(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え１型インターフェロンタンパク質を産生する方法であって、該方法は、
発現構築物を含むＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓまたはＥ．ｃｏｌｉの宿主細胞の培養によって組換えインターフェロンタンパク質を発現する工程であって、前記発現構築物が、宿主細胞における発現のために最適化された組換え１型インターフェロンタンパク質のコード配列を含む核酸を含む、工程と、
培養した宿主細胞を溶解する工程と、
溶解した宿主細胞から不溶画分および可溶画分を得る工程と、
０．５％から２％の両性イオン界面活性剤またはオクチルグルコピラノシドを含む非変性の抽出条件に不溶画分をさらすことによって不溶画分を抽出する工程と、
抽出した不溶画分から抽出ペレットおよび抽出上清を得る工程と、
抽出物の上清中の組換えインターフェロンタンパク質の活性を測定する工程を含み、ここで上清中の組換えインターフェロンタンパク質の８０から１００％がさらに再生または再折り畳みの工程にさらされずに、活性であることが決定される、工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
組換え１型インターフェロンタンパク質のコード配列が、ｌａｃ誘導プロモーターに操作可能に連結され、
培養は、
８０〜１６０までのＯＤ６００まで、２５℃〜３３℃の温度で、かつ５．７〜６．５のｐＨで、宿主細胞を成長させる工程と、
０．０８ｍＭ〜０．４ｍＭのＩＰＴＧ濃度で宿主細胞を誘導する工程、
を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記両性イオン界面活性剤が、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−０８、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１０、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１２、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４、または、ＣＨＡＰＳであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記非変性の抽出条件が、カオトロピック剤およびコスモトロピック塩をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記カオトロピック剤が、尿素または塩酸グアニジウムであり、および前記コスモトロピック塩が、ＮａＣｌ、ＫＣｌまたは（ＮＨ４）２ＳＯ４であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記非変性の抽出条件が、０．５〜２％のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４、０〜２Ｍの尿素、０〜２ＭのＮａＣｌを含み、およびｐＨは６．５〜８．５であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記非変性の抽出条件が、１％のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４、２Ｍの尿素、２ＭのＮａＣｌを含み、およびｐＨは８．２であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記非変性の抽出条件が、さらに１％乃至４０％ｗ／ｖの固体を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記非変性の抽出条件が、さらに５％ｗ／ｖの固体を含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記組換え１型インターフェロンタンパク質が、インターフェロン−β、インターフェロン−α、インターフェロン−κ、またはインターフェロン−ωであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記組換え１型インターフェロンタンパク質が、インターフェロン−βであり、前記インターフェロン−βは、ヒトインターフェロン−β１ｂおよびヒトインターフェロン−β１ｂ  Ｃ１７Ｓからなる群から選択されるか、あるいは、前記組換え１型インターフェロンタンパク質が、インターフェロン−αであり、前記インターフェロン−αは、ヒトインターフェロン−α２ａおよびヒトインターフェロン−α２ｂからなる群から選択されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
不溶画分のサンプル中の組換え１型インターフェロンタンパク質の量を測定する工程であって、不溶画分の前記サンプルが不溶画分の抽出前に得られる、工程と、抽出上清画分のサンプル中の組換え１型インターフェロンタンパク質の量を測定する工程であって、抽出上清画分の前記サンプルが不溶画分の抽出後に得られる、工程とをさらに含み、
不溶画分の抽出後に得られた抽出上清画分の前記サンプル中で検出される組換えインターフェロンタンパク質の量が、不溶画分の抽出前に得られる不溶画分のサンプル中で測定された組換えインターフェロンタンパク質の量の１０％〜９５％であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
抽出上清画分中の組換えインターフェロンタンパク質の９０％〜１００％が活性であると測定されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記組換え１型インターフェロンタンパク質が、インターフェロン−βであり、活性な組換えタンパク質の量は、受容体結合アッセイ、抗ウイルス活性アッセイまたは細胞変性効果アッセイによって測定されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
抽出上清中の組換え１型インターフェロンタンパク質が、０．３ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌの濃度で存在することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記宿主細胞が、ｌｏｎ  ｈｓｌＵＶプロテアーゼ欠失株であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記組換え１型インターフェロンが、前記宿主細胞の細胞質において発現されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記組換え１型インターフェロンが、ヒトインターフェロン−β１ｂまたはヒトインターフェロン−β１ｂ  Ｃ１７Ｓであり、および、前記ヒトインターフェロン−β１ｂまたはヒトインターフェロン−β１ｂ  Ｃ１７Ｓが、前記宿主細胞の細胞質において発現されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（優先権の主張）
【０００２】
この出願は、米国特許法第１１９条の下で２０１０年３月４日に出願された米国出願第６１／３１０,６７１号に対する優先権を主張する。米国出願第６１／３１０,６７１号の内容は、本明細書によってその全体が参照として組み込まれる。
【０００３】
本出願は、ＥＦＳ−ＷｅｂによってＡＳＣＩＩ書式で提出され、本明細書によってその全体が参照として組み込まれる配列表を含む。２０１１年の２月１１日に作られた前記ＡＳＣＩＩのコピーは、３８１９４６９１（２）.ｔｘｔと名付けられ、容量にして９２３７バイトになる。
【背景技術】
【０００４】
多くの異種組換えタンパク質は、細菌系で発現するときに、封入体と呼ばれる誤って折り畳まれた不溶性の形態で産生される。一般に、変性させる試薬は封入体の中の組換えタンパク質を可溶化するために用いられなければならない。タンパク質は、正しく折り畳まれるように最大限に利用される状況の下、再生されなければならない。緩慢な再折り畳み工程や低い工程産生量と同様に、最適化のために費やされる労力は、組換えタンパク質の生産にかかる時間と労力を増大させる。
【０００５】
インターフェロンは、抗ウイルス性の、抗増殖性の、免疫調節性の、及び他の活性を示す。α、β、γを含むヒトインターフェロンのいくつかの異なった型は、例えば抗ウイルス性や抗増殖性の活性に基づき識別されている。インターフェロンの分泌物は、ウイルスや二本鎖のＲＮＡや他のポリヌクレオチド、抗原、及び有糸分裂促進因子を含む信号により引き起こされる。インターフェロンβは、バクテリアにおいて組換え型で発現したタンパク質の一例であり、バクテリアにおいて封入体の中で隔離(ｓｅｑｕｅｓｔｅｒｅｄ)されている。
【０００６】
ヒトインターフェロンβ１ｂは、分子の重さが約２２キロダルトンで、１６５個のアミノ酸残基からなる調節ポリペプチドである。ヒトインターフェロンβ１ｂは、ウイルス感染や他の生物製剤にさらされることを受けて、特に線維芽細胞の中において、体内の多くの細胞によって産生される。それは、多量体の細胞の表面の受容体に結合する。増殖性の受容体の結合は、インターフェロンβ誘導性遺伝子を発現させ、抗ウイルス活性や抗増殖性活性や免疫調節活性を引き起こすという一連の細胞内事象に結果としてつながる。
【０００７】
インターフェロンβ１ｂとりわけＢｅｔａｓｅｒｏｎ（ｈ−ＩＦＮ−β１ｂＣ１７Ｓ）は、多発性硬化症（ＭＳ）、Ｂ型及びＣ型肝炎感染、神経膠腫、メラノーマを含む疾患を処置するために使用されてきた。インターフェロンβは、ＭＳを再発したり寛解したりする患者が経験する発作の数を減らすということが明らかにされてきた。大量のインターフェロンβ１ｂが治療用に必要とされる。組換えインターフェロンβ１ｂは、ヒトの線維芽細胞やＣＨＯ細胞を含む哺乳動物の細胞の中に低水準で産生されてきた。動物の細胞発現は、概して工程所要時間がより長くかかってしまうこと、培養液が容易に汚染されてしまうこと、厳重な培養状態を保つ必要性があること、培地に多くの費用がかかってしまうことを含む技術的な困難性によって妨げられる。糖タンパク成分が一般にインターフェロンβの活性に不必要だということがわかったため、研究はバクテリアの発現系であるＥ．ｃｏｌｉにおいて組換えタンパク質の発現に向けられた。記載した通り、Ｅ．ｃｏｌｉの中で生み出された封入体は、変性や再折り畳みされたインターフェロンβによって可溶化されなければならない。緩慢な再折り畳みは、工程所要時間を長くし、費用もさらにかかり、産出量を減少させてしまう。現在までに、変性および再折り畳みの工程を必要とすることなく、哺乳動物あるいはバクテリアの宿主細胞のどちらかにおいて迅速かつ経済的に高濃度の可溶性組換えインターフェロンβを産生する方法は、未だ解明されていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ内でのインターフェロンの発現および穏やかな界面活性剤を用いて、かつ再折り畳みのプロセスの必要性なしに、発酵生成物から活性タンパク質を抽出する新しい方法の開発に関する。
【０００９】
特に、本発明は、組換え１型インターフェロンタンパク質を産生する方法を提供し、該方法は、宿主細胞における発現のために最適化されたコード配列を含む発現構築物を含むＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓまたはＥ．ｃｏｌｉの宿主細胞の培養によって組換えインターフェロンタンパク質を発現する工程、宿主細胞を溶解する工程、溶解工程からの不溶画分および可溶性画分を得る工程、それを非変性の抽出条件にさらすことによって不溶画分を抽出する工程、および、不溶画分から抽出ペレットおよび抽出上清を得る工程を含み、抽出上清中の組換えタンパク質は、さらに再生または再折り畳みの工程にさらされずに、可溶形態、活性形態またはその組み合わせで存在する。
【００１０】
実施形態において、非変性の抽出条件は、穏やかな界面活性剤の存在を含む。特定の実施形態において、穏やかな界面活性剤は両性イオン界面活性剤である。具体的な実施形態において、両性イオン界面活性剤は、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−０８、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１０、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１２、又はＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４である。実施形態において、非変性の抽出条件は、約０．５％から約２％のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４を含む。特定の実施形態において、穏やかな界面活性剤はＮ−ラウロイル−サルコシン（ＮＬＳ）ではない。
【００１１】
実施形態において、非変性の抽出条件は、穏やかな界面活性剤の存在を含み、カオトロピック剤およびコスモトロピック（ｃｏｓｍｏｔｒｏｐｉｃ）塩をさらに含む。特定の実施形態において、カオトロピック剤は尿素または塩酸グアニジウムであり、コスモトロピック塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌまたは（ＮＨ４）２ＳＯ４である。具体的な実施形態において、非変性の抽出条件は、約０．５〜約２％のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４；約０〜約２Ｍの尿素；約０〜約２ＭのＮａＣｌを含み；およびｐＨは約６．５〜約８．５である。実施形態において、非変性の抽出条件は：１％のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４；２Ｍの尿素；２ＭのＮａＣｌを含み；およびｐＨは約８．２である。他の実施形態において、非変性の抽出条件は、さらに約１％〜約４０％ｗ／ｖの固体を含む。特定の実施形態において、非変性の抽出条件はさらに約５％ｗ／ｖの固体を含む。
【００１２】
実施形態において、組換え１型インターフェロンタンパク質は、インターフェロンタ−β、インターフェロンタ−α、インターフェロンタ−κ、インターフェロンタ−τ、またはインターフェロンタ−ωである。具体的な実施形態において、組換え１型インターフェロンタンパク質はインターフェロン−βまたはインターフェロン−αである。実施形態において、組換え１型インターフェロンタンパク質は、インターフェロン−βであり、該インターフェロン−βは、ヒトインターフェロン−β１ｂおよびヒトインターフェロン−β１ｂ  Ｃ１７Ｓからなる群から選択される。実施形態において、組換え１型インターフェロンはインターフェロン−αであり、インターフェロン−αは、ヒトインターフェロン−α２ａおよびヒトインターフェロン−α２ｂからなる群から選択される。
【００１３】
更なる実施形態において、権利を主張された方法はさらに、不溶画分および抽出上清画分中の組換え１型インターフェロンタンパク質の量を測定する工程を含み、抽出上清画分中で検出される組換えインターフェロンタンパク質の量は、不溶画分中で検出される組換えインターフェロンタンパク質の量の約１０％〜約９５％である。他の実施形態において、該方法は、さらに、組換えタンパク質の活性を測定する工程を含み、抽出上清の中に存在する組換えタンパク質の約４０％〜約１００％は活性であると測定される。関連する実施形態において、組換えタンパク質は、インターフェロン−βであり、活性組換えタンパク質の量は、ブルーセファロースアフィニティカムクロマトグラフィー、受容体結合アッセイ、抗ウイルス活性アッセイまたは細胞変性効果アッセイによって測定される。他の実施形態において、組換えタンパク質は、インターフェロン−αであり、インターフェロン−κ、またはインターフェロン−ωであり、活性組換えタンパク質の量は、ブルーセファロースアフィニティカムクロマトグラフィー、受容体結合アッセイ、抗ウイルス活性アッセイまたは細胞変性効果アッセイによって測定される。
【００１４】
本発明は、さらに、組換え１型インターフェロンタンパク質を産生するための方法を含み、該方法は、宿主細胞における発現のために最適化されたコード配列を含む発現構築物を含むＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓまたはＥ．ｃｏｌｉの宿主細胞の培養によって組換えインターフェロンタンパク質を発現する工程、宿主細胞を溶解する工程、溶解工程から不溶画分及び可溶画分を得る工程、それを非変性抽出条件にさらすことによって不溶画分を抽出する工程、および不溶画分から抽出ペレットおよび抽出上清を得る工程を含み、抽出上清中の組換えタンパク質は、再生または再折り畳みの工程にさらされることなく、可溶性の形態、活性の形態、またはそれらの組み合わせで存在し、組換えタンパク質はインターフェロン−βであり、さらに、非変性の抽出条件は、図４のＢの情報を用いて最適化される。
【００１５】
実施形態において、抽出上清中の組換えタンパク質は、約０．３ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌの濃度で存在する。他の実施形態において、宿主細胞は、約１から約２０リットルまたはそれ以上の量で培養される。具体的な実施形態において、宿主細胞は、約１リットル、約２リットル、約３リットル、約４リットル、約５リットル、約１０リットル、約１５リットル、又は約２０リットルの容積で培養される。
【００１６】
本発明の実施形態において、発現構築物は誘導プロモーターを含む。具体的な実施形態において、発現構築物は、ｌａｃプロモーター誘導体を含み、インターフェロンの発現はＩＰＴＧによって誘導される。
【００１７】
