(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（ｉ）口腔表面に対する親和性を有し、ＭＢ50値が１×１０-5モル濃度又はそれ未満である第１の結合要素、および
（ii）第２の結合要素
を含むペプチド組成物であって、ここで上記ペプチド組成物または上記第１の結合要素が、配列番号６６のアミノ酸配列を含む、上記ペプチド組成物と、
（ｂ）０.０１ミクロン〜１０ミクロンの範囲の平均粒径を有する粒子を含む組成物で
あって、該粒子が、
（ｉ）着色剤、ホワイトニング剤、酵素、抗プラーク剤、防汚剤、抗菌剤、抗う蝕剤、香味剤、冷却剤、唾液分泌剤またはこれらの組み合わせである、有益剤、および
（ii）リガンド特性
を含む組成物と
を含み、ここで上記第２の結合要素および上記リガンド特性が非共有結合でまたはキレート化によって互いに会合し、そしてビオチンおよびアビジン、ビオチンおよびストレプトアビジン、ストレプトアビジンタグおよびストレプトアビジン、マルトース結合タンパク質およびマルトース、マルトース結合タンパク質およびアミラーゼ、ポリヒスチジンタグおよび金属イオンを含む親和性媒体、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼおよびグルタチオン、エピトープタグおよび抗体、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される、口腔ケアシステム。
【請求項２】
配列番号６６のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリペプチドを含む口腔ケア組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２００９年３月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／１６４，４７６号の利益を主張する。
【０００２】
本明細書には、ペプチドベースの組成物、口腔ケアシステム、および口腔表面への粒子の適用方法が提供されている。
【背景技術】
【０００３】
歯の美容的外観は、多くの人々にとって非常に重要である。これらの人々は、通常、「輝く」笑顔および白い歯を望んでいる。残念なことに、歯の表面の色は、一般に、歯科材料の吸収性のために時間と共にくすんで変色する。
【０００４】
歯の着色は、年齢および遺伝的性質などの内因性因子と、種々の食品、飲料、薬物、および喫煙によって生じる染色などの外因性因子との組み合わせによって影響を受ける。定期的なブラッシングおよびフロッシングを用いても、染色性および変色性の物質にさらされると、顕著な変色が生じ得る。従って、歯を急速かつ安全に白くするための製品および方法が必要とされている。
【０００５】
歯の変色の問題に対する１つの解決法は、ポーセレン、複合体またはセラミックで作られたベニヤフェーシング（ｖｅｎｅｅｒ  ｆａｃｉｎｇ）の適用である。しかしながら、ベニヤフェーシングの適用は高価であり、訓練された歯科専門家の助けを必要とする。
【０００６】
歯を白くするために漂白剤が使用され得る。一部の漂白剤の適用は、歯科専門家の助け（すなわち、高濃度の酸化剤の適用）および／または多数回の適用を必要とすることがあり、所望の白化度を達成できないこともある。店頭販売での漂白製品は、通常、より低濃度の漂白剤を使用し、多くの場合、所望の効果を達成するために製品を多数回適用する必要がある。しかしながら、漂白剤の使用は、化学熱傷、歯肉に対する刺激、および歯の敏感性の増大を含むいくつかの望ましくない副作用と関連している。
【０００７】
歯を白くするために白色着色剤も使用され得る。通常、無毒性の着色剤は白色顔料であるか、あるいはより「自然な」白色の外観を達成するために白色顔料と他の非白色顔料との組み合わせである。しかしながら、歯の美容的外観を改善するための顔料粒子の使用は、一般に、所望の美容効果を達成するために必要とされる耐久性が欠けている。
【０００８】
歯のホワイトニング剤の結合耐久性を高めるために、種々の試みが成されている。特許文献１には、歯のホワイトニング組成物として、シロキサン接着剤およびホワイトニング微粒子（ヒドロキシアパタイト粉末）の使用が記載されている。Ｓｈｉｍａｋｏらによる特許文献２には、（Ａ）二酸化チタン、二酸化ケイ素、酸化亜鉛、酸化アルミニウム、酸化マグネシウム、および酸化ジルコニウムから選択される１つまたは複数の顔料と、（Ｂ）プルランと、（Ｃ）リゾチーム、カチオン化セルロースおよびポリリジンから選択される１つまたは複数のメンバーとを含む歯のホワイトニング組成物が開示されており、成分（Ｂ）および（Ｃ）は、金属酸化物粉末を歯の表面に取り付けるために使用される。どちらの参考文献にも、歯の表面に対する強力な親和性を有する第１の結合要素と、白色顔料などの微粒子状の有益剤（ｂｅｎｅｆｉｔ  ａｇｅｎｔ）のリガンド特性に非共有結合で結合することができる第２の結合要素とを含むペプチドベースの試薬を含む歯のホワイトニングシステムは開示されていない。
【０００９】
共有される特許文献３には、毛髪、皮膚および爪に高い親和性で結合するペプチド配列、ならびに毛髪、皮膚および爪のためのペプチドベースのコンディショナーおよび着色剤が開示されている。同時係属中の共有の特許文献４、５、および６には、バイオパニングによって同定されるいくつかの歯結合ペプチドが開示されている。
【００１０】
歯を白くするための顔料の使用に加えて、様々な他の有益剤を口腔表面に送達するための粒子が使用されてもよい。非限定的な例としては、酵素、抗プラーク剤、防汚剤、抗菌剤、抗う蝕剤、香味剤、冷却剤、または唾液分泌剤を挙げることができる。従って、歯の表面などの口腔表面に対する微粒子状の有益剤の耐久性を高めるための組成物および方法を提供することが一般的に必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５−００６９５０１号明細書（Ｉｂｒａｈｉｍら）
【特許文献２】ＰＣＴ公報の国際公開第２００６／０６８０１１号パンフレット
【特許文献３】米国特許第７，２２０，４０５号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００５−０２２６８３９号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００８−０１５２６００号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００８−０２８０８１０号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
解決すべき問題は、口腔ケアシステム、口腔ケアペプチド、および口腔ケア用有益剤をペプチド媒介により口腔表面に適用するためのこのような組成物の使用方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本明細書では、口腔ケアシステム、口腔ケアペプチド、口腔ケアペプチドを含む口腔ケア組成物、および口腔ケア用有益剤を口腔表面に適用するための方法が提供されている。
【００１４】
本明細書では、
（ａ）（ｉ）口腔表面に対する親和性を有し、ＭＢ５０値が１０−５モル濃度以下である第１の結合要素、および
（ｉｉ）第２の結合要素
を含むペプチド組成物と、
（ｂ）０．０１ミクロン〜１０ミクロンの範囲の平均粒径を有する粒子を含む組成物であって、上記粒子が、
（ｉ）有益剤、および
（ｉｉ）リガンド特性
を含む組成物と、
を含む口腔ケアシステムであって、第２の結合要素およびリガンド特性が非共有結合またはキレート化によって互いに会合される口腔ケアシステムが提供されている。
【００１５】
一実施形態では、粒子を含む組成物は上記粒子の安定な分散液である。いくつかの実施形態では、提供される口腔ケアシステムは安定な分散液を有し、安定な分散液は電荷的に安定化されている。また、安定な分散液のゼータ電位の絶対値が少なくとも２５ｍＶであるシステムも提供される。安定な分散液は立体的に安定化されていてもよい。安定な分散液は、イオン性分散剤、非イオン性分散剤またはこれらの組み合わせなどの分散剤を含んでもよい。
【００１６】
一実施形態では、第２の結合要素とリガンド特性との間の会合は、イオン結合に基づく、水素結合に基づく、キレート化に基づく、生物学的親和性に基づく、静電気に基づく、またはこれらの組み合わせである。
【００１７】
一実施形態では、第２の結合要素およびリガンド特性は、ビオチンおよびアビジン、ビオチンおよびストレプトアビジン、ストレプトアビジンタグおよびストレプトアビジン、マルトース結合タンパク質およびマルトース、マルトース結合タンパク質およびアミラーゼ、ポリヒスチジンタグおよび金属イオンを含む親和性媒体、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼおよびグルタチオン、エピトープタグおよび抗体、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１８】
別の実施形態では、第１の結合要素は複数の口腔表面結合ペプチドを含み、いくつかの態様では、複数の口腔表面結合ペプチドは、同じ口腔表面結合ペプチドを２つ以上含む。
【００１９】
別の実施形態では、口腔表面は歯の表面であり、歯の表面はエナメル質またはペリクル（ｐｅｌｌｉｃｌｅ）である。いくつかの態様では、第１の結合要素は、口腔表面に対して、粒子に対するよりも大きい結合親和性を有する。
【００２０】
別の実施形態では、有益剤は、着色剤、ホワイトニング剤、酵素、抗プラーク剤、防汚剤、抗菌剤、抗う蝕剤、香味剤、冷却剤、唾液分泌剤またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【００２１】
別の実施形態では、有益剤は着色剤であり、着色剤は、ＴｉＯ２などの顔料であり得る。いくつかの態様では、ペプチド組成物および粒子は、別の容器において提供される。
【００２２】
別の実施形態では、口腔ケアシステムは、配列番号６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１２０、１２１、１２２、１２３、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、および１４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む。
【００２３】
別の実施形態では、口腔ケアシステムは、配列番号１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、および１５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む。
【００２４】
別の実施形態では、ペプチド組成物は、配列番号１６１、１６２、１６３、および１６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む。
【００２５】
別の実施形態では、ペプチド組成物は、配列番号１１６、１１７、１１９、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１６５、および１６８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する第２の結合要素を含む。
【００２６】
本明細書では、配列番号６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１２０、１２１、１２２、１２３、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、および１４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。
【００２７】
一態様では、配列番号１６１、１６２、１６３、および１６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。
【００２８】
上記ポリペプチドを１つまたは複数含む口腔ケア組成物も提供される。
【００２９】
本明細書では、口腔ケア用有益剤を口腔表面に適用するための方法も提供されており、本方法は、
（ａ）（ｉ）（１）口腔表面に対する親和性を有し、ＭＢ５０値が１０−５モル濃度以下である第１の結合要素、および
（２）第２の結合要素
を含むペプチド組成物と、
（ｉｉ）０．０１ミクロン〜１０ミクロンの範囲の平均粒径を有する粒子を含む組成物であって、上記粒子が、
（１）有益剤、および
（２）リガンド特性
を含む組成物と、
を含む口腔ケアシステムであって、第２の結合要素およびリガンド特性が非共有結合またはキレート化によって互いに会合される口腔ケアシステムを提供するステップと、
（ｂ）口腔表面を（ａ）の口腔ケアシステムと接触させ、それにより、有益剤が上記口腔表面に適用されるステップと
を含む。
【００３０】
本方法の一実施形態では、口腔表面はまずペプチド組成物と接触され、次に粒子を含む組成物と接触される。
【００３１】
本方法の一実施形態では、粒子を含む組成物は上記粒子の安定な分散液である。いくつかの実施形態では、安定な分散液は電荷的に安定化されている。
【００３２】
また、安定な分散液のゼータ電位の絶対値が少なくとも２５ｍＶである口腔ケアシステムおよび方法も提供される。安定な分散液は立体的に安定化されていてもよい。安定な分散液は、イオン性分散剤、非イオン性分散剤またはこれらの組み合わせなどの分散剤を含んでもよい。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
［生物学的配列の簡単な説明］
本発明は、以下の詳細な説明および添付の配列の記述（本出願の一部を形成する）からより完全に理解することができる。
【００３４】
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１−１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ  −  ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ）」）に従い、世界知的所有権機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８年）ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）ならびに実施細則の第２０８条および付属書Ｃ）と一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で規定される規則に従う。
【００３５】
配列番号１〜４０は、口腔表面結合ペプチドのアミノ酸配列である。
【００３６】
配列番号４１〜４４、４６、４８、５０〜６２、および１６０は、ペプチドリンカーのアミノ酸配列である。
【００３７】
配列番号４５、４７、および４９はブランクである。
【００３８】
配列番号６３は、プライマーのヌクレオチド配列である。
【００３９】
配列番号６４〜９４は、口腔表面結合ペプチドのアミノ酸配列である。
【００４０】
配列番号９５は、合成ペプチド対照のアミノ酸配列である。
【００４１】
配列番号９６〜１１５は、口腔表面結合ペプチドのアミノ酸配列である。
【００４２】
配列番号１１６は、ヒスチジン親和性タグ「ＨＡＴ」ポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００４３】
配列番号１１７は、帯電ペプチドブロックのアミノ酸配列である。
【００４４】
配列番号１１８は、実施例１０に記載されるようないくつかの配列に対するＮ末端付加のアミノ酸配列である。
【００４５】
配列番号１１９は、ポリヒスチジンのアミノ酸配列である。
【００４６】
配列番号１２０〜１２３は、ペプチド媒介によるＣｏ−ＮＴＡポリスチレンビーズのエナメル質への接着を実証するために使用されるペプチド組成物のアミノ酸配列である。
【００４７】
配列番号１２４は、シリカ結合ペプチドのアミノ酸配列である。
【００４８】
配列番号１２５〜１４４は、ペリクル結合ペプチドを含む第１の結合要素のアミノ酸配列である。
【００４９】
配列番号１４５〜１５１は、負に帯電した顔料への静電結合のために設計されたペリクル結合性の結合体（ｐｅｌｌｉｃｌｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）のアミノ酸配列である。
【００５０】
配列番号１５２〜１５７は、第２の結合要素のアミノ酸配列である。
【００５１】
配列番号１５８は、可動性の非帯電ペプチドリンカーのアミノ酸配列である。
【００５２】
配列番号１５９は、ベクターｐＫＳＩ（Ｃ４）Ｅ−ＨＣ７７６４３のヌクレオチド配列である。
【００５３】
配列番号１６１は、ペプチドＤｅｎＰ０３−Ｃのアミノ酸配列である。
【００５４】
配列番号１６２は、ペプチドＤｅｎＰ０３−Ｄのアミノ酸配列である。
【００５５】
配列番号１６３は、ペプチドＤＥ１１８のアミノ酸配列である。
【００５６】
配列番号１６４は、ペプチドＤＥ１１８の第１の結合要素のアミノ酸配列である。
【００５７】
配列番号１６５は、ペプチドＤＥ１１８の第２の結合要素のアミノ酸配列である。
【００５８】
配列番号１６６は、ペプチドＤＥ１０１のアミノ酸配列である。
【００５９】
配列番号１６７は、ペプチドＤＥ１０１の第１の結合要素のアミノ酸配列である。
【００６０】
配列番号１６８は、ペプチドＤＥ１０１の第２の結合要素のアミノ酸配列である。
【００６１】
［詳細な説明］
本明細書には、組成物、口腔ケアシステム、粒子を口腔表面に非共有結合で結合させるためのその使用が提供されている。本明細書において記載される口腔ケアシステムは、口腔表面と粒子との間の相互作用を促進するためにペプチドベースの組成物を含む。
【００６２】
本開示において、多数の用語および略語が使用される。他に具体的に記載されない限りは以下の定義が適用される。
【００６３】
本明細書で使用される場合、本発明の要素または成分に先行する冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その要素または成分の事例（すなわち、発生）の数に関して非限定的であることが意図される。従って、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は１つまたは少なくとも１つを含むと解釈されるべきであり、要素または成分の単数の語形は、その数が明らかに単数形であることを意味しない限りは複数形も含む。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、特許請求の範囲において言及されるような規定の特徴、整数、工程、または成分の存在を意味するが、１つまたは複数の他の特徴、整数、工程、成分またはそれらの群の存在または付加を排除しない。「含む」という用語は、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語によって包含される実施形態を含むことが意図される。同様に、「から本質的になる」という用語は、「からなる」という用語によって包含される実施形態を含むことが意図される。
【００６５】
本明細書で使用される場合、使用される原料または反応物の量を修正する「約」という用語は、例えば、実際に濃縮物の製造または溶液の使用のために使用される典型的な測定および液体処理手順によって、これらの手順における不注意な誤差によって、組成物の製造または方法の実行のために使用される原料の製造、供給源、または純度の差異によって、そして同様のことによって生じ得る数量の変動を指す。また「約」という用語は、特定の初期混合物から得られる組成物に対する平衡条件が異なるために異なる量も包含する。「約」という用語によって修正されているかどうかにかかわらず、特許請求の範囲はその量と同等の量を含む。
【００６６】
