(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクチニウム−２２５（Ａｃ−２２５）放射性複合体を生成するための方法であって、（ａ）ｐＨ８．０〜９．１を有する複合体化反応混合物中でキレート剤を生体分子に複合体化して複合体化された生体分子を産生するステップであって、前記キレート剤が、Ｓ−２−（４−イソチオシアナトベンジル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン四酢酸（ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡ）又は２，２´，２´´−（１０−（２−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシ）−２−オキソエチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリイル）三酢酸（ＤＯＴＡ−ＮＨＳエステル）であるステップと、
（ｂ）前記複合体化反応混合物を、フィルタを通して濾過して複合体化されていないキレート剤を除去するステップと、
（ｃ）ｐＨ５．５〜７．０を有するキレート化反応混合物中で、１つ以上のＡｃ−２２５放射性核種を前記複合体化された生体分子でキレート化してＡｃ−２２５放射性複合体を産生するステップと、
を含み、前記Ａｃ−２２５放射性複合体の収率が、少なくとも８４％であることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ステップ（ａ）における複合体化は、前記複合体化反応混合物を３７℃で１．５時間インキュベートすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ステップ（ａ）における複合体化は、前記複合体化反応混合物を１６℃〜２０℃で２４時間インキュベートすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記複合体化反応混合物は、重炭酸塩緩衝液を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記複合体化反応混合物は、リン酸緩衝液を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記濾過は、ＨＥＰＥＳ緩衝液中で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記濾過は、ＮａＡｃ緩衝液中で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記濾過は、少なくとも１０，０００Ｄａの分子量分画を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記キレート化反応混合物は、ゲンチシン酸またはアスコルビン酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ステップ（ｃ）におけるキレート化は、前記１つ以上のＡｃ−２２５放射性核種を、前記複合体化された生体分子とともに３７℃で１．５時間インキュベートすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
末端キレート化剤を前記キレート化反応混合物に加えるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記末端キレート化剤は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記末端キレート化剤を加える前記ステップの後に、前記キレート化反応混合物を３７℃で３０分間インキュベートするステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記生体分子は、タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記生体分子は、抗体、その抗原結合断片、抗体の抗原結合ポリペプチド配列を含む一本鎖タンパク質、または単一ドメイン抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗原結合断片は、モノクローナル抗体可変領域である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記生体分子は、抗体の抗原結合配列を含むタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記生体分子は、細胞表面上の抗原に結合する抗体の抗原結合配列を含む、天然に、合成的に、または、組み換え的に生成されたタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
標的細胞表面上の前記抗原は、ＣＤ３３である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記生体分子は、ＨｕＭ１９５である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記放射性複合体は、放射性免疫複合体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
［Ａｃ−２２５］−ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡ／ＨｕＭ１９５放射性免疫複合体を生成するための方法であって、
（ａ）ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡを、３７℃で１．５時間、重炭酸塩緩衝液を含み、かつ８．０〜９．２のｐＨを有する複合体化反応混合物中で、ＨｕＭ１９５抗体に複合体化してｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡ／ＨｕＭ１９５免疫複合体を産生するステップと、
（ｂ）少なくとも１０，０００Ｄａの分画分子量を有するフィルタを通して、前記複合体化反応混合物を濾過して前記ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡ／ＨｕＭ１９５免疫複合体を精製するステップであって、前記濾過は、ＨＥＰＥＳ緩衝液またはＮａＡｃ緩衝液を用いて行われる、ステップと、
（ｃ）１つ以上のアクチニウム−２２５放射性核種を、３７℃で１．５時間、ゲンチシン酸を含み、かつ５．５〜７．０のｐＨを有するキレート化反応混合物中で、前記ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡ／ＨｕＭ１９５免疫複合体でキレート化して［Ａｃ−２２５］−ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡ／ＨｕＭ１９５放射性免疫複合体を産生するステップと、
（ｄ）ＤＴＰＡを前記キレート化反応混合物に加えるステップと、
（ｅ）前記キレート化反応混合物を３７℃で３０分間インキュベートするステップと、
を含み、前記Ａｃ−２２５放射性免疫複合体の収率が、少なくとも８４％であることを特徴とする方法。
【請求項２３】
前記ステップ（ｂ）の濾過の前に、サイズ排除樹脂を通してのサイズ排除クロマトグラフィのステップをさらに含む、請求項１または請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記サイズ排除樹脂は、５，０００Ｄａのサイズ排除制限を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
サイズ排除樹脂を通してのサイズ排除クロマトグラフィによって、前記放射性複合体を精製することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
サイズ排除樹脂を通してのサイズ排除クロマトグラフィによって、前記［Ａｃ−２２５］−ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡ／ＨｕＭ１９５放射性免疫複合体を精製することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記サイズ排除樹脂は、６，０００Ｄａのサイズ排除制限を有する、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記サイズ排除樹脂は、５，０００Ｄａのサイズ排除制限を有する、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記濾過が、少なくとも２０，０００Ｄａの分子量分画を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記濾過が、少なくとも４０，０００Ｄａの分子量分画を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記キレート化反応混合物が、酢酸Ｎａまたは酢酸ＮＨ4を含む請求項１または２２に記載の方法。
【請求項３２】
酢酸Ｎａまたは酢酸ＮＨ4の濃度が、３Ｍである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記生体分子が、抗体である、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
この特許開示は、著作権保護を受ける資料を含む。著作権所有者は、米国特許商標局の特許出願または記録に現れるような特許文書または特許開示を、第三者がファクシミリで複製することに異存はないが、その他の場合には、著作権に関する全ての権利を保有するものである。
【０００２】
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【背景技術】
【０００３】
放射性免疫複合体は、診断的および治療的医療処置の際に使用することができる。放射性医薬品は、担体（例えば、標的化部分）に結合される少なくとも１つの放射性核種を搬送することができる。放射性核種は、放射線診断装置によって検出可能な信号を生成することができる。放射性核種によって放射される放射線は、組織への毒性作用を有する可能性があるので、１つ以上の治療効果を達成するために、放射性免疫複合体を利用することができる。治療剤として使用した時に、体内の特定の構造または部位における放射性免疫複合体の局在化を使用して、放射性免疫複合体の効果を治療すべき構造または部位に集中させることができ、かつ体内の他の構造または部位における悪影響を低減することができる。例えば、放射性免疫複合体は、癌組織を殺傷する化学療法薬として使用されてもよい。放射性免疫複合体を生成するための改善された方法の必要性がある。本発明は、この必要性に対処する。
【発明の概要】
【０００４】
一態様において、本明細書に記載される方法は、アクチニウム−２２５（Ａｃ−２２５）放射性複合体を生成するための方法に関し、本方法は、（ａ）複合体化反応混合物中でキレート剤を生体分子に複合体化して複合体化された生体分子を産生するステップと、（ｂ）反応混合物を精製して複合体化されていないキレート剤を除去するステップと、（ｃ）キレート化反応混合物中で、１つ以上のＡｃ−２２５放射性核種を複合体化された生体分子でキレート化してＡｃ−２２５放射性複合体を産生するステップと、を含む。
【０００５】
一実施形態において、ステップ（ａ）における複合体化は、複合体化反応混合物を約３７℃で約１．５時間インキュベートするステップを含む。別の実施形態において、ステップ（ａ）における複合体化は、複合体化反応混合物を約１６℃〜約２０℃で約２４時間インキュベートするステップを含む。
【０００６】
さらなる実施形態において、精製するステップは、複合体化反応混合物をフィルタを通して濾過して複合体化された生体分子を精製するステップを含む。
【０００７】
一実施形態において、複合体化反応混合物は、重炭酸塩緩衝液を含む。別の実施形態において、複合体化反応混合物は、リン酸緩衝液を含む。さらなる実施形態において、複合体化反応混合物は、約８．０〜約９．２のｐＨを有する。
【０００８】
一実施形態において、濾過するステップは、ＨＥＰＥＳ緩衝液中で行われる。別の実施形態において、濾過するステップは、ＮａＡｃ緩衝液中で行われる。さらなる実施形態において、濾過するステップは、少なくとも約１０，０００Ｄａ、少なくとも約２０，０００Ｄａ、または少なくとも約４０，０００Ｄａの分画分子量を含む。
【０００９】
一実施形態において、キレート化反応混合物は、ゲンチシン酸またはアスコルビン酸を含む。
【００１０】
別の実施形態において、キレート化反応混合物は、約５．５〜約７．０のｐＨを有する。
【００１１】
さらに別の実施形態において、ステップ（ｃ）におけるキレート化は、１つ以上のＡｃ−２２５放射性核種を、複合体化された生体分子とともに約３７℃で約１．５時間インキュベートするステップを含む。
【００１２】
別の実施形態において、本方法は、末端キレート化剤をキレート化反応混合物に加えるステップをさらに含む。一実施形態において、末端キレート化剤は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）である。さらに別の実施形態において、本方法は、末端キレート化剤を加えるステップの後に、キレート化反応混合物を約３７℃で約３０分間インキュベートするステップをさらに含む。
【００１３】
一実施形態において、生体分子は、タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、それらの組み合わせ、またはそれらの誘導体を含む。
【００１４】
一実施形態において、生体分子は、抗体、その抗原結合断片、抗体の抗原結合ポリペプチド配列を含む一本鎖タンパク質、単一ドメイン抗体、前述したもののうちのいずれかの類似体、または前述したもののうちのいずれかの誘導体である。別の実施形態において、抗原結合断片は、モノクローナル抗体可変領域である。さらに別の実施形態において、生体分子は、抗体の抗原結合配列を含むタンパク質である。さらに別の実施形態において、生体分子は、細胞表面上の抗原に結合する抗体の抗原結合配列を含む、天然に、合成的に、または、組み換え的に生成されたタンパク質である。さらに別の実施形態において、標的細胞表面上の抗原は、ＣＤ３３である。さらに別の実施形態において、生体分子は、ＨｕＭ１９５である。
【００１５】
一実施形態において、放射性複合体は、放射性免疫複合体である。
【００１６】