実施形態において、宿主細胞は、約２５℃〜約３３℃の温度で、約５．７〜約６．５のｐＨで成長し、ＩＰＴＧは、ＯＤ５７５が約８０〜約１６０までに達したとき、約０．０８ｍＭ〜約０．４ｍＭの最終濃度まで加えられる。具体的な実施形態において、宿主細胞は、約３２℃の温度で５．７〜６．２５のｐＨで成長し、ＩＰＴＧは、ＯＤ５７５が約１６０に達したとき、約０．２ｍＭの最終濃度まで加えられる。
【００１８】
本発明の実施形態において、発現構築物は、高活性リボソーム結合部位を含む。特定の実施形態において、宿主細胞は、ｌｏｎ  ｈｓｌＵＶプロテアーゼ欠失株である。他の実施形態において、１型インターフェロンは宿主細胞の細胞質において発現される。関連する実施形態において、１型インターフェロンは、ヒトインターフェロン−β１ｂまたはヒトインターフェロン−β１ｂ  Ｃ１７Ｓであり、宿主細胞の細胞質において発現される。
【００１９】
本発明はまた、組換え１型インターフェロンタンパク質を抽出する方法を提供し、組換えインターフェロンタンパク質は不溶画分中に存在し、その不溶画分は、組換えインターフェロンタンパク質を発現するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓまたはＥ．ｃｏｌｉの宿主細胞の溶解後に産生され、該方法は、不溶画分を非変性の抽出条件にさらす工程、および不溶画分から抽出ペレットを得る工程を含み、抽出ペレットは、組換えインターフェロンタンパク質を含み、抽出ペレット中の組換えインターフェロンタンパク質は、再生又は再折り畳みの工程にさらされずに、可溶形態、活性形態、またはそれらの組み合わせである。
【００２０】
実施形態において、抽出される組換え１型インターフェロンタンパク質は、インターフェロン−β、インターフェロン−α、インターフェロン−κ、インターフェロン−τ、またはインターフェロン−ωである。特定の実施形態において、組換え１型インターフェロンタンパク質はインターフェロン−βまたはインターフェロン−αである。実施形態において、組換え１型インターフェロンタンパク質は、インターフェロン−βであり、該インターフェロン−βは、ヒトインターフェロン−β１ｂおよびヒトインターフェロン−β１ｂ  Ｃ１７Ｓからなる群から選択される。他の実施形態において、インターフェロン−αは、ヒトインターフェロン−α２ａおよびヒトインターフェロン−α２ｂからなる群から選択される。
【００２１】
本発明は、さらに、組換え１型インターフェロンタンパク質を含む不溶画分を作成する方法を提供し、組換えインターフェロンタンパク質は、ｌａｃ誘導体プロモーターに操作可能に連結される核酸配列を含む核酸構築物から、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓまたはＥ．ｃｏｌｉの宿主細胞において発現され、その方法は、約８０〜約１６０までのＯＤ６００まで、約２５℃〜約３３℃の温度で、かつ約５．７〜約６．５のｐＨで、宿主細胞を成長させる工程、および約０．０８ｍＭ〜約０．４ｍＭのＩＰＴＧ濃度で宿主細胞を誘導する工程、宿主細胞を溶解し、ペレット画分を作成するためにそれを遠心分離機にかける工程を含み、可溶性の、活性な、または可溶性で活性な組換えインターフェロンタンパク質は、その後の再生又は再折り畳みの工程なしに、非変性の条件の下でペレット画分の抽出により得ることができる。
【００２２】
実施形態において、不溶画分に包含される組換え１型インターフェロンタンパク質は、インターフェロン−β、インターフェロン−α、インターフェロン−κまたはインターフェロン−ωである。具体的な実施形態において、組換え１型インターフェロンタンパク質はインターフェロン−βまたはインターフェロン−αである。実施形態において、組換え１型インターフェロンタンパク質がインターフェロン−βであり、インターフェロン−βは、ヒトインターフェロン−β１ｂおよびヒトインターフェロン−β  １ｂ  Ｃ１７Ｓからなる群から選択される。実施形態において、１型インターフェロンタンパク質がインターフェロン−αであり、インターフェロン−αは、ヒトインターフェロン−α２ａおよびヒトインターフェロン−α２ｂからなる群から選択される。実施形態において、組換え１型インターフェロンタンパク質を含む不溶画分を作成するための方法において、宿主細胞が成長する温度は、約３２℃であり、ＩＰＴＧ濃度は約０．２ｍＭである。
【００２３】
（参照による組み込み）
この特許明細書の中で言及されている全ての出版物、特許、特許出願は、個々の出版物、特許、特許出願が具体的にかつ個別的に参照することにより組み込まれる件を示すのと同程度に参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００２４】
本発明の新しい特徴は、添付の特許請求の範囲の中に詳細に明らかにされている。本発明の原理が利用されている実施形態を示す下記の詳細な説明を参照することで、及び添付している図面において本発明の特徴と長所のさらなる理解が得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ株ＰＳ５３０−００１から回収したＩＦＮ−βの事前のＣＧＥ評価。Ａ．抑制条件下で分析されたタンパク質。Ｂ．非抑制条件下で分析されたタンパク質。  ＡとＢの両方に対して。  レーン１．示された通りの大きさの分子量ラダー（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｌａｄｄｅｒ）。  レーン２．細胞溶解の後の最初の遠心分離からのペレット（不溶画分）。  レーン３−９．抽出工程の後の遠心分離からの上清。レーン３〜７は、示されるように、１％のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４を含む場合と含まない場合のＰＢＳバッファーを用いた抽出を表しており、レーン８と９は、それぞれ１％のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４を含む場合と含まない場合の酢酸緩衝液を用いた抽出を表している。  レーン１０−１３．抽出工程の後の回転からのペレット（Ｐｅｌｌｅｔ  ｆｒｏｍ  ｓｐｉｎ）。レーン１０と１１は、それぞれ１％の両性洗浄剤３−１４を含む場合と含まない場合のＰＢＳバッファーを用いた抽出を表しており、そしてレーン１２と１３は、それぞれ１％のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４を含む場合と含まない場合の酢酸緩衝液を用いた抽出を表している。
【図２】異なる界面活性剤を用いたインターフェロンβの抽出を評価するために行われた研究のフローチャート。
【図３】Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４を含む異なった抽出条件を用いたインターフェロンβの抽出を評価するために行われた統計的に設計された研究のフローチャート。
【図４】Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４を含む異なった抽出条件を用いたインターフェロンβの抽出を評価するために行われた研究の結果。Ａ．統計的概要。Ｂ．有益な抽出条件の範囲。
【図５】複製発酵（Ｒｅｐｌｉｃａｔｅ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ）のための誘導後の時間にわたる不溶性のＩＦＮ−βの産生。  三つの異なった複製（ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）からの結果がプロットされた。
【図６】別のｐＨとＯＤに関する誘導後の時間にわたる不溶解性のＩＦＮ−β産生。  三つの異なった複製からの結果がプロットされた。
【図７】ＩＦＮ−β１ｂ配列  Ａ．ＩＦＮ−β１ｂＣ１７Ｓアミノ酸配列（配列番号１）。配列は、精製タンパク質の中に存在していないＮ末端メチオニンを示している。Ｂ．蛍光菌のために最適化したコドンを含むＩＦＮ−βＤＮＡ配列。この配列は、図７Ａに示されたアミノ酸配列をコード化する。（配列番号２）  Ｃ．Ｎ末端メチオニンを伴わないＩＦＮ−β１ｂＣ１７Ｓアミノ酸配列。（配列番号３）
【図８】ＩＦＮ−α２ａ配列。Ａ．ＩＦＮ−α２ａアミノ酸配列。（配列番号４）  Ｂ．蛍光菌のために最適化したコドンを含むＩＦＮ−α２ａＤＮＡ配列。（配列番号５）
【図９】ＩＦＮ−α２ｂ配列。Ａ．ＩＦＮ−α２ｂアミノ酸配列。（配列番号６)  Ｂ．蛍光菌のために最適化したコドンを含むＩＦＮ−α２ｂＤＮＡ配列。（配列番号７)
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ発現系において大量の可溶性組換えインターフェロンタンパク質を産生するための方法に関する。特に、この方法は、一般に必要とされる変性工程とその後の再生／再折り畳み工程の必要性を除去する。
【００２７】
バクテリアの発現系における組換えインターフェロンβの産生は、不溶性の封入体の中のタンパク質の隔離により妨げられてきた。封入体の可溶化は、変性を必要とし、これは今度は費用がかかり、時間がかかり、かつタンパク質の収量を減少させる再折り畳み工程を用いることを必要とする。本発明は、変性によらずにインターフェロンを産生し、可溶化するための方法を提供することにより、再折り畳み工程の必要性を回避する。
【００２８】
タンパク質に変性工程を受けさせることなく、バクテリア発現系の中で、可溶性である、活性である、あるいはその両方である組換えインターフェロンタンパク質を産生するための方法が提供される。特に、可溶性のインターフェロンタンパク質を結果としてもたらす非変性の抽出工程が記載される。バクテリア発現系において発現されたインターフェロンは、概して不溶画分に局在化する。本発明の抽出工程において、この不溶画分は非変性の濃度の緩やかな界面活性剤を含み、可溶性タンパク質を産生する抽出条件の影響を受けやすい。
【００２９】
特に発明の抽出方法が使用されるとき、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ宿主細胞にとっての成長条件が可溶性組換えインターフェロンタンパク質の収量を最大化するために最適化される組換えインターフェロンタンパク質を産生するための方法もまた、本発明によって提供される。可溶性タンパク質の産生に対するＥ．ｃｏｌｉの成長条件の影響の研究が報告されてきた。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓにおいて発現される時の所与のタンパク質の可溶性は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける可溶性と異なり得る。これは、例えば、宿主としてＥ．ｃｏｌｉ又はＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓを使用して産生された幾つかのタンパク質の可溶性の量の対照比較を示す米国特許出願公開第２００６／００４０３５２号、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  Ｆｌｕｏｒｅｃｅｎｓ」の中で説明されており、これは、さらに、可溶性は、例えばアミノ酸配列のようなタンパク質構造に強く影響を受けるため、たとえ同じ宿主の中にあっても異なるタンパク質の可溶性の間で相当な差異が存在する。Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＩＦＮ−βを産生するという以前に報告された試みは、再折り畳みを必要とするタンパク質を結果としてもたらした。例えば、Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｈａｒｄｅ，  １９９５，  “Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−β  Ｓｅｒ１７（Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ）ｅｔ  ａｌ.,  Ｊ.  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．１５：３１−３７，  ａｎｄ  Ｇｈａｎｅ，ｅｔ  ａｌ.,  ２００８“Ｏｖｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｂｅｔａ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ，”  Ｊ.  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｓｌａｍｉｃ  Ｒｅｐｕｂｌｉｃ  ｏｆ  Ｉｒａｎ  １９（３）：２０３−２０９を参照（両者は参照により本明細書に組み込まれる）。
【００３０】
その方法は、さらに、成長温度、プロモーターの誘導時のＯＤ、誘導物質の濃度及びｐＨを含む最適成長条件を提供する。提供された抽出条件は、界面活性剤の型、濃度、カオトロピック剤、コスモトロピック塩（ｃｏｓｍｏｔｒｏｐｉｃ  ｓａｌｔ）、及びｐＨを含む。最適パラメータ範囲と同様に特性値が与えられる。提供された範囲を用いる抽出条件を最適化するための方法もまた提供される。
【００３１】
（バクテリアの成長条件）
本発明の実施形態において、バクテリアの成長条件は本明細書に提供されるような抽出方法を用いて得られる可溶性インターフェロンタンパク質の量を増加させるために最適化される。他の抽出条件、例えば当該技術分野で記載され、使用される他の方法と共に、本発明の成長条件を使用することもまた熟考される。
【００３２】
発明の抽出方法と関連して特に有用な最適成長条件は以下を含む：約２５℃〜約３３℃の温度；約５．７〜約６．５のｐＨ、及び培養物が約８０〜約１６０のＯＤ５７５に達したときの約０．０８ｍＭ〜約０．４ｍＭ  ＩＰＴＧでの誘導。
【００３３】
培養物のｐＨはｐＨバッファーと当事者に既知の方法を用いることにより維持することができる。培養中のｐＨの制御もまた、アンモニア水を用いることにより達成することができる。実施形態において、培養物のｐＨは約５．７〜約６．５である。特定の実施形態において、ｐＨは５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４又は６．５である。他の実施形態において、ｐＨは５．７〜５．９、５．８〜６．０、５．９〜６．１、６．０〜６．２、６．１〜６．３又は６．２〜６．５である。さらに他の実施形態において、ｐＨが５．７〜６．０、５．８〜６．１、５．９〜６．２、６．０〜６．３、６．１〜６．４、又は６．２〜６．５である。特定の実施形態において、ｐＨは約５．７〜約６．２５である。
【００３４】
実施形態において、成長温度は約２５℃〜約３３℃に維持される。特定の実施形態において、成長温度は約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃又は３３℃である。他の実施形態において、成長温度は約２５℃〜約２７℃、約２５℃〜約２８℃、約２５℃〜約２９℃、約２５℃〜約３０℃、約２５℃〜約３１℃、約２５℃〜約３２℃、約２５℃〜約３３℃、約２６℃〜約２８℃、約２６℃〜約２９℃、約２６℃〜約３０℃、約２６℃〜約３１℃、約２６℃〜約３２℃、約２７℃〜約２９℃、約２７℃〜約３０℃、約２７℃〜約３１℃、約２７℃〜約３２℃、約２６℃〜約３３℃、約２８℃〜約３０℃、約２８℃〜約３１℃、約２８℃〜約３２℃、約２９℃〜約３１℃、約２９℃〜約３２℃、約２９℃〜約３３℃、約３０℃〜約３２℃、約３０℃〜約３３℃、約３１℃〜約３３℃、約３１℃〜約３２℃、約３０℃〜約３３℃、又は約３２℃〜約３３℃に維持されている。
【００３５】
（誘導)
本明細書の中の他の記載箇所で記載されているように、組換えインターフェロン遺伝子の発現を制御するために誘導性プロモーターが発現構築物（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）において使用され得る。例えばｔａｃプロモーターのようなｌａｃプロモーターの誘導体又はファミリーメンバーの場合、エフェクター化合物が、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β―Ｄ−１−チオガラクトピラノシド、「イソプロピルチオガラクシド」とも呼ばれる）のような非代謝性誘導物質のような誘導物質である。実施形態において、ｌａｃプロモーター誘導体は使用され、細胞密度が約８０〜約１６０のＯＤ５７５により識別される水準に達したとき、さらにインターフェロン発現は、約０．０８ｍＭ〜約０．４ｍＭの最終濃度までＩＰＴＧを加えることにより誘導される。
【００３６】
実施形態において、培養誘導時のＯＤ５７５は、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０又は約１８０である。他の実施形態において、ＯＤ５７５は、約８０〜約１００、約１００〜約１２０、約１２０〜約１４０、約１４０〜約１６０である。他の実施形態において、ＯＤ５７５は、約８０〜約１２０、約１００〜約１４０、又は約１２０〜約１６０である。他の実施形態において、ＯＤ５７５は、約８０〜約１４０又は約１００〜１６０である。細胞密度は他の方法により測定することができ、他の単位で、例えば単位体積当たりの細胞で表現することができる。例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの培養物の約８０〜約１６０のＯＤ５７５は、およそ１ｍＬ当たり８×１０１０から約１．６×１０１１のコロニー形成単位又は３５〜７０ｇ／Ｌ乾燥菌重量と等しい。実施形態において、培養誘導時における細胞密度は、細胞密度又は測定単位を測定するために使用される方法に関わらずＯＤ５７５での吸光度により本明細書で明示された細胞密度と等しい。当事者は、任意の細胞培養のための適切な形質転換の仕方を知っているだろう。
【００３７】
実施形態において、培養物の最終ＩＰＴＧ濃度は、約０．０８ｍＭ、約０．１ｍＭ、約０．２ｍＭ、約０．３ｍＭ，又は０．４ｍＭである。他の実施形態において、培養物の最終ＩＰＴＧ濃度は、約０．０８ｍＭ〜約０．１ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約０．２ｍＭ、約０．２ｍＭ〜約０．３ｍＭ、約０．３ｍＭ〜約０．４ｍＭ、約０．２ｍＭ〜約０．４ｍＭ又は約０．０８〜約０．２ｍＭである。
