(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１、ｇＨおよびｇＬを含む五量体ｇＨ複合体、および
（ｂ）必須タンパク質ＩＥ１/２と不安定化タンパク質の間の第一の融合タンパク質、および必須タンパク質ＵＬ５１と不安定化タンパク質の間の第二の融合タンパク質をコードする核酸、
を含む条件付き複製欠損型サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）であって、
ここで、不安定化タンパク質は、ＦＫ５０６結合タンパク（ＦＫＢＰ）またはＦＫＢＰ誘導体のいずれかであり、ここでＦＫＢＰ誘導体は、Ｆ３６ＶおよびＬ１０６Ｐのアミノ酸置換を含み、
ここで、野生型のＩＥ１/２およびＵＬ５１はもはや存在せず、そしてここで、
ＣＭＶは、ＵＬ１３１遺伝子における突然変異の修復に起因して、ｇＨ複合体の発現を復元した弱毒化株である、条件付き複製欠損型サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）。
【請求項２】
不安定化タンパク質が、アミノ酸置換Ｆ３６ＶおよびＬ１０６Ｐを含むＦＫＢＰ誘導体である、請求項１の条件付き複製欠損型ＣＭＶ。
【請求項３】
（ａ）第一の融合タンパク質が配列番号１または配列番号１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸であり、そして
（ｂ）第二の融合タンパク質が配列番号３または配列番号３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸である、
請求項１又は請求項２に記載の条件付き複製欠損型ＣＭＶ。
【請求項４】
（ａ）第一の融合タンパク質が配列番号２または配列番号２と少なくとも９５％同一である核酸によってコードされており、そして
（ｂ）第二の融合タンパク質が配列番号４または配列番号４と少なくとも９５％同一である核酸によってコードされている、
請求項３の条件付き複製欠損型ＣＭＶ。
【請求項５】
ＣＭＶが、ＵＬ１３１遺伝子における突然変異の修復に起因して、ｇＨ複合体の発現が復元されたＡＤ１６９である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の条件付き複製欠損型ＣＭＶ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項の条件付き複製欠損型ＣＭＶおよび薬学的に許容可能な担体を含む組成物。
【請求項７】
アジュバントをさらに含む請求項６の組成物。
【請求項８】
患者におけるＣＭＶに対する免疫応答を誘導するための、免疫学的に有効量の請求項６または７に記載の組成物。
【請求項９】
免疫応答がＣＭＶ感染に対する患者における防御免疫応答である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
患者が減衰した免疫を有するヒトである、請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１１】
患者が妊娠可能年齢のヒトの女性である、請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１２】
ＣＭＶ感染に対する患者における防御免疫応答の誘導用の薬剤の製造における、請求項１〜５のいずれか一項の条件付き複製欠損型ＣＭＶの使用。
【請求項１３】
患者におけるＣＭＶ感染を治療するための医薬において使用するための、請求項１〜５のいずれか一項の条件付き複製欠損型ＣＭＶ。
【請求項１４】
Ｓｈｉｅｌｄ−１の存在下において上皮細胞中で組換えＣＭＶを増殖することを含む、請求項１〜５のいずれか一項の条件付き複製欠損型ＣＭＶを作成する方法。
【請求項１５】
上皮細胞がヒト網膜色素上皮細胞である請求項１４の方法。
【請求項１６】
ヒト網膜色素上皮細胞が寄託番号ＣＲＬ−２３０２としてアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に寄託されたＡＲＰＥ−１９細胞である、請求項１５の方法。
【請求項１７】
Ｓｈｉｅｌｄ−１が少なくとも０．５μＭの濃度で存在する請求項１４の方法。
【請求項１８】
５〜７の間のｐＨの緩衝液中に請求項１〜５のいずれか一項の条件付き複製欠損型ＣＭＶを含む組成物であって、ここで、緩衝液が
（ａ）１５〜３５ｍＭの間のヒスチジン、および
（ｂ）１００〜２００ｍＭの間のＮａＣｌ、
を含む、組成物。
【請求項１９】
緩衝液がｐＨ６で１５０ｍＭ  ＮａＣｌと共に２５ｍＭ  ヒスチジンを含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
９％（ｗ／ｖ）ショ糖をさらに含む請求項１９の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、条件付き複製欠損型である遺伝子組換えＣＭＶを使用するサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に対する免疫応答を誘導する方法に関する。本発明はまた、ウイルス複製の外部制御を可能とするように組換え的に改変されたＣＭＶにも関する。複製欠損型ＣＭＶを含む組成物もまた本発明に包含される。
【背景技術】
【０００２】
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）は、ヒトヘルペスウイルス５型（ＨＨＶ−５）としても知られており、ベータヘルペスウイルス亜科に属すると分類されるヘルペスウイルスである。アメリカ疾病予防管理センターによれば、ＣＭＶ感染は人間母集団にかなり広範に見出され、合衆国成人人口の４０〜８０％が感染していると推定される。該ウイルスは主に体液により伝播し、しばしば妊娠中の母親から胎児または新生児に伝わる。ほとんどの個体においてＣＭＶ感染は潜在性であるが、しかしウイルス活性化は、高熱、悪寒、疲労、頭痛、吐き気および脾腫をもたらし得る。
【０００３】
ほとんどのヒトＣＭＶ感染は無症候性ではあるが、免疫不全状態の個体（例えば、ＨＩＶ陽性患者、同種間移植患者および癌患者等）または免疫系がまだ完全には発達していない人間（新生児等）におけるＣＭＶ感染は特に問題となり得る（Ｍｏｃａｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ，ｉｎ  Ｆｉｅｌｄ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２７０１−２７７２，Ｅｄｉｔｏｒ：Ｋｎｉｐｅｓ  ａｎｄ  Ｈｏｗｌｅｙ，２００７）。当該個体におけるＣＭＶ感染は、他の有害な疾患の中でもとりわけ肺炎、肝炎、脳炎、大腸炎、ブドウ膜炎、網膜炎、盲目症および神経障害を含む重篤な罹患を引き起こし得る。加えて妊娠中のＣＭＶ感染は、先天性欠損症の主な原因である（Ａｄｌｅｒ，２００８  Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｖｉｒｏｌ，４１：２３１；Ａｒｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ，２００４  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，３９：２３３；Ｒｅｖｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ，２００８  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ，８０：１４１５）。ＣＭＶは、単核細胞、マクロファージ、樹状細胞、好中球、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、神経細胞、平滑筋細胞、肝細胞および間質細胞を含む種々の細胞にインビボで感染する（Ｐｌａｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９６，Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．４６：１９５）。ＣＭＶの臨床分離株は種々の細胞型において複製するが、実験室株ＡＤ１６９（Ｅｌｅｋ  ＆  Ｓｔｅｒｎ，１９７４，Ｌａｎｃｅｔ  １：１）およびＴｏｗｎｅ（Ｐｌｏｔｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１２：５２１）は、もっぱら繊維芽細胞においてだけ複製する（Ｈａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：１００２３）。指向性における制限は、繊維芽細胞における連続継代および最終的なウイルスの順応に起因するが、弱毒化のマーカーと規定される（Ｇｅｒｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８６：２７５；Ｇｅｒｎａ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．８３：１９９３；Ｇｅｒｎａ  ｅｔ  ａｌ，２００３，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．８４：１４３１；Ｄａｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１０，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．９１：１５３５）。ヒトＣＭＶ実験室株における上皮細胞、内皮細胞、白血球および樹状細胞指向性の損失を引き起こす突然変異が、３個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であるＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１にマッピングされた（Ｈａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：１００２３；Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｈｅｎｋ，２００５  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：１０３３０；Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｈｅｎｋ，２００５  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０２：１８１５３）。生化学的研究および再構成研究は、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１がｇＨ／ｇＬスキャフォールド上でアセンブルし五量体ｇＨ複合体を形成することを示している（Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｈｅｎｋ，２００５  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０２：１８１５；Ｒｙｃｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，２００８  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．８２：６０）。ビリオンにおけるこの複合体の復元は、実験室株におけるウイルスの上皮指向性を復元する（Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｈｅｎｋ，２００５  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．���９：１０３３０）。
【０００４】
内皮および上皮指向性の喪失は、Ｔｏｗｎｅ株のように以前にワクチンとして評価されたところにおける欠損性ではないかと思われてきた（Ｇｅｒｎａ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．８３：１９９３；Ｇｅｒｎａ  ｅｔ  ａｌ，２００３，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．８４：１４３１）。ＣＭＶ自然感染のヒト被験者由来の血清中の中和抗体は、ウイルスの線維芽侵入に対してよりも上皮侵入に対して１５倍より大きな高い活性を有する（Ｃｕｉ  ｅｔ  ａｌ，２００８  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２６：５７６０）。一次感染したヒトは、ウイルスの内皮および上皮侵入に対する中和抗体を急激に発達させるが、しかしウイルスの線維芽侵入に対する中和抗体はゆっくり発達させるだけである（Ｇｅｒｎａ  ｅｔ  ａｌ，２００８  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８９：８５３）。さらに、ウイルスの上皮および内皮侵入に対する中和活性は、Ｔｏｗｎｅワクチンを接種されたヒト被験者由来の免疫血清には存在しない（Ｃｕｉ  ｅｔ  ａｌ，２００８  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２６：５７６０）。最近になって、ＨＣＭＶ感染した４名の供血者由来のヒトモノクローナル抗体パネルが記載され、該パネル由来のより高い効力のある中和活性のあるクローンが五量体ｇＨ複合体の抗原を識別した（Ｍａｃａｇｎｏ  ｅｔ  ａｌ，２０１０  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８４：１００５）。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、条件付き複製欠損型ＣＭＶ（ｒｄＣＭＶ）および組成物におけるｒｄＣＭＶの使用、ならびに患者におけるＣＭＶ感染の可能性または該感染に関連する症状を治療および／または低下させる方法を対象とする。本明細書記載のｒｄＣＭＶは、不安定化タンパク質に融合した必須タンパク質を含む、一または複数の融合タンパク質をコードする核酸を含む。安定化剤の非存在下では融合タンパク質は分解される。従ってｒｄＣＭＶは、複製が可能な条件下（即ち安定化剤の存在下）では組織培養で増殖し得るが、しかし患者に投与された場合（安定化剤の非存在下）には、複製は減少され好ましくは阻止される。
