(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養細胞を互いに接着させて細胞の三次元構造体を製造する方法であって、
培養細胞を、第１の物質の含有液と、前記第１の物質とは異なる第２の物質の含有液とに交互に接触させ、前記培養細胞の個々の表面全体に前記第１の物質を含む膜と前記第２の物質を含む膜とを含む接着膜を形成し、個々に表面全体が被覆された被覆細胞を調製する工程、
前記被覆細胞を播種する工程、及び
前記播種した被覆細胞を培養し、前記接着膜を介して前記被覆細胞と前記培養細胞とを互いに接着させる工程を含み、
前記第１の物質と前記第２の物質との組み合わせが、インテグリンが結合するアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列を含む高分子と前記ＲＧＤ配列を含む高分子と相互作用をする高分子との組み合わせである、細胞の三次元構造体を製造する方法。
【請求項２】
前記培養細胞に形成する接着膜の厚みが１ｎｍ以上１×１０3ｎｍ以下である、請求項１記載の三次元構造体を製造する方法。
【請求項３】
前記被覆細胞を播種する工程は、前記被覆細胞を０．０１×１０4〜１００×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2で播種することを含む、請求項１又は２に記載の三次元構造体を製造する方法。
【請求項４】
前記培養細胞が、第一培養細胞と、前記第一培養細胞とは異なる第二培養細胞とを含む、請求項１から３のいずれかに記載の三次元構造体を製造する方法。
【請求項５】
前記培養細胞が、第一培養細胞と、前記第一培養細胞とは異なる第二培養細胞とを含み、
前記被覆細胞が、前記第一培養細胞が前記接着膜で被覆された第一被覆細胞と、前記第二培養細胞が前記接着膜で被覆された第二被覆細胞とを含み、
前記被覆細胞を培養する前記工程において、
前記接着膜を介して、前記第一培養細胞と前記第一被覆細胞とを接着させて、第一の積層構造を形成する第一の培養工程と、
前記接着膜を介して、前記第二培養細胞と前記第二被覆細胞とを接着させて、前記第一の積層構造上に第二の積層構造を形成する第二の培養工程と、
を含む、請求項１から４のいずれかに記載の三次元構造体を製造する方法。
【請求項６】
前記第二の培養工程の後、さらに前記第一の培養工程を実行し、前記第二の積層構造上に、前記第一の積層構造を形成する、請求項５記載の三次元構造体を製造する方法。
【請求項７】
前記培養細胞が、第一培養細胞と、前記第一培養細胞とは異なる第二培養細胞とを含み、
前記被覆細胞が、前記第一培養細胞が前記接着膜で被覆された第一被覆細胞と、前記第二培養細胞が前記接着膜で被覆された第二被覆細胞とを含み、
前記被覆細胞を培養する前記工程において、前記接着膜を介して、前記第一被覆細胞と前記第二培養細胞とを互いに接着させるとともに、前記第二被覆細胞と前記第一培養細胞とを互いに接着させる、請求項１から６のいずれかに記載の三次元構造体を製造する方法。
【請求項８】
前記第一の培養細胞が繊維芽細胞であり、前記第二の培養細胞が血管内皮細胞である、請求項４から７のいずれかに記載の三次元構造体を製造する方法。
【請求項９】
前記被覆細胞を培養する前記工程の後、前記第二の培養細胞に血管網を形成させる組織化工程をさらに含む、請求項８記載の三次元構造体を製造する方法。
【請求項１０】
前記第１の物質と前記第２の物質との組み合わせが、フィブロネクチンとゼラチン、フィブロネクチンとヘパリン、フィブロネクチンとデキストラン硫酸、及びラミニンとコラーゲンのいずれかである、請求項１から９のいずれかに記載の三次元構造体を製造する方法。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれかに記載の三次元構造体を製造する方法により製造された細胞の三次元構造体。
【請求項１２】
前記細胞の三次元構造体の厚みは、４０μｍ以上１００μｍ以下である、請求項１１記載の三次元構造体。
【請求項１３】
前記三次元構造体は、接着膜を介して互いに接着している被覆細胞と培養細胞とを含み、前記被覆細胞と前記培養細胞とが異なる種類の細胞である、請求項１１又は１２に記載の三次元構造体。
【請求項１４】
基材上に前記培養細胞が積層し、シート状の構造体を構築している、請求項１１から１３のいずれかに記載の三次元構造体。
【請求項１５】
前記培養細胞が、第一培養細胞と、前記第一培養細胞とは異なる第二培養細胞とを含む、請求項１１から１４のいずれかに記載の三次元構造体。
【請求項１６】
前記培養細胞が、第一培養細胞と、前記第一培養細胞とは異なる第二培養細胞とを含み、
前記被覆細胞が、前記第一培養細胞が前記接着膜で被覆された第一被覆細胞と、前記第二培養細胞が前記接着膜で被覆された第二被覆細胞とを含み、
前記第一培養細胞と前記第一被覆細胞とが前記接着膜を介して互いに接着している第一の積層構造をなし、
前記第二培養細胞と前記第二被覆細胞とが前記接着膜を介して互いに接着している第二の積層構造をなし、
前記第一の積層構造上に前記第二の積層構造が積層されている、請求項１１から１５のいずれかに記載の三次元構造体。
【請求項１７】
前記第二の積層構造上に、さらに前記第一の積層構造が積層されている、請求項１６に記載の三次元構造体。
【請求項１８】
前記培養細胞が、第一培養細胞と、前記第一培養細胞とは異なる第二培養細胞とを含み、
前記被覆細胞が、前記第一培養細胞が前記接着膜で被覆された第一被覆細胞と、前記第二培養細胞が前記接着膜で被覆された第二被覆細胞とを含み、
前記第一被覆細胞と前記第二培養細胞とが前記接着膜を介して互いに接着し、前記第二被覆細胞と前記第一培養細胞とが前記接着膜を介して互いに接着している、請求項１１から１７のいずれかに記載の三次元構造体。
【請求項１９】
前記第一培養細胞が繊維芽細胞であり、前記第二培養細胞が血管内皮細胞である、請求項１５から１８のいずれかに記載の三次元構造体。
【請求項２０】
前記第二培養細胞が、血管網を形成している、請求項１９に記載の三次元構造体。
【請求項２１】
個々の培養細胞の表面全体が接着膜で被覆された細胞を製造する方法であって、
培養細胞を、第１の物質の含有液と、前記第１の物質とは異なる第２の物質の含有液とに交互に接触させ、前記培養細胞の個々の表面全体に前記第１の物質を含む膜と前記第２の物質を含む膜とを含む接着膜を形成することを含み
前記第１の物質と前記第２の物質との組み合わせが、インテグリンが結合するアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列を含む高分子と前記ＲＧＤ配列を含む高分子と相互作用をする高分子との組み合わせである、表面全体が被覆された細胞を製造する方法。
【請求項２２】
前記接着膜の厚みが１ｎｍ以上１×１０3ｎｍ以下となるように前記接着膜を形成することを含む、請求項２１に記載の表面全体が被覆された細胞を製造する方法。
【請求項２３】
個々の細胞の表面全体が、第１の物質を含む膜と、前記第１の物質とは異なる第２の物質を含む膜とを含む接着膜で被覆された被覆細胞であって、
前記接着膜の厚みが１ｎｍ以上１×１０3ｎｍ以下であり、
前記第１の物質と前記第２の物質との組み合わせが、インテグリンが結合するアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列を含む高分子と前記ＲＧＤ配列を含む高分子と相互作用をする高分子との組み合わせである、被覆細胞。
【請求項２４】
細胞の分散液であって
個々の細胞の表面全体が、第１の物質を含む膜と、前記第１の物質とは異なる第２の物質を含む膜とを含む接着膜で被覆された被覆細胞を含み、
前記被覆細胞における接着膜の厚みが１ｎｍ以上１×１０3ｎｍ以下であり、
前記第１の物質と前記第２の物質との組み合わせが、インテグリンが結合するアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列を含む高分子と前記ＲＧＤ配列を含む高分子と相互作用をする高分子との組み合わせである、細胞の分散液。
【請求項２５】
個々の培養細胞の表面全体を接着膜で被覆する方法であって、
培養細胞を、第１の物質の含有液と、前記第１の物質とは異なる第２の物質の含有液とに交互に接触させ、前記培養細胞の個々の表面全体に前記第１の物質を含む膜と前記第２の物質を含む膜とを含む接着膜を形成することを含み
前記第１の物質と前記第２の物質との組み合わせが、インテグリンが結合するアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列を含む高分子と前記ＲＧＤ配列を含む高分子と相互作用をする高分子との組み合わせである、細胞を被覆する方法。
【請求項２６】
培養細胞を互いに接着させる接着膜を前記培養細胞に形成させるための接着成分と、
前記接着成分で前記培養細胞の全体を被覆して被覆細胞を作製し、前記被覆細胞を培養するための使用説明書と、
を含み、
前記接着成分は、第１の物質と、前記第１の物質とは異なる第２の物質とを含み、
前記第１の物質と前記第２の物質との組み合わせは、インテグリンが結合するアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列を含む高分子と前記ＲＧＤ配列を含む高分子と相互作用をする高分子との組み合わせである、請求項１から１０のいずれかに記載の三次元構造体を製造する方法によって三次元構造体を製造するためのキット。
【請求項２７】
請求項１１から２０のいずれかに記載の三次元構造体の上にさらに培養細胞を積層させる、細胞の培養方法。
【請求項２８】
請求項１１から２０のいずれかに記載の三次元構造体を培養し、前記接着膜を介して接着した前記培養細胞と前記被覆細胞とを組織化させる、細胞の培養方法。