【００３８】
実施形態において、インターフェロンは、当該技術分野で既知の方法および、文献、例えば米国特許第７,７５９,１０９号の「Ｈｉｇｈ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  Ｔ７  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ａｕｔｏ−ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｐｔｉｏｎ」において記載されている方法により、ＩＰＴＧ、ラクトース、又はアロラクトースを用いて、ｌａｃプロモーター又は誘導体を誘導することによって発現される（これは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
【００３９】
ラクトースを含まない型の（ａ  ｎｏｎ−ｌａｃ  ｔｙｐｅ）のプロモーターが使用される実施形態において、本明細書及び文献の中で記載されるように、他の誘導物質又はエフェクターが使用され得る。
【００４０】
誘導が開始された後で、培養物は組換えインターフェロンタンパク質が発現する間の概して約２４時間の期間に増殖する。細胞培養物は、遠心分離によって濃縮され、その培養ペレットは、その後の溶解手順に適切なバッファー又は溶液中に再懸濁され得る。
【００４１】
実施形態において、細胞は、高圧の機械細胞破壊のための装置（例えばＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ，Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ，Ｎｉｒｏ−Ｓｏａｖｉ  ホモジナイザー、ＡＰＶ−Ｇａｕｌｉｎホモジナイザーのように商業的に入手できる）を用いて破壊される。細胞を溶解するために当該技術分野で既知の任意の適切な方法が、不溶性画分を遊離するために使用され得る。例えば、実施形態において、細胞壁溶菌酵素及びＥＤＴＡのような化学的および／または酵素的細胞溶解試薬を使用することができる。凍結した、又は以前に保管された培養物の使用もまた、本発明の方法において熟考される。培養物は、溶解前にＯＤ標準化（ＯＤ−ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）され得る。
【００４２】
遠心分離は、任意の適切な装置又は方法を用いて行なわれる。可溶画分を不溶画分から分離するための細胞培養物あるいは溶解液の遠心分離は、当該技術分野で周知である。例えば、溶解された細胞は、２０,８００×ｇで２０分間（４℃で）遠心分離され、上清は、手作業のあるいは自動化された液体の処理方法を用いて除去され得る。ペレット（不溶）画分は、例えばリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４のような緩衝液中に再懸濁される。再懸濁は、例えばオーバーヘッドミキサー、磁力攪拌子、ロッキングシェーカーなどに接続されたインペラーのような装置を使用して行われる。
【００４３】
「可溶画分」、即ち溶解液の遠心分離の後に得られる可溶性の上清、及び「不溶画分」、即ち溶解液の遠心分離の後に得られるペレットは、培養物の溶解及び遠心分離の結果としてもたらされる。これらの二つの画分は、それぞれ「第１の可溶画分」と「第１の不溶画分」と呼ぶこともできる。
【００４４】
ｐＨや誘導ＯＤがあまりしっかりと制御されていない状況下で（例えば実施例２参照）、培養物を増殖することにより準備される発現培養物から本発明による抽出法を用いて可溶性のＩＦＮ−βを得ることが可能である。本明細書に記載されているように、成長条件を最適化することは、実質的には可溶性のＩＦＮ−βの収量を増加させることに結果としてつながる。
【００４５】
（非変性の抽出工程）
高水準の可溶性インターフェロンタンパク質は、本発明の非変性の抽出方法を用いて不溶画分から得ることができるということがわかった。
【００４６】
高水準の可溶性組換えインターフェロンタンパク質の産生にとって特に有用だと認められた非変性の抽出条件は、以下を含む：非変性の濃度の緩やかな界面活性剤、例えばＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４（０．５〜２％ｗ／ｖ）；カオトロピック剤、例えば尿素（０−２Ｍ）および６．５〜８．５のバッファーのｐＨで固体濃度が５−２０％ｗ／ｖでのコスモトロピック塩、例えばＮａＣｌ（０−２Ｍ）。
【００４７】
可溶画分と不溶画分を得た後、上に記載されているように，可溶性組換えインターフェロンタンパク質は、本明細書に記載されている非変性の抽出条件下において再懸濁された不溶画分を培養することにより、不溶画分から抽出される。培養後、抽出された混合物は「抽出上清」（可溶化組換えタンパク質を含む抽出後に得られる可溶性の上清画分）と「抽出ペレット」（抽出後に得られる不溶性の沈殿物画分）を作製するために遠心分離される。これらの破片は、「第２の可溶画分」及び「第２の不溶画分」とも呼ばれ得る。
【００４８】
（抽出条件）
抽出条件のための多くの異なったパラメータは、本明細書中の実施例３に記載されているように、抽出上清の中で観察される可溶性タンパク質の量に対する影響について評価された。他のパラメータが変化したときと同じく、変化する濃度において、抽出条件が多くの異なる界面活性剤のいずれかを含むとき、可溶性インターフェロンタンパク質が観察されたということが分かった。しかしながら、特定のパラメータは、産生された可溶性タンパク質の量に特に顕著な影響を有した。
【００４９】
特に両性イオン界面活性剤（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）を含む抽出条件は、最も高い可溶性タンパク質収量をもたらした。特に両性イオン界面活性剤、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−０８、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１０、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１２、及び特にＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４を用いると、最も高い収量を結果としてもたらした。Ｎ−ラウロイルザルコシン（ＮＬＳ）は、特に高い収量を生みだしたが、得られた可溶性タンパク質は、アフィニティアッセイに基づき、不活性であることが分かった（セファロースブルーアフィニティカラム結合）。それゆえ、本明細書で使用される用語「緩やかな界面活性剤」は、Ｎ−ラウロイルザルコシンを含まないことを意図する。
【００５０】
界面活性剤は、非変性の濃度で試験された。少なくとも０．５％（ｗ／ｖ）の、好ましくは１％のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４（３−（Ｎ，Ｎ）−デシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホナート）の濃度は臨界ミセル濃度（０．０１％）を軽く超えているが、可溶性インターフェロンタンパク質の最も効率的な抽出をもたらす。
【００５１】
それゆえ、緩やかな界面活性剤、特に両性イオン界面活性剤、より具体的にはＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−０８、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１０、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１２、及びＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４、さらに特にＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４及びＮＬＳでないものの非変性の濃度の使用は、本発明の抽出条件において用いるために熟考される。
【００５２】
本発明の他の実施形態において、非変性の抽出条件は、約０．５％〜約２％（ｗ／ｖ）の濃度のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４を含む。実施形態において、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４のｗ／ｖ濃度は、約０．５％〜約１％、約１％〜約１．５％、約１．５％〜約２％、あるいは約１％〜約２％である。特定の実施形態において、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４のｗ／ｖ濃度は、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．１％、約１．２％、約１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％、あるいは約２．０％である。
【００５３】
本発明の他の実施形態において、非変性の抽出条件は、約０．５％〜約２％（ｗ／ｖ）の濃度のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−０８、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１０、あるいはＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１２を含む。実施形態において、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−０８、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１０、あるいはＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１２のｗ／ｖ濃度は、約０．５％〜約１％、約１％〜約１．５％、約１．５％から約２％、あるいは約１％〜約２％である。特定の実施形態において、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−０８、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１０、あるいはＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１２のｗ／ｖ濃度は、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．１％、約１．２％、約１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％あるいは約２．０％である。
【００５４】
緩やかな界面活性剤は、低水準、例えば２％又はそれ以下でタンパク質のアンフォールディングを引き起こさない。例えば、ＳＤＳとＮＬＳは、これらの水準においてタンパク質を変性させることができるので、一般的により強い界面活性剤と考えられる。非変性の濃度は、タンパク質が変性されない試薬の濃度を示す。処理中に変性されないタンパク質は、再折り畳みを必要としない。
【００５５】
実施形態において、本発明の非変性の抽出条件は、約０．５〜約２％のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４；約０〜約２Ｍの尿素；約０〜約２ＭのＮａＣｌを含み；そこではｐＨが約６．５〜約８．５である。
【００５６】
下記の表に、イオン性の、非イオン性の、両性イオン性の界面活性剤を含む一般の界面活性剤の例とそれらの特性を記載する。界面活性剤の重要な特性は、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）であり、それは、タンパク質溶液からの界面活性剤のその後の除去の容易さのみでなく、そのタンパク質可溶化能力にも関係がある。
【００５７】
【表１】
0005840148.tif 000002
【００５８】
【表２】
0005840148.tif 000003
【００５９】
非変性の抽出条件が、カオトロピック試薬、尿素、コスモトロピック塩、ＮａＣｌ、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４、および適切なバッファー範囲の組み合わせを含むとき、抽出収量は、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４単独での使用と比較して数倍に増加するということが、さらにまた観察された。
【００６０】
【表３】
0005840148.tif 000004
【００６１】
カオトロピック試薬は、タンパク質又は核酸の３次元構造を破壊し、変性を引き起こす。実施形態において、非変性の抽出条件は、カオトロピック試薬、例えば尿素又は塩酸グアニジニウムの低い、非変性の濃度を含む。実施形態において、非変性の抽出条件は、約０．５Ｍ〜約２Ｍ又はもっと高い濃度で尿素を含む。６Ｍの尿素は、ＩＦＮ−βを変性することが分かった。一般的に、尿素又は塩酸グアニジニウムの非変性の濃度は、３Ｍよりも低い。実施形態において、非変性の抽出条件は、約０．５〜約１Ｍ、約１〜１．５Ｍ、約１．５〜約２Ｍ、約１〜約２Ｍ、約０．５Ｍ、約０．６Ｍ、約０．７Ｍ、約０．８Ｍ、約０．９Ｍ、約１．０Ｍ、約１．１Ｍ、約１．２Ｍ、約１．３Ｍ、約１，４Ｍ、約１．５Ｍ、約１．６Ｍ、約１．７Ｍ、約１．８Ｍ、約１．９Ｍ、又は約２．０Ｍの濃度で尿素を含む。他の実施形態において、抽出条件は０．５〜２Ｍの濃度での塩酸グアニジニウムを含む。実施形態において、抽出条件は、０．５〜１Ｍ、１〜１．５Ｍ、１．５〜２Ｍ、１〜２Ｍ、０．５Ｍ、約０．６Ｍ、約０．７Ｍ、約０．８Ｍ、約０．９Ｍ、約１．０Ｍ、約１．１Ｍ、約１．２Ｍ、約１．３Ｍ、約１．４Ｍ、約１．５Ｍ、約１．６Ｍ、約１．７Ｍ、約１．８Ｍ、約１．９Ｍあるいは約２．０Ｍの濃度で塩酸グアニジニウムを含む。
【００６２】
コスモトロピック塩は、安定性と水―水相互作用の構造に寄与する。コスモトロープ（ｃｏｓｍｏｔｒｏｐｅｓ）は、水分子に良好に相互作用させ、それはまたタンパク質のような高分子において分子間相互作用を安定化させる。任意のこのような適切な薬剤は、当該技術分野で公知であるように、本発明の抽出条件において用いられ得る。実施形態において、非変性の抽出条件は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４から選択されたコスモトロピック塩を含む。特定の実施形態において、ＮａＣｌは約０．１５〜約２Ｍの濃度で存在する。実施形態において、ＮａＣｌは、約０．１５Ｍ〜約０．５Ｍ、約０．５〜約０．７５Ｍ、約０．７５Ｍ〜約１Ｍ、約１Ｍ〜約１．２５Ｍ、約１．２５Ｍ〜約１．５Ｍ、約１．５Ｍ〜約１．７５Ｍ、約１．７５Ｍ〜約２Ｍ、約０．１５Ｍ〜約１Ｍ、約１Ｍ〜約１．５Ｍ、約１．５Ｍ〜約２Ｍ、約１Ｍ〜約２Ｍ、約０．１５Ｍ、約０．２５Ｍ、約０．５Ｍ、約０．６Ｍ、約０．７Ｍ、約０．８Ｍ、約０．９Ｍ、約１．０Ｍ、約１．１Ｍ、約１．２Ｍ、約１．３Ｍ、約１．４Ｍ、約１．５Ｍ、約１．６Ｍ、約１．７Ｍ、約１．８Ｍ、約１．８５Ｍ、約１．９Ｍあるいは約２．０Ｍの濃度での抽出条件において存在する。
【００６３】
他の実施形態において、ＫＣｌは、約０．１５〜約０．５Ｍ、約０．５〜約０．７５Ｍ、約０．７５Ｍ〜約１Ｍ、約１Ｍ〜約１．２５Ｍ、約１．２５Ｍ〜約１．５Ｍ、約１．５Ｍ〜約１．７５Ｍ、約１．７５Ｍ〜約２Ｍ、約０．１５Ｍ〜約１Ｍ、約１Ｍ〜約１．５Ｍ、約１．５Ｍ〜約２Ｍ、約１Ｍ〜約２Ｍ、約０．１５Ｍ、約０．２５Ｍ、約０．５Ｍ、約０．６Ｍ、約０．７Ｍ、約０．８Ｍ、約０．９Ｍ、約１．０Ｍ、約１．１Ｍ、約１．２Ｍ、約１．３Ｍ、約１．４Ｍ、約１．５Ｍ、約１．６Ｍ、約１．７Ｍ、約１．８Ｍ、約１．８５Ｍ、約１．９Ｍ、又は約２．０Ｍの濃度での非変性の抽出条件において存在する。
【００６４】
他の実施形態において、（ＮＨ４）２ＳＯ４は、約０．１５〜約０．５Ｍ、約０．５Ｍ〜約０．７５Ｍ、約０．７５Ｍ〜約１Ｍ、約１Ｍ〜約１．２５Ｍ、約１．２５Ｍ〜約１．５Ｍ、約１．５Ｍ〜約１．７５Ｍ、約１．７５Ｍ〜約２Ｍ、約０．１５Ｍ〜約１Ｍ、約１Ｍ〜約１，５Ｍ、約１．５Ｍ〜約２Ｍ、約１Ｍ〜約２Ｍ、約０．１５Ｍ、約０．２５Ｍ、約０．５Ｍ、約０．６Ｍ、約０．７Ｍ、約０．８Ｍ、約０．９Ｍ、約１．０Ｍ、約１．１Ｍ、約１．２Ｍ、約１．３Ｍ、約１．４Ｍ、約１．５Ｍ、約１．６Ｍ、約１．７Ｍ、約１．８Ｍ、約１．８５Ｍ、約１．９Ｍ又は約２．０Ｍの濃度での非変性の抽出条件において存在する。
【００６５】
抽出条件は、ｐＨが６．５〜８．５の範囲内に維持されるとき、最も効率的であるということが分かった。効果的なｐＨバッファーは、標準タンパク質精製テキスト（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，著  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｓｃｏｐｅｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，１９９３））において推奨されているものであり、ここで用いられることができ、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、グリシン、ジエタノールアミン、２−アミノ−２―メチル―１，３−プロパンジオール、トリエタノールアミン、イミダゾール、ヒスチジン、ピリジンなどを含む。多くのバッファーは、文献の中で記載されてきており、商業的に入手可能である。実施形態において、非変性の、抽出条件のｐＨは、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、又は約８．５である。他の実施形態において、ｐＨは、約６．５〜約６．８、約６．６〜約６．９、約６．７〜約７．０、約６．８〜約７．１、約６．９〜約７．２、約７．０〜約７．３、約７．１〜約７．４、約７．２〜約７．５、約７．３〜約７．６、約７．４〜約７．７、約７．５〜約７．８、約７．６〜約７．９、約７．８〜約８．１、約７．９〜約８．２、約８．０〜約８．３、約８．１〜約８．４又は約８．２〜約８．５である。他の実施形態において、ｐＨは、約６．５〜約７．０、約７．０〜約７．５、又は約７．５〜約８．０である。
