(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＰＧＧＴの酵素的に不活性な形態を含む免疫原性組成物であって、前記ＨＰＧＧＴが、配列番号１に示されるアミノ酸配列の４５１位及び４５２位のセリン残基がアラニンに置換されているアミノ酸配列（Ｓ４５１／４５２Ａ）を有する、免疫原性組成物。
【請求項２】
ＨＰＧＧＴの酵素的に不活性かつ免疫原性のフラグメントを含む免疫原性組成物であって、前記フラグメントが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＨＰＧＧＴのアミノ酸４５１及び４５２を含む一続きの切れ目のないアミノ酸から成り、４５１位及び４５２位のセリン残基がアラニンに置換されており（Ｓ４５１／４５２Ａ）、リンパ球増殖のＨＰＧＧＴ依存性抑制を無効にする作用を有する抗体を含む抗体応答を誘導する、免疫原性組成物。
【請求項３】
動物又はヒトのワクチン接種用である請求項１または２のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
動物又はヒトの体内で免疫応答を誘導することができる請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記免疫応答が、抗体応答である請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記抗体応答が、ＨＰＧＧＴに対する阻害作用及び／又はリンパ球増殖のＨＰＧＧＴ依存性抑制を無効にする作用を有する抗体を含む請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
ピロリ菌感染に罹患している又はピロリ菌による感染を発症する危険度が高い患者においてリンパ球の活性化及び増殖を促進する請求項１〜６のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記リンパ球が、Ｂ又はＴ細胞である請求項７に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
１又は複数のアジュバントを含む請求項１〜８のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
ピロリ菌からの１又は複数の抗原を含む請求項１〜９のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記抗原が、外膜タンパク質を含む群から選択される請求項１０に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
前記抗原が、ＨｐａＡ、Ｏｍｐ １８及びそれらの組み合わせを含む群から選択される請求項１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
ピロリ菌によって引き起こされる疾患の予防ならびに／又は治療を目的とする請求項１〜１２のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
ピロリ菌に関連する疾患の予防ならびに／又は治療を目的とする請求項１〜１３のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
前記疾患が、ピロリ菌による感染、ピロリ菌によって引き起こされる胃十二指腸障害、胃炎、慢性胃炎、胃もしくは十二指腸潰瘍、胃癌ならびに（ＭＡＬＴ）リンパ腫を含む群から選択される請求項１３又は１４に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
ワクチンである請求項１〜１５のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘリコバクターピロリのγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＨＰＧＧＴ）のフラグメントであるポリペプチド、それらを含む免疫原性組成物、不活化形態のＨＰＧＧＴを含む免疫原性組成物、そのようなポリペプチド及びＨＰＧＧＴの不活性フラグメントの使用、そのようなポリペプチド及び不活性形態のＨＰＧＧＴに対する及びそれらに特異的に結合する抗体、アプタマー及びスピーゲルマー、薬剤候補物質を同定するための方法、ワクチンを開発するための方法、およびＨＰＧＧＴのリガンドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘリコバクターピロリはヒト胃粘膜に選択的にコロニー形成するグラム陰性病原体であり、世界人口の５０％以上にまん延している。感染は、ほとんどが生涯にわたって持続し、胃及び十二指腸潰瘍、胃粘膜に関連するリンパ様組織リンパ腫及び胃癌の病因に関係づけられてきた。ピロリ菌感染の顕著な特徴は、好中球性顆粒球、リンパ球及び単球／マクロファージによる粘膜の密な浸潤を特徴とする、慢性活動性胃炎である。いくつかの試験は、ピロリ菌に関連する胃炎においてヘルパーＴ細胞１型が増加し、活性化されることの証拠を提供し、インビボでのＣＤ２５及びＣＤ６９の上方調節を示した。様々なピロリ菌抗原に対する強い体液性応答も惹起される。この炎症性応答にもかかわらず、感染は宿主免疫系によって除去されない。このことから、ピロリ菌は免疫系に干渉すると思われるが、その明確な仕組みはまだ曖昧なままである。
【０００３】
いくつかの研究がこの問題を取り上げ、ピロリ菌が免疫応答を免れる受動的経路と能動的経路を説明した。食菌作用に対するピロリ菌の抵抗性が報告されており、これは、ＩＶ型分泌装置の成分をコードする、ｖｉｒＢ７及びｖｉｒＢ１１のようなビルレンス遺伝子に依存する。Ｚａｂａｌｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．は、ピロリ菌アルギナーゼがＴ細胞増殖を阻害し、Ｔ細胞受容体ζ鎖の発現を低下させることを報告した。ピロリ菌のプロ炎症性ペプチドは、単球を活性化して反応性酸素ラジカルを産生することによってリンパ球機能不全を誘導することが示された。これらのデータは、細菌と非特異的免疫応答の相互作用を強調する。しかし、Ｔ細胞又はインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）欠損マウスにおけるワクチン接種試験が失敗に終わったことから、特異的Ｔ細胞応答は細菌の除去のために決定的に重要であると思われる。
【０００４】
これらの取り組みにもかかわらず、胃病原体の慢性的残存の理由は曖昧なままである１。ＣＤ４陽性Ｔ細胞は細菌の除去のために極めて重要であるが２、ピロリ菌によってそれらの増殖が阻害されることが示された３。これに関していくつかのグループは、ピロリ菌からのタンパク質の免疫抑制作用を検討した。Ｋｎｉｐｐとその共同研究者達は、ビルレンス因子ＣａｇＡ（細胞毒関連遺伝子Ａ）及びＶａｃＡ（空胞化細胞毒Ａ）とは無関係にリンパ球及び単球の増殖を低下させる、いわゆる「増殖阻害タンパク質（ＰＩＰ）」を部分的に精製した４。
【０００５】
これに対し、２つのグループが最近、高濃度の精製ＶａｃＡの存在下でリンパ球増殖が抑制されることを報告した５，６。逆説的に、しかしながら、ＶａｃＡ欠損のピロリ菌突然変異体はその増殖阻害特性に欠陥を有していなかった５。加えて、ＶａｃＡを発現するヘリコバクター株に感染した患者において胃の炎症は変化しないか、さらには上昇することが早期に認識されている７，８。
【０００６】
ピロリ菌の分泌産物は、Ｇ１期での細胞周期停止を誘導することによってＴリンパ球増殖を阻害することが先に示された３。この作用は、ＶａｃＡ及びＣａｇＡタンパク質を含む公知のビルレンス因子とは無関係であった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ピロリ菌が宿主による除去を免れる、考えられる機構について研究が増えつつあるにもかかわらず、ピロリ菌感染を特異的に治療する又は予防するための臨床手段を開発する上で実質的な成功はまだ得られていない。
【０００８】
本発明の基礎をなす問題は、動物又はヒトにおいて免疫応答を惹起するのに適したポリペプチドを提供することであり、そのような免疫応答は、ピロリ菌感染及びピロリ菌に関連する又はピロリ菌によって引き起こされる疾患に対する防護を与える。
【０００９】
そのような免疫応答を惹起するのに適した免疫原性組成物を提供することが、本発明の基礎をなすさらなる問題である。
【００１０】
本発明の基礎をなすもう１つの問題は、ピロリ菌感染を治療する及び／又は予防するための新規薬剤候補物質を同定するための手段並びにこの感染を治療し、予防するための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
これらや他の問題は、独立請求項の内容によって解決される。好ましい実施形態は従属請求項から理解され得る。
【００１２】
より詳細には、前記問題は、第１の側面の実施形態において、アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸配列が、配列番号１に対応するアミノ酸配列を含むＨＰＧＧＴの領域の一続きの連続アミノ酸配列と少なくとも８０％同一であり、そのような領域が、
（ａ）配列番号１に従ったアミノ酸配列のアミノ酸位置１５０〜２００、又は
（ｂ）配列番号１に従ったアミノ酸配列のアミノ酸位置４１０〜４８０
によって規定され、ＨＰＧＧＴの触媒活性を阻害することができる免疫応答を惹起するのに適するポリペプチドによって解決される。
【００１３】
第１の側面の１つの実施形態では、ポリペプチドは約１５〜約３０個のアミノ酸を含む。
【００１４】
前記問題は、第２の側面において、
（ａ）配列番号１に従ったアミノ酸配列のアミノ酸位置１５０〜２００、又は
（ｂ）配列番号１に従ったアミノ酸配列のアミノ酸位置４１０〜４８０
に対応するアミノ酸配列を含み、及び約１５〜約３０個のアミノ酸を含むポリペプチド、好ましくは１番目の態様に従ったポリペプチドによって解決される。
【００１５】
第２及び第１の側面の１つの実施形態では、ポリペプチドのアミノ酸配列は、前記位置の一続きの１５〜３０個の切れ目のないアミノ酸に対応する。
【００１６】
第２及び第１の側面の１つの実施形態では、ポリペプチドは、
ＱＲＱＡＥＴＬＫＥＡＲＥＲＦＬＫＹ（配列番号２）、
ＦＤＩＫＰＧＮＰＮＬＹＧＬＶＧＧＤＡＮＡＩ（配列番号３）、
ＤＦＳＩＫＰＧＮＰＮＬＹＧＬＶＧＧＤＡＮＡＩＥＡＮＫＲＰＬ（配列番号４）及び
ＳＳＭＳＰＴＩＶＬＫＮＮＫＶＦＬＶＶＧＳＰ（配列番号５）
を含む群から選択される配列を含む。
【００１７】
前記問題は、第３の側面の１つの実施形態において、第１及び第２の側面に従ったポリペプチドの１つ又は数個を含む免疫原性組成物によって解決される。
【００１８】
前記問題は、第４の側面の１つの実施形態において、不活化形態のＨＰＧＧＴを含む免疫原性組成物によって解決される。
【００１９】
前記問題は、第５の側面の１つの実施形態において、ＨＰＧＧＴのフラグメントを含む免疫原性組成物であって、そのようなフラグメントが、ＨＰＧＧＴのアミノ酸４５１及び４５２を含む一続きの切れ目のないアミノ酸から成る免疫原性組成物によって解決される。
【００２０】
第３、第４及び第５の側面の１つの実施形態では、組成物は動物又はヒトのワクチン接種用である。
【００２１】
第３、第４及び第５の側面の１つの実施形態では、組成物は、動物又はヒトの体内で免疫応答を誘導することができる。
【００２２】
第３、第４及び第５の側面の１つの実施形態では、前記免疫応答は抗体応答である。
【００２３】
第３、第４及び第５の側面の１つの実施形態では、前記抗体応答は、ＨＰＧＧＴに対する、より好ましくはＨＰＧＧＴの特異的活性に対する阻害作用及び／又はリンパ球増殖のＨＰＧＧＴ依存性抑制を無効にする作用を有する抗体を含む。
【００２４】
第３、第４及び第５の側面の１つの実施形態では、組成物は、ピロリ菌感染に罹患している又はピロリ菌による感染を発症する危険度が高い患者においてリンパ球の活性化及び増殖を促進することを目的とする。
【００２５】
第３、第４及び第５の側面の１つの実施形態では、リンパ球はＢ又はＴ細胞である。
【００２６】
第３、第４及び第５の側面の１つの実施形態では、組成物は１又は複数のアジュバントを含む。
【００２７】
第３、第４及び第５の側面の１つの実施形態では、組成物は、ピロリ菌からの１又は複数の抗原を含む。
【００２８】
第３、第４及び第５の側面の１つの実施形態では、抗原は、外膜タンパク質を含む群から選択される。
【００２９】
第３、第４及び第５の側面の１つの実施形態では、抗原は、ＨｐａＡ、Ｏｍｐ  １８及びそれらの組み合わせを含む群から選択される。
【００３０】
第３、第４及び第５の側面の１つの実施形態では、組成物は、ピロリ菌によって引き起こされる又はピロリ菌に関連する疾患、より好ましくはピロリ菌感染によって引き起こされる又はピロリ菌感染に関連する疾患の予防及び／又は治療を目的とする。
【００３１】
第３、第４及び第５の側面の１つの実施形態では、疾患は、ピロリ菌による感染、ピロリ菌によって引き起こされる胃十二指腸障害、胃炎、慢性胃炎、胃又は十二指腸潰瘍、胃癌及び（ＭＡＬＴ）リンパ腫を含む群から選択される。
【００３２】
第３、第４及び第５の側面の１つの実施形態では、免疫原性組成物はワクチンである。
【００３３】
本発明の基礎をなす問題は、第６の側面によれば、薬剤の製造のための、本発明の第１の側面に従ったポリペプチドの使用によって解決される。
【００３４】
本発明の基礎をなす問題は、第７の側面において、薬剤の製造のための、本発明の第３、第４及び第５の側面に従った免疫原性組成物の使用によって解決される。
【００３５】
本発明の第６及び第７の側面の１つの実施形態では、薬剤はワクチンである。
【００３６】