【請求項２９】
請求項１１から２０のいずれかに記載の三次元構造体を用いて薬物の細胞応答を評価する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の三次元構造体、これを製造する方法、そのためのキット、並びに、この細胞の三次元構造体を用いた細胞の培養方法、及び、薬物の細胞応答を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体外で細胞の三次元組織を構築する技術が知られている。
非特許文献１には、温度応答性の樹脂であるｐｏｌｙ（Ｎ−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）（ＰＩＰＡＡｍ）を培養皿としてシート状の細胞外マトリックスを作製する技術が記載されている。
【０００３】
非特許文献２には、細胞膜と静電相互作用をするナノ磁性微粒子を含むマグネタイトカチオニックリポソーム（ＭＣＬ）を細胞に取り込ませてこれを培養することで、細胞の三次元組織を構築する技術が記載されている。
【０００４】
特許文献１には、細胞層の形成と、前記細胞層を第１物質含有液と第２物質含有液とに交互に接触させる工程とを繰り返し行い、ナノメートルサイズの厚みのＥＣＭ（細胞外マトリックス）を介して連続的に細胞層を積層する技術が記載されている。これにより、単層の細胞シートの剥離や剥離した細胞シートの重ね合わせ等が不要であるため、優れた再現性・効率で、極めて簡便に三次元組織を製造できるとされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−２２８９２１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊｏｓｅｐｈ  Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｃｒｉａｌｓ，２６，２００５，６４１５−６４２２
【非特許文献２】Ａｋｉｒａ  Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１０，５／６，２００４，８３３−８４０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、非特許文献１に記載の技術では、細胞シートの剥離を必須とするため、細胞の形状を維持させつつ剥離するのが困難だった。そのため、複雑な形状の構造体を作製する方法に適していなかった。また、同一平面に異種細胞を組織化させることが困難だった。
【０００８】
また、非特許文献２に記載の技術は、細胞層の厚みや三次元配置の制御が困難だった。
【０００９】
特許文献１の技術では、薄い細胞層や複雑な三次元構造を有する組織を構築することができる。しかしながら、細胞層を一層ずつ培養して作製させる技術であるため、作製に長時間を要していた。また、同一平面内に多種細胞の配置をさせることが困難であるため、三次元配置のバリエーションに限界があった。
【００１０】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、三次元配置のバリエーションが豊富な細胞組織を短時間で作製できる三次元構造体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明によれば、
培養細胞が互いに接着している細胞の三次元構造体であって、
前記培養細胞は、前記培養細胞の表面全体が接着膜で被覆された被覆細胞を含み、
前記接着膜を介して前記被覆細胞と前記培養細胞とが互いに接着している、細胞の三次元構造体が提供される。
【００１２】
また、本発明によれば、
培養細胞を互いに接着させて細胞の三次元構造体を製造する方法であって、
前記培養細胞の表面全体が接着膜で被覆された被覆細胞を培養する工程を含み、
前記被覆細胞を培養する前記工程において、前記接着膜を介して、前記被覆細胞と前記被覆細胞から増殖した前記培養細胞とを互いに接着させる、細胞の三次元構造体を製造する方法が提供される。
【００１３】
また、本発明によれば、
培養細胞を互いに接着させる接着膜を前記培養細胞に形成させるための接着成分と、
前記接着成分で前記培養細胞の全体を被覆して被覆細胞を作製し、前記被覆細胞を培養するための使用説明書と、
を含む、三次元構造体を製造するためのキットが提供される。
【００１４】
また、本発明によれば、上記の三次元構造体の上にさらに培養細胞を積層させる、細胞の培養方法が提供される。
【００１５】
また、本発明によれば、上記の三次元構造体を培養し、前記接着膜を介して接着した前記培養細胞と前記被覆細胞とを組織化させる、細胞の培養方法が提供される。
【００１６】
さらに、本発明によれば、上記の三次元構造体を用いて薬物の細胞応答を評価する方法が提供される。
【００１７】
この発明によれば、培養細胞の表面全体が接着膜で被覆された被覆細胞を用いて細胞を培養する。これにより、個々の細胞に形成された接着膜同士が相互作用して、組織化することができる。したがって、一段階で同種又は異種の細胞の三次元構造体を作製することができるため、三次元配置のバリエーションが豊富な細胞組織を短時間で作製できる構造体が実現可能になる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、三次元配置のバリエーションが豊富な細胞組織を短時間で作製可能な三次元構造体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】第１の実施の形態に係る細胞の三次元構造体を模式的に示した断面図である。
【図２】実施の形態に係る細胞の三次元構造体を製造する方法を説明する図である。
【図３】実施の形態に係る細胞の三次元構造体を製造する方法を説明する図である。
【図４】実施例の結果を示す図である。
【図５】比較例の結果を示す図である。
【図６】実験例の結果を示す図である。
【図７】実験例の結果を示す図である。
【図８】実験例の結果を示す図である。
【図９】実験例の結果を示す図である。
【図１０】第２の実施の形態に係る細胞の三次元構造体を模式的に示した断面図である。
【図１１】第２の実施の形態に係る細胞の三次元構造体を製造する方法を模式的に示した断面図である。
【図１２】第２の実施の形態に係る細胞の三次元構造体の変形例を模式的に示した断面図である。
【図１３】第３の実施の形態に係る細胞の三次元構造体を模式的に示した断面図である。
【図１４】実施例の結果を示す図である。
【図１５】実施例の結果を示す図である。
【図１６】実施例の結果を示す図である。
【図１７】実施例の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。尚、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、適宜説明を省略する。
【００２１】
（第１の実施形態）
本実施の形態は、培養細胞が互いに接着している細胞の三次元構造体である。図１は、本実施の形態に係る三次元構造体の一例を示す模式的な断面図である。本実施の形態の三次元構造体を構成する培養細胞１０１には、培養細胞１０１の表面全体が接着膜１０２で被覆された被覆細胞１０３が含まれており、接着膜１０２を介して被覆細胞１０３と培養細胞１０１とが互いに接着している。
【００２２】
具体的に、接着膜１０２は、培養細胞１０１同士を接着できる物質であれば制限されないが、第１の物質を含む膜１０２ａと、第１の物質とは異なる第２の物質を含む膜１０２ｂとが積層された膜とすることが好ましく、第１の物質からなる膜１０２ａと、第２の物質からなる膜１０２ｂとが積層された膜とすることがより好ましい。
【００２３】
また、接着膜１０２は、第１の物質を含む膜１０２ａと第２の物質を含む膜１０２ｂとがそれぞれ複数積層された多層膜であることがより好ましく、第１の物質からなる膜１０２ａと第２の物質からなる膜１０２ｂとがそれぞれ複数積層された多層膜とするとさらに好ましい。
【００２４】
また、接着膜１０２の厚みは、１ｎｍ以上１×１０３ｎｍ以下であることが好ましく、２ｎｍ以上１×１０２ｎｍ以下とすることがより好ましい。また、第１の物質からなる膜１０２ａと第２の物質からなる膜１０２ｂとを積層させることで接着膜１０２の厚みを制御することができ、特に、３ｎｍ以上１×１０２ｎｍ以下の多層膜を形成させることがより好ましい。このような多層膜とすることで、より密に積層した構造体とすることができる。なお、本発明において、接着膜１０２の厚みは、位相差顕微鏡により１０箇所測定した平均値により求めることができる。また、接着膜１０２の厚みは、別途、基材上に接着膜の形成を行い、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定法を用いて、行った処理（ステップ）数と形成される厚みとを測定し、その結果から細胞表面への接着膜形成時に行ったステップ数に応じて算出してもよい。
【００２５】
第１、第２の物質は、それぞれ分子量１千以上１千万以下の高分子であることが好ましい。本明細書でいう高分子には、タンパク質などの天然高分子や化学的に得られる合成高分子も含むものである。第１の物質及び第２の物質の組合せとしては、インテグリンが結合するアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列を含む高分子とＲＧＤ配列を含む高分子と相互作用する高分子との組み合わせであることが好ましい。また、正の電荷を有する高分子と、負の電荷を有する高分子との組合せも用いることができる。本発明において、ＲＧＤ配列を含む高分子と「相互作用する」とは、例えば、静電的相互作用、疎水性相互作用、水素結合、電荷移動相互作用、共有結合形成、タンパク質間の特異的相互作用、ファンデルワールス力等により、化学的、物理的に、ＲＧＤ配列を含む高分子と結合、接着、吸着、または電子の授受が可能な程度に近接することを意味する。なお、第１、第２の物質は、生分解性であることが好ましい。
