(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３に記載のアミノ酸配列を包含するヒトＩＧＦＢＰ−４タンパク質のアミノ酸残基Ｍ１３５とＫ１３６との間のＰＡＰＰ−Ａ依存性開裂によって発生する新規エピトープを特異的に認識する抗体であって、全長ヒトＩＧＦＢＰ−４に対する交差反応性が５％未満である抗体。
【請求項２】
新規エピトープを、全長ヒトＩＧＦＢＰ−４を認識するよりも高い親和性をもって特異的に認識することを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
モノクローナル抗体またはその断片である、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
組み換え抗体またはその断片である、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項５】
循環器系疾患または癌の診断のために、ヒトＩＧＦＢＰ−４タンパク質のアミノ酸残基Ｍ１３５とＫ１３６との間のＰＡＰＰ−Ａ依存性開裂によって発生するヒトＩＧＦＢＰ−４タンパク質分解断片の少なくとも１種を定性的または定量的に検出するための方法であって、
該断片を含有する生物学的試料を請求項１〜３のいずれかの抗体と接触させ、そして
抗体と該断片との複合体の存在またはその量を検出する
ことを包含する方法。
【請求項６】
ＩＧＦＢＰ−４断片と全長ＩＧＦＢＰ−４タンパク質を区別することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）内因性ヒトＩＧＦＢＰ−４タンパク質分解断片、組み換えヒトＩＧＦＢＰ−４タンパク質分解断片または合成ペプチドであって、ＩＧＦＢＰ−４のアミノ酸残基Ｍ１３５とＫ１３６との間のＰＡＰＰ−Ａ依存性開裂によって発生する新規エピトープに相当するエピトープを包含する断片またはペプチドを標準物質として用いて検量曲線を作製し、そして
（ｂ）抗体によって検出された断片を、作製した検量曲線と比較することによって、試料中に存在する抗体検出断片の量を決定する
ことを包含する、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれかの抗体を少なくとも１種包含するアッセイにおける、ＩＧＦＢＰ−４のアミノ酸残基Ｍ１３５とＫ１３６との間のＰＡＰＰ−Ａ依存性開裂によって発生する新規エピトープに相当するエピトープを包含する、内因性ＩＧＦＢＰ−４タンパク質分解断片、組み換えＩＧＦＢＰ−４タンパク質分解断片、または合成ペプチドの、標準物質または検量物質としての使用。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれかの抗体の製造における、ＩＧＦＢＰ−４のアミノ酸残基Ｍ１３５とＫ１３６との間のＰＡＰＰ−Ａ依存性開裂によって発生する新規エピトープに相当するエピトープを包含する、内因性ＩＧＦＢＰ−４タンパク質分解断片、組み換えＩＧＦＢＰ−４タンパク質分解断片、または合成ペプチドの製造用抗原としての使用。
【請求項１０】
患者試料中のＩＧＦＢＰ−４タンパク質分解断片の診断的アッセイを行うためのキットであって、
（ａ）請求項１〜４のいずれかの抗体、および
（ｂ）請求項８において定義した標準物質または検量物質
を包含するキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＧＦＢＰ−４（インスリン様成長因子結合タンパク質−４）の断片を患者血液から検出することを包含する、循環器系疾患および癌疾患を含むヒト疾患の診断方法に関する。
【０００２】
本発明は、特異的なタンパク質分解酵素であるＰＡＰＰ−ＡによるＩＧＦＢＰ−４分子の開裂後に発生する、ＩＧＦＢＰ−４のタンパク質分解断片（Ｎ末端断片とＣ末端断片のいずれか）に特異的な抗体、ならびに前記抗体のエピトープを提供する。これら特定のエピトープを認識する抗体は、ＩＧＦＢＰ−４断片のみに対して特異的であり、全長ＩＧＦＢＰ−４分子との交差反応性は全くないか低度のものである。抗体は、ヒト血液中のＩＧＦＢＰ−４断片の定量的または定性的な検出のための免疫アッセイ法の開発に使用することができる。
【背景技術】
【０００３】
以前はソマトメジン類として知られていたインスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）およびインスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）は、インスリンと構造的に関連しており、ヒト血漿中に最も豊富に循環している２種のポリペプチド成長因子である（１）。ＩＧＦは、正常な組織の成長と再生を司る多能性成長因子である。更にＩＧＦは、そのグルコース低下作用およびインスリン感作作用によって、グルコース恒常性に有益な効果をもたらすことが示唆されている。しかし、ＩＧＦの全ての効果が好ましいわけではなく、疫学的研究によって、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの通常癌、アテローム性動脈硬化症および２型糖尿病の発生における関与が示唆されている（２）。
【０００４】
ＩＧＦは、平滑筋細胞やマクロファージなどを含む多数種の細胞によって分泌されている。ＩＧＦの細胞効果は、膜に結合した高親和性受容体によって仲介されている。ＩＧＦ受容体には２つの個別の種類があり、広範囲にわたる細胞種によって発現されている。ＩＧＦは強力な平滑筋細胞マイトジェンであり、パラ分泌機構、自己分泌機構または内分泌機構によるアテローム硬化性病変の形成におけるこれらポリペプチドの寄与が示唆されている（３）。
【０００５】
血漿およびその他の体液においてＩＧＦは、ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）と呼ばれる、構造的に関連したタンパク質群からなるファミリーのタンパク質と複合体を形成している。ＩＧＦＢＰは、循環ＩＧＦプールの約９９％と結合する。このタンパク質ファミリーには少なくとも６種のＩＧＦＢＰが含まれる。ＩＧＦＢＰはＩＧＦ受容体とは別のものである。ＩＧＦＢＰは、骨などを含む種々の組織においてＩＧＦの効果を調節すると考えられている（４）。