本発明の第６及び第７の側面１つの実施形態では、薬剤は、ピロリ菌によって引き起こされる又はピロリ菌に関連する疾患、より好ましくはピロリ菌感染によって引き起こされる又はピロリ菌感染に関連する疾患の予防及び／又は治療を目的とする。
【００３７】
本発明の基礎をなす問題は、第８の側面において、試料中のＨＰＧＧＴに対する抗体を検出するための、第１の側面に従ったポリペプチドの使用によって解決される。
【００３８】
第８の側面の１つの実施形態では、前記抗体は、ＨＰＧＧＴの酵素活性及び／又はリンパ球増殖へのＨＰＧＧＴの阻害活性を阻害することができる。
【００３９】
本発明の基礎をなす問題は、第９の側面において、第１の側面に従ったポリペプチドに特異的に結合する抗体によって解決される。
【００４０】
第９の側面の１つの実施形態では、前記抗体は、ＨＰＧＧＴに対する、より好ましくはＨＰＧＧＴの特異的活性に対する阻害作用及び／又はリンパ球増殖のＨＰＧＧＴ依存性抑制を無効にする作用を有する。
【００４１】
本発明の基礎をなす問題は、第１０の側面において、第９の側面に従った抗体をコードする核酸によって解決される。
【００４２】
本発明の基礎をなす問題は、第１１の側面において、第１の側面に従ったポリペプチドに特異的に結合するか又はＨＰＧＧＴのアミノ酸４５１及び４５２を含む一続きの切れ目のないアミノ酸から成るＨＰＧＧＴのフラグメントに特異的に結合する核酸分子であって、アプタマー及びスピーゲルマーを含む群から選択される核酸分子によって解決される。
【００４３】
１１番目の態様の１つの実施形態では、核酸は、ＨＰＧＧＴに対する、より好ましくはＨＰＧＧＴの特異的活性に対する阻害作用及び／又はリンパ球増殖のＨＰＧＧＴ依存性抑制を無効にする作用を有する。
【００４４】
本発明の基礎をなす問題は、第１２の側面において、薬剤の製造のための、第９の側面に従った抗体の使用によって解決される。
【００４５】
本発明の基礎をなす問題は、第１３の側面において、薬剤の製造のための、第１１の側面に従った核酸の使用によって解決される。
【００４６】
第１２及び第１３の側面の１つの実施形態では、薬剤は、ピロリ菌によって引き起こされる又はピロリ菌に関連する疾患、より好ましくはピロリ菌感染によって引き起こされる又はピロリ菌感染に関連する疾患の治療及び／又は予防を目的とする。
【００４７】
本発明の基礎をなす問題は、第１４の側面において、薬剤候補物質の、
ａ．ピロリ菌のγ−グルタミルトランスペプチダーゼの特異的活性に対する阻害作用、及び
ｂ．リンパ球増殖のＨＰＧＧＴ依存性抑制を無効にする作用
を評価する工程を含む疾患の治療のための薬剤候補物質を同定するための方法によって解決される。
【００４８】
第１４の側面の１つの実施形態では、疾患は、ピロリ菌によって引き起こされるか又はピロリ菌に関連し、より好ましくは疾患は、ピロリ菌感染、より好ましくはヒトにおけるピロリ菌感染によって引き起こされるか又はそれに関連する。
【００４９】
本発明の基礎をなす問題は、第１５の側面において、
ａ）ＨＰＧＧＴ又はその少なくとも１つのフラグメントを含む免疫原性組成物を提供する工程と、
ｂ）該免疫原性組成物で動物を免疫し、それによって抗体を作製する工程と、
ｃ）該抗体を、ピロリ菌のγ−グルタミルトランスペプチダーゼの特異的活性に対するそれらの阻害作用及びリンパ球増殖のＨＰＧＧＴ依存性抑制を無効にするそれらの作用に関して評価する工程と、
ｄ）適切な免疫原性組成物を選択する工程とを含むワクチンを開発するための方法によって解決される。
【００５０】
第１５の側面の１つの実施形態では、前記ワクチンは、ヒトにおけるピロリ菌感染に対するワクチンである。
【００５１】
本発明の基礎をなす問題は、第１６の側面において、予防及び／又は疾患のための薬剤の製造のためのＨＰＧＧＴのリガンドの使用であって、リガンドが、ＨＰＧＧＴ活性を有意に阻害し、リンパ球増殖のＨＰＧＧＴ依存性抑制を無効にする、前記使用によって解決される。
【００５２】
第１６の側面の１つの実施形態では、前記疾患は、ピロリ菌によって引き起こされる又はピロリ菌に関連する、より好ましくはピロリ菌感染によって引き起こされる又はピロリ菌感染に関連する。
【００５３】
第１６の側面の１つの実施形態では、リガンドは、９番目の態様に従った抗体、又は１１番目の態様に従った核酸である。
【００５４】
第１６の側面の１つの実施形態では、リンパ球増殖及び／又は活性化は、リンパ球増殖アッセイにおいて評価される。
【００５５】
本発明の基礎をなす問題は、第１７の側面において、免疫抑制剤組成物の製造のためのＨＰＧＧＴの使用によって解決される。
【００５６】
本発明の基礎をなす問題は、第１８の側面において、ＨＰＧＧＴとグルタミンを、ＨＰＧＧＴ特異的活性を可能にする培地でインキュベートした後に上清として得られる免疫抑制剤組成物によって解決される。
【００５７】
特定の理論に縛られることを望むものではないが、発明者は、意外にも、ヘリコバクターピロリのγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＨＰＧＧＴ）に対するリガンド（Ｅ．Ｃ．２．３．２．２．）が、ピロリ菌感染、特に胃十二指腸障害の治療及び／又は予防のために使用でき、前記リガンドが、ＨＰＧＧＴの触媒活性の阻害剤であり、この酵素の存在下で抑制される対照と比較してリンパ球増殖を回復されることを見出した。さらに、本発明の発明者は、ＨＰＧＧＴと共にインキュベートしたとき、前記リンパ球増殖が、リンパ球においてＧ１細胞周期停止を導き、それによってリンパ球増殖を阻害する、ＨＰＧＧＴ特異的活性によってブロックされることを認めた。その結果として、ＨＰＧＧＴ特異的活性の阻害はリンパ球増殖の阻害を無効にし、その結果ピロリ菌が宿主の免疫系を免れることを不可能にする。そこで、本発明によって示唆されるようなリガンドの使用は、宿主／患者の体内でのピロリ菌のコロニー形成を予防する又は少なくとも実質的に低減する。最後に、発明者は、ピロリ菌のγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）の触媒活性がリンパ球増殖、特に宿主の体内でのＴ細胞増殖の抑制のために必要であることを見出した。これは、ＧＧＴ活性を欠く突然変異型細菌がリンパ球の増殖を廃する能力を喪失し、同時にマウスにコロニー形成することができないことを示すことによって明らかに実証された。リンパ球への阻害作用は、組換えＨＰＧＧＴに関して完全に存在した。Ｔ細胞におけるシグナル伝達へのその作用の分析は、Ｇ１細胞周期停止の誘導を導くＲａｓシグナル伝達経路の崩壊を示唆する。あらゆるピロリ菌株がＨＰＧＧＴを有すること、及び阻害性リガンドによるこの酵素の標的は、あらゆるピロリ菌感染に適用し得る新規治療を提供し、それによって抗生物質療法に関連する問題（耐性、副作用、突然変異の選択等）を回避することに留意することが重要である。本発明に従って、ＨＰＧＧＴの触媒活性を阻害し、それにより、さもなければピロリ菌に対する有効な免疫応答を妨げる免疫抑制を打破することによって、好ましくはピロリ菌感染に対する防護が与えられる。
【００５８】
ＨＰＧＧＴは、動物、植物及び細菌の間に広く分布する。ヘテロ二量体タンパク質であり、１本のポリペプチド鎖として翻訳され、翻訳後、異なる分子量を有する２つのサブユニットに切断される。この酵素の哺乳動物形態は膜結合タンパク質であり、主として全身の腺及び細管の管腔表面で発現される。ヘリコバクターピロリのホモログを含む一部の細菌ＧＧＴの細胞局在は、哺乳動物酵素のものとは異なる。ＨＰＧＧＴは、細胞外液中に分泌されることが以前に示された（Ｂｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。加えて、種々のＧＧＴホモログのアミノ酸配列のアラインメントは、ＨＰＧＧＴとヒト及び他の哺乳動物のＧＧＴとの間の２２％という低い相同性を明らかにしたが、細菌ホモログに対してはより高い相同性を示した。ＨＰＧＧＴと他の種からのホモログとの間のもう１つの重要な相違は、ＨＰＧＧＴのＣ末端におけるＧＹ残基の欠如である（Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。したがって、ＨＰＧＧＴとその哺乳動物ホモログとの間での細胞局在及びタンパク質構造に関する実質的な相違は明白である。
【００５９】
γ−グルタミルトランスペプチダーゼはまた、グルタミルトランスペプチダーゼ；α−グルタミルトランスペプチダーゼ；ｇ−グルタミルペプチジルトランスフェラーゼ；ｇ−グルタミルトランスペプチダーゼ；ｇ−ＧＰＴ；ｇ−ＧＴ；ｇ−ＧＴＰ；Ｌ−ｇ−グルタミルトランスペプチダーゼ；Ｌ−ｇ−グルタミルトランスフェラーゼ；Ｌ−グルタミルトランスフェラーゼ；ＧＧＴ；ｇ−グルタミルトランスペプチダーゼとしても知られる。特異的（触媒）活性は、以下で概説するようなグルタミル残基の転移である。
（５−Ｌ−グルタミル）−ペプチド＋アミノ酸＝ペプチド＋５−Ｌ−グルタミルアミノ酸
【００６０】
この反応又はそのような反応を実施する能力を、ここではまた、ＨＰＧＧＴの酵素活性又はＨＰＧＧＴの特異的活性とも称する。
【００６１】
ＧＴＴ活性は、当業者に公知の方法で（例えばＬ−γ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリドを供与体基質として使用して；以下参照）評価することができる。ＨＰＧＧＴ及び／又はリガンドの存在下又は不在下でのリンパ球増殖アッセイは、ここで詳細に述べるように実施できる。
【００６２】
ＧＧＴは、以前に他のグループによって、インビボでのコロニー形成のために重要なピロリ菌からの因子であると述べられた１１，１３。しかし、この所見の根拠となる理由は曖昧なままであった。
【００６３】
本発明は、ヒトＴリンパ球増殖のＧＧＴ依存性阻害及びピロリ菌によるＧ１停止の誘導についての明確な証拠を提供する。これは、一方では、細菌の同質遺伝子的ＧＧＴノックアウト突然変異体の使用によって明らかにされ、前記突然変異体は、抗原刺激した一次ヒトＴ細胞並びにＰＢＭＣの増殖を抑制することができなかった。他方で、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現された組換えＨＰＧＧＴは、ピロリ菌によって分泌される他のタンパク質の不在下でＴ細胞増殖を阻害した。興味深いことに、我々のデータは、哺乳動物ＧＧＴがこの阻害作用を欠如していたことを示す。上述したように、哺乳動物とＨＰＧＧＴの構造及び局在性の相違が報告されている。我々の結果は、哺乳動物ＧＧＴがリンパ球の増殖を阻害できないことの原因である、哺乳動物とＨＰＧＧＴの触媒機構及び／又は基質特異性のさらなる違いを示すものである。
【００６４】
セリン残基４５１及び４５２がＧＧＴの触媒活性のために必須であることを同定するために構造試験及び突然変異誘発実験が使用された２１。アミノ酸位置３８０（Ｔ３８０）がＨＰＧＧＴの触媒活性のために極めて重要であると報告されている先行技術の学術的教示３１と異なり、ＨＰＧＧＴのセリン４５１／４５２のアラニンへの部位指定突然変異誘発が、リンパ球に対するその触媒活性、特にその阻害活性の完全な廃止を生じさせることがここで示される。よって、ＧＧＴ阻害剤であるアシビシン（ａｃｉｖｉｃｉｎ）とのＨＰＧＧＴのインキュベーションは、酵素の触媒活性並びに阻害作用を完全に無効にする。したがって、我々のデータは、ＨＰＧＧＴの触媒ドメインの構造的完全性がその免疫抑制作用のために必要な前提条件であることを明らかにする。インビボでのコロニー形成におけるピロリ菌からのＧＧＴの重要な役割と一致して１１，１３、我々は、この酵素が宿主の胃粘膜中に存在する低いｐＨ値でも触媒的に活性であることを認めた。
【００６５】
ヒトの胃における上皮細胞が、内側区画と外側区画との間の分子の移動を制限する連続的なバリアを形成することは広く確立されている。加えて、このバリアの細胞間空隙を通しての高分子の受動拡散は、タイト結合及び接着結合を含む様々な機構によって妨げられる。そこで、ヘリコバクターピロリによって分泌されるＧＧＴタンパク質は、Ｔ細胞増殖を抑制するために上皮バリアの反対側の宿主免疫系とどのようにして相互作用し得るのかという疑問が生じる。これに関して、以前に、ＨＰはいくつかの機構によって胃上皮のバリア機能を弱めることができることが明らかにされた。加えて、ＨＰタンパク質ＶａｃＡ及びＣａｇＡタンパク質による上皮結合複合体の破壊並びにピロリ菌ウレアーゼによって誘導される上皮バリアを横断するトランスサイトーシスタンパク質輸送の上昇が、以前に明らかにされている。これらの機構が最終的に、粘膜固有層内のＨＰタンパク質の存在増加及びピロリ菌感染の結果として胃粘膜を浸潤する免疫系の細胞とのそれらの相互作用を導く。ＨＰＧＧＴによる胃粘膜内のＴ細胞の障害の裏付けとして、我々の結果は、ＨＰ感染患者で認められるが非感染対照患者では認められない、このビルレンス因子に対する著明な血清抗体応答を示す。これは、ＧＧＴタンパク質成分の抗原プロセシング及び胃粘膜内のＴリンパ球を含む免疫系の成分に対するこれらの抗原の提示という概念を裏付ける。したがって、ＨＰＧＧＴによる胃粘膜内のＴリンパ球増殖の抑制は、ヘリコバクターピロリの、ヒトの胃におけるその慢性的残存を促進する免疫回避機構に寄与し得る。
【００６６】
本発明の基礎をなす研究の結果は、Ｔ細胞活性化の重要な機構が、ピロリ菌野生型上清及びまた組換えＨＰＧＧＴとのインキュベーションの間も無傷であることを明らかにする。これは、細胞表面抗原ＣＤ６９及びＣＤ２５（ＩＬ−２受容体α鎖）の発現がピロリ菌上清の存在下で低下しないことを示した本発明の発明者の以前の試験と一致する３。加えて、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ染色によって測定されるホスファチジルセリンの露出がピロリ菌上清及び組換えＨＰＧＧＴの存在下で上昇しなかったことから、リンパ球へのＨＰＧＧＴの抑制作用がアポトーシス非依存性機構によって媒介されることが明らかにされる。ＨＰＧＧＴは胃上皮細胞において酸化的ストレス及びアポトーシスを誘導することが以前に記述されている１２，１６。免疫系の細胞へのこの酵素の作用は、しかしながら、これまで測定されておらず、認められた相違は標的細胞の間の相違を反映する可能性がある。
