(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、
Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ、
Ｉｌｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、
Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ、
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ、
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ、
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ、
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ、
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ、
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ、
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ、
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、
およびＧｌｙ−Ａｌａからなる群から選択されるいずれか１種以上のペプチドを有効成分とするＤＰＰ−４阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ酸が２〜６の特定配列のペプチドからなるジペプチジルペプチダーゼ４阻害剤（以下、単にＤＰＰ−４阻害剤と称する）に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、高血糖、糖尿、体タンパク質の崩壊、ケトーシス、アシドーシスなどの全身性代謝障害を引き起こす慢性疾患である。一般的に、膵臓のβ細胞が何らかの理由によって破壊されて血糖値を調節するインスリンが枯渇する１型と、血中にインスリンは存在するがインスリンの働きが悪く、あるいは膵臓のβ細胞からのインスリン分泌量が減少し、結果として血糖値の調整不全となる２型とに大別される。【０００３】
近年、血糖値を調整するホルモンとして、消化管ホルモンの一つであるインクレチンが注目されている。インクレチンは食物摂取に伴って消化管より分泌され膵β細胞に作用してインスリン分泌を促進するホルモンの総称であり、グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（ＧＩＰ：ｇｌｕｃｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）とグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１：ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１）の２つが知られている。分泌されたインクレチンは、膵臓β細胞表面の受容体に結合してインスリン分泌促進及びグルカゴンの分泌抑制により血糖値降下作用を示す。インクレチンによるインスリン分泌促進作用は血中グルコース濃度に依存し、一定濃度以上のグルコース存在下のみで発現する。すなわち、従来の治療法であるインスリン直接投与で懸念される低血糖が起きる危険性が少なく、安全に食後高血糖を是正することが期待出来る。実際、インクレチンのひとつであるＧＬＰ−１を、静脈を介して２型糖尿病患者に持続投与することでインスリン分泌が促進され、血糖コントロールが顕著に改善されることが明らかとなり、ＧＬＰ−１補充療法の有用性が示された。【０００４】
一方、ＧＬＰ−１は、生体内に広範に存在するジペプチジルペプチダーゼ４（ＥＣ３．４．１４．５、以下単にＤＰＰ−４と称す。）で急速に分解される。そこで、糖尿病治療法として、ＤＰＰ−４の活性を阻害して内因性ＧＬＰ−１の作用を持続増強させる薬剤が新たに開発されている。なお、ＤＰＰ−４は、Ｔ細胞などの免疫系細胞表面にＣＤ２６として細胞膜上に発現するが、可溶性タンパク質として血液中にも存在し、ＧＬＰ−１を不活化するセリンプロテアーゼである。Ｎ末端から２番目にＰｒｏまたはＡｌａを持つ生理活性ペプチドに対して特異的に作用し、Ｎ末端からジペプチドを遊離させる。【０００５】
このようなＤＰＰ−４の作用に由来して、Ｎ末端から２番目にＰｒｏが配列されたアミノ酸３〜１２のペプチドからなるＤＰＰ−４阻害剤がある（特許文献１）。チーズを水性溶媒に懸濁した後、不溶性物質を除去して得られた水溶性画分に含まれるペプチドであり、当該ペプチドを配合した飲食品を経口摂取すると生体内で血糖値を低下させ得るという。特許文献１に記載されるＤＰＰ−４阻害剤は、天然物から得られるため毒性が低く、安全性が高いという。【０００６】
また、乳タンパク質加水分解物からなり、ＧＬＰ−１の分泌を刺激し、およびＤＰＰ−４阻害作用を有するペプチドもある（特許文献２）。特許文献２で開示するペプチドは、２〜８アミノ酸長で、Ｐｒｏを第二Ｎ末端残基として含むものが好ましいとする。実施例では、ある乳タンパク質加水分解物として５００〜２０００Ｄａのペプチド組成物のＤＰＰ−４阻害効果を評価するが、それらの組成やペプチド配列は不明である。【０００７】
更に、飲食用素材由来の調製物を有効成分として含有するＤＰＰ−４阻害剤（特許文献３）もある。固形分濃度３．５ｍｇ／ｍｌ以下でのＤＰＰ−４阻害率が６０％以上の飲食用素材由来の調製物を有効成分として含有するものである。特許文献３の実施例では、緑豆、大豆、コラーゲン、海藻、茶、クルミ、甜茶、ザクロ、ブドウ種子等を由来とするペプチドのＤＰＰ−４阻害率を評価している。【０００８】
更に、コラーゲンまたはゼラチン由来のペプチドであって、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ−（Ｇｌｙ−Ｚ−Ｗ）ｎ（式中、nは０〜４の整数、ＸはＰｒｏまたはＬｅｕ、Ｙ、ＺおよびＷはそれぞれ独立して同一または異なる任意のアミノ酸残基（ただし、Ｇｌｙを除く）を示す。）で示すペプチドをＤＰＰ−４阻害剤とするものもある(特許文献４）。実施例では、市販のコラーゲンペプチドを高速液体クロマトグラフィーで分画し、ＤＰＰ−４阻害活性に優れる画分のペプチド配列を同定している。【０００９】