【０００６】
ＩＧＦＢＰ−４は、最初はヒト骨細胞馴化培地から２５ｋＤａのタンパク質として精製された。その後、ＩＧＦＢＰ−４は、種々の細胞種について回収した馴化培地からも精製され、様々な細胞種によるＩＧＦＢＰ−４の発現が明らかとなった（５，６）。ヒトＩＧＦＢＰ−４タンパク質の一次構造は、ヒト胎盤相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライブラリーおよびヒト骨肉種ｃＤＮＡライブラリーから演繹された（７，８）。ヒトＩＧＦＢＰ−４のｃＤＮＡは２５８残基からなるタンパク質をコードし、このタンパク質は、シグナル配列の除去によってプロセシングされ、アスパラギン結合グリコシル化部位を１つ有する２３７残基（２５．６ｋＤａ）の成熟タンパク質になる（７）。様々な細胞種が培養条件下ではグリコシル化型ＩＧＦＢＰ−４（２８〜２９ｋＤａ）と非グリコシル化型ＩＧＦＢＰ−４（２４〜２５ｋＤａ）の両方を分泌するものの、典型的には非グリコシル化型が正常ヒト血液に最も豊富に含まれるものである（５，６）。
【０００７】
６種のＩＧＦＢＰの中でも、２つの余分のシステイン残基を可変Ｌドメインに有するＩＧＦＢＰ−４はユニークなタンパク質である。ＩＧＦＢＰ−４のユニークな特性によって、ＩＧＦＢＰ−４の独自の生物学的機能が生じていると考えられる（１３）。
【０００８】
成人血清における平均ＩＧＦＢＰ−４レベルは、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２およびＩＧＦＢＰ−６のいずれのレベルよりも高く、ＩＧＦＢＰ−５レベルとほぼ同等であり、ＩＧＦＢＰ−３レベルよりも低い。血清ＩＧＦＢＰ−４が年齢と共に増加する傾向は、ＩＧＦＢＰ−１およびＩＧＦＢＰ−２に関する報告と類似しているが、年齢と共に減少するＩＧＦＢＰ−３およびＩＧＦＢＰ−５のレベルとは異なることから、種々のＩＧＦＢＰのヒト血清レベルは、加齢と共に差動的に調節されることを示唆している（１２）。
【０００９】
血清ＩＧＦＢＰ−４の正確な機能的役割は完全に明らかなわけではないが、in vitroの研究によって、ＩＧＦＢＰ−４は骨細胞やその他の細胞においてＩＧＦ活性を阻害することが示された。Mohan et al.（９，１０）は、ＩＧＦＢＰ−４が胎生ニワトリ頭蓋冠細胞およびＭＣ３Ｔ３−Ｅ１マウス骨芽細胞のＩＧＦ−Ｉ誘導性細胞増殖およびＩＧＦ−ＩＩ誘導性細胞増殖の両方を阻害することを明らかにした。ＩＧＦＢＰ−４は、ＩＧＦ−Ｉ促進性およびＩＧＦ−ＩＩ促進性のＤＮＡ合成を種々の細胞種において阻害する（６）。
【００１０】
ＩＧＦＢＰ−４の合成は、全身ホルモンおよび局所成長因子によって、転写レベルまたは転写後のレベルにおいて調節されている可能性がある（１１）。In vitroの研究によって、副甲状腺ホルモン、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、トランスフォーミング増殖因子−βおよび骨形成タンパク質１／骨形成タンパク質７は、ヒト骨細胞におけるＩＧＦＢＰ−４産生の主要な調節因子であることが判明した（８，９）。
【００１１】
特異的なタンパク質分解は、ＩＧＦＢＰ−４機能の主な調節機構である。ＩＧＦ依存性ＩＧＦＢＰ−４特異的タンパク質分解酵素は、最初はヒト真皮線維芽細胞馴化培地およびヒツジ真皮線維芽細胞馴化培地の両方について報告された。このタンパク質分解酵素は、後に妊娠関連血漿タンパク質Ａ（ＰＡＰＰ−Ａ）であると同定された。同じタンパク質分解活性が、培養したヒト骨芽細胞、血管平滑筋細胞、顆粒膜細胞、栄養芽細胞および脱落膜性子宮内膜間質細胞のそれぞれに由来する馴化培地のみならず、卵胞液およびヒト妊娠血清からも検出された（１３）。
【００１２】
ＰＡＰＰ−Ａは、ヒト妊娠血清から１９７４年に、好酸球のプロ主要塩基性タンパク質（ｐｒｏＭＢＰ）と共に形成した四量体複合体として初めて単離された。ＰＡＰＰ−Ａは、メタロプロテアーゼである大きなメトジンシンファミリーに属することが判明した。組み換えＰＡＰＰ−Ａは、ＩＧＦＢＰ−４をＭ１３５／Ｋ１３６（アミノ酸残基の１文字表記を使用）の間の単一部位で開裂させることのできる、活性型タンパク質分解酵素であることが示されている。ＰＡＰＰ−ＡによるＩＧＦＢＰ−４開裂は、ＩＧＦＢＰがＩＧＦと複合体を形成している場合にのみ可能である。ＰＡＰＰ−Ａは、ＩＧＦＢＰ−５をＳ１４３／Ｋ１４４の間でも開裂させるが、この場合は、ＩＧＦの存在は必要ない。
【００１３】
妊娠関連血漿タンパク質Ａは、Bayes-Genis et al.（１６）の研究に鑑みて、最初はアテローム性動脈硬化巣の不安定性に対する生物学的マーカーとして提案された。上記著者らは、不安定な動脈硬化巣の細胞外マトリクスにおいてＰＡＰＰ−Ａが高レベルであることを実証した。いくつかの研究によって、急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）の患者血液におけるＰＡＰＰ−Ａ濃度が、安定な冠動脈疾患の患者血液または対照個体の血液の場合よりも高いことが示されている。従ってＰＡＰＰ−Ａは、不安定な狭心症や心筋梗塞などの冠状動脈血液凝固に関連した循環器系疾患のマーカーとしての用途が提案されている。
【００１４】
アテローム性動脈硬化巣において、活性化平滑筋細胞によって発現されたＰＡＰＰ−Ａは、ＩＧＦと複合体を形成したＩＧＦＢＰ−４を開裂させる活性酵素として機能することが可能であり、その結果、ＩＧＦのバイオアベイラビリティーを増強するとの仮説が立てられた。ＩＧＦシステムは、急性冠状動脈症状に繋がる、アテローム性動脈硬化巣の発生、脱安定化および破裂に寄与している可能性もある（１７）。
【００１５】
ＩＧＦＢＰ−４は、肺腺癌、非小細胞肺癌、乳癌、結腸癌腫、濾胞性甲状腺癌腫、胃癌、神経膠腫、肝臓癌、骨髄腫、神経芽腫、骨肉腫および前立腺癌などの腫瘍に由来する種々の細胞による発現が知られている。In vitroおよびin vivoの研究は、ＩＧＦＢＰ−４が、おそらくは自己分泌ＩＧＦの活性阻害によって、種々の腫瘍の増殖制御において重要な役割を担っていると示唆している。ＩＧＦのバイオアベイラビリティーの調節は、腫瘍の増殖および発生において重要な役割を担っている可能性がある（１３）。
