(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１および４〜１４の１２種類のペプチドから構成される、脳腫瘍を治療するための薬剤であって、患者末梢血中の各ペプチドに対する抗体を測定し、抗体が陽性であったペプチドを抗体の測定値が高い順に４種類選択して１種類のペプチドあたり３〜５ｍｇのペプチドを該患者に投与し、ペプチドの投与回数が６回以上であり、６〜１２回の投与毎に抗体の測定値が高い順に４種類のペプチドを再度選択するよう用いられ、かつ、４種類のペプチドが配列番号４、５、６、７、１１、１２、１３、および１４の８種類から選択され、４種類のペプチドのうち３種類が配列番号４、５、６、１１、１２、１３、および１４の７種類から選択されるペプチドであることを特徴とする薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんの免疫療法に用いるための腫瘍抗原由来のペプチド群を含む薬剤、具体的にはがんペプチドワクチンに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
世界では、年間約１，０００万人が新たにがんを発症し、うち約６００万人が死亡している。日本国内では、年間のがん患者発生数は約６０万人であり、毎年約３３万人以上ががんのため死亡し、これは全死亡者数の約３０％を占める。このようながんに対して従来行なわれている主な治療方法は、手術、放射線療法、化学療法などである。そして、近年では、がん細胞が発現するレセプターなどの分子を標的とした抗体医薬が盛んに開発され、臨床で用いられている。しかしながら、これらの治療方法は、一時的には効果を示すもののがんの進行を止めることができない。よって、新たな作用機序を有する次世代の治療方法として、免疫療法に関する研究並びに開発が行なわれている。
【０００３】
免疫療法については、世界的には腫瘍抗原提示細胞（樹状細胞）を用いた細胞療法（ＵＳ，Ｄｅｎｄｒｅｏｎ社のＰｒｏｖｅｎｇｅ等）が先行しており、２００９年４月にはｐｉｖｏｔａｌ  Ｐ−III試験成績の速報が発表され、２０１０年には米国ＦＤＡからの承認がなされた。
【０００４】
また、腫瘍抗原を薬剤として用いるワクチン療法については、ルドウィヒ研究所で発見されたＭＡＧＥ−Ａ３抗原を用いた非小細胞肺がんの術後再発予防に関する試験や、悪性ＥＧＦＲｖＩＩＩを用いた脳腫瘍（神経膠芽腫）に対するペプチドワクチンの開発がなされている。
【０００５】
一方、がんの予防を目的としたワクチンについては、メルク社とＧＳＫ社がそれぞれ、子宮頸癌の予防ワクチンについて承認を得ている。
【０００６】
しかしながら、現在先行している免疫療法の一つである細胞療法は、患者から採取した細胞を必須とするため、実際には設備が整った施設でしか実施できないという問題点がある。また、現在開発が進められているＭＡＧＥ−Ａ３やＥＧＦＲｖＩＩＩ由来のペプチドワクチンは、全ての患者に同一の抗原を投与する薬剤形態をとっているが、各患者におけるがん細胞のタンパク質の発現パターンは様々であることから（非特許文献５２）、患者によってはがん細胞が投与された抗原を発現していないということもあり、その場合は十分な効果が期待できないことが予想される。事実、このような免疫療法の奏効率は十分でないという報告も存在する（非特許文献５１）。
【０００７】
そこで、本発明者らは、各患者のがん細胞がヘテロな集団であり、患者毎にがんに対する免疫応答を引き起こす抗原が異なることに着目し、腫瘍抗原ペプチドを複数同定し、このペプチド群の各ペプチドに対する免疫応答を患者毎に確認し、免疫応答が得られる最適なペプチドを投与するという、いわゆる「テーラーメイド型がんペプチドワクチン」の研究、開発を試みてきた。
【０００８】
がんの免疫療法では、がん細胞が発現する抗原がヒト白血球抗原（ＨＬＡ）分子によって細胞表面上に提示され、これを認識する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）ががん細胞を傷害することによってがんの進行を阻止するとされており、本発明者らは、数百の腫瘍抗原ペプチドを同定し、これらのうち約８０種類のペプチドを用いて、患者末梢血中に存在するＣＴＬのペプチドに対する反応性を測定し、最適なペプチドを選択して投与する方法について鋭意検討してきた。（特許文献１〜３）。
【０００９】
しかしながら、医薬品化に当たっては、ペプチドの種類が多ければ多いほど製造や開発にコストがかかり、製品化しにくいという問題がある。さらに、実際の医療現場においても、ペプチドの保管や、ペプチドの取り違いがないよう管理するための負担が増大してしまうなど、ペプチド選択から投薬までのプロセスが煩雑になるという問題点があった。一方、ペプチドの種類を減らすと患者によっては最適なペプチドが選択できなくなり、薬剤の効果を低くしてしまうという懸念もあった。また、ＣＴＬを用いた測定によるペプチドの選択は、時間を要する、十分な再現性を担保した測定が難しい等の問題点もあった。
【００１０】
以下の文献は引用により本明細書に含まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ＷＯ２００５／０４１９８２
【特許文献２】ＷＯ２００５／１２３１２２
【特許文献３】ＷＯ０３／０２５５６９
【特許文献４】特開平１１−３１８４５５号公報
【特許文献５】ＷＯ００／１２７０１
【特許文献６】ＷＯ０１／０１１０４４
【特許文献７】ＷＯ０３／０５０１４０
【特許文献８】特開２００５−１６２６７９号公報
【特許文献９】特開２００５−１７０７９９号公報
【特許文献１０】ＷＯ２００５／０７１０７５
【特許文献１１】特開２００７−１４５７１５号公報
【特許文献１２】ＷＯ２００９／０３８０２６
【特許文献１３】特開２００３−２７０号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Nakao M, Shichijo S, Imaizumi T, Inoue Y, Matsunaga K, Yamada A, Kikuchi M, Tsuda N, Ohta K, Takamori S, Yamana H, Fujita H, and Itoh K.  Identification of a gene coding for a new squamous cell carcinoma antigen recognized by the CTL. J Immunol. 164:2565-2574, 2000.
【非特許文献２】Yang D, Nakao M, Shichijo S, Sasatomi T, Takasu H, Matsumoto H, Mori K, Hayashi A, Yamana H, Shirouzu K, and Itoh K. Identification of a gene coding for a protein possessing shared tumor epitopes capable of Inducing HLA-A24-restricted cytotoxic T lymphocytes in cancer patients. Cancer Res. 59:4056-4063, 1999.
【非特許文献３】Harashima N, Tanaka K, Sasatomi T, Shimizu K, Miyagi Y, Yamada A, Tamura M, Yamana H, Itoh K, and Shichijo S.  Recognition of the Lck tyrosine kinase as a tumor antigen by cytotoxic T lymphocytes of cancer patients with distant metastases. Eur J Immunol. 31:323-332, 2001.
【非特許文献４】Inoue Y, Takaue Y, Takei M, Kato K, Kanai S, Harada Y, Tobisu K, Noguchi M, Kakizoe T, Itoh K, and Wakasugi H.  Induction of tumor specific cytotoxic T lymphocytes in prostate cancer using prostatic acid phosphatase derived HLA-A2402 binding peptide. J Urol. 166:1508-1513, 2001.
【非特許文献５】Harada M, Kobayashi K, Matsueda S, Nakagawa M, Noguchi M, and Itoh K.  Prostate-specific antigen-derived epitopes capable of inducing cellular and humoral responses in HLA-A24+ prostate cancer patients. Prostate. 57:152-159, 2003.
【非特許文献６】Kobayashi K, Noguchi M, Itoh K, and Harada M.  Identification of a prostate-specific membrane antigen-derived peptide capable of eliciting both cellular and humoral immune responses in HLA-A24+ prostate cancer patients. Cancer Sci. 94(7):622-627, 2003.
【非特許文献７】Ogata R, Matsueda S, Yao A, Noguchi M, Itoh K, and Harada M.  Identification of polycomb group protein enhancer of zeste homolog 2(EZH2)-derived peptides immunogenic in HLA-A24+ prostate cancer patients. Prostate. 60:273-281, 2004.
【非特許文献８】Yao A, Harada M, Matsueda S, Ishihara Y, Shomura H, Noguchi M, Matsuoka K, Hara I, Kamidono S, and Itoh K. Identification of parathyroid hormone-related protein-derived peptides immunogenic in human histocompatibility leukocyte antigen-A24+ prostate cancer patients. Br J Cancer. 91:287-296, 2004.
【非特許文献９】Shomura H, Shichijo S, Komatsu N, Matsueda S, Mine T, Rikimaru T, Sato Y, and Itoh K. Identification of epidermal growth factor receptor-derived peptides recognised by both cellular and humoral immune responses in HLA- A24+ non-small cell lung cancer patients. Eur J Cancer. 40:1776-1786, 2004.