【００６７】
発明者は、Ｔ細胞における細胞周期進行へのＨＰＧＧＴの干渉を分析し、ＨＰＧＧＴが、細胞周期のＧ１期で停止を生じさせることによってリンパ球の増殖を阻害することを認めた。Ｇ１停止は、Ｃｄｋ阻害剤ｐ２７の量の増加並びにサイクリンタンパク質の細胞レベル低下によって特徴づけられた。Ｒａｓ及びＰＩ３Ｋ依存性経路は、その触媒パートナーによるＤ型サイクリンの誘導、合成及び構築において中心的な重要性を持つ２２，２３。Ｒａｓシグナル伝達経路の活性化は、ｃ−Ｒａｆ及び他のキナーゼを含むタンパク質カスケードを通してサイクリンＤの転写を誘導する２４。加えて、Ｒａｓシグナル伝達の誘導は、細胞周期、細胞増殖及び形質転換において重要な役割を果たすｃ−Ｍｙｃタンパク質の合成増強を導くことが確立されている２５。これまでの試験は、ＰＩ３Ｋシグナル伝達がＴ細胞内でＲａｓシグナル伝達とは独立して進行することを明らかにした１７。ＰＩ３Ｋシグナル伝達の重要なメディエイター（ＡＫＴ、ｐ７０Ｓ６Ｋ及びＦｏｘｏ３）の活性化状態はＨＰＧＧＴの存在下で不変であったが、我々は、ＨＰＧＧＴと共にインキュベートした細胞においてｃ−Ｒａｆリン酸化及びｃ−Ｍｙｃタンパク質のレベル低下を認めた。よって、我々のデータは、ピロリ菌からのＧＧＴによる、ＰＩ３Ｋ依存性シグナル伝達ではなくＲａｓ依存性シグナル伝達の破壊が、細胞増殖の排除を導くＴ細胞における細胞周期停止の誘導において役割を果たすことを示唆する。
【００６８】
もう１つの重要な疑問は、ＨＰＧＧＴのような酵素が、細胞周期停止及び増殖阻害を導く細胞内シグナル伝達事象にどのようにして影響を及ぼし得るかということである。ペプチド転移反応において、ＧＧＴは供与体から受容体基質へのγ−グルタミル部分の転移を触媒する２７。体系的なアミノ酸枯渇分析により、発明者は、ＨＰＧＧＴの阻害作用が培地からのアミノ酸グルタミンの不在下では完全に無効化され、ピロリ菌からのＧＧＴの阻害作用がペプチド転移の間の転写産物の形成によって間接的に媒介されることを示唆することを認めた。これは、ＨＰＧＧＴと培養基のプレインキュベーション及びその後の細胞添加に先立つ酵素の不活化が、リンパ球増殖の阻害のために十分であるという我々の所見によって裏付けられる。
【００６９】
これまでの試験は、ヒトＴリンパ球の増殖を阻害する、ＧＧＴとは異なるピロリ菌のいくつかの因子を記述した。Ｗａｎｇとその共同研究者達は、３００のＭＯＩ（Ｔ細胞当たり３００細菌）のピロリ菌がアポトーシスの誘導によってＴ細胞の増殖を阻害することを示した。しかし、そのような高い量の細菌がヒトの胃の粘膜固有層においてＴ細胞と接触するかどうかは疑わしいと考えられる。我々の以前の公表文献において（（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２００５  ２００５：１２８（５）：１３２７−３９）、発明者は、３００倍低い１のＭＯＩ（Ｔ細胞当たり１細菌）でさえも我々の系においてリンパ球増殖を阻害するために十分であることを示した。リンパ球と共にインキュベートしたＨＰ培養上清の濃度を１００μｇ／ｍｌ以上に上げたとき、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．と同等の量でアポトーシスが観察された。これは、ここで述べるリンパ球に対するＨＰの阻害作用が、このグループによって記述された機構よりも著明であり、その機構とは異なることを示唆する。
【００７０】
Ｚａｂａｌｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．によるもう１つの試験は、細胞質ＨＰタンパク質アルギナーゼによるＴ細胞増殖の阻害を述べた３０。著者らは、細菌の細胞質タンパク質及び膜結合タンパク質を含むＨＰからの全細胞溶解産物を使用した。これに対し本発明の発明者は、ＨＰの分泌タンパク質を含むＨＰからの培養上清を使用した。アルギナーゼはＨＰによって分泌されないので、この酵素のＴ細胞に対する阻害作用はここで使用した系では検出できず、インビボで起こる可能性は低い。
【００７１】
Ｇｅｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．による研究は、ピロリ菌によって分泌される空胞化細胞毒Ａ（ＶａｃＡ）がＴ細胞の増殖を阻害することを示唆した。著者らは、我々が本試験において使用した（１０μｇ／ｍｌ）よりも２５倍高い濃度（２５０μｇ／ｍｌ）の細菌上清を使用した。以前の試験で、本発明の発明者は、高濃度のＨＰ培養上清（≧１１０μｇ／ｍｌ）がリンパ球において有意量のアポトーシスを誘導することを明らかにした。加えて、ＶａｃＡの存在又は不在は、我々の系ではリンパ球に対するＨＰの阻害作用に影響を及ぼさなかった（Ｇａｓｔｒｏ  ２００５）。
【００７２】
したがって、これまでに記述されたピロリ菌によるＴ細胞阻害の他の方法にもかかわらず、細菌によって分泌されるＧＧＴが、ここで使用した系においてＴ細胞増殖を阻害するために必要且つ十分である。
【００７３】
要するに、本出願の基礎となるデータは、免疫エフェクター細胞の細胞周期進行を阻害するために分泌タンパク質を利用する、ピロリ菌によって適用される免疫回避のための新規機構を提供する。この細菌のＧＧＴ欠損突然変異体では阻害作用が完全に無効化されたので、酵素ＧＧＴがピロリ菌によるＴ細胞増殖の阻害に関与することが示される。組換えＨＰＧＧＴタンパク質の酵素的に不活性な突然変異体はＴ細胞増殖を抑制する能力を欠如していたので、この作用は明らかにＧＧＴの触媒活性に依存した。加えて、Ｔ細胞のＧ１期における細胞周期停止がピロリ菌からのＧＧＴの存在下でのみ誘導されたことが示される。やはり特定の理論に縛られることを望むものではないが、さらなる結果は、Ｇ１停止及びＴ細胞増殖抑制の原因として、ＨＰＧＧＴによる、ＰＩ３Ｋ依存性シグナル伝達ではなくＲａｓ依存性シグナル伝達の破壊を示唆する。リンパ球阻害因子としてのＨＰＧＧＴの同定は、ピロリ菌コロニー形成のためのＨＰＧＧＴの重要な役割を示す、動物モデルでの所見に関する生物学的根拠を形成する。ＨＰＧＧＴ及び宿主のコロニー形成におけるその役割の可能性は、ＷＯ００／０１８２５及びＷＯ９８／１７８０４で論じられている。どちらの資料も、しかしながら、ＨＰＧＧＴ活性が宿主の免疫系の抑制に関与することの証拠を提示しておらず、宿主におけるＴ細胞増殖及び免疫抑制へのＨＰＧＧＴの作用については記述していない。
【００７４】
本発明の発明者は、ＨＰＧＧＴ自体、好ましくは配列番号１に従ったアミノ酸配列を有する野生型ＨＰＧＧＴだけでなく、その特定フラグメントも、各々が好ましくはＨＰＧＧＴに特異的に結合し、ＨＰＧＧＴの特異的活性を阻害する及び／又はリンパ球増殖のＨＰＧＧＴ依存性抑制の無効化効果に適する抗体、アプタマーならびにスピーゲルマーの作製のための抗原として使用し得ることを見出した。
【００７５】
したがって、本発明の１つの側面は、特異的ポリペプチドに関する。そのようなポリペプチドは、ＨＰＧＧＴの特定領域のアミノ酸の部分又は一続きのアミノ酸に同一である又は対応するアミノ酸の配列を含む。好ましくは、ＨＰＧＧＴのアミノ酸配列は、配列番号１に従ったアミノ酸配列を含む。
【００７６】
ここで好ましく使用されるように、２つのアミノ酸の配列もしくは順序がアミノ酸の性質及び互いに対する相対的位置に関して同じである場合、１つのアミノ酸配列はもう１つのアミノ酸配列に同一である。もう１つの実施形態では、同一である配列の一次アミノ酸配列は同じである。
【００７７】
ここで好ましく使用されるように、２つのアミノ酸の配列又は順序がアミノ酸の性質及び互いに対する相対的位置に関して同じである場合、１つのアミノ酸配列はもう１つのアミノ酸配列に同一である。もう１つの実施形態では、互いに対応する配列の一次アミノ酸配列は同じであり、両方の対応するアミノ酸配列の全体的状況は同じであるか又は異なる。アミノ酸の全体的状況は、アミノ酸配列の一方又は両方の末端に隣接するアミノ酸によって定義される。
【００７８】
同一である又は互いに対応する配列が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列相同性を有することは当業者に認識される。
【００７９】
１つの実施形態では、本発明によるポリペプチドは、ＨＰＧＧＴの一続きの連続アミノ酸に同一である又は対応するアミノ酸配列を含む又は前記アミノ酸配列から成る。好ましくは、及び本発明のいずれかの実施形態及び態様に該当する場合、ＨＰＧＧＴは配列番号１に従ったアミノ酸配列を有する。ＨＰＧＧＴの用語に包含されるＨＰＧＧＴの変異体及び突然変異体が存在し得ることは当業者に認識される。また、ＨＰＧＧＴの配列が配列番号１で規定されるＨＰＧＧＴのものと異なる場合、配列番号１で規定されるアミノ酸配列を有するＨＰＧＧＴに関してここで開示されるものがそのような異なる形態のＨＰＧＧＴにも適用されることは本発明の範囲内である。より詳細には、当業者は、それぞれその位置、化学的性質及び／又は機能に関して配列番号１で規定されるアミノ酸配列を有するＨＰＧＧＴにおいて同定されるものに対応し、指定されるそのような異なる形態のアミノ酸を同定する。
【００８０】
ここで開示されるように、本出願によるポリペプチドは、ＨＰＧＧＴの特定領域のアミノ酸配列に同一であるか又は対応する。１つの実施形態では、そのような領域は、配列番号１に従ったアミノ酸配列のアミノ酸位置１５０〜２００によって定義される領域である。もう１つの実施形態では、そのような領域は、配列番号１に従ったアミノ酸配列のアミノ酸位置４１０〜４８０によって定義される領域である。
【００８１】
本発明の発明者は、意外にも、アミノ酸１５０〜２００によって定義されるＨＰＧＧＴの部分及びアミノ酸４１０〜４８０によって定義されるＨＰＧＧＴの部分が、ＨＰＧＧＴの触媒活性を阻害することができ、したがってピロリ菌に感染している又はピロリ菌に感染する危険度が高い生物においてピロリ菌に対する又は少なくともＨＰＧＧＴに対する免疫応答を惹起する前提条件を提供する、抗体の作製のための抗原又はワクチンとして使用されるために特に有益であることを見出した。
【００８２】
特定の理論に縛られることを望むものではないが、発明者は、アミノ酸位置１５０〜２００及びアミノ酸位置４１０〜４８０によって定義される領域の両方がＨＰＧＧＴの酵素活性と特別な関係を有すると推測する。より詳細には、アミノ酸位置４１０〜４８０によって定義されるＨＰＧＧＴの領域は、ＨＰＧＧＴの活性中心に関連する又は近接すると言われている。より詳細には、ＨＰＧＧＴのこの領域は、直接活性中心と接するループ領域及び活性中心自体の部分を含む。したがって、ＨＰＧＧＴのこの部分のブロッキングは、おそらくＨＰＧＧＴの触媒活性の基質の侵入をブロックすることによって、ＨＰＧＧＴの酵素活性を阻害するための適切な手段である。同じことが、原則として、アミノ酸位置１５０〜２００によって定義されるＨＰＧＧＴの領域にも当てはまる。配列番号１に従ったＨＰＧＧＴのアミノ酸位置１５０〜２００のこの領域は、ＨＰＧＧＴの活性中心の外側のループに関連する又はループ（の部分）を形成するが、基質に対する結合ポケットに空間的に近接する。これを考慮すると、これらの領域に特異的に干渉する分子は、ここでより詳細に述べるように、この種の結合特性を有する抗体に関して使用できる作用物質である。抗体のほかに、先行技術において記述されているペプチドアプタマー、アンチカリン、アプタマー及びスピーゲルマーは、抗体に関してここで開示する様々な目的のために、それぞれ作製され、使用され得る。
【００８３】
本出願は、その配列が以下のアミノ酸位置に対応する又は同一であるポリペプチドを提供する。
（ａ）（１５０＋ｎ）から（１５０＋ｎ＋ｍ）まで［式中、ｎは０から３５までの何らかの整数であり、ｍは１５から３０までの何らかの整数である］。このようにして定義される位置は、ｎとｍの何らかの組み合わせから生じるものであることが了解される。そのような組み合わせは、好ましくは、そのように定義される上限位置が約２００である範囲に限定されることがさらに了解される。（１５０＋ｎ）によって定義される位置は下限位置とも称され、及び（１５０＋ｎ＋ｍ）によって定義される位置は上限位置とも称される。
（ｂ）（４１０＋ｎ）から（４１０＋ｎ＋ｍ）まで［式中、ｎは０から５５までの何らかの整数であり、ｍは１５から３０までの何らかの整数である］。このようにして定義される位置は、ｎとｍの何らかの組み合わせから生じるものであることが了解される。そのような組み合わせは、好ましくは、そのように定義される上限位置が約２００である範囲に限定されることがさらに了解される。（４１０＋ｎ）によって定義される位置は下限位置とも称され、及び（４１０＋ｎ＋ｍ）によって定義される位置は上限位置とも称される。
【００８４】
さらなる実施形態では、本発明によるポリペプチドは、ＨＰＧＧＴのフラグメント、好ましくはＨＰＧＧＴの免疫原性フラグメント、より好ましくは宿主生物において免疫応答、好ましくは抗体応答を惹起するのに適したＨＰＧＧＴの免疫原性フラグメントであり、抗体は、ＨＰＧＧＴに対する、より好ましくはＨＰＧＧＴの特異的活性に対する阻害作用及び／又はリンパ球増殖のＨＰＧＧＴ依存性抑制を無効にする作用を有する。好ましくは、本発明による免疫原性フラグメントは、ＨＰＧＧＴのアミノ酸４５１及び／又は４５２を含む。フラグメントはいかなる長さであってもよい。しかし、１０〜約５０アミノ酸残基のペプチド、より好ましくは１０〜４０、１０〜３０又は最も好ましくは１０〜２０アミノ酸残基のペプチドが使用される。ペプチドに基づくワクチンのためのエピトープ予測アルゴリズムがここで適用される。ここで好ましく使用されるように、宿主生物は、好ましくは、抗原に対する免疫応答を発現することができる動物、好ましくは哺乳動物又はヒトである。