【００６６】
非変性の抽出条件における固体濃度もまた、変えられた。このパラメータは、抽出培養混合物中の固体成分を示す。固体濃度は、湿ったペレット（不溶画分）の重さを量ることにより、及びこの重量を抽出混合物の総重量と比較することにより、決定され得る。具体的な固体濃度は、不溶画分を濃縮する又は希釈することにより達成される。高い抽出収量は、５％〜４０％（ｗ／ｖ）の固体濃度の範囲を超えて観察された。本発明の実施形態において、非変性の抽出条件における固体は、約５％、約７．５％、約１０％、約１２．５％、約１５％、約１７．５％、約２０％、約２２．５％、約２５％、約２７．５％、約３０％、約３２．５％、約３５％、約３７．５％、又は約４０％のｗ／ｖ濃度で存在する。本発明の他の実施形態において、非変性の抽出条件における固体は、約５％〜約７．５％、約７．５％〜約１０％、約１０％〜約１２．５％、約１２．５％〜約１５％、約１５％〜約１７．５％、約１７．５％〜約２０％、約２０％〜約２２．５％、約２２．５％〜約２５％、約２５％〜約２７．５％、約２７．５％〜約３０％、約３０％〜約３２．５％、約３２．５％〜約３５％、約３５％〜約３７．５％、約３７．５％〜約４０％、約５〜約１０％、約１０％〜約１５％、約１５％〜約２０％、約２０％〜約２５％、約２５％〜約３０％、約３５％〜約４０％、約５％〜約１５％、約５％〜約２５％、約５％〜約３０％、約５％〜約３５％、約１０％〜約２０％、約２０％〜約３０％、約３０％〜約４０％、約５％〜約２０％、又は約２０％〜約４０％のｗ／ｖ濃度で存在する。
【００６７】
実施形態において、本発明の抽出方法は、タンパク質収量をさらに高めるため、吸着のような同時濃縮技術と組み合わされる。
【００６８】
可溶化タンパク質は、遠心分離および／または、例えばサイズ排除、陰イオン又は陽イオン交換、疎水性相互作用あるいはアフィニティクロマトグラフィーのようなクロマトグラフィーによって、他のタンパク質と細胞片から分離または精製され得る。
【００６９】
（インターフェロン）
ヒトインターフェロンは、３つの主要な型に分類されてきた。Ｉ型インターフェロン：Ｉ型ＩＦＮは、ＩＦＮＡＲ１とＩＦＮＡＲ２鎖から成るＩＦＮ−α受容体（ＩＦＮＡＲ）として知られている特定の細胞表面の受容体複合体に結び付く。ヒトＩ型インターフェロンが含むのは、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−κ、ＩＦＮ−ω、ＩＦＮ−εである。ＩＩ型インターフェロン：ＩＩ型ＩＦＮ（ヒトＩＦＮ−γ）は、ＩＦＮＧＲに結び付く。ＩＩＩ型インターフェロン：ＩＩＩ型インターフェロンは、ＩＬ１０Ｒ２（ＣＲＦ２−４とも呼ばれる）とＩＦＮＬＲ１（ＣＲＦ２−１２とも呼ばれる）から成る受容体複合体を介して信号を送る。
【００７０】
ヒトＩ型インターフェロンは、２つの受容体サブユニットであるＩＦＮＡＲ−１とＩＦＮＡＲ−２に結合すると考えられ、これらは、様々な細胞型の細胞の表面に広く分布される。リガンドの関与は、それぞれＩＦＮＡＲ−１と２に結合されるチロシンキナーゼであるＴＹＫ２とＪＡＫ−１のリン酸化を誘導する。いったんリン酸化されると、ＳＴＡＴタンパク質は、受容体から放出され、ヘテロ二重体だけでなく、ホモ二重体からも形成する。いったん放出されると、インターフェロンＲｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｆａｃｔｏｒ９（ＩＲＦ−９）と関連し、ＳＴＡＴの二重体であるＤＮＡ結合プロテインは、ＩＦＮ−刺激遺伝子因子―３（ＩＳＧＦ−３）と呼ばれる複合体を形成し、それは核に移動する。次に、ＩＳＧＦ−３複合体は、全てのＩＦＮ誘導遺伝子の上流に存在するＤＮＡ要素に結び付く。Ｉ型インターフェロンは、例えば米国特許第７，６２５，５５５号の、“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  ｈｅｒｅｉｎ  ｂｙ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ”のような文献の中で広く記載されている。
【００７１】
１型ＩＦＮは、それらの配列とそれらの共有の受容体結合能により明示されるように、実質的な構造上の類似点を有する。Ｋｏｎｔｓｅｋ，Ｐ．，１９９４,“Ｈｕｍａｎ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，”Ａｃｔａ  Ｖｉｒｏｌ．３８（６）：３４５−６０（これは、参照により本明細書の中に組み込まれる）ヒトＩ型インターフェロン（その時点で１３個が報告されていた）は、２０％の全体の配列相同性を有し、それは、ポリペプチドの同一の二次の、又は三次の折り畳みを決定する。さらに、Ｋｏｎｔｓｅｋは、３次元のモデルは、Ｉ型のＩＦＮの球状構造が、２つのポリペプチドドメインを形成するかもしれない５α―らせん体の束から成ることを示唆すると報告する。ジスルフィド結合Ｃｙｓ２９−Ｃｙｓ１３９は、生理活性の配置において両方のドメインを安定させる。アミノ酸（ａａ）３０−４１と１２０−１４５と関連する２つの保存された親水性の領域は、Ｉ型ＩＦＮ中の受容体認識部位の基本的なフレームワークを構成すると考えられ、ヒトＩ型ＩＦＮ中における生物学的効果の異なる範囲は、ａａ３０−４１と１２０−１４５のセグメント内におけるわずかな配列の異種性や、可変の親水性ａａ領域である２３−２６、６８−８５、および１１２−１２１に起因するものだと推測される。Ｏｒｉｔａｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，２００１，“ＴｙｐｅＩ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ  ａｎｄ  ｌｉｍｉｔｉｎ：ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，”Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  １２（４）：３３７−４８, （これは参照により本明細書に組み込まれる）によるその後の報告は、ファミリーメンバーＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ｐｉ、又はＩＦＮ−ｔａｕを記載する。その研究論文は、またＩＦＮ−αとＩＦＮ−βは、５つのらせん体から成る球状構造を有することも報告し、比較配列解析、原型の３次元構造、モノクローナル抗体による解析、混成分子の構造、又は特定部位の定方向突然変異誘発について論ずる。
【００７２】
本発明の方法を用いる任意のＩ型インターフェロンタンパク質の産生が熟考される。本発明の方法を用いて産生され得るＩ型インターフェロンタンパク質は、ヒトＩＦＮ−α２ａおよび２ｂ、ヒトＩＦＮ−β１ｂ、ヒトＩＦＮ−κ（例えば、ＮＭ＿０２０１２４、ＡＡＫ６３８３５、これらはＬａＦｌｅｕｒ，ｅｔ  ａｌ．，２００１，“Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｋａｐｐａ，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（４３），３９７６５−３９７７１，（これは、参照により本明細書の中に組み込まれる）によって記載される）およびヒトＩＦＮ−ω（例えばＮＭ＿００２１７７、ＮＰ＿００２１６８、これらはまた米国特許第７，４７０，６７５号、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ω―ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，”（これは参照することにより全体として本明細書の中に組み込まれる）中に記載されている）を含むが、これらに限定されない。本発明の方法を用いるＩＦＮ−τの産生もまた熟考される。アミノ酸と核酸配列は、公的に、例えばＧｅｎＢａｎｋから利用できる。
【００７３】
ＩＦＮ−αタンパク質の１４サブタイプが記載されている：ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７、ＩＦＮＡ２１。ＩＦＮ−αは、ペグインターフェロンａｌｆａ−２ａやペグインターフェロンａｌｆａ−２ｂのような治療薬として合成的に作られる。
【００７４】
ＩＦＮ―β（ＩＦＮＢ１、又はＩＦＮ−β１ｂ）は主なβサブタイプである（例えばＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ００２１６７．１参照、それは成熟したペプチド配列を提供する）。Ｂｅｔａｓｅｒｏｎは、ヒトＩＦＮ−βアナログであり、その中でセリンは、ポジション１７のシステインと置換するように遺伝子上操作され、それはＩＦＮ−β１ｂＣ１７Ｓとして知られている（米国特許第４，５８８，５８５“Ｈｕｍａｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｄｅｐｌｅｔｅｄ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−β  ｍｕｔｅｉｎｓ，”（これは、参照により本明細書の中に組み込まれる）において記載される）。分子は、１つのジスルフィド結合を伴った１６５アミノ酸の小さなポリペプチドであり、非グリコシル化タンパク質として産生される。
【００７５】
ＩＦＮ−τは記載され、ＩＦＮ−τの配列が、例えば米国特許第７，２１４，３６７号，“Ｏｒａｌｌｙ−ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｔａｕ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ，”（これは、全体として参照により本明細書の中に組み込まれる）に開示される。
【００７６】
多くのＩ型ＩＦＮは、ヒトにおいて疾患を処置する時にＦＤＡにより使用が認可されてきた。下記の表は、Ｉ型インターフェロン薬物の例を挙げる。本発明の実施形態において、これらの薬物の任意のものは、本明細書の中で出願され、または記載される方法を用いて作り出される。
【００７７】
【表４】
0005840148.tif 000005
【００７８】
実施形態において、１型インターフェロンタンパク質の変異及び改変は、本発明の方法を用いて作り出される。例えば、ＩＦＮ−β変異体は、米国特許第６，５３１，１２２号“Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−β  ｖａｒｉａｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”および米国特許第７，６２５，５５５号に記載され、両方とも参照として本明細書に組み込まれる。共役はペグ１型インターフェロン、例えば、表４に示されるＰＥＧｙｌａｔｅｄ）、および非ペプチド部分に連結されたインターフェロンを含む。
【００７９】
本発明の方法は、それらの構造類似性によりすべての１型インターフェロンに役立つと予想される。特定の構造上無関係なタンパク質、例えばヒトＧＣＳＦは、本発明の方法を用いて産生するためにあまり候補とならない（ｂｅ  ｐｏｏｒ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ）とわかった。本明細書に記載される方法を用いてＧＣＳＦが産生され、抽出される時、不溶画分中のＧＣＳＦタンパク質の５％未満の量は、可溶性タンパク質として抽出された（示されないデータ）。
【００８０】
一般に、アミノ酸配列に関して、用語「改変（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」は、置換、挿入、伸長、欠失および誘導単独、またはそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態において、ペプチドは、「非本質的な」アミノ酸残基の１つ以上の改変を含むかもしれない。この文脈において、「非本質的な」アミノ酸残基は、新規なアミノ酸配列において、ペプチド（例えばアナログペプチド）の活性（例えばアゴニスト活性）を実質的に減少させることなく変更、例えば、欠失または置換、することができる残基である。幾つかの実施形態において、ペプチドは、「不可欠な」アミノ酸残基の１以上の改変を含み得る。この文脈において、「不可欠な」アミノ酸残基は、新規なアミノ酸配列において、変更、例えば、欠失または置換されると、参照ペプチドの活性が実質的に減少されるまたは無効にされる残基である。必須アミノ酸残基が変更されるような実施形態において、改変されたペプチドは、提供される方法において、対象の１型インターフェロンの活性を有し得る。置換、挿入および欠失は、Ｎ末端またはＣ末端である場合もあり、またはタンパク質の内部の部分にある場合もある。一例として、タンパク質は、連続的な形式で、又はペプチド分子の全体にわたって間隔を置いての両方で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の置換を含み得る。単独又は置換と組み合わせて、ペプチドは、連続的な形式で又はペプチド分子の全体にわたって間隔を置いてかのいずれかで、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の挿入を含み得る。ペプチドは、単独または置換及び／又は挿入と組み合わせて、重ねて連続的な形式で、又はペプチド分子の全体にわたって間隔を置いてのいずれかで、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の欠失を含み得る。ペプチドはまた、単独でまたは置換、挿入及び／又は欠失と組み合わせて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のアミノ酸付加を含み得る。
【００８１】
置換は、保存的なアミノ酸置換を含む。「保存的なアミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似した側鎖または物理化学的特性（例えば、静電気的な、水素結合の、等配電子の（ｉｓｏｓｔｅｒｉｃ）、疎水性の特徴）を有するアミノ酸残基と交換されるアミノ酸残基である。アミノ酸は、天然である場合もあり又はまたは非天然（ｎｏｒｍａｔｕｒａｌ）（人工的）である場合もある。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野で公知である。これらのファミリーは、塩基性の側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性の側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、荷電していない極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、メチオニン、システイン）、無極性の側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。置換はまた、非保存的な変化を含み得る。
【００８２】
（最適な抽出条件を選択するための方法）
本発明の実施形態において、提供されるパラメータ値の範囲内の抽出条件をさらに最適化するために、図４Ｂにおいて明らかにされた統計分析の結果を使用する。明らかにされた範囲内の任意の値を用いて本発明を実行すると、すべての１型インターフェロンの高水準の可溶性タンパク質産生が観察されると予期される。それにもかかわらず、近い将来にその必要を満たすために抽出条件を最適化するために、図４のＢに示されるツールを利用することは当業者の能力内にある。
【００８３】
（産生物の評価）
（タンパク質収量）
本明細書に記載される不溶性および可溶性の画分中のタンパク質収量は、例えば、キャピラリーゲル電気泳動法（ＣＧＥ）およびウエスタンブロット分析によって、当業者に既知の方法によって測定されることができる。
【００８４】
タンパク質収量の有用な測定は、例えば、培養量当たりの組換えタンパク質の量（例えば、タンパク質のｇまたはｍｇ／培養物のＬ）、溶解後に得られる不溶性のペレット中で測定された組換えタンパク質のパーセントまたは画分（抽出上清中の組換えタンパク質の量／不溶画分中のタンパク質の量）、活性タンパク質のパーセントまたは画分（例えば、活性タンパク質の量／アッセイにおいて使用されるタンパク質の量）、全細胞タンパク質（ｔｃｐ）のパーセント又は画分、タンパク質／細胞の量およびパーセント乾燥バイオマスを含む。実施形態において、本明細書に記載されるタンパク質の測定は、得られた可溶性のタンパク質の量または活性タンパク質の量、またはその両方に基づく。
【００８５】
実施形態において、本発明の方法は、約０．３グラム／L〜約１０グラム／Lの抽出される組換えタンパク質収量を得るために使用することができる。特定の実施形態において、抽出される組換えタンパク質は、約０．３グラム／Ｌ〜約１グラム／Ｌ、約１グラム／Ｌ〜約２グラム／Ｌ、約２グラム／Ｌ〜約３グラム／Ｌ、約３グラム／Ｌ〜約４グラム／Ｌ、約４グラム／Ｌ〜約５グラム／Ｌ、約５グラム／Ｌ〜約６グラム／Ｌ、約６グラム／Ｌ〜約７グラム／Ｌ、約７グラム／Ｌ〜約８グラム／Ｌ、約８グラム／Ｌ〜約９グラム／Ｌ、又は約９グラム／Ｌ〜約１０グラム／Ｌである。実施形態において、抽出されるタンパク質収率は、約１グラム／Ｌ〜約３グラム／Ｌ、約２グラム／Ｌ〜約４グラム／Ｌ、約３グラム／Ｌ〜約５グラム／Ｌ、約４グラム／Ｌ〜約６グラム／Ｌ、約５グラム／Ｌ〜約７グラム／Ｌ、約６グラム／Ｌ〜約８グラム／Ｌ、約７グラム／Ｌ〜約９グラム／Ｌ、又は約８グラム／Ｌ〜約１０グラム／Ｌである。実施形態において、抽出されるタンパク質収率は、約０．５グラム／Ｌ〜約４グラム／Ｌ、約１グラム／Ｌ〜約５グラム／Ｌ、約２グラム／Ｌ〜約６グラム／Ｌ、約３グラム／Ｌ〜約７グラム／Ｌ、約４グラム／Ｌ〜約８グラム／Ｌ、約５グラム／Ｌ〜約９グラム／Ｌ、又は約６グラム／Ｌ〜約１０グラム／Ｌである。実施形態において、抽出されるタンパク質収率は、約０．５グラム／Ｌ〜約５グラム／Ｌ、約１グラム／Ｌ〜約６グラム／Ｌ、約２グラム／Ｌ〜約７グラム／Ｌ、約３グラム／Ｌ〜約８グラム／Ｌ、約４グラム／Ｌ〜約９グラム／Ｌ、又は約５グラム／Ｌ〜約１０グラム／Ｌである。