【００１６】
入手可能な証拠は、不安定なアテローム性動脈硬化巣を有する患者のみならず、癌を有する患者の識別における血漿ＰＡＰＰ−Ａ濃度の測定値の有用性を示唆するように見受けられる。しかし、今では、ＰＡＰＰ−Ａの正確な血液測定は簡単な作業ではないことが判明した。これは、まず初めに、患者血漿中のこのタンパク質の濃度が非常に低レベルであるという事実によるものである。更にヘパリン注射が患者血漿中のＰＡＰＰ−Ａレベルに影響を与えうることも知られている（１８）。
【００１７】
我々は、ＰＡＰＰ−Ａ酵素活性によって生じた産物の測定の方が、直接ＰＡＰＰ−Ａを測定するよりも臨床的価値が高いことを提案した。なぜなら、このような産物はＰＡＰＰ−Ａよりも高濃度で血中に存在し、その血中濃度は、ヘパリン注射の影響を受けないはずだからである。
【００１８】
本発明は、体内で上昇したＰＡＰＰ−Ａ活性のマーカー、更にはＰＡＰＰ−Ａの濃度および活性の上昇に関連した種々の疾患のためのマーカーとしての、ＩＧＦＢＰ−４断片の利用に関する。患者試料中の完全なＩＧＦＢＰ−４の存在の影響を受けることなく、ＩＧＦＢＰ−４のタンパク質分解断片を特異的に測定するために設計した免疫アッセイ法は、ＡＣＳや癌などの種々の病理の診断または予測において、実用価値を発揮しうるものである。
【発明の概要】
【００１９】
本発明は、循環器系疾患および癌などのヒト病理のための新規な血液マーカーである、ＩＧＦＢＰ−４のタンパク質分解断片の発見に基づくものである。
【００２０】
我々の研究においては、アテローム性動脈硬化巣において発現されているＰＡＰＰ−Ａが、活性タンパク質分解酵素であることを示した。アテローム性動脈硬化症の血管から得たＰＡＰＰ−Ａを均一になるまで精製し、それがＩＧＦ−ＩＩの存在下で効果的にＩＧＦＢＰ−４を開裂することを示した。ＰＡＰＰ−Ａは、ＩＧＦＢＰ−４をアミノ酸残基Ｍ１３５とＫ１３６との間で開裂し、２つのＩＧＦＢＰ−４断片、即ち、（完全ＩＧＦＢＰ−４分子のＮ末端からＭ１３５までを含む）「Ｎ末端断片」および（完全ＩＧＦＢＰ−４分子のＫ１３６からＣ末端までを含む）「Ｃ末端断片」をもたらす。
【００２１】
ＩＧＦＢＰ−４タンパク質分解断片に特異的であり、全長分子とは全くまたは低度しか交差反応性を示さないモノクローナル抗体を得た。これらのＭＡｂは、ＰＡＰＰ−ＡによるＩＧＦＢＰ−４のアミノ酸残基Ｍ１３５とＫ１３６との間の開裂の結果として発生する新規エピトープのみを認識し、完全（全長）ＩＧＦＢＰ−４分子とは全くまたは低度しか交差反応性を示さなかった。具体的には、本発明の抗体は、ＩＧＦＢＰ−４の酵素依存性開裂によって発生した新規エピトープを、全長ＩＧＦＢＰ−４を認識する場合よりも高い親和性をもって特異的に認識する。
【００２２】
これらの断片特異的抗体の１種を、完全ＩＧＦＢＰ−４を認識する別の抗体とペアで使用することによって、いくつかのサンドイッチ免疫アッセイを設計した。これらアッセイは、試料中の全長ＩＧＦＢＰ−４の存在の影響を受けることなく、ＩＧＦＢＰ−４断片を定量するためのアッセイに適している（図２Ｂ）。
【００２３】
ＡＣＳ患者血液および健常ドナー血液について、ＩＧＦＢＰ−４の２種のタンパク質分解断片を測定するために免疫アッセイ法を使用した。ＩＧＦＢＰ−４タンパク質分解断片のレベルは、健常ドナー血液よりもＡＣＳ患者血液において有意に高いことが示された。ＡＣＳ患者の血漿におけるＩＧＦＢＰ−４断片の平均レベルは、健常ドナーの血漿の３．２倍も高かった（ｐ＜０．０００５）（図３）。これら知見に基づき、我々は、ＩＧＦＢＰ−４の２種のタンパク質分解断片は、どちらもアテローム性動脈硬化巣の不安定化および破裂のマーカーとして使用できることを提案した。
【００２４】
従って、本発明においては、循環器系疾患を含むヒト病理に対する新規マーカーとなるＩＧＦＢＰ−４の断片、ならびに患者血液中のＩＧＦＢＰ−４断片の測定値を用いたＡＣＳの予後判定および診断のための方法について詳述する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】アテローム性動脈硬化症の組織から精製したＰＡＰＰ−Ａのタンパク質分解酵素活性を示す、ＩＧＦＢＰ−４のタンパク質分解断片のウェスタンブロッティングによる検出。ＩＧＦＢＰ−４（レーン当たり２００ｎｇ）を次の酵素で処理した。レーン１：組み換えＰＡＰＰ−Ａ、レーン２：アテローム性動脈硬化症の組織のＰＡＰＰ−Ａ、レーン３：ＰＡＰＰ−Ａなし。レーン４：分子量標準物質、ｋＤａで示した。ウサギ抗ＩＧＦＢＰ−４ポリクローナル抗体を免疫染色に用いた。
【図２Ａ】ＥＬＩＳＡによるＩＧＦＢＰ−４断片特異的ＭＡｂの試験。１０ｎｇの全長組み換えＩＧＦＢＰ−４、またはＰＡＰＰ−Ａ依存性開裂によって作製したＩＧＦＢＰ−４断片をポリスチレンプレートに吸着させた。洗浄した後、断片特異的ＭＡｂであるＩＢＰ３、ＩＢＰ１２、ＩＢＰ２７、ＩＢＰ１３およびＩＢＰ２８（１０μｇ／ｍｌ）をウェル内、振盪下で３０分間インキュベートした。特異的に結合した抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体で検出した（基質：ＴＭＢ）。
【図２Ｂ】ＩＧＦＢＰ−４の断片に特異的なサンドイッチ免疫アッセイ。免疫アッセイ条件は次の通りである。捕捉ＭＡｂ：ＩＢＰ５１３、ＩＢＰ５２１（２００ｎｇ／ウェル）。検出ＭＡｂ：安定なＥｕ3+キレートで標識したＩＢＰ１２、ＩＢＰ２７およびＩＢＰ３０（１μｇ／ｍｌ）。抗原：１００ｎｇ／ｍｌの、全長組み換えＩＧＦＢＰ−４、またはＰＡＰＰ−Ａ依存性開裂によって作製したＩＧＦＢＰ−４断片。インキュベーション容量：０．１ｍｌ。インキュベーション時間：室温で３０分。ＣＰＳはカウント／秒、ＡＵ（４５０ｎｍ）は４５０ｎｍにおける吸光度である。
