(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１疎水性物質が磁性物質の表面にコーティングされた磁性ナノ粒子；及び
第２疎水性物質、二本鎖オリゴＲＮＡ、及び親水性物質が結合した構造体；を含むＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体であって、
前記磁性ナノ粒子は、前記第１疎水性物質と前記第２疎水性物質との疎水性相互作用により前記複合体の核に位置し、前記構造体は前記複合体の外側に位置する構造であり、そして前記構造体の前記親水性物質は、前記二本鎖オリゴＲＮＡの最外側に結合しており、そして前記二本鎖オリゴＲＮＡは、共有結合により前記第２疎水性物質及び前記親水性物質に結合しているものとする、前記ＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体。
【請求項２】
前記第１疎水性物質と前記第２疎水性物質は互いに同一または、互いに相違する物質であることを特徴とする請求項１に記載のＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体。
【請求項３】
ＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体からの磁性ナノ粒子及び二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の質量比は０．０１：１〜１００：１であることを特徴とする請求項１に記載のＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体。
【請求項４】
前記ＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体の直径は５０ｎｍ〜３００ｎｍであることを特徴とする請求項１に記載のＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体。
【請求項５】
ＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体の多分散指数（ＰＤＩ）は０．０１〜０．４であることを特徴とする請求項１に記載のＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体。
【請求項６】
前記磁性物質の直径は１ｎｍ〜２００ｎｍであることを特徴とする請求項１に記載のＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体。
【請求項７】
前記磁性物質は磁性金属または磁性金属酸化物であることを特徴とする請求項１に記載のＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体。
【請求項８】
前記磁性金属は、鉄族元素（Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ）、希土類元素（Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、Ｌｕ）、貨幣金属元素（Ｃｕ、Ａｇ、Ａｕ）、亜鉛族元素（Ｚｎ、Ｃｄ、Ｈｇ）、アルミニウム族元素（Ａｌ、Ｇａ、Ｉｎ、Ｔｌ）、アルカリ土類金属元素（Ｃａ、Ｓｒ、Ｂａ、Ｒａ）および白金族元素（Ｐｔ、Ｐｄなど）からなる群から選択されるいずれか一つ以上の金属またはこれらの合金からなることを特徴とする請求項７に記載のＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体。
【請求項９】
前記磁性金属酸化物は、鉄族元素（Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ）、希土類元素（Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、Ｌｕ）、貨幣金属元素（Ｃｕ、Ａｇ、Ａｕ）、亜鉛族元素（Ｚｎ、Ｃｄ、Ｈｇ）、アルミニウム族元素（Ａｌ、Ｇａ、Ｉｎ、Ｔｌ）、アルカリ土類金属元素（Ｃａ、Ｓｒ、Ｂａ、Ｒａ）および白金族元素（Ｐｔ、Ｐｄなど）からなる群から選択されるいずれか一つ以上の金属の酸化物またはこれらの合金の酸化物からなることを特徴とする請求項７に記載のＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体。
【請求項１０】
前記磁性ナノ粒子の第１疎水性物質は、Ｃ６〜Ｃ２５の芳香族化合物、Ｃ６〜Ｃ２５のエーテル、Ｃ６〜Ｃ２５の脂肪族炭化水素およびＣ６〜Ｃ２５のアミンからなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載のＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体。
【請求項１１】
前記二本鎖オリゴＲＮＡ構造体は、下記式（１）の構造からなることを特徴とする請求項１に記載のＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体：
【化１】
0005906327.tif 000010
（前記式（１）中、ＡとＢのいずれか一つは親水性物質であり、他の一つは第２疎水性物質であり、ＸとＹは、互いに独立して、単純共有結合またはリンカー媒介の共有結合であり、Ｒは、二本鎖オリゴＲＮＡを意味する）。
【請求項１２】
前記二本鎖オリゴＲＮＡ構造体は、下記式（１’）の構造からなることを特徴とする請求項１に記載のＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体：
【化２】
0005906327.tif 000011
（前記式（１’）中、ＡとＢのいずれか一つは親水性物質であり、他の一つは第２疎水性物質であり、ＸとＹは、それぞれ独立して、単純共有結合またはリンカー媒介の共有結合であり、Ｓは、二本鎖オリゴＲＮＡのセンス鎖、ＡＳは、二本鎖オリゴＲＮＡのアンチセンス鎖を意味する）。
【請求項１３】
前記二本鎖オリゴＲＮＡ構造体は、下記式（２）の構造からなることを特徴とする請求項１に記載のＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体：
【化３】
0005906327.tif 000012
（前記式（２）中、Ａは、第２疎水性物質であり、Ｂは、親水性物質であり、ＸとＹは、それぞれ独立して、単純共有結合またはリンカー媒介の共有結合であり、Ｓは、二本鎖オリゴＲＮＡのセンス鎖であり、ＡＳは二本鎖オリゴＲＮＡのアンチセンス鎖を意味する）。
【請求項１４】
前記二本鎖オリゴＲＮＡは１９〜３１個のヌクレオチドからなることを特徴とする請求項１に記載のＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体。
【請求項１５】
前記共有結合は非分解性結合または、分解性結合であることを特徴とする請求項１に記載のＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体。
【請求項１６】
前記非分解性結合はアミド結合またはリン酸化結合であることを特徴とする請求項１５に記載のＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体。
【請求項１７】
前記分解性結合は、ジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合、無水物結合、生分解性結合または酵素分解性結合の中選択されることを特徴とする請求項１に記載のＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体。
【請求項１８】
前記第２疎水性物質の分子量は１００〜２，０００であることを特徴とする請求項１に記載のＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体。
【請求項１９】
前記第２疎水性物質は、ステロイド誘導体、グリセリド誘導体、グリセロールエーテル、ポリプロピレングリコール、Ｃ１２〜Ｃ５０の不飽和または飽和炭化水素、ジアシルホスファチジルコリン、脂肪酸、リン脂質、リポポリアミンからなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載のＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体。
【請求項２０】
前記ステロイド誘導体は、コレステロール、コレスタノール、コール酸、コレステリルホルメート、コレスタニルホルメートおよびコレスタニルアミンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１９に記載のＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体。
【請求項２１】
前記グリセリド誘導体は、モノ−、ジ−およびトリ−グリセリドなどから選択されることを特徴とする請求項１９に記載のＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体。
【請求項２２】
前記親水性物質は、分子量１，０００〜１０，０００の非イオン性高分子化合物であることを特徴とする請求項１に記載のＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体。
【請求項２３】
前記親水性物質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン及びポリオキサゾリンからなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載のＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体。
【請求項２４】
二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の親水性物質にリガンドが結合されたことを特徴とする請求項１に記載のＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体。
【請求項２５】
前記リガンドは標的特異的に結合して受容体を介したエンドサイトーシスを行う、標的特異的抗体、アプタマー、ペプチドまたは受容体特異的化学物質からなる群から選択されることを特徴とする請求項２４に記載のＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体。
【請求項２６】
前記受容体特異的化学物質は、葉酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノースからなる群から選択されることを特徴とする請求項２４に記載のＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体。
【請求項２７】
第１疎水性物質が磁性物質の表面にコーティングされた磁性ナノ粒子；および
第２疎水性物質、単一鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）及び親水性物質が結合した一本鎖オリゴヌクレオチド構造体；を含むＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体。
【請求項２８】