【００８６】
実施形態において、抽出上清画分中で検出される組換えインターフェロンタンパク質の量は、不溶画分中で検出される組換えインターフェロンタンパク質の量の約１０％から約９５％である。実施形態において、この量は、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、又は約９５％である。実施形態において、この量は、約１０％〜約２０％、２０％〜約５０％、約２５％〜約５０％、約２５％〜約５０％、約２５％〜約９５％、約３０％〜約５０％、約３０％〜約４０％、約３０％〜約６０％、約３０％〜約７０％、約３５％〜約５０％、約３５％〜約７０％、約３５％〜約７５％、約３５％〜約９５％、約４０％〜約５０％、約４０％〜約９５％、約５０％〜約７５％、約５０％〜約９５％、又は約７０％〜約９５％である。
【００８７】
材料が抽出プロセスの間に失われるので、抽出されていない不溶画分中で測定されるタンパク質収量は、典型的には、抽出上清中の収量より高い。発酵培養物からの収量は、より小さなＨＴＰ培養からの収量より典型的にはより高い。
【００８８】
「パーセント全細胞タンパク質」は、総計の細胞のタンパク質の割合としての宿主細胞中のタンパク質またはポリペプチドの量である。パーセント全細胞タンパク質の測定は、当該技術分野において周知である。
【００８９】
実施形態において、産生される抽出上清画分中で検出されるインターフェロンタンパク質の量は、全細胞タンパク質の約１％から約７５％である。特定の実施形態において、産生される組換えタンパク質は、全細胞タンパク質の約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約１％〜約５％、約１％〜約１０％、約１％〜約２０％、約１％〜約３０％、約１％〜約４０％、約１％〜約５０％、約１％〜約６０％、約１％〜約７５％、約２％〜約５％、約２％〜約１０％、約２％〜約２０％、約２％〜約３０％、約２％〜約４０％、約２％〜約５０％、約２％〜約６０％、約２％〜約７５％、約３％〜約５％、約３％〜約１０％、約３％〜約２０％、約３％〜約３０％、約３％〜約４０％、約３％〜約５０％、約３％〜約６０％、約３％〜約７５％、約４％〜約１０％、約４％〜約２０％、約４％〜約３０％、約４％〜約４０％、約４％〜約５０％、約４％〜約６０％、約４％〜約７５％、約５％〜約１０％、約５％〜約２０％、約５％〜約３０％、約５％〜約４０％、約５％〜約５０％、約５％〜約６０％、約５％〜約７５％、約１０％〜約２０％、約１０％〜約３０％、約１０％〜約４０％、約１０％〜約５０％、約１０％〜約６０％、約１０％〜約７５％、約２０％〜約３０％、約２０％〜約４０％、約２０％〜約５０％、約２０％〜約６０％、約２０％〜約７５％、約３０％〜約４０％、約３０％〜約５０％、約３０％〜約６０％、約３０％〜約７５％、約４０％〜約５０％、約４０％〜約６０％、約４０％〜約７５％、約５０％〜約６０％、約５０％〜約７５％、約６０％〜約７５％、または約７０％〜約７５％である。
【００９０】
（溶解度および活性）
【００９１】
タンパク質の「溶解度」および「活性」は、性質に関連するが、一般的に、異なる方法によって測定される。タンパク質、特に疎水性タンパク質の溶解度は、疎水性アミノ酸残基が折り畳まれたタンパク質の外部に誤って位置付けられることを示す。タンパク質活性（それは別の方法を用いて評価することができる）は、例えば、下記に記載されるように、適切なタンパク質構造の別の指標である。本明細書に使用されるように、「可溶性の、活性な、またはその両方」は、当業者に知られている方法によって、可溶性、活性、または可溶性かつ活性の両方であると測定されるタンパク質を指す。
【００９２】
（インターフェロン活性アッセイ）
【００９３】
インターフェロンタンパク質活性を評価するためのアッセイは、当該技術分野で知られており、インターフェロンの標準リガンドへの結合を測定する結合活性アッセイ、例えばブルーセファロースカラム、又は特異抗体カラムを含む。
【００９４】
インターフェロンの生物学的活性は、既知のアッセイを用いて定量化することができ、その多くは、キットで市販されている。大部分またはすべてのインターフェロンの種類は、Ｉ型およびＩＩ型ＩＦＮのための異なる受容体の存在にもかかわらず、応答細胞におけるインビトロの生物学的活性の類似したスペクトルを働かせることが示された。ＩＦＮによって誘導された生物学的活性は、抗ウイルス活性を含み、それは細胞受容体によって媒介され、シグナル伝達経路の活性化、特定の遺伝子産物の発現および抗ウイルス機構の発展に依存する。ＩＦＮを媒介とした抗ウイルス活性に対する細胞の感受性は、可変的で、細胞型、ＩＦＮ受容体および下流のエフェクター反応要素の発現、抗ウイルス機構の有効性、および細胞を感染させるために使用されるウイルスの型を含む多くの因子に依存する。
【００９５】
生物学的活性アッセイは、例えば、細胞変性効果アッセイ（ＣＰＥ）、抗ウイルス活性アッセイ、細胞増殖の阻害、機能的な細胞活性の調整、細胞の分化の調整および免疫調節を測定するアッセイを含む。レポーター遺伝子アッセイは、実施例において本明細書に記載されるルシフェラーゼレポーター細胞ベースのアッセイを含む。レポーター遺伝子アッセイでは、ＩＦＮ応答遺伝子のプロモーター領域は、異種のレポーター遺伝子、例えばホタルルシフェラーゼ又はアルカリフォスファターゼ、と連結され、ＩＦＮ感受性細胞株へトランスフェクトされる。ＩＦＮにさらされた、安定してトランスフェクトされた細胞株は、ＩＦＮの用量と直接関係してレポーター遺伝子産物の発現を増加させ、そのリードアウトは、この産物の酵素の作用の測定値である。多くの活性アッセイツールおよびキットが市販されている。インターフェロンのための生物学的アッセイは、例えば、Ｍｅａｇｅｒ  Ａ（“Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ，”  １  Ｍａｒ  ２００２、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６１（１−２）：２１−３６）によって記載され、これは、参照として本明細書に組み込まれる。
【００９６】
実施形態において、活性は、アッセイされた総量に対する、抽出上清中の％活性タンパク質で表わされる。これは、アッセイにおいて用いられるタンパク質の総量に関連するアッセイによって活性であることを測定されたタンパク質の量に基づく。他の実施形態において、活性は、標準、例えば天然タンパク質に対するタンパク質の％活動レベルによって表わされる。これは、標準サンプル（そこでは、各々のサンプルからの同じ量のタンパク質がアッセイにおいて使用される）中の活性タンパク質の量に関連する上清抽出液サンプル中の活性タンパク質の量に基づく。
【００９７】
実施形態において、組換えインターフェロンタンパク質の約４０％〜約１００％までが活性であることが測定される。実施形態において、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％の組換えインターフェロンタンパク質が活性であると測定される。実施形態において、約４０％〜約５０％、約５０％〜約６０％、約６０％〜約７０％、約７０％〜約８０％、約８０％〜約９０％、約９０％〜約１００％、約５０％〜約１００％、約６０％〜約１００％、約７０％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約４０％〜約９０％、約４０％〜約９５％、約５０％〜約９０％、約５０％〜約９５％、約５０％〜約１００％、約６０％〜約９０％、約６０％〜約９５％、約６０％〜約１００％、約７０％〜約９０％、約７０％〜約９５％、約７０％〜約１００％、または約７０％〜１００％の組換えインターフェロンタンパク質が活性であることが測定される。
【００９８】
他の実施形態において、約７５％〜約１００％の組換えインターフェロンタンパク質が活性であることが測定される。実施形態において、約７５％〜約８０％、約７５％〜約８５％、約７５％〜約９０％、約７５％〜約９５％、約８０％〜約８５％、約８０％〜約９０％、約８０％〜約９５％、約８０％〜約１００％、約８５％〜約９０％、約８５％〜約９５％、約８５％〜約１００％、約９０％〜約９５％、約９０％〜約１００％、または約９５％〜約１００％の組換えインターフェロンタンパク質が活性であることが測定される。
【００９９】
（発現系）
本発明の方法において有用な宿主細胞のみでなくシュードモナス宿主細胞においても有用な調節配列（例えば、プロモーター、分泌リーダーおよびリボソーム結合部位）を含む異種のタンパク質を発現するための方法は、米国特許出願公開第２００８／０２６９０７０号および米国特許出願第１２／６１０，２０７号，共に、発明の名称“Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄｌｙ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｈｏｓｔｓ  ｔｏ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙ  Ｃｅｒｔａｉｎ  Ｓｔｒａｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｙｉｅｌｄ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｑｕａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”、  米国特許出願公開第２００６／００４０３５２号、  “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ”、および  米国特許出願公開第２００６／０１１０７４７号、“Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｔｒａｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”、（これらは全て、その全体が参照として本明細書に組み込まれる）に記載される。これらの出版物はまた、本発明の方法を実行する際に有用な細菌宿主株を記載し、それらは、折り畳みモジュレーターを過剰発現するように設計されており、または異種のタンパク質発現を増加させるためにプロテアーゼ変異体が導入されている。配列リーダーは、米国特許出願第１２／６１０，２０７号のみでなく、米国特許出願公開第２００８／０１９３９７４号，“Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｌｅａｄｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”、および、米国特許出願公開第２００６／０００８８７７号、“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｅｃ−ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ”（両方ともその全体が参照として本明細書に組み込まれる）にも記載される。
【０１００】
（プロモーター）
本発明に従って使用されるプロモーターは、構成的プロモーター、または調節プロモーターであり得る。有用な調節プロモーターの一般的な例は、ｌａｃプロモーター（すなわちｌａｃＺプロモーター）、特に、Ｐｔａｃ１６、Ｐｔａｃ１７、ＰｔａｃＩＩ、ＰｌａｃＵＶ５、およびＴ７ｌａｃプロモーターだけでなく、ＤｅＢｏｅｒの米国特許第４，５５１，４３３号に記載されるｔａｃおよびｔｒｃプロモーターも含む。１つの実施形態において、プロモーターは、宿主の細胞生物体に由来しない。特定の実施形態において、プロモーターは、Ｅ．ｃｏｌｉ生物体に由来する。
【０１０１】
誘導性プロモーター配列は、本発明の方法に従ってインターフェロンの発現を調節するために使用することができる。実施形態において、本発明の方法において有用な誘導プロモーターは、ｌａｃプロモーター（すなわちｌａｃＺプロモーター）、特に、Ｐｔａｃ１６、Ｐｔａｃ１７、ＰｔａｃＩＩ、ＰｌａｃＵＶ５、およびＴ７ｌａｃプロモーターだけでなく、ＤｅＢｏｅｒの米国特許第４，５５１，４３３号に記載されるｔａｃおよびｔｒｃプロモーターも含む。１つの実施形態において、プロモーターは、宿主細胞生物体に由来しない。特定の実施形態において、プロモーターは、Ｅ．ｃｏｌｉ生物体に由来する。
【０１０２】
本発明による発現系において有用なｌａｃを含まない型の（ｎｏｎ−ｌａｃ−ｔｙｐｅ）プロモーターの一般的な例は、例えば表５にリストされたものを含む。
【０１０３】
【表５】
0005840148.tif 000006
【０１０４】
例えば、以下を参照：Ｊ．  Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒｏｍｅｒｏ  ＆  Ｖ．  Ｄｅ  Ｌｏｒｅｎｚｏ  （１９９９）  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （Ａ．  Ｄｅｍａｉｎ  ＆  Ｊ．  Ｄａｖｉｅｓ，  ｅｄｓ．）  ｐｐ．  ４６０−７４  （ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．）；  Ｈ．  Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ  （２００１）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １２：４３９−４４５；  およびＲ．  Ｓｌａｔｅｒ  ＆  Ｒ．  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  （２０００  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （Ｊ．  Ｗａｌｋｅｒ  ＆  Ｒ．  Ｒａｐｌｅｙ，  ｅｄｓ．）  ｐｐ．  １２５−５４  （Ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＵＫ））。選択された細菌の宿主細胞に固有のプロモーターのヌクレオチド配列を有するプロモーターはまた、標的ポリペプチド、例えば、シュードモナスアントラニラートまたは安息香酸塩オペロンプロモーター（Ｐａｎｔ、Ｐｂｅｎ）をコード化する導入遺伝子の発現を制御するために使用され得る。１を超えるプロモーターが別のもの（それが、配列において同じであろうと又は異なろうと）（または同じ若しくは異なる生物体に由来しようと）、に共有結合するタンデムプロモーター、例えば、Ｐａｎｔ−Ｐｂｅｎタンデムプロモーター（内部プロモーターハイブリッド（ｉｎｔｅｒｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｈｙｂｒｉｄ）またはＰｌａｃ−Ｐｌａｃタンデムプロモーター、も使用され得る。
【０１０５】
調節プロモーターはプロモーターが一部分である遺伝子の転写を制御するためにプロモーター調節タンパク質を利用する。調節プロモーターが本明細書に使用される場合、相当するプロモーター調節タンパク質はまた、本発明による発現系の一部分である。プロモーター調節タンパク質の例は、以下を含む：活性化タンパク質、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉカタボライト活性化タンパク質、ＭａｌＴタンパク質；ＡｒａＣファミリー転写活性化因子；抑制タンパク質、例えばＥ．ｃｏｌｉ  ＬａｃＩタンパク質；および二重機能調節タンパク質（ｄｕａｌ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、例えばＥ．ｃｏｌｉ  ＮａｇＣタンパク質。多くの調節プロモーター／プロモーター調節―タンパク質の組が当該技術分野において知られている。１つの実施形態において、標的タンパク質のための発現構築物および対象の異種のタンパク質は、同じ調節要素の制御下にある。
【０１０６】
プロモーター調節タンパク質は、エフェクター化合物、すなわち、タンパク質が、放出されるか、又はプロモーターの制御下にある遺伝子の少なくとも１つのＤＮＡ転写制御領域に結合することが可能にするように調節タンパク質と可逆的にまたは不可逆的に関連する化合物と相互作用し、それによって、遺伝子の転写を開始する際に転写酵素の作用をさせる又は遮断する。エフェクター化合物は、誘導物質または抑制補体のいずれかとして分類され、これらの化合物は、天然のエフェクター化合物および非代謝性誘導物質化合物を含む。多くの調節プロモーター／プロモーター調節タンパク質／エフェクター−化合物の三つ組（ｔｒｉｏ）が、当該技術分野において知られている。エフェクター化合物は細胞培養または発酵の全体にわたって使用することができるが、調節プロモーターが使用される好ましい実施形態において、所望の量または密度の宿主細胞バイオマスの増殖後に、対象のタンパク質またはポリペプチドをコード化する所望の遺伝子の発現を直接的又は間接的に結果としてもたらすために、適切なエフェクター化合物が培養物に加えられる。
【０１０７】
ｌａｃファミリープロモーターが利用される実施形態において、ｌａｃＩ遺伝子はまた、系に存在し得る。ｌａｃＩ遺伝子、それは、通常本質的に発現される遺伝子である、は、Ｌａｃ抑制タンパク質ＬａｃＩタンパク質をコード化し、それはｌａｃファミリープロモーターのｌａｃオペレーターに結合する。従って、ｌａｃファミリープロモーターが利用される場合、ｌａｃＩ遺伝子も含まれ得、発現系において発現し得る。
【０１０８】