【図３】ヒト血漿におけるＩＧＦＢＰ−４断片の検出。免疫アッセイ条件は次の通りである。捕捉ＭＡｂ：ＩＢＰ５２１（２００ｎｇ／ウェル）。検出ＭＡｂ：安定なＥｕ3+キレートで標識したＩＢＰ３０（１μｇ／ｍｌ）。ＭＡｂ ＩＢＰ５２１は、全長ＩＧＦＢＰ−４のみならず、ＰＡＰＰ−Ａ仲介性タンパク質分解によって生成されたそのＣ末端断片も認識する。ＭＡｂ ＩＢＰ３０は、ＩＧＦＢＰ−４のＣ末端断片のみを特異的に認識し、全長ＩＧＦＢＰ−４は認識しない。インキュベーション容量：０．１ｍｌ。インキュベーション時間：室温で３０分。ＣＰＳはカウント／秒である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の好ましい態様に関する詳細な説明
本発明においては、ＩＧＦＢＰ−４のＮ末端タンパク質分解断片およびＣ末端タンパク質分解断片を、ＡＣＳ患者や数種の癌患者の血漿試料において、健常ドナーの血漿よりも有意に高いレベルで存在するバイオマーカーとして開示する。ＩＧＦＢＰ−４断片の免疫アッセイは、ＡＣＳまたは癌の早期発見、あるいは疾患発症の危険度を決定するために使用することができる。
【００２７】
ＩＧＦＢＰ−４ペプチドに特異的なモノクローナル抗体のみならず、完全ＩＧＦＢＰ−４に特異的なモノクローナル抗体を開発するために、標準的なプロトコルに従った。モノクローナル抗体を得るために動物の免疫に用いた合成ペプチドである特定のＩＧＦＢＰ−４断片は、ＰＡＰＰ−Ａ依存性開裂によって生じるＩＧＦＢＰ−４タンパク質分解断片に対応していた。合成ペプチドは、カップリングのために、（推定タンパク質分解部位とは反対の末端に）追加の末端システインを含有していた。配列は質量分析によって確認し、ペプチドは担体タンパク質に結合させた。得られた結合タンパク質を、マウス免疫用の抗原として使用した。
【００２８】
ペプチド結合性モノクローナル抗体は、当業者に知られた標準的な技術（１９〜２２）に基づいて作製した。動物の免疫を数サイクル繰り返した後、マウス脾臓細胞を骨髄腫細胞系の細胞と融合させた。このようなプロトコルには、形成されたハイブリドーマクローンについて、所望の特異性を示す産生抗体のスクリーニングを行う工程も含まれる。本発明の抗体を得るために、ＩＧＦＢＰ−４タンパク質分解断片に相当するＩＧＦＢＰ−４ペプチドとの特異的結合を示し、且つ、同時に完全なＩＧＦＢＰ−４とは無反応であるハイブリドーマクローンのスクリーニングを行った。この手法によって、タンパク質のＰＡＰＰ−Ａ依存性開裂の過程で発生したＩＧＦＢＰ−４の新規エピトープに特異的なモノクローナル抗体を産生する数種のハイブリドーマクローンを見出すことができた（図２Ａ）。
【００２９】
実験においては、ＰＡＰＰ−Ａ依存性開裂によって作製したＩＧＦＢＰ−４のタンパク質分解断片に特異的な一群のモノクローナル抗体を製造し、完全なＩＧＦＢＰ−４との交差反応性が５％未満のものを選択した。しかし、得られる交差反応性のパーセンテージは、例えば、使用した実験方法に依存するため、５％という値を低交差反応性の限界値と考えるべきではない。
【００３０】
こうして得られたペプチド特異的抗体を、完全（全長）ＩＧＦＢＰ−４に特異的なモノクローナル抗体と共にサンドイッチ免疫アッセイで試験した。この試験は、完全な全長ＩＧＦＢＰ−４の存在の影響を受けることなく、ＩＧＦＢＰ−４タンパク質分解断片の特異的な検出を行うためのサンドイッチ免疫アッセイの開発に適した二重抗体（two-site antibodies）の組み合わせを見つけるための試験である。完全なＩＧＦＢＰ−４に特異的なモノクローナル抗体を捕捉抗体として使用し、ＩＧＦＢＰ−４のタンパク質分解断片に特異的なモノクローナル抗体を検出用抗体として使用した。いくつかの態様においては、２つの抗体を反対に配置することも可能である。本願に記載したサンドイッチ免疫アッセイは、ＩＧＦＢＰ−４のタンパク質分解断片に対する特異性が高い（図２Ｂ）。
【００３１】
本発明においては、開発したサンドイッチ免疫アッセイ法の検出用抗体を、安定なＥｕ3+キレートで標識した。他の種々の態様においては、検出用抗体は、種々の標準的な手法、例えば、発光、化学発光、蛍光、吸光度や放射能の検出、あるいは顕微鏡観察、画像化処理などによって視覚化または検出可能な様々な種類のシグナルを発生しうる様々な種類の標識を付すことが可能である。免疫アッセイには、免疫組織化学、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロッティング、ネフェロ分析、比濁分析、免疫放射線アッセイ、ラテラルフロー免疫組織化学／サイトメトリーや、他の当業者に知られた方法が含まれる。
【００３２】
免疫アッセイは、試料中の生物マーカーの存在または不存在の検出のみならず、試料中の生物マーカーの量の検出にも用いることができる。試料中のＩＧＦＢＰ−４タンパク質分解断片の量は、試料中に存在することが分かっている参照物質または標準物質、例えば、完全なＩＧＦＢＰ−４やその他のポリペプチド、との比較によって（またはそれらに対する比として）求めることができる。試料中のＩＧＦＢＰ−４タンパク質分解断片の量は、参照値または標準値、例えば、参照試料または対照試料に含まれる内因性ＩＧＦＢＰ−４断片量、組み換えＩＧＦＢＰ−４断片量または合成ＩＧＦＢＰ−４断片量など、との比較によって求めることもできる。従って、試料中の生物マーカーの量は絶対値として定量する必要はなく、参照物質または対照物質に対する相対値として測定することができる。
【００３３】
本発明においては、ＡＣＳの血漿試料に含まれるＩＧＦＢＰ−４タンパク質分解断片の検出を行った。ＩＢＰ５２１−ＩＢＰ３０サンドイッチペアの使用によって、断片の顕著な増加が明らかとなった（図３）。本発明の種々の態様には、ＡＣＳ発症危険度の評価を目的とした、患者血漿試料中のＩＧＦＢＰ−４のＮ末端断片またはＣ末端断片の検出、あるいはＩＧＦＢＰ−４のＣ末端断片およびＮ末端断片の同時検出が含まれる。
【００３４】
本発明の更なる態様は、試料中のＩＧＦＢＰ−４タンパク質分解断片の検出またはＩＧＦＢＰ−４タンパク質分解断片量の測定のための免疫アッセイキットである。このようなキットは、（ｉ）Ｎ末端ＩＧＦＢＰ−４タンパク質分解断片またはＣ末端ＩＧＦＢＰ−４タンパク質分解断片に特異的なモノクローナル抗体、（ii）完全なＩＧＦＢＰ−４のいずれかの適切なエピトープに特異的な、第２の検出用モノクローナル抗体、および（iii）標準物質または検量物質となる、内因性ＩＧＦＢＰ−４断片またはＩＧＦＢＰ−４断片の配列の少なくとも一部に対応する組み換えタンパク質を包含してもよい。第２のモノクローナル抗体は、抗体−ＩＧＦＢＰ−４断片複合体を検出するために適切に標識されていてもよい。