【００８５】
ここで好ましく使用されるように、アミノ酸はα−アミノ酸である。同じくここで好ましく使用されるように、アミノ酸はＤ−又はＬ−アミノ酸のいずれか、好ましくはＬ−アミノ酸である。さらに好ましくは、アミノ酸は天然に生じるアミノ酸である。
【００８６】
本発明の発明者はまた、驚くべきことに、ＨＰＧＧＴのセリン残基４５１及び／又は４５２からアラニンへの突然変異誘発が、組換えＨＰＧＧＴの酵素活性を完全に排除し、そのＴ細胞増殖の阻害を無効にすることを認めた。しかし、セリン残基３８５（Ｓ３８５Ａ）の置換はＴ細胞増殖へのＨＰＧＧＴ依存性阻害作用を低減しなかったが、この突然変異型ＨＰＧＧＴの触媒活性は有意に（すなわち約５０％）低下した。したがって、ピロリ菌感染の治療のための適切な薬剤物質は、２つの必要条件、すなわち（ｉ）ＨＰＧＧＴの触媒活性への阻害作用を示さなければならないこと、さらに、ＨＰＧＧＴと共にインキュベートしたときＴ細胞増殖を回復しなければならないこと、を満たす必要がある。適切な薬剤候補物質の同定のための本発明による有効な方法は、両方の評価を含む。
【００８７】
この所見を踏まえて、本発明のもう１つの側面は不活化形態のＨＰＧＧＴの使用に関する。
【００８８】
不活化形態のＨＰＧＧＴは、１つの実施形態では、ここで示すＨＰＧＧＴの酵素活性を欠くＨＰＧＧＴである。そのような不活化形態のＨＰＧＧＴを提供するために、常に酵素的に活性なＨＰＧＧＴと比較して、１又は複数のアミノ酸の欠失、１又はそれ以上のアミノ酸の変化を含む、様々な方法が存在することは当業者に認識される。不活化形態のＨＰＧＧＴの１つの実施形態は、配列番号１に従ったアミノ酸配列の４５１位及び４５２位のセリンアミノ酸を欠くものである。１つの実施形態では、不活化形態のＨＰＧＧＴは、ここで述べる免疫応答、好ましくは野生型ＨＰＧＧＴへの阻害作用、より好ましくはＨＰＧＧＴの特異的活性への阻害作用及び／又はリンパ球増殖のＨＰＧＧＴ依存性抑制に対する無効化作用を有する抗体を含む動物及び／又はヒトにおける抗体応答を、まだ惹起することができる。ここで好ましく使用されるように、ＨＰＧＧＴの特異的活性という用語は、酵素活性、より詳細にはここで述べるＨＰＧＧＴの酵素活性と同義的に使用される。不活化形態のＨＰＧＧＴのさらなる実施形態は、野生型アミノ酸配列を有するＨＰＧＧＴであるが、その酵素作用はＨＰＧＧＴの酵素活性に対する阻害剤の添加によって抑制されている。そのような阻害剤は、抗体、スピーゲルマー、アプタマー、又はＨＰＧＧＴの酵素活性のために必要とされるイオンを含む因子をＨＰＧＧＴから奪う何らかの分子であり得る。
【００８９】
ポリペプチド、不活化形態のＨＰＧＧＴ及びＨＰＧＧＴは、ここではまた、特にそれに特異的に結合する抗体、アプタマー及びスピーゲルマーの作製に関連して標的分子とも称される。
【００９０】
本発明のさらなる態様は、本発明によるポリペプチド、不活化形態のＨＰＧＧＴ又はＨＰＧＧＴ、好ましくは、典型的には配列番号１に従ったアミノ酸配列を有する野生型のＨＰＧＧＴに対する抗体に関する。
【００９１】
好ましくはここで使用される抗体は、それぞれその製造と作製が当業者に周知である、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体の両方を含む。
【００９２】
標的に特異的な抗体の製造は当業者に公知であり、例えばＨａｒｌｏｗ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，（１９８８）に述べられている。好ましくは、Ｋｏｅｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎのプロトコール及びそれに基づくさらなる開発に従って製造され得るモノクローナル抗体は、本発明に関連して使用され得る。
【００９３】
ここで使用される抗体は、それらが適切であり、標的に結合することができる限り、完全抗体、抗体フラグメント又は誘導体、例えばＦａｂフラグメント、Ｆｃフラグメント及び一本鎖抗体、又はアンチカリンを含むが、これらに限定されない。モノクローナル抗体のほかに、ポリクローナル抗体も使用及び／又は作製され得る。ポリクローナル抗体の作製も当業者に公知であり、例えばＨａｒｌｏｗ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，（１９８８）に述べられている。好ましくは、治療のために使用される抗体は、ヒト化又はヒト抗体である。
【００９４】
本発明に従って使用され得る抗体は、１又はいくつかのマーカー又は標識を有し得る。そのようなマーカー又は標識は、その診断適用又はその治療適用において抗体を検出するために有用であり得る。好ましくは、マーカー及び標識は、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、金及びフルオレセインを含む群から選択され、例えばＥＬＩＳＡ法において使用される。これらやさらなるマーカー並びに方法は、例えばＨａｒｌｏｗ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，（１９８８）に述べられている。加えて又は選択的に、ここで述べる抗体並びに他のいずれかの標的アンタゴニスト又は相互作用パートナーは、ここでより一般的に述べるような標識アンタゴニストであり得る。
【００９５】
標識又はマーカーが、他の分子との相互作用のような、検出以外の付加的な機能を示すことも本発明の範囲内である。そのような相互作用は、例えば他の化合物との特異的相互作用であり得る。これら他の化合物は、ヒト又は動物の身体のような抗体が使用される系、又はそれぞれの抗体を使用することによって分析される試料に固有のものであり得る。適切なマーカーは、例えば、ビオチン又はフルオレセインと、アビジン及びストレプトアビジン及びそのようにマーク又は標識された抗体と相互作用するためにそれぞれの化合物又は構造上に存在する同様のもののような、その特異的相互作用パートナーであり得る。やはりこれも、アプタマー及びスピーゲルマーのようなここで述べるその他の標的相互作用パートナーにも当てはまる。
【００９６】
１つの実施形態では、抗体は、組換えＨＰＧＧＴのアミノ酸４５１及び／又は４５２を含むＨＰＧＧＴのエピトープに対して特異的活性を有する抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。もう１つの実施形態では、抗体は、これらのアミノ酸位置に空間的に近接するエピトープを標的し、好ましくは前記位置に隣接するループを標的して特異的に結合し、より好ましくはエピトープは、配列番号１のＨＰＧＧＴのアミノ酸位置１５０〜２００、より好ましくはアミノ酸位置１７４〜１９０によって定義される、又は配列番号１のＨＰＧＧＴのアミノ酸位置４１０〜４８０、より好ましくはアミノ酸位置４２３〜４４３によって定義されるＨＰＧＧＴの一続きの範囲、及びそれらが基本的に同一の免疫反応性を示すことを条件とするそれらの誘導体によって定義される又はそれらに含まれる。
【００９７】
好ましくは、本発明の抗体は、ＨＰＧＧＴ特異的活性を阻害し、宿主内でのリンパ球増殖のＨＰＧＧＴ依存性阻害を少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも８０％又は９０％抑制する。同じく好ましくは、本発明による抗体はさらに、ＨＰＧＧＴ特異的活性への阻害作用を示し、インビトロで評価されるＴ細胞増殖のＨＰＧＧＴ依存性抑制を無効にする。
【００９８】
抗体と同じ方法で、したがって同じ目的のために本発明に従って使用できる相互作用パートナーのもう１つのクラスは、標的結合ポリペプチドの特定形態である、いわゆる「アンチカリン」である。アンチカリン及びそれらの製造方法は、中でも特に、ドイツ特許出願第ＤＥ  １９７  ４２  ７０６号に述べられている。
【００９９】
抗体と同じ方法で、したがって同じ目的のために使用できる分子のさらなるクラスは、いわゆるペプチドアプタマーである。標的を使用して、ペプチドアプタマーは、ここでより詳細に説明するポリペプチドライブラリーを利用したスクリーニング工程を用いて作製できる。選択基準は、選択されたポリペプチドが実際に及び特異的に標的に結合することである。
【０１００】
より詳細には、そのようなペプチドアプタマーは、ファージディスプレイのような技術水準に従った方法を使用することによって作製され得る。基本的には、ファージの形態などの、ペプチドのライブラリーを作製し、この種のライブラリーを標的分子と接触させる。標的分子に結合しているペプチドを、その後、好ましくは標的分子との複合体として、それぞれの反応から取り出す。結合特性が、少なくともある程度までは、塩濃度等のような個々に実施される実験設定に依存することは当業者に公知である。より高い親和性又はより大きな力で標的分子に結合しているポリペプチドをライブラリーの非結合成員から分離した後、また場合により標的分子とポリペプチドの複合体から標的分子を分離した後、続いてそれぞれのポリペプチドを特性決定し得る。特性決定の前に、場合により、例えばポリペプチドをコードするファージを増殖させることによって、増幅工程が実施される。特性決定は、好ましくは標的結合ポリペプチドの、及び最終的にはここで定義される標的のアンタゴニスト又は相互作用パートナーとして働くポリペプチドの配列決定を含む。基本的には、ポリペプチドはそれらに長さに関して限定されないが、好ましくは約８〜２０アミノ酸長を有するポリペプチドが、好ましくはそれぞれの方法で入手される。ライブラリーの大きさは、約１０２〜１０１８、好ましくは１０８〜１０１５の異なるポリペプチドであり得るが、それらに限定されない。
【０１０１】
本発明のさらなる側面は、本発明によるポリペプチドに対する、不活化形態のＨＰＧＧＴ又はＨＰＧＧＴに対する、好ましくは、典型的には配列番号１に従ったアミノ酸配列を有する野生型のＨＰＧＧＴに対するアプタマーに関する。
【０１０２】
アプタマーは、一本鎖又は二本鎖であり、標的分子と特異的に相互作用するＤ−核酸である。アプタマーの製造と選択は、例えば欧州特許第ＥＰ  ０  ５３３  ８３８号に述べられている。基本的には、以下の工程が実施される。第一に、各々の核酸が、典型的には数個の、好ましくは少なくとも８個のその後ランダム化されるヌクレオチドのセグメントを含む、核酸の混合物、すなわち潜在的アプタマーを提供する。この混合物を、その後、標的分子と接触させ、それにより核酸は、候補混合物と比較して、例えば標的に対する高い親和性に基づいて又はそれに対するより大きな力で標的分子に結合する。結合核酸を、その後、残りの混合物から分離する。場合により、このようにして得られた核酸を、例えばポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅する。これらの工程を数回反復して、最後に、標的に特異的に結合する核酸の高い比率を有する核酸の混合物を得、場合によりそこから最終的な結合核酸を選択する。これらの特異的に結合する核酸をアプタマーと称する。アプタマーの作製又は同定のための方法のいかなる段階でも、個々の核酸の混合物の試料を、標準手法を用いてその配列を決定するために採取し得る。アプタマーを、例えばアプタマーを作製する技術分野の当業者に公知である定義された化学基を導入することなどにより、安定化し得ることは本発明の範囲内である。そのような修飾は、例えばヌクレオチドの糖部分の２’位置にアミノ基を導入することであり得る。アプタマーは現在、治療薬及び診断薬の両方として使用されている。しかし、そのように選択又は作製されたアプタマーを、標的の確認のため及び／又は薬剤、好ましくは低分子に基づく薬剤の開発のための先導物質として使用し得ることも本発明の範囲内である。これは、実際には競合アッセイによって実施され、競合アッセイでは、標的分子とアプタマーとの間の特異的相互作用が候補薬剤によって阻害され、標的とアプタマーの複合体からのアプタマーの置換後、それぞれの薬剤候補物質は標的とアプタマーとの間の相互作用の特異的阻害を可能にし、相互作用が特異的である場合、前記候補薬剤は、少なくとも原理上、標的をブロックするのに適しており、したがってそのような標的を含むそれぞれの系においてその生物学的アベイラビリティー又は活性を低下させると推測され得る。そのようにして得られた低分子を、次に、毒性、特異性、生分解性及びバイオアベイラビリティーのようなその物理的、化学的、生物学的及び／又は医学的特性を最適化するためにさらなる誘導体化及び修飾に供し得る。
【０１０３】
本発明のさらなる側面は、本発明によるポリペプチド、不活化形態のＨＰＧＧＴ又はＨＰＧＧＴ、好ましくは、典型的には配列番号１に従ったアミノ酸配列を有する野生型のＨＰＧＧＴに対するスピーゲルマーに関する。
【０１０４】
スピーゲルマーはアプタマーの特殊形態である。標的を用いて本発明に従って使用又は作製し得るスピーゲルマーの作製又は製造は、同様の原理に基づく。スピーゲルマーの製造は、ＷＯ９８／０８８５６に述べられている。スピーゲルマーはＬ−核酸であり、これは、それらが、Ｄ−ヌクレオチドで構成されるアプタマーと異なり、Ｌ−ヌクレオチドから成ることを意味する。スピーゲルマーは、生物系において非常に高い安定性を有し、アプタマーと遜色なく、それらが対象とする標的分子と特異的に相互作用するという事実によって特徴づけられる。スピーゲルマーを作製するには、Ｄ−核酸の不均一な集団を創製し、この集団を標的分子の光学的対掌体と、ここでは、例えば標的の天然に生じるＬ−鏡像異性体のＤ−鏡像異性体と接触させる。その後、標的分子の光学的対掌体と相互作用しないＤ−核酸を分離する。しかしながら、標的分子の光学的対掌体と相互作用するＤ−核酸を分離して、場合により測定及び／又は配列決定し、その後、Ｄ−核酸から得られた核酸配列情報に基づいて対応するＬ−核酸を合成する。標的分子の光学的対掌体と相互作用する前記Ｄ−核酸と配列に関して同一であるこれらのＬ−核酸は、標的分子の光学的対掌体ではなく天然に生じる標的分子と特異的に相互作用する。アプタマーの作製のための方法と同様に、様々な工程を数回反復し、標的分子の光学的対掌体と特異的に相互作用する核酸を冨化することも可能である。
