(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
爪試料に真菌を感染させた後、真菌を接種した平板培地上に爪試料を配置し、次いで爪試料上に抗真菌剤又は抗真菌剤を含む組成物を適用して培養した後、爪試料及び平板培地における真菌量をATP生物発光法を利用して評価することを特徴とする抗真菌剤又は抗真菌剤を含む組成物の抗真菌性評価方法。
【請求項２】
真菌を接種した液体培地に爪試料を浸漬することによって、爪試料に真菌を感染させるものである請求項第1項記載の抗真菌剤又は抗真菌剤を含む組成物の抗真菌性評価方法。
【請求項３】
真菌を接種した液体培地の真菌濃度が１×１０２〜１×１０７個/mLである請求項第２項記載の抗真菌性評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、爪真菌症の実態に即し、かつ抗真菌剤又は抗真菌剤を含む組成物の効果を定量的に評価できる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
爪真菌症は爪を感染の場とする真菌症であり、爪の混濁、肥厚、変形を引き起こす難治性の疾患である。爪真菌症の治療は、通常、内服療法により行われるが、全身性の副作用や薬剤相互作用など安全性の点で内服治療が困難な場合は、外用療法が選択される。外用療法の場合、全身性の副作用や薬剤相互作用などの可能性が極めて小さいので、本来、爪真菌症治療には理想的である。
【０００３】
現在、国外ではロセリル（登録商標）、ペンラック（登録商標）等のネイルラッカー剤が爪真菌症用外用薬として発売されているが、国内では爪真菌症用の外用薬は発売されていない。これは、多くの爪真菌症において、感染力のある真菌は爪甲の下の皮膚（爪床）に存在するため、抗真菌薬を爪甲表面に投与しても、薬剤が厚い爪甲を浸透できず、爪床まで到達しない、あるいは到達しても爪床で十分な抗真菌効果を発揮できないなど、有効な外用製剤の開発が難しいことによる。爪真菌症用の外用製剤を開発する上では、かかる爪真菌症の病態の特殊性を十分に考慮した方法でその効果を評価することが必要である。
【０００４】
爪真菌症用外用製剤の評価方法として、従来報告されているものの中には、爪試料に真菌を感染させた後、この爪試料に抗真菌剤又は抗真菌剤を含む組成物を作用させ、ついで、当該爪試料を生体色素で処理した後、爪試料中の生体色素の量を測定することにより、抗真菌剤又は抗真菌剤を含む組成物の評価を行う方法がある（特許文献１）。しかしながら，この方法は爪試料のみにおける抗真菌剤又は抗真菌剤を含む組成物の効果を対象としたものであり、薬剤の爪床への送達を考慮していないと考えられることから爪真菌症の実態に即しているとはいえない。
【０００５】
また、真菌を接種した平板培地上に、これに接して爪試料を配置し、当該爪の非接面に、平板培地上に漏れることなく抗真菌剤を含有する組成物をチャージし、爪と培地間の真菌の生育状況を指標として抗真菌剤を評価する方法がある（特許文献２）。この方法は、薬剤の爪甲への浸透を考慮し、爪と培地間の真菌に着目していることから、特許文献１と比較すると爪真菌症の病態を想定したものになっていると考えられるが、爪真菌症における爪床での抗真菌効果については言及していないため、やはり完全に爪真菌症の実態に即した方法とはいい難い。従って、爪真菌症の実態に即し、かつ抗真菌剤又は抗真菌剤を含む組成物の効果を定量的に評価できる方法が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−２９２４８１号公報
【特許文献２】特開２００１−１２８６９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、爪真菌症の病態の特殊性に即し、かつ抗真菌剤又は抗真菌剤を含む組成物の効果を定量的に評価できる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、かかる課題を解決するために鋭意検討した結果、爪試料を平板培地上に配置し、爪試料及び平板培地を共に真菌に感染させることにより、この平板培地を爪真菌症における爪床に見立てることが可能となることを見出した。