一方、ＤＰＰ−４阻害剤の作用として、Ｔリンパ球の増殖を抑制することが知られている（非特許文献１）。非特許文献１は、ＤＰＰ−４阻害剤によって自己免疫性脊椎炎、多発性硬化症、関節炎、リューマチなどの自己免疫疾患を緩和しうることを指摘している。また、ＤＰＰ−４はＨＩＶ−１のＣＤ４陽性Ｔ細胞に対する感染促進に係わっているため、ＤＰＰ−４阻害剤と他の薬剤との併用によってＨＩＶ−１の感染防御が期待できる旨の報告もある（非特許文献２）。さらに、皮膚細胞はＤＰＰ−４を発現しているため、ＤＰＰ−４阻害剤は、皮脂腺細胞や表皮細胞の増殖や分化やサイトカイン産生に影響するとの報告もある（非特許文献３）。ＤＰＰ−４阻害剤により、アクネ菌で刺激されたＴリンパ球の増殖を抑え、線維芽細胞のＴＧＦβの発現抑制、増殖抑制、マトリックス産生抑制を引き起こし、結果としてＤＰＰ−４阻害剤によって、アクネ、乾癬、ケロイドを治療しうることが示唆される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００７−３９４２４号公報
【特許文献２】特表２００９−５１７４６４号公報
【特許文献３】特開２０１０−１３４２３号公報
【特許文献４】国際公開第２００８／０６６０７０号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ＩＶ  （ＤＰ  ＩＶ）−ｌｉｋｅ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ：  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＤＰ  ＩＶ／ＣＤ２６−ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｉｃ，  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ．  ２００９；４７（３）：２６８−７４．
【非特許文献２】Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  （ＣＥＭ）  ｂｙ  ｎｅｗ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ＩＶ  （ＣＤ２６）  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．  Ｒｅｓ  Ｖｉｒｏｌ．  １９９７  Ｊｕｌ−Ａｕｇ；１４８（４）：２５５−６６．
【非特許文献３】Ｔｈｅ  ｅｃｔｏｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ＩＶ  （ＤＰ  ＩＶ）  ａｎｄ  ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｎ  （ＡＰＮ）  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｓ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｋｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．  Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．  ２００８  Ｊａｎ  １；１３：２３６４−７５．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記特許文献１〜４に記載するＤＰＰ−４阻害剤は、いずれもチーズや乳タンパク質、その他の飲食用素材などの天然物を原料とする点で安全性に優れるが、より阻害効果の強いＤＰＰ−４阻害剤の開発が望まれる。【００１３】
すなわち、特許文献１や特許文献２は、特定のペプチド配列に限定されたものであり、他の配列でのＤＰＰ−４阻害効果は不明である。また、特許文献１に記載されているこれらのペプチドはそもそもチーズの水溶性画分に由来するものに限定されるため、他の配列に関するＤＰＰ−４阻害効果も不明である。また、特許文献２は、２〜８アミノ酸長で、Ｐｒｏを第一、第二、第三、又は第四Ｎ末端残基として含み、またはＰｒｏをＣ末端残基または最後から二番目のＣ末端残基に含むものを好ましいペプチドとして選択するものである。これらはＤＰＰ−４が、特異的にＮ末端から２番目のＰｒｏまたはＡｌａを持つ生理活性ペプチドに対して作用する点に着目したものである。しかしながら、実施例でＤＰＰ−４阻害効果を評価した加水分解物は、分子量分布とＤＰＰ−４阻害、およびＧＬＰ−１分泌との関係を評価するものの、使用した加水分解物の組成は不明である。【００１４】
特許文献３も、豚や魚のコラーゲンペプチドのＤＰＰ−４阻害率を評価しているが、具体的なペプチド配列に関する記載は存在しない。更に、インクレチンはＤＰＰ−４の基質として速やかに分解されるため、血中半減期は非常に短い。従って、ＤＰＰ−４阻害剤によって血中のインクレチン濃度を確保するには、血液中で速やかにＤＰＰ−４阻害作用を発揮する必要があり、ＤＰＰ−４阻害剤は生体吸収性に優れる必要がある。【００１５】
一方、特許文献４の実施例で使用するペプチドは、市販のコラーゲンペプチドを逆相カラムで分取し、ＤＰＰ−４阻害活性に優れるペプチドを特定したものであり、ペプチド配列とＤＰＰ−４阻害活性とを体系的に評価するものではない。また、そもそも原料のコラーゲンは、コラゲナーゼ処理してなる市販のゼラチンである。コラゲナーゼによる分解では、Ｎ末端がＧｌｙのペプチドが主成分であるから、Ｎ末端がＧｌｙ以外のペプチドや、Ｃ末端がＧｌｙであるペプチドを製造し、ＤＰＰ−４阻害活性を評価することはできない。【００１６】
一方、ＤＰＰ−４阻害剤は、非特許文献１〜非特許文献３に示すように、免疫系に作用し、皮膚疾患の治療など医療用途にも使用できるため、用途が広がる可能性がある。【００１７】
