(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
撮像光学系によって結像された試料を撮像素子により撮像する撮像装置におけるデフォーカス量推定方法であって、
透過光に対して位相変化および振幅変化の少なくとも一方を与えるマークを有する透光性部材を撮像することで得られる、前記試料の像を含まない複数の基準画像を評価する基準画像評価ステップと、
前記透光性部材を介して前記試料を撮像することで得られる、前記試料の像と前記マークの像とが混在した撮像画像を評価する撮像画像評価ステップと、
前記基準画像評価ステップ及び前記撮像画像評価ステップでの評価結果に基づいてデフォーカス量を推定する推定ステップと、を有し、
前記基準画像評価ステップおよび前記撮像画像評価ステップは、
取得した画像を夫々が前記マークの像を含む複数の分割領域に分割する分割工程と、
前記複数の分割領域の夫々におけるマークの画像の平均値を算出する第１平均化工程と、
前記複数の分割領域の夫々における画像全体の平均値を算出する第２平均化工程と、
前記第１平均化工程で算出した平均値の夫々を、前記第２平均化工程で算出した平均値の夫々により除算する除算工程と、
前記複数の分割領域のうち同一のマークを含む分割領域間で、前記除算工程で取得した値を平均化して評価量を算出する第３平均化工程と、
を含む評価量算出工程を有することを特徴とするデフォーカス量推定方法。
【請求項２】
前記推定ステップは、前記基準画像評価ステップにおける前記評価量算出工程によって前記複数の基準画像から算出した複数の評価量と、前記撮像画像評価ステップにおける前記評価量算出工程によって前記撮像画像から算出した評価量と、に基づいて前記デフォーカス量を推定するステップであることを特徴とする請求項１に記載のデフォーカス量推定方法。
【請求項３】
前記推定ステップの後に、前記撮像画像および前記基準画像を演算処理することにより、前記撮像画像から前記マークの像を除去する画像回復ステップを有することを特徴とする請求項１又は２に記載のデフォーカス量推定方法。
【請求項４】
前記複数の基準画像は、複数のデフォーカス量に対応するスルーフォーカス画像であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載のデフォーカス量推定方法。
【請求項５】
前記透光性部材は、透過光に対して位相変化および振幅変化を与えるマークを有することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載のデフォーカス量推定方法。
【請求項６】
試料を結像する撮像光学系と、該撮像光学系を介して前記試料を撮像する撮像素子と、請求項１乃至５のいずれか１項に記載のデフォーカス量推定方法によってデフォーカス量を推定する演算部と、を有することを特徴とする撮像装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、撮像装置により画像を取得する際のデフォーカス量を推定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医療分野においてバーチャルスライドシステムと呼ばれる病理診断支援システムが注目されている。バーチャルスライドシステムによれば、バーチャルスライド（デジタル撮像装置）で観察対象の試料を撮像してデジタル画像を取得することができるため、従来の顕微鏡では実現し得なかった遠隔診断や自動診断などの新しい診断方法を提供することができる。また、病理診断の際には、試料（染色された生体組織など）の観察領域全域の高精細な画像が必要となるため、バーチャルスライドによって広い視野でかつ高画質な画像取得を行うことが求められている。
【０００３】