【非特許文献１０】Yamada A, Kawano K, Koga M, Matsumoto T, and Itoh K. Multidrug resistance-associated protein 3 is a tumor rejection antigen recognized by HLA-A2402-restricted cytotoxic T lymphocytes. Cancer Res. 61: 6459-6466, 2001.
【非特許文献１１】Miyagi Y, Imai N, Sasatomi T, Yamada A, Mine T, Katagiri K, Nakagawa M, Muto A, Okouchi S, Isomoto H, Shirouzu K, Yamana H, and Itoh K.  Induction of cellular immune responses to tumor cells and peptides in colorectal cancer patients by vaccination with SART3 peptides. Clin Can Res. 7:3950-3962, 2001.
【非特許文献１２】Hida N, Maeda Y, Katagiri K, Takasu H, Harada M, and Itoh K.  A simple culture protocol to detect peptide-specific cytotoxic T lymphocyte precursors in the circulation. Cancer Immunol Immunother.  51:219-228, 2002.
【非特許文献１３】Komatsu N, Shichijo S, Maeda Y, and Itoh K. Measurement of interferon-γ by high-throughput fluorometric microvolume assay technology (FMAT) system. J Immunol Methods. 263:169-176, 2002.
【非特許文献１４】Noguchi M, Kobayashi K, Suetsugu N, Tomiyasu K, Suekane S, Yamada A, Itoh K, and Noda S.  Induction of cellular and humoral immune responses to tumor cells and peptides in HLA-A24 positive hormone-refractory prostate cancer patients by peptide vaccination. Prostate. 57: 80-92, 2003.
【非特許文献１５】Tanaka S, Harada M, Mine T, Noguchi M, Gohara R, Azuma K, Tamura M, Yamada A, Morinaga A, Nishikori M, Katagiri K, Itoh K, Yamana H, and Hashimoto T. Peptide vaccination for patients with melanoma and other types of cancer based on pre-existing peptide-specific cytotoxic T-lymphocyte precursors in the periphery. J Immunother. 26(4):357-366, 2003.
【非特許文献１６】Sato Y, Shomura H, Maeda Y, Mine T, Une Y, Akasaka Y, Kondo M, Takahashi S, Shinohara T, Katagiri K, Sato M, Okada S, Matsui K, Yamada A, Yamana H, Itoh K, and Todo S. Immunological evaluation of peptide vaccination for patients with gastric cancer based on pre-existing cellular response to peptide. Cancer Sci. 94(9):802-808, 2003.
【非特許文献１７】Noguchi M, Itoh K, Suekane S, Yao A, Suetsugu N, Katagiri K, Yamada A, Yamana H, and Noda S. Phase I trial of patient-oriented vaccination in HLA-A2-positive patients with metastatic hormone-refractory prostate cancer. Cancer Sci. 95: 77-84, 2004.
【非特許文献１８】Harada M, Gohara R, Matsueda S, Muto A, Oda T, Iwamoto Y, and Itoh K.  In vivo evidence that peptide vaccination can induce HLA-DR-restricted CD4+ T cells reactive to a class I tumor peptide. J Immunol. 172: 2659-2667, 2004.
【非特許文献１９】Tsuda N, Mochizuki K, Harada M, Sukehiro A, Kawano K, Yamada A, Ushijima K, Sugiyama T, Nishida T, Yamana H, Itoh K, and Kamura T.  Vaccination with predesignated or evidence-based peptides for patients with recurrent gynecologic cancers. J Immunother. 27: 60-72, 2004.
【非特許文献２０】Mine T, Sato Y, Noguchi M, Sasatomi T, Gouhara R, Tsuda N, Tanaka S, Shomura H, Katagiri K, Rikimaru T, Shichijo S, Kamura T, Hashimoto T, Shirouzu K, Yamada A, Todo S, Itoh K, and Yamana H.  Humoral responses to peptides correlate with overall survival in advanced cancer patients vaccinated with peptides based on pre-existing, peptide-specific cellular responses. Clin Cancer Res. 10: 929-937, 2004.
【非特許文献２１】Sato Y, Maeda Y, Shomura H, Sasatomi T, Takahashi M, Une Y, Kondo M, Shinohara T, Hida N, Katagiri K, Sato K, Sato M, Yamada A, Yamana H, Harada M, Itoh K, and Todo S.  A phase I trial of cytotoxic T-lymphocyte precursor-oriented peptide vaccines for colorectal carcinoma patients.  Br J Cancer. 90: 1334-1342, 2004.
【非特許文献２２】Noguchi M, Itoh K, Suekane S, Morinaga A, Sukehiro A, Suetsugu N, Katagiri K, Yamada A, and Noda S.  Immunological monitoring during combination of patient-oriented peptide vaccination and estramustine phosphate in patients with metastatic hormone refractory prostate cancer.  Prostate. 60: 32-45, 2004.
【非特許文献２３】Mochizuki K, Sato Y, Tsuda N, Shomura H, Sakamoto M, Matsuura K, Ushijima K, Maeda Y, Katagiri K, Yamada A, Todo S, Kamura T, Harada M, and Itoh K.  Immunological evaluation of vaccination with pre-designated peptides frequently selected as vaccine candidates in an individualized peptide vaccination regimen. Int J Oncol. 25: 121-131, 2004.
【非特許文献２４】Takedatsu H, Okamura T, Yoshimoto K, Harada M, Koga M, Shichijo S, Sata M, and Itoh K. Expression of epithelial cancer-related antigens in hematologic malignancies applicable for peptide-based immunotherapy. J Immunother. 27(4): 289-297, 2004.
【非特許文献２５】Komatsu N, Shichijo S, Nakagawa M, and Itoh K.  New multiplexed flow cytometric assay to measure anti-peptide antibody: a novel tool for monitoring immune responses to peptides used for immunization. Scand J Clin Lab Invest. 64: 535-545, 2004.
【非特許文献２６】Noguchi M, Itoh K, Yao A, Mine T, Yamada A, Obata Y, Furuta M, Harada M, Suekane S, and Matsuoka K.  Immunological evaluation of individualized peptide vaccination with a low dose of estramustine for HLA-A24+ HRPC patients. Prostate. 63: 1-12, 2005.
【非特許文献２７】Yajima N, Yamanaka R, Mine T, Tsuchiya N, Honma J, Sano M, Kuramoto T, Obata Y, Komatsu N, Arima Y, Yamada A, Shigemori M, Itoh K, and Tanaka R.  Immunologic evaluation of personalized peptide vaccination for patients with advanced malignant glioma. Clin Cancer Res. 11(16) : 5900-5911, 2005
【非特許文献２８】Rosenberg SA, Yang JC, and Restifo NP. Cancer immunotherapy: moving beyond current vaccines. Nat Med. 10(9): 909-915, 2004.
【非特許文献２９】Jaeckle KA, Hess KR, Yung WK, Greenberg H, Fine H, Schiff D, Pollack IF, and Kuhn J. Phase II evaluation of temozolomide and 13-cis-retinoic acid for the treatment of recurrent and progressive malignant glioma: a North American brain tumor consortium study. J Clin Oncol. 21(12): 2305-2311, 2003.
【非特許文献３０】Prados MD, Yung WK, Fine HA, Greenberg HS, Junck L, Chang SM, Nicholas MK, Robins HI, Mehta MP, Fink KL, Jaeckle KA, Kuhn J, Hess KR, Schold SC Jr., and North American Brain Tumor Consortium study. Phase 2 study of BCNU and temozolomide for recurrent glioblastoma multiforme: North American brain tumor consortium study. Neuro-oncol. 6: 33-37, 2004.
【非特許文献３１】Rich J N, Reardon DA, Peery T, Dowell JM, Quinn JA, Penne KL, Wikstrand CJ, Van Duyn LB, Dancey JE, McLendon RE, Koa JC, Stenzel TT, Ahmed Rasheed BK, Tourt-Ushlig SE, Herndon JE 2nd, Vredenburgh JJ, Sampson JH, Friedman AH, Bigner DD, and Friedman HS. Phase II trial of gefitinib in recurrent glioblastoma. J Clin Oncol. 22: 133-142, 2004.
【非特許文献３２】Stupp R, Mason WP, van den Bent MJ, Weller M, Fisher B, Taphoorn MJ, Belanger K, Brandes AA, Marosi C, Bogdahn U, Curschmann J, Janzer RC, Ludwin SK, Gorlia T, Allgeier A, Lacombe D, Cairncross JG, Eisenhauer E, and Mirimanoff RO; European Organisation for Research and Treatment of Cancer Brain Tumor and Radiotherapy Groups; National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med 352(10): 1036-1038, 2005.
【非特許文献３３】Yagoda A, and Petrylak D. Cytotoxic chemotherapy for advanced hormone-resistant prostate cancer. Cancer. 71: 1098-1109, 1993.