【０００６】
本発明の一実施形態は、条件付き複製欠損型ＣＭＶである。該ｒｄＣＭＶは、不安定化タンパク質に融合した一の必須タンパク質を含む、一または複数の融合タンパク質をコードする核酸を含む。野生型の必須タンパク質をコードする核酸はもはやｒｄＣＭＶ中に存在しないので、従ってウイルス複製のためには融合タンパク質が要求される。好ましい実施形態において、必須タンパク質はＩＥ１／２、ＵＬ５１、ＵＬ５２、ＵＬ７９およびＵＬ８４から成る群より選択され、および不安定化タンパク質はＦＫＢＰまたはその誘導体である。
【０００７】
本発明の他の実施形態は、単離したｒｄＣＭＶおよび薬学的に許容可能な担体を含む組成物である。該組成物は、限定されるものではないが、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバントおよびリン酸アルミニウムアジュバントを含むアジュバントをさらに含み得る。
【０００８】
本発明の他の実施形態は、患者においてＣＭＶに対する免疫応答を誘導するためのｒｄＣＭＶ組成物の使用である。患者は、本発明のｒｄＣＭＶの投与によって予防的にまたは治療的に処置され得る。予防的処置は、一次感染、回帰感染（即ち、潜在性ＣＭＶの再活性化に起因する感染）および重複感染（即ち、患者の前に感染したＣＭＶとは異なる株による感染に起因する感染）を含む、ＣＭＶ感染の可能性または重症度を低下させるために十分な防御免疫を提供する。特定の実施形態において、妊娠可能年齢の女性、特に思春期前期の女性は、妊娠中のＣＭＶ感染（一次、回帰または重複）の可能性を低下するためおよびそれによって胎児へのＣＭＶの伝染の可能性を低下するためにワクチン接種される。治療的処置は、流行しているＣＭＶ感染の期間／重症度を低下させるために実施され得る。
【０００９】
本発明の他の実施形態は、ＡＲＰＥ−１９細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−２３０２）等の上皮細胞上でＳｈｉｅｌｄ−１の存在下にｒｄＣＭＶを増殖することを含む、本発明のｒｄＣＭＶを作製する方法である。いくつかの実施形態においてｒｄＣＭＶは、マイクロキャリアまたは他の高密度細胞培養系上の上皮細胞上で増殖される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１Ａ〜１Ｂは、五量体ｇＨ複合体の復元された発現を有するＣＭＶ株の構築の模式図を示す。（Ａ）ＡＤ１６９株のウイルスゲノムを操作するための自己切断性細菌人工染色体（ＢＡＣ）の作製ストラテジー。（Ｂ）発現を復元するためのＵＬ１３１におけるフレームシフト突然変異の修復。（Ｃ）ＣＭＶの自己切断性ＢＡＣを作製するためのＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子によるＧＦＰの置換。
【図２Ａ】図２Ａは、ｇＨ複合体の免疫原性に関する従来の不活化法の影響を示す。γ線照射（Ａ、Ｃ）およびβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）（Ｃ、Ｄ）を、ｇＨ複合体を発現するＣＭＶを不活化するために使用した。不活化反応速度はプラーク分析法によって測定し（Ａ、Ｃ）、一方で免疫原性は、ウイルスの上皮細胞侵入に対する活性を中和するためにＣＭＶを投与したマウス由来の血清を評価することによって測定した（Ｂ、Ｄ）。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ｇＨ複合体の免疫原性に関する従来の不活化法の影響を示す。γ線照射（Ａ、Ｃ）およびβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）（Ｃ、Ｄ）を、ｇＨ複合体を発現するＣＭＶを不活化するために使用した。不活化反応速度はプラーク分析法によって測定し（Ａ、Ｃ）、一方で免疫原性は、ウイルスの上皮細胞侵入に対する活性を中和するためにＣＭＶを投与したマウス由来の血清を評価することによって測定した（Ｂ、Ｄ）。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ｇＨ複合体の免疫原性に関する従来の不活化法の影響を示す。γ線照射（Ａ、Ｃ）およびβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）（Ｃ、Ｄ）を、ｇＨ複合体を発現するＣＭＶを不活化するために使用した。不活化反応速度はプラーク分析法によって測定し（Ａ、Ｃ）、一方で免疫原性は、ウイルスの上皮細胞侵入に対する活性を中和するためにＣＭＶを投与したマウス由来の血清を評価することによって測定した（Ｂ、Ｄ）。
【図２Ｄ】図２Ａは、ｇＨ複合体の免疫原性に関する従来の不活化法の影響を示す。γ線照射（Ａ、Ｃ）およびβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）（Ｃ、Ｄ）を、ｇＨ複合体を発現するＣＭＶを不活化するために使用した。不活化反応速度はプラーク分析法によって測定し（Ａ、Ｃ）、一方で免疫原性は、ウイルスの上皮細胞侵入に対する活性を中和するためにＣＭＶを投与したマウス由来の血清を評価することによって測定した（Ｂ、Ｄ）。
【図３】図３は、ＦＫＢＰ誘導体に融合した種々の必須タンパク質を含む、ｇＨ複合体を発現するＣＭＶのＳｈｉｅｌｄ  １濃度依存性の子孫ウイルス産生を示す。ＡＲＰＥ−１９細胞は、０．０１ＰＦＵ／細胞の多重度でｒｄＣＭＶにより１時間感染し、新鮮培地により２回洗浄し、Ｓｈｉｅｌｄ−１を０、０．０５、０．１、０．５または２μＭ含有する増殖培地にインキュベートした。感染後７日にセルフリーウイルスを収集し、ウイルス力価を、２μＭのＳｈｉｅｌｄ  １の存在下、ＡＲＰＥ−１９細胞上のＴＣＩＤ５０分析法によって測定した。
【図４】図４Ａ〜４Ｄは、ＡＲＰＥ−１９細胞中でのｒｄＣＭＶの増殖速度を示す。細胞は、（Ａ）ＩＥ１／２、（Ｂ）ＵＬ５１、（Ｃ）ＩＥ１／２−ＵＬ５１融合タンパク質、または（Ｄ）親ｂｅＭＡＤウイルスを、０．０１ＰＦＵ／細胞の多重度で含有するウイルスにより感染した。１時間後に細胞を新鮮培地により２回洗浄し、２μＭのＳｈｉｅｌｄ−１の非存在下（白丸）または存在下（黒丸）でインキュベートした。セルフリーウイルスは感染後の表示時点で収集し、感染性ウイルスは２μＭのＳｈｉｅｌｄ−１を含有する培地中のＡＲＰＥ−１９細胞上でＴＣＩＤ５０分析法によって定量した。
【図５】図５Ａ〜５Ｅ  種々の細胞型におけるＩＥ１／２−ＵＬ５１  ｒｄＣＭＶの増殖速度。（Ａ）ＭＲＣ−５（Ｂ）ＨＵＶＥＣ（Ｃ）ＡｏＳＭＣ（Ｄ）ＳＫＭＣ（Ｅ）ＣＣＦ−ＳＴＴＧ１細胞は、ｒｄＣＭＶウイルスにより感染し１時間インキュベートした。細胞は新鮮培地で２回洗浄し、次に２μＭのＳｈｉｅｌｄ−１の非存在下（白丸）または存在下（黒丸）でインキュベートした。セルフリーウイルスは感染後の表示時点で収集し、感染ウイルスは２μＭのＳｈｉｅｌｄ−１を含有する培地中のＡＲＰＥ−１９細胞上でＴＣＩＤ５０分析法によって定量した。
【図６Ａ】図６Ａは、マウス、ウサギおよびアカゲザルにおけるＩＥ１／２−ＵＬ５１    ｒｄＣＭＶの免疫原性分析。マウスは、ｂｅＭＡＤ（白丸）またはＩＥ１／２−ＵＬ５１  ｒｄＣＭＶ（黒丸）により、０および４週目に免疫した。
【図６Ｂ】図６Ｂは、マウス、ウサギおよびアカゲザルにおけるＩＥ１／２−ＵＬ５１    ｒｄＣＭＶの免疫原性分析。ウサギは、１０μｇ  ｂｅＭＡＤまたは表示したｒｄＣＭＶにより、０、３および８週目に免疫した。
【図６Ｃ】図６Ｃは、マウス、ウサギおよびアカゲザルにおけるＩＥ１／２−ＵＬ５１    ｒｄＣＭＶの免疫原性分析。アカゲザルは、１００μｇ  ｂｅＭＡＤまたはＩＥ１／２−ＵＬ５１  ｒｄＣＭＶにより０および８週目に免疫した。いずれの場合にも、血清試料を収集して、ＡＲＰＥ−１９細胞上でＣＭＶマイクロ中和分析法によって分析した。線は、各群における中和（ＮＴ５０）の幾何平均力価を示す。
【図７】図７は、二重融合ウイルスＩＥ１／２−ＵＬ５１によりワクチン接種したアカゲザルにおける長期にわたる中和力価を示す。アカゲザルの群（ｎ＝５）は、表示したワクチン用量または製剤により０、８および２４週目にワクチン接種し（赤色三角形で示す）、一方で一の群はｇｂ／ｍｆ５９（３０ｍｇ／用量）を０、４および２４週目にワクチン接種した。免疫血清は表示時点で収集しウイルス中和分析法で評価した。ＮＴ５０力価のＧＭＴは、群に対する標準誤差を伴って長期的にプロットした。ＡＡＨＳ：不定形アルミニウムヒドロキシホスファートスルファート；ＩＭＸ：ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ；ＨＮＳ：緩衝塩基。
【図８Ａ】図８Ａは、用量当たり１００μｇ（Ａ）または１０μｇ（Ｂ〜Ｄ）のいずれかでの、二重融合ウイルスＩＥ１／２−ＵＬ５１ワクチン接種によるアカゲザルにおけるＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴを示す。無アジュバント（Ａ〜Ｂ）、ＡＡＨＳ（Ｃ）またはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸのいずれかを使用した。ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）は、ＨＣＭＶ抗原を代表するペプチドプールにより刺激した。灰色のバーは群（ｎ＝５）の各々の抗原に対するＧＭＴを表す。各々の抗原に対する応答率（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ  ｒａｔｅ）は、パネル内の各々の抗原の（バーの）上端で示される。
【図８Ｂ】図８Ｂは、用量当たり１００μｇ（Ａ）または１０μｇ（Ｂ〜Ｄ）のいずれかでの、二重融合ウイルスＩＥ１／２−ＵＬ５１ワクチン接種によるアカゲザルにおけるＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴを示す。無アジュバント（Ａ〜Ｂ）、ＡＡＨＳ（Ｃ）またはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸのいずれかを使用した。ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）は、ＨＣＭＶ抗原を代表するペプチドプールにより刺激した。灰色のバーは群（ｎ＝５）の各々の抗原に対するＧＭＴを表す。各々の抗原に対する応答率（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ  ｒａｔｅ）は、パネル内の各々の抗原の（バーの）上端で示される。
【図８Ｃ】図８Ｃは、用量当たり１００μｇ（Ａ）または１０μｇ（Ｂ〜Ｄ）のいずれかでの、二重融合ウイルスＩＥ１／２−ＵＬ５１ワクチン接種によるアカゲザルにおけるＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴを示す。無アジュバント（Ａ〜Ｂ）、ＡＡＨＳ（Ｃ）またはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸのいずれかを使用した。ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）は、ＨＣＭＶ抗原を代表するペプチドプールにより刺激した。灰色のバーは群（ｎ＝５）の各々の抗原に対するＧＭＴを表す。各々の抗原に対する応答率（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ  ｒａｔｅ）は、パネル内の各々の抗原の（バーの）上端で示される。
【図８Ｄ】図８Ｄは、用量当たり１００μｇ（Ａ）または１０μｇ（Ｂ〜Ｄ）のいずれかでの、二重融合ウイルスＩＥ１／２−ＵＬ５１ワクチン接種によるアカゲザルにおけるＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴを示す。無アジュバント（Ａ〜Ｂ）、ＡＡＨＳ（Ｃ）またはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸのいずれかを使用した。ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）は、ＨＣＭＶ抗原を代表するペプチドプールにより刺激した。灰色のバーは群（ｎ＝５）の各々の抗原に対するＧＭＴを表す。各々の抗原に対する応答率（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ  ｒａｔｅ）は、パネル内の各々の抗原の（バーの）上端で示される。
【図９】図９Ａ〜９Ｂは、二重融合ウイルスＩＥ１／２−ＵＬ５１のワクチン接種が、アカゲザルにおいてＣＤ８＋（Ａ）およびＣＤ４＋（Ｂ）の表現型の双方のＴ細胞応答を誘導し得ることを示す。ＰＢＭＣは、アジュバントとしてＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）を含むワクチンの、１００μｇまたは１０μｇ用量のいずれかを投与したサルから収集した。ＰＢＭＣはＨＣＭＶを代表するペプチドプールにより刺激し、続いてＩＦＮ−γおよびＴ細胞表面マーカーＣＤ４＋／ＣＤ８＋を染色した。データは、ＰＢＭＣの１００万個当たりのＣＤ４＋／ＣＤ８＋陽性、ＩＦＮ−γ陽性の細胞数として提示する。線は同一のワクチンを投与された群（ｎ＝５）の幾何平均（ＧＭＴ）を表す。グラフ下部にある数字は、双方のワクチン接種群（ｎ＝１０）のＧＭＴを表す。ＣＭＶ：精製ウイルス；ＳＥＢ：正の対照剤として使用したマイトジェン；ＩＭＸ：ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ。