【００２６】
「ＲＧＤ配列を含む高分子」とは、元来、ＲＧＤ配列を有するタンパク質でもよいし、また、ＲＧＤ配列が化学的に結合されたタンパク質であってもよい。また、ＲＧＤ配列を有していればよく、タンパク質以外の天然由来高分子であってもよいし、合成高分子であってもよい。
【００２７】
タンパク質からなるＲＧＤ配列を含む高分子としては、例えば、従来公知の接着性タンパク質が挙げられ、フィブロネクチン（分子量約５０万）、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン、コラーゲン等が使用できる。
【００２８】
また、ＲＧＤ配列を有する水溶性タンパク質も使用でき、例えば、ＲＧＤを結合させたコラーゲン、ゼラチン、アルブミン、グロブリン、プロテオグリカン、酵素、抗体等があげられる。
【００２９】
その他のＲＧＤ配列を有する天然由来高分子としては、例えば、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、α−ポリリジン、ε−ポリリジン等のポリアミノ酸、キチンやキトサン等の糖等においてＲＧＤ配列を有するものがあげられる。
【００３０】
合成高分子としては、ＲＧＤ配列を有していればよく、特に制限されない。合成高分子は、例えば、ポリマーでも共重合体でもよく、重合の形態も特に制限されず、例えば、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、星型等があげられる。具体例として、例えば、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリアミド、及び、これらの共重合体、並びに、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリエチレングリコール−グラフト−ポリアクリル酸、ポリ(Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−ポリアクリル酸)、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリエチレンオキサイド、ポリε−カプロラクタム、ポリアクリルアミド、ポリ(メタクリル酸メチル−γ−ポリメタクリル酸オキシエチレン)等があげられる。
【００３１】
ＲＧＤ配列を含む高分子の具体例を下記表１に示すがこれらには限定されない。
【表１】
0005850419.tif 000002
【００３２】
また、「ＲＧＤ配列を含む高分子と相互作用する高分子」としては、「ＲＧＤ配列を含む高分子」との相互作用により、両物質が、例えば、結合、接着、吸着、電子の授受が可能な程度近接できる物質であれば特に制限されないが、「ＲＧＤ配列を含む高分子」と相互作用するタンパク質、天然由来高分子及び合成高分子のいずれかを使用できる。
【００３３】
「ＲＧＤ配列を含む高分子」と相互作用するタンパク質としては、特に制限されないが、例えば、水溶性タンパク質があげられ、具体例として、コラーゲン、ゼラチン（一例として分子量１０万）、プロテオグリカン、インテグリン、酵素、抗体等が使用できる。
【００３４】
「ＲＧＤ配列を含む高分子」と相互作用する天然由来高分子としては、特に制限されないが、例えば、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、α−ポリリジン，ε−ポリリジン（分子量５千）等のポリアミノ酸、ヘパリンやヘパラン硫酸、デキストラン硫酸（分子量５０万）、ヒアルロン酸（分子量１００万〜）等の糖等があげられる。
【００３５】
合成高分子としては、特に制限されず、例えば、ポリマーでも共重合体でもよく、重合の形態も、例えば、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、星型等があげられる。具体例として、例えば、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート、及び、これらの共重合体、並びに、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリエチレングリコール−グラフト−ポリアクリル酸、ポリ(Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏポリアクリル酸)、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリエチレンオキサイド、ポリε−カプロラクタム、ポリアクリルアミド、ポリ(メタクリル酸メチル−γ−ポリメタクリル酸オキシエチレン)等があげられる。
【００３６】
ＲＧＤ配列を含む高分子と相互作用する高分子の具体例を下記表２に示すがこれらには限定されない。
【００３７】
【表２】
0005850419.tif 000003
【００３８】
このような第１の物質と第２の物質との組合せとしては、特に制限されず相互作用する異なる物質の組合せであればよく、いずれか一方がＲＧＤ配列を含む高分子であり、他方が、ＲＧＤ配列を含む高分子と相互作用する高分子であればよい。具体的には、フィブロネクチンとゼラチン、フィブロネクチンとε−ポリリジン、フィブロネクチンとヒアルロン酸、ラミニンとゼラチン、ビトロネクチンとゼラチン、フィブロネクチンとデキストラン硫酸、フィブロネクチンとへパリン、エラスチンとポリリジン、フィブロネクチンとコラーゲン、ラミニンとコラーゲン、ビトロネクチンとコラーゲン、ＲＧＤ結合コラーゲンまたはＲＧＤ結合ゼラチンとコラーゲンまたはゼラチン等の組合せがあげられ、中でもフィブロネクチンとゼラチン、フィブロネクチンとヘパリン、フィブロネクチンとε−ポリリジン、フィブロネクチンとヒアルロン酸、フィブロネクチンとデキストラン硫酸との組合せが好ましく、より好ましくはフィブロネクチンとゼラチンとの組合せである。なお、第１の物質と第２の物質は、それぞれ一種類ずつでもよいし、相互作用を示す範囲で二種類以上をそれぞれ併用してもよい。
【００３９】
正の電荷を有する高分子としては、正の電荷を有していれば、例えば、天然由来高分子でも合成高分子でもよい。正イオンに対応するカウンターの負イオンは、特に制限されないが、塩化物イオンが好ましい。天然由来高分子としては、例えば、水溶性タンパク質が好ましく、具体的には、塩基性コラーゲン、塩基性ゼラチン、リゾチーム、シトクロムｃ、ペルオキシダーゼ、ミオグロビン等があげられる。
【００４０】
また、その他の天然由来高分子としては、例えば、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、α−ポリリジン塩、ε−ポリリジン塩（一例として、分子量５千）、ポリアルギニン塩、ポリヒスチジン塩等のポリアミノ酸、キチン、キトサン等の糖等があげられる。
【００４１】
また、合成高分子としては、特に制限されず、例えば、ポリマーでも共重合体でもよく、重合の形態も、例えば、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、星型等があげられる。具体例として、例えば、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート及びその共重合体等、並びに、ポリエステル、ポリジアリルジメチルアンモニウム塩（一例として、分子量７万）、ポリアリルアミン塩、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアミドアミンデンドリマー等があげられる。
【００４２】
また、負の電荷を有する高分子としては、負の電荷を有していれば、例えば、天然由来高分子でも合成高分子でもよい。負イオンに対応するカウンターの正イオンは、特に制限されないが、ナトリウムイオンが好ましい。天然由来高分子としては、特に制限されないが、例えば、負の電荷を有するタンパク質が好ましく、具体的には、酸性コラーゲン、酸性ゼラチン、アルブミン、グロブリン、カタラーゼ、β−ラクトグロブリン、チログロブリン、α−ラクトアルブミン、卵白アルブミン等があげられる。
【００４３】
また、その他の天然由来高分子としては、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、α−ポリリジン、ε−ポリリジン等のポリアミノ酸、糖等があげられる。
【００４４】
合成高分子としては、特に制限されず、例えば、ポリマーでも共重合体でもよく、重合の形態も、例えば、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、星型等があげられる。具体例として、例えば、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネートおよびその共重合体、並びに、ポリエステル、ポリアクリル酸（一例として、分子量２５万）、ポリメタクリル酸、ポリスチレンスルホン酸塩（一例として、分子量２０万）、ポリアクリルアミドメチルプロパンスルホン酸、末端カルボキシ化ポリエチレングリコール等があげられる。
【００４５】