【非特許文献３４】Scher HI, Mazumadar M, and Kelly WK. Clinical trials in relapsed prostate cancer: Defining the target. J Natl Cancer Inst. 88(22): 1623-1634, 1996.
【非特許文献３５】de Voogt HJ, Smith PH, Pavone-Macaluso M, de Pauw M, and Suciu S. Cardiovascular side effects of diethylstilbestrol, cyproterone acetate, medroxyprogesterone acetate and estramustine phosphate used for treatment of advanced prostatic cancer. Results from European organization for research on treatment of cancer trials 30761 and 30762. J Urol. 135: 303-307, 1986.
【非特許文献３６】Tannock IF, de Wit R, Berry WR, Horti J, Pluzanska A, Chi KN, Oudard S, Theodore C, James ND, Turesson I, Rosenthal MA, and Eisenberger MA; TAX 327 Investigators. Docetaxel plus prednisone or mitoxantrone plus prednisone for advanced prostate cancer. N Engl J Med. 351: 1502-1512, 2004.
【非特許文献３７】Petrylak DP, Tangen CM, Hussain MH, Lara PN Jr, Jones JA, Taplin ME, Burch PA, Berry D, Moinpour C, Kohli M, Benson MC, Small EJ, Raghavan D, and Crawford ED. Docetaxel and estramustine compared with mitoxantrone and prednisone for advanced refractory prostate cancer. N Engl J Med. 351: 1513-1520, 2004.
【非特許文献３８】Kojima S, Suzuki H, Akakura K, Shimbo M, Ichikawa T, and Ito H. Alternative antiandrogens to treat prostate cancer relapse after initial hormone therapy. J Urol. 171:679-683. 2004.
【非特許文献３９】Salgaller ML, Marincola FM, Cormier JN, and Rosenberg SA. Immunization against epitopes in the human melanoma antigen gp100 following patient immunization with synthetic peptides. Cancer Res. 56:4749-4757, 1996.
【非特許文献４０】Rosenberg SA, Yang JC, Schwartzentruber DJ, Hwu P, Marincola FM, Topalian SL, Restifo NP, Dudley ME, Schwarz SL, Spiess PJ, Wunderlich JR, Parkhurst MR, Kawakami Y, Seipp CA, Einhorn JH, and White DE. Immunologic and therapeutic evaluation of a synthetic peptide vaccine for the treatment of patients with metastatic melanoma. Nat Med. 4(3):321-327, 1998.
【非特許文献４１】Nestle FO, Alijagic S, Gilliet M, Sun Y, Grabbe S, Dummer R, Burg G, and Schadendorf D. Vaccination of melanoma patients with peptide- or tumor lysate-pulsed dendritic cells. Nat Med. 4(3):328-332, 1998.
【非特許文献４２】Marchand M, van Baren N, Weynants P, Brichard V, Dreno B, Tessier MH, Rankin E, Parmiani G, Arienti F, Humblet Y, Bourlond A, Vanwijck R, Lienard D, Beauduin M, Dietrich PY, Russo V, Kerger J, Masucci G, Jager E, De Greve J, Atzpodien J, Brasseur F, Coulie PG, van der Bruggen P, and Boon T. Tumor regressions observed in patients with metastatic melanoma treated with an antigenic peptide encoded by gene MAGE-3 and presented by HLA-A1. Int J Cancer 80:219-230, 1999.
【非特許文献４３】Slingluff CL Jr., Yamshchikov G, Neese P, Galavotti H, Eastham S, Engelhard VH, Kittlesen D, Deacon D, Hibbitts S, Grosh WW, Petroni G, Cohen R, Wiernasz C, Patterson JW, Conway BP, and Ross WG. Phase 1 trial of a melanoma vaccine with gp100280-288 peptide and tetanus helper peptide in adjuvant: Immunologic and clinical outcomes. Clin Cancer Res. 7:3012-3024, 2001.
【非特許文献４４】Wang F, Bade E, Kuniyoshi C, Spears L, Jeffery G, Marty V, Groshen S, and Weber J. Phase I trial of a MART-1 peptide vaccine with incomplete Freund’s adjuvant for resected high-risk melanoma. Clin Cancer Res. 5:2756-2765, 1999.
【非特許文献４５】Jager E, Gnjatic S, Nagata Y, Stockert E, Jager D, Karbach J, Neumann A, Rieckenberg J, Chen YT, Ritter G, Hoffman E, Arand M, Old LJ, and Knuth A. Induction of primary NY-ESO-1 immunity: CD8＋T lymphocyte and antibody responses in peptide-vaccinated patients with NY-ESO-1＋cancers. Proc Natl Acad Sci USA. 97(22):12198-12203, 2000.
【非特許文献４６】Tsugawa T, Kuwashima N, Sato H, Fellows-Mayle WK, Dusak JE, Okada K, Papworth GD, Watkins SC, Gambotto A, Yoshida J, Pollack IF, and Okada H.  Sequential delivery of interferon-alpha gene and DCs to intracranial gliomas promotes an effective antitumor response.  Gene Ther. 11:1551-8, 2004.
【非特許文献４７】The committee of brain tumor registry of Japan: Report of brain tumor registry of Japan (1969-1993) 10th edition. Neurol medico-chirurgica 40 (suppl), 2000.
【非特許文献４８】Kitamura T. Necessity of re-evaluation of estramustine phosphate sodium (EMP) as a treatment option for first-line monotherapy in advanced prostate cancer. Int J Urology. 8: 33-36, 2001.
【非特許文献４９】Noguchi M, Mine T, Yamada A, Obata Y, Yoshida K, Mizoguchi J, Harada M, Suekane S, Itoh K, and Matuoka K. Combination therapy of personalized peptide vaccination and low-dose estramustine phosphate for metastatic hormone refractory prostate cancer patients: an analysis of prognostic factors in the treatment.    Oncol Res. 16:341-349, 2007.
【非特許文献５０】Murayama K, Kobayashi T, Imaizumi T, Matsunaga K, Kuramoto T, Shigemori M, Shichijo S, and Itoh K, . Expression of the SART3 tumor-rejection antigen in brain tumors and induction of cytotoxic T lymphocytes by its peptides. J Immunother. :23(5)  511-518, 2000.
【非特許文献５１】Rosenberg SA, Yang JC, Restifo NP, Cancer immunotherapy: moving beyond current vaccines. Nat Med. 2004 Sep;10(9):909-15.
【非特許文献５２】Homma S, Komohara Y, Harada M, Saya H, Todo S, Itoh K, Noguchi M, Differential levels of human leukocyte antigen-class I, multidrug-resistance 1 and androgen receptor expressions in untreated prostate cancer cells: the robustness of prostate cancer. Oncol Rep. 2007 Aug;18(2):343-6
【非特許文献５３】Noguchi M, Kakuma T, Uemura H, Nasu Y, Kumon H, Hirao Y, Moriya F, Suekane S, Matsuoka K, Komatsu N, Shichijo S, Yamada A, Itoh K, A randomized phase II trial of personalized peptide vaccine plus low dose estramustine phosphate (EMP) versus standard dose EMP in patients with castration resistant prostate cancer, Cancer Immunol Immunother. 2010 Jul;59(7):1001-9. Epub 2010 Feb 10.
【非特許文献５４】Noguchi M, Yao A, Harada M, Nakashima O, Komohara Y, Yamada S, Itoh K, Matsuoka K, Immunological evaluation of neoadjuvant peptide vaccination before radical prostatectomy for patients with localized prostate cancer, Prostate. 2007 Jun 15;67(9):933-42.