このような状況下、安全性が高いペプチド由来のＤＰＰ−４阻害剤の開発が望まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは上記課題を解決すべく、コラーゲンのアミノ酸一次構造を参照して各種のペプチドを合成し、ＤＰＰ−４阻害剤を評価した。その結果、Ｎ末端から２番目のアミノ酸残基がＨｙｐであってもＤＰＰ−４阻害活性を発揮しうること、Ｎ末端から２番目がＰｒｏやＡｌａであってもＤＰＰ−４阻害活性がないペプチドが存在すること、Ｎ末端から３番目のアミノ酸残基がＧｌｙであるとＤＰＰ−４阻害活性に優れることなどを見出し、本発明を完成させた。しかも、本発明で使用するペプチドは、アミノ酸が２〜６個からなる特定配列のペプチドであるため血中への移行性に優れ、迅速にＤＰＰ−４阻害作用を発揮することができ、かつコラーゲン由来のアミノ酸配列であるため安全性に優れる。【００１９】
すなわち本発明は、
コラーゲンに由来する、式（１）：Ｘｅ−Ｐｒｏ／Ａｌａ／Ｈｙｐ−Ｘａ−Ｘｂ−Ｘｃ−Ｘｄ（式中、Ｘｅは、等電点５．９〜６．３のアミノ酸残基であり、Ｐｒｏ／Ａｌａ／Ｈｙｐは、Ｐｒｏ、ＡｌａまたはＨｙｐを示し、ＸａはＨｙｐ、ＰｒｏおよびＡｒｇ以外のアミノ酸残基または欠失であり、ＸｂはＧｌｙ、Ｐｒｏまたは欠失であり、ＸｃはＰｒｏ、Ａｌａまた欠失、Ｘｄはアミノ酸残基または欠失である。）で示されるペプチドを有効成分とするＤＰＰ−４阻害剤であって、
前記ペプチドが、
式（Ｂ−１）：Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｘａ−Ｘｂ−Ｘｃ（式中、ＸａはＧｌｙであり、ＸｂはＰｒｏまたは欠失、ＸｃはＡｌａまたは欠失である。）、
式（Ｂ−２）：Ｌｅｕ／Ｉｌｅ−Ｈｙｐ−Ｘａ−Ｘｂ−Ｘｃ（式中、Ｌｅｕ／ＩｌｅはＬｅｕまたはＩｌｅを示し、ＸａはＧｌｙ、ＸｂはＰｒｏまたは欠失、ＸｃはＡｌａまたは欠失である。）、
式（Ａ−１）：Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘａ−Ｘｂ−Ｘｃ−Ｘｄ（式中、ＸａはＨｙｐおよびＶａｌ以外の等電点が３．０〜６．２のアミノ酸残基、ＸｂはＧｌｙ、ＸｃはＰｒｏまたは欠失、ＸｄはＡｌａ以外のアミノ酸残基または欠失である。）、
式（Ａ−２）：Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｘａ−Ｘｂ−Ｘｃ−Ｘｄ（式中、Ｘａは等電点が５．８〜６．２のアミノ酸残基または欠失であり、ＸｂはＧｌｙまたは欠失、ＸｃはＰｒｏまたは欠失、Ｘｄはアミノ酸残基または欠失である。）で示されるペプチドのいずれかであることを特徴とする、ＤＰＰ−４阻害剤を提供するものである。【００２０】
また、本発明は、前記ペプチドが、
Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、
Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ、
Ｉｌｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、
Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ、
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ、
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ、
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ、
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ、
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ、
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ、
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ、
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、
およびＧｌｙ−Ａｌａからなる群から選択されるいずれか１種以上である、上記ＤＰＰ−４阻害剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、安全性に優れ、かつＤＰＰ−４阻害活性に優れる新規なＤＰＰ−４阻害剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】実施例６で合成したペプチド（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ）のＤＰＰ−４阻害曲線を示す図である。
【図２】実施例１７で合成したペプチド（Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）のＤＰＰ−４阻害曲線を示す図である。
【図３】アミノ酸の等電点を示す一覧表である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の第一は、式（１）：Ｘｅ−Ｐｒｏ／Ａｌａ／Ｈｙｐ−Ｘａ−Ｘｂ−Ｘｃ−Ｘｄ（式中、Ｘｅは、等電点５．９〜６．３のアミノ酸残基であり、Ｐｒｏ／Ａｌａ／Ｈｙｐは、Ｐｒｏ、ＡｌａまたはＨｙｐを示し、ＸａはＨｙｐ、ＰｒｏおよびＡｒｇ以外のアミノ酸残基または欠失であり、ＸｂはＧｌｙ、Ｐｒｏまたは欠失であり、ＸｃはＰｒｏ、Ａｌａまたは欠失、Ｘｄはアミノ酸残基または欠失である。）で示されるペプチドを有効成分とする、ＤＰＰ−４阻害剤である。
【００２７】
ヒトのＤＰＰ−４は、７６６個のアミノ酸から構成される１１０ｋＤａの膜タンパク質であり、アミノ基側末端にβプロペラドメイン、カルボキシル基側末端にα／βヒドロラーゼドメインが配置され、前記α／βヒドロラーゼドメインには３つの触媒残基（Ｓｅｒ６３０，Ｈｉｓ７４０，Ａｓｐ７０８）が存在する酵素である。血中では細胞外領域が膜結合領域と切断され可溶型として存在している。Ｎ末端から２番目のＰｒｏまたはＡｌａを持つペプチドからジペプチドを遊離させるという特異性に鑑みて、例えば前記特許文献１に示すように、アミノ基末端から２番目にＡｌａやＰｒｏが配される種々のペプチドがＤＰＰ−４阻害剤として提案され、ＩＣ５０が測定されている。また、ジプロチンＡ（Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ）が、ＤＰＰ−４の基質でありながらｋｃａｔおよびＫｍ値が共に低いため阻害剤のように作用することが知られており、特許文献１の実施例でも、各種ペプチドと一緒にジプロチンＡのＩＣ５０の測定値が記載されている。