存在する場合、全ての範囲は包括的であり、組み合わせ可能である。例えば、「１〜５」の範囲が列挙される場合、列挙された範囲は、「１〜４」、「１〜３」、「１〜２」、「１〜２および４〜５」、「１〜３および５」などの範囲を含むと解釈されるべきである。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「口腔ケアシステム」という用語は、口腔表面への粒子の適用（すなわち、非共有結合による結合）を促進する１つまたは複数のペプチド試薬と、粒子を含む組成物とを含むシステムを指す。一実施形態では、粒子を含む組成物は、粒子の安定な分散液である。口腔表面は、歯肉、舌、および頬などの軟組織を含む口腔内に見られる表面を含む。一実施形態では、口腔表面は、歯のエナメル質、ヒドロキシアパタイト、歯のペリクル、およびペリクル被覆ヒドロキシアパタイトを含む。好ましい実施形態では、口腔表面は、歯のエナメル質または歯のペリクルを含む。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「口腔ケア組成物」という用語は、口腔ケアシステムと、経口的に許容可能なキャリア媒体などの口腔ケア製品中に通常見られる成分とを含む組成物を指す。
【００６９】
本明細書では、表面において所望の効果をもたらすように口腔表面への粒子の適用が企図される。このような効果は利益であると考えることができ、従って粒子は「有益剤」を含む。一実施形態では、利益はホワイトニングである。好ましい実施形態では、粒子は、ホワイトニング効果を生じる有益剤を含む。このような有益剤は、ホワイトニング剤または着色剤であってもよい。好ましい着色剤は、ＴｉＯ２などの顔料を含む。一実施形態では、有益剤は、ＴｉＯ２を含む粒子またはシリカ被覆ＴｉＯ２粒子であってもよい。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「システムのペプチドベースの部分」という用語は、少なくとも１つの第２の結合要素に結合された少なくとも１つの第１の結合要素を有する少なくとも１つのペプチドを含む口腔ケアシステムのペプチド成分を指す。一実施形態では、口腔ケアシステムのペプチドベースの部分は、第２の結合要素に共有結合された第１の結合要素を含む。
【００７１】
「ペプチド組成物」という用語は、本明細書で使用される場合、口腔ケアシステムのペプチドベースの部分を指す。ペプチド組成物は、好ましくは、「第１の結合要素」および「第２の結合要素」を含む。「第１の結合要素」は、スキャフォールドタンパク質のフレームワークを欠くと共に免疫グロブリンフォールドを欠いている単鎖ペプチドである。従って、第１の結合要素は、スキャフォールドタンパク質、抗体、抗体断片（Ｆａｂ）、ならびに単鎖可変断片（ｓｃＦｖ、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合）および単一ドメインラクダ科抗体を含まない（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｓ．，Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００１年）７４：２７７−３０２）。いくつかの実施形態については、第１の結合要素および第２の結合要素は互いに共有結合されることが想定される。例えば、本明細書において記載または例示される特定の実施形態では、ペプチド組成物は２つの結合要素で構成される線状ペプチドであるが、ただし、第２の結合要素はバイオパニングされたペプチドではない。
【００７２】
［第１の結合要素］
「第１の結合要素」は、本明細書で使用される場合、口腔表面に対する強力な親和性を有する１つまたは複数の口腔表面結合ペプチドを含む線状ペプチドを指す。一実施形態では、第１の結合要素は、歯結合ペプチド（例えば、歯のエナメル質および／またはペリクルに対する強力な親和性を有するように選択されたペプチド）などの複数の口腔表面結合ペプチドを含む。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「口腔表面結合ペプチド」という用語は、口腔表面に結合するペプチドを指す。一実施形態では、口腔表面結合ペプチドは、ディスプレイライブラリーのバイオパニングによって同定および／または獲得される天然に存在しないペプチドである。別の実施形態では、バイオパニングから得られる２つ以上の口腔表面結合ペプチドが組み合わせられて第１の結合要素を形成してもよい。より長い結合領域を形成するための２つ以上の口腔表面結合ペプチドの組み合わせは、本明細書では、「結合ドメイン」と称してもよい。一実施形態では、口腔表面結合ペプチドは、長さが７アミノ酸〜６０アミノ酸であり、より好ましくは長さが７アミノ酸〜２５アミノ酸、最も好ましくは長さが７〜２０アミノ酸である。好ましい実施形態では、口腔表面ペプチドは、コンビナトリアルに生成されたペプチドである。
【００７４】
第１の結合要素は、好ましくは、バイオパニングによって同定される１つまたは複数の口腔表面結合ペプチドを含む。第１の結合要素が複数の口腔表面結合ペプチドを含む場合、これらは、場合によりペプチドスペーサーによって分離された、同一の配列を有する複数のペプチド、または異なる配列を有するペプチドの集合体であってもよい。異なる配列を有する複数のペプチドが使用される場合、これらは全て、同じ口腔表面に結合するように選択されてもよい（例えば、全てがペリクル結合ペプチド）。しかしながら、他の表面または基質に結合するペプチドも包含され得ることも企図されてもよい。いくつかの実施形態では、第１の結合要素は、以下に記載される少なくとも１つの「歯結合ペプチド」を含む。いくつかの実施形態では、第１の結合要素は単一の口腔表面結合ペプチドを含む、または単一の口腔表面結合ペプチドからなる。
【００７５】
第１の結合要素は、長さが７〜６００アミノ酸、好ましくは長さが１４〜６００アミノ酸、より好ましくは長さが７〜２００アミノ酸、最も好ましくは長さが１４〜２００アミノ酸の範囲であってもよい。
【００７６】
口腔表面結合ペプチドは、歯の表面に結合するペプチドである「歯結合ペプチド」を含むことが認識されるであろう。「歯の表面」という用語は、歯のエナメル質（通常、専門的なクリーニングまたはポリッシングの後に露出される）または歯のペリクル（唾液タンパク質を含む獲得表面）で構成された口腔表面を指す。従って、「ペリクル結合ペプチド」または「エナメル質結合ペプチド」も含まれる。ヒドロキシアパタイトは、天然の歯のペリクル表面を模倣するために唾液糖タンパク質で被覆されてもよい。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「ペリクル」および「歯のペリクル」という用語は、歯冠の表面上に生じる唾液糖タンパク質に由来する薄膜（通常、約２０ｎｍ〜約２００μｍの範囲の厚さ）を指すであろう。毎日の歯磨きはペリクル表面の一部を除去する傾向しかないが、研磨性の歯のクリーニングおよび／またはポリッシング（通常、歯科の専門家による）は、歯のエナメル質表面のより多くを露出させるであろう。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「エナメル質」および「歯のエナメル質」という用語は、歯の外層を形成する高度に石灰化した組織を指すであろう。エナメル質層は、主として、水およびいくらかの有機材料と共に結晶性リン酸カルシウム（すなわち、ヒドロキシアパタイト）で構成される。
【００７９】
同時係属中の共有の米国特許出願公開第２００８−０２８０８１０−Ａ１号明細書に開示されている歯結合ペプチドの例は、表Ａにおいて提供される。付加的な歯結合ペプチドは本明細書において例示されている。
【００８０】
【表１】
0005850825.tif 000002
【００８１】
【表２】
0005850825.tif 000003
【００８２】
第１の結合要素は、さらに、リンカー（「Ｌ」）および／またはスペーサー（「Ｓ」）を含んでもよい。スペーサーは、有機スペーサーおよび／またはペプチドスペーサーであってもよい。一実施形態では、スペーサーは、エタノールアミン、エチレングリコール、６個の炭素原子の鎖長を有するポリエチレン、３〜６個の繰り返し単位を有するポリエチレングリコール、フェノキシエタノール、プロパノールアミド、ブチレングリコール、ブチレングリコールアミド、プロピルフェニル、エチルアルキル鎖、プロピルアルキル鎖、ヘキシルアルキル鎖、ステリルアルキル鎖、セチルアルキル鎖、およびパルミトイルアルキル鎖からなる群から選択される。別の実施形態では、スペーサーはペプチドスペーサーである。適切なスペーサーおよびリンカーは、当該技術分野において、例えば、米国特許第７，２２０，４０５号明細書、ならびに米国特許出願公開第２００５−０２２６８３９号明細書、米国特許出願公開第２００７−０１９６３０５号明細書、米国特許出願公開第２００６−０１９９２０６号明細書、米国特許出願公開第２００７−００６５３８７号明細書、米国特許出願公開第２００８−０１０７６１４号明細書、米国特許出願公開第２００８−０２８０８１０号明細書、米国特許出願公開第２００７−０１１０６８６号明細書、米国特許出願公開第２００６−００７３１１１号明細書、米国特許出願公開第２００６−０２２２６０９号明細書、米国特許出願公開第２００８−０１７５７９８号明細書、および米国特許出願公開第２００７−０２６５４３１号明細書などにおいて記載されている。適切なペプチドリンカー／スペーサーのいくつかの例は表Ｂにおいて提供される。
【００８３】
【表３】
0005850825.tif 000004
【００８４】
また、参照によって本明細書中に援用される同時係属中の米国特許出願第１２／６３２，８３１号明細書（Ｃｈｅｎｇら）に記載されるような剛性ペプチドリンカーも適している。剛性リンカーには、一般式：（Ｘａａ１−Ｘａａ１−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｘａａ２−Ｘａａ２）ｄ（配列番号５７）または（Ｘａａ１−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｘａａ２）ｄ（配列番号５８）または（Ｘａａ１−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ３）ｄ（配列番号５９）（式中、Ｘａａ１＝ＧｌｕまたはＡｓｐ、Ｘａａ２＝ＬｙｓまたはＡｒｇ、そしてＸａａ３＝Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、ＭｅｔまたはＴｙｒであり、ｄ＝２〜１０である）の塩橋安定化α−らせん体形成配列が含まれてもよいが、これらに限定されない。また、式：（Ｘａａ４−Ｐｒｏ）ｅ（配列番号６０）または（Ｐｒｏ−Ｘａａ４）ｅ（配列番号６１）または［（Ｘａａ４−Ｐｒｏ）６−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ］ｅ（配列番号６２）（式中、ｅ＝２〜２０であり、Ｘａａ４は酸性または塩基性アミノ酸である）の伸長プロリンジペプチドも含まれる。
【００８５】
［有益剤］
本明細書で使用される場合、「有益剤」という用語は、所望の／有益な効果または属性を口腔表面に提供する化合物または物質に適用される一般用語である。一実施形態では、口腔表面のための有益剤は、二酸化チタンなどの白色顔料およびヒドロキシアパタイトまたはジルコンなどの白色鉱物を含むがこれらに限定されない着色剤を含んでもよい。別の実施形態では、有益剤は、ホワイトニング剤、ならびに例えば、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、グリコシダーゼ、エステラーゼ、および多糖類ヒドロラーゼなどの酵素も含んでもよい。別の態様では、有益剤は、抗プラーク剤、防汚剤、および抗菌剤を含んでもよい。抗菌剤には、抗菌ペプチド、マガイニン、セクロピン、殺菌剤（ｍｉｃｒｏｂｉｏｃｉｄｅ）、トリクロサン、クロルヘキシジン、塩化セチルピリ
ジニウム、第４級アンモニウム化合物、クロロキシレノール（ｃｈｌｏｒｘｙｌｅｎｏｌ）、クロロキシエタノール（ｃｈｌｏｒｏｘｙｅｔｈａｎｏｌ）、フタル酸およびその塩、チモール、およびこれらの組み合わせが含まれてもよいが、これらに限定されない。また、有益剤は、フッ化ナトリウムまたはモノフルオロリン酸ナトリウムなどの抗う蝕剤、およびウィンターグリーン油、ペパーミント油、もしくはスペアミント油、またはサリチル酸メチル、ユーカリプトール、もしくはバニリンなどの香味剤を含んでもよい。また、有益剤は、いくつか名前を挙げると、コハク酸ベースの冷却化合物などの冷却剤、および唾液分泌剤も含んでもよい。本明細書で使用される場合、「唾液分泌剤」という用語は、口腔ケア組成物中に存在する場合、ユーザーにおいてより多くの唾液分泌を促進する材料を指す。一実施形態では、有益剤は、口腔ケア製品における使用が認可された経口的に許容可能な材料である。別の実施形態では、経口的に許容可能な有益剤は、歯の美容的外観を改善するために使用される。
【００８６】
いくつかの実施形態では、有益剤は微粒子であってもよい。他の実施形態では、有益剤は粒子に会合または負荷させてもよく、粒子は次に、リガンド特性を介して第２の結合要素と会合されるであろう。有益剤が本質的に微粒子状であろうと、粒子と会合していようと、いずれの場合も粒径は上記の平均粒径範囲内にとどまることが好ましい。
【００８７】
本明細書に記載される口腔ケアシステムのために、有益剤は、平均粒径が少なくとも約０．０１ミクロン〜約１０ミクロンの微粒子状であるのが好ましい。さらにより好ましいのは、約０．１ミクロン〜約１０ミクロンまたは約０．１ミクロン〜約１ミクロンの平均粒径を有する有益剤である。動的光散乱を用いて、約１０ミクロン未満の粒径を測定してもよい。
【００８８】
「平均粒径」は専門用語であり、均一または不規則な形状および寸法にかかわらず粒子の集団の特徴を説明するために使用される。平均粒径は、光散乱法などのなどの当該技術分野において知られている方法によって決定される。本明細書で言及される「粒径」が、レーザー回折（ＩＳＯ  １３３２０−１：１９９６、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ，Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄを参照）および／または動的光散乱（ＩＳＯ  １３３２１：１９９６を参照）方法（両方とも当該技術分野において知られている）などの光散乱法を用いて得られる粒径測定値を指し得ることは、当業者によって理解されるであろう。例示的なシステムは、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍから入手可能である。一実施形態では、粒径は、動的光散乱を用いて測定される。
【００８９】
第２の結合要素およびリガンド特性の親和性対
「第２の結合要素」という用語は、本明細書で使用される場合、適用される有益剤のリガンド特性に対する親和性を有するように選択されたペプチド組成物の一部を指す。理論により束縛されないが、第２の結合要素は、「プレイ」リガンド特性を介するペプチド組成物と粒子との相互作用を促進する「ベイト」の役割を果たす。本発明の目的は、バイオパニング方法（ファージディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイなど）による選択を必要とすることなくリガンド特性を介して粒子に結合する第２の結合要素を提供することである。第２の結合要素およびリガンド特性は、通常、粒子またはリガンド特性に対するバイオパニングに基づかない互いに対する親和性を有するであろう。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「リガンド特性」という用語は、有益剤（すなわち、「ベイトおよびプレイセット」の「プレイ」成分）に関連する特性を指し、有益剤をペプチド組成物の第２の結合ドメイン（すなわち、「ベイトおよびプレイセット」の「ベイト」成分、本明細書では「親和性セット」とも称される）と会合させる。いくつかの実施形態では、リガンド特性は有益剤に固有のものであってもよく、例えば、有益剤が負に帯電された顔料であり、第２の結合ドメインが負電荷と会合されてもよいし、あるいは別の例として、有益剤が金属または金属イオンであり、第２の結合ドメイン（「ベイト」）がその金属または金属イオン（「プレイ」）と会合されてもよい。他の実施形態では、リガンド特性を有益剤に付与してもよく、例えば、有益剤はストレプトアビジンに共有結合されてもよく、第２の結合ドメインは、ストレプトアビジン（「プレイ」）と会合されるビオチンである。あるいは、有益剤は、それ自体がペプチド断片と結合されていてもよく、第２の結合ドメイン（「ベイト」）は結合されたペプチド断片（「プレイ」）と会合される。有益剤は、リガンド特性が会合されていても、約０．０１ミクロン〜約１０ミクロンの平均粒径を保持することが好ましい。さらにより好ましいのは、約０．１ミクロン〜約１ミクロンの平均粒径である。
【００９１】
適切な第２の結合要素およびリガンド特性のセットには、イオン結合、水素結合、疎水性相互作用、静電相互作用、キレート化、またはこれらの組み合わせによって相互作用をするものが含まれる。ただし、具体的に言うと、第２の結合要素およびリガンド特性の共有結合による物理的会合は除外される（すなわち、第２の要素および有益剤のリガンド特性は、共有結合によって互いに会合されない）。従って、適切な会合はイオン結合に基づく、水素結合に基づく、疎水結合に基づく、静電相互作用に基づく、またはキレート化に基づく成分であるか、あるいはこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、第２の結合要素およびリガンド特性のセットは、アビジンに対するビオチンの親和性、ストレプトアビジンに対するビオチンの親和性、ストレプトアビジンに対するストレプトアビジンタグの親和性、マルトースに対するマルトース結合タンパク質の親和性、アミラーゼに対するマルトース結合タンパク質の親和性、金属（例えば、ＩＭＡＣ樹脂などのマトリックスに固定化された金属イオン）に対するポリヒスチジンタグの親和性、グルタチオンに対するグルタチオンＳ−トランスフェラーゼの親和性、抗体に対するエピトープタグの親和性、またはこれらの組み合わせに基づく。
【００９２】
１つの好ましい態様では、第２の結合要素と有益剤のリガンド特性との間の会合はキレート化である。本明細書で使用される場合、「キレート化に基づく」対という用語はルイス酸およびルイス塩基の配位共有結合による錯体を指し、ここで、ルイス塩基はルイス酸に２つ以上の孤立電子対を供与する。キレート化に基づく対の例は、種々のアミノ酸側鎖と金属イオンとの相互作用である。キレート化に基づく対において使用するための例示的な金属には、二価の金属、例えばニッケル、銅、コバルト、および亜鉛が含まれる。
【００９３】
ポリヒスチジンタグは、多くの場合、固定化された金属イオン、例えばニッケル（Ｎｉ２＋）、銅（Ｃｕ２＋）、コバルト（Ｃｏ２＋）、または亜鉛（Ｚｎ２＋）などに結合するために使用される。金属イオンは、通常、ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）−アガロース、ＨｉｓＰｕｒコバルト樹脂、イミノジ酢酸（ＩＤＡ）樹脂、カルボキシルメチルアスパルタート（ＣＭＡ）樹脂、ＴＡＬＯＮ（登録商標）（または他の任意の固定化金属アフィニティークロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）樹脂）などの媒体／樹脂中に包含される。金属親和性樹脂は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、ＥＭＤ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、およびＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）などの種々の業者から市販されている。ポリヒスチジン親和性タグは、「ＨＡＴ」タグ（ＫＤＨＬＩＨＮＶＨＫＥＦＨＡＨＡＨＮＫ、配列番号１１６）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）などの、合成または天然に存在するヒスチジン親和性タグであってもよい。一実施形態では、ポリヒスチジンタグは、６〜１０個のヒスチジン残基、好ましくは６〜８個のヒスチジン残基、最も好ましくは６個のヒスチジン残基を含む。別の実施形態では、ポリヒスチジンタグは、長さが６〜約１０個、６〜約８個、または約６個の連続ヒスチジン残基の範囲である。
【００９４】