【００３５】
いくつかの態様においては、ＩＧＦＢＰ−４断片の競合的測定のためのキットは、（ｉ）Ｎ末端ＩＧＦＢＰ−４タンパク質分解断片またはＣ末端ＩＧＦＢＰ−４タンパク質分解断片に特異的なモノクローナル抗体、および（ii）標準物質または検量物質となる、検出用に標識された、内因性ＩＧＦＢＰ−４断片またはＩＧＦＢＰ−４断片の配列の少なくとも一部に対応する組み換えタンパク質を包含してもよい。分析試料中のＩＧＦＢＰ−４断片レベルは、ＩＧＦＢＰ−４断片からなる標識標準物質の競合的除去の程度によって決定することができる。
【実施例１】
【００３６】
ＩＧＦＢＰ−４の新規なタンパク質分解仲介性エピトープに特異的な、マウスモノクローナル抗体の作製
マウスの免疫のために入手した合成ペプチド：
ペプチド−１（配列番号１）
ペプチド−２（配列番号２）
【００３７】
ペプチド−１およびペプチド−２は、固相Ｆｍｏｃ化学（２３）を用いて合成した。ペプチドは、ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂上に調製した。樹脂から切り離した後、粗ペプチド標品を逆相高圧液体クロマトグラフィーで精製した。Ｃ１８分取カラムに０．１％トリフルオロ酢酸水溶液および０．１％トリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液の濃度勾配をかけた。精製度（＞９５％）は、分析用Ｃ１８高圧液体クロマトグラフィーおよび質量分光測定法（精度が±０．５ダルトンの、マトリックス補助レーザー脱離／イオン化質量分析法）で決定した。
【００３８】
ＩＧＦＢＰ−４ペプチド−１（配列番号１）は、ＩＧＦＢＰ−４断片１２２−１３５と同一のアミノ酸配列と、そのＮ末端に更に付加された１つのシステイン残基を含有していた。ＩＧＦＢＰ−４ペプチド−２（配列番号２）は、ＩＧＦＢＰ−４断片１３６−１５０と同一のアミノ酸配列と、そのＣ末端に更に付加された１つのシステイン残基を含有していた。これら付加されたシステイン残基のスルフヒドリル基を、担体タンパク質とのペプチド結合体を作製するために使用した。
【００３９】
担体タンパク質とのペプチド結合体の作製には、Pierce社（イリノイ州、ロックフォード）より入手したスルフォ−ＳＭＣＣを製造者の説明書に従って使用した。結合のために、２．５ｍｇの担体タンパク質、具体的には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）または卵白アルブミン（共にミズーリ州、セントルイス、Sigma Chemicalsより入手）を、１０ｍＭのＫＨＰＯ4、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４（即ち、ＰＢＳ）に１０ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解した。０．１ｍｌのジメチルスルフォキシドに溶解した２ｍｇのスルフォ−ＳＭＣＣをタンパク質溶液に加えた。担体タンパク質の活性化反応を、室温で２時間実施した。過剰なスルフォ−ＳＭＣＣを、ＮＡＰ−５カラム（ニュージャージー州、ピスカタウェイ、GE Healthcare Life Sciencesより入手）を用いたゲル濾過で除去した。ＮＡＰ−５カラムは１０ｍＭのＫＨＰＯ4、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２で事前に平衡化しておいた。次に、２ｍｇの合成ペプチド−１または合成ペプチド−２をタンパク質溶液に加え、結合を開始した。反応は、恒常的な振盪と共に氷上で２時間実施した。未反応ペプチド画分を、ＰＢＳで平衡化しておいたＮＡＰ−５カラムを用いたゲル濾過によってタンパク質−ペプチド結合体から除去した。ペプチドの適切な担体タンパク質への結合は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で求めたタンパク質分子量の３〜５ｋＤａの増加によって確認した。結合体は分注し、使用まで−２０℃で保存した。
【００４０】
ペプチド−（担体タンパク質）結合体によるマウスの免疫
１群が５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを、ペプチド−タンパク質結合体で５回免疫した。
グループ１．１次免疫：１０μｇのＢＳＡ−ペプチド−１を含有するＰＢＳ溶液０．２ｍｌを６０％のフロインド完全アジュバントと共に腹腔内投与。２次免疫：３０日目に、５μｇのＢＳＡ−ペプチド−１を含有するＰＢＳ溶液０．２ｍｌを６０％のフロインド完全アジュバントと共に腹腔内投与。３次免疫：６０日目に、２．５μｇのＢＳＡ−ペプチド−１を含有するＰＢＳ溶液０．２ｍｌを腹腔内投与。
【００４１】
グループ２．１次免疫：１０μｇのＢＳＡ−ペプチド−２を含有するＰＢＳ溶液０．２ｍｌを６０％のフロインド完全アジュバントと共に腹腔内投与。２次免疫：３０日目に、５μｇのＢＳＡ−ペプチド−２を含有するＰＢＳ溶液０．２ｍｌを６０％のフロインド完全アジュバントと共に腹腔内投与。３次免疫：６０日目に、２．５μｇのＢＳＡ−ペプチド−２を含有するＰＢＳ溶液０．２ｍｌを腹腔内投与。
【００４２】
３次免疫の２０日後に、ペプチド特異的抗体の力価が最も高いマウスを最終免疫およびハイブリダイゼーションのために選択した。グループ１のマウスには、１０μｇのＢＳＡ−ペプチド−１を含有するＰＢＳ溶液０．２ｍｌを静脈注射し、グループ２のマウスには、１０μｇのＢＳＡ−ペプチド−２を含有するＰＢＳ溶液０．２ｍｌを静脈注射した。次の日にも、同じプロトコルに従って静脈注射を行った（５次免疫）。５次免疫の２日後には、免疫したマウスの脾臓を無菌的に単離し、既報（１９〜２２）に従って、ホモジェナイズした組織をマウス骨髄腫細胞系ｓｐ２／０と融合した。
【００４３】
