(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルソータシステムから分取された細胞を受けるキャリアにおいて、
複数の中空の偏向チューブであって、各偏向チューブが、第１の末端に第１の開口部、および第２の末端に第２の開口部を有する偏向チューブ、
前記複数の偏向チューブに対応する複数の収集チューブであって、各収集チューブが、対応する偏向チューブを通過して出てきた細胞を受けるように配置された開口部を含む収集チューブ、ならびに
少なくとも１つの偏向チューブに連結された電流検出回路
を備えることを特徴とするキャリア。
【請求項２】
各偏向チューブが電気的に絶縁されていることを特徴とする請求項１に記載のキャリア。
【請求項３】
各収集チューブが電気的に絶縁されていることを特徴とする請求項１または２に記載のキャリア。
【請求項４】
各偏向チューブに連結された電流検出回路をさらに備えることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のキャリア。
【請求項５】
前記電流検出回路は、偏向チューブに入る荷電液滴の存在を検出するための電流電圧変換器を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のキャリア。
【請求項６】
前記電流検出回路は、偏向チューブに入る単位時間当たりの液滴の数を検出するための積分器を有することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のキャリア。
【請求項７】
各偏向チューブは、金属材料またはプラスチック材料から形成されることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のキャリア。
【請求項８】
前記第１の開口部が全て同一直線上になるように、各偏向チューブの第１の開口部が、隣接する偏向チューブの第１の開口部と整列されていることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載のキャリア。
【請求項９】
各偏向チューブの第２の開口部が、隣接する偏向チューブの第２の開口部と相互に互い違いの配置であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載のキャリア。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のキャリアを含むことを特徴とするセルソータシステム。
【請求項１１】
それぞれの偏向チューブを通過した細胞が予想と一致しない場合を特定するように構成されているコンピュータプロセッサをさらに含むことを特徴とする請求項１０に記載のセルソータシステム。
【請求項１２】
前記キャリアを動作停止位置に移動するモータをさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載のセルソータシステム。
【請求項１３】
各偏向チューブの第２の開口部が、隣接する偏向チューブの第２の開口部と相互に互い違いの配置であることを特徴とする請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のセルソータシステム。
【請求項１４】
セルソータシステムにより分取された細胞を受けるためのキャリアを形成する方法において、
各偏向チューブの第１の開口端が、隣接する偏向チューブの第１の開口端と同一線上に配置するように、複数の中空偏向チューブを整列させること、
各収集チューブの開口部が、偏向チューブを通過し、出てきた細胞を受ける配置になるように、複数の対応する収集チューブを位置決めすること、ならびに
少なくとも１つの偏向チューブに電流検出回路を連結すること
を有することを特徴とする方法。
【請求項１５】
各偏向チューブの第２の開口部が、隣接する偏向チューブの第２の開口部と相互に互い違いの配置であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
セルソータシステムから分取された細胞を受けるように構成された物品において、
複数の中空の偏向チューブであって、各偏向チューブが、第１の末端に第１の開口部、および第２の末端に第２の開口部を有する偏向チューブ、
前記複数の偏向チューブに対応する複数の収集チューブであって、各収集チューブが、対応する偏向チューブを通過して出てきた細胞を受けるように配置された開口部を含む収集チューブ、ならびに
少なくとも１つの偏向チューブに連結された電流検出回路
を備えることを特徴とする物品。
