(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）採取された臍帯血または採取された末梢血から、ＣＤ８陽性分画の細胞を抽出し、培養するステップと、
（２）前記ＣＤ８陽性分画の細胞に、抗ＣＤ２８抗体が固相化された固体支持体と、ＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドとを曝露させるステップと、
（３）前記ＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドを認識する細胞傷害性Ｔ細胞を培養するステップとを含むことを特徴とする、細胞傷害性Ｔ細胞を含む医薬品組成物の製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記固体支持体はマイクロビーズ又は細胞培養容器であることを特徴とする、
方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法であって、
前記ＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドは、前記ＣＤ８陽性分画の細胞のＨＬＡ適合型のＨＬＡ複合体によって抗原として提示され、前記細胞傷害性Ｔ細胞に認識されることを特徴とする、方法。
【請求項４】
腫瘍治療用医薬品組成物の製造方法であって、
請求項３に記載の方法を含み、
前記ＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドは、腫瘍細胞の特異的抗原タンパク質のアミノ酸配列の一部を含み、前記細胞傷害性Ｔ細胞は前記腫瘍細胞を認識することを特徴とする、
方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、
腫瘍細胞の特異的抗原タンパク質はＷＴ−１であることを特徴とする、
方法。
【請求項６】
ウイルス疾患治療用医薬品組成物の製造方法であって、
請求項３に記載の方法を含み、
前記ＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドは、ウイルスの特異的抗原タンパク質のアミノ酸配列の一部を含み、前記細胞傷害性Ｔ細胞は前記ウイルス感染細胞を認識することを特徴とする、
方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、
前記ウイルスの特異的抗原タンパク質はサイトメガロウイルスのｐｐ６５タンパク質であることを特徴とする、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物と、該細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物を曝露して得られる細胞傷害性Ｔ細胞を含む医薬品組成物と、該医薬品組成物の製造方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内において、抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（以下、「ＣＴＬ」ともいう。）は、造血幹細胞由来のＣＤ８陽性細胞が樹状細胞との相互作用によって誘導される。前記相互作用には、抗原分子の断片と樹状細胞の表面のＨＬＡクラスＩ分子との複合体と、ＣＤ８陽性細胞の表面のＴＣＲ／ＣＤ３／ＣＤ８複合体との会合が関与する。そして、前記相互作用の結果、前記ＣＤ８陽性細胞は、前記ＨＬＡクラスＩ分子の適合型と一致するＨＬＡクラスＩ分子が前記抗原分子の断片と複合体を形成している細胞を特異的に認識して攻撃する細胞になる。前記相互作用は、他に、ＣＤ８陽性細胞の表面のＣＤ２８分子と、樹状細胞の表面のＣＤ８０／８６分子との会合によって促進される。
【０００３】
ウイルス感染の場合には、ウイルス抗原を特異的に認識する細胞傷害性Ｔ細胞がウイルス感染細胞を攻撃する。腫瘍細胞の場合には、腫瘍特異的な抗原を認識する細胞傷害性Ｔ細胞が腫瘍細胞を攻撃する。そこで、腫瘍の免疫療法では、細胞傷害性Ｔ細胞を如何にして効率的に誘導するかが問題となる。
【０００４】
サイトカインの研究の進歩によって、臍帯血、末梢血、骨髄等の造血幹細胞から細胞傷害性Ｔ細胞の前駆細胞であるＣＤ８陽性細胞を分化・増殖させる技術は比較的容易になった。しかし、樹状細胞を生体から大量に単離精製することは困難である。そこで、人工的に樹状細胞の機能を模倣する技術が開発されてきた。かかる人工抗原提示細胞の例には、線維芽細胞のような培養細胞に、ＨＬＡクラスＩ分子、抗原分子、ＣＤ８０／８６分子等の遺伝子をトランスフェクションさせて、樹状細胞の代行をさせる技術がある。また、ＭＨＣクラスＩ分子４量体と抗原ペプチドとの複合体（以下、「抗原テトラマー」という。）は、同一細胞表面の複数のＴ細胞レセプターと結合できるので、解離定数が高く、特定の抗原を認識するＴ細胞を検出する（非特許文献１）他、抗原特異的なＴ細胞活性化に用いられている（非特許文献２）。そして、フィコエリスリン（以下、「ＰＥ」という。）で標識された抗原テトラマーと、ＰＥで標識された抗ＣＤ２８抗体とが、ビオチン化された抗ＰＥ抗体とアビジンとを介して結合された蛍光標識常磁性ビーズ粒子は、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導できる（非特許文献３）。これは生物とはいえないが、人工抗原提示細胞の一種とされる。
【０００５】
ビーズ、微粒子等の表面に、ＣＤ８陽性細胞で発現する分子に対する抗体を結合させて、樹状細胞の代わりにＣＤ８陽性細胞を刺激する技術もある。かかる固相化抗体による技術では、アゴニスト活性を有する抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を同一のビーズ粒子に結合させた、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズが知られている（特許文献１）。ＣＴＬを誘導する相互作用のうち、抗原分子の断片と樹状細胞の表面のＨＬＡクラスＩ分子との複合体と、ＣＤ８陽性細胞の表面のＴＣＲ／ＣＤ３／ＣＤ８複合体との会合については、抗原分子の断片と樹状細胞の表面のＨＬＡクラスＩ分子との複合体の代わりに、アゴニスト活性を有する抗ＣＤ３抗体を用いることによって、ＣＤ８陽性細胞を刺激することができる。また、ＣＤ８陽性細胞の表面のＣＤ２８分子と、樹状細胞の表面のＣＤ８０／８６分子との会合については、樹状細胞の表面のＣＤ８０／８６分子の代わりに、アゴニスト活性を有する抗ＣＤ２８抗体を用いることによって、ＣＤ８陽性細胞を刺激することができる。しかしながら、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズだけでは抗原特異的なＣＴＬ誘導はできず、抗原特異的なＣＴＬ誘導を行うためには、生体由来の抗原提示細胞か、人工抗原提示細胞かを併用する必要があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００４／１０４１８５号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ａｌｔｍａｎ、Ｊ．Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４：９４（１９９６）
【非特許文献２】Ｄａｎｉｅｌｓ、Ｍ．Ａ．及びＪａｍｅｓｏｎ、Ｓ．Ｃ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９１：３３５（２０００）
【非特許文献３】Ｏｅｌｋｅ、Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、９：６１９（２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、従来の抗原提示細胞又は人工抗原提示細胞を作成するのは、時間及び労力を要する。したがって、任意の抗原について、簡便に抗原特異的なＣＴＬ誘導を行うことができる新規技術を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、抗ＣＤ２８抗体と、該抗ＣＤ２８抗体が固相化された固体支持体と、ＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドとを含む、細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物を提供する。
【００１０】
本発明の細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物は、抗ＣＤ２８抗体と、該抗ＣＤ２８抗体が固相化された固体支持体と、ＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドとからなる場合がある。
【００１１】
本発明の細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物において、前記固体支持体は、前記ＣＤ８陽性細胞を含む細胞培養に用いられる培養容器か、マイクロビーズかの場合がある。
【００１２】
本発明の細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物において、前記ＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドは、患者のＨＬＡ適合型のＨＬＡ複合体によって抗原として提示され、前記細胞傷害性Ｔ細胞に認識される場合がある。
【００１３】
本発明は腫瘍治療用医薬品組成物を提供する。本発明の腫瘍治療用医薬品組成物は、本発明の細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物を含み、前記ＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドは、腫瘍細胞の特異的抗原タンパク質のアミノ酸配列の一部を含み、前記細胞傷害性Ｔ細胞は前記腫瘍細胞を認識する。
【００１４】
本発明の腫瘍治療用医薬品組成物において、前記腫瘍細胞の特異的抗原タンパク質はＷＴ−１の場合がある。
【００１５】
本発明はウイルス疾患治療用医薬品組成物を提供する。本発明のウイルス疾患治療用医薬品組成物は、本発明の細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物を含み、前記ＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドは、ウイルスの特異的抗原タンパク質のアミノ酸配列の一部を含み、前記細胞傷害性Ｔ細胞は前記腫瘍細胞を認識する。
【００１６】
本発明のウイルス疾患治療用医薬品組成物において、前記ウイルスの特異的抗原タンパク質はサイトメガロウイルスのｐｐ６５タンパク質の場合がある。
【００１７】
本発明は医薬品組成物を提供する。本発明の医薬品組成物は、造血幹細胞由来のＣＤ８陽性細胞に本発明の細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物を曝露して得られ、前記ＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドを認識する細胞傷害性Ｔ細胞を含む。
【００１８】
本発明の医薬品組成物において、前記造血幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞及び人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞からなるグループから選択されるいずれかの幹細胞由来の造血幹細胞と、臍帯血由来の造血幹細胞と、末梢血由来の造血幹細胞と、骨髄血由来の造血幹細胞とからなるグループから選択される場合がある。
【００１９】
本発明は、細胞傷害性Ｔ細胞を含む医薬品組成物の製造方法を提供する。本発明の細胞傷害性Ｔ細胞を含む医薬品組成物の製造方法は、（１）胚性幹細胞、成体幹細胞及び人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞からなるグループから選択されるいずれかの幹細胞由来の造血幹細胞と、臍帯血由来の造血幹細胞と、末梢血由来の造血幹細胞と、骨髄血由来の造血幹細胞とからなるグループから選択される少なくとも１種類の造血幹細胞からＣＤ８陽性細胞を優占的に増殖させるステップと、（２）前記ＣＤ８陽性細胞に、請求項１に記載の細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物を曝露させるステップと、（３）前記ＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドを認識する細胞傷害性Ｔ細胞を培養するステップとを含む。