一般的な病理診断においては、試料を透光性部材（カバーグラス）で覆い固定したプレパラートを用いるが、試料やカバーグラスには予期できないうねりが存在する。そのため、プレパラートごとに、あるいは同じプレパラートでも撮像位置により、異なるデフォーカスが発生することになる。また、温度変化や機械的な誤差によってもデフォーカスが発生してしまう。よって、病理診断のための高精細な画像を広い視野で取得するためには、各撮像位置におけるデフォーカス量を推定し、観察領域の全域においてデフォーカスを補正する必要がある。
【０００４】
ここで、特許文献１および２では、半導体露光装置におけるデフォーカス量を推定する方法として、非対称回折格子を有するマスクの像強度分布を用いる方法が開示されている。特許文献１では、非対称回折格子パターンを有するテストマスクを用いており、その非対称回折格子パターンの像がデフォーカス量に比例して横シフトすることから、このシフト量を測定することによってデフォーカス量を定量化している。また、特許文献２では、製造用のマスク基板上に非対称回折格子を配置することで、その投影像の位置とウェハの位置との関係からデフォーカス量を算出している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−５５４３５号公報
【特許文献２】特開２００５−７０６７２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、特許文献１では、製造用のマスクとは別のテストマスクを用いてデフォーカス量を推定しているため、フォーカス推定のための露光と製造のための露光とを別々に行う必要がある。すなわち、特許文献１の方法をバーチャルスライドに適用したとしても、テストサンプルとプレパラートとを別々に撮像することになるため、試料やカバーグラスのうねりに起因するデフォーカス量を推定することができない。また、特許文献２に記載の非対称回折格子は、マスク基板上において露光対象のデバイスパターンとは異なる位置に設けられているため、デバイスパターン表面の予期できないうねりを考慮したデフォーカス量の推定を行うことはできない。したがって、特許文献１または２に記載の方法を用いたとしても、バーチャルスライドにおける、プレパラートの観察領域内のうねりを考慮したデフォーカス量の推定を行うことは困難である。
【０００７】
そこで本発明は、試料の画像を取得する撮像装置において、試料のうねり等に起因するデフォーカス量を推定することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するための、本発明の一側面としてのデフォーカス量推定方法は、撮像光学系によって結像された試料を撮像素子により撮像する撮像装置におけるデフォーカス量推定方法であって、透過光に対して位相変化および振幅変化の少なくとも一方を与えるマークを有する透光性部材を撮像することで得られる、前記試料の像を含まない複数の基準画像を評価する基準画像評価ステップと、前記透光性部材を介して前記試料を撮像することで得られる、前記試料の像と前記マークの像とが混在した撮像画像を評価する撮像画像評価ステップと、前記基準画像評価ステップ及び前記撮像画像評価ステップでの評価結果に基づいてデフォーカス量を推定する推定ステップと、を有し、前記基準画像評価ステップおよび前記撮像画像評価ステップは、取得した画像を夫々が前記マークの像を含む複数の分割領域に分割する分割工程と、前記複数の分割領域の夫々におけるマークの画像の平均値を算出する第１平均化工程と、前記複数の分割領域の夫々における画像全体の平均値を算出する第２平均化工程と、前記第１平均化工程で算出した平均値の夫々を、前記第２平均化工程で算出した平均値の夫々により除算する除算工程と、前記複数の分割領域のうち同一のマークを含む分割領域間で、前記除算工程で取得した値を平均化して評価量を算出する第３平均化工程と、を含む評価量算出工程を有することを特徴とする。
【０００９】
本発明の更なる目的またはその他の特徴は、以下、添付の図面を参照して説明される好ましい実施形態によって明らかにされる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、試料の画像を取得する撮像装置において、試料のうねり等に起因するデフォーカス量を推定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】撮像装置（バーチャルスライド）の概略構成図。
