(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
胚性幹細胞、成体幹細胞及び人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞からなるグループから選択されるいずれかの幹細胞由来の造血幹細胞と、臍帯血由来の造血幹細胞と、末梢血由来の造血幹細胞と、骨髄血由来の造血幹細胞と、臍帯血単核球細胞と、末梢血単核球細胞とからなる群から選択される少なくとも１種類の細胞から、又は、採取された血液から、ＮＫ細胞を含む単核球細胞を調製するステップと、
タクロリムス又はその塩と、ダルテパリン又はその塩とを含む組成物の存在下で、前記ＮＫ細胞を培養するステップとを含むことを特徴とする、
ＮＫ細胞を増幅する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記タクロリムス又はその塩は、タクロリムスの濃度に換算して０．０２ｎｇ／ｍＬないし０．１ｎｇ／ｍＬの濃度であり、前記ダルテパリン又はその塩は、ダルテパリンの濃度に換算して５Ｕ／ｍＬないし１０Ｕ／ｍＬの濃度であることを特徴とする、
方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、
前記「タクロリムス又はその塩と、ダルテパリン又はその塩とを含む組成物」が、ＩＬ−２及びＩＬ−１５をさらに含むことを特徴とする、
方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、
前記ＩＬ−２は０．０７５ｎｇ／ｍＬないし２５ｎｇ／ｍＬの濃度であり、前記ＩＬ−１５は０．５ｎｇ／ｍＬないし５０ｎｇ／ｍＬの濃度であることを特徴とする、
方法。
【請求項５】
請求項３又は４に記載の方法であって、
前記「タクロリムス又はその塩と、ダルテパリン又はその塩とを含む組成物」が抗ＣＤ３抗体をさらに含むことを特徴とする、
方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、
前記抗ＣＤ３抗体は、ＯＫＴ３の濃度に換算して１０ｎｇ／ｍＬないし１ｍｇ／ｍＬの濃度であることを特徴とする、
方法。
【請求項７】
請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法であって、
前記「タクロリムス又はその塩と、ダルテパリン又はその塩とを含む組成物」が、自家血清、ヒトＡＢ型血清、及び／又は、ヒト血清アルブミンをさらに含むことを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＫ細胞の増幅に用いる組成物と、ＮＫ細胞の増幅方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＮＫ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子を発現する細胞は攻撃しないで、ＭＨＣクラスＩ分子の発現が低下した細胞だけを攻撃する。そこでがん及び感染症の細胞療法に同種ＮＫ細胞を用いると、ＧＶＨ（Ｇｒａｆｔ−Ｖｅｒｓｕｓ−Ｈｏｓｔ）病の副作用を回避できる利点がある。実際、Ｍｉｌｌｅｒら（非特許文献１）及びＲｕｂｎｉｔｚら（非特許文献２）の報告によると、がん患者をレシピエントとし、その近縁の健常者のドナーの新鮮な末梢血単核球細胞をＮＫ細胞を濃縮したうえで移植した場合には、移植されたＮＫ細胞は、レシピエントに副作用を起こすことなく、一時的に生着し、細胞傷害活性を保持した。しかし、ＮＫ細胞の移植療法の有効性を示す臨床治験の報告はまだない。その理由の１つは、ドナーからリンパ球アフェレーシスで回収できる細胞数に限度があるため、がん細胞及び病原体感染細胞のような標的細胞を死滅させるのに十分な数のＮＫ細胞を標的細胞が死滅するまでの期間レシピエント体内に滞留させることができないからである。
【０００３】
正常な成人の末梢血の１回のアフェレーシスからは約１×１０１０個の単核球が回収でき、末梢血単核球中のＮＫ細胞の構成比率を約７％とすると、７×１０８個のＮＫ細胞が得られる（非特許文献３）。一方、ＮＫ細胞の移植には、１×１０５個／ｋｇないし２×１０７個／ｋｇ（非特許文献１）か、５×１０５個／ｋｇないし８．１×１０７個／ｋｇ（非特許文献２）のオーダーのＮＫ細胞が用いられる。患者の体重を６０ｋｇとすると、６×１０６個ないし４．８×１０９個のＮＫ細胞が必要となる。これは、正常な成人の末梢血の１回のアフェレーシスから得られるＮＫ細胞の０．００８６倍ないし６．８６倍に相当する。しかし、例えば非特許文献２によると、ＮＫ細胞の生着期間は投与されたＮＫ細胞の数とは相関がみられず、２日ないし１８９日で、中央値は１０日にすぎなかった。つまり、非特許文献２に記載の最大投与量である８．１×１０７個／ｋｇでも、効果も十分ではなかったことになる。すると、がん細胞及び病原体感染細胞のような標的細胞を死滅させるのに十分な数のＮＫ細胞を、標的細胞が死滅するまでの期間レシピエント体内に滞留させるためには、より大量のＮＫ細胞移植をより頻繁に繰り返す必要がある。
【０００４】