別の実施形態において、キレート剤は、二官能性キレート剤である。一実施形態において、二官能性キレート剤は、Ｓ−２−（４−イソチオシアナトベンジル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン四酢酸（ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡ）である。別の実施形態において、キレート剤は、ジエチレントリアミン五酢酸（「ＤＴＰＡ」）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ´，Ｎ´´，Ｎ´´´−四酢酸（「ＤＯＴＡ」）、ｐ−イソチオシアナトベンジル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（「ｐＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＯＴＡ」）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ´，Ｎ´´−三酢酸（「ＤＯ３Ａ」）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラキス（２−プロピオン酸）（「ＤＯＴＭＡ」）、３，６，９−トリアザ−１２−オキサ−３，６，９−トリカルボキシメチレン−１０−カルボキシ−１３−フェニル−トリデカン酸（「Ｂ−１９０３６」）、１，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ´，Ｎ´´−三酢酸（「ＮＯＴＡ」）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ´，Ｎ´´，Ｎ´´´−四酢酸（「ＴＥＴＡ」）、トリエチレンテトラアミン六酢酸（「ＴＴＨＡ」）、トランス−１，２−ジアミノヘキサン四酢酸（「ＣＹＤＴＡ」）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１−（２−ヒドロキシプロピル）４，７，１０−三酢酸（「ＨＰ−ＤＯ３Ａ」）、トランス−シクロヘキサン−ジアミン四酢酸（「ＣＤＴＡ」）、トランス（１，２）−シクロヘキサンジエチレントリアミン五酢酸（「ＣＤＴＰＡ」）、１−オキサ−４，７，１０−トリアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ´，Ｎ´´−三酢酸（「ＯＴＴＡ」）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラキス｛３−（４−カルボキシル）−ブタン酸｝、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラキス（酢酸−メチルアミド）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラキス（メチレンホスホン酸）、２，２´，２´´−（１０−（２−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシ）−２−オキソエチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリイル）三酢酸（ＤＯＴＡ−ＮＨＳエステル）、ならびにそれらの誘導体、類似体、および混合物から成る化合物の群より選択される。
【００１７】
別の態様において、本明細書に記載される方法は、［Ａｃ−２２５］−ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡ／ＨｕＭ１９５放射性免疫複合体を生成するための方法に関し、本方法は、（ａ）ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡを、約３７℃で約１．５時間、重炭酸塩緩衝液を含み、かつ約８．０〜約９．２のｐＨを有する複合体化反応混合物中で、ＨｕＭ１９５抗体に複合体化してｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡ／ＨｕＭ１９５免疫複合体を産生するステップと、（ｂ）少なくとも約１０，０００Ｄａ、少なくとも約２０，０００Ｄａ、または少なくとも約４０，０００Ｄａの分画分子量を有するフィルタを通して、複合体化反応混合物を濾過してｐ  ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡ／ＨｕＭ１９５免疫複合体を精製するステップであって、該濾過するステップは、ＨＥＰＥＳ緩衝液またはＮａＡｃ緩衝液を用いて行われる、ステップと、（ｃ）１つ以上のアクチニウム−２２５放射性核種を、約３７℃で約１．５時間、ゲンチシン酸を含み、かつ約５．５〜約７．０のｐＨを有するキレート化反応混合物中で、ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡ／ＨｕＭ１９５免疫複合体でキレート化して［Ａｃ−２２５］−ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡ／ＨｕＭ１９５放射性免疫複合体を産生するステップと、（ｄ）ＤＴＰＡをキレート化反応混合物に加えるステップと、（ｅ）キレート化反応混合物を約３７℃で約３０分間インキュベートするステップと、を含む。
【００１８】
特定の実施形態において、本明細書に記載される方法は、ステップ（ｂ）の濾過の前に、サイズ排除樹脂を通してのサイズ排除クロマトグラフィのステップをさらに含む。一実施形態において、サイズ排除樹脂は、約５，０００Ｄａのサイズ排除制限を有する。
【００１９】
特定の実施形態において、本明細書に記載される方法は、サイズ排除樹脂を通してのサイズ排除クロマトグラフィによって、放射性複合体（ｒａｄｉｏｎｃｏｎｊｕｇａｔｅ）または［Ａｃ−２２５］−ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡ／ＨｕＭ１９５放射性免疫複合体を精製するステップをさらに含む。一実施形態において、サイズ排除樹脂は、約６，０００Ｄａのサイズ排除制限を有する。別の実施形態において、サイズ排除樹脂は、約５，０００Ｄａのサイズ排除制限を有する。
【００２０】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載される方法によって生成される、放射性免疫複合体に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】天然のＨｕＭ１９５（ピンク色）およびＨｕＭ１９５／ＤＯＴＡ複合体（青色）のＵＶスペクトルである。どちらの溶液も約１００μｇ／ｍＬの濃度であり、吸光度は、１ｃｍの光経路のキュベットを使用して測定した。
【図１Ｂ】ＨＳＡ（０．１％、緑色）、天然ＨｕＭ１９５（１００μｇ／ｍＬ、ピンク色）、およびＤＴＰＡ／ＮａＡｃ（１００μｇ／ｍＬ）のＵＶスペクトルである。
【図２】天然ＨｕＭ１９５のＳＥ−ＨＰＬＣ／ＵＶクロマトグラムである。
【図３】ＨｕＭ１９５の定量化のための、ＵＶ検出器によるＨＰＬＣの校正を示す図である。
【図４】複合体のＳＥ−ＨＰＬＣ／ＵＶクロマトグラムである。
【図５】典型的な校正曲線（ＨｕＭ１９５の定量化の際のＵＶ分光光度計の校正のための波長は、２８０ｎｍ）を示す図である。
【図６】Ａｃ−２２５で標識された複合体（精製後の主要タンパク質画分）のＳＥ−ＨＰＬＣ／ＲＡＤクロマトグラムである。
【図７】遊離またはＤＴＰＡ関連Ａｃ−２２５を含有する画分のＳＥ−ＨＰＬＣ／ＲＡＤクロマトグラムである。
【図８】Ｐ−１０カラムおよび反応バイアル＋ＱＣ（総活性１．２ｍＣｉのＡｃ−２２５）における、精製後の液体画分中のＡｃ−２２５の典型的な活性分布である。
【図９】高分解能Ｇｅ検出器上のＡｃ−２２５および娘の典型的なガンマスペクトルである。
【図１０】マトリクス溶液としてＣＨＣＡを伴う天然ＨｕＭ１９５の典型的なＭＡＬＤＩスペクトルである。
【図１１】マトリクス溶液としてＣＨＣＡを伴う複合体の典型的なＭＡＬＤＩスペクトルである。
【図１２】カウントの分析のために切断されたゲルの断面を示す、１ステップおよび２ステップ調製品のＰＡＧＥゲル電気泳動である。
【図１３】ゲルの切断された各断面における活性を示す図である。結果は、ＨｕＭ１９５と関連するＡｃ−２２５のかなりの割合と一致する。結果は、１ステップおよび２ステップの製剤について同一であった。
【図１４】１ステッププロセスを使用した調製品および対照を分析するために、ＰＡＧＥゲル電気泳動を使用した。対照は、１ステップの手順と同じように調製したが、抗体は、Ａｃ−２２５によるキレート化の前にＤＯＴＡ二官能性キレート剤と復号化させなかった。対照調製は、１ステップ調製とは対照的に、極めて少量のＨｕＭ１９５と関連するＡｃ−２２５を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、放射性免疫複合体を生成するための方法を提供する。一態様において、本発明は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（ＩｇＧ）を標識するための改善された方法に関する。一実施形態において、本方法は、「後標識または１ステップ法」である。
【００２３】
一態様において、本明細書に記載される方法は、放射性免疫複合体を製造するための１ステップキレート化、後複合体化プロセスに関する。一実施形態において、放射性免疫複合体は、［Ａｃ−２２５］−ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡ／ＩｇＧ（ＨｕＭ１９５）構成体である。
【００２４】
本明細書に記載される放射性免疫複合体は、最初に、複合体化された標的部分を形成し、次いで、複合体化された標的部分で放射性核種をキレート化して放射性免疫複合体を形成することによって調製することができる。複合体化された標的部分は、標的部分に対する複合体化の後に、任意の時に放射性標識されてもよい。
【００２５】
一実施形態において、ｍＡｂは、最初に、ＤＯＴＡ二官能性キレート剤で複合体化され、次いで、精製された複合体は、Ａｃ−２２５で標識される。本明細書に記載されるいくつかの実施形態によれば、生体分子を標識するためには、225Ａｃが関与する単一のステップが１つだけあればよい。２ステップまたは再標識プロセスに勝る、本明細書に記載される方法の利点には、安定したより高い標識収率、簡潔さ、およびより短い標識時間が挙げられるが、これに限定されない。加えて、本明細書に記載される方法のスケールアップは、２ステップまたは再標識プロセスと比較して、より容易に行うことができる。また、本明細書に記載される方法は、最終的な放射能標識が臨床現場で起こる可能性がある、キット製剤の調製に有用である。
【００２６】
一実施形態において、ＨｕＭ１９５／ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡ複合体は、約８〜約９の間のｐＨで、重炭酸塩中またはリン酸緩衝液中で、ＨｕＭ１９５をｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡと反応させ、かつ約３７℃または室温のいずれかでインキュベートすることによって調製される。別の実施形態において、生体複合体は、濾過または遠心分離を繰り返し、かつ重力サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によって、過度の二官能性キレート化剤から精製することができる。精製プロセス中に、重炭酸塩またはリン酸緩衝液は、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ；遊離酸）または酢酸媒体に変化する。複合体は、サイズ排除高性能液体クロマトグラフィ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）によって特徴付けることができる。
【００２７】
標識については、約５．５〜約７．０のｐＨを有するアセテート緩衝液中のＨｕＭ１９５および225Ａｃの混合物を、少量のフリーラジカルスカベンジャーの存在下で、約８０〜約９０分間インキュベートする。ＤＴＰＡとの反応および対抗の後に、インスタント薄層クロマトグラフィ（ＩＴＬＣ）によって標識収率を定量することができる。次いで、重力サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によって、試料混合物を精製することができる。精製されたタンパク質画分において、225Ａｃおよびタンパク質の量は、それぞれ、非破壊高分解能ガンマ分光測定法および紫外分光光度法で測定することができる。精製された画分の放射化学的純度は、ＩＴＬＣおよび／またはＳＥ−ＨＰＬＣで測定される。
【００２８】
一態様において、本発明は、ＣＤ３３標的部分を有する放射性免疫複合体を含む。本発明によれば、標的部分は、合成もしくは天然のタンパク質、またはタンパク質もしくはその変異体（種、対立遺伝子、および突然変異体を含む）とすることができる。いくつかの実施形態において、標的部分は、抗体部分を含む。
【００２９】
本明細書に記載される方法を使用して生成される放射性免疫複合体は、診断的または治療的医療処置で使用されてもよい。例えば、放射性医薬品は、ＰＥＴまたは他の放射線画像を生成するために、撮像造影剤として使用されてもよい。代替として、放射性医薬品は、体内の生理学的活性の特定の構造または部位に放射線の用量を送達する、治療剤として使用されてもよい。当業者は、放射性医薬品の他の薬理学的な用法を理解するであろう。
【００３０】
別の態様において、本発明は、被験者の癌を治療するための方法を提供し、本方法は、放射性免疫複合体の薬学的に有効な量を被験者に投与することを含む。
【００３１】
さらに別の態様において、本発明は、被験者の癌を治療するための方法を提供し、本方法は、薬学的組成物の薬学的に有効な量を被験者に投与することを含み、本組成物は、細胞表面上のＣＤ３３分子に特異的に結合する、放射性免疫複合体を含む。
【００３２】
定義
【００３３】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈に明示されていない限り、複数の参照先を含む。
【００３４】