【００２８】
このような状況下、安全性に優れ、かつＤＰＰ−４阻害効果に優れるペプチドを開発するため、Ｐｒｏを多く含有するペプチドとしてコラーゲンのアミノ酸配列を参照して各種のペプチドを合成した。
【００２９】
なお、コラーゲンは、３本のポリペプチド鎖の三重螺旋構造を基本単位とし、生体の真皮、靱帯、腱、骨、軟骨などを構成するタンパク質である。コラーゲン分子が複数会合してコラーゲン線維となる。コラーゲン分子を構成するアミノ酸は、−Ｇｌｙ−アミノ酸Ｘ−アミノ酸Ｙ−で示される、Ｇｌｙを３残基ごとに繰り返す、いわゆる「コラーゲン様配列」と呼ばれる一次構造を有する。コラーゲンに特有のアミノ酸としてＰｒｏやＬｙｓに水酸基が１つ付加したヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）やヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）などがあり、前記コラーゲン様配列では、前記アミノ酸ＸとしてＰｒｏを有するものや、アミノ酸ＹとしてＨｙｐが多く存在し、このコラーゲン様配列により三重螺旋構造が維持されている。強靭なコラーゲンの加工に際し、酸やアルカリ、酵素による加水分解が施され、ゼラチンその他に加工されている。このような酵素としてコラゲナーゼがあり一般的に使用されているが、コラゲナーゼは主としてＮ末端がＧｌｙのペプチドを産生するエンドペプチダーゼであり、従って、従来のコラーゲン分解物は、Ｎ末端がＧｌｙのペプチドが主成分である。そこで本発明は、このような酵素分解に限定されず、ＤＰＰ−４阻害活性に優れるペプチドを創生すべく、コラーゲンのアミノ酸配列を参照して配列の一部を抜き出し、または抜き出した配列の一部を変更して各種のペプチドを合成し、ＤＰＰ−４に対する阻害率を評価した。
【００３０】
本願発明で評価したペプチドは、コラーゲンのアミノ酸配列を参照するものであるから、生体内ではコラーゲンを摂取した際の通常のプロセスに従い代謝され、安全性が高い。参考のため、牛由来Ｉ型コラーゲンα１鎖の配列を配列番号１４に記載する。この配列は、ＮＣＢＩのアクセッションナンバー  ＮＰ  ００１０２９２１１として登録されている。なお、コラーゲンに含まれるＨｙｐは、コラーゲン生成後にＰｒｏがプロリンヒドロキシラーゼによって修飾されたものである。配列番号１４は翻訳後修飾前のアミノ酸配列であり、Ｈｙｐは含まれていない。以下、本発明を詳細に説明する。
【００３１】
本発明のＤＰＰ−４阻害剤は、式（１）：Ｘｅ−Ｐｒｏ／Ａｌａ／Ｈｙｐ−Ｘａ−Ｘｂ−Ｘｃ−Ｘｄ（式中、Ｘｅは、等電点５．９〜６．３のアミノ酸残基であり、Ｐｒｏ／Ａｌａ／Ｈｙｐは、Ｐｒｏ、ＡｌａまたはＨｙｐを示し、ＸａはＨｙｐ、ＰｒｏおよびＡｒｇ以外のアミノ酸残基または欠失であり、ＸｂはＧｌｙ、Ｐｒｏまたは欠失であり、ＸｃはＰｒｏ、Ａｌａまたは欠失、Ｘｄはアミノ酸残基または欠失である。）で示されるペプチドを有効成分とする。アミノ酸配列とＤＰＰ−４阻害活性とを精査したところ、Ｎ末端から３番目のアミノ酸残基がＨｙｐまたはＰｒｏの場合は、他のアミノ酸残基の如何に関わらずＤＰＰ−４阻害活性が低いか、ＤＰＰ−４阻害活性を有しないことが判明した。また、Ｎ末端から２番目のアミノ酸残基はＰｒｏ、ＡｌａまたはＨｙｐである場合にＤＰＰ−４阻害活性に優れ、上記条件を満たせば、Ｎ末端のアミノ酸残基は等電点５．９〜６．３の範囲で広く選択しうる。Ｘｅとしては、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏが好ましく、より好ましくはＧｌｙ、Ａｌａ、ＩｌｅまたはＬｅｕである。
【００３２】
上記式（１）で示すペプチドとしては、式（Ａ）：Ｇｌｙ−Ｐｒｏ／Ａｌａ−Ｘａ−Ｘｂ−Ｘｃ−Ｘｄ（式中、Ｐｒｏ／Ａｌａは、ＰｒｏまたはＡｌａを示し、ＸａはＨｙｐ、ＰｒｏおよびＡｒｇ以外のアミノ酸残基または欠失であり、ＸｂはＧｌｙまたは欠失、ＸｃはＰｒｏまたは欠失、Ｘｄはアミノ酸残基または欠失である。）であってもよい。
【００３３】
Ｎ末端がＧｌｙである場合には、ＸａはＨｙｐ、ＰｒｏおよびＡｒｇ以外のアミノ酸残基であることが好ましい。ＤＰＰ−４は、Ｎ末端から２番目のＰｒｏまたはＡｌａを持つペプチドからジペプチドを遊離させるという特異性を有するため、Ｎ末端から２番目のアミノ酸残基がＰｒｏやＡｌａであるペプチドは、ＤＰＰ−４阻害活性を有すると推定される。しかしながら、２番目のアミノ酸残基がＰｒｏやＡｌａであっても、Ｎ末端から３番目のアミノ酸残基がＨｙｐやＰｒｏであると、ＤＰＰ−４阻害活性が極めて低いか、または全く存在しないことが判明した。
【００３４】
更に、Ｎ末端から２番目のアミノ酸残基がＰｒｏの場合には、ＸａとしてＡｌａ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌなどの等電点がｐＨ３．０〜６．２であって、Ｈｙｐ以外のアミノ酸残基が好ましい。特に好ましくは、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌである。
【００３５】
一方、Ｎ末端から２番目のアミノ酸残基がＡｌａの場合には、ＸａとしてＶａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅなどの等電点がｐＨ５．８〜６．２のアミノ酸残基または欠失である。後記する実施例に示すように、Ｎ末端から４番目以降のアミノ酸配列に係わらず、ＤＰＰ−４阻害活性に優れるからである。なお、本発明において、アミノ酸の等電点は図３に示す数値に従った。
【００３６】
上記式（Ａ）において、ＸｂはＧｌｙまたは欠失であり、Ｘｂが欠失の場合にはトリペプチドとなる。
【００３７】