そこで、医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理規則に適合した条件（good manufacturing practice、ＧＭＰ）で、ドナーから得たＮＫ細胞をいったん試験管内で培養増幅して、標的細胞を死滅させるのに十分なＮＫ細胞を得る技術の開発が進められている。Ｃａｒｌｅｎｓ、Ｓ．ら（非特許文献４）は、ヒトＣＤ３に対するアゴニスト抗体であるＯＫＴ３と、ＩＬ−２との存在下で健常者の末梢血単核球細胞を２１日間培養して、ＮＫ細胞を純度５５％、１９３倍に増幅したと報告した。Ａｌｉｃｉ，Ｅ．ら（非特許文献５）は、同様の条件でミエローマ患者の末梢血単核球細胞を２０日間培養して、ＮＫ細胞を純度６５％、１６２５倍に増幅したと報告した。Ｆｕｊｉｓａｋｉ，Ｈ．ら、（非特許文献６）は、ＮＫ細胞を活性化する因子を発現するように遺伝的に改変された白血病細胞をフィーダー細胞として用いる培養条件で健常者の末梢血単核球細胞を２１日間培養して、ＮＫ細胞を純度９６．８％、２７７倍に増幅したと報告した。
【０００５】
従来のＮＫ細胞の増幅技術では、副作用の安全性が評価されたＮＫ細胞の投与量の数倍に増幅することしかできない。Ｃａｒｌｅｎｓ、Ｓ．ら（非特許文献４）及びＡｌｉｃｉ，Ｅ．ら（非特許文献５）の報告で増幅された細胞集団中のＮＫ細胞の構成比率、すなわち、純度は、それぞれ、５５％及び６５％で、ＣＤ３陽性細胞の構成比率は、それぞれ、２２％及び２５％であった。ＮＫ細胞の投与数が増大すると、混在するＴ細胞の数も増えるが、これは副作用のリスクを高めるので好ましくない。遺伝的に改変された細胞をフィーダー細胞として用いるＦｕｊｉｓａｋｉ，Ｈ．ら、（非特許文献６）では、Ｔ細胞はほとんど混在しないが、このようなフィーダー細胞の使用は遺伝改変細胞の最終産物への混入というリスクがあるので好ましいとは言えない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ、１０５：３０５１（２００５）
【非特許文献２】Ｒｕｂｎｉｔｚ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２８：９５５（２０１０）
【非特許文献３】Ｃｈｏ，Ｄ．及びＣａｍｐａｎａ，Ｄ．、Ｋｏｒｅａｎ  Ｊ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．、２９：８９（２００９）
【非特許文献４】Ｃａｒｌｅｎｓ，Ｓ．ら、Ｈｕｍ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６２：１０９２（２００１）
【非特許文献５】Ａｌｉｃｉ，Ｅ．ら、Ｂｌｏｏｄ、１１１：３１５５（２００８）
【非特許文献６】Ｆｕｊｉｓａｋｉ，Ｈ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６９：４０１０（２００９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、ＮＫ細胞の純度が高くて、ＮＫ細胞の増幅倍率が高くて、しかも、Ｔ細胞の混在が少ない細胞を、フィーダー細胞を用いないで、臍帯血からでも、末梢血からでも増幅できる技術を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、タクロリムス又はその誘導体又は塩と、ダルテパリン又はその誘導体又は塩とを含む、ＮＫ細胞を増幅するための組成物を提供する。
【０００９】
本発明の組成物は、感染症及び／又はがんを治療するために用いられる場合がある。
【００１０】
本発明の組成物において、前記タクロリムス又はその誘導体又は塩はタクロリムスの濃度に換算して０．０２ｎｇ／ｍＬないし０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で、前記ダルテパリン又はその誘導体又は塩はダルテパリンの濃度に換算して５Ｕ／ｍＬないし１０Ｕ／ｍＬの濃度の場合がある。
【００１１】
本発明の組成物は、ＩＬ−２及びＩＬ−１５をさらに含む場合がある。
【００１２】
本発明の組成物において、前記ＩＬ−２は０．０７５ｎｇ／ｍＬないし２５ｎｇ／ｍＬの濃度の場合があり、０．５ｎｇ／ｍＬないし１０ｎｇ／ｍＬの濃度の場合があり、１ｎｇ／ｍＬないし１０ｎｇ／ｍＬの濃度の場合があり、５ｎｇ／ｍＬないし１０ｎｇ／ｍＬの濃度の場合がある。前記ＩＬ−１５は０．５ｎｇ／ｍＬないし５０ｎｇ／ｍＬの濃度の場合があり、１ｎｇ／ｍＬないし２０ｎｇ／ｍＬの濃度の場合があり、２ｎｇ／ｍＬないし２０ｎｇ／ｍＬの濃度の場合があり、１０ｎｇ／ｍＬないし２０ｎｇ／ｍＬの濃度の場合がある。
【００１３】
本発明の組成物は、抗ＣＤ３抗体をさらに含む場合がある。前記抗ＣＤ３抗体はアゴニスト抗体の場合がある。前記抗ＣＤ３抗体は、ＯＫＴ３、ＵＣＨＴ１及びＨＩＴ３ａの場合がある。
【００１４】
本発明の組成物において、前記抗ＣＤ３抗体は、ＯＫＴ３の濃度に換算して１０ｎｇ／ｍＬないし１ｍｇ／ｍＬの濃度の場合がある。
【００１５】
本発明の組成物は、自家血清、ヒトＡＢ型血清、及び／又は、ヒト血清アルブミンをさらに含む場合がある。
【００１６】
本発明は、ＮＫ細胞を含む単核球細胞を調製するステップと、本発明のＮＫ細胞を増幅するための組成物の存在下で、前記単核球細胞を培養するステップとを含む、ＮＫ細胞を増幅する方法を提供する。
【００１７】
本発明のＮＫ細胞を増幅する方法において、前記ＮＫ細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞及び人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞からなるグループから選択されるいずれかの幹細胞由来の造血幹細胞と、臍帯血由来の造血幹細胞と、末梢血由来の造血幹細胞と、骨髄血由来の造血幹細胞と、臍帯血単核球細胞と、末梢血単核球細胞とからなる群から選択される少なくとも１種類の細胞から調製される場合がある。