「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、本明細書で使用する場合、大体（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）、〜の辺り（ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ）、大まかに（ｒｏｕｇｈｌｙ）、または、およそ（ａｒｏｕｎｄ）を意味する。「約」という用語が数値範囲とともに使用された場合、それは、記載された数値範囲の上下に境界を拡大することによってその範囲を加減する。「約」という用語は、本明細書で使用する場合、言及された数値を２０％の変動幅で上下に加減する。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「純度」という用語は、実質的に単一の化学物質の実体が存在すること、または混合物中に実質的な汚染物質が存在しないことを指す。
【００３６】
開示される方法によって生成される複合体化された分子の純度は、標準的な分析法（例えば、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）または濾過精製）を使用して測定されてもよい。複合体化された標的部分または放射性免疫複合体の量を定量することによって純度が測定される時、純度は、約７０％よりも高く、約８０％よりも高く、約９０％よりも高く、約９５％よりも高く、約９６％よりも高く、約９７％よりも高く、約９８％よりも高く、または約９９％よりも高くなり得る。汚染の量を定量することによって純度が測定される時、複合体化されていないキレート剤等の汚染物質は、約２０％未満、約１０％未満、または約１％未満であり得る。
【００３７】
「生体分子」という用語は、本明細書で使用される場合、高分子を含む炭素を含有する分子を指し、アミノ酸、抗体、タンパク質、ペプチド、核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡを含む）、単糖類、多糖類等を含む、生体系に見出されることが分かっているあらゆる分子を含む。生体分子は、自然発生的であるもの、ならびにそのような分子の誘導体、類似体、および修飾体を含む。加えて、この用語は、薬剤に使用される医薬品、抗生物質等の、炭素を含有する分子を指す。自然界に見られない修飾された塩基を含有する核酸の類似体は、生体分子として含まれる。同様に、自然界に見られる分子のあらゆる類似体またはそのような分子のあらゆる化学物質修飾体も、生体分子の定義に含まれる。生体分子は、天然源から分離されてもよく、または、例えば合成タンパク質、ペプチド、またはオリゴヌクレオチドとして、研究室で合成されてもよい。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「標的部分」という用語は、あらゆるタンパク質、抗体、抗体断片、ホルモン、ペプチド、成長因子、抗原、ハプテン、または特定の生物学的標的部位を認識するように機能するあらゆる他の担体を指す。抗体および抗体断片は、あらゆるポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト、哺乳類、単一鎖、二量体、および四量体の、抗体または抗体断片を指す。そのような生物学的担体は、官能化された錯体に付着した時に、付着した放射性核種を特定の標的組織に搬送する役割を果たす。
【００３９】
「抗体」という用語は、あらゆるポリクローナル、モノクローナル、キメラ抗体、または異種抗体を指す。本発明の放射性核種複合体で使用される抗体は、所望の癌細胞に対する高い特異性を有する、モノクローナル抗体である。本発明において使用される抗体は、例えば、癌、腫瘍、白血病、免疫系の細胞、骨髄および前立腺組織等の切除する必要がある正常な細胞、ＨＩＶ、マイコプラズマ、分化および他の細胞膜抗原、病原体表面抗原、ならびにあらゆる生物活性分子を含む、ウイルス感染した細胞を伴う自己免疫疾患を対象としてもよい。
【００４０】
本明細書に記載される方法とともに使用するのに適切な抗体のいくつかの例には、ＨｕＭ１９５（抗ＣＤ３３）、ＣＣ−１１、ＣＣ−４６、ＣＣ−４９、ＣＣ−４９Ｆ（ａｂ´）2、ＣＣ−８３、ＣＣ−８３Ｆ（ａｂ´）2、および７２．３が挙げられるが、これに限定されない。抗体断片は、Ｆａｂ断片およびＦ（ａｂ´）2断片、ならびに所望の１つまたは複数のエピトープに対する特異性を有する抗体の任意の部分を含む。本発明の放射性核種複合体で使用されてもよい抗体は、当技術分野でよく知られている技術によって調製することができる。非常に特異なモノクローナル抗体は、当技術分野でよく知られているハイブリダイゼーション技術によって精製することができる。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５）、およびＥｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５１１〜５１９（１９７６）を参照されたい。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「放射性複合体」という用語は、放射性核種で標識した生体分子複合体（例えば、タンパク質複合体のキレート剤部分が放射性核種との錯体を形成したもの）を指す。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「放射性免疫複合体」という用語は、放射性核種で標識した標的部分複合体（例えば、タンパク質複合体のキレート剤部分が放射性核種との錯体を形成したもの）を指す。
【００４３】
本明細書に記載される放射性免疫複合体を形成するにあたり、有利なことに、キレート化および複合体化の程度は高い。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「複合体化の程度」および「複合体化収率」という用語は、代替可能に使用され、標的部分によって成功裏に複合体化されたキレート剤を、複合体化反応で使用した総キレート剤で割った割合を意味するように定義される。本反応の複合体化された標的部分を作製する時の複合体化の割合は、５０％よりも大きい、７０％よりも大きい、９０％よりも大きい、９５％よりも大きい、約９６％よりも大きい、約９７％よりも大きい、約９８％よりも大きい、または約９９％よりも大きい。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「キレート化の程度」および「キレート化収率」という用語は、代替可能に使用され、複合体化された標的部分によって成功裏にキレート化された放射性核種を、キレート化反応で使用した総放射性核種で割った割合を意味するように定義される。本反応の放射性免疫複合体を作製する時のキレート化の割合は、５０％よりも大きい、７０％よりも大きい、９０％よりも大きい、９５％よりも大きい、約９６％よりも大きい、約９７％よりも大きい、約９８％よりも大きい、または約９９％よりも大きい。
【００４６】
本明細書に記載されるように、複合体化およびキレート化の生成の程度は、放射性免疫複合体調製プロセスの１つ以上のパラメータに依存する。
【００４７】
本明細書に記載される方法によれば、標的部分は、キレート剤を含む緩衝液中に溶解されてもよい。ｐＨは、複合体化反応混合物中の標的部分によるキレート剤の複合体化の状態を最適化するように選択されてもよい。一実施形態において、複合体化反応混合物は、重炭酸塩緩衝液を含むことができる。別の実施形態において、複合体化反応混合物は、リン酸緩衝液を含むことができる。さらに別の実施形態において、複合体化反応混合物は、約８．０〜約９．２のｐＨを有することができる。例えば、複合体化反応混合物は、約８．０、約８．１、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９、約９．０、約９．１、または約９．２のｐＨを有することができる。複合体化反応混合物の温度も、標的部分によるキレート剤の複合体化を促進するように調整されてもよい。一実施形態において、複合体化反応混合物は、約３７℃の温度でインキュベートすることができる。さらなる実施形態において、複合体化反応混合物は、約１．５時間インキュベートすることができる。
【００４８】
別の実施形態において、複合体化された標的部分は、放射性核種を含む緩衝液中に溶解されてもよい。ｐＨは、キレート化反応混合物中の複合体化された標的部分との放射性核種のキレート化の状態を最適化するように選択されてもよい。一実施形態において、キレート化反応混合物は、ゲンチシン酸を含むことができる。別の実施形態において、キレート化反応混合物は、約５．５〜約７．０のｐＨを有することができる。例えば、キレート化反応混合物は、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、または約７．０のｐＨを有することができる。
【００４９】
また、キレート化反応混合物の温度も、複合体化された標的部分による放射性核種のキレート化を促進するように調整されてもよい。一実施形態において、キレート化反応混合物は、約３７℃の温度でインキュベートすることができる。さらなる実施形態において、キレート化反応混合物は、約１．５時間インキュベートすることができる。ある期間の後、溶液は、クエンチングキレート（例えば、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ））を加えることによって急冷することができ、反応混合物を精製することができる。一実施形態において、キレート化反応混合物は、クエンチングキレートを加えた後、さらにインキュベートすることができる。一実施形態において、キレート化反応混合物は、クエンチングキレートを加えた後、さらに約３０分間インキュベートすることができる。別の実施形態において、キレート化反応混合物は、クエンチングキレートを加えた後、さらに約３７℃でインキュベートすることができる。
【００５０】
キレート化剤
【００５１】
二官能性キレート化剤は、金属イオンを封鎖する能力に加えて、腫瘍細胞エピトープまたは抗原に対する特異性を有する生物学的担体を共有結合的に結合する能力といった、二重の官能性を有する化合物である。そのような化合物は、例えば、それらを放射性金属イオンで錯体化して、特異的抗体に共有結合的に付着させる時の、治療および診断アプリケーションに有効である。この種の錯体は、付着した抗体の特異性によって標的とされる腫瘍細胞に放射性金属を搬送するために使用されている（例えば、Ｍｅａｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４２、６８〜７４（１９８４）、Ｋｅｒｊａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．７７、５８１〜５８５（１９７７）を参照されたい）。
【００５２】
数多くのキレート化剤が、当技術分野において知られている。例えば、Ｐｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＩＮＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＩＮ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＥＤＩＣＩＮＥの「Ｔｈｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｒｏｎ  Ｏｖｅｒｌｏａｄ」、Ｍａｒｔｅｌｌ，Ｅｄ．；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９８０、ｐｐ．２７９〜３１２、Ｌｉｎｄｏｙ、ＴＨＥ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＭＡＣＲＯＣＹＣＬＩＣ  ＬＩＧＡＮＤ  ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、１９８９、Ｄｕｇａｓ、ＢＩＯＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９、およびそれらに含まれる参考文献を参照されたい。
【００５３】
本明細書に記載される放射性免疫複合体の調製に適切な例示的なキレート化剤には、Ｓ−２−（４−イソチオシアナトベンジル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン四酢酸（ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ´，Ｎ´´，Ｎ´´´−四酢酸（ＤＯＴＡ）、ｐ−イソチオシアナトベンジル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ｐ−ＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＯＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ´，Ｎ´´−三酢酸（ＤＯ３Ａ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラキス（２−プロピオン酸）（ＤＯＴＭＡ）、３，６，９−トリアザ−１２−オキサ−３，６，９−トリカルボキシメチレン−１０−カルボキシ−１３−フェニル−トリデカン酸（Ｂ−１９０３６）、１，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ´，Ｎ´´−三酢酸（ＮＯＴＡ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ´，Ｎ´´，Ｎ´´´−四酢酸（ＴＥＴＡ）、トリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、トランス−１，２−ジアミノヘキサン四酢酸（ＣＹＤＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１−（２−ヒドロキシプロピル）−４，７，１０−三酢酸（ＨＰ−ＤＯ３Ａ）、トランス−シクロヘキサン−ジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、トランス（１，２）−シクロヘキサンジエチレントリアミン五酢酸（ＣＤＴＰＡ）、１−オキサ−４，７，１０−トリアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ´，Ｎ´´−三酢酸（ＯＴＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラキス｛３−（４−カルボキシル）−ブタン酸｝、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラキス（酢酸−メチルアミド）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラキス（メチレンホスホン酸）、およびその誘導体、等のキレート剤が挙げられるが、これに限定されない。