【０１０５】
さらなる側面では、本発明は免疫原性組成物に関する。免疫原性組成物は、本発明によるポリペプチド及び／又は不活化形態のＨＰＧＧＴ、特にここで述べるような不活化形態のＨＰＧＧＴ、及び／又は野生型ＨＰＧＧＴの少なくとも１つを含む。本発明による前記ポリペプチド及び／又は前記不活化形態のＨＰＧＧＴ、特にここで述べるような不活化形態のＨＰＧＧＴ、及び／又は前記野生型ＨＰＧＧＴが、１つの実施形態では、免疫応答の惹起を可能にする又は促進する方法で宿主の免疫系にそれぞれの抗原を提示し、高力価の抗体を惹起するために、ＫＬＨ又はキーホールリンペットヘモシアニン、ＢＳＡ、オボアルブミン等のような担体物質に結合されることは了解される。
【０１０６】
本発明に関連して、免疫原性組成物がインビトロ又はインビボで使用できることは了解される。後者の場合そのような免疫原性組成物は、典型的にはワクチンであり、好ましくはそのようなワクチンとして製剤される。免疫原性組成物、及びそれぞれ免疫原性組成物を含有する薬剤及びワクチンは、好ましくは小児における、ピロリ菌感染の予防のため、又は、ピロリ菌感染及びそのような生物によって引き起こされるもしくはそのような生物に関連する何らかの疾患に罹患しているもしくは罹患する危険度が高い動物及びヒトの治療ならびに／又は予防のために使用できる。
【０１０７】
１つの実施形態では、本発明の免疫原性組成物は１又はいくつかのアジュバントを含む。好ましくは、アジュバントは、免疫系の全身性刺激を提供する物質である。アジュバントは当分野において公知であり、ポリカチオン性ポリマー、免疫刺激性デオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、合成ＫＬＫペプチド、神経活性化合物、ミョウバン、フロイント完全又は不完全アジュバント、コレラ毒素を含むが、これらに限定されない。好ましくは、ポリカチオン性ポリマーはポリカチオン性ペプチドであり及び／又は神経活性化合物はヒト成長ホルモンである。
【０１０８】
さらなる実施形態では、免疫原性組成物は、Ｂａｂ  Ａ、ＨｐａＡ、Ｏｍｐ  １８及びそれらの組み合わせのような、ピロリ菌の外膜タンパク質を含む。ＨｐａＡ及びＯｍｐ  １８は、例えばＶｏｌａｎｄ  ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｊｕｌｙ  ２００３，ｐ．３８３７−３８４３に述べられている。Ｂａｂ  Ａ、ＨｐａＡ及びＯｍｐ  １８という用語が、完全長ポリペプチドだけでなく、そのいかなる免疫原性フラグメント又はペプチドも包含することは本発明の範囲内である。ＨｐａＡは、推定上のＮ−アセチルノイラミニルラクトース結合赤血球凝集素であり、Ｂａｂ  Ａは、ルイス血液型抗原に結合する接着タンパク質である。他の抗原ならびに好ましくはタンパク質及びポリペプチド、及びそれらのそれぞれのフラグメントが、ピロリ菌に対する免疫応答を高めるために使用され得ることは了解される。それぞれ、本発明の１つの実施形態において使用され得る好ましいタンパク質及びポリペプチドは、典型的にはピロリ菌の外形質膜に組み込まれ、及び例えばイオン輸送、接着、構造的及び浸透圧安定性、及び細菌ビルレンスのために重要である、外膜タンパク質である。
【０１０９】
ピロリ菌から採取でき、本発明による免疫原性組成物の一部であり得るさらなる抗原は、米国特許出願公開第２００７００４２４４８号に記載されているものである。
【０１１０】
不活化形態のＨＰＧＧＴ及び野生型ＨＰＧＧＴを含む、本発明のポリペプチド及びタンパク質、並びに動物又はヒトの身体への投与用のここで述べるいずれかの他の化合物は、好ましくは製剤されることが認識される。そのような製剤は当業者に公知である。１つの実施形態では、製剤は米国特許第６，８３８，０８９号に述べられているものである。この米国特許に述べられている製剤は、複数のポリマー粒子を含む送達システムであって、水不溶性タンパク質抗原がそのポリマー粒子と共に組み込まれており、ポリマー粒子は、１又はそれ以上のホモポリマー及び／又はコポリマーを含むマトリックスポリマーであり、その方法は以下を含む：（ａ）タンパク質のような水不溶性物質及びその臨界ミセル濃度の０．１〜１００倍の濃度の１又はそれ以上の親水性界面活性剤を含む水相（Ｗ）を、タンパク質抗原を変性させない有機溶媒中にマトリックスポリマーを含む有機相（Ｏ）と混合して、Ｗ／Ｏ乳剤を生成すること、但しＯはＷと不混和性であり、Ｗ又はＯ又はその両方が、可溶化剤の存在下でＷ／Ｏ乳剤を安定化し、工程（ｂ）の間のポリマー粒子内への水不溶性タンパク質の組込みを促進するために混合の前に添加される１又はそれ以上の安定剤をさらに含む、及び（ｂ）乳剤を液体媒質に分散させることによって前記Ｗ／Ｏ乳剤の液滴を形成し、Ｗ／Ｏ乳剤液滴のＯ相から前記溶媒を除去して、水不溶性タンパク質抗原を組み込んだポリマー粒子を形成すること。
【０１１１】
さらなる実施形態では、ここで述べる作用物質及び化合物のための製剤及び送達物質は、米国特許第６，３７２，２６０号に述べられているようなミクロスフェアシステムである。
【０１１２】
本発明の１つの側面では、本発明によるポリペプチド、不活化形態のＨＰＧＧＴ、抗体、スピーゲルマー及びアプタマー、本発明に従ってこれらのいずれかを含む免疫原性組成物、医薬組成物は、好ましくはピロリ菌によって引き起こされる又はピロリ菌に関連する、より好ましくはピロリ菌感染によって引き起こされる疾患の予防及び／又は治療において使用される。１つの実施形態では、疾患は、ピロリ菌感染によって引き起こされる胃十二指腸障害である。さらなる実施形態では、疾患は、胃炎、特に慢性胃炎である。慢性胃炎は、胃又は十二指腸潰瘍、さらには胃癌及びＭＡＬＴリンパ腫の病因に関与するので、本発明の方法及び上記作用物質はこれらの疾患を予防するために使用できる。また、例えば胃及び十二指腸潰瘍疾患及び（ＭＡＬＴ）リンパ腫を治療するためにも使用できる。本発明によれば、一般的用語「治療」は、明白に異なる定義が為されない限り、病的障害の何らかの形態の治療・治癒（ｃｕｒｉｎｇ）、緩和、診断又は予防として使用される。
【０１１３】
本発明のさらなる態様では、及びリンパ球増殖、特にＴ細胞増殖へのその抑制作用に関して、ＨＰＧＧＴは宿主において免疫抑制を引き起こし、したがって新規免疫抑制剤として適用され得る。免疫抑制剤は、例えば移植後の臓器移植拒絶反応の危険性を低減するため、又は慢性関節リウマチ、クローン病又はアトピー性湿疹のような自己免疫疾患の治療のために使用できる。ＨＰＧＧＴの触媒活性は、γ−グルタミルのための供与体／受容体として機能するためにグルタミンの存在を必要とする。そこで、ＨＰＧＧＴを含有する免疫抑制剤組成物は、好ましくはグルタミンをさらに含む。
【０１１４】
さらに、発明者は、リンパ球増殖アッセイのために適用される細胞培養基の、グルタミン、ロイシン及びヒスチジン及び活性ＨＰＧＧＴとのプレインキュベーションが、ＨＰＧＧＴがその後不活性化されたときでも、Ｔ細胞に対する抗増殖作用を示すことを明らかにすることができた。よって、免疫抑制作用はＨＰＧＧＴ依存性であると結論された。しかしながら、酵素反応のまだ同定されていない直接又は間接産物が作用の形態に関わっている。したがって、本発明の１つの実施形態は、好ましくは医薬的に許容されるインキュベーション培地内で、ＨＰＧＧＴとグルタミン、ロイシン及びヒスチジンをインキュベートし、ＨＰＧＧＴ特異的反応を可能にすることによって得られる免疫抑制組成物に関する。この反応の上清は、その後、適切な免疫抑制組成物として適用され得る。好ましくは、この組成物は、そのような基質へのグルタミンの転移によって生成されるグルタミル−ペプチド、例えばポリ−グルタミル−グルタメート又はグルタミル誘導体を含む。
【０１１５】
この態様に関して使用されるＨＰＧＧＴが、ここで述べる特異的酵素活性を有する何らかのＨＰＧＧＴであることは本発明の範囲内である。ＨＰＧＧＴという用語が野生型ＨＰＧＧＴ、完全長ＨＰＧＧＴ及び何らかの誘導体、より詳細にはこの種の酵素活性を有する何らかのフラグメントを包含する。そのような誘導体及びフラグメントは、当分野において周知の方法を使用することにより、当業者によって生産され得る。
【０１１６】
ここで好ましく使用されるように、リンパ球の増殖を促進するという用語は、好ましい実施形態では、リンパ球の活性化及び増殖を促進することを意味する。
【０１１７】
さらなる態様では、本発明は、ＨＰＧＧＴ、より詳細には分泌配列（シグナルペプチド）を欠く又は非機能性の分泌配列を有する組換えＨＰＧＧＴを生産する方法に関する。機能的分泌配列、すなわちアミノ酸１〜２６、２６位と２７位の間の切断部位：ＬＳＡ−ＡＳを欠くそのようなＨＰＧＧＴは、そのようなＨＰＧＧＴが宿主細胞における生産の間にそのような宿主細胞から分泌されない限りにおいて好都合である。この態様に関して、宿主生物は、好ましくは大腸菌のような原核生物であるが、それらに限定されない。
【０１１８】
当業者は、機能的分泌配列を欠くそのようなＨＰＧＧＴを作製する方法を認識する。例えばこれは、タンパク質をコードする遺伝子を分泌リーダー配列なしで発現することによって達成され得る。そのような改変されたＨＰＧＧＴタンパク質はまだその宿主細胞内にとどまり、それにより、そこから精製することができる。
【０１１９】
さらなる態様では、本発明は、抗体の作製のための本発明によるポリペプチド及び本発明に従った不活性ＨＰＧＧＴの使用に関する。密接に関連する態様では、抗体の作製のために動物を免疫化するため、及び当業者に公知であるように、ハイブリドーマ細胞系の作製のためにそれぞれスターター細胞及び細胞系を提供するために使用される。そのようなハイブリドーマはさらに培養され、さらに選択され得ることが当業者に認識される。したがって、本発明によるポリペプチド及び本発明による活性及び不活性ＨＰＧＧＴが、本発明によるポリペプチド及び本発明による不活性ＨＰＧＧＴに対する及び／又はそれらと特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて使用されることも本発明の範囲内である。詳細には、ハイブリドーマは、ＨＰＧＧＴの触媒及び阻害機能を無効にする抗体を産生するハイブリドーマを同定するためにＨＰＧＧＴ活性アッセイをスクリーニングに適用することによって選択され得る。
【０１２０】
さらなる態様では、本発明は、本発明によるポリペプチド及び本発明による不活性ＨＰＧＧＴをコードする核酸に関する。そのような核酸を発現する宿主生物における遺伝暗号、及び場合によりコドン使用頻度を知ることにより、当業者がそのような核酸を作製し得ることは当業者に認識される。さらなる態様では、核酸は、ベクター、好ましくは発現ベクター内に含まれる。１つの実施形態では、ベクターという用語は、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ及び遺伝子工学の分野で通常使用される他のベクターを含む。尚さらなる態様では、本発明は、そのようなベクターを含む宿主生物に関する。１つの実施形態では、宿主生物、特に宿主細胞は、本発明の核酸分子又はベクターを一過性に又は安定に含む組換え宿主細胞である。宿主細胞又は宿主生物は、インビトロで組み換えＤＮＡを受け入れることができ、場合によっては、本発明の核酸分子によってコードされるタンパク質を合成することができる生物であると理解される。好ましくは、これらの細胞は、原核又は真核細胞、例えば哺乳動物細胞、細菌細胞、昆虫細胞又は酵母細胞である。本発明の宿主細胞は、好ましくは本発明の導入核酸分子が形質転換細胞に対して異種である、すなわち天然ではこれらの細胞において生じない又は対応する天然に生じる配列とは異なるゲノム内の位置に局在するという事実によって特徴づけられる。
【０１２１】
本発明のさらなる実施形態は、ＨＰＧＧＴ、好ましくは通常生じる分泌配列が除去されているか又は非機能性であるＨＰＧＧＴの生物学的性質を示し、及び本発明の核酸分子によってコードされる単離タンパク質、並びに、例えば本発明の宿主細胞を、前記タンパク質の合成を可能にする条件下で培養し、その後タンパク質を培養細胞及び／又は培養基から単離することによる、前記タンパク質の生産のための方法に関する。組換え生産されたタンパク質の単離と精製は、分取クロマトグラフィー、及びモノクローナル又はポリクローナル抗体によるアフィニティークロマトグラフィーを含むアフィニティー及び免疫学的分離を包含する従来の手段によって実施される。ここで使用されるように、「単離タンパク質」という用語は、それが天然に結合している他のタンパク質、核酸、脂質、炭水化物又は他の物質を実質的に含まないタンパク質を包含する。そのようなタンパク質は、しかし、組換え生産されたタンパク質を含むのみならず、単離された天然に生じるタンパク質、合成生産されたタンパク質又はこれらの方法の組み合わせによって生産されたタンパク質を包含する。そのようなタンパク質を作製するための手段は当分野において広く理解されている。本発明のタンパク質は、好ましくは実質的に精製された形態である。
【０１２２】
そこで、本発明はまた、原核又は宿主細胞において、外部から適用されたとき前記細胞に対して有害であるタンパク質を作製する一般的方法であって、（ａ）分泌シグナル配列を欠失している又は非機能性分泌シグナル配列を有する前記タンパク質をコードする核酸配列でトランスフェクトした宿主細胞を、前記タンパク質が発現される条件下で培養することと、（ｂ）前記タンパク質を細胞から回収することと、を含む方法に関する。これはまた、前記細胞から回収され得る、本発明によるポリペプチドをコードする核酸でトランスフェクトした宿主細胞にも当てはまる。
【０１２３】