【００１８】
本発明は、ＮＫ細胞を含む単核球細胞を調製するステップと、本発明のＮＫ細胞を増幅するための組成物の存在下で、前記単核球細胞を培養するステップと、前記単核球細胞から増幅されたＮＫ細胞を患者に移植するステップとを含む、細胞療法（Adoptive Cell Therapy）を提供する。本発明の細胞療法は、がん及び／又は感染症の治療に用いられる場合がある。
【００１９】
本発明の細胞療法において、前記ＮＫ細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞及び人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞からなるグループから選択されるいずれかの幹細胞由来の造血幹細胞と、臍帯血由来の造血幹細胞と、末梢血由来の造血幹細胞と、骨髄血由来の造血幹細胞と、臍帯血単核球細胞と、末梢血単核球細胞とからなる群から選択される少なくとも１種類の細胞から調製される場合がある。前記ＮＫ細胞のドナーは、レシピエントである患者自身か、該患者の近縁者か、患者とは血縁関係のない者かに由来する場合がある。前記ＮＫ細胞は、レシピエントの腫瘍組織適合性抗原（ＭＨＣ）と抑制性ＮＫ細胞受容体（ＫＩＲ）とが不一致であるドナーに由来する場合がある。
【００２０】
本明細書における「ＮＫ細胞」とは、ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性の単核球細胞をいい、ＭＨＣクラスＩ分子の発現が少ないか、該発現が消失している細胞に対する細胞傷害活性を有する。
【００２１】
本発明の方法において、ＮＫ細胞を含む単核球細胞の調製は、当業者に知られたさまざまな手順を用いることができる。例えば、臍帯血及び末梢血のような血液から単核球細胞を回収する際には、比重遠心法を用いることができる。
【００２２】
本発明の方法において、臍帯血及び末梢血から分離された単核球細胞は凍結保存され、患者への移植時期に応じて解凍され、ＮＫ細胞の増幅に供される場合がある。あるいは、前記単核球細胞は、本発明のＮＫ細胞の増幅方法によって増幅される途中か、増幅が終わった後かに凍結され、患者への移植時期に応じて解凍され、患者への移植に供される場合がある。血球細胞の凍結及び解凍は当業者に周知のいかなる方法を用いてもかまわない。前記細胞の凍結には、いずれかの市販の細胞凍結保存液が用いられる場合がある。
【００２３】
本明細書における「タクロリムス」とは、藤沢薬品工業株式会社（アステラス製薬株式会社）によってＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｕｓｋｕｂａｅｎｓｉｓから単離された免疫抑制物質を指し、ヘルパーＴ細胞においてインターロイキン−２（ＩＬ−２）等のサイトカイン産生を抑制する。本明細書における「ダルテパリン」とは、ブタ小腸粘膜由来のヘパリンを亜硝酸分解して得られた解重合ヘパリンのナトリウム塩を指し、血液凝固Ｘａ因子を阻害することによって抗凝固作用を有する低分子へパリン製剤である。しかし、前記タクロリムス及び前記ダルテパリンのＮＫ細胞の増幅への作用機序は明らかにされていない。
【００２４】
本明細書におけるタクロリムス及びダルテパリンの「塩」とは、タクロリムス及び／又はダルテパリンのＮＫ細胞の増幅効果を損なわないことを条件として、金属塩、アミン塩等を含むいずれかの塩をいう。前記金属塩は、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩等を含む場合がある。前記アミン塩は、トリエチルアミン塩、ベンジルアミン塩等を含む場合がある。
【００２５】
本明細書におけるタクロリムス及びダルテパリンの「誘導体」とは、タクロリムス及びダルテパリンのＮＫ細胞の増幅効果を損なわないことを条件として、タクロリムス及びダルテパリンが、アミノ基か、カルボキシル基か、側鎖かにおいて、いずれかの原子団と共有結合したものを指す。前記いずれかの原子団は、Ｎ−フェニルアセチル基、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基等のような保護基と、タンパク質、ペプチド、糖、脂質、核酸等のような生体高分子と、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリビニル、ポリエステル等のような合成高分子と、エステル基等のような官能基とを含むがこれらに限定されない。前記エステル基は、例えば、メチルエステル、エチルエステルその他の脂肪族エステルか、芳香族エステルかを含む場合がある。
【００２６】
本明細書における「インターロイキン−２（ＩＬ−２）」とは、抗原提示されたＴ細胞から主に産生されるサイトカインの１種類であり、分子量が約１５０００の糖タンパク質を指す。前記ＩＬ−２は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞の増殖・分化を促進することが知られている。本明細書における「インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）」とは、上皮細胞、単球等のさまざまな細胞タイプから産生されるサイトカインの１種類であり、分子量が約１５０００の糖タンパク質を指す。前記ＩＬ−１５は、前記ＩＬ−２と類似の生理作用を示すことが知られている。
【００２７】