【００２０】
本発明の細胞傷害性Ｔ細胞を含む医薬品組成物の製造方法において、前記ＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドは、ヒトＷＴ−１タンパク質か、サイトメガロウイルスのｐｐ６５タンパク質かのアミノ酸配列を含む場合がある。
【００２１】
本発明は、本発明の細胞傷害性Ｔ細胞を含む医薬品組成物を移植するステップを含む、免疫療法を提供する。
【００２２】
本発明の免疫療法は、患者の末梢血及び骨髄を含むが、これらに限定されない造血幹細胞を採取して得られるＣＤ８陽性細胞か、あるいは、得られた造血幹細胞から分化及び／又は増幅されるＣＤ８陽性細胞かを、試験管内で本発明の細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物に曝露するステップと、誘導された細胞傷害性Ｔ細胞を患者に再移植するステップとを含む場合がある。
【００２３】
本発明の免疫療法は、患者の体細胞由来の成体幹細胞か、患者の体細胞由来の人工多能性幹細胞かから分化されるＣＤ８陽性細胞を、試験管内で本発明の細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物に曝露するステップと、誘導された細胞傷害性Ｔ細胞を患者に再移植するステップとを含む場合がある。
【００２４】
本発明のＣＤ８陽性細胞の出所は、末梢血と骨髄とリンパ節と臍帯血とを含むが、これらに限定されない組織の場合がある。本発明の樹状細胞又はその前駆細胞は末梢血から調製されることが好ましい。しかし、胚性幹細胞、成体幹細胞及び人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞から生成される造血幹細胞から調製されてもかまわない。
【００２５】
ＣＤ８陽性細胞が細胞傷害性Ｔ細胞に誘導されるためには、ＣＤ８陽性細胞上のＣＤ２８を刺激するのと同時に、ＭＨＣクラスＩ分子及び抗原エピトープ分子との複合体と、Ｔ細胞レセプター／ＣＤ３／ＣＤ８複合体との会合による抗原提示が起こる必要がある。本発明によると、固相化された抗ＣＤ２８抗体と、可溶性抗原ペプチドとだけを用いて、樹状細胞を用いないで、ＣＤ８陽性細胞が細胞傷害性Ｔ細胞に誘導される。その作用機序について理論的に拘泥するわけではないが、ＣＤ８陽性細胞の培養に含まれるＨＬＡクラスＩ分子を発現する細胞の関与を想定することによって本発明の細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物の作用機序は合理的に説明することができる。図１は本発明の作用機序を説明するための模式図である。図１を参照して、ＣＤ８陽性細胞１は、可溶性ペプチド２と、磁気ビーズのような固体支持体３に固定化された抗ＣＤ２８抗体４とによるＣＴＬ誘導に供される。ここで固体支持体３に固定化された抗ＣＤ２８抗体４は、ＣＤ８陽性細胞１上のＣＤ２８分子５と反応して、ＣＤ２８分子５が樹状細胞上のＣＤ８０／８６と相互作用したのと同じ刺激をＣＤ８陽性細胞１に与える。一方、可溶性ペプチド２だけでは、ＣＤ８陽性細胞１上のＴ細胞レセプター／ＣＤ３／ＣＤ８複合体６に認識されない。しかし可溶性ペプチド２は、前記ＣＤ８陽性細胞１の培養中のＨＬＡクラスＩ分子を発現する細胞８上のＨＬＡクラスＩ分子７と結合すると、ＣＤ８陽性細胞１上のＴ細胞レセプター／ＣＤ３／ＣＤ８複合体６に抗原として提示される。こうして、可溶性ペプチド２と、固体支持体３に固定化された抗ＣＤ２８抗体とをＣＤ８陽性細胞１に添加するだけで、ＨＬＡクラスＩ分子７で制限された可溶性ペプチド２を認識する細胞傷害性Ｔ細胞９がＣＤ８陽性細胞１から誘導される。本発明の方法によると、可溶性ペプチドを取り替えるだけで、異なる種類の抗原に対するＣＴＬ誘導を行うことができる。また、同時に２種類又は３種類以上の抗原に対するＣＴＬ誘導を行うこともできる。
【００２６】
本発明のＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドは、本明細書に添付される配列表の配列番号１ないし５に列挙されるアミノ酸配列からなる場合がある。本発明のＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ拘束性エピトープに限定されない。試験管内でその他の抗原に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を増幅できること、及び、かかる細胞傷害性Ｔ細胞を患者に移植すると臨床効果が得られることは従来から知られている。例えば、Ｇｏｄｅｔ、Ｙ．ら、（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、５８：  ２７１−２８０（２００９））は、メラノーマに特異的な癌抗原チロシナーゼ由来のＨＬＡ−Ｂ拘束性ペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を得た。Ｓｔｒａａｔｈｏｆ、Ｋ．  Ｃ．  Ｍ．ら、（Ｂｌｏｏｄ、１０５：  １８９８−１９０４（２００５））は、ＥＢウイルス関連抗原ＬＭＰ２のＨＬＡ−Ｂ拘束性エピトープ、ＥＢウイルス関連抗原ＥＢＮＡ１のＨＬＡ−Ｂ拘束性エピトープ、ＥＢウイルス関連抗原ＥＢＮＡ３のＨＬＡ−Ｂ拘束性エピトープ、ＥＢウイルス関連抗原ＢＺＬＦ１のＨＬＡ−Ｂ拘束性エピトープ等に特異的なＣＴＬを、ＥＢウイルス関連鼻咽頭癌患者に移植して臨床効果を得た。Ｗａｌｔｅｒ、Ｅ．  Ａ．  ら、（Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．、３３３：  １０３８−４４（１９９５））はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）特異的ＣＴＬを、白血病治療のためにＣＭＶ陽性血縁者から骨髄移植を受けた後、免疫抑制剤を投与されている間にＣＭＶが再活性化した患者に移植して臨床効果を得た。なお、Ｂｉｏｌｅｙ  Ｇ．ら（Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １５：  ２９９−３０６（２００９））によると、癌抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１をワクチン接種した患者から当該抗原由来のＨＬＡ−Ｂ又はＨＬＡ−Ｃ拘束性ペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞が得られた。そこで、本発明のＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドは、ＷＴ−１タンパク質由来のペプチドのようなＨＬＡ−Ａ拘束性エピトープだけでなく、ＨＬＡ−Ｂ又はＨＬＡ−Ｃ拘束性エピトープであってもよい。
【００２７】
患者の細胞が発現する疾患関連抗原は、ＷＴ−１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、サバイビン、チロシナーゼ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＥＡ、ＮＳＥ、ＰＳＡ、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−３を含むが、これらに限られない腫瘍関連抗原と、ＥＢＥＲ、ＬＭＰ−１等のＥＢウイルス関連抗原のように癌細胞で（過剰に）発現する抗原の場合と、サイトメガロウイルスｐｐ６５（ＣＭＶｐｐ６５）タンパク質等のサイトメガロウイルス特異抗原、ＨＩＶｇｐ１６０等のエイズウイルス特異抗原を含むが、これらに限られないウイルス特異抗原のように感染細胞で発現する抗原の場合とがある。したがって本発明の医薬品組成物は、癌治療に用いられる場合と、感染症治療に用いられる場合とがある。本発明のＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドはこれらの抗原のエピトープであってもよい。
【００２８】
本発明のＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドは、天然のタンパク質と同一のアミノ酸配列か、天然のタンパク質のアミノ酸とは一部異なるアミノ酸配列かからなる場合がある。あるいは、天然のタンパク質と同一のアミノ酸配列か、天然のタンパク質のアミノ酸とは一部異なるアミノ酸配列かを含むペプチドの場合がある。例えば、前記可溶性ペプチドは、ＷＴ−１タンパク質の第１２６番目から第１３４番目までのアミノ酸配列（配列番号１）と、ＷＴ−１タンパク質の第２３５番目から第２４３番目までのアミノ酸配列のうち、第２３６番目のメチオニン残基がチロシン残基に置換された突然変異体型アミノ酸配列（配列番号２）と、ｈＴＥＲＴの第４６１番目から第４６９番目までのアミノ酸配列（配列番号３）と、サバイビンのスプライシングバリアント２Ｂの第８０番目から第８８番目までのアミノ酸配列（配列番号４）と、ＣＭＶｐｐ６５の第３４１番目から第３４９番目までのアミノ酸配列（配列番号５）とからなるグループから選択されるアミノ酸配列からなるか、あるいは、該グループから選択されるアミノ酸配列を含む場合がある。
【００２９】
本発明の固相化された抗ＣＤ２８抗体は、ＣＤ２８に対してアゴニスト活性を有するいずれかの抗体であればよい。固相化には、培養ＣＤ８陽性細胞の表面にアクセスして、有効なＣＴＬ誘導を行うことができるいずれかの固体支持体が用いられる。本発明において好ましい固体支持体は、ラテックスその他の商業的に入手可能な微粒子及び培養容器を含むが、これらに限定されない。前記培養容器は、ディッシュ、フラスコ、プレート、マルチウェルプレートを含むが、これらに限定されない。本発明の抗ＣＤ２８抗体は、本発明の固体支持体に直接的に結合されてもよいが、アビジン−ビオチンのような特異的相互作用を行う特異的結合パートナーを介して結合されてもよい。ストレプトアビジンが固定化されたマイクロビーズと、ビオチン化された抗ＣＤ２８抗体とが用いられる場合がある。前記マイクロビーズは、磁性を有する場合がある。以下では、ビオチンとストレプトアビジンとの特異的相互作用によりマイクロビーズに固定化された抗ＣＤ２８抗体を抗ＣＤ２８免疫ビーズという場合がある。
【００３０】
本発明の医薬品組成物は、医薬品として許容される担体を含む場合がある。生細胞を懸濁することができるいずれかの溶液、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地、血清等が代表例である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明の細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物の作用機序に関する仮説を示す模式図。
【図２Ａ】ＣＴＬ誘導処理を施さないで培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、フルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ＣＤ３抗体及びアロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識抗ＣＤ８抗体で染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。
【図２Ｂ】ＣＴＬ誘導処理を施さないで培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＷＴ−１（ｍｕ）−テトラマーと、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。
【図２Ｃ】可溶性ＷＴ−１ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによるＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導を行った後、培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。