生育中のハイブリドーマの馴化培地について、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）で抗体のスクリーニングを行った。ペプチド−１またはペプチド−２に特異的な抗体を産生したハイブリドーマを、卵白アルブミン−ペプチド−１または卵白アルブミン−ペプチド−２のそれぞれを前吸着用抗体として用いたＥＬＩＳＡによって選択した。ＮＳ０細胞系の発現したヒト組み換えＩＧＦＢＰ−４（ミズーリ州、セントルイス、Sigma Chemicalsより入手）も、更なる試験において前吸着用抗体として使用した。アッセイのために、ウェル当たり５０ｎｇの卵白アルブミン−ペプチド−１、卵白アルブミン−ペプチド−２またはヒト組み換えＩＧＦＢＰ−４を含むＰＢＳ ０．１ｍｌを免疫アッセイ用ポリスチレンプレート（マサチューセッツ州、ケンブリッジ、Corningより入手）に吸着させた。抗原吸着を４０分間行った後、プレートを２回洗浄し、０．１％の界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（即ち、ＰＢＳＴ）で１０分間ブロッキングした。次にプレートを、生育中のハイブリドーマから回収した馴化培地０．０５ｍｌと共に３０分間インキュベートし、ＰＢＳＴで２回洗浄した。前吸着させておいた抗原に結合したマウス抗体は、ＨＲＰと結合した２次抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（ＰＢＳＴで１０００倍希釈したものをウェル当たり０．１ｍｌ）と３０分間インキュベートすることによって顕在化させた。２次抗体は、ミズーリ州、セントルイス、Sigma Chemicalsより入手した。２次抗体とのインキュベーションの後にプレートをＰＢＳＴで６回洗浄し、０．０３％の過酸化水素を添加した、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）含有パーオキシダーゼ発色基質を加えた。１５分間のインキュベーションの後に０．１ｍｌの０．５Ｍ リン酸溶液を加えて反応を停止し、ウェルの吸光度を４５０ｎｍで測定した。吸光度の測定は、Labsystems Multiscan マイクロプレートリーダー（フィンランド国、Labsystems製）で行った。
【００４４】
卵白アルブミンと結合した適切なペプチドに特異的であり（上記条件において４５０ｎｍで測定した吸光度のバックグラウンド値に対する増加が０．５を超え）、且つ同時に、ヒト組み換えＩＧＦＢＰ−４とは反応しない（４５０ｎｍで測定した吸光度のバックグラウンド値に対する増加が０．０２５未満）の抗体を産生するハイブリドーマを、更なる研究のために選択した。このようなハイブリドーマを、限界希釈法でクローニングした。所望のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマクローンを、１０％胎仔ウシ血清（ユタ州、ローガン、HyClone Laboratories製）を含むダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。
【００４５】
抗体のアフィニティー精製
選択したハイブリドーマクローンを腹腔内に注射し、モノクローナル抗体をマウス腹水中で産生した。タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを用いて、腹水から抗体を精製した。樹脂はGE Healthcare Life Sciences（ニュージャージー州、ピスカタウェイ）より入手し、精製は製造者の説明書に従って実施した。精製モノクローナル抗体は、５０％硫酸アンモニウムの懸濁液として４℃で保存した。
【００４６】
モノクローナル抗体の特異性に関する研究
選択したモノクローナル抗体の特異性を確認するために、ＩＧＦＢＰ−４タンパク質分解断片を得た。ＰＡＰＰ−Ａ依存性タンパク質分解反応を、既報（１４）の条件に従って実施した。２μｇのヒト組み換えＩＧＦＢＰ−４を、２ｍＭのＣａＣｌ2、１．８μｇのＩＧＦ−ＩＩ（ミズーリ州、セントルイス、Sigma Chemicalsより入手）、４０ｎｇのヒト組み換えＰＡＰＰ−Ａ（フィンランド国、トゥルク、HyTest製）および２μｌのタンパク質分解酵素阻害剤カクテル（ミズーリ州、セントルイス、Sigma Chemicalsより入手）の存在下で、０．２３ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中でインキュベートした。反応は３７℃で１５時間実施し、試料を−２０℃で凍結することによって反応を停止した。ＩＧＦＢＰ−４のＰＡＰＰ−Ａ依存性開裂の程度は、Abcam社（マサチューセッツ州、ケンブリッジ）より入手した特異的ウサギポリクローナル抗体 １μｇ／ｍｌを用いたウェスタンブロッティングで決定した（図１）。
【００４７】
選択したモノクローナル抗体のＩＧＦＢＰ−４タンパク質分解断片に対する特異性の研究は、アフィニティー精製抗体を用いた間接ＥＬＩＳＡ法で実施した（図２Ａ）。１０ｎｇの全長組み換えＩＧＦＢＰ−４またはＰＡＰＰ−Ａ依存性開裂によって調製した（方法は上述したとおり）ＩＧＦＢＰ−４断片をポリスチレンプレートに吸着させた。４０分間のインキュベーション後にプレートを２回洗浄し、０．１％の界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（即ち、ＰＢＳＴ）で１０分間ブロックした。選択したＭＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）を振盪下、室温で３０分間インキュベートし、その後、ＰＢＳＴで２回洗浄した。特異的に結合した抗体は、ＨＲＰを結合した抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（ＰＢＳＴで１０００倍希釈したものをウェル当たり０．１ｍｌ）で検出した。２次抗体は、ミズーリ州、セントルイス、Sigma Chemicalsより入手した。２次抗体とのインキュベーションの後、プレートをＰＢＳＴで６回洗浄し、０．０３％の過酸化水素を添加した３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）含有ペルオキシダーゼ発色基質を加えた。１５分間のインキュベーションの後に０．１ｍｌの０．５Ｍリン酸溶液を加えて反応を停止し、ウェルの吸光度を４５０ｎｍで測定した。ＩＧＦＢＰ−４のＰＡＰＰ−Ａ依存性開裂によって産生されたタンパク質分解断片に特異的であり、完全なＩＧＦＢＰ−４との交差反応性が５％未満である以下のモノクローナル抗体群を最終的に選択した：ＩＢＰ２８、ＩＢＰ２７、ＩＢＰ１２、ＩＢＰ３、ＩＢＰ４、ＩＢＰ７、ＩＢＰ１３、ＩＢＰ１８、ＩＢＰ１９、ＩＢＰ２０、ＩＢＰ３０、ＩＢＰ１６７、ＩＢＰ１６６、ＩＢＰ１６８、ＩＢＰ１７４、ＩＢＰ１６０、ＩＢＰ１６１、ＩＢＰ１６４、ＩＢＰ１７１。ＩｇＭアイソタイプであるＩＢＰ３０以外の全てのモノクローナル抗体が、ＩｇＧアイソタイプであった。