前記一本鎖オリゴヌクレオチド構造体は、下記の式（７）の構造からなることを特徴とする請求項２７に記載のＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体；
【化４】
0005906327.tif 000013
（前記式（７）中、ＡとＢのいずれか一つは親水性物質であり、他の一つは第２疎水性物質であり、ＡＳＯは、単一鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、ＸとＹは、それぞれ独立して、単純共有結合またはリンカー媒介の共有結合を意味する）。
【請求項２９】
前記ＡＳＯは、１０〜５０個のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする請求項２７に記載のＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体。
【請求項３０】
（１）親水性物質および第２疎水性物質が結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を製造する段階と、
（２）第１疎水性物質が磁性物質の表面にコーティングされた磁性ナノ粒子を製造する段階と、
（３）前記二本鎖オリゴＲＮＡ構造体からなるＳＡＭｉＲＮＡと第１疎水性物質が磁性物質の表面にコーティングされた磁性ナノ粒子を混合する段階と、を含むＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体の製造方法。
【請求項３１】
前記二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の親水性物質にリガンドを結合させる段階をさらに含むことを特徴とする請求項３０に記載のＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体の製造方法。
【請求項３２】
請求項１〜２９のいずれか一項によるＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体を含む薬剤学的組成物。
【請求項３３】
請求項１〜２９のいずれか一項によるＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体を含む診断用組成物。
【請求項３４】
請求項１〜２９のいずれか一項によるＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体を含む診断及び治療を同時に行うことができる組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガンおよび感染性疾病などの治療に有効に使用されることができる二本鎖オリゴＲＮＡの伝達を向上させるために親水性および疎水性物質が結合している二本鎖オリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子であるＳＡＭｉＲＮＡと診断に使用される磁性ナノ粒子からなるＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体、かかる複合体を製造する方法および前記複合体を用いた二本鎖オリゴＲＮＡの伝達およびガンと感染性疾病を含む疾病の治療および／または診断技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
診断および治療は、疾病の臨床応用における二つの主要範疇であり、近年、抗ガン剤に映像機能を活用した診断（ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）と治療（ｔｈｅｒａｐｙ）を同時に行う技術であるセラグノーシス（ｔｈｅｒａｇｎｏｓｉｓ）という概念が導入された。効果的なセラグノーシスのためには、造影剤（ｉｍａｇｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）と薬物が標的疾病部位に効果的に伝達される必要がある。薬物伝達過程において標的疾病部位に薬効を示すほどに薬物が伝達されず、臨床治療において実効を挙げることができない場合が多く、ひどい場合には、薬物が体内に投与されて薬物が当該組織ではなく正常組織に伝達されて、重大な副作用を起こすことがある。
【０００３】
また、造影剤が標的部位特異的に伝達されたときに当該疾病の診断が可能となるため、かかる薬物および造影剤を標的部位に効果的に伝達する方法が求められる（Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２０１１，４４（１０），ｐｐ１０１８−１０２８）。
【０００４】
映像撮影（ｉｍａｇｉｎｇ  ｍｏｄａｌｉｔｙ）には、蛍光映像法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ）、磁気共鳴映像法（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ；ＭＲＩ）、陽電子断層撮影法（Ｐｏｓｉｔｒｏｎ−Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ；ＰＥＴ）およびコンピューター断層撮影法（Ｃｏｍｐｕｔｅｄ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ；ＣＴ）などが活用されており、前記の映像撮影機器に使用される様々な造影剤が開発されてきた。特に、疾病の診断および治療の面からみて磁性ナノ粒子は、毒性がなく、生体適合性（ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）に優れ、血管からの注射が可能であるだけでなく、人体組織内に高含量に蓄積できるという利点がある（キム・テオク、ナノバイオテクノロジー、バイオテクノロジー政策研究センター、２００９）。
【０００５】
ナノ−バイオ分野において、磁性ナノ粒子は、生体物質の分離、磁気共鳴映像診断造影剤、巨大磁気抵抗センサー（Ｇｉａｎｔ  Ｍａｇｎｅｔｏ  Ｒｅｓｉｓｔｉｖｅ  Ｓｅｎｓｏｒ）を含むバイオセンサー、薬物／遺伝子伝達、および磁性高温治療などの広い応用範囲にわたって使用されている。具体的に、磁性ナノ粒子は、分子の磁気共鳴映像を診断するための造影剤として使用されることができる。磁性ナノ粒子は、ナノ粒子周辺の水分子の水素原子のスピン−スピン緩和時間を短縮して磁気共鳴映像の信号を増幅する効果を奏し、従来、磁気共鳴映像の診断に広く使用されている。
【０００６】
また、磁性ナノ粒子は、薬物または遺伝子の伝達による生体治療にも使用されることができる。磁性ナノ粒子に化学的な結合または吸着により薬物または遺伝子を担持し、外部磁場を用いて所望の位置に移動させて特定の部位に薬物および遺伝子を放出させることで、選択的な治療効果を奏することができる（韓国特開第０８１９３７８号公報参照）。現在、磁性ナノ粒子を用いて薬物を伝達する手段として、磁性リポソーム（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）が最も有効なツールとして浮上している。磁性リポソームは、磁性ナノ粒子がリン脂質層で囲まれたリポソーム内に入っている形態を有し、リポソーム内に治療用薬物や遺伝子などを包含して特定の部位に伝達することができるという利点がある（Ｔｏｓｈｉｈｉｒｏ  Ｍａｔｓｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｔ  Ａ，６６Ａ（４）：７４７−７５４，２００３）。また、リポソームの表面に化学的処理を施して特定の組織を追跡する機能を持たせることもできる。近年、磁性リポソームがガン細胞を効果的に追跡するために生体組織内に吸着および蓄積特性を増進させる磁性体カチオニックリポソーム（ＭＣＬ、ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）が開発された（ＸｉａｏｌｉＺｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，３６６：２１１−２１７，２００９）。しかし、依然として、生体適合性および安定性が増進した安定した形態の磁性ナノ粒子が求められている。
【０００７】
また、ナノ粒子を生体内に注入する場合、血液内で凝集することなく均一に分散されて適宜時間循環する特性が求められている。しかし、ナノ粒子は、表面積が大きいため、様々な血漿タンパク質および塩などが付着しやすい生物付着（ｂｉｏｆｏｕｌｉｎｇ）によって凝集が起こりやすく、肝臓のクッパー（Ｋｕｆｆｅｒ）細胞や脾臓のマクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）のような細網内皮系細胞（ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｓｙｓｔｅｍ、ＲＥＳ）により簡単に除去されることができる。そのため、ナノ粒子を体内に投与してから数分以内に血液から無くなり、所望の組織に到達できなくする。また、酸化鉄ナノ粒子は、生体内で十分安定していなければ本来の構造が変わり、磁気的特性が変化するか迅速な生分解が起こりうる。したがって、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ、ＰＥＧ）のような高分子を用いてナノ粒子の表面にコーティング処理を施して生体適合性および安定性を増加させる技術が研究されている（高分子科学と技術，第１９巻２号，２００８，１１６−１２４）。
【０００８】
一方、ｓｉＲＮＡは、動物細胞において特定遺伝子の発現を阻害するために卓越した効果を奏するものと公知され、遺伝子の治療剤として脚光を浴びており、これらの高い活性と精密な遺伝子選択性により、従来２０年間研究されて現在治療剤として活用中のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）を代替する治療剤として期待されている（Ｄａｎａ  Ｊ．Ｇａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １２１：６４−７３，２００７）。
【０００９】
特に、治療のために用いられるｓｉＲＮＡ技法は、他の医薬品に比べて簡単にデザインすることができ、高い標的選択性と、特定遺伝子の発現を効果的に阻害する特徴を有するという大きい利点があり、ｓｉＲＮＡなどのＲＮＡｉによる遺伝子発現の抑制は、生体内で自然に存在するメカニズムを利用することで毒性が低いという利点がある。また、特定の部位に存在する受容体と結合できる物質およびガン細胞などを殺すことができる薬物を結合した形態のナノ粒子は、特定の細胞を標的として薬物を伝達する手段となりうる。
【００１０】
ガンなどの疾病を治療するために解決すべき最大の課題は、治療剤を含有するナノ粒子を正確且つ選択的にガン細胞などの標的組織に伝達できる好適な「標的物質（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）」を選定してナノ粒子に結合する技術である。ナノ粒子に結合した標的物質またはリガンドは、腫瘍細胞の表面に適宜の方法で結合して受容体を作動させて、ナノ粒子に含まれた抗ガン物質を細胞内に取り込む必要がある（イ・ジュンウン、ガン治療のためのナノ粒子と標的追跡システム、先端技術情報分析報告書、韓国科学技術情報研究所、２００４）。
【００１１】