【図１０】図１０は、Ｍｅｒｃｋリン酸アルミニウムアジュバント（ＭＡＰＡ）がサルにおいて中和抗体力価を高め得ることを示す。アカゲザルは、ＨＮＳ（緩衝塩基）、ＡＡＨＳまたはＭＡＰＡ中で製剤化した二重融合ウイルスワクチンの３０μｇ用量により０および８週目に免疫した。血清試料は、１２週目に収集し中和力価を評価した。線は群についての幾何平均を表す。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｂは、異なる温度でのハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中のｇＨ発現ＣＭＶの安定性を示す。（Ａ）ＨＢＳＳ中のＣＭＶ試料は、ウイルス侵入分析法を使用してＣＭＶのウイルス安定性を測定する前に、表示温度で４日間保存した。（Ｂ）ＥＣ５０値は、ウイルス侵入分析法の結果を使用して試料に対して算出した。＊は、完全な感染力喪失のためにＥＣ５０が算出し得なかったことを示す。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｂは、室温でのｇＨ発現ＣＭＶの安定性に関するｐＨの影響を示す。（Ａ）異なるｐＨを有する緩衝液中のＣＭＶ試料は、ウイルス侵入分析法を使用してＣＭＶのウイルス安定性を測定する前に、室温で４日間保存した。（Ｂ）ＥＣ５０値は、ウイルス侵入分析法の結果を使用して試料に対して算出した。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｂは、ｇＨ発現ＣＭＶのウイルス安定性に関する尿素単独または塩化ナトリウムと併用の尿素の影響を示す。（Ａ）２％尿素単独または１５０ｍＭ  ＮａＣｌと併用の２％尿素を、ウイルス侵入分析法を使用してＣＭＶのウイルス安定性を測定する前に、ｐＨ６の２５ｍＭヒスチジン緩衝液中のＣＭＶに室温で４日間添加された。（Ｂ）ＥＣ５０値は、ウイルス侵入分析法の結果を使用して試料に対して算出した。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｂは、ｇＨ発現ＣＭＶのウイルス安定性に関するイオン強度の影響を示す。（Ａ）濃度を増加させたＮａＣｌ（０ｍＭ、７５ｍＭ、１５０ｍＭおよび３２０ｍＭ  ＮａＣｌ）が、ウイルス侵入分析法を使用してＣＭＶのウイルス安定性を測定する前に、ｐＨ６の２５ｍＭヒスチジン緩衝液中のＣＭＶに室温で４日間添加された。（Ｂ）ＥＣ５０値は、ウイルス侵入分析法の結果を使用して試料に対して算出した。
【図１５】図１５は、凍結融解サイクルに対するｇＨ発現ＣＭＶの安定性に関する凍結保護物質の影響を示す。表示した凍結保護物質は、ｐＨ６の２５ｍＭヒスチジン緩衝液中のＣＭＶに添加され、ウイルス侵入分析法を使用してＣＭＶのウイルス安定性を測定する前に３回の凍結融解サイクルを受けた。ＥＣ５０値は、ウイルス侵入分析法の結果を使用して試料に対して算出した。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｂは、マウス免疫原性研究におけるＣＭＶの中和抗体誘導に関する保存温度の影響を示す。マウスは０日目に免疫し、２１日目に追加免疫し、続いて２８日目に放血した。マウス血清は、ＡＲＰＥ−１９細胞を使用してｇＨ発現ＣＭＶに対する中和抗体について試験した。ＮＴ５０力価は非線形曲線近似によって得た。（Ａ）ＣＭＶ試料は、免疫原性研究の前に異なる温度で３か月間保存した。（Ｂ）ＣＭＶ試料は、融解のあとかつ免疫原性研究の前に、異なる温度で８時間保存した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、条件付き複製欠損型ＣＭＶ（ｒｄＣＭＶ）および組成物中におけるｒｄＣＭＶの使用、ならびに患者におけるＣＭＶ感染の可能性または該感染に関連する症状を治療および／または低下する方法を対象とする。本明細書記載のｒｄＣＭＶは、野生型必須タンパク質の代わりに不安定化タンパク質に融合した必須タンパク質を含む一または複数の融合タンパク質をコードする。安定化剤の非存在下では、融合タンパク質は宿主細胞機構によって分解される。安定化剤の存在下では、融合タンパク質は安定化され分解しない。
【００１２】
本発明における使用に適した融合タンパク質は、安定化剤の存在下では宿主細胞におけるウイルス複製を促進するために、十分な必須タンパク質の活性を保持し、そして安定化剤の非存在下ではＣＭＶ複製の低下（好ましくは５０％、７５％、９０％、９５％または９９％より大きい低下）を引き起こす。好ましくは融合タンパク質のための必須タンパク質は、非構造タンパク質をコードし、それ故にｒｄＣＭＶビリオンの中にパッケージングされない。本明細書で特定した好適な必須タンパク質には、必須遺伝子ＩＥ１／２、ＵＬ５１、ＵＬ５２、ＵＬ７９およびＵＬ８４によってコードされたＣＭＶタンパク質が含まれる。
【００１３】
不安定化タンパク質および安定化剤の例は、小分子を使用してタンパク質の安定性を調節するための組成物、系および方法を開示する米国公開特許２００９／０２１５１６９に記載されている。即ちタンパク質は、安定性に影響を与えるタンパク質であるＦＫＢＰまたはその誘導体に融合される。外来性の細胞透過性小分子であるＳｈｉｅｌｄ−１（Ｓｈｌｄ−１）は、ＦＫＢＰまたはその誘導体と相互作用し融合タンパク質を安定化する。Ｓｈｉｅｌｄ−１の非存在下でＦＫＢＰまたはその誘導体は、融合タンパク質に宿主細胞機構によって分解されるように指図する。
【００１４】
本発明の一実施形態において、ＣＭＶの必須タンパク質はＦＫＢＰまたはその誘導体に融合される。Ｓｈｉｅｌｄ−１の存在下において、融合タンパク質は安定化される。しかしながらＳｈｉｅｌｄ−１の非存在下においてＦＫＢＰまたはその誘導体は、融合タンパク質に宿主細胞機構によって分解されるように指図する。
【００１５】
融合タンパク質の非存在下で、ｒｄＣＭＶの複製は低下（好ましくは不安定化必須タンパク質を含有しないＣＭＶと比較して５０％、７５％、９０％、９５％または９９％まで大きく）または阻止される。
【００１６】
本発明の方法において使用される組換えウイルスはまた、そのビリオン上に免疫原性の五量体ｇＨ複合体を呈する。
【００１７】
実施形態にはまた、（ｉ）（ａ）治療（例えば人体の治療）、（ｂ）医薬、（ｃ）ＣＭＶ複製の阻害、（ｄ）ＣＭＶ感染の治療もしくは予防、または、（ｅ）ＣＭＶに関連する疾患の治療、予防もしくは発症もしくは進行の遅延、における使用のための、（ｉｉ）薬剤としての使用のための、または（ｉｉｉ）薬剤の調製における使用のための、本明細書記載の組換えＣＭＶまたはその組成物、または前記ＣＭＶまたは組成物を含むまたはそれらから成るワクチンが含まれる。これらの使用において、組換えＣＭＶ、その組成物および／または前記ＣＭＶまたは組成物を含むまたはそれらから成るワクチンは、一または複数の抗ウイルス剤（例えば、抗ウイルス化合物または抗ウイルス免疫グロブリン；下記に記載の混合ワクチン）と併用して利用してもよい。
【００１８】
本明細書で用いる場合、用語「免疫応答を誘導する」とは、それが投与される患者、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおいて免疫応答を誘導する条件付き複製欠損型ＣＭＶの能力を表し、ここで限定されるものではないが、該応答には、特異的に結合し好ましくはＣＭＶを中和しおよび／またはＴ細胞の活性化を引き起こす要素（抗体等）の産生が含まれる。「防御免疫応答」とは、患者がＣＭＶ感染（一次感染、回帰感染および／重複感染を包含する）に罹患する可能性を低下しおよび／またはＣＭＶ感染に関連する少なくとも一の症状を改善しおよび／またはＣＭＶ感染の重症度／期間を低下する免疫応答である。
【００１９】
本明細書で用いる場合、用語「免疫学的に有効な量」とは、患者に投与されたときにＣＭＶに対し免疫応答を誘導し得る、患者をＣＭＶ感染（一次感染、回帰感染および／重複感染を包含する）から保護しおよび／または患者においてＣＭＶ感染に関連する少なくとも一の症状を改善しおよび／またはＣＭＶ感染の重症度／期間を低下し得る、免疫原の量を表す。該量は、ＣＭＶ感染の可能性または重症度を顕著に低下させるのに十分でなければならない。当該分野で既知の動物モデルが、免疫原の投与の防御効果を評価するために使用し得る。例えば、免疫原を投与した個体由来の免疫血清または免疫Ｔ細胞は、中和能については抗体または細胞障害性Ｔ細胞によって、またはサイトカイン産生能については免疫Ｔ細胞によって分析し得る。これらの評価に通常用いられる分析には、限定されるものではないが、ウイルス中和分析法、抗ウイルス抗原ＥＬＩＳＡ、インターフェロン・ガンマ  サイトカインＥＬＩＳＡ、インターフェロン・ガンマＥＬＩＳＰＯＴ、細胞内マルチ・サイトカイン染色（ＩＣＳ）および５１クロム放出細胞障害性分析法を含む。動物疾患モデルもまた免疫原の免疫学的に有効な量を測定するために使用し得る。
【００２０】
本明細書で用いる場合、用語「条件付き複製欠損型ウイルス」とは、一定の環境下で複製し得るが他の環境下では複製し得ないウイルス粒子を表す。好ましい実施形態において、ウイルスはウイルス複製に必須の一または複数のタンパク質の不安定化によって条件付き複製欠損型ウイルスが作成される。野生型の非不安定化必須タンパク質をコードする核酸は、条件付き複製欠損型ウイルスにはもはや存在しない。一または複数の必須タンパク質が不安定化される条件下でウイルス複製は、不安定化必須タンパク質を含まないウイルスと比較して好ましくは５０％、７５％、９０％、９５％、９９％を超えてまたは１００％減少する。しかしながら、不安定化必須タンパク質が安定化される条件下では、ウイルス複製は、不安定化必須タンパク質を含有しないＣＭＶの複製量の好ましくは少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％起こり得る。より好ましい実施形態において一または複数の必須タンパク質は、ＦＫＢＰまたはその誘導体等の不安定化タンパク質との融合によって不安定化される。該融合タンパク質は、Ｓｈｉｅｌｄ−１等の安定化剤の存在によって安定化され得る。本明細書で用いる場合、用語「ｒｄＣＭＶ」は条件付き複製欠損型サイトメガロウイルスを表す。
【００２１】
好ましい実施形態において複製欠損型ウイルスによって誘導される免疫応答は、その生ウイルスカウンターパートと比較して程度および／または範囲において同一または実質的に同一である。他の好ましい実施形態において電子顕微鏡解析による複製欠損型ウイルスの形態は、その生ウイルスカウンターパートと区別ができないかまたは実質的に同一である。
【００２２】
本明細書で用いる場合、用語「ＦＫＢＰ」は配列番号１１の不安定化タンパク質を表す。ＦＫＢＰを含有する融合タンパク質は、宿主細胞機構によって分解される。本明細書で用いる場合、用語「ＦＫＢＰ誘導体」は、一または複数のアミノ酸置換、欠失および／または付加によって改変されたＦＫＢＰタンパク質またはその部分を表す。ＦＫＢＰ誘導体は、タンパク質に融合したときにＦＫＢＰの不安定化特性の全てを実質的に保持し、しかもＳｈｉｅｌｄ−１によって安定化されるＦＫＢＰの能力の全ても実質的に保持する。好ましいＦＫＢＰ誘導体は、表示するアミノ酸位置における以下の置換、Ｆ１５Ｓ、Ｖ２４Ａ、Ｈ２５Ｒ、Ｆ３６Ｖ、Ｅ６０Ｇ、Ｍ６６Ｔ，Ｒ７１Ｇ、Ｄ１００Ｇ、Ｄ１００Ｎ、Ｅ１０２Ｇ、Ｋ１０５１およびＬ１０６Ｐの一または複数の置換を有する。Ｆ３６ＶおよびＬ１０６Ｐ置換を有するＦＫＢＰ誘導体（配列番号１２）が特に好ましい。好ましい実施形態においてＦＫＢＰまたはＦＫＢＰ誘導体をコードする核酸は、ヒトにおいて通常は内在性ＦＫＢＰに対して使用されない少なくともいくつかのコドンを含有する。このことは、融合タンパク質のＦＫＢＰまたはＦＫＢＰ誘導体がヒトゲノムにおいてそのカウンターパートと再配列するまたは組換える可能性を低下させる。配列番号１３の核酸配列は、該コドンを使用する配列番号１２をコードする。
【００２３】
本明細書で用いる場合、用語「Ｓｈｉｅｌｄ−１」または「Ｓｈｌｄ１」は、野生型ＦＫＢＰおよびその誘導体に結合しかつ安定化剤として作用する合成小分子を表す。結合は、野生型ＦＫＢＰに対するのと比較してＦ３６Ｖ誘導体に対する方が約１、０００倍強い（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，ＰＮＡＳ  ９５：１０４３７−４２）。Ｓｈｉｅｌｄ−１は、合成され得（基本的にＨｏｌｔ  ｅｔ  ａ．，１９９３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：９９２５−３８およびＹａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４３：１１３５−４２およびＧｒｉｍｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １８：７５９に記載された通りである）またはＣｈｅｍｉｎｐｈａｒｍａ  ＬＬＣ（Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ，ＣＴ）もしくはＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＩＮＣ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）から市販され利用可能である。Ｓｈｉｅｌｄ−１の塩もまた本発明の方法において使用され得る。Ｓｈｉｅｌｄ−１は下記の構造を有する。
【化１】
0005926804.tif 000002
【００２４】
本明細書で用いる場合、用語「融合」または「融合タンパク質」とは、同一の連続するアミノ酸配列の部分としてイン・フレームに配列された２個のポリペプチドを表す。融合はポリペプチドの間に付加アミノ酸残基が存在しないように直接的であり得るし、または性能を向上させるかもしくは機能性を付加するために小さなアミノ酸リンカーが存在するように間接的であり得る。好ましい実施形態において融合は直接的である。
【００２５】
本明細書で用いる場合、用語「五量体ｇＨ複合体」または「ｇＨ複合体」とは、ＣＭＶビリオンの表面上の５個のウイルスタンパク質の複合体を表す。複合体はＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１によってコードされるタンパク質から成り、ｇＨ／ｇＬスキャフォールド上でアセンブルされる（Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｈｅｎｋ，２００５  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０２：１８１５；Ｒｙｃｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，２００８  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：６０）。ＣＭＶ株ＡＤ１６９由来の複合体タンパク質の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿７８３７９７．１（ＵＬ１２８）、ＮＰ＿０４００６７（ＵＬ１３０）、ＣＡＡ３５２９４．１（ＵＬ１３１）、ＮＰ＿０４０００９（ｇＨ、別称ＵＬ７５）およびＮＰ＿７８３７９３（ｇＬ、別称ＵＬ１１５）に示されている。いくつかの弱毒化ＣＭＶ株は、タンパク質が発現されないようにＵＬ１３１において一または複数の変異を有し、それ故にｇＨ複合体は形成されない。このような場合ＵＬ１３１は、ｇＨ複合体が本発明のｒｄＣＭＶにおいて発現されるように、修復すべきである（Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｈｅｎｋ，２００５  Ｊ．Ｖｏｒｏｌ．７９：１０３３０等の方法を使用する）。本発明のウイルスは、五量体ｇＨ複合体を構成する５個のウイルスタンパク質を発現し、ウイルスのエンベロープ上で五量体ｇＨ複合体をアセンブルする。