【００４８】
ＩＧＦＢＰ−４断片の定量化のためのサンドイッチ免疫アッセイの設計
アフィニティー精製したモノクローナル抗体の特異性を、サンドイッチ免疫アッセイでも確認した（図２Ｂ）。ＩＧＦＢＰ−４のタンパク質分解断片（Ｎ末端断片またはＣ末端断片）に特異的な１種のモノクローナル抗体（間接ＥＬＩＳＡにおける全長分子との交差反応性は５％未満）、および完全なＩＧＦＢＰ−４いずれかのエピトープを認識する別のＭＡｂを用いる、数種のサンドイッチアッセイを開発した。完全なＩＧＦＢＰ−４に特異的なマウスモノクローナル抗体の作製については、実施例２に記載した。
【００４９】
サンドイッチ蛍光免疫アッセイを実施するために、Hyytia et al.（２４）に記載の安定化Ｅｕ3+キレートで標識した検出用ＭＡｂを用いた。このアッセイに用いる捕捉抗体は完全なＩＧＦＢＰ−４に特異的であるが、一方、検出用抗体は、ＩＧＦＢＰ−４のタンパク質分解性新規エピトープに特異的である。ウェル当たり２μｇの捕捉抗体（ＩＢＰ５１３、ＩＢＰ５２１）を含む１００μＬのリン酸緩衝化生理食塩水を、９６穴の免疫アッセイプレート中で、恒常的な振盪のもと、室温で３０分間インキュベートした。プレートを、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０２５％のＴｗｅｅｎ２０および０．５ｇ／ＬのＮａＮ3を添加した１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）緩衝液（即ち、緩衝液Ａ）で洗浄した。洗浄後、１００ｎｇ／ｍｌの全長ヒト組み換えＩＧＦＢＰ−４またはＰＡＰＰ−Ａ依存性開裂によって作製したＩＧＦＢＰ−４断片を添加した０．１ｍｌのアッセイ用緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）、９ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ４０、０．５％のＢＳＡおよび０．５ｇ／ＬのＮａＮ3）をプレートに加えた。プレートを、恒常的な振盪下、室温で３０分間インキュベートした。緩衝液Ａで洗浄した後、０．１ｍｌの検出用抗体（ＩＢＰ１２、ＩＢＰ２７およびＩＢＰ３０）のアッセイ用緩衝液溶液（１ｍｇ／Ｌ）を添加した。プレートを、恒常的な振盪下、室温で３０分間インキュベートした。緩衝液Ａで洗浄した後、各ウェルに０．２ｍｌの増強溶液（１．７５ＭのＮａＳＣＮ、１ＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール、２０％の１−プロパノール、５ｍＭのＮａ2ＣＯ3、５０ｍＭのグリシン−ＮａＯＨ、ｐＨ１０．０）を添加し、穏やかな振盪下、室温で３分間インキュベートした。Ｅｕ3+の蛍光をVictor 1420 マルチラベルカウンター（Wallac-Perkin Elmer製）で測定した。蛍光は、１秒当たりのカウント（ＣＰＳ）で表した。
【００５０】
開発したサンドイッチ免疫アッセイは、ＰＡＰＰ−Ａ依存性開裂によって作製したＩＧＦＢＰ−４断片のみを検出し、全長ＩＧＦＢＰ−４との交差反応は生じなかった（あるいは非常に低く、１％未満だった）。
【実施例２】
【００５１】
完全なＩＧＦＢＰ−４に特異的なマウス モノクローナル抗体の作製
マウスの免疫
５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを、哺乳動物ＮＳ０細胞系で発現させたヒト組み換えＩＧＦＢＰ−４で５回免疫した。このタンパク質は、ミズーリ州、セントルイス、Sigma Chemicalsより入手した。１次免疫：５μｇのＩＧＦＢＰ−４を含有するＰＢＳ溶液０．２ｍｌを６０％のフロインド完全アジュバントと共に腹腔内投与。２次免疫：３０日目に、２μｇのＩＧＦＢＰ−４を含有するＰＢＳ溶液０．２ｍｌを６０％のフロインド完全アジュバントと共に腹腔内投与。３次免疫：６０日目に、２μｇのＩＧＦＢＰ−４を含有するＰＢＳ溶液０．２ｍｌを腹腔内投与。
【００５２】
３次免疫の２０日後に、タンパク質特異的抗体の力価が最も高いマウスを、次の免疫およびハイブリダイゼーションのために選択した。マウスに対する４回目の注射は、２μｇのＩＧＦＢＰ−４を含有するＰＢＳ溶液０．２ｍｌの静脈注射で行った。最後の静脈注射は、次の日に同じプロトコルに従って実施した（５次免疫）。２日後には、免疫したマウスの脾臓を無菌的に単離し、既報（１９〜２２）に従って、ホモジェナイズした組織をマウス骨髄腫細胞系ｓｐ２／０と融合した。
【００５３】
生育中のハイブリドーマの馴化培地について、ＥＬＩＳＡ法でＩＧＦＢＰ−４特異的抗体のスクリーニングを行った。完全なＩＧＦＢＰ−４に特異的な抗体を産生するハイブリドーマを、間接ＥＬＩＳＡで選択した。アッセイのために、ウェル当たり５０ｎｇの全長ヒト組み換えＩＧＦＢＰ−４を含むＰＢＳ ０．１ｍｌを免疫アッセイ用ポリスチレンプレートに吸着させた。４０分間のインキュベーションの後にプレートを２回洗浄し、０．１％の界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（即ち、ＰＢＳＴ）で１０分間ブロッキングした。次にプレートを、生育中のハイブリドーマの入ったウェルから回収した馴化培地０．０５ｍｌと共に３０分間インキュベートした。インキュベーションの後に、プレートをＰＢＳＴで２回洗浄した。洗浄後にプレートを、ＨＲＰと結合した２次抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（ＰＢＳＴで１０００倍希釈したものをウェル当たり０．１ｍｌ）と共に３０分間インキュベートした。２次抗体とのインキュベーションの後にプレートをＰＢＳＴで６回洗浄し、ＴＭＢおよび０．０３％の過酸化水素を含有するペルオキシダーゼ発色基質を加えた。１５分間のインキュベーションの後に０．１ｍｌの０．５Ｍ リン酸溶液を加えて反応を停止し、ウェルの吸光度を４５０ｎｍで測定した。