一実施形態では、ペプチド成分は、微粒子状有益剤の表面の固定化金属イオン（すなわち、リガンド特性）に結合することができる少なくとも１つのポリヒスチジンタグ（例えば、第２の結合要素）を含む。別の実施形態では、微粒子状有益剤は、粒子の表面に有効量の適切な媒体（例えば、金属キレート樹脂）を含む。金属キレート樹脂は、微粒子状有益剤の表面の部分的または完全なコーティングとして適用されてもよい。別の実施形態では、微粒子状有益剤の表面に適用される樹脂は、四座の金属キレート剤を含む（参照によって本明細書中に援用される米国特許第５，９６２，６４１号明細書）。別の実施形態では、親和性対は、ポリヒスチジンタグ、すなわち、マイクロモルの親和性で樹脂固定化金属イオンに結合することができる有効な数のヒスチジン残基を含むアミノ酸モチーフを含むキレート化対である。ポリヒスチジンタグは第２の結合要素の役割を果たすペプチド成分中に組み込まれ、固定化金属イオンは微粒子状有益剤中に組み込まれ、ここで、金属イオンは、ニッケル、銅、コバルト、亜鉛、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００９５】
一実施形態では、第２の結合要素および有益剤のリガンド特性は、イオン結合または静電相互作用で構成され得る。例えば、親和性セットはイオン結合対を含むことができる。本明細書で使用される場合、「イオン結合」対という用語は、一方が正味の正電荷を有し、他方が正味の負電荷を有する２つの部分の会合錯体を指す。静電相互作用は、共有結合の強度と同程度である最強の結合の１つであり、およそ５０ｎｍの長い範囲を有する（Ｉｓｒｅａｌａｃｈｖｉｌｉ，Ｊ．Ｎ．，Ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｆｏｒｃｅｓ，第２版，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９２年）３２−３４頁）。
【００９６】
特定のアミノ酸は、イオン性側基、例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸の側鎖のカルボキシル基、ならびにリジン、アルギニン、およびヒスチジン残基にあるアミノ基を含有する。帯電アミノ酸のいずれかがペプチド配列内にある場合、ペプチドの中には、正味の電荷（正または負）および特定の電荷分布を含有するものが多い。第２の結合要素の全体（または一部）の正味の電荷は、逆に帯電した有益剤のリガンド特性との静電引力を引き起こすか、あるいは同様に帯電した有益剤の親和性対の第２の部分との静電反発力を引き起こすことができる。
【００９７】
イオン（静電）結合対の例としては、正帯電微粒子状有益剤に結合された負帯電ペプチド、正帯電コーティング（例えば、アニオン交換樹脂）で構成または被覆された微粒子状有益剤に結合された負帯電ペプチド、負帯電微粒子状有益剤（例えば、マイカ、シリカ）に結合された正帯電ペプチド、および負電荷を提供するコーティング（例えば、ＳＯ４−２などの基を有するカチオン交換樹脂）を含む微粒子状有益剤に結合された正帯電ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
微粒子状有益剤のリガンド特性の第２の部分の電荷および電荷密度は、適切な表面処理およびｐＨ条件により獲得および調節することができる。電荷は、１）アミノ基、カルボキシル基、スルホン酸基、およびヒドロキシル基などの表面官能基のイオン化によって、あるいは２）溶液からのイオンの特異的吸着によって生じ得る。これに関連して、「特異的吸着」は、吸着イオンが正味の表面電荷を作り出すことができるように吸着が部分的に非電気的性質を有することを暗示する。不活性な有益剤のために、当該技術分野における多数の表面処理法を使用して、イオン性官能基を形成することができる：１）表面を酸化するための酸素プラズマ、または表面ヒドロキシル基および他の基を形成するための特殊ガスのプラズマ重合を用いる（Ｃ．Ｌ．Ｒｉｎｓｃｈら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ（１９９６），１２（２９９５−３００２）、２）金属酸化物表面にシロキサン単分子層を形成するアミノプロピルシランなどの末端官能基により自己組織化単分子膜を形成する（Ｘｉａ，Ｙ．Ｎ．およびＷｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇ．Ｍ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．（１９９８），３７：５５１−５７５）、３）多価電解質多層を任意の表面に吸着させて所望の電荷符号および電荷密度を帯電表面に与えるために多層構築法（ｌａｙｅｒ−ｂｙ−ｌａｙｅｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｐｒｏｃｅｓｓ）を用いる（Ｄｅｃｈｅｒ，Ｇ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７），２７７：１２３２−１２３７）、そして４）帯電ポリマーまたはゾルゲルの沈殿コーティング。微粒子状有益剤の表面電荷は、その表面等電点（ＩＥＰ）、正味の表面電荷がゼロであるｐＨ値によって特徴付けられ得る。従って、そのＩＥＰよりも低いｐＨにおいて、微粒子状有益剤、特に微粒子状有益剤の親和性セット第２の部分は正電荷を有するが、そのＩＥＰよりも高いｐＨでは、有益剤は負電荷を有する。
【００９９】
静電相互作用の範囲は、さらに、イオン強度により調節することができ、イオン強度が低いほど長い相互作用範囲が提供され、イオン強度が高いほど短い相互作用範囲が提供される。相互作用範囲の調節は、低いイオン強度で安定なペプチド−有益剤付加生成物を獲得するが、より高いイオン強度で口腔表面への有益剤の送達を増強するように適用することができる。
【０１００】
親和性セットの第１の部分の正味の電荷は、システムのｐＨに依存して、負であっても正であってもよい。一実施形態では、第２の結合ドメインの正味の電荷は特定のｐＨで正であり、この場合、ｐＨは３．０〜約１０の範囲であってもよい。別の実施形態では、第２の結合ドメインの正味の電荷は特定のｐＨで負であり、この場合、ｐＨは３．０〜約１０の範囲であってもよい。
【０１０１】
例えば、第２の結合要素は正に帯電されてもよく、配列ＫＱＰＮ（配列番号１１７）の反復または配列ＧＫの反復を含んでもよく、負帯電顔料と物理的に会合されてもよい。好ましい態様では、負帯電顔料はシリカ被覆顔料である。さらなる態様では、負帯電粒子は、メソ多孔質シリカ粒子などのケイ質粒子である。
【０１０２】
好ましい実施形態では、第２の結合要素は、負帯電顔料（被覆または非被覆）と会合することが知られている正帯電アミノ酸のドメインである。静電気に基づく相互作用のために、第２の結合要素およびリガンド特性は逆に帯電されるべきであることが認識されるであろう。
【０１０３】
一態様では、第２の結合要素およびリガンド特性セットは、本明細書に記載されるような生物学的な対であってもよく、ビオチン：アビジン、ビオチン：ストレプトアビジン、ストレプトアビジンタグ：ストレプトアビジン、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）：マルトースまたはアミラーゼ、およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）：グルタチオンを含んでもよいが、これらに限定されない。ペプチド成分の第２の結合要素がエピトープタグを含み、微粒子状有益剤が対応する抗体または抗体断片を含む限り、セットはエピトープタグ：抗体対を含んでもよい。市販のエピトープタグの例としては、ＨＡタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｅタグ、Ｓタグ、およびｍｙｃタグが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、第２の結合要素およびリガンド特性対は、エピトープタグ：抗体対を含まない。
【０１０４】
別の実施形態では、第２の結合要素およびリガンド特性は、本明細書に記載されるシステムにおいて置き換えてもよい。例えば、ビオチンは、本明細書に記載されるようにペプチド組成物または結合剤のいずれに会合されているかによって、第２の結合要素またはリガンド特性のいずれかであると考えてもよい。反対に、ストレプトアビジンは、その会合に依存して、結合要素またはリガンド特性であると考えてもよい。
【０１０５】
本明細書に記載される口腔ケアシステムの実施形態のために、ペプチド組成物および有益剤は、それぞれ第２の結合ドメインおよびリガンド特性を介して互いに結合するであろう。第２の結合ドメインおよびリガンド特性の会合は、ペプチド組成物と有益剤との間の会合だけであり、第２の結合要素およびリガンド特性セットについて上記したように、会合はイオン結合に基づく、水素結合に基づく、疎水結合に基づく、静電気に基づく、またはキレート化に基づく、またはこれらの組み合わせであることが好ましい。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、第１の結合ドメインは、リガンド特性を有する有益剤を含む粒子に結合するよりも強力に口腔表面に結合する。いくつかの実施形態では、第１の結合ドメインは、粒子に結合するよりも少なくとも１桁低いＭＢ５０値で口腔表面に結合する（すなわち、より強力に結合する）。他の実施形態では、第１の結合ドメインの口腔表面に対するＭＢ５０値は、第１の結合ドメインと粒子との値よりも少なくとも２桁低い。
【０１０７】
［安定な粒子分散液およびゼータ電位］
本明細書で使用される場合、「安定な分散液」は、粒子が分散されたマトリックスを指し、平均粒径は時間が経っても極めて一定に保たれる。本明細書に記載される目的のために、サンプル（すなわち、粒子分散液）は、サンプルの平均粒径が数日で５０％を超えて増大しなければ、安定に分散されると考えてもよい。別の実施形態では、サンプル中の粒子の平均粒径が分散液の形成後２日以内に粒子の初期粒径よりも５０％を超えて増大しなければ、サンプルは安定に分散され得る。特定の実施形態では、分散液の形成後３日以内の平均粒径の増大は５０％に過ぎない。別の実施形態では、分散液の形成の少なくとも５日以内の平均粒径の増大は５０％に過ぎない。さらに他の実施形態では、分散液の形成の７日以内の平均粒径の増大は５０％に過ぎない。さらに別の実施形態では、５０個の一次粒子よりも大きい凝集体を検出することなく、平均粒径が少なくとも７日で５０％を超えて増大しない場合に、微粒子状分散液は安定であると考えてもよい。当業者は、粒子が最小のエネルギーで容易に再分散され得る（例えば、通常、口腔ケア組成物または口腔ケアシステム内の粒子の均一分散液を再形成するための手による混合／振とうと関連する手による穏やかな振とう／攪拌）限り、安定な粒子分散液は、時間と共にいくらかの沈降を有し得ることを認識するであろう。
【０１０８】
安定な分散液は、当該技術分野において知られている技術を用いて達成してもよい。いくつかの実施形態では、安定な分散液は電荷的に安定化されているか、あるいは立体的に安定化されている。いくつかの実施形態では、安定な分散液は分散剤を含む。本明細書で使用される場合、「分散剤」という用語は、液体媒体中の固体顔料粒子のコロイド溶液の形成を安定化する物質を指す。いくつかの実施形態では、分散剤はイオン性分散剤または非イオン性分散剤である。分散剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、ココイルメチルタウリンナトリウム、ポロキサマー４０７、ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ＰＥＧ−４０ヒマシ油、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、コカミドプロピルベタイン、ラウリルエーテル硫酸ナトリウムを含んでもよいが、これらに限定されない。
【０１０９】
分散液の安定性は、ゼータ電位に関係し得る。ゼータ電位は、分散液中の同様に帯電した隣接する粒子間の反発力の度合いを示す。高いゼータ電位（負または正）を有するコロイドは電気的に安定化されており、低いゼータ電位を有するコロイドは凝固または凝結する傾向がある（「水および廃水におけるコロイドのゼータ電位」、ＡＳＴＭ標準Ｄ４１８７−８２，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，１９８５）。
【０１１０】
ゼータ電位は、当該技術分野において知られている方法／装置を用いて測定することができる。簡単には、分散溶液は、印加電界において測定される。電界において分散した粒子の移動度は、レーザー光散乱を用いて測定される。移動度は、溶液の粘度に対する既知の定数を用いてゼータ電位に変換される。いくつかの実施形態では、電気的に安定な分散液のゼータ電位の絶対値は少なくとも２５ｍＶである。高い絶対ゼータ電位は、凝集および時間依存性の平均粒径の増大を阻止し得る電荷的に安定化された分散液を示す。
【０１１１】
［結合親和性］
「ＭＢ５０」という用語は、ＥＬＩＳＡベースの結合アッセイにおいて得られる最大シグナルの５０％であるシグナルを与える結合ペプチドの濃度を指す（本実施例１１および米国特許出願公開第２００５−０２２６８３９号明細書を参照）。ＭＢ５０値は、複合体の成分の結合相互作用または親和性の強度の表示を提供する。ＭＢ５０値が低いほど、ペプチドと、その対応する基質との相互作用は強くなる。「結合親和性」という用語は、結合ペプチドと、所与の基質との相互作用の強度を指す。結合親和性は、本明細書では、ＥＬＩＳＡベースの結合アッセイにおいて決定されるＭＢ５０値に関して定義される。
【０１１２】
標的表面に対する親和性を有するペプチド（すなわち、標的表面結合ペプチド）は、当該技術分野においてよく知られているコンビナトリアル法を用いて選択されてもよいし、あるいは実験的に生成されてもよい。ペプチド組成物の第１の結合要素は、それが１つの口腔表面結合ペプチドで構成されていても、あるいは複数の口腔表面結合ペプチドで構成されていても、約１０−５Ｍ以下、より好ましくは約１０−６Ｍ以下、さらにより好ましくは約１０−７Ｍ以下、そしてさらにより好ましくは約１０−８Ｍ以下のＭＢ５０値で測定されるような結合親和性によって口腔表面に結合することが好ましい。
【０１１３】
一実施形態では、「高い親和性」または「強力な親和性」という用語は、約１０−５Ｍ以下、好ましくは約１０−６Ｍ以下、より好ましくは約１０−７Ｍ以下、そしてさらにより好ましくは約１０−８Ｍ以下のＭＢ５０値によって測定されるような結合親和性を有する口腔表面結合ペプチドを説明するために使用されるであろう。
【０１１４】
［口腔ケアシステムの方法および使用］
本明細書では、口腔表面に粒子を適用する（すなわち、非共有結合させる）方法が提供および例示されており、本方法は、口腔表面をペプチド組成物と接触させ、続いて、リガンド特性を含む粒子とペプチド組成物とを接触させることとを含む。いくつかの実施形態では、粒子は口腔用有益剤も含む。一実施形態では、粒子は有益剤である。着色剤およびホワイトニング剤は、好ましい口腔用有益剤である。好ましい態様では、ホワイトニング剤は顔料ＴｉＯ２を含む。
【０１１５】
提供される特定の方法を実行するために、本明細書に記載されるようなペプチド組成物および粒子を提供することが必要である。ペプチド組成物を口腔表面に適用してもよく、続いて、微粒子状有益剤が適用される。ペプチド組成物、および微粒子状有益剤を含む組成物は、別の容器において提供されてもよい。好ましくは、ペプチド組成物は、微粒子状有益剤の適用の前に口腔表面に結合するのに十分な時間、口腔表面に適用および接触されることが認識されるであろう。好ましくは、微粒子状有益剤自体は、ペプチド組成物に結合するのに十分な時間、口腔表面に適用および接触される。
【０１１６】
提供されるペプチド組成物および第１の結合ドメインは、口腔ケアシステムにおいて使用してもよい。いくつかの実施形態では、ペプチド組成物は、約１０−５Ｍ以下のＭＢ５０値で口腔表面に結合する第１の結合要素を含み、さらに第２の結合要素も含む。口腔ケアシステムは、さらに、粒子または粒子の安定な分散液を含んでもよく、粒子は有益剤およびリガンド特性を含む。好ましいシステムでは、ペプチド組成物および粒子は、それぞれ第２の結合要素およびリガンド特性を介して会合する。
【０１１７】
［口腔表面結合ペプチドのバイオパニングおよび同定］
一実施形態では、口腔表面結合ペプチドはコンビナトリアルに生成され、長さが７アミノ酸〜６０アミノ酸、より好ましくは長さが７アミノ酸〜２５アミノ酸、最も好ましくは長さが７〜２０アミノ酸の範囲である。ただし、その短い長さおよび直線的な性質のために、本発明の口腔表面結合ペプチドは、標的表面結合抗体および標的表面結合単鎖抗体を除外する。口腔表面結合ペプチドはランダムに生成され、次に標的表面（例えば、歯のエナメル質および歯のペリクルからなる群から選択される歯の表面）に対して選択されてもよい。
【０１１８】
ペプチドのランダムライブラリーの生成はよく知られており、細菌ディスプレイ（Ｋｅｍｐ，Ｄ．Ｊ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８（７）：４５２０−４５２４（１９８１年）、酵母ディスプレイ（Ｃｈｉｅｎら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８（２１）：９５７８−８２（１９９１年））、コンビナトリアル固相ペプチド合成（米国特許第５，４４９，７５４号明細書、米国特許第５，４８０，９７１号明細書、米国特許第５，５８５，２７５号明細書、および米国特許第５，６３９，６０３号明細書）、ファージディスプレイ技術（米国特許第５，２２３，４０９号明細書、米国特許第５，４０３，４８４号明細書、米国特許第５，５７１，６９８号明細書、および米国特許第５，８３７，５００号明細書）、リボソームディスプレイ（米国特許第５，６４３，７６８号明細書、米国特許第５，６５８，７５４号明細書、および米国特許第７，０７４，５５７号明細書）、およびｍＲＮＡディスプレイ技術（ＰＲＯＦＵＳＩＯＮＴＭ、米国特許第６，２５８，５５８号明細書、米国特許第６，５１８，０１８号明細書、米国特許第６，２８１，３４４号明細書、米国特許第６，２１４，５５３号明細書、米国特許第６，２６１，８０４号明細書、米国特許第６，２０７，４４６号明細書、米国特許第６，８４６，６５５号明細書、米国特許第６，３１２，９２７号明細書、米国特許第６，６０２，６８５号明細書、米国特許第６，４１６，９５０号明細書、米国特許第６，４２９，３００号明細書、米国特許第７，０７８，１９７号明細書、および米国特許第６，４３６，６６５号明細書）を含むがこれらに限定されない様々な技術によって達成してもよい。このような生物学的ペプチドライブラリーを生成するための技術は、Ｄａｎｉ，Ｍ．，Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＆  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｒｅｓ．，２１（４）：４４７−４６８（２００１年）に記載されている。さらに、ファージディスプレイライブラリーは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）などの会社から市販されている。
【０１１９】
標的表面結合ペプチドを得るための好ましい方法は、ファージディスプレイによるものである。ファージディスプレイはインビトロの選択技術であり、ペプチドまたはタンパク質がバクテリオファージのコートタンパク質に遺伝的に融合されて、ファージビリオンの外側に融合ペプチドのディスプレイをもたらすが、融合をコードするＤＮＡはビリオン内に存在する。提示されたペプチドとそれをコードするＤＮＡとの間のこの物理的な連結は、「バイオパニング」と呼ばれる簡単なインビトロの選択手順によって、対応するＤＮＡ配列にそれぞれが連結された膨大な数のペプチドの変異形のスクリーニングを可能にする。その最も簡単な形態では、バイオパニングは、ファージ提示変異形のプールをプレートまたはビーズ上に固定化された対象の標的と共にインキュベートし、結合していないファージを洗い流し、そしてファージと標的との間の結合相互作用を破壊することにより特異的に結合したファージを溶出させることによって実行される。溶出されたファージは次にインビボで増幅され、この過程が繰り返されて、最も堅固な結合配列に有利なファージプールの段階的濃縮がもたらされる。３回以上の選択／増幅の後、個々のクローンがＤＮＡ配列決定によって特徴付けられる。