近年、ｓｉＲＮＡの細胞内伝達効率性を向上させるために、ｓｉＲＮＡに生体適合性高分子である親水性物質（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を単純共有結合またはリンカー媒介共有結合により接合したｓｉＲＮＡ接合体により、ｓｉＲＮＡの安定性確保および効率的な細胞膜透過性のための技術が開発された（韓国登録特許第８８３４７１号公報参照）。しかし、ｓｉＲＮＡにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を接合すること（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）だけでは、生体内における低い安定性と標的組織への伝達がスムーズでないという欠点が依然として存在する。
【００１２】
これを解決するために、二本鎖オリゴＲＮＡに親水性および疎水性物質が結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体が開発され、前記二本鎖オリゴＲＮＡ構造体は、疎水性物質の疎水性相互作用によって自己組織化ナノ粒子を形成する。前記の自己組織化ナノ粒子を「ＳＡＭｉＲＮＡ」と称する（韓国特開２００９−００４２２９７号公報）。
【発明の概要】
【００１３】
本発明の目的は、治療用に用いられることができる二本鎖オリゴＲＮＡに親水性および疎水性物質が結合している二本鎖オリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子であるＳＡＭｉＲＮＡと、診断に使用される磁性ナノ粒子からなるＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体、およびかかる複合体を製造する方法を提供することにある。本発明における二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の親水性物質には標的特異的なリガンドをさらに結合することで、標的への伝達能力を向上させることができる。前記ＳＡＭｉＲＮＡ内の疎水性物質と磁性ナノ粒子の磁性物質の表面にコーティングされた疎水性物質の相互作用によりＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体が形成されることができる。
【００１４】
また、本発明の他の目的は、前記ＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体を含む治療および／または診断用組成物およびこれを用いた疾病の治療および／または診断方法を提供することにあり、本発明によるＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体は、ガンおよび感染性疾患を含む様々な疾患の治療および／または診断に非常に有効に用いられることができる。
【００１５】
また、前記ＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体において、ＳＡＭｉＲＮＡ形成技術は、二本鎖オリゴＲＮＡだけでなく、一本鎖オリゴヌクレオチド、特に、治療を目的とする単一鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）にも適用されることができる。
【００１６】
本発明のＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体は、向上した二本鎖オリゴＲＮＡの生体安定性およびナノ粒子の均質な大きさにより細胞伝達効率が増加して優れた治療効能を示し、磁性ナノ粒子の特性により診断のための活用もまた可能である。すなわち、治療と診断が同時に行われることができるいわゆるセラグノーシスに用いられることができ、これにより、疾病の診断および治療のための新たな形態の二本鎖オリゴＲＮＡ伝達システムとして、バイオテクノロジーのための基礎研究および医薬産業など、様々な産業分野にわたり非常に有効に使用されることができる。
【００１７】
また、さらに結合したリガンドを介して標的細胞特異的伝達によりガンを含む標的細胞内に治療用二本鎖オリゴＲＮＡを効率よく伝達することができ、ガンの診断と同時に伝達された二本鎖オリゴＲＮＡによる治療を行うことができる。リガンドが結合したＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体は、他の臓器および細胞への非特異的伝達が阻害されて、効率的且つ特異的にガンの診断および治療を行うことができる。
【００１８】
特に、磁性ナノ粒子の生体内伝達を向上させるために磁性ナノ粒子と二本鎖オリゴＲＮＡ構造体が複合体をなす場合、ＳＡＭｉＲＮＡに磁性ナノ粒子を内包させることができ、より均一な形態のＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体を形成できるという利点がある。前記ＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体を用いて二本鎖オリゴＲＮＡをガン特異的に伝達することで、比較的低い濃度の投与量でも標的組織で二本鎖オリゴＲＮＡの活性を示すことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体の模式図である。
【図２】実施例１−３で製造されたＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子の多分散指数（ＰＤＩ）グラフを示す図である。
【図３】ＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体の透過型電子顕微鏡写真であって、（Ａ）は、磁性ナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真であり、（Ｂ）は、ＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体の透過型電子顕微鏡写真である。
【図４】ＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体の磁気共鳴映像（ＫＢ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌにＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体を腫瘍内に投与した後、ＭＲＩ撮影によりガン組織（点線）の診断を確認）であって、（Ａ）は、未投与群であり、（Ｂ）は、ＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体投与群（ＭＲＩにおいてガン組織の映像信号は黒色で表される。撮影角度−Ｃｏｒｏｎａｌ  Ｓｅｃｔｉｏｎ、冠状断面Ａｘｉａｌ  Ｓｅｃｔｉｏｎ、側直角断面）である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明についてより詳細に説明する。
【００２１】
本発明は、ガンなどの疾病の診断および治療を同時に行うことができる新たなセラグノーシス技術を提供するために、第１疎水性物質が磁性物質の表面にコーティングされた構造を有する磁性ナノ粒子および二本鎖オリゴＲＮＡに親水性物質と第２疎水性物質を結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を含むＳＡＭｉＲＮＡからなるＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体を提供する。
【００２２】
本発明における用語「第１疎水性物質」は、磁性ナノ粒子の磁性物質の表面にコーティングされた疎水性物質を意味し、「第２疎水性物質」は、ＳＡＭｉＲＮＡの二本鎖オリゴＲＮＡ構造体内に共有結合により連結されて含まれた疎水性物質を意味する。後でより詳細に説明するが、第１疎水性物質と第２疎水性物質は、互いに同一または類似した物質であってもよく、互いに相違する物質であってもよい。
【００２３】
本発明で提供されるＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体は、最内側には第１疎水性物質が磁性物質の表面にコーティングされている磁性ナノ粒子が核（ｃｏｒｅ）をなしており、磁性物質の表面にコーティングされた第１疎水性物質と二本鎖オリゴＲＮＡ構造体に含まれた第２疎水性物質が疎水性相互作用をしており（第２疎水性物質は、二本鎖オリゴＲＮＡと結合している）、二本鎖オリゴＲＮＡの他側方向である最外側に親水性物質が二本鎖オリゴＲＮＡに結合している構造を形成する（図１参照）。本発明における「コーティング」とは、磁性物質に第１疎水性物質が物理的に吸着したり、化学的に結合することをすべて含む意味である。
【００２４】
また、前記ＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体に含まれたＳＡＭｉＲＮＡ内における親水性および疎水性物質と二本鎖オリゴＲＮＡとの結合は、共有結合が好ましいが、必ずしもこれに限定されるものではない。
【００２５】
ＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体の磁性ナノ粒子は、磁性物質を含有しているため、磁気的性質を用いた診断方法に有効に使用されることができる。具体的に、磁気的性質を用いる磁気共鳴映像（ＭＲＩ）診断法を含む様々な診断方法に適用されることができる。
【００２６】
前記磁性ナノ粒子の磁性物質は、直径が１ｎｍ〜２００ｎｍ、好ましくは、２ｎｍ〜１００ｎｍの粒子であれば制限なく使用されることができ、前記磁性物質は、磁性金属または磁性金属酸化物であることを特徴とする。
【００２７】
より詳細には、前記磁性金属は、鉄族元素（Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ）、希土類元素（Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、Ｌｕ）、貨幣金属元素（Ｃｕ、Ａｇ、Ａｕ）、亜鉛族元素（Ｚｎ、Ｃｄ、Ｈｇ）、アルミニウム族元素（Ａｌ、Ｇａ、Ｉｎ、Ｔｌ）、アルカリ土類金属元素（Ｃａ、Ｓｒ、Ｂａ、Ｒａ）および白金族元素（Ｐｔ、Ｐｄなど）からなる群から選択されるいずれか一つ以上の金属またはこれらの合金からなることが好ましい。
【００２８】
前記磁性金属酸化物（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｍｅｔａｌ  ｍａｔｅｒｉａｌ）は、鉄族元素（Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ）、希土類元素（Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、Ｌｕ）、貨幣金属元素（Ｃｕ、Ａｇ、Ａｕ）、亜鉛族元素（Ｚｎ、Ｃｄ、Ｈｇ）、アルミニウム族元素（Ａｌ、Ｇａ、Ｉｎ、Ｔｌ）、アルカリ土類金属元素（Ｃａ、Ｓｒ、Ｂａ、Ｒａ）および白金族元素（Ｐｔ、Ｐｄなど）からなる群から選択されるいずれか一つ以上の金属の酸化物またはこれらの合金の酸化物からなることが好ましい。
【００２９】
前記磁性物質の表面にコーティングされている第１疎水性物質は、本発明のＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体を形成することができる物質であればいかなるものでも制限なく使用可能であり、非制限的な例としては、炭素数がＣ６〜Ｃ２５の芳香族化合物、炭素数がＣ６〜Ｃ２５のエーテル、炭素数がＣ６〜Ｃ２５の脂肪族炭化水素および炭素数がＣ６〜Ｃ２５のアミンであってもよく、ナノ粒子複合体の形成を考慮すると、飽和または不飽和脂肪酸および／またはアルキルアミンを使用することが好ましい。
