(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において、骨形成を増強し、同時に骨再吸収を阻害するための医薬組成物であって、前記対象において骨の沈着および成熟を誘導するのに有効な量の、ＫＨＨＬＧＬＥＥＰＫＫＬＲ（配列番号１）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、ＫＨＨＬＧＬＥＥＰＫＫ（配列番号２）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、もしくはＨＬＧＬＥＥＰＫＫＬＲ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、もしくはそれらの類似体、またはそれらのいずれかの薬学的に許容される塩を含み、ここで、前記類似体は、配列番号１を参照したアミノ酸位置の、１番目、２番目または３番目のＫまたはＨのＲまたはＫによる置換、４番目または６番目のＬのＩまたはＶによる置換、１０番目または１１番目のＫのＨまたはＲによる置換、１２番目のＬのＩまたはＶによる置換、または、１３番目のＲのＫまたはＨによる置換を含む、医薬組成物。
【請求項２】
障害のある骨状態を有する対象において骨の沈着および成熟を誘導するための医薬組成物であって、前記対象において骨の沈着および成熟を誘導するのに有効な量の、ＫＨＨＬＧＬＥＥＰＫＫＬＲ（配列番号１）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、ＫＨＨＬＧＬＥＥＰＫＫ（配列番号２）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、もしくはＨＬＧＬＥＥＰＫＫＬＲ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、もしくはそれらの類似体、またはそれらのいずれかの薬学的に許容される塩を含み、ここで、前記類似体は、配列番号１を参照したアミノ酸位置の、１番目、２番目または３番目のＫまたはＨのＲまたはＫによる置換、４番目または６番目のＬのＩまたはＶによる置換、１０番目または１１番目のＫのＨまたはＲによる置換、１２番目のＬのＩまたはＶによる置換、または、１３番目のＲのＫまたはＨによる置換を含む、医薬組成物。
【請求項３】
前記障害のある骨状態が、前記対象の標的化された部位にある、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記標的化された部位が、椎間腔、椎間関節、骨折部位、口の骨、顎先の骨、顎の骨、インプラント部位およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択される、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
薬学的に許容される担体と組み合わせた、請求項１または２に記載の医薬組成物を含む医薬組成物。
【請求項６】
前記担体が液体担体である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記担体が、生体医用インプラントである、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項８】
骨再吸収阻害剤および体重管理薬からなる群から選択される少なくとも１つの追加の活性薬剤をさらに含む、請求項５〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
髄腔内投与、皮下投与、皮膚投与、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、インプラントを介した投与、マトリックスを介した投与、ゲルを介した投与、およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択される方法により投与される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記状態が、骨折、骨欠損、骨移植、骨移植片、骨がん、関節置換、関節修復、癒合、小関節面修復、骨変性、歯科インプラント、歯の修復、骨髄欠陥およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択される、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記骨欠損が、骨における間隙、変形または癒着不能骨折である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記骨変性が、骨減少症または骨粗鬆症によるものである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記骨欠損が、小人症によるものである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記関節置換が、脊椎関節、膝関節、股関節、足根関節、指節骨関節、肘関節、肩関節、足首関節、手関節、仙腸関節およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択される関節のものである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記関節修復が、脊椎関節、膝関節、股関節、足根関節、指節骨関節、肘関節、肩関節、足首関節、手関節、仙腸関節およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択される関節のものである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
骨再吸収阻害剤を前記対象に有効量において投与するステップをさらに含む、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
対象において体重を減少させるための医薬組成物であって、体重を減少させるのに有効な量の、ＫＨＨＬＧＬＥＥＰＫＫＬＲ（配列番号１）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、ＫＨＨＬＧＬＥＥＰＫＫ（配列番号２）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、もしくはＨＬＧＬＥＥＰＫＫＬＲ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、もしくはそれらの類似体、またはそれらのいずれかの薬学的に許容される塩を含み、ここで、前記類似体は、配列番号１を参照したアミノ酸位置の、１番目、２番目または３番目のＫまたはＨのＲまたはＫによる置換、４番目または６番目のＬのＩまたはＶによる置換、１０番目または１１番目のＫのＨまたはＲによる置換、１２番目のＬのＩまたはＶによる置換、または、１３番目のＲのＫまたはＨによる置換を含む、医薬組成物。
【請求項１８】
前記対象における体重の減少が、体重増加の減少または体重減少の誘導である、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記対象における体重の減少が、前記対象の体格指数の減少である、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記対象が、少なくとも２５ｋｇ／ｍ２の体格指数を有する、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記対象が、少なくとも３０ｋｇ／ｍ２の体格指数を有する、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
少なくとも１６週または２４週の期間、継続投与される、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記対象が少なくとも５％の体重減少を達成するまで、または、前記対象の体格指数が２５ｋｇ／ｍ２未満まで減少するまで継続投与される、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記対象における脂肪減少を誘導するのに有効な量において投与される、請求項１７〜２３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記対象における脂肪細胞分化を阻害するのに有効な量において投与される請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
体重管理薬をさらに含む、請求項１７〜２５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記体重管理薬が、食欲抑制薬、リパーゼ阻害剤、抗鬱薬、抗痙攣薬およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択される、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
対象において骨髄再構成を改善するための医薬組成物であって、骨髄再構成を改善するのに有効な量の、ＫＨＨＬＧＬＥＥＰＫＫＬＲ（配列番号１）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、ＫＨＨＬＧＬＥＥＰＫＫ（配列番号２）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、もしくはＨＬＧＬＥＥＰＫＫＬＲ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、もしくはそれらの類似体、またはそれらのいずれかの薬学的に許容される塩を含み、ここで、前記類似体は、配列番号１を参照したアミノ酸位置の、１番目、２番目または３番目のＫまたはＨのＲまたはＫによる置換、４番目または６番目のＬのＩまたはＶによる置換、１０番目または１１番目のＫのＨまたはＲによる置換、１２番目のＬのＩまたはＶによる置換、または、１３番目のＲのＫまたはＨによる置換を含む、医薬組成物。
【請求項２９】
前記対象が、化学療法を受けているまたは受けた対象、放射線を受けているまたは受けた対象、再生不良性貧血を有する対象、骨髄異形成を有する対象、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
幹細胞をエクスビボで増殖させる方法であって、ＫＨＨＬＧＬＥＥＰＫＫＬＲ（配列番号１）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、ＫＨＨＬＧＬＥＥＰＫＫ（配列番号２）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、もしくはＨＬＧＬＥＥＰＫＫＬＲ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、もしくはそれらの類似体、またはそれらのいずれかの薬学的に許容される塩を対象由来の幹細胞と接触させるステップを含み、ここで、前記類似体は、配列番号１を参照したアミノ酸位置の、１番目、２番目または３番目のＫまたはＨのＲまたはＫによる置換、４番目または６番目のＬのＩまたはＶによる置換、１０番目または１１番目のＫのＨまたはＲによる置換、１２番目のＬのＩまたはＶによる置換、または、１３番目のＲのＫまたはＨによる置換を含み、前記幹細胞が、対象中に再導入可能な条件下で維持される方法。
【請求項３１】
前記対象が、化学療法を受けているまたは受けた対象、放射線を受けているまたは受けた対象、再生不良性貧血を有する対象、骨髄異形成を有する対象、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載の医薬組成物の製造における、ＫＨＨＬＧＬＥＥＰＫＫＬＲ（配列番号１）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、ＫＨＨＬＧＬＥＥＰＫＫ（配列番号２）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、もしくはＨＬＧＬＥＥＰＫＫＬＲ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、もしくはそれらの類似体、またはそれらのいずれかの薬学的に許容される塩の使用であって、ここで、前記類似体は、配列番号１を参照したアミノ酸位置の、１番目、２番目または３番目のＫまたはＨのＲまたはＫによる置換、４番目または６番目のＬのＩまたはＶによる置換、１０番目または１１番目のＫのＨまたはＲによる置換、１２番目のＬのＩまたはＶによる置換、または、１３番目のＲのＫまたはＨによる置換を含む、使用。
【請求項３３】
請求項３０または３１に記載の方法を実行するための、ＫＨＨＬＧＬＥＥＰＫＫＬＲ（配列番号１）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、ＫＨＨＬＧＬＥＥＰＫＫ（配列番号２）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、もしくはＨＬＧＬＥＥＰＫＫＬＲ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、もしくはそれらの類似体、またはそれらのいずれかの薬学的に許容される塩の使用であって、ここで、前記類似体は、配列番号１を参照したアミノ酸位置の、１番目、２番目または３番目のＫまたはＨのＲまたはＫによる置換、４番目または６番目のＬのＩまたはＶによる置換、１０番目または１１番目のＫのＨまたはＲによる置換、１２番目のＬのＩまたはＶによる置換、または、１３番目のＲのＫまたはＨによる置換を含む、使用。
【請求項３４】
前記ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分が結合している、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
前記ＰＥＧ部分がシステイン残基に結合している、請求項３４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［優先権に関する陳述］
本発明は、米国特許法１１９条（ｅ）に基づいて、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２００９年６月４日出願の米国仮出願シリアル番号６１／１８４，２０９の利益を主張する。
【０００２】
［政府援助に関する陳述］
本発明は、米国国立衛生研究所の助成金番号ＨＬ−５６５８０およびＡＧ−０２３３１に基づいて、政府の援助によって一部資金の提供を受けた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、体重の管理、骨障害の治療および骨髄再構成の改善における、ペプチド、それらを含有する医薬製剤、ならびにその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
インスリン様成長因子結合タンパク質−２（ＩＧＦＢＰ−２）は、ＩＧＦＢＰファミリーのメンバーである３６，０００ダルトンのタンパク質である。６つの形態の高親和性ＩＧＦ結合タンパク質が存在する。インスリン様増殖因子ＩおよびＩＩに結合すること、ならびに輸送タンパク質として機能することに加えて、これらのタンパク質は、ＩＧＦに結合するそれらの能力に非依存的ないくつかの作用を有することが示されている。
【０００５】
ＩＧＦＢＰ−２は、血清中に２番目に多く存在する結合タンパク質である。ＩＧＦＢＰ−２は、ヒトにおいて１００〜６００ｎｇ／ｍｌの間で変動する濃度で循環する。タンパク質濃度は、胎生期の間および出生時に高く、幼少期および青年期の間、徐々に下がる。６０〜８０歳の間にわずかな上昇が存在し、約２５％の増加が生じる。ＩＧＦＢＰ−２の血清濃度は、ホルモンおよび栄養素によって制御される。絶食は、ＩＧＦＢＰ−２の顕著な増加の原因となり、摂食（特に、タンパク質の摂食）は、濃度を正常に回復させる。濃度はまた、インスリンまたは成長ホルモンの投与によって抑制され、インスリン様成長因子Ｉによって増加する。このことはおそらく、一部分において、成長ホルモンおよびインスリンの抑制によるものであり、これらは両方とも、ＩＧＦ−Ｉを投与することによって抑制される。
【０００６】
ＩＧＦＢＰ−２のタンパク質分解による切断は、ヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）を含む小断片を生じさせる。ＩＧＦＢＰ−２のリンカー領域に存在するＨＢＤを含有する低分子は合成されている。この分子中の２つのＨＢＤのうち、合成された１つはＩＧＦＢＰ−２に特有であり、別のＩＧＦＢＰにおいては示されない。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、骨障害の治療、体重の管理および骨髄再構築の改善における、ＩＦＧＢＰ−２のペプチドおよびそれらの使用方法を提供することによって、当技術分野における以前の欠点を克服する。
【０００８】
本発明の第１の態様は、ＩＧＦＢＰ−２断片ＫＨＨＬＧＬＥＥＰＫＫＬＲ、ＫＨＨＬＧＬＥＥＰＫＫ、ＨＬＧＬＥＥＰＫＫＬＲ、それらの類似体、任意のそれらのプロドラッグ、または任意のそれらの薬学的に許容される塩（すべて、本明細書において以後、「活性化合物」または「活性薬剤」と称される場合がある）を含む、それらからなる、または本質的にそれらからなる化合物である。
【０００９】
本発明の第２の態様は、薬学的に許容される担体と組み合わせることができ、任意選択により骨再吸収阻害剤または体重管理薬などの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）のさらなる活性薬剤を含む、本明細書に記載の活性化合物を含む組成物である。
【００１０】
本発明のさらなる一態様は、障害のある骨状態を有する対象において骨の沈着および成熟を誘導するための方法であって、対象における骨の沈着および成熟を誘導するのに有効な量で活性化合物を対象に投与することを含む方法である。本方法は、骨再吸収阻害剤を対象に有効量で併用して投与することをさらに含んでもよい。
【００１１】
本発明のさらなる一態様は、それを必要としている対象において、骨形成を増強し、同時に骨再吸収を阻害するための方法であって、活性化合物を、前記対象において骨形成を増強し、同時に骨再吸収を阻害するのに有効な量で対象に投与することを含む方法である。
【００１２】
本発明のさらなる一態様は、それを必要としている対象において体重を管理するための方法であって、本明細書に記載の活性化合物を、体重を管理するのに有効な量で対象に投与することを含む方法である。本方法は、対象にさらなる体重管理薬を併用して投与することをさらに含んでもよい。
【００１３】
本発明の別の態様は、それを必要としている対象において骨髄再構成を改善するための方法であって、本発明の活性化合物を、骨髄再構成を改善するのに有効な量で前記対象に投与することを含む方法である。
【００１４】
本発明のさらなる一態様は、本明細書に記載の方法を実行するための、および／または本明細書に記載の方法を実行するための医薬の調製のための、本明細書に記載の活性化合物の使用である。
【００１５】