【図２Ｄ】可溶性ＷＴ−１ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによるＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導を行った後、培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＷＴ−１（ｍｕ）−テトラマーと、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。
【図２Ｅ】ＷＴ−１変異ペプチド添加同種末梢血由来樹状細胞によるＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導を行った後、培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。
【図２Ｆ】ＷＴ−１変異ペプチド添加同種末梢血由来樹状細胞によるＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導を行った後、培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＷＴ−１（ｍｕ）−テトラマーと、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。
【図２Ｇ】ＷＴ−１変異ペプチド添加自家臍帯血単球由来樹状細胞によるＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導を行った後、培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。
【図２Ｈ】ＷＴ−１変異ペプチド添加自家臍帯血単球由来樹状細胞によるＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導を行った後、培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＷＴ−１（ｍｕ）−テトラマーと、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。
【図３】可溶性ＷＴ−１ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによってＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬの誘導処理が施された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＷＴ−１（ｍｕ）−テトラマーと、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。
【図４Ａ】ＣＴＬ誘導処理を施さないで培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。
【図４Ｂ】ＣＴＬ誘導処理を施さないで培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＷＴ−１（ｍｕ）−テトラマーと、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。
【図４Ｃ】ｈＴＥＲＴ可溶性ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによって刺激された後、培養された末梢血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ｈＴＥＲＴ−テトラマーと、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。
【図４Ｄ】ＰＥ標識ｈＴＥＲＴペプチド−テトラマーを混合しないで、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とを混合して染色されたサンプルで、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。
【図５Ａ】ＣＴＬ誘導処理を施さないで培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。
【図５Ｂ】ＣＴＬ誘導処理を施さないで培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）−２Ｂ−テトラマーと、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。
【図５Ｃ】ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２  ｓｕｒｖｉｖｉｎ−２Ｂ  ＡＹＡＣＮＴＳＴＬ可溶性ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによって刺激された後、培養された末梢血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ｈＴＥＲＴ−テトラマーと、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。
【図５Ｄ】ＰＥ標識ｓｕｒｖｉｖｉｎ−２Ｂペプチド−テトラマーを混合しないで、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とを混合して染色されたサンプルで、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。
【図６Ａ】ＷＴ−１変異ペプチド、ＣＭＶｐｐ６５ペプチド、ｈＴＥＲＴ可溶性ペプチド、ｓｕｒｖｉｖｉｎ−２Ｂ可溶性ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによって刺激された後、培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体、ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＷＴ−１（ｍｕ）−テトラマーと、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。
【図６Ｂ】ＷＴ−１変異ペプチド、ＣＭＶｐｐ６５ペプチド、ｈＴＥＲＴ可溶性ペプチド、ｓｕｒｖｉｖｉｎ−２Ｂ可溶性ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによって刺激された後、培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＣＭＶｐｐ６５−テトラマーと、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。
【図６Ｃ】ＷＴ−１変異ペプチド、ＣＭＶｐｐ６５ペプチド、ｈＴＥＲＴ可溶性ペプチド、ｓｕｒｖｉｖｉｎ−２Ｂ可溶性ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによって刺激された後、培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ｈＴＥＲＴ−テトラマーと、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。
【図６Ｄ】ＷＴ−１変異ペプチド、ＣＭＶｐｐ６５ペプチド、ｈＴＥＲＴ可溶性ペプチド、ｓｕｒｖｉｖｉｎ−２Ｂ可溶性ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによって刺激された後、培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ｓｕｒｖｉｖｉｎ−２Ｂ−テトラマーと、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。
【図６Ｅ】ＣＴＬ誘導が施されなかった対照実験の臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞についてＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＷＴ−１（ｍｕ）−テトラマーと、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。
【図６Ｆ】ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とを混合して染色されたサンプルで、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。
【符号の説明】
【００３２】
１    ＣＤ８陽性細胞
２    可溶性ペプチド
３    固体支持体
４    抗ＣＤ２８抗体
５    ＣＤ２８分子
６    Ｔ細胞レセプター／ＣＤ３／ＣＤ８複合体
７    ＨＬＡクラスＩ分子
８    ＨＬＡクラスＩ分子を発現する細胞
９    ＨＬＡクラスＩ分子７で制限された可溶性ペプチド２を認識する細胞傷害性Ｔ細胞
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
【実施例１】
【００３４】
臍帯血からのＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導（１）
１．材料及び方法
（１）ヒト臍帯血
ヒト臍帯血試料は、母親のインフォームド・コンセント署名を得た後に採血され、理化学研究所バイオリソースセンター内の液体窒素システムで凍結保存された。採血方法はＲｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｐ．ら（Ｂｌｏｏｄ，８１：１６７９−１６９０（１９９３））に説明され、凍結保存方法はＲｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｐ．ら（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９２：１０１１９−１０１２２（１９９５））に説明される。
【００３５】
（２）培地及び試薬
培地としてＸ−ＶＩＶＯ（商標）１５（タカラバイオ株式会社、滋賀）が使用された。一部の実験では最終濃度０ないし５％のヒトＡＢ型血清（Ｌｏｎｚａ、ロンザジャパン株式会社）が添加された。組換えヒトＩＬ−７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、東洋紡績株式会社）と、ＩＬ−１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、東洋紡績株式会社）とが、それぞれ、０ないし１０ｎｇ／ｍＬと、０ないし３００ｎｇ／ｍＬとの最終濃度で添加された。可溶性ペプチドとしては、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＷＴ−１（ｍｕ）ＣＹＴＷＮＱＭＮＬが用いられた。当該ペプチドのアミノ酸配列（ＣＹＴＷＮＱＭＮＬ）は、添付される配列表に配列番号２として列挙される。固相化された抗ＣＤ２８抗体としては、ビオチン化抗ヒトＣＤ２８マウスモノクローナル抗体（クローンＣＤ２８．２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  Ｊａｐａｎ株式会社）が磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）  Ｍ−２８０  ストレプトアビジン、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）と室温で３０分間インキュベーションされ、ビオチン・アビジン反応により結合されてから用いられた。前記磁気ビーズに結合された抗ＣＤ２８抗体は、以下、ビオチン化ＣＤ２８抗体とビーズとの複合体、又は、固相化抗ＣＤ２８抗体という。
【００３６】
（３）自家臍帯血由来樹状細胞の精製及び増幅