【００３０】
本発明におけるＳＡＭｉＲＮＡを構成する二本鎖オリゴＲＮＡ構造体は、下記式（１）の構造を有する。
【００３１】
【化１】
0005906327.tif 000002
【００３２】
前記式（１）中、ＡとＢのいずれか一つは親水性物質であり、他の一つは第２疎水性物質であり、Ｒは、二本鎖オリゴＲＮＡであり、ＸとＹは、好ましくは、単純共有結合またはリンカー媒介の共有結合であるが、これに限定されない。
【００３３】
特に、本発明におけるＳＡＭｉＲＮＡを構成する二本鎖オリゴＲＮＡ構造体は、下記式（１’）の構造を有することが好ましい。
【００３４】
【化２】
0005906327.tif 000003
【００３５】
前記式（１’）中、ＡとＢのいずれか一つは親水性物質であり、他の一つは第２疎水性物質であり、ＸとＹは、それぞれ独立して、単純共有結合またはリンカー媒介の共有結合であり、Ｓは、二本鎖オリゴＲＮＡのセンス鎖、ＡＳは、二本鎖オリゴＲＮＡのアンチセンス鎖である。
【００３６】
また、本発明におけるＳＡＭｉＲＮＡを構成する二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の親水性物質に標的特異的なリガンドをさらに結合することで、目標の標的への伝達能力を向上させることができる。
【００３７】
本発明におけるリガンドは、受容体を介したエンドサイトーシス（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ、ＲＭＥ）により標的細胞内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を増進させる受容体と特異的に結合する特性を有する物質をすべて含むものを意味し、特に、標的特異的に結合して受容体を介したエンドサイトーシス（ＲＭＥ）を行う標的特異的抗体、アプタマー、ペプチドまたは受容体特異的化学物質から群から選択されてもよく、これに限定されない。また、前記受容体特異的化学物質は、葉酸（Ｆｏｌａｔｅ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノースからなる群から選択されることが好ましいが、これに限定されない。
【００３８】
前記リガンドなどの物質を結合するために、二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の親水性物質は、リガンドなどの物質との結合に必要な官能基を有するように修飾されてもよい。前記親水性物質のうち、特に、ＰＥＧは、様々な分子量と官能基を取り込むことができ、生体内親和性が良好で、免疫反応を誘導しないなど、生体適合性に優れており、二本鎖オリゴＲＮＡの生体内での安定性を増加させ、伝達効率を増加させるため、本発明の構造体の製造において非常に好適である
【００３９】
本発明の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体において、前記二本鎖オリゴＲＮＡは、１９〜３１個のヌクレオチドからなることが好ましい。本発明で使用可能な二本鎖オリゴＲＮＡとしては、遺伝子治療用または研究用に使用されるか使用される可能性のあるいかなる遺伝子から来由した、すなわち、そのような遺伝子に配列特異的に結合することができる二本鎖オリゴＲＮＡが採択されることができる。
【００４０】
前記共有結合は、非分解性結合または分解性結合のいずれであってもよい。この際、非分解性結合としては、アミド結合またはリン酸化結合が挙げられ、分解性結合としては、ジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合、無水物結合、生分解性結合または酵素分解性結合などが挙げられるが、必ずしもこれに限定されるものではない。
【００４１】
前記第２疎水性物質は、本発明のＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体を形成できる物質であればいかなるものでも制限なく使用可能であり、分子量が１００〜２，０００であるものが好ましいが、特に、ステロイド誘導体、グリセリド誘導体、グリセロールエーテル、ポリプロピレングリコール、Ｃ１２〜Ｃ５０の不飽和または飽和炭化水素、ジアシルホスファチジルコリン、脂肪酸、リン脂質、リポポリアミンなどが使用されてもよく、これに制限されず、本発明の目的に適合するものであれば、いかなる第２疎水性物質を使用してもよい点は、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者にとって自明なことである。
【００４２】
特に、前記ステロイド誘導体は、コレステロール、コレスタノール、コール酸、コレステリルホルメート、コレスタニルホルメートおよびコレスタニルアミンからなる群から選択されてもよく、前記グリセリド誘導体は、モノ−、ジ−およびトリ−グリセリドなどから選択されてもよく、この際、グリセリドの脂肪酸は、Ｃ１２〜Ｃ５０の不飽和または飽和脂肪酸であることを特徴とする。
【００４３】
前記第２疎水性物質は、第１疎水性物質との疎水性相互作用を起こし、前記の疎水性相互作用は、磁性ナノ粒子と二本鎖オリゴＲＮＡ構造体からなるＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体を形成させる機能を果たし、前記第１疎水性物質と第２疎水性物質は、互いに同じまたは互いに異なる物質であってもよい。
【００４４】
また、前記親水性物質は、分子量１，０００〜１０，０００の非イオン性高分子来由のものが好ましい。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｏｌｉｄｏｎｅ）、ポリオキサゾリン（ｐｏｌｙｏｘａｚｏｌｉｎｅ）などの非イオン性親水性物質を使用することが好ましいが、必ずしもこれに限定されるものではない。
【００４５】
上述したように、本発明における二本鎖オリゴＲＮＡ構造体は、二本鎖オリゴＲＮＡの両末端に親水性物質および第２疎水性物質が結合している形態を有するが、一例として、下記式（２）のように二本鎖オリゴＲＮＡセンス鎖の５’末端に第２疎水性物質が結合し、３’末端に親水性物質が結合した形態の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体が用いられてもよい。
【００４６】
【化３】
0005906327.tif 000004
【００４７】
前記式（２）中、Ａは、第２疎水性物質であり、Ｂは、親水性物質であり、Ｓは、二本鎖オリゴＲＮＡのセンス鎖であり、ＡＳは二本鎖オリゴＲＮＡのアンチセンス鎖であり、ＸとＹは、好ましくは、それぞれ独立して、単純共有結合またはリンカー媒介の共有結合であるが、これに限定されない。
【００４８】
前記式（２）の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を製造する方法は、（１）親水性物質が結合した固形支持体、好ましくはＣＰＧをベースとし、ＲＮＡ単一鎖を合成する段階と、（２）前記ＲＮＡ単一鎖の５’末端に第２疎水性物質を共有結合する段階と、（３）合成が完了すると、固形支持体（ＣＰＧ）からＲＮＡ−高分子構造体を分離する段階と、（４）製造されたＲＮＡ−高分子構造体と別に合成された相補的な配列のＲＮＡ単一鎖をアニーリングして二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を製造する段階と、を含むことができる。
【００４９】
前記（３）または（４）段階の後、製造が完了すると、高速液体クロマトグラフィーにより前記反応物を精製した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置で分子量を測定して、所望の二本鎖オリゴＲＮＡおよび二本鎖オリゴＲＮＡ構造体が製造されているか否かを確認することができる。
【００５０】
前記製造方法において、（１）段階で合成されたＲＮＡ単一鎖の配列と相補的な配列のＲＮＡ単一鎖を合成する段階は、独立した合成過程として、（１）段階の前または（１）〜（４）段階のいずれか一つの過程中に行われてもよい。また、（１）段階で合成されたＲＮＡ単一鎖と相補的な配列を有するＲＮＡ単一鎖は、５’末端にリン酸基が結合した形態で用いられてもよい。
【００５１】
他の様態において、下記式（３）のようにオリゴＲＮＡのセンス鎖の５’末端に親水性物質が結合し、３’末端に第２疎水性物質が結合した形態の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体が用いられてもよい。
【００５２】
【化４】
0005906327.tif 000005
【００５３】
前記式（３）中、Ａは、第２疎水性物質であり、Ｂは、親水性物質であり、Ｓは、二本鎖オリゴＲＮＡのセンス鎖であり、ＡＳは、二本鎖オリゴＲＮＡのアンチセンス鎖であり、ＸとＹは、好ましくは、単純共有結合またはリンカー媒介の共有結合であるが、これに限定されない。
【００５４】
前記式（３）の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を製造する方法は、（１’）官能基が結合している固形支持体、好ましくはＣＰＧをベースとし、ＲＮＡ単一鎖を合成する段階と、（２’）前記ＲＮＡ単一鎖の５’末端に親水性物質を共有結合して合成する段階と、（３’）合成が完了すると、固形支持体（ＣＰＧ）から官能基が結合したＲＮＡ−親水性高分子構造体を分離する段階と、（４’）前記官能基により第２疎水性物質を結合してＲＮＡ両末端に親水性物質および第２疎水性物質が結合したＲＮＡ−高分子構造体を合成する段階と、（５’）製造されたＲＮＡ−高分子構造体と別に合成された相補的な配列のＲＮＡ単一鎖をアニーリングして二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を製造する段階と、を含むことができる。
【００５５】
前記（４’）または（５’）段階の後、製造が完了すると、高速液体クロマトグラフィーにより前記反応物を精製した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置で分子量を測定して、所望の二本鎖オリゴＲＮＡおよび二本鎖オリゴＲＮＡ構造体が製造されているか否かを確認することができる。前記製造方法において、（１’）段階で合成されたＲＮＡ単一鎖の配列と相補的な配列のＲＮＡ単一鎖を合成する段階は、独立した合成過程として、（１’）段階の前または（１’）〜（５’）段階のいずれか一つの過程中に行われてもよい。また、（１’）段階で合成されたＲＮＡ単一鎖と相補的な配列を有するＲＮＡ単一鎖は、５’末端にリン酸基が結合した形態で用いられてもよい。
【００５６】
また、リガンドが結合した形態の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体は、二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の親水性物質にリガンドが結合した形態で用いられてもよい。一例として、下記式（４）のように二本鎖オリゴＲＮＡセンス鎖の３’末端に親水性物質が結合し、親水性物質にリガンドが結合し、５’末端に第２疎水性物質が結合した形態の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体が用いられてもよい。
【００５７】
【化５】
0005906327.tif 000006
【００５８】