本発明を、以下により詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＩＧＦＢＰ２のヘパリン結合ドメインが、インビトロで骨芽細胞形成を増強することを示す図である。ａ．８週齢のＩｇｆｂｐ２＋／＋およびＩｇｆｂｐ２−／−雄マウスの脛骨を使用して、フォンコッサ（Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ）染色を実施した。ｂ．頭蓋冠骨芽細胞（ＣＯＢ）を、７日齢の雄のＩｇｆｂｐ２＋／＋およびＩｇｆｂｐ２−／−雄マウスから採取し、２．５％ＦＣＳの存在下において骨形成培地で処理した。７日目に、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）染色を実施した。ｃおよびｄ．Ｉｇｆｂｐ２−／−マウスのＣＯＢおよび骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）を、１０％ＦＣＳの存在下においてペグ化されたヘパリン結合ドメインペプチド（ＰＥＧ−ＨＢＤ）を含む骨形成培地で処理した。ＡＬＰ染色（７日目）およびアリザリンレッド染色（１４日目）を実施した（ｃ）。ＲＮＡを、ＢＭＳＣから１４日目に単離し、ＡＬＰ、オステオカルシン（ＯＣ）およびＲｕｎｘ２の発現を、リアルタイムＰＣＲによって分析した。示されている図は、少なくとも３つの独立した実験を表す（ｎ＝３）。統計学的差異を、スチューデントのｔ検定によって分析した。＊；ｐ＜０．０５。
【図２】ＩＧＦＢＰ２のヘパリン結合ドメインが、エクスビボで中手骨の骨膜伸展を増強することを示す図である。中手骨を、１日齢の雄マウスから回収し、ＩＧＦ−１（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下において、ＩＧＦＢＰ２（２００ｎｇ／ｍｌ）またはヘパリン結合ドメインペプチド（ＨＢＤペプチド）（２μｇ／ｍｌ）を含む骨形成培地で１０日間処理した。骨をカルセイン（５００ｎｇ／ｍｌ）で標識し、カルセイン取り込み面積を可視化し（ａ）、カルセイン取り込み面積の縦方向の長さを定量した（ｂ）。アルシアンブルーおよびフォンコッサ二重染色を実施し（ｃ）、中手骨の長さおよび幅を定量した（ｄ）。統計学的差異を、ＡＮＯＶＡ、その後ボンフェローニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）事後検定によって分析した。示されている図は、少なくとも３つの独立した実験を表す。値は、平均±ＳＥＭとして表す（ｎ＝３〜４）。ａ；ＰＢＳに対して＜０．０５、ｂ；ＰＢＳに対して＜０．０１、ｃ；ＰＢＳに対して＜０．００１、ｄ；ＨＢＤに対して＜０．０１、ｅ；ＩＧＦ−Ｉに対して＜０．０５、ｆ；ＨＢＤに対して＜０．０５。
【図３】ＩＧＦＢＰ５のヘパリン結合ドメインが、インビトロでの骨芽細胞形成またはエクスビボで中手骨の骨膜伸展に対する効果を有しないことを示す図である。ａ．初代頭蓋冠骨芽細胞を、雄のＩｇｆｂｐ２−／−雄マウスから回収し、ＩＧＦＢＰ−５のヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ−ＢＰ５）（２μｇ／ｍｌ）を含むまたは含まない骨形成培地で処理した。骨芽細胞形成を、アリザリンレッド染色によって評価した。ｂおよびｃ．中手骨を、１日目の雄マウスから回収し、ＨＢＤ−ＢＰ５（２μｇ／ｍｌ）を含むまたは含まない骨形成培地で１０日間処理した。骨を、カルセイン（５００ｎｇ／ｍｌ）で標識し、カルセイン取り込み面積を可視化した（ａ）。カルセイン取り込み面積の縦方向の長さを定量した（ｂ）。アルシアンブルーおよびフォンコッサ二重染色を実施し（ｃ）、中手骨の長さおよび幅を定量した（ｄ）。示されている図は、少なくとも３つの独立した実験を表す。値は、平均±ＳＥＭとして表す。統計学的差異を、スチューデントのｔ検定によって分析した（ｎ＝３〜４）。
【図４】ＩＧＦＢＰ２のヘパリン結合ドメインが、Ｉｇｆｂｐ２−／−マウスの骨減少性表現型を部分的にレスキューすることを示す図である。Ｉｇｆｂｐ２−／−マウスを、ＰＢＳまたはペグ化されたヘパリン結合ドメイン（ＰＥＧ−ＨＢＤ）で６週齢から９週齢まで処理した。ａ．遠位大腿骨のマイクロＣＴ画像。ｂ．３点曲げ研究によるパラメータを示した。ｃ．骨芽細胞数／骨梁周囲長（Ｎｏｂ／ＢＰｍ）、骨芽細胞面／骨面（ＯｂＳ／ＢＳ）、破骨細胞数／骨パラメータ（Ｎｏｃ／ＢＰｍ）およびびらん面／骨面（ＥＳ／ＢＳ）を、組織形態計測（ｎ＝５）によって決定した。ｄ．脂肪細胞数（Ｎ．Ａｄ）を、大腿骨の遠位成長板の直近位で計数し、合計面積（Ｔ．Ａｒ）によって正規化した（ｎ＝６）。ｅ．Ｉｇｆｂｐ２−／−頭蓋冠骨芽細胞（ＣＯＢ）を、ＰＢＳまたはＰＥＧ−ＨＢＤで２４時間、無血清培地中で処理した。Ｐｐａｒｇの発現を、リアルタイムＰＣＲによって分析した（ｎ＝３）。ｆ．Ｔｒａｐ５ｂの血清中濃度を、ＥＬＩＳＡによって分析した（Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．）（ｎ＝６〜９）。ｇおよびｈ．Ｉｇｆｂｐ２−／−ＣＯＢを、ＰＥＧ−ＨＢＤありまたはなしで２時間処理した（ｈ）。Ｉｇｆｂｐ２−／−ＢＭＳＣを、ＰＢＳまたはＰＥＧ−ＨＢＤを含む骨形成培地で２週間培養した（ｉ）。ＯｐｇおよびＲａｎｋｌの発現を、リアルタイムＰＣＲによって分析した（ｎ＝３）。示されている図は、少なくとも３つの独立した実験を表す。値は、平均±ＳＥＭとして表す。統計学的差異を、スチューデントのｔ検定によって分析した＊；＜０．００１、＊＊；＜０．０１、†；＜０．０５、††；＜０．０６。
【図５】ＩＧＦＢＰ２のヘパリン結合ドメインが、ＰＴＥＮ発現を抑制することを示す図である。ａおよびｂ、Ｉｇｆｂｐ２−／−頭蓋冠骨芽細胞（ＣＯＢ）を単離し、ＰＢＳ、ＩＧＦＢＰ−２またはペグ化されたヘパリン結合ドメインペプチド（ＰＥＧ−ＨＢＤ）で、０．１％ＢＳＡを含有するＭＥＭα中で終夜処理した。全細胞溶解物を回収し、ＰＴＥＮおよびα−アクチンの発現を、ウェスタンブロット分析によって分析した。ＰＴＥＮの発現レベルを、α−アクチンの発現レベルに対して正規化することによって定量した。ｃおよびｄ．ＰＢＳ、ＩＧＦＢＰ−２またはＰＥＧ−ＨＢＤとともに終夜プレインキュベートしたＣＯＢを、ＩＧＦ−Ｉ（１００ｎｇ／ｍｌ）で１５分間処理した。全細胞溶解物を回収し、ｐＳｅｒ４７３−ＡｋｔおよびＡｋｔの発現を、ウェスタンブロット分析によって分析した。ｐＳｅｒ４７３−Ａｋｔの発現レベルを、Ａｋｔの発現レベルに対して正規化することによって定量した。示されている図は、少なくとも３つの独立した実験を表す。値は、平均±ＳＥＭとして表す（ｎ＝３〜４）。統計学的差異を、スチューデントのｔ検定によって分析した。＊；＜０．００１、＊＊；＜０．０１、†；＜０．０５。
【図６】ＩＧＦＢＰ−２のヘパリン結合ドメインが、ＩＧＦ−Ｉによるβ−カテニンの細胞質基質蓄積およびＳｅｒ５５２リン酸化を刺激することを示す図である。ａ、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を終夜、血清飢餓状態にし、示されている濃度のＩＧＦ−Ｉで６時間処理した。β−カテニンおよびα−アクチンの発現を、膜および細胞質基質画分を用いてウェスタンブロット分析によって分析した。ｂ、Ｉｇｆｂｐ２−／−頭蓋冠骨芽細胞（ＣＯＢ）を終夜、ＰＢＳまたはペグ化されたヘパリン結合ドメインペプチド（ＰＥＧ−ＨＢＤ）とともに血清飢餓状態にし、次いでＩＧＦ−Ｉ（１００ｎｇ／ｍｌ）で６時間処理した。β−カテニンの発現を、細胞質基質画分を用いてウェスタンブロット分析によって分析し、α−アクチンに対して正規化することによって定量した（ｎ＝３）。ｃ、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を終夜、血清飢餓状態にし、ＩＧＦ−Ｉ（１００ｎｇ／ｍｌ）で１５分間処理した。ｐＳｅｒ５５２−β−カテニン、β−カテニン、ｐＳｅｒ４７３−Ａｋｔ、Ａｋｔおよびα−アクチンの発現を、全細胞溶解物を用いてウェスタンブロット分析によって分析した。ｄ、Ｉｇｆｂｐ２−／−ＣＯＢを終夜、ＰＢＳまたはＰＥＧ−ＨＢＤとともに血清飢餓状態にし、次いで、ＩＧＦ−Ｉ（１００ｎｇ／ｍｌ）で１５分間処理した。ｐＳｅｒ５５２−β−カテニンの発現を、全細胞溶解物を用いるウェスタンブロット分析によって分析し、β−カテニンに対して正規化することによって定量した（ｎ＝３）。示されている図は、少なくとも３つの独立した実験を表す。値は、平均±ＳＥＭとして表す。統計学的差異を、スチューデントのｔ検定によって分析した。＊；＜０．００１、＊＊；＜０．０１、†；＜０．０５。
【図７】ヘパリン結合ドメインペプチドについての対照ペプチドが、インビトロでの骨芽細胞形成に対して同化作用効果を有さないことを示す図である。Ｉｇｆｂｐ２−／−頭蓋冠骨芽細胞（ＣＯＢ）を、ＰＢＳ、対照ペプチド（２μｇ／ｍｌ）またはヘパリン結合ドメインペプチド（ＨＢＤペプチド）（２μｇ／ｍｌ）を含む骨形成培地で培養した。骨芽細胞形成を、アリザリンレッド染色によって評価した。
【図８】ヘパリン結合ドメインペプチドについての対照ペプチドが、エクスビボで中手骨に対して同化作用効果を有さないことを示す図である。中手骨を、１日目の雄のＩｇｆｂｐ２＋／＋マウスから回収し、１ｍＭのβ−グリセロリン酸および５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸を含有するＤＭＥＭ（１ｇ／Ｌのグルコース）中で培養した。ＰＢＳまたは対照ペプチド（２μｇ／ｍｌ）のいずれかを、この培地に加えた。１０日目に、骨を５００ｎｇ／ｍｌのカルセインで２時間処理した。カルセイン取り込み面積を可視化し（ｂ）、取り込み面積の縦方向の長さを定量した（ｃ）。中手骨を、４％ＰＦＡで固定し、アルシアンブルーおよびフォンコッサ二重染色に供した（ｄ）。中手骨の長さおよび幅を定量した（ｅ）。値は、平均±ＳＥＭとして表した（ｎ＝３）。統計学的有意性を、スチューデントのｔ検定によって分析した。ｎｓ；有意でない。
【図９】ヘパリン結合ドメインペプチドについての対照ペプチドが、Ｉｇｆｂｐ２＋／＋頭蓋冠骨芽細胞においてＰＴＥＮ発現を抑制しないことを示す図である。Ｉｇｆｂｐ２＋／＋頭蓋冠骨芽細胞を、ＰＢＳ、対照ペプチド、またはヘパリン結合ドメインペプチド（ＨＢＤペプチド）で終夜処理し、全細胞溶解物を回収した。ＰＴＥＮ発現を、ウェスタンブロット分析を使用して分析し（ａ）、定量的分析を実施した（ｂ）。値は、平均±ＳＥＭとして表した（ｎ＝３）。統計学的有意性を、ＡＮＯＶＡ、その後ボンフェローニ事後検定によって分析した。ａ；ＰＢＳに対するｐ＜０．０１、ｂ；対照ペプチドに対するｐ＜０．０１。
【図１０】ＩＧＦＢＰ−２のＨＢＤが、完全長（ＦＬ）ＩＧＦＢＰ−２（ＢＰ２）および対照ペプチドと比較して、アルカリホスファターゼおよびアリザリンレッド染色の増加によってそれぞれ見られるように、骨芽細胞および骨髄間質細胞の細胞増殖を増加させたことを示す図である。
【図１１】ＩＧＢＰ−２のＨＢＤが、μＣＴ分析によって見られるように、インビボでＩｇｆｂｐ２−／−マウスの低骨量表現型をレスキューしたことを示す図である。
【図１２】ＨＢＤが、Ｉｇｆｂｐ２−／−マウスのリンパ系および骨髄系造血表現型の増加を逆転させたことを示す図である。
【図１３】競合的再構築骨髄移植において、Ｉｇｆｂｐ２−／−骨髄ドナー細胞が、Ｉｇｆｂｐ２＋／＋ドナー細胞より３０％低い効率で同系統レシピエントの骨髄を再構築したことを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明を、以下にさらに詳細に説明する。この説明は、本発明を実行することができるすべての異なる様式、または本発明に加えられてもよいすべての特徴の詳細な目録であることを意図していない。例えば、一実施形態に関して例示されている特徴が、別の実施形態に組み込まれてもよく、特定の実施形態に関して例示されている特徴がその実施形態から削除されてもよい。加えて、非常に多くの変形形態および本明細書において提案されている様々な実施形態に対する付加が、本発明を逸脱しない本開示に照らして、当業者に明らかとなるだろう。したがって、以下の本明細書は、本発明のいくつかの特定の実施形態を例示することを意図しており、それらのすべての順列、組合せおよび変形形態を網羅的に明記することは意図していない。
【００１８】
本明細書において引用されているすべての米国特許、特許公開および非特許文献の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００１９】
本発明は、ＩＧＦＢＰ−２のペプチド（例えば、ヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ））が、骨障害を治療する方法、体重管理の方法および骨髄再構成を改善する方法において用いることができるという発見に基づいている。
【００２０】
したがって、ある特定の実施形態では、本発明は、対象において同時に、骨形成を増強し（すなわち、形成される新しい骨の量を増加させる）、骨再吸収を阻害する（すなわち、分解される骨の量を減少させる）ための方法であって、本発明の活性化合物を、前記対象において骨形成を増強し、同時に骨再吸収を阻害するのに有効な量で対象に投与することを含む方法を提供する。そのような治療を必要とするであろうおよび／またはこれが有益であろう対象の非限定的な例は、骨粗鬆症または低骨量の女性（例えば、閉経後の；閉経前の）、骨粗鬆症または低骨量の男性、回復途中の骨折を有する対象、長時間の固定化を受けている対象、長期間固定化されていた、または固定化されている対象、長時間の固定化を受けるまたは経験する可能性の高い対象、エストロゲン欠乏を有する対象などを含み、当技術分野において知られているであろう。
【００２１】
対象（例えば、障害のある骨状態を有する対象）において、骨の沈着および成熟を誘導するための方法であって、本発明の活性化合物を、対象における骨の沈着および成熟を誘導するのに有効な量で対象に投与することを含む方法もまた本明細書において提供される。本発明の方法は、骨再吸収阻害剤を対象に有効量で併用して投与することをさらに含んでもよい。
【００２２】
いくつかの実施形態では、障害のある骨状態は、対象の標的化された部位にある。部位は、椎間腔、椎間関節、骨折部位、口、顎先および顎の骨またはインプラント部位であってもよい。
【００２３】
対象において骨髄再構成を改善するための方法であって、前記対象に本発明の活性化合物を、骨髄再構成を改善する（すなわち、例えば、化学療法、放射線または骨髄細胞を激減させる別の治療を受けている対象であってもよい対象において骨髄細胞を回復させる（例えば、部分的にまたは完全に））のに有効な量で投与することを含む方法もまた本明細書において提供される。例えば、放射線を含むまたは含まない化学療法を受けている対象は、日和見感染症を予防するために、骨髄における細胞のより迅速な回復が有益であるだろう。これらの方法の対象はまた、骨髄細胞を激減させる血液障害（例えば、再生不良性貧血；骨髄異形成）を有するまたは有することが疑われる対象とすることもできる。骨髄再構成におけるそのような改善または増強または増加は、活性化合物が投与されなかった対象と比較される。
【００２４】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、当技術分野において知られているプロトコルに従って行われる、幹細胞のエクスビボ増殖の方法において用いることができる。したがって、本発明は、エクスビボで幹細胞を増殖させる方法であって、本発明の化合物を対象の幹細胞と接触させることを含み、前記幹細胞が、対象中に再導入される条件下で維持される方法を提供する。
【００２５】
例えば、いくつかのエクスビボの実施形態において、幹細胞は、対象、例えば、ヒトから、例えば、末梢血、臍帯血、または骨髄から得られ、幹細胞を、対象の体外で本発明の化合物と接触させる。エクスビボの実施形態は、対象から幹細胞を得ることおよび細胞を使用前に（例えば、移植のために）一定期間培養することを含む。いくつかの実施形態では、化合物との接触の後、細胞は、対象、例えば、細胞が単離されたのと同じ対象（自己由来の提供（ｄｏｎａｔｉｏｎ））または異なる対象（非自己由来の（例えば、同系または同種異系の）提供）に送達される。
【００２６】
これらの方法が必要とされるであろうまたはこれらの方法が有益であろう対象の非限定的な例は、化学療法を受けているまたは受けた対象、放射線を受けているまたは受けた対象、再生不良性貧血を有する対象、骨髄異形成を有する対象、およびそれらの任意の組合せを含む。
【００２７】
本発明の化合物または組成物の投与は、髄腔内注入、皮下、皮膚、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内注入、インプラント中、マトリックス中、ゲル中、またはそれらの任意の組合せを含む任意の適した経路によるものであってよい。
【００２８】
本発明の方法に従って治療することができる骨状態は、骨折、骨欠損、骨移植、骨移植片、骨肉腫、関節置換、関節修復、癒合、小関節面修復、骨変性、歯科インプラントおよび修復、骨髄欠陥ならびに骨および骨組織に関連した別の状態の１つまたは複数とすることができる。骨欠損は、骨における間隙、変形および／または癒着不能骨折であってもよい。
【００２９】
骨変性は、骨減少症または骨粗鬆症によるもの（例えば、患者が老人または老人性骨粗鬆症、閉経後の骨粗鬆症などに罹患している）、または小人症によるものであってもよい。
【００３０】
治療することができる関節置換は、脊椎関節、膝関節、股関節、足根関節、指節骨関節、肘関節、足首関節および／または別の関節を形成している関節またはそれらの置換を含む。関節修復は、脊椎関節、膝関節、股関節、足根関節、指節骨関節、肘関節、足首関節、および仙腸関節の修復を含むがこれらに限定されない。
【００３１】
本発明のさらなる一態様は、それを必要としている対象において体重を管理するための方法であって、本明細書に記載の活性化合物を、体重を管理するのに有効な量で対象に投与することを含む方法である。本方法は、対象にさらなる体重管理薬を併用して投与することをさらに含んでもよい。
【００３２】
いくつかの実施形態では、対象は肥満である。
【００３３】
いくつかの実施形態では、化合物は、対象において体重増加を減少させる、または体重減少（または特に脂肪減少）を誘導するのに有効な量で投与される。
【００３４】
いくつかの実施形態では、化合物は、対象の体格指数を減少させるのに有効な量で投与される。
【００３５】
いくつかの実施形態では、対象は、２５または３０ｋｇ／ｍ２以上の体格指数を有する。
【００３６】
いくつかの実施形態では、投与は、少なくとも１６週または２４週の期間、および／または個体が少なくとも５％の体重減少を達成するまでもしくは個々の体格指数が２５ｋｇ／ｍ２未満まで減少するまで、継続される。
【００３７】
いくつかの実施形態では、活性化合物は、対象において脂肪細胞分化を阻害（例えば、脂肪細胞前駆体の成熟脂肪細胞への分化の阻害）するのに有効な量で投与される。
【００３８】
いくつかの実施形態は、対象にさらなる体重管理薬を併用して投与することをさらに含む。
【００３９】
任意の特定の本発明の活性化合物の治療上有効な投薬量は、化合物によって、および患者によって異なることになり、とりわけ、達成するべき効果または結果、患者の状態および送達経路に依存することになる。いくつかの実施形態では、約０．００１（すなわち、１μｇ／ｋｇ）、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０ｍｇ／ｋｇから、約３０、４０もしくは５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０ｍｇ／ｋｇ）、またはそれ以上までの投薬量を使用することができる。
【００４０】
Ａ．定義