【図２】プレパラートの概略構成図。
【図３】カバーグラスが透過光に与える位相変化および振幅変化を示す概要図。
【図４】カバーグラスの断面図。
【図５】試料の強度透過率を示す図。
【図６】プレパラートのスルーフォーカス像。
【図７】評価量算出工程を説明するためのフローチャート。
【図８】画像の分割方法を示す図。
【図９】像面デフォーカス量に対する評価量１および評価量２の変化を示す図。
【図１０】画像回復後のプレパラートのスルーフォーカス像。
【図１１】マークのないカバーグラスを用いたプレパラートのスルーフォーカス像。
【図１２】デフォーカス量推定方法を説明するためのフローチャート。
【図１３】カバーグラスにおけるマークの配置図。
【図１４】像面デフォーカス量に対する評価量３の変化を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の好ましい実施の形態について図面を用いて説明する。
【００１３】
図１は、本発明の実施形態に係る撮像装置（バーチャルスライド）の概略構成図である。撮像装置１０００は、撮像ユニット１００、制御ユニット２００、および情報処理ユニット４００を備えている。この撮像装置１０００によって、観察対象のプレパラート１０３を撮像し、その撮像画像を取得する手順を説明する。
【００１４】
まず、制御ユニット２００における搬送部２０１が、制御部２０２の命令に応じてプレパラート１０３を撮像ユニット１００におけるステージ１０２上へ移動する。ステージ１０２に載置されたプレパラート１０３は、照明系１０１により照明され、撮像光学系１０４を介して撮像素子１０５上に拡大して結像される。そして、撮像素子１０５によってプレパラート１０３の拡大像が電気信号に変換され、この電気信号は画像データとして情報処理ユニット４００に伝送される。撮像素子１０５から送られた画像データは、画像処理部４０２によってデジタル信号（輝度信号）に変換され、ノイズ除去や圧縮等の画像処理が施されて演算部（コンピュータ）４０１に蓄積される。なお、演算部４０１は、蓄積した撮像画像に対して演算を行い、デフォーカス量の推定や画像回復を行う（詳細は後述）。
【００１５】
図２に、本実施形態に係るプレパラート１０３の概略構成図を示す。プレパラート１０３は、観察対象となる試料３０３を、透光性部材であるスライドグラス３０１およびカバーグラス３０２で固定することにより構成される。カバーグラス３０２の光軸に垂直な面内には、特定のマークが複数個形成されている。このカバーグラス３０２に形成された特定のマークとは、照明系１０１からの透過光に対して、位相変化および振幅変化を特定の分布で与えるものである（詳細は後述）。プレパラート１０３を撮像する際に、試料３０３やカバーグラス３０２に起因するデフォーカスが生じると、撮像画像にボケが生じることになる。なお、本実施形態においては、特定のマークを有する透光性部材としてカバーグラスを用いているが、透光性部材の素材はガラスに限ることはなく、例えばプラスチック製のフィルム等を用いてもよい。また、特定のマークを、カバーグラスではなくスライドグラスに対して形成してもよい。
【００１６】
図３（ａ）は、本実施形態に係るカバーグラス３０２が透過光に与える位相変化の分布を示している。黒で示された領域は、透過光に−π／４ラジアンの位相変化を与えており、１辺１μｍの正方形がｙ方向に３μｍ周期、ｘ方向に６μｍ周期で並んだ分布になっている。なお、ここでは、透過光に与える位相変化が負の値である時に、照明系１０１から見たプレパラート１０３の方向（図１の＋Ｚ方向）にその位相変化が生じるとしている。本実施形態に係るカバーグラス３０２において、−π／４ラジアンの位相変化を与える正方形をマークＡとし、このマークＡの集合をマークＡ群とする。また、図３（ａ）で示すように、マークＡ群を含まない領域（白い領域）は、透過光に位相変化を与えない。すなわち、このマークＡによる位相変化は、マークＡを含まない領域を透過した波面（基準波面）との差分量として与えられる。