ＸｃはＰｒｏまたは欠失であり、Ｘｃが欠失の場合はテトラペプチドとなる。また、Ｘｄは、いずれのアミノ酸残基であってもよく、または欠失であってもよい。本発明で使用する上記一般式（Ａ）で示すペプチドは、Ｎ末端からＧｌｙ−Ｐｒｏ／Ａｌａ−の配列を有し、後記する実施例に示すように、アミノ酸数２〜６の範囲でペプチド鎖が長くなるにつれＤＰＰ−４阻害活性が上昇する傾向があるが、５アミノ酸残基を超えると活性上昇率は横ばいとなる。これは、Ｎ末端から４番目までの配列によってＤＰＰ−４阻害活性が決定され、Ｎ末端から６番目のアミノ酸残基はその種類を問わないことを意味する。Ｘｄとして各種のアミノ酸残基を結合してＤＰＰ−４阻害活性を評価したところ、親水性かつ等電点がｐＨ１０を超えるＡｒｇ、イミノ酸の一種であるＨｙｐ、疎水性かつ等電点が弱酸性側のＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ａｌａなど、広範囲のアミノ酸残基を結合するペプチドにおいて、ＤＰＰ−４阻害活性が発揮された。
【００３８】
本発明で使用する式（Ａ）で示すペプチドとしては、式（Ａ−１）：Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘａ−Ｘｂ−Ｘｃ−Ｘｄ（式中、ＸａはＨｙｐおよびＶａｌ以外の等電点が３．０〜６．２のアミノ酸残基、ＸｂはＧｌｙ、ＸｃはＰｒｏまたは欠失、ＸｄはＡｌａ以外のアミノ酸残基または欠失である。）であってもよい。
【００３９】
上記式（Ａ−１）に示すＸａとしては、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＬｅｕが好ましく、Ｘｄとしては、Ａｌａ、Ｈｙｐ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｒｇまたは欠失が好ましい。
【００４０】
また、本発明で使用する式（Ａ）で示すペプチドとしては、式（Ａ−２）：Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｘａ−Ｘｂ−Ｘｃ−Ｘｄ（式中、Ｘａは等電点が５．８〜６．２のアミノ酸残基または欠失であり、ＸｂはＧｌｙまたは欠失、ＸｃはＰｒｏまたは欠失、Ｘｄはアミノ酸残基または欠失である。）であってもよい。
【００４１】
上記式（Ａ−２）に示すＸａとしては、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌまたは欠失が好ましく、Ｘｄとしては、Ａｌａ、Ｓｅｒまたは欠失が好ましい。
【００４２】
本発明のＤＰＰ−４阻害剤において、上記式（Ａ）で示すペプチドとして、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ、Ｇｌｙ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏがある。
【００４３】
また、本発明のＤＰＰ−４阻害剤は、式（Ｂ）：Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ａｌａ−Ｈｙｐ／Ｐｒｏ−Ｘａ−Ｘｂ−Ｘｃ（式中、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／ＡｌａはＬｅｕ、ＩｌｅまたはＡｌａを示し、Ｈｙｐ／ＰｒｏはＨｙｐまたはＰｒｏを示し、ＸａはＨｙｐ、Ｐｒｏ、ＩｌｅおよびＡｒｇ以外のアミノ酸残基または欠失であり、ＸｂはＰｒｏまたは欠失、ＸｃはＡｌａまたは欠失である。）に示すペプチドであってもよい。
【００４４】
コラーゲンには、−Ｇｌｙ−アミノ酸Ｘ−アミノ酸Ｙ−で示されるコラーゲン様配列が含まれるが、Ｎ末端をＧｌｙに限定することなくＤＰＰ−４阻害活性を評価したところ、Ｎ末端から３番目のアミノ酸残基がＧｌｙである場合にＤＰＰ−４阻害活性に優れることが判明した。この場合、Ｎ末端のアミノ酸残基は、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＡｌａであり、ペプチド長が長くなるにつれＤＰＰ−４阻害活性が増加する傾向があった。Ｎ末端から２番目のアミノ酸は、ＰｒｏでもＨｙｐであってもよい。ＤＰＰ−４はＮ末端から２番目のＰｒｏまたはＡｌａを持つペプチドからジペプチドを遊離させるという特異性を有するが、Ｎ末端がＰｈｅ、ＰｒｏまたはＡｌａの場合は、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がＰｒｏやＨｙｐでもＤＰＰ−４阻害活性が低いか全く存在しない。このことは、ＤＰＰ−４阻害活性がＮ末端のアミノ酸残基の種類にも影響されることを意味する。ただし、この場合でも、Ｎ末端から３番目のアミノ酸残基としてＧｌｙを結合させるとＤＰＰ−４阻害活性が向上する。Ｘａが欠失の場合、ジペプチドとなり、Ｘｂが欠失の場合はトリペプチドとなる。なお、コラーゲンのアミノ酸配列を参照すると、式（Ｂ）において、Ｘａのアミノ酸残基がＩｌｅであることは想定できず、Ｘａを、Ｈｙｐ、Ｐｒｏ、ＩｌｅおよびＡｒｇ以外のアミノ酸残基または欠失とした。
【００４５】
本発明で使用する式（Ｂ）で示すペプチドとしては、式（Ｂ−１）：Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｘａ−Ｘｂ−Ｘｃ（式中、ＸａはＧｌｙであり、ＸｂはＰｒｏまたは欠失、ＸｃはＡｌａまたは欠失である。）を好ましく使用することができる。
【００４６】
また、本発明で使用する式（Ｂ）で示すペプチドとしては、式（Ｂ−２）：Ｌｅｕ／Ｉｌｅ−Ｈｙｐ−Ｘａ−Ｘｂ−Ｘｃ（式中、Ｌｅｕ／ＩｌｅはＬｅｕまたはＩｌｅを示し、ＸａはＧｌｙ、ＸｂはＰｒｏまたは欠失、ＸｃはＡｌａまたは欠失である。）であってもよい。
【００４７】
更に、本発明で使用する式（Ｂ）で示すペプチドとしては、式（Ｂ−３）：Ａｌａ−Ｈｙｐ／Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（式中、Ｈｙｐ／ＰｒｏはＨｙｐまたはＰｒｏを示す。）であってもよい。
【００４８】
本発明のＤＰＰ−４阻害剤において、上記式（Ｂ）で示すペプチドとして、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｉｌｅ−Ｈｙｐ−ＧｌｙおよびＬｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａがある。
【００４９】