前記ＩＬ−２及び前記ＩＬ−１５は、ＮＫ細胞の増幅効果を損なわないことを条件として特に限定されないが、ヒトのアミノ酸配列を有することが好ましく、安全上、組換えＤＮＡ技術で生産されることが好ましい。
【００２８】
本明細書における「抗ＣＤ３抗体」とは、Ｔ細胞、胸腺細胞、ＮＫＴ細胞等に発現するＣＤ３分子を認識する抗体を指す。前記ＣＤ３分子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と会合してＴＣＲのシグナル伝達に関与する。抗ＣＤ３抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ細胞を活性化及び増幅するために用いられ、ＴＣＲ複合体に結合してアゴニスト活性を示すことが知られている。前記アゴニスト活性を有する抗ＣＤ３抗体には、例えば、ＯＫＴ３（ヤンセンファーマ株式会社）、ＵＣＨＴ１（ベイバイオサイエンス株式会社）、ＨＩＴ３ａ（ベイバイオサイエンス株式会社）が含まれるがこれらに限定されない。
【００２９】
本発明のＮＫ細胞を増幅するための組成物は、ＧＭＰグレードの幹細胞培養用培地であって、血液系細胞の増殖に適する培地に添加されて、ＮＫ細胞の増幅培養に用いられる。好ましい培地は、ＣｅｌｌＧｒｏ  ＳＣＧＭ培地（セルジェニックス、岩井化学薬品株式会社）や、Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地（ロンザ、タカラバイオ株式会社）の他、ＩＭＤＭ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０等を含むが、これらに限らない。これらの培地には、被験者の自家血清、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社その他から入手可能なヒトＡＢ型血清や、日本赤十字社から入手可能な献血ヒト血清アルブミンが添加される場合がある。前記自家血清及びヒトＡＢ型血清は０ないし１５％の濃度で添加されることが好ましく、５％の濃度で添加されることがより好ましい。献血ヒト血清アルブミンは０ないし１０％の濃度で添加されることが好ましい。前記被験者は、健常者と、感染症及び／又はがんに罹患した患者との場合がある。
【００３０】
本発明の方法において、培養容器は、商業的に入手可能なディッシュ、フラスコ、プレート、マルチウェルプレートを含むが、これらに限定されない。培養条件は、ＮＫ細胞の増幅効果を損なわないことを条件として特に限定されないが、３７°Ｃ、５％ＣＯ２及び飽和水蒸気雰囲気下の培養条件が一般的である。本発明の目的はＮＫ細胞を増幅することであるため、前記培地で培養する期間が長いほどより多くのＮＫ細胞が得られるので有利である。培養期間は、ＮＫ細胞を所望の細胞数まで増幅することを条件として、特に限定されない。
【００３１】
増幅されたＮＫ細胞の細胞傷害活性は、当業者に周知の方法によって評価できる。前記細胞傷害活性は、前記ＮＫ細胞（エフェクター細胞）と、放射性物質、蛍光物質等で標識した標的細胞とをインキュベーションした後、放射線量又は蛍光強度を測定することによって評価することが一般的である。前記標的細胞は、Ｋ５６２細胞、急性骨髄性白血病細胞、同種ＰＨＡ芽球、慢性骨髄性白血病細胞の場合があるが、これらに限定されない。増幅されたＮＫ細胞の性質は、ＲＴ−ＰＣＲ法、固相雑種形成法、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、免疫比濁法等を用いて調べられる場合がある。
【００３２】
本発明において、自家血清の調製と、臍帯血又は末梢血の全血の採取と、該全血からの単核球細胞の調製と、該単核球細胞の培養前後の細胞数の測定と、培養前後の前記単核球細胞中のＮＫ細胞、Ｔ細胞その他の細胞タイプの構成比率の測定と、ＮＫ細胞の増幅倍率の算出と、測定誤差や有意性についての統計解析とは、当業者に周知のいかなる方法を使用して実施されてもかまわない。
【００３３】
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１Ａ】タクロリムス及びダルテパリンが添加された培地（＋Ｆ＋ＦＫ培地）で培養された臍帯血単核球におけるＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ５６−）、ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）及びＮＫＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ５６＋）の培養細胞全体に対する構成比率の経時的な変化をフロー・サイトメトリー法で測定した実験結果を示すグラフ。
【図１Ｂ】タクロリムス及びダルテパリンが添加された培地（＋Ｆ＋ＦＫ培地）で培養された臍帯血単核球について、グランザイム及びＣＤ５６をともに発現する細胞と、ＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ５６をともに発現する細胞との構成比率の経時的変化をフロー・サイトメトリー法で調べた実験結果を示すグラフ。
【図２Ａ】本発明の方法で増幅された臍帯血由来ＮＫ細胞のＫ５６２に対する細胞傷害活性を調べた実験結果を示すグラフ。
【図２Ｂ】本発明の方法で増幅された臍帯血由来ＮＫ細胞のＡＭＬに対する細胞傷害活性を調べた実験結果を示すグラフ。
【図２Ｃ】本発明の方法で増幅された臍帯血由来ＮＫ細胞のさまざまな細胞に対する細胞傷害活性を調べた実験結果を示すグラフ。
