(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンゴージンジャー（Curcuma amada ROXB.）の植物体若しくはその抽出物、及び／又は高麗人参（Panax Ginseng）若しくはその抽出物を含んでなるTie2（tyrosine kinase with Ig and EGF homology domain-2）活性化剤（Tie2活性剤として使用せずに、むくみ改善又は予防の目的として使用する場合を除く）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マンゴージンジャー（Curcuma amada ROXB.）の植物体若しくはその抽出物及び／又は高麗人参（Panax Ginseng）若しくはその抽出物を含んで成る新規なTie2活性化剤、及び当該活性化剤を含んで成るリンパ管の安定化剤を提供する。
【背景技術】
【０００２】
血液は、心臓から送り込まれて毛細血管・静脈を経て心臓へもどる。この血管系とは別個に組織液の排水路を形成するものがリンパ管である。リンパ管は、末梢組織で血管から漏出した間質液、タンパク質、脂肪、細胞などを血管系へと環流することにより血液量を一定に保ち、閉鎖循環系を維持する。皮膚に存在する毛細血管では、内皮細胞の外側を基底膜が取り囲み、さらに周皮細胞が付着している。一方、毛細リンパ管では、内皮細胞の外には基底膜がほとんどなく、周皮細胞の付着もない。この構造が、効率よく間質から体液や細胞を取り込むために役立っている（非特許文献１）。これまでに、チロシナーゼ型受容体VEGFR(vascular endothelial growth factor receptor)-3がリンパ管内皮細胞に特異的に発現することが示され、そのリガンドであるVEGF-CおよびVEGF-Dがリンパ管の新生を誘導することが示された。また、VEGF-Aはリンパ管内皮細胞に発現するVEGFR2を介してリンパ管新生を誘導していることが明らかになった（非特許文献２）。さらに、リンパ管の機能に関しては、以下の報告がある。VEGF-Aを発現するアデノウイルスを感染させたマウス耳では、顕著なリンパ管新生が見られたが、構造的な異常とともに、コロイダルカーボンを耳に注入した実験から、リンパ管の回収機能も顕著に阻害されていることが明らかになった（非特許文献３）。つまり、リンパ管の機能にはリンパ管内皮細胞が適切に配置して裏打ちされていることが必要であると考えられる。これをわれわれは“リンパ管の安定化”と定義する。
【０００３】
皮膚に対する物理的あるいは化学的刺激は血管新生やVEGF-Aなどによる血管透過性亢進を誘導して、この結果組織液の貯留と浮腫が生じる。一方で、これらの刺激は直接的にリンパ管の新生・拡張を誘導することも知られている。これまでに、紫外線炎症によってリンパ管の拡張が観測され、染料を注入した実験からリンパ管の機能が障害されていることが明らかになった。血管拡張に伴う水分の真皮内への漏出にともない、リンパ管は拡張して間質液を回収しようとしていると考えられる。しかしながら、過剰なリンパ管の拡張はその回収機能を逆に低下させ浮腫を遅延していると考えられた（非特許文献４）。つまり、組織間液の速やかな回収には、リンパ管の過剰な拡張を誘導しないような“リンパ管の安定化”が必要であると考えられる。
【０００４】
これまでに、リンパ管の機能不全が関与する病態としては、先天性リンパ浮腫とともに、フィラリア、手術、悪性腫瘍、炎症にともなう二次性のリンパ浮腫が知られている。先天性のリンパ浮腫としてはMilroy病、Meige病、lymphedema-distichiasis症候群がある。Milroy病ではリンパ管の無形成や低形成が報告され、一方でlymphedema-distichiasis症候群ではリンパ管の過形成が報告されている。これらからも、リンパ管の新生だけではなくリンパ管の安定化によって回収機能を保持することが必要であると考えられる（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】実験医学  Vol. 24, No. 18 (2006), pp. 133-138
【非特許文献２】Jussila L and Alitalo K, (2006) Vascular growth factors and lymphangiogenesis. Phisiol Rev 82:673-700
【非特許文献３】Nagy et al., (2002) Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor induces lymphangiogenesis as well as angiogenesis. J Exp Med 196: 1497-1506