【非特許文献５５】Naito M, Itoh K, Komatsu N, Yamashita Y, Shirakusa T, Yamada A, Moriya F, Ayatuka H, Mohamed ER, Matsuoka K, Noguchi M. Dexamethasone did not suppress immune boosting by personalized peptide vaccination for advanced prostate cancer patients. Prostate. 2008 Dec 1;68(16):1753-62.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
よって、本発明の目的は、かかる問題点を克服した、患者毎に最適なペプチドを投与可能なテーラーメイド型がんペプチドワクチンを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、患者末梢血中のペプチドに対する抗体を測定することによってペプチドを選択する方法について検討したところ、高い抗体反応が得られるペプチドを患者毎に選択して投与することによって、臨床的効果が得られることを見出した。また、選択され投与されたペプチドについて検討したところ、テーラーメイド型がんペプチドワクチンとして様々な患者に対応しうる最適なペプチドの組を見出すことができた。
【００１５】
すなわち、本発明は、以下のａ）〜ｄ）の６〜１３種類のペプチドから構成される、がんを治療するための薬剤であって、患者末梢血中の各ペプチドに対する抗体を測定し、抗体が陽性であったペプチドを選択して該患者に投与するよう用いられることを特徴とする薬剤を提供する：
ａ）配列番号４、５、および１４のペプチド、
ｂ）配列番号６、８、１１、１２、および１３から選択される３〜５種類のペプチド、
ｃ）配列番号７および９から選択される０〜２種類のペプチド、および
ｄ）配列番号１、３、および１０から選択される０〜３種類のペプチド。
【００１６】
また、本発明は、がんを治療するために投与されるペプチドの選択方法であって、以下のａ）〜ｄ）の６〜１３種類のペプチドに対する患者末梢血中の抗体を測定し、抗体が陽性であったペプチドを選択することを含む方法を提供する：
ａ）配列番号４、５、および１４のペプチド、
ｂ）配列番号６、８、１１、１２、および１３から選択される３〜５種類のペプチド、
ｃ）配列番号７および９から選択される０〜２種類のペプチド、および
ｄ）配列番号１、３、および１０から選択される０〜３種類のペプチド。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の薬剤は、前立腺がんや脳腫瘍などのがん、特に進行性のがんに対して優れた臨床的効果を発揮する。また、本発明の薬剤は、ペプチド群からなる薬剤であり、使用に際して特別な設備を必要としないため従来の医薬と同様に取り扱うことができるという利点を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＨＲＰＣ患者におけるペプチド投与量とＩＦＮ−γ値の関係。
【図２】ＨＲＰＣ患者におけるペプチド投与量とＦＩＵの関係。
【図３】膠芽腫患者におけるペプチド投与量とＩＦＮ−γ値の関係。
【図４】膠芽腫患者におけるペプチド投与量とＦＩＵの関係。
【図５】ＨＲＰＣ患者におけるペプチド投与回数とＩＦＮ−γ値の関係。
【図６】ＨＲＰＣ患者におけるペプチド投与回数とＦＩＵの関係。
【図７】膠芽腫患者におけるペプチド投与回数とＩＦＮ−γ値の関係。
【図８】膠芽腫患者におけるペプチド投与回数とＦＩＵの関係。
【図９】ＨＲＰＣ患者における投与回数と初回選択ペプチドおよび再選択ペプチドのＩＦＮ−γ値の関係。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の薬剤について説明する。なお、以下の記載は本発明を限定するものでなく、当業者は本発明の範囲内で種々の改変を行うことができる。
【００２０】
本発明の薬剤は、以下に示す配列番号１および３〜１４から選択される６〜１３種類のペプチドにより構成される。これらのペプチドは、がん細胞が発現する腫瘍抗原タンパク質に由来するペプチドであり（特許文献４〜１３）、ＨＬＡクラスＩアレルのＡ２４に拘束性されるＣＴＬに認識され、がん細胞に対する細胞傷害活性を誘導するペプチドである。すなわち、本発明の薬剤は、ＨＬＡ−Ａ２４陽性のがん患者に適応する薬剤である。
0005980303.tif 000002
【００２１】
本発明の薬剤におけるペプチドは、常套的な方法で製造することができ、例えば、PeptideSynthesis，Interscience，NewYork，1966；The Proteins，Vo1.2，Academic Press Inc，NewYork，1976；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）１９８５；医薬品の開発続第十四巻・ペプチド合成、広川書店、1991（これら文献は引用により本明細書に含まれる）などに記載の方法が挙げられるが、これらに限らず公知の方法が広く利用可能である。また、ペプチドの精製・回収は、ゲルクロマトグラフィー、イオンカラムクロマトグラフィーまたはアフィニティクロマトグラフィー等を組み合わせるか、硫安やアルコール等を用いた溶解度差に基づく分画手段等に例示される公知の方法により行うことができる。ペプチドのアミノ酸配列の情報に基づき、これらに特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を作製し、当該抗体を用いて特異的に吸着回収する方法も当然ながら利用可能である。
【００２２】
本発明の薬剤において、各ペプチドは水溶液化されて患者に投与される。よって、本発明の薬剤は、粉末化したペプチドにより構成されていてもよいが、投与前に容易に水溶液化できるよう製剤化されたペプチドにより構成されることが好ましい。製剤化の方法としては、各ペプチドを生理食塩水や１〜６ｗ／ｖ％のアルカリ金属炭酸水素塩水溶液に溶解した溶液を凍結乾燥する方法が挙げられる。
【００２３】
ペプチドを溶解する溶媒としては、生理食塩水または１〜６ｗ／ｖ％のアルカリ金属炭酸水素塩水溶液を用いても、生理食塩水と当該アルカリ金属炭酸水素塩水溶液を混合したものを用いてもよい。アルカリ金属炭酸水素塩としては、炭酸水素リチウム、炭酸水素ナトリウムおよび炭酸水素カリウムが挙げられるが、特に炭酸水素ナトリウムが好適である。ペプチドを溶解する生理食塩水または炭酸水素塩水溶液の量は、ペプチドを均一に溶解できる量であれば特に制限はないが、得られるペプチド溶液のペプチド濃度が０．４質量％以下、好ましくは０．１〜０．４質量％、より好ましくは０．３〜０．４質量％となる量とすることが好ましい。
【００２４】
製剤化は、好ましくは、溶媒に溶解したペプチドをバイアルに分注後、凍結乾燥することにより行う。この場合の溶媒としては生理食塩水が好適であるが、生理食塩水に溶解しにくいペプチドの場合は１〜６ｗ／ｖ％のアルカリ金属炭酸水素塩水溶液を用いればよい。
【００２５】
本発明の薬剤は、１種類ずつ個別に溶解および凍結乾燥したペプチドにより構成されることが好ましい。しかしながら、２種類以上のペプチドを一緒に溶媒に溶解して凍結乾燥したものや、各ペプチドを溶解および凍結乾燥後に混合したものにより構成されていてもよい。
【００２６】
このように製剤化したペプチドは、血漿と等張となる量の医薬上許容される純度の水で溶解して投与すればよい。
【００２７】
本発明の薬剤は、具体的には
ａ）配列番号４、５、および１４のペプチド、
ｂ）配列番号６、８、１１、１２、および１３から選択される３〜５種類のペプチド、
ｃ）配列番号７および９から選択される０〜２種類のペプチド、および
ｄ）配列番号１、３、および１０から選択される０〜３種類のペプチド
の６〜１３種類により構成される。本発明の薬剤を構成するペプチド数は６〜１３の範囲内であれば特に制限されないが、ペプチド数が多ければ適応可能な患者数およびがんの種類が多くなるという点で好ましい。
【００２８】
ある態様において、本発明の薬剤は、抗体検査によって選択される頻度が高い配列番号４、５、１４、６、８、１１、１２、および１３と、配列番号７および９から選択される０〜２種類のペプチド、および配列番号１、３、および１０から選択される０〜３種類のペプチドの、８〜１３種類のペプチドから構成される。
【００２９】
別の態様において、本発明の薬剤は、配列番号４、５、１４、６、８、１１、１２、および１３と、配列番号７および９から選択される０〜２種類のペプチドの、８〜１０種類のペプチドから構成される。
【００３０】
さらに別の態様において、本発明の薬剤は、配列番号４、５、１４、６、８、１１、１２、および１３の、８種類のペプチドから構成される。