本発明による抗体、アンチカリン、ペプチドアプタマー、アプタマー及びスピーゲルマーが、好ましくはヘリコバクターピロリのγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＨＰＧＧＴ）に対するリガンドとみなされ得ることは了解される。
【０１２４】
本発明の範囲内で、野生型ＨＰＧＧＴという用語又は同様の表現は、好ましくは、分泌配列を欠くが触媒的に活性である、より詳細にはＨＰＧＧＴに関してここで述べる酵素反応を触媒する、野生型のＨＰＧＧＴを指す。
【０１２５】
本発明を、ここで図面及び実施例によってさらに説明し、それらからさらなる特徴、実施形態及び利点が理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】図１Ａは、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．及びＢｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．９，１０に従った、分子量３０〜６６ｋＤａを有するピロリ菌からの分泌タンパク質を示す表である。図１Ｂは、サイズ排除クロマトグラフィーからの溶出分画中のタンパク質を示す銀染色後のＳＤＳ−ＰＡＧＥであり、ｂ−ｆの分画だけがヒトＴ細胞の増殖を阻害し、他のすべての分画は増殖を阻害しなかった。分画の阻害プロフィールに対応するタンパク質バンドを矢印で示す。図１Ｃは、実施例１で述べる分光光度アッセイによって測定したゲルろ過分画の酵素ＧＧＴ活性を示す棒グラフである。（ＨＰ＝ピロリ菌）
【図２】３Ｈ−チミジン取込みアッセイによって測定した、指示されているＨＰＳＮの存在下又は不在下での刺激ＰＢＭＣ（Ａ）及び単離一次ヒトＴリンパ球（Ｃ）の細胞増殖を示す棒グラフである。構築したノックアウト菌株のＧＧＴ表現型を、酵素活性アッセイ及び大型ＧＧＴサブユニットに対して惹起したポリクローナル抗体を使用した免疫ブロット法によって確認した（Ｂ）。免疫ブロット法のためにＨＰＳＮのタンパク質３０μｇを使用した。抗ＶａｃＡ抗体による免疫ブロットを負荷対照として使用した（挿入図参照）。データは３回の独立した実験の平均±標準偏差（ＳＤ）を示す。＊スチューデントｔ検定によって決定したＰ値＜０．００１を有意とみなした。（ＨＰ＝ピロリ菌、ＳＮ＝上清、ＷＴ＝野生型）
【図３】図３Ａ及び図３Ｂは、ＧＧＴの大型サブユニットに対する抗ＧＧＴ抗体による精製組換えＨＰＧＧＴ分画の銀染色（Ａ）及び免疫ブロット法（Ｂ）後のゲルがＧＧＴのプロセシングを示すことを明らかにする。星印は以下を示す：＊＊＊プロ形態、＊＊大型及び＊小型サブユニット。図３Ｃ〜図３Ｅは、大腸菌において発現された組換えＨＰＧＧＴ（ｒＨＰＧＧＴ）によるヒトＰＢＭＣの酵素活性（Ｃ）及び増殖阻害（Ｄ）を示す棒グラフである。対照として使用した大腸菌からのＬＰＳはＰＢＭＣの増殖を阻害しなかった。組換えＨＰＧＧＴは、ｐＨ２〜１０で触媒活性を示した（Ｅ）。データは３回の独立した実験の平均±標準偏差（ＳＤ）を示す。＊スチューデントｔ検定によって決定したＰ値＜０．００１を有意とみなした。（ＦＴ＝フロースルー、ＨＰ＝ピロリ菌）
【図４】ウマ腎臓からの精製ＧＧＴは触媒ＧＧＴ活性を示すが（Ａ）、リンパ球に対する増殖阻害作用を欠く（Ｂ）ことを示す棒グラフである。Ｓｅｒ４５１／４５２（Ｓ４５１／４５２Ａ）における組換えＨＰＧＧＴの部位指定突然変異誘発は、ＧＧＴ酵素活性（Ａ）及び阻害作用（Ｂ）を無効にした。３７℃で２時間のアシビシン（５０μＭ）とＨＰＷＴＳＮのプレインキュベーションは、ＧＧＴ活性（Ｃ）及びＰＢＭＣ増殖の阻害（Ｄ）を無効にした。データは３回の独立した実験の平均±標準偏差（ＳＤ）を示す。＊スチューデントｔ検定によって決定したＰ値＜０．０５を有意とみなした。（ＨＰ＝ピロリ菌、ＳＮ＝上清、ＷＴ＝野生型）
【図５Ａ．５Ｂ】実施例で述べるように２４時間後にＥＬＩＳＡによって測定したＰＢＭＣによるサイトカインＩＬ−２（Ａ）及びＩＦＮ−γ（Ｂ）の産生を示すグラフである。データは３回の独立した実験の平均±標準偏差（ＳＤ）を示す。＊スチューデントｔ検定によって決定したＰ値を示す。
【図５Ｃ】指示されているように２４時間処理し（灰色の曲線）、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ及びヨウ化プロピジウムで染色したジャーカットＴ細胞のＦＡＣＳ分析の結果を示す。アポトーシスしたジャーカットＴ細胞の割合を、ＦＡＣＳ分析によって１００００事象を取得して測定した。陽性対照として使用した抗癌剤、スタウロスポリン（白色の曲線）は、１μＭの濃度でアポトーシスを強力に誘導した。（ＨＰ＝ピロリ菌、ＷＴ＝野生型）
【図６Ａ】指示されているＨＰＳＮと共に又はＨＰＳＮなしで２４時間処理したジャーカットＴ細胞の細胞周期分析の結果を示す。Ｇ１期（左下）、初期及び後期Ｓ期（左上及び右上）及びＧ２期（右下）の細胞のパーセンテージが示されている（ｙ軸：ＢｒｄＵ−ＦＩＴＣ；ｘ軸：ＰＩ）。細胞周期調節タンパク質の細胞レベルを同じ細胞において免疫ブロット法によって測定した。
【図６Ｂ】種々の濃度のＨＰＷＴ及びＨＰΔＧＧＴＳＮ又はｒＨＰＧＧＴと共に２４時間及び４８時間インキュベートし、その後溶解した１０７ＰＢＭＣから得られたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。全タンパク質３５μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、免疫ブロット法によって分析した。指示されているタンパク質のレベルを、対応する抗体を用いて測定した。データを２回再現し、同様の結果を得た。（ＨＰ＝ピロリ菌、ＳＮ＝上清、ＷＴ＝野生型）
【図７】ピロリ菌陽性（レーン１〜９）及び陰性（レーン１０〜１４）患者からの血清の免疫ブロットであり、患者を、実施例１で述べるように免疫ブロット法によってＨＰＧＧＴに対する抗体の存在に関して試験した。ウサギ抗ＧＧＴ抗体（αＧＧＴ）を陽性対照として使用した。星印は以下を示す：＊＊＊ＨＰＧＧＴタンパク質のプロ形態及び＊＊大型サブユニット。
【図８】ＨＰＧＧＴによるリンパ球増殖の阻害がグルタミンに依存し、グルタメート又はｇ−グルタミルグルタミンによって又はグルタミン枯渇によって媒介されるのではないことを示す棒グラフである。ＰＢＭＣをＰＭＡ／イオノマイシンで刺激し（基礎を除くすべて）、指示されているように処理した。２μｇ／ｍｌで使用したＲｅｋ．ＨＰＧＧＴを２４時間後に不活化した。次に培地を交換し、ＨＰＧＧＴ処理した培地を刺激後のＰＢＭＣに添加した。グルタミンを同時に（図示しない）又はグルタミン枯渇の可能性を検討するために２４時間後に２ｍＭで添加した。阻害作用の可能性を検討するためにＰＢＭＣ刺激後にグルタメート又はｇ−グルタミルグルタミンを添加した。グルタミンに対する阻害作用の依存性を示すためにグルタミンを含まない（ｗ／ｏ）アミノ酸を使用した。
【図９】ＨＰＧＧＴの酵素活性に対する免疫化された又は感染マウスからの血清の阻害作用を示すグラフである。マウスを指示されている製剤で免疫するか又は対照としてＰＢＳを与えるか又は生ピロリ菌に感染させた。免疫化又は感染の６週間後に尾静脈から血清を採取し、ＧＧＴ触媒活性に対する阻害活性に関して検定した。ＣＴ＿ＧＧＴ、可溶性ＣＴ及び不活性ＧＧＴタンパク質、［ＣＴ＿ＧＧＴ］ｅｎｃ、ＣＴ及び不活性ＧＧＴタンパク質は、ミクロスフェアに封入された。
【実施例１】
【０１２７】
実験材料及び方法
細菌培養。この試験で使用したピロリ菌野生型株Ｇ２７  ＷＴ（ｖａｃＡ＋ｃａｇＡ＋）はＡ．Ｃｏｖａｃｃｉ（ＩＲＩＳ，Ｓｉｅｎａ，Ｉｔａｌｙ）より入手した。細菌を、先に述べられているように２９Ｄｅｎｔ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｍｉｘ（Ｏｘｏｉｄ，Ｗｅｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加したウィルキンス‐チャルグレン（Ｗｉｌｋｉｎｓ−Ｃｈａｌｇｒｅｎ）又はブレインハートインフュージョン（Ｂｒａｉｎ−Ｈｅａｒｔ−Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）（ＢＨＩ）プレートで培養した。ＨＰの液体培養を、１０％ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及び１％Ｄｅｎｔ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを添加したＢＨＩブロにおいて実施した。ＨＰ上清の生成のために、細菌をプレートで４８時間増殖させ、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、１のＯＤ６００ｎｍ（約２×１０８細菌／ｍｌに相当する）に調整した。細菌を、微好気的条件下で強く振とうしながらＰＢＳ中で２時間インキュベートし、その後の、細菌と膜を除去するための３０００×ｇ及び１００００×ｇでの遠心分離工程によってペレット化した。その後、限外ろ過（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ＭＷＣＯ  １０ｋＤａ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて上清を濃縮した。上清の総タンパク質含量を、ウシ血清アルブミンを標準品としてＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）によって測定し、−８０℃で保存した。大腸菌をルリアブロス（ＬＢ）寒天プレート（ＵＳＢ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）で培養し、液体培養については適切な抗生物質を添加したＬＢブロス（ＵＳＢ）中で培養した。
【０１２８】
ピロリ菌上清のゲルろ過クロマトグラフィー。ピロリ菌野生型株Ｇ２７からの上清を上述したように調製した。サイズ排除クロマトグラフィーを以前に述べられているように３実施した。簡単に述べると、タンパク質５００μｇをＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に負荷し、４℃にて脱気したＰＢＳで溶出した。標準タンパク質α−アミラーゼ（２００ｋＤａ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（１５０ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（６６ｋＤａ）及びカルボニックアンヒドラーゼ（２９ｋＤａ）を溶出タンパク質の分子量評価のために使用した。各々の分画を増殖阻害及び以下で述べるＧＧＴ活性に関して試験した。
【０１２９】
ＧＧＴ突然変異株の作製。ＧＧＴ  ｋ．ｏ．プラスミドを自然形質転換によってピロリ菌株Ｇ２７に形質転換した。形質転換体を、２５μｇ／ｍｌカナマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含む寒天プレートでインキュベートした。３日後、クローンを採取し、カナマイシンを含む新鮮寒天プレートに塗布した。プラスミドの挿入を、細菌ＤＮＡのＰＣＲ（プライマー：センス５’−ＡＡＡＣＧＡＴＴＧＧＣＴＴＧＧＧＴＧＴＧＡＴＡＧ−３’（配列番号６）；アンチセンス５’−ＧＡＣＣＧＧＣＴＴＡＧＴＡＡＣＧＡＴＴＴＧＡＴＡＧ−３’（配列番号７））及びピロリ菌△ＧＧＴ上清からのタンパク質のウエスタンブロット法によって確認した。
【０１３０】
細胞培養。末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ）の単離を以前に述べられているように３実施した。すべての細胞を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。ジャーカットＴ細胞及びＰＢＭＣを、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で培養した。ＥＬ−４  Ｔ細胞を、１０％ウマ血清（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を添加したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。
【０１３１】
一次ヒトリンパ球の単離。一次ヒトＴ細胞を、Ｐａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造者の指示に従って使用して、ピロリ菌非感染健常志願者からのバフィーコート又はヘパリン化末梢静脈血から陰性選択によって単離した。
【０１３２】
細胞増殖アッセイ。細胞（１０５ＰＢＭＣ、精製一次Ｔ細胞又は１０４ジャーカット／ＥＬ−４細胞／穴）を９６穴平底プレートにて完全培地中で培養した。ＰＢＭＣをＰＭＡ（２０ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）及びイオノマイシン（１００ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）で３回刺激し、すべての細胞を、指示されている総タンパク質濃度のピロリ菌上清又は組換えタンパク質と共に又はそれらなしで増殖させた。一次ヒトＴ細胞を、上述したようにＰＭＡ／イオノマイシンで又は１ビーズ／Ｔ細胞の抗−ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で刺激した。細胞増殖を、４８時間後にＰａｃｋａｒｄ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｂｅｔａ  Ｃｏｕｎｔｅｒ  Ｍａｔｒｉｘ  ９６００（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏ．，Ｄｏｗｎｅｒ’ｓ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）を使用してメチル−［３Ｈ］−チミジン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）取込みによって測定した。