このような第１の物質と第２の物質との組合せとしては、特に制限されず相互作用する異なる物質の組合せであればよく、いずれか一方が正の電荷を有する物質であり、他方が、負の電荷を有する物質であればよい。具体的には、例えば、ε−ポリリジン塩とポリスチレンスルホン酸塩との組合せ、ポリジアリルジメチルアンモニウム塩とポリアクリル酸塩との組合せ、キトサンとデキストラン硫酸との組合せ、ポリアリルアミンハイドロクロライドとポリスチレンスルホン酸塩との組合せ、ε−ポリリジンとポリスチレンスルホン酸塩との組合せ、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドとポリスチレンスルホン酸塩との組合せ等があげられ、好ましくはε−ポリリジン塩とポリスチレンスルホン酸塩との組合せ、ポリジアリルジメチルアンモニウム塩とポリアクリル酸塩との組合せである。なお、第１の物質と第２の物質とは、それぞれ一種類ずつでもよいし、相互作用を示す範囲で二種類以上をそれぞれ併用してもよい。
【００４６】
培養細胞１０１の種類は、組織を形成する多細胞生物の細胞であればどのような細胞でも用いることができる。動物細胞であってもよいし、植物細胞であってもよいが、動物細胞が好ましく、哺乳類由来の細胞がより好ましい。哺乳類由来の細胞として、肝細胞、血管内皮細胞、線維芽細胞、表皮細胞、上皮細胞、乳腺細胞、筋細胞、神経細胞、組織幹細胞、胚性幹細胞、骨細胞および免疫細胞等の接着性細胞があげられる。細胞は、一種類でもよいし、二種類以上を用いて共培養を行ってもよい。互いに接着している被覆細胞１０３と培養細胞１０１とが同一種類の細胞であってもよいし、異なる種類の細胞であってもよく、垂直方向に積層され接着している培養細胞１０１と被覆細胞１０３とが異なる細胞であってもよいし、平面視方向で接着している培養細胞１０１と被覆細胞１０３とが同一種類の細胞であってもよいし、異なる細胞であってもよい。
【００４７】
本実施の形態の三次元構造体は、基材上に作製されたものであってもよい。基材の種類は何ら制限されず、例えば、その形状、形態、材質等についても特に制限されず、従来公知のものが使用できる。基材の形状は平板なものが好ましく、これによりシート状の三次元構造体を作製することができる。基材の材質としては、特に制限されないが、例えば、ガラス、各種ポリマーからなるプラスチック、ろ紙、金属、ハイドロゲル等があげられる。その形態も、特に制限されず、例えば、非孔質基材、多孔質基材、ファイバー、織布や不織布等の布や、例えば、ハイドロゲル表面、医療用材料表面、人工臓器表面、細胞膜のようなリン脂質膜等の上にも形成できる。
【００４８】
つづいて、本実施の形態に係る細胞の三次元構造体を製造する方法の一例について図２を用いつつ説明する。
まず、培養細胞１０１を用意し（図２（ａ））、その表面全体を接着膜１０２で被覆して被覆細胞１０３を作製する（図２（ｂ））。
【００４９】
被覆細胞１０３の作製工程を図３を用いてより具体的に説明する。図３で示すように、用意した培養細胞１０１を試験管に入れる（図３（ａ））。ここで用いる試験管としては、細胞の付着をできるだけ抑制しうるものであれば、どのようなものであってもよく、ガラス製であってもよいし、プラスチック製のものを用いてもよい。
【００５０】
ついで、第１の物質を培養細胞１０１に接触させる（図３（ｂ））。培養細胞１０１と第１の物質との接触方法としては、特に制限されず、例えば、第１の物質を直接添加する方法、第１の物質の含有液に基材を浸漬する方法、培養細胞１０１に第１の物質の含有液を滴下または噴霧する方法等があげられるが、操作が容易であることから浸漬が好ましい。接触の条件は、特に制限されず、接触方法や使用する含有液の濃度等によって適宜決定できる。具体的には、接触時間は、特に制限されないが、例えば、１〜１４４０分であり、好ましくは５〜６０分、より好ましくは１０〜１５分であり、接触温度は、特に制限されないが、例えば、４〜６０℃であり、好ましくは２０〜４０℃、より好ましくは３０〜３７℃である。
【００５１】
第１の物質の含有液を調製する場合、溶媒としては、特に制限されないが、水や緩衝液等の水性溶媒があげられ、緩衝液としては、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等のＴｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸−リン酸緩衝液、グリシルグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液、ＧＴＡ緩衝液等が使用できる。溶媒のｐＨも、特に制限されないが、例えば、３〜１１であり、好ましくは６〜８であり、より好ましくは７．２〜７．４である。第１の物質の濃度は、特に制限されないが、例えば、０．０００１〜１質量％であり、好ましくは０．０１〜０．５質量％であり、より好ましくは０．０２〜０．１質量％である。第１の物質は、このように溶媒に溶解もしくは分散させることによって、第１の物質の含有液を調製することができる。
【００５２】
また、第１の物質の含有液は、さらに、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、炭酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カリウム、リン酸水素ナトリウム、硫酸マグネシウム、コハク酸ナトリウム等の塩を含有してもよい。いずれか一方の含有液のみでもよいし、両含有液が前記塩を含有してもよい。前記含有液における塩濃度は、特に制限されないが、例えば、１×１０-6〜２Ｍであり、好ましくは１×１０-4〜１Ｍであり、より好ましくは１×１０-4〜０．０５Ｍである。塩は、一種類でもよいし二種類以上を併用してもよい。
【００５３】
第１の物質の含有液は、さらに、細胞成長因子、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、生理活性ペプチド等を含んでもよい。このように成長因子等を含有することによって、細胞層の形成の際に、例えば、細胞の増殖速度や増殖程度を調節することも可能となる。
【００５４】
また、第１の物質の含有液は、さらに、疾患の治療剤、予防剤、抑制剤、抗菌剤、抗炎症剤等の医薬組成物を含有してもよい。このような含有液を用いて製造した三次元組織は、前述のような医薬組成物を含むことから、例えば、ヒトやヒトを除く哺乳類、その他の動物の体内等に移植することによって、疾患の治療や予防を行うこともできる。
【００５５】
このようにして培養細胞１０１を第１の物質からなる膜１０２ａにより被覆した後、遊離している第１の物質を除去する。第１の物質を除去する方法としては、特に制限されないが、上記の溶媒を用いて遠心分離を行い、培養細胞１０１と第１の物質の含有液とを分離して上澄みを取り除くことで、遊離している第１の物質を除去する方法が挙げられる（図３（ｃ））。こうすることで、第１の物質からなる膜１０２ａで被覆された被覆細胞を得ることができる。
【００５６】
接着膜１０２として、第１の物質からなる膜１０２ａと第１の物質とは異なる第２の物質からなる膜１０２ｂとからなる積層膜を形成させる場合、第１の物質で被覆された培養細胞１０１を第２の物質と接触させることにより、第２の物質からなる膜１０２ｂで被覆する（図３（ｄ））。第２の物質との接触方法は、第１の物質と同様な方法で行うことができ、第２の物質の含有液を用いて接触させる場合は、第１の物質の含有液を調製する方法と同様にして第２の物質の含有液を調製することができる。
【００５７】
こうすることで、第１の物質からなる膜１０２ａと、第２の物質からなる膜１０２ｂとからなる接着膜１０２で被覆された培養細胞１０１が被覆細胞１０３として得られる。
【００５８】
なお、第１の物質及び第２の物質として用いる材料としては前述したものを用いることができるが、ＲＧＤ配列を含む高分子と、ＲＧＤ配列を含む高分子と相互作用する高分子とを組み合わせて用いる場合は、第１の物質としてＲＧＤ配列を含む高分子を用い、第２の物質としてＲＧＤ配列を含む高分子と相互作用する高分子を用いることが好ましい。具体的には、最初にＲＧＤ配列を含む高分子からなる膜（１０２ａ）を形成した後、ＲＧＤ配列を含む高分子と相互作用する高分子からなる膜（１０２ｂ）を形成させることが好ましい。また、正の電荷を有する高分子と、負の電荷を有する高分子とを組み合わせて用いる場合は、第１の物質として正の電荷を有する高分子を用い、第２の物質として負の電荷を有する高分子を用いることが好ましい。具体的には、最初に正の電荷を有する高分子からなる膜（１０２ａ）を形成した後、負の電荷を有する高分子からなる膜（１０２ｂ）を形成させることが好ましい。
【００５９】
例えば、第１の物質からなる膜１０２ａとしてフィブロネクチンからなる膜を形成した後、第２の物質からなる膜１０２ｂとしてゼラチン、ε−ポリリジン、ヒアルロン酸及びデキストラン硫酸の少なくとも一種からなる膜を形成する方法や、第１の物質からなる膜１０２ａとしてε−ポリリジン塩（特にε−ポリリジンの塩酸塩）からなる膜を形成した後、第２の物質からなる膜１０２ｂとしてポリスチレンスルホン酸塩（特にナトリウム塩）を形成する方法、第１の物質からなる膜１０２ａとしてポリジアリルジメチルアンモニウム塩（特にクロライド塩）を形成した後、第２の物質からなる膜１０２ｂとしてポリアクリル酸塩（特にナトリウム塩）を形成する方法が挙げられる。
【００６０】
培養細胞１０１の表面の全面を接着膜１０２で覆うことができれば、本発明の効果を得ることはできる。そのため、第１の物質からなる膜１０２ａと第２の物質からなる膜１０２ｂとはそれぞれ１層ずつ形成させて、培養細胞１０１の表面の全面を接着膜１０２で覆うことができればよいが、第２の物質で被覆された培養細胞に第１の物質をさらに接触させて第１の物質からなる膜１０２ａで被覆し（図３（ｂ））、第１の物質からなる膜１０２ａと第２の物質からなる膜１０２ｂとを交互に積層させる（図３（ｂ）〜（ｄ））ことで、確実に培養細胞１０１の表面の全面を接着膜１０２で覆うことができる。
【００６１】