【請求項１７】
各偏向チューブが電気的に絶縁されていることを特徴とする請求項１６に記載の物品。
【請求項１８】
各偏向チューブに連結された電流検出回路をさらに備えることを特徴とする請求項１６または１７に記載の物品。
【請求項１９】
前記電流検出回路は、偏向チューブに入る荷電液滴の存在を検出するための電流電圧変換器を有することを特徴とする請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の物品。
【請求項２０】
前記電流検出回路は、偏向チューブに入る単位時間当たりの液滴の数を検出するための積分器を有することを特徴とする請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の物品。
【請求項２１】
前記第１の開口部が全て同一直線上になるように、各偏向チューブの第１の開口部が、隣接する偏向チューブの第１の開口部と整列されていることを特徴とする請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の物品。
【請求項２２】
各偏向チューブは金属材料を有し、各収集チューブはプラスチック材料を有することを特徴とする請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の物品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フローサイトメータ、ならびに細胞等の粒子の高速同定および分取用装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
フローサイトメトリは、生物学的粒子、例えば、細胞および構成分子の分析および単離に有用な方法である。従って、広範囲の診断および治療への用途がある。この方法は、流体の流れを利用して、直線的に粒子を分離させ、それにより、粒子は一列に並んで検出装置を通過することができる。個別の細胞は、流体の流れ中のそれらの位置および検出可能マーカーの存在により識別できる。従って、フローサイトメータを使って、生物学的粒子集団の診断プロファイルを作成できる。
【０００３】
生物学的粒子の単離は、フローサイトメータに選別または収集能力を付与することにより実現されている。１つまたは複数の所望の特性を有するものと検出された、分離された流れ中の粒子は、それぞれ、機械的または電気的除去により試料浮遊液の流れから単離される。通常のフローソーティング技術は、直線的に分離された粒子を含む流体の流れが壊されて液滴になり、目的の粒子を含む液滴が電気的に荷電され、電場を通過することにより収集チューブ内へ偏向させられる液滴分取を利用する。
【０００４】
典型的な例では、流れ中で直線的に分離された粒子は、ノズル端の直下に位置する観測点を通過する際に特性評価される。粒子が１つまたは複数の所望の基準に合致すると特定されるとすぐに、液滴がブレークオフ点（ＢＯＰ）に達し、流れから液滴になる時間が予測できる。理想的には、選択粒子を含む液滴が流れから形成される直前に、流体の流れに短時間の電荷を印加し、その後、液滴形成の直後に、接地される。流体の流れから液滴が形成されると、分取される液滴は電荷を維持し、他の全ての液滴は、無電荷のまま残される。荷電液滴は、電場により他の液滴の下向き軌道から横向きに偏向され、試料チューブに集められる。無電荷液滴は、直接ドレインに落下する。
【０００５】
液滴ソータは、液滴に電荷を印加する（典型的な例では、５０〜１５０ボルト）ことにより目的の細胞を含む液滴を偏向させる。液滴は、静電場により偏向され、電荷に応じて、異なる軌道を経由して収集チューブに到達する。細胞は、異なる電荷を印加することにより複数のグループに分配でき、それぞれの離散的な電荷により、液滴が特定のチューブに導かれる。最初、細胞集団は、２つのグループ：左と右のソートに分けられた。最近、ソート方向（グループ）の数は、４（大部分のソータ）、さらには６まで増やされた。複数の収集チューブを有するフローサイトメータシステムの一例は、米国特許第５，４８３，４６９号で提供されている。この特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００６】
ソート方向の数は、現在、液滴が分配される軸上に配置できる収集チューブの数によって制限されている。液滴の１つの方向での典型的な広がりは、約２２ｍｍである。チューブの中心は、１４ｍｍ離れており、そのため、ようやく３つのグループを分取できる。
【０００７】