本明細書において使用される「対象」は、一般にヒト対象であり、閉経後の対象を含むがこれらに限定されない。対象は、男性または女性であってもよく、白色人種、アフリカ系アメリカ人、アフリカ人、アジア人、ヒスパニック、インド人などを含むがこれらに限定されない任意の人種または民族であってもよい。対象は、出生直後の新生児、新生児、乳幼児、小児、青年、成人、および老人を含む任意の年齢であってもよい。いくつかの実施形態では、対象は、閉経後の女性対象、または老人性骨粗鬆症に罹患している対象である。対象はまた、動物用医薬品または医薬品開発のための、動物対象、特に、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ブタ、げっ歯類動物（例えば、ラットおよびマウス）、ウサギ目動物、霊長類（ヒト以外の霊長類を含む）などの哺乳動物対象を含んでもよい。
【００４１】
本明細書において使用される「治療する」、「治療すること」または「治療」は、患者の状態の（例えば、１つまたは複数の症状の）改善、疾患の進行の遅延などを含む、疾患に罹患している患者に利益を付与する任意のタイプの治療を指す。
【００４２】
本明細書において使用される「薬学的に許容される」は、化合物または組成物が、疾患の重症度および治療の必要性に照らして過度に有害な副作用を伴わずに本明細書に記載の治療を達成するために、対象への投与に適していることを意味する。
【００４３】
本明細書において使用される「併用して投与すること」または「併用して投与する」は、２つ以上の化合物または組成物が、複合効果をもたらすのに十分近い時間に投与される（すなわち、併用して、は同時にであってもよく、または２つ以上の事象が互いの前または後の短時間以内に行われること、例えば、逐次的であってもよい）ことを意味する。同時の併用投与は、投与前に化合物を混合することによって、または同じ時点ではあるが異なる解剖学的部位に化合物を投与することによって、および／または異なる投与経路を使用することによって行われてもよい。
【００４４】
本明細書において使用される「骨再吸収阻害剤」は、ビスホスホネート、選択的エストロゲン受容体修飾因子、カルシトニン、ビタミンＤ類似体、およびカルシウム塩を含むがそれらに限定されない任意の適した骨再吸収阻害剤とすることができる。例えば、米国特許第７，５０７，７１５号を参照されたい。非常に多くのそのような化合物が知られている。例えば、米国特許第７，０１８，９８２号；同第６，７２３，６９６号；同第６，２８４，７３０号；および同第５，０３９，６６９号を参照されたい。
【００４５】
本明細書において使用される「体重管理薬」は、シブトラミン、フェンテルミン、ジエチルプロピオン、フェンジメトラジンなどの食欲抑制薬；オリルスタット（ｏｒｉｌｓｔａｔ）などのリパーゼ阻害剤；ブプロピオンなどの抗鬱薬；トピラメート、ゾニサミド、およびメトホルミンなどの抗痙攣薬を含むがそれらに限定されない任意のさらなる体重管理活性薬剤を含む。
【００４６】
本明細書において使用される「キャッピング基」は、アセチル、ベンゾイル、ホルミル、トリフルオロアセチル、ベンジルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、ビフェニルイルイソプロピルオキシカルボニル、トリフェニルメチル、ｏ−ニトロベンゼンスルフェニル、およびジフェニルホスフィニルを含むがこれらに限定されない。キャッピング基は、Ｒ１０ＣＯ−、Ｒ１０−Ｏ−ＣＯ−、Ｒ１０−ＰＯ−、Ｒ１０−ＳＯ２−およびアリールアルキル−（Ｒ１０は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、およびアリールアルキルからなる群から選択される）などの基からなってもよい。
【００４７】
本明細書において使用される「連結基」または「リンカー」は、当技術分野において知られている（例えば、米国特許第７，４６８，４１８号；同第７４０２，６５２号；および同第７，３５１，７９７号を参照されたい）ものなどの非アミノ酸連結基または当業者に明らかであろうそれらの変形形態を含む。
【００４８】
本明細書において使用される「アルキル」は、１個〜１０個の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖炭化水素を指す。アルキルの代表的な例は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、３−メチルヘキシル、２，２−ジメチルペンチル、２，３−ジメチルペンチル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシルなどを含むがこれらに限定されない。本明細書において使用される「低級アルキル」は、アルキルの部分集合であり、１個〜４個の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖炭化水素基を指す。低級アルキルの代表的な例は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチルなどを含むがこれらに限定されない。
【００４９】
本明細書において使用される「アルケニル」は、２個〜１０個の炭素を含有し、２つの水素の除去によって形成された少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含有する直鎖または分岐鎖炭化水素を指す。「アルケニル」の代表的な例は、エテニル、２−プロペニル、２−メチル−２−プロペニル、３−ブテニル、４−ペンテニル、５−ヘキセニル、２−ヘプテニル、２−メチル−１−ヘプテニル、３−デセニルなどを含むがこれらに限定されない。本明細書において使用される「低級アルケニル」は、アルケニルの部分集合であり、１個〜４個の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖炭化水素基を指す。
【００５０】
本明細書において使用される「アルキニル」は、２個〜１０個の炭素原子を含有し、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含有する直鎖または分岐鎖炭化水素基を指す。アルキニルの代表的な例は、アセチレニル、１−プロピニル、２−プロピニル、３−ブチニル、２−ペンチニル、１−ブチニルなどを含むがこれらに限定されない。本明細書において使用される「低級アルキニル」は、アルキルの部分集合であり、１個〜４個の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖炭化水素基を指す。
【００５１】
本発明のアルキル基、アルケニル基、およびアルキニル基は、置換されていても、または置換されていなくてもよく、別途明記されていない限りいずれかである。置換されているとき、本発明のアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基は、アルケニル、アルケニルオキシ、アルコキシ、アルコキシアルコキシ、アルコキシカルボニル、アルキル、アルキルカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルチオ、アルキニル、アリール、アジド、アリールアルコキシ、アリールアルキル、アリールオキシ、カルボキシ、シアノ、ホルミル、ハロゲン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、メルカプト、ニトロ、スルファミル、スルホ、スルホン酸から独立に選択される１個、２個、３個、４個、または５個またはそれ以上の置換基で置換されていてもよい。
【００５２】
本明細書において使用される「アリール」は、単環式炭素環式環系または１つもしくは複数の芳香族環を有する二環式炭素環式縮合環系を指す。アリールの代表的な例は、アズレニル、インダニル、インデニル、ナフチル、フェニル、テトラヒドロナフチルなどを含む。
【００５３】
本発明のアリール基は、アルケニル、アルケニルオキシ、アルコキシ、アルコキシアルコキシ、アルコキシカルボニル、アルキル、アルキルカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルチオ、アルキニル、アリール、アジド、アリールアルコキシ、アリールアルキル、アリールオキシ、カルボキシ、シアノ、ホルミル、ハロゲン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、メルカプト、ニトロ、スルファミル、スルホ、スルホン酸から独立に選択される１個、２個、３個、４個、または５個またはそれ以上の置換基で置換されていてもよい。
【００５４】
本明細書において使用される「アリールアルキル」は、本明細書において定義されているアルケニル基を介して親分子部分に付加されている、本明細書において定義されているアリール基を指す。アリールアルケニルの代表的な例は、上記されている通り置換されていてもまたは置換されていなくてもよい２−フェニルエテニル、３−フェニルプロペン−２−イル、２−ナフト−２−イルエテニルなどを含むがこれらに限定されない。
【００５５】
本明細書において使用される「ポリアルキレンオキシド」は、知られており（例えば、米国特許第７，４６２，６８７号を参照されたい）、ポリ（エチレングリコール）または「ＰＥＧ」を含む。さらなる例は、ＳまたはＮなどのヘテロ原子を含有していてもよく、典型的には、Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−ＮＲＣＨ２ＣＨ２２−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＲ−、および−ＳＨＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ−（式中、ＲはＨまたは低級アルキル（好ましくはメチル）であり、ｘは、約１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００または１００，０００ダルトンまたはそれ以上の分子の合計数平均分子量をもたらすまたは与える整数である）などの直鎖状ポリアルキレンオキシドである。
【００５６】
本明細書において使用される「類似体」は、その親化合物の生理活性を有し、天然に存在する親ペプチドのアミノ酸配列とは異なる１個または複数の（例えば、２個、３個、４個、５個または６個以上の）アミノ酸を含むペプチドである。そのような類似体は、好ましくは、親ペプチドの生理活性の少なくとも約７０％を有する。そのような異なるアミノ酸は、非天然側鎖基およびバックボーン連結の付加を含む付加、置換、欠失、またはこれらの組合せであってもよい。それらの類似体を作製するためのペプチドの修飾は既知である。例えば、米国特許第７，３２３，５４３号を参照されたい；米国特許第７，４８２，１７１号；米国特許第７，４５９，１５２号；および米国特許第７，３９３，９１９号もまた参照されたい。
【００５７】
Ｂ．活性化合物
本明細書で使用されるアミノ酸の１文字コードは、Ａ（Ａｌａ）、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ｄ（Ａｓｐ）、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｆ（Ｐｈｅ）、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｈ（Ｈｉｓ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｋ（Ｌｙｓ）、Ｌ（Ｌｅｕ）、Ｍ（Ｍｅｔ）、Ｎ（Ａｓｎ）、Ｐ（Ｐｒｏ）、Ｑ（Ｇｌｎ）、Ｒ（Ａｒｇ）、Ｓ（Ｓｅｒ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｖ（Ｖａｌ）、Ｗ（Ｔｒｐ）、およびＹ（Ｔｙｒ））である。
【００５８】
本発明の活性化合物は、一般に、式Ｉ：
Ｘ−Ｙ−Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｒ５Ｒ６Ｒ７Ｒ８Ｒ９Ｒ１０Ｒ１１Ｒ１２Ｒ１３−Ｙ’−Ｘ’  （Ｉ）
の化合物（アミノ末端またはＮ末端からカルボキシ末端またはＣ末端まで）である
（式中、
Ｘは、存在し、または存在せず、存在する場合、キャッピング基、ポリアルキレンオキシド（例えば、ポリ（エチレングリコール）、「ＰＥＧ」）、または２個〜６個または１０個のさらなる（任意のタイプの）アミノ酸からなるペプチドであり、このペプチドは、キャッピング基またはポリアルキレンオキシドによって任意選択的に終結しており、
Ｙは、存在し、または存在せず、存在する場合、連結基であり、
Ｒ１は、存在し、または存在せず、存在する場合、（ｐＨ６．０において）プラスに荷電したアミノ酸であり、これは、Ｋ、ＲおよびＨからなる群から選択されるアミノ酸とすることができ、
Ｒ２は、存在し、または存在せず、存在する場合、（ｐＨ６．０において）プラスに荷電したアミノ酸であり、これは、Ｋ、ＲおよびＨからなる群から選択されるアミノ酸とすることができ、
Ｒ３は、任意のアミノ酸であり、いくつかの実施形態では、（ｐＨ６．０において）プラスに荷電したアミノ酸であり、これは、Ｋ、ＲおよびＨからなる群から選択されるアミノ酸とすることができ、
Ｒ４は、任意のアミノ酸であり、いくつかの実施形態では、非極性側鎖を有するアミノ酸であり、これは、Ｌ、ＩまたはＶからなる群から選択されるアミノ酸とすることができ、
Ｒ５は、任意のアミノ酸であり、いくつかの実施形態では、Ｇであり、
Ｒ６は、任意のアミノ酸であり、いくつかの実施形態では、非極性側鎖を有するアミノ酸であり、これは、Ｌ、ＩおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸とすることができ、
Ｒ７は、任意のアミノ酸であり、いくつかの実施形態では、ＥおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｒ８は、任意のアミノ酸であり、いくつかの実施形態では、ＥおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｒ９は、任意のアミノ酸であり、いくつかの実施形態では、Ｐであり、
Ｒ１０は、（ｐＨ６．０において）プラスに荷電したアミノ酸であり、これは、Ｋ、ＲおよびＨからなる群から選択されるアミノ酸とすることができ、
Ｒ１１は、（ｐＨ６．０において）プラスに荷電したアミノ酸であり、これは、Ｋ、ＲおよびＨからなる群から選択されるアミノ酸とすることができ、
Ｒ１２は、存在し、または存在せず、存在する場合、任意のアミノ酸であり、いくつかの実施形態では、非極性側鎖を有するアミノ酸であり、これは、Ｌ、ＩまたはＶからなる群から選択されるアミノ酸とすることができ、
Ｒ１３は、存在し、または存在せず、存在する場合、（ｐＨ６．０において）プラスに荷電したアミノ酸であり、これは、Ｋ、ＲおよびＨからなる群から選択されるアミノ酸とすることができ、
Ｙ’は、存在し、または存在せず、存在する場合、連結基であり、
Ｘ’は、存在し、または存在せず、存在する場合、キャッピング基、ポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）、または２個〜６個または１０個のさらなるアミノ酸からなるペプチドであり、このペプチドは、キャッピング基またはポリアルキレンオキシドによって任意選択的に終結していてもよい）。
【００５９】
式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩もまた本明細書において提供される。
【００６０】
本発明のペプチド中のアミノ酸は、Ｄ配置またはＬ配置であってもよい。例えば、すべてＤ；すべてＬ；任意の組合せで一部がＤおよび一部がＬ。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ｘは、好ましくは、ポリアルキレンオキシド、または２個〜６個または１０個のさらなるアミノ酸からなるペプチドであり、このペプチドは、ポリアルキレンオキシドで終結している。
【００６２】
本発明の活性薬剤の非限定的な例は、ＫＨＨＬＧＬＥＥＰＫＫＬＲ（配列番号１）、ＫＨＨＬＧＬＥＥＰＫＫ（配列番号２）、ＨＬＧＬＥＥＰＫＫＬＲ（配列番号３）、それらの類似体、任意のそれらのプロドラッグ、または任意のそれらの薬学的に許容される塩を含む。
【００６３】
前述したものの例示的な例は、本明細書において表７で列挙されているペプチドを含むがこれらに限定されない。
【００６４】
本発明の化合物のさらなる例は、最初の１個または２個のＮ末端アミノ酸が欠失している前述の化合物のすべてを含む。
【００６５】
本発明の化合物のさらなる例は、それに対して１個、２個または３個の任意のタイプのさらなるＣ末端アミノ酸が結合している前述の化合物のすべてを含む。
【００６６】
本発明の化合物のさらなる例は、そのＮ末端またはＣ末端のいずれかに対して１０，０００〜３０，０００分子量のポリ（エチレングリコール）（または「ＰＥＧ」）部分が結合している前述の化合物のすべてを含む。
【００６７】
「ポリアルキレングリコール」は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、およびポリブチレングリコール（ＰＢＧ）、ならびに任意の組合せのＰＥＧ、ＰＰＧおよびＰＢＧのコポリマーを含むがこれらに限定されない、直鎖状または分岐状ポリアルキレングリコールポリマーを意味し、ポリアルキレングリコールのモノアルキルエーテルを含む。したがって、本発明の様々な実施形態において、本発明の組成物中のポリアルキレングリコールは、これらに限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、およびそれらの任意の組合せとすることができる。
【００６８】
ある特定の実施形態では、組成物のポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコールまたは「ＰＥＧ」である。「ＰＥＧサブユニット」という用語は、単一のポリエチレングリコール単位、すなわち、−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−−を指す。
【００６９】
いくつかの実施形態では、ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）は、非多分散であっても、単分散していても、実質的に単分散していても、純粋に単分散していても、または実質的に純粋に単分散していてもよい。
【００７０】
「単分散している」は、混合物中の化合物の約１００パーセントが同じ分子量を有する化合物の混合物を説明するために使用される。
【００７１】
「実質的に単分散している」は、混合物中の化合物の少なくとも約９５パーセントが同じ分子量を有する化合物の混合物を説明するために使用される。
【００７２】
「純粋に単分散している」は、混合物中の化合物の約１００パーセントが同じ分子量を有し、同じ分子構造を有する化合物の混合物を説明するために使用される。したがって、純粋に単分散している混合物は単分散している混合物であるが、単分散している混合物は必ずしも純粋に単分散している混合物ではない。
【００７３】
「実質的に純粋に単分散している」は、混合物中の化合物の少なくとも約９５パーセントが同じ分子量を有し、同じ分子構造を有する化合物の混合物を説明するために使用される。したがって、実質的に純粋に単分散している混合物は実質的に単分散している混合物であるが、実質的に単分散している混合物は必ずしも実質的に純粋に単分散している混合物ではない。
【００７４】
Ｃ．医薬製剤