理化学研究所から入手した臍帯血（ＩＤ番号：ＨＣＢ００７４７、ＨＬＡ−Ａ遺伝子座の適合型：２４：０２及び０２：０６）２５ｍＬは３７°Ｃの温水浴で解凍され、終濃度５％デキストセラン４０（テルモ・ジャパン社）と終濃度２．５％ヒト血清アルブミン（日本赤十字社）が添加されたＰＢＳ中に浮遊された。得られた白血球は、５ｍＭ  ＥＤＴＡ及び２％ヒト血清アルブミンが添加されたＰＢＳでさらに３回洗浄された。その後、前記白血球懸濁液に細胞１０８個あたり２５μＬのＤｙｎａｌ（商標）免疫磁気ビーズＣＤ１４（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）が添加され、室温２０°Ｃで１０分間以上攪拌された。ＣＤ１４陽性細胞と、ビーズを貪食した単球マクロファージとが磁気粒子分離器（ＤｙｎａＭａｇ−１５、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて分離された。ＣＤ１４陰性細胞の分画は以下の（４）節のとおり、ＣＤ３／ＣＤ２８陽性細胞の精製及び増幅に用いられた。分離されたＣＤ１４陽性単球は、５％ヒトＡＢ型血清が添加されたＸ−ＶＩＶＯ（商標）１５培地に１０６個／ｍＬの濃度で浮遊され、３５ｍｍシャーレ（ＥＺ−ＢｉｎｄＳｈｕｔ（商標）、旭硝子株式会社）に移された後に、５０ｎｇ／ｍＬの組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）と、５０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン−４（ＩＬ−４、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）とが添加され、培養された。培養６日目に、５０ｎｇ／ｍＬのプロスタグランジンＥ２（第一化学）と、終濃度１０μｇ／ｍＬのピシバニル（ＯＫ４３２、ロシュ中外製薬）とが添加された。さらに１日間培養され、成熟樹状細胞が得られた。
【００３７】
（４）臍帯血由来ＣＤ３／ＣＤ２８陽性細胞の精製及び増幅
（３）節で分離されたＣＤ１４陰性細胞分画からさらにＣＤ４陽性細胞を除去するため、細胞２×１０７個あたり２５μＬのＤｙｎａｌ（商標）免疫磁気ビーズＣＤ４（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）が添加され、室温２０°Ｃで１０分間以上攪拌された。ＣＤ４陽性細胞が磁気粒子分離器（ＤｙｎａＭａｇ−１５）を用いて除去された後、新たにＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）、Ｔｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｄｅｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８（商標、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）が単核球１０７個あたり２５μＬ添加され、氷上又は４°Ｃで３０分間攪拌された後、ＣＤ３／ＣＤ２８陽性細胞が磁気粒子分離器（ＤｙｎａＭａｇ−１５）を用いて濃縮された。前記ＣＤ８陽性細胞は、５％ヒトＡＢ型血清と、３００ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＩＬ−１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）とが添加されたＸ−ＶＩＶＯ（商標）１５培地に１０６個／ｍＬの濃度で浮遊培養された。培養開始後２ないし３日毎にサイトカインが添加された培地の交換が行われた。その際には、トリパンブルー染色を用いて生細胞数が測定され、１０６個／ｍＬの細胞濃度になるように、ＩＬ−１５が３００ｎｇ／ｍＬ添加された新鮮な培地が添加された。前記ＣＤ３／ＣＤ２８陽性細胞は、総細胞数が１×１０６個に達した段階で以下に説明する手順で可溶性ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズにより刺激された。
【００３８】
なお、ＣＤ３／ＣＤ２８陽性細胞の増殖が速い場合には、最初の１週間は、５％ヒトＡＢ型血清と、１０ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＩＬ−７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）とが添加されたＸ−ＶＩＶＯ（商標）１５培地で培養された。７日目以降は、ＩＬ−７を３００ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＩＬ−１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）に切り替えて、最短１９日間の培養でも同様の結果が得られた。
【００３９】
（５）可溶性ＷＴ−１ペプチド及び固相化抗ＣＤ２８抗体によるＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導
ＣＤ３／ＣＤ２８陽性細胞が総細胞数１×１０６個に達した段階で、初回刺激が固相化抗ＣＤ２８抗体及び可溶性ペプチドにより実施され、２回目の刺激は初回刺激から７日目に実施された。５％ヒトＡＢ型血清と３００ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＩＬ−１５とが添加されたＸ−ＶＩＶＯ（商標）１５培地に、最終濃度１０μｇ／ｍＬの可溶性ペプチドＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＷＴ−１（ｍｕ）ＣＹＴＷＮＱＭＮＬと、固相化抗ＣＤ２８抗体とが添加された培地がＣＴＬ誘導のために用いられた。この際、磁気免疫ビーズ数とＴ細胞との比が４：１になるようビーズ濃度が調整され、その後の培地交換の際にビーズは細胞とともに希釈された。
【００４０】
（６）ＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導後の増幅
前記ＣＴＬ誘導以後の培地交換には、終濃度１０μｇ／ｍＬとなるよう可溶性ペプチドと、５％ヒトＡＢ型血清と、３００ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＩＬ−１５とが添加されたＸ−ＶＩＶＯ（商標）１５培地が用いられた。ＣＴＬの増幅のためには、最短で１９日間、長い場合４０日間を要した。
【００４１】
（７）同種ＨＬＡ一致末梢血由来樹状細胞によるＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導
（7.1）末梢血の採血
健康なボランティア被検者２名（ＨＬＡ−Ａ遺伝子座の適合型：ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２及び０２：０７、ＨＬＡ-Ａ＊２４：０２及び２６：０１）から末梢血が採取された。本実験は、東京大学医科学研究所倫理審査委員会の承認（承認番号２０−５６−０２１０、初回承認日：平成２１年２月１０日、変更承認日：平成２２年１１月１９日）を得て実施され、前記ボランティア被検者からは書面による同意が得られている。採血には、２１〜２２Ｇ針を取り付けた真空採血管（ＴＥＲＵＭＯ  ベノジェクトＩＩ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ）が用いられた。
【００４２】
（7.2）末梢血からの樹状細胞の調製
得られた血液は、常温に保たれた希釈液（ＰＢＳ）で２倍希釈され、各遠心管に、希釈血２０ないし３５ｍＬが、１０ないし１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ  Ｐａｑｕｅ（比重１．０７７、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）に重層された。遠心は、５００×ｇ、室温で３０分間行われ、ブレーキをかけずに停止された。遠心上清（血漿部分）は数ｍＬを残して除去され、中間層が回収された。遠心管１ないし２本から回収された前記中間層が１本の新たな遠心管に集められ、前記希釈液により体積が５０ｍＬに調製された。２回目の遠心は、５００×ｇ、室温、５分間の条件で行われた。上清は除去され、ペレットが、前記希釈液３０ｍＬに懸濁された。３回目の遠心は、５００×ｇ、室温、５分間の条件で行われた。上清は除去され、ペレットは、細胞濃度が１×１０７個／ｍＬになるように、２ｍＭ  ＥＤＴＡと、０．１％ヒト血清アルブミンとが添加されたＰＢＳに懸濁された（以下、「単核球懸濁液」という。）。前記単核球懸濁液にＤｙｎａｌ（商標）免疫磁気ビーズＣＤ１４（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を単核球１０８個あたり２５μＬずつ添加し、４°Ｃにて３０分間撹拌した。反応後、磁気粒子分離器（ＤｙｎａＭａｇ−１５）を用いてＣＤ１４陽性単球が分離され、この単球は、５０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦと、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４と、５％ヒトＡＢ型血清とが添加されたＸ−ＶＩＶＯ（商標）１５培地にて培養された。６日間の培養期間中、培地交換は行われなかった。培養６日目に５０ｎｇ／ｍＬのプロスタグランジンＥ２と、１０μｇ／ｍＬのピシバニルとが添加された後さらに１日間培養され、成熟樹状細胞が得られた。
【００４３】
（7.3）ヒト末梢血由来樹状細胞によるＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬの誘導
（４）節で説明された手順で精製及び増幅された臍帯血由来ＣＤ３／ＣＤ２８陽性細胞は、５％ヒトＡＢ型血清と、３００ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ−１５とが添加されたＸ−ＶＩＶＯ（商標）１５培地中で、３７°Ｃ、５％ＣＯ２の条件下培養された。ＣＴＬ誘導は、総細胞数１×１０６個に達した段階での初回刺激と、初回刺激から７日目の第２回刺激との２回行われた。（7.2）節に記載の手順で調製された末梢血由来の成熟樹状細胞の培養液に、１０μｇ／ｍＬの可溶性ペプチドＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＷＴ−１（ｍｕ）ＣＹＴＷＮＱＭＮＬ（ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ドナーの場合）又はＨＬＡ−Ａ＊０２：０１ＷＴ−１  ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１ドナーの場合）が添加され、３７°Ｃで３時間撹拌され、前記ペプチドが前記樹状細胞上のＨＬＡクラスＩ分子上に結合された。その後、前記成熟樹状細胞と前記ＣＤ８陽性細胞とが、１：５ないし１：６．７の比で１２穴プレートに混合されて、さらに初回刺激後１２日間共培養された。
【００４４】
（８）蛍光標識テトラマー試薬の信頼性の検証
誘導された細胞傷害性Ｔ細胞のうちＷＴ−１ペプチド抗原を認識する細胞の割合を測定するために、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２分子上に突然変異型アミノ酸配列からなるＷＴ−１ペプチド分子４個が固相化され、ＰＥで蛍光標識されたビーズ（以下、「ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＷＴ−１（ｍｕ）−テトラマー」という。）が用いられた。しかし、このビーズはアビジンが共有結合により結合されており、ビオチン化されたＰＥ標識ＷＴ−１ペプチドのテトラマーとは、アビジン−ビオチンの特異的相互作用によって結合されている。一方、誘導に用いた抗ＣＤ２８抗体もビオチン化され、アビジン結合ビーズに固相化されている。そこで、誘導に用いられた固相化抗ＣＤ２８抗体が、ＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬの検出のためのフロー・サイトメトリー解析のサンプルに残存していると、ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＷＴ−１（ｍｕ）−テトラマーのビーズの一部でビオチン化されたＰＥ標識ＷＴ−１ペプチドのテトラマーが脱落して、ビオチン化された抗ＣＤ２８抗体に置換される可能性がある。かかる脱落・置換が起こると、ＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬの検出の際に、ＣＤ２８を発現する細胞も反応してしまう。そこで、以下の実験によって、かかる脱落・置換の可能性を検証した。
【００４５】
ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２陽性の臍帯血２検体から、（４）節で説明された手順でＣＤ３／ＣＤ２８陽性細胞が得られた。前記細胞が、１，５００  ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２と、３００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５と、５％ヒトＡＢ型血清とが添加されたＸ−ＶＩＶＯ（商標）１５にて４２日間培養された。またＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性健常人ボランティアから（7.3）節で説明された手順に従ってＣＤ３／ＣＤ２８陽性細胞が分離され、３００  ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２と、３００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５と、５％ヒトＡＢ型血清とが添加されたＸ−ＶＩＶＯ（商標）１５で２１日間培養された。前記ヒト臍帯血又は健常人末梢血由来ＣＤ３／ＣＤ２８陽性細胞にビオチン化抗ヒトＣＤ２８マウスモノクローナル抗体（クローンＣＤ２８．２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  Ｊａｐａｎ株式会社）が細胞１０６個あたり２０μＬずつ添加され、０°Ｃないし４°Ｃにて３０分間撹拌された。その後、ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＷＴ−１（ｍｕ）ＣＹＴＷＮＱＭＮＬテトラマー（ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ドナーの場合）か、ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１ＷＴ−１  ＲＭＦＰＮＡＰＹＬテトラマー（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１ドナーの場合）かが添加され、室温で２０分間インキュベーションされ、テトラマーが前記細胞のＴ細胞受容体上に結合された。その後、抗ヒトＣＤ２８マウスモノクローナル抗体が細胞表面に結合したことを検証するための２次抗体である、ＡＰＣ標識抗マウスＩｇＧロバモノクローナル抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）が２０μＬ添加され、０°Ｃないし４°Ｃで２０分間撹拌され、フロー・サイトメトリー法で細胞上のビオチン化ＣＤ２８抗体の結合が検証された。
【００４６】
（９）ＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬの検出
前記３種類の手順のいずれかでＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬの誘導処理が総細胞数１×１０６個に達した段階での初回刺激と、初回刺激から７日目の第２回刺激と２回施された臍帯血由来ＣＤ３／ＣＤ２８陽性細胞は、初回刺激後１２日目に回収され、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ３モノクローナルマウスIｇＧ２ａ抗体（クローンＨＩＴ３ａ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  Ｊａｐａｎ株式会社）と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＷＴ−１（ｍｕ）−テトラマーとで三重染色され、フロー・サイトメトリー解析が行われた。
【００４７】
２．結果
図２ＡないしＨは、前記３種類の手順のいずれかで総細胞数１×１０６個に達した段階での初回刺激と、初回刺激から７日目の第２回刺激と２回ＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬの誘導処理が施された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、初回刺激後１２日目にＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＷＴ−１（ｍｕ）−テトラマーを特異的に認識する細胞（以下、「テトラマー陽性細胞」という。）の２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図である。図２ＡないしＨの結果図の縦軸はＰＥ標識の蛍光強度で、横軸はＡＰＣ標識の蛍光強度である。図２Ａ及びＢのサンプルは、前記３種類のいずれの誘導処理も行わずに、５％ヒトＡＢ型血清と、３００ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＩＬ−１５とを添加したＸ−ＶＩＶＯ（商標）１５培地だけで培地交換して図２Ｃおよび図２Ｄの実験と同じ日数培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞である。図２Ｃ及びＤのサンプルは、可溶性ＷＴ−１ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによるＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導を総細胞数１×１０６個に達した段階での初回刺激と、初回刺激後７日目の第２回刺激との２回行った後、初回刺激後１２日目まで培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞である。図２Ｅ及びＦは、ＷＴ−１変異ペプチド添加同種末梢血由来樹状細胞によるＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導を総細胞数１×１０６個に達した段階での初回刺激と、初回刺激後７日目の第２回刺激との２回行った後、初回刺激後１２日目まで培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞である。図２Ｇ及びＨは、ＷＴ−１変異ペプチド添加自家臍帯血単球由来樹状細胞によるＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導を総細胞数１×１０６個に達した段階での初回刺激と、初回刺激後７日目の第２回刺激との２回行った後、初回刺激後１２日目まで培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞である。図２Ａ、Ｃ、Ｅ及びＧの結果図のサンプルは、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とを混合して染色された。図２Ｂ、Ｄ、Ｆ及びＨの結果図のサンプルは、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＷＴ−１（ｍｕ）−テトラマーとを混合して染色された。
【００４８】
図２Ｄに示すとおり、可溶性ＷＴ−１ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによるＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導が施された臍帯血由来ＣＤ３／ＣＤ２８陽性細胞のうちＣＤ３＋ゲートを通過した細胞の約８．２１％は、テトラマー陽性、すなわち、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２アリルのコンテキストで癌抗原であるＷＴ−１由来ペプチドを特異的に認識した。ＷＴ−１特異的な細胞傷害性Ｔ細胞は、リンパ腫その他のＷＴ−１を過剰発現する悪性細胞とは反応するが、ＷＴ−１を比較的少量しか発現しない正常細胞を攻撃しないことが知られている（Ｇａｏ，Ｌ．ら、Ｂｌｏｏｄ、９５：２１９８−２２０３（２０００）、Ｏｋａ、Ｙ．ら、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０：２１１−２２０（２００８））。これに対し、図２Ｆに示すとおり、ＷＴ−１変異ペプチド添加同種末梢血由来樹状細胞によるＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導が施された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞のうちＣＤ３＋ゲートを通過した細胞の約０．２２％しか、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２アリルのコンテキストで癌抗原であるペプチドＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＷＴ−１（ｍｕ）ＣＹＴＷＮＱＭＮＬを特異的に認識しなかった。また、図２Ｈに示すとおり、ＷＴ−１変異ペプチド添加自家臍帯血単球由来樹状細胞によるＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導が施された臍帯血由来ＣＤ３陽性細胞のうちＣＤ３＋ゲートを通過した細胞の約０．５５％しか、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２アリルのコンテキストで癌抗原であるペプチドＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＷＴ−１（ｍｕ）ＣＹＴＷＮＱＭＮＬを特異的に認識しなかった。なお、図２Ｂに示すとおり、ＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導が施されなかった対照実験の臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞では、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞の約１．２８％しか、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２アリルのコンテキストで癌抗原であるペプチドＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＷＴ−１（ｍｕ）ＣＹＴＷＮＱＭＮＬを特異的に認識しなかった。図２Ａ、Ｃ、Ｅ及びＧの結果図に示すとおり、ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＷＴ−１（ｍｕ）−テトラマーを混合しないで、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体のみと混合して染色されたサンプルでは、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥの発光波長での蛍光を示す細胞は０．１％以下であった。以上のとおり、図２ＡないしＨの結果から、前記３種類のＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬの誘導処理のうち、可溶性ＷＴ−１ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによるＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導処理は、他の２種類の樹状細胞を用いた誘導処理に比べて、ＷＴ−１ペプチドを認識するＣＴＬをはるかに多く誘導した。なお、（８）の実験の結果、ビオチン化ＣＤ２８抗体を添加しても添加しなくてもテトラマー陽性細胞は出現せず、テトラマーが脱ビオチン・アビジン結合により偽陽性となる可能性は極めて低いことが確認された。
【実施例２】
【００４９】
臍帯血からのＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導（２）
１．材料及び方法
実施例１と異なる臍帯血（ＩＤ番号：ＨＣＢ００７５１、ＨＬＡ−Ａ遺伝子座の適合型：２４：０２及び３３：０３）由来ＣＤ８陽性細胞が、実施例１と同じ３種類の誘導処理を施され、テトラマー陽性細胞のフロー・サイトメトリー解析に供された。
【００５０】
２．結果