【非特許文献４】Kajiya K., Hirakawa S., and Detmar M., (2006) VEGF-A mediates UVB-induced impairment of lymphatic vessel function. Am J Pathol 169: 1496-1503
【非特許文献５】実験医学  Vol. 24, No. 18 (2006), pp. 139-143
【非特許文献６】Kajiya K., et al., (2005) Hepatocyte growth factor promotes lymphatic vessel formation and function. EMBO J 24:2885-95
【非特許文献７】実験医学  Vol. 20, No.8 (2002), pp. 52-57
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、新規なTie2活性化剤の提供、延いてはリンパ管の安定化を図り、リンパ管の回収機能を維持・亢進するのに有効な薬剤の提供にある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
VEGFが分子クローニングされたのを皮切りに血管形成に特異的に作用する因子としてVEGFファミリーとアンジオポエチン（angiopoietin；Ang）ファミリーの分子が次々に同定されてきた。VEGFとその受容体は脈管形成とよばれる血管の初期発生からその後の血管新生に至るまで非常に広い範囲の血管形成に関与する。一方、Angは脈管形成後、血管内皮細胞による発芽、分枝、嵌入、退縮などの細胞現象を伴った管腔形成において機能する。Angは血管内皮細胞に発現する受容体型チロシンキナーゼTie（tyrosine kinase with Ig and EGF homology domain）-2を介し、血管内皮細胞と、周皮細胞（ペリサイト）や血管平滑筋細胞のような血管壁細胞との接着を制御し、血管の構造的安定化に機能していることが報告されている（非特許文献７）。
【０００８】
以前の研究で本発明者は、Ang-1とリンパ管内皮細胞で発現しているTie2との関係に着目してAng-1の機能について調べた結果、Ang-1はTie2の活性化を介してリンパ管の回収機能を促進することを明らかにした（特願2010-517947号）。更に、本発明者がTie2活性化能を有する化合物についてスクリーニングを行ったところ、マンゴージンジャー（Curcuma amada ROXB.）の植物体若しくはその抽出物、及び／又は高麗人参（Panax Ginseng）若しくはその抽出物が、Ang-1と同様にTie2活性を有することを見出し、以下の発明を完成するに至った：
（１）マンゴージンジャー（Curcuma amada ROXB.）の植物体若しくはその抽出物、及び／又は高麗人参（Panax Ginseng）若しくはその抽出物を含んで成るTie2活性化剤。
（２）前記Tie2活性化剤を含んで成るリンパ管の安定化剤。
（３）（２）のリンパ管の安定化剤を適用することからなる、むくみを改善又は予防するための美容学的方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係るリンパ管の安定化剤を使用することにより、むくみ等の改善・予防が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、マンゴージンジャー（Curcuma amada ROXB.）抽出物又は高麗人参（Panax Ginseng）抽出物を添加した場合の、正常ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（HUVEC）におけるリン酸化Tie2量の変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
Tie2活性化剤
１つの観点において、本発明はマンゴージンジャー（Curcuma amada ROXB.）の植物体若しくはその抽出物、及び／又は高麗人参（Panax Ginseng）若しくはその抽出物を含んで成るTie2活性化剤を提供する。
【００１２】
Tie2の活性化とは、Tie2をリン酸化することでその活性体（リン酸化Tie2）に変換できる能力をいう。Tie2の活性化剤として、アンジオポエチン１など、Tie2を活性化する活性を有することが周知のものや、本発明者によってTie2活性が見出されたジフェンヒドラミン若しくは塩酸ジフェンヒドラミン、ニッケイ（Cinnamomum)属植物由来の抽出物、あるいはシリンガレシノールや２−メトキシケイヒアルデヒドなどがある。
【００１３】
本発明で用いるマンゴージンジャー（Curcuma amada ROXB.）はショウガ科ウコン属に