上記の活性化合物は、投与するために、既知の技術に従って医薬担体中に製剤化することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（第９版、１９９５）を参照されたい。本発明による医薬製剤の製造において、活性化合物（生理学的に許容できるそれらの塩を含む）は、典型的には、とりわけ、許容できる担体と、混合される。担体は、当然ながら、製剤中の任意の別の成分と適合性であるという意味で許容可能でなければならず、患者に対して有害であってはならない。担体は、固体または液体、または両方であってもよく、好ましくは、単位用量製剤、例えば、０．０１重量％または０．５重量％〜９５重量％または９９重量％の活性化合物を含有していてもよい錠剤として、化合物とともに製剤化される。１つまたは複数の活性化合物が本発明の製剤中に組み込まれてもよく、これは、１つまたは複数の補助的成分を任意選択により含む構成要素を混合することを含む、よく知られている製薬技術のいずれかによって調製することができる。
【００７５】
任意の所与の事例において最も適した経路は、治療されている状態の性質および重症度によって、ならびに使用されている特定の活性化合物の性質によって決定するが、本発明の製剤は、経口、直腸、局所、頬側（例えば、舌下）、膣内、非経口的（例えば、皮下、筋肉内、皮内、または静脈内）、局所（すなわち、皮膚および粘膜の両方の表面、気道表面を含む）および経皮投与に適したものを含む。
【００７６】
経口投与のために適した製剤は、所定量の活性化合物をそれぞれ含有する、カプセル、カシェ、ロゼンジ、または錠剤などの別個の単位中に、粉末または顆粒として；水性または非水性の液体中の溶液または懸濁液として；または水中油型または油中水型エマルジョンとして、存在していてもよい。そのような製剤は、活性化合物および適した担体（上記されている通り１つまたは複数の補助的成分を含有してもよい）を会合させるステップを含む任意の適した製薬方法によって調製することができる。一般に、本発明の製剤は、活性化合物を液体または微粉化された固体担体、または両方と、均質におよび完全に混合すること、および次いで、必要であれば、結果として得られた混合物を成形することによって調製される。例えば、錠剤は、任意選択により１つまたは複数の補助的成分とともに、活性化合物を含有する粉末または顆粒を圧縮または成型することによって調製することができる。圧縮錠剤は、適した装置において、結合剤、滑沢剤、不活性な希釈剤、および／または表面活性剤／分散剤（複数の分散剤）と任意選択により混合された粉末または顆粒などの自由流動性形態の化合物を圧縮することによって調製することができる。湿製錠（ｍｏｌｄｅｄ  ｔａｂｌｅｔ）は、適した装置において、不活性の液体結合剤で湿らせた粉末化された化合物を成型することによって製造することができる。
【００７７】
頬側（舌下）投与に適した製剤は、フレーバーを付けた基剤、通常はスクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカント中に活性化合物を含むロゼンジ；ならびにゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアラビアゴムなどの不活性基剤中に化合物を含むトローチ（ｐａｓｔｉｌｌｅ）を含む。
【００７８】
非経口投与のために適した本発明の製剤は、活性化合物（複数の活性化合物）の無菌の水性および非水性注射溶液を含み、この調合剤は、好ましくは、予定されたレシピエントの血液と等張である。これらの調合剤は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤および予定されたレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を含有してもよい。水性および非水性の無菌懸濁液は、懸濁化剤および増粘剤を含んでもよい。製剤は、単位用量または反復用量容器、例えば、密封したアンプルおよびバイアル中に存在していてもよく、使用の直前に無菌の液体担体、例えば、生理食塩水または注射用水の添加のみを必要とするフリーズドライされた（凍結乾燥された）状態で保存されてもよい。用時の注射溶液および懸濁液は、以前に記載されている種類の無菌の粉末、顆粒および錠剤から調製されてもよい。例えば、本発明の一態様において、密封容器中に単位剤形で、活性化合物（複数の活性化合物）、またはそれらの塩を含む注入可能で安定な無菌の組成物が提供される。化合物または塩は、適した薬学的に許容される担体を用いて再構成して対象への注射に適した液体組成物を形成することができる凍結乾燥物の形態で提供される。単位剤形は、典型的には、約１０ｍｇ〜約１０グラムの化合物または塩を含む。化合物または塩が実質的に水に不溶性である場合、十分な量の生理学的に許容できる乳化剤を、水性担体中で化合物または塩を乳化するのに十分な量で用いてもよい。１つのそのような有用な乳化剤は、ホスファチジルコリンである。
【００７９】
直腸投与のために適した製剤は、好ましくは、単位用量坐剤として存在する。これらは、活性化合物を１つまたは複数の従来の固体担体、例えば、カカオ脂と混合すること、および次いで結果として得られた混合物を成形することによって調製することができる。
【００８０】
皮膚への局所適用のために適した製剤は、好ましくは、軟膏、クリーム、ローション、パスタ、ゲル、スプレー、エアロゾル、または油の形態をとる。使用することができる担体は、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、経皮吸収促進剤、および２つ以上のそれらの組合せを含む。
【００８１】
経皮投与のために適した製剤は、レシピエントの表皮と長期間じかに接触したままになるように適合させた別個のパッチとして存在していてもよい。経皮投与のために適した製剤はまた、イオン導入法（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３（６）：３１８（１９８６）を参照されたい）によって送達されてもよく、典型的には、活性化合物の任意選択により緩衝化された水溶液の形態をとる。適した製剤は、クエン酸緩衝液もしくはビス／トリス緩衝液（ｐＨ６）またはエタノール／水を含み、０．１〜０．２Ｍの活性成分を含有する。
【００８２】
さらに、本発明は、本明細書において開示されている化合物およびそれらの塩のリポソーム製剤を提供する。リポソーム懸濁液を形成するための技術は、当技術分野においてよく知られている。化合物またはその塩が、水可溶性の塩である場合、従来のリポソーム技術を使用してこの化合物または塩を、脂質小胞中に組み込むことができる。そのような場合には、化合物または塩の水溶性のために、この化合物または塩はリポソームの親水性中心またはコア内に実質的に引き込まれることになる。用いられる脂質層は、任意の従来の組成物のものであってもよく、コレステロールを含有していても、またはコレステロールを含まなくても、いずれであってもよい。対象とする化合物または塩が、水に不溶性である場合、やはり従来のリポソーム形成技術を用いてこの塩は、リポソームの構造を形成している疎水性の脂質二重層内に実質的に引き込むことができる。いずれの場合においても、作製されるリポソームは、例えば標準的な超音波処理およびホモジナイゼーション技術の使用によって、サイズを減少させてもよい。
【００８３】
当然ながら、本明細書において開示されている化合物またはそれらの塩を含有するリポソーム製剤を凍結乾燥して、水などの薬学的に許容される担体で再構成してリポソーム懸濁液を再生することができる凍結乾燥物を作製してもよい。
【００８４】
別の医薬組成物は、水系エマルジョンなどの、本明細書において開示されている水に不溶性の化合物、またはそれらの塩から調製することができる。そのような場合には、組成物は、所望の量の化合物またはその塩を乳化するのに十分な量の薬学的に許容される乳化剤を含有する。特に有用な乳化剤は、ホスファチジルコリン、およびレシチンを含む。
【００８５】
活性化合物（複数可）に加えて、医薬組成物は、ｐＨを調整する添加剤などの別の添加剤を含有してもよい。特に、有用なｐＨ調整剤は、塩酸などの酸、乳酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、もしくはグルコン酸ナトリウムなどの塩基または緩衝剤を含む。さらに、組成物は、微生物防腐剤を含有してもよい。有用な微生物防腐剤は、メチルパラベン、プロピルパラベン、およびベンジルアルコールを含む。微生物防腐剤は、典型的には、反復用量使用のために設計されているバイアル中に製剤が入れられる場合に用いられる。当然ながら、指摘されているように、本発明の医薬組成物は、当技術分野においてよく知られている技術を使用して凍結乾燥することができる。
【００８６】
本発明を、以下の非限定的な実施例において説明する。
【実施例】
【００８７】
初期の研究は、いくつかの細胞型をＩＧＦＢＰ−２に曝露させた場合、これがＩＧＦ−ＩのＤＮＡ合成および増殖を刺激する能力を増強することができることを示した。対照的に、別の研究室は、高濃度のこのネイティブなタンパク質は、ＩＧＦ−Ｉの増殖を刺激する能力をしばしば阻害することを示した。
【００８８】
本明細書に記載されている研究は、その受容体へのＩＧＦ−Ｉ結合を阻害し、増殖を阻害する能力に非依存的である、ＩＧＦＢＰ−２のＩＧＦ非依存的な作用に重点をおいた。具体的には、ＩＧＦＢＰ−２遺伝子を欠失させたマウスにおいて、これらのマウスが、テトラサイクリン標識付け後の骨の組織学的検査によって示されたように骨代謝回転を減少させたこと、およびＤＥＸＡスキャニング、ＰＩＸＩスキャニングおよびマイクロＣＴ分析によって証明されたように、皮質の厚さおよび骨梁の厚さもまた減少したことが示された。この現象についての分子的説明は、これらの動物から取り出された大動脈平滑筋および骨細胞の両方が高濃度の増殖阻害剤ＰＴＥＮを示した、およびＩＧＦＢＰ−２または本明細書に記載の１３アミノ酸ペプチドの外部からの添加はＰＴＥＮ濃度を抑制することができ、したがって、増殖刺激のために必要なＰＩ−３キナーゼ／ＡＫＴ経路の活性化の増強につながる、という観察結果によってもたらされた。別の研究者もまた、ＩＧＦＢＰ−２が幹細胞を刺激し得ることを示唆した。ＬｏｄｉｓｈおよびＺｈａｎｇは、ＩＧＦＢＰ−２が強力な幹細胞増殖因子であり、放射線療法を伴う骨髄除去後の造血幹細胞再構成を刺激することができることを実証した。これらの調査者は、ＩＧＦＢＰ−２の任意の断片またはこのタンパク質の任意の部分がこの特性を有するかどうかを調査しなかった。
【実施例１】
【００８９】
＜ペプチド配列＞
本発明の１３アミノ酸ペプチドのアミノ酸配列は以下の通りである：
ＫＨＨＬＧＬＥＥＰＫＫＬＲ（配列番号１）。
【００９０】
本発明の１１アミノ酸ペプチドのアミノ酸配列（生物活性を保持する配列番号１の断片）は以下の通りである：
ＫＨＨＬＧＬＥＥＰＫＫ（配列番号２）。
【００９１】
本発明の１１アミノ酸ペプチドのアミノ酸配列（生物活性を保持する配列番号１の断片）は以下の通りである：
ＨＬＧＬＥＥＰＫＫＬＲ（配列番号３）。
【００９２】
生物学的に活性な前述の配列における変形形態は、１番目、２番目、および３番目（配列番号１を参照した位置）のＫまたはＨをアルギニンまたはリシンで行うことができる置換を含み、これは活性を保持する。同様に、４番目および６番目のＬをＩまたはＶで置換を行うことができる。７番目または８番目の、いずれもＥを、Ｎで置換を行うことができる。１０番目および１１番目を、ＨまたはＲのいずれかで置換を行うことができる。１２番目のＩまたはＶをＬで、１３番目のＲをＫまたはＨで置換を行うことができる。
【００９３】
ＩＧＦＢＰ−２タンパク質のこの特定の領域を選ぶことの原理的説明は、主として特定の因子に基づいていた。第１は、その電荷密度であり、換言すれば、ペプチドは１３箇所の位置における６個の塩基性残基および２個の酸性残基を含有する。これは、ペプチドに極端に高い電荷密度を与える。第２に、ペプチドにはポリプロリン配列が隣接しており、このことは、ペプチドが親タンパク質によって厳密な位置に保たれていることを示す。第３に、この配列は、ＩＧＦＢＰ−２に特有である。ＩＧＦＢＰファミリーは、タンパク質のＮ末端およびＣ末端において高度な配列保存を有する６つのメンバーを含有する。しかしながら、各タンパク質の中間領域は、配列多様性を示す。この１３アミノ酸配列は、ＩＧＦＢＰ−２に完全に特有であり、６つの残りのＩＧＦ結合タンパク質のいずれにも含有されていない。このことの重要性は、マウスにおけるＩＧＦＢＰ−２のノックアウトが特有の表現型である低い骨代謝回転および高い脂肪量を与えるということである。残りの５つのＩＧＦ結合タンパク質のいずれかのノックアウトは、この表現型を与えない。したがって、これらの効果の原因となるＩＧＢＰ−２内の領域が存在するという仮説が立てられた。
【実施例２】
【００９４】
＜ペグ化ペプチドの調製＞
本明細書に記載の配列番号１の１３アミノ酸ペプチドを、固相合成によって調製し、ＨＰＬＣによって精製し、次いで、質量分析を使用して純度について評価した。ポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）は、ＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＵＳＡ（２０３３  Ｗ．ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ  Ｄｒ．、Ｓｕｉｔｅ  ３２０  ＃１８８、Ａｌｌｅｎ、ＴＸ  ７５０１３−４６７５）から購入した。１０．３ｍｇのペプチドを、１．０ｍｌの５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５中に溶解させた。４０６ｍｇのメトキシＰＥＧプロピンアルデヒド分子量２０ｋＤａを、４ｍｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム中に溶解させた。１２０μｌのシアノ水素化ホウ素ナトリウムの１Ｍ溶液、テトラヒドロフラン（Ａｌｄｒｉｄｇｅ）を、ＰＥＧの溶液に添加した。次いで、１ｍｌのペプチドをＰＥＧ溶液に、その後さらなる１ｍｌのリン酸ナトリウムを添加した。反応混合物を、次いで、１５ｍｌコニカルチューブ中で２４時間４℃で回転させた。インキュベーション後、トリス塩基を６．８ｍＭの最終濃度まで添加して、反応していない部位をブロックした。Ｎ末端のペグ化を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、その後クマシー染色によって確認し、これはペプチド１分子につき付加された１個のＰＥＧ分子と一致する分子量を生じた。化合物はまた、１３アミノ酸配列に対して特異的に調製された抗体を使用した免疫ブロット法によって分析した。クマシー染色されたタンパク質および免疫ブロットされたタンパク質の電気泳動の移動性は同一であり、免疫反応性ペプチドがペグ化されたことを示した。
【実施例３】
【００９５】
＜脂肪細胞アッセイ＞
いくつかのアッセイにおいて、脂肪細胞分化を研究するために使用される細胞系３Ｔ３Ｌ１を使用することによって、脂肪細胞データを得た。これらの細胞を、脂肪細胞前駆体として増殖させる。これらの細胞を、ウシ胎仔血清および１５ｍＭグルタミンを含むＨａｍｓ  Ｆ１２において維持する。脂肪細胞分化経路に入るようにそれらを刺激するために、イソメチルブチルキサニン（ｉｓｏｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌｘａｎｉｎｅ）、デキサメタゾンおよびインスリンを、０．５ｍＭのＩＢＭＸ、１６．７ｎＭインスリンおよび０．１μＭデキサメタゾンの濃度を使用して添加した。場合によって、１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−Ｉをインスリンの代わりに添加した。添加の３日後、脂肪細胞への分化が明らかであり、オイルレッドＯ染色によって検出される。
【００９６】
配列番号１のペプチドの効果を決定するために、このペプチドを２０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌおよび２μｇ／ｍｌの濃度で添加した。オイルレッドＯ陽性細胞の数の減少によって決定される、脂肪細胞分化の検出可能な阻害は、２０ｎｇ／ｍｌのペプチドを使用して検出された。この応答は、２００ｎｇ／ｍｌで最大であり、２ｍｃｇ／ｍｌを添加することによってはさらに増加しなかった。野生型ＩＧＦＢＰ−２を並行して試験し、５０〜５００ｎｇ／ｍｌの間の濃度を使用して、脂肪細胞分化を阻害することも見出した。
【００９７】
オイルレッドＯ染色のために、０．５ｍｌ／１００ｍｌイソプロポノールのストック溶液を調製する。６０ｍｌの溶液を４０ｍｌの水と混合し、室温で１時間静置させ、次いで濾過する。培地を、脂肪細胞培養物から吸引し、細胞を１％ホルムアルデヒド中で固定する。ホルムアルデヒドを吸引し、オイルレッドＯ溶液を、細胞を覆うのに必要な量で添加し、次いでこれを室温で１時間置く。次いで染料を除去し、プレートを蒸留水で洗浄し、乾燥する。典型的には、３日後に６０〜７０％の細胞が陽性に染色される。
【００９８】
ペプチドの最大効果は、２０％未満の細胞が陽性であるレベルまで分化を阻害することであった。これらの発見は、初代マウス前駆脂肪細胞を使用して再確認された。３５〜５０日齢のマウスを屠殺し、鼠蹊部脂肪体を無菌的に除去した。脂肪組織を洗浄し、０．１％グルコースおよび２ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ、（タイプ３  Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）および４％ＢＳＡを含有するハンクス塩基性塩溶液中で溶解させた。３７°で１５分の消化に続き、組織を分散およびピペッティングすることによって分離し、次いで８０ミクロン無菌ナイロンフィルターによって濾過した。次いで、細胞を１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ−Ｆ１２においてプレーティングし、次いで、７００×ｇで遠心分離にかけて、間質血管細胞を、浮遊している脂肪細胞から分離させた。上清を捨て、間質血管細胞を含有する細胞ペレットを、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２中に再懸濁し、１５，０００細胞／ｃｍ２の密度でプレーティングした。２４時間後に培地を吸引し、細胞が８０〜９０％コンフルエンスに到達するまで３日おきに新鮮培地を置き換えた。２５ｍＭグルコース、１０μｇ／ｍｌトランスフェリン、１０ｎＭのＴ３、１０〜７デキサメタゾン、５μｇ／ｍｌのＨＤＬおよび１６．７ｎＭインスリンを含有する無血清培地を添加することによって分化を誘導した。これは、３０〜５０％の間のコンフルエントである培養物に添加された。脂肪小滴が観察されるまで、通常は６〜８日、３日おきに培地を置き換えた。次いでこれらを、以前に記載されている通りオイルレッドＯ染色によって確認した。ペプチドを２ｎｇ／ｍｌ〜２μｇ／ｍｌの間の、ネイティブなＩＧＦＢＰ−２タンパク質を５０〜５００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で試験した。ＩＧＦＢＰ−２は、細胞馴化培地から精製され、アミノ酸配列分析によって均質であることが決定された。
【実施例４】
【００９９】
＜破骨細胞分化の測定＞