本発明のＤＰＰ−４阻害剤で使用する上記ペプチドは、医学的に許容可能な塩を構成するものであってもよい。なお、医学的に許容可能な塩とは、薬理学的に許容可能であり、かつ投与された被験者に対して略無毒の本発明の化合物である塩形態をいう。上記ペプチドの医薬的に許容可能な塩として、ナトリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などの無機塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、ヒドロキシブチル酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、琥珀酸塩、アジピン酸、酒石酸、クエン酸塩、グルタル酸塩などの有機酸塩、塩酸塩、リン酸塩、塩化水素酸塩、硫酸塩、カルボン酸塩、ホスホン酸塩、スルホン酸塩などの付加塩がある。
【００５０】
本発明のＤＰＰ−４阻害剤は、前記したように、コラーゲンのアミノ酸一次配列を参照してＤＰＰ−４阻害効果に優れるものを選択し、または配列の一部を改変したものであり、ペプチド合成により製造することができる。ただし、他の方法で調製したものであってもよい。
【００５１】
本発明のＤＰＰ−４阻害剤は、経口的に投与して、生体においてＤＰＰ−４を阻害することにより血糖値を低下させることができ、糖尿病の予防薬、治療薬として使用することができる。経口投与する場合、本発明のＤＰＰ−４阻害剤の剤型としては、ペプチドをそのまま使用する他、他のふ形剤を配合して錠剤、細粒剤、丸剤、トローチなどに調製してもよく、カプセルに収納してカプセル剤としてもよく、更には液剤などに調製することができる。経口投与の場合は、治療や予防の目的、症状、体重、年齢などの条件を考慮して、適宜選択することができる。また、サプリメントとして摂取することもできる。
【００５２】
本発明のＤＰＰ−４阻害剤の投与量は、投与形態、投与目的、被験者の年齢その他に応じて適宜、選択することができる。一般には、経口投与の場合、成人一日当り０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１〜２０ｍｇ／ｋｇである。注射剤の場合は、例えば０．０００１〜５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．００１〜２０ｍｇ／ｋｇ、特に好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇである。
【００５３】
このようなペプチドとして、式（Ａ）：Ｇｌｙ−Ｐｒｏ／Ａｌａ−Ｘａ−Ｘｂ−Ｘｃ−Ｘｄ（式中、Ｐｒｏ／Ａｌａは、ＰｒｏまたはＡｌａを示し、ＸａはＨｙｐ、ＰｒｏおよびＡｒｇ以外のアミノ酸残基または欠失であり、ＸｂはＧｌｙまたは欠失、ＸｃはＰｒｏまたは欠失、Ｘｄはアミノ酸残基または欠失である。）で示されるいずれか１種以上と、式（Ｂ）：Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ａｌａ−Ｈｙｐ／Ｐｒｏ−Ｘａ−Ｘｂ−Ｘｃ（式中、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／ＡｌａはＬｅｕ、ＩｌｅまたはＡｌａを示し、Ｈｙｐ／ＰｒｏはＨｙｐまたはＰｒｏを示し、ＸａはＨｙｐ、Ｐｒｏ、ＩｌｅおよびＡｒｇ以外のアミノ酸残基または欠失であり、ＸｂはＰｒｏまたは欠失、ＸｃはＡｌａまたは欠失である。）で示されるいずれか１種以上との混合物をＤＰＰ−４阻害剤として好適に使用することができる。いずれもコラーゲンのアミノ酸配列に由来するが、式（Ａ）はＮ末端がＧｌｙであり、式（Ｂ）はＮ末端がＧｌｙ以外のアミノ酸残基であるため、摂取後の代謝速度その他が異なり、併用効果が期待できるからである。
【００５４】
本発明のＤＰＰ−４阻害剤は、これを食品に配合して経口摂取することができる。このような本発明のＤＰＰ−４阻害剤が配合された食品としては、野菜やフルーツ、乳酸菌などを含むジュースその他の飲料、ゼリー、ヨーグルト、プリン、アイスクリームなどの半流動性食品の他、他の食材に混練して固形食品に調製することができる。
【００５５】
また、ＤＰＰ−４阻害剤は、Ｔリンパ球の増殖効果を有し、また自己免疫性脊椎炎、多発性硬化症、関節炎、リューマチなどの自己免疫疾患を緩和することが指摘されている。したがって、本発明のＤＰＰ−４阻害剤も上記疾患に使用しうる可能性がある。この際の用途は、内服に限定されず炎症部位に注入するなどの外科的処方であってもよい。
【実施例】
【００５６】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。【００５７】
ＤＰＰ−４阻害活性の測定方法
（１）ＤＰＰ−４阻害率の測定方法
５０ｍＭのトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．５）１ｍｌに試料１ｍｇを溶解したサンプル液３５μｌと、５０ｍＭのトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．５）に溶解したＤＰＰ−４（シグマ社製、豚腎臓由来；８．６ｍＵ／ｍｌ）１５μｌとをマイクロプレートウェル（ＮＵＮＣ社製、商品名「２３７０１５」）中で混合し３７℃、１０分間インキュベートした。
これに、予め３７℃に保温しておいた基質溶液（グリシルＰｒｏ−４−メチルクマリン−７−アミド（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＭＣＡ）を１０μＭとなるよう５０ｍＭトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．５）に溶解したもの）５０μｌを添加および混合し、３７℃で２０分間反応させた。
ＤＰＰ−４によって遊離される７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）の蛍光強度をマイクロプレートリーダー型蛍光検出器（コロナ電器社製、商品名「ＳＨ−９０００」）で経時的に測定した。なお、測定波長は励起波長３８０ｎｍ、測定波長４６０ｎｍで行った。なお、サンプルに代えて５０ｍＭのトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．５）を同量使用したものを対照として蛍光強度を測定した。
ＤＰＰ−４の活性は、反応時間中における蛍光強度変化量の平均勾配で表し、ＤＰＰ−４阻害率は、対照を１００％とし、サンプルの活性を前記対照から差し引いた分を阻害率（％）として算出した。【００５８】
（２）ＩＣ５０値の測定方法
上記したＤＰＰ−４阻害率の測定方法に準じて、サンプル濃度を０．００１〜７．２μｍｏｌ／ｍｌの間で変化させて阻害率を得て、ＤＰＰ−４活性の５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）を算出した。【００５９】