【００３１】
本発明の薬剤は、がん種に特異的な抗原以外の抗原、例えばＳＡＲＴ−３、ＳＡＲＴ−２、ＭＲＰ３等を由来とするペプチドを含むことから、対象となるがんの種類は特に限定されない。例として、前立腺がん、膵臓癌、大腸癌、肺癌、造血器腫、脳腫瘍、子宮癌、子宮頸癌、胃癌、黒色腫、甲状腺癌、肝臓癌、食道癌が挙げられる。好ましくは、本発明の薬剤は、前立腺がんおよび脳腫瘍に用いられる。
【００３２】
特に、前立腺がんを対象とする場合、本発明の薬剤は、配列番号４、５、１４、６、８、１１、および１２、または配列番号４、５、１４、６、８、１１、および１３の、７種類のペプチドから構成されていてもよい。あるいは、配列番号４、５、１４、６、８、および１１の６種類のペプチドから構成されていてもよい。
【００３３】
また、脳腫瘍を対象とする場合、本発明の薬剤は、配列番号４、５、１４、６、１１、１２、１３、７の８種類、あるいは配列番号４、５、１４、６、１１、１２、１３の７種類のペプチドから構成されていてもよい。
【００３４】
本発明の薬剤は、患者末梢血中に存在する本発明の薬剤を構成する各ペプチドに対する抗体を測定することによって、患者毎に適したペプチドを選択して投与するよう用いられるという点に特徴を有する。
【００３５】
患者末梢血中の抗体は、ＥＬＩＳＡやＬＵＭＩＮＥＸ社が提供するマルチプレックス・フローメトリー技術を用いた測定方法等の、公知の抗原抗体反応を利用した免疫測定法により測定することができる。具体的には、本発明の薬剤を構成するペプチドをそれぞれ担体に固相化し、この固相化されたペプチドに対して結合する患者末梢血中の抗体を蛍光等によって検出・測定する。この測定値が高いことが当該ペプチドに対する患者の反応性が高いことを示すため、かかるペプチドを投与するペプチドとして選択する。
【００３６】
患者末梢血中の抗体の反応が測定できたペプチドが複数存在する場合、反応性が高いペプチドから順に複数種を選択すればよい。選択するペプチドは、少なくとも２種以上、好ましくは３〜４種、より好ましくは４種である。患者に投与するペプチドの種類は、多ければ多いほど患者のＣＴＬをより多種にわたり誘導でき、ヘテロな集団であるがん細胞をより効率よく排除しうると考えられる。一方、投与にかかる患者の負担は、投与するペプチドの種類が少ない方が軽減される。よって、投与するペプチドは最大４種類とすることが好ましい。
【００３７】
したがって、本発明は、がんを治療するために投与されるペプチドの選択方法であって、
ａ）配列番号４、５、および１４のペプチド、
ｂ）配列番号６、８、１１、１２、および１３から選択される３〜５種類のペプチド、
ｃ）配列番号７および９から選択される０〜２種類のペプチド、および
ｄ）配列番号１、３、および１０から選択される０〜３種類のペプチド
のａ）〜ｄ）の６〜１３種類のペプチドに対する患者末梢血中の抗体を測定し、抗体が陽性であったペプチドを選択することを含む方法に関する。
【００３８】
ある態様において、本発明の方法は、配列番号４、５、１４、６、８、１１、１２、および１３と、配列番号７および９から選択される０〜２種類のペプチド、および配列番号１、３、および１０から選択される０〜３種類のペプチドの、８〜１３種類のペプチドに対する患者末梢血中の抗体を測定し、抗体が陽性であったペプチドを選択することを含む。
【００３９】
別の態様において、本発明の方法は、配列番号４、５、１４、６、８、１１、１２、および１３と、配列番号７および９から選択される０〜２種類のペプチドの、８〜１０種類のペプチドに対する患者末梢血中の抗体を測定し、抗体が陽性であったペプチドを選択することを含む。
【００４０】
さらに別の態様において、本発明の方法は、配列番号４、５、１４、６、８、１１、１２、および１３の、８種類のペプチドに対する患者末梢血中の抗体を測定し、抗体が陽性であったペプチドを選択することを含む。
【００４１】
特に、前立腺がんを対象とする場合、本発明の選択方法は、配列番号４、５、１４、６、８、１１、および１２、または配列番号４、５、１４、６、８、１１、および１３の、７種類のペプチド、あるいは、配列番号４、５、１４、６、８、および１１の６種類のペプチドに対する患者末梢血中の抗体を測定し、抗体が陽性であったペプチドを選択することを含んでいてもよい。
【００４２】
また、脳腫瘍を対象とする場合、本発明の選択方法は、配列番号４、５、１４、６、１１、１２、１３、７の８種類、あるいは配列番号４、５、１４、６、１１、１２、１３の７種類のペプチドに対する患者末梢血中の抗体を測定し、抗体が陽性であったペプチドを選択することを含んでいてもよい。
【００４３】
なお、本発明のペプチドの選択方法においては、ペプチドに対する抗体の測定によって得られた各ペプチドに対する抗体の測定値が高い順、すなわち抗体の反応性が高い順に３〜４種を選択することが好ましい。例えば、蛍光標識を用いた場合の蛍光強度（ＦＩＵ）や比色定量（ＯＤ）等の測定値が挙げられ、標準物質を用いて定量した場合は、その標準物質へ測定値を換算値した値でもよい。
【００４４】
このようにして患者毎に選択されたペプチドは、前述のとおり水溶液化され、好ましくはアジュバント等と混合され、投与される。本発明で用いるアジュバントとしては、ペプチドの水溶液をエマルション化することでペプチドの投与局所への貯留性を高める不完全フロイントアジュバント（例えばＩＳＡ−５１等、ＳＥＰＰＩＣ社）やプルランなどの多糖類や、完全フロイントアジュバント、ＢＣＧ、アラム、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＣｐＧ等の免疫増強作用を有するものを使用することができる。中でも、不完全フロイントアジュバントが好ましい。
【００４５】
このように調製されたペプチドは、通常患者の皮下へ投与される。これは、本発明の薬剤を構成するペプチドは、例えば静脈注射等により投与されると速やかに分解されてしまい免疫応答を十分に引き起こすことができないため、および、皮下には抗原を捕獲してＨＬＡ分子を介して細胞表面上に提示しＣＴＬ等のＴ細胞やＢ細胞を活性化する抗原提示細胞が存在することから皮下に投与されたペプチドは細胞傷害活性を示すＣＴＬを効率よく活性化できるためである。
【００４６】
投与部位は、投与開始時から、可能な限りがんの病変に近いリンパ節付近とすることが好ましく、例えば、前立腺がんであれば大腿部、脳腫瘍であれば背部である。また、当該投与部位に投与の副作用によって炎症等が発生し投与が困難になった場合は、他の部位（腹部や上腕部等）に投与してもよい。
【００４７】
ペプチドの投与量は、皮下投与が許容される量であれば特に制限はないが、好ましくは１種類のペプチドにつきペプチドの乾燥粉末の質量で１ｍｇ以上、より好ましく１〜５ｍｇ、さらに好ましくは３〜５ｍｇである。５ｍｇ以上の量を投与することも可能である。
【００４８】
ペプチドの投与頻度は、免疫応答が得られる頻度であればよく、例えば７〜２８日間に１回、好ましくは７〜２１日間に１回、より好ましくは７〜１４日に１回である。投与頻度は投与期間中に変更してもよく、例えば、投与開始から６回目までは７日間に１回の頻度で投与し、７回目以降は患者の状況に応じて１４日間に１回の頻度で投与し、十分な免疫応答が得られているのであれば、さらに間隔をあけて２１〜２８日間に１回の投与とするなどが考えられる。なお、「患者の状況」とは、投与部位の炎症、疼痛などの激しい痛み等、投与によって生じる患者の負担を意味する。
【００４９】
ペプチドの投与回数は、少なくとも６回、好ましくは１２回以上、より好ましくは１８回以上である。なお、患者が投与に耐えうる限り、投与回数の上限には特に制限はないが、実施例に記載の臨床試験では最大８４回まで投与した実績があり、当該回数までの投与は可能である。
【００５０】
このようにペプチドを選択して患者に投与することによって、投与されたペプチドに対するＣＴＬが活性化され、がん細胞が排除され、臨床効果を得ることが可能となる。なお、ペプチドを選択して投与しても、当該ペプチドに対する抗体の反応性が上昇しない、または投与したペプチドに対するＣＴＬが活性化しないこともある。そのため、抗体の反応性の上昇を考慮すると、少なくとも６回投与毎、より好ましくは、６〜１２回投与毎に再度患者より末梢血を採取し、薬剤を構成する各ペプチドに対する抗体の反応性を測定し、反応性の高いペプチドを再選択することが好ましい。このような再選択によって、患者毎に反応性の高い最適なペプチドが選択されるようになり、より優れた免疫応答を得ることができる。
【００５１】
ペプチドの再選択の回数は特に限定されないが、１回以上、好ましくは２回以上行なうことが好ましい。なお、実施例に記載の臨床試験の結果において、投与開始から２４回投与後においては、投与したペプチドに対する抗体の反応が十分得られることにより、投与するペプチドの変更が見られなかったことを考慮すると、６〜１２回投与毎にペプチドを再選択した場合は１〜４回、好ましくは２〜４回の再選択でよい。