【００２６】
本明細書で用いる場合、用語「必須タンパク質」とは、インビボおよび組織培養でのウイルス複製にとって必要とされるウイルスタンパク質を表す。ＣＭＶ中の必須タンパク質の例には、限定されるものではないが、ＩＥ１／２、ＵＬ３７ｘ１、ＵＬ４４、ＵＬ５１、ＵＬ５２、ＵＬ５３、ＵＬ５６、ＵＬ７７、ＵＬ７９、ＵＬ８４、ＵＬ８７およびＵＬ１０５が含まれる。
【００２７】
本明細書で用いる場合、用語「不安定化必須タンパク質」とは、ウイルス複製において発現されかつその機能を果たし、安定化剤の非存在下では分解される必須タンパク質を表す。好ましい実施形態において必須タンパク質は、ＦＫＢＰまたはその誘導体等の不安定化タンパク質に融合されている。正常な増殖条件下（即ち、安定化剤の非存在下）で融合タンパク質は発現されるが宿主細胞機構によって分解される。該分解は必須タンパク質がウイルス複製において機能することを可能としないので、従って必須タンパク質は機能的にノックアウトされる。Ｓｈｉｅｌｄ−１等の安定化剤が存在する条件下で融合タンパク質は安定化され、しかも不安定化必須タンパク質を含有しないＣＭＶの複製量の、好ましくは少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％であるウイルス複製を維持し得る濃度でその機能を果たし得る。
【００２８】
複製欠損型ＣＭＶ
本発明の方法は、五量体ｇＨ複合体を発現する複製欠損型ＣＭＶ（ｒｄＣＭＶ）を使用する。五量体ｇＨ複合体を発現するいかなる弱毒化ＣＭＶウイルスも、本発明の方法によって複製欠損型にされ得る。一実施形態において弱毒化ＣＭＶは、ＵＬ１３１遺伝子における突然変異の修復に起因してｇＨ複合体の発現を復元したＡＤ１６９株である（実施例１を参照されたい）。
【００２９】
条件付き複製欠損型ウイルスは、一または複数の必須ウイルスタンパク質が必須タンパク質の不安定化カウンターパートによって置換された変異体である。不安定化カウンターパートは、必須タンパク質と不安定化タンパク質との間の融合タンパク質をコードする核酸によってコードされる。不安定化必須タンパク質は、安定化剤が存在するときだけ機能してウイルス複製を支持する。好ましい実施形態において、米国公開特許２００９／０２１５１６９に記載の方法が五量体ｇＨ複合体を発現するＣＭＶに条件付き複製欠損型の表現型を与えるために使用される。即ち、ＣＭＶ複製に必須の一または複数のタンパク質が、不安定化タンパク質であるＦＫＢＰまたはＦＫＢＰ誘導体に融合される。野生型の必須タンパク質をコードする核酸は、もはやｒｄＣＭＶ中に存在しない。外部から添加された細胞透過性の小分子安定化剤であるＳｈｉｅｌｄ−１（Ｓｈｌｄ−１）の存在下で融合タンパク質は安定化されて、必須タンパク質がウイルス複製を支持するように機能する。安定化剤の存在下におけるｒｄＣＭＶの複製は、不安定化融合タンパク質を含有しないＣＭＶ（例えば、ｒｄＣＭＶを構築するために使用された親弱毒化ＣＭＶ）の複製量の好ましくは少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％である。Ｓｈｉｅｌ−１の非存在下において、融合タンパク質の不安定化タンパク質は、融合タンパク質に宿主細胞機構によって実質的に分解されるように指図する。必須タンパク質がないか最小量しか存在しない場合、ＣＭＶは、患者においてＣＭＶ感染を引き起こすかまたは維持するための量で複製できない。安定化剤の非存在下においては、ｒｄＣＭＶの複製は、起こらないか、または不安定化融合タンパク質を含有しないＣＭＶ（例えば、ｒｄＣＭＶを構築するために使用された親弱毒化ＣＭＶ）と比較して、好ましくは５０％、７５％、９０％、９５％または９９％以上に減少される。
【００３０】
当該分野において周知の組換えＤＮＡ方法を使用して、ＣＭＶ複製および／またはＣＭＶ感染の確立／維持にとって必須なタンパク質をコードする核酸は、ＦＫＢＰまたはその誘導体をコードする核酸に付着される。コード化融合タンパク質は、イン・フレームで必須タンパク質に融合したＦＫＢＰまたはＦＫＢＰ誘導体を含む。コード化融合タンパク質は、Ｓｈｉｅｌｄ−１の存在下で安定である。しかしながらコード化融合タンパク質は、Ｓｈｉｅｌｄ−１の非存在下において不安定化されかつ破壊の標的となる。好ましい実施形態においてＦＫＢＰは配列番号１１である。他の好ましい実施形態においてＦＫＢＰ誘導体は、Ｆ１５Ｓ、Ｖ２４Ａ、Ｈ２５Ｒ、Ｆ３６Ｖ、Ｅ６０Ｇ、Ｍ６６Ｔ、Ｒ７１Ｇ、Ｄ１００Ｇ、Ｄ１００Ｎ、Ｅ１０２Ｇ、Ｋ１０５ＩおよびＬ１０６Ｐから成る群より選択される一または複数のアミノ酸置換を含むＦＫＢＰである。より好ましい実施形態においてＦＫＢＰ誘導体は、Ｆ３６Ｖおよび／またはＬ１０６Ｐ置換を含む（配列番号１２）。より好ましい実施形態においてＦＫＢＰ誘導体は配列番号１３によってコードされる。
【００３１】
ＦＫＢＰまたはその誘導体との融合による不安定化の標的となる必須タンパク質は、１）ウイルス複製に必須であり；２）必須タンパク質の機能を実質的に破壊することなく不安定化タンパク質の融合に適応し得るものであり；および３）他の包囲するウイルス遺伝子のＯＲＦを実質的に破壊することなく、必須タンパク質をコードするウイルスＯＲＦの５‘または３’末端での、ＦＫＢＰまたはその誘導体をコードする核酸の挿入に適応し得る。好ましい実施形態においてＦＫＢＰまたはその誘導体との融合による不安定化の標的とされる必須タンパク質は、非構造タンパク質をコードし、それ自体組換えＣＭＶビリオンにパッケージングされる可能性は低い。表１は前述の基準を満たすＣＭＶ遺伝子を示す。
【表１】
0005926804.tif 000003
【００３２】
本発明は、不安定化タンパク質に融合した必須タンパク質またはその誘導体を有する融合タンパク質を含むｒｄＣＭＶを包含する。野生型必須タンパク質と比較して一または複数のアミノ酸置換、付加および／または欠失を含有する必須タンパク質誘導体は、Ｓｈｉｅｌｄ−１の存在下で少なくともウイルス複製を援助するのに十分な必須タンパク質の活性を未だ提供し得る。ウイルス活性を測定する例は、下記の実施例において提供される。当該分野で既知の方法が、対象のＣＭＶ必須タンパク質と誘導体との間の差異の程度を測定するために使用し得る。一実施形態において配列相同性が、近縁性を決定するために使用される。本発明の誘導体は、塩基配列について好ましくは少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一である。同一性パーセンテージは、同一の残基数を残基総数で除して１００を掛けた数字として定義される。整列した配列が異なる長さであるならば（間隙または伸長のために）、最長の配列の長さが計算において使用され、全長の値を代表する。
【００３３】
いくつかの実施形態において、不安定化の標的となるウイルス複製に必須の一または複数のウイルタンパク質は、ＩＥ１／２、ＵＬ５１、ＵＬ５２、ＵＬ８４、ＵＬ７９、ＵＬ８７、ＵＬ３７ｘ１、ＵＬ７７およびＵＬ５３またはその誘導体から成る群より選択される。具体的な実施形態において、不安定化の標的となるウイルス複製に必須な一または複数のウイルスタンパク質は、ＩＥ１／２、ＵＬ５１、ＵＬ５２、ＵＬ８４、ＵＬ７９、ＵＬ８７から成る群より選択される。より具体的な実施形態において、不安定化の標的となるウイルス複製に必須な一または複数のウイルスタンパク質は、ＩＥ１／２、ＵＬ５１、ＵＬ５２、ＵＬ７９およびＵＬ８４から成る群より選択される。
【００３４】
複数の必須タンパク質が、ＦＫＢＰまたはその誘導体への融合によって不安定化され得る。いくつかの実施形態において必須タンパク質は、ＣＭＶ複製および／または感染の異なる期（限定されるものではないが、最初期、初期または後期が含まれる）において機能する。好ましい実施形態において、不安定化の標的となるウイルス複製に必須のウイルスタンパク質の組み合せは、ＩＥ１／２とＵＬ５１、ＩＥ１／２とＵＬ５２、ＩＥ１／２とＵＬ７９、ＩＥ１／２とＵＬ８４、ＵＬ８４とＵＬ５１およびＵＬ８４とＵＬ５２から成るより選択される。より好ましい実施形態において、ＩＥ１／２とＵＬ５１が同一の組換えＣＭＶにおける不安定化の標的となる。一の最も好ましい実施形態において、ＩＥ１／２を含む融合タンパク質は配列番号１であり、ＵＬ５１を含む融合タンパク質は配列番号３である。配列番号１および３は配列番号２および４によってそれぞれコードされ得る。不安定化ＩＥ１／２およびＵＬ５１を有するｒｄＣＭＶのゲノムは、配列番号１４に示される。
【００３５】
ＦＫＢＰまたはその誘導体は、直接的か間接的に必須タンパク質に融合され得る。好ましい実施形態においてＦＫＢＰまたはその誘導体は、直接的に必須タンパク質に融合される。
【００３６】
ＦＫＢＰまたはその誘導体は、必須タンパク質のＮ末端かＣ末端で必須タンパク質に融合され得る。好ましい実施形態においてＦＫＢＰは、必須タンパク質のＮ末端に融合される。
【００３７】
複数のＦＫＢＰまたはその誘導体は、必須タンパク質に融合され得る。必須タンパク質に融合された複数のＦＫＢＰまたはその誘導体が存在する実施形態において、個々のＦＫＢＰまたはその誘導体の各々は同一であるかまたは異なり得る。好ましい実施形態において、必須タンパク質に融合された一のＦＫＢＰまたはその誘導体が存在する。
【００３８】
追加の不活化法
いくつかの実施形態において上記のｒｄＣＭＶは、化学的または物理的不活化法を使用してさらに不活化される。当該例には、熱処理、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）もしくはバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）とのインキュベーションまたはガンマ線照射が含まれる。好ましい方法は、限定されるものではないが、五量体ｇＨ複合体によって誘導される免疫原性を含む免疫原性を崩壊しないかまたは実質的に崩壊しない。さらに不活化されたＣＭＶによって引き起こされた免疫応答は、追加の不活化処理されてないｒｄＣＭＶと比較して、保存または実質的に保存される。好ましい実施形態において、さらに不活化されたＣＭＶの中和抗体を誘導する能力は、追加で不活化処理されていないｒｄＣＭＶによって誘導される能力と同等である。化学的または物理的方法のいずれか一または併用による不活化レジメは、五量体ｇＨ複合体を含めたＣＭＶの免疫原性を保証するように経験的に決定される。
【００３９】
ウイルス複製の評価
当業者は、ＦＫＢＰまたはその誘導体に融合した特定の必須タンパク質の有用性を測定するためにウイルス複製分析法を使用し得る。遺伝子発現／コード化産物の機能は、Ｓｈｉｅｌｄ−１の存在下でのＦＫＢＰまたはその誘導体の必須タンパク質への付着によって実質的には影響されてはならないので、ｒｄＣＭＶはＳｈｉｅｌｄ−１存在下で親ＣＭＶと同等の割合で複製すべきである（親ウイルスのレベルの好ましくは少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％）。ｒｄＣＭＶの複製は、Ｓｈｉｅｌｄ−１の非存在下においては、親ＣＭＶから実質的に変更される（不安定化融合タンパク質を含有しないＣＭＶと比較して好ましくは５０％、７５％、９０％、９５％、９９％以上または１００％減少される）。
【００４０】
好ましい実施形態において、少なくとも２μＭ  Ｓｈｉｅｌｄ−１の存在下におけるｒｄＣＭＶは、非−ｒｄＣＭＶが複製する量の好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％を複製する。
【００４１】
一の実施形態において本発明のｒｄＣＭＶを含む組成物は、少なくとも２μＭ  Ｓｈｉｅｌｄ−１の存在下において、少なくとも１０５ｐｆｕ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも１０７ｐｆｕ／ｍｌのウイルス力価を有する。
【００４２】
反対にｒｄＣＭＶは、Ｓｈｉｅｌｄ−１の非存在下において実質的に複製してはならない。複製欠損機構の質は、ウイルス複製にとって非許容的な条件下で対照がどれほどストリンジェントであるか、即ちこれらの条件下での子孫ウイルスの感染力価によって判断される。本発明のｒｄＣＭＶは、Ｓｈｉｅｌｄ−１の存在なしでは実質的に複製し得ない（細胞培養か患者内のどちらでも）。ＡＲＰＥ−１９細胞および他の型のヒト初代細胞におけるその複製は条件付きであり、培養培地中で０．１μＭ以上、好ましくは少なくとも２μのモル濃度のＳｈｉｅｌｄ−１がウイルス複製を維持するために要求される。
【００４３】
一実施形態において本発明のｒｄＣＭＶを含む組成物は、Ｓｈｉｅｌｄ−１の非存在下において２ｐｆｕ／ｍｌ未満、より好ましくは１ｐｆｕ／ｍｌ未満のウイルス力価を有する。
【００４４】
ＣＭＶの複製を評価する方法が、Ｓｈｉｅｌｄ−１の非存在下または存在下のいずれにおいてもｒｄＣＭＶの複製を評価するために使用され得る。しかしながら好ましい実施形態においては、ＴＣＩＤ５０が使用される。
【００４５】
他の実施形態においてｒｄＣＭＶの力価は、５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）分析法によって定量される。即ち本希釈分析法は、感染宿主の５０％を死滅させるために要求されるウイルス量を定量する。宿主細胞（例えば、ＡＲＰＥ−１９細胞）が播種され、ウイルスの段階希釈液が添加される。インキュベーション後、各々のウイルス希釈液に対する細胞死（即ち感染細胞）のパーセンテージが観察され記録される。結果はＴＣＩＤ５０を数学的に算出するために使用される。
【００４６】