式（４）中、Ａは、親水性物質であり、Ｂは、第２疎水性物質であり、Ｓは、二本鎖オリゴＲＮＡのセンス鎖であり、ＡＳは、二本鎖オリゴＲＮＡのアンチセンス鎖であり、ＸとＹは、好ましくは、単純共有結合またはリンカー媒介の共有結合であるが、これに限定されず、Ｌは、受容体を介したエンドサイトーシス（ＲＭＥ）により標的細胞内在化を増進させる受容体と特異的に結合する特性を有するリガンドである。
【００５９】
前記式（４）のリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を製造する方法は、（１’’）官能基が結合している固形支持体（ＣＰＧ）に親水性物質を結合する段階と、（２’’）官能基−親水性物質が結合している固形支持体（ＣＰＧ）をベースとし、ＲＮＡ単一鎖を合成する段階と、（３’’）前記ＲＮＡ単一鎖の５’末端に第２疎水性物質を共有結合して合成する段階と、（４’’）合成が完了すると固形支持体（ＣＰＧ）から官能基−ＲＮＡ−高分子構造体を分離する段階と、（５’’）前記官能基を用いて親水性物質の末端にリガンドを結合したＲＮＡ−高分子構造体を製造する段階と、（６’’）製造されたリガンドが結合したＲＮＡ−高分子構造体と相補的な配列のＲＮＡ単一鎖をアニーリングしてリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を製造する段階と、を含むことができる。
【００６０】
前記（４’’）、（５’’）または（６’’）段階の後、製造が完了すると、高速液体クロマトグラフィーにより前記反応物とＲＮＡ−高分子構造体および相補的な配列のＲＮＡ単一鎖を分離して精製した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置で分子量を測定して、所望の二本鎖オリゴＲＮＡおよび二本鎖オリゴＲＮＡ構造体が製造されているか否かを確認することができる。
【００６１】
前記製造方法において、（３’’）段階で合成されたＲＮＡ単一鎖の配列と相補的な配列のＲＮＡ単一鎖を合成する段階は、独立した合成過程として、（１’’）段階の前または（１’’）〜（６’’）段階のいずれか一つの過程中に行われてもよい。
【００６２】
さらに他の様態において、下記式（５）のように二本鎖オリゴＲＮＡセンス鎖およびアンチセンス鎖の５’末端に親水性物質または第２疎水性物質が結合した形態のリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体が用いられてもよい。
【００６３】
【化６】
0005906327.tif 000007
【００６４】
前記式（５）中、Ａは、親水性物質であり、Ｂは、第２疎水性物質であり、Ｓは、二本鎖オリゴＲＮＡのセンス鎖であり、ＡＳは、二本鎖オリゴＲＮＡのアンチセンス鎖であり、ＸとＹは、好ましくは、単純共有結合またはリンカー媒介の共有結合であるが、これに限定されず、Ｌは、受容体を介したエンドサイトーシス（ＲＭＥ）により標的細胞内在化を増進させる受容体と特異的に結合する特性を有するリガンドである。
【００６５】
前記式（５）のリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を製造する方法は、（１’’’）固形支持体をベースとし、ＲＮＡ単一鎖を合成する段階と、（２’’’）前記ＲＮＡ単一鎖の５’末端に親水性物質を共有結合する段階と、（３’’’）固形支持体からリガンドが結合したＲＮＡ−親水性高分子構造体および別に合成された相補的な配列のＲＮＡ−第２疎水性高分子構造体の単一鎖を分離する段階と、（４’’’）前記ＲＮＡ−親水性高分子構造体と相補的な配列のＲＮＡ−第２疎水性高分子構造体のアニーリングによりリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を製造する段階と、を含むことができる。
【００６６】
前記（３’’’）または（４’’’）段階の後、製造が完了すると、高速液体クロマトグラフィーにより前記反応物を精製した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置で分子量を測定して、所望のリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡおよび二本鎖オリゴＲＮＡ構造体が製造されているか否かを確認することができる。
【００６７】
前記製造方法において、（１’’’）段階で合成されたＲＮＡ単一鎖の配列と相補的な配列のＲＮＡ−第２疎水性高分子構造体を合成する段階は、独立した合成過程として、（１’’’）段階の前または（１’’’）〜（４’’’）段階の間に、（１’’’）段階のＲＮＡ単一鎖と相補的な配列からなるＲＮＡ単一鎖を合成した後、第２疎水性物質を共有結合して第２疎水性物質が結合した形態のＲＮＡ−第２疎水性高分子構造体単一鎖を合成した後、固形支持体から分離する段階を含む。
【００６８】
前記親水性物質の官能基は、必要に応じて、他の官能基で置換されてもよい。前記親水性物質の中でも特に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、様々な分子量と官能基を取り込むことができる末端を有しており、生体内親和性が良好で、免疫反応を誘導せず、水に対する溶解度を増加させて生体内での遺伝子伝達効率を増加させる点から、本発明の構造体の製造において非常に好適である。
【００６９】
さらに他の様態において、下記式（６）のように二本鎖オリゴＲＮＡセンス鎖の５’末端に親水性物質が結合し、親水性物質にリガンドが結合し、３’末端に第２疎水性物質が結合した形態の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体が用いられてもよい。
【００７０】
【化７】
0005906327.tif 000008
【００７１】
式（６）中、Ａは、親水性物質であり、Ｂは、第２疎水性物質であり、Ｓは、二本鎖オリゴＲＮＡのセンス鎖であり、ＡＳは、二本鎖オリゴＲＮＡのアンチセンス鎖であり、ＸとＹは、好ましくは、単純共有結合またはリンカー媒介の共有結合であるが、これに限定されず、Ｌは、受容体を介したエンドサイトーシス（ＲＭＥ）により標的細胞内在化を増進させる受容体と特異的に結合する特性を有するリガンドである。
【００７２】
前記式（６）のリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を製造する方法は、（１’’’’）官能基が結合している固形支持体（ＣＰＧ）をベースとし、ＲＮＡ単一鎖を合成する段階と、（２’’’’）前記ＲＮＡ単一鎖の５’末端に親水性物質を共有結合する過程で合成する段階と、（３’’’’）前記ＲＮＡ単一鎖の親水性物質にリガンドが結合した官能基−ＲＮＡ−親水性高分子構造体を合成する段階と、（４’’’’）合成が完了すると、固形支持体（ＣＰＧ）からリガンドが結合した官能基−ＲＮＡ−親水性高分子構造体を分離する段階と、（５’’’’）前記官能基により第２疎水性物質を結合してリガンドが結合したＲＮＡ−高分子構造体を合成する段階と、（６’’’’）製造されたリガンドが結合したＲＮＡ−高分子構造体と別に合成された相補的な配列のＲＮＡ単一鎖をアニーリングして二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を製造する段階と、を含むことができる。
【００７３】
前記（５’’’’）または（６’’’’）段階の後、製造が完了すると、高速液体クロマトグラフィーにより前記反応物を精製した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置で分子量を測定して、所望のリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡおよびＲＮＡが製造されているか否かを確認することができる。前記製造方法において、（１）段階で合成されたＲＮＡ単一鎖の配列と相補的な配列のＲＮＡ単一鎖を合成する段階は、独立した合成過程として、（１’’’’）段階の前または（１’’’’）〜（６’’’’）段階のいずれか一つの過程中に行われてもよい。
【００７４】
また、本発明によるＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体を製造する方法は、（ａ）親水性物質および第２疎水性物質が結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を製造する段階と、（ｂ）第１疎水性物質が磁性物質の表面にコーティングされた磁性ナノ粒子を製造する段階と、（ｃ）前記（ａ）および（ｂ）段階で製造された二本鎖オリゴＲＮＡ構造体からなるＳＡＭｉＲＮＡと第１疎水性物質が磁性物質の表面にコーティングされた磁性ナノ粒子を混合する段階と、を含むことができる。
【００７５】
前記製造方法において、（ａ）段階と（ｂ）段階は、逐次に行われる必要はないため、順番と関係なく行われてもよい。すなわち、（ｂ）段階が（ａ）段階の前に行われてもよい。また、（ａ）段階で製造される二本鎖オリゴＲＮＡ構造体には、リガンドがさらに含まれてもよい。
【００７６】
前記ＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体において磁性ナノ粒子とＳＡＭｉＲＮＡとの質量比は０．０１：１〜１００：１であることが好ましく、０．１：１〜１０：１の質量比であることがより好ましい。
【００７７】
ＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体は、５０〜３００ｎｍの大きさを有することが好ましく、前記ＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体の多分散指数（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ；ＰＤＩ）は０．０１〜０．４であることが好ましく、０．１〜０．３の値を有することがより好ましい。
【００７８】
また、前記ＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体において、ＳＡＭｉＲＮＡ形成技術は、二本鎖オリゴＲＮＡだけでなく、一本鎖オリゴヌクレオチド、特に、治療の目的を有する単一鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）に適用されてもよい。すなわち、ＳＡＭｉＲＮＡを構成する二本鎖オリゴＲＮＡ構造体において、二本鎖オリゴヌクレオチドの代りに単一鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む一本鎖オリゴヌクレオチド構造体が、磁性ナノ粒子との複合体の形成に用いられてもよい。
【００７９】
