを表し、２５ｒＸは、２’−５’結合を有するリボヌクレオチドを表し、Ｃ３は、１，３−プロパンジオールスペーサーを表し、ｉｄＡＢは、逆位１，２−ジデオキシ−Ｄ−リボースを表し、Ｐは、３’末端のリン酸基を表す。３’末端のＣ３は、支持体に負荷された（support-loaded）１，３−プロパンジオールスペーサーによって導入される。３’末端のリン酸基（Ｐ）は、支持体に負荷されたジエチルスルホニル（パイ）スペーサーを用いて導入される。
【０５６６】
取り出した肺の一部は、常法に従ってホルマリン固定し、アザン染色（アゾカルミン、アニリンブルーオレンジＧ溶液）を行った。図３１のアザン染色結果が示すように、ＰＢＳ投与群(疾患)において、大量の青染されたコラーゲン原線維による間質の拡大を特徴とする、顕著な線維化像が観察された一方、製剤投与群において（処置）、線維化は顕著に抑制されていた。
【０５６７】
図３２の組織学的スコア（Ｔ.アシュクロフトスコア）の結果が示すように、製剤投与群（処置）において、線維化スコアが有意に減少した。
【０５６８】
例２３：ＨＳＰ４７  ｍＲＮＡのin vivoでの減少（ＤＭＮモデル）
例２２のＨＳＰ４７リポソームのin vivo活性を、短期肝障害モデル（急速モデル（Quick Model）と呼ぶ）で評価した。このモデルでは、ジメチルニトロソアミン（ＤＭＮ）などの肝毒性剤での処置によって誘導される短期的な肝障害には、ＨＳＰ４７  ｍＲＮＡレベルの上昇が伴う。これらの変化を誘導するために、雄性Sprague-Dawleyラットに、ＤＭＮを６日間連続して腹腔内注射した。ＤＭＮ処置期間の終了時に、動物は、個々の動物の体重に基づいて無作為に複数群に分けた。リポソーム試料は、単回ＩＶ用量として（０．３７５または０．７５ｍｇ／ｋｇ、ｓｉＲＮＡ用量を反映する）、ＤＭＮの最後の注射の１時間後に投与した。１日後、肝葉を切除し、ＨＳＰ４７およびＧＡＰＤＨ両方のｍＲＮＡレベルを、定量ＲＴ−ＰＣＲ（TaqMan）アッセイによって決定した。ＨＳＰ４７のｍＲＮＡレベルは、ＧＡＰＤＨレベルに対して標準化した。図３３に示すように、ＨＳＰ４７についての強い、用量依存的なｍＲＮＡの低減が、肝臓で検出された。ＮＤ−Ｌ０２−０１０１の０．７５ｍｇ／ｋｇの単回投与後、ＨＳＰ４７  ｍＲＮＡの８０％の減少が観察された。０．３７５ｍｇ／ｋｇの低用量においてさえも、４０％の顕著なノックダウンが観察された。
【０５６９】
本明細書に記載または引用された論文、特許、および特許出願、および他のすべての文書および電子的に入手可能な情報の内容は、個々の刊行物が参照により組み込まれると具体的かつ個別に示されるのと同程度に、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０５７０】
出願人は、本出願に、任意のかかる論文、特許、特許出願、または他の物理的および電子的文書からの任意の全ての資料および情報を、物理的に組み込む権利を留保する。
【０５７１】
本明細書に開示された記載に対して、種々の置換および改変を本明細書の範囲および精神から逸脱することなく行えることは、当業者には容易に明らかである。したがって、かかる追加の態様は、本明細書および以下の特許請求の範囲の範囲内である。本明細書では、当業者に対して、ＲＮＡｉ活性を媒介するための改良された活性を有する核酸コンストラクトを生成するために、本明細書に記載の化学的修飾の様々な組合せおよび／または置換を試験することを教示している。かかる改善された活性には、改善された安定性、改善された生物学的利用能、および／または、ＲＮＡｉを媒介する細胞応答の改善された活性化を含めることができる。したがって、本明細書に記載された特定の態様は限定的ではなく、当業者は容易に、本明細書に記載の変形の特定の組合せが、改良されたＲＮＡｉ活性を有する核酸分子の同定のために、過度の実験なしで試験可能であることを理解することができる。
【０５７２】