【００５２】
本発明の薬剤は、治療対象となるがん種に応じて、他の抗腫瘍薬や治療方法と併用することができる。各患者のがん細胞は、前述のとおりへテロな集団であり、免疫応答では排除しきれない細胞や、抗腫瘍薬やホルモン療法等に耐性を持つ細胞が存在していることから、本発明の薬剤と他の抗腫瘍薬や治療方法とを併用することによって、がん病変の縮小や生存期間の延長等の臨床効果を高めることが可能となる。他の抗腫瘍薬の例としては、アルキル化剤、代謝拮抗剤、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害薬、微小管重合阻害薬、分子標的薬等が例示され、具体的には、５−ＦＵ、エストラムスチン、ドセタキセル、テモゾロミド、シスプラチン、ジェムザール、リツキシマブ等が挙げられる。また、他の治療方法としては、手術、放射線療法、ホルモン療法（デキサメタゾン、ミトキサントロン、プレゾニゾロン、エストロゲン、プロゲストロン等のステロイドやリュープリン等のアナログ剤）等が挙げられる。
【００５３】
本発明の薬剤と他の抗腫瘍薬や治療方法とを併用する場合、本発明の薬剤がＣＴＬ等の血球系の細胞を活性化して効果を発揮することから、造血系や免疫応答の活性化に影響を及ぼさない範囲で他の抗腫瘍薬や治療方法を使用することが好ましい。例えば、抗腫瘍薬の投与後リンパ球数が（例えば、５００個／ｍＬ以上、より好ましくは１，０００個／ｍＬ以上に）回復してから本発明の薬剤を投与する、本発明の薬剤を投与した後に他の抗腫瘍薬や治療方法を用いる、あるいは本発明の薬剤の投与期間中に白血球数やリンパ球数の減少を起こさない範囲で他の抗腫瘍薬や治療方法を用いる、などの方法が考えられる。
【００５４】
例えば、本発明の薬剤とエストラムスチンを併用する場合、エストラムスチンが造血系に影響を及ぼすため、本発明の薬剤の投与期間中のエストラムスチンの投与量は１８０〜２８０ｍｇ／日とすることが好ましい。また、本発明の薬剤とデキサメタゾンを併用する場合、デキサメタゾンに免疫応答を抑制する作用があるため、本発明の薬剤の投与期間中のデキサメタゾンの投与量は０．５〜１ｍｇ／日とすることが好ましい。一方、ＬＨ−ＲＨアナログ剤であるリュープリンは造血系および免疫系に対する影響が少ないため、本発明の薬剤の投与期間中にリュープリンを投与する場合でも、通常の投与量で投与することが可能である。このように、薬剤に応じて適宜調整を行なうことで、本発明の薬剤の投与期間中の併用も可能となる。
【００５５】
以下、本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明は記載される実施例に制限されるものではない。
【実施例】
【００５６】
１４種類の腫瘍抗原ペプチド（配列番号１〜１４）を用いて、前立腺がんおよび脳腫瘍（膠芽種）を適応症とする臨床試験を行なった。
【００５７】
（患者）
本臨床試験に参加した被験者は、ＨＬＡ−Ａ２４陽性であり、ホルモン療法およびエストラムスチンに対して抵抗性である再燃前立腺がん（ＨＲＰＣ）を有する患者１５名、および手術等の初期治療に抵抗性であり再発が見られる進行性の膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）を有する患者１２名であった。なお、これらの患者の状態は、前立腺がん患者では、パフォーマンスが０または１、リンパ球数が１，０００個／ｍＬ以上であり、膠芽腫患者では、パフォーマンスステータスが０から３、リンパ球数が５００個／ｍＬ以上であった。
【００５８】
（薬剤）
本臨床試験では、配列番号１〜１４の各ペプチドの粉末（純度９５％以上）をそれぞれ生理食塩水または重曹に溶解し凍結乾燥して得られた製剤と、不完全フロイントアジュバント（ＩＳＡ−５１ＶＧ、ＳＥＰＰＩＣ社）とを用いた。
【００５９】
（ペプチド選択検査並びに再選択検査）
配列番号１〜１４の各ペプチドの粉末を用いて、特許第３９６０６１４号（引用により本明細書に含まれる）に記載の方法で、Ｌｕｍｉｎｅｘ社が提供するマルチプレックス・フローメトリー技術を用いて、患者末梢血中のペプチドに対する抗体を測定した。より具体的には、ペプチド粉末をそれぞれＤＭＳＯに溶解後、マイクロビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ社）の表面にペプチドを固相化した担体を調製した。次いで、患者より採血して得られた血漿（ヘパリン血）と当該固相担体を混合して、血漿に含まれる抗体と担体に固相化されたペプチドとを反応させた。そして、反応後に固相担体を回収し、ビオチン化抗ヒト抗体（Ｖｅｃｔｏｒ社）およびアビジン化した蛍光色素（ストレプトアビジン−ＰＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、担体上のペプチドに結合した患者末梢血中の抗体を蛍光標識し、この蛍光強度（ＦＩＵ）を測定した。
【００６０】
このようにして得られたＦＩＵを基に、ＦＩＵの数値が高い順から４種類のペプチドを患者毎に選択した。また、各ペプチドを患者へ１クールあたり６回投与として各クール終了後に採血して得られた血漿を用いてペプチドに対する抗体を再度測定し、得られたＦＩＵの数値の高い順に４種類のペプチドを選択しなおして患者への投与を行なった。
【００６１】
（ペプチドの投与）
選択された４種のペプチドへそれぞれ注射用水を添加して水溶液化し、ＩＳＡ−５１ＶＧと混合してエマルション化し、患者の皮下へ投与した。ペプチドの原末換算で１ペプチドあたり、１ｍｇ投与群（ＨＲＰＣ患者６名、膠芽腫患者６名）、３ｍｇ投与群（ＨＲＰＣ患者６名、膠芽腫患者６名）、５ｍｇ投与群（ＨＲＰＣ患者３名）に分けて１クールあたり６回投与として投与を行なった。なお、５ｍｇ投与群は、投与部位の炎症反応に伴い、３ｍｇへの減薬または最大２回までの休薬を可能として投与を行なった。また、以後の解析においては、１回の休薬を１回の投与分としてカウントし、１クール６回投与として解析している。
【００６２】
投与は、投与開始から１クール終了後までは７日間に１回の頻度で行い、７回目の投与以降は、患者の投与部位の炎症の状態によって医師の判断により７日間または１４日間に１回の頻度で行なった。
【００６３】
投与部位は、ＨＲＰＣ患者は大腿部、膠芽腫患者は背部とし、選択されたペプチドをそれぞれ個別に皮下へ投与した。
【００６４】
なお、ペプチドの投与は、患者が継続治療を希望し、患者の疾病の進行が見られない間は継続し、疾病の進行が見られると医師が判断したときに終了した。具体的には、前立腺がんにおいては、ＰＳＡの上昇や新たな転移が見られた場合等に、医師が疾病の進行を判断した。また、脳腫瘍においては、画像診断（２方向測定法またはＲＥＣＩＳＴ法）による判定で病変部の増大が見られた場合や転移が見られた場合等に、医師が病状の進行を判断した。
【００６５】
また、ＨＲＰＣ患者は、ペプチド投与期間中、去勢状態維持のために３．７５ｍｇ／月のリュープリンまたは３．６ｍｇ／月の酢酸ゴセレリンを投与するとともに、エストラムスチンを２８０ｍｇ／日で併用した。
【００６６】
（ＣＴＬ活性の測定）
投与開始時および各クールの終了時に採血して得た末梢血からＰＢＭＣを分離して凍結保存し、投与終了後、全てのＰＢＭＣを用いて、既知の方法（Hida N, Maeda Y, Katagiri K, Takasu H, Harada M, Itoh K. A simple culture protocol to detect peptide-specific cytotoxic T lymphocyte precursors in circulation. Cancer Immunol Immunotherapy 2002; 51: 219-228. （引用により本明細書に含まれる））でＣＴＬ活性を測定した。まず、各投与ペプチドの存在下でＰＢＭＣを２週間培養後、このＰＢＭＣと、ＨＬＡ分子を介して投与ペプチドを提示しているＨＬＡ−２４陽性の標的細胞とを共培養した。そして、ＰＢＭＣ中のＣＴＬが標的細胞と反応することで培養上清中に分泌されるＩＦＮ−γを測定することによって、ＣＴＬ活性を測定した。なお、共培養は、１ペプチドあたり４つの独立した条件で培養を行い、各採血で得られたＰＢＭＣ毎に１ペプチドあたり４つの値を得て、この４つの値の合計をＩＦＮ−γ値（ｐｇ／ｍＬ）として後述の解析に用いた。
【００６７】
（臨床効果の評価）
臨床効果の評価は以下のようにして行った。
ＨＲＰＣについては、臨床試験の本登録日からの生存期間を３年間観察し、生存期間の中央値（ＭＳＴ）を算出した。その結果、表１に示すとおり、１５例のＭＳＴは２３．８ヶ月であった（２０１０年３月１０日現在）。また、３ｍｇ以上を投与した被験者は２９．４ヶ月、１ｍｇ投与では２２．８ヶ月であり、３ｍｇ以上を投与したほうがＭＳＴは長かった。なお、ホルモン療法抵抗性となった前立腺がんに対して化学療法剤ドセタキセルを用いた報告（非特許文献３６、３７）におけるＭＳＴが、ドセタキセルとエストラムスチンの併用で１７．５ヶ月、ドセタキセルとプレドニゾロンの併用で１８．９ヶ月であったことを考慮すると、本薬剤は生存期間の延長効果を有することが示唆された。