また、接着膜１０２は一層でも本発明の効果を得ることができるが、薄膜を積層させることでより密な細胞構造体を得ることができる。そこで、第２の物質で被覆された培養細胞にさらに第１の物質を接触させ、図３（ｂ）で示す第１の物質との接触工程と、図３（ｄ）で示す第２の物質との接触工程とを繰り返す。こうすることで、第１の物質からなる膜１０２ａと第２の物質からなる膜１０２ｂとを交互に積層させ、所望の厚みからなる接着膜１０２を形成させることができる。図３（ｂ）で示す第１の物質との接触工程と、図３（ｄ）で示す第２の物質との接触工程は、５段階以上繰り返すと好ましく、９段階以上繰り返すとより好ましい。こうすることで、３ｎｍ以上１×１０２ｎｍ以下の厚みの接着膜１０２を形成させることができる。
【００６２】
図２に戻り、得られた被覆細胞１０３を基材に播種する（図２（ｃ））。基材の種類は何ら制限されず、例えば、その形状、形態、材質等についても特に制限されず、従来公知のものが使用できる。基材の材質としては、特に制限されないが、例えば、ガラス、各種ポリマー、ろ紙、金属、ハイドロゲル等があげられる。その形態も、特に制限されず、例えば、非孔質基材、多孔質基材、ファイバー、織布や不織布等の布等があげられる。また、例えば、ハイドロゲル表面、医療用材料表面、人工臓器表面、細胞膜のようなリン脂質膜等の上にも形成できる。
【００６３】
基材には、細胞の培養に必要な培地を形成し、培地上に被覆細胞１０３を播種させてもよい。培地は特に制限されず、細胞に応じて適宜使用でき、例えば、Ｅａｇｌｅ'ｓ ＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ培地 (ＤＭＥＭ)、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ培地(ＭＥＭ)、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地、ＲＤＭＩ、ＧｌｕｔａＭａｘ培地、無血清培地等が使用できる。播種する細胞数は、特に制限されないが、例えば、０．０１×１０4〜１００×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2であり、好ましくは１×１０4〜１０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2である。
【００６４】
その後、培養細胞１０１表面全体が接着層１０２で被覆された被覆細胞１０３を培養する（図２（ｄ））。細胞の培養条件は、特に制限されず、培養する細胞に応じて適宜決定できる。一般的な条件としては、培養温度が、例えば、４〜６０℃であり、好ましくは２０〜４０℃、より好ましくは３０〜３７℃であり、培養時間は、例えば、１〜１６８時間であり、好ましくは３〜２４時間、より好ましくは３〜１２時間である。これにより、接着膜１０２を介して、被覆細胞１０３同士を接着させたり、被覆細胞１０３から増殖した培養細胞１０１と被覆細胞１０３とを互いに接着させたりして、細胞の三次元構造体を製造することができる。
【００６５】
三次元構造体の厚みは、培養時間により制御させることができるが、例えば、２４時間培養させることで、シート状の三次元構造体を７層以上形成させることができ、厚みは、１０μｍ以上１００μｍ以下にすることができる。
【００６６】
接着膜１０２を形成させる成分（例えば、第１の物質及び第２の物質）と、上記説明した三次元構造体の製造方法を記載した使用説明書とを備えることで、本発明の三次元構造体を製造するためのキットとすることができる。こうしたキットには、さらに基材を備えてもよく、板状の基材を備えることで、シート状の細胞の三次元構造体を製造するためのキットとすることができる。
【００６７】
また、こうして得られた細胞の三次元構造体の上にさらに培養細胞からなる細胞層を積層させてもよい。このとき用いられる培養細胞としては、被覆細胞１０３を構成する培養細胞１０１と同種であっても異種であってもよいし、接着膜１０２で被覆された被覆細胞１０３であってもよいし、接着膜１０２で被覆されていない培養細胞１０１であってもよい。得られる三次元構造体を用いて薬物の細胞応答を評価することができる。こうした薬物の細胞応答評価は特に限定されず、例えば、皮膚細胞を培養させて化粧品のアレルギー反応の評価に用いることもできる。
【００６８】
また、本発明の細胞の三次元構造体の上にヒトやヒト以外のほ乳類から分離した肝細胞、血管内皮細胞、線維芽細胞、表皮細胞、上皮細胞、乳腺細胞、筋細胞、神経細胞、組織幹細胞、胚性幹細胞、骨細胞、歯髄細胞および免疫細胞等の接着性細胞を培養させてもよい。こうすることで、異常な組織を除去して健常な組織のみを再生し、ヒトやヒト以外のほ乳類の体内に戻すことで治療に役立てることができる。また、血液、皮膚、歯、骨などの再生にも役立てることができる。
【００６９】
なお、これら細胞の培養条件は、前述と同様である。
【００７０】
（第２の実施形態）
図１０は、本実施の形態に係る三次元構造体の一例を示す模式的な断面図である。本実施の形態では、第１の実施形態と異なる点を説明し、第１の実施形態と同様な説明は適宜省略する。本実施の形態での三次元構造体には、第１の実施形態において説明した培養細胞１０１として、第一培養細胞１０１ａ及び第一培養細胞１０１ａとは異なる第二培養細胞１０１ｂが用いられる。また、第１の実施形態において被覆細胞１０３として、第一培養細胞１０１ａが接着膜１０２で被覆された第一被覆細胞１０３ａ、及び、第二培養細胞１０１ｂが接着膜１０２で被覆された第二被覆細胞１０３ｂが用いられる。そして、第一培養細胞１０１ａと第一被覆細胞１０３ａとが接着膜１０２を介して互いに接着して第一の積層構造１０を形成し、第二培養細胞１０１ｂと第二被覆細胞１０３ｂとが接着膜１０２を介して互いに接着している第二の積層構造２０を形成し、第一の積層構造１０上に第二の積層構造２０が積層されることで三次元構造体が構築されている。
【００７１】
第一培養細胞１０１ａ及び第二培養細胞１０１ｂは、互いに異なる細胞であればよく、第１の実施の形態で培養細胞１０１として例示された任意の細胞を組み合わせて用いることができる。
【００７２】
接着膜１０２は、第１の実施形態で説明した接着膜１０２と同様にすることができる。具体的には、本実施の形態の接着膜１０２もまた、第１の実施の形態と同様に、第１の物質を含む膜１０２ａと第２の物質を含む膜１０２ｂとが積層された構成を採用することができる。第一被覆細胞１０３ａと第二の被覆細胞１０３ｂとは、接着膜１０２の構成が同じであってもよいし、異なっていてもよいが、同じであることが好ましい。
【００７３】
第一の積層構造１０と第二の積層構造２０との間には、ナノ細胞外マトリックス（ナノＥＣＭ）３０が形成されており、第一の積層構造１０と第二の積層構造２０とを接着している。ナノＥＣＭ３０は、接着膜１０２と同成分から構築されており、好ましくは、第１の実施形態で説明した、第１の物質と第２の物質とが交互に積層されることで形成されている。第１の物質及び第２の物質の種類は、第１培養細胞１０１ａや第２培養細胞１０１ｂを覆う接着膜１０２の構成成分と同じであってもよいし異なってもよいが、同じにするのが好ましい。ナノＥＣＭ３０の厚みは、特に制限されないが、１ｎｍ以上が好ましく、１〜１０００ｎｍがより好ましく、１〜１００ｎｍがさらに好ましい。
【００７４】
つづいて、図１１を用いて本実施の形態の三次元構造体の製造方法について説明する。まず、第１の実施形態で説明した方法と同様に、第一培養細胞１０１ａに、第１の物質からなる膜１０２ａと第２の物質からなる膜１０２ｂとを積層させて、第一培養細胞１０１ａが接着膜１０２で被覆された第一被覆細胞１０３ａを形成する（図１１（ａ））。また、同様に、第二培養細胞１０１ｂに、第１の物質からなる膜１０２ａと第２の物質からなる膜１０２ｂとを積層させて、第二培養細胞１０１ｂが接着膜１０２で被覆された第二被覆細胞１０３ｂを形成する。
【００７５】
ついで、第一被覆細胞１０３ａを基材に播種する。基材及び播種する細胞の数は、第１の実施形態と同様にすればよい。
【００７６】
その後、第１の実施形態と同様に第一被覆細胞１０３ａを培養し、第一の積層構造１０を形成する（第一の培養工程、図１１（ｂ））。
【００７７】
ここで、第一の積層構造１０の厚みは、１０μｍ以上１００μｍ以下にすることが好ましい。こうすることで、第一被覆細胞１０３ａを良好に培養させることができる。これにより、数時間の培養で、１〜１０層のシート状の第一の積層構造１０を、一度に作成することができる。
【００７８】
ついで、接着膜１０２の構成材料を第１の積層構造１０の表面に接触させて、ナノ細胞外マトリックス（ナノＥＣＭ）３０を形成する（図１１（ｃ））。ナノＥＣＭ３０を形成する方法としては、例えば、第１の実施形態で説明した第１の物質と第２の物質とを交互に積層させる方法がある。具体的には、第１の物質と第２の物質をそれぞれ含む溶液に交互に浸積する方法が挙げられる。ナノＥＣＭ３０は、例えば、特許文献１記載の技術を用いて形成してもよい。
【００７９】
その後、あらかじめ、第１の実施形態で説明した方法と同様に作製された第二被覆細胞１０３ｂをナノＥＣＭ３０上に播種する。このとき播種する細胞の密度も第１の実施の形態と同様にすることができる。ついで、第一被覆細胞１０３ａと同様に第二被覆細胞１０３ｂを培養し、第一の積層構造１０上に第二の積層構造２０を形成する（第二の培養工程、図１１（ｄ））。
【００８０】
第二の積層構造２０の厚みもまた、１０μｍ以上１００μｍ以下にすることが好ましい。これにより、数時間の培養で、１〜１０層のシート状の第二の積層構造２０を、一度に作成することができる。
【００８１】
この後、さらに第二の積層構造２０にナノＥＣＭ３０を形成した後に第一の被覆細胞１０を播種し、第一の培養工程を繰り返してもよい。こうすることで、第二の積層構造２０上に、第一の積層構造１０を形成させることができる（図１２）。