【００５４】
全長ＩＧＦＢＰ−４に特異的な（上記条件において４５０ｎｍで測定した吸光度のバックグラウンド値に対する増加が０．５を超える）抗体を産生するハイブリドーマを、限界希釈法でクローニングした。所望のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマクローンを、１０％胎仔ウシ血清を含むＤＭＥＭで培養した。
【００５５】
抗体のアフィニティー精製
選択したハイブリドーマクローンを腹腔内注射し、全長ＩＧＦＢＰ−４に特異的なモノクローナル抗体をマウス腹水中で産生した。タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを用いて、腹水から抗体を精製した。樹脂はGE Healthcare Life Sciences（ニュージャージー州、ピスカタウェイ）より入手し、精製は製造者の説明書に従って実施した。精製モノクローナル抗体は、５０％硫酸アンモニウムの懸濁液として４℃で保存した。
【実施例３】
【００５６】
アテローム性動脈硬化症由来ＰＡＰＰ−Ａのタンパク質分解活性
ヒト アテローム性動脈硬化症の冠状血管試料は、使用するまで−７０℃で保存した。アテローム性動脈硬化症の冠状動脈からのＰＡＰＰ−Ａの抽出は、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ１００およびタンパク質分解酵素阻害剤カクテルを含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）緩衝液中で組織をホモジェナイズした後に行った。抽出したＰＡＰＰ−Ａは、アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。ＰＡＰＰ−Ａの精製に用いたアフィニティーマトリックスは、ＰＡＰＰ−Ａ特異的モノクローナル抗体４Ｇ１１（フィンランド国、トゥルク、HyTestより入手）を用いて調製した。精製タンパク質がＰＡＰＰ−Ａであることを確認するために、数種のＰＡＰＰ−Ａ特異的モノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングおよび液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析法を使用した。
【００５７】
アテローム性動脈硬化症由来ＰＡＰＰ−Ａのタンパク質分解活性を解析するために、２μｇのヒト組み換えＩＧＦＢＰ−４を、２ｍＭのＣａＣｌ2、１．８μｇのＩＧＦ−ＩＩ（ミズーリ州、セントルイス、Sigma Chemicalsより入手）、４０ｎｇのアテローム性動脈硬化症由来ＰＡＰＰ−Ａおよび２μｌのタンパク質分解酵素阻害剤カクテル（ミズーリ州、セントルイス、Sigma Chemicalsより入手）の存在下で、０．２３ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中でインキュベートした。反応は３７℃で１５時間実施し、試料を−２０℃で凍結することによって反応を停止した。ＩＧＦＢＰ−４のＰＡＰＰ−Ａ依存性開裂の程度は、ＩＧＦＢＰ−４特異的ウサギポリクローナル抗体（マサチューセッツ州、ケンブリッジ、Abcamより入手）を用いたウェスタンブロッティングで決定した（図１）。
【００５８】
アテローム性動脈硬化症由来ＰＡＰＰ−Ａは、組み換えＰＡＰＰ−Ａと同じ効率でＩＧＦＢＰ−４を開裂することが明らかになった。これをもって、ヒト プラークの発現する内因性ＰＡＰＰ−Ａが、ＩＧＦ−ＩＩの存在下でＩＧＦＢＰ−４を開裂することが可能な活性なタンパク質分解酵素であることが初めて明らかとなった。
【実施例４】
【００５９】
ＡＣＳ患者の血漿試料におけるＩＧＦＢＰ−４断片の測定
（ＳＴ上昇型の）ＡＣＳ患者４３人の血液と、健常ドナー由来の３４例の血漿試料について、断片特異的なサンドイッチ免疫アッセイで試験した。全ての血漿試料をＥＤＴＡの存在下で採取し、測定まで−７０℃で保存した。
【００６０】
サンドイッチ免疫アッセイによる測定のために、ウェル当たり２μｇの捕捉抗体（ＩＢＰ５２１）を含む０．１ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水を９６穴の免疫アッセイプレート中で、恒常的な振盪のもと、室温で３０分間インキュベートした。プレートを緩衝液Ａで洗浄した後、アッセイ緩衝液で１：１に希釈した患者の血漿試料０．１ｍｌをプレートに加えた。プレートは、恒常的な振盪下、室温で３０分間インキュベートした。緩衝液Ａで洗浄した後、検出用抗体ＩＢＰ３０（１ｍｇ／Ｌ）を含むアッセイ用緩衝液溶液 ０．１ｍｌを添加した。プレートは、恒常的な振盪下、室温で３０分間インキュベートした。緩衝液Ａで洗浄した後、各ウェルに０．２ｍｌの増強溶液を添加し、穏やかな振盪下、室温で３分間インキュベートした。Ｅｕ3+の蛍光をVictor 1420 マルチラベルカウンター（Wallac-Perkin Elmer製）で測定した。ＡＣＳ患者の血漿におけるＩＧＦＢＰ−４断片レベルは、健常ドナーの血漿におけるレベルよりも３．２倍も高かった（ｐ＜０．０００５）（図３）。平均±標準偏差を図面に記した。蛍光は、１秒当たりのカウント（ＣＰＳ）で表した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００６１】
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【配列表フリーテキスト】
【００６２】
配列番号３：  ＰＡＰＰ−Ａ開裂部位
【図１】
0005840605.tif 000002
【図２Ａ】
0005840605.tif 000003
【図２Ｂ】
0005840605.tif 000004
【図３】
0005840605.tif 000005
【配列表】
0005840605000001.app