【００５４】
放射性核種
【００５５】
複合体化された標的部分によって錯体化される放射性核種は、アクチニウム−２２５、アスタチン−２１１、ヨウ素−１２０、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２４、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１２６、ヨウ素−１３１、ヨウ素−１３３、ビスマス−２１２、ヒ素−７２、臭素−７５、臭素−７６、臭素−７７、インジウム−１１０、インジウム−１１１、インジウム−１１３ｍ、ガリウム−６７、ガリウム−６８、ストロンチウム−８３、ジルコニウム−８９、ルテニウム−９５、ルテニウム−９７、ルテニウム−１０３、ルテニウム−１０５、水銀−１０７、水銀−２０３、レニウム−１８６、レニウム−１８８、テルリウム−１２１ｍ、テルリウム−１２２ｍ、テルリウム−１２５ｍ、ツリウム−１６５、ツリウム−１６７、ツリウム−１６８、テクネチウム−９４ｍ、テクネチウム−９９ｍ、フッ素−１８、銀−１１１、白金−１９７、パラジウム−１０９、銅−６２、銅−６４、銅−６７、リン−３２、リン−３３、イットリウム−８６、イットリウム−９０、スカンジウム−４７、サマリウム−１５３、ルテチウム−１７７、ロジウム−１０５、プラセオジミウム−１４２、プラセオジミウム−１４３、テルビウム−１６１、ホルミウム−１６６、金−１９９、コバルト−５７、コバルト−５８、クロム−５１、鉄−５９、セレニウム−７５、タリウム−２０１、およびイッテルビウム−１６９が挙げられるが、これに限定されず、あらゆる適切な金属放射性同位元素に由来するものであってもよい。
【００５６】
225Ａｃ放射性核種を得る方法は、本発明にはあまり重大ではない。例えば、225Ａｃは、サイクロトロンにおいて調製することができる。225Ａｃは、米国エネルギー省（ＤＯＥ）、および超ウラン元素研究所（ＩＴＵ）（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から、純粋な形態で得ることができる。
【００５７】
精製
【００５８】
特定の実施形態において、本明細書に記載される方法は、反応混合物の他の成分から、複合体化された標的部分または放射性免疫複合体を分離する、１つ以上のステップを含む。一実施形態において、混合物は、濾過デバイスを通した反応混合物の濾過で、反応混合物の他の成分から、複合体化された標的部分または放射性免疫複合体を分離することが分離することができるように、特定の分画分子量を有する濾過デバイス（例えば、ミリポア社の遠心装置）にに移送することができる。一実施形態において、反応混合物の濾過は、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．５％の純度を有する、複合体化された標的部分または放射性免疫複合体を得るために使用することができる。
【００５９】
種々の実施形態において、複合体化された標的部分または放射性免疫複合体の収率は、最終生成物の少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％である。
【００６０】
標的化部分
【００６１】
本明細書に記載される標的部分は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的または部分的にコード化された、１つ以上のポリペプチドを含むことができる。認識された免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、およびミューの定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンに分類され、それぞれ、免疫グロブリンのクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ）を定義する。
【００６２】
基本的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含む。各四量体は、２対の同一のポリペプチド鎖から成り、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）と、１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）とを有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０またはそれより以上のアミノ酸の可変領域を定義する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖を指す。
【００６３】
抗体は、無傷の免疫グロブリンとして、または種々のペプチダーゼによる消化によって生じた、多数の十分特徴付けられた断片として存在する。具体的には、ペプシンは、ヒンジ領域の中のジスルフィド結合より下側で抗体を消化して、Ｆ（ａｂ´）2、すなわち、それ自体がジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１に連結された軽鎖である、Ｆａｂの二量体を生成する。Ｆ（ａｂ´）2を、穏やかな条件下で還元してヒンジ領域の中のジスルフィド結合を切断し、それによって、Ｆ（ａｂ´）2二量体をＦａｂ´単量体に変換することができる。Ｆａｂ´単量体は、本質的に、ヒンジ領域の一部を伴うＦａｂである（さらなる抗体断片用語については、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ，ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）を参照されたい）。Ｆａｂ´領域は、無傷の抗体の消化に関して定義されるが、当業者は、そのようなＦａｂ´断片が、化学的に、または組み替えＤＮＡ法を利用することによって、新たに合成され得ることを理解されるであろう。
【００６４】
Ｆａｂ´領域は、動物（特に、マウスまたはラット）またはヒト起源の抗体から誘導することができ、またはキメラ化（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１，６８５１〜６８５５（１９８４））、またはヒト化（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１，５２２〜５２５（１９８６）および英国特許出願公開第８７０７２５２号）されてもよい。
【００６５】
本明細書に記載されるように、抗体は、これに限定されないが、ヒト、マウス、ウサギ、ラット、齧歯類、霊長類、またはそれらの任意の組み合わせ等の、あらゆる哺乳類を含み、またはこれらから誘導することができ、単離されたヒト抗体、霊長類抗体、齧歯類抗体、哺乳類抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および／または相補性決定領域（ＣＤＲ）グラフト化抗体もしくはＣＤＲ適合化抗体、免疫グロブリン、切断性生物および他の部分、ならびにその変異体を含む。
【００６６】
本発明の実施形態に有用な抗体は、当技術分野でよく知られている幾通りかの方法で誘導することができる。一態様において、抗体は、当技術分野でよく知られているハイブリドーマ技術のうちのいずれかを使用して得ることができる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ、Ｎ．Ｙ．（１９８７〜２００１）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、Ｃｏｌｌｏｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４〜２００１）、Ｃｏｌｌｏｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．（１９９７〜２００１）を参照されたい。
【００６７】
抗体はまた、例えばファージライブラリといった、そのような領域または成分のライブラリから選択することによって得てもよい。ファージライブラリは、免疫化された動物またはヒトのＢ細胞等からの、ランダムオリゴヌクレオチドのライブラリ、または関心の配列を含むポリヌクレオチドのライブラリを挿入することによって作成することができる（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５〜１３１７）。抗体ファージライブラリは、一本鎖ＦｖフラグメントまたはＦａｂフラグメントの発現を可能にする、１つのファージの中に重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖の可変領域対を含む（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ２１（８）３７１〜８）。ファージミドライブラリの多様性は、ライブラリのモノクローナル抗体の免疫特異性を高め、および／または変化させて、付加的な所望のヒトモノクローナル抗体を生成し、その後に識別するように操作することができる。例えば、遺伝子を符合化する重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖の免疫グロブリン分子は、組み立てられた免疫グロブリン分子の中に新しいＨＬ対を作成するように、ランダムに混合（シャッフル）することができる。加えて、Ｈ鎖およびＬ鎖コード化遺伝子のいずれかまたは両方を、免疫グロブリンポリペプチドの可変領域のＣＤＲの中で突然変異を起こさせ、その後に、所望の親和性および中和能力のためにスクリーニングすることができる。抗体ライブラリはまた、１つ以上のヒトフレームワーク配列を選択し、かつヒト抗体レパートリーから、または設計された変形を通して誘導された一群のＣＤＲカセットを導入することによって、合成的に作成することもできる（Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ  ａｎｄ  ｖｏｎ  Ｒｕｄｅｎ  ２０００，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３：５９８〜６０２）。多様性の位置は、ＣＤＲに限定されず、可変領域のフレームワークセグメントを含むこともでき、またはペプチド等の、抗体可変領域以外を含んでもよい。
【００６８】
抗体可変領域以外を含んでもよい他の標的結合成分は、リボソームディスプレイ、酵母ディスプレイ、および細菌ディスプレイである。リボソームディスプレイは、ｍＲＮＡをそれらの同族タンパク質に翻訳し、一方でタンパク質をＲＮＡに付着させたままにする方法である。核酸コード化配列は、ＲＴ−ＰＣＲによって復元される（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ，Ｌ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃｉｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１，９０２２）。酵母ディスプレイは、交配型系の一部である、膜結合アルファ−アグルチニン酵母接着受容体、ａｇａ１およびａｇａ２の融合タンパク質の構築に基づく（Ｂｒｏｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：５５３〜７）。細菌ディスプレイは、細胞膜または細胞壁と関連する、輸送細菌タンパク質への標的の融合に基づく（Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ２００２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，７９：４９６〜５０３）。
【００６９】
ハイブリドーマ技術と比較して、ファージおよび他の抗体のディスプレイ法は、インビトロで、かつ抗原への宿主効果もしくはその逆の可能性を制限することなく、抗原標的に対する選択を操作する機会を与える。
【００７０】
抗体サブ配列の具体的な例には、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）2、Ｆｖ、または一本鎖抗体（ＳＣＡ）フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）が挙げられる。サブ配列は、全長配列 の機能または活性の少なくとも一部を維持する部分を含む。例えば、サブ配列の結合親和性が全長抗体の結合親和性よりも高い、または少ない場合があっても、抗体のサブ配列は、抗原に選択的に結合する能力を維持する。
【００７１】
Ｆｖ断片は、２つの鎖として発現される、軽鎖ＶＬの可変領域および重鎖ＶＨの可変領域を含む断片である。この結合は、非共有結合であってもよく、または化学架橋剤もしくは分子間ジスルフィド結合等の共有結合であってもよい（Ｉｎｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２６５９、Ｓａｎｄｈｕ（１９９２）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：４３７）。
【００７２】
一本鎖抗体（「ＳＣＡ」）は、軽鎖ＶＬの可変領域および重鎖の可変領域を含む、遺伝子操作された抗体または酵素的に消化された抗体であり、随意に、ＶＬ−リンカー−ＶＨ配向またはＶＨ−リンカー−ＶＬ配向のいずれかで、ポリペプチド配列等の可撓性リンカーによって結合される。代替として、一本鎖Ｆｖ断片は、２つのシステイン残基間のジスルフィド結合を介して２つの可変領域を結合することによって生成することができる。ｓｃＦｖ抗体を生成するための方法は、例えば、Ｗｈｉｔｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）：Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：９７、米国特許第４，９４６，７７８号、およびＰａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１２７１によって説明されている。
【００７３】
サブ配列が、無傷の抗体が結合する抗原に結合するのであれば、一価の軽鎖−重鎖の断片を形成するための重鎖の分離、断片のさらなる開裂、または他の酵素的、化学的、もしくは遺伝子的な技術等の、抗体サブ配列を生成する他の方法が使用されてもよい。