またこの際、従来の方法（特許文献２）にあるように、真菌を接種した平板培地上に爪試料を配置して培養する方法では、爪試料中の真菌が増殖する間に、薬剤を適用していないにも関わらず平板培地中の真菌が減少してしまうが、爪試料を予め真菌に感染させておき、この感染させた爪試料を、真菌を接種した平板培地上に配置して培養することで、爪試料中の真菌と平板培地中の真菌が、薬剤を投与しない限り共に増殖するため、薬剤の抗真菌性効果をより正確に評価できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、爪試料に真菌を感染させた後、真菌を接種した平板培地上に爪試料を配置し、次いで爪試料上に抗真菌剤又は抗真菌剤を含む組成物を適用して培養した後、爪試料及び平板培地における真菌量をATP生物発光法を利用して評価することを特徴とする抗真菌剤又は抗真菌剤を含む組成物の抗真菌性評価方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の抗真菌性評価方法は、抗真菌剤又は抗真菌剤を含む組成物の爪真菌症に対する効果を、爪真菌症の実態に即し、かつ定量的に評価することができるものである。また、本発明の評価方法は、抗真菌剤又は抗真菌剤を含む組成物の爪への浸透性及び爪甲での抗真菌効果を、定量的に評価することができるものである。さらに本発明の評価方法は、抗真菌剤又は抗真菌剤を含む組成物の爪床への送達及び爪床での抗真菌効果を、定量的に評価することができるものである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の抗真菌性評価方法は、爪試料に真菌を感染させた後、真菌を接種した平板培地上に爪試料を配置し、次いで爪試料上に抗真菌剤又は抗真菌剤を含む組成物を適用して培養した後、爪試料及び平板培地における真菌量をATP生物発光法を利用してそれぞれ評価するものである。
【００１２】
本発明で用いる爪試料としては、一般に真菌が増殖する動物の爪の一部あるいは全部を採取して用いるが、動物種に関しては特に制限なく使用でき、例えばヒト、ブタ、ウシ、モルモット等の爪が例示できる。これらの爪は、真菌に非感染のものを爪試料として使用することが望ましいが、さらに定量的な評価を行うため、真菌を含む雑菌を殺菌してから用いることが望ましい。殺菌の方法としては、アルコール処理、UV照射処理等があるが、滅菌効果の点からオートクレーブ処理を行うことがより望ましい。また、定量的な評価を可能とするため、爪試料を予め一定の径及び厚みなど、所定形状に加工してから用いることが望ましい。
【００１３】
本発明方法においては、まず上記爪試料に真菌を感染させる。爪試料に感染させる真菌は、通常爪に感染すると認められているものであれば特に限定されるものではなく、例えばトリコフィトン・ルブルム（Trichophyton rubrum）、トリコフィトン・メンタグロファイテス（Trichophyton mentagrophytes）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）などが例示できる。
【００１４】
爪試料に対する真菌の感染方法は特に限定されるものではなく、例えば真菌の分生子数を一定量に調整して接種した培地と爪試料を接触させ、一定期間培養する方法によって爪に真菌を感染させることができる。さらに望ましくは、真菌の分生子数を一定量に調整して接種した液体培地に爪試料を浸漬し、一定期間培養することにより、効率的かつ定量的に爪の感染を進行させることができる。より具体的には、真菌を予め他の培地で培養し、必要に応じて界面活性剤等を添加した分散媒を加えて分生子を分散させ、ガーゼなどで濾過して菌糸を除去し、さらに分散媒を加えて分生子数を一定にした分生子分散液を、一定容量均一に混合した液体培地に爪試料を浸漬することで、定量的な評価が可能となり、効率的かつ定量的な爪の感染を行うことができる。分散媒としては、生理食塩水やリン酸緩衝生理食塩水などが望ましく、爪試料の感染に液体培地を用いる場合には途中段階からは分散媒として液体培地自体を用いることがより望ましい。爪試料を浸漬する液体培地の真菌濃度は１×１０２個/mL〜１×１０７個/mLが好ましく、１×１０３個/ｍＬ〜１×１０５個/mLがさらに好ましい。感染は、爪試料を液体培地に浸漬した状態で２０〜３０℃、５〜１４日間程度培養することにより行う。例えば２８℃程度の温度条件で、７日間程度培養を行えばよく、感染が十分に行われたことは、例えば爪試料周囲の菌の発育により判断することができる。また参考例１に記載の方法に従ってＡＴＰ発光強度を測定し、その測定値が１×１０３CPS〜１×１０４CPS程度になることにより判断することもできる。上記液体培地としては、液状のものであれば特に限定されずに使用することができ、例えばRPMI1640培地などを用いることができる。