【００１７】
図３（ｂ）には、本実施形態に係るカバーグラス３０２が透過光に与える振幅変化の分布を示す。灰色で示された領域は、透過光に０．７倍の振幅変化を与えており、入射光を吸収していることを示している。この領域は、マークＡと同様に、１辺１μｍの正方形がｙ方向に３μｍ周期、ｘ方向に６μｍ周期で並んだ分布になっている。本実施形態に係るカバーグラス３０２において、０．７倍の振幅変化を与える正方形をマークＢとし、このマークＢの集合をマークＢ群とする。また、図３（ｂ）で示すように、マークＢ群を含まない領域（白い領域）では透過光に振幅変化を与えない。
【００１８】
図４は、本実施形態に係るカバーグラス３０２の、マークＡおよびマークＢを含む位置での断面図を示している。３０４はマークＡを示しており、透過光に負の（−π／４ラジアンの）位相変化を与えるために、グラス基板３０７の表面に１辺１μｍの正方形の掘り込みが設けられている。このマークＡ３０４がある面を不図示の試料側にして試料を固定することにより、掘り込みが試料で満たされることになるため、掘り込みの深さは、グラス基板３０７および試料の屈折率と、照明光の中心波長と、与えたい位相変化によって決定できる。ここでは、グラス基板３０７の屈折率を１．５、試料の屈折率を１．４とすると、掘り込みの深さは照明光の中心波長の１．２５倍となる。このマークＡ３０４の掘り込みは、エッチング等の加工を行うことで作成することができる。また、３０５はマークＢを示しており、透過光に振幅変化を与えるために、グラス基板３０７の表面に１辺が１μｍの正方形フィルタが配置されている。例えば、透過光に０．７倍の振幅変化を与えるためには、透過光の振幅を３０％減衰させるフィルタを配置すればよい。このマークＢ３０５のフィルタは、光吸収物質を塗布することで作成することができる。なお、一つのマークで位相変化と振幅変化の両方を与えるものを作成してもよい。
【００１９】
本実施形態に係るカバーグラスには、上述したマークＡおよびマークＢの夫々が、＋ｘ方向に３μｍの間隔で交互に配置されているとするが、マークＡ群およびマークＢ群の相対的な配置や各マークの分布はこれに限るものではない。例えば、マークＡおよびマークＢの夫々がｙ方向に６μｍ周期、ｘ方向に３μｍ周期で並んでマークＡ群およびマークＢ群を構成し、そのマークＡ群とマークＢ群との間隔が＋ｙ方向に３μｍとなるように配置してもよい。なお、本実施形態におけるマークＡおよびマークＢの夫々は周期的に配置されているが、本発明はこれに限るものではない。また、マークＡおよびマークＢの形状を１辺１μｍの正方形としたが、いずれのマークもこの形状に限らず、例えば円形や長方形などのマークを配置してもよい。さらに、マークＡが透過光に与える位相変化を−π／４ラジアン、マークＢが透過光に与える振幅変化を０．７倍としたが、これらの値に限ることはなく、例えば位相変化をπ／２ラジアン、振幅変化を０．５倍などの値としてもよい。
【００２０】
ここで、本実施形態に係るカバーグラスを用いて作成したプレパラートを撮像ユニットで撮像した時の撮像画像をシミュレーションする。シミュレーションにおいて、試料は図５に示した強度透過率分布を持つとする。また、撮像光学系の開口数は０．７で結像倍率は４０倍、撮像素子の画素サイズは４μｍで同画素の面積開口率は５０％、照明系は波長が５５０ｎｍの単色光でコヒーレンスファクタσが０．７の部分コヒーレント照明とする。なお、デフォーカス量は撮像素子の撮像面上を像面とした時の像面デフォーカス量で示し、その像面デフォーカス量は撮像素子が撮像光学系から離れる方向を正とする。
【００２１】