シュードモナスにおいて有益なプロモーター系は、文献、例えば、米国特許出願公開第２００８／０２６９０７０号に記載され、これらも上に参照される。
【０１０９】
（他の調節要素）
実施形態において、可溶性タンパク質は、産生の間、細胞の細胞質または周辺質のいずれかの中に存在する。タンパク質を標的化するのに役立つ分泌リーダーは、本明細書の至る所、および米国特許出願公開第２００８／０１９３９７４号、米国特許出願公開第２００６／０００８８７７号において、および米国特許出願第１２／６１０，２０７号に記載され、これらは、上に参照される。
【０１１０】
本発明の方法を実施する際に有用な発現構築物は、タンパク質コード配列に加えて、それらに操作可能に結合する以下の調節要素を含み得る：プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、転写ターミネーター、および翻訳の開始および停止信号。有用なＲＢＳは、例えば、米国特許出願公開第２００８／０２６９０７０号および米国特許出願第１２／６１０，２０７号に従って、発現系において宿主細胞として有益な任意の種から得ることができる。多くの特異的なおよび様々なコンセンサスＲＢＳ、例えば、Ｄ．  Ｆｒｉｓｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ２３４（２）：２５７−６５  （８  Ｊｕｌ．  １９９９）；およびＢ．  Ｅ．  Ｓｕｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １７（１２）：１１２３−３０  （Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００１）において記載され、およびそれらに参照されるもの、が知られている。さらに、天然又は合成のＲＢＳのいずれかは、ＥＰ  ０２０７４５９  （ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＲＢＳｓ）；  Ｏ．  Ｉｋｅｈａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １８１（３）：５６３−７０  （１９８９）  （ｎａｔｉｖｅ  ＲＢＳ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ＡＡＧＧＡＡＧ）に記載されたものが使用され得る。方法、ベクター、および翻訳および転写の要素および本発明において有用な他の要素のさらなる例は、例えば、Ｇｉｌｒｏｙの米国特許第５，０５５，２９４号およびＧｉｌｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，１２８，１３０号；    Ｒａｍｍｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，２８１，５３２号；Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第４，６９５，４５５号及び第４，８６１，５９５号；  Ｇｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第４，７５５，４６５号；およびＷｉｌｃｏｘの米国特許第５，１６９，７６０号に記載される。
【０１１１】
（宿主株）
シュードモナスを含む細菌の宿主、および密接に関連する細菌の生物体が本発明の方法を実施する際に使用するために熟考される。特定の実施形態において、シュードモナス宿主細胞は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓである。宿主細胞はまた、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞であり得る。
【０１１２】
シュードモナスおよび密接に関連する細菌は、一般に、「グラム（−）プロテオバクテリアサブグループ１」又は「グラム陰性好気性の桿菌および球菌」（Ｂｕｃｈａｎａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｂｂｏｎｓ  （ｅｄｓ．）  （１９７４）  Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  ｐｐ．  ２１７−２８９）として規定されるグループの一部である。シュードモナス宿主株は、文献、例えば、米国特許出願公開第２００６／００４０３５２号に記載され、これは、上に引用される。
【０１１３】
例えば、シュードモナス宿主は、属シュードモナス、シュードモナス−エナリア（ｅｎａｌｉａ）（ＡＴＣＣ  １４３９３）、シュードモナス・ニグリファシエンス（ｎｉｇｒｉｆａｃｉｅｎｓｉ）（ＡＴＣＣ  １９３７５）およびシュードモナス・プトレファシエンス（ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）（ＡＴＣＣ  ８０７１）に由来する細胞を含み得、それらは、それぞれ、アルテロモナス・ハロプランクティス（ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ）、アルテロモナス・ニグリファシエンス（ｎｉｇｒｉｆａｃｉｅｎｓ）およびアルテロモナス・プトレファシエンス（ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）として再分類された。同様に、例えば、シュードモナス−アシドボランス（ＡＴＣＣ  １５６６８）およびシュードモナス−テストステロニ（ＡＴＣＣ  １１９９６）は、その後、それぞれ、コマモナス・アシドボランスおよびコマモナス・テストステローニとしてそれぞれ再分類され；およびシュードモナス・ニグリファシエンス（ＡＴＣＣ  １９３７５）およびシュードモナス・ピシシダ（ｐｉｓｃｉｃｉｄａ）（ＡＴＣＣ  １５０５７）は、それぞれ、シュードモナス・ニグリファシエンスおよびシュードモナス・ピシシダとして再分類された。
【０１１４】
宿主細胞は「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１６」から選択され得る。「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１６」は、以下のシュードモナス種（ＡＴＣＣまたは典型的な株の他の寄託番号を括弧内に示す）のプロテオバクテリアのグループとして定義される：シュードモナス・アビエタニフィラ（ａｂｉｅｔａｎｉｐｈｉｌａ）（ＡＴＣＣ  ７００６８９）；シュードモナス・エルジノーサ  （ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＡＴＣＣ  １０１４５）；シュードモナス・アルカリゲネス（  ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）（ＡＴＣＣ  １４９０９）；シュードモナス・アンギリセプチカ（ａｎｇｕｉｌｌｉｓｅｐｔｉｃａ）（ＡＴＣＣ  ３３６６０）；シュードモナス・シトロネロリス（ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌｉｓ）（ＡＴＣＣ  １３６７４）；シュードモナス・フラベセンス（ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）（ＡＴＣＣ  ５１５５５）；シュードモナス・メンドシナ（ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）（ＡＴＣＣ  ２５４１１）；シュードモナス・ニトロレデュセンス（ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｅｎｓ）（ＡＴＣＣ  ３３６３４）；シュードモナス・オレオボランス（ＡＴＣＣ  ８０６２）；シュードモナス・シュードアルカリゲネス（ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）（ＡＴＣＣ  １７４４０）；シュードモナス・レジノボランス（ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ）（ＡＴＣＣ  １４２３５）；シュードモナス・ストラミネア（ｓｔｒａｍｉｎｅａ）（ＡＴＣＣ  ３３６３６）；シュードモナス・アガリシ（ａｇａｒｉｃｉ）（ＡＴＣＣ  ２５９４１）；シュードモナス・アルカリフィラ（ａｌｃａｌｉｐｈｉｌａ）；シュードモナス・アルギノボラ（ａｌｇｉｎｏｖｏｒａ）；シュードモナス・アンデルソニイ（ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ）；シュードモナス・アスプレニイ（ａｓｐｌｅｎｉｉ）（ＡＴＣＣ  ２３８３５）；シュードモナス・アゼライカ（ａｚｅｌａｉｃａ）（ＡＴＣＣ  ２７１６２）；シュードモナス・ベイジェリンキイ（ｂｅｙｅｒｉｎｃｋｉｉ）（ＡＴＣＣ  １９３７２）；シュードモナス・ボレアリス（ｂｏｒｅａｌｉｓ）；シュードモナス・ボレオポリス（ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ）（ＡＴＣＣ  ３３６６２）；シュードモナス・ブラシカセラム（ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｒｕｍ）；シュードモナス・ブタノボラ（ｂｕｔａｎｏｖｏｒａ）（ＡＴＣＣ  ４３６５５）；シュードモナス・セルロサ（ｃｅｌｌｕｌｏｓａ）（ＡＴＣＣ  ５５７０３）；シュードモナス・アウランチアカ（ａｕｒａｎｔｉａｃａ）（ＡＴＣＣ  ３３６６３）；シュードモナス・クロロラフィス（ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）（ＡＴＣＣ  ９４４６、ＡＴＣＣ  １３９８５、ＡＴＣＣ  １７４１８、ＡＴＣＣ  １７４６１）；シュードモナス・フラジ（ｆｒａｇｉ）（ＡＴＣＣ  ４９７３）；シュードモナス・ルンデンシス（ｌｕｎｄｅｎｓｉｓ）（ＡＴＣＣ  ４９９６８）；シュードモナス・タエトロレンス（ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ）（ＡＴＣＣ  ４６８３）；シュードモナス・シシコーラ（ｃｉｓｓｉｃｏｌａ）（ＡＴＣＣ  ３３６１６）；シュードモナス・コロナファシエンス（ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ）；シュードモナス・ジテルペニフィラ（ｄｉｔｅｒｐｅｎｉｐｈｉｌａ）；シュードモナス・エロンガータ（ｅｌｏｎｇａｔａ）（ＡＴＣＣ  １０１４４）；シュードモナス・フレクテンス（ｆｌｅｃｔｅｎｓ）（ＡＴＣＣ  １２７７５）；シュードモナス・アゾトフォルマンス（ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ）；シュードモナス・ブレンネリ（ｂｒｅｎｎｅｒｉ）；
シュードモナス・セドレラ（ｃｅｄｒｅｌｌａ）；シュードモナス・コルガータ（ｃｏｒｒｕｇａｔａ）（ＡＴＣＣ  ２９７３６）；シュードモナス・エクストレモリエンタリス（ｅｘｔｒｅｍｏｒｉｅｎｔａｌｉ）；シュードモナス・フルオレッセンス  （ＡＴＣＣ  ３５８５８）；シュードモナス・ゲサルディイ（ｇｅｓｓａｒｄｉｉ）；シュードモナス・リバネンシス（ｌｉｂａｎｅｎｓｉｓ）；シュードモナス・マンデリイ（ｍａｎｄｅｌｉｉ）（ＡＴＣＣ  ７００８７１）；シュードモナス・マージナリス（ｍａｒｇｉｎａｌｉｓ）（ＡＴＣＣ  １０８４４）；シュードモナス・ミグラエ（ｍｉｇｕｌａｅ）；シュードモナス・ムシドレンス（ｍｕｃｉｄｏｌｅｎｓ）（ＡＴＣＣ  ４６８５）；シュードモナス・オリエンタリス（ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）；シュードモナス・ローデシアエ（ｒｈｏｄｅｓｉａｅ）；シュードモナス・シンクサンタ（ｓｙｎｘａｎｔｈａ）（ＡＴＣＣ  ９８９０）；シュードモナス・トラアシイ（ｔｏｌａａｓｉｉ）（ＡＴＣＣ  ３３６１８）；シュードモナス・ベロニイ（ｖｅｒｏｎｉｉ）（ＡＴＣＣ  ７００４７４）；シュードモナス・フレデリクスベルゲンシス（ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）；シュードモナス・ゲニクラタ（ｇｅｎｉｃｕｌａｔａ）（ＡＴＣＣ  １９３７４）；シュードモナス・ギンゲリ（ｇｉｎｇｅｒｉ）；シュードモナスシュードモナス・グラミニス（ｇｒａｍｉｎｉｓ）；シュードモナス・グリモンティ（ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ）；シュードモナス・ハロデニトリフィカンス（ｈａｌｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）；シュードモナス・ハロフィラ（ｈａｌｏｐｈｉｌａ）；シュードモナス・ヒビシコラ（ｈｉｂｉｓｃｉｃｏｌａ）（ＡＴＣＣ  １９８６７）；シュードモナス・ヒュッチエンシス（ｈｕｔｔｉｅｎｓｉｓ）（ＡＴＣＣ  １４６７０）；シュードモナス・ヒドロゲノボラ（ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｏｒａ）；シュードモナス・ジェッセニイ（ｊｅｓｓｅｎｉｉ）（ＡＴＣＣ  ７００８７０）；シュードモナス・キロネンシス（ｋｉｌｏｎｅｎｓｉｓ）；シュードモナス・ランセオラタ（ｌａｎｃｅｏｌａｔａ）（ＡＴＣＣ  １４６６９）；シュードモナス・リニ（ｌｉｎｉ）；シュードモナス・マルギナタ（ｍａｒｇｉｎａｔａ）（ＡＴＣＣ  ２５４１７）；シュードモナス・メフィチカ（ｍｅｐｈｉｔｉｃａ）（ＡＴＣＣ  ３３６６５）；シュードモナス・デニトリフィカンス（ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ  ）（ＡＴＣＣ  １９２４４）；シュードモナス・ペルツシノゲナ（ｐｅｒｔｕｃｉｎｏｇｅｎａ）（ＡＴＣＣ  １９０）；シュードモナス・ピクトラム（ｐｉｃｔｏｒｕｍ）（ＡＴＣＣ  ２３３２８）；シュードモナス・サイクロフィラ（ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ）；シュードモナス・フィルバ（ｆｉｌｖａ）（ＡＴＣＣ  ３１４１８）；シュードモナス・モンテイリイ（ｍｏｎｔｅｉｌｉｉ）（ＡＴＣＣ  ７００４７６）；シュードモナス・モッセリイ（ｍｏｓｓｅｌｉｉ）；シュードモナス・オリジハビタンス（ｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓ）（ＡＴＣＣ  ４３２７２）；シュードモナス・プレコグロシシダ（ｐｌｅｃｏｇｌｏｓｓｉｃｉｄａ）（ＡＴＣＣ  ７００３８３）；シュードモナス・プチダ（ｐｕｔｉｄａ）（ＡＴＣＣ  １２���３３）；シュードモナス・レアクタンス（ｒｅａｃｔａｎｓ）；シュードモナス・スピノサ（ｓｐｉｎｏｓａ）（ＡＴＣＣ  １４６０６）；シュードモナス・バレアリカ（ｂａｌｅａｒｉｃａ）；シュードモナス・ルテオラ（ｌｕｔｅｏｌａ）（ＡＴＣＣ  ４３２７３）；シュードモナス・スタッツェリ（ｓｔｕｔｚｅｒｉ）（ＡＴＣＣ  １７５８８）；シュードモナス・アミグダリ（ａｍｙｇｄａｌｉ）（ＡＴＣＣ  ３３６１４）；シュードモナス・アベラナエ（ａｖｅｌｌａｎａｅ）（ＡＴＣＣ  ７００３３１）；シュードモナス・カリカパパヤエ（ｃａｒｉｃａｐａｐａｙａｅ）（ＡＴＣＣ  ３３６１５）；シュードモナス・シコリー（ｃｉｃｈｏｒｉｉ）（ＡＴＣＣ  １０８５７）；シュードモナス・フィクセレクタエ（ｆｉｃｕｓｅｒｅｃｔａｅ）（ＡＴＣＣ  ３５１０４）；シュードモナス・フソコバギナエ（ｆｕｓｃｏｖａｇｉｎａｅ）；シュードモナス・メリアエ（ｍｅｌｉａｅ）（ＡＴＣＣ  ３３０５０）；シュードモナス・シリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）（ＡＴＣＣ  １９３１０）；シュードモナス・ビリジフラバ（ｖｉｒｉｄｉｆｌａｖａ）（ＡＴＣＣ  １３２２３）；シュードモナス・サーモカルボキシドボランス（ｔｈｅｒｍｏｃａｒｂｏｘｙｄｏｖｏｒａｎｓ）（ＡＴＣＣ  ３５９６１）；シュードモナス・サーモトレランス（ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）；シュードモナス・チベルバレンシス（ｔｈｉｖｅｒｖａｌｅｎｓｉｓ）；シュードモナス・バンコウベレンシス（ｖａｎｃｏｕｖｅｒｅｎｓｉｓ）（ＡＴＣＣ  ７００６８８）；シュードモナス・ウィスコンシネンシス（ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ）；およびシュードモナス・キアメンシス（ｘｉａｍｅｎｅｎｓｉｓ）。
【０１１５】
宿主細胞はまた、「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１７」から選択され得る。「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１７」は、例えば、以下のシュードモナス種に属するものを含む「蛍光性シュードモナス」として当該技術分野で既知のプロテオバクテリアのグループとして定義される：シュードモナス・アゾトフォルマンス（ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ）；シュードモナス・ブレンネリ（ｂｒｅｎｎｅｒｉ）；シュードモナス・セドレラ（ｃｅｄｒｅｌｌａ）；シュードモナス・コルガータ（ｃｏｒｒｕｇａｔａ）；シュードモナス・エクストレモリエンタリス（ｅｘｔｒｅｍｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）；シュードモナス・フルオレッセンス（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）；シュードモナス・ゲサルディイ（ｇｅｓｓａｒｄｉｉ）；シュードモナス・リバネンシス（ｌｉｂａｎｅｎｓｉｓ）；シュードモナス・マンデリイ（ｍａｎｄｅｌｉｉ）；シュードモナス・マージナリス（ｍａｒｇｉｎａｌｉｓ）；シュードモナス・ミグラエ（ｍｉｇｕｌａｅ）；シュードモナス・ムシドレンス（ｍｕｃｉｄｏｌｅｎｓ）；シュードモナス・オリエンタリス（ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）；シュードモナス・ローデシアエ（ｒｈｏｄｅｓｉａｅ）；シュードモナス・シンクサンタ（ｓｙｎｘａｎｔｈａ）；シュードモナス・トラアシイ（ｔｏｌａａｓｉｉ）；およびシュードモナス・ベロニイ（ｖｅｒｏｎｉｉ）。