他の実施形態においてｒｄＣＭＶ力価は、プラーク分析法を使用して測定される。ウイルスプラーク分析法は、ウイルス試料中のプラーク形成単位数（ｐｆｕ）を測定する。即ち、宿主細胞（例えば、ＡＲＰＥ−１９細胞）のコンフルエントな単層が、種々の希釈液でｒｄＣＭＶにより感染され、ウイルス感染が無差別に拡散するのを防止するために寒天またはカルボキシメチルセルロース等の半固形培地により被覆される。ウイルスが固定細胞の単層内で細胞に感染するとウイルスプラークが形成される。ウイルスに感染した細胞は溶解し、隣接細胞に感染を拡大しそこで溶解感染サイクルが繰り返される。感染細胞領域は、肉眼でまたは光学顕微鏡で観察され得るプラーク（未感染細胞に囲まれた感染領域）を作成する。プラークが計数され、結果はプレートを調製するために使用された希釈係数と共に、試料単位容量当たりのプラーク形成単位数（ｐｆｕ／ｍＬ）を算出するために使用される。ｐｆｕ／ｍＬの結果は試料中の感染性粒子の数を表し、形成された各プラークは１個の感染性ウイルス粒子を代表しているという仮定に基づいている。
【００４７】
他の実施形態においてｈｕ−ＳＣＩＤマウスモデルが、ｒｄＣＭＶのインビボで複製する能力を評価するために使用される。即ち、ヒト胎児組織（胸腺や肝臓等）の小片がＳＣＩＤマウスの腎被膜に外科的に移植される。ｒｄＣＭＶは、ヒト組織が血管新生化される２〜３か月後に接種される。ウイルス力価は、接種後３〜４週間目にプラーク分析法で評価される。動物実験は、Ｓｈｉｅｌｄ−１の非存在下または存在下で実施され得る。
【００４８】
免疫応答の評価
患者に対する本発明のｒｄＣＭＶの投与は、ＣＭＶに対する免疫応答、好ましくは防御免疫応答を誘発し、それは患者におけるＣＭＶ感染の可能性または当該感染に関連する症状を治療しおよび／または低下し得る。免疫応答は、少なくとも一部は五量体ｇＨ複合体に対するものである。
【００４９】
ｒｄＣＭＶによって誘発される免疫応答は、当該分野で既知の方法を使用して評価され得る。
【００５０】
当該分野で既知の動物モデルは、ｒｄＣＭＶ投与の防御効果を評価するために使用され得る。一実施形態においてｒｄＣＭＶを投与された個体由来の免疫血清は、限定されるものではないが、ウイルス付着または宿主細胞への侵入の遮断を含めた中和能力に対して分析され得る。他の実施形態においてｒｄＣＭＶを投与された個体由来のＴ細胞は、限定されるものではないが、対象抗原の存在下でのインターフェロンガンマを含むサイトカイン産生能力に対して分析され得る。感染動物モデルもまた、免疫原の免疫学的に有効な量を測定するために使用し得る。
【００５１】
ウイルス中和とは、培養におけるウイルス侵入および／または複製を阻止することのできるウイルス特異的抗体を表す。中和活性のための通常の分析法は、ウイルスプラーク減少分析法である。本発明の中和分析とは、ウイルスの細胞侵入を阻止し得る血清の力価測定を表す。ＮＴ５０力価は、ウイルス中和分析法における投与ウイルスの５０％を阻止するような血清希釈倍数の逆数と定義される。ＮＴ５０は、ロジスティック（Ｓ字状）な４パラメータ非線形曲線近似から得られる。
【００５２】
複製欠損型ＣＭＶの作製
本発明はｒｄＣＭＶを作製する方法を包含する。本発明のｒｄＣＭＶは、Ｓｈｉｅｌｄ−１等の安定化剤の存在下に、上皮細胞好ましくはヒト上皮細胞、より好ましくはヒト網膜色素上皮細胞上で増殖される。さらなる実施形態においてヒト網膜色素上皮細胞は、寄託番号ＣＲＬ−２３０２としてアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に寄託されたＡＲＰＥ−１９細胞である。いくつかの実施形態においてＳｈｉｅｌｄ−１は、組織培養培地中において少なくとも０．５μＭの濃度で存在する。好ましい実施形態においてＳｈｉｅｌｄ−１は、組織培養培地において少なくとも２．０μＭの濃度で存在する。
【００５３】
いくつかの実施形態においてｒｄＣＭＶを増殖するために使用される細胞は、マイクロキャリア（微粒子担体）上で増殖される。マイクロキャリアは、スピナーフラスコまたはバイオリアクター（回転壁微小重力バイオリアクターおよび流動床バイオリアクター等）における接着細胞の増殖を可能とする支持マトリックスである。マイクロキャリアは、典型的には穏やかな撹拌により懸濁液状で保持し得ることが可能な比重を有する１２５〜２５０μＭの球である。マイクロキャリアは、限定されるものではないが、ＤＥＡＥ−デキストラン、ガラス、ポリスチレンプラスチック、アクリルアミドおよびコラーゲンを含むいくつかの異なる物質から作製され得る。マイクロキャリアは、限定されるものではないが、細胞外基質タンパク質、組換えタンパク質、ペプチドおよび荷電分子を含む種々の界面化学的性質を有し得る。他の高密度細胞培養系、例えばコーニング社のＨｙｐｅｒＦｌａｓｋ（登録商標）およびＨｙｐｅｒＳｔａｃｋ（登録商標）系等もまた使用され得る。
【００５４】
セルフリーの組織培養液を収集し得、ｒｄＣＭＶをそれから精製し得る。ＣＭＶウイルス粒子は直径約２００ｎｍであり、限定されるものではないが密度勾配または２０％ソルビトールのクッションによる超遠心分離法を含む当該分野で既知の技術を使用して、収集された培養液中に存在する他のタンパク質から分離し得る。ワクチンのタンパク質量は、ブラッドフォード分析法によって定量し得る。
【００５５】
Ｓｈｉｅｌｄ−１は、ＦＫＢＰと共にｒｄＣＭＶの複製を制御するために使用し得る。組織培養細胞中のウイルス増殖の所望の量が得られた後は、複製能はもはや望ましくない。Ｓｈｉｅｌｄ−１は、ウイルス複製欠損性とするために（例えば、患者に投与するために）ｒｄＣＭＶから取り除かれる。一実施形態においてｒｄＣＭＶは、一または複数回洗浄することによってＳｈｉｅｌｄ−１から精製される。他の実施形態においてｒｄＣＭＶは、超遠心分離法によりＳｈｉｅｌｄ−１から精製される。他の実施形態においてｒｄＣＭＶは、透析濾過によりＳｈｉｅｌｄ−１から精製される。透析濾過は、ウイルス粒子を精製するために通常使用される。一実施形態においてフィルターは、Ｓｈｉｅｌｄ−１だけが孔を通過することを可能とするものであって、約７５０キロダルトンの孔径を備えたものが使用される。
【００５６】
Ｓｈｉｅｌｄ−１からｒｄＣＭＶを精製後に、ｒｄＣＭＶ組成物中に少量の残存Ｓｈｉｅｌｄ−１が残っていてもよい。一実施形態において精製後のＣＭＶ組成物中のＳｈｌｄ−１の濃度は、組織培養における複製を維持するために必要とされる濃度の少なくとも１００倍低い。他の実施形態において、精製後のｒｄＣＭＶ組成物中のＳｈｉｅｌｄ−１の濃度は、０．１μＭ以下である。他の実施形態において、精製後のｒｄＣＭＶ組成物中のＳｈｉｅｌｄ−１濃度は検出限界以下である。
【００５７】
組成物中のＳｈｉｅｌｄ−１濃度の定量は、ＬＣ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析）またはＨＰＬＣ／ＭＳ（高速液体クロマトグラフィー−質量分析）分析法を使用して検出し得る。これらの技術は、ＬＣまたはＨＰＬＣの物理的分離能を質量分析法の質量分析能と組み合わせており、複合混合物中の対象の化学物質を検出し得る。
【００５８】
アジュバント
アジュバントとは、免疫応答を生成する上で免疫原を補助し得る物質である。アジュバントは、例えば、以下の機構、抗原の生物学的または免疫学的半減期を高める；抗原提示細胞への抗原送達を改良する；抗原提示細胞による抗原プロセシングおよび提示を改良する；用量節約を達成する；および免疫調節性サイトカイン産生を誘導する、ような一または複数の異なる機構によって機能し得る（Ｖｏｇｅｌ，２０００，Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ３０：Ｓ２６６）。いくつかの実施形態において本発明の組成物は、ｒｄＣＭＶおよびアジュバントを含む。
【００５９】
種々の異なる型のアジュバントが、免疫応答の生成を補助するために採用され得る。特定のアジュバントの例には、水酸化アルミニウム；リン酸アルミニウム、アルミニウムヒドロキシホスファート、不定形アルミニウムヒドロキシフォスファートサルファートアジュバント（ＡＡＨＳＡ）または他のアルミニウム塩；リン酸カルシウム；ＤＮＡ  ＣｐＧモチーフ；モノホスホリルリピドＡ；コレラ毒素；Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素；百日咳毒素；ムラミルジペプチド；不完全フロイントアジュバント；ＭＦ５９；ＳＡＦ；免疫刺激複合体；リポソーム；生分解性マイクロスフェア；サポニン；非イオン性ブロック共重合体；ムラミルペプチドアナログ；ポリホスファゼン；合成ポリヌクレオチド；ＩＦＮ−γ；ＩＬ−２；ＩＬ−１２；およびＩＳＣＯＭが含まれる。（Ｖｏｇｅｌ，２０００，Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ３０：Ｓ２６６；Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ８９：３１１；Ｒｉｍｍｅｌｚｗａａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：１１８０；Ｋｅｒｓｔｅｎ，２００３，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１：９１５；Ｏ‘Ｈａｇｅｎ，２００１，Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｏｒｄ．１：２７３）
いくつかの実施形態において、限定されるものではないが不完全フロイントアジュバントおよびＭＦ５９を含む油性アジュバントは、本発明の組成物において使用されない。
【００６０】
他の実施形態において、限定されるものではないがＩＳＣＯＭＴＲＩＸ（登録商標）アジュバントおよび／またはリン酸アルミニウムアジュバントを含む粒子状アジュバントは、本発明の組成物において使用される。
【００６１】
医薬組成物
本発明のさらなる特徴は、ＣＭＶ感染患者を治療するためのおよび／またはＣＭＶ感染の可能性を減少するための組成物、好ましくは免疫原性組成物またはワクチンにおける本明細書記載の組換えＣＭＶの使用である。適宜、組成物は薬学的に許容可能な担体を含む。
【００６２】
「薬学的に許容可能な担体」とは、全身投与において安全に使用し得る液体賦形剤、希釈剤または封入物質を意味することが意図されている。特定の投与経路に依存して、当該分野で周知の種々の薬学的に許容可能な担体が使用され得る。これらの担体は、糖類、デンプン、セルロースおよびその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝生理食塩水を含むリン酸緩衝液、乳化剤、等張性生理食塩水および発熱性物質除去蒸留水を含む群より選択され得る。具体的には、薬学的に許容可能な担体には、緩衝液、注射用滅菌水、通常生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水、ショ糖、ヒスチジン、塩類およびポリソルベート等の異なる成分が含まれ得る。「生理学的に許容可能な」、「希釈剤」または「賦形剤」等の用語は、同じ意味で使用し得る。
【００６３】
ワクチンの製剤化法は、例えばＮｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ（１９９７，Ｌｅｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｂａｓｅｌ，Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ）において開示されており、本明細書において参照することにより援用される。
【００６４】
製剤
いくつかの実施形態において本発明のｒｄＣＭＶは、免疫応答を引き起こすために患者に投与される。免疫原性組成物の保存の間、ｒｄＣＭＶ組成物の効力の損失を最小化または回避することが望ましい。当該目的を支持する条件には、限定されるものではないが、（１）持続的な保存安定性、（２）凍結−融解サイクルストレスに対する耐性、（３）雰囲気温度で１週間までの安定性、（４）免疫原性の維持、（５）アジュバント戦略との相性、が含まれる。ｒｄＣＭＶの安定性に影響する条件には、限定されるものではないが、緩衝液のｐＨ、緩衝液のイオン強度、特定の賦形剤の有無および温度が含まれる。組成物は、ワクチン組成物として適する精製ｒｄＣＭＶウイルス粒子の安定性を高めるために緩衝液を含む。
【００６５】
ウイルス粒子の完全性の保存性は、マウスにおける免疫原性分析法および／またはウイルス侵入分析法によって評価され得る。ウイルスの侵入事象は、五量体ｇＨ複合体を含むウイルスの糖タンパク質の完全性および機能に依存する。五量体ｇＨ複合体はまたｒｄＣＭＶの実質的な免疫原性も提供し、従って二つの特性は関連している。
【００６６】
いくつかの実施形態においてｒｄＣＭＶは、５から７の間のｐＨで１５〜３５ｍＭ  ヒスチジンおよび１００〜２００ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液中に保存される。より特定の実施形態において緩衝液は、ｐＨ６で２５ｍＭ  ヒスチジンおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む。
【００６７】
他の実施形態において、例えばポリオール（限定されるものではないが、マンニトールおよびソルビトールを含む）；単糖類（限定されるものではないが、グルコース、マンノース、ガラクトースおよびフルクトースを含む）：二糖類（限定されるものではないが、ラクトース、マルトース、ショ糖、ラクツロースおよびトレハロースを含む）および三糖類（限定されるものではないが、ラフィノースおよびメレジトースを含む）等の糖類がさらなる安定性を与えるために添加され得る。より特定の実施形態において糖はショ糖である。より一層の特定の実施形態において、ショ糖は５〜１５％の間である。
【００６８】
好ましい実施形態においてｒｄＣＭＶは、ｐＨ６で２５ｍＭ  ヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、９％ショ糖を含む緩衝液中で保存される。
【００６９】
投与