【００７４】
本発明で使用される抗体は、完全長抗体、サブ配列（例えば、単一鎖の形態）、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、または単量体の抗原結合活性の少なくとも一部を維持する任意の他の高次オリゴマーを含む。多量体は、本明細書に記載されているような、および従来技術において知られているような、完全長抗体、サブ配列、修飾されていない、または修飾されたヘテロマーもしくはホモマーの組み合わせを含むことができる。抗体の多量体は、複数の抗原結合部位を有する多量体のため、単量体と比較して、抗原の結合活性を高めるのに有用である。抗体の多量体はまた、異なる抗体のオリゴマー（例えば、二量体、三量体、四量体等）の組み合わせを生成し、それによって、多官能性（例えば、二官能性、三官能性、四官能性等）である抗体の組成を生成するのにも有用である。
【００７５】
抗体は、（合成手段によって、またはポリペプチドをコード化する核酸の発現によって生成された）選択された分子の化学的架橋を通して、またはポリペプチドのインビトロもしくは細胞発現、およびその後のオリゴマー化と組み合わせた組み換えＤＮＡ技術を通して生成することができる。抗体は、組み換え技術および発現、異なるエピトープ特異性を伴う抗体を生成するハイブリドーマの融合、または単一の細胞の中に複数のエピトープ特異性を伴う複数の核酸コード化抗体可変鎖の発現を通して、同様に生成することができる。
【００７６】
抗体は、多量体を生成するように、例えば多量体化領域を介して、共有結合または非共有結合を通して直接的または間接的に連結されてもよい。「多量体化領域」は、非共有結合タンパク質−タンパク質の相互作用を媒介する。具体的な例には、コイルドコイル（例えば、ロイシンジッパー構造）、およびアルファへリックスタンパク質配列が挙げられる。ファンデルワールス力、水素結合、または電荷−電荷結合を介してタンパク質−タンパク質結合を媒介する配列も、多量体化領域として考えられる。さらなる例には、基本的なヘリックス−ループ−ヘリックス領域および核酸結合タンパク質（例えば、ＴＡＦ等のＤＮＡ結合翻訳因子）の中でヘテロマーまたはホモマーのタンパク質−タンパク質の相互作用を媒介する他のタンパク質配列が挙げられる。多量体化領域の１つの具体的な例は、四量体の形成を媒介する、ｐ５３の残基３１９〜３６０である。別の例は、四量体に自己組織化するヒト血小板因子４である。さらに別の例は、五量体を形成することができる、トロンボスポンジンファミリのメンバーである、細胞外タンパク質ＴＳＰ４である。さらなる具体的な例は、ｊｕｎ、ｆｏｓ、および酵母タンパク質ＧＣＮ４のロイシンジッパーである。
【００７７】
抗体は、多量体を形成するように、化学架橋剤を介して互いに直接的に結合されてもよく、またはリンカー配列（例えば、ペプチド配列）を介して接続することができる。
【００７８】
一実施形態において、本明細書に記載される方法は、特異的にＣＤ３３に結合し、かつヒト化Ｖ領域の少なくとも一部分を含む、標的部分に関する。例えば、抗体は、定義されているようなＶＬ領域、および少なくとも１つのヒト化断片を有するＶＨ領域を含むことができる。
【００７９】
薬学的組成物
【００８０】
本発明の実践において、放射性免疫複合体は、それ自体が、または薬学的に許容される製剤の成分として投与されてもよい。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」とは、哺乳類の治療で有用であるように十分に無毒である、配合Ｉの化合物のあらゆる塩を意味する。有機源および無機源から標準的な反応によって形成される塩類の代表例には、例えば、硫酸、塩酸、リン酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、乳酸、マレイン酸、フマ酸、パルミチン酸、コール酸、パルモ酸、粘液酸、グルタミン酸、ｄ−樟脳酸、グルタル酸、グリコール酸、フタル酸、酒石酸、ギ酸、ラウリン酸、ステアリン酸、サリチル酸、メタン硫酸、ベンゼンスルホン酸、ソルビ酸、ピクリン酸、安息香酸、桂皮酸、および他の適切な酸が挙げられる。また、アンモニウム、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、および他の類似イオン等の、有機源および無機源から標準的な反応によって形成される塩類も挙げられる。塩が、カリウム、ナトリウム、アンモニウム、またはその混合物である、配合Ｉの化合物の塩類が好適である。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「治療上有効量」という用語は、治療される疾患に治療効果を生成する、放射性免疫複合体の量を意味する。治療上有効量は、哺乳類、放射性免疫複合体、およびその投与の方法（例えば、経口、または非経口）に応じて変動する。当業者は、放射性免疫複合体の治療上有効量を定量することができる。
【００８３】
薬学的組成物は、「薬学的に許容される」および「生理学的に許容される」担体、希釈剤、または賦形剤を含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」および「生理学的に許容される」という用語は、薬学的投与と適合する、溶媒（水性または非水性）、溶液、乳濁液、分散媒体、被覆剤、等張および吸収促進剤、または遅延剤を含む。そのような製剤は、液体：乳濁液、懸濁液、シロップもしくはエリキシル中に、または固体形態：錠剤（被覆ありまたは被覆なし）、カプセル（硬質または軟質）、粉末、顆粒、結晶、またはミクロビーズ中に含有することができる。補充活性化合物（例えば、防腐剤、抗菌剤、抗ウイルス剤および抗真菌剤）を、組成物に組み込むこともできる。
【００８４】
薬学的組成物は、特定の投与の局所経路または全身経路と適合するように製剤化することができる。したがって、薬学的組成物は、特定の経路による投与に適切な担体、希釈剤、または賦形剤を含む。
【００８５】
本発明の組成物の投与経路の特定の限定的でない例は、吸入または鼻腔内送達である。付加的な経路には、経口、経鼻、非経口（例えば、静脈、皮内、皮下）、経口、経皮（局所）、および経粘膜投与が挙げられる。
【００８６】
本明細書に記載される放射性免疫複合体を含む薬学的組成物は、標準的な技術に従って調製することができ、かつ薬学的に許容される担体をさらに含むことができる。一般に、薬学的に許容される担体として、生理食塩水を用いることができる。他の適切な担体には、例えば、水、緩衝水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシンなどが挙げられ、アルブミン、リポタンパク質、グロブリン等の安定性を強化するための糖タンパク質を含む。これらの組成物は、従来の、よく知られている殺菌技術によって殺菌されてもよい。結果として生じる水溶液は、使用のためにパッケージ化されてもよく、または無菌状態の下で濾過されて凍結乾燥されてもよく、凍結乾燥された調製品は、投与の前に無菌水溶液と組み合わせられる。組成物は、ｐＨ調整剤および緩衝液、張度調整剤等の、生理的条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容される補助物質（例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等）を含有していてもよい。
【００８７】
本明細書に記載される放射性免疫複合体の濃度は、薬学的製剤中で大きく異なる可能性があり、すなわち、約０．０５重量％〜約１重量％、約１重量％〜約２重量％、約２重量％〜約５重量％、約５重量％〜約１０重量％、約１０重量％〜約３０重量％、約３０重量％〜約５０重量％、約５０重量％〜約７５重量％、約７５重量％〜約９９重量％である。薬学的組成物は、液量、粘度、および選択された特定の投与方法に従う他のパラメータが挙げられるが、これに限定されない、薬学的組成物の物理的特性に従って選択することができる。例えば、濃度は、治療と関連する流体負荷を低減するように、増加させてもよい。投与される放射性免疫複合体の量は、使用される特定の標的部分、治療されている疾病状態、送達されている治療剤、および臨床医の判断に依存する。一般に、投与される放射性免疫複合体の量は、特定の薬理学的薬剤の治療上有効用量を送達するのに十分なものとなる。種々の薬理学的薬剤のための治療上有効な投与量は当業者によく知られており、代表的な範囲が前述したいくつかの医薬品に与えられる。典型的な放射性免疫複合体の投与量は、体重１キログラムあたり約０．００１〜約５０ｍｇの間、または体重１キログラムあたり約０．１〜約１０ｍｇの間とすることができる。治療上有効な投与量はまた、医師の裁量で定量することもできる。
【００８８】
放射性免疫複合体の薬学的組成物は、非経口的に、すなわち、関節内、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内に、経口で、または経鼻で投与することができる。この用途に適切である特定の製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈ  ｅｄ．（１９８５）に見出される。製剤は、許容される担体または水性担体中に懸濁される放射性免疫複合体の溶液を含むことができる。種々の水性担体（例えば、水、緩衝水、０．９％生理食塩水等）を使用してもよい。これらの組成物は、従来のよく知られている滅菌技術によって滅菌するか、または滅菌濾過することができる。結果として生じる水溶液は、そのまま使用するためにパッケージ化されてもよく、または凍結乾燥されてもよく、凍結乾燥された調製品は、投与の前に無菌水溶液と組み合わせられる。組成物は、ｐＨ調整剤および緩衝液、張度調整剤、湿潤剤等の、生理的条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容される補助物質（例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールミンオレイン酸等）を含有していてもよい。
【００８９】
非経口、皮内、皮下に適用するために使用される溶液または懸濁液には、次のようなものが挙げられる：注射のための水等の無菌希釈剤、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベン等の抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム等の抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩等の緩衝液；および、塩化ナトリウムまたはブドウ糖等の張度調整剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウム等の酸または塩基で調整することができる。
【００９０】
経粘膜または経皮投与には、浸透する障壁に対する適切な浸透剤を製剤中に使用することができる。そのような浸透剤は、一般に当技術分野において知られており、例えば、経粘膜投与のためのもの、洗浄剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、点鼻薬、吸入デバイス（例えば、アスピレータ）、または坐薬の使用を通して達成することができる。経皮投与には、活性化合物を、一般に当技術分野において知られているような軟膏、塗剤、ゲル、またはクリームに製剤化することができる。
【００９１】
本発明の方法で投与するための組成物に適切な付加的な薬学的製剤は、当技術分野において知られている（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）１８ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．、Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ（１９９６）１２ｔｈ  ｅｄ．，Ｍｅｒｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ，Ｎ．Ｊ．、およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｔｅｃｈｎｏｎｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｐａ．（１９９３）を参照されたい）。
【００９２】
薬学的製剤は、投与の容易さおよび投与量の均一性のために、用量単位の形態でパッケージ化することができる。「用量単位の形態」とは、本明細書で使用される場合、治療される被験者に対する単位投与量として適している物理的に別個の単位を指し、各単位は、薬学的担体または賦形剤と関連して所望の治療効果を生成するように計算された、活性化合物の所定の量を含有する。
【００９３】
キット
【００９４】
本発明はまた、本明細書に記載される方法に従って産生される放射性免疫複合体を含むキットも提供する。キットの放射性免疫複合体の標的部分は、本質的にモノクローナルまたはポリクローナルであってもよい。キットの標的部分の一方または両方の腕は、キメラ、ヒト、ヒト化されたもの、または脱免疫化されたものであってもよい。
【００９５】
本明細書によって提供されるキットはまた、組織から非結合放射性免疫複合体を取り除く、クリアリング組成物を含んでもよい。１つの適切なクリアリング剤は、放射性免疫複合体の標的部分の腕を標的とする疾患を標的とした、グリコシル化された抗イディオタイプのＦａｂ´である。この実施形態では、放射性免疫複合体が与えられ、その最大の範囲で標的に付着することが可能である。残存する放射性免疫複合体を取り除くために、グリコシル化されたＦａｂ´として、標的Ａｂに対する抗イディオタイプＡｂが与えられる。クリアリング剤は、一価の様式で放射性免疫複合体に結合し、一方で、その添付のグリコシル残基は、急速な代謝が行われる肝臓に錯体全体を方向付ける。クリアリング剤は、米国特許出願第０９／３１４，１３５号および第０９／３３７，７５６号にさらに詳細に論じられている。
【００９６】
以下の実施例は、本発明を例証するものであり、本発明を理解する際の補助となるように記載されており、いかなる形であれ、その後に続く特許請求の範囲に定義される本発明の範囲を制限するものと解釈するべきではない。
【実施例】
【００９７】
実施例１：用語および定義
【００９８】
Ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡ：Ｓ−２−（４−イソチオシアナトベンジル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン四酢酸（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）