【０１１６】
（コドン最適化）
細菌の宿主における発現を向上させるためにコドンを最適化する方法は、当該技術分野で知られており、文献に記載されている。例えば、シュードモナス宿主株における発現のためのコドンの最適化は、米国特許出願公開第２００７／０２９２９１８号、“Ｃｏｄｏｎ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ”に記載され、これは、その全体が参照として本明細書に記載される。
【０１１７】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためのコドン最適化は、例えば、Ｗｅｌｃｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，  “Ｄｅｓｉｇｎ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｔｏ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，  ４（９）：  ｅ７００２，  Ｇｈａｎｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  “Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Β  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ，”  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｓｌａｍｉｃ  Ｒｅｐｕｂｌｉｃ  ｏｆ  Ｉｒａｎ  １９（３）：  ２０３−２０９、およびＶａｌｅｎｔｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  “Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ａｌｐｈａ  ２ｂ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，”  Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７０（８）：  ５０３３−５０３６によって記載され、これらはすべて本明細書に参照として組み込まれる。
【０１１８】
（発酵様式）
本発明による発現系は、任意の発酵様式（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒｍａｔ）において培養され得る。例えば、バッチ、フェドバッチ、半連続式、又は連続式の発酵モードが本明細書において利用され得る。
【０１１９】
実施形態において、発酵培地は、富栄養培地、最少培地および無機塩培地の中から選択され得る。他の実施形態において、最少培地または無機塩培地のいずれかが選択される。
特定の実施形態において、無機塩培地が選択される。
【０１２０】
無機塩培地は、無機塩と、例えば、グルコース、スクロース、グリセロールなどの炭素源からなる。無機塩培地の例は、例えば、Ｍ９培地、シュードモナス培地（ＡＴＣＣ  １７９）、及びＤａｖｉｓ−Ｍｉｎｇｉｏｌｉ培地（Ｂ  Ｄ  Ｄａｖｉｓ  ＆  Ｅ  Ｓ  Ｍｉｎｇｉｏｌｉ  （１９５０）  Ｊ．  Ｂａｃｔ．  ６０：１７−２８を参照）を含む。無機塩培地を作るために使用される無機塩は、例えば、リン酸カリウム、硫酸アンモニウム又は塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム又は塩化マグネシウム、および鉄、銅、マンガンおよび亜鉛の塩化カルシウム、ホウ酸塩および硫酸塩などの微量金属の間から選択されるものを含む。典型的には、ペプトン、トリプトン、アミノ酸または酵母抽出物など有機窒素源は、無機塩培地に含まれていない。代わりに、無機窒素源が使用され、これは、例えばアンモニウム塩、アンモニア水、気体のアンモニアの間から選択され得る。無機塩培地は、典型的には炭素源としてグルコースまたはグリセロールを含む。無機塩培地と比較して、最少培地も無機塩と炭素源を含み得るが、補うことができ、例えば、低レベルのアミノ酸、ビタミン、ペプトンまたは他の成分で補われ得、もっとも、これらは、ごく最低限のレベルで加えられる。培地は、当該技術分野において、例えば、米国特許出願公開第２００６／００４０３５２号において記載され、それは、上に引用され、参照として組み込まれる。培養手順および本発明の方法において有用な無機塩培地の詳細は、Ｒｉｅｓｅｎｂｅｒｇ，  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  “Ｈｉｇｈ  ｃｅｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｔ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ｒａｔｅ”，Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０  （１）：１７−２７によって記載される。
【０１２１】
発酵は任意の規模で行なわれ得る。本発明による発現系は、任意の規模での組換えタンパク質発現のために有用である。したがって、例えば、マイクロリットルの規模、センチリットルの規模、およびデシリットルの規模の発酵容量が使用されてもよく、１リットルの規模およびより大きな発酵容量を使用することができる。
【０１２２】
実施形態において、発酵容量は約１Ｌであり、または１Ｌを超える。幾つかの実施形態において、醗酵容量は約１Ｌ〜約１００Ｌである。実施形態において、醗酵容量は、約１Ｌ、約２Ｌ、約３Ｌ、約４Ｌ、約５Ｌ、約６Ｌ、約７Ｌ、約８Ｌ、約９Ｌ、又は約１０Ｌである。実施形態において、発酵容量は、約１Ｌ〜約５Ｌ、約１Ｌ〜約１０Ｌ、約１Ｌ〜約２５Ｌ、約１Ｌ〜約５０Ｌ、約１Ｌ〜約７５Ｌ、約１０Ｌ〜約２５Ｌ、約２５Ｌ〜約５０Ｌ、あるいは約５０Ｌ〜約１００Ｌである。他の実施形態において、発酵容量は、５Ｌであり、あるいは５Ｌを超え、１０Ｌ、１５Ｌ、２０Ｌ、２５Ｌ、５０Ｌ、７５Ｌ、１００Ｌ、２００Ｌ、５００Ｌ、１，０００Ｌ、２，０００Ｌ、５，０００Ｌ、１０，０００Ｌまたは５０，０００Ｌである。
【０１２３】
本発明の好ましい実施形態が、本明細書に示され記載されているが、このような実施形態が、ほんの一例として提供されることは当業者に明白であるであろう。ここで、本発明から逸脱することなく、多数の変更、変化、及び置換がなされることは、当業者によって理解される。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代替案が、本発明を実行する際に利用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を規定するものであり、この特許請求の範囲及びそれらの同等物の範囲内の方法及び構成がそれによって包含されることが意図される。
【実施例】
【０１２４】
（実施例１：高スループット発現サンプルからのｒＩＦＮ−βの産生）
下記の実験において、ＩＦＮ−βＣ１７Ｓ発現株を作製し、各々の得られた不溶画分中のＩＦＮ−βの量を定量化した。結果として得られたデータに基づくと、特定の株を本発明の非変性の抽出プロセスを最適化する際に、使用するために選択した。
【０１２５】
（ＩＦＮ−β発現株の作製と増殖）
【０１２６】
ＩＦＮ−β１ｂコード配列を、治療上のＢｅｔａｓｅｒｏｎに相当するヒトＩＦＮ−βアミノ酸配列をコード化するためにＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの好ましいコドンを用いて作製した。図７は、アミノ酸と合成のＩＦＮ−β（Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ）遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
【０１２７】
１９のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ分泌リーダーへ融合されたコドン最適化されたＩＦＮ−βを産出する（ｃａｒｒｙ）プラスミドを作製した。タンパク質がきちんと折り畳まれた活性型において回復され得る周辺質にタンパク質を標的化するために、分泌リーダーを入れた。細胞質の発現のために設計されたコドンを最適化されたＩＦＮ−βを産出する１つのプラスミドを作製した。
【０１２８】
Ｐｔａｃプロモーターと、高活性（Ｈｉ）および中活性（Ｍｅｄ）リボソーム結合部位（ＲＢＳ）のいずれかから開始される翻訳がＩＦＮ−βの発現を引き起こした。結果として生じた２０のプラスミドを、６００の発現株を産生するために、３０のＰ．ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主株（１６のプロテアーゼ欠損株、１３の折り畳みモジュレーター過剰発現株および１の野生株）に形質転換した（表６及び７参照）。折り畳みモジュレーターは、存在しているとき、第２のプラスミドにコード化され、マンニトール誘導性プロモーターが発現を引き起こした。
【０１２９】
２０のＩＦＮ−β発現プラスミド（全部で６００の発現宿主）の各々を産出する第３０宿主株を、９６ウェルプレートで３通り（ｉｎ  ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）増殖させた。誘導の２４時間後に回収したサンプルを分析に用いた。
【０１３０】
（９６−ウェルフォーマットにおけるＰｆｅｎｅｘ発現技術を用いるＩＦＮ−βの発現）
各々のプラスミド（表６）を、下記のように３０のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主株（表７）に形質転換した。：コンピテント細胞の２５マイクロリットルを解凍し、９６ウェルの電気穿孔プレート（ＢＴＸＥＣＭ６３０  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ）に移し、各々のウェルに１μｌのミニプレッププラスミドＤＮＡを加えた。細胞を、２．５ＫＶ、２００オーム、および２５μＦで電気穿孔した。細胞を微量元素を用いて７５μｌのＨＴＰ−ＹＥ培地中に再懸濁し、５００μｌのＭ９塩  １％グルコース培地を用いて９６ウェルのディープウェルプレートに移し（種培養）、３０℃で培養し、４８時間の間、３００ｒｐｍおよび５０ｍｍ直径のスロー（ｔｈｒｏｗ）で振盪した。
【０１３１】
種培養１０μｌを９６ウェルのディープウェルプレートの３通りのウェルに移し、各々のウェルはＨＴＰ-ＹＥ培地５００μｌを含み、２４時間の間、以前と同じように培養した。イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）をＩＦＮ−βの発現を誘導するために、０．３ｍＭの最終濃度のために各々のウェルに加えた。ＨＴＰマイクロウェル中での小さな培養物の成長のために、具体的な培養ｐＨはあまり厳しく制御せず、細胞密度をウェルごとにわずかに異ならせることがある。モジュレーター過剰発現株を折り畳む際に、折り畳みモジュレーターの発現を誘導するために、Ｍａｎｎｉｔｏｌ（Ｓｉｇｍａ，Ｍ１９０２）を１％の最終濃度で各々のウェルに加え、温度を２５℃に下げた。誘導の２４時間後、培養物を分析のために集めた。ＯＤ正規化のために、Ｂｉｏｍｅｋ  リキッド  ハンドリング  ステーション（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて、４００μｌの最終容量で最終ＯＤ６００＝２０を得るために、細胞を無菌の１ＸＰＢＳと混ぜた。サンプルをクラスター試験管立ての中に集めた。
【０１３２】
（サンプルの調製とＳＤＳ−ＣＧＥ分析）
可溶画分（溶解液の遠心分離後に得られた上清）及び、不溶画分（溶解液の遠心分離後に得られたペレット）を、ＯＤ正規化培養菌を超音波処理することにより調製し、その後遠心分離にかけた。凍結した、正規化された培養物ブロス（４００μｌ）を解凍し、３．５分間超音波処理した。溶解液を２０分間（４℃）２０，８００×ｇで遠心分離し、可溶画分は、手動の又は自動化されたリキッドハンドリングを用いて除去する。不溶画分を凍結し、その後残りの上清を取り除くために、２０，０８０×ｇで２０分間４℃でもう一度遠心分離するために解凍した。不溶画分を１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ），ｐＨ７．４  ４００μＬ中に再懸濁した。ＳＤＳ−ＣＧＥ分析のための可溶画分及び不溶画分のさらなる希釈を、１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ），ｐＨ７．４の中で行った。可溶画分及び不溶画分を、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）の存在下で、ＳＤＳ毛管ゲル電気泳動（ＣＧＥ）（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＬａｂＣｈｉｐ  Ｋｉｔ，Ｐａｒｔ７６０３０１）による、分析のために調製した。
【０１３３】
ＩＦＮ−βを発現する６００の株の各々のウェルから正規化された可溶画分と不溶画分を、可溶画分と不溶画分のための１つの複製において、ＳＤＳ―ＣＧＥ分析を減少させることにより分析した。可溶画分においてＩＦＮ−β信号を検出しなかった。不溶画分において、ＩＦＮ−β信号は、無信号から４００ｍｇ／Ｌ以上まで変化した。試験された２０のプラスミドのうち５つだけが全ての３０の宿主株の不溶画分においてＩＦＮ−βの測定可能な信号を示した：ｐ５３０−００１、ｐ５３０−００７、ｐ５３０−０１１、ｐ５３０−０１８、およびｐ５３０−０２０。Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐＧＸ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いるＩＦＮ−β信号の谷から谷への積分（ｖａｌｌｅｙ  ｔｏ  ｖａｌｌｅｙ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）を３０の宿主株中の上記の５つのプラスミドから成る全ての１５０の株において行い、容積測定収量を算出するためにデータを用いた。分析された１５０の株の容積測定収量は、２〜４８２ｍｇ／Ｌに及んだ。ｐ−５３０−０２０を産出する株は、一貫して、他の発現株よりも、不溶画分において、ＩＦＮ−βのより高い収量を得た。；しかしながら、ＳＤＳ−ＣＧＥで予期されるよりもより高く移動する（ｍｉｇｒａｔｅ  ｈｉｇｈｅｒ）タンパク質は、分泌リーダーが開裂（ｃｌｅａｖｅ）されなかったということを示した。高い収量もまた、ｐ５３０−００１産出をする２つの宿主株によって、観察された。不溶画分中の３０の株の間で、潜在的に１つの株、ＤＣ４４１、ａ  ｌｏｎ  ｈｓｌＵＶ  プロテーゼ欠損株を除いてＩＦＮ−βの大きな違いは観察されなかったが、その１つの株は、他の２９の株よりもいくらかより高い収量を示した。
【０１３４】
１７のトップの発現株のサブセット（表８）は、プラスミドｐ５３０−０２０を含む株を除外するが、これをさらなる分析のために選択した。プラスミドｐ５３０−０２０を含む発現株は、潜在的に加工されないリーダーのためにこの実験においてさらなる考慮をしなかった。ＳＤＳ−ＣＧＥ分析は、これらの株に関して可溶画分と不溶画分において行った。ＳＤＳ-ＣＧＥアウトプットの定量化を表８に示す。ＩＦＮ−βタンパク質濃度は、１０２から４８２ｍｇ／Ｌ以上まで及ぶ。不溶性の収量と周辺質リーダー配列またはＩＦＮ−βからのＮ末端Ｍｅｔのいずれかのプロセシングに基づいて、株を、発酵評価を行うために選択した。
【０１３５】
【表６】
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【０１３６】
【表７】
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【０１３７】
【表８】
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【０１３８】
（実施例２．高スループット発現材料からのＩＦＮ−β１ｂの抽出）
ＩＦＮ−β１ｂを、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４界面活性剤を含む抽出条件を用いて、ＨＴＰ発現培養物からの不溶画分からうまく抽出した。
【０１３９】
細胞質のＩＦＮ―β１ｂと５３０−２２０を過剰発現させ、分泌ＩＦＮ−β１ｂを過剰発現している（実施例１記載）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ株ＰＳ５３０−００１のＨＴＰ発現プレート培養物は、不溶画分と可溶画分を得るためにこれを超音波処理し、遠心分離した。ペレットを、抽出バッファー１ＸＰＢＳ、ｐＨ７．４あるいはｐＨ４．５の酢酸ナトリウムにおいて再懸濁した。各々のバッファーを、１％（ｗ／ｖ）のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４を含む場合と含まない場合において、試験した。バッファーと界面活性剤の４つの組み合わせのそれぞれを、室内温度で１−２時間の間、又は４℃で一晩振蘯しながら培養した。抽出後、各々のサンプルを第２の不溶性ペレット画分（抽出ペレット）及び第２の可溶性上清画分（抽出上清）を作成するために、２０分間２０，０８０ｘｇで４℃で遠心分離した。第１の不溶画分、第１の可溶画分、抽出ペレット画分及び抽出上清画分をＳＤＳ−ＣＧＥによって分析した。表１Ａ及び１Ｂに結果を示す。レーン７を見て分かるように、ＰＢＳバッファーとＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４を含む抽出条件が、可溶性ＩＦＮ−βを産出した。