破骨細胞分化のための方法は以下の通りである。ＩＧＦＢＰ−２遺伝子を欠失させたＢａｌｂ／ｃマウス（Ｖ．ＤｅＭａｍｂｒｏら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１４９（５）：２０５１〜２０６１（２００７）を参照されたい）に麻酔をかけ、頸椎脱臼を使用して屠殺した。各マウスの大腿骨を軟組織を含まないように解剖し、針穿刺によって骨髄を吸引した。細胞を無菌で取り出し、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ中に再懸濁した。細胞を７００×ｇで遠心分離にかけ、細胞ペレットを培地中に再懸濁し、２４ウェルプレート中に５０００細胞／ｃｍ２の濃度でプレーティングした。使用されるプレートは、細胞接着を容易にするための添加物を有さない低接着プレートである。これらの条件下で、マクロファージは接着するが別の細胞は接着しない。培地には、２０ｎｇ／ｍｌのｍＣＳＦが追加されている。３日後、細胞をプレートから取り出し、接着したマクロファージを１０％ＦＢＳおよびｍＣＳＦを含有する新鮮培地に曝露させる。これを、３日後に再度繰り返し、次いでさらに３日後、細胞をトリプシン処理し、新鮮なプレート中に６×１０４細胞／ｃｍで再プレーティングする。いくつかの実験においては、１０ｎｇ／ｍｌという低い濃度が利用されたものの、この時点で、５０ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＫリガンドを添加する。３日目および６日目に培地を交換し、７日目に、破骨細胞分化マーカーである酒石酸耐性酸性ホスファターゼについて細胞を染色する。ＩＧＦＢＰ−２を、５０ｎｇ／ｍｌから５００ｍｃｇ／ｍｌの間の濃度で添加した。ペプチドを２０または２００ｎｇ／ｍｌで添加した。
【０１００】
結果は、ペプチドまたはネイティブなＩＧＦＢＰ−２の添加なしでは細胞が破骨細胞に分化しないであろうことを示した。さらに、ペプチドの存在下において、血清濃度は０．５％まで低くすることができ、破骨細胞分化は依然として検出された。さらに、２％血清を利用した場合、ｍＣＳＦを培地からなくすことができ、ＲＡＮＫリガンドは３０ｎｇ／ｍｌまで低下した。しかしながら、ＩＧＦＢＰ−２を除去することはできなかった。換言すれば、培養物はＩＧＦＢＰ−２なしで維持し、またはペプチドは破骨細胞に分化しなかった。
【０１０１】
酒石酸耐性酸性ホスファターゼ染色のために、１％溶液を調製し、細胞とともに３０分間室温でインキュベートする。次いで培養物を洗浄し、細胞数を手作業による計数によって決定する。いくつかの実験において、ペグ化された１３アミノ酸ペプチドを、ペグ化されていないペプチドと比較し、同等の生物学的活性を有することを見出した。
【実施例５】
【０１０２】
＜骨芽細胞分化の測定＞
骨芽細胞分化の測定のために、細胞をまた、同じ骨髄吸引物から得る。しかしながら、いくつかの実験において、細胞は新生動物から得た頭蓋冠から得られた。細胞を６ウェルプレートにおいて２０×１０６細胞／ウェルで、１０％胎仔ウシ血清を含むαＭＥＭ中にプレーティングする。１日目および３日目に培地を交換した。３日目で細胞に、１０％ウシ胎仔血清、８ｍＭグリセロールリン酸および５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸を含有するαＭＥＭである分化培地を与えた。その後、培地を実験の終了、概して１８日目まで２日おきに交換する。いくつかの実験において、ウシ胎仔血清濃度は、５％または２％のいずれかまで低くなった。２００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦＢＰ−２をいくつかの培養物に、またはＩＧＦＢＰ−２ペプチドを２ｎｇ／ｍｌから２ｍｃｇ／ｍｌの間の濃度で添加した。骨芽細胞分化を決定するために、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、次いで、アルカリホスファターゼに対して染色した。次いで細胞をフォンコッサ染料で対比染色して、鉱化を検出した。いくつかの実験において、ペグ化された１３アミノ酸ペプチドを、ペグ化されていないペプチドと比較し、同等の生物学的活性を有することを見出した。
【実施例６】
【０１０３】
＜骨成長および鉱化研究＞
この系はエクスビボ外植系を使用するため、培養細胞とインビボ実験との間の移行部である。骨形成組織をマウスから直接取り出し、次いで臓器培養において数日間増殖させる。試験添加物は、生物活性を試験するために、培地に直接、任意の濃度で添加することができる。方法は以下の通りである：マウス中足骨を出生後０日目から３日目の間の新生マウスから、解剖顕微鏡を使用して単離した。すべての実験で、中間の３つの中足骨を使用した。１ウェル当たり３つの中足骨を、２４ウェル組織培養ディッシュにおいて、０．５％ウシ血清、０．５Ｍアスコルビン酸、１ｍＭβグリセロールリン酸を含有するＤＭＥＭ中で３７℃でウェルごとにインキュベートした。１日後に培地を置き換え、中足骨を最大１０日間、培養する。測定用のマイクロメータースケーリングバーを内蔵した倒立位相差顕微鏡を使用して、サイズ、骨の長さと幅の両方の量的増加によって成長を測定した。組織固定の前に２時間、培地へのカルセイン（５００ｎｇ／ｍｌ）を添加することによって鉱化を評価した。蛍光画像は、倒立顕微鏡に接続され、適切な重量長の刺激のもとでカルセイン蛍光を定量するデジタルカメラを使用して撮られた。骨および軟骨組織構造は、骨を４％ＰＦＡ中で終夜固定し、７０％エタノールで保存し、その後パラフィルム包埋、切片化、および染色することによって測定した。切片をＨ＆Ｅ、アリザランレッドまたはアルカリホスファターゼで染色した。タンパク質の分析のために、組織をＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液中でホモジナイズし、標準的なＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウェスタンブロッティングを使用してゲルを泳動した。
【０１０４】
結果は、インタクトなＩＧＦＢＰ−２またはＩＧＦＢＰ−２ペプチドのいずれかの２０〜２００ｎｇ／ｍｌの濃度での添加が、ＩＧＦＢＰ−２−／−マウス由来の中足骨において骨成長および石灰化を刺激することを実証した。ペプチドはまた、正常動物由来の中足骨に対して軽微なさらなる刺激効果を有したが、ＩＧＦＢＰ−２ヌル動物由来の中足骨における増加パーセントははるかに大きいものであった。
【実施例７】
【０１０５】
＜ＩＧＦＢＰ−２−／−マウスにおける骨表現型のインビボレスキュー＞
ＩＧＦＢＰ−２−／−マウスは、骨塩密度の減少、皮質の厚さおよび骨梁の厚さの減少ならびに形成および再吸収の両方の骨代謝回転の減少を有する。１３アミノ酸ペプチドが全身において活性であるかどうかを決定するため、半減期を延ばすためにペグ化された調合剤を調製した。次いで、この調合剤をマウスに注射した。１６週齢から２０週齢の間のマウスを利用した。これらのマウスは、主要な骨表現型を有することが知られている。ペプチドを、コンジュゲートを加えたペプチド５０ｍｃｇの用量で注射し、換言すれば、ペプチドを加えたＰＥＧの合計分子量（約２３，０００分子量である）を、１週当たり５日、３週間、腹腔内に注射した。各群において６匹のマウスに注射した。骨密度の主要な測定は、マイクロＣＴ分析により計算される全体積に対する骨体積である。これは、所与の空間の範囲内の全骨の量を測定する。対照動物はＰＢＳ注射を受ける。
【０１０６】
ＢＶ／ＴＶ値は以下の通りであった：正常マウスでは、骨が占める体積の値は０．２２（２２％）であった；ＩＧＦＢＰ−２遺伝子欠失を有するマウスでは、この値は０．１２であった；ペプチドを投与されたマウスでは、これは０．１８であった。したがって、ペプチドの注射は、これらのマウスがこのタンパク質への曝露なしで生後の６週間を過ごしても、骨表現型を正常の７０％以内までレスキューした。皮質の厚さの測定はまた、ペプチドの投与によって皮質の厚さが実質的に増加したことを示した。骨の分析は、ＰＴＥＮが下方制御されていることを生化学的に示した。したがって、ペプチドは、丸ごとの動物モデルにおいて骨表現型をレスキューすることが十分に可能であるようである。
【実施例８】
【０１０７】
＜ＩＧＦＢＰ２のヘパリン結合ドメインは、骨格に対して同化的であり、ＩＧＦ−Ｉ結合に非依存的な機構によって働く＞
マウス。Ｉｇｆｂｐ２−／−マウスと称される、もとの混合バックグラウンド系統、Ｂ６；１２９−Ｉｇｆｂｐ２＜ｔｍ１Ｊｅｐ＞の作製は、以前に記載されている１０、５２。もとのマウスを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドに少なくとも１０世代、戻し交配した。すべてのインビボおよびエクスビボ実験の試験は、雄のマウスを使用して実施した。すべての動物試験は、メイン医療センター研究所（Ｍａｉｎｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の施設内動物管理使用委員会によって検討および認可された。マウスは、試験の継続期間中、水および飼料を自由に摂取させた。コロニー環境条件は、１４：１０時間の明：暗サイクルを含んでいた。
【０１０８】
細胞培養。新生児の頭蓋冠骨芽細胞を、７〜１０日齢のマウスから、以前に記載されている通り回収した５３。手短に述べると、頭蓋冠を５回、コラゲナーゼＰおよびトリプシンで消化した。消化産物２〜５から放出された細胞を、初代頭蓋冠骨芽細胞として回収し、１０％ＦＣＳおよび非必須アミノ酸を追加したＤＭＥＭ中で維持した。初代頭蓋冠骨芽細胞の骨芽細胞形成は、４ｍＭβ−グリセロリン酸および５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸のαＭＥＭ中で細胞を処理することによって行った。骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）を、８週齢のマウスの大腿骨および脛骨から、以前に記載された通り採取した１０。ＢＭＳＣの骨芽細胞形成を、１０％ＦＣＳ、８ｍＭのβ−グリセロリン酸、および５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸を含有するαＭＥＭからなる骨形成培地による処理によって誘導した。
【０１０９】
中手骨培養。中手骨を、１日齢のＩｇｆｂｐ２−／−マウスから単離し、０．５％ＢＳＡ、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸および１ｍＭのβ−グリセロールリン酸を含有するＤＭＥＭ中で１０日間インキュベートした５４。１日目から刺激物を培養培地に添加した。１０日目に、中手骨を、カルシウム沈着の染色のためにカルセイン（５００ｎｇ／ｍｌ）を含有する培地中で２時間インキュベートし、画像を得た。次いで、骨を４％ＰＦＡで固定し、パラフィン中に包埋し、アルシアンブルーおよびフォンコッサ二重染色のために処理した。
【０１１０】
リアルタイムＰＣＲ。ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡを調製し、ＤＮａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）で処理した。ランダムヘキサマーおよび逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造業者の使用説明書に従って、ｃＤＮＡを作製した。ｍＲＮＡ発現の定量は、ｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘを使用して、ｉＱ５サーマルサイクラーおよび検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）において行った。１８Ｓ  ｒＲＮＡまたはＧａｐｄｈを、すべての定量化について内部標準対照遺伝子として使用した。
【０１１１】
ウェスタンブロット分析。全細胞溶解物を調製するために、細胞をＲＩＰＡ緩衝液中で可溶化した５５。細胞質基質画分では、細胞を、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤（１０ｍＭ  トリス、０．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）を含有する低張性緩衝液で可溶化し、氷上に１０分間保持した。細胞溶解物を、スクロース緩衝液（最終濃度；２５ｍＭスクロース、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）と混合し、２０，０００×ｇで１時間遠心分離にかけた。上清を細胞質基質画分として使用した。膜画分を調製するために、細胞を、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を含有するＰＢＳで可溶化した。溶解物を−８０℃で１時間凍結し、室温で解凍した。３サイクル後、これらを１３，０００×ｇで２５分間遠心分離にかけた。ペレットを、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を含有する膜タンパク質単離緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ；１５０ｍＭのＮａＣｌ；１ｍＭのＥＤＴＡ；１ｍＭのＥＧＴＡ；および１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ７．５）を用いて懸濁させた。タンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって評価し、等量の試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、電気泳動によってニトロセルロース膜に移した。トリス緩衝生理食塩水中の５％ＢＳＡにおいて膜をブロックした。その後、膜を、抗ＰＴＥＮ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃９５５９）、抗Ａｋｔ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃９２７２）、抗ｐＳｅｒ４７３−Ａｋｔ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃９２７１）、抗β−カテニン（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、６１０１５３）、抗ｐＳｅｒ５５２−β−カテニン（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃９５６６Ｐ）、または抗α−アクチン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ−４７７７８）を用いて免疫ブロットし、セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスまたはウサギＩｇＧ抗体で展開し、続いて、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）で増強した。
【０１１２】
ヘパリン結合ドメインペプチドの作製。ヘパリン結合ドメイン（ＡＡ２４６〜２４９）のマウス相同体を含有する合成ペプチドおよびマウスＩＧＦＢＰ２の９個のさらなるアミノ酸、２３７ＫＨＬＳＬＥＥＰＫＫＬＲＰ２５０（ＨＢＤペプチドと称する）、ならびにＨＢＤペプチドの対照ペプチド（ＡＡＬＳＬＥＥＰＡＡＬＡＰ）を、チャペルヒルのノースカロライナ大学のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙによって合成した。ＩＧＦＢＰ５のヘパリン結合ドメインの合成ペプチド（２０１ＲＫＧＦＹＫＲＫＱＣＫＰＳＲＧＫＲＫ２１８）を同じように作製した。純度および配列確認は、質量分析によって決定した。ＩＧＦＢＰ−２のＨＢＰペプチドを、以下の通りペグ化した。１０ｍｇのペプチドを、４．０ｍｌの０．０５Ｍ  ＮａＨ２Ｐ０４、ｐＨ７．０中で３８０μｇのメトキシＰＥＧマレイミド（２００００ｋＤａ）（ペプチド対ＰＥＧ１：３のモル比）（Ｊｅｎｋｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と混合した。４℃で終夜のインキュベーションに続いて、システインを１７ｍＭの最終濃度まで添加して、反応していない部位をブロックした。ペグ化されていないペプチドおよびシステインを除去するために、製造業者の使用説明書に従ってＺｅｂｒａ  Ｄｅｓａｌｔスピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して混合物を脱塩した。ペグ化は、クマシー染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって確認した。
【０１１３】
Ｉｇｆｂｐ２−／−マウスの、ペグ化されたヘパリン結合ペプチド（ＰＥＧ−ＨＢＤペプチド）によるインビボ処理。Ｉｇｆｂｐ２＋／＋およびＩｇｆｂｐ２−／−マウスに、ＰＢＳまたはＰＥＧ−ＨＢＤペプチド（５０μｇ／日）を腹腔内に１週間に５回、６週齢から９週齢まで投与した。二重エネルギーＸ線吸光光度分析法を、処理の開始の前に実施した。マウスに、２０ｍｇ／ｋｇカルセインを腹腔内に、試料採取の７日前および２日前に、注射した。
【０１１４】
二重エネルギーＸ線吸光光度分析法（ＤＸＡ）。全身および大腿部の面積骨塩密度（ａＢＭＤ）および頭部を除く体成分についての二重エネルギーＸ線吸光光度分析法（ＤＸＡ）を、ＰＩＸＩｍｕｓ（ＧＥ−Ｌｕｎａｒ）を使用して実施した１０。ＰＩＸＩｍｕｓは、製造業者により提供されたマウス模型を用いて毎日較正した。
【０１１５】
マイクロＣＴ。遠位部骨梁骨および骨幹中央部皮質骨の微細構造は、大腿骨および椎骨（Ｌ５）を用いてマイクロＣＴ（マイクロＣＴ４０）によって分析した１０。約１００個の薄片を、遠位成長板の直近位で、１２μｍのアイソトロピックピクセルサイズおよび１２μｍの薄片厚さで測定した。骨幹中央部皮質骨の厚さを、大腿骨の厳密な中間点で得られた約１８個の薄片を使用して、同様にして分析した。
【０１１６】
骨組織形態計測。インビボ組織形態計測の差異を、ＰＢＳまたはＰＥＧ−ＨＢＤペプチドで処理した９週齢のＩｇｆｂｐ２−／−マウス間で分析した。マウスに、２０ｍｇ／ｋｇカルセインを腹腔内に、試料採取の７日前および２日前に注射した。大腿骨は、以前に記載された通り分析した１０。
【０１１７】
大腿部の生体力学。大腿部の生体力学的特性を、３点曲げによって、９週齢でＰＢＳまたはＰＥＧ−ＨＢＤペプチドで処理したＩｇｆｂｐ２−／−マウス間で比較した。破壊まで一定の速度（０．０５ｍｍ／秒）で荷重をかけた。破壊荷重（ニュートン）、曲げ剛性（１ミリメートル当たりのニュートン）、および荷重変位曲線から得られる破壊に要した仕事量（ニュートン−ミリメートル）を測定し、見かけの弾性率（メガパスカル）および極限強度（ギガパスカル）を、μＣＴにより測定された関連する大腿骨中央部断面形状を使用して測定した。
【０１１８】
統計分析。すべてのデータは、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表す。結果を、統計学的に有意な差異について、スチューデントのｔ検定またはＡＮＯＶＡに続くボンフェローニ多重比較事後検定を使用して分析した。糖耐性試験は、反復測定ＡＮＯＶＡを使用して分析した。統計学的有意性は、ｐ＜０．０５に設定した。
【０１１９】