本明細書に例示的に記載された説明は、本明細書に具体的には開示されていない、任意の１要素または複数要素、および１つの限定または複数の限定の不在のもとで、好適に実施することができる。したがって、例えば、明細書の記載の文脈における（特に、以下の特許請求の範囲の文脈における）用語「a」および「an」および「the」および類似の指示は、本明細書に別の記述がなければ、または明らかに文脈と矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。用語「含む」、「有する」、「含む（including）」、「含有する（containing）」などは、拡張的に、かつ、限定なしで読まれるべきである（例えば、「〜を含むがこれらに限定されない」を意味する）。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書に別の記載がない限り、範囲内の個々の値を個別に言及するための簡略方法として機能することのみを意図し、各個別の値は、それぞれが明細書に言及されているかのように明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書に別の記載がない限り、または文脈により明らかに矛盾がない限り、任意の適切な順序で行うことができる。本明細書に提供される、任意の、または全ての例、または例示する用語（例えば、「などの」）は、本明細書をより明らかにすることのみを意図しており、別の主張がない限り、記載の範囲の限定を意図しない。明細書中の如何なる用語も、任意のクレームされていない要素が、説明の実施に不可欠であることを示すものと解釈されるべきではない。また、本明細書で用いる用語および表現は、説明のための用語であり、限定する用語として使用されず、かかる用語および表現の使用において、示され記載された特徴の任意の均等物またはその一部を除外するとの意図はないが、クレームされた記述の範囲内で、種々の変更が可能であることが認識される。したがって本説明は、好ましい態様および任意の特徴によって特定的に開示されているが、本明細書に開示された、具体化された記述の変更および変形は、当業者により再区分することができ、かかる変更および変形は、本明細書の範囲内と考えられる。
【０５７３】
本明細書は、広くかつ一般的に記載されている。一般的開示内に含まれる狭い種および亜属のグループの各々もまた、明細書の一部を形成する。これは、但書または任意の主題を属（genus）から取り除く否定的限定を有する、説明の一般的記述を含み、それは、切り取られる物質が具体的に本明細書に記載されているか否かとは無関係である。他の態様は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。さらに、明細書の特徴または側面がマーカッシュグループで記載されている場合には、当業者は、明細書がこれにより、マーカッシュグループの任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループの観点からも記載されていることを認識する。
【図１】
0005873168.tif 000109
【図２】
0005873168.tif 000110
【図３】
0005873168.tif 000111
【図４】
0005873168.tif 000112
【図５】
0005873168.tif 000113
【図６】
0005873168.tif 000114
【図７】
0005873168.tif 000115
【図８】
0005873168.tif 000116
【図９】
0005873168.tif 000117
【図１０】
0005873168.tif 000118
【図１１】
0005873168.tif 000119
【図１２】
0005873168.tif 000120
【図１３】
0005873168.tif 000121
【図１４】
0005873168.tif 000122
【図１５】
0005873168.tif 000123
【図１６】
0005873168.tif 000124
【図１７】
0005873168.tif 000125
【図１８】
0005873168.tif 000126
【図１９】
0005873168.tif 000127
【図２０】
0005873168.tif 000128
【図２１】
0005873168.tif 000129
【図２２】
0005873168.tif 000130
【図２３】
0005873168.tif 000131
【図２４】
0005873168.tif 000132
【図３０】
0005873168.tif 000133
【図３１】
0005873168.tif 000134
【図３２】
0005873168.tif 000135
【図２５】
0005873168.tif 000136
【図２６】
0005873168.tif 000137
【図２７】
0005873168.tif 000138
【図２８】
0005873168.tif 000139
【図２９】
0005873168.tif 000140
【配列表】
0005873168000001.app