本明細書記載のｒｄＣＭＶは、当該分野で周知の技術と共に本明細書に示したガイダンスを使用して製剤化され患者に投与され得る。医薬投与一般に関するガイドラインは、例えば、Ｖａｃｃｉｎｅｓ（「ワクチン」）  Ｅｄｓ．（編者）Ｐｌｏｔｋｉｎ  ａｎｄ  Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９９；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（「レミントン薬学  第２０版」），Ｅｄ．（編者）Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０００；およびＭｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（「現代薬学  第２版」），Ｅｄｓ．Ｂａｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｒｈｏｄｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９９０に与えられている。
【００７０】
ワクチンは、皮下、筋肉内、静脈内、粘膜、非経口、経皮または皮内のような異なる経路によって投与され得る。皮下および筋肉内投与は、例えば針式注射器またはジェット式注射器を使用して実施され得る。一実施形態において本発明のワクチンは筋肉内で投与される。経皮送達または皮内送達は、皮下注射針注射、またはマイクロニードルまたはマイクロアレイパッチ等のイネーブル装置により達成され得る。
【００７１】
本明細書記載の組成物は、投与製剤と整合する方法により、そしてＣＭＶ感染（一次、回帰および／重複を含む）の可能性を治療しおよび／または低下するために免疫学的に有効であるような量で投与され得る。本発明において患者へ投与される用量は、ＣＭＶ感染レベルの低下、ＣＭＶ感染に関連する疾病の症状の改善および／またはＣＭＶ感染の期間および／または重症度の軽減化等の有益な応答をもたらすために、またはＣＭＶ感染（一次、回帰および／または重複を含む）の可能性を低下するために、患者において長期間にわたり有益な応答を奏するよう十分でなければならない。
【００７２】
適切な投与レジメは当業者によって容易に決定され得るが、好ましくは、患者の年齢、体重、性別および病状；投与経路；所望の効果；および用いられる特定の組成物を含む、当該分野において周知の要因を考慮して決定される。ＣＭＶに対する治療または予防において投与されるべきｒｄＣＭＶの有効な量を決定する際に医師は、循環血漿ウイルス濃度、疾患進行および／または抗ＣＭＶ抗体産生を評価してもさしつかえない。ワクチン組成物の用量は、１０３ないし１０１２プラーク形成単位（ｐｆｕ）の範囲から構成される。別の実施形態において用量範囲は、１０４ないし１０１０ｐｆｕ、１０５ないし１０９ｐｆｕ、１０６ないし１０８ｐｆｕまたはこれらの決められた範囲の任意の用量である。複数のワクチンが投与されるときは（即ち、混合ワクチンの際）、各々のワクチン剤の量はそれらについて記述された範囲内である。
【００７３】
ワクチン組成物は、単回投与または複数投与方式で投与され得る。ワクチンは、安定化緩衝液および適したアジュバント組成物の同定を受けて、投与に先立つ数時間または数日前にアジュバントと調製され得る。ワクチンは、０．１ｍＬないし０．５ｍＬの範囲の通常実施される量で投与され得る。
【００７４】
投与のタイミングは当該分野において周知の要因に依存する。初回投与後に、一または複数の用量が抗体力価およびＴ細胞免疫を維持および／または追加免疫するために投与されてよい。さらなる追加免疫が、ＥＬＩＳＰＯＴ等の抗体力価およびＴ細胞免疫に反映される免疫応答の防御レベルを維持するために要求されてもよい。当該免疫応答レベルは臨床試験の対象である。
【００７５】
混合ワクチン接種については、免疫原の各々は一の組成物中で一緒にまたは異なる組成物中で別々に投与され得る。本明細書記載のｒｄＣＭＶは、一または複数の望ましい免疫原と共に同時に投与される。用語「同時に」とは、正確に同時の治療薬の投与に限定されるものではなく、むしろ本明細書記載のｒｄＣＭＶおよび他の望ましい免疫原が順番に、かつ、もしそれらが別な方法で投与されたときと比べて、それらが一緒になって増大した有用性を提供できるよう作用し得るような時間の間隔内に患者に投与されることを意味する。例えば、各々の治療薬は同時にまたは異なる時点で任意の順番で順次投与されてもよいが、しかしながら同時に投与されない場合には、それらは所期の治療効果を提供するように時間的に十分接近して投与されるべきである。各々の治療薬は、任意の適切な剤形および任意の適した経路によって別々に投与され得る。
【００７６】
患者集団
「患者」とは、ＣＭＶに感染され得る哺乳動物を表す。好ましい実施形態において患者はヒトである。患者は予防的または治療的に処置され得る。予防的処置は、一次感染、回帰感染（即ち、潜在性ＣＭＶの再活性化に起因する感染）および重複感染（即ち、患者が前に感染したのとは異なるＣＭＶ株による感染に起因する感染）を含むＣＭＶ感染の可能性または重症度を低下させるために十分な防御免疫を提供する。治療処置はＣＭＶ感染の重症度を低下させるため、または回帰または重複感染の可能性／重症度を低下させるために実施され得る。
【００７７】
治療は、明細書記載のｒｄＣＭＶを含む医薬組成物を使用して実施され得る。医薬組成物は、一般集団に、特にＣＭＶ感染（一次、回帰か重複のいずれでも）のリスクが高い人々に対しまたはＣＭＶ感染が特に問題となるであろう人々（例えば、免疫不全個体、移植患者または妊婦等）のために投与され得る。一実施形態において、妊娠可能年齢の女性、特に思春期前期の女性は、妊娠中のＣＭＶ感染（一次、回帰か重複のいずれでも）の可能性を低下させるためにワクチン接種される。
【００７８】
治療を必要とする人々には、すでに感染した人々、ならびに感染し易い人々または感染の可能性の低下が望まれる人々が含まれる。治療は、潜在性ＣＭＶの再活性化による感染を含む、ＣＭＶ感染に関連した疾患の症状を改善しおよび／またはＣＭＶ感染の期間および／または重症度を軽減し得る。
【００７９】
ＣＭＶ感染（一次、回帰か重複のいずれでも）のリスクが高い人々には、免疫の減衰した患者または免疫の減衰をもたらす治療を受けている患者（例えば、癌の化学療法または放射線療法をうけているまたは免疫抑制剤を摂取している患者）が含まれる。本明細書で用いる場合「減衰した免疫」とは、適切に機能しないまたは正常で健康な成人のレベルで機能しない免疫応答のために、感染と闘う能力が低下した免疫系を表す。免疫の減衰した患者の例は、幼児、低年齢小児、高齢者、妊婦またはＨＩＶ感染またはＡＩＤＳ等の免疫系の機能に悪影響を与える疾病に罹患した患者である。
【００８０】
実施例
本発明の種々の特徴をさらに説明するために、以下に実施例を示す。実施例はまた、本発明を実施するための有用な方法も説明する。これらの実施例は請求項にかかる発明を限定しない。
【００８１】
実施例１
五量体ｇＨ複合体の復元
感染性ＣＭＶの細菌人工染色体クローンは、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１からなる五量体ｇＨ複合体を発現したコード化ビリオンが、ｇＨ／ｇＬスキャフォールド上でアセンブルするように構築した。
【００８２】
ＣＭＶ株であるＡＤ１６９株は、もともとは７歳の少女の咽頭扁桃腺から単離された（Ｅｌｅｋ  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｎ，１９７４，Ｌａｎｃｅｔ，１：１）。ウイルスは、ウイルスを弱毒化するために数種類のヒト線維芽細胞中で５８回継代し（Ｎｅｆｆ  ｅｔ  ａｌ，１９７９，Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ，１６０：３２）、最後５回の継代はＷＩ−３８ヒト線維芽細胞で行った。ＡＤ１６９ウイルスの継代変異株は、本研究においてＭｅｒｃｋ  ＡＤ１６９（ＭＡＤ１６９）と表すが、感染性ＢＡＣクローンを構築するための親ウイルスとして使用した。親ウイルスＡＤ１６９も継代変異株ウイルスＭＡＤ１６９のどちらも、ＵＬ１３１または五量体ｇＨ複合体を発現しなかった。
【００８３】
ＭＡＤ１６９は、感染性細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンを構築するために親ウイルスとして使用した。ＢＡＣベクターは、ＣＭＶゲノム（〜２３０Ｋｂ）等の大型ＤＮＡフラグメントのＥ．ｃｏｌｉ中での遺伝子操作を可能とする分子ツールである。ＧＦＰマーカー遺伝子を伴うＢＡＣエレメントは、フラグメントの両端に作製したＬｏｘＰ部位を有するＵＳ２８オープンリーディングフレームの終始コドンの直後（ウイルスゲノムのＵＳ２８ＯＲＦとＵＳ２９ＯＲＦの間）に挿入した（図１Ａ）。即ち、２個のｌｏｘＰ部位により隣接されるＧＦＰ発現カセットおよびＣＭＶ  ＵＳ２８−ＵＳ２９配列を含有するＤＮＡフラグメントを合成して、ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１ベクターにクローニングした。ＢＡＣベクターは、制限酵素Ｐｍｅ  Ｉにより直線化し、精製ビリオンから抽出したＭＡＤ１６９のＤＮＡと共にＭＲＣ−５細胞中にコトランスフェクトした。組換え変異株は、緑色蛍光の発現により同定し、プラーク法で精製した。１回の増幅後に、環状形態のウイルスゲノムを感染細胞から抽出し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０細胞中に電気穿孔した。細菌コロニーは、ＵＳ２８およびＵＳ２９領域の存在を調べるためにＰＣＲによってスクリーニングした。候補クローンは、ＥｃｏＲ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｖ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ、Ｓｐｅ  ＩおよびＢａｍ  ＨＩの制限酵素分析によってさらに検討した。スクリーニング後、一のクローン、ｂＭＡＤ−ＧＦＰが親ＭＡＤ１６９ウイルスと同一の切断パターンを示した。
【００８４】
ＭＡＤ１６９における上皮指向性欠損の根底にあるＵＬ１３１の最初のエクソン中のフレームシフト変異を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて遺伝子的に修復した（図１Ｂ）。具体的には、ＵＬ１３１遺伝子中の７個のアデニンヌクレオチド（ｎｔ）のＡストレッチから１個のｎｔを欠失させた（図１Ｂ）。１個のｎｔの欠失が、ＵＬ１３１による上皮および皮内細胞指向性を奪回するために十分だったために、今や五量体ｇＨ複合体が発現されている。発現は、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットによって確認した（データ未記載）。このクローンはＬｏｘＰ／Ｃｒｅ組換えによりＢＡＣ染色体部分を除去することによってさらに修飾した。ＢＡＣ  ＤＮＡを、感染性のウイルスを取り戻すためにヒト網膜色素上皮細胞であるＡＲＰＥ−１９細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−２３０２）にトランスフェクトした（図１Ｃ）。得られた感染性のウイルスは、ＢＡＣ由来上皮指向性ＭＡＤ１６９ウイルス（ｂｅＭＡＤ）と命名されたが、（１）単一のアデニンヌクレオチドが欠失されたＵＬ１３１のＯＲＦ、および（２）ＵＳ２８ＯＲＦとＵＳ２９ＯＲＦの間に挿入された３４ｂｐのＬｏｘＰ部位、の二か所の遺伝子座においてＭＡＤ１６９と異なる（表２を参照されたい）。
【００８５】
ＢＡＣクローンｂｅＭＡＤのゲノムは、完全に配列決定された。ｂｅＭＡＤの全体ゲノム構造は、ＡＴＣＣ  ＡＤ１６９変異株（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ１７４０３）において報告されたものと同一であり、二つの特異領域、即ち長い特異領域（ＵＬ）および短い特異領域（ＵＳ）を含む。各々の特異領域は、二つの反復配列、即ち長い末端反復（ＴＲＬ）−長い内部反復（ＩＲＬ）、短い末端反復（ＴＲＳ）−短い内部反復（ＩＲＳ）によって囲まれている。継代変異株ＭＡＤ１６９およびｂｅＭＡＤ由来ウイルスの増殖速度は、ヒト繊維芽株化細胞であるＭＲＣ−５細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ−１７１）において区別不能だった（データ未記載）。ｇＨ複合体は線維芽細胞上での増殖にとって必要ではないので、ＭＡＤ１６９とｂｅＭＡＤの間のｇＨ複合体発現における相違は関連性がない。
【表２】
0005926804.tif 000004
【００８６】
実施例２
従来の不活化法のｇＨ複合体への影響
ウイルス不活化の二つの従来法、即ちγ線照射およびβ−プロピオンラクトン（ＢＰＬ）のｇＨ発現ＣＭＶに関する影響を調べた。
【００８７】
γ線照射を凍結乾燥ビリオンに実施した。ＨＮＳ（２５ｍＭ  ヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、９％（ｗ／ｖ）ショ糖、ｐＨ６．０）製剤中で０．１５ｍｇ／ｍＬ濃度の組換えＣＭＶワクチンを、乾燥粉末を得るために保存的な凍結乾燥サイクル（−５０℃での凍結および−３５℃で〜３０時間の一次乾燥、続いて２５℃で６時間の二次乾燥）を使用して凍結乾燥した。ワクチンを、３ｍＬのガラスバイアル中、各バイアルに０．５ｍｌ充填して凍結乾燥した。凍結乾燥の最後にバイアルを窒素環境下で栓をして、試料を取出し、ラベルをし、圧着してγ線照射まで−７０℃に保存した。バイアルを、Ｃｏ照射器下で所期の照射線量だけ照射した。
【００８８】
ＢＰＬ処理については、ＢＰＬ保存液が０．０１％または０．１％（ｖ／ｖ）の終濃度に達するまで、ＡＲＰＥ−１９細胞上の増殖液由来の粗ウイルス培養上清に添加された。反応は、さまざまな時点でチオ硫酸ナトリウムにより終結した。ＢＰＬ処理したｇＨ発現ＣＭＶは、次に超遠心分離によって精製した。
【００８９】
双方の方法に対する不活化速度は、ＡＲＰＥ−細胞におけるプラーク分析法によって測定した。即ち、ＰＢＳ中でウイルス試料の段階希釈液を作成し、ＡＲＰＥ−１９細胞を播種しておいた６ウェルプレートの各ウェルに接種するために０．１ｍＬを使用した。ウェル当たり６ｍＬの０．５％アガロースを含有するオーバーレイ培地の添加前に、プレートを３７℃で１時間インキュベートする。プレートを３７℃で１８日間インキュベートする。プラークを可視化するために、約０．５ｍＬのＭＴＴ溶液（チアゾリルブルーテトラゾリウムブロマイド、Ｓｉｇｍａ  Ｍ５６５５）を５ｍｇ／ｍＬで各ウェルに添加した。プレートを３７℃で２〜４時間インキュベートし、プラークはライトボックス下で計数した（図２Ａおよび２Ｃ）。
【００９０】