【０１３３】
組換えタンパク質の作製。ピロリ菌のＧＧＴタンパク質を、製造者の指示に従って（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）６×Ｈｉｓタグタンパク質として発現させた。ピロリ菌からのＧＧＴタンパク質のコード領域をＰＣＲ（プライマー  センス：５’−ＴＧＡＡＡＧＧＡＡＡＡＣＣＣＡＴＧＧＧＡＣＧＧＡＧ−３’（配列番号８）；アンチセンス：５’−ＣＡＡＡＧＧＴＡＣＣＡＡＡＴＴＣＴＴＴＣＣＴＴＧＧ−３’（配列番号９））によって増幅した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分離し、ゲル抽出（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製した。それを次にＮｃｏＩとＫｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）で制限し、続いて再精製後にｐＱＥ−Ｔｒｉ  Ｓｙｓｔｅｍベクター（Ｑｉａｇｅｎ）に連結した。生じたベクターを大腸菌株Ｍ１５に形質転換した。１００μｇ／ｍｌアンピシリン（Ｓｉｇｍａ）及び２５μｇ／ｍｌカナマイシンを添加したＬＢブロスに形質転換細菌の一晩培養物を接種し、ＯＤ６００が０．６に達するまで強く振とうしながら３７℃で増殖させた。最終濃度１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ；Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加することによって組換えＨＰＧＧＴの発現を誘導し、封入体の量を最小限に抑えるために２５℃で４時間実施した。その後全培養物を４℃で１０分間遠心分離した（５０００×ｇ）。非変性条件下での溶解のために、ペレットを、プロテアーゼ阻害剤（Ｈｉｓタグタンパク質のためのプロテアーゼ阻害剤カクテル、Ｓｉｇｍａ）を含む氷冷結合緩衝液（２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール（Ｓｉｇｍａ）、ｐＨ７．４）に可溶化した。次に液体Ｎ２中での２回の凍結／解凍サイクル及びその後の氷上での超音波処理（氷上で５分間の休止をはさんで１分間の超音波処理を２回）によって細胞を溶解した。１０分間の遠心分離（４℃で１７５００×ｇ）後、上清をＤＮＡ及びＲＮＡ消化に供した。さらなる遠心分離工程（４℃、２２０００×ｇで１０分間）後、上清を精製のために調製した。最初の精製工程では、５ｍｌ  ＨｉｓＴｒａｐＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。室温で精製を実施し、全体を通じて試料を氷上に保持した。大腸菌の溶解産物を１ｍｌ／分でＮｉ−セファロースカラムに負荷し、フロースルーを収集した。試料負荷後、カラムを１０カラム容量（ｃｖ）の結合緩衝液、１０ｃｖ洗浄緩衝液（２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、９００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）及びもう一度１０ｃｖ結合緩衝液で洗浄した。結合タンパク質を、段階イミダゾール勾配（１００ｍＭ段階）を用いて溶出緩衝液（２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００〜１０００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）で溶出した。溶出液を勾配の段階につき１分画で収集した。次に各々の分画をＧＧＴ酵素活性に関して試験し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロット分析に供した。組換えＨＰＧＧＴのさらなる精製のために、Ｎｉ−セファロースアフィニティークロマトグラフィーからの酵素的に活性な分画をプールし、４℃で２０ｍＭトリス／ＨＣｌ  ｐＨ７．５に対して��析して、２回目の精製工程に供した。透析した試料をＡｆｆｉ−Ｇｅｌ（登録商標）  Ｂｌｕｅ（ＢｉｏＲａｄ）カラム（ｃｖ：１２．３ｍｌ）に負荷した。カラムを２ｃｖの結合緩衝液で洗浄し、結合タンパク質を、段階ＮａＣｌ勾配（５０ｍＭ段階）を用いて溶出緩衝液（２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、５０〜１０００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で溶出した。収集したすべての分画を、抗ＧＧＴ抗体（以下参照）を用いた免疫ブロット法によって又はＧＧＴ酵素活性アッセイ（以下参照）によって組換えＨＰＧＧＴの存在に関して分析した。活性分画をプールし、４℃で９０分間、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ  ｐＨ７．５に対して透析して、アリコートに分け、さらなる使用時まで−８０℃で保存した。
【０１３４】
部位指定突然変異誘発。ＨＰＧＧＴの部位指定突然変異誘発を、製造者のプロトコールに従ってＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  部位指定突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で実施した。プライマー配列は以下の通りであった：Ｓ４５１／４５２Ａセンス：５’−ＣＣＡＡＴＡＡＧＣＧＣＣＣＴＴＴＡＧＣＣＧＣＣＡＴＧＴＣＧＣＣＴＡＣＧＡＴＴＧＴＧ−３’（配列番号１０）；Ｓ４５１／４５２Ａアンチセンス：５’−ＣＡＣＡＡＴＣＧＴＡＧＧＣＧＡＣＡＴＧＧＣＧＧＣＴＡＡＡＧＧＧＣＧＣＴＴＡＴＴＧＧ−３’（配列番号１１）。突然変異誘発の成功を配列決定によって確認した。
【０１３５】
免疫ブロット法。免疫ブロット分析のために１０７ジャーカットＴ細胞又はＰＢＭＣを使用した。実験の前に、ジャーカット細胞を、０．２％ＦＣＳを含む培地で１８時間血清飢餓させた。その後、１０％ＦＣＳで細胞を放出させ、記述されているように処理した。指示されている時点で、細胞を採集し、氷冷ＰＢＳで１回洗浄して、プロテアーゼ阻害剤（２．５ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ  β−グリセロリン酸、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１ｍＭ  ＰＭＳＦ；Ｓｉｇｍａ）を含む１×溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）に再懸濁し、氷上で３０秒間、マイクロチップソニファイアーで超音波処理した。溶解産物を４℃で１０分間、１００００×ｇで遠心分離し、上清を免疫ブロット法のために使用した。等量のタンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイによって測定した、ＢｉｏＲａｄ）をトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ）に電気転移した。検出のために、膜を一次抗体、抗ｐ２７、抗サイクリンＤ３、抗サイクリンＥ、抗ｃ−Ｍｙｃ（Ｄｉａｎｏｖａ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、抗Ｃｄｋ２（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、抗ホスホＡＫＴ（Ｓｅｒ  ４７３）、抗ホスホｃ−Ｒａｆ（Ｓｅｒ  ３３８）、抗ホスホｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｔｈｒ  ３８９；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ホスホＦＫＨＲＬ１／Ｆｏｘｏ３（Ｔｈｒ  ３２；Ｕｐｓｔａｔｅ，Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）、抗アクチン（Ｓｉｇｍａ）及び抗ＶａｃＡ（Ａｕｓｔｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ，ＣＡ）でプローブした。適切なペルオキシダーゼ結合二次抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）及び化学発光試薬（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて一次抗体の結合を明らかにした。ＨＰＧＧＴタンパク質の大型サブユニットの検出のために、ＨＰ  １１１８遺伝子産物のアミノ酸残基３５６〜３７１を含む合成ペプチドＩＱＰＤＴＶＴＰＳＳＱＩＫＰＧＭ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｋｉｓｓｌｅｇｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に対して挙げられたポリクロナールウサギ抗ＧＧＴ抗体を使用した。
【０１３６】
血清ブロット法。ヒト血清におけるＨＰＧＧＴ特異的抗体の検出のために、精製組換えＨＰＧＧＴタンパク質０．１μｇを上述したようにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜に移した。膜をＰｏｎｃｅａｕ  Ｓ溶液（０．２％Ｐｏｎｃｅａｕｓ  Ｓ、Ｈ２Ｏ中３％トリクロロ酢酸）で染色し、細片に切断した。ブロッキング（１×ＴＢＳ＋５％低脂肪粉乳）後、各々の細片をそれぞれピロリ菌感染患者及び非感染患者の血清（ブロッキング緩衝液で１：２００００希釈）と共に４℃で攪拌しながら一晩インキュベートした。洗浄後、膜細片をＨＲＰ結合抗ウサギ二次抗体（Ｄｉａｎｏｖａ；１：１００００希釈）と共にインキュベートし、最後に、再度の洗浄工程後、ＨＰＧＧＴタンパク質への血清抗体の結合を上述したような化学発光反応によって明らかにした。患者のピロリ菌感染の状態を従来のピロリ菌ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡを用いて評価した。
【０１３７】
細胞周期分析。分析の前に、ジャーカットＴ細胞（５×１０６細胞／分析）を、０．２％ＦＣＳを含む培地で１８時間血清飢餓させた。１０％ＦＣＳで細胞を放出させ、指示されているピロリ菌株の上清で２４時間処理した後、ＦＩＴＣ結合抗ＢｒｄＵ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、製造者のプロトコールに従って、ＢｒｄＵ−ＦＩＴＣ／ＰＩ（Ｓｉｇｍａ）染色によって細胞周期分析を実施した。その後の蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）分析において、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターを使用して１００００事象を取得した。Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウエアパッケージ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてデータを解析した。
【０１３８】
γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）活性アッセイ。ＧＧＴ活性についてのアッセイを、Ｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２７の方法から適合させた。簡単に述べると、受容体としての２０ｍＭグリシルグリシン（Ｓｉｇｍａ）、供与体基質としての２．５ｍＭ  Ｌ−γ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリド（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及び１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）から成る反応緩衝液を調製した。一部の実験では、アッセイ緩衝液のｐＨを２〜１０の間で変化させた。種々のピロリ菌株、精製組換えＨＰＧＧＴ又はウマ腎ＧＧＴ（Ｓｉｇｍａ）の上清を添加し、３７℃で３０分間反応を進行させた。ｐ−ニトロアニリドの放出を４０５ｎｍで分光光度法によって観測した。活性の１単位は、３７℃で１分当たり及びタンパク質１ｍｇ当たりにｐ−ニトロアニリド１μｍｏｌを放出する酵素の量と定義した。
【０１３９】
ＥＬＩＳＡ。ＰＢＭＣ（各々５×１０５）を表示されているように２４時間処理した。指示されている時点で遠心分離によって細胞を除去し、上清を、ＥＬＩＳＡにより製造者の指示に従ってＩＬ−２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）及びＩＦＮ−γ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，Ｓｏｌｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の量に関して分析した。検出の下限は４ｐｇ／ｍｌであった。
【０１４０】