ＡＳＯ技術は、単一鎖のＲＮＡまたはＤＮＡ鎖によりｍＲＮＡを分解して遺伝子からタンパク質への情報伝達を調節する技術である。すなわち、十分に相補的、特異的に混成化する塩基配列を選択して標的タンパク質の好ましい発現抑制が行われるようにするものである。ＡＳＯは、標的遺伝子に配列特異的に結合するため、標的遺伝子以外の他の遺伝子発現に影響を及ぼさない。したがって、ＡＳＯ技術は、特定のタンパク質の生体内における機能を分析するために有効なツールであるだけでなく、特定の疾病に対する遺伝子治療法としての活用可能性をも有する（ＦＡＳＥＢＪ．９，１２８８−１２９６，１９９５）。特に、近年、単一鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの新たな種類の一つであるアンタゴｍｉｒ（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）が開発されて、細胞内由来のｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）の機能を阻害するために使用されている。化学的に合成した短いＲＮＡであるアンタゴｍｉｒあるいはｍｉｃｒｏＲＮＡ阻害剤は、標的となるｍｉｃｒｏＲＮＡに相補的に結合してその機能を阻害すると知られている。通常、アンタゴｍｉｒは、分解されることを防止するために、２'  ｍｅｔｈｏｘｙやｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔｅなどの修飾された化学構造を有することが好ましく、現在、ガン、心臓および肺線維症を含む様々な疾病に係るｍｉＲＮＡの機能を阻害するアンタゴｍｉｒが報告されている（“Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｗｉｔｈ  ‘ａｎｔａｇｏｍｉｒｓ'”  Ｎａｔｕｒｅ，Ｄｅｃ．２００５，４３８（７０６８）；６８５−６８９；“ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ  ａｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｔａｒｇｅｔｓ”  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００６，３５４（１１）；１１９４−１１９５；Ｍｅｉｓｔｅｒ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ−ａｎｄ  ｓｉＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＲＮＡ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ”  ＲＮＡ，Ｍａｒ．２００４，１０（３）；５４４−５５０）。
【００８０】
本発明における単一鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、通常のアンチセンスだけでなく、アンタゴｍｉｒを含む特定の遺伝子の発現または活性を抑制する機能を果たすすべての一本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。
【００８１】
特に、本発明による一本鎖オリゴヌクレオチド構造体は、下記の式（７）の構造を有する。
【００８２】
【化８】
0005906327.tif 000009
【００８３】
前記式（７）中、ＡとＢのいずれか一つは親水性物質であり、他の一つは第２疎水性物質であり、ＡＳＯは、単一鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、ＸとＹは、好ましくは、それぞれ独立して、単純共有結合またはリンカー媒介の共有結合であるが、これに限定されない。
【００８４】
前記式（７）における親水性物質と第２疎水性物質、またＸおよびＹで表される単純共有結合またはリンカー媒介の共有結合は、既に説明した二本鎖オリゴＲＮＡを用いたＳＡＭｉＲＮＡ構造体で定義したことと同様な特性を有する。
【００８５】
本発明において、前記ＡＳＯは、１０〜５０個のオリゴヌクレオチドを含むことが好ましく、より好ましくは、１３〜２５個のオリゴヌクレオチドを含む。
【００８６】
また、生体内安定性を向上させるために、核酸分解酵素抵抗性を有する様々な修飾が行われたオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ；ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）形態を含む。前記修飾は、一つ以上のヌクレオチド内の糖構造の２炭素位置で−ＯＨ基が−ＣＨ３（メチル）、−ＯＣＨ３、−ＮＨ２、−Ｆ（フッ素）、−Ｏ−２−メトキシエチル、−Ｏ−プロピル、−Ｏ−２−メチルチオエチル、−Ｏ−３−アミノプロピル、−Ｏ−３−ジメチルアミノプロピル、−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミドまたは−Ｏ−ジメチルアミドオキシエチルへの置換による修飾；ヌクレオチド内の糖構造内の酸素が硫黄で置換された修飾；ヌクレオチド間の結合のホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）またはボラノホスフェート（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｐｈａｔｅ）、メチルホスホネート（ｍｅｔｈｙｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）結合への修飾などのいずれか一つ以上が組み合わされて使用されてもよく、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）またはＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）形態への修飾が使用されてもよい。
【００８７】
本発明において使用可能なＡＳＯは、治療用または研究用に使用されるものに特に限定されず、遺伝子治療または研究のために使用されるか使用される可能性のあるいかなる遺伝子に対するＡＳＯが採択されてもよい。
【００８８】
また、本発明におけるＡＳＯは、標的ｍＲＮＡと完全に相補的結合（ｐｅｒｆｅｃｔ  ｍａｔｃｈ）の関係にあるものだけでなく、一部の配列で相補的結合をなさなくても標的ｍＲＮＡと結合して、そのようなｍＲＮＡの翻訳を阻害できる不完全な相補的結合（ｍｉｓｍａｔｃｈ）の関係にあるものを使用してもよいことは、通常の技術者にとっては自明なことである。
【００８９】
本発明のＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体は、二本鎖オリゴＲＮＡの細胞内伝達を向上させ、これを疾病モデルの治療および／または診断のために応用することができる。より具体的なＳＡＭｉＲＮＡおよび磁性ナノ粒子の製造および特徴、細胞伝達効率および効果については、後述する実施例においてより詳細に説明する。
【００９０】
また、本発明は、前記ＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体を用いた遺伝子治療および／または診断方法を提供する。具体的に、前記二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を合成する段階と、第１疎水性物質が磁性物質の表面にコーティングされた磁性ナノ粒子およびＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体を準備する段階と、前記ＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体を体内に投入する段階と、を含むガンおよび感染性疾患などを含む疾病の診断および／または治療方法を提供する。
【００９１】
本発明は、ＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体を含む治療および／または診断のための組成物を提供する。特に、本発明によるＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体は、治療および診断を同時に行うことができる利点を有する。本発明の組成物は、投与のために前記有効成分以外にさらに薬剤学的に許容可能な担体が１種以上含まれることができる。薬剤学的に許容可能な担体は、本発明の有効成分と両立可能である必要があり、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセリン、エタノールおよびこれらの成分のいずれか一つ以上の成分を混合して使用してもよく、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など、他の通常の添加剤を添加してもよい。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤をさらに含み、水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形に製剤化することができる。特に、凍結乾燥した形態の剤形に製剤化して提供することが好ましい。凍結乾燥の剤形を製造するために、本発明が属する技術分野において通常知られている方法が使用されてもよく、凍結乾燥のための安定化剤が追加されてもよい。
【００９２】
本発明の組成物は、投与のために前記の有効成分以外に、薬剤学的活性成分を１種以上さらに含んで製造されることができる。前記本発明の組成物に含まれる薬剤学的活性成分が抗ガン剤、抗生剤、ホルモン、ホルモン拮抗剤、インターロイキン、インターフェロン、成長因子、腫瘍壊死因子、エンドトキシン、リンフォトキシン、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性剤、ＲＮＡ分解阻害剤、アルキルホスホコリン、放射性同位元素標識成分、界面活性剤、心血管系薬物、胃腸関係薬物および神経系薬物からなる群から選択された一つ以上であってもよい。
【００９３】
本発明の薬剤学的組成物は、通常、患者の症状と疾病の深刻度に応じて本技術分野における通常の専門家が決定することができる。また、散剤、錠剤、カプセル剤、液剤、注射剤、軟膏剤、シロップ剤などの様々な形態に製剤化することができ、単一投与量または多回投与量容器、例えば、アンプルおよびビンなどで提供されることができる。
【００９４】
本発明の薬剤学的組成物は、経口または非経口投与が可能である。本発明による薬剤学的組成物の投与経路は、これらに限定されるものではなく、例えば、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、硬皮、皮下、腹腔内、腸管、舌下または局所投与が可能である。
【００９５】
かかる臨床投与のために、本発明の薬剤学的組成物は、公知の技術を用いて好適な剤形に製剤化することができる。本発明の組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、方法、排泄率および疾病の重症度などに応じてその範囲が様々であり、本技術分野における通常の専門家が容易に決定することができる。
【００９６】
以下、実施例を参照して本発明についてより詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨により本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないということは、当該技術分野における通常の知識を有する者にとって自明なことである。
【００９７】
実施例１．ＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体の製造
ＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体は、二本鎖オリゴＲＮＡ構造体と第１疎水性物質が磁性物質の表面にコーティングされた磁性ナノ粒子をそれぞれ製造した後、二つの物質を混合して複合体の形態に製造された。
【００９８】
実施例１−１．二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の製造