まず、像面デフォーカス量を変化させた時に撮像ユニットから出力される、プレパラートの一連の撮像画像（スルーフォーカス像）を図６に示す。図６に示すように、マークＢ群の像は、像面デフォーカス量が０ｍｍの時は黒く現れ、像面デフォーカス量が増大すると、その値の正負にかかわらず対称的にボケが生じていることがわかる。また、マークＡ群の像は、像面デフォーカス量が正に増大すると白く現れ、像面デフォーカス量が負に増大すると黒く現れており、デフォーカスの方向によって明暗が変化することがわかる。すなわち、本実施形態に係るカバーグラスでプレパラートを作成すると、像面デフォーカス量の正負に対して、マークＡの像は非対称的な変化を、マークＢの像は対称的な変化を示す。
【００２２】
次に、撮像ユニットで取得した画像から、像面デフォーカス量を推定するための評価量を算出する方法（評価量算出工程）を、図７のフローチャートを用いて説明する。なお、このフローチャートの各工程における処理は、特に断りがない限り、撮像装置における演算部によって行うものとする。
【００２３】
まずＳ７０１（分割工程）では、マークＡおよびマークＢの夫々の画像変化を抽出するために、１つの分割領域にマークＡおよびマークＢのうち少なくとも１つが含まれるように画像を分割する。なお、本実施形態に係るカバーグラスに対しては、上述したように各マークが等間隔に配置されているため、図８の点線で示すように画像を等分割し、その分割領域の中心に各マークが１つずつ配置されるようにすることが好ましい。
【００２４】
続くＳ７０２（第１平均化工程）では、マークの像が現れている領域内（図８の細い実線内）の画像の平均値を算出する。ここで算出した値は、像面デフォーカス量に対するマークの変化を示している。ただし、プレパラートは試料とカバーグラスとを重ねて構成されているため、もし各分割領域間で試料の透過率に違いがあれば、Ｓ７０２で求めた値は各分割領域間で異なることになる。そこでＳ７０３（第２平均化工程）において、マークの像を含む分割領域内（図８の太い実線内）の画像の平均値を算出する。ここで算出した値は、分割領域内の試料の透過率に相当する。そしてＳ７０４（除算工程）では、Ｓ７０２で求めた値をＳ７０３で求めた値で除算することにより、各分割領域間での試料の透過率の違いを除去する。上述したＳ７０２からＳ７０４の処理を、各分割領域において行う。
【００２５】
しかしながら、各分割領域内で試料の透過率に分布が生じている場合、Ｓ７０４で求めた値は分割領域毎に異なるものになってしまう。そこで、Ｓ７０５（第３平均化工程）において、Ｓ７０４で求めた値を同一のマーク群（すなわちマークＡ群およびマークＢ群の夫々）の間で平均化する。これにより、各分割領域における試料の透過率分布による影響が低減した値が算出される。このようにして、マークＡ群に対して得られた値を評価量１、マークＢ群に対して得られた値を評価量２とし、Ｓ７０６で各評価量を演算部に保存する。
【００２６】
以上、この評価量算出工程によって、本実施形態に係るカバーグラスと試料とを含むプレパラートの撮像画像から、評価量を算出することができる。なお、ここではプレパラートの撮像画像に対する評価量を算出する場合を想定して評価量算出工程を説明したが、この評価量算出工程は予め試料を配置せずにカバーグラスのみを撮像して取得した画像（基準画像）にも適用することができる。すなわち、プレパラートを作成する前に予めカバーグラスのみを撮像し、取得した基準画像に対して評価量算出工程を経ることにより、その評価量を演算部に保存しておくことができる（詳細は後述）。
【００２７】
図９（ａ）には像面デフォーカス量に対する評価量１の変化を、図９（ｂ）には評価量２の変化を示す。ここで、実線は試料を含むプレパラートの撮像画像に対する評価量、破線は試料を含まないカバーグラスのみの基準画像に対する評価量を示している。図９（ａ）および図９（ｂ）のいずれにおいても、実線は破線に近い変化を示している。このことから、評価量１および評価量２は、試料の有無に関わらず像面デフォーカス量に対して定まった値となることがわかる。すなわち、予め基準画像に対する評価量を複数の像面デフォーカス量に対応させて取得しておけば、その複数の評価量と撮像画像に対する評価量とを比較することで、像面デフォーカス量を推定することができる。
【００２８】