属する植物で、インドの野生に分布または栽培される一年草本である。マンゴージンジャー（C. amada）は生のままでも乾燥したものでも使用することができるが、使用性、製剤化等の点から乾燥粉末あるいは溶媒抽出物として用いることが好ましい。マンゴージンジャーの使用部位としては、全草、葉、塊根、花、種子等、任意に用いられ得る。中でも塊根部が好ましく用いられる。
【００１４】
マンゴージンジャーの抽出物は常法より得ることができ、例えば、マンゴージンジャーを必要により乾燥した後、抽出溶媒に一定期間浸漬するか、あるいは加熱還流している抽出溶媒と接触させ、次いで濾過し、濃縮して得ることができる。抽出溶媒としては、通常抽出に用いられる溶媒であれば任意に用いることができ、例えば、水、メタノール、エタノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン等のアルコール類、クロロホルム、ジクロルエタン、四塩化炭素、アセトン、酢酸エチル等の有機溶媒を、それぞれ単独あるいは組み合わせて用いることができる。上記溶媒で抽出して得た抽出液をそのまま、あるいは濃縮したエキスを用いるか、あるいはこれらエキスを吸着法、例えばイオン交換樹脂を用いて不純物を除去したものや、ポーラスポリマー（例えばアンバーライトＸＡＤ−２）のカラムにて吸着させた後、メタノールまたはエタノールで溶出し、濃縮したものも使用することができる。また分配法、例えば水／酢酸エチルで抽出した抽出物等も用いられる。
【００１５】
このようにして得たマンゴージンジャー抽出物は、安全性が高く、優れたTie2活性化作用を有する。マンゴージンジャーについては、特開2010-222313などで、ヒアルロン酸産生促進効果が知られているが、マンゴージンジャーおよびその抽出物にTie2活性化作用があることはこれまで全く知られておらず、本発明者によってこれら作用をもつことが初めて確認されたものである。マンゴージンジャー抽出物は、例えば「マンゴージンジャー乾燥エキスＦ」（丸善製薬（株））等として市販されており、これら市販品を用いてもよい。
【００１６】
本発明に用いられる高麗人参は、（学名：Panax Ginseng ）として広く知られ、漢方薬として、その薬効が知られている。生のままでも乾燥したものでも使用することができるが、使用性、製剤化等の点から乾燥粉末あるいは溶媒抽出物として用いることが好ましい。抽出物としては、高麗人参（学名：Panax Ginseng ）の根の抽出物が最も好ましいが、高麗人参の葉，茎，枝，花，果実等にも有効成分が含まれているので、これらのうちいずれか一つ又は二つ以上の抽出物を使用することもできる。また、高麗人参を圧搾することにより得られる圧搾液にも抽出物と同様の有効成分が含まれているので、抽出物の代わりに高麗人参の圧搾液を使用することもできる。
【００１７】
高麗人参からの有効成分の抽出方法は特に限定されるものではなく、マンゴージンジャーの場合と同様であるので、その詳細な説明は省略する。ある実施態様によれば、高麗人参の根を例えば水又は水性有機溶剤中に浸漬し、室温又は８０℃〜１００℃にて抽出する。抽出処理により得られた抽出液をろ過後、そのまま又は必要に応じて濃縮若しくは乾固して使用することができる。なお、この抽出処理の際には、高麗人参の根は細断又は粉砕したものを用いてもよい。また、生の根又は乾燥した根を用いてもよいし、焙煎した根を用いてもよい。焙煎方法は特に限定されるものではないが、１００℃〜１５０℃で０．５時間〜２時間焙煎する方法があげられる。
【００１８】
このようにして得た高麗人参抽出物は、安全性が高く、優れたTie2活性化作用を有する。高麗人参抽出物については、例えば特開2003-238365で育毛剤としての利用が報告されているが、高麗人参及びその抽出物にTie2活性化作用があることはこれまで全く知られておらず、本発明者によってこれら作用をもつことが初めて確認されたものである。高麗人参抽出物は、例えば「高麗人参エキスパウダーＭＦ」（丸善製薬（株））等として市販されており、これら市販品を用いてもよい。
【００１９】
本発明においてマンゴージンジャー植物体若しくはその抽出物、及び高麗人参抽出物は、各々単独で用いても、組み合わせて用いてもよい。Tie2活性化剤中のマンゴージンジャー抽出物及び／又は高麗人参抽出物の配合量は、剤全量中、０．００１〜１０質量％、好ましくは、０．０１〜１．０質量％、より好ましくは０．１〜１.０質量％である（乾燥質量）。
【００２０】
リンパ管安定化剤
別の観点において、本発明は、前記Tie2活性化剤を含んで成る、リンパ管安定化剤を提供する。
【００２１】
本発明に係るリンパ管安定化剤はリンパ管の構造の不安定化を原因とするリンパ液の漏出による様々な皮膚疾患、例えば浮腫（むくみ）の治療・予防に有効な医薬品または化粧品として利用できる。浮腫には、例えば紫外線照射、フィラリア、手術、悪性腫瘍、炎症にともなう二次性のリンパ浮腫や、先天性リンパ浮腫、例えばMilroy病、Meige病、lymphedema-distichiasis症候群がある。