チューブサイズは、ソート方向の数を制限する唯一の因子ではない。液滴が電荷を持つため、分取された液滴を近接近状態で配置することもまた難しい。このように、荷電液滴は、相互に反発し合う。液滴が集まってより大きな容積になるにつれ、電荷は、不釣り合いに急速に成長する。電荷の蓄積のために、分取された細胞容積は、より小さい液滴に分解し易い傾向がある。これらの液滴は、反発し、相互に押しのけ、液滴を不規則に飛び回らせる原因となり、反対の電荷の液滴を含む隣接したチューブ内に飛び込む場合さえあり、従って、分取の純度に大きな影響を及ぼす。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】欧州特許出願公開第０１５４６８７号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本明細書で提供されるのは、改良されたマルチウェイセルソータシステムおよび方法である。例えば、提供されるのは、複数の方向に分取された細胞の収集のためのシステムおよび方法である。このシステムおよび方法は、マルチウェイソータ（例えば、現状では４方向分取のみ可能なスペースでの１０方向分取ソータ）の構成を可能とする。さらに、この装置は、試料チューブの位置で液滴（目的の細胞を含む）の到着を能動的に検知し、液滴の到着が予測パターンから逸脱すると、警告を発することができる。このようなシグナルを使って、収集チューブを安全な位置に移動し、分取された試料の汚染を防ぐことが可能となる。この装置は、臨床的分取に望ましい。装置は、また、使い捨てユニットとしても適する。
【００１０】
提示されるシステムおよび方法は、液滴蓄積の問題を克服し、流れの安定性に影響することなく、偏向された液滴の流れをより近接近して配置することを可能とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
提示される代表的システムおよび方法は、両端が開口した分取チューブ（または偏向チューブ）の列から構成される分取液滴容器（またはキャリア）を含む。偏向された液滴は、従って、分取チューブの内側に向かう。各分取チューブは、個別に接地され、液滴の偏向電荷は、害を及ぼさない形で、対地へ偏向される。従って、液滴は、もはや電荷を持たず、より大きな液滴に成長し、分取チューブを滑り落ちることができる。各分取チューブは、試料捕集チューブの開口部に挿入される。分取チューブは、曲げることができるので、もはや収集チューブを線に沿って配置する必要はなく、互い違いのパターンで配置できる。このように、従来では、直線上に配置された３つのチューブを収容していた収集領域に、今や、互い違いの配置で５つのチューブを収容できる。分取チューブは、収集チューブより狭い幅にできるので、チューブの底部を２０×３０ｍｍ領域に設置された５つの互い違いの収集チューブに繋げて、５つの分取チューブの上部を２０ｍｍの線に沿って配置できる。
【００１２】
一実施形態では、１０個の分取チューブを有する１０個の収集チューブの配置を、標準的顕微鏡スライドの領域上に適合させることができる。顕微鏡スライドの寸法のプラスチックキャリアは、約１０個の薄壁ステンレス鋼偏向チューブを保持できる。１０個の偏向チューブは、プラスチックキャリアの底に結合された１０個のプラスチック収集チューブに繋がる。全ユニットは、１つの無菌および使い捨てユニットとして利用できる。
【００１３】
分取チューブの上部は、また、適切な場合、封止できる。例えば、システムは、個別金属分取チューブ中に沈積した電荷を測定することにより、分取画分中の液滴の到着をモニタできる。金属分取チューブが、可変積分時間機能を有する電流電圧変換器を介して接地されている場合、各分取チューブで測定された電圧は、各チューブ中に沈積した単位時間当たりの液滴の数を表す。コンピュータプログラムは、各分取方向に対して生成される予想電圧を予測するように構成できる。測定電圧が予想電圧と異なる場合、コンピュータは、ステッピングモータに対して、分取チューブに蓋をするか、または収集トレイを安全な遮蔽された（またはそうでなければ動作停止された）位置に移動する指示を出し、分取画分の望ましくない細胞による汚染を防止できる。
【００１４】
提示されるキャリアは、流入設計に何ら変更の必要がなく、マルチウェイ（例えば、１０方向）ソータとして全ての現状の流入ソータで使用可能である。各チューブ中に沈積した細胞数の連続的なモニタの実現性は、また、現状のセルソータで利用できない安全装置を提供する。この制御装置は、細胞画分の純度に対する高度の信頼性の必要な分取にとって、非常に望ましいものであるはずである。
【００１５】