【００８２】
図１２の三次元構造体においては、例えば、第一培養細胞１０１ａとして繊維芽細胞を用い、第二培養細胞１０１ｂとして血管内皮細胞を用いることができる。このとき、図１２で示す三次元構造体を、好ましくは３５〜３９℃、より好ましくは３７℃の温度条件下で、０．５日〜７日間培養してもよい。これにより、第二の積層構造２０には、血管内皮細胞から血管枝が成長し、これを分岐して組織化させることができる。したがって、第二の積層構造２０に血管網を形成させることも可能である。
【００８３】
このように本実施の形態においても、三次元配置のバリエーションが豊富な細胞組織を短時間で作製することができる。
【００８４】
（第３の実施形態）
図１３は、本実施の形態に係る三次元構造体の一例を示す模式的な断面図である。本実施の形態では、第１の実施形態と異なる点を説明し、第１の実施形態と同様な説明は適宜省略する。本実施の形態の三次元構造体には、第１の実施形態において説明した培養細胞１０１として、第一培養細胞１０１ａ及び第一培養細胞１０１ａとは異なる第二培養細胞１０１ｂが用いられる。また、第１の実施形態において被覆細胞１０３として、第一培養細胞１０１ａが接着膜１０２で被覆された第一被覆細胞１０３ａ、及び、第二培養細胞１０１ｂが接着膜１０２で被覆された第二被覆細胞１０３ｂが用いられる。そして、第一被覆細胞１０３ａと第二培養細胞１０１ｂとが接着膜１０２を介して互いに接着し、第二被覆細胞１０３ｂと第一培養細胞１０１ａとが接着膜１０２を介して互いに接着することで、三次元構造体が構築されている。
【００８５】
第一培養細胞１０１ａ及び第二培養細胞１０１ｂは、互いに異なる細胞であればよく、第１の実施の形態で培養細胞１０１として例示された任意の細胞を組み合わせて用いることができる。
【００８６】
接着膜１０２は、第１の実施形態で説明した接着膜１０２と同様にすることができる。具体的には、本実施の形態の接着膜１０２もまた、第１の実施の形態と同様に、第１の物質を含む膜１０２ａと第２の物質を含む膜１０２ｂとが積層された構成を採用する。第一被覆細胞１０３ａと第二の被覆細胞１０３ｂとは、接着膜１０２の構成が同じであってもよいし、異なっていてもよいが、同じであることがより好ましい。
【００８７】
つづいて、本実施の形態の三次元構造体の製造方法について説明する。まず、第１の実施形態で説明した方法と同様に、第一培養細胞１０１に、第１の物質からなる膜１０２ａと第２の物質からなる膜１０２ｂとを積層させて、第一培養細胞１０１ａが接着膜１０２で被覆された第一被覆細胞１０３ａを形成する。また、第１の物質からなる膜１０２ａと第２の物質からなる膜１０２ｂとを積層させて、第二培養細胞１０１ｂが接着膜１０２で被覆された第二被覆細胞１０３ｂを形成する。
【００８８】
ついで、第一被覆細胞１０３ａ及び第二被覆細胞１０３ｂを混合して基材に播種する。基材及び播種する細胞の数も第１の実施の形態と同様にすればよい。ついで、第１の実施形態と同様に第一被覆細胞１０３ａ及び第二被覆細胞１０３ｂを培養し、図１３で示す三次元構造体を形成する。
【００８９】
ここで、図１３で示す三次元構造体の厚みは、１０μｍ以上１００μｍ以下にすることが好ましい。こうすることで、第一被覆細胞１０３ａ及び第二被覆細胞１０３ｂを良好に培養させることができる。これにより、数時間の培養で、１〜１０層のシート状の細胞構造体を、一度に作成することができる。
【００９０】
図１３の三次元構造体において、例えば、第一培養細胞１０１ａとして繊維芽細胞を用い、第二培養細胞１０１ｂとして血管内皮細胞を用いることができる。このとき、図１３で示す三次元構造体を、好ましくは３５〜３９℃、より好ましくは３７℃の温度条件下で、０．５日〜７日間培養してもよい。これにより、第２の実施形態に比して効率は劣る一方、接着膜１０２を介して繊維芽細胞が接着した血管内皮細胞から血管枝が成長し、これが分岐して組織化し、血管網を形成させることが可能である。
【００９１】
このように本実施の形態においても、三次元配置のバリエーションが豊富な細胞組織を短時間で作製することができる。
【００９２】
以上、図面を参照して本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
【実施例】
【００９３】
（実施例１）
第１の物質としてフィブロネクチンを用い、第２の物質としてゼラチンを用い、フィブロネクチンとゼラチンとからなる接着膜１０２で細胞表面全面を被覆したヒト繊維芽細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ社製、正常ヒト皮膚繊維芽細胞  ＮＨＤＦ）を用いて図１に示す細胞の三次元構造体を作製した。作製方法は、図２、３に示す方法に従った。具体的には、１ウェルあたりヒト繊維芽細胞４×１０６個をそれぞれ用意し、０．２ｍｇ／ｍＬのフィブロネクチン（ウシ由来）（シグマアルドリッチ社製、Ｆ−４７５９）の５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）１ｍＬを加えて３７℃で１分間インキュベーションした。その後、２０００ｒｐｍで２分間遠心分離を行い、上澄みを除去した。続いて、０．２ｍｇ／ｍＬのゼラチン（和光純薬工業社製、０７７−０３１５５）の５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）１ｍＬを加えて３７℃で１分間インキュベートした。その後、２０００ｒｐｍで２分間遠心分離を行い、上澄みを除去した。これを１ステップとして、９ステップ実行し、フィブロネクチンからなる膜とゼラチンからなる膜とを交互に積層して、膜厚６ｎｍの接着膜をヒト繊維芽細胞に形成した。なお、膜厚は、位相差顕微鏡により１０箇所測定し、得られた測定値を平均化することで求めた。その後、接着膜で被覆されたヒト繊維芽細胞２×１０６個をセルカルチャーインサート（ベクトンディッキンソン社製、３５３０９０）のメンブレンフィルターに播種し、さらに、１０重量％ウシ胎仔血清（ＦＡＢ）を含むＥａｇｌｅ'ｓＭＥＭ培地を添加してから３７℃で４８時間インキュベートして培養した。これにより厚み４０μｍのシート状のヒト繊維芽細胞の三次元構造体が得られた。得られた実施例１の三次元組織をＨＥ染色した後、位相差顕微鏡より評価した。図４に結果を示す。図４で図示するように、細胞の重なりが観察された。なお、２４時間インキュベート後には、７層のヒト繊維芽細胞の三次元構造体が観察された。
【００９４】
（比較例１）
実施例１において、接着膜を形成していないヒト繊維芽細胞にセルカルチャーインサートに播種し、同様に培養した。得られた実施例１の三次元組織をＨＥ染色した後、位相差顕微鏡より評価した。図５に結果を示す。空隙が観察されており、細胞が接着できず組織化できないことが示された。
【００９５】
（実施例２）
実施例１において、フィブロネクチンとゼラチンとの接触を１ステップのみ行い、膜厚２ｎｍの接着膜を形成した。その他は、実施例１と同様にし、厚み５２μｍのシート状のヒト繊維芽細胞の三次元構造体を得た。
【００９６】
（実施例３）
実施例１において、フィブロネクチンとゼラチンとの接触を５ステップ行い、膜厚４ｎｍの接着膜を形成した。その他は、実施例１と同様にし、厚み４５μｍのシート状のヒト繊維芽細胞の三次元構造体を得た。
【００９７】
（比較例２）
特開２００７−２２８９２１号公報の実施例４において、ヒト臍帯動脈平滑筋細胞（ＵＡＳＭＣ）にかえてヒト繊維芽細胞を用い、ゼラチンとフィブロネクチンとからなるナノＥＣＭ（細胞外マトリックス）と細胞層とを順に積層させる構造を作製した。１層の細胞層を形成させるために、３７℃で６時間インキュベーションさせる必要があるため、７層の細胞層を作製するのに４２時間要し、実施例１の２倍の時間がかかった。
【００９８】
（実験例１）
培養細胞に接着膜が形成されていることの確認実験を図３に従った方法で行った。
具体的には、まず、フィブロネクチン（シグマアルドリッチ社製、Ｆ−４７５９）をファロイジン−ローダミン（Ｒｈ）を用いて標識した。また、ゼラチン（和光純薬工業社製、０７７−０３１５５）は、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）を用いて標識した。そして、５×１０６個のＬ９２９マウス繊維芽細胞（ＤＳファーマバイオメディカル、ＥＣ８５０１１４２５）に０．２ｍｇ／ｍＬのＲｈラベル化フィブロネクチンの５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）１ｍＬを加えて３７℃で１分間インキュベーションした。その後、２０００ｒｐｍで２分間遠心分離を行い、上澄みを除去した。続いて、０．２ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣラベル化ゼラチンの５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）１ｍＬを加えて３７℃で１分間インキュベートした。その後、２０００ｒｐｍで２分間遠心分離を行い、上澄みを除去した。これを１ステップとして、９ステップ実行し、フィブロネクチンからなる膜とゼラチンからなる膜とを交互に積層して、膜厚６ｎｍの接着膜をマウス繊維芽細胞に形成した。膜厚は、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）により求めたが、位相差顕微鏡の観察による測定結果と同様の結果が得られた。