【０１２０】
より具体的には、適切なペプチドライブラリーを生成するか購入した後、ライブラリーは次に適切な量の試験基質と接触される。ペプチドライブラリーは、通常は溶液中に懸濁されるかあるいはプレートまたはビーズ上に固定化されてもよい標的表面と接触させるために、適切な溶液中に溶解される。好ましい溶液は、界面活性剤を含有する緩衝生理食塩水溶液である。適切な溶液は、０．５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）である。溶液は、さらに、標的サンプル／表面へのペプチドの質量移動速度を増大させるために任意の手段によって攪拌され、それにより、最大結合を得るために必要とされる時間を短縮してもよい。
【０１２１】
従って、標的表面結合ペプチドを生成するために以下の方法を使用してもよい。コンビナトリアルに生成されたファージ−ペプチドのライブラリーは対象の標的表面（すなわち、歯の表面などの口腔表面）と接触され、ファージペプチド−標的表面複合体を形成することができる。ファージ−ペプチド−標的表面複合体は非複合ペプチドおよび非結合基質から分離され、ファージ−ペプチド−標的表面複合体からの結合ファージ−ペプチドは、好ましくは酸性溶液を用いて複合体から溶出される。次に、溶出されたファージ−ペプチドは同定および配列決定される。１つの基質に結合するが、別のもの、例えば、別の表面（すなわち、「非標的」表面、例えば、毛髪、皮膚、爪などの別の材料表面）に結合するペプチドには結合しないペプチド配列を同定するために、サブトラクティブパニング工程が使用されてもよい。具体的には、コンビナトリアルに生成されたファージ−ペプチドのライブラリーはまず非標的表面と接触されて、それに結合するファージ−ペプチドを除去する。次に、非結合ファージ−ペプチドは所望の基質と接触され、上記の過程が追随される。あるいは、コンビナトリアルに生成されたファージペプチドのライブラリーは、非標的および所望の基質と同時に接触されもよい。次に、ファージ−ペプチド−標的表面複合体はファージ−ペプチド−非標的複合体から分離され、所望のファージ−ペプチド−標的表面複合体に対して、上記の方法が追随される。
【０１２２】
一実施形態では、標的表面に対してより高い親和性を有するペプチドを単離するための修正ファージディスプレイスクリーニング法が使用されてもよい。修正法では、ファージ−ペプチド−標的表面複合体は上記のように形成される。次に、これらの複合体は溶出緩衝液で処理される。上記の溶出緩衝液のどれが使用されてもよい。好ましくは、溶出緩衝液は酸性溶液である。次に、残存する溶出耐性ファージ−ペプチド−標的表面複合体を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２７３８などの細菌宿主細胞を直接感染させることができる。感染した宿主細胞は、ＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地などの適切な成長培地中で成長され、この培養物は、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）およびＳ−ＧＡＬＴＭを有するＬＢ培地などの適切な成長培地を含有する寒天上に広げられる。成長後、ＤＮＡ単離のためのプラークが採取され、配列決定されて、対象の標的表面に対する高い結合親和性を有するペプチド配列が同定される。
【０１２３】
別の実施形態では、Ｊａｎｓｓｅｎらによって米国特許出願公開第２００３−０１５２９７６号明細書に記載されるように、適切なプライマーを用いてファージ−ペプチド−標的表面複合体においてＰＣＲを直接実行することによって、ＰＣＲを使用して上記の修正ファージディスプレイスクリーニング法から溶出耐性ファージ−ペプチドを同定することができる。
【０１２４】
ペプチドの産生
本明細書において記載されるペプチドは、当該技術分野においてよく知られている標準ペプチド合成法を用いて調製してもよい（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ，１９８４年、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８４年、およびＰｅｎｎｉｎｇｔｏｎら，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９４年を参照）。さらに、多くの会社がカスタムペプチド合成サービスを提供している。
【０１２５】
あるいは、本明細書に記載されるペプチドは、組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術を用いて調製されてもよい。ペプチドをコードする遺伝子は、異種宿主細胞、特に微生物宿主の細胞において産生され得る。
【０１２６】
本発明のペプチドの発現のために好ましい異種宿主細胞は微生物宿主であり、真菌または細菌ファミリーにおいて広く見出すことができ、幅広い温度、ｐＨ値、および溶媒耐性にわたって成長する。転写、翻訳、およびタンパク質生合成装置は細胞原料にかかわらず同じなので、機能性遺伝子は、細胞バイオマスを生成するために使用される炭素原料に関係なく発現される。宿主株の例としては、アスペルギルス属、トリコデルマ属、サッカロミセス属、ピキア属、カンジダ、ヤロウイア属、ハンゼヌラ属などからの真菌または酵母種、またはサルモネラ属、バチルス属、アシネトバクター属、ロドコッカス属、ストレプトミセス属、エシェリキア属、シュードモナス属、メチロモナス属、メチロバクター属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、アルカリゲネス属、シネコシスティス属、アナベナ属、チオバチルス属、メタノバクテリウム属、およびクレブシエラ属などからの細菌種が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２７】
様々な発現系を使用して本発明のペプチドを産生することができる。このようなベクターには、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクター、例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、挿入要素、酵母エピソーム、ウイルス（バキュロウイルス、レトロウイルスなど）由来のベクターと、これらの組み合わせに由来するベクター（例えば、コスミドおよびファージミドなどのプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝因子に由来するものなど）とが含まれるが、これらに限定されない。発現系構築物は、発現を制御すると共に引き起こす制御領域を含有し得る。一般に、これに関連して、宿主細胞においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドを維持、増殖または発現させるために適切な任意の系またはベクターを発現のために使用することができる。微生物発現系および発現ベクターは、宿主細胞の成長に関連して異種タンパク質の高レベルの発現を指示する制御配列を含有する。制御配列は当業者によく知られており、例として、ベクター中の制御要素の存在を含む、化学的または物理的な刺激に応答して遺伝子の発現をオンまたはオフにさせるもの、例えばエンハンサー配列が挙げられるが、これらに限定されない。これらのいずれかが、本発明の結合ペプチドのいずれかの産生のためのキメラ遺伝子を構築するために使用され得る。これらのキメラ遺伝子は次に形質転換によって適切な微生物に導入され、ペプチドの高レベルの発現を提供し得る。
【０１２８】
適切な宿主細胞の形質転換のために有用なベクターまたはカセットは当該技術分野においてよく知られている。通常、ベクターまたはカセットは、関連遺伝子の転写および翻訳を指示する配列、１つまたは複数の選択可能なマーカー、および自律複製または染色体の組込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始の調節を含む遺伝子の領域５’と、転写終結を調節するＤＮＡ断片の領域３’とを含む。両方の調節領域が、形質転換宿主細胞と相同である遺伝子に由来する場合が最も好ましいが、このような調節領域は、産生宿主として選択された特定の種にネイティブな遺伝子に由来する必要はないことが理解されるべきである。選択可能なマーカー遺伝子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性など、形質転換宿主細胞の選択のための表現型形質を提供する。
【０１２９】
所望の宿主細胞におけるキメラ遺伝子の発現を駆動するために有用である開始調節領域またはプロモーターは多数あり、当業者によく知られている。遺伝子を駆動することができる実質的にあらゆるプロモーターが本発明の結合ペプチドの産生に適しており、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセス属における発現のために有用）、ＡＯＸ１（ピキア属における発現のために有用）、およびｌａｃ、ｐＢＡＤ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における発現のために有用）、ならびにａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーターおよび種々のファージプロモーター（バチルス属における発現のために有用）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３０】
また、終結調節領域も好ましい宿主にネイティブな種々の遺伝子に由来してもよい。場合により、終結部位は不要であってもよいが、含まれるのが最も好ましい。
【０１３１】
宿主が本発明のペプチドを発現できるようにするために、適切なＤＮＡ配列、および適切なプロモーターまたは調節配列を含有するベクターを用いて適切な宿主を形質転換してもよい。本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを用いてこのようなペプチドを産生するために、無細胞翻訳系を用いることもできる。場合により、形質転換宿主の分泌産物として、本発明の遺伝子産物を産生することが所望されてもよい。成長培地への所望のタンパク質の分泌は、簡易化されたより安価な精製手順という利点を有する。発現可能なタンパク質の細胞膜を横切る能動輸送を促進する際に、分泌シグナル配列が有用である場合が多いことは、当該技術分野においてよく知られている。分泌が可能な形質転換宿主の作成は、産生宿主において機能性である分泌シグナルをコードするＤＮＡ配列の組込みによって達成してもよい。適切なシグナル配列を選択するための方法は当該技術分野においてよく知られている（例えば、欧州特許第５４６０４９Ｂ１号明細書および国際公開第９３／２４６３１号パンフレットを参照）。
【０１３２】
口腔ケア組成物
本明細書では、有効量の１つまたは複数の本発明のペプチド組成物と、有益剤を含む（または有益剤の機能を果たす）有効量の１つまたは複数の粒子を含む組成物とを含む口腔ケアシステムが企図される。本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、歯のホワイトニングなどの所望の利益を達成するために口腔ケア組成物中に取り込まれた、少なくとも１つの本発明のペプチド組成物の量、あるいは有益剤を含む少なくとも１つまたは複数の粒子の量である。
【０１３３】
口腔ケア組成物は、粉末、ペースト、ゲル、液体、軟膏、錠剤の形態であってもよい。例示的な口腔ケア組成物としては、練り歯磨き、歯科用クリーム、ゲルまたは歯磨き粉、マウスウォッシュ、ブレスフレッシュナー、およびデンタルフロスが挙げてもよいが、これらに限定されない。口腔ケア組成物は、経口的に許容可能なキャリア媒体中に、有効量の本発明のペプチド組成物を含む。口腔ケア組成物中で使用するためのペプチド組成物および粒子を含む組成物（すなわち、口腔ケアシステム）の有効量は、製品のタイプに依存して変わってもよい。通常、口腔ケアシステムの有効量は、口腔ケア組成物の全重量に対して約０．０１重量％〜約９０重量％の割合である。さらに、異なる口腔ケアシステム（例えば、異なる有益剤を含む）の混合物が口腔ケア組成物中で使用されてもよい。混合物中の成分が、ペプチド組成物間に所望の効果を軽減する相互作用が存在しないように選択されることは認識されるであろう。本明細書において開示される口腔ケアシステムの適切な混合物は、日常的な実験を用いて当業者により決定されてもよい。口腔ケアシステムの混合物が組成物中で使用される場合、試薬（ペプチド組成物および微粒子状有益剤）の全濃度は、口腔ケア組成物の全重量に対して約０．０１重量％〜約９０重量％である。
【０１３４】
経口的に許容可能なキャリア媒体の成分は、Ｗｈｉｔｅらにより米国特許第６，７４０，３１１号明細書において、Ｌａｗｌｅｒらにより米国特許第６，７０６，２５６号明細書において、Ｆｕｇｌｓａｎｇらにより米国特許第６，２６４，９２５号明細書において、そしてＩｂｒａｈｉｍらにより米国特許出願公開第２００５−００６９５０１号明細書において記載されており、これらはそれぞれ参照によってその全体が本明細書に援用される。例えば、口腔ケア組成物は以下のうちの１つまたは複数を含むことができる：研磨剤、界面活性剤、酸化防止剤、キレート化剤、フッ化物源、増粘剤、緩衝剤、溶媒、湿潤剤、キャリア、増量剤、ならびに酵素、抗プラーク剤、防汚剤、抗菌剤、抗う蝕剤、抗炎症剤、減感剤、甘味剤、香味剤、ブレスフレッシュ剤、冷却剤、栄養物、および唾液分泌剤などの口腔用有益剤。
【０１３５】
「アミノ酸」という用語は、タンパク質またはポリペプチドの基本的な化学構造単位を指す。本明細書において特定のアミノ酸を同定するために以下の略語が用いられる：
【０１３６】
【表４】
0005850825.tif 000005
【実施例】
【０１３７】
一般的な方法：
本明細書で使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野においてよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｄ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２００１年）、ならびにＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ、Ｍ．Ｌ．およびＥｎｑｕｉｓｔ、Ｌ．Ｗ．，「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｌｄ  Ｐｒｅｓｓ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４年）、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，「Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，第５版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．，２００２年によって記載されている。
【０１３８】
細菌培養物の維持および成長に適した材料および方法も当該技術分野においてよく知られている。以下の実施例において使用するために適切な技術は、「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」，Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ，Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ、Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ，Ｎｏｅｌ  Ｒ．ＫｒｉｅｇおよびＧ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ編，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．，１９９４年、またはＴｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋによる「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」，第２版，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ，１９８９年において見出すことができる。細菌細胞の成長および維持のために使用される全ての試薬、制限酵素および材料は、他に指定されない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、またはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。
【０１３９】
使用される略語の意味は以下の通りである：「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「ｃｍ」はセンチメートルを意味し、「μｍ」はマイクロメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「μＭ」はマイクロモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「ｇ」は引力定数を意味し、「ＲＣＦ」は相対遠心力を意味し、「ｒｐｍ」は１分当たりの回転数を意味し、そして「ｐｆｕ」はプラーク形成単位を意味する。
【０１４０】
実施例１
標準的なバイオパニングを用いる歯（ペリクル）結合ペプチドの選択
本実施例の目的は、標準的なファージディスプレイバイオパニングを用いて、歯のペリクルに結合するファージペプチドを同定することであった。
【０１４１】
圧縮ヒドロキシアパタイトディスク（ＨＡＰディスク、３ｍｍ直径）を使用して、ディスクをヒトの口中で１．５時間インキュベートすることによりペリクルを形成した後、ＴＢＳですすいだ。次に、ＳＵＰＥＲＢＬＯＣＫ（登録商標）ブロッキング緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ、製品＃３７５３５）中において、ディスクを室温で１時間インキュベートした後、ＴＢＳＴ（０．０５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０中のＴＢＳ）で３回洗浄した。１４〜２０のアミノ酸のランダムペプチドインサート（１０１１ｐｆｕ）を含有するファージのライブラリーを各チューブに添加した。６０分間の室温でのインキュベーションおよび５０ｒｐｍでの振とうの後、各ウェルから液体を吸引することによって非結合ファージを除去した後、０．０５％の最終濃度で洗剤ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（ＴＢＳＴ）を含有する１．０ｍＬのＴＢＳにより６回洗浄した。
【０１４２】
次に、サンプルディスクを清浄なチューブに移し、０．２Ｍのグリシン−ＨＣｌ中１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡからなる２００μＬの溶出緩衝液（ｐＨ２．２）を各ウェルに添加し、１０分間インキュベートして、結合ファージを溶出させた。次に、１Ｍのトリス−ＨＣｌからなる３２μＬの中和緩衝液（ｐＨ９．２）を各ウェルに添加した。溶出緩衝液中およびサンプルディスク上にあるファージ粒子は、ＬＢ培地中に１：１００で希釈された一晩培養物から希釈大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２７３８細胞と共に３７℃で４．５時間インキュベートすることにより増幅した。その後、細胞培養物を３０秒間遠心分離し、上澄みの上部８０％を新しいチューブに移し、１／６体積のＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％のポリエチレングリコール−８００、２．５Ｍの塩化ナトリウム）を添加し、ファージを４℃で一晩沈殿させた。４℃で１０，０００×ｇにおける遠心分離によって沈殿物を捕集し、得られたペレットを１ｍＬのＴＢＳ中に再懸濁させた。これは１回目の増幅ストックであった。次に、１回目の増幅されたファージストックを標準プロトコルに従って滴定した。２回目、３回目および４回目のバイオパニングのために、前の回からの２×１０１１ｐｆｕを超えるファージストックを使用した。バイオパニングプロセスを上記と同じ条件下であと２回繰り返した。４回目については、洗浄溶液が０．０５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０の代わりに０．５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含むＴＢＳであったことを除いて同じバイオパニング条件を使用した。