アポトーシスの分析。５×１０５のジャーカットＴ細胞を指示されているように処理した。２４時間後、細胞を遠心分離によって採集し、洗浄して、アネキシンＶ結合緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ、ｐＨ７．４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）５００μｌに再懸濁し、暗所にて室温で組換えアネキシンＶ−ＦＩＴＣ（Ｃａｌｔａｇ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）５μｌ及び０．５μｇ／ｍｌ  ＰＩで各々１０分間染色した。アポトーシス細胞をＦＡＣＳ分析によって測定した（上記参照）。Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウエアを用いてデータを解析した。
【０１４１】
統計。データは、平均±標準偏差（ＳＤ）として提示している。統計解析のためにスチューデントｔ検定を使用した。Ｐ値＜０．０５を有意とみなした。
【実施例２】
【０１４２】
ピロリ菌の推定上のＴ細胞増殖阻害タンパク質としてのＧＧＴの同定
ピロリ菌から分泌される低分子量タンパク質はＴリンパ球の増殖を阻害することが以前に示された３。免疫抑制因子を同定するため、ピロリ菌株Ｇ２７からの上清に関するサイズ排除クロマトグラフィーを実施した。先の研究と一致して、３０〜６６ｋＤａの分子量で溶出する分画だけがリンパ球の増殖を阻害し、他のすべての分画はリンパ球の増殖を阻害しなかった（データは示していない）。
【０１４３】
２つの独立したグループが以前に、種々のプロテオミクス手法によって分泌ピロリ菌タンパク質の体系的分析を実施した９，１０。これらのデータを使用して、３０〜６６ｋＤａの分子量を有するすべての分泌ピロリ菌タンパク質を列挙した（図１Ａ）。得られたクロマトグラフィー分画のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色によってさらに分析した（図１Ａ）。分画の阻害活性プロフィールに一致する溶出プロフィールを示す、３０〜６６ｋＤａの大きさの４つの潜在的候補物質を認めた（図１Ｂ；矢印で示している）。阻害分画中の他のすべてのタンパク質バンドは非阻害分画にも存在し、したがってＴ細胞増殖の阻害の原因ではあり得なかった。４つの候補タンパク質のうち２つの分子量は（図１Ｂ）、分泌ピロリ菌タンパク質γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ、ＨＰ１１１８）のフラグメントに対応する。６０ｋＤａの１番目のバンドはＧＧＴのプロ形態（分子量６１ｋＤａ）を示すと考えられ、３８ｋＤａの他方のバンドはＧＧＴの大型サブユニットを示すと考えられる１１。これらの上清分画における触媒的に活性なＨＰＧＧＴの存在を調べるため、分光光度ＧＧＴ活性アッセイを実施した。図１Ｃは、リンパ球増殖を阻害する分画（ｂ−ｆ）だけが同時にＧＧＴ活性を示すことを明らかにする。
【実施例３】
【０１４４】
ＧＧＴ欠損ピロリ菌突然変異化物はＴ細胞増殖を阻害する能力を欠く。
ＧＧＴが認められたリンパ球増殖阻害の原因であるかどうかを判定するため、ピロリ菌の同系ＧＧＴノックアウト突然変異株を作製した。突然変異株は、他のグループによって述べられているようにインビトロで正常に増殖し、ＧＧＴがピロリ菌の生存のために必須ではないことを示唆した１１、１２、１３。これらの突然変異株の上清を、対応する野生型菌株と比較して、抗ＣＤ３／ＣＤ２８又はＰＭＡ／イオノマイシンで刺激した単離ヒトＴ細胞及びＰＢＭＣに対するそれらの増殖阻害活性に関して試験した（図２Ａ、２Ｃ）。野生型菌株と異なり、一次ヒトＴ細胞及びＰＢＭＣに対する△ＧＧＴ細菌の阻害潜在能は完全に廃止された。ＧＧＴの自発的組換え及び活性化を排除するため、ＧＧＴ欠損細菌からの上清を、酵素活性を測定することによって及びＨＰＧＧＴの大型サブユニットに対して惹起したポリクローナル抗体を使用した免疫ブロット法によって確認した。負荷対照は、野生型及びＧＧＴ欠損細菌からの上清において分泌ＶａｃＡタンパク質の存在を示す（図２Ｂ）。したがって、ＧＧＴはヘリコバクターピロリによるＴ細胞増殖の阻害の原因である。
【実施例４】
【０１４５】
組換えＨＰＧＧＴはリンパ球の増殖を阻害する。
認められた阻害がＨＰＧＧＴによってのみ媒介されることをさらに示すため、大腸菌において組換えＨｉｓタグＨＰＧＧＴタンパク質を発現させた。タンパク質を、「実験材料及び方法」の章で述べたようにクロマトグラフィーによって精製し、均質にした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色並びに免疫ブロット法は、組換えＨＰＧＧＴがプロ形態として合成され、その後分子量約３８及び約２０ｋＤａの分子量を有する大形及び小型サブユニットにそれぞれプロセシングされることを指示した（図３Ａ，Ｂ）。組換えタンパク質は強力なＧＧＴ活性を示し（図３Ｃ）、ＰＢＭＣ増殖を効率的に阻害した（図３Ｄ）。加えて、さらなる実験は、２〜１０のｐＨ範囲でＨＰＧＧＴの触媒活性を示し（図３Ｅ）、感染部位における機能的酵素の存在を裏付けた。
【実施例５】
【０１４６】
ＨＰＧＧＴの阻害作用は触媒的ＧＧＴ活性に依存する。
ＧＧＴはまた、ヒトＴ細胞を含む哺乳動物細胞によっても発現されるので、哺乳動物ＧＧＴもリンパ球増殖を阻害するかどうかを判定することを試みた。ウマ腎からの精製ＧＧＴは触媒活性を示した（図４Ａ）。しかし、ＨＰＧＧＴと比較して４倍高い量のウマＧＧＴはＰＢＭＣ増殖を阻害することができなかった（図４Ｂ）。ＧＧＴ触媒的トランスペプチダーゼ活性がＴ細胞増殖の阻害のために必要とされるかどうかを探索するため、我々は組換えタンパク質の突然変異体を作製した。我々は、セリン残基４５１及び４５２のアラニンへの突然変異誘発（Ｓ４５１／４５２Ａ）は組換えＨＰＧＧＴの酵素活性を完全に廃止し（図４Ａ）、同時にリンパ球増殖の阻害も無効にする（図４Ｂ）ことを認めた。
【０１４７】
これらの結果を確認するため、組換えＨＰＧＧＴ及びピロリ菌野生型株Ｇ２７からの上清をＧＧＴ阻害剤、アシビシンと共にプレインキュベートした。この化合物は、ＧＧＴの不可逆性で競合的な阻害剤として働く。アシビシンによるＧＧＴの阻害は、ＧＧＴの特定ヒドロキシル基に結合した阻害種における酵素への結合後のその形質転換を含むことが示された１４，１５。酵素ＧＧＴ活性の測定及びリンパ球増殖の測定は、アシビシンによる前処理がピロリ菌野生型上清によるＧＧＴ活性（図４Ｃ）及びＰＢＭＣ増殖の阻害（図４Ｄ）を完全に抑制することを示した。同様の結果が組換えＨＰＧＧＴに関して得られた（データは示していない）。
【実施例６】
【０１４８】
ＨＰＧＧＴは、ＩＬ−２及びＩＦＮ−γの分泌を低下させることなく及びアポトーシスを誘導することなくリンパ球増殖を阻害する。
これまで、宿主の免疫応答の抑制におけるＨＰＧＧＴの役割については全く知られていなかった。ここで報告するＨＰＧＧＴによるリンパ球増殖阻害は、ヒトＰＢＭＣのサイトカイン分泌への干渉から生じると考えられる。この仮説を調べるため、細胞をＰＭＡ及びイオノマイシンで刺激し、種々の濃度のピロリ菌野生型及び△ＧＧＴ上清又は組換えＨＰＧＧＴと共に又はそれらなしで２４時間インキュベートした。刺激した対照と比較して、これらの処理のいずれもが、リンパ球の増殖のために必須であることが知られる、ＩＬ−２分泌の低下を導かなかった（図５Ａ）。加えてＩＦＮ−γの分泌も低下しなかった（図５Ｂ）。したがって我々は、ＨＰＧＧＴによるＴ細胞増殖の阻害がこれらの細胞の活性化低下によって引き起こされるのではないことを示す。これまでの報告は、胃上皮細胞でのＨＰＧＧＴによる酸化的ストレス及びアポトーシスの誘導を示唆した１２，１６。しかし、ピロリ菌からのＧＧＴのリンパ球に対する作用については不明である。
【０１４９】
さらなる報告は、ピロリ菌によるＴ細胞でのアポトーシスの誘導を、細菌によるＴ細胞増殖の阻害についての機構として示唆した（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００１）。アポトーシスがここで述べるＨＰＧＧＴによるリンパ球増殖の低下の原因である可能性を検討するため、ジャーカットＴ細胞を使用したアネキシンＶ−ＦＩＴＣ／ＰＩ染色及びその後のＦＡＣＳ分析を実施した（図５Ｃ）。リンパ球増殖の強力な阻害を引き起こす濃度で使用したピロリ菌野生型及び△ＧＧＴ株又は組換えＨＰＧＧＴからの上清のいずれもが、アポトーシスの上昇を誘導しなかった。したがって、ＨＰＧＧＴによるＴ細胞増殖の排除はアポトーシス非依存性機構によって媒介される。
【実施例７】
【０１５０】
Ｔ細胞における細胞周期進行へのＨＰＧＧＴの作用
次に我々は、Ｔ細胞の増殖に関わる細胞過程へのＨＰＧＧＴの作用をさらに特性決定することを試みた。ＢｒｄＵ／ＰＩ染色を用いた分析は、野生型によってジャーカットＴ細胞におけるＧ１細胞周期の停止が誘導されるが、ピロリ菌からのＧＧＴ欠損上清では細胞周期の停止が誘導されないことを示した（図６Ａ）。この停止は、ピロリ菌ＧＧＴの存在下でのＧ１期の細胞の３５％から４６％への増加（図６Ａ；左下象限）を特徴とした。したがって、野生型による処理においてはＳ基の細胞の量（左上及び右上象限）が対照（基礎、５５％）と比較して３８％に低下したが、ピロリ菌のＧＧＴ欠損上清では低下しなかった。これと一致して、同じ試料の免疫ブロット分析は、細胞サイクリンＤ３並びにＥ１タンパク質レベルの顕著な低下を明らかにした。加えて、Ｃｄｋ阻害剤ｐ２７Ｋｉｐｌの量がＧＧＴ依存的に増加した（図６Ａ）。１０μｇ／ｍｌと５μｇ／ｍｌのＨＰ野生型上清で処理した細胞の間でのサイクリンタンパク質レベルの差は、リンパ球増殖に拮抗するためにはＧＧＴ活性の閾値を上回らなければならないことを指示する。これは明らかに、上清中の総タンパク質１０μｇ／ｍｌの濃度に該当する。５μｇ／ｍｌというより低い濃度では、ＧＧＴがリンパ球において細胞周期進行を阻害するためにより長い時間を要する。組換えＨＰＧＧＴタンパク質を使用して、我々は２μｇ／ｍｌという低濃度でサイクリンレベルの完全な低下を認めた。
【０１５１】
これらの結果はヒトＰＢＭＣで確認され、ヒトＰＢＭＣは、組換えＨＰＧＧＴ又は種々の濃度のピロリ菌野生型からの上清で処理したとき、同じ細胞周期調節タンパク質のさらに強力な低下を示したが（図６Ｂ）、△ＧＧＴ株で処理したときには低下を示さなかった。我々の結果は、ＧＧＴを、ピロリ菌によるＴリンパ球でのＧ１細胞周期停止の誘導の原因となる因子として明らかに指し示す。
【実施例８】
【０１５２】
Ｔ細胞におけるＲａｓ依存性シグナル伝達へのＨＰＧＧＴの干渉
Ｒａｓ及びＰＩ３Ｋ依存性経路は、細胞周期進行の鍵となる調節因子である。これらの経路はＴ細胞において互いに独立して進行することが示されているので１７、我々は、両方の経路の重要な成員の活性化状態へのピロリ菌上清並びに組換えＨＰＧＧＴの影響を検討した。ジャーカットＴ細胞及びＰＢＭＣからの細胞溶解産物の免疫ブロット分析は、ＰＩ３Ｋシグナル伝達の重要なメディエイターであるＡＫＴ、ｐ７０Ｓ６ｋ及びＦｏｘｏ  ３の細胞レベル及びリン酸化がＨＰＧＧＴの存在下で低下しないことを示した（図６Ａ）。これに対し、Ｒａｓ依存性経路の中心的メディエイターであるｃ−Ｍｙｃの細胞レベル並びにｃ−Ｒａｆタンパク質のリン酸化は、同じ細胞においてＨＰＧＧＴの存在下で低下した（図６Ａ、Ｂ）。
【実施例９】
【０１５３】
ＨＰ陽性患者の血清中のＨＰＧＧＴに対する抗体応答
ピロリ菌からのＧＧＴは細菌によって細胞外液中に分泌されることが示されたが（Ｂｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．）、このタンパク質が粘膜固有層中のＴ細胞に達してその免疫抑制作用を及ぼすかどうかは不明である。この問題を調べるため、１４名の患者（ピロリ菌感染患者９名と非感染患者５名）からの血清をＨＰＧＧＴ特異的抗体の存在に関して試験した。結果は、ピロリ菌陽性患者でのＨＰＧＧＴのプロ形態及び大型サブユニットに対する強い抗体応答を示した（図７、１〜９）が、非感染患者では抗体応答を示さず（図７、１０〜１４）、ヒト免疫系とＨＰＧＧＴの相互作用を示唆した。
【実施例１０】
【０１５４】
免疫後のＨＰＧＧＴに対する阻害性免疫応答と感染後の免疫応答の不在
動物を、アジュバントとしてのＣＴと組み合わせた、ヘリコバクターピロリのγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＨＰＧＧＴ）の触媒中心から遠く離れた場所に位置するペプチド３５６  ＩＱＰＤＴＶＴＰＳＳＱＩＫＰＧＭ  ３７１又は不活性組換えＨＰＧＧＴタンパク質のいずれかでワクチン摂取した。不活性形態のＨＰＧＧＴでワクチン接種した動物においてのみ、標準ＨＰＧＧＴ活性化アッセイを用いて血清中の阻害抗体が検出可能であった。緩衝液だけを摂取した対照動物、感染動物又はペプチド３５６〜３７１でワクチン接種した動物では阻害性免疫応答は検出されなかった。これらの結果は、ＨＰＧＧＴに対する阻害性免疫応答が達成され得、抗原の選択に高度に依存することを実証する。さらに、ピロリ菌による感染はそのような阻害応答を惹起しない。
【０１５５】
結果を図９に示す。
【０１５６】
参考文献
【表１Ａ】
0005989958.tif 000002
【表１Ｂ】
0005989958.tif 000003
【表１Ｃ】
0005989958.tif 000004
数字を使用してここで参照する先行技術の資料は以下の通りであり、それらの全体が参照によりここに組み込まれる。
【０１５７】
本明細書、特許請求の範囲、及び／又は図面に開示された本発明の特徴は、個別でも、またいずれかの組み合わせによっても、本発明を様々な形態で実現する材料であり得る。
【図１】
0005989958.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ．５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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