（実施例１）
表１に示すＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏを、アプライドバイオシステムズ社製のペプチド自動合成装置（４３３Ａ）を用いたＦｍｏｃ固相合成法にて合成した。
合成は、オリゴペプチドのＣ−末端にあたるアミノ酸を樹脂に担時させ、Ｎ−末端を１アミノ酸ずつ伸長させていくステップワイズエロンゲーション法にて行い、伸長反応にあたるペプチドカップリング反応は、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）と１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を縮合剤として用いた。なお、伸長させていくＮ−末端アミノ酸のアミノ基は、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）にて保護したが、オリゴペプチドの構成アミノ酸には反応活性のある側鎖が含まれていないため、特に側鎖の保護は行わないこととした。
まず、オリゴペプチドのＣ−末端にあたるＰｒｏのＮ−末端をＦｍｏｃで保護し、Ｃ−末端を樹脂に担持させたＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ｗａｎｇ樹脂（０．５−０．８ｍｍｏｌ／ｇ、Ｂａｃｈｅｍ社製）０．５ｇを樹脂に担持させた。これをペプチド自動合成装置の反応容器に入れ、２０％ピペリジン−ＤＭＦ溶液でＦｍｏｃの脱保護を１０分間行った。ＤＭＦで樹脂を１分間洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、ＤＩＣおよびＨＯＢｔをそれぞれ１ｍｍｏｌずつ反応溶液に加えた。１時間反応後、未反応のＮ−末端が検出されない事を確認し、ＤＭＦで１分間洗浄した。更に２０％ピペリジン−ＤＭＦでＦｍｏｃの脱保護を行い、ＤＭＦで樹脂を洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、ＤＩＣおよびＨＯＢｔをそれぞれ１ｍｍｏｌ加え反応を行った。以下同様の方法でＰｒｏ、Ｇｌｙについても上記操作を行い、アミノ酸を一つずつ伸長させた。得られたＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｗａｎｇ樹脂を２０％ピペリジン−ＤＭＦ溶液で１０分間脱保護後、減圧乾燥を行った。得られた乾燥樹脂をＴＦＡ（１０ｍＬ×３回）で処理し、樹脂からオリゴペプチド粗生成物をＴＦＡに溶出させた。
得られたＴＦＡ溶液は室温にて減圧留去後、残渣に氷冷下ジエチルエーテル１０ｍＬを加え沈殿物を得た。沈殿物は更にジエチルエーテル（１０ｍＬ×５回）で洗浄し、沈殿物を減圧乾燥させた。このとき得られた粗生成物の重量は３８．５ｍｇ（収率２９．８％）であった。得られた粗生成物は精製水に溶解し、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分取し精製した。得られた精製物は薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ＨＰＬＣにて純度を確認後、エドマン法にてアミノ酸配列を決定し、質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）にて目的の分子量であることを確認した。
最終的な目的物の重量は３０．７ｍｇで収率は２３．８％であった。
得られたペプチドを用いてＤＰＰ−４阻害率およびＩＣ５０値を測定した。結果を表１に示す。【００６０】
（実施例２〜実施例９）
オリゴペプチドのＣ−末端アミノ酸としてＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｗａｎｇ樹脂、Ｆｍｏｃ−Ｈｙｐ−Ｗａｎｇ樹脂、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−Ｗａｎｇ樹脂、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｗａｎｇ樹脂、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ−Ｗａｎｇ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ｗａｎｇ樹脂を使用し、Ｆｍｏｃ基保護アミノ酸として、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨを使用し、実施例１に準じて表１に示す、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ(実施例２)、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ（実施例３）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ（実施例４）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ（実施例５）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ（実施例６）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ（実施例７）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ（実施例８）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（実施例９）を合成した。【００６１】
なお、実施例２のペプチドの合成は、実施例１と相違して、２つのアミノ基を含むＡｒｇを使用するため、Ａｒｇ側鎖のグアニジノ基をＰｂｆ基（２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルフォニル基）で保護したＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｗａｎｇ樹脂を使用し、最後にＴＦＡにてＰｂｆ基の除去を行った。【００６２】