【表１】
0005980303.tif 000003
【００６８】
一方、脳腫瘍については、６回投与ごとに病変部のＭＲＩ検査を行い、腫瘍形態変化の判定を行なった。２方向測定法では、測定可能病変の長径とそれに直角に交わる最大径の積によって病変部の増大または縮小を判定し、ＲＥＣＩＳＴ法では、最大で５箇所の測定可能病変について各病変の最長径の和によって、病変部の増大または縮小を判定した。結果を表２に示す。表中、「ＰＲ」は２方向測定法またはＲＥＣＩＳＴ法のいずれかで一部奏効（積が５０％以上減少または和が３０%以上減少）、すなわち病変部の縮小効果があったことを示し、「ＮＣ」は病変部の増大がなかったことを示し、「ＰＤ」は病変部の増大等の疾病の進行が見られたことを示している。
【表２】
0005980303.tif 000004
【００６９】
本発明の薬剤によって、進行性の膠芽腫において２例のＰＲ、５例のＮＣが得られたことから、本薬剤は膠芽腫の疾病の進行を抑制し得るものと考えられた。
【００７０】
なお、ＨＲＰＣ患者１５例、膠芽腫患者１２例における副作用は軽微な副作用のみであり、本薬剤は優れた安全性を有することも確認することができた。
【００７１】
（投与量と免疫応答における解析）
ＨＲＰＣ患者について、１ｍｇ投与群(レベルＩ)、３ｍｇ投与群(レベルＩＩ)、５ｍｇ投与群（レベルＩＩＩ）におけるＩＦＮ−γ値またはＦＩＵの平均を算出して、投与量と免疫応答との関係を解析した。ＩＦＮ−γ値についての結果を表３および図１に、ＦＩＵについての結果を表４および図２に示す。
【表３】
0005980303.tif 000005
＊：投与前（ｐｒｅ）の値に対してｐ＜０．０５
【表４】
0005980303.tif 000006
＊：投与前（ｐｒｅ）の値に対してｐ＜０．０５
【００７２】
同様に、膠芽腫患者について、１ｍｇ投与群(レベルＩ)、３ｍｇ投与群(レベルＩＩ)におけるＩＦＮ−γ値またはＦＩＵの平均を算出して、投与量と免疫応答との関係を解析した。ＩＦＮ−γ値についての結果を表５および図３に、ＦＩＵについての結果を表６および図４に示す。
【表５】
0005980303.tif 000007
＊：投与前（ｐｒｅ）の値に対してｐ＜０．０５
【表６】
0005980303.tif 000008
＊：投与前（ｐｒｅ）の値に対してｐ＜０．０５
【００７３】
ＨＲＰＣ患者では、３ｍｇ以上の投与（３ｍｇ投与群、５ｍｇ投与群、または両方）において投与後のＩＦＮ−γ値が投与前に比べ有意に増加した（表３）。また、ＦＩＵは、全ての群において投与前に比べ投与後に有意に増加した（表４）。一方、膠芽腫患者においては、１ｍｇ投与以上で有意なＩＦＮ−γ値およびＦＩＵの増加が認められた（表５、６）。
【００７４】
これらの結果から、少なくとも１ｍｇの投与、より好ましくは３ｍｇ以上、より好適には３ｍｇ〜５ｍｇの投与により、ＣＴＬの活性化が得られることがわかった。なお、５ｍｇの投与では、投与は可能であるものの投与部位の炎症のために投与間隔をあける必要がある患者が存在したことから、患者への負担とＣＴＬの活性化の双方を考慮すると、ペプチドの投与量は好ましくは最大５ｍｇであり、より好ましくは３〜５ｍｇであると考えられた。
【００７５】
（投与回数と免疫応答における解析）
ＨＲＰＣ患者について、１ｍｇ投与群および３ｍｇ以上の投与群において、投与前から６クールまでの各クールの終了時に得た血漿又はＰＢＭＣより得られたＩＦＮ−γ値およびＦＩＵの平均値を算出し、投与回数と免疫応答との関係について解析を行なった。ＩＦＮ−γ値についての結果を表７および図５に、ＦＩＵについての結果を表８および図６に示す。なお、表および図の「投与回数」とは各クール終了時の合計投与回数であり、１クールあたりの投与回数は６回である。
【表７】
0005980303.tif 000009
＊：投与回数「０」の値に対してｐ＜０．０５，
＃：投与回数「０」の値に対してｐ＜０．１
【表８】
0005980303.tif 000010
＊：投与回数「０」の値に対してｐ＜０．０５
【００７６】
同様に、膠芽腫患者について、１ｍｇ投与群(レベルＩ) および３ｍｇ以上の投与群(レベルＩＩ)において、投与前から２クールまでの各クールの終了時に得た血漿又はＰＢＭＣより得られたＩＦＮ−γ値およびＦＩＵの平均値を算出し、投与回数と免疫応答との関係について解析を行なった。ＩＦＮ−γ値についての結果を表９及び図７に、ＦＩＵについての結果を表１０および図８に示す。なお、表および図の「投与回数」とは各クール終了時の合計投与回数であり、１クールあたりの投与回数は６回である。
【表９】
0005980303.tif 000011
＊：投与回数「０」の値に対してｐ＜０．０５，
＃：投与回数「０」の値に対してｐ＜０．１
【表１０】
0005980303.tif 000012
＊：投与回数「０」の値に対しｐ＜０．０５，
＃：投与回数「０」の値に対しｐ＜０．１
【００７７】
ＨＲＰＣ患者では、ＣＴＬについては１８回投与後に３ｍｇ以上の投与群において有意な増加が認められた（表７）。また、抗体については、全群では６回投与後、１ｍｇ投与群では１２回投与後に有意な増加が認められた（表８）。このことから、各ペプチドを１８回、３ｍｇ以上投与することでＣＴＬを活性化できることがわかった。
【００７８】
また、膠芽腫患者では、ＣＴＬについては６回投与後から有意な上昇が確認でき（表９）、抗体については１２回投与後から有意な上昇が確認された（表１０）。
【００７９】
以上の結果から、ペプチドの投与回数は少なくとも６回以上、より好ましくは１２回以上であり、前立腺がんについては１８回以上が最も好ましいことがわかった。なお、投与回数の上限に制限はなく、患者が投与に耐えうる限り投与可能であるが、本試験では前立腺がん患者で最大５４回、膠芽腫患者で最大７９回の投与がなされていることから、少なくとも７９回までは投与可能であるといえる。
【００８０】
さらに、抗体の値は、１２回投与後にほぼプラトーに達することがわかった（図３）。よって、投与したペプチドの免疫応答を確認しペプチドを再選択する頻度に関して、６回投与、より好ましくは６〜１２回投与ごとに各ペプチドに対する抗体を調べることで、各患者に最適なペプチドを選択することができることもわかった。
【００８１】
（抗体とＣＴＬの相関関係解析）
ペプチドの投与量および投与回数に応じてＣＴＬ活性または抗体の反応性が増加することがわかったため、ＣＴＬ活性の増加と抗体の反応性の増加に相関関係があるか否かついて解析を行なった。なお、解析は、投与回数が全体的に多いＨＲＰＣ患者について行なった。
【００８２】
ＣＴＬ活性化については、各採血ポイントのＰＢＭＣより得られたＩＦＮ−γ値からペプチド投与前のＩＦＮ−γ値を差引いた値を算出し、患者毎にこの値の平均値（Δ値）を算出した。一方、抗体については、投与開始時のＦＩＵの値が投与後の値に比べ極端に小さいことから、各採血ポイントで得られたＦＩＵの値の平均を患者毎に算出した。次いで、患者毎に得られたΔ値とＦＩＵの平均値の間における相関を解析した。得られた相関係数を表１１に示す。
【表１１】
0005980303.tif 000013
【００８３】
ＣＴＬの増加が有意に認められた３ｍｇ投与群、３ｍｇ投与群と５ｍｇ投与群を合わせた群（３ｍｇ以上の投与群）、および全群において、有意な相関関係が得られた。
【００８４】
表７〜１１の結果から、ＣＴＬの反応が有意に得られた３ｍｇ投与以上の群でみると、（１）抗体の反応性は６回投与後から有意な増加が見られること、（２）ＣＴＬ活性は６回投与後から上昇する傾向が見られ、抗体より遅れて１８回投与後から有意な増加が見られること、（３）抗体の反応性とＣＴＬ活性の増加は相関すること、がわかる。
【００８５】
すなわち、各ペプチドに対して反応を示す抗体の測定値を基にペプチドを再選択して投与することにより、投与したペプチドに対するＣＴＬを効率よく増加させることができ、かかる選択方法によって各患者に最適なペプチドを選択して投与することが可能であると考えられた。
【００８６】
ＨＲＰＣ患者において、ＣＴＬの有意な増加が見られた３ｍｇ投与群および５ｍｇ投与群のうちペプチドの再選択が行なわれた７症例について、初回の選択で選ばれたペプチドによるＣＴＬ反応と再選択によって投与されたペプチドによるＣＴＬ反応とをＩＦＮ−γ値を用いて解析した。結果を表１２および図９に示す。なお、初回のペプチド再選択が１クール目終了時に行なわれていることから、これら表および図には再選択後の測定値（２クール目終了時以降の測定値）の平均を示している。また、表および図の「投与回数」とは各クール終了時の合計投与回数であり、１クールあたりの投与回数は６回である。