ＩＧＦＢＰ−２のヘパリン結合ドメインは、インビトロでの骨芽細胞形成を刺激する。Ｉｇｆｂｐ２−／−マウスは、野生型細胞と比較して、Ｉｇｆｂｐ２−／−マウスの骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）において骨形成の低い骨減少性表現型および損なわれた骨芽細胞形成（図１ａ）を示したことが以前に報告されている１０。このことと一致して、Ｉｇｆｂｐ２−欠損頭蓋冠骨芽細胞（ＣＯＢ）は、野生型細胞と比較して骨芽細胞形成中に損なわれたアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を示した（図１ｂ）。ＩＧＦＢＰ−２のヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）が、骨格に対して同化作用効果を有するかどうかを調査するために、ＩＧＦＢＰ−２のＨＢＤを含有する低分子（ＨＢＤペプチド）を作製し、インビトロでの骨芽細胞形成に対するその効果について試験した。ＨＢＤペプチドの効果が特異的であったことを確認するために、対照ペプチドもまた作製し、骨形成に対するその効果について分析した。対照ペプチドは、ＰＢＳ処理した細胞と比較してＩｇｆｂｐ２−／−ＣＯＢの鉱化を増強しなかったが、一方ＨＢＤペプチドは、完全に活性であった（図７）。インビボ試験に着手することが実行可能となるように低分子の半減期を引き延ばすために、ＨＢＤペプチドのペグ化を実施した（ＰＥＧ−ＨＢＤ）。Ｉｇｆｂｐ２−／−ＣＯＢおよびＢＭＳＣを、骨形成培地（すなわち、アスコルビン酸およびβ−グリセロールリン酸）中でＰＥＧ−ＨＢＤの存在下において培養した。ＰＥＧ−ＨＢＤは、アルカリホスファターゼおよびアリザリンレッド染色によって測定したところ、ＣＯＢおよびＢＭＳＣの骨形成を強く増強した（図１ｃ）。このことと一致して、ＡＬＰ、Ｒｕｎｘ２およびオステオカルシン（ＯＣ）発現は、対照で処理した細胞と比較して、ＰＥＧ−ＨＢＤで処理したＢＭＳＣにおいて増強された（図１ｄ）。
【０１２０】
ＩＧＦＢＰ−２のヘパリン結合ドメインは、エクスビボで中手骨の骨膜伸展を刺激する。骨格に対するＨＢＤの同化作用効果をさらに理解するために、１日齢マウスの中手骨を回収し、骨形成培地でウシ胎仔血清の非存在下においてインキュベートし、骨格の成長に対するＨＢＤペプチドの効果について分析した。骨の自然増加を、カルセイン取り込み面積の縦方向の長さならびに中手骨の幅および長さによって評価した。対照ペプチドは、カルセイン取り込み面積に対して効果を有さず、中手骨の長さおよび幅は、ＰＢＳで処理した中手骨と同等であった。したがって、さらなる試験のためのその後の対照としてＰＢＳを使用した（図８）。図２ａに示しているように、ＩＧＦＢＰ−２およびＨＢＤペプチドは、中手骨のカルセイン取り込み面積を有意に増大させた（図２ａおよびｂ）。ＩＧＦ−Ｉもまた、カルセイン取り込み面積の拡大を、ＩＧＦＢＰ−２およびＨＢＤペプチドと同様の程度まで刺激した（図２ａおよびｂ）。中手骨をＨＢＤペプチドと一緒にＩＧＦ−Ｉで処理した場合、中手骨はカルセイン取り込み面積のさらなる増大を示した。加えて、ＩＧＦＢＰ−２およびＨＢＤペプチドもまた中手骨の幅を増加させ、ＩＧＦＢＰ−２が骨膜伸展において重要な役割を有することを示した（図２ｃおよびｄ）。
【０１２１】
ＩＧＦＢＰ−５のヘパリン結合ドメインは、インビトロでおよびエクスビボで骨格に対する同化作用効果を有さない。別のＩＧＦＢＰは、ＨＢＤ領域ならびにＩＧＦＢＰ−２を持っていることから、分析を行って、ＨＢＤペプチドの骨形成効果がＩＧＦＢＰ−２中のこの領域に特異的であるかどうか、または、別の形態のＩＧＦＢＰ中のＨＢＤドメインもまたこの効果を有するかどうかを決定した。この目的のために、ＩＧＦＢＰ−５においてＨＢＤ領域を含有するペプチド（ＨＢＤ−ＢＰ５）を調製し、骨芽細胞形成に対するその効果を決定した。Ｉｇｆｂｐ２−欠損ＣＯＢを、ＨＢＤ−ＢＰ５の存在下において培養し、ＨＢＤ−ＢＰ５が、ＰＢＳ処理した細胞と比較して鉱化の増強を示さないことを決定した（図３ａ）。次に、中手骨を回収し、ＨＢＤ−ＢＰ５を含むまたは含まない骨形成培地で処理した。ＨＢＤ−ＢＰ５は、カルセイン取り込み面積または中手骨の長さおよび幅に対して効果を有さなかった。これらのデータは、骨格の獲得に対するＨＢＤの効果がＩＧＦＢＰ−２に特異的である可能性が高いことを示す。
【０１２２】
ＩＧＦＢＰ−２のヘパリン結合ドメインは、骨格の微細構造を改善することによってインビボでＩｇｆｂｐ２−／−マウスの骨減少性表現型をレスキューする。これらのインビトロおよびエクスビボでの観察に基づいて、研究を実施して、ＨＢＤペプチドがＩｇｆｂｐ２−／−マウスの骨減少性表現型をレスキューすることができるかどうかを決定した。この目的のために、Ｉｇｆｂｐ２−／−マウスを、ＰＢＳまたはＰＥＧ−ＨＢＤで処理した。ＰＥＧ−ＨＢＤの半減期分析（データは示さず）に基づいて、５０μｇのＰＥＧ−ＨＢＤを、１週間に５回、３週間、６〜９週齢のマウスに投与した。ＤＸＡによって分析した全身の面積骨塩密度（ａＢＭＤ）および骨塩含有量（ａＢＭＣ）／体重（ＢＷ）は、処理の開始前はＰＢＳまたはＰＥＧ−ＨＢＤで処理したＩｇｆｂｐ２−／−マウス間で異なっていなかった（表３）。正常な成長および硬化のために予期されたように、ＰＢＳで処理したＩｇｆｂｐ２＋／＋マウスは、ＰＢＳで処理したＩｇｆｂｐ２−／−マウスと比較して増加した骨梁骨体積をマイクロＣＴによって示した。ＰＥＧ−ＨＢＤによる処理は、統計学的有意性には到達しなかったものの、Ｉｇｆｂｐ２−／−マウスにおいて全身のａＢＭＤおよびａＢＭＣ／ＢＷを増大させた（表４）。一方、マイクロＣＴ分析は、ＰＢＳで処理したＩｇｆｂｐ２−／−マウスに対してＰＥＧ−ＨＢＤで処理したＩｇｆｂｐ２−／−マウスの遠位大腿骨およびＬ５椎骨の両方において骨梁骨体積の増加を明らかにした。これには、骨梁の厚さの増加が伴っていた（図４ａ、表１、表５）。大腿骨中央骨幹における皮質の厚さは、ＰＥＧ−ＨＢＤの投与によって影響を及ぼされなかったが、大腿骨中央骨幹のレベルで分析された合計面積は、ＰＢＳで処理したＩｇｆｂｐ２−／−マウスと比較してＰＥＧ−ＨＢＤで処理したＩｇｆｂｐ２−／−マウスにおいて増加した。このことは、エクスビボ中手骨アッセイにおいて実証されたものと同じように、骨膜伸展に対するＰＥＧ−ＨＢＤの効果と一致する（表１および図２）。骨格の構造的な変化は、骨強度における同様の傾向と関連していた。大腿骨の３点曲げ研究において、ＰＥＧ−ＨＢＤで処理したＩｇｆｂｐ２−／−マウスは、ＰＢＳ処理したヌルマウスと比較してわずかに高い骨剛性および推定ヤング率を有していた（図４ｂ）。さらに、降伏点荷重および降伏点変位は、対照と比較してＰＥＧ−ＨＢＤ処理した動物において低かった（図４ｂ）。
【０１２３】
組織形態計測分析は、ＰＢＳで処理したＩｇｆｂｐ２−／−マウスに対してＰＥＧ−ＨＢＤで処理したＩｇｆｂｐ２−／−マウスにおいて、骨梁周囲長当たりの骨芽細胞数は有意に増加し、一方、骨梁周囲長当たりの破骨細胞数は減少を示すことを明らかにした（図４ｃ、表６）。興味深いことに、ＰＥＧ−ＨＢＤは全身脂肪症に対して直接の効果を有さなかったものの、骨髄脂肪細胞の数は、ＰＥＧ−ＨＢＤで処理したＩｇｆｂｐ２−／−マウスにおいて減少した（図４ｄ、表３および４）。骨髄脂肪細胞の減少と一致するＰＥＧ−ＨＢＤで処理したＩｇｆｂｐ２−／−マウスの骨芽細胞数の増加は、間葉系幹細胞の配分が、ＰＥＧ−ＨＢＤで処理したマウスにおいて骨形成系の方に変更され得ることを示す。このことと一致して、Ｐｐａｒｇ発現は、ＰＥＧ−ＨＢＤで処理したＣＯＢにおいて減少した（図４ｅ）。
【０１２４】
ＰＥＧ−ＨＢＤ処理したマウスの組織形態計測において見られた破骨細胞数の減少に関して、血清ＴＲＡＰ５ｂレベルもまた、ＰＥＧ−ＨＢＤで処理したＩｇｆｂｐ２−／−マウスにおいて有意に減少した（図４ｆ）。ＰＥＧ−ＨＢＤが破骨細胞に影響を及ぼす機構を調査するために、Ｉｇｆｂｐ２−／−マウスの骨髄間質細胞を培養し、ＨＢＤの存在下または非存在下において破骨細胞形成を誘導した。ＰＥＧ−ＨＢＤは、破骨細胞形成に対して直接の効果を有さなかった（データは示さず）。次に、Ｉｇｆｂｐ２−／−ＣＯＢおよびＢＭＳＣを回収し、ＰＥＧ−ＨＢＤで処理した。ＰＥＧ−ＨＢＤは、Ｏｐｇ発現に影響を及ぼさなかったが、Ｒａｎｋｌ発現を著しく抑制した（図４ｇおよびｈ）。これらのデータは、ＰＥＧ−ＨＢＤが、骨芽細胞におけるＲａｎｋｌ発現の下方制御によって破骨細胞形成を間接的に減少させることを示す。
【０１２５】
ＩＧＦＢＰ−２のヘパリン結合ドメインは、ＰＴＥＮ発現を抑制し、ＩＧＦ−Ｉ／Ａｋｔシグナル伝達を刺激する。膠芽腫および前立腺がんなどのヒトがん細胞におけるＩＧＦＢＰ−２発現とＰＴＥＮ発現の間の負の関連の証拠がある１８〜２１。加えて、ＰＴＥＮ発現は、Ｉｇｆｂｐ２欠損骨芽細胞において増強されることが示されている１０。これらの発見は、ＩＧＦＢＰ−２が、骨芽細胞においてＰＴＥＮ発現を負に制御し、ＩＧＦ−Ｉシグナル伝達を増強するという推測をもたらした。初代Ｉｇｆｂｐ２−／−ＣＯＢを使用して、ＩＧＦＢＰ−２がＰＴＥＮ発現を抑制するかどうかを決定するために、最初の分析を行った。完全長ＩＧＦＢＰ−２が、これらの細胞においてＰＴＥＮ発現を著しく抑制することが見出された（図５ａ）。対照ペプチドは、ＰＴＥＮ発現に対して効果を有さなかった（図９）が、ＩＧＦＢＰ−２とほぼ同様に、ＰＥＧ−ＨＢＤもまたＰＴＥＮ発現の減少を誘導した（図５ｂ）。次に、ＰＴＥＮ発現の減少がＩＧＦ−Ｉ／Ａｋｔシグナル伝達の増強をもたらすかどうかを決定するために分析を行った。セリン４７３のＡｋｔのリン酸化（ｐＳｅｒ４７３−Ａｋｔ）に関するウェスタンブロット分析によって、ＩＧＦ−Ｉに刺激されるＡｋｔ活性化は、Ｉｇｆｂｐ２＋／＋ＣＯＢと比較してＩｇｆｂｐ２−／−ＣＯＢにおいて損なわれることが明らかとなった（図５ｃ）。さらに、ｐＳｅｒ４７３−Ａｋｔは、ＰＢＳ処理した対照に対してＰＥＧ−ＨＢＤで処理したＩｇｆｂｐ２−／−ＣＯＢにおいて増強された（図５ｄ）。これらのデータは、ＩＧＦＢＰ−２が、ＰＴＥＮ発現を一部ＨＢＤによって抑制することによって、ＩＧＦ−Ｉに刺激される／Ａｋｔ活性化を増強することを示す。
【０１２６】
ＩＧＦＢＰ−２のヘパリン結合ドメインは、ＩＧＦ−Ｉに誘導される細胞質基質のβ−カテニン蓄積およびβ−カテニンのＳｅｒ５５２リン酸化を刺激する。いくつかの証拠は、腫瘍細胞系におけるＩＧＦ−Ｉシグナル伝達とβ−カテニンシグナル伝達の間のクロストークを実証している２４〜２７。したがって、ＩＧＦ−Ｉシグナル伝達が、β−カテニンシグナル伝達を刺激する、および、ＨＢＤペプチドが、骨芽細胞においてＰＴＥＮ発現を抑制することによってβ−カテニンシグナル伝達を増強することができるという仮説を立てた。ＩＧＦ−Ｉが、骨芽細胞の細胞質基質におけるβ−カテニン蓄積に影響を及ぼすかどうかを決定するために、分析をまず行った。ウェスタンブロット分析により、ＩＧＦ−Ｉは、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞において、膜結合β−カテニン発現を減少させ、β−カテニンの細胞質基質蓄積を増強することが明らかになった（図６ａ）。加えて、ＩＧＦ−Ｉに応答するβ−カテニンの細胞質基質蓄積は、ＰＢＳ処理した対照細胞と比較してＰＥＧ−ＨＢＤで処理したＩｇｆｂｐ２−／−  ＣＯＢにおいて増強した（図６ｂ）。このことは、ＨＢＤペプチドが、おそらくＰＴＥＮ発現を抑制することによって、ＩＧＦ−Ｉ／β−カテニンシグナル伝達に関与していることを示唆する。Ａｋｔによって誘導され得るβ−カテニンのセリン５５２（Ｓｅｒ５５２）リン酸化は、β−カテニンの膜からの解離、細胞質および核への再局在化のために重要であることが示されている２８〜３０。この観察に基づいて、ＩＧＦ−Ｉは、β−カテニン中のＳｅｒ５５２リン酸化を刺激するかどうか、およびＨＢＤペプチドが、骨芽細胞においてこの応答を容易にするかどうかを決定するために、研究を実施した。図５ｃおよびｄに示しているように、ＩＧＦ−Ｉは、Ｓｅｒ５５２でのβ−カテニンリン酸化を刺激し、この応答は、ＰＥＧ−ＨＢＤで処理した細胞において増強された。β−カテニンの活性化は骨形成のために重要であることから、ＨＢＤペプチドの骨形成効果は、骨芽細胞においてＩＧＦ−Ｉβ−カテニンシグナル伝達によって媒介されている可能性がある。
【０１２７】
この試験は、ＩＧＦＢＰ−２のヘパリン結合ドメインが、骨に対するＩＧＦＢＰ−２の同化作用のために不可欠であり得るという証拠をもたらす。ＨＢＤが骨芽細胞においてＰＴＥＮ発現を抑制すると決定することにより、ＩＧＦＢＰ−２が細胞の運命を制御し得る１つの機構がもたらされる。しかしながら、インタクトなＩＧＦＢＰ−２のＩＧＦ−Ｉ依存的および非依存的な活性を選別することは、困難である。ＩＧＦ−Ｉシグナル伝達は、骨格の獲得のための前提条件であり、このシグナル伝達経路の調節は、骨格ホメオスタシスにおいて変更をもたらす１７、３４〜４０。したがって、骨格に対するＨＢＤの同化作用効果は、ＰＴＥＮ抑制の結果としてＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路のＩＧＦ−Ｉに誘導される活性化の増強によって一部媒介される可能性がある。加えて、骨芽細胞におけるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達の増強は細胞増殖に関与しているため、ＨＢＤ処理したＩｇｆｂｐ２−／−マウスにおける骨芽細胞数の増加はまた、この機構の変化によるものである可能性がある。実際に、Ｌｉｕらは、インビボの骨芽細胞におけるＰＴＥＮの低下が、非常に高い骨量および骨芽細胞数の増加をもたらすことを示した１７。
【０１２８】
ＨＢＤはＩｇｆｂｐ２−／−マウスにおいて低い骨芽細胞数をレスキューしたが、破骨細胞数はＨＢＤの投与によってさらに減少した。この観察は、骨量において観察された増加と一致するが、骨代謝回転はＨＢＤ処理によって促進されないことを示唆する。実際に、骨石灰化速度および骨形成速度は、ＨＢＤで処理したＩｇｆｂｐ２−／−マウスにおいてごくわずかな変化を示した。ＨＢＤとは対照的に、ＩＧＦ−Ｉシグナル伝達は、破骨細胞形成を直接刺激することが示されており、前のデータは、骨格の微小環境においてＩＧＦＢＰ−２の生理的レベルが、破骨細胞形成ために必要とされることを示唆している４１。ＩＧＦＢＰ−２が作用することにより、細胞周囲のニッチ内のＩＧＦ−Ｉ濃度を維持するが、ＩＧＦ−Ｉ結合ドメインを欠くＨＢＤは、超生理学的濃度が投与された場合に骨再吸収を阻害することによって異なる役割を果たし得る可能性がある。ＨＢＤは、インビトロで破骨細胞分化を直接抑制しないので、ＨＢＤが骨再吸収を減少させる根底となる機構は間接的であり、骨芽細胞におけるＲａｎｋｌ発現の減少によるものであり得る。Ｒａｎｋｌの発現は、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を含む非常に多くの因子によって制御される４２。Ｇｌａｓｓらは、安定化させた形態のβ−カテニンを発現するマウスが、増加したＯｐｇ／Ｒａｎｋｌ比によって主に引き起こされる、破骨細胞数の減少を伴う骨梁骨体積の増加を示すことを報告した４３。このことと一致して、骨芽細胞におけるβ−カテニンの標的欠失は、骨再吸収の増加とともに低い骨量をもたらした４３。したがって、骨芽細胞におけるβ−カテニンの安定化は、Ｗｎｔに媒介される活性化を増加させることによってだけでなく、骨再吸収の抑制によってもまた、骨量を増加させる。
【０１２９】
ＰＴＥＮ発現の減少は、シグナル伝達におけるβ−カテニンの増加と関連していることが示されている。ＡｋｔによるＧＳＫ３β（グリコーゲン合成酵素キナーゼ３）の不活性化は、Ａｋｔ活性化がβ−カテニン安定化を増強する重要な経路であることが提案されているが、一方、いくつかの証拠は、β−カテニン活性化におけるＳｅｒ５５２リン酸化の重要な役割を実証している２８〜３０。β−カテニンは、Ａｋｔによって直接リン酸化され、Ｓｅｒ５５２リン酸化は、β−カテニンの細胞質基質蓄積および核蓄積に重要であり、結果としてβ−カテニン転写活性の増加をもたらす２８。Ｈｅらは、ＰＴＥＮの低下が、一部Ｓｅｒ５５２リン酸化によってβ−カテニン活性を刺激することによって、過剰の腸幹細胞をもたらすことを報告した２９。この研究は、ＩＧＦ−Ｉが、細胞質におけるβ−カテニン蓄積を増強し、骨芽細胞においてβ−カテニンのｓｅｒ５５２をリン酸化し、この応答が、ＨＢＤによってさらに増強されることを実証した。総合すると、これらの証拠は、β−カテニンシグナル伝達の活性化の増強は、ＰＥＧ−ＨＢＤで処理したＩｇｆｂｐ２−／−マウスにおいて、骨形成の増加および骨再吸収の減少の両方に寄与する可能性があることを示唆する。
【０１３０】
ＰＥＧ−ＨＢＤ処理したＩｇｆｂｐ２−／−マウスにおいて、骨芽細胞数は増加し、これは、骨髄脂肪細胞の数の減少を伴っていた。間葉細胞の配分は、骨量および骨髄の脂肪症の制御において重要なステップである。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達および転写因子であるＰＰＡＲ−γを含む非常に多くの因子が、このプロセスに関与している４４。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の活性化は、一部分において、ＰＰＡＲ−γを隔離することまたはＰＰＡＲ−γ転写活性を抑制することのいずれかによって、脂肪生成よりも骨芽細胞形成に有利に働く４５〜４７。ＨＢＤがＩＧＦ−Ｉによって誘導されるβ−カテニンの安定性を増強することから、骨形成系統への間葉細胞の転換は、ＰＥＧ−ＨＢＤで処理したＩｇｆｂｐ２−／−マウスの骨髄における骨芽細胞の増加および脂肪細胞の減少を説明し得る。
【０１３１】
しかしながら、ＨＢＤがＰＴＥＮ発現を抑制する機構は明確にされていない。１つの可能性は、インテグリン受容体とのＨＢＤの結合にある。Ｍａｉｌｅらは、平滑筋細胞において、ビトロネクチンのヘパリン結合ドメインがβ３インテグリンのシステインループ領域に結合し、αＶβ３インテグリンシグナル伝達を調節することを報告した４８。さらに、Ｐｅｒｋｓらは、ＩＧＦＢＰ−２と特定のインテグリン受容体の間の相互作用、またはＨＢＤがこの相互作用に関与しているかどうかは実証しなかったものの、ＩＧＦＢＰ−２によるＰＴＥＮ下方制御がインテグリン受容体によって媒介されている可能性があることを報告した２０。
【０１３２】
ＩＧＦＢＰ−２のＣ末端におけるＲＧＤ配列モチーフの存在は、ＩＧＦＢＰ−２が、そのＩＧＦ−結合に非依存的に、インテグリンに結合し得るという推測をもたらした３。Ｓｃｈｕｔｔらは、ユーイング肉腫および乳がん細胞系において、細胞表面へのＩＧＦＢＰ−２の結合が、α５β１インテグリンによって媒介され、ＲＧＤ含有ペプチドによってブロックされることを報告した４９。Ｗａｎｇらはまた、ヒト膠芽腫細胞系において、ＩＧＦＢＰ−２がＲＧＤモチーフを介してα５インテグリンと相互作用することを示した５０。これらの報告とは対照的に、ＲｕｓｓｏらおよびＰｅｒｅｉｒａらは、神経芽細胞腫細胞および乳がん細胞において、細胞外マトリックスへのＩＧＦＢＰ−２の結合が、ＲＧＤ配列に非依存的であることをそれぞれ独立に報告した。加えて、Ｈｏｅｆｌｉｃｈらは、複数の臓器において、ＲＧＤモチーフが原形質膜へのＩＧＦＢＰ−２の結合に関与していないことを示した５１。したがって、Ｉｇｆｂｐ２−／−マウスにおけるＲＧＤモチーフの機能的役割は、論争中のままであり、さらなる研究が必要とされる。
【０１３３】
超生理学的濃度のＨＢＤを使用した結果は、骨獲得における生理学的濃度のＩＧＦＢＰ−２の役割に関する明確な結論に到達するために使用することができない。しかしながら、これは、この結合タンパク質が、生後の１年間などの急速な成長の期間中および思春期中のＩＧＦＢＰ−２の高い循環レベルを説明し得る特有の特性を有することは示唆している。要約すると、これらの研究は、ＩＧＦＢＰ−２中のＨＢＤが、骨格に対する同化作用効果を有すること、この効果が、ＰＴＥＮ発現の抑制によって部分的に媒介され、β−カテニンシグナル伝達の活性化を伴うことを示す。これらの証拠は、骨におけるＩＧＦＢＰ−２の生理学的役割に関する新しい洞察をもたらし、ＨＢＤペプチドなどの低分子が、骨粗鬆症の治療のための薬理学的介入としての潜在能力を有する可能性があることを示唆する。