以下、実施例では、サバイビンを抑制するためにサバイビン二本鎖オリゴＲＮＡを使用した。サバイビンは、今までテストされたほとんどの新生腫瘍や形質転換された細胞株において共通して発現するタンパク質であって、抗ガン治療において重要な標的になると予測されている（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ；ａ  ｎｅｗ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｒｅｖ．２００９  Ｎｏｖ；３５（７）；５５３−６２）。
【００９９】
本発明のサバイビン二本鎖オリゴＲＮＡは、配列番号１と記載されるセンス鎖とこれに相補的な配列であるアンチセンス鎖からなっており、対照群として使用される二本鎖オリゴＲＮＡは、配列番号２と記載されるセンス鎖とこれに相補的な配列であるアンチセンス鎖からなっている。本実施例に使用される二本鎖オリゴＲＮＡは、下記の塩基配列からなっている。
【０１００】
（配列番号１）５’−ＡＡＧ  ＧＡＧ  ＡＵＣ  ＡＡＣ  ＡＵＵ  ＵＵＣ  Ａ−３’
（配列番号２）５’−ＣＵＵ  ＡＣＧ  ＣＵＧ  ＡＧＵ  ＡＣＵ  ＵＣＧ  Ａ−３’
【０１０１】
前記二本鎖オリゴＲＮＡは、β−シアノエチルホスホラミダイト（２’ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ  ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  β−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）を用いてＤＮＡ骨格構造をなすホスホジエステル結合を連結する方法を用いて、前記二本鎖オリゴＲＮＡ単一鎖を合成した。合成過程は、ヌクレオシドが結合した固形支持体（ＣＰＧ）から開始し、遮断除去（ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ）、結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）、キャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）および酸化（ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）からなる繰り返し過程を繰り返すことで、所望の配列のＲＮＡを得る。
【０１０２】
具体的に、サイクルの最初段階である遮断除去段階は、ヌクレオチドが結合した固形支持体（ＣＰＧ）に３％の卜リクロロ酢酸を処理してＤＭＴ（４，４’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ）を除去し、次の段階である結合段階は、以前段階で固形支持体（ＣＰＧ）に形成された５’−水酸基と所望の配列のヌクレオシドホスホラミダイトモノマー（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ  ｍｏｎｏｍｅｒ）と結合反応によりオリゴヌクレオチド鎖が連結される段階である。
【０１０３】
第三の段階であるキャッピング段階は、結合段階で反応されなかった５’−水酸基を遮断（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）して次のサイクルで結合過程で所望しない塩基配列を有するオリゴヌクレオチド鎖を排除する段階であって、無水酢酸とＮ−メチルイミダゾール（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ）を処理してアセチル化する。最後の段階である酸化段階は、結合段階で形成された５’−水酸基とホスホラミダイトとの結合が亜リン酸トリエステル結合をなすが、これをホスホジエステル結合に変換させる段階であって、０．０２Ｍの酸化溶液（Ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（０．０２Ｍ−Ｉ２  ｉｎ  ＴＨＦ／ピリジン／Ｈ２Ｏ））を処理して亜リン酸がリン酸に変更される。当該一連のＲＮＡ単一鎖の合成過程は、ＲＮＡ合成機（３８４Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ、ＢＩＯＮＥＥＲ社製、韓国）を使用して行われた。
【０１０４】
二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の二本鎖オリゴＲＮＡセンス鎖の場合、上述した方式通りに、β−シアノエチルホスホラミダイトを用いてＲＮＡ骨格構造をなすホスホジエステル結合を連結する方法を用いて合成を行った後、さらに５’末端にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ホスホラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）に続けて二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の二本鎖オリゴＲＮＡセンス鎖を作製した。前記ＲＮＡ−親水性高分子構造体センス鎖とアニーリングを行うアンチセンス鎖の場合、上述した方式通りに、β−シアノエチルホスホラミダイトを用いてＲＮＡ骨格構造をなすホスホジエステル結合を連結する方法を用いて合成を行った後、さらにジスルフィド結合が含まれている炭素数２４個のテトラドコサン試薬を通常の遮断除去、結合（、キャッピングおよび酸化からなる過程により５’末端に結合してＲＮＡ−第２疎水性高分子構造体のアンチセンス鎖を作製した。
【０１０５】
リガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の場合、上述した方式通りに、β−シアノエチルホスホラミダイトを用いてＲＮＡ骨格構造をなすホスホジエステル結合を連結する方法を用いて合成を行った後、さらに５’末端部位にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ホスホラミダイトを結合した後、リガンドが結合したホスホラミダイトまたはリガンドが結合したＮＨＳ形態の結合可能なリガンドを製造してポリエチレングリコール（ＰＥＧ）末端部位にリガンドを結合することでリガンドが結合したＲＮＡ−第２疎水性高分子構造体センス鎖を作製した。前記リガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体とアニーリングを行うアンチセンス鎖の場合、上述した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体アンチセンス鎖と同じ方法で製造した。
【０１０６】
合成が完了すると、６０℃の恒温槽で２８％（ｖ／ｖ）のアンモニア処理を施して合成されたＲＮＡおよびＲＮＡ−高分子構造体（ＲＮＡ−親水性高分子構造体センス鎖、ＲＮＡ−第２疎水性高分子構造体アンチセンス鎖、リガンドが結合したＲＮＡ−親水性高分子構造体センス鎖）を固形支持体（ＣＰＧ）から分離した後、脱保護（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）反応により保護残基を除去した。保護残基が除去された二本鎖オリゴＲＮＡおよび二本鎖オリゴＲＮＡ構造体は、７０℃のオーブンでＮ−メチルピロリドン（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｏｌｉｄｏｎ）、トリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）およびトリエチルアミントリヒドロフルオリド（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅｔｒｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｉｄｅ）を１０：３：４の体積比で処理して２’ＴＢＤＭＳ（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）を除去した。
【０１０７】
前記反応物を高速液体クロマトグラフィー（ＬＣ−２０Ａ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製、日本）によりＲＮＡを分離し、これをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製、日本）で分子量を測定し、合成しようとする塩基配列のＲＮＡ−高分子構造体単一鎖およびリガンドが結合したＲＮＡ−高分子構造体単一鎖と対応するかを確認した。
【０１０８】
次に、それぞれの二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を製造するためにセンスとアンチセンスＲＮＡ鎖を同量混合して１Ｘアニーリングバッファー（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  酢酸カリウム、２ｍＭの酢酸マグネシウム、ｐＨ７．０〜７．５）に投入し、９０℃の恒温槽で３分間反応させた後、また３７℃で反応させて、標的二本鎖オリゴＲＮＡ構造体およびリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体をそれぞれ製造した。製造された二本鎖オリゴＲＮＡ構造体は、電気泳動によりアニーリングを確認した。
【０１０９】
実施例１−２．第１疎水性物質が磁性物質の表面にコーティングされた磁性ナノ粒子の製造
第１疎水性物質が磁性物質の表面にコーティングされた磁性ナノ粒子は、ｉ）オレイン酸鉄錯体を形成するために水に溶かした塩化鉄をエタノール、蒸留水および核酸を含む溶媒混合物に溶かしたオレイン酸ナトリウムと反応させる段階と、ｉｉ）ナノ粒子を生成するために前記オレイン酸鉄錯体を非活性環境下で脱水したオクタデセンとオレイン酸混合物を添加して加熱させる段階と、を含む方法によりオレイン酸鉄錯体を完全に分解させて、酸化鉄ナノ粒子を製造した。前記反応により生成されたナノ粒子を含む溶液が常温で冷却され、過量のエタノールを加えて遠心分離によって分離および上澄み除去による洗浄過程を３回繰り返した後、前記残余物に含まれたエタノールを真空乾燥によって除去した。前記結果で生じた生成物は、核酸中に簡単に再分散されて所望の鉄ナノ粒子を製造した（韓国特開第２００７−０１０２６７２号公報参照）。
【０１１０】
実施例１−３．ＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体の製造
二本鎖オリゴＲＮＡ構造体と第１疎水性物質が磁性物質の表面にコーティングされた磁性ナノ粒子は、二本鎖オリゴＲＮＡ構造体一側の末端に結合した第２疎水性物質間の疎水性相互作用によって磁性ナノ粒子が核として存在するＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体を形成する（図１参照）。
【０１１１】
実施例１−１で製造された二本鎖オリゴＲＮＡ構造体と実施例１−２で製造された第１疎水性物質が磁性物質の表面にコーティングされた磁性ナノ粒子は、超音波分散機により均質化した形態のＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体に製造された。詳細に説明すると、二本鎖オリゴＲＮＡ構造体１．５ｍｇをＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）２ｍＬに溶かした後、磁性ナノ粒子（２０ｎｍ、１ｗｔ％、ｉｎ  ｈｅｘａｎｅ）２００μＬを添加した。超音波分散機（Ｗｉｓｅｃｌｅａｎ、ＤＡＩＨＡＮ社製、韓国）でナノ粒子の大きさを均質化（２００Ｗ、４０ｋＨｚ、ｏｎ  ｉｃｅ）した後、５０００ｐｍで１０分間遠心分離してＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体が存在する中問層を採取した。