【０１４０】
（実施例３．抽出条件の最適化）
発酵培養物からの不溶画分を、異なった界面活性剤を含む条件下で抽出した。
【０１４１】
株ＰＳ５３０−００１の１Ｌの発酵物（３２℃、ｐＨ６．５で成長し、１００のＯＤ５７５で０．２ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて誘導した）からの凍結した細胞ペーストは、組換えＩＦＮ−β１ｂを過剰発現しているが、それを、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ）、ｐＨ７．４を含む溶解バッファー中において２０％（ｗ／ｖ）の最終固体濃度まで再懸濁した。よく混ぜ合わせた懸濁液を、一定の細胞スラリー（Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を介して３８ｋｐｓｉで２回のパスを用いて溶解した。溶解液を半分に分け、１５，０００ｘｇで３０分間４℃で遠心分離により回転させた（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＰＮ♯Ｊ−２０，ＸＰＦ）。ペレット（ＩＦＮ−β細胞破片を含む）を再懸濁し、各々をバッファーＡ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）及びバッファーＢ（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０）のいずれかの中で洗浄した。サンプルを、初めの回転のために記載された同じ条件下で遠心分離により回転し、上清を取り除き、ペレットを２０％の固体濃度でバッファーＡあるいはＢのいずれか中にもう一度再懸濁した。各々のバッファーについて、１ｍＬごとの２０のアリコートを１．５ｍＬ円錐チューブの中に置いた。界面活性剤のストック溶液を異なる濃度において円錐体のチューブに加えた。全てのチューブは、室温で１時間、あるいは４℃で一晩（１８時間）絶え間なく混ぜながら培養した。抽出後、液体を遠心分離し、抽出上清画分を、ＳＤＳ-ＣＧＥによってタンパク質濃度について分析した。表２は、どのようにサンプルの準備と抽出を実施するかを示すフローチャートを提供する。
【０１４２】
試験された界面活性剤のうち、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４及びＮ−ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ（ＮＬＳ）は、バッファーと培養時間に関わらず、最高収量をもたらすことが分かった（表９）。しかしながら、ＮＬＳを用いて抽出された産生物は、セファロースアフィニティカラムまたは陽イオン交換カラム（ＳＰ  ＨＰ）（データは示されていない）のいずれかに結合することができないことにより測定されるように、活性ではない。Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４を用いて抽出された産生物は、活性であることが測定された。
【０１４３】
【表９】
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【０１４４】
（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔアナログの評価）
同様の方法を用いて、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔアナログの抽出効率を評価した。その結果を表１０に示す。最も高い収量は、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４に関して観察した。Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１２、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１０、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−０８もまた、効果的だった。
【０１４５】
【表１０】
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【０１４６】
（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ ３−１４の濃度の評価）
タンパク質を効率的に可溶性にするために、界面活性剤の濃度は、典型的に、そのＣＭＣ値を超える必要がある。Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ ３−１４のＣＭＣは、約０．０１％ｗ／ｖである。Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ ３−１４の増加する濃度を有するｐＨ７．４でのリン酸ナトリウムバッファーを含む抽出条件を評価した。使用される細胞ペーストを、３２℃、ｐＨ６．５で株ＰＳ５３０−００１を成長させることによって得、１００のＯＤ５７５で０．２ｍＭのＩＰＴＧを使用して誘導した。表１１の結果は、１％（ｗ／ｖ）の濃度でのＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ ３−１４の使用が、最も高い抽出収量をもたらしたことを示す。
【０１４７】
【表１１】
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【０１４８】
（追加の化学試薬の評価）
表１１に示されるように、ｐＨ７．４でのリン酸ナトリウムバッファー中の１％（ｗ／ｖ）の濃度でＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ ３−１４を含む抽出条件によって、元来の不溶画分中で検出された２１％のＩＦＮ−β １ｂをもたらした。さらなる最適化を行った。
【０１４９】
高濃度（例えば６〜８Ｍ）の尿素および塩酸グアニジンのようないくつかのカオトロピック試薬は、封入体の可溶化のための強力な変性剤として一般に使用されてきた。尿素などのカオトロープは、界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を増加させることができ、抽出効率を向上させる可能性がある。低濃度の尿素（２Ｍ以内）を、抽出条件で評価した。
塩、例えば、ＮａＣｌはまた、界面活性剤のＣＭＣに影響を与え得る。変更させたＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ ３−１４濃度を、界面活性剤のＣＭＣとカオトロピック試薬および塩の存在との間で起こり得る相互作用によって評価した。抽出条件中の不溶性の封入固体の濃度も変更させた。以前に使用された２０％（ｗ／ｖ）より低い固体の濃度を評価した。
【０１５０】
要約すると、抽出効率への以下のパラメータを変えることの効果を試験した。
【０１５１】
塩化ナトリウム：１５０−１８５０ｍＭ
【０１５２】
尿素：０−２Ｍ
【０１５３】
Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ ３−１４：０．１−１．０％ｗ／ｖ
【０１５４】
固体：５−２０％ｗ／ｖ
【０１５５】
ｐＨ：６．５−８．５
【０１５６】
図３のフローチャートは、この最適化研究のための第１の不溶性のペレット画分の調製および抽出を記載する。表１２は研究の結果を示す。図４のＡおよびＢは、各パラメータの抽出収量への効果の結果および有意性を要約する。不溶画分からのインターフェロンβの抽出を最適化するために、２水準 ５因子 半分実施要因実験を使用した。ＪＭＰソフトウェア（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｃａｒｙ，  ＮＣ）を、実験の計画および分析に使用した。ソフトウェアは、実験の結果（抽出されたインターフェロンの量）への個々の因子および相互作用の効果を推測する。
【０１５７】
【表１２】
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【０１５８】
上記のデータに基づいて、最適化された抽出条件を、以下に記載される実験のために選択した：１％（ｗ／ｖ）のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ ３−１４、２Ｍの尿素、２ＭのＮａＣｌ、固体 ５％のｗ／ｖ、バッファー ｐＨ７．５〜８．５。これらの最適化された条件を使用して、（抽出上清内の）観察された抽出収量は、一貫して９０％以上（すなわち、不溶画分中で測定された組換えタンパク質の量の９０％以上）であることがわかった。
【０１５９】
（実施例４．大規模発酵からのｒＩＦＮ−β １ｂの産生）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのＰｆｅｎｅｘ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商標）の株ＰＳ５３０−００１内の組換えヒト−βインターフェロン（ＩＦＮ−β １ｂ）タンパク質の産生は、２リットルの発酵槽においてうまく達成された。複数の発酵条件は、９．２ｇ／ＬまでのＩＦＮ−β １ｂの発現を結果としてもたらすと評価された。
【０１６０】
（本明細書および、例えば、Ｒｉｅｓｅｎｂｅｒｇ，  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１によって記載されるように）発酵培養物を、無機塩培地を含む２リットルの発酵槽中で成長させた。培養条件を、３２℃およびアンモニア水を加えることによるｐＨ６．５で維持した。溶解酸素を、発酵槽への拡散された空気および酸素の撹拌および流れの増加によって過剰に維持した。過剰レベルを維持するために、グリセロールを、発酵の間中に培養物に送達した。誘導のための標的培養物の光学濃度（Ａ５７５）が達成されるまで、これらの条件を維持し、その時に、ＩＦＮ−β産生を開始するためにＩＰＴＧを加えた。誘導での光学濃度、ＩＰＴＧの濃度、ｐＨおよび温度をすべて、発現のための最適条件を決定するために変化させた。２４時間後、各発酵槽からの培養物を、遠心分離によって採取し、細胞ペレットを−８０℃で凍結させた。
【０１６１】
発酵培養を、０．２ｍＭのＩＰＴＧを使用して１００ ＯＤ５７５で、ｐＨ６．５で、および３２℃の温度で誘導した。複製発酵（Ｒｅｐｌｉｃａｔｅ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ）は、最初の不溶画分のＳＤＳ−ＣＧＥによって測定されるように、７．５、８．４、および７．９ｇ／ＬでのＩＦＮ−β産生を結果的にもたらした（図５）。これらの不溶画分が抽出にさらされた時（１％（ｗ／ｖ）のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ ３−１４、２Ｍの尿素、２ＭのＮａＣｌ、固体 ５％ｗ／ｖ、およびバッファー ｐＨ８．２を含む条件下）、可溶性になったＩＦＮ−βを、２．２、２．４、および２．６ｇ／Ｌでの抽出上清中で観察した。これは、３１％の平均抽出収量を示す。
【０１６２】
誘導ＯＤを１２０から１６０に増加させ、発酵ｐＨを５．７から６．２５に減少させることで、最初の不溶画分中のＩＦＮ−β力価を８．８から９．２ｇ／Ｌまで増加させた（図６）。（図５に示される実験に関する同じ抽出条件を使用する）これらの細胞ペレットの抽出は、抽出された上清画分において３．１〜４．０ｇ／ＬのＩＦＮ−βを結果的にもたらし、これは３９％の平均抽出収量であった（表１３）。
【０１６３】
【表１３】
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【０１６４】
（実施例５．ＩＦＮ−βの抽出産物の活性分析）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ株ＰＳ５３０−００１の発酵からのブロース（０．２ｍＭのＩＰＴＧを使用して１００のＯＤ５７５で誘導した、３２℃、ｐＨ６．０での１Ｌの発酵）を遠心分離にかけ、上清を捨てた。細胞ペーストを、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．２で再懸濁し（１：４の比率で）、１５，０００ｐｓｉでＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ  Ｍ１１０Ｙに通すことによって溶解した。溶解物を遠心分離にかけ、可溶画分を捨てた。不溶画分は、室温で１時間、抽出バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ、２ＭのＮａＣｌ、２Ｍの尿素、１％のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ ３−１４、ｐＨ８．２）と混合し、遠心分離にかけ、抽出物の上清画分および抽出物のペレット画分を作り出した。ＩＦＮ−βの抽出収量（抽出物の上清画分中のＩＦＮ−β／最初の不溶画分中のＩＦＮ−β）は、ＳＤＳ−ＣＧＥ分析に基づいて、１００％（＞９９％）に近かった（データは示されず）。
【０１６５】
抽出上清をろ過し、２０ｍＭのＴｒｉｓ、２ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．２によって平衡化された５ｍＬのＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム上に充填した。カラムを、同じバッファーで洗浄し、ＩＦＮ−βを、２０ｍＭのＴｒｉｓ、２ＭのＮａＣｌ、５０％のプロピレングリコール、ｐＨ８．２によって溶出した。溶出プール中のタンパク質を、ＳＤＳ−ＣＧＥによって分析し、９８％以上の純度のＩＦＮ−βであることがわかった。溶出プールのアリコートを、バッファーＣ（５ｍＭのグリシン ｐＨ３．０）およびＤ（５ｍＭのアスパラギン酸、９％のトレハロース、ｐＨ４．０）へと交換した。
【０１６６】
交換されたサンプルを、ＳＤＳ−ＣＧＥによって、および細胞ベースのアッセイ（ＰＢＬ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ，＃５１１００−１）によっても分析した。細胞ベースのアッセイは、１型ＩＦＮ受容体によって感作されたヒト細胞株（ＰＩＬ５）を使用する。ＩＦＮ−βが受容体に結合することで、Ｊａｋ１／ＳＴＡＴ１信号伝達経路を介して信号を送り、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ（ＩＳＲＥ）を介してＩＳＧ１５−ルシフェラーゼ転写を活性化する。製造業者のプロトコル（５１１００ ｒｅｖ０１）通りに、細胞ベースのアッセイ・キット・インストラクションに従った。信号を、発光検出によるプレートリーダーを使用して読み出した。表１４は、ＳＤＳ−ＣＧＥおよび細胞ベースのアッセイの結果を示し、これは、サンプル中のＩＦＮ−βが十分に活性であったことを示す。
【０１６７】
【表１４】
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【０１６８】
（実施例６．高スループットの発現サンプルからのＩＦＮ−α２ａおよび２ｂの産生）
ＩＦＮ−α２ａおよびＩＦＮ−α２ｂコード配列を、ヒトタンパク質に関してコード化するために、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの好ましいコドンを使用して構築した。図８は、合成のＩＦＮ−α２ａ遺伝子のアミノ酸およびＤＮＡの配列を示し、図９は、合成のＩＦＮ−α２ｂ遺伝子のアミノ酸およびＤＮＡの配列を示す。
【０１６９】
どちらかのタンパク質を発現するプラスミドを、構築し、異なる宿主株に形質転換した。発現株を、本明細書のＩＦＮ−βに関して記載されるように、ＨＴＰ分析を使用して、組換えタンパク質を発現するそれらの能力に関して試験した。発現株のサブセットを発酵研究のために選択する。
【０１７０】
選択された菌株を、本発明に従って成長させ、誘導した。細胞を、ＩＦＮ−βに関して本明細書に記載されるように、遠心分離にかけ、溶解し、再び遠心分離にかけた。結果として生じる不溶画分および第１の可溶画分を、本明細書に記載される抽出条件を使用して抽出した。結果として生じるＩＦＮ−α２ａおよびＩＦＮ−α２ｂの抽出上清の量を、ＳＤＳ−ＣＧＥを使用して計った（データは示されず）。
【０１７１】
（実施例７．高スループット発現材料からのＩＦＮ−α２ａおよび２ｂの抽出）
実施例６に記載されるように得られた第１の不溶画分を、本発明の抽出条件を使用して抽出する。結果として生じる第２の可溶画分中のＩＦＮ−α２ａおよび２ｂを、ＣＧＥおよび生物活性のアッセイによって評価する。
【０１７２】
（実施例８．大規模発酵からのＩＦＮ−α２ａおよび２ｂの産生）
ＨＴＰ分析によって選択されるＩＦＮ−α２ａおよび２ｂを発現する菌株を、本発明の最適化した発酵条件を使用して、例えば、実施例４に記載されるように、２リットルの発酵槽中で成長させる。第１の不溶画分を、本発明の方法を使用して、例えば、実施例４に記載されるように抽出する。第１の不溶性および第２の可溶性の画分中に存在するＩＦＮ−α２ａおよび２ｂのタンパク質を、ＣＧＥによって評価し、比較する。
【０１７３】
（実施例９．ＩＦＮ−α２ａおよび２ｂの抽出産物の分析）
実施例８で得られた抽出産物を、ＩＦＮ−α２ａおよび２ｂの生物活性に関して分析する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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