ＱＣＭ測定法を用いた測定は、具体的には以下のように行った。ＱＣＭ水晶センサをピランハ溶液（過酸化水素水：濃硫酸（１：３、ｖ／ｖ）混合液）で１分間洗浄してから、０．２ｍｇ／ｍＬフィブロネクチンの５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）に３７℃で１分間浸漬し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄して風乾した後、振動数シフトを測定した（ステップ１）。ついで０．２ｍｇ／ｍＬゼラチンの５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）に３７℃で１分間浸漬し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄して風乾した後、振動数シフトを測定した（ステップ２）。このステップ１及び２を交互に繰り返すことによりＱＣＭ水晶センサに接着膜を形成すると共に、振動数シフトの測定を行った。得られた振動数シフトに基づき、ステップの数とそれにより形成される接着膜の厚みとを得た。特許文献１の図２に示すように、ステップを繰り返すことによって、振動数シフトが減少し、ＱＣＭ基材上にナノレベルの層が連続的に形成されることがわかる。また、振動数の減少が、ステップ数と相関関係を示していることから、ステップ数の増加によって形成するナノＥＣＭの膜厚を増加させ、ステップ数の減少によって形成するナノＥＣＭの膜厚を低減できる。
【００９９】
実験例１のＬ９２９マウス繊維芽細胞の位相差顕微鏡の画像を図６に示す。図６（ａ）が接着膜を形成する前の画像であり、図６（ｂ）が１ステップ目のフィブロネクチンからなる膜を形成した直後の画像であり、図６（ｃ）が２ステップ目のゼラチンからなる膜を形成した直後の画像であり、図６（ｄ）が５ステップ目のフィブロネクチンからなる膜を形成した直後の画像であり、図６（ｅ）が９ステップ目のフィブロネクチンからなる膜を形成した直後の画像であり、図６（ｆ）が図６（ｄ）で示す画像と５ステップ目のゼラチンからなる膜を形成した直後の画像との重ね合わせ画像である。各ステップにおいて、個々の細胞表面の全面がフィブロネクチンからなる膜、及び、ゼラチンからなら膜で覆われていることがわかる。
【０１００】
（実験例２〜７）
接着膜の形成と細胞毒性との関係を評価した。接着膜の形成は、５×１０６個のＬ９２９マウス繊維芽細胞（理化学研究所、ＣｅｌｌＢａｎｋ）を用いて、図３に従った方法で行った。第１の物質として、フィブロネクチン（シグマアルドリッチ社製、Ｆ−４７５９）、ε−ポリリシン塩酸塩（チッソ社製、分子量４７００）、ポリアリルアミン塩酸塩（日東紡社製、ＰＡＡ−ＨＣＬ）に５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）を加え、０．２ｍｇ／ｍＬの第１の物質の含有液をそれぞれ調製した。また、第２の物質として、ゼラチン（和光純薬工業社製、０７７−０３１５５）、ヘパリン（和光純薬  ０８１−００１３６  １００，０００ユニット）、デキストラン硫酸（和光純薬工業社製、１９９−０９９８３、分子量５００，０００）、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム塩、ポリアクリル酸ナトリウム塩に５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）を加え、０．２ｍｇ／ｍＬの第２の物質の含有液をそれぞれ調製した。Ｌ９２９マウス繊維芽細胞を第１の物質の含有液１ｍＬに１分間浸積した後、２０００ｒｐｍで２分間遠心分離を行った。上澄みを取り除いて第１の物質を除去した。その後、第２の物質の含有液１ｍＬを添加して１分間浸積し、同様に遠心分離を行って、上澄みを取り除くことで第２の物質を除去した。これを１ステップとして、１０ステップ繰り返した。
【０１０１】
遠心分離直後、上澄みを除去前に、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ（ＣＭＦＤＡ、インビトロジェン社製）及びＨＥ染色して細胞の挙動を確認したところ、第１の物質としてフィブロネクチンを用い第２の物質としてゼラチン又はε−ポリリシン塩酸塩を用いた場合（実験例２、５）は、細胞の凝集が見られなかったが、第１の物質としてフィブロネクチンを用い第２の物質としてヘパリンを用いた場合（実験例４）は、細胞の凝集が認められた。ただし、実験例４においても、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）を１ｍＬ加えることで細胞は分散した。１０ステップ処理後の被覆細胞の膜厚を位相差顕微鏡により観察したところ、表３で示す結果が得られた。また、各ステップの処理後の細胞の構造体の生存数を確認し、接着膜を形成する前の５×１０６個を１００として、生存率を求めた。ステップ数と生存率との関係を図７に示す。
【０１０２】
【表３】
0005850419.tif 000004
【０１０３】
（実験例８）
実験例２で作製したＬ９２９マウス繊維芽細胞の被覆細胞と、接着膜で被覆されていないＬ９２９マウス繊維芽細胞を、１０重量％ウシ胎仔血清（ＦＡＢ）を含むＥａｇｌｅ'ｓＭＥＭ培地が添加されたシャーレに１．８×１０３個／ｃｍ２播種し、３７℃でインキュベートして培養した。２４時間後及び９６時間後の位相差顕微鏡の画像を図８に示す。図８（ａ）（ｂ）が、接着膜が形成されていないＬ９２９マウス繊維芽細胞を培養させた結果であり、図８（ｃ）（ｄ）が実施例２のＬ９２９マウス繊維芽細胞を培養させた結果である。図８（ａ）（ｃ）が培養２４時間後の結果であり、図８（ｂ）（ｄ）が培養９６時間後の結果である。また、培養後２４、４８、７２、９６時間における細胞数を位相差顕微鏡で観察することで計測した。図９が培養時間と細胞数との関係を示す図である。倍加時間はＬ９２９マウス繊維芽細胞で２３時間であり、実験例２の被覆細胞で２５時間だった。
【０１０４】
なお、実験例２〜７で得られた被覆細胞を実施例１と同様に培養することで、Ｌ９２９マウス繊維芽細胞の三次元構造体が得られる。
【０１０５】
（実施例４）
図１０で示す三次元構造体を作製した。図１１は、異種細胞の積層組織を構築する方法を説明する模式的な図である。異種細胞のモデルとして、ヒト繊維芽細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ社製、正常ヒト皮膚繊維芽細胞  ＮＨＤＦ）を赤色色素（タカラバイオ、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅ、ＰＡ−３０１２）と緑色色素（タカラバイオ、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅ、ＰＡ−３０１１）に着色したものをそれぞれ用意し、第１の物質としてフィブロネクチン、第２の物質としてゼラチンを用いて、実施例１と同様な手技により、フィブロネクチンとゼラチンとからなる接着膜１０２（膜厚６ｎｍ）を成膜した。これにより、緑色色素に着色したヒト繊維芽細胞が、フィブロネクチンとゼラチンとからなる接着膜１０２で被覆された第一被覆細胞１０３ａと、赤色色素に着色したヒト繊維芽細胞がフィブロネクチンとゼラチンとからなる接着膜１０２で被覆された第二被覆細胞１０３ｂとが得られた。
その後、第一被覆細胞１０３ａを１．１×１０６個／ｃｍ２セルカルチャーインサート（ベクトンディッキンソン社製、３５３０９０）のメンブレンフィルターに播種し、さらに、１０重量％ウシ胎仔血清（ＦＡＢ）を含むＥａｇｌｅ'ｓＭＥＭ培地を添加した後、３７℃で２４時間インキュベートして培養し、４層の第一の積層構造１０を構築した。
ついで、実施例１で用いたフィブロネクチン含有緩衝液とゼラチン含有緩衝液への浸積を交互に合計９ステップ行い、フィブロネクチンとゼラチンとが交互に積層されたナノＥＣＭ３０を作成した。
その後、第二被覆細胞１０３ｂを１．１×１０６個／ｃｍ２播種し、さらに、１０重量％ウシ胎仔血清（ＦＡＢ）を含むＥａｇｌｅ'ｓＭＥＭ培地を添加した後、３７℃で２４時間インキュベートして培養し、４層の第二の積層構造２０を構築した。
得られた三次元構造体を共焦点レーザー顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ：ＣＬＳＭ）で観察したところ、図１４で示す結果が得られ、４層からなる第一被覆細胞１０３ａの積層組織の上に４層からなる第二被覆細胞１０３ｂの積層組織が構築できたことを確認した。
【０１０６】
（実施例５）
図１３で示す三次元構造体を作製した。実施例４で得られた第一被覆細胞１０３ａを１．１×１０６個／ｃｍ２、及び、第二被覆細胞１０３ｂを１．１×１０６個／ｃｍ２セルカルチャーインサート（ベクトンディッキンソン社製、３５３０９０）のメンブレンフィルターに播種し、さらに、１０重量％ウシ胎仔血清（ＦＡＢ）を含むＥａｇｌｅ'ｓＭＥＭ培地を添加した後、３７℃で２４時間インキュベートして培養し、８層の積層組織を構築した。得られた積層組織を共焦点レーザー顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｌａｓｅｓｒ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ：ＣＬＳＭ）で観察したところ、図１５で示す結果が得られ、第一被覆細胞１０３ａと第二被覆細胞１０３ｂとがランダムに積層した８層の積層組織が構築できたことを確認した。
【０１０７】
（実施例６）