なお、図９（ｂ）では、評価量２は像面デフォーカス量の変化に対して対称な変化を示している。すなわち、像面デフォーカス量の絶対値に対応して評価量の値が定まるため、画像から評価量２を算出することで、像面デフォーカス量の絶対値を推定することができる。さらに図９（ａ）では、像面デフォーカス量の正負の変化に対して評価量１は反対称な変化を示している。すなわち、評価量１を用いることで、評価量２から得た像面デフォーカス量の絶対値に対して正負を判定することができる。
【００２９】
以上のように、本実施形態に係る特定のマークを持つカバーグラスを用いることで、観察対象の試料やカバーグラスなどに起因する像面デフォーカス量を推定することができる。この時、図６に示したように、プレパラートを撮像した撮像画像は試料およびカバーグラスのマークの像が混在したものとなる。ここで、像面デフォーカス量の推定のために取得した撮像画像を病理診断に用いる場合、カバーグラスのマークが混在したものでは好ましくない。そこで、プレパラートの撮像画像からカバーグラスによる影響を以下の画像回復ステップで取り除く。
【００３０】
まず、評価量１および評価量２を用いて、プレパラートの撮像画像から像面デフォーカス量を推定する。次に、演算部に事前に保存しておいた複数の基準画像（カバーグラスのスルーフォーカス像）のうち、推定された像面デフォーカス量に対応した画像を読み出す。そして、プレパラートの撮像画像を、読み出したカバーグラスの基準画像で除算する。図１０は、この画像回復ステップによる処理結果を示したものであり、図６に現れていたカバーグラスのマークが図１０では見られないことがわかる。また、図１１に示す、本実施形態のようなマークを有しない、従来のカバーグラスを用いたプレパラートのスルーフォーカス像と比較すると、両者に視認できる差は見られない。このように、予め取得したカバーグラスの基準画像を用いることで、プレパラートの撮像画像からカバーグラスの影響を除去することが可能である。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明の実施例におけるデフォーカス量推定方法について、図１２のフローチャートを用いて説明する。なお、このフローチャートの各ステップにおける処理についても、特に断りがない限り演算部によって行うものとし、上述した条件と同じ条件でシミュレーションを行う。
【００３２】
まず、Ｓ１２０１では、撮像ユニットによって本実施例に係るカバーグラスを複数のデフォーカス量に対して撮像し、取得した複数の基準画像（スルーフォーカス像）を演算部に保存する。本実施例においては、撮像素子を撮像光学系１０４の光軸方向に上下駆動することによって、撮像時のデフォーカス量を変化させる場合を想定しているが、プレパラートが載置されたステージを駆動してデフォーカス量を変化させてもよい。
【００３３】
Ｓ１２０２では、Ｓ１２０１で取得した複数の基準画像の夫々に対して、図７に示した評価量算出工程に従って評価量１および評価量２を算出し、各像面デフォーカス量と対応付けて演算部に保存する。この評価量１および評価量２は、図９の破線で示した“試料なし”の値と一致する。Ｓ１２０１で取得した複数の基準画像およびＳ１２０２で算出した各評価量を基準データとし、観察対象の試料を含むプレパラートを撮像する際の像面デフォーカス量の推定および画像回復に用いることができる。なお、この基準データは、観察対象の試料を撮像する度に取得する必要はなく、像面デフォーカス量の推定開始時に１度取得すればよい。Ｓ１２０１およびＳ１２０２を合わせて基準画像評価ステップとする。
【００３４】
続いて、Ｓ１２０３では、基準画像評価ステップ（Ｓ１２０１）で撮像したカバーグラスにより観察対象の試料を固定し、作成したプレパラートの撮像画像を取得して演算部に保存する。さらに、Ｓ１２０４では、図７に示した評価量算出工程に従って、Ｓ１２０３で取得したプレパラートの撮像画像から評価量１および評価量２を算出する。Ｓ１２０３およびＳ１２０４を合わせて撮像画像評価ステップとする。
【００３５】