【表１２】
0005980303.tif 000014
【００８７】
表１２の結果から、６回投与後の再選択によって投与されたペプチドにとって１８回投与後に相当する２４回投与以降は、ＣＴＬ活性化全体に対する再選択したペプチドによるＣＴＬ活性化の割合が高かった。このことから、ペプチドの再選択によって選ばれたペプチドに対するＣＴＬの活性化が、各患者の全体のＣＴＬの活性化に大きく寄与していることがわかった。なお、ペプチドを再選択した人数は、６回投与後で７人中６人、１２回投与後で６人中３人、１８回投与後で５人中２人であり、２４回投与後は０人であった。
【００８８】
（免疫応答と生存期間に関する解析）
さらに、ＨＲＰＣ患者において、患者毎に得られたΔ値およびＦＩＵの平均を算出し、生存期間との相関関係を解析した。得られた相関係数の結果を、Δ値については表１３に、ＦＩＵについては表１４に示す。
【表１３】
0005980303.tif 000015
【表１４】
0005980303.tif 000016
【００８９】
Δ値およびＦＩＵのいずれにおいても、３ｍｇ以上を投与した群においてＣＴＬの活性化または抗体の上昇と生存期間との間において相関する傾向が見られ、特に３ｍｇ投与群では強い相関関係が得られた。この結果から、少なくとも３ｍｇ以上、好ましくは３〜５ｍｇのペプチドを投与することにより、抗体の反応性またはＣＴＬ活性の増加が生存期間の延長に寄与するものと考えられた。
【００９０】
（投与ペプチドに関する解析）
ＨＲＰＣ患者１５例（合計４０２回投与）と膠芽腫患者１２例（合計１９８回投与）における各ペプチドの使用頻度、投与者数、ペプチド投与後の抗体の測定値（ＦＩＵ）およびＣＴＬのＩＦＮ−γ値の各平均値、平均投与回数を算出した。結果を表１５に示す。
【表１５】
0005980303.tif 000017
【００９１】
配列番号１〜１４のうち、配列番号２は、ペプチド選択において選択されておらず、配列番号１および３〜１４の１３種類のペプチド群からペプチドを選択すればよいことがわかった。特に、配列番号４、５、１４は、前立腺がんおよび脳腫瘍のいずれにおいても使用頻度、投与者数、抗体およびＣＴＬの値が良好であり、配列番号６、８、１１、１２、１３は、前立腺がんまたは脳腫瘍のいずれかにおいて使用頻度、投与者数、抗体またはＣＴＬの値が良好であることがわかった。
【００９２】
一方、配列番号１、３および１０は前立腺がんおよび脳腫瘍のいずれにおいても使用頻度が低く、このうち配列番号３は１名のＨＲＰＣ患者において１２回の投与がなされたが、抗体およびＣＴＬの反応性が増加せず、その後のペプチド再選択検査によって他のペプチドに変更されていた。一方、配列番号１は１名のＨＲＰＣ患者で使用されたが、ＣＴＬの反応性が他のペプチドに比べ低かった。さらに、配列番号１０はＣＴＬの値が高くなっているが、２例中１例で高い値が測定されたものの継続的に投与されていなかった。
【００９３】
特に、配列番号３は、同程度の投与頻度である配列番号１および１０と比べると抗体とＣＴＬの増加が見られないことから、ペプチドを抗体で選択して投与する方法においては、配列番号２および３を除く１２種類のペプチド群からペプチドを選択しても十分な臨床効果が得られるものと考えられた。また、配列番号３を除くことで、よりＣＴＬの活性化や抗体の増加が期待できる他のペプチドを選択して投与し得るため、より優れた臨床効果を期待し得るものと考えられた。
【００９４】
すなわち、ペプチドの継続投与によってＣＴＬが活性化され、延命効果が発揮されることを考慮すると、配列番号１および３〜１４の１３種類から配列番号３を除く１２種類、さらに配列番号１または１０を除く１１種類、あるいは当該１３種類から配列番号１、３、１０を除く１０種類で、十分な延命効果を期待しうるものと考えられた。さらには、これらのペプチドが除かれることによって、よりＣＴＬの活性化や抗体の増加が期待できるペプチドが投与されることになるため、ＣＴＬの活性化や抗体の増加が延命効果と相関することを考慮すると、よりＣＴＬの活性化や抗体の増加が見込まれる他のペプチドを投与することでより優れた臨床効果が期待できることとなる。
【００９５】
また、配列番号４〜９および１１〜１４の１０種類について、表１４の１クールあたり６回投与とした場合の平均投与回数およびＩＦＮ−γ値から１投与あたりのＩＮＦ−γ値を算出すると、配列番号７および９は他のペプチドよりもＣＴＬ活性の増加が低く、ＣＴＬの活性化による延命効果が弱いものと考えられた。よって、当該１０種類から配列番号７または９のいずれか一方を除く９種類、または両方を除く８種類でも、延命効果が得られるものと考えられた。さらに、配列番号７は１２名、配列番号９は５名の被験者に投与されており、全ての患者において、各クールで投与された４種のペプチドのうち１種は配列番号７または９であった。従って、これらのペプチドに対するＣＴＬ活性の増加が十分でなかったことを考慮すると、投与するペプチドは最低３種類でもよいことが考えられた。
【００９６】
さらに、配列番号４〜６、８、および１１〜１４の８種類のうち、配列番号１２および１３は、ＨＲＰＣ患者では他のペプチドに比べＣＴＬ活性化の値が低く、また平均投与回数が少ないことから、前記と同様の理由により除外可能と考えられた。すなわち、前立腺がんを対象とした場合は、配列番号４〜６、８、１１、および１４の６種類で十分に延命効果が期待できると考えられた。同様に、配列番号８は膠芽腫患者に対して使用されていないことから、脳腫瘍を対象とした場合は、配列番号４〜６、および１１〜１４の７種類で延命効果が期待できると考えられた。
【００９７】
これらを検証するため、ＨＲＰＣ患者を対象として、表１６に示す６〜１３種類のペプチドの組により得られたＣＴＬの測定値と生存期間との相関関係を解析した。解析によって得られた相関係数（Ｒ）を表１６に示す。表中の「３種合致割合」とは、投与されたペプチドのうちいずれか３種類が全てのクールで継続して投与されていた患者の１５人中の割合を示し、「抗体陽性率」とは、抗体検査において３種類以上のペプチドに対する抗体が陽性であった患者の１５人中の割合を示す。
【表１６】
0005980303.tif 000018
【００９８】
表１６に示されるように、６種類のペプチドの組でも、ＣＴＬの値と生存期間との相関係数は大きな影響を受けないことがわかった。また、１０〜１３種類では１００％（１５例中１５例）、８種類で８０％（１５例中１２例）であり、６種類でも約６割の患者に３種類以上のペプチドを全てのクールで継続して投与できることがわかった。また、被験者のＭＳＴは、Ｎｏ．３〜１１のペプチドの組では同等以上の値であったが、Ｎｏ．１および２の組は若干低くなる傾向を示した。この結果から、好ましくは７種類以上のペプチドの組とすることで、ほとんどの被験者において同等の効果を得られるものと考えられた。
【００９９】
同様に、１２例の膠芽腫患者における３種合致割合と抗体陽性率について解析を行なった。結果を表１７に示す。
【表１７】
0005980303.tif 000019
【０１００】
表１７に示されるように、膠芽腫患者では７種類のペプチドでも３種合致割合が１００％（１２人中１２人）であった。
【０１０１】
さらに、投与回数および投与量の相違が臨床効果に影響するかについて、ＨＰＲＣ患者１５名を群分けして解析した。解析は、１）３ｍｇ以上および１２回以上投与した患者とそれ以外の患者の２群に分けてＭＳＴを算出する、２）３ｍｇ以上および１８回以上投与した患者とそれ以外の患者の２群に分けてＭＳＴを算出する、の２種類の解析を行った。結果を表１８、表１９に示す。
【表１８】
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【表１９】
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表１８および１９より、ＣＴＬや抗体の上昇が確認できる１２回投与または１８回投与した患者の群は、それ以外の群に比べＭＳＴが長い傾向があることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明の薬剤は、腫瘍抗原由来のペプチド群からなる薬剤であり、手術、化学療法、放射線療法に次ぐ第四の治療方法として期待される免疫療法に用いるための薬剤である。本薬剤は、患者毎に適したペプチドを選択して投与することができるものであり、前立腺がんや脳腫瘍といった治療が困難ながんの進行を抑制する臨床的効果を有するため有用である。また、本薬剤は、他の治療方法との併用も可能である。
【図１】
0005980303.tif 000022
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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