同様に、実施例８のペプチドの合成では、側鎖にアミド基を含むＧｌｎを使用するため、Ｇｌｎ側鎖のアミド基をＴｒｔ基（トリチル基）で保護したＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｗａｎｇ樹脂を使用し、最後にＴＦＡにてＴｒｔ基の除去を行った。【００６３】
得られたペプチドを用いて実施例１と同様にしてＤＰＰ−４阻害率を測定した。結果を表１に示す。また、実施例６で合成したペプチド（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ）のＤＰＰ−４阻害曲線を作成した。この阻害曲線を図１に示す。【００６４】
（実施例１０〜実施例１５）
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸を使用し、実施例１に準拠して、表１に示す実施例１０〜１５のペプチドを合成しＤＰＰ−４阻害曲線を作成した。結果を表１に示す。なお、実施例１０のペプチドの合成は、実施例１と相違して、２つのカルボキシル基を含むＧｌｕを使用するため、Ｇｌｕ側鎖のカルボキシル基をtertiary−ブチル基（Ｂｕｔ基）で保護したＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−Ｗａｎｇ樹脂を使用し、最後にＴＦＡにてＢｕｔ基の除去を行った。【００６５】
また、実施例１３のペプチドは、オリゴペプチドのＣ−末端アミノ酸としてＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ｗａｎｇ樹脂を使用し、実施例１に準じてＧｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒを合成した。なお、実施例１と相違して、水酸基を含むセリンを使用するためＳｅｒ側鎖の水酸基をtertiary−ブチル基（Ｂｕｔ基）で保護したＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ｗａｎｇ樹脂を使用し、最後にＴＦＡにてＢｕｔ基の除去を行った。【００６６】
（比較例１〜比較例３）
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸を使用し、実施例１に準じて、表１に示す比較例１〜比較例３のペプチドを合成した。得られたペプチドを用いてＤＰＰ−４阻害率およびＩＣ５０値を測定した。結果を表１に示す。なお、比較例１〜比較例３のペプチドは、いずれも配列番号１４のアミノ酸配列の一部を構成するペプチドである。
なお、本願では、上記測定法に基づくＤＰＰ−４阻害率が３０％以下、またはＩＣ５０が１０μｍｏｌ／ｍｌ以上のいずれかを満たすものを比較例とした。【００６７】
【表１】
0005926279.tif 000002
【００６８】
（結果）
表１の実施例１〜６、９、１２〜１５に示すように、Ｎ末端がＧｌｙであり、Ｎ末端から２番目のアミノ酸残基がＰｒｏまたはＡｌａのアミノ酸数４〜６のペプチドは、Ｎ末端が４番目のアミノ酸残基がＧｌｙであると、Ｎ末端から３番目のアミノ酸の種類を問わず、いずれもＤＰＰ−４阻害活性に優れた。特に、実施例１〜４、および実施例９に示すように、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙの配列を有するペプチドは、ペプチド長が長くなるに従いＤＰＰ−４阻害活性が増加した。
表１の比較例１〜比較例３と実施例７、８、１０および１１とを比較して明らかなように、ジペプチドまたはトリペプチドの場合、Ｎ末端から２番目がＰｒｏやＡｌａであっても３番目がＨｙｐであるとＤＰＰ−４阻害活性が極めて低いかＤＰＰ−４阻害活性は存在しなかった。【００６９】
（実施例１６〜実施例２５）
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸を使用し、実施例１に準拠して、表２に示すペプチドを合成した。また、実施例１７で合成したペプチド（Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）のＤＰＰ−４阻害曲線を作成した。この阻害曲線を図２に示す。【００７０】
（比較例４〜比較例７）
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸を使用し、実施例１に準じて、表２に示す比較例４から比較例７のペプチドを合成した。得られたペプチドを用いてＤＰＰ−４阻害率およびＩＣ５０値を測定した。結果を表２に示す。なお、比較例４から比較例７のペプチドは、いずれも配列番号１４のアミノ酸配列の一部を構成するペプチドである。【００７１】
【表２】
0005926279.tif 000003
【００７２】
（結果）
表２の実施例１６〜実施例２５から、Ｎ末端から２番目のアミノ酸残基がＨｙｐであっても、ＤＰＰ−４阻害活性が発揮されることが判明した。一方、実施例２０と比較例４〜７とを比較して明らかなように、Ｎ末端から２番目のアミノ酸残基がＰｒｏまたはＨｙｐであるジペプチドは、Ｎ末端のアミノ酸残基の種類によってＤＰＰ−４阻害活性が大きく異なる傾向があり、Ｐｈｅ、Ｐｒｏの場合にはＤＰＰ−４阻害活性は全く存在しない。
実施例２５と比較例６とを比較すると、Ａｌａ−ＨｙｐのジペプチドにＮ末端から３番目のアミノ酸残基としてＧｌｙが結合するとＤＰＰ−４阻害活性が発揮される。この傾向は、実施例２１から実施例２５に示すように、Ｎ末端のアミノ酸残基に限定されずに観察された。更に、実施例１６〜実施例１８に示すように、Ｎ末端から２番目のアミノ酸残基がＰｒｏの場合も３番目にＧｌｙが結合するとＤＰＰ−４阻害活性が増し、ペプチド長が長くなると更にＤＰＰ−４阻害活性が増強される傾向が観察された。【００７３】
本発明は２０１１年１１月４日に出願された日本国特許出願２０１１−２４２０５０号に基づく。本明細書中に日本国特許出願２０１１−２４２０５０号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明によれば、コラーゲンに由来する安全性に優れるＤＰＰ−４阻害剤を調製することができ、有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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