不活化ｇＨ発現ＣＭＶの免疫原性は、マウス中に誘導される中和抗体力価を測定することによって分析した。即ち、雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝１０）を用量当たり２．５μｇのＣＭＶにより０および３週間目に免疫化した。４週目に血清を収集し、ウイルス上皮侵入に対する中和活性について評価した。中和力価（ＮＴ５０）は、負の対照と比較してウイルス上皮侵入において５０％の減少を生じさせる血清の希釈度の逆数として定義した。マウスの免疫原性研究からの結果は、双方の従来の不活化法がｇＨ発現ＣＭＶによって誘導される中和抗体力価について負の影響を有することを示した（図２Ｂおよび２Ｄ）。ＮＴ５０力価の低下は、γ線照射またはＢＰＬによる処理期間と相互に関連があった。長期の処理は、五量体ｇＨ複合体発現ＣＭＶを、免疫原性の点からむしろマウスにおける親ＡＤ１６９ＣＭＶに近い状態にした。γ線照射またはＢＰＬにより不活化されたワクチンを試験したとき、同様の結果がウサギおよびアカゲザルにおいて観察された（データ未記載）。これらの知見は、五量体ｇＨ複合体が選択された不活化条件下で双方の不活化法に感受性であることを明らかにした。
【００９１】
実施例３
ＦＫＢＰ−必須タンパク質融合体の構築およびスクリーニング
ＣＭＶを、条件付き複製欠損型でありながら、上皮指向性を回復する弱毒化ＡＤ１６９株の主鎖を使用して構築した。上皮指向性を復元するために、実施例１に記載の方法を使用した。
【００９２】
ＦＫＢＰ誘導体に融合すべきウイルスタンパク質は、二つの基準に基づいて選択した。第一に、目的のタンパク質はプロテオミクス分析によってＣＭＶビリオン中に検出されなかったので（Ｖａｒｎｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：１０９６０）、従ってＦＫＢＰ融合タンパク質がウイルスに取り込まれる可能性を低下させる。第二に、目的のタンパク質は組織培養中でのウイルス複製に必須である。
【００９３】
親ウイルスとしてｂｅＭＡＤを使用して、ＦＫＢＰ誘導体（配列番号１２）は、ＩＥ１／２（配列番号１）、ｐＵＬ３７ｘ１、ｐＵＬ４４、ｐＵＬ５１（配列番号３）、ｐＵＬ５２（配列番号５）、ｐＵＬ５３、ｐＵＬ５６、ｐＵＬ７７、ｐＵＬ７９（配列番号７）、ｐＵＬ８４（配列番号９）、ｐＵＬ８７およびｐＵＬ１０５を含む１２の必須ウイルスタンパク質に個別的に融合した。ＦＫＢＰに融合した二つの異なる必須タンパク質を有するウイルス、即ちＩＥ１／２およびＵＬ５１の各々がＦＫＢＰ誘導体に融合したウイルス、もまた構築した（不安定化ＩＥ１／２およびＵＬ５１を有するｒｄＣＭＶのゲノムを配列番号１４に示す）。構築後、全ての組換えＢＡＣ  ＤＮＡは、ＡＲＰＥ−９細胞にトランスフェクトし、Ｓｈｌｄ−１を含有する培地中で培養した。
【００９４】
ウイルス増殖のＳｈｌｄ−１依存性を検討した。ＩＥ１／２、ＵＬ５１、ＵＬ５２、ＵＬ８４、ＵＬ７９およびＵＬ８７融合ウイルスは、プラーク分析法において２μＭ  Ｓｈｌｄ−１中で速やかに救出された（データ未記載）。ＵＬ３７ｘ１、ＵＬ７７およびＵＬ５３ウイルスもまたプラークを形成したが、プラークは小さく、それらは親ｂｅＭＡＤと比較して著しく緩慢に成長した。Ｓｈｌｄ−１濃度を１０μＭまで増加してもウイルス増殖を顕著には促進しなかった（データ未記載）。ＵＬ５６およびＵＬ１０５融合体は救出されなかったが、このことはこれらのタンパク質のタグ付けがこれらのタンパク質の機能または隣接する遺伝子の発現を崩壊させることを示唆している。
【００９５】
Ｓｈｌｄ−１の有無におけるウイルス複製をさらに評価するために、様々な濃度のＳｈｌｄ−１を追加の実験において使用した。ＡＲＰＥ−１９細胞を、必須タンパク質に融合したＦＫＢＰ誘導体も含有する、ｇＨ発現ＣＭＶにより０．０１ｐｆｕ／ｍｌのＭＯＩ（感染多重度）で感染した。１時間の感染後に細胞を、接種菌液からＳｈｌｄ−１を除去するために新鮮な培地で２回洗浄した。次に接種菌液を、Ｓｈｉｅｌｄ−１を０．０５、０．１、０．５または２μＭ含有する培地中で培養されたＡＲＰＥ−１９細胞に添加した。感染後７日目に上清中のセルフリー子孫ウイルスを収集して、Ｓｈｉｅｌｄ−１が２ｍＭ補充されたＡＲＰＥ−１９細胞上に滴定した。ウイルス力価を、５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）分析法によって測定した。即ち、この希釈分析法は、感染宿主の５０％を死滅させるために要求されるウイルス量を定量する。ＡＲＰＥ−１９細胞を播種して、ウイルスの段階希釈液を添加した。インキュベーション後に、各々のウイルス希釈液について細胞死（即ち感染細胞）のパーセンテージを手作業で観察し記録した。結果は、ＴＣＩＤ５０を数学的に算出するために使用した。
【００９６】
図３に示す通り、すべてのＦＫＢＰ融合体を含有するＣＭＶの効率的な複製は、様々な度合であるがＳｈｉｅｌｄ−１濃度に依存した。概してより低濃度のＳｈｉｅｌｄ−１は、子孫ウイルス産生の力価を低下させた。単一融合体を有するウイルスの中で、ＵＬ５１とＵＬ５２だけが複製のためにＳｈｉｅｌｄ−１を絶対的に要求した。単一融合体、ＩＥ１／２、ＵＬ８４、ＵＬ７９およびＵＬ８７を有する他のウイルスは、Ｓｈｉｅｌｄ−１の非存在下において検出可能な子孫ウイルスを産生し得た。制御は、ＦＫＢＰ誘導体がＵＬ５１またはＵＬ５２に融合したときに最も堅固だった。
【００９７】
ＩＥ１／２、ＵＬ５１、ＩＥ１／２−ＵＬ５１融合体を有するウイルスの増殖速度を、２μＭのＳｈｌｄ−１の有無における親ｂｅＭＡＤウイルスと比較した。図４に示す通り、Ｓｈｌｄ−１の存在下において単一または二重融合体は、親ｂｅＭＡＤと同等の増殖速度を有した。しかしながらＳｈｌｄ−１の非存在下においては、親ｂｅＭＡＤよりもより低率でより緩慢であるがＩＥ１／２だけが複製し得た。
【００９８】
二重融合ウイルスにおけるウイルス複製の制御の堅固さをも、異なる細胞型において試験した（図５）。これらの細胞には、ヒト臍帯静脈細胞（ＨＵＶＥＣ）、ＭＲＣ−５繊維芽細胞、大動脈平滑筋細胞（ＡｏＭＣ）、骨格筋細胞（ＳＫＭＣ）およびＣＣＦ−ＳＴＴＧ１星状細胞種細胞が含まれた。細胞は、０．０１ｐｆｕ／細胞のＭＯＩ（５ｐｆｕ／細胞のＭＯＩで感染したＣＣＦ−ＳＴＴＧ１を除く）でＩＥ１／２−ＵＬ５１融合ウイルスに感染し、次にＳｈｉｅｌｄ−１の存在下または非存在下に培地中でインキュベートした。すべての細胞型は、Ｓｈｉｅｌｄ−１の存在下でウイルスの溶解感染を支持し得た。Ｓｈｉｅｌｄ−１の非存在下でウイルス産生は検出されなかった。
【００９９】
実施例４
動物におけるＩＥ１／２−ＵＬ５１二重融合ウイルスの免疫原性
ＩＥ１／２−ＵＬ５１二重融合ウイルスの免疫原性を、マウス、ウサギおよびアカゲザルにおいて評価した。ＩＥ１／２−ＵＬ５１二重融合ウイルスまたは親ｂｅＭＡＤウイルスに対するマウスにおける用量依存的中和応答を最初に比較した（図６Ａ）。６週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを、０および４週目に、ｂｅＭＡＤまたはＩＥ１／２−ＵＬ５１二重融合ウイルスにより０．１２μｇないし１０μｇの範囲の用量で免疫した。６週目の血清試料を収集し、上記の通りＡＲＰＥ−１９細胞上でＣＭＶマイクロ中和分析法によって分析した（Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ，“Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｎｅｔｕｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ（ヒトサイトメガロウイルスワクチンの臨床評価を支援する新処理能中和分析法）”ｅ−ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ（電子出版）  Ａｕｇｕｓｔ  ３０，２０１１  ａｔ  ｄｏｉ（デジタル識別子）：１０．１０１６／ｊ．ｖａｃｃｉｎｅ．２０１１．０８．０８６）。応答は、０．１２、０．３７、１．１、３．３および１０μｇの用量で比較した。低用量範囲（０．１２ないし１．１μｇ）において、ｂｅＭＡＤは、用量レベルが０．３７より高いときには、一貫して検出された中和抗体についてわずかにより免疫原性だった。高用量範囲（３．３および１０μｇ）において、二つのウイルスによって誘導された中和抗体力価は同等であった。
【０１００】
次に、ウサギにおける１０μｇ用量での種々のウイルスの免疫原性を比較した。雌性ＮＺＷウサギを、０、３および８週目に、ｂｅＭＡＤまたは表示した融合ウイルスの１０μｇにより免疫した。１０週目の血清を収集し、ＡＲＰＥ−１９細胞上でＣＭＶマイクロ中和分析法によって分析した（図５Ｂ）。ｂｅＭＡＤ、単一融合ウイルスＩＥ１／２またはＵＬ５１および二重融合ウイルスＩＥ１／２−ＵＬ５１は、ＡＤ１６９に類似して五量体ｇＨ複合体を欠くウイルスであるＭＡＤ１６９よりも顕著に高い中和抗体力価を誘導し得た。これは、ウイルスによるｇＨ複合体の発現が組換えＣＭＶの免疫原性を顕著に高めたということを裏付けた。
【０１０１】
次に、二重融合ＩＥ１／２−ＵＬ５１ウイルスまたは親ｂｅＭＡＤウイルスの１００μｇの免疫原性をアカゲザルにおいて試験した。１２週目の血清を収集し、ＡＲＰＥ−１９細胞上でＣＭＶマイクロ中和分析法によって分析した。１２週目（投与３の後）のＮＴ５０力価のＧＭＴは、それぞれ１１５００または１５６００だった。これらの力価は、自然感染した個体において観察されるＮＴ５０力価と同等であった（図５Ｃ）。
【０１０２】
二重融合ウイルスＩＥ１／２−ＵＬ５１ＣＭＶワクチンで誘導された免疫応答の寿命を、アカゲザルにおいて明らかにした。動物を、１０μｇ／用量か１００μｇ／用量かいずれかの二重融合ウイルスＩＥ１／２−ＵＬ５１によりワクチン接種した（総タンパク質量に基づいて）。また不定形アルミニウムヒドロキシフォスファートサルファート（ＡＡＨＳ）またはＩＳＣＯＭＡＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバントを含む１０μｇ／用量ワクチンの製剤も含めた。ワクチンを０、８および２４週目にアカゲザルに投与した（ｎ＝５）。比較のために、対照群は、ＭＦ５９アジュバントと処方した組換えｇＢを、３０μｇ／用量で、０、４および２４週目に投与した。すべての群に対する相互のＮＴ５０力価についての幾何平均（ＧＭＴ）を縦に示した（図７）。ワクチン接種に先立って、４０を超える検出可能な中和抗体力価はいかなるサルにも存在しなかった。最小の中和活性は、全ての群に対して最初の投与後の４週目に検出されたが、中和抗体力価は約１２週目および２８週目（それぞれ二次接種および三次接種後４週目）にピークに達した。１００μｇ／用量群に対する２８週目のピークのＧＭＴは、１４，５００であった（１０μｇ／用量群に対する力価４，６６０より約３倍高い）。ＡＡＨＳではなくＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバントが、１０μｇ／用量群について比較するとアジュバントの利益を与えた。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）群に対する２８週目のＧＭＴは１５，８００を測定したが、一方ＡＡＨＳ群は３，０００および１０μｇ／用量群は４，６６０であった。最小の中和活性が対照群（ｇＢ／ＭＦ５９）に対して検出されたが、ピークのＧＭＴは決して２００を超えなかった。研究７２週目、即ち０、８および２４週目でのワクチン接種投与レジメの終了後１年近い頃に、１００μｇ／用量群およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）製剤群に対するＧＭＴは、それぞれ１４００および３０００を維持していた。この時点で、１０μｇ／用量群およびＡＡＨＳ群に対するＧＭＴは約２００であった。
【０１０３】
アカゲザル由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、ワクチン接種レジメの２８週目（投与３後の４週目）に収集し、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ分析法で評価した。サルは、二重融合ウイルスＩＥ１／２−ＵＬ５１の１００μｇ／用量（図８Ａ）または１０μｇ／用量（図８Ｂ〜８Ｄ）のいずれかでワクチン接種した。さらに、無アジュバント（図８Ｂ）、またはＡＡＨＳ（図８Ｃ）、あるいはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）（図８Ｄ）アジュバントを含むいずれかの１０μｇ／用量を処方した。５個のＨＣＭＶ抗原を示す、プールされたオーバーラップするペプチドの抗原を、エクスビボでのＩＦＮ−γ産生を刺激するために使用した。使用したＨＣＭＶ抗原は、ＩＥ１およびＩＥ２（双方ともウイルス調節タンパク質）ならびにｐｐ６５、ｇＢおよびｐｐ１５０（主なウイルス構造抗原）であった。Ｔ細胞応答の質は、ＥＬＩＳＰＯＴ応答の大きさ（幾何平均）ならびにウイルス抗原に対する応答率によって評価した。ワクチン接種に先立って、抗原特異的ＥＬＩＳＰＯＴ力価はいずれのサルにおいても存在しなかった（データ未記載）。
【０１０４】
２８週目に、５個のＨＣＭＶ抗原（即ち、ＩＥ１、ＩＥ２、ｐｐ６５、ｇＢおよびｐｐ１５０）に対するＥＬＩＳＰＯＴ応答の幾何平均は、それぞれ、１００μｇ／用量群について１８６、１３２、２５３、８７、２５７スポット形成細胞（ＳＦＣ）／１０６ＰＢＭＣであったのに対して、１０μｇ／用量群については２１、２４、１０７、１１１、３３ＳＦＣ／１０６ＰＢＭＣであった（図８Ａおよび８Ｂ）。各群（ｎ＝５）における応答動物は、５５ＳＦＣ／１０６ＰＢＭＣ以上かつ抗原特異的応答におけるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）応答の３倍以上の増加、というカットオフ基準に基づいてスコア化した。５個のＨＣＭＶ抗原（即ち、ＩＥ１、ＩＥ２、ｐｐ６５、ｇＢおよびｐｐ１５０）に対する応答動物の数は、１００μｇ／用量群について４、４、５、１、３であったのに対し１０μｇ／用量群については１、１、５、４、０であった。
【０１０５】
二重融合ウイルスＩＥ１／２−ＵＬ５１の１０μｇ／用量に対するＴ細胞応答に関するＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバントの影響を図８Ｄに示す。５個のＨＣＭＶ抗原（即ち、ＩＥ１、ＩＥ２、ｐｐ６５、ｇＢおよびｐｐ１５０）に対するＥＬＩＳＰＯＴ応答の幾何平均は、それぞれ１１４、５３、４９１、８５、１１３ＳＦＣ／１０６ＰＢＭＣであり、群（ｎ＝５）中の応答動物の数はそれぞれ３、２、５、３、３であった。ＩＳＣＯＭＴＲＩＸ（登録商標）アジュバントの群におけるＴ細胞応答の大きさと幅は、１００μｇ／用量群におけるそれらと類似していた。