【０１３４】
実施例８に関する参考文献
【表１−１】
0005906183.tif 000002
【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【実施例９】
【０１３５】
＜脂肪蓄積の阻害におけるペプチドの有効性＞
文献中の様々なデータは、ＩＧＦＢＰ−２が脂肪蓄積を阻害することを支持する。これらのデータは、ＩＧＦＢＰ−２がマウスにおいて過剰発現された。すなわち、過剰のＩＧＦＢＰ−２を産生するトランスジェニックマウスが作出された研究を含む。これらの動物は、脂肪量を減少させた。重要なことに、これらの動物に、通常、糖不耐性を誘導する高脂肪食を摂取させた場合、これらの動物は、同じ高脂肪食を摂取させ高血糖症を発症した対照マウスと比較して正常な糖耐性を維持した。このことは、ＩＧＦＢＰ−２がインスリン抵抗性から保護することを示唆する。対照的に、ＩＧＦＢＰ−２遺伝子が欠失したマウスは、反対の表現型を有した。換言すれば、これらのマウスは対照マウスよりも有意に太っていた。２４週後、ＩＧＦＢＰ−２ノックアウトマウスは、体重が３７±１．５ｇｍであり、一方、対照動物は、体重が３２±１．３ｇｍであった。５２週後、この差異は維持されていた。これは、合計体重において非常に有意な差異である。さらに重要なことに、脂肪量を、ＤＥＸＡスキャニングによって分析した場合、ほとんど全体の体重の差異が、脂肪量の差異によるものであった。２６週で、対照マウスにおける体脂肪パーセントは１６．１±１．４％脂肪であったが、一方ノックアウトマウスにおいて、体脂肪パーセントは２４．２±１．１％であった。やはり、これは非常に有意な差異であり、重量の差異の多くが脂肪の差異によるものであったことを示す。糖耐性試験は、ＩＧＦＢＰ−２遺伝子欠失マウスが糖不耐性を有し、インスリンの投与に対して感受性が低いことを示した。このことは、脂肪量の増加が、ホルモンインスリンに対する抵抗性の増加を引き起こしたことを示す。血液インスリンレベルは、ＩＧＦＢＰ−２ノックアウトマウスにおいてより高く、これらのマウスが高い血清インスリン濃度をもたらすインスリン抵抗性を有することを示した。このことは、心血管疾患の重要なリスク因子であることが他の人によって示されている。
【０１３６】
さらなる実験が行われ、この実験ではノックアウトマウスおよび対照動物にヘパリン結合ペプチドのマウス相同体が投与された。ペプチドを、各群において８匹の動物に投与した。６週処理のデータを、表２に示す。ノックアウト動物は、体重が３０．４±１．５ｇｍであり、一方、対照動物は、体重が２５．２±１．１ｇｍであった。活性ペプチドを投与したノックアウト動物は、体重が２４．９±１．３ｇｍであった。このことは、１週間に３日、腹腔内に投与された５０ｍｃｇの用量で与えられたペプチドの投与が、体重増加を予防することにおいて有効であることを明らかに示した。さらに重要なことに、絶対的脂肪量をＭＲＩによって分析した場合、非常に有意な差異がまた存在した。ノックアウトマウスは、６．２１±０．７６グラムの脂肪を有していた。対照マウスは、３．８２±０．６７グラムを有し、ヘパリン結合ペプチドを投与されたノックアウトマウスは、３．６７±０．３６グラムを有していた。やはり、これらは非常に有意な差異であった。これらの動物において糖耐性試験もまた実施され、ノックアウト動物が損なわれた糖耐性を有し、これは、ペプチドの投与によって有意に改善し、対照マウスと有意に異ならないことを示した。
【実施例１０】
【０１３７】
＜ＩＧＦＢＰ−２の全体的な欠失は、致死量の放射線を照射したマウスにおいて、血液生成を妨害し、骨髄生着に障害を生じさせる＞
ＩＧＦＢＰ２（ＢＰ２）の全体的な欠失が定常状態の血液生成を妨害、および骨髄ドナー細胞の生着を妨げ得るかどうかを決定するために、研究を行った。雄の（Ｍ）および雌の（Ｆ）ＷＴおよびＢＰ２−／−マウスの末梢血および脾臓細胞を、フローサイトメトリーによって主要な白血球（ＷＢＣ）集団についてまず分析した。末梢血において、ＢＰ２−／−ＦマウスはＷＴ−ＦおよびＢＰ２−／−Ｍと比較して有意に低いＣＤ３＋Ｔ細胞を有していた（ｐ＝０．０２）が、ＢＰ２−／−Ｍは、ＷＴ−ＭおよびＢＰ２−／−Ｆの両方と比較して有意に増加したＣＤ３＋Ｔ細胞（ｐ＝０．０３）、ＣＤ１９＋Ｂ細胞（ｐ＝０．００）、Ｆ４８０＋マクロファージ（ｐ＝０．００）、ＣＤ１１ｂ＋単球（ｐ＝０．００）およびＬＹ６Ｇ＋好中球（ｐ＝０．０２）を有していた。ＩＧＦＢＰ−２ヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）ペプチドの腹腔内注射は、ＰＢＳ注射した対照と比較して、ＢＰ２−／−Ｍの末梢血においてマクロファージ（ｐ＝０．０１）および好中球（ｐ＝０．０２）のパーセンテージを減少させた。ＷＴ−Ｆ、ＷＴ−ＭおよびＢＰ２−／−Ｍと比較して、ＢＰ２−／−Ｆ脾臓ＣＤ３＋Ｔ細胞は増加し（ｐ＝０．０）、ＣＤ１９＋Ｂ細胞は減少した（ｐ＝０．０５）。ＷＴ−Ｍと比較してＢＰ２−／−Ｍの脾臓においてＢ２２０＋Ｂ細胞前駆体細胞の顕著な増加があったが、すべての他の成熟したＷＢＣ集団のパーセンテージには差異がなかった。致死量の放射線を照射されたＷＴおよびＢＰ２−／−雄のレシピエントへの骨髄移植が次に実施された。非競合的移植において、ＷＴおよびＢＰ２−／−の両方において７５％以上の再増殖細胞がドナー由来（Ｌｙ５．１＋）であったことから、ドナー生着の効率は両系統について同じであった。競合的再構築移植において、ＬＹ５．１＋マウスの支持ドナー細胞を、ＷＴまたはＢＰ２−／−のいずれかの競合相手ドナー細胞と２：３および１：３の比で混合し、系統特異的レシピエントに移植した。移植後８週で、ドナー細胞の２／３がＷＴであったＷＴ（ＬＹ５．２＋）レシピエントは、骨髄細胞の７５％がＷＴ由来（ＬＹ５．２＋）であったが、ドナー細胞の２／３がＢＰ２−／−由来であったＢＰ２−／−（ＬＹ５．２＋）レシピエントにおいて、移植後８週で骨髄細胞の５６％のみがＬＹ５．２＋であり、ＷＴと比較してＢＰ２−／−ドナー細胞の２０％低い（ｐ＝０．０１）生着を表した。これらのデータは、ＩＧＦＢＰ２が、造血幹細胞ニッチの重要なレギュレーターである可能性があることを裏付ける。
【実施例１１】
【０１３８】
＜骨髄ニッチにおける間葉系間質細胞（ＭＳＣ）のＩＧＦＢＰ−２は、造血幹細胞増殖および骨髄生着を制御する＞
ＩＧＦＢＰ２（ＢＰ２）は、ＩＧＦをそれらのそれぞれの受容体まで輸送する６つのＩＧＦ結合タンパク質のうちの１つである。ＰＴＨは、頭蓋冠骨芽細胞においてＩＧＦＢＰ２合成を誘導することが示されおり、ＢＰ２の全体的な欠失は、小脾臓、非常に低い骨形成、損なわれた骨再吸収および骨髄の脂肪症の増加をもたらす。インビトロで、ｂｐ２−／−マウスの骨髄は、骨芽細胞および破骨細胞の両方の動員が損なわれることを示す。ＢＰ２ヌル雄もまた、末梢血および脾臓の両方においてリンパ系および骨髄系部分集団のパーセンテージの増加が見出される造血性表現型を有する。ＢＰ２が骨髄ニッチにおいて増殖性因子として不可欠な役割を果たすかどうかを決定するために、研究を実施した。精製されたマウス間葉系幹細胞（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＲＮＡを使用して、ＢＰ２遺伝子発現レベルが、精製されたＢまたはＴ細胞のものよりも６〜８倍高いことをまず決定した。非競合的骨髄移植（ＢＭＴ）を、ＬＹ５．１＋ドナー細胞を致死量の放射線を照射したＷＴおよびｂｐ２−／−レシピエントに移植することによって実施した。ドナー生着は、両系統のレシピエントマウスの末梢血に存在する７０％を超えるドナー細胞によって示されるように、系統間で異ならなかった。しかしながら、同じ系統のドナー−レシピエントの組を使用した競合的再構築移植において、ｂｐ２−／−ドナー細胞は、ｂｐ２−／−レシピエント骨髄を、ＷＴ移植よりも３０％低い効率で（Ｐ＝０．０１）生着させた。加えて、ｂｐ２−／−レシピエントの末梢血において有意に少ない成熟リンパ系（ＣＤ３、ＣＤ１９）および骨髄系（ＣＤ１１ｂ、ＬＹ６ＧおよびＦ４８０）細胞が存在していた（ｐ≦０．０５）。ＩＧＦＢＰ２分子の単一の構成要素であるヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）の、ｂｐ２−／−マウスへの投与に応答して、骨梁骨量はレスキューされ、骨芽細胞数は増加した。重要なことに、ＨＢＤのインビボの投与は、末梢循環において成熟した単球、マクロファージおよび好中球のパーセンテージを、ＷＴマウスにおいて見出されるものと同等に、抑制した。総合すると、これらのデータは、ＭＳＣにより合成され、ＰＴＨにより誘導可能であるＢＰ２が、血液生成の強力なレギュレーターであり、骨髄ニッチ内でＩＧＦ結合非依存的に幹細胞の運命を特異的に制御し得ることを実証する。ＩＧＦＢＰ２によるニッチ制御は、現在のところ多くの血液および固形組織悪性腫瘍のための唯一の治療の選択肢である、臨床的骨髄移植にとって治療上重要である可能性がある。
【実施例１２】
【０１３９】
＜ＩＧＦＢＰ−２のヘパリン結合ドメインによる造血幹細胞の制御＞
以下の研究は、造血性骨髄再構築を刺激することによって骨髄移植の成功を増強するための、そのヘパリン結合ドメインを介するＩＧＦＢＰ−２の役割を決定するために記載する。
【０１４０】
原理的説明。造血幹細胞移植は、非造血器悪性腫瘍のための高用量化学療法に続いて、造血がん（白血病およびリンパ腫）の治療において主として使用される。これはまた、再生不良性貧血および自己免疫疾患などの遺伝性または後天性の骨髄機能不全を含む疾患にも使用される。陽性の移植転帰は、（１）ドナー骨髄、臍帯血または末梢血の十分な数の造血幹細胞（ＨＳＣ）の回復および（２）ＨＳＣのレシピエント骨髄へのホーミングの成功に依存する１。ＩＧＦＢＰ−２は、ヒトおよびマウス造血幹細胞の両方のインビトロでの増殖のために必要な因子であることが示されている２、３。この結果と一致して、マウスにおけるＩＧＦＢＰ−２の全体的な欠失は、致死量の放射線照射後の骨髄の再構築障害をもたらすことが判明した。ＩＧＦＢＰ−２のヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）に特有のペプチドが合成され、このペプチドが、インビトロで骨芽細胞および骨髄間質細胞数を増加させる能力、およびＩＧＦシグナル伝達に非依存的にインビボの骨形成を増強する能力を有することが実証された。これらの研究は、抗がん治療レジメンの不可欠な構成要素である造血幹細胞移植におけるＩＧＦＢＰ−２のＨＢＤの役割を調査する。
【０１４１】
有意性。骨髄移植の成功は、血液のおよび固形組織の新生物の両方にとって重要な治療の選択肢である。例えば、多発性骨髄腫の治療における主な進歩は、骨髄造血幹細胞（ＨＳＣ）の移植であった。移植前のＨＳＣの増殖は、生着の成功および定常状態の血液生成の再確立の可能性を増加させる４。ＩＧＦＢＰ−２は、マウスおよびヒト造血幹細胞のインビトロでの増殖のための強力な刺激であることが示されている２、３。しかしながら、この効果を担う機構は不明である。最近の研究は、インビボの骨髄移植の成功ならびに間葉系間質細胞（ＭＳＣ）分化を刺激するその能力のための、ＩＧＦＢＰ−２の重要性を確立した。本明細書に記載されている研究は、ＩＧＦＢＰ−２がＨＳＣ増殖を増加させ、造血幹細胞ニッチの確立を増強する経路を解明することを意図している。ＨＳＣ移植は、造血器および非造血器悪性腫瘍のための療法として広く使用されるため、これらの研究は広い治療上の意味を有するはずである。
【０１４２】
背景。幹細胞ニッチのストレスおよび傷害に応答する潜在能力は、ＨＳＣだけでなく骨を形成する骨芽細胞もまた必要とする５、６。インスリン様成長因子結合タンパク質２（ＩＧＦＢＰ−２）は、増殖性成長因子ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの生体内利用性を制御する６つのＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ１〜６）のうちの１つである。研究は、骨芽細胞増殖および分化の制御におけるＩＧＦＢＰ−２の重要性を確立した７。予備的な証拠は、ＩＧＦＢＰ−２がＩＧＦ非依存的に作用することができないことを示唆するが、これらの作用のもとにある機構は未だ調査されていない。例えば、膠芽腫における細胞移動性は、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ドメインを介するＩＧＦＢＰ−２のインテグリンα５受容体への結合によって媒介されるようである８。加えて、ＩＧＦＢＰ２のタンパク質分解による切断は、ヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）を含む小断片を生じる。ＨＢＤが細胞外マトリックスに結合すると、神経芽細胞腫細胞の増殖および転移挙動を刺激することができる９。ＩＧＦＢＰ−２のリンカー領域に存在するＨＢＤを含有する低分子が合成された。この分子中の２つのＨＢＤのうち、合成された１つはＩＧＦＢＰ−２に特有であり、別のＩＧＦＢＰにおいては示されない。ＨＳＣ移植療法のためのアジュバントとしてＨＢＤの有用性を明確にすることを最終的な目的として、このペプチドを、ＨＳＣ増殖、遊走、および骨髄ホーミングに対するその効果について研究する。
【０１４３】
提案された調査を支持するデータ。骨形成との関連において、ＩＧＦＢＰ−２のＩＧＦ非依存的作用を、ＩＧＦＢＰ−２のリンカー領域中に含有されているＨＢＤの合成ペプチドを使用して調査した。このペプチドは、別のＩＧＦ結合タンパク質とは異なる。インビトロで、ＨＢＤペプチドは、Ｉｇｆｂｐ２−／−骨髄間質細胞および頭蓋冠骨芽細胞の低い骨鉱化表現型をレスキューし（図１０）、Ｉｇｆｂｐ２−／−中手骨のエクスビボ外植における骨膜伸展および増殖を刺激した。インビボで、ＨＢＤペプチドは、骨芽細胞数の増加、骨量の回復、および骨強度の改善によって分かる通り、Ｉｇｆｂｐ２−／−マウスの低い骨量表現型をレスキューした（図１１）。
【０１４４】
間葉細胞に対するその作用に加えて、ＩＧＦＢＰ−２は、マウスおよびヒト造血幹細胞のインビトロでの増殖のために必要な因子であることが示されている。ＩＧＦＢＰ−２の全体的な欠失は、Ｉｇｆｂｐ２−／−マウスの末梢血および脾臓が、有意に増加したＢリンパ球および骨髄系細胞を含有するように血液生成を変更させる。ＨＢＤのインビボ投与は、分化したリンパ系および骨髄系細胞の数を、ＰＢＳ注射した対照のベースラインパーセンテージまで減少させた（図１２）。さらに、競合的再構築骨髄移植において、Ｉｇｆｂｐ２−／−ドナー細胞は、同じ系統レシピエントの骨髄を効率的に再構築することができなかった（図１３）。
【０１４５】
総合すると、これらの発見は、ＨＢＤが、ＨＳＣにおいて細胞増殖を増強し、分化を抑制するＩＧＦＢＰ−２シグナル伝達の重要な構成要素であり得ることを示している。ここに記載されている研究は、ＨＳＣに対するＩＧＦＢＰ−２の増殖促進効果が、ＨＢＤによって媒介され、ＩＧＦ−Ｉの作用に非依存的であるかどうかを決定するためのものである。
【０１４６】
＜インビトロでの造血幹細胞増殖および分化に対するＩＧＦＢＰ−２ヘパリン結合ドメインペプチド（ＨＢＤ）の効果の調査＞
原理的説明：骨髄移植の前にドナー骨髄細胞調製物における長期（ＬＴ）ＨＳＣの数を増加させることは、移植転帰を改善する。インビトロで、ＩＧＦＢＰ−２はＨＳＣの増殖を増加させるように作用するが、この効果の根底にある機構は不明である。ＩＧＦＢＰ−２は、ＲＧＤおよびＨＢＤドメインを介してＩＧＦ−１シグナル伝達に非依存的に作用することが示されている。ＩＧＦＢＰ−２に特有の合成ＨＢＤペプチドを使用して、ヒトおよびマウスＨＳＣの増殖を増加させる、およびＨＳＣを未分化の状態に維持するＨＢＤの能力が試験される。ＩＧＦＢＰ−２非依存的効果を描出するために、Ｉｇｆｂｐ２−／−およびＩｇｆｂｐ２＋／＋マウスの両方から回収されたマウスＨＳＣにおいてＨＢＤをインビトロで試験する。
【０１４７】
設計および方法：Ｉｇｆｂｐ２−／−マウスは、１９９０年代にＪｏｈｎ  Ｐｉｎｔａｒ博士によって作出され、次いで、２０００年代早期にＴｅｒｒｉ  Ｗｏｏｄ博士によってＢ６に戻し交配された。これらのマウスは、Ｗｏｏｄ博士から得、これらのマウスはジャクソン研究所（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）においてＣ５７ＢＬ６に継続して戻し交配された。ＨＢＤペプチドおよびスクランブル対照ペプチドは、ＵＮＣチャペルヒルのＤａｖｉｄ  Ｃｌｅｍｍｏｎｓ医学博士により提供される。短い半減期を延ばすために、ＨＢＤをペグ化した。インビトロでの実験は、ＨＢＤおよびペグ化されたＨＢＤが、骨芽細胞増殖および分化を刺激するそれらの能力において同一であることを実証した。臍帯血から単離されたヒトＨＳＣは、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入し、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ幹細胞培地において、製造業者の使用説明書に従って培養する。マウス骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）は、Ｉｇｆｂｐ２−／−およびＩｇｆｂｐ２＋／＋マウスの大腿骨から回収する。ＢＭＳＣを、蛍光コンジュゲート抗体で染色し、ＦＡＣＳＡｒｉａセルソーターを使用してＨＳＣを単離する。ＨＳＣは、Ｌｉｎ−ＣＤ３４−Ｓｃａ−１＋Ｋｉｔ＋Ｆｌｋ−２−として規定される。各系統の２０個のＨＳＣを、以前に報告されている通り、ヘパリン、幹細胞因子、トロンボポエチン、およびＦＧＦ−１を追加したＳｔｅｍＳｐａｎ無血清培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において培養する３。ＨＢＤ、完全長ＩＧＦＢＰ−２、またはスクランブル対照ペプチドを、所定の濃度でおよび最適化された曝露時間で、細胞培養物に添加する。培養の１０日目に、試験検体および対照についての細胞増殖を、Ｈ３チミジンの取り込みによって１分当たりの放射活性カウントとして、Ｌ５６５００液体シンチレーションカウンターを使用して定量する。結果は、３連の試験の平均として表す。細胞をまた、フローサイトメトリーによって分析して、短期（ＳＴ）および長期（ＬＴ）造血幹細胞のパーセンテージを、それぞれ、ＣＤ３４＋Ｓｃａ−１＋Ｔｈｙ１．１＋／ｌｏｃ−ｋｉｔ＋ｌｉｎ−ＣＤ１３５−Ｓｌａｍｆ１／ＣＤ１５０＋ＣＤ１１ｂｌｏおよびＣＤ３４−Ｓｃａ−１＋Ｔｈｙ１．１＋／ｌｏｃ−ｋｉｔ＋ｌｉｎ−ＣＤ１３５−Ｓｌａｍｆ１／ＣＤ１５０＋によって規定される通り決定する。ＨＳＣが培養において未分化のままであることを確認するために、分化した細胞のパーセンテージもまた、フローサイトメトリーによって、Ｔｅｒ１１９（赤血球）ＬＹ６Ｇ（Ｇｒ−１、骨髄系）、ＣＤ３（Ｔ細胞）、ＣＤ１９（Ｂ細胞）およびＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ−１、マクロファージ）を含む系統特異的マーカーに対する抗体を使用して決定する。パーセンテージは、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを使用した２０，０００事象の集合に基づく。細胞培養実験は、３回繰り返す。分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、群間の差異を評価する。信頼区間は、９５％に設定される（ｐ≦０．０５）。
【０１４８】
＜造血幹細胞に対するＨＢＤの効果が、ＩＧＦシグナル伝達非依存的であるかどうかの調査＞