図３は、可溶性ＷＴ−１ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによって総細胞数１×１０６個に達した段階での初回刺激と、初回刺激から７日目の第２回刺激と２回ＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬの誘導処理が施された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、初回刺激後１２日目にＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、テトラマー陽性細胞の２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図である。図３の結果図の縦軸はＰＥ標識の蛍光強度で、横軸はＡＰＣ標識の蛍光強度である。図３のサンプルは、可溶性ＷＴ−１ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによるＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導を総細胞数１×１０６個に達した段階での初回刺激と、初回刺激から７日目の第２回刺激との２回行った後、初回刺激後１２日目まで培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞であり、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＷＴ−１（ｍｕ）−テトラマーとを混合して染色された。
【００５１】
図３に示すとおり、実施例１と異なる臍帯血由来のＣＤ８陽性細胞においても、可溶性ＷＴ−１ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによるＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導が施された臍帯血由来ＣＤ３／ＣＤ２８陽性細胞のうちＣＤ３＋ゲートを通過した細胞の約９．４３％は、テトラマー陽性であった。これに対し、同じ臍帯血について、自家臍帯血由来樹状細胞によるＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導が施された場合と、同種ＨＬＡ一致末梢血由来樹状細胞によるＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導が施された場合とでは、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうちテトラマー陽性細胞は、それぞれ、０．３６％と、０．３３％とであった（図示されない）。ＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導が施されなかった対照実験の臍帯血由来ＣＤ３／ＣＤ２８陽性細胞では、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞の約０．５２％しか、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２アリルのコンテキストで癌抗原であるＷＴ−１由来ペプチドを特異的に認識しなかった。ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＷＴ−１（ｍｕ）−テトラマーを混合しないで、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とを混合して染色されたサンプルでは、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥの蛍光波長での蛍光を示す細胞は０．０５％以下であった。
【００５２】
以上の結果から、複数の臍帯血を使った実験で、可溶性ＷＴ−１ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによるＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導処理は、他の２種類の誘導処理に比べて、ＷＴ−１ペプチドを認識するＣＴＬをはるかに多く誘導することが示された。ペプチドワクチンによる癌治療法の臨床試験では、患者体内でワクチン感作を行った場合のテトラマー陽性細胞の比率が報告されている。例えば、Ｏｋａ  Ｙら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０１：１３８８５（２００４））の報告によると、乳癌２名、肺癌１０名、白血病等１４名に対して、野生型又は突然変異型のＨＬＡ−Ａ＊２４：０２制限ＷＴ−１ペプチド（０．３ｍｇ−３０ｍｇ）がフロイント不完全アジュバントとともに２週間間隔で３回感作されたとき、感作前のＷＴ−１テトラマー陽性ＣＤ８陽性細胞の比率が中央値０．２４５％（範囲：０．０８−１．２１％）で、感作後のＷＴ−１テトラマー陽性ＣＤ８陽性細胞の比率は中央値０．３４％（範囲０．１１−６．６１％）であった。また、Ｖａｎ  Ｔｅｎｄｅｌｏｏ  ＶＦら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０７：１３８２４（２０１０））の報告によると、寛解期急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者にＷＴ−１タンパク質のｍＲＮＡが遺伝子導入された自家樹状細胞を皮下接種する臨床試験において、末梢血で検出されたテトラマー陽性細胞は１％未満であった。ＨＬＡクラスＩ分子で制限されたペプチド抗原の用いる試験管内での感作実験でテトラマー陽性細胞の比率が明示された報告は見あたらなかった。
【実施例３】
【００５３】
臍帯血からの単回ＣＴＬ誘導
１．材料及び方法
実施例１で説明された手順にしたがって、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２陽性であることが確認できた異なる臍帯血（ＩＤ番号：ＨＣＢ００７５６、ＨＬＡ−Ａ遺伝子座の適合型：２４：０２及び３３：０３）からＣＤ１４陰性ＣＤ４陰性ＣＤ３／ＣＤ２８陽性細胞が分離された。前記細胞は最初の１週間は１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−７と、５％ヒトＡＢ型血清とが添加されたＸ−ＶＩＶＯ（商標）１５培地中で３７°Ｃ、５％ＣＯ２で増幅され、その後、３００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５と、５％ヒトＡＢ型血清とが添加されたＸ−ＶＩＶＯ（商標）１５培地が至適細胞濃度１０６個／ｍＬとなるよう２〜３日に１回ずつ追加され、さらに２８日間増幅された。その後前記細胞は、セルバンカー（商標）（十慈フィールド株式会社）に浮遊されて液体窒素中に凍結保存され、用時解凍して以下の実験に用いられた。５％ヒトＡＢ型血清と、３００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５とが添加されたＸ−ＶＩＶＯ（商標）１５培地に、さらに、ビオチン化ＣＤ２８抗体とビーズとの複合体と、癌抗原ＷＴ−１特異的変異可溶性ペプチドＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＷＴ−１（ｍｕ）ＣＹＴＷＮＱＭＮＬ又はＣＭＶｐｐ６５特異的ペプチドＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＣＭＶｐｐ６５  ＱＹＤＰＶＡＡＬＦ（配列番号５）とが添加された培地中で、解凍されたＣＤ３／ＣＤ２８陽性細胞が１０日間培養された。１０日目に前記細胞はＰＢＳで回収され、ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＷＴ−１（ｍｕ）ＣＹＴＷＮＱＭＮＬテトラマーか、ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＣＭＶｐｐ６５  ＱＹＤＰＶＡＡＬＦテトラマーかが細胞１０６個あたり２０μＬ添加され、室温で２０分間静置された後、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ３モノクローナルマウスIｇＧ２ａ抗体（クローンＨＩＴ３ａ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  Ｊａｐａｎ株式会社）と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体（クローンＲＰＡ−Ｔ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  Ｊａｐａｎ株式会社）とが２０μＬずつ添加され、０°Ｃないし４°Ｃで２０分間撹拌されてから、フロー・サイトメトリー解析に供された。
【００５４】
２．結果
実施例１及び２と同様のフロー・サイトメトリー解析の結果、最初の培養後１度凍結された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、再解凍後総細胞数１×１０６個に調製した段階で癌抗原ＷＴ−１特異的変異可溶性ペプチドＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＷＴ−１（ｍｕ）ＣＹＴＷＮＱＭＮＬか、ＣＭＶｐｐ６５特異的可溶性ペプチドＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＱＹＤＰＶＡＡＬＦかと、ＣＤ２８免疫ビーズとが添加された培地にて１回刺激が行われた後、刺激後１０日目まで培養された細胞では、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＷＴ−１ペプチドテトラマー陽性細胞は約２．７２％であった（図示されない）。同様に、ＣＭＶｐｐ６５特異的可溶性ペプチドＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＱＹＤＰＶＡＡＬＦ及びＣＤ２８免疫ビーズが添加された培地にて１回刺激が行われた後、刺激後１０日目まで培養された細胞では、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＣＭＶｐｐ６５ペプチドテトラマー陽性細胞は約３．３９％であった（図示されない）。ペプチド特異的ＣＴＬ誘導が施されなかった対照実験の臍帯血由来ＣＤ３陽性細胞が、ＰＥ標識ＷＴ−１ペプチドテトラマーと、ＰＥ標識ＣＭＶｐｐ６５ペプチドテトラマーとを混合して染色されたサンプルでは、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥの蛍光波長での蛍光を示す細胞は０．７７％であった（図示されない）。ＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導が施された臍帯血由来ＣＤ３陽性細胞が、ＰＥ標識ＷＴ−１ペプチドテトラマーを混合しないで、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体のみと混合して染色されたサンプルでは、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥの蛍光波長での蛍光を示す細胞は０．１９％であった（図示されない）。ＣＭＶｐｐ６５ペプチド特異的ＣＴＬ誘導が施された臍帯血由来ＣＤ３陽性細胞が、ＰＥ標識ＣＭＶｐｐ６５ペプチドテトラマーを混合しないで、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体のみと混合して染色されたサンプルでは、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥの蛍光波長での蛍光を示す細胞は０．２７％であった（図示されない）。ペプチド特異的ＣＴＬ誘導が施されなかった対照実験の臍帯血由来ＣＤ３陽性細胞が、ＰＥ標識ＷＴ−１ペプチドテトラマー又はＰＥ標識ＣＭＶｐｐ６５ペプチドテトラマーを混合しないで、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体のみと混合して染色されたサンプルでは、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥの蛍光波長での蛍光を示す細胞は０．１４％であった（図示されない）。
【００５５】