【０１４３】
４回目のバイオパニングの後、製造業者の使用説明書（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に従って９５のランダムな単一ファージプラークライセートを調製し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍ１３  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて一本鎖ファージゲノムＤＮＡを精製し、ＤｕＰｏｎｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて−９６ｇＩＩＩ配列決定プライマー（５’−ＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−３’、配列番号６３）を用いて配列決定した。提示されたペプチドは、遺伝子ＩＩＩのシグナルペプチドの直後に位置する。３回目および４回目の分析において存在するペプチド配列に基づいて、さらなるペリクル結合分析のために２０のファージ候補を選択した。
【０１４４】
実施例２
ペリクル表面における歯（ペリクル）結合ペプチド候補のキャラクタリゼーション
合計２０の選択されたファージ候補（実施例１）をファージＥＬＩＳＡ実験において使用した。精製ファージライセートを用いて、ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合された抗Ｍ１３ファージ抗体を用いてペリクル被覆ＨＡＰディスクに結合させた後、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商品＃３４０２１、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から入手した発色剤ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）を添加した。プレートをＡ４５０ｎｍにおいて読み取った。
【０１４５】
試験される各ファージ候補に対して、ペリクル被覆ＨＡＰディスク（３ｍｍ直径）を、ＴＢＳ中２％の脱脂粉乳（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｉｎｃ．）からなる２００μＬのブロッキング緩衝液と共に室温で１時間インキュベートした。各チューブから液体を吸引することによってブロッキング緩衝液を除去した。ＴＢＳＴ−０．０５％からなる洗浄緩衝液でチューブを６回すすいだ。１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含有する２００μＬのＴＢＳＴ−０．５％をウェルに満たし、次に、１０μＬ（１０１０ｐｆｕを超える）の精製ファージストックを添加した。サンプルをゆっくり振とうさせながら室温で６０分間インキュベートした。ＴＢＳＴ−０．５％で６回洗浄することによって非結合ファージを除去した。次に、ブロッキング緩衝液中に１：５００で希釈されたホースラディッシュペルオキシダーゼ／抗Ｍ１３抗体結合体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＵＳＡ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を１００μＬ添加し、室温で１時間インキュベートした。結合体溶液を除去し、ＴＢＳＴ−０．５％で６回洗浄した。ＴＭＢ基質（２００μＬ）を各ウェルに添加し、室温で５〜３０分間、通常は１０分間発色させた。次に、停止溶液（２００μＬの２ＭのＨ２ＳＯ４）を各ウェルに添加し、溶液を９６ウェルプレートに移し、マイクロプレート分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いてＡ４５０を測定した。得られた吸光度値は表１に与えられる。
【０１４６】
【表５】
0005850825.tif 000006
【０１４７】
本明細書において企図される口腔表面には、歯、より具体的にはペリクルが含まれる。一実施形態では、ペプチド組成物または第１の結合要素は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の配列を有する少なくとも１つのペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ペプチド組成物または第１の結合要素は複数のペプチドを含み、ペプチドの少なくとも１つは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の配列を有する。
【０１４８】
実施例３
標準的なバイオパニングを用いる歯（エナメル質）結合ペプチドの選択
本実施例の目的は、標準的なファージディスプレイバイオパニングを用いて、歯のエナメル質に結合するファージペプチドを同定することであった。
【０１４９】
切歯からの非研磨ウシエナメル質ブロック（３ｍｍ角）および切歯からの研磨ウシエナメル質ディスク（３ｍｍ直径ディスク）をワックス内に埋め込み、意図される表面のみが露出されたウェルを形成した。次に、ＳＵＰＥＲＢＬＯＣＫ（登録商標）ブロッキング緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ、製品＃３７５３５）中で、エナメル質表面を室温（〜２２℃）で１時間インキュベートした後、ＴＢＳＴ（０．０５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０中のＴＢＳ）で３回洗浄した。１４〜２０のアミノ酸のランダムペプチドインサート（１０１１ｐｆｕ）を含有するファージのライブラリーを１０分の前吸収のためにエナメル質ウェルに添加してワックス表面を滴定し、ウェルから液体を吸引することによって非結合ファージを除去した。次に、１００μＬの同じファージライブラリー（１０１１ｐｆｕ）を５０ｒｐｍでゆっくり振とうさせながら、室温で６０分のインキュベーションのためにエナメル質ウェルに添加した後、０．０５％の最終濃度で洗剤ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（ＴＢＳＴ）を含有する１．０ｍＬのＴＢＳで６回洗浄した。
【０１５０】
次に、エナメル質ブロックをワックスウェルから切り出して清浄なチューブに移し、０．２Ｍのグリシン−ＨＣｌ中１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡからなる２００μＬの溶出緩衝液（ｐＨ２．２）を各ウェルに添加し、１０分間インキュベートして、結合ファージを溶出させた。次に、１Ｍのトリス−ＨＣｌからなる３２μＬの中和緩衝液（ｐＨ９．２）を各チューブに添加した。溶出緩衝液中およびエナメル質ブロック上にあるファージ粒子は、ＬＢ培地中に１：１００で希釈された一晩培養物から希釈大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２７３８細胞と共に３７℃で４．５時間インキュベートすることにより増幅した。その後、細胞培養物を３０秒間遠心分離し、上澄みの上部８０％を新しいチューブに移し、１／６体積のＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％のポリエチレングリコール−８００、２．５Ｍの塩化ナトリウム）を添加し、ファージを４℃で一晩沈殿させた。４℃で１０，０００×ｇにおける遠心分離によって沈殿物を捕集し、得られたペレットを１ｍＬのＴＢＳ中に再懸濁させた。これは１回目の増幅ストックであった。次に、１回目の増幅されたファージストックを標準プロトコルに従って滴定した。２回目のバイオパニングのために、前の回からの２×１０１１ｐｆｕを超えるファージストックを使用した。バイオパニングプロセスを上記と同じ条件下であと１回繰り返した。３回目については、洗浄溶液が０．０５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０の代わりに０．５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含むＴＢＳであったことを除いて同じバイオパニング条件を使用した。
【０１５１】
３回目のバイオパニングの後、製造業者の使用説明書（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に従って９５のランダムな単一ファージプラークライセートを調製し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍ１３  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて一本鎖ファージゲノムＤＮＡを精製し、配列番号６３で与えられる−９６ｇＩＩＩ配列決定プライマー（５’−ＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−３’）を用いて、ＤｕＰｏｎｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて配列決定した。提示されたペプチドは、遺伝子ＩＩＩのシグナルペプチドの直後に位置する。ペプチド配列に基づいて、さらなるペリクル結合分析のために２０のファージ候補を選択した（表２）。「ＢｏＥｎ」はウシエナメル質を意味し、「ＢｏＥｎ  Ｐ」は研磨ウシエナメル質を意味する。
【０１５２】
【表６】
0005850825.tif 000007
【０１５３】
本明細書において企図される口腔表面には、歯、より具体的にはペリクルが含まれる。一実施形態では、ペプチド組成物または第１の結合要素は、配列番号２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０の配列を有する少なくとも１つのペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ペプチド組成物または第１の結合要素は複数のペプチドを含み、ペプチドの少なくとも１つは配列番号２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０の配列を有する。
【０１５４】
実施例４
エナメル質表面における歯（エナメル質）結合ペプチド候補のキャラクタリゼーション
合計１１の選択されたファージ候補（実施例３）をファージＥＬＩＳＡ実験において使用した。精製ファージライセートを用いて、ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合された抗Ｍ１３ファージ抗体を用いてエナメル質ブロックに結合させた後、発色剤ＴＭＢを添加した。プレートをＡ４５０ｎｍにおいて読み取った。
【０１５５】
試験される各ファージ候補に対して、研磨および非研磨エナメル質ブロックを、ＴＢＳ中２％の脱脂粉乳（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｉｎｃ．）からなる２００μＬのブロッキング緩衝液と共に室温で１時間インキュベートした。液体を各チューブから吸引することによってブロッキング緩衝液を除去した。ＴＢＳＴ−０．０５％からなる洗浄緩衝液でチューブを６回すすいだ。１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有する２００μＬのＴＢＳＴ−０．５％をウェルに満たし、次に、１０μＬ（１０１０ｐｆｕを超える）の精製ファージストックを添加した。サンプルをゆっくり振とうさせながら室温で６０分間インキュベートした。ＴＢＳＴ−０．５％で６回洗浄することにより非結合ファージを除去した。次に、ブロッキング緩衝液中に１：５００で希釈されたホースラディッシュペルオキシダーゼ／抗Ｍ１３抗体結合体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＵＳＡ，（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））を１００μＬ添加し、室温で１時間インキュベートした。結合体溶液を除去し、ＴＢＳＴ−０．５％で６回洗浄した。ＴＭＢ基質（２００μＬ）を各ウェルに添加し、室温で５〜３０分間、通常は１０分間発色させた。次に、停止溶液（２００μＬの２ＭのＨ２ＳＯ４）を各ウェルに添加し、溶液を９６ウェルプレートに移し、マイクロプレート分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ））を用いてＡ４５０を測定した。得られた吸光度値は表３および４に与えられる。ＢｏＥｎ
Ｐはウシ研磨エナメル質を意味し、ＢｏＥｎはウシエナメル質を意味する。
【０１５６】
【表７】
0005850825.tif 000008
【０１５７】
【表８】
0005850825.tif 000009
【０１５８】
本明細書において企図される口腔表面には、歯、より具体的にはエナメル質または研磨エナメル質が含まれる。一実施形態では、ペプチド組成物または第１の結合要素は、配列番号２２、２３、２５、２６、または２８の配列を有する少なくとも１つのペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ペプチド組成物または第１の結合要素は複数のペプチドを含み、ペプチドの少なくとも１つは、配列番号２２、２３、２５、２６、または２８の配列を有する。一実施形態では、ペプチド組成物または第１の結合要素は、配列番号３１、３５、３６、３７、３９、または４０の配列を有する少なくとも１つのペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ペプチド組成物または第１の結合要素は複数のペプチドを含み、ペプチドの少なくとも１つは、配列番号３１、３５、３６、３７、３９、または４０の配列を有する。
【０１５９】
実施例５
標準的なバイオパニングを用いる歯（ペリクル）結合ペプチドの選択
本実施例の目的は、標準的なファージディスプレイバイオパニングを用いてインビボでウシエナメル質上に形成された歯のペリクルに結合するファージペプチドを同定することであった。
【０１６０】
ウシエナメル質切歯は、ＳＥ  Ｄｅｎｔａｌ（Ｂａｔｏｎ  Ｒｏｕｇｅ，ＬＡ）から入手した。歯を約５ｍｍ角に切断し、研磨して、表面のくずを除去した。エナメル質ブロックを滅菌し、エナメル質表面をヒトの口腔環境にさらすために口腔内リテーナーに縫い付けた。２〜４個のエナメル質ブロックを付けたリテーナーをヒトの口の中に３０分間装着させ、エナメル質上にペリクル層を形成した。インキュベーションの後、エナメル質ブロックをリテーナーから除去し、水ですすぎ、成形材料を含有するウェルプレートに、ウェル内のペリクル被覆エナメル質表面のみを露出させるように埋め込んだ。プレートをＵＶ光で１０分間滅菌した。
【０１６１】
次に、基質をブロッキング緩衝液中、室温で１時間インキュベート（〜２２℃、０．１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（ＰＢＳＴ）を有するリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）（Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＵＰＨＴＭ  ＃２８３７２）中１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン）した後、ＰＢＳＴで２回洗浄した。１５〜２０のアミノ酸のランダムペプチドインサート（１０１１ｐｆｕ）を含有するファージのライブラリーを各ウェルに添加した。３７℃における３０分間のインキュベーションおよび５０ｒｐｍでの振とうの後、各ウェルから液体を吸引することによって非結合ファージを除去した後、１．０ｍＬのＰＢＳＴで６回洗浄した。
【０１６２】
次に、エナメル質ブロックを清浄なチューブに移し、０．２Ｍのグリシン−ＨＣｌ中１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡからなる１ｍＬの溶出緩衝液（ｐＨ２．２）を各ウェルに添加し、１０分間インキュベートして、結合ファージを溶出させた。次に、１Ｍのトリス−ＨＣｌからなる１６７μＬの中和緩衝液（ｐＨ９．１）を各ウェルに添加した。溶出緩衝液中およびエナメル質ブロック上にあるファージ粒子は、ＬＢ培地中に１：１００で希釈された一晩培養物から２０ｍＬの希釈大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２７３８細胞と共に３７℃で４．５時間インキュベートすることにより増幅した。その後、細胞培養物を２分間遠心分離し、上澄みの上部１５ｍＬを新しいチューブに移し、２．５ｍＬのＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％ポリエチレングリコール−８００、２．５Ｍの塩化ナトリウム）を添加し、ファージを４℃で一晩沈殿させた。４℃で１０，０００×ｇにおける遠心分離によって沈殿物を捕集し、得られたペレットを１ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁させた。これは１回目の増幅ストックであった。次に、１回目の増幅されたファージストックを標準プロトコルに従って滴定した。次の回のバイオパニングのために、前の回からの２×１０１１ｐｆｕを超えるファージストックを使用した。１回目の後の付加的な回のバイオパニングのそれぞれには、水中０．５％のラウリル硫酸ナトリウム（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）による付加的な洗浄、炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．４）（Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＵＰＨＴＭ  炭酸塩−重炭酸塩緩衝液＃２８３８２）による２回の洗浄、および５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ２．５）による２回の洗浄も含まれた。
【０１６３】
ファージストックをさらに口腔軟組織にさらして、バイオパニングプロセスを上記と同じ条件下でさらにあと３回繰り返した。８μＬの２回目のファージストック＋４２μＬのブロッキング緩衝液（ＰＢＳＴ＋１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ）を６０分間インキュベートすることによって、２回目のバイオパニングから増幅したファージストックをまずＥＰＩＯＲＡＬＴＭおよびＥＰＩＧＩＮＧＩＶＡＬＴＭ軟組織（ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐ，（Ａｓｈｌａｎｄ，ＭＡ））にさらした。溶液を組織から除去し、付加的な５０μＬのＰＢＳを組織と共に３０分間インキュベートした。溶液を合わせ、上記のような付加的な回のバイオパニングにおいて使用した。
【０１６４】