【図２Ｄ】本発明の方法で増幅された臍帯血由来ＮＫ細胞の細胞傷害活性に対する抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の阻害効果を調べた実験結果を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
【実施例１】
【００３６】
ヒト臍帯血由来のＮＫ細胞の増幅
１．材料及び方法
（１）細胞の出所
臍帯血単核球細胞は、文書による説明と文書による同意とが得られた被験者の臍帯血から調製され、北海道臍帯血バンク内の液体窒素システムで凍結保存された。本実験は、北海道臍帯血バンク倫理委員会の承認（承認番号第００５番、初回承認日：２００５年１月２０日）を得て実施された。
【００３７】
（２）細胞培養
前記臍帯血単核球細胞の培養条件の検討には、ＧＭＰグレードの幹細胞培養用培地（ＣｅｌｌＧｒｏ  ＳＣＧＭ、セルジェニックス、岩井化学薬品株式会社）に、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、東洋紡績株式会社、ＥＤ５０  ＜０．５  ｎｇ／ｍＬ、比活性＞  ２ｘ１０６  Ｕ／ｍｇ）と、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２（Ｒ＆Ｄシステムズ、コスモ・バイオ株式会社、ＥＤ５０は０．０７５−０．３７５  ｎｇ／ｍＬ）と、５％のヒトＡＢ型血清（ＮＯＶＡ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，  Ｉｎｃ、コスモ・バイオ株式会社）とが添加された培地（以下、「２＋１５培地」と表される。）が基本培地として用いられた。前記２＋１５培地に、１０ｎｇ／ｍＬないし１ｍｇ／ｍＬの抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ＯＫＴ３、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ  Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ、ヤンセンファーマ株式会社）が添加された培地（以下、「２＋３＋１５培地」と表される。）が調製された。タクロリムス及びダルテパリンの効果を検討する場合には、前記２＋１５培地（培養開始時のみ前記２＋３＋１５培地）に、０．０２−０．１ｎｇ／ｍＬのタクロリムス（ＦＫ５０６、アステラス製薬株式会社）、及び／又は、５−１０Ｕ／ｍＬのダルテパリン（フラグミン（登録商標）、ファイザー株式会社）が添加された培地が用いられた。以下では、２＋１５培地にタクロニムスのみが添加された培地は、「＋ＦＫ培地」と表され、２＋１５培地にダルテパリンのみが添加された培地は、「＋Ｆ培地」と表され、２＋１５培地にタクロニムス及びダルテパリンが添加された培地は、「＋ＦＫ＋Ｆ培地」と表される。臍帯血単核球細胞は常法に従って解凍され、培地１ｍＬあたり１×１０６個の濃度に調製され、フィーダー細胞なしで、市販の２４穴培養プレート（ファルコン、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）又はＴ−２５フラスコ（ファルコン、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）に播種され、３７°Ｃ、５％ＣＯ２及び飽和水蒸気雰囲気下で培養された。前記細胞は、３−４日間毎に、新鮮な培地で２分の１ないし４分の１に希釈され、２１日後に、以下のとおり細胞数及び細胞表面マーカーの解析に供せられた。
【００３８】
（３）細胞数及び細胞表面マーカーの解析
前記臍帯血単核球細胞の培養２１日後の細胞数は、トリパンブルーで染色され、改良ノイバウエル血球計算盤を用いて計測された。前記臍帯血単核球細胞の培養開始時及び培養２１日後における、Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ５６−）、ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）及びＮＫＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ５６＋）を識別する細胞表面マーカーＣＤ３及びＣＤ５６と、ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞の細胞傷害能に関与するグランザイムＡと、ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞の細胞傷害性誘導シグナルレセプターＮＫＧ２Ｄ（ＣＤ３１４）とは、それぞれ、抗ＣＤ３抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）、抗ＣＤ５６抗体（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）、抗グランザイムＡ抗体（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）及び抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ、ベックマン・コールター株式会社）とを用いて、フロー・サイトメトリー法で解析された。有意性の検定はスチューデントt検定で行われた。
【００３９】
２．結果