そしてＳ１２０５（推定ステップ）では、撮像画像評価ステップ（Ｓ１２０４）で取得した各評価量と、基準画像評価ステップ（Ｓ１２０２）で演算部に保存しておいた基準データとの比較を行い、像面デフォーカス量を推定する。例えば、取得したプレパラートの撮像画像から、評価量１および評価量２の値が夫々１．１３および０．８５８と求められた場合を考える。これらの値と事前に演算部に保存しておいた基準データとを比較すると、評価量２から像面デフォーカスが±３ｍｍ程度であると推定でき、さらに評価量１の符号が正であることから像面デフォーカスが＋３ｍｍであると推定することができる。なお、推定ステップ（Ｓ１２０５）における推定方法は前述の方法に限らず、例えば、評価量１から像面デフォーカス量を１ｍｍまたは３ｍｍであると推定した場合、評価量２から２つの推定値のうち３ｍｍの方が妥当であると推定してもよい。また、評価量１および評価量２を演算することによって求められる他の値を評価量として用いてもよい。
【００３６】
像面デフォーカス量を推定した後、Ｓ１２０６（画像回復ステップ）では画像回復を行う。具体的には、基準画像評価ステップ（Ｓ１２０１）で取得したカバーグラスの複数の基準画像のうち、推定ステップ（Ｓ１２０５）で推定された像面デフォーカス量に対応した画像を演算部上に読み出し、この基準画像でプレパラートの撮像画像を除算する。これにより、撮像画像からカバーグラスの影響を取り除くことができるため、像面デフォーカス量の推定のために取得した撮像画像を病理診断に用いることができる。
【００３７】
以上、本実施例における像面デフォーカス量推定方法により、プレパラートの撮像位置における像面デフォーカス量を推定し、かつカバーグラスの影響が除去されたプレパラートの画像を取得することができる。また、この像面デフォーカス量推定方法を、試料の各撮像位置に対して行うことにより、試料の観察領域の全域における像面デフォーカス量の分布を取得することができる。その際に用いるカバーグラスにおける、マーク配置の一例を図１３に示す。図１３に示した夫々のマーク群に対して、図１２に示したステップを行うことにより、各マーク群を配置した観察領域での像面デフォーカス量とプレパラートの画像を取得することができる。なお、このカバーグラスには、マークＡとマークＢを夫々８個ずつ有する複数のマーク群が規則的に配置されているが、マークの数や配置方法はこれに限らず、像面デフォーカス量を推定したい観察領域に合わせて決定すればよい。
【００３８】
（その他の実施例）
以上、本発明の好ましい実施例について説明したが、本発明はこれに限定されないことは言うまでもなく、その要旨の範囲内で種々の変形および変更が可能である。
【００３９】
例えば、前述した実施例では、事前にカバーグラスを撮像して取得した基準データとの比較により像面デフォーカス量を推定しているが、正負のいずれの方向にデフォーカスしているかを判別するだけであれば基準データを取得しなくてもよい。すなわち、デフォーカスの方向はプレパラートの撮像画像におけるマークＡの像の明暗だけで判別可能であり、例えば、マークＡの像が周りに比べて明るく（白く）浮かび上がれば、正のデフォーカスであると判定することができる。
【００４０】
また、前述した実施例に係るカバーグラスには、透過光に負の位相変化および振幅変化を与えているが、位相変化のみを与えるカバーグラスを用いても像面デフォーカス量は推定可能である。その場合、カバーグラスにはマークＡのみを設ければよく、振幅変化を与えるフィルタ（マークＢ）を配置する必要がないため、製造が容易となる。ただし、このカバーグラスを用いた場合、取得できる評価量は評価量１のみとなるため、像面デフォーカス量が推定可能な範囲が限定される。例えば、本実施例におけるシミュレーションの結果によると、像面デフォーカス量が−２ｍｍ以上２ｍｍ以下の範囲ならば、評価量１だけで推定可能となる。また、Ｒａｙｌｅｉｇｈ  Ｕｎｉｔと呼ばれる撮像光学系に依存しない単位で表すために、波長×倍率の２乗÷開口数の２乗÷２で規格化を行うと、推定可能な範囲は−２．２４以上２．２４以下となる。なお、位相変化のみを与えるカバーグラスを用いた場合も、事前に保存しておいたカバーグラスの基準画像でプレパラートの撮像画像を除算することで、カバーグラスの影響を取り除くことが可能である。