【０１０６】
ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）を含む１０μｇ／用量または１００μｇ／用量の二重融合ウイルスＩＥ１／２−ＵＬ５１によりワクチン接種された動物由来のＰＢＭＣを、ＨＣＭＶ抗原（ｐｐ６５、ＩＥ１、ＩＥ２または全ＨＣＭＶビリオン）により刺激した後に細胞内サイトカイン染色によりさらに分析した。負の対照は二重融合ウイルスＩＥ１／２−ＵＬ５１によりワクチン接種されていない一匹の無感作のサルであり、一方、正の対照はスタフィロコッカスエンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）であった。図９は、負の対照が全ての抗原刺激に対し最小の応答を示したが、想定通り正の対照剤であるスタフィロコッカスエンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）に対し応答したことを示す。両群からのワクチン接種された全１０匹のサルは、類似した大きさとパターンでＨＣＭＶ特異的抗原に応答した。各々の抗原に対する幾何平均値を、全てのサルに対して算出した。すべてのサルは、そのＰＢＭＣがＣＭＶ抗原ペプチドプール（即ち、ｐｐ６５、ＩＥ１およびＩＥ２）により刺激されたとき、同等のＣＤ８＋（図９Ａ）およびＣＤ４＋（図９Ｂ）Ｔ細胞応答を示したが、一方、全ＨＣＭＶ粒子ビリオンにより刺激されたときには優先的にＣＤ４＋Ｔ細胞応答を示した。全粒子ビリオンはタンパク質抗原であり、おそらく外来性抗原としてプロセシングされ、ＭＨＣクラス分子によってＣＤ４＋Ｔ細胞に提示されるので、このことは予想外というわけではなかった。二重融合ウイルスＩＥ１／２−ＵＬ５１は、ＨＣＭＶ感染した健康な被験者に通常みられるＴ細胞応答と類似する、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋表現型の双方のＴ細胞応答を誘発し得る。
【０１０７】
アルミニウム塩を含む二重融合ウイルスＩＥ１／２−ＵＬ５１の異なる製剤を、その中和抗体を産生する能力についてアカゲザルにおいて比較した（図１０）。二重融合ウイルスＩＥ１／２−ＵＬ５１の３０μｇ／用量は、ＨＮＳ（緩衝塩基）、不定形アルミニウムヒドロキシフォスファートサルファート（ＡＡＨＳ）、又はＭｅｒｃｋリン酸アルミニウムアジュバント（ＭＡＰＡ）のいずれかと処方して、０および８週目に投与した。１２週目に収集された血清試料は、ＭＡＰＡが中和抗体誘導を増強したとはいえ、その増強が統計的に有意でなかったことを明らかにした（両側不対ｔ検定）。
【０１０８】
実施例５
保存緩衝液の確認試験
ＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩類溶液）中で使用まで−７０℃に保存されたＣＭＶウイルスを、適切な緩衝液で〜１０倍に希釈した。各々の試料におけるＨＢＳＳ緩衝液の残差成分には、塩化カリウム０．５３３ｍＭ、第一リン酸カリウム０．０４４ｍＭ、第二リン酸ナトリウム０．０３４ｍＭ、塩化ナトリウム１３．７９ｍＭ、重炭酸ナトリウム０．４１７ｍＭおよびグルコース０．１％（ｗ／ｖ）が含まれた。次に試料を、室温もしくは２℃〜８℃の温度で４日間保存または凍結融解した。１又は３サイクルのいずれかの凍結融解のために、試料を−７０℃で少なくとも１時間保存し、ＲＴで３０分間融解した。試料の安定性は、ウイルス侵入分析法を使用して４日目に試験した。即ち、応答曲線を得るためにいくつかの異なる試料希釈液を使用して分析を実施し、ＥＣ５０（μｇ／ｍＬ）値をウイルス侵入分析の結果から非線形曲線近似によって得た。ＥＣ５０値が低いほど良好な安定性を表す。安定性試料のＥＣ５０値を−７０℃凍結の対照試料と比較した。
【０１０９】
ウイルス侵入分析は、ＡＲＰＥ−１９細胞に感染し、そしてＩＥ１（前初期タンパク質１）を発現するＣＭＶの能力を測定する。分析は、透明な９６ウェルプレートで実施する。固定細胞中の標的タンパク質を検出するために、ＩＥ１特異的一次抗体およびビオチン標識二次抗体を使用し、各ウェルからの蛍光シグナルを、Ｓａｐｐｈｉｒｅ  ７００／ＤＲＡＱ５と共にＩＲ  Ｄｙｅ  ８００ＣＷストレプトアビジンを使用して定量する（細胞数入力正規化のため）。結果を、８００／７００積算強度比（積算比）対ＣＭＶ濃度（総タンパク質、μｇ／ｍＬ）としてプロットした。ＥＣ５０値もまた感染性試験の結果から非線形曲線近似を使用して得た。ＡＲＰＥ−細胞のウイルス感染は、ウイルス糖タンパク質抗原、特に五量体ｇＨ複合体の完全性に因るので、ＥＣ５０値はウイルス粒子がこれらの条件下でどれだけ良好に保存されるかを反映する。
【０１１０】
図１１に示す通り、ＣＭＶは、ＲＴでＨＢＳＳ中に４日間保存されると感染性を失う。さらに、ＨＢＳＳ中での３サイクルの凍結融解は、ウイルス侵入分析法により評価すると完全な感染性の喪失をもたらす。従ってＨＢＳＳは、ＣＭＶ保存に対する最適の緩衝液ではなかった。
【０１１１】
室温でのＣＭＶ安定性に関するｐＨの影響を、３ないし８のｐＨ範囲を使用して検討した。以下の緩衝液：クエン酸緩衝液（２５ｍＭ）、ｐＨ３．０；酢酸緩衝液（２５ｍＭ）、ｐＨ４；酢酸緩衝液（２５ｍＭ）、ｐＨ５；ヒスチジン緩衝液（２５ｍＭ）、ｐＨ６；ＨＥＰＥＳ緩衝液（２５ｍＭ）、ｐＨ７；ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）、ｐＨ７．５およびＴｒｉｓ緩衝液（２５ｍＭ）、ｐＨ８を利用した。
【０１１２】
試料を、ウイルスの原体を適切な緩衝液により１０回希釈して調製した。試料をＲＴ（２５℃）で４日間保存した。４日目に、試料の安定性を、ウイルス侵入分析法を使用して測定した。ＨＢＳＳ中−７０℃で凍結保存したＣＭＶを、対照として処理した。各々の試料に対する紫外・可視スペクトルを、保存中に生じた構造変化および凝集を調べるために、時間０および４日目に取得した。
【０１１３】
図１２に示す通り、ｐＨ６の２５ｍＭ  ヒスチジン緩衝液は、他の試験ｐＨと比較してＲＴでより高い感染性を維持することによってＣＭＶに対してより良好な安定性を与えた。紫外スペクトルの二次導関数は、全ｐＨで類似したウイルスの構造特性を示した（データ未掲載）。顕著な凝集は、３５０ｎｍでの光学密度による測定で試験ｐＨのいずれにおいても観察されなかった（データ未記載）。
【０１１４】
ＣＭＶウイルス安定性に関する、単独または塩化ナトリウムとの併用による尿素の影響を、ｐＨ６の２５ｍＭヒスチジン緩衝液中で試験した。２％尿素単独の添加はＣＭＶ安定性に影響しなかった。しかしながら、１５０ｍＭ  ＮａＣｌとの併用での２％尿素は、ＲＴでＣＭＶの安定性を改善した（図１３）。
【０１１５】
ＣＭＶ安定性に関するイオン強度の影響をｐＨ６で検討した。ＮａＣｌの増加する濃度（０ｍＭ、７５ｍＭ、１５０ｍＭおよび３２０ｍＭ  ＮａＣｌ）をｐＨ６の２５ｍＭヒスチジン緩衝液に添加した。ＣＭＶ安定性はイオン強度に依存し、ここで高いイオン強度ほどより良好な安定性をもたらした（図１４）。尿素の存在は、ＣＭＶ安定性に全く影響がないかまたは最小の影響しかなかった（データ未記載）。
【０１１６】
さらにいくつかの他の賦形剤（ショ糖、ソルビトール、グリセリンおよびプロリン）を、室温でのｇＨ発現のＣＭＶ安定性に関するその影響についてスクリーニングした。試験した賦形剤を、ウイルス侵入分析法を使用してＣＭＶウイルス安定性を測定する前に、ｐＨ６の２５ｍＭヒスチジン緩衝液中のＣＭＶに室温で４日間添加した。ＥＣ５０値を試料に対して算出した。試験した全ての賦形剤中、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ単独または９％（ｗ／ｖ）ショ糖との併用がｐＨ６でのより良好な安定性を与えた（データ未記載）。従ってＲＴでのＣＭＶ保存のために推奨できる緩衝液は、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含み、９％（ｗ／ｖ）ショ糖を含むかまたは含まない２５ｍＭヒスチジン（ｐＨ６）である。
【０１１７】
凍結融解の間のＣＭＶ安定性に関する凍結保護物質の影響を調べた。既に述べた通り（図１１）、ＨＢＳＳ中のＣＭＶは、三回の凍結融解サイクルを受けると完全にその感染性を失った。いくかの凍結保護物質（ショ糖、ソルビトール、グリセリンを含む）を、ＣＭＶへの凍結融解ストレスを減少する能力についてスクリーニングした。各々の凍結融解サイクルのために、試料は−７０℃で少なくとも１時間凍結し、ＲＴで３０分間融解した。凍結保護物質の添加は、増強されたウイルス安定性をもたらした。さらに、１５０ｍＭ塩化ナトリウムと組み合わせた９％（ｗ／ｖ）ショ糖は、他の試験凍結保護物質と比較すると顕著に高められたウイルス安定性をもたらした（図１５）。従って−７０℃でのまたは３回までの凍結融解サイクルでのＣＭＶ保存のための推奨緩衝液組成物は、２５ｍＭヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび９％ショ糖（ＨＮＳ緩衝液）である。
【０１１８】
ＨＮＳ緩衝液を、３回の凍結融解サイクル、冷却（２〜８℃）およびＲＴ（２５℃）におけるＣＭＶ安定性の保護についてＨＢＳＳ緩衝液と比較した。ＨＮＳ緩衝液は、全ての試験保存条件においてＣＭＶ生菌ウイルスに対するより良好な安定性を与えた（データ未記載）。
【０１１９】
実施例６
ＨＮＳ緩衝液中でのＣＭＶ安定性
二重融合ＩＥ１／２−ＵＬ５１ＣＭＶウイルスのストック溶液を、ＨＮＳ緩衝液に補給し、使用まで−７０℃で保存した。安定性研究は１００μｇ／ｍＬの濃度（ブラッドフォード分析法により測定した総タンパク質含量に基づく）で実施した。原体ウイルスは、最終ウイルス濃度を得るようにＨＮＳ緩衝液により希釈した。次に試料を適切な温度で保存し、記載の通り３か月まで試験した。凍結融解のために、試料を−７０℃で少なくとも１時間凍結し、室温で３０分間融解した。試料は種々の時点で取り出し、分析するまで−７０℃で凍結保存した。
【０１２０】
試料の総タンパク質含量は、ブラッドフォード分析法を使用して測定した。試料の総タンパク質含量は、３か月の期間にわたり変化しなかった（データ未記載）。
【０１２１】
経時的な試料中のＣＭＶの粒子径は、ＤＬＳ法を使用して試料の流体力学的直径を測定することによってモニターした。この方法では、経時的にかつ異なる保存温度でウイルス粒子のいかなる凝集または崩壊をもモニターした。実質的な傾向は、一定の試料の粒子径における突発的変化について確認されなかった（データ未記載）。結果は、ウイルス粒子が高温度でもインタクトであり凝集していなかったことを示した。
【０１２２】
実施例７
ウイルス侵入および免疫原性に関する保存条件の影響
ウイルス侵入力価（ＥＣ５０値）における顕著な変化が、ＣＭＶ試料を種々の保存温度に晒すことによって観察された（データ未記載）。−２０℃での保存は、２〜８℃および２５℃と比較してより低いウイルス侵入力価をもたらした。２〜８℃の試料の力価は、２５℃保存と比較してより低いウイルス侵入力価であることが見出された。ＥＣ５０値に基づいて、保存温度は次の順番（最も安定から最も不安定な順）、２５℃＞２〜８℃＞−２０℃で一カ月の時点まで順位づけされた。ウイルス侵入力価は、−２０℃、２〜８℃および２５℃で保存された試料に対して３カ月の時点で検出できなかった。
【０１２３】
マウスの免疫原性研究は、安定性研究の終わりに開始し、ＣＭＶ中和抗体を誘導するＣＭＶの能力に関する保存温度の影響を測定した。マウスを、用量当たり２．５μｇのワクチンの筋肉内注射により０日目に免疫し、２１日目に追加免疫し続いて２８日目に放血した。マウス血清は、ＡＲＰＥ１９細胞を使用してｇＨ発現ＣＭＶに対する中和抗体について試験し、ＮＴ５０力価を非線形曲線近似によって得た。
【０１２４】
ＩＥ１／２−ＵＬ５１二重融合ＣＭＶの免疫原性に関する種々の温度での３か月間の保存の影響を評価した。ＮＴ５０力価は、有意差はないものの（ｐ＝０．２５８４、一元配置分散分析法）保存温度に依存し、より高い温度では−７０℃凍結対照と比較して低下した力価をもたらした（図１６Ａ）。−２０℃に保存された製剤についてのＮＴ５０力価は２倍弱低かったが、しかしこれらの試料に対するウイルス侵入分析力価は、−７０℃凍結対照と比較して著しく影響を受けた。−２０℃、２〜８℃および２５℃安定性試料に対するＮＴ５０力価の傾向は、これらの試料に対して得られるＣＭＶ質量ＥＬＩＳＡ力価に従っている。
【０１２５】
ＩＥ１／２−ＵＬ５１二重融合ＣＭＶの免疫原性に関する融解後の種々の温度における８時間保存の影響を評価した。製剤のＮＴ５０力価は−７０℃凍結対照と比較した。ＮＴ５０力価は、試料を８時間いかなる試験温度に保存しても影響されなかった（ｐ＝０．５８６５、一元配置分散分析法）（図１６Ｂ）。
【０１２６】
試料融解後の種々の時点についての二重融合ＩＥ１／２−ＵＬ５１ＣＭＶの２５℃での保存の影響は、マウスの免疫原性研究において評価した。これらの製剤のＮＴ５０力価は、−７０℃凍結対照と比較した。ＴＮ５０力価は、２５℃で試料を１週間まで保存することによって影響を受けなかった（ｐ＝０．１８４８、両側不対ｔ検定）。３月目に、ＮＴ５０力価は２倍強だけ低下したが、これは２５℃でのより長時間に対する製剤の起こり得る安定性の問題を示している（データ未記載）。
【０１２７】
ＨＮＳ緩衝液中で製剤化した二重融合ＩＥ１／２−ＵＬ５１ＣＭＶに関する凍結融解の３サイクルの影響を、マウス免疫原性によって評価した。二重融合ＣＭＶ製剤の凍結融解（Ｆ／Ｔ）の３サイクルは、−７０℃凍結対照と比較して免疫原性に影響しなかった（ｐ＝０．２１０３、両側不対ｔ検定）（データ未記載）。
【０１２８】
他の実施形態は以下の請求項の範囲内にある。いくつかの実施形態が示され記載されているが、種々の変更が本発明の趣旨および範囲から逸脱せずに成され得る。
【図１】
0005926804.tif 000005
【図２Ａ】
0005926804.tif 000006
【図２Ｂ】
0005926804.tif 000007
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
0005926804.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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