【００９９】
ＢＦＣ：二官能性キレート剤
【０１００】
ＤＯＴＡ−ＢＦＣ：ＤＯＴＡ二官能性キレート剤：例えば、ＮＨＳ−ＤＯＴＡ；ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡ
【０１０１】
Ｎａ（ＮＨ4）Ａｃ：酢酸ナトリウム（アンモニウム）
【０１０２】
ｍＡｂ：モノクローナル抗体：ＨｕＭ１９５
【０１０３】
ＨｕＭ１９５：脊髄性白血病の治療のための抗ＣＤ３３抗体構成体。ＨｕＭ１９５は、ネズミのＭ１９５のＣＤＲ領域をヒトフレームワーク／定常領域と組み合わせた、組み換えＩｇＧ１  ｍＡｂである。
【０１０４】
ＳＥＣ：サイズ排除クロマトグラフィ
【０１０５】
ＨＰＬＣ：高性能液体クロマトグラフィ
【０１０６】
ＳＥ−ＨＰＬＣ／ＵＶ：ＵＶ検出器と連結されたＳＥ−ＨＰＬＣ
【０１０７】
ＳＥ−ＨＰＬＣ／ｒａｄ．：放射線検出器と連結されたＳＥ−ＨＰＬＣ
【０１０８】
ＩＴＬＣ：インスタント薄層クロマトグラフィ
【０１０９】
ＮＨ4ＣＨ3ＣＯ2：酢酸アンモニウム、ＮＨ4Ａｃ
【０１１０】
ＮａＣＨ3ＣＯ2：酢酸ナトリウム、ＮａＡｃ
【０１１１】
Ｄf：希釈係数
【０１１２】
ＣＨＣＡ：アルファ−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸
【０１１３】
ＭＡＬＤＩ：マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法
【０１１４】
ＨＤＰＥ：高密度ポリエチレン
【０１１５】
ＨＥＰＥＳ：Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸
【０１１６】
実施例２：ＨｕＭ１９５のｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡとの複合体化
【０１１７】
２．３．１    材料および化学物質。仕様については表２を参照されたい。
【０１１８】
２．３．２    化学物質の調製および複合体化反応のための条件
【０１１９】
２．３．２．１    事前に以下の溶液を調製する。
【０１２０】
天然ＨｕＭ１９５、５ｍｇ／ｍＬ、４〜８℃で貯蔵
【０１２１】
ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡ、−２０℃で貯蔵
【０１２２】
ＮａＣｌ、０．９％：０．４５ｇのＮａＣｌを秤量し、それを無金属水中に溶解し、次いで容積を５０ｍＬにする。溶液を混合し、均質化の後に、それを０．４５μｍの酢酸セルロース薄膜フィルタを通して濾過する。溶液は、５０ｍＬのＨＤＰＥ容器に保管する。
【０１２３】
０．２Ｍのリン酸一ナトリウム（溶液Ａ）：０．４８ｇのＮａＨ2ＰＯ4を秤量し、２０ｍＬの蒸留されたＨ2Ｏに加える。完全に溶解するまで溶液を混合する。
【０１２４】
０．２Ｍのリン酸二ナトリウム（溶液Ｂ）：２．８３ｇのＮａＨＰＯ4を秤量し、１００ｍＬの蒸留されたＨ2Ｏに加える。
【０１２５】
０．１Ｍのリン酸塩緩衝液、ｐＨ＝８：５．３ｍＬの溶液Ａを９４．７ｍＬの溶液Ｂと組み合わせて、混合する。ｐＨの試験には、ｐＨ紙を使用する。等しい容積の蒸留されたＨ2Ｏ（１００ｍＬ以下）を加えることによって、緩衝液を希釈する。溶液を０．４５μｍの酢酸セルロース薄膜フィルタを通して濾過する。溶液は、５０ｍＬのＨＤＰＥ容器に保管する。
【０１２６】
２ＭのＮａＯＨ：約５ｍＬの３０％ＮａＯＨを取り出し、それを無金属水と混合し、溶液を冷まし、次いで容積を２５ｍＬにする。溶液は、５０ｍＬのＦＥＰ容器に保管する。
【０１２７】
４ＭのＮａＯＨ：５０ｍＬのＨＤＰＥ容器に、５０ｍＬの無金属水および８．０ｇのＮａＯＨを加えて、完全に溶解するまで撹拌する。
【０１２８】
３ＭのＮＨ4Ａｃ（またはＮａＡｃ）：６．１５ｇのＮａＡｃを秤量し、無金属水中に溶解する。塩の溶解後に、容積を２５ｍＬにする。溶液を混合し、均質化の後に、それを０．４５μｍの酢酸セルロース薄膜フィルタを通して濾過する。溶液は、２５ｍＬのＨＤＰＥ容器に保管する。
【０１２９】
０．２５ＭのＮＨ4Ａｃ（またはＮａＡｃ）：２．１ｍＬの３ＭのＮａＡｃを取り出し、無金属水と混合し、容積を２５ｍＬにする。溶液を混合し、均質化の後に、それを０．４５μｍの酢酸セルロース薄膜フィルタを通して濾過する。溶液は、２５ｍＬのＨＤＰＥ容器に保管する。
【０１３０】
０．１ＭのＮＨ4Ａｃ（ＮａＣＨ3ＣＯ2）、ｐＨ７：３．３ｍＬの３ＭのＮａＡｃを取り出し、無金属水と混合し、容積を１００ｍＬにする。溶液は、１００ｍＬのＨＤＰＥ容器に保管する。
【０１３１】
０．１ＭのＨＣｌ：２．５ｍＬの１０ＭのＨＣｌを取り出し、それを２５ｍＬのＰＥ容積測定フラスコ中で無金属水と混合する。溶液が冷めるまで待ち、容積を２５ｍＬにする。溶液を混合し、均質化の後に、それを０．４５μｍの酢酸セルロース薄膜フィルタを通して濾過する。溶液は、２５ｍＬのＨＤＰＥ容器に保管する。
【０１３２】
０．０５ＭのＨＣｌ：１．２５ｍＬの１０ＭのＨＣｌを取り出し、それを２５ｍＬのＰＥ容積測定フラスコ中で無金属水と混合する。溶液が冷めるまで待ち、容積を２５ｍＬにする。溶液を混合し、均質化の後に、それを０．４５μｍの酢酸セルロース薄膜フィルタを通して濾過する。溶液は、２５ｍＬのＨＤＰＥ容器に保管する。
【０１３３】
ＮａＮ3  ０．０５％：０．５ｇのＮａＮ3を秤量し、それをミリポア水中に溶解する。容積を１Ｌにする。
【０１３４】
１．０ＭのＮａＨＣＯ3：５０ｍＬのＨＤＰＥ容器に、５０．０ｍＬの無金属水および８．４ｇのＮａＨＣＯ3を加えて、完全に溶解するまで撹拌する。（これは、２ＭのＮａＨＣＯ3溶液を生じる）。１７．８ｍＬの４ＭのＮａＯＨ溶液および５０ｍＬの２ＭのＮａＨＣＯ3溶液を、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ２５０ｍＬ貯蔵容器（または同等物）の中で混合する。十分に混合する。
【０１３５】
代替として：
【０１３６】
１．０ＭのＮａＨＣＯ3：１００ｍＬのＨＤＰＥ容器に、５０．０ｍＬの無金属水および８．４ｇのＮａＨＣＯ3を加えて、１７．８ｍＬの４ＭのＮａＯＨ溶液と混合する。全体が溶解するまで撹拌し、容積を１００ｍＬにする。溶液は、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ２５０ｍＬ貯蔵容器（または同等物）に保管する。十分に混合する。
【０１３７】
０．１ＭのＨＥＰＥＳ溶液：３．０ｍＬの１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｆｉｓｈｅｒ  ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ、製品番号ＢＰ２９９−５００）を５０ｍＬのＨＤＰＥ瓶の中に置いて、注射のための２７ｍＬの水を加える。
【０１３８】
２．３．２．２    材料
表２：化学物質および複合体化のための材料のリスト
0005985392.tif 000002
0005985392.tif 000003
【０１３９】
２．３．２．３    測定器：
【０１４０】
冷凍（４℃）付き超遠心分離機「Ｂｉｏｆｕｇｅ  ｐｒｉｍｏ  Ｒ（Ｈｅｒａｅｕｓ社製）」またはＴｈｅｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製の同等物、または類似物（６５００ｒｐｍで回転するもの）
【０１４１】
渦流または類似のシステム
【０１４２】
スペクトルの記憶および評価用のコンピュータを備える、ＵＶ可視分光光度計Ｖａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ−Ｗｉｎ５０００または類似のシステム（または同等物）
【０１４３】
ＵＶ検出器、および固定相としてのＷａｔｅｒｓ社製Ｐｒｏｔａｉｎ  Ｐａｃｋ  ３００ＳＷ（または同等物）を伴い、スペクトルの記憶および評価用のコンピュータを備える、ＨＰＬＣ
【０１４４】
ｍＡｂおよび複合体化されたｍＡｂを貯蔵する冷蔵庫（４〜８℃）
【０１４５】
ＢＦＣ−ＤＯＴＡを貯蔵する冷凍庫（−２０℃）
【０１４６】
分析用天秤
【０１４７】
加熱ブロックまたはオーブン内部のＮｕｔａｔｏｒ
【０１４８】
２．３．３    ＨｕＭ１９５の定量化のためのＨＰＬＣ−ＵＶ検出器の校正。ＨｕＭ１９５の品質管理
【０１４９】
２．３．３．１    ＨｕＭ１９５の５ｍｇ／ｍＬの溶液から、ＳＥ−ＨＰＬＣに連結された放射線検出器の感度および使用時の設定によって画定される、既知の濃度を含有する少なくとも３つの希釈された溶液を調製する。感度および直線性に関係があるので、通常は、１２５〜６２５μｇ／ｍＬの濃度の範囲が妥当である。
【０１５０】
２．３．３．２    ２８０ｎｍでＵＶ検出器を使用して測定するために、ＨＰＬＣを準備する。
【０１５１】
２．３．３．３    ０．５ｍＬ／分の速度を使用して、０．９％ＮａＣｌ中でＳＥ−ＨＰＬＣカラムを整える。
【０１５２】
２．３．３．４  希釈されたＨｕＭ１９５溶液から（または複合体から）一定分量を取り出し、それらにＳＥ−ＨＰＬＣ／ＵＶを通過させる。例えば、１００μＬループの注射システムを用いて設定したＨＰＬＣの場合、Ｐｒｏｔａｉｎ  Ｐａｃｋ  ３００ＳＷカラムを通るタンパク質の量は、１２．５μｇ〜６２．５μｇとなる。移動相として、０．９％ＮａＣｌを使用する。典型的なクロマトグラムの具体例として、図２を参照されたい。
【０１５３】
２．３．３．５  信号Ｉc（ピークの下の領域）と濃度との間の関係を確立する。校正曲線（典型的なクロマトグラムを示す、図３を参照されたい）を作成して、分析者が、複合体試料*中のＨｕＭ１９５の濃度を計算することができるようにする。別の類似する手法は、標準的なＨｕＭ１９５試料のＳＥ−ＨＰＬＣ／ＵＶクロマトグラムから得られる濃度と信号との比率を見出すことに基づいている。直線性の条件が満たされていれば、濃度／信号の比率は、定数（Ｋ２８０ｎｍ）となる。したがって、複合体試料のＨｕＭ１９５の濃度は、次式に従って計算される。
Ｃ（ＨｕＭ１９５、ｍｇ／ｍＬ）    ＝    Ｋ280nm×Ｉs×Ｄf
Ｋ280nm     校正試料のＵＶのピーク（２７０ｎｍに設定）の下の
面積（Ｉc）に対する、校正試料の中のＨｕＭ１９５の
濃度（ｍｇ／ｍＬ）の比率。
Ｉc         校正試料のＳＥ−ＨＰＬＣ／ＵＶ（２８０ｎｍ）クロマ
トグラムのピークの下の面積（図２）。
Ｉs         試料のＳＥ−ＨＰＬＣ／ＵＶ（２８０ｎｍ）クロマトグ
ラムのピークの下の面積（図４）。
Ｄf         希釈係数
Ｃ（ＨｕＭ１９５、ｍｇ／ｍＬ）    希釈されていない試料中のＨｕ
Ｍ１９５の濃度（ｍｇ／ｍＬ）。
*  複合体溶液は、２８０ｎｍで吸収する遊離ＢＦＣまたは任意の他の物質を含有すべきではない（図１Ｂを参照されたい）
【０１５４】
２．３．４    任意選択：濾過−遠心分離によるｍＡｂの濃縮
【０１５５】
このステップは、大量の複合体を調製する時に関連する。単一の実験／バイアルあたり約１０ｍｇのＨｕＭ１９５を取り扱うために、次の手順を適用する。
【０１５６】
２．３．４．１    １０，０００ＭＷの分画分子量を伴う新しいミリポア遠心装置ＹＭ−１０を取り（それに応じて回転時間を増加させた、より高い分画のＹＭデバイスを使用してもよい）、それを数ｍＬの０．０５ＭのＨＣｌおよび純粋なＨ2Ｏで洗浄する。
【０１５７】
２．３．４．２  事前に、遠心分離機のチューブの温度を４℃に調整する。
【０１５８】
２．３．４．３  ２ｍＬの天然の５ｍｇ／ｍＬのＨｕＭ１９５溶液または精製されたＨｕＭ１９５を秤量し、それを遠心分離チューブに移す。
【０１５９】
２．３．４．４  溶液の容積が１ｍＬ以下になるまで、該溶液を６５００ｒｐｍおよび４℃で遠心分離する。
【０１６０】
２．３．４．５    遠心分離後、遠心チューブおよび遠心分離機を再度５００ｒｐｍで回転させて、濃縮されたｍＡｂ溶液を残留液バイアルに回収する。
【０１６１】
２．３．４．６  濃縮されたｍＡｂ（約１０ｍｇ／ｍＬ）をエッペンドルフ型バイアルに移す。また、両方の溶液中の濾過水を回収して、ＳＥ−ＨＰＬＣによってＨｕＭ１９５の含有量を分析する。溶液は、４〜８℃に保つ。
【０１６２】
２．３．５  重炭酸塩緩衝液の複合体化反応
【０１６３】
２．３．５．１    ０．２５ｍＬの無金属水中で、２．５ｍｇのＤＯＴＡ／ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎを含有するエッペンドルフ型バイアルを解凍する。
【０１６４】
２．３．５．２    １ｍＬの５ｍｇ／ｍＬの（または０．５ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬの）ＨｕＭ１９５の溶液を加え、溶液を混合する。
【０１６５】
２．３．５．３    ０．０５ｍＬの１．０ＭのＮａＨＣＯ3を加えて、溶液を混合する。
【０１６６】
２．３．５．４    混合した後、０．００１ｍＬの一定分量を除去し、それを適切なｐＨ範囲を伴うｐＨ紙上にスポッティングすることによって、ｐＨを確認する。ｐＨは８〜９にすべきであり、目標ｐＨは９である。ｐＨが８．０〜９．２の間になるまで、０．０１ｍＬの０．１ＭのＮａＨＣＯ3の追加およびｐＨの測定を続ける。
【０１６７】
２．３．５．５  反応混合物を、Ｎｕｔａｔｏｒの中で、３７℃で１時間３０分間インキュベートする。
【０１６８】
２．３．６    任意選択：リン酸塩緩衝液の複合体化反応
【０１６９】
２．３．６．１    予め洗浄したエッペンドルフ型バイアルに５ｍｇのｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡを秤量し、それを０．４ｍＬの０．１Ｍのリン酸塩緩衝液（ｐＨ＝８）中に溶解する。
【０１７０】
２．３．６．２    約１０ｍｇ／ｍＬの濃縮されたｍＡｂ溶液を、４００μＬのリン酸塩緩衝液溶液と穏やかに混合する。
【０１７１】
２．３．６．３    混合した後、０．００１ｍＬの一定分量を除去し、それを適切なｐＨ範囲を伴うｐＨ紙上にスポッティングすることによって、ｐＨを確認する。ｐＨは、８．０〜９．２にすべきである。
【０１７２】
２．３．６．４    ｐＨが低すぎる場合は、２ＭのＮａＯＨの０．０１０ｍＬの一定分量を溶液に加えて、溶液を緩やかに混合する。
【０１７３】
２．３．６．５  目標ｐＨに到達するまで、ステップ２．３．６．３および２．３．６．４を繰り返す。目標ｐＨに到達させるためには、約０．０３ｍＬの２ＭのＮａＯＨ溶液が必要である。