【００１５】
このようにして真菌に感染させた爪試料を，爪試料に感染させた真菌と同一の真菌を接種した平板培地上に配置する（以下、「爪真菌症モデル」という）。この際の平板培地としては、平板を形成するものであれば特に限定されることなく、例えば寒天を固化剤として用いた無機塩水のものを用いることができる。さらにはリン酸２カリウム塩、硫酸マグネシウム塩、塩化カルシウム塩等を含有する寒天塩培地が望ましい。かかる培地に真菌を接種する際には、定量的な評価を可能とするため、加熱滅菌した後５０℃程度まで放冷し、かつ固化がまだ始まっていない平板培地に上記爪試料の感染にあたって調製した分生子分散液を一定容量一様に混ぜ込むことにより、定量的な平板培地への接種が行える。平板培地の真菌濃度は、１×１０２個/mL〜１×１０６個/mLが好ましく、さらに１×１０３個/mL〜１×１０５個/mLが好ましい。この範囲であると培養時の真菌濃度のばらつきを小さくすることができる。
【００１６】
このような爪真菌症モデルは、爪試料、平板培地ともに一定の真菌量に達しているため、直ぐに抗真菌剤又はこれを含む組成物（以下、「抗真菌製剤」という）を適用し、抗真菌性評価に用いることが可能である。あるいは２８℃程度の温度条件で一定期間培養し、さらに真菌量を増加させた後に抗真菌性評価に用いることもできる。
【００１７】
次にこの爪真菌症モデルの爪試料上に、抗真菌剤又は抗真菌製剤を適用する。抗真菌剤としては、特に限定されることなく使用でき、ミコナゾール、ミコナゾール硝酸塩、テルビナフィン、テルビナフィン塩酸塩、アモロルフィン、アモロルフィン塩酸塩、ルリコナゾール、ケトコナゾール、リラナフタート等が例示できる。これらの抗真菌剤を適当な担体に溶解ないし分散させて適用することができる。またこれらの抗真菌剤を含有する抗真菌製剤の剤形は、外用剤として爪に適用可能な剤形であれば特に限定されず、例えば、液剤、クリーム剤、ラッカー剤、軟膏剤、貼付剤等が挙げられ、これらを爪試料上に塗布あるいは貼付して適用する。この際、薬剤の爪甲の浸透及び平板培地への送達を定量的に評価するため、抗真菌剤又は抗真菌製剤と平板培地は直接接触しないようにすることが望ましい。このため、例えば液剤を適用する場合には漏出しないよう、漏出防止壁を設けることが望ましい。このような漏出防止壁としては、例えばゴム、樹脂などでできたOリングやシリコンボンドを用いることができる。なお、クリーム剤や貼付剤のように、塗布量あるいは貼付サイズを調整することで漏出を防止できる剤形の場合は、漏出防止壁を設けなくともよい。
【００１８】
上記のように、爪真菌症モデルに抗真菌剤又は抗真菌製剤を適用し、一定期間培養した後、爪試料と平板培地を分離し、それぞれの真菌量をATP生物発光法を利用して評価する。抗真菌剤又は抗真菌製剤を適用後の培養は、抗真菌剤の種類、用量や真菌の種類等に応じて適宜設定できるが、例えば２０〜３０℃で５〜４０日間程度行えばよい。培養後、爪試料と平板培地のATP発光強度を測定し、それぞれの真菌量を評価することにより、爪試料における抗真菌効果及び平板培地における抗真菌効果を共に評価できる。このように本発明の評価方法は、爪真菌症の病態における爪甲及び爪床での抗真菌剤又は抗真菌製剤の効果を総合的に評価することができるため、爪真菌症の実態に即した方法といえる。ATP（アデノシン三リン酸）は全ての生細胞中に存在する生体エネルギーであり、ルシフェリン・ルシフェラーゼ試薬と反応すると発光し、この発光強度はATP量に比例する。そしてATP発光強度は生存する真菌数に比例するものであることから、ATP発光強度を指標とすることにより、定量的な抗真菌性の評価が可能である。ATP発光強度は、高感度で生菌数のみの測定ができるため優れた指標となる。この際のATP発光強度の測定法としては特に限定されるものではないが、爪試料及び平板培地を、歯科用ルーター、ホモジネーター等を用いて粉砕し、必要に応じて界面活性剤等を添加した生理食塩水等の分散媒を加えて真菌を抽出したところにATP発光測定試薬を加え、ルミノメーター等の測定装置により簡便に測定することができる。
【実施例】
【００１９】