添付の図面は、本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する。本明細書と一緒に、これらの図面は、本発明によるシステムおよび方法の原理を説明し、当業者がこのシステムおよび方法を製造し使用することを可能とするためにさらに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本明細書で提示される一実施形態によるマルチウェイセルソータキャリアの部分斜視図である。
【図２】図１のマルチウェイセルソータキャリアの部分側面図である。
【図３】図１のマルチウェイセルソータキャリアの部分正面図である。
【図４】図１のマルチウェイセルソータキャリアの部分上面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下の詳細説明では、セルソータシステム用キャリアの代表的実施形態を示す添付された図を参照する。他の実施形態も可能である。発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、本明細書記載の実施形態に対し変更を行うことができる。従って、以下の詳細説明は限定を意図するものではない。
【００１８】
図１は、本明細書で提示される一実施形態によるマルチウェイセルソータキャリア１００の部分斜視図である。図２は、マルチウェイセルソータキャリア１００の部分側面図である。図３は、マルチウェイセルソータキャリア１００の部分正面図である。図４は、マルチウェイセルソータキャリア１００の部分上面図である。キャリア１００は、セルソータシステムに組み込むことができる。代表的なセルソータシステムは、米国特許第５，４８３，４６９号で与えられている。この特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００１９】
示された実施形態で、キャリア１００は、複数の偏向（または分取）チューブ１０２および対応する収集チューブ１０４を含む。各偏向チューブ１０２は、両端に開口部を有する中空体である。偏向チューブ１０２の開口部１０６は、偏向軸に沿って同一線上に相互に配列されている。このように、キャリア１００がセルソータシステムに組み込まれる場合、偏向チューブ１０２の開口部１０６は、偏向された荷電液滴を受ける。
【００２０】
各偏向チューブ１０２の第２の開口部は、収集チューブ１０４中の対応する開口部に対して配置される。従って、偏向チューブ１０２中に受けられた荷電液滴は、収集チューブ１０４中に滑り込む。キャリア１００で使用される収集チューブの間隔および数を最大にするために、収集チューブ１０４は、互い違いの配置に置かれることが好ましい。偏向チューブ１０２および収集チューブ１０４の位置決めを容易にするために、ならびに／または偏向チューブ１０２および収集チューブ１０４の間の連結を確実にするために、キャリアプレート１０８が使用される。図に示されるように、５個の偏向チューブ１０２および５個の収集チューブ１０４のみが示されている。しかし、一実施形態では、１０個以上までの偏向チューブおよび収集チューブを使用可能である。
【００２１】
一実施形態では、各偏向チューブ１０２は、電気伝導材料（例えば、ステンレス鋼等の金属）から作られる。各収集チューブ１０４は、軽量プラスチック材料から作ることができる。キャリアプレート１０８は、プラスチック材料から形成できる。
【００２２】
別の実施形態では、各偏向チューブ１０２は、電流電圧変換器（ＣＶＣ）（図示せず）にさらに連結され、これは適宜接地される。ＣＶＣの接地により、偏向チューブ１０２に受けられた液滴の電荷の除去が可能となる。さらに、ＣＶＣは、偏向チューブ１０２での電流の測定を可能とし、この電流は、偏向チューブ１０２に到着した荷電液滴の関数である。従って、各別の偏向チューブ１０２中に沈積した電荷の測定により、キャリア１００での液滴の到着をモニタできる。偏向チューブ１０２が、可変積分時間機能を有するＣＶＣ経由で接地されている場合、各偏向チューブで測定された電圧は、各チューブ中に沈積した単位時間当たりの液滴の数を表す。コンピュータプログラムは、各分取方向に対して生成される予想電圧を予測するように構成できる。測定電圧が予想電圧と異なる場合、コンピュータは、ステッピングモータに対して、キャリアに蓋をするか、またはキャリアを安全な遮蔽された、および／または動作停止された位置に移動する指示を出し、キャリアの望ましくない細胞による汚染を防止できる。
【００２３】