本実施例の結果から、可溶性ＷＴ−１ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによるＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導の処理工程は、１回だけでも有効であることが示された。また、可溶性ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによるペプチド特異的ＣＴＬ誘導は、ＷＴ−１ペプチドに限定されるものではなく、ＣＭＶｐｐ６５ペプチドでも有効であることが示された。そこで、可溶性ペプチドと抗ＣＤ２８免疫ビーズとを併用する本発明のペプチド特異的ＣＴＬ誘導法は、ペプチド抗原の種類の如何に関わらず、実施可能であることが示唆される。これは、患者のＨＬＡ適合型に応じて、抗原として提示されるペプチドのアミノ酸配列が決定されていれば、腫瘍抗原か、ウイルス抗原かに関わらず、細胞傷害性Ｔ細胞を多数誘導して治療することを可能にするものである。また、ペプチド抗原として可溶性ペプチドを使うことにより、腫瘍細胞なり、ウイルスなりが変異して、ワクチン耐性を獲得するエスケープ変異を起こした場合にも、容易に抗原を変更することができる。また、本実施例において１回のＣＴＬ誘導でも有効であったことから、従来のＣＴＬ誘導法より簡便な培養プロトコールで実施できることが期待される。
【実施例４】
【００５６】
末梢血からのＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導
１．材料及び方法
実施例１（7.1）と同一の健康なボランティア被検者（ＨＬＡ−Ａ遺伝子座の適合型：ＨＬＡ-Ａ＊２４：０２及び２６：０１）から末梢血が採取された。実施例１（7.1）と同じ手順で採血が行われ、実施例１（7.2）と同じ手順で単核球懸濁液が調製され、前記単核球懸濁液からＣＤ１４陽性単球が除去された。残りのＣＤ１4陰性分画から、フローコンプＣＤ８キット（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いてＣＤ８陽性細胞が精製された。具体的にはビオチン化抗ＣＤ８抗体とヒト末梢血単核球懸濁液ＣＤ１4陰性分画とを氷上（０°Ｃないし４°Ｃ）で１０分間反応させた後、アビジン結合磁気免疫ビーズと氷上（０°Ｃないし４°Ｃ）で１５分間反応させ、磁気粒子分離器（ＤｙｎａＭａｇ−１５）を用いてＣＤ８陽性細胞が分離された。その後、室温でリリースバッファーが添加されて１０分間インキュベーションされて、前記アビジン結合磁気免疫ビーズがＣＤ８陽性リンパ球から遊離された。回収されたＣＤ８陽性細胞は、５％ヒトＡＢ型血清と３００ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−１５とが添加されたＸ−ＶＩＶＯ（商標）１５培地中で３７°Ｃ、５％ＣＯ２条件下培養された。総細胞数１×１０６個に調製後、癌抗原ＷＴ−１特異的変異可溶性ペプチドＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＷＴ−１（ｍｕ）ＣＹＴＷＮＱＭＮＬか、ＣＭＶｐｐ６５特異的ペプチドＨＬＡ−Ａ＊２４：０２  ＱＹＤＰＶＡＡＬＦかと、ＣＤ２８免疫ビーズとが添加された培地にて初回刺激、さらに初回刺激後７日目に同様の刺激が行われた後、初回刺激後１１日目まで培養された。２〜３日毎に、ＩＬ−１５が添加された新鮮な培地で細胞濃度が１０６個／ｍＬとなるように希釈された。初回刺激後１１日目にフロー・サイトメトリーによるテトラマー陽性率の解析が行われた。
【００５７】
２．結果
実施例１ないし３と同様のフロー・サイトメトリー解析の結果、癌抗原ＷＴ−１特異的変異可溶性ペプチドＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＷＴ−１（ｍｕ）ＣＹＴＷＮＱＭＮＬ及びＣＤ２８免疫ビーズが添加された培地にて総細胞数１×１０６個に達した段階で初回刺激、さらに初回刺激後７日目に同様の刺激を行った後、初回刺激後１１日目までペプチド特異的ＣＴＬの誘導処理が施された末梢血由来ＣＤ８陽性細胞について、培養開始１１日目にＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＷＴ−１ペプチドテトラマー陽性細胞は約５．１３％であった（図示されない）。ペプチド特異的ＣＴＬ誘導が施されなかった対照実験の末梢血由来ＣＤ３陽性細胞では、培養開始１１日目にＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＷＴ−１ペプチドテトラマー陽性細胞は約０．１５％であった（図示されない）。同様に末梢血由来ＣＤ８陽性細胞が、ＣＭＶｐｐ６５可溶性ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによって培養開始初日と７日目との２回刺激された場合には、培養開始１１日目にＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＷＴ−１ペプチドテトラマー陽性細胞は約４．５３％であった（図示されない）。ＰＥ標識ＷＴ−１ペプチド−テトラマーを混合しないで、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とを混合して染色されたサンプルでは、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥの蛍光波長での蛍光を示す細胞は０．１３％以下であった（図示されない）。
【実施例５】
【００５８】
臍帯血からのヒトテロメラーゼｈＴＥＲＴ由来ペプチド特異的ＣＴＬ誘導
１．材料及び方法
ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２陽性であることが確認できた異なる臍帯血（ＩＤ番号：ＨＣＢ０１１００、ＨＬＡ−Ａ遺伝子座の適合型：２４：０２及び２６：０１）から、実施例１（３）で説明された手順に従って、磁気免疫ビーズを用いてＣＤ１４陰性ＣＤ４陰性ＣＤ３／ＣＤ２８陽性細胞が分離された。前記細胞は、１０６個／ｍＬの濃度に希釈され、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−７と、５％ヒトＡＢ型血清とが添加されたＸ−ＶＩＶＯ（商標）１５培地中で３７°Ｃ、５％ＣＯ２濃度で培養開始後最初の１週間増幅され、その後７日目から、３００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５と５％ヒトＡＢ型血清とが添加されたＸ−ＶＩＶＯ（商標）１５培地で、至適細胞濃度が１０６個／ｍＬとなるよう２〜３日に１回ずつ希釈された。総細胞数１×１０６個に達した段階でｈＴＥＲＴ由来可溶性ペプチドＨＬＡ−Ａ＊２４：０２  ＶＹＧＦＶＲＡＣＬ（配列番号３）及びＣＤ２８免疫ビーズが添加された培地にて初回刺激、さらに初回刺激後７日目に同様の刺激を行った後、初回刺激後１４日目まで培養された。刺激時には、ビオチン化ＣＤ２８抗体とビーズとの複合体は、ビーズ：細胞の比が４：１の濃度で添加された。初回刺激後１４日目に細胞がＰＢＳで回収され、細胞１０６個あたり２０μＬのＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ｈＴＥＲＴ  ＶＹＧＦＶＲＡＣＬテトラマーが添加され、室温で２０分間静置された後、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ３モノクローナルマウスIｇＧ２ａ抗体（クローンＨＩＴ３ａ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  Ｊａｐａｎ株式会社）と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体（クローンＲＰＡ−Ｔ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  Ｊａｐａｎ株式会社）とが２０μＬずつ添加され、０°Ｃないし４°Ｃで２０分間撹拌され、フロー・サイトメトリー解析に供された。
【００５９】
２．結果
図４ＡないしＤは、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ｈＴＥＲＴ  ＶＹＧＦＶＲＡＣＬテトラマーと、ＡＰＣ標識ヒト抗ＣＤ８抗体とを用いる２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図である。図４ＡないしＤの結果図の縦軸はＰＥ標識の蛍光強度で、横軸はＡＰＣ標識の蛍光強度である。ｈＴＥＲＴ可溶性ペプチドＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＶＹＧＦＶＲＡＣＬ及びＣＤ２８免疫ビーズが添加された培地にてｈＴＥＲＴ由来ペプチド特異的ＣＴＬの誘導処理が施された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、初回刺激後１４日目にＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ｈＴＥＲＴペプチドテトラマー陽性細胞は約０．７４％であった（図４Ｃ）。ペプチド特異的ＣＴＬ誘導が施されなかった対照実験の臍帯血由来ＣＤ３陽性細胞では、培養開始１１日目にＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ｈＴＥＲＴペプチドテトラマー陽性細胞は約０．０６％であった（図４Ｂ）。ｈＴＥＲＴ可溶性ペプチドＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＶＹＧＦＶＲＡＣＬ及びＣＤ２８免疫ビーズが添加された培地にてｈＴＥＲＴ由来ペプチド特異的ＣＴＬの誘導処理が施された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞にＰＥ標識ｈＴＥＲＴペプチド−テトラマーを混合しないで、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とを混合して染色されたサンプルでは、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥの発光波長での発蛍光を示す細胞は０．０８％以下であった（図４Ｄ）。ペプチド特異的ＣＴＬ誘導が施されなかった対照実験の臍帯血由来ＣＤ３陽性細胞では、ＰＥ標識ｈＴＥＲＴペプチド−テトラマーを混合しないで、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色されたサンプル中のＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥの蛍光波長での蛍光を示す細胞は０．０２％であった（図４Ａ）。
【実施例６】
【００６０】
臍帯血からのｓｕｒｖｉｖｉｎ−２Ｂ特異的ペプチド特異的ＣＴＬ誘導
１．材料及び方法
ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２陽性であることが確認できた異なる臍帯血（ＩＤ番号：ＨＣＢ０１１００、ＨＬＡ−Ａ遺伝子座の適合型：２４：０２及び２６：０１）から、実施例１（３）で説明された手順に従って、磁気免疫ビーズを用いてＣＤ１４陰性ＣＤ４陰性ＣＤ３／ＣＤ２８陽性細胞が分離された。前記細胞は１０６個／ｍＬの濃度に希釈され、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−７と、５％ヒトＡＢ型血清とが添加されたＸ−ＶＩＶＯ（商標）１５培地中で３７°Ｃ、５％ＣＯ２濃度で培養開始後最初の１週間増幅され、その後７日目から、３００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５と５％ヒトＡＢ型血清とが添加されたＸ−ＶＩＶＯ（商標）１５培地で、至適細胞濃度１０６個／ｍＬとなるよう２〜３日に１回ずつ希釈された。総細胞数１×１０６個に達した段階でｓｕｒｖｉｖｉｎ−２Ｂ由来可溶性ペプチドＨＬＡ−Ａ＊２４：０２  ｓｕｒｖｉｖｉｎ−２Ｂ  ＡＹＡＣＮＴＳＴＬ（配列番号４）及びＣＤ２８免疫ビーズが添加された培地にて初回刺激、さらに初回刺激後７日目に同様の刺激を行った後、初回刺激後１０日目まで培養された。刺激時には、ビオチン化ＣＤ２８抗体とビーズとの複合体が、ビーズ：細胞の比が４：１の濃度で添加された。刺激後１０日目に前記細胞がＰＢＳで回収され、細胞１０６個あたり２０μＬのＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２  ｓｕｒｖｉｖｉｎ−２Ｂ  ＡＹＡＣＮＴＳＴＬテトラマーが添加され、室温で２０分間静置された後、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ３モノクローナルマウスIｇＧ２ａ抗体（クローンＨＩＴ３ａ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  Ｊａｐａｎ株式会社）と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体（クローンＲＰＡ−Ｔ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  Ｊａｐａｎ株式会社）とが２０μＬずつ添加され、０°Ｃないし４°Ｃで２０分間撹拌され、フロー・サイトメトリー解析に供された。