３回目のバイオパニングおよびその後の各回の後に、９５のランダムな単一ファージプラークを単離し、Ｉｌｌｕｓｔｒａ  Ｔｅｍｐｌｉｐｈｉ  ５００  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））を用いて一本鎖ファージゲノムＤＮＡを調製し、−９６ｇＩＩＩ配列決定プライマー（５’−ＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−３’、配列番号６３）を用いて、ＤｕＰｏｎｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて配列決定した。提示されたペプチドは、遺伝子ＩＩＩのシグナルペプチドの直後に位置する。ペプチド配列に基づいて、さらなるペリクル結合分析のために３１のファージ候補を同定した。
【０１６５】
【表９】
0005850825.tif 000010
【０１６６】
本明細書において企図される口腔表面には、歯、より具体的にはペリクルが含まれる。一実施形態では、ペプチド組成物または第１の結合要素は、配列番号６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、または９４の配列を有する少なくとも１つのペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ペプチド組成物または第１の結合要素は複数のペプチドを含み、ペプチドの少なくとも１つは、配列番号６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、または９４の配列を有する。
【０１６７】
実施例６
ペリクル表面における歯（ペリクル）結合候補のキャラクタリゼーション
表５からの合計２９の選択されたファージ候補をファージＥＬＩＳＡ実験において使用して、ペリクル基質上の各ファージの結合親和性および被覆度を決定した。精製ファージライセートを用いて、ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合された抗Ｍ１３ファージ抗体を用いてペリクル被覆ウシエナメル質に結合させた後、発色剤ＴＭＢを添加した。プレートをＡ４５０ｎｍにおいて読み取った。
【０１６８】
エナメル基質を約７ｍｍ角に切断し、口の中で３０分間インキュベーションするためにワックス台上に取り付けて、ペリクル被覆表面を形成した。ペリクル被覆エナメル基質をワックスバッキングから除去し、ウェルプレート内に置き、実施例５のようにペリクル表面を露出させた。各ペリクル被覆基質を、ＰＢＳＴ（０．１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を有するＰｉｅｒｃｅ  ＢＵＰＨＴＭ♯２８３７２）中１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡからなる１ｍＬのブロッキング緩衝液と共に室温で１．５時間インキュベートした。各ウェルから液体を吸引することによってブロッキング緩衝液を除去した。ＰＢＳＴからなる洗浄緩衝液でチューブを２回すすいだ。ブロッキング緩衝液中に希釈することにより精製した１ｍＬの１０１１ｐｆｕの精製ファージストックをウェルに満たした。サンプルをゆっくり振とうさせながら３７℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄することによって非結合ファージを除去した。次に、ブロッキング緩衝液中に１：５００で希釈されたホースラディッシュペルオキシダーゼ／抗Ｍ１３抗体結合体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＵＳＡ，（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））を５００μＬ添加し、室温（〜２２℃）で１時間インキュベートした。結合体溶液を除去し、ＰＢＳＴで３回洗浄した。各エナメル基質をウェルから除去し、１５ｍＬの試験管中で５ｍＬのＰＢＳＴにより再度洗浄した。次に、各エナメル基質を清浄なウェルプレート内に取り付け、エナメル質表面のみを露出させた。ＴＭＢ基質およびＨ２Ｏ２の１：１溶液（２００μＬ）を各ウェルに添加し、室温（〜２２℃）で５分間〜３０分間の間、通常は１０分間発色させた。次に、停止溶液（１００μＬの２ＭのＨ２ＳＯ４）を各ウェルに添加し、溶液を９６ウェルプレートに移し、マイクロプレート分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ））を用いてＡ４５０を測定した。得られた吸光度値は表６に与えられる。３０のペリクル結合候補全ての分析を２日間にわたって完了させ、結果を内部対照に対して正規化した。
【０１６９】
【表１０】
0005850825.tif 000011
【０１７０】
本明細書において企図される口腔表面には、歯、より具体的にはペリクルが含まれる。一実施形態では、ペプチド組成物または第１の結合要素は、配列番号６４、６５、６６、６７、６８、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、または９３の配列を有する少なくとも１つのペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ペプチド組成物または第１の結合要素は複数のペプチドを含み、ペプチドの少なくとも１つは、配列番号６４、６５、６６、６７、６８、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、または９３の配列を有する。
【０１７１】
実施例７
標準的なバイオパニングを用いるペリクル結合ペプチドの選択
本実施例の目的は、標準的なファージディスプレイバイオパニングを用いて、口の中に長期間さらして作られた歯のペリクルに結合するファージペプチドを同定することであった。
【０１７２】
ウシエナメル質切歯は、ＳＥ  Ｄｅｎｔａｌ（Ｂａｔｏｎ  Ｒｏｕｇｅ，ＬＡ）から入手した。歯を約７ｍｍ角に切断し、研磨して、表面のくずを除去した。エナメル質ブロックを滅菌し、エナメル質表面をヒトの口腔環境にさらすために口腔内リテーナーに縫い付けた。４個のエナメル質ブロックを付けたリテーナーをヒトの口の中に約８時間装着させた。リテーナーを被験者から取り出し、水中で練り歯磨きおよび柔らかい毛先のブラシを用いて各エナメル質ブロックを手でブラッシングした。リテーナーを被験者の口にさらに１分間再挿入した。エナメル質ブロックをリテーナーから除去し、水ですすぎ、成形材料を含有するウェルプレートに、ウェル内のペリクル被覆エナメル質表面のみを露出させるように埋め込んだ。プレートをＵＶ光で１０分間滅菌した。
【０１７３】
次に、基質をブロッキング緩衝液中、室温（〜２２℃）で１時間インキュベート（０．１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（ＰＢＳＴ）を有するリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）（Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＵＰＨＴＭ  ＃２８３７２）中１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン）した後、ＰＢＳＴ（０．１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０中のＰＢＳ）で２回洗浄した。１６〜２０のアミノ酸のランダムペプチドインサート（１０１１ｐｆｕ）を含有するファージライブラリーを各ウェルに添加した。３７℃における３０分間のインキュベーションおよび５０ｒｐｍでの振とうの後、各ウェルから液体を吸引することによって非結合ファージを除去した後、１．０ｍＬのＰＢＳＴで２回洗浄した。
【０１７４】
次に、エナメル質ブロックを清浄なチューブに移し、０．２Ｍのグリシン−ＨＣｌ中１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡからなる１ｍＬの溶出緩衝液（ｐＨ２．２）を各ウェルに添加し、１０分間インキュベートして、結合ファージを溶出させた。次に、１Ｍのトリス−ＨＣｌからなる１６７μＬの中和緩衝液（ｐＨ９．１）を各ウェルに添加した。溶出緩衝液中およびエナメル質ブロック上にあるファージ粒子は、ＬＢ培地中に１：１００で希釈された一晩培養物から２０ｍＬの希釈大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２７３８細胞と共に３７℃で４．５時間インキュベートすることにより増幅した。その後、細胞培養物を２分間遠心分離し、上澄みの上部１５ｍＬを新しいチューブに移し、２．５ｍＬのＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％ポリエチレングリコール−８００、２．５Ｍの塩化ナトリウム）を添加し、ファージを４℃で一晩沈殿させた。４℃で１０，０００×ｇにおける遠心分離によって沈殿物を捕集し、得られたペレットを１ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁させた。これは１回目の増幅ストックであった。次に、１回目の増幅されたファージストックを標準プロトコルに従って滴定した。２回目、３回目、４回目および５回目のバイオパニングのために、前の回からの２×１０１１ｐｆｕを超えるファージストックを使用した。これらの後続の回のバイオパニングには、ファージの最初のインキュベーションの後に付加的な洗浄プロセスが含まれた。これらの洗浄には、水中０．５％のラウリル硫酸ナトリウム（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）、炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．４）（Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＵＰＨＴＭ  炭酸塩−重炭酸塩緩衝液＃２８３８２）による２回の洗浄、および５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ２．５）による２回の洗浄、その後のＰＢＳＴによる５回の洗浄が含まれた。
【０１７５】
３回目およびそれに続く各回のバイオパニングの後、９５のランダムな単一ファージプラークを単離し、Ｉｌｌｕｓｔｒａ  Ｔｅｍｐｌｉｐｈｉ  ５００  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））を用いて一本鎖ファージゲノムＤＮＡを調製し、ＤｕＰｏｎｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて−９６ｇＩＩＩ配列決定プライマー（５’−ＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−３’、配列番号６３）を用いて配列決定した。提示されたペプチドは、遺伝子ＩＩＩのシグナルペプチドの直後に位置する。ペプチド配列に基づいて、さらなるペリクル結合分析のために２３のファージ候補を選択した。これらの候補には、実施例５のパニングにおいて既に発見されている３つの配列が含まれた。
【０１７６】
【表１１】
0005850825.tif 000012
【０１７７】
本明細書において企図される口腔表面には、歯、より具体的にはペリクル、さらにより具体的にはブラッシングされたペリクルが含まれる。一実施形態では、ペプチド組成物または第１の結合要素は、配列番号９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、７４、７０、または７１の配列を有する少なくとも１つのペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ペプチド組成物または第１の結合要素は複数のペプチドを含み、ペプチドの少なくとも１つは、配列番号９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、７４、７０、または７１の配列を有する。
【０１７８】
実施例８
ペリクル表面における歯ペリクル結合候補のキャラクタリゼーション
合計１８の選択されたファージ候補をファージＥＬＩＳＡ実験において使用した。精製ファージライセートを用いて、ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合された抗Ｍ１３ファージ抗体を用いてペリクル被覆ウシエナメル質に結合させた後、発色剤ＴＭＢを添加した。プレートをＡ４５０ｎｍにおいて読み取った。
【０１７９】
エナメル基質を約４ｍｍ角に切断し、清浄にし、滅菌し、口の中で３０分間インキュベーションするためにワックス台上に取り付けて、ペリクル被覆表面を形成した。ペリクル被覆エナメル基質をワックスバッキングから除去し、ウェルプレート内に置き、実施例５のようにペリクル表面を露出させた。各ペリクル被覆基質を、ＰＢＳＴ（ｐＨ７．２）（０．１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を有するＰｉｅｒｃｅ  ＢＵＰＨＴＭ  ♯２８３７２）中１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡからなる０．５ｍＬのブロッキング緩衝液と共に室温（〜２２℃）で１時間インキュベートした。各ウェルから液体を吸引することによってブロッキング緩衝液を除去した。ウェルをＰＢＳＴからなる洗浄緩衝液で２回すすいだ。ブロッキング緩衝液中に希釈することにより調製した１ｍＬの１０１１ｐｆｕの精製ファージストックをウェルに満たした。サンプルをゆっくり振とうさせながら３７℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄することによって非結合ファージを除去した。次に、ブロッキング緩衝液中に１：５００で希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ／抗Ｍ１３抗体結合体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＵＳＡ，（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））を５００μＬ添加し、室温で４５分間インキュベートした。結合体溶液を除去し、ＰＢＳＴで５回洗浄した。各エナメル基質をウェルから除去し、１５ｍＬの試験管中で１０ｍＬのＰＢＳＴにより再度洗浄した。次に、各エナメル基質を清浄なウェルプレート内に取り付け、エナメル質表面のみを露出させた。ＴＭＢ基質およびＨ２Ｏ２の１：１溶液（２００μＬ）を各ウェルに添加し、室温で５分間〜３０分間の間、通常は１０分間発色させた。次に、停止溶液（１００μＬの２ＭのＨ２ＳＯ４）を各ウェルに添加し、溶液を９６ウェルプレートに移し、マイクロプレート分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ））を用いてＡ４５０を測定した。得られた吸光度値は表８に与えられる。１８のペリクル結合候補全ての分析を２日間にわたって完了させ、結果を、両方の日に測定したＤｅｎＰ３の結果に対して正規化した。
【０１８０】
【表１２】
0005850825.tif 000013
【０１８１】
本明細書において企図される口腔表面には、歯、より具体的にはペリクルが含まれる。一実施形態では、ペプチド組成物または第１の結合要素は、配列番号６６、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、または１１４の配列を有する少なくとも１つのペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ペプチド組成物または第１の結合要素は複数のペプチドを含み、ペプチドの少なくとも１つは、配列番号６６、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、または１１４の配列を有する。
【０１８２】
実施例９
ペプチド媒介によるＣｏ−ＮＴＡポリスチレンビーズのウシエナメル質への接着
ウシエナメル質におけるファージディスプレイパニングによって発見された口腔表面（エナメル質）結合ペプチド（実施例３および４を参照）と、金属キレート化ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）への親和性を有する６個のヒスチジンの配列（以下、「Ｈｉｓ６」とも称する、配列番号１１９）とを組み込んだペプチド組成物を設計した。エナメル質結合ドメインの一般的な設計には、短いＮ末端配列と、それに続くペプチドリンカーによって離間された２つ以上の口腔表面結合ドメインとが含まれた。ポリヒスチジン配列はＣ末端に位置した。ペプチドベースの試薬を構築するために使用された配列は、表９に記載される。ペプチドサンプルを発酵により産生した（実施例１５に記載される通り）。ペプチド「Ｓｏｔｉ１３」は配列ＬＮＳＭＳＤＫＨＨＧＨＱＮＴＡＴＲＮＱＨ（配列番号１２４）を有し、シリカ被覆ＴｉＯ２に対するバイオパニングによって同定した（米国特許出願公開第１２／６３２，８２９号明細書（Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋら）を参照
【０１８３】
【表１３】
0005850825.tif 000014
【０１８４】
ウシエナメル質切歯は、ＳＥ  Ｄｅｎｔａｌ（Ｂａｔｏｎ  Ｒｏｕｇｅ，ＬＡ）から入手した。歯を薄片にし、ダイヤモンド刃の付いたＤＲＥＭＥＬ（登録商標）ｒｏｔａｒｙ（Ｒｏｂｅｒｔ  Ｂｏｓｃｈ  ＬＬＣ，（Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ  Ｈｉｌｌｓ，ＭＩ））のこぎりを用いて、各辺約５ｍｍのエナメルスラブに切断した。エナメルスラブを清浄にし、成形材料を含有するウェルプレートに、ウェル内のエナメル質表面のみを露出させるように埋め込んだ。
【０１８５】
コバルト−ＮＴＡコーティング（ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＴＡＬＯＮ（登録商標））を有するポリスチレンビーズは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商品＃１０１．０２Ｄ）から４０ｍｇ／ｍＬのスラリーとして入手した。スラリー（５０μＬ、２ｍｇのビーズ）を再懸濁させ、Ｈｉｓ６結合の調製において７００μＬの結合緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）で洗浄した。
【０１８６】
ペプチドをリン酸緩衝食塩水（Ｐｉｅｒｃｅ、ｐＨ７．２）中に２０μＭの濃度で溶解した。エナメルスラブを含有する各ウェル内にペプチド溶液（５００μＬ）を入れた。この工程でＰＢＳのみにさらしたエナメルスラブを対照として用いた。サンプルを穏やかに攪拌しながらペプチド溶液と共に３０分間インキュベートした。ペプチド溶液およびＰＢＳをウェルプレートから除去し、ＰＢＳを繰り返し添加して、各ウェルを３回すすいだ。ＴＡＬＯＮ（登録商標）ビーズ（５０μＬ）を各ウェルに添加し、穏やかに攪拌しながら３０分間インキュベートした。ＴＡＬＯＮ（登録商標）溶液を除去し、サンプルを同じ結合緩衝液で３回洗浄した。
【０１８７】
各エナメル質サンプルをウェルプレートから除去し、緩衝液で再度すすいだ。ビーズ結合の後の観察により、ペプチドを含まない対照およびＤＥ０４５を除く各エナメル質表面に薄い茶色が示された。１０００Ｘ、２５００Ｘおよび５０００Ｘ倍率におけるＥｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（Ｈｉｔａｃｈｉ  ＴＭ−１０００  Ｔａｂｌｅｔｏｐ  ＳＥＭ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）によってエナメルスラブをさらに調査した。各ペプチドにさらした基質は、視野全体で１μｍの粒子の実質的な被覆度を示した。ＤＥ０４５にさらした基質も他のサンプルよりも低い程度のビーズ結合を示した。ペプチドのない対照においては、ビーズは少ししか〜まったく見られなかった。コバルト−ＮＴＡコーティングを有するポリスチレンビーズに加えてシリカにも結合するように設計されたＤＥ００８は、エナメル質結合配列のみにより設計されたペプチドと同様の結果を有した。表１０には、各ペプチドおよびペプチドのない対照の粒子被覆度が記載される。エナメル質表面にわたるビーズの優れた被覆度は、エナメル質表面およびＣｏ−ＮＴＡビーズの両方に対するペプチド組成物の親和性を実証する。