さらに別の実施形態では、各偏向チューブ１０２は、２つの分割片１０２ａ、１０２ｂを含んでもよい。偏向チューブの分割は、チューブの「屈曲」により形成してもよい。偏向チューブは曲げることができるため、収集チューブは、もはや線に沿って配置する必要がなく、互い違いのパターンで配置できる。このように、従来では、直線上に配置された３つのチューブを収容していた収集領域に、今や、互い違いの配置で５つのチューブを収容できる。偏向チューブは、収集チューブより狭い幅にできるので、チューブの底を２０×３０ｍｍ領域に設置された５つの互い違いの収集チューブに繋げて、５つの偏向チューブの上部を２０ｍｍの線に沿って配置できる。
【００２４】
さらに別の実施形態では、セルソータシステムから分取された細胞を受けるキャリアが提供される。キャリアは、複数の中空偏向チューブおよび複数の対応する収集チューブを含む。各偏向チューブは、第１の末端に第１の開口部、および第２の末端に第２の開口部を含む。各偏向チューブの第１の開口部は、第１の開口部が全て同一線上になるように、隣接する偏向チューブの第１の開口部と整列される。複数の偏向チューブの第２の開口部は、相互に互い違いの配列になる。各収集チューブは、対応する偏向チューブを通過し、出てきた細胞を受けるように配置された開口部を含む。一実施形態では、各偏向チューブおよび／または各収集チューブは、電気的に絶縁されている。一実施形態では、キャリアは、少なくとも１つの偏向チューブに連結された電流検出回路、または各偏向チューブに連結された電流検出回路をさらに含む。電流検出回路は、偏向チューブに入る荷電液滴の存在を検出する電流電圧変換器、および／または偏向チューブに入る単位時間当たりの液滴の数を検出する積分器をさらに含んでもよい。各偏向チューブは、金属の材料で形成されていてもよい。各収集チューブは、プラスチック材料から形成されていてもよい。一実施形態では、キャリアは、１０個以上の偏向チューブおよび１０個以上の対応する収集チューブを含む。
【００２５】
さらに、セルソータシステムにより分取された細胞を受けるためのキャリアを形成する方法が提供される。この方法は、各偏向チューブの第１の開口端が隣接する偏向チューブの第１の開口端と同一線上に位置するように、複数の中空偏向チューブを配列することを含む。各偏向チューブの第２の開口端は、隣接する偏向チューブの第２の開口端に対し互い違いに配置される。方法は、各収集チューブの開口部が対応する偏向チューブを通過し、出てきた細胞を受ける配置になるように、複数の対応する収集チューブの位置決めを行うことをさらに含む。各偏向チューブは、電気的に絶縁されてもよい。各収集チューブは、電気的に絶縁されてもよい。方法は、電流検出回路を少なくとも１つの偏向チューブに連結すること、または電流検出回路を各偏向チューブに連結することをさらに含んでもよい。電流検出回路は、偏向チューブに入る荷電液滴の存在を検出するための電流電圧変換器、および／または偏向チューブに入る単位時間当たりの液滴の数を検出するための積分器を含んでもよい。各偏向チューブは、金属材料から形成されていてもよい。各収集チューブは、プラスチック材料から形成されていてもよい。キャリアは、１０個以上の偏向チューブおよび１０個以上の対応する収集チューブを含むように構成されていてもよい。
【００２６】
上述の本発明の説明は、例示および説明の目的で提示されている。網羅的とする、または開示の正確な形態に本発明を限定する意図はない。上記教示を考慮すると、他の修正および変形が可能となろう。本発明の原理およびその実際の適用を最良に説明するために、また、それにより特定の意図された使用に適するように種々の実施形態で、および様々な修正をして、当業者が本発明を最良に利用することを可能とするために、実施形態は選択および説明された。添付の請求項は、等価構造、構成要素、方法、および手段を含む本発明の他の代替実施形態を含むように解釈されるべきであることが意図されている。
【００２７】
概要と要約セクションでなく、詳細説明セクションが請求項を解釈するために使用されることが意図されていることは理解されたい。概要と要約セクションは、発明者により意図されたように、１つまたは複数の、しかし全部ではない、本発明の代表的実施形態を説明することができるものであり、従って、本発明および添付請求項を制限する意図は何らない。
【００２８】
本発明は、記載された特定の実施形態に限定されるものではなく、したがって、当然変わってもよいことは理解されたい。また、本発明の範囲は、添付の請求項によってのみ限定されるものであるので、本明細書で使われた用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、限定する意図がないことは理解されたい。
【００２９】