表１−１及び表１−２は前記臍帯血からのＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）の２１日培養下での増幅に対する０．０２ｎｇ／ｍＬ、０．０５ｎｇ／ｍＬ又は０．１ｎｇ／ｍＬのタクロリムス（以下、「＋ＦＫ０．０２」、「＋ＦＫ０．０５」又は「＋ＦＫ０．１」と表す。）、及び／又は、５Ｕ／ｍＬのダルテパリン（以下、「＋Ｆ」と表す。）の効果を調べた実験結果を示す。各実験条件の標準偏差は、同一条件で５回繰り返された実験結果から算出された。表の「ＮＫ細胞の構成比率」では、フロー・サイトメトリー法により計測された、各実験群の全培養細胞中のＮＫ細胞の割合が百分率で表される。表の「全細胞数」では、各実験群の２１日後の全細胞数が１×１０６個の単位で表される。表の「ＮＫ細胞の増幅倍率」では、各実験群の２１日培養後のＮＫ細胞の数を培養開始時の臍帯血単核球細胞中に存在したＮＫ細胞の数で除算した結果が表される。
【００４０】
【表１−１】
0005840876.tif 000002
【００４１】
【表１−２】
0005840876.tif 000003
【００４２】
表１の数値に上付き文字で示された注記ａ及びｂは、２＋１５培地で培養された実験群の結果に対して比較したときに、有意性のｐ値が、それぞれ、１％未満及び５％未満であることを示す。注記ｃ及びｅは、＋ＦＫ培地で培養された実験群の結果に対して＋ＦＫ＋Ｆ培地で培養された実験群の結果を比較したときに、有意性のｐ値が、それぞれ、１％未満及び５％未満であることを示す。注記ｄは、＋Ｆ培地で培養された実験群の結果に対して＋ＦＫ＋Ｆ培地で培養された実験群の結果を比較したときに、有意性のｐ値が５％未満であることを示す。
【００４３】
表１−１及び表１−２から、０．０２ｎｇ／ｍＬタクロリムス及び５Ｕ／ｍＬダルテパリンが添加された培地（＋ＦＫ０．０２＋Ｆ培地）で臍帯血単核球を２１日培養すると、ＮＫ細胞が１７００倍と多く増幅され、しかも、ＮＫ細胞の構成比率は７２．８％で純度が高いことが明らかになった。ダルテパリンのみが添加された培地（＋Ｆ培地）は、培養下での全細胞の増殖が最も活発なために、ＮＫ細胞は１９８９倍と最も多く増幅されたが、ＮＫ細胞の純度が６５％と低いため、０．０２ｎｇ／ｍＬタクロリムス及び５Ｕ／ｍＬダルテパリンが添加された培地（＋ＦＫ０．０２＋Ｆ培地）、０．０５ｎｇ／ｍＬタクロリムス及び５Ｕ／ｍＬダルテパリンが添加された培地（＋ＦＫ０．０５＋Ｆ培地）とのほうがＮＫ細胞増幅に適する。なお、タクロリムスのみが添加された培地（＋ＦＫ０．０２培地、＋ＦＫ０．０５培地及び＋ＦＫ０．１培地）では、培養下での全細胞の増殖は、基本培地（２＋１５）より成績が悪かった。しかし、ダルテパリンのみが添加された培地（＋Ｆ培地）よりもタクロリムス及びダルテパリンが添加された培地（＋ＦＫ０．０２＋Ｆ培地）のほうがＮＫ細胞の構成比率が高い。そこで、本発明におけるタクロリムスの作用は従来技術から予想することができたとはいえない。
【００４４】
図１Ａは、０．０２ｎｇ／ｍＬタクロリムス及びダルテパリンが添加された培地（＋Ｆ＋ＦＫ培地、「以下、図１及び図２では、いずれの実験でも、タクロリムスの濃度は０．０２ｎｇ／ｍＬで、ダルテパリンの濃度は５Ｕ／ｍＬなので、濃度の記載は省略する。）で培養された臍帯血単核球におけるＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ５６−）、ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）及びＮＫＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ５６＋）の培養細胞全体に対する構成比率の経時的な変化をフロー・サイトメトリー法で測定した実験結果を示すグラフである。グラフの縦軸は培養細胞全体に対する各細胞の構成比率（％）で、横軸は培養日数である。誤差棒は、同一条件で５回繰り返された実験結果の標準偏差を示す。
【００４５】
図１Ａに示されるとおり、０．０２ｎｇ／ｍＬタクロリムス及びダルテパリンが添加された培地（＋Ｆ＋ＦＫ培地）では、培養開始後７日まではＴ細胞の構成比率に大きい変化はみられなかった。この結果から、タクロリムス及びダルテパリンが添加された培地（＋Ｆ＋ＦＫ培地）のＣＤ３を発現する臍帯血単核球細胞に対する作用は、ＯＫＴ３が培養開始時にのみ添加されるため、ＣＤ３を介するＴ細胞刺激は一過性である。理論に拘泥するわけではないが、ＯＫＴ３はＣＤ３を介するＴ細胞増殖促進を通じてＮＫ細胞を含む培養系全体の細胞増殖を促進すると考えられる。Ｔ細胞の構成比率は培養開始後７日から急激に低下し、２１日の培養で約７％にまで減少した。一方、ＮＫ細胞の構成比率は培養開始後７日から急激に増大した。これは、表１に示すとおりＮＫ細胞が２１日の培養で約１７００倍に増幅されることから、ＮＫ細胞だけが培養開始後７日経過後から急激に増殖したためである。なお、ＮＫＴ細胞の構成比率は培養開始後１４日までは緩やかに増大したが、培養開始後１４日を過ぎるとほぼ一定のままであった。
【００４６】
図１Ｂは、タクロリムス及びダルテパリンが添加された培地（＋Ｆ＋ＦＫ培地）で培養された臍帯血単核球について、グランザイム及びＣＤ５６をともに発現する細胞と、ＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ５６をともに発現する細胞との構成比率の経時的変化をフロー・サイトメトリー法で調べた実験結果を示すグラフである。グラフの縦軸は培養細胞全体に対する各細胞の構成比率（％）で、横軸は培養日数である。誤差棒は、同一条件で５回繰り返された実験結果の標準偏差を示す。