【０１８８】
【表１４】
0005850825.tif 000015
【０１８９】
第１の結合要素および第２の結合要素を含むペプチド組成物も実証されており、ここで第２の結合要素はポリヒスチジンである。第２の結合要素と、リガンド特性を有する粒子（コバルト−ＮＴＡ被覆ポリスチレンビーズ）との会合も実証される。一実施形態では、ペプチド組成物は、配列番号１２０、１２１、１２２または１２３を含む。別の実施形態では、ペプチド組成物は、配列番号１２１、１２２、または１２３を含む。
【０１９０】
実施例１０
ペリクル表面における歯ペリクル結合候補のキャラクタリゼーション
本実施例の目的は、合成的に産生されたペプチドを用いて、ペリクル表面におけるペプチド組成物の結合を確認することである。
【０１９１】
表６から得られる配列を用いて合計２０の合成ペプチドを製造した。ペプチドはＳｙｎＢｉｏＳｃｉ  Ｃｏｒｐ．（Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ，ＣＡ）から入手され、Ｎ末端に付加的な配列（ＳＳＲＰ、配列番号１１８）、そしてＣ末端にビオチン標識リジンを含んでいた。
【０１９２】
エナメル基質を約７ｍｍ角に切断し、口の中で３０分間インキュベーションするためにワックス台上に取り付けて、ペリクル被覆表面を形成した。ペリクル被覆エナメル基質をワックスバッキングから除去し、ウェルプレート内に置き、実施例５のようにペリクル表面を露出させた。各ペリクル被覆基質を、ＰＢＳＴ（０．１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を有するＰｉｅｒｃｅ  ＢＵＰＨＴＭ  ♯２８３７２）中１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡからなる１ｍＬのブロッキング緩衝液と共に室温（〜２２℃）で１時間インキュベートした。各ウェルから液体を吸引することによってブロッキング緩衝液を除去した。ＰＢＳＴからなる洗浄緩衝液でチューブを２回すすいだ。ブロッキング緩衝液中に希釈することにより調製した５００μＬの２０μＭのペプチド溶液をウェルに満たした。サンプルをゆっくり振とうさせながら３７℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳＴで６回洗浄することによって非結合ペプチドを除去した。次に、ＰＢＳＴ中に１：２０００で希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ／ストレプトアビジン結合体（Ｐｉｅｒｃｅ  ♯２２１２７）を５００μＬ添加し、室温（〜２２℃）で１時間インキュベートした。結合体溶液を除去し、ＰＢＳＴで４回洗浄した。
【０１９３】
各エナメル基質をウェルから除去し、１５ｍＬの試験管中で１０ｍＬのＰＢＳＴにより再度洗浄した。次に、各エナメル基質を清浄なウェルプレート内に取り付け、エナメル質表面のみを露出させた。ＴＭＢ基質およびＨ２Ｏ２の１：１溶液（２００μＬ）を各ウェルに添加し、室温（〜２２℃）で１０分間〜２０分間の間、通常は１５分間発色させた。次に、各ウェル中に停止溶液（１００μＬの２ＭのＨ２ＳＯ４）を含有する９６ウェルのリーディングプレートに各ウェルからの１００μＬの溶液を移した。マイクロプレート分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いてＡ４５０を測定した。得られた吸光度値は表１１に与えられる。２０のペリクル結合候補の分析を２日間にわたって完了させ、結果を、１日目からの最良の結合候補（ＤｅｎＰ０３）に対して正規化した。３回再現したエナメル質被覆ペリクル基質を用いて各配列を試験した。
【０１９４】
【表１５】
0005850825.tif 000016
【０１９５】
ペリクル結合ペプチドおよびビオチンを含むペプチド組成物が提供される。一実施形態では、ペプチド組成物の第１の結合要素は、ペリクル結合ペプチド、または配列番号１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、もしくは１４４の配列を含むペプチドを含む。一実施形態では、第２の結合要素はビオチンを含む。
【０１９６】
実施例１１
ペリクル表面におけるペプチド結合親和性の決定
本実施例の目的は、ペリクル結合ペプチドの、そして実施例１０で同定されたペリクル結合ペプチドを含むペプチド組成物の、ＥＬＩＳＡアッセイを用いてＭＢ５０値で測定される親和性および特異性を決定することであった。
【０１９７】
標準的な固体ファージ合成法を用いて、表１１に記載されるようなペリクル結合ペプチド、ＤｅｎＰ３およびＤｅｎＰ３２を合成し、検出のために結合配列のＣ末端のリジン残基においてビオチン化した。
【０１９８】
エナメル基質を約４ｍｍ角に切断し、口の中で３０分間インキュベーションするためにワックス台上に取り付けて、ペリクル被覆表面を形成した。ペリクル被覆エナメル基質をワックスバッキングから除去し、ウェルプレート内に置き、実施例５のようにペリクル表面を露出させた。各ペリクル被覆基質を、ＰＢＳＴ（０．１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を有するＰｉｅｒｃｅ  ＢＵＰＨＴＭ  ♯２８３７２）中１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡからなる１ｍＬのブロッキング緩衝液と共に室温で１時間インキュベートした。各ウェルから液体を吸引することによってブロッキング緩衝液を除去した。ＰＢＳＴからなる洗浄緩衝液でチューブを２回すすいだ。様々な濃度にわたってブロッキング緩衝液中に希釈することにより調製した５００μＬのペプチド溶液をウェルに満たした。サンプルをゆっくり振とうさせながら３７℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳＴで６回洗浄することによって非結合ペプチドを除去した。次に、ＰＢＳＴ中に１：２５００で希釈したアルカリホスファターゼ／ストレプトアビジン結合体（Ｐｉｅｒｃｅ）を５００μＬ添加し、室温で１時間インキュベートした。結合体溶液を除去し、ＰＢＳＴで４回洗浄した。
【０１９９】
各エナメル基質をウェルから除去し、１５ｍＬの試験管中で１０ｍＬのＰＢＳＴにより再度洗浄した。次に、各エナメル基質を清浄なウェルプレート内に取り付け、エナメル質表面のみを露出させた。４−リン酸メチルウンベリフェロン（４−ＭＵＰ）（１５０μＬ）基質（Ｓｉｇｍａ）を各ウェルに添加し、周囲の光から保護して３０分間インキュベートした。次に、９６ウェルのリーディングプレートに各ウェルからの１００μＬの溶液を移した。マイクロプレート分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ））を用いて蛍光を読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））を用いて、ペプチドの濃度に対する相対蛍光単位として結果をプロットした。ＳｃａｔｃｈａｒｄプロットからＭＢ５０値を計算し、表１２に示す。
【０２００】
【表１６】
0005850825.tif 000017
【０２０１】
一実施形態では、ペプチド組成物は、配列番号１２７または１４４を含む。別の実施形態では、ペプチド組成物は、ペリクル結合ペプチドおよびビオチンを含む。一実施形態では、ペプチド組成物は、約１０−５ＭのＭＢ５０でペリクル表面に結合する。
【０２０２】
実施例１２（予測的（ＰＲＯＰＨＥＴＩＣ））
有益剤表面におけるペプチド結合親和性の決定
本実施例の目的は、リガンド特性を含有する有益剤の表面に対して、ペリクル表面における結合要素の結合優先度を確認することである。ペリクル表面に対して既知の親和性を有するビオチン化ペプチドは、ポリヒスチジン部分（例えば、６個のヒスチジン残基）に結合するように設計されたビーズに対して試験される。
【０２０３】
コバルト−ＮＴＡコーティング（ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＴＡＬＯＮ（登録商標））を有するポリスチレンビーズは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商品＃１０１．０２Ｄ）から、４０ｍｇ／ｍＬのスラリーとして入手される。約５０μＬのスラリー（２ｍｇのビーズ）を再懸濁し、７００μＬのＰＢＳＴで洗浄する。ブロッキング緩衝液（ＰＢＳＴ中１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ）中でビーズを室温（〜２２℃）で１時間インキュベートする。磁石を用いて、ビーズを試験管の底に保持しながらブロッキング緩衝液を除去する。ビーズをＰＢＳＴで２回洗浄し、磁石を除去した後、攪拌により溶液中に再懸濁させる。様々な濃度にわたってブロッキング緩衝液中に希釈することによってペプチド溶液（５００μＬ）を調製する。サンプルをゆっくり振とうさせながら３７℃で３０分間インキュベートする。ＰＢＳＴで６回洗浄することによって非結合ペプチドを除去する。次に、ＰＢＳＴ中に１：２５００で希釈したアルカリホスファターゼ／ストレプトアビジン結合体（Ｐｉｅｒｃｅ）を５００μＬ添加し、室温で１時間インキュベートした。結合体溶液を除去し、ビーズをＰＢＳＴで４回洗浄する。ビーズを清浄な試験管に移した。４−リン酸メチルウンベリフェロン（４−ＭＵＰ）基質（Ｓｉｇｍａ）を各試験管に添加し、周囲の光から保護して３０分間インキュベートした。ビーズを磁石により再び管の底に保持し、各試験管からの１００ｕＬの溶液を９６ウェルのリーディングプレートに移した。マイクロプレート分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ））を用いて蛍光を読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．，（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））を用いて、ペプチドの濃度に対する相対蛍光単位として結果をプロットする。ＳｃａｔｃｈａｒｄプロットからＭＢ５０値を計算する。いくつかの実施形態では、ＭＢ５０値によって、Ｃｏ−ＮＴＡ被覆ビーズに対する親和性はペリクル表面に対して測定されるよりも少なくともほぼ一桁高いことが示され、従って、結合要素は粒子よりもペリクル表面に対してより大きい親和性を有する。
【０２０４】
実施例１３
ペプチド媒介によるストレプトアビジン被覆金粒子のウシエナメル質への接着
歯の表面におけるファージディスプレイパニングによって発見された結合ドメイン（実施例３を参照）と、ストレプトアビジンおよびアビジンタンパク質に対して既知の親和性を有するＣ末端にビオチン結合された第２の結合要素とを組み込んだペプチドを設計した。標準的な合成固体ファージ法によりペプチドサンプルを産生した。対照として、歯の表面に対する同じ結合ドメインを含む非ビオチン化ペプチドも試験した。
【０２０５】
【表１７】
0005850825.tif 000018
【０２０６】
ウシエナメル質切歯は、ＳＥ  Ｄｅｎｔａｌ（Ｂａｔｏｎ  Ｒｏｕｇｅ，ＬＡ）から入手した。歯を薄片にし、ダイヤモンド刃の付いたＤＲＥＭＥＬ（登録商標）のこぎりを用いて、各辺約５ｍｍのエナメルスラブに切断した。エナメル質ブロックを清浄にし、それぞれをプラスチック微量遠心管に入れた。
【０２０７】
各エナメル質ブロックを、０．１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（ＰＢＳＴ）および１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を有するリン酸緩衝食塩水中、室温（２２℃）で４５分間インキュベートした。全てのブロックを、微量遠心管中でボルテックスしながらＰＢＳＴで２回すすいだ。ペプチドをまず水中１０ｍＭに希釈し、次に、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを有するＰＢＳＴ中２０μＭの作業濃度を調製した。各サンプルをペプチド溶液またはペプチドを含まない緩衝液対照に室温で３０分間さらした。インキュベーション中、サンプルをゆっくり回転させた。エナメル質ブロックをペプチド溶液から除去し、ボルテックスしながらＰＢＳＴで４回洗浄した。
【０２０８】
ストレプトアビジンで官能性を持たせた５０ｎｍの金ナノ粒子をＮａｎｏｃｓ  Ｉｎｃ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）から入手し、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを有するＰＢＳＴ中０．００６重量％に希釈した。次に、全てのエナメル質サンプルを、ゆっくり回転させながら金ナノ粒子溶液に室温で１時間さらした。サンプルを水で３回すすぎ、分析の前に乾燥させた。
【０２０９】
Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙにより各エナメル質サンプルを調査した。電子帯電を低減するために、分析の前に、各サンプルを炭素で被覆した。Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓ４７００  ＦＥＳＥＭにおいて１０００Ｘ、１００００Ｘおよび３００００Ｘの倍率で画像を集めた。顕微鏡写真あたりの粒子をカウントし、粒子被覆の密度を比較した（表１４）。
【０２１０】
【表１８】
0005850825.tif 000019
【０２１１】
ビオチン含有配列で最初に被覆されたエナメル質表面におけるストレプトアビジン粒子の被覆度がより高いと、エナメル質表面およびストレプトアビジン被覆粒子の両方に対して設計されたペプチドの親和性が実証される。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、ペプチド組成物は、配列番号１６１および１６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０２１３】
実施例１４
ペプチドおよび顔料の連続適用による歯のホワイトニング
ペプチド組成物は、バイオパニングにおいて発見されたペリクル結合ドメインおよびシリカ被覆二酸化チタンなどの負帯電顔料に結合するように設計した第２の結合要素を含むように設計した。ペリクル結合ドメインは、２つのペリクル結合要素ＤｅｎＰ０３（配列番号６６）およびリンカー「Ｌｂ２」配列番号５４を含む。可動性の非帯電リンカー（ＧＳＳＧＰＧＳＳ、配列番号１６０）が２つの結合要素を結びつける。対照として、同じペリクル結合ドメインを組み込むが、負帯電顔料に結合する付加的なドメインを含まない第２のペプチドを設計した。実施例１６に記載されるような発酵によってペプチドを産生した。
【０２１４】
【表１９】
0005850825.tif 000020
【０２１５】
シリカ被覆ルチル二酸化チタン（Ｌｕｃｅ  ＩＩ  ＷＷ）は、ＵＳ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．（Ｄａｙｖｉｌｌｅ，ＣＴ）から入手した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水により１２重量％の顔料溶液を調製した。１０ＷにおいてＢｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  １５０を用いるホーン超音波処理により溶液を分散させた。氷浴中、２分間の超音波処理期間で合計６分間、溶液を超音波処理した。ペプチド被覆エナメル質に適用するために１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中１重量％の作業溶液を作った。同じ緩衝液中に希釈したこの分散液の０．０１％溶液をＭａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  動的光散乱機器において測定した。分散液は、４４５ｎｍの平均粒径（Ｚ−ａｖｇ）および−５７ｍＶのゼータ電位を有した。
【０２１６】
ウシエナメル質切歯は、Ｅ  Ｄｅｎｔａｌ（Ｂａｔｏｎ  Ｒｏｕｇｅ，ＬＡ）から入手した。歯を薄片にし、ダイヤモンド刃の付いたＤＲＥＭＥＬ（登録商標）のこぎりを用いて各辺約７ｍｍのエナメルスラブに切断した。エナメルスラブを清浄にし、軽く研磨して表面のくずを除去した。ヒトの染色された歯と同様の色に染色するためにエナメル質をコーヒーおよびお茶の混合物で前処理した。次に、各エナメル質ブロックをワックス台に取り付け、エチレンオキシドで滅菌した。取り付けたエナメル質ブロックを口の中で３０分間インキュベートして、ペリクル被覆表面を形成した。取り付けたエナメル質ブロックを、歯ブラシおよびＣＯＬＧＡＴＥ（登録商標）ＭＡＸＦＲＥＳＨ（登録商標）練り歯磨き（Ｃｏｌｇａｔｅ−Ｐａｌｍｏｌｉｖｅ  Ｃｏ．，（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ））の１：２希釈物でブラッシングしてから、口の中に１分間再挿入した。ペリクル被覆エナメル基質をワックスバッキングから除去し、水ですすぎ、ウェルプレートに入れた。各ペリクル被覆エナメル質スラブを、Ｋｏｎｉｃａ−Ｍｉｎｏｌｔａ  ２６００ｄ積分球分光光度計を用いて色について測定した。
【０２１７】
表１５に記載されるペプチドをｐＨ７．２のＰＢＳ緩衝液中に２０μＭの濃度で溶解した。各実験条件に対して３回再現した歯を用いた。各歯をペプチド溶液と共に３０分間、あるいは対照として緩衝液単独でインキュベートした。エナメル質ブロックをペプチド溶液から除去し、ＰＢＳ緩衝液ですすいだ。次に、エナメル質ブロックをシリカ被覆ＴｉＯ２の１％溶液中で３０分間インキュベートした。エナメル質ブロックを除去し、１０ｍＭのリン酸緩衝液ですすぎ、吸い取り乾燥（ｂｌｏｔｔｅｄ  ｄｒｙ）した。各基質を色（Ｌ、ａ＊、ｂ＊、Ｃ＊、ｈ）値について測定した。ホワイトニングプロセスの全色差、デルタＥ＊ａｂおよびメトリック色相差、デルタＨ＊ａｂは、以下の式（１）および（２）：
デルタＥ＊ａｂ＝（（Ｌ＊１−Ｌ＊２)２＋（ａ＊１−ａ＊２)２＋（ｂ＊１−ｂ＊２)２)１／２  （１)
デルタＨ＊ａｂ＝（２(Ｃ＊１Ｃ＊２−ａ＊１ａ＊２−ｂ＊１ｂ＊２）)１／２   （２）
を用いて計算した。ここで、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ（ＣＩＥ）により定義され、ＡＳＴＭ  Ｄ２２４４−０９ｂに記載されるように、Ｌ＊＝明度変数、ａ＊およびｂ＊は色度座標およびＣ＊はＣＩＥＬＡＢ色空間の彩度であり、下付き文字１は初期色値を示し、下付き文字２は最終色値を示す。色測定値は表１６に提供される。
【０２１８】
【表２０】
0005850825.tif 000021
【０２１９】
表１６における色測定値は、ペリクル結合要素と、負帯電シリカ被覆二酸化チタンとの静電相互作用のために設計された第２の結合要素との両方を含有するペプチド配列が、ペプチドのない対照および第２の結合要素を含有しないペプチドと比較してより大きい色差測定値によって示されるように、粒子付着の改善をもたらすことを実証する。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、ペプチド組成物は、配列番号１６４および１６７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する第１の結合要素を含む。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、ペプチド組成物は、配列番号１６５および１６８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する第２の結合要素を含む。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、ペプチド組成物は、配列番号１６３および１６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０２２３】
実施例１５（予測的）
ペプチドおよび顔料の連続適用による歯のホワイトニング