【０１７４】
２．３．６．６  エッペンドルフ型バイアルを閉じ、混合するために渦流システムを使用して、それを室温で２４時間そのままにするか、または、以下のステップ２．３．６．７で説明されるように進行する。
【０１７５】
２．３．６．７    代替として、反応混合物を、加熱ブロックで、または保温シェーカーキャビネットで、３７℃で１時間３０分間インキュベートする。
【０１７６】
２．３．７    濾過−遠心分離による反応混合物の精製  ＳＥ−ＨＰＬＣ／ＵＶのＱＣ
【０１７７】
２．３．７．１    全ての構成体反応混合物（２．３．５．５節または２．３．６．７節）を、新しいミリポア遠心装置ＹＭ−１０または同等物（１０，０００ＭＷ分画）に移す。２０，０００または４０，０００の分画分子量のフィルタも使用可能である。
【０１７８】
２．３．７．２    溶液の容積が約１ｍＬになるまで、１ｍＬの０．１ＭのＨＥＰＥＳまたは０．１ＭのＮａＡｃを加え、６５００*ｒｐｍおよび４℃で試料を遠心分離する。*必然的な分離時間の増加に伴って、より低い回転を使用することができる。他のフィルタを使用する時には、製造業者の指示を用いる。
【０１７９】
２．３．７．３    ステップ２．３．７．２をさらに３回繰り返す。
【０１８０】
２．３．７．４    最終的な精製された複合体化された画分から少量の一定分量を取り出し、それにＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐａｃｋ  ３００ＳＷカラムから成るＳＥ−ＨＰＬＣを通過させる（２．３．３を参照されたい）。移動相として、０．９％ＮａＣｌを使用する。複合化されていないｍＡｂと比較すると、複合体化されたｍＡｂは、クロマトグラムの左側に移行したピークを示す（図４を参照されたい）。
【０１８１】
２．３．７．５    ＳＥ−ＨＰＬＣ／ＵＶクロマトグラム（例えば、図４を参照されたい）を分析し、遊離ＢＦＣに対応するいかなる信号領域も観察されないことを確認する。
【０１８２】
２．３．７．６    遊離ＢＦＣがＳＥ−ＨＰＬＣ／ＵＶクロマトグラムで観察された場合は、ステップ２．３．７．２を繰り返し、それ以外の場合は、以下のステップを継続する。
【０１８３】
２．３．７．７  校正実験のために２．３．３．４〜２．３．３．５に説明されるように、または２．３．９節に示されるように、試料中の複合体化されたｍＡｂの含有量を定量化する。
【０１８４】
２．３．７．８    精製された複合体化された画分は、４〜８℃で貯蔵する：試料は、放射能標識の準備ができている。
【０１８５】
２．３．８    任意選択：重力ＳＥ−クロマトグラフィおよび濾過−遠心分離による反応混合物の精製
【０１８６】
以下の手順は、２．３．７に記載される方法の代替案である。
【０１８７】
２．３．８．１    ステップ２．３．７．１を参照されたい。
【０１８８】
２．３．８．２    ５ｍＬの０．１ＭのＮａＡｃにカラムを通過させることによって、０．１ＭのＮａＡｃ溶液中で、新しいＰＤ−１０樹脂を整える。洗浄液を廃棄する。
【０１８９】
２．３．８．３  全ての構成体反応混合物を（２．３．６．７節または２．３．５．５節の後に）カラムのリザーバに加え、溶離液をエッペンドルフ型チューブまたはＰＥバイアルに回収する（画分１）。
【０１９０】
２．３．８．４    ０．５ｍＬの０．１ＭのＮａＡｃ溶液で反応バイアルを洗浄し、洗浄液をＰＤ−１０カラムのリザーバに注入する。
【０１９１】
２．３．８．５    溶離液を、エッペンドルフ型チューブに別に回収する（画分２）。
【０１９２】
２．３．８．６    ステップ２．３．８．４〜２．３．８．５を２回繰り返す（画分３、４）。
【０１９３】
２．３．８．７    総溶出容積が６ｍＬに到達するまで、０．５ｍＬの０．１ＭのＮａＡｃをＰＤ−１０カラムのリザーバに加え続け、この作業を繰り返す（画分５、６、７、８、９、１０、１１、１２）
【０１９４】
２．３．８．８  それぞれ２ｍＬの０．１ＭのＮａＡｃでカラムを２回以上洗浄する（画分１３および１４）。溶出液を回収する。
【０１９５】
２．３．８．９    画分５〜１２（４ｍＬ）は大部分の複合体化されたｍＡｂを含有するので、これらを組み合わせる。画分１３〜１４は、大部分の結合していないまたは遊離ＢＦＣを含有する。
【０１９６】
２．３．８．１０    ステップ２．３．７．２〜２．３．７．８に示されるように進行する。
【０１９７】
２．３．９    ＵＶ分光光度法による複合体中のタンパク質濃度の定量
【０１９８】
２．３．９．１    ＵＶ分光光度計を２８０ｎｍに設定する（図１に関連する、天然および複合体化されたＨｕＭ１９５の典型的なＵＶスペクトルを見る）。
【０１９９】
２．３．９．２    １つの希釈標準試料を調製し、または随意に、校正曲線を作成するために、少なくとも３つの、既知の０．９％ＮａＣｌ中のＨｕＭ１９５の濃度を伴う希釈された標準溶液を調製し、光学密度（一般的に０．１〜０．８）と濃度（一般的に６０〜６００  ６００μｇ／ｍＬ）との間の直線領域を見出す。校正曲線の例については図５を参照されたい。１ｃｍの光経路キュベットにおける０．１％（０．９％ＮａＣｌ中１ｍｇ／ｍＬ）のＨｕＭ１９５溶液の場合、吸光度は、約１．４である。
【０２００】
２．３．９．３    グラフ「光学密度対濃度」（例えば、図５）からの校正曲線を使用することによって、またはあまり正確ではないが、次式に基づいて、資料中のタンパク質濃度を計算する。
Ｃ（ＨｕＭ１９５、ｍｇ／ｍＬ）  ＝  Ａ280nm×Ｄf×ｆc／ε280nm．Ｌ
Ａ280nm      ２８０ｎｍでの吸光度
ε280nm      ０．１％の場合の２８０ｎｍでの減衰係数＝１．４
Ｌ           キュベットの光経路（１ｃｍ）
Ｄf          希釈係数
ｆc          天然および複合体化されたＩｇＧの減衰係数の差を修正
する係数。この係数は、２８０ｎｍで約１である（図１を
参照されたい）
Ｃ（ＨｕＭ１９５  ｃｏｎｊ、ｍｇ／ｍＬ）  希釈されていない試料中
のＨｕＭ１９５の濃度（ｍｇ／ｍＬ）
【０２０１】
実施例３：放射能標識手順の記述：１ステップ法
【０２０２】
３．１      目的
【０２０３】
予めＤＯＴＡ二官能性キレート剤によって複合体化されたＨｕＭ１９５で225Ａｃを標識する。
【０２０４】
３．２      用語および定義
【０２０５】
実施例１も参照されたい。
【０２０６】
ＤＴＰＡ：ジエチレントリアミン五酢酸
【０２０７】
ゲンチシン酸：２，５−ジヒドロキシ安息香酸
【０２０８】
ＡＡ：アスコルビン酸
【０２０９】
３．３      放射性標識プロトコル
【０２１０】
３．３．１  材料および化学物質
【０２１１】
表３を参照されたい。
表３：化学物質および標識のための材料のリスト
0005985392.tif 000004
0005985392.tif 000005
【０２１２】
３．３．２    化学物質の調製および反応のための条件
【０２１３】
反応バイアルおよび加熱ブロック
【０２１４】
３．３．２．１    新しい反応チューブ（例えば、容積２ｍＬのエッペンドルフ型チューブ）を取り出し、それを数ｍＬの０．１ＭのＨＣｌ、Ｈ2Ｏを注入するための水、そして最後に、０．５ＭのＮａＡｃ（０．５ＭのＮＨ4Ａｃ）緩衝液で洗浄する。
【０２１５】
３．３．２．２    標識のために、同じ種類の反応チューブを使用して加熱ブロックを校正する。チューブ内の液体（水）の温度は、３７±２℃にすべきである。
【０２１６】
Ａｃ−２２５の調製
【０２１７】
３．３．２．３    製造業者から入手したバイアルで225Ａｃの活性を定量化する。
【０２１８】
３．３．２．４    バイアルの中の残留物（試料が乾燥している場合）を０．０５ｍＬの０．２ＭのＨＣｌ溶液中に溶解する。放射性標識について、取り出される一定分量は、０．３ｍＬ未満にすべきである。
【０２１９】
３．３．２．５    不溶性物質の存在を調査する。残留物は、完全に溶解すべきであり、結果として生じた溶液は、均一、透明であるべきで、かつ粒子および異物を含むべきではない。
【０２２０】
他の化学物質および材料
【０２２１】
３．３．２．６    標識のために、予め次の溶液を調製する。
【０２２２】
２節に記載されるような、０．９％ＮａＣｌ中の５〜１０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度のｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡ−ｍＡｂ複合体溶液
【０２２３】
０．５ＭのＮＨ4Ａｃ（またはＮａＡｃ）：４．２ｍＬの３ＭのＮａＡｃを取り出し、それを無金属水と混合して、容積を２５ｍＬにする。溶液を混合し、均質化の後に、それを０．４５μｍの酢酸セルロース薄膜フィルタを通して濾過する。溶液は、２５ｍＬのＨＤＰＥ容器に保管する。
【０２２４】
３ＭのＮａＡｃ中のゲンチシン酸の溶液：０．０３３ｇのゲンチシン酸を秤量して、１ｍＬの３ＭのＮａＡｃ中に溶解する。使用前に、溶液を０．４５μｍの酢酸セルロース薄膜フィルタを通して濾過する。溶液は、容積２ｍＬのエッペンドルフ型バイアルで冷暗所に保管する。
【０２２５】
１５０ｇ／Ｌのｌ−ＡＡ溶液：１．５ｇのＡＡを秤量し、１０ｍＬの無金属水中に溶解する。溶液を０．４５μｍの酢酸セルロース薄膜フィルタを通して濾過する。溶液は、２５ｍＬのＨＤＰＥ容器で冷暗所に保管する。
【０２２６】
５０ｍＭのＤＴＰＡ溶液：０．４９ｇのＤＴＰＡを秤量し、２５ｍＬの無金属水中に溶解する。溶液を０．４５μｍの酢酸セルロース薄膜フィルタを通して濾過する。溶液は、２５ｍＬのＨＤＰＥ容器に保管する。
【０２２７】
２０ｍＭのＤＴＰＡ溶液：０．２０ｇのＤＴＰＡを秤量し、２５ｍＬの無金属水中に溶解する。溶液を０．４５μｍの酢酸セルロース薄膜フィルタを通して濾過する。溶液は、２５ｍＬのＨＤＰＥ容器に保管する。
【０２２８】
以下の材料を調製する。
【０２２９】
ＰＤ−１０カラム
【０２３０】
ｐＨ紙：４〜１０の範囲のｐＨ紙の細帯
【０２３１】
エッペンドル型フバイアル
【０２３２】
ＰＥバイアル
【０２３３】
０．４５μｍ、直径２５ｍｍの酢酸セルロースフィルタおよび濾過用の無菌シリンジ
【０２３４】
ＩＴＬＣ  ＳＧ  ５×２０ｃｍ
【０２３５】
３．３．２．７    標識の前に、非放射性溶液を、０．４５μｍ、直径２５ｍｍの酢酸セルロースフィルタを通して濾過する。
【０２３６】
３．３．２．８    測定器：
【０２３７】
渦流または類似のシステム
【０２３８】
ＵＶ検出器、および固定相としてのＰｒｏｔａｉｎ  Ｐａｃｋ  ３００ＳＥＣカラムを伴うＨＰＬＣ
【０２３９】
ｍＡｂおよび複合体化されたｍＡｂ試料を貯蔵する冷蔵庫（４〜８℃）
【０２４０】
ＢＦＣを貯蔵するための冷凍庫（−２０℃）
【０２４１】
高純度ゲルマニウム検出器を伴うガンマ分光測定システム。随意に、および特に活性バランス評価について、例えばバイアル、カラム等のそれぞれの特定のカウンティングジオメトリの絶対測定を可能にするように、検出器は、Ｃａｎｂｅｒｒａ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社によって特徴付けられるＩＳＯＣＳであるべきで、また、標準的なＧＥＮＩＥ２０００ソフトウェア構成の下で動作する、ＩＳＯＣＳ／ＬＡＢＳＯＣＳソフトウェアパッケージを伴うべきである。
【０２４２】
Ｓｑｕｉｂｂ社製ＣＲＣ−１７放射性同位元素用量校正器（または同等モデル）
【０２４３】
３．３．３    放射性標識
【０２４４】
３．３．３．１    225Ａｃの必要とされる活性を含む（例えば、標識日に約１ｍＣｉ）、０．３ｍＬの０．０５ＭのＨＣｌの一定分量を取り出し、それを反応チューブの中にピペットで移す（３．３．７．３節の表を更新する）。
【０２４５】
３．３．３．２    随意に、反応チューブの中の225Ａｃの活性を、高分解能ガンマ分光測定法で測定する。
【０２４６】
３．３．３．３    ０．１ｍＬの３ＭのＮａＡｃ（またはＮＨ4Ａｃ）を加えて、渦流システムを使用して緩やかに、かつ短く混合する。
【０２４７】
３．３．３．４    ０．００１ｍＬの一定分量を除去し、それを適切なｐＨ範囲を伴うｐＨ紙上にスポッティングすることによって、ｐＨを確認する。ｐＨは、５〜８．５にすべきである。先端部およびｐＨ紙は廃棄せず、それらは、放射能バランス評価のために、小さいＰＥバッグに回収する。
【０２４８】
３．３．３．５    複合体溶液中のＨｕＭ１９５の濃度に応じて、０．１ｍＬ（１０ｍｇ／ｍＬの時）の、または計算した容積の、約１ｍｇのｍＡｂを含有するｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡ−ｍＡｂ複合体溶液を加える。容積は、０．２ｍＬを超えるべきではない。
【０２４９】
注：対照実験では、このステップは省略される。
【０２５０】
３．３．３．６    ０．０２０ｍＬの新しく調製した飽和ゲンチシン酸溶液を加えて、渦流システムを使用して短く緩やかに混合する。
【０２５１】
３．３．３．７    ３．３．３．４を繰り返す。標的ｐＨは、５．５〜７．０の間にすべきである。
【０２５２】
３．３．３．８    ｐＨが７．０を超えている場合は、０．０１０ｍＬの０．１ＭのＨＣｌを加える。ｐＨが５．５以下である場合は、０．０２５ｍＬの３ＭのＮａＡｃを加える。
【０２５３】
３．３．３．９    必要であれば、ステップ３．３．３．８を繰り返す。
【０２５４】
３．３．３．１０    反応混合物を含む２ｍＬの反応バイアル反応チューブを閉じ、それを３７℃の加熱ブロック（３．３．２．２）の中に８０〜９０分間置く。
【０２５５】
３．３．４    ＤＴＰＡの対抗およびＩＴＬＣによる反応収率の定量
【０２５６】
３．３．４．１    ９０分後に、反応を停止させ、０．０１０ｍＬの１０ｍＭのＤＴＰＡ溶液を加え、渦流システムを使用して短く緩やかに混合する。
【０２５７】
３．３．４．２    反応チューブを加熱ブロックの中に戻して、３０分間インキュベートする。
【０２５８】
３．３．４．３    ２０分後、加熱ブロックのスイッチを切り、反応混合物から０．００２ｍＬの一定分量を取り除き、それをＩＴＬＣストライプ（一方から約１５ｍｍの所に記される線）の中央にスポッティングする。空の先端部は、廃棄物用のバックに回収する（３．３．３．４を参照されたい）。反応混合物を含有するチューブは、安全に保つ。
【０２５９】
３．３．４．４    ＩＴＬＣを、移動相を含むガラス管の中に配置する：数ｍＬの２０ｍＭのＤＴＰＡ溶液（ＩＴＬＣに使用される容器の寸法に依存する）。