【００４７】
図１Ａと図１Ｂとを比較すると、ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）と、グランザイム及びＣＤ５６をともに発現する細胞と、ＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ５６をともに発現する細胞とは、構成比率の経時的変化パターンがほぼ一致した。そこで、本発明で増幅されるＮＫ細胞は、グランザイム及びＮＫＧ２Ｄを発現することが示唆された。
【実施例２】
【００４８】
増幅されたＮＫ細胞の細胞傷害活性
１．材料及び方法
（１）細胞
タクロリムス及びダルテパリンが添加された培地（＋Ｆ＋ＦＫ培地）で臍帯血単核球細胞が２１日培養されて得られた細胞（以下、「本発明の方法で増幅された臍帯血由来ＮＫ細胞」という。）が、エフェクター細胞として用いられた。慢性骨髄性白血病細胞由来のＫ５６２株（以下、「Ｋ５６２」という。）と、未分化型の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ（Ｍ０））細胞（以下、「ＡＭＬ」という。）と、第三者の同種ＰＨＡ幼若化細胞（以下、「ＡｌｌｏＰＨＡ」という。）と、慢性期の慢性骨髄性白血病細胞（以下、「ＣＭＬ」という。）とが、標的細胞として用いられた。
【００４９】
（２）細胞傷害活性の定量
本発明の方法で増幅された臍帯血由来ＮＫ細胞の細胞傷害活性（％）は、当業者に周知の方法で評価された。簡潔には、５１Ｃｒで標識された標的細胞と、エフェクター細胞とが４時間混合培養された。その後、培養上清に遊離した５１Ｃｒの放射線量が測定され、傷害された標的細胞の比率が、ＮＫ細胞の細胞傷害活性（％）として決定された（４時間５１Ｃｒ遊離アッセイ）。エフェクター細胞と標的細胞との比（Ｅ：Ｔ）は、１対１、３対１、及び、１０対１であった。
【００５０】
（３）抗体による細胞傷害活性阻害
抗ＮＫＧ２Ｄモノクローナル抗体（１Ｄ１１、ＡｂＤ（Ｓｅｒｏｔｅｃ）、Ｒ＆Ｄシステムズ、フナコシ株式会社）が、エフェクター細胞及び標的細胞をインキュベーションするときに最終濃度５０μｇ／ｍＬで添加された。
【００５１】
２．結果
図２Ａは、本発明の方法で増幅された臍帯血由来ＮＫ細胞のＫ５６２に対する細胞傷害活性を調べた実験結果を示すグラフである。縦軸は細胞傷害活性（単位：％）である。各実験条件の誤差棒は、同一条件で３回繰り返された実験結果の標準偏差を示す。Ｅ：Ｔが１：１のとき、細胞傷害活性は約５５％であった。Ｅ：Ｔの比が、３対１と１０対１とのとき、前記細胞傷害活性はともに８０％を上回り、最大域に達した。
【００５２】
図２Ｂは、本発明の方法で増幅された臍帯血由来ＮＫ細胞のＡＭＬに対する細胞傷害活性を調べた実験結果を示すグラフである。縦軸は細胞傷害活性（単位：％）である。各実験条件の誤差棒は、同一条件で３回繰り返された実験結果の標準偏差を示す。Ｅ：Ｔが１：１のとき、前記細胞傷害活性は約１５％であった。Ｅ：Ｔが３：１及び１０：１のとき、前記細胞傷害活性は、それぞれ、約３０％及び約５５％であった。以上の結果から、本発明の方法で増幅された臍帯血由来ＮＫ細胞はＡＭＬに対しても細胞傷害活性を示すことが示された。
【００５３】
図２Ｃは、本発明の方法で増幅された臍帯血由来ＮＫ細胞のさまざまな細胞に対する細胞傷害活性を調べた実験結果を示すグラフである。縦軸は細胞傷害活性（単位：％）である。各実験条件の誤差棒は、同一条件で３回繰り返された実験結果の標準偏差を示す。Ｅ：Ｔの比が１０：１のとき、前記細胞傷害活性は、Ｋ５６２に対しては約９０％であり、ＡｌｌｏＰＨＡに対しては約５％であり、２名の異なる患者由来のＣＭＬに対しては、それぞれ、約２５％及び約３５％であり、ＡＭＬに対しては約５３％であった。以上の結果から、本発明の方法で増幅された臍帯血由来ＮＫ細胞は、白血病細胞に対しては細胞傷害活性を示すが、ＰＨＡで幼若化されたリンパ球に対しては細胞傷害活性を示さないことが示された。
【００５４】
図２Ｄは、本発明の方法で増幅された臍帯血由来ＮＫ細胞の細胞傷害活性に対する抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の阻害効果を調べた実験結果を示すグラフである。縦軸は細胞傷害活性（単位：％）である。黒色の棒グラフは抗体非存在下での細胞傷害活性を表し、灰色の棒グラフは抗体存在下での細胞傷害活性を表す。各実験条件の誤差棒は、同一条件で３回繰り返された実験結果の標準偏差を示す。本発明の方法で増幅された臍帯血由来ＮＫ細胞のＫ５６２に対する細胞傷害活性はＥ：Ｔの比が１０：１のとき約５３％であったが、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体存在下では細胞傷害活性が約２５％に低下した。本発明の方法で増幅された臍帯血由来ＮＫ細胞のＡＭＬに対する細胞傷害活性は約１８％であったが、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体存在下では細胞傷害活性が約８％に低下した。以上の結果から、本発明の方法で増幅された臍帯血由来ＮＫ細胞のＫ５６２及びＡＭＬに対する細胞傷害活性には、ＮＫＧ２Ｄを介するシグナル伝達経路が少なくとも部分的に関与することが示された。
【実施例３】
【００５５】
末梢血由来のＮＫ細胞の増幅
１．材料及び方法
（１）細胞の出所