原理的説明。ＩＧＦ−Ｉは、正常細胞および悪性細胞の両方の増殖プロモーターである。ＩＧＦＢＰ−２の上昇した血清中濃度は、再発する転移性疾患において、および造血幹細胞移植後の幼少期急性骨髄性白血病において、予後不良指標として認識される１０、１１。したがって、インビトロでのＨＳＣ増殖に対するＩＧＦＢＰ−２の効果が、ＩＧＦシグナル伝達に非依存的であるかどうか、および細胞シグナル伝達に関してＩＧＦとＩＧＦＢＰ−２との間に相乗効果があるかどうかを決定することは重要である。
【０１４９】
設計および方法：ＨＳＣは、本明細書において記載されている通りマウス骨髄間質細胞から培養する。ＩＧＦシグナル伝達は、マウスＨＳＣ培養物においてαＩＲ−３抗体を使用してＩＧＦ受容体をブロックすることによって阻害される。これらの実験において使用されるαＩＲ−３抗体は、マウス造血幹細胞を含む様々な細胞型においてＩＧＦシグナル伝達を有効にブロックすると発表されている１２。これらの実験において、ＩＧＦ受容体のブロッキングの成功は、ＩＧＦ１を細胞培養物に添加することおよびＨ３チミジン取り込みによって細胞増殖を測定することによって評価する。受容体ブロッキングの確認に続いて、ＨＢＤ、スクランブルペプチドおよび完全長ＩＧＦＢＰ−２を、ＨＳＣ培養物に添加し、細胞増殖をＨ３チミジン取り込みによって定量する。データは、本明細書に記載されている通りＡＮＯＶＡによって分析される。
【０１５０】
どのようなシグナル伝達事象がＩＧＦＢＰ−２のＨＢＤによって造血幹細胞において開始されるかの調査。
原理的説明。ＨＢＤは、ＰＴＥＮ発現を減少させることおよびＡＫＴリン酸化を増加させることによって骨芽細胞増殖を増加させることが示されている。ＩＧＦＢＰ−２がＨＳＣ増殖を増加させる機構は、決定されていない。骨芽細胞および造血細胞は、骨髄において極めて接近して一緒に存在し、多くの細胞シグナル伝達経路が、骨および造血のニッチの両方に共通している。ＨＢＤによって活性化されるシグナル伝達事象を決定するために、遺伝子発現プロファイリングを、ＨＢＤ、スクランブルペプチド、および完全長ＩＧＦＢＰ−２を含むまたは含まないＨＳＣ細胞培養物において実施する。ＰＣＲ遺伝子アレイによって、細胞増殖および／またはアポトーシス阻害のＨＳＣ増殖に対する寄与を決定する。
【０１５１】
設計および方法：ＨＳＣを、ＨＢＤ、完全長ＩＧＦＢＰ−２、およびスクランブルペプチドに、本明細書において記載されている通り曝露させる。ＲＮＡは、培養したＨＳＣから培養の１０日目に抽出する。ｃＤＮＡは、ＲＴ２  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｋｉｔ（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）を使用して、製造業者の指示に従って調製する。ｃＤＮＡ、Ｓｙｂｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＴ２  ｑＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）からなる実験カクテルの小アリコート（すなわち、２５μｌ）を、９６ウェルプレートフォーマット（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中のＰＣＲアレイの各ウェルに加える。ＰＣＲ増幅は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｉＱ５サーモサイクラーを使用して以下の設定で実施する：９５℃で１０分間の１サイクル、その後各９５℃で１５秒間の４０サイクルおよび各６０℃で１分間の４０サイクル。ベースラインおよび閾値は、手作業により決定される。ΔΔＣｔ（デルタ閾値変化）は、ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＰＣＲ  Ａｒｒａｙ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｗｅｂ  Ｐｏｒｔａｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ）を使用して各遺伝子について計算する。実験ΔＣｔ（デルタ閾値変化）と対照ΔＣｔの間の１より大きい倍率変化は、遺伝子の上方制御とみなされる。１未満の倍率変化は、遺伝子の下方制御とみなされる。３５より高いＣｔ値は陰性とみなされる。ＰＣＲアレイを、アポトーシス、造血幹細胞および血液生成、およびＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ、Ｗｎｔ、マップキナーゼおよびインスリンシグナル伝達経路について実施する。
【０１５２】
＜インビボでの骨髄移植に対するＩＧＦＢＰ−２のＨＢＤの効果の調査＞
骨髄移植において機能的なＩＧＦＢＰ−２のＨＢＤを使用してＨＳＣがインビトロで増殖するかどうかの決定。
原理的説明：ＨＳＣが移植の前に未分化のままであることが重要である一方、移植の成功は、十分な数の骨髄へのＨＳＣホーミングならびにまずは前駆体細胞におよび最終的には成熟したおよび機能的赤血球および白血球に分化することに依存する。ＨＢＤペプチドによりインビトロで増殖させたＨＳＣの、致死量の放射線を照射したレシピエントマウスに移植された場合に骨髄を再構築する、および定常状態の血液生成を維持する能力を試験する。
【０１５３】
設計および方法：Ｉｇｆｂｐ２＋／＋マウスからから回収し、ＨＢＤペプチドによりインビトロで増殖させたマウスＨＳＣを、Ｉｇｆｂｐ２＋／＋マウスに移植する。ＨＢＤペプチドによって同様に増殖させたヒト臍帯血由来のＨＳＣを、ヒト骨髄細胞の移植試験のために一般に使用される系統である非肥満性糖尿病の、重度の複合免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスに移植する。レシピエントマウスに、致死的な線量（ＩＧＦＢＰ２＋／＋では１０Ｇｙ）または致死量以下の線量（ＮＯＤ／ＳＣＩＤでは３．５Ｇｙ）の放射線照射を、Ｊ．Ｌ  Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  １４３−４５  Ｉｒｒａｄｉａｔｏｒを使用して、セッション間を４時間おいた２つのセッションで、セシウム供給源への曝露によって受けさせる。ヒトおよびマウスＨＳＣを、１０日間の培養において増殖させ、計数し、ＰＢＳ中に１０×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁する。３０μｌのドナーＨＳＣを、レシピエントマウスの眼窩後に移植する。移植後８週で、Ｉｇｆｂｐ２＋／＋およびＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスそれぞれにおいて、レシピエントマウスの末梢血を、ＬＹ５．２＋マウスドナー細胞およびＣＤ４５／７１＋ヒトドナー細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって決定することによって、骨髄生着の成功について試験する。８０％以上のドナー細胞の存在は、生着成功の指標となる。レシピエントマウスを移植後１６週で屠殺する。末梢血において主な血液細胞集団のパーセンテージを、Ｔｅｒ１１９（赤血球）、ＬＹ６Ｇ（Ｇｒ−１、骨髄系）、ＣＤ３（Ｔ細胞）、ＣＤ１９（Ｂ細胞）、およびＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ−１、マクロファージ）に対するコンジュゲート抗体を使用してフローサイトメトリーによって決定する。移植されたＨＳＣの生着の成功の機能的試験および自己再生能力の評価として、骨髄細胞を、レシピエントマウスの１つの大腿骨から移植後１６週で回収し、移植レシピエントの第２のセットのためのドナー細胞として使用する。これらの第２のセットのレシピエントを、最初の移植について記載されている通りモニタリングする。各試験および対照条件について３匹のマウスを移植し、移植は、各実験条件についてＮ＝６で少なくとも２つの独立した実験において実施する。ＡＮＯＶＡを使用して、群間の差異を以前に記載されている通り分析する。
【０１５４】
＜Ｉｇｆｂｐ２−／−マウスにおいて、ＨＢＤが、骨髄破壊後の骨髄再構築の効率を増加させるかどうかの調査＞
原理的説明。Ｉｇｆｂｐ２−／−骨髄移植レシピエントにおけるＩＧＦＢＰ−２の全体的な欠失は、ＩＧＦＢＰ−２陽性ドナー細胞の生着の成功を妨げないことが示されている。しかしながら、競合的再構築移植実験において見られるように、Ｉｇｆｂｐ２−／−マウスのドナー細胞は、Ｉｇｆｂｐ２＋／＋ドナー細胞と比較した場合３０％低い効率で生着する。総合すると、これらのデータは、ＩＧＦＢＰ−２が、骨髄へのＨＳＣホーミングの重要なレギュレーター、および造血幹細胞ニッチ内でＨＳＣを確立するためのコントリビューターであることを意味する。これらのステップは両方とも、移植の成功のために必要とされる。これらの実験における目的は、ＨＢＤペプチドをＩｇｆｂｐ２−／−移植レシピエントに同時投与することによって、Ｉｇｆｂｐ２−／−ドナー細胞の生着の効率減少をレスキューすることである。これらの実験は、骨髄細胞の生着を改善するＨＢＤの能力の機能的試験としての役割を果たす。
【０１５５】
設計および方法：ＬＹ５．１／ＬＹ５．２遺伝子系は、競合的実験において、骨髄を再構築するため、ドナー生着骨髄細胞をレシピエント内因性骨髄細胞と区別するために使用される。Ｂ６．ＳＪＬ−Ｐｔｐｒｃａｐｅｐｃｂ／ＢｏｙＪマウス系統（ＬＹ５．１陽性）を、競合相手骨髄ドナー細胞の供給源として使用する。すべてのレシピエントマウスは、ＬＹ５．２陽性である。ドナーおよびレシピエントマウスは、移植の時点で８週齢の雄である。ドナー骨髄細胞を得るために、マウスを屠殺し、大腿骨を無菌的に回収する。骨髄細胞を回収し、洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に３０μＬ注射体積当たり０．３×１０６細胞の濃度で再懸濁する。競合的再構築移植では、ＬＹ５．１＋ドナー細胞をＬＹ５．２＋（Ｉｇｆｂｐ２−／−またはＩｇｆｂｐ２＋／＋）ドナー細胞と１：０（１００％ＬＹ５．１ドナー細胞、陽性対照）、１：３および１：６の比で混合する。ＨＢＤペプチド、スクランブルペプチド、または完全長ＩＧＦＢＰ２を、ドナー細胞調製物に以前のインビボ実験において最適化された濃度（５０μｇ／３０μＬ）で添加する。レシピエントマウスに致死量の放射線を照射し、本明細書において記載されている通り移植する。移植後８週で、ＬＹ５．１陽性およびＬＹ５．２陽性の生着ドナー細胞のパーセンテージを、末梢血においてフローサイトメトリーによって決定する。移植レシピエントを移植後１６週で屠殺し、白血球集団をフローサイトメトリーによって分析する。骨髄中に存在するＨＳＣを定量し、ＦＡＣＳＡｒｉａセルソーターを使用して選別する。選別した細胞を培養し、コロニー形成単位数を、標準的なコロニー形成細胞培養アッセイ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において決定する。加えて、移植されたＨＳＣ機能性を、本明細書に記載されている通り実施される移植の第２のセットによって評価する。各試験および対照条件について３匹のマウスを移植し、移植を、各実験条件についてＮ＝６で少なくとも２つの独立した実験において実施する。ＡＮＯＶＡを使用して、試験（Ｉｇｆｂｐ２−／−）および対照（Ｉｇｆｂｐ２＋／＋）レシピエントの群平均間の統計学的有意性を評価する。信頼区間は、０．０５以下に設定する。
【０１５６】
実施例１２に関する参考文献リスト
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【０１５７】
前述したものは本発明の例示であり、それを限定するものと解釈されるべきではない。本発明は、以下の特許請求の範囲によって定義され、特許請求の範囲の等価物は、特許請求の範囲に含まれる。
【０１５８】
【表３】
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【０１５９】
【表４】
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【０１６０】
【表５】
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【０１６１】
【表６】
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【０１６２】
【表７】
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【０１６３】
【表８】
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【０１６４】
【表９−１】
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【表９−２】
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【表９−３】
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【表９−４】
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【表９−５】
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【表９−６】
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【表９−７】
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【表９−８】
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【表９−９】
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【表９−１０】
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【表９−１１】
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【表９−１２】
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【表９−１３】
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【表９−１４】
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【表９−１５】
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【表９−１６】
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【表９−１７】
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【表９−１８】
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【表９−１９】
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【表９−２０】
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【表９−２１】
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【表９−２２】
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【表９−２３】
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【表９−２４】
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【表９−２５】
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【表９−２６】
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【表９−２７】
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【表９−２８】
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【表９−２９】
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【表９−３０】
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【表９−３１】
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【表９−３２】
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【表９−３３】
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【表９−３４】
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【表９−３５】
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【表９−３６】
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【表９−３７】
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【表９−３８】
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【表９−３９】
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【表９−４０】
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【図１Ｄ】
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【図２Ｂ．２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ｃ−３Ｅ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ−４Ｅ】
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【図４Ｆ−４Ｈ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１Ａ−１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図３Ａ．３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図５Ａ−５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８Ａ−８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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