【００２２】
本発明に係るリンパ管安定化剤は、その使用目的に合わせて用量、用法、剤型を適宜決定することが可能である。例えば、本発明のリンパ管安定化剤の投与形態は特に制限されるものではなく、経口、非経口、外用等であってよいが、好ましくは外用剤である。剤型としては、例えば軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、浴用剤等の外用剤、注射剤、点滴剤、若しくは坐剤等の非経口投与剤、又は錠剤、粉剤、カプセル剤、顆粒剤、エキス剤、シロップ剤等の経口投与剤を挙げることができる。
【００２３】
本発明のリンパ管安定化剤中のTie2活性化剤の配合量は、用途に応じて適宜決定できるが、一般には剤全量中、0.0001〜20.0モル％配合でき、好ましくは0.0001〜10.0モル％、より好ましくは０．１〜１モル％である。
【００２４】
また、本発明のリンパ管安定化剤には、Tie2活性化剤以外に、例えば、通常の食品や医薬品に使用される賦形剤、防湿剤、防腐剤、強化剤、増粘剤、乳化剤、酸化防止剤、甘味料、酸味料、調味料、着色料、香料等、化粧品等に通常用いられる美白剤、保湿剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色剤、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
【００２５】
さらに、本発明のリンパ管安定化剤を皮膚外用剤として使用する場合、皮膚外用剤に慣用の助剤、例えばエデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属封鎖剤、カフェイン、タンニン、ベラパミル、トラネキサム酸およびその誘導体、甘草抽出物、グラブリジン、カリンの果実の熱水抽出物、各種生薬、酢酸トコフェロール、グリチルリチン酸およびその誘導体またはその塩等の薬剤、ビタミンＣ、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、コウジ酸等の美白剤、グルコース、フルクトース、マンノース、ショ糖、トレハロース等の糖類、レチノイン酸、レチノール、酢酸レチノール、パルミチン酸レチノール等のビタミンA類なども適宜配合することができる。
【００２６】
美容方法
更に別の観点において、本発明は、リンパ管の安定化剤を適用することからなる、むくみを改善又は予防するための美容学的方法、を提供する。
【００２７】
本発明に係る美容方法は、むくみや目袋の軽減・予防を目的とするものである。この美容学的方法は、例えば本発明に係るリンパ管安定化剤をむくみなどのある部位に適用し、そのまま放置するか又は例えばリンパ管の流れの方向に即してマッサージなどを施し、リンパ管液の流れを促進するなどして行うことができる。この方法の適用箇所には顔面、首、手足、など、全身のあらゆる部位が挙げられる。
【実施例】
【００２８】
次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
【００２９】
血管内皮細胞のウエスタンブロッティング
Tie2を発現する正常ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（HUVEC）は、三光純薬より購入した。増殖因子などの添加因子を加えたEBM-2（Cambrex; Verviers, Belgium）中でHUVECを培養した後、濃度質量０．１％の各マンゴージンジャー抽出物（マンゴージンジャー乾燥エキスＦ、丸善製薬（株）製）及び高麗人参抽出物（高麗人参エキスパウダーＭＦ、丸善製薬（株）製）存在下でHUVEC内のタンパク質をPhosphosafe Extraction Reagent（Novagen, Madison, WI）で抽出した。コントロールとしてＤＭＳＯを添加したHUVECも調製した。
【００３０】
総タンパク量をRC DC Protein Assay Kit（BIO-RAD, Hercules, CA） にて定量し、以下のようにウエスタンブロッティングして検出した。等量の総タンパク量を７．５％アクリルアミドゲル（NPU-7.5L, ATTO, Japan）でSDS−PAGEを行い、Tie2およびリン酸化Tie2のタンパク質の発現は、抗体（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）を用いて、ECL  Kitにより発色させた。
【００３１】
図１の結果より、コントロールのＤＭＳＯと比較して、各マンゴージンジャー抽出物及び高麗人参抽出物が顕著なTie2活性化作用を示すことが分かる。Tie2活性化能を有するAng-1がリンパ管の回収機能を促進することから、これらの薬剤もAng-1と同様にリンパ管の安定化作用を奏するものと考えられる。
【図１】
0005926895.tif 000002