【０２６０】
３．３．４．５    移動相の最前部が、ストライプの他端から約１５ｍｍの所に記された第２の基準線に到達するまで、７〜８分間待つ。
【０２６１】
３．３．４．６    ＩＴＬＣチューブから帯を除去して、それを乾燥させる。次いで、帯を、それぞれ１５ｍｍの間隔で小さい切片に切断する。
【０２６２】
３．３．４．７    予め番号を付けたポリエチレンバイアル（例えば、液体シンチレーションカウンティングに通常使用される２０ｍＬのＰＥバイアル）の中に、各切片を置く。
【０２６３】
３．３．４．８    １時間待ち、最初の評価のために、高分解能ガンマ分光計上で各クロマトグラム切片の中の221Ｆｒを測定することによって、225Ａｃの活性をカウントする（任意選択）。
【０２６４】
３．３．４．９  225Ａｃと全ての娘との間の放射能平衡のために、６時間以上待ち、最終的な評価のために、221Ｆｒおよび213Ｂｉの両方を通して225Ａｃの活性を測定する。
【０２６５】
３．３．４．１０  次式を使用して放射性標識収率を計算する。
Ｙ（％）＝（Ａ1＋Ａ2）×１００％／Ａt
式中、
Ｙ＝  放射性標識収率（％）
Ａ1＝  クロマトグラムの切片１（最後から数える）において測定される225
Ａｃの活性（Ｂｑ（μＣｉ））
Ａ2＝  クロマトグラムの切片２において測定される225Ａｃの活性（Ｂｑ
（μＣｉ））
Ａt＝  クロマトグラムの全ての切片において測定される225Ａｃ活性の合計
（Ｂｑ（μＣｉ））
同じジオメトリ（線源〜検出器距離、同じバイアル、検出器等）を使用して試料を測定する場合、収率は、次式を使用して計算することができる。
Ｙ（％）＝（Ｉ1＋Ｉ2）×１００％／Ｉt
式中、
Ｙ＝  放射化学収率（％）
Ｉ1＝  クロマトグラムの切片１（最後から数える）において測定される225Ａｃのカウント率（ｃｐｓ）
Ｉ2＝  クロマトグラムの切片２において測定される225Ａｃのカウント率（ｃｐｓ）
Ｉt＝  クロマトグラムの全ての切片において測定される225Ａｃのカウント率（ｃｐｓ）
【０２６６】
３．３．５  １０ＤＧカラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィによる反応混合物の精製
【０２６７】
３．３．５．１    次の構成要素を入手する。１０ｍＬの１０ＤＧのＳＥ樹脂、カラム構成要素、および以下に説明される精製ステップのための３方ストップコック。
【０２６８】
３．３．５．２    １０ｍＬ容積の１０ＤＧの樹脂をプラスチック製の使い捨てカラムに注入し、安定させて、トップフリットを適用する。これらの全ての材料は、Ｂｉｏｒａｄ  Ｉｎｃ．（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）から入手される。パッケージ化した樹脂を２つの容積１０ｍＬの０．９％ＮａＣｌで洗浄する。洗浄液を廃棄する。
【０２６９】
３．３．５．３    樹脂を２つの容積１０ｍＬの１％ＨＳＡで平衡させる。洗浄液を廃棄する。
【０２７０】
３．３．５．４    薬物生成物の回収のために新しい５０ｍＬ無菌コーニングチューブを取り出し、全ての構成体反応混合物（３．３．４を参照されたい）をカラムに適用して、溶出液を廃棄物チューブに回収する。
【０２７１】
３．３．５．５    構成体反応バイアルを０．２０ｍＬの１％ＨＳＡで洗浄し、この洗浄液をカラムに加えて、同じく溶出液を廃棄物チューブに回収する。移動相として２．０ｍＬの１％ＨＳＡを加え、同じく溶出液を廃棄物チューブに回収する。２ｍＬの１％ＨＳＡをサイズ排除カラムに加えて、最終生成物を回収する。
【０２７２】
３．３．５．５    回収された薬物生成物を秤量し、生成物を含有する溶液の質量を記録する。
【０２７３】
３．３．５．６    精製スキームを使用して１．０ｍｇの抗体の８０％が復元されたものと仮定する。活性を、復元されたＨｕＭ１９５の総量（０．８ｍｇ）で割ることによって、生成物の比活性を計算する。生成物の活性レベルは、精製に続いて、６時間後に定量することができる。今回は、Ａｃ−２２５の永続平衡を確立することが必要とされ、生成物収率および活性レベルを定量するために、用量校正器または同等物で測定される。
【０２７４】
３．３．６    任意選択：ＰＤ−１０カラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィによる反応混合物の精製
【０２７５】
これは、３．３．５節に記載される手順の代替案である。
【０２７６】
３．３．６．１    カラム（５ｍＬ、０．９％ＮａＣｌ）を通過させることによって、０．９％ＮａＣｌ溶液中で、ＰＤ−１０樹脂を整える。洗浄液を廃棄する。
【０２７７】
３．３．６．２    全ての構成体反応混合物（３．３．４．３節）をカラムのリザーバに適用し、溶離液（ｆ１）をエッペンドルフ型チューブまたはＰＥバイアルに回収する。
【０２７８】
３．３．６．３    反応バイアルを０．５ｍＬの０．９％ＮａＣｌ溶液で反洗浄し、洗浄液をＰＤ−１０カラムのリザーバに注入する。活性バランス評価のために、空の反応バイアルを廃棄物用の小さいＰＥバッグの中に置く（３．３．３．４を参照されたい）。
【０２７９】
３．３．６．４    溶離液を、エッペンドルフ型チューブまたはＰＥバイアルに別に回収する。
【０２８０】
３．３．６．５    ステップ３．３．６．３〜３．３．６．４を２回繰り返し、これらの溶離液をまとめて回収する（ｆｗ）。
【０２８１】
３．３．６．６    総溶出容積が６ｍＬに到達するまで、０．５ｍＬの０．９％ＮａＣｌをＰＤ−１０カラムのリザーバに加え続ける。４ｍＬの溶離液をまとめて回収する。これらの画分は、大部分の標識された複合体（ｆｐ）を含有するはずである。
【０２８２】
３．３．６．７    付加的な８ｍＬの０．９％ＮａＣｌでカラムを洗浄する。溶離液を、新しい容器の中に別に回収する。これは、遊離または結合したＤＴＰＡ  Ａｃ−２２５（ｆｆ）を含有する、画分である。
【０２８３】
３．３．６．８    １時間待ち、最初の評価のために、高分解能ガンマ分光計上で各バイアルの中の221Ｆｒを測定することによって、225Ａｃの活性をカウントする（任意選択）。
【０２８４】
３．３．６．９    225Ａｃと全ての娘との間の放射能平衡のために、６時間以上待ち、最終的な評価のために、221Ｆｒおよび213Ｂｉの両方を通して225Ａｃの活性を測定する。
【０２８５】
３．３．６．１０    濃縮が必要とされる場合は、画分ｆp（４ｍＬ）を、１０，０００ＭＷの分画分子量を伴う新しいミリポア遠心装置ＹＭ−１０に移す（それに応じて回転時間を増加させた、より高い分画の膜を伴うＹＭチューブを使用してもよい）。そうでない場合は、直接３．３．５．５に進む。
【０２８６】
３．３．６．１１    複合体を組み合わせた溶液の容積が約１ｍＬになるまで、該溶液を６５００ｒｐｍおよび４℃で遠心分離する。
【０２８７】
３．３．６．１２    １モルの０．９％ＮａＣｌを加えて、ステップ３．３．６．１１を繰り返す。
【０２８８】
３．３．６．１３    生成物の回収のために、新しい５０モルの無菌コーニングチューブを取り出す。
【０２８９】
３．３．６．１４    生成物を、新しい５０ｍＬ無菌コーニングチューブに移す。
【０２９０】
３．３．６．１５    最高１ｍＬの１％ＨＳＡで空のＹＭ−１０チューブを洗浄し、洗浄液を、生成物を含有するチューブに移す。
【０２９１】
３．３．６．１６    ３．３．５．５に示されるように進行する。
【０２９２】
３．３．７        任意選択：活性バランスの評価
【０２９３】
３．３．７．１    カラム上に残っている225Ａｃの活性を定量化するために、高分解能ガンマ分光計上でＰＤ−１０カラムを測定する。
【０２９４】
３．３．７．２    標識実験中にＱＣのために使用される空の反応バイアル、先端部、およびｐＨ紙を含むバッグを測定する。
【０２９５】
３．３．７．３    結果を下表（表４）に要約する。
0005985392.tif 000006
【０２９６】
３．４    放射性標識複合体の品質管理
【０２９７】
３．４．１    外観／目視試験：
【０２９８】
３．４．１．１    白および黒の背景を使用して、生成物の透明性、色、および異物がないことを目視で検査する。
【０２９９】
３．４．２        放射性核種の識別
【０３００】
３．４．２．１    校正されたガンマ分光計上のガンマスペクトルを回収する。例として図９を参照されたい。
【０３０１】
３．４．２．２    標準的な核種ライブラリ（表１を参照されたい）を使用して、Ｆｒ−２２１からの２１８ｋｅＶおよびＢｉ−２１３からの４４１ｋｅＶでの主ピークの存在を探す。また、確認のためにＡｃ−２２５およびＴｌ−２０９のピークを探す。
0005985392.tif 000007
【０３０２】
３．４．３        ＩＴＬＣによる放射化学的純度
【０３０３】
３．４．３．１    前述の３．３．４に記載
【０３０４】
３．４．４        サイズ排除ＨＰＬＣによる放射化学的純度
【０３０５】
３．４．４．１    ピークの中のカウント率が放射能検出器のバックグラウンドを大幅に上回るように、構成体から一定分量を取り出す。
【０３０６】
３．４．４．２    校正実験と同じ条件（０．９％ＮａＣｌ、１ｍＬ／分の速度等）を使用して、試料をＳＥ−ＨＰＬＣに通す。
【０３０７】
３．４．４．３    検出器によって検出された全活性に対する、複合体と関連する活性を比較および計算する。具体例として、図６を参照されたい。
【０３０８】
３．４．４．４    次式を使用して複合体「Ｒc」の放射化学的純度を計算する。
Ｒc（％）＝（Ｉc）×１００％／Ｉt
式中、
Ｒc    ＝    標識された複合体の放射化学的純度（％）
Ｉc    ＝    ＳＥ−ＨＰＬＣ／ｒａｄ．クロマトグラム上の複合体ピークの下側で測定される面積（図６）。
Ｉt    ＝    ＳＥ−ＨＰＬＣ／ｒａｄ．クロマトグラム上で測定される総面積（図６）。
次式を使用して、Ａｃ−２２５が関連する高分子量凝集体の割合を計算する。
ＡH（％）＝（Ｉh）×１００％／Ｉt
式中、
ＡＨ    ＝    高分子量凝集体（％）と関連するＡｃ−２２５の割合（％）。
Ｉh    ＝    ＳＥ−ＨＰＬＣ／放射能クロマトグラム上の複合体ピークの左側で測定される面積。
次式を使用して、Ａｃ−２２５が関連する低分子量凝集体の割合を計算する。
ＡL（％）＝（Ｉl）×１００％／Ｉt
式中、
ＡL    ＝    低分子量凝集体の割合と関連するＡｃ−２２５の割合（％）。
Ｉt    ＝    遊離Ａｃ−２２５に対応するピークが始まるまで、複合体ピークの右側で測定される面積（図６）。
【０３０９】
３．４．５    免疫反応性
【０３１０】
３．４．５．１    225Ａｃ−ＨｕＭ１９５の免疫反応性は、総容積０．０３０ｍＬの２ｎｇの放射性標識された抗体を、５００〜１０００倍過剰な抗原（約１０×１０6個のＣＤ３３陽性ＡＬ６７細胞）とともにインキュベートすることによって決定される。
【０３１１】
これらの細胞は、細胞１個当たり約４００、０００個のＣＤ３３陽性結合部位を発現し、加えられたＨｕＭ１９５に対して過剰な抗原の中にある。０℃で３０分間インキュベートした後、遠心分離によって細胞を回収し、上澄み液を取り除き、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１度洗浄して、この洗浄液を取り除いた。細胞ペレット、上澄み液、および洗浄液は、シンチレーションカウンティングによって放射能を測定する。パーセント免疫反応性は、｛（細胞に結合した225Ａｃ−ＨｕＭ１９５）／（結合活性＋非結合活性の総量（上澄み液および洗浄液）｝×１００に等しいものとして計算される。
【０３１２】
３．４．６    バイアルの中のＡｃ−２２５の活性
【０３１３】
３．４．６．１    225Ａｃと全ての娘との間の放射能平衡のために、６時間以上待ち、最終的な評価のために、221Ｆｒおよび213Ｂｉの両方を通して225Ａｃの活性を測定する。
【０３１４】
３．４．７    構成体の総数
【０３１５】
３．４．７．１    生成物の総容積は、重量的に測定される。
【０３１６】
３．４．８    Ａｃ−２２５活性濃度の計算
【０３１７】
３．４．８．１    ３．４．６．１で得られた活性を３．４．７．１で得られた容積で割ることによって、活性濃度（ｍＣｉ／ｍＬ）を計算する。
【０３１８】
３．４．９        比活性の計算
【０３１９】
３．４．９．１    ３．３．５．５節に従う。
【０３２０】
３．４．１０    任意選択：ＵＶ分光光度法によるタンパク質の定量および比活性の計算
【０３２１】
この方法は、ＨＳＡが精製されたタンパク質画分の中に存在しない場合にだけ使用されるべきである（図１．２を参照されたい）。
【０３２２】
３．４．１０．１    組み合わせたタンパク質画分「ｆｐ」（３．３．６．６節）から、０．０２ｍＬの一定分量を取り出し、０．９％ＮａＣｌで容積を０．５ｍＬ（Ｄｆ＝２５）にする。２５という希釈係数Ｄｆは、１ｍｇの複合体が標識に使用される時に推奨される。
【０３２３】
３．４．１０．２    ２．３．７節または２．３．９節で説明されるように、組み合わせて濃縮された試料のタンパク質濃度（ｃｐｉ）を測定する。
【０３２４】
実施例４
【０３２５】
表５：「１ステップ」プロセスと既存のプロセスとのリンツズマブ−Ａｃ−２２５を生成するための製造手順の比較
0005985392.tif 000008
【０３２６】
非特許文献
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【図１Ａ】
0005985392.tif 000009
【図１Ｂ】
0005985392.tif 000010
【図２】
0005985392.tif 000011
【図３】
0005985392.tif 000012
【図４】
0005985392.tif 000013
【図５】
0005985392.tif 000014
【図６】
0005985392.tif 000015
【図７】
0005985392.tif 000016
【図８】
0005985392.tif 000017
【図９】
0005985392.tif 000018
【図１０】
0005985392.tif 000019
【図１１】
0005985392.tif 000020
【図１２】
0005985392.tif 000021
【図１３】
0005985392.tif 000022
【図１４】
0005985392.tif 000023