【００６１】
２．結果
図５ＡないしＤは、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体、ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ｓｕｒｖｉｖｉｎ−２Ｂ  ＡＹＡＣＮＴＳＴＬテトラマーと、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色し、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣによる２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図である。図５ＡないしＤの結果図の縦軸はＰＥ標識の蛍光強度で、横軸はＡＰＣ標識の蛍光強度である。ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２  ｓｕｒｖｉｖｉｎ−２Ｂ  ＡＹＡＣＮＴＳＴＬ可溶性ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによって総細胞数１×１０６個に達した段階で初回刺激、さらに初回刺激後７日目に同様の刺激を行った後、初回刺激後１０日目まで培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ｈＴＥＲＴ−テトラマーと、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色し、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ｓｕｒｖｉｖｉｎ−２Ｂペプチドテトラマー陽性細胞は約１．１６％であった（図５Ｃ）。ＰＥ標識ｓｕｒｖｉｖｉｎ−２Ｂペプチド−テトラマーを混合しないで、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色されたサンプルでは、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥの蛍光波長での蛍光を示す細胞は０．００％以下であった（図５Ｄ）。ペプチド特異的ＣＴＬ誘導が施されなかった対照実験の臍帯血由来ＣＤ３陽性細胞では、培養開始１０日目にＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ｓｕｒｖｉｖｉｎ−２Ｂペプチドテトラマー陽性細胞は約０．０３％であった（図５Ｂ）。ＰＥ標識ｓｕｒｖｉｖｉｎ−２Ｂペプチド−テトラマーを混合しないで、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とを混合して染色されたサンプルでは、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥの蛍光波長での蛍光を示す細胞は０．０３％であった（図５Ａ）。
【実施例７】
【００６２】
４種類のペプチドに特異的なＣＴＬの臍帯血からの同時誘導
１．材料及び方法
ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２陽性であることが確認できた異なる臍帯血（ＩＤ番号：ＲＣ２Ｒ１００１０、ＨＬＡ−Ａ遺伝子座の適合型：２４：０２／ブランクおそらく２４：０２ホモザイゴート）から単球が貼り付き法にて除去された後、実施例１で説明された手順にしたがって、磁気免疫ビーズを用いてＣＤ４陰性ＣＤ８陽性細胞が分離された。前記細胞は１０６個／ｍＬの濃度で３００ｎｇ／ｍＬＩＬ−１５と５％ヒトＡＢ型血清とが添加されたＸ−ＶＩＶＯ（商標）１５培地で培養が開始され、総細胞数１×１０６個に調製後、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２拘束性の以下の４種のペプチド及びＣＤ２８免疫ビーズが添加された培地にて初回刺激が行われた。添加されたペプチドは、（１）ＷＴ−１特異的変異型ペプチド  ＣＹＴＷＮＱＭＮＬ、（２）ＣＭＶｐｐ６５ペプチド  ＱＹＤＰＶＡＡＬＦ、（３）ｈＴＥＲＴ特異的ペプチド  ＶＹＧＦＶＲＡＣＬ、及び、（４）ｓｕｒｖｉｖｉｎ−２Ｂ特異的ペプチド  ＡＹＡＣＮＴＳＴＬの４種類であった。さらに初回刺激後７日目に同様の刺激を行った後、初回刺激後１２日目まで培養された。刺激時には、ペプチドに加えて、ビオチン化ＣＤ２８抗体とビーズとの複合体がビーズ：細胞比４：１の濃度で添加された。前記細胞は、至適細胞濃度１０６個／ｍＬとなるよう２〜３日に１回ずつ希釈されながら、初回刺激から１２日間培養増幅された。
【００６３】
１２日目に前記細胞はＰＢＳで回収され、ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＷＴ−１（ｍｕ）−テトラマーか、ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＣＭＶｐｐ６５テトラマーか、ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ｈＴＥＲＴテトラマーか、ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ｓｕｒｖｉｖｉｎ−２Ｂテトラマーかが、細胞１０６個あたり２０μＬ添加され、室温で２０分間静置された後、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ３モノクローナルマウスIｇＧ２ａ抗体（クローンＨＩＴ３ａ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  Ｊａｐａｎ株式会社）と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体（クローンＲＰＡ−Ｔ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  Ｊａｐａｎ株式会社）とが２０μＬずつ添加され、０°Ｃないし４°Ｃで２０分間撹拌されフロー・サイトメトリー解析に供された。
【００６４】
２．結果
図６ＡないしＤは、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＷＴ−１（ｍｕ）−テトラマーと、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色し、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣによる２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図である。図６ＡないしＤの結果図の縦軸はＰＥ標識の蛍光強度で、横軸はＡＰＣ標識の蛍光強度である。総細胞数が１×１０６個に調製された後、ＷＴ−１特異的変異型ペプチド  ＣＹＴＷＮＱＭＮＬ及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによって初回刺激が行われ、さらに初回刺激後７日目に同様の刺激を行い、初回刺激後１２日目まで培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体由来、ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ＊ＷＴ−１−テトラマーと、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色が行われた。ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＷＴ−１ペプチド特異的テトラマー陽性細胞は約０．８９％であった（図６Ａ）。ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２ＣＭＶｐｐ６５ペプチドと抗ＣＤ２８免疫ビーズとによって図６Ａの実験と同じ日数培養され、染色された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、初回刺激後１２日目にＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＣＭＶｐｐ６５特異的テトラマー陽性細胞は約０．６６％であった（図６Ｂ）。ｈＴＥＲＴ由来ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによって図６Ａの実験と同じ日数培養され、染色された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、初回刺激後１２日目にＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ｈＴＥＲＴ特異的テトラマー陽性細胞は約０．９５％であった（図６Ｃ）。ｓｕｒｖｉｖｉｎ−２Ｂ由来可溶性ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによって図６Ａの実験と同じ日数培養され、染色された臍帯末梢血由来ＣＤ８陽性細胞について、培養開始１２日目にＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ｓｕｒｖｉｖｉｎ−２Ｂ特異的テトラマー陽性細胞は約１．１９％であった（図６Ｄ）。ペプチド特異的ＣＴＬ誘導処理が施されずに図６Ａないし図６Ｄの実験と同じ日数培養され、染色された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞では、初回刺激後１２日目にＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＷＴ１ペプチド特異的テトラマー陽性細胞は約０．５８％であった（図６Ｅ）。ＰＥ標識ペプチド−テトラマーを混合しないで、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とを混合して染色されたサンプルでは、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥの発光波長での蛍光を示す細胞は０．０５％であった（図６Ｆ）。
【００６５】
実施例の結果から、可溶性ＷＴ−１ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによるＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導は、臍帯血由来のＣＤ８陽性細胞に限らず、少なくとも末梢血由来のＣＤ８陽性細胞にも適用できることが示された。同様に、可溶性ＣＭＶｐｐ６５ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによるＷＴ−１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導は、臍帯血由来のＣＤ８陽性細胞に限らず、少なくとも末梢血由来のＣＤ８陽性細胞にも適用できることが示された。さらにＷＴ−１やＣＭＶｐｐ６５に限定されず、ｈＴＥＲＴやｓｕｒｖｉｖｉｎ−２Ｂ等他の幅広い癌抗原にもこの手法が利用可能であることが示された。そこで、可溶性ペプチドと固定化抗ＣＤ２８抗体とを併用する本発明の細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物は、いかなる造血幹細胞由来のＣＤ８陽性細胞についても適用可能であることが示唆される。すると、本発明の細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物は、末梢血以外の生体内の造血幹細胞、例えば、骨髄、リンパ節その他の組織由来の造血幹細胞由来のＣＤ８陽性細胞や、胚性幹細胞、成体幹細胞及び人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞から分化した造血幹細胞に由来するＣＤ８陽性細胞にも適用できる。
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図１】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【配列表】
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