【００４１】
一方で、振幅変化のみを与えるカバーグラスを用いても像面デフォーカス量は推定可能である。この場合、カバーグラスにはマークＢのみを配置すればよく、位相変化を与える掘り込み（マークＡ）を設ける必要がないため、製造が容易となる。ただし、このカバーグラスを用いた場合、推定可能な値は像面デフォーカス量の絶対値のみとなる。
【００４２】
あるいは、透過光に対して負の位相変化および振幅変化を与えるマークに加えて、正の位相変化を与えるマークをカバーグラスに配置してもよい。正の位相変化を与えるマークをマークＣとして配置すると、カバーグラスのスルーフォーカス像におけるマークＣの像は、デフォーカスの方向によって明暗の変化を示すことになる。ここで、このマークＣの像における明暗の変化は、マークＡの像におけるものとは反対の変化となるため、デフォーカスの方向にかかわらず必ずどちらかのマークが白現れることになる。すなわち、マークＣを加えることにより、像面デフォーカス量の推定を行う際に、スルーフォーカス像の変化を視覚的に判別し易くでき、振幅変化を与えたマークＢの像との見間違いを防ぐことができる。
【００４３】
また、マークＡから求まる評価量１と、マークＣから求まる評価量１との差分を取ることで、新たな評価量３を取得してもよい。一例として、透過光に−π／４ラジアンの位相変化を与えるマークＡと、０．７倍の振幅変化を与えるマークＢとに加え、π／４ラジアンの位相変化を与えるマークＣをカバーグラスに配置した場合の評価量３を図１４に示す。この評価量３は、マークＡに対する評価量１と同様に、像面デフォーカス量の変化に対して反対称となるため、合焦の判定および像面デフォーカス量の正負の判別に用いることができる。ここで、像面デフォーカス量が０の時、すなわちベストフォーカス時の評価量１の値は、図９（ａ）より約０．９３であることがわかるが、この値は基準データ無しには特定できない。それに対して、評価量３は、ベストフォーカス時の値が０となるため、基準データが無い場合は評価量１よりも高精度にデフォーカスの有無を判断することができる。また、評価量３と評価量２とを組み合わせれば、評価量１を用いる場合と同様に像面デフォーカス量を知ることができる。このように正の位相変化を与えるマークＣを配置した場合も、事前に保存しておいたカバーグラスの基準画像でプレパラートの撮像画像を除算することでカバーグラスの影響を取り除くことが可能である。
【００４４】
なお、前述した実施例では、カバーグラスの影響を取り除く画像回復ステップとして、事前に取得したカバーグラスの基準画像による除算を行ったが、画像の演算処理はこの方法に限ることはない。例えば、プレパラートの撮像画像から事前に取得したカバーグラスの基準画像を減算することでもカバーグラスの影響を取り除くことが可能である。
【符号の説明】
【００４５】
１０３  プレパラート
１０４  撮像光学系
１０５  撮像素子
４０１  演算部
３０１  スライドグラス
３０２  カバーグラス
３０３  試料
３０４  マークＡ
３０５  マークＢ
１０００  撮像装置
【図１】
0006016463.tif 000002
【図３】
0006016463.tif 000003
【図４】
0006016463.tif 000004
【図７】
0006016463.tif 000005
【図９】
0006016463.tif 000006
【図１２】
0006016463.tif 000007
【図１３】
0006016463.tif 000008
【図１４】
0006016463.tif 000009
【図２】
0006016463.tif 000010
【図５】
0006016463.tif 000011
【図６】
0006016463.tif 000012
【図８】
0006016463.tif 000013
【図１０】
0006016463.tif 000014
【図１１】
0006016463.tif 000015