図１２で示す三次元構造体を図１１に示す方法に従って作製した。第一培養細胞１０１ａとして、ヒト繊維芽細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ社製、正常ヒト皮膚繊維芽細胞  ＮＨＤＦ）を用意し、緑色色素（タカラバイオ、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅ、ＰＡ−３０１１）に着色した。また、第二培養細胞１０１ｂとして、ヒト血管内皮細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ社製、正常ヒト臍帯静脈血管内皮細胞）を用意した。第一培養細胞１０１ａ及び第二培養細胞１０１ｂのそれぞれの表面に、第１の物質としてフィブロネクチン、第２の物質としてゼラチンを用いて、実施例１と同様な手技により、フィブロネクチンとゼラチンとからなる接着膜１０２（膜厚６ｎｍ）を成膜した。これにより、ヒト繊維芽細胞が接着膜１０２で被覆された第一被覆細胞１０３ａ、及び、血管内皮細胞が接着膜１０２で被覆された第二被覆細胞１０３ｂを得た。
その後、第一被覆細胞１０３ａ１．１×１０６個／ｃｍ２セルカルチャーインサート（ベクトンディッキンソン社製、３５３０９０）のメンブレンフィルターに播種し、１０重量％ウシ胎仔血清（ＦＡＢ）を含むＥａｇｌｅ'ｓＭＥＭ培地を添加した後、３７℃で２４時間インキュベートして培養し、４層の第一の積層構造１０を構築した。
ついで、実施例１で用いたフィブロネクチン含有緩衝液とゼラチン含有緩衝液への浸積を交互に合計９ステップ行い、フィブロネクチンとゼラチンとが交互に積層されたナノＥＣＭ３０を第一の積層構造１０上に作成した。
その後、第二の被覆細胞１０３ｂを０．２×１０６個／ｃｍ２播種し、１０重量％ウシ胎仔血清（ＦＡＢ）を含むＥａｇｌｅ'ｓＭＥＭ培地を添加した後、３７℃で２４時間インキュベートして培養し、ナノＥＣＭ３０上に１層の第二の積層構造２０を構築した。
ついで、実施例１で用いたフィブロネクチン含有緩衝液とゼラチン含有緩衝液への浸積を交互に合計９ステップ行い、第二の積層構造２０上に、フィブロネクチンとゼラチンとが交互に積層されたナノＥＣＭ３０を作成した。
さらに、第一被覆細胞１０３ａを１．１×１０６個／ｃｍ２を播種し、１０重量％ウシ胎仔血清（ＦＡＢ）を含むＥａｇｌｅ'ｓＭＥＭ培地を添加した後、３７℃で２４時間インキュベートして培養し、ナノＥＣＭ３０上に４層の第一の積層構造１０を構築した。
【０１０８】
得られた三次元構造体を、３７℃で７日間培養した。ｍｏｎｏｃｌｏｃａｌ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ３１抗体（製品コード：ＪＣ７０Ａ、Ｄａｋｏ社製）及びＧｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ＩｇＧ抗体（製品コード：Ａ１１００１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にて第二培養細胞１０１ｂであるヒト血管内皮細胞を選択的に着色し、培養１日目、及び、７日目の積層組織を、それぞれ、共焦点レーザー顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ：ＣＬＳＭ）で観察した。結果を図１６（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）に示す。図１６（ｅ）、（ｆ）は、培養１日目を示し、図１６（ｇ）、（ｈ）が培養７日目を示す。図１６（ｆ）は、図１６（ｅ）の拡大図であり、図１６（ｈ）は、図１６（ｇ）の拡大図である。図１６では、血管内皮細胞が白く描出されるように示している。図１６（ｅ）、（ｆ）で示すように、培養１日目では、血管内皮細胞から血枝が成長しているのが示される。また、図１６（ｇ）、（ｈ）で示すように、培養７日目には、緻密な血管網が形成されている。
【０１０９】
図１７に第二の積層構造２０の平面視で上記共焦点レーザー顕微鏡により観察した結果を示す。第二の積層構造２０の断面中、血管網占有面積は、４５−６０％であり、血管網の間隔は、５０−１００μｍであった。
【０１１０】
（実施例７）
図１０で示す三次元構造体を、図１１に示す方法に従って作製した。第一培養細胞１０１ａとして、ヒト繊維芽細胞を用意し、第二培養細胞１０１ｂとして、ヒト血管内皮細胞を用意した。第二の積層構造２０上に、ナノＥＣＭ３０及び第一の積層構造１０を形成しない以外は、実施例６と同様にした。
【０１１１】
得られた三次元構造体を、３７℃で７日間培養した。ｍｏｎｏｃｌｏｃａｌ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ３１抗体（製品コード：ＪＣ７０Ａ、Ｄａｋｏ社製）及びＧｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ＩｇＧ抗体（製品コード：Ａ１１００１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にて第二培養細胞１０１ｂであるヒト血管内皮細胞を選択的に着色し、培養１日目、及び、７日目の積層組織を、それぞれ、ＣＬＳＭで観察した。結果を図１６（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）に示す。図１６（ａ）、（ｂ）は、培養１日目を示し、図１６（ｃ）、（ｄ）が培養７日目を示す。図１６（ｂ）は、図１６（ａ）の拡大図であり、図１６（ｄ）は、図１６（ｃ）の拡大図である。図１６では、血管内皮細胞が白く描出されるように示している。図１６（ａ）〜（ｄ）で示すように、実施例６とは異なり、培養１日目、７日目のいずれも、血枝の成長が観察されず、血管網は観察できなかった。
【０１１２】
（実施例８）
図１３で示す三次元構造体を図１１に示す方法に従って作製した。第一培養細胞１０１ａとして、ヒト繊維芽細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ社製、正常ヒト皮膚繊維芽細胞  ＮＨＤＦ）を用意し、緑色色素（タカラバイオ、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅ、ＰＡ−３０１１）に着色した。また、第二培養細胞１０１ｂとして、ヒト血管内皮細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ社製、正常ヒト臍帯静脈血管内皮細胞）を用意した。第一培養細胞１０１ａ及び第二培養細胞１０１ｂのそれぞれの表面に、第１の物質としてフィブロネクチン、第２の物質としてゼラチンを用いて、実施例１と同様な手技により、フィブロネクチンとゼラチンとからなる接着膜１０２（膜厚６ｎｍ）を成膜した。これにより、ヒト繊維芽細胞が接着膜１０２で被覆された第一被覆細胞１０３ａ、及び、血管内皮細胞が接着膜１０２で被覆された第二被覆細胞１０３ｂを得た。
得られた第一被覆細胞１０３ａを１．１×１０６個／ｃｍ２、及び、第二被覆細胞１０３ｂを１．１×１０６個／ｃｍ２、セルカルチャーインサート（ベクトンディッキンソン社製、３５３０９０）のメンブレンフィルターに播種した。さらに、１０重量％ウシ胎仔血清（ＦＡＢ）を含むＥａｇｌｅ'ｓＭＥＭ培地を添加した後、３７℃で２４時間インキュベートして培養し、５層の積層組織を構築した。
【０１１３】
得られた三次元構造体を、３７℃で７日間培養した。ｍｏｎｏｃｌｏｃａｌ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ３１抗体（製品コード：ＪＣ７０Ａ、Ｄａｋｏ社製）及びＧｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ＩｇＧ抗体（製品コード：Ａ１１００１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にて第二培養細胞１０１ｂであるヒト血管内皮細胞を選択的に着色し、培養１日目、及び、７日目の積層組織を、それぞれ、ＣＬＳＭで観察した。結果を図１６（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）に示す。図１６（ｉ）、（ｊ）は、培養１日目を示し、図１６（ｋ）、（ｌ）が培養７日目を示す。図１６（ｊ）は、図１６（ｉ）の拡大図であり、図１６（ｌ）は、図１６（ｋ）の拡大図である。図１６では、血管内皮細胞が白く描出されるように示している。図１６（ｈ）、（ｉ）で示すように、培養１日目は、血枝の成長が観察されなかったが、培養７日目で微量の血枝の成長が観察され、実施例６ほど血管網占有面積は高くないものの、血管網も観察することができた。
【符号の説明】
【０１１４】
１０      第一の積層構造
２０      第二の積層構造
３０      ナノ細胞外マトリックス
１０１    培養細胞
１０１ａ  第一培養細胞
１０１ｂ  第二培養細胞
１０２    接着膜
１０２ａ  第１の物質からなる膜
１０２ｂ  第２の物質からなる膜
１０３    被覆細胞
１０３ａ  第一被覆細胞
１０３ｂ  第二被覆細胞
【図１】
0005850419.tif 000005
【図２】
0005850419.tif 000006
【図３】
0005850419.tif 000007
【図７】
0005850419.tif 000008
【図９】
0005850419.tif 000009
【図１０】
0005850419.tif 000010
【図１１】
0005850419.tif 000011
【図１２】
0005850419.tif 000012
【図１３】
0005850419.tif 000013
【図４】
0005850419.tif 000014
【図５】
0005850419.tif 000015
【図６】
0005850419.tif 000016
【図８】
0005850419.tif 000017
【図１４】
0005850419.tif 000018
【図１５】
0005850419.tif 000019
【図１６】
0005850419.tif 000020
【図１７】
0005850419.tif 000021