ペプチド組成物は、バイオパニングにおいて発見されたペリクル結合ドメインおよびシリカ被覆二酸化チタンなどの負帯電顔料に結合するように設計された付加的なドメインを含むように設計した（表１７）。可動性の非帯電リンカー（ＧＳＳＧＰＧＳＰ、配列番号１５８）が２つの結合要素を結びつける。実施例１６に記載されるような発酵によってペプチドを産生した。
【０２２４】
【表２１】
0005850825.tif 000022
【０２２５】
【表２２】
0005850825.tif 000023
【０２２６】
【表２３】
0005850825.tif 000024
【０２２７】
米国特許第２，８８５，３６６号明細書（Ｉｌｅｒ）に記載される方法によって、３％のシリカ負荷でシリカにより最初に被覆されたシリカ被覆二酸化チタンを、ルチル二酸化チタン（ＤｕＰｏｎｔ，（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ））を用いて調製する。ＳＰＥＥＤＭＩＸＥＲＴＭ  ＤＡＣ１５０  ＦＶＺ−Ｋ（ＦｌａｃｋＴｅｋ  Ｉｎｃ．，（Ｌａｎｄｒｕｍ，ＳＣ））において、約１０ｇのシリカ被覆二酸化チタンを、２５ｇの０．５ｍｍのジルコニア−シリカビーズおよび４０ｇの水と混ぜ合わせて安定な分散液を作る。混合物を合計２０分間処理する。混合に続いて、溶液をろ過して、ジルコニア−シリカビーズを除去する。得られた顔料分散液は不透明な白色溶液であり、負のゼータ電位を有する安定な分散液である。シリカ被覆二酸化チタンの０．５％（固体重量）溶液を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中で調製する。
【０２２８】
ＳＥ  Ｄｅｎｔａｌ（Ｂａｔｏｎ  Ｒｏｕｇｅ，ＬＡ）から入手したウシ切歯からエナメル基質を約７ｍｍ角に切断する。各エナメル質ブロックをまずお茶およびコーヒーの組み合わせで２日間処理して、自然のヒト歯の色調と同様の色にブロックを染色する。基質を研磨し、滅菌し、口の中で３０分間インキュベーションするためにワックス台上に取り付けて、ペリクル被覆表面を形成する。ペリクル被覆エナメル基質をワックスバッキングから除去し、積分球分光光度計（Ｍｉｎｏｌｔａ  ＣＭ２６００ｄ）を用いて、各基質において色を測定する（Ｌ、ａ＊、ｂ＊）
【０２２９】
ペプチドをｐＨ７．２のＰＢＳ緩衝液中に濃度１０μＭで溶解する。各歯をペプチド溶液と共に３０分間、あるいは対照として緩衝液単独でインキュベートする。エナメル質ブロックをペプチド溶液から除去し、ＰＢＳ緩衝液ですすぐ。次に、エナメル質ブロックを、シリカ被覆ＴｉＯ２の０．５％溶液中で３０分間インキュベートする。エナメル質ブロックを除去し、１０ｍＭのリン酸緩衝液ですすぎ、吸い取り乾燥する。各基質を色（Ｌ、ａ＊、ｂ＊、Ｃ＊、ｈ）値について測定し、実施例１４に記載されるように色の変化を計算した。好ましい実施形態では、ペプチド媒介による色の付着は、計算されたデルタＥがペプチドのない対照よりも著しく大きいことによって認められる。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、ペプチド組成物は、配列番号１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、および１５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する第２の結合要素を含む。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、ペプチド組成物は、配列番号１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、および１５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０２３２】
実施例１６
発酵によるペプチドの生物学的産生
産生株の構築
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のために有利なコドンを用いて所与のペプチド配列コードするように、そして配列反復およびｍＲＮＡ二次構造を回避するようにＤＮＡ配列を設計した。Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎら（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，（２００４年）２２（７）：３４６−３５５）によって記載される独自開発のソフトウェアを用いて、ＤＮＡ  ２．０，Ｉｎｃ．（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）により遺伝子配列を設計した。アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の後には、２つの終結コドンおよびエンドヌクレアーゼＡｓｃＩのための認識部位があった。
【０２３３】
合成オリゴヌクレオチドから遺伝子を構築し、ＤＮＡ  ２．０，Ｉｎｃ．によって標準プラスミドクローニングベクターにクローニングした。次に、ＤＮＡ  ２．０，Ｉｎｃ．によるＤＮＡ配列決定によって配列を検証した。合成遺伝子をエンドヌクレアーゼ制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｓｃＩによりクローニングベクターから切り取り、標準組換えＤＮＡ法を用いて発現ベクター内に連結した。ベクターｐＫＳＩ（Ｃ４）Ｅ−ＨＣ７７６４３（配列番号１５９）（米国特許出願公開第２００９−００２９４２０−Ａ１号明細書、参照によって本明細書に援用される）を用いて、ペプチドをコードする遺伝子を発現させた。ベクターｐＫＳＩ（Ｃ４）Ｅ−ＨＣ７７６４３は、発現ベクターｐＫＳＩＣ４−ＨＣ７７６２３の誘導体である。特に、ＫＳＩ（Ｃ４）封入体タグ中の５つの酸に不安定なアスパラギン酸残基を、タグをより耐酸性にするためにグルタミン酸で置換した。
【０２３４】
プラスミドｐＫＳＩＣ４−ＨＣ７７６２３は、市販のベクターｐＤＥＳＴ１７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））に由来した。このベクターの構築は、参照によって本明細書に援用される米国特許第７，２８５，２６４号明細書（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら）において既に記載されている。これには、酵素ケトステロイドイソメラーゼ（ＫＳＩ）の断片をコードする市販のベクターｐＥＴ３１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））に由来する配列が含まれる。ＫＳＩ断片は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における不溶性の封入体へのペプチドの分割を促進するために融合パートナーとして含まれた。標準変異誘発手順（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））を用いて、野生型ＫＳＩ配列中に見られる１つのＣｙｓコドンに加えて３つの付加的なＣｙｓコドンを含むように、ｐＥＴ３１ｂからのＫＳＩコード配列を修飾した。
【０２３５】
所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列を、ＢａｍＨＩ部位とＡｓｃＩ部位の間でベクター内の配列を置換することによってｐＫＳＩ（Ｃ４）Ｅ−ＨＣ７７６４３内に挿入した。ペプチドコード配列およびベクターＤＮＡを含有するプラスミドＤＮＡをエンドヌクレアーゼ制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｓｃＩで消化し、次に、ペプチドコード配列およびベクターＤＮＡを混合し、標準ＤＮＡクローニング手順を用いてファージＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結した。ペプチドをコードする配列がｐＫＳＩ（Ｃ４）Ｅ−ＨＣ７７６４３に挿入された正確な構築物を制限分析により同定し、ＤＮＡ配列決定により検証した。この構築物において、ペプチド結合体をコードする配列を、ＨＣ７７６４３をコードする配列と置換した。配列をバクテリオファージＴ７遺伝子１０プロモーター作動可能に連結させ、変異形ＫＳＩパートナーと融合された融合タンパク質として発現させた。
【０２３６】
ペプチドの発現を試験するために、発現プラスミドをＢＬ２１−ＡＩ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｃ６０７０−０３）に形質転換した。組換え融合ペプチドを産生するために、５０ｍＬのＬＢ−アンピシリンブロス（１０ｇ／Ｌバクト−トリプトン、５ｇ／Ｌのバクト−酵母抽出物、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン、ｐＨ７．０）に形質転換細菌を接種し、ＯＤ６００が０．６に到達するまで培養物を３７℃で振とうした。０．５ｍＬの２０重量％のＬ−アラビノースを培養物に添加することによって発現を誘発し、振とうをさらに４時間継続した。
【０２３７】
成長条件
ペプチドをコードする発現プラスミドを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１−ＡＩ細胞を、１Ｌの修正ＺＹＰ−５０５２自己誘導培地を含有する２．８ＬのＦｅｒｎｂａｃｈフラスコ中で、攪拌（２００ｒｐｍ）しながら３７℃で２０時間成長させた（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ，（２００５）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ４１：２０７−２３４）。１リットルあたりの培地組成は、次の通りである：１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／ＬのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、２５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、３ｍＭのＭｇＳＯ４、０．７５％のグリセロール、０．０７５％のグルコースおよび０．０５％のＬ−アラビノース（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１ＡＩＴ７系のための誘発剤）。これらの条件下で、１リットルあたり約２０ｇ／Ｌの湿重量の細胞を得た。
【０２３８】
封入体の単離
１本の５００ｍＬビンの中で以下のプロセスを実施した。細胞を遠心分離により成長培地から分離し、２００ｍＬ（１０ｇの細胞ペースト／１００ｍＬの緩衝液）の２０ｍＭのトリス緩衝液および１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）で洗浄した。リゾチーム（５ｍｇ／２００ｍＬ）を添加した２００ｍＬの２０ｍＭのトリス緩衝液および１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中に細胞ペーストを再懸濁させ、少なくとも１回の凍結融解サイクルを通して、溶解を促進した。超音波処理により溶解を完了させ、遠心分離（９０００ＲＣＦ、４℃で２０分間）により封入体ペーストを回収する。それぞれの付加的な洗浄工程は、封入体ペーストの再懸濁と、その後の超音波処理および遠心分離（９０００ＲＣＦ、４℃で２０分間）とを含んだ。洗浄工程は、高ｐＨ洗浄（５０ｍＭのトリスＨＣＬ、ｐＨ９．０）と、その後の２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）による付加的な洗浄を含んだ。通常、５ｇ／Ｌの封入体ペーストを回収した。
【０２３９】
酸切断
回収した封入体ペーストを１００ｍＬの純水中に再懸濁し、ＨＣｌを用いて混合物のｐＨを２．２に調整した。酸性化した懸濁液を攪拌しながら７０℃に１４時間加熱し、融合ペプチドを産物ペプチドから分離するアスパルチル−プロリル（ＤＰ）部位の切断を完了させた。
【０２４０】
ＩＢＴを対象のペプチドから分離するための酸化架橋
産物を〜５℃に冷却してから、ＮａＯＨを用いてｐＨを５．３に中和し、さらに１時間〜５℃に冷却して、システイン架橋ＫＳＩ（Ｃ４）Ｅタグの沈殿を促進した。次に、混合物を、１００００ＲＣＦ、４℃において３０分間遠心分離した。ペレットは、封入体融合パートナーＫＳＩ（Ｃ４）Ｅを含有した。
【０２４１】
酸化架橋後の結果：
沈殿ペーストおよび残存する可溶性画分の両方のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析によって、不溶性ペースト中のＫＳＩ（Ｃ４）Ｅの存在と、所望のペプチドが可溶性画分中に残存することが示された。
ペプチドを含有する上澄みをＨＰＬＣにより分析して、ペプチドの存在を確認した。単離したペプチドのＬＣＭＳによるさらなる分析によって、５つの潜在的な内部の酸切断可能な「Ｄ」配列および１つの好ましい酸切断部位（Ａｓｐ−Ｐｒｏ）を含有するＫＳＩ（Ｃ４）バージョンで見られる汚染ＫＳＩ断片の不在が確認された。
【０２４２】
以上、本発明を要約すると以下の通りである。
１．（ａ）（ｉ）口腔表面に対する親和性を有し、ＭＢ５０値が１０−５モル濃度又はそれ未満である第１の結合要素、および
（ii）第２の結合要素
を含むペプチド組成物と、
（ｂ）０．０１ミクロン〜１０ミクロンの範囲の平均粒径を有する粒子を含む組成物であって、該粒子が、
（ｉ）有益剤、および
（ii）リガンド特性
を含む組成物と
を含み、ここで上記第２の結合要素および上記リガンド特性が非共有結合でまたはキレート化によって互いに会合する、口腔ケアシステム。
２．粒子を含む前記組成物が前記粒子の安定分散液である、上記１に記載の口腔ケアシステム。
３．平均粒径がレーザー回折または動的光散乱などの光散乱法によって測定される、上記１または２に記載の口腔ケアシステム。
４．第１の結合要素が複数の口腔表面結合ペプチドを含む、上記１に記載の口腔ケアシステム。
５．口腔表面が歯の表面である、上記１に記載の口腔ケアシステム。
６．歯の表面がエナメル質である、上記５に記載の口腔ケアシステム。
７．歯の表面がペリクルである、上記５に記載の口腔ケアシステム。
８．第１の結合要素が、粒子に対する親和性に比べて、口腔表面に対してより大きい結合親和性を有する、上記１に記載の口腔ケアシステム。
９．第２の結合要素とリガンド特性との間の会合が、イオン結合に基づく、水素結合に基づく、キレート化に基づく、生物学的親和性に基づく、静電気に基づく、またはこれらの組み合わせである、上記１に記載の口腔ケアシステム。
１０．第２の結合要素とリガンド特性との間の会合がキレート化に基づく、上記９に記載の口腔ケアシステム。
１１．第２の結合要素がポリヒスチジンタグである、上記１０に記載の口腔ケアシステム。
１２．第２の結合要素とリガンド特性との間の会合が静電気に基づく、上記９に記載の口腔ケアシステム。
１３．第２の結合要素およびリガンド特性が、ビオチンおよびアビジン、ビオチンおよびストレプトアビジン、ストレプトアビジンタグおよびストレプトアビジン、マルトース結合タンパク質およびマルトース、マルトース結合タンパク質およびアミラーゼ、ポリヒスチジンタグおよび金属イオンを含む親和性媒体、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼおよびグルタチオン、エピトープタグおよび抗体、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記９に記載の口腔ケアシステム。
１４．親和性媒体が、コバルト、銅、ニッケル、亜鉛、またはこれらの組み合わせの金属イオンを含む、上記１３に記載の口腔ケアシステム。
１５．有益剤が、着色剤、ホワイトニング剤、酵素、抗プラーク剤、防汚剤、抗菌剤、抗う蝕剤、香味剤、冷却剤、唾液分泌剤またはこれらの組み合わせを含む、上記１に記載の口腔ケアシステム。
１６．着色剤が顔料である、上記１５に記載の口腔ケアシステム。
１７．顔料がＴｉＯ２を含む、上記１６に記載の口腔ケアシステム。
１８．安定分散液が電荷安定化されている、上記２に記載の口腔ケアシステム。
１９．安定分散液が、少なくとも２５ｍＶの絶対値を有するゼータ電位を含む、上記２に記載の口腔ケアシステム。
２０．安定分散液が立体的に安定化されている、上記２に記載の口腔ケアシステム。
２１．安定分散液が分散剤を含む、上記２に記載の口腔ケアシステム。
２２．分散剤がイオン性分散剤または非イオン性分散剤である、上記２１に記載の口腔ケアシステム。
２３．ペプチド組成物が、配列番号６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１２０、１２１、１２２、１２３、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、および１４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む、上記１に記載の口腔ケアシステム。
２４．ペプチド組成物が、配列番号１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、および１５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む、上記１に記載の口腔ケアシステム。
２５．ペプチド組成物が、配列番号１６１、１６２、１６３、および１６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む、上記１に記載の口腔ケアシステム。
２６．ペプチド組成物が、配列番号１１６、１１７、１１９、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１６５、および１６８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する第２の結合要素を含む、上記１に記載の口腔ケアシステム。
２７．口腔ケア用有益剤を口腔表面に適用するための方法であって、
（ａ）（ｉ）（１）口腔表面に対する親和性を有し、ＭＢ５０値が１０−５モル濃度又はそれ未満である第１の結合要素、および
（２）第２の結合要素
を含むペプチド組成物と、
（ii）０．０１ミクロン〜１０ミクロンの範囲の平均粒径を有する粒子を含む組成物であって、該粒子が、
（１）有益剤、および
（２）リガンド特性
を含む組成物と
を含み、ここで上記第２の結合要素および上記リガンド特性が非共有結合またはキレート化によって互いに会合する口腔ケアシステムを備えることと、
（ｂ）口腔表面を上記（ａ）の口腔ケアシステムと接触させ、それにより、該有益剤を該口腔表面に適用することと
を含む、上記方法。
２８．口腔ケアシステムのペプチド組成物を、口腔表面と接触させた後、粒子を含む組成物と接触させる、上記２７に記載の方法。
２９．口腔ケアシステムのペプチド組成物および粒子を含む組成物が同時に前記口腔表面に適用される、上記２７に記載の方法。
３０．ペプチド組成物が、配列番号６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、および１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記２７に記載の方法。
３１．配列番号６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１２０、１２１、１２２、１２３、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、および１４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
３２．１６１、１６２、１６３、および１６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
３３．上記３１または３２に記載のポリペプチドを含む口腔ケア組成物。
３４．組成物が散剤、パスタ剤、ゲル剤、液剤、軟膏剤、または錠剤の形態である、上記３３に記載の口腔ケア組成物。
【配列表】
0005850825000001.app