以下に実施例等を挙げて、本発明について更に詳細を加えるが、本発明がこれら実施例にのみ限定を受けないことは言うまでもない。
【００２０】
参  考  例  １
爪真菌症モデルの作製と評価：
約５ｍｍ×５ｍｍに加工したヒト爪をオートクレーブ滅菌して爪試料とした。０．２％リン酸水素二カリウム、０．００５％硫酸マグネシウム、０．００５％塩化カルシウムを添加した１Ｌの水にバクト・アガー１５ｇを加えて寒天塩培地を調製した。この寒天塩培地でトリコフィトン・メンタグロファイテス（TIMM1189株）をスラント培養し、０．０５％Tween80を加えた生理食塩水で分生子を掻き取り、ガーゼで濾過して菌体を除去し、分生子分散液とした。この分生子分散液を、分生子の分散量が1×１０４個/mLになるようRPMI１６４０液体培地で調整したものに上記爪試料を浸漬して約２８℃で７日間培養し、爪真菌症モデル用爪試料とした。また、オートクレーブ滅菌した後約５０℃に冷却した上記寒天塩培地に、上記分生子分散液を分生子の分散量が１×１０５個/mL（平板培地での最終濃度）になるように添加して、爪真菌症モデル用平板培地とした。上記爪真菌症モデル用爪試料を取り出し、表面に菌糸等が付着していた場合は軽く拭き取ってから、上記爪真菌症モデル用平板培地上に配置して爪真菌症モデルとした。この爪真菌症モデルを約２８℃で３５日間培養した。培養開始から２１日、２８日、３５日後に爪と平板培地を分離した。爪はミニルータを用い、平板培地はホモジナイザーを用いてそれぞれ粉砕し、０．０５%Tween80を加えた生理食塩水を爪および平板培地と同量加え、攪拌混合した。それぞれの懸濁液１００μLにATP発光測定試薬（BacTiter-GloTM Microbial Cell Viability Assay（Promega））１００μLを加え、ルミノメーターによりATP発光強度測定を行った。結果を表１に示す。
【００２１】
比  較  参  考  例  １
オートクレーブ滅菌した約５ｍｍ×５ｍｍに加工したヒト爪を、参考例１で調製した爪真菌症モデル用平板培地上に配置し、約２８℃で３２日間培養した。培養開始から７，１４，２０，３２日後に爪と平板培地を分離し、参考例１と同様にしてそれぞれを粉砕して０．０５％Tween80を加えた生理食塩水及びATP発光測定試薬を加え、ルミノメーターによりATP発光強度測定を行った。結果を表２に示す。
【００２２】
【表１】
0005980062.tif 000002
【００２３】
【表２】
0005980062.tif 000003
【００２４】
予め爪試料を真菌に感染させた参考例１のモデルでは、爪及び平板培地におけるATP発光強度が培養期間にわたって増加傾向にあった。一方、爪試料を真菌に感染させていない比較参考例１のモデルでは、培養期間内に平板培地におけるATP発光強度の減少が認められた。このように参考例１のモデルでは、抗真菌製剤を投与しない限りATP発光強度が維持されることから、比較参考例１のモデルと比較して抗真菌剤又は抗真菌製剤を投与した際の薬剤の抗真菌効果をより正確に評価できることが明らかとなった。
【００２５】
実  施  例  １
参考例１で作製した爪真菌症モデルの爪試料上に、爪真菌症用ネイルラッカー剤であるロセリル（登録商標ガルデルマ）を、平板培地に漏れることのないよう適量塗布し、約２８℃で７日間培養した後、爪と平板培地を分離して、参考例１と同様にしてそれぞれ粉砕し、０．０５％Tween80を加えた生理食塩水及びATP発光測定試薬を添加して、ルミノメーターによりＡＴＰ発光強度測定を行った。結果を表３に示す。
【００２６】
比  較  例  １
実施例１の方法で作製した爪真菌症モデルを約２８℃で７日間培養した後、爪と平板培地を分離して、参考例１と同様にしてそれぞれ粉砕し、０．０５％Tween80を加えた生理食塩水及びATP発光測定試薬を添加して、ルミノメーターによりATP発光強度測定を行った。結果を表３に示す。
【００２７】
【表３】
0005980062.tif 000004
【００２８】
実施例１では、爪真菌症の臨床上効果のある製剤を塗布した際に、比較例１に対してATP発光強度が顕著に減少しており、実態とよく適合していた。また定量的な比較が可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明の方法は、爪真菌症の実態に即し、かつ抗真菌剤の効果を定量的に評価できるため、爪真菌症に対する抗真菌剤の評価方法として有用なものである。