【０１１２】
実施例２．ＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体の物性分析
実施例１−３で製造されたＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体の形成および形態を確認した。
【０１１３】
実施例２−１．ＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体の粒径および多分散指数（ＰＤＩ）の測定
ゼータ電位測定装置（ｚｅｔａ−ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）により前記ナノ粒子の大きさを測定した。実施例１−３で製造されたＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体は、ゼータ電位測定装置（Ｎａｎｏ−ＺＳ、ＭＡＬＶＥＲＮ社製、英国）で大きさを測定したが、物質に対する屈折率（Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ）は１．４５４、吸収率は０．００１とし、溶媒である水の温度２５℃およびそれによる粘度および屈折率を入力して測定した。１回の測定は、大きさを２０回繰り返して測定することで行われ、これを３回繰り返した。
【０１１４】
ＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体は、１００ｎｍ未満の大きさと０．３未満の多分散指数（ＰＤＩ）値を観察することができた（図２参照）。多分散指数（ＰＤＩ）値は、低いほど当該粒子が均一に分布していると判断できる数値であって、前記ナノ粒子は比較的均一な大きさのナノ粒子を形成し、これは、エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれるために十分な大きさである（Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ａ．Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．ｎａｔｕｒｅ  ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：８４−８５、２００９）。ＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体は、粒子内部に磁性ナノ粒子が位置する構造を有するが、磁性ナノ粒子にコーティングされている第１疎水性物質と二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の第２疎水性物質との相互作用によりＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体の構造が安定化することで、比較的小さく、均一な大きさを形成することを確認することができた。
【０１１５】
実施例２−２．ＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体の透過型電子顕微鏡観察
前記ＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体が形成された形態は、透過型電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＴＥＭ）により観察した。
【０１１６】
具体的に実施例１−３で製造されたＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体を均質化して観察した。ＴＥＭにより観察されたナノ粒子は、実施例２−１で測定されたナノ粒子の大きさと類似した程度に、ナノ粒子がよく形成されたことが確認され、第１疎水性物質が磁性物質の表面にコーティングされた磁性ナノ粒子のみを観察した写真とは異なり、当該磁性ナノ粒子の表面に二本鎖オリゴＲＮＡ構造体からなる表面がさらに形成されていることを確認することができた（図３参照）。
【０１１７】
実施例３．ＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体を用いた腫瘍細胞株での標的遺伝子の発現抑制
前記実施例１−３で製造したＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体を用いて腫瘍細胞株であるヒト子宮頚部ガン細胞株（ＨｅＬａ）を形質転換させ、前記形質転換された腫瘍細胞株で標的遺伝子であるサバイビン遺伝子の発現パターンを分析した。
【０１１８】
実施例３−１．腫瘍細胞株の培養
アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ）から手に入れたヒト子宮頚部ガン細胞（ＨｅＬａ）は、ＥＭＥＭ培養培地（ＡＴＣＣ−ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ、アメリカ）に１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬを添加し、３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【０１１９】
実施例３−２．ＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子を用いた腫瘍細胞株の形質転換
前記実施例３−１で培養された腫瘍細胞株を１つのウェル当たり１．３×１０５を前記実施例の３−１条件下で６−ウェルプレートで１８時間ＥＭＥＭ培養培地で培養してから培地を除去した後、各ウェル当たり同量のＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を分注した。
【０１２０】
Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地１００μＬに前記実施例１−３で製造したＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体を添加してＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体形質転換用溶液を製造した。次に、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭが分注された腫瘍細胞株の各ウェルに形質転換用溶液をそれぞれ１００〜２００ｎＭの濃度で処理し、３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で計４８時間培養した。
【０１２１】
実施例３−３．サバイビン遺伝子のｍＲＮＡ相対定量分析
前記実施例３−２でトランスフェクションされた細胞株から全体ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成した後、リアルタイムＰＣＲによりサバイビンｍＲＮＡ発現量を韓国特開第２００９−００４２２９７号公報の方法にしたがって相対定量した。
【０１２２】
配列番号１の二本鎖オリゴＲＮＡが含まれているＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体が処理された実験群は、配列番号２の二本鎖オリゴＲＮＡが含まれているＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体対照群に比べて、当該ナノ粒子に含まれている二本鎖オリゴＲＮＡの標的遺伝子であるサバイビンｍＲＮＡの発現が阻害されることを確認することができた。
【０１２３】
実施例４．ＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ複合体の磁気共鳴映像（ＭＲＩ）撮影
前記実施例１−３と同じ方法で製造したＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体の生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）条件下での磁気共鳴映像診断可能性を確認するために、ヒト口腔ガン上皮細胞であるＫＢ細胞株からなる腫瘍を有するマウスに投与し、ＭＲＩ撮影によりガンの診断を確認した。
【０１２４】
実施例４−１．ＫＢ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｍｏｄｅｌの準備
実施例３−１で培養されたＫＢ細胞株を１×１０６ずつ５週齢ヌードマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ  ｎｕ）の背部の両皮下組織に投与（Ｓｕｂｃｕｔｅｎｏｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）して二つの腫瘍組織の成長を誘導した。投与後、２日おきに腫瘍の長軸および短縮の長さを測定して腫瘍の成長を観察し、投与後、２週経過した時点で約２００〜３５０ｍｍ３ほど腫瘍が成長したことを確認した。
【０１２５】
実施例４−２．ＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体の投与およびＭＲＩ撮影
実施例４−１で準備したＫＢ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｍｏｄｅｌに実施例１−３で製造したＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体は、両方のガン組織にそれぞれ（左）３００および（右）３０μｇの量で腫瘍内に１回投与した後、ＭＲＩ撮影（Ｔ４．７  ＭＲＩ、Ｂｒｕｋｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を行った。ＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体が投与された実験群（図４の（Ｂ）参照、（Ａ）は未投与群）の場合、３００μｇ投与した腫瘍部位でガン組織の映像信号が黒色に表示されてガン組織の存在を確認することができ、これは、磁性ナノ粒子のみを投与した実験群の映像信号と類似した程度を示して、ＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体によるガン組織の診断が可能であることを確認することができた（図４参照；撮影角度−Ｃｏｒｏｎａｌ  Ｓｅｃｔｉｏｎ、冠状断面Ａｘｉａｌ  Ｓｅｃｔｉｏｎ、側直角断面）。
【産業上の利用可能性】
【０１２６】
本発明によるＳＡＭｉＲＮＡ−磁性ナノ粒子複合体は、向上した二本鎖オリゴＲＮＡの生体安定性および均質なナノ粒子の大きさにより細胞伝達効率が増加して優れた治療効能を示し、磁性ナノ粒子の特性により診断の目的にも活用することができる。すなわち、治療と診断が同時に行われることができるいわゆるセラグノーシスに用いられることができるため、疾病の診断および治療のための新たな形態の二本鎖オリゴＲＮＡ伝達システムとしてバイオテクノロジーのための基礎研究および医薬産業など様々な産業分野にわたり非常に有効に使用されることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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