値のある範囲が提供される場合、その範囲の上限値と下限値、および、指定範囲内の他のいずれかの指定値または介在値は、文脈が明確に別義を指定していない限り、単位の１／１０の値まで、本発明の範囲に包含されることは理解されよう。これらのより小さい範囲の上限値および下限値は、そのより小さい範囲に独立に含まれることができ、示された範囲中のいずれかの限界値が特別に除外されることを仮定して、それらもまた本発明の範囲内にある。指定された範囲が１つまたは両方の限界値を含む場合は、これらの含まれた限界値の片方または両方を除く範囲もまた、本発明に含まれる。
【００３０】
本明細書で、特定の範囲が、用語の「約」を前につけた数値で表される。用語の「約」は、本明細書では、それに先行される正確な数だけでなく、その用語に先行される数に近いか、または凡その数である数に対する文字上の支援を提供するために使われる。数が具体的に記述された数に近いか、または凡そその数であるかどうかの判定にあたり、近いか、または近似の記述がされていない数は、それが示される文脈中で、具体的に記述された数の実質的に等価物を与える数である場合もある。
【００３１】
特に断らなければ、本明細書で使われる全ての技術および科学用語は、通常、本発明の属する当業者により理解されるものと同じ意味を有する。本明細書記載のものに類似または等価ないずれの方法および材料も、本発明の実施または試験に使用可能であるが、代表的な例示的方法および材料をここに記載する。
【００３２】
本明細書で引用された全ての出版物および特許は、あたかも、個別出版物または特許が具体的に、また個別に、参照によって組み込まれるように指示されているかのように、参照によって本明細書に組み込まれ、また、方法および／または材料を開示および記載するために、参照によって本明細書に組み込まれ、それらの方法および／または材料に関連して引用される。いずれの出版物の引用も出願日以前の開示に対するものであり、先行発明を理由に、本発明がこのような出版物に先立つ資格がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、付与された出版物の日付は、別に確認の必要がある場合もあり、実際の出版物の日付とは異なる可能性がある。
【００３３】
文脈が明確に別義を指示しない限り、本明細書および添付の請求項で使われる単数形の「一つの」および「その」は、複数の参照物を含むことに留意されたい。請求項は、いずれの選択肢的要素も除くように立案されうることにさらに留意されたい。従って、この記述は、請求項の要素の記述に関連した「唯一」、「単に」、等のような排他的用語の使用に対し、または「否定的」限定の使用に対し、先行詞の役割を果たすことが意図されている。
【００３４】
明確にするために、別の実施形態の文脈中で記載される本発明の特定の特徴を、また、単一の実施形態中で組み合わせとして提供できることは理解されよう。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈中で記載されている本発明の種々の特徴を、別々にまたはいずれかの適切な部分的組み合わせとして提供することもできる。実施形態の全ての組み合わせは、本発明により具体的に包含され、本明細書で、あたかもそれぞれのおよび全ての組み合わせが個別に明示的に開示されるかのように、このような組み合わせが、運用可能なプロセスおよび／または装置／システム／キットを包含する程度に開示される。さらに、実施形態に挙げたこのような変数を記載する全ての部分的組み合わせもまた、具体的に本発明により包含され、あたかも、それぞれのおよび全てのこのような化学基の部分的組み合わせが個々に、明示的に本明細書で開示されるかのように、本明細書で開示される。
【００３５】
本開示を読むことにより当業者には自明なように、本明細書で記載され説明された個別実施形態のそれぞれは、本発明の範囲または趣旨を逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離でき、またはそれらと組み合わせることができる分離可能構成要素および特徴を有する。記載されたいずれの方法も、記載されたイベントの順序で、または理論的に可能ないずれかの他の順序で行うことができる。
【００３６】
合衆国法典第３５巻，１１９条（ｅ）（３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ））に基づき、本出願は、２０１１年４月２９日出願の米国特許仮出願第６１／４８０，８６７号の出願日の優先権を主張する。この出願の開示は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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