末梢血単核球細胞は、文書による説明と文書による同意とが得られた被験者の末梢血から調製され、定法に従って凍結保存された。保存検体を使用する本実験は、北海道大学医学研究科医の倫理委員会によって平成１３年２月２３日に初回承認、平成２０年１１月６日に追加変更承認を得て実施された。
【００５６】
（２）細胞培養
末梢血単核球細胞は、健常者と、同種幹細胞移植を施された白血病患者とから、常法に従って調製された。前記末梢血単核球細胞は、実施例１で説明された手順に従って、タクロリムス及びダルテパリンが添加された培地（＋Ｆ＋ＦＫ培地）で２１日培養された。
【００５７】
（３）細胞数及び細胞表面マーカーの解析
前記末梢血単核球細胞の培養２１日後の細胞数は、自動細胞計数装置により計測された。前記臍帯血単核球細胞の培養開始時及び培養２１日後における、Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ５６−）、ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）及びＮＫＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ５６＋）を識別する細胞表面マーカーＣＤ３及びＣＤ５６は、実施例１と同様にフロー・サイトメトリー法で解析された。
【００５８】
２．結果
表２は、０．０２ｎｇ／ｍＬのタクロリムス及び５Ｕ／ｍＬのダルテパリンが添加された培地（＋Ｆ＋ＦＫ培地）で健常者の末梢血からＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）が２１日培養された実験の結果を示す。標準偏差は、同一条件で６回繰り返された実験結果から算出された。表の「培養前」と「培養後」とは、それぞれ、培養開始時と、＋Ｆ＋ＦＫ培地での培養２１日後とを表す。表の「ＮＫ細胞数」は、培養開始時（培養前）及び培養２１日後（培養後）のＮＫ細胞数が１×１０６個の単位で表される。表の「ＮＫ細胞の構成比率」では、フロー・サイトメトリー法により計測された、全培養細胞中のＮＫ細胞の割合が百分率で表される。表の「ＮＫ細胞増幅倍率」では、＋Ｆ＋ＦＫ培地での２１日培養後のＮＫ細胞の数を培養開始時の末梢血単核球細胞中に存在したＮＫ細胞の数で除算した結果が表される。
【００５９】
【表２】
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【００６０】
表２の培養後のＮＫ細胞構成比率の数値に上付き文字で示された注記ａは、２＋１５培地と比較した＋Ｆ＋ＦＫ培地の場合がｐ値  ５％未満であることを示す（６検体）。
【００６１】
表２から、健常者の末梢血単核球では、タクロリムス及びダルテパリンが添加された培地（＋Ｆ＋ＦＫ培地）で２１日培養すると、ＮＫ細胞が約６３００倍と非常に多く増幅され、しかも、ＮＫ細胞の純度も７３．４％と高いことが明らかになった。
【００６２】
表３は、０．０２ｎｇ／ｍＬのタクロリムス及び５Ｕ／ｍＬのダルテパリンが添加された培地（＋Ｆ＋ＦＫ培地）で同種幹細胞を移植された患者の末梢血からＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）が２１日培養された実験の結果を示す。標準偏差は、同一条件で７回繰り返された実験結果から算出された。表の「培養前」と「培養後」とは、それぞれ、培養開始時と、＋Ｆ＋ＦＫ培地での培養２１日後とを表す。表の「ＮＫ細胞数」は、培養開始時（培養前）及び培養２１日後（培養後）のＮＫ細胞数が１×１０６個の単位で表される。表の「ＮＫ細胞の構成比率」では、フロー・サイトメトリー法により計測された、全培養細胞中のＮＫ細胞の割合が百分率で表される。表の「ＮＫ細胞増幅倍率」では、＋Ｆ＋ＦＫ培地での２１日培養後のＮＫ細胞の数を培養開始時の末梢血単核球細胞中に存在したＮＫ細胞の数で除算した結果が表される。
【００６３】
【表３】
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【００６４】
表３から、同種幹細胞を移植された患者の末梢血単核球では、タクロリムス及びダルテパリンが添加された培地（＋Ｆ＋ＦＫ培地）で２１日培養すると、ＮＫ細胞が約４３００倍と非常に多く増幅され、しかも、ＮＫ細胞の純度も８３．２％と高いことが明らかになった。また、同種幹細胞を移植された患者の末梢血単核球では、グランザイム及びＮＫＧ２Ｄの発現が臍帯血単核球と同様に増大した（データは示されない。）。したがって、前記末梢血単核球は、前記臍帯血単核球と同程度の細胞傷害活性を有することが示唆された。
【００６５】
以上のとおり、本発明のタクロリムス及びダルテパリンが添加された培地（＋Ｆ＋ＦＫ培地）を用いる方法によって、末梢血単核球細胞を２１日間培養したところ、ＮＫ細胞が純度７３．４％、６２６８倍に増幅された。本発明の方法による末梢血単核球細胞の増幅成績は、健常者の末梢血単核球細胞を２１日間培養して、ＮＫ細胞が純度５５％、１９３倍に増幅されたとの報告（Ｃａｒｌｅｎｓ、Ｓ．ら、Ｈｕｍ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６２：１０９２（２００１））と、ミエローマ患者の末梢血単核球細胞を２０日間培養して、ＮＫ細胞を純度６５％、１６２５倍に増幅したとの報告（Ａｌｉｃｉ、Ｅ．ら、Ｂｌｏｏｄ、１１１：３１５５（